(57)【要約】  本発明は、対称ジメチル化アルギニンを含有し、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清に存在する抗体の免疫学的決定基を構成し、前記抗体との反応に対してメチル化が必要条件であるペプチドに関する。本発明はまた、ＳＬＥ診断及びＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別のための前記ペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清中に存在する抗体と反応することができる、対称ジメチル化アルギニン（ｓＤＭＡ）を含む１５個から１６個のアミノ酸を含有するペプチド（Ｓ３３）。
【請求項２】
アミノ酸配列
ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ
を含む、請求項１に記載のＳ３３ペプチド。
【請求項３】
前記ジメチル化アルギニンが、ＳｍＤ３のポリペプチド配列において１１２番の位置にある、請求項１及び２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記対称ジメチル化アルギニンの構造が、
【化１】
2007528840.tif 000012
である、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の診断のための、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の血清中に存在する抗体と反応することができる、対称ジメチル化アルギニン（ＳＤＭＡ）を含む１５個から１６個のアミノ酸を含有するペプチド（Ｓ３３）の使用。
【請求項６】
ＳＬＥ患者と混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）患者とを見分ける鑑別診断のための、請求項５に記載のペプチド（Ｓ３３）の使用。
【請求項７】
前記診断が、ＳＬＥのインビトロ診断である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記ペプチドが、ｄｓＤＮＡ陰性ＳＬＥ患者の疾患活性のインビトロ監視のために使用される、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記ペプチドが、ＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別のために使用される、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
前記ペプチドが、アミノ酸配列
ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ
を含む、請求項５から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記ジメチル化アルギニンが、ＳｍＤ３のポリペプチド配列において１１２番目の位置にある、請求項５から１０のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドを含有する、多量体ペプチドの使用。
【請求項１３】
前記対称ジメチル化アルギニンの構造が、
【化２】
2007528840.tif 000013
である、請求項５から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
アミノ酸のうち１個が対称ジメチル化アルギニン（ｓＤＭＡ）であり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の血清中に存在する抗体と反応することができる、１５個から１６個のアミノ酸のペプチド（Ｓ３３）を含む、前記抗体の検出のためのキット。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ＳＬＥのインビトロ診断のために使用される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＳＬＥと混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）とを区別するための鑑別診断に前記ペプチドが使用される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列
ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ
を含む、請求項１４から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
前記ジメチル化アルギニンが、ＳｍＤ３のポリペプチド配列において１１２番の位置にある、請求項１４から１７のいずれかに記載のペプチドの使用のためのキット。
【請求項１９】
前記対称ジメチル化アルギニンの構造が、
【化３】
2007528840.tif 000014
である、請求項１４から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
治療効果又は疾患活性を監視するために、前記抗体の力価を追跡するための反復試験を行うことを含む、疾患活性を監視するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対称ジメチル化アルギニンを含有し、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清に存在する抗体の免疫学的決定基を構成し、前記抗体との反応に対してメチル化が必要条件であるペプチドに関する。本発明はまた、ＳＬＥの診断及びＳＬＥと混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）との鑑別のための前記ペプチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性リウマチ性疾患の特徴は、一定の細胞内標的に対する循環性の自己抗体が生じることである（ｖｏｎ  Ｍｕｈｌｅｎ及びＴａｎ、１９９５にまとめられている。）。それらの自己抗体のうち最初に同定されたものは、抗−Ｓｍであり、これは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と密接に関連している（Ｔａｎ及びＫｕｎｋｅｌ、１９９６）。従って、抗−Ｓｍ抗体は、この疾患に対するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ分類基準の１つに含まれている（Ｔａｎら、１９８２）。Ｓｍ−複合体抗ＤＮＡを標的とする自己抗体とは別に、抗−ＰＣＮＡ、抗−Ｕ１−ＲＮＰ、抗−ヌクレオソーム、抗−ヒストン、抗−Ｒｏ／ＳＳ−Ａ、抗−Ｌａ／ＳＳ−Ｂ、抗−リボソームＲＮＰ及び抗−リン脂質抗体が、ＳＬＥに罹患している患者において見られることが多い（ｖｏｎ  Ｍｕｈｌｅｎ及びＴａｎ、１９９５）。
【０００３】
抗−Ｓｍ反応性は、平均でＳＬＥ患者の５％から３０％で見られるが、特異的頻度は、検出系及びＳＬＥ集団の人種構成により様々となろう（Ａｂｕａｆら、１９９０；Ｊａｅｋｅｌら、２００１）。Ｓｍ−抗原は、核の前駆体ｍ−ＲＮＡのスプライシングを触媒するスプライソソーム複合体の一部である（Ｓｅｒａｐｈｉｎ、１９９５；Ｌｅｒｎｅｒら、１９８０）。その複合体そのものが、少なくとも９個の、分子量が９ｋＤａから２５ｋＤａの範囲にある様々なポリペプチドを含有する［Ｂ（Ｂ１、２８ｋＤａ）、Ｂ’（Ｂ２、２９ｋＤａ）、Ｎ（Ｂ３、２９．５ｋＤａ）、Ｄ１（１６ｋＤａ）、Ｄ２（１６．５ｋＤａ）、Ｄ３（１８ｋＤａ）、Ｅ（１２ｋＤａ）、Ｆ（１１ｋＤａ）及びＧ（９ｋＤａ）］（Ｈｏｃｈ、１９９４）。それらのコアタンパク質は全て、抗Ｓｍ免疫反応の標的として働き得るが、最も頻度が高いのは、Ｂ及びＤポリペプチドであり、従ってこれらは主要な抗原とみなされている（Ｈｏｃｈ、１９９４；Ｂｒａｈｍｓら、１９９７；Ｏｕら、１９９７）。しかし、ＭＣＴＤ患者において自己抗体の標的となることが多いＳｍＢＢ’及びＵ１特異的ＲＮＰｓは交差反応性エピトープを共有しているため、ＳｍＤが最も特異的なＳｍ−抗原とみなされる（ｖａｎ  Ｖｅｒｏｏｉｊら、１９９１；Ｈｏｃｈら、１９９９）。ＳｍＤファミリーの中で、ＳｍＤ１／Ｄ３パターンは、ＳｍＤ１に対する顕著な免疫反応性によるＳｍＤ１／Ｄ２／Ｄ３認識よりも少なくとも４倍よく見られる（Ｈｏｃｈら、１９９９）。エピトープマッピング研究において、直線状及び立体エピトープがいくつかＳｍＢ及びＤタンパク質にマッピングされている（Ｒｏｋｅａｃｈら、１９９２；Ｈｉｒａｋａｔａら、１９９３）。ＳｍＤ１及びＢＢ’において、主要な反応は、主にＣ−末端伸長において見られる（Ｒｏｋｅａｃｈら、１９９２；Ｈｉｒａｋａｔａら、１９９３；Ｒｏｋｅａｃｈ及びＨｏｃｈ、１９９２）。ＳｍＢＢ’のＣ−末端伸長内で３回起こるエピトープ、ＰＰＰＧＭＲＰＰは、Ｕ１特異的抗原等のスプライソソーム自己抗原及びＨＩＶ−１のｐ２４  ｇａｇ等のレトロウイルスタンパク質の他のプロリンリッチな構造と交差反応することが示された（Ｄｅ  Ｋｅｙｓｅｒら、１９９２）。追跡研究及び免疫付与試験から、このモチーフが常に、ＢＢ’分子内の、及びＳｍＤ−ポリペプチドに対するエピトープスプレッディング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の開始点として作用する、初期の検出可能なＳｍＢＢ’エピトープであることが明らかになった（Ａｒｂｕｃｋｌｅ、１９９９；Ｇｒｅｉｄｉｎｇｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ、２００１）。最近の研究で、全分子に分布する、ＳｍＤ２における５個の直線状エピトープ及びＳｍＤ３における４個の直線状エピトープが同定された（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。これらのエピトープは全て、同じ基本的特性を有し、それらを抗原にならしめるタンパク質表面で露出される（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。ＳｍＤ３における説明したＢ−細胞エピトープの１つ（エピトープ４；ａａ  １０４−１２６）は、最終的に交差反応を導くＳｍＤ１タンパク質由来の抗原領域と密接なホモロジーを示した（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。診断目的に対��て、診断に使用できる感度及び特異性、それぞれ３６％から７０％の範囲及び９１．７％から９７．２％の範囲、を有するＥＬＩＳＡシステムを開発するために、ＳｍＤ１のＣ−末端伸長に相当する合成ペプチドが用いられた（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９９８；Ｊａｅｋｅｌら、２００１）。最近、ポリペプチドＤ１、Ｄ３及びＢＢ’が、ＳｍＤ１のＣ−末端内で主要な自己エピトープを構成する対称ジメチルアルギニン（ｓＤＭＡ）を含有することが示された（Ｂｒａｈｍｓら、２０００；Ｂｒａｈｍｓら、２００１）。これらの研究のうちの１つにおいて、ｓＤＭＡを含有するＳｍＤ１の合成ペプチド（ａａ  ９５−１１９）が、以前のデータとの矛盾を示す非修飾ペプチドと比較して、免疫反応が顕著に高いことが明らかとなった（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９９８；Ｂｒａｈｍｓら、２０００）。
【０００４】
国際特許ＷＯ第９９／１１６６７号において、メチル化アルギニンを含有し、ＳＬＥ患者由来の血清中又はエプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ））に存在する抗体の抗原決定基を構成し、前記抗体と反応するためにそのメチル化が必要条件であるペプチドを調製するための方法が記載されている。しかし、これらのペプチドは概括的に説明されており、ペプチド配列と自己免疫疾患診断能との間の関係は何ら開示されていない。
【０００５】
本発明の要約
ここで、発明者らは、発明者らの請求する、ある一定の位置に対称ジメチル化アルギニンを含有するペプチドがＳＬＥの診断に不可欠であることを見出し、驚くべきことに、ＳＬＥ患者の鑑別及びＳＬＥとＭＣＴＤとを鑑別するための特異性及び信頼性が高い診断免疫アッセイにこのペプチドを使用することができることを示した。本ペプチドの多量体もまた、同じ目的に対して使用できる。請求するペプチドを含有するキットは、ＳＬＥの診断ならびにＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別に使用することができる。本発明の長所は、ＭＣＴＤ試料群から偽陽性試料を拾い上げないことである。
【０００６】
本発明の目的は、抗−Ｓｍ抗体を検出するための分析方法を提供することである。
【０００７】
本発明により、驚くべきことに、ＳｍＤ３配列内のあるアルギニン残基の対称ジメチル化がその抗原性に重要であることが分かった。
【０００８】
従って、ある局面において、本発明は、抗体と反応することができる、対称なジメチル化アルギニン（ｓＤＭＡ）を含む１５個から１６個のアミノ酸を含有するペプチド（Ｓ３３）を提供するが、前記ペプチドと前記抗体との反応に前記ジメチル化が不可欠であり、前記抗体は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清中に存在する。
【０００９】
第２の局面において、本Ｓ３３ペプチドは、アミノ酸配列、
ＡＡＲＧｓＤＭＡ  ＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦを含有する。
【００１０】
第３の局面において、本対称ジメチル化アルギニンは、ＳｍＤ３のポリペプチド配列における１１２番の位置にある。
【００１１】
第４の局面において、本Ｓ３３ペプチドは、構造、
【００１２】
【化４】
2007528840.tif 000002
を有する対称ジメチル化アルギニンを含有する。
【００１３】
第５の局面において、本発明は、ＳＬＥのインビトロ診断に本Ｓ３３ペプチドを使用するための方法である。
【００１４】
第６の局面において、本発明は、ＳＬＥと混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）との鑑別のために本Ｓ３３ペプチドを使用するための方法である。
【００１５】
第７の局面において、本発明は、ｄｓＤＮＡ陰性ＳＬＥ患者における疾患活性のインビトロ監視に本Ｓ３３ペプチドを使用するためのキットであるが、ここで疾患活性とは、新規ミモトープペプチドに対する抗体の力価とその疾患活性との間の相関関係として定義される。
【００１６】
第８の局面において、本発明は、治療効果又は疾患活性を監視するために反復試験により前記抗体力価を追跡するための方法である。
【００１７】
第９の局面において、本発明は、本Ｓ３３ペプチドを複数含有する多量体ペプチドである。
【００１８】
本発明の詳細な説明
【実施例１】
【００１９】
血清サンプル
血清（ｎ＝６２８）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；ｎ＝１７６）、関節リウマチ（ＲＡ、ｎ＝８６）、シェーグレン症候群（ＳＳ、ｎ＝２４）；混合性結合組織病（ＭＣＴＤ、ｎ＝２６）、強皮症（Ｓｓｃ、ｎ＝２６）及び多発性筋炎／皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ、ｎ＝１３）の患者から回収した。各疾患に対するＡＣＲ基準（Ｔａｎら、１９８２；Ａｒｎｅｔｔら、１９８８）により全患者を分類した。さらにそのアッセイ特異性を評価するために、発明者らは、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ；ｎ＝３０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ｎ＝２２）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ；ｎ＝２５）を含む感染症患者（ｎ＝７７）、由来の血清群、ならびに１９２名の健常血液提供者由来の血清群を分析した。使用するまで全血清を−８０℃で保存した。エピトープマッピングのために、抗−Ｓｍ抗体を含有する５つの血清のパネルを使用した。ネガティブコントロールとして、抗−Ｓｍ以外の他の抗体特異性を有する自己免疫血清を選択した。
【００２０】
無作為に選択したＳＬＥ患者血清の血清学的特性
ヒストン、ｄｓＤＮＡ及びＳｍ−複合体に対する自己抗体について、定量的Ｖａｒｅｌｉｓａ（Ｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、自己免疫患者の血清を全て試験した。予想外の結果を示したＳＬＥ血清及び試料もまた、半定量的ＡＮＡ−Ｓｐｌｉｔ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅｓａｒｃｈ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にいおて測定した。後者のアッセイには、自己抗原  Ｕ１−６８ｋＤａ、Ｕ１−Ａ、Ｕ１−Ｃ、ＳｍＢＢ’、ＳｍＤ、Ｒｏ−５２、Ｒｏ−６０及びＬａが含まれる。ＥＬＩＳＡは全て、使用説明書に従って行った。
【実施例２】
【００２１】
固定化オリゴペプチドを用いたエピトープマッピング
ＳｍＤ１の公表されている配列、Ｐ１３６４１（Ｒｏｋｅａｃｈら、１９８８）及びＳｍＤ３、Ｐ４３３３１、（Ｌｅｈｍｅｉｅｒら、１９９４）を使用して、Ｇａｕｓｅｐｏｈｌ及びＢｅｈｎ（２００２）により述べられたプロトコールに従い、ピペッティングロボットを用いて重複１５マーペプチドを合成した。オフセットを２アミノ酸にして、両ポリペプチドのＣ−末端伸長を合成した（１３アミノ酸重複）。天然アルギニン、ｓＤＭＡ又は非対称ジメチルアルギニン（ａｓＤＭＡ）をそれぞれの位置に有する３種類の変異体として各アルギニン含有ペプチドを合成した。後に、天然アルギニン及びｓＤＭＡの一定の組み合わせを用いてＳｍＤ３の高反応性ペプチドを合成した。ペプチド合成完了後、ブロッキング緩衝液（ＢＢ）中で室温（ＲＴ）にてメンブレンを一晩インキュベーションすることにより非特異的結合部位をブロックした。１回の洗浄段階後、ＢＢ中で１：１００に希釈した血清試料とともに、ＲＴにて２時間、膜をインキュベーションした。洗浄段階を３回行い、非結合抗体を除去した。検出のために、ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＢＢ中で１：５０００に希釈し、７５分間インキュベーションを行った（ＲＴ）。洗浄段階を３回行い過剰な二次抗体を除去した。最後に、高感度化学発光（ＥＣＬ）検出系を使用して、結合した抗体を視覚化した。アッセイ条件はネガティブ血清が反応性を示さない条件を用いた。
【実施例３】
【００２２】
Ｓ３３−ペプチドＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ−プレートの調製
凍結乾燥させたＳ３３ペプチドを使用して、１０μｇ／μｌの保存溶液を調製し、使用するまで分注したものを−２０℃において保存した。各ウェルの最終体積が１２０μｌとなるようにして、被覆用緩衝液中で本ペプチド２．５μｇ／ｍｌを用いてＥＬＩＳＡプレートに対する本ペプチドの結合を行った。被覆手順は１５℃にて２０時間行った。非特異的結合部位をブロッキング溶液でブロックした。そのブロッキング溶液を捨てた後、固相を３７℃にて２時間乾燥させ、密封した。
【００２３】
本アッセイは、Ｖａｒｅｌｉｓａ（Ｒ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の一般プロトコールに従い行った。供血者の反応性は、０．４Ｕ／ｍｌから１１．５Ｕ／ｍｌの範囲であり、その結果、平均値が２．２Ｕ／ｍｌ及びＳＤが１．２Ｕ／ｍｌであることが明らかになった。カットオフは、ＲＯＣ−解析後に技術的に１３Ｕ／ｍｌに設定した。ＰＰＶｓ及びＮＰＶｓは、異なるカットオフ値で計算した。
【００２４】
精度と再現性
不正確さの測定（アッセイ間及びアッセイ内の変動）は、それぞれ４回及び６回繰り返して行った。抗−Ｓｍ血清に適切な抗−Ｓ３３ペプチドＥＬＩＳＡの精度を評価するために、１日の間に５回の独立した試験において（アッセイ間）、又は１回の試験において（アッセイ内）、低値試料（Ｌ）；中間値試料（Ｍ）及び高値試料（Ｈ）をアッセイした。試験内精度を調べるために、１つの固相においてＬ、Ｍ及びＨを６回反復測定した。ＡＮＯＶＡ解析を用いて精度データを計算した。
【００２５】
直線性
最高濃度の標準試料（Ｓ６）の、及び精度解析における高値試料（Ｈ）の希釈物（１：１；２：３；１：２；１：４；１：８；１：１６；１：３２）を試験することにより、直線性を解析した。各希釈点に対して、予想値に対する測定反応値の比を計算し、この比率から１を差し引いた。
【実施例４】
【００２６】
相関研究
様々な製造者の市販の抗−Ｓｍ抗体テスト（Ｓｍ  ｔｅｓｔ  Ａ−Ｓｍ  Ｔｅｓｔ  Ｄ）を使用して、無作為に選択したＳＬＥ血清（ｎ＝５０）及び様々な対照（ｎ＝１００）を試験し、抗−Ｓ３３ＥＬＩＳＡテストの所見とその結果を比較した。
【実施例５】
【００２７】
ＳＬＥ患者の追跡研究
男性のＳＬＥ患者を臨床的及び血清学的に１８ヶ月の期間にわたり観察した（６例の血清試料；図３参照。）。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのそれぞれのテストキットを使用して、ＲＮＰ／Ｓｍ複合体、Ｓｍ抗原、単離Ｕ１−ＲＮＰ複合体、ヒストン、ｄｓＤＮＡ及びＳ３３ペプチドに対する抗体について、本患者を試験した。
【００２８】
結果
ＳｍＤ１及びＤ３のＣ−末端伸長のエピトープ精細マッピング
ＳｍＤ１及びＳｍＤ３の抗原性に対するアルギニン−ジメチル化の影響を評価し、両ポリペプチドにおける関連エピトープをマッピングするために、ＳｍＤ１（Ｐ１３６４１）及びＳｍＤ３（Ｐ４３３３１）のＣ−末端領域を含むペプチドアレイ（１５マー、２オフセット）を用いて、抗−Ｓｍ血清のパネルを試験した。
【００２９】
その結果、アルギニン残基のジメチル化が、Ｃ−末端  ＳｍＤ１及びＤ３ポリペプチドに対する抗−Ｓｍ抗体の結合に顕著に影響を与えることが示される（図１参照）。抗ＳｍＤ血清は全て（＃３６、＃３７、＃３１、＃８４、＃Ｓｍ）、対称形態のジメチルアルギニン（ｓＤＭＡ）を含有するＳｍＤ１ペプチドに対する結合性が上昇していることが明らかになった。特に、グリシン及びＤＭＡリピートからなるペプチドのみが、それらの抗体に対して強い反応性を示した（ペプチド番号９、１０）。とは言え、ＤＭＡを含有するＳｍＤ１ポリペプチドは、抗−セントロメア抗体（ＡＣＡ；＃ｓｅｒｕｍ  ＣＥＮ（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒ））の標的でもあるので、抗−Ｓｍ抗体にとってむしろ非特異的な基質である。興味深いことに、それらのＡＣＡは、非対称形のＤＭＡを含有するペプチドにも結合した。
【００３０】
ＳｍＤ３由来のペプチドとの結合実験から同様の結果が示された。ｓＤＭＡ含有ＳｍＤ３ペプチドのみが、抗−Ｓｍ抗体と反応したことから、アルギニン残基の対称的メチル化が重要であることが確認される（図１ｂ参照）。ＳｍＤ１と比較して、対照血清（例えばＣＥＮ）では、ＳｍＤ３由来ペプチドに対する抗体結合は見られないが、これは高い特異性を反映するものである。ある特定のペプチド（第７７番、１０８ＡＡｓｄＲＧｓｄＲＧｓｄＲＧＭＧｓｄＲＧＮＩＦ１２２）が、５種類の抗−Ｓｍ血清のうち３種類により強く認識された。１０８ＡＡＲＧＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２のアルギニン残基が連続的にｓＤＭＡに置換された突然変異分析を用いて、発明者らは、１個のジメチル化アルギニン残基を１１２番の位置に有するミモトープペプチドが５種類の抗−Ｓｍ血清全て（＃３６、＃３７、＃３１、＃８４、＃Ｓｍ）に対して免疫反応性を示すが対照（例えばＣＥＮ；図１ｃ参照）には示さないことを明らかにすることができた。従って、ｓＤＭＡを１個のみ、ＳｍＤ３の決められた位置（アミノ酸１１２）に導入することにより、特異性を失うことなく、このペプチド（１０８ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２；Ｓ３３）の感度を増強することができた。この候補ペプチドをその後、可溶性抗原として合成し、ＥＬＩＳＡにおける基質として使用した。
【００３１】
ＳＬＥ患者群の免疫血清学的性質
発明者らのＳＬＥ患者コホートが典型的なＳＬＥ血清パネルを示すか否かを評価するために、約１００検体のＳＬＥ試料を無作為に選択し、Ｕ１−６８ｋＤ、Ｕ１−Ａ、Ｕ１−Ｃ、ＳｍＢＢ’、ＳｍＤ、Ｒｏ−５２／ＳＳ−Ａ、Ｒｏ−６０／ＳＳ−Ａ、Ｌａ／ＳＳ−Ｂ、ヒストンｄｓＤＮＡ及びβ２−糖タンパク質反応性（Ｓｐｌｉｔ  ＡＮＡ−Ｐｒｏｆｉｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｓｓａｙ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）について試験した。様々な自己抗体の保有率は、先行研究と十分一致していた（Ｊａｅｋｅｌら、２００１）。従って、それらの自己抗体プロファイルに関して、本ＳＬＥコホートは、典型的なＳＬＥ集団であると思われる。このＳＬＥパネルの測定結果を表１にまとめる。
【００３２】
表１．ＳＬＥ患者における臨床的に意義のある自己抗体特異性の保有率（％）（ｎ＝１０１）
【００３３】
【表１】
2007528840.tif 000003
【００３４】
抗−Ｓ３３ペプチド  ＥＬＩＳＡ
ＳＰＯＴアッセイにおいて最高の感度及び特異性を示した１５個のアミノ酸可容性ペプチド（１０８ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２）を、技術的な理由でＣ−末端にＣｙｓを追加することにより合成した。このペプチドをその後、Ｖａｒｅｌｉｓａ（Ｒ）テスト（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の一般プロトコールに基づきＥＬＩＳＡシステムを開発するために使用した。
【００３５】
アッセイの性能特性
アッセイの性能特性の精密度を評価するために、再現性及び直線性を分析した。３種類の試料のアッセイ内及びアッセイ間の変動（ＣＶ％）は、それぞれ、１．８２％から６．５２％及び２．２７％から７．４２％の範囲であることが分かった。２つの試料の連続希釈物から、５回の連続希釈の範囲で直線性が示された（＞２０％  偏差）。カットオフの定義のために、ＳＬＥ及び対照血清を用いて受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を行った。アッセイ内及びアッセイ間変動（ａ．）、直線性（ｂ．）、ＲＯＣ−解析、ＰＰＶ、ＮＰＶ及び効率（ｃ．）を含む新規の抗−Ｓ３３試験のアッセイ性能特性を図２（ａ−ｃ）にまとめる。
【００３６】
この新規テストの診断適合率を評価するために、１３Ｕ／ｍｌの技術的カットオフを使用して、特異性を高くして感度を中程度にした。１７６名のＳＬＥ患者、１８１名のＳＬＥ以外の診断を受けた自己免疫疾患患者、７７名の感染症患者及び１９２名のヒト健常供血者から得た血清を、この新規ＥＬＩＳＡシステムで分析した。２８名のＳＬＥ患者（１５．９％）において、平均値  ４３Ｕ／ｍｌ（ＳＤ＝１６０．２Ｕ／ｍｌ）、最高で９５２Ｕ／ｍｌまで反応性が著しく上昇し、抗−Ｓ３３抗体に対して陽性であると分析された。関連疾患の患者では、この新規ＥＬＩＳＡシステムにおいて反応性が著しく低いことが分かった（平均  ３．３６Ｕ／ｍｌ）。ＲＡ群でただ１名の患者のみ、陽性と分析された（２４．６Ｕ／ｍｌ）。ＳＳｃ（ｎ＝２６）、ＰＭ／ＤＭ（ｎ＝１３）、ＭＣＴＤ（ｎ＝１２６）又は感染症（ｎ＝７７）患者を含め、残りの対照は、このＳ３３ペプチドに対する反応性を示さなかった。健常供血者と比較しても（平均  ２．２１Ｕ／ｍｌ；最高値  １１．５Ｕ／ｍｌ）、感染症患者由来の試料は反応性が低い（平均  ０．６７Ｕ／ｍｌ；最高値  ３．３Ｕ／ｍｌ）ことが分かった。感染症患者血清の最高値は、ＥＢＶ群で見られた。この結果を表２にまとめる。
【００３７】
表２．ＳＬＥ及び様々な対照血清に対するＳ３３を使用したＥＬＩＳＡの結果
【００３８】
【表２】
2007528840.tif 000004
【００３９】
要約すると、ＳＬＥ群（ｎ＝１７６）のうち１５試料及び対照のうち１血清のみ（ｎ＝４４９、０．２％）が陽性と分析され、その結果、診断特異性は９９．８％、感度は１５．９％となった。ＰＰＶ及びＮＰＶ、ならびに診断効率は、計算の結果、それぞれ
９６．６％、７５．３％及び７６．３％となった（図２ｃ参照）。これらのデータから、抗−Ｓ３３抗体がＳＬＥ患者由来の血清にのみ存在すると思われる。
【００４０】
抗−Ｓ３３ペプチド反応性とは別に、偽陽性ｒａ試料は、ｕ１−ｒｎｐｓ−６８ｋＤａ（比率  ４．５）、ｕ１−ｃ（比率９．４）及びヒストン（１３３．８ｕ／ｍｌ）に対する抗体のタイターが高い（表３参照）。ｅｌｉｓａにより測定した場合、抗−ｓｍｂｂ’及び抗−ｓｍｄタイターは、対照と比較して上昇していたが、依然としてカットオフ値以下であった（表３参照）。
【００４１】
表３．新規Ｓ３３ペプチドアッセイにおける偽陽性ＲＡ患者の自己抗体プロファイル
【００４２】
【表３】
2007528840.tif 000005
【００４３】
他の自己抗体に対する相関
抗−Ｓ３３抗体と他の自己抗体種との間に存在しうる相関関係について、約１００例の無作為選択血清のＳＬＥパネルを用いて統計学的評価を行った。Ｕ１−６８ｋＤａ（ｐ＝０．０３３５）、Ｕ１−Ａ（ｐ＜０．０００１）、Ｕ１−Ｃ（ｐ＜０．０００１）、ＳｍＢＢ’（ｐ＜０．０００１）、ＳｍＤ（ｐ＜０．０００１）、ｄｓＤＮＡ（ｐ＜０．０００１）及びヒストン（ｐ＜０．０００１）と有意な相関があったが、Ｒｏ−５２（ｐ＝０．２１９２）、Ｒｏ−６０（ｐ＝０．２２１２）及びＬａ（ｐ＝０．８７８５）とは有意な相関がなかった（表４参照）。
【００４４】
表４．ＳＬＥにおける抗−Ｓ３３陽性結果と他のＡａｂ種との間の関連
【００４５】
【表４】
2007528840.tif 000006
【００４６】
Ｓｍ複合体に対する反応性に着目すると、無作為選択したＳＬＥ患者（ｎ＝１０１）のうち５例が精製ＳｍＤ抗原と反応したが、Ｓ３３ペプチドとは反応しなかった。残りの１１例のＳｍＤ陽性血清（６８．８％）も、この新規抗−Ｓ３３ペプチドＥＬＩＳＡにおいて陽性であると分析された。興味深いことに、抗−Ｓ３３陽性試料のうち、４名の患者（＃８９、＃９２、＃２０６２７、＃９８１１）の全てが抗−ＳｍＤ陰性で、それぞれ１５．４、２１．３、４１．３及び１３．９ユニットの抗−Ｓ３３ペプチド反応性を示した。
【００４７】
様々な製造元の市販の抗−Ｓｍ抗体テストとの相関を評価するために、ＳＬＥ患者群由来の５０検体の無作為選択ＳＬＥ血清及び１００検体の対照を、様々な製造元の抗−Ｓｍ抗体テストを用いて試験した。この抗−Ｓ３３抗体テストにおいて５０検体のＳＬＥ血清のうち６検体（１２％）が陽性となったが対照では陽性になったものはなく（０％）、その結果、１２％の感度及び１００％の特異性となった。一方、様々な製造元の抗−Ｓｍアッセイ、ＳｍテストＡ、Ｂ及びＣでは、わずか５検体のＳＬＥ試料（１０％）しか陽性とならず、対照群の患者では、６検体（ＳｍテストＡ、Ｃ）から１２検体（ＳｍテストＤ）が陽性となった。偽陽性となった結果のほとんどがＭＣＴＤ患者の群で見られた（表５参照）。
【００４８】
表５．様々な製造元のテストにおける対照血清（主にＭＣＴＤ）の反応性
【００４９】
【表５】
2007528840.tif 000007
【００５０】
ＳＬＥ患者の追跡研究
男性ＳＬＥ患者を臨床的及び血清学的に１８ヶ月の期間にわたり観察した（６検体の血清試料；図３参照）。追跡研究の最初に、この患者はＲＮＰ／Ｓｍ複合体（比率１８）、Ｓｍ抗原（比率  ６）、新規Ｓｍ抗原（３３７．５Ｕ／ｍｌ）に対して強い免疫反応を示し、単離Ｕ１−ＲＮＰ複合体（比率  ２）ならびにヒストン（５９．５Ｕ／ｍｌ）に対して中程度の反応を示した。ｄｓＤＮＡに対する反応性は見られなかった（１９．１Ｕ／ｍｌ；カットオフ値  ５５Ｕ／ｍｌ）。その時点で、医療記録によると、疾患の非活動フェーズであると報告されていた。後に、新規Ｓｍ抗原に対する抗体に対する抗体力価が顕著に上昇し、１９９９年８月に採取した３番目の血清試料においてピークに到達した。一方、抗−ＲＮＰ／Ｓｍタイターは、２番目と４番目の血液試料との間で上昇が観察され、５番目の試料においてさらに強い上昇が見られた。その時点で、新規Ｓｍ抗原（Ｓ３３）に対するタイターは、以前よりも低下しており、疾患の状態は、医療記録によると非活動として報告されていた。その患者の観察期間中に抗−ｄｓＤＮＡ及び抗−ヒストンタイターにおいては顕著な変化が観察されなかった。
【００５１】
示した実施例において、Ｓｍ抗原  Ｄ１及びＤ３に対して、抗−Ｓｍ免疫反応を分析したが、これらはＳＬＥ特異的ポリペプチドと考えられる（ｖａｎ  Ｖｅｎｒｏｏｊｉら、１９９１；Ｈｏｃｈら、１９９９）。固定化ペプチドを用いて、両自己抗原においてアルギニン残基の対称ジメチル化が主要なＢ細胞エピトープの形成に重要な役割を果たすことが示された。この観察は、Ｂｒａｈｍｓら（２０００）の結果とよく一致しており、従って、Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎ及び共同研究者ら（１９９８）の知見とは矛盾していた。興味深いことに、先行研究に加えて、既に述べたように、ペプチドに関して、ＳｍＤ３ペプチドはＳｍＤ１由来のものよりも特異性が高いことが分かった。
【００５２】
ＭｃＣｌａｉｎ及び共同研究者ら（２００２）は、ＳｍＤ３の４個の抗原性領域について述べているが、そのうち抗原領域４は、１０４−１２６の領域を包含している。この発明において、ピン上で合成したペプチドを分析に供したが、アルギニンの修飾型は用いなかった。本発明において、この領域内の反応性は、天然アルギニンをｓＤＭＡに置換した場合にのみ見られる。これらの矛盾する結果は、異なる血清、方法の使用及び／又はペプチドの長さが様々であることにより説明できるであろう。５種類の血清のうち３種類が、この実施例のペプチド、１０８ＡＡｓｄＲＧｓｄＲＧｓｄＲＧＭＧｓｄＲＧＮＩＦ１２２を特異的に認識した。
【００５３】
興味深いことに、決められた位置（ａａ  １１２）で１個のアルギニンのみをジメチル化することにより、特異性を失うことなく、この特定のミモトープペプチドの感度をさらに向上させることができる。このデータに基づき、候補ペプチド（１０８ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２）を使用してＥＬＩＳＡシステムを開発した。この新規抗−Ｓｍアッセイ（抗−Ｓ３３）は、ループスに対して１４．９％の感度及び９９．７％の特異性を示し、その結果、陽性的中率（ＰＰＶ；９３．７％）及び陰性的中率（ＮＰＶ；８０．２％）が高くなり、したがって高い診断効率（８０．７％）が得られたことが示された。したがって、相関研究により明らかになったように、このテストにより、全身性エリテマトーデス診断、特にＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別に対する新たな機会が得られる。
【００５４】
同定されたＳｍ−エピトープの生化学的特性に着目すると、ｐＩがＳｍ複合体の抗原性の予想因子とみなすことができることが分かる。Ｕ１−ＲＮＰ−Ａ、ＳｍＢ’及びＤ１において、抗原性領域の平均ｐＩは、１０．４（非抗原性領域は６．０）であり、ＳｍＤ２及びＤ３では、ｐＩが９．０を超えていた（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。これらの独創的な知見は、Ｓ３３ペプチドのｐＩが高値（＞１２．８８）であることとよく一致する。塩基性の性質であることが単純にこれらの領域の表面露出、つまり抗体へ接触の可能性を上昇させているだけであるか否かについて、さらに調べる必要がある。
【００５５】
ＥＢＶ、ＥＢＶＡ及び抗−ＳｍＤ抗体
ＳｍＤ１におけるエピトープマッピング研究により、エプスタインバーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）の相同配列  ３５−５８と交差反応するエピトープモチーフ（ａａ９５−１１９）が同定された（Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、１９９３；Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、１９９３；Ｍａｒｃｈｉｎｉら、１９９４）。さらに最近の研究により、このエピトープがグリシンアルギニンリピート（ＲＧＲＧＲＧＭＧＲ）を含有するＳｍＤ３の相同領域とも交差反応することが示された（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。さらに、ＧＰＲＲ（ＳｍＤ１のａａ  １１４−１１９）が共通の交差反応性自己エピトープモチーフを表し、それはＥＢＮＡ−１においてだけでなく、ＣＥＮＰ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＳｍＢＢ’、ＳｍＤ１及びＲｏ−５２（これらはごく一部である。）を含む様々な自己抗原においても存在することが明らかになった（Ｍａｈｌｅｒら、２００１）。したがって、感染性単核球症又はＳＬＥ関連疾患の患者は、ＳｍＤ１又はＳｍＤ３のＣ−末端伸長を用いたＥＬＩＳＡにおいて偽陽性となる可能性がある。さらに、あるいくつかの研究から、ループス様状態の進行におけるＥＢＶの影響が示唆される（Ｊａｍｅｓら、１９９７）。したがって、ＥＢＶ陽性血清を対照として使用することは、特異性及び信頼性が高い抗−ＳｍＤ免疫アッセイに向けての重要な発見であると考えられる。提示された２５例のＥＢＶ疾患対照の中で偽陽性の試料が見られなかったことから、抗−Ｓ３３−ａｂｓアッセイが高い特異性を有するという示唆が裏付けられる。残念ながら、Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎ及び共同研究者ら（１９９８）は、それらのテストの評価にこの患者群を含めていなかった。
【００５６】
他の自己抗体種に対する相関
ＤＮＡとＳｍ抗原との間で重複する反応性があることを報告している文献がある（Ｂｌｏｏｍら、１９９３；Ｒｅｉｃｈｌｉｎら、１９９４；Ｚｈａｎｇら、１９９５）。これらの研究においては全長ＳｍＤが使用されているが、一方、本発明においては抗−ｄｓＤＮＡ及び抗−Ｓ３３反応性の相関もあった（ｐ＜０．０００１）。ＤＮＡの他に、本発明では、Ｕ１−６８（ｐ＜０．０００１）、Ｕ１−Ａ（ｐ＜０．０００１）、Ｕ１−Ｃ（ｐ＜０．０００１）、ＳｍＢＢ’（ｐ＜０．０００１）、Ｓｍ（ｐ＜０．０００１）及びＳｍＤ（ｐ＜０．０００１）に対する抗−Ｓ３３の正相関も示されたが、ヒストン（ｐ＝０．０２５９）、Ｌａ（ｐ＝０．８７４７）、Ｒｏ−５２（ｐ＝０．４０３４）及びＲｏ−６０（ｐ＝０．０１４３）に対する相関関係は示されなかった。観察された関連性が、交差反応性により生じるのか、又は同時に生じることが多い異なる自己抗体種により生じるのか否かについては依然として分かっていない。この問題をさらに明らかにするために、さらなる研究に取り組む必要がある。
【００５７】
ＲｉｅｍｅｋａｓｔｅｎとＢｒａｈｍｓ
ＲｉｅｍｅｋａｓｔｅｎらとＢｒａｈｍｓらの結果が明らかに矛盾することは、ＳｍＤ１のＣ−末端伸長に様々なエピトープが存在することにより説明することが可能であろう。ペプチドａａ  ８３−１１９（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９８９）は立体エピトープを形成し得るが、一方で、第二の研究で使用された短いペプチドは、直線状の、ｓＤＭＡ依存性結合部位を含有する（Ｂｒａｈｍｓら、２０００）。さらに、ＳｍＤ１８３−１１９ペプチドと比較して、全長ＳｍＤ１に対する反応性が低下している（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９９８）ことから、このペプチドエピトープが隠れた構造を示すことが示唆される。この観察により、どのエピトープがインビトロで「見られ」、どのエピトープがＳＬＥの発症機序において中心的役割を果たすのか、という疑問が浮上する。最近の研究において、キャリアタンパク質と融合させたＳｍＤ１８３−１１９の注射により、ループス傾向のマウスの発病過程を加速することが可能であることが明らかとなった（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、２００１）。
【００５８】
「ループス」症候群
関節リウマチ（ＲＡ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己免疫病因の関連疾患である。両疾患とも、一定の構造に対する自己反応性抗体の出現を伴う。いくつかの研究において、ＲＡとループスとの間の重複する症候群が報告されており、従って、「ループス」症候群と呼ばれることがある（Ｍｉｙａｃｈｉ及びＴａｎ，１９７９；Ｐａｎｕｓｈら、１９８８；Ｂｒａｎｄら、１９９２）。本実施例において、ＲＡ群内で、抗−Ｓ３３反応性（２４．６Ｕ／ｍｌ）を示す患者が見出された。この結果が偽陽性の試験結果を反映するか否か、又は本Ｓ３３ペプチドに対する自己抗体がループス様状態の前駆体となるか否かについては未だ明らかではなく、取り組むべき問題である。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１ａ】ＳｍＤ１及びＳｍＤ３のエピトープ分析。ＳｍＤ１（ａ）及びＳｍＤ３（ｂ）のＣ−末端伸長をペプチドアレイとして合成し（１５マー、ａａカットオフ）、患者の血清を用いて調べた。免疫活性ペプチド番号７７をミモトープ変異体（ｃ）としてさらに試験した。
【図１ｂ】ＳｍＤ１及びＳｍＤ３のエピトープ分析。ＳｍＤ１（ａ）及びＳｍＤ３（ｂ）のＣ−末端伸長をペプチドアレイとして合成し（１５マー、ａａカットオフ）、患者の血清を用いて調べた。免疫活性ペプチド番号７７をミモトープ変異体（ｃ）としてさらに試験した。
【図１ｃ】ＳｍＤ１及びＳｍＤ３のエピトープ分析。ＳｍＤ１（ａ）及びＳｍＤ３（ｂ）のＣ−末端伸長をペプチドアレイとして合成し（１５マー、ａａカットオフ）、患者の血清を用いて調べた。免疫活性ペプチド番号７７をミモトープ変異体（ｃ）としてさらに試験した。
【図２ａ】新規抗−Ｓ３３アッセイのアッセイ性能特性。アッセイ内及びアッセイ間の変動ａ．）、直線性（ｂ．）及び、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）及び様々なカットオフにおける効率（ｃ．）を含む、受信者動作特性  ＲＯＣ−分析。
【図２ｂ】新規抗−Ｓ３３アッセイのアッセイ性能特性。アッセイ内及びアッセイ間の変動ａ．）、直線性（ｂ．）及び、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）及び様々なカットオフにおける効率（ｃ．）を含む、受信者動作特性  ＲＯＣ−分析。
【図２ｃ】新規抗−Ｓ３３アッセイのアッセイ性能特性。アッセイ内及びアッセイ間の変動ａ．）、直線性（ｂ．）及び、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）及び様々なカットオフにおける効率（ｃ．）を含む、受信者動作特性  ＲＯＣ−分析。
【図３】男性ＳＬＥ患者を１８ヶ月の期間にわたり、臨床的及び血清学的に観察した。
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月3日(2005.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清中に存在する抗体と反応することができる、対称ジメチル化アルギニン（ｓＤＭＡ）を含む１５個から１６個のアミノ酸を含有するペプチド（Ｓ３３）。
【請求項２】
アミノ酸配列
ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ
を含む、請求項１に記載のＳ３３ペプチド。
【請求項３】
前記ジメチル化アルギニンが、ＳｍＤ３のポリペプチド配列において１１２番の位置にある、請求項１及び２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記対称ジメチル化アルギニンの構造が、
【化１】
2007528840.tif 000022
である、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の診断用の組成物の製造のための、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の血清中に存在する抗体と反応することができる、対称ジメチル化アルギニン（ＳＤＭＡ）を含む、１５個から１６個のアミノ酸を含有するペプチド（Ｓ３３）の使用。
【請求項６】
前記診断がＳＬＥ患者と混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）患者とを見分けるための鑑別診断である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記診断が、ＳＬＥのインビトロ診断である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記組成物が、ｄｓＤＮＡ陰性ＳＬＥ患者の疾患活性のインビトロ監視のために使用される、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が、ＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別のために使用される、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
前記ペプチドが、アミノ酸配列
ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ
を含む、請求項５から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記ジメチル化アルギニンが、ＳｍＤ３のポリペプチド配列において１１２番目の位置にある、請求項５から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドを含む、多量体ペプチドの使用。
【請求項１３】
前記対称ジメチル化アルギニンの構造が、
【化２】
2007528840.tif 000023
である、請求項５から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
アミノ酸のうち１個が対称ジメチル化アルギニン（ｓＤＭＡ）であり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の血清中に存在する抗体と反応することができる、１５個から１６個のアミノ酸のペプチド（Ｓ３３）を含む、前記抗体の検出のためのキット。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ＳＬＥのインビトロ診断のために使用される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＳＬＥと混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）とを区別するための鑑別診断に前記ペプチドが使用される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列
ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ
を含む、請求項１４から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
前記ジメチル化アルギニンが、ＳｍＤ３のポリペプチド配列において１１２番の位置にある、請求項１４から１７のいずれかに記載のペプチドの使用のためのキット。
【請求項１９】
前記対称ジメチル化アルギニンの構造が、
【化３】
2007528840.tif 000024
である、請求項１４から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
治療効果又は疾患活性を監視するために、請求項１−４のいずれかに記載のペプチドと反応できる抗体の力価を追跡するための反復試験を行うことを含む、疾患活性を監視するための方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月22日(2006.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対称ジメチル化アルギニンを含有し、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清に存在する抗体の免疫学的決定基を構成し、前記抗体との反応に対してメチル化が必要条件であるペプチドに関する。本発明はまた、ＳＬＥの診断及びＳＬＥと混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）との鑑別のための前記ペプチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性リウマチ性疾患の特徴は、一定の細胞内標的に対する循環性の自己抗体が生じることである（ｖｏｎ  Ｍｕｈｌｅｎ及びＴａｎ、１９９５にまとめられている。）。それらの自己抗体のうち最初に同定されたものは、抗−Ｓｍであり、これは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と密接に関連している（Ｔａｎ及びＫｕｎｋｅｌ、１９９６）。従って、抗−Ｓｍ抗体は、この疾患に対するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ分類基準の１つに含まれている（Ｔａｎら、１９８２）。Ｓｍ−複合体抗ＤＮＡを標的とする自己抗体とは別に、抗−ＰＣＮＡ、抗−Ｕ１−ＲＮＰ、抗−ヌクレオソーム、抗−ヒストン、抗−Ｒｏ／ＳＳ−Ａ、抗−Ｌａ／ＳＳ−Ｂ、抗−リボソームＲＮＰ及び抗−リン脂質抗体が、ＳＬＥに罹患している患者において見られることが多い（ｖｏｎ  Ｍｕｈｌｅｎ及びＴａｎ、１９９５）。
【０００３】
抗−Ｓｍ反応性は、平均でＳＬＥ患者の５％から３０％で見られるが、特異的頻度は、検出系及びＳＬＥ集団の人種構成により様々となろう（Ａｂｕａｆら、１９９０；Ｊａｅｋｅｌら、２００１）。Ｓｍ−抗原は、核の前駆体ｍ−ＲＮＡのスプライシングを触媒するスプライソソーム複合体の一部である（Ｓｅｒａｐｈｉｎ、１９９５；Ｌｅｒｎｅｒら、１９８０）。その複合体そのものが、少なくとも９個の、分子量が９ｋＤａから２５ｋＤａの範囲にある様々なポリペプチドを含有する［Ｂ（Ｂ１、２８ｋＤａ）、Ｂ’（Ｂ２、２９ｋＤａ）、Ｎ（Ｂ３、２９．５ｋＤａ）、Ｄ１（１６ｋＤａ）、Ｄ２（１６．５ｋＤａ）、Ｄ３（１８ｋＤａ）、Ｅ（１２ｋＤａ）、Ｆ（１１ｋＤａ）及びＧ（９ｋＤａ）］（Ｈｏｃｈ、１９９４）。それらのコアタンパク質は全て、抗Ｓｍ免疫反応の標的として働き得るが、最も頻度が高いのは、Ｂ及びＤポリペプチドであり、従ってこれらは主要な抗原とみなされている（Ｈｏｃｈ、１９９４；Ｂｒａｈｍｓら、１９９７；Ｏｕら、１９９７）。しかし、ＭＣＴＤ患者において自己抗体の標的となることが多いＳｍＢＢ’及びＵ１特異的ＲＮＰｓは交差反応性エピトープを共有しているため、ＳｍＤが最も特異的なＳｍ−抗原とみなされる（ｖａｎ  Ｖｅｒｏｏｉｊら、１９９１；Ｈｏｃｈら、１９９９）。ＳｍＤファミリーの中で、ＳｍＤ１／Ｄ３パターンは、ＳｍＤ１に対する顕著な免疫反応性によるＳｍＤ１／Ｄ２／Ｄ３認識よりも少なくとも４倍よく見られる（Ｈｏｃｈら、１９９９）。エピトープマッピング研究において、直線状及び立体エピトープがいくつかＳｍＢ及びＤタンパク質にマッピングされている（Ｒｏｋｅａｃｈら、１９９２；Ｈｉｒａｋａｔａら、１９９３）。ＳｍＤ１及びＢＢ’において、主要な反応は、主にＣ−末端伸長において見られる（Ｒｏｋｅａｃｈら、１９９２；Ｈｉｒａｋａｔａら、１９９３；Ｒｏｋｅａｃｈ及びＨｏｃｈ、１９９２）。ＳｍＢＢ’のＣ−末端伸長内で３回起こるエピトープ、ＰＰＰＧＭＲＰＰ（配列番号１）は、Ｕ１特異的抗原等のスプライソソーム自己抗原及びＨＩＶ−１のｐ２４  ｇａｇ等のレトロウイルスタンパク質の他のプロリンリッチな構造と交差反応することが示された（Ｄｅ  Ｋｅｙｓｅｒら、１９９２）。追跡研究及び免疫付与試験から、このモチーフが常に、ＢＢ’分子内の、及びＳｍＤ−ポリペプチドに対するエピトープスプレッディング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の開始点として作用する、初期の検出可能なＳｍＢＢ’エピトープであることが明らかになった（Ａｒｂｕｃｋｌｅ、１９９９；Ｇｒｅｉｄｉｎｇｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ、２００１）。最近の研究で、全分子に分布する、ＳｍＤ２における５個の直線状エピトープ及びＳｍＤ３における４個の直線状エピトープが同定された（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。これらのエピトープは全て、同じ基本的特性を有し、それらを抗原にならしめるタンパク質表面で露出される（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。ＳｍＤ３における説明したＢ−細胞エピトープの１つ（エピトープ４；ａａ  １０４−１２６）は、最終的に交差反応を導くＳｍＤ１タンパク質由来の抗原領域と密接なホモロジーを示した（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）��診断目的に対して、診断に使用できる感度及び特異性、それぞれ３６％から７０％の範囲及び９１．７％から９７．２％の範囲、を有するＥＬＩＳＡシステムを開発するために、ＳｍＤ１のＣ−末端伸長に相当する合成ペプチドが用いられた（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９９８；Ｊａｅｋｅｌら、２００１）。最近、ポリペプチドＤ１、Ｄ３及びＢＢ’が、ＳｍＤ１のＣ−末端内で主要な自己エピトープを構成する対称ジメチルアルギニン（ｓＤＭＡ）を含有することが示された（Ｂｒａｈｍｓら、２０００；Ｂｒａｈｍｓら、２００１）。これらの研究のうちの１つにおいて、ｓＤＭＡを含有するＳｍＤ１の合成ペプチド（ａａ  ９５−１１９）が、以前のデータとの矛盾を示す非修飾ペプチドと比較して、免疫反応が顕著に高いことが明らかとなった（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９９８；Ｂｒａｈｍｓら、２０００）。
【０００４】
国際特許ＷＯ第９９／１１６６７号において、メチル化アルギニンを含有し、ＳＬＥ患者由来の血清中又はエプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ））に存在する抗体の抗原決定基を構成し、前記抗体と反応するためにそのメチル化が必要条件であるペプチドを調製するための方法が記載されている。しかし、これらのペプチドは概括的に説明されており、ペプチド配列と自己免疫疾患診断能との間の関係は何ら開示されていない。
【０００５】
本発明の要約
ここで、発明者らは、発明者らの請求する、ある一定の位置に対称ジメチル化アルギニンを含有するペプチドがＳＬＥの診断に不可欠であることを見出し、驚くべきことに、ＳＬＥ患者の鑑別及びＳＬＥとＭＣＴＤとを鑑別するための特異性及び信頼性が高い診断免疫アッセイにこのペプチドを使用することができることを示した。本ペプチドの多量体もまた、同じ目的に対して使用できる。請求するペプチドを含有するキットは、ＳＬＥの診断ならびにＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別に使用することができる。本発明の長所は、ＭＣＴＤ試料群から偽陽性試料を拾い上げないことである。
【０００６】
本発明の目的は、抗−Ｓｍ抗体を検出するための分析方法を提供することである。
【０００７】
本発明により、驚くべきことに、ＳｍＤ３配列内のあるアルギニン残基の対称ジメチル化がその抗原性に重要であることが分かった。
【０００８】
従って、ある局面において、本発明は、抗体と反応することができる、対称なジメチル化アルギニン（ｓＤＭＡ）を含む１５個から１６個のアミノ酸を含有するペプチド（Ｓ３３）を提供するが、前記ペプチドと前記抗体との反応に前記ジメチル化が不可欠であり、前記抗体は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者由来の血清中に存在する。
【０００９】
第２の局面において、本Ｓ３３ペプチドは、アミノ酸配列、
ＡＡＲＧｓＤＭＡ  ＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ（配列番号２）を含有する。
【００１０】
第３の局面において、本対称ジメチル化アルギニンは、ＳｍＤ３のポリペプチド配列における１１２番の位置にある。
【００１１】
第４の局面において、本Ｓ３３ペプチドは、構造、
【００１２】
【化４】
2007528840.tif 000025
を有する対称ジメチル化アルギニンを含有する。
【００１３】
第５の局面において、本発明は、ＳＬＥのインビトロ診断に本Ｓ３３ペプチドを使用するための方法である。
【００１４】
第６の局面において、本発明は、ＳＬＥと混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）との鑑別のために本Ｓ３３ペプチドを使用するための方法である。
【００１５】
第７の局面において、本発明は、ｄｓＤＮＡ陰性ＳＬＥ患者における疾患活性のインビトロ監視に本Ｓ３３ペプチドを使用するためのキットであるが、ここで疾患活性とは、新規ミモトープペプチドに対する抗体の力価とその疾患活性との間の相関関係として定義される。
【００１６】
第８の局面において、本発明は、治療効果又は疾患活性を監視するために反復試験により前記抗体力価を追跡するための方法である。
【００１７】
第９の局面において、本発明は、本Ｓ３３ペプチドを複数含有する多量体ペプチドである。
【００１８】
本発明の詳細な説明
【実施例１】
【００１９】
血清サンプル
血清（ｎ＝６２８）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；ｎ＝１７６）、関節リウマチ（ＲＡ、ｎ＝８６）、シェーグレン症候群（ＳＳ、ｎ＝２４）；混合性結合組織病（ＭＣＴＤ、ｎ＝２６）、強皮症（Ｓｓｃ、ｎ＝２６）及び多発性筋炎／皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ、ｎ＝１３）の患者から回収した。各疾患に対するＡＣＲ基準（Ｔａｎら、１９８２；Ａｒｎｅｔｔら、１９８８）により全患者を分類した。さらにそのアッセイ特異性を評価するために、発明者らは、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ；ｎ＝３０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ｎ＝２２）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ；ｎ＝２５）を含む感染症患者（ｎ＝７７）、由来の血清群、ならびに１９２名の健常血液提供者由来の血清群を分析した。使用するまで全血清を−８０℃で保存した。エピトープマッピングのために、抗−Ｓｍ抗体を含有する５つの血清のパネルを使用した。ネガティブコントロールとして、抗−Ｓｍ以外の他の抗体特異性を有する自己免疫血清を選択した。
【００２０】
無作為に選択したＳＬＥ患者血清の血清学的特性
ヒストン、ｄｓＤＮＡ及びＳｍ−複合体に対する自己抗体について、定量的Ｖａｒｅｌｉｓａ（Ｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、自己免疫患者の血清を全て試験した。予想外の結果を示したＳＬＥ血清及び試料もまた、半定量的ＡＮＡ−Ｓｐｌｉｔ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅｓａｒｃｈ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にいおて測定した。後者のアッセイには、自己抗原  Ｕ１−６８ｋＤａ、Ｕ１−Ａ、Ｕ１−Ｃ、ＳｍＢＢ’、ＳｍＤ、Ｒｏ−５２、Ｒｏ−６０及びＬａが含まれる。ＥＬＩＳＡは全て、使用説明書に従って行った。
【実施例２】
【００２１】
固定化オリゴペプチドを用いたエピトープマッピング
ＳｍＤ１の公表されている配列、Ｐ１３６４１（Ｒｏｋｅａｃｈら、１９８８）及びＳｍＤ３、Ｐ４３３３１、（Ｌｅｈｍｅｉｅｒら、１９９４）を使用して、Ｇａｕｓｅｐｏｈｌ及びＢｅｈｎ（２００２）により述べられたプロトコールに従い、ピペッティングロボットを用いて重複１５マーペプチドを合成した。オフセットを２アミノ酸にして、両ポリペプチドのＣ−末端伸長を合成した（１３アミノ酸重複）。天然アルギニン、ｓＤＭＡ又は非対称ジメチルアルギニン（ａｓＤＭＡ）をそれぞれの位置に有する３種類の変異体として各アルギニン含有ペプチドを合成した。後に、天然アルギニン及びｓＤＭＡの一定の組み合わせを用いてＳｍＤ３の高反応性ペプチドを合成した。ペプチド合成完了後、ブロッキング緩衝液（ＢＢ）中で室温（ＲＴ）にてメンブレンを一晩インキュベーションすることにより非特異的結合部位をブロックした。１回の洗浄段階後、ＢＢ中で１：１００に希釈した血清試料とともに、ＲＴにて２時間、膜をインキュベーションした。洗浄段階を３回行い、非結合抗体を除去した。検出のために、ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＢＢ中で１：５０００に希釈し、７５分間インキュベーションを行った（ＲＴ）。洗浄段階を３回行い過剰な二次抗体を除去した。最後に、高感度化学発光（ＥＣＬ）検出系を使用して、結合した抗体を視覚化した。アッセイ条件はネガティブ血清が反応性を示さない条件を用いた。
【実施例３】
【００２２】
Ｓ３３−ペプチドＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ−プレートの調製
凍結乾燥させたＳ３３ペプチドを使用して、１０μｇ／μｌの保存溶液を調製し、使用するまで分注したものを−２０℃において保存した。各ウェルの最終体積が１２０μｌとなるようにして、被覆用緩衝液中で本ペプチド２．５μｇ／ｍｌを用いてＥＬＩＳＡプレートに対する本ペプチドの結合を行った。被覆手順は１５℃にて２０時間行った。非特異的結合部位をブロッキング溶液でブロックした。そのブロッキング溶液を捨てた後、固相を３７℃にて２時間乾燥させ、密封した。
【００２３】
本アッセイは、Ｖａｒｅｌｉｓａ（Ｒ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の一般プロトコールに従い行った。供血者の反応性は、０．４Ｕ／ｍｌから１１．５Ｕ／ｍｌの範囲であり、その結果、平均値が２．２Ｕ／ｍｌ及びＳＤが１．２Ｕ／ｍｌであることが明らかになった。カットオフは、ＲＯＣ−解析後に技術的に１３Ｕ／ｍｌに設定した。ＰＰＶｓ及びＮＰＶｓは、異なるカットオフ値で計算した。
【００２４】
精度と再現性
不正確さの測定（アッセイ間及びアッセイ内の変動）は、それぞれ４回及び６回繰り返して行った。抗−Ｓｍ血清に適切な抗−Ｓ３３ペプチドＥＬＩＳＡの精度を評価するために、１日の間に５回の独立した試験において（アッセイ間）、又は１回の試験において（アッセイ内）、低値試料（Ｌ）；中間値試料（Ｍ）及び高値試料（Ｈ）をアッセイした。試験内精度を調べるために、１つの固相においてＬ、Ｍ及びＨを６回反復測定した。ＡＮＯＶＡ解析を用いて精度データを計算した。
【００２５】
直線性
最高濃度の標準試料（Ｓ６）の、及び精度解析における高値試料（Ｈ）の希釈物（１：１；２：３；１：２；１：４；１：８；１：１６；１：３２）を試験することにより、直線性を解析した。各希釈点に対して、予想値に対する測定反応値の比を計算し、この比率から１を差し引いた。
【実施例４】
【００２６】
相関研究
様々な製造者の市販の抗−Ｓｍ抗体テスト（Ｓｍ  ｔｅｓｔ  Ａ−Ｓｍ  Ｔｅｓｔ  Ｄ）を使用して、無作為に選択したＳＬＥ血清（ｎ＝５０）及び様々な対照（ｎ＝１００）を試験し、抗−Ｓ３３ＥＬＩＳＡテストの所見とその結果を比較した。
【実施例５】
【００２７】
ＳＬＥ患者の追跡研究
男性のＳＬＥ患者を臨床的及び血清学的に１８ヶ月の期間にわたり観察した（６例の血清試料；図３参照。）。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのそれぞれのテストキットを使用して、ＲＮＰ／Ｓｍ複合体、Ｓｍ抗原、単離Ｕ１−ＲＮＰ複合体、ヒストン、ｄｓＤＮＡ及びＳ３３ペプチドに対する抗体について、本患者を試験した。
【００２８】
結果
ＳｍＤ１及びＤ３のＣ−末端伸長のエピトープ精細マッピング
ＳｍＤ１及びＳｍＤ３の抗原性に対するアルギニン−ジメチル化の影響を評価し、両ポリペプチドにおける関連エピトープをマッピングするために、ＳｍＤ１（Ｐ１３６４１）及びＳｍＤ３（Ｐ４３３３１）のＣ−末端領域を含むペプチドアレイ（１５マー、２オフセット）を用いて、抗−Ｓｍ血清のパネルを試験した。
【００２９】
その結果、アルギニン残基のジメチル化が、Ｃ−末端  ＳｍＤ１及びＤ３ポリペプチドに対する抗−Ｓｍ抗体の結合に顕著に影響を与えることが示される（図１参照）。抗ＳｍＤ血清は全て（＃３６、＃３７、＃３１、＃８４、＃Ｓｍ）、対称形態のジメチルアルギニン（ｓＤＭＡ）を含有するＳｍＤ１ペプチドに対する結合性が上昇していることが明らかになった。特に、グリシン及びＤＭＡリピートからなるペプチドのみが、それらの抗体に対して強い反応性を示した（ペプチド番号９、１０）。とは言え、ＤＭＡを含有するＳｍＤ１ポリペプチドは、抗−セントロメア抗体（ＡＣＡ；＃ｓｅｒｕｍ  ＣＥＮ（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒ））の標的でもあるので、抗−Ｓｍ抗体にとってむしろ非特異的な基質である。興味深いことに、それらのＡＣＡは、非対称形のＤＭＡを含有するペプチドにも結合した。
【００３０】
ＳｍＤ３由来のペプチドとの結合実験から同様の結果が示された。ｓＤＭＡ含有ＳｍＤ３ペプチドのみが、抗−Ｓｍ抗体と反応したことから、アルギニン残基の対称的メチル化が重要であることが確認される（図１ｂ参照）。ＳｍＤ１と比較して、対照血清（例えばＣＥＮ）では、ＳｍＤ３由来ペプチドに対する抗体結合は見られないが、これは高い特異性を反映するものである。ある特定のペプチド（第７７番、１０８ＡＡｓｄＲＧｓｄＲＧｓｄＲＧＭＧｓｄＲＧＮＩＦ１２２、配列番号３）が、５種類の抗−Ｓｍ血清のうち３種類により強く認識された。１０８ＡＡＲＧＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２（配列番号４）のアルギニン残基が連続的にｓＤＭＡに置換された突然変異分析を用いて、発明者らは、１個のジメチル化アルギニン残基を１１２番の位置に有するミモトープペプチドが５種類の抗−Ｓｍ血清全て（＃３６、＃３７、＃３１、＃８４、＃Ｓｍ）に対して免疫反応性を示すが対照（例えばＣＥＮ；図１ｃ参照）には示さないことを明らかにすることができた。従って、ｓＤＭＡを１個のみ、ＳｍＤ３の決められた位置（アミノ酸１１２）に導入することにより、特異性を失うことなく、このペプチド（１０８ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２；Ｓ３３、配列番号２）の感度を増強することができた。この候補ペプチドをその後、可溶性抗原として合成し、ＥＬＩＳＡにおける基質として使用した。
【００３１】
ＳＬＥ患者群の免疫血清学的性質
発明者らのＳＬＥ患者コホートが典型的なＳＬＥ血清パネルを示すか否かを評価するために、約１００検体のＳＬＥ試料を無作為に選択し、Ｕ１−６８ｋＤ、Ｕ１−Ａ、Ｕ１−Ｃ、ＳｍＢＢ’、ＳｍＤ、Ｒｏ−５２／ＳＳ−Ａ、Ｒｏ−６０／ＳＳ−Ａ、Ｌａ／ＳＳ−Ｂ、ヒストンｄｓＤＮＡ及びβ２−糖タンパク質反応性（Ｓｐｌｉｔ  ＡＮＡ−Ｐｒｏｆｉｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｓｓａｙ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）について試験した。様々な自己抗体の保有率は、先行研究と十分一致していた（Ｊａｅｋｅｌら、２００１）。従って、それらの自己抗体プロファイルに関して、本ＳＬＥコホートは、典型的なＳＬＥ集団であると思われる。このＳＬＥパネルの測定結果を表１にまとめる。
【００３２】
表１．ＳＬＥ患者における臨床的に意義のある自己抗体特異性の保有率（％）（ｎ＝１０１）
【００３３】
【表１】
2007528840.tif 000026
【００３４】
抗−Ｓ３３ペプチド  ＥＬＩＳＡ
ＳＰＯＴアッセイにおいて最高の感度及び特異性を示した１５個のアミノ酸可容性ペプチド（１０８ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２、配列番号２）を、技術的な理由でＣ−末端にＣｙｓを追加することにより合成した。このペプチドをその後、Ｖａｒｅｌｉｓａ（Ｒ）テスト（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の一般プロトコールに基づきＥＬＩＳＡシステムを開発するために使用した。
【００３５】
アッセイの性能特性
アッセイの性能特性の精密度を評価するために、再現性及び直線性を分析した。３種類の試料のアッセイ内及びアッセイ間の変動（ＣＶ％）は、それぞれ、１．８２％から６．５２％及び２．２７％から７．４２％の範囲であることが分かった。２つの試料の連続希釈物から、５回の連続希釈の範囲で直線性が示された（＞２０％  偏差）。カットオフの定義のために、ＳＬＥ及び対照血清を用いて受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を行った。アッセイ内及びアッセイ間変動（ａ．）、直線性（ｂ．）、ＲＯＣ−解析、ＰＰＶ、ＮＰＶ及び効率（ｃ．）を含む新規の抗−Ｓ３３試験のアッセイ性能特性を図２（ａ−ｃ）にまとめる。
【００３６】
この新規テストの診断適合率を評価するために、１３Ｕ／ｍｌの技術的カットオフを使用して、特異性を高くして感度を中程度にした。１７６名のＳＬＥ患者、１８１名のＳＬＥ以外の診断を受けた自己免疫疾患患者、７７名の感染症患者及び１９２名のヒト健常供血者から得た血清を、この新規ＥＬＩＳＡシステムで分析した。２８名のＳＬＥ患者（１５．９％）において、平均値  ４３Ｕ／ｍｌ（ＳＤ＝１６０．２Ｕ／ｍｌ）、最高で９５２Ｕ／ｍｌまで反応性が著しく上昇し、抗−Ｓ３３抗体に対して陽性であると分析された。関連疾患の患者では、この新規ＥＬＩＳＡシステムにおいて反応性が著しく低いことが分かった（平均  ３．３６Ｕ／ｍｌ）。ＲＡ群でただ１名の患者のみ、陽性と分析された（２４．６Ｕ／ｍｌ）。ＳＳｃ（ｎ＝２６）、ＰＭ／ＤＭ（ｎ＝１３）、ＭＣＴＤ（ｎ＝１２６）又は感染症（ｎ＝７７）患者を含め、残りの対照は、このＳ３３ペプチドに対する反応性を示さなかった。健常供血者と比較しても（平均  ２．２１Ｕ／ｍｌ；最高値  １１．５Ｕ／ｍｌ）、感染症患者由来の試料は反応性が低い（平均  ０．６７Ｕ／ｍｌ；最高値  ３．３Ｕ／ｍｌ）ことが分かった。感染症患者血清の最高値は、ＥＢＶ群で見られた。この結果を表２にまとめる。
【００３７】
表２．ＳＬＥ及び様々な対照血清に対するＳ３３を使用したＥＬＩＳＡの結果
【００３８】
【表２】
2007528840.tif 000027
【００３９】
要約すると、ＳＬＥ群（ｎ＝１７６）のうち１５試料及び対照のうち１血清のみ（ｎ＝４４９、０．２％）が陽性と分析され、その結果、診断特異性は９９．８％、感度は１５．９％となった。ＰＰＶ及びＮＰＶ、ならびに診断効率は、計算の結果、それぞれ
９６．６％、７５．３％及び７６．３％となった（図２ｃ参照）。これらのデータから、抗−Ｓ３３抗体がＳＬＥ患者由来の血清にのみ存在すると思われる。
【００４０】
抗−Ｓ３３ペプチド反応性とは別に、偽陽性ｒａ試料は、ｕ１−ｒｎｐｓ−６８ｋＤａ（比率  ４．５）、ｕ１−ｃ（比率９．４）及びヒストン（１３３．８ｕ／ｍｌ）に対する抗体のタイターが高い（表３参照）。ｅｌｉｓａにより測定した場合、抗−ｓｍｂｂ’及び抗−ｓｍｄタイターは、対照と比較して上昇していたが、依然としてカットオフ値以下であった（表３参照）。
【００４１】
表３．新規Ｓ３３ペプチドアッセイにおける偽陽性ＲＡ患者の自己抗体プロファイル
【００４２】
【表３】
2007528840.tif 000028
【００４３】
他の自己抗体に対する相関
抗−Ｓ３３抗体と他の自己抗体種との間に存在しうる相関関係について、約１００例の無作為選択血清のＳＬＥパネルを用いて統計学的評価を行った。Ｕ１−６８ｋＤａ（ｐ＝０．０３３５）、Ｕ１−Ａ（ｐ＜０．０００１）、Ｕ１−Ｃ（ｐ＜０．０００１）、ＳｍＢＢ’（ｐ＜０．０００１）、ＳｍＤ（ｐ＜０．０００１）、ｄｓＤＮＡ（ｐ＜０．０００１）及びヒストン（ｐ＜０．０００１）と有意な相関があったが、Ｒｏ−５２（ｐ＝０．２１９２）、Ｒｏ−６０（ｐ＝０．２２１２）及びＬａ（ｐ＝０．８７８５）とは有意な相関がなかった（表４参照）。
【００４４】
表４．ＳＬＥにおける抗−Ｓ３３陽性結果と他のＡａｂ種との間の関連
【００４５】
【表４】
2007528840.tif 000029
【００４６】
Ｓｍ複合体に対する反応性に着目すると、無作為選択したＳＬＥ患者（ｎ＝１０１）のうち５例が精製ＳｍＤ抗原と反応したが、Ｓ３３ペプチドとは反応しなかった。残りの１１例のＳｍＤ陽性血清（６８．８％）も、この新規抗−Ｓ３３ペプチドＥＬＩＳＡにおいて陽性であると分析された。興味深いことに、抗−Ｓ３３陽性試料のうち、４名の患者（＃８９、＃９２、＃２０６２７、＃９８１１）の全てが抗−ＳｍＤ陰性で、それぞれ１５．４、２１．３、４１．３及び１３．９ユニットの抗−Ｓ３３ペプチド反応性を示した。
【００４７】
様々な製造元の市販の抗−Ｓｍ抗体テストとの相関を評価するために、ＳＬＥ患者群由来の５０検体の無作為選択ＳＬＥ血清及び１００検体の対照を、様々な製造元の抗−Ｓｍ抗体テストを用いて試験した。この抗−Ｓ３３抗体テストにおいて５０検体のＳＬＥ血清のうち６検体（１２％）が陽性となったが対照では陽性になったものはなく（０％）、その結果、１２％の感度及び１００％の特異性となった。一方、様々な製造元の抗−Ｓｍアッセイ、ＳｍテストＡ、Ｂ及びＣでは、わずか５検体のＳＬＥ試料（１０％）しか陽性とならず、対照群の患者では、６検体（ＳｍテストＡ、Ｃ）から１２検体（ＳｍテストＤ）が陽性となった。偽陽性となった結果のほとんどがＭＣＴＤ患者の群で見られた（表５参照）。
【００４８】
表５．様々な製造元のテストにおける対照血清（主にＭＣＴＤ）の反応性
【００４９】
【表５】
2007528840.tif 000030
【００５０】
ＳＬＥ患者の追跡研究
男性ＳＬＥ患者を臨床的及び血清学的に１８ヶ月の期間にわたり観察した（６検体の血清試料；図３参照）。追跡研究の最初に、この患者はＲＮＰ／Ｓｍ複合体（比率１８）、Ｓｍ抗原（比率  ６）、新規Ｓｍ抗原（３３７．５Ｕ／ｍｌ）に対して強い免疫反応を示し、単離Ｕ１−ＲＮＰ複合体（比率  ２）ならびにヒストン（５９．５Ｕ／ｍｌ）に対して中程度の反応を示した。ｄｓＤＮＡに対する反応性は見られなかった（１９．１Ｕ／ｍｌ；カットオフ値  ５５Ｕ／ｍｌ）。その時点で、医療記録によると、疾患の非活動フェーズであると報告されていた。後に、新規Ｓｍ抗原に対する抗体に対する抗体力価が顕著に上昇し、１９９９年８月に採取した３番目の血清試料においてピークに到達した。一方、抗−ＲＮＰ／Ｓｍタイターは、２番目と４番目の血液試料との間で上昇が観察され、５番目の試料においてさらに強い上昇が見られた。その時点で、新規Ｓｍ抗原（Ｓ３３）に対するタイターは、以前よりも低下しており、疾患の状態は、医療記録によると非活動として報告されていた。その患者の観察期間中に抗−ｄｓＤＮＡ及び抗−ヒストンタイターにおいては顕著な変化が観察されなかった。
【００５１】
示した実施例において、Ｓｍ抗原  Ｄ１及びＤ３に対して、抗−Ｓｍ免疫反応を分析したが、これらはＳＬＥ特異的ポリペプチドと考えられる（ｖａｎ  Ｖｅｎｒｏｏｊｉら、１９９１；Ｈｏｃｈら、１９９９）。固定化ペプチドを用いて、両自己抗原においてアルギニン残基の対称ジメチル化が主要なＢ細胞エピトープの形成に重要な役割を果たすことが示された。この観察は、Ｂｒａｈｍｓら（２０００）の結果とよく一致しており、従って、Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎ及び共同研究者ら（１９９８）の知見とは矛盾していた。興味深いことに、先行研究に加えて、既に述べたように、ペプチドに関して、ＳｍＤ３ペプチドはＳｍＤ１由来のものよりも特異性が高いことが分かった。
【００５２】
ＭｃＣｌａｉｎ及び共同研究者ら（２００２）は、ＳｍＤ３の４個の抗原性領域について述べているが、そのうち抗原領域４は、１０４−１２６の領域を包含している。この発明において、ピン上で合成したペプチドを分析に供したが、アルギニンの修飾型は用いなかった。本発明において、この領域内の反応性は、天然アルギニンをｓＤＭＡに置換した場合にのみ見られる。これらの矛盾する結果は、異なる血清、方法の使用及び／又はペプチドの長さが様々であることにより説明できるであろう。５種類の血清のうち３種類が、この実施例のペプチド、１０８ＡＡｓｄＲＧｓｄＲＧｓｄＲＧＭＧｓｄＲＧＮＩＦ１２２（配列番号３）を特異的に認識した。
【００５３】
興味深いことに、決められた位置（ａａ  １１２）で１個のアルギニンのみをジメチル化することにより、特異性を失うことなく、この特定のミモトープペプチドの感度をさらに向上させることができる。このデータに基づき、候補ペプチド（１０８ＡＡＲＧｓｄＲＧＲＧＭＧＲＧＮＩＦ１２２、配列番号２）を使用してＥＬＩＳＡシステムを開発した。この新規抗−Ｓｍアッセイ（抗−Ｓ３３）は、ループスに対して１４．９％の感度及び９９．７％の特異性を示し、その結果、陽性的中率（ＰＰＶ；９３．７％）及び陰性的中率（ＮＰＶ；８０．２％）が高くなり、したがって高い診断効率（８０．７％）が得られたことが示された。したがって、相関研究により明らかになったように、このテストにより、全身性エリテマトーデス診断、特にＳＬＥとＭＣＴＤとの鑑別に対する新たな機会が得られる。
【００５４】
同定されたＳｍ−エピトープの生化学的特性に着目すると、ｐＩがＳｍ複合体の抗原性の予想因子とみなすことができることが分かる。Ｕ１−ＲＮＰ−Ａ、ＳｍＢ’及びＤ１において、抗原性領域の平均ｐＩは、１０．４（非抗原性領域は６．０）であり、ＳｍＤ２及びＤ３では、ｐＩが９．０を超えていた（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。これらの独創的な知見は、Ｓ３３ペプチドのｐＩが高値（＞１２．８８）であることとよく一致する。塩基性の性質であることが単純にこれらの領域の表面露出、つまり抗体へ接触の可能性を上昇させているだけであるか否かについて、さらに調べる必要がある。
【００５５】
ＥＢＶ、ＥＢＶＡ及び抗−ＳｍＤ抗体
ＳｍＤ１におけるエピトープマッピング研究により、エプスタインバーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）の相同配列  ３５−５８と交差反応するエピトープモチーフ（ａａ９５−１１９）が同定された（Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、１９９３；Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、１９９３；Ｍａｒｃｈｉｎｉら、１９９４）。さらに最近の研究により、このエピトープがグリシンアルギニンリピート（ＲＧＲＧＲＧＭＧＲ）を含有するＳｍＤ３の相同領域とも交差反応することが示された（ＭｃＣｌａｉｎら、２００２）。さらに、ＧＰＲＲ（ＳｍＤ１のａａ  １１４−１１９）が共通の交差反応性自己エピトープモチーフを表し、それはＥＢＮＡ−１においてだけでなく、ＣＥＮＰ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＳｍＢＢ’、ＳｍＤ１及びＲｏ−５２（これらはごく一部である。）を含む様々な自己抗原においても存在することが明らかになった（Ｍａｈｌｅｒら、２００１）。したがって、感染性単核球症又はＳＬＥ関連疾患の患者は、ＳｍＤ１又はＳｍＤ３のＣ−末端伸長を用いたＥＬＩＳＡにおいて偽陽性となる可能性がある。さらに、あるいくつかの研究から、ループス様状態の進行におけるＥＢＶの影響が示唆される（Ｊａｍｅｓら、１９９７）。したがって、ＥＢＶ陽性血清を対照として使用することは、特異性及び信頼性が高い抗−ＳｍＤ免疫アッセイに向けての重要な発見であると考えられる。提示された２５例のＥＢＶ疾患対照の中で偽陽性の試料が見られなかったことから、抗−Ｓ３３−ａｂｓアッセイが高い特異性を有するという示唆が裏付けられる。残念ながら、Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎ及び共同研究者ら（１９９８）は、それらのテストの評価にこの患者群を含めていなかった。
【００５６】
他の自己抗体種に対する相関
ＤＮＡとＳｍ抗原との間で重複する反応性があることを報告している文献がある（Ｂｌｏｏｍら、１９９３；Ｒｅｉｃｈｌｉｎら、１９９４；Ｚｈａｎｇら、１９９５）。これらの研究においては全長ＳｍＤが使用されているが、一方、本発明においては抗−ｄｓＤＮＡ及び抗−Ｓ３３反応性の相関もあった（ｐ＜０．０００１）。ＤＮＡの他に、本発明では、Ｕ１−６８（ｐ＜０．０００１）、Ｕ１−Ａ（ｐ＜０．０００１）、Ｕ１−Ｃ（ｐ＜０．０００１）、ＳｍＢＢ’（ｐ＜０．０００１）、Ｓｍ（ｐ＜０．０００１）及びＳｍＤ（ｐ＜０．０００１）に対する抗−Ｓ３３の正相関も示されたが、ヒストン（ｐ＝０．０２５９）、Ｌａ（ｐ＝０．８７４７）、Ｒｏ−５２（ｐ＝０．４０３４）及びＲｏ−６０（ｐ＝０．０１４３）に対する相関関係は示されなかった。観察された関連性が、交差反応性により生じるのか、又は同時に生じることが多い異なる自己抗体種により生じるのか否かについては依然として分かっていない。この問題をさらに明らかにするために、さらなる研究に取り組む必要がある。
【００５７】
ＲｉｅｍｅｋａｓｔｅｎとＢｒａｈｍｓ
ＲｉｅｍｅｋａｓｔｅｎらとＢｒａｈｍｓらの結果が明らかに矛盾することは、ＳｍＤ１のＣ−末端伸長に様々なエピトープが存在することにより説明することが可能であろう。ペプチドａａ  ８３−１１９（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９８９）は立体エピトープを形成し得るが、一方で、第二の研究で使用された短いペプチドは、直線状の、ｓＤＭＡ依存性結合部位を含有する（Ｂｒａｈｍｓら、２０００）。さらに、ＳｍＤ１８３−１１９ペプチドと比較して、全長ＳｍＤ１に対する反応性が低下している（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、１９９８）ことから、このペプチドエピトープが隠れた構造を示すことが示唆される。この観察により、どのエピトープがインビトロで「見られ」、どのエピトープがＳＬＥの発症機序において中心的役割を果たすのか、という疑問が浮上する。最近の研究において、キャリアタンパク質と融合させたＳｍＤ１８３−１１９の注射により、ループス傾向のマウスの発病過程を加速することが可能であることが明らかとなった（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、２００１）。
【００５８】
「ループス」症候群
関節リウマチ（ＲＡ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己免疫病因の関連疾患である。両疾患とも、一定の構造に対する自己反応性抗体の出現を伴う。いくつかの研究において、ＲＡとループスとの間の重複する症候群が報告されており、従って、「ループス」症候群と呼ばれることがある（Ｍｉｙａｃｈｉ及びＴａｎ，１９７９；Ｐａｎｕｓｈら、１９８８；Ｂｒａｎｄら、１９９２）。本実施例において、ＲＡ群内で、抗−Ｓ３３反応性（２４．６Ｕ／ｍｌ）を示す患者が見出された。この結果が偽陽性の試験結果を反映するか否か、又は本Ｓ３３ペプチドに対する自己抗体がループス様状態の前駆体となるか否かについては未だ明らかではなく、取り組むべき問題である。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１ａ】ＳｍＤ１及びＳｍＤ３のエピトープ分析。ＳｍＤ１（ａ）及びＳｍＤ３（ｂ）のＣ−末端伸長をペプチドアレイとして合成し（１５マー、ａａカットオフ）、患者の血清を用いて調べた。免疫活性ペプチド番号７７をミモトープ変異体（ｃ）としてさらに試験した。
【図１ｂ】ＳｍＤ１及びＳｍＤ３のエピトープ分析。ＳｍＤ１（ａ）及びＳｍＤ３（ｂ）のＣ−末端伸長をペプチドアレイとして合成し（１５マー、ａａカットオフ）、患者の血清を用いて調べた。免疫活性ペプチド番号７７をミモトープ変異体（ｃ）としてさらに試験した。
【図１ｃ】ＳｍＤ１及びＳｍＤ３のエピトープ分析。ＳｍＤ１（ａ）及びＳｍＤ３（ｂ）のＣ−末端伸長をペプチドアレイとして合成し（１５マー、ａａカットオフ）、患者の血清を用いて調べた。免疫活性ペプチド番号７７をミモトープ変異体（ｃ）としてさらに試験した。
【図２ａ】新規抗−Ｓ３３アッセイのアッセイ性能特性。アッセイ内及びアッセイ間の変動ａ．）、直線性（ｂ．）及び、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）及び様々なカットオフにおける効率（ｃ．）を含む、受信者動作特性  ＲＯＣ−分析。
【図２ｂ】新規抗−Ｓ３３アッセイのアッセイ性能特性。アッセイ内及びアッセイ間の変動ａ．）、直線性（ｂ．）及び、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）及び様々なカットオフにおける効率（ｃ．）を含む、受信者動作特性  ＲＯＣ−分析。
【図２ｃ】新規抗−Ｓ３３アッセイのアッセイ性能特性。アッセイ内及びアッセイ間の変動ａ．）、直線性（ｂ．）及び、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）及び様々なカットオフにおける効率（ｃ．）を含む、受信者動作特性  ＲＯＣ−分析。
【図３】男性ＳＬＥ患者を１８ヶ月の期間にわたり、臨床的及び血清学的に観察した。
【国際調査報告】
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