(57)【要約】本発明は、粘膜内層への投与を通じた、抗原としてのオバルブミン（ＯＶＡ）を使ったアジュバント活性と同様に、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／あるいはイムノマーの粘膜先天性免疫への治療的使用に関する。
2007523173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物における粘膜免疫応答を発生させる方法であり、イムノマーを脊椎動物の粘膜内層に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
イムノマーが経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与経路が、鼻腔内、気管内、直腸内、膣内および胃内投与からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脊椎動物が、魚類、鳥類、および哺乳類からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類が、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、ヒト以外の霊長類、およびヒトからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーにより結合し、２つ以上の５’末端を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、利用可能な５’末端を有する免疫賦活オリゴヌクレオチドであり、免疫賦活ジヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫賦活ジヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、ここで、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換−アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然型ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
疾患または障害をもつ脊椎動物の治療上の処置方法であり、イムノマーを脊椎動物の粘膜内層に投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
イムノマーが経口投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
投与経路が、鼻腔内、気管内、直腸内、膣内および胃内投与からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物が、魚類、鳥類、および哺乳類からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類が、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、ヒト以外の霊長類、およびヒトからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーにより結合し、２つ以上の５’末端を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、利用可能な５’末端を有する免疫賦活オリゴヌクレオチドであり、免疫賦活ジヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
免疫賦活ジヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、ここで、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換−アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然型ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
疾患または障害が、癌、炎症性障害、炎症性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、気道炎症、喘息およびアレルギーからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
ワクチン、アレルゲン、抗原、抗体、モノクローナル抗体、化学療法薬物、抗生物質、脂質、ＤＮＡワクチンおよびミョウバンなどの他のアジュバントからなる群から選択される剤を投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
疾患または障害と関連する抗原を投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
イムノマーまたは抗原、あるいは両方が、免疫原性タンパク質または非免疫原性タンパク質に連鎖している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アジュバントを投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
脊椎動物における粘膜免疫応答を調節する方法であり、イムノマーを脊椎動物の粘膜内層に投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
免疫応答がＴｈ１免疫応答である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
免疫応答がＴｈ２免疫応答である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
イムノマーが経口投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
投与経路が、鼻腔内、気管内、直腸内、膣内および胃内投与からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
脊椎動物が、魚類、鳥類、および哺乳類からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳類が、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、ヒト以外の霊長類、およびヒトからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーによって結合し、２つ以上の５’末端を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、利用可能な５’末端を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドであり、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
免疫賦活ジヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、ここで、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換−アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然型ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組込まれる2004年11月12日出願の米国仮出願第60/627,263号、および2004年9月28日出願の米国仮出願第60/613,786号、および2004年2月20日出願の米国仮出願第60/546,147号に基づく優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、イムノマー(immunomer)を使って粘膜免疫応答を誘導するための用途に関連する。
【０００３】
関連技術の概要
最近、数名の研究者が、免疫治療投与におけるオリゴヌクレオチドの免疫賦活剤としての使用の有効性を実証した。ホスホジエステルおよびホスホロチオアート型オリゴヌクレオチドが免疫賦活を誘導することができるという観察は、これらの化合物を治療ツールとして開発する関心を生み出した。これらの努力は、天然ジヌクレオチドＣｐＧ含有のホスホロチオアート型オリゴヌクレオチドに焦点を当てていた。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)では、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドローム含有のホスホジエステル型オリゴヌクレオチドが、インターフェロン−αおよびγの合成をを誘導し、ナチュラルキラー活性を高めることができることを教示している。Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)は、ホスホロチオアート型ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドが、免疫賦活作用を有することを開示している。Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)は、かかるオリゴヌクレオチドが、ヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)は、ＣｐＧを含むホスホロチオアート型オリゴヌクレオチドが、インフルエンザウィルスに対する免疫応答を高めることを教示している。McCluskie and Davis, J. Immunol. 161:4463-4466 (1998)は、ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドが、強力なアジュバントとして作用し、Ｂ型肝炎の表面抗原に対する免疫応答を高めることを教示している。
【０００４】
ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドが調節し得る一つの応答は、喘息である。アレルギー性喘息の応答は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）リンパ球の活性化により特徴付けられる。Ｔｈ２リンパ球により誘導される応答は、喘息におけるアレルギー性炎症の発症および増加において、主要な役割を担う。Ｔｈ２サイトカインＩＬ−５は、好酸球の発生および生存を増加させ、気道の好酸球の増加をもたらす。他のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３）もまた、アレルゲン特異的ＩｇＥの産生、脂肪細胞の増殖、内皮細胞接着分子の発現、および気道過敏症の誘導により、アレルギー性炎症において重要な役割を果たす。コルチコステロイドは現在、アレルギー性喘息の処置に最も広く使われる。ステロイド治療は、炎症の徴候を最小限に抑えることにのみ効果的であるが、しかしながら、疾患を治さない。継続的治療が、アレルギー性喘息の進行を防ぐのに必要である。
【０００５】
これらの報告は、免疫賦活オリゴヌクレオチドに起因する免疫応答を高め、修飾することができる必要性があることを明らかにしている。しかしながら、経口または胃内投与のための従来のＣｐＧを含むＤＮＡの使用は、胃腸環境におけるその急速な分解のため、制限されている。したがって、粘膜免疫応答を誘導するために胃腸環境においてより安定性の高いＣｐＧ  ＤＮＡ（あるいは他のＣｐＧ類似体／モチーフ）の必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の概要
本発明は、粘膜免疫応答を誘導するための組成物および方法を提供する。第一の点において、本発明は、脊椎動物における粘膜免疫応答を発生させるための方法を提供する。本発明のこの点の一態様において、該方法は、イムノマーを脊椎動物の粘膜内層に投与することを含む。
第二の点において、本発明は、疾患または障害を有する脊椎動物の治療上の処置方法を提供する。本発明のこの点の一態様において、該方法は、イムノマーを脊椎動物の粘膜内層に投与することを含む。
第三の点において、本発明は、脊椎動物における粘膜免疫応答を調節するための方法を提供する。本発明のこの点の一態様において、該方法は、イムノマーを脊椎動物の粘膜内層に投与することを含む。
【０００７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫治療の投与のための免役刺激薬としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関するものである。特に、本発明は、経口、胃内、鼻腔内、気管内、膣内および直腸内投与による抗原としてオバルブミン（ＯＶＡ）を使用したアジュバント作用と同様に、粘膜性先天性免疫への免疫賦活化オリゴヌクレオチド及び／又はイムノマーの治療的使用に関する。ここで引用する交付済み特許、特許出願および引用文献は、あたかもそれぞれを特異的および個々に引用文献で組み入れるのを示したかのように同程度引用文献として組み入れられている。ここで挙げられているあらゆる引用文献と本明細書のあらゆる教示が一貫しない場合は、後者を本発明の目的として優勢にするものとする。
【０００８】
本発明は、成人および小児のヒトおよび脊椎動物における、癌、自己免疫性疾患、炎症性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、喘息、呼吸アレルギー、食物性アレルギー、および、バクテリア、寄生虫、ウイルス感染などの、限定はしないが、免疫治療の用途に使う免疫賦活性化合物によって起こる免疫応答を増強および修飾するための方法を提供する。本発明は、さらに、免疫治療の免疫賦活効果の最適なレベルを有する化合物、および該化合物の製造および使用の方法を提供するものである。付け加えて、本発明のイムノマーはＤＮＡワクチン、抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、アレルゲン、化学療法剤およびアンチセンスヌクレオチドの混合物のアジュバントと同程度に有用な物である。
【０００９】
第一の点において、本発明は脊椎動物で粘膜免疫応答を産生する方法を提供する。本発明のこの点での一態様において、該方法はイムノマーの脊椎動物の粘膜内層への投与を含む。
【００１０】
本発明の目的においては、ＣｐＧ  ＤＮＡという用語は、天然的に発生したＣｐＧジヌクレオチド、あるいはその免疫賦活性類似物を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドを意味する。限定はしないが、好ましい類似物として、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊を含み、ここでＣはシチジンあるいは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は２’−デオキシチミヂン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキルーシチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、あるいは他の非天然型ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇはグアノシンあるいは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザノグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、２’−デオキシイノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’−置換−アラビノグアシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、あるいは他の非天然型プリンヌクレオシドであり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選んだヌクレオシド間連鎖である。オリゴヌクレオチドという用語は、複数の連鎖したヌクレオシド単位から構成されるポリヌクレオシドを示す。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムあるいはｃＤＮＡを含む現存の核酸の源から得ることができるが、合成的方法で産生するのが好ましい。好ましい態様において、各々のヌクレオシド単位は、リボース、２’−デオキシリボース、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換−アラビノースあるいは六炭糖類、あるいはそれらの混合物の、複素環塩基およびペントフラノシルを含む。かかるヌクレオシド残基は互いに多数の既知のヌクレオシド間連鎖のいずれにより重合しうる。該ヌクレオシド間連鎖には、限定はしないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、炭酸塩、カルボアルコキシ、架橋ホスホネート、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連鎖を含む。オリゴヌクレオチドという用語は、１または２以上の立体特異的なヌクレオシド間結合（例えば（ＲＰ）−あるいは（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、あるいはホスホトリエステル結合）を包含する。ここで使うオリグヌクレオチドおよびジヌクレオチドという用語は、表現的には、連鎖がリン酸基を含んでも含まなくても前記ヌクレオシド間連鎖を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを意図する。ある好ましい態様においては、これらのヌクレオシド間連鎖は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート連鎖あるいはそれらの組合せでもよい。
【００１１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約３から約３５のヌクレオシド残基を有し、好ましくは約４から約３０のヌクレオシド残基を有し、さらに好ましくは約４から約２０のヌクレオシド残基を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは約５から約１８、あるいは約５から約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで使う約という用語は、正確な数は決定的でないことを示唆する。このように、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は決定的ではなく、１つあるいは２つ少ないヌクレオシド残基を有する、あるいは１つからいくつかの付加的ヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上で述べた態様のそれぞれの同等物として考える。いくつかの態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１のヌクレオチドを有する。
【００１２】
本発明のいくつかの核酸分子の非限定的な例を、表１Ａおよび１Ｂに示す。
【表１】
2007523173.tif 000003
【００１３】
【表２】
2007523173.tif 000004
Ｎ１およびＮｎはそれぞれの発生に独立して、好ましくは天然的に発生したあるいは合成のヌクレオシドであり、ここでｎは０から３０の番号である。Ｘ＝グリセロールリンカーであるが、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、エチレングリコールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、分枝アルキルリンカーでもよい。
【００１４】
本発明の目的のために、イムノマーという用語は、３’末端あるいはヌクレオシド間連鎖で連鎖した少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、あるいは、直接あるいは非ヌクレオチドリンカーを介して官能基化された核酸塩基あるいは糖を含むいかなる化合物をも指し、ヌクレオチドのうち少なくとも１つは（イムノマーという文脈では）、免疫賦活オリゴヌクレオチドであり、利用可能な５’末端を有し、ここで化合物は脊椎動物に投与されると免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、脊椎動物はヒトを含む哺乳類である。
【００１５】
いくつかの態様において、イムノマーは２または３以上の免疫賦活オリゴヌクレオチドを含み、（該イムノマーの文脈では）同様のものでも異なるものでもよい。好ましくは、それぞれのかかるヌクレオチドは、少なくとも１つの利用可能な５’末端を有する。
【００１６】
本発明のさまざまな態様により、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸を提供する。この点では、免役刺激的な核酸は１で詳細を説明する構造を含む。
ドメインＡ−ドメインＢ−ドメインＣ  （Ｉ）
【００１７】
それぞれのドメインは、約２から約１２ヌクレオチド長であってもよい。ドメインＡは５’−３’、あるいは３’−５’あるいは２’−５’のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、上で述べたようにＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択した少なくとも１つのジヌクレオチドを含むまたは含まない、回文的なあるいは自己相補的な領域を有するまたは有さない。
【００１８】
ある態様において、ドメインＡは、ドメインＡオリゴヌクレオチドの５’末端に位置するＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択した２つ以上のジヌクレオチドを有する。
【００１９】
ドメインＢは、ドメインＡとドメインＣとをつなぐリンカーであり、３’−５’連鎖、２’−５’連鎖、３’−３’連鎖、リン酸基、ヌクレオシド、あるいは脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラルであってもよい非ヌクレオシドリンカー、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、エチレングリコールリンカー、分枝アルキルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間リンカー、グリセロール、モノ、トリあるいはヘキサポリエチレングリコール、あるいは複素環部分であってもよい。
【００２０】
ドメインＣは、５’−３’、３’−５’あるいは２’−５’のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡポリＩ−ポリＣであってもよく、回文的あるいは自己相補的配列を有しまたは有さず、上で述べたようにＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択したヂヌクレオチドを有することができるかまたは有することができない。
【００２１】
ある態様において、本発明は明白なドメイン、つまり刺激的そして構造的なドメインで、自己安定化ＣｐＧ  ＤＮＡと言われる２つの明白なドメインを含有する。ＣｐＧ  ＤＮＡの刺激性ドメインは、天然的に発生するＣｐＧジヌクレオチドあるいはその免疫賦活的なアナログを５’末端に含有した。構造ドメイン領域においては、７、１１、１５あるいは１９塩基対（ｂｐ）のヘアピンステムループ構造を形成した相補的配列が、刺激的ドメインの３’末端に隣接して組み込まれた。これらの態様において、免疫賦活的な核酸は相補的配列と共に水素結合を介して３’末端に２次構造を有する。ここで使用する２次構造という用語は、分子内および分子間の水素結合を指す。分子内水素結合の結果、ステムループ構造が形成される。分子間水素結合の結果、二重核酸分子が形成される。これらのＣｐＧ  ＤＮＡは、刺激的領域がいかなる構造のモチーフを含まないように作られており、ＣｐＧ刺激モチーフは構造的ドメインに現れても現れなくてもよい。構造的ドメイン内のヌクレオシドは、ヘアピンステムループ構造の安定性を改善する糖、リン酸塩および／または塩基修飾を含んでもよく、胃腸内環境におけるエンドヌクレアーゼ消化に対する自己安定化ＣｐＧ  ＤＮＡの安定性をさらに改善する。
【００２２】
本発明の目的のために、オリゴヌクレオチドという用語は複数の連鎖したヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指す。かかるオリゴヌクレオチドは、現存のゲノムあるいはｃＤＮＡを含む核酸源から得ることができるが、人工的な方法で産生するのが好ましい。好ましい態様において、それぞれのヌクレオシド単位は複素環基やペントフラノシル、２’−デオキシペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースあるいはヘキソース基を含む。ヌクレオシド塩基は、数々の既知のヌクレオシド間連鎖のいずれかを介して互いに重合する。かかるヌクレオシド間連鎖には、限定はしないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエステル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロティオエートおよびスルホンヌクレオシド間連鎖を含む。オリゴヌクレオチドという用語はまた、１または２以上の立体特異的なヌクレオシド間連鎖（例えば（ＲＰ）−あるいは（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートあるいはホスホトリエステル連鎖）を有するポリヌクレオシドを包含する。ここで使うオリゴヌクレオチドとジヌクレオチドという用語は、連鎖がリン酸基を含んでも含まなくても、そのようなヌクレオシド連鎖を有するポリヌクレオシドとジヌクレオシドを含むことを表現的に意図する。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド間連鎖は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートあるいはホスホロジチオエート連鎖、あるいはそれらの組合せであってもよい。
【００２３】
オリゴヌクレオチドという用語は、限定はしないが、タンパク基、脂溶性の基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、アダマンタンを含む付加的な置換基を有するポリヌクレオシドもまた包含する。オリゴヌクレオチドという用語は、限定はしないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、固定した核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドおよびアルキルリンカーあるいはアミノリンカーでの骨格部位を有するオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーを含有するいかなる核酸塩基もまた包含する。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然的に発生するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドあるいはそれらの混合物を含み得る。ここで使う、修飾ヌクレオシドという用語は、修飾複素環塩基、修飾糖部分あるいはそれらの組合せを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで言及する非天然ピリミジンあるいはプリンヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、あるいは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００２５】
本発明の目的のために、２’−置換リボヌクレオシド、あるいは２’−置換アラビノシドという用語は、ペントース部分の２’部位の水酸基が２’−置換あるいは２’−Ｏ置換リボヌクレオシドを産生するために置換されているリボヌクレオシドあるいはアラビノヌクレオシドを含む。好ましくは、かかる置換は１〜６の飽和あるいは不飽和炭素原子を含む低アルキル分子、あるいは６〜１０の炭素原子を有するアリール基とし、ここでかかるアルキルあるいはアリール基は置換されていなくても、たとえばハロ、水酸、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシあるいはアミノ基で置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドあるいは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例は、限定はしないが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシデオあるいは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドあるいは２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドを含む。
【００２６】
２’−置換リボヌクレオシド、あるいは２’−置換アラビノシドという用語は、２’−ヒドロキシル基が１〜６個の飽和あるいは不飽和炭素原子を含有する低級アルキル基と、あるいはアミノあるいはハロ基と置換した、リボヌクレドシドあるいはアラビノヌクレオシドもまた含む。かかる２’−置換リボヌクレオシドあるいは２’−置換アラビノシドの例として、限定はしないが、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドあるいはアラビノシドが含まれる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドという用語は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。キメラオリゴヌクレオチドとは、２種類以上のヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの好ましい一例として、ホスホロチオエート、ホスホジエステルあるいはホスホロジチオエート領域、およびアルキルホスホネートあるいはアルキルホスホノチオエート連鎖のような非イオン連鎖を含むキメラオリゴヌクレオチドである。例えば、Pedersonらの米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照のこと。
【００２８】
ハイブリッドオリゴヌクレオシドとは、２種類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオシドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい一例として、リボヌクレオチド、あるいは２’置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域がある。例えば、MatelevとAgrawalの米国特許第5,652,355号、第6,346,614号および第6,143,811号を参照のこと。
【００２９】
本発明の目的のために、免疫賦活オリゴヌクレオチドという用語は、魚類、鳥類、哺乳類などの脊椎動物に投与したときに免疫応答を誘導する上で述べたようなオリゴヌクレオチドを指す。ここで使う哺乳類という用語は、限定こそしないが、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、ヒトでない霊長類およびヒトを含む。好ましくは、免疫賦活オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートあるいはホスホロジチオエートヌクレオシド間連鎖を含む。
【００３０】
本発明による方法で使うイムノマーは、直接あるいは非ヌクレオチドリンカーを介して連鎖した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。 本発明の目的のために、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに共有あるいは非共有連鎖の方法で連結できるあらゆる部分である。好ましくは、該リンカーは、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、エチレングリコールリンカー、分枝アルキルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間連鎖、あるいは、式ＨＯ−（ＣＨ２）Ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨ構造のグリセロールあるいはグリセロール同族体である、ここでｏとｐは独立して、１から約６、１から約４、１から約３までの整数である。
【００３１】
本発明の方法において、免疫修飾オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの投与は、限定しないが、経口、胃内、鼻腔内、気管内、膣内、直腸内を含む、あらゆる好適な経路によるものであることができる。治療組成物であるイムノマーの投与は、既知の手順を用いて、兆候と疾患の代用マーカーを減少させるのに効果のある投与量および期間実行することができる。全身投与するとき、治療組成物は、好ましくは０．０００１マイクロモラーからおよそ１０マイクロモラーの血中イムノマーレベルに達するために十分な投与量で投与される。局所投与では、これよりはるかに少ない濃度で効果的であるかもしれず、はるかに高い濃度でも許容できるかもしれない。好ましくは、イムノマーの総投与量、は患者１日あたり約０．００１ｍｇから体重１ｋｇあたり１日約２００ｍｇにわたる。同時にあるいは順番に治療的に効果のある量の本発明の１つあるいは２つ以上の治療組成物を単一の治療エピソードとして個人に投与するのが望ましいかもしれない。
【００３２】
本発明による方法で使用される免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、自動合成装置やホスホラミダイト法を使用して都合良く合成される。いくつかの態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、線形合成法により合成される。ここで使う線形合成という用語は、イムノマーの一端で開始し線形的に他端へと進む合成を指す。線形合成は、（長さ、塩基構成、化学修飾の融合した観点で）同一あるいは非同一のモノマー単位を、免疫賦活オリグヌクレオチドおよび／またはイムノマーへの組込みを可能にする。
【００３３】
イムノマーの合成の代替的な方法には平行合成があり、合成は中央リンカー部位から外側へと進む。米国特許第5,912,332号で記述されているように、固体支持体に接着したリンカーを平行合成に使用することができる。代替的に、リン酸を付着させた制御微細孔ガラス支持体などの一般的な固体支持体を使うことができる。
イムノマーの平行合成には、線形合成を超えるいくつかの利点がある。（１）平行合成だと同一のモノマー単位との組込みが可能である。（２）線形合成の場合と異なり、両方（あるいは全て）のモノマー単位は同時に合成され、それにより合成段階の数と合成に必要とされる時間はモノマー単位の場合と同じである。（３）合成段階が減少したために、最終イムノマー生成物の純度と収率が改善された。
【００３４】
線形合成あるいは平行合成手順のいずれかによる合成の最後には、本発明による方法において使用される免疫賦活オリゴヌクレオチドあるいはイムノマーは、修飾ヌクレオシドが組み込まれる場合、飽和アンモニア溶液によってあるいはホスホラミダイト供給元により推奨されるように都合良く脱保護される。免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの生成物は、好ましくは逆相高速液体クロマトグラフィー、脱トリチル化、脱塩化および透析で精製するのがよい。
【００３５】
本発明はさらに、ここで開示する単独のあるいは組合せの免疫賦活オリゴヌクレオチドのいずれかおよび生理学的に許容できる担体のいずれを含む製剤処方を供給する。ここで使用する生理学的に許容できるという用語は、免疫賦活的オリゴヌクレオチドの効果を妨げず、細胞、細胞培養、組織、生物のような生物系と共存する物質を指す。好ましくは、生物系とは、脊椎動物などの生存している生命体である。
【００３６】
ここで使う担体という用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、あるいは製剤処方での使用の方法において周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤あるいは希釈剤の特徴は、特定の用途のための投与経路に依存すると理解されている。これらの材料を含む薬学的に許容できる処方の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００３７】
本発明は、疾患や障害を有する患者を治療上処置する方法を提供し、かかる方法には経口、胃内、鼻腔内、気管内、膣内あるいは直腸内投与のいずれかにより患者の粘膜内層に本発明によるイムノマーあるいはイムノマー複合体の投与を含む。本発明はまた、脊椎動物の免疫応答を調節する方法でもあり、かかる方法には経口、胃内、鼻内、気管内、膣内、あるいは直腸内投与のいずれかによる、脊椎動物の粘膜内層への本発明によるイムノマーあるいはイムノマー混合物の投与を含む。さまざまな態様において、治療されるべき疾患あるいは障害には、癌、自己免疫性疾患、炎症性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、喘息あるいは病原体により引き起こされる疾患がある。病原体には、バクテリア、寄生虫、菌類、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンを含む。
【００３８】
イムノマー複合体には、上で述べたイムノマーおよび利用可能な５’末端以外の部位のイムノマーに複合した抗原を含む。ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに複合する抗原を含む。いくつかの他の態様において、抗原はオリゴヌクレオチドの３’末端以外の部位に複合している。いくつかの態様において、抗原はワクチン効果を生じる。
【００３９】
本発明の目的のために、アレルギーという用語は、限定はしないが、食物アレルギー性アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症としても知られる）、アレルギー性結膜炎、皮膚の掻痒（じんましんとしても知られる）、呼吸アレルギーおよび、ラテックス、薬物および虫さされ、あるいはアレルギーの鼻腔・副鼻腔および耳腔の媒体から普通は生じる問題に対するアレルギー反応を含む。気道炎症という用語には、限定はしないが、喘息を含む。喘息の特定の例には、限定はしないが、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息、および夜間性喘息を含む。
【００４０】
アレルギー性喘息は、アレルギーと関連しアレルゲンと呼ばれる物質を引き金とする気道障害として特徴付けられる。アレルギー喘息の引き金には、限定はしないが、空中の花粉、かび、動物のフケ、ハウスダストのダニおよびゴキブリの糞を含む。非アレルギー性喘息は、鼻や気道を悪化させる、ウイルス感染、ある薬物、あるいは空中で見られる刺激物により引き起こされる。非アレルギー性喘息の引き金には、限定はしないが、空中の粒子（例えば石炭やチョークの粉）、空気汚染物質（例えばタバコの煙や薪の煙）、強いにおいのあるスプレー（例えば香水、家庭用洗剤、調理の煙、塗料あるいはニス）、ウイルス感染（例えばカゼ、ウイルス感染、副鼻腔炎、鼻ポリープ）、アスピリン過敏症および逆流性食道炎（ＧＥＲＤ）を含む。運動誘発性喘息（ＥＩＡ）は、精力的な運動活動が引き金となる。ＥＩＡの兆候は、喘息疾患者の大多数において異なる程度で起こり、運動中に冷えて乾いた空気を呼吸した結果として引き金になりやすい。ＥＩＡの引き金には、限定はしないが、運動中の空中の花粉の吸引、運動中の空気汚染物質の吸引、ウイルス性気道感染状態での運動および冷たく乾いた空気の中での運動が含まれる。職業性喘息は、刺激物および仕事場で見られる他の潜在的に害のある物質の吸引と直接関連がある。職業性喘息の引き金は、限定はしないが、噴煙、化学物質、ガス、樹脂、金属、ほこり、蒸気および殺虫剤が含まれる。
【００４１】
特別な法則を望むわけではないが、バクテリアへの暴露が減ることが、先進国における喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎などのアレルギー性疾患の発生率、重症度、死亡の増加の原因の一端を担うのではないかといえる。この仮説は、バクテリア感染あるいは生産物は実験動物モデルや臨床研究でのアレルギー障害の進行を阻害するという根拠により支持される。メチル化していないＣｐＧジヌクレオチドをある配列関係に含むバクテリアＤＮＡあるいは合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＤＮＡ）は、強く先天性免疫応答とそれにより得られた免疫を刺激する。ＣｐＧ  ＤＮＡ−ＲＮＡに対する免疫応答には、先天性免疫細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、Ｔｈ１サイトカイニン分泌の誘導および免疫グロブリン（Ｉｇ）の産生を含む。ＣｐＧ  ＤＮＡによる免疫細胞の活性化は、分子パターン認識受容体であるトール様受容体９（ＴＬＲ９）を介して起こる。ＣｐＧ  ＤＮＡは、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの分泌により特徴付けられる強いＴｈ１優勢の免疫応答を誘導する。イムノマー（ＩＭＯ）単独あるいはアレルゲン複合体としては、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩｇＥの産生を減少させ、アレルギー性喘息のマウスモデルで好酸球増加を低減させる。ＩＭＯ化合物はまた、定着したアトピー性好酸球気道疾患をＴｈ２応答をＴｈ１応答に変換することにより効果的に逆転させる。
【００４２】
ミョウバンを伴ったＯＶＡは、さまざまなマウスおよびラットモデルにおけるＴｈ２優勢の免疫応答の成立に広く使われている。Ｔｈ２免疫応答には、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生の増加、全体および抗原特異的なＩｇＥ、ＩｇＧ１の血清レベルの増加および低レベルのＩｇＧ２ａが含まれる。ＩＭＯ化合物はマウスにおける定着したＴｈ２優勢の免疫応答を防ぎ、そして逆転させる。ＩＭＯ化合物をマウスにＯＶＡ／ミョウバンと共に投与することにより、抗原の再刺激を受ける脾臓細胞培養中においてＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生を減少させ、ＩＦＮ−γの産生を誘導した。さらに、ＩＭＯ化合物はこれらのマウスにおいて、抗原特異的および全体的なＩｇＥを阻害し、ＩｇＧ２ａ産生を増加させた。
【００４３】
ＯＶＡ／ミョウバンとＩＭＯ化合物の注入により、低レベルのＴｈ２関連サイトカイン、ＩｇＥおよびＩｇＧ１、および高レベルのＴｈ１関連サイトカインおよびＩｇＧ２ａで特徴付けられる、マウスにおけるＴｈ１型のリンパ球性の抗原再生(antigen-recall)応答を誘導する。ＩＭＯ化合物をマンソン住血吸虫(S. mansoni)の卵や鶏卵のリゾチームのような他の種類の抗原と共に投与するとまた、in vitroおよびin vivoにおいてＴｈ２応答からＴｈ１優勢応答への逆転という結果となった。ここで記述するように、ＩＭＯ化合物は効果的にＴｈ２免疫応答の進行を阻害し、強いＴｈ１応答を可能にする。
【００４４】
Ｔｈ２サイトカインはＩｇアイソタイプをＩｇＥおよびＩｇＧ１生産へと切り替える引き金となるのであるが、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γはＩｇＧ２ａの生産をＢリンパ球によって誘導する。ＯＶＡ／ミョウバンとＩＭＯ化合物を注入したマウスは、ＯＶＡ／ミョウバンのみを注入したマウスよりも、低レベルのＩｇＥとＩｇＧ１および高レベルのＩｇＧ２ａとともに、低レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３と高レベルのＩＦＮ−γを生産する。このことにより、マウスにおける抗原とＩＭＯ化合物を受け取るＴｈ１サイトカイン誘導と免疫グロブリンアイソタイプの切り替えの間の近接なつながりの存在が示唆される。
【００４５】
血清抗原特異的、および総ＩｇＥレベルは、ＯＶＡ／ミョウバンおよびＩＭＯ化合物を受け取っているマウスに置いてはＯＶＡ／ミョウバンのみを受け取っているマウスよりも明らかに低い。対照的に、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１レベルははっきりとは変わっておらず、ＩｇＧ１レベルはＯＶＡ／ミョウバンのみを注入したマウスと比較してほんのわずかに減少した（データは公表していない）。異なる応答は、ＩｇＥおよびＩｇＧ１クラスの切り替えの制御に関する、どちらのアイソタイプもＩＬ−４およびＩＬ−１３による影響を受けるのではあるが、異なる機構に起因するかもしれない。例えば、ＩＬ−６はＢリンパ球がＩＬ−４の存在下でＩｇＧ１を合成するのを促進する。
【００４６】
本発明に関するどの方法においても、イムノマーあるいはイムノマー複合体は、イムノマーの免疫賦活効果を減少させない疾患あるいは状態を処置するのに役に立ついかなる剤と組み合わせて投与することができる。本発明のこの点の目的のために、組み合わせてという用語は、同患者の同疾患を処置する過程を意味し、同時投与ならびにあらゆる時間的に間隔をおいた順序、例えば、連続して即座にから７日間まで空けて１つの剤から他の剤へを含む、イムノマーと剤とをあらゆる順序で投与することを含む。かかる組合せの処置はまた、ＩＭＯの単回より多く、および剤と独立した投与も含んでもよい。イムノマーと剤との投与は、同じルートあるいは異なるルートによるものでもよい。
【００４７】
本発明に関するいかなる方法においても、疾患あるいは状態を処置するのに役に立つ剤は、限定はしないが、抗原、アレルゲン、あるいはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの共刺激分子を含む。加えて、剤には、抗原あるいはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。
【００４８】
ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＤＮＡ）は先天性免疫系をＴＬＲ９を介して活性化させる。ここで示すように、３’−３’−連鎖を介して結合しているＣｐＧオリゴヌクレオチドは、イムノマー（ＩＭＯ）として言及されているが、従来のＣｐＧ  ＤＮＡと比較してＴＬＲ−９媒介の免疫応答よりも強力な誘導体である。ＩＭＯの場合、明らかな構造の存在により（遊離型３’−末端の欠如）、胃腸管におけるよりよい安定性となり、粘膜内層への投与を通じて粘膜免疫の誘導の増強をもたらす。
【００４９】
例に示すように、ＩＭＯの単回投与により、有意に高いレベルのケモカイン（ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１およびＩＰ１０）およびサイトカイン（ＩＬ−１２）を局所的（胃および／または小腸）におよび全身的（血清）に誘導した。一方、同条件、同用量において、従来のＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、局所的および全身的にあまり効果を示さなかった。ＯＶＡとＩＭＯを１対１の割合で加えて胃内的に免疫化したマウスは、ＯＶＡとＣｐＧ  ＤＮＡとを加えて同様に免疫化したマウスと比較して、有意に低いレベルの抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１であった。同じ実験条件下で、非ＣｐＧ  ＤＮＡは局所的および全身的両方のケモカイン／サイトカイン分泌および免疫グロブリン産生に効果がなかった。これらの結果により、新規の構造を含むＩＭＯはＧＩトラックにて安定であり、従来のＣｐＧＤＮＡと比較して強い粘膜免疫応答を誘導することが示される。これらの結果はまた、ワクチンと抗原を伴ったＩＭＯの粘膜Ｔｈ１アジュバント活性を粘膜内層への投与を通して示す。
【００５０】
本発明は免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはＩＭＯを含むキットを提供し、後者は、ＩＭＯが２つ以上の利用可能な５’末端を有し、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは免疫賦活オリゴヌクレオチドであるような、少なくとも２つの互いに連鎖したオリゴヌクレオチドを含む。別の点において、キットは、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／または免疫賦活オリゴヌクレオチド複合体および／または本発明によるイムノマーあるいはイムノマー複合体、および生理学的に許容できる担体を含む。キットはまた、一般的に使用説明書一式を含む。
【００５１】
下の例は、本発明のある好ましい態様のさらなる説明を意図するものであり、本発明の範囲を限定を意図するものではない。
【００５２】
例
例１：ＩＭＯの合成と精製
ＣｐＧ＊  ＤＮＡ：（５’−ＴＣＴＧＡＣＧ＊ＴＴＣＴ−Ｘ−ＴＶＴＴＧ＊ＣＡＧＴＣＴ−５’）、ここでＸおよびＧ＊はそれぞれグリセロールリンカーおよび２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、従来のＣｐＧ  ＤＮＡ：（５’−ＣＴＡＴＣＴＧＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＴ−３’）および非ＣｐＧ  ＤＮＡ：（ＣＴＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴ−３’）を前述したように合成、精製および解析した。
【００５３】
例２：マウス
５〜８週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスをJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した。マウスはHybridon's IACUC承認の動物手順に従って維持した。
【００５４】
例３：胃内投与
全てのマウスを、ＩＭＯ投与前にイソフルレン吸入で軽度に鎮静化させた。それぞれの群のうち３〜５匹のマウスに５ｍｇ／ｋｇあるいは１５ｍｇ／ｋｇのＩＭＯ、ＣｐＧ  ＤＮＡあるいは対照群として非ＣｐＧ  ＤＮＡを含んだ２００μｌのＰＢＳを、胃内（ｉ．ｇ）経由でツベルクリン用注射筒に付けた１８ゲージ接餌針で単回与えた。マウスを処分したとき、血液、胃および小腸を４〜１２０時間の異なる時点で収集した。
【００５５】
鶏卵ＯＶＡ（ＯＶＡ、グレードＶ、Sigma, St. Louis, MO）免疫化群は、１００μｇのＯＶＡおよび１００μｇのＩＭＯあるいはＣｐＧ  ＤＮＡを含む２００μｌのＰＢＳを胃内投与した。対照群のマウスはＰＢＳ２００μｌ中の１００μｇＯＶＡあるいはＰＢＳのみで免疫化した。すべてのマウスに胃内で１４日目に追加投与(boost)した。ＯＶＡ特異的抗体レベルを決定するために、血液および胃洗浄物を２４〜４２日目に収集した。
【００５６】
例４：組織からのケモカインの抽出
胃および小腸からのケモカインの抽出はいくつかの変更をしたJohanssonらの記述した方法を使って実施した。端的に表すと、異なる時点で収集した新鮮な臓器を重量測定し、小さな破片に切り、２ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（Sigma）、０．１ｍｇの大豆トリプシン阻害剤および０．０５ＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液中で−７０℃で即座に凍結させた。試料は室温で解凍し、そののちサポニン（Sigma）で最終濃度である２％（ｗｔ／ｖｏｌ）でＰＢＳ中で４℃で回転を続けながら一晩透過化した。組織試料はそののち１６，０００ｘｇで２０分間遠心し、上清はＥＬＩＳＡ法で解析した。
【００５７】
例５：ケモカインの定量化
組織抽出液および血清試料中のマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）およびインターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）の濃度を、ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡ開発システム（R&D, Minneapolis, MN）を製造者の推奨に従い使用して決定した。
【００５８】
例６：サイトカインレベルの評価
組織抽出物および血清試料からのＩＬ−１２レベルは先に述べたようにサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により決定した。ＥＬＩＳＡプレート（Costar, Corning, NY）のウェルを、マウスＩＬ−１２特異的抗体で被覆し、そののちに１００μｌの段階希釈した組織抽出物あるいは血清をそれぞれのウェルに加えた。ＩＬ−１２量は製造者の使用説明書に従い決定し、ｐｇ／ｍｌとして表現した。全ての試薬は、サイトカイン抗体、標準化物も含めて、PharMingen（San Diego, CA）から購入した。
【００５９】
例７：抗体の決定
血清抗体を解析するために、９６ウェルプレートにて、ＯＶＡ（グレードＶ、Sigma, St. Louis, MO）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２μｇ／ｍｌで室温で培養した。固相を一晩４℃で腸の洗浄物あるいは血清試料と共に培養し、引き続きいて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を接合したヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、あるいはＩｇＡ（PharMingen, San Diego, CA）と共に培養した。抗体の結合を、ＡＢＴＳ基質（Zymed, San Francisco, CA）との免疫複合物の反応ののちに４０５ｎｍで吸光として測定した。
【００６０】
例８：組織学
胃内投与後の異なる時点で収集した胃、小腸および腸間膜リンパ節を、１０％リン酸緩衝液ホルマリン（VWR, West Chester, PA）で固定し、それからパラフィンで包埋した。厚さ５μｍの切片を切り出し、ヘマトキシリンよびエオジンで染色した。
【００６１】
例９：直腸内免疫化
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、５０μｌのＰＢＳ中に１００μｌのＩＭＯを混合した、１００μｇＯＶＡタンパク質を１日目および１４日目の２度投与した。５０μｌＰＢＳ中の１００μｇＯＶＡまたはＰＢＳ５０μｌのみを投与したマウスを対照群として使用した。２３日目に血清を採取し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡおよびＩｇＥをＥＬＩＳＡ法で試験した（図８を参照）。
【００６２】
例１０：ＣｐＧ＊  ＩＭＯおよび従来のＣｐＧ  ＤＮＡの粘膜および全身先天性免疫に対する影響
５ｍｇ／ｋｇの単用量のＣｐＧ＊  ＩＭＯ胃内投与では、より高いレベルのケモカイン（ＭＩＰ１β、ＩＰ１０およびＭＣＰ−１）およびサイトカイン（ＩＬ−１２）を局所的に（胃および／あるいは腸、図１）および全身的に（血清、図２）産生した。同じ条件および用量下においては、従来のＣｐＧ  ＤＮＡは、あまり効果を示さなかった（図１および２）。ＣｐＧ＊  ＩＭＯと比較すると、ＣｐＧ  ＤＮＡはより低いレベルの血清ＭＩＰ−β（図３）およびＩＬ−１２（図４）を産生した。非ＣｐＧ  ＤＮＡは局所的および全身的なケモカイン／サイトカイン分泌には効果がなかった（図３、４）。
【００６３】
例１１：ワクチンアジュバントとしてのＣｐＧ＊  ＩＭＯ
メスＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）に２００μｌのＰＢＳ中に１００μｇＯＶＡタンパク質と１００μｇＩＭＯとを混合して、１日目と１４日目に２度胃内投与した。ＰＢＳ２００μｌ中の１００μｇＯＶＡタンパク質あるいはＰＢＳ２００μｌのみを胃内投与したマウスを対照群として使用した。血清は２３日目に採取し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを、ＥＬＩＳＡ法により決定した。ＯＶＡにＣｐＧ＊  ＩＭＯを加えて免疫化したマウスは、ＯＶＡに従来のＣｐＧ  ＤＮＡを加えて免疫化したマウスと比較して、明らかにより高いレベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよびＯＶＡ特異的ＩｇＧ１産生を示した。
【００６４】
これらの結果により、ＩＭＯ含有の新規の構造およびＣｐＧ＊モチーフは、強力な粘膜免疫応答を胃腸環境におけるより高い安定性による結果として誘導するということがはっきりと示された。加えて、ＣｐＧ＊  ＩＭＯの経口あるいは胃内投与は、従来のＣｐＧ  ＤＮＡと比較して、強力な粘膜Ｔｈ１アジュバント活性をＯＶＡとともに誘導する。
【００６５】
例１２：ＩＭＯ媒介胃内ワクチン接種
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝１０）に胃内的にＰＢＳ４００μｌ中２５ｍｇ／ｋｇＯＶＡタンパク質のみあるいは１５ｍｇ／ｋｇのＯｌｉｇｏ１７またはＩＭＯ２を混合して１日目および１４日目に投与した。それぞれの群の３匹のマウスを４２日目の処分した。ＯＶＡ特異的抗体およびＴ細胞応答を、ＥＬＩＳＡ法とＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法により評価した。ＩＭＯの経口投与により腫瘍の拒絶が結果として起こるかどうか決定するために、それぞれの群の７匹のマウスにＯＶＡを発現しているＥＧ−７腫瘍細胞を接種した（図９を参照）。
【００６６】
例１３：経口ワクチン接種したマウスにおけるＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌
免疫化したマウス（ｎ＝３）からの脾臓および腸間膜リンパ節（実施例１２を参照）を４２日目に収集した。Ｔ細胞は貯蔵した脾臓細胞およびリンパ節からＴ細胞濃縮カラムを使って精製した。２．５×１０５個のＴ細胞を、２．５×１０５個のマイトマイシンＣ処置したＴ細胞および免疫優勢のＯＶＡ２５７−２６４またはＯＶＡ３２３−３３７パルスした同系間の脾臓細胞により、２４時間刺激した。ＭＨＣクラスＩに特異的に応答するＴ細胞を限定して、ＯＶＡ２５７−２６４再刺激を製造者の取扱説明書に従ってＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ解析（R&D Systems）により決定した。スポットを電子的に列挙した（Zellnet, New York, NY）。Ｏｌｉｇｏ１７およびＩＭＯ２の両方は、ＯＶＡ単独と比較してより高いレベルのＩＦＮ−γ分泌をする。図１０はＯＶＡを伴ったＩＭＯ２の経口投与により、より強い全身的にＨ−２ｋｂが限定された、脾臓細胞におけるＯＶＡ２５７−２６４特異的Ｔ細胞応答が、Ｏｌｉｇｏ１７と比較して引き出されたことを示す。
【００６７】
例１４：ＩＭＯ２およびＯｌｉｇｏ１７を粘膜アジュバントとして混合したＯＶＡによる胃内免疫化に引き続く血清抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１応答
本来の免疫化（実施例１２を参照）後４２日目に収集した血清試料を、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ（Ａ）およびＩｇＧ１（Ｂ）に関してＥＬＩＳＡ法で評価した。Ｏｌｉｇｏ１７と比較すると、ＩＭＯ２は明らかにより高い血清ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよび抑制された抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１を誘導した。図１１で示すように、Ｈ−２ｋｂが制限された、ＯＶＡ２５７−２６４特異的ＣＴＬおよびＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの強い誘導は、ＩＭＯ２が強いＴｈ１免疫応答を引き出したことを示す。
【００６８】
例１５：腸内洗浄物における抗ＯＶＡ  ＩｇＡレベル
本来の免疫化後４２日目に収集した腸内洗浄物をＯＶＡ特異的ＩｇＡに関してＥＬＩＳＡ法で解析した。図１２は、ＩＭＯ２がＯｌｉｇｏ１７と比較して腸内組織においてより高いＯＶＡ特異的ＩｇＡを誘導していることを示す。
【００６９】
例１６：ＯＶＡ陽性腫瘍接種に対する免疫防御効果を誘導するＩＭＯ２あるいはＯｌｉｇｏ１７を混合したＯＶＡで胃内免疫化したマウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを実施例１２で記述されたように胃内ワクチン接種をした。免疫化したマウス（ｎ＝７）を、ＯＶＡを発現している１．５×１０６個のＥＧ−７細胞で接種した。１００％のＰＢＳあるいはＯＶＡタンパク質のみを胃内投与をした対照群のマウスは、平均生存時間２６．４日で死亡した。ＩＭＯ２あるいはＯｌｉｇｏ１７で胃内免疫化したマウスのうち約４３％は、５５日以上腫瘍なしであった。図１３は、ＩＭＯ２あるいはＯｌｉｇｏ１７混合ＯＶＡ胃内群で腫瘍で死亡したマウスの生存期間は、それぞれ４３日および３８．８日まで有意に延長したということを示す。
【００７０】
例１７：粘膜免疫化の用量依存応答
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００μｇのＩＭＯ２あるいはＯｌｉｇｏ１７を混合した１００μｇのＯＶＡ、あるいは３００μｇのＩＭＯ２あるいはＯｌｉｇｏ１７を混合した５００μｇのＯＶＡを、１日目および１４日目に胃内投与した。血清試料を４２日目に収集し、ＥＬＩＳＡ法で抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａおよび抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１に関して解析した。図１４は、ＩＭＯ２が、より低いおよび高い用量の胃内投与の両方において、より高い抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａおよびより低い抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１を誘導したことを示す。
【００７１】
例１８：粘膜免疫応答の経時変化研究
Ｃ５７ＢＬ／ｃマウスを１００μｇのＯＶＡのみ、１００μｇのＩＭＯ２あるいはＯｌｉｇｏ１７を混合した１００μｇＯＶＡを、１日目および１４日目の２度胃内ワクチン化した。血清試料を２３、４２、６０および２００日目に採集した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡ法で決定した。図１５は、ＩＭＯ２／ＯＶＡがＯＶＡ単独あるいはＯｌｉｇｏ１７／ＯＶＡよりも高レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ２を産生し、６０日目にピークに達し２００日目まで上昇したままであることを示す。
【００７２】
例１９：処置手順に対する応答パラメーター
処置手順は、図１６に示す通りである。図１７〜２２に結果を示す。ＩＭＯの鼻腔内（ｉ．ｎ．）あるいは皮下（ｓ．ｃ．）投与のいずれかの投与により、ＯＶＡ感作および接種したマウスの肺における生産を、Ｔｈ２サイトカインに関しては抑制をし、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに関しては誘導をした。ブテノシドではなく、ＩＭＯが、ＯＶＡ感作および接種したマウスにおいて血清ＩｇＥを抑制し血清ＩｇＧａを増加させた。ブテノシドではなく、ＩＭＯが、ＯＶＡ感作および接種マウスの肺において、炎症性細胞の浸潤および粘液過分泌を減少させた。対照群ＩＭＯではなく、経口投与したＩＭＯが、肺の炎症および粘液過分泌を減少させるのと同様に、血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥを抑制し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａを誘導した。要約すれば、ＩＭＯ含有の合成モチーフは、強いＴｈ１免疫賦活剤であり、Ｔｈ２サイトカイン産生抑制剤である。鼻腔内あるいは皮下投与したＩＭＯ含有ＣｐＧ＊ジヌクレオチドは、ＯＶＡによりアレルギー性喘息のネズミモデルにおいてＴｈ２応答を逆転させた。経口投与したＩＭＯは、対照群ＩＭＯと比較して、肺におけるＴｈ２応答を効果的に逆転させた。
【００７３】
例２０：胃内ワクチン接種
メスＣ５７ＢＬ／６マウスをオリゴ投与前にイソフルレン吸入で軽度に鎮静化した。１５ｍｇ／ｋｇのＩＭＯ２０４８または１１８２あるいはＣｐＧ  ＤＮＡを２５ｍｇ／ｋｇトリオバルブミン（ＯＶＡ）（グレードＶ、Sigma, St. Louis, MO）とＰＢＳ４００μｌ中に混合して胃内投与で１日目および１４日目に投与し、対照群マウスは４００μｌのＰＢＳ中の２５ｍｇ／ｋｇのＯＶＡで免疫化した（図２３に処置手順を示す）。図２４〜２６に結果を示す。
【００７４】
ＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＴＬ応答を決定するために、それぞれの群から３匹のマウスを３５日目と４２日目に処分し、それぞれの群の脾臓細胞と腸間膜リンパ節からのＴ細胞をＴ細胞濃縮カラム（R&D Systems, Minneapolis, MN）を使って精製した。精製したＴ細胞（２．５×１０５個）を、２．５×１０５個のマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ、Sigma, St. Louis, MO）およびＯＶＡ２５７−２６４あるいはＯＶＡ３２３−３３７パルスで不活化したＡＰＣにより、２４時間刺激した。ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドでの刺激に応答するＣＴＬ分泌ＩＦＮ−γの数は、ＥＬＩＳＰＯＴ法（R&D System）により決定した。血清試料（ｎ＝７）は、４２日目に採取し、ＯＶＡ特異的血清抗体応答は、４２日目にＥＬＩＳＡ法で評価した。図２４は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法で決定したように、Ｔ細胞が、腸間膜リンパ節および脾臓から採集したＯＶＡ２５７−２６４に特異的に応答することを示す。
【００７５】
ＯＶＡ特異的抗体決定のために、９６ウェルプレートを室温で３時間ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのＯＶＡと培養した。固相は一晩４℃で最初の免疫化から３５〜４２日後に採集した腸洗浄物あるいは血清試料とともに培養し、引き続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を接合したヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａあるいはＩｇＡ（PharMingen, San Diego, CA）と共に培養した。抗体の結合は、ＡＢＴＳ基質（Zymed, San Francisco, CA）との免疫複合物の反応ののち４５０ｎｍで吸光として測定した。図２５で示すように、２０４８を混合したＯＶＡはより強いＴｈ１型の応答を誘導して、より高い血清ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａを示し（Ａ）、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１を抑制する（低くする）（Ｂ）。付け加えて、図２６で示すように、ＩＭＯ媒介胃内ＯＶＡワクチン接種は、腸内洗浄物において局所的なＯＶＡ特異的分泌ＩｇＡを誘導した。
【００７６】
例２１：ＩＭＯ媒介胃内ワクチン接種の経時研究
図２７で表したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５ｍｇ／ｋｇのＯＶＡのみあるいは、直線ＣｐＧオリゴ（１１８２）あるいはＩＭＯ２０４８との混合物を１日目と１４日目に胃内投与し、ＯＶＡ特異的血清抗体応答を４２日目と６０日目にＥＬＩＳＡ法で評価した。図２８で示すように、４２日目のＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａレベルは、ＯＶＡ２０４８グループにおいて増え始めた。ところが一方、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１は、この時点ではＯＶＡ−２０４８群において完全に抑制された。６０日目までは、抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａはＯＶＡ−２０４８群においては増え続け、ＯＶＡ−１１８２群におけるＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａはＯＶＡ−２０９２（非ＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオリド）対照群レベルまで減少した。ところが一方、抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１力価はこの時点では劇的に増加し、恒常的なＯＶＡ−２０４８の存在がＯＶＡ−２０４８群においてＴｈ１優勢状態のままにすることに必要なことを示唆している。
【００７７】
例２２：ＩＭＯ媒介胃内ワクチン接種免疫化のスケジュールの研究
図２９で示したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５ｍｇ／ｋｇのＯＶＡのみ、あるいは５ｍｇ／ｋｇの１１８２あるいは２０４８との混合物を１日目および１４日目に（第１群）、あるいは１日目、１４日目および４２日目（第２群）に胃内投与した。ＯＶＡ特異的血清抗体応答を、４２日目および６０日目のＥＬＩＳＡ法で評価した。図３０は、恒常的なＯＶＡ−２０４８の存在がＯＶＡ−２０４８群においてＴｈ１優勢状態を維持するために必要なことを示す。２つの免疫群（１日目および１４日目）において、ＯＶＡ−２０４８群において６０日目にＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１の両方に高い力価がみられ、免疫応答が早い時点（４２日目）のＴｈ１型のものから遅い時点（６０日目）のＴｈ１およびＴｈ２混合型のものへと移行したことを示唆している。ＯＶＡ−１１８２の胃内免疫化により引き出される体液性応答は、ＩｇＧ２ａが６０日目に対照群レベルまで減少するので、有意により短い期間続いた。４２日目のさらなる免疫化は、ＯＶＡ−２０４８群においてＯＶＡ特異的ＩｇＧ１を明らかに阻害するので、かかる応答を逆転することができる。
【００７８】
例２３：ＩＭＯ媒介胃内ワクチン接種用量依存性応答
図３３で示すように、Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝１０）マウスに５ｍｇ／ｋｇあるいは２５ｍｇ／ｋｇのＯＶＡのみ、あるいは５ｍｇ／ｋｇあるいは１５ｍｇ／ｋｇの直線ＣｐＧオリゴ（１１８２）あるいはＩＭＯ２０４８を混合して１日目と１４日目に投与し、ＯＶＡ特異性血清抗体応答を４２日目にＥＬＩＳＡ法で評価した。図３２は、ＯＶＡ−２０４８がより強いＴｈ１型の応答を誘導したことを示す。
【００７９】
例２４：ＩＭＯ媒介胃内ワクチン接種腫瘍接種研究
図３３に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）に、１５ｍｇ／ｋｇの２０４８あるいは１１８２を４００μｌのＰＢＳで混合した２５ｍｇ／ｋｇのＯＶＡを１日目と１４日目に胃内投与し、免疫化したマウス（ｎ＝７）に１．５×１０６個のＯＶＡ陽性ＥＧ−７細胞を４２日目に接種した。図３４は、ＯＶＡ−１１８２およびＯＶＡ−２０４８の両方が抗原特異的な腫瘍拒絶を引き出したが、しかしながら異なる免疫応答プロフィルが２０４８あるいは１１８２におけるＯＶＡにより引き出され、ＯＶＡ陽性ＥＧ−７腫瘍細胞接種に対する異なる免疫防御が結果として起こり得るということを示す。
【００８０】
先行発明を、明確化と理解の目的のためにいくらか詳細に記述しているが、当然のことながら、この開示の解釈から、当業者は、本発明および添付の請求項の本来の範囲から逸脱せずに形式および詳細において様々な変化をなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＣｐＧ＊  ＩＭＯまたはＣｐＧ  ＤＮＡ胃内（ｉ．ｇ．） 投与４時間後の胃抽出物における、ＭＩＰ−β（Ａ）、ＩＰ−１０（Ｂ）産生および腸抽出物におけるＩＬ−１２（Ｃ）レベルを示す図である。
【図２】ＣｐＧ＊  ＩＭＯまたはＣｐＧ  ＤＮＡ胃内投与４時間後の血清ＩＬ−１２およびＭＣＰ−１レベルを示す図である。
【図３】ＣｐＧ＊  ＩＭＯまたはＣｐＧ  ＤＮＡ胃内投与４時間後の血清ＭＩＰ−βレベルを示す図である。
【図４】ＣｐＧ＊  ＩＭＯまたはＣｐＧ  ＤＮＡ胃内投与４時間後の血清ＩＬ−１２レベルを示す図である。
【図５】ＣｐＧ＊  ＩＭＯまたはＣｐＧと混合したＯＶＡの胃内投与後の血清ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示す図である。
【００８２】
【図６】胃内投与後の腸内洗浄物における局所的ＩｇＡレベルを示す図である。
【図７】胃内投与後４２日目の抗ＯＶＡ ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１血清レベルを示す図である。
【図８】直腸内（ｉ．ｒ．）投与後３５日目の抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１血清レベルを示す図である。
【図９】ＩＭＯ媒介胃内ワクチン接種および接種の処置手順を表す図である。
【図１０】経口ワクチン接種したマウスにおけるＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を示す図である。
【００８３】
【図１１】ＩＭＯ２あるいはオリグヌクレオチド１７を粘膜アジュバントとして混合したＯＶＡによる胃内免疫化に引き続く血清抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１応答を示す図である。
【図１２】腸内洗浄物および血清洗浄物における抗ＯＶＡ  ＩｇＡレベルを示す図である。
【図１３】ＩＭＯ２、あるいはオリゴヌクレオチド１７を混合したＯＶＡで胃内免疫化したマウスにおける、ＯＶＡ陽性腫瘍接種に対する誘導された免疫防御効果を示す図である。
【図１４】粘膜免疫に対する容量依存的な応答を示す図である。
【図１５】粘膜免疫応答の経時的研究に対するＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１応答を表す図である。
【００８４】
【図１６】ブデオノサイドを接種したマウスと比較した、ＩＭＯ接種マウスに対する処置手順を表す応答。
【図１７】ＯＶＡ感作マウスにおけるサイトカイン／ケモカインレベルへの、ＩＭＯの鼻腔内（ｉ，ｎ．）および皮内（ｓ．ｃ．）投与の効果を示す図である。
【図１８】ＯＶＡ感作マウスにおける血清抗体レベルへの、ＩＭＯの鼻腔内（ｉ，ｎ．）および皮内（ｓ．ｃ．）投与の効果を示す図である。
【図１９】ＯＶＡ感作マウスにおける肺炎症への、ＩＭＯの鼻腔内（ｉ，ｎ．）および皮内（ｓ．ｃ．）投与の効果を示す図である。
【図２０】ＯＶＡ感作および接種マウスにおける血清免疫グロブリン（Ｉｇ）レベルへの、ＩＭＯの経口投与の効果を示す図である。
【００８５】
【図２１】ＯＶＡ感作および接種マウスにおけるＢＡＬＦ  Ｉｇレベルへの、ＩＭＯの経口投与の効果を示す図である。
【図２２】ＯＶＡ感作マウスにおける肺炎症への、ＩＭＯの経口投与の効果を示す図である。
【図２３】胃内ワクチン接種の処置手順を表す図である。
【図２４】Ｔ細胞が特異的に腸間膜リンパ節および脾臓から収集したＯＶＡ２５７−２６４へ応答していることを示す図である。
【図２５】より高い血清ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ（Ａ）、および抑制された（より低い）ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１（Ｂ）を示すことにより、２０４８を混合したＯＶＡがより強いＴｈ１型の応答を誘導したことを示す図である。
【００８６】
【図２６】ＩＭＯ媒介胃内ＯＶＡワクチン接種により、腸内洗浄物中に局所的ＯＶＡ特異的なＩｇＡ分泌が誘導したことを示す図である。
【図２７】胃内ワクチン接種の処置手順を表す図である。
【図２８】４２日目のＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａのレベルがＯＶＡ−２０４８群において増加し始めたことを示す図である。
【図２９】胃内ワクチン接種およびＯＶＡ特異的体液性応答の処置手順を表す図である。
【図３０】ＯＶＡ−２０４８群においてＴｈ１優勢の状態を維持するためには、ＯＶＡ−２０４８が一貫して存在している必要があることを示す図である。
【００８７】
【図３１】胃内ワクチン接種とＯＶＡ特異的体液性応答の処置手順を表す図である。
【図３２】ＯＶＡ−２０４８がより強いＴｈ１型の応答を誘導したことを示す図である。
【図３３】胃内ワクチン接種腫瘍接種研究の処置手順を表す。
【図３４】ＯＶＡ−１１８２およびＯＶＡ−２０４８の両方は抗原特異的な腫瘍拒絶反応を発現させたが、しかしながら、異なる免疫応答の分析結果が２０４８あるいは１１８２におけるＯＶＡにより引き出され、ＯＶＡ陽性ＥＧ−７腫瘍細胞接種に対して異なる免疫防御が起こりうることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
2007523173.tif 000039
2007523173.tif 000040