(57)【要約】  本発明は、標的化療法と選択された化学療法剤とを組み合わせるための合理的基礎を提供する。これは、黒色腫の治療用として現在存在しているものではない。本発明は、黒色腫においてAkt3がアポトーシスをレギュレートしV599E B-Rafが増殖および血管発生をレギュレートするという本発明者らの発見に基づく。黒色腫を治療するのに有効な組合せ標的化治療法を確認したのは、発明者らが最初である。一実施形態では、本発明は、Akt3活性を低下させることにより黒色腫腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、黒色腫腫瘍細胞とAkt3活性を低下させる薬剤とを接触させることを含む黒色腫腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導方法を提供する。したがって、提供された本方法は、黒色腫腫瘍細胞で正常なアポトーシス感受性を回復し、それにより、より低濃度の化学療法剤の投与を可能にし、結果として、患者に対する毒性を低下させる。本発明者らは、アポトーシスを誘導するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；血管新生および細胞増殖を低減するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；を含む哺乳動物における黒色腫腫瘍の治療方法を考えている。さらに本明細書中に開示されているのは、Akt3活性を低下させるのに有効な量の薬剤を哺乳動物の黒色腫腫瘍に投与することと；V599E B-Raf活性を低下させるのに有効な量の薬剤を哺乳動物の黒色腫腫瘍に投与することと；を含み、それにより黒色腫腫瘍を治療する、哺乳動物における黒色腫の治療方法である。他の態様において、本発明は、Akt3活性を低下させる薬剤と；担体と；を含む黒色腫腫瘍治療用の医薬組成物を提供する。【選択図】図１Ａ
2007530453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Akt3活性を低下させることを含む、黒色腫腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導方法。
【請求項２】
前記低下が、Akt3活性を低下させる薬剤に黒色腫腫瘍細胞を接触させることによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'、5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'、およびそれらの相補体の配列を有する群から選択されるポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記黒色腫腫瘍細胞の前記接触が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションの使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインまたは調節ドメインに対する偽基質として作用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、Akt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、
アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、天然のもしくは植物由来の産物、ホルモンおよびステロイド、ならびに白金製剤よりなる群から選択される化学療法剤を投与すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化学療法剤はダカルバジンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、放射線照射を行うことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アポトーシスを誘導するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；血管新生および細胞増殖を低減するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；を含む、哺乳動物における黒色腫腫瘍の治療方法。
【請求項１６】
アポトーシスを誘導する前記薬剤が、Akt3活性を低下させる薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血管新生および細胞増殖を低減する前記薬剤が、V599E B-Raf活性を低下させることにより黒色腫腫瘍を治療する薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Akt3活性を低下させる前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Akt3活性を低下させる前記薬剤が、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'、5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'、およびそれらの相補体の配列を有する群から選択されるポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Akt3活性を低下させる前記薬剤が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションを用いることにより前記黒色腫腫瘍に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインまたは調節ドメインに対する偽基質として作用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドが、Akt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、天然のもしくは植物由来の産物、ホルモンおよびステロイド、ならびに白金製剤よりなる群から選択される化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、放射線照射を行うことをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
V599E B-Raf活性を低下させる前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
V599E B-Raf活性を低下させる前記薬剤が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションを用いることにより前記黒色腫腫瘍に導入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
V599E B-Raf活性を低下させる前記siRNA分子が、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
B-Raf活性を低下させる前記siRNA分子が、5' GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3'の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
V599E B-Raf活性を低下させる前記薬剤がB-Raf阻害剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記B-Raf阻害剤がBAY 43-9006である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療が、Akt3活性を低下させる薬剤とV599E B-Raf活性を低下させる薬剤とを有効量で併行的または逐次的に投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３６】
Akt3活性を低下させる薬剤と；担体と；を含む、黒色腫腫瘍治療用の医薬組成物。
【請求項３７】
前記担体が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(Dアルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、およびリン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達よりなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子が5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記薬剤が、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインまたは調節ドメインに対する偽基質として作用する、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記薬剤が、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記ペプチドが、Akt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記ペプチドが、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記組成物が、B-Raf活性を低下させる薬剤をさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'またはその相補体を含む、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3'またはその相補体を含む、請求項６０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条に準拠して2004年3月19日出願の米国特許仮出願第60/554,509号(該出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に基づく優先権を主張する。
【０００２】
助成金に関する言及
本出願は、The Foreman Foundation for Melanoma Research and American Cancer Societyによる援助を受けている(RSG-04-053-01-GMC)。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
皮膚癌の3つの主要な形態のうち、悪性黒色腫は、転移が原因で死亡する危険性が最も高い(Schalick et al., Blackwell Science, Inc. Malden, MA 180-348 (1998); Jemal et al., J. Nat. Cancer Inst. 93:678-683 (2001); および Jemal et al., Ca: a Cancer Journal for Clinicians 52:23-47 (2002))。この疾患の末期の患者の予後は、非常に悪い状態のままであり、平均生存期間は6〜10ヶ月間である。(Jemal et al., Ca: A Cancer Journal for Clinicians 52:23-47 (2002); および Soengas et al., Oncogen 22:3138-3151 (2003))。現在、手術から免疫療法、放射線療法、および化学療法に至るまで多種多様な治療法の効力を試験する多くの臨床試験が行われているにもかかわらず、この癌の進行した段階にある患者に対する有効な長期治療法は存在しない(Soengas et al., Oncogen 22:3138-3151 (2003); Serrone et al., Melanoma Res 9:51-58 (1999); Grossman et al., Cancer Metastasis Rev 20:3-11 (2001); Helmbach et al., Int J Cancer 93:617-622 (2001); Ballo et al., Surgical Clinics North Am 83:323-342 (2003); および Hersey, P., Int Med J 33:33-43 (2003))。有効な治療方式の欠如は、部分的には、黒色腫の発生時に変化する主要な遺伝子に関する情報やこれらの欠陥を是正することにとくに的を絞った療法が欠如していることが原因である(Serrone et al., J Exp Clin Cancer Res 19:21-34 (2000); および Atkins et al., Nature Rev. Drug Dis 1:491-492 (2002))。
【０００４】
転移性(第IV期)悪性黒色腫を有する患者の生存期間の中央値は、約1年である(Balch et al., 1993; Koh, 1991)。現在の標準的治療法は、インターロイキン-2(IL-2)やインターフェロン-アルファ(IFN-アルファ)のようなサイトカインと併用してまたは併用せずに、シスプラチン、DTIC、およびBCNUのような薬剤を用いる併用化学療法よりなる(Balch et al., 1993; Koh, 1991; Legha and Buzaid, 1993)。化学療法の奏効率は、利用される治療方式のいかんにかかわらず、60%程度であると報告されているが、約5%の患者が長期生存を体験するにすぎない。従来の化学療法は、増殖の速い細胞を標的にすることにより癌の増殖を抑制することを目標とする。しかしながら、骨髄や腸上皮の細胞のような多くの正常細胞もまた基礎レベルの増殖を有するので、この機能は、特異的なものではない。したがって、身体の多くの正常細胞もまた、化学療法の毒性作用を受けやすく、従来の化学療法では、患者が実質的な程度の病的状態になる可能性がある。明らかに、転移性黒色腫の新しい治療方法が必要とされている。
【０００５】
Aktプロテインキナーゼファミリーは、Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ、およびAkt3/PKBγの3つのメンバーよりなり、それらは、高度の構造類似性を共有する(Brazil et al., Cell 111:293-303 (2002); および Nicholson et al., Cell Signal 14:381-395 (2002))。ファミリーメンバーは、互いにかなりの構造類似性を共有し、アミノ酸レベルで80%を超える相同性を呈する(Nicholson KM, Anderson NG. Cell Signal. 14(5):381-95 (2002), Datta SR et al. Genes Dev. 13(22):2905-27 (1999).)。Aktアイソフォームはすべて、3の異なる機能性ドメインを有する主要な構造上の特徴を共有する(Testa JR, Bellacosa. A. Proc Natl Acad Sci U S A. 98(20):10983-5 (2001), Nicholson KM, Anderson NG. Cell Signal. 14(5):381-95 (2002), Scheid MP, Woodgett JR. Nat Rev Mol Cell Biol. 2(10):760-8 (2001), Scheid MP, Woodgett JR. FEBS Lett. 546(1):108-12 (2003), Bellacosa A et al. Cancer Biol Ther. 3(3):268-75. Epub 2004 (2004), Brazil DP et al. Trends Biochem Sci. 29(5):233-42 (2004), Brazil, D.P. et al. Cell 111:293-303 (2002), Brazil DP, Hemmings BA. Trends Biochem Sci. 26(11):657-64 (2001), Datta SR et al. Genes Dev. 13(22):2905-27 (1999).)。1つは、タンパク質-タンパク質相互作用およびタンパク質-脂質相互作用を媒介するアミノ末端プレクストリン相同ドメイン(PH)ドメインである
。このドメインは、約100個のアミノ酸よりなり、他のシグナリング分子中の3つのホスホイノシチド結合ドメインに類似している(Lietzke SE et al. Mol Cell. 6(2):385-94 (2000), Ferguson KM et al. Mol Cell. 6(2):373-84 (2000).)。第2のドメインは、基質タンパク質のリン酸化を媒介するカルボキシ末端キナーゼ触媒領域である。それは、プロテインキナーゼA(PKA)およびプロテインキナーゼC(PKC)中の領域に対して高度の類似性を示す(Jones PF et al. Cell Regul. 2(12):1001-9 (1991)., Andjelkovic M, Jones PF, Grossniklaus U, Cron P, Schier AF, Dick M, Bilbe G, Hemmings BA.Developmental regulation of expression and activity of multiple forms of the Drosophila RAC protein kinase. J Biol Chem. 270(8):4066-75 (1995).)。第3のドメインは、重要な調節の役割を有するテール領域である。この領域は、テールドメインまたは調節ドメインと呼ばれることもある。後の2つの領域内には、セリン残基およびトレオニン残基が存在し、Aktの活性化のためにそのリン酸化が必要とされる。その部位は、特定のAktアイソフォームに依存してわずかに異なる。3つすべてのアイソフォーム上の第1の部位は、アミノ酸位置308/309/305(それぞれAkt1/2/3上)のトレオニンである。第2の部位は、疎水性C末端テール内のアミノ酸位置473/474/472(それぞれAkt1/2/3上)に存在するセリンである。増殖因子または他の細胞外刺激に反応して起こる両方の部位でのリン酸化は、最大限にAktを活性化させるのに不可欠である(Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P, Hemmings BA. インスリンおよびIGF-1によるプロテインキナーゼBの活性化の機序(Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1). EMBO J. 15(23):6541-51 (1996).)。Aktはまた、他の残基がリン酸化される可能性もあるが；このリン酸化の機能的重要性は、継続的研究の対象となる領域である(Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P, Hemmings BA. インスリンおよびIGF-1によるプロテインキナーゼBの活性化の機序(Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1). EMBO J. 15(23):6541-51 (1996).)。さらに、セリン472リン酸化部位が欠失したAkt3のスプライス変異体も同定されているが、この変異体の細胞内の役割は、いまだに明らかにされていない(Brodbeck D, Hill MM, Hemmings BA. J Biol Chem. 276(31):29550-8. Epub 2001 (2001). )。また、この変異体が黒色腫細胞中に存在するかまたはそこでなんらかの役割を担うかについても不明である。
【０００６】
アイソフォームはすべて特定の細胞タイプにおいて発現されうるが、ある種のアイソフォームだけが活性であることもある。また、各アイソフォームは、細胞内で特有の機能さらには共通の機能を発揮しうるようにも思われる(Brazil et al., Cell 111:293-303 (2002); and Nicholson et al., Cell Signal 14:381-395 (2002); Chen et al., Genes Dev 15:2203-2208 (2001); および Cho et al., Science 292:1728-1731 (2001))。Akt1が欠如したノックアウトマウスは、成長が遅れ、精巣および胸腺における自発的アポトーシスの割合が増大する(Chen et al., Genes Dev 15:2203-2208 (2001); Cho et al., J Biol Chem 276:38349-38352 (2001); Peng et al., Genes Dev 17:1352-1365 (2003))。これとは対照的に、Akt2ノックアウトマウスは、インスリンレギュレーションが損なわれ、その結果、肝臓および骨格筋でインスリン作用の欠如により血糖値の低下能力が損なわれる(Cho et al., Science 292:1728-1731 (2001); Peng et al., Genes Dev 17:1352-1365 (2003))。現在、Akt3ノックアウトマウスに関連する表現型を記述した報告は発表されておらず；したがって、Akt3の特異的機能やヒト癌におけるその役割については、ほとんど知られていない。
【０００７】
Akt1またはAkt2の発現を増大させる遺伝子増幅は、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、および乳癌で報告されている(Staal, S.P., Proc Nat Acad Sciences ISA 84:5034-5037 (1987); Cheng et al., Proc Nat Acad Sciences USA 89:9267-9271 (1992); Cheng et al., Proc Nat Acad Sciences USA 93:3636-3641 (1996); Lu et al., Chung-Hua I Hsueh Tsa Chih [Chinese Medical Journal] 75:679-682 (1995); Bellacosa et al., Int J Cancer 64:280-285 (1995); および van Dekken et al., Cancer Res 59:749-752 (1999))。Aktの変異の活性化は黒色腫では同定されていないが(Waldmann et al., Arch Dermatol Res 293:368-372 (2001); Waldmann et al., Melanoma Res 12:45-50 (2002))、(P13K阻害剤ワートマニンまたはLY-294002を用いて)P13Kを標的にすることにより全Akt機能を妨害すると、細胞増殖が阻害され、UV線に対する黒色腫細胞の感受性が低減される(Krasilnikov et al., Mol Carcinogenesis 24:64-69 (1999))。通常のまたは軽度の異形成母斑と比較して重度の異形成母斑および転移性黒色腫における全リン酸化Aktレベルの増大を実証するために、免疫組織化学を用いて、全Akt活性も黒色腫で測定されている(Dhawan et al., Cancer Res 62:7335-7342 (2002))。しかしながら、個々のAktアイソフォームが担う役割および黒色腫における特定のAktアイソフォームのデレギュレーションを引き起こす機序については、不明である。最近、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)/Aktシグナリング経路が黒色腫腫瘍形成において重要な役割を果たすことが見いだされた(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。PTENホスファターゼの消失によりAkt活性がデレギュレートされると(P13K/Aktシグナリングのネガティブレギュレーター)、黒色腫細胞のアポトーシス能力が低減され、それにより黒色腫腫瘍形成がレギュレートされることが見いだされた(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。
【０００８】
Rafプロテインセリン/トレオニンキナーゼファミリーは、A-Raf、B-Raf、およびC-Rafの3つのメンバーよりなる。(Mercer et al., Biochim Biophys Acta 1653:25-40 (2003))。Rafファミリーメンバーは、順序付けられた一連の連続的リン酸化事象を介して細胞膜から核まで細胞外シグナルを中継するシグナルトランスダクション経路であるMAPK(Ras/Raf/MAPKキナーゼ(MEK)/細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK))経路の中間分子である(Mercer et al., Biochim Biophys Acta 1653:25-40 (2003), Smalley. Int J Cancer 104: 527-32 (2003))。典型的には、細胞外リガンドが、そのチロシンキナーゼレセプターに結合することにより、Rasが活性化され、リン酸化事象のカスケードが開始される(Mercer et al., Biochim Biophys Acta 1653:25-40 (2003), Smalley. Int J Cancer 104: 527-32 (2003))。活性化されたRasは、Rafのリン酸化および活性化を引き起こし、これが、続いて、MEK1 MEK2をリン酸化して活性化させる。MEKキナーゼは、続いて、ERK1およびERK2をリン酸化して活性化させ(Chong et al, Cell Signal 15:163-69 (2003))、これが、続いて、いくつかの細胞質および核の標的をリン酸化し、これが、最終的に、細胞増殖および生存に関して重要な役割を果たすタンパク質の発現を引き起こす(Chang et al., Int J Oncol 22:469-80 (2003))。
【０００９】
B-Rafの活性化を引き起こす変異は、散発性黒色腫の大多数で見いだされ、その大部分は、黒色腫における最多変異遺伝子であるB-RAFであり、これは60〜90%の範囲内の変異率を有する(Davies et al., Nature 417:949-54 (2002); Pollock et al., Nat Genet 33:19-20 (2003); Brose et al., Cancer Res 62:6997-7000 (2002); and Yazdi et al., J Invest Dermatol 121:1160-62 (2003 ))。B-RAF変異の大多数は、ヌクレオチド1796でTをAに変えてエキソン15内のコドン599でグルタミン酸からバリンへの置換え(V599E)を行う単一塩基ミスセンス置換の結果として起こる(Davies et al., Nature 417:949-54 (2002))。この変異は、B-Rafの基礎キナーゼ活性を増大させ、結果として、下流のキナーゼMEKおよびERKのレベルが構成的に増大されることにより実証されるMAPK経路の過剰活性を生じる(Davies et al., Nature 417:949-54 (2002))。B-RAF変異は、家族性黒色腫では確認されていない後天性体細胞性接合後事象である(Lang et al. Hum Mutat 21:327-30 (2003); Laud et al, Cancer Res 63:3061-65 (2003); and Meyer et al, Int J Cancer 106:78-80 (2003))。
【００１０】
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNAにより行われるポリヌクレオチド配列特異的転写後遺伝子サイレンシング機序であり、特定のメッセンジャーRNA(mRNA)の分解を引き起こすことにより、mRNAによりコードされる所望の標的ポリペプチドの発現を低減させる(たとえば、WO 99/32619; WO 01/75164; U.S. Pat. No. 6,506,559; Fire et al., Nature 391:806-11 (1998); Sharp, Genes Dev. 13:139-41 (1999); Elbashir et al. Nature 411:494-98 (2001); Harborth et al., J. Cell Sci. 114:4557-65 (2001)を参照されたい)。RNAiは、本明細書中で以下にも記載されるように、発現の抑制の対象となるポリペプチド部分をコードするエキソン配列に対応する配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドたとえば二本鎖RNA(dsRNA)により媒介される。報告によれば、RNAiは、イントロン配列またはプロモーター配列と配列同一性を共有する二本鎖RNAポリヌクレオチドにより行われることはない(Elbashir et al., 2001)。RNAi経路は、DrosophilaおよびCaenorhabditis elegansで最も良好に特性付けられているが、哺乳動物(ヒトを包含する)のような高等真核生物において特定のポリペプチドの発現を妨害する「低分子干渉RNA」(siRNA)ポリヌクレオチドも検討されている(たとえば、Tuschl, 2001 Chembiochem. 2:239-245; Sharp, 2001 Genes Dev. 15:485; Bernstein et al., 2001 RNA 7:1509; Zamore, 2002 Science 296:1265; Plasterk, 2002 Science 296:1263; Zamore 2001 Nat. Struct. Biol. 8:746; Matzke et al., 2001 Science 293:1080; Scadden et al., 2001 EMBO Rep. 2:1107)。
【００１１】
現在の非限定的モデルによれば、RNAi経路は、長いdsRNAを低分子干渉RNA(siRNA)と呼ばれる約18〜27(たとえば、19、20、21、22、23、24、25、26など)ヌクレオチド塩基対長の二本鎖断片にするATP依存性プロセッシブ切断により開始される(総説 Hutvagner et al., Curr. Opin. Gen. Dev. 12:225-32 (2002); Elbashir et al., 2001; Nyknen et al., Cell 107:309-21 (2001); Bass, Cell 101:235-38 (2000)); Zamore et al., Cell 101:25-33 (2000)を参照されたい)。Drosophilaでは、「Dicer」として知られる酵素が、より長い二本鎖RNAをsiRNAに切断し；Dicerは、dsRNA特異的エンドヌクレアーゼのRNアーゼIIIファミリーに属する(WO 01/68836; Bernstein et al., Nature 409:363-66 (2001))。さらに、この非限定的モデルによれば、siRNA二本鎖は、タンパク質複合体中に組み込まれ、続いて、siRNAのATP依存性巻戻しが行われ、次に、活性RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)を生成する(WO 01/68836)。複合体は、siRNAのガイド鎖に相補的な標的RNAを認識して切断することにより、特定のタンパク質の発現を妨害する(Hutvagner et al., supra)。
【００１２】
C. elegansおよびDrosophilaでは、RNAiは、長い二本鎖RNAポリヌクレオチドにより媒介されうる(WO 99/32619; WO 01/75164; Fire et al., 1998; Clemens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6499-6503 (2000); Kisielow et al., Biochem. J. 363:1-5 (2002); また、WO 01/92513(酵母におけるRNAi媒介サイレンシング)をも参照されたい)。しかしながら、哺乳動物細胞では、長いdsRNAポリヌクレオチド(すなわち30塩基対超)を用いてトランスフェクションを行うと、タンパク質合成の開始を全体的に阻止する非特異的配列反応が活性化されてmRNAの分解が起こる(Bass, Nature 411:428-29 (2001))。約18〜27ヌクレオチド塩基対長の二本鎖RNAを用いてヒトおよび他の哺乳動物の細胞のトランスフェクションを行うと、対応するヌクレオチド配列を含有するメッセンジャーRNA(mRNA)によりコードされる特定のポリペプチドの発現が配列特異的に妨害される(WO 01/75164; Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., Genes Dev. 15:188-200 (2001)); Harborth et al., J. Cell Sci. 114:4557-65 (2001); Carthew et al., Curr. Opin. Cell Biol. 13:244-48 (2001); Mailand et al., Nature Cell Biol. Advance Online Publication (Mar. 18, 2002); Mailand et al. 2002 Nature Cell Biol. 4:317)。
【００１３】
siRNAポリヌクレオチドは、改変されたレベルのコードされたポリペプチド産物を生成するように遺伝子発現の配列特異的な改変またはモジュレーションを行う際に使用される当技術分野で公知の他のポリヌクレオチドよりも優れた特定の利点を提供しうる。これらの利点としては、そのような他のポリヌクレオチド(たとえば、アンチセンス、リボザイム、または三本鎖のポリヌクレオチド)と比べて、有効siRNAポリヌクレオチド濃度が低いこと、siRNAポリヌクレオチドの安定性が高いこと、およびsiRNAポリヌクレオチドオリゴヌクレオチド長が短いことが挙げられる。背景を簡単に説明すると、「アンチセンス」ポリヌクレオチドは、mRNAやDNAのような標的核酸に配列特異的に結合してDNAの転写またはmRNAの翻訳を阻止する(たとえば、U.S. Pat. No. 5,168,053; U.S. Pat. No. 5,190,931; U.S. Pat. No. 5,135,917; U.S. Pat. No. 5,087,617を参照されたい; また、たとえば、「ダンベル」アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されているClusel et al., 1993 Nucl. Acids Res. 21:3405-11をも参照されたい)。「リボザイム」ポリヌクレオチドは、任意のRNA転写産物を標的にすることが可能であり、そしてそのような転写産物を触媒的に切断することが可能であり、それにより、mRNAの翻訳を阻害する(たとえば、U.S. Pat. No. 5,272,262; U.S. Pat. No. 5,144,019; and U.S. Pat. Nos. 5,168,053, 5,180,818, 5,116,742 および 5,093,246; U.S. 2002/193579を参照されたい)。「三本鎖」DNA分子とは、二本鎖DNAに結合して共線的三本鎖分子を形成することにより転写を阻止する単一DNA鎖を意味する(たとえば、二本鎖DNA上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドの作製方法が記載されているU.S. Pat. No. 5,176,996を参照されたい)。そのような三本鎖構造は、不安定であり、生理学的条件下で一時的に生じるにすぎない。一本鎖ポリヌクレオチドは容易に細胞中に拡散することはなく、したがって、ヌクレアーゼ消化を受けやすいので、アンチセンス技法または三本鎖技法に供される一本鎖DNAの開発では、多くの場合、安定性および細胞による吸収を改善するように化学修飾されたヌクレオチドが必要とされる。これとは対照的に、siRNAは、インタクトな細胞により容易に取り込まれ、アンチセンスまたはリボザイムのいずれのポリヌクレオチドに必要とされるよりも数桁少ない濃度で特定のポリペプチドの発現を妨害するのに有効であり、しかも化学修飾されたヌクレオチドを使用する必要がない。
【００１４】
悪性黒色腫は、ヒトに最も深刻な影響を及ぼす皮膚癌であり、転移が原因で死亡する危険性が最も高い。罹患率および死亡率はいずれも、毎年上昇し続けており、有効な長期治療法の実現の兆しは見えない。これは、部分的には、関係する重要な遺伝子の同定やこれらの欠陥を是正することに絞った特異的療法が欠如していることの表れである。したがって、関係する重要な遺伝子の同定およびこれらの欠陥を是正することに的を絞った特異的療法ならびにPI3K/AktおよびMEK/ERKシグナリング経路で鍵を握るみなされる遺伝子の標的化減少に対する必要性が当技術分野に存在する。選択標的として遺伝子を同定すれば、黒色腫患者に新しい治療機会が与えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の主な目的、特徴、または利点は、最新技術を改良することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的、特徴、または利点は、癌細胞のAkt3活性を低減することにより癌細胞で正常なアポトーシス感受性を回復する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的、特徴、または利点は、Akt3活性を低減する薬剤を用いて癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的、特徴、または利点は、黒色腫腫瘍細胞で正常なアポトーシス感受性を回復し、黒色腫腫瘍細胞の細胞増殖および成長を減少させ、かつ黒色腫腫瘍細胞の血管新生を阻害することにより、黒色腫を治療するコンビナトリアル法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的、特徴、または利点は、従来の方法よりも効率的に腫瘍サイズを減少させる黒色腫の治療方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的、特徴、または利点は、より低濃度の化学療法の使用を必要とし、それにより、患者に対する毒性を低下させる黒色腫の治療方法を提供することである。
【００２１】
これらのおよび他の目的、特徴、または利点は、以下の本発明の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、標的化療法と選択された化学療法剤とを組み合わせるための合理的基礎を提供する。これは、黒色腫の治療用として現在存在しているものではない。本発明は、黒色腫においてAkt3がアポトーシスをレギュレートしV599E B-Rafが増殖および血管発生をレギュレートするという本発明者らの発見に基づく。黒色腫を治療するのに有効な組合せ標的化治療法を確認したのは、発明者らが最初である。一実施形態では、本発明は、Akt3活性を低下させることにより黒色腫腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、黒色腫腫瘍細胞とAkt3活性を低下させる薬剤とを接触させることを含む黒色腫腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導方法を提供する。したがって、提供された本方法は、黒色腫腫瘍細胞で正常なアポトーシス感受性を回復し、それにより、より低濃度の化学療法剤の投与を可能にし、結果として、患者に対する毒性を低下させる。本発明者らは、アポトーシスを誘導するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；血管新生および細胞増殖を低減するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；を含む哺乳動物における黒色腫腫瘍の治療方法を考えている。
【００２３】
さらに本明細書中に開示されているのは、Akt3活性を低下させるのに有効な量の薬剤を哺乳動物の黒色腫腫瘍に投与することと；V599E B-Raf活性を低下させるのに有効な量の薬剤を哺乳動物の黒色腫腫瘍に投与することと；を含み、それにより黒色腫腫瘍を治療する、哺乳動物における黒色腫の治療方法である。
【００２４】
他の態様において、本発明は、Akt3活性を低下させる薬剤と；担体と；を含む黒色腫腫瘍治療用の医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明のこれらのおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかになるであろう。本明細書中に開示されている参考文献はすべて、あたかもそれぞれが個別に組み入れられたごとくその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、部分的には、Akt3が重要なセリン/トレオニンプロテインキナーゼであり黒色腫の生存に関与して黒色腫腫瘍細胞がアポトーシスに対して耐性をもつようにするという発見に関連する。黒色腫腫瘍形成におけるAktの重要性が反映された黒色腫モデルを用いて、黒色腫腫瘍形成時にデレギュレートされる主要なアイソフォームとしてAkt3を同定した。本明細書中で実証されるように、Akt1でもなくAkt2でもなくAkt3の選択的ノックダウンが全リン酸化Aktのレベルを減少させ、黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させる。したがって、Akt3は、黒色腫癌に対する治療標的を提供する。
【００２７】
本発明はまた、部分的には、V599E B-Rafが黒色腫の成長および増殖に関与するという発見に関連する。このたび、B-Raf発現の阻害または減少が腫瘍細胞の増殖および新しい血管の生成(血管新生)を低減することを見いだした。配列データに誤りがあるため、B-Raf中のバリン(V)からグルタミン酸(E)への置換は、実際には、NCBI遺伝子バンク寄託番号NT_007914に示される正しいデータではコドン600およびヌクレオチド1799(1796ではない)に対応することに留意すべきである。Kumar et al., Clinical Cancer Research, 9: 3362-3368 (2003)。しかしながら、本出願では、実績や馴染みがあるという理由で、全体を通して未修正のヌクレオチド番号およびコドン番号を使用した。
【００２８】
本発明者らは、アポトーシスの誘導と細胞増殖および血管新生の減少とを含む、腫瘍細胞の併用治療法を考えている。一実施形態では、Akt3活性を低下させることによりアポトーシスを誘導し、V599E B-Raf活性を低下させることにより細胞増殖および血管新生を低減する。本発明者らはまた、腫瘍細胞のAkt3活性を低下させて腫瘍細胞(特定的には黒色腫細胞)のアポトーシス閾値を低減することにより、従来の治療法に基づくよりもはるかに少ない用量の化学療法を利用可能にすることを考えている。したがって、患者は、より効果的な治療を受けて、有毒な化学療法剤に伴う副作用を受けにくくなるであろう。
【００２９】
本明細書および特許請求の範囲の理解の助けとなるように、以下の定義を与える。 
定義
本明細書中で使用する場合、「siRNA」という用語は、(i)18塩基対長、19塩基対長、20塩基対長、21塩基対長、22塩基対長、23塩基対長、24塩基対長、25塩基対長、26塩基対長、27塩基対長、28塩基対長、29塩基対長、または30塩基対長であり、かつAkt3ポリペプチドまたはAkt3ポリペプチドの変異体の発現および活性を妨害しうる、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ただし、siRNAの一本鎖は、Akt3ポリペプチド、その変異体、またはそれらの相補的配列をコードするRNAポリヌクレオチド配列の一部を含む；(ii)18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長、27ヌクレオチド長、28ヌクレオチド長、29ヌクレオチド長、または30ヌクレオチド長であり、かつ標的Akt3ポリペプチドもしくはAkt3ポリペプチドの変異体の発現および/もしくは活性を妨害しうるかまたは相補的配列にアニーリングして標的ポリペプチド発現を妨害しうるdsRNAを生成するかのいずれかである、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ただし、そのような一本鎖オリゴヌクレオチドは、PTP-1Bポリペプチド、その変異体、またはそれらの相補的配列をコードするRNAポリヌクレオチド配列の一部を含む；あるいは(iii)以上の(i)または(ii)のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ただし、そのようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、1、2、3、もしくは4個の核酸改変または核酸置換を有する；を意味する。
【００３０】
本明細書中で使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、プリンおよびピリミジンを含有する任意の長さのポリマー、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ-ポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかを意味する。これは、一本鎖および二本鎖の分子、すなわち、DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAハイブリッド、さらにはアミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成される「タンパク質核酸」(PNA)を包含する。これは、修飾塩基を含有する核酸をも包含する。
【００３１】
「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリーを意味し、cDNAおよびゲノムDNA核酸が包含される。
【００３２】
「ベクター」とは、核酸を宿主細胞に移入するための任意の手段である。ベクターは、他のDNAセグメントを結合させて結合されたセグメントの複製を可能にするレプリコンでありうる。「レプリコン」とは、in vivoでDNA複製の自律的単位として機能する(すなわち、自己の管理下で複製可能である)任意の遺伝因子(たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス)である。「ベクター」という用語は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで細胞に核酸を導入するためのウイルス性手段および非ウイルス性手段の両方を包含する。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン-バーウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA-タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸に加えて、ベクターはまた、核酸移入結果(移入先組織、発現持続期間など)の選択、測定、および監視に有用な1つ以上の調節領域および/または選択性マーカーをも含有しうる。
【００３３】
「カセット」とは、ベクターの特定の制限部位に挿入可能なDNAセグメントを意味する。DNAセグメントは、対象ポリペプチドをコードし、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適したリーディングフレームで確実にカセットの挿入が行われるようにデザインされる。
【００３４】
そのようなDNAが細胞内に導入された場合、細胞は、外因性もしくは異種のDNAにより「トランスフェクト」されたことになる。トランスフェクトされたDNAが表現型の変化を引き起こす場合、細胞は、外因性もしくは異種のDNAにより「トランスフォーム」されたことになる。トランスフォーミングDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNA中への組込み(共有結合)が可能である。
【００３５】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「RNA分子」)またはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「DNA分子」)あるいはそれらの任意のホスホエステル類似体(たとえば、ホスホロチオエートおよびチオエステル)よりなる一本鎖形もしくは二本鎖へリックスのいずれかの状態のリン酸エステルポリマー形を意味する。二本鎖DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAへリックスの形をとりうる。核酸分子とくにDNAまたはRNA分子という用語は、分子の一次および二次の構造のみを意味し、特定の三次形態をなんら限定するものではない。したがって、この用語は、とくに、線状もしくは環状のDNA分子(たとえば制限断片)、プラスミド、および染色体に見いだされる二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖DNA分子の構造について論じる場合、本明細書中では、配列は、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAに相同的な配列を有する鎖)に沿って5'→3'方向の配列だけを与える通常の規約に従って記述されうる。「組換えDNA分子」とは、分子生物学的操作の施されたDNA分子のことである。
【００３６】
本発明では、全長形すなわち天然に存在する形のAkt3またはその任意のヒトAkt3特異的抗原性断片を含む本発明に係るヒトAkt3タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を黒色腫から単離することが意図される。本明細書中で使用する場合、「Akt3」とは、Akt3ポリペプチドを意味し、「akt3」とは、Akt3ポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。
【００３７】
「Akt3」という用語は、(i)寄託番号AJ245709(セリン/トレオニンキナーゼAkt-3に対するHomo sapiens mRNA(Akt3遺伝子)gi|5804885|emb|AJ245709.1|HSA245709[5804885])；寄託番号AF135794(Homo sapiens AKT3プロテインキナーゼmRNA、完全コード配列gi|4574743|gb|AF135794.1|AF135794[4574743]))；寄託番号NM_005465(Homo sapiens v-aktネズミ胸腺腫ウイルスオンコジーン相同体3(プロテインキナーゼB、ガンマ)(AKT3)、転写産物変異体1、mRNA gi|32307164|ref|NM_005465.3|[32307164])；寄託番号NM_181690(Homo sapiens v-aktネズミ胸腺腫ウイルスオンコジーン相同体3(プロテインキナーゼB、ガンマ)(AKT3)、転写産物変異体2、mRNA gi|32307162|ref|NM_181690.1|[32307162])；寄託番号AY005799(Homo sapiensプロテインキナーゼBガンマ1(AKT3)mRNA、完全コード配列、選択的スプライシングgi|15072339|gb|AY005799.1|[15072339])；寄託番号AF124141(Homo sapiensプロテインキナーゼBガンマmRNA、完全コード配列gi|4757578|gb|AF124141.1|AF124141[4757578])；のヌクレオチドとの実質的ヌクレオチド配列相同性；または(ii)寄託番号CAB53537(Akt-3タンパク質[Homo sapiens] gi|5804886|emb|CAB53537.1|[5804886])；寄託番号AAD24196(AKT3プロテインキナーゼ[Homo sapiens] gi|4574744|gb|AAD24196.1|AF135794_1[4574744])；寄託番号AAF91073(プロテインキナーゼBガンマ1[Homo sapiens] gi|15072340|gb|AAF91073.1|[15072340])；寄託番号AAD29089(プロテインキナーゼBガンマ[Homo sapiens] gi|4757579|gb|AAD29089.1|AF124141_1[4757579])；寄託番号NP_005456(v-aktネズミ胸腺腫ウイルスオンコジーン相同体3アイソフォーム1;プロテインキナーゼBガンマ;RAC-ガンマセリン/トレオニンプロテインキナーゼ;セリントレオニンプロテインキナーゼAkt-3[Homo sapiens] gi|4885549|ref|NP_005456.1|[4885549])；寄託番号NP_859029(v-aktネズミ胸腺腫ウイルスオンコジーン相同体3アイソフォーム2;プロテインキナーゼBガンマ;RAC-ガンマセリン/トレオニンプロテインキナーゼ;セリントレオニンプロテインキナーゼ、Akt-3[Homo sapiens] gi|32307163|ref|NP_859029.1|[32307163]))；のコードアミノ酸配列との実質的配列相同性を有する、Akt3核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多形変異体、対立遺伝子、変異体、および種間相同体を意味する。
【００３８】
「B-Raf」という用語は、(i)Genbank (NM_004333) Homo sapiens v-rafネズミ肉腫ウイルスオンコジーン相同体B1(BRAF)、mRNA、gi|33188458|ref|NM_004333.2|[33188458]に見いだされるB-Rafのヌクレオチド配列との実質的ヌクレオチド配列相同性を有する、B-Raf核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多形変異体、対立遺伝子、変異体、および種間相同体を意味する。B-Rafに対するコグネイトタンパク質配列は、GenBank寄託番号P15056である。
【００３９】
Genbank中に見いだされるB-Rafタンパク質の1つは、M95712 Homo sapiens B-rafタンパク質(BRAF) mRNA、完全コード配列gi|41387219|gb|M95712.2|HUMBRAF[41387219])である。
【００４０】
「対照サンプル」とは、癌のない健常動物を代表する生体物質のサンプルを意味する。対照サンプル中のAkt3もしくはB-Rafのレベルまたはコードしている対応する遺伝子のコピー数は、望ましくは、癌のない健常な同一種の被験者の一般集団に特有なものである。このサンプルは、本発明に記載される方法で使用するための動物から採取しうるか、または他の理由で取得されたものであるが本発明に係る方法で使用するのに好適である癌のない健常動物を代表する任意の生体物質でありうるか、のいずれかである。対照サンプルはまた、癌を有するかまたは癌を有する疑いのある動物の正常組織から取得することも可能である。対照サンプルはまた、癌のない健常被験者から得られた測定値に基づいてあらかじめ設定された、癌のない集団を代表する所与のレベルのAkt3をも意味しうる。他の選択肢として、生物学的対照サンプルは、さまざまな個体から取得されたサンプルを意味しうるか、または集団から取得されたベースラインデータに基づいて規格化された値でありうる。さらに、対照サンプルは、特定の年齢、性別、民族性、または他の個体群統計学的パラメーターにより規定されうる。いくつかの状況下では、対照は、特定の測定において暗黙的に存在する。暗黙的対照の一例は、検出方法が、癌のない健常被験者に特有なレベルよりも高いレベルが存在するときしか、Akt3または対応する遺伝子のコピー数を検出することができない場合である。遺伝子に関する典型的な対照レベルは、1細胞あたり2コピーである。他の例は、アッセイに関する対照レベルが公知である免疫組織化学的アッセイに関連している場合である。そのような対照の他の例は、当業者の知識の範囲内である。
【００４１】
対照サンプルで「期待」されるAkt3ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはB-Rafポリペプチドもしくはポリヌクレオチドのレベルは、癌のない典型的サンプルを代表しかつAkt3ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの高存在量もしくは診断的存在量と区別しうるレベルを意味する。好ましくは、「期待」されるレベルは、哺乳動物の年齢、性別、病歴などのような因子、さらには試験される特定の生物学的被験者に関して、照査されるであろう。
【００４２】
「腫瘍細胞」という用語は、被験者の腫瘍の構成要素である細胞または腫瘍の構成要素になる運命にあることが確定している細胞(すなわち、被験者の前癌性病変の構成要素である細胞)を意味する。
【００４３】
「cDNA」とは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)の作用によりRNA鋳型から生成される相補的DNAまたはコピーDNAを意味する。したがって、「cDNAクローン」とは、クローニングベクターに組み入れられて運ばれるかまたはPCR増幅される、対象RNA分子に相補的な二本鎖DNA配列を意味する。この用語は、介在配列が除去された遺伝子を包含する。
【００４４】
「クローニングベクター」とは、プラスミドDNAもしくはファージDNAまたは宿主細胞中で複製可能な他のDNA配列を意味する。クローニングベクターは、そのようなDNA配列をDNAに不可欠な生物学的機能を損なうことなく決定可能に切断しうる1つ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位により特性付けられ、トランスフォーム細胞の同定に使用するのに好適なマーカーを含んでいてもよい。
【００４５】
「発現ベクター」とは、クローニングベクターに類似しているがそれにクローニングされた核酸配列を宿主中へのトランスフォーミング後に発現させうる媒体またはベクターを意味する。核酸配列は、それが転写されてmRNA配列を生成する場合に「発現」される。ほとんどの場合、この転写産物は、翻訳されてアミノ酸配列を生成するであろう。クローン化遺伝子は、通常、発現制御配列の制御下に(すなわち、それに機能しうる形で連結されて)、配置される。
【００４６】
「発現制御配列」または「調節配列」とは、構造遺伝子の発現をそれらの遺伝子に機能しうる形で連結された場合に制御またはレギュレートするヌクレオチド配列を意味する。これらとしては、たとえば、lac系、trp系、ファージラムダの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、ならびに原核生物または真核生物の細胞において遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列が挙げられる。発現制御配列は、機能しうる形で連結された遺伝子を原核宿主または真核宿主において発現するようにベクターがデザインされているかに依存して異なるであろう。この配列また、転写エレメント、たとえば、エンハンサーエレメント、終止配列、組織特異性エレメント、または翻訳の開始部位および終止部位を含有しうる。
【００４７】
「機能しうる形で連結された」とは、プロモーターが遺伝子の発現の開始を制御することを意味する。宿主細胞中に導入したときに、プロモーターが1種以上のRNAへの近位DNA配列の転写を決定するのであれば、プロモーターは、近位DNAの配列に機能しうる形で連結されている。プロモーターがDNA配列の転写を開始しうるのであれば、プロモーターは、DNA配列に機能しうる形で連結されている。
【００４８】
「宿主」とは、真核生物を意味する。この用語は、複製可能な発現ベクターのレシピエントである生物または細胞を包含する。
【００４９】
本明細書に記載のものを含めて当技術分野で公知の任意の方法による宿主細胞への核酸の導入は、本明細書中では「トランスフォーメーション」と記される。以上に記載の核酸が導入された細胞には、そのような細胞の後代をも包含されるものとする。
【００５０】
本明細書中で「単離された」と記されている核酸は、それらの起源のゲノムDNAまたは細胞RNA(たとえば、それが細胞中またはライブラリーのような核酸混合物中に存在する場合)の核酸から分離された核酸であり、さらにプロセシングを受けていてもよい。「単離された」とは、本明細書中で使用する場合、天然で一体化されている他の構成要素が少なくとも60%除去されている、好ましくは75%除去されている、最も好ましくは90%除去されている核酸配列またはアミノ酸配列を意味する。「単離された」核酸(ポリヌクレオチド)としては、本明細書に記載の方法、類似の方法、または他の好適な方法により取得された核酸、たとえば、本質的に純粋な核酸、化学合成により、生物学的方法と化学的方法との併用により生成された核酸、および単離された組換え核酸が挙げられる。本明細書中で「組換え」と記されている核酸は、組換えDNA法により生成された核酸、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や制限酵素を用いるベクター中へのクローニングのような人為的複製方法に依存する手順により生成された核酸である。「組換え」核酸はまた、細胞の自然の機序を介して起こる組換え事象から得られたものであるが、ただし、これは、所望の組換え事象が可能になるようにまたはその確率が高くなるようにデザインされた核酸を細胞に導入した後で選択されたものである。特定の機能を有するポリペプチドをコードする単離された核酸の部分は、たとえば、Jasin, M., et al., U.S. Pat. No. 4,952,501の方法により同定および単離が可能である。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、同義である。「ペプチド」は、ポリペプチドの断片または一部、好ましくは、完全ポリペプチド配列として少なくとも1つの機能活性(たとえば、タンパク質分解活性、接着活性、融合活性、抗原活性、または細胞内活性)を有する断片または一部として定義される。
【００５２】
「患者」または「被験者」という用語は、同義的に用いられ、ヒト患者および非ヒト霊長類のような哺乳動物、さらにはウサギ、ラット、およびマウスのような実験動物、ならびに他の動物を意味する。
【００５３】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」とは、Akt3核酸もしくはポリペプチドおよび/またはB-Raf核酸もしくはポリペプチドを含有する生物学的な組織または流体のサンプル、たとえば、黒色腫癌のタンパク質、ポリヌクレオチド、または転写産物のことである。そのようなサンプルとしては、ヒトから単離された組織が挙げられるが、これに限定されるものではない。生物学的サンプルとしてはまた、生検および剖検のサンプル、組織学的目的で採取された凍結切片、血液、血漿、血清、喀痰、糞便、涙、粘液、毛髪、皮膚などのような組織の切片も挙げられうる。生物学的サンプルとしてはまた、患者の組織に由来する外植片ならびに初代細胞培養物および/またはトランスフォーム細胞培養物も挙げられる。生物学的サンプルは、典型的には、真核生物、好ましくは、真菌、植物、昆虫、原生動物、トリ、サカナ、爬虫動物のような真核生物、好ましくは、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギのような哺乳動物、最も好ましくは、チンパンジーまたはヒトのような霊長動物から取得される。
【００５４】
「癌」または「悪性疾患」は、同義語として用いられ、無制御の異常な細胞増殖、罹患細胞が局所的にまたは血流やリンパ系を介して他の身体部分に拡がる(すなわち転移する)能力、さらにはいくつかの特徴的な構造特性および/または分子特性のいずれかにより特性付けられるいくつかの疾患のいずれかを意味する。「癌細胞」または「悪性細胞」は、特定の構造特性を有し、分化が欠如し、かつ浸潤および転移が可能である細胞として理解される。癌の例は、皮膚癌、腎臓癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、および肝臓癌である。(DeVita, V. et al. (eds.), 2001, Cancer Principles and Practice of Oncology, 6th. Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.(この参考文献は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい)。
【００５５】
「アポトーシス」および「プログラム細胞死」(PCD)という用語は、同義語として用いられ、制御下の細胞自己破壊を引き起こす分子的および形態学的過程を記載する(たとえば、Kerr J. F. R. et al., 1972, Br J Cancer. 26:239-257を参照されたい)。アポトーシス細胞死は、細胞表面レセプターの連結反応、飢餓、増殖因子/生存因子の欠乏、熱ショック、酸素圧低下、DNA損傷、ウイルス感染、および細胞傷害剤/化学療法剤のようなさまざまな刺激により誘導可能である。アポトーシス過程は、胚形成、分化、増殖/ホメオスタシス、欠陥細胞つまり有害細胞の除去、とくに、免疫系のレギュレーションおよび機能に関係する。したがって、アポトーシスプログラムの機能不全またはディスレギュレーションは、免疫不全、自己免疫疾患、神経変性疾患、および癌のようなさまざまな病的症状に関連付けられる。アポトーシス細胞は、常同的形態学的変化すなわち細胞収縮により認識可能であり、変形を示し、その隣接細胞への接触を解除する。そのクロマチンが凝縮し、最終的に、細胞は、サイトゾルと凝縮クロマチンとオルガネラとを含有する「アポトーシス小体」と呼ばれる緻密な膜被包構造体に断片化される。アポトーシス小体は、マクロファージにより取り込まれるので、炎症反応を引き起こすことなく組織から除去される。これは、細胞死のネクローシス形態とは対照的である。ネクローシスの場合、細胞は、重大な傷害を受けて、膜完全性の消失、細胞の膨潤および破壊を生じる。壊死時、細胞内容物は、無制御な状態で細胞の環境中に放出され、周囲の細胞の損傷および対応する組織における強力な炎症反応を引き起こす。たとえば、Tomei L. D. and Cope F. O., eds., 1991, Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death, Plainville, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Isaacs J. T., 1993, Environ Health Perspect. 101(suppl 5):27-33(いずれも、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。さまざまなアポトーシスアッセイが、当業者に周知である(たとえば、DNA断片化アッセイ、放射性増殖アッセイ、処理細胞に対するDNAラダーリングアッセイ、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色細胞アッセイの蛍光顕微鏡観察など)。
【００５６】
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列と対比して、保存的修飾変異体とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のポリペプチドをコードする。たとえば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGはすべて、アミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、コドンによりアルギニンが指定されたすべて位置で、コードされたポリペプチドを変化させることなくコドンを記載の対応するコドンのいずれかに変更することが可能である。そのような核酸変異は、「サイレント置換」または「サイレント変異」であり、「保存的修飾変異」の1種である。また、ポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド配列はすべて、とくに記載のないかぎり、すべてのサイレント変異を記述する。したがって、サイレント置換は、アミノ酸をコードするすべての核酸配列の黙示的特性である。当業者であれば、標準的技術により核酸中の各コドン(通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUGを除いて)を機能的に同一の分子を生成するように修飾しうることは理解されよう。いくつかの実施形態では、酵素をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、酵素の産生に使用される特定の宿主細胞(たとえば、酵母、哺乳動物、植物、真菌など)中で発現されるように最適化される。
【００５７】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸または低パーセントのアミノ酸の変更、付加、または欠失を行う核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対するそれぞれの置換体、欠失体、または付加体は、改変の結果としてアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換されるのであれば、「保存的修飾変異体」であることは理解されよう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。たとえば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology" Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut (1994)を参照されたい。そのような保存的修飾変異体は、本発明に係る多形変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、それらを除外するものではない。
【００５８】
次の8つの群は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：1)アラニン(A)、グリシン(G)；2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4)アルギニン(R)、リシン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7)セリン(S)、トレオニン(T)；および8)システイン(C)、メチオニン(M)(たとえば、Creighton, 1984, Proteinsを参照されたい)。
【００５９】
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、同一であるか、または以下に記載のデフォルトパラメーターでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムによりまたは手作業のアライメントおよび目視検査により測定したときに指定パーセントの同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する(すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって比較して最大の対応が得られるようにアライメントしたときに、指定領域(たとえば、黒色腫関連Akt3遺伝子の配列)にわたり、約70%の同一性、好ましくは、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の同一性を有する)、2つ以上の配列またはサブ配列を意味する。その場合、そのような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義はまた、試験配列の相補体にもあてはまる。また、定義には、欠失および/または付加を有する配列さらには置換を有する配列も包含される。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮することが可能である。好ましくは、同一性は、少なくとも約25アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは50〜100アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、存在する。
【００６０】
配列比較を行う場合、典型的には、1つの配列は、試験配列と比較される参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用可能であるか、または択一的パラメーターを指定可能である。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００６１】
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用する場合、2つの配列を最適にアライメントした後で配列を同一個数の連続位置よりなる参照配列と比較しうる、20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150よりなる群から選択されるいずれか1つの個数の連続位置よりなるセグメントの参照を包含する。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アライメントは、たとえば、Smith & Waterman, 1991, Adv. Appi. Math. 2:482の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, by the search for similarity method of Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の相同性アライメントアルゴリズムにより、これらのアルゴリズムをコンピューターで実施することにより(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)、または手作業のアライメントおよび目視検査により(たとえば、Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)中の現用プロトコルを参照されたい)、実施可能である。
【００６２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に好適であるアルゴリズムの他の例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 および Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントしたときに、なんらかの正値の閾値スコアTに一致するかまたはそれを満足する、クエリー配列中の長さWのショートワードを同定することにより、最初に、高スコア配列ペア(HSP)を同定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al., supra)。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いHSPを見いだすための検索を開始するためのシードの役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大されうるかぎり、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対して、パラメーターM(1対のマッチ残基に対するリウォードスコア；常に>0)およびN(ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に<0)を用いて、計算される。アミノ酸配列に対しては、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向へのワードヒットの伸長は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Xだけ減少した場合；1つ以上の負スコア残基アライメントが蓄積して累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値(E)、および50のBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい)アライメント数(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００６３】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析をも行う(たとえば、Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標となる最小合計確率(P(N))である。たとえば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であるならば、核酸は、参照配列に類似しているとみなされる。
【００６４】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることを示す指標は、以下に記載されるように、第1の核酸によりコードされるポリペプチドが、第2の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生成された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、たとえば、2つのペプチドが保存的置換に関してのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には、第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が本質的に同一であることを示す他の指標は、以下に記載されるように、2つの分子またはそれらの相補体がストリンジェント条件下で互いハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらに他の指標は、同一のプライマーを用いて配列を増幅しうることである。
【００６５】
「〜に選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」という表現は、配列が複合混合物(たとえば、全細胞または全ライブラリーのDNAまたはRNA)中に存在するときにストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子の結合、二本鎖化、またはハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６６】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という表現は、プローブがその標的サブ配列(典型的には、核酸の複合混合物中に存在する)にはハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なったものになるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, 1993, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" in Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes中に見いだされる。一般的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度pHにおける特異的配列の熱融解点(TM)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。TMとは、(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下で)標的に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズするときの温度のことである(標的配列が過剰に存在する場合、TMにおいて、プローブの50%が平衡状態で占有される)。ストリンジェント条件とは、pH7.0〜8.3において塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオンの濃度であり(または他の塩)かつ温度が短いプローブ(たとえば10〜50ヌクレオチド)に対しては少なくとも約30℃、長いプローブ(たとえば50ヌクレオチド超)に対しては少なくとも約60℃であるときの条件のことである。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することにより達成することも可能である。選択的もしくは特異的なハイブリダイゼーションの場合、ポジティブシグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、場合によりバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、次のとおりでありうる：50%ホルムアミド、5×SSC、および1% SDS、42℃でインキュベート、または5×SSC、1% SDS、65℃でインキュベート、65℃で0.2×SSCおよび0.1% SDS中で洗浄。そのような洗浄は、5、15、30、60、120分間、またはそれ以上の時間をかけて実施しうる。PCRの場合、低ストリンジェンシー増幅に対しては、約36℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して、約32℃〜48℃の間で異なりうる。高ストリンジェンシーPCR増幅に対しては、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約50℃〜約65℃の範囲内でありうる。高および低ストリンジェンシー増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、30秒間〜2分間にわたる90℃〜95℃の変性段階、30秒間〜2分間持続するアニーリング段階、および1〜2分間にわたる約72℃の伸長段階を含む。
【００６７】
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、たとえば、遺伝暗号により許容される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、37℃における40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの緩衝液中でのハイブリダイゼーションおよび45℃における1×SSC中での洗浄を包含する。そのような洗浄は、5、15、30、60、120分間、またはそれ以上の時間をかけて実施しうる。ポジティブハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者であれば、他の選択肢のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用して類似のストリンジェンシーの条件を提供しうることは容易にわかるであろう。
【００６８】
組換えDNA技術の一般原理を示す標準的参考資料としては、J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; P. B. Kaufman et al., (eds), 1995, Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton; M. J. McPherson (ed), 1991, Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; J. Jones, 1992, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford; B. M. Austen and O. M. R. Westwood, 1991, Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford; D. N Glover (ed), 1985, DNA Cloning, Volumes I and II; M. J. Gait (ed), 1984, Oligonucleotide Synthesis; B. D. Hames and S. J. Higgins (eds), 1984, Nucleic Acid Hybridization; Wu and Grossman (eds), Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), Vol. 154 and Vol. 155; Quirke and Taylor (eds), 1991, PCR-A Practical Approach; Hames and Higgins (eds), 1984, Transcription and Translation; R. I. Freshney (ed), 1986, Animal Cell Culture; Immobilized Cells and Enzymes, 1986, IRL Press; Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; J. H. Miller and M. P. Calos (eds), 1987, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press; M. J. Bishop (ed), 1998, Guide to Human Genome Computing, 2d Ed., Academic Press, San Diego, Calif.; L. F. Peruski and A. H. Peruski, 1997, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research, American Society for Microbiology, Washington, D.Cが挙げられる。
【００６９】
「Akt3活性を低下させる」という用語は、Akt3活性が約25%〜約100%減少することを意味するように本明細書中で使用される。本発明では、(a)薬剤を細胞に投与したときに細胞により産生されるAkt3 mRNAのレベルもしくはAkt3タンパク質のレベルを低下させる任意の薬剤、または(b)薬剤を細胞に投与したときに、PI3K/Aktシグナルトランスダクション経路を介してAkt3 mRNAもしくはタンパク質のレベルに影響を与えて、細胞により産生されるAkt3 mRNAのレベルもしくはAkt3タンパク質のレベルの低下を引き起こす任意の薬剤、または(c)リン酸化もしくは脱リン酸化などを介してAkt3の活性を低下させる任意の薬剤、を介してAkt3を阻害することが意図される。Akt3活性の産物を除去する下流の経路の活性を低下させて、Akt3に対する反応物を提供する上流の経路の活性を低下させる薬剤もまた、この用語の範囲内に包含される。Akt3活性の低下または変化は、任意の公知の方法により、たとえば、キナーゼアッセイ、ウエスタンブロット中のリン酸化状態、またはタンパク質発現のレベルにより、測定可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
「V599E B-Raf活性を低下させる」という用語は、B-Raf活性が約25%〜約100%減少することを意味するように本明細書中で使用される。本発明では、(a)薬剤を細胞に投与したときに細胞により産生されるV599E B-Raf mRNAのレベルもしくはV599Eタンパク質のレベル低下させる任意の薬剤、または(b)薬剤を細胞に投与したときに、MAPKもしくはERKシグナルトランスダクション経路を介してB-Raf mRNAもしくはタンパク質のレベルに影響を与えて、細胞により産生されるV599E B-Raf mRNAのレベルもしくはV599Eタンパク質のレベルの低下を引き起こす任意の薬剤、または(c)リン酸化もしくは脱リン酸化などを介してB-Rafの活性を低下させる任意の薬剤、を介してB-Rafを阻害することが意図される。V599E B-Raf活性の産物を除去する下流の経路の活性を低下させて、V599E B-Rafに対する反応物を提供する上流の経路の活性を低下させる薬剤もまた、この用語の範囲内に包含される。B-Raf活性の低下または変化は、任意の公知の方法により、たとえば、キナーゼアッセイ、ウエスタンブロット中のリン酸化状態、またはタンパク質発現のレベルにより、測定可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
「黒色腫を治療する」という用語は、哺乳動物において、進行を禁止するか、軽減するか、改善するか、停止させるか、抑制するか、緩徐化させるか、もしくは逆転するか、または腫瘍発生を減少させること、あるいは腫瘍細胞において、アポトーシス率を増大させるかまたはアポトーシスを誘導することを意味する。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、血管新生を減少させることに関連して使用されるときの「血管新生」という用語は、薬剤の存在下で起こる新しい血管形成の量が、外因的に添加される薬剤の不在下で起こる血管形成の量未満に低減されることを意味する。CD-31抗原に対して陽性に染色された血管の数またはCD-31陽性血管により占有された腫瘍の面積を定量することにより、組織における血管形成の量を決定する方法(免疫組織化学的方法を含めて)は、当技術分野で周知である。
【００７３】
Akt3および/またはB-Raf核酸の検出
本発明のいくつかの実施形態では、黒色腫細胞に由来する全長Akt3もしくはB-Rafタンパク質、またはその任意の誘導体、変異体、相同体、または断片を含めて、、Akt3もしくはB-Rafポリペプチドをコードする核酸が使用されるであろう。そのような核酸は、Akt3もしくはB-Rafタンパク質の産生、診断的アッセイ、治療的適用、Akt3特異的もしくはBRaf特異的プローブ、Akt3もしくはB-Raf結合性および/もしくはモジュレート性化合物のアッセイ、他の種由来もしくはマウス由来のAkt3もしくはB-Raf相同体の同定および/もしくは単離を含むいくつかの用途のいずれにも、さらには他の用途にも有用である。
【００７４】
A. 一般的組換えDNA法
本発明の多数の用途は、組換え遺伝学の分野の常法を用いて実施可能である核酸配列のクローニング、合成、維持、変異誘発、および他の操作を含む。本発明で使用される一般的方法が開示されている基本的書籍としては、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2n Ed. 1989); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression: a Laboratory Manual; and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, (Ausubel et al., eds.)が挙げられる。
【００７５】
核酸に対して、サイズは、キロベース(kb)単位または塩基対(bp)単位のいずれかで与えられる。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または発表されたDNA配列から、得られる推定値である。タンパク質に対して、サイズは、キロダルトン(kDa)単位またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、配列決定されたアミノ酸配列から、または発表されたタンパク質配列から、推定される。
【００７６】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Van Devanter et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12:6159-6168に記載の自動合成機を用いて、Beaucage & Caruthers, 1981, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862により最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、化学合成することが可能である。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動によるかまたはPearson & Reanier, 1983, J. Chrom. 255:137-149に記載されるようなアニオン交換HPLCによるかのいずれかである。
【００７７】
クローン化遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、クローニング後、たとえば、Wallace et al., 1981, Gene 16:21-26に記載の二本鎖鋳型配列決定用のチェーンターミネーション法を用いて、確認可能である。
【００７８】
B. Akt3および/またはB-Rafヌクレオチド配列の単離および検出
本発明のいくつかの実施形態では、Akt3および/またはB-Raf核酸は、単離され、組換え法によりクローニングされる。そのような実施形態は、たとえば、タンパク質の発現や、Akt3および/またはB-Rafに由来する変異体、誘導体、発現カセット、あるいは他の配列を生成する際の、Akt3および/またはB-Rafポリヌクレオチドを単離するために、Akt3および/またはB-Raf遺伝子発現を監視するために、さまざまな種においてAkt3および/またはB-Raf配列を決定するために、患者における診断目的のために、すなわち、Akt3および/またはB-Rafにおける変異を検出するために、あるいは遺伝子型決定用途および/または法医学用途のために、使用される。
【００７９】
多形変異体、対立遺伝子、および種間相同体、ならびにAkt3またはB-Raf遺伝子と実質的に同一の核酸は、Akt3またはB-Raf核酸プローブを用いて、オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングすることにより、単離可能である。他の選択肢として、発現ライブラリーを使用し、Akt3またはB-Rafポリペプチドに対して作製された抗血清または精製抗体(これはまた、Akt3またはB-Raf相同体を認識しそれに選択的に結合する)で、発現された相同体を免疫学的に検出することにより、Akt3またはB-Rafタンパク質、多形変異体、対立遺伝子、および種間相同体をクローニングすることが可能である。
【００８０】
Akt3 cDNAライブラリーを作製するために、Akt3 RNAに富んだ供給源を選択するべきである。B-Raf cDNAライブラリーを作製するために、B-Raf RNAに富んだ供給源を選択するべきである。次に、逆転写酵素を用いてmRNAからcDNAを作製し、組換えベクター中に連結し、そして増殖、スクリーニング、およびクローニングのために宿主中にトランスフェクトする。cDNAライブラリーの作製方法およびスクリーニング方法は、周知である(たとえば、Gubler & Hoffman, 1983, Gene 25:263-269; Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supraを参照されたい)。
【００８１】
ゲノムライブラリーの場合、DNAを組織から抽出し、そして機械的に剪断するかまたは酵素的に消化させ、約12〜20kbの断片を生成する。次に、勾配遠心分離により断片を望ましくないサイズのものから分離し、バクテリオファージラムダベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージは、in vitroでパッケージ化される。組換えファージは、Benton & Davis, 1977, Science 196:180-182に記載されているようなプラークハイブリダイゼーションにより分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunstein et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965に概説されているように行われる。
【００８２】
より遠縁のAkt3またはB-Raf相同体は、いくつかの周知の技術のいずれかを用いることにより、たとえば、中程度にストリンジェントな条件を用いて、またはAkt3もしくはB-Rafに対して選択性のある領域に由来するプローブ(たとえば、C末端ドメインに対して発生させた特異的プローブ)を用いる低ストリンジェンシー条件下で、Akt3プローブもしくはB-RafプローブをゲノムもしくはcDNAライブラリーとハイブリダイズさせることにより、同定可能である。さらに、遠縁の相同体は、とくに、高度に保存されたアミノ酸ストレッチに基づいて、縮重プライマーセット(すなわち、所与のアミノ酸配列をコードするすべての可能なコドンが組み込まれたプライマー)を用いて、核酸ライブラリーから増幅可能である。そのようなプライマーは、当業者に周知であり、縮重プライマーデザインに関する多数のプログラムが、たとえばインターネット上で、入手可能である。
【００８３】
特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションに基づく方法を用いてAkt3もしくはB-Rafポリヌクレオチドを検出することにより、たとえば診断目的で、Akt3もしくはB-Raf RNAレベルなどを決定したりまたは特定のDNA配列を検出したりすることが可能である。たとえば、Akt3および/またはB-Rafの遺伝子発現は、当技術分野で公知の技術により、たとえば、ノーザンブロッティング、mRNAの逆転写およびPCR増幅(リアルタイムPCR手順(たとえば、逆転写酵素-TAQMANTM増幅)を用いるmRNAレベルの定量的PCR分析を包含する)、ドットブロッティング、in situハイブリダイゼーション、RNアーゼプロテクション、プローブDNAマイクロチップアレイなどにより、分析可能である。
【００８４】
他の実施形態では、高密度オリゴヌクレオチド分析技術(たとえば、GeneChipTM)を用いて、Akt3および/もしくはB-Rafのオーソログ、対立遺伝子、保存的修飾変異体、および多形変異体を同定したり、またはAkt3および/もしくはB-Raf mRNAのレベルを監視したりすることが可能である。相同体が既知の疾患(たとえば黒色腫)に関連付けられる場合、それらを診断ツールとしてのGeneChipTMと併用して、生物学的サンプル中の黒色腫を検出することが可能である。たとえば、Gunthand et al., 1998, AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:869-876; Kozal et al., 1996, Nat. Med. 2:753-759; Matson et al., 1995, Anal. Biochem. 224:110-106; Lockhart et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:1675-1680; Gingeras et al., 1998, Genome Res. 8:435-448; Hacia et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:3865-3866を参照されたい。
【００８５】
Akt3および/またはB-Rafポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの定量的または定性的検出を含みうるか、対照値との実際的比較を含みうるか、あるいは他の選択肢として、検出自体がAkt3および/またはB-Rafの増大されたレベルを本質的に示すように実施しうる。
【００８６】
特定の実施形態では、たとえば、黒色腫癌の診断では、Akt3および/またはB-Rafポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性レベルが定量されるであろう。そのような実施形態では、高レベルのAkt3および/またはB-Rafと正常な対照レベルとの差は、好ましくは、統計的に有意であろう。典型的には、診断的存在（diagnostic presence）、すなわち、Akt3および/またはB-Rafポリペプチドまたは核酸の過剰発現または増大は、非癌サンプルで期待されるレベルと比較して、生物学的サンプル中のAkt3および/またはB-Rafポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの少なくとも約1.5、2、3、5、10倍、またはそれ以上の増加を示す。Akt3および/またはB-Rafの検出は、in vitroで、すなわち、患者から採取された生物学的サンプル中の細胞で、またはin vivoで、実施可能である。一実施形態では、Akt3および/またはB-Rafの増大されたレベルは、それぞれ、Akt3および/またはB-Rafの診断マーカーとして使用される。本明細書中で使用する場合、「診断的存在」とは、非癌サンプルで期待されるレベルよりも高い任意のレベルのAkt3またはB-Rafを意味する。一実施形態では、生物学的サンプルにおけるAkt3またはB-Rafポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関するアッセイは、正常レベルのAkt3またはB-Rafポリペプチドまたはポリヌクレオチド(すなわち、非癌サンプルに特有なレベル、すなわち、癌でないレベル)が検出されない条件下で行われるであろう。したがって、そのようなアッセイでは、生物学的サンプルにおいてAkt3および/またはB-Rafポリペプチドまたは核酸が検出されたとすれば、診断的存在または増大されたレベルであることが示唆される。
【００８７】
以下に記載されるように、Akt3および/またはB-Rafを検出するためのいくつかの方法のいずれかを使用することが可能である。Akt3および/またはB-Rafポリヌクレオチドのレベルは、Akt3ゲノムDNA、mRNA、およびcDNAを含めて、任意のコグネイトAkt3またはB-Raf DNAまたはRNAを検出することにより、検出可能である。Akt3もしくはB-Rafポリペプチドは、Akt3および/もしくはB-Rafポリペプチド自体を検出することにより、またはAkt3および/もしくはB-Rafタンパク質の活性を検出することにより、検出可能である。検出は、Akt3および/もしくはB-Rafのレベル(たとえば、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、もしくはタンパク質のレベル、またはタンパク質の活性)の定量化を含みうるか、または他の選択肢として、とくに、対照レベルと比較して、Akt3および/もしくはB-Rafのレベルまたは存在もしくは不在の定性的評価でありうえる。以下に記載されるように、以上のいずれかを検出するためのいくつかの方法のいずれかを使用することが可能である。そのような方法としては、たとえば、ハイブリダイゼーション、増幅、および他のアッセイが挙げられる。
【００８８】
特定の実施形態では、細胞において増大されたレベルまたは診断的存在を検出する能力は、癌細胞に対するマーカーとして、すなわち、in vivoでまたはin vitroで検出される患者の癌細胞の数または局在化を監視するために、使用される。
【００８９】
典型的には、ここで検出されるAkt3ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然に存在するAkt3遺伝子に対して、少なくとも約50、100、200ヌクレオチドもしくはそれ以上、または20、50、100アミノ酸、もしくはそれ以上、の領域にわたり、少なくとも約70%同一、好ましくは、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上同一であろう。そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、機能形もしくは非機能形のAkt3、またはその任意の変異体、誘導体、もしくは断片を表しうる。
【００９０】
1. コピー数の検出
一実施形態では、たとえば、癌の診断または存在に対して、コピー数、すなわち、細胞中のAkt3遺伝子の数が、評価される。一般的には、所与の常染色体遺伝子に関して、動物は、それぞれの遺伝子の2つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は、たとえば癌細胞において、遺伝子増幅もしくは複製により、増大されたり、または欠失により低減されたりする可能性がある。特定の遺伝子のコピー数を評価する方法は、当業者に周知であり、とくに、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイが挙げられる。
【００９１】
a)ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
ハイブリダイゼーションに基づくいくつかのアッセイのいずれかを用いて、生物学的サンプルの細胞中のAkt3遺伝子またはAkt3遺伝子のコピー数を検出すること可能である。そのような方法の1つは、サザンブロットによるものである。サザンブロットでは、典型的には、ゲノムDNAを断片化し、電気泳動により分離し、膜に転写し、続いて、Akt3特異的プローブにハイブリダイズさせる。コピー数の測定では、標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度を、正常なゲノムDNAの領域(たとえば、同一のまたは関連する細胞、組織、器官などの非増幅部分)に対する対照プローブからのシグナルと比較することにより、相対的Akt3コピー数の推定値を提供する。サザンブロット法は、当技術分野で周知であり、たとえば、Ausubel et al., or Sambrook et al., supraに記載されている。
【００９２】
サンプル中のAkt3遺伝子のコピー数を決定するための他の選択肢の手段は、in situハイブリダイゼーション、たとえば、蛍光in situハイブリダイゼーションすなわちFISHによるものである。in situハイブリダイゼーションアッセイは、周知である(たとえば、Angerer, 1987, Meth. Enzymol 152:649)。一般的には、in situハイブリダイゼーションは、次の主要な工程を含む：(1)分析対象の組織または生物学的構造体の固定；(2)標的DNAの利用可能性を増大させ、非特異的結合を低減するための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；(3)生物学的構造中または組織中の核酸への核酸混合物のハイブリダイゼーション；(4)ハイブリダイゼーション時に結合されない核酸断片のポストハイブリダイゼーション洗浄除去；および(5)ハイブリダイズされた核酸断片の検出。
【００９３】
そのような用途で使用されるプローブは、典型的には、たとえば、ラジオアイソトープまたは蛍光レポーターを用いて、標識化される。好ましいプローブは、ストリンジェント条件下で標的核酸(複数可)に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ、たとえば、約50、100、もしくは200ヌクレオチドから約1000ヌクレオチドまで、またはそれ以上である。
【００９４】
本発明では、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)のような「比較プローブ」法を用いてAkt3遺伝子増幅を検出することが意図される。比較ゲノムハイブリダイゼーション法では、核酸の「試験」コレクションを第1の標識で標識化し、第2のコレクション(たとえば、健常な細胞または組織に由来するもの)を第2の標識で標識化する。アレイ内の各繊維に結合する第1および第2の標識の比により、核酸のハイブリダイゼーションの比を決定する。試験コレクションにおける遺伝子増幅などに起因する2つの標識からのシグナルの比の差を検出する。この比は、Akt3遺伝子コピー数の尺度を提供する。
【００９５】
本発明に係る方法で使用するのに好適なハイブリダイゼーションプロトコルは、たとえば、Albertson, 1984, EMBO J. 3:1227-1234; Pinkel, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9138-9142; EPO Pub. No. 430,402; Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Choo, Ed., 1994, Humana Press, Totowa, N.J.などに記載されている。
【００９６】
b)増幅に基づくアッセイ
他の実施形態では、増幅に基づくアッセイを用いて、Akt3を検出するかまたはAkt3遺伝子のコピー数を測定する。そのようなアッセイでは、Akt3核酸配列は、増幅反応(たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちPCR)において鋳型の役割を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量は、元のサンプル中の鋳型の量に比例するであろう。適切な対照との比較は、Akt3遺伝子のコピー数の尺度を提供する。定量的増幅の方法については、当業者に周知である。定量的なPCRに対する詳細なプロトコルは、たとえば、Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.)に提供されている。当業者が遺伝子の任意の部分を増幅するためのプライマーをルーチン的に選択できるようにするには、Akt3に対する核酸配列があれば十分である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、TaqManに基づくアッセイを用いてAkt3ポリヌクレオチドを定量する。TaqManに基づくアッセイでは、5'蛍光染料と3'消光剤とを含有する発蛍光団オリゴヌクレオチドプローブを使用する。プローブは、PCR産物にハイブリダイズするが、それ自体、3'末端にブロッキング剤があるため、伸長させることはできない。PCR産物が後続のサイクルで増幅された場合、ポリメラーゼ(たとえばAmpliTaq)の5'ヌクレアーゼ活性によりTaqManプローブの切断が起こる。この切断により5'蛍光染料と3'消光剤とが分離されるので、増幅の関数として蛍光の増大を生じる(たとえば、www.perkin-elmer.comなどでPerkin-Elmerにより提供される文献を参照されたい)。
【００９８】
本発明により意図される他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace, 1989, Genomics 4:560, Landegren et al., 1988, Science 241:1077, and Barringer et al., 1990, Gene 89:117を参照されたい)、転写増幅(Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173)、自律的配列複製(Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874)、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCRなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
2. Akt3および/またはB-Raf発現の検出
a) 直接的なハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてAkt3および/またはB-Raf遺伝子転写産物(mRNAまたはそれから作製されるcDNA)の検出および/またはレベルの定量を行う方法は、当業者に公知である(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2D Ed., Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, New Yorkを参照されたい)。
【０１００】
たとえば、Akt3 cDNAの存在、不在、または量を評価するための一方法は、ノーザンブロットを含む。簡潔に述べると、典型的な実施形態では、所与の生物学的サンプルからmRNAを単離し、電気泳動させてmRNA種を分離し、ゲルからニトロセルロース膜に転写させる。次に、標識化Akt3プローブを膜にハイブリダイズして、mRNAの同定および/または定量を行う。
【０１０１】
b)増幅に基づくアッセイ
他の実施形態では、増幅に基づく方法(たとえば、RT-PCR)を用いて、Akt3および/またはB-Raf転写産物(たとえば、Akt3 mRNA)を検出する。RT-PCR方法は、当業者に周知である(たとえば、Ausubel et al., supraを参照されたい)。好ましくは、定量的RT-PCRを用いることにより、サンプル中のmRNAのレベルを対照サンプルまたは対照値と比較可能にする。
【０１０２】
3. Akt3および/またはB-Rafポリペプチド発現の検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いるAkt3および/またはB-Raf遺伝子ならびに遺伝子発現の検出に加えて、ポリペプチドの検出または定量を行うことにより、Akt3および/またはB-Rafレベルの検出および/または定量を行うことも可能である。Akt3またはB-Rafポリペプチドは、当業者に周知であるいくつかの手段のいずれかにより検出および定量が行われる。これらとしては、分析生化学的方法、たとえば、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィー法(HPLC)、薄層クロマトグラフィー法(TLC)、超拡散クロマトグラフィー法など、またはさまざまな免疫学的方法、たとえば、流体もしくはゲル沈降反応法、免疫拡散法(単一もしくは二重)、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティングなどが挙げられる。Akt3ポリペプチド検出については以下で論じる。
【０１０３】
C. 原核生物および真核生物における発現
いくつかの実施形態では、組換え技術を用いてAkt3および/またはB-Rafポリペプチドを産生することが望ましい。Akt3またはB-RafポリペプチドをコードするcDNAのようなクローン化遺伝子または核酸の高レベル発現を取得するために、Akt3またはB-Raf配列は、典型的には、転写を指令する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。好適な細菌性プロモーターは、当技術分野で周知であり、たとえば、Sambrook et al. and Ausubel et al.に記載されている。Akt3タンパク質を発現するための細菌性発現系は、たとえば、E. coli系、Bacillus sp.系、およびSalmonella系のものが利用可能である(Palva et al., 1983, Gene 22:229-235; Mosbach et al., 1983, Nature 302:543-545。そのような発現系のためのキットは、入手可能である。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞に対する真核発現系は、当技術分野で周知であり、市販されている。一実施形態では、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【０１０４】
治療用途では、Akt3および/またはB-Raf核酸は、ウイルスベクターによる感染、リポソームに基づく方法、バイオリスティック粒子加速(遺伝子銃)、およびネイキッドDNA注射をはじめとする多数の方法のいずれかを用いて、in vitro、in vivo、またはex vivoで、細胞中に導入されるが、これらに限定されるものではない。そのような治療上有用な核酸としては、全長Akt3またはB-Rafに対するコード配列、Akt3またはB-Raf断片、ドメイン、誘導体、または変異体に対するコード配列、Akt3またはB-Rafアンチセンス配列、Akt3またはB-Raf siRNA配列、およびAkt3またはB-Rafリボザイムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。典型的には、そのような配列は、プロモーターに機能しうる形で連結されるであろうが、多数の用途では、特定のアンチセンス、siRNA、またはリボザイム分子などのように、それ自体、直接的に治療上有効である核酸は、細胞に投与されるであろう。
【０１０５】
異種核酸の発現を指令するために使用されるプロモーターは、個々の用途に依存する。プロモーターは、場合により、その自然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同一の距離だけ異種転写開始部位から離間して配置される。しかしながら、当技術分野で公知のごとく、プロモーター機能を損なうことなく、この距離をいくらか変化させることが可能である。
【０１０６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞においてAkt3コード核酸またはBRafコード核酸の発現に必要とされるすべてのさらなるエレメントを含有する転写ユニットまたは発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、Akt3またはB-Rafポリペプチドをコードする核酸配列に機能しうる形で連結されたプロモーター、ならびに転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要とされるシグナルを含有する。Akt3またはB-Rafポリペプチドをコードする核酸配列は、トランスフェクト細胞によるコードタンパク質の分泌を促進するために切断可能なシグナルペプチド配列に連結させることが可能である。カセットのさらなるエレメントは、エンハンサーと、ゲノムDNAが構造遺伝子として使用される場合、機能的なスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を有するイントロンと、を含みうる。
【０１０７】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を提供するように、構造遺伝子の下流に転写終結領域をも含有するべきである。終結領域は、プロモーター配列と同一の遺伝子から取得可能であるか、または異なる遺伝子から取得可能である。
【０１０８】
遺伝情報を細胞に輸送にするために使用される特定の発現ベクターは、とりわけ重要であるというわけでない。真核細胞または原核細胞における発現に用いられる従来のベクターのいずれかを使用することが可能である。有用な発現ベクターは、たとえば、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列のセグメントで構成されうる。好適なベクターとしては、SV40プラスミドおよび既知の細菌プラスミド、たとえば、E. coliプラスミドco1 E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith et al., 1988, Gene 67:31-40)の誘導体、pMB9およびその誘導体、RP4のようなプラスミド; ファージDNA、たとえば、ファージ1の多数の誘導体、たとえば、NM989、および他のファージDNA、たとえば、M13および繊維状一本鎖ファージDNA; 酵母プラスミド、たとえば、2mプラスミドまたはその誘導体; 真核細胞に有用なベクター、たとえば、昆虫細胞または哺乳動物細胞に有用なベクター; プラスミドとファージDNAとの組合せから誘導されるベクター、たとえば、ファージDNAまたは他の発現制御配列を利用するように改変されたプラスミド; などが挙げられる。たとえば、本発明で使用されることが意図される哺乳動物発現ベクターとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)プロモーターのような誘導プロモーターを有するベクター、たとえば、DHFR発現ベクターを有する任意の発現ベクター、またはDHFR/メトトレキセート共増幅ベクター、たとえば、pED(クローン化遺伝子とDHFRの両方を発現するベクターを有するPstI、SalI、SbaI、SmaI、およびEcoRIクローニング部位; Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)を参照されたい)が挙げられる。他の選択肢として、グルタミンシンテターゼ/メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、たとえば、pEE14(ベクターがグルタミンシンターゼとクローン化遺伝子とを発現するHindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、およびBclIクローニング部位; Celltech)。他の実施形態では、エプスタインバーウイルス(EBV)の制御下でエピソーム発現を指令するベクター、たとえば、pREP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成ラウス肉腫ウイルス長末端反復(RSV-LTR)プロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー; Invitrogen)、pCEP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択性マーカー; Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamH1クローニング部位、誘導可能methallothionein IIa遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー: Invitrogen)、pREP8(BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheI、およびKpnIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、ヒスチジノール選択性マーカー; Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、およびBamHIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、G418選択性マーカー; Invitrogen)、およびpEBVHis(RSV-LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー、ProBond樹脂により精製可能でエンテロキナーゼにより切断されるN末端ペプチド; Invitrogen)を使用することが可能である。本発明で使用すべく選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、およびApaIクローニング部位、G418選択; Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaIクローニング部位、G418選択; Invitrogen)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明により意図されるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター(Kaufman, 1991, supraを参照されたい)としては、pSC11(SmaIクローニング部位、TK-および.beta.-gal選択、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnIおよびHindIIIクローニング部位; TK-およびベータ(β)-gal選択)、およびpTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHII、およびHpaクローニング部位、TKまたはXPRT選択)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
発現ベクターに典型的に含まれるエレメントとしてはまた、E. coliで機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域のユニークな制限部位も挙げられる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は、とくに重要というわけではなく、当技術分野で公知の多くの耐性遺伝子のいずれも好適である。原核配列は、場合により、必要であれば、真核細胞におけるDNAの複製を妨害しないように選択される。
【０１１０】
特定の組換えDNA分子が同定され単離された後、当技術分野で公知のいくつかの方法を用いてそれを増殖させることが可能である。好適な宿主系および増殖条件が設定された後、組換え発現ベクターを増殖させ、多量に調製することが可能である。使用しうる発現ベクターとしては、次のベクターまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない：ヒトウイルスまたは動物ウイルス、たとえば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス、たとえば、バキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター(たとえば、ラムダ)ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター(これらはいくつかの例を挙げたにすぎず、当業者には公知である)。
【０１１１】
それに加えて、挿入配列の発現をモジュレートしたりまたは所望の特定の方式で遺伝子産物の修飾および処理を行ったりする宿主細胞株を選択してもよい。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後プロセシングおよび改変に対する特徴的かつ特異的機序を有する。適切な細胞系または宿主系は、発現された外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングが確実に行われるように選択可能である。酵母における発現は、生物学的活性産物を産生しうる。真核細胞における発現は、「天然の」折畳みの可能性を増大しうる。さらに、哺乳動物細胞における発現は、黒色腫においてAkt3および/またはB-Raf活性の再構成または構成を行うためのツールを提供しうる。さらに、異なるベクター/宿主発現系は、異なる程度で、タンパク質分解切断のようなプロセシング反応に影響を及ぼしうる。
【０１１２】
標準的トランスフェクション法を用いて、大量のAkt3またはB-Rafタンパク質を発現する細菌細胞系、哺乳動物細胞系、酵母細胞系、または昆虫細胞系を作製し、次に、標準的技術を用いてそれを精製する(たとえば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:17619-17622; "Guide to Protein Purification," in Methods in Enzymology, Vol. 182, 1990 (Deutscher, Ed.を参照されたい)。真核細胞および原核細胞のトランスフォーメーションは、標準的技術に従って行われる(たとえば、Morrison, 1977, J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362, 1983 (Wu et al., eds.)を参照されたい)。
【０１１３】
宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用することが可能である。これらとしては、Superfect(Qiagen)のような試薬、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バイオリスティック粒子加速(遺伝子銃)、またはクローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、もしくは他の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる(たとえば、Sambrook et al., supraを参照されたい)。
【０１１４】
発現ベクターを細胞中に導入した後、Akt3および/またはB-Rafポリペプチドの発現に有利な条件下でトランスフェクト細胞を培養し、以下に明示される標準的技術を用いて培養物から該ペプチドを回復する。原核生物または真核生物の細胞を培養する方法は、周知であり、たとえば、Ausubel et al., Sambrook et al., and in Freshney, 1993, Culture of Animal Cells, 3.sup.rd. Ed., A Wiley-Liss Publicationに教示されている。
【０１１５】
宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを用いて、ベクター(たとえば標的化ベクター)を細胞中に導入することが可能である。宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用することが可能である。宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれも使用可能である。以下に提供されるように、本発明に係る核酸は、任意の遺伝子移入機序を介して、たとえば、ウイルス媒介遺伝子送達、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームなどを介して、細胞中に導入することが可能である。次に、細胞型または組織型に適した標準的な方法に従って、トランスジュース細胞を被験者中に注入するか(たとえば、製薬上許容される担体に組み入れて)または同位置に移植することが可能である。さまざまな細胞を被験者中に移植または注入するための標準的方法は、周知である。
【０１１６】
一例として、送達は、LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, Md.)、SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany)、およびTRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.)のような市販のリポソーム調剤、ならびに当技術分野で標準的である手順に従って開発された他のリポソームを用いて、リポソームを介して行われうる。それに加えて、本発明に係る核酸またはベクターは、Genetronics, Inc. (San Diego, Calif.)から入手可能な技術であるエレクトロポレーションにより、さらにはSONOPORATION machine (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Ariz.)を利用して、送達可能である。
【０１１７】
一例として、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージ化しうるレトロウイルスベクター系のようなウイルス系を介して行われうる(たとえば、62、63を参照されたい)。次に、組換えレトロウイルスを感染に使用することにより、感染細胞に核酸を送達することが可能である。哺乳動物細胞中に核酸を導入する正確な方法は、当然ながら、レトロウイルスベクターの使用に限定されるものではない。他の技術は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス性(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクターの使用を含めて、この手順に広く利用可能である。リポソーム送達ならびにレセプター媒介機序および他のエンドサイトーシス機序のような物理的トランスダクション技術もまた、使用可能である。本発明は、これらまたは他の一般に用いられる遺伝子移入方法のいずれかと組み合わせて使用可能である。
【０１１８】
細胞内のAkt3活性レベルを低下させることによる癌細胞におけるアポトーシスの誘導
一実施形態では、本発明は、Akt3活性を低下させる薬剤に細胞を接触させることにより黒色腫腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供する。好ましい実施形態では、薬剤は、siRNA分子である。
【０１１９】
siRNAポリヌクレオチドとは、転写後遺伝子サイレンシング機序であるRNA干渉の作用を媒介するRNA核酸分子のことである。siRNAポリヌクレオチドは、好ましくは、二本鎖RNA(dsRNA)を含むものであるが、そのように限定されるものではなく、一本鎖RNAを含むものであってもよい(たとえば、Martinez et al. Cell 110:563-74 (2002)を参照されたい)。siRNAポリヌクレオチドは、ヌクレオチド(リボヌクレオチドもしくはもデオキシリボヌクレオチドまたはその両方の組合せ)および/または本明細書に提供されるようなヌクレオチド類似体よりなる他の天然に存在する組換えもしくは合成の一本鎖もしくは二本鎖のポリマーを含みうる(たとえば、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドなど、典型的には5'→3'ホスホジエステル結合)。したがって、相補的ヌクレオチド塩基対形成の原理が十分に認識されていることを考えれば、本発明に係るsiRNAポリヌクレオチドの実施形態の転写を指令しうるDNA配列として本明細書中に開示されている特定の例示的な配列もまた、対応するRNA配列およびそれらの相補体を記述することが意図されることはわかるであろう。siRNAは、RNAポリメラーゼプロモーター(たとえば、U6プロモーターもしくはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーター)を含有するDNA(ゲノム、cDNA、もしくは合成)を鋳型として用いて転写させることが可能であるか、またはsiRNAは、合成により得られるRNA分子でありうる。特定の実施形態では、本発明に係るsiRNAポリヌクレオチドは、平滑末端を有していてもよい。すなわち、二本鎖の一方の鎖の各ヌクレオチドは、対向する鎖のヌクレオチドと完全に相補的である(たとえば、ワトソン・クリック型塩基対形成による)。特定の他の実施形態では、本発明に係るsiRNAポリヌクレオチドの少なくとも1本の鎖は、siRNAポリヌクレオチドのいずれか一方の鎖、好ましくは両方の鎖の3'末端に「オーバーハング」する(すなわち、対向する鎖の相補的塩基と塩基対を形成しない)少なくとも1個、好ましくは2個のヌクレオチドを有する。特定の本発明の他の実施形態では、siRNAポリヌクレオチド二本鎖のそれぞれの鎖は、3'末端に2ヌクレオチドのオーバーハングを有する。2ヌクレオチドのオーバーハングは、好ましくは、チミジンジヌクレオチド(TT)であるが、他の塩基、たとえば、TCジヌクレオチドもしくはTGジヌクレオチドまたは任意の他のジヌクレオチドをも含んでいてもよい。siRNAポリヌクレオチドの3'末端に関する考察については、たとえば、WO 01/75164を参照されたい。
【０１２０】
好ましいsiRNAポリヌクレオチドは、約18〜30個のヌクレオチド塩基対、好ましくは約18、19、20、21、22、23、24、25、26、もしくは27個の塩基対、他の好ましい実施形態では、19、20、21、22、もしくは23個の塩基対、または約27個の塩基対よりなる、二本鎖オリゴマーヌクレオチドを含む。ただし、「約」の使用は、以上に記載される場合、選択されたポリペプチドの発現を妨害しうる機能性siRNAポリヌクレオチドを生成可能なプロセッシブ切断工程が、特定の実施形態でかつ特定の条件下で、完全には効率的でない可能性もあることを示唆する。したがって、たとえば、「約」18、19、20、21、22、23、24、もしくは25個の塩基対よりなるsiRNAポリヌクレオチドは、非限定的理論によれば、プロセシング、生合成、または人為的合成のばらつきの結果として、1、2、3、もしくは4塩基対だけ長さが異なる(たとえば、ヌクレオチドの挿入または欠失により)1種以上のsiRNAポリヌクレオチド分子を含んでいる可能性がある。本発明の対象となるsiRNAポリヌクレオチドはまた、特定の配列と1、2、3、もしくは4ヌクレオチドだけ異なる(たとえば、転位または転換を含めてヌクレオチド置換により)変化を呈するポリヌクレオチド配列をも含む可能性もある。この差異は、分子の長さ、二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖中に位置するかまたはアンチセンス鎖中に位置するかに依存して、特定のsiRNAポリヌクレオチド配列の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、もしくは19のいずれかで、またはsiRNAポリヌクレオチドの位置20、21、22、23、24、25、26、もしくは27で、生じる。ヌクレオチド置換は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖のみに、たとえば、アンチセンス鎖のみに見いだされることもあり、置換ヌクレオチドが典型的には水素結合塩基対を形成する相補的ヌクレオチドは、必ずしもセンス鎖中に対応して置換されるとは限らない。好ましい実施形態では、siRNAポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列に関して均一である。本明細書に記載されているように、好ましいsiRNAポリヌクレオチドは、本発明に係るAkt3ポリペプチドの発現を妨害する。これらのポリヌクレオチドはまた、プローブまたはプライマーとしても使用可能である。
【０１２１】
本発明に係るsiRNAポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドは、特定の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド断片(たとえば、約18〜30ヌクレオチドのもの、ただし、これは、両端の値を含めて18〜30の任意の整数のヌクレオチド数を含むものと理解すべきである)とそのリバース相補体(典型的には、スペーサー配列により分離されている)とを含む一本鎖ポリヌクレオチドから誘導可能である。特定のそのような実施形態によれば、スペーサーの切断により、一本鎖オリゴヌクレオチド断片とそのリバース相補体とが提供され、その結果、それらは、アニーリングして本発明に係る二本鎖siRNAポリヌクレオチドを形成する(場合により、一方もしくは両方の鎖の3'末端および/または5'末端で1、2、3個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの付加または除去を生じうる追加のプロセシング工程を伴いうる)。特定の実施形態では、スペーサーは、スペーサーの切断(および場合により、一方または両方の鎖の3'末端および/または5'末端で1、2、3、4個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの付加または除去を生じうる後続のプロセシング工程)の前に断片とそのリバース相補体とがアニーリングして二本鎖構造(たとえば、ヘアピン型ポリヌクレオチド)を形成しうる長さである。したがって、スペーサー配列は、二本鎖核酸の状態にアニーリングされたときに、siRNAポリヌクレオチドを含む2つの相補的ポリヌクレオチド配列領域間に位置する本明細書中に提供された任意のポリヌクレオチド配列でありうる。好ましくは、スペーサー配列は、少なくとも4個のヌクレオチドを含むが、特定の実施形態では、スペーサーは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21〜25、26〜30、31〜40、41〜50、51〜70、71〜90、91〜110、111〜150、151〜200個、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含みうる。スペーサーにより分離された2つの相補的ヌクレオチド配列を含む一本ヌクレオチド鎖から誘導されるsiRNAポリヌクレオチドの例は、報告されている(たとえば、Brummelkamp et al., 2002 Science 296:550; Paddison et al., 2002 Genes Develop. 16:948; Pa
ul et al. Nat. Biotechnol. 20:505-508 (2002); Grabarek et al., BioTechniques 34:734-44 (2003))。
【０１２２】
ポリヌクレオチド変異体は、先に記載したごとく、siRNAポリヌクレオチドの活性が実質的に低減されないように、1つ以上の置換、付加、欠失、および/または挿入を含有しうる)。siRNAポリヌクレオチドの活性に及ぼす影響は、一般的には、本明細書に記載されるようにまたは従来法を用いて評価可能である。変異体は、天然のAkt3をコードするポリヌクレオチド配列の一部に対して、好ましくは少なくとも約75%、78%、80%、85%、87%、88%、または89%の同一性、より好ましくは少なくとも約90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を呈する。同一性パーセントは、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムの使用を含めて任意の方法を用いて、たとえば、AlignまたはBLASTアルゴリズム(Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992)、これは、NCBIウェブサイト([online] Internet:<URL: http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTを参照されたい)で入手可能である)を用いて、ポリヌクレオチドの配列を、当技術分野で公知であり本明細書に引用されているような全長Akt3ポリヌクレオチドの対応する部分と、比較することにより、容易に決定可能である。デフォルトパラメーターを使用することが可能である。
【０１２３】
特定のsiRNAポリヌクレオチド変異体は、天然のPTP1B遺伝子の一部に実質的に相同的である。そのようなポリヌクレオチド変異体から誘導される一本鎖核酸(たとえば熱変性により)は、天然のAkt3ポリペプチド(または相補的配列)をコードする天然に存在するDNAまたはRNA配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能である。中程度にストリンジェントな条件下で検出可能にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド、より好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有しうる。特定の好ましい実施形態では、そのような配列(またはその相補体)は、発現を妨害することが望まれるAktポリペプチドに特有なものであろう。また、特定の他の実施形態では、配列(またはその相補体)は、ポリペプチド発現を妨害することが望まれるAkt3および1つ以上のAktアイソフォームにより共有されうる。特定の好ましい実施形態では、そのような配列(またはその相補体)は、発現を妨害することが望まれるB-Rafポリペプチドに特有なものであろう。また、特定の他の実施形態では、配列(またはその相補体)は、ポリペプチド発現を妨害することが望まれるB-Rafおよび1つ以上のRafアイソフォームにより共有されうる。
【０１２４】
好適な中程度にストリンジェントな条件は、たとえば、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液中で予洗することと；50℃〜70℃、5×SSCで、1〜16時間(たとえば一晩)にわたりハイブリダイズすることと；続いて、0.05〜0.1% SDSを含有する2×、0.5×、および0.2×SSCの1つ以上を毎回用いて22〜65℃で20〜40分間にわたり1回もしくは2回洗浄することと；を含む。さらなるストリンジェンシーでは、条件は、0.1×SSCおよび0.1% SDS中で50〜60℃で15〜40分間にわたり洗浄含みうる。当業者には公知のように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変化は、プレハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション工程、および洗浄工程に用いられる時間、温度、および/または溶液の濃度を変更することにより達成可能である。好適な条件はまた、部分的には、使用されるプローブのおよびブロットされるプロバンド核酸サンプルの特定のヌクレオチド配列に依存しうる。したがって、プローブの所望の選択性が、1つ以上の特定のプロバンド配列にはハイブリダイズするが特定の他のプロバンド配列にはハイブリダイズしないその能力に基づいて確定したとき、過度の実験を行わなくとも適切なストリンジェンシー条件を容易に選択しうることはわかるであろう。
【０１２５】
本発明に係る配列特異的siRNAポリヌクレオチドは、いくつかの基準のうちの1つ以上を用いてデザイン可能である。たとえば、対象ポリペプチド(たとえば、本明細書に記載のAkt3および他のポリペプチド)をコードする配列と同一の19個の連続したヌクレオチドを有するsiRNAポリヌクレオチドをデザインするために、次の特性のうちの1つ以上を有する21塩基配列に対してポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームを走査しうる：(1) 約1:1(ただし2:1以下)または1:2のA+T/G+C比；(2) 5'末端のAAジヌクレオチドまたはCAジヌクレオチド；(3) 55℃未満の内部ヘアピンループ融解温度；(4) 37℃未満のホモダイマー融解温度((3)および(4)に記載される融解温度の計算値は、当業者に公知のコンピューターソフトウェアを用いて決定可能である)；(5) いかなる他の既知のポリヌクレオチド配列中にも存在が確認されない一連の少なくとも16個の連続したヌクレオチド(そのような評価は、BLASTのような当業者に利用可能なコンピュータープログラムを用いて公的に利用可能なデータベースを探索することにより容易に決定しうる)。他の選択肢として、さまざまな販売業者(たとえば、OligoEngine.TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colo.); Ambion Inc. (Austin, Tex.); and QIAGEN, Inc. (Valencia, Calif.))から市販品として入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、siRNAポリヌクレオチド配列をデザインし選択することが可能である。(Elbashir et al., Genes & Development 15:188-200 (2000); Elbashir et al., Nature 411:494-98 (2001); および [online] Internet:URL<http://www.mp- ibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/Tuschl_MIV2(3).sub.--2002.p df.をも参照されたい)。次に、当技術分野で公知の方法および本明細書に記載の方法に従って、標的ポリペプチドの発現を妨害するsiRNAポリヌクレオチドの能力に関して試験することが可能である。siRNAポリヌクレオチドの有効性の判定は、ポリペプチド発現を妨害するその能力を考慮することを含むだけでなく、siRNAポリヌクレオチドが不適切な毒性作用、たとえば、細胞死がRNA干渉(たとえば、細胞におけるAkt3発現の妨害)の所望の効果でない細胞のアポトーシスを呈するかを考慮することも含む。
【０１２６】
また、当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果として、多くのヌクレオチド配列が本明細書に記載のポリペプチドをコードしうることは、容易にかわるであろう。すなわち、アミノ酸は、いくつかの異なるコドンのうちの1つによりコードされうる。また、当業者であれば、ある特定のヌクレオチド配列が他のものと異なっていようとも(本明細書中に開示されるアライメント法および当技術分野で公知のアライメント法により測定しうる)、配列は、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性があることを容易に確認しうる。たとえば、ポリペプチド中のアミノ酸ロイシンは、6つの異なるコドン(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、およびCTG)のうちの1つによりコードされうる。同様に、セリンは、(TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、およびAGC)のうちの1つによりコードされうる。たとえば、プロリン、アラニン、およびバリンのような他のアミノ酸は、4つの異なるコドン(プロリンの場合、CCT、CCC、CCA、CCG;アラニンの場合、GCT、GCC、GCA、GCG;およびバリンの場合、GTT、GTC、GTA、GTG)のいずれか1つによりコードされうる。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、いずれの天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を保有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度に差がある点で異なるポリヌクレオチドは、とくに本発明の考慮対象となる。
【０１２７】
標的ポリヌクレオチド(たとえば、対象標的ポリペプチドをコードしうるポリヌクレオチド)を含めて、ポリヌクレオチドは、とくに望ましいsiRNAポリヌクレオチドの調製ならびにsiRNAポリヌクレオチドで使用される望ましい配列の同定および選択に有用であるさまざまな技術のいずれかを用いて、調製可能である。たとえば、好適な細胞型または組織型から調製されたcDNAからポリヌクレオチドを増幅することが可能である。そのようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して増幅されうる。この手法のために、本発明で提供される配列に基づいて配列特異的プライマーをデザインすることが可能であり、そして購入または合成することが可能である。増幅された部分は、周知の技術を用いて、好適なライブラリー(たとえば、ヒト黒色腫cDNA)から全長遺伝子またはその所望の部分を単離するために使用可能である。そのような技術の範囲内で、ライブラリー(cDNAまたはゲノム)は、増幅に好適な1種以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーは、より大きい分子を含むようなサイズのものが選択される。また、遺伝子の5'領域および上流領域を同定するために、ランダムプライムライブラリーが好ましいこともある。イントロンの取得および5'配列の伸長を行うには、ゲノムライブラリーが好ましい。本発明の考慮対象となるsiRNAポリヌクレオチドに好適な配列はまた、siRNAポリヌクレオチド配列のライブラリーから選択することも可能である。
【０１２８】
ハイブリダイゼーション法のために、周知の技術を用いて部分配列を標識化することが可能である(たとえば、32Pを用いてニックトランスレーションまたは末端標識化を行うことにより)。次に、変性細菌コロニーを含有するフィルター(またはファージプラークを含有するローン)を標識化プローブでハイブリダイズすることにより、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーをスクリーニングすることが可能である(たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001を参照されたい)。ハイブリダイズコロニーまたはプラークを選択し、増殖し、単離し、さらなるDNA分析に供する。たとえば、部分配列由来のプライマーおよびベクター由来のプライマーを用いるPCRによりクローンを分析して追加の配列の量を決定することが可能である。制限地図および部分配列を生成し、1種以上のオーバーラップクローンを同定することが可能である。周知の技術を用いて好適な断片を連結することにより、全長cDNA分子を生成することが可能である。
【０１２９】
他の選択肢として、部分cDNA配列から全長コード配列を取得するための多数の増幅技術が当技術分野で公知である。そのような技術の範囲内で、増幅は、一般的にはPCRを介して行われる。そのような技術の1つは、「cDNA末端の迅速増幅」すなわちRACEとして知られる。この技術は、既知の配列の3'側および5'側にある配列を同定するために内部プライマーおよび外部プライマー(ポリA領域またはベクター配列にハイブリダイズする)の使用を含む。さまざまな市販のキットのいずれかを用いて、増幅工程を行うことが可能である。
【０１３０】
プライマーは、たとえば、当技術分野で周知のソフトウェアを用いて、デザイン可能である。プライマー(または本発明の考慮対象となる他の用途に供されるオリゴヌクレオチド、たとえば、プローブおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、好ましくは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32ヌクレオチド長であり、少なくとも40%のGC含有率を有し、かつ約54℃〜72℃の温度で標的配列にアニーリングする。増幅された領域を先に記載されるように配列決定し、オーバーラップ配列をコンティグ配列にアセンブルすることが可能である。本発明の考慮対象となる特定のオリゴヌクレオチドは、いくつかの好ましい実施形態では、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33〜35、35〜40、41〜45、46〜50、56〜60、61〜70、71〜80、81〜90ヌクレオチド長、またはそれ以上を有しうる。
【０１３１】
本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列は、確立された組換えDNA技術を用いてさまざまな他のヌクレオチド配列に連結させることが可能である。たとえば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ誘導体、およびコスミドをはじめとするさまざまなクローニングベクターのいずれかにクローン化することが可能である。とくに興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。一般的には、好適なベクターは、少なくとも1種の生物の機能性複製起点、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1種以上の選択性マーカーを含有する。(たとえば、WO 01/96584; WO 01/29058; U.S. Pat. No. 6,326,193; U.S. 2002/0007051を参照されたい)。他のエレメントは、所望の用途に依存するであろう。また、当業者には明らかであろう。たとえば、本発明では、Akt3またはB-Rafポリペプチドのような所望の標的ポリペプチドの発現をin vivoで妨害するためのベクターを含む組換え核酸構築物の調製時にsiRNAポリヌクレオチド配列を使用することが意図される；本発明ではまた、siRNAトランスジェニックまたは「ノックアウト」動物および細胞(たとえば、1種以上の所望のポリペプチド(たとえば標的ポリペプチド)の発現が完全にもしくは部分的に損なわれている細胞、細胞クローン、系もしくは系列、または生物)を生成することも意図される。したがって、本明細書中に提供されるような所望のポリペプチド(たとえば標的ポリペプチド)の発現を妨害しうるsiRNAポリヌクレオチドは、siRNAポリヌクレオチドの不在下で標的ポリペプチド発現を起こすのに十分な条件および時間で本明細書中に提供されるような被験者または生物源に接触させたときに、検出可能な標的ポリペプチド発現のレベルの統計学的に有意な減少(発現の「ノックダウン」とも呼ばれる)をもたらす任意のsiRNAポリヌクレオチドを包含する。好ましくは、減少は、当技術分野に公知であるおよび本明細書中に提供されるポリペプチド発現を測定するための従来法を用いてsiRNAの不在下で検出されるポリペプチドの発現レベルと比べ、10%超、より好ましくは20%超、より好ましくは30%超、より好ましくは40%超、50%超、60%超、70%超、75%超、80%超、85%超、90%超、95%超、もしくは98%超である。好ましくは、細胞内にsiRNAポリヌクレオチドが存在しても、望ましくない毒性作用、たとえば、アポトーシスがRNA干渉の所望の効果でない細胞のアポトーシスまたは死滅をも招くこともなければ、それらの原因となることもない。
【０１３２】
本明細書中に開示されるようなAkt3 siRNAの例示的な19mer配列は、ヒトを対象としたAkt3(NM_005465): Akt3二本鎖2:CUAUCUACAUUCCGGAAAG; Akt3二本鎖4:GAAUUUACAGCUCAGACUA; およびAkt3二本鎖5:CAGCUCAGACUAUUACAAU;である。
【０１３３】
本明細書中に開示されるようなAkt3 siRNAの例示的な25mer配列は、以下のとおりである：
プライマー名  配列
Akt3#2センス        CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG
Akt3#2アンチセンス  CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG
Akt3#4センス        GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA
Akt3#4アンチセンス  UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC
Akt3#5センス        AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU
Akt3#5アンチセンス  AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU
本発明はまた、siRNAを介して標的遺伝子(PTEN)のサイレンシングを引き起こすウイルス媒介ストラテジーの使用に関する。このストラテジーを使用すると、PTENの発現が著しく減少し、それにより、全リン酸化Aktが増大される。このウイルス媒介ストラテジーは、黒色腫におけるAkt3デレギュレーションの根底をなす機序を同定するのに有用であり、生物過程をモデル化したりまたはこの癌の療法を提供したりする目的で使用される。
【０１３４】
本発明はまた、本発明に係るsiRNAポリヌクレオチドを含むかまたはコードするベクターおよび構築物、とくに、転写されて先に提供されるような本発明に係るAkt3ポリヌクレオチド特異的siRNAポリヌクレオチドを生成しうるなんらかの核酸たとえばDNAポリヌクレオチドを含む「組換え核酸構築物」と、に関する。本発明に係るベクターおよび/または構築物を用いて遺伝子操作された宿主細胞と、組換え法による本発明に係るsiRNAポリヌクレオチド、ポリペプチド、および/もしくは融合タンパク質、またはそれらの断片もしくは変異体の産生と、RNAポリヌクレオチドとして本明細書中に開示されているsiRNA配列は、本明細書に記載されるような十分に確立された方法を用いて、対応するDNA配列を産生するように工学的に操作可能である。したがって、たとえば、DNAポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のsiRNA配列から生成可能であるので、本siRNA配列は、対応するDNAポリヌクレオチド(およびそれらの相補体)をも提供するものであることがわかるであろう。したがって、これらのDNAポリヌクレオチドは、たとえば、siRNAに転写されうる本発明に係る組換え核酸構築物中に組み込むことが意図される本発明の範囲内に包含される。
【０１３５】
他の実施形態では、薬剤は、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。他の実施形態では、薬剤は、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。さらに他の実施形態では、薬剤は、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'またはその相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である。好ましい実施形態では、宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを用いて、薬剤を細胞に接触させる。これらとしては、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達(calcium phosphate mediated nucleotide delivery)、ポリ(D-アルギニン)、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。薬剤を細胞に送達するためのナノリポソーム、ナノ微粒子、ナノデンドリマーの使用については、図5〜11に示されており、さらには、2004年4月26日出願の特許出願第10/835,520号(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１３６】
アンチセンスポリヌクレオチド
他の実施形態では、薬剤はアンチセンスポリヌクレオチドである。 
とくに考慮の対象となる実施形態は、コードmRNA核酸配列(たとえばAkt3 mRNA)またはそのサブ配列に相補的でありかつ好ましくはそれに特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスポリヌクレオチド(すなわち核酸)を用いるAkt3活性のダウンレギュレーションに関する。アンチセンスヌクレオチドがAkt3 mRNAに結合すると、Akt3またはB-Raf mRNAの翻訳および/または安定性が低減される。
【０１３７】
本発明に関連して、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドもしくは天然に存在するサブユニットから形成された合成種またはそれらの類似相同体を包含しうる。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、改変された糖部分または糖間結合を有しうる。これらに包含される代表的な例は、ホスホロチオエートおよび当技術分野で使用されることでよく知られている他の硫黄含有種である。そのような類似体はすべて、それらがAkt3またはB-Raf mRNAにハイブリダイズするように効果的に機能するかぎり、本発明に包含される。全般的レビューに関しては、たとえば、Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; and Synthesis 1:1-5 (1988)を参照されたい。
【０１３８】
アンタゴニスト
本発明ではまた、Akt3活性を低下させる薬剤がアンチセンスポリヌクレオチドである実施形態も考慮の対象となる。本発明はまた、Akt3アンタゴニストとして機能するAkt3タンパク質の変異体に関する。Akt3タンパク質の変異体は、変異誘発(たとえば、Akt3タンパク質の離散点変異またはトランケーション)により生成可能である。Akt3タンパク質のアンタゴニストは、たとえば、Akt3タンパク質を含む細胞シグナリングカスケードの下流もしくは上流のメンバーに競合的に結合することにより、天然に存在する形のAkt3タンパク質の活性の1つ以上を阻害しうる。したがって、限定された機能を有する変異体で治療することにより、特定の生物学的作用を誘発することが可能である。本発明では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性の一部を有する変異体による被験者の治療が、天然に存在する形のAkt3タンパク質による治療と比べて、被験者においてより少ない副作用を有することが意図される。
【０１３９】
Akt3アンタゴニストとして機能するAkt3タンパク質の変異体は、Akt3アンタゴニスト活性に関してAkt3タンパク質の変異体(たとえばトランケーション変異体)のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定可能である。本発明では、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発によりAkt3変異体の多様化ライブラリーを作製し、多様化遺伝子ライブラリーによりコードすることが意図される。たとえば、可能性のあるAkt3配列の縮重セットが個々のポリペプチドとしてまたは他の選択肢としてAkt3配列を含有するより大きい融合タンパク質のセット(たとえばファージディスプレイ用)として発現されうるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、Akt3変異体の多様化ライブラリーを作製することが可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるAkt3変異体のライブラリーを作製するために使用しうるさまざまな方法が存在する。自動DNA合成機で縮重遺伝子配列の化学合成を行い、次に、合成遺伝子を適切な発現ベクター中に連結することが可能である。遺伝子の縮重セットを使用することにより、Akt3配列の所望のセットをコードする配列のすべてを1つの混合物中に提供することが可能である。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業界内で周知である。たとえば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１４０】
リボザイム
さらに他の実施形態では、薬剤はリボザイムである。リボザイムを用いることにより、Akt3の転写を標的にし阻害することが可能である。リボザイムとは、触媒的に他のRNA分子を切断するRNA分子のことである。グループIリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、RNAアーゼP、およびアックスヘッド型リボザイムをはじめとするさまざまな種類のリボザイムが報告されている(たとえば、リボザイムの性質の全般的レビューに関しては、Castanotto et al. 1994, Adv. In Pharmacology 25:289-317を参照されたい)。
【０１４１】
ヘアピン型リボザイムの一般的特徴は、たとえば、Hampel et al., 1990, Nucl. Acids Res., 18:299-304; Hampel et al., 1990, European Patent Publication No. 0 360 257; U.S. Pat. No. 5,254,678に記載されている。調製方法は、当業者に周知である(たとえば、Wong-Staal et al., WO 94/26877; Ojwang et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6340-6344; Yamada et al., 1994, Human Gene Therapy 1:39-45; Leavitt et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:699-703; Leavitt et al., 1994, Human Gene Therapy 5:1151-120; and Yamada et al., 1994, Virology 205:121-126を参照されたい)。
【０１４２】
Akt3ポリペプチド活性の阻害剤
さらに他の実施形態では、Akt3ポリペプチドの阻害剤である薬剤によりAkt3活性を低下させる。これは、ドミナントネガティブAkt3ポリペプチド、たとえば、単独では活性を有していないが機能性Akt3と同一の細胞中に存在するときは機能性Akt3のAkt3活性を低下または除去する形のAkt3を提供することによる方法を含めて、いくつかの方法のいずれかにより達成可能である。ドミナントネガティブ形のデザインは、当業者に周知であり、たとえば、Herskowitz, 1987, Nature, 329:219-22の中に記載されている。さらに、不活性ポリペプチド変異体(ムテイン)は、たとえば、Akt3活性を阻害する能力に関してスクリーニングすることにより、使用可能である。ムテインの作製方法は、当業者に周知である(たとえば、U.S. Pat. Nos. 5,486,463, 5,422,260, 5,116,943, 4,752,585, 4,518,504を参照されたい)。それに加えて、任意の小分子、たとえば、任意のペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、または任意の他の有機分子もしくは無機分子を、結合能力またはAkt3活性の阻害能力に関してスクリーニングすることが可能である。
【０１４３】
ペプチド
さらに他の実施形態では、薬剤(Akt3のプレクストリン相同ドメインまたは触媒もしくは調節ドメインのコンティグアミノ酸配列に対応するペプチド)は、Akt 3活性を低下させるであろう。この理論により拘束されることを望むものではないが、ペプチドは、偽基質または競合阻害剤として作用することによりAkt3活性を阻害すると考えられる。他の実施形態では、ペプチドは、Akt3の触媒もしくは調節(テール)ドメインに対する偽基質として作用する。さらに他の実施形態では、ペプチドは、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する。本発明者らはまた、ペプチドがAkt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用すると考えている。さらに他の実施形態では、ペプチドは、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する。当業者であれば、デザインおよびペプチドがAkt3の活性を低下させるかの判定を容易に行うことが可能である。Obata T et al. J Biol Chem. 275(46):36108-15 (2000), Niv MY et al. J Biol Chem. 279(2):1242-55. Epub 2003 (2004), Luo Y et al. Biochemistry. 43(5):1254-63 (2004)。
【０１４４】
たとえば、Akt3の活性を評価するのに好適な条件下で細胞をペプチドと共に培養する。トレオニン305またはセリン472を認識する抗体を用いるウェスタンブロット分析により、Akt3の活性を評価し、好適な対照(たとえば、ペプチドの不在下で同一条件下でインキュベートされた同一細胞の活性またはスクランブルペプチドの活性)と比較する。Akt3を認識する抗体は、いくつかの供給元から入手可能である。たとえば、いくつか例を挙げると、Stratagene (La Jolla, CA) および IGeneX, Inc. (Palo Alto)である。他の選択肢として、Akt3を免疫沈降させ、免疫沈降物をin vitroキナーゼアッセイで使用することにより、Akt3活性を評価することが可能である。このアッセイでは、Crosstide(Discover Rx Corporation, Fremont, CAから入手可能なAkt3に対する合成ペプチド基質)をAkt3によりリン酸化して活性を推定する。対照と比較したときのリン酸化活性の大小から、試験ペプチドが該Akt3の活性を低下させるかが示される。
【０１４５】
ペプチドは、約5〜30アミノ酸残基長、好ましくは10〜20アミノ酸残基長である。本発明に係るペプチド配列は、固相ペプチド合成法(たとえば、BOC法もしくはFMOC法)により、溶液相合成により、または以上の方法の併用を含めて他の好適な技術により、合成可能である。確立され広く使用されているBOC法およびFMOC法は、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88:2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C. H. Li, Ed., Academic Press, 1983, pp. 48-267; および Barany and Merrifield, in The Peptides, E. Gross and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980, pp. 3-285に記載されている。固相ペプチド合成法は、Merrifield, R. B., Science, 232: 341 (1986); Carpino, L. A. and Han, G. Y., J. Org. Chem., 37: 3404 (1972); および Gauspohl, H. et al., Synthesis, 5: 315 (1992)に記載されている。これらの参考文献の教示は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１４６】
小分子
本発明ではまた、Akt3活性を低下させる薬剤が小分子である実施形態も考慮の対象となる。小分子を用いて、たとえば、開示されたキナーゼ、キナーゼレセプター、キナーゼレセプターと相互作用する分子、およびキナーゼレセプターのシグナリング経路の分子の機能をレギュレートすることも可能である。このタイプの小分子および例示的なライブラリーの作製方法ならびに小分子レギュレーターの単離方法は、当業者の熟知するところである。「小分子」は、本明細書中で使用する場合、好ましくは、Akt3および/またはB-Rafに結合し、その機能の少なくとも1つを阻害する。
【０１４７】
モジュレーターおよび結合性化合物
Akt3および/またはB-Rafタンパク質のモジュレーターとして試験される化合物は、任意の低分子化学化合物または生物学的物質、たとえば、タンパク質、糖、核酸、もしくは脂質でありうる。典型的には、試験化合物は、小化学分子およびペプチドであろう。本発明に係るアッセイにおいて本質的に任意の化学化合物を可能性のあるモジュレーターまたは結合性化合物として使用しうるが、ほとんどの場合、化合物は、水溶液または有機溶液(特定的にはDMSO系)に溶解可能である。アッセイ工程を自動化して、任意の便利な供給源から得られた化合物をアッセイに付すことにより、大きい化学ライブラリーをスクリーニングするように、アッセイをデザインする。アッセイは、典型的には、パラレル方式で行われる(たとえば、ロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレート上でマイクロタイター方式で)。Sigma (St. Louis, Mo.)、Aldrich (St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland)などをはじめとする多くの化学化合物供給業者が存在することは理解されよう。
【０１４８】
本発明では、多数の可能性のある治療化合物(可能性のあるモジュレーターまたは結合性化合物)を含有するコンビナトリアル化学物質またはペプチドライブラリーを提供することをハイスループットスクリーニング方法に含めることが意図される。次に、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」を本明細書に記載されているような1種以上のアッセイでスクリーニングして、所望の特性活性を呈するライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」の役割を果たしうるか、またはそれ自体で可能性のあるもしくは実際の治療剤として使用されうる。
【０１４９】
コンビナトリアル化学ライブラリーとは、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより、試薬のようないくつかの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、生成されたさまざまな化学化合物のコレクションのことである。たとえば、ポリペプチドライブラリーのようなリニアコンビナトリアル化学ライブラリーは、所与の化合物長さ(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)に対してできるかぎりの方法で一連の化学的ビルディングブロック(アミノ酸)を組み合わせることにより形成される。化学的ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合を介して、何百万もの化学化合物を合成することが可能である。
【０１５０】
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製およびスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー(たとえば、U.S. Pat. No. 5,010,175, Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 および Houghton et al., 1991, Nature 354:84-88を参照されたい)が挙げられるが、これに限定されるものではない。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学を使用することも可能である。そのような化学としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：ペプトイド類(たとえば、PCT公開WO 91/19735号)、コードペプチド類(たとえば、PCT公開WO 93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー類(たとえば、PCT公開WO 92/00091号)、ベンゾジアゼピン類(たとえば、U.S. Pat. No. 5,288,514)、ダイバーソマー類、たとえば、ヒダントイン類、ベンゾジアゼピン類、およびジペプチド類(Hobbs et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913)、ビニロガスポリペプチド類(Hagihara et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568)、グルコーススカフォールドを有する非ペプチド性ペプチドミメティックス類(Hirschmann et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218)、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成(Chen et al., 1994, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661)、オリゴカルバメート類(Cho et al., 1993, Science 261:1303)、および/またはペプチジルホスホネート類(Campbell et al., 1994, J. Org. Chem. 59:658)、核酸ライブラリー(Ausubel, Berger and Sambrook, all supraを参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリー(たとえば、U.S. Pat. No. 5,539,083を参照されたい)、抗体ライブラリー(たとえば、Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314 and PCT/US96/10287を参照されたい)、炭水化物ライブラリー(たとえば、Liang et al., 1996, Science, 274:1520-1522 and U.S. Pat. No. 5,593,853を参照されたい)、小有機分子ライブラリー(たとえば、ベンゾジアゼピン類、Baum, 1993, C&EN, January 18, page 33; イソプレノイド類、U.S. Pat. No. 5,569,588; チアゾリジノン類およびメタチアザノン類、U.S. Pat. No. 5,549,974; ピロリジン類、U.S. Pat. Nos. 5,525,735 および 5,519,134; モルホリノ化合物類、U.S. Pat. No. 5,506,337; ベンゾジアゼピン類、U.S. Pat. No. 5,288,514などを参照されたい)。
【０１５１】
コンビナトリアルライブラリーを作製するための装置は、入手可能である(たとえば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.を参照されたい)。それに加えて、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が、市販されている(たとえば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, Mo., 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md.などを参照されたい)。
【０１５２】
化学療法剤
他の実施形態では、化学療法剤と組み合わせてAkt3活性を低下させることにより、アポトーシスを誘導する。本明細書中で使用する場合、化学療法は、単一の化学療法剤を用いた治療または薬剤を組み合わせた治療を包含する。本発明で使用しうる化学療法剤としては、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、天然のもしくは植物由来の産物、ホルモンおよびステロイド(合成類似体を包含する)、ならびにSoengas MS, Lowe SW. Apoptosis and Melanoma Chemoresistance. Oncogene. 2003 May 19; 22(20):3138-51に記載されているような白金製剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのクラスに包含される薬剤の例を次に与える。アルキル化剤としては、たとえば、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、およびトリアゼンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ニトロソウレアとしては、たとえば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ナイトロジェンマスタードとしては、たとえば、シクロホスファミドが挙げられるが、これに限定されるものではない。トリアゼンとしては、たとえば、ダカルバジンおよびテモゾロマイドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。FDAは、黒色腫の治療にダカルバジンを使用することを認可している。抗代謝剤としては、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤:メトトレキセート、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明で使用しうる抗生物質としては、アントラサイクリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。アントラサイクリンの例としては、ドキソルビシン(アドリアマイシン)が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で使用しうる天然のもしくは植物由来の産物としては、たとえば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ビンカアルカロイドの例としては、たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。エピポドフィロトキシンの例としては、たとえば、エトポシドが挙げられるが、これに限定されるものではない。タキサンとしては、たとえば、タキソール、パクリタキセル、およびドセタキセルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明で使用しうるホルモン類似体およびステロイドとしては、たとえば、抗エストロゲン剤、17アルファ-エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明で使用しうる白金製剤���しては、たとえば、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシウレア、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミゾール、およびヘキサメチルメラミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】
ほとんどのこれらの化学療法剤の安全かつ有効な投与方法は、当業者に公知である。それに加えて、それらの投与については、標準的文献に記載されている。たとえば、"Physicians' Desk Reference" (PDR), e.g., 1996 edition (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)(その開示内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする)には、多くの化学療法剤の投与についての記載がある。
【０１５４】
放射線照射
場合により、本発明に係る治療法に放射線照射を追加することが可能である。本明細書中で使用される「放射線照射」という用語は、その従来の意味を有しており、X線照射が身体を通過するのに十分なエネルギーを有しかつin vivoで腫瘍特異的抗原の放出を誘導しうる程度のみに制限されるものではない。特定のタイプの腫瘍に損傷を与えるのに最適の放射線強度は、当業者に公知である。
【０１５５】
アポトーシス
当業者であれば、さまざまな方法を用いて、たとえば、Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs. 6:522-32に記載のヨウ化プロピジウムフローサイトメトリーアッセイを用いて、またはGorczyca, (1993) Cancer Res 53:1945-51に記載のin situターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ・ニックトランスレーションアッセイ(TUNEL分析)により、アポトーシスの検出および/または測定をいかに行うかを熟知していよう。
【０１５６】
黒色腫腫瘍の治療
本発明は、部分的には、Akt3がアポトーシスをレギュレートしV599EB-Rafが増殖および血管発生をレギュレートすることを示す本発明者らの観測に基づく。それにより黒色腫に対する効果的な組合せ標的化治療法が初めて特定されるので、これは重要な発見である。以下に論じられるように、Akt3活性を低下させるとアポトーシスに対する黒色腫細胞の感受性が増大されるであろう；したがって、従来の化学療法剤のようなアポトーシスを介して作用する薬剤は、黒色腫細胞においてAkt3活性を低下させた場合、より効果的である。一実施形態では、本発明は、V599E B-Raf活性を低下させるのに有効な量の薬剤を哺乳動物の腫瘍に投与することと；Akt3活性を低下させるのに有効な量の薬剤を哺乳動物の腫瘍に投与することと；を含み、それにより腫瘍のサイズを減少させる、哺乳動物における黒色腫腫瘍の治療方法を提供する。
【０１５７】
好ましい実施形態では、Akt3活性を低下させる薬剤は、siRNA分子である。他の実施形態では、薬剤は、siRNA分子であり、Akt3活性を低下させる該siRNA分子は、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'、5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU、3'、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'、またはそれらの相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１５８】
一実施形態では、B-Raf活性を低下させるための薬剤は、siRNA分子である。好ましい実施形態では、薬剤は、siRNA分子であり、B-Raf活性を低下させる該siRNA分子は、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'および/または5' GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3'の配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１５９】
好ましい実施形態では、宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを用いて、Akt3を減少させる薬剤を細胞に接触させる。これらとしては、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウム媒介ヌクレオチド送達、ポリ(D-アルギニン)、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。薬剤を細胞に送達するためのナノリポソーム、ナノ微粒子、ナノデンドリマーの使用については、図5〜11に示されており、さらには、2004年4月26日出願の特許出願第10/835,520号(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１６０】
好ましい実施形態では、宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを用いて、B-Raf活性を低下させる薬剤を細胞に接触させる。これらとしては、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウム媒介ヌクレオチド送達、ポリ(D-アルギニン)、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。薬剤を細胞に送達するためのナノリポソーム、ナノ微粒子、ナノデンドリマーの使用については、図5〜11に示されており、さらには、2004年4月26日出願の特許出願第10/835,520号(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１６１】
好ましい実施形態では、本発明は、複数の薬剤を投与することにより黒色腫腫瘍発生を阻害しアポトーシスを増大もしくは誘導するストラテジーとしてナノテクノロジーの使用方法を提供する。Akt3ペプチド；Akt 3 siRNA、V599E B-Raf siRNA、パクリタキセル、カルボプラチン、カルムスチン、ダカルバジン、またはビンブラスチンの組合せを無毒のリポソームに同時に充填する。これらのリポソームは、培養下で増殖する黒色腫細胞中にこのカーゴを効果的に送達する。単一の送達剤を用いて癌細胞中にさまざまな治療剤を同時に送達することを実証するのは、これが初めてである。組合せ治療剤を運ぶリポソームは、血流中を移動し、腫瘍血管系に入り、露出した黒色腫細胞により取り込まれるであろう。この結果、腫瘍において黒色腫細胞の標的化死滅が起こり、腫瘍が退縮する。この方法の臨床的有用性は、腫瘍中に組合せ治療剤を送達することにある。抗CD63抗体をリポソームから伸長するペグ化セグメントに共有結合させると、黒色腫細胞による優先的取込みが起こるであろう。したがって、間質組織は、リポソームをほとんどまたはまったく取り込まないので、リポソームの標的化送達が実証される。イムノリポソームは、対照間質組織と対比して黒色腫腫瘍細胞中への取込みを増大させることが可能である。
【０１６２】
他の実施形態では、Akt3活性を低下させる薬剤は、アンチセンスポリヌクレオチドである。一実施形態では、B-Raf活性を低下させる薬剤は、アンチセンスポリヌクレオチドである。
【０１６３】
さらに他の実施形態では、Akt3活性を低下させる薬剤は、リボザイムである。さらに他の実施形態では、B-Raf活性を低下させる薬剤は、リボザイムである。リボザイムを用いることにより、Akt3、B-Raf、またはその両者の転写を標的にして阻害することが可能である。
【０１６４】
さらに他の実施形態では、Akt3ポリペプチドの阻害剤である薬剤によりAkt3活性を低下させる。これは、ドミナントネガティブAkt3ポリペプチド、たとえば、単独では活性を有していないが機能性Akt3と同一の細胞中に存在するときは機能性Akt3のAkt3活性を低下または除去する形のAkt3を提供することによる方法を含めて、いくつかの方法のいずれかにより達成可能である。さらに他の実施形態では、B-Rafポリペプチドの阻害剤である薬剤によりB-Raf活性を低下させる。好ましい実施形態では、B-Raf阻害剤はBAY 43-9006である。B-Rafの阻害剤としては、BAYERから市販されているBAY 43-9006または他の市販のB-Raf阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。B-Rafの阻害剤は、さらに、競合および非競合B-Raf阻害剤を包含しうる。競合B-Raf阻害剤とは、基質結合を互いに排除し合う形でB-Raf酵素に結合する分子のことである。典型的には、B-Rafの競合阻害剤は、活性部位に結合するであろう。非競合B-Raf阻害剤は、B-Rafの合成を阻害するものでありうるが、酵素へのその結合は、基質結合に関して互いに排他的ではない。本発明の考慮対象となるB-Raf阻害剤は、少なくとも同等の濃度で他の細胞活性になんら有意な影響を及ぼすことなく動物細胞においてB-Rafの活性を低下させる化合物である。しかしながら、この阻害は、ドミナントネガティブB-Rafポリペプチド、たとえば、単独では活性を有していないが機能性B-Rafと同一の細胞中に存在するときは機能性B-RafのB-Raf活性を低下または除去する形のAkt3を提供することによる方法を含めて、いくつかの方法のいずれかにより達成可能である。
【０１６５】
さらに他の実施形態では、Akt3活性を低下させる薬剤は、Akt3のプレクストリン相同ドメインまたは触媒もしくは調節ドメインのコンティグアミノ酸配列に対応するペプチドである。
【０１６６】
本発明ではまた、Akt3活性を低下させる薬剤が小分子である実施形態も考慮の対象となる。他の実施形態では、本発明はまた、B-Raf活性を低下させる薬剤が小分子である実施形態も考慮の対象となる。
【０１６７】
他の実施形態では、黒色腫腫瘍の治療方法は、化学療法剤を投与することを含む。本明細書中で使用する場合、化学療法は、単一の化学療法剤を用いた治療または薬剤を組み合わせた治療を包含する。本発明で使用しうる化学療法剤としては、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、天然のもしくは植物由来の産物、ホルモンおよびステロイド(合成類似体を包含する)、ならびに記載のごとき白金製剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 
他の実施形態では、哺乳動物における黒色腫腫瘍の治療方法は、放射線療法を含む。
【０１６８】
好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、細胞死(たとえば、アポトーシスによるもの)さらには増殖および血管新生に有意な影響を及ぼすことにより黒色腫を治療すべく使用可能である。当業者であれば、腫瘍のサイズ(たとえば、退縮を測定するため)または腫瘍サイズの減少、血管新生、およびアポトーシスを測定する方法に精通しているであろう。有利なことに、正常な非トランスフォーム細胞に対する可能性のある有毒な副作用を最小限に抑えるべく、比較的少ない用量で(かつ/またはより少ない頻度で)化学療法剤を投与することが可能である。
【０１６９】
したがって、本発明はまた、Akt3活性を低下させる薬剤とB-Raf活性を低下させる薬剤とを有効量で併行的にまたは逐次的に投与することを含む、黒色腫を有する被験者において癌細胞死(たとえばアポトーシス)および黒色腫腫瘍発生阻害を有意レベルで誘導する方法を提供する。本明細書中で使用する場合、「併行的に」とは、一般的な治療スケジュールの期間中に時間的に同時にまたはさまざま時点でという意味であり；「逐次的に」とは、実質的に第1の薬剤の直後に第2の薬剤を投与しうるかまたは第1の薬剤の後の有効期間を経た後で第2の薬剤を投与しうる形で、Akt3またはB-Raf活性を低下させるための本方法の薬剤のうちの一方と、B-RafまたはAkt3活性を低下させるための追加の薬剤と、を投与することを意味し；有効期間とは、第1の薬剤の投与から最大限の有益性が実現されるように与えられる時間のことである。
【０１７０】
変異V599EB-Rafおよび選択された化学療法剤と共にAkt3をターゲッティングすると、いずれかを単独でターゲッティングするよりも相乗的で強力で長期にわたる効果が得られる。これは、標的化療法と選択された化学療法剤とを組み合わせるための合理的基礎を提供する。これは、黒色腫用として現在存在しているものではない。
【０１７１】
Akt3および/またはB-Rafタンパク質ならびにAkt3関連および/またはB-Raf関連タンパク質の用途
本発明に係るタンパク質は、多種多様な特定用途を有する。Akt3およびB-Rafはいずれも、黒色腫の発生の一因となる主要なタンパク質である。Akt3および/またはB-Rafタンパク質ならびにAkt3関連またはB-Raf関連タンパク質は、癌組織と対比して正常組織におけるAkt3および/またはB-Raf遺伝子産物の状態を評価することにより悪性表現型を解明する方法に使用される。典型的には、Akt3またはB-Rafタンパク質の特定領域から得られるポリペプチドを用いて、それらの領域(たとえば、1つ以上のモチーフを含有する領域)における撹乱(たとえば、欠失、挿入、点変異など)の存在を評価することが可能である。例としては、Akt3および/またはB-Rafタンパク質ならびにそれぞれAkt3および/またはB-Rafポリペプチド配列内に含まれる1つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むAkt3関連および/またはB-Raf関連タンパク質を標的とする抗体を用いて、癌組織と対比して正常組織におけるこの領域の特性を評価したりまたはエピトープに対して免疫応答を誘導したりすることが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の選択肢として、それぞれAkt3および/またはB-Rafタンパク質中の1つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含有するAkt3関連および/またはB-Raf関連タンパク質を用いて、Akt3および/またはB-Rafのその領域と相互作用する因子をスクリーニングする。
【０１７２】
Akt3およびB-Rafタンパク質の断片/サブ配列はいずれも、ドメイン特異的抗体(たとえば、Akt3またはB-Rafタンパク質の細胞外または細胞内エピトープを認識する抗体)の生成および特性付け、Akt3もしくはB-Rafまたはそれらの特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子の同定、ならびにさまざまな治療的および診断的状況、たとえば、限定されるものではないが、診断アッセイ、癌ワクチン、およびそのようなワクチンの調製方法、にとくに有用である。
【０１７３】
Akt3および/もしくはB-Raf遺伝子またはそれらの類似体、相同体、もしくは断片によりコードされるタンパク質は、抗体の生成さらにはAkt3および/またはB-Raf遺伝子産物に結合するリガンドならびに他の薬剤および細胞成分の同定方法をはじめとするさまざまな用途を有するが、これらの用途に限定されるものではない。Akt3もしくはB-Rafタンパク質またはそれらの断片に対して生成される抗体は、診断アッセイおよび予後アッセイならびにAkt3またはB-Rafタンパク質の発現により特性付けられるヒト黒色腫癌の管理におけるイメージング法に有用である。
【０１７４】
Akt3および/またはB-Rafタンパク質の検出に有用であるさまざまな免疫学的アッセイが使用可能であり、その例としては、さまざまなタイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素結合免疫蛍光アッセイ(ELIFA)、免疫細胞化学的方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体を標識化し、Akt3またはB-Raf発現細胞を検出しうる免疫学的イメージング試薬として使用することが可能である。
【０１７５】
黒色腫中のAkt3および/またはB-Rafに対する抗体
本発明によれば、黒色腫中に見いだされるAkt3アイソフォームまたはB-RafアイソフォームによりそれぞれコードされるAkt3および/またはB-Rafポリペプチドは、融合タンパク質を含めて、それらの断片を包含し、抗体を生成するための抗原または免疫原として使用可能である。好ましくは、抗体は、ヒトAkt3アイソフォームには特異的に結合するが他の形のAktには結合しない。好ましくは、抗体は、ヒトB-Rafアイソフォームには特異的に結合するが他の形のB-Rafには結合しない。
【０１７６】
分子は、それが免疫グロブリン(抗体)やT細胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用しうる場合、「抗原性」である。抗原ポリペプチドまたはペプチドは、少なくとも約5個、好ましくは少なくとも約10個のアミノ酸を含有する。分子の抗原性部分は、抗体もしくはT細胞レセプターの認識に対して免疫優性である部分でありうるか、またはそれは、免疫化のために抗原性部分を担体分子にコンジュゲートすることにより分子に対する抗体を生成するために使用される部分でありうる。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である必要はない(すなわち、担体を用いずに免疫応答を惹起しうる必要はない)。
【０１７７】
そのような抗体としては、ポリクロナール、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に係る抗Akt3抗体は、交差反応性でありうる。たとえば、それらは、さまざまな種に由来するAkt3を認識しうる。同様に、本発明に係る抗B-Raf抗体は、交差反応性でありうる。たとえば、それらは、さまざまな種に由来するB-Rafを認識しうる。ポリクロナール抗体は、交差反応性の可能性がより大きい。他の選択肢として、本発明に係る抗体は、単一形のAkt3またはB-Rafに特異的でありうる。好ましくは、そのような抗体は、ヒト黒色腫Akt3またはB-Rafに特異的である。
【０１７８】
当技術分野で公知のさまざまな手順が、ポリクロナール抗体の産生に使用可能である。抗体を産生するために、Akt3もしくはB-Rafポリペプチドまたはそれらの誘導体(たとえば、断片もしくは融合タンパク質)を注射することにより、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどをはじめとするさまざまな宿主動物を免疫化することが可能であるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、Akt3もしくはB-Rafポリペプチドまたはそれらの断片を、免疫原性担体、たとえば、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にコンジュゲートすることが可能である。宿主種に応じて、さまざまなアジュバントを用いて免疫応答を増大させることが可能であり、例としては、フロイント(完全および不完全)、ミネラルゲル、たとえば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、たとえば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用性のあるヒトアジュバント、たとえば、BCG(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７９】
Akt3もしくはB-Rafポリペプチド、またはそれらの断片、類似体、もしくは誘導体に対するモノクローナル抗体を調製するために、培養下の連続細胞系により抗体分子の産生を行う任意の技術が使用可能である。これらとしては、Kohler and Milstein [Nature 256:495-497 (1975)]により最初に開発されたハイブリドーマ技術、さらにはトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術[Kozbor et al., Immunology Today 4:72 1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)]、およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBVハイブリドーマ技術[Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の他の実施形態では、無菌動物においてモノクローナル抗体を産生することが可能である[1989年12月28日公開の国際特許公開WO 89/12690号]。実際に、本発明によれば、Akt3ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子の遺伝子と適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子の遺伝子とをスプライシングすることにより、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術[Morrison et al., J. Bacteriol. 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)]を使用することが可能であり；そのような抗体は、本発明の範囲内にある。そのようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体は、ヒト疾患(以下に記載)の治療に使用するのに好ましい。なぜなら、ヒト抗体またはヒト化抗体は、それ自体、免疫応答とくにアレルギー性応答を誘導する可能性が異種抗体よりもかなり低いからである。
【０１８０】
一本鎖Fv(scFv)抗体の産生用として記載されている技術[Hustonに付与されたU.S. Pat. Nos. 5,476,786 および 5,132,405 ; U.S. Pat. No. 4,946,778]は、Akt3ポリペプチド特異的一本鎖抗体を産生するように適合化が可能である。本発明の他の実施形態では、Akt3ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にすべく、Fab発現ライブラリーの構築用として記載されている技術[Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]を利用する。
【０１８１】
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、公知の技術により生成可能である。たとえば、そのような断片としては、抗体分子のペプシン消化により生成可能なF(ab')2フラグメント；F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成可能なFab'フラグメント、およびパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することにより生成可能なFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８２】
抗体の生成時、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、たとえば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(たとえば、コロイド金、酵素、またはラジオアイソトープ標識を用いる)、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(たとえば、ゲル内凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどにより達成可能である。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出可能である。他の実施形態では、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる実施形態では、二次抗体は標識化される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が、当技術分野で公知であり、本発明の範囲内にある。たとえば、Akt3ポリペプチドもしくはペプチドまたはB-Rafポリペプチドもしくはペプチドの特定のエピトープを認識する抗体を選択するために、そのようなエピトープを含有するAkt3またはB-Rafポリペプチド断片に結合する産物に関して生成ハイブリドーマをアッセイすることが可能である。特定の動物種に由来するAkt3ポリペプチドもしくはペプチドまたはB-Rafポリペプチドもしくはペプチドに特異的な抗体を選択するために、その動物種の細胞により発現されたまたはそれから単離されたAkt3ポリペプチドもしくはペプチドまたはB-Rafポリペプチドもしくはペプチドとのポジティブ結合に基づいて選択することが可能である。
【０１８３】
Akt3またはB-Rafと相互作用する分子の同定
当業者であれば、黒色腫中に見いだされるAkt3およびB-Rafに対するタンパク質配列および核酸配列から、当業界で認められたプロトコルのいずれか1つを利用して、Akt3またはB-Rafと相互作用するタンパク質、小分子、および他の薬剤、さらにはAkt3またはB-Rafにより活性化される経路を同定することが可能である。たとえば、いわゆる相互作用トラップシステム(「ツーハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる)のうちの1つを利用することが可能である。そのようなシステムでは、分子は、レポーター遺伝子の発現を指令する転写因子と相互作用して再構成する。その後、レポーター遺伝子の発現がアッセイされる。他のシステムでは、真核性転写アクチベーターの再構成を介してタンパク質-タンパク質相互作用をin vivoで同定する。たとえば、1999年9月21日に交付されたU.S. Pat. No. 5,955,280、1999年7月20日に交付されたU.S. Pat. No. 5,925,523、1998年12月8日に交付されたU.S. Pat. No. 5,846,722、および1999年12月21日に交付されたU.S. Pat. No. 6,004,746を参照されたい。また、ゲノムに基づいてタンパク質の機能を予測するアルゴリズムを利用することも可能である(たとえば、Marcotte, et al., Nature 402: 4 November 1999, 83-86を参照されたい)。
【０１８４】
他の選択肢として、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、Akt3またはB-Rafタンパク質配列と相互作用する分子を同定することが可能である。そのような方法では、アミノ酸のランダムコレクションまたは制御コレクションをコードするライブラリーをスクリーニングすることにより、Akt3またはB-Rafに結合するペプチドを同定する。ライブラリーによりコードされるペプチドをバクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現し、次に、それぞれAkt3またはB-Rafタンパク質に対してバクテリオファージ粒子をスクリーニングする。
【０１８５】
したがって、予想されるリガンドまたはレセプター分子の構造に関する事前情報をまったく用いることなく、治療試薬、予後試薬、または診断試薬のような多種多様な用途を有するペプチドがこうして同定される。
【０１８６】
医薬組成物
一実施形態では、Akt3活性を低下させる薬剤と担体とを含む黒色腫腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。本発明で使用するのに好適な担体は、当業者に公知であろう。そのような担体としては、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、およびリン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
他の実施形態では、医薬組成物は、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子(ただし、これらに限定されるものではない)を包含する薬剤を含む。他の実施形態では、低分子干渉RNA(siRNA)分子は、ポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'、5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'、またはそれらの相補体を包含する。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである薬剤を含む。他の実施形態では、ペプチドは、Akt3の触媒ドメインに対する偽基質として作用する。
【０１８８】
さらに他の実施形態では、Akt3活性を低下させる薬剤は、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである。本発明者らは、ペプチドが、Akt3の触媒ドメイン、Akt3のプレクストリン相同ドメイン、および/またはAkt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用しうると考えている。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、B-Raf活性を低下させる薬剤を含む。本発明者らは、薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子を包含すると考えている。他の実施形態では、B-Raf活性を低下させる薬剤は、ポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'もしくはその相補体またはポリヌクレオチド5' GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3'もしくはその相補体を含む低分子干渉RNA(siRNA)分子である。
【実施例】
【０１８９】
実例として以下の実施例を提供するが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
AKT3に対する実施例
材料および方法
実施例1：AktアイソフォームのsiRNA媒介ダウンレギュレーション：
UACC 903細胞においてAkt1、Akt2、およびAkt3に対するsiRNA(Dharmacon)の特異性を実証するために、HAタグ付きAkt1、Akt2、またはAkt3構築物を、それぞれの対応するsiRNAと一緒に共ヌクレオフェクトした。これらの試験に使用したAkt構築物については、既に報告されている(Sun et al., Am J Path 159:431-437 (2001); Mitsuuchi et al., J Cellular Biochem 70:433-441 (1998); and Brodbeck et al., J Biol Chem 274:9133-9136 (1999))。Amaxa Nucleofectorを用いたヌクレオフェクションを介して、それぞれの構築物(5μg)を、単独または100pmolもしくは200pmolのそれぞれの対応するsiRNAとの組合せのいずれかで、7×105個のUACC 903細胞中に導入した。GFPを発現する構築物を用いて得られたトランスフェクション効率は、>60%であった。タンパク質溶解物を72時間後に採取し、既に報告されているようにウェスタンブロット分析を行った(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。また、siRNAを用いたヌクレオフェクションを使用して、メラノサイトにおけるならびに黒色腫細胞系UACC 903、SK-MEL-24、WM115、およびWM35におけるAktアイソフォームおよび/またはPTEN(Dharmacon)の内因性発現をノックダウンした。また、メラノサイトに対するAmaxaヌクレオフェクション試薬およびプロトコルをWM35細胞で使用し、一方、Amaxa Solution R/ program K-17を用いて他の細胞系をヌクレオフェクトした。これらの細胞系に対する増殖条件については、既に報告されている(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003); Hsu et al., In Human Cell Culture, J.R.W.M.a.B. Palsson, editor. Great Britain: Kluwer Academic Publishers. 259-274 (1999))だった。
【０１９１】
実施例2：ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびキナーゼアッセイ：
使用したウェスタンブロット手順および抗体については、Akt2(Santa Cruz)およびAkt3(Upstate Biotech)を除けば、既に報告されている(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。免疫沈降のために、タンパク質溶解緩衝液(50mM Tris-HCI pH7.5、0.1% Triton X-100、1mM EDTA、1mM EGTA、50mM NaCl、10mM β-グリセロールリン酸ナトリウム、5mMピロリン酸ナトリウム、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、0.1% 2-メルカプトエタノール、および0.5%プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma))を添加した後でタンパク質を捕集し、続いて、液体窒素中でスナップ凍結した。溶解物を遠心分離(≧10,000×g)することにより細胞片をペレット化し、BioRad BCA Protein Assayを用いてタンパク質濃度を定量した。免疫沈降用のタンパク質(100μg)を2μgのAkt2抗体または5μlのAkt3抗体と共に絶えず攪拌しながら4℃で一晩インキュベートした。次に、15μlの平衡化GammaBind Gセファロースビーズ(Amersham Biosciences)をそれぞれのチューブに添加し、絶えず攪拌しながら2時間(4℃)インキュベートした。ペレット化ビーズを溶解緩衝液で2回洗浄し、未結合の抗体およびタンパク質を除去した。次に、サンプルを再懸濁させ、NuPage Gel Systemを用いてInvitrogen Life Technologiesにより提供されたプロトコルに従って還元性条件下で電気泳動させた。既に報告されているように、ウェスタンブロットを蛍光-Aktでプローブし、デンシトメトリーにより定量した(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。
【０１９２】
Aktキナーゼアッセイのために、15μlの平衡化GammaBind Gセファロースビーズを200μlの溶解緩衝液で洗浄し、次に、絶えず攪拌しながら400μlの量で2μgのAkt2抗体または5μlのAkt3抗体と共に4℃で≧2時間インキュベートした。細胞性PP1およびPP2ホスファターゼが完全に不活性化されるように、MP Biomedicals製のミクロシスチン(1μM)を溶解緩衝液に添加した。抗体/セファロース複合体を750μlの溶解緩衝液で2回洗浄し、次に、絶えず攪拌しながら400μlの量で100μgのタンパク質と共に4℃で≧1.5時間インキュベートした。この複合体を500μlの溶解緩衝液(3×)で洗浄し、次に、500μlのアッセイ希釈緩衝液(20mM MOPS, pH7.2、25mM μ-グリセロールリン酸、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、および1mM DTT)で1回洗浄した。Santa Cruz製のPKA阻害剤ペプチド(10μM)、37.5μM ATP、17mM MgCl2、0.25μCi/μl γ-32P-ATP、およびUIpstate Biotechnology製の90μM Akt特異的基質Crosstideをアッセイ希釈緩衝液に加えてチューブに添加し、連続混合しながら35℃で10分間インキュベートした。次に、20μlの液をホスホセルロース紙に移し、それを40mlの0.75%リン酸で5分間にわたり3回洗浄した。5分間のアセトン洗浄の後、ホスホセルロースを乾燥させ、5mlのAmersham Biosciencesシンチレーション流体を用いてシンチレーションバイアルに移し、Beckman Coulter LS 3801 Liquid Scintillation Systemでcpmを測定した。
【０１９３】
実施例3：腫瘍試験およびアポトーシス測定：
the Penn State Human Subjects Protection Office、the Dana-Farber Cancer Institute Protocol Administration Office、およびCooperative Human Tissue Networkにより承認されたプロトコルに従って、ヒト患者由来の黒色腫腫瘍の採取を行った。免疫組織化学によりリン酸化Aktを測定するために、ホルマリン固定パラフィン包埋長期保存黒色腫標本を使用した。製造業者の推奨プロトコルに従って1:50の力価で蛍光-Akt(Ser473)モノクローナル抗体(Cell Signaling Technology)を用いて免疫組織化学実験を行うために、メラノサイト性病変の63個のホルマリン固定パラフィン包埋長期保存標本を使用した。それぞれの標本に存在する内側血管内皮、扁平上皮、または平滑筋の対照との定性的比較を介して、特異性および染色の強度を決定した。
【０１９４】
それぞれの標本に存在する内側血管内皮、扁平上皮、または平滑筋の対照との定性的比較を介して、特異性および染色の強度を決定した。液体窒素で冷却された乳鉢および乳棒を使用し、液体窒素でフラッシュ凍結された腫瘍材料(>60%腫瘍材料よりなる)を微粉砕することにより、ウェスタンブロッティング用または免疫沈降用の腫瘍タンパク質を捕集した。200mgの組織粉末すべてに1mlのタンパク質溶解緩衝液を添加し、氷の充填された超音波処理浴中で2分間(15秒間隔)超音波処理した。サンプルを4℃で10分間遠心分離した(約12,000×g)。上清をクリーンなチューブに移し、BioRad BCA Protein Assayを用いて定量した。
【０１９５】
Institutional Animal Care and Use Committee at the Pennsylvania State College of Medicineにより承認されたプロトコルに従って動物実験を行った。Harlan Sprague Dawleyから胸腺欠損雌ヌードマウスを購入し、10% FBSを含有する0.2mlのDMEM中の1×106個の細胞を4〜6週齢のヌードマウスの左側および右側胸郭の上部に皮下注射することにより、腫瘍動態を測定した。siRNAを利用する動物実験のために、Aktアイソフォームに対するsiRNAで1×106個のUACC 903細胞をヌクレオフェクトし、48時間後、10% FBSを含有する0.2mlのDMEM中のヌクレオフェクト細胞をヌードマウスの左側および右側胸郭の上部に皮下注射した。カリパスを用いて発生腫瘍の寸法を1日おきに測定した。アポトーシスの測定時、1部位あたり5×106個の細胞を注射し、4日後に4〜6片の腫瘍を採取した。既に報告されているようにRoche TUNEL TMR Red Apoptosis kitを用いてホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍切片に対してアポトーシス測定を行った(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。3もしくは4片の異なる腫瘍切片から少なくとも8つの領域を計数し、TUNEL陽性細胞の数をアポトーシス細胞のパーセントとして表現した。
【０１９６】
実施例4：統計：
統計解析のために、ペアワイズ比較では、Studentのt検定を使用し、群比較では、順位に関する一元配置分散分析またはKruskal Wallis分散分析を使用し、続いて、適切なポストホック検定(Dunnett検定もしくはDunn検定)を使用した。<0.05のP値のときに結果を有意であるとみなした。
【表１】
2007530453.tif 000003
【０１９７】
実験結果
実施例5：アイソフォーム特異的siRNAにより黒色腫へのAkt3の関与が確認される
最近報告された実験的遺伝的黒色腫モデル(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))において、Akt活性のデレギュレーション(PTENの減少を介する)が黒色腫細胞のアポトーシス能の減少による黒色腫腫瘍形成に重要な役割を果たすことが実証された(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。このモデルは黒色腫腫瘍形成におけるAktの重要性を反映しているので、活性のデレギュレーションにより黒色腫腫瘍発生が抑制される特定のAktアイソフォームを同定するために使用可能であると我々は推論した。以前の結果(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))を実証して、親UACC 903(-PTEN)細胞は、全リン酸化Akt発現(活性の尺度)を増大させた(図1A)。UACC 903細胞におけるPTENの発現は、結果として、3つの独立に誘導された細胞系(36A、29A、および37A)においてAkt活性を低下させ、腫瘍形成時の機能性PTEN活性の失われた復帰変異細胞系(36A復帰変異体)では逆の結果になった。
【０１９８】
黒色腫中で活性である主要なAktアイソフォームを同定するために、我々は、それぞれのAktアイソフォームに特異的なsiRNAを使用して、それぞれのアイソフォームが親UACC 903(-PTEN)細胞系においてリン酸化(活性)Aktの量を減少させる度合を決定した。タグ付きHA-Akt1、HA-Akt2、またはHA-Akt3を発現する構築物をそれぞれのアイソフォームに特異的なsiRNAと一緒に共ヌクレオフェクトすることにより、UACC 903細胞においてそれぞれのAktアイソフォームの発現をノックダウンする特異性を調べた。特異性を証明して、それぞれのAkt siRNAは、図1Bに示されるように、作製の対象となったAktアイソフォームの発現のみを低下させることが判明した。次に、それぞれのAktアイソフォームに対するsiRNAを、UACC 903細胞系中さらには2つの追加の独立に誘導された黒色腫細胞系(WM115およびSK-MEL-24)中にヌクレオフェクトし、これらの細胞においてsiRNAがリン酸化(活性)Aktのレベルを低下させるかを調べた(図1C)。Akt1またはAkt2に対するsiRNAは、無視しうる有意でない効果を有するにすぎなかったが、Akt3に対するsiRNAは、リン酸化された全Aktのレベルを有意に減少させたことから、Akt3がUACC 903(PTEN)モデル(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))において腫瘍発生をレギュレートするアイソフォームであったことが示唆される。3つの独立に誘導された黒色腫細胞系はすべて、Akt3が黒色腫における主要な活性アイソフォームであることを示唆したので、後続の実験では、Akt3のデレギュレーションを調べることに焦点をあて、そして複数のタイプの癌で増幅されることが報告されていることから比較対照としてAkt2を使用した(Chen et al., Proc Nat Acad Sciences USA 89:9267-9271 (1992); Cheng et al., Proc Nat Acad Sciences USA 93:3636-3641 (1996); Lu et al., Chung-0Hua I Hsueh Tsa Chih [Chinese Medical Journal] 75:679-682 (1995); Bellacosa et al., Int J Cancer 64:280-285 (1995); および van Dekken et al., Cancer Res 59:748-752 (1999))。
【０１９９】
Akt3がUACC 903(PTEN)腫瘍形成モデルにおいてPTENにより活性が特異的に低下される主要なアイソフォームであることをさらに確認するために、細胞溶解物から得られた全Akt3または全Akt2を免疫沈降させてからウェスタンブロッティングを行って免疫沈降物中のリン酸化(活性)Aktの量を推定することにより、Akt3活性を測定した(図1D)。リン酸化Akt3(Akt2ではない)のレベルは、親UACC 903細胞系さらにはPTENの欠如した2つの腫瘍形成性復帰変異36A細胞系において増大された。これとは対照的に、見掛け上PTEN発現に起因して低レベルのAkt活性を有していた36A、29A、または37A細胞系(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))では、かろうじて検出可能なレベルのリン酸化Akt3が観測された。Akt3のリン酸化レベルが活性Aktを反映することを確認するために、免疫沈降Akt3およびAkt2をin vitroキナーゼアッセイでアッセイした。Akt3に対する結果を図1Eに示す。PTEN発現細胞と比較して復帰変異体(-PTEN)において、Akt2活性(データは示されていない)ではなくAkt3活性の統計学的有意差(図1E)が確認された(P<0.05)。全体として、これらの結果から、Akt3活性がUACC 903(PTEN)腫瘍形成モデルにおいてPTENにより特異的にレギュレートされたことが示唆される。
【０２００】
実施例6：黒色腫腫瘍進行の初期にAkt3活性の増大が起こる
メラノサイトは、黒色腫に直接的にトランスフォームされうると考えられる(Herlyn, M., Molecular and cellular biology of melanoma: Austin: R.G. Landes Co. (1993))。他の選択肢として、メラノサイトは、一般的母斑から非定型母斑に、表皮内黒色腫(放射状増殖期および垂直増殖期)に、そして最終的には転移性黒色腫に段階的に発展する腫瘍進行モデルに従いうる(Herlyn, M., Molecular and cellular biology of melanoma: Austin: R.G. Landes Co. (1993))。過程のいかんにかかわらず、より侵攻性の腫瘍細胞の発生には、腫瘍サプレッサー遺伝子およびオンコジーンに影響を及ぼす改変の蓄積が必要とされる。これらは、順次、増え続ける選択的増殖効果または腫瘍形成過程を促進する延命効果を有する細胞の亜集団を生じる。
【０２０１】
黒色腫腫瘍進行時のAkt3の選択的関与を示す証拠を提供するために、Akt3およびAkt2の発現および活性を黒色腫腫瘍進行モデル(寛大にもDr. Meenhard Herlynにより提供された)で測定した(Herlyn, M., Molecular and cellular biology of melanoma: Austin: R.G. Landes Co. (1993); Hsu et al., In Human Cell Culture J.R.W.M.a.B. Palsson, editor. Great Britain: Kluwer Academic Publishers. 259-274 (1999))。この進行モデルでは、メラノサイトが、放射状増殖期(WM35およびWM3211)ならびに垂直増殖期(WM115、WM98.1、およびWM278)の原発性黒色腫腫瘍から樹立された低継代細胞系と比較される。メラノサイトと比較して、2つの放射状増殖期細胞系のうちの1つおよび3つすべての垂直増殖期細胞系がリン酸化Aktを増大させたことを図2Aは示しており、このことから、Akt活性は、放射状増殖期の原発性黒色腫発生の初期に増大したことが示唆される。次に、これらの細胞系において、Akt3アイソフォームの発現をウェスタンブロッティングにより調べ、Akt2発現と比較した(図2B)。メラノサイトに匹敵するWM98.1放射状増殖期細胞系を除くすべてにおいて、Akt3発現は増大されることが判明した。発現が必ずしも活性を反映するとは限らないので、Akt3またはAkt2を免疫沈降させてからウェスタンブロット分析を行って免疫沈降物中のリン酸化Aktのレベルを測定することにより、活性Akt3の量を調べた。メラノサイトと比較して、Akt3活性は、WM35放射状増殖期細胞系を除くすべてにおいて増大された(図2C)。WM98.1垂直増殖期細胞系におけるAkt3タンパク質発現は、メラノサイトで観測されたものに類似しているとはいえ、Akt3活性は有意により高かったことに留意されたい。Akt3の結果とは対照的に、Akt2発現は、メラノサイトと比較して放射状増殖期細胞系においてのみ増大された(図2C)。しかしながら、WM3211放射状増殖期細胞系だけは、Akt2活性の対応する増大を有していたが、メラノサイトと比較してAkt3活性をも増大させた。これらのデータから、Atk3が黒色腫腫瘍進行モデルにおいて活性である優位に関与するAktアイソフォームであったことが示唆される。
【０２０２】
実施例7：黒色腫患者由来の腫瘍におけるAkt3デレギュレーションの頻度
以上の実験によりUACC 903(PTEN)腫瘍形成モデルおよび黒色腫腫瘍進行モデルのいずれにおいても優位に活性なAktアイソフォームとしてAkt3が同定されたので、後続のin vivo試験では、黒色腫患者由来の腫瘍におけるAkt3デレギュレーションの頻度を確定することに焦点をあてた。最初に、黒色腫患者に由来する一般的母斑、異形成母斑、原発性黒色腫、および転移の免疫組織化学的分析を行ってAkt活性化の頻度を決定することにより、全リン酸化Aktの相対強度をメラノサイト性病変で評価した(表1)。一般的母斑の100%で中程度のレベルの染色が検出されたが、異形成母斑の12%、原発性黒色腫の53%、および転移性黒色腫の67%で、強い染色が観測された。Akt活性は母斑発生においていくつかの確認されていない役割を果たしているかもしれないが、Akt活性のデレギュレーションは進行した段階の黒色腫においてより重要な役割を示す指標になることがこれらの結果から示唆される。
【０２０３】
発表された報告(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998))によれば、Akt1、Akt2、およびAkt3遺伝子を含有するゲノム領域の分析では、増幅は見いだされていない。しかしながら、Akt3を含有する1q43-44領域はコピー数の増加を示すことから(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998); Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997))、黒色腫におけるAkt3活性の増大に寄与する機序として過剰発現が示唆される。これとは対照的に、Akt1を含有する14q32領域およびAkt2を含有する19q13領域は、不変のまま保持されるかまたは減少を示す傾向がある(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998); Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997))。Akt3発現の増大が活性増加を引き起こす選択的機序でありうるかを確認するために、黒色腫患者の腫瘍に由来するタンパク質溶解物を抽出してAkt3およびAkt2の発現レベルおよび活性を比較した。31の転移性黒色腫からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングにより分析し、腫瘍材料におけるAkt3およびAkt2の発現レベルおよび活性を調べた。
【０２０４】
3つの独立したウェスタンブロットを用いて各サンプルにおける発現を定量し、次に、メラノサイトにおける発現と比較した(図2D)。全体として、腫瘍の61%(19/31)は、Akt3タンパク質発現を増大させ、メラノサイトで観測された発現の約2〜9倍の範囲内の増加を示し、Akt2に対する10%(3/31)とは対照的である。これらの結果は、Akt3遺伝子を含有する染色体1q43-44の領域に関して文献に報告されているタイプのコピー数増加が黒色腫腫瘍において生じることと一致している(Bastian et al. Cancer Res 58:2170-2175; Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); and Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997))。原発部位黒色腫の約55%(6/11)および黒色腫転移の65%(13/20)は、Akt3発現を増大させした。これとは対照的に、メラノサイトに対して腫瘍におけるAkt2の発現を比較した場合、無視しうる変動が観測されたにすぎなかった(図2D)。次に、Akt3またはAkt2のいずれかの免疫沈降物中のリン酸化Aktを定量することにより活性レベルを測定した。際立った点として、サンプルの62±0.02%(SE)でリン酸化(活性)Akt3が検出された(図2E)。これとは対照的に、これらの腫瘍においてリン酸化Akt2は検出されなかった(陽性対照を除く)。さらに、腫瘍の約35%は、培養下で増殖されたメラノサイトと比較してAkt3活性を増大させた。これらのデータから、進行した段階の黒色腫患者に由来する腫瘍の>60%においてAkt3デレギュレーションの関与が確認されるので、発現の増大が黒色腫におけるAkt3活性のデレギュレーションに寄与する機序の1つであることが示唆される。
【０２０５】
実施例8：黒色腫におけるAkt3デレギュレーションの根底をなす機序
以上の実験により、細胞培養物モデルにおいてin vitroでおよび患者腫瘍においてin vivoで優位に活性なアイソフォームとしてAkt3が同定された。したがって、我々は、次に、黒色腫においてAkt3活性のデレギュレーションを引き起こす機序を調べることに焦点をあてた。最初のUACC 903(PTEN)腫瘍形成モデルから黒色腫においてPTENがAkt活性をレギュレートする重要な役割を担っていることが示唆されたので、我々は、PTEN発現の減少が直接的かつ特異的にAkt3活性を増大させるかを調べた。この目的を達成するために、メラノサイトおよび放射状増殖期原発性黒色腫細胞(WM35)においてPTEN発現(活性)をsiRNAによりノックダウンし、リン酸化Aktのレベルに及ぼす影響を測定した。WM35細胞系を選択した。なぜなら、これらの細胞は、無視しうる基礎Akt3活性を有しかつPTENタンパク質を発現するからである(図1C参照)。予測されたように、PTENのsiRNA媒介ダウンレギュレーションは全リン酸化Aktの増大をもたらし(レーン4および11)、一方、スクランブルsiRNA対照は無視しうる有意でない効果を呈したことが(レーン2および9)、図3Aおよび図3Bから明らかである。Akt1(レーン5および12)、Akt2(レーン6および13)、またはAkt3(レーン7および14)に対するいずれかのsiRNAと一緒にPTENに対するsiRNAを共ヌクレオフェクトすることにより、PTENのダウンレギュレーションに続いて活性化される主要なAktアイソフォームを調べた。Akt3(レーン7および14)に対するsiRNAだけが、リン酸化Aktのレベルを非ヌクレオフェクト細胞(レーン1および8)またはスクランブルsiRNAのみをヌクレオフェクトした細胞(レーン2および9)で観測されたレベルに低下させた。これとは対照的に、Akt1またはAkt2タンパク質レベルの減少によりリン酸化Aktの量は減少しなかったので、このことからもAkt3デレギュレーションの選択性が証明される。したがって、PTENの減少により過剰発現を伴うことなくAkt3活性が増大されるので、PTENによるAkt3活性の選択的レギュレーションは、黒色腫においてAkt3を活性化させる重要な機序である。このため、PTENの減少は、順次、
細胞性PIP3(ホスファチジルイノシチド3,4,5-三リン酸)濃度の増大を引き起こすことが可能であり、黒色腫においてAkt3活性を特異的に増大させるのに有効であろう。この特異性の根底をなす機序は、現在知られていない。
【０２０６】
黒色腫患者由来の腫瘍材料を利用した試験により、Akt3発現の増大はまた、黒色腫においてAkt3活性を増大させる重要な役割を担っている可能性もあることが示唆された。この可能性について調べるために、メラノサイトおよびPTENタンパク質を発現するWM35細胞(図示せず)において、Akt3を過剰発現させた。HAタグ付き野生型Akt3、キナーゼ活性失活型Akt3 T305A/S472A(不活性)、またはミリストイル化Akt3(活性)をメラノサイトにおいて過剰発現させた(図3C)。次に、24時間にわたり細胞から増殖因子を除去し、完全培地を補充し、次に、10分後に溶解物を採取した。Akt2に対する等価な構築物を対照として使用した(データは示されていない)。野生型Akt3およびミリストイル化Akt3の過剰発現は、ベクターのみまたはキナーゼ活性失活Akt3をヌクレオフェクトした細胞と比較して、リン酸化された全Aktのレベルの増加をもたらした。さらに、Akt3過剰発現と併用されたPTENのsiRNA媒介ノックダウンは、野生型Akt3発現単独と比較してより高レベルのリン酸化Aktをもたらした(データは示されていない)。したがって、単独のまたはPTEN減少と併用されたAkt3の過剰発現は、黒色腫におけるAkt3活性の増大に寄与するさらなる機序である。
【０２０７】
実施例9：Akt3活性の増大はアポトーシスの低減により黒色腫腫瘍形成を促進する
Akt3活性のデレギュレーションが黒色腫腫瘍において常に観測されたので、後続の試験では、Akt3活性の増大が腫瘍形成を促進する機序を調べることに焦点をあてた。UACC 903(PTEN)由来細胞系腫瘍形成モデルを用いて、Akt3活性の増大がヌードマウスモデルにおいて黒色腫腫瘍形成を促進することを実証した。親UACC 903(-PTEN)細胞系、36A(+PTEN)細胞系、または36A復帰変異(-PTEN)細胞系に由来する100万個の細胞を4〜6週齢の雌ヌードマウスの皮下に注射し、10日後、形成された腫瘍のサイズを測定した。図4Aは、Akt3活性の低減された36A細胞が親UACC 903細胞およびAkt3活性の増大された復帰変異36A細胞と比較して非腫瘍形成性であることを示している(P<0.5)。36A復帰変異細胞の腫瘍形成能は36A細胞と比較して有意に増大されたが、このモデルを作製するために使用された第10染色体上の第2の黒色腫サプレッサー遺伝子が保持されているため、腫瘍発生は、依然として遅れた状態であった(Robertson et al., Cancer Res 59:3596-3601 (1999))。これらの観測結果を確認し、黒色腫腫瘍形成へのAkt3関与の特異性を実証するために、我々は、siRNAを用いるUACC 903(Akt)モデルを作製した。UACC 903細胞におけるAkt3発現(活性)のsiRNA媒介減少(図4Bに示される)により、腫瘍発生は、緩衝液のみ、スクランブルsiRNA、またはAkt2もしくはAkt1に対するsiRNAをヌクレオフェクトした細胞と比較して有意に遅延された(P<0.05)。したがって、Akt3に対するsiRNAを用いて特異的にAkt3活性を低下させること(図4B)またはPTEN発現を増大させること(図4A)のいずかによって、ヌードマウスにおける黒色腫腫瘍発生が阻害された。
【０２０８】
アポトーシスの増大がAkt活性の低下に続くin vivoにおける腫瘍阻害の根底をなす主要な機序であることを確認するために(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))、Akt3活性の異なるUACC 903(PTEN)モデル(図4C、4E)とUACC 903(Akt)モデル(図4D、4F)との両方でアポトーシスを調べた。非腫瘍形成性36A細胞系ならびに腫瘍形成性UACC 903細胞系および36A復帰変異細胞系をヌードマウスに皮下注射し、次に、それぞれの細胞型から併行して発生する時間的かつ空間的に対応する腫瘍塊を4日後に採取し、TUNELにより評価されるアポトーシスの大きさを比較した(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。低Akt3活性を有する36A(+PTEN)腫瘍塊では、高Akt3活性を有する親UACC 903(-PTEN)細胞系または36A復帰変異(-PTEN)細胞系から生成された腫瘍よりも有意に多いアポトーシス細胞数が観測された(図4C、4E)(P<0.05)。Akt3発現(活性)を低下させるべくAkt3に対するsiRNAが使用されたUACC 903細胞において、類似の結果が観測された。緩衝液のみまたはAkt2に対するsiRNAをヌクレオフェクトした細胞は、Akt3に対するsiRNAで処理されたUACC 903細胞の約1/5〜1/7の数のアポトーシス細胞を有していた(図4D、4F)(P<0.05)。したがって、Akt3活性は、アポトーシスの度合を優先的にレギュレートすることにより、黒色腫細胞の生存を助長し腫瘍形成を促進することが、これらの結果から実証される。
【０２０９】
AKT3に対する実験的考察
本発明において、本発明者らは、Akt3が黒色腫の発生に部分的に関与する重要な生存キナーゼであることを実証する。黒色腫腫瘍形成におけるAktの重要性を反映したUACC 903(PTEN)黒色腫モデルを用いて、黒色腫腫瘍形成時にデレギュレートされる主要なアイソフォームとしてAkt3を同定した。siRNAの使用により、Akt1でもなくAkt2でもなくAkt3の選択的ノックダウンが全リン酸化Aktのレベルを減少させ、黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させることを実証した。2つの独立に誘導された黒色腫細胞系(WM115およびSK-MEL-24)において類似の結果が見いだされたことから、この発見の重要性がさらに裏付けられる。Akt3発現の選択的阻害(siRNAノックダウンによる)または活性の選択的阻害(PTEN発現による)が黒色腫腫瘍発生を有意に減少させることを実証することにより、この観測の臨床的適合性を確認した。
【０２１０】
黒色腫においてAkt3の活性化をもたらす2つの異なる機序をこの試験で特定した。第1の機序は、構造的に正常なAkt3タンパク質の過剰発現に依存する。ヒト患者に由来する進行した段階の黒色腫の分析により、症例の>60%において発現の増大が明らかにされた。メラノサイトおよびWM35細胞におけるAkt3の過剰発現が活性の増大を引き起こすことから、ヒト腫瘍の結果が確証される。Aktの過剰発現は、黒色腫に特有なものではなく、Aktアイソフォームの増幅を報告するいくつかの試験によりいくつかのヒト癌で実証されている。Akt1の増幅は、胃癌で報告されており(Staal, S.O., Proc Nat Acad Sciences USA 84:5034-5037 (1987))、一方、Akt2遺伝子増幅は、卵巣、膵臓、胃、および乳房の癌で見いだされている(Cheng et al., Proc Nat Acad Sciences USA 89:9267-9271 (1992); Chent et al., Proc Nat Acad Sciences USA 93:3636-3641 (1996); Lu et al., Chung-Hua I Hsueh Tsa Chih [Chinese Medical Journal] 75:679-682 (1995); Bellacosa et al., Int J Cancer 64:280-285 (1995); van Dekken et al., Cancer Res 59:748-752 (1999))。Akt遺伝子を含有するゲノム領域の増幅は黒色腫で報告されていないが、いくつかの報告にはAkt3遺伝子を含有する第1染色体の長腕のコピー数の増加が記載されている(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998); Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997))。これとは対照的に、Akt1およびAkt2の遺伝子を含有する第14染色体および第19染色体の長腕は、それぞれ、不変であるかまたは減少を示す傾向がある(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998); Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997))。したがって、Akt3遺伝子のコピー数の増加は、黒色腫発生におけるAkt3の発現および活性の増大に寄与する機序の1つである。
【０２１１】
第2の機序は、UACC 903(PTEN)モデルにおける選択的Akt3活性化が部分的にPTEN活性の低下に基づくことを確認するものであった。メラノサイトおよびPTEN発現を保持する原発性黒色腫細胞(WM35)における関連する観測により、PTENのsiRNA媒介減少がAkt3リン酸化(活性)を特異的に増大せることが明らかにされたことから、黒色腫発生へのAkt3関与の有意性がさらに裏付けられる。黒色腫患者から取得された腫瘍材料中に存在する遺伝的変化を特性付ける研究報告は、PTEN発現の低下が初期黒色腫発生において重要な役割を果たすことを示すさらなる裏付けを提供する(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998); Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997); Parmiter et al., Cancer Genet Cytogenet 30:313-317 (1988))。特定的には、第10染色体の全コピーの消失を介してPTENの1つの対立遺伝子の消失またはPTENハプロ不全が初期黒色腫で一般に起こる(Bastian et al., Cancer Res 58:2170-2175 (1998); Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997); Parmiter et al., Cancer Genet Cytogenet 30:313-317 (1988))。この条件下では、第10染色体の消失により進行性黒色腫細胞の亜集団においてPTEN発現が低減されてAkt3の活性化が増大されるので、これらの細胞は、選択的増殖および延命効果を備えるようになる。したがって、黒色腫におけるPTENのハプロ不全または活性消失に起因する発現の減少は、Akt3活性を特異的に増大することにより黒色腫腫瘍進行に重要な役割を果たす。
【０２１２】
黒色腫におけるPTEN発現の減少に続くAkt1およびAkt2を上回る選択的Akt3活性化の根底をなす分子レベルでの基本原理は、不明である。しかしながら、我々は、この特異性をもたらす機序がPIP3または他のタンパク質とプレクストリン相同(PH)ドメインとの優先的相互作用を含むと推測している。アミノ末端PHドメインは、タンパク質-タンパク質およびPIP3脂質-タンパク質の相互作用を媒介する。ヒトAkt3のPHドメインは、約104アミノ酸長であり(NCBl寄託番号:NP_005456)、Akt1およびAkt2とそれぞれ84%および78%同一である(Brazil et al., Cell 111:293-303 (2002); and Nicholson et al., Cell Signal 14:381-395 (2002))。さらに、PHドメイン内には、Aktアイソフォームごとに異なりいまだに特性付けされていない機能を有するリン酸化部位が存在する。たとえば、トレオニン34に位置するセラミド誘導PKCゼータ依存性リン酸化部位(PHドメイン内)は、PIP3への結合を阻止することによりAkt1の不活性化を引き起こす(Powell et al., Mol Cell Biol 23:7794-7808 (2003))。一方、Akt2およびAkt3は、この位置にセリンを有し、異なった形でリン酸化されレギュレートされる可能性がある。3種のAktアイソフォームのPHドメイン内の他の可能性のあるリン酸化部位の我々の分析により、3つの可能性のあるユニークなAkt3部位を特定した。Akt3の残基21はアスパラギンであるが、Akt1上およびAkt2上の等価な部位はトレオニンである。さらに、Akt3のトレオニン31およびチロシン49もまた、他の2種のAktアイソフォーム(それぞれAkt1およびAkt2のAsn31およびSer31; それぞれAkt1およびAkt2のAla50およびPro50)と異なることが判明した。したがって、PHドメインに結合するPIP3脂質内の推定リン酸化部位の示差的レギュレーションが黒色腫におけるAkt3活性化の特異性の根拠を提供する可能性がある。また、既知のオンコジーン間の存在の知られていない相互作用が黒色腫においてAktアイソフォームの活性化を選択的にレギュレートしている可能性もある。たとえば、TCL1は、Akt3 PHドメインに選択的に結合し、白血病誘発においてAkt分子のリン酸基転移をもたらすAkt1とAkt3とのヘテロオリゴマー化を促進することが明らかにされている(Laine et al., J Biol Chem 277:3743-3751 (2002))。黒色腫細胞中のTCL1または他の特性付けされていない因子が、同様な方法で選択的Akt3活性化を促進する可能性もある。
【０２１３】
Akt3活性化の増大はまた、より進んだ侵攻性腫瘍への発展において重要な役割を果たす。転移性黒色腫におけるAkt3の発現および活性を調べたところ、進行した段階の転移性黒色腫の>60%で発現または活性のデレギュレーションが起こることが示唆された。しかしながら、Akt3活性増大の存在により疾患の予後または治療法の結果を予測しうるかは、現在のところ不明である。黒色腫におけるAkt3活性化の測定は、現在使用されているBreslow深さ(すなわち、顆粒細胞層から最も深い腫瘍細胞までのミリメートル単位で測定された距離)や潰瘍形成(すなわち、黒色腫上に位置する表皮の消失)のような組織病理学的測定よりも疾患の転帰に対する新規で正確な予後指標として期待がもてる。メラノサイト性病変におけるAkt3の活性化状態を評価する分子レベルでの試験は、組織学的評価よりも感度が高くしかもそれほど主観的なものではないと思われる。この方法はまた、活性化されたAkt3またはこのシグナリング経路の他のメンバーを標的にするようにデザインされた薬剤を利用する臨床試験のために適切な患者を選択するうえでも有用であると思われる。
【０２１４】
この試験では、siRNAを使用してまたはPTENを発現させてAkt3活性を低下させるとアポトーシス感受性の変化により黒色腫細胞の腫瘍形成能が効果的に低減されうることを明らかにした。したがって、高レベルのAkt3活性を有する黒色腫細胞は、in vivo腫瘍環境中で生存するのにより適しており、Akt3活性の阻害は、直接的にまたはその上流レギュレーターを妨害することにより、黒色腫患者に対する効果的な抗癌ストラテジーを提供すると思われる(Soengas et al., Oncogen 22:3138-3151 (2003); Johnstone et al., Cell 108:153-164 (2002))。実際に、化学療法剤の大多数は、アポトーシスを誘導することにより機能するので、Akt3を阻害すれば、有効な化学療法または放射線療法に必要とされる薬剤または放射線の閾用量が低減され、黒色腫細胞を選択的に標的とする機序が提供されうると予想される(Soengas et al., Oncogen 22:3138-3151 (2003))。したがって、Akt3活性を単独で治療のために標的にするかまたは化学療法剤と組み合わせることは、黒色腫患者のための潜在的に重要な療法になりうる(Soengas et al., Oncogen 22:3138-3151 (2003))。要約すると、我々は、黒色腫腫瘍における活性の増大が腫瘍進行に対応するとともに増殖し環境ストレスに耐えて生存する選択有利性を備えた細胞を提供する特異的生存促進キナーゼとしてAkt3を特定した。
【０２１５】
B-RAFに対する実施例
材料および方法
実施例10：細胞系、培養条件、およびB-Raf変異状態：
ヒト黒色腫細胞系UACC 903、1205 Lu、およびC8161、ならびにHEK 293T細胞を、10% FBS(Hyclone, Logan, UT)が追加されたDMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)中に保持した。UACC 903およびC8161細胞系中のT1796A B-RAF変異の存在または不在は、既に報告されているとおりであるとみなした( Miller CJ et al. J Invest Dermatol. 123: 990-2 (2004).)。さらに、UACC 903および1205 Lu細胞中のこの変異の存在は、既に報告されている(Miller CJ et al. J Invest Dermatol. 123: 990-2 (2004)., Tsao H et al. J Invest Dermatol. 122: 337-41 (2004)., Krasilnikov M et al. Oncogene. 22: 4092-101 (2003).)。
【０２１６】
実施例11：in vitro siRNA試験：
参考文献(Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004).)に記載されているように、Solution R/ program K-17を用いたAmaxa Nucleofector(Koeln, Germany)によるヌクレオフェクションを介して、siRNA(100pmol)を1×106個のUACC 903、1205 Lu、またはC8161細胞中に導入した。得られたトランスフェクション効率は、>90%であった。ヌクレオフェクションに続いて、細胞を24〜48時間再プレーティングし、その後、ウェスタンブロット分析のためにタンパク質溶解物を採取した。siRNAノックダウンの持続期間を測定するために、B-RafまたはC-Rafに対するsiRNAのヌクレオフェクションの0、2、4、6、および8日後、細胞を採取し、ウェスタンブロット分析に付した。Duplexed Stealth siRNA(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用し、参考文献(Hingorani SR et al. Cancer Res.;63: 5198-202 (2003).)に変更を加えたB-Raf配列を用いてこれらの試験を行った。使用したsiRNA配列は、次のとおりであった: WT B-RAF(COM4または4) - GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU; MUT B-RAF(MuAまたはA) - GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU; C-Raf - GGUCAAUGUGCGAAAUGGAAUGAGC; lamin A/C - GAGGAACUGGACUUCCAGAAGAACA; およびVEGF - GCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTA。
【０２１７】
実施例12：ウェスタンブロット分析：
ウェスタンブロット分析のために、50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、10mM EDTA、10%グリセロール、1% Triton X-100、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、0.1mMモリブデン酸ナトリウム、1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、20μg/mlアプロチニン、および5μg/mlロイペプチンを含有する溶解緩衝液を添加することにより、細胞溶解物をペトリ皿中に採取した。全細胞溶解物を4℃で10分間遠心分離し(10,000×g)、細胞片を除去した。Pierce (Rockford, IL)から提供されるBCA Assayを用いてタンパク質を定量し、1レーンあたり30μgの溶解物をNuPage Gel Life Technologies, Inc. (Carlsbad, CA)上に充填した。電気泳動の後、サンプルをポリビニリデンジフルオライド膜(Pall Corporation, Pensacola, FL)に移した。それぞれの供給業者の推奨基準に準拠した抗体: Cell Signaling Technologies (Beverly, MA)製の抗pErkおよび抗pMek; Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)製のB-Raf、C-Raf、Erk2、およびα-エノラーゼに対する抗体; ならびにBiomeda Corp (Foster City, CA)製のlamin A/Cに対する抗体でブロットをプローブした。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされたものてあり、Santa Cruz Biotechnologyか入手したものであった。増強化学発光検出システム(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて、イムノブロットを発色させた。
【０２１８】
実施例13：in vivo siRNA試験：
Institutional Animal Care and Use Committee at the Pennsylvania State University College of Medicineにより承認されたプロトコルに従って動物実験を行った。10% FBSが追加された0.2mlのDMEM中のsiRNAをヌクレオフェクトした1×106個のUACC 903または1205 Lu細胞を6匹の4〜6週齢のヌードマウス(Harlan Sprague Dawley, Indianopolis. IN)の左右両方の胸郭の上部に皮下注射することにより、腫瘍動態を測定した。カリパスを用いて発生腫瘍の寸法を1日おきに測定した。機序試験のために、siRNAをヌクレオフェクトした5×106個のUACC 903細胞をマウスに注射し、既に報告されているように細胞増殖およびアポトーシスの変化を測定すべく細胞の注射の4日後に腫瘍を採取した(Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004)., Stahl JM et al. Cancer Res. 63: 2881-90 (2003).)。
【０２１９】
実施例14：in vitroおよびin vivo BAY 43-9006試験
これらの試験に使用したBAY 43-9006化合物は、参考文献(Bankston D et al. Organic Process Res Dev. 6: 777-81 (2002).)に記載されているように合成したものである。野生型および変異B-Rafに及ぼすBAY 43-9006の阻害作用を評価するために、既に報告されているようにリン酸カルシウムを用いて、HAタグ付き野生型B-RAF、変異V599EB-RAF、またはベクター(pcDNA3)をHEK 293T細胞にトランスフェクトした(Robertson GP et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 9418-23 (1998).)。トランスフェクションの後(72時間後)、10% FBSと5μM BAY 43-9006またはDMSO媒体とが追加されたDMEM培地で培地を置き換えた。2時間後、ウェスタンブロット分析のためにタンパク質溶解物を捕集した。リン酸化MekおよびErkのレベルを3個の独立したブロットから定量し、Erk 2ローディングコントロールに対して規格化した後、さまざまな条件下における変化倍率を評価した。
【０２２０】
5×106個のUACC 903細胞または1×106個の1205 Lu細胞をヌードマウスに皮下注射することにより、腫瘍発生に及ぼすBAY 43-9006の作用を測定した。6日後(このとき小腫瘍(50〜100mm3)が発生した)、50μlの媒体(DMSO)またはUACC 903細胞に対しては10、50、もしくは100mg/kg(体重)、1205 Lu細胞に対しては50mg/kg(体重)の濃度の薬剤BAY 43-9006を1日おきにマウスに腹腔内注射した。BAY 43-9006による前治療を含む試験のために、UACC 903細胞または1205 Lu細胞の皮下注射の前に(4日前および2日前に)、50mg/kg(体重)の薬剤を2回腹腔内注射した。併行して発生する同一サイズの腫瘍を比較することにより、変異V599EB-Rafの薬理学的阻害が腫瘍発生を遅らせる機序を特定した。これは、5×106個のUACC 903細胞の皮下注射を行った後、6日目から2日ごとに50mg/kgのBAY 43-9006を腹腔内注射することにより、達成された。対照DMSOと薬剤処理された腫瘍との時間的かつ空間的な対応をとるために、1×106、2.5×106、または5×106(100万)個のUACC 903細胞を皮下注射し、6日目から2日ごとにDMSO媒体で腹腔内処理した。比較のために、併行して発生する同一サイズの薬剤処理または媒体処理された腫瘍を9、11、13、および15日目に採取した。既に報告されているように、細胞増殖、アポトーシス、および血管発生の分析を行うべく、各時間点で、媒体または薬剤で処理されたマウスの腫瘍を採取した(Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004), Stahl JM et al. Cancer Res. 63: 2881-90 (2003).)。
【０２２１】
実施例15：腫瘍におけるアポトーシス、細胞増殖、および血管密度の測定
既に報告されているように、Roche (Manheim, Germany)製のTUNEL TMR Red Apoptosis kitを用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍切片に対してアポトーシス測定を行った( Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004), Stahl JM et al. Cancer Res. 63: 2881-90 (2003).)。BrdU取込みおよび免疫細胞化学を利用するRPN 20細胞増殖キット(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いて、ホルマリン固定腫瘍切片における細胞増殖率を測定した。屠殺の2時間前、0.2mlのBrdUをマウスに腹腔内注射し、増殖キットの使用説明書に従って腫瘍を処理した。BAY 43-9006または媒体(DMSO)で処理された腫瘍の全細胞に対するパーセントとして、BrdU染色細胞の数を評価した。精製されたラット抗マウスCD31(PECAM-1)モノクローナル抗体(Pharmingen, San Diego, CA)を用いる血管密度の定量については、既に報告されている(Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004), Stahl JM et al. Cancer Res. 63: 2881-90 (2003).)。IP Labイメージングソフトウェアプログラムを用いて、全面積に対する血管により占有された腫瘍の面積比率を計算した。すべての腫瘍分析に対して、腫瘍1つあたり4〜6領域で少なくとも6つの異なる腫瘍を分析し、結果を平均±SEMとして表現した。
【０２２２】
実施例16：in vivo pErk測定：
ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍切片におけるpErkレベルの変化を定量するために、pH6.0の0.01Mクエン酸緩衝液を用いて95℃の水浴中で抗原回復を20分間行った。スライドを20分間冷却し、PBS中で濯ぎ、次に、3% H2O2中で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。次に、切片を1% BSAで30分間ブロックし、1:100希釈の抗pERK抗体(Cell Signaling Technologies, Beverly, MA)と共に4℃で一晩インキュベートした。PBS中で濯いだ後、切片をビオチン化抗ウサギIgGと共に1時間インキュベートし、PBS中で再び濯ぎ、そしてペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンと共に30分間インキュベートした。AEC(アミノエチルカルバゾール)基質キットを用いて5〜10分間かけて可視化を達成し(Zymed laboratories Inc., South San Francisco, CA)、ヘマトキシリンで核対比染色を行い、その後、マウント水溶液を用いてカバースリップをマウントした。腫瘍1つあたり4〜6領域を計数して少なくとも6つの異なる腫瘍から、pErkに対して陽性染色された細胞の平均パーセント±SEMを算出した。
【０２２３】
実施例17：in vitro倍加時間およびin vivo腫瘍潜伏期間
10% FBSが追加された200μlのDMEM中の5×103細胞/ウェルを5つの96ウェルプレート中の複数列のウェルにプレーティングすることにより、siRNAをヌクレオフェクトしたUACC 903細胞のin vitro倍加時間を推定した。Sulforhodamine B (SRB)結合アッセイ(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)を用いて毎日1プレートずつ5日間にわたり24時間ごとに比色アッセイを行うことにより増殖を測定し、既に報告されているように倍加時間を計算した(Stahl JM et al. Cancer Res. 63: 2881-90 (2003).)。平均腫瘍サイズが10mm3に達するのに必要とされる日数を推定することにより、in vivo腫瘍潜伏期間を測定した。
【０２２４】
実施例18：UACC 903黒色腫細胞のBAY 43-9006増殖阻害/IC-50
UACC 903細胞に対するBAY 43-9006の増殖阻害効果またはIC-50を測定するために、5×103細胞/ウェルを96ウェルプレート中にプレーティングした。24時間後、さまざま濃度のBAY 43-9006(0、0.02、0.1、0.4、1.6、6.3、25、または100μM))をプレート中の2×8ストリップウェルに添加した。5% CO2加湿雰囲気中、37℃で72時間増殖させた後、培地を廃棄し、細胞を10%トリクロロ酢酸中で固定した。SRB結合アッセイ(Stahl JM et al. Cancer Res. 63: 2881-90 (2003).)を用いて、薬剤の各濃度における生存細胞を計算した。ウェスタンブロット分析を用いて、2時間の薬剤への暴露の後におけるUACC 903細胞中のMek 1/2およびErk 1/2のリン酸化レベルに及ぼす漸増濃度のBAY 43-9006(5、10、15、または20μM)の影響を実証した。
【０２２５】
実施例19：VEGF発現分析
B-Rafタンパク質のsiRNA媒介ノックダウンの後またはBAY 43-9006による処理の後において細胞により分泌されたVEGFの量を調べるために、human VEGF Quantikine kit (DVE00)を使用した(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)。さまざまなsiRNAをヌクレオフェクトしたUACC 903細胞または1205 Lu細胞(5×105個)を60mmペトリ皿中にプレーティングし、24時間後、2% FBSを含有するDMEMで培地を置き換えた。さらに24時間経過した後、培地を再び置き換え、そして24時間後および48時間後、ELISA分析用の馴化培地を採取した。BAY 43-9006試験のために、3×105個のUACC 903細胞または1205 Lu細胞を60mmペトリ皿中にプレーティングし、24時間後、2% FBSを含有するDMEMと培地を交換した。さらに24時間経過した後、2% FBS単独またはBAY 43-9006(5、10、15μM)もしくはDMSO媒体との組合せが追加されたDMEMと培地を置き換えた。12時間後または24時間後、ELISA分析用に馴化培地を採取した。14,000rpm(4℃)で5分間遠心分離することにより、培地を清澄化させ、そして-80℃で貯蔵した。製造業者の使用説明書に従って、三重反復試験方式または二重反復試験方式の実験で、VEGF ELISA分析を行った。
【０２２６】
実施例20：統計：
統計解析のために、対比較では、Studentのt検定を使用し、群比較では、一元配置分散分析(ANOVA)またはKruskal-Wallis分散分析を使用し、続いて、適切なポストホック検定(Dunnett検定、Tukey検定、もしくはDunn検定)を使用した。<0.05のP値のときに結果を有意であるとみなした。
【０２２７】
実験結果
実施例21：変異V599EB-RafのsiRNA媒介ターゲッティングは黒色腫腫瘍発生を阻害する
【表２】
2007530453.tif 000004
【０２２８】
黒色腫腫瘍形成における変異V599EB-Rafの役割は、現在のところ不明である。この課題に対処するために、我々は、変異V599EB-Rafタンパク質の発現または活性の阻害を用いて、このタンパク質が黒色腫腫瘍形成において果たす役割を特定しうると推測した。siRNA媒介法を用いて、変異タンパク質を含有するUACC 903および1205 Lu細胞系における変異V599EB-RafまたはT1796A変異の欠如したC8161細胞系におけるB-Rafの発現をノックダウンした。MuAまたはA siRNAは、野生型および変異タンパク質の発現を低減させるようにデザインされ、一方、Com4または4 siRNAは、既に報告されているように変異タンパク質の発現のみを低減させた(Hingorani SR et al. Cancer Res.;63: 5198-202 (2003).)。これらの試験のためのsiRNAをヌクレオフェクションを介して細胞系中に導入したところ、>90%のトランスフェクション効率が得られた(データは示されていない)(Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004).)。ヌクレオフェクションの後でUACC 903(図12A)、1205 Lu(図12B)、およびC8161(図12C)細胞においてB-RafおよびC-Rafタンパク質の発現を低減するsiRNAの有効性をウェスタンブロット分析により測定した。ヌクレオフェクションの24時間後および48時間後、それぞれのsiRNAは、作製の対象となったタンパク質の発現のみを低減させたことから、これらの細胞系のそれぞれにおいてsiRNAノックダウンの特異性および有効性が実証される。UACC 903細胞および1205 Lu細胞では、B-Rafに対するsiRNAは、下流の標的MekおよびErkのリン酸化(活性)レベルを低減させ、一方、スクランブルsiRNAまたはC-Rafに対するsiRNAは、これらのタンパク質に影響を及ぼさなかった(図12Aおよび図12B)。UACC 903細胞および1205 Lu細胞におけるMekおよびErkのリン酸化(活性)レベルの最大の減少は、ヌクレオフェクションの48時間後に観測された。これに対して、C8161細胞におけるB-RafまたはC-Rafの発現の減少は、リン酸化MekおよびErkのレベルに対して無視しうるごくわずかな効果を有していた(図12C)。したがって、変異タンパク質を含有する黒色腫細胞系におけるV599EB-Raf発現の阻害は、MekおよびErkの活性の減少を引き起こし、一方、T1796A変異の欠如した黒色腫細胞におけるB-Rafタンパク質の発現の減少は、下流の標的の活性に影響を及ぼさないように思われる。
【０２２９】
黒色腫腫瘍発生に及ぼすV599EB-Raf発現(活性)の減少の影響を調べるために、我々が既に報告した一時的ノックダウン法( Stahl JM et al. Cancer Res. 64: 7002-10 (2004).)によりsiRNAを用いてUACC 903および1205 Lu細胞系におけるV599EB-Raf発現を阻害してからマウスに皮下注射した。タンパク質発現のsiRNA媒介ノックダウンは、UACC 903(図13A)および1205 Lu(図13B)細胞において少なくとも8日間持続した。さらに、pErkレベルの対応する減少もまた、同一時期に観測された(図13B)。ヌクレオフェクションの17.5日後まで1日おきに発生腫瘍のサイズを測定し、黒色腫腫瘍形成に及ぼすB-Rafノックダウンの影響を調べた。腫瘍発生の減少は、変異V599EB-Raf発現がノックダウンされたUACC 903(図13C)および1205 Lu(図13D)細胞の両方で観測された。これに対して、C-RafのsiRNA媒介阻害、スクランブルsiRNA、緩衝液対照はいずれも、腫瘍発生を変化させなかった。C-Rafのノックダウンの後に影響が現れないことから、V599EB-Rafを介するシグナリングは腫瘍発生に特異的に必要とされることが示唆される。したがって、黒色腫細胞においてV599EB-Raf発現(活性)のsiRNA媒介減少を行ってからマウスに注射することにより、腫瘍形成が阻害された。
【０２３０】
BAY 43-9006と呼ばれるRafキナーゼ阻害剤を用いて類似の実験を行い、UACC 903、1205 Lu、またはC8161細胞においてB-Rafタンパク質の活性を阻害した。Rafキナーゼ阻害剤に関するスクリーニングで最初に同定されたこの化合物は、野生型B-Rafタンパク質の活性を効果的に阻害することが明らかにされている(Lowinger TB et al. Curr Pharm Des. 8: 2269-78 (2002)., Lyons JF et al. Endocr Relat Cancer. 8: 219-25 (2001).)。最初に、我々は、UACC 903細胞の生存数を半分に減少させるBAY 43-9006の濃度(IC-50とも呼ばれる)を調べたところ、5〜6μMであることが判明した(データは示されていない)。したがって、後続のin vitro試験では5μMの濃度を選択した。次に、我々は、HEK 293T細胞においてHAタグ付き野生型または変異V599EB-Raf構築物を発現させることにより、BAY 43-9006が変異および野生型B-Rafタンパク質の両者の活性を類似の程度で阻害することを実証した(図14A)。既に報告されているように、我々は、V599EB-Rafを発現する細胞においてリン酸化(活性)ErkまたはMekのレベルが野生型B-RAFのみをトランスフェクトした細胞のときの5〜7倍になることを観測した(Davies H et al. Nature. 417: 949-54 (2002).)。次に、野生型または変異V599EB-Rafタンパク質のいずれかを発現するHEK 293T細胞を5μM BAY 43-9006に2時間暴露し、シグナリング経路の活性に及ぼす影響を調べた。BAY 43-9006への暴露により、野生型または変異V599EB-Rafタンパク質のいずれかを発現する細胞におけるリン酸化MekおよびErkのレベルは、それぞれ、1/5〜1/6および1/3〜1/4に低減された(図14A)。したがって、BAY 43-9006は、野生型および変異B-Rafの両者の活性を阻害する。
【０２３１】
BAY 43-9006がUACC 903細胞において変異V599EB-Rafタンパク質シグナリングを阻害することを実証するために、in vitro培養物を漸増濃度のBAY 43-9006に2時間暴露した。BAY 43-9006は、UACC 903細胞において用量に応じてリン酸化(活性)MekおよびErkのレベルを低減させた(図14B)。MAPキナーゼシグナリングに対するBAY 43-9006の阻害作用は、UACC 903および1205 Lu細胞系において少なくとも2〜3日間持続した(データは示されていない)。我々は、次に、UACC 903または1205 Lu細胞の皮下注射前にBAY 43-9006で動物を前処置する効果を評価した。これらの実験のために、マウスを50mg/kg BAY 43-9006に4日間暴露した後で5×106個の細胞の皮下注射を行い、次に、22日目まで2または3日ごとに薬剤を腹腔内注射した。UACC 903(図14C)および1205 Lu(図示せず)腫瘍発生はいずれも、有意に阻害され(Studentのt検定;p<0.05)、サイズの対応するUACC 903腫瘍の比較により、媒体処理された対照と比較してBAY 43-9006処理された腫瘍において増殖の減少および血管発生の減少が明らかにされた(図示せず)。さらに、腫瘍サイズは、8日目まで徐々に増大し、その後、一定になり、後続の腫瘍測定では統計的差異はみられなかった(分散分析; P>0.05)。したがって、BAY 43-9006で宿主動物を前処置して変異V599EB-Raf活性の薬理学的阻害を行うことにより、変異V599EB-Rafを発現する黒色腫細胞の腫瘍形成能が有意に低減された。
【０２３２】
V599EB-Raf活性をノックダウンするようにsiRNAで前処理された細胞において腫瘍阻害を引き起こす機序を特定するために、皮下注射の4日後、UACC 903腫瘍において腫瘍細胞増殖率およびアポトーシス率を測定した。アポトーシス率の差(1〜2%)は、TUNELアッセイを用いて検出されなかった(データは示されていない)。しかしながら、B-Rafに対するsiRNAで処理されたUACC 903細胞は、緩衝液のみ、スクランブルsiRNA、またはC-RAF siRNAをヌクレオフェクトした対照細胞と比較して1/5〜1/6の数の増殖細胞を有していた(図14D)。次に、UACC 903細胞系のin vitro倍加時間、in vivo増殖率、および腫瘍潜伏期間を比較して、増殖の減少が腫瘍発生の遅延を説明しうるかを調べた。C-RAFに対するsiRNAまたはスクランブルsiRNAをヌクレオフェクトしたUACC 903細胞は、in vitroで1.2日(すなわち約29時間)ごとに数が2倍になり、一方、B-RAFに対するsiRNAをヌクレオフェクトした細胞は、1.65日(すなわち約40時間)ごと2倍になり、約38%の遅延であった。これに対して、腫瘍における増殖細胞の分析から、C-Rafに対するsiRNAまたはスクランブルsiRNAをヌクレオフェクトした対照腫瘍(10〜15%の増殖細胞を有していた)と、B-Rafに対するsiRNAをヌクレオフェクトした腫瘍細胞(2〜3%の増殖細胞を有していた)と比較して、有意差が示された(分散分析; p<0.05)。B-RAF siRNAをヌクレオフェクトした細胞の増殖能の約82%減少は、腫瘍発生の潜伏期間の遅延を説明しうる。したがって、5日目の対照と同一サイズの腫瘍に対して、B-RAFに対するsiRNAをヌクレオフェクトした細胞は、同一サイズの腫瘍を形成するのにさらに10日間を必要とした。腫瘍発生が>200%遅延されたので、vitroおよびin vivoで観測された増殖率の減少は、これらの細胞の腫瘍形成能の減少を説明しうる。したがって、腫瘍生成前に黒色腫細胞において変異V599EB-Raf発現(活性)を阻害することにより細胞のin vivo増殖能が有意に低減され、それにより、腫瘍形成が遅延された。
【０２３３】
実施例22：既存の腫瘍における変異V599EB-Rafを標的にすることによる黒色腫腫瘍発生の阻害
樹立された既存の黒色腫腫瘍において変異V599EB-Rafを標的にすることにより腫瘍発生を遅延させうるか、もし遅延されるとしたら、その機序が、腫瘍生成前の細胞においてV599EB-Rafを標的にしたときに存在する機序と同一であるかについては、現在のところ不明である。したがって、我々は、次に、既存の黒色腫腫瘍においてB-Rafを薬理学的に標的にすることにより類似の機序で腫瘍発生が阻害されるかを調べた。500万個のUACC 903細胞、100万個の1205 Lu細胞、または500万個のC8161細胞を、4〜6週齢の雌ヌードマウスに皮下注射した。6日目、媒体(DMSO)または媒体に溶解されたBAY 43-9006化合物(10、50、または100 mg/kg)を48時間ごとに腹腔内注射を介してマウスに投与した。48時間の薬剤投与間隔を選択したのは、、UACC 903、1205 Lu、およびC8161細胞におけるMAPキナーゼシグナリング経路に対する阻害作用が、少なくともその時間にわたり持続したからである(データは示されていない)。カリパスを用いて発生腫瘍のサイズを1日おきに測定した。その結果をUACC 903細胞については図4Aに、1205 Lu細胞については図15Bに示す。BAY 43-9006化合物のすべて濃度で、UACC 903腫瘍発生が遅延され、わずか濃度50mg/kgで処置開始の7日後に腫瘍発生がプラトー状態になった(図4B)。10mg/kgのBAY 43-9006で処置されたマウスにおける腫瘍発生は、約1週間遅延されたが、UACC 903腫瘍は、徐々にサイズが増大し、27日目に腫瘍が>2,400mm3のサイズに達し、マウスを安楽死させなければならなかった。UACC 903細胞では、13日目まで腫瘍のサイズのわずかな増加を生じたが；薬剤処置の1週間後、腫瘍サイズは安定化し、13日目から31日目まで腫瘍サイズの統計学的に有意な増加はみられなかった(図15A)(分散分析; P>0.05)。50mg/kg BAY 43-9006で1205 Lu腫瘍を処置したときにもまた、同様に腫瘍発生が低減され、17日目から31日目まで腫瘍サイズがプラトー状態になった(図15B)(分散分析; P=0.12)。これに対して、BAY 43-9006は、C8161細胞においてpMekおよびpErkレベルを阻害したが、腫瘍生成の動態に差異は観測されなかった(データは示されていない)。したがって、変異V599EB-Raf活性の薬理学的阻害は、既存の黒色腫腫瘍において腫瘍発生を遅延させるが、腫瘍退縮を引き起こさない。これに対して、T1796A変異の欠如した黒色腫細胞におけるB-Rafの阻害は、腫瘍形成能を変化させないようには思われた。
【０２３４】
BAY 43-9006化合物が腫瘍における変異V599EB-Rafシグナリング経路の活性に影響を及ぼすことを確認するために、媒体(DMSO)または50mg/kg BAY 43-9006を含有する媒体による処置開始の9日後、マウスの腫瘍において高レベルのリン酸化Erkを発現する細胞のパーセントを算出した(図15C)。pErk陽性細胞の数を定量することにより、BAY 43-9006処置された腫瘍が対照媒体処置された腫瘍の約1/3の数のpErk陽性細胞を有することが明らかにされた(図15D)(Studentのt検定; P<0.05)。媒体処置された腫瘍におけるリン酸化Erk陽性細胞の数が有意に多いことから、BAY 43-9006が変異V599EB-Rafシグナリング経路の活性をin vivoで阻害していることが示唆された。したがって、これらの結果から、BAY 43-9006を用いる変異V599EB-Rafの薬理学的阻害は、腫瘍におけるMAPキナーゼ経路シグナリングを低減させ、それにより、腫瘍阻害を媒介する。
【０２３５】
実施例23：機序として、BAY 43-9006は、既存の黒色腫腫瘍の血管発生を阻害することにより、アポトーシスの増大を引き起こす
以上の実験から、変異V599EB-Raf活性の阻害と腫瘍発生の減少との間で一貫性のある関係が明らかにされたので；後続の試験では、これが既存の黒色腫腫瘍で起こる機序を特定することに焦点をあてた。これらの試験のために、既存の樹立腫瘍の増殖を遅延させる主要な事象を特定すべく、媒体またはBAY 43-9006のいずれかに暴露された時間的かつ空間的に対応するUACC 903腫瘍を血管発生率さらにはアポトーシス率および増殖率に関して分析した。9日目から始めて15日目で終了するように、対応する腫瘍を2日ごとに採取した。アポトーシス率、増殖率、および血管発生率を各時間点で比較した(図16)。媒体処置された腫瘍とBAY 43-9006処置された腫瘍との間で9日目において血管発生に関して統計学的有意差が観測された(図5A)(Studentのt検定; P<0.05)。これに対して、対照腫瘍とBAY 43-9006処置された腫瘍との間で9日目において増殖細胞の数(Studentのt検定; P=0.61)に関しても腫瘍塊中のアポトーシス面積(Studentのt検定; P=0.15)に関しても統計学的有意差は検出されなかった(図16Bおよび図16C)。しかしながら、11日目以降の分析ではいずれも、対照腫瘍と薬剤処置された腫瘍との間で統計学的有意差が観測された(Studentのt検定; P<0.05)。全体として、これらのデータから、BAY 43-9006処置された腫瘍で9日目に観測された血管発生の有意な減少は腫瘍増殖の遅延を引き起こす最初の事象であったことが示唆される。アポトーシスは、BAY 43-9006処置された腫瘍で11日目に顕在化した状態になり、15日目までに腫瘍面積の25%までを占有した(図16B)。20日目までに、腫瘍面積の約50%は、アポトーシスを起こしていた(データは示されていない)。BAY 43-9006はまた、既存の腫瘍の腫瘍細胞増殖に影響を及ぼし、増殖細胞のパーセントを32〜57%減少させた(図16C)。全体として、これらのデータから、血管発生の阻害は、既存の黒色腫腫瘍の増殖阻害を引き起こす主要な事象であるという結論が得られた。
【０２３６】
腫瘍における血管発生は、血管新生を介してまたは周囲の血管床からの新しい血管の増殖を介して起こり、腫瘍細胞により分泌される血管形成因子が引き金となって起こるので(Carmeliet P , Jain RK. Nature. 407: 249-57 (2000).)、我々は、V599EB-RafのBAY 43-9006媒介阻害およびsiRNA媒介阻害が主要な血管形成因子の活性を低下させ、それにより血管発生を低減させるものと推測した(Kranenburg O et al. Biochim Biophys Acta. 1654: 23-37 (2004)., Jain RK. Semin Oncol. 29: 3-9 (2002).)。この可能性を検討するために、ELISAアッセイを用いてV599EB-RAFの阻害の後でVEGFの分泌が減少するか調べた。最初に、V599EB-Raf発現がsiRNAを用いて阻害されているUACC 903および1205 Lu細胞を調べ、対照と比較してVEGF分泌の有意な減少を明らかにした(図17A)。次に、V599EB-Raf UACC 903および1205 Lu細胞のBAY 43-9006媒介阻害の影響を調べ、用量依存的にVEGF分泌が低減されることを見いだした(図17B)。VEGFのsiRNA媒介減少が、V599EB-Raf阻害の後でみられたのと同じように腫瘍阻害を引き起こすか調べるために、VEGFに対するsiRNAをUACC 903または1205 Lu細胞中にヌクレオフェクトした。VEGF特異的siRNAを用いてVEGF発現の減少が観測された(図17A)。これは、V599EB-Raf発現の減少の後で起こるものと一致した形でUACC 903(図17C)および1205 Lu(図17D)細胞の腫瘍形成能を低下させた。したがって、V599EB-Raf活性の減少により媒介されるVEGF分泌の減少は、血管発生の阻害を引き起こし、その結果として黒色腫腫瘍発生に影響を及ぼした。
【０２３７】
B-Rafに対する実験的考察
この試験では、変異V599EB-Raf発現(活性)のsiRNA阻害または薬理学的阻害を用いると腫瘍細胞の増殖能および/または血管新生能を低下させることにより黒色腫細胞の腫瘍形成能が効果的に低減されることを実証する。したがって、変異V599EB-Rafを有する黒色腫細胞は、in vivo腫瘍環境における増殖に、より適している。我々は、腫瘍発生前に黒色腫細胞においてV599EB-Raf発現(活性)の標的化減少を行うと黒色腫細胞の増殖能が有意に低減され、それにより、腫瘍発生が阻害されることを明らかにした。これに対して、アポトーシスは、この過程において重要な役割を果たさなかった。さらに、腫瘍発生の阻害は、変異V599EB-Raf発現がノックダウンされた細胞でのみ観測され、T1796A B-RAF変異の欠如した黒色腫細胞ではC-Rafのノックダウンの後でもB-Rafのノックダウンの後でも観測されなかった。したがって、V599EB-Rafを介するシグナリングは黒色腫腫瘍発生に特異的に必要とされることは明らかである。これらのデータは、WM793黒色腫細胞におけるV599EB-RafのsiRNA媒介阻害がこれらの細胞のin vitro増殖能を低下させることを実証した我々の前の試験と一致している(Hingorani SR et al. Cancer Res.;63: 5198-202 (2003).)。本報告におけるUACC 903細胞を用いた類似のin vitro試験から、これらの先行する観測がさらに確証される。変異V599EB-Raf発現(活性)のノックダウンはまた、構成的Erkシグナリングを特異的に低減させ、C-Rafのノックダウンの後では起こらなかった増殖の減少を引き起こした。したがって、変異V599EB-Rafは、in vitroおよびin vivoの両方で黒色腫細胞の増殖を促進し；さらに、腫瘍発生前の標的化阻害は、腫瘍細胞の増殖の減少により媒介されて腫瘍形成を阻害する。
【０２３８】
既存の樹立腫瘍において変異V599EB-Rafを標的にすることにより増殖は停止されたが；増殖阻害は、この過程において部分的役割を果たしているにすぎなかった。より注目すべき点として、サイズおよび時間の対応する腫瘍の比較から、血管発生の阻害は、腫瘍増殖の遅延を開始する役割を果たすことをが明らかにされた。すべての固形腫瘍でみられるように、血管発生は、腫瘍細胞により分泌される血管形成因子により周囲の血管床からの新しい血管の増殖が促進される血管新生を介して起こる(Carmeliet P , Jain RK. Nature. 407: 249-57 (2000).)。本試験において、我々は、V599EB-Rafの阻害がUACC 903および1205 Lu黒色腫細胞によるVEGF分泌を低減させることを見いだした。B-RAFノックアウトマウスが有意な内皮細胞死滅を呈して出血および胚致死を引き起こすことから、B-Rafは、胚の血管発生において重要な役割を果たすことが報告された(Wojnowski L et al. Nat Genet;16: 293-7 (1997).)。しかしながら、BAY 43-9006を用いたV599EB-Rafの阻害の後で既存の腫瘍血管における有意な内皮細胞死滅は、我々には観測されなかった。むしろ、V599EB-Rafの阻害は、腫瘍細胞によるVEGF分泌の減少により媒介されて血管新生を阻害した(Kranenburg O et al. Biochim Biophys Acta. 1654: 23-37 (2004)., Jain RK. Semin Oncol. 29: 3-9 (2002).)。この観測は、VEGF分泌の減少が血管新生の減少を引き起こし、それにより、癌細胞の腫瘍形成能が阻害されることを示す既報の証拠により裏付けられる(Heidenreich R et al. Int J Cancer. 111: 348-57 (2004)., Inai T et al. Am J Pathol. 165: 35-52 (2004).)。したがって、変異V599EB-Rafシグナリングの減少により媒介されるVEGF分泌の減少は、血管新生の阻害を引き起こし、既存の黒色腫腫瘍の増殖を停止させる。
【０２３９】
我々の試験はまた、BAY 43-9006は、in vitroおよびin vivoでV599EB-Raf活性を阻害し、下流の標的MekおよびErkのリン酸化の減少を引き起こし、黒色腫腫瘍発生を緩徐化することを示す。我々は、BAY 43-9006による動物の前処置が、siRNA媒介阻害と類似した形で黒色腫腫瘍発生を低減させることを観測した。しかしながら、BAY 43-9006処置は、血管発生を破壊することにより樹立腫瘍の発生を遅延させるにすぎなかった。腫瘍の完全な退縮は起こらず、むしろ、腫瘍サイズは、処置後、相対的変化を示さない状態になった。この観測は、BAY 43-9006単独療法が進行した段階の黒色腫患者を治療するうえでそれほど効果がなかった臨床試験で得られた予備データと一致している(Tuveson DA et al. Cancer Cell. 4: 95-8 (2003)., Ahmad T et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 23: 708 (2004).)。しかしながら、伝統的な化学療法(パクリタキセルおよびカルボプラチナム)と併用したところ、患者において50%の奏効率を生じた(Tuveson DA et al. Cancer Cell. 4: 95-8 (2003)., Flaherty K et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 23: 708 (2004).)。したがって、BAY 43-9006は腫瘍発生を緩徐化するが、この薬剤は、樹立された既存の腫瘍の退縮を引き起こす他の相乗的治療剤と組み合わせる必要があると思われる(Tuveson DA et al. Cancer Cell. 4: 95-8 (2003)., Bollag G et al. Curr Opin Investig Drugs. 4: 1436-41 (2003)., Lyons JF et al. Endocr Relat Cancer. 8: 219-25 (2001).)。また、薬剤の投与経路が黒色腫患者においてBAY 43-9006の効力を変化させる可能性もある。臨床試験は薬剤の経口投与を含むものであったが、我々の試験では、腹腔内注射を介して2〜3日ごと薬剤を投与した。他の投与経路が、薬剤の局所的生物学的利用能を増大させることにより、より有効である可能性もある(Sparreboom A et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 2031-5 (1997)., Bardelmeijer HA et al. Cancer Research. 62: 6158-64 (2002)., Hale JT et al. Bioch Pharm.64: 1493-502 (2002)., Kimura Y et al. Cancer Chemother Pharm. 49: 322-8 (2002).)。したがって、化学療法剤と組み合わせてV599EB-Raf活性を治療のために標的化すれば、この変異タンパク質を含有する樹立黒色腫腫瘍を縮小させるのに有効な方法が提供される可能性がある。
【０２４０】
結論として、我々は、変異V599E B-Rafが黒色腫腫瘍発生を促進する機序を特定した。そして、この変異が腫瘍環境において選択的増殖効果および血管新生効果を備えた黒色腫細胞をどのように提供するかを明らかにする。
【０２４１】
実施例24：Akt3ドメイン交換実験、結果、および考察
Aktアイソフォーム間のドメイン交換により、黒色腫においてAkt1でもAkt2でもなくAkt3の優先的活性化を引き起こすAkt3の領域を特定した。活性化は、Akt3上のトレオニン308またはセリン472のリン酸化のレベルとして；またはAkt3の免疫沈降を行ってから、Akt3によりCrosstideをリン酸化して活性を推定するin vitroキナーゼアッセイを行うことにより、測定される。Akt3のドメインをAkt2またはAkt1のものと交換し、キメラ遺伝子を含有する構築物を黒色腫細胞系WM35またはUACC 903中にヌクレオフェクトした。ミリストイル化Akt3およびAkt2は、陽性対照の役割を果たし、一方、失活したAkt3(T305A/S472A)およびAkt2(T309A/S474A)は、陰性対照の役割を果たした。野生型Akt3の移入により活性増加が起こったが、それとは対照的に、野生型Akt2では起こらなかったことから、黒色腫細胞におけるAkt3活性化の特異性が実証される。Akt3のプレクストリン相同ドメイン(アミノ酸1〜110)がAkt2の触媒-調節ドメインに結合された構築物は、活性化を引き起こさなかった。これに対して、Akt2のプレクストリン相同ドメイン(アミノ酸1〜110)がAkt3の触媒-調節ドメイン(アミノ酸111〜497)に結合された構築物は、活性であった。このことから、黒色腫における優先的Akt3活性化を引き起こすクリティカル領域は、アミノ酸111〜497に位置付けられる。これは、黒色腫におけるAkt3活性化を特異的に阻止すべく治療剤の標的になりうる領域である。
【０２４２】
以上に記載の特定の実施形態と組み合わせて本発明について説明してきたが、多くのそれらの代替形態、修正形態、および変更形態は、当業者には自明なものであろう。そのような代替形態、修正形態、および変更形態はすべて、本発明の精神および範囲に包含されるものとする。本明細書に引用されているすべての文献(たとえば、出版物および特許出願)は、あたかも個々の文献が具体的かつ個別的に示されて参照により組み入れられたのと同一程度まで参照により組み入れられるものとする。
【０２４３】
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【図面の簡単な説明】
【０２４４】
【図１Ａ】図1は、悪性黒色腫へのAkt3の関与の同定を示す。図1A：黒色腫細胞系UACC 903におけるAkt活性はPTENによりレギュレートされる。リン酸化Akt、全Akt、PTEN、およびα-エノラーゼ(ローディングコントロール)の発現を示すウェスタンブロット分析。36A、29A、および37A細胞系は、PTENを発現するUACC 903親細胞系から作製された遺伝的関連細胞系である。36A細胞系から誘導された腫瘍形成性復帰変異細胞系は、同遺伝子型であると考えられ、PTEN発現のみが異なる。メラノサイトは、正常細胞に対する対照としての役割を果たす。グラフは、各細胞系における全Aktに対するリン酸化Aktのレベルを定量的に示すべく3つの独立したウェスタンブロットから得られたデンシトメトリースキャンを表している；バー、±SEM；統計、一元配置分散分析の後でメラノサイト対照に対するDunnetの多重比較、*P<0.5。
【図１Ｂ】図1B：Aktアイソフォームのそれぞれに対するsiRNAは、UACC 903細胞系において異所的に発現される各Aktアイソフォームのノックダウンの特異性を示す。タグ付きHA-Akt1、HA-Akt2、またはHA-Akt3を発現する構築物を、Akt1、Akt2、またはAkt3に特異的なsiRNAと一緒にUACC 903細胞中に共ヌクレオフェクトした。対照は、非ヌクレオフェクト細胞またはベクターのみをヌクレオフェクトした細胞であった。異所的に発現されたタンパク質を検出すべくHAに対する抗体を用いてウェスタンブロットをプローブし、さらにローディングコントロールの役割を果たすα-エノラーゼについてもプローブを行った。
【図１Ｃ】図1C：Akt2でもAkt2でもなくAkt3のsiRNA媒介ノックダウンが、黒色腫細胞系UACC 903、WM1 15、およびSK-MEL-24においてリン酸化Aktのレベル(活性)を改変する。各siRNAごとに50(左側)または100ピコモル(右側)を用いてヌクレオフェクションを行った後のリン酸化Akt、Akt3、Akt2、およびα-エノラーゼの発現を示すウェスタンブロット分析。対照は、非ヌクレオフェクト細胞またはスクランブルsiRNAをヌクレオフェクトした細胞であった。データは、少なくとも2回の個別実験を代表するものである。これらの実験に対するローディングコントロールは、α-エノラーゼであった。
【図１Ｄ】図1D：リン酸化Akt3は、UACC 903(PTEN)腫瘍形成性モデル中にPTENタンパク質が存在するときに低減される。Akt3およびAkt2をUACC 903(PTEN)腫瘍形成性モデルで細胞系から免疫沈降させ、リン酸化Aktを認識する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。PTENタンパク質が欠如しているUACC 903親細胞系から、PTENを発現する36A、29A、および37A細胞系を誘導した。2つの腫瘍形成性復帰変異細胞系を36A細胞系から誘導したが、これらは、もはやPTENを発現しない。Akt3およびAkt2に対する陽性対照および陰性対照と一緒に陰性抗原対照を示す。Akt3およびAkt2に対する対照は、それぞれ、未処理(陽性)であるかまたはP13Kの阻害剤LY-294002による処理(陰性)の施されたHEK 298T細胞またはLNCaP細胞であった。E：Akt3活性は、UACC 903(PTEN)腫瘍形成性モデルにおいてPTENの存在下で低減される。Akt3によりCrosstideがリン酸化されるin vitroキナーゼアッセイにおいて免疫沈降Akt3を用いて活性を推定した。プロットは、抗原無しの対照を差し引いた後の活性を示している；バー、±SEM；統計、一元配置分散分析の後でメラノサイト対照に対するDunnetの多重比較、*P<0.05。
【図２】図2は、黒色腫腫瘍進行中に生じる増大されたAkt3の発現および活性を示す。A．リン酸化(活性)Aktのレベルの増大は、黒色腫腫瘍進行モデルにおいて放射状増殖期に生じる。メラノサイトにおけるリン酸化Aktの量と放射状増殖期(WM35およびWM3211)および垂直増殖期(WM115、WM98.1、およびWM278)の原発性腫瘍から樹立された低継代黒色腫細胞系におけるリン酸化Aktの量とのウェスタンブロット比較。全Aktを対照として示す。B．黒色腫腫瘍進行モデルにおけるAkt3発現とAkt2発現との比較。Akt3およびAkt2の発現レベルを示すウェスタンブロットをローディングコントロールとしてのα-エノラーゼと一緒に示す。C．Akt3は、Akt2と比較して黒色腫腫瘍進行モデルの細胞系において優先的に活性化される。Akt3またはAkt2を各細胞系から免疫沈降させ、そしてウェスタンブロット分析にかけて免疫沈降物中のリン酸化Aktの量を測定した。D．Akt3は、メラノサイトと比較してヒト患者の転移性黒色腫において優先的に過剰発現される。31の腫瘍に由来する転移性黒色腫からのAkt3およびAkt2の発現を測定した。Akt3およびAkt2の発現をα-エノラーゼ発現に対して規格化した。グラフは、各腫瘍におけるAkt3またはAkt2の発現レベルをメラノサイトの場合と定量的に比較したものである。バーは、3つの独立したウェスタンブロットのデンシトメトリースキャンの平均値を表している；バー、±SEM。上に記された値は、メラノサイトにおける発現に対する発現増加倍率を表している；≧2倍の差だけが有意であると評価された。E．Akt2ではなくAkt3の発現および活性は、メラノサイトと比較して黒色腫患者の腫瘍において増大する。Akt3およびAkt2の免疫沈降を行ってからリン酸化Aktを認識する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行ってリン酸化(活性)Akt3またはAkt2の検出が可能であった腫瘍のパーセントを決定ことにより、活性を決定した；統計、t検定、*P<0.05。
【図３Ａ−Ｄ】図3は、悪性黒色腫におけるAkt3活性のデレギュレーションの根底をなす機序を示す。A．メラノサイトおよび：B．放射状増殖期WM35(放射状増殖期)細胞において、PTEN発現(活性)を低減すると、Akt3活性が特異的に増大される。PTENのsiRNA媒介減少を、単独の場合(対照)、またはスクランブルsiRNAと併用した場合、またはAkt1、Akt2、もしくはAkt3に対するsiRNAと併用した場合について示す。ウェスタンブロット分析は、リン酸化Akt、Akt3、Akt2、およびPTENの発現を示している。α-エノラーゼは、ローディングコントロールの役割を果たした。C.ヒトメラノサイトにおけるAkt3の過剰発現は、リン酸化Aktのレベルを増大させる。野生型Akt3、失活Akt3(不活性)、またはミリストイル化Akt3(活性)を、メラノサイト中にヌクレオフェクトした。Akt2に対する類似の構築物は、対照の役割を果たした(データは示されていない)。ウェスタンブロット分析によりAktリン酸化(活性)を測定してリン酸化Aktのレベルを求めた。矢印は、内因的に活性なAkt3の位置を示し、一方、矢印は、異所的に発現された活性なHAタグ付きAkt3を示している。
【図４Ａ−Ｂ】図4は、増大されたAkt3活性がアポトーシス率を低下させることにより黒色腫腫瘍発生を促進することを示している。A．Akt3活性のPTEN媒介減少は、黒色腫腫瘍発生を抑制する。親UACC 903黒色腫細胞、同遺伝子型36A(PTEN保持)、および復帰変異細胞系(PTEN欠如)により形成された腫瘍のサイズを、ヌードマウスへの注射の10日後に測定した。値は、1細胞系あたり3匹のマウスで少なくとも6ヶ所の注射部位の平均である;バー、±SEM。統計、一元配置分散分析の後でUACC 903に対するDunnetの多重比較、*P<0.05。B．Akt3のsiRNA媒介ダウンレギュレーションは、UACC 903黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させる。Akt3、Akt2、およびAkt1に対するsiRNAをUACC 903細胞中にヌクレオフェクトし、48時間後、細胞をヌードマウスに注射した。腫瘍のサイズを10日間後に測定した。対照は、緩衝液のみまたはスクランブルsiRNAをヌクレオフェクトしたUACC 903細胞である。値は、1細胞系あたり3匹のマウスで少なくとも6ヶ所の注射部位の平均である；バー、±SEM；統計、一元配置分散分析の後でUACC 903に対するDunnetの多重比較、*P<0.05。
【図４Ｃ】C．D．E．F． PTENまたはsiRNAにより媒介されるAkt3の減少は、ヌードマウスで増殖する腫瘍のアポトーシスを増大させる。PTENを発現するUACC 903細胞(36A)またはsiAkt3およびsiAkt2に対するsiRNAをヌクレオフェクトしたUACC 903細胞に由来する腫瘍塊におけるTUNEL陽性細胞の定量(C、D)および写真(E、F)；バー、±SEM；統計、Kruskal-Wallis比較の後でUACC 903に対するDunnetの多重比較、*P<0.05。ヌードマウスに細胞を注射した4日後に腫瘍を分析した；倍率、200倍。対照は、UACC 903細胞または緩衝液のみをヌクレオフェクトしたUACC 903細胞であった。白色の核は、アポトーシスを起こしている細胞を表す。
【図５】図5は、リポソームが単独で黒色腫細胞に対して無毒であることを実証するものである。種々の濃度でリポソームを添加剤したが、生細胞の数は減少しなかった。実際上、それらは、48時間ですべての濃度で細胞生存能力を増大させた。方法：6.25、12.5、25、および50μMの濃度でリポソームを添加した24、48、および72時間後、MTSアッセイを用いて1205 Luにおいてリポソームの毒性を評価した。
【図６】図6は、黒色腫細胞が容易にリポソームを取り込むことを実証するものである。方法：標識化リポソーム(緑色)を培養下で増殖するAUCC 903黒色腫細胞に添加した。画像は、左側に細胞核(DAPIで対比染色した)および右側に標識化リポソームを取り込んだ細胞を示している。倍率、40倍。概算で、99%の細胞がリポソームを取り込む。
【図７】図7は、黒色腫細胞によるリポソーム取込みを定量化したものである。方法：標識化リポソームまたは標識化siRNAを含有するリポソームを培養下で増殖する細胞に20nmの濃度で添加した。1時間後、5%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、DAPIで対比染色し、標識化生成物を取り込んだ細胞の%を求めた。
【図８】図8は、リポソームのサイズ均一性およびサイズ分布を示したものである。方法：左側：リポソームの均一なサイズを示す走査型電子顕微鏡写真。右側：光散乱分析により決定されたリポソームのサイズ分布。グラフは、リポソームのサイズ範囲を示しており、平均サイズは70〜80nmである。
【図９】図9は、リポソームがsiRNAのプールを黒色腫細胞に送達することを示したものである。方法：赤色および緑色に標識化されたsiRNAを培養下で増殖する黒色腫細胞に添加した。取込みの1時間後、4%パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、DAPIで対比染色した。左側に、青色に染色された細胞核、続いて、赤色siRNAおよび緑色siRNAを示している。最後のカラムは、組合せ画像である(倍率40倍)。
【図１０】図10は、1205 Lu黒色腫細胞におけるタンパク質発現のStealth siRNAノックダウンの持続期間を示したものである。方法：Invitrogen製のStealth siRNAによるタンパク質ノックダウンの持続期間は、8日間を超えることが確認された。ヌクレオフェクションによりsiRNAを1205 Lu黒色腫細胞系に移入した。2日間隔で8日目までB-Rafタンパク質レベルのウェスタンブロット分析を行った。C-Rafに対するsiRNAは、対照としての役割を果たした。B-Raf発現の減少に加えて、シグナリング経路の下流のpErk 1'/2の活性もまた、8日間にわたり減少した。Erk-2は、タンパク質ローディングコントロールの役割を果たした。
【図１１】図11は、黒色腫細胞中へのsiRNAのリポソーム媒介送達の後のタンパク質発現のノックダウンを示したものである。変異B-Rafを標的にするsiRNAリポソーム複合体は、200nmでタンパク質発現の50%をノックダウンすることが可能である。これはベースラインを示しており；より高い濃度ではノックダウンが増大されるであろう。方法：siRNAリポソーム複合体を100または2oonMの濃度で細胞に添加した。溶解物を72時間後に捕集し、ウェスタンブロットにより分析した。
【図１２Ａ】図12Aは、黒色腫において変異V599EB-RafのsiRNA媒介減少が下流のMEKおよびERKの活性を低下させることを示す。B-RafおよびC-RafのsiRNA媒介ノックダウンは、黒色腫細胞系UACC 903において、ヌクレオフェクションの24時間後および48時間後、それぞれの対応するタンパク質のレベルを低下させる。スクランブルsiRNAを対照として使用し、lamin A/C siRNAをUACC 903細胞に対する追加の対照として使用した。B-Rafに対するsiRNAだけが、変異V599EB-Rafを含有するUACC 903細胞および1205 LU細胞において、B-Rafの下流の活性(リン酸化)MEKおよびERKのレベルを低下させた。ERK2をローディングコントロールとして使用する。
【図１２Ｂ−Ｃ】図12Bは、黒色腫において変異V599EB-RafのsiRNA媒介減少が下流のMEKおよびERKの活性を低下させることを示す。B-RafおよびC-RafのsiRNA媒介ノックダウンは、黒色腫細胞系1205 Lu(B)およびC8161(C)において、ヌクレオフェクションの24時間後および48時間後、それぞれの対応するタンパク質のレベルを低下させる。スクランブルsiRNAを対照として使用し、lamin A/C siRNAをUACC 903細胞に対するさらなる対照として使用した。B-Rafに対するsiRNAだけが、変異V599EB-Rafを含有するUACC 903細胞および1205 LU細胞において、B-Rafの下流の活性(リン酸化)MEKおよびERKのレベルを低下させた。ERK2をローディングコントロールとして使用する。
【図１３Ａ−Ｂ】図13は、黒色腫腫瘍発生がC-RAFに対するsiRNAでもなくスクランブルsiRNAでもなくV599EB-Rafにより抑制されたことを示す。B-Rafタンパク質のsiRNA媒介ノックダウンは、培養下で増殖するUACC 903(A)細胞系および1205 Lu(B)細胞系において、ヌクレオフェクション後の6〜8日間にわたり持続する。対応する減少は、リン酸化ERK1/ERK2レベルで観測された(B)。ERK2は、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図１３Ｃ−Ｄ】B-RafのsiRNA媒介減少は、UACC 903(C)細胞および1206 Lu(D)細胞の腫瘍形成能の低下を引き起こした。B-Raf、C-Rafに対するsiRNAおよびスクランブルsiRNAをUAC 903細胞または1205 Lu細胞に導入し(白色の矢印)、36時間後、細胞をヌードマウスに注射した(黒色の矢印)。腫瘍のサイズを2日間隔で測定した。B-RafのsiRNA媒介ダウンレギュレーションは、UACC 903および1205 Lu黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させた。緩衝液のみ、スクランブルsiRNA、またはC-Rafに対するsiRNAを対照細胞にヌクレオフェクトした。値は、2回の個別実験による6匹のマウスの少なくとも12ヶ所の注射部位の平均である。バー±SE。
【図１４Ａ】図14は、BAY 43-9005を用いてB-Raf活性を薬理学的に阻害すると黒色腫腫瘍発生が抑制されることを示している。図14A：BAY 43-9006は、野生型V599EB-Raf活性および変異V599EB-Raf活性の両方を阻害する。HAタグ付きの野生型V599EB-Rafまたは変異V599EB-Rafを、5μmol/L BAY 43-9006またはDMSO媒体に暴露されたHEK 293T細胞で発現させた。HAは、異所的に発現されたB-Rafタンパク質を示す。MAPK経路の活性化または阻害は、pMEKおよびpERKの含有レベルにより決定され、ERK2は、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図１４Ｂ−Ｃ】図14B：BAY 43-9006は、変異V599EB-Rafを含有するUACC 903黒色腫細胞において、用量に応じてpMEKおよびPERK (活性)のレベルを低減する。BAY 43-9006の濃度の増加に伴うUACC 903細胞における低減されたpMEKおよびPERKレベルのウェスタンブロット分析。ローディングコントロールは、ERK2であった。 図14C：BAY 43-9006を用いてマウスの前処置を行うと黒色腫腫瘍の発生が抑制される。5×108個のUACC 903細胞の注射の4日前、50mg/kg BAY 43-9006またはDMSO媒体を用いてマウスの腹腔内を2回前処置し、それを2日間ごとに繰り返した(矢印)。2日間隔で22日目までの腫瘍サイズを示す。バー、±SE。
【図１４Ｄ】図14D：黒色腫腫瘍発生のsiRNA媒介阻害に伴って腫瘍細胞増殖が低減される。B-RafのsiRNA媒介阻害の後、ブロモデオキシウリジン陽性細胞が1/5〜1/8に減少するが、C-RafやスクランブルsiRNAでは減少しない。*.P<0.05。カラム、腫瘍1つあたり4〜6視野を計数して6つの個別の腫瘍から得た平均；バー、±SE。
【図１５Ａ−Ｂ】図15は、BAY 43-9006を用いてB-Raf活性を阻害すると黒色腫腫瘍発生が抑制されることを示している。UACC 903(A)および1205 Lu(B)腫瘍発生に及ぼすBAY 43-9006処置の効果を示す。UACC 903細胞および1205 Lu細胞をヌードマウスに注射し、6日目まで腫瘍発生を行い、その時点から2日ごとに、DMSOに溶解されたBAY 43-9006をマウスの腹腔内に注射した(矢印)。対照条件は、DMSO処置のみであった。Rafキナーゼ阻害剤BAY 43-9006は、濃度≧50mg/kgにおいて、変異V599EB-Rafタンパク質を含有する黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させる。
【図１５Ｃ−Ｄ】図15 C:BAY 43-9006による処置の後、それらの細胞でリン酸化(活性)ERKの量の減少が観測されたが、媒体処置では観測されなかった。図15 D:50mg/kg BAY 43-9006(DMSO中)またはDMSO媒体単独で処置されたUACC 903腫瘍切片におけるpERK陽性細胞の数の免疫組織化学的比較。対照媒体およびBAY 43-9006で処置された細胞間で3倍の差異が検出された。*.P<0.05。カラム、腫瘍1つあたり4〜6視野を計数して6つの個別の腫瘍から得た平均；バー、±SE。
【図１６】図16は、黒色腫腫瘍における変異V599EB-Rafの薬理学的阻害またはsiRNA媒介阻害の後の黒色腫腫瘍発生の抑制の根底をなす機序を示している。BAY 43-9006または媒体(DMSO)に暴露された時間的かつ空間的に対応する腫瘍における血管発生率(A)、アポトーシス率(B)、および増殖率(C)の比較。併行して発生するサイズおよび時間の対応した腫瘍を比較して、腫瘍発生に及ぼすB-Raf阻害の効果を同定した。血管発生の差は、BAY 43-9006を用いてUACC 903腫瘍を処置した後で観測された最初の統計学的に有意な差(*、P<0.05)であり、続いて、増大されたアポトーシス(*、P<0.05)および低減された細胞増殖(*；P<0.05)が有意な差として観測された。カラム、実験1回あたり6つの腫瘍のそれぞれから4〜6視野を分析して2回の個別実験から得た平均；バー、±SE。
【図１７Ａ−Ｂ】図17は、V599EB-RafのsiRNA阻害および薬理学的阻害が黒色腫細胞からのVEGF分泌を低減することを示している。B-Raf siRNAもしくはVEGF siRNAのいずれかを用いてヌクレオフェクションを行った後(A)または漸増濃度のBAY 43-9006を用いて処理した後(B)、培養下で増殖するUACC 903細胞または1205 Lu細胞からのVEGF分泌をELISAアッセイにより測定した。C-RafおよびスクランブルsiRNAは、対照の役割を果たした。バー、±SD。
【図１７Ｃ−Ｄ】UACC 903(C)および1205 Lu(D)腫瘍発生に及ぼすVEGF発現減少の効果を示す。2日間隔で17.5日目までの腫瘍サイズを示す。VEGF発現の減少は、V599EB-Raf発現の減少の後でみられるのと同じように黒色腫腫瘍発生を抑制する。点、6つの個別の腫瘍から得た平均；バー、±SE。
【図１８】図18は、黒色腫において優先的活性化を引き起こすAkt3の領域を示している。活性化は、リン酸化のレベルとして測定され；バンドが暗いほど、活性が高い。下側のバンドは、内因性Akt活性を示している。Akt3のドメインをAkt2のものと交換し、キメラ構築物を含有する構築物を黒色腫細胞系WM35中にヌクレオフェクトした。ミリストイル化されたAkt3およびAkt2は、陽性対照の役割を果たした。失活したAkt3(T305A/S472A)およびAkt2(T309A/S474A)は、陰性対照の役割を果たした。野生型Akt3の移入により活性増加が起こったが、それとは対照的に、野生型Akt2では起こらなかった。Akt3のプレクストリン相同(PH)ドメイン(アミノ酸1〜110)をAkt2のものと交換した構築物を用いて、黒色腫細胞において活性化を引き起こすAkt3の領域を同定した。Akt3の触媒および調節(C/R)ドメイン(アミノ酸111〜497)を含有する構築物だけが活性化を引き起こしたことに注目されたい。これは、ヒト黒色腫におけるAkt3の活性化に重要なアミノ酸111〜497の領域に位置する。これは、黒色腫においてAkt3活性化を特異的に阻止する治療的標的化に重要な部位の1つである。方法：プレクストリン相同(PH)ドメイン(アミノ酸1〜110)および触媒ドメイン(Akt3では111〜479またはAkt2では111〜481)を交換することにより、HAタグ付き野生型構築物ならびにキメラ構築物PH-Akt3-C/R-Akt2およびPH-Akt2-C/R-Akt3を調製した。Amaxa NHEM-NEOヌクレオフェクター試薬を用いて構築物をWM35黒色腫細胞系中にヌクレオフェクトし、48時間後、Aktのser-473に対する抗体でプローブしてウェスタンブロット分析により分析した。
【図１Ａ】
2007530453.tif 000005
【図１Ｂ】
2007530453.tif 000006
【図１Ｃ】
2007530453.tif 000007
【図１Ｄ】
2007530453.tif 000008
【図２】
2007530453.tif 000009
【図３Ａ−Ｄ】
2007530453.tif 000010
【図４Ａ−Ｂ】
2007530453.tif 000011
【図４Ｃ】
2007530453.tif 000012
【図５】
2007530453.tif 000013
【図６】
2007530453.tif 000014
【図７】
2007530453.tif 000015
【図８】
2007530453.tif 000016
【図９】
2007530453.tif 000017
【図１０】
2007530453.tif 000018
【図１１】
2007530453.tif 000019
【図１２Ａ】
2007530453.tif 000020
【図１２Ｂ−Ｃ】
2007530453.tif 000021
【図１３Ａ−Ｂ】
2007530453.tif 000022
【図１３Ｃ−Ｄ】
2007530453.tif 000023
【図１４Ａ】
2007530453.tif 000024
【図１４Ｂ−Ｃ】
2007530453.tif 000025
【図１４Ｄ】
2007530453.tif 000026
【図１５Ａ−Ｂ】
2007530453.tif 000027
【図１５Ｃ−Ｄ】
2007530453.tif 000028
【図１６】
2007530453.tif 000029
【図１７Ａ−Ｂ】
2007530453.tif 000030
【図１７Ｃ−Ｄ】
2007530453.tif 000031
【図１８】
2007530453.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月25日(2007.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Akt3活性を低下させることを含む、黒色腫腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導方法。
【請求項２】
前記低下が、Akt3活性を低下させる薬剤に黒色腫腫瘍細胞を接触させることによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'、5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'、およびそれらの相補体の配列を有する群から選択されるポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記黒色腫腫瘍細胞の前記接触が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションの使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインまたは調節ドメインに対する偽基質として作用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、Akt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、
アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、天然のもしくは植物由来の産物、ホルモンおよびステロイド、ならびに白金製剤よりなる群から選択される化学療法剤を投与すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化学療法剤はダカルバジンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、放射線照射を行うことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アポトーシスを誘導するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；血管新生および細胞増殖を低減するのに有効な量の薬剤を黒色腫腫瘍に投与することと；を含む、哺乳動物における黒色腫腫瘍の治療方法。
【請求項１６】
アポトーシスを誘導する前記薬剤が、Akt3活性を低下させる薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血管新生および細胞増殖を低減する前記薬剤が、V599E B-Raf活性を低下させることにより黒色腫腫瘍を治療する薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Akt3活性を低下させる前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Akt3活性を低下させる前記薬剤が、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'、5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'、5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'、5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'、5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'、5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'、5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'、およびそれらの相補体の配列を有する群から選択されるポリヌクレオチドを含むsiRNA分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Akt3活性を低下させる前記薬剤が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションを用いることにより前記黒色腫腫瘍に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインまたは調節ドメインに対する偽基質として作用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドが、Akt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、天然のもしくは植物由来の産物、ホルモンおよびステロイド、ならびに白金製剤よりなる群から選択される化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、放射線照射を行うことをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
V599E B-Raf活性を低下させる前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
V599E B-Raf活性を低下させる前記薬剤が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションを用いることにより前記黒色腫腫瘍に導入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
V599E B-Raf活性を低下させる前記siRNA分子が、5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
B-Raf活性を低下させる前記siRNA分子が、5' GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3'の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
V599E B-Raf活性を低下させる前記薬剤がB-Raf阻害剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記B-Raf阻害剤がBAY 43-9006である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療が、Akt3活性を低下させる薬剤とV599E B-Raf活性を低下させる薬剤とを有効量で併行的または逐次的に投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３６】
Akt3活性を低下させる薬剤と；担体と；を含む、黒色腫腫瘍治療用の医薬組成物。
【請求項３７】
前記担体が、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ微粒子、カルシウムリンシリケートナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(Dアルギニン)、ナノデンドリマー、ウイルス、およびリン酸カルシウムヌクレオチド媒介ヌクレオチド送達よりなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子が5' CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GAAUUUACAGCUCAGACUA 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' CAGCUCAGACUAUUACAAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記低分子干渉RNA(siRNA)分子がポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'またはその相補体を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記薬剤が、Akt3に対する偽基質として作用するペプチドである、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインまたは調節ドメインに対する偽基質として作用する、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記薬剤が、Akt3に対する競合阻害剤として作用するペプチドである、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記ペプチドが、Akt3の触媒ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記ペプチドが、Akt3のプレクストリン相同ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ペプチドが、Akt3の調節ドメインに対する競合阻害剤として作用する、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記組成物が、B-Raf活性を低下させる薬剤をさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記薬剤が、siRNA分子、アンチセンス分子、アンタゴニスト、リボザイム、阻害剤、ペプチド、および小分子よりなる群から選択される、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記siRNA分子がポリヌクレオチド5' GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3'またはその相補体を含む、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記siRNA分子がポリヌクレオチド5' GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3'またはその相補体を含む、請求項５７に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
さらに他の実施形態では、Akt3ポリペプチドの阻害剤である薬剤によりAkt3活性を低下させる。これは、ドミナントネガティブAkt3ポリペプチド、たとえば、単独では活性を有していないが機能性Akt3と同一の細胞中に存在するときは機能性Akt3のAkt3活性を低下または除去する形のAkt3を提供することによる方法を含めて、いくつかの方法のいずれかにより達成可能である。さらに他の実施形態では、B-Rafポリペプチドの阻害剤である薬剤によりB-Raf活性を低下させる。好ましい実施形態では、B-Raf阻害剤はBAY 43-9006である。B-Rafの阻害剤としては、BAYERから市販されているBAY 43-9006または他の市販のB-Raf阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。B-Rafの阻害剤は、さらに、競合および非競合B-Raf阻害剤を包含しうる。競合B-Raf阻害剤とは、基質結合を互いに排除し合う形でB-Raf酵素に結合する分子のことである。典型的には、B-Rafの競合阻害剤は、活性部位に結合するであろう。非競合B-Raf阻害剤は、B-Rafの結合を阻害するものでありうるが、酵素へのその結合は、基質結合に関して互いに排他的ではない。本発明の考慮対象となるB-Raf阻害剤は、少なくとも同等の濃度で他の細胞活性になんら有意な影響を及ぼすことなく動物細胞においてB-Rafの活性を低下させる化合物である。しかしながら、この阻害は、ドミナントネガティブB-Rafポリペプチド、たとえば、単独では活性を有していないが機能性B-Rafと同一の細胞中に存在するときは機能性B-RafのB-Raf活性を低下または除去する形のAkt3を提供することによる方法を含めて、いくつかの方法のいずれかにより達成可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
黒色腫腫瘍進行時のAkt3の選択的関与を示す証拠を提供するために、Akt3およびAkt2の発現および活性を黒色腫腫瘍進行モデル(寛大にもDr. Meenhard Herlynにより提供された)で測定した(Herlyn, M., Molecular and cellular biology of melanoma: Austin: R.G. Landes Co. (1993); Hsu et al., In Human Cell Culture J.R.W.M.a.B. Palsson, editor. Great Britain: Kluwer Academic Publishers. 259-274 (1999))。この進行モデルでは、メラノサイトが、放射状増殖期(WM35およびWM3211)ならびに垂直増殖期(WM115、WM98.1、およびWM278)の原発性黒色腫腫瘍から樹立された低継代細胞系と比較される。メラノサイトと比較して、2つの放射状増殖期細胞系のうちの1つおよび3つすべての垂直増殖期細胞系がリン酸化Aktを増大させたことを図2Aは示しており、このことから、Akt活性は、放射状増殖期の原発性黒色腫発生の初期に増大したことが示唆される。次に、これらの細胞系において、Akt3アイソフォームの発現をウェスタンブロッティングにより調べ、Akt2発現と比較した(図2B)。メラノサイトに匹敵するWM98.1放射状増殖期細胞系を除くすべてにおいて、Akt3発現は増大されることが判明した。発現が必ずしも活性を反映するとは限らないので、Akt3またはAkt2を免疫沈降させてからウェスタンブロット分析を行って免疫沈降物中のリン酸化Aktのレベルを測定することにより、活性Akt3の量を調べた。メラノサイトと比較して、Akt3活性は、WM35放射状増殖期細胞系を除くすべてにおいて増大された(図2C)。WM98.1垂直増殖期細胞系におけるAkt3タンパク質発現は、メラノサイトで観測されたものに類似しているとはいえ、Akt3活性は有意により高かったことに留意されたい。Akt3の結果とは対照的に、Akt2発現は、メラノサイトと比較して放射状増殖期細胞系においてのみ増大された(図2B)。しかしながら、WM3211放射状増殖期細胞系だけは、Akt2活性の対応する増大を有していたが、メラノサイトと比較してAkt3活性をも増大させた。これらのデータから、Atk3が黒色腫腫瘍進行モデルにおいて活性である優位に関与するAktアイソフォームであったことが示唆される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
3つの独立したウェスタンブロットを用いて各サンプルにおける発現を定量し、次に、メラノサイトにおける発現と比較した。全体として、腫瘍の61%(19/31)は、Akt3タンパク質発現を増大させ、メラノサイトで観測された発現の約2〜9倍の範囲内の増加を示し、Akt2に対する10%(3/31)とは対照的である。これらの結果は、Akt3遺伝子を含有する染色体1q43-44の領域に関して文献に報告されているタイプのコピー数増加が黒色腫腫瘍において生じることと一致している(Bastian et al. Cancer Res 58:2170-2175; Thompson et al., Cancer Genet Cytogenet 83:93-104 (1995); and Mertens et al., Cancer Res 57:2765-2780 (1997))。原発部位黒色腫の約55%(6/11)および黒色腫転移の65%(13/20)は、Akt3発現を増大させした。これとは対照的に、メラノサイトに対して腫瘍におけるAkt2の発現を比較した場合、無視しうる変動が観測されたにすぎなかった。次に、Akt3またはAkt2のいずれかの免疫沈降物中のリン酸化Aktを定量することにより活性レベルを測定した。際立った点として、サンプルの62±0.02%(SE)でリン酸化(活性)Akt3が検出された。これとは対照的に、これらの腫瘍においてリン酸化Akt2は検出されなかった(陽性対照を除く)。さらに、腫瘍の約35%は、培養下で増殖されたメラノサイトと比較してAkt3活性を増大させた。これらのデータから、進行した段階の黒色腫患者に由来する腫瘍の>60%においてAkt3デレギュレーションの関与が確認されるので、発現の増大が黒色腫におけるAkt3活性のデレギュレーションに寄与する機序の1つであることが示唆される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
実施例8：黒色腫におけるAkt3デレギュレーションの根底をなす機序
以上の実験により、細胞培養物モデルにおいてin vitroでおよび患者腫瘍においてin vivoで優位に活性なアイソフォームとしてAkt3が同定された。したがって、我々は、次に、黒色腫においてAkt3活性のデレギュレーションを引き起こす機序を調べることに焦点をあてた。最初のUACC 903(PTEN)腫瘍形成モデルから黒色腫においてPTENがAkt活性をレギュレートする重要な役割を担っていることが示唆されたので、我々は、PTEN発現の減少が直接的かつ特異的にAkt3活性を増大させるかを調べた。この目的を達成するために、メラノサイトおよび放射状増殖期原発性黒色腫細胞(WM35)においてPTEN発現(活性)をsiRNAによりノックダウンし、リン酸化Aktのレベルに及ぼす影響を測定した。WM35細胞系を選択した。なぜなら、これらの細胞は、無視しうる基礎Akt3活性を有しかつPTENタンパク質を発現するからである(図1C参照)。予測されたように、PTENのsiRNA媒介ダウンレギュレーションは全リン酸化Aktの増大をもたらし(レーン4および11)、一方、スクランブルsiRNA対照は無視しうる有意でない効果を呈したことが(レーン2および9)、図4Aおよび図4Bから明らかである。Akt1(レーン5および12)、Akt2(レーン6および13)、またはAkt3(レーン7および14)に対するいずれかのsiRNAと一緒にPTENに対するsiRNAを共ヌクレオフェクトすることにより、PTENのダウンレギュレーションに続いて活性化される主要なAktアイソフォームを調べた。Akt3(レーン7および14)に対するsiRNAだけが、リン酸化Aktのレベルを非ヌクレオフェクト細胞(レーン1および8)またはスクランブルsiRNAのみをヌクレオフェクトした細胞(レーン2および9)で観測されたレベルに低下させた。これとは対照的に、Akt1またはAkt2タンパク質レベルの減少によりリン酸化Aktの量は減少しなかったので、このことからもAkt3デレギュレーションの選択性が証明される。したがって、PTENの減少により過剰発現を伴うことなくAkt3活性が増大されるので、PTENによるAkt3活性の選択的レギュレーションは、黒色腫においてAkt3を活性化させる重要な機序である。このため、PTENの減少は、順次、
細胞性PIP3(ホスファチジルイノシチド3,4,5-三リン酸)濃度の増大を引き起こすことが可能であり、黒色腫においてAkt3活性を特異的に増大させるのに有効であろう。この特異性の根底をなす機序は、現在知られていない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
黒色腫患者由来の腫瘍材料を利用した試験により、Akt3発現の増大はまた、黒色腫においてAkt3活性を増大させる重要な役割を担っている可能性もあることが示唆された。この可能性について調べるために、メラノサイトおよびPTENタンパク質を発現するWM35細胞(図示せず)において、Akt3を過剰発現させた。HAタグ付き野生型Akt3、キナーゼ活性失活型Akt3 T305A/S472A(不活性)、またはミリストイル化Akt3(活性)をメラノサイトにおいて過剰発現させた(図4C)。次に、24時間にわたり細胞から増殖因子を除去し、完全培地を補充し、次に、10分後に溶解物を採取した。Akt2に対する等価な構築物を対照として使用した(データは示されていない)。野生型Akt3およびミリストイル化Akt3の過剰発現は、ベクターのみまたはキナーゼ活性失活Akt3をヌクレオフェクトした細胞と比較して、リン酸化された全Aktのレベルの増加をもたらした。さらに、Akt3過剰発現と併用されたPTENのsiRNA媒介ノックダウンは、野生型Akt3発現単独と比較してより高レベルのリン酸化Aktをもたらした(データは示されていない)。したがって、単独のまたはPTEN減少と併用されたAkt3の過剰発現は、黒色腫におけるAkt3活性の増大に寄与するさらなる機序である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
実施例9：Akt3活性の増大はアポトーシスの低減により黒色腫腫瘍形成を促進する
Akt3活性のデレギュレーションが黒色腫腫瘍において常に観測されたので、後続の試験では、Akt3活性の増大が腫瘍形成を促進する機序を調べることに焦点をあてた。UACC 903(PTEN)由来細胞系腫瘍形成モデルを用いて、Akt3活性の増大がヌードマウスモデルにおいて黒色腫腫瘍形成を促進することを実証した。親UACC 903(-PTEN)細胞系、36A(+PTEN)細胞系、または36A復帰変異(-PTEN)細胞系に由来する100万個の細胞を4〜6週齢の雌ヌードマウスの皮下に注射し、10日後、形成された腫瘍のサイズを測定した。Akt3活性の低減された36A細胞は親UACC 903細胞およびAkt3活性の増大された復帰変異36A細胞と比較して非腫瘍形成性であった(P<0.5)。36A復帰変異細胞の腫瘍形成能は36A細胞と比較して有意に増大されたが、このモデルを作製するために使用された第10染色体上の第2の黒色腫サプレッサー遺伝子が保持されているため、腫瘍発生は、依然として遅れた状態であった(Robertson et al., Cancer Res 59:3596-3601 (1999))。これらの観測結果を確認し、黒色腫腫瘍形成へのAkt3関与の特異性を実証するために、我々は、siRNAを用いるUACC 903(Akt)モデルを作製した。UACC 903細胞におけるAkt3発現(活性)のsiRNA媒介減少により、腫瘍発生は、緩衝液のみ、スクランブルsiRNA、またはAkt2もしくはAkt1に対するsiRNAをヌクレオフェクトした細胞と比較して有意に遅延された(P<0.05)。したがって、Akt3に対するsiRNAを用いて特異的にAkt3活性を低下させることまたはPTEN発現を増大させることのいずれかによって、ヌードマウスにおける黒色腫腫瘍発生が阻害された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
アポトーシスの増大がAkt活性の低下に続くin vivoにおける腫瘍阻害の根底をなす主要な機序であることを確認するために(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))、Akt3活性の異なるUACC 903(PTEN)モデルとUACC 903(Akt)モデルとの両方でアポトーシスを調べた。非腫瘍形成性36A細胞系ならびに腫瘍形成性UACC 903細胞系および36A復帰変異細胞系をヌードマウスに皮下注射し、次に、それぞれの細胞型から併行して発生する時間的かつ空間的に対応する腫瘍塊を4日後に採取し、TUNELにより評価されるアポトーシスの大きさを比較した(Stahl et al., Cancer Res 63:2891-2897 (2003))。低Akt3活性を有する36A(+PTEN)腫瘍塊では、高Akt3活性を有する親UACC 903(-PTEN)細胞系または36A復帰変異(-PTEN)細胞系から生成された腫瘍よりも有意に多いアポトーシス細胞数が観測された(P<0.05)。Akt3発現(活性)を低下させるべくAkt3に対するsiRNAが使用されたUACC 903細胞において、類似の結果が観測された。緩衝液のみまたはAkt2に対するsiRNAをヌクレオフェクトした細胞は、Akt3に対するsiRNAで処理されたUACC 903細胞の約1/5〜1/7の数のアポトーシス細胞を有していた (P<0.05)。したがって、Akt3活性は、アポトーシスの度合を優先的にレギュレートすることにより、黒色腫細胞の生存を助長し腫瘍形成を促進することが、これらの結果から実証される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
実施例22：既存の腫瘍における変異V599EB-Rafを標的にすることによる黒色腫腫瘍発生の阻害
樹立された既存の黒色腫腫瘍において変異V599EB-Rafを標的にすることにより腫瘍発生を遅延させうるか、もし遅延されるとしたら、その機序が、腫瘍生成前の細胞においてV599EB-Rafを標的にしたときに存在する機序と同一であるかについては、現在のところ不明である。したがって、我々は、次に、既存の黒色腫腫瘍においてB-Rafを薬理学的に標的にすることにより類似の機序で腫瘍発生が阻害されるかを調べた。500万個のUACC 903細胞、100万個の1205 Lu細胞、または500万個のC8161細胞を、4〜6週齢の雌ヌードマウスに皮下注射した。6日目、媒体(DMSO)または媒体に溶解されたBAY 43-9006化合物(10、50、または100 mg/kg)を48時間ごとに腹腔内注射を介してマウスに投与した。48時間の薬剤投与間隔を選択したのは、、UACC 903、1205 Lu、およびC8161細胞におけるMAPキナーゼシグナリング経路に対する阻害作用が、少なくともその時間にわたり持続したからである(データは示されていない)。カリパスを用いて発生腫瘍のサイズを1日おきに測定した。その結果をUACC 903細胞については図15Aに、1205 Lu細胞については図15Bに示す。BAY 43-9006化合物のすべて濃度で、UACC 903腫瘍発生が遅延され、わずか濃度50mg/kgで処置開始の7日後に腫瘍発生がプラトー状態になった。10mg/kgのBAY 43-9006で処置されたマウスにおける腫瘍発生は、約1週間遅延されたが、UACC 903腫瘍は、徐々にサイズが増大し、27日目に腫瘍が>2,400mm3のサイズに達し、マウスを安楽死させなければならなかった。UACC 903細胞では、13日目まで腫瘍のサイズのわずかな増加を生じたが；薬剤処置の1週間後、腫瘍サイズは安定化し、13日目から31日目まで腫瘍サイズの統計学的に有意な増加はみられなかった(図15A)(分散分析; P>0.05)。50mg/kg BAY 43-9006で1205 Lu腫瘍を処置したときにもまた、同様に腫瘍発生が低減され、17日目から31日目まで腫瘍サイズがプラトー状態になった(図15B)(分散分析; P=0.12)。これに対して、BAY 43-9006は、C8161細胞においてpMekおよびpErkレベルを阻害したが、腫瘍生成の動態に差異は観測されなかった(データは示されていない)。したがって、変異V599EB-Raf活性の薬理学的阻害は、既存の黒色腫腫瘍において腫瘍発生を遅延させるが、腫瘍退縮を引き起こさない。これに対して、T1796A変異の欠如した黒色腫細胞におけるB-Rafの阻害は、腫瘍形成能を変化させないようには思われた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
実施例23：機序として、BAY 43-9006は、既存の黒色腫腫瘍の血管発生を阻害することにより、アポトーシスの増大を引き起こす
以上の実験から、変異V599EB-Raf活性の阻害と腫瘍発生の減少との間で一貫性のある関係が明らかにされたので；後続の試験では、これが既存の黒色腫腫瘍で起こる機序を特定することに焦点をあてた。これらの試験のために、既存の樹立腫瘍の増殖を遅延させる主要な事象を特定すべく、媒体またはBAY 43-9006のいずれかに暴露された時間的かつ空間的に対応するUACC 903腫瘍を血管発生率さらにはアポトーシス率および増殖率に関して分析した。9日目から始めて15日目で終了するように、対応する腫瘍を2日ごとに採取した。アポトーシス率、増殖率、および血管発生率を各時間点で比較した(図16)。媒体処置された腫瘍とBAY 43-9006処置された腫瘍との間で9日目において血管発生に関して統計学的有意差が観測された(図16A)(Studentのt検定; P<0.05)。これに対して、対照腫瘍とBAY 43-9006処置された腫瘍との間で9日目において増殖細胞の数(Studentのt検定; P=0.61)に関しても腫瘍塊中のアポトーシス面積(Studentのt検定; P=0.15)に関しても統計学的有意差は検出されなかった(図16Bおよび図16C)。しかしながら、11日目以降の分析ではいずれも、対照腫瘍と薬剤処置された腫瘍との間で統計学的有意差が観測された(Studentのt検定; P<0.05)。全体として、これらのデータから、BAY 43-9006処置された腫瘍で9日目に観測された血管発生の有意な減少は腫瘍増殖の遅延を引き起こす最初の事象であったことが示唆される。アポトーシスは、BAY 43-9006処置された腫瘍で11日目に顕在化した状態になり、15日目までに腫瘍面積の25%までを占有した(図16B)。20日目までに、腫瘍面積の約50%は、アポトーシスを起こしていた(データは示されていない)。BAY 43-9006はまた、既存の腫瘍の腫瘍細胞増殖に影響を及ぼし、増殖細胞のパーセントを32〜57%減少させた(図16C)。全体として、これらのデータから、血管発生の阻害は、既存の黒色腫腫瘍の増殖阻害を引き起こす主要な事象であるという結論が得られた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
【図１Ａ】図1は、悪性黒色腫へのAkt3の関与の同定を示す。図1A：黒色腫細胞系UACC 903におけるAkt活性はPTENによりレギュレートされる。リン酸化Akt、全Akt、PTEN、およびα-エノラーゼ(ローディングコントロール)の発現を示すウェスタンブロット分析。36A、29A、および37A細胞系は、PTENを欠如しているUACC 903親細胞系から作製された遺伝的関連細胞系である。36A細胞系から誘導された腫瘍形成性復帰変異細胞系は、同遺伝子型であると考えられ、PTEN発現のみが異なる。メラノサイトは、正常細胞に対する対照としての役割を果たす。グラフは、各細胞系における全Aktに対するリン酸化Aktのレベルを定量的に示すべく3つの独立したウェスタンブロットから得られたデンシトメトリースキャンを表している；バー、±SEM；統計、一元配置分散分析の後でメラノサイト対照に対するDunnetの多重比較、*P<0.5。
【図１Ｂ】図1B：Aktアイソフォームのそれぞれに対するsiRNAは、UACC 903細胞系において異所的に発現される各Aktアイソフォームのノックダウンの特異性を示す。タグ付きHA-Akt1、HA-Akt2、またはHA-Akt3を発現する構築物を、Akt1、Akt2、またはAkt3に特異的なsiRNAと一緒にUACC 903細胞中に共ヌクレオフェクトした。対照は、非ヌクレオフェクト細胞またはベクターのみをヌクレオフェクトした細胞であった。異所的に発現されたタンパク質を検出すべくHAに対する抗体を用いてウェスタンブロットをプローブし、さらにローディングコントロールの役割を果たすα-エノラーゼについてもプローブを行った。
【図１Ｃ】図1C：リン酸化Akt3は、UACC 903(PTEN)腫瘍形成性モデル中にPTENタンパク質が存在するときに低減される。Akt3およびAkt2をUACC 903(PTEN)腫瘍形成性モデルで細胞系から免疫沈降させ、リン酸化Aktを認識する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。PTENタンパク質が欠如しているUACC 903親細胞系から、PTENを発現する36A、29A、および37A細胞系を誘導した。2つの腫瘍形成性復帰変異細胞系を36A細胞系から誘導したが、これらは、もはやPTENを発現しない。Akt3およびAkt2に対する陽性対照および陰性対照と一緒に陰性抗原対照を示す。Akt3およびAkt2に対する対照は、それぞれ、未処理(陽性)であるかまたはP13Kの阻害剤LY-294002による処理(陰性)の施されたHEK 298T細胞またはLNCaP細胞であった。
【図１Ｄ】図1D：Akt1でもAkt2でもなくAkt3のsiRNA媒介ノックダウンが、黒色腫細胞系UACC 903、WM1 15、およびSK-MEL-24においてリン酸化Aktのレベル(活性)を改変する。各siRNAごとに50(左側)または100ピコモル(右側)を用いてヌクレオフェクションを行った後のリン酸化Akt1、Akt3、Akt2、およびα-エノラーゼの発現を示すウェスタンブロット分析。対照は、非ヌクレオフェクト細胞またはスクランブルsiRNAをヌクレオフェクトした細胞であった。データは、少なくとも2回の個別実験を代表するものである。これらの実験に対するローディングコントロールは、α-エノラーゼであった。
【図２】図2は、黒色腫腫瘍進行中に生じる増大されたAkt3の発現および活性を示す。A．リン酸化(活性)Aktのレベルの増大は、黒色腫腫瘍進行モデルにおいて放射状増殖期に生じる。メラノサイトにおけるリン酸化Aktの量と放射状増殖期(WM35およびWM3211)および垂直増殖期(WM115、WM98.1、およびWM278)の原発性腫瘍から樹立された低継代黒色腫細胞系におけるリン酸化Aktの量とのウェスタンブロット比較。全Aktを対照として示す。B．黒色腫腫瘍進行モデルにおけるAkt3発現とAkt2発現との比較。Akt3およびAkt2の発現レベルを示すウェスタンブロットをローディングコントロールとしてのα-エノラーゼと一緒に示す。C．Akt3は、Akt2と比較して黒色腫腫瘍進行モデルの細胞系において優先的に活性化される。Akt3またはAkt2を各細胞系から免疫沈降させ、そしてウェスタンブロット分析にかけて免疫沈降物中のリン酸化Aktの量を測定した。
【図３Ａ−Ｄ】図3は、一般的な母斑、異形成母斑、原発性母斑、および黒色腫患者の転移性母斑におけるp-Akt染色の相対強度ならびにAkt-発現と-強度を示す。
【図４Ａ−Ｂ】図4は、悪性黒色腫におけるAkt3活性のデレギュレーションの根底をなす機序を示す。A．メラノサイトおよび：B．放射状増殖期WM35(放射状増殖期)細胞において、PTEN発現(活性)を低減すると、Akt3活性が特異的に増大される。PTENのsiRNA媒介減少を、単独の場合(対照)、またはスクランブルsiRNAと併用した場合、またはAkt1、Akt2、もしくはAkt3に対するsiRNAと併用した場合について示す。ウェスタンブロット分析は、リン酸化Akt、Akt3、Akt2、およびPTENの発現を示している。α-エノラーゼは、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図４Ｃ】図4C:ヒトメラノサイトにおけるAkt3の過剰発現は、リン酸化Aktのレベルを増大させる。野生型Akt3、失活Akt3(不活性)、またはミリストイル化Akt3(活性)を、メラノサイト中にヌクレオフェクトした。Akt2に対する類似の構築物は、対照の役割を果たした(データは示されていない)。ウェスタンブロット分析によりAktリン酸化(活性)を測定してリン酸化Aktのレベルを求めた。矢印は、内因的に活性なAkt3の位置を示し、一方、矢印は、異所的に発現された活性なHAタグ付きAkt3を示している。
【図５】図5は、リポソームが単独で黒色腫細胞に対して無毒であることを実証するものである。種々の濃度でリポソームを添加剤したが、生細胞の数は減少しなかった。実際上、それらは、48時間ですべての濃度で細胞生存能力を増大させた。方法：6.25、12.5、25、および50μMの濃度でリポソームを添加した24、48、および72時間後、MTSアッセイを用いて1205 Luにおいてリポソームの毒性を評価した。
【図６】図6は、黒色腫細胞が容易にリポソームを取り込むことを実証するものである。方法：標識化リポソーム(緑色)を培養下で増殖するUACC 903黒色腫細胞に添加した。画像は、左側に細胞核(DAPIで対比染色した)および右側に標識化リポソームを取り込んだ細胞を示している。倍率、40倍。概算で、99%の細胞がリポソームを取り込む。
【図７】図7は、黒色腫細胞によるリポソーム取込みを定量化したものである。方法：標識化リポソームまたは標識化siRNAを含有するリポソームを培養下で増殖する細胞に20nmの濃度で添加した。1時間後、5%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、DAPIで対比染色し、標識化生成物を取り込んだ細胞の%を求めた。
【図８】図8は、リポソームのサイズ均一性およびサイズ分布を示したものである。方法：上：リポソームの均一なサイズを示す走査型電子顕微鏡写真。下：光散乱分析により決定されたリポソームのサイズ分布。グラフは、リポソームのサイズ範囲を示しており、平均サイズは70〜80nmである。
【図９】図9は、リポソームがsiRNAのプールを黒色腫細胞に送達することを示したものである。方法：赤色および緑色に標識化されたsiRNAを培養下で増殖する黒色腫細胞に添加した。取込みの1時間後、4%パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、DAPIで対比染色した。左側に、青色に染色された細胞核、続いて、赤色siRNAおよび緑色siRNAを示している。最後のカラムは、組合せ画像である(倍率40倍)。
【図１０】図10は、1205 Lu黒色腫細胞におけるタンパク質発現のStealth siRNAノックダウンの持続期間を示したものである。方法：Invitrogen製のStealth siRNAによるタンパク質ノックダウンの持続期間は、8日間を超えることが確認された。ヌクレオフェクションによりsiRNAを1205 Lu黒色腫細胞系に移入した。2日間隔で8日目までB-Rafタンパク質レベルのウェスタンブロット分析を行った。C-Rafに対するsiRNAは、対照としての役割を果たした。B-Raf発現の減少に加えて、シグナリング経路の下流のpErk 1'/2の活性もまた、8日間にわたり減少した。Erk-2は、タンパク質ローディングコントロールの役割を果たした。
【図１１】図11は、黒色腫細胞中へのsiRNAのリポソーム媒介送達の後のタンパク質発現のノックダウンを示したものである。変異B-Rafを標的にするsiRNAリポソーム複合体は、200nmでタンパク質発現の50%をノックダウンすることが可能である。これはベースラインを示しており；より高い濃度ではノックダウンが増大されるであろう。方法：siRNAリポソーム複合体を100または2oonMの濃度で細胞に添加した。溶解物を72時間後に捕集し、ウェスタンブロットにより分析した。
【図１２Ａ】図12Aは、黒色腫において変異V599EB-RafのsiRNA媒介減少が下流のMEKおよびERKの活性を低下させることを示す。B-RafおよびC-RafのsiRNA媒介ノックダウンは、黒色腫細胞系UACC 903において、ヌクレオフェクションの24時間後および48時間後、それぞれの対応するタンパク質のレベルを低下させる。スクランブルsiRNAを対照として使用し、lamin A/C siRNAをUACC 903細胞に対する追加の対照として使用した。B-Rafに対するsiRNAだけが、変異V599EB-Rafを含有するUACC 903細胞および1205 LU細胞において、B-Rafの下流の活性(リン酸化)MEKおよびERKのレベルを低下させた。ERK2をローディングコントロールとして使用する。
【図１２Ｂ−Ｃ】図12Bは、黒色腫において変異V599EB-RafのsiRNA媒介減少が下流のMEKおよびERKの活性を低下させることを示す。B-RafおよびC-RafのsiRNA媒介ノックダウンは、黒色腫細胞系1205 Lu(B)およびC8161(C)において、ヌクレオフェクションの24時間後および48時間後、それぞれの対応するタンパク質のレベルを低下させる。スクランブルsiRNAを対照として使用し、lamin A/C siRNAをUACC 903細胞に対するさらなる対照として使用した。B-Rafに対するsiRNAだけが、変異V599EB-Rafを含有するUACC 903細胞および1205 LU細胞において、B-Rafの下流の活性(リン酸化)MEKおよびERKのレベルを低下させた。ERK2をローディングコントロールとして使用する。
【図１３Ａ−Ｂ】図13は、黒色腫腫瘍発生がC-RAFに対するsiRNAでもなくスクランブルsiRNAでもなくV599EB-Rafに対するsiRNAより抑制されたことを示す。B-Rafタンパク質のsiRNA媒介ノックダウンは、培養下で増殖するUACC 903(A)細胞系および1205 Lu(B)細胞系において、ヌクレオフェクション後の6〜8日間にわたり持続する。対応する減少は、リン酸化ERK1/ERK2レベルで観測された(B)。ERK2は、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図１３Ｃ−Ｄ】B-RafのsiRNA媒介減少は、UACC 903(C)細胞および1205 Lu(D)細胞の腫瘍形成能の低下を引き起こした。B-Raf、C-Rafに対するsiRNAおよびスクランブルsiRNAをUAC 903細胞または1205 Lu細胞に導入し(白色の矢印)、36時間後、細胞をヌードマウスに注射した(黒色の矢印)。腫瘍のサイズを2日間隔で測定した。B-RafのsiRNA媒介ダウンレギュレーションは、UACC 903および1205 Lu黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させた。緩衝液のみ、スクランブルsiRNA、またはC-Rafに対するsiRNAを対照細胞にヌクレオフェクトした。値は、2回の個別実験による6匹のマウスの少なくとも12ヶ所の注射部位の平均である。バー±SE。
【図１４Ａ】図14は、BAY 43-9006を用いてB-Raf活性を薬理学的に阻害すると黒色腫腫瘍発生が抑制されることを示している。図14A：BAY 43-9006は、野生型V599EB-Raf活性および変異V599EB-Raf活性の両方を阻害する。HAタグ付きの野生型V599EB-Rafまたは変異V599EB-Rafを、5μmol/L BAY 43-9006またはDMSO媒体に暴露されたHEK 293T細胞で発現させた。HAは、異所的に発現されたB-Rafタンパク質を示す。MAPK経路の活性化または阻害は、pMEKおよびpERKの含有レベルにより決定され、ERK2は、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図１４Ｂ−Ｃ】図14B：BAY 43-9006は、変異V599EB-Rafを含有するUACC 903黒色腫細胞において、用量に応じてpMEKおよびpERK (活性)のレベルを低減する。BAY 43-9006の濃度の増加に伴うUACC 903細胞における低減されたpMEKおよびPERKレベルのウェスタンブロット分析。ローディングコントロールは、ERK2であった。 図14C：BAY 43-9006を用いてマウスの前処置を行うと黒色腫腫瘍の発生が抑制される。5×108個のUACC 903細胞の注射の4日前、50mg/kg BAY 43-9006またはDMSO媒体を用いてマウスの腹腔内を2回前処置し、それを2日間ごとに繰り返した(矢印)。2日間隔で22日目までの腫瘍サイズを示す。バー、±SE。
【図１４Ｄ】図14D：黒色腫腫瘍発生のsiRNA媒介阻害に伴って腫瘍細胞増殖が低減される。B-RafのsiRNA媒介阻害の後、ブロモデオキシウリジン陽性細胞が1/5〜1/8に減少するが、C-RafやスクランブルsiRNAでは減少しない。*.P<0.05。カラム、腫瘍1つあたり4〜6視野を計数して6つの個別の腫瘍から得た平均；バー、±SE。
【図１５Ａ−Ｂ】図15は、BAY 43-9006を用いてB-Raf活性を阻害すると黒色腫腫瘍発生が抑制されることを示している。UACC 903(A)および1205 Lu(B)腫瘍発生に及ぼすBAY 43-9006処置の効果を示す。UACC 903細胞および1205 Lu細胞をヌードマウスに注射し、6日目まで腫瘍発生を行い、その時点から2日ごとに、DMSOに溶解されたBAY 43-9006をマウスの腹腔内に注射した(矢印)。対照条件は、DMSO処置のみであった。Rafキナーゼ阻害剤BAY 43-9006は、濃度≧50mg/kgにおいて、変異V599EB-Rafタンパク質を含有する黒色腫細胞の腫瘍形成能を低下させる。
【図１５Ｃ−Ｄ】図15 C:BAY 43-9006による処置の後、それらの細胞でリン酸化(活性)ERKの量の減少が観測されたが、媒体処置では観測されなかった。図15 D:50mg/kg BAY 43-9006(DMSO中)またはDMSO媒体単独で処置されたUACC 903腫瘍切片におけるpERK陽性細胞の数の免疫組織化学的比較。対照媒体およびBAY 43-9006で処置された細胞間で3倍の差異が検出された。*.P<0.05。カラム、腫瘍1つあたり4〜6視野を計数して6つの個別の腫瘍から得た平均；バー、±SE。
【図１６】図16は、黒色腫腫瘍における変異V599EB-Rafの薬理学的阻害またはsiRNA媒介阻害の後の黒色腫腫瘍発生の抑制の根底をなす機序を示している。BAY 43-9006または媒体(DMSO)に暴露された時間的かつ空間的に対応する腫瘍における血管発生率(A)、アポトーシス率(B)、および増殖率(C)の比較。併行して発生するサイズおよび時間の対応した腫瘍を比較して、腫瘍発生に及ぼすB-Raf阻害の効果を同定した。血管発生の差は、BAY 43-9006を用いてUACC 903腫瘍を処置した後で観測された最初の統計学的に有意な差(*、P<0.05)であり、続いて、増大されたアポトーシス(*、P<0.05)および低減された細胞増殖(*；P<0.05)が有意な差として観測された。カラム、実験1回あたり6つの腫瘍のそれぞれから4〜6視野を分析して2回の個別実験から得た平均；バー、±SE。
【図１７Ａ−Ｂ】図17は、V599EB-RafのsiRNA阻害および薬理学的阻害が黒色腫細胞からのVEGF分泌を低減することを示している。B-Raf siRNAもしくはVEGF siRNAのいずれかを用いてヌクレオフェクションを行った後(A)または漸増濃度のBAY 43-9006を用いて処理した後(B)、培養下で増殖するUACC 903細胞または1205 Lu細胞からのVEGF分泌をELISAアッセイにより測定した。C-RafおよびスクランブルsiRNAは、対照の役割を果たした。バー、±SD。
【図１７Ｃ−Ｄ】UACC 903(C)および1205 Lu(D)腫瘍発生に及ぼすVEGF発現減少の効果を示す。2日間隔で17.5日目までの腫瘍サイズを示す。VEGF発現の減少は、V599EB-Raf発現の減少の後でみられるのと同じように黒色腫腫瘍発生を抑制する。点、6つの個別の腫瘍から得た平均；バー、±SE。
【図１８】図18は、黒色腫において優先的活性化を引き起こすAkt3の領域を示している。活性化は、リン酸化のレベルとして測定され；バンドが暗いほど、活性が高い。下側のバンドは、内因性Akt活性を示している。Akt3のドメインをAkt2のものと交換し、キメラ構築物を含有する構築物を黒色腫細胞系WM35中にヌクレオフェクトした。ミリストイル化されたAkt3およびAkt2は、陽性対照の役割を果たした。失活したAkt3(T305A/S472A)およびAkt2(T309A/S474A)は、陰性対照の役割を果たした。野生型Akt3の移入により活性増加が起こったが、それとは対照的に、野生型Akt2では起こらなかった。Akt3のプレクストリン相同(PH)ドメイン(アミノ酸1〜110)をAkt2のものと交換した構築物を用いて、黒色腫細胞において活性化を引き起こすAkt3の領域を同定した。Akt3の触媒および調節(C/R)ドメイン(アミノ酸111〜497)を含有する構築物だけが活性化を引き起こしたことに注目されたい。これは、ヒト黒色腫におけるAkt3の活性化に重要なアミノ酸111〜497の領域に位置する。これは、黒色腫においてAkt3活性化を特異的に阻止する治療的標的化に重要な部位の1つである。方法：プレクストリン相同(PH)ドメイン(アミノ酸1〜110)および触媒ドメイン(Akt3では111〜479またはAkt2では111〜481)を交換することにより、HAタグ付き野生型構築物ならびにキメラ構築物PH-Akt3-C/R-Akt2およびPH-Akt2-C/R-Akt3を調製した。Amaxa NHEM-NEOヌクレオフェクター試薬を用いて構築物をWM35黒色腫細胞系中にヌクレオフェクトし、48時間後、Aktのser-473に対する抗体でプローブしてウェスタンブロット分析により分析した。