(57)【要約】  本発明は、短い化学的に修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、およびゲノムミクス用途におけるかかるマイクロアレイの使用に関する。より具体的には、本発明は、表面および多数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイを提供し、ここで、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが２’ＯＨ位に少なくとも１個の修飾糖部分を有する。さらに具体的には、本発明のマイクロアレイは、低分子ＲＮＡの検出に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾糖部分を有する、表面および多数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２】
前記糖部分の２’−ＯＨ基が置換されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項３】
前記糖部分が、２’位に、Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルが、非置換または置換Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニル、アルキニルまたはアルコキシアルキルであり得る）、Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換Ｃ１からＣ１０低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項４】
前記糖部分が、２’−ＭＯＥ、２’−ＤＭＡＯＥ、２’−メトキシまたは２’−アミノプロポキシを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項５】
該オリゴヌクレオチドが、約１５から５０ヌクレオチド長を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０個の修飾糖部分を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドアレイが、少なくとも５０％の修飾糖部分を有するオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１から６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項８】
該オリゴヌクレオチドアレイが、短い哺乳動物ＲＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項９】
該オリゴヌクレオチドが、短いヒトＲＮＡと特異的にハイブリダイズする、請求項８記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１０】
該オリゴヌクレオチドアレイが、生物の所定の器官、組織または細胞の低分子ＲＮＡの包括的な検出のためのものである、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１１】
該オリゴヌクレオチドが前記表面と非共有結合している、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１２】
該オリゴヌクレオチドアレイが、１個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドアレイを、エバネセント波センサ基板に用いることができる、請求項１から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１４】
（ａ）生物学的試料を提供する工程（ここで、該試料は短いＲＮＡを含む）；（ｂ）該試料を、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程；（ｃ）短い内生ＲＮＡと前記アレイ中のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応を行う工程を含む、短いＲＮＡの検出のための方法。
【請求項１５】
（ａ）生物学的試料を提供すること（ここで、該試料は短いＲＮＡを含む）；（ｂ）該試料を、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイと接触させること（ここで、該アレイは短いＲＮＡの検出に適する所定の配列セットを含む）；（ｃ）得られるハイブリダイゼーションパターンを標準ハイブリダイゼーションパターンと比較することを含む、生物学的試料を生物学的状態と関連付ける方法。
【請求項１６】
該短いＲＮＡが、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料が健康状態と関連がある、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）生物学的試料を提供すること、（ｂ）短いＲＮＡの検出に有用な定義された配列セットに対応する請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドアレイを接触させること、（ｃ）ハイブリダイゼーションパターンを得ること、（ｄ）該ハイブリダイゼーションパターンと標準ハイブリダイゼーションパターンを比較すること（ここで、特定のパターンの存在または不存在は、疾患を発症する可能性または疾患の存在の指標である）を含む、疾患の予後診断または診断のための方法。
【請求項１９】
前記生物学的試料がヒト由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が、ガン、神経変性疾患または感染症である、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、短い化学的に修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、およびゲノミクス用途におけるかかるマイクロアレイの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
生体高分子のマイクロアレイは、生物医学研究における有益な手段となっている。マイクロアレイ技術は、マイクロアレイが、費用効果が高くかつ望ましい融通性および品質保証を備えて研究者に提供され得る点で優れている（Barrett J Carl; Kawasaki Ernest S  Microarrays: the use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of gene expression. Drug Discovery Today, 2003, 8, 134−41）。例えば、抗体または酵素アレイを含むタンパク質またはペプチドアレイなどの、様々な型の利用可能な生体高分子アレイを備える多くのマイクロアレイ基板がある。他の利用可能なマイクロアレイ基板を用いるＤＮＡアレイには、その表面に結合するオリゴヌクレオチドプローブの形態により異なるいくつかの型がある：例としては、通常固体支持体表面にスポットされる長いポリヌクレオチドを用いるｃＤＮＡアレイ、アレイ表面にスポットされるかまたは末端結合を介して結合されるどちらかの長い（例えば、４０−８０ヌクレオチドの）オリゴヌクレオチド、およびインサイチュウで合成される短い（例えば、２５−ヌクレオチド（ｎｔ）の）オリゴヌクレオチド（例えば、アフィメトリクス社）から構成されるＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイが含まれる。実験手段としてのＤＮＡマイクロアレイの能力は、相補的塩基対合による特異的分子認識に依存し、それはＤＮＡマイクロアレイを高性能の遺伝子発現の同時分析に非常に有用であるようにする。ポストゲノム時代において、マイクロアレイは、発現プロファイリング、一塩基多型（ＳＮＰ）検出、ＤＮＡシークエンシングおよび大規模な遺伝子型解析などの多くのハイブリダイゼーションに基づくアッセイの発展に重要な手段となっている。
【０００３】
近年、真核細胞は、約１８から約２５ヌクレオチドの短いＲＮＡを多く含むことが発見された。かかる短いＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のエフェクター、または転写後段階での遺伝子発現の調節因子として作用する。ＲＮＡｉは、長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを、２０から２３ヌクレオチドの短い干渉ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に変換することに基づく、進化的に保存された過程であり、それは標的ｍＲＮＡの分解を介して遺伝子を沈黙させる。他の短いＲＮＡには、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）（ｍｉＲＮＡのより大きな群の下位集団）が含まれ、それらは、内生的にコードされたヘアピン前駆体（７０から１００ヌクレオチドまたはそれ以上）から一本鎖の１８から２５ヌクレオチドＲＮＡとして加工され、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲへの塩基対形成を介する翻訳抑制により機能するように見える（Lau N C; Lim L P; Weinstein E G; Bartel D P; Science (2001), 294, 858−62）。
【０００４】
約２００の異なるｍｉＲＮＡが、これまでに植物、線虫、ショウジョウバエおよび哺乳動物にて同定されているが、ｓｔＲＮＡであるｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７のみが、線虫の幼虫生長にて翻訳レベルで遺伝子発現のタイミング調節を制御することが十分に立証されている。脊椎動物にて、多くのｍｉＲＮＡの発現は、重要な生長特異的パターンまたは組織特異的パターンを有するが、現在のところ、ほんの少しの機能のみしか立証されていない。ｍｉＲＮＡの数および多様性が増え続けていることは（Lim, Lee P.; Glasner, Margaret E.; Yekta, Soraya; Burge, Christopher B.; Bartel, David P. Vertebrate microRNA genes. Science  2003, 299, 1540）、ｍｉＲＮＡが、生長のタイミング以外の様々な経路に重要な役割を果たすことを主張する。このことは、ショウジョウバエにてｍｉＲＮＡが、細胞死および増殖の制御に関与し、そして正常な脂質代謝に必要であるという発見により支持される（Xu et al., 2003; see Current Biol. 13, 790−795 (2003); Brennecke et al., 2003 (Cell 113, 25−36 (2003)）。さらに、ｍｉＲＮＡは、ヒト疾患に関連するようである。ショウジョウバエにて行われた最近の研究は、ＲＮＡｉ／ｍｉＲＮＡ経路と、脆弱Ｘ症候群（精神遅滞の最も一般的な遺伝型）に影響するヒトタンパク質ＦＭＲ１の相同体であるタンパク質ｄＦＭＲ１を関連付けている（Caudy, Amy A.; Myers, Mike; Hannon, Gregory J.; Hammond, Scott M. Fragile X−related protein and VIG associate with the RNA interference machinery.  Genes ＆ Development 2002, 16, 2491−2496）。加えて、染色体１３ｑ１４に位置する２個のｍｉＲＮＡが、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の大多数で欠失または下方制御されることが分かっている（Calin George Adrian et al.; PNAS 2002, 99, 15524−9）。
【０００５】
生物学的過程における短いＲＮＡの役割、特に疾患におけるそれらの役割を明らかにするために、短いＲＮＡの検出のための手段が必要とされる。かかる手段は、理想的には、真核細胞にて様々な短いＲＮＡの同時分析を可能とすべきである。しかしながら、短い長さおよび少ない量のため、かかるＲＮＡの分析は、現在利用可能な手段では困難であり、かつ多大な時間を要する。本発明はここに、短いＲＮＡの検出を可能とし、よって、短いＲＮＡの役割および機能の解明に特に有用な新しい手段を提供する。本開示内容に鑑みて当業者には明らかであるように、この手段の適用は、短いＲＮＡの検出および分析に限定されず、核酸の検出または分析全般に用いることができる。
【０００６】
発明の概要
第一の局面にて、本発明は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾糖部分を有する、表面および多数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイを提供する。１つの態様にて、該オリゴヌクレオチドの糖部分の２’−ＯＨ基は、置換される。好ましくは、該糖部分は、２’位に、Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルが、置換または非置換Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニル、アルキニルまたはアルコキシアルキルであり得る）、Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換Ｃ１からＣ１０低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノを含む。
【０００７】
好ましい態様にて、該糖部分は、２’−ＭＯＥ、２’−ＤＭＡＯＥ、２’−メトキシまたは２’−アミノプロポキシを含む。
もう１つの局面にて、本発明は、（ａ）生物学的試料を提供する工程（ここで、該試料は短いＲＮＡを含む）；（ｂ）該試料を本発明のオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程；（ｃ）短い内生ＲＮＡと前記アレイ中のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応を行う工程を含む、短いＲＮＡの検出のための方法を提供する。
【０００８】
さらなる局面にて、本発明は、（ａ）生物学的試料を提供すること（ここで、該試料は短いＲＮＡを含む）；（ｂ）該試料を本発明のオリゴヌクレオチドアレイと接触させること（ここで、該試料は短いＲＮＡの検出に適する所定の配列セットを含む）；（ｃ）得られるハイブリダイゼーションパターンと標準ハイブリダイゼーションパターンを比較することを含む、生物学的試料を生物学的状態と関連付ける方法を提供する。
【０００９】
もう１つの局面にて、本発明は、（ａ）生物学的試料を提供すること、（ｂ）短いＲＮＡの検出に有用な定義された配列セットに対応する本発明のオリゴヌクレオチドアレイを接触させること、（ｃ）ハイブリダイゼーションパターンを得ること、（ｄ）該ハイブリダイゼーションパターンと標準ハイブリダイゼーションパターンを比較すること（ここで、特定のパターンの存在または不存在は、疾患を発症する可能性または疾患の存在の指標である）を含む、疾患の予後診断または診断のための方法を提供する。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、７個のＲＮＡ試料と１ＭＭおよび２ＭＭのキャプチャープローブとのハイブリダイゼーションが示す強度値を、個々のマッチ配列から得られた強度に標準化したものである。強度を、密度（平均）−バックグラウンド（平均）として定義する。Ｃｙ５標識ＲＮＡとハイブリダイズしたＭＯＥプローブでの改善されたミスマッチ識別力が、ハイブリダイゼーション温度を３７℃から４２℃に上げることで得られた。同じ条件下、同じ長さの標準ＤＮＡプローブは、全くシグナル強度を示さなかった。
【００１１】
発明の詳しい説明
本明細書中に引用されるすべての特許出願、特許および文献は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【００１２】
本発明は、高い感受性および選択性を有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供し、それは短い核酸分子の検出に特に有用である。今までのところ、短いＲＮＡなどの短い核酸の検出および分析は、かかる核酸の長さが短く、かつ存在量が少ないために困難であることが分かっている。現在利用可能なヌクレオチドマイクロアレイは、それらの感受性および／または選択性が短いＲＮＡの検出には弱すぎるため適した手段ではない。これに対して、本発明は、短いオリゴヌクレオチド、特に短いＲＮＡの検出に特に適するオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供する。
【００１３】
本明細書中に用いる、用語“オリゴヌクレオチド”および“オリゴリボヌクレオチド”は同義的に用いられ、リボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基からなるポリマーを意味する。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド残基の両方から成るポリマーもまた、本発明に従って“オリゴヌクレオチド”および“オリゴリボヌクレオチド”の意味する範囲内にある。
【００１４】
本明細書中、以下に同義的に用いられる用語“オリゴヌクレオチドアレイ”または“アレイ”または“マイクロアレイ”は、硬い表面に別の既知の位置で結合する多数のオリゴヌクレオチドを有する少なくとも１個の表面を備える基板、好ましくは固体の基板を示す。オリゴヌクレオチドアレイは一般に、１ｃｍ２に対して少なくとも１００個のオリゴヌクレオチドの密度を有する。ある態様にて、前記アレイは、１ｃｍ２に対して、少なくとも約５００、少なくとも１０００、少なくとも１００００、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７個のオリゴヌクレオチドの密度を有する。
【００１５】
第一の局面にて、本発明は、表面および多数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイに関し、ここで該オリゴヌクレオチドアレイは、少なくとも１個の修飾糖部分を有する少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（以下、修飾オリゴヌクレオチドと称する）を含む。好ましくは、前記オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも５個、または少なくとも１０個の修飾糖部分を含む。特定の態様にて、オリゴヌクレオチドのすべての糖部分は修飾されているか、または他のさらなる好ましい態様にて、オリゴヌクレオチドの１、２、３または４個の糖部分以外のすべては、修飾されている。前記オリゴヌクレオチドアレイは一般に、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の修飾糖部分を含むオリゴヌクレオチドを含む。特に好ましい態様にて、オリゴヌクレオチドアレイは、１００％修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、１個またはそれ以上の修飾糖部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様にて、前記糖部分は、糖部分の２’−ＯＨ基にて修飾される。様々な２’−ＯＨ置換基が当技術分野で公知である（Uhlmann, Eugen. Recent advances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides. Current Opinion in Drug Discovery & Development (2000), 3(2), 203−213、およびUhlmann, Eugen; Peyman, Anusch. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chemical Reviews (Washington, DC, United States) (1990), 90(4), 543−84に記載の修飾を参照のこと）。他の好ましい態様にて、糖部分の４’−Ｃは修飾されておらず、より好ましい態様にて、前記オリゴヌクレオチドには、構造的にロックされた核酸（locked nucleic acid）は含まれない（ＬＮＡ、例えば（Rajwanshi, Vivek K.et al; The eight stereoisomers of LNA (locked nucleic acid): a remarkable family of strong RNA binding molecules. Angewandte Chemie, International Edition (2000), 39(9), 1656−1659）を参照のこと）。
【００１７】
本発明に従い、好ましい修飾糖部分には、２’位に以下：Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アリール；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルのうち１つが含まれ、ここで前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルが、置換または非置換Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。他の好ましいオリゴヌクレオチドには、その糖部分の２’位に、以下：低級アルキル、置換Ｃ１からＣ１０低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノのうち１個またはそれ以上が含まれる。他の好ましい態様にて、前記修飾糖部分には、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン結合は含まれない。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、および／またはＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは、１から約１０である）で置換される糖部分が、特に好ましい。他の好ましい修飾には、アルコキシアルコキシ基、特に２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２  ＣＨ２  ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチルまたは２’−ＭＯＥとしても公知）が含まれる（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486−504）。さらに好ましい修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥ、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２  ＣＨ２  ＣＨ２  ＮＨ２）としても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基が含まれる。当業者は、かかる修飾糖構造を作製するために常套法を用いることができる。かかる修飾糖構造の製造を教示する代表的な米国特許には、米国特許番号第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，７００，９２０号および第５，９６９，１１６号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書中に含まれる）が含まれるが、それらに限定されない。
【００１８】
所定の化合物のすべての位置が一様に修飾される必要はなく、実際に、２以上の上記の修飾が、単一の化合物にかまたはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドのときでさえ組み込まれ得る。本発明はまた、キメラオリゴヌクレオチドを含む。本発明の文脈中、“キメラ”オリゴヌクレオチドとは、それぞれ少なくとも１個のモノマー単位からなる２個またはそれ以上の化学的に異なる部位を含むオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドは、例えば、上記のような１個またはそれ以上の修飾糖部分を有するヌクレオチド部位、およびデオキシリボヌクレオチド部位を含み得る（Lima, Walt F.; Crooke, Stanley T; Biochemistry (1997), 36(2), 390−398）。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖部分の２’位の修飾に加えて、さらに他の修飾を含み得る。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、骨格に修飾を有し得る。様々な骨格修飾は、当技術分野で公知であり、かかる修飾には、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミデートなどが含まれる（Uhlmann, Eugen. Recent advances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides. Current Opinion in Drug Discovery & Development (2000), 3(2), 203−213、およびUhlmann, Eugen; Peyman, Anusch. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chemical Reviews (Washington, DC, United States) (1990), 90(4), 543−84に記載の修飾を参照のこと）。
【００１９】
本発明に従うオリゴヌクレオチドアレイのオリゴヌクレオチドは一般に、約１０から１００ヌクレオチド長を有する。好ましくはその長さは、約１２から５０ヌクレオチド、より好ましくは１５から３０ヌクレオチドである。特に好ましい態様にて、オリゴヌクレオチド長は、１８から２５ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドアレイのオリゴヌクレオチドが同じ長さを有する必要はないが、本発明によるオリゴヌクレオチドアレイは一般に、類似のまたは同じ長さの多数のオリゴヌクレオチドを含む。
【００２０】
“遺伝子チップ”としても公知のオリゴヌクレオチドアレイが、当技術分野で記載されている。前記オリゴヌクレオチドアレイは通常、オリゴヌクレオチドが結合し得る少なくとも１個の表面を有する固体の基質を含む。基質は、ガラス、ＳｉＯ２、石英、Ｓｉなどの無機物から形成され得る。あるいは、基質は、ポリマー、好ましくはポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはポリウレタン（ＰＵ）などの有機物から形成され得る。一例にて、前記基質は、ガラスから形成される。前記表面は、前記基質と同じかまたは異なる物質から構成され得る。前記基質およびその表面はまた、好適な光吸収特性を供するように選択され得る。好ましい態様にて、前記基質および／または前記表面は、要すれば光透過性である。他の好ましい態様にて、前記基質は、光透過層を含む。その光透過層は、無機物から形成され得る。あるいは、それは有機物から形成され得る。一例にて、光透過層は、Ｔａ２Ｏ５、ＴｉＯ２、Ｎｂ２Ｏ５、ＺｒＯ２、ＺｎＯまたはＨｆＯ２などの金属酸化物である。光透過層は、非金属である。
【００２１】
特に好ましい態様にて、オリゴヌクレオチドアレイを、ＷＯ０１／０２８３９に記載のとおりにエバネセント波センサ基板上に置く。従って、試料分析に用いるためのセンサ基板は、例えば、基質の一方の表面に形成された、屈折率（ｎ１）を有し、薄く、光透過層の光透過性基質を含み得、該層は、（ｎ１）より大きな屈折率（ｎ２）を有し、該基板は１個または多数の検出領域または部位（各々１個または多数のキャプチャー成分のため）を規定する周期的な溝を含む１個または多数のコルゲート構造をそこに組み込まれており、該溝は、ａ）該基板上に入射するコヒーレント光が、個々の光線または回折次数で回折され、その干渉は、透過ビームの減少および入射光線の異常に高い反射をもたらし、それ故に、１つまたは多数の検出領域の表面に増大されたエバネセント場を生じるように；または、ｂ）該基板上に入射するコヒーレント光および直線偏光が、個々の光線または回折次数で回折され、その干渉は、透過ビームのほとんど完全な遮光および入射光線の異常に高い反射をもたらし、それ故に１個または多数の検出領域の表面に増大されたエバネセント場を生じるように、描かれ、寸法を測られかつ配向を合わせられている。
【００２２】
オリゴヌクレオチドアレイを、化学的にインサイチュウでオリゴヌクレオチド合成することにより形成することができる。本方法にて、前記オリゴヌクレオチドを、例えば機械的合成法または光特異的合成法を用いて基質の表面に直接合成し、その方法は、例えばＷＯ９０／０３３３８２またはＷＯ９２／１００９２に記載のとおりのフォトリソグラフィー法とオリゴヌクレオチド固相合成法との組合せ、またはＷＯ９８／２７４３０に記載のとおりの非常に大規模な固定化ポリマー合成法（ＶＬＳＩＰＳ）を利用してよい。
【００２３】
あるいは、天然または合成起源のオリゴヌクレオチドを、例えば、圧電アクチュエーター、電磁アクチュエーター、圧力／電磁弁アクチュエーターまたは他の力変換器を有するインクジェットプリンター、熱電アクチュエーター、レーザーアクチュエーター、リングピンプリンターまたはピンツールスポッターを使用するバブルジェットプリンターを含む様々な技術を用いてチップにスポットすることができる。（Heller MJ (2002) Annu Rev Biomed Eng; 4:129−53）。前記オリゴヌクレオチドを、基質の表面に共有結合することができる。かかる共有結合は一般に、表面の活性化、および／または官能基／反応基を有する核酸分子の修飾を必要とする。その固定化はまた、化学または光化学リンカーによっても達成され得る（ＷＯ９８／２７４３０およびＷＯ９１／１６４２５）。かかる技術は既知であり、当業者に明らかであろう。反応基または光反応基は、基板の表面に結合することができ、それは、さらなる反応工程のための固定基としての役割を果たす。あるいは、前記オリゴヌクレオチドは、例えば、正電荷の表面フィルム上への静電気的吸着などの非共有結合により表面に結合され得る。本発明の好ましい態様にて、オリゴヌクレオチドは、表面と非共有結合する。基板をより疎水性にするための炭化水素鎖を提供する官能基性有機分子を用いることができ、基板をより親水性にするために極性基を用いることができ、またはイオン基あるいは可能性のあるイオン基を、電荷をもたらすために用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体を、基板を親水性にするために用いることができ、それは、タンパク質の基板／表面への非特異的な吸着を妨げる。
【００２４】
検出可能シグナルを得るために、試料の核酸を標識することができる。オリゴヌクレオチドの検出に適するいずれかの標識を用いることができる。例えば、放射性同位体、化学発光標識、生物発光または熱量測定標識を用いることができる。好ましい態様にて、発光標識を用いることができる。用いることのできる発光色素には、ランタニド複合体が含まれるが、それに限定されず（Kricka LJ (2002) Stains, labels and detection strategies for nucleic acids assays. Ann Clin Biochem; 39(Pt 2):114−29）、そしてそれはオリゴヌクレオチドに化学的または物理的に結合され得る。より好ましい態様にて、前記マーカーは、蛍光標識である。フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオロＸなどの、多くの好ましい蛍光プローブが知られている。当然のことながら、異なるスペクトルを有する異なる蛍光プローブを、異なるプローブを区別するために用いることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドアレイのオリゴヌクレオチドを、上記の標識などの適した標識で標識することができる。
【００２５】
試料の核酸（“プローブ”）および前記オリゴヌクレオチドアレイの適したオリゴヌクレオチドはハイブリダイズし得、すなわち、相補的配列の非共有結合が適した条件下で生じ得る。前記配列は、完全に相補的であることが好ましいが、ハイブリダイゼーション条件に依存して変化し、１、２、３、４または５個のミスマッチを有する配列でもハイブリダイズし得る。適するハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で公知であるかまたは実験的に決定することができる。反応の特異性および反応速度に影響を与えることがよく知られているパラメーターには、塩条件、溶媒のイオン組成、ハイブリダイゼーション温度、オリゴヌクレオチドマッチ配列の長さ、グアニンおよびシトシン（ＧＣ）含量、ハイブリダイゼーション促進剤の存在、ｐＨ、マッチ配列に見られる特異的塩基、溶媒条件、および有機溶媒の添加が含まれる。例えば、高ストリンジェンシーの条件について、ミスマッチがほんの少しかまたはない核酸がハイブリダイズするためには、塩濃度を一般に低くするほうが良い。通常、高ストリンジェンシー条件としては、約１モル以下、たいてい約７５０ミリモル以下、通常約５００ミリモル以下の塩濃度を用いることができ、約２５０または１５０または１５ミリモルまで低くても良い。用いる一般的な塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である；しかしながら、他の無機塩、例えば、ＫＣｌ、またはテトラアルキルアンモニウム塩を用いることができる。低ストリンジェンシー条件について、望ましいストリンジェンシーハイブリダイゼーションにより、塩濃度は、約３ミリモル以下、好ましくは２．５ミリモル以下、２ミリモル以下、またはより好ましくは約１．５ミリモル以下であり得る。ハイブリダイゼーションの反応速度およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーはまた、ハイブリダイゼーションを行う温度に依存して変化する。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの温度は、一般に、低温、例えば、約１５℃または２０℃から約２５℃または３０℃の温度であり得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションが必要なときは、ハイブリダイゼーションを行う温度は一般に高温であり得る。例えば、少なくとも３７℃、少なくとも４２℃、少なくとも４８℃、または少なくとも５６℃の温度を用いることができる。高温、例えば、８０℃またはそれ以上を、ストリッピング、すなわち、相補的配列の結合を分離するために用いることができる。ハイブリダイゼーション反応はまた、オリゴヌクレオチドと結合していない核酸を洗浄して取り去る洗浄工程の後に行うことができる。しかしながら、かかる洗浄工程はまた、例えば、エバネセント場により誘導される発光が検出されるときは、省略され得る（ＷＯ０１／０２８３９）。
【００２６】
本発明の好ましい態様にて、前記ハイブリダイゼーション条件は、修飾オリゴヌクレオチド、特にＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドと短いＲＮＡとのハイブリダイゼーションに最適化される。かかる最適化は、実験的に行われ得、かつ当業者に困難なく行われる。温度を、例えば、約３０℃から約６０℃、約３７℃から約６０℃、または約４２℃から約５６℃にすることができる。
【００２７】
どんなハイブリダイゼーションが行われたかの測定に用いる検出方法は、選択する標識に依存して変化し得る。発光は、適するレーザー光源により誘導され得る。発光に好適な検出器には、例えばＣＣＤカメラ、光電子増倍管、アバランシェ・フォトダイオード、複合型光電子増倍管が含まれる。蛍光標識プローブを用いるとき、その検出を共焦点レーザー顕微鏡で行うのが好ましい。シグナルを記録し、好ましい態様にて、コンピューターで、例えば１２ビットのアナログ・ボードからデジタル・ボードまでを用いて分析する。
【００２８】
第二の局面にて、本発明は、短いＲＮＡの検出方法を提供する。本明細書中に用いる用語“短いＲＮＡ”とは、約１５から約３０ヌクレオチド、好ましくは約１８から約２５ヌクレオチドの短いＲＮＡを示す。前記短いＲＮＡには、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは短いヘパリン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または上記のすべての前駆体が含まれるが、それらに限定されない。前記ＲＮＡは、細胞にて内生的に形成され得るが、例えばｓｉＲＮＡなどの細胞にトランスフェクトされたＲＮＡでもあり得る。本発明の発明者らは、本発明に従い、短いＲＮＡ、特に短い内生ＲＮＡが、本発明のオリゴヌクレオチドアレイによりこれまでに知られていた方法および手段よりも高い感受性および特異性で検出され得ることを発見した。
【００２９】
１つの態様にて、本発明は、生物学的試料と本発明のオリゴヌクレオチドアレイを接触させることを含む、短いＲＮＡの検出方法を提供する。生物学的試料を、細胞、組織、器官、体液（例えば、血清、血漿、精液、尿、滑液および髄液など）から誘導することができる。細胞または組織を、特定の性質で選択することもでき、例えば、ガン細胞または組織を、様々な生長段階または病態における細胞または組織について選択することができる。好ましい態様にて、生物学的試料を、哺乳動物、より好ましくは例えばマウスまたはラットなどのげっ歯動物、最も好ましくは、ヒトから誘導する。生物学的試料の核酸を、例えばフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿またはゲル精製などの精製工程により濃縮することができる。好ましい態様にて、試料を短いＲＮＡについて濃縮し、それは、例えば、ゲル精製またはサイズ分画により達成され得る。試料を、希釈せずにかまたは添加溶媒と共にかのどちらかで用いることができる。適する溶媒には、水、水性緩衝液または有機溶媒が含まれる。適する有機溶媒には、アルコール、ケトン、エステル、脂肪族炭化水素、アルデヒド、アセトニトリルまたはニトリルが含まれる。
【００３０】
短いＲＮＡの適した検出方法には、（ａ）生物学的試料を提供する工程（ここで、該試料は短い内生ＲＮＡを含む）；（ｂ）該試料を本発明のオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程；（ｃ）前記アレイにて短い内生ＲＮＡとオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応を行う工程、および要すれば；（ｄ）試料の短いＲＮＡとアレイのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出する工程が含まれる。好ましい態様にて、生物学的試料の短いＲＮＡは、蛍光色素で標識されるのが好ましい。
【００３１】
もう１つの態様にて、本発明の方法を短いＲＮＡの選別に用いる。例えば、短いＲＮＡの検出に有用な定義された配列セットに対応するオリゴヌクレオチドアレイを、正常な細胞または組織試料および疾患細胞または組織と接触させることができる。アレイにてハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのパターンは、組織試料における短いＲＮＡの存在または不存在を示すであろう。故に、正常および疾患細胞または組織に存在する短いＲＮＡのパターンを比較することができ、それにより試料を疾患状態と関連づけることができる。故に、本発明は、（ａ）生物学的試料を提供すること（ここで、該試料は短いＲＮＡを含む）；（ｂ）該試料と本発明のオリゴヌクレオチドアレイを接触させること（ここで、該試料は、短いＲＮＡの検出に適する所定の配列セットを含む）；（ｃ）得られるハイブリダイゼーションパターンと標準ハイブリダイゼーションパターンを比較することを含む、生物学的試料または特定の短いＲＮＡの発現レベルを健康状態と関連付ける方法を提供する。標準パターンを、例えば、疾患細胞または組織から誘導される試料から得ることができる。故に、同様のパターンは、ある疾患状態を有する細胞または組織試料の指標であり得る。好ましい態様にて、細胞または組織を、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、インフルエンザ感染、マラリア、肝炎、プラスモジウム、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、または口蹄疫ウイルスなどの病原体に感染させる。好ましい態様にて、細胞または組織を、ウイルス性または細菌性病原菌に感染させる。もう１つの好ましい態様にて、前記疾患はガンであり（例えば、McManus, Michael T. MicroRNAs and cancer.  Seminars in Cancer Biology (2003), 13(4), 253−258を参照のこと）、より好ましい態様にて、固形ガンまたは血液悪性腫瘍である。さらなる好ましい態様にて、前記疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病または多発性硬化症などの神経変性疾患である。特に好ましい態様にて、前記疾患は、脆弱性Ｘ関連精神遅滞である（例えば、Caudy AA et al. (2002) Genes Dev; 16:2491−6 and Dostie, Josee et al RNA (2003), 9(2), 180−186を参照のこと）。
【００３２】
もう１つの好ましい態様にて、オリゴヌクレオチドアレイは、生物体の所定の器官、組織または細胞の小さなＲＮＡの検出を包括的に含み、すなわち、前記アレイは、特定の生物体または該生物体の器官、組織あるいは細胞にて形成される低分子ＲＮＡの大部分またはすべてに関するオリゴヌクレオチドを含む。本文中大部分とは、前記小さなＲＮＡの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％を意味する。前記アレイはまた、細胞の特定の段階または状態のマーカーの所定の配列セット、例えば、特定の腫瘍または細胞の特定の型についての既知のマーカーまたはマーカーの組合せを包括的に含み得る。もう１つの好ましい態様にて、前記オリゴヌクレオチドアレイは、所定の生物体、または該生物体の器官、組織あるいは細胞の低分子ＲＮＡの特定のサブセット、好ましくはｓｉＲＮＡ、より好ましくはｍｉＲＮＡまたはｓｔＲＮＡの検出に適する。
【００３３】
当業者には明らかなように、上記の方法を、短いＲＮＡ、特に細胞または組織中のｍｉＲＮＡの量および／または組成に違いを有するいずれかの生物学的状態を識別するために用いることができる。例えば、生物学的試料を、適した生物学的試料および生物学的試料を用いて得られるパターンを比較することができる適当な標準パターンを用いる方法などにより、例えば低酸素または機械的ストレスなどの別のストレス状態と関連付けることができる。あるいは、生物学的試料を、生長の異なる段階で関連付けることができる。
【００３４】
本発明のもう１つの態様は、分化中の短いＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ動態を探るための方法を提供する。例えば、短いＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡの検出に有用な定義された配列セットを有するオリゴヌクレオチドアレイを、例えば、インビトロでの造血細胞の分化、筋芽細胞の分化、またはＰＣ１２細胞の神経への分化などの異なる系統へ分化中の胚性幹細胞から誘導される生物学的試料と接触させることができる。
【００３５】
本発明の他の局面は、疾患、特に、ヒト疾患の予後診断または診断のための方法を提供する。かかる方法には、
（ａ）生物学的試料を提供すること（それらは、目的の組織または器官または体液から単離され得、要すれば、前もって処理され得る）
（ｂ）短いＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡの検出に有用な定義された配列セットに対応するオリゴヌクレオチドアレイを該試料と接触させること
（ｃ）ハイブリダイゼーションパターンを得ること
（ｄ）該ハイブリダイゼーションパターンと標準ハイブリダイゼーションパターンを比較すること（ここで、あるパターンの存在または不存在は、疾患の発生の可能性または疾患の存在の可能性の指標である）
が含まれる。
【００３６】
例えば、ガン性状態を、ある短いＲＮＡの組合せにより示すことができる。かかる組合せは、前記短いＲＮＡを適したオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズするとき、特定のパターンを生じ得る。よって、生物学的試料とのかかるオリゴヌクレオチドアレイのあるハイブリダイゼーションパターンの存在または不存在は、ガン性状態の存在または不存在の指標であり得る。そのパターンを、正常細胞、組織または器官などで得られる標準パターンと比較することもでき、標準パターンと比較して生物学的試料から得られたパターンにおける相違は、分析する生物学的試料の異常または疾患状態の指標であり得る。
【００３７】
本発明はさらに、以下の実施例を説明の目的でのみ記載する。本開示および実施例に明確に記載されていない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド生化学ならびに免疫学の方法は、科学文献にて報告されており、当技術分野でよく知られている。
【００３８】
実施例
材料および方法
ＭＯＥオリゴヌクレオチドの設計および合成
ＭＯＥキャプチャープローブを、Lagos−Quintana Mら；Science 2001, 294, 853−8, Lagos−Quintana Mら；Current Biology, 2002, 12, 735−9, Lagos−Quintana M.；RNA  2003, 9, 175−9, Mourelatos Zissimosら；Genes And Development  2002,  16,  720−8により同定された３１個のヒトｍｉＲＮＡについて設計した。これらのｍｉＲＮＡの長さは、２０から２４ヌクレオチドで変化する。これらのｍｉＲＮＡの存在量はまた、個々のｍｉＲＮＡのクローニングの頻度に基づき異なる。ｍｉＲＮＡの同定に用いるクローニングおよびシークエンシング方法は、ｍｉＲＮＡの５’および３’末端を正確に定義することがしばしばできないため、ＭＯＥキャプチャープローブを、ｍｉＲＮＡの中心部に相当する１９ヌクレオチドに相補的に設計した。２０ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡについて、キャプチャープローブは、ｍｉＲＮＡの１９  ５’隣接ヌクレオチドと相補的であり、２１ヌクレオチド長およびそれより長いｍｉＲＮＡについて、前記キャプチャープローブは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２−２０に相補的である。キャプチャープローブの同じ（１９ヌクレオチド）長さの維持には、個々のプローブ−ｍｉＲＮＡの二本鎖の融解温度の違いを最小にするべきである。
【００３９】
１ｂｐおよび２ｂｐのミスマッチ対照オリゴを、以下の交換則に従い設計した：Ａ→Ｃ；Ｃ→Ａ；Ｔ→Ｇ；Ｇ→Ｔ。ミスマッチを、すべてのｍｉＲＮＡ種に対して最大の特異性を有するアルゴリズムを用いて導入した（J. Lange, LSI）。本発明に記載の合成ＤＮＡおよび２’−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ３９４またはＥｘｐｅｄｉｔｅ／Ｍｏｓｓ合成器（Applied Biosystems）で標準フォスファミダイト化学を用いて製造する。フォスファミダイトを、０．０５Ｍ濃度のアセトニトリルに溶解する。カップリングを、０．２Ｍのベンゾイミダゾリウムトリフレート アセトニトリル溶液によるフォスファミダイトの活性化により行う。カップリング時間は通常、３から６分間である。最初のキャッピングを、標準キャッピング試薬を用いて行う。酸化を、０．５Ｍのｔ−ブチルヒドロペルオキシド ジクロロメタン溶液にて２分間で行う。次のキャッピングを、酸化または硫化後に行う。オリゴヌクレオチド成長鎖を、ジクロロメタン中２％トリクロロ酢酸による次のカップリングのために脱トリチル化する。配列の完了後、支持体結合化合物を切断し、８０℃で２時間、３２％アンモニア水溶液により“トリチル−オン”のように脱保護する。
【００４０】
得られた粗溶液を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより直接精製する。精製された脱トリチル化化合物をエレクトロスプレー質量分析およびキャピラリーゲル電気泳動により分析し、そして２６０ｎＭでの吸光係数に従いＵＶにより定量する。ｍｉＲＮＡ配列と相補的なＭＯＥ−オリゴヌクレオチド（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＭＡＴＣＨ＝ＰＭ）および対応する１（１ＭＭ）および２塩基対（２ＭＭ）ミスマッチ対照を、表１に示す。
【００４１】
【表１】
2007512805.tif 000002
【００４２】
【表２】
2007512805.tif 000003
【００４３】
ｎ（ｇ，ａ，ｔ）＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−リボヌクレオシド、ｃ＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン。３’末端の大文字は、Ｎ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）２’−デオキシヌクレオチド（ｎｔ）を示す。実際上の理由により、すべての配列を、３’末端の位置に１個の２’−デオキシヌクレオチドを有するＭＯＥオリゴヌクレオチドをもたらすようなＤＮＡ支持体を用いて合成した。
【００４４】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイのプリンティングおよびハイブリダイゼーション
ＮｏｖａＣｈｉｐ（D, Budach W, Wanke C, Chibout SD(2003) Evanescent resonator chips: a universal platform with superior sensitivity for fluorescence−based microarrays. Biosens Bioelectron; 18:489−97）を製造し、プリントし、そして実質的に記載のとおりにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション混合物は、３μグラムの標識ミクロＲＮＡを含んでいた（Budach, Wolfgang; Neuschaefer, Dieter; Wanke, Christoph; Chibout, Salah−Dine.  Generation of transducers for fluorescence−based microarrays with enhanced sensitivity and their application for gene expression profiling. Analytical Chemistry (2003), 75(11), 2571−2577）。
【００４５】
ヒトＨｅＬａおよびマウスＰ１９細胞からのｍｉＲＮＡの製造
ＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したダルベッコの修飾イーグルス培地中、３７℃で増殖させた。約１，５×１０７細胞をＰＢＳで洗浄し、製造業者の説明書に従い、１０ｃｍ２表面に対して１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ−ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）でＲＮＡを抽出した。水相に存在するＤＮＡを、３７℃で１時間、５００μｌにつき２０ＵのＤＮａｓｅＩで消化した。フェノール／クロロホルム抽出の後、全ＲＮＡをエタノール沈殿し、ＲＮａｓｅなしの水に再懸濁し、そして１００μｇのＲＮＡを、製造業者のＲＮＡ浄化説明書に従いＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。流れに含まれる〜２００ｎｔより小さいＲＮＡ種をエタノール沈殿し、変性ゲル充填緩衝液（７０％ホルムアミド、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０，０５％キシレンシアノール、０，０５％ブロモフェノールブルー）に再懸濁し、そしてＴＢＥ緩衝液中、８Ｍ尿素−１２，５％ポリアクリルアミドゲル泳動にて分ける。１５から３０ｎｔのサイズ範囲のＲＮＡを、ＵＶ光照射下でゲルの陰影から切り出し、５００ｍＭ酢酸アンモニウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２０％フェノール／クロロホルムを含む溶液で４℃にて１６時間溶出し、エタノール沈殿し、そしてＲＮａｓｅなしの水に再懸濁した。回収したＲＮＡの量を、２６０ｎｍの吸光度を測定することにより推定した。あるいは、ＲＮＡ試料を、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に用いるか、ＰＡＧＥ精製工程を省略したチップ実験に用いた。
【００４６】
合成対照ｍｉＲＮＡオリゴならびにＨｅＬａおよびＰ１９細胞からの断片化サイズ選択ｍｉＲＮＡの蛍光標識
８つの異なるｍｉＲＮＡ配列と相補的な１９−ｍｅｒのＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｘｅｒａｇｏｎから購入した。ＲＮＡの標識に関して、水９μｌ中ＲＮＡ９μｇを、１μｌの新鮮に調製した１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液の添加によりジアルデヒドに酸化し、その後、暗所で室温にて１時間インキュベーションした。過剰量の酸化物を、１μｌの２００ｍＭ亜硫酸ナトリウム溶液の添加により除去し、室温で２０分間インキュベートした。１２μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４を添加後、５μｌの２０ｍＭ塩酸エチレンジアミン水溶液ｐＨ７．２を、酸化型ＲＮＡに加えた。反応混合物を、３７℃で１時間インキュベーションし、ＲＮＡとスペーサー間のアルジミン結合を、２μｌの新鮮に調製した２００ｍＭシアノボロハイドライドナトリウムのアセトニトリル溶液で還元することにより安定化した。３０分間室温でインキュベーションし、沈殿を０℃で１時間、２倍量の２％過塩素酸リチウム・アセトン溶液で行った。試料を、１４０００ｒｐｍで４５分間回転させ（３−４℃）、上清を除去後、ＲＮＡペレットをアセトンで２度洗浄し乾燥させた。結合を、５μｌのＤＥＰＣ処理水にアミノ修飾ＲＮＡを再懸濁し、５μｌの１Ｍナトリウムリン酸緩衝液中３０ｍＭ  Ｃｙ５  Ｎ−ヒドロキシスクシニミジ活性エステル（ｐＨ７．８）を加えることにより行った。暗所にて室温で１時間インキュベーションした後、ＲＮＡを−２０℃で１時間、２．５倍量の１００％氷冷エタノールで沈殿させた。試料を１４０００ｒｐｍで３０分間回転させ（３−４℃）、上清を除去後、Ｃｙ５−ＲＮＡペレットを氷冷７０％エタノール水溶液で２回洗浄し、空気乾燥した。標識ＲＮＡの質および量をキャピラリーゲル電気泳動により分析し、２６０ｎｍでの吸光係数に従いＵＶにより定量した。
【００４７】
Ｃｙ５標識ＲＮＡ配列は、表２に含まれる。
【００４８】
表２：３’−Ｃｙ５標識合成ｍｉＲＮＡ同等物の配列を、固定化した相補的“キャプチャー”オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするために用いた。塩基対を形成するヌクレオチドを、太字で強調する。
【００４９】
【表３】
2007512805.tif 000004
【００５０】
結果
オリゴヌクレオチドキャプチャープローブの親和性および特異性を、ＭＯＥおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドと共にその対応する１および２ヌクレオチドミスマッチ対照をスポットしたパネルを含むチップを用いて試験した。チップ上に示される８個の異なるｍｉＲＮＡ配列と相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドをＣｙ５で標識し（表２）、異なる条件でチップとハイブリダイズした。
【００５１】
すべてのＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイに関する一般的な問題は、基板の感受性および特異性に関する適切な妥協の必要性である。
【００５２】
図１に示すように、ＭＯＥ修飾１および２ヌクレオチドミスマッチオリゴヌクレオチドで得られる蛍光強度は、完全にマッチした二本鎖と比べて著しい強度の減少を示す。ハイブリダイゼーション温度の上昇により、識別がさらに改善されるはずである。対照的に、対応する標準ＤＮＡキャプチャープローブは、選択したハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件下で安定な二本鎖を形成することができず、結果としてすべてのＤＮＡキャプチャープローブからの強度値は有意でない。
８例中５例にて、ＭＯＥプローブを有するミスマッチ識別を、ハイブリダイゼーション温度を３７℃から４２℃に上げることにより、そのキャプチャー感受性を損なうこと無しに、著しく改善することができる（図１）。オリゴヌクレオチドｍｉｒ−９９およびｍｉｒ−１００（それは、単一のヌクレオチドのみが異なるｍｉＲＮＡを示す）の場合に、十分な交叉反応が観察された。
【００５３】
ヒトおよびマウス細胞抽出物からのｍｉＲＮＡのＭＯＥ  ＮｏｖａＣｈｉｐへのハイブリダイゼーション
次工程にて、サイズ選択的ｍｉＲＮＡをＨｅＬａ／Ｐ１９マウス細胞から抽出し、Ｃｙ５で標識し、そして３０℃から５６℃の範囲の温度で高感度のチップへプローブと共にハイブリダイズした（Novachip: Generation of transducers for fluorescence−based microarrays with enhanced sensitivity and their application for gene expression profiling.  Budach, Wolfgang; Neuschaefer, Dieter; Wanke, Christoph; Chibout, Salah−Dine. Novartis Pharma AG Switzerland,  Basel,  Switz. Analytical／Chemistry (2003), 75(11), 2571−2577）。蛍光強度を、相補的ＭＯＥキャプチャープローブを有する３１個の異なる標識ｍｉＲＮＡについて測定し、Ｃｈｉｐ上の１ｎｔＭＭおよび２ｎｔＭＭ対照を表３に示す。いくつかのｍｉＲＮＡの特異的ハイブリダイゼーションは、既に３０℃および３７℃で観察され得ると考えられたが（野生型、および１ＭＭおよび２ＭＭ  ＭＯＥプローブで得られるシグナルの比較に基づく）、ＮｏｖａＣｈｉｐ上に存在するミスマッチ配列と完全に相補的な配列の間の識別は、４２℃またはより高い温度でより良くなった。４８℃および５６℃でのハイブリダイゼーションの実行は、より高い温度で強度が付随して減少する、ほぼすべてのｍｉＲＮＡの特異的な検出を可能とした。少数例にて、５６℃でのシグナルは記録されなかった。３つの異なる温度（４２、４８および５６℃）でのハイブリダイゼーションの実行により、ほとんどすべての試験したｍｉＲＮＡについての特異的シグナルを記録することが可能であった。実際には、６つのｍｉＲＮＡのみが、試験したいずれかの温度で不存在かまたは非特異的などちらかのシグナルを示した。これは、分離細胞株中特異的ｍｉＲＮＡの不存在のため、またはハイブリダイゼーションに用いたＲＮＡ試料中の交叉ハイブリダイズする関係のないＲＮＡの存在のためのいずれかであり得る。１つの例で例示されるように、単一のミスマッチがｍｉＲＮＡの特異的検出を可能にしない場合、２つのミスマッチが、識別をよりよくすることが可能である。最後に、４２℃（データ掲載せず）での２つの個別に実施したハイブリダイゼーションからの強度値は、高レベルの再現性を示す同程度の強度値を示した。
【００５４】
表３：Ｃｙ５で標識したＨｅＬａ  ｍｉＲＮＡを、チップ上、記載の条件下で異なる温度（Ｔ）にてハイブリダイズした。４８℃のハイブリダイゼーション温度（太字で示す）は、チップ上のほとんどのプローブについてのシグナル強度と特異性との間の最も良い妥協を示す。
【００５５】
【表４】
2007512805.tif 000005
【００５６】
【表５】
2007512805.tif 000006
【表６】
2007512805.tif 000007
【表７】
2007512805.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】７個のＲＮＡ試料と１ＭＭおよび２ＭＭのキャプチャープローブとのハイブリダイゼーションが示す強度を、個々のマッチ配列から得られた強度を標準化したものである。強度を、密度（平均）−バックグラウンド（平均）として定義する。Ｃｙ５標識ＲＮＡとハイブリダイズしたＭＯＥプローブでの改善されたミスマッチ識別力が、ハイブリダイゼーション温度を３７℃から４２℃に上げることで得られた。同じ条件下、同じ長さの標準ＤＮＡプローブは、シグナル強度を示さなかった。
【図１】
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【国際調査報告】
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