(57)【要約】  希釈されたまたは不均一な被験試料（体液、排泄物または組織など）中の核酸およびタンパク質などの標的分子の分離、単離、富化または検出のための改善された方法を開示する。この方法は、少なくとも１つの領域が標的分子の結合パートナーを含む導管の少なくとも１つの領域に試料を繰り返し高速で通過させることを含む。特定の方法では、少なくとも１つの他の領域が非標的分子に特異的な結合パートナーを含む。試料は、導管がループである場合、同じ方向に結合パートナー上を通過させ得、または逆平行に（すなわち、結合パートナー上を往復）通過させ得る。一態様において、少なくも１つの領域が標的分子の結合パートナーを含む電気泳動メディウム中またはその上部で試料を電気泳動させ得る。本発明はまた、この方法に適合する装置および試料調製システムを提供する。
2007512509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  被験試料を、第１の空間的範囲内に連続的に配列された少なくとも２つの領域を有する電気泳動メディウムの少なくとも一部分に導入する工程、ここで、前記領域の１つは、該領域内に固定された第１の結合パートナーを含有し、第１の結合パートナーは、標的分子に対する選択的結合親和性を有するが、非標的分子に対する選択的結合親和性は有しない；
（ｂ）  電気泳動メディウムを該第１の範囲に平行な第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
（ｃ）  電気泳動メディウムを第１の方向と反対の第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含み、
それにより、標的分子が第１の結合パートナーに選択的に結合され、被験試料中の非標的分子から分離される、
希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的分子から標的分子を分離するための方法。
【請求項２】
再度、電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
電気泳動メディウムを少なくとも１回のさらなる電気泳動のサイクルに供する工程、ここで、各サイクルは、
電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
電気泳動メディウムを第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含む、
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
電気泳動メディウムが、第１の空間的範囲に実質的に垂直な第２の空間的範囲内に、前記少なくとも２つの領域の少なくとも１つと隣接した少なくとも第３の領域をさらに含み、
電気泳動メディウムを第２の空間的範囲に平行な第３の方向の電界に供し、第２の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第３の領域が、試料中の少なくともいくつかの分子に対する選択的結合親和性を有する結合パートナーを含有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ａ）  被験試料を、第１の空間的範囲内に連続的に配列された少なくとも２つの領域を有する電気泳動メディウムの少なくとも一部分に導入する工程、ここで、
（ｉ）  第１の領域が、該領域内に固定された第１の結合パートナーを含有し、第１の結合パートナーは、標的分子に対する選択的結合親和性を有するが、非標的分子に対する選択的結合親和性は有しない；および
（ii）第２の領域が、該領域内に固定された第２の結合パートナーを含有し、該第２の結合パートナーは、少なくともいくつかの非標的分子に対する選択的結合親和性を有するが、標的分子に対する選択的結合親和性は有しない；
（ｂ）  電気泳動メディウムを該第１の範囲に平行な第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
（ｃ）  電気泳動メディウムを第１の方向と反対の第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含み、
それにより、標的分子が第１の結合パートナーに選択的に結合され、被験試料中の非標的分子から分離される、
希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的分子から標的分子を分離するための方法。
【請求項７】
再度、電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
電気泳動メディウムを少なくとも１回のさらなる電気泳動のサイクルに供する工程、ここで、各サイクルは、
電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
電気泳動メディウムを第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含む、
をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】
電気泳動メディウムが、第１の空間的範囲に実質的に垂直な第２の空間的範囲内に、前記少なくとも２つの領域の少なくとも１つと隣接した少なくとも第３の領域をさらに含み、
電気泳動メディウムを第２の空間的範囲に平行な第３の方向の電界に供し、第２の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
第３の領域が、試料中の少なくともいくつかの分子に対する選択的結合親和性を有する第３の結合パートナーを含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）  請求項１記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を分離する工程；および
（ｂ）  電気泳動メディウムを処理して、以下の少なくとも１種類：
（ｉ）  標的分子、または
（ii）  標的特異的結合パートナーに結合した標的分子
を放出させることにより標的分子を放出させる工程；および
工程（ｂ）で放出させた分子を電気泳動メディウムから溶出して標的分子を単離する工程
を含む、希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的分子から標的分子を単離する方法。
【請求項１２】
（ａ）  請求項１記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を分離する工程；および
（ｂ）  電気泳動メディウムを処理して、以下の少なくとも１種類：
（ｉ）  標的分子、または
（ii）  標的特異的結合パートナーに結合した標的分子
を放出させることにより標的分子を放出させる工程；および
工程（ｂ）で放出させた分子を電気泳動メディウムから溶出して標的分子が富化された試料を提供する工程
を含む、希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的分子に対して標的分子を富化させる方法。
【請求項１３】
（ａ）  請求項１記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を分離する工程；および
（ｂ）  標的分子に特異的な親和性プローブの結合、標的分子と標的特異的結合パートナーとの間で形成される複合体に特異的な親和性プローブの結合、および標的分子による標的特異的結合パートナーからの検出可能なリガンドの置換からなる群より選択される方法により標的分子を検出する工程
を含む、非標的分子を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的分子を検出する方法。
【請求項１４】
（ａ）  請求項１記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を単離する工程；および
（ｂ）  標的分子に特異的な親和性プローブの結合、標的分子と標的特異的結合パートナーとの間で形成される複合体に特異的な親和性プローブの結合、および標的分子による標的特異的結合パートナーからの検出可能なリガンドの置換からなる群より選択される方法により標的分子を検出する工程
を含む、非標的分子を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的分子を検出する方法。
【請求項１５】
（ａ）  請求項１記載の方法により被験試料中の非標的分子に対する標的分子について該試料を富化させる工程；および
（ｂ）  標的分子に特異的な親和性プローブの結合、標的分子と標的特異的結合パートナーとの間で形成される複合体に特異的な親和性プローブの結合、および標的分子による標的特異的結合パートナーからの検出可能なリガンドの置換からなる群より選択される方法により標的分子を検出する工程
を含む、非標的分子を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的分子を検出する方法。
【請求項１６】
（ａ）  被験試料を、第１の空間的範囲内に連続的に配列された少なくとも３つの領域を有する電気泳動メディウムの少なくとも一部分に導入する工程  、ここで：
（ｉ）  第１の領域は該第１の領域内に固定された第１の結合パートナーを含有し、第１の結合パートナーは、少なくともいくつかの非標的核酸に対する選択的結合親和性を有するが、標的核酸に対する選択的結合親和性は有しない；
（ii）  第２の領域は該第２の領域内に固定された第２の結合パートナーを含有し、第２の結合パートナーは、標的核酸に対する選択的結合親和性を有するが、非標的核酸に対する選択的結合親和性は有しない；および
（iii）  第３の領域は該第３の領域内に固定された第３の結合パートナーを含有し、第３の結合パートナーは、少なくともいくつかの非標的核酸に対する選択的結合親和性を有するが、標的核酸に対する選択的結合親和性は有しない；
（ｂ）  電気泳動メディウムを該第１の範囲に平行な第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
（ｃ）  電気泳動メディウムを第１の方向と反対の第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；
を含み、
それにより、標的核酸は、第２の領域内の第２の結合パートナーに選択的に結合され、被験試料中の非標的核酸から分離される、
体液、排泄物または組織から得られる希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的核酸から標的核酸を分離する方法。
【請求項１７】
再度、電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
電気泳動メディウムを少なくとも１回のさらなる電気泳動のサイクルに供する工程、ここで、各サイクルは、
電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
電気泳動メディウムを第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含む、
をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）  請求項１６記載の方法により被験試料中の非標的核酸から標的核酸を分離する工程；および
（ｂ）  電気泳動メディウムを処理して、以下の少なくとも１種類：
（ｉ）  標的核酸、または
（ii）  標的特異的結合パートナーに結合した標的核酸
を放出させることにより標的核酸を放出させる工程；および
工程（ｂ）で放出させた分子を電気泳動メディウムから溶出して標的核酸を単離する工程
を含む、体液、排泄物または組織から得られる希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的核酸から標的核酸を単離する方法。
【請求項２０】
（ａ）  請求項１６記載の方法により被験試料中の非標的核酸から標的核酸を分離する工程；および
（ｂ）  電気泳動メディウムを処理して、以下の少なくとも１種類：
（ｉ）  標的核酸、または
（ii）  標的特異的結合パートナーに結合した標的核酸
を放出させることにより標的核酸を放出させる工程；および
工程（ｂ）で放出させた分子を電気泳動メディウムから溶出して標的核酸が富化された試料を提供する工程
を含む、体液、排泄物または組織から得られる希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的核酸に対して標的核酸を富化させる方法。
【請求項２１】
（ａ）  請求項１６記載の方法により被験試料中の非標的核酸から標的核酸を分離する工程；および
（ｂ）  標的核酸に特異的なポリヌクレオチドプローブの結合、および標的核酸による標的特異的結合パートナーにハイブリダイズした検出可能なポリヌクレオチドの置換からなる群より選択される方法により電気泳動メディウム中の標的核酸を検出する工程
を含む、体液、排泄物または組織から得られ、かつ非標的核酸を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的核酸を検出する方法。
【請求項２２】
（ａ）  請求項１９記載の方法により被験試料中の非標的核酸から標的核酸を単離する工程；および
（ｂ）  標的核酸に特異的なポリヌクレオチドの結合、および標的核酸による標的特異的結合パートナーにハイブリダイズした検出可能なポリヌクレオチドの置換からなる群より選択される方法により電気泳動メディウム中の標的核酸を検出する工程
を含む、体液、排泄物または組織から得られ、かつ非標的核酸を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的核酸を検出する方法。
【請求項２３】
（ａ）  請求項２０記載の方法により被験試料中の非標的核酸に対する標的核酸について該試料を富化させる工程；および
（ｂ）  標的核酸に特異的なポリヌクレオチドプローブの結合、および標的核酸による標的特異的結合パートナーにハイブリダイズした検出可能なポリヌクレオチドの置換からなる群より選択される方法により電気泳動メディウム中の標的核酸を検出する工程
を含む、体液、排泄物または組織から得られ、かつ非標的核酸を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的核酸を検出する方法。
【請求項２４】
（ａ）  被験試料を、第１の空間的範囲内に連続的に配列された少なくとも３つの領域を有する電気泳動メディウムの少なくとも一部分に導入する工程、ここで：
（ｉ）  第１の領域は該第１の領域内に固定された第１の結合パートナーを含有し、第１の結合パートナーは、少なくともいくつかの非標的分子に対する選択的結合親和性を有するが、標的分子に対する選択的結合親和性は有しない；
（ii）  第２の領域は該第２の領域内に固定された第２の結合パートナーを含有し、第２の結合パートナーは、標的分子に対する選択的結合親和性を有するが、非標的分子に対する選択的結合親和性は有しない；および
（iii）  第３の領域は該第３の領域内に固定された第３の結合パートナーを含有し、第３の結合パートナーは、少なくともいくつかの非標的分子に対する選択的結合親和性を有するが、標的分子に対する選択的結合親和性は有しない；
（ｂ）  電気泳動メディウムを該第１の範囲に平行な第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
（ｃ）  電気泳動メディウムを第１の方向と反対の第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含み、
それにより、標的分子が第２の領域内の第２の結合パートナーに選択的に結合され、被験試料中の非標的分子から分離される、
希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的分子から標的分子を分離するための方法。
【請求項２５】
再度、電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
電気泳動メディウムを少なくとも１回のさらなる電気泳動のサイクルに供する工程、ここで、各サイクルは、
電気泳動メディウムを第１の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程；および
電気泳動メディウムを第２の方向の電界に供し、第１の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
を含む、
をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）  請求項２４記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を分離する工程；および
（ｂ）  電気泳動メディウムを処理して、以下の少なくとも１種類：
（ｉ）  標的分子、または
（ii）  標的特異的結合パートナーに結合した標的分子
を放出させることにより標的分子を放出させる工程；および
工程（ｂ）で放出させた分子を電気泳動メディウムから溶出して該分子を単離する工程
を含む、希釈されたまたは不均一な被験試料中の非標的分子から標的分子を単離する方法。
【請求項２８】
（ａ）  請求項２４記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を分離する工程；および
（ｂ）  電気泳動メディウムを処理して、以下の少なくとも１種類：
（ｉ）  標的分子、または
（ii）  標的特異的結合パートナーに結合した標的分子
を放出させることにより標的分子を放出させる工程；および
工程（ｂ）で放出させた分子を電気泳動メディウムから溶出して標的分子が富化された試料を提供する工程
を含む、非標的分子に対する標的分子について希釈されたまたは不均一な被験試料を富化させる方法。
【請求項２９】
（ａ）  請求項２４記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を分離する工程；および
（ｂ）  標的分子に特異的な親和性プローブの結合、標的分子と標的特異的結合パートナーとの間で形成される複合体に特異的な親和性プローブの結合、および標的分子による標的特異的結合パートナーからの検出可能なリガンドの置換からなる群より選択される方法により電気泳動メディウム中の標的分子を検出する工程
を含む、非標的分子を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的分子を検出する方法。
【請求項３０】
（ａ）  請求項２７記載の方法により被験試料中の非標的分子から標的分子を単離する工程；および
（ｂ）  標的分子に特異的な親和性プローブの結合、標的分子と標的特異的結合パートナーとの間で形成される複合体に特異的な親和性プローブの結合、および標的分子による標的特異的結合パートナーからの検出可能なリガンドの置換からなる群より選択される方法により電気泳動メディウム中の標的分子を検出する工程
を含む、非標的分子を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的分子を検出する方法。
【請求項３１】
（ａ）  請求項２８記載の方法により被験試料中の非標的分子に対する標的分子について該試料を富化させる工程；および
（ｂ）  標的分子に特異的な親和性プローブの結合、標的分子と標的特異的結合パートナーとの間で形成される複合体に特異的な親和性プローブの結合、および標的分子による標的特異的結合パートナーからの検出可能なリガンドの置換からなる群より選択される方法により電気泳動メディウム中の標的分子を検出する工程
を含む、非標的分子を含有する希釈されたまたは不均一な被験試料中の標的分子を検出する方法。
【請求項３２】
電気泳動メディウムが、該第１の範囲に実質的に垂直な第２の空間的範囲内に、前記第１、第２および第３の領域の少なくとも１つと隣接した第４の領域をさらに含み、
電気泳動メディウムを第２の空間的範囲に平行な第３の方向の電界に供し、第２の空間的範囲の該領域内において被験試料中の荷電分子の電気泳動メディウム内での移動をもたらす工程
をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
第４の領域が、試料中の少なくともいくつかの分子に対する選択的結合親和性を有する第４の結合パートナーを含有する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）  電気泳動メディウムを収納するための非伝道性ハウジング；
（ｂ）  電極によって画定される空間的範囲内のメディウムに沿って電界を負荷するための前記ハウジング内に配置される少なくとも１対の電極；および
（ｃ）  電気泳動メディウムの端部に近づきながら試料前面を検出する検出器
を含む、反復的逆転場電気泳動のための装置。
【請求項３５】
（ｄ）  検出器が試料前面を検出した後に電界を逆転させる手段
をさらに含む、請求項３４記載の反復的逆転場電気泳動のための装置。
【請求項３６】
（ａ）  電気泳動メディウムを収納するための非伝道性ハウジング；
（ｂ）  電極によって画定される空間的範囲内のメディウムに沿って電界を負荷するための前記ハウジング内に配置される少なくとも１対の電極；および
（ｃ）  電界逆転電気泳動のサイクル数を追跡するための計測器
を含む、反復的逆転場電気泳動のための装置。
【請求項３７】
（ｄ）  所定のサイクル数が達成されたときシグナルを伝達する手段、または所定のサイクル数が達成されたとき反復的逆転場電気泳動を終結させる手段をさらに含む、請求項３６記載の反復的逆転場電気泳動のための装置。
【請求項３８】
（ａ）  電気泳動メディウムを収納するための非伝道性ハウジング；
（ｂ）  電極によって画定される空間的範囲内のメディウムに沿って電界を負荷するための前記ハウジング内に配置される少なくとも１対の電極；および
（ｃ）  電気泳動メディウムの隣接する領域を隔離するための、ハウジング内に配置される少なくとも１つのセパレータ
を含む、反復的逆転場電気泳動のための装置。
【請求項３９】
（ａ）  電気泳動メディウムを収納するための非伝道性ハウジング；
（ｂ）  電極によって画定される空間的範囲内のメディウムに沿って電界を負荷するための前記ハウジング内に配置される少なくとも１対の電極；および
（ｃ）  少なくとも２つの領域を含む電気泳動メディウム、
ここで、該領域の少なくも１つは、標的分子に対する選択的結合親和性を有する結合パートナーを含有する、
を含む、反復的逆転場電気泳動のためのシステム。
【請求項４０】
該領域の少なくも１つが、非標的分子に対する選択的結合親和性を有する結合パートナーを含有する、請求項３９記載の反復的逆転場電気泳動のためのシステム。
【請求項４１】
電気泳動メディウムが少なくとも３つの領域を含み、ここで、該領域の各々が、該領域内に固定され、かつ直接隣接する各領域内の結合パートナーとは異なる結合パートナーを含む、請求項３９記載のシステム。
【請求項４２】
少なくとも２つの隣接しない領域が、同一の結合パートナーを有する、請求項４１記載のシステム。
【請求項４３】
（ｄ）  電気泳動メディウムの端部に近づきながら試料前面を検出する検出器
をさらに含む、請求項３９記載のシステム。
【請求項４４】
（ｅ）  検出器が試料前面を検出した後に電界を逆転させる手段
をさらに含む、請求項４３記載の反復的逆転場電気泳動のためのシステム。
【請求項４５】
（ｄ）  電界逆転電気泳動のサイクル数を追跡するための計測器
をさらに含む、請求項３９記載のシステム。
【請求項４６】
（ｅ）  所定のサイクル数が達成されたときシグナルを伝達する手段、または所定のサイクル数が達成されたとき反復的逆転場電気泳動を終結させる手段をさらに含む、請求項４５記載の反復的逆転場電気泳動のためのシステム。
【請求項４７】
（ｄ）  電気泳動メディウムの隣接する領域間に少なくとも１つのセパレータ
をさらに含む、請求項３９記載のシステム。
【請求項４８】
電気泳動メディウムの該領域の少なくも１つが、充填容積のビーズを含有する、請求項４７記載のシステム。
【請求項４９】
電気泳動メディウムの該領域の少なくも１つが、アクリルアミドポリマー、アガロースポリマー、デンプンポリマー、デキストランポリマー、セルロースポリマーおよびその複合材料からなる群より選択される材料を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項５０】
電気泳動メディウムの該領域の少なくも１つが、充填容積のビーズを含有し、ここで、ビーズは、アガロースポリマー、デキストランポリマー、アクリル系ポリマー、ガラス、ラテックスおよびポリスチレンからなる群より選択される材料を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項５１】
電気泳動メディウムの該第１の領域が、電気泳動メディウムの該第２の領域とは異なるポリマー系材料を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの結合パートナーが、標的特異的ポリヌクレオチドおよび標的特異的タンパク質からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５３】
結合パートナーが、DNA分子、RNA分子およびポリヌクレオチドアナログからなる群より選択される標的特異的ポリヌクレオチドである、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
結合パートナーが、ヒトヌクレオチド配列、ヒト病原体ヌクレオチド配列およびヒト腸内微生物叢ヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む標的特異的ポリヌクレオチドである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
結合パートナーが標的特異的アプタマーである、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
結合パートナーが、抗体、抗体断片、結合ドメイン、リガンドおよびそのアナログからなる群より選択される標的特異的タンパク質である、請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
前記被験試料が、糞便、尿、血液、血漿、精液、唾液、痰、汗、涙、羊水、房水、硝子体液、脳脊髄液、および生検材料由来の組織からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、試料、例えば、希少な、または希釈された標的分子からの標的分子の分離、単離、富化または検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
試料中の標的分子を分離、単離、富化、および検出するための種々の手法が開発されている。これらの手法としては、クロマトグラフィー (例えば、ペーパー、液体（高速液体相(HPLC)など)；電気泳動(例えば、キャピラリーおよびスラブ電気泳動（アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、アフィニティー電気泳動)；アフィニティー精製 (例えば、イムノアフィニティーカラム)；核酸ハイブリダイゼーション(例えば、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション、核酸アレイ)；ならびに抗体系の方法(例えば、ウエスタンハイブリダイゼーション、抗体アレイ) が挙げられる。
【０００３】
ゲル電気泳動は、荷電分子、特に巨大分子（例えば、タンパク質または核酸など）の分離、精製および特性付けのための最もよく知られた方法の１つである(Freifelder, 編, Physical Biochemistry, 第2版, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1982), pp.276-3 10)。電気泳動による分離では、荷電分子は、電界の影響下にある支持メディウム中を移動する。支持メディウムは、運搬(convection)および拡散を抑制する作用をし、場合によっては、篩として作用する。電気泳動は、分子を、大きさ、電荷、コンホメーションまたはこれらの性質の組合せに基づいて分離するために使用され得る。
【０００４】
最も頻繁には、電気泳動は、ゲルメディウムの両端に配置される２つの固定された電極間に一定電圧（これは、定まった方向の一定の線形電圧勾配を生じる）を用いて行なわれる。しかしながら、非常に大きなDNA 分子(すなわち、30〜2000 kb)の場合では、ポリマー鎖は、電界方向に指向され(orients with)、ゲル中を蛇行し、電気泳動メディウムの篩作用を無効にする。大きなDNA 分子を分離するため、電界方向を周期的に逆転させる「フィールドインバージョン(field inversion)」電気泳動(例えば、Caneら (1986), Science 232: 65-68を参照)、および電界を周期的に斜角で再配向する「パルスフィールド(pulsed field)」電気泳動(例えば、Schwartzら (1984), Cell 37: 67)が開発されている。電界を交互にしたり、変化させることを含む他のアプローチとしては、十字変換電場(transverse alternating field)電気泳動(TAFE)およびコンター・クランプ均一電場(contour-clamped homogeneous electric field)(CHEF)電気泳動(例えば、Gardinerら (1986), Somatic Cell Molec. Genet. 12: 185-195.；Chuら (1986), Science 234: 1582-1585；米国特許第5,549,796号を参照のこと)が挙げられる。
【０００５】
アフィニティー電気泳動では、支持メディウム(例えば、ゲル)は、１種類以上の所望の標的分子と特異的または非特異的に相互作用し、電気泳動での移動中に標的分子を非標的分子から分離するのを補助する結合パートナーを含む。例えば、アフィニティー電気泳動は、タンパク質の結合親和性を測定するために使用されている（Horcjsiら (1974), Biochim. Biophys. Ada 336: 338-343 ；Chuら (1992), .J〜 Med. Chem. 35: 2915-2917)。また、ビニル-アデニン修飾ポリアクリルアミド電気泳動メディウムは、キャピラリー電気泳動における核酸の分離を向上させるために使用されている(Babaら (1992), Analyt. Chem. 64: 1920-1924)。
【０００６】
PCT国際特許公開公報第WO 98/51823号には、固定化されたポリヌクレオチドを標的分子のための結合剤(binding)として含有する電気泳動メディウムを用いた標的分子の検出方法が記載されている。標的分子は、典型的には核酸であるが、核酸に結合する他の分子、例えば、DNA結合性タンパク質およびアプタマー結合パートナーなども挙げられ得る。
【０００７】
PCT国際特許公開公報第WO 99/45374には、電気泳動の方向を周期的に変化させ、一方で、電気泳動メディウムの１つ以上の性質を、標的分子が、メディウム内に固定化された結合パートナーに結合する特定の可逆性結合に交互に有利および不利となる２つの状態間で同期的に変化させる、アフィニティー電気泳動方法が記載されている。
【０００８】
PCT国際特許公開公報第WO 00/50644には、電気泳動メディウム内に固定化された結合パートナーを用いるDNAの精製方法が記載されている。いくつかの態様では、結合パートナーに結合した標的分子を放出させるために電界の強度を上げ、また、いくつかの態様では、放出された標的分子を回収のために取り出すために電界の方向を逆転させる。
【０００９】
標的分子に関して極めて薄い試料もしくは標的分子が希少な試料、または非常に類似した非標的分子に関して極めて不均一な試料は、分離および検出の特定の問題をもたらす。例えば、結腸癌の診断について検査したヒト糞便試料は、ヒトDNAおよびタンパク質と比べて大量の細菌系DNAおよびタンパク質を含み、例えば、癌関連変異を示すDNAまたはタンパク質と比べて大量の正常ヒトDNAおよびタンパク質を含む。同様に、病原体の感染の存在について検査したヒト血液試料は、任意の病原体由来DNAまたはタンパク質と比べて大量のヒトDNAおよびタンパク質を含む。
【００１０】
同様に、病原体の存在について検査した環境(例えば、分水界)または産業(例えば、食品加工)試料は、いずれかの病原体由来DNAまたはタンパク質に関して極めて薄い。さらにまた、ごくわずかな構造上の違い（例えば、タンパク質または核酸における点変異）を含む標的および非標的生体分子は、標準的な電気泳動手法では、正常分子から容易に分離され得ない。
【００１１】
したがって、希釈された、または不均一な被験試料中の標的分子の分離、単離、富化および検出のための改善された方法の必要性がなお存在する。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、試料中の標的分子を分離、単離、富化または検出するための改善された方法を提供する。目的の標的分子(例えば、核酸、タンパク質、または標的分子を発現する細胞)を含有する試料を(sis)、例えば、標的分子の結合パートナーを通過する高速流の試料により、固相支持体上またはメディウム中の結合パートナーに繰り返し曝露する。本発明の方法の反復的および高速性により、試料からの標的分子の回収効率の向上とともに、標的分子のその結合パートナーへの結合の特異性の維持の両方が提供される。結合パートナーへの試料の各曝露により、標的分子に、その結合パートナーに結合する機会が提供され、それにより、各曝露でその結合パートナーに結合された標的分子の総数が向上する。
【００１３】
その結合パートナーを通過する試料の流速は、標的分子と結合パートナーとの所望される結合特異性の程度に依存する。その結合パートナーを通過する試料の流速が速いほど、標的分子と結合パートナーとの結合特異性は大きい。結合パートナーに対する試料の流速が低いほど、非標的分子が標的分子の結合パートナーに結合しやすくなる。したがって、標準的な方法を用いて回収されない希少な標的分子が、希釈された、または不均一な試料から回収され、結合パートナーに対する試料の高速かつ反復通過によるバックグラウンド(background)が最小限である。
【００１４】
結合パートナーは、固相支持体に結合させてもよく、またはメディウム (例えば、アガロース、ポリアクリルアミドメディウム、ビーズ)内に包埋してもよく、試料はこれらの内部を通過するか、またはこれらを通過する。
【００１５】
試料の移動は、原動力、例えば機械的手段(例えば、真空、正圧もしくは重力)または例えば電気泳動手段(例えば、電流)によって駆動される。
【００１６】
一つの態様において、試料は、試料由来のいくつかの標的分子の同時に起こる分離または単離に対し、メディウムまたは固相支持体の独立した領域でいくつかの結合パートナーに繰り返し曝露される。いくつかの態様において、少なくとも一つの結合パートナーは、非標的分子が、メディウムを通じてそれぞれの試料の通過によって同時に、かつ繰り返し試料から除去されるような、非標的分子または複数の分子に対して特異的である。試料の繰り返しの移動は、それぞれの繰り返しにより同一方向（例えば、同一方向への連続的な流動、または循環）であり得るか、または実質的に反対方向（例えば試料を、結合パートナーを通過して前方および後方へ移動させる）であり得る。好ましい態様において、少なくとも一方向に一つの結合パートナーを含有するメディウムを通じて試料を電気泳動に供し、次いで電流の極性を逆転させ、反対方向のメディウムを通じて試料を後方へ電気泳動に供し、所望の前方−後方サイクルが繰り返される。
【００１７】
本発明の一つの態様において、標的分子は、繰り返される曝露、または試料が結合パートナーを通過するサイクルを通してその結合パートナーへ結合したままである。例えば、試料が流れるメディウムの条件（例えば、温度またはpH）は、標的分子がその結合パートナーから分離するようには変化しない。
【００１８】
別の態様において、標的分子結合パートナーによる試料のそれぞれの曝露のタイミングは、実質的に一定のままである。例えば試料を、ある電圧にてある時間、標的分子に対する結合パートナーを含有するメディウムで第一の方向へ電気泳動に供する場合、逆転方向における試料の電気泳動のタイミングおよび電圧は、実質的に同一である。
【００１９】
別の態様において、非標的分子が結合パートナーに曝露される時間量が最小限となる条件下で、標的分子は結合パートナーに曝露され、それにより非標的分子の結合パートナーへの背景結合が最小限となる。メディウムの状態（例えば、電気泳動におけるゲルのアガロース濃度）または原動力（例えば、ポンプ速度もしくは電流）の変化によって、標的分子は、固相支持体の領域または特異性が最適化されるような結合性分子を含有するメディウムを即座に横切る。
【００２０】
一つの態様において、固相支持体はキュベットまたはチップ、例えばシリコンチップである。一つの態様において、固相支持体は、試料が通過する少なくとも一つの溝(channel)を有する。一つの態様において、該溝は固相支持体によってエッチングされるかもしくは穴があけられ、または固相支持体は別な方法で、溝を含有するために製造されるかもしくは組み立てられる。別の態様において、該溝は連続的であり（例えばループ）、同一方向への連続的なサイクル運動を可能とする。別の態様において、該溝は、試料が流れ得る排出口を有し、所望により例えば、試料を除去しまたは標的分子を溶出する。
【００２１】
少なくとも、固相支持体の一つの領域は、そこで固定された結合パートナーを含有する。一つの態様において、溝は試料の通路に突出物を含有する。一つの態様において、該突出物は、ジグザグに配置される。該突出物は、標的分子に結合する少なくとも一つの固定された結合パートナーを含有する。試料は溝を通過する際に、突出物と遭遇し、それにより標的分子の突出物に対する曝露が最大化される。
【００２２】
別の態様において、固相支持体は、試料が流れるいくつかの相互連結した溝を含有し、そこで少なくとも一つの結合パートナーが固定され得る。一つの態様において、溝は、流体流動が流体ループであり循環的であるように、少なくとも一つの共通部分を共有する。
【００２３】
固相支持体またはメディウムは、少なくとも一つの標的分子に対して同一かまたは異なる結合パートナーを含有する、いくつかの領域を有し得る。一つの態様において、固相支持体は、そこで固定された非標的分子に対する結合パートナーを有する、少なくとも一つの領域を有する。別の態様において、固相支持体またはメディウムは、いくつかの異なる標的および／または非標的分子に対する結合パートナーを含有するいくつかの隣接した領域を有する。いくつかの態様において、それぞれの領域は、その領域で固定された結合パートナーを含み、それぞれのすぐ近くに隣接した領域における結合パートナーとは異なる。ある態様において、５〜１０、５〜５０、５〜１００以上の異なる領域が存在し、異なる標的結合パートナーを含む。別の態様において、領域は異なるメディウムを含有する。
【００２４】
一つの態様において、原動力は、その結合パートナーを通過して、試料を押し動かす（例えば正の電圧）。別の態様において、原動力は、その結合パートナーを通過して、試料を引き寄せる（例えば負の電圧）。別の態様において、原動力の大きさは、本発明の方法を通して一定である。別の態様において、原動力はポンプで提供される。さらなる別の態様において、原動力は電流である。
【００２５】
一つの態様において、試料は、大便、全血、血清、血漿、涙、唾液、鼻水、痰、耳汁、生殖分泌液、乳汁、母乳、初乳、胎盤分泌液、羊水、汗、滑液、腹水、髄液、胆汁、胃液、水様液、硝子液、胃腸液、滲出液、濾出液、胸膜液、心膜液、精液、上気道分泌液、腹膜液、免疫応答部位から採取された分泌液、貯留された収集部位から採取された分泌液、気管支肺胞洗浄液、尿、生検材料、有核細胞試料、粘膜表面関連分泌液、体毛または皮膚等の、生物学的試料を含む。
【００２６】
一つの態様において、結合パートナーはタンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、ヌクレオシド、抗体、抗体断片、抗体リガンド、アプタマー、ペプチド核酸、小さな有機分子、脂質、ホルモン、薬物、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、無機分子、多糖類、および単糖類、炭水化物またはその組み合わせである。特定の態様において、結合パートナーは、少なくとも一つのヒト腸管微生物叢ヌクレオチド配列に対し特異性を有する。ある態様において、結合パートナーは、標的特異的ポリヌクレオチドであり、ヒトヌクレオチド配列、ヒト病原体ヌクレオチド配列、およびヒト腸管微生物叢ヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
別の態様において、本発明の方法は、標的分子または結合パートナーを放出する工程を含む。特定の態様において、該放出工程は、標的分子を第一の結合パートナーから放出することを含む。別の態様において、該放出工程は、第一の結合パートナーをメディウムから放出することを含む。
【００２８】
特定の態様において、本発明は、（a）被験試料を、第一の空間範囲中に連続的に配置された少なくとも二つの領域を有するメディウムの少なくとも一部分に導入すること；（b）試料を第一の方向の電場に供し、第一の空間範囲中の領域を通しておよび領域間においてメディウム内での帯電分子の移動を生じさせること；ならびに（c）試料を、第一の方向とは反対である第二の方向の電場に供し、第一の空間範囲中の領域を通しておよび領域間において被験試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせることにより、被験試料中の標的分子を非標的分子から分離する方法を提供する。これらの態様において、領域の少なくとも一つは、第一の標的分子（複数の分子）に対し選択的結合親和性を有し、かつ非標的分子に対し選択的結合親和性を有さない、第一の標的結合パートナーを含む。これらの態様において、第一の標的分子は、被験試料にて選択的に第一の標的結合パートナーと結合し、かつ非標的分子から分離される。
【００２９】
いくつかの態様において、前記の方法は、試料を少なくとも一つのさらなる電気泳動のサイクルに供するさらなる工程を含み、ここでそれぞれのサイクルは、試料を第一の方向の電場に供し、第一の空間範囲中の領域を通しておよび領域間において試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせること；ならびに試料を、第二の方向の電場に供し、第一の空間範囲中の領域を通しておよび領域間において試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせることを含む。ある態様において、該方法は、試料を少なくとも５、１０、２０、３０以上のかかるサイクルに供することを含む。
【００３０】
いくつかの態様において、メディウムはさらに、第二の空間範囲中の他の領域の少なくとも一つと隣接する、少なくとも一つの領域（例えば、実質的に第一の空間範囲に対して垂直である）を含み、該方法は、試料を、第二の空間範囲に対して平行である第三の方向の電場に供し、第二の空間範囲の領域において被験試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせる、さらなる工程を含む。いくつかの態様において、垂直領域は、試料中の少なくともいくつかの標的または非標的分子に対し、選択的結合親和性を有する結合パートナーを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、メディウムは、第一の空間範囲中に連続的に配置された非常に多数の領域を有し、それぞれのかかる領域は、異なる標的分子に対し選択的結合親和性を有し、かつ非標的分子に対し選択的結合親和性を有さない標的結合パートナーを含む。これらの態様において、非常に多数の異なる標的分子は、被験試料にて非常に多数の標的結合パートナーに選択的に結合し、かつ非標的分子から分離される。ある態様において、５〜１０、５〜５０、５〜１００以上の異なる領域が存在し、異なる標的結合パートナーを含む。
【００３２】
いくつかの態様において、前記の方法は、試料を少なくとも一つのさらなる電気泳動のサイクルに供するさらなる工程を含み、ここでそれぞれのサイクルは、試料を電場に供し、第一の空間範囲中のメディウムの領域を通しておよび領域間において試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせること；およびメディウムを第二の電場に供し、第二の空間範囲中の領域を通しておよび領域間において試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせることを含む。一つの態様において、第二の方向は第一の方向に対して逆平行である。ある態様において、該方法は、試料を少なくとも５、１０、２０、３０以上のかかるサイクルに供することを含む。
【００３３】
いくつかの態様において、メディウムはさらに、第一の空間範囲に対し実質的に垂直である第二の空間範囲における他の領域の少なくとも一つと隣接する少なくとも一つの垂直領域を含み、該方法は、メディウムを、第二の空間範囲に対して平行である第三の方向の電場に供し、第二の空間範囲中の領域を通しておよび領域間において試料中の帯電分子のメディウム内での移動を生じさせる、さらなる工程を含む。いくつかの態様において、垂直領域は、試料中の少なくともいくつかの分子に対し、選択的結合親和性を有する結合パートナーを含む。
【００３４】
別の局面において、本発明は、上記に記載された方法のいずれかによって被験試料の非標的分子から標的分子を分離し、それによって被験試料の非標的分子から標的分子を単離する方法；メディウムが、（i）標的分子または（ii）標的特異性結合パートナーに結合した標的分子を放出するように処置することによって、標的分子を放出する方法；および分子を単離するために、メディウムから放出された分子を溶出する方法を提供する。
【００３５】
いくつかの態様において、メディウムは、第二の標的分子に対し選択的結合親和性を有し、かつ非標的分子に対し選択的結合親和性を有さない第二の標的結合パートナーを含む第二の領域を有する。これらの態様において、第二の標的分子は「第一の標的分子」と異なり、第二の標的分子は、被験試料にて選択的に第二の標的結合パートナーと結合し、かつ非標的分子から分離される。
【００３６】
いくつかの態様において、メディウムは、第一の空間範囲中に連続的に配置された非常に多数の領域を有し、それぞれのかかる領域は、異なる標的分子に対し選択的結合親和性を有し、かつ非標的分子に対し選択的結合親和性を有さない異なる標的結合パートナーを含む。これらの態様において、非常に多数の異なる標的分子は、被験試料にて非常に多数の標的結合パートナーに選択的に結合し、かつ非標的分子から分離される。ある態様において、５〜１０、５〜５０、５〜１００以上の異なる領域が存在し、異なる標的結合パートナーを含む。
【００３７】
別の態様において、本発明は、上記に記載された方法により標的分子を分離すること、単離することもしくは富化することで、非標的分子を含有する希釈したまたは異質の被験試料中の標的分子を検出する方法、核酸である標的分子を増幅する方法、および／または（i）標的分子に対して特異的である結合パートナーの結合、（ii）標的分子および標的特異性結合パートナーの間で形成された複合体に対して特異的である結合パートナーの結合、および（iii）標的分子による標的特異性結合パートナー由来の検出可能なリガンドの置換(displacement)から選択される方法によって標的分子を検出する方法を提供する。
【００３８】
ある態様において、電気泳動メディウムの領域の少なくとも一つは、多量のビーズを含む。
【００３９】
前記の局面および方法の態様のそれぞれにおいて、電気泳動メディウムは、アクリルアミドポリマー、アガロースポリマー、デンプンポリマー、デキストランポリマー、セルロースポリマーおよびビーズの群から選択され得る。さらに、前記の局面および態様のそれぞれにおいて、電気泳動メディウムの一つ以上の領域は、他の領域（複数の領域）とは異なる材料（例えば、異なるポリマーマトリクス、異なる満杯のビーズ、またはその混合物）から形成され得る。
【００４０】
前記および本発明の他の目的、特徴および利点、ならびに本発明それ自体は、添付の図面と一緒にして読むと、好ましい態様の以下の説明からより十分に理解されるであろう。
【００４１】
（詳細な説明）
本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、以下で別な方法で規定されない限り、当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有するものとする。本明細書中で使用される技術の参照は、当該分野で一般に理解される技術を言うものであり、これらの技術または当業者にとって明確であり、同等のもしくは後に開発された技術の代用における変化を含む。さらに、本発明の内容をより明瞭にかつ簡潔に記載するために、以下の規定は、明細書および追加クレームで使用される、ある用語を提供する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「標的分子」は、試料中の任意の目的の分子を意味し、被験試料内の非標的分子に対して、検出され、分離され、単離されまたは富化されるのが望ましい。標的分子としては、限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、ヌクレオシド、抗体、抗体断片、抗体リガンド、アプタマー、ペプチド核酸、小さな有機分子、脂質、ホルモン、薬物、酵素、レクチン、細胞接着分子、抗体エピトープ、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、無機分子、多糖類、単糖類が挙げられ得る。試料は、本発明の方法が試料において一つより多い標的分子を同時に、または連続して分離、単離、富化または検出するために使用されるような一つより多い標的分子を含み得る。試料はまた、標的分子を発現する細胞を含み得、本発明の方法によって単離され得る。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「非標的分子」は、試料において標的分子でない任意の分子を意味する。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「結合パートナー」は、標的分子または非標的分子に対し選択的結合親和性を有する任意の分子を意味し、その結果、適切な条件下（例えば、pH、温度、溶媒、イオン強度、電場強度）において、電気泳動を通して標的分子と結合し得る。結合パートナーとしては、限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、ヌクレオシド、抗体、抗体断片、抗体リガンド、アプタマー、ペプチド核酸、小さな有機分子、脂質、ホルモン、薬物、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、無機分子、多糖類、および単糖類が挙げられ得る。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「選択的結合親和性」は、適切な条件下で、試料中の非共有な物理的結合に対するより大きな親和性、または他の分子に対する選択された分子への結合を意味する。選択的結合親和性の例としては、適切な条件下（例えば、pH、温度、溶媒、イオン強度、電場強度）において、ポリヌクレオチドの相補的なまたは実質的に相補的なポリヌクレオチドへの結合、抗体の同起源エピトープへの結合、および受容体の同起源リガンドへの結合が挙げられる。選択的結合親和性とは、結合がテストされるが、適切な条件下での試料中に存在する任意の非標的分子に対してよりも、標的分子に対して少なくとも二倍の大きさの親和性を含むであろうという条件に依存する、相対的な用語である。被験試料が、一種類の標的分子よりも多く含む場合（例えば、一座由来の対立バリアント）、結合パートナーは非標的分子に対し、一つ以上の異なる標的分子に対する選択的結合親和性を有し得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に相補的な」は、ヌクレオチド配列を有することを意味し、それは配列に対して十分な同一性を有し、適切な条件下で特定のポリヌクレオチドに対し選択的結合親和性を有するために、特定のポリヌクレオチドに対して完全に相補的である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、任意の単離された天然に産生された抗体、組み換えによって産生された抗体、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、キメラ抗体等の合成抗体、またはFab断片、F(ab’)2断片、Fv断片もしくは一本鎖Fv断片(scFv)等の任意の抗体断片を意味する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「アプタマー」は、非共有な物理的相互作用を介し、非ポリヌクレオチド分子に対して選択的結合親和性を有する任意のポリヌクレオチドを意味する。アプタマーは、ある様式において抗体がそのエピトープへ結合するのに類似した、リガンドへ結合するポリヌクレオチドである。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「反対の」および「逆の」および「後方への」は、電気泳動の方向を言う場合、電気泳動の以前の方向に対して実質的に逆平行の方向を意味する。反対の、逆のまたは後方への方向は、電気泳動の平面において正確に180°回転させる必要が無い。むしろ実質的に反対の、逆のまたは後方への回転は、被験試料が十字変換電場電気泳動（TAFE）およびコンタークランプ同一電場（CHEF）電気泳動（例えば、Gardinerら(1986), Somatic Cell Molec. Genet. 12:185-195; Chuら(1986), Science 234:1582-1585を参照）にて斜めに移動されるように使用され得る（例えば、120°〜240°回転）。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「検出可能な」および「標識化」は、化学的に構成されるかまたは修飾されることを意味し、標準化学的、生化学的または生物学的アッセイ（限定されないが、ラジオイムノアッセイ（例えば、放射性同位体アッセイ）、写真分光計アッセイ（例えば、蛍光性、化学ルミネセンス、生物ルミネセンスアッセイ）、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）、サンドイッチアッセイ、免疫蛍光性アッセイ、イムノラジオアッセイ）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションまたは置換アッセイ）、プラスモン共鳴アッセイ（例えば、BiaCORETMアッセイ（Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ））、核酸増幅アッセイ（例えば、PCRアッセイ、LCRアッセイ）などが挙げられる）による検出を容易にする。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、特に別に示されない限り、単語「または」は「および／または」の包括的な意味で使用され、「かどちらか」の排他的な意味ではない。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「増加する」および「減少する」は、それぞれ、統計的に有意に（すなわち、p＜0.1）増加または減少を意味する。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、変数に対する数的範囲の列挙は、本発明がその範囲内の任意の値と等しい変数によって実行され得ることを意味するであろう。かくして本質的に離散している変数に対し、該変数は数的範囲内の任意の整数値と等しくあり得、範囲の終了点を含む。同様に、本質的に連続している変数に対し、該変数は数的範囲内の任意の実数値と等しくあり得、範囲の終了点を含む。例として限定されないが、0および2の間の値を有するように記載された変数は、該変数が本質的に離散している場合、0、1または2の値を取り得、該変数が本質的に連続している場合、0.0、0.1、0.01、0.001、または0以上および2以下の任意の他の実数値を取り得る。
【００５４】
反復的親和性分離
部分的に、本発明は試料中の標的分子の分離、単離、濃縮または検出が、少なくとも一つの固相支持体の領域を横切って、もしくは通過して、または標的分子特異的結合パートナーを有する少なくとも一つの電気泳動メディウムの領域を超えて、試料を通過させることのそれぞれにより有意に改善されるという発見による。いくつかの態様において、異なる標的分子特異的結合パートナーを含む二つ以上の領域がある。いくつかの態様において、非標的分子特異的結合パートナーを含む少なくとも一つの他の領域がある。
【００５５】
本発明の特定の理論になんら拘束されないが、試料が結合パートナー領域を複数回横切って移動する際に、試料中の標的分子が標的分子特異的結合パートナーと結合するための複数の機会を有することが信じられる。同様に、非標的分子は、任意の非標的分子特異的結合パートナーと結合するための複数の機会を有する。さらに、非特異的結合分子は、置換されるためのさらなる時間および機会を有する。一つの態様において、試料は結合パートナーを横切って迅速に移動し、非常に高い特異性の結合のみを選択する。さらに、増加した特異的な結合の機会の結果として、実質的な感度の喪失無く、より高いストリンジェントな結合条件によって、より高い特異性が達せられることが信じられる。従って、標的分子の分離、単離、濃縮または検出の質もまた、有意に改善される。
【００５６】
該方法は、希釈されたまたは不均一な、体液、排泄物または組織試料から得られた生物分子の試料の分離、単離、濃縮または検出について特に有用であり、便、全血、血清、血漿、涙、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器分泌液、乳液、母乳、初乳、胎盤分泌液、羊水、汗、滑液、腹水、髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸膜液、心膜液、精液、上気道分泌液、腹膜液、免疫反応の場より採取した分泌液、プールされた堆積場（pooled collection site）より採取された分泌液、気管支肺胞洗浄液、尿、生検物質、有核細胞試料、粘膜表面関連液、毛髪もしくは皮膚における、ヒト正常型もしくは変異のヌクレオチド配列または病原体由来のヌクレオチド配列の同定において、特に有用であり得る。
【００５７】
例えば、かかる方法は、癌の診断または病気分類（例えば、便試料における結腸癌関連核酸またはタンパク質の検出）において、感染性疾患の診断（例えば、血液試料におけるウィルスタンパク質の検出）において、出生前遺伝子型診断（例えば、羊液または母性血液における胎児性核酸の検出）ならびに環境試験（例えば、水源における病原体の検出）および工業的または商業的プロセス制御（例えば、食肉および鶏肉のプロセッシング；食物および医薬品のプロセッシング）等の非医学的応用において有用であり得る。
【００５８】
さらに、該方法は、単一試料中の複数の標的を分離するため、単離するため、濃縮するためまたは検出するために特に有用であり得る。例えば、ゲノム、DNA、mRNA、cDNAまたは増幅したDNA試料を、変異の多様性またはマーカーDNA配列の存在について同時にスクリーニングし得るか、または環境試料を病原体の多様性の存在について同時にスクリーニングし得る。
【００５９】
一つの局面において、本発明は、試料中の非標的分子から標的分子を分離する方法に用いるカートリッジを提供する。例の方法によっておよび図1に示されるように、カートリッジ1は、実質的に平面状の外被を有し、ポリスチレンもしくはポリカーボネート等の成型可能な物質またはポリビニルクロライドにより組立てられ、流入口3による流体伝達において、流体接触表面を有する少なくとも一つの流入口3および少なくとも一つの導管(conduit)5の特徴を持つ。カートリッジ1は、さらに導管5の流体接触表面の第一の領域7に配置される少なくとも一つの結合パートナーを含み、これにより試料が流入口3に流し込まれた際に試料は領域を通過し、導管5を通る試料の移動の間に、試料中の標的分子が結合パートナーに結合する。図1は、試料が繰り返し通過するためのループを導管が形成する場所における、カートリッジの態様について示し、それ故、標的分子についての結合パートナーと繰り返し接触する。一つの態様において、少なくとも一つの領域は非標的分子についての結合パートナーを含む。カートリッジはまた、少なくとも一つのさらなる入口（port）または排出口（vent）10を含み、試料を循環させるためにまたはそこを通って試料が除去され得るため、またはそこを通って標的分子が溶出され得るためにポンプが付着している。導管の個々の領域において結合パートナーと結合している分子の溶出は、別々に行われ得、数個の標的分子および／または非標的分子が分離および／または単離される。一つの態様において、カートリッジの領域は、溶出（Elution）工程より前に分離され得る（例えば、スナップアパートされる（snapped apart））。別の態様において、カートリッジの領域は単離され得、各々の領域において、別々に溶出され得、単離され得る分子および領域結合間の流体伝達はもはや不可能である。
【００６０】
図2を参照すると、別の態様において、カートリッジ1は流体伝達において、互いに流入口3および複数の導管5を含み、導管の少なくとも一つの領域7は標的分子についての結合パートナーを含む。試料は導管を横断し得、標的分子は、導管の領域に結合している結合パートナーと結合する。複数の導管は、標的分子についての結合パートナーが結合する表面エリアを増大させるため、または種々の標的分子および／もしくは非標的分子についての種々の結合パートナーを含むいくつかの領域を有するために有用である。一つの態様において、少なくとも一つの領域は非標的分子を含む。カートリッジはまた、ポンプを取り付けるため、またはそこを通って試料が除去され得るため、またはそこを通って標的が排出され得るために、少なくとも一つのさらなる入口または排出口を有し得る。個々の領域において結合パートナーと結合した分子の溶出は、別々に行われ得、いくつかの標的分子および／または非標的分子は分離および／または単離される。一つの態様において、カートリッジの領域または導管は、溶出工程より以前に分離され得る（例えば、スナップアパートされる）。別の態様において、カートリッジの領域は単離され得、流体伝達は、各々の領域に結合し、別々に溶出または単離され得る分子および導管または領域間では、もはや不可能である。
【００６１】
図3を参照すると、別の態様において、カートリッジ1は、流体伝達において流入口3および少なくとも一つの導管5を有し、流入口3および標的分子についての結合パートナーを含有し少なくとも一つの突出物7を含む導管の少なくとも一つの領域を伴う。突出物は導管内に突き出し、標的分子は突出物の内部および周囲に流入し、標的分子とパートナーの結合のためのさらなる表面領域を提供すし、これにより標的分子がその結合パートナーと結合する機会を増大させる。一つの態様において、図３に示されるように、突出物は互い違いに配置される。突出物は、例えば曲線的、平坦または正方形のようないかなる形状でもあり得る。図4は、導管5内の突出物7を示すような、図3の態様のある態様の横断面を図示している。一つの態様において、例えば試料は、結合パートナーを含有する領域の上流または下流に位置しているポンプ口につながれたポンプにより誘発される、陽圧または陰圧に従って引かれ得る。ポンプは入れ替わり得、試料は結合パートナー領域を超えて戻り、進む。選択的に、例えば、カートリッジの両端に接するような二つのシリンジ等の手動の系が用いられ得、そこで試料がシリンジの陽圧または陰圧を用いて、結合パートナーを含む導管の領域を反復的に押しのけて前後する。カートリッジを通じて流動する流体は、例えば米国特許番号第6,287,850号に記載される方法により達成される。
【００６２】
本発明の一つの態様において、カートリッジはマイクロチップまたはウェハース（wafer）状であり、結合パートナーアレイは、例えば米国特許番号第5,143,854号またはPCT公開公報WO92/10092号に記載されるように調製される。チップは、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、半球、容器、キャピラリー、パッド、切片、フィルム、プレート、スライド、その他の形として存在する、生物学的、非生物学的、有機的、無機的のいずれかの広域な物質またはこれらの任意の組み合わせからなり得る。チップは、ディスク状、正方形、半球、円形、その他のいかなる都合のよい形状も有し得る。好ましくは、チップは、平坦であるが、多様な任意の表面形態を取る。例えば、チップは、結合パートナーが位置する凸型領域または凹型領域を含み得る。好ましくは、チップおよびその表面は、結合パートナーが形成され得る場所において、固形の支持体を形成する。チップは、ポリマー化されたLangmuir Blodgett フィルム、機能化されたガラス、Si、Qe、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修飾されたシリコーンもしくは非常に多様なゲルもしくは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネート等のポリマーのいずれか一つ、またはその組み合わせであり得る。チップを構成する他の物質は、この開示の総論、ならびに全教示が参照によって本明細書中に援用される米国特許番号第6,287,850号、6,399,365号、6,551,817号、6,664,104号、6,653,121号および6,664,104号において、当業者に容易に理解されよう。好ましい態様において、チップは平坦なガラスまたは単一結晶シリコーンである。
【００６３】
チップ内の導管の表面は、該ウェハースと同様の物質からなり得、非常に多様な物質、例えばポリマー、プラスティック、樹脂、ポリサッカライド、シリカもしくはシリカに基づく物質、カーボン、金属、無機的ガラス、メンブレンまたは上記のウェハース上の物質の任意のものからなり得る。
【００６４】
別の局面において、本発明は、カートリッジの一つの導管の少なくとも一部の表面上で、結合パートナーを乾燥させることにより、カートリッジを調製する方法を提供する。結合パートナーを乾燥させることは、少なくとも一つの導管の少なくとも一部の表面上の目的の結合パートナーを含む混合物の体積を利用することにより達せられる。用いられる結合パートナーは、カートリッジによりアッセイされるものに依存する。結合パートナーは、当該分野に公知の方法に従って、永久に導管に結合し得、導管に可逆的に結合し得る。
【００６５】
反復的逆転場(repetitive reversed-field)親和性電気泳動
ある態様において、本発明は、例えば第一の空間的範囲(spatial dimension)において、連続的に配置された少なくとも二つの領域を有する電気泳動メディウム中で、試料を反復的逆転場親和性電気泳動に供することにより、試験試料中の標的分子を非標的分子から分離するための方法を提供する。少なくとも一つの領域は、第一の標的分子についての選択的結合親和性を有し、非標的分子について選択的結合親和性を有さない、第一の結合パートナーを含む。電気泳動メディウムはまず、第一の方向の電界に供され、第一の空間的範囲において領域中の帯電分子のメディウム内での移動を生じる。次いで、電界を逆転させ、電気泳動メディウムは、第一の方向に対して本質的に逆平行である第二の方向における電界に供され、第一の空間的範囲における領域中の試験試料内のメディウム中での帯電分子の移動を生じる。電界を逆転させ、反対方向に試料を電気泳動するこのプロセスは、一回以上繰り返される。例えば試験試料は、逆転場電気泳動に5、10、20、30サイクル以上供され得、これは試料が一方向および次いで反対方向に電気泳動される。一つの態様において、第一および第二の電気泳動の場は、約1Amp〜約200Ampの間を含み、用いられる電気泳動メディウム（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドの濃度、pH、温度）および分離または単離される分子または細胞の大きさによる。別の態様において、第一および第二の電気泳動の場により、約1mm/mm〜約100cm/mm間の速度でメディウム中を標的分子が移動する。
【００６６】
図5は、本発明の電気泳動装置の略図表示であり、第一の領域101および第二の領域102を伴う電気泳動メディウム100を有する。先の態様において、一つの領域は固定された標的特異的結合パートナーを含み、他は含まない。これらの領域は、矢印aで示される第一の空間的範囲に配置される。試験試料は、典型的にある領域の遠位の縁である、一つまたは両方の領域に適用もしくは導入され、次いで範囲aの電界に供され、帯電分子は領域中で移動する。電界は次いで逆転し、帯電分子は範囲aにおいて反対方向における領域中で移動する。本発明に従って、電界は逆転し得、試験試料は、改善された分離を遂げるために、空間的範囲aにおいて前方および後方に複数回電気泳動され得る。領域には、図5の略図表示に示されるような同じ大きさである必要なく、領域の形状は任意であり得る。さらに、結合パートナーは、領域中に均等に分布する必要はない。
【００６７】
図6は、本発明の電気泳動装置の略図表示であり、第一の領域201、第二の領域202および第三の領域203を伴う電気泳動メディウム200を有する。先の態様において、一つの領域（例えば、第二の領域202）は固定された標的特異的結合パートナーを含む。これらの領域は、矢印aで示される第一の空間的範囲に配置される。試験試料は、典型的に領域201または203の遠位の縁である、一つ以上の領域に適用または導入され、次いで範囲aの電界に供され、帯電分子は領域中で移動する。電界は次いで逆転し、帯電分子は空間的範囲aにおいて反対方向に領域中で移動する。本発明に従って、電界は逆転し得、試験試料は、改善された分離を遂げるために、空間的範囲aにおいて前方および後方に複数回電気泳動され得る。
【００６８】
いくつかの態様において、電気泳動メディウムは、第二の標的分子についての選択的結合親和性を有し、非標的分子に関しては選択的結合親和性を有さない第二の標的結合パートナーを含む第二の領域を有する。これらの態様において、第二の標的分子は、第一の標的分子とは異なり、第二の標的分子は、選択的に第二の標的結合パートナーと結合し、試験試料中の非標的分子から分離される。
【００６９】
図7を再び参照すると、本発明の電気泳動装置は、第一の領域101および第二の領域102を伴う電気泳動メディウム100を有し、矢印aで示される第一の空間的範囲に配置される。これらの態様において、第一の領域101は第一の標的結合パートナーを含み、第二の領域102は第二の標的結合パートナーを含む。同様に、図6を再び参照すると、本発明の電気泳動装置は、第一の領域201、第二の領域202および第三の領域203を伴う電気泳動メディウム200を有し、矢印aで示される第一の空間的範囲に配置される。これらの態様において、二つの領域（例えば、第一の領域201および第二の領域202）は、第一および第二の標的結合パートナーを含む。以前のように、試験試料は、一つ以上の領域に適用または導入され、範囲∀において反復的逆転場電気泳動に供される。
【００７０】
他の態様において、電気泳動メディウムは、第一の空間的範囲において連続的に配置される多数の領域を有し、かかる領域の各々は、種々の標的分子についての選択的結合親和性を有し、非標的分子に対する選択的結合親和性は有さない種々の標的結合パートナーを含む。これらの態様において、種々の多数の標的分子は、選択的に多数の標的結合パートナーに結合し、試験試料における非標的分子と分離される。ある態様において、種々の標的結合パートナーを含む5〜10、5〜50、5〜100またはそれ以上の種々の領域が存在する。
【００７１】
別の態様において、本発明の電気泳動装置は、第一領域、第二領域、第三領域および第四領域を伴う電気泳動メディウムを有する。多数の領域は、固定された標的特異的結合パートナーを含む。任意に、標的特異的結合パートナーを含まない一つ以上の領域は、非標的特異的結合パートナーを含む。該領域は、第一の空間的範囲中に配置される。以前のように、試験試料は、一つ以上の領域に適用または導入され、範囲において反復的逆転場電気泳動に供される。
【００７２】
別の局面において、本発明は、標的特異的および非標的特異的結合パートナーの両方の使用方法を提供する。これらの態様において、電気泳動メディウムの第一の空間的範囲に配置される少なくとも一つの領域は、標的分子についての選択的結合親和性を有し、非標的分子については結合親和性を有さない標的結合パートナーを含み、少なくとも一つの領域は、少なくともいくつかの非標的分子についての選択的結合親和性を有し、標的分子については結合親和性を有さない非標的結合パートナーを含む。非標的特異的結合パートナーを有する領域は、電気泳動により移動するサンプル由来の、少なくともいくつかの非標的分子の除去に有用であり、それにより非特異的に標的特異的結合パートナーに結合し得るか、または標的分子の標的特異的結合パートナーに対する結合を妨げ得る、いくつかの非標的分子を除去する。以前記載した態様におけるように、試験試料は、一つ以上の領域に適用または導入され、第一の空間的範囲において反復的逆転場電気泳動に供される。
【００７３】
図5を再び参照すると、本発明の電気泳動装置は、第一の領域101および第二の領域102を伴う電気泳動メディウム100を有し、矢印aで示される第一の空間的範囲に配置される。これらの態様において、第一の領域101は第一の標的特異的標的結合パートナーを含み、領域102は第二の非標的特異的標的結合パートナーを含む。同様に、図6を再び参照すると、本発明の電気泳動装置は、第一の領域201、第二の領域202および第三の領域203を伴う電気泳動メディウム200を有し、矢印aで示される第一の空間的範囲に配置される。これらの態様において、少なくとも一つの領域は、標的特異的結合パートナー（例えば、第二の領域202）を含み、少なくとも一つの領域は、非標的特異的結合パートナー（例えば、第一の領域201および／または第三の領域203）を含む。同様に、一つの態様において、本発明の電気泳動装置は、第一領域、第二領域、第三領域および第四領域を伴う電気泳動メディウムを有し、第一の空間的範囲中に配置される。これらの態様において、少なくとも一つの領域は、標的特異的結合パートナー（例えば、第二領域および第三領域）を含み、少なくとも一つの領域は、非標的特異的結合パートナー（例えば、第一領域および／または第四領域）を含む。以前のように、試験試料は、一つ以上の領域に適用または導入され、範囲において反復的逆転場電気泳動に供される。
【００７４】
以前の局面の各々のいくつかの態様において、電気泳動メディウムは、さらに第二の空間的な範囲中の少なくとも一つの他の領域に隣接し、第一の空間的範囲に対して実質的に垂直な、少なくとも一つの垂直な領域を含む。これらの態様において、該方法は、第二の空間的範囲に対して平行な第三の方向における電界に対する電気泳動メディウムに供するさらなる工程を含み、第二の空間的範囲において領域内の試験試料中の帯電分子の電気泳動メディウム内での移動を生じる。従って、本発明は、第二の空間的範囲における分離を提供する。いくつかの態様において、垂直領域は、試料中の少なくともいくつかの分子についての選択的結合親和性を有する結合パートナーを有する。本発明に従って、第二の空間的範囲における電界は、任意に逆転され得、試験試料は改善された分離を達成するために、第二の空間的範囲において前方および後方に複数回電気泳動され得る。第二の空間的範囲における電気泳動は、以前、以降または交互に、第一の空間的範囲における電気泳動を伴って、実行され得る。いくつかの態様において、第二の空間的範囲における電気泳動は、場の逆転なく、標的分子の単離または検出の前に最終的な分離を遂げるため、一度だけ実行される。
【００７５】
図7は、矢印aで示される第一の空間的範囲内に配置される本発明の電気泳動装置の略図表示であり、第一の領域401、第二の領域402および第三の領域403を伴う電気泳動メディウム400を有する。垂直な領域404は、他の領域に対して矢印bで示される第二の空間的範囲内に配置される。少なくとも一つの領域401、402および403は、固定された標的特異的結合パートナーを含む。任意に、標的特異的結合パートナーを含まない一つ以上の領域401、402および403は、非標的特異的結合パートナーを含み得る。垂直領域404は、標的特異的または非標的特異的結合パートナーを任意に含み得る。試験試料は、典型的に領域401または403の遠位の縁である、一つ以上の領域に適用または導入され、次いで空間的な範囲aにおける電界に供され、帯電分子は領域401、402および403中で移動する。次いで、電界は逆転され、帯電分子は、空間的範囲aにおいて反対方向にこれらの領域中で移動する。本発明に従って、電界は逆転され得、試験試料は、空間的範囲aにおいて、分離を改善するために、後方および前方に複数回電気泳動され得る。試験試料はまた、空間的範囲bにおいて電界に供され、帯電分子は領域401、402および403ならびに垂直領域404中で移動する。電界は逆転し得、試料は、空間的範囲bにおいて前方および後方に複数回電気泳動され得るか、または範囲bにおける電気泳動は、場の逆転なく、標的分子の単離もしくは検出より前に最終的な分離がなされるために、一度だけ実行され得る。三領域（すなわち401、402および403）は空間的範囲において示されるが、領域の任意の数は含まれ得る。同様にさらなる領域は、空間的範囲bに含まれ得る。
【００７６】
別の局面において、本発明は、試験試料中の非標的分子から標的分子（例えば核酸）を単離する方法を提供する。これらの方法において、標的分子は、前述の任意の方法により分離され、次いで標的分子は、電気泳動メディウムの処置により放出され、いずれの標的分子も標的特異的結合パートナーから放出されるか、または標的分子および標的特異的結合パートナーの複合体が放出される。これらの放出された分子は、標的分子を単離するために電気泳動メディウムから溶出される。分子の放出のための処置は、放出される分子の性質による。例えば、限定されないが、熱、塩、変性または増大した電界により、ポリペプチド、タンパク質もしくはアプタマー結合パートナーに結合したポリペプチドもしくはタンパク質は放出されるか、または相補的もしくは本質的に相補的なポリヌクレオチド結合パートナーにハイブリダイズした核酸標的は解離される。同様に、限定されないが、化学的分裂、酵素性分裂、または機械的分裂（例えば、結合領域をメディウムから切り離すこと）、ならびに熱、塩、変性、または増大した電界により、固定された結合パートナーおよび結合標的分子はメディウムから放出される。
【００７７】
別の局面において、本発明は、試験試料中の非標的分子に関する標的分子（例えば、特異的核酸）についての濃縮の方法を提供する。これらの方法において、標的分子は、前述の任意の方法により分離、放出され、次いで、標的分子は、標的分子についての濃縮された試料を提供するため電気泳動メディウムから溶出される。
【００７８】
別の局面において、本発明は、非標的分子を含有する試験試料中の標的分子（例えば、特異的核酸）の検出の方法を提供する。これらの方法において、標的分子は、前述の任意の方法により分離され、標的分子についての前述の方法により、任意に単離または濃縮され、次いで標的分子は、任意の適切な検出方法により検出される。例えば、限定されないが、ポリペプチド標的分子は、検出可能な抗体、アプタマー、標的ポリペプチド特異的なレセプターまたはリガンドの結合により検出され得、核酸標的分子は、標的核酸特異的なポリヌクレオチドプローブの結合、または標的核酸により標的特異的結合パートナーにハイブリダイズする検出可能なポリヌクレオチドの置換により検出され得る。任意に、標的分子は核酸分子であり、検出の前に増幅され得る。
【００７９】
いくつかの前述の態様において、電気泳動メディウムの隣接する領域は連続的であり、該領域は単一の連続した電気泳動メディウムを形成する。他の態様において、該領域は連続的ではないが、むしろ溶剤で満たされた隙間、スペーサー、セパレーターまたは他の一つ（または複数）の構造のいずれによっても分離され、該領域は、該領域が流体伝達内にあるような場所において、非連続的な電気泳動メディウムを形成する。電気泳動メディウムの一つ以上の領域における充填容積の(packed volume)ビーズを用いる態様において、分離により電界に応答してビーズが領域中で移動することが妨げられる。
【００８０】
いくつかの前述の態様において、本発明は、高度に不均一または複雑な試験試料に関して用いられ、標的分子が、該資料中に存在する非常に小さな生物分子の断片を含む。これらの態様のいくつかにおいて、本発明が、（a）相対的により多くの非標的分子を捕獲するために標的特異的結合パートナーに関してより多くの非標的特異的結合パートナーを、（b）多様な非標的分子を捕獲するために多様な非標的特異的結合パートナーを、および／または（c）標的特異的結合パートナーに関してより低い特異性または選択性を伴う非標的特異的結合パートナーを用い得、各々の非標的特異的結合パートナーが、多様な種々の非標的分子（例えば、所定の決まった状況下で、より長いポリヌクレオチドプローブはより短いプローブよりも低い特異性を伴いハイブリダイズし得る）を捕獲し得ることが熟慮される。
【００８１】
いくつかの前述の態様において、電気泳動メディウムの隣接する領域は、種々の領域内で固定された種々の結合パートナーを除いて同一である。他の態様において、該領域は、メディウムの化学的構成において異なり得、孔の大きさ、変性剤の構成および／または濃度、イオン電荷、pH、塩濃度または疎水性／親水性等の特性は変化する。かかる変化により、天然または変性コンフォメーション、異なるpH値におけるネットチャージ（net charge）、種々の結合（例えば、ハイブリダイゼーション）ストリンジェンシーにおける結合パートナーに対する結合親和性または電気泳動メディウム自身に対する非特異的結合親和性における物理的な大きさに基づく分子は分離され得る。これらの特性はまた、電気泳動の変性剤を変えることまたは他の方法による領域を処置することにより、領域内で繰り返し変化し得る。最終的に、電気泳動メディウムの温度および電界の強度は、繰り返し変化し得、それ故、電気泳動メディウムの異なる領域内で固定された結合パートナーの結合特性に影響を与える。
【００８２】
試料中の標的分子の分離、単離または濃縮は、ほとんどの解析的または診断的目的に関して完全である必要はないことが当業者には理解されよう。むしろ、分離、単離または濃縮の程度を変えることは、目的を変えるために有用である。従って、用語「分離」、「単離」または「濃縮」は、当該分野においてその通常の意味を有し、分離、単離または濃縮における統計学的に有意な増大を導き、全非標的分子からの全標的分子の絶対的な分離ではないであろう。
【００８３】
電気泳動メディウム
本発明において有用な電気泳動メディウムは、いかなるメディウムも含み、それを通じて、帯電分子が電界に応答して溶液中で移動し得、メディウムに対して、結合パートナーが固定され得るような、ポリマーゲルの基質、充填容積の粒子またはビーズおよびポリマーゲルの基質中に埋め込まれたビーズまたは粒子を含むハイブリッドメディウムが含まれる。
【００８４】
いくつかの態様において、一つ以上の電気泳動メディウムの領域は、他の領域とは異なる物質から形成され得る（例えば、種々のポリマー物質、種々の充填されたビーズ、ゲルとビーズの混合されたメディウムおよびそれらの組み合わせ）。種々の領域についての物質は、種々の分離に効果をおよぼすかまたは標的もしくは非標的分子を保有するような、当該分野において周知の原理に従い選択され得る。
【００８５】
Ａ．  ポリマーゲルメディウム
いくつかの態様において、一つ以上の電気泳動メディウムは、ポリマーゲルとして形成される。本発明において有用な共通に用いられるゲルメディウムは、アクリルアミド、アガロース、デンプン、デキストランおよびセルロースのモノマーならびに化学的に修飾されるかまたは機能化されるこれらモノマーのバリアントからなるポリマーゲルを含む (例えば, Polysciences, Inc. , Polymer & Monomer catalog, 1996-1997, Warrington, PA, 参照)、(Smithies (1959), Biochem. J. 71: 585; Quesada (1997), Curr. Opin. Biotech. 8: 82-93)。
【００８６】
タンパク質の分離について、典型的に5〜15％（w/v）ポリアクリルアミドゲルが用いられる。小核酸分子（例えば、＜1kb）について5％〜20％（w/v）、ポリアクリルアミドゲルが用いられ得る。非常に大きな核酸断片の分離については、しかしながら標準的なポリアクリルアミドゲルの孔の大きさが、断片の移動および分離には十分であり得ない。従って、より低いパーセンテージのポリアクリルアミドゲル（例えば、2〜5％（w/v））が用いられ得る。これらの低パーセンテージポリアクリルアミドゲルは、しかしながら十分な機械的強度を有さない。任意に、アガロース電気泳動メディウムは、核酸ゲルとして用いられ得る。例えば、0.5〜2.0％（w/v）アガロースのゲルは、ほとんどの核酸の分離にであり得、0.5〜1.0％（w/v）のゲルは、より大きな核酸断片について用いられ得る。低パーセンテージのアガロースゲルは、低パーセンテージのポリアクリルアミドゲルより大きな機械的強度を有する。
【００８７】
いくつかの方法について、二つ以上の支持物質の混合物を含む混成ゲルメディウムが用いられ得る。例えば、限定されないが、アクリルアミド-アガロース混成ゲルが用いられ得、2〜5％（w/v）アクリルアミドおよび0.5〜1.0％（wfv）アガロースを含有する。かかるゲルにおいて、ポリアクリルアミド基質の実行は主要なふるい（seive）の機能を提供するが、アガロースは、アクリルアミドのふるいの特性を大きく改変することなく、便利な扱いについての機械的な強度を提供する。混成ゲルにおいて、コンポーネントが標的分子により密に接するために、結合パートナーは、ゲルの主要なふるいの機能を果たすコンポーネントに任意に接し得る。
【００８８】
他の態様において、 巨大な多孔性ゲルは、ポリマー化されるよりも前に、ゲルを形成する物質と有機的液体または孔形成因子を混合することにより形成され得る。これらの液体または孔形成因子は、より大きな孔を伴うポリマーゲル基質を形成するために、ポリマー化に続き除去され得る。より大きな孔は、ポリマー基質物質を通る大きな標的分子（例えば、ゲノム断片）の移動を可能にするために、一方メディウムの機械的強度を保持するためにも有用である。
【００８９】
Ｂ.  充填されたビーズメディウム
他の態様において、高分子ゲル倍地の代替物として、小さいビーズまたは粒子床の充填容積を、電気泳動メディウムとして使用し得る。クロマトグラフィーにおいてしばしば使用されるかかる粒子ベッドは、核酸断片＞1kbなどの大きい分子を通過させる大きい間質性空隙の利点を有する。いくつかの態様において、より大きいビーズが使用され得るが、ビーズは、1〜5:m、5〜50:m、または50〜150:mの範囲の平均直径を有する。本発明において有用なビーズは、物質（アガロースポリマー、デキストランポリマー、アクリルポリマー、ガラス、ラテックス、ポリスチレン、ポリ（ヒドロキシエチルセルロース）、ポリ（エチレンオキサイド）、修飾されたアクリルアミド、およびアクリル酸エステルを含むが限定されない）から形成され得る。
【００９０】
本発明で有用なビーズ等は、固体ビーズまたは多孔性ビーズであり得、いくつかの態様では、多孔性ビーズは、10〜20:mまたはより一般には10〜50:mの範囲の直径を有し、孔サイズの広い範囲を有し得る。かかる多孔性ビーズは、孔内に包埋されるおよび/またはプローブの表面に結合する結合パートナーを含み得る。非多孔性または固体ビーズは、直径のより広い範囲を有し、限定されないが、1〜100:mの範囲におけるビーズなどである。
【００９１】
かかるビーズは、親和性結合対の１つのメンバーによって、都合の良いことに被覆（孔の内部を含む）し得るので、親和性結合パートナーの他のメンバーに結合する結合パートナーを、ビーズ上に固定化し得る。例えば、および限定されないが、ビーズはアビジンまたはストレプトアビジンで被覆され得、結合パートナーは、ビオチンと接合され得、ビーズ上で結合パートナーの固定化を引き起こす。同様に、プローブを、プロテインＡで被覆し得、プロテインＡに結合する抗体結合パートナーを固定化する。
【００９２】
ビーズをまた、処置または被覆して、試料中の、非特異的結合または標的または他の分子を減少させる。例えば、ビーズを処置して、表面上の疎水性基（例えば、ベンジル基）の数を減少させ、または表面上の親水性基（例えば、カルボキシル基）の数を増加させ得る。ビーズをまた、試験試料で使用する前に、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、または表面に非特異的に結合するおよび「ブロック」する他の分子によって被膜し得る。
【００９３】
電気泳動メディウムとしてビーズを使用する態様において、電界に応答して、１つの領域から他の領域へのビーズの運動を妨げる膜またはメッシュであるセパレーターによって、電気泳動メディウムの異なる領域を分離することは、必要であり得る。かかるセパレーターは、標的分子に浸透出来るが、ビーズに浸透出来ないほど十分大きい孔を有する必要がある。かかるセパレーターは、単独または電気泳動メディウムの領域間のスペーサー要素または他の構造との組み合わせによって使用し得る。
【００９４】
Ｃ．  ハイブリッドゲル-ビーズメディウム
他の態様において、ハイブリッドメディウムを形成し得、高分子ゲル中に包埋されたまたは網にかけた(enmeshed)小さいビーズまたは粒子を含む。かかるハイブリッドゲルメディウムを、高分子ゲル材料のいくつか、および上記のようなビーズ材料のいくつかから形成し得る。例えば、限定されないが、ポリアクリレートまたはポリスチレンビーズは、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルマトリックス中で包埋し得る。いくつかの態様において、結合パートナーは、ハイブリッドゲル-ビーズメディウムの産生の前に、ビーズに結合するであろう。他の態様において、しかしながら、結合パートナーは、その形成の間に、高分子ゲル中に共重合し得、または形成の後にハイブリッドゲル-ビーズメディウムに結合し得る。
【００９５】
Ｄ．  電気泳動の条件
電気泳動のための適切な条件（バッファシステム、温度、および電圧を含む）は、周知の原則に従って、分析される試験試料および標的分子の型ならびに使用される電気泳動メディウムの型によって、当業者により選択されうる。
【００９６】
例えば、電界中を移動するために標的分子を帯電させる必要があるので、適するpHのバッファを選択して、標的分子を電気泳動の間適切に帯電する。いくつかの態様において、標的または非標的分子の帯電を変えて、それによって電気泳動的分離に作用するために、電気泳動の工程またはサイクル中または間、バッファを変更し得る。更に、バッファを選択し得、これは結合パートナーへのストリンジェンシーまたは親和性結合の選択性の程度を、より大きくまたはより小さく促進する。例えば、単一ポリヌクレオチド結合パートナーによって与えられた遺伝子の、全ての対立遺伝子を捕捉しようと試みる場合、単一ヌクレオチド多形性による他の対立遺伝子とは異なる特異的対立遺伝子のみを捕捉しようと試みる場合よりも、ストリンジェンシーのより小さい程度を使用し得る。
【００９７】
同様に、電気泳動メディウムを選択された温度で維持し、生体分子の変性を抑制し（例えば、＜37℃）、または変性を促進する（例えば、60℃〜90℃）。いくつかの態様において、標的または非標的分子の結合を変えて、それによって電気泳動的分離に作用するために、電気泳動の工程またはサイクル中または間、温度を変更し得る。例えば、単一ポリヌクレオチド結合パートナーによって与えられた遺伝子の全ての対立遺伝子を捕捉しようと試みる場合、単一ヌクレオチド多形性による他の対立遺伝子とは異なる特異的対立遺伝子のみを捕捉しようと試みる場合よりも、より低い温度を使用し得る。
【００９８】
同様に、電気泳動メディウムを横切る電界を、当該技術分野で周知の原則に従って、選択し得る。特に、電圧を選択し、これが標的分子またはメディウム自身のいずれかを分裂し得るメディウムにおける実質的な温度上昇を引き起こすこと無く、妥当な期間、領域の間で標的分子を移動させる電流を発生させる。一般的に、SDS-ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質の電気泳動に対して、2〜20mAの電流を使用し得、一方、核酸のアガロースゲル電気泳動に対して、100〜200mAの電流を使用し得る。
【００９９】
標的分子および試験試料
本発明の方法によって、分離し、単離し、濃縮し、または検出する標的分子は、適切なバッファ中の電気泳動により分離することが出来る、いずれかの帯電された生体分子を含む。標的分子等は、限定されないが、核酸（ゲノムのDNA、cDNA、mRNA、または増幅されたDNA/RNA生成物等）、小さいポリペプチド（一定のホルモンおよびタンパク分解性の断片等）、および大きいポリペプチド（分泌されたタンパク質、構造的タンパク質、受容体、酵素、アミノ酸、ヌクレオシド、抗体、抗体断片、抗体リガンド、アプタマー、ペプチド核酸、小さい生体分子、脂質、ホルモン、薬物、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、無機分子、多糖類、単糖類等）を含む。更に、標的分子は、これらの分子の特異的多形変異体（変異体または疾患関連形態等）または多形変異体（法医学的鑑定において有用である）であり得る。いくつかの態様において、標的分子の単一型（例えば、特異的核酸配列を有する核酸）が存在し、一方他の態様において、標的分子は、分子のクラス(class)(例えば、特異ヌクレオチド配列を含む種々の長さの核酸、または特定の遺伝子の様々な対立遺伝子と対応する核酸)を含み得る。
【０１００】
本発明において使用され得る試験試料は、本発明の方法によって、分離し、単離し、濃縮し、または検出し得る標的生体分子を含むいずれかの試料を含む。かかる試料は、限定されないが、便、全血、血清、血漿、涙、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器分泌液、乳液、母乳、初乳、胎盤分泌液、羊水、汗、滑液、腹水、髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸膜液、心膜液、精液、上気道分泌液、腹膜液、免疫応答の場より採取された分泌液、プールされた採取部位より採取された分泌液、気管支肺胞洗浄液、尿、生検物質、有核細胞試料、粘膜表面関連液、毛髪もしくは皮膚を、全て試験試料の供給源として使用し得る。更に、環境テスト（例えば、水源における病原体の検出）および工業的または商業的プロセス制御（例えば、食肉および鶏肉の加工）のテスト試料を、使用し得る。例えば、限定されないが、テスト試料を、池、小川または川、分水界、都市の水源、水処理施設、食肉および家禽類屠殺場または加工施設、食品加工場、医薬品および生物製剤製造工場、血液バンク、器官バンク等から得ることが出来る。テスト試料をまた、生物学的および化学的兵器の使用可能性の用地を含む、危険な病原体または生体分子による潜在的汚染の地から得ることが出来る。
【０１０１】
いくつかの態様において、試験試料を、直接電気泳動メディウムに適用し得る。他の態様において、しかしながら、未処理の試料は、標準試料調製技法に供され、任意に部分的精製を含み、これは電気泳動の間に標的分子を、結合パートナーにより接近可能にする。例えば、限定されないが、血液試料を遠心分離して、血清からの完全な細胞または膜を含む画分を分離し、便試料を細かく分け、生理学的に許容され得るバッファおよび洗浄剤によって均一化し得(例えば、米国特許第5,741,650号、米国特許第6,503,718号参照)、および痰試料を液化し、分別し得る。抗生物質および殺菌薬を、任意に試料に加え、更なるいずれかの生体の存在の成長を防止する。完全な細胞を取り除き得、または溶解してそれらの内容物を放出し得る。核酸が検出される分析のために、プロテイナーゼならびにDNAおよびRNA分解酵素の阻害剤を、任意に使用加え得る。更に、検出の前に、核酸である標的分子を、任意に増殖し得る。あるいは、タンパク質が検出される分析のために、プロテナーゼの阻害剤を任意に加え得る。テスト試料中の核酸を剪断し、より小さい断片に切断し得（例えば、機械的剪断または制限酵素消化によって）、または当該技術分野で既知の方法（ポリメラーゼ鎖反応(PCR)およびリガーゼ鎖反応(LCR)を含むが限定されない）によって、電気泳動の前に増殖し得る。異種の試料を精製して、試験試料を電気泳動メディウム中に充填する前に、実質的に全ての非核酸分子または実質的に全ての非タンパク質分子を、取り除き得る。例えば、限定されないが、核酸試料を、フェノールおよびクロロホルムによって抽出し得る。核酸およびタンパク質試料調製の多数の他の標準技法は、当該技術分野で既知であり、（例えば、Sambrookら,編, Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 第３版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(2001),およびWatson ら,Recombinant DNA, 第２版, W.H.Freemanおよび Company, New York(1992)）で見出され得、この全ての開示は、参照として本明細書に取り込まれる。
【０１０２】
ある態様において、標的分子は、癌に関する身体の細胞変異を示す、突然変異するヒトヌクレオチド配列である。例えば、および限定されないが、結腸癌のヌクレオチド配列は便において同定され得、腎臓または膀胱癌の配列特徴は尿において同定され得、網膜芽腫の配列の特徴は硝子体液において同定され得、神経膠腫または神経芽腫の配列の特徴は脳脊髄液において同定され得、および乳癌の配列の特徴は乳房または腋窩の生検において同定され得る。
【０１０３】
他の態様において、標的分子は、疾患に対する遺伝素因に関するまたは個体の法医学的同定に有用であるヒトヌクレオチド配列の多形変異体である。例えば、限定されないが、ある癌への素因のヌクレオチド配列の特徴は、便、血液または生検試料中で同定し得、特異的個体の配列特徴は、犯罪調査において得られる血液、唾液、および精液から同定し得る；および特異的ハプロタイプの配列特徴は、羊水、または実父確定検査のために、胎児もしくは新生児の試料から同定し得る。
【０１０４】
他の態様において、標的分子は、病原体由来の核酸、または感染したヒト被検体からの試験試料において存在するタンパク質である。例えば、および限定されないが、HIV-感染の核酸またはタンパク質の特徴は、血液または血漿試料において同定し得る；緑膿菌またはヒト結核菌感染の核酸またはタンパク質の特徴は、痰試料において同定し得る；または性感染病による感染の核酸またはタンパク質の特徴は、精液試料において同定し得る。
【０１０５】
他の態様において、標的分子は、病原体由来の核酸または環境的、工業的もしくは商業的試料からの試験試料において存在するタンパク質である。例えば、限定されないが、HIV-感染の核酸またはタンパク質の特徴は、血液または器官バンクからの試料において同定し得る；腸炎菌または大腸菌血清型 0157:H7汚染の核酸またはタンパク質の特徴は、食品加工工場において検出し得る；またはコレラ菌もしくは大腸菌型バクテリア(coliform bacteria)のタンパク質の特徴は、水源において同定し得る。
【０１０６】
結合パートナー
いくつかの態様において、結合パートナーは、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、受容体またはリガンドである。それぞれの例において、プローブは、電気泳動メディウム内での、または検出の容易さのための固定化を容易にするためのみに修飾される、自然発生した分子であり得、または、増加した、減少したまたは変更した選択的結合親和性；増加した、減少もしくは変更した化学的もしくは熱安定性；または意図した目的のために有用な他の変更した特徴の、目的のために修飾された発生学的または化学的に処理された分子であり得る。
【０１０７】
ポリヌクレオチドプローブは、当該技術分野で公知であろうと、またはなお発展中であろうと、DNAプローブ、RNAプローブ、または修飾されたヌクレオシド塩基もしくは修飾されたヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオチドプローブであり得る。修飾されたヌクレオシド塩基の例は、限定されないが、WIPO Standard ST.25(1998),Appendix 2,table 2（その全体の開示は、参照として本明細書中に取り込まれる（37C.F.R.1.821-1.825もまた参照））中に記載の修飾された塩基を含む。修飾されたヌクレオシド間結合の例は、限定されないが、リボースまたはデオキシリボース単位（ハロゲン化、アルキル化、アルコキシル化または同様なもの（例えば、２-フッ素化、２-O-メチル化、5-メチル化）等）、ホスホジエステル結合の修飾または置換（例えば、ホスホロチオエート結合による置換）、または（デオキシ）リボースおよびホスフェート主鎖（例えば、ペプチド核酸（PNA）結合による置換）を含む。例えば、Wetmur(1991),Crit.Rev.Biochem.Mol.biol.26:227-259; Moody ら(1989),Nucleic Acid Res. 17:4769-4782:Iyer ら(1995),.J.Biol.Chem.270:14712-14717;Nielsen ら(1991),Science254:1497-1500を参照。
【０１０８】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドプローブは、15と200の間の塩基長を有する。ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは、15と50の間、50と80の間、80と110の間、110と140の間、140と170の間、または170と200の間の塩基長を有する。実質的に、より長い結合パートナーをまた、使用し得る。
【０１０９】
ポリヌクレオチド結合パートナーはまた、ヌクレオチド置換（単一ヌクレオチド多形性を含む）、欠失もしくは停止、またはマイクロサテライト(microsatellite)不安定性の領域を含むことで知られる配列に向けられ得る。例えば、本発明において有用なポリヌクレオチド結合パートナーは、限定されないが、BAT-26配列（例えば、米国特許6,503,718号参照）、p53遺伝子配列（例えば、米国特許第5,527,676号参照）、MCC遺伝子配列（例えば、米国特許第5,330,892号参照）、APC遺伝子配列（例えば、米国特許第5,352,775号、米国特許第6,503,718号参照）、DCC遺伝子配列（例えば、米国特許第5,532,108号参照）およびMETオンコジーン配列（例えば、Liら(2003),Gene Ther. Mol. Biol,7:99-102）の検出のために発達したものを含む。
【０１１０】
抗体結合パートナーは、動物または細胞培養から産生または単離された自然発生する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む）を含み得る。あるいは、抗体結合パートナーは、遺伝子的に処理された分子（キメラ抗体を含み、組換え生体または細胞において産生される）を含み得、または化学的合成または分解（例えば、分裂または消化）によって産生される、化学的に処理された分子であり得る。本発明において有用な抗体結合パートナーはまた、抗体断片（Fab 断片、F(ab’)２断片、Fv断片、または単鎖Fv断片（scFv）等）を含む。かかる抗体結合パートナーは、特異的アミノ酸置換、欠失もしくは停止、またはタンパク質の換えられた翻訳後過程を含むことで知られるエピトープに向けられ得る。
【０１１１】
抗体を、当該技術分野で周知の、標準の方法によって作製し得る（例えば、Pluckthun, Nature 347:497-498(1990);Huseら, Science 246:1275-1289(1989);Chaudhary ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070(1990); Mullinax ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8095-8099(1990); Berg ら, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:4723-4727(1991);Wood ら, J.Immunol. 145:3011-3016(1990); および本明細書で引用された参照を、参照）。本明細書において有用な抗体結合パートナーは、限定されないが、ヒト癌関連抗原の検出に対して特異的なもの（例えば、PCT 国際公開公報第 WO96/08514号）、および前立腺特異的抗原（PSA）を含む。
【０１１２】
パートナーを結合するアプタマーを、当該技術で周知の方法によって発達および選択し得（例えば、Tuerk ら.(1990), Science. 249:5050;Joyce(1989), Gene 82:83-87; Ellington ら.(1990), Nature 346:818-822;Klug ら.(1994), Mol. Biol. Reports 20:97-107参照）、ならびにタンパク質、炭水化物および小さい生体分子を含む、多数の種類の被検体に対する結合パートナーとして使用し得る。
【０１１３】
結合パートナーは、電気泳動メディウムの領域へ共有的に結合し得、イオン的にまたは親和性結合によってメディウムに結合し得、または架橋された高分子マトリックスを含むメディウムの隙間内で捕捉し得る。
【０１１４】
多数の種類の方法は、様々な電気泳動メディウムに対するポリヌクレオチドまたは抗体などの共有的な結合パートナーに対して、当該技術分野で公知である。該方法は、結合パートナーおよび/または電気泳動メディウム上で存在する反応性の基を使用する標準化学的性質を使用し得、または結合パートナーおよび/または電気泳動メディウムの１つもしくは両方を機能化し、望ましい反応性の基に加える。例えば、限定されないが、カルボキシル基は、カルボジイミド接合反応を使用するアミノ基と反応し得る；一次アミンは、グルタルアルデヒドを使用する他のアミン基と反応し得る；CNBr処置は、ヒドロキシル基を、一次アミンと反応し得るシアン酸エステルまたはイミドカルボネート基に変換し得る；および塩化シアヌル処置は、一次アミンを、一次アイニン(ainines)またはチオールと反応し得るクロロトリアジンに変換し得る。有用な接合反応の概要に対して、例えば、Wong, 編 ,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRCPress, Boca Raton, FL(1993)を参照。
【０１１５】
あるいは、結合パートナーを、親和性結合対の１つのメンバーに結合し得、プローブを、メディウムに結合する結合パートナーを通して電気泳動メディウム内で固定化し得る。本文脈において有用な親和性結合対は、限定されないが、ビオチンおよびストレプトアビジン結合対ならびにジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン結合対を含む。かくして、例えば、および限定されないが、結合パートナーはビオチンと結合して、アビジンおよびストレプトアビジンで被覆されたビーズ上の結合パートナーの固定化を引き起こす。かかる充填容積のビーズは、電気泳動メディウムを構成し得、または該ビーズを、高分子マトリックスまたはゲルと混合してハイブリッドゲル-ビーズ電気泳動メディウムを形成する。例えば、米国特許第5,482,863号 を参照、ここには、懸濁液または粒子を含む電気泳動ゲルをキャストするための方法が記載されている。抗体結合パートナーに対して、抗体自身は、プロテインA との親和性結合パートナーとして役に立ち得、これは電気泳動メディウム内で固定化され得る（例えば、Suroliaら.(1981), Trends biochem. Sci. 7:74を参照）。あるいは、抗体を、プロテインA コートビーズ上で固定化し得る。
【０１１６】
他の態様において、結合パートナーを、重合または共重合するモノマー単位と機能化して、電気泳動メディウムを形成する。かかる修飾された結合パートナーを、モノマーの適した混合物と共重合する場合、高濃度の固定化された結合パートナーを含む高分子メディウムを、産生し得る。例えば、制限することなく、アクリルアミド基と固定化された結合パートナー（例えば、ポリヌクレオチド結合パートナーに対する5'アクリルアミド基）を、ポリアクリルアミド電気泳動メディウムの領域内で共重合し得る。核酸を重合可能な化学的グループに共有的に結合させるための方法の更なる例は、米国特許第5,932,711号; 米国特許第6,180,770号; 米国特許出願公開第2002/0172955号; 米国特許出願公開第2002/0197614号およびPCI Intl.公開第 98/51823号において見出される。重合体マトリックスおよびゲル内のタンパク質および小さい生体分子を固定化するために使用された他の方法の記載のためにまた、Rehman ら.(1999), Nucleic Acid Res. 27:649;Bille ら.(1989), Eur..J. Biochem. 180:41-47; Wang ら.(1997), Nature Biotechnology 15:789-793; Holtz ら.(1997), Nature 389:829-832;Timofeev ら. (1996), Nucleic Acids Res. 24:3142-3148; および米国特許第5,478,893号を参照。
【０１１７】
電気泳動装置
電気泳動のための装置は、一般的に非伝道性ハウジング、および電極により規定される空間的範囲においてメディウムを横切る電界を負荷するための電極の、少なくとも一対内に配置される電気泳動メディウムを含む。該ハウジングは、一般的に、実質的に平面のゲルの形態における、またはキャピラリー電気泳動、シリンダーまたはキャピラリーチューブにおける電気泳動メディウムの形態を含み、および規定する。他の形態および立体配置は、しかしながら、本発明に従って使用し得る。第２の範囲の電気泳動において、電極の第２の対は、メディウムを横切って第二の空間的範囲を規定する。一般的に、Giddings, 編, Unified Separation Science, John Wiley & Sons, New York(1991), p.155-170を参照。
【０１１８】
一次元の電気泳動のための従来の二電極装置を用い、電界転移ゲル電気泳動(Carle ら(1986), Science 232:65-68)における実施されるように、電界の逆転を、二電極の極性をスイッチすることによって簡単に達成することが出来る。パルス電界電気泳動（例えば、Schwartz ら.(1984), Cell 3 7:67）において使用されるように、二次元の電極配置は、本発明の分離過程を、２つの空間的範囲において実行させる。原則的に、第３の空間的範囲における電極操作の他のセットの追加は、所望により、更なる分離能力を追加し得る。
【０１１９】
１次元および２次元の電気泳動分離を実行するための計測および方法論の状態は、非常に進歩している。少なくとも１つの市販の装置（CHEF gel apparatus, Bio-Rad Life Science Research Products Catalog(1997),pp. 175-182）は、電界配向およびパルス持続のプログラム可能な自動制御による、二次元の電気泳動分離を実行する能力を提供する。
【０１２０】
本発明は更に、電気泳動メディウムがそれぞれの領域内に固定化された明確な結合パートナーを有する、少なくとも２つの領域を含む、電気泳動装置を提供する。いくつかの態様において、本発明は、電気泳動メディウムがそれぞれの領域内に固定化された明確な結合パートナーを有する、少なくとも３つの領域を含む、電気泳動装置またはシステムを提供する。少なくとも３つの領域を含むいくつかの態様において、隣接領域における結合パートナーは明確であるが、非隣接領域における結合パートナーは同様であり得る。
【０１２１】
装置の隣接領域を接触し得、または領域間で液体伝達させる隙間、スペーサーまたはセパレーターによって分離得る。該装置はまた、試験試料を導入させる試料入口チャンバ、または、メディウムから溶出した、溶媒および分子を除去させる、収集チャンバを含み得る。
【０１２２】
該装置はまた、全体の電気泳動メディウムまたは明確な領域の温度を調節するための方法を含み得る。
【０１２３】
該装置はまた、検出器が電気泳動メディウムの遠位の端に近づいて、試料前面（すなわち、メディウムを通じての試料の最も遠い進行(advance)のライン）を検出するための検出器を含み得る。図６を参照すると、試料を第一の領域201に適当しまたは導入する場合、電気泳動は、充填された分子を、第二の領域を通っておよび第三の領域203中に移動させる。検出器が第三の領域203の遠位の端に到達して、検出器は試料を検出し得、電界を逆転し、それによって電気泳動の方向を逆転する。他の検出器は第一領域201の反対の遠位の端に配置して、検出器が戻って試料前部を検出して、電界を再び逆転し、逆転された電界電気泳動の他のサイクルを引き起こし得る。染料を試験試料中に含んで、光学検出器による検出を促進し得る。あるいは、検出器は、抵抗における変化または試料中の溶液によって起こされる伝導性を検出し得る。
【０１２４】
該装置はまた、電界を定期的に逆転するタイマーを含み得る。例えば、一度、試料前部が電気泳動メディウムの末端に到達するのに必要な期間が決定されれば、タイマーがセットされ、決定された期間後、またはいくぶん短いまたは長い期間の後、電界を定期的に逆転する。
【０１２５】
該装置はまた、逆転電界電気泳動のサイクルの数を追跡するための定数装置を含み得る。例えば、計測装置は、電界のそれぞれの逆転を記録または登録し得、サイクルの決定前の数が到達した場合、計測装置をシグナル（例えば、可聴の、可視のまたは電子的な）にセットし得、または、サイクルの決定前の数が到達した場合、反復的逆転場電気泳動を終了させる。
【０１２６】
反復的逆転場電気泳動のためのシステム
本発明はまた、反復的逆転場電気泳動のためのシステムを提供する。かかるシステムは、電気泳動の装置（上記のようなもの、同様に該方法において使用し得る他の要素）を含む。例えば、該システムは、電気泳動メディウムを含むための非伝道性ハウジング、１つ以上の空間的範囲におけるメディウムを横切る電界を適用するためのハウジング内に配置された電極の１つ以上の対、および電気泳動メディウム自身を含み得る。
【０１２７】
いくつかの態様において、電気泳動メディウムは、１つの空間的範囲において配列された、少なくとも２つの領域を含み、一方、他の態様において、該メディウムは、１つ以上の空間的範囲において配列された３つ以上の領域を含む。それぞれの態様では、領域の少なくとも１つは、標的分子に対する選択的結合親和性を有する結合パートナーを含み、ある態様では、領域の少なくとも１つは、非標的分子に対する選択的結合親和性を有する結合パートナーを含む。
【０１２８】
いくつかのシステムにおいて、電気泳動メディウムは、１つの空間的範囲において配列された少なくとも３つの領域を含み、領域のそれぞれは、その領域に固定化され、それぞれの即座隣接領域における結合パートナーとは異なる結合パートナーを含む。ある態様において、少なくとも２つの非隣接領域は、同定的結合パートナーを有する。かくして、例えば、限定されないが、第１および第３の領域は、非標的分子に対する、異なるおよび同定的結合パートナーを含み得、第２の領域は、標的分子に対する結合パートナーを含み得る。
【０１２９】
任意に、該システムは、検出器が電気泳動メディウムの端に近づいて、試料前部を検出するための検出器を含み得る。ある態様では、検出器が試料前部を検出した後に、電界を逆転させる方法を含む。
【０１３０】
任意に、該システムは、逆転された電界電気泳動のサイクルの数を追跡するための計測装置を含み得る。ある態様では、サイクルの決定前の数が到達した場合にシグナルを出すため、またはサイクルの決定前の数が到達した場合に反復的逆転場電気泳動を終了させるための方法を含む。
【０１３１】
ある態様では、該システムはまた、少なくとも１つのセパレーター（網目のまたは半透過性の膜）を含み、これは、電気泳動メディウムの異なる領域を分離する。かかるセパレーターは、電気泳動のメディウムの領域の異なる領域を分離する。かかるセパレーターは電気泳動の間のビーズの移動を防止する充填容積のビーズを含む分離領域に対して、特に有用である。かくして、ある態様では、該システムは充填容積のビーズを含む電気泳動メディウムの少なくとも１つの領域と隣接するセパレーターを含む。
【０１３２】
均等物
本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から離れることなく、他の特定の形態に組み込まれ得る。前記の具体例は、それゆえ、本明細書に記載の発明における制限よりもむしろ、例示される全ての尊重において考えられる。本発明の範囲はかくして、前記によってよりもむしろ追加される特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の同等物の意味および範囲内である全ての変化は、本明細書に包含される。
【０１３３】
参照による取り込み
本明細書で引用された全ての出版物および特許文献は、それぞれ個別の出版物および特許文献が本明細書で取り込まれたような、同様の範囲への全ての目的に対するその全体において、参照として取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、溝を有する固相支持体中で行われた、本発明の方法の態様の概略図である。
【図２】図２は、多数の溝を有する固相支持体中で行われた、本発明の方法の態様の概略図である。
【図３】図３は、本発明の方法の実行で使用された、固相支持体の断面図である。
【図４】図４は、図３で示された断面図の概略図である。
【図５】図５は、二つの領域を持つ電気泳動メディウムを有する、本発明の電気泳動装置の概略図である。
【図６】図６は、三つの領域を持つ電気泳動メディウムを有する、本発明の電気泳動装置の概略図である。
【図７】図７は、二つの空間範囲中に配置された四つの領域を持つ電気泳動メディウムを有する、本発明の電気泳動装置の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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