(57)【要約】  予め決定した植物の細胞で、対象のタンパク質を生成する方法であって、（ｉ）融合タンパク質を色素体内にターゲティングする輸送ペプチド、及びそれに隣接して（ｉｉ）前記対象のタンパク質をＮ末端からＣ末端に含む前記融合タンパク質をコードするベクターを前記細胞内に導入することを含み、前記輸送ペプチドＣ末端の３個のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及び前記対象のタンパク質Ｎ末端のアミノ酸Ｚが、色素体で前記対象のタンパク質を放出するためにＸ−１とＺとの間で前記融合タンパク質を開裂するための開裂部位Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚを形成し、前記対象のタンパク質の予め決定したアミノ酸Ｚに対して、アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、植物の色素体を標的とする融合タンパク質で天然に存在するＺに隣接するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択され、それにより前記開裂部位を形成する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め決定した植物の細胞内で、対象のタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）融合タンパク質を色素体内にターゲティングする輸送ペプチド、及びそれに隣接して、
（ｉｉ）前記対象のタンパク質
をＮ末端からＣ末端に含む前記融合タンパク質をコードするベクターを前記細胞内に導入することを含み、
前記輸送ペプチドＣ末端の３個のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及び前記対象のタンパク質Ｎ末端のアミノ酸Ｚが、色素体で前記対象のタンパク質を放出するためにＸ−１とＺとの間で前記融合タンパク質を開裂するための開裂部位：
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚ
を形成し、
前記対象のタンパク質の予め決定したアミノ酸Ｚに対して、アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、植物の色素体を標的とする融合タンパク質で天然に存在するＺに隣接するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択され、それにより前記開裂部位を形成する方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、前記予め決定した植物がその一員である植物の科において、色素体を標的とする融合タンパク質で天然に存在するＺに隣接するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、前記予め決定した植物がその一員である植物の属において、色素体を標的とする融合タンパク質で天然に存在するＺに隣接するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、前記予め決定した植物と同じ種の植物において、色素体を標的とする融合タンパク質で天然に存在するＺに隣接するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が以下の相関表に従い、前記対象のタンパク質のアミノ酸Ｚに応じて選択される、請求項１から４までの一項に記載の方法。
【表１】
2007500010.tif 000004
［表中、アミノ酸の３つ組は全てＮ末端からＣ末端の方向で示され、アミノ酸は１文字アミノ酸コードで表される］
【請求項６】
Ｚ＝Ａに対して、
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、ＡＳＮ、ＡＣＲ、ＡＡＡ、ＦＶＡ、ＨＶＲ、ＩＣＣ、ＩＧＡ、ＩＲＡ、ＩＲＣ、ＩＳＡ、ＩＳＣ、ＩＱＣ、ＱＩＲ、ＫＴＫ、ＫＡＫ、ＰＬＱ、ＰＩＡ、ＰＩＱ、ＲＭＧ、ＲＣＭ、ＲＡＱ、ＲＶＫ、ＳＡＡ、ＳＣＴ、ＳＬＡ、ＳＩＣ、ＳＩＶ、ＴＣＱ、ＴＡＭ、ＴＡＱ、ＴＣＫ、ＶＣＫ、ＶＡＭ、ＶＶＡ、ＶＫＡ、ＶＲＡ、ＶＴＲ、ＶＧＡ、ＶＶＲ、ＶＶＹ、ＶＶＱ、ＶＳＣ、ＶＶＣ、またはＶＦＡである、請求項１から４までの一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｚ＝Ａに対して、
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、ＡＳＮ、ＡＣＲ、ＡＡＡ、ＦＶＡ、ＩＧＡ、ＩＲＣ、ＩＱＣ、ＱＩＲ、ＫＴＫ、ＫＡＫ、ＰＬＱ、ＲＭＧ、ＲＣＭ、ＲＡＱ、ＲＶＫ、ＳＡＡ、ＳＣＴ、ＳＬＡ、ＳＩＣ、ＳＩＶ、ＴＣＱ、ＴＣＫ、ＶＣＫ、ＶＡＭ、ＶＴＲ、ＶＧＡ、ＶＶＹ、ＶＶＱ、ＶＳＣ、ＶＶＣ、またはＶＦＡである、請求項１から４までの一項に記載の方法。
【請求項８】
予め決定したＺ及び所与の輸送ペプチドに対して、輸送ペプチドのＣ末端アミノ酸の好適な３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、
（ａ）そのＮ末端からＣ末端の方向に、前記予め決定したＺに対する請求項５又は６で定義したＣ末端アミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１を有する輸送ペプチド、及びそれに隣接して、予め決定したＮ末端アミノ酸Ｚを有する緑色蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質を含む融合タンパク質をコードするベクターを構築すること、
（ｂ）前記融合タンパク質を発現するために、前記ベクターを植物細胞に導入すること、
（ｃ）色素体のＸ−１とＺとの間での前記融合タンパク質の開裂を評価すること、
（ｄ）前記予め決定したＺに対する、請求項５又は６で定義した１つ又は複数の別のＸ−３Ｘ−２Ｘ−１について、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すこと、
（ｅ）好ましい開裂に導くＸ−３Ｘ−２Ｘ−１を選択すること、
を含むアッセイにより選択される、請求項１から７までの一項に記載の方法。
【請求項９】
予め決定したＺ及び所定の輸送ペプチドに対して、輸送ペプチドのＣ末端アミノ酸の好適な３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、
（ａ）そのＮ末端からＣ末端の方向に、前記予め決定したＺに請求項５又は６で定義したようなＣ末端アミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１を有する輸送ペプチド、及びそれに隣接して、緑色蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質が続く前記対象のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするベクターを構築すること、
（ｂ）前記融合タンパク質を発現するために、前記ベクターを植物細胞に導入すること、
（ｃ）色素体のＸ−１とＺとの間での前記融合タンパク質の開裂を評価すること、
（ｄ）前記予め決定したＺに対する、請求項５又は６で定義した１つ又は複数の別のＸ−３Ｘ−２Ｘ−１について、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すこと、
（ｅ）好ましい開裂に導くＸ−３Ｘ−２Ｘ−１を選択すること、
を含むアッセイにより選択される、請求項１から７までの一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記上流の輸送ペプチドが開裂部位に配列ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＡ  ＶＶＡＴＲＡＳＡＡＱ  ＡＳＭＶＡＰＦＴＧＬ  ＫＳＡＡＳＦＰＶＴＲ  ＫＱＮＮＬＤＩＴＳＩ  ＡＳＮＧＧＲを有する、請求項１から９までの一項に記載の方法。
【請求項１１】
輸送ペプチドが開裂部位の上流に配列ＭＡＰＴＶＭＡＳＳＡ  ＴＴＶＡＰＦＱＧＬＫ  ＳＴＡＧＲＬＰＶＡＲ  ＲＳＳＧＳＬＧＳＶＳ  ＮＧＧＲを有する、請求項１から９までの一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象のタンパク質が、細菌、ウィルス、植物、又は動物起源であるか、或いは前記対象のタンパク質が人工的に設計された、請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象のタンパク質が、農業的形質、ヒト又は動物の健康タンパク質、免疫応答タンパク質、又はポリペプチドホルモンである、請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象のタンパク質がインターフェロンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
植物で実施され、前記ベクターが植物の細胞に導入される、請求項１から１４までの一項に記載の方法。
【請求項１６】
予め決定した植物の細胞で対象のタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）融合タンパク質を色素体に導く輸送ペプチド、及びそれに隣接して、
（ｉｉ）前記対象のタンパク質
をＮ末端からＣ末端に含む前記融合タンパク質をコードするベクターを前記細胞内に導入することを含み、
前記輸送ペプチドＣ末端の３個のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及び前記対象のタンパク質Ｎ末端のアミノ酸Ｚが、色素体で前記対象のタンパク質を放出するためにＸ−１とＺとの間で前記融合タンパク質を開裂するための開裂部位：
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚ
を形成し、
前記配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が以下の相関表に従い、前記対象のタンパク質のアミノ酸Ｚに応じて選択される方法。
【表２】
2007500010.tif 000005
［表中、３つ組アミノ酸は全てＮ末端からＣ末端の方向で示され、アミノ酸は一文字アミノ酸コードで示される］
【請求項１７】
予め決定した植物の細胞で対象のタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）融合タンパク質を色素体内にターゲティングする輸送ペプチド、及びそれに隣接して、
（ｉｉ）前記対象のタンパク質
をＮ末端からＣ末端に含む前記融合タンパク質をコードするベクターを前記細胞内に導入することを含み、
前記輸送ペプチドＣ末端の３個のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及び前記対象のタンパク質Ｎ末端のアミノ酸Ｚが、色素体で前記対象のタンパク質を放出するためにＸ−１とＺとの間で前記融合タンパク質を開裂するための開裂部位：
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚ
を形成し、
Ｚ＝Ａに対して、Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＳＮ、ＡＣＲ、ＡＡＡ、ＦＶＡ、ＨＶＲ、ＩＣＣ、ＩＧＡ、ＩＲＡ、ＩＲＣ、ＩＳＡ、ＩＳＣ、ＩＱＣ、ＱＩＲ、ＫＴＫ、ＫＡＫ、ＰＬＱ、ＰＩＡ、ＰＩＱ、ＲＭＧ、ＲＣＭ、ＲＡＱ、ＲＶＫ、ＳＡＡ、ＳＣＴ、ＳＬＡ、ＳＩＣ、ＳＩＶ、ＴＣＱ、ＴＡＭ、ＴＡＱ、ＴＣＫ、ＶＣＫ、ＶＡＭ、ＶＶＡ、ＶＫＡ、ＶＲＡ、ＶＴＲ、ＶＧＡ、ＶＶＲ、ＶＶＹ、ＶＶＱ、ＶＳＣ、ＶＶＣ、及びＶＦＡからなる群から選択される方法。
【請求項１８】
予め決定した植物の細胞で対象のタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）融合タンパク質を色素体内にターゲティングする輸送ペプチド、及びそれに隣接して、
（ｉｉ）前記対象のタンパク質
をＮ末端からＣ末端に含む前記融合タンパク質をコードするベクターを前記細胞内に導入することを含み、
前記輸送ペプチドＣ末端の３個のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及び前記対象のタンパク質Ｎ末端のアミノ酸Ｚが、色素体で前記対象のタンパク質を放出するためにＸ−１とＺとの間で前記融合タンパク質を開裂するための開裂部位：
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚ
を形成し、
Ｚ＝Ａに対し、Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＳＮ、ＡＣＲ、ＡＡＡ、ＦＶＡ、ＩＧＡ、ＩＲＣ、ＩＱＣ、ＱＩＲ、ＫＴＫ、ＫＡＫ、ＰＬＱ、ＲＭＧ、ＲＣＭ、ＲＡＱ、ＲＶＫ、ＳＡＡ、ＳＣＴ、ＳＬＡ、ＳＩＣ、ＳＩＶ、ＴＣＱ、ＴＣＫ、ＶＣＫ、ＶＡＭ、ＶＴＲ、ＶＧＡ、ＶＶＹ、ＶＶＱ、ＶＳＣ、ＶＶＣ、及びＶＦＡからなる群から選択される方法。
【請求項１９】
請求項１から１８までのいずれか一項の方法により生成される、又は生成可能である対象のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え植物細胞、特にその色素体における対象の異種タンパク質の生成方法、及びその方法で生成されたタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、薬剤的及び産業的応用を含む組換えタンパク質の安価で制限なく大規模に実現できる生成システムであるため、魅力ある選択となっている（Ｓｔｏｇｅｒら、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２巻、５８３〜５９０頁、及びＬａｒｒｉｃｋ及びＴｈｏｍａｓ、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻、４１１〜４１８頁）。特に薬剤分野の殆どのタンパク質は分泌性であり、例えば、最初にシグナルペプチドを有するタンパク質前駆体として翻訳され、シグナルペプチドはさらなる翻訳後プロセシング及び区画化のためにタンパク質を小胞体の網状構造（ＥＲ）に導く。前記プロセシングには、正確な折りたたみとアセンブリ、即ちジスルフィド結合の形成及び複合的な酵素的修飾が含まれる。しかし、植物はグリコシル化部位に結合した様々なタイプの炭水化物を合成するため、動物細胞と植物細胞のＥＲでは翻訳後のタンパク質修飾、特にグリコシル化パターンに大幅な相違があり得る（Ｗｉｌｓｏｎ，ＩＢ．、２００２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１２巻、５６９〜５７７頁、及びＳｃｈｉｌｌｂｅｒｇ、Ｆｉｓｃｈｅｒ及びＥｍａｎｓ、２００３年、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、６０巻、４３３〜４４５頁）。植物に特有の翻訳後修飾、特に植物が産生した薬剤用タンパク質のグリコシル化は、患者にアレルギー反応を引き起こすことがあるため、多くの場合、避ける方が好都合である。葉緑体にはそれ自体のタンパク質品質管理システムがあり、ＥＲ同様正確なジスルフィド結合形成及びタンパク質の折りたたみを提供することができる（Ｄｉｃｋｓｏｎら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５巻、１１８２９〜１１８３５頁）。タンパク質の活性にいかなる役割も演じないグリコシル化は、２つの異なる手段、即ちａ）プロセシングのために対象のタンパク質を様々な細胞レベル下の区画、例えば葉緑体内にターゲティングする手段、ｂ）トランスプラストミック植物を操作することにより、対象のタンパク質を植物の色素体で発現する手段を用いれば容易に避けることができる。後者の方法は、メチオニン（Ｍ）以外のＮ末端アミノ酸残基を必要とするタンパク質を発現させるのには適当でない。ユビキチンの開裂の際必要とされるＮ末端を得るために、ヒトの分泌タンパク質であるソマトトロピンをトランスプラストミックタバコで、ユビキチン融合として発現させることによりこの問題に取り組む試みがあった（Ｓｔａｕｂら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、３３３〜３３８頁）。ユビキチン融合タンパク質は、ユビキチンプロテアーゼによりユビキチンのＣ末端残基のすぐ下流で開裂され、プロリン以外の選択したＮ末端残基を含む組換えタンパク質が生成できるようになる（Ｂａｋｅｒ、Ｒ．Ｔ．、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７巻、５４１〜５４６頁）。しかし、葉緑体にはユビキチンに特異性のあるプロテアーゼは存在せず、ユビキチン−ソマトトロピン融合体のプロセシングはタンパク質の抽出過程の間にのみ起こり、高レベル（７０％まで）のプロセシングされていないソマトトロピンが得られた。
【０００３】
異種タンパク質を色素体の外で発現させた後に、植物細胞の色素体内にターゲティングする試みがあった（米国特許第６，０６３，６０１号、米国特許第６，１３０，３６６号）。これには、対象のタンパク質をＮ末端の輸送ペプチドと融合する必要がある。輸送ペプチドには、色素体の膜を通過するトランスロケーションを促進する機能がある。色素体内部で、輸送ペプチドは色素体プロテアーゼにより開裂する。天然の色素体標的植物タンパク質の開裂部位については、詳しく調べられている（Ｇａｖｅｌ及びＶｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、１９９０年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２６１巻、４５５〜４５８頁）。これらは、適応の良好なある植物の天然タンパク質に関する調査である。しかし、異種タンパク質は、進化により植物色素体に適合していない。したがって、望ましい対象のタンパク質を高品質で、特にＮ末端配列を高い正確度で生成する、輸送ペプチド、及び対象の異種タンパク質、及び効率的かつ規定の融合タンパク質の開裂を確実にするための予想される開裂場所周辺の配列を有する融合タンパク質を構築するという普遍的な問題が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、対象の色素体標的異種タンパク質の生成方法を提供し、それにより前記対象のタンパク質の望ましいＮ末端配列を高い信頼性で容易に得ることが、本発明の問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この問題は、予め決定した植物の細胞で、対象のタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）融合タンパク質を色素体内にターゲティングする輸送ペプチド、及びそれに隣接して、
（ｉｉ）前記対象のタンパク質
をＮ末端からＣ末端の方向で含む前記融合タンパク質をコードするベクターを前記細胞内に導入することを含み、
前記輸送ペプチドＣ末端の３個のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及び前記対象のタンパク質Ｎ末端のアミノ酸Ｚが、色素体で前記対象のタンパク質を放出するためにＸ−１とＺとの間で前記融合タンパク質を開裂するための開裂部位：
Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚ
を形成し、前記対象のタンパク質の予め決定したアミノ酸Ｚに対して、アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、植物の色素体を標的とする融合タンパク質のＮ末端側のＺに天然に存在するＺに隣接するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択され、これらにより前記開裂部位を形成する方法により解決される。
本明細書において、一文字コードは、２０個の標準アミノ酸に対して一般的に用いられるものである。同様に、Ｘ−３、Ｘ−２、Ｘ−１、及びＺの記号はそれぞれ標準アミノ酸を意味する。−１、−２、及び−３の数字は、輸送ペプチドのＮ末端に向かう方向で輸送ペプチド配列におけるそれぞれのアミノ酸の位置を示す。
【０００６】
開裂の正確さ及び効率が、開裂場所付近の輸送ペプチド及び色素体標的天然タンパク質の配列に依存することは、一般的に認められている。しかし、任意の輸送ペプチド及び選択された対象のタンパク質の組合せにまで拡張することのできる一般的な知識を、異種タンパク質に応用することはできない。
【０００７】
開裂場所を共同して決定する、輸送ペプチドのＣ末端配列の長さ及び対象のタンパク質のＮ末端配列の長さは明らかではない。天然タンパク質では、これら２つの配列は進化の間に相互に調節されてきたと仮定するのが理にかなっている。色素体に導かれる異種タンパク質では、適当な輸送ペプチドを試行錯誤で決定しなければならない。前記試行錯誤の成功は予測できない。全くの幸運で好適な配列の組合せが見つかることもある。しかし、不確実性は大きく、あてにならない。
【０００８】
我々は驚くべきことに、対象のタンパク質のＮ末端配列に適合する輸送ペプチドのＣ末端配列を見出すという問題が、考慮の序列に基づきさらに高い成功率で解決できることを見出した。この序列の中では、対象の異種タンパク質のＮ末端アミノ酸及び輸送ペプチドの最後の３個のアミノ酸のみを主に考えれば十分であることが見出された。特に、対象のタンパク質のＮ末端のアミノ酸はそれぞれ、輸送ペプチドの好適なＣ末端アミノ酸の３つ組の特定の組と相関があることが見出されている。
【０００９】
本発明の方法では、前記融合タンパク質をコードするベクターを植物細胞内に導入する。すると、前記対象のタンパク質は、前記植物細胞、例えば細胞培養物で発現することができる。前記対象のタンパク質を植物全体で発現させるのが好ましい。これは、前記ベクターで形質転換された植物細胞から植物を再生することにより達成できる。或いは、前記ベクターを植物全体の植物細胞に導入する。植物又は植物細胞の形質転換方法、又はトランスフェクション方法のいくつかは当業者に知られており、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した形質転換、微粒子銃、ＰＥＧが介するプロトプラスト形質転換、ウィルス感染等が含まれる。一過性発現又は一過性発現のためのトランスフェクションの好ましい実施形態では、ウィルス感染又はアグロバクテリウム属が介する形質転換を用いると好都合である。植物又は植物細胞を、前記融合タンパク質をコードするコード領域を有するヌクレオチド配列（ベクター）で形質転換またはトランスフェクションする。形質転換により、例えばトランスジェニック植物のような、安定に形質転換された植物又は植物細胞を生成することができる。或いは、前記植物又は植物細胞を、前記融合タンパク質の一過性発現のためにトランスフェクションすることができる。成熟した植物の一過性トランスフェクションが、最も好ましい。
【００１０】
前記ベクターは、形質転換又はトランスフェクションの方法に応じて、ＤＮＡ又はＲＮＡのベクターとすることができる。殆どの場合は、ＤＮＡである。一方、重要な実施形態においては、形質転換又はトランスフェクションは、ＲＮＡウィルスをベースとしたベクターを用いて行われ、この場合、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡとすることができる。ある非常に便利な方法では、ウィルスをベースとしたＤＮＡベクターを用いる。ＤＮＡベクターがＲＮＡウィルスをベースとした、即ちＤＮＡベクターが前記ヌクレオチド配列に加えてウィルスのＲＮＡ配列のｃＤＮＡを含むのが好ましい。本発明によるウィルスベクターに用いることができる植物ＤＮＡ又はＲＮＡウィルスの配列の例は、ＷＯ０２／２９０６８及びＷＯ０２８８３６９に示されている。このようなＤＮＡベクターは、ＲＮＡウィルスの転写物を生成する転写プロモータをさらに含む。これらの実施形態では、形質転換又はトランスフェクションは、好ましくはウィルスのトランスフェクションにより、より好ましくはアグロバクテリウム属を介する形質転換により行われる。
【００１１】
本発明の方法により生成される対象のタンパク質のＮ末端アミノ酸Ｚに対して、３つ組のアミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、植物の色素体標的融合タンパク質のＺに隣接したＮ末端側のＺに天然に存在するアミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の組から選択される。前記対象のタンパク質が被子植物で生成されるのが好ましい。この場合、予め決定したＺに対して、被子植物に天然に存在するＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の３つ組を選択する。より好ましくは、前記予め決定した植物がそのメンバーである科、より好ましくは属の植物の色素体標的融合タンパク質のＺに隣接する天然に存在するＸ−３Ｘ−２Ｘ−１のアミノ酸配列の組から、アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１（又は３つ組）が選択される。アミノ酸配列Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、前記予め決定した植物と同じ種の植物の色素体標的融合タンパク質のＺに隣接する天然に存在するＸ−３Ｘ−２Ｘ−１のアミノ酸配列の組から選択されるのが、最も好ましい。
【００１２】
ＺがＭである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＦＲＶ、ＮＲＥ、ＶＮＣ、ＶＳＣ、ＶＱＣ、ＶＲＣ、ＶＫＣ、又はＶＰＥであるのが好ましい。
ＺがＣである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＲＧＡ、ＳＩＲ、ＴＩＶ、又はＶＲＡであるのが好ましい。
ＺがＩである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＨＳ、ＧＳＴ、又はＶＨＣであるのが好ましい。
ＺがＡである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＳＮ、ＡＣＲ、ＡＡＡ、ＦＶＡ、ＨＶＲ、ＩＣＣ、ＩＧＡ、ＩＲＡ、ＩＲＣ、ＩＳＡ、ＩＳＣ、ＩＱＣ、ＱＩＲ、ＫＴＫ、ＫＡＫ、ＰＬＱ、ＰＩＡ、ＰＩＱ、ＲＭＧ、ＲＣＭ、ＲＡＱ、ＲＶＫ、ＳＡＡ、ＳＣＴ、ＳＬＡ、ＳＩＣ、ＳＩＶ、ＴＣＱ、ＴＡＭ、ＴＡＱ、ＴＣＫ、ＶＣＫ、ＶＡＭ、ＶＶＡ、ＶＫＡ、ＶＲＡ、ＶＴＲ、ＶＧＡ、ＶＶＲ、ＶＶＹ、ＶＶＱ、ＶＳＣ、ＶＶＣ、又はＶＦＡであるのが好ましい。
ＺがＮである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＧＳＴ、ＫＡＴ、又はＫＱＳであるのが好ましい。
ＺがＨである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＧＳＤであるのが好ましい。
ＺがＹである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＶＡＡであるのが好ましい。
ＺがＦである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＰＳＲ、又はＲＦＮであるのが好ましい。
ＺがＰである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＩＡＥ、ＲＶＡ、ＲＳＡ、又はＳＶＤであるのが好ましい。
ＺがＱである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＤＤＮ、ＩＲＡ、ＳＬＧ、又はＰＧＬであるのが好ましい。
ＺがＧである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＤＳＣ、ＩＩＣ、ＩＶＣ、ＬＲＱ、ＳＡＴ、ＶＨＣ、ＶＨＡ、又はＶＫＣであるのが好ましい。
ＺがＫである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＩＶＡ、ＬＬＶ、ＬＰＬ、ＬＡＳ、ＬＲＱ、ＭＡＡ、ＮＮＮ、ＲＴＤ、ＴＡＥ、ＴＡＱ、ＴＥＡ、ＴＳＥ、ＶＡＡ、ＶＥＡ、又はＶＶＣであるのが好ましい。
ＺがＲである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＡＡ、ＩＰＡ、ＭＰＴ、又はＶＰＳであるのが好ましい。
ＺがＥである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＬＡ、ＣＲＡ、ＩＶＣ、ＴＰＳ、又はＶＲＡであるのが好ましい。
ＺがＬである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＶＬＡ又はＬＳＲであるのが好ましい。
ＺがＳである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＧＡ、ＣＬＳ、ＧＫＲ、ＦＰＩ、ＩＡＧ、ＩＴＣ、ＩＶＡ、ＫＡＭ、ＬＣＭ、ＮＭＴ、ＰＡＫ、ＲＬＲ、ＳＶＳ、ＴＴＲ、ＶＣＭ、ＶＶＡ、ＶＡＱ、ＶＣＣ、ＶＲＣ、ＶＣＡ、又はＶＲＡであるのが好ましい。
ＺがＶである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＫＭＳ、ＰＲＡ、ＰＫＡ、ＳＬＦ、ＳＴＳ、ＴＧＶ、ＴＲＭ、ＶＳＦ、ＶＲＡであるのが好ましい。
ＺがＤである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＳＡであるのが好ましい。
ＺがＴである場合、前記３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１は、ＡＶＡ、ＰＡＡ、ＶＡＡ、ＶＡＧ、ＶＳＡ、ＶＮＮ、又はＷＰＲであるのが好ましい。
【００１３】
３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１と対象のタンパク質の予め決定したＮ末端残基Ｚとの上記の組合せを用いることにより、得られた融合タンパク質が効率的に色素体に導かれ、開裂して、Ｎ末端終末の高度の正確さで対象のタンパク質を放出するように選ばれた対象のタンパク質に好適な輸送ペプチドを見出す確率は、運任せであった従来技術の方法に比較して大幅に上昇する。あるＺに対し１を超えるＸ−３Ｘ−２Ｘ−１が可能である場合、これら３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の有効性は異なることがある。ある対象のタンパク質に特に適したＸ−３Ｘ−２Ｘ−１のアミノ酸３つ組は、次のステップ：
（ａ）そのＮ末端からＣ末端の方向に、前記予め決定したＺに対する表１で定義されたＣ末端アミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１を有する輸送ペプチド、及びそれに隣接して、予め決定したＮ末端アミノ酸Ｚを有する緑色蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質を含む融合タンパク質をコードするベクターを構築すること、
（ｂ）前記融合タンパク質を発現させるために、前記ベクターを植物細胞に導入すること、
（ｃ）色素体のＸ−１とＺとの間での前記融合タンパク質の開裂を評価すること、
（ｄ）前記予め決定したＺに対する、請求項５又は６で定義したように１つまたは複数の別のＸ−３Ｘ−２Ｘ−１について、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すこと、
（ｅ）好ましい開裂に導くＸ−３Ｘ−２Ｘ−１を選択すること、
を含むアッセイにより選択することができる。
前記レポータータンパク質をＸ−３Ｘ−２Ｘ−１のＣ末端側に入れる代わりに、前記対象のタンパク質をＸ−３Ｘ−２Ｘ−１に隣接して配置することができ、この場合前記対象のタンパク質にレポータータンパク質が続くことができる。前記対象のタンパク質を前記アッセイで用いる場合には、本発明の方法では効果的なターゲティング及び開裂を付与する確率がより高くなるため、アッセイではＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の３つ組が選択される。
【００１４】
簡潔にするために、アッセイは植物細胞培養物で行うのが好ましく、この場合細胞は対象のタンパク質を生成するのに用いるのと同じ植物に由来することができる。或いは、植物の葉を、アッセイのベクターで一過性にトランスフェクションしてもよい。どちらの方法でも、融合タンパク質の色素体へのターゲティング、及び融合タンパク質の開裂を直接評価できる。融合タンパク質の色素体へのターゲティングは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光レポータータンパク質と共に図４で行っているように蛍光顕微鏡を用いて評価することができる。融合タンパク質の正確な開裂は、レポータータンパク質、又は（ＧＦＰのようなレポータータンパク質に融合することができる）前記対象のタンパク質を分離し、続けてＮ末端の配列を決定して確認することができる。要約すると、前記アッセイにより色素体にターゲティングされる対象のタンパク質に適した輸送ペプチドを見つける成功率をさらに上昇させることができる。
【００１５】
本発明の方法で用いる前記輸送ペプチドに関して、特に制限はない。しかし、本発明の方法に用いる予め決定した植物に関係のある植物から知られている、色素体輸送ペプチドを用いると好都合である。本発明の方法を双子葉植物細胞又は双子葉植物で行う場合、非常に好ましい輸送ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向にＭＡＳＳＭＬＳＳＡＡ  ＶＶＡＴＲＡＳＡＡＱ  ＡＳＭＶＡＰＦＴＧＬ  ＫＳＡＡＳＦＰＶＴＲ  ＫＱＮＮＬＤＩＴＳＩ  ＡＳＮＧＧＲＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の配列を有する。本発明の方法を単子葉植物細胞又は単子葉植物で行う場合、非常に好ましい輸送ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向にＭＡＰＴＶＭＡＳＳＡ  ＴＴＶＡＰＦＱＧＬＫ  ＳＴＡＧＲＬＰＶＡＲ  ＲＳＳＧＳＬＧＳＶＳ  ＮＧＧＲＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の配列を有する。
【００１６】
本発明により生成される対象のタンパク質に関して、特に制限はない。対象のタンパク質は、細菌、ウィルス、植物、若しくは動物起源とすることができるか、又は人工的に設計されたものとすることができる。前記対象のタンパク質は農業的形質、ヒト又は動物の健康タンパク質、免疫応答タンパク質、ポリペプチドホルモン等とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の原則は以下の通りである：
（ｉ）Ｃ末端アミノ酸残基Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１を有する葉緑体輸送ペプチドＴＰ（Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１）、及びそれに隣接して、
（ｉｉ）対象のタンパク質（Ｚ）Ｐ［（Ｚ）は対象のタンパク質ＰのＮ末端アミノ酸を示す］を含む融合タンパク質ＴＰ（ＸＸＸ）−（Ｚ）Ｐ（Ｎ末端からＣ末端）をコードする遺伝子を、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡベクターを用いて植物細胞内に送達する。輸送ペプチドＴＰは、輸送ペプチドの前記３個のＣ末端アミノ酸残基Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が、対象のタンパク質のＮ末端アミノ酸Ｚと共に、ストロマのプロセシングペプチダーゼにより認識される開裂部位を形成するような方法で操作される。（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＥｌｌｉｓ、１９８４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４２巻、３３７〜３４２頁）。このような開裂の結果、前記対象のタンパク質に必要なＮ末端のＺが設けられる。この目的を達成するために、輸送ペプチドは、前記対象のタンパク質のＮ末端Ｚに応じてアミノ酸残基Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１が選択されるよう操作される（表１を参照）。例えば様々なＺと合致できるなど、縮重が限定されたＸ−３Ｘ−２Ｘ−１以外、大部分は、それぞれのＮ末端アミノ酸Ｚに対してＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の組は特有である（表２に示す）。
【００１８】
表１に示したデータは、公的に入手できるデータベースから得られた、約４００種の核にコードした葉緑体標的タンパク質に対する輸送ペプチド開裂部位を分析した結果である。Ｇａｖｅｌ及びＶｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、１９９０年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２６１巻、４５５〜４５８頁に示された開裂モチーフ（Ｉ／Ｖ）−Ｘ−（Ａ／Ｃ）−Ａと関係のある３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１もあった。表１を作成するにあたり、我々は、輸送ペプチドを開裂して分離した後に１〜２個のアミノ酸残基がＮ末端からはずれる可能性を考慮に入れた（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ、Ｎｉｅｌｓｅｎ及びＨｅｉｊｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、８巻、９７８〜９８４頁）。我々は、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）を除く、殆ど全ての可能なＮ末端アミノ酸残基Ｚに対して、適するＸ−３Ｘ−２Ｘ−１３つ組を見出した。しかし、Ｎ末端則によると、Ｎ末端にＷがあると真核細胞及び原核細胞におけるタンパク質が不安定になり、タンパク質の半減期を２〜３分に短縮する（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、１２１４２〜１２１４９頁）。
【００１９】
我々は、また、対象のタンパク質を双子葉植物の色素体（図１）及び単子葉植物の色素体内（図２）に効率的に導入するのに適した人工コンセンサス輸送ペプチドを構築するために、様々な植物種に由来するルビスコの小サブユニットの輸送ペプチドの配列アラインメントを用いた。このような配列を操作し、その機能を試験することについては、詳細を実施例１に述べる。人工輸送ペプチドとのＧＦＰ融合体を有する構築体を設計し（図３Ａ、Ｂ）、タバコ及びコムギの葉の微粒子銃を用いて試験した。図４に示した結果は、図３Ａ、Ｂに示した人工輸送ペプチドは、レポータータンパク質を効率的に単子葉植物及び双子葉植物の植物細胞の葉緑体内に導くことを実証する。コンセンサスを構築するために用いられる輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列との相同性は最小となるように輸送ペプチドを設計したが、そのターゲティング効率を脅やかすことはなかった。これは、ホストにコードした輸送ペプチドの導入遺伝子の一つに対する相同性が引き起こす、起こり得る導入遺伝子サイレンシングを避けるための予防的措置として行った。
【００２０】
実施例１に記載したように設計した配列を、特異的なＺと３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１との全ての可能な組合せを試験するために用いることができる。実験の概要は、実施例２に記載する。
【００２１】
本発明の実施例３では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ソマトトロピン及びヒトインターフェロンα２ｂを、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物の葉緑体に送達する人工輸送ペプチドの使用について、記載する。タンパク質は両者とも分泌性であり、プロセシングされた型（輸送ペプチドを開裂し分離した後）では、ソマトトロピンではフェニルアラニン（Ｆ）、インターフェロンα２ｂではシステイン（Ｃ）から開始するＮ末端を有する。図６の、枠で囲んだものは、対象のタンパク質のそれぞれのＮ末端に可能な３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１である。図６の融合タンパク質をコードする構築体は、ウィルス発現系の３’プロベクター中（図８）にサブクローニングされ（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻、６８５２〜６８５７頁）、ニコチアナベンサミアナ植物で一過性に発現された。或いは、前記融合タンパク質をコードするベクターは、植物の核ＤＮＡに安定して形質転換することができた。図９に示したウェスタンブロット分析の結果は、２つの３つ組のうち一方（Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１＝Ｒ−Ｆ−Ｎ；ｐＩＣＨ１４０６１Ａ）は正確にプロセシングされたタンパク質に期待されるサイズのｈＧＨの大部分を生成するが、第二の融合体（Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１＝Ｐ−Ｓ−Ｒ；ｐＩＣＨ１４０６１Ｂ）は期待されたサイズにバンドを示さないが、プロセシングされていないｈＧＨ前駆体（Ｕ）及び正確にプロセシングされた成熟タンパク質より小型の不正確に開裂したタンパク質に関連したバンド（Ｓ）を実証している。３つ組の両方とも、Ｇａｖｅｌ及びＶｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、１９９０年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２６１巻、４５５〜４５８頁で示された、予測された輸送ペプチド開裂部位（Ｉ／Ｖ）−Ｘ−（Ａ／Ｃ）−Ａの部分ではないことを考えると、これは本発明の方法が有効であることを実証している。
【００２２】
植物細胞中にＤＮＡ又はＲＮＡベクターを送達するのに、微粒子銃、電気穿孔、又はＰＥＧを介するプロトプラスト処理により前記ベクターを直接植物細胞内に導入することを含む、様々な方法を用いることができる（総説としては、Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻、２２７〜２３２頁、及びＨａｎｓｅｎ及びＷｒｉｇｈｔ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、４巻、２２６〜２３１頁を参照のこと）。植物ＲＮＡ及びＤＮＡウィルスもまた、効率的な送達システムである（Ｈａｙｅｓら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３４巻、１７９〜１８２頁、及びＰａｌｍｅｒら、１９９９年、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４４巻、１３４５〜１３６０頁、Ｌｉｎｄｂｏら、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、４巻、１８１〜１８５頁）。前記ベクターは、植物のゲノムに安定に組み込むか（直接又はアグロバクテリウム属の介するＤＮＡ組込み）、又は導入遺伝子を一過性に発現させる（「アグロインフィルトレーション」（“ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ“））のいずれかのために、導入遺伝子を送達することができる。
【００２３】
本発明に使用する好ましい植物には、農薬的及び園芸的に重要な種を優先してあらゆる植物の種を含む。本発明で使用する一般的な作物には、アルファルファ、オオムギ、豆、カノーラ、ササゲ、綿花、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、カラスムギ、エンドウ、ナンキンマメ、コメ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、ヤムビーン、ベルベットビーン、カラスノエンドウ、コムギ、フジ、及びナッツ植物がある。本発明を実践するのに好ましい植物種は、イネ科、キク科、ナス科、及びバラ科の典型を含むが、これらに制限されない。
さらに、本発明で用いる好ましい種は：アラビドプシス属、コヌカグサ属、ネギ属、キンギョソウ属、オランダミツバ属、ナンキンマメ属、アスパラガス属、ロウトウ属、カラスムギ属、ホウライチク属、アブラナ属、スズメノチャヒキ属、ルリマガリバナ属、チャノキ属、アサ属、トウガラシ属、ヒヨコマメ属（Ｃｉｃｅｒ）、アカザ属、キコリウム属（Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ミカン属、コーヒー属、ハトムギ属、キュウリ属、カボチャ属（Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ）、ギョウギシバ属、カモガヤ属、チョウセンアサガオ属、ニンジン属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、エラエイス属（Ｅｌａｅｉｓ）、オヒシバ属、ウシノゲグサ属、オランダイチゴ属、フウロソウ属、ダイズ属、ヒマワリ属、ヘテロカリス属、ゴムノキ属、オオムギ属、ヒヨス属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、ヒラマメ属（Ｌｅｎｓ）、ユリ属、アマ属、ドクムギ属、ハス属、トマト属、マジョラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、リンゴ属、マンギフェラ属、イモノキ属、ウマゴヤシ属、アフリカウンラン属、タバコ属、オノブリキス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、イネ属、キビ属、ペラルゴニウム属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、チカラシバ属、ペチュニア属、エンドウ属、インゲンマメ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、サクラ属、キンポウゲ属、ダイコン属、スグリ属、トウゴマ属、キイチゴ属、サトウキビ属、サルピグロッシス属、ライムギ属、キオン属、エノコログサ属、シロガラシ属、ナス属、モロコシ属、ステノタフルム属（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）、カカオ属、シャジクソウ属、トリゴネラ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、コムギ属、ソラマメ属、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）、ブドウ属、トウモロコシ属、及びオリルアエ（Ｏｌｙｒｅａｅ）、ファロイダエ（Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ）、及びその他多数の属に由来する植物である。
【００２４】
本発明の範囲内では、薬剤上及び実用のタンパク質を生成するには、食物又は食物連鎖に含まれない植物種が特に好ましい。その中でもタバコ種は、形質転換、及びよく発達した発現ベクター（特にウィルスベクター）系との栽培が容易であるため、最も好ましい。
【００２５】
本発明を用いて対象の細胞のプロセスとして発現させ、分離することができる対象の遺伝子、そのフラグメント（機能的又は非機能的）、及びその人工誘導体は、デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、枝切り酵素、デンプン分枝酵素、デンプン分枝酵素ＩＩ、粒結合デンプン合成酵素）、スクロースリン酸合成酵素、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ（ｐｏｌｙｆｒｕｃｔａｎ  ｓｕｃｒａｓｅ）、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌性レバンスクラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及びオーソログ、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又はこれらの活性フラグメント若しくは変異体）、イソペンテニルトランスフェラーゼ、ＳｃａＭ５（ダイズカルモジュリン）、甲殻類タイプの毒素又は殺虫活性フラグメント、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂肪、アミノ酸、糖、核酸、及び多糖類を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、プロテアーゼの不活性プロ酵素型、植物タンパク質毒素、繊維生成植物における形質変更繊維、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の甲虫類活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣ毒素、デルタエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロ毒素等）、昆虫特有毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、アシドサームスセルロティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ）由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコール脱水素酵素、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニアハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）リコペン合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ｐＴＯＭ３６コードタンパク質、フィターゼ、ケト加水分解酵素、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタン酸）合成酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５コードタンパク質、ＥＴＲ（エチレンレセプター）、色素体ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導性膜孔タンパク質、植物細胞の形質増強光合成又は色素体機能、スチルベン合成酵素、フェノールを水酸化できる酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネートシクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナ属ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ）、ＡＭＶ  ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポティウィルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウィルスレプリカーゼ、ＭＤ��ＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウィルスレプリカーゼ、ウンベルラリアカリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、（ｌｕｘＤ）、植物合成因子Ａ、植物合成因子Ｂ、Δ６−不飽和化酵素、植物細胞において脂肪酸のペルオキシソーム性β酸化における酵素活性を有するタンパク質、アシルＣｏＡ酸化酵素、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、５−エノールピルビン酸シキメート−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、翻訳後開裂部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を授与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌性ニトリラーゼ、２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌性ニトリラーゼ、制限エンドヌクレアーゼを含むその他多くの細菌又はファージの酵素、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ及びＲＮＡｓｅ）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ等を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
我々の発明は、また、分子農業、並びに工業用酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ等）及び線維性タンパク質（コラーゲン、クモの糸のタンパク質等）を含む商業的に価値がありかつ薬剤的に重要なタンパク質の精製の目的に使用することができる。ヒト又は動物の健康タンパク質はいずれも、我々の発明の方法に記載したものを用いて発現し精製することができる。そのような対象のタンパク質の例として、特に、免疫反応タンパク質（モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター等）、病原性微生物に由来するものを含む抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含むポリペプチドホルモン、サイトカイン及びそのレセプター、インターフェロン、増殖因子及び凝固因子、酵素的活性のあるリソソーム酵素、フィブリノーゲン溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、並びに上記タンパク質の融合、変異型、及び合成誘導体のような機能保存性タンパク質が含まれる。
【実施例】
【００２７】
（実施例１）
単子葉植物及び双子葉植物の合成輸送ペプチド配列の生成
ａ）双子葉植物における色素体標的のための輸送ペプチド
様々な双子葉植物由来のルビスコ小サブユニットの前駆体タンパク質（ｒｂｃｓ）に由来する輸送ペプチドを標的とする９個の葉緑体のコンセンサスアミノ酸配列を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアパッケージの配列分析で作成した（図１）。コンセンサス輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、双子葉植物のコドンの使用頻度を考慮に入れて設計し、平均ＧＣ含量が４３．６％になる最高コドン使用頻度値を基準にして各々の３つ組コドンを選択した。また、我々は配列を設計することにより、コンセンサス配列のｃＤＮＡと、コンセンサスを構築するのに用いられる双子葉植物種の輸送ペプチドをコードするｃＤＮＡとの間のｃＤＮＡレベルの相違を最大にしようと試みた。Ｎ末端翻訳融合体をレポーター遺伝子（ＧＦＰ）と共に作成するため、好都合な制限部位の側面に位置する最終ヌクレオチド配列をｄｅ  ｎｏｖｏ合成し、ＣｌａＩ／ＮｃｏＩフラグメント（ＣｌａＩ  ５’−ｃＡＴＣＧＡＴａａｃ  ａｔｇｇｃｔｔｃｔｔ  ｃｔａｔｇｃｔｔｔｃ  ｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔ  ｇｔｔｇｔｔｇｃｔａ  ｃｔｃｇｔｇｃｔａｇ  ｔｇｃｔｇｃｔｃａａ  ｇｃｔａｇｔａｔｇｇ  ｔｔｇｃｔｃｃｔｔｔ  ｔａｃｔｇｇａｃｔｔ  ａａｇｔｃｔｇｃｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｔｔｃｃ  ｔｇｔｔａｃｔａｇａ  ａａｇｃａａａａｃａ  ａｃｃｔｔｇａｔａｔ  ｔａｃｔｔｃｔａｔｔ  ｇｃｔａｇｔａａｃｇ  ｇａｇｇａａｇａｇｔ  ｔｃａａｔｇｃｇＣＣ  ＡＴＧＧ−３’  ＮｃｏＩ）として対象の構築体内にサブクローンした（図３Ａ、プラスミドｐＩＣＨ５３００を参照のこと）。
【００２８】
ｂ）単子葉植物における標的のための輸送ペプチド
上記に述べたのと同様の方法を用いて、単子葉植物において、シグナル配列を標的にして発現する人工葉緑体、及び単子葉植物を標的とする色素体を作製した。様々な単子葉植物のｒｂｃｓタンパク質由来の６個の葉緑体輸送ペプチドに導出されるコンセンサスアミノ酸配列を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアパッケージの配列分析で作成した（図２）。コンセンサス輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物のコドンの使用頻度を考慮に入れて設計し、最終ヌクレオチド配列の平均ＧＣ含量が７１．０％になる最高コドン使用頻度値を基にして各々の３つ組コドンを選択した。単子葉植物種のコンセンサス輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列をｄｅ  ｎｏｖｏ合成し、ＣｌａＩ／ＮｃｏＩ又はＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ−フラグメント（ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ  ５’−ｃＡＴＣＧＡＴＡＧＧ  ＡＴＣＣａｃｇａｔｇ  ｇｃｃｃｃａａｃｃｇ  ｔｇａｔｇｇｃｃｔｃ  ｃｔｃｃｇｃｃａｃｃ  ａｃｃｇｔｇｇｃｃｃ  ｃａｔｔｃｃａｇｇｇ  ｃｃｔｃａａｇｔｃｃ  ａｃｃｇｃｃｇｇｃｃ  ｔｃｃｃａｇｔｇｇｃ  ｃａｇｇａｇｇｔｃｃ  ｔｃｃｇｇｃａｇｃｃ  ｔｃｇｇｃａｇｃｇｔ  ｇａｇｃａａｃｇｇｃ  ｇｇｃａｇｇａｔｃａ  ｇｇｔｇｃｇＣＣＡＴ  ＧＧ−３’ＮｃｏＩ）として対象のベクター内にサブクローンした（図３Ｂ、プラスミドｐＩＣＨ５３２０を参照のこと）。
【００２９】
人工輸送ペプチドの助けを借りて葉緑体ターゲティングの有効性を試験するために、輸送ペプチド−レポーター遺伝子融合体をコードするプラスミドを、微粒子銃の助けを借りてタバコ及びコムギの葉の細胞内に送達した。結果は、人工輸送ペプチドの助けを借りて、双子葉植物種及び単子葉植物種の両方の葉緑体内に導く効果的なＧＦＰを示した（図４）。
【００３０】
（実施例２）
対象のタンパク質の望ましいＮ末端（アラニン以外）を提供するための輸送ペプチド開裂部位の設計及び試験
葉緑体内にターゲティングする対象のタンパク質に必要なＮ末端を生成するために、我々は公的に入手できるデータベースから、予想又は実験的に確認された、約４００個の核にコードされた葉緑体を標的とするタンパク質の輸送ペプチド開裂部位を分析した。この分析の結果を表１に示した。図５に示した構築体を用いて対象のタンパク質に望ましいＮ末端を提供する適性があるか、開裂部位を試験することができる。最も単純な型（構築体Ａ）は、輸送ペプチド（ＴＰ）及びレポーター遺伝子（ＧＦＰ）側面に並ぶクローニング部位からなる。ＧＦＰの最初のメチオニン（Ｍ）は、共に開裂部位を生成するのに適合性のある３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１を見出すために、あらゆる他のアミノ酸Ｚで置換することができる。好適な制限部位であるＲＳ１及びＲＳ２は、ＴＰ及びＧＦＰのコード領域内に位置することができるが、相互に離れておらず（好ましくは３０〜５０ｂｐの範囲内）、そのため構築体に３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１及びアミノ酸残基Ｚの望ましい組合せを導入するために、２個の部分的に一致する対象のプライマーの合成が容易になっている。調製された構築体は、植物細胞で一過性に発現することができ、ＧＦＰの区画化は紫外線顕微鏡下で容易に観察でき、必要とされるＮ末端はタンパク質マイクロシーケンシングで存在を確認できる。ＧＦＰの分離を促進するために、レポータータンパク質のＣ末端終末を（例えば、６ｘＨＩＳ−タグで）タギングすることができる。より複雑な型の試験構築体は対象の遺伝子のＧＦＰ融合体を含む（構築体Ｂ、図５）、というのは、これにより葉緑体で前記対象の遺伝子をプロセシングするという期待された結果についてのさらに精密なデータを提供できるからである。
【００３１】
（実施例３）
本発明による開裂部位に人工輸送ペプチドを用いることによる、ソマトトロピン（ｈＧＨ）及びインターフェロンα２Ｂの葉緑体へのターゲティング
図６に示したタンパク質融合体のコード配列を作成し、標準分子生物学クローニングプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、バイナリーベクターにクローンした（図８）。図６に示したタンパク質融合体に関連したＤＮＡ構築体を、図８に示す。ソマトトロピンの輸送ペプチドとの２個の融合体、及びインターフェロンα２ｂの４個の異なる融合体を、表１のＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の３つ組に従い、Ｎ末端のアミノ酸を、ソマトトロピンはフェニルアラニン（Ｆ）で、インターフェロンα２ｂはシステイン（Ｃ）でそれぞれ作成した。図８に示したバイナリーベクターは、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）をベースとした発現システムの３’構成部分（プロベクター）であり、ＷＯ０２０８８３６９に、及びＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら（２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻、６８５２〜６８５７頁）により詳しく記載されている。ニコチアナべンサミアナ植物を用いて、プロベクター技術を用い、両タンパク質を発現させた。或いは、この実験の目的を達成するために、あらゆる適当な植物発現系を用いることができる。葉緑体のターゲティング及び輸送ペプチドの標的タンパク質から開裂分離の効率を調査するために、葉の材料から可溶タンパク質を全て抽出し、市販で入手できる抗ソマトトロピンモノクローナル抗体（マウス抗−ｈＧＨ、カタログＮｏ：ＲＤＩ−ＴＲＫ２Ｇ２−Ｇｈ２９、米国ニュージャージー州、フランダース、ＲＤＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）及び抗インターフェロンα２ｂモノクローナル抗体（カタログＮｏ．９５３６０−０１２８、ドイツ、ケルン、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いてウェスタンブロットで分析した。２つの異なるＸ−３Ｘ−２Ｘ−１３つ組を用いた色素体標的ｈＧＨのウェスタンブロット分析結果を、図９Ａに示す。これら２つの融合体の発現に用いた構築体（ｐＩＣＨ１４０６１Ａ、Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１＝Ｒ−Ｆ−Ｎ；ｐＩＣＨ１４０６１Ｂ、Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１＝Ｐ−Ｓ−Ｒ）を図９Ｂに示す。
【表１】
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【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】９種の異なる双子葉植物に由来するルビスコ小サブユニットの輸送ペプチドのペプチド配列であり、下はそれらから導かれたコンセンサス配列を示す図である。
【図２】６種の異なる単子葉植物種に由来するルビスコ小サブユニットの輸送ペプチドのペプチド配列であり、下はそれらから導かれたコンセンサス配列示す図である。
【図３Ａ】ｐＩＣＨ５３００ベクターの概要を示す図である。
【図３Ｂ】ｐＩＣＨ５３２０ベクターの概要を示す図である。
【図４】タバコ（Ａ、Ｃ）及びコムギ（Ｂ、Ｄ）の表皮細胞における、ＧＦＰの一過性発現を示す図である。Ａ、Ｂは輸送ペプチドのないＧＦＰ、Ｃは双子葉植物種の合成輸送ペプチドとのＧＦＰ融合体、Ｄは単子葉植物の合成輸送ペプチドとのＧＦＰ融合体である。
【図５】ある所定のＮ末端アミノ酸Ｚで対象のタンパク質の最適なＸ−３Ｘ−２Ｘ−１の３つ組をスクリーニングするための構築体を示す図である。ＴＰはＣ末端アミノ酸Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１のない輸送ペプチドをコードする配列、ＧＯＩは対象の遺伝子、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質をコードする配列、ｐｒ１及びｐｒ２はＸ−３Ｘ−２Ｘ−１−Ｚ配列をコードする領域を設計しクローニングするオーバーラッププライマー、ＲＳ１及びＲＳ２はカスタムの制限酵素切断部位である。
【図６】合成輸送ペプチドにより対象のタンパク質（ソマトトロピン又はインターフェロンα２ｂ）を色素体内にターゲティングするための融合タンパク質に予想される全てのタイプのアミノ酸配列を示す図である。融合タンパク質は、輸送ペプチドを開裂して分離した後、対象のタンパク質の必要なＮ末端アミノ酸配列を生成するように設計されている。下線を付けたものは合成輸送ペプチド、枠で囲んだものは輸送ペプチドのＣ末端アミノ酸として予想されたＸ−３Ｘ−２Ｘ−１３つ組の変異体、太文字は対象のタンパク質の最初のアミノ酸配列である。
【図７】図６に示したタンパク質融合体をコードするＤＮＡ配列を示す図である。
【図８】バイナリーベクターであるｐＩＣＨ１４０６１及びｐＩＣＨ１４０７１のＴ−ＤＮＡ領域の概要を示す図である。
【図９Ａ】輸送ペプチドのＣ末端アミノ酸として、予想された２つの異なる３つ組Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１の変異体を用いて、色素体標的ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ソマトトロピンのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。  抗ｈＧＨ抗体のウェスタンブロットである。レーンＣは成熟ｈＧＨ（対照）、レーン１、２はｐＩＣＨ１４０６１Ａから発現されたｈＧＨ、レーン３、４はｐＩＣＨ１４０６１Ｂから発現されたｈＧＨ、ＵはｈＧＨ前駆物質（未処理）、Ｍは成熟、正確にプロセシングされたｈＧＨ、Ｓは不正確にプロセシングされた（小型）ｈＧＨである。
【図９Ｂ】バイナリーベクターｐＩＣＨ１４０６１Ａ及びｐＩＣＨ１４０６１ＢのＴ−ＤＮＡ領域の詳細図である。ＴＰは輸送ペプチド、Ｐは転写プロモータ、Ｔは転写ターミネータ、ＮＰＴはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ＮＴＲはタバコモザイクウィルスの３’非翻訳領域である。アミノ酸３つ組Ｒ−Ｆ−Ｎ（ｐＩＣＨ１４０６１Ａ）及びＰ−Ｓ−Ｒ（ｐＩＣＨ１４０６１Ｂ）は、Ｎ末端側からＣ末端側の方向に一文字アミノ酸コードで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【国際調査報告】
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