(57)【要約】  本発明は、ヒト血漿で分泌されるポリペプチド形質、上記ポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、その多形変異型、並びに検出検定および病気の診断を目的とする上記核酸およびポリペプチドまたはその組成物の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血漿ポリペプチド（ＨＰＰ）の検出方法であって、
ｉ）生物学的試料をＨＰＰ結合吸着剤と接触させ、そして
ii）ＨＰＰ結合吸着剤へのＨＰＰの結合を検出および／または定量する
段階を含む方法。
【請求項２】
生物学的試料が血漿試料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＨＰＰ結合吸着剤がＨＰＰ特異的抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＨＰＰ結合吸着剤が基質に結合されている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出および／または定量段階が、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法、保持物質クロマトグラフィー、タンパク質アレイ、表面強化レーザー脱離／イオン化、および質量分析法から成る群から選択される方法を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種のヒト血漿ポリペプチド（ＨＰＰ）に特異的な吸着剤を含むタンパク質アレイ。
【請求項７】
個体における少なくとも１種のヒト血漿ポリペプチド（ＨＰＰ）の異常濃度の検出方法であって、
ｉ）個体から試料を入手し、
ii）試料における少なくとも１種のＨＰＰの第一レベルを測定し、そして
iii）対照試料の場合とレベルを比較する
段階を含み、第一レベルおよび対照レベル間の差異がＨＰＰの異常濃度の診断確定的なものである方法。
【請求項８】
ＨＰＰ−３８ポリペプチドの有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
癌疾患または過形成に関連する疾患または病状の処置方法であって、上記疾患に罹患しているヒトを含む哺乳類にＨＰＰ−３８ポリペプチドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１０】
過形成に関連する疾患または病状が、線維症、前立腺過形成、副腎過形成、子宮内膜増殖症、乾癬、炎症に起因する過形成から成る群から選択される疾患または病状である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
癌疾患または過形成に関連する疾患または病状の同定方法であって、
ｉ）ＨＰＰ−３８生物活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−３８ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、
ii）少なくとも１種のＨＰＰ−３８生物活性のレベルを測定し、
iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較し、そして
iv）癌疾患または過形成に関連する疾患または病状の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−３８モジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項１２】
表４に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、ＨＰＰ−３８生物活性レベルが測定される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＨＰＰ−３８の血漿レベルの検出を含む癌疾患または過形成に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、レベル増加が癌疾患または過形成に関連する疾患または病状を示すものである方法。
【請求項１４】
癌疾患または過形成に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、
ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表４で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そして
ii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較する
ことを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が癌疾患または過形成に関連する疾患または病状に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法。
【請求項１５】
配列番号３９７に示されたものを含むポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３９５または配列番号３９６に示されたアミノ酸配列を含む非アミド化ポリペプチド。
【請求項１７】
有効量のＨＰＰ−１３ポリペプチドまたはＧＰＡ１０１ポリペプチドまたはその組合わせおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
神経変性に関連する疾患または病状の処置方法であって、ＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１ポリペプチドまたはその組合わせの有効量を、上記疾患に罹患している哺乳類、例えばヒトに投与することを含む方法。
【請求項１９】
神経変性に関連する疾患または病状が、脊椎損傷またはＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、末梢神経障害、ギラン−バレー病、糖尿病性ニューロパシー、脱髄ニューロパシーから成る群から選択される疾患または病状である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
神経変性に関連する疾患または病状のモジュレーターの同定方法であって、
ｉ）ＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１生物活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、
ii）少なくとも１種のＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１生物活性のレベルを測定し、
iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較し、そして
iv）神経変性に関連する疾患または病状の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１ポリペプチドモジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項２１】
ＨＰＰ−１３生物活性レベルが、表１１に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより測定される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＨＰＰ−１３ポリペプチドの血漿レベルの検出を含む神経変性に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、レベル増加が神経変性に関連する疾患または病状を示すものである方法。
【請求項２３】
神経変性に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、
ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表１１で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そして
ii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較する
ことを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が神経変性に関連する疾患または病状に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法。
【請求項２４】
鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状の処置方法であって、ＨＰＰ−１３ポリペプチドの有効量を、上記疾患に罹患している哺乳類、例えばヒトに投与することを含む方法。
【請求項２５】
鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状が、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年型ヘモクロマトーシス、サラセミア、鉄過剰負荷に関連した病状、貧血、鎌状赤血球貧血から成る群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状のモジュレーターの同定方法であって、
ｉ）ＨＰＰ−１３生物活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−１３ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、
ii）少なくとも１種のＨＰＰ−１３生物活性のレベルを測定し、
iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較し、そして
iv）鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−１３モジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項２７】
ＨＰＰ−１３生物活性レベルが、表６、７、８、９および／または１０に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより測定される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＨＰＰ−１３ポリペプチドの血漿レベルの検出を含む鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、レベル増加が鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状を示すものである方法。
【請求項２９】
鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、
ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表６、７、８、９および／または１０で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そして
ii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較する
ことを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が鉄バランスまたは鉄輸送に関連する疾患または病状に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法。
【請求項３０】
有効量のＨＰＰ−２３ポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
血清グルコース調節障害を伴う疾患の処置方法であって、ＨＰＰ−２３ポリペプチドの有効量を、上記疾患に罹患している哺乳類、例えばヒトに投与することを含む方法。
【請求項３２】
血清グルコース調節障害を伴う疾患が糖尿病である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
代謝障害の処置方法であって、ＨＰＰ−２３ポリペプチドの有効量を、上記障害に罹患している哺乳類、例えばヒトに投与することを含む方法。
【請求項３４】
代謝障害がアミロイドーシスである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類、例えばヒトにおける血中グルコースレベルの低減化方法であって、哺乳類にＨＰＰ−２３ポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項３６】
血清グルコース調節障害を伴う病気または代謝疾患のモジュレーターの同定方法であって、
ｉ）ＨＰＰ−２３生物活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−２３ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、
ii）少なくとも１種のＨＰＰ−２３生物活性のレベルを測定し、
iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較し、そして
iv）血清グルコース調節障害を伴う病気または代謝疾患の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−２３モジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項３７】
ＨＰＰ−２３生物活性レベルが、表１２または１４に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより測定される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＨＰＰ−２３の血漿レベル検出を含む、血清グルコース調節障害を伴う病気または代謝疾患の予後または診断方法であって、レベル増加が血清グルコース調節障害を伴う病気または代謝疾患を示すものである方法。
【請求項３９】
血清グルコース調節障害を伴う病気または代謝疾患の予後または診断方法であって、
ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表１２または１４で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そして
ii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較する
ことを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が血清グルコース調節障害を伴う病気または代謝疾患に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法。
【請求項４０】
ＨＰＰ−２３ポリペプチドがアミド化されていない、請求項３１〜３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒト血漿で分泌されるポリペプチド形質（species）、上記ポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、その多型変異型、並びに検出検定法および病気の診断および医療処置を目的とする核酸およびポリペプチドまたはその組成物の使用に関するものである。
【０００２】
（背景）
多くの病気の症状は非特異的性質を有するため、医療従事者にとって確定的な診断を下すのは困難な場合が多い。患者の説明は変化し易く、不正確な場合が多い。より定量的な診断方法でも、個体間および単一個体での解釈間の両方において変動するというを欠点を有する。すなわち、診断の尺度は、標準化され、病歴が記録により十分に立証され、完璧である個体に適用されなければならない。これらの統制がある場合でさえ、全く異なる根元的条件についての症状が同一に思われることがあり得る。さらに、多くの深刻な状態が、要因の組合わせ、例えば神経精神疾患（例、統合失調症および双極性疾患、Johnston-Wilson et al.、Int J Neuropsychopharmacol、２００１、４：８３−９２参照）および代謝疾患（例、糖尿病、Gloynおよび McCarthy、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab、２００１、１５：２９３−３０８参照）から生じる。現行の診断方法では、ある観察結果または解釈についての根元的誘因（複数も有る）が明らかにされないことが多い。従って、特定の陽性結果に基づいた治療戦略は、原因となる問題に取組むものではないと思われ、場合によっては個体にとって有害なこともあり得る。
【０００３】
ヌクレオチド検出に頼る診断方法には、遺伝的方法および発現プロファイリングがある。例えば、特定疾患に関与することが知られている遺伝子は、一般的な遺伝子解析技術、例えばシーケンシング、ハイブリダイゼーションに基づく技術またはＰＣＲを用いることにより突然変異についてスクリーニングされ得る。別の例では、既知遺伝子からの発現が、ＲＴＰＣＲ、様々なハイブリダイゼーションに基づく技術、およびシーケンシングを含む標準技術により追跡され得る。これらの戦略では、医療従事者でもｍＲＮＡプロセッシングおよびスプライシング、翻訳速度、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳後修飾、例えばタンパク質加水分解的プロセッシング、リン酸化、グリコシル化およびアミド化における差異を検出できないことが多い。
【０００４】
当業界の診断状況における現時点での弱点に取組むため、本発明は、ヒト血漿で見出されるポリペプチドの範囲に関する新たな情報を提供する。ヒト血漿は、健康および病気の両方に関連したタンパク質の最も有用な供給源である。血漿は、活性タンパク質およびテルテール疾患マーカーを含むだけではない。それは、患者および対照対象の両方から非侵襲的にかなり大量に入手され得る（対照から大量に得るのが困難であることが多い、組織とは対照的である）。さらに、血液、血漿、および血清は、全く一般的に既存の臨床試験（例、ゲノム的方法）に使用される。しかしながら、血漿のタンパク質含有量に関与する細胞の多くは血液からは見出されないため、ゲノム的方法は制限される。最後に、血漿は流体であることから、プールされるため（同じく、組織とは対照的である）、分析用に大量の典型的試料が得られる。
【０００５】
血漿プロテオーム分析は、存在すると予測されるタンパク質が多数であり、少なくとも１１〜１２桁の範囲に及ぶことが知られている、絶えず変化する広範な濃度範囲の点で興味が引かれる方法である。非常に低濃度で存在するポリペプチドを同定および特性確認するためには、質量分析法による検出にとって十分な量を確保するのに大量の試料から出発することが必要である。例えば、有効な分離、消化および質量分析法による同定に１００ｆｍｏｌのタンパク質が要求される場合、試料サイズ１００μｌで少なくとも１ｎＭのタンパク質濃度が要求される。しかしながら、１リットルの試料が入手可能である場合、この必要最少濃度は１００ｆＭに下がる。
【０００６】
明細書に記載されている本発明は、この論理に由来する。試料プールを含む工業的規模（２.５Ｌ）方法については、小型タンパク質（分子量が約４０ｋＤ未満、ほとんどの場合２０ｋＤ未満の分子量）分析に関して詳述されている。ポリペプチドから生じる何千ものペプチドが、単一プールから同定された。本発明方法についての概念の証拠として、低存在量タンパク質、例えばレプチンおよびグレリンおよびペプチド、例えばブラジキニンが、明白に同定された。これは、ヒト血漿における小タンパク質が徹底分析された初めてのことである。すなわち、本発明は、血漿からはこれまでに見出されたことのないタンパク質を開示している。実際の血漿ポリペプチド形質を提供することにより、ｍＲＮＡプロセッシングおよびスプライシング、翻訳速度、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳後修飾における差異が明らかにされている。上記翻訳後修飾（例、タンパク質加水分解的プロセッシング、リン酸化、グリコシル化、およびアミド化）は、特定ポリペプチドの機能に影響を及ぼし得、実際にそうである場合が多い。さらに、血漿局在化は、本発明ポリペプチドについての新規でこれまでのところ未知の機能を指している。これらのポリペプチドは、「ヒト血漿ポリペプチド」またはＨＰＰとして記載されている。これらのポリペプチド配列は、表１に列挙した受託番号をもつポリペプチドに関連しており、表３に列挙したアミノ酸配列の一つまたはそれ以上を含むポリペプチド形質を含む。
【０００７】
本発明は、「ヒト血漿ポリペプチド」（ＨＰＰ）、ヒト血漿に存在するＨＰＰのフラグメント、および翻訳後修飾形質を開示している。本発明のＨＰＰは、診断および薬剤開発にとって重要なツールを意味する。ＨＰＰは、分泌因子であり、それ自体、例えば検出可能分子、タンパク質チップまたはモジュレーターにより検出およびターゲッティングが容易である。
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、ヒト血漿で分泌されるポリペプチド形質に関連した組成物に関するものである。これらのポリペプチド形質を、本明細書では「ヒト血漿ポリペプチド」またはＨＰＰと称す。上記ヒト血漿ポリペプチドは、表３のリストから選択されたアミノ酸配列を含む。組成物は、ＨＰＰ前駆体、ＨＰＰに特異的な抗体、例えばモノクローナル抗体およびそこから誘導される他の結合組成物を含む。さらに、これらの組成物の製造および使用方法も含まれる。本発明の前駆体は、非修飾前駆体、表３からの配列から成る群のタンパク質加水分解前駆体、および表３からの配列から成る群における別のタンパク質加水分解部位から生じる中間体を包含する。
【０００９】
本発明の好ましい態様は、翻訳後修飾、例えばリン酸化、グリコシル化、アセチル化、アミド化、またはＣ−、Ｎ−またはＯ−結合炭化水素基を有するＨＰＰを含む。さらに好ましいのは、分子内または分子間相互作用、例えば高秩序構造をもたらすジスルフィドおよび水素結合をもつＨＰＰである。また、差次的ｍＲＮＡプロセッシングまたはスプライシングから生じるＨＰＰも好ましい。好ましくは、ＨＰＰは、翻訳後修飾形質、構造変異型、または血漿に存在するスプライス変異型を意味する。
【００１０】
別の側面において、本発明は、表３に列挙された配列の群から選択される配列と少なくとも９５パーセント同一である配列を含むＨＰＰを含む。好ましくは、本発明は、表３から選択された配列のいずれか一つとの同一性が少なくとも９７パーセント、さらに好ましくは少なくとも９８パーセント、およびさらに好ましくは少なくとも９９パーセントであるポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明は、表３に列挙された配列の群から選択される配列と少なくとも９９パーセント同一である配列を含むポリペプチドを含む。
【００１１】
別の側面において、本発明は、選択された集団で少なくとも２パーセントの頻度を有するＨＰＰの天然変異型を含む。さらに好ましくは、上記天然変異型は、選択された集団において少なくとも５パーセント、さらに好ましくは少なくとも１０パーセントの頻度を有する。最も好ましくは、上記天然変異型は、選択された集団において少なくとも２０パーセントの頻度を有する。選択された集団は、集団遺伝学分野において認められた試験集団であり得る。好ましくは、選択された集団は、白色人種、黒色人種またはアジア人種である。さらに好ましくは、選択された集団は、フランス人、ドイツ人、イギリス人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、アイルランド人、韓国人、シンガポール人、アイスランド人、北アメリカ人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシア人、イタリア人、ポーランド人、太平洋諸島人、フィンランド人、ノルウェー人、スウェーデン人、エストニア人、オーストリア人、またはインド人である。さらに好ましくは、選択された集団は、アイスランド人、サーメ（ラップ）人、フィンランド人、白色人種系フランス人、スイス人、中国系シンガポール人、韓国人、日本人、ケベック人、北アメリカピマインディアン、ペンシルベニアアーミッシュおよびアーミッシュメノナイト、ニューファンドランド人またはポリネシア人である。
【００１２】
本発明の好ましい側面は、単離ＨＰＰ、すなわちＨＰＰとは著しく異なる等電点または著しく異なる見かけ上の分子量を有するタンパク質またはタンパク質イソ型を不含有のＨＰＰを含む組成物を提供する。ＨＰＰの等電点および分子量は、親和力およびサイズに基づく分離クロマトグラフィー、２次元ゲル分析、および質量分析法により示され得る。
【００１３】
追加的側面において、本発明は修飾ＨＰＰを含む。上記修飾には、保護／遮断基、抗体分子または他の細胞リガンドへの連鎖、および検出可能な標識、例えばタンパク質の検出および単離を可能にする酵素、蛍光、同位体またはアフィニティー標識がある。化学的修飾は、限定されるわけではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元またはツニカマイシンの存在下における代謝合成を含む公知技術により実施され得る。
【００１４】
また、本発明は、追加的利点、例えばポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少をもたらし得る本発明ポリペプチドの化学的に修飾された誘導体（例、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール）を提供する。ＨＰＰは、分子内のランダムな位置、または分子内の予め定められた位置で修飾され、１、２、３個またはそれ以上の結合された化学部分を含み得る。
【００１５】
別の側面において、本発明は、診断および分析検定法（例、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションに基づく技術）を目的とする、本発明のＨＰＰをコード化するポリヌクレオチド、表３で列挙された配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、上記配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＨＰＰ遺伝子配列に相補的なオリゴヌクレオチドを包含する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ＨＰＰをコード化するＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明はまた、上記ベクターを含む宿主細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を含む。
【００１７】
また、ＨＰＰまたはＨＰＰ前駆体の製造方法も提供される。好ましい一方法は、（ａ）上記で開示された発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、（ｂ）ＤＮＡセグメントが発現される条件下で宿主細胞を培養し、そして（ｃ）ＤＮＡセグメントによりコード化されたタンパク質を回収する段階を含む。別の好ましい方法は、（ａ）ＨＰＰを発現し得る宿主細胞を提供し、（ｂ）ＨＰＰを発現させ得る条件下で宿主細胞を培養し、そして（ｃ）ＨＰＰを回収する段階を含む。一態様内において、発現ベクターは、さらにＤＮＡセグメントに機能し得るように結合された分泌シグナル配列を含み、細胞はタンパク質を培養培地へ分泌し、タンパク質は培地から回収される。ＨＰＰの特に好ましい製造方法は、「ＨＰＰ組成物の化学的製造」と題する項および実施例２で記載されている、標準ペプチド合成技術を用いた化学合成を含む。
【００１８】
別の側面において、本発明は、上記ポリペプチド、ペプチドフラグメント、またはペプチドのいずれかに特異的な単離抗体を含む。好ましくは、本発明抗体はモノクローナル抗体である。さらに好ましいのは、特異的または排他的にＨＰＰに結合する抗体、すなわち高い親和力で他のポリペプチドを認識することのない抗体である。抗ＨＰＰ抗体は、精製、検出、診断および予後的適用性を有する。精製および検出に好ましい抗ＨＰＰ抗体は、標識基に結合される。検出方法には、限定されるわけではないが、ＨＰＰ抗原に特異的な抗体または抗体由来の組成物を使用するものがある。好ましい検出方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。上記の１つまたはそれ以上の抗体を医薬上許容される担体と一緒に含む組成物もまた、例えばインビボ検出を目的として、本発明の範囲内に含まれる。
【００１９】
特異的組織試料および生物学的流体（好ましくは血漿）においてＨＰＰを同定するための検出方法は、本発明の一部を形成する。細胞に基づく試料からＨＰＰ発現を同定するための検出方法もまた包含される。
【００２０】
さらに本発明は、体液、好ましくは血漿試料において少なくとも一つのＨＰＰのレベルを検出することを含む方法を提供する。さらに、組織および生物学的流体、好ましくは血漿におけるＨＰＰの量の検出および測定を目的とする、ＨＰＰ遺伝子および／またはメッセンジャーＲＮＡに相補的なプライマーおよび抗ＨＰＰ抗体を含む、ＨＰＰ組成物の使用方法も含まれる。さらに、本発明は、質量分析法、保持物質クロマトグラフィー（タンパク質アレイを含む）、および表面強化レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）技術を含む検出方法を含む。これらの方法はまた、臨床スクリーニング、診断、治療結果のモニター、特定治療処置に応答する可能性が最も高い患者の同定に適切である。
【００２１】
本発明は、上記で列挙した方法で使用され得、単一または多数の調製物、吸着剤および基質材料、抗体、標識基、必要ならば他の試薬および使用説明書を含み得るキットを提供する。キットは、診断または新規診断薬剤を同定するための検定法に使用され得る。
【００２２】
好ましい態様において、少なくとも一つの本発明ＨＰＰの血漿レベル増加が検出されたということは、ＨＰＰ増加に関連するＨＰＰ疾患の危険性が増加したことを示している。好ましくは、上記検出は、個体についてのＨＰＰ疾患を発現する見込みが、少なくとも１.０５倍、１.１倍、１.１５倍およびさらに好ましくは少なくとも１.２倍に増加したことを示す。別法として、特異的ＨＰＰにより、少なくとも一つの本発明ＨＰＰの血漿レベル減少が検出されたということは、個体についてＨＰＰ増加に関連するＨＰＰ疾患の危険性が増加したことを示している。対照試料と比較した場合の個体で観察されるＨＰＰの増加または減少の量は、予測の確実性と相関関係を示す。個々の血漿ＨＰＰレベルは、家族歴および他の危険因子により異なるため、好ましくは各々について個別に調査する。好ましい態様において、ＨＰＰは、本発明方法によりヒト血漿試料で検出される。特に好ましい技術は、質量分析法、保持物質クロマトグラフィー（タンパク質アレイを含む）、および免疫検出法である。好ましくは、予後または診断は、対照との比較において実験的ＨＰＰレベルでの少なくとも１.１、１.１５、１.２、１.２５およびさらに好ましくは１.５倍増加（または減少）に基づいている。
【００２３】
本発明のさらなる側面については、明細書および請求の範囲にも記載されている。
【００２４】
（発明の詳細な記載）
下記で詳述されている本発明は、ヒト血漿のスクリーニングおよび診断に、特定治療処置に応答する可能性が最も高い個体の同定に、そして治療結果のモニターに有用な組成物、方法、およびキットを提供する。限定するわけではないが、開示内容を明確にするため、本発明を血漿試料の分析に関して説明する。しかしながら、当業者であれば、下記検定法および技術は、他の生物学的流体試料（例、脳脊髄液、リンパ液、胆汁、血漿、唾液または尿）または組織試料にも適用され得ることは容易に理解できるはずである。本発明の方法および組成物は、生きている個体のスクリーニング、診断および予後に有用であるが、また個体における検死解剖にも使用され得る。
【００２５】
（定義）
本明細書で使用されている「核酸」および「核酸分子」の語は、ＤＮＡ分子（例、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を包含するものとする。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。本明細書全体を通して、「ヌクレオチド配列」という表現は、普通にポリヌクレオチドまたは核酸を表すのに使用され得る。さらに正確には、「ヌクレオチド配列」の表現は、核酸物質それ自体を包含するため、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特性確認する配列情報（すなわち、４塩基文字間で選択される一連の文字）に限定されるわけではない。また、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」の語は、本明細書では互換的に使用される。
【００２６】
「単離（された）」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されているものである。好ましくは、「単離（された）」核酸は、核酸が誘導される生物体のゲノムＤＮＡにおいて天然で核酸の両端に隣接する配列（すなわち、核酸の５'および３'末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な態様において、単離ＨＰＰ核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然で核酸分子の両端に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂまたは０.１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、他の細胞材料、または遺伝子組換え技術により製造されたときには培養培地を実質的に含んでおらず、または化学合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質について実質的に不含有であり得る。ハイブリダイゼーションプローブとして核酸の全部または一部分を用いることにより、ＨＰＰ核酸分子は、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて単離され得る（例、Sambrook, J.、Fritsh, E. F.および Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第２版に記載、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９）。
【００２７】
本明細書で使用されている「ベクター」の語は、それが結合されているもう一つの核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの一タイプは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状２本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがそのウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自己複製し得る（例、細菌複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組込まれることにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能し得るように結合されている遺伝子の発現を指令し得る。上記ベクターを本明細書では「発現ベクター」と称す。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。プラスミドが最もよく使用されるベクター形態であるため、本明細書において「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等内容の機能を果たす上記の発現ベクターの他形態、例えばウイルスベクター（例、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含するものとする。
【００２８】
本明細書で使用されている「とハイブリダイゼーションする」の語は、緩和なストリンジェンシーまたは高度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションについての条件を述べたものとし、好ましくはハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、互いに少なくとも６０％相同性であるヌクレオチド配列を互いにハイブリダイゼーションしたままにさせ得るものである。好ましくは、条件は、典型的には、互いに少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％相同性である配列が互いにハイブリダイゼーションしている状態を維持するものである。ストリンジェント条件は、当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９８９）、６.３.１−６.３.６に記載されている。好ましい、非限定的な例では、核酸相互作用についてのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：ハイブリダイゼーション段階は、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精液ＤＮＡの存在下６５℃で実施される。ハイブリダイゼーション段階に続いて以下の４洗浄段階を実施する：
−好ましくは２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中６５℃で、５分間２洗浄；
−好ましくは２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中６５℃で、３０分間１洗浄；
−好ましくは０.１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中６５℃で、１０分間１洗浄；
これらのハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸分子に適切である。上記ハイブリダイゼーション条件は、当業者によく知られた技術に従って、所望の核酸長に応じて適合化され、例えばHames B. D.およびHiggins S. J.（１９８５）Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach. Hames および Higgins 編、ＩＲＬプレス、オックスフォード、および Current Protocols in Molecular Biologyに開示されている内容に従って適合化されるものとする。
【００２９】
本明細書で使用されている「相同性パーセント」とは、核酸配列およびアミノ酸配列の両方に対するものである。アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等内容である。２アミノ酸配列または２核酸の相同性パーセントを測定するため、最適な比較目的で配列を平行に整列させる（例、第二アミノ酸または核酸配列と最適な形で平行整列させるためギャップが第一アミノ酸の配列または核酸配列に導入され得、非相同性配列は比較目的のために無視され得る）。比較目的のために平行整列させたレファレンス配列の長さは、レファレンス配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、およびさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列における位置が第二配列における対応位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められているとき、分子はその位置で相同性である。２配列間の相同性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数・１００）。
【００３０】
２配列間における配列比較および相同性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを用いて実施され得る。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin および Altschul（１９９３）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：５８７３−７７で修正されている、Karlinおよび Altschul（１９９０）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschul et al.（１９９０）J. Mol. Biol. ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２.０）に組込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することにより、本発明配列と相同的なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することにより、本発明ポリペプチド配列と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るため、Altschul et al.（１９９７）Nucleic Acids Research ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載された要領でギャップＢＬＡＳＴが使用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、それぞれのプログラム（例、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。http://www.ncbi.nlm.nih.gov 参照。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、CABIOS（１９８９）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）に組込まれる。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いるとき、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用され得る。
【００３１】
「ポリペプチド」の語は、ポリマーの長さとは関係無く、アミノ酸のポリマーを包含する。すなわち、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に包含される。この語はまたポリペプチドの翻訳後修飾を特定または排除するものではないものとし、例えば、グリコシル、アセチル、リン酸、アミド、脂質、カルボキシル、アシル、または炭化水素基の共有結合を含むポリペプチドは、明白にポリペプチドの語に包含される。また、アミノ酸の１個またはそれ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸、非関連生物系においてのみ天然に存在するアミノ酸、哺乳類系からの修飾アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換連鎖を伴うポリペプチド、並びに天然および非天然に存するものの両方を含む、当業界で公知の他の修飾体も定義の範囲内に含まれる。
【００３２】
本明細書で使用されている「タンパク質」の語は、「ポリペプチド」の語と同義的に使用され得るか、またはさらに、ペプチド結合以外の結合により結合され得る２つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体を包含し得、例えば、タンパク質を構成する上記ポリペプチドはジスルフィド結合により結合され得る。「タンパク質」の語はまた、特に上記タンパク質が真核生物宿主で発現されたときに付加され得る、同一アミノ酸配列ではあるが異なる翻訳後修飾を有する一群のポリペプチドを包含し得る。
【００３３】
「単離」または「精製」タンパク質またはその生物学的活性部分は、本発明タンパク質（すなわち、ＨＰＰまたはその生物活性フラグメント）が誘導される細胞または組織供給源からの細胞物質または他の汚染タンパク質を実質的に含まないものとし、または化学合成時における化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものとする。「細胞物質を実質的に含まない」の語は、本発明タンパク質が単離または遺伝子組換により製造される細胞の細胞成分からタンパク質が分離されているタンパク質調製物を含む。一態様において、「細胞物質を実質的に含まない」の語は、本発明タンパク質以外のタンパク質（本明細書では「汚染タンパク質」とも称す）の割合が約３０％未満（乾燥重量にして）、さらに好ましくは本発明タンパク質以外のタンパク質の割合が約２０％未満、さらに好ましくは本発明タンパク質以外のタンパク質の割合が約１０％未満、そして最も好ましくは本発明タンパク質以外のタンパク質の割合が５％未満である本発明タンパク質の調製物を含む。本発明によるタンパク質またはその生物活性部分が遺伝子組換えにより製造されたときもまた、好ましくは培養培地を含まないものとし、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましく約５％未満であるものとする。
【００３４】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という語は、本発明タンパク質が化学的前駆体またはタンパク質合成に関与する他の化学物質から分離されているタンパク質調製物を含む。一態様において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」の語は、化学的前駆体または非タンパク質化学物質の割合が約３０％未満（乾燥重量にして）、さらに好ましくは化学的前駆体または非タンパク質化学物質の割合が約２０％未満、さらに好ましくは化学的前駆体または非タンパク質化学物質の割合が約１０％未満、そして最も好ましくは化学的前駆体または非タンパク質化学物質の割合が約５％未満である本発明タンパク質の調製物を含む。
【００３５】
本明細書で使用されている「組換えポリペプチド」の語は、人工的に設計されたもので、最初の自然環境では連続したポリペプチド配列としては見出されない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチド、または組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドをいう。
【００３６】
「漿」は、血液およびリンパ液の液体部分をいい、体積の約半分を構成する。漿は細胞不含有であり、血清とは異なり、凝固していない。血漿は、抗体および他のタンパク質を含む。個体から採取された血液は、多くの場合遠心分離にかけることにより細胞成分が除去される。別の血漿分離方法には、米国特許第６２４１８８６号に記載されている、滅菌濾過が含まれる。
【００３７】
「ヒト血漿ポリペプチド」または「ＨＰＰ」の語は、表１に列挙された受付番号のいずれか一つにより記載された配列を含むポリペプチドまたは表３の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列をいう。上記ポリペプチドは、本明細書記載の要領で翻訳後修飾され得る。ＨＰＰはまた、他の構造的または化学的修飾、例えばジスルフィド結合またはアミノ酸側鎖相互作用、例えば複雑な二次または三次構造をもたらす水素およびアミド結合を含み得る。ＨＰＰはまた、突然変異ポリペプチド、例えば欠失、付加、置換（スワップ）または先端切除突然変異体、上記ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、および表３の配列の少なくとも３個、好ましくは８、１０、１２、１５または２１連続アミノ酸のポリペプチドフラグメントを包含する。さらに、表３からの配列から成る群から選択される配列のＨＰＰタンパク質加水分解前駆体および中間体も含まれる。本発明は、表３からの配列により構成されるか、本質的にそれらにより構成されるか、またはそれらを含む単離ＨＰＰを含む、ＨＰＰ遺伝子またはＨＰＰｍＲＮＡ形質、好ましくはヒトＨＰＰ遺伝子およびｍＲＮＡ形質の核酸配列によりコード化されるポリペプチドを包含する。好ましいＨＰＰは、表３からのＨＰＰの少なくとも一つの生物活性を保持している。
【００３８】
本明細書で使用されている「生物活性」の語は、ＨＰＰにより実行される機能をいう。これには、（１）ヒト個体の血流全体にわたる循環、（２）抗原性、または抗ＨＰＰ特異的抗体との結合能力、（３）免疫原性、または抗ＨＰＰ特異的抗体産生能力、および（４）ＨＰＰ標的分子または吸着剤との相互作用があるが、限定されるわけではない。
【００３９】
「ＨＰＰ関連障害」または「ＨＰＰ関連疾患」は、本発明ＨＰＰに関連していることが知られている医学的状態をいう。ＨＰＰ関連障害は、ＨＰＰまたはＨＰＰポリヌクレオチドの異常レベルの存在が、個体がその状態に罹患しているかまたは発現する危険があることを示すものである状態を包含する。ＨＰＰ関連障害はまた、ＨＰＰまたはＨＰＰポリヌクレオチドの異常形態（例、突然変異、先端切除、生物活性の増加または減少、異常な翻訳後修飾またはプロセッシングに起因）の存在が、個体がその状態に罹患しているかまたはそれを発現する危険があることを示すものである状態を包含する。
【００４０】
本発明の別の側面は、抗ＨＰＰ抗体に関するものである。本明細書で使用されている「抗体」の語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち抗原、例えばＨＰＰ、またはその生物活性フラグメントまたは相同体と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。好ましい抗体は、ＨＰＰと排他的に結合し、高い親和力で他のポリペプチドを認識することはない。免疫グロブリン分子の免疫活性部分の例には、抗体を酵素、例えばペプシンで処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ'）２フラグメントがある。本発明は、ＨＰＰまたはその生物活性フラグメントまたは相同体と結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用されている「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」の語は、ＨＰＰの特定エピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の唯一の形質を含む抗体分子の集団をいう。すなわちモノクローナル抗体組成物は、典型的にはそれが免疫反応する特定ＨＰＰについての単一結合親和力を示す。好ましいＨＰＰ抗体は、標識基に結合されている。
【００４１】
本明細書で使用されている「標識基」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（抗体を含む）に結合されたときに、上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出または精製を可能にする化合物である。標識基は、標識基に特異的な抗体を含む、二次化合物により直接的または間接的に検出または精製され得る。有用な標識基には、放射性同位元素（例、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）、蛍光化合物（例、５−ブロモデスオキシウリジン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリスリンアセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）、ルミネセンス化合物（例、ルミノール、ＧＦＰ、ルシフェリン、エクオリン）、酵素または酵素補因子検出可能標識（例、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ）、または二次因子、例えばストレプトアビジン、ＧＳＴ、またはビオチンにより認識される化合物がある。好ましくは、標識基は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物活性を妨げることのない形でポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合される。
【００４２】
放射性同位元素は、放射線の直接計数、フィルム露出、または例えばシンチレーション計数管により検出され得る。酵素標識は、通常蛍光反応を誘発する生成物への適切な基質の変換の測定により検出され得る。蛍光およびルミネセンス化合物および反応は、例えば放射線、蛍光顕微鏡、蛍光活性化細胞選別、またはルミノメーターにより検出され得る。
【００４３】
「吸着剤」は、ポリペプチド（すなわち、ＨＰＰ）を吸着し得る物質をいう。本明細書で使用されている「吸着剤」の語は、ポリペプチドが曝露される単一物質（「モノプレックス吸着剤」）（例、化合物または官能基）、および試料が曝露される複数の異なる物質（「マルチプレックス吸着剤」）の両方を包含する。マルチプレックス吸着剤における吸着物質は、「吸着形質」と称される。例えば、基質における取組み可能な位置は、多くの異なる吸着形質（例、アニオン交換物質、金属キレート化剤または抗体）を特徴とし、異なる結合特性を有するマルチプレックス吸着剤を含み得る。誘引のベースは、一般的に化学的または生物学的分子認識の機能である。吸着剤およびポリペプチド間における誘引のベースには、例えば（１）塩促進相互作用、例えば疎水性相互作用、チオフィリック相互作用、および固定化染料相互作用、（２）水素結合および／またはファンデルワールス力相互作用および電荷移動相互作用、例えば親水性相互作用の場合、（３）静電相互作用、例えばイオン電荷相互作用、特に正または負イオン電荷相互作用、（４）ポリペプチドの吸着剤における金属イオンとの配位共有結合形成（すなわち配位錯体形成）能力、（５）酵素活性部位結合、（６）可逆的共有結合相互作用、例えばジスルフィド交換相互作用、（７）糖タンパク質相互作用（８）生体特異的相互作用、または（９）上記相互作用形式の２つまたはそれ以上の組合わせがある。すなわち、吸着剤は、２つまたはそれ以上の誘引ベースを呈し得るため、「混合官能性」吸着剤として知られ得る。
【００４４】
本発明のＨＰＰ
本発明のヒト血漿ポリペプチド（ＨＰＰ）は、表１および３に記載されている。表３からの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＰＰおよびそのフラグメントは、血漿で分泌され、循環する。
【００４５】
本発明のＨＰＰは、ヒト血漿からはこれまで見出されたことのない公知ポリペプチドである。すなわち、本発明は、これらのポリペプチドについての新たな役割または機能を紹介する。表１に列挙されたＨＰＰは、表１に記載されている通り、血漿から見出されるとは予測されていないポリペプチド形質を包含する。
【００４６】
本明細書で使用されている「ヒト血漿ポリペプチド」および「ＨＰＰ」の語は、本発明のあらゆるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を全て包含する。また、本発明のポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチド、および上記ポリペプチドを含む融合ポリペプチドも本発明の一部を形成する。本発明は、表３の配列から成る群から選択されたアミノ酸配列により構成されるか、本質的にそれにより構成されるか、またはそれを含む単離または精製ＨＰＰを含む、ヒト由来のＨＰＰを包含する。さらに、表３の配列から成る群から選択される配列の非修飾前駆体、タンパク質加水分解前駆体および中間体も包含される。
【００４７】
本発明は、表３の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸の連続範囲を含む単離、精製、および組換えポリペプチドフラグメントを包含しており、上記フラグメントはＨＰＰ生物活性を有するものとする。包含される態様において、アミノ酸の連続伸長部は、ＨＰＰ配列におけるアミノ酸の欠失、付加、置換（スワップ）または先端切除を含む一突然変異または機能的突然変異の部位を含む。本発明はまた、本発明のＨＰＰヌクレオチド配列、またはその相補的配列によりコード化されるポリペプチドまたはそのフラグメントに関するものである。上記ポリペプチドフラグメントは、ヒト血漿に存在する実際のペプチド形質を示し得る。上記ポリペプチドフラグメントは、例えばＨＰＰ特異的抗体の産生または別タイプのＨＰＰ特異的吸着剤の設計に使用され得る。
【００４８】
本発明の一側面は、単離ＨＰＰ、およびその生物活性部分、並びに抗ＨＰＰ抗体を産生させるための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントに関するものである。一態様において、天然ＨＰＰペプチドは、標準的タンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームにより血漿、細胞または組織供給源から単離され得る。別の態様において、ＨＰＰは、組換えＤＮＡ技術により生成される。組換え発現に代わるものとして、ＨＰＰは、「ＨＰＰ組成物の化学的製造」と題する項および実施例２の記載に従ってペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
【００４９】
典型的には、生物活性部分は、ＨＰＰの少なくとも一活性をもつドメインまたはモチーフを含む。生物活性ＨＰＰは、例えば、表３からの配列から成る群から選択される配列からの少なくとも１、２、３または５アミノ酸変化を含むか、または表３からの配列から成る群から選択される配列からのアミノ酸の少なくとも１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１５％の変化を含み得る。
【００５０】
ＨＰＰの特性確認
本発明ポリペプチド、ＨＰＰは、表３のポリペプチドおよび表１に列挙された受託番号により特定される。これらのペプチドは、実施例１記載の要領で、ヒト血漿から単離され、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔ（登録商標）方法に従って特性確認された。各ＨＰＰについて、表１は、以下の内容を提供する：
・関連ポリペプチド配列に対応する、公開データベースにおける受託番号；
・公開データベースにおけるポリペプチドに関して観察されたポリペプチドを特定するアミノ酸位置；
・以下の鍵による、３範ちゅうへの分類
・ａ：血漿性であることが以前には知られていなかったタンパク質、分泌されると思われる。
・ｂ：血漿性であることが以前には知られていなかったタンパク質、細胞漏出によるものと思われる。
・ｃ：分類されていないタンパク質−それらの大部分は、例えばＤＮＡから予測される、新規タンパク質である。
【００５１】
表１に列挙された受託番号の大部分は、ＳｗｉｓｓＰＲＯＴ／ＴｒＥＭＢＬデータベースについてのレファレンスであり、それらは両方とも公的に入手可能である、例えばhttp://www.expasy.ch.。しかしながら、ＨＰＰ４０〜５７は、表１で詳述されている通り、公開特許出願で現われる配列として特定される。さらに、ＨＰＰ受託番号５８〜６１についての受託番号は、表１で詳述されている通り、ＧｅｎＢａｎｋエントリーで若干のソフトウェアを使うことにより得られる予測タンパク質配列に対応する。ＨＰＰ１〜４についての受託番号は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でＮＣＢＩから入手可能なタンパク質エントリーを示す。最後に、ＨＰＰについての受託番号はＥＳＴを示し、その配列はｄｂＥＳＴデータベース、例えばＮＣＢＩから、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で入手可能である。
【００５２】
【表１】
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【表２】
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【００５３】
本発明のＨＰＰは全て、分子量が２０ｋＤ未満または前後である。低存在量タンパク質（レプチンおよびグレリン）およびペプチド（ブラジキニン）の明白な同定により、本発明検出方法の感度が確認される。
【００５４】
初回分離は、カチオン交換クロマトグラフィーカラムにおけるものであり、増加塩濃度で溶離される。１８のフラクションを集める。表３におけるＣＥＸ欄は、どのフラクションが各ＨＰＰについてのトリプシンペプチドを含んだかを列挙している。表２は、本明細書実施例１の段階３に記載されたプロトコルによる、各フラクションが溶離されたＮａＣｌ濃度を提供する。カチオン交換による分離は、ポリペプチド形質の全体的正電荷の指標を与える。カチオン交換に続いて、逆相ＨＰＬＣ分離が実施される。表３におけるＲＰ１欄は、３０フラクションのうちどのトリプシンペプチドが各ＨＰＰについて溶離されたかを列挙している。表２は、実施例１の段階４に記載されたプロトコルによる、溶離条件（％Ｂ）を提供する。逆相による分離は、ポリペプチド形質の全体的疎水性の指標を提供する。最後に、各ＨＰＰについて、表３は、各ＣＥＸフラクションおよび各ＲＰ１フラクションについて、これらのトリプシンが検出されたＲＰ２フラクション（各トリプシン配列後の括弧内）と一緒に、これらのフラクションから検出されたトリプシンのリストを提供する。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
表３
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【００５７】
ＨＰＰ核酸
本発明の一面は、本明細書でさらに詳述されているＨＰＰまたはその生物学的活性部分をコード化する精製または単離核酸分子、並びにその核酸フラグメントに関するものである。上記核酸は、例えば本明細書でさらに詳述されている検出方法において使用され得る。
【００５８】
本発明の一目的は、ＨＰＰ、それと相補的な配列、およびそのフラグメントをコードする精製、単離、または組換え核酸である。本発明はまた、ＨＰＰをコードするポリヌクレオチドとの少なくとも９５％ヌクレオチド同一性、有利には９９％ヌクレオチド同一性、好ましくは９９.５％ヌクレオチド同一性および最も好ましくはＨＰＰをコードするポリヌクレオチド、またはそれと相補的な配列またはその生物学的活性フラグメントとの９９.８％ヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含む精製または単離核酸に関するものである。本発明の別の目的は、ＨＰＰをコードするポリヌクレオチド、またはそれと相補的な配列またはその変異型またはその生物学的活性フラグメントと、本明細書記載のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組換え核酸に関するものである。
【００５９】
別の好ましい面において、本発明は、ＨＰＰの一部分または変異型をコード化する精製または単離核酸分子に関するものであり、その一部分または変異型は、ＨＰＰ生物学的活性を示す。好ましくは、上記一部分または変異型は、天然ＨＰＰまたはその前駆体の一部分または変異型である。
【００６０】
本発明の別の目的は、表３からの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それにより本質的に構成されるか、またはそれにより構成されるＨＰＰをコード化する精製、単離または組換え核酸であり、単離核酸分子は一つまたはそれ以上のモチーフ、例えば標的結合部位をコード化するものとする。
【００６１】
「ＨＰＰの生物学的活性部分」をコード化する核酸フラグメントは、ＨＰＰをコードするヌクレオチド配列の一部分であって、ＨＰＰ生物学的活性を有するポリペプチドをコード化する部分を単離し、ＨＰＰのコード化部分を（例、インビトロまたはインビボ組換え発現により）発現させ、そしてＨＰＰのコード化部分の活性を評価することにより製造され得る。
【００６２】
さらに本発明は、遺伝コードの縮重故に本発明ＨＰＰヌクレオチド配列とは異なるが、本発明の同じＨＰＰをコード化する核酸分子も包含する。
【００６３】
上記ＨＰＰヌクレオチド配列に加えて、当業者であれば、ＨＰＰのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列多型が一集団（例、ヒト集団）内に存在し得ることは容易に理解できるはずである。上記遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異故に一集団内の個体間に存在し得る。上記天然対立遺伝子変異は、典型的にはＨＰＰコード化遺伝子のヌクレオチド配列または核酸配列に１〜５％の変動をもたらし得る。
【００６４】
本発明ＨＰＰ核酸の天然対立遺伝子変異型および相同体に対応する核酸分子は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での標準ハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書で開示されているｃＤＮＡまたはその一部分を用いることにより、本明細書で開示されているＨＰＰ核酸とのそれらの相同性に基づいて単離され得る。
【００６５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかによりコード化されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するものとする。
【００６６】
ＨＰＰ核酸の使用
ＨＰＰをコード化するポリヌクレオチド配列（またはその相補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含め、様々な適用性を有する。さらに、ＨＰＰコード化核酸は、本明細書に記載されている通り、遺伝子組換え技術によるＨＰＰの製造に有用である。本明細書記載のポリヌクレオチドは、その配列変異型を含め、検出検定法で使用され得る。従って、体液または組織試料における上記ポリヌクレオチドの存在の検出は、本発明の一つの特徴である。本発明による核酸に基づく検出検定法の例には、限定されるわけではないが、ハイブリダイゼーション検定法（例、in situ ハイブリダイゼーションまたはヌクレオチドアレイ）およびＰＣＲに基づく検定法がある。本明細書に記載されている、延長されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、その配列変異型およびフラグメントは、上記検定法で使用されるハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーの生成に使用され得る。上記プローブおよびプライマーは、本明細書記載のＨＰＰポリヌクレオチドと類似しているかまたは相補的であるゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出し得る。
【００６７】
本発明は、ＰＣＲを実施することにより、本発明ポリヌクレオチドのセグメントを増幅させるプライマー対を包含する。一対の各プライマーは、１５〜３０ヌクレオチド間の長さを有するオリゴヌクレオチドであり、ｉ）対の一方のプライマーが本発明ポリヌクレオチドの一鎖と完全マッチした二重らせんを形成し、対の他方のプライマーが同ポリヌクレオチドの相補鎖と完全マッチ二重らせんを形成する、そしてii）対のプライマーが１０〜２５００ヌクレオチド間の距離により分離されたポリヌクレオチドにおける部位で上記の完全マッチ二重らせんを形成する形をとる。好ましくは、対の各プライマーのその各相補的配列へのアニーリング温度は実質的に同じである。
【００６８】
本発明ポリヌクレオチドから誘導されるハイブリダイゼーションプローブは、例えば、組織試料、例えば顕微鏡スライド上で調製された固定または冷凍組織片または懸濁細胞においてin situ ハイブリダイゼーションを実施する場合に使用され得る。簡単に述べると、標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、制御条件下、顕微鏡スライド上の組織片においてそのＤＮＡまたはＲＮＡ標的試料を結合させ得る。一般的に、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡベクターへクローン化された興味の対象であるＤＮＡから成るｄｓＤＮＡプローブがこの目的には使用されるが、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡプローブもまた使用され得る。プローブは、一般的に約１５〜４０ヌクレオチド間の長さのオリゴヌクレオチドである。別法として、プローブは、ＰＣＲランダムプライミングプライマー伸長またはプラスミドからのＲＮＡのインビトロ転写により生成されるポリヌクレオチドプローブ（リボプローブ）であり得る。これらの後者のプローブは、典型的には長さが数１００の塩基対である。プローブは、若干の標識基のいずれかにより標識され得、特定の検出方法は、プローブで使用される標識のタイプに対応する（例、適切なものとしてオートラジオグラフィー、Ｘ線検出、蛍光または視覚的顕微鏡分析）。反応物は、使用される検出用分子の標識に対して指向した免疫細胞化学技術、例えば蛍光標識プローブに存在するフルオレセイン部分に指向した抗体を用いることにより、その場でさらに増幅され得る。特異的標識および in situ 検出方法は、例えばHoward, G. C.編、Methods in Nonradioactive Detection、Appleton & Lange、ノーウォーク、コネティカット（１９９３）に記載されている（出典明示により援用する）。
【００６９】
ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーはまた、天然に存するポリペプチドをコード化する遺伝子のプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含む、本発明に従って同定された完全長タンパク質に対応するゲノム配列から選択され得る。ＨＰＰをコード化するヌクレオチド配列はまた、そのＨＰＰをコード化する遺伝子のマッピングおよび個体の遺伝子解析に用いられるハイブリダイゼーションプローブの構築に使用され得る。本発明のＨＰＰをコード化する遺伝子の変異型または突然変異をもつ個体は、様々な技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断に使用される核酸は、例えば組織生検および剖検材料を含む、患者の細胞から入手される。ゲノムＤＮＡは、検出に直接使用され得るか、または解析前にＰＣＲ（Saiki et al. Nature ３２４：１６３−１６６（１９８６））を用いることにより酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた、同じ目的に使用され得る。一例として、本発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、本発明遺伝子における突然変異の同定および解析に使用され得る。欠失および挿入は、正常遺伝子型と比べた増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを本発明の放射性標識ＲＮＡまたは別法として本発明の放射性標識アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせることにより同定され得る。特定位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護検定法、例えばリボヌクレアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例、Cotton, et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：４３９７−４４０１（１９８５））、または融解温度の差異により示され得る。「分子ビーコン」（Kostrikis L. G. et al.、Science ２７９：１２２８−１２２９（１９９８））、本発明核酸に相補的であるプローブ配列を含むヘアピン形状、１本鎖合成オリゴヌクレオチドもまた、点突然変異または他の配列変化の検出並びにＨＰＰ発現レベルのモニターに使用され得る。
【００７０】
ＰＣＲプライマーおよびプローブを含む本発明ヌクレオチドは、市販されている自動式ＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（フォスター・シティー、カリフォルニア）モデル３８０Ｂ、３９２または３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置における慣用的手段により合成され得る。好ましくは、ホスホルアミダイト化学作用が使用され、これは例えば以下の参考文献で開示されている：Beaucage およびIyer、Tetrahedron、４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Molko et al.、米国特許第４９８０４６０号、Koster et al.、米国特許第４７２５６７７号；Caruthers et al.、米国特許第４４１５７３２号、同第４４５８０６６号および同第４９７３６７９号。
【００７１】
本発明のプライマーおよびプローブはまた、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限および例えばNarang SA et al（Methods Enzymol １９７９；６８：９０−９８）のホスホジエステル法、Brown EL et al（Methods Enzymol １９７９；６８：１０９−１５１）のホスホジエステル法、Beaucage et al（Tetrahedron Lett １９８１、２２：１８５９−１８６２）のジエチルホスホルアミダイト法および欧州特許第０７０７５９２号記載の固体支持体法といった方法による直接的化学合成により製造され得る。
【００７２】
検出プローブは、一般的に核酸配列または非荷電核酸類似体、例えば国際公開第９２／２０７０２号に開示されているペプチド核酸、米国特許第５１８５４４４号、同第５０３４５０６号および同第５１４２０４７号に記載されているモルホリノ類似体である。所望ならば、プローブは、追加のｄＮＴＰがプローブに付加され得ないという点で「非伸長性」にされ得る。本質的に、そしてそれ自体、類似体は通常非伸長性であり、核酸プローブは、ヒドロキシル基がそれ以上延長に関与し得ないようにプローブの３'末端を修飾することにより非伸長性にされ得る。例えば、プローブの３'末端を捕捉または検出標識で官能性にすることにより、ヒドロキシル基は消費または他の形で遮断され得る。
【００７３】
本発明ポリヌクレオチドは、いずれも所望ならば顕微鏡、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出可能であることが当業界では公知である標識基を組込むことにより標識され得る。追加的な例には、Urdea et al.（Nucleic Acids Research、１１：４９３７−４９５７、１９８８）またはSanchez−Pescador et al.（J. Clin. Microbiol. ２６（１０）：１９３４−１９３８、１９８８）に記載された核酸フラグメントの非放射性標識がある。さらに、本発明によるプローブは、それらがシグナル増幅を可能にするような構造的特徴を有し得、上記の構造的特徴は、例えばUrdea et al（Nucleic Acids Symp. Ser, ２４：１９７−２００、１９９１）または欧州特許第ＥＰ０２２５８０７号（Chiron）により報告されているような分枝ＤＮＡプローブであり得る。
【００７４】
また、標識をプライマーの捕捉に使用することにより、固体支持体におけるプライマーまたはプライマー伸長産物、例えば増幅ＤＮＡの固定化が容易になり得る。捕捉標識は、プライマーまたはプローブに結合され、固相試薬特異的結合要員（例、ビオチンおよびストレプトアビジン）との結合対を形成する特異的結合要員になり得る。従って、ポリヌクレオチドまたはプローブが担う標識のタイプによって、それは標的ＤＮＡの捕捉または検出に使用され得る。さらに、本発明で提供されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それら自体、捕捉標識としての機能を果たし得ることがわかる。例えば、固相試薬結合要員が核酸配列である場合、それがプライマーまたはプローブの相補的部分と結合することにより、プライマーまたはプローブを固相に固定化するように選択され得る。ポリヌクレオチドプローブそれ自体が結合要員としての機能を果たす場合、当業者であれば、プローブが、標的とは相補的ではない配列または「テイル」を含むことは容易に認めるはずである。ポリヌクレオチドプライマーそれ自体が捕捉標識としての機能を果たす場合、プライマーの少なくとも一部分が遊離していることにより、固相上の核酸とハイブリダイゼーションする。ＤＮＡ標識技術は、当業者にはよく知られている。
【００７５】
本発明プローブは、若干の目的に有用である。それらは特にゲノムＤＮＡとのサザーンハイブリダイゼーションで使用され得る。プローブはまた、ＰＣＲ増幅産物の検出に使用され得る。それらはまた、他の技術を用いてＨＰＰコード化遺伝子またはｍＲＮＡにおける誤対合を検出するのにも使用され得る。
【００７６】
本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブは、いずれも固体支持体に好都合に固定化され得る。固体支持体は当業者には公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、微粒子、例えばラテックス粒子、ヒツジ（または他の動物）赤血球、デュラサイト（duracyte）などが挙げられる。固体支持体については厳密なものではなく、当業者により選択され得る。すなわち、ラテックス粒子、微粒子、磁気または非磁気ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはマイクロチップ、ヒツジ（または他の適切な動物）赤血球およびデュラサイトは全て適切な例である。固相における核酸の適切な固定化方法には、イオン性、疎水性、共有結合相互作用などがある。本発明で使用される固体支持体は、不溶性であればいずれの材料でもよく、または後続反応により不溶性にされ得る。固体支持体は、捕捉試薬を誘引および固定化するその固有の能力に関して選択され得る。別法として、固相は、捕捉試薬を誘引および固定化する能力を有する追加の受容体を保持し得る。追加の受容体は、捕捉試薬それ自体または捕捉試薬にコンジュゲートした荷電物質に関して反対に荷電している荷電物質を含み得る。さらに別の方法として、受容体分子は、固体支持体に結合され、特異的結合反応を通して捕捉試薬を固定化する能力を有する特異的結合要員であり得る。受容体分子は、検定法実施前または検定法実施中に捕捉試薬を固体支持体材料へ間接的に結合させ得る。すなわち、固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたは珪素表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適切な動物）赤血球、デュラサイトおよび当業者に公知の他の立体配置であり得る。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブは、固体支持体上に個々に、または単一固体支持体へ本発明の少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０または２５の異なるポリヌクレオチドから成る群で結合または固定化され得る。さらに、本発明のもの以外のポリヌクレオチドも、本発明の１種またはそれ以上のポリヌクレオチドと同じ固体支持体に結合され得る。
【００７７】
本発明で提供されるポリヌクレオチドは、いずれも固体支持体上のオーバーラップ領域またはランダムな位置に結合され得る。別法として、本発明ポリヌクレオチドは規則正しく配列されたアレイに結合され得、各ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドの結合部位とは重複しない固体支持体の異なる領域に結合される。好ましくは、ポリヌクレオチドの規則正しく配列された上記アレイは「アドレス可能」であるように設計され、明確な場所が記録され、検定手順の一部として評価され得る。アドレス可能なポリヌクレオチドアレイは、典型的には異なる既知の場所における基質の表面にカップリングされた複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置の正確な場所の情報により、これらの「アドレス可能」アレイはハイブリダイゼーション検定法で特に有用なものとなる。当業界で公知のアドレス可能アレイ技術は、本発明ポリヌクレオチドと共に使用され得る。これらのポリヌクレオチドアレイの一態様はジーンチップとして知られており、米国特許第５１４３８５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０７０号および９２／１００９２号に総括的に記載されている。好ましくは、複数のＨＰＰポリヌクレオチドプローブが上記アレイに含まれる。
【００７８】
変異型核酸およびポリペプチドの入手方法
集団に存在し得るＨＰＰ配列の天然に存する対立遺伝子変異型に加えて、当業者であれば、ＨＰＰをコードするヌクレオチド配列への突然変異により変化が導入されることにより、ＨＰＰの機能的能力の改変を伴い、または伴わずにコード化ＨＰＰのアミノ酸配列の変化が導かれることは容易に理解できるはずである。
【００７９】
変異型の幾つかのタイプは、１）アミノ酸残基の１個またはそれ以上が、保存または非保存アミノ酸残基により置換されており、上記置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコード化されたものである場合もそうでない場合もあり得るもの、または２）アミノ酸残基の１個またはそれ以上が置換基を含むもの、または３）突然変異ＨＰＰが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、または４）追加アミノ酸、例えばリーダー、シグナルまたはアンカー配列、ＨＰＰの精製に使用される配列、または前駆体タンパク質からの配列がＨＰＰに融合されているものを含むと考えられる。上記変異型も、当業者の研究領域内に含まれると考えられる。
【００８０】
本発明は、ＨＰＰキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用されているＨＰＰ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＨＰＰポリペプチド配列と枠内で機能し得るように結合または融合された、本発明のＨＰＰまたはそのフラグメントを包含する。好ましい態様において、ＨＰＰ融合タンパク質は、ＨＰＰの少なくとも一つの生物学的活性部分を含む。別の好ましい態様において、ＨＰＰ融合タンパク質は、ＨＰＰの少なくとも２つの生物学的活性部分を含む。例えば、一態様において、融合タンパク質は、ＨＰＰドメイン配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合されているＧＳＴ−ＨＰＰ融合タンパク質である。上記融合タンパク質は、組換えＨＰＰの精製を容易にし得る。別の態様において、融合タンパク質は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含むＨＰＰであり、例えばある種の宿主細胞において所望の細胞局在性をもたらし得る。さらに別の態様では、融合体は、ＨＰＰ生物学的活性フラグメントおよび免疫グロブリン分子である。上記融合タンパク質は、例えばＨＰＰ結合部位の結合価を増加させるのに有用である。例えば、二価ＨＰＰ結合部位は、生物学的活性ＨＰＰフラグメントをＩｇＧ Ｆｃタンパク質に融合させることにより形成され得る。
【００８１】
好ましい態様において、本発明のＨＰＰ融合タンパク質は、対象において抗ＨＰＰ抗体を産生させるための免疫原として、ＨＰＰを精製するため、またはＨＰＰリガンドおよび吸着剤として使用される。
【００８２】
さらに、ＨＰＰの単離フラグメントはまた、ペプチドをコード化する核酸の対応するフラグメントから遺伝子組換により製造されたペプチドをスクリーニングすることにより得られる。さらに、フラグメントは、当業界で公知の技術、例えば慣用的メリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学作用を用いて化学合成され得る。例えば、本発明のＨＰＰは、フラグメントの重複を伴わない所望の長さのフラグメントへ任意に分割されるか、または好ましくは所望の長さのオーバーラップフラグメントに分割され得る。フラグメントを（遺伝子組換えまたは化学合成により）製造および試験することにより、ＨＰＰ生物学的活性をもつペプチジルフラグメントが、例えば顕微注入検定法またはインビトロタンパク質結合検定法により同定され得る。例証的態様において、ＨＰＰのペプチジル部分、例えばＨＰＰ標的結合領域は、各々ＨＰＰの別々のフラグメントを含む、チオレドキシン融合タンパク質としての発現によりＨＰＰ活性（例、免疫原性）について試験され得る（例えば、米国特許第５２７０１８１号および同第５２９２６４６号および国際公開第９４／０２５０２号参照）。
【００８３】
ＨＰＰ組成物の化学的製造
本発明のペプチドは、標準技術（例、StewartおよびYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、ピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ、１９８４）により合成される。好ましくは、市販のペプチド合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ、インコーポレイテッド（フォスター・シティー、カリフォルニア）モデル４３０Ａが使用され、本発明ポリペプチドは、収束合成方法で多数の別々に合成および精製されたペプチドから構築され得る、例、Kent et al.、米国特許第６１８４３４４号およびDawsonおよびKent、Annu. Rev. Biochem.、６９：９２３−９６０（２０００）。本発明のペプチドは、カルボキシル末端残基から出発し、ペプチド全体が形成されるまでアミノ酸を段階的に付加する架橋ポリスチレン支持体での固相合成により構築され得る。以下の参考文献は合成中に使用される化学作用への指針である：Schnolzer et al.、Int. J. Peptide Protein Res.、４０：１８０−１９３（１９９２）；Merrifield、J. Amer. Chem. Soc.、第８５巻、２１４９頁（１９６３）；Kent et al.、１８５頁、Peptides １９８４、Ragnarsson編（AlmquistおよびWeksell、ストックホルム、１９８４）；Kent et al.、２１７頁、Peptide Chemistry ８４、Izumiya編（プロテイン・リサーチ・ファンデーション、B. H. Osaka、１９８５）；Merrifield、Science、第２３２巻、３４１−３４７頁（１９８６）；Kent、Ann. Rev. Biochem、第５７巻、９５７−９８９頁（１９８８）およびこれら最後の２参考文献で挙げられている参考文献。
【００８４】
好ましくは、本発明ポリペプチドの化学合成は、Dawson et al.、Science、２６６：７７６−７７９（１９９４）およびKent et al.、米国特許第６１８４３４４号により記載された要領で、天然化学連結反応によるペプチドフラグメントの構築により実施される。簡単に述べると、この方法では、第一ペプチドフラグメントに非酸化スルフヒドリル側鎖を有するＮ−末端システインを付加し、第二ペプチドフラグメントにＣ−末端チオエステルを付加する。次いで、Ｎ−末端システインの非酸化スルフヒドリル側鎖をＣ−末端チオエステルと縮合することにより、第一および第二ペプチドフラグメントをβ−アミノチオエステル結合で結合する中間体ペプチドフラグメントを製造する。次いで、中間体ペプチドフラグメントのβ−アミノチオエステル結合に対し、分子内転位を行うことにより、第一および第二ペプチドフラグメントをアミド結合で結合するペプチドフラグメント生成物を製造する。好ましくは、内部フラグメントのＮ−末端システインは、下記の通り環状チアゾリジン保護基により望ましくない閉環および／または鎖状体形成反応から保護される。好ましくは、上記環状チアゾリジン保護基はチオプロリニル基である。
【００８５】
Ｃ−末端チオエステルを有するペプチドフラグメントは、以下の参考文献（これらについては出典明示により援用する）に記載された要領で製造され得る：Kent et al、米国特許第６１８４３４４号、Tam et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.、９２：１２４８５−１２４８９（１９９５）；Blake、Int. J. Peptide Protein Res.、１７：２７３（１９８１）；Canne et al、Tetrahedron Letters、３６：１２１７−１２２０（１９９５）；Hackeng et al、Proc. Natl. Acad. Sci.、９４：７８４５−７８５０（１９９７）；またはHackeng et al、Proc. Natl. Acad. Sci.、９６：１００６８−１００７３（１９９９）。好ましくは、Hackeng et al（１９９９）により記載された方法を使用する。簡単に述べると、Schnolzer et al、Int. J. Peptide Protein Res.、４０：１８０−１９３（１９９２）（出典明示により援用する）により開示されたＢｏｃ化学作用についてのin situ 中和／ＨＢＴＵ活性化手順を用いることにより典型的には０.２５ｍｍｏｌ規模で固相支持体（下記）においてペプチドフラグメントを合成する。（ＨＢＴＵは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートおよびＢｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである）。各合成サイクルは、純ＴＦＡによる１〜２分処理、１分ＤＭＦフロー洗浄、ＤＩＥＡの存在下における１.０ｍｍｏｌの前活性化Ｂｏｃ−アミノ酸との１０〜２０分カップリング時間、および第二ＤＭＦフロー洗浄によるＮα−Ｂｏｃ除去により構成される。（ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＭＦはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ＤＩＥＡはＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである）。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（１.１ｍｍｏｌ）を、過剰のＤＩＥＡ（３ｍｍｏｌ）の存在下１.０ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０.５Ｍ）により３分間前活性化する。各カップリング工程後、例えばSarin et al、Anal. Biochem.、１１７：１４７−１５７（１９８１）に開示されている、慣用的定量ニンヒドリン検定法で残留遊離アミンを測定することにより収量を測定する。Ｇｌｎ残基のカップリング後、ＴＦＡを用いることによる脱保護の前後にＤＣＭフロー洗浄を使用して、可能性のある高温（ＴＦＡ／ＤＭＦ）−触媒ピロリドン形成を阻止する。鎖構築が完了後、ペプチドフラグメントを脱保護し、スカベンジャーとして４％ｐ−クレゾールを用い、１時間０℃で無水ＨＦでの処理により樹脂から開裂させる。ｄｎｐ−除去手順はＣ−末端チオエステル基と相容れないため、イミダゾール側鎖２,４−ジニトロフェニル（ｄｎｐ）保護基はＨｉｓ残基に残っている。しかしながら、ｄｎｐは、連結反応中にチオールにより徐々に除去される。開裂後、ペプチドフラグメントを氷冷ジエチルエーテルで沈澱させ、水性アセトニトリルに溶かし、凍結乾燥する。
【００８６】
好ましくは、Hackeng et al（１９９９）により開示された要領またはそれと同等のプロトコルに従って製造された、トリチル会合メルカプトプロピオン酸ロイシン（ＴＡＭＰＡＬ）樹脂において上記チオエステルペプチドフラグメントを合成する。簡単に述べると、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（４ｍｍｏｌ）を、６ｍｍｏｌのＤＩＥＡの存在下で３.６ｍｍｏｌのＨＢＴＵにより活性化し、１６分間２ｍｍｏｌのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂、または均等内容物とカップリングする。次に、３ｍｍｏｌのＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を、６ｍｍｏｌのＤＩＥＡの存在下で２.７ｍｍｏｌのＨＢＴＵにより活性化し、１６分間Ｌｅｕ−ＭＢＨＡ樹脂とカップリングする。生成したＴＡＭＰＡＬ樹脂は、ＴＦＡ中の３.５％トリイソプロピルシランおよび２.５％Ｈ２Ｏでの２回の１分処理によるトリチル保護基除去後、ポリペプチド−鎖構築用の出発樹脂として使用され得る。チオエステル結合は、Schnolzer et al（前出）により開示された要領で、１時間標準 in situ 中和ペプチドカップリングプロトコルを用いることにより、所望のアミノ酸により形成され得る。無水ＨＦによる最終ペプチドフラグメントの処理により、Ｃ−末端活性化メルカプトプロピオン酸−ロイシン（ＭＰＡＬ）チオエステルペプチドフラグメントを得る。
【００８７】
好ましくは、チアゾリジン保護チオエステルペプチドフラグメント中間体は、Hackeng et al（１９９９）により記載された条件または同等条件下での天然化学的連結反応で使用される。簡単に述べると、６Ｍグアニジン、４％（体積／体積）ベンジルメルカプタン、および４％（体積／体積）チオフェノールを含む０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.５）を、乾燥ペプチドに加えて連結させ、凍結乾燥ペプチドからのチオールおよびＴＦＡの添加故に低下した、約ｐＨ７で１〜３ｍＭの最終ペプチド濃度を得る。好ましくは、連結反応は、加熱ブロックにおいて３７℃で実施され、周期的に渦状に攪拌することによりチオール付加物を平衡状態にする。この反応は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化ＭＳにより完了の程度についてモニターされ得る。
【００８８】
天然化学的連結反応が完了または停止後、生成物のＮ−末端チアゾリジン環を、３７℃で２時間、ｐＨ３.５〜４.５でのシステイン脱保護剤、例えばＯ−メチルヒドロキシルアミン（０.５Ｍ）による処理により開環させ、その後１０倍過剰のトリス−（２−カルボキシエチル）−ホスフィンを反応混合物に加えることにより、慣用的分取ＨＰＬＣによる生成物の精製前に酸化反応成分があればそれらを完全に還元する。好ましくは、連結反応産物含有フラクションは、エレクトロスプレーＭＳにより同定され、プールされ、凍結乾燥される。
【００８９】
合成が完了し、最終生成物を精製した後、最終ポリペプチド生成物は、例えばCreighton、Meth. Enzymol.、１０７：３０５−３２９（１９８４）；White、Meth. Enzymol.、１１：４８１−４８４（１９６７）；Wetlaufer、Meth. Enzymol.、１０７：３０１−３０４（１９８４）などの慣用的技術により再生され得る。好ましくは、最終生成物は、以下の手順による空気酸化などにより再生される。還元凍結乾燥生成物を、ｐＨ８.６で、１００ｍＭトリス、１０ｍＭメチオニン含有の１Ｍグアニジン塩酸塩（または同様のカオトロピック剤）に溶解する（約０.１ｍｇ／ｍＬで）。一晩緩やかに攪拌後、慣用的プロトコルでの逆相ＨＰＬＣにより再生生成物を単離する。
【００９０】
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本明細書記載のポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞において対応するポリペプチドの発現を指令する組換えＤＮＡ分子で使用され得る。遺伝コードの縮重故に、他のＤＮＡ配列でも、同等のアミノ酸配列をコード化し得、そしてＨＰＰをクローン化および発現させるのに使用され得る。特定宿主細胞により好まれるコドンを選択し、天然ヌクレオチド配列へ置換することにより、発現の速度および／または有効性が高められ得る。所望のＨＰＰをコード化する核酸（例、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）が、クローニング（ＤＮＡの増幅）用または発現用の複製可能なベクターへ挿入され得る。ポリペプチドは、当業界で公知の方法（Ausubel et al.編、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９９０）に従って若干の発現系のいずれかにおいて遺伝子組換えにより発現され得る。適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌および昆虫、および哺乳類細胞を含む動物細胞、例えば一次細胞、限定されるわけではないが、例えば骨髄幹細胞を含む幹細胞がある。さらに具体的には、これらの例としては、限定されるわけではないが、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌、および酵母発現ベクターにより形質転換された酵母がある。また、組換え昆虫ウイルス（例えばバクロウイルス）により感染させた昆虫細胞、および哺乳類発現系も含まれる。発現される核酸配列は、様々な手順によりベクターへ挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当業界で公知の技術を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位へ挿入される。ベクター成分としては、一般的にシグナル配列、複製起点、１種またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの一つまたはそれ以上が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの成分の一つまたはそれ以上を含む適切なベクターの構築は、当業者には公知のものである標準連結技術を用いる。
【００９１】
本発明のＨＰＰは、タンパク質の発現を誘導または誘発するのに適切な条件下で、ＨＰＰをコード化する核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することにより製造される。ＨＰＰ発現に適切な条件は、当業者により確認されている通り、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変化する。例えば、発現ベクターにおける構成プロモーターの使用は、宿主細胞成長および増殖の常用の最適化手順を必要とし得、誘導性プロモーターの使用は誘導に適切な成長条件を必要とする。さらに、態様によっては、採取のタイミングが重要な場合もある。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバクロウイルス系は、溶菌ウイルスであるため、採取時間の選択は生成物の収率にとって重大なものであり得る。
【００９２】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現をモジュレーションするかまたは発現タンパク質を所望の形でプロセッシングするその能力を基に選択され得る。タンパク質の上記修飾には、グリコシル、アセチル、リン酸、アミド、脂質、カルボキシル、アシルまたは炭水化物基があるが、これらに限定されるわけではない。また、翻訳後プロセッシングは、タンパク質の「プレプロ」形態を開裂するもので、正確な挿入、折りたたみおよび／または機能にとっては重要であり得る。例として、宿主細胞、例えばＣＨＯ、ヒーラ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８などは、上記の翻訳後活性に特異的な細胞組織および特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にするように選択され得る。特に興味深いものは、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）細胞、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）および他の酵母、エシェリキア・コリ（E. coli）、バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ（Neurospora）、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびヒーラ細胞、線維芽細胞、神経鞘腫細胞株、不死化哺乳類骨髄およびリンパ球細胞株、ジャーカット細胞、ヒト細胞および他の初代細胞である。
【００９３】
ＨＰＰをコード化する核酸は、別の核酸配列との機能的関係にそれを配置させることにより、「機能し得るように結合されて」いなければならない。例えば、前駆配列または分泌先導配列についてのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドについてのＤＮＡに機能し得るように結合されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合にはその配列に機能し得るように結合されている。またはリボソーム結合部位は、それが翻訳し易くするように配置されている場合にはコーディング配列に機能し得るように結合されている。一般的に、「機能し得るように結合されている」ＤＮＡ配列は連続しており、そして分泌先導または他のポリペプチド配列の場合には、読取相において連続している。しかしながら、エンハンサーは連続している必要は無い。連鎖は、慣用的制限部位での連結反応により達成される。上記部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、慣用的実施方法に従って使用される。プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーターをコード化する。プロモーターは、天然に存するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターは、複数のプロモーターのエレメントを組合わせたもので、当業界でも公知であり、本発明においては有用である。発現ベクターは追加のエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得るため、２種の生物体、例えば発現については哺乳類または昆虫細胞およびクローニングおよび増幅については原核生物宿主で維持され得る。発現およびクローニングの両ベクターは、一つまたはそれ以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製させ得る核酸配列を含む。上記配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適切であり、２：プラスミド起点は、酵母に適切であり、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。さらに、発現ベクターを組込むため、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムと相同的な少なくとも一つの配列、および好ましくは、発現構築物の両端に隣接する二つの相同性配列を含む。組込みベクターは、ベクターにおける含有に適切な相同性配列を選択することにより宿主細胞における特定位置に指向され得る。組込みベクターについての構築物は当業界ではよく知られている。追加的態様において、異種発現制御エレメントは、相同的組換えにより宿主細胞における内在性遺伝子と機能し得るように結合され得る（米国特許第６４１０２６６号および同第６３６１９７２号に記載）。この技術により、宿主細胞により内在的に発現されたＨＰＰの適正なプロセッシングおよび修飾を確実にしながら、選択された制御エレメントで所望のレベルに発現を調節することが可能となる。有用な異種発現制御エレメントには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターがあるが、これらに限定されるわけではない。
【００９４】
好ましくは、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界ではよく知られており、使用される宿主細胞により異なる。発現およびクローニングベクターは、典型的には選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性遺伝子欠失を補完する、または（ｃ）複合培地からは入手できない重大な栄養素を供給するタンパク質をコード化し、例えばバシラス（Baccilli）についてのＤ−アラニンラセマーゼをコード化する遺伝子がある。
【００９５】
ＨＰＰをコード化するヌクレオチド配列により形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのコード化タンパク質の発現および回収に適切な条件下で培養され得る。組換え細胞により製造されるタンパク質は、配列および／または使用されるベクターにより分泌されるか、膜結合されるか、または細胞内に含まれ得る。当業者であれば容易に理解できるように、ＨＰＰをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞膜を通したＨＰＰの分泌を指令するシグナル配列を伴う形で設計され得る。所望のＨＰＰは、遺伝子組換により直接的に、またシグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドであり得る、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても製造され得る。一般に、シグナル配列はベクターの一成分であり得るか、またはそれは、ベクターへ挿入されたＨＰＰコード化ＤＮＡの一部分であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンII先導配列から成る群から選択される原核生物シグナル配列であり得る。酵母分泌については、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼ先導配列、アルファ因子先導配列（サッカロマイシス（Saccharomyces）およびクルイベロマイシス（Kluyveromyces）ａ−因子先導配列を含む、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載）、または酸性ホスファターゼ先導配列、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼ先導配列（１９９０年４月４日公開の欧州特許第３６２１７９号）、または１９９０年１１月１５日公開の国際公開第９０／１１３６４６号に記載されたシグナルであり得る。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列は、タンパク質の分泌を指令するのに使用され得、例えば同一または関連種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、およびウイルス分泌先導配列も挙げられる。選択された発現系により、コーディング配列は適切なベクターへ挿入され、それはある種の特徴的な「制御エレメント」または「調節配列」の存在を必要とし得る。適切な構築物は、当業界では公知であり（Ausubel et al.、１９９０）、そして多くの場合、販売供給業者、例えばインビトロゲン（サンディエゴ、カリフォルニア）、ストラタジーン（ラジョラ、カリフォルニア）、ギブコＢＲＬ（ロックビル、メリーランド）またはクロンテック（パロアルト、カリフォルニア）から入手可能である。
【００９６】
細菌系での発現
細菌細胞の形質転換は、誘導性プロモーター、例えば「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」ファージミド（ストラタジーン）または「ｐＳＰＯＲＴ１」（ギブコＢＲＬ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターを用いて達成され得る。さらに、細菌細胞で使用することにより、容易に検出および／または精製され得る開裂可能な融合タンパク質を製造させる若干の発現ベクターが選択され得、限定されるわけではないが、例えば「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」（ａ−ガラクトシダーゼ；ストラタジーン）またはｐＧＥＸ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）が挙げられる。適切な細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡへのＨＰＰ遺伝子のコーディング配列の下流（３'）転写を開始させ得る核酸配列である。細菌性プロモーターは、通常コーディング配列の５'末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコード化する配列からは、特に有用なプロモーター配列が提供される。例としては、糖代謝酵素、例えばガラクトース、ラクトースおよびマルトースから誘導されるプロモーター配列、および生合成酵素、例えばトリプトファンから誘導される配列がある。バクテリオファージからのプロモーターもまた使用され得、当業界では公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である。例えば、ｔａｔプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼとの結合および転写開始能力を有する非細菌起源の天然に存するプロモーターを含み得る。有効なリボソーム−結合部位も望ましい。発現ベクターはまた、細菌においてＨＰＰを分泌させるシグナルペプチド配列を含み得る。シグナル配列は、当業界では十分認識されているように、典型的には細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸により構成されるシグナルペプチドをコード化する。タンパク質は、成長培地（グラム陽性菌）または細胞（グラム陰性菌）の内膜と外膜の間にある周辺腔へ分泌される。細菌性発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺伝子には、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンといった薬剤耐性遺伝子が含まれる。また、選択可能マーカーには、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるものがある。例えば抗体誘導について大量のＨＰＰが必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが望ましいものであり得る。上記ベクターには、多機能性エシェリキア・コリ（E. coli）クローニングおよび発現ベクター、例えばＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（ストラタジーン）、この場合ＨＰＰコーディング配列は、アミノ末端Ｍｅｔおよびベータ−ガラクトシダーゼの後続７残基についての配列との枠でベクターへ連結され得、その結果ハイブリッドタンパク質が製造される；ＰＩＮベクター（Van Heeke & Schuster J Biol Chem ２６４：５５０３−５５０９、１９８９）；ＰＥＴベクター（ノヴァゲン、マディソン、ウィスコンシン）などがあるが、これらに限定はされない。細菌用の発現ベクターは、上記の様々な成分を含み、当業界では公知である。例としては、特にバシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、エシェリキア・コリ（E. coli）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、およびストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）についてのベクターがある。細菌性発現ベクターは、当業界で公知の技術、例えば塩化カルシウム介在トランスフェクション、電気穿孔などを用いて細菌宿主細胞に形質転換される。
【００９７】
酵母における発現
酵母発現系は当業界ではよく知られており、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Saccharomyces）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびカンジダ・マルトサ（C. maltosa）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロマイシス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）およびクルイベロマイシス・ラクティス（K. lactis）、ピキア・ギレルモンディ（Pichia guillermondii）およびピキア・パストリス（P pastoris）、シゾサッカロマイシス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）についての発現ベクターが含まれる。酵母宿主での使用に適切なプロモーターの例には、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al.、J. Biol. Chem. ２５５：２０７３（１９８０））または他の解糖酵素（Hess et al.、J. Adv. Enzyme Reg. ７：１４９（１９６８）；Holland、Biochemistry １７：４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、アルファ因子についてのプロモーター、ＡＤＨ２ＩＧＡＰＤＨプロモーター、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨがある。例えば、Ausubel et al.、１９９０；Grant et al.、Methods in Enzymology １５３：５１６−５４４（１９８７）参照。誘導性である他の酵母プロモーターは、成長条件により制御される転写の追加利点を有し、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素についてのプロモーター領域を含む。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターについては、さらに欧州特許第７３６５７号に記載されている。酵母選択可能マーカーには、ＡＤＥ２．ＨＩＳ４．ＬＥＵ２．ＴＲＰ１．およびＡＬＧ７（ツニカマイシンへの耐性を付与する）、Ｇ４１８への耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオンの存在下で酵母を成長させ得るＣＵＰ１遺伝子がある。酵母発現ベクターは、興味の対象であるＨＰＰをコード化するＤＮＡからのＨＰＰの細胞内生産および分泌用に構築され得る。例えば、選択されたシグナルペプチドおよび適切な構成的または誘導性プロモーターは、ＨＰＰの直接細胞内発現用に選択されたプラスミドにおける適切な制限部位に挿入され得る。ＨＰＰを分泌させるため、ＨＰＰをコード化するＤＮＡは、ＨＰＰの発現を目的とする、プロモーター、酵母アルファ−因子分泌シグナル／先導配列、およびリンカー配列（必要に応じて）をコード化するＤＮＡと一緒に、選択されたプラスミドへクローン化され得る。次いで、酵母細胞は、上記発現プラスミドにより形質転換され、そして適切な発酵培地で培養され得る。次いで、上記形質転換酵母により生産されたタンパク質が、１０%トリクロロ酢酸による沈澱により濃縮され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびクーマシー・ブルー染料でのゲル染色後、分析され得る。組換えＨＰＰは、当業者に公知の技術により発酵培地から連続して単離および精製され得る。
【００９８】
哺乳類系における発現
ＨＰＰは、哺乳類細胞で発現され得る。哺乳類発現系は、当業界では公知であり、レトロウイルスベクター仲介発現系を含む。哺乳類宿主細胞は、若干の異なるウイルスベース発現系のいずれか、例えばアデノウイルスにより形質転換され得、その場合コーディング配列は、後期プロモーターおよび三部分先導配列から成るアデノウイルス転写／翻訳複合体へ連結され得る。ウイルスゲノムの非本質的Ｅ１またはＥ３領域における挿入により、感染宿主細胞において興味の対象であるポリペプチドを発現し得る生存可能なウイルスが生じる。好ましい発現ベクター系は、レトロウイルスベクター系であり、それ自体ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０１０４８に総括的に記載されている。適切な哺乳類発現ベクターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡへのＨＰＰについてのコーディング配列の下流（３'）転写を開始させ得るＤＮＡ配列である哺乳類プロモーターを含む。プロモーターは、通常コーディング配列の５'末端の近位に配置される転写開始領域、および転写開始部位の上流に位置する２５〜３０塩基対を用いた、ＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼIIを指令してＲＮＡ合成を正確な部位で開始させると考えられる。哺乳類プロモーターはまた、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００塩基対内に位置する、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの配向で作用し得る。ウイルス遺伝子は高度発現されることが多く、広範な宿主範囲を有するため、哺乳類プロモーターとして特に有用なのは哺乳類ウイルス遺伝子からのプロモーターである。例としては、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開英国特許第２２１１５０４号）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類プロモーターから、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、および熱ショックプロモーターからのものがあり、上記プロモーターは宿主細胞系と適合し得るものとする。高等真核生物によりＨＰＰをコード化するＤＮＡの転写は、ベクターへエンハンサー配列を挿入することにより増強され得る。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐである、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、プロモーターに作用してその転写を増加させる。多くのエンハンサー配列は、哺乳類遺伝子に由来することが知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。エンハンサーは、好ましくはプロモーターから５'部位に位置する。一般に、哺乳類細胞により認識される転写終結およびポリア���ニル化配列は、翻訳停止コドンに対し３'に位置する調節領域であるため、プロモーターエレメントと一緒に、コーディング配列の両端に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から誘導されるものがある。組換えタンパク質の長期高収率生産は、安定した発現系で実施され得る。ウイルス複製起点または内在性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含む発現ベクターは、この目的に使用され得る。哺乳類細胞で使用される選択可能マーカーを含む適切なベクターは、容易に購入でき、当業者には公知である。上記選択可能マーカーの例には、ｔｋ−またはｈｐｒｔ−細胞でそれぞれ使用される単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼがあるが、これらに限定されるわけではない。外生核酸を哺乳類宿主、および他の宿主へ導入する方法は、当業界では公知であり、使用される宿主細胞によって異なる。技術としては、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、リポソームにおけるポリヌクレオチド（複数も可）の封入、および核へのＤＮＡの直接顕微注入がある。
【００９９】
ＨＰＰは、ＨＰＰコード化配列をもつ発現ベクターにより一時的トランスフェクションまたは安定して形質転換された哺乳類細胞の培養上清から精製され得る。好ましくは、ＨＰＰは、ｐｃＤ発現ベクターにより一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞の培養上清から精製される。ｐｃＤによるＣＯＳ７細胞のトランスフェクションは以下の要領で進められる：トランスフェクションの１日前、約１０６のＣＯＳ７サル細胞を、１０％胎児ウシ血清および２ｍＭグルタチオン含有ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）における個々の１００ｍｍプレートへ播種する。トランスフェクションを実施するため、培地を各プレートから吸引し、５０ｍＭのトリス.ＨＣｌ ｐＨ７.４、４００ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランおよび５０μｇのプラスミドＤＮＡを含む４ｍｌのＤＭＥと置き換える。プレートを４時間３７℃でインキュベーションし、次いでＤＮＡ含有培地を除去し、５ｍｌの血清不含有ＤＭＥでプレートを２回洗浄する。ＤＭＥをプレートに再び加え、次いでさらに３時間３７℃でインキュベーションする。プレートをＤＭＥで１回洗浄した後、４％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタチオン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／Ｌ）を含む標準濃度のＤＭＥを加える。次いで、細胞を３７℃で７２時間インキュベーションした後、ＨＰＰを精製するため成長培地を集める。エシェリキア・コリ（E. coli）ＭＣ１０６１（CasadabanおよびCohenにより報告、J. Mol. Biol.、第１３８巻、１７９−２０７頁（１９８０））または同様の生物体にＨＰＰコード化ｃＤＮＡ挿入体を含む、ｐｃＤ（ＳＲα）または同様の発現ベクターを成長させることにより、トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡを得る。プラスミドＤＮＡを標準技術により培養から単離する、例、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８９）またはAusubel et al（１９９０、前出）。
【０１００】
昆虫細胞における発現
ＨＰＰはまた、昆虫細胞でも生産され得る。昆虫細胞の形質転換用発現ベクター、および特にバクロウイルスに基づく発現ベクターは、当業界では公知である。上記系の一つにおいて、ＨＰＰコード化ＤＮＡを、バクロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープ標識の上流で融合させる。アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用することにより、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Ｓｆ９細胞またはトリコプルシア・ラーバエ（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子が発現される。ＨＰＰコード化配列を、ウイルスの非本質的領域、例えば多角体タンパク質遺伝子へクローン化し、多角体タンパク質プロモーターの制御下におく。ＨＰＰコード化配列の有効な挿入により、多角体タンパク質遺伝子は不活性にされ、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが製造される。次いで、組換えウイルスを用いて、ＨＰＰが発現されるスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア・ラーバエ（Trichoplusia larvae）を感染させる（Smith et al.、J. Wol. ４６：５８４（１９９４）；Engelhard E K et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. ９１：３２２４−３２２７（１９９４））。ＨＰＰコード化ＤＮＡとの融合に適切なエピトープ標識には、ポリｈｉｓ標識および免疫グロブリン標識（同じくＩｇＧのＦｃ領域）がある。市販のプラスミド、例えばｐＶＬ１３９３（ノヴァゲン）を含む、様々なプラスミドが使用され得る。簡単に述べると、ＨＰＰコード化ＤＮＡまたはＨＰＰコード化ＤＮＡの所望の部分は、５'および３'領域と相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、フランキング制限部位を組込み得る。次いで、ＰＣＲ産物を選択された制限酵素で消化し、発現ベクターへサブクローニングする。組換えバクロウイルスは、リポフェクチン（ギブコ−ＢＲＬから市販されている）、または当業者に知られている他の方法を用いて、上記プラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（ファーミンゲン）をスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）へ共トランスフェクションすることにより生成される。ウイルスは、２８℃でのＳｆ９細胞における培養の４〜５日目までに製造され、さらなる増幅に使用される。さらにO'Reilley et al.、BACULOVIRUD EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（１９４４）記載された手順を実施する。抽出物は、Rupert et al.、Nature ３６２：１７５−１７９（１９９３）に記載された要領で組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から製造され得る。別法として、発現されたエピトープ標識ＨＰＰは、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得、または例えば、ＩｇＧ標識（またはＦｃ標識）ＨＰＰの精製は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー技術を用いて実施され得る。
【０１０１】
遺伝子発現の評価
遺伝子発現は、試料において直接的、例えば当業者に公知の標準技術、例えばノーザン・ブロッティングによりｍＲＮＡの転写を測定するか、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または本発明で提供された配列に基づいた適切な標識プローブを用いる in situ ハイブリダイゼーションにより評価され得る。別法として、抗体は、ポリペプチド、核酸、例えば特異的デュプレックス、例えばＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデュプレックスまたはＤＮＡ−タンパク質デュプレックスを検出するための検定で使用され得る。上記抗体を標識し、デュプレックスを表面に結合させることにより、表面上でデュプレックスが形成されたとき、デュプレックスに結合した抗体の存在が検出され得るように検定が実施され得る。別法として、遺伝子発現を、細胞または組織片の免疫組織化学的染色および細胞培養または体液の検定を用いて測定することにより、ＨＰＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現が直接評価され得る。上記免疫学的検定法に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、天然配列ＨＰＰに対して製造され得る。タンパク質レベルもまた、質量分析法により検出され得る。さらなるタンパク質検出方法は、保持物質クロマトグラフィー（タンパク質アレイを含む）および表面強化レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）技術によるものである。
【０１０２】
発現されたタンパク質の精製
発現されたＨＰＰは、当業者に公知の様々な方法のいずれかを用いることにより、発現後に精製または単離され得る。適切な技術は、他の如何なる成分が試料に存在するかにより異なる。単離または精製により除去される汚染成分は、典型的にはポリペプチドについての診断または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他の溶質が含まれ得る。選択された精製工程（複数も可）は、例えば、使用される製造方法および製造された特定ＨＰＰの性質により異なる。ＨＰＰは分泌されるため、それらは培養培地から回収され得る。別法として、ＨＰＰは、宿主細胞ライゼートから回収され得る。膜結合の場合、それは、適切なデタージェント溶液（例、トリトン−Ｘ１００）を用いるかまたは酵素的開裂により膜から解離され得る。別法として、ＨＰＰの発現に使用される細胞は、様々な物理的または化学的手段、例えば冷凍解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用により破壊され得る。精製方法の例としては、イオン交換カラムクロマトグラフィー、シリカゲルまたはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥを用いたクロマトグラフィー、例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過、プロテインＡセファロースカラムによる汚染物質、例えばＩｇＧの除去、金属キレート化カラムを用いてＨＰＰのエピトープ標識形態を結合させるクロマトグラフィー、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈澱法があるが、これらに限定はされない。通常、単離ＨＰＰは、少なくとも一精製工程により製造される。例えば、ＨＰＰは、標準抗ＨＰＰ抗体カラムを用いて精製され得る。タンパク質濃度と連係させた、限外濾過および透析技術もまた有用である（例えば、Scopes, R., PROTEIN PURIFICATION、スプリンガー−フェルラーク、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８２参照）。必要な精製度は、ＨＰＰの使用により異なる。場合によっては、精製が必要ではないこともある。必要に応じて発現および精製された、本発明のＨＰＰおよび核酸は、本明細書で詳述されている若干の適用法において有用である。
【０１０３】
ＨＰＰ活性の評価
さらに本発明は、ＨＰＰおよびＨＰＰ配列の機能的フラグメントおよび変異型の活性を試験するかまたはそれらを得る方法を提供するものとする。上記方法では、変異型または修飾ＨＰＰコード化核酸を提供し、コード化されたポリペプチドがＨＰＰ生物学的活性を示すか否かを評価する。すなわち、ＨＰＰの機能の評価方法であって、（ａ）ＨＰＰ、またはその生物学的活性フラグメントまたは相同体を提供し、そして（ｂ）ＨＰＰ活性に適切な条件下で、ＨＰＰ生物学的活性についてＨＰＰまたはその生物学的活性フラグメントまたは相同体を試験することを含む方法も包含される。無細胞検定法、細胞に基づく検定法およびインビボ検定法もＨＰＰ活性の試験に使用され得る。例えば、上記検定法は、宿主細胞においてＨＰＰ核酸を発現させ、上記細胞および他の罹患細胞においてＨＰＰ活性を観察することを含み得る。別の例では、ＨＰＰまたはその生物学的活性フラグメントまたは相同体を、細胞と接触させ、そしてＨＰＰ生物学的活性を観察する。
【０１０４】
ＨＰＰ生物学的活性は、（１）ヒト個体の血流全体にわたる循環、（２）抗原性、または抗ＨＰＰ特異的抗体との結合能力、（３）免疫原性、または抗ＨＰＰ特異的抗体産生能力、および（４）ＨＰＰ標的分子または吸着剤との相互作用を含む。
【０１０５】
ＨＰＰ生物学的活性は、当業界で公知の適切な方法により検定され得る。抗原性および免疫原性は、例えば、「抗ＨＰＰ抗体」および「ＨＰＰ抗体の使用」と題する項で記載されている要領で欠失され得る。血漿における循環は、「診断および予後的使用」に記載された要領で検出され得る。
【０１０６】
ＨＰＰがＨＰＰ標的分子に結合またはそれと相互作用する能力の測定は、当業界では一般的である、直接的または間接的な結合測定方法により実施され得る。上記方法は、細胞に基づくか（例、膜結合ＨＰＰへの結合が検出される形をとる）または無細胞であり得る。試験化合物とＨＰＰの相互作用は、例えばＨＰＰまたはその生物学的活性部分を標識基とカップリングすることにより検出され得るもので、それは、ＨＰＰまたはその生物学的活性部分とその同族標的分子の結合が、複合体における標識ＨＰＰまたはその生物学的活性部分を検出することにより測定され得る方法である。例えば、複合体形成の範囲は、複合体の免疫沈降またはゲル電気泳動の実施により測定され得る。また、ＨＰＰがＨＰＰ標的分子に結合する能力の測定は、例えばリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）といった技術を用いて遂行され得る。Sjolander, S. およびUrbaniczky, C.（１９９１）Anal. Chem. ６３：２３３８−２３４５および Szabo et al.（１９９５）Curr. Opin. Struct. Biol. ５：６９９−７０５。本明細書で使用されている「ＢＩＡ」は、反応体（例、ＢＩＡコア）をいずれも標識せずに、リアルタイムでの生物特異的相互作用を試験する技術である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象における変化は、生物分子間におけるリアルタイム反応の指標として使用され得る。タンパク質アレイ方法は相互作用の検出に有用である。例えば、受容体／リガンド対の一員を吸着剤にドッキングさせ、その結合パートナーとの結合能力を試験物質の存在下で測定する。吸着が試験され得る迅速さ故に、試験物質のコンビナトリアルライブラリーは、それらの相互作用モジュレーション能力について容易にスクリーニングされ得る。好ましい方法では、ＨＰＰを吸着剤にドッキングさせる。好ましくは結合パートナーを標識することにより、相互作用が検出され得る。別法として、ある種の態様では、試験物質を吸着剤にドッキングさせる。本発明ポリペプチドを試験物質に曝露し、結合を検出する。
【０１０７】
抗ＨＰＰ抗体
本発明は、ＨＰＰに特異的な抗体および結合組成物を提供する。上記抗体および結合組成物には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのＦａｂおよび側鎖Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート、およびヒト化抗体が含まれる。上記抗体および結合組成物は、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳類細胞培養物における組換え発現、およびトランスジェニック動物における組換え発現を含む、様々な方法で製造され得る。特定の製造方法の選択については文献に豊富なガイダンスが記載されている：例、ChaddおよびChamow、Curr. Opin. Biotechnol.、１２：１８８−１９４（２００１）。
【０１０８】
製造方法の選択は、所望の抗体構造、抗体に対する炭水化物部分の重要性、培養および精製の容易さ、および費用を含む幾つかの因子に左右される。多くの異なる抗体構造は、完全長抗体、抗体フラグメント、例えばＦａｂおよびＦｖフラグメント、並びに異なる種からの成分を含むキメラ抗体を含む、標準発現技術を用いて生成され得る。エフェクター機能をもたず、薬物動態（pharmokinetic）活性が制限されたサイズの小さい抗体フラグメント、例えばＦａｂおよびＦｖフラグメントは、細菌発現系で生成され得る。１本鎖Ｆｖフラグメントは、インビボ腫瘍については高度選択性であり、良好な腫瘍浸透性および低い免疫原性を示し、血液から急速に消去される、例、Freyre et al.、J. Biotechnol.、７６：１５７−１６３（２０００）。すなわち、上記分子は放射性免疫検出に望ましい。
【０１０９】
ポリクローナル抗体
本発明の抗ＨＰＰ抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。上記ポリクローナル抗体は、哺乳類において、例えば免疫化剤および好ましくはアジュバントの１回またはそれ以上の注射後に生成され得る。典型的には、免疫化剤および／またはアジュバントを、一連の皮下または腹腔内注射により哺乳類に注射する。免疫化剤は、ＨＰＰまたはその融合タンパク質を含み得る。免疫化される哺乳類において免疫原性であることが知られているタンパク質に抗原をコンジュゲートすることは、有用であり得る。上記免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターがあるが、これらに限定されるわけではない。アジュバントには、例えばフロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロース・ジコリノ−ミコレート）がある。免疫化プロトコルは、当業者により標準プロトコルに基づいて、または常用の実験により決定され得る。
【０１１０】
別法として、ＨＰＰまたはその一部分について濃厚化された粗タンパク質調製物は、抗体の産生に使用され得る。上記タンパク質、フラグメントまたは調製物は、適切なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に導入される。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含む場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
【０１１１】
有効なポリクローナル抗体生産は、抗原および宿主の種の両方に関連した多くの因子による影響を受ける。また、宿主動物は、接種部位および用量に応じて変化し、抗原の用量が不十分な場合および過剰な場合は両方とも低力価の抗血清となる。多くの皮内部位で投与された小用量（ｎｇレベル）の抗原は、最も信頼性が高いと思われる。ポリクローナル抗血清の製造および加工処理技術は、当業界では公知であり、例えば、MayerおよびWalker（１９８７）参照。ウサギについての有効な免疫化プロトコルは、Vaitukaitis, J. et al. J, Clin. Endocrinol. Metab. ３３：９８８−９９１（１９７１）に記述されている。ブースター注射を一定間隔で行い、半定量的に、例えば既知濃度の抗原に対する寒天での二重免疫拡散により測定される、その抗体力価が降下し始めたとき、抗血清が採取され得る。例えば、Ouchterlony, O. et al.、１９章、Handbook of Experimental Immunology D. Wier（編）ブラックウェル（１９７３）参照。抗体のプラトー濃度は通常血清の０.１〜０.２ｍｇ／ｍｌの範囲である。抗原についての抗血清の親和力は、例えば、Fisher, D.、４２章、Manual of Clinical Immunology、第２版（RoseおよびFriedman編）Amer. Soc. For Microbiol.、ワシントン、Ｄ.Ｃ.（１９８０）に記載された要領による、競合的結合曲線の作成により測定される。
【０１１２】
モノクローナル抗体
別法として、抗ＨＰＰ抗体はモノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより生産され得、その場合マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を免疫化剤で免疫化することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘導する、例、KohlerおよびMilstein、Nature ２５６：４９５（１９７５）。免疫化剤は、典型的にはＨＰＰまたはその融合タンパク質および所望による担体を含む。別法として、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。一般的に、ヒト以外の哺乳類供給源が望ましい場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するか、またはヒト由来の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用する。適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を不死化細胞株と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を製造する、例、Goding、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE、アカデミック・プレス、５９−１０３（１９８６）；Liddellおよび Cryer、A Practical Guide to Monoclonal Antibodies（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９９１）；Malikおよび Lillenoj編、Antibody Techniques（アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９４）。一般に、不死化細胞株は、形質転換哺乳類細胞、例えば、ラット、マウス、ウシまたはヒトに由来する骨髄腫細胞である。好ましくは、非融合不死化細胞の成長または生存を阻害する１種またはそれ以上の物質を含む適切な培養培地において、ハイブリドーマ細胞を培養する。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）、すなわちＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する物質を含む。好ましい不死化細胞株は、有効に融合し、抗体の安定した高レベル生産を支え、例えばＨＡＴ培地といった培地に感受性を示すものである。さらに好ましい不死化細胞株は、マウスまたはヒト骨髄腫ラインであり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド）から入手され得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産について報告されている、例、Kozbor、J. Immunol. １３３：３００１（１９８４）；Brodeur et al.、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、マーセル・デッカー、インコーポレイテッド、ニューヨーク、５１−６３頁（１９８７）。
【０１１３】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地（上清）は、ＨＰＰに対して指向したモノクローナル抗体の存在について検定され得る。好ましくは、ハイブリドーマ上清に存在するモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合検定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定される。適切な技術および検定法は当業界では公知である。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えば、Munsonおよび Pollard、Anal. Biochem. １０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析により測定され得る。所望の抗体産生ハイブリドーマ細胞が同定された後、制限希釈手順により細胞をクローン化し、標準方法により成長させ得る（Goding、１９８６、前出）。この目的に適した培養培地には、例えばダルベッコ修飾イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地がある。別法として、ハイブリドーマ細胞を、哺乳類における腹水としてインビボで成長させ得る。選択されたクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、当業者により常用される免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシル−アパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【０１１４】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により製造され得る。本発明モノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、ＨＰＰ特異的ハイブリドーマ細胞から単離され、例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより配列決定され得る。単離後、ＤＮＡは発現ベクターに挿入され得、次いでこれを、他の形では免疫グロブリンタンパク質を生産しない宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞へトランスフェクションすることにより、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。ＤＮＡはまた、マウス重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコーディング配列を相同性ヒト配列の代わりに用いることにより（Morrison et al.、Proc. Nat. Acad. Sci. ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Neuberger et al.、Nature、３１２：６０４−６０８（１９８４）；Takeda et al.、Nature、３１４：４５２−４５４（１９８５））、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコーディング配列の全部または一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合させることにより修飾され得る。非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明抗体の定常ドメインの代わりに用いるか、または本発明抗体の一抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いることにより、キメラ二価抗体が製造され得る。抗体はまた一価抗体であり得る。一価抗体の製造方法は当業界ではよく知られている。例えば、インビトロ方法は、一価抗体の製造に適切である。抗体の消化によるそのフラグメント、特にＦａｂフラグメントの製造は、当業界で公知の常用技術を用いて実施され得る。
【０１１５】
本発明ハイブリドーマに特徴的な抗体および抗体フラグメントはまた、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、そして抗体分子のセグメントをコード化するクローンを選択することによる組換え技法により製造され得る。抗体産生についての遺伝子組換技術を開示している参考文献の例を以下に挙げる：Wall et al.、Nucleic Acids Research、第５巻、３１１３−３１２８頁（１９７８）；Zakut et al.、Nucleic Acids Research、第８巻、３５９１−３６０１頁（１９８０）；Cabilly et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.、第８１巻、３２７３−３２７７頁（１９８４）；Boss et al.、Nucleic Acids Research、第１２巻、３７９１−３８０６頁（１９８４）；Amster et al.、Nucleic Acids Research、第８巻、２０５５−２０６５頁（１９８０）；Moore et al.、米国特許第４６４２３３４号；Skerra et al.、Science、第２４０巻、１０３８−１０４１頁（１９８８）；Huse et al.、Science、第２４６巻、１２７５−１２８１頁（１９８９）；および米国特許第６０５４２９７、５５３０１０１、４８１６５６７、５７５０１０５および５６４８２３７号、これらについては出典明示により援用する。特に、上記技術は、種間モノクローナル抗体の製造に使用され得、ある種の結合領域を別の種の抗体の非結合領域と組合わせることにより、免疫原性を低下させる、例、Liu et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.、第８４巻、３４３９−３４４３頁（１９８７）、および特許第６０５４２９７および５５３０１０１号。好ましくは、遺伝子組換えにより製造されたＦａｂおよびＦｖフラグメントは、細菌宿主系で発現される。好ましくは、完全長抗体は、哺乳類細胞培養技術により製造される。さらに好ましくは、完全長抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＮＳＯ細胞で発現される。
【０１１６】
ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体はＥＬＩＳＡによりスクリーニングされ得る。他の固相免疫検定法の場合と同様、この試験は、高分子がプラスチックへ非特異的に吸着される傾向に基づくものである。この反応は不可逆的であり、免疫学的活性の喪失を伴わないため、抗原−抗体複合体が形成され得、単に非結合物質から上記複合体を分離するだけでよい。抗ペプチド血清を滴定するため、免疫化で使用したのとは異なる担体にコンジュゲートしたペプチドを、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに吸着させる。次いで、吸着された抗原をウェルにおいて抗ペプチド血清の希釈液と反応させる。非結合抗体を洗浄し、残存する抗原−抗体複合体を、免疫化動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。この二次抗体を、酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートする。酵素基質を加えたときに生じる可視的着色反応は、どのウェルが結合抗ペプチド抗体を有するかを示している。分光計の示数を用いることにより、結合したペプチド特異的抗体の量がより正確に定量され得る。高力価抗血清により、１０−３〜１０−５間の希釈率の直線滴定曲線が得られる。
【０１１７】
ＨＰＰペプチド担体
本発明は、ＨＰＰから誘導された免疫原、および担体および本発明ペプチド間のコンジュゲートを含む免疫原を含む。本明細書で使用されている免疫原の語は、免疫応答を誘発し得る物質をいう。本明細書で使用されている担体の語は、本発明ペプチドへ化学的にコンジュゲートされたとき、生成されたコンジュゲートで免疫化された宿主生物体においてコンジュゲートペプチドに特異的な抗体を産生させ得る物質をいう。担体には、赤血球、バクテリオファージ、タンパク質、または合成粒子、例えばアガロースビーズがある。好ましくは、担体は、タンパク質、例えば血清アルブミン、ガンマ−グロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、卵アルブミンまたはフィブリノーゲンである。
【０１１８】
担体に合成ペプチドを結合させる一般的技術は、幾つかの参考文献に記載されている：例、Walterおよび Doolittle、「Antibodies Against Synthetic Peptides」、Setlow et al.編、Genetic Engineering、第５巻、６１−９１頁（プレナム・プレス、ニューヨーク、１９８３）；Green et al. Cell、第２８巻、４７７−４８７頁（１９８２）；Lerner et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.、第７８巻、３４０３−３４０７頁（１９８１）；Shimizu et al.、米国特許第４４７４７５４号および Ganfield et al.、米国特許第４３１１６３９号。従って、これらの参考文献は、出典明示により援用する。また、担体にハプテンを結合させるのに用いる技術は、上記参考文献による技術、例えばTijssen、Practice and Theory of Enzyme Immunoassays、２０章（エルセビア、ニューヨーク、１９８５）と本質的に同じである。担体にペプチドを結合させるための４つの最も一般的に使用されるスキームは、（１）例えばKaganおよび Glick、Jaffeおよび Behrman編、Methods of Hormone Radioimmunoassay、３２８−３２９頁（アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９７９）、および Walter et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.、第７７巻、５１９７−５２００頁（１９８０）により開示された、アミノカップリングについてのグルタルアルデヒド；（２）例えば、Hoare et al.、J. Biol. Chem.、第２４２巻、２４４７−２４５３頁（１９６７）により開示された、カルボキシルについてアミノカップリングさせる水溶性カルボジイミド；（３）例えば、Bassiri et al.、４６−４７頁、JaffeおよびBehrman編（前出）、および Walter et al.（前出）により開示された、チロシンについてチロシン側鎖カップリングさせるビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＢ）；および（４）例えば、Kitagawa et al.、J. Biochem.（東京）、第７９巻、２３３−２３９頁（１９７６）、および Lerner et al.（前出）により開示された、アミノ基へシステイン（または他のスルフヒドリル）をカップリングさせるマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）である。所定のペプチドをタンパク質担体へカップリングさせる適切な方法の選択に関する一般的規則は、以下の通りである。結合に関与する基は配列中に１回のみ、好ましくはセグメントの適切な端部に見出されるべきである。例えば、チロシン残基がその潜在的抗原特性について選択された配列の主要部分に存在する場合は、ＢＤＢを使用するべきではない。同様に、中心に位置するリシンの場合グルタルアルデヒド方法は除外され、アスパラギン酸およびグルタミン酸が見出される場合、カルボジイミド方法は除外されることが多い。他方、適切な残基は、それらが「天然」タンパク質配列から見出される場合も見出されない場合も、結合部位として選択された配列セグメントのいずれか一端に配置され得る。内部セグメントは、アミノおよびカルボキシ末端とは異なり、ポリペプチドバックボーンが連続している天然タンパク質で見出されるのと同じ配列とは「非結合末端」が著しく異なる。α−アミノ基をアセチル化し、次いでそのカルボキシ末端を介してペプチドを結合することにより、この問題はある程度まで改善され得る。担体タンパク質へのカップリング効率は、好都合には、合成の一段階に関して放射性アミノ酸を用いるかまたはチロシン残基のヨウ素化で完成したペプチドを標識することによ���製造された、放射性標識ペプチドを用いることにより測定される。また、ペプチドにおけるチロシンの存在により、望ましい場合には高感度ラジオイムノアッセイの設定が可能となる。従って、チロシンは、それが天然ポリペプチドにより特定されたペプチド配列の一部ではない場合、末端残基として導入され得る。
【０１１９】
好ましい担体はタンパク質であり、好ましいタンパク質担体には、ウシ血清アルブミン、ミオグロブリン、オブアルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などがある。Liu et al.、Biochemistry、第１８巻、６９０−６９７頁（１９７９）により開示されたところによると、ペプチドは、ＭＢＳによりシステインを通してＫＬＨに結合され得る。ペプチドを、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７.５）、０.１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.０）または１.０Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.０）に溶かす。ペプチドの溶解についてのｐＨは、ペプチドの溶解度を最適化するように選択される。可溶性ペプチドについての遊離システインの含有量は、Ellman、Arch. Biochem. Biophys.、第８２巻、７０７７頁（１９５９）のEllman方法により測定される。各ペプチドについて、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）０.２５ｍｌ中の４ｍｇのＫＬＨを、０.７ｍｇのＭＢＳ（ジメチルホルムアミドに溶解）と反応させ、室温で３０分間攪拌する。ＫＬＨは＞３０％ホルムアミドには不溶性であるため、ＭＢＳを滴下することにより、確実にホルムアミドの局所濃度が高くなり過ぎないようにする。反応生成物、ＫＬＨ−ＭＢＳを、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）で平衡させたセファデックスＧ−２５に通すことにより、遊離ＭＢＳを除去し、カラム溶出液のピークフラクションからのＫＬＨ回収（ＯＤ２８０によりモニター）を評価したところ約８０％である。次いで、ＫＬＨ−ＭＢＳを、選択された緩衝液１ｍｌに溶かした５ｍｇのペプチドと反応させる。ｐＨを７〜７.５に調節し、反応物を室温で３時間攪拌する。カップリング効率を、リン酸緩衝食塩水に対するコンジュゲート試料の透析により放射性ペプチドでモニターすると、８％〜６０％の範囲であり得る。ペプチド−担体コンジュゲートが利用可能になると、例えばCampbell、Monoclonal Antibody Technology （エルセビア、ニューヨーク、１９８４）；Hurrell編、Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techniques and Applications （ＣＲＣプレス、ボカレートン、フロリダ、１９８２）；Schreier et al.、Hybridoma Techniques （コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８０）；米国特許第４５６２００３号に開示された要領で、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を標準技術により産生させる。
【０１２０】
ヒト化抗体
さらに本発明の抗ＨＰＰ抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。「ヒト化抗体」の語は、非ヒト抗体から誘導された配列のある部分を含むキメラ抗体、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')、または抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例、マウス）抗体のヒト化形態をいう。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の結合特異性、親和力および受容力を有するヒト以外の種、例えばマウス、ラットまたはウサギのＣＤＲからの残基により置換されているヒト免疫グロブリンを含む。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンの場合に対応しており、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン共通配列の同領域である少なくとも一つ、および一般的には二つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む（Jones et al.、Nature ３２１：５２２−５２５（１９８６）および Presta、Curr. Op. Struct. Biol.、２：５９３−５９６（１９９２））。非ヒト抗体のヒト化方法は、当業界では熟知されている。一般的に、ヒト化抗体は、抗体の当初の結合活性を保持しながらも、ヒト抗体とより密接に類似したものとなるように、ヒト以外である供給源からそれへ導入された１個またはそれ以上のアミノ酸を有する。抗体のヒト化方法は、さらにJones et al.、Nature ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Riechmann et al.、Nature ３３２：３２３−３２７（１９８８）；および Verhoeyen et al.、Science ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）で詳述されている。上記「ヒト化」抗体は、実質的に無傷のヒト可変ドメインには満たない部分がヒト以外の種からの対応する配列により置換されているという点でキメラ抗体である。
【０１２１】
ヘテロコンジュゲート抗体
２種の共有結合により連結された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学における公知方法を用いてインビトロで製造され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することにより製造され得る。
【０１２２】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる抗原についての結合特異性を有する。上記抗体はモノクローナルであり、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。本発明二重特異性抗体の結合特性の一方はＨＰＰについてのものであり、他方は、好ましくは細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットについてのものである。二重特異性抗体の製造方法は当業界では公知であり、一般に、二重特異性抗体の組換え生産は、ハイブリドーマ細胞における２種の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、２種の重鎖は異なる特異性を有する、例、Milsteinおよび Cuello、Nature ３０５：５３７−５３９（１９８３）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖をランダムに取合わせることにより、ハイブリドーマにより可能なものとして１０種の異なる抗体分子が製造される場合、正確な分子の精製には通常ある種のアフィニティー精製、例えばアフィニティークロマトグラフィーが必要とされる。
【０１２３】
ＨＰＰ抗体の使用
ＨＰＰ抗体は、好ましくは本発明のＨＰＰに特異的であり、それ自体、他のタンパク質から誘導されたペプチドと高い親和力で結合することはない。本明細書で使用されている「重鎖可変域」の語は、（１）１１０〜１２５アミノ酸長であり、そして（２）アミノ酸配列が、重鎖Ｎ−末端アミノ酸から始まる、本発明抗体の重鎖の配列に対応しているポリペプチドを意味する。同様に、「軽鎖可変域」の語は、（１）９５〜１１５アミノ酸長であり、そして（２）アミノ酸配列が、軽鎖Ｎ−末端アミノ酸から始まる、本発明抗体の軽鎖の配列に対応しているポリペプチドを意味する。本明細書で使用されている「モノクローナル抗体」の語は、ＨＰＰに特異的に結合し得る免疫グロブリンの異種集団をいう。
【０１２４】
抗体フラグメントの使用もまた熟知されている、例えばＦａｂフラグメント：Tijssen、Practice and Theory of Enzyme Immunoassays（エルセビア、アムステルダム、１９８５）；およびＦｖフラグメント：Hochman et al.、Biochemistry、第１２巻、１１３０−１１３５頁（１９７３）、Sharon et al.、Biochemistry、第１５巻、１５９１−１５９４頁（１９７６）および Ehrlich et al.、米国特許第４３５５０２３号、および抗体半分子：Auditore-Hargreaves、米国特許第４４７０９２５号。
【０１２５】
好ましくは、モノクローナル抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、または本発明モノクローナル抗体から誘導された他の結合組成物は、ＨＰＰに対して高い親和力を有する。ＨＰＰに対するモノクローナル抗体および関連分子の親和力は、プラスモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、または平衡透析を含む慣用的技術により測定され得る。プラスモン共鳴技術による親和力測定は、例えばＢＩＡコア２０００装置（ビアコア、ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて製造業者の推奨するプロトコルに従って実施され得る。好ましくは、例えば米国特許第６２３５８８３号に記載された要領で、ＥＬＩＳＡにより親和力を測定する。好ましくは、ＨＰＰおよび本発明モノクローナル抗体間の解離定数は１０−５モル未満である。さらに好ましくは、上記解離定数は１０−８モル未満であり、さらに好ましくは、上記解離定数は１０−９モル未満であり、そして最も好ましくは、上記解離定数は１０−９〜１０−１１モルの範囲である。
【０１２６】
本発明抗体は、ＨＰＰの検出に有用である。上記検出方法は、ＨＰＰ関連疾患の診断に有利に適用される。本発明抗体は、抗原−抗体反応を含むほとんどの検定法で使用され得る。この検定法は、ホモジニアスまたはヘテロジニアスであり得る。ホモジニアス検定方法では、試料は、生物学的試料または流体、例えば血清、尿、全血、リンパ液、血漿、唾液、細胞、組織、およびインビトロで培養された細胞または組織により分泌される物質であり得る。必要ならば、試料を前処理することにより、望ましくない物質を除去し得る。免疫学的反応は、通常、特異的抗体、標識被分析試料、および抗原を含む疑いのある試料を必然的に含む。標識から生じるシグナルは、標識被分析試料へ抗体が結合したとき、直接的または間接的に修飾される。免疫学的反応およびその範囲の検出は両方とも、均一溶液で実施される。使用され得る免疫学的標識には、遊離基（ラジカル）、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、補酵素などがある。
【０１２７】
ヘテロジニアス検定方法において、試薬は、通常、試料、特異的抗体、および検出可能シグナル発生手段である。一般的には試料を支持体、例えばプレートまたはスライド上に置き、液相中の抗体と接触させる。次いで、支持体を液相から分離し、支持相または液相のいずれかを、上記シグナル発生手段またはシグナル発生系を用いることにより検出可能シグナルについて調べる。シグナルは、試料中における抗原の存在と関連している。検出可能シグナルの発生手段には、放射性標識、蛍光化合物、酵素などの使用がある。ヘテロジニアス免疫検定法の例としては、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光方法、酵素結合免疫検定法などがある。
【０１２８】
上記免疫検定技術のより詳細な検討については、Edward T. Maggioによる“Enzyme-Immunoassay”（ＣＲＣプレス、インコーポレイテッド、ボカレートン、フロリダ、１９８０）を参照。また、例えば米国特許第３６９０８３４、３７９１９３２、３８１７８３７、３８５０５７８、３８５３９８７、３８６７５１７、３９０１６５４、３９３５０７４、３９８４５３３、３９６６３４５および４０９８８７６号も参照（このリストで全部網羅しているわけではない）。抗体および抗体フラグメントに標識をコンジュゲートする方法は、当業界ではよく知られている。上記方法は、米国特許第４２２０４５０、４２３５８６９、３９３５９７４および３９６６３４５号に記載されている。本発明抗体が使用され得る技術の別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識（Sternberger、Immunocytochemistry（１９７９）１０４−１６９頁）である。
【０１２９】
本発明抗体を使用する検定法の一態様は、本発明モノクローナル抗体が結合される表面の使用を含む。表面の基礎構造は、種々の形態をとり、異なる組成を有し得、組成物またはラミネートの混合物またはその組合わせであり得る。表面は、様々な形状および形態を呈し得、使用および測定方法によって異なる寸法を有し得る。表面の例としては、パッド、ビーズ、ディスク、または平坦、凹状または凸状であり得るストリップがあり得る。厚さは厳密なものではなく、一般的には約０.１〜２ｍｍ厚さであり、好都合な直径または他の寸法を有する。典型的には、表面は、ロッド、チューブ、毛細管、繊維、ストリップ、ディスク、プレート、キュベット上で支えられており、典型的には、多孔質であり、抗体の共有結合を可能にし、そして検出可能シグナル発生手段の一部分を形成する他の化合物の結合を可能にするように多官能性であるかまたは多官能性化され得る。天然および合成の両方を含む、広く多様な有機および無機ポリマーおよびその組合わせが、固体表面用の材料として使用され得る。ポリマーの例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、およびラテックスがある。他の表面には、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、セメント、シリケートなどがある。また、ゲル、ゼラチン、リポ多糖類、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミドを形成する基質または幾つかの水相、例えばデキストラン、ポリアルキレングリコール（２〜３個の炭素原子のアルキレン）を形成するポリマーまたは界面活性剤、例えばリン脂質も含まれる。表面への抗体の結合は、文献で一般的に利用可能である公知技術により達成され得る（例えば、“Immobilized Enzymes”、Ichiro Chibata、プレス、ニューヨーク（１９７８）およびCuatrecasas、J. Bio. Chem.、２４５：３０５９（１９７０）参照）。本発明のこの面に従って検定法を実施する場合、試料を水性媒質と混合し、抗体を結合させた表面と媒質を接触させる。標識は、同時にまたは後続的に加えられることにより、水性媒質に含まれ得、表面に随伴した検出可能シグナルが提供され得る。検出可能シグナルの発生手段は、標識被分析試料の組込みを伴い得るか、またはそれは標識をコンジュゲートさせた第二モノクローナル抗体の使用を含み得る。分離および洗浄段階は、必要に応じて実施される。検出されたシグナルは、試料中におけるＨＰＰの存在と関連している。同一支持体に目盛を定めることは、本発明の範囲内である。本発明による検定法の一特定態様は、限定ではなく、説明を意図したものであるが、支持体、例えばスライドまたはペトリ皿のウェルの使用を含む。この技術では、分析すべき試料を、適切な固定材料で支持体に固定し、スライド上の試料をモノクローナル抗体とインキュベーションする。適切な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水で洗浄後、抗体についての標識特異的結合パートナーと支持体を接触させる。所望に応じてインキュベーション後、スライドを水性緩衝液で再度洗浄し、抗��への標識モノクローナル抗体の結合から成る測定を実施する。標識が蛍光性である場合、スライドを、カバーグラス上の蛍光抗体封入液で覆い、次いで蛍光顕微鏡で検査することにより、結合の範囲が測定され得る。他方、標識は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされた酵素であり得、結合の範囲は、沈澱の尾形成、着色などにより示され得る、酵素活性の存在についてスライドを調べることにより測定され得る。
【０１３０】
本発明抗体を使用する検定法の具体例は、二重決定基ＥＬＩＳＡ検定法である。支持体、例えばガラスまたはビニルプレートを、慣用的技術によりＨＰＰに特異的な抗体で被覆する。通常水性媒質中で、ＨＰＰを含有する疑いのある試料と支持体を接触させる。３０秒から１２時間のインキュベーション期間後、支持体を媒質から分離し、例えば水または水性緩衝媒質で洗浄することにより、非結合ＨＰＰを除去し、再び普通は水性媒質中でＨＰＰに特異的な抗体と接触させる。抗体を、直接的または間接的に酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼで標識する。インキュベーション後、支持体を媒質から分離し、上記と同様に洗浄する。支持体または水性媒質の酵素活性を測定する。この酵素活性は、試料中のＨＰＰの量と関連している。
【０１３１】
別の抗体利用検出方法には、本明細書に記載されている保持物質クロマトグラフィー方法がある。この場合、吸着剤は抗体である。好ましくは、本発明の複数のＨＰＰについて特異的な複数の抗体を表面または基質に含ませる。
【０１３２】
本発明はまた、上記で開示された方法を実施するためのキット、例えば診断検定キットを含む。一態様では、キットは、（ａ）上記でより具体的に特定したモノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクローナル抗体についての特異的結合パートナーおよび検出可能シグナルを発生し得る標識のコンジュゲートをパッケージ化した組合わせで含む。試薬はまた、助剤、例えば緩衝剤およびタンパク質安定剤、例えば多糖類などを含み得る。キットは、さらに必要な場合、標識が一員であるシグナル発生系の他の要員、試験においてバックグラウンド干渉を低減化する薬剤、対照試薬、試験実施用装置などを含み得る。別の態様において、診断キットは、本発明のモノクローナル抗体および検出可能シグナルを発生し得る標識のコンジュゲートを含む。上記助剤もまた存在し得る。
【０１３３】
さらに、抗ＨＰＰ抗体（例、モノクローナル抗体）は、標準技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法によるＨＰＰの単離に使用され得る。例えば、抗ＨＰＰ抗体は、細胞からの天然ＨＰＰの精製および宿主細胞で発現される遺伝子組換えにより製造されたＨＰＰの精製を簡便化し得る。さらに、抗ＨＰＰ抗体を用いてＨＰＰを単離することにより、低濃度のＨＰＰの（例、血漿、細胞ライゼートまたは細胞上清における）検出を助けるかまたはＨＰＰの存在量および発現パターンを評価し得る。抗ＨＰＰ抗体を診断に使用することにより、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターする、例えば与えられた治療法の効力を測定することができる。抗体を標識基にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことにより検出は容易になり得る。
【０１３４】
タンパク質アレイを用いた検出
本発明ポリペプチドの検出および精製は、米国特許第６２２５０２７号および米国特許出願第２００１００１４４６１号に記載された要領で、保持物質クロマトグラフィー（好ましくは、タンパク質アレイまたはチップ）を用いて実施され得る。簡単に述べると、保持物質クロマトグラフィーは、ポリペプチド（および／または他の試料成分）を吸着剤（例、アレイまたはチップ）上に保持させ、それに続いて検出する方法をいう。上記方法では、（１）複数の異なる吸着剤／溶離剤の組合わせ（「選択的条件」）のもとで試料からのポリペプチドを基質に選択的に吸着させ、そして（２）脱離分光測定法により（例、質量分析法により）吸着されたポリペプチドの保持を検出する。「脱離分光測定法」は、物質（例、ポリペプチド）を検出する方法であって、固定相から気相へ物質を脱離させるエネルギーに物質を曝露し、二次固定相での中間体捕捉を伴わずに、脱離された物質またはその識別可能な部分を、検出器により直接検出する方法をいう。慣用的クロマトグラフィー方法では、ポリペプチドは、検出前に吸着剤から溶出される。吸着クロマトグラフィーと、脱離分光測定法による検出の結合により、驚くべき感度、様々な異なる選択性条件により保持成分を迅速に分析する性能が得られ、また異なる溶離条件下におけるアレイ上の異なる部位（すなわち、「アフィニティー部位」または「スポット」）に吸着された成分の並行プロセッシングが達成される。
【０１３５】
好ましい態様は、特異的ポリペプチド、好ましくはＨＰＰを検出するために開発された、化学的（例、イオン−アフィニティーまたは疎水性物質）または生物特異的（例、抗体またはその抗原結合フラグメント）のいずれかである吸着剤を提供する。ある種の態様では、基質は、例えば診断マーカーとして、ポリペプチドの組合わせについて選択された吸着スポットのアレイを有する。僅か２および１０、１００、１０００またはそれ以上もの吸着剤が、単一基質にカップリングされ得る。吸着部位のサイズは、実験設計および目的により変化し得る。しかしながら、それは、衝撃的エネルギー供給源の直径（例、レーザースポット直径）より大きい必要は無い。スポットは、同一または異なる吸着剤により構成され得る。場合によっては、複数の異なる溶離液に対する評価が行えるかまたは結合ポリペプチドが恐らくは二次プロセッシングにおける、将来的使用または対照標準用に保存され得るため、基質上の多数の場所に同じ吸着剤を配することが有利なこともある。基質に複数の異なる吸着剤を配することにより、単一試料（例、血漿試料）に関して異なる吸着剤の組合わせにより提供される複数の結合特性を利用し、それによって広く多様な種々のポリペプチド（好ましくはＨＰＰ）を結合および検出することが可能である。単一試料評価のための基質に対する複数の異なる吸着剤の使用は、各々異なるクロマトグラフィーカラムによる、多数のクロマトグラフィー実験を同時に実施するのと本質的に同等であるが、本発明方法は単一系のみですむという利点を有する。
【０１３６】
基質が複数の吸着剤を含むとき、予め定められたアドレス可能な場所に吸着剤を配することは特に有用である。予め定められたアドレス可能な場所に吸着剤を配することにより、第一溶離液で第一の予め定められたアドレス可能な場所における吸着剤を洗浄し、第二溶離液で第二の予め定められたアドレス可能な場所における吸着剤を洗浄することが可能である。このようにして、単一吸着剤のその特定ポリペプチドに関する結合特性は、各々吸着剤−ポリペプチド結合特性の各セットを選択的に修飾する多くの溶離液の存在下で評価され得る。
【０１３７】
保持物質クロマトグラフィーは、多数のポリペプチドの並行した分離および検出を含む組合わせ分離方法で使用され得る。この方法は、ａ）試料（例、生物学的流体、例えば血漿）を、各々吸着剤および溶離液の組合わせにより特定された選択条件である、少なくとも２つの異なる選択条件に曝露することにより、吸着剤によりポリペプチドを保持させ、そしてｂ）脱離分光測定法により異なる選択条件下で保持されたポリペプチドを検出する段階を含む。異なる各選択条件は、並行プロセッシングするために予め定められた、異なるアドレス可能な場所で特定される。この方法は、ｉ）試料を特定場所での第一選択条件に曝露することにより、吸着剤によりポリペプチドを保持させ、ii）脱離分光測定法により第一選択条件下で保持されたポリペプチドを検出し、iii）特定場所での第二の異なる選択条件下で吸着剤を洗浄することにより、その場所での吸着剤にポリペプチドを保持させ、そしてiv）脱離分光測定法により第二選択条件下で保持されたポリペプチドを検出する段階を含む。
【０１３８】
ポリペプチドは、本明細書で詳述されている気相イオン分光測定法、ＳＥＬＤＩまたは質量分析技術により検出され得る。「気相イオン分光測定法」は、イオン化源の使用により表面に提示された物質から気相イオンを発生させ、気相イオン分光計で気相イオンを検出する方法をいう。「表面強化レーザー脱離／イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」は、物質提示表面が、脱離およびイオン化プロセスにおいてある能動的な役割を演じる気相イオン分光測定法である。ＳＥＬＤＩ技術は、例えば米国特許第５７１９０６０および６２２５０４７号（Hutchensおよび Yip）に記載されている。
【０１３９】
これらの方法は、ＨＰＰの組合わせ（コンビナトリアル）の生化学的分離および精製、差次的遺伝子発現の試験、および試料間におけるタンパク質レベルの差異の検出（例、診断用）に有用である。国際公開第０３／０１９１９３号（Ciphergen）は、流体試料における特異的腎臓病マーカーの上記検出方法の使用について報告している。YipおよびLomas（Technol Cancer Res Treat、２００２、１：２７３−８０）は、癌関連ポリペプチドを検出するのに類似方法を採用している。本発明のＨＰＰまたはＨＰＰ結合物質は、好ましくは標識基に結合されるため、直接検出され、単一ユニット作動中に同じ「回路」（すなわち、アドレス可能な「チップ」場所）から２つまたはそれ以上のシグナルが同時に伝達され得る。本発明の好ましい態様は、試料、好ましくは血漿から少なくとも一つのＨＰＰを同定するための保持物質クロマトグラフィーの使用を包含する。
【０１４０】
Chen et al.（Anal Chem ２００２；７４：５１４６−５３）により報告されたところによると、マイクロチップに基づく検出法の変形では電気泳動を利用する。この方法では、フロー−スルーサンプリングチップを、免疫分離、タンパク質精製、濃縮および検出目的に適用する。この装置は、動水圧を用いてサンプルフローを駆動し、そしてゲーティング電圧をマイクロチップ上の電気泳動チャンネルに適用する。この装置を用いると、洗浄／溶離段階が、マイクロチップにおける電気泳動分離および検出とオンラインで統合され得る。さらに、無電界床により、タンパク質−吸着剤相互作用が洗浄／溶離段階中に電界による影響を受けないことが確実にされる。
【０１４１】
質量分析法によるＨＰＰの検出
本発明によると、試料中におけるタンパク質の同一性および存在量を測定するのにいかなる器具、方法、プロセス等でも使用され得る。同一性を得る好ましい方法は質量分析法によるものであり、試料中のタンパク質分子をイオン化し、次いでその結果のタンパク質イオンの質量および電荷を検出および測定する。
【０１４２】
質量分析法を用いてタンパク質を分析するため、タンパク質をガス−イオン相に変換するのが好ましい。様々なタンパク質イオン化方法が有用であり、例えば高速イオン衝撃（ＦＡＢ）、プラズマ脱離、レーザー脱離、熱脱離、好ましくはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。多くの異なる質量分析装置がペプチドおよびタンパク質分析に利用可能であり、例えば、飛行時間型（ＴＯＦ）、イオントラップ（ＩＴＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン（ＦＴＭＳ）、四重極イオントラップ、およびセクター（電気および／または磁気）分光計があるが、これらに限定されるわけではない。例えば、イオントラップＭＳについては米国特許第５５７２０２５号参照。質量分析装置は、単独でも、またはタンデム質量分析計における他の質量分析装置と組合わせても使用され得る。後者の場合、第一質量分析装置は、タンパク質イオン（前駆イオン）を互いに分離し、試料中における様々なタンパク質成分の分子量を測定するのに使用され得る。第二の質量分析装置は、例えば、前駆イオンを、例えば不活性ガスを用いることにより生成イオンに断片化することにより、分離された各成分を分析するのに使用され得る。例えば三連四重極、タンデム飛行時間型、イオントラップ、および／またはその組合わせを含め、質量分析装置の如何なる所望の組合わせでも使用され得る。
【０１４３】
様々な種類の検出装置がタンパク質イオンの検出に使用され得る。例えば、破壊的検出装置、例えばイオン電子倍率器または極低温検出装置が使用され得る（例、米国特許第５６４００１０号）。さらに、非破壊的検出装置、例えば四重極イオントラップ質量分析計またはＦＴＭＳにおけるイオン電流ピックアップ装置として使用されるイオントラップも使用され得る。
【０１４４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦについては、若干の試料製造方法が使用され得、乾燥飛沫（Karasand Hillenkamp、Anal. Chem.、６０：２２９９−２３０１、１９８８）、真空乾燥（Winberger et al.、Proceedings of the 41st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics、サンフランシスコ、１９９３年５月３１日〜６月４日、７７５ａ−ｂ頁）、粉砕結晶（Xiang et al.、Rapid Comm. Mass Spectrom.、８：１９９−２０４、１９９４）、低速結晶成長（Xiang et al.、Org. Mass Spectrom、２８：１４２４−１４２９、１９９３）、活性フィルム（Mock et al.、Rapid Comm. Mass Spectrom.、６：２３３−２３８、１９９２、Bai et al.、Anal. Chem.、６６：３４２３−３４３０、１９９４）、エアー式スプレー（Kochling et al.、Proceedings of the 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics、アトランタ、ジョージア、１９９５年５月２１〜２６日、１２２５頁）、エレクトロスプレー（Hensel et al.、Proceedings of the 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics、アトランタ、ジョージア、１９９５年５月２１〜２６日、９４７頁）、高速溶媒濃縮（Vorm et al.、Anal. Chem.、６６：３２８１−３２８７、１９９４）、サンドイッチ（Li et al.、J. Am. Chem. Soc.、１１ ８：１１６６２−１１６６３、１９９６）、および２層方法（Dal et al.、Anal. Chem.、７１：１０８７−１０９１、１９９９）が含まれる。また、例えば Liang et al.、Rapid Commun. Mass Spectrom.、１０：１２１９−１２２６（１９９６）；van Adrichem et al.、Anal. Chem.、７０：９２３−９３０（１９９８）も参照。
【０１４５】
ＭＡＬＤＩ分析については、液相において試料をエネルギー吸収性化合物またはコロイド（マトリックス）と混合し、最終的に不活性プローブの表面上で溶液を固体状に乾燥することにより、固態共結晶または薄膜として試料を調製する。場合によっては、エネルギー吸収性分子（ＥＡＭ）が、試料提示表面の必須成分であることもある。ＥＡＭ適用戦略とは関係無く、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩＭＳ）への導入前に、プローブ内容物を固体状態に乾燥させる。
【０１４６】
ＴＯＦ質量分析法におけるイオン検出は、典型的には電子放出検出装置、例えば電子増倍管（ＥＭＰ）またはマイクロチャンネルプレート（ＭＣＰ）の使用により達成される。これらの装置は両方とも、一次入射荷電粒子を、二次、三次、四次等の電子のカスケードに変換することにより機能する。単一入射荷電粒子の衝撃により発生する二次電子の確率は、この荷電粒子のイオン対電子変換効率（または、より単純には変換効率）であるとみなされ得る。入射荷電粒子の総数と比較したときのカスケード事象についての電子収率は、典型的には検出装置利得として報告される。一般的にＭＣＰの全体的応答時間はＥＭＰの場合よりかなり優れているため、ＭＣＰは、質量／電荷分解能増強にとって好ましい電子放出検出装置である。しかしながら、迅速な応答時間および広い周波数帯域幅が必要ではない場合には、ＥＭＰでも運動エネルギーが分配されたイオン集団の検出については十分に機能する。
【０１４７】
消化されたタンパク質分析についての好ましい面では、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ−ＴＭＳ）が使用される。このシステムは、液体クロマトグラフ、次いでタンデム質量分析法の使用により試料分離の追加段階を提供する。
【０１４８】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびＭＡＬＤＩは、ＭＳへキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を連結する常用的イオン化技術である（Moini, M.、Anal Bioanal Chem、２００２；３７３：４６６−８０）。ＣＥは、高い感度および分離効率という利点を有する。ＣＥの高濃度検出限界については、試料濃縮および試料フォーカシング方法の開発により取組まれてきた。さらに、広く多様な技術、例えばキャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点フォーカシング、およびオンカラム過渡的等速電気泳動は、現時点でＭＳに連結されている。Deterding et al.（Electrophoresis ２００２；２３：２２９６−３０５）は、血漿試料からのアポリポタンパク質種の同定に関するＣＥ−ＭＳ技術の有効な適用について報告している。すなわち、これらの方法も、同様に特にヒト血漿試料におけるＨＰＰの検出に適用されると考えられる。
【０１４９】
好ましい面では、実施例１に記載されたシステムによるカラムから溶出されたタンパク質を、ＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析の両方を用いて分析する。例えば、ＲＰ２から溶離する無傷タンパク質の小部分は、ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳを用いてオンライン検出に転換され得る。トリプシン消化またはトリプシンによらない消化、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳについての調製、並びに異なるマトリックスによるＭＡＬＤＩプレートの調製を可能にする若干のプレートでタンパク質を等分する。すなわち、これらの方法により、無傷質量に関する情報に加えて、ペプチドマスフィンガープリンティングおよびＭＳ−ＭＳ技術の両方により分析が実施され得る。
【０１５０】
本明細書に記載されているタンパク質の分離および分画方法により、個々のタンパク質または少数の異なるタンパク質を含むフラクションが提供される。これらのタンパク質は、タンパク質およびその断片化から生じるペプチドの分子質量のマススペクトル測定により同定され得る。タンパク質配列データベースにおいて入手可能な情報を利用することにより、インシリコで作成されたタンパク質加水分解ペプチド質量パターン、および実験的に観察されるペプチド質量パターン間の比較が行われ得る。理論的および実験的タンパク質加水分解フラグメント間のマッチ数に基づいて（他の基準の中でも）、データベースにおける候補タンパク質をランク付けしている「ヒット・リスト」がコンパイラーで作成され得る。ペプチドマッピングおよび配列データベース検索戦略に基づいた、オンラインタンパク質同定用ソフトウェアを提供する幾つかのウェブサイトがアクセス可能である（例、http://www.expasy.ch）。ＭＳを用いるペプチドマッピングおよび配列決定方法は、国際公開第９５／２５２８１９号、米国特許第５５３８８９７号、米国特許第５８６９２４０号、米国特許第５５７２２５９号、および米国特許第５６９６３７６号に記載されている。また、Yates, J. Mass Spec.、３３：１（１９９８）も参照。
【０１５１】
質量分析計から集められたデータは、典型的には検出された各事象についての強度および質量対電荷比を含む。スペクトルデータは、例えばグラフ、数値または電子フォーマットのディジタルまたはアナログ形態を含む、適切な形態で記録され得る。スペクトルは、好ましくは例えば磁気的、例えばフロッピーディスク、テープ、またはハードディスク、光学的、例えばＣＤ−ＲＯＭまたはレーザーディスク、またはＲＯＭ−ＣＨＩＰＳを含む記憶媒体で記録される。
【０１５２】
与えられた試料のマススペクトルは、典型的にはタンパク質強度、質量対電荷比、および分子量に関する情報を提供する。本発明の好ましい態様では、試料中におけるタンパク質の分子量を、マッチング基準として使用することによりデータベースをクエリーする。慣用的に、例えば単電荷プロトン化分子イオンについてイオン化プロトンの質量を控除し、測定された質量／電荷比に多電荷イオンについての電荷数を乗じ、イオン化プロトンの数を控除することにより分子量を計算する。
【０１５３】
本発明によると、様々なデータベースが有用である。有用なデータベースには、ゲノム配列、発現された遺伝子の配列、および／または発現されたタンパク質の配列を含むデータベースがある。好ましいデータベースは、既知生物体、器官、組織または細胞型に存在するタンパク質のヌクレオチド配列誘導分子量を含む。読み枠（ＯＲＦ）を同定し、ヌクレオチド配列をタンパク質配列および分子量情報に変換するための若干のアルゴリズムが存在する。ＳｗｉｓｓＰＲＯＴ／ＴｒＥＭＢＬデータベース（http://www.expasy.ch）を含む、幾つかの公的にアクセス可能なデータベースが利用可能である。
【０１５４】
典型的には、質量分析計は、ある種の閾値レベルを超えるピークを同定し、検出されたイオンの質量、電荷および強度を計算する市販のソフトウェアを備えている。与えられたアウトプットピークと分子量との相関関係は、スペクトルデータから直接明らかにされ得、すなわち、イオンにおける電荷が一つであるため、分子量は、計算器の値−イオン化プロトンの質量に等しい。しかしながら、タンパク質イオンは、様々な対イオンおよび付加物、例えばＮ、ＣおよびＫと複合体を形成し得る。かかる場合には、所定のタンパク質イオンは、同一タンパク質の種々のイオン状態（または種）を表す、多重ピーク、例えばトリプレットを呈することが予後される。すなわち、スペクトルデータを分析および処理することにより、同一タンパク質から生じるピークの群を測定することが必要であり得る。この分析は、慣用的に、例えばMann et al.、anal. Chem.、６１：１７０２−１７０８（１９８９）による記載に従って実施され得る。
【０１５５】
質量分析計から計算された分子量を、データベース、例えばゲノムまたは発現された遺伝子のデータベースから予後される分子量とマッチングする際には、翻訳後プロセッシングを考慮に入れなければならない。タンパク質加水分解的プロセッシング、Ｎ−末端メチオニンの除去、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化などを含む、タンパク質構造を修飾する様々なプロセッシング事象がある。
【０１５６】
データベースは、未知分子量とマッチする一連のタンパク質についてクエリーされ得る。レンジのウインドウは、器具の精度、試料を調製した方法などにより決定され得る。スペクトルにおけるヒットの数（ヒットがマッチである場合）に基き、未知タンパク質またはペプチドを同定または分類する。
【０１５７】
質量分析法により一つまたはそれ以上のＨＰＰを同定する方法は、診断および予後に有用である。好ましくは、上記方法を用いることにより、ヒト血漿に存在する一つまたはそれ以上のＨＰＰが検出される。技術の例は、米国特許出願０２／００６０２９０、０２／０１３７１０６、０２／０１３８２０８、０２／０１４２３４３、０２／０１５５５０９に記載されている。
【０１５８】
診断および予後判定用途
本明細書に記載されている核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗体は、以下の方法の一つまたはそれ以上で使用され得る：診断検定法、予後判定法、臨床試験のモニター、および本明細書で詳述されている薬理遺伝学的方法。
【０１５９】
本発明は、さらに記載されている通り、ＨＰＰ核酸およびタンパク質を検出する診断および予後判定法を提供する。また、ＨＰＰおよびＨＰＰ標的分子、特に天然アゴニストおよびアンタゴニスト間の相互作用を検出する診断および予後判定法が提供される。
【０１６０】
本発明は、２つまたはそれ以上の試料間で示差的に発現されるポリペプチドの同定方法を提供する。「示差的発現」とは、試料間におけるポリペプチドの量または質の差異についていう。上記差異は、転写から翻訳後修飾を通してタンパク質発現のどの段階でも起こり得る。例えば、タンパク質アレイ方法を用いると、吸着剤の異なるセット（例、チップ）におけるアフィニティースポットに２試料を結合させ、認識地図を比較することにより、２セットの吸着剤が示差的に保持しているポリペプチドを同定する。示差的保持は、ポリペプチドにおける量的保持および質的保持を含む。例えば、タンパク質の翻訳後修飾における差異は、結合特性の差異（例、グリコシル化タンパク質はレクチン吸着剤に示差的に結合する）または質量の差異（例、翻訳後開裂生成物）として検出され得る認識地図の差異をもたらし得る。ある種の態様において、吸着剤は、病気または症候群診断用マーカーの組合わせについて選択されたアフィニティースポットのアレイを有し得る。
【０１６１】
試料間におけるポリペプチドレベルの差異（例、血漿試料における示差的発現ＨＰＰ）は、試料を様々な分析条件に曝露することにより脱離分光測定法（例、質量分析法）により同定され得る。タンパク質は、物理化学特性（例、分子量）を検出することにより同定され得、この情報を用いて、類似プロファイルを有するタンパク質についてのデータベースを検索し得る。
【０１６２】
ＨＰＰの好ましい検出方法は、質量分析技術を利用する。上記方法は、診断または予後判定にかけられた試料、例えば生物学的試料中に存在する特定ＨＰＰイソ型のサイズおよび特徴についての情報を提供する。質量分析技術は、「質量分析法によるＨＰＰの検出」と題する項で詳述されている。実施例１は好ましい検出スキームを概説しており、そこでは生物学的試料を、質量分析法による特性確認前にクロマトグラフィーにより分離する。本発明は、生物学的試料におけるＨＰＰの検出方法であって、少なくとも一つのクロマトグラフィー段階により生物学的試料（例、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、特定組織の細胞ライゼート）を分画し、フラクションを質量分析法にかけ、そして質量分析法で観察されたポリペプチド形質の特性をＨＰＰポリペプチドの既知特性と比較する段階を含む方法を提供する。
【０１６３】
特に好ましい方法は、例えば、タンパク質アレイまたはチップを含む、保持物質クロマトグラフィー方法を用いた少なくとも一つのＨＰＰの検出を含む。上記方法は、「タンパク質アレイを用いた検出」と題する項で記述されている。好ましくは、上記の複数のＨＰＰは、生物学的試料、好ましくは血漿から検出される。有利な態様は、ヒト血漿に存在するタンパク質を示すアドレス可能なアレイにおいてＨＰＰを検出し得るタンパク質チップを提供する。
【０１６４】
従って、本発明の一態様は、本発明分子（例、ＨＰＰ、ＨＰＰ核酸、または抗体）を用いることにより、ＨＰＰ関連疾患または前述のＨＰＰ活性のいずれかが示される疾患を診断または予後判定する用法（例、診断検定法または予後判定法）を含む。別の態様において、本発明は、本発明分子を、例えば、前述の活性のいずれかが病理学的に摂動されている対象、好ましくはヒト対象の診断または予後判定に使用する用法を含む。
【０１６５】
例えば、本発明は、ＨＰＰが生物学的試料内で発現されるか否かの測定方法であって、ａ）ｉ）ストリンジェント条件下でＨＰＰ核酸とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、またはii）ＨＰＰと選択的に結合する検出可能なポリペプチド（例、抗体）と生物学的試料を接触させ、そしてｂ）上記ポリヌクレオチドおよび上記試料内のＲＮＡ形質間におけるハイブリダイゼーションの存在または非存在、または検出可能なポリペプチドと上記試料内のポリペプチドとの結合の存在または非存在を検出することを含む方法を包含する。上記のハイブリダイゼーションまたは結合の検出は、ＨＰＰが試料内で発現されテイルことを示す。好ましくは、ポリヌクレオチドはプライマーであり、この場合ハイブリダイゼーションは、プライマー配列を含む増幅産物の存在を検出することにより検出され、または検出可能なポリペプチドは抗体である。
【０１６６】
ある種の態様において、検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例、米国特許第４６８３１９５および４６８３２０２号参照）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ、または別法としてライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例、Landegren et al.（１９８８）Science ２４１：１０７７−１０８０；およびNakazawa et al.（１９９４）PNAS ９１：３６０−３６４参照）におけるプローブ／プライマーの使用を伴い、後者の場合、特にＨＰＰコード化遺伝子における点突然変異の検出に有用であり得る（Abravaya et al.（１９９５）Nucleic Acids Res. ２３：６７５−６８２参照）。
【０１６７】
また、哺乳類、好ましくはヒトがＨＰＰ発現レベルの上昇または低下を示すか否かの測定方法であって、ａ）哺乳類から生物学的試料を入手し、そしてｂ）上記生物学的試料内におけるＨＰＰまたはＨＰＰをコード化するＨＰＰ ＲＮＡ形質の量を、対照試料で検出されるレベルと比較することを含む方法も考えられる。対照試料から検出または予測されるレベルと比べて生物学的試料内におけるＨＰＰまたはＨＰＰ ＲＮＡ形質の量が多いのは、哺乳類においてＨＰＰ発現レベルが増加したことを示し、対照試料から検出または予測されるレベルと比べて生物学的試料内におけるＨＰＰまたはＨＰＰ ＲＮＡ形質の量が少ないのは、哺乳類においてＨＰＰ発現レベルが低下したことを示す。
【０１６８】
本発明はまた、診断検定法、予後判定法、および臨床試験のモニターを予後判定目的に使用する予測医学分野に関するものである。従って、本発明の一面は、生物学的試料（例、血液、血漿、細胞、組織）の状況において、ＨＰＰおよび／または核酸発現並びにＨＰＰ活性を測定することにより、個体が、有害なＨＰＰ発現または活性に随伴した病気または障害に罹患しているか否か、または発病する危険に瀕しているかを測定する診断検定法に関するものである。本発明はまた、個体が、ＨＰＰ、核酸発現または活性に随伴した疾患を発症する危険に瀕しているか否かを測定する予後（または予測）検定法を提供する。例えば、ＨＰＰコード化遺伝子における突然変異は、生物学的試料において検定され得る。上記検定法を予後または予測目的に使用することにより、ＨＰＰ発現または活性を特徴とするかまたはそれに随伴する疾患が始まる前に個体に予防処置を施すことができる。
【０１６９】
「生物学的試料」の語は、個体から単離された組織、細胞および生物学的流体、並びに個体内に存在する組織、細胞および流体を包含するものとする。すなわち、本発明検出方法を用いることにより、インビトロおよびインビボでの生物学的試料からＨＰＰ ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡが検出され得る。好ましい生物学的試料は、生物学的流体、例えば細胞ライゼート、リンパ液、脳脊髄液、血液および特に血漿である。例えば、ＨＰＰ ｍＲＮＡのインビトロ検出技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよび in situ ハイブリダイゼーションがある。ＨＰＰのインビトロ検出技術には、質量分析法、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法がある。ＨＰＰコード化ゲノムＤＮＡのインビトロ検出技術には、サザーンハイブリダイゼーションがある。さらに、ＨＰＰのインビボ検出技術には、標識抗ＨＰＰ抗体を個体へ導入する方法がある。
【０１７０】
医薬組成物
本発明の一面は、投与に適切な医薬組成物に関するものである。一態様において、医薬組成物は、医薬上許容される担体と共に、１種またはそれ以上のＨＰＰポリペプチドを含む。別の態様では、医薬組成物は、本発明の小分子、ペプチド、ＨＰＰ核酸分子および抗ＨＰＰ抗体を含む、ＨＰＰまたはＨＰＰ生物学的活性を検出またはモジュレーションし得る化合物を含む。上記組成物は、典型的には医薬上許容される担体を含む。本明細書で使用されている「医薬上許容される担体」の語は、医薬組成物と適合し得る、あらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを全て包含するものとする。医薬活性物質に関する上記媒質および薬剤の使用は、当業界では熟知されている。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合以外は、組成物におけるその使用が考えられる。補足的活性化合物もまた、組成物に組込まれ得る。
【０１７１】
本発明医薬組成物は、意図された投与経路と適合し得るように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与がある。非経腸、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えば酢酸、クエン酸またはリン酸緩衝液、および張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨て注射器または多容量型バイアルに封入され得る。
【０１７２】
注射可能用途に適した医薬組成物は、滅菌注射可能溶液または分散液を即座に製造するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。全ての場合において、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射器に使用できる程度まで流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒質であり得る。適正な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含ませるのが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより可能となる。
【０１７３】
活性化合物がタンパク質、例えば抗ＨＰＰ抗体である場合、滅菌注射可能溶液は、必要に応じて上記で列挙した成分の一つまたは組合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組込み、次いで濾過滅菌することにより製造され得る。一般的に、分散液は、基礎分散媒質および上記で列挙したものからの他の必要成分を含む滅菌賦形剤中へ活性化合物を組込むことにより製造される。滅菌注射可能溶液製造用の滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、有効成分に所望の追加成分を加えた粉末が先に滅菌濾過しておいたその溶液から生成される。
【０１７４】
経口組成物は、一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与目的の場合、活性化合物は、賦形剤と共に組込まれ、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。吸入投与の場合、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素といった気体を含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエーロゾルスプレー形態で送達される。全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、透過すべきバリアーに適切な浸透剤が製剤に使用される。上記浸透剤は、一般的に当業界では公知であり、例えば、経粘膜投与については、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当業界において公知の要領で、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。最も好ましくは、活性化合物は、静脈内注射により対象に送達される。
【０１７５】
一態様において、活性化合物は、例えば移植片およびマイクロカプセルデリバリーシステムを含む放出制御型製剤として、身体からの急速な排出に対して化合物を保護する担体を用いて製造される。生物分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酪酸が使用され得る。上記処方物の製造方法は、当業者には容易に理解できるものである。材料はまた、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入され得る。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染させた細胞にターゲッティングされたリポソームを含む）は、医薬上許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば米国特許第４５２２８１１号（これについては出典明示により援用する）記載の要領で製造され得る。
【０１７６】
さらなる態様では、活性化合物は、マイクロチップ薬剤送達装置においてコーティングされ得る。上記装置は、タンパク質組成物を消化にかけたり、個体に注射をすること無く、個体の血流、脳脊髄液、リンパまたは組織へ上記組成物を制御型送達するのに有用である。マイクロチップ薬剤送達装置の使用方法は、米国特許第６１２３８６１、５７９７８９８号および米国特許出願２００２０１１９１７６Ａ１に記載されており、これらについては出典明示により援用する。
【０１７７】
投与のし易さおよび投薬量の均一性にとっても投薬単位形態で経口または好ましくは非経腸組成物を処方することは、特に有利である。本明細書で使用されている投薬単位形態は、処置される対象にとって単位投薬量として適した物理的個別単位をいい、各単位は、必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された予め定められた量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態についての特殊化は、活性化合物固有の特徴および達成されるべき特定治療効果、および個体治療用として上記活性化合物を調合する際の当技術分野固有の限界により直接的に規定される。
【０１７８】
上記化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）の測定についての細胞培養または実験動物における標準的医薬手順により測定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物が使用され得る場合、非感染細胞への潜在的損傷を最小限に抑えることにより副作用を低減化するために、上記化合物を罹患組織部位へターゲッティングするデリバリーシステムの設計には注意するべきである。
【０１７９】
細胞培養検定法および動物試験から得られたデータは、人体で使用される投薬量の範囲を処方するのに使用され得る。上記化合物の投薬量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く伴わず、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に含まれる。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路によりこの範囲内で変動し得る。本発明方法で使用される化合物については、治療有効量は、最初に細胞培養検定法から評価され得る。用量を動物モデルで処方することにより、人体で有用な用量がより正確に決定され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１８０】
医薬組成物は、投与についての説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサーに封入され得る。
【０１８１】
病気の治療
本発明のＨＰＰポリペプチド並びに本発明のＨＰＰモジュレーターおよびＨＰＰ関連組成物は、ＨＰＰ関連障害の処置または予防で使用され得る。上記疾病および障害には、下記の疾病および障害があるが、これらに限定されるわけではない。実施例４は、本発明のＨＰＰポリペプチドが治療、予後および／または診断に使用され得る疾病および障害を決定するのに適した方法を提供する。しかしながら、この目的に使用され得る、当業界で公知の適切な方法も他に存在するものとする。
【０１８２】
細胞増殖および癌に関連した病気の治療
本発明の一面によると、ＨＰＰ−３８ポリペプチドは、癌疾患または過形成に関連する疾患または状態の処置用または上記疾患の予後または診断用に提供される。
【０１８３】
本発明に従ってヒト血漿から検出されたポリペプチドＨＰＰ−３８は、食道癌関連遺伝子２（ＥＣＲＧ２）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ５８０６２の一部であるアミノ酸配列を有することが見出された。本発明の明細書において、ＨＰＰ−３８ポリペプチドの語は、配列番号３９１および３９２に示された配列のポリペプチドを包含する。また、変異型および誘導体が、望ましくは少なくとも８０％、さらに望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の割合で配列番号３９１および３９２に示された配列と同一である配列を有する場合、それらの変異型および誘導体も包含される。変異型および誘導体は、配列番号３９１および３９２に示されたアミノ酸配列に対して１、２または３個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し得る。変異型および誘導体はまた、本明細書に記載されている要領で化学的に修飾され得る。ＨＰＰ−３８ポリペプチドは、ジーンプロット、インコーポレイテッド（ジュネーブ、スイス国）により合成されたもので、実施例４記載の方法で、ペプチドをマウスに注射し、多くの臓器において遺伝子発現プロファイリングを実施した。表４は、ＨＰＰ−３８ポリペプチドが、アポトーシスの正の調節に関与する遺伝子、乳癌の指標である遺伝子、ストレス応答遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す。さらに、密着結合タンパク質をコード化する多くのＲＮＡは、血液、心臓、腎臓、肝臓および脾臓において協調した形でダウンレギュレーションされていた。それらの遺伝子群は全て、細胞成長の調節に関連付けられ得る。我々の発見を確認するため、ＥＣＲＧ２を、ＭＤＳファーマ・サービスでの細胞成長検定法でその成長調節活性について試験した。ＥＣＲＧ２を、０.０１〜１００マイクロモルの範囲の濃度で１５癌細胞株の上清に加え、細胞成長を経時的に測定した。ＥＣＲＧ２は、ＭＣＦ−７（胸部）、ＤＬＤ−１（結腸）、Ａ−４９８（腎臓）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、Ａ５４９（肺）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（黒色腫）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（神経上皮腫）、ＰＡＮＣ−１（膵臓）、ＰＣ−３（前立腺）、Ａ４３１（皮膚）、ＭＥＳ−ＳＡ（子宮）を含む、試験した１５細胞株のうち１１の成長を著しく阻害（細胞増殖の＜５０％）することができた。ＩＣ−５０は、神経上皮腫、前立腺、皮膚および子宮細胞株については２０マイクロモル未満であった。
【０１８４】
従って、本発明は、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態の処置に適切な治療法としてＨＰＰ−３８ポリペプチドを提供するもので、その方法は、上記疾患に罹患しているヒトを含む哺乳類にＨＰＰ−３８ポリペプチドの有効量を投与することを含む。好ましくは、癌疾患は、神経上皮腫、前立腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫および頚部上皮内癌から成る群から選択される。別の好ましい態様において、過形成に随伴する疾患または状態は、線維症、前立腺過形成、副腎過形成、子宮内膜過形成、乾癬、炎症に起因する過形成から成る群から選択される疾患または状態である。好ましい一態様では、医薬におけるＨＰＰ−３８ポリペプチドの使用が提供される。
【０１８５】
別の一面によると、本発明は、ＨＰＰ−３８ポリペプチドの血漿レベルを検出することを含む、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態の予後または診断方法を提供し、その方法において、レベル増加は癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態を示すものである。本発明明細書の範囲内において、ＨＰＰ−３８ポリペプチド血漿レベルの増加とは、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態に罹患していない個体で見出されるＨＰＰ−３８ポリペプチド血漿レベルに対するものである。増加は、好ましくは少なくとも１.２倍、さらに好ましくは少なくとも１.５倍、２倍、３倍、５倍または１０倍である。
【０１８６】
別の面によると、本発明は、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態の予後または診断方法であって、ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表４に示されている少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより、第一値が提供され、そしてii）無疾患対象からの上記遺伝子の発現レベルと第一値を比較することを含み、無疾患対象からの試料と比較した対象試料における発現レベルの大小が、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態に対象が罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法を提供する。遺伝子発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで検出され得る。適切な組織には、皮膚、前立腺、膵臓、子宮、肺、肝臓、腸、腎臓があるが、これらに限定はされない。ｍＲＮＡ発現レベルは、適切な技術、例えばマイクロアレイ解析、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲにより検出され得る。同様に、タンパク質レベルは、例えばタンパク質に特異的な標識プローブを用いるウエスタン・ブロッティングを通した適切な技術により検出され得る。
【０１８７】
上記の面の好ましい態様において、遺伝子（複数も可）は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている表４に示された遺伝子（複数も可）から選択される。好ましくは、遺伝子（複数も可）は、１.２倍またはそれ以上、１.３倍またはそれ以上、または１.５倍またはそれ以上アップレギュレーションされている表４に示された遺伝子（複数も可）から、または０.８倍またはそれ未満、０.７倍またはそれ未満ダウンレギュレーションされている表４に示された遺伝子から選択された遺伝子（複数も可）から選択される。上記の面のさらに別の好ましい態様では、少なくとも１、２、３、４または５遺伝子の発現が測定される。
【０１８８】
別の面によると、本発明は、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態のモジュレーターの同定方法であって、ｉ）ＨＰＰ−３８生物学的活性に許容される試料条件下でＨＰＰ−３８ポリペプチドと試験化合物を接触させ、ii）少なくとも一つのＨＰＰ−３８生物学的活性のレベルを測定し、そしてiii）試験化合物を欠く対照試料のレベルと上記レベルとを比較することを含む方法を提供する。好ましい態様において、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を、癌疾患または過形成に随伴する疾患または状態の予防および／または治療処置を目的とするＨＰＰ−３８モジュレーターとしてさらなる試験用に選択する。好ましい態様では、表４に示された一つまたはそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより、ＨＰＰ−３８生物学的活性レベルを測定する。
【０１８９】
鉄輸送または鉄バランスの欠損に関連した病気の治療
本発明に従ってヒト血漿で検出されたポリペプチドＨＰＰ−１３は、ヒトチモシンベータ４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０１２５３）の一部であるアミノ酸配列を有することが見出された。本発明の明細書において、ＨＰＰ−１３ポリペプチドの語は、配列番号３９３（ヒト形態および短いマウスイソ型）および配列番号３９４（長いマウスイソ型）に示された配列のポリペプチドを包含する。また、変異型および誘導体が、望ましくは少なくとも８０％、さらに望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の割合で配列番号３９３および３９４に示された配列と同一である配列を有する場合、それらの変異型および誘導体も包含される。変異型および誘導体は、配列番号３９３および３９４に示されたアミノ酸配列に対して１、２または３個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し得る。変異型および誘導体はまた、本明細書に記載されている要領で化学的に修飾され得る。ＨＰＰ−１３ポリペプチドは、ジーンプロット、インコーポレイテッド（ジュネーブ、スイス国）により合成されたもので、実施例４記載の方法で、ペプチドをマウスに注射し、多くの臓器において遺伝子発現プロファイリングを実施した。表６、７、８、９および／または１０は、ＨＰＰ−１３ポリペプチドが、ヘム生合成および代謝、ポルフィリン生合成および代謝および赤血球生成に関与する遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示している。さらに、食事の鉄バランス、鉄輸送に関与する遺伝子も示差的に調節される。
【０１９０】
従って、本発明は、鉄過負荷疾患、貧血または赤血球生産不足に至る、体内の鉄バランスが改変されている疾患または状態に関連した病状の処置を目的とするＨＰＰ−１３ポリペプチドを提供する。一態様において、ＨＰＰ−１３ポリペプチドは、鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または状態の処置に適切な治療法として提供され、有効量のＨＰＰ−１３ポリペプチドが、上記疾患に罹患しているヒトを含む哺乳類に投与される。好ましくは、鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または状態は、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年型ヘモクロマトーシス、サラセミア、鉄過剰負荷に関連した状態、貧血、鎌状赤血球貧血から成る群から選択される。好ましい一態様において、医薬におけるＨＰＰ−１３の使用が提供される。
【０１９１】
別の面によると、本発明は、ＨＰＰ−１３ポリペプチドの血漿レベルの検出を含む鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または病状の予後または診断方法であって、レベル増加が鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または病状を示すものである方法を提供する。本明細書の範囲内において、ＨＰＰ−１３ポリペプチド血漿レベルの増加とは、鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または状態に罹患していない個体で見出されるＨＰＰ−１３ポリペプチド血漿レベルに対するものである。増加は、好ましくは少なくとも１.２倍、さらに好ましくは少なくとも１.５倍、２倍、３倍、５倍または１０倍である。
【０１９２】
別の面によると、本発明は、鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または病状の予後または診断方法であって、ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表６、７、８、９および／または１０で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そしてii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較する
ことを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または病状に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法を提供する。遺伝子発現はｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで検出され得る。適切な組織には、肝臓、心臓、腸、例えば十二指腸、脾臓、骨髄があるが、これらに限定はされない。ｍＲＮＡ発現レベルは、適切な技術、例えばマイクロアレイ解析、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲにより検出され得る。同様に、タンパク質レベルは、例えばタンパク質に特異的な標識プローブを用いることによるウエスタン・ブロッティングを通した適切な技術により検出され得る。
【０１９３】
上記の面の好ましい態様において、遺伝子（複数も可）は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている表６、７、８、９および／または１０に示された遺伝子（複数も可）から選択される。好ましくは、遺伝子（複数も可）は、１.２倍またはそれ以上、１.３倍またはそれ以上、または１.５倍またはそれ以上アップレギュレーションされている表６、７、８、９および／または１０に示された遺伝子（複数も可）から、または０.８倍またはそれ未満、０.７倍またはそれ未満、または０.６倍またはそれ未満ダウンレギュレーションされている表６、７、８、９および／または１０に示された遺伝子から選択された遺伝子（複数も可）から選択される。上記の面のさらに別の好ましい態様では、少なくとも１、２、３、４または５遺伝子の発現が測定される。
【０１９４】
別の面によると、本発明は、鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または病状のモジュレーターの同定方法であって、ｉ）ＨＰＰ−１３生物学的活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−１３ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、ii）少なくとも１種のＨＰＰ−１３生物学的活性のレベルを測定し、iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較することを含む方法を提供する。好ましい態様では、鉄バランスまたは鉄輸送に関連した疾患または病状の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−１３モジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する。好ましい態様では、表６、７、８、９および／または１０に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより、ＨＰＰ−１３生物学的活性のレベルを測定する。
【０１９５】
神経変性に関連した病気の治療
表１１は、ＨＰＰ−１３ポリペプチドでマウスを処置した結果、これらのポリペプチドが、神経変性および末梢神経障害、例えば多発性硬化症、脱髄性疾患、ギラン−バレー病、糖尿病性ニューロパシー、化学療法誘導ニューロパシー、自己免疫関連ニューロパシー、ＣＮＳ関連ニューロパシー、例えばアルツハイマー病および例えば卒中に関連した神経損傷（神経系虚血）の病状の処置に有用であることを示す遺伝子発現プロファイルが得られたことを示す。
【０１９６】
さらに、上記病状の処置に有用であるＧＰＡ１０１ポリペプチドが本発明により提供される。ＧＡＰ１０１は、ＨＰＰ−１３のランダム化配列を有するポリペプチドである。本発明の明細書において、ＧＰＡ１０１ポリペプチドの語は、配列番号３９７に示された配列のポリペプチド並びに上記の変異型および誘導体を包含する。すなわち、一態様において、本発明は、配列番号３９７に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、好ましい態様において、本発明は、配列番号３９７に示された配列から成るポリペプチドを提供する。
【０１９７】
従って、本発明は、神経変性に関連する疾患または病状を処置するための適切な治療法としてＨＰＰ−１３およびＧＰＡ１０１ポリペプチドを提供し、その方法では、上記疾患に罹患しているヒトを含む哺乳類に、ＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１ポリペプチドの有効量を投与する。好ましくは、神経変性に関連する疾患または状態は、脊椎損傷またはＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、末梢神経障害、ギラン−バレー病、糖尿病性ニューロパシー、脱髄ニューロパシーから成る群から選択される。好ましい一態様では、医薬におけるＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１ポリペプチドの使用が提供される。
【０１９８】
別の面によると、本発明は、ＨＰＰ−１３ポリペプチドの血漿レベルの検出を含む神経変性に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、レベル増加が神経変性に関連する疾患または病状を示すものである方法を提供する。本発明明細書の範囲内において、ＨＰＰ−１３ポリペプチド血漿レベルの増加とは、神経変性に関連する疾患または状態に罹患していない個体で見出されるＨＰＰ−１３ポリペプチド血漿レベルに対するものである。増加は、好ましくは少なくとも１.２倍、さらに好ましくは少なくとも１.５倍、２倍、３倍、５倍または１０倍である。
【０１９９】
別の面によると、本発明は、神経変性に関連する疾患または病状の予後または診断方法であって、ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表１１で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そしてii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較することを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が神経変性に関連する疾患または病状に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法を提供する。遺伝子発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで検出され得る。適切な組織には、脳、脊髄、運動神経支配系組織、末梢神経、中枢および末梢神経組織があるが、これらに限定はされない。ｍＲＮＡ発現レベルは、適切な技術、例えばマイクロアレイ解析、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲにより検出され得る。同様に、タンパク質レベルは、例えばタンパク質に特異的な標識プローブを用いることによるウエスタン・ブロッティングを通した適切な技術により検出され得る。
【０２００】
上記の面の好ましい態様において、遺伝子（複数も可）は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている表１１に示された遺伝子（複数も可）から選択される。好ましくは、遺伝子（複数も可）は、１.２倍またはそれ以上、１.３倍またはそれ以上、または１.５倍またはそれ以上アップレギュレーションされている表１１に示された遺伝子（複数も可）から、または０.８倍またはそれ未満、０.７倍またはそれ未満、または０.６倍またはそれ未満ダウンレギュレーションされている表１１に示された遺伝子から選択された遺伝子（複数も可）から選択される。上記の面のさらに別の好ましい態様では、少なくとも１、２、３、４または５遺伝子の発現が測定される。
【０２０１】
別の面によると、本発明は、神経変性に関連する疾患または病状のモジュレーターの同定方法であって、ｉ）ＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１生物学的活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、ii）少なくとも１種のＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１生物学的活性のレベルを測定し、iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較することを含む方法を提供する。好ましい態様では、神経変性に関連する疾患または病状の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−１３またはＧＰＡ１０１モジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する。好ましい態様では、ＨＰＰ−１３生物学的活性のレベルを測定し、表１１に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現を検出する。
【０２０２】
グルコース代謝の欠損に関連した病気の治療
本発明に従ってヒト血漿で検出されたポリペプチドＨＰＰ−２３は、パンクレアスタチン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１０６４５）の一部であるアミノ酸配列を有することが見出された。本発明の明細書において、ＨＰＰ−２３ポリペプチドの語は、配列番号３９５および配列番号３９６に示された配列のポリペプチドを包含する。特に好ましい態様では、ポリペプチドはアミド化されていない。また、変異型および誘導体が、望ましくは少なくとも８０％、さらに望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の割合で配列番号３９５および３９６に示された配列と同一である配列を有する場合、それらの変異型および誘導体も包含される。変異型および誘導体は、配列番号３９５および３９６に示されたアミノ酸配列に対して１、２または３個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し得る。変異型および誘導体はまた、本明細書に記載されている要領で化学的に修飾され得る。ＨＰＰ−２３ポリペプチドは、ジーンプロット、インコーポレイテッド（ジュネーブ、スイス国）により合成されたもので、実施例４記載の方法で、ペプチドをマウスに注射し、多くの臓器において遺伝子発現プロファイリングを実施した。脳および他の臓器において、ＨＰＰ−２３ポリペプチド注射は、グルコース代謝、他の炭水化物異化経路、脈管形成および炎症応答に関与する遺伝子のＲＮＡ発現レベルに対して強い効果を示した（表１２）。さらに、パンクレアスタチンのシグナリング経路の主要段階は、再構成され得る。
【０２０３】
ＨＰＰ−２３を、ＭＤＳファーマ・サービスでの３匹のマウスモデル：絶食ＩＣＲマウス、グルコース負荷ＩＣＲマウス、および２型糖尿病のモデルである、ｄｂ／ｄｂ（ＮＩＤＤＭ、非インスリン依存性真性糖尿病）マウスにおいてグルコースレベルに対するそのモジュレーター効果について試験した。１０ｍｇ／ｋｇの用量で、非アミド化パンクレアスタチンは、賦形剤と比べて２０％ほどグルコース負荷マウスにおいて血清グルコースレベルを著しく低下させた。これは、パンクレアスタチンの非アミド化形態の生物学的活性の第一記録である。生物学的活性は、血清グルコースレベルの調節である。
【０２０４】
従って、本発明は、血清グルコース調節障害を伴う疾患を処置するための適切な治療法としてＨＰＰ−２３ポリペプチドを提供し、その方法では、上記疾患に罹患しているヒトを含む哺乳類に、ＨＰＰ−２３ポリペプチドの有効量を投与する。好ましくは、血清グルコース調節障害を伴う疾患は、糖尿病または他の高血糖状態である。特に好ましい態様において、ＨＰＰ−２３は、哺乳類、例えばヒトに投与されると、血中グルコースレベルを低下させる。好ましい一態様では、医薬におけるＨＰＰ−２３の使用が提供される。
【０２０５】
別の面によると、本発明は、ＨＰＰ−２３ポリペプチドの血漿レベルの検出を含む血清グルコース調節障害を伴う疾患の予後または診断方法であって、レベル増加が血清グルコース調節障害を伴う疾患を示すものである方法を提供する。本発明明細書の範囲内において、ＨＰＰ−２３ポリペプチド血漿レベルの増加とは、血清グルコース調節障害を伴う疾患に罹患していない個体で見出されるＨＰＰ−２３ポリペプチド血漿レベルに対するものである。増加は、好ましくは少なくとも１.２倍、さらに好ましくは少なくとも１.５倍、２倍、３倍、５倍または１０倍である。
【０２０６】
別の面によると、本発明は、血清グルコース調節障害を伴う疾患の予後または診断方法であって、ｉ）対象から入手した適切な組織の試料において表１２で同定された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出することにより第一値を得、そしてii）無疾患対象からの遺伝子の発現レベルと第一値を比較することを含み、無疾患対象からの試料と比べた場合の対象試料における発現レベルの大小が、対象が血清グルコース調節障害を伴う疾患に罹患し易いかまたは罹患していることの指標である方法を提供する。遺伝子発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで検出され得る。適切な組織には、脂肪（脂肪）組織、心臓、膵臓、筋肉、脳があるが、これらに限定はされない。ｍＲＮＡ発現レベルは、適切な技術、例えばマイクロアレイ解析、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲにより検出され得る。同様に、タンパク質レベルは、例えばタンパク質に特異的な標識プローブを用いることによるウエスタン・ブロッティングを通した適切な技術により検出され得る。
【０２０７】
上記の面の好ましい態様において、遺伝子（複数も可）は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている表１２に示された遺伝子（複数も可）から選択される。好ましくは、遺伝子（複数も可）は、１.２倍またはそれ以上、１.３倍またはそれ以上、または１.５倍またはそれ以上アップレギュレーションされている表１２に示された遺伝子（複数も可）から、または０.８倍またはそれ未満、０.７倍またはそれ未満、または０.６倍またはそれ未満ダウンレギュレーションされている表１２に示された遺伝子から選択された遺伝子（複数も可）から選択される。上記の面のさらに別の好ましい態様では、少なくとも１、２、３、４または５遺伝子の発現が測定される。
【０２０８】
別の面によると、本発明は、血清グルコース調節障害を伴う疾患のモジュレーターの同定方法であって、ｉ）ＨＰＰ−２３生物学的活性に関して許容される試料条件下、ＨＰＰ−２３ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、ii）少なくとも１種のＨＰＰ−２３生物学的活性のレベルを測定し、iii）上記レベルを、試験化合物を欠く対照試料の場合と比較することを含む方法を提供する。好ましい態様では、血清グルコース調節障害を伴う疾患の予防および／または治療的処置についてのＨＰＰ−２３モジュレーターとしてさらに試験することを目的として、上記レベルの変化を誘発する試験化合物を選択する。好ましい態様では、表１２に示された１個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによりＨＰＰ−２３生物学的活性のレベルを測定する。
【０２０９】
代謝障害に関連した病気の治療
本発明のさらなる一面において、ＨＰＰ−２３ポリペプチドは、代謝障害、特にアミロイドーシスの処置に適切な治療法として提供されている。また、不整脈、特に徐脈、頻脈、洞不全症候群、および新脈管形成、特に卒中、黄斑再生、癌に適切な処置としてＨＰＰ−２３ポリペプチドは、本発明の一部として提供されている。
【０２１０】
アミロイドーシスは、組織におけるタンパク質含有原線維（アミロイド）の沈積から生じる、完全に解明されたわけではない代謝障害の一群である。この病気は、局在しているかまたは広範に及ぶ臓器不全を誘発し得る。アミロイドは、心臓および血管、脳および末梢神経を含む多くの臓器に浸潤し得る。このため、アミロイドーシスの臨床的発現は非常に変化に富むことから、この病気は、ネフローゼ症候群から認知症またはうっ血性心不全の範囲に及ぶ他の状態を模倣し得る。酸化的ストレスの経路は、アミロイド原線維の発生誘因であると思われる。酸化的ストレスは、核ＤＮＡ分解および神経および血管細胞における膜ホスファチジルセリン曝露の両方を早めることにより、細胞完全性の喪失、小グリア細胞食作用および血栓破壊を促進する。酸化的ストレス中に細胞生存を助長する能力において重大なのは、代謝調節型グルタミン酸系のモジュレーション、有糸分裂後ニューロンにおける細胞周期調節、およびＧＳＫ−３ベータ活性の制御およびプレセニリン完全性である。これらの細胞経路は、最終的にはＢｃｌ−２ファミリー要員を通したミトコンドリア膜透過性の維持、栄養因子、およびミトコンドリアエネルギー貯蔵を含むより中枢的な細胞機構に収束する。
【０２１１】
脳組織におけるパンクレアスタチン：ＨＰＰ−２３ポリペプチド処置マウスの脳において、ＨＰＰ−２３ポリペプチドは、アミロイドーシス疾患に影響を及ぼすことが本発明により見出された。ＨＰＰ−２３ポリペプチドは、プレセニリン１、大きな一団のペルオキシレドキシン遺伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼ、内皮性一酸化窒素、シトクロムｃ−オキシダーゼをアップレギュレーションする（１５プローブセット）。（それらの群は全て対照による影響は受けなかった）。それらの遺伝子は、レドックス系における大きな変化を示し、酸化的ストレスを指す。さらに、多くの細胞周期遺伝子（サイクリンおよびサイクリン依存的キナーゼ）の発現が改変される。
【０２１２】
アミロイドーシスの発現におけるパンクレアスタチンおよびＨＰＰ−２３ポリペプチドの関与の別の指標は、チューブリン遺伝子（チューブリンアルファ１,２,４ベータ、ガンマ、補因子アルファ）の強いアップレギュレーションである。チューブリン−アミロイド沈積は、家族性脳アミロイド血管障害で見出される（Baumann et al.、Biochem Biophys Res Comm、１９９６、２１９：２３８−２４２）。（また、それらの変化は対照脳からは見出されない）。
【０２１３】
Ｎｏｔｃｈ−およびアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）プロセッシングに関与するプレセニリンおよびアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）の強い発現は、家族性アルツハイマー病の進行に関する機構の一部であることが示された（Tezapsidis et al.、FASEB ２００３、１７：１３２２−１３２４）。プレセニリンおよびアポＥは両方とも、ＨＰＰ−２３ポリペプチドによりアップレギュレーションされた。アミロイド前駆体遺伝子（ＡＰＰ）および様々なＡＰＰ結合タンパク質もまた、ＨＰＰ−２３によりアップレギュレーションされる。Schipper（Ann N Y Acad Sci ２００４、１０１２：８４−９３）は、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）発現が、酸化促進刺激因子、例えばドーパミン、過酸化水素、ベータ−アミロイドなどのもとで刺激されること、およびＨＯ−１が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症および他の変性および非変性ＣＮＳ疾患による罹患ＣＮＳ組織においてアップレギュレーションされているのが見出されたことを報告している。ＨＰＰ−２３ポリペプチドは、脳におけるＨＯ−１のアップレギュレーションをまねく。
【０２１４】
Ferreiro et al（J Neurosci Res、２００４、７６：８７２−８８０）は、アミロイド−ベータペプチドで処理したインビトロ培養ニューロンが、少なくとも一部は細胞内Ｃａ（２＋）ホメオスタシスの摂動に起因している、アポトーシスによるニューロン喪失を示すことを発表した。リアノジン受容体（Ｒｙｒ）およびＩＰ（３）Ｒにより伝達される、小胞体からのＣａ（２＋）放出の阻害により、この神経傷害作用が排除された。Ｒｙｒは、ＨＰＰ−２３ポリペプチド処理脳においては約２倍ダウンレギュレーションされている。
【０２１５】
心臓組織におけるパンクレアスタチン：リアノジン受容体それ自体は、パンクレアスタチン処理動物の心臓では影響されない。しかしながら、多くのｒｙｒ結合タンパク質、例えばＦＫＢＰ１２、カルモジュリン、ソルシン、トリアジン、およびホスファターゼ１はダウンレギュレーションされている。ソルシンは、同じく心臓でダウンレギュレーションされているプレセニリン１に結合する。プレセニリンは、特に、ＡＤＡＭ１７、ｎｏｔｃｈ（ノッチ）、および標的ｓｎａｉｌ、ｈｅｓ１およびホメオボックス遺伝子ｍｓｘから成るＮｏｔｃｈ経路の一部である。ｓｎａｉｌおよびｈｅｓ１はアップレギュレーションされており、他の要員は全てダウンレギュレーションされていた。ｎｏｔｃｈの阻害剤、ｎｕｍｂはアップレギュレーションされており、経路の一般的阻害を指していた。別のプレセニリン結合タンパク質はレスチンである。この複合体の破壊は、内在性アミロイドベータペプチドの分泌減少および培養細胞培地からの外生アミロイドベータの取込減少の両方に関連する（Tezapsidis et al、FASEB ２００３、１７：１３２２−１３２４）。レスチンは、ＨＰＰ−２３ポリペプチド処理マウスの心臓においてアップレギュレーションされていた。
【０２１６】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路は、心臓の発達に不可欠である（例、Timmerman et al、Genes Dev ２００４ １８：９９−１１５）。さらに、それはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）とクロストークしており、例えばｎｏｔｃｈ４はＶＥＧＦシグナリングの阻害剤であり、ＶＥＧＦおよびｎｏｔｃｈ１は発芽を調節する（Liu et al. Mol Cell Biol ２００３、２３：１４−２５）。心臓および脳の両方におけるＶＥＧＦ発現の変化に加えて、我々は、アンギオモチンおよびアンギオポイエチン並びに他の血管形成関連遺伝子における変化を検出している。Nakajima et alは、プレセニリン−１を欠くマウスにおいて異常な血管が発生することを発表した（Mech dev ２００３、１２０：６５７−６６７）。我々のデータから見ると、これはｎｏｔｃｈ経路におけるプレセニリンの参与に起因し得る。
【０２１７】
これらを考え合わせると、心臓におけるこれらの遺伝子発現変化は、例えば不整脈（徐脈、頻脈、洞不全症候群）、および新脈管形成（例、卒中、黄斑再生、癌）といった状態におけるＨＰＰ−２３ポリペプチドの参与を示している。従って、本発明は、これらの適応症について上述されている治療、予後および診断方法並びにスクリーニング方法（例、モジュレーター同定方法）を目的としたＨＰＰ−２３ポリペプチドを提供する。
【０２１８】
本明細書全体を通して引用されている参考文献の開示内容については、出典明示により援用する。この発明について総括的に記載したが、説明を目的とするに過ぎず、特記しない場合は制限を意図したものではない、本明細書に記載されている若干の態様を参照することによりさらに理解を深めることができるはずである。
【実施例】
【０２１９】
実施例１：ＨＰＰレベルの特性確認
表現型の差異を希薄にし、大きなプール容量を提供するため、５０名を越える健康な男性ボランティアからの血漿部分をプールした。医療センターでインフォームドコンセントを書面で得た後の設定で標準静脈穿刺手順を用いることにより血液（１００〜４５０ｍｌ）を入手した。試料にバーコードを付け、標準技術による遠心分離およびフィルターでの白血球の除去により血漿を調製した。回数、温度および遠心分離条件および後続の手順を厳しく制御することにより、確実に全試料に同様の処理を行った。製造業者の使用説明書に従ってプロテアーゼ阻害剤（コンプリート、ロシュ）を加え、穏やかに混合することにより確実に溶解させた。次いで、血漿試料を冷凍し、−８０℃で貯蔵した。医療歴および臨床化学パラメーターを注意深く考慮に入れた後、少なくとも５０試料の分量をプールした。マイクロプロットに従って、２.５Ｌ（全６Ｌのうち）の容量を多重クロマトグラフィー段階による分離にかけた。ＴＭプロセスは以下の通りである：
【０２２０】
段階１：ＨＳＡ／ＩｇＧ枯渇
１２５ｍｌの冷凍血漿を解凍し、滅菌フードにおいて０.４５μｍ滅菌フィルターで濾過した。
【０２２１】
濾液を、それぞれ３００ｍｌのＨＳＡリガンドセファロース高速フローカラム（アマシャム、ウプサラ、スウェーデン）、５ｃｍ ＩＤ、１５ｃｍ長、および１００ｍｌのプロテインＧセファロース高速フローカラム（アマシャム、ウプサラ、スウェーデン）、５ｃｍ ＩＤ、５ｃｍ長の２本のインラインカラムに注入した。
【０２２２】
カラムを、５０ｍＭのＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.１、０.１５ＭのＮａＣｌで平衡状態にし、洗浄した。流速は５ｍｌ／分であった。
【０２２３】
非保持フラクション（５３ｇの枯渇ポリペプチド）を第二段階まで冷凍しておいた。２０回作業を実行した。
【０２２４】
段階２：ゲル濾過／逆相捕捉段階
段階１からの試料を解凍し、滅菌フードにおいて０.４５μｍ滅菌フィルターで濾過した。
【０２２５】
濾液を、２本のインラインゲル濾過カラムに注入した：２×９.５リットルのスーパーデックス７５（アマシャム、英国）カラム、１４ｃｍ ＩＤ、６２ｃｍ長。５０ｍＭのＰＯ４緩衝液ｐＨ７.４、０.１ＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素により、カラムを平衡状態にした。疎水性不純物は逆相プレカラム：１５０ｍｌのＰＬＲＰＳ（ポリマー・ラブズ、英国）に保持された。プレカラムを試料インジェクション用に交換した。ゲル濾過を４０ｍｌ／分の流速で実施した。
【０２２６】
低分子量タンパク質（＜２０ｋＤａ）を、インライン逆相捕捉カラム：５０ｍｌのＰＬＲＰＳ１００オングストローム（ポリマー・ラブズ、英国）へ指向させた。ＰＬＲＰＳカラム上の３方向バルブ制御型インジェクションを、３３ｍＡＵ（２８０ｎｍ）のカットオフで切換えることにより、ゲル濾過溶離液を逆相捕捉カラムへ送った。このカットオフ値は、まずＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＯＤ値の推定範囲を与え、それに続いて３つのカットオフ値（ＯＤ範囲の高い値、中央値および低い値）を評価することにより確立された。少なくとも８５％の低分子量タンパク質比率で、得られる低分子量タンパク質を最大にするように最終カットオフ値を選択した。低分子量タンパク質およびペプチドを、水中０.１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮの一カラム容量勾配により逆相捕捉ＰＬＲＰＳカラムから溶離させた。
【０２２７】
ＢＳＡ標準により２１０ｎｍでモニターした分析的ゲル濾過ＨＰＬＣにより測定したところ、約１.５ｇの小タンパク質が得られ、そのうち１.３ｇは＜２０ｋＤａであった。溶離フラクション（５０ｍｌ）を次の段階まで冷凍した。２０回作業を実行した。この段階の最後に、全逆相溶離液を解凍し、プール（１リットル）し、７個のポリペプチド容器（１４３ｍｌ）に分けた。次の段階で使用するまで容器を−２０℃に保った。
【０２２８】
段階３：カチオン交換
段階２からの試料（１４７ｍｌ）を解凍し、等量のカチオン交換緩衝液Ａ（Ｇｌｙ／ＨＣｌ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ２.７、尿素８Ｍ）と混合した。
【０２２９】
試料を、１００ｍｌソース１５Ｓカラム（アマシャム、ウプサラ、スウェーデン）、３５ｍｍＩＤ、１００ｍｍ長に注入した。カラムを緩衝液Ａにより平衡状態にし、洗浄した。流速は１０ｍｌ／分であった。
【０２３０】
１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂまでの段階勾配でタンパク質およびペプチドを溶離した（１ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）：
３カラム容量７.５％Ｂ（７５ｍＭのＮａＣｌ）。
３カラム容量１０％Ｂ（１００ｍＭのＮａＣｌ）
３カラム容量１７.５％Ｂ（１７５ｍＭのＮａＣｌ）
２カラム容量２２.５％Ｂ（２２５ｍＭのＮａＣｌ）
２カラム容量２７.５％Ｂ（２７５ｍＭのＮａＣｌ）
２カラム容量１００％Ｂ（１ＭのＮａＣｌ）。
【０２３１】
４５〜６０フラクションをピークに基づいて集めた。７回作業を実施した。７回実施した後、フラクションを作業中および作業間にプールすることにより、１８フラクションを得た。フラクションを次の段階で使用するまで−２０℃で保った。
【０２３２】
段階４：還元／アルキル化および逆相ＨＰＬＣ分画１
濃縮トリス−ＨＣｌでｐＨを８.５に調節した後、１８カチオン交換フラクションの各々をジチオエリスリトールにより還元し（ＤＴＥ、３０ｍＭ、３７℃で３時間）、ヨードアセトアミド（１２０ｍＭ、暗所で１時間２５℃）によりアルキル化した。ＤＴＥ（３０ｍＭ）を加え、次いで酸性化（ＴＦＡ、０.１％）することにより、後の反応を停止させた。次いで、フラクションを、Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒ Ｃ８、５μｍ、３００オングストロームカラム（インターキム、フランス）、２１ｍｍ ＩＤ、１５０ｍｍ長において注入した。１０ｍｌ／分の流速で注入を実施した。
【０２３３】
Ｃ８カラムを水中０.１％ＴＦＡ（溶液Ａ）により平衡状態にし、洗浄した。タンパク質およびペプチドを、６０分で１００％Ａから１００％Ｂ（０.１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮ、水中）までの二相勾配で溶離した。流速は２０ｍｌ／分であった。４０ｍｌの３０フラクションを集めた。
【０２３４】
そのフラクションでのタンパク質濃度を反映する、各フラクションの２８０ｎｍで測定された光学密度（ＯＤ）に基づいて、同様のタンパク質含有量のアリコートを各フラクションについて作製した。
【０２３５】
過剰の乾燥を防ぐため、各フラクションにおいて５００μｌの水中１０％グリセリンを加えた後、全アリコートを冷凍し、さらなる使用時まで保存したが、一フラクションについては、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（サヴァント、フィシャー、ジュネーブ）により乾燥した。乾燥フラクションを次の段階での使用時まで−２０℃で保存した。
【０２３６】
段階５：逆相ＨＰＬＣ分画２
段階４からの乾燥試料を、１ｍｌの溶液Ａ（水中０.０３％ＴＦＡ）に再懸濁し、Ｖｙｄａｃ ＬＣＭＳ Ｃ４カラム、５マイクロメートル、３００オングストローム（ヴァイダック、米国）、４.６ｍｍ ＩＤ、１５０ｍｍ長において注入した。流速は０.８ｍｌ／分であった。
【０２３７】
Ｃ４カラムを溶液Ａにより平衡状態にして洗浄し、タンパク質およびペプチドを、逆相ＨＰＬＣ分画１における試料の溶離位置に適合させた二相勾配で溶離した。エレクトロスプレーイオントラップ質量分析法を用いて、そのままの質量データを得た。１６の異なる勾配を、ＲＰ１フラクション対応溶媒濃度のＣＨ３ＣＮ濃度範囲−および＋５％ＣＨ３ＣＮにより用いた。３０％ＣＨ３ＣＮと等しいかまたはそれを越える溶媒濃度によりＲＰ１で溶離したタンパク質については、ＲＰ２勾配についての出発溶離条件を、ＲＰ１溶離濃度−３０％でのＣＨ３ＣＮパーセンテージで設定した。最適なＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮およびさらなるロボット処理用に設計された最適化された異なる収集立体配置を採用している、深型ウェルプレートに、２４の溶離フラクションを集めた。
【０２３８】
段階６：質量検出
９６ウェル深型ウェルプレート（ＤＷＰ）への逆相ＨＰＬＣ分画２の後、１２９６０（１８×３０×２４）のフラクションを集めた。小比率（２.５％）の容量については、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ブルカー・エスクワイア）を用いるオンライン解析に切換えた。未消化タンパク質のアリコートを、ＭＡＬＤＩマトリックスと混合し、質量測定標準および感度標準と一緒にしたＭＡＬＤＩプレートにおいてスポットした。自動式スポット装置（ブルカーＭＡＬＤＩサンプル調製ロボット）を使用した。２種の異なるＭＡＬＤＩマトリックスを使用した：シナピン(sinapinic)酸としても知られている、シナピン（sinapic）酸（ＳＡ）、トランス−３,５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸、およびアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）。ブルカー・リフレックスIII ＭＡＬＤＩ ＭＳ装置を用いて、ＭＡＬＤＩプレートを質量検出法にかけた。９６ウェルプレートを＋４℃で貯蔵した。
【０２３９】
９６ウェルプレート（ＤＷＰ）を回収し、２連続濃縮段階にかけた。ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥することにより、体積を１ウェル当たり０.８ｍｌから約５０マイクロリットルに濃縮し、次いで１ウェル当たり再溶解して約２００マイクロリットルにし、そして約５０マイクロリットルに再濃縮し、＋４℃で貯蔵した。次いで、再緩衝し、ウェルにトリプシンを加え、密閉し、プレートを３７℃で１２時間インキュベーションした後、クエンチング（蟻酸を加えてｐＨを２.０に下げる）することにより、タンパク質を消化した。ウェルに加えられるトリプシンの濃度を、各特定フラクションについて記録された２８０ｎｍでのＯＤに基づいて調節した。これにより、確実にトリプシンが最適に使用され、そしてほとんどの濃縮フラクションが完全消化された。自動式スポット装置（ブルカーＭＡＬＤＩサンプル調製ロボット）を用いて、感度および質量測定標準と一緒にしたＭＡＬＤＩプレート上へＨＣＣＡマトリックスと前混合しておいた各ウェルからの一定量を沈積させた。ブルカー・リフレックスIII ＭＡＬＤＩ ＭＳ装置を用いてＭＡＬＤＩプレートを分析した。９６ウェルプレートの各ウェルからの内容物を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳブルカー・エスクワイアＥＳＩイオン−トラップＭＳ装置により分析した。
【０２４０】
段階７：ヒト血漿における低存在量ペプチドの検出および同定
分離したフラクションを、さらに分離および検出のため質量分析法（ＭＡＬＤＩおよびＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳの両方）にかけた。
【０２４１】
１５０万を越えるＭＳ／ＭＳスペクトルを生成させ、手動的試験および自動式同定用に開発されたアルゴリズムの確認用に３３００００を使用した。そのままの質量データ、ペプチドマスフィンガープリントおよびペプチド配列データを、タンパク質同定および特性確認用に統合した。マスコットソフトウェア（マトリックス・サイエンス・リミテッド、ロンドン、英国）を用いてタンパク質を同定し、ペプチド同定から得られた結果をスペクトルの手動的分析によりチェックした。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、異なる６データベースのセット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、公開ＥＳＴおよびゲノム配列データ、および特許データベース）にアクセスするカスタム同定エンジン（Ｏｌａｖ）により翻訳処理した。統合段階により、異なるデータベース全体にわたる包括的同定結果の一貫性を確認した。確認された同定結果に対して注釈をつける（自動的および手動的）ことにより、観察されたポリペプチドの重要な特徴についてさらに特性確認した。
【０２４２】
本発明によるタンパク質分離および同定方法は、非常に高感度である。Ｍｉｃｒｏｐｕｒｏｔ.ＴＭプロセスは、血漿濃度が５０ｐＭの範囲である非常に低存在量のタンパク質でも検出できる。本明細書記載の方法を実施しながら精度を確認した。特に、ヒト血漿において十分に特性確認された役割をもつタンパク質が検出された。
【０２４３】
実施例２：ＨＰＰの化学合成
この実施例では、本発明のＨＰＰを合成する。まずペプチドフラグメント中間体を合成し、次いで所望のポリペプチドに組立てる。
【０２４４】
ＨＰＰは、最初に、カップリングされるフラグメントのＮ−末端にＣｙｓ残基を有するように選択された例えば５フラグメントにおいて製造され得る。フラグメント１を最初にフラグメント２にカップリングすることにより第一生成物を得、次いで分取ＨＰＬＣ精製後、第一生成物をフラグメント３にカップリングすることにより第二生成物を得る。分取ＨＰＬＣ精製後、第二生成物をフラグメント４にカップリングすることにより第三生成物を得る。最後に、分取ＨＰＬＣ精製後、第三生成物をフラグメント５にカップリングすることにより、所望のポリペプチドを得、これを精製し、再生する。
【０２４５】
チオエステル形成
上記の要領で、チオエステル生成樹脂においてフラグメント２、３、４および５を合成する。この目的のため、以下の樹脂を製造する：Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステルを、本質的にHackeng et al（１９９９）記載の条件下でＬｅｕ−ＰＡＭ樹脂にカップリングする。第一の場合、生成した樹脂を、ＤＭＦ中１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンによる３０分処理でアセチル保護基の除去後、０.２ｍｍｏｌ規模でのペプチド連鎖伸長用の出発樹脂として使用する。フラグメント２から５のＮ−末端Ｃｙｓ残基のＮαを、慣用的ＮαまたはＳβ保護を有するＣｙｓの代わりにそれぞれの鎖の末端にＢｏｃ−チオプロリン（Ｂｏｃ−ＳＰｒ、すなわちＢｏｃ−Ｌ−チオプロリン）をカップリングすることにより保護する、例、Brik et al.、J. Org. Chem.、６５：３８２９−３８３５（２０００）。
【０２４６】
ペプチド合成
Schnolzer et al、Int. J. Peptide Protein Res.、４０：１８０−１９３（１９９２）による記載に従い、in situ 中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,１,３,３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロ−リン酸（ＨＢＴＵ）活性化プロトコールを用いて、アプライド・バイオシステムズ製の特注修正４３３Ａペプチド合成装置において固相合成を実施する。各合成サイクルは、純ＴＦＡでの１〜２分処理によるＮα−Ｂｏｃ−除去、１分ＤＭＦフロー洗浄、過剰ＤＩＥＡの存在下における２.０ｍｍｏｌの前活性化Ｂｏｃ−アミノ酸との１０分カップリング時間および２度目のＤＭＦフロー洗浄により構成される。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（２ｍｍｏｌ）を、過剰のＤＩＥＡ（６ｍｍｏｌ）の存在下、１.８ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０.５Ｍ）により３分間前活性化する。Ｇｌｎ残基のカップリング後、ＴＦＡを用いる脱保護の前後にジクロロメタンフロー洗浄を使用することにより、起こり得る高温（ＴＦＡ／ＤＭＦ）−触媒ピロリドンカルボン酸形成を阻止する。側鎖保護アミノ酸は、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ｐ−トルエンスルホニル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ（キサンチル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−シクロヘキシル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（４−メチルベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−シクロヘキシル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ジニトロフェニルベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（シクロヘキシルカルボニル）−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）−ＯＨである（オルパーゲン・ファルマ、ハイデルベルク、ドイツ）。他のアミノ酸は側鎖保護を伴わずに使用される。Ｃ−末端フラグメント１をＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ−ＣＨ２−Ｐａｍ樹脂（ローディングした樹脂、０.７１ｍｍｏｌ／ｇ）で合成し、フラグメント２については、５機械支援合成を通じてＢｏｃ−Ｘａａ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｐａｍ樹脂において開始する。この樹脂は、標準条件下におけるＬｅｕ−ＰＡＭ樹脂へのＳ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステルのカップリングにより得られる。ＤＭＦ中の１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンによる３０分処理でアセチル保護基を除去した後、生成した樹脂を、０.２ｍｍｏｌ規模でのペプチド連鎖伸長の出発樹脂として使用する。
【０２４７】
連鎖構築が完了した後、ペプチドフラグメントを脱保護し、スカベンジャーとして５％ｐ−クレゾールを用いた１時間０℃での無水フッ化水素処理により樹脂から開裂させる。フラグメント１以外の全ての場合において、ＤＮＰ−除去手順はＣ−末端チオエステル基には適合し得ないため、イミダゾール側鎖２,４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）保護基は、Ｈｉｓ残基に残存している。しかしながら、連結反応中、ＤＮＰがチオールにより徐々に除去されるため、非保護Ｈｉｓが得られる。開裂後、ペプチドフラグメントを氷冷ジエチルエーテルにより沈澱させ、水性アセトニトリルに溶解し、凍結乾燥する。ペプチドフラグメントを、緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏ／０.１％トリフルオロ酢酸）中における緩衝液Ｂ（アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸）の線形勾配を用いることによるウォーターズからのＣ１８カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、２１４ｎｍでＵＶ検出する。エスクワイア計器（ブルカー、ブレーメン、ドイツ）または同様の計器を用いるエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＭＳ）により、試料を分析する。
【０２４８】
下記でさらに詳述されているように、非保護フラグメントの連結反応を以下の要領で実施する：乾燥ペプチドを、当モル量で６Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、０.２Ｍリン酸、ｐＨ７.５に溶かすことにより、７前後のｐＨで１〜８ｍＭの最終ペプチド濃度を達成し、そして１％ベンジルメルカプタン、１％チオフェノールを加える。通常、反応を一晩実施し、ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析法によりモニターする。それに続いて、連結反応生成物を処理することにより、依然として存在する保護基を除去する。Ｎ−末端チアゾリジン環の開環は、さらに固体メトキサミンの添加によりｐＨ３.５で０.５Ｍの最終濃度にし、３７℃で２時間さらにインキュベーションすることを必要とする。分取ＨＰＬＣ精製前に、１０倍過剰のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを加える。ポリペプチド鎖を含むフラクションをＥＳＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥する。
【０２４９】
フラグメント４および５の連結反応は、６ＭのＧｕＨＣｌ中ｐＨ７.０で実行される。各反応体の濃度は８ｍＭであり、１％ベンジルメルカプタンおよび１％チオフェノールを加えて、還元的環境を作り出し、連結反応をし易くする。一晩３７℃で攪拌後、ほぼ定量的な連結反応が観察される。反応におけるこの時点で、ＣＨ３−Ｏ−ＮＨ２.ＨＣｌを溶液に加えて０.５Ｍの最終濃度を達成し、ｐＨを３.５に調節することにより、Ｎ−末端チアゾリジン環を開環させる３７℃で２時間インキュベーション後、ＥＳＭＳを用いて、反応の完了を確認する。それに続いて、反応混合物を、ペプチドフラグメントに対し１０倍過剰のトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）で処理し、１５分後、分取ＨＰＬＣ（例、Ｃ４、２０〜６０％ＣＨ３ＣＮ、１分当たり０.５％）を用いて、連結反応生成物を精製し、凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵する。
【０２５０】
残りの連結反応についても僅かの修正を加えながら同じ手順を反復する。
【０２５１】
ペプチド折りたたみ
完全長ペプチドを、還元凍結乾燥タンパク質（約０.１ｍｇ／ｍＬ）を１ＭのＧｕＨＣｌ、１００ｍＭのトリス、１０ｍＭのメチオニン、ｐＨ８.６に溶解することにより、空気酸化により再生する。一晩穏やかに攪拌後、タンパク質溶液を上記と同様にしてＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【０２５２】
実施例３：ＨＰＰ抗体組成物の製造
実質的に純粋なＨＰＰまたはその一部分を得る。最終調製物におけるタンパク質の濃度は、例えばアミコンフィルター装置での濃縮により、１ｍｌにつき数マイクログラムのレベルに調節される。次いで、タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、「モノクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体」と題する項に記載された要領で調製する。
【０２５３】
簡単に述べると、抗ＨＰＰモノクローナル抗体を産生させるため、マウスに数マイクログラムのＨＰＰまたはその一部分を数週間の期間にわたって反復接種する。次いで、マウスを殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリエチレングリコール手段によりマウス骨髄腫細胞と融合させ、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）において系を成長させることにより、過剰の非融合細胞を破壊する。有効に融合した細胞を希釈し、希釈物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに入れ、そこで培養物の成長を続行させる。最初にEngvall, E.、Meth．Enzymol.７０：４１９（１９８０）により記載された要領で、免疫検定手順、例えばＥＬＩＳＡによるウェルの上清液からの抗体の検出により、抗体産生クローンが同定される。選択された陽性クローンを増大させ、それらのモノクローナル抗体産物を使用するために採取し得る。モノクローナル抗体製造についての詳細な手順は、Davis, L. et al.、Basic Methods in Molecular Biology エルセビア、ニューヨーク、２１〜２項に記載されている。
【０２５４】
免疫化によるポリクローナル抗体製造については、非修飾または免疫原性を高めるために修飾され得る、ＨＰＰまたはその一部分でマウスを免疫化することにより、ＨＰＰまたはその一部分における異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を調製する。適切なヒト以外の動物、好ましくはヒト以外の哺乳類、例えばラット、ウサギ、ヤギまたはウマが選択され得る。
【０２５５】
モノクローナルまたはポリクローナルプロトコルに従って調製された抗体調製物は、生物学的試料におけるＨＰＰの濃度を測定する定量的免疫検定法において有用であるか、またはそれらはまた、生物学的試料における抗原の存在の同定に半定量的または定性的に使用される。抗体はまた、タンパク質を発現する細胞を殺すかまたは体内におけるタンパク質のレベルを低下させる治療組成物で使用され得る。
【０２５６】
実施例４：インビボでのＨＰＰポリペプチドの特性確認
ＨＰＰポリペプチドのマウスホモログ／オーソログタンパク質を、３００、６００または１０００マイクログラム／日の用量で７〜１４日間雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下投与する。処置期間の最後に、全臓器からの試料を剖検時に急速冷凍し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現プロファイリングにより解析する。
【０２５７】
製造業者の使用説明書に従いトリゾール試薬（ライフ・テクノロジーズ）を用いて、全ＲＮＡをこれらの冷凍組織から抽出する。λ＝２６０ｎｍ（Ａ２６０ｎｍ）での吸光度により全ＲＮＡを定量し、純度をＡ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比により評価する。変性ゲル電気泳動により完全性をチェックする。ＲＮＡを分析時まで−８０℃で貯蔵する。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ選択システム（ライフ・テクノロジーズ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成するために、良い品質の全ＲＮＡを使用する。次いで、ｃＤＮＡをインビトロ転写することにより（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット、アンビオン）、ビオチン標識ｃＲＮＡを形成させる。次に、１２〜１５ｍｇの標識ｃＲＮＡを、４５℃で１６時間アフィメトリックス・マウスＭＯＥ４３０Ａ発現プローブアレイとハイブリダイゼーションする。次いで、ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコル（アフィメトリックス）に従って、アレイを洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート（モレキュラー・プローブス）で染色する。２ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ライフ・テクノロジーズ）、１００ｍＭのＭＥＳ、１Ｍ［Ｎａ＋］、０．０５％トウィーン２０、０.００５％アンチオフォーム（シグマ）、０.１ｍｇ／ｍｌのヤギＩｇＧおよび０.５ｍｇ／ｍｌビオチニル化抗体により、シグナルを抗体増幅させ、ストレプトアビジン溶液で再染色する。洗浄後、アレイをジーン・アレイ（登録商標）スキャナー（アフィメトリックス）で２回走査する。
【０２５８】
所定のプローブのオリゴヌクレオチド対により測定されたシグナル強度の差異を平均化することにより（ＡｖｇＤｉｆｆ値）、発現レベルを評価する。この試験に使用する画像取込および数値翻訳ソフトウェアは、アフィメトリックス・マイクロアレイスイートバージョン５（ＭＡＳ５）である。処置により影響される遺伝子を同定するため、データセットを最初にフィルターに通すことにより、実験ノイズが高い場合に値が系統的に低い発現範囲にある（実験点のレプリカの最小数に対応する若干の実験において少なくとも５０のＡｖｇＤｉｆｆ値）遺伝子を解析の第一波で排除する。選択の第２ラウンドでは、閾値ｔ−試験ｐ−値（０.０５）により、２成分エラーモデル（グローバルエラーモデル）に基づいて、そして可能な場合、多仮説試験についての段階的減少補正（BenjaminiおよびHochberg 偽発見率）により処置および未処置間において値が異なる遺伝子が同定される。
【０２５９】
次いで、フィッシャー直接確率検定を用いて、経路および細胞成分について確立された遺伝子リストと、選択された遺伝子リストを比較する。ベン図を用いることにより、異なる臓器間で共通している遺伝子変化を同定する。関連性の高い遺伝子の発現プロファイルを用いることにより、幾つかの距離測定基準（標準、ピアソン）を用いた、個体実験点での変化が相関関係を示す遺伝子を見出す。
【０２６０】
特定遺伝子が関連しているとみなす決定は、上記の調査的フィルタリングおよび統計的アルゴリズムおよび共通の生物学的テーマに指向する他のモジュレーションされた遺伝子との関係により確認された数値変化の連結に基づいている。表４および６〜１１は、ＲＮＡレベルでＨＰＰポリペプチドが、アポトーシス経路、プロテオソーム、ユビキチン経路およびリボソームＲＮＡおよびタンパク質に関連した遺伝子に影響を及ぼすことを示している。ほとんどの遺伝子は、少なくとも１.２倍を越える割合でアップレギュレーションされているかまたは少なくとも０.８倍未満の割合でダウンレギュレーションされている。
【０２６１】
４．１：インビボでのＨＰＰ−３８ポリペプチドの特性確認
上記要領で、ＨＰＰ−３８ポリペプチドをマウスに投与し、発現レベルを評価し、遺伝子リストを選択した（表４）。
【表１１１】
2007502971.tif 000112
【０２６２】
１５の腫瘍細胞株でインビトロ実験を行った。細胞増殖における変化の検出に使用した検定法は、生存可能な細胞がアラマーブルーをその酸化非蛍光青色形態から還元蛍光赤色形態へ変色させる能力に基づいていた。アラマーブルー反応から得られた結果により、細胞増殖は定量され、生存可能な細胞の代謝活性が評価され得る。試験化合物を滅菌蒸留水で溶解および希釈することにより、１００００、１０００、１００、１０および１マイクロモルの初回作業溶液を得た。さらに培養培地で１００倍希釈を行うことにより、１００、１０、１、０.１および０.０１マイクロモルの最終検定濃度にした。細胞懸濁液１００マイクロリットルのアリコート（１ウェル当たり約１５００〜５０００細胞）を、摂氏３７度、５％二酸化炭素雰囲気中で９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた。２４時間後、１００マイクロリットルの成長培地および２マイクロリットルの試験溶液、マイトマイシン（陽性対照物質）または賦形剤（蒸留水）を、それぞれ１ウェルにつきデュプリケイトで加えて、さらに７２時間インキュベーションした。細胞増殖に対する可能な阻害効果について、１００、１０、１、０.１および０.０１マイクロモル濃度で試験物質を評価した。インキュベーションの最後に、２０マイクロリットルの９０％アラマーブルー試薬を各ウェルに加え、さらに６時間インキュベーションした後、蛍光強度により細胞生存能力を検出した。５３０ｎｍでの吸光度および５９０ｎｍでの放射によるSpectafluor Plus プレート読取装置を用いて蛍光強度を測定した。賦形剤処置対照培養物に対する蛍光強度の５０％またはそれ以上の減少は、顕著な細胞成長阻害、静細胞性または細胞傷害性を示すもので、次いで、非線形回帰分析により半定量的ＩＣ５０、ＴＢＩおよびＬＣ５０を測定した。結果は、少なくとも腫瘍細胞株の中には、他の腫瘍細胞株よりもＨＰＰ−３８誘導による細胞傷害性または細胞成長阻害に対して高い感受性を示すものもあることを示していた。従って、ＨＰＰ−３８はある程度の選択性を有する。これらの結果は、抗癌剤としてのＨＰＰ−３８の可能性を立証している。
【０２６３】
【表１１２】
2007502971.tif 000113
【０２６４】
ａＩＣ５０（５０％阻害濃度）：処置細胞の数または質量における時間０からの増加が、実験の最後において賦形剤対照での対応する増加の僅か５０％であった試験化合物濃度。
ｂＴＧＩ（合計成長阻害）：実験の最後における処置細胞の数または質量が、０時点での値に等しかった試験化合物濃度。
ｃＬＣ５０（５０％致死濃度）：実験の最後における処置細胞の数または質量が、０時点での値の半分であった試験化合物濃度。
ＩＣ５０、ＴＧＩおよびＬＣ５０の半定量的測定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、米国）を用いた非線形回帰分析により実施した。
【０２６５】
４.２：インビボでのＨＰＰ−１３ポリペプチドの特性確認
上記と同じ要領で、ＨＰＰ−１３ポリペプチドをマウスに投与し、発現レベルを評価し、遺伝子リストを選択した（表６、７、８、９および１０）。影響された遺伝子は、鉄輸送、鉄代謝、ヘム生合成、赤血球生成および免疫調節に関連しているか、または神経変性に関連している（表１１）。変化倍率は１.２より大または小である。
【０２６６】
【表１１３】
2007502971.tif 000114
【０２６７】
【表１１４】
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【０２６８】
【表１１５】
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【０２６９】
【表１１６】
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【０２７０】
【表１１７】
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【０２７１】
【表１１８】
2007502971.tif 000119
【０２７２】
４．３：インビボでのＨＰＰ−２３ポリペプチドの特性確認
上記要領で、ＨＰＰ−２３をマウスに投与し、発現レベルを評価し、遺伝子リストを選択した（表１２）。影響された遺伝子は、糖代謝（例、グルコース）、血管形成、脈管形成、血圧に関連している。
【０２７３】
【表１１９】
2007502971.tif 000120
【０２７４】
４．４：インビボでのＨＰＰ−１３およびＧＰＡ１０１ポリペプチドの特性確認
４．４．１：緒論
ニューロン集団における進行性細胞喪失は、神経変性疾患の顕著な病理学的特徴である。神経栄養素、例えばＮＧＦ（神経成長因子）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン３）、ＮＴ−４／５（ニューロトロフィン４／５）またはＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）の発見は、大きくて有望な研究分野の突破口となった。神経栄養因子は、幾つかの神経変性疾患の処置に既に使用されている。しかしながら、この用途は、それらが血液脳関門を通過できないこと、それらの短い半減期およびそれらの副作用により制限されている。そこで、それらの限界を伴わず、神経栄養効果（ニューロン生存および神経突起生長を促進）を模倣し得る新規化合物の開発は、神経変性疾患における新たな治療法の開発にとって優れた戦略であると思われる。
【０２７５】
本インビトロ試験の目的は、脊髄運動ニューロンからの神経突起生長に対するＨＰＰ−１３およびＧＰＡ１０１の推定的神経栄養効果を調べることである。試験化合物の神経栄養効果を、主要神経突起の長さの測定により処置の３日後に調べる。２つの培養を行い、一条件当たり２枚のペトリ皿で実施する。
【０２７６】
４．４．２：材料および方法
４．４．２．１：運動ニューロン培養
Martinou et al．（１９９２）Neurons、８、７３７−７４４により記載された方法に従って、ラット脊髄運動ニューロンを調製する。簡単に述べると、妊娠期間１５日の（妊娠した）雌ラットを頚部脱臼（ラッツ・ウィスター；ジャンヴィア、ルジュヌ−サンアイル、フランス）により殺し、胎児を子宮から取出す。脊髄を除去し、Leibovitzの氷冷培地（Ｌ１５、ギブコ、インビトロゲン、セルジュ−ポントワ、フランス）に入れる。髄膜を注意深く除去する。脊髄組織を、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ロシュ・メイラン）の存在下、３７℃で３０分間トリプシン処理（トリプシン、ギブコ）により解離する。１０％胎児ウシ血清（ギブコ）を含むＤＭＥＭを加えることにより、反応を停止させる。懸濁液を１０ｍｌピペットで磨砕し、次いで細胞を、注射器の２１ゲージ針により数回通して機械的に解離させる。次いで、細胞を、室温で１０分間、５８０×ｇでの遠心分離にかける。解離した細胞のペレットを、Ｌ１５培地に再懸濁し、生成した懸濁液を、まずＬ１５培地中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３.５％溶液の層において室温で１０分間、１８０×ｇでの１０分間遠心分離により運動ニューロンについて濃縮する。上清を廃棄し、ペレットを、デオキシリボヌクレアーゼＩを補ったＬ１５中でホモジネートし、懸濁液をオプティプレップ（Optiprep）（ｄ：１.０６ｇ.ｍＬ−１；アブシィ、パリ、フランス）のクッション上において層状に重ね、そして室温で１５分間、３３５×ｇでの遠心分離にかける。精製された運動ニューロンを含む上方の相を集め、Ｌ１５に再懸濁し、室温で１０分間、８００×ｇでの遠心分離にかける。細胞ペレットを、最後にＢ２７サプリメント（２％、ギブコ）を補ったＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ニューロベーサル、ギブコ）および０.５ｍＭのＬ−グルタミン（ギブコ）から成る規定培養培地に再懸濁する。この培養培地は、血清を全く含まない。ニューロベーサルは、ニューロンを長期生存させる血清不含有培地であるが、処方は機密事項である（公式データシートはインビトロゲンのウェブサイトで公開されている）。Ｂ２７は、最適成長条件を与えるために加えられるサプリメントである（Ｂ２７サプリメントは以下の成分を含む：ｄ−ビオチン、ＢＳＡ、脂肪酸遊離フラクションＶ、カタラーゼ、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣｌ、Ｄ−ガラクトシダーゼ（無水物）、グルタチオン（還元型）、インシュリン（ヒト、組換え体）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン.２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム（１０００Ｘ）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ−３／アルブミン複合体、ＤＬアルファ−トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロールアセテート、トランスフェリン（ヒト、鉄不足）、ビタミンＡ酢酸塩）。トリパンブルー排除試験（シグマ）を用いるノイバウアー血球計で生存し得る細胞を計数する。次いで、細胞を１ペトリ皿（ヌンク、デュッチャー、ポリ−１−リシンでプレコーティング）につき３００００細胞で培養し、加湿空気（９５％）−ＣＯ２（５％）雰囲気中３７℃で培養する。平板培養の２時間後（細胞接着に要求される時間）、試験化合物を培養に加える。
【０２７７】
この試験は、以下の条件を使用した：
・対照
・＋ＢＤＮＦ、５０ｎｇ／ｍｌ
・＋ＨＰＰ−１３（配列番号３９３）、１ｎＭ
・＋ＨＰＰ−１３（配列番号３９３）、１０ｎＭ
・＋ＨＰＰ−１３（配列番号３９３）、３０ｎＭ
・＋ＧＰＡ１０１、１ｎＭ
・＋ＧＰＡ１０１、１０ｎＭ
・＋ＧＰＡ１０１、３０ｎＭ
【０２７８】
４．４．２．２神経突起生長の評価
３日の処置後、培養物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ギブコ）で洗浄し、ＰＢＳ中２.５％のグルタルアルデヒドに固定する。一条件（各皿において約半分）につき、枝分かれの無い神経突起をもつ細胞の８０〜１００枚の写真を、顕微鏡（ニコン、対物レンズ２０倍）に固定したカメラ（クールピクス９９５、ニコン）で撮影し、ソフトウェア（イメージ−プロ・プラス、フランス）による写真の分析により、長さの測定を行う。
【０２７９】
４．４．２．３ データ分析
一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、データの分析を行う。適用し得る場合、フィッシャーＰＬＳＤ検定を、多対比較法に用いる。有意性のレベルをｐ＜０.０５に設定した。
【０２８０】
４．４．３結果
４．４．３．１  ＢＤＮＦの効果
５０ｎｇ／ｍｌで試験したＢＤＮＦは、脊髄運動ニューロンでの神経突起生長を誘導した。３日培養後の対照条件では、主たる神経突起長は約１１１.７４μｍ±４.０３２であり、ＢＤＮＦによると、主たる神経突起は、１９９.５６μｍ±７.１２２に達した。７７％の増加が観察された。
【０２８１】
【表１２０】
2007502971.tif 000121
【０２８２】
４．４．３．２ ＨＰＰ−１３およびＧＰＡ１０１の効果
ＨＰＰ−１３およびＧＰＡ１０１はまた、神経突起生長を著しく増加させており、神経突起生長はＢＤＮＦと類似している。各化合物について、最良の濃度は１０ｎＭであることが見出された。この濃度の場合、平均神経突起長は、ＨＰＰ−１３については１９３.６５μｍ±８.７３７およびＧＰＡ１０１については１７９.７４μｍ±７.５４５に達した。試験濃度全部について、平均神経突起長は対照条件の１５０％に達する。
【０２８３】
４．４．４ 検討
この試験では、ＨＰＰ−１３およびＧＰＡ１０１の大きな神経栄養効果が観察された。
【０２８４】
実施例４．５：インビボでのＨＰＰ−２３ポリペプチドの特性確認
上記と同じ要領で、ＨＰＰ−２３をマウスに投与し、発現レベルを評価し、遺伝子リストを選択した（表１４）。影響された遺伝子は、糖アミロイドーシス、不整脈または血管形成（例、卒中、黄斑再生、癌）に関連している。
【０２８５】
【表１２１】
2007502971.tif 000122
【表１２２】
2007502971.tif 000123
【表１２３】
2007502971.tif 000124
【０２８６】
実施例５：ヒトおよびマウスオーソログペプチドのアラインメント
実施例４記載の要領で、ヒト血漿中に存在することが本発明に従って検出されたタンパク質を、マウスへの注射に適切な相同性マウス配列について検索した。
【０２８７】
下線は合成に使用されたペプチド配列を示す。
GPA056 (HPP-38)
ジーンプロット ID: GP_1727089についてのアラインメント
種類: 食道癌関連遺伝子 2
遺伝子記号: ECG2
同一性:    26/74 = 35%
オーソロジー:   セレラ合成オーソログ
【表１２４】
2007502971.tif 000125
【０２８８】
GPA065 (HPP-13)
ジーンプロット ID: GP_909415についてのアラインメント
種類: チモシンのパラログ, ベータ 4, X 染色体
遺伝子記号: 
同一性:    43/43 = 100%
オーソロジー:   ノバルティス相互最適マッチオーソログ, SwissProt オーソログ
【表１２５】
2007502971.tif 000126
【０２８９】
GPA066
ジーンプロット ID: GP_909415についてのアラインメント
種類: チモシンのパラログ, ベータ 4, X 染色体
遺伝子記号: 
同一性:    44/44 = 100%
オーソロジー: ノバルティス相互最適マッチオーソログ, SwissProt オーソログ
【表１２６】
2007502971.tif 000127
【０２９０】
GPA068 (HPP-23)
ジーンプロット ID: GP_805366についてのアラインメント
種類: クロモグラニン A (上皮小体分泌タンパク質 1)
遺伝子記号: CHGA
同一性:    28/52 = 54%
オーソロジー:   セレラ 合成オーソログ
【表１２７】
2007502971.tif 000128
【配列表】
2007502971000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月13日(2006.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007502971000001.app
【国際調査報告】
2007502971.tif 000202
2007502971.tif 000203
2007502971.tif 000204
2007502971.tif 000205
2007502971.tif 000206
2007502971.tif 000207