(57)【要約】   本発明は、Ｇタンパク共役型レセプター及びこれに対する新規なリガンドに関する。本発明は、このＧタンパク共役型レセプターの活性をモジュレートする候補化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供し、またＧタンパク共役型レセプターシグナリングの調節不良に関係する疾患又は疾病の診断及び治療に有用なアッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｎ１Ｎ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｎ３Ｘ４Ｎ４Ｘ５を含む５０アミノ酸までのポリペプチドであって、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３及びＮ４は芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１−Ｘ５がいずれかのアミノ酸であり、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合できるポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ１はチロシンであり、Ｎ２−Ｎ４はフェニルアラニンである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列はＹＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＦＸ５であって、Ｘ１−Ｘ５はいずれかのアミノ酸である請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がプロリン、Ｘ２，Ｘ４及びＸ５はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンからなる群より選ばれ、Ｘ３はグルタミン又はアスパラギンのいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は、ＹＦＰＧＱＦＡＦＳである請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、ＱＲＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳである請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｎ１及びＮ２は芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｎ３及びＮ４は芳香族アミノ酸であり、Ｘ１−Ｘ５はいずれかのアミノ酸であり、該ポリペプチドはＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｎ１又はＮ２はチロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンからなる群より選ばれる請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｎ３及びＮ４はフェニルアラニンである請求項７又は８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２，Ｘ４及びＸ５はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンからなる群より選ばれ、Ｘ３はグルタミン又はアスパラギンのいずれかである請求項７〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列は、ＬＦＰＧＱＦＡＦＳ、ＩＦＰＧＱＦＡＦＳ、ＦＬＰＧＱＦＡＦＳ、ＹＬＰＧＱＦＡＦＳ、ＹＶＰＧＱＦＡＦＳ及びＹＦＰＧＱＦＡＦＤ−ＣＯＮＨ２である請求項７〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列ＩＤ  Ｎｏ．１２（１４３アミノ酸Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）からなるポリペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列ＩＤ  Ｎｏ．１４（１３７アミノ酸Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）からなるポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、放射性アイソトープ、蛍光団、蛍光の消光剤、酵素、アフィニティタグ及びエピトープタグからなる群より選ばれる団（ｍｏｉｅｔｙ）で標識されている請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかのポリペプチドをコードしている核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５の核酸をコードしている配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
前記発現ベクターがプラスミドＤＮＡ発現ベクターである請求項１６の発現ベクター。
【請求項１８】
前記発現ベクターは、組織特異的、腫瘍選択的プロモータの調節下でコードしている配列を含むアデノウィルスベクターである請求項１６又は１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれかの発現ベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれかのポリペプチドを含む組成物。
【請求項２１】
請求項１５の核酸配列を含む組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドを含む治療用組成物。
【請求項２３】
請求項１５の核酸を含む治療用組成物。
【請求項２４】
医薬調製のための請求項２０〜２３のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２５】
医薬調製のための請求項１６〜１８のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
【請求項２６】
体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用医薬の調製のための請求項２４又は２５の使用。
【請求項２７】
体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用医薬の調製のための請求項２４又は２５の使用。
【請求項２８】
大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び尿生殖に位置する腫瘍、並びにγグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾病、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖及び他の高増殖病からなる群より選ばれる疾病を、治療する医薬の調製のための請求項２４〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
請求項１〜１３のいずれかのポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項３０】
前記抗体は、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎ、又はこれらのアナローグ又はこれらの断片である請求項２９の抗体。
【請求項３１】
前記抗体は、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ、Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ、若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎＲ、又はこれらのアナローグ又は断片が、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲへ結合することを阻害するものである請求項２９の抗体。
【請求項３２】
前記抗体は、モノクローナル抗体である請求項２９〜３２のいずれかに記載の抗体。
【請求項３３】
前記抗体は、ＦＳＫＡＬＰＲＳを含むエピトープに結合するモノクローナル抗体である請求項２９〜３２の抗体。
【請求項３４】
前記抗体は、検出可能な標識、放射活性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識又は治療剤に結合又は共役されている請求項２９〜３３のいずれかに記載の抗体。
【請求項３５】
前記治療剤は、代謝拮抗物質、アルキル化剤、構成物質、増殖因子、サイトカイン、細胞障害剤、毒、又は抗血管新生促進剤である請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとの間の相互作用をモジュレートする薬物を同定する方法であって、
（ａ）前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合させる条件下で、候補モジュレータの存在下又は不在下で、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドへの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの結合を測定し、前記候補モジュレータの不在下での結合に対して、候補モジュレータの存在下で結合が減少しているとき、前記候補モジュレータはＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬物であると同定する工程
を含む方法。
【請求項３７】
サンプル内でのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとの間の相互作用をモジュレートする薬剤の存在を、サンプルン内で検出する方法であって、
（ｃ）前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合させる条件下で、前記サンプルの存在下又は不在下で、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドにＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを接触させる工程；及び
（ｄ）前記サンプルの不在下での結合に対して、前記サンプルの存在下での結合が減少しているとき、前記サンプル内にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤が存在していると同定する工程
を含む方法。
【請求項３８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレータの存在下又は不在下で、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを接触させる工程；及び
（ｂ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定し、前記候補モジュレータ不在下での活性に対して、前記候補モジュレータの存在下での活性が変化しているとき、前記候補モジュレータはＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤であると同定する工程
を含む方法。
【請求項３９】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤の同定方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを候補モジュレータに接触させる工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程；及び
（ｃ）前記候補モジュレーターの存在下で測定された活性を、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドが請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触している反応中に測定された活性と比べて、前記活性に差違があるとき、前記候補モジュレータはＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤であるとの指標とする工程
を含む方法。
【請求項４０】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤の存在を、サンプル内で検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルの存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）前記サンプルの存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程；及び
（ｃ）前記サンプルなしで、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド及び請求項１〜１４のいずれかに記載のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを含む反応中で測定された活性量を、
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、請求項１〜１４のいずれかに記載のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド及び前記サンプルを含む反応中で測定された前記活性と比べ、
前記サンプルの不在下での活性に対して前記サンプルの存在下での前記活性に変化があれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤が前記サンプル中に存在することを示しているとする工程
を含む方法。
【請求項４１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤の存在を、サンプル内で検出する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを前記サンプルと接触させる工程；
（ｂ）前記サンプル存在下で前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程：及び
（ｃ）前記サンプルの存在下で測定された前記活性を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドが請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触している反応内で測定された前記活性と比べて、前記活性に差違があれば、前記サンプルにＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤が含まれている指標としている工程
を含む方法。
【請求項４２】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルを、請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに特異的抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合を標準と比べ、前記標準に対して結合に差違があれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良で特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項４３】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルを、請求項１〜１３のいずれかに特異的なＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに特異的な抗体と工程と接触させる工程；
（ｂ）前記抗体の前記組織サンプルとの結合を検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合を標準と比べ、前記標準に対する結合に差違があれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良で特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項４４】
前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド配列は、配列ＩＤ  Ｎｏ．２若しくは４若しくは６又はこれらの機能的部分である請求項３６〜４３のいずれかの方法。
【請求項４５】
前記接触は、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞内又は細胞上で行なわれる請求項３６〜４１のいずれかの方法。
【請求項４６】
前記接触は、合成リポソーム内又は合成リポソーム上で行なわれる請求項３６〜４１のいずれかの方法。
【請求項４７】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを含む、ウィルス誘導された出芽膜内又は出芽膜上で行なわれる請求項３６〜４１のいずれかの方法。
【請求項４８】
前記方法は、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞からの膜機能を用いて行なわれる請求項３６〜４４のいずれかの方法。
【請求項４９】
前記測定は、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光及び蛍光偏光から選ばれる方法を用いて行なわれる請求項３６〜４４の方法。
【請求項５０】
前記薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体の抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、及び有機低分子からなる群より選ばれる請求項３６〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリング活性を測定する前記工程は、セカンドメッセンジャーのレベル内の変化を検出する工程を含む請求項３８〜４１のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項５２】
シグナリング活性を測定する前記工程は、グアニンヌクレオチド結合又は変換、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、フォスファチジルイノシトールブレークダウン、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、又はレポータ遺伝子発現の測定を含んでいる請求項３８〜４１のいずれかの方法。
【請求項５３】
前記シグナリング活性を測定する工程は、エクオリンに基づくアッセイを用いる工程を含む請求項５２の方法。
【請求項５４】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断方法であって、
（ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
（ｂ）鋳型として核酸を用いて、請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を増幅する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で生産された増幅されたポリヌクレオチドの量を標準と比べ、前記標準に対して増幅されたポリヌクレオチドの量に差違があるとき、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項５５】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
（ｂ）鋳型として核酸を用いて、請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を増幅する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で生産され増幅されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドの配列を標準と比べ、前記標準に対して前記配列に差違があるとき、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項５６】
前記配列比較工程は、ミニ配列決定を含む請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記標準は配列ＩＤ  ＮＯ：７である請求項５５又は５６の方法。
【請求項５８】
量又は配列の前記比較は、マイクロアレイ上で行なわれる請求項５５〜５７のいずれかの方法。
【請求項５９】
前記結合又は活性における前記差違は、前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導された結合又は活性の少なくとも１０％の増加又は減少である請求項３６〜４１の方法。
【請求項６０】
前記結合又は活性における差違は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導された結合又は活性の少なくとも５０％の増加又は減少である請求項３６又は４１の方法。
【請求項６１】
単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドと請求項１〜１４のいずれかの単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとを含む組成物。
【請求項６２】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするためのキットであって、
単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、及びこれらのためのパッケージング材料を含んでいるキット。
【請求項６３】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリング活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするためのキットであって、
請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチド、及びこれらのためのペッケージング材料を含むキット。
【請求項６４】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに含む請求項６３のキット。
【請求項６５】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリング活性をモジュレートする薬剤のためのスクリーニングキットであって、
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞を含み、請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを任意に含む、これらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６６】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、
単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを任意的に含み、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、及びこれらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６７】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、
請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド及びこれらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、
請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞と、これらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６９】
請求項１〜１３のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドのための非ヒトほ乳類のトランスジェニック。
【請求項７０】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体の存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；及び
（ｂ）請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合を測定し、前記抗体不在下での前記結合に対して、前記抗体存在下で前記結合が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する指標であるとする工程
を含む方法。
【請求項７１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、（ａ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲに特異的な抗体の存在又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導されるＣａ２＋の動員を測定し、前記抗体不在下でのＣａ２＋の動員に対して、前記抗体存在下での前記Ｃａ２＋の動員が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する指標であるとする工程
を含む方法。
【請求項７２】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）からの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを請求項１〜１４のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；及び
（ｃ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに対する結合を測定し、前記抗体と接触させない同じＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合に対して、前記結合が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する指標であるとする工程
を含む方法。
【請求項７３】
前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド配列は、配列ＩＤ  ＮＯ．２，４若しくは６、又はこれらの機能的部分で表されるヒト、マウス若しくはラットのＣｈｅｍｅｒｉｎＲである又は含んでいる請求項７０〜７２のいずれかの方法。
【請求項７４】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項７０〜７３のいずれかの方法。
【請求項７５】
前記モノクローナル抗体は、仮の受託番号０４０６１６０１で、２００４年６月１６日にＥＣＡＣＣで寄託された、ＣＨＥＭＲ２３  ５Ｃ  ４Ｃ７と称されるものである請求項７４の方法、又は請求項３２若しくは３３の抗体。
【請求項７６】
前記モノクローナル抗体は、仮の受託番号０４０６１６０２で、２００４年６月１６日にＥＣＡＣＣで寄託された、ＣＨＥＭＲ２３  Ｃ５  １Ｈ２と称されるものである請求項７４の方法、又は請求項２３若しくは３３の抗体。
【請求項７７】
請求項２０〜２３のいずれかの組成物を、細胞に投与する工程を含む、インビトロでの細胞増殖阻害の方法。
【請求項７８】
請求項１６〜１８の発現ベクターを細胞に投与する工程を含む、インビトロでの細胞増殖阻害の方法。
【請求項７９】
請求項７〜１１のいずれかのポリペプチド、又は細胞増殖阻害のための医薬調製のための核酸をコードする核酸を含む治療用組成物の使用。
【請求項８０】
細胞増殖阻害のための医薬調製のための請求項１１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項８１】
前記医薬は体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療を目的とするものである請求項７９又は８０のいずれかの使用。
【請求項８２】
前記医薬は体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療を目的とするものである請求項７９又は８０のいずれかの使用。
【請求項８３】
前記医薬で治療される疾病は、大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び尿生殖に位置する腫瘍、並びに高γグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾患、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖、及び他の高増殖病からなる群より選ばれる請求項７９〜８２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーファンＧタンパク共役型レセプター（ＧＰＣＲ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲに対する天然リガンドの同定と、病気の診断及び免疫治療におけるＣｈｅｍｅｒｉｎＲの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、細胞内へのシグナル伝達を引き受けるタンパク質である。ＧＰＣＲは、通常、７つの膜貫通ドメインを有している。ＧＰＣＲの細胞外部分又はフラグメントにリガンドが結合すると、細胞内でシグナル伝達され、細胞の生物学的若しくは生理学的性質又は細胞挙動における変化をもたらす。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク及び効果器（Ｇタンパクによってモジュレートされた細胞内酵素及びチャネル）と一緒になって、細胞内のセカンドメッセンジャーの状態を細胞外の入力に結びつける基本単位組み合わせ形式のシグナリングシステムの成分である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子及び遺伝子産物は、種々の生理学的プロセスをモジュレートすることができ、病気の原因物質となり得る。ＧＰＣＲは、中枢神経系プロセス及び末梢生理学的プロセスの双方に対して重要らしい。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパクスーパーファミリーは、５つのファミリーで表される：ファミリーＩは、ロードプシンやβ２アドレナリンレセプターによって代表されるレセプターで、現在２００以上の特有のメンバーがあると考えられている；ファミリーＩＩは、副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチンレセプターファミリーである；ファミリーＩＩＩは、代謝共役型グルタミン酸レセプターファミリーであり、ファミリーＩＶは、ＣＡＭＰレセプターファミリーで、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性及び成長に重要である；ファミリーＶには、菌類の交配フェロモンレセプターであるＳＴＥ２などがある。
【０００５】
Ｇタンパクは、グアニンヌクレオチドに結合する、α、β及びγサブユニットからなるヘテロ３量体タンパクのファミリーで表される。これらのタンパクは、通常、シグナル伝達のための細胞表面レセプター（７回膜貫通ドメインを含むレセプター）に結合（ｌｉｎｋ）する。実際、リガンドのＧＰＣＲへの結合の後、ＧＤＰ分子をＧＴＰ分子に変えて、αサブユニットをβγサブユニットから引き離すという立体的変化がＧタンパクに伝えられる。
【０００６】
α、β、γサブユニットのＧＴＰ結合型は、典型的には、効果器モジュレーテイング部分として機能し、（例えばアデニルシクラーゼの活性化による）ｃＡＭＰやジアシルグリセロール又はイノシトールリン酸のようなセカンドメッセンジャーの産生を導く。
【０００７】
２０以上の異なるタイプのαサブユニットが、ヒトでは知られている。これらのαサブユニットは、βサブユニットとγサブユニットからなる小さなたまりに結合している。哺乳類のＧタンパクには、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ及びＧｔが含まれ、Ｌｏｄｉｓｈらの「分子細胞生物学」（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ社、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９５年；及びＤｏｗｎｅｓとＧａｕｔａｍによっても１９９９年「Ｇタンパクサブユニット遺伝子ファミリー」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２：５４４−５２２、）に広範囲に説明されていて、これらの双方の内容が、ここでは参考に組み入れられる。
【０００８】
既知だが特徴づけられていないＧＰＣＲは、現在、薬物の作用及び開発に対する主たるターゲットを構成している。予防的特性及び治療的特性の可能性を有している新しいアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするのに用いられることができる新しいＧタンパク共役型レセプターを同定するために、努力され続けている。
【０００９】
３００以上のＧＰＣＲは、嗅覚レセプターファミリーを除いて、起源をもつためにクローン化された。臨床的に関係あるすべての薬物の約５０〜６０％は、種々のＧＰＣＲの機能を、機械学的にモジュレートすることによって作用している（Ｃｕｄｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７３：５１−６３、１９９５年）。
【００１０】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、また、Ｄｅｚとも称され〔配列ＩＤ  Ｎｏ：１（ヒトポリヌクレオチド配列、図１）；２（ヒトアミノ酸配列、図２）；３（マウスポリヌクレオチド配列、図３）、４（マウスアミノ酸配列、図３）、５（ラットポリヌクレオチド配列、図４）；及び６（ラットアミノ酸配列、図４）〕、ＧＰＲ−１（全長アミノ酸アイデンティティの３８％）、Ｃ３ａレセプター（３８％）、Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター（３６％）及びホルミルＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅレセプター（３５％）に関連するオーファンＧタンパク共役型レセプターとして説明されてきた。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、ケモカインレセプターサブファミリーと、さらに離れた関係にある（Ｍｅｔｈｎｅｒ  Ａ，Ｈｅｒｍｅｙ  Ｇ，Ｓｃｈｉｎｋｅ  Ｂ，Ｈｅｒｍａｎｓ−Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ  Ｉ．（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３３：３３６−４２；Ｓａｍｓｏｎ  Ｍ、Ｅｄｉｎｇｅｒ  ＡＬ、Ｓｔｏｒｄｅｕｒ  Ｐ、Ｒｕｃｋｅｒ  Ｊ、Ｖｅｒｈａｓｓｅｌｔ  Ｖ、Ｓｈａｒｒｏｎ  Ｍ、Ｇｏｖａｅｒｔｓ  Ｃ、Ｍｏｌｌｅｒｅａｕ  Ｃ、Ｖａｓｓａｒｔ  Ｇ、Ｄｏｍｓ  ＲＷ、Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ  Ｍ．（１９９８年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：１６８９−７００）。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ転写物は、ＬＰＳを用いて処理した又は処理されていない、単球由来の樹状細胞及びマクロファージ内に、豊富にあることが見出された。ＣＤ４＋Ｔリンパ球内でも、逆転写ＰＣＲによって、低発現であるが検出されることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験でも、そのレセプターが、発達中の骨組織及び軟骨組織内では際だって発現して、成長の間、弁別的に制御されることを示した。大人の副甲状腺の中でも検出されることができ、リン酸カルシウム（ｐｈｏｓｈｐｏｃａｌｉｃ）代謝内での可能な機能をほのめかす。
【００１１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲをコードする遺伝子は、放射線ハイブリッドマッピングによって、ヒト１２番染色体のｑ２１．２−２１．３領域に割り当てられ、今までのところ、化学誘因物質レセプターのために同定された遺伝子クラスターの外側になる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶウィルス株の範囲によって、可能性あるコレセプター活性に対する融合アッセイの中でテストされた。いくつかのＳＩＶ株（ＳＩＶｍａｃ３１６、ＳＩＶｍａｃ２３９、ＳＩＶｍａｃ１７Ｅ−Ｆｒ及びＳＩＶｓｍ６２Ａ）は、プライマリーＨＩＶ−１株（９２ＵＧ０２４−２）と同様に、コレセプターとして、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを有効に用いた。従って、このレセプターは、ケモカインレセプターファミリーに属しない免疫不全ウィルスのためのコレセプターであるらしい。それは、また、推定上の化学誘因物質レセプターであり、白血球細胞ポピュレーションの補充又は転送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に重要な役割を果たしている。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、マクロファージ及び未熟な樹状細胞におけるその特異的発現によって、免疫応答の開始及び早期の調節に関わり合った特に魅惑的な候補レセプターとして現れる。
【００１２】
ＴＩＧ２（Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ誘導遺伝子２、その後、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ〔配列ＩＤ  Ｎｏ：７（ヒトＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチド配列、図６）；８（ヒトアミノ酸配列、図６）；９（マウスポリヌクレオチド、図７）；及び１０（マウスアミノ酸配列、図７）〕は、ｃＤＮＡとして同定された。このｃＤＮＡの発現は、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）β／γ−選択的抗乾癬合成レチノイドであるｔａｚａｒｏｔｅｎｅ〔ＡＧＮ１９０１６８／エチル６−〔２−（４，４−ジメチルチオクロマン−６−イル）−エチニル〕ニコチン酸塩〕によって、皮膚ラフト培養の処理によってアップレギュレートされる（Ｎａｇｐａｌ  Ｓ，Ｐａｔｅｌ  Ｓ，Ｊａｃｏｂｅ  Ｈ，ＤｉＳｅｐｉｏ  Ｄ，Ｇｈｏｓｎ  Ｃ，Ｍａｌｈｏｔｒａ  Ｍ，Ｔｅｎｇ  Ｍ，Ｄｕｖｉｃ  Ｍ，Ｃｈａｎｄｒａｒａｔｎａ  ＲＡ．（１９９７年）J  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ１０９：９１−５）。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎの発現における、レチノイド媒介アップレギュレーションは、ノザンブロット分析によって確認された。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎは、１７ｐ１３．３に位置づけられる。この位置は、すい臓の腫瘍形成と結びついている領域である。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ  ｃＤＮＡは、８３０ｂｐ長さで、１６３アミノ酸からなる推定上のタンパク生産物をコードしている。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎは、ケラチノサイトとフィブロブラストが組織のような３次元構造を形成するときだけ、培地の中で、ｔａｚａｒｏｔｅｎｅによって発現され、誘導される。ＲＡＲ特異的レチノイドは、またＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのｍＲＮＡレベルを増大することが示された。逆に、ＲＸＲ特異的レチノイド及び１，２５―ジヒドロキシビタミンＤ３のいずれも、これらの細胞内でＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのレベルを増大させなかった。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎは、また、病的でない乾癬皮膚では高レベルで発現されるが、乾癬性疾患では低レベルでしか発現されず、その発現は、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅの局所適用後、乾癬性疾患の中でアップレギュレートされる。更に、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎは、破骨細胞支持基質細胞において、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３及びデキサメタゾンによって劇的にアップレギュレートされるように示されてきた（Ａｄａｍｓ  ＡＥ，Ａｂｕ−Ａｍｅｒ  Ｙ，Ｃｈａｐｐｅｌ  Ｊ，Ｓｔｕｅｃｋｌｅ  Ｓ，Ｒｏｓｓ  ＦＰ，Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ＳＬ，Ｓｕｖａ  ＬＪ．（１９９９年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７４：５８７−９５）。
【００１３】
樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージは、生来免疫及び適応性免疫の双方において役割を果たす、プロフェッショナルな抗原提示細胞である。ＤＣ及びマクロファージは、ケモカインが今までのところ最も大きいグループを構成している因子のうちの、種々の因子によって感染部位及び炎症部位に引き付けられる（Ｃａｕｘ，Ｃら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７３：Ｓ７−Ｓ１１，Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．とＳｔｅｉｎｍａｎ，ＲＭ（２００１年）Ｃｅｌｌ１０６：２５５−２５８）。途方もなく大きな機能的、形態学的及び代謝の多様性が、これらの細胞のポピュレーションの中に存在することが示された。これらの機能的差異の１つは、化学誘因物質レセプターの差動的セットの発現である。化学誘因物質レセプターは、血統、起源、及び成熟段階によれば、特異的細胞サブポピュレーションの選択的補強を担っている（Ｃａｕｘ，Ｃら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７３：Ｓ７−Ｓ１１）。多くの腫瘍タイプは、化学誘因物質因子の直接的又は間接的生産を通してマクロファージ及びＤＣを誘因することが明らかにされた（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，ＬＭ及びＷｅｒｂ，Ｚ（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ４２０：８６０−８６７，Ｖｉｃａｒｉ，ＡＰ及びＣａｕｘ，Ｃ（２００２年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｖ．１３：１４３−１５４）。これらは、ＭＣＰ−１のように、いくつかのＣＣケモカインに含まれる。
【００１４】
ＤＣは、人体全体にわたって位置を決定された、特殊化された抗原提示細胞である。ＤＣは免疫システムの見張りとして機能する。ＤＣは、生来の免疫システムと適応性の免疫システムとの間の本質的リンクに役立ち、一次免疫応答、二次免疫応答の双方を誘導する（Ｐａｌｕｃｋａ，ＫＡとＢａｎｃｈｅｒｅａｕ，（１９９９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１２−２５）。ＤＣは、幼年期の間、ＤＣが抗原を捕捉するところで、血液から組織へ行き交う。そして、ＤＣは、組織を離れて、流れているリンパ器官に移動する。リンパ器官では、成熟なＤＣの中へ隠れて、無垢なＣＤ８＋細胞を活性化することによって、免疫応答を開始させる。ＣＤ８＋は抗原を発現している腫瘍細胞を探し出して、殺す。ケモカインは、ＤＣ補充の調節の重要な効果器であり、損傷部位で解除されるケモカインの勾配に依存して、異なるＤＣポピュレーションが補充されるだろう。結果として生じる免疫応答のタイプは、補充されたＤＣサブポュレーションに依存するらしく、こうして分泌されたケモカインに依存するらしいと期待される（Ｃａｕｘ，Ｃら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７３：Ｓ７−Ｓ１１）。
【００１５】
ＷＯ０３／００６９９６は、ＴＩＧ２、すなわちＣｈｅｍＲ２３Ｇタンパク共役型レセプターの天然リガンド（ＧＰＣＲ）としての、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｅｎｅ−２のポリペプチド生産物の同定に関係する。本発明は、ＣｈｅｍＲ２３に本質的に結合するＴＩＧ２の正確な機能部位を同定することを目的とする。本発明では、ＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３は、それぞれＣｈｅｍｅｒｉｎ、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲと名前が付け直された。
【００１６】
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのリガンドである新規なポリペプチドを提供することを目的とする。同様に、当該ポリペプチドをコードする核酸、それを含む組成物、方法、キット及びそれを利用する使用を提供することを目的とする。
【００１７】
また。本発明は、既知の新規なＣｈｅｍｅｒｉｎＲリガンドの新規な使用を開発することも目的とする。
【発明の開示】
【００１８】
〔発明の要旨〕
ＷＯ０３／００６９９６は、ＴＩＧ２のＣ末端での切断に焦点をあてていて、それにより、ＣｈｅｍＲ２３の結合のために、前記ＴＩＧ２ポリペプチドのＮ末端領域が重要であることを提案している。反対に、本発明は、ＴＩＧ２（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）ポリペプチドの特異的Ｃ末端切断と組合わされる機能的で非特異的なＮ末端（６アミノ酸）の切断の創造を教示している。特に、さらに本発明は、ＴＩＧ２ポリペプチドは、ＴＩＧ２ポリペプチド内で起源的にＣ末端に位置づけられた、９アミノ酸残基程度の小さな機能的ポリペプチド領域にまで減じられ得ることを教示している。前記特異的領域は、ＣｈｅｍＲ２３に対するＴＩＧ２の可能性ある結合部位として、ＷＯ０３／００６９９６で、決して、提案されてこなかった。ＷＯ０３／００６９９６は、ＴＩＧ２のＣ末端で切断された誘導体は、ＣｈｅｍｅＲ２３に結合するように用いられることができることを提案する；ＣｈｅｍＲ２３結合に関してはＴＩＧ２の活性について第１に重要であると本発明で見出された特定領域内での欠損さえも、前記誘導体のいくつかが運搬することを提案する。従って、ＷＯ０３／００６９９６は、９アミノ酸のコアを運搬しているペプチドが、本発明で定義されているように、機能的ＣｈｅｍＲ２３（ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ）レセプターの結合活性を隠すという本発明の発見から引き離すように、当業者を教え導く。
【００１９】
本発明は、アミノ酸配列Ｎ１Ｎ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｎ３Ｘ４Ｎ４Ｘ５を含む５０アミノ酸のポリペプチドに関する。ここで、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３及びＮ４は、芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１−Ｘ５はいずれかのアミノ酸であり、ここでポリペプチドは特異的にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合する。前記ペプチド又はポリペプチドは、好ましくは、９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９、又は５０アミノ酸の長さを有している。
【００２０】
本発明によれば、前記５０アミノ酸までの（ポリ）ペプチドと少なくとも９アミノ酸は、例えば、表４で示された配列のグループから選ばれ得る。
【００２１】
本発明は、また、アミノ酸配列Ｎ１Ｎ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｎ３Ｘ４Ｎ４Ｘ５からなるポリペプチドに関する。ここで、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３及びＮ４は、芳香族アミノ酸で、Ｘ１−Ｘ５は、いずれかのアミノ酸で、ポリペプチドは特異的にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合する。本発明は、また、アミノ酸配列Ｎ１Ｎ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｎ３Ｘ４Ｎ４Ｘ５からなるポリペプチドに関する。ここで、Ｎ１とＮ２は、芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｎ３とＮ４は芳香族アミノ酸であり、Ｘ１−Ｘ５はいずれかのアミノ酸であり、ここではポリペプチドは特異的にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合する。本明細書の説明から、前記Ｎ残基及びＸ残基がいずれの特異的アミノ酸を表し得るかについて、当業者は、誘導することができる。
【００２２】
さらに、本発明は、配列ＩＤ  Ｎｏ．７３又はこの機能的断片によって示されるポリペプチド、少なくともポリペプチドの一つをコードする核酸配列又は前記核酸配列の少なくとも１つを運搬する発現ベクターを含む組成物を、細胞に投与する工程を含む細胞増殖を阻害するインビトロの方法、あるいは増殖を阻害するための使用に関する。
【００２３】
本発明は、また、Ｎ１はチロシンであり、Ｎ２−Ｎ４はフェニルアラニンである上述のようなポリペプチドに関する。
【００２４】
本発明は、さらに、アミノ酸配列がＹＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＦＸ５であり、Ｘ１−Ｘ５はいずれかのアミノ酸である、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００２５】
本発明は、また、Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２，Ｘ４，及びＸ５は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３はグルタミン又はアスパラギンのいずれかである、上述ような（ポリ）ペプチドに関する。
【００２６】
また、本発明は、アミノ酸配列は、ＹＦＰＧＱＦＡＦＳである、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００２７】
本発明は、さらに、アミノ酸配列がＱＲＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳである、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００２８】
本発明は、また、上述のような（ポリ）ペプチドであって、Ｎ１とＮ２は芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｎ３及びＮ４は芳香族アミノ酸であり、Ｘ１−Ｘ５はいずれかのアミノ酸であり、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドに関する。
【００２９】
本発明は、さらに、Ｎ１又はＮ２がチロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンからなる群から選ばれる、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００３０】
本発明は、また、Ｎ３及びＮ４がフェニルアラニンである、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００３１】
本発明は、また、Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンからなる群から選ばれ、Ｘ３はグルタミン又はアスパラギンのいずれかである、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００３２】
本発明は、また、アミノ酸配列がＬＦＰＧＱＦＡＦＳ、ＩＦＰＧＱＦＡＦＳ、ＦＬＰＧＱＦＡＦＳ、ＹＬＰＧＱＦＡＦＳ、ＹＶＰＧＱＦＡＦＳ、及びＹＦＰＧＱＦＡＦＤ−ＣＯＮＨ２からなる群から選ばれる、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００３３】
本発明は、更に、アミノ酸配列、配列ＩＤ  ＮＯ．１２（１４３アミノ酸Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）からなるポリペプチドに関する。
【００３４】
本発明は、さらにアミノ酸配列、配列ＩＤ  ＮＯ．１４（１３７アミノ酸Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）からなるポリペプチドに関する。
【００３５】
本発明は、また、放射性アイソトープ、発蛍光団、蛍光の消光剤、酵素、アフィニティタグ及びエピトープタグからなる群より選ばれる団（ｍｏｉｅｔｙ）で標識されている、上述のような（ポリ）ペプチドに関する。
【００３６】
本発明は、また、上述のような（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列に関する。
【００３７】
本発明によれば、関係ある前記核酸配列は、蛍光標識、アイソトープ標識、酵素標識、化学的標識、電子密度試薬、微粒子標識などを用いて標識されることができる。例えば、好適なアイソトープ標識には、放射能標識、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃが挙げられる。例えば、好適な酵素標識には、グルコースオキシダーゼ、ぺルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。他の好適な標識には、光散乱を有するサイズ粒子を含む。蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、マラカイトグリーン、オレゴングリーン、テキサスレッド、コンゴレッド、シブルグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシＸ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、シアニン染料（例えばＣｙ５、Ｃｙ３）、ＢＯＤＩＰＹ染料（例えばＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、Ａｌｅｘａ５４２など）、緑蛍光タンパク（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）など（例えばモレキュラープローブス社、Ｅｕｇｅｎｅ社、オレゴン州、米国、参照）があり得る。
【００３８】
本発明は、さらに、上述のような核酸のコード配列を含む発現ベクターに関する。
【００３９】
本発明は、また、前記発現ベクターがプラスミドＤＮＡ発現ベクターである、上述のような発現ベクターに関する。
【００４０】
本発明は、また、前記発現ベクターが、組織特異的、腫瘍選択的プロモータのコントロール下でのコード配列を含むアデノウィルスベクターである、上述のような発現ベクターに関する。
【００４１】
本発明は、さらに上述のような発現ベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック動物に関する。
【００４２】
本発明は、また、上述のような（ポリ）ペプチドを含む組成物に関する。
【００４３】
本発明は、また、上述のような（ポリ）ペプチドを含む治療組成物に関する。
【００４４】
本発明は、また、医薬調製のための、上述のような組成物の使用に関する。
【００４５】
本発明は、また、医薬調製のための、上述のような発現ベクターの使用に関する。
【００４６】
本発明は、また、体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用医薬の調製のための上述のような使用に関する。
【００４７】
本発明は、また、体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用医薬の調製のための上述のような使用に関する。
【００４８】
本発明は、また、大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び尿生殖に位置する腫瘍、並びに高γグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾病、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖、及び他の高増殖病からなる群から選ばれる疾病を、治療する医薬の調製のための上述のような使用に関する。
【００４９】
本発明は、また、配列ＩＤ  ＮＯ．７３で表されるポリペプチド又はその機能的断片を含む組成物の使用で、大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び尿生殖に位置する腫瘍；並びに高γグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾患、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖、及びその他の高増殖病からなる群より選択される疾病を治療するための医薬の調製のための使用に関する。用いられようとする機能的ポリペプチド断片は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドになおも特異的に結合する配列ＩＤ  ＮＯ．７３によって示されるポリペプチドのいかなる部分であってもよい。前記機能的断片についての複数の実施例が、本明細書に開示されている。前記医薬は、体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）又は体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療に用いられることができる。本発明によれば、前記ポリペプチドは、細胞増殖を阻害するのに用いられることができる。
【００５０】
前記ポリペプチドだけでなく、前記ポリペプチドをコードする核酸配列及び前記核酸配列を運搬する発現ベクターは、前記疾病を治療するための医薬の調製のために用いられることができる。前記核酸配列でトランスフォームされた宿主細胞も、前記疾病を治療するための医薬調製のために用いられ得る。
【００５１】
本発明は、また、（ポリ）ペプチド選択的に結合する上述のような抗体に関する。
【００５２】
本発明は、また、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎ、又はこれらのアナローグ又は断片の、アゴニスト若しくはアンタゴニストである上述のような抗体に関する。
【００５３】
本発明は、また、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎ、又はこれらのアナローグ又は断片の、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲへの結合を阻害する上述のような抗体に関する。
【００５４】
本発明は、また、モノクローナル抗体である上述のような抗体に関する。
【００５５】
本発明は、また、ＦＳＫＡＬＰＲＳを含むエピトープに結合するモノクローナル抗体である上述のような抗体に関する。
【００５６】
本発明は、また、検出可能な標識、放射活性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、又は治療剤に結合若しくは共役する上述のような抗体に関する。
【００５７】
本発明は、また、前記治療剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、細胞障害剤、毒、抗血管新生促進剤である上述のような抗体に関する。
【００５８】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（ポリ）ペプチドとの間の相互作用をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドが前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合することを許容する条件下で、候補モジュレータの存在下又は不在下で、前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドにＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを接触させる工程；及び
（ｂ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドへの結合を測定し、候補モジュレータの不在下での結合に対して、候補モジュレータの存在下での結合が減少していると、前記候補モジュレータをＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤であると同定する工程を含む方法に関する。
【００５９】
本発明は、また、サンプル中でＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとの間の相互作用をモジュレートする薬剤の存在を、サンプル中で検出する方法であって、
（ａ）上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合することを許容する条件下で、前記サンプルの存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドに接触させる工程；
（ｂ）Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに対する上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの結合を測定し、サンプル不在下での結合に対して、前記サンプル存在下での結合が減少すると、前記サンプルの中に、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤が存在するとする工程を含む方法に関する。
【００６０】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレータの存在下又は不在下で、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；及び
（ｂ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定し、前記候補モジュレータ不在下での活性に対して、前記候補モジュレータ存在下での活性が変化していると、候補モジュレータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤であると同定する工程を含む方法に関する。
【００６１】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを候補モジュレータと接触させる工程；
（ｂ）候補モジュレータの存在下で、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及び
（ｃ）前記候補モジュレータの存在下で測定された前記活性を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドが上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させられる反応で測定された前記活性と比較し、前記活性に差異があれば、前記候補モジュレータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤であるとの指標とする工程を含む方法に関する。
【００６２】
本発明は、また、サンプルの中で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤の存在を検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルの存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させ、
（ｂ）前記サンプルの存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程；及び、
（ｃ）前記サンプルなしで、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド及び上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドを含む反応で測定された前記活性の量を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチド及び前記サンプルを含む反応の中で測定された活性量と比べ、前記サンプルの不在下での活性に対して、前記サンプルの存在下で前記活性が変化していると、前記サンプル中にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤が存在しているとする工程を含む方法に関する。
【００６３】
本発明は、また、サンプル内で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤の存在を検出する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを前記サンプルと接触させる工程；
（ｂ）前記サンプルの存在下で、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程；及び、
（ｃ）前記サンプルの存在下で測定された前記活性を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドが上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（ポリ）ペプチドと接触させられる前記反応の中で測定された活性と比べ、前記活性の差違は、前記サンプル中にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤を含んでいる指標であるとする工程を含む方法に関する。
【００６４】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルを、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドに特異的な抗体と接触させ、
（ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合を標準と比べ、前記標準に対して結合について差異があると、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良で特徴づけられた疾患又は疾病の徴候であるとする工程を含む方法に関する。
【００６５】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
（ａ）組織サンプルを、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドに対して特異的な抗体と接触させ、
（ｂ）前記組織サンプルに対する前記抗体の結合を検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合を標準と比較し、前記標準品に対して結合に差異があれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程を含む方法に関する。
【００６６】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド配列が配列ＩＤ  ＮＯ．２若しくは４若しくは６又はこれらの機能的断片である上述のような方法に関する。
【００６７】
本発明は、また、前記接触が、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞内又は細胞上で行われる上述のような方法に関する。
【００６８】
本発明は、また、前記接触が、合成リポゾーム内又は合成リポゾーム上で行われている（Ｔａｉｊｂら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：６４９−６５４、これはここに参考として組み入れられる）上述のような方法に関する。
【００６９】
本発明は、また、前記接触が、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを含むウィルスに誘導された出芽膜の中又は膜上で行われる（ＷＯ０１０２５５１、２００１年、ここでは参考に組み入れられる）上述の方法に関する。
【００７０】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞からの膜フラクションを用いて行われる上述のように方法に関する。
【００７１】
本発明は、また、前記測定が、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光、及び蛍光偏光からなる群より選ばれる方法を用いて行われる上述のような方法に関する。
【００７２】
本発明は、また、前記薬剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、及び有機低分子からなる群より選ばれる上述のように方法に関する。
【００７３】
本発明は、また、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性の測定工程が、セカンドメッセンジャーのレベルにおける変化の検出を含む上述のように方法に関する。
【００７４】
本発明は、また、シグナル活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチド結合又は交換、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、フォスファチジルイノシトールブレークダウン、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、又はレポータ遺伝子発現の測定を含む上述のような方法に関する。
【００７５】
本発明は、前記シグナル活性の測定がエクオリンに基づくアッセイを用いることを含む上述のような方法に関する。
【００７６】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
ｂ）鋳型として核酸を用いて、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を増幅する工程；
ｃ）工程（ｂ）で生産され増幅されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドの量を標準と比べ、前記標準に対して増幅されたポリヌクレオチドの量に差異があるとき、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程を含む方法に関する。
【００７７】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
ａ）組織サンプルから核酸を単離し、
ｂ）鋳型として前記核酸を用いて、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程；及び
ｃ）工程（ｂ）で生産され増幅されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドの配列を標準と比較し、前記標準に対する前記配列に差異があるときは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程を含む方法に関する。
【００７８】
本発明は、また、前記配列の比較工程はミニ配列決定を含む、上述の方法に関する。
【００７９】
本発明は、また、前記標準が配列ＩＤ  ＮＯ：７である上述のような方法に関する。
【００８０】
本発明は、また、量又は配列の前記比較がマイクロアレイ上で行われる上述の方法に関する。
【００８１】
本発明は、また、結合又は活性における前記差異が、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドによって誘導される結合又は活性の少なくとも１０％の増加又は減少である、上述のような方法に関する。
【００８２】
本発明は、また、結合又は活性における前記差異は、前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドによって誘導される結合又は活性の少なくとも５０％の増加又は減少である、上述のような方法に関する。
【００８３】
本発明は、さらに、単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドと上述のような単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドを含む組成物に関する。
【００８４】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートするスクリーニング薬剤のためのキットであって、単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチド、及びそれらのためのパッケージ材料を含むキットに関する。
【００８５】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするためのキットであって、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、及びこれらのためのパッケージ材料を含むキットに関する。
【００８６】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに含む上述のようなキットに関する。
【００８７】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするためのキットであって、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞、任意に、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、及びこれらのためのパッケージ材料を含むキットに関する。
【００８８】
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、任意には、単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチド、及びこれらのためのパッケージ材料を含むキットに関する。
【００８９】
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、及びこれらのためのパッケージ材料を含むキットに関する。
【００９０】
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断のためのキットであって、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞、及びこれらのためのパッケージ材料を含むキットに関する。
【００９１】
本発明は、上述のように、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードするＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドのための非ヒト哺乳類トランスジェニックに関する。
【００９２】
本発明は、またＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体の存在下又は不在下で、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させる工程；及び
（ｂ）上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合を測定し、前記抗体の不在下における結合に対して、前記抗体の存在下での前記結合の減少は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体の指標とする工程を含む方法に関する。
【００９３】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体の存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させる工程；及び
（ｂ）上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドによって誘導されるＣａ２＋の動員を測定し、抗体の不在下でのＣａ２＋の動員に対する抗体の存在下でのＣａ２＋の動員の減少を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体の指標とする工程を含む方法に関する。
【００９４】
本発明は、また、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを該ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）からのＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させる工程；及び
（ｃ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドへの結合を測定し、前記抗体と接触させないときの同じＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合に対する前記結合の減少は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する前記抗体の指標とする工程を含む方法に関する。
【００９５】
本発明は、また、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド配列が、配列ＩＤ  ＮＯ．２，４，又は６において存在するようなヒト、マウス、又はラットのＣｈｅｍｅｒｉｎＲである、あるいはこれらの機能的部分を含む上述のような方法に関する。
【００９６】
本発明は、また、前記抗体がモノクローナル抗体である上述のような方法に関する。
【００９７】
本発明は、また、前記モノクローナル抗体が、２００４年６月１６日にＥＣＡＣＣにて、仮の受託番号０４０６１６０１で寄託され、ＣＨＥＭＲ２３  ５Ｃ  ４Ｃ７と称されるものである上述のような方法又は抗体に関する。
【００９８】
本発明は、また、前記モノクローナル抗体が、２００４年６月１６日にＥＣＡＣＣにて、仮の受託番号０４０６１６０２で寄託されたＣＨＥＭＲ２３  Ｃ５  １Ｈ２と称されるものである上述の方法又は抗体に関する。
【００９９】
本発明のモノクローナル抗体である、ＣｈｅｍＲ２３  ５Ｃ４Ｃ７（４Ｃ７）及びＣｈｅｍＲ２３  Ｃ５１Ｈ２（１Ｈ２）は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、ソールズベリー、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４  ＯＪＧ、英国）コレクションに、２００４年６月１６日に寄託され、ここに要求することができる。仮の受託番号０４０６１６０１及び０４０６１６０２は、それぞれ４Ｃ７と１Ｈ２に割り当てられた。
【０１００】
本発明は、また、細胞増殖を阻害するインビトロの方法で、細胞に上述のような組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１０１】
本発明は、細胞に、上述のような発現ベクターを投与することを含む、細胞増殖阻害のインビトロの方法にも関する。
【０１０２】
本発明は、上述のような（ポリ）ペプチド又は細胞増殖を阻害するための医薬の調製のための同ポリペプチドをコードする核酸を含む（治療用）組成物の使用にも関する。
【０１０３】
本発明は、また、細胞増殖を阻害する医薬の調製のための上述のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの使用に関する。
【０１０４】
本発明は、また、前記医薬は体外遺伝子治療を目指している、上述のような使用に関する。
【０１０５】
本発明は、また、前記医薬で治療される疾病が、高γグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾患、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖、及び他の高増殖病、並びに大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び尿生殖に位置する腫瘍からなる群より選ばれる疾病である上述の使用に関する。
【０１０６】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプターの活性をモジュレートする薬剤のスクリーニングアッセイの基礎として、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの相互作用の使用に拡張する。
【０１０７】
本発明は、さらにＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを候補モジュレータと接触させる工程；
ｂ）候補モジュレータの存在下でＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程；及び
ｃ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドがそのＥＣ５０で上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させられるサンプル内で測定された活性と、候補モジュレータの存在下で測定された活性と比べ、候補モジュレータの存在下で測定された活性量が、そのＥＣ５０で存在している上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドによって誘導される量の少なくとも５０％であるとき、候補モジュレータは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤と同定される工程を含む方法に拡張する。
【０１０８】
本発明は、さらに、サンプル内で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤の存在を検出する方法であって、
ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをサンプルと接触させる工程；
ｂ）サンプルの存在下でＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナル活性を測定する工程；及び
ｃ）サンプルの存在下で測定された活性を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドがそのＥＣ５０で存在している上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドと接触させられる反応内で測定された活性と比較し、もしサンプルの存在下で測定された活性量がＥＣ５０で存在している上述のようなＣｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドによって誘導される量の少なくとも５０％であるならば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ機能をモジュレートする薬剤が検出されるとする方法に拡張する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、ヌクレオチド（配列ＩＤ  ＮＯ：１）と、本発明の一実施形態のヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ（ＡＣ０７５７４８）の推定上のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施形態のヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１（３７１アミノ酸）（配列ＩＤ  ＮＯ：２）のアミノ酸配列を示す。７つの推定される膜貫通ドメインに下線が引かれている。Ｎ末端においてＮに連結されたグリコシル化（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の共通配列はボールドされ、Ｃ末端のＰＫＣ（Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｒ／Ｋ）によるリン酸化が起こりえる部位はイタリック体で示されている。
【図３】図３は、本発明の一実施形態によるＣｈｅｍｅｒｉｎＲのマウスオルソローグであるマウスＤｅｚのヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：３）と推定アミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）（ＡＣ  ｕ７９５２５）を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１（ＡＣＮＭ＿０２２２１８）のラットオルソローグであるラットのＧタンパク共役型化学誘因物質−１のヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：５）と推定アミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：６）を示す。
【図５】図５は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１のアミノ酸配列と、ＡＴ２、Ｃ３ａ、ｃ５ａ及びｆＭＬＰレセプターの配列と、本発明の一実施形態のＣｌｕｓｔａｌＸアルゴリズムを用いて達成された選ばれたケモカインレセプター配列との間での構造的類似性を示す。配列に関連あるＡＴ２レセプター、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ及びｆＭＬＰレセプター及び他の化学誘因物質を伴ったＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（ＣｈｅｍＲ２３）のアミノ酸配列の列は、ＣｌｕｓｔａｌＸアルゴリズムを用いて達成される。示された樹状図は、ＴｒｅｅＶｉｅｗアルゴリズムを用いて構成された。
【図６】図６は、本発明の一実施形態のヒトＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（ＡＣ  Ｑ９９９６９）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：７）と推定アミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：８）を示す。
【図７】図７は、本発明の一実施形態のマウスＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：９）と推定アミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１０）を示す。
【図８】図８は、本発明の一実施形態のヒトＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１１）と推定アミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１２）を示す。
【図９】図９は、本発明の一実施形態のヒトＣｈｅｍｅｒｉｎのヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１３）と推定アミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１４）を示す。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態のヒト及びマウスのＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのアミノ酸配列のアラインメントを示す。全く同じアミノ酸は控えめに表され、置換部分はボックスで囲まれている。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態のヒト、マウス、ラット、ｓｕｓ、ｂｏｓ及びＧａｌｌｕｓ  Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ配列のアラインメントを示す。図は、リストに挙げられている２つの種にまたがっているアミノ酸アイデンティティのパーセントを提供する。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態の腹水流体からＣｈｅｍｅｒｉｎを精製する第５工程の部分的クロマトグラムを示す。前の工程の活性フラクション（約２８％ＣＨ３ＣＮで溶出されている）は、Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡで６倍希釈され、室温で流速０．１ｍｌ／ｍｉｎで、Ｈ２Ｏ中５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡで、予め平衡化されたＣ１８逆相カラム（１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上に直接ロードされた。０．１％ＴＦＡ中ＣＨ３ＣＮ５−９５％勾配で、２５−４５％の間で０．３％／ｍｉｎの傾きでアプライされた。活性は、４０％ＣＨ３ＣＮで溶出された（黒い水平線によって示されている）。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態のヒトの卵巣の腹水のフラクション化から得られたＨＰＬＣフラクションのプライマリースクリーニングに続くＣｈｅｍｅｒｉｎＲの特異的応答の同定を示す。ヒトの卵巣の腹水のフラクション化後に得られた異なるフラクションは、アッセイバッファーの中で５倍に希釈され、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する細胞系（白丸）又は関係ないレセプターを発現する細胞系（黒三角と黒四角）を用いるエクオリンアッセイでテストされる。各フラクションのために得られた応答は、各フラクションのＡＴＰ応答を用いて規格化され、各細胞系のＡＴＰ応答を用いて規格化された。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎで一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の馴し培地によるＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性化を示す。２９３Ｔ細胞は、ｐＣＤＮＡ３−Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（ＴＩＧ２）で一時的にトランスフェクト又はｐＣＤＮＡ３だけでトランスフェクト（ｍｏｃｋトランスフェクト）された。トランスフェクションの４日後に集められた上清の容量の増加は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現するＣＨＯ細胞でのエクオリンに基づくアッセイの中でＭｉｃｒｏｌｕｍａｔを用いて分析された。アッセイは３回行われ、ＳＤは指標とされる。代表的実験が示される。
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態のフローサイトメトリーによってＣｈｅｍｅｒｉｎＲに対して向けられる抗体の特徴づけを示す。２／３組変えＣｈｅｍｅｒｉｎＲ  ＣＨＯ細胞と１／３組変えＨＣＲ  ＣＨＯ細胞（ネガティブコントロール）で作り上げられた組み換え細胞の混合物は、抗ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ５Ｃ１Ｈ２モノクローナル抗体の上清（太線）又は未知の抗体活性を有する上清（細線、グレー塗りつぶし）のいずれかと反応するように曝露された。標識された抗マウスＩｇＦＩＴＣで染色した後、これらの調製物は、フローサイトメトリーによって分析された。結果は、与えられた蛍光（ＦＬ１−Ｈ軸）を発現するたくさんの細胞（イベント軸）のヒストグラムとして表示される。モノクローナル５Ｃ１Ｈ２は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ組換体の細胞サブポピュレーションを、両タイプの細胞の相対割合によって明示されるようなネガティブコントロール細胞から区別するようにした。アッセイのバックグラウンド蛍光は、第２染色（グレーぬりつぶし）によって与えられる。
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態の切断されたヒトＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのポリペプチド（配列ＩＤ  ＮＯ：７３）とポリヌクレオチド（配列ＩＤ  ＮＯ：７２）を示す。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態の切断されたヒトＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（切断されたｈＴＩＧ２）によるＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性化のためのＥＣ５０を示す。
【図１８】図１８は、本発明の一実施形態のｈＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ  ｍＲＮＡの組織分布を示す。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲ  ｍＲＮＡの組織分布を示す。
【図２０】図２０ａは、本発明の一実施形態のヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ−１９ペプチドからＣ末端に伸長された又は切断されたヒトポリペプチドを示す。図２０ｂは、本発明の一実施形態のマウスＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを示す。
【図２１】図２１は、本発明の一実施形態のヒト炎症性流体からのヒトＣｈｅｍｅｒｉｎの単離を示す。ヒト炎症性流体からのＣｈｅｍｅＲ２３レセプターの天然リガンドの精製。Ａ：ヒト腹水流体の最初の工程ＨＰＬＣフラクション化（Ｐｏｒｏｓカラム）。ＣｈｅｍｅＲ２３における吸収（ＡＵ）と生物学的活性（エクオリンに基づくアッセイでの発光、ＡＴＰ応答に規格化された、黒いバー）が示される。Ｂ：第３工程（カチオン交換カラム）。Ｃ：第４工程（Ｃ１８カラム）。Ｄ：活性化合物の最終工程の精製（Ｃ１８カラム）。Ｘ軸は、関心ある領域をフォーカスするように拡大する。
【図２２】図２２Ａ及びＢは、本発明の一実施形態のマススペクトロメータスペクトルからの主たるピークのフラクションと配列を示す。図２２Ｃは、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド配列アラインメントを示す。ＣｈｅｍｅｒｉｎレセプターであるＣｈｅｍＲ２３の天然リガンドであるとのＣｈｅｍｅｒｉｎの同定。Ａ：トリプシン消化後Ｍａｌｄｉ  Ｑ−ＴＯＦマススペクトロメータ上の活性フラクションのモノ放射性同位体ペプチドマスフィンガープリンティング。Ｂ：トリプシン消化後のＭａｌｄｉ  Ｑ−ＴＯＦマススペクトロメータスペクトルの選ばれた主ピークに相当する配列。ペプチド１−７は、ＴＩＧ−２遺伝子産物（Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）から誘導されたトリプシンペプチドに相当し、一方、ペプチド８は、トリプシンペプチドではなく、精製されたタンパクのＣ末端に相当する。このペプチドの位置は、この配列内に与えられる。ピーク３，５，７及び８のペプチドの配列は、マイクロ配列決定によって確認された。Ｃ：ヒトアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：８）とマウス（受託番号：ＡＫ００２２９８、配列ＩＤ  ＮＯ：１０）Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ、及びヒトｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ＦＡＬＬ３９（配列ＩＤ  ＮＯ：５１）前駆体。ヒトＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎと比べられるようなアミノ酸アイデンティティは枠で囲まれる。シグナルペプチド（マウスＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ用に予測された）は、ボールドされた下方の枠の文字であり、システインはボールドされている。切断されたＣ末端ペプチドは、ボールドされたイタリック体で、アンダーラインが付されている（マウスＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ用のアナロジーによって予測された）。イントロンの位置（コドン間の配列をコードする遺伝子を妨害する）は矢印の矢によって示されている。
【図２３】図２３は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎレセプターの薬学。Ａは、本発明の一実施形態により、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で発現され、ＨＰＬＣによって精製されたヒト組換体ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのＳＤＳ／ＰＡＧＥを示す。ゲルは銀染色され、主バンドは１８ｋＤａのタンパクに相当する。マススペクトロメトリー分析は、この生物学的に活性なタンパクにおけるＣ末端側の６個のアミノ酸の切断を示す。図２３Ｂ−Ｆは、ヒト組換体Ｃｈｅｍｅｒｉｎの機能的分析を示す。Ｂ：生物学的図、エクオリン分析を用いたヒト組換えＣｈｅｍｅｒｉｎ（黒丸）及びＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（白丸）のＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性。Ｃ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ  Ｃ末端から誘導されたヨウ素化されたペプチドをトレーサとして用いた結合アッセイ比較。比較は、非標識ペプチド（白四角）又はヒト組換えＣｈｅｍｅｒｉｎ（黒四角）と行われる。Ｄ：ＣＨＯ／ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ細胞の膜を用いたＧＴＰ〔３５Ｓ〕結合アッセイにおけるヒトＣｈｅｍｅｒｉｎの濃度アクション曲線である。Ｅ：ヒト組換えＣｈｅｍｅｒｉｎによる２分間の刺激に続いて、ＣＨＯ／ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ細胞内でリン酸化されたＥＲＫ１／２の免疫検出。Ｆ：ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ１０ｎＭによる刺激後のＥＲＫ１／ＥＲＫ２活性化の機構。各実験は、少なくとも３回繰り返された。
【図２４】図２４Ａ−Ｆは、本発明の一実施形態のヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ及びそのレセプターの発現と組織分布。Ａ：ハムスターＣＨＯ−Ｋ１細胞からの馴らし培地内でのヒト組換えＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（１００ｎＭ）の変換。変換速度は、同モル量の精製された処理されたＣｈｅｍｅｒｉｎの変換速度と比較することによって評価された。Ｂ及びＣ：ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（Ｂ）とＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（Ｃ）をコードする転写物は、ヒト組織と細胞ポピュレーションのセットにおける定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された。ＰＭＢＣ：末梢血の単核細胞、ｉＤＣ；未熟樹状細胞、Ｄ及びＥ：ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの発現は、ＬＰＳ（Ｄ）又はＣＤ４０Ｌ（Ｅ）による刺激後、１Ｈ２モノクローナル抗体（ＩｇＧ２Ａ）を用いて、未熟樹状細胞（実線）及び成熟樹状細胞（灰色エリア）においてＦＡＣＳにより分析された。コントロールの標識（点線）は、同じアイソタイプの抗体を用いて作られた。Ｆ：マクロファージ上でのＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現は、ＩＨ２モノクローナル抗体（太い実線）と４Ｃ７モノクローナル抗体（細い実線）を用いてモニタされた。コントロールの標識（点線）は、同じアイソタイプの抗体を用いて作成された。
【図２５】図２５Ａ−Ｄは、本発明の一実施形態のエクオリンアッセイにおいてのように、切断されたＣｈｅｍｅｒｉｎペプチドの生物学的活性を示す。Ａ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎの生物学的活性とＣｈｅｍｅＲ２３上のＣ末端ペプチド。エクオリンに基づく細胞内Ｃａ２＋放出アッセイ（エクオリンアッセイ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系で発現されたヒトＣｈｅｍＲ２３上での、ヒト組み換えＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ、ヒト組換え処理されたＣｈｅｍｅｒｉｎ、ＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端側の２５アミノ酸のペプチド、処理されたＣｈｅｍｅｒｉｎの相当するＣ末端側の１９アミノ酸のペプチド。Ｂ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ生物学的活性におけるＣ末端切断の影響。エクオリンに基づくベースの細胞内Ｃａ２＋放出アッセイ（エクオリンアッセイ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系で発現されたヒトＣＨＥＭR２３上で、処理されたＣｈｅｍｅｒｉｎ（ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ−１９）のＣ末端と比べて、Ｃ末端側に伸長された又は切断されたペプチドの生物学的活性。Ｃ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ誘導されたペプチドの生物学的活性におけるＮ末端切断の影響。エクオリンに基づく細胞内Ｃａ２＋放出アッセイ（エクオリンアッセイ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系で発現されたヒトＣｈｅｍＲ２３上で、ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ−１９と比べての、Ｎ末端切断されたペプチドの生物学的活性。D：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−９ペプチドのアラニンスキャン。エクオリンに基づく細胞内Ｃａ２＋放出アッセイ（エクオリンアッセイ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系で発現されたヒトＣｈｅｍＲ２３上でほとんど十分な活性を表す短い方のＣ末端ペプチド（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−９）のａｌａ−スキャンを表すペプチドの生物学的活性。
【図２６】図２６Ａ−Ｈは、本発明の一実施形態のプライマリ細胞におけるＣｈｅｍｅｒｉｎ生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の生物学的活性を示す。Ａ：４Ｃ７抗ＣｈｅｍｅｒｉｎＲモノクローナル抗体によるＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の機能的応答の阻害（エクオリンアッセイ）。細胞は、１０ｎＭ組換えＣｈｅｍｅｒｉｎによる刺激の前に種々の量の４Ｃ７抗体を用いて、室温で３０分間プレインキュベートされた。データは、抗体不在下（１００％）及びアゴニスト不在下（０％）での応答に従って規格化された。Ｂ：組換えＣｈｅｍｅｒｉｎによるヒト未熟樹状細胞の化学走性。結果は、平均値±ｓ．ｄ（ｎ＝３）のように表される、３人のドナーの代表例である。Ｃ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ誘導された（１０ｐＭ）樹状細胞移動は、細胞を百日咳毒素（３μｇ／ｍｌ）で前処理することによって阻害され、また４Ｃ７モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加えて細胞をプレインキュベーションすることによっても阻害された。チェッカーボード分析は、樹状細胞上でのＣｈｅｍｅｒｉｎの化学走性の影響対化学動力学の影響を調査する。ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ（１０ｐＭ）は、化学走性デバイスの下方及び／又は上方のチャンバーに添加された。ケモカインＲＡＮＴＥＳ（１０ｎＭ）が、実験におけるポジティブコントロールとして用いられた。Ｄ：組換Ｃｈｅｍｅｒｉｎ（３０ｎＭ、矢）に応答した単球誘導樹状細胞中のＣａ２＋フラックス。Ｅ：４Ｃ７モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに細胞を３０分間プレインキュベーションした後の同じ実験。Ｆ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ誘導されたマクロファージの移動（１０ｐＭ及び１００ｐＭ）と百日咳毒（３μｇ／ｍｌ）での前処理及び４Ｃ７モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）によるマクロファージ移動の阻害。チェッカーボード分析は、マクロファージへのＣｈｅｍｅｒｉｎの化学走性の影響対化学動力学的影響を調べる。Ｇ：組換えＣｈｅｍｅｒｉｎに応答するマクロファージにおけるＣａ２＋フラックス（３０ｎＭ、矢印）。Ｈ：細胞を４Ｃ７モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに３０分間プレインキュベーションした後の同じ実験。
【図２７】図２７は、本発明の一実施形態のインビボでのマウスＣｈｅｍｅｒｉｎの抗腫瘍活性を示す。Ａ−Ｃ：ＢｒｄＵ組み入れとヨウ化プロピジウム染色後のＧ１期、Ｇ２期及びＳ期における細胞ポピュレーションの割合の評価。コントロール（Ａ）とＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ発現Ｂ１６／Ｆ０（Ｂ）細胞のＦＡＣＳ分析、及びＳ期の細胞割合（Ｃ）。Ｄ：マウスＣｈｅｍｅｒｉｎを発現（黒四角）又は発現しない（白四角）Ｂ１６／Ｆ０細胞の移植後のマウスにおける腫瘍サイズの評価。データは、各グループにおいてｎ＝１１の平均±ｓ．ｅ．ｍを示し、独立的に類似の結果を達成した３つの実験の代表例である。：ｐ＜０．０５、＊：ｐ＜０．０１、ペアでない非パラメータのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテスト。Ｅ及びＦ：移植して１８日後、コントロール（Ｅ）及びＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ発現腫瘍（Ｆ）のクリオセクション（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）のヘマトキシリエオジン染色。
【図２８】図２８は、本発明の一実施態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおけるＬＦＰＧＱＦＡＦＳの生物学的活性を示す。
【図２９】図２９は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおけるＩＦＰＧＱＦＡＦＳの生物学的活性を示す。
【図３０】図３０は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおけるＦＬＰＧＱＦＡＦＳの生物学的活性を示す。
【図３１】図３１は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおけるＹＬＰＧＱＦＡＦＳの生物学的活性を示す。
【図３２】図３２は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおけるＹＶＰＧＱＦＡＦＳの生物学的活性を示す。
【図３３】図３３は、本発明の一実施形態のＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおけるＹＦＰＧＱＦＡＦＤ−ＣＯＮＨ２の生物学的活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１０】
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドがＣｈｅｍｅｒｉｎＲの天然リガンドであること、及びＣｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎＲとの間の相互作用が抗疾病免疫応答を誘導するという発見に関する。この相互作用は、相互作用とそれゆえのＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能をモジュレートする薬剤のスクリーニングアッセイに有用である。ＣｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎＲとの間の相互作用は、また、調節不良となったレセプター活性を伴う状態の診断を提供する。本発明は、また、疾病又は疾患の治療のための治療上のアプローチを提供する。
【０１１１】
〔定義〕
便宜のため、本発明明細書、実施例、並びに添付されたクレームで用いられるある用語及びフレーズの意味を以下に与える。
【０１１２】
用語「ポリペプチド」は、モノマーがアミノ酸でペプチド結合又はジスルフィド結合で一緒に繋げられたポリマーをいう。これはまた、全長天然に生じるアミノ酸配列又は長さが約８アミノ酸から５００アミノ酸までの間にある断片をいう。従って、天然でないアミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、及びホモアルギニンが含まれていてもよい。遺伝子でコードされていない共通に見出されるアミノ酸は、また、本発明で使われ得る。本発明で用いられるすべてのアミノ酸は、Ｄ又はＬ光学異性体のいずれであってもよい。Ｌ−異性体が好ましい。用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」が本発明では相互置換可能に用いられる。
【０１１３】
ここで用いられるように、用語「ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド」は、２つの本質的特性を有するポリペプチドをいう：１）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは少なくとも７０％アミノ酸アイデンティティを有し、好ましくは８０％、９０％、９５％またはそれ以上、１００％アミノ酸アイデンティティである配列ＩＤ  ＮＯ：２まで含み；及び２）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性を有する。すなわちこのＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドはＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又はその機能的断片と結合する。最適には、「ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド」も、ここで定義されるように、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナル活性を有する。
【０１１４】
用語「Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド」は、配列ＩＤ  ＮＯ：１４、配列ＩＤ  ＮＯ：７３、配列ＩＤ  ＮＯ：６１及び配列ＩＤ  ＮＯ９２〜９７からなる群より選ばれるポリペプチドと、少なくとも３０％又はそれ以上のアイデンティティを有するポリペプチドをいい、定義されたポリペプチドは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合し、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリング活性を活性化する。好ましくは、このポリペプチドは、配列ＩＤ  ＮＯ：１４、配列ＩＤ  ＮＯ：７３、配列ＩＤ  ＮＯ：６１及び配列ＩＤ  ＮＯ９２〜９７からなる群より選ばれるポリペプチドと、少なくとも５０％又はそれ以上高いアイデンティティを有する。好ましくは、このＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、配列ＩＤ  ＮＯ：１４、配列ＩＤ  ＮＯ：７３、配列ＩＤ  ＮＯ：６１及び配列ＩＤ  ＮＯ．９２〜９７からなる群より選ばれるポリペプチドと、少なくとも６０％又は７０％又は８０％又は８５％又はそれ以上高いアイデンティティを有する。用語「特異的に結合する」は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが、ＥＣ50、ＩＣ50又は１００ｎＭ以下のＫｄを有することを意味する。「Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド」は、また、前述の定義に合うポリペプチド断片をいい、ここで断片は、少なくとも５０％の結合活性を保持し、配列ＩＤ  ＮＯ：１４の全長ポリペプチドのシグナリング活性のレベルを保持している。Ｃｈｅｍｅｒｉｎは、また、アナローグ、バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）、又は図８、１６，２０ａ及び２０ｂに描かれているように、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合するＣｈｅｍｅｒｉｎ（配列ＩＤ  ＮＯ１４）のＣ末端からいくつかの短いポリペプチドを含む。結果として生じるポリペプチドが配列ＩＤ  ＮＯ：１４で表される全長ポリペプチドの少なくとも５０％の結合活性とシグナリング活性のレベルを保持する限り、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、配列ＩＤ  ＮＯ１４に対して、付加、挿入、欠失、又は置換を含むことができる。ある実施形態では、「Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド」は、さらに図１６（図１６に示されているヌクレオチド配列は、切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードし、配列ＩＤ  ＮＯ：７２である）に示される配列ＩＤ  ＮＯ：７３の切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ配列に拡張する。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲへの結合及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリング活性の活性化に必要な配列に加えて、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、切断されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドも含めて、例えば、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ融合タンパクのような付加的配列を含むことができる。融合パートナーの実施例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク、アルカリフォスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例えば、６×又はより大きなＨｉｓ）又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）があり、これらに限定されない。
【０１１５】
用語「核酸配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡのようなポリヌクレオチドをいう。この用語は、また、一重ラセン又は二重ラセンポリヌクレオチドを含むべきである。この用語は、また、ヌクレオチドアナローグから作成されるＲＮＡ又はＤＮＡいずれかのアナローグ、アナローグのようなもの、説明されている形態に適用可能なように、一重（センス又はアンチセンス）及び二重ラセンポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ＥＳＴｓ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡは、核酸といわれ得るような分子の代表例である。
【０１１６】
ここで用いられる用語「Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチド」は、ここで定義するように、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその相補体をいう。一実施形態では、「Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチド」は、図１７に示すポリヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４９）のように、切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド（例えば、図１７に示すような切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１１７】
ここで用いられているように、用語「ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリヌクレオチド」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はここで定義されるようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドアナローグ若しくはバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）をいう。
【０１１８】
「疎水性アミノ酸」に関しては、まさに疎水性アミノ酸（Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、又はＣｙｓ（Ｃ））；（Ａｌａ（Ａ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、又はＧｌｙ（Ｇ）のような）より少ない疎水性又は送り出されない（ｉｎｄｅｆｅｒｅｎｔ）アミノ酸又は部分的に疎水性であるアミノ酸（Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ））を意味する。
【０１１９】
「芳香族アミノ酸」に関しては、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）又はＴｒｐ（Ｗ））を意味する。
【０１２０】
ここで用いられるように、用語「標準」は、Ｇタンパク共役型レセプター（すなわちＣｈｅｍｅｒｉｎＲ）活性の調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患によって影響されていない個体から採取されたサンプルをいう。「標準」は、レセプターのｍＲＮＡレベル又はポリペプチドのレベル及び質（すなわち変異種ｖｓ野生型）の比較のための参考として用いられる。同様に、Ｇタンパク共役型レセプター活性の比較のための参考としても用いられる。「標準」は、また、核酸の配列又はコードされたポリペプチドと比較される参照配列、例えば配列ＩＤ  ＮＯ：１に拡張する。
【０１２１】
ここで用いられるように、用語「調節不良」は、サンプルにおいて、ａ）１以上のＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、リガンド、又はｍＲＮＡレベルの量における１０％以上の増加又は減少が、与えられたアッセイにおいて、ここで定義されるように、標準に対して測定されたり、あるいは；ｂ）配列をコードするＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおける少なくとも１シングル塩基対の変化が、配列ＩＤ  ＮＯ：１に対して検出され、その結果、パラグラフａ），ｃ）又はｄ）で定義されるＣｈｅｍｅｒｉｎＲリガンド結合又はシグナル活性に変更を生じたり、あるいは；ｃ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲリガンドの結合活性の量の１０％以上の増加又は減少が、与えられたアッセイにおいて、ここで定義されるように、標準に対して測定されたり、あるいはｄ）ここで定義されるように、セカンドメッセンジャーにおける１０％以上の増加又は減少が、与えられたアッセイにおいて、ここで定義されるように、標準に対して測定されたりする、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのシグナル活性をいう。
【０１２２】
用語「発現ベクター」は、連結されている遺伝子の発現を指図できる核酸構成をいう。この構成は、さらに調節配列を含み、調節配列は、例えば、遺伝子に実施可能に連結されたプロモータを含む。一般に、組換え技術において有用なものである発現ベクターは、しばしば、円形二重ラセンＤＮＡループを一般的ににいう「プラスミド」の形であり、ベクターフォームにおいては染色体に結合されていない。
【０１２３】
用語「プラスミドＤＮＡ発現ベクター」は、一般に、ベクターフォームにおいて染色体に結合されておらず、且つそれがリンクされている核酸の自律複製及び／又は発現できる、円形二重ラセンＤＮＡループをいう。
【０１２４】
用語「アデノウィルス発現ベクター」は、ヒトアデノウィルスセロタイプ５から誘導される発現ベクターをいい、自己複製能力を欠くが、細胞の中へ遺伝子を送ることができる、細胞内側で遺伝子の自律複製及び／又は遺伝子を発現できる。
【０１２５】
用語「組成物」は、１以上の分子からなる化合物、好ましくはタンパク又はタンパクをコードする核酸又はこれらの混合物から作製される化合物をいう。組成物は、天然に生じているもの、組換え技術又は当業者に知られた他の合成手段によって誘導されることができる。
【０１２６】
用語「治療的組成物」は、細胞内へデリバリーされる組成物をいい、細胞を修正するように、又は基礎となる分子の欠損を補償するように、又は細胞の疾病状態若しくは症候群を妨げるように作用する組成物をいう。
【０１２７】
用語「抗体」は、従来のイムノグロブリン分子をいい、同様に、主題のポリペプチドの一つと特異的にも反応するイムノグロブリン分子の断片をいう。抗体は、従来技術及び抗体全体に対して説明するのと同様の方法で有用性のためにスクリーニングされた断片を用いて断片化されることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は、ペプシンを用いて抗体を処理することによって生成されることができる。結果として生じるＦ（ａｂ）２断片は処理されて、ジスルフィド架橋を減らして、Ｆａｂ断片を生産する。本発明の抗体は、さらに、二重特異性、単一鎖、並びに、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって授与されたポリペプチドのためのアフィニティを有するキメラ及びヒト化分子を含むことを意図する。好ましい態様では、抗体は、さらに、抗体につけられた標識及び検出できる標識（その標識は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、又は酵素コファクター）を含む。
【０１２８】
用語「モノクローナル抗体」は、１つのタイプの抗原だけを認識する抗体をいう。このタイプの抗体は、シングル抗体産生ハイブリドーマの娘細胞によって生産される。
【０１２９】
用語「トランスジェニック動物」は、動物の１以上の細胞が、当該分野でよく知られているトランスジェニック技術によるようなヒトの仲介により導入されたヘテロ接合体核酸を含んでいるいずれかの動物、好ましくは非ヒトほ乳類、鳥類、魚類、両生類をいう。この核酸は、マイクロインジェクション又は組換えウィルスでの感染によってのような、人為的な遺伝的操作による、細胞の前駆体の中への導入により、直接又は非直接的に、細胞の中に導入される。用語遺伝的操作は、古典的交差繁殖又はインビトロの受精を含まないが、どちらかといえば、組換えＤＮＡ分子の導入に向けられる。この組換えＤＮＡ分子は、染色体内で集積されてもよいし、あるいは染色体外で複製しているＤＮＡであってもよい。ここで説明された典型的なトランスジェニック動物において、トランスジーンは、細胞に、主題ポリペプチドの１つの組換え型、例えば、アゴニスト型又はアンタゴニスト型のいずれかを発現させる。しかしながら、組換え遺伝子がサイレントなトランスジェニック動物も、例えば、下記に説明されるようなＦＬＰ又はＣＲＥ組換え酵素依存構成物として、期待されている。さらに、「トランスジェニック動物」は、また、組換え及びアンチセンス技術の双方を含むヒトの介在によって１以上の遺伝子の遺伝子破壊がもたらされるこれらの組換え動物も含む。
【０１３０】
用語「治療的に有効な量」とは、意味のある患者に利益、すなわち、治療、治癒、関連ある医療状態の予防又は改善を示すのに十分な、またはそのような状態の治療、治癒、予防若しくは改善速度の増大を示すのに十分な、薬学的組成物の各活性成分の総量又は方法をいう。個々の活性な成分に適用されるとき、単独で投与されるとき、この用語は、成分単独の量をいう。組合わせて適用されるとき、この用語は、組み合わせ、連続的に、又は同時に投与されるいずれかであっても、治療効果になる活性成分の組合わせられた量をいう。一般に、組成物は、単一投与量で、１００μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１μｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重範囲で、投与されるだろう。この投与量は、日単位で、週単位で、月単位で、年単位で又は治療する医師によってふさわしいと思われるように繰り返される。
【０１３１】
ここで用いられるように、用語「ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドによる、Ｃｈｅｍｅｒｉｎペプチド又はその機能的断片へ特異的に結合することをいう。
【０１３２】
ここで用いられるように、用語「ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナル活性」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドによるシグナル伝達の開始又は伝達をいう。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリング活性は、下記の１つ以上のアッセイによるシグナリングカスケードにおいて検出可能な工程を測定することによってモニタされる。
ＧタンパクにおけるＧＴＰ交換のためのＧＤＰの刺激；
アデニレートシクラーゼ活性の代替；
プロテインキナーゼＣモジュレーション；
フォスファチジルイノシトールブレークダウン（セカンドメッセンジャージアシルグリセロール及びイノシトール３リン酸の生成）；
細胞内カルシウムフラックス；
ＭＡＰキナーゼの活性化；
チロシンキナーゼのモジュレーション；
又は遺伝子若しくはレポータ遺伝子活性のモジュレーション。
もし測定可能な活性が、ここで下記に説明されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性アッセイのいずれかに対して、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが実質的に不在の場合に設定される基底ラインの１０％以上又は以下に変更されるならば、シグナリングカスケードにおける検出可能なステップは、開始又は媒介されると考えられる。測定可能な活性は、例えば、ｃＡＭＰレベルまたはジアシルグリセロールレベルの測定においてのように、直接的に測定されることができる。あるいは、測定可能な活性が、例えば、レポーター遺伝子アッセイにおいてのように、非直接的に測定されることができる。
【０１３３】
ここで用いられている用語「検出可能なステップ」は、例えば、セカンドメッセンジャーの測定又はモデファイされた（例えばリン酸化された）タンパク質の検出によって直接的に、あるいは、例えば、そのステップのダウンストリームの影響をモニターすることによって間接的にのいずれかで測定されることができるステップをいう。例えば、アデニレートシクラーゼの活性化は、結果的にｃＡＭＰを生成する。アデニレートシクラーゼの活性は、例えば、アッセイにおけるｃＡＭＰの生産をモニタするアッセイによって直接的に、あるいはｃＡＭＰの活性レベルの測定によって間接的に測定されることができる。
【０１３４】
ここで用いられるように、用語「単離された」は、同じでない特性を有する汚染されている分子が５０％（重量％）未満、好ましくは４０％未満及び最も好ましくは２％以下の組成物、分子、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチドのポピュレーションをいう。用語「単離された」が、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに適用されるとき、具体的には脂質膜に結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）又は埋め込まれた（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに拡張されることを意味する。
【０１３５】
ここで用いられるように、用語「候補化合物」及び「候補モジュレータ」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合するリガンドをモジュレートする能力又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性をモジュレートする能力を評価される組成物をいう。候補モジュレーターは、動物細胞、植物細胞、バクテリア細胞、かび類細胞の抽出物、及び同様にこれらの細胞からのならし培地に含まれる、例えば低分子、化合物を含む天然又は合成化合物であることができる。
【０１３６】
ここで用いられるように、用語「低分子」は、３０００ダルトン未満の分子質量を有する化合物、好ましくは２０００未満又は１５００未満、より好ましくは１０００未満、最も好ましくは６００ダルトン未満の化合物をいう。「有機低分子」は、炭素を含む低分子である。
【０１３７】
ここで用いられるように、用語「結合における変化」又は「活性における変化」及び等価的用語「結合における差違」又は「活性における差違」は、結合における又は与えられたアッセイでのシグナル活性における少なくとも１０％の増加又は減少をいう。
【０１３８】
ここで用いられるように、用語「ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣｈｅｍｅｒｉｎＲへの結合を許容する条件」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎがＣｈｅｍｅｒｉｎＲに結合している下での条件、例えば温度、塩濃度、ｐＨ及びタンパク濃度をいう。正確な結合条件は、アッセイの特性、例えば、生存できる細胞か又は細胞の膜フラクションを、アッセイが使用するかということに依存して変わるだろう。しかしながら、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは細胞表面タンパクなので、またＣｈｅｍｅｒｉｎは細胞表面のＣｈｅｍｅｒｉｎＲと相互作用する分泌されたポリペプチドであるので、好ましい条件は、一般に、生理学的塩（９０ｍＭ）及びｐＨ（約７．０から８．０）を含む。結合温度は、１５℃〜３７℃まで変化することができ、多分室温から約３０℃までの間が好ましい。結合反応におけるＣｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの濃度も変わるが、好ましくは０．１ｐＭ（例えば濃度は一般にＫｄ以下である、放射性標識されたトレーサＣｈｅｍｅｒｉｎとの反応において）から１μＭ（例えば競合相手としてのＣｈｅｍｅｒｉｎ）であろう。実施例のように、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現細胞、及び精製され、組換えられた、標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを用いた結合アッセイのためには、結合は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２と０．５％ＢＳＡフリー脂肪酸からなる結合バッファー２５０μｌ中、２７℃で２５０００細胞、及び０．１ｎＭ標識されたＣｈｅｍｅｒｉｎ、１００ｎＭ冷Ｃｈｅｍｅｒｉｎを用いて行なわれる。
【０１３９】
ここで用いられるように、用語「サンプル」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリング活性をモジュレートする薬剤の存在のためにテストされる分子のソースをいう。サンプルは、環境的サンプルでもよいし、動物、植物酵母、又はバクテリア細胞若しくは組織、臨床的サンプル、合成サンプル、又は組換え細胞若しくは発酵プロセスからのならし培地であってもよい。用語「組織サンプル」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする核酸、又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのリガンド結合若しくの活性をモデファイする薬剤の存在、存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、品質若しくは活性ためにテストされる組織をいう。
【０１４０】
ここで用いられるように、「組織」は、有機体における特定機能を達成する細胞の塊である。ここで用いられるような用語「組織」は、特定の生理学的領域からの細胞物質をいう。特定組織における細胞は、種々の異なる細胞タイプを含むことができる。細胞の限定しない例としては、毛細血管の内皮細胞及び血液細胞と同様に、さらにニューロン細胞及びグリアル細胞を含み、与えられた組織切片又はサンプルの中に含まれているすべてを含む脳組織であろう。固体組織にくわえて、用語「組織」は、また、血液のような非固体組織に拡張することを意図される。
【０１４１】
ここで用いられるように、用語「膜フラクション」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを含む細胞脂質膜の調製物をいう。ここで用いられる用語のように、「膜フラクション」は、膜に結合していない細胞の構成成分の少なくとも一部分（すなわち、少なくとも１０％及び好ましくはこれ以上）が除去されたホモジェネートにおいて、細胞のホモジェネートから区別されている。用語「膜に結合した（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」は、脂質膜の中に集積された、あるいは脂質膜の中へ集積された成分と物理学的に結合されているかのいずれかである、これらの細胞構成成分をいう。
【０１４２】
ここで用いられるように、用語「結合の減少」は、ここで説明されるような結合アッセイで測定されるようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のアゴニストの結合における少なくとも１０％の減少をいう。
【０１４３】
ここで用いられるように、用語「セカンドメッセンジャー」は、Ｇタンパク共役型レセプターの活性化によって生成された又は濃度が変化するようになった分子であって、そのＧＰＣＲからのシグナルの形質導入に参与する分子をいう。セカンドメッセジャーの例には、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、及び細胞内カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。用語「セカンドメッセンジャーのレベルの変化」は、候補モジュレータの不在下で行なわれるアッセイで検出される量に対して与えられたセカンドメッセジャーの検出レベルの少なくとも１０％の増加又は減少をいう。
【０１４４】
ここで用いられるように、用語「エクオリンに基づくアッセイ」は、活性化されたＧＰＣＲによって誘導される細胞内カルシウムフラックスを測定するＧＰＣＲ活性のためのアッセイで、細胞内カルシウムフラックスは細胞内で発現されるエクオリンの発光によって測定される。
【０１４５】
ここで用いられるように、用語「結合」は、レセプター（例えばＣｈｅｍｅｒｉｎＲ）とリガンド（例えばＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド）の物理的結合をいう。ここで用いられる用語のように、もし、ＥＣ５０又は１００ｎＭ以下のＫｄで、一般に１００ｎＭから１０ｐＭで起るならば、その結合は「特異的」である。例えば、もし、ＥＣ５０又はＫｄが、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、又は１０ｐＭ以下であるならば、結合は特異的である。
【０１４６】
ここで用いられるように、用語「ＥＣ５０」は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のリガンドの結合、及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲの機能的活性などの与えられた活性が、同じアッセイを用いて測定できるＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のための最大値の５０％である薬剤の濃度をいう。言い換えると、「ＥＣ５０」は、１００％活性化が、より多くのアゴニストの添加を伴って増加しない活性量でセットされるときの、５０％活性化を与える薬剤の濃度である。「ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのＥＣ５０」は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのアイデンティティとともに変化することに留意されるべきである。例えば変異種Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド（すなわち挿入、欠失、置換又は他のペプチドとの融合を含むポリペプチドで、上述のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの定義を満足するヒト及びヒトのバリアント以外の種からのＣｈｅｍｅｒｉｎ分子を含む）は、野生型Ｃｈｅｍｅｒｉｎより高い又は低い又は同じＥＣ５０値を有することができる。従って、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲバリアント配列は、配列ＩＤ  ＮＯ：８の野生型Ｃｈｅｍｅｒｉｎとは異なり、当業者は、従来の方法にしたがって、そのバリアントのためにＥＣ５０を決めることができる。与えられたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのＥＣ５０は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ応答が飽和又は最大になるまで、少なくとも増加するＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの投与の存在下でＣｈｅｍｅｒｉｎＲの固定量の活性のためのアッセイを行ない、そして、測定されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性をＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの濃度に対してプロットすることによって測定される。
【０１４７】
ここで用いられるように、用語「ＩＣ５０」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプターの最大活性化を５０％まで減じさせるアンタゴニスト又は逆アゴニストの濃度である。
【０１４８】
ここで用いられるように、用語「検出可能に標識された」は、容易に検出されることができる官能基（標識）を組み入れる構造的修飾を有する分子、例えば、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のＣｈｅｍｅｒｉｎＲリガンドのような分子の特性をいう。検出可能な標識には、蛍光化合物、同位体化合物、化学発光化合物、量子ドット標識、ビオチン、酵素、電子密度試薬、又は抗血清若しくはモノクローナル抗体が有効なハプテン若しくはタンパクが挙げられるが、これらに限定されない。検出の種々の手段は、分光器的、光化学的、放射化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
ここで用いられるように、用語「アフィニティタグ」は、関心ある分子（例えばＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のＣｈｅｍｅｒｉｎＲリガンド）にとりつけられた標識をい、その標識は、標識された化合物に、標識を結合させる試薬によって特異的に結合させられる能力を付与する。アフィニティタグには、抗体のためのエピトープ（「エピトープタグ」として知られている）、ビオチン、６ＸＨｉｓ、及びＧＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティタグは、標識された種の精製のためと同様に、検出のために用いられることができる。
【０１５０】
ここで用いられるように、用語「結合の減少」は、既知または疑わしいモジュレータに不足しているアッセイにおいて検出される結合に対して、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの既知の又は疑わしいモジュレータを用いる与えられたアッセイで検出される量の少なくとも１０％の減少をいう。
【０１５１】
ここで用いられるように、薬品又は薬剤に関連して用いられるときの用語「デリバリーング（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」は、アッセイ混合物又は培地内の細胞に薬品又は薬剤を添加することを意味する。またその用語は、動物への薬品又は薬剤の投与もいう。このような投与は、例えば、注射（例えば滅菌生理食塩水又は滅菌水のような好適なキャリア）又は吸入によって、または経口、経皮、肛門、膣、又は薬品投与の他の共通ルートによって行なわれることができる。
【０１５２】
ここで用いられるように、用語「有効量」は、ここで定義されるようなＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性に変化をもたらす（すなわちＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性の少なくとも１０％の増加又は減少）薬品またはＣｈｅｍｅｒｉｎＲモジュレーティング剤の量である。
【０１５３】
ここで用いられるように、核酸配列に適用されるときの用語「増幅」は、核酸配列の１以上の核酸配列のコピーが、鋳型核酸から生成されることによるプロセスをいう。「増幅」の好ましい「方法」は、ＰＣＲ又はＲＴ／ＰＣＲである。
【０１５４】
ここで用いられるように、用語「実質的不在」は、ここで開示された又は当該分野で既知の与えられたアッセイによって測定される少なくとも１０％、ＧＰＣＲ機能を活性化又は阻害するのに必要なレベル未満である活性化因子又は阻害因子のレベルをいう。
【０１５５】
ここで用いられるように、「Ｇタンパク共役型レセプター」又は「ＧＰＣＲ」は、７回αヘリカル膜貫通ドメインと膜結合しているポリペプチドをいう。機能的ＧＰＣＲは、リガンド又はアゴニストと結合し、またＧタンパクと結合してＧタンパクを活性化する。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、ＧＰＣＲである。
【０１５６】
ここで用いられるように、用語「ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤」は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性を増大又は減少する分子又は化合物であり、これには、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のアゴニストの結合を変化させる化合物、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲダウンストリームのシグナリング活性を変化させる化合物がある。
【０１５７】
ここで用いられるように、用語「ヌル突然変異」は、ポリペプチドが発現しないように、ポリペプチドをコードする染色体配列をモデファイする挿入、欠失又は置換をいう。
【０１５８】
Ｉ．ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性をモジュレートする薬剤の同定のためのアッセイ
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性をモジュレートする薬剤は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎとレセプターの相互作用を利用するたくさんの方法で同定されることができる。例えば、インビトロで培養された細胞上又はインビボのいずれかでＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｃｈｅｍｅｒｉｎ結合を再構成する能力は、結合を邪魔する薬剤の同定のための標的を提供する。結合の妨害に基づくアッセイは、そのような分子のライブラリー又はコレクションから、有機低分子のような薬剤を同定することができる。その代りに、そのようなアッセイは、サンプル内で、又は植物、カビ類、又はバクテリア抽出物又はヒト組織サンプルの中でさえ（例えば腫瘍組織）も、天然ソースからのサンプル又は抽出物中で薬剤を同定することができる。ある見解では、その抽出物は、核酸、ペプチド又はポリペプチドのバリアントのライブラリー、例えば、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド自身のバリアントを含むライブラリーを発現する細胞から作られることが出来る。そして、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｃｈｅｍｅｒｉｎ結合のモジュレータは、レセプターを通じてのダウンストリームシグナリングを測定する結合アッセイ又は機能的アッセイを用いてスクリーニングされることができる。結合アッセイ及び機能的アッセイの双方が、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを用いて有効になる。
【０１５９】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用をもっと直接的に用いて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ機能をモジュレートする薬剤を同定する他アプローチは、候補薬剤又は候補モジュレータによって誘導されるＣｈｅｍｅｒｉｎＲダウンストリームシグナリングにおける変化を測定する。これらの機能的アッセイは、又は単離された細胞膜フラクション内又は表面にレセプターを発現している細胞上で行なわれる。
【０１６０】
〔Ａ．ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及びＣｈｅｍｅｒｉｎの相互作用を用いるアッセイは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのソースを要求する。ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、ここでは配列ＩＤ  ＮＯ：１と２のように、提出されている。ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリヌクレオチド配列は、またＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１４８３８で入手でき、Ｓａｍｓｏｎら、１９９８年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１６８９−１７００で報告されており、これは、ここでは、参考として組み入れられる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド配列は、また、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースにおける受託番号Ｏ７５７４８とＣＡＡ７５１１２で記録されている。関係ある配列は、ＣＭＫＲＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００６８６４とＮＭ００４０７２（ヌクレオチド配列）及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ９９７８８（ポリペプチド配列））、ヒトＤＥＺｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７９５２７（ヌクレオチド配列））、ヒトＤＥＺａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７９５２６（ヌクレオチド配列）、マウスＤＥＺ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７９５２５（ヌクレオチド配列））及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ９７４６８（ポリペプチド配列））、及びラットＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００２７４５（ヌクレオチド配列）及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｏ３５７８６（ポリペプチド配列）。
【０１６１】
当業者は、既知の配列からデザインされたプライマー又はプローブを用いる基本的ＰＣＲ及び分子クローニング技術を通じて、タンパクをコードするｍＲＮＡを含有するサンプルから、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ配列を容易に増幅できる。
【０１６２】
組換えポリペプチドの発現は、当該分野でよく知られている。当業者は、有核細胞又は原核細胞において、本発明によれば有用なＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの発現のための発現コントロール配列とベクターを容易に選択することができる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、結合又はシグナル機能を有するために、細胞膜又は合成リポゾームのような界面活性剤と結合されなければならない。細胞膜フラクションの調製のための方法は、当該分野でよく知られていて、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄ＆Ｃｏｈｎ、１９７５年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６４：４６１−４７９により報告された方法があり、これは参考としてここに組み入れられる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを含む膜を生産するために、ひとつ必要なことは、このような技術を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを組換え的に又は内因的に発現する細胞に適用するだけである。その代りに、膜フリーＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、ポリペプチドの界面活性剤溶液の希釈によって、膜調製物の中へ集積されることができる（例えばＳａｌａｍｉｎら、１９９６年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１：２８３−２９４を参照、これはここで参考に組み入れられる）。
【０１６３】
〔Ｂ．Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド〕
本発明は、全長活性型及び切断されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを含むＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに関する。１６３アミノ酸全長Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、不活性型のような細胞内で最初に生産される（図６）。Ｃｈｅｍｅｒｉｎのこの不活性型は、以下の２工程によってＣｈｅｍｅｒｉｎ（１３７アミノ酸）の活性型へ変換される。この２工程とは、ａ）Ｎ末端の２０アミノ酸を除去（この型は、Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎとよばれる１４３アミノ酸、図８）；ｂ）Ｃ末端での６アミノ酸を除去（１３７アミノ酸、図９）。好ましくは、Ｃ末端が切断されたヒトＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが、図１６、８及び２０ａ（ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ−９，−１０，−１１，−１２，−１３，−１９）に、それぞれ示される。本発明のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、天然Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、又は合成Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、好ましくは組換えＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドであってもよい。本発明のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、また、そのポリペプチド配列が天然に生じる配列とは異なるが、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと同じ機能又は活性を実質的に保持しているアナローグ又はバリアントに拡張し得る。
【０１６４】
全長ヒト不活性なＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、ここでは、それぞれ配列ＩＤ  ＮＯ：７，８で示される（図６）。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ配列は、またＧｅｎＢａｎｋから入手される（例えば、ヒトポリヌクレオチド配列は、受託番号ＸＭ００４７６５、Ｕ７７５９４、ＮＭ００２８８９、ヒトポリペプチド配列は、受託番号Ｑ９９９６９、ＢＡＡ７６４９９、ＡＡＢ４７９７５、ＮＰ００２８８０、及びＸＰ００４７６５；Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓポリヌクレオチド配列には、受託番号ＢＧ７１３７０４、ＢＧ７１３６６０；マウスポリヌクレオチド配列にはＢＦ０２０２７３、ＡＷ１１３６４１及びｂｆ０１８０００があり；ラットポリヌクレオチド配列には、ＡＷ９１５１０４；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａポリヌクレオチド配列にはＢＦ０７８９７８及びＢＦ１３０９２（重複しているＥＳＴｓ、ＢＦ７１３０９２におけるＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ配列の最後の７アミノ酸）；及びＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓポリヌクレオチド配列にはＢＧ６９１１３２がある）。Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ配列のアラインメントは、図１１に示されている。
【０１６５】
本発明は、またＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明の核酸配列は、また、フレームにおいて本発明のポリペプチド精製のためのマーカー配列に融合されているコード配列を含んでもよい。本発明の核酸配列は、組換え技術によって本発明のポリペプチドを生産するために採用されてもよい。本発明の核酸配列は、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、又はウィルスＤＮＡベクターなどのような発現ベクターのどのひとつにも含まれることができ、全てのベクターは、当該分野でよく知られている。
【０１６６】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを用いてのように、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドは、増幅ソースであるプライマー又はプローブとしての公知配列を用いた分子クローニング技術、及び標準ＰＣＲを通じてクローン化されることができる。同様に、クローン化されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドは、公知技術としての有核細胞又は原核細胞内で発現されることができる。非限定的実施例として、Ｃｈｅｍｅｒｉｎは、宿主細胞における発現のためのｐＣＤＮＡ３（インビトロジェン社）のような、受け入れられるほ乳類の発現ベクターの中へクローン化されてもよい。酵母内での発現のためのＣｈｅｍｅｒｉｎ発現構成物は、実施例４で説明される。
【０１６７】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎは、また、インビトロでの転写及び翻訳を通じて、インビトロで発現されることができる。さらに、もし、与えられたアッセイ又は技術に対して望むならば、本発明の有用なＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが、融合タンパク又はタグ化されたタンパクとして生産されることができる。例えば、全長Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又はその一部のいずれか（すなわち、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸以上、全長Ｃｈｅｍｅｒｉｎよりも１アミノ酸少ないまで）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、分泌されたアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、又は６Ｘ−Ｈｉｓペプチドに融合されて、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの精製又は検出を容易にすることができる。タグ化された又は融合タンパクの生産のための方法及びベクターは、そのように融合された又はタグ化されたタンパクのように単離及び検出の方法として、当該分野でよく知られている。
【０１６８】
組換えＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、精製型で用いられることができる。代替として、Ｃｈｅｍｅｒｉｎトランスフェクトされた細胞からのならし培地が用いられることができる。本発明の与えられた結合又は機能的アッセイにおいて必要なＣｈｅｍｅｒｉｎの量は、アッセイに依存して変化するが、アッセイ毎に、１ｐＭ〜１ｎＭの標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎ及び１０ｐＭ〜１μＭの非標識ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを一般に使用するだろう。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのためのタグ化されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのアフィニティとＥＣ５０は、全長野生型のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのＥＣ５０に比例して変化し、したがって、与えられたアッセイに必要な量は、野生型の値に比例して調節されることができる。もし、与えられたアッセイに必要ならば、Ｃｈｅｍｅｒｉｎは、合成の間の培地内で、放射性標識されたアミノ酸、例えば３５Ｓ−Ｍｅｔ、１４Ｃ−Ｌｅｕ、トリチウムＨ３又はふさわいしいその他のものの組み入れによって標識されることができる。１２５Ｉで標識する化学的方法は、当該分野で公知である。蛍光標識は、また、標準標識技術を用いるＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のＣｈｅｍｅｒｉｎＲリガンドにつけられる。
【０１６９】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、また、疾病又は疾患の治療のために採用されてもよい。例えば、患者からの細胞は、生体外でポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とともに、そのとき設計された細胞が、ポリペプチドで治療される患者に提供されるように設計されてもよい。そのような方法は、当該分野でよく知られている。同様に、細胞は、生体内でのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で知られた処理によって、生体内で設計されてもよい。そのような方法による本発明のポリペプチドを投与するための、これら及び他の方法は、本発明の教示から当業者に明白であるべきである。例えば、生体内での細胞設計のための発現ベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、又は非ウィルスベクターであってもよい。
【０１７０】
〔Ｃ．ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレータを同定するアッセイ〕
Ｃｈｅｍｅｒｉｎが、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプターのリガンドであるという発見は、スクリーニングアッセイにアゴニスト、アンタゴニスト、及びレセプター活性の逆アゴニストを同定させる。このスクリーニングアッセイは、２つの一般的アプローチを有するだろう。
【０１７１】
１）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する細胞、そのような細胞からの膜抽出物、又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲを含む免疫化された脂質膜は、標識されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド及び候補化合物にさらされる。培養後、反応混合物は標識ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプターへの特異的結合について測定される。標識ポリペプチドを妨げる化合物又は標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを置換する化合物は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のアゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストであることができる。機能的分析は、ポジティブ化合物上で行なわれ、これらのカテゴリのいずれに化合物がフィットするのかを決定することができる。
【０１７２】
２）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのシグナル活性が測定される機能的アッセイ
ａ）アゴニストスクリーニングのために、細胞発現ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はそれらから調製された膜は、候補化合物とともに培養され、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのシグナル活性が測定される。そのアッセイは、アゴニストとしてＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを用いて有効化され、レセプター活性をモジュレートする化合物によって誘導される活性が、Ｃｈｅｍｅｒｉｎによって誘導される活性と比較される。アゴニスト又は部分的アゴニストは、アゴニスト又は部分的アゴニストが１０μＭ以下で存在するとき、野生型ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎの最大活性の少なくとも１０％に相当する最大生物学的活性を有していて、好ましくは野生型ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎよりも５０％、７５％、２倍、５倍、１０倍以上といった１００％以上の活性を有するだろう。
【０１７３】
ｂ）アンタゴニスト又は逆アゴニストスクリーニングのために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する細胞又はこれらから分離された膜は、候補化合物とともに又は伴わずに、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの存在下でのシグナル活性について分析される。アンタゴニスト又は逆アゴニストは、アンタゴニスト又は逆アゴニストを不足する反応に対して、少なくとも１０％まで、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ刺激されたレセプター活性のレベルを減少させる。
【０１７４】
ｃ）逆アゴニストスクリーニングのために、構成的なＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性を発現する細胞又はこれらから分離された膜が、候補化合物の存在下及び不在下でのレセプターの活性を測定する機能的アッセイで用いられる。逆アゴニストは、少なくとも１０％レセプターの構成的活性を減少させるこれらの化合物である。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの過剰発現（すなわち生体内でマクロファージ内で自然に発現されるレベルに対して５倍以上高く過剰にＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現）は、構成活性化に導くであろう。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、強い構成プロモータ、例えばＣＭＶ初期プロモータの制御下で、それを置くことによって過剰発現されることができる。その代りに、保存されたＧＰＣＲアミノ酸又はアミノ酸ドメインのある変異は、構成活性に導く傾向にある。例えばＫｊｅｌｓｂｅｒｇら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０；ＭｃＷｈｉｎｎｅｙら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２０８７；Ｒｅｎら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６４８３；Ｓａｍａｍａら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４６２５；Ｐａｒｍａら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ３６５：６４９；Ｐａｒｍａら、１９９８年、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８６：８５；及びＰａｒｅｎｔら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７９４９参照。
〔リガンド結合及び置換アッセイ：〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣｈｅｍｅｒｉｎＲへの結合を阻害する化合物のスクリーニングのために、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと一緒に、細胞上で発現されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、又はレセプターポリペプチドを含む単離された膜を使用することができる。結合又はＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド置換だけを測定するアッセイにおいて同定されるとき、化合物は、これらがアゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用するかどうかを決定する機能的テストを受けなければならないだろう。
【０１７５】
置換実験のために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞（一般にアッセイあたり又は膜抽出物１〜１００μｇあたり２５０００細胞）が、増大しつつある濃度の候補モジュレータの存在下又は不在下で、結合バッファー（例えば、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）脂肪酸フリー；及び０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）内で、（例えば２５℃で）１．５時間、標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとともに培養される。このアッセイを有効化し調整するために、濃度が増大しつつある非標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを用いた制御競合反応を行なうことができる。培養後、細胞は広範囲にわたって洗浄され、結合された標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎが、与えられた標識にふさわしい方法で測定される（例えば、シンチレーションカウンティング、酵素アッセイ、蛍光など）。候補モジュレータの存在下で結合された標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド量の少なくとも１０％の減少は、候補モジュレータによる結合の置換を指示する。もし、１０μＭ以下の濃度で（すなわちＥＣ５０が１０μＭ以下である）これらが標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎの５０％を置換するならば（サブ飽和しているＣｈｅｍｅｒｉｎ投与）、候補モジュレータは、ここで説明されたこのアッセイ又は他のアッセイにおいて、特異的に結合すると思われる。
【０１７６】
あるいは、結合又は結合の置換は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニタされることができる。水相からのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが、センサ上の膜内に固定化されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合することによって又は結合を喪失することによって引き起こされる、固定化されたセンサ近くでの質量変化によって、２分子間の結合を測定する定量的方法として、表面プラズモン共鳴アッセイは用いられることができる。この質量変化は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は候補モジュレータの注射又は除去後の時間に対する共鳴ユニットとして測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて測定される。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、Ｓａｌａｍｏｎらによって説明された方法（Ｓａｌａｍｏｎら、１９９６年、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．７１：２８３−２９４；Ｓａｌａｍｏｎら、２００１年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８０：１５５７−１５６７；Ｓａｌａｍｏｎら、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：２１３−２１９、これらはそれぞれここに参照として組み入れられる）の薄層脂肪膜内のセンサチップ（例えばリサーチグレードＣＭ５チップ；Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）上で固定化されることができる。Ｓａｒｒｉｏらは、ＳＰＲが、チップ上の脂質層内に固定化されたＧＰＣＲ  Ａ（１）アデノシンレセプターに結合しているリガンドを検出するのに用いられることができる（Ｓａｒｒｉｏら、２０００年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５１６４−５１７４、ここに参照として組み入れられる）。ＳＰＲアッセイにおけるＣｈｅｍｅｒｉｎＲへのＣｈｅｍｅｒｉｎの結合のための条件は、開始点として、Ｓａｒｒｉｏらによって報告された条件を用いて、当業者によって、微調整されることができる。
【０１７７】
ＳＰＲは、少なくとも２つの手法において、結合のモジュレータのために分析できる。第１に、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、固定化されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドにプレ結合されることができ、続いて流速約１０μｌ／ｍｉｎで１ｎＭから１００μＭ、好ましくは約１μＭの範囲の濃度で、候補モジュレータを注入する。結合されたＣｈｅｍｅｒｉｎの置換は定量されることができ、モジュレータ結合を検出させることができる。あるいは、膜に結合したＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、候補モジュレータとともにプレインキュベートし、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとともに要求することがある。モジュレータに予め曝露されなかったチップ上でのＣｈｅｍｅｒｉｎの結合に対して、モジュレータに曝されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲへのＣｈｅｍｅｒｉｎの結合と相違しているとき、結合を証明するだろう。いずれかのアッセイにおいて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲとＣｈｅｍｅｒｉｎの相互作用を候補モジュレータが阻害することを示す候補モジュレータの不在下でのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの量に対して、候補モジュレータ存在下では、結合されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド量が１０％以上減少している。
【０１７８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのＣｈｅｍｅｒｉｎＲへの結合の阻害を測定する他の方法は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を使用する。もし、蛍光ドナー（Ｄ）の放射スペクトルが蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルとオーバーラップするならば、ＦＲＥＴは、互いにきわめて接近（通常＜１００Ａの離隔）した蛍光ドナー（Ｄ）と蛍光アクセプター（Ａ）との間におこる量子物理的現象である。テストされる分子は、例えば、ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドが、ドナーとアクセプターの発蛍光団の相補対で標識される。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用によって一緒に接近して結合している間、ドナーの発蛍光団の励起で放射された蛍光が、ポリペプチドが結合されないときその励起波長に応答して放射される波長と異なる波長を有するだろう、そして、各波長での放射密度の測定によって、結合されていないポリペプチドに対する結合されたポリペプチドの量を提供する。発蛍光団のドナー：アクセプター対を用いてポリペプチドを標識することは、当該分野でよく知られている。特定の興味は、シアンＦＰ（ＣＦＰ、ドナー（Ｄ））とイエローＦＰ（ＹＦＰ、アクセプター（Ａ））として知られているＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰのバリアントである。ＧＦＰバリアントは、結合対のそれぞれのメンバーとの融合タンパクとして作られ、ＦＲＥＴスキームにおけるＤ−Ａ対としてサーブし、タンパク−タンパク相互作用を測定することができる。ＧＦＰバリアントの発現のためのベクターは、融合として当該分野でよく知られている。実施例として、ＣＦＰ−Ｃｈｅｍｅｒｉｎ融合とＹＦＰ−ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ融合が作られることができる。候補モジュレータを標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎタンパクと標識ＣｈｅｍｅｒｉｎＲタンパクの混合物に添加すると、例えば、候補モジュレータなしのサンプルに対してＹＦＰ蛍光における減少によって証明されるエネルギートランスファーの阻害をもたらすだろう。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用の検出のためにＦＲＥＴを用いるアッセイにおいて、候補モジュレータなしのサンプルに対して、候補モジュレータを含むサンプルにおけるアクセプター波長での蛍光発光密度の１０％以上の減少は、候補モジュレータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用を阻害することを示す。
【０１７９】
ＦＲＥＴ上での多様性は、分子相互作用をモニタする蛍光消光を用いる。相互作用しているペアの分子の一方は発蛍光団で標識されることができ、他方は、その近くに並置されるように持って来られたときに発蛍光団の蛍光を消光する分子で標識されることができる。励起上での蛍光の変化は、発蛍光団：消光団ペアでタグ化された分子の結合における変化の指標となる。一般に、標識されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの蛍光における増加は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドが有する消光団が置換されたことの指標となる。消光アッセイとしては、候補モジュレータなしのサンプルに対して、候補モジュレータを含むサンプルでの蛍光放射密度の１０％以上の増加は、候補モジュレーターがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用を阻害することを示す。
【０１８０】
表面プラズモン共鳴とＦＲＥＴ方法に加えて、蛍光分極測定は、タンパク−タンパク結合の定量に有用である。蛍光的にタグ化された分子のための蛍光分極化値は、回転の相互関係時間又は転動速度に依存する。蛍光的に標識されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと結合するＣｈｅｍｅｒｉｎＲによって形成された複合体のようなタンパク複合体は、複合化されていない、標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎよりも高い分極値を有する。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用の候補モジュレーターが含まれている場合、もし、候補インヒビターがＣｈｅｍｅｒｉｎとのＣｈｅｍｅｒｉｎＲの相互作用を妨害又は阻害するならば、候補インヒビターなしの混合物に対して、蛍光分極における減少をもたらす。蛍光分極は、ポリペプチド又はタンパク複合体の形成を妨害する低分子の同定に好適である。候補モジュレータを欠いたサンプルでの蛍光分極に対して、候補モジュレーターを含むサンプルにおける蛍光分極での１０％以上の減少は、候補モジュレータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用を阻害することを示す。
【０１８１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ相互作用をモニタする他の代替物は、バイオセンサアッセイを用いる。ＩＣＳバイオセンサは、ＡＭＢＲＩ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｍｂｒｉ．ｃｏｍ．ａｕ／）によって説明されてきた。この技術では、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲとＣｈｅｍｅｒｉｎのような巨大分子の会合体は、懸濁された（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ）膜２層の中でのグラミシジンで促進されたイオンチャネルに接近し、そうして、バイオセンサのアドミッタンス（妨害（ｉｍｐｅｄｅｎｃｅ）に類似）における測定可能な変化に共役される。このアプローチは、直線的に６オーダーを越える大きさのアドミッタンス変化で、低分子のコンビナトリアルライブラリーの大規模で高速のスループットスクリーニングに理想的に適している。候補モジュレータの欠いているサンプルのアドミッタンスに対して、候補モジュレータを含むサンプルのアドミッタンスにおける１０％以上の変化（増加又は減少）は、候補モジュレータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲとＣｈｅｍｅｒｉｎの相互作用を阻害することを示す。
【０１８２】
タンパク−タンパク相互作用のアッセイにおいて、相互作用のモジュレータが物理的に相互作用するタンパクのドメインと直接的に相互作用することを必ずしも必要としない可能性があることに留意することは重要である。また、モジュレータは、タンパク−タンパク相互作用部位から除去された位置で相互作用し、例えばＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドにおける構造的変化を引き起こす可能性がある。このように作動するモジュレータ（阻害剤又はアゴニスト）は、それにもかかわらず、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性をモジュレートする薬剤として興味深い。
【０１８３】
ここで説明されたどの結合アッセイも、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの非Ｃｈｅｍｅｒｉｎリガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニストなど）、例えばここで説明されるように同定された低分子を用いて達成されることができると理解されるべきである。実際には、低分子リガンド又は他の非Ｃｈｅｍｅｒｉｎリガンドの使用は、非ポリペプチド化学的化合物が一般にＣｈｅｍｅｒｉｎのようなポリペプチドよりも安価で容易に精製型で生産されるという利益を有している。このようにして、非Ｃｈｅｍｅｒｉｎリガンドは、全長Ｃｈｅｍｅｒｉｎよりも、アゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストの同定のためのハイスループットアッセイにより好適である。しかしながら、このようなアッセイが、非Ｃｈｅｍｅｒｉｎリガンドの最初の同定に好適であるように、この有利さは、決して、Ｃｈｅｍｅｒｉｎを用いるアッセイの重要性を浸食しない。
【０１８４】
説明されたどの結合アッセイも、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプター分子に結合するサンプル又はＣｈｅｍｅｒｉｎのレセプターへの結合に影響するサンプル、例えば組織サンプルなどのサンプル内に薬剤が存在することを決定するのに用いられることができる。そうすると、サンプルの存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドはＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又は他のリガンドと反応させられ、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又はリガンドの結合は、好適使用の結合アッセイで測定される。Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又は他のリガンドとの結合が１０％以上減少していると、レセプターポリペプチドに結合しているＣｈｅｍｅｒｉｎ又はリガンドをモジュレートする薬剤を、サンプルが含んでいることを示す。
【０１８５】
レセプター活性の機能的アッセイ
ｉ．ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合アッセイ
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのようなＧＰＣＲに対するレセプターの活性の尺度は、レセプターを含む細胞膜とＧＴＰとの結合である。ＴｒａｙｎｏｒとＮａｈｏｒｓｋｉ、１９９５年、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：８４８−８５４によって説明された方法（ここに参考として組み入れられる）において、標識ＧＴＰの結合測定により、本質的に膜に共役しているＧタンパクを測定する。ＧＴＰ結合アッセイのために、レセプターを発現する細胞から単離された膜が、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８０ｐＭ  ３５Ｓ−ＧＴＰγＳ及び３μＭ  ＧＤＰを含むバッファー内でインキュベートされる。このアッセイ混合物は、結合されていない標識ＧＴＰがＧＦ／Ｂフィルターでの濾過によって除去され、その後、３０℃で６０分間インキュベートされる。結合された標識ＧＴＰが、液体シンチレーションカウントにより測定される。Ｃｈｅｍｅｒｉｎに誘導されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレーションを分析するために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞から調製された膜を、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと混合し、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性の候補モジュレータの存在下及び不在下で、ＧＴＰ結合アッセイを行なう。モジュレータなしのアッセイに対して、候補モジュレータを含むこの種のアッセイにおいてシンチレーションカウントで測定されるように、標識ＧＴＰ結合が１０％以上減少しているとき、候補モジュレータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性を阻害することを示している。
【０１８６】
類似のＧＴＰ結合アッセイが、Ｃｈｅｍｅｒｉｎなしで行なわれ、アゴニストとして作動する化合物を同定することができる。この場合、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ刺激されたＧＴＰ結合が標準として用いられる。化合物が１μＭ以下で存在するとき、そして好ましくはＣｈｅｍｅｒｉｎによって誘導されるレベルと同等又はそれ以上のレベルを誘導するときに、もし化合物が、全長野生型Ｃｈｅｍｅｒｉｎによって誘導されるＧＴＰ結合のレベルの少なくとも５０％を誘導するならば、その化合物は、アゴニストと考えられる。
【０１８７】
ＧＴＰａｓｅ活性は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを含む膜をγ３２Ｐ−ＧＴＰとともにインキュベートすることによって、測定される。活性なＧＴＰａｓｅは、無機リン酸塩としての標識を放出し、この無機リン酸塩は、２０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４中５％活性炭の懸濁液内でフリーの無機リン酸を分離することによって、続いてシンチレーションカウントを行なうことによって、検出されることができる。候補化合物の考えられる非特異的影響を排除するために、コントロールは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現しない細胞（モックトランスフェクトされている）から単離された膜を用いるアッセイを含む。
【０１８８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ調節されたＧＴＰａｓｅ活性に対する候補モジュレータの影響についてアッセイするために、膜サンプルは、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとともに、モジュレータと共に又は伴わないでインキュベートされ、続いてＧＴＰａｓｅアッセイが行なわれる。モジュレータなしのサンプルに対してＧＴＰ結合又はＧＴＰａｓｅ活性のレベルにおける１０％以上の変化（増加又は減少）が、候補モジュレータによるＣｈｅｍｅｒｉｎＲモジュレーションの指標となる。
【０１８９】
ｉｉ．ダウンストリーム経路活性化アッセイ
ａ．カルシウムフラックス−エクオリンに基づくアッセイ：
エクオリンアッセイは、ＧＰＣＲの活性化によって誘導された細胞内カルシウムの放出に対するミトコンドリアのアポエクオリンの応答を利用する（Ｓｔａｂｌｅｓら、１９９７年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：１１５−１２６；Ｄｅｔｈｅｕｘら，２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２  １５０１−１５０８；これらの双方は、ここに参考として組み入れられる）。要するに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現クローンは、トランスフェクトされて、ミトコンドリアのアポエクオリンとＧα１６を共同発現する。細胞は、５μＭ  ＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎＨ（モレキュラープローブス社）を用いて、室温で４時間培養され、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地で洗浄され、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ ／ｍｌの濃度で再懸濁される。そのとき、細胞は、試験アゴニストペプチドと混合され、エクオリンによる光放出が３０秒間ルミノメータで記録される。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）として表される。コントロールは、候補化合物の考えられる非特異的影響を排除するために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現しない（モックトランスフェクトされた）細胞から単離された膜を用いるアッセイを含む。
【０１９０】
もし、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現するが候補モジュレータで処理されていない細胞のサンプルに比例して、あるいはＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現しない（モックトランスフェクトされた）が、候補モジュレータで処理されている細胞のサンプルに比例して、光強度が、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現して候補モジュレータで処理された細胞サンプル中で１０％以上増大又は減少するならば、エクオリン活性又は細胞内カルシウムレベルは、「変化される」。
【０１９１】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの不在下で行なわれるとき、そのアッセイは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のアゴニストを同定するのに使われることができる。このアッセイが、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの存在下で行なわれるとき、アンタゴニストをアッセイするのに使われることができる。
【０１９２】
ｂ．アデニレートシクラーゼアッセイ
アデニレートシクラーゼ活性用のアッセイは、Ｋｅｎｉｍｅｒ＆Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇによって、１９８１年、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０：５８５−５９１で、説明されており、これはここで参考に組み入れられる。このアッセイは、Ｓｏｌｏｍｏｎらによって、１９７４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５４１−５４８９で教示されたアッセイの変形である。これも、ここに参考に組み入れられる。要するに、１００μｌ反応は、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭクレアチンリン酸（２ナトリウム塩）、１０ユニット（７１μｇのタンパク）のクレアチンホスホキナーゼ、１ｍＭのα−３２Ｐ−ＡＴＰ（４ナトリウム塩、２μＣｉ）、０．５ｍＭサイクリックＡＭＰ、Ｇ−３Ｈ−標識サイクリックＡＭＰ（約１００００ｃｐｍ）、０．５ｍＭ  Ｒｏ２０−１７２４、０．２５％エタノール、及び５０〜２００μｇの試験されるタンパクホモジェネート（すなわち、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現している又は発現していない細胞からのホモジェネートで、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドで処理された又は処理されずに、候補モジュレータと共に又は伴わない）を含む。反応混合物は、一般に、３７℃で６分間培養される。培養後、反応混合物は、０．９ｍｌの冷６％トリクロロ酢酸の添加によって脱タンパク化される。チューブは、１８００×ｇで２０分間遠心分離され、各上澄み溶液は、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに添加される。カラムからのｃＡＭＰフラクションは、０．１ｍＭイミダゾール塩酸（ｐＨ７．５）４ｍｌで、カウンテイングバイアルの中へ溶出される。アッセイは、３回行なわれるべきである。コントロール反応も、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現しない細胞からのタンパクホモジェネートを用いて行なわれるべきである。
【０１９３】
本発明によれば、もし、候補モジュレータで処理されない細胞の類似サンプルに対して、又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現しない（モックトランスフェクトされた細胞）が候補モジュレータで処理された細胞のサンプルに対して、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性の候補モジュレータで処理された細胞から得られたサンプル内で、アデニレートシクラーゼ活性が１０％以上増加又は減少すれば、アデニレートシクラーゼ活性は、「変化させられている」。
【０１９４】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
細胞内又は細胞外ｃＡＭＰは、当該分野で広く知られた方法に従って、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はｃＡＭＰ結合タンパクを用いて測定される。例えば、Ｈｏｒｔｏｎ＆Ｂａｘｅｎｄａｌｅ、１９９５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：９１−１０５は、ｃＡＭＰのためのＲＩＡを説明している。これはここで参考に組み入れられる。
【０１９５】
たくさんのｃＡＭＰ測定用キットが上市されている。例えば、ＬＪＬバイオシステムズ社とＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社から販売されている高効率蛍光偏光に基づく均一アッセイがある。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレータの考えられる非特異的影響を排除するために、モックトランスフェクトされた細胞の抽出物を用いて行なわれるべきである。
【０１９６】
もし、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現し、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性の候補モジュレータで処理された細胞（又はそのような細胞抽出物）内で検出されたｃＡＭＰレベルが、Ｈｏｒｔｏｎ＆Ｂａｘｅｎｄａｌｅ、１９９５年（上記）のＲＩＡに基づくアッセイを用いて、候補モジュレータで処理されない類似の細胞におけるｃＡＭＰレベルに対して、少なくとも１０％増大又は減少するならば、ｃＡＭＰのレベルは、「変化させられている」。
【０１９７】
ｄ．リン脂質ブレークダウン、ＤＡＧ生産とイノシトール３リン酸レベル：
リン脂質のブレークダウンを活性化するレセプターは、リン脂質ブレークダウン及びセカンドメッセンジャーＤＡＧ及び／又はイノシトール３リン酸（ＩＰ３）の結果物である生産物をモニタリングすることによって、既知の又は疑わしいＣｈｅｍｅｒｉｎＲモジュレータの活性のために、変化としてモニタされることができる。１９９８年、Ｉａｎ  Ｍ．Ｂｉｒｄ．Ｔｏｔｏｗａ，ニュージャージー州，Ｈｕｍａｎａプレスによって編集された「リン脂質シグナリングプロトコル」に、これらの各測定方法が説明されていて、これは、ここで参考に組み入れられる。ホスファチジルイノシトールブレークダウン用アッセイについても説明している、Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１８２４−１１８３１も参照（これはここで参照に組み入れらる）。アッセイは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現し、候補モジュレータを用いて又は用いずに、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドで処理され又は処理されていない細胞又は細胞抽出物を用いて行なわれるべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレータの考えられる非特異的影響を排除するために、モックトランスフェクトされた細胞又はこれらからの抽出物を用いて行なわれるべきである。
【０１９８】
本発明によれば、候補モジュレータで処理されていないＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞からのサンプル内で観察されたレベルに対して、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現し、候補モジュレータで処理された細胞からのサンプル内で、ホスファチジルイノシトールブレークダウン、及びジアシルグリセロール及び／又はイノシトール３リン酸のレベルが少なくとも１０％増大又は減少しているならば、これらのレベルは「変化させられている」。
【０１９９】
ｅ．ＰＫＣ活性アッセイ：
増殖因子レセプターチロシンキナーゼは、タンパクキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を含む経路を通じてシグナルを送る傾向にある。ＰＫＣは、リン脂質活性化及びカルシウム活性化されたタンパクキナーゼのファミリーである。ＰＫＣ活性化は、最後に、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、及びｃ−ｊｕｎ等のガン原遺伝子転写因子をコードする遺伝子；プロテアーゼ；コラゲナーゼタイプＩ及びプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター等のプロテアーゼインヒビター；細胞内接着分子（ＩＣＡＭＩ）等の接着分子を、アレイの転写内で生じる。ＰＫＣによって誘導された遺伝子産物における増加を検出するようにデザインされたアッセイは、ＰＫＣ活性化とこれによるレセプター活性がモニタするのに用いられることができる。さらに、ＰＫＣ活性化によって活性化された遺伝子のコントロール配列によって駆動されるレポータ遺伝子構造物の使用を通じて、ＰＫＣを通じてシグナルを出すレセプターの活性は、モニタされることができる。このタイプのレポータ遺伝子に基づくアッセイは、後でさらに詳細に論じられる。
【０２００】
ＰＫＣ活性のより直接的な測定としては、Ｋｉｋｋａｗａら、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３３４１（これは参考に、ここに組み入れられる）の方法が用いられることができる。このアッセイは、ＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定し、ＰＫＣ基質ペプチドは、続いて、ホスホセルロース紙に結合することによって分離される。このＰＫＣアッセイシステムは、精製されたキナーゼの活性又は粗細胞抽出物における活性を測定するのに用いられることができる。プロテインキナーゼＣサンプルは、アッセイに先立ってすぐに、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＤＴ内で溶出されることができる。
【０２０１】
アッセイに対する基質は、ペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列ＩＤ  Ｎｏ．：８０）であり、これは、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク（ＭＡＲＣＫＳ）から誘導される。このペプチドのための酵素のＫｍは、約５０μＭである。当該分野で知られている他の塩基性の、プロテインキナーゼＣ選択的ペプチドも、また、Ｋｍの少なくとも２〜３倍の濃度で、用いられることができる。このアッセイに要求されるコファクターには、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン、及びジアシルグリセロールが含まれる。ユーザーの意図に依存して、アッセイは、ＰＫＣ存在量（活性化状態）又は活性なＰＣＫ存在量（非活性化状態）を決めるのに用いられることができる。本発明の最大の目的のために、活性化されることができるＰＫＣを測定するよりもむしろ、それが分離されたときにサンプル内で活性であるＰＫＣが測定されるように、非活性化状態が用いられる。比活性化状態としては、カルシウムは、ＥＧＴＡを指示しているアッセイで、省略される。
【０２０２】
このアッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１〜２ｍＭ  ＤＤＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰ、〜１μＣｉγ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１００μｇ／ｍｌペプチド基質（〜１００μＭ）、１４０μＭ／３．８μＭホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜及び１００μＭカルシウム（又は５００μＭ  ＥＧＴＡ）を含む混合物中で行なわれる。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＤＤＴ中で溶出された４８μｌのサンプルは、最終反応体積である８０μｌの中で用いられる。反応は、３０℃、５〜１０分間行なわれ、続いて、１００ｍＭ  ＡＴＰ２５μｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の添加によって、反応を停止させる。
【０２０３】
反応を停止させた後、各反応部分（８５μｌ）は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１セルロースフォスフェートフィルター上にスポットされ、続いて、０．４％リン酸（１洗浄あたり５〜１０分）５００ｍｌで４回洗浄；９５％エタノール５００ｍｌで２〜５分間で最終洗浄する。結合された放射性活性は、シンチレーションカウントによって測定される。標識されたＡＴＰの特異的活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、ｐ８１ペーパー上で反応サンプルをスポットし、洗浄なしでカウントすることによって、決定される。ＰＫＣ活性のユニットは、分あたりトランスファーされたフォスフェートｎｍｏｌとして定義され、下記で計算される。
【数１】
2007534297.tif 000002
【０２０４】
選択的アッセイは、ＰａｎＶｅｒａ社（Ｃａｔ．＃Ｐ２７４７）によって販売されているプロテインキナーゼＣアッセイキットを用いることによって行なわれることができる。
【０２０５】
アッセイは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞で、候補モジュレータを用いて又は用いることなく、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドで処理又は処理されることなく、当該細胞の抽出物上で行なわれる。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレータの可能性ある非特異的影響を排除するために、モックトランスフェクトされた細胞又はその細胞からの抽出物を用いて、行なわれるべきである。
【０２０６】
本発明によれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現し、候補モジュレータで処理された細胞からの抽出物内で、上述のアッセイのいずれかによって測定されたＰＫＣユニットが、候補モジュレータで処理されていない細胞からの類似サンプル上で行なわれる反応に対して、少なくとも１０％増大又は減少するとき、ＰＫＣ活性は、候補モジュレータによって「変化させられている」。
【０２０７】
ｆ．キナーゼアッセイ：
ＭＡＰキナーゼ活性は、上市されているいくつかのキットのいずれを用いても、分析することができる。上市されているキットとしては、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｃａｔ＃９８２０）によって販売されているｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキットやパーキンエルマー・ライフ・サイエンス社から販売されているＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭＭＡＰキナーゼがある。
【０２０８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現し、候補モジュレータで処理されている細胞からのサンプル内で、もし、候補モジュレータで処理されていない類似の細胞からのサンプル内でのＭＡＰキナーゼ活性に対して、活性レベルが１０％以上増大又は減少したならば、ＭＡＰキナーゼ活性は、「変化させられている」。
【０２０９】
既知の合成又は天然のチロシンキナーゼ基質と標識されたフォスフェートを用いて、チロシンキナーゼ活性のための直接的アッセイは、他のタイプのキナーゼ（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）用の類似のアッセイとして、よく知られている。キナーゼアッセイは、候補モジュレーターを用いて又は用いることなく、Ｃｈｅｍｅｒｉｎで処理又は処理されていないＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞から調製される粗製抽出物と、精製されたキナーゼとの双方を用いて、行なわれることができる。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの考えられる非特異的影響を排除するために、モックトランスフェクトされた細胞又はこれらからの抽出物を用いて、行なわれるべきである。基質は、基質を示す十分な長さのタンパク又は合成ペプチドのいずれかであってもよい。Ｐｉｎｎａ＆Ｒｕｚｚｅｎｅ（１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３１４：１９１−２２５、これはここで参考に組み入れられる）は、キナーゼ活性の測定に有用なたくさんのリン酸化基質部位を、列挙している。たくさんのキナーゼ基質ペプチドは、上市されている。特に有用な一つは、「Ｓｒｃ関連ペプチド」で、ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（配列ＩＤ  Ｎｏ：７４；シグマ社＃Ａ７４３３から入手）で、たくさんのレセプター及びノンレセプターチロシンキナーゼのための基質である。後述するアッセイは、ペプチド基質がフィルターに結合することを要求するので、ペプチド基質は、結合を促進する正味の陽性荷電を有しているべきである。一般に、ペプチド基質は、少なくとも２塩基残基とフリーのアミノ末端を有しているべきである。一般に、反応は、０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を使用する。
【０２１０】
アッセイは、一般に、５Ｘキナーゼバッファー（５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；正確なキナーゼアッセイに依存して、ＭｇＣｌ２の代わりに又は加えて用いられることができるＭｎＣｌ２）５μｌ、１．０ｍＭ  ＡＴＰ５μｌ（最終濃度０．２ｍＭ）、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００〜５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１０ｍＭペプチド基質３μｌ（最終濃度１．２ｍＭ）、テストされるキナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼ分析に用いられる細胞抽出物はフォスファターゼインヒビターを含むべきである（例えば０．１〜１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム））、及びＨ２Ｏを加えて２５μｌとした２５μｌ容積内で実行される。反応は、３０℃で行なわれ、細胞抽出物の添加によって開始される。
【０２１１】
キナーゼ反応は、３０秒間から約３０分間行なわれ、続いて、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４５μｌを添加する。サンプルは、遠心分離器で、２分間、回転させられ、上清３５μｌが、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１セルロースフォスフェートフィルターサークル上にスポットされる。このフィルターは、５００ｍｌの冷０．５％リン酸で３回洗浄し、続いて、室温で５分間、アセトン２００ｍｌで１回洗浄する。フィルターを乾燥し、取り入れられた３２Ｐをシンチレーションカウントによって測定する。キナーゼ反応（例えばｃｐｍ／ｐｍｏｌで）内のＡＴＰの特異的活性は、ｐ８１フィルターサークル上での反応の小さなサンプル（２〜５μｌ）をスポットすることによって決定し、洗浄することなく、直接カウントする。キナーゼ反応（マイナスブランク）で得られた分あたりのカウントは、そのときに、特異的活性によって分配され、反応内でリン酸基転移されたモル数を決定する。
【０２１２】
もし、候補モジュレータで処理され、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞からのサンプル内で、キナーゼ活性のレベルが、候補モジュレータで処理されない類似細胞からのサンプル内でのキナーゼ活性に対して、１０％以上増大又は減少するならば、チロシンキナーゼ活性は、「変化させられている」。
【０２１３】
ｇ．ダウンストリーム経路活性化に対する転写レポータ：
例えばＣｈｅｍｅｒｉｎＲのようなレセプターにアゴニストが結合することによって開始される細胞内シグナルは、細胞内イベントのカスケードを始動させ、最終結果は、１つ以上の遺伝子の転写又は翻訳において迅速で検出可能な変化となる。従って、レセプターの活性は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化に対する応答性のコントロール配列によって駆動されるレポータ遺伝子の発現を測定することによってモニターされることができる。
【０２１４】
ここで用いられる「プロモータ」は、遺伝子発現のレセプター媒介調節に必要な転写コントロール要素をいい、基本プロモータだけでなく、エンハンサー又はレセプター制御された発現に必要な転写因子結合部位も含む。アゴニストの結合から生じる細胞内シグナルに応答するプロモータを選択することによって、また、転写、翻訳又は最終活性が容易に検出又は測定可能なレポータ遺伝子に選択されたプロモータを、作動可能に連結することによって、レポータアッセイに基づく転写は、与えられたレセプターが活性化されるかどうかの迅速な指示を提供する。
【０２１５】
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ又はβガラクトシダーゼのようなレポータ遺伝子は、これらの産物の検出のアッセイとして、当該分野でよく知られている。
【０２１６】
レセプター活性をモニターするのに特に好適な遺伝子は、「極初期」遺伝子であり、これらは、迅速に、一般に、レセプターと効果器タンパク又はリガンドとの間で、接触している数分内に誘導される。極初期遺伝子の転写の誘導は、新規な調節タンパクの合成を要求しない。リガンド結合の迅速な応答に加えて、レポータ構成物を作るのに有用な好ましい遺伝子の特徴は：静止細胞における低い又は検出されない発現；新規タンパク合成の過渡的で独立した誘導；続いて起る転写のシャットオフは新規タンパク合成を要求する；及びこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが短い半減期を有している。転写コントロール要素は、それにとって有用であるこれらの特性の全てを有していることは、好ましいが、必要ではない。
【０２１７】
たくさんの異なる刺激に応答する遺伝子の実施例は、ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子である。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、増殖因子、ホルモン、分化特異的薬剤、ストレス、及び細胞表面タンパクの他の既知の誘導因子によって、タンパク合成とは独立した方式で、活性化される。ｃ−ｆｏｓ発現の誘導は、極めて速く、しばしば、レセプター刺激の数分内に起る。この特徴は、レセプター活性化のレポータとしての使用に特に魅惑的なｃ−ｆｏｓ調節領域を作る。
【０２１８】
ｃ−ｆｏｓ調節要素は、転写開始に要求されるＴＡＴＡボックス；基本転写の２つの上流要素及びエンハンサー；を含む（Ｖｅｒｍａら、１９８７年、Ｃｅｌｌ  ５１：５１３−５１４を参照）。エンハンサーは、２個一組のシメトリーな要素を含み、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ、及びＰＭＡによる誘導に要求される。
【０２１９】
２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサー要素は、ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡのｃａｐ部位から上流の−３１７から−２９８ｂｐまでの間に位置し、血清欠乏のＮＩＨ３Ｔ３細胞中での血清誘導に必須である。２つの上流要素の一つは、−６３〜−５７に位置し、ｃＡＭＰ調節に対するコンセンサス配列ににている。
【０２２０】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答要素結合タンパク）は、名前が意味するように、細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。従って、ｃＡＭＰレベルのモジュレーションを通じてシグナルを出すレセプターの活性化は、転写因子の結合又はＣＲＥＢ結合要素（ＣＲＥ、又はｃＡＭＰ応答要素と称される）に連結されたレポータ遺伝子の発現のいずれかを測定することによって、モニタされる。ＣＲＥのＤＮＡ配列は、ＴＧＡＣＧＴＣＡ（配列ＩＤ  ＮＯ：７５）である。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポータ構成物は、米国特許Ｎｏ．５９１９６４９に説明されている。
【０２２１】
他のプロモータ及び転写コントロール要素は、ｃ−ｆｏｓ要素及びＣＲＥＢ応答構成物に加えて、血管に作用する腸内ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Ｆｉｎｋら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：６６６２−６６６６）；ソマトスタチン遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Ｍｏｎｔｍｉｎｙら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８．３：６６８２−６６８６）；プロエンケファリンプロモータ（ｃＡＭＰ応答、ニコチンアゴニスト、及びホルボールエステル；Ｃｏｍｂら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ３２３：３５３−３５６）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Ｓｈｏｒｔら、１９８６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９７２１−９７２６）。
【０２２２】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答性の転写コントロール要素の付加的例は、ＡＰ−１転写因子に応答性の転写コントロール要素、ＮＦ−κＢ活性に応答性の転写コントロール要素が挙げられるが、これらに限定されない。共通のＡＰ−１結合部位は、パリンドロームＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡである（Ｌｅｅら、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ３２５：３６８−３７２；Ｌｅｅら、１９８７年、Ｃｅｌｌ４９：７４１−７５２）。ＡＰ−１部位は、また、ホルボールエステル１２−ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）のような腫瘍プロモータによる媒介誘導を担っていて、従って、時々、ＴＲＥ、すなわちＴＰＡ応答要素（ＴＰＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と称される。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の初期の応答に巻き込まれるたくさんの遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答遺伝子の例としては、Ｆｏｓ及びＪｕｎ遺伝子（これらのタンパクはそれ自身でＡＰ−１活性を作り出す）を含むが、これらに限定されない。Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１と２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、及びアネキシンＩとＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
ＮＦ−κＢ結合要素は、コンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列ＩＤ  ＮＯ：８１）を有している。多大な遺伝子は、ＮＦ−κＢ応答性として同定され、これらの調節要素は、ＧＰＣＲ活性をモニタするレポータ遺伝子に連結されることができる。ＮＦ−κＢ応答性の遺伝子の小さなサンプルは、ＩＬ−１β（Ｈｉｓｃｏｔｔら、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：６２３１−６２４０）、ＴＮＦ−α（Ｓｈａｋｏｖら、１９９０年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：３５−４７）、ＣＣＲ５（Ｌｉｕら、１９９８年、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１４：１５０９−１５１９）、Ｐ−セレクチン（Ｐａｎ＆ＭｃＥｖｅｒ、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３０７７−２３０８３）、Ｆａｓリガンド（Ｍａｔｓｕｉら１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４６９−３４７３）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｒｅｃｋ＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１２８１−１２８６）及びＩκＢα（Ｈａｓｋｉｌｌら、１９９１年、Ｃｅｌｌ６５：１２８１−１２８９）をコードする遺伝子を含む。これらの参考文献は各々、参考にここに組み入れられる。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは、また、当該分野で知られている、あるいは、例えば合成ＮＦ−κＢ要素及び最小プロモータを用いて、又はＮＦ−κＢ調節を受けると知られている遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて当業者によって容易に作られることができる。さらに、ＮＦ−κＢ応答レポータ構成物は、例えば、クロンテック社から入手可能である。
【０２２４】
与えられたプロモータ構成物は、その構成物でトランスフェクトされたＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現細胞を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに曝露することによって、テストされるべきである。Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに応答したレポータの発現における少なくとも２倍の増加は、そのレポータがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性の指標であることを示している。
【０２２５】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−応答性の転写レポータ構成物を伴うＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性を分析するために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを安定的に発現する細胞が、レポータ構成物で安定的にトランスフェクトされている。アゴニストのスクリーニングのために、細胞は、未処理のままにされ、候補モジュレータにさらされ、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに曝され、レポータの発現が測定される。Ｃｈｅｍｅｒｉｎ処理された培地は、既知のアゴニストによって誘導された転写レベルの標準として役立つ。候補モジュレータ存在下でのレポータ発現における少なくとも５０％の増加は、その候補がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレータであることを示す。アゴニストは、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドよりも、少なくとも同じ、好ましくは同程度以上、レポータ発現を誘導する。このアプローチは、また、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又は他のアゴニストの不在下で、レポータの上昇された基礎活性があるようなレベルで、細胞がＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現するところで、逆アゴニストのためのスクリーニングに用いられることができる。候補モジュレータの存在下で、その不在下に対して、レポータ活性が１０％以上減少しているとき、その化合物は逆アゴニストであることを示す。
【０２２６】
アゴニストのスクリーニングのために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現し、レポータ構成物を運搬する細胞は、候補モジュレータの存在下及び不在下で、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド（又は他のアゴニスト）に曝される。候補モジュレータの不在下に対して、候補モジュレータの存在下でのレポータ発現が１０％以上減少しているとき、その候補がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレータであることを示す。
【０２２７】
転写アッセイのコントロールは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現しないが、レポータ構成物を運搬する細胞を、プロモータのないレポータ構成物を伴う細胞と同様に、含む。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ調節された転写のモジュレーターとして同定される化合物は、これらの活性の特異性及びスペクトルを決定するために、また分析されて、これらが他の調節配列によって及び他のレポータによって作動される転写に影響を与えるかどうかを、決定すべきである。
【０２２８】
転写レポータアッセイ、及び殆どの細胞に基づくアッセイは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性をモジュレートするもののためのタンパクの発現ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。例えば、ライブラリーは、植物、動物、バクテリアなどの天然資源からのｃＤＮＡライブラリーであることができ、これらは、ランダムに又は系統的に変異させられた１以上のポリペプチド変異体のライブラリーであることもできる。ウィルスベクターにおけるゲノムライブラリーは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのスクリーニングに用いられる異なるライブラリーの中で、１細胞又は組織のｍＲＮＡ量を発現するのに用いられることができる。
【０２２９】
レセプター活性のアッセイのいずれかは、ＧＴＰ結合、ＧＴＰａｓｅ、アデニレートシクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質ブレークダウン、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、ＰＫＣ、キナーゼ及び転写レポータアッセイを含み、サンプル内で薬剤の存在を決定するのに用いられることができる。サンプルとしては、例えば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプター分子の活性に影響を与える組織サンプルがある。そうすると、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドは、サンプル又はサンプル抽出物の存在下及び不在下での活性について分析される。サンプルの不在下に対して、サンプル又は抽出物の存在下でＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性が増大していると、そのサンプルが、レセプター活性のアゴニストを含むことを示している。Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドだけの存在下でのレセプター活性に対して、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又は他のアゴニスト及びサンプルの存在下でレセプター活性が減少していると、サンプルがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のアンタゴニストを含むことを示している。望むならば、サンプルは、そのとき、画分化されることができ、さらに試験されて、アゴニスト若しくはアンタゴニストを単離又は精製する。モジュレータを含むと言われているサンプルに必要な測定された活性の増大量又は減少量は、用いられるアッセイのタイプに依存する。一般に、サンプルの不在下で行なわれたアッセイに対して、１０％以上の変化（増加又は減少）は、サンプル内にモジュレータが存在していることを示す。１つの例外は、転写レポータアッセイである。転写レポートアッセイでは、サンプルがモジュレータを含むといわれるためには、シグナルが少なくとも２倍増加又は１０％減少することが必要である。アゴニストは、少なくとも５０％レセプター活性化を刺激することが好ましく、好ましくは７５％又は１００％以上、例えば野生型Ｃｈｅｍｅｒｉｎの２倍、５倍、１０倍以上のレセプター活性化を刺激する。
【０２３０】
他の機能的アッセイとしては、例えば、マイクロフィジオメータ又はバイオセンサーアッセイがある（Ｈａｆｎｅｒ、２０００年、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１５：１４９−１５８、これは参考にここに組み入れられる）。
【０２３１】
ＩＩ．ＣｈｅｍｅｒｉｎＲとＣｈｅｍｅｒｉｎの相互作用に基づく診断アッセイ：
ＧＰＣＲを通じてのシグナリングは、多数の病気及び疾病の病理に役立つ。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、リンパ球系列の細胞において発現され、免疫欠損ウィルスに対するコレセプターとして作動することが示されてきて、免疫プロセス、疾病又は疾患における役割を有することができる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現パターンは、また、骨及び軟骨を含み、このレセプターはこれらの組織に影響を与えるプロセス（例えば骨折治療）、疾患又は疾病において役割を果たすことができることを示している。大人の副甲状腺における発現は、リン酸カルシウム（ｐｈｏｓｐｈｏｃａｌｉｃ）代謝において潜在的に重要であることを提案している。
【０２３２】
リンパ球系列の細胞における発現のために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、ウィルス感染に対する身体の応答に、又はＨＩＶタイプＩ及びＩＩ等の種々のウィルス又はバクテリアにより引き起こされる病気に、関係することができる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの発現パターン、及びＧＰＣＲによって一般に媒介される病気に関する知識は、細胞移動の異常、癌、腫瘍の進行及び腫瘍の転移、炎症及び悪性（ｎｅｏ−ｐｌａｓｔｉｃ）プロセス、創傷治療及び骨治療及び調節性増殖機能の機能障害、糖尿病、肥満、食欲不振、大食症、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム硬化、過剰な平滑筋細胞増殖により特徴づけられる病気、動脈瘤、平滑筋細胞の欠損及び平滑筋細胞増殖の低減により特徴付けられる病気、脳卒中、虚血、潰瘍、アレルギー、前立腺肥大、片頭痛、嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆及び精神遅滞を含む精神障害及び神経性障害；消耗性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病のような神経消耗性疾患；及びハンチントン病又はギルドラトゥーレット症候群及び他の関連疾患のようなジスケネジアに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲが関係できることを提案している。
【０２３３】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのＣｈｅｍｅｒｉｎとの相互作用は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲがシグナルを出すことに関連する関係する病気、疾病又はプロセスの診断又はモニタのためのアッセイの基礎として用いられることができる。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ関連疾患又は疾病のための診断アッセイは、いくつかの異なる形態を有している。第１に、診断アッセイは、組織サンプル中のＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及び／又はＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、遺伝子、又はｍＲＮＡの量を測定することができる。これらのポリペプチドのいずれか又は双方をコードするｍＲＮＡ量を測定するアッセイは、このカテゴリーにもフィットする。第２に、アッセイは、レセプター又はリガンドの質を上昇させることができる。例えば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎのいずれか一方又は双方の変異体又はバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）を個々に表現するかどうかを決定するアッセイが、診断的に役立つように用いられることができる。第３に、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの１以上の活性を測定するアッセイが診断に役立つように用いられることができる。
【０２３４】
〔Ａ．ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎの量を測定するアッセイ〕
レセプター又はそのリガンドの異常レベルがサンプル内に存在するかどうか、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良らしいことを示すのはいずれかを決定するために、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲレベル及びＣｈｅｍｅｒｉｎレベルが測定されて、標準品と比べられることができる。ポリペプチドレベルは、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫組織化学によって、測定される。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性によって特徴づけられる病気又は疾病に患っていると疑われる患者から単離されたサンプルが、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎの抗体と接触させられ、この抗体との結合が、当該分野に既知のように（例えば、二次抗体に抱合された酵素の活性の測定によって）測定される。
【０２３５】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及び／又はＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドレベルの測定に対する他のアプローチは、影響された組織からの細胞のフローサイトメトリー分析を用いている。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎに特異的な抗体の蛍光標識を含むフローサイトメトリーの方法は、当該分野でよく知られている。他のアプローチは、ラジオイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡを含む。これらの各方法も、当該分野でよく知られている。
【０２３６】
検出された結合量は、健康な個体又はあまり影響されていない影響された個体上の部位からの、同様の組織のサンプルにおける結合と比較される。標準に対する１０％以上の増加は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良によって特徴づけられる病気又は疾病の診断に役立つ。
【０２３７】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及びＣｈｅｍｅｒｉｎ発現は、また、組織のサンプル内でのポリペプチドのいずれか一方又は双方をコードするｍＲＮＡ量を決定することによっても測定されることができる。ｍＲＮＡ量が、定量又は半定量ＰＣＲによって、定量されることができる。「量的」増幅方法は、当業者によく知られていて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及びＣｈｅｍｅｒｉｎの双方の増幅のためのプライマー配列は、ここに開示されている。定量的ＰＣＲの共通の方法は、同時に共同増幅する、既知のコントロール配列の同じプライマーを用いた定量を伴う。これは、ＰＣＲ反応を基準化するのに用いられる内部標準品を提供する。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、「ＰＣＲプロトコル、方法と応用のガイド」Ｉｎｎｉｓら、アカデミックプレス社、ニューヨーク（１９９０年）（これは、参考としてここに組み入れられる）に提供されている。サンプル中のＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎをコードするｍＲＮＡ量における１０％以上の増加は、健康な個体からの組織様サンプル又は影響された個体中の影響されていない位置からの組織サンプル内で発現している量に対して、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断に役立つ。
【０２３８】
〔Ｂ．定性アッセイ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡが野性型かそうでないかどうかを評価するアッセイが診断に役立つように用いられることができる。このような方式で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎ調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病を診断するために、サンプルから単離されたＲＮＡがＣｈｅｍｅｒｉｎ及び／又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲのＰＣＲ増幅のための鋳型として用いられる。増幅された配列は、そのとき、標準方法を用いて直接的に配列決定される、又はベクターに最初にクローン化されて、次いで配列決定されるかのいずれかである。野生型ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎの配列に対して、１つ以上のコードされたアミノ酸を変化させる配列における違いは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断に役立つ。コード配列における変化は、サンプル内で同定されるとき、バリアントレセプター又はリガンドを発現し、野生型ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎのレセプター又はリガンドに対する活性と比べるのに有用であることができる。他の長所の中で、このアプローチが、構造上活性な変異体及びヌル変異体を含む新規な変異体を提供することができる。
【０２３９】
標準的な配列決定法に加えて、増幅された配列は、例えば、野生型配列とバリアント配列との間を識別する分子的目印のハイブリダイゼーションを用いて、特異的突然変異の存在について分析されることができる。１ヌクレオチドといった小さな変化に基づいて区別するハイブリダイゼーションアッセイは、当該分野でよく知られている。あるいは、たくさんの「ミニ配列決定」のどれでも、行なわれることができる。例えば、米国特許５８８８８１９、６００４７４４及び６０１３４３１（ここで参考に組み入れられる）で説明されているアッセイを含む。これらのアッセイ及び当該分野で知られている他のアッセイは、与えられたサンプルにおいて、既知の多型性を伴う核酸の存在を決定することができる。
【０２４０】
もし望むならば、アレイ又はマイクロアレイをベースとする方法は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎ配列内での、発現又は突然変異の存在を分析するのに用いられることができる。ミニ配列決定及び核酸発現の定量のためのアレイをベースとする方法は、当該分野でよく知られている。
【０２４１】
〔Ｃ．機能的アッセイ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断は、また、機能的アッセイを用いて行なわれることができる。そうすると、組織サンプルから調製された細胞膜又は細胞抽出物は、ここで説明されるＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のアッセイ（例えば、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ結合アッセイ、ＧＴＰａｓｅアッセイ、アデニレートシクラーゼアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、リン脂質ブレークダウン、ジアシルグリセロール又はイノシトール３リン酸アッセイ、ＰＫＣ活性化アッセイ、又はキナーゼアッセイ）で用いられる。検出された活性は、健康な個体又は影響された個体の影響されていない部位から採取された標準サンプル内の活性と比較される。その代用として、サンプル又はサンプル抽出物が、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する細胞に適用され、それに続いて、標準サンプルに対するＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリング活性が測定される。これらのアッセイのいずれかで測定された活性が標準の活性に対して１０％以上相違すると、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候である。
【０２４２】
〔本発明に従った細胞におけるＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレーション〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのリガンドとしてのＣｈｅｍｅｒｉｎの発見は、細胞内でのＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性をモジュレートする方法を提供する。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤を、その細胞にデリバリーすることによって、細胞内でモジュレートされる。このモジュレーションは、付加的モジュレーティング薬剤の同定のためのアッセイの部分として培養細胞において、又は例えばヒトを含む動物内で、行なわれることができる。薬剤は、ここで説明されたスクリーニング方法を用いて同定された付加的モジュレータと同様に、ここで定義されるように、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを含む。
【０２４３】
薬剤は、薬剤を培養培地に添加することによって、細胞にデリバリーされることができる。デリバリー量は、薬剤のアイデンティティに伴って、また薬剤がデリバリーされる目的に伴って、変わるだろう。例えば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のアンタゴニストを同定する培養アッセイにおいては、レセプターを最大の半分だけ活性化するＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド量（例えばＥＣ５０）、好ましくはレセプター飽和に要求される投与量を超えない量を添加することが好ましい。この投与量は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの量を滴定して、Ｃｈｅｍｅｒｉｎのさらなる添加がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性に付加的影響を与えない点を決定することによって、決められる。
【０２４４】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレータが、疾病又は疾患の治療のために動物に投与されるとき、投与量は、所望出力に基づいて、当業者によって調節されることができる。成功する治療は、病理の１以上の測定可能な様子（例えば腫瘍細胞の増殖、炎症細胞の蓄積）が、治療に先立つその様子のための価値に対して、少なくとも１０％変化させられる。
【０２４５】
〔本発明の有用な候補モジュレータ〕
合成又は天然の化合物の大きなライブラリーから、候補モジュレータがスクリーニングされることができる。化合物に基づくサッカライド、ペプチド、脂質、炭水化物、及び核酸のランダム及び直接的合成に、多くの手段が、現在は用いられる。合成化合物ライブラリーは、例えば、ＭａｙｂｒｉｄｇｅＣｈｅｍｉｃａｌ社（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、コーンウォール、イギリス）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（プリンストン、ニュージャージー州）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（メリマック、ニューハンプシャー州）及びマイクロソース社（ニューミルフォード、コネチカット州）を含む多くの会社から上市されている。稀少な化学ライブラリーは、アルドリッチ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手できる。有機低分子のコンビナトリアルライブラリーは、入手可能で、調製されることができる。あるいは、バクテリア、カビ類、植物、及び動物抽出物の形態で、天然化合物のライブラリーが、例えば、Ｐａｎ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ボスウェル、ワシントン州）又はＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ社（ノースカロナイナ州）、又は当該分野でよく知られた方法で、容易に生産可能である。さらに、天然又は合成的に生産されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通じて容易にモデファイされる。
【０２４６】
ここで、先に記したように、候補モジュレータは、また、既知のポリペプチド（例えばＣｈｅｍｅｒｉｎ、抗体）又は核酸ライブラリーでコードされている核酸（例えばアプタマー）のバリアントであり得る。ライブラリーでトランスフォームされた細胞（例えばバクテリア、酵母又は上級の有核細胞）は、増殖され、抽出物として調製されることができ、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ結合アッセイ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性の機能的アッセイに適用される。
【０２４７】
ＩＩＩ．本発明の有用な抗体
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及びＣｈｅｍｅｒｉｎに対する抗体を提供する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マルチ特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、いずれのタイプでもよく（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、いずれのクラスでもよく（例えばＩｇＧ１−４、ＩｇＡ１−２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。好ましい態様では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。他の好ましい態様では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。さらに好ましい態様では、ＩｇＧ２アイソタイプである。さらに好ましい態様では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０２４８】
本発明の抗体は、ポリペプチド又はポリペプチド断片又はＣｈｅｍｅｒｉｎのバリアントに特異的に結合してもよい。好ましくは、本発明の抗体は、完全長Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに特異的に結合する。また好ましくは、本発明の抗体は、先端が切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの１５７アミノ酸（配列ＩＤ  ＮＯ：７３）に特異的に結合する。また、好ましくは、本発明の抗体は、１９アミノ酸Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド（配列ＩＤ  ＮＯ：５３）に特異的に結合する。また、好ましくは、本発明の抗体は、９アミノ酸Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド（配列ＩＤ  ＮＯ：５９）に特異的に結合する。また、好ましくは、本発明の抗体は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ断片ＦＳＫＡＬＰＲＳ（配列ＩＤ  ＮＯ：８９）に特異的に結合する。
【０２４９】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明の抗体は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ／ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ相互作用を乱す。また、本発明は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ／ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ相互作用を乱さないが、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を乱す抗体を特徴とする。
【０２５０】
本発明の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドを精製、検出、標的とするのに用いられるが、これに限定せず、インビトロ及びインビボでの診断及び治療方法の双方を含む。例えば、本発明の抗体は、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的及び定量的に測定するためのイムノアッセイに用いられることができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：実験マニュアル、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編集（コールド・スプリング・ハーバー・プレス社：１９８８年）。本発明の抗体は、単独又は他の組成物との組合わせのいずれで用いられてもよい。この抗体は、さらに、Ｎ末端又はＣ末端で、異種ポリペプチドに組換的に融合されてもよいし、あるいはポリペプチド又は他の組成物と化学的に抱合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（共有結合的又は非共有的結合を含む）されてもよい。本発明の抗体は、また、どのタイプの分子もその抗体に対して、化学的連結によって、モディファイされ得る。モディファイには、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化；既知の保護基／ブロック基による誘導化、タンパク切断、細胞のリガンド又は他のタンパクなどへの連結などが挙げられる。
【０２５１】
抗体は、当該分野で既知の標準プロトコルを用いて作成されることができる（例えば、（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：実験マニュアル、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編集（コールド・スプリング・ハーバー・プレス社：１９８８年）参照）。マウス、ハムスター、又はウサギのようなほ乳類は、免疫原型のペプチド（例えば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、又は抗体の応答を引出すことができる抗原断片、又は上述のような融合タンパク）で免疫感作されることができる。抗体を生じさせる免疫原は、ポリペプチド（例えば、単離された組換えポリペプチド又は合成ペプチド）をアジュバントと混合することによって調製される。あるいは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎのポリペプチド若しくはペプチドは、より大きな免疫原タンパクへの融合タンパクとして作られる。ポリペプチドは、また笠貝ヘモシアニンの鍵穴のように、他のより大きな免疫原タンパクに、共有結合的に連結されることができる。その代わりに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎ又はこれらのタンパク断片をコードするプラスミド又はウィルスベクターは、Ｃｏｓｔａｇｌｉｏら、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：８０３−８１１（これは、ここに参考に組み入れられる）に説明されているように、ポリペプチドを発現させて動物内で免疫応答を生じさせるのに用いられることができる。抗体を生じさせるために、典型的には、ウサギ、ヒツジ、及びマウスのような実験動物に、免疫原が、皮膚内、皮下、又は筋肉内に投与される。上記で論じた抗体に加えて、一般に、設計された抗体誘導体が、単鎖抗体のように、作られることができる。
【０２５２】
免疫感作の進行は、血漿又は血清における抗体力価の検出によってモニタされることができる。標準ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、又は他のイムノアッセイは、また、抗原として免疫原を用いて、抗体のレベルを評価するのに用いられることができる。抗体調製は、単に、免疫感作された動物からの血清であってもよいし、所望であれば、例えば、固定化された免疫原を用いたアフィニティクロマトグラフィによって、ポリクローナル抗体は血清から単離されることができる。
【０２５３】
モノクローナル抗体を生産するために、抗体産生脾臓細胞を、免疫感作された動物から採取し、標準的な体細胞融合処理によって、ミエローマ細胞のような不死化細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を生じさせることができる。このような技術は、当該分野でよく知られており、例えば、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによってオリジナルに開発された（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社、７７−９６ページ）がある。ハイブリドーマ細胞は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎＲペプチド若しくはポリペプチド、及びハイブリドーマ細胞等を含む培地から単離されたモノクローナル抗体と特異的に反応する抗体の産生に対して免疫化学的にスクリーニングされることができる。
【０２５４】
本発明の抗体断片は、既知の技術によって生成されてもよい。例えば、本発明のＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパインのような酵素（Ｆａｂ断片を生産）又はペプシンのような酵素（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成）を用いた、免疫グロブリンのタンパク分解的切断によって生産されることができる。
【０２５５】
ＩＶ．Ｃｈｅｍｅｒｉｎ及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲの相互作用に基づく治療的アプローチ
〔組成物及び治療組成物及びその投与〕
本発明は、上述のようにＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド又はＣｈｅｍｅｒｉｎ核酸配列を含む組成物若しくは治療用組成物を提供する。治療組成物は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎを含む治療的有効量の化合物と薬学的に許容し得る担体を含んでいる。好ましい態様では、組成物は、ヒトへの静脈注射に適用できる薬学的組成物として、ルーチン処理に従って処方されることができる。
【０２５６】
他の好ましい態様では、本発明の組成物は、中性又は塩型として、処方されることができる。薬学的に許容し得る塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される塩のようなアニオンとともに形成される塩；及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される塩のようなカチオンと形成される塩が含まれる。
【０２５７】
一般に、組成物は、１００μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、好ましくは１μｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重の範囲で１回投与量で投与されるだろう。この投与は、日単位で、週単位で、月単位で、年単位で、又は扱っている医者によって適当と思われるように、繰り返されることができる。あるいは、本発明の組成物の治療的に有効な量が、標準的臨床的技術により決定されることができる。さらに、インビトロアッセイが、任意に採用されて、任意の投与量範囲の同定を助ける。処方で採用される正確な投与量は、投与ルート、及び疾病又は疾患の重病度に依存するだろうし、開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な投与量は、インビトロ又は動物モデルテストシステムから誘導される投与応答曲線から外挿されてもよい。
【０２５８】
本発明は、また、検体への本発明の組成物又は治療用組成物、好ましくは、核酸又はポリペプチドＣｈｅｍｅｒｉｎ分子の有効量を検体へ投与することによる疾病又は疾患のための治療方法及び阻害方法を提供する。ある面においては、組成物は、効果を限定する基質又はＣｈｅｍｅｒｉｎの望ましくない副作用を生成する基質から、実質的にフリーである。検体は、いずれかの動物、好ましくはほ乳類、好ましくはヒトであることができる。
【０２５９】
当該分野で知られた種々のデリバリーシステムは、本発明の組成物を投与するのに用いられることができる。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、本発明の組成物を発現できる組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシスなどがあり、これらはここで参考として組み入れられる。導入方法は、皮膚内ルート、筋肉内ルート、腹腔ルート、静脈内ルート、皮下ルート、鼻内ルート、硬膜外ルート、及び経口ルートが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、従来のルートによって、例えば輸液又はボーラス注射によって、上皮性又は皮膚粘膜の内側膜（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば口腔粘膜、直腸粘膜及び腸粘膜など）を通しての吸収によって投与され、また他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されることができる。投与は、全身に又は局所的に行なわれることができる。さらに、本発明の組成物又は治療用組成物を、いずれかの好適なルートによって中枢神経系の中へ導入することが望ましい。好適なルートには、心室内及びクモ膜下注射があり、心室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバ（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）のようなリザーバに取り付けられた心室内カテーテルによって容易にされることができる。肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザーの使用により、エアロゾル化剤との処方によって、採用されることもできる。
【０２６０】
本発明は、また、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で、１以上の容器がみたされている薬学的パック又はキットを提供する。
【０２６１】
種々の疾病又は疾患は、本発明の組成物若しくは治療用組成物で治療されることができる。これらの疾病又は疾患には、大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び尿生殖に位置する腫瘍が含まれ、また高γグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾患、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖、及び他の高増殖病も同様に含まれるが、これらに限定されない。
【０２６２】
〔本発明の有用なトランスジェニック動物〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎ又はこれらのバリアントを発現するトランスジェニック動物は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを通じてのシグナリングの研究に有用であり、またＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性をモジュレートする医薬又は薬剤の研究にも同様に有用である。トランスジェニック動物は、その遺伝的物質の部分であるトランスジーンと称される外来遺伝子を少なくとも１つ含む非ヒト動物である。トランスジーンは、それが動物の子孫に伝達されることができるように、動物の生殖系列に含まれることが好ましい。多くの技術が、トランスジーンを動物の遺伝的材料に導入するのに用いられることができ、技術にはトランスジーンの多核受精卵への微量注射法及び胚性幹細胞の取り扱い（ＷａｇｎｅｒとＨｏｐｐｅによる米国特許Ｎｏ．４８７３１９１号；ＰａｌｍｉｔｅｒとＢｒｉｎｓｔｅｒ、１９８６年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：４６５−４９９；１９８７年８月７日に公開されたフランス特許出願２５９３８２７号、これらは参考として、ここに組み入れられる）が挙げられるが、これらに限定されない。トランスジェニックアニマルは、これらのすべての細胞の中でトランスジーンを運搬し、遺伝的にモザイクであることができる。
【０２６３】
従来のトランス遺伝学の方法によれば、通常又はモデファイされた遺伝子の付加的コピーが、接合体の雄多核の中に注入され、受け入れ側マウスのゲノムＤＮＡの中へ集積するようになる。トランスジーンは、樹立されたトランスジェニック株においてメンデルの法則にしたがって伝達される。トランスジーンは、構造的に発現されるか、あるいは、例えばテトラサイクリンのような外因性医薬に、組織に特異的又は平等な応答性であり得る。トランスジェニック動物は、彼らの子孫が双方のトランスジーンを運搬し、発現するように、第２のトランスジーンを発現する第２のトランスジェニック動物に交差されることができる。
【０２６４】
〔ノックアウト動物〕
いずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎＲ若しくはＣｈｅｍｅｒｉｎまたはバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）のいずれかをコードする染色体の配列におけるホモ接合欠失を有する動物又はバリアントは、レセプター及びリガンドの機能を研究するのに用いられることができる。特定の興味は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎノックアウトが区別できる表現型を有するかどうか、ＣｈｅｍｅｒｉｎがＣｈｅｍｅｒｉｎＲを結合するリガンドのみかどうか、またはファミリーのメンバーかどうかをいずれが指示するかということである。さらに特定の興味は、特異的な生理学上プロセス及び／又は病理学プロセスにおけるＣｈｅｍｅｒｉｎＲ／Ｃｈｅｍｅｒｉｎの同定の同定である。
【０２６５】
ｉ．標準的ノックアウト動物
ノックアウト動物は、ホモ接合組換えを用いた遺伝子欠失を創造する方法によって生産される。この技術は、胚から誘導され、培養で維持され、宿主胚盤胞の中へ導入されるときには動物の組織毎の成長に参加する可能性を有している胚性幹（ＥＳ）細胞の開発に基づく。ノックアウト動物は、ＥＳ細胞における特異的標的遺伝子にホモ接合組換えを行なうことによって生産され、これにより、ヌル対立遺伝子を生産する。ノックアウト動物を作製する技術は、よく説明されている（例えば、Ｈｕｚｅｒら、１９９７年、Ｃｅｌｌ、８８：１３１；及びＯｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、３９０：１６５、これらのいずれも参考にここに組み入れられる）。当業者は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ及びＣｈｅｍｅｒｉｎの配列（ここに開示されていて、当該分野で既知である）を用いて、ホモ接合のＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎノックアウト動物（例えばマウス）を作り出して、遺伝子標的構造物をつくる。
【０２６６】
ｉｉ．組織特異的ノックアウト
バクテリオファージＰ１部位特異的組換え酵素Ｃｒｅに基づく部位特異的組換えのためのシステムの発展により、標的されたホモ接合組換え方法は、改良されてきた。バクテリオファージＰ１からのＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡ組換え酵素は、明らかにされた組織又は成長段階で限定された遺伝子ノックアウトを作り出すために、トランスジェニックマウスアッセイで用いられる。領域的に限定された遺伝的欠失は、遺伝子全体のノックアウトとは逆に、表現型が特定の細胞／組織に起因するとできる有利さがある（Ｍａｒｔｈ、１９９６年、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１９９９年）。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系において、あるトランスジェニック株は、ｌｏｘＰ部位が興味ある遺伝子の１つ以上のエクソンの側面に配置するように設計される。このためのホモ接合体は、「ｆｌｏｘｅｄ遺伝子」と呼ばれ、細胞／組織タイプの転写プロモータの調節下で、Ｃｒｅ遺伝子を発現するセカンドトランスジェニックマウスと交差される。そして、Ｃｒｅタンパクは、ｌｏｘＰ認識配列間でＤＮＡを切開し、有効に標的遺伝子機能を取り除く（Ｓａｕｅｒ、１９９８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４：３８１）。この方法のインビボの例は今やたくさんあり、例えば、ほ乳類の組織特異的遺伝子の誘導可能な不活性化を含む（Ｗａｇｎｅｒら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：４３２３）。従って、当業者は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎは、選択された組織又は細胞タイプの中で、ホモ接合的に除去される組織特異的ノックアウト動物を生ずることができる。
【０２６７】
〔本発明の有用なキット〕
本発明は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のモジュレータのスクリーニングに有用なキットを提供し、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良に特徴づけられた疾患又は疾病の診断に有用なキットも提供する。本発明の有用なキットは、単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド（膜又は細胞に会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）したＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、例えばＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する、単離された膜上又はＳＰＲチップ上を含む）と単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを含むことができる。また、キットは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲに特異的抗体及び／又はＣｈｅｍｅｒｉｎに対する抗体を含むことができる。その代わりに、又はさらに、キットは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現するようにトランスフォームされた細胞及び／又はＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを発現するようにトランスフォームされた細胞を含むことができる。さらなる態様では、本発明のキットは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び／又はＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。またさらなる態様では、本発明のキットは、後述するように、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又はＣｈｅｍｅｒｉｎの増幅に有用な特異的プライマーを含んでもよい。本発明のキットの全ては、述べられた品目又は品目の組合わせ、及びこれらのためのパッケージ材料を含むだろう。キットは、また、使用指示書を含むだろう。
【０２６８】
〔発現ベクター〕
本発明は、また、Ｃｈｅｍｅｒｉｎと宿主細胞を含むベクターに関し、同様に組換え技術によるＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの生産にも関する。ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウィルスベクター、又はレトロウィルスベクターのであってもよい。Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドは、宿主内で、選択可能なマーカーの増殖を含むベクターに連結されてもよい。Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドは、ファージλＰＬプロモータ；大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｔａｃプロモータ；ＳＶ４０初期及び後期プロモータ；並びにレトロウィルスＬＴＲｓのプロモータのような適切なプロモータに実施可能に連結されるべきである。発現ベクターは、さらに転写開始部位及び転写末端部位、転写された領域内で、翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。
【０２６９】
構成物によって発現された転写物のコードしている部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチド末端にほとんど位置づけされる開始コドン及び停止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）で翻訳開始コドンを含む。発現ベクターは、また、１つ以上のプロモータを含む。採用され得る好適なプロモータには、レトロウィルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモータ、アデノウィルスプロモータ；サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータのようなヘテロ接合のプロモータ；呼吸シンシチウム（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウィルス（ＲＳＶ）プロモータ；ＭＭＴプロモータのような誘導可能なプロモータ、メタロチオネインプロモータ、ヒートショックプロモータ；アルブミンプロモータ；ＡｐｏＡＩプロモータ；ヒトグロブリンプロモータ；ヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼプロモータのようなウィルスチミジンキナーゼプロモータ；レトロウィルスＬＴＲ（上述のモデファイされたレトロウィルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモータ；及びヒト成長ホルモンプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。また、プロモータは、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモータであってもよい。
【０２７０】
示すように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択的マーカーを含むだろう。このようなマーカーには、有核細胞培養におけるジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンテターゼ、又はネオマイシン耐性；大腸菌及び他のバクテリアにおける培養のためにテトラサイクリン、カナマイシン、又はアンピシリン耐性遺伝子がある。ふさわしい宿主の代表例には、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｕｍｕｒｉｕｍ）のようなバクテリア細胞；酵母細胞のようなカビ細胞（例えば、サッカロミセスｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ  受託番号２０１１７８）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ  Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＣＯＳ、２９３、ボーズメラノーマ細胞のような動物細胞；及び植物細胞があるが、これらに限定されない。上記宿主細胞にふさわしい培養培地及び培養条件は、当該分野で知られている。
【０２７１】
〔遺伝子トランスファー法〕
遺伝子治療は研究されてきて、種々のタイプの病気の治療のために用いられてきている。一般に、遺伝子治療は、異常状態の正常化のために病気に冒された細胞に利益ある遺伝子をデリバリーする工程を含む。本発明は、肺、前立腺、食道、咽頭、大腸−直腸、肝胆道、胃、喉頭、膵臓、膀胱、胸部、大腸−直腸、卵巣、胃、子宮−賃貸、膵臓、肺、肝臓、リンパ腫、白血病における癌のような腫瘍／癌を含む病気の治療のためのＣｈｅｍｅｒｉｎ遺伝子の遺伝子トランスファー方法を提供する。本発明にしたがってＣｈｅｍｅｒｉｎ遺伝子トランスファーは、ウィルスベクター法及び非ウィルス法の双方によってなど、多くの手段を通じて達成されることができる。
【０２７２】
非ウィルス遺伝子トランスファー方法には、ＤＮＡプラスミド発現ベクター、リポゾーム、レセプター媒介エンドサイトーシス、及び粒子媒介（遺伝子銃）方法などがある。これら全ての方法は、当業者によく知られており、ここで参照として組み入れられる。
【０２７３】
ウィルス遺伝子トランスファー法は、レトロウィルス（レンチウィルスを含む）、アデノウィルス、アデノ−随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、種痘診、ファウルポックス（ｆｏｗｌｐｏｘ）、カナリポックス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ）ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルスなどがあり、これらは当該分野でよく知られている。一実施形態では、遺伝子トランスファーは、マウスＭｏｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａウィルスに基づくウィルス、キメラＭｏｌｏｎｅｙ−ヒトレンチウィルス（ＨＩＶ）ベクターなどのような、組換えレトロウィルスベクターに関係している。
【０２７４】
他の実施形態では、遺伝子トランスファーは、ヒトアデノウィルスに関係している。ヒトアデノウィルスは、そのライフサイクルを通じて５０以上の遺伝子産物を発現する遺伝子を含む３６ｋｂ二重ラセンのＤＮＡウィルスである。ベクターのＥ1領域を除くことによって、ウィルスは自己複製する能力を欠損し、治療上の発現配列を置くためのスペースが作られる。アデノウィルスベクターは、インビボ投与後の大部分の組織の中へ遺伝子をトランスファーすることに特に有効であることが示されている。他の特定の態様においては、アデノウィルスベクターは、モデファイされて、組織特異的、腫瘍選択的発現を表す（Ｄｏｒｏｎｉｎ，Ｋら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５：３３１４ー３３２４）。一実施例において、アデノウィルスプロモータＥ１Ａ領域が削除され、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のためのモデファイされたプロモータと置き換えられる。このモデファイされたアデノウィルスの発現は、肝細胞の癌細胞に限定される（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ，ＰＬら（１９９９年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１７２１−１７３３）。他の実施例では、アデノウィルスＥ４プロモータ領域が削除され、界面活性剤プロテインＢ（ＳＰＢ）のためのプロモータと置き換えられる。モデファイされたアデノウィルスの発現は、肺癌細胞に限定される（Ｄｏｒｏｎｉｎ，Ｋら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５：３３１４−３３２４）。
【０２７５】
他の態様においては、遺伝子トランスファーは、組換えアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターに関係する。ＡＡＶベクターは、小さな、１重ラセンのＤＮＡゲノムを含み、脳、骨格筋、及び肝組織を形質導入するように示されてきた。
【０２７６】
遺伝子トランスファーのために標的とされた細胞には、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ遺伝子のデリバリーが所望されるどの細胞も含む。一般に、細胞は、腫瘍細胞に限定されないように疾病に影響された細胞である。種々のほ乳類の細胞系は、また、遺伝子トランスファーに採用されることができ、実施例はサルの腎の繊維芽細胞、及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ２３：１７５（１９８１年）によって説明されているように、適合性のベクターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系のＣＯＳ−７ラインを含むが、これらに限定されない。具体的には、その細胞は癌細胞系のような疾病によって影響される組織から誘導される細胞系である。
【０２７７】
〔ＣｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎＲの相互作用に基づく体外治療アプローチ〕
体外遺伝子治療は、患者の血液又は組織からの細胞除去を含み、一般にインビトロでモデファイし、続いて、同じレシピエントの中へ移植して戻すことを含む。一実施形態では、核酸配列が、結果として生じる組換え細胞の生体内への投与に先だって、細胞内へ導入される。このような導入は、当該分野で既知のいずれかの方法によって実行されることができる。当該分野の既知の方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウィルス又はバクテリオファージベクターを用いた感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子トランスファー、マイクロセル媒介遺伝子トランスファー、スフェロプラスト融合などがあるが、これらに限定せず、当該分野で公知の全てを含む。遺伝子トランスファー方法は、核酸配列が細胞内で発現できること、好ましくはその細胞の子孫によって受け継がれて発現可能であるために、核酸配列の細胞への安定なトランファーを提供すべきである。結果として生じる組換え血液細胞は、好ましくは静脈内に投与される。使用に計画される細胞量は、所望の効果、患者状態などに依存し、当業者によって決定されることができる。遺伝子治療目的のために核酸が導入されることができる細胞は、所望の入手可能なタイプの細胞に拡張でき、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、繊維芽球、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；種々の幹細胞又は前駆細胞、具体的には、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られる造血幹細胞又は造血前駆細胞が挙げられるが、これらに限定しない。好ましい態様では、核酸配列は、切断されたものから全長までの範囲のポリペプチドを含むＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合するＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドのバリアントをコードする。好ましい態様では、体外遺伝子治療に用いられる細胞は、レシピエントと同原である。
【０２７８】
他の好ましい態様では、用いられる細胞は、樹状細胞である。例えば、樹状細胞は、造血前駆体又は付着末梢血単球から、誘導されることができる。培養された樹状細胞は、そのとき、腫瘍関連抗原とともに負荷される。腫瘍抗原の負荷は、種々の技術により達成されることができる。種々の技術には（１）精製された明瞭にされたペプチド又はモデファイされた腫瘍溶解物とともに律動的に送ること（ｐｕｌｓｉｎｇ）、（２）アポトーシス腫瘍細胞とともに共培養、（３）ＲＮＡを用いたトランスフェクション、（４）腫瘍細胞との融合、又は（５）上記で説明されたようなウィルス又は非ウィルス遺伝子トランスファーシステムを用いた遺伝子トランスファー。負荷された樹状細胞は、患者の免疫応答を刺激するために患者の中に注入される。
【０２７９】
他の態様では、細胞は、異なるタイプの組成物、好ましくはタンパク又はペプチドと共に律動的に送られることができる。そのような技術は、当業者に知られており、Ｎｅｓｔｌｅら（１９９８年）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．４：３２８−３３２に説明されている。要するに、細胞が、好適な培地内へトランスファーされ、組成物とともにふさわしい時間だけインビトロで培養される。そうして、細胞は洗浄され、好適な量の培地内に、インビボトランスファーのために再懸濁される。好ましい態様では、ペプチドパルスのために用いられる細胞は、組成物が適用されるべき個体と同種のものである。特に好ましい態様では、細胞は、レシピエントと同原である。他の好ましい態様では、細胞は、樹状細胞である。
【０２８０】
体外の樹状細胞遺伝子治療の特定の実施例には、メラノーマ内（Ｎｅｓｔｌｅら（１９９８年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８−３３２）、腎癌（Ｋｕｒｏｋａｗａら（２００１年）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９１：７４９−７５６）、膠腫（Ｙｕら（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：８４２−８４７）、乳及び卵巣（Ｂｒｏｓｓａｒｔら（２０００年）、Ｂｌｏｏｄ，９６：３１０２−３１０８）、前立腺（Ｂｕｒｃｈら（２０００年），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６：２１７５−２１８２）、消化管、大腸及び肺（Ｆｏｎｇら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｌ．，１６６：４２５４−４２５９）で評価された治療がある。
【０２８１】
〔体内遺伝子治療〕
本発明は、体内遺伝子治療方法を提供する。この方法は、核酸又は核酸／タンパク複合体の治療される個体への直接的投与を包含する。例えば、体内遺伝子治療を用いた動物モデルの成功例は、肺癌（ＺｈａｎｇとＲｏｔｈ（１９９４年）、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，８（５）：７５５−７６９）と皮膚のメラノーマ（Ｇａｒｙら（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：１１３０７−１１３１１）などの治療に見出されることができる。
【０２８２】
核酸又はタンパクは、好ましくは本発明のＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（配列ＩＤ  ＮＯ：７）、切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（配列  ＩＤ  ＮＯ：７２）又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（配列ＩＤ  ＮＯ：１）である。体内への投与は，たくさんの設立された技術により達成され、この技術には、裸の核酸の注射、ウィルス感染、リポソーム経由輸送、上記で説明されるようなエンドサイトーシスによる輸送などがあるが、これらには限定されない。好適なウィルスベクターには、例えば、上記で詳述したように、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルスなどがある。
【０２８３】
ベクター内でのＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチド又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドは、個体が持つ組織の間質空間にデリバリーされることができる。組織の間質空間には、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺及び結合組織がある。
【０２８４】
本発明の一実施形態において、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチド又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ／ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドは、リポソーム調製において複合化される。本発明の使用のためのリポソーム調製は、カチオン調製、アニオン調製、中性調製を含み、すべてが当該分野でよく知られている。
【０２８５】
一実施形態において、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎＲＮＡ配列を含むレトロウィルスベクターは、体内遺伝子治療に用いられる。本発明の他の実施形態において、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドを含むアデノウィルス随伴ウィルスベクターが用いられる。他の態様において、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを含むアデノウィルスベクターが用いられる。
【０２８６】
本発明の一実施形態において、遺伝子トランスファーのためのウィルスベクターは、ベクターの発現が特異的腫瘍又は特定組織に限定されるために、プロモータがモデファイされているアデノウィルスベクターである。このタイプのベクターは、標的された位置に興味のある遺伝子をデリバリーする有利さを有していて、これにより、通常の細胞組織を含む種々の組織へのウィルスベクターの非特異的デリバリーによる危害の機会を減じる。
【０２８７】
本発明の特定の実施形態において、体内遺伝子治療がＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする遺伝子を、患者の免疫応答または病気の治療的処理を刺激するために患者に投与することを含む。好ましくは、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする遺伝子が、プラスミドベクター又はウィルスベクター、又は非ウィルス的方法によって投与される。好ましくは、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする遺伝子は、発現が組織特異的及び／又は腫瘍選択的であるアデノウィルスベクターによって投与される。
【０２８８】
Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ又は切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎをコードするポリヌクレオチドは、血管新生促進タンパクをコードする他のポリヌクレオチドとともに投与されてもよい。血管新生促進タンパクの例には、酸性繊維芽細胞増殖因子及び塩基性繊維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子α及びβ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍ネクローシス因子α、肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子、及び酸化窒素シンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
デリバリーされる物質の有効量の決定は、例えば、物質の化学的構造及び生物学的活性、動物の年齢及び体重、治療およびその厳格性を要求する明確な状態、及び投与ルートを含むたくさんの要因に依存することができる。治療頻度は、１回分に投与されるポリヌクレオチド構成要素量のようなたくさんの因子に依存し、同様に患者の健康及び病歴にも依存する。服用の正確な量、回数、及び服用のタイミングは、医師又は獣医師の参加によって決定される。
【実施例】
【０２９０】
下記実施例において、もし述べていなければ、すべての化学物質はシグマ社から入手される。細胞培養培地は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製であり、ペプチドはＢａｃｈｅｍ社製である。
【０２９１】
〔実施例１：ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲレセプターのクローニング〕
ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲは、Ｓａｍｓｏｎら（１９９８年）（配列ＩＤ  ＮＯ：１と２）で説明されているように、クローン化された。本発明に有用な他のＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをクローン化して使用する１セットの工程の例として、その方法はここで説明される。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ配列をクローン化するために、古典的なクローニング処理が、ヒトゲノムＤＮＡ上で達成された。設計されたＨＯＰ１０２（ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ）のクローンが、退化オリゴヌクレオチドを用いることによって、ヒトゲノムＤＮＡから増幅された。ＨＯＰ１０２は、ｆＭＬＰレセプター及びＣ５ａレセプターとの４５−５０％アイデンティティと、ケモカインレセプターのファミリーとの幾分か低い類似性に、分配している（図５）。この部分的クローンは、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いられ、３つのオーバーラップしたλクローンが単離された。クローンの制限地図が確立され、１．７ｋｂ  ＸｂａＩ断片が、ｐＢＳ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内でサブクローン化され、両方のらせんについて配列決定された。この配列は、１００％アイデンティティをもって、ＨＯＰ１０２プローブ全体をを含んで見出された。この新規な遺伝子は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号Ｙ１４８３８）と名付けられた。
【０２９２】
増幅するＣｈｅｍｅｒｉｎＲのコード配列は、１．１ｋｂ断片になった。この断片は、ｐＣＤＮＡ（インビトロジェン社）ベクターの中へサブクローン化されて、双方のらせんについて配列決定された（図１及び２）。
【０２９３】
マウスとラットのオルソローグ遺伝子は、それぞれ図３及び図４に開示される。
【０２９４】
〔実施例２ａ：ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの天然リガンドの精製とＣｈｅｍｅｒｉｎの同定〕
子宮癌患者からの約１リットルのヒト腹水流体が予め濾過され、続いて０．４５μｍ及び０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（ミリポア社）を通して濾過された。
【０２９５】
工程１において、腹水は、室温で流速２０ｍｌ／ｍｉｎで、５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡで予め平衡化されたＣ１８逆相カラム（１０ｍｍ×１００ｍｍ  ＰＯＲＯＳ２０Ｒ２ビーズ、アプライドバイオシステムズ社）上に直接ロードされた。そうして０．１％ＴＦＡ中で５−９５％勾配のＣＨ３ＣＮが、６％／ｍｉｎの傾きでアプライされ、５ミリリットルづつフラクションが集められ、各フラクションの２０μｌが取り分けられ、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現ＣＨＯ細胞内で〔Ｃａ２＋〕トランジエントを分析した。
【０２９６】
工程２において、活性フラクション（２５％ＣＨ３ＣＮと４０％ＣＨ３ＣＮとの間で約１０フラクション溶出）がプールされ、ｐＨ５に調節され、２０μｍＭｉｌｌｅｘフィルター（ミリポア社）を通して濾過され、ｐＨ４．８の酢酸バッファーで３倍に希釈され、そうして、４℃でｐＨ４．８の酢酸バッファーで予め平衡化されたカチオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｃａｔ９．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）にアプライされた。ｐＨ４．８の酢酸バッファー中０−１Ｍ勾配のＮａＣｌが、流速４ｍｌ／ｍｉｎで１０％／ｍｉｎで、アプライされた。１ミリリットルフラクションが集められ、各フラクションからの２５μｌアリコットが、１０ｋＤａカットオフメンブレン（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ、ミリポア社）上で脱塩した後、〔Ｃａ２＋〕アッセイに用いられた。
【０２９７】
工程３において、活性フラクション（約７００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出）がプールされ、ＮａＣｌ濃度約１０ｍＭにまで、１０ｋＤａカットオフウルトラフリーメンブレン上で脱塩された。別のカチオン交換ＨＰＬＣランからの溶出液がプールされた。ｐＨ４．８の酢酸バッファー用いて４℃で予め平衡化された第２のカチオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｃａｔ２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上にロードされ、ｐＨ４．８の酢酸バッファー中０−１Ｍ勾配のＮａＣｌが、流速１ｍｌ／ｍｉｎで２％／ｍｉｎの傾きで適用された。０．５ｍｌフラクションが集められ、各フラクションから、２０μｌアリコートが、１０ｋＤａカットオフＵｌｔｒａｆｒｅｅメンブレン上で脱塩した後、細胞内カルシウムのために用いられた。
【０２９８】
工程４では、活性フラクションがプールされ、Ｈ２Ｏ／０．１％Ｈ３ＰＯ４で８倍希釈され、室温で、流速１ｍｌ／ｍｌの流速で、５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％Ｈ３ＰＯ４を用いて予め平衡化された分析的Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上にロードされた０．１％Ｈ３ＰＯ４中５−９５％勾配ＣＨ３ＣＮが、ＣＨ３ＣＮ２５−４０％の間の勾配で、０．３％／ｍｉｎで適用された。個々のＵＶ吸収ピーク（２１４ｎｍ）が手動で集められ、各フラクション体積の約５％について、生物学的活性が分析された。
【０２９９】
工程５では、活性ピーク（約２８％ＣＨ３ＣＮ）が、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡで６倍希釈され、５％ＣＨＣＮ／０．１％ＴＦＡで予め平衡化された第２のＣ１８逆相カラム（１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上に、室温、流速０．１ｍｌ／ｍｉｎで、直接ロードされた。０．１％ＴＦＡ中５−９５％勾配のＣＨ３ＣＮが、ＣＨ３ＣＮ３０−４５％の間の勾配で０．３％／ｍｉｎでアプライされた。４０％ＣＨ３ＣＮにて、手動でファイナルピークが集められ、マススペクトロメトリーで分析された。８００ｍｌの卵巣癌腹水流体から、５０ｆモルのＣｈｅｍｅｒｉｎを得た。
【０３００】
活性フラクションは、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ内で完全に乾燥され、ｐＨ８．７の０．１ＭＴｒｉｓ  １０μｌ内に再懸濁された。９５℃で１５分間、サンプルを沸騰させた後、そのサンプルは、モデファイされたトリプシン（プロメガ社）２５０ｎｇ存在下、３７℃で一晩中培養された。そうして、消化されたサンプルが、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社）上での固相抽出によって精製された。溶出されたサンプル（７０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ中１．５μｌ）が、１２０ｍｇ／ｍｌジヒドロキシ安息香酸マトリックスの存在下で、ＭＡＬＤＩ標的上にアプライされ、そうしてＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦプロトタイプ（マイクロマス社）上で分析された。８ペプチドは、ヒトｔａｚａｒｏｔｅｎｅ誘導遺伝子（Ｔｉｇ）−２（図２０）の産物から誘導することが予測され、（予測されたシグナルペプチド除去後の）Ｔｉｇ２遺伝子産物である１４３アミノ酸長の配列のうちの９１アミン酸をカバーしている。しかしながら、Ｃ末端ペプチド（ペプチド８）はトリプシンペプチドではなく、予測されたタンパクの最後の６アミノ酸を欠いている。この観察は、コードされた前駆体（図１２、１３）のタンパク分解処理から活性化合物を生じるかもしれないことを示した。
【０３０１】
〔実施例２ｂ：ヒト天然Ｃｈｅｍｅｒｉｎの精製（図２１）〕
腹水流体１リットルが濾過され、逆相カラム（１０×１００ｍｍ、Ｐｏｒｏｓ２０Ｒ２ビーズ、アプライド・バイオシステムズ社）上に、ロードされた（ランあたり５０ｍｌ）。０．１％ＴＦＡ中の５−９５％ＣＨ３ＣＮ勾配でアプライされ、５ｍｌフラクションが集められ、ＣｈｅｍＲ２３活性化のために分析された。活性フラクションは、ｐＨ４．８に調節され、１０％ＣＨ３ＣＮ存在下でカチオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｃａｔ９．６×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）にアプライされ、酢酸バッファー（ｐＨ５）中０〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した（１０％／ｍｉｎ）。活性フラクションは、脱塩され（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ、カットオフ値：１０ＫＤａ、ミリポア社）、第２のカチオン交換カラム上（Ｐｏｌｙｃａｔ２．１×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）にロードされ、同じバッファー（２％／ｍｉｎ  ＮａＣｌ勾配）で溶出した。活性フラクション（０．５ｍｌ、脱塩されている）がプールされ、０．１％Ｈ３ＰＯ４で８倍希釈され、Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上にロードされた。０．１％Ｈ３ＰＯ４中５−９５％ＣＨ３ＣＮ勾配（０．３％／ｍｉｎ）がアプライされ、個々のＵＶ吸収ピーク（２１４ｎｍ）が手動で集められ、分析された。活性フラクションは、第２のＣ１８カラム（２．１×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ、０．１％ＴＦＡ中５−９５％ＣＨ３ＣＮ、０．３％／ｍｉｎ）上にロードされた。ピークは手動で集められ、マススペクトルによって分析された。診断又は治療目的のために集められたヒト材料の用途は、ブリュッセル自由大学のメディカルスクールの倫理委員会によって承認された。
【０３０２】
〔実施例２ｃ：マススペクトル分析〕
活性フラクションは真空乾燥され、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．７）の１０μｌ中に再懸濁され、９５℃で１５分間加熱され、トリプシン２５０ｎｇ（プロメガ社）を用いて３７℃で一晩中培養され、固相抽出（Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐ、ミリポア社）によって精製された。消化されたペプチドは、金属製のＭＡＬＤＩ標的上に、７０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ１．５μｌ中に溶出され、乾燥され、そしてマトリックス混合（２ｍｇ／ｍｌ、２，５−ジヒドロキシ安息香酸と１０ｍｇ／ｍｌ＜−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２ｍＭフコース、５ｍＭ酢酸アンモニウム）１．５μｌの中で混合された。ＳＤＳ／アクリルアミドゲルから切り取られたタンパクサンプルとして、そのサンプルは、（１４）で説明されたように処理された。組換えタンパクのＮ末端の決定としては、消化されたペプチドが、最初にＣ１８カラム（１×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ、０．１％ＴＦＡ中５−９５％ＣＨ３ＣＮ、２％／ｍｉｎ）上で分離され、各ＨＰＬＣフラクションが別々に分析された。マススペクトル分析は、ＭＡＬＤＩ源（マイクロマス社）で設置されたＱ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｌｏｂａｌマススペクトロメータで行なわれ、ウシ血清アルブミンからのトリプシンペプチド及びキモトリプシンペプチドのモノ中性子質量を用いて計算された。イオン化は、窒素レーザー（３３７ｎｍビーム、１０Ｈｚ）を用いて達成され、獲得はＶモードリフレクトロン位置内で行なわれた。マイクロ配列決定は、親イオンの選択の後、アルゴン誘導されたフラグメンテーションによって行なわれた。
【０３０３】
８ペプチドはヒトＴａｚａｒｏｔｅｎｅ誘導遺伝子（ＴＩＧ）−２（図２２）産物に由来すると予測され、、ＴＩＧ２遺伝子産物（予測されたシグナルペプチドの除去後）の１４３アミノ酸長配列の中から９１アミノ酸をカバーしている。しかしながら、Ｃ末端ペプチド（ププチド８）は、予測されたタンパクの最後の６アミノ酸を欠いたトリプシンペプチドではなかった。この観察は、活性化合物がコードされた前駆体のタンパク分解処理から生じるかもしれないことを指し示した（表１及び図２２）。
【０３０４】
表１：モノ中性子マスフィンガープリンティングで見出されたペプチド配列
アステリスク（＊）で示されている２つのペプチドは、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションによってマイクロ配列決定された。ペプチドの位置は、Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎアミノ酸配列（配列ＩＤ  Ｎｏ：８）と比べて定義されている。
【０３０５】
【表１】
2007534297.tif 000003
【０３０６】
〔実施例３：ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎのクローニングと組換え発現〕
Ｃｈｅｍｅｒｉｎ配列（図６、ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号Ｑ９９９６９）をクローン化するために、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が、腎臓ｃＤＮＡ（クロンテックラボラトリー）で行なわれた。プライマーは、ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ配列に基づいて合成され、下記の通りとなった：
【０３０７】
【化１】
2007534297.tif 000004
【０３０８】
増幅は、供給者によって説明された条件下で、Ｑｉａｇｅｎ  Ｔａｑポリメラーゼを用いて、以下のようなサイクルで行なわれた：９４℃で３分、９４℃で１分間５８℃で９０秒間及び７２℃で９０秒間の３５サイクル、続いて７２℃で１０分間の最終培養。増幅は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ遺伝子のコード配列全体を含む５００ｂｐの断片について、することになった。この断片は、ＤＮＡ配列分析のためにベクターｐＣＤＮＡ３（インビトロジェン社）の中へサブクローン化された。
【０３０９】
Ｍａｘｉｐｒｅｐ（キアゲン社）ＤＮＡが、１０ｃｍプレート上のＦｕｇｅｎｅ６を用いて大きなＴ抗原（２９３Ｔ）及びＣＯＳ−７細胞を発現するＨＥＫ２９３細胞のトランジエントトランスフェクションの中で用いられた。並行して、トランスフェクションは、発現ベクターだけが同じ細胞系（モックトランスフェクトされた）の中で行なわれた。トランスフェクション２４時間後、培地は、９ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２，１％ＢＳＡよって置換され、上清３ｍｌが２４時間ごとに３日間集められた（トランスフェクション後、４８、７２及び９６時間）。ＣＨＯ細胞は、同じプラスミドでトランスフェクトされ、このトランスフェクトされた細胞は、Ｇ４１８とともに選択された。馴し培地の活性は、エクオリンアッセイを用いて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現細胞上で、実証された。
【０３１０】
〔実施例４：酵母中のＣｈｅｍｅｒｉｎの組換え発現〕
ヒト及びマウスＣｈｅｍｅｒｉｎのコード配列は、下記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅される（２つの異なるプライマーがヒトＣｈｅｍｅｒｉｎの５’端の増幅のために用いられて、このタンパクのシグナルペプチド異なる予測を考慮する）：
【０３１１】
【化２】
2007534297.tif 000005
【０３１２】
この増幅されたＣｈｅｍｅｒｉｎ配列がクローン化され、ｐＰＩＣ９Ｋ、発現されたタンパクの分泌を行なうシグナルを含むマルチコピーＰｉｃｈｉａ発現プラスミド（インビトロジェン社）内にインサートされる。形質転換後、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、Ｇ４１８抗生物質を用いて選択される。選択後、２０クローンが、この発現について分析され、最も高い発現を有するクローンが、シェーカーフラスコにおける大規模発現のために増幅される。培地が集められ、遠心分離され、Ｃｈｅｍｅｒｉｎの最初の精製のために用いられたものに由来するプロトコルで部分的精製に用いられた（上記参照）。
【０３１３】
〔実施例５：選択されたアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）で融合されたキメラＣｈｅｍｅｒｉｎの組換え発現〕
マウス及びヒトＣｈｅｍｅｒｉｎをコードする配列が、ＰＣＲによって増幅され、クローン化され、配列決定された。ＰＣＲ及び配列決定プライマーは下記通りである。
【０３１４】
【化３】
2007534297.tif 000006
【０３１５】
クローン化されたＣｈｅｍｅｒｉｎ配列は、そうしてほ乳類のバイシストロン性の発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３の中へサブクローン化されて、Ｃｈｅｍｅｒｉｎのカルボキシ末端で分泌されたアルカリフォスファターゼに連結され、６ヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）でタグ化されたＣｈｅｍｅｒｉｎとともに融合タンパクを得る。ＣＯＳ−７、大きなＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するＨＥＫ−２９３を含むほ乳類細胞、及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が、Ｆｕｇｅｎｅ６ＴＭを用いたこのプラスミドでトランスフェクトされ、１０％ウシ胎児血清；１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２．５μｇ／ｍｌのファンギーゾーン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（アンフォテリシンＢ）を含む完全Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ライフテクノロジー社）中で、３−４日間培養された。Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ６を含む上清が、遠心分離後集められ、濾過され（０．４５μｍ）、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）及び０．０２％アジ化ナトリウムを添加後、４℃で保存された。
【０３１６】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎ融合タンパクの１工程であるアフィニティ精製として、上清が１ｍｌのＨｉｓ結合残基（キアゲン社）にアプライされた。洗浄後、結合されたＣｈｅｍｅｒｉｎ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ６が、イミダゾールの勾配で溶出される。単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ６濃度がサンドイッチタイプのＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によって決定される。簡易なマイクロタイタープレートは、抗胎盤性アルカリフォスファターゼ抗体でコートされる。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした後、サンプルは、播種され、室温で１時間培養される。洗浄後、プレートは、室温で１時間、１：５００で希釈されたビオチン化ウサギ抗胎盤性アルカリフォスファターゼとともに培養され、再び洗浄されて、３０分間、ペルオキシダーゼを結合したストレプトアビジンとともに培養される。洗浄後、結合ペルオキシダーゼは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応させられる。この反応は、１Ｎ硫酸を添加することにより停止させられ、４５０ｎｍでの吸収が測定される。アルカリフォスファターゼ活性は、Ｇｒｅａｔ  ＥｓｃａｐｅＴＭ検出キット（クローンテック社）を用いて化学発光アッセイにより決定される。精製された胎盤性アルカリフォスファターゼが、標準曲線をえがくのに、用いられる。酵素活性は、相対光ユニット／ｓｅｃとして表わされる。
【０３１７】
〔実施例６：定量ＲＴ−ＰＣＲ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ転写物及びＣｈｅｍｅｒｉｎ転写物は商業的に入手（クローンテック社及びＡｍｂｉｏｎ社）または特定場所で調製（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、キアゲン社）されたヒト組織及び血液細胞ポピュレーションからの総合的又はｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡサンプル内で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって、検出された。プライマーは、前進方向として、５’−ＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：３４）、逆方向として５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：３５）、Ｃｈｅｍｅｒｉｎのプローブとして５’−ＡＡＣＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：３６）、前進方向として５’−ＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：３７）、逆方向として５’−ＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：３８） 及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲのプローブとして５’−ＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：３９）、前進方向として５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：４０）、逆方向として５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：４１）、参考ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロギナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプローブとして５’−ＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧ−３’（配列ＩＤ  ＮＯ：４２）であった。標準曲線は、３個の遺伝子のために、系統的にランされ、Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲの転写物コピー数は、各サンプルのＧＡＰＤＨ転写物コピー数に規格化された。
【０３１８】
我々は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって種々のヒト組織と白血球ポピュレーションにおいて、ＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎとｃｈｅｍｅｒｉｎＲ転写物の存在を調査した。未熟な樹状細胞に加えて、ｃｈｅｍｅｒｉｎＲ転写物が、脾臓、リンパ節及び肺、及び他の多くの組織でより低いレベルで主に見出された（図２４Ｂ）。たくさんのＣｈｅｍｅｒｉｎ転写物が、肝臓、肺、卵巣（図２４Ｃ）内で見出され、より低いレベルでは、ほとんどの組織で検出されることができた。しかしながら、興味あることに、ｃｈｅｍｅｒｉｎの発現は、末梢血液白血球ポピュレーション内で見出されなかった。遺伝的免疫感作（Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌａら、１９９８年で説明されているように）ヒトｃｈｅｍｅｒｉｎＲに対して生成されたモノクローナル抗体、及びレセプターを発現する（データを示さず）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系におけるＦＡＣＳによって特徴づけられるモノクローナル抗体が、樹状細胞及びマクロファージの表面でのレセプターの存在を確認するのに用いられた。高レベルのｃｈｅｍｅｒｉｎＲ免疫感作が、単球に誘導された未熟な樹状細胞上で見出され、ｃｈｅｍｅｒｉｎＲがＬＰＳ又はＣＤ４０Ｌ刺激の結果として、細胞の成熟に続いてダウンモジュレートされた（図２４、Ｄ及びＥ）。同時に、ｃｈｅｍｅｒｉｎＲ免疫反応性が、単球誘導されたヒトマクロファージの表面で観察された（図２４Ｆ）。
【０３１９】
〔実施例７：ＣｈｅｍｅｒｉｎＲのための機能的アッセイ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現クローンが、共発現しているミトコンドリアアポエクオリンとＧα１６へのＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクションによって入手され、ノザーンブロッティングによる希釈及び選択を制限している。ポジティブクローンが、上記で説明されるように調製されたヒト卵巣腫瘍腹水抽出物とともにスクリーニングするのに用いられた。ミトコンドリアのエクオリンの細胞内Ｃａ２＋放出の化学発光に基づく機能的アッセイ（Ｓｔａｂｌｅｓら、１９９７年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：１１５−１２６；ここでは参照として組み入れられる）が説明されるように行なわれた（Ｄｅｔｈｅｕｘら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２  １５０１−１５０８；ここで参照として組み入れられる）。要するに、細胞は、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだＰＢＳ中のプレートから集められ、ペレット化されてＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内に５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁された。細胞は、室温で４時間、５μＭ  Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ  Ｈ（モレキュラープローブス社）とともに培養された。そうして、細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内で洗浄され、０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁された。そうして、細胞がテストアゴニストペプチド又は組織抽出物を含むプレートと混合され、光放出がＭｉｃｒｏｌｕｍａｔルミノメータ（パーキンエルマー社）を用いて３０秒間記録された。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）として表される。
【０３２０】
図１７は、ＣＨＯ細胞内で発現されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲに対する、切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎペプチド（配列ＩＤ  ＮＯ：７３、図１６）の濃度応答曲線を示す。このアッセイは、先のパラグラフ内で説明されるように実行された。図に示すように、切断されたＰｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ分子は、ＥＣ５０が４．２７ｎＭでＣｈｅｍｅｒｉｎＲを活性化する。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）で表される。
【０３２１】
〔実施例８：組換えＣｈｅｍｅｒｉｎによってＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する細胞の活性化〕
Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又はｐＣＤＮＡ３だけをコードするｐＣＤＮＡ３でトランスフェクトされたＣＯＳ−７、ＣＨＯ−Ｋ１及び２９３Ｔ細胞の馴し培地が集められ、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現するＣＨＯ細胞上でのエクオリンアッセイに用いられた。結果を図１４に示す。馴しの上清量が増大すると、その結果、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現するエクオリンシステム細胞内の発光が増大する。
【０３２２】
〔実施例９：Ｃｈｅｍｅｒｉｎ及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲに特異的な抗体の産生〕
Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲに対して直接向けられる抗体は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲをコードするプラスミドをマウスへ繰り返し注入することによって生産された。第２の注入後の開始で血清が集められ、抗体の力価及び特異性が、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞、及び関係しないＧＰＣＲ  ｃＤＮＡのｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞について、フローサイトメトリーで評価された。いくつかの血清は陽性で、ヒトプライマリー細胞のフローサイトメトリー分析などの免疫組織化学及び他の関連する応用分野に用いられることができた。
【０３２３】
モノクローナル抗体は、不死化パートナーとしてのＮＳＯマウスのミエローマ細胞系を用いた標準ハイブリドーマ技術によって、免疫マウスから入手された。上清は、抗血清を評価するのに用いられたテストを用いる抗ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ抗体活性のためにテストされた。陽性ウェルからの細胞は、拡大され、凍結されて、その上清が採取された。
【０３２４】
特に、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、１００μｇ  ｐｃＤＮＡ−ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを又はＣｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端オクタペプチドＦＳＫＡＬＰＲＳを注入された。血清は、ＣＨＯ−ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ細胞系上でＦＡＣＳによってテストされ、あるいはＣｈｅｍｅｒｉｎペプチドについてＥＬＩＳＡによってテストされ、免疫マウスが、ＮＳＯミエローマ細胞系を用いる標準ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体を生成するのに用いられる。選択されたハイブリドーマのＩｇクラスは、ｍＡＢアイソタイプキット（ＩｓｏＳｔｒｉｐ、ベーリンガー・マンハイム社）を用いて決定された。
【０３２５】
図１５は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲに対して生じた抗体を特徴づける実験結果を示している。２／３組換えＣｈｅｍｅｒｉｎＲ  ＣＨＯ細胞と１／３モックトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ネガティブコントロール）から作成された組換え細胞の混合物は、抗ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ  ５Ｃ  １Ｈ２モノクローナル抗体（太線）を発現する細胞の上清、あるいは未知の抗体活性を有する細胞からの上清（細線、グレー塗りつぶし）のいずれかと反応させられた。ＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇで染色した後、これらの調製物が、フローサイトメトリーによって分析された。結果は、与えられた蛍光（ＦＬ１−Ｈ軸）を発現するたくさんの細胞（イベント軸）のヒストグラムとして表されている。両タイプの細胞の相対的割合によって証明されるように、モノクローナル５Ｃ  １Ｈ２は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ組換えサブポピュレーション細胞をネガティブコントロール細胞から区別させた。アッセイのバックグラウンド蛍光は、２番目の染色（グレー塗りつぶし）によって与えられる。
【０３２６】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎによってレセプター活性化をブロックするという抗ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ抗体の能力は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞についてのエクオリンアッセイを用いて調べられた。我々は、２つの抗体（４Ｃ７と１Ｈ２）が、濃度依存方式で（図２６Ａ）、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎによって促進されるカルシウムの動員を有効に阻害することができることを見出した。
【０３２７】
モノクローナル抗体である４Ｃ７及び１Ｈ２は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、ソールズベリー、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ州ＳＰ４  ＯＪＧ  イギリス）のコレクションに寄託され、そこへ請求することができる。仮の受託番号は０４０６１６０１と０４０６１６０２が、それぞれ４Ｃ７及び１Ｈ２抗体に対して割り当てられた。これらの抗体には、暫定的に、ＣＨＥＭＲ２３  ５Ｃ  ４Ｃ７（４Ｃ７）およびＣＨＥＭＲ２３  ５Ｃ  １Ｈ２（１Ｈ２）が与えられた。
【０３２８】
〔実施例１０：結合置換アッセイ〕
置換実験として、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ−ＣＨＯ−Ｋ１細胞（２５０００細胞／チューブ）が、２５０μｌの結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）脂肪酸フリー；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で非標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎの濃度が増大する状態下で、１ｎＭのＳＥＡＰ−ＨＩＳ６又はＣｈｅｍｅｒｉｎ−ＳＥＡＰ−ＨＩＳ６とともに、２７℃で９０分間、培養される。飽和実験として、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ−ＣＨＯ−Ｋ１細胞（２５０００細胞／チューブ）が、１μＭの非標識Ｃｈｅｍｅｒｉｎの存在下又は不在下で、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−ＳＥＡＰ−ＨＩＳ６の濃度増大に伴って、２７℃で９０分間培養される。培養後、細胞は５回洗浄され、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．０）５０μｌ、１％トリトンＸ１００中で分解される。サンプルは、６５℃で１０分間加熱され、細胞のホスファターゼを不活性化させる。分解物が遠心分離によって集められ、２５μｌの分解物におけるアルカリフォスファターゼ活性が、上述の化学発光アッセイによって決定される。
【０３２９】
〔実施例１１．競合結合アッセイ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞が、５ｍＭ  ＥＤＴＡを補ったＰＢＳを用いて、プレートから集められ、１０００×ｇで２分間緩やかにペレット化され、結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％ＢＳＡ）中に再懸濁された。競合結合アッセイは、トレーサ（特異的活性：６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、チューブあたり５００００ｃｐｍ）としての１２５Ｉ−ＹＨＳＦＦＦＰＧＱＦＡＦＳ（配列ＩＤ  ＮＯ：９１）、種々の濃度の競合物、及び最終体積０．１ｍｌ中に５０００００細胞を用いて、ミニソルブチューブ（Ｎｕｎｃ）内で行なわれた。総合的結合は、競合物不在下で測定され、非特異的結合が１００倍を超える非標識リガンドの存在下で測定された。サンプルは、２７℃で９０分間培養され、そして、結合されたトレーサーは、０．５％ＢＳＡ中で前もって浸されたＧＦ／Ｂフィルターを通した濾過によって分離された。フィルターは、シンチレーションカウンター（登録商標）内でカウントされた。結合パラメータは、１部位競合モデルにアプライされる非線形回帰を用いたＰＲＩＳＭソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて決定された。
【０３３０】
ｃｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端から誘導されるペプチドの構造機能分析は生物活性ペプチド（ＹＨＳＦＦＦＰＧＱＦＡＦＳ（配列ＩＤ  ＮＯ：９１）、エクオリンに基づくアッセイを用いて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞上でＥＣ５０が２８ｎＭ）をデザインし、結合研究のために、このペプチドのＮ末端チロシンを標識するようにした。このヨウ素化ペプチドは、競合物としての非標識ペプチド又は組換えｃｈｅｍｅｒｉｎを用いて、競合結合アッセイに用いられた。図２３Ｃに示すように、Ｋｉ値は、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎ（黒丸）については２．５±１．２ｎＭ（ｐＫｉ：８．８２±０．３８）と評価され、非標識ペプチド（白丸）については１２．１±４．９７ｎＭ（ｐＫｉ：７．９５±０．１８）と評価された（３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【０３３１】
〔実施例１２．細胞内カスケードアッセイ〕
ヒトＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞の膜へのＧＴＰγ３５Ｓの結合は、先に説明したように（Ｋｏｔａｎｉら、２０００年）行なわれた。要するに、ＣＨＯ−ｈＣｈｅｍＲ２３細胞からの膜（１０μｇ）（ＰＴＸで前処理された、あるいはされていない）が、９６ウェルマイクロプレート（ベーシックＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）内に、異なる濃度のペプチドを含むＧＴＰγＳ結合バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３μＭ  ＧＤＰ、１０μｇ／ｍｌサポニン）内で、室温で１５分間培養された。〔３５Ｓ〕−ＧＴＰγＳ（０．１ｎＭ、アメルシャム−ファルマシア社）が添加され、マイクロプレートは、１分間振盪され、さらに３０℃で３０分間培養された。培養は、８００ｇ、４℃で１０分間、マイクロプレートの遠心分離によって停止させられ、上清を吸引した。マイクロプレートは、ウェルあたり１分間、ＴｏｐＣｏｕｒｔ（パッカード、Ｄｏｗｎｅｒｓ、イリノイ州）内でカウントされた。機能的パラメータが、Ｓ字形投与応答モデルに適用された非線形回帰を用いたＰＲＩＳＭソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて決定された。
【０３３２】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲによって活性化されたシグナル経路が、ヒトレセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞内で調べられたが、Ｇα１６又はアポエクオリン（ＣＨＯ／ｃｈｅｍｅｒｉｎＲ細胞）では調べなかった。レセプター活性化は、ＣＨＯ／ｃｈｅｍｅｒｉｎＲ細胞及びヒトｃｈｅｍｅｒｉｎからの膜を用いてＧＴＰγ〔３５Ｓ〕結合アッセイでテストされた。その結果は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の刺激を示す（ＥＣ５０：７．８±０．４ｎＭ、４回の独立した実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ、図２３Ｄ）。さらに、低ナノモル濃度でのヒトＣｈｅｍｅｒｉｎによるこれらの細胞の刺激は、細胞内カルシウムの放出とｃＡＭＰ蓄積の阻害をもたらし（図示せず）、同様に、ｐ４２及びｐ４４ＭＡＰキナーゼのリン酸化をもたらした（図２３Ｅ及びＦ）。これらのすべての影響は、百日咳毒の前処理によって阻害され、Ｇｉファミリーメンバーの掛かり合いを示した。組換えＣｈｅｍｅｒｉｎ又はＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎが活性がないことは、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞についてのこれらのアッセイのいずれにおいても得られた（データを示さず）。
【０３３３】
〔実施例１３．ＣｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎＲの組織分布〕
半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、種々のヒト組織（クローンテック社とＡｍｂｉｏｎ社）からのｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ及び総ＲＮＡ上でｈＣＨＥＭＥＲＩＮとＣｈｅｍｅｒｉｎＲへの遺伝子特異的プライマーを用いて行なわれた。要するに、血液細胞からの総ＲＮＡは、Ｒｎｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いて調製された。ｈＣＨＥＭＥＲＩＮプライマーは、前進方向（５’−ＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＡＣＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３６）、及び逆方向（５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３５）であった。ｈＣｈｅｍｅｒｉｎＲプライマーは、前進方向（５’−ＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ；３７）、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３９）、及び逆方向（５’−ＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３８）であった。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ前進方向（５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’：配列ＩＤ  ＮＯ：４０）、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４２）、及び逆方向（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４１）が参考ｍＲＮＡプロフィールを生産するのに用いられた。種々の組織におけるｈＣＨＥＭＥＲＩＮ及びＣｈｅｍｅｒｉｎＲの分布は、それぞれ図１８及び１９に示されている。ｈＣＨＥＭＥＲＩＮ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲの発現レベルは、ＧＡＰＤＨ参考ｍＲＮＡ発現に対するｈＣＨＥＭＥＲＩＮ又はＣｈｅｍｅｒｉｎＲの比率として表される。
【０３３４】
〔実施例１４．ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎの発現と薬学的特徴〕
組換えＣｈｅｍｅｒｉｎタンパクが、０．４５μｍＭｉｌｌｅｘフィルター（ミリポア社）を通した濾過によって精製され、カチオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｃａｔ９．６×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ、酢酸バッファー（ｐＨ５）中０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配）を通して分離された。活性フラクションにおけるタンパク濃度は、銀染色後、グルタチオンＳトランスフェラーゼとリゾチームとの比較によって、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ後に決定された。
【０３３５】
ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎ  ｃＤＮＡがクローン化され、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で発現された。生物活性組換えタンパクは、馴し培地から均質に精製され、マススペクトロメトリ及びＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析されて、セリン１５７後のＣ末端切断を確認した（図示せず）。遺伝子産物の予期されたＣ末端配列に対応するペプチド（ＦＳＫＡＬＰＲＳ、配列ＩＤ  ＮＯ：８９）に対して生成されたモノクローナル抗体が、ＣＨＯ−Ｋ１馴し培地から、タンパク（Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）の未処理型を均質に精製するのに用いられた。このタンパク（Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）は、マススペクトロメトリによってＣ末端の６アミノ酸を保持していることが確認された（図示せず）。精製された組換えＣｈｅｍｅｒｉｎ（図２３Ａ）及びＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎの量（図示せず）が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び銀染色後に、タンパク標準と比較することによって決定され。ＣＨＯ−Ｋ１細胞によって放出される９０％を越えるＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎが酵素的に処理されてＣｈｅｍｅｒｉｎとなるることが推論された。ヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞上で並行して分析された２つの精製されたタンパクの生物学的活性の比較（図２３Ｂ）は、その処理されたＣｈｅｍｅｒｉｎを示した（黒丸）が未処理のＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ（白丸）（ＥＣ５０：３９３±１１６ｎＭ、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ）よりも約１００倍以上活性であった（ＥＣ５０：４．５±０．７ｎＭ、７つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ）ことを証明した。ＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎのＮ末端がマススペクトロメトリによって決定された：Ｐｒｅｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのアミノ酸２１−２７に相当するトリプシン性ペプチド（ＥＬＴＥＡＱＲ、８４５．４５Ｄａ、配列ＩＤ  ＮＯ：９０）が、配列決定によって同定され（データ示さず）、Ｅｘｐａｓｙ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）からのＳｉｇｎａｌＰソフトエウェアによって予測されたシグナルペプチド切断部位を確認した。ＣｈｅｍｅｒｉｎＲは構造的及び進化論的にＣ５ａ及びＣ３ａレセプター、プロスタグランジンＤ２レセプターＣＲＴＨ２、並びにオーファンＧＰＲ１レセプター（２０）に関係している。これらのレセプターは、殆どのケモカインレセプターを含む他の特徴付けられた及びオーファンレセプターの大きなセットと同様に、精製されたヒトＣｈｅｍｅｒｉｎと総合的に反応しないことが示された（データ示さず）。現在入手可能なケモカインであるＣ５ａ、Ｃ３ａ、ｆＭＬＰ、ブラジキニン、ＰＡＦ及びロイコトリエンなど全てを含む２００を越える生物活性分子のセットによるＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性化も、テストされた。これらの薬剤はすべて、これら自身のレセプターを活性化すると報告された濃度よりも遙かに高い濃度（１００ｎＭ又は１μＭ）でさえ、レセプター活性化を促進することができなかった。従って、Ｃｈｅｍｅｒｉｎとそのレセプターは、炎症性ケモカインとそれらのそれぞれのレセプターを勧誘する状況とは逆に、特異的なシグナリングシステムとして現れる。Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのタンパク分解の活性化が分泌的経路内で細胞内へ行なわれる��、あるいは細胞外のプロテアーゼの活性化によって潜在的に調節された細胞外プロセスであるかどうかを調べるために、培養された細胞の培地及び馴し培地内の精製されたヒトＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎの活性化をテストした。我々は、ハムスターＣＨＯ−Ｋ１細胞、サルのＣｏｓ−７細胞又はヒトＨＥＫ２９３細胞の培養培地内で培養（１００ｎＭ）している間に、これらの細胞からの馴し培地内（図２４Ａ）と同様に、ヒトＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎがＣｈｅｍｅｒｉｎＲ上で活性な形へ十分に変換されることができることを示した（データは示さず）。これらのデータは、Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ処理が細胞外で行なわれること、及び活性なＣｈｅｍｅｒｉｎ産物がタンパク分解処理によってさらに退化させられないこと、従って細胞外培地においては安定であることを示す。この処理に応答可能なプロテアーゼは知られていないけれども、この酵素活性の調節が、生体内での活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎの細胞外での生成を調節すると期待されている。
【０３３６】
〔実施例１５．ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端切断されたペプチドによるＣｈｅｍｅｒｉｎＲの高いアフィニティ活性化〕
ＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端ドメインから誘導されたペプチドの潜在的影響を調べるために、最後のシステインの後、Ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎの１３９位置で開始するいくつかのペプチドを、最初に合成し（表２）、Ｃｈｅｍｅｒｉｎレセプターとアポエクオリンとを共発現する細胞系列における細胞内カルシウム放出をトリガーするこれらの能力をテストした。我々は、Ｄｅｔｈｅｕｘら（２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１５０１−１５０８）で先に説明されたように、エクオリン（ａｒｑｕｏｒｉｎ）アッセイを用いた。図２５Ａ及び表２で示されるように、ＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端に相当するペプチド（ｈＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ−２５）が、高濃度（平均ＥＣ５０である１６０±２１μＭ）下でレセプターを活性化できなかったこともあれば、最後の６アミノ酸を欠いた同じペプチド（ｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−１９）がとても高いアフィニティ（平均ＥＣ５０である１６．７±３．２ｎＭ）を有するＣｈｅｍｅｒｉｎレセプターを活性化したこともあった。先に述べたように、処理された組換えＣｈｅｍｅｒｉｎのアフィニティ（平均ＥＣ５０である４．５±０．７ｎＭ）と比べて、組換えＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎは、活性が不十分であった（平均ＥＣ５０である３９３±１１６ｎＭ）。これらの結果は、ＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端側の処理の機能的重要性を示す先のデータを満足し、低いアフィニティ前駆体が高アフィニティ形リガンドへトランスフォーメーションすることを許す。驚いたことに、これらのデータも、ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端の１９個のアミノ酸に相当する配列が、高いアフィニティレセプター活性化を提供するのに十分であるらしいことを提案する。
【０３３７】
未熟型Ｃｈｅｍｅｒｉｎのプロセッシングの正確さを研究するために、我々は、さらに、Ｃ末端が切断されたペプチドのバリアントの影響を調べた（表２）。図２５Ｂ及び表２に示すように、調節ペプチドのＣ末端へのシングルアミノ酸（ｈ〔Ｌｙｓ−２０〕Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−１９）の添加は、アフィニティに強く影響した（ＥＣ５０１７０μＭが、ｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−１９の１６．７±３．２ｎＭの値と比べられる）。同じ影響が、少なくとも２個のアミノ酸除去後に観察された（ｈ〔Ｐｈｅ１８Ｓｅｒ１９〕Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−１９のＥＣ５０は２２０μＭ；ｈ〔Ａｌａ１７Ｐｈｅ１８Ｓｅｒ１９〕Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−１９のＥＣ５０が１３０±１０μＭ）。しかしながら、たった１つのアミノ酸除去が、わずかに応答を損なった（ｈ〔Ｓｅｒ１９〕Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−１９のＥＣ５０＝９７±１３ｎＭ）。これらのデータから、たったひとつのアミノ酸の追加が高アフィニティの細胞内カルシウムの応答を破棄するように、ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端は極めて精密であるらしい。我々はまた、位置１８におけるフェニルアラニン残基の機能的重要性を示し、さらにわずかに、位置１９におけるセリンの重要性を示す。こうして、ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端モデファイは、そのレセプターの高アフィニティ活性化を深刻に損ない、切断の活性化の正確性を示す。
【０３３８】
表２．切断されたＣｈｅｍｅｒｉｎペプチドのＥＣ５０値
【表２−１】
2007534297.tif 000007
【表２−２】
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【０３３９】
〔実施例１６．短い方のＣ末端側の９ペプチドであるＹＦＰＧＱＦＡＦＳはＣｈｅｍｅｒｉｎＲに対して高アフィニティである〕
そして、我々は、高い潜在力を有するＣｈｅｍｅｒｉｎレセプターを活性化できるＣ末端断片の最小長さを決定した。ｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−１９ペプチドのＮ末端ドメインの継続的切断を行ない、エクオリンアッセイを用いてテストした（図２５Ｃ）。残基１から残基１０までの切断（ｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−１７からｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−９まで、図２０及び表２におけるＥＣ５０値）が、細胞内のカルシウムシグナル伝達に影響しなかった。しかしながら、位置１１（ｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−８）におけるチロシン残基の除去は、レセプターに対するアフィニティの深刻な欠失をもたらし（２±１μＭのＥＣ５０は、調節ペプチド：ヒトｃｈｅｍｅｒｉｎ−１９のＥＣ５０値である１６．７±３．２ｎＭと比べられる）、その応答は短い方のペプチド（ｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−７のＥＣ５０は２２０±１００μＭ）については完全に破棄された。これらの結果は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎの最後のたった９個のアミノ酸だけが、高いアフィニティのレセプター活性化に必要であることを示している。９ペプチドのＥＣ５０が７±０．２５ｎＭであり、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎのアフィニティと同じ範囲である。
【０３４０】
〔実施例１７．Ｃｈｅｍｅｒｉｎ  Ｃ末端の芳香族残基は、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの活性化に必要である〕
Ｃｈｅｍｅｒｉｎの最後の９個のアミノ酸配列内の複数の残基がレセプター活性化に重要であるらしいので、我々は、アラニンスキャニング突然変異誘発アプローチを用いることによって、Ｃｈｅｍｅｒｉｎレセプター活性化におけるＹＦＰＧＱＦＡＦＳペプチドの各アミノ酸の相対的寄与を調べた。８個の異なるアラニン置換されたｈＣｈｅｍｅｒｉｎ−９アナローグが合成され、細胞内カルシウム蓄積のためにテストされた。図２５及び表２に示すように、変異させたペプチドであるＱ５Ａ、Ｐ３Ａ及びＳ９ＡのＥＣ５０は、調節ペプチド（平均のＥＣ５０は７±０．２５ｎＭ）と比べてより高い濃度（それぞれのＥＣ５０は３５．８±５．９ｎＭ、４２．５±７．５ｎＭ及び４８．３±５．７ｎＭ）にシフトされた。Ｆ２ＡペプチドとＹ１ＡペプチドのＥＣ５０はより厳しく影響され（それぞれのＥＣ５０は１５５．３±４１．６ｎＭと４９６±８０ｎＭ）、Ｐｈｅ６とＰｈｅ８のアラニン置換は劇的にＣｈｅｍｅｒｉｎレセプターの機能的応答を損なった（それぞれのＥＣ５０は５±１μＭと３８±７μＭ）。これらのデータは、芳香族のＹ１、Ｆ２、Ｆ６及びＦ８残基がレセプター活性化において重要な役割を果たしていることを提案した。
【０３４１】
〔実施例１８．プライマリー細胞における走化性とＣａ２＋の動員〕
先に（１７）で説明されたように、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）刺激によって、単球に誘導されたＤＣが生成された。１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激した後、ＤＣの成熟が達成された。マクロファージは、１０％ＦＣＳと１０ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦで補填されたＲＰＭＩ中で６日間、Ｐｅｔｒｉｐｅｒｍディシュ（Ｈａｅｒｅｕｓ）内で単球を培養することによって得られた。細胞移動は、（１８）で説明されたように、４８ウェルマイクロ走化性チャンバー技術を用いて評価された。Ｃａ２＋の動員アッセイとしては、単球に誘導されたＤＣ又はマクロファージ（フェノールレッドを含まないが０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ中に１０７細胞／ｍｌ）が、暗がりで３７℃、３０分間、５μＭ  ＦＵＲＡ−２（モレキュラープローブス社）で負荷された。負荷された細胞は、２回洗浄され、１０６細胞／ｍｌで再懸濁され、４Ｃ７モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）をブロックして、又はしないで、暗がりで４℃、３０分間保持され、発光スペクトロメータＬＳ５０Ｂの水晶キュベッテ（パーキンエルマー社）の中に移された。組換えＣｈｅｍｅｒｉｎに対して応答したＣａ２＋の動員は、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの結果として起る励起後に、５１０ｎｍで放射された蛍光の割合を記録することによって測定された。
【０３４２】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎの生物学的機能が、さらに白血球ポピュレーションについて調べられた。ＧｉクラスのＧタンパク、化学誘因物質レセプターに対するその構造的相関、及び抗原提示細胞におけるその発現を介するヒトＣｈｅｍｅｒｉｎＲの共役に従って、我々は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎがこれらの細胞に対する走化生因子として作用することを示した。樹状細胞及びマクロファージは、ヒト単球からインビトロで分化させられた。ヒト組換えＣｈｅｍｅｒｉｎは、インビトロで、マクロファージ及び未熟樹状細胞の移動を促進した（図２６Ｂ，Ｃ，及びＦ）が、これに反して成熟樹状細胞の走化生は観察されなかった（データ示さず）。最大の走化性の応答が、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎのバッチによれば、１００ｐＭから１ｎＭの濃度で得られた。そのようなベル形走化性応答は、他の機能的アッセイ中で観察されたＥＣ５０以下の濃度に対応する最大値をもって、典型的にはケモカインのような他の走化性因子のために観察される。百日咳毒を用いた処理の後で、その影響が完全に破棄され（図２６Ｃ及びＦ）、ＧｉクラスのＧタンパクの掛かり合いを証明した。マクロファージ及び樹状細胞の移動は、また、ＲＡＮＴＥＳ誘導された細胞移動を影響することなく、抗ＣｈｅｍｅｒｉｎＲモノクローナル抗体４Ｃ７によって阻害され（図２６Ｃ及びＦ）、その影響がＣｈｅｍｅｒｉｎＲによって特異的に媒介されることを証明した。チェッカーボード分析では、より下方及び上方の双方のウェルにおいてＣｈｅｍｅｒｉｎが等しい濃度で存在するとき、細胞移動における重大な増加は観察されなかった（図２６Ｃ及びＦ）。このようにして、Ｃｈｅｍｅｒｉｎによって誘導されたマクロファージと未熟樹状細胞の移動は、本質的に、ケモカインの影響よりも走化性の影響である。我々は、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎが抗原提示細胞におけるＣａ２＋の動員を誘導できるかどうかも調べた。予期されるように、未熟樹状細胞内での細胞内Ｃａ２＋レベルの増加は、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎに応答して増加し（図２６Ｄ）、これに反して、４Ｃ７抗体は、Ｃａ２＋応答を阻害した（図２６Ｅ）。類似の観察は、マクロファージについてなされた（図２６Ｇ及びＨ）。
【０３４３】
〔実施例１９．ヒトサンプル内での生物活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎ〕
Ｃｈｅｍｅｒｉｎがヒトの病的状態内でしばしば生成されるかどうかを調べるために、我々は１セットの炎症性流体を分画し、精製された組換えＣｈｅｍｅｒｉｎで作成された標準曲線と比べて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲにおける生物活性画分を測定することによってＣｈｅｍｅｒｉｎ量を分析した。活性範囲内（３３から３５８ｎｇ／ｍｌで、２から２３ｎＭに相当する）のウェルである活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎの重要なレベルは、卵巣癌から生じる大部分の腹水流体に見出されるが、関節炎患者からの関節液のプールにおいてと同様に、肝臓癌及び卵巣の高刺激シンドロームから生じる腹水流体においても見出された（表３）。興味あることに、活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎは関節制動の患者からプールされた関節流体の中で検出されなかった（表３）し、また血液濾過物からのフラクションにおいても検出されず（示さず）、その存在が炎症性状態に結びつくことを証明している。
【０３４４】
腹水流体（サンプル１−１７）及び関節流体（サンプル１８及び１９）のＣｈｅｍｅｒｉｎ量が、精製された組換えヒトＣｈｅｍｅｒｉｎで作成されたエクオリンに基づくアッセイ及び標準曲線を用いて、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現細胞におけるフラクションを分析することによって、２つの分画工程に続いて評価された。関節炎及び関節制動の患者からの関節流体が、遠心分離後、測定のためにプールされた。０．Ｈ．Ｓ．：卵巣の高刺激シンドローム。ｎ．ｄ．：検出できず（分析条件での検出限界が与えられる）。
【０３４５】
表３．ヒトサンプルにおける生物活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎ濃度
【表３】
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【０３４６】
〔実施例２０．マウスにおける体内遺伝子治療〕
Ｂ１６−Ｆ０メラノーマモデル
Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ）は、ＦｕＧｅｎｅ６を用いたｐＥＦＩＮ３−マウスＣｈｅｍｅｒｉｎプラスミドでトランスフェクトされ、８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いて選択された。クローンは、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現細胞についての馴し培地を分析することによって特徴付けられた。インビトロでの増殖速度は、３０で説明されたように、ＢｒｄＵ組み入れによって決定された。インビボでの研究のために、細胞がＰＢＳで２回洗浄され、１０週齢のＣ５７Ｂ１６マウス（グループあたり５−１１マウス、Ｈａｒｌａｎ、オランダ）の背中の中へ、皮下移植（０．１ｍｌ  ＰＢＳ中６×１０５細胞）された。直交する腫瘍直径（Ｄとｄ）が２日毎に測定され、体積は、Ｖ＝π（ｄ／２）（Ｄ／２）（ｄ／２）で算出された。統計的分析が、対になっていない非パラメータのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストを用いることによって行なわれた。顕微鏡分析としては、腫瘍は、ＯＣＴ内に埋設され、−８０℃のイソペンテン内で急速冷凍され（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）、１２μｍでカットされた。切片はルーチンな分析のためにヘマトキシリエオジン（ＨＥ）で染色された。全ての動物処理は、ブリュッセル自由大学のメディカルスクールの倫理委員会によって承認された。
【０３４７】
Ｃｈｅｍｅｒｉｎの生物学的機能は、さらにマウスモデルにおいて、インビボで調べられた。Ｇ１クラスのＧタンパク、化学誘因物質レセプターに対するその構造的相関、及び樹状細胞におけるその発現に従って、Ｃｈｅｍｅｒｉｎがこれらの細胞のための走化性因子として作用した。樹状細胞は、インビトロでヒト単球から分化させられた。ヒト組換えＣｈｅｍｅｒｉｎは、未熟であるが成熟でない樹状細胞のために、１ｎＭで最大活性を有していて、インビトロで走化性であった（本明細書の実施例１８参照）。
【０３４８】
活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎが、腫瘍の腹水から初めに分離されるので、マウスの腫瘍モデルにおけるインビボでのＣｈｅｍｅｒｉｎ発現の結果を調べることによって、腫瘍状況におけるこの発現の重要性を評価した。マウスＰｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎとＣｈｅｍｅｒｉｎＲ  ｃＤＮＡがクローン化された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞における発現に続いて、機能的分析は、ヒト及びマウスの組換えリガンドがヒト及びマウスレセプターの双方に等しく活性であった（データを示さず）。メラノーマ細胞系Ｂ１６Ｆ０は、マウスＣｈｅｍｅｒｉｎ  ｃＤＮＡを含むバイシストロン性発現ベクター（又はコントロールベクター）でトランスフェクトされ、安定な細胞系が樹立された。生物活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎの発現は、馴し培地の活性を測定することによって確認された。２つの選択された細胞系は、培養培地内に、約１２５ｎｇ／ｍｌの活性Ｃｈｅｍｅｒｉｎを２４時間を越える期間放出した。細胞周期の種々の期で細胞割合を測定することによって（図２７Ａ−Ｃ）、又は時間について細胞を直接カウントすることによって（データを示さず）評価するように、Ｃｈｅｍｅｒｉｎの発現は、細胞系の増殖速度をモデファイしなかった。しかしながら、同系マウスへの細胞の皮下移植の後、成長している腫瘍の表現型が大いにＣｈｅｍｅｒｉｎ発現によってモデファイされた。３つの独立したシリーズにおいて、野生型Ｂ１６Ｆ０細胞を受け入れている全てのマウスが、文献に従って、急速に増殖している腫瘍を発達させた。一方、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ発現細胞を受け入れているたくさんのマウスは、移植後４週間まで腫瘍を成長させなかった。３シリーズを組合わせることによって、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ発現細胞が移植された２４匹のマウスのうち５匹は、腫瘍を成長させなかった（コントロールグループにおいて０／２４に対して、ｐ＜０．０５、フィッシャーテスト）。成長している腫瘍のサイズは、またＣｈｅｍｅｒｉｎのグループに対してずっと小さい（細胞の移植後２１−２４日間、平均７０％の減少、図２７Ｄ）。違いは、移植後１０日から顕著であった（時間ポイントによれば、ｐ＝０．０２から０．００４まで、非パラメータ性のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテスト）。観察期間（１２から３０日）の終りでの肉眼観察は、２つのグループ間のたくさんの表現型の違いを明らかにした。Ｃｈｅｍｅｒｉｎ産生腫瘍は、よりたくさんの血管新生とより低い程度の壊死領域によって特徴付けられた。これらは、２つのグループに属する稀なサイズがマッチした腫瘍の選択の後で同様に観察されたように、これらの表現型の違いは、腫瘍サイズの違いの結果でなかった。ヘマトキシリンエオジン染色の後の顕微鏡分析は、これらの観察、特に壊死の程度の主要な違いを確認させ、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ産生腫瘍においては稀である一方、コントロール腫瘍の最も大きな部分を占めることを確認させた（図２７Ｅ及びＦ）。
【０３４９】
〔実施例２１．カルシウムフラックス−ＡｅｑｕｏｓｃｒｅｅｎＴＭアッセイ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ発現クローンが、トランスフェクトされて、ミトコンドリアのアポエクオリンとＧα１６を共発現した。ｍｉｄ−ｌｏｇ期の細胞は、テストに先だって、１８時間抗生物質なしで培地内で増殖され、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で緩やかにフラッシュイングすることによってはずされ、遠心分離によって回収し、そして「ＢＳＡ培地」（ＨＥＰＥＳを伴い、フェノールレッド＋０．１％ＢＳＡを伴わないＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２）内に再懸濁した。そうして細胞をカウントし、遠心分離し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内に再懸濁した。
【０３５０】
Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ  ｈ（モレキュラープローブス社、ｃａｔ  Ｎｏ．Ｃ−６７８０、ストック溶液：メタノール中に５００μＭ）は、最終濃度５μＭでの懸濁液の中の細胞に添加した。
【０３５１】
Ｆａｌｃｏｎチューブは、アルミニウムホイル内でラップし、そうして垂直回転ホイール上に置き、室温で（室温は２２℃以下に保持されるべきである）、活性エクオリンを再構成するために一晩中培養した。
【０３５２】
そうして、細胞は、「ＢＳＡ培地」内で１／１０に希釈し、６０分間、上記のように培養した。参考リガンドは、「ＢＳＡ培地内で希釈し、９６ウェルプレート内に分配した（５０μｌ／ウェル）。各測定のために、５０μｌの細胞（すなわち５０００細胞）が、リガンドを含むプレートの各ウェルの中へ注入され、放射光が細胞注入後の２０秒間に記録された（ＦＤＳＳ、Ｈａｍａｍａｔｕ）。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）で表された。ジギトニン（５０μＭ、シグマ社、ｃａｔ  ｎ°３７００６）が細胞応答のポジティブコントロールとして用いられる。
【０３５３】
放射光の密度が集光され、各ウェルに放射光の１つの代表値をもたらす。
【０３５４】
〔実施例２２．９ペプチドであるＹＦＰＧＱＦＡＦＳのＮ末端側の芳香族及び疎水性残基がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化に必要である〕
９ペプチドであるＹＦＰＧＱＦＡＦＳのＮ末端部分の重要性を調べるために、いくつかのペプチドを合成し、カルシウムフラックスＡｅｑｕｏｓｃｒｅｅｎアッセイを用いてテストした。図２８から３２及び表４に示されるように、芳香族又は位置Ｎ１及びＮ２に疎水性残基を含むペプチドは、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎの活性と同じ範囲内にある。これらのデータは、芳香族及び疎水性残基がレセプター活性化に重要な役割を果たすことを提案した。
【０３５５】
表４：疎水性残基（Ｎ末端）によってモデファイされたペプチドのＥＣ５０値及びアスパラギン酸残基とアミド機能によって位置９内でモデファイされたペプチドのＥＣ５０値
【表４】
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【０３５６】
〔実施例２３．９ペプチドであるＹＦＰＧＱＦＡＦＳのＣ末端部分のモディフィケーション〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲとの相互作用におけるＣ末端部分の役割を明らかにするために、位置９でのセリンを、アスパラギン酸残基に変異させ、Ｃ末端のカルボキシル基をアミド機能に置換させた。このペプチドは、カルシウムフラックスＡｅｑｕｏｓｃｒｅｅｎアッセイを用いてテストされた。図３３及び表４に示すように、このモデフィケーションは、組換えＣｈｅｍｅｒｉｎの同範囲内で活性を有するペプチドの同定化に導いた。
【０３５７】
他の実施形態
先の実施例は、本発明の形成及び実行において、本発明者らによって行なわれ企図された実験を説明している。これらの実験は、本発明の実行技術の通告及びその有用性の証明の双方に役立つ技術の開示を含むと信じられる。ここに開示された技術及び実施形態は、一般に多くの等価的方法と技術が同じ結果に達成するのに採用され得る実施形態のみが好ましいことが、当業者によって、認められるだろう。
【０３５８】
本明細書の上記で同一視された参照の全ては、本発明の１以上の実施形態の実行に重要であり得る組成物及び／又は方法のための基礎を説明し、述べ、提供する又は可能にする程度まで、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０３５９】
表４
【表５−１】
2007534297.tif 000011
【表５−２】
2007534297.tif 000012
【表５−３】
2007534297.tif 000013
【表５−４】
2007534297.tif 000014
【表５−５】
2007534297.tif 000015
【表５−６】
2007534297.tif 000016
【表５−７】
2007534297.tif 000017
【表５−８】
2007534297.tif 000018
【図１−１】
2007534297.tif 000019
【図１−２】
2007534297.tif 000020
【図２】
2007534297.tif 000021
【図３−１】
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【図３−２】
2007534297.tif 000023
【図４−１】
2007534297.tif 000024
【図４−２】
2007534297.tif 000025
【図５】
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【図６】
2007534297.tif 000027
【図７】
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【図８】
2007534297.tif 000029
【図９】
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【図１０】
2007534297.tif 000031
【図１１−１】
2007534297.tif 000032
【図１１−２】
2007534297.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
2007534297.tif 000035
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2007534297.tif 000038
【図１７】
2007534297.tif 000039
【図１８】
2007534297.tif 000040
【図１９】
2007534297.tif 000041
【図２０−１】
2007534297.tif 000042
【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
2007534297.tif 000045
【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
2007534297.tif 000048
【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2007534297.tif 000052
【図２９】
2007534297.tif 000053
【図３０】
2007534297.tif 000054
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月2日(2007.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｎ１Ｎ２Ｘ１ＧＸ３Ｎ３Ｘ４Ｎ４Ｘ５を含む５０アミノ酸までのポリペプチドであって、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３及びＮ４は芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４，及びＸ５がいずれかのアミノ酸であり、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合できるポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ１はチロシンであり、Ｎ２−Ｎ４はフェニルアラニンである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列はＹＦＸ１ＧＸ３ＦＸ４ＦＸ５であって、Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４，及びＸ５はいずれかのアミノ酸である請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がプロリン、Ｘ４及びＸ５はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンからなる群より選ばれ、Ｘ３はグルタミン又はアスパラギンのいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は、ＹＦＰＧＱＦＡＦＳである請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、ＱＲＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳである請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｎ１及びＮ２は芳香族又は疎水性アミノ酸であり、Ｎ３及びＮ４は芳香族アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４，及びＸ５はいずれかのアミノ酸であり、該ポリペプチドはＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的に結合する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｎ１又はＮ２はチロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンからなる群より選ばれる請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｎ３及びＮ４はフェニルアラニンである請求項７又は８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ１はプロリンであり、Ｘ４及びＸ５はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンからなる群より選ばれ、Ｘ３はグルタミン又はアスパラギンのいずれかである請求項７〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列は、ＬＦＰＧＱＦＡＦＳ、ＩＦＰＧＱＦＡＦＳ、ＦＬＰＧＱＦＡＦＳ、ＹＬＰＧＱＦＡＦＳ、ＹＶＰＧＱＦＡＦＳ及びＹＦＰＧＱＦＡＦＤ−ＣＯＮＨ２である請求項７〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、放射性アイソトープ、蛍光団、蛍光の消光剤、酵素、アフィニティタグ及びエピトープタグからなる群より選ばれる団（ｍｏｉｅｔｙ）で標識されている請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかのポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項１４】
請求項１３の核酸をコードしている配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
前記発現ベクターがプラスミドＤＮＡ発現ベクターである請求項１４の発現ベクター。
【請求項１６】
前記発現ベクターは、組織特異的、腫瘍選択的プロモータの調節下でコードしている配列を含むアデノウィルスベクターである請求項１４又は１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかの発現ベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック動物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかのポリペプチドを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１３の核酸を含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを含む治療用組成物。
【請求項２１】
請求項１３の核酸を含む治療用組成物。
【請求項２２】
医薬調製のための請求項１８〜２１のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２３】
医薬調製のための請求項１４〜１６のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
【請求項２４】
体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用医薬の調製のための請求項２２又は２３の使用。
【請求項２５】
体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用医薬の調製のための請求項２２又は２３の使用。
【請求項２６】
大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び尿生殖に位置する腫瘍、並びにγグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾病、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖及び他の高増殖病からなる群より選ばれる疾病を、治療する医薬の調製のための請求項２２〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
請求項１〜１１のいずれかのポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項２８】
前記抗体は、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドがＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合することを阻害するものである請求項２７の抗体。
【請求項２９】
ＦＳＫＡＬＰＲＳを含むエピトープに選択的に結合する抗体。
【請求項３０】
前記抗体は、モノクローナル抗体である請求項２７〜２９のいずれかに記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体は、検出可能な標識、放射活性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識又は治療剤に結合又は共役されている請求項２７〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項３２】
前記治療剤は、代謝拮抗物質、アルキル化剤、構成物質、増殖因子、サイトカイン、細胞障害剤、毒、又は抗血管新生促進剤である請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
ＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとの間の相互作用をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドを前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに結合させる条件下で、候補モジュレータの存在下又は不在下で、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドへの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの結合を測定し、前記候補モジュレータの不在下での結合に対して、候補モジュレータの存在下で結合が減少しているとき、前記候補モジュレータはＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド間の相互作用をモジュレートする薬剤であると同定する工程
を含む方法。
【請求項３４】
前記薬剤は、サンプル内に存在している請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレータの存在下又は不在下で、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを接触させる工程；及び
（ｂ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定し、前記候補モジュレータ不在下での活性に対して、前記候補モジュレータの存在下での活性が変化しているとき、前記候補モジュレータはＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤であると同定する工程
を含む方法。
【請求項３６】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤の同定方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを候補モジュレータに接触させる工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する工程；及び
（ｃ）前記候補モジュレーターの存在下で測定された活性が、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドが請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触している反応中に測定された活性と比べて、前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導される量の少なくとも１０％であるとき、前記候補モジュレータが、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの機能をモジュレートする薬剤である同定する工程
を含む方法。
【請求項３７】
前記薬剤はサンプル内に存在している請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルを、請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに特異的抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合を標準と比べ、前記標準に対して結合に差違があれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの調節不良で特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項３９】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルを、請求項１〜１１のいずれかに記載のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナリングを検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたシグナリングを標準と比べ、前記標準に対してシグナリングに差違があれば、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの調節不良で特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項４０】
前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの配列は、配列ＩＤ  Ｎｏ．２若しくは４若しくは６又はこれらの機能的部分である請求項３３〜３９のいずれかの方法。
【請求項４１】
前記接触は、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞内又は細胞上で行なわれる請求項３３〜３７のいずれかの方法。
【請求項４２】
前記接触は、合成リポソーム内又は合成リポソーム上で行なわれる請求項３３〜３７のいずれかの方法。
【請求項４３】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを含む、ウィルス誘導された出芽膜内又は出芽膜上で行なわれる請求項３３〜３７のいずれかの方法。
【請求項４４】
前記方法は、前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを発現する細胞からの膜フラクションを用いて行なわれる請求項３３〜４０のいずれかの方法。
【請求項４５】
前記測定は、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光及び蛍光偏光から選ばれる方法を用いて行なわれる請求項３３〜４０のいずれかの方法。
【請求項４６】
前記薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体の抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、及び有機低分子からなる群より選ばれる請求項３３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４７】
前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定する前記工程は、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出する工程を含む請求項３５〜３７のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項４８】
シグナル活性を測定する前記工程は、グアニンヌクレオチド結合又は変換、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、フォスファチジルイノシトールブレークダウン、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、又はレポータ遺伝子発現の測定を含んでいる請求項３５〜３７のいずれかの方法。
【請求項４９】
前記シグナル活性を測定する工程は、エクオリンに基づくアッセイを用いる工程を含む請求項４８の方法。
【請求項５０】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断方法であって、
（ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
（ｂ）前記核酸を鋳型として用いて、請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を増幅する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で生産され増幅されたポリヌクレオチドの量を標準と比べ、前記標準に対して増幅されたポリヌクレオチドの量に差違があるとき、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項５１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断する方法であって、
（ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
（ｂ）前記核酸を鋳型として用いて、請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を増幅する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で生産され増幅されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドの配列を標準配列と比べ、前記標準配列に対して前記配列に差違があるとき、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程
を含む方法。
【請求項５２】
前記配列比較工程は、ミニ配列決定を含む請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記標準配列は配列ＩＤ  ＮＯ：７である請求項５１又は５２の方法。
【請求項５４】
量又は配列の前記比較は、マイクロアレイ上で行なわれる請求項５１〜５３のいずれかの方法。
【請求項５５】
前記結合又は活性における前記差違は、前記Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導された結合又は活性の少なくとも１０％の増加又は減少である請求項３３又は３７の方法。
【請求項５６】
前記結合又は活性における差違は、Ｃｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導された結合又は活性の少なくとも５０％の増加又は減少である請求項３３又は３７の方法。
【請求項５７】
単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドと請求項１〜１２のいずれかの単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドとを含む組成物。
【請求項５８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするためのキットであって、
単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、及びこれらのためのパッケージング材料を含んでいるキット。
【請求項５９】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするためのキットであって、
請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチド、及びこれらのためのペッケージング材料を含むキット。
【請求項６０】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに含む請求項５９のキット。
【請求項６１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性をモジュレートする薬剤のためのスクリーニングキットであって、
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞を含み、請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを任意に含み、これらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６２】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、
単離されたＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを任意的に含み、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチド、及びこれらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６３】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、
請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド及びこれらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６４】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断のためのキットであって、
請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞と、これらのためのパッケージング材料を含むキット。
【請求項６５】
請求項１〜１１のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドをコードするＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドのためのトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項６６】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体の存在下又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；及び
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合を測定し、前記抗体不在下での前記結合に対して、前記抗体存在下で前記結合が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害することの指標であるとする工程
を含む方法。
【請求項６７】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、（ａ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲに特異的な抗体の存在又は不在下で、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導されるＣａ２＋の動員を測定し、前記抗体不在下でのＣａ２＋の動員に対して、前記抗体存在下での前記Ｃａ２＋の動員が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性化を阻害することの指標であるとする工程
を含む方法。
【請求項６８】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）を行なった後の前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドを請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと接触させる工程；及び
（ｃ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドに対する結合を測定し、前記抗体と接触させない場合のＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合に対して、前記結合が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性化を阻害することの指標であるとする工程
を含む方法。
【請求項６９】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド活性化を阻害する抗体の同定方法であって、
（ａ）請求項２７に記載の抗体の存在又は不在下で、請求項１〜１２のいずれかに記載のＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとを接触させる工程；及び
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかにＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドの前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドへの結合を測定し、
前記抗体不在下での結合に対して、前記抗体存在下での前記結合が減少しているとき、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性化を阻害していることの指標とする工程
を含む同定方法。
【請求項７０】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性化を阻害する抗体を同定する方法であって、
（ａ）請求項２７に記載の抗体の存在又は不在下で、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとを接触させる工程；及び
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドによって誘導されるＣａ２＋動員を測定し、前記抗体の不在下での前記Ｃａ２＋動員に対して、前記抗体の存在下でのＣａ２＋動員の減少を、前記抗体がＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド活性化を阻害することの指標とする工程
を含む同定方法。
【請求項７１】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド活性化を阻害する抗体の同定方法であって、
（ａ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドに特異的な抗体の存在又は不在下で請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとを接触させる工程；及び
（ｂ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定し、前記抗体の不在下での活性に対して前記抗体存在下での前記活性が減少していれば、前記抗体を、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド活性化を阻害する抗体であると同定する工程
を含む同定方法。
【請求項７２】
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドの活性化を阻害する抗体の同定方法であって、
（ａ）請求項２７の抗体の存在下又は不在下で、請求項１〜１２のいずれかのＣｈｅｍｅｒｉｎポリペプチドと、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチドのシグナル活性を測定し、前記抗体不在下での前記活性に対して、前記抗体存在下での前記活性が減少していれば、前記抗体をＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド活性化を阻害する抗体であると同定する工程
を含む同定方法。
【請求項７３】
前記ＣｈｅｍｅｒｉｎＲポリペプチド配列は、配列ＩＤ  ＮＯ．２，４若しくは６、又はこれらの機能的部分で表されるヒト、マウス若しくはラットのＣｈｅｍｅｒｉｎＲである又は含んでいる請求項６６〜７２のいずれかの方法。
【請求項７４】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項６６〜７３のいずれかの方法。
【請求項７５】
前記モノクローナル抗体は、仮の受託番号０４０６１６０１で、２００４年６月１６日にＥＣＡＣＣで寄託された、ＣＨＥＭＲ２３  ５Ｃ  ４Ｃ７と称されるものである請求項７４の方法、又は請求項３０の抗体。
【請求項７６】
前記モノクローナル抗体は、仮の受託番号０４０６１６０２で、２００４年６月１６日にＥＣＡＣＣで寄託された、ＣＨＥＭＲ２３  Ｃ５  １Ｈ２と称されるものである請求項７４の方法、又は請求項３０の抗体。
【請求項７７】
請求項１８〜２１のいずれかの組成物を、細胞に投与する工程を含む、インビトロでの細胞増殖阻害の方法。
【請求項７８】
請求項１４〜１６の発現ベクターを細胞に投与する工程を含む、インビトロでの細胞増殖阻害の方法。
【請求項７９】
請求項７〜１１のいずれかのポリペプチド、又は細胞増殖阻害のための医薬調製のための核酸をコードする核酸を含む治療用組成物の使用。
【請求項８０】
細胞増殖阻害用の医薬調製のための請求項１１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項８１】
前記医薬は体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療を目的とするものである請求項７９又は８０のいずれかの使用。
【請求項８２】
前記医薬は体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療を目的とするものである請求項７９又は８０のいずれかの使用。
【請求項８３】
前記医薬で治療される疾病は、大腸、腹部、骨、乳、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭と首、神経（中枢及び末梢）、リンパ系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び尿生殖に位置する腫瘍、並びに高γグロブリン血症、リンパ球増殖病、疾患、及び／又は状態、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織的増殖、及び他の高増殖病からなる群より選ばれる請求項７９〜８２の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本発明は、また、シグナル活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチド結合又は交換、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、フォスファチジルイノシトールブレークダウン、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、又はレポータ遺伝子発現の測定を含む上述のような方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
本発明は、上述のように、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ（ポリ）ペプチドをコードするＣｈｅｍｅｒｉｎポリヌクレオチドのためのトランスジェニック非ヒト哺乳類に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
〔Ｃ．機能的アッセイ〕
ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の診断は、また、機能的アッセイを用いて行なわれることができる。そうすると、組織サンプルから調製された細胞膜又は細胞抽出物は、ここで説明されるＣｈｅｍｅｒｉｎＲ活性のアッセイ（例えば、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ結合アッセイ、ＧＴＰａｓｅアッセイ、アデニレートシクラーゼアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、リン脂質ブレークダウン、ジアシルグリセロール又はイノシトール３リン酸アッセイ、ＰＫＣ活性化アッセイ、又はキナーゼアッセイ）で用いられる。検出された活性は、健康な個体又は影響された個体の影響されていない部位から採取された標準サンプル内の活性と比較される。その代用として、サンプル又はサンプル抽出物が、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲを発現する細胞に適用され、それに続いて、標準サンプルに対するＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナル活性が測定される。これらのアッセイのいずれかで測定された活性が標準の活性に対して１０％以上相違すると、ＣｈｅｍｅｒｉｎＲシグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候である。
【国際調査報告】
2007534297.tif 000085
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