(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物、ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物、ＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物のうちの少なくとも１つに由来するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであって、前記配列が前記遺伝子産物の天然配列に関して突然変異し、そして前記配列が実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）およびｎｅｆに規定した前記遺伝子産物の天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの各々を保持している組換えポリペプチドに関する。さらに、本発明は同一物をコードする核酸、および同一物をコードするウイルスベクターに、そして医学ならびに免疫およびワクチン接種におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物と、
（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物と、
（ｉｉｉ）ＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物と
に由来するアミノ酸配列を含み、
前記配列が、前記遺伝子産物の天然配列に関して突然変異し、前記配列が、前記遺伝子産物の天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの実質的に全てを保持し、前記ポリペプチドは配列番号９との少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記遺伝子産物の天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）ならびにｎｅｆに規定されたとおりである、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号９との少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記配列同一性が、エピトープ間配列同一性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号９を含む、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記遺伝子産物の天然型Ｔヘルパーエピトープの実質的に全てが保持されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記遺伝子産物の天然型Ｔヘルパーエピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）ならびにｎｅｆに規定されたとおりである、請求項６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
組換えポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物と、
（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物と、
（ｉｉｉ）ＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物と
のうちの少なくとも２つに由来するアミノ酸配列を含み、
前記配列が前記遺伝子産物の天然配列に関して突然変異し、そして前記配列が前記遺伝子産物の対応する１つ以上の部分の天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの実質的に全てを保持している組換えポリペプチド。
【請求項９】
天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）ならびにｎｅｆに規定されたとおりである、請求項８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に由来するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチド配列が前記ｎｅｆ配列の機能を破壊するために突然変異し、前記ｎｅｆ配列が天然型ｎｅｆ遺伝子内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１２】
天然型ｎｅｆ配列内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープが、図３Ａに示されている、請求項１１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
天然型ｎｅｆ配列内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープが、図３Ａに示されていて、図３Ｂには存在しない、請求項１１または請求項１２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
ｎｅｆ遺伝子産物の全ての天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
前記ｎｅｆ遺伝子産物の天然型ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープが実施例８に規定したとおりである、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
全ての天然型ｎｅｆヒトＴヘルパーエピトープをさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
前記天然型ｎｅｆヒトＴヘルパーエピトープが、実施例８に規定したとおりである、請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが配列番号６に示すアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチドがｐｏｌ配列の逆転写酵素活性を破壊するように突然変異し、前記天然型ｐｏｌ配列のＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの実質的に全てが前記組換えポリペプチド内に保持されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記天然型ｐｏｌ配列のＣＤ８+Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）に規定されたとおりである、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記ｐｏｌ配列の逆転写酵素活性が、前記天然型ｐｏｌ遺伝子の中心に由来する内部配列の重複ならびに前記ｐｏｌ配列のアミノ末端およびカルボキシ末端部分の置換によって突然変異している、請求項１９または２０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
前記重複した内部配列がＴＰＤＫＫＨＱＫＥＰＰＦ（配列番号４）を含む、請求項２１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、配列番号１２に示すアミノ酸配列、またはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、請求項２１または請求項２２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドがＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチド配列が前記ｇａｇ遺伝子産物のプロセッシングを破壊するように突然変異し、そして前記ｇａｇ配列が破壊されたミリストイル化部位をさらに含み、前記天然型ｇａｇ配列のＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの実質的に全てが前記組換えポリペプチド内に保持されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
前記天然型ｇａｇ配列のＣＤ８+Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）に規定されたとおりである、請求項２４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２６】
ｇａｇの前記プロセッシングがｐ１７およびｐ２４ドメインを置換することによって破壊されており、そして前記ミリストイル化部位が第２のグリシンからアラニンへの突然変異によって破壊されている、請求項２４または２５に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号１３に示すアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２８】
抗体認識タグをさらに含み、前記タグが配列番号８に示す配列を含むＨＡタグである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２９】
ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープタグをさらに含み、前記タグが配列番号７に示す配列を含むｇｐ１６０に由来するタグである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが配列番号１に示す配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３１】
前記ＨＩＶがクレードＢ  ＨＩＶである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項３３】
配列番号１１を含む組換え核酸配列、または遺伝子コードに比較してサイレント突然変異しか相違していない配列、またはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列。
【請求項３４】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、アルファウイルス、ＶＳＶ、ＨＳＶおよびセンダイウイルスからなる群から任意に選択されるウイルスベクター。
【請求項３５】
前記ベクターがＭＶＡもしくはＭＶＡ由来ベクターである、請求項３３に記載のウイルスベクター。
【請求項３６】
前記ベクターが鶏痘もしくは鶏痘由来ベクターである、請求項３４に記載のウイルスベクター。
【請求項３７】
前記ベクターがＦＰ９鶏痘ベクターである、請求項３６に記載のウイルスベクター。
【請求項３８】
請求項３２もしくは３３に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸ベクター。
【請求項３９】
請求項３２もしくは請求項３３に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター。
【請求項４０】
請求項３２もしくは請求項３３に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポックスウイルスベクター。
【請求項４１】
ｐ２９Ｄ．ｇｐｎ、ｐＯＰＫ６．ｇｐｎおよびｐＳＧ２．ｇｐｎからなる群から選択されるプラスミド。
【請求項４２】
医学における請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４３】
ＨＩＶ感染症を治療または予防するための医薬の調製における、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４４】
ＨＩＶ感染症に対する免疫化のための医薬の調製における、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４５】
医学における請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の核酸またはベクターの使用。
【請求項４６】
ＨＩＶ感染症を治療または予防するための薬剤の調製における、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の核酸またはベクターの使用。
【請求項４７】
ＨＩＶ感染症に対する免疫化のための薬剤の調製における、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の核酸またはベクターの使用。
【請求項４８】
ＨＩＶ感染症に対して被験者を免疫する方法であって、前記被験者へ請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを投与するステップを含む方法。
【請求項４９】
プライム・ブースト免疫過程（regime）における初回抗原刺激剤または追加刺激剤としての、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３２〜４１のいずれかに記載の核酸もしくはベクターの使用。
【請求項５０】
免疫応答の誘導における請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターの使用。
【請求項５１】
前記免疫応答がＣＤ８+Ｔ細胞応答、ＣＤ４+Ｔ細胞応答、および体液性応答からなる群から選択される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
被験者において免疫応答を誘導する方法であって、前記被験者へ請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを投与するステップを含む方法。
【請求項５３】
前記免疫応答がＣＤ８+Ｔ細胞応答、ＣＤ４+Ｔ細胞応答、および体液性応答からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
配列番号９に示すアミノ酸配列との少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【請求項５５】
請求項３２もしくは請求項３３に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター。
【請求項５６】
添付の図面を参照して本明細書に実質的に記載された組換えポリペプチド、組換えポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ抗原を含むポリペプチド、詳細には突然変異ＨＩＶ配列を含むポリペプチドであって、前記突然変異配列がそれらの天然型ＣＤ８＋エピトープを保持しているポリペプチドに関する。さらに、本発明は、追加のＴヘルパーエピトープが導入されている突然変異ＨＩＶ配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶは、ＡＩＤＳなどの消耗性かつ致死性の免疫不全症を引き起こす病原性ウイルスである。ＡＩＤＳなどの状態に対する、平均余命を延長させて罹患した個体のクオリティ・オブ・ライフを向上させることのできる一定の療法は存在するが、この疾患は通例は死に至る。
【０００３】
ＨＩＶ感染患者においてウイルスを排除もしくは制御することが難題である。
【０００４】
ＨＩＶ感染症予防の問題は、これまではほとんどが性的行動の変更などの社会的解決策および／またはより多くの皮下注射針の使用者が無菌的な手法を習慣とすることによって対応されてきた。
【０００５】
ＨＩＶ感染症の医学的な予防は、依然として極めて優先度の高い研究分野である。効果的なＨＩＶワクチン接種戦略に対する必要がある。
【０００６】
ＨＩＶ粒子の１つ以上の所定要素に対して免疫応答が生じた場合でさえ、免疫優性、ウイルス逃避、および応答の改善をもたらすことのできるウイルスタンパク質の提示という問題がある。明らかに、ＨＩＶ粒子をワクチンに使用可能にするのは極度に危険である。さらに、天然タンパク質と同一のタンパク質の使用は、これらのタンパク質が望ましくない作用を有する場合はそれ自体が問題となることがある。さらに、これらのタンパク質は、それら自体が免疫抑制性の性質を有する、および／または適切に強力もしくは広範囲の免疫応答を誘発するために十分なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが欠如していることがある。
【０００７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、詳細には免疫優性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの突然変異によるウイルス逃避は、ウイルスワクチン接種における重要な問題である。現在あるワクチンはＴヘルパー細胞の不良な動員を示すので、したがって狭いおよび／または弱い免疫応答を生じさせる可能性がある。インビボで進化的圧力に曝される天然ウイルス配列は、免疫学的に重大なエピトープを相当に少数しか有していない可能性がある。さらに、免疫優性作用は、所定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの臨床的重要性を歪め、応答を（もしあれば）これらに集中させる可能性がある。明らかに、これは、例えば潜在的に致死性ウイルス逃避を引き起こす、このエピトープで突然変異するウイルス系のサブ選択をもたらす免疫優性問題を際だたせるために役立つ（例えば、Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５  ｐ．３３５を参照されたい）。
【０００８】
ＷＯ０２／３２９４３号（Ｎａｂｅｌ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ）は、遺伝子免疫のために免疫原性を増強するためのＨＩＶ  ＥＮＶ、ＧＡＧおよびＰＯＬの修飾を開示している。詳細には、彼らはＥＮＶのグリコシル化の修飾、およびδＣＦＩ  ＨＩＶ  ＥＮＶをコードする核酸構築物に焦点を当てている。さらに、ＥＮＶ開裂部位の特異的欠失、融合誘導ドメイン、および７残基反復配列１および２の間隔が開示されている。ＧＡＧ単独もしくはＧＡＧ−ＰＯＬをコードするＤＮＡプラスミドを用いた免疫が記載されており、ｇａｇ−ｐｏｌプラスミド免疫について最善の結果が得られたと主張されている。ＷＯ０２／３２９４３号の大部分は、ＷＯ０２／３２９４３号の表１および特許請求の範囲に列挙された特異的プラスミドの開示に関係している。同様に、これらのプラスミドの様々な部分の「アナログ」、およびそれらと少なくとも９５％配列同一性を有するセグメントが請求されている。ＷＯ０２／３２９４３号ではＭＨＣクラスＩおよび／またはＣＤ４発現の制限などのＮｅｆの機能を破壊させるために、ＨＩＶ−１  ＰＶ２２由来のＮｅｆ遺伝子内に点突然変異が導入された。ＰＶ２２は、突然変異の位置でＨＸＢ２参照配列（実施例８を参照）に一致する。そこで、ＷＯ０２／３２９４３号の突然変異は天然型エピトープを破壊することを見て取ることができる。例えば、構築物ＶＲＣ４３０１のＮｅｆポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、Ｐ６９Ａ、Ｐ７２Ａ、Ｐ７５Ａ、Ｐ７８Ａ、Ｄ１７４ＡおよびＤ１７５Ａである。６つの突然変異は各々、実施例８を参照して規定されたエピトープ内に存在するので、このため天然型エピトープはこの修飾Ｎｅｆ遺伝子内には残留していなかった。ＷＯ０２／３２９４３号に記載の構築物ＶＲＣ  ４３０６、ＶＲＣ  ４３０９、ＶＲＣ  ４３１０、ＶＲＣ  ４３１１、ＶＲＣ  ４３１２および類似の構築物では、作製された逆転写酵素突然変異（Ｄ７７１Ｈ）は、多数の記録されたエピトープを備える領域であるＹＭＤＤモチーフ（ＲＴ  １８３−１８６としてエピトープマップに示されている）内に含まれている。そこでこれらのエピトープは、これらの先行技術構築物中には保持されていない。さらに、ＷＯ０２／３２９４３号に開示された合成ｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆ遺伝子は、ＶＲＣ  ４３１２および類似の構築物について記載されたような融合を短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅ）することによって作製されてきた。ＶＲＣ  ４３１２を参照すると、合成ｇａｇ遺伝子は、５１アミノ酸が５’から欠失し；７７アミノ酸がｐｏｌポリタンパク質の５’から欠失し、そしてその中でｔａｇ終結コドンが欠失しているｎｅｆの３’を用いてライゲートされた合成ｎｅｆ遺伝子をコードする配列を備えるフレーム内でライゲートされた。ｐｏｌおよびｎｅｆのこれらの短縮はエピトープの消失を生じさせるので、したがって天然型エピトープは全長ｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆ遺伝子の形では保持されていない。
【０００９】
ＷＯ０２／０２２０８０号（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．）は、ＨＩＶｌ−Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆの修飾を開示している。上記の主要な修飾は、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ遺伝子のコドン最適化である。Ｇａｇポリペプチドの突然変異については言及されておらず、それをコードする核酸のコドン最適化についてしか言及されていない。ＷＯ０２／０２２０８０号の実施例１７は、Ｐｏｌタンパク質の様々な突然変異を提示している；７つの点突然変異が提示されており、それらのうちの３つは、前記タンパク質の逆転写酵素、ＲＮＡｓｅおよびインテグラーゼ領域の各々に局在している。ＨＩＶ−１  Ｐｏｌの少なくともＤ１１２Ａ、Ｄ１８７Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｄ４４５ＡおよびＤ５００Ａ突然変異がヒトエピトープ内に含まれているので、このため天然型エピトープは保持されていない。少なくともＦＨＶ−１およびＩＲＶ−１  Ｎｅｆの「ＬＬＡＡ」突然変異（すなわち、Ｌ１６４Ａ、Ｌ１６５Ａの二重突然変異体）はヒトエピトープ内に含まれているので、このためこの突然変異Ｎｅｆポリペプチド内に天然型エピトープは保持されていなかった。
【００１０】
ＷＯ０３／０２５００３号は様々な変化したｇａｇ遺伝子構築物を開示し、さらにｎｅｆおよびｐｏｌ遺伝子構築物についても言及している。これらのｎｅｆ遺伝子構築物は、ｎｅｆのＮ末端からエピトープを取り除いて短縮されていると思われる。ｇａｇ遺伝子構築物は突然変異していないと思われる。
【００１１】
本発明は、特に、上記で考察した１つ以上の問題の一部を克服することを試みる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、ＨＩＶ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを特に効果的に提示させる設計に基づいている。この方法で、極めて強力かつ広範囲の免疫応答を発生させることができる。
【００１３】
これは、エピトープを有するポリペプチドの状況を変化させることによって遂行される。この方法で、先行技術は破壊することが知られている天然型エピトープを注意深く保存しながら、有益にもウイルスポリペプチドをワクチン接種使用のために安全なものにするために、ウイルスポリペプチドの１つ以上の自然生物学的機能を破壊することができる。
【００１４】
この態様やその他の態様では、補助的（すなわち、非天然型）Ｔヘルパーエピトープもまた抗原性ポリペプチド内に導入され、それによって有益にも免疫応答が強化かつ拡大される。
【００１５】
そこで１つの態様では、本発明は、組換えポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物と、
（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物と、
（ｉｉｉ）ＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物と
のうちの少なくとも１つに由来するアミノ酸配列を含み、
前記配列が前記遺伝子産物の天然配列に関して突然変異し、そして前記配列が実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）ならびにｎｅｆに規定された前記遺伝子産物の対応する部分の天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てを保持している組換えポリペプチドを提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つに由来するアミノ酸配列を含む上述の組換えポリペプチドに関する。前記ポリペプチドが（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のうちの２つだけに由来するアミノ酸配列を含む場合は、それらは好ましくは（ｉ）および（ｉｉｉ）、すなわちｇａｇおよびｎｅｆである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に由来するアミノ酸配列を含む上述の組換えポリペプチドに関する。
【００１８】
好ましくは、前記組換えポリペプチドが含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）由来の各配列は、前記遺伝子産物の天然配列と比較して突然変異している。好ましくは、各前記配列は天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全て、好ましくは全ての前記エピトープを保持している。
【００１９】
別の態様では、本発明は上述の組換えポリペプチドに関するが、（ｉ）および／または（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）に由来するアミノ酸配列は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ向かって（ｉ）−（ｉｉ）−（ｉｉｉ）の順序で配列されている。
【００２０】
別の態様では、本発明は、組換えポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物と、
（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物と、
（ｉｉｉ）ＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物と
に由来するアミノ酸配列を含み、
前記配列が前記遺伝子産物の天然配列に比較して突然変異し、そして前記配列が実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）およびｎｅｆに規定された前記遺伝子産物の天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てを保持し、前記ポリペプチドが配列番号９との少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドに関する。好ましくは、前記ポリペプチドは配列番号９との少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２１】
また別の態様では、配列同一性はエピトープ間配列同一性である。これは、エピトープが天然もしくは参照配列におけるエピトープと１００％配列同一性で一致している、そして引用された配列同一性が配列の残りの非エピトープ領域、すなわちエピトープ間領域に対してであることを意味する。好ましくは、これは存在する全エピトープ間領域にわたって計算される。好ましくは、「エピトープ」は、好ましくは実施例８においてマッピングされたエピトープを参照して、それに対してエピトープがマッピングされている線状アミノ酸配列を表す。
【００２２】
別の態様では、本発明は、配列番号９、もしくはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、上述の組換えポリペプチドに関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、抗体認識タグをさらに含む上述の組換えポリペプチドに関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、前記タグが配列番号８に示す配列を含むＨＡタグである、上述の組換えポリペプチドに関する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープタグをさらに含む上述の組換えポリペプチドに関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、前記タグが配列番号７に示す配列を含むｇｐ１６０に由来するタグである、上述の組換えポリペプチドに関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１に示す配列を含む、上述の組換えポリペプチドに関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチドが前記ｎｅｆ配列の機能を破壊するために突然変異し、前記ｎｅｆ配列が天然型ｎｅｆ遺伝子内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープをさらに含む組換えポリペプチドに関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、天然型ｎｅｆ配列内には存在せず、図３Ａに示されている１つ以上のＴヘルパーエピトープを含む上述の組換えポリペプチドに関する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、さらに実施例８に規定した天然型ｎｅｆ  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てを含む上述の組換えポリペプチドに関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、さらに実施例８に規定した天然型ｎｅｆ  Ｔヘルパーエピトープの実質的に全てを含む上述の組換えポリペプチドに関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は上述の組換えポリペプチドに関するが、前記ポリペプチドは、配列番号６に示す配列、もしくはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチドがｐｏｌ配列の逆転写酵素活性を破壊するように突然変異し、実施例８に示されているＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）に規定した天然型ｐｏｌ配列のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てが前記組換えポリペプチド内に保持されている組換えポリペプチドに関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記ｐｏｌ配列の逆転写酵素活性が天然型ｐｏｌ遺伝子の中心に由来する内部配列の重複ならびに前記ｐｏｌ配列のアミノ末端およびカルボキシ末端部分の置換によって突然変異する組換えポリペプチドに関する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記重複内部配列はＴＰＤＫＫＨＱＫＥＰＰＦ（配列番号４）を含む組換えポリペプチドに関する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１２に示す配列、もしくはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む組換えポリペプチドに関する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチド配列がｇａｇ遺伝子産物のプロセッシングを破壊するように突然変異し、そして前記ｇａｇ配列がさらに破壊されたミリストイル化部位を含み、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）に規定された天然型ｇａｇ配列のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てが前記組換えポリペプチド内に保持されている組換えポリペプチドに関する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、ｇａｇのプロセッシングがｐ１７およびｐ２４ドメインを置換することによって破壊されており、そして前記ミリストイル化部位が第２グリシンからアラニンへの突然変異によって破壊されている組換えポリペプチドに関する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、上述の組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１３に示す配列、もしくはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む組換えポリペプチドに関する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶがクレードＢ  ＨＩＶである、上述の組換えポリペプチドに関する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、上述のポリペプチドをコードする組換え核酸に関する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、配列番号１１を含む組換え核酸配列、または遺伝子コードに比較してサイレント突然変異しか相違しない配列、またはそれに対する少なくとも９５％同一性を有する配列に関する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、上述のポリペプチドをコードするウイルスベクターに関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、前記ベクターがＭＶＡもしくはＭＶＡ由来ベクターである、上述のウイルスベクターに関する。
【００４５】
別の態様では、本発明は上述のウイルスベクターに関するが、前記ベクターは鶏痘もしくは鶏痘由来ベクターである。
【００４６】
別の態様では、本発明は上述のウイルスベクターに関するが、前記ベクターはＦＰ９鶏痘ベクターである。このベクターに関する特定の教示は、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０４７６１７号の中に見いだすことができる。
【００４７】
別の態様では、本発明は、薬剤中での上述のポリペプチドの使用に関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染症を治療もしくは予防するための薬剤の調製における上述のポリペプチドの使用に関する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染症に対する免疫化のための薬剤の調製における上述のポリペプチドの使用に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、薬剤中での上述の核酸の使用に関する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染症を治療もしくは予防するための薬剤の調製における上述の核酸の使用に関する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染症に対する免疫化のための薬剤の調製における上述の核酸の使用に関する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染症に対して被験者を免疫する方法であって、前記被験者に上述のポリペプチドもしくは核酸を投与するステップを含む方法に関する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、プライム・ブースト免疫過程(regimen)における初回抗原刺激剤または追加刺激剤としての上述のポリペプチドもしくは核酸の使用に関する。プライム・ブースト免疫法は当分野において周知であり、そしてこの主題に関する特別の教示は、参照して本明細書に組み込まれるＷＯ９８／０５６９１９号から取り出すことができる。
【００５５】
別の態様では、本発明は、免疫応答の誘導における本明細書に記載のポリペプチドもしくは核酸の使用に関する。前記免疫応答は、例えばＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋応答などの細胞性免疫応答、または体液性（抗体）応答であってよい。本発明はさらに、被験者において免疫応答を誘導するための方法であって、そのような投与を必要とする可能性がある前記被験者へ本明細書に記載のポリペプチド、核酸もしくはベクターを投与するステップを含む方法を提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、上述の核酸配列を含む、または上述のポリペプチドをコードする核酸ベクターに関する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、上述の核酸配列を含む、または上述のポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターに関する。
【００５８】
さらに別の態様では、本発明は、上述の核酸配列を含む、または上述のポリペプチドをコードするＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）、アルファウイルス、センダイウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスに基づくベクターに関する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、上述の核酸配列を含む、または上述のポリペプチドをコードするポックスウイルスベクターに関する。
【００６０】
別の態様では、本発明はｐ２９Ｄ．ｇｐｎ、ｐＯＰＫ６．ｇｐｎおよびｐＳＧ２．ｇｐｎからなる群から選択されるプラスミドに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
定義
本明細書で使用する用語「アデノウイルス」には、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（アデノウイルス科）のメンバーが含まれる。この科は、順に３つの属：Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓおよびＡＴａｄｅｎｏｖｉｒｕｓを含む。詳細には、本発明はヒツジアデノウイルス（ＡＴａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）の使用を意図している。
【００６２】
「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、通常はクラスＩ主要組織適合性複合体と関連してＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるペプチドであるアミノ酸配列である。詳細には、「全ての」ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、および／または「全ての知られている」ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープについての言及は、それの実施例８、ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２：Ｍａｐｓ  ｏｆ  ＣＴＬ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｌｏｔｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ  ７，２００３に規定されているように現在知られているエピトープを意味する。本発明によると、実質的に全てのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが修飾されたポリペプチド内に保持されている。しかし、他の哺乳動物種において重要である例えばマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなどのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは失われていてよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）と同義である。
【００６３】
「Ｔヘルパーエピトープ」は、同様に通常はクラスＩＩ主要組織適合性複合体と関連しているＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである；「全ての」および／または「全ての知られている」Ｔヘルパー細胞エピトープは実施例８、ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２：Ｍａｐｓ  ｏｆ  ＣＴＬ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｌｏｔｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ  ７，２００３に規定されているとおりである。本発明によると、実質的に全てのヒトＴヘルパー細胞エピトープは修飾されたポリペプチド内に保持されている；しかし他の哺乳動物種において重要である例えばマウスＴヘルパーエピトープなどのＴヘルパーエピトープは失われていてよい。Ｔヘルパー細胞は、ヘルパーＴ細胞と同義である。
【００６４】
「実質的に全て」は少なくとも９９％を意味する；好ましくは、それは少なくとも９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％もしくは８５％を意味する。また別の実施形態では、「実質的に全て」は、１つを除く全て、２つを除く全て、３つを除く全て、４つを除く全て、５つを除く全て、６つを除く全て、７つを除く全て、８つを除く全て、９つを除く全て、１０を除く全て、１１を除く全て、１２を除く全て、１３を除く全て、１４を除く全て、１５を除く全てを意味する。
【００６５】
エピトープは、例えば実施例８を参照してそれにマッピングされるべきペプチド配列が突然変異している場合は、「失われている」もしくは「破壊されている」もしくは「保持されていない」と見なされる。好ましくは、実施例８に示すものを参照すると、全てのエピトープが保持されている。
【００６６】
本明細書で使用する「天然」配列もしくは「参照」配列は、請求されたポリペプチドもしくはヌクレオチド配列がそれから設計される、もしくは由来する起源配列を表す。可能な場合は常に、この用語は通常の意味を有する。すなわち自然状態で見いだされるウイルス中の対応する１つ以上の遺伝子の配列を表すと理解されたい。しかし、当業者には、自然状態で見いだされる単一ＨＩＶウイルスは存在せず、むしろ多数の様々なクレードおよびそれらのクレード内の多数の様々な単離体もしくはクローンが存在することは明白である。このため、本発明による特定配列がＨＩＶの特定クローンもしくは単離体から設計されている、もしくは由来している場合は、「天然」もしくは「参照」配列はその特定クローンもしくは単離体の固有配列を表す。しかし、１つ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸位置で相違する可能性がある多数の様々な単離体もしくはクローン配列の比較もしくは「パイルアップ」によって形成されていて、実際に時々は更新されている当分野において知られる極めて多数のコンセンサス配列が存在する。本発明による構築物がそのようなコンセンサス配列から設計されている、もしくは由来する状況では、このコンセンサス配列は天然もしくは参照配列であると見なされる。
【００６７】
好ましくは、本明細書に記載する「全長」ｇ／ｐ／ｎ遺伝子産物についての全エピトープが保持されている。好ましくは、全前記エピトープは、遺伝子産物の非エピトープ含有領域が短縮もしくは欠失している場合でさえ保持されている。
【００６８】
天然もしくは参照配列は、好ましくは遺伝子１つ１つについて考察すべきである。例えば、本発明による構築物は、ｇａｇ遺伝子、ｎｅｆ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含み得る。これらの遺伝子は、各々が天然もしくは参照配列を有する。各遺伝子についての天然もしくは参照配列は、同一起源から、例えば同一の全コンセンサス配列由来である可能性がある、または各々についての天然もしくは参照配列は相違する起源から、例えばｇａｇおよびｐｏｌ参照配列は２００１クレードＢコンセンサス配列由来であり、他方ｎｅｆ参照配列は２０００クレードＢコンセンサス配列からである可能性があり、逆もまた同様である。参照配列（コンセンサスおよびクローンの両方）は本明細書に記載のようにＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース内で見いだすことができる（ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２：Ｍａｐｓ  ｏｆ  ＣＴＬ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｌｏｔｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ  ７，２００３）。詳細には、２００１クレードＢコンセンサス配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＡＬＩＧＮ＿０２／ＡＬＩＧＮ−ＩＮＤＥＸ．ｈｔｍｌに見いだすことができる、そして２０００クレードＢコンセンサス配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＡＬＩＧＮ＿０１／ＡＬＩＧＮ−ＩＮＤＥＸ．ｈｔｍｌに見いだすことができる。
【００６９】
「ＨＩＶ」は、身体内でＣＤ４＋細胞を攻撃することによって免疫不全症を誘発するウイルスであるヒト免疫不全症ウイルスである。本明細書で使用する用語「ＨＩＶ」には、例えばＨＩＶ−１  Ｍ群およびＨＩＶ−１  Ｏ群などのＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の全ての群およびサブタイプ（クレード）を含むあらゆるＨＩＶが含まれる；本発明は、知られているクレード各々を包含する；クレードＢ  ＨＩＶ−１が好ましい。Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ遺伝子産物は当分野において周知であり、例えば本明細書の実施例８に規定されたとおりである。
【００７０】
様々なクレードへの本発明の適用についてのガイダンスは、参照して本明細書に組み込まれるＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ２００２  Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃ，Ｆｏｌｅｙ  Ｂ，Ｆｒｅｅｄ  Ｅ，Ｈａｈｎ  Ｂ，Ｍａｒｘ  Ｐ，ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  Ｆ，Ｍｅｌｌｏｒｓ  Ｊ，Ｗｏｌｉｎｓｋｙ  Ｓ，ａｎｄ  Ｋｏｒｂｅｒ  Ｂ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬＡ−ＵＲ  ｎｕｍｂｅｒ  ０３−３５６４の中にも見いだすことができる。詳細には、ＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、ＣおよびＤについてのコンセンサス配列データおよび多数の単離体は第４９０から５５０頁に見いだすことができる；ＨＩＶ−２クレードＡ、Ｂ、ＣおよびＤについてのコンセンサス配列データならびに多数の単離体は第５５４から５７８頁に見いだすことができる。好ましくは、ＨＩＶはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２であり、最も好ましくはＨＩＶ−１である。好ましくは、ＨＩＶはクレードＡ、Ｂ、ＣもしくはＤの、好ましくはクレードＢもしくはＤの、好ましくはクレードＢのＨＩＶである。ＨＩＶ配列はＨＸＢ２参照配列にアラインすることができ（実施例８）、そしてこのためいずれのクレードを使用しても、ｇ／ｐ／ｎ遺伝子を同定し、対応するエピトープを描出することができる。これは目視によって実施できるが、好ましくはこのためにＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベースの「ＨＸＢ２  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ｅｎｇｉｎｅ」を用いて実施される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＮＵＭ−ＨＸＢ２／ＨＸＢ２．ＭＡＩＮ．ｈｔｍｌ）。
【００７１】
本明細書で言及する「突然変異」は、ポリペプチドもしくは核酸中でのあらゆるアミノ酸の付加、欠失もしくは置換を包含する。突然変異は、一般に、１つもしくは当該天然型ポリペプチド配列とは相違するように当該のポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる。
【００７２】
本発明の文脈で、突然変異はしばしばウイルスタンパク質の知られている生物活性を阻害する、もしくは改善するために導入される。そこで、好ましくは配列が天然配列に関して突然変異していると言われる場合は、これはウイルスポリペプチドの１つ以上の生物活性を減少させる、もしくは好ましくは除去するように突然変異していることを意味する。本明細書では特定のウイルス生物活性の減少もしくは除去を生じさせる特異的突然変異の例を提示する。ウイルス機能に関連するモチーフもしくはドメインのまた別の例は、当分野において知られている。しかし、本発明によると、生物学的機能を減少／除去するための突然変異が作製される場合に、天然型エピトープが本明細書で説明したように保存されることが重要である。
【００７３】
本明細書で言及する「組換え」ポリペプチドは、その配列が１つもしくは当該天然型同等ポリペプチドとは相違する、そしてＤＮＡ合成および遺伝子操作を含む遺伝子組換えテクノロジーによって作製できるペプチドである。組換えペプチドには、さらにまた組換え手段によって作製されるのではないが、組み換えＤＮＡテクノロジーを用いて設計されている、または好ましくはそのようなテクノロジーによって設計されたペプチドと同一である配列を有するペプチドが含まれる。
【００７４】
本明細書で言及する「免疫応答」は、抗原性配列に対する細胞性（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を含むが、それらに限定されない）もしくは体液性応答のいずれか、または両方の組み合わせである。
【００７５】
例えば「ｇａｇ」、「ｐｏｌ」、「ｎｅｆ」などの核酸および／またはポリペプチド配列のセグメントを規定するために本明細書で使用する遺伝子名は、好ましくはそれらの通常の意味を有する。最も頻回には、これらの用語はポリペプチド配列、または前記ポリペプチド配列をコードする対応するヌクレオチド配列を記述するために使用する。
【００７６】
本明細書で言及する「保護免疫応答」は、予防的および／または治療的有益性を提供する抗原特異的免疫応答である。
【００７７】
ウイルス逃避
突然変異は、あらゆるエピトープ内で発生して、ウイルス逃避を引き起こすことがある。相当に多数のエピトープを提供することによって、エピトープの一部は突然変異していないままになる可能性が高くなる。さらに、有益にも追加のＴヘルパーエピトープを提供することによって、本発明によって免疫応答を拡張および／または強化することができる。
【００７８】
そこで、１つの実施形態では、本発明は、有益にも従来型ワクチンに影響を及ぼす免疫優性作用に対抗する。
【００７９】
ＨＩＶ分子免疫学データベース内で同定されたｎｅｆヒトエピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴヘルパーエピトープの両方）の全てが本発明のＧＰＮ配列（配列番号１）内に存在することは証明されている。
【００８０】
上述のように、ＷＯ０２／３２９４３号（Ｎａｂｅｌ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ）は、ＨＩＶワクチンの分野において様々な情報開示を行なっている。この明細書から明白になるように、本発明はその中で成された情報開示とは別個である。好ましい実施形態では、本発明は、ＷＯ０２／３２９４３号において開示されたタンパク質を明示的に除外する、そして好ましくはＷＯ０２／３２９４３号において開示されたタンパク質と９５％以上の同一性を有するタンパク質を除外するＨＩＶ由来タンパク質含む、および／またはコードする物質に関する。
【００８１】
上述のように、ＷＯ０２／０２２０８０号（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．）は、ＨＩＶワクチンの分野において様々な情報開示を行なっている。この明細書から明白になるように、本発明はその中で成された情報開示とは別個である。好ましい実施形態では、本発明は、ＷＯ０２／０２２０８０号において開示されたタンパク質を明示的に除外する、そして好ましくはＷＯ０２／０２２０８０号において開示されたタンパク質と９５％以上の同一性を有するタンパク質を除外するＨＩＶ由来タンパク質を含む、および／またはコードする物質に関する。
【００８２】
上述のように、ＷＯ０３／０２５００３号は、ＨＩＶの分野において様々な情報開示を行なっている。本明細書から明白になるように、本発明はその中で成された情報開示とは別個である。好ましい実施形態では、本発明は、ＷＯ０３／０２５００３号において開示されたタンパク質を明示的に除外する、そして好ましくはＷＯ０３／０２５００３号において開示されたタンパク質と９５％以上の同一性を有するタンパク質を除外するＨＩＶ由来タンパク質含む、および／またはコードする物質に関する。
【００８３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、実験により同定できる、そして当該配列の分析によって予測できる。好ましくは、これらのエピトープはＰｒｏＰｒｅｄプログラム（（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）において見いだすことのできるような、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７．５５５−５６１（１９９９）およびＳｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７の中で開示されたマトリックスベースの予測アルゴリズムを使用する、エピトープ予測プログラム）を用いて予測／認識される。
【００８４】
本発明の長所は、天然型エピトープが１つ以上の当該ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸中で保存されていることである。
【００８５】
新規ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの付加もしくは導入は、突然変異および遺伝子構築のプロセス中に生じることがある。
【００８６】
Ｔヘルパーエピトープ
Ｔヘルパーエピトープは、実験により同定できる、そして当該配列の分析によって予測できる。好ましくは、これらのエピトープはＰｒｏＰｒｅｄプログラム（（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）において見いだすことのできるような、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７．５５５−５６１（１９９９）およびＳｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７の中で開示されたマトリックスベースの予測アルゴリズムを使用する、エピトープ予測プログラム）を用いて予測／認識される。
【００８７】
好ましくは、本発明では、天然型Ｔヘルパーエピトープは１つ以上の当該ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸中で保存されている。
【００８８】
さらに、本発明は、有益にも前記エピトープを有する抗原に対する免疫応答を追加刺激および／または拡張するステップの有益な作用を有する新規のＴ細胞エピトープを提供する。本発明の好ましい実施形態では、増加した数のＴヘルパーエピトープが提供される。
【００８９】
本発明のまた別の好ましい実施形態では、新規のＴヘルパーエピトープが作製され、および／または本発明のポリペプチド内へ導入され、それによって免疫応答が強化される。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）、好ましくはクレードＢのｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ遺伝子の翻訳産物中で見いだされる抗原性ペプチド配列を含有する新規融合タンパク質を各々が発現する組換え系統ＦＰ９鶏痘および／または組換え修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む。
【００９１】
本発明はさらにまた、プライム・ブースト法（プライム・ブーストの単一初回抗原刺激・複数追加刺激バージョンを含む）などのワクチン接種法におけるそのようなベクターの使用にも関する。実際に、以下で考察するように、ＤＮＡプラスミド媒介性初回抗原刺激を促進するためのこれらの２種の組換えウイルスのいずれか、もしくは両方の使用は、齧歯類などの哺乳動物において強力な免疫応答を誘導することが証明されており、ヒトなどの霊長類において適用される。本発明は、例えば本発明の１つ以上の抗原性遺伝子を用いて、ＨＡＡＲＴと併用してＨＩＶ−１に感染した人々のための治療的免疫療法に、および／またはＨＩＶ−１感染症の高リスクである人々のための予防的免疫療法にさらに関する。
【００９２】
有益にも、本発明によるベクターは、哺乳動物細胞からのタンパク質発現を最適化するために適切なコドン使用を利用する。有益には、ヒトコドン使用が利用される。
【００９３】
好ましい実施形態では、本発明の１つ以上の治療的抗原は、ＨＩＶ−１（好ましくはクレードＢ）ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ遺伝子の産物の産物に基づく融合タンパク質を含む。好ましくは、前記１つ以上の抗原は、本明細書に記載の２種の組換えポックスウイルスの一方もしくは両方によって送達される。
【００９４】
１つの態様では、本発明は、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）、好ましくはクレードＢのｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ遺伝子の翻訳産物由来の抗原性ペプチド配列を含有する新規の融合タンパク質を提供する。
【００９５】
融合タンパク質の好ましいアミノ酸配列を図１に示す。このアミノ酸配列をコードする好ましいヌクレオチド配列を図６に示す。当然ながら、当業者であれば、遺伝子コードの縮重に起因して、極めて多数の考えられるヌクレオチド配列が可能であり、これが同一物の唯一の好ましい実施例であることを理解する。
【００９６】
遺伝子産物は、好ましくは融合タンパク質内でＧＡＧ−ＰＯＬ−ＮＥＦの順序にある。これは、さらにＨＩＶゲノム内に配列されている方法でもある。その他の順序が同等に有効な場合もある。特定の用途の必要を満たすため、または１種以上の試薬のより容易な構築および／または取り扱いを単に促進するためにさえ、この順序を変化させることは当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。
【００９７】
好ましい実施形態では、本発明の構築物は、免疫優性に関する有益な作用を有する。免疫優性は、特別には１つ以上のｇａｇエピトープに関して、先行技術ワクチンを妨害してきた。これは上記で考察されている。本発明による好ましいＧＰＮ構築物内のＧＡＧ内の３つのエピトープは、実施例の項において試験されており、各々が免疫応答を引き起こした。好ましい実施形態では、全融合タンパク質にわたる免疫応答を監視する方法についてもさらに開示されている（より詳細については、以下を参照されたい）。
【００９８】
例えば構築物のサイズを減少させるために、ＧＰＮタンパク質の一部を欠失させることができるのは明白である。実際に、本明細書では個別適用のために１つ以上の所定の個別遺伝子を提示する。好ましくは、本明細書に開示したｇｐｎ構築物は短縮されていない。理論によって結び付けることを望まなくても、単一タンパク質は、遺伝子内で開示されたとおりに使用されるより小さな実体として単独で使用された場合は、低免疫原性であることが示唆されている。そこで、好ましい実施形態では、本明細書に開示したｇｐｎ遺伝子は短縮／欠失を伴わずに使用される。好ましくは、使用するｇ／ｐ／ｎ遺伝子は、各々全長である。
【００９９】
当業者には、本発明の免疫原性構成成分が一般にポリペプチドであることは明白である。しかし、本発明は、それらがＤＮＡ、プラスミド、ウイルスベクターまたはその他の当該実体のいずれの形態を取ろうと、これらのポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の両方に関する。実際に、抗原性ポリペプチドの実際的生産様式は、それに本発明が投入される特定用途によって当業者が変化させることができよう。これらのポリペプチドは、細胞内もしくは細胞外のいずれであろうと、インビトロまたは好ましくはインビボで作製できる。本明細書では、特定の使用様式について記載する。
【０１００】
ＧＡＧ
ＧＡＧタンパク質は、２つの機能的ドメインであるｐ１７マトリックスタンパク質およびｐ２４コアカプシドタンパク質を有し、そのどちらもＨＩＶウイルス様粒子のアセンブリのために不可欠かつ十分である。本発明の１つ以上のｇａｇ遺伝子では、ｐ１７およびｐ２４ドメインは有益にも、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｉｄｓ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＷＯ０１／４７９５５号）にしたがって、ＧＡＧタンパク質のプロセッシングを破壊させるために置換されている。天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが保存されている限り、スクランブルなどがｎｅｆ（以下を参照されたい）に適用されるなどのその他の破壊的再配列も考えられる。
【０１０１】
Ｐ１７ドメインのミリストイル化部位は、細胞膜へのＧＡＧタンパク質の結合、およびその結果としてのアセンブリおよび出芽を防止するために突然変異している。この突然変異は、好ましくはドメイン内の第２グリシン残基の欠失もしくは他のアミノ酸との置換、より好ましくは不活性非極性アミノ酸との置換、最も好ましくはドメイン内の第２グリシン残基のアラニン残基との置換によってである。これはＧＡＧが細胞膜への結合、ウイルスアセンブリおよび出芽において機能するのを防止する。
【０１０２】
有益には、ｇａｇの免疫原性は、本発明の１つ以上の組換え遺伝子において有害には変化していない。
【０１０３】
好ましくは、本発明による「全長」ｇａｇは、ｐ１７およびｐ２４ドメインの全長配列を含むことを意味する。好ましくは、全長ｇａｇは、ｐ１７およびｐ２４ドメインの全長配列だけを含む。
【０１０４】
ＰＯＬ
ｐｏｌ遺伝子は、プロテアーゼ（ｐ１０）、逆転写酵素（ｐ５１）、ＲＮａｓｅ  Ｈ（ｐ１５）およびインテグラーゼ（ｐ３１）を含む多数のタンパク質をコードする。
【０１０５】
逆転写酵素活性に対する機能的アミノ酸残基は、多数の記録されたエピトープを備える領域であるＹＭＤＤモチーフ（エピトープマップ内でＲＴ  １８３−１８６として示されている）に集中している。有益にも、逆転写酵素は、以下でより詳細に記載するように、ドメインスワッピング突然変異によってエピトープを消失することなく不活化される。そこで、本発明では、好ましくはＰ５１サブユニット内に存在する逆転写酵素活性が破壊される。これは、好ましくは、変化したＰ５１ポリペプチドが破壊されたＲＴ活性を備えて作製されるようにコーディング配列の再配列によって実施される。最も好ましくは、配列ＴＰＤＫＫＨＱＫＥＰＰＦ（Ｐ５１ポリペプチドの中心の近くに存在する）が重複させられ、Ｐ５１ポリペプチドのアミノおよびカルボキシ末端部分をコードする配列が重複配列間の点の近くで置換させられる。
【０１０６】
この新規の技術は、逆転写酵素活性を改善するためにＰＯＬ内の活性部位を破壊する。さらに、これは有益にも、遺伝子産物の免疫原性を保持しながら本発明によって遂行される。活性部位が、例えば挿入、欠失もしくはその他の知られている置換タイプの突然変異によって突然変異している場合は、Ｔ細胞エピトープは破壊させられる。本発明によると、そのような１つ以上のエピトープが保持される。
【０１０７】
好ましくは本発明による「全長」ｐｏｌは、しばしば逆転写酵素（ＲＴ）として知られているｐｏｌのｐ５１ドメインの全て（すなわち、アミノ酸１〜４４０）を含むことを意味する。実施例８では、ＲＴおよびＲＮａｓｅはＲＴ  ＣＴＬマップと名付けたセクションで結合される；この実施例を読む場合には、適切な注意を払わなければならない。ときどきは、これは「ＲＴの１−４４０」と呼ばれることがある。ときどきは、ｐｏｌのアミノ酸１〜４４０は、例えばＲＮＡｓｅユニットなどの全ウイルスｐｏｌ  ＯＲＦの他の部分が除外されていることを示すために「短縮型ｐｏｌ」（ｐ５１）と呼ばれる。しかし、「ｐｏｌ」、「短縮型ｐｏｌ」（ｐ５１）および「全長ｐｏｌ」についての言及は、好ましくは本明細書で使用され、そして状況から明白になるであろうｐｏｌ  ｐ５１アミノ酸１〜４４０を意味する。
【０１０８】
ＮＥＦ
ｎｅｆ遺伝子は、ウイルス増殖を増強して免疫逃避を媒介する多機能タンパク質をコードする。本発明における遺伝子によってコードされるＮＥＦタンパク質は不活化されている（すなわち、その機能が破壊されている）。好ましい実施形態では、この不活化は、コーディング領域を８つのサブ領域に分割することによって行なわれ、これらのサブ領域はその後記録される。好ましくは、これらの８つの領域は、２６アミノ酸の６領域および２５アミノ酸の２領域を含む。高度に好ましいスクランブルＮＥＦ配列を以下に提示する（図２を参照されたい）。この配列内の精確な接合境界は、天然ｎｅｆ配列（同様に以下に提示した）との比較によって容易に同定される。
【０１０９】
本発明によるスクランブルの目的は、そのＴ細胞エピトープを保存しながらｎｅｆの機能を破壊することである。
【０１１０】
本発明によりｎｅｆをスクランブルする際には、最小数の追加のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを作製しながらｎｅｆの機能を破壊することに注意を払わなければならない。
【０１１１】
本明細書に開示した８つのサブ領域の好ましい選択は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを保持することと過剰に多数の新規接合部ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを作製しないこととの有益な平衡を表している。好ましい実施形態では、新規の接合部ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの作製が最小限に抑えられる。この状況では、「新規の」ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、天然ｎｅｆ配列内では発生しない細胞エピトープである。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの平均長は、９アミノ酸である。
【０１１２】
エピトープが保持されている、および新規の接合部エピトープが作製されている場所を示すために、本発明による好ましいＧＰＮ融合タンパク質をマッピングした。これについて以下でさらに考察する。
【０１１３】
本発明によるスクランブルされた遺伝子を作製する場合は、選択された接合部にわたる任意のエピトープを保持するために、接合部リンカーを導入するのが有益である。これは、ＰｒｏＰｒｅｄツールを使用し、そして必要に応じて相関する修飾を作製する１つ以上の配列の審査によって容易に遂行できる。
【０１１４】
好ましい実施形態では、これらのサブ領域接合部に及ぶ１２個の残基リンカーが、最初のＮＥＦタンパク質配列内の８つのサブ領域の接合部に位置するＴ細胞エピトープを再構築するために並べ替えられたサブ領域間に挿入される。
【０１１５】
好ましくは、本発明による「全長」ｎｅｆは、ｎｅｆ遺伝子のアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。好ましくは、これは、エピトープを含有するが、先行技術ｎｅｆ構築物からは欠失しているｎｅｆポリペプチドのＮ末端部分（すなわち、ｎｅｆアミノ酸１〜６５）を含む。
【０１１６】
配列
特定配列は、配列リストに提示した。手短には、配列番号１は、タグを含む代表的な全長ｇｐｎ遺伝子配列を含む。好ましい実施形態では、例えばヒト使用などのためにタグは除去されており、代表的なコアＧＰＮ配列は配列番号９に提示した。
【０１１７】
配列番号２はｐ２４  ｇａｇフラグメントであり、配列番号３はｐ１７  ｇａｇフラグメントである。ＧＡＧ  ｐ２４構築物は、天然もしくは参照ｐ２４配列がＭ  Ａを含有していない場合でさえ、Ｍ  Ａ  Ｐ  Ｉ  Ｖを開始する。これは、翻訳のために使用される好ましいＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  Ｇ；配列番号１４）に起因する。ＡＴＧは開始コドンであり、メチオニン（Ｍ）に翻訳する。プロリン（Ｐ）に対するＤＮＡコドンはＣから始まるので、Ｇで始まる１つ以上のＤＮＡコドンを有する追加のアミノ酸を挿入した（アラニン）。
【０１１８】
１つの実施形態では、本発明による好ましいｇａｇ遺伝子を作製するために、配列番号２および配列番号３が結合させられる（配列番号２の最終残基から配列番号３の第１残基へ）。
【０１１９】
配列番号４は、有益にも本明細書に説明した本発明による好ましいｐｏｌ構築物中で重複している短いｐｏｌ  ｐ５１配列を提示している。配列番号５は、ＮおよびＣ末端ｐｏｌ配列である。１つの実施形態では、配列番号４−配列番号５−配列番号４の順序でより大きな配列が構築され、配列番号５の両端に１つの反復配列（すなわち、配列番号５のＮ末端に１つおよびＣ末端に１つ）を備える配列番号４の重複が生じ、それによって本発明による好ましいｐｏｌ遺伝子が作製される。
【０１２０】
配列番号６は、本発明によるスクランブルされたｎｅｆである。
【０１２１】
配列番号７はマウスＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるタグであり、そして配列番号８はＨＡタグである。これらのタグのいずれかもしくは両方は、例えば発現を監視するため、および／または１つ以上の免疫応答を監視するため、および／またはＮもしくはＣ末端を介する（好ましくはＣ末端を介する）のタンパク質の持続／プロセッシングについて監視するために、有益にも本発明の遺伝子配列内に組み込むことができる。しかし、ヒト被験者に関係する実施形態のためには、好ましくは、これらのタグは本発明の１つ以上の遺伝子配列内に組み込まれない、または前記遺伝子配列から除去される、または前記遺伝子配列上で発現させられない。
【０１２２】
配列番号１０は、ＨＩＶクレードＢコンセンサス配列タンパク質の天然ＨＩＶｎｅｆ配列である。
【０１２３】
配列番号１１は、ＧＰＮをコードする代表的なヌクレオチド配列である。当然ながら、当業者は、遺伝子コードの縮退に起因して、多数の変異体ヌクレオチド配列が本発明のＧＰＮ、特別には配列番号１１に関連して、ヌクレオチド配列内の翻訳に関してサイレント相違しか相違しないＧＰＮを同等にコードできることを理解する。
【０１２４】
本明細書で使用する用語であるＨＩＶ遺伝子産物に「由来する」配列は、当分野における本来の意味を有する。「由来する」は、単純に、これがコンピュータ内もしくは例えばクローニング、ＰＣＲなどによる実際的な実験誘導によるものであろうと、それが例えば出発点としてＨＩＶ配列に基づくことを意味している。例えば、この用語はＨＩＶ  ＯＲＦからの予測アミノ酸配列を含むと考えられ、実験的に誘導された配列に限定されない。いかに再配列されていても、または突然変異していても、配列がＨＩＶから出発することを当業者が認識できる場合は、それはＨＩＶに「由来する」と見なされる。好ましい実施形態では、他の配列に由来する配列は、それが由来する配列と同一である多数の連続残基（アミノ酸もしくはヌクレオチド）を有する。好ましくは、少なくとも５個のそのような残基、好ましくは少なくとも８個のそのような残基、好ましくは少なくとも１０個のそのような残基、好ましくは少なくとも１４個のそのような残基、好ましくは少なくとも１８個のそのような残基、好ましくは少なくとも２０個のそのような残基、好ましくは少なくとも２２個のそのような残基、好ましくは少なくとも２５個のそのような残基が存在する。例えば、本明細書に記載のｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ配列は各々ＨＩＶに由来する。
【０１２５】
用語「突然変異した」はその通常の意味を有し、欠失、挿入、点変異、短縮、逆位、ならびに本明細書に記載の指定部位突然変異誘発およびスクランブルを含む。
【０１２６】
本発明が、本明細書に開示したヌクレオチド配列の１つ以上の核酸フラグメントも包含することは理解される。核酸フラグメントは、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３４００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３４１０ヌクレオチドを含む。
【０１２７】
本発明は、遺伝子コードの縮退によってのみ明らかな相違を示す核酸とは相違する核酸にさらに関することは理解される。遺伝子コードの縮退に結び付いている変異を判定する際に重要な１つ以上のオープンリーディングフレームは、本発明の１つ以上のポリペプチドをコードする、特別にはコアＧＰＮ（配列番号９およびそれをコードする核酸）をコードするオープンリーディングフレームである。
【０１２８】
非天然ヌクレオチド残基もしくはアナログまたは誘導体化部分は、本発明による核酸において重要な役割を果たすことができる。
【０１２９】
本発明が、本明細書に開示したアミノ酸配列の１つ以上のポリペプチドフラグメントも包含することは理解される。好ましくは、フラグメントは遺伝子１つ１つについて考察される。好ましくは、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも８アミノ酸、好ましくは少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１２アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、好ましくは少なくとも２５アミノ酸、好ましくは少なくとも２６アミノ酸、好ましくは少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも４０アミノ酸、好ましくは少なくとも６０アミノ酸、好ましくは少なくとも８０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、好ましくは少なくとも２００アミノ酸、好ましくは少なくとも３００アミノ酸、好ましくは少なくとも４００アミノ酸、好ましくは少なくとも６００アミノ酸、好ましくは少なくとも８００アミノ酸、好ましくは少なくとも１０００アミノ酸、好ましくは少なくとも１１０８アミノ酸、好ましくは少なくとも１１２５アミノ酸を含む。
【０１３０】
本発明のポリペプチドおよび核酸のフラグメントを考察する場合に、エピトープの保存に同様の重要性が置かれることは理解される。すなわち、本発明による構築物中に遺伝子の一部分（逆転写酵素のアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）など）しか存在しない場合は、遺伝子産物のその部分にとって対応する天然型エピトープが保存されていることが必要とされる。これは、適切にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＴヘルパーエピトープにも同等に当てはまる。一般に、そして上記で記載したように、個別遺伝子のより長いフラグメントが好ましく、そして最も好ましいのは本明細書に記載し、配列リストに規定した全長ポリペプチドである。明らかに、同一原理は配列同一性の考察にも及ぶ。すなわち、本発明によるフラグメントに関して配列同一性を評価する場合には、まず最初にフラグメント長が選択され、次に天然もしくは参照配列の対応するフラグメント長セクションにわたって配列比較が行なわれる。本発明は、そのフラグメント長上に存在する全エピトープが保存されることを必要とする。好ましくは、全長ｇ／ｐ／ｎ遺伝子は、本明細書に記載のとおりに見なされる。
【０１３１】
１つの実施形態では、本発明は最小の接続配列だけを含む、天然型エピトープのストリングを含むｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆポリペプチドに関する。
【０１３２】
非天然アミノ酸もしくはそのアナログまたは誘導体化部分は、本発明のポリペプチドにおいて重要な役割を果たすことができる。
【０１３３】
相対配列同一性は、例えばデフォルトパラメータを使用して、同一性を決定するためのいずれか適切なアルゴリズムを用いて２つ以上の配列間の同一性（％）を計算できるコンピュータプログラムによって決定できる。そのようなコンピュータプログラムの典型的な例はＣＬＵＳＴＡＬ（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（ＮＡＲ  ２２：４６７３−８０）またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｃｌｕｓｔａｌ／ｃｌｕｓｔａｌ．ｈｔｍｌを参照されたい）である。あるいは、デフォルト値に設定したパラメータを用いてＢＬＡＳＴアルゴリズムが使用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、参照して本明細書に組み込まれるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌに詳細に記載されている。
【０１３４】
配列間の同一性および／または類似性を決定するために使用される他のコンピュータプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ  １９８４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏｏｌｓが含まれるが、それらに限定されない。
【０１３５】
ＦＡＳＴＡは、１つの配列（クエリー）といずれかの配列群との類似性について検索するためにＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５；２４４４−２４４８（１９８８））を使用する。ＦＡＳＴＡは、以下の検索パラメータを使用する。これらは、有益にも規定デフォルトパラメータへ設定することができる。Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＡＳＴに関しては（ヌクレオチド比較のためにはＦＡＳＴＡによって使用されない）。ワードサイズ−初期比較において即時に考察される連続残基もしくは塩基の数；デフォルトは、ヌクレオチド配列については６、アミノ酸配列については２である。ギャップペナルティ：これは新しいギャップが作り出されるときに類似性スコアから推論される点数である；デフォルトは、ヌクレオチド配列については１６、アミノ酸配列については１２である。ギャップ延長ペナルティ：これは現行ギャップが拡大されるときに類似性スコアから推論される点数である；デフォルトは、ヌクレオチド配列については４、アミノ酸配列については２である。予期値：これは、統計的有意性にしたがって復帰される配列数を限定する；デフォルトは２である。リスト：これは、報告される相同配列数を限定する；デフォルトは４０である。アライン：これは、それに対してアラインメントが提示される相同配列数を限定する；デフォルトは１０である。
【０１３６】
ＦＡＳＴＡはイリノイ大学のＢｉｏｌｏｇｙ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｇｙ．ｎｃｓａ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／）を介して、またはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）から入手できる。
【０１３７】
ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムによって使用される発見的検索アルゴリズムである；これらのプログラムの有意性は、一部の追加機能を加えたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌの方法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌを参照されたい）を用いるそれらの所見に帰せられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えばクエリー配列とのホモログを同定する目的で、配列類似性検索のために特別仕立てされた。配列データベースの類似性検索における基本的問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９４：Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１１９−２９）を参照されたい。
【０１３８】
ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメータを使用する。これらは、有益にも規定デフォルトパラメータへ設定することができる。ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索に対してスコアのヒストグラムを表示する；デフォルトは、「ｙｅｓ（はい）」である。ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−報告される相同配列の記述数を限定する；デフォルトは１００である。ＥＸＰＥＣＴ−Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌの確率論的モデル（１９９０：ＰＮＡＳ  ８７：２２６４−８）にしたがって、配列間の一致についての統計的有意性閾値；デフォルトは１０である。ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−それに対してアラインメントが提示される配列数を限定する；デフォルトは５０である。ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸに対するスコアリング・マトリックスを規定する。デフォルトマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  １９９２：ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５−９）である。ＳＴＲＡＮＤ−配列の一方もしくは他方のストランドについての検索を限定する（ヌクレオチド配列の場合）；デフォルトは両方のストランドである。ＦＩＬＴＥＲ−Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＆  ＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（１９９３：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１４９−１６３）によって決定されるような低複雑性を有するクエリー配列のセグメント、またはＣｌａｖｅｒｉｅ  ＆  ＳｔａｔｅｓのＸＮＵプログラム（１９９３：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１９１−２０１）もしくはＴａｔｕｓｏｖ  ａｎｄ  ＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）によって決定されるような短周期性内部反復配列からなるセグメントを覆い隠す；デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮのためにはＤＵＳＴ、他のプログラムのためにはＳＥＧである。
【０１３９】
最も好ましくは、配列比較はＦＡＳＴＡアラインメントツールを用いて実施する。
【０１４０】
一般に本明細書で言及した配列比較技術は当分野において周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４th  Ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。
【０１４１】
本発明は、本明細書に開示した代表的配列との有意な同一性を有する配列を包含する。好ましくは、配列は、少なくとも本明細書に開示した配列との４０％同一性、好ましくは少なくとも４５％同一性、好ましくは少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも５５％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性、好ましくは少なくとも６５％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性、好ましくは少なくとも７５％同一性、好ましくは少なくとも７６％同一性、好ましくは少なくとも７８％同一性、好ましくは少なくとも８０％同一性、好ましくは少なくとも８５％同一性、好ましくは少なくとも９０％同一性、好ましくは少なくとも９１％同一性、好ましくは少なくとも９２％同一性、好ましくは少なくとも９３％同一性、好ましくは少なくとも９４％同一性、好ましくは少なくとも９５％同一性、より好ましくは少なくとも９６％同一性、好ましくは少なくとも９７％同一性、好ましくは少なくとも９８％同一性、好ましくは少なくとも９９％同一性またはそれ以上さえを有する。
【０１４２】
明らかに、本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列に対しては、エピトープの保存に対する要件とは、配列同一性が１つ以上の実際的エピトープ配列内で好ましくは１００％であろう知られているエピトープの領域内に配列同一性が集中している可能性があることを意味する。このため、エピトープ間アミノ酸配列の領域は、好ましくは参照配列と比較して不変のままである実際のエピトープ領域より大きな程度まで変動してもよい。好ましくは、同一性（％）の数値は、エピトープおよびエピトープ間領域を含む、比較される関連配列の対応する全長にわたって判定される。また別の実施形態では、この実施形態ではエピトープが１００％保存されていると考えると、同一性の数値は可変領域にのみ、すなわちエピトープ間領域にのみ関連している可能性がある。
【０１４３】
遺伝子構築物の最適化
好ましい実施形態では、「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列、ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  Ｇが、１つ以上の遺伝子構築物の上流に配置されている。
【０１４４】
好ましい実施形態では、配列のコドン使用を修飾してヒト細胞内でのｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ転写産物の翻訳の有効性を最適化することができる。
【０１４５】
好ましい実施形態では、Ａｐａ  ＩおよびＡｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ（ｇｐｎ）遺伝子の５末端および３末端の各々に配置されている。これは、有益にも遺伝子カセットのサブクローニングを促進する。この実施形態では、制限部位は組換えウイルス内に存在するであろうが、有益にはＧＡＧ−ＰＯＬ−ＮＥＦ融合タンパク質のオープンリーディングフレームの外側にある。結果として、それらは融合タンパク質のアミノ酸配列にも、そのタンパク質に対して発生する免疫応答にも何の影響も及ぼさない。ＡｐａＩおよびＡｓｃＩもまた、有益にもｐＯＰＫ６組換えプラスミド内への直接クローニングを可能にするように選択した。それらは、遺伝子機能へ知られている影響を及ぼさないというまた別の長所を有する。
【０１４６】
好ましい実施形態では、ｇｐ１６０タンパク質に対して特異的なマウスＣＤ８−陽性Ｔ細胞によって認識されるレポーターＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであるＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ（配列番号７）をコードする配列を本発明の組換え遺伝子内に組み込むことができる。これは、ＧＰＮ含有ワクチンを用いた免疫後のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導の監視を可能にするという長所を有する。有益にも、このエピトープの存在が融合遺伝子の機能に影響を及ぼすことは知られていない。高度に好ましい実施形態では、このレポーターエピトープは、ヒトワクチン接種などの霊長類ワクチン接種のための１つ以上の構築物／組換え遺伝子には存在していない。
【０１４７】
好ましい実施形態では、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンタンパク質のこの部分に対して特異的である抗体によって認識される追加の抗体タグＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号８）が本発明の遺伝子（またはそれをコードする核酸）へ付加される。好ましくは、これは「ウェスタンブロットアッセイ法」などの抗体をベースとするイムノアッセイ法における発現の検出を可能にするためにタンパク質のカルボキシ末端へ付加される。高度に好ましい実施形態では、このタグは、組換えｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ遺伝子を含む組換えベクターなどの、組換えｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ遺伝子のカルボキシ末端に組み込まれる。高度に好ましい実施形態では、この抗体タグは、ヒトワクチン接種などの霊長類ワクチン接種のための１つ以上の構築物／組換え遺伝子には存在していない。
【０１４８】
医薬組成物
本発明は、治療有効量の本発明の物質（例えば、本明細書で考察する組換えｇｐｎ遺伝子などの組換えＨＩＶ遺伝子）および医薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤（それらの組み合わせを含む）を投与するステップを含む医薬組成物を提供する。
【０１４９】
本医薬組成物は、２種の成分を含んでいてよいが、第１成分は核酸ベクターを含み、第２成分はそのウイルスベクターを含む。第１および第２成分は、連続的、同時もしくは一緒に、そして相違する投与経路によってでさえ送達することができる。
【０１５０】
本医薬組成物は、人間医学および獣医学においてヒトもしくは動物に使用することができ、典型的にはいずれか１種以上の医薬上許容される希釈剤、担体、もしくは賦形剤を含む。治療使用のために許容できる担体もしくは希釈剤は製薬学の分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。医薬上の担体、賦形剤、もしくは希釈剤は、所望の投与経路および標準製薬実践を考慮に入れて選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として、またはそれらに加えて、いずれか適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、もしくは可溶化剤を含むことができる。
【０１５１】
保存料、安定剤、色素およびフレーバー剤さえ本医薬組成物中に提供されてよい。保存料の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤および懸濁化剤もまた使用できる。
【０１５２】
様々な送達系に依存して、様々な組成／調製要件が存在することがある。例えば、本発明の医薬組成物は、例えば鼻腔スプレーもしくは吸入用エーロゾルもしくは摂取液として、ミニポンプを用いて、または粘膜経路によって送達するように、あるいは例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下経路による送達のための注射形で組成物が調製される非経口経路によって送達するように調製できる。あるいは、調製物を両方の経路によって送達するように設計することもできる。
【０１５３】
本剤を消化器粘膜を通して粘膜経由で送達しなければならない場合は、消化管を通る移動中に安定性のままで存在できなければならない；例えば、本剤は、タンパク質分解に対して抵抗性、酸性ｐＨで安定性、そして胆汁の界面活性作用に対して抵抗性でなければならない。
【０１５４】
適切な場合は、本医薬組成物は、吸入によって、坐剤もしくはペッサリーの形状で、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤もしくは散布剤の形状で局所的に、皮膚パッチを使用して、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形状で経口的に、または単独もしくは賦形剤との混合物によるカプセル剤もしくは膣坐剤として、またはフレーバー剤もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、液剤、懸濁剤の形状で投与できる、あるいはそれらは例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下のように非経口的に注射することができる。非経口投与のためには、本組成物は、血液と等張性の溶液を作製するために十分な塩類もしくは単糖類などの他の物質を含有していてよい無菌水溶液の形状で使用するのが最善である。経口腔もしくは舌下投与のためには、本組成物は、従来型方法で調製できる錠剤もしくはトローチ剤の形状で投与されてよい。
【０１５５】
製薬学的併用
本発明の物質は、１種以上の他の製薬学的有効成分と一緒に投与することができる。例えば、本発明は、本発明による物質と１種以上のステロイド剤、鎮痛薬、抗ウイルス薬もしくは他の１種以上の製薬学的有効成分との同時、もしくは連続的治療を範囲に含めている。
【０１５６】
本発明は、さらにまたＨＩＶ−１などのＨＩＶに感染した人々のための治療的免疫療法にも適用できる。本発明は、ＨＡＡＲＴと併用できる、および／またはＨＩＶ−１などのＨＩＶに感染するリスクがある人々のための予防的免疫療法と併用できる。
【０１５７】
これらの治療計画には上記の物質の連続的、同時もしくは一緒の投与が含まれることは理解される。
【０１５８】
ここで以下では、下記の図面を参照しながら、添付の特許請求の範囲を限定することを意図していない実施例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【０１５９】
ＧＰＮ配列におけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴヘルパーエピトープの分析。
本発明者らは、ＰｒｏＰｒｅｄを使用して天然ＮＥＦ対スクランブルＮＥＦについてＴヘルパーエピトープを比較した。このプログラムは、本発明によるスクランブルＮＥＦ中により多数のＴヘルパーエピトープが存在すると予測した。これは、スクランブルＮＥＦ配列が、ＴヘルパーおよびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する際に、天然ＮＥＦと少なくとも同等に強力であることを証明した。
【０１６０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ
ＣＤ８＋Ｔ細胞はウイルス感染Ｔ細胞を認識して排除することができるので、ヒトにおけるＨＩＶ感染症およびサルにおけるＳＩＶ感染症のウイルス血症のコントロールと関連付けられてきた。
【０１６１】
ＧＰＮ配列（図１）とＨＩＶ分子免疫学データベース（「ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２：Ｍａｐｓ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｌｏｔｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ａｕｇｕｓｔ  ７，２０３；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｍａｐｓ／ｃｔｌ／ｃｔｌ．ｐｄｆ）において公表されたＨＸＢ２参照配列との比較を実施した。
【０１６２】
この比較により、天然ｇａｇ（ｐ１７、ｐ２４）、短縮型ｐｏｌ（ｐ５１）およびｎｅｆについて同定された既知のマウスおよびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列の全てがＧＰＮポリペプチド配列内に存在することが明らかになった。ＧＰＮ配列とＨＸＢ２参照配列との間には単一アミノ酸相違が存在した。エピトープ配列がＨＸＢ２のタンパク質配列上に示され、規定されたエピトープの相対位置を提供するが、エピトープが規定されたタンパク質配列に関してエピトープが変化していることがある（ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ２００２：Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ−Ａ−２−ＨＩＶ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｓ，ｐ５６；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｐｄｆ／２００２／ｉｍｍｕｎｏ２００２．ｐｄｆを参照されたい）。
【０１６３】
このため、ＧＰＮ配列内のシャッフリングおよび再配列は、この分子がＨＩＶにおいて存在する天然ｇａｇ（ｐ１７、ｐ２４）、短縮型ｐｏｌ（ｐ５１）およびｎｅｆ配列に対してマウス、サルもしくはヒトにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する能力を本質的には変化させなかった。
【０１６４】
ＧＰＮタンパク質を構成する天然ポリペプチドのスクランブルおよび再配列は、この分子に固有の新規のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを作り出した可能性がある。これらのエピトープはＨＩＶウイルス内の天然ｇａｇ、ｐｏｌもしくはｎｅｆ配列内に存在するとは思われないので、このためそれらはＨＩＶに対するワクチンに含めるための新規抗原にとって生物学的重要性があるとは思われない。その結果として、本実施例ではこれらのエピトープについてこれ以上調査しなかった。
【０１６５】
Ｔヘルパーエピトープ
Ｔヘルパー免疫応答は、大きさおよび幅に関してＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター応答を増強させるので、このためＨＩＶ感染症に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の有効性を増強することができる。
【０１６６】
ＧＰＮ配列とＨＩＶ分子免疫学データベース（「ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２：Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｌｏｔｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ａｕｇｕｓｔ  ７，２０３；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｍａｐｓ／ｈｅｌｐｅｒ／ｈｅｌｐｅｒ．ｐｄｆ）において公表されたＨＸＢ２参照配列との比較は、天然ｇａｇ（ｐ１７，ｐ２４）、短縮型ｐｏｌ（ｐ５１）およびｎｅｆに対して同定されたヒトＴヘルパーエピトープ配列の全てがＧＰＮポリペプチド配列内に存在することを明らかにした。このため、ＧＰＮ配列内のシャッフリングおよび再配列は、この分子がヒトにおけるクレードＢウイルス内に存在する天然ｇａｇ（ｐ１７、ｐ２４）、短縮型ｐｏｌ（ｐ５１）およびｎｅｆ配列に対してＴヘルパー応答を誘導する能力を本質的には減少させなかった。
【０１６７】
Ｔヘルパーエピトープは通常は１５アミノ酸より長いので、ＧＰＮ内のｇａｇ、短縮型ｐｏｌおよびｎｅｆ配列の融合は、有益にはこれらの遺伝子もしくは遺伝子の部分が融合している点を架橋する新規エピトープを作り出していると思われる。さらに、ｎｅｆ遺伝子のシャッフリングは、結果として生じるポリペプチドのシャッフルされた区間を架橋する多数の新規エピトープを作り出していると思われる。そのような新規のＴヘルパーエピトープは、有益にもＧＰＮがワクチンとして投与されると免疫応答を誘発し、それによって天然ＧＡＧ、短縮型ＰＯＬおよびＮＥＦタンパク質に比較して本発明の１つ以上のポリペプチドによって誘発される生物学的に重要なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の幅および強さを増強することができる。
【０１６８】
シャッフリングが潜在的に新規のＴヘルパーエピトープを作り出したことを証明するために、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）において見いだすことのできるような、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７．５５５−５６１（１９９９）およびＳｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７の中で開示されたマトリックスベースの予測アルゴリズムを使用するＰｒｏｐｒｅｄ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープ予測プログラムを用いて、天然ＮＥＦおよびスクランブルＮＥＦポリペプチド配列（図２）を比較した。
【０１６９】
これらの分子の比較によって、予測されたヒトＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔヘルパーエピトープ内の実質的な変化が明らかになり、天然ＮＥＦ配列内よりスクランブルＮＥＦ配列内においてより多数の予測エピトープが生じていた（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１７０】
そこで、ｎｅｆ配列のスクランブルは、本発明によるこのポリペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強化するための追加のＴヘルパーエピトープの作製を生じさせた。これらの有益な新規Ｔヘルパーエピトープは、図３Ａには示されているが、図３Ｂには欠如しているエピトープを含む。
【０１７１】
ＧＰＮポリペプチドを含むタンパク質間の融合点を越えて類似の新規Ｔヘルパーエピトープが生成している。上述の比較を使用すると、これらをより詳細に規定／調査することができる。
【実施例２】
【０１７２】
ＤＮＡ、ＭＶＡおよび鶏痘における組換えＧＰＮ遺伝子
ＧＰＮ融合タンパク質を発現させるために、組換えｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ（ｇｐｎ）遺伝子を構築した。この遺伝子構築物を、ＤＮＡ担体（例、プラスミド担体）などの核酸担体中、ならびにＭＶＡおよび鶏痘ベクターおよび同一物を構築するための物質中で使用した。
【０１７３】
ＤＮＡプラスミド媒介初回抗原刺激を追加刺激するためのＭＶＡおよび／または鶏痘ベクターなどの組換えウイルスベクターの使用は、齧歯類において強力な免疫応答を誘導することが証明されている。
【０１７４】
本質的に、同一構築物はヒトなどの霊長類においても適用される。
【０１７５】
この実施例では、組換えポックスウイルスによって送達される治療用抗原は、ＨＩＶ−１クレードＢ  ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ遺伝子の産物の産物に基づく融合タンパク質を含む。
【０１７６】
組換えｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ遺伝子を一連の重複オリゴヌクレオチドとして合成し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させ、市販で入手できるプラスミドであるｐＵＣ１９の中にクローニングしてｐＵＣ１９．ｇｐｎ（もしくは０２−２１３）を作製し、ヌクレオチド配列を決定した。
【０１７７】
ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ遺伝子を３種のプラスミドベクター内へサブクローニングして
ｉ）ｇｐｎ含有組換えポックスウイルスベクターの前臨床試験などでインビボ使用するための初回抗原刺激剤として使用するためのプラスミド発現プラスミド、ｐＳＧ２．ｇｐｎ；
ｉｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆを発現する組換えＭＶＡを構築するための組換えプラスミド、ｐＯＰＫ６．ｇｐｎ；
ｉｉｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆを発現する組換え鶏痘系統ＦＰ９を構築するための組換えプラスミド、ｐ２９Ｄ．ｇｐｎ、
を作製した。
【０１７８】
発現プラスミド、ｐＳＧ２．Ｍｅｌ３（Ｐａｌｍｏｗｓｋｉ，ＭＪ．ｅｔ  ａｌ  ２００２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８  ｐ４３９１−４３９８）は、黒色腫抗原を含有する合成エピトープのストリングを発現するために、ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナルと結合したヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびイントロンをベースとする発現カセットを含有している。発現プラスミドｐＳＧ２．ｇｐｎは、ＡｐａＩおよびＡｓｃＩを用いてｐＵＣｌ９．ｇｐｎを消化し、インサートの末端を平滑化し、平滑末端化したＰｓｔＩ消化ｐＳＧ２Ｍｅ１３内へサブクローニングすることによって作製した。
【０１７９】
ＭＶＡ組換えプラスミドであるｐＯＰＫ６は以下のように作製した。このプラスミドは、市販で入手できるクローニングプラスミドｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）をベースとしている；標準的な複数クローニング部位は固有の制限部位を含有する合成リンカーと置換されており、ワクシニアウイルスＰ７．５後期−初期プロモーターおよび後期Ｐ１１プロモーターは相対方向に配列されている。リンカーもまた、ワクシニアウイルス組換えプラスミドｐＳＣ１１内で見いだされるような遺伝子であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）の最初から２０個のヌクレオチドを有する（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ  １９８５  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５  ｐ３４０３−３４０９）。ｐＬｉｎｋ（もしくは０２−３６３）を作製するためには、合成リンカーを一連の重複オリゴヌクレオチドとして合成し、ＰＣＲによって増幅させ、市販のクローニングプラスミドｐｃＤＮＡ３．１内へクローニングした。３００塩基対のリンカーの配列を以下に示す：
【０１８０】
ａｇａｔｃｔｔｔａａｔｔａａｔｇｃｃｔａｇｇｃａａｔｔｇａｇａｃｇｇｃｇｃｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｔａｇｔａａｇｇｇｃｃｃｇｔｇｃａａｔａａａｔｔａｇａａｔａｔａｔｔｔｔｃｔａｃｔｔｔｔａｃｃａｇａａａｔｔａａｔｔｇｔａｃａａｔｔｔａｔｔａｔｔｔａｔｇｇｇｔｇａａａａａｃｔｔａｃｔａｔａａａａａｇｃｇｇｇｔｇｇｇｔｔｔｇｇａａｔｔａｇｔｇｇｔａｃｃａｔｇｃａｔｃｔｔａｇａａｔａｔａｔｇｔａｔｇｔａａａａａｔａｔａｇｔａｇａａｔｔｔｃａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｔｔｔｃｔａｔｇｃｔａｔａａａｔｇａａｔｔｃｃｔｃａａｇｇｇａｔｃｃｇｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃｔａａｇｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｇｃｃｃｔｃｇａｇ
【０１８１】
ｐＬｉｎｋＬａｃＺを作製するために、ｐＳＣ１１由来のＬａｃＺ遺伝子の一部分をｐＬＩＮＫ内へサブクローニングした。リンカーおよびＬａｃＺ遺伝子を次に、ｐＳＰ７２ＬｉｎｋＬａｃＺを作製するために完全β−ガラクトシダーゼをコードするオープンリーディングフレームがＰ１１後期プロモーターの３末端へ形成されるように、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてｐＳＰ７２内へサブクローニングした。
【０１８２】
以下のプライマー対を用いるＰＣＲによって、ＭＶＡチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子内のＥｃｏＲＩ部位に対する１５００塩基対５末端および３末端を表しているＭＶＡフランキング領域をＭＶＡから単離した：
【０１８３】
左側、（５末端）ｔｋフランク
フォワードプライマー  ＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＧＡＴＡＧＧＴ
リバースプライマー  ＣＧＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧ
【０１８４】
右側、（３末端）ｔｋフランク
フォワードプライマー  ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＴＡＴＧＧＣＡＡＡＣＧ
リバースプライマー  ＴＣＡＴＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＡ
【０１８５】
１５００ｂｐ  ＰＣＲ産物を市販のクローニングベクターｐＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へクローニングし、配列決定した。
【０１８６】
ｐ７２ＬｉｎｋＬａｃＺＲを作製するために、右側フランクをＥｃｏＲＩ−ＭｆｅＩフラグメントとしてｐＳＰ７２ＬｉｎｋＬａｃＺ内へサブクローニングした。ｐＯＰＫ６を作製するために、左側フランクインサートを次にＮｈｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントとしてｐ７２ＬｉｎｋＬａｃＺＲ内にサブクローニングした。
【０１８７】
このプラスミドについてのその後の配列分析により、ＮｈｅＩ酵素による非特異的開裂に起因して左側フランクを用いたｐＴＯＰＯ−ＴＡベクターから導入されたｐＯＰＫ６主鎖プラスミド内で追加の１７４塩基対の配列が同定された。
【０１８８】
ｐＯＰＫ６．ｇｐｎを作製するためにｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆオープンリーディングフレームをＡｐａＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてｐＵＣｌ９．ｇｐｎからｐＯＰＫ６内へサブクローニングし、ｇｐｎインサートを配列決定してサブクローニングステップ中に変化が発生しなかったことを確証した。
【０１８９】
このプラスミドは、Ｐ７．５後期−初期プロモーターの制御下で、ｇｐｎオープンリーディングフレームをＭＶＡのｔｋ遺伝子座へ導入するためのビヒクルとして機能した。
【０１９０】
ＦＰ９ベクター
ＦＰ９系統の鶏痘組換えプラスミドであるｐＥＦＬ２９は、Ｑｉｎｇｚｈｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ  １９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２（６）ｐ５６９−５７３に公表されているように、英国コンプトンに所在のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈに所属するＤｒ  Ｍｉｋｅ  Ｓｋｉｎｎｅｒから入手した。
【０１９１】
ｐＥＦＬ２９．ｇｐｎを作製するために、ｇｐｎオープンリーディングフレームを平滑末端化ＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメントとしてｐＵＣｌ９．ｇｐｎからｐＥＦＬ２９のＳｍａＩ部位内へサブクローニングした。このプラスミドの配列決定は、ＬａｃＹおよび一部のＬａｃＡがｐＥＦＬ２９の構築中にＬａｃＺマーカー遺伝子と一緒に導入されたことを証明した。結果として、ｐ２９Ｄｅｌｔａを作製するためにｐＥＦＬ２９のＢｓｒＧＩ−ＢＩｐＩ消化物によってＬａｃＹの全ておよび残っているＬａｃＡオープンリーディングフレームのほとんどの欠失を可能にするリンカーが合成された。このリンカーの配列を以下に示す：
【０１９２】
ＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＡＣ
【０１９３】
次に、ｐ２９Ｄ．ｇｐｎを作製するために、ｇｐｎ発現カセットをＡａｔＩＩ−ＳｐｈＩフラグメントとしてｐＥＦＬ２９．ｇｐｎからＡａｔＩＩ−ＳｐｈＩ切断ｐ２９Ｄｅｌｔａ内へサブクローニングした。ｇｐｎインサートを次に配列決定して、サブクローニングステップ中に変化が全く発生しなかったことを確証した。
【０１９４】
組換えプラスミドのｐＯＰＫ６．ｇｐｎおよびｐ２９Ｄ．ｇｐｎを使用して、Ｐ７．５−ｇｐｎ発現カセットを各々ＭＶＡおよびＦＰ９に導入した。
【０１９５】
組換えポックスウイルスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに記載された標準分子生物学技術；または供給業者もしくは製造業者の指示にしたがってニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）培養中の関連組換えプラスミドを用いたウイルスゲノムの相同組換えによって作製した。
【０１９６】
ＭＶＡ．ｐｇｎは、ＣＥＦ細胞のコンフルエント培養を、１時間にわたり感染多重度０．１でＭＶＡ継代数５７５（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ［ｂ］．１６７（５−６）：３７５−９０）由来の非組換えＭＶＡ（ストック５７５ＦＨＥ−Ｋ）を用いて感染させることによって作製した。感染細胞を次に、製造業者のプロトコールにしたがって、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した０．５から２．０μｇのｐＯＰＫ６．ｇｐｎプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。これらの培養を３日間にわたりインキュベートした後に採取した。採取した細胞は冷凍−解凍を３回繰返し、１０倍希釈液として滴定し、３日間にわたりＣＭＣ含有培地中で培養した。培地を取り除き、Ｘ−Ｇａｌを含有するＣＭＣ培地と交換し、この培養をこの培地中で２０時間にわたりインキュベートした。
【０１９７】
組換えウイルスは、青色プラーク表現型によって同定し、ピペットで１００μＬ培地を含有するクリオチューブ内へ採集した。採集したウイルスは、純度を保証するために５回以上プラーク精製した。非組換え親ウイルスからの純度は、適切なプライマーを用いてウイルスＤＮＡをスクリーニングした場合の白色プラーク表現型の不在およびＷＴ  ＰＣＲ産物の不在によって確証した。
【０１９８】
純度ＰＣＲスクリーニングは、ＭＶＡ．ｇｐｎの第５もしくは第６ラウンドのクローンで感染させた２ｍＬ培養から精製したウイルスＤＮＡについて実施した。
【０１９９】
ウイルスＤＮＡは、製造業者のプロトコールにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ血液および細胞培養ＤＮＡ  ｍｉｎ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｍａｘ  Ｖｏｌｍａｒ  ｓｔｒ．４，４０７２４、ドイツ国ヒルデン）を用いて精製した。ＰＣＲ反応は、適切なインキュベーション条件を用いてＫｌｅｎｔａｑプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を使用して実施した。
【０２００】
親ウイルスを以下のプライマーを用いてスクリーニングすると、野生型では４７１塩基対のバンドが得られたが、ＭＶＡでは全く得られなかった：
ＴＫＵ  ＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＧＡＴＡＧＧＴ
ＴＫＬ  ＴＣＡＴＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＡ
【０２０１】
プライマーＴＫＬおよび以下のプライマーを用いてＭＶＡ．ｇｐｎをスクリーニングすると、ＭＶＡ．ｇｐｎ構築物からおよそ２０００塩基対のバンドが得られた：
ＨＩＶ−Ｕ  ＡＴＡＣＣＣＣＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＴＴＡＡＧＡ
【０２０２】
ＭＶＡ．ｇｐｎからのＧＰＮタンパク質の発現は、下記に記載するように免疫ブロット法によって確証した。
【０２０３】
ＣＥＦ細胞をＭＶＡ．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ＬａｃＺコントロールウイルスにより感染多重度１で感染させた。この培養を３日間にわたりインキュベートした後に採取した。細胞をＳＤＳサンプルバッファー中で１００℃へ加熱し、４〜２０％アクリルアミドゲルに通して電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜上で電気ブロッティングした。移したタンパク質は、次にヘマグルチニンタグ（Ａｂｃａｍ）に対して特異的な抗体、またはＨＩＶ  ＧＡＧ  Ｐ２４（Ｄａｋｏ）に対して特異的な抗体のいずれかを用いて試験し、適切なペルオキシダーゼ標識二次抗体および色原体を用いて可視化した。このブロットアッセイは、ＭＶＡ．ｇｐｎに感染した細胞がＭＶＡ．ＬａｃＺに感染した細胞中には不在であるＰ２４およびＨＡエピトープを含有する約１３４ｋＤａのタンパク質を含有することを証明した。ＧＰＮタンパク質の予測分子量は１２８．５ｋＤａであり、これはＭＶＡ．ｇｐｎ感染細胞中で生成した特異的バンドと緊密に一致している。
【０２０４】
ＦＰ９．ｇｐｎからのＧＰＮタンパク質の発現は、免疫ブロット法によって確証した。ＣＥＦ細胞は、ＦＰ９．ｇｐｎもしくはＦＰ９．ＬａｃＺ、（「ＦＰ９．２９Ｄ」）コントロールウイルスにより感染多重度１で感染させた。この培養を５日間にわたりインキュベートした後に採取した。細胞をＳＤＳサンプルバッファー中で１００℃へ加熱し、４〜２０％アクリルアミドゲルに通して電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜上で電気ブロッティングした。移したタンパク質は、次にヘマグルチニンタグ（Ａｂｃａｍ）に対して特異的な抗体、またはＨＩＶ  ＧＡＧ  Ｐ２４（Ｄａｋｏ）に対して特異的な抗体のいずれかを用いて試験し、適切なアルカリホスファターゼ標識二次抗体および色原体を用いて可視化した。このブロットアッセイは、ＦＰ９．ｇｐｎに感染した細胞がＦＰ９．２９Ｄに感染した細胞中には不在であるＰ２４およびＨＡエピトープを含有する約１３４ｋＤａのタンパク質を含有することを証明した。ＧＰＮタンパク質の予測分子量は１２８．５ｋＤａであり、これはＦＰ９．ｇｐｎ感染細胞中で生成した特異的バンドと緊密に一致している。
【０２０５】
「プライム・ブースト」プロトコールを用いて、ＭＶＡ．ｇｐｎおよびＦＰ９．ｇｐｎウイルスの免疫原性をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて試験した。マウスは４匹ずつの群に分けた。下記の試験群およびコントロール群が確立された：
ｐＳＧ２．ｇｐｎ（５０μ）初回抗原刺激の１４日後に１×１０6ｐｆｕのＭＶＡ．ｇｐｎによる追加刺激。
ｐＳＧ２．ｇｐｎ（５０μ）初回抗原刺激の１４日後に１×１０6ｐｆｕのＦＰ９．ｇｐｎによる追加刺激。
１×１０6ｐｆｕのＭＶＡ．ｇｐｎ単独。
１×１０6ｐｆｕのＦＰ９．ｇｐｎ単独。
【０２０６】
ウイルス感染の７日後、末梢血リンパ球を採取し、ＨＩＶの次にＴ細胞エピトープを用いるＥＬＩＳｐｏｔアッセイでＧＰＮ特異的インターフェロンγ分泌性リンパ球の数を決定した（実施例３も参照されたい）：
Ｈ２−Ｄ  ＣＤ８エピトープ：ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ
ＴＴＳＴＬＱＥＱ
Ｇｐ１６０  Ｈ２−Ｄ  ＣＤ８エピトープ：ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ
Ｈ２−Ｄ  ＣＤ４エピトープ：ＮＰＰＩＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫ
【０２０７】
ＭＶＡ．ｇｐｎおよびＦＰ９．ｇｐｎはどちらもマウスにおいて強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することが証明された。
【０２０８】
プライム・ブーストプロトコールは、ウイルスを用いた単回注射を受けた群において所見された応答より大きな応答を生じさせることが証明された。
【実施例３】
【０２０９】
ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎによる免疫は抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する
本実施例では、ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎが、単独またはｐＳＧ２．ｇｐｎを用いたプライム・ブースト免疫投与計画で投与したときに、増強された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することが証明された。本実施例では、この証明をマウスにおいて提示する。
【０２１０】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を５０μｇのｐＳＧ２．ｇｐｎの筋肉内（ｉｍ．）注射によって免疫し、２週間後に１×１０6ＰＦＵのＦＰ９．ｇｐｎもしくは１×１０5のＭＶＡ．ｇｐｎの静脈内注射（ｉｖ．）によって追加刺激した。また別の実験未使用の年齢が適合する雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群を追加刺激と同時に１×１０6ＰＦＵのＦＰ９．ｇｐｎもしくは１×１０5のＭＶＡ．ｇｐｎを用いて静脈内投与により免疫した。
【０２１１】
追加刺激の１４日後、全マウスを頸椎脱臼により致死させ、ＧＰＮポリペプチド（表Ａ：ＡＭＱ、ＴＴＳ、ＲＧＰ）からの３種のＨ−２d制限ＣＤ８＋エピトープに対して誘発したＴ細胞応答を以下に記載するようにＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。
【０２１２】
マウスＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔプロトコール：
材料：
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ  ＡＬＰキットＭａｂｔｅｃｈ  ３３２１−２Ａ
６００μｇの抗ＩＦＮ−γ精製Ｍａｂ  ＡＮ１８
５０μｇの抗ＩＦＮ−γビオチニル化Ｍａｂ  Ｒ４６Ａ２
５０μＬのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ
【０２１３】
完全α−ＭＥＭ培地
５００ｍＬのＭＥＭ  α−修飾Ｓｉｇｍａ  Ｍ−４５２６
５０ｍＬのＦＣＳ［１０％］Ｓｉｇｍａ  Ｆ−２４４２
５ｍＬのｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ［１００Ｕペニシリン  １００μｇ  ｓｔｒｅｐ］Ｓｉｇｍａ  Ｐ−０７８１
１０ｍＬのＬ−グルタミン［４ｍＭ］Ｓｉｇｍａ  Ｇ−７５１３
５００μＬの２−メルカプトエタノール［５０μｍ］Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ３１３５０−０１０
【０２１４】
ＡＣＫバッファー
８．２９ｇ  ＮＨ4Ｃｌ［０．１５Ｍ］（Ｓｉｇｍａ  Ａ−４５１４）
１ｇのＫＨＣＯ3［１ｍＭ］（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−９１４４）
３７．２ｍｇのＮａ2ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  ＥＤ２ＳＳ）
８００ｍＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒ
ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７６５３）を用いてｐＨを７．２−７．４へ調整する
水を用いて１０００ｍＬとし、オートクレーブにかける
【０２１５】
発色バッファー：
ＢｉｏＲａｄ  ＡＰコンジュゲート基質キット（１７０−６４３２）．
１つのプレートについて、
５ｍＬの脱イオン水
２００μＬの２５×バッファー
５０μＬの試薬Ａ
５０μＬの試薬Ｂ
しっかりと混合し、直ちに使用する。
【０２１６】
プロトコール
１．プレートの調製：
１．１．プレートをコーティングする。ＭＡＩＰマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＩＰＳ４５１０）をラット抗マウスＩＦＮγ（Ｍａｂ  ＡＮ１８）抗体でコーティングする。リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３８１３）中で１０μｇ／ｍＬへ希釈し、ＭＡＩＰプレートへ１ウェル当たり５０μＬを添加する。４℃の加湿チャンバー内で一晩インキュベートする。
１．２．プレートをブロッキングする。コーティング抗体を払い落とし、マルチチャンネルピペットを使用して、１ウェル当たり１５０ｕＬの無菌ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３８１３）を用いてプレートを１回洗浄する。ＰＢＳを払い落とし、１ウェル当たり１００ｕＬの完全α−ＭＥＭ培地を添加し、室温で１時間以上インキュベートする。この段階ではプレートを無菌で保持することが重要である。
【０２１７】
２．脾細胞の調製：
２．１．ペトリ皿に含有された７０μｍ細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ  ３５２３５０）内で１０ｍＬシリンジのプランジャーを用いて２ｍＬのＰＢＳ中で個々の脾臓をつぶし、５ｍＬのＰＢＳを添加し、ピペッティングによって脾細胞を懸濁させ、５０ｍＬチューブへ移す。さらに１０ｍＬのＰＢＳを用いて細胞ストレーナーおよび皿を洗い流し、５０ｍＬチューブへ添加する。１５００ｒｐｍで５分間にわたり遠心する。
【０２１８】
２．２．上清を取り除き、試験管を軽く叩いて細胞を再懸濁させ、５ｍＬのＡＣＫバッファーを添加し、反転させることにより混合する。５分間まで室温でインキュベートする。２５ｍＬのＰＢＳを添加し、反転させることによって混合し、５分間にわたり４００Ｘｇで遠心する。
【０２１９】
２．３．上清を除去し、試験管を軽く叩いてペレットを再懸濁させ、１０ｍＬのＰＢＳを添加して、ボルテックスミキサーにかける。０．４％トリパンブルー液（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−８１５４）中で１：１０に希釈することによって改良型Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計を用いて計数する。Ｅｌｉｓｐｏｔのために必要な量のアリコートを採取し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、適切な量の完全αＭＥＭ培地中でボルテックスミキサーにかけることによって再懸濁させると、１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度が得られる。
【０２２０】
３．プレートのセットアップ：
【表１】
2007534302.tif 000002
【０２２１】
注意：プレートのレイアウトは、必要に応じて変化させなければならない。このレイアウトは、本実施例のために便宜的である。
３．１．プレートからブロッキング培地を払い落とし、第３、４、７、８、１１および１２列へ５０μＬの完全αＭＥＭ培地を添加する。
３．２．第２、６および１０列へ１５０μＬの脾細胞を２回ずつ添加する。（１プレート当たり１２サンプルまで）
３．３．第２、６および１０列から５０μＬの脾細胞を取り出して各々第１、５および９列へ移す：これらは陰性コントロールウェルである。
３．４．第２、６および１０列から第３、７および１１列へ５０μＬを移すことによって各サンプルを連続的に希釈し、しっかりと混合し、第４、９および１２列へ５０μＬを移す。希釈して最終列を混合した後に５０μＬを廃棄する。
３．５．完全α−ＭＥＭ培地中で１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬで試験に使用されていない脾細胞の所望の最終濃度を２倍にするために試験ペプチドおよびコントロールペプチドを添加する。第１、５および９列へ５０μＬのコントロールペプチドおよび標的細胞を添加する。５０μＬの試験ペプチドおよび標的細胞を残りの列へ添加する。
３．６．プレートを１８〜２０時間にわたり３７℃でインキュベートする。
【０２２２】
４．アッセイを展開する
４．１．０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１３７９）を含有するＰＢＳを用いて２回、蒸留水を用いて１回、そしてＰＢＳＴを用いて２回プレートを洗浄する。
４．２．ＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬへ希釈した５０μＬ／ウェルのビオチニル化ラット抗マウスインターフェロンγを添加する。室温で２時間にわたりインキュベートする。
４．３．ＰＢＳＴを用いて４回プレートを洗浄し、次にＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬに希釈した５０μＬのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加する。室温で１時間にわたりインキュベートする。
４．４．ＰＢＳＴを用いてプレートを４回洗浄し、５０μＬ／ウェルの発色バッファーを添加する。スポットが発生するまで（約１０分間）室温でインキュベートする。水道水でプレートをしっかりと洗浄し、プラスチックの底部を引き剥がし、ペーパータオル上で一晩かけて乾燥するに任せる。
【０２２３】
計算
結果は、脾細胞１０6ｃｅｌｌｓ当たりのエピトープ特異的ＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｆｃ／１０6）の数として計算する。群間の差は一方向ＡＮＯＶＡおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｓｔａｔバージョン３．０５を用いたｌｏｇ10変換データについての事後Ｔｕｋｅｙ−Ｋａｒａｍｅｒ多重比較試験によって決定する。
【０２２４】
結果
ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎ単独もしくはｐＳＧ２．ｇｐｎを用いたプライム・ブーストレジメンによる免疫がマウスにおいて抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘発するという証明を図７に例示する。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをｐＳＧ２．ｇｐｎ（ＤＮＡ）の筋肉内投与により免疫し、またはＰＢＳ（−）により偽免疫し、上述のように１４日後にＦＰ９．ｇｐｎ（ＦＰ９）もしくはＭＶＡ．ｇｐｎ（ＭＶＡ）により追加刺激した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、追加刺激免疫の１４日後に脾細胞中でＣＤ８+Ｔ細胞応答を決定した。列は、ＣＤ８+応答性エピトープＡＭＱ、ＴＴＳおよびＲＧＰによって誘発された１群当たり４匹のマウスについての平均ＩＦＮ−γスポット形成細胞数／１０6（脾細胞）±標準偏差を表している（表２を参照）。
【０２２５】
表２：本試験で使用したＧＰＮエピトープ（lＮＤ＝決定されなかった）
【表２】
2007534302.tif 000003
【０２２６】
単回免疫またはＦＰ９．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ｇｐｎいずれかを用いてのプライム・ブースト免疫は、偽免疫コントロールに比較して、ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの各々に対して有意に（Ｐ＜０．０１）増強された抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発した（図７）。
【０２２７】
さらに、ｐＳＧ２．ｇｐｎを用いた初回抗原刺激およびＦＰ９．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ｇｐｎを用いた追加刺激は、各ウイルスを用いた単回免疫に比較して、各ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープに対して有意に（Ｐ＜０．０１）増強された応答を誘発した（図７）。
【０２２８】
この実験においてウイルス力価は同一ではなかったことに留意されたい。そこで、ウイルスの相対免疫効力は比較していない。当然ながら、同一ウイルス力価を備える実施例を実施することによってこれを評価することは容易である。
【０２２９】
そこで、ＦＰ９．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ｇｐｎのいずれかを用いた免疫によるｇｐｎ遺伝子などの本発明による組換えＨＩＶ遺伝子に対して特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答が誘発されることが証明され、これはこれらの構築物がＧＰＮポリペプチドに対する免疫応答を誘発することにどちらも効力があることを示している。
【０２３０】
さらに、強力な免疫応答はＧＰＮポリペプチドのＮおよびＣ末端領域に存在するエピトープに向けられており、これはＦＰ９．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ｇｐｎいずれかの送達後にポリペプチド全体が発現して、プロセッシングされ、提示されることを示している。
【０２３１】
どちらのウイルスもｐＳＧ２．ｇｐｎを用いて初回抗原刺激されている動物に投与されたときに各エピトープに対して有意に高い免疫応答を誘発したが、これはどちらもプライム・ブースト免疫レジメンにおける追加刺激剤として機能できることを示している。
【実施例４】
【０２３２】
霊長類におけるＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎの免疫原性
ｇｐｎ免疫原の免疫原性を以下のように霊長類においてインビボで証明した。
【０２３３】
クレードＢのＨＩＶ−１のｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆタンパク質からなるＧＰＮポリペプチドの免疫原性を非ヒト霊長類（アカゲザル：Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）において試験した。
【０２３４】
ポリプロテイン（ヒトコドン使用）を組換えＭＶＡ、鶏痘ウイルスＦＰ９、アデノウイルスおよびＤＮＡワクチンベクターにおいて発現させた。高レベルの抗原特異的ＣＤ８+およびＣＤ４+細胞を誘発するために、ポリプロテイン発現構築物を異種免疫計画において投与した。
【０２３５】
表３は、免疫原性試験の試験デザインを示している。
表３
【表３】
2007534302.tif 000004
【０２３６】
本実施例のアカゲザル試験のデザインは表３に示す。
【０２３７】
血液サンプルを免疫前および各免疫の７日後および最終免疫の４週間後に採取した。ＰＢＭＣを冷凍保存し、重複ペプチドのプールを使用してＥＬＩＳｐｏｔおよび細胞内サイトカインアッセイにおいて検査した。
【０２３８】
細胞性免疫応答を試験中および試験終了時に検査する。ＩＦＮ−γ−分泌Ｔ細胞の発生頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって検査した（使用する重複ペプチドについては図９を参照）。
【０２３９】
追加の群では、比較の目的で、ＩＬ−２／Ｉｇ融合タンパク質（Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．，Ａ．Ｃｒａｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（８）：４１９２−７）および組換えアデノウイルスを補充したＤＮＡワクチンについて検査した。試験デザインについては表３を参照されたい。
【０２４０】
本試験では数種のパラメータを提示する。
【０２４１】
（ａ）ＦＰ９およびＭＶＡの投与順序。ポックスウイルスベクターによるプライムおよびブーストの最も効果的な組み合わせを証明する。これは詳細には、本試験デザインの第１および２群に焦点を当てる（表３参照）。
【０２４２】
（ｂ）プライムおよびブーストの実施頻度。単一ポックスウイルス免疫による初回抗原刺激および単一異種ポックスウイルスベクター追加刺激による追加免疫の有効性（免疫原性に関して）を証明する。これは特に、略述したように免疫される第３群の動物に焦点を当てる。
【０２４３】
読み取り：このワクチン接種戦略の重要な目的は細胞性免疫応答を誘導することである。このため、以下のアッセイを使用して細胞性免疫応答を監視した：重複ペプチド（図９に示すように１０アミノ酸による２０ｍｅｒの重複）、ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞に対する細胞内サイトカイン染色を用いるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでは、ＣＤ４／８枯渇実験によりＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞によるペプチドへ反応したＩＦＮ−γ分泌が確証される。
【０２４４】
第４群についてのデータを以下に示す。このデータは、アカゲザルにおける新規プライム・ブースト免疫計画を用いたＨＩＶ免疫療法薬の免疫原性を示している。
【０２４５】
表４．免疫およびサンプリングのスケジュール
【表４】
2007534302.tif 000005
【０２４６】
結果
ＧＰＮインサートは免疫原性であり、アカゲザルにおけるウイルスベクター免疫後にインターフェロンγ分泌Ｔ細胞を誘導する。
【０２４７】
第４群では、ＦＰ９．追加刺激の７日後に５匹中４匹の動物においてｇｐｎ特異的Ｔ細胞応答が検出された。これらの応答はＭＶＡ追加刺激後に保持されていた。
【０２４８】
このデータは、霊長類においてＧＰＮ融合タンパク質が組換えベクターを用いて送達されたときに免疫原性であることを証明している。
【０２４９】
ｇｐｎのＧＡＧ、ＰＯＬおよびＮＥＦは免疫されたアカゲザルにおいて認識された。
図１０、１１および１２は、個々の動物がｇｐｎタンパク質の様々な部分へ応答することを示し、これはタンパク質ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ由来のＴ細胞エピトープが同一の応答する動物において認識されることを示している。例えば、第４群の動物Ｎ９３は、ＧＰＮを用いて細胞応答を誘導できることを示すＧＰＮタンパク質のＧＡＧ、ＰＯＬおよびＮＥＦ部分を認識するＴ細胞応答を示している。さらに、理論によって結び付けることを望まなくても、３種類のＧＰＮポリペプチドの様々な要素に対する免疫応答の幅は、当該ポリペプチド上に存在する他のエピトープに対する応答を犠牲にして単一エピトープが免疫応答を決定付けることのある免疫優性作用を回避することについての本発明の有益な特徴を示している。これとは対照的に、本実施例の本発明によるポリペプチドは、有益にも広範囲でバランスの取れた応答を示す。
【０２５０】
霊長類免疫原性についての単回投与実験
ＧＰＮポリペプチド（配列番号１）の免疫原性をＡからＪと表示した１０匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）において単回投与（「シングルショット」）実験で検査した。本実施例では、ポリペプチドはＭＶＡもしくはＦＰ９ベクターのいずれかを介して送達した。
【０２５１】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは上述のとおりに実施した。１１９の重複する約２０ｍｅｒのペプチド（実施例７に記載した）に対する応答を測定し、次に合計して全応答を得た。
【０２５２】
注射前および注射２８日後の応答を測定した。応答を以下に示す。ＧＰＮは、試験した全動物において免疫応答を誘発した。
【０２５３】
【表５】
2007534302.tif 000006
【０２５４】
結果は、ＧＰＮポリペプチドが免疫原性であり、アカゲザルなどの霊長類におけるウイルスベクター免疫後にインターフェロンγ分泌Ｔ細胞を誘導することを示している。
【０２５５】
そこで、本発明の組換え遺伝子の有効性が霊長類においてインビボで証明された。
【実施例５】
【０２５６】
ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎを用いた異種プライム・ブースト免疫レジメンは増強されたＴ細胞応答を誘発する
本実施例では、ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎが、異種もしくは同種プライム・ブースト免疫レジメンで被験者に投与したときに、増強された抗原特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘発することを証明した。本実施例では、この作用をマウスにおいて証明した。
【０２５７】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を静脈内注射によって１×１０5ＰＦＵのＦＰ９．ｇｐｎもしくは１×１０6のＭＶＡ．ｇｐｎのいずれかを用いて免疫した。動物は、プライムと同一方法でいずれかのウイルスを用いて２週間後に追加刺激した。
【０２５８】
追加刺激免疫の１４日後、全マウスを頸椎脱臼により屠殺し、ＧＰＮ由来の３種のＣＤ８+エピトープ（表２：ＡＭＱ、ＴＴＳ、ＲＧＰ）およびＣＤ４+エピトープ（表２：ＮＰＰ）に対して誘発したＴ細胞応答を上記の実施例で記載したようにＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。
【０２５９】
結果は、脾細胞１０6ｃｅｌｌｓ当たりのエピトープ特異的ＩＦＮγスポット形成細胞数（ｓｆｃ／１０6）の合計として計算した。群間の差は一方向ＡＮＯＶＡおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｓｔａｔバージョン３．０５を用いた対数10変換データについての事後Ｔｕｋｅｙ−Ｋａｒａｍｅｒ多重比較試験によって決定した。
【０２６０】
結果
プライム・ブースト計画過程におけるＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎを用いた免疫が、マウスにおいてＧＰＮに対する増強されたＴ細胞応答を誘発するという証明は図８に例示する。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＦＰ９．ｇｐｎ（ＦＰ９）もしくはＭＶＡ．ｇｐｎ（ＭＶＡ）の静脈内投与により免疫し、またはＰＢＳ（−）により偽免疫し、上述のように１４日後にいずれかのウイルスにより追加免疫した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、追加刺激免疫の１４日後に脾細胞中でＣＤ８+Ｔ細胞応答を決定した。列は、ＡＭＱ、ＴＴＳ、ＲＧＰおよびＮＰＰによって誘発された１群当たり４匹のマウスについての平均ＩＦＮ−γスポット形成細胞数／１０6（脾細胞）の合計±標準偏差を表している（表２を参照）。
【０２６１】
いずれかの順序でＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎを用いた異種プライム・ブースト免疫は、いずれかのウイルスによる同種免疫を受けた被験者と比較して、ＧＰＮ由来のエピトープに対して有意に（Ｐ＜０．００１）増強された全Ｔ細胞応答を誘発した（図８）。
【０２６２】
ＦＰ９．ｇｐｎ／ＭＶＡ．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ｇｐｎ／ＦＰ９．ｇｐｎを用いた異種免疫は、ＦＰ９．ｇｐｎ／ＦＰ９．ｇｐｎもしくはＭＶＡ．ｇｐｎ／ＭＶＡ．ｇｐｎを用いた同種免疫よりＧＰＮに対して有意に高いＴ細胞応答を誘発した。
【０２６３】
さらに、これらのウイルスは、有益にも相互に初回抗原刺激剤および追加刺激剤として互換的に使用することができる。
【０２６４】
そこで、ｇｐｎ遺伝子などの組換えＨＩＶ遺伝子の有効性は、特に鶏痘ウイルスもしくはＭＶＡウイルスをベースとするベクターなどのウイルスベクターによって送達されたときに証明された。
【実施例６】
【０２６５】
ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎを用いた異種プライム・ブースト免疫は、ｇｐｎの個別成分タンパク質に対して増強されたＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞応答を誘発する
ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎまたはＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎを用いた異種プライム・ブースト免疫が、ＧＰＮポリペプチドの成分部分に対して増強された抗原特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘発することは証明されている。本実施例では、この証明をマウスにおいて提示する。
【０２６６】
雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６マウス（６〜８週齢）を静脈内注射によって１×１０6ＰＦＵのＦＰ９．ｇｐｎもしくは１×１０6ＰＦＵのＭＶＡ．ｇｐｎのいずれかを用いて免疫した。動物は、初回抗原刺激と同一方法でいずれかのウイルスを用いて２週間後に追加刺激した。
【０２６７】
ブースト免疫の１４日後、全マウスを頸椎脱臼により屠殺し、ＧＰＮ由来配列の１ライブラリーのペプチド（１０アミノ酸が重複している２０アミノ酸）に対して誘発したＴ細胞応答を上記の実施例で記載したようにＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。
【０２６８】
結果は、各ペプチドについて脾細胞１０6ｃｅｌｌｓ当たりのエピトープ特異的ＩＦＮγスポット形成細胞数（ｓｆｃ／１０6）の合計として計算した。
【０２６９】
結果
ＦＰ９．ｇｐｎおよびＭＶＡ．ｇｐｎ（いずれかの順序で投与した）を用いた異種プライム・ブースト免疫は、同一ベクターを用いる同種免疫過程に比較して全ＧＰＮ配列にわたり増強されたＴ細胞応答を誘発した。
【０２７０】
さらに、これらのＴ細胞応答にはＣＤ８+およびＣＤ４+応答が含まれ、ＧＰＮポリペプチドの数ヵ所の領域に由来するエピトープに向けられている。
【０２７１】
そこで、異種プライム・ブーストは、本発明の１つ以上の組換え遺伝子の高度に効果的な適用であることが証明された。
【実施例７】
【０２７２】
マウスにおけるＧＰＮのエピトープマッピング
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆポリプロテインをコードする遺伝子（ｇｐｎ；図１；配列番号１１）をポックスウイルスベクターである修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ．ｇｐｎ）および弱毒化鶏痘ウイルス（ＦＰ９．ｇｐｎ）の中に挿入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、プライム・ブースト免疫過程でこれらのベクターによってｇｐｎに対して誘発された免疫応答を評価した。これらの試験は、重複ペプチドのプールを用いてＴ細胞応答をこのポリペプチドのｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆレジメンで検出できることを証明した。本試験の１つの目的は、応答性ペプチドプール内の個別ペプチドを同定し、それによってこのポリペプチドのｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ領域内で応答するエピトープの場所を規定することであった。
【０２７３】
本実施例では、各応答性ペプチドプール内の免疫原性エピトープを同定し、同定されたペプチド特異的ＩＦＮ−γ応答を誘発する原因であるＴ細胞サブセットを明らかにして、同定されたエピトープに対応する配列を他の試験と比較する。
【０２７４】
方法
マウスと免疫
全実験において雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ２d；６〜８週齢）を使用し、英国の動物（科学的処置）法１９８６を準拠して空調設備の整った個別のケージ内で飼養した。１×１０6ｐｆｕの組換えウイルスを静脈内投与した（静脈内；尾静脈へ（ｌ００μ））。
【０２７５】
免疫学的アッセイ
以前に記載したようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。陽性応答を検出するために、陰性コントロール（応答＞６０ＳＦＣ／１０6）の標準偏差の３倍のカットオフ値を適用した。
【０２７６】
ＣＤ４+およびＣＤ８+細胞の枯渇
１％  ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で単細胞懸濁液を調製し、製造業者の指示にしたがって抗ＣＤ４もしくは抗ＣＤ８  ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（登録商標）、ドイツ）のいずれかと一緒に４℃で１５分間にわたりインキュベートした。インキュベーションの完了時に、細胞を１回洗浄し（ＰＢＳ、１％  ＦＣＳ）、ＭＡＣＳ磁石上に配置されたＭＡＣＳカラムに装填した。ＣＤ４およびＣＤ８細胞含量を細胞サブセット枯渇試験の前後に２色フローサイトメトリーによって決定した。ＣＤ４+枯渇脾細胞は＜１％  ＣＤ４+細胞を含有していたが、他方ＣＤ８+枯渇後の脾細胞調製物中にはまだ＞６％のＣＤ８+細胞が存在していた。
【０２７７】
ペプチド
全ｇｐｎ配列に及ぶ計１１９の重複する約２０ｍｅｒペプチドは、Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＭＩ；ドイツ、ロイトリンゲン）（表６）によって合成された。ペプチドは６つのペプチドプールへ配列された。
【０２７８】
表６：本試験で使用したペプチド
【表６Ａ】
2007534302.tif 000007
【表６Ｂ】
2007534302.tif 000008
【表６Ｃ】
2007534302.tif 000009
【表６Ｄ】
2007534302.tif 000010
【表６Ｅ】
2007534302.tif 000011
【０２７９】
結果
各応答性ペプチドプール内の免疫原性エピトープの同定
応答性ペプチドプールの個別エピトープマッピングをＩＦＮ−γによって実施した。
【０２８０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、各プールからの重複ペプチドを用いて実施した（図１３を参照）。図１３は、全ｇｐｎ配列をカバーするペプチドプールおよび重複ペプチドフラグメントに対して誘発されたＩＦＮ−γ応答を示している（マーカーを用いて）。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ２d；ｎ＝４マウス）の群にＭＶＡ．ｇｐｎの１×１０6ｐｆｕ（プラーク形成単位）を用いる静脈内投与により免疫した。１４日後、マウスを１×１０6ｐｆｕのＦＰ９．ｇｐｎの静脈内投与により追加刺激した。追加刺激の１４日後、脾臓を切除し、プールし（ｎ＝４片の脾臓）、そして脾細胞１０6ｃｅｌｌｓ当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。列は、ＳＦＣ／１０6の数を表している。
【０２８１】
これをまとめると、これらの結果は、応答性ペプチドプール内で以下の個別ペプチドが同定されたことを示している。
ペプチドプールｇａｇ１では、
ペプチド７：ＮＴＶＧＧＨＱＡＡＭＱＭＬＫＥＴＩ
ペプチド８：ＡＡＭＱＭＬＫＥＴＩＮＥＥＡＡＥＷＤＲＬ
ペプチド１５：ＧＥＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ
ペプチドプールｐｏｌ１では、ペプチド５０：ＬＫＥＰＶＨＧＶＹＹＤＰＳＫＤＬＩＡＥＩ
ペプチドプールｐｏｌ２では、ペプチド６６：ＫＱＷＰＬＴＥＥＫＩＫＡＬＶＥＩＣＴＥＭ
ペプチド８５：ＴＫＩＥＥＬＲＱＨＬＬＲＷＧＦＴＴＰＤＫ
ペプチドプールｎｅｆ２では、ペプチド１１８：ＥＰＡＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＹＰＹＤＶ
【０２８２】
ｎｅｆ２内の下線付きの配列は、ＩＦＮ−γ応答を誘導する手段を提供するために追加されたレポーターエピトープに一致する。最後から２番目のペプチドである１１８におけるこの応答は、全ＧＰＮポリプロテインが発現していることを示している。しかしペプチドプールｎｅｆ２内で検出されたＩＦＮ−γ応答は、天然ｎｅｆに由来するエピトープ配列が原因ではなく、挿入されたレポーターエピトープに起因する応答であった。実施例８は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に対するｎｅｆにおいて極めて少数のＣＤ８+Ｔ細胞エピトープしか含有していないので、ｎｅｆにおける応答の欠如は驚くことではない。
【０２８３】
同定されたペプチド特異的ＩＦＮ−γ応答を誘発する原因となるＴ細胞サブセットの決定
図１４は、ｇｐｎ配列から選択したペプチドに対して誘発されたＩＦＮ−γ応答を示している。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ２d；ｎ＝４マウス）の群にＭＶＡ．ｇｐｎの１×１０6ｐｆｕ（プラーク形成単位）を用いる静脈内投与により免疫した。１４日後、マウスを１×１０6ｐｆｕのＦＰ９．ｇｐｎの静脈内投与により追加刺激した。追加刺激の１４日後に、脾臓を切除し、プールし（ｎ＝４片の脾臓）、そして未処置のままとするか、上述のようにＣＤ４+細胞を枯渇させるか、あるいはＣＤ８+細胞を枯渇させた。脾臓細胞１０6ｃｅｌｌｓ当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。列は、ＳＦＣ／１０6の数を表している。
【０２８４】
ＣＤ４+細胞枯渇試験は、ペプチド１５および６６を用いたエックスビボ刺激後のＩＦＮ−γ分泌の劇的な減少を証明したが、他方ペプチド１１８を用いた刺激後には中等度の減少が観察された。これらの所見は、ＣＤ４+Ｔ細胞がペプチド１５、６６および１１８に対するＩＦＮ−γ応答を誘発することを示唆している（図１４を参照）。
【０２８５】
ＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇後には、ペプチド７、５０、８５および１１８に対するＩＦＮ−γ応答における部分的減少が観察された。これらのペプチドに対して観察されたＩＦＮ−γ応答における部分的減少は、それらがＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介されることを指摘している（図１４）。
【０２８６】
同定されたエピトープに一致する配列と他の報告されたエピトープの比較
本試験で同定されたペプチド配列が以前に定義されているかどうかを決定するために、それらをＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶ配列データベース（マウス；実施例８を参照（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｈ２d））内の配列と比較した。
【０２８７】
ペプチド７、８、１５および１１８に対応する配列内のエピトープは実施例８によってＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて以前に同定されているが、他方ペプチド５０、６６およびペプチド８５に対応する配列内のエピトープは以前に報告されていない。
【０２８８】
この報告書に記載された全７種のペプチドに対応する配列内のエピトープは、表７に示すようにヒトＨＩＶ感染者において免疫原性であると同定されている。
【０２８９】
表７：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶデータベース検索の結果。
【表７】
2007534302.tif 000012
【０２９０】
これらの試験は、ＭＶＡ．ｇｐｎおよびＦＰ９．ｇｐｎを用いた異種プライム・ブースト免疫レジメンがＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｇｐｎ分子のｇａｇおよびｐｏｌ領域に対して強力なＣＤ４+およびＣＤ８+ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞応答を誘発することを指摘している。ＢＬＡＢ／ｃマウスを用いて以前に実施された試験と共通して、ｎｅｆ分子内では、免疫原性エピトープは同定されなかった。
【０２９１】
上記の明細書で言及した全ての出版物は、参照して本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法および系の様々な修飾および変化は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに当業者には明白である。本発明は特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、本明細書で請求する本発明はそのような特定の実施形態へ不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、生化学および生物工学または関連分野における当業者には明白である本発明を実施するための記載した様式の様々な修飾は添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【実施例８】
【０２９２】
タンパク質毎にプロットしたＣＴＬエピトープの所在位置のマップ
本実施例では、ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２：Ｍａｐｓ  ｏｆ  ＣＴＬ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｌｏｔｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ  ７，２００３にしたがった好ましいＣＴＬエピトープを提示する。２２アミノ酸長未満の線状ＣＴＬエピトープを示す。さらにまた、好ましいＴヘルパーエピトープのＴヘルパーエピトープマップも示す。
【０２９３】
【表８】
2007534302.tif 000013
【表９】
2007534302.tif 000014
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
2007534302.tif 000021
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
2007534302.tif 000033
【表２９】
2007534302.tif 000034
【表３０】
2007534302.tif 000035
【表３１】
2007534302.tif 000036
【表３２】
2007534302.tif 000037
【表３３】
2007534302.tif 000038
【表３４】
2007534302.tif 000039
【表３５】
2007534302.tif 000040
【表３６】
2007534302.tif 000041
【表３７】
2007534302.tif 000042
【表３８】
2007534302.tif 000043
【表３９】
2007534302.tif 000044
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】好ましいｇｐｎ遺伝子構築物を示す図である。配列は連続し、本明細書では明確にする目的でのみ分けられている。太字は、ＧＰＮ配列とＨＩＶ分子免疫学的配列との配列変化を指摘している（注意：そのような配列変化全てが示されている訳ではない）。
【図２】ＭＨＣクラスＩＩエピトープ比較のために使用したスクランブルおよび天然ｎｅｆ遺伝子配列を示す図である。
【図３】スクランブルｎｅｆ（図３Ａ）および天然ｎｅｆ（図３Ｂ）についてのＴヘルパーエピトープを示す図である。
【図４】ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆを発現する組換え鶏痘系統ＦＰ９を構築するための、組換えプラスミドｐ２９Ｄ．ｇｐｎのマップを示す図である。
【図５】ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆを発現する組換えＭＶＡを構築するための、組換えプラスミドｐＯＰＫ６．ｇｐｎのマップを示す図である。
【図６】ＧＰＮの配列を示す図である。ＧＰＮ配列は通常の文字で示されている。上流領域は斜体で示されている。５末端ＡｐａＩおよび３末端ＡｓｃＩ部位には下線が付けられている。開始ＡＴＧおよび終止ＴＧＡは太字で示されている。
【図７】実施例３に記載したＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔの棒グラフである。
【図８】実施例５に記載したＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔの棒グラフである。
【図９】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて使用した重複している２０ｍｅｒペプチドを示す図である。アミノ酸長は括弧内に示されている。
【図１０】実施例４の第４群の動物におけるＧＡＧ特異的応答の棒グラフである。
【図１１】実施例４の第４群の動物におけるＰＯＬ特異的応答の棒グラフである。
【図１２】実施例４の第４群の動物におけるＮＥＦ特異的応答の棒グラフである。
【図１３】ＩＦＮ−γ応答の棒グラフである。
【図１４】ｇｐｎ配列から選択したペプチドに対して誘発されたＩＦＮ−γ応答の棒グラフである。
【図１】
2007534302.tif 000045
【図２】
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【図３Ａ】
2007534302.tif 000047
【図３Ａ】
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【図３Ａ】
2007534302.tif 000049
【図３Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2007534302.tif 000059
【図６】
2007534302.tif 000060
【図７】
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【図８】
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【図９】
2007534302.tif 000063
【図１０】
2007534302.tif 000064
【図１１】
2007534302.tif 000065
【図１２】
2007534302.tif 000066
【図１３ａ−ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４】
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【配列表】
2007534302000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月21日(2007.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物と、
（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物と、
（ｉｉｉ）ＨＩＶ  ｎｅｆ遺伝子産物と
に由来するアミノ酸配列を含み、
前記配列が、前記遺伝子産物の天然配列に関して突然変異し、前記配列が、前記遺伝子産物の天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てを保持し、前記ポリペプチドは配列番号９の全長と少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記遺伝子産物の天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）ならびにｎｅｆに規定されたとおりである、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号９の全長と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記配列同一性が、エピトープ間配列同一性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号９を含む、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記遺伝子産物の天然型Ｔヘルパーエピトープの実質的に全てが保持されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記遺伝子産物の天然型Ｔヘルパーエピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）ならびにｎｅｆに規定されたとおりである、請求項６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドがＨＩＶのｎｅｆ遺伝子産物に由来するアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチド配列が前記ｎｅｆ配列の機能を破壊するために突然変異し、前記ｎｅｆ配列が天然型ｎｅｆ遺伝子内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項９】
天然型ｎｅｆ配列内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープが、図３Ａに示されているものである、請求項８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
天然型ｎｅｆ配列内には存在しない１つ以上のＴヘルパーエピトープが、図３Ａに示されていて、図３Ｂには存在しないものである、請求項８または請求項９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１１】
ｎｅｆ遺伝子産物の全ての天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１２】
前記ｎｅｆ遺伝子産物の天然型ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが実施例８に規定したとおりである、請求項１１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
全ての天然型ｎｅｆヒトＴヘルパーエピトープをさらに含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
前記天然型ｎｅｆヒトＴヘルパーエピトープが、実施例８に規定したとおりである、請求項１３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列、または配列番号６に示すアミノ酸配列に対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドがＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチドがｐｏｌ配列の逆転写酵素活性を破壊するように突然変異し、前記天然型ｐｏｌ配列のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てが前記組換えポリペプチド内に保持されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
前記天然型ｐｏｌ配列のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すＲＴのアミノ酸１〜４４０（ｐｏｌ）に規定されたとおりである、請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記ｐｏｌ配列の逆転写酵素活性が、前記天然型ｐｏｌ遺伝子の中心に由来する内部配列の重複ならびに前記ｐｏｌ配列のアミノ末端およびカルボキシ末端部分の置換によって突然変異している、請求項１６または１７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
前記重複した内部配列がＴＰＤＫＫＨＱＫＥＰＰＦ（配列番号４）を含む、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号１２に示すアミノ酸配列、または配列番号１２に示すアミノ酸配列に対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、請求項１８または請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物由来のアミノ酸配列を含み、前記組換えポリペプチド配列が前記ｇａｇ遺伝子産物のプロセッシングを破壊するように突然変異し、前記ｇａｇ配列が破壊されたミリストイル化部位をさらに含み、前記天然型ｇａｇ配列のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの実質的に全てが前記組換えポリペプチド内に保持されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
前記天然型ｇａｇ配列のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、実施例８に示すｐ１７およびｐ２４（ｇａｇ）に規定されたとおりである、請求項２１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
ｇａｇの前記プロセッシングがｐ１７およびｐ２４ドメインを置換することによって破壊されており、前記ミリストイル化部位が第２のグリシンからアラニンへの突然変異によって破壊されている、請求項２１または２２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、配列番号１２に示すアミノ酸配列、または配列番号１２に示すアミノ酸配列に対する少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
抗体認識タグをさらに含み、前記タグが配列番号８に示す配列を含むＨＡタグである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープタグをさらに含み、前記タグが配列番号７に示す配列を含むｇｐ１６０に由来するタグである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが配列番号１に示す配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２８】
前記ＨＩＶがクレードＢ  ＨＩＶである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項３０】
配列番号１１を含む組換え核酸配列、または遺伝子コードに関してサイレント突然変異しか相違していない配列、または配列番号１１を含む組換え核酸配列に対する少なくとも９５％同一性を有する配列。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、アルファウイルス、ＶＳＶ、ＨＳＶおよびセンダイウイルスからなる群から任意に選択されるウイルスベクター。
【請求項３２】
前記ベクターがＭＶＡもしくはＭＶＡ由来ベクターである、請求項３１に記載のウイルスベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが鶏痘もしくは鶏痘由来ベクターである、請求項３１に記載のウイルスベクター。
【請求項３４】
前記ベクターがＦＰ９鶏痘ベクターである、請求項３３に記載のウイルスベクター。
【請求項３５】
請求項２９もしくは３０に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸ベクター。
【請求項３６】
請求項２９もしくは請求項３０に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター。
【請求項３７】
請求項２９もしくは請求項３０に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクター。
【請求項３８】
医薬における請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３９】
ＨＩＶ感染症を治療または予防するための医薬の調製における、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４０】
ＨＩＶ感染症に対する免疫化のための医薬の調製における、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４１】
医薬における請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の核酸またはベクターの使用。
【請求項４２】
ＨＩＶ感染症を治療または予防するための医薬の調製における、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の核酸またはベクターの使用。
【請求項４３】
ＨＩＶ感染症に対する免疫化のための医薬の調製における、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の核酸またはベクターの使用。
【請求項４４】
ＨＩＶ感染症に対して被験者を免疫する方法であって、前記被験者へ請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを投与するステップを含む方法。
【請求項４５】
プライム・ブースト免疫処方における初回抗原刺激剤または追加刺激剤としての、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２９〜３７のいずれかに記載の核酸もしくはベクターの使用。
【請求項４６】
免疫応答の誘導における請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターの使用。
【請求項４７】
前記免疫応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、および体液性応答からなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
被験者において免疫応答を誘導する方法であって、前記被験者へ請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを投与するステップを含む方法。
【請求項４９】
前記免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、および体液性応答からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
配列番号９に示すアミノ酸配列の全長の少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【請求項５１】
請求項２９もしくは請求項３０に記載の核酸配列を含む、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター。
【請求項５２】
添付の図面を参照して本明細書に実質的に記載された組換えポリペプチド、組換えポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
【国際調査報告】
2007534302.tif 000078
2007534302.tif 000079
2007534302.tif 000080
2007534302.tif 000081
2007534302.tif 000082