(57)【要約】本発明は、組成物ならびに乳房の腫瘍の分類における該組成物の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３〜７３組の異なるプローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物であって、前記異なるプローブセットの少なくとも４０％が、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体のうち１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなることと、前記異なるプローブセットが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズすることとを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記異なるポリヌクレオチドプローブセットが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも５つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記異なるプローブセットの少なくとも５０％が、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体のうち１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記異なるプローブセットが全体として、
（ａ）配列番号１またはその相補体、
（ｂ）配列番号２またはその相補体、
（ｃ）配列番号４またはその相補体、および
（ｄ）配列番号５またはその相補体
のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
乳房の腫瘍を分類する方法であって、
（ａ）乳房に腫瘍を有する対象から得たｍＲＮＡ由来の核酸試料を核酸プローブと接触させる工程であって、該核酸プローブが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体で構成される群から選択された３つ以上の核酸標的に選択的にハイブリダイズし、接触が、核酸試料中に存在する核酸標的またはその相補体への核酸プローブの選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で行われることを特徴とする工程と、
（ｂ）核酸プローブと核酸標的またはその相補体とのハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程であって、いくつかのそのようなハイブリダイゼーション複合体により配列番号１〜２９の１または複数の核酸の遺伝子発現の尺度が提供されることを特徴とする工程と、
（ｃ）配列番号１〜２９の１または複数の核酸の遺伝子発現における、対照に対する変化を、乳がんの再発リスクと関連付ける工程と
からなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、核酸、核酸検出、がん、および乳がんの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（相互参照）
本願は、２００４年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５６４，７５７号（全体を参照により本願に援用する）の優先権を主張する。
【０００３】
（背景）
乳がんは、女性に最も一般的ながんであり、米国におけるがんによる死の２番目に多い原因である。生殖細胞系列でのＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子における突然変異により、その突然変異を持った女性は乳がんに罹患しやすくなるが、これらの乳がん感受性遺伝子に関係しているのは乳がんの約５−１０％のみである。現在使用されている乳がん予後の臨床上の指標は、予後が好ましいであろう患者の識別においては正確ではない。その結果、補助化学療法から利益を得るであろう患者よりも多くの患者が該治療を受けている。（２００４年３月２５日公開の特許文献１）。
【０００４】
生殖細胞系列の突然変異（「散発的な腫瘍」）に関係しているとは現在認識されていない腫瘍が、大多数の乳がんを構成している（特許文献１）。非遺伝的な要因も乳がんの発症に重要な役割を果たしていると思われる。いずれにせよ、乳がんがその進行の初期で検出されない場合は罹病率および死亡率が増加するので、乳房腫瘍の発生の早期発見に相当な努力が為されてきた。
【０００５】
乳がんの診断は、典型的には腫瘍の存在を組織病理学的に証明する必要がある。病理組織検査は予後に関する情報も提供し、治療計画を選択するのを支援する。予後診断は、腫瘍のサイズ、腫瘍の等級、患者の年齢およびリンパ節への転移のような臨床的パラメータに基づいて為される場合もある（特許文献１）。
【０００６】
乳がん患者の中で遠隔転移を伴わずに生存するものについて正確に予後診断または判定することにより、最も積極的な治療を受けている予後の比較的悪い女性に、選択的に補助化学療法を投与することが可能になるだろう。
【０００７】
マイクロアレイ技術の成熟は、ゲノム全体に渡る遺伝子発現（ＲＮＡ）データの日常的収集を可能にした。がんの診断においては、様々な著者により、腫瘍から集められたマイクロアレイデータが鑑別診断、腫瘍ステージの判定および予後診断において有用かもしれないことが示されている。これらの研究によって得られたデータはまさしく新しい診断法開発のための有用な資源に相当するものである。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００５８３４０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在使用されている乳がんの予後の臨床上の指標は、十分に正確なものではない。その結果、補助化学療法から利益を得るであろう患者よりも多くの患者がそのような治療を受けている。したがって、より良好かつより特異的な乳がんの予後の臨床上の予測材料が、当分野において依然必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、組成物および乳房の腫瘍の分類におけるそれらの使用方法を提供する。
一態様では、本発明は３〜７３組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物を提供し、該組成物は、前記異なるプローブセットの少なくとも４０％が、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体のうち１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含むことと、前記異なるプローブセットが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズすることとを特徴とする。
【００１０】
第二の態様では、本発明は乳房の腫瘍を分類する方法を提供し、該方法は、
（ａ）乳房に腫瘍を有する対象から得たｍＲＮＡ由来の核酸試料を核酸プローブと接触させる工程であって、該核酸プローブが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体で構成される群から選択された３つ以上の核酸標的に選択的にハイブリダイズし、接触が、核酸試料中に存在する核酸標的またはその相補体への核酸プローブの選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で行われることを特徴とする工程と、
（ｂ）核酸プローブと核酸標的またはその相補体とのハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程であって、いくつかのそのようなハイブリダイゼーション複合体により配列番号１〜２９の１または複数の核酸の遺伝子発現の尺度が提供されることを特徴とする工程と、
（ｃ）配列番号１〜２９の１または複数の核酸の遺伝子発現における、対照に対する変化を、乳がんの分類と関連付ける工程と
からなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
引用される全ての参照文献は、その全体が参照により本願に援用される。
本願においては、別途記載のない限り、使用される技法については、いくつかの著名な参照文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、コールドスプリングハーバー研究所出版社）、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１年、第１８５巻、ディー．ゲデル（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（エム．ピー．デューシャー（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ）編、１９９０年、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））の中の「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、１９９０年、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミック・プレス）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第２版（アール．アイ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のリス・インコーポレイテッド（Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．））、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｐ．１０９−１２８、イー．ジェイ．マレー（Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ）編、米国ニュージャージー州クリフトン所在のヒューマナ・プレス・インコーポレイテッド（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）、ならびにアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社の１９９８年版カタログ（米国テキサス州オースティン所在のアンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））などのいずれかに見出すことができる。
【００１２】
本発明は、新規な組成物および乳房の腫瘍の分類における該組成物の使用方法を提供する。本明細書に使用する場合、用語「分類する（こと）」は、乳房の腫瘍の１または複数の特徴、または乳房組織試料を得た患者の予後を測定することを意味し、
（ａ）乳がんの診断（良性腫瘍か悪性腫瘍か）；
（ｂ）転移の可能性、特定の器官に転移する可能性、再発リスク、または腫瘍の進行；
（ｃ）腫瘍のステージ；
（ｄ）化学療法またはホルモン療法を行わない状態での患者の予後；
（ｅ）治療（化学療法、放射線療法および／または腫瘍を切除する手術）に対する患者の応答性の予測；
（ｆ）患者にとって最適な治療コースの予測；
（ｇ）治療後の患者の再発に関する予測；および
（ｈ）患者の余命
が含まれる。
【００１３】
第一態様において、本発明は、３〜７３組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなるかまたは該乳がんバイオマーカーで構成される組成物を提供し、前記異なるプローブセットの少なくとも４０％が、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体のうち１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該単離ポリヌクレオチドで構成されることと、前記異なるプローブセットが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズすることとを特徴とする。
【００１４】
乳房の腫瘍を分類するために本明細書に開示されたマーカーのうち２つを用いて得られた結果が統計学的に有意である一方、本発明者らは、これらのマーカーの別のサブセットを臨床診断に利用することは、マーカー対を臨床診断に利用するよりも優れていると考えている。３つ以上のプローブで構成されるそのような組合せにより、乳がんの特定の表現型を伴う遺伝子発現異常の複雑さがより良く特性解析される可能性がある。従って、本発明の第一態様の種々の好ましい実施形態において、組成物は、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体のうち１つの核酸に選択的にハイブリダイズする、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなり、該異なるプローブセットは全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個に選択的にハイブリダイズする。これらの実施形態それぞれにおいて、所与の乳がんバイオマーカーのプローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該単離ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。当業者には明らかなように、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該単離ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットの割合（％）につれ、その乳がんバイオマーカーのプローブセットの最大数は減少することになる。従って、例えば、プローブセットの少なくとも８０％が配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該単離ポリヌクレオチドで構成される場合、その乳がんバイオマーカーは３〜３６組のプローブセットで構成されることになる。当業者であれば、本発明の第三態様の種々の実施形態の組成物に包含されるその他の様々な置換形態を認識するであろう。
【００１５】
本発明の組成物は、例えば哺乳動物（好ましくはヒト）の対象に由来するヒト乳房組織の分類において、有用である。該組成物は、例えば、上記に列挙した遺伝子に相補的なｍＲＮＡの組織における発現レベルを測定するために使用することができる。この本発明の第一態様の組成物は、例えば乳房組織試料（バイオプシー、腫瘤摘出試料、固形腫瘍試料を含むが、これらに限定されない）、類繊維腫、腫瘍から流出した流血中腫瘍細胞、血液サンプル（血液塗抹標本など）および骨髄細胞などの、対象の組織中の遺伝子からのＲＮＡ発現の分析に使用するのに特に好適である。そのような、本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、対象の核酸への選択的ハイブリダイゼーションが可能な任意の長さであってよい。本発明のこの態様の種々の好ましい実施形態ならびに以下に開示される関連の態様および実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体で構成される群から選択された核酸の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００ヌクレオチドを含んでなるかまたはそれらのみで構成される。別の実施形態では、本発明の第一態様の単離ポリヌクレオチドは、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体の核酸を含んでなるかまたは前記核酸のみで構成される。
【００１６】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において用いられるように、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを意味し、該ポリヌクレオチドは対象として挙げられた遺伝子に相補的な配列を含んでいなければならない。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、列挙された核酸（またはその対応ＲＮＡ配列）に対する「アンチセンス」である一本鎖の核酸である。用語「ポリヌクレオチド」には、所望の目的に関して、参照ポリヌクレオチドと類似もしくは改善された結合特性を備えた、天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸が包含される。該用語は、合成の骨格を備えた核酸類似構造も包含する。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカーバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート結合またはメチルホスホネート結合とホスホジエステル結合とが交互になっているもの（シュトラウス‐ソーカプ（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ）、１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻、ｐ．８６９２−８６９８）、ならびに米国特許第６，６６４，０５７号明細書で議論されているようなベンジルホスホネート結合が挙げられる。また、エフ．エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編「Ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、オックスフォード大学出版社のＩＲＬプレス、１９９１年；「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｒｉｅｓ」、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６００巻、バセルガ（Ｂａｓｅｒｇａ）およびデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）編、（ＮＹＡＳ  １９９２）；ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）、１９９３年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第３６巻、ｐ．１９２３−１９３７；「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９３年、ＣＲＣプレス）も参照されたい。
【００１７】
本明細書において本発明の全ての態様および実施形態について使用される「単離（された）」ポリヌクレオチドとは、その核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいて自然状態では該ポリヌクレオチドに隣接する配列を含まず、かつ好ましくはｃＤＮＡライブラリなどの核酸ライブラリに見出されるリンカー配列を含まないポリヌクレオチドである。さらに、「単離」ポリヌクレオチドとは、組換え技法で生産される場合は他の細胞成分、ゲ
ル材料、および培地を実質的に含まず、あるいは化学合成される場合は前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリからのＰＣＲ増幅によるなど、標準的技法を使用して様々な供給源から単離されてもよいし、あるいは、米国特許第６，６６４，０５７号明細書および同文献に開示された参照文献で議論されるように、当業者に周知の方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されてもよい。様々な溶液または固相の方法により合成ポリヌクレオチドを調製することができる。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエステル、およびＨ−ホスホネートの化学的性質を用いたポリヌクレオチドの固相合成手法に関する詳細な記載は、広く入手可能である。（例えば、米国特許第６，６６４，０５７号明細書および同文献に開示された参照文献を参照されたい）。ポリヌクレオチドを精製する方法には、アクリルアミドゲルネイティブ電気泳動、およびピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、１９８３年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．第２５５巻、ｐ．１３７−１４９に記述されているような陰イオン交換ＨＰＬＣが挙げられる。合成ポリヌクレオチドの配列は標準的方法を使用して確認することができる。
【００１８】
本発明のすべての態様および実施形態に関して本明細書で使用される場合、「プローブセット」とは、例えば乳がんの分類において使用することができる同じ標的（例えば特定のｍＲＮＡ）にそれぞれ選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドの集団を意味する。したがって、１つの「プローブセット」は、ある標的に選択的にハイブリダイズする任意の数の異なる単離ポリヌクレオチドを含みうる。例えば、配列番号１０に選択的にハイブリダイズするプローブセットは、配列番号１０の１つの１００ヌクレオチド長セグメントについてのプローブ、または配列番号１０の１００ヌクレオチド長セグメントと配列番号１０の別の１００ヌクレオチド長セグメントとについてのプローブ、またはこれら両方に加えて配列番号１０の別個の１０ヌクレオチド長セグメントについてのプローブ、または配列番号１０の５００個の異なる１０ヌクレオチド長セグメントについてのプローブ（例えば、比較的大きなプローブを多くの個々の短いポリヌクレオチドに分断するなど）を含むことができる。当業者は、多くのそのような置換形態が可能であると理解するだろう。
【００１９】
本発明の組成物は、凍結乾燥された形態であってもよいし、または好ましくは、異なるプローブセットを含む溶液を含んでなるものであってもよい。そのような溶液はそのようなものとして製造されてもよいし、または、以下に議論されるように、標的配列にポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる時に組成物が調製されてもよい。別例として、組成物は、マイクロアレイまたはマイクロプレートの形式などのように、固体支持体上に配置されてもよい。
【００２０】
上記の全ての実施形態において、ポリヌクレオチドが検出可能な標識で標識されることがさらに好ましい。好ましい実施形態では、該核酸組成物の異なるポリヌクレオチド上の検出可能な標識は、例えば複数のポリヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーション反応を実施する場合にそれらのシグナルを区別して測定し易いように、相互に識別可能である。標識を検出する方法には、分光分析法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、物理学的方法、または化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３Ｈおよび１４Ｃのような放射活性標識；イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド燐光体、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（登録商標）、ＡＬＥＸＩＳ（商標）（アボットラボ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ））、ＣＹ（商標）色素（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））のような蛍光色素；金のような高電子密度試薬；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素；金コロイドのような比色定量標識；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）として販売されているような磁気標識；ビオチン；ジゴキシゲニン；または抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質が挙げられる
が、これらに限定はされない。標識は、ポリヌクレオチドに直接組み入れられてもよいし、または、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合するプローブもしくは抗体に結合させてもよい。標識は、当業者に周知の任意の手段によってプローブに連結されうる。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ニックトランスレーション法、ＰＣＲまたはランダムプライマー伸長法（例えば、前掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの文献を参照）を使用して標識される。
【００２１】
上述のように、本発明者らは乳がんに関連するＲＮＡ発現の変化についての最適なマーカーを特定した。従って、第二態様において、本発明は乳房の腫瘍を分類する方法を提供し、該方法は、
（ａ）乳房に腫瘍を有する対象から得たｍＲＮＡ由来の核酸試料を核酸プローブと接触させる工程であって、該核酸プローブが全体として、配列番号１〜２９もしくはそれらの相補体で構成される群から選択された２つ以上の核酸標的に選択的にハイブリダイズし、接触が、核酸試料中に存在する核酸標的またはその相補体への核酸プローブの選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で行われることを特徴とする工程と、
（ｂ）核酸プローブと核酸標的またはその相補体とのハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程であって、いくつかのそのようなハイブリダイゼーション複合体により配列番号１〜２９の１または複数の核酸の遺伝子発現の尺度が提供されることを特徴とする工程と、
（ｃ）配列番号１〜２９の１または複数の核酸の遺伝子発現における、対照に対する変化（すなわち、増大または減少）を、乳がんの分類と関連付ける工程と
からなる。好ましい実施形態において、分類は乳がんの再発を含む。
【００２２】
本発明の第二態様の方法は、配列番号１〜２９の１または複数のマーカーの遺伝子発現における対照に対する変化を、乳房の腫瘍を再発しそうであるとの分類に関連している対照に対する発現の変化により検出する。
【００２３】
当技術分野で周知の任意の対照を本発明の方法に用いることができる。例えば、がん性腫瘍組織および非がん性腫瘍組織のいずれにおいても比較的一定のレベルで発現することが知られている遺伝子の発現レベルを、比較に用いることができる。別例として、プローブが標的とする遺伝子の発現レベルを、被験試料と同等の非がん性ＲＮＡ試料において分析することもできる。多くのそのような対照を本発明の方法において使用可能であることは、当業者には認識されるであろう。
【００２４】
本発明の第二態様において、該方法は、乳がんに関連した遺伝子発現の変化を検出するために使用される。本明細書に使用される場合、「乳がんに関連した」とは、１または複数のマーカーの発現レベルの変化を用いて、乳房の腫瘍の特徴、または核酸試料を得た患者の予後を分類することを意味し、
（ａ）乳がんの診断（良性腫瘍か悪性腫瘍か）；
（ｂ）転移の可能性、特定の器官に転移する可能性、または腫瘍の進行；
（ｃ）腫瘍のステージ；
（ｄ）化学療法またはホルモン療法を行わない状態での患者の予後；
（ｅ）治療（化学療法、放射線療法および／または腫瘍を切除する手術）に対する患者の応答性の予測；
（ｆ）患者にとって最適な治療コースの予測；
（ｇ）治療後の患者の再発に関する予測；および
（ｈ）患者の余命
が含まれる。
【００２５】
従って、本発明のこの態様の方法は、例えば、乳がんの診断、および化学療法を行う場
合と行わない場合の患者の予後、患者にとって最適な治療コースの予測、および患者の余命に関する情報を提供する。好ましい実施形態では、乳がんの分類には乳房腫瘍の再発についての予後診断が含まれる。さらに好ましい実施形態では、１または複数の核酸標的の発現レベルの変化が、対照に対する乳房腫瘍の再発率の増大と関連している。本明細書において使用される場合、「再発」とは同一の部位における腫瘍の再発、転移または乳がんによる死を意味する。
【００２６】
さらに好ましい実施形態では、１または複数の核酸標的の正常な発現レベルにおける変化が、乳房腫瘍の再発リスクの増大と関連している。当業者には当然のことであるが、「発現レベルにおける変化」とは、同一の正常な健常組織に対する発現レベルの何らかの偏りを意味している。さらに当然のことであるが、「リスクの増大」とは、本明細書に記載のマーカーを使用して得られる情報がない状態では類似または同一の臨床上かつ／または病理学的特性を有するすべての他のものに対してリスクが高いことを意味する。
【００２７】
本方法の全ての態様および実施形態について本明細書に使用される場合、対照に対する遺伝子発現の変化（すなわち増大または減少）は、その疾患状態に対応する正常組織またはその他の適切な対照などの対照に対する何らかの増大または減少である。種々の実施形態において、増大または減少は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれ以上の増大または減少である。
【００２８】
従って、本発明はさらに、乳がんの患者の治療について決定する方法を提供し、該方法は、本発明の第二態様およびその実施形態による乳房腫瘍を分類する方法を実施することと、次いで、その結果を、乳がん患者の治療コースを決定するに際して、その他の臨床上かつ病理学的リスク要因に照らして検討することからなる。例えば、本発明の方法により再発リスクが増大していることが示された患者に対して、化学療法、放射線療法、および／または腫瘍の外科的切除などの標準的治療法を用いてより積極的な治療を行うことができよう。
【００２９】
本発明の方法において使用されるＲＮＡ試料は、例えば乳房組織試料（バイオプシー、腫瘤摘出試料、固形腫瘍試料を含むが、これらに限定されない）、類繊維腫、腫瘍から流出した流血中腫瘍細胞、血液サンプル（血液塗抹標本など）および骨髄細胞など（これらに限定されない）、乳房の腫瘍を分類するのに有用な任意の供給源に由来するものでよい。好ましい実施形態において、ＲＮＡ試料はヒトＲＮＡ試料である。当業者には当然のことであるが、試験しようとするＲＮＡを含んだ複雑な試料混合物、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで分析される細胞または組織の試料などを使用することが可能なので、ＲＮＡ試料はＲＮＡの単離を要するものではない。
【００３０】
最も好ましい実施形態では、プローブは、本発明の核酸組成物の一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドを含んでなる。例えば、ｍＲＮＡの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（すなわち、メッセンジャーＲＮＡを検出するＦＩＳＨ）では、アンチセンスプローブ鎖のみがＲＮＡ試料中の一本鎖ｍＲＮＡにハイブリダイズし、そのような実施形態においては「センス」鎖オリゴヌクレオチドを陰性対照として使用することができる。
【００３１】
別例として、ＤＮＡプローブをプローブとして使用することができる。この実施形態では、細胞質のＲＮＡへのハイブリダイゼーションと核ＤＮＡへのハイブリダイゼーションとを識別することが望ましい。この識別を行うための主な２つの基準は次のとおりである。（１）標的の種類によるコピー数の差（コピー数が何百〜何千ものＲＮＡか、２コピーのＤＮＡか）。この差は通常シグナル強度の顕著な差を生じる。および（２）細胞質（こ
こでＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーションが起きると思われる）と核との明瞭な形態学的相違から、シグナルの位置が明白となること。したがって、二本鎖ＤＮＡプローブが使用される場合、該方法は、体液試料内の分析されている細胞の細胞質および核を識別する工程をさらに含むことが好ましい。そのような識別工程は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２またはＤＡＰＩのような、分析されている細胞の核ＤＮＡを描出する核染色剤の使用など、当該技術分野で周知の任意の手段によって遂行されうる。この実施形態では、核染色剤が検出可能なプローブから識別可能であることが好ましい。核膜が維持されること、すなわちＨｏｅｃｈｓｔまたはＤＡＰＩ染色剤のすべてが核の可視構造内に維持されることがさらに好ましい。
【００３２】
プローブがＲＮＡ試料に選択的に結合してハイブリダイゼーション複合体を形成し、かつ他の配列には最小限しか結合しないか全く結合しない任意の条件を、本発明の方法に使用することができる。使用される厳密な条件は、用いられるポリヌクレオチドプローブの長さ、該ポリヌクレオチドプローブのＧＣ含量、ならびに当業者によく知られたその他の種々の要因に依存することになる。（例えば、ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、１９９３年「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」第Ｉ部第２章の「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」（米国ニューヨーク所在のエルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）を参照されたい）。一実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、規定のイオン強度およびｐＨでその特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ条件下）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃の０．２×ＳＳＣ中で１５分間の洗浄条件である（例えば、ＳＳＣバッファの記載に関してはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第２版）第１〜３巻、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ））を参照）。高ストリンジェンシーの洗浄の前に、バックグラウンドのプローブシグナルを除くための低ストリンジェンシーの洗浄が行われることが多い。
【００３３】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件の好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＲＮＡ試料をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブと接触させる工程と、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程と、ＲＮＡ試料中の開示された遺伝子のＲＮＡ発現レベルを（プローブから）定量する工程とからなる。核酸のハイブリダイゼーション技法を用いて核酸を特異的に測定する種々の方法は、当業者によく知られている。例えば、ヘームス，ビー．ディー．（Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．）およびヒギンス，エス．ジェイ．（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．）編「ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」、１９８５年、ＩＲＬプレス；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を参照されたい。
【００３４】
試料中の標的ＲＮＡの有無を評価する任意の方法、例えばノーザンブロッティング法，ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、またはアレイを用いる方法などを使用することができる。
【００３５】
好ましい実施形態では、検出はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）
によって行なわれる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは当業者に周知である。一般に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは次の主な工程、すなわち：（１）分析しようとする組織、生体構造物または核酸試料の固定、（２）核酸試料（その実施形態における組織または生体構造物内の核酸試料）へのアクセスしやすさを向上させ、かつ非特異的な結合を低減するための、組織、生体構造物または核酸試料のプレハイブリダイゼーション処理、（３）核酸試料へのプローブのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかったプローブを除去するための、ハイブリダイゼーション後の洗浄処理、ならびに（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出、を含む（例えば、米国特許第６，６６４，０５７号明細書を参照）。上記の各工程で使用される試薬およびその使用条件は、特定の用途に応じて変わる。特に好ましい実施形態では、ＩＳＨは、全体が参照により本願に組み込まれる米国特許第５，７５０，３４０号明細書および／または同第６，０２２，６８９号明細書に開示された方法によって実施される。
【００３６】
典型的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞が、一般にはスライドグラスなどの固体支持体に固定される。細胞は通常、熱またはアルカリで変性され、次いでそのタンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能とするハイブリダイゼーション溶液と接触させる。本発明のポリヌクレオチドは一般に、上述のようにして標識される。一部の用途では、反復配列へのハイブリダイゼーションの可能性を阻止することが必要である。この場合、ヒトゲノムＤＮＡまたはＣｏｔ−１  ＤＮＡを用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。
【００３７】
さらなる実施形態では、アレイを用いる形式を使用可能であり、同形式では本発明のポリヌクレオチドを表面にアレイ状に配置することができ、ＲＮＡ試料を該表面上のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。この種の形式では、多数の異なるハイブリダイゼーション反応を本質的に「並行して」実行することができる。これにより、迅速かつ本質的に同時に多数の遺伝子を評価することができる。アレイを用いる形式でハイブリダイゼーション反応を実施する方法は、例えばパスティネン（Ｐａｓｔｉｎｅｎ）、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、第７巻、ｐ．６０６−６１４；（１９９７）ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、ｐ．１６８５；チー（Ｃｈｅｅ）、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、ｐ．６１０；国際公開公報第９６／１７９５８号パンフレットにも記載されている。表面上にポリヌクレオチドを固定化し、表面を誘導体化する方法は当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，６６４，０５７号明細書を参照されたい。
【００３８】
上記の態様および実施形態の各々において、ハイブリダイゼーションの検出は一般に、上述したものなど本発明のポリヌクレオチド上の検出可能な標識の使用により遂行されるが、いくつかの別例においては、標識は標的核酸上にあってもよい。標識は、ポリヌクレオチドに直接組み入れてもよいし、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合するプローブもしくは抗体に付着させてもよい。標識は、上述したように、当業者に周知の様々な手段でプローブに連結させることができる。好ましい実施形態では、核酸組成物の異なるポリヌクレオチド上の検出可能な標識は、互いに識別可能である。標識は、上記に議論されるように、分光分析法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、物理学的方法、または化学的方法（これらに限定されない）など任意の技法により検出することができる。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組成物とその使用説明書からなる、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。好ましい実施形態では、上記に開示されるように、ポリヌクレオチドは標識されており、最も好ましくは所与のプローブセット中の各ポリヌクレオチド上の標識が同一で、別のプローブセット中のポリヌクレオチド上の検出可能な標識とは異なっている。さらに好ましい実施形態では、プローブは溶液状態で提供され
、最も好ましくは本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーションバッファ中に提供される。さらなる実施形態では、キットは洗浄溶液および／またはプレハイブリダイゼーション溶液も備える。
【実施例１】
【００４０】
現在使用されている乳がん予後診断の臨床的指標は、予後が良好と思われる患者の特定においては正確ではない。
その結果、補助化学療法から利益を得るであろう患者よりも多くの患者が該治療を受けている。ファントビア（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ）ら（２００２）は、予後に関連している遺伝子発現プロファイルを特定するという問題に取り組んだ。彼のグループによって集められたデータは、臨床データを備えた９７件の乳房腫瘍試料に関する２４４８１個の遺伝子にわたる遺伝子発現測定値で構成されるものであった。一変量の遺伝子選択メカニズム（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を適用して、予後の予測に有用な７０個の遺伝子群が特定されている：
ファントビアの７０個の遺伝子マーカー
精度    ８０．８％
感度    ９１．２％
特異性  ７２．７％
しかしながら、７０個の遺伝子マーカーの臨床上の実用性は、７０個の測定値を統合するコストおよび複雑さによって制限されている。
【００４１】
ファントビアのデータセットは、最初の研究者らによって、予後良好の患者の試料４４個および予後不良の患者の試料３４個から収集されたデータで構成される練習用データセットと、予後良好の患者の試料７個および予後不良の患者の試料１２個から収集されたデータで構成される試験用データセットとに分けられた。彼らはデータの練習用の部分を使用して７０個の遺伝子マーカーを特定し、データの試験用の部分を使用してこのマーカーの性能を独立に試験した。
【００４２】
本発明者らは、データの練習用のサブセットを使用して５つの遺伝子に関する８５１２個のバイオマーカーと３つの遺伝子に関する２６２４個のバイオマーカーの組合せを開発した。線形判別分析の一変法を用いて、該分析の練習段階における各バイオマーカーの遺伝子発現の値の関係を規定した。この工程において、練習用試料を予後良好群と予後不良群とに分類する能力に応じてマーカーセットが特定される。しかしながら、この関係を規定するために他の方法を使用することも可能であろう。各バイオマーカーの性能を、予後を予測する精度に従って評価した。本明細書で使用される場合、精度とは、正確に予後良好または予後不良として特定された試料の割合を指す。練習用データにおいては、ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔクロスバリデーション（ｌｏｏｃｖ）として知られた技法を用いて精度を評価した。
【００４３】
本発明者らは、遺伝子２９個のセットを特定したが、このセットから２つまたはそれ以上の遺伝子を組合せてバイオマーカーとして使用すると、バイオマーカーの発現パターンが疾患の無病生存率に関する乳がんの予後に関連を有する。これらの配列それぞれについてのｃＤＮＡ配列を配列番号１〜２９に示す。
【００４４】
例えば、３つの遺伝子のバイオマーカーの使用は、最初の研究者らの７０個の遺伝子による解の精度に匹敵した。分析を５つの遺伝子のバイオマーカーに拡張することにより、精度が著しく高いマーカーが得られた。すなわち、
精度            感度            特異性
ファントビアの          ８０．８％      ９１．２％      ７２．７％
（７０個の遺伝子）
本明細書                ８８．５％      ９４．１％      ８４．１％
（５つの遺伝子）
である。
【００４５】
精度については上記に定義されている。感度は、予後不良の試料が予後不良として正確に分類された割合を意味し、特異性は、予後良好な試料が予後良好として正確に分類された割合を意味する。
【００４６】
さらに、この特定の５つの遺伝子のマーカーは、独立の試験試料１９個のうち１８個を正確に分類した。これは非常に有望な結果であり、遺伝子発現データに含まれる予後に関する情報を実証するものである。
【００４７】
表１は、５つのマーカーセットを用いた練習用データおよび試験用データについての試験の精度の例を示している。
【００４８】
【表１】
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2007532142.tif 000009
2007532142.tif 000010
【配列表】
2007532142000001.app
【国際調査報告】
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2007532142.tif 000012
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