(57)【要約】  本発明は、少なくとも2種のポリペプチド、1つはアニオン性であり他はカチオン性のポリペプチドを含む生分解性バリア網様構造に関する。本発明はまた、当該生分解性バリア網様構造をつくるために用いられる成分を含むアプリケータ及びキットに関する。本発明はまた、治療、例えば医薬、獣医薬及び園芸における当該アプリケータ又はキットの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)カチオン性ポリペプチド；
b)アニオン性ポリペプチド；及び
c)薬学的に許容される担体
を含む、生分解性バリア網様構造。
【請求項２】
a)がアミノ酸残基R、H、K、合成及び半合成変形体、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる、請求孔１記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項３】
b)が、アミノ酸残基D、E、合成及び半合成変形体、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる、請求孔２記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項４】
前記ポリペプチド内の少なくとも1つのアミノ酸残基が、同一種のアミノ酸残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項５】
前記ポリペプチドの少なくとも1つが、1以上のアミノ酸残基、他のペプチド又は他の物質に結合する、請求項１〜５のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項６】
前記ポリペプチドの少なくとも1つが、アミド化、エステル化、アシル化、PEG化又はアルキル化によって修飾される、請求項１〜６のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項７】
前記ペプチドが、少なくとも5,000 Da、例えば約5,000〜約50,000 Daの大きさを有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項８】
薬学的に許容される担体、例えば希釈剤又は緩衝剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項９】
治療剤、例えば抗菌剤、抗炎症剤、洗浄剤、抗酸化剤、アポトーシス調節因子、治癒剤、繊維成長阻害剤、抗腫瘍剤及び止血剤を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項１０】
前記治療剤が、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、テトラサイクリン、マクロライド、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、アセチルサリチル酸、タンパク質分解酵素、ビタミン、グルタチオン、葉酸、カルクミン、デキサメタソン、カロチノイド、リノール酸及び共役-リノール酸、メラトニン、イソシオシアネート、シコニン、ソラマルギン、ペリホシン、デオキシニバレノール、カルボキシアミド-トリアゾール（CAI）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、成長因子、インシュリン、ビタミンE、レチノール酸、ハーブ成分、ノルエピネフリン、ゼラチン、コラーゲン及び酸化セルロースからなる群より選ばれる、請求項９記載の生分解性バリア網様構造。
【請求項１１】
a)カチオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体；及び
b)アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体
を含むアプリケータであって、
当該カチオン性ポリペプチド及びアニオン性ポリペプチドは、互いにセパレータによって分離される、前記アプリケータ。
【請求項１２】
前記アプリケータが、シリンジ、1以上の成分スプレイ、噴霧剤（nebulators）、膏薬、カテーテル、絆創膏、インプラント及び包帯を含む群より選ばれる、請求項１１記載のアプリケータ。
【請求項１３】
前記セパレータが、ゲル化水溶液又は膜である、請求項１１又は１２記載のアプリケータ。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、請求項２〜１０のいずれか１項により定義される、請求項１１〜１３のいずれか１項記載のアプリケータ。
【請求項１５】
a)カチオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体；
b)アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体；並びに
c)当該カチオン性及びアニオン性ポリペプチドを投与する手段
を含むキット。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが請求項２〜１０のいずれか１項によって定義される、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
前記手段が、シリンジ、膏薬、カテーテル、絆創膏、インプラント、包帯、1以上の成分スプレイ及び噴霧剤（nebulators）からなる群より選ばれる、請求項１６又は１６記載のキット。
【請求項１８】
治療剤、例えば抗菌剤、抗炎症剤、洗浄剤、抗酸化剤、アポトーシス調節因子、治癒剤、繊維形成阻害剤、抗腫瘍剤及び止血剤を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項記載のアプリケータ又は請求項１５〜１７のいずれか１項記載のキット。
【請求項１９】
前記治療剤が、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、テトラサイクリン、マクロライド、ヨウ素、銀、銅、クロロヘキシジン、アセチルサリチル酸、タンパク質分解酵素、ビタミン、グルタチオン、葉酸、クルクミン、レスベラトロール、エピガロカテキン、アントシアニド、グルココルチコステロイド、インシュリン、デキサメタソン、カロチノイド、リノール酸及び共役-リノール酸、メラトニン、イソチオチアネート、シコニン、ソラマルジン、ペリホシン、デオキシニバレノール、カルボキシアミド-トリアゾール（CAI）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、成長因子、ビタミンE、レチノール酸、ハーブ成分、ノルエピネフリン、ゼラチン、コラーゲン及び酸化セルロースからなる群より選ばれる、請求項１８記載のアプリケータ又はキット。
【請求項２０】
前記治療剤が、2種のポリペプチドと分離されているか又は当該ポリペプチドの1つもしくは両方と混合されている、請求項１８又は１９記載のアプリケータ又はキット。
【請求項２１】
例えば医薬、獣医薬及び園芸における、請求項１１〜２０のいずれか１項記載のアプリケータ又はキットの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の生分解性バリア網様構造をつくるための、請求項１１〜２１のいずれか１項記載のアプリケータ又はキットの使用を含む、損傷を有する哺乳動物の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、1つはアニオン性であり他はカチオン性である、2種のポリペプチドを含む生分解性バリア網目組織に関する。本発明はまた、当該生分解性バリア網様構造をつくるために使用される成分を含むアプリケータ及びキットに関する。本発明はまた、治療、例えば医薬、獣医薬及び園芸における当該アプリケータ又はキットの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組織表面は、化学的曝露の種類及び程度によって保護を必要とし、それらが通常供される被覆を必要とする。よって、身体の全ての細胞は、主に脂質及びタンパク質から成る細胞膜バリアによって覆われている。真皮表面は、気道、胃腸管及び程度によっては尿生殖路のような外の世界と結合し、より過酷な環境に曝されている。これらの上皮表面は、粘性と弾性を併せ持ち、保護特性を有する粘液層によって更に被覆されている。一方、組織、例えば滑液及び中皮は、同程度の強烈な条件に曝されないので、粘液に保護されていない。
【０００３】
加えて、生上皮組織、例えば血管又は血液器官は、他と無関係に機能することができるように、粘膜、漿膜、及び滑膜及び内皮膜によって覆われる。中皮細胞の単一層からなる腹膜、心膜及び胸膜は、腹液の薄膜によって覆われている。膜成分及び液体の被覆層は、いくつかの機能、例えば内封された器官の潤滑化を有する。
【０００４】
保護的上皮膜は、非常に薄く、中皮細胞の単一層及び1つのみ又は少数のリン脂質二重層で覆われている結合組織の繊細な層を含む。これは、滑液及び中皮組織、特に感染及び外傷を受けやすい組織をつくる。かかる膜は、物理的、化学的又は微生物的チャレンジに曝露される場合に、通常、膜にとって有害な多くの強力な物質がそこから反応時に放出される。従って、膜の構造及び機能は、外傷、虚血及び感染と関連して容易に破壊される。ストレス-感受性膜の炎症後、例えば外科手術の際に膜表面の乾燥又は磨り減りによって、フィブリンクロットで直ちに被覆されることになる。
【０００５】
プラスミノーゲン活性（すなわち、フィブリン分解能力）は、外傷後に減少するので、フィブリンクロットは、線維性癒着、異常な方法で、隣接する漿膜又は滑膜によって、すなわち、小さなバンド又は構造として後に形成される。体のそのような部分での外科的手術、感染又は炎症は、漿膜又は滑膜によって覆われるが、冒された領域の大きさに関係なく、癒着炎症を引き起こす。生上皮組織間の癒着は、外科的外傷又は感染後、最初に数日内に形成され、全ての生組織ではなく体の特定の部分でのみ観察される。例えば腸どうし、又は腸と腹壁との間の接触領域のかかる癒着は、通常、乾燥のようなき気づかない組織損傷を招き、外科的操作、手術後の細菌感染、炎症又は更なる合併症を伴う、生組織の機械的及び化学的刺激を含む様々な原因となる。
【０００６】
大小の生上皮組織の癒着は、ほとんどの外科分野で観察される。4年の期間に1つの病院で腹部の手術を受ける全ての患者の中で、93％は、前の手術による癒着を有することが明らかになった、ことが報告されている。加えて、10年の期間では、全ての外科手術の内のほとんどにおいて、癒着予防の必要性があることになる。それは、それぞれの主な大陸での、1年間で百万件の手術を越える手術に等しい。
【０００７】
しかしながら、得られる外科手術後の癒着は、外科手術の際に起こる組織損傷の自然損傷治癒反応の結果である。腹膜の損傷治癒及び癒着の形成には、多数の要因が働いている。他には、腹膜マクロファージが、初期の腹膜修復に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００８】
従って、体が、新規な保護層がつくられるのを待つ間に、効率的な方法で、外側から曝露された上皮表面まで対応する保護がなされることが望ましい。更に、外科手術の後に生じる完成及び/又は炎症、及び随伴するフィブリン形成を予防又は減少させることが重要である。
【０００９】
様々な生物活性材料及び巨大分子は、手術後の腹部癒着の程度を減少させることが報告されている。同様に、外科手術癒着の形成に限定されない多数の方法が有望にも研究されているが、一般的に曖昧な結果である。しかしながら、手術後の腹膜癒着を避け又は減少させるために払われたほとんどの努力が最終的には断念されている。フィブリン形成を予防するために使用された方法の中では、フィブリン形成、表面分離及び外科手術技術の削減が言及されている。
【００１０】
損傷組織及び隣接器官の間のフィブリン・ブリッジの形成を予防するために、損傷部位にバリアを置く多数の研究がなされている。かかるバリアは、再吸収材料、例えば酵素的に分解可能な、酸化再生セルロース、及びゆっくり溶解するその種の物理化学的に架橋したハイドロゲルを含む。
【００１１】
曝露された上皮表面の表面保護のほとんどの方法は、そのため手術後の癒着に限られるが、組織間に材料を置くことによって損傷分離を与えることにも集中している。加えて、推測される組織損傷が起こった後の損傷治癒事象を制御するために、いくつかの種類の粘性ポリマー溶液、例えばポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、デキストラン及びヒアルロン酸は、外科手術の前後に添加されてきた。潤滑化を増加させ、かつフィブリンクロットが他の表面に癒着しないようにすることにより、又は治癒する間に損傷組織を機械的に分離することによって、これらの溶液が働くことが想定される。
【００１２】
採用したポリマー溶液は、高分子量ポリマーの粘度に主に基づき、これは、濃度が増加すると、増加することを意図する。当該ポリマーは、米国特許第4,994,277号明細書では一般的にポリサッカライドであり、そこには、生組織間の癒着を抑制するための、生分解性キサンタンガムの粘弾性ゲル水溶液が記載されている。しかしながら、例えば、腹膜癒着を減少させるために、外科手術中に保護コーティングとして又は手術後に表面セパレータとして使用される場合に、これらのポリマーの主な欠点は、当該ポリマーの腹腔内での短滞留のために、癒着をそれ程減少させることができない点である。患者に次の手術を実施しなければならないという結果になる。
【００１３】
粘性の低いポリマー溶液は、組織及び器官の自然潤滑性を維持し、かつ内包膜を保護するために、外科手術中に、組織保護コーティングとして使用されてきた。組織保護及び癒着抑制のための前コーティングは、保護コーティングが組織で維持され得るように、過度な組織操作及び炎症が手術を介して起こりかつ継続する前の、外科手術開始での組織コーィングを含む。
【００１４】
米国特許第5,366,964号明細書は、損傷治癒を受ける細胞と直接接触して使用される、損傷治癒を促進するための外科的粘弾性溶液を示している。当該溶液は、外科手術中の、細胞保護及び細胞コーティングを目的としており、1又はいくつかのポリマー成分を含む。ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び硫酸コンドロイチンは、組織を潤滑化すると想定され、一方、ヒアルロン酸ナトリウムは、当該溶液に粘弾性を与える。
【００１５】
外科手術後癒着を治療するための今日のいくつかの薬剤は、ヒアルロン酸を含む。例えば、米国特許第5,409,904号明細書は、眼の手術中に上皮細胞を保護することを目的とした細胞損失及び組織損傷を減ずる溶液を記載する。使用される組成物は、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、修飾コラーゲン、及び/又は修飾セルロースを含む粘弾性材料からなる。WO 9010031には、相乗的に作用すると考えられるデキストラン及びヒアルロン酸を含む、外科手術後の組織癒着を抑制する組成物が記載されている。WO 9707833には、ベンジルエステル又はヒアルロン酸の共有結合架橋誘導体を含む、外科手術癒着を抑制するためのバリア材料が示されている。
【００１６】
Healonの商標でファルマシアにより製造される、もともと点眼を目的としたヒアルロン酸系薬剤は、今日までに最も効果的な薬剤であることが見出されている。しかしながら、ヒアルロン酸は、鶏のとさかから単離され、そのため、非常に高価であり、更に、少量でアレルギーを引き起こす可能性があり、大表面、例えば約2 m2の面積を有する腹膜にはなおさらである。
【００１７】
WO 9903481には、隣接膜又は隣接細胞又は組織由来の組織及び生物膜を潤滑化及び分離する組成物が示されている。これは、疎水性基と共有結合する生物的に許容される水溶性カチオンポリマーから形成される疎水性ポリマーを含む。
【００１８】
同様に、水不溶性生物適合性組成物は、EP 0,705,878号に示されている。それは、疎水性の生物吸収性ポリマーと組み合わせたポリアニオン性ポリサッカライドを含む。
【００１９】
米国特許第6,235,313号明細書では、多数のポリマーの、粘膜表面に対する癒着力を比較している。負に荷電したハイドロゲル、例えばアルギン酸塩及びカルボキシメチルセルロース、表面上の曝露されたカルボン酸基、並びにいくつかの正に荷電したハイドロゲル、例えばキトサンが試験された。選択は、ほとんどの細胞膜が具体的に負に荷電しているという事実に基づいている。しかしながら、最も重要な性質が、胃腸管の壁への生物的癒着を得ることである、に関して明確な結論は未だない。例えば、キトサンは、ポリマー上の正に荷電したアミノ基と、膜上の負に荷電したシアル酸基との間のイオン相互作用の方法により、膜に結合すると考えられる。従って、ポリカチオン性分子、例えばキトサン及びポリリジンは、一般的に負の正味電荷を有するので、暴露された上皮上面に結合する傾向が強い。
【００２０】
これらの両カチオン性分子の主な欠点は、毒性効果を示す点である。例えば、ポリリジンは、立体化学的変化を起こし、それによって膜輸送イオン流動を阻害することにより、カルシウムイオンチャネルの阻害剤として働くと考えられる。
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明は、非毒性であり、低コスト、生分解的及び非アレルギー誘発的に製造することができる、新規に発明された生分解性バリア網様構造に関する。かかる網様構造は、効率的な方法で外科手術後の癒着を治療することができる。第一に、本発明は、カチオン性ポリペプチド、アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む生分解性バリア網様構造に関する。
【００２２】
第二に、本発明は、カチオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体、アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むアプリケータに関する。当該カチオン性及びアニオン性ペプチドは互いにセパレータによって分離されている。
【００２３】
第三に、本発明は、カチオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体、アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むキット、並びに当該カチオン性及びアニオン性ポリペプチドを投与する手段に関する。
【００２４】
最後に、本発明は、本発明に従う生分解性バリア網様構造をつくるための、本発明に従うアプリケータ又はキットの使用を含む、損傷を有する哺乳動物を治療する方法に関する。かかる網様構造、アプリケータ及びキットを提供することによって、損傷治癒に使用するための新規改良生成物は市場で入手可能なことになる。
【００２５】
発明の詳細な説明
定義
本発明の文脈において、以下のように定義する。用語「生分解性バリア網様構造」とは、損傷状態の組織間の癒着を抑制するバリアを意味し、例えば炎症及び感染性薬剤に対する損傷組織の保護を提供する。
【００２６】
加えて、バリアは、損傷の治癒過程で終始、分解性である。「網様構造」は、少なくとも2つのポリペプチドの混合物間で形成される網様構造を意味する。少なくとも1つはカチオン性であり、他の1つはアニオン性である。
【００２７】
「アミノ酸残基の同一種」とは、ポリペプチド内のアミノ酸残基が例えば、単にH (H-H-H-H-H-H-H)である、ことを意味する。
【００２８】
本文脈では、アミノ酸残基の名称は、IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides), Eur J Biochem., 138, 9-37 (1984) together with their corrections in Eur J Biochem., 152, 1 (1985)に基づくProtein DataBank (PNB) (www. pdb. org)によって定義されているように使用される。用語「アミノ酸」は、アルギニン(Arg又はR)、ヒスチジン(His又はH)、リジン(Lys又はK)、アスパラギン酸(Asp又はD)及びグルタミン酸(Glu又はE)から成る群より選ばれるアミノ酸を示す。
【００２９】
生分解性バリア網様構造
本発明は、生分解性バリア網様構造に関する。生分解性バリア網様構造は損傷部位に形成される。当該網様構造は、カチオン性ポリペプチド、アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。当該網様構造は、少なくとも1つのアニオン性及び少なくとも1つのカチオン性ポリペプチドを組織に順に適用することにより形成される。カチオン性ポリペプチド担体は、その投与を集中させるためにゲル化されている。組織が損傷され、保護膜部分又はその全体が剥がれる。そのため、その下にある組織は曝露され、網様構造は、哺乳動物、例えばヒト又は動物の曝露された上皮表面の保護として役立つだろう。
【００３０】
カチオン性ポリペプチドは、アミノ酸残基R、H、K、合成及び半合変形体及びその混合物、例えばポリリジン、ポリアルギニン又はポリヒスチジンからなる群より選択される。ポリペプチドはL形態であってもよい。ポリペプチドは、1つ及び同一のアミノ酸残基から成る群のポリペプチド、例えば、R-R-R-RもしくはH-H-H-H、又はその混合物、例えばR-H-R-R-H等でもよい。1以上の合成又は半合成アミノ酸残基が当該ポリペプチドに存在してもよい。
【００３１】
アニオン性ポリペプチドは、アミノ酸残基D、E、合成及び半合変形体及びその混合物、例えばポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸からなる群より選ばれる。ポリペプチドはL形態であってもよい。ポリペプチドは、1つ及び同一のアミノ酸残基から成る群のポリペプチド、例えば、D-D-D-DもしくはE-E-E-E、又はその混合物、例えばD-D-E-D-Eでもよい。1以上の合成又は半合成アミノ酸残基が当該ポリペプチドに存在してもよい。
【００３２】
ポリペプチドの長さは、生分解性バリア網様構造が形成される場所、すなわちペプチドが適用される組織により、同一でも異なってもよい。大きさは少なくとも5,000 Da、例えば5,OOO〜約50,000 Daでよい。例えば、6,000、7,000、8,000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000及びその混合物である。 
【００３３】
加えて、少なくとも1つの上記ポリペプチドは、少なくとも1つの異なった中性アミノ酸残基、他のペプチド又は他の物質、例えば損傷表面を洗浄し、抗酸化剤を提供し、アポトーシスを調節し、治癒を促進し、繊維成長及び腫瘍成長を阻害し、出血を制御し、炎症を抑制し、安定性を増加し又は感染に対して保護する物質、に関連している。例えば、抗菌剤、抗炎症剤、洗浄剤、抗酸化剤、アポトーシス調節因子、治癒剤、繊維成長阻害剤、抗腫瘍剤及び止血剤である。
【００３４】
従って、ポリペプチドは、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、PEG化又はアルキル化によって修飾することができる。
【００３５】
上記網様構造は、薬学的に許容される希釈剤又は緩衝剤を含んでもよい。
【００３６】
「薬学的に許容される担体」とは、ポリペプチドの表面保護活性の効率を妨げない非毒性物質を意味する。かかる許容される緩衝剤又は希釈剤は、当該分野で周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences edition, A. R Gennaro著, Mack Publishing Company (1990)参照）。
【００３７】
用語「緩衝剤」とは、pHを安定させる目的の、酸-塩基混合物を含む水溶液を意味する。緩衝剤の例は、トリズマ、ビシン、トリシン、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ACES、ADA、酒石酸塩、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、カコジル酸塩、CHES、DIPSO、EPPS、エタノールアミン、グリシン、HEPPSO、イミダゾール、イミダゾール乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、TESである。
【００３８】
用語「希釈剤」とは、医薬調製物中のペプチドを希釈する目的の、水溶性又は非水溶性を意味する。希釈剤は、1以上の生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油剤（例えば、紅花油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油又はゴマ油）でよい。
【００３９】
発明の網様構造は、1以上の治療剤、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、損傷表面を洗浄し、抗酸化剤を提供し、アポトーシスを調節し、治癒を促進し、繊維成長を阻害し及び腫瘍成長し、又は出血を制御する物質、を含んでもよい。
【００４０】
治療剤の例は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、テトラサイクリン、マクロライド、ヨウ素、銀、銅、クロルへキシジン、アセチルサリチル酸であり、洗浄物質の例はタンパク質分解酵素である。
【００４１】
抗酸化活性を有する薬剤の例は、様々なビタミン、グルタチオン、葉酸、クルクミン、レスベラトロール、アントシアニジン及び多数の他の薬剤である。
【００４２】
アポトーシスを調節し、繊維成長及び腫瘍成長を阻害する薬剤の例は、グルココルチコステロイド、インシュリン、デキサメタソン、カロチノイド、リノール酸、メラトニン、イソチオシアネート、シコニン、ソラマルギン、ペリホシン、デオキシニバレノール（CAI）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び多数の他の薬剤である。
【００４３】
治癒を促進する薬剤の例は、様々な成長因子、インシュリン、ビタミンE、レチノール酸、ハーブ成分及び多数の他の薬剤であり、出血を制御する薬剤の例は、ノルエピネフリン、ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース及び多数の他の薬剤である。
【００４４】
上記のポリペプチドは、自動操作による合成を含む標準的化学的方法によって合成することができる。一般的に、ペプチドアナローグは、カップリング剤として、HATU (N-[DEMETHYLAMINO-1H-1.2.3.-TRIAZOLO[4,5-B] PYRIDIN-1-YLMETHYLELE]-N-METHYLMETHANAMINIUM HEXAFLUOROPHOSPHATE N-OXIDE)、又は他のカップリング剤、例えばHOAt-1-HYDROXY-7-AZABENZOTRIAZOLEを用いる、標準固相Fmoc保護法に基づいて合成される。ペプチドは、側鎖の官能基も保護する好適なスカベンジャーを含む酸で固相樹脂から切り離される。粗ペプチドは、調製逆相クロマトグラフィーを用いて更に精製される。他の精製方法、例えば分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、又はイオン交換クロマトグラフィーを使用してもよい。等価なペプチドを製造するために、当該分野で公知の他の合成法、例えば、保護法又は異なったカップリング試薬の使用等が使用することができる。
【００４５】
本発明のアプリケータ又はキット
更に、本発明は、カチオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体、アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むアプリケータに関する。当該カチオン性及びアニオン性ポリペプチドは、セパレータによって互いに分離される。上で定義したポリペプチド及び溶液は、上で定義した薬学的に許容される溶液である。
【００４６】
アプリケータは、シリンジ、1又は2の成分を含むスプレイ、噴霧剤（nebulators）、膏薬、カテーテル、絆創膏、インプラント及び包帯でもよい。
【００４７】
アニオン性及びカチオン性ポリペプチドが損傷組織に適用される前のアニオン性及びカチオン性ポリペプチドを分離するセパレータは、非毒性で、ポリペプチドの効果に影響を与えない限り、任意のセパレータでよい。セパレータは、生分解性でもよい。2つのポリペプチド溶液を分離する層の主な機能は、ポリアニオン性ペプチドの投与前に、カチオン性ペプチドの全てを洗浄すること、及びアプリケータ内での沈殿を避けること、である。従って、それは、ポリペプチドの溶液に用いられる希釈水又は緩衝剤のみからなるべきである。しかしながら、この水溶液は、ポリペプチド溶液を希釈してはならず、そのため、最初に適用されたカチオン性ポリペプチドに投与されるべきではない。セパレータは水溶液のゲル状態でもよい。加えて、セパレータは膜でもよい。
【００４８】
加えて、アプリケータは、1以上の治療剤、例えば上で定義した薬剤を含んでもよい。薬剤は、（当該2つのポリペプチドから分離されるか又は）ポリペプチドの1つ又は2つと混合される。
【００４９】
治療剤は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、テトラサイクリン、マクロライド、ヨウ素、銀、銅、クロロへキシジン及び抗炎症剤、例えばアセチルサリチル酸からなる群より選ばれる。
【００５０】
加えて、本発明は、カチオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体、アニオン性ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むキット、並びに当該カチオン性及びアニオン性ポリペプチドを投与するための手段に関する。ポリペプチドは上で定義したとおりである。この手段は、シリンジ、スプレイ、膏薬、カテーテル、絆創膏、インプラント及び包帯からなる群より選ばれる。
【００５１】
加えて、キットは、1以上の治療剤、例えば抗菌剤及び抗炎症剤を含んでもよい。他の好適な治療剤は上で定義したとおりである。治療剤は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、テトラサイクリン、マクロライド、ヨウ素、銀、銅、クロロへキシジン及びアセチルサリチル酸からなる群より選ばれる。
【００５２】
上記のアプリケータ又はキット内の治療剤は、当該2つのポリペプチドから分離することができ、又は当該ポリペプチドの1つもしくは2つと混合することができる。上記のアプリケータ及び/又はキットは、治療、例えば医薬、獣医薬及び園芸に使用することができる。
【００５３】
最後に、本発明は、上記のアプリケータ及び/又はキットの使用を含む、損傷を有する哺乳動物を治療し、開示した網様構造をつくる方法に関する。本発明が有用である範囲の例は、眼球の損傷及び感染、鼻の創傷、損傷及び感染、皮膚の損傷及び感染、日焼け、日射皮膚損傷/火傷、床ずれ、慢性下腿潰瘍、膣創傷、膀胱感染、咽頭潰瘍及び胃潰瘍、腸の炎症及び潰瘍、関節の炎症及び漿膜損傷、固体器官例えば脚、肝臓及び脾臓への表面切断又は損傷、骨損傷、腹膜異常及び炎症である。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例を参考に本発明を更に記載し、例証する。しかしながら、留意されたいが、これらの実施例が多少なりとも本発明を限定するものと考えてはならない。
【００５５】
実施例１
癒着抑制
再生可能かつ標準ラット及びウサギモデルを採用した。癒着を誘導するために48匹の雌性の体重約25〜30 gを使用し、42匹を更なる試験に使用した。動物を標準条件下に飼育し、ペレット及び生水を自由に摂取させた。
【００５６】
ケタミン150 mg/kg (Ketalar, Parke Davis)及び7.5 mg/kg (Rompun, Bayer Sverige AB)筋肉内注射で麻酔した。消毒後に、25 mmの長さで中線開腹を行った。側面腹部壁の両腹膜表面を曝露し、中線から同一の距離で、筋肉を含んで、2×15 mm長の鋭利な切開を行った。5.0ポリプロピレン(Prolene, Ethicon, Johnson & Johnson)を用いて等しい距離を2×4の単一縫合することにより、損傷を直ちに閉じた。連続的な5.0ポリプロピレン縫合により2層内で中線開腹を閉じた。麻酔の過剰量を投与した評価時間に、下から右にU字形切開により腹部を全体的に開いた。金属キャリパーを用いて、癒着の長さをその両側につて測定し、データを、癒着によって覆われた創傷割合として表した。
【００５７】
0.5％ポリ-L-グルタミン酸塩及びポリ-L-リジンの水溶液を実験の日に新たにつくり、使用するまで冷蔵庫に保存した。1:10 (wt)の割合で、FITZ-標識ポリリジンを、ポリリジンを混合した。全ての化学物質及び細胞培養物質をSigma-Aldrich, St Louis, USAから購入し；蛍光を発する微粒子(Nile Blue Labeled）をMicroparticles GmbH (Berlin, Germany)から購入した。
【００５８】
動物は、処置及び評価時間に基づいて無作為に4群に分けた。対照群は、2 mlの生理食塩水溶液を腹腔内投与した。2つの処置群は、1 ml ポリ-L-リジン溶液を投与し、5分後、1 mlのポリ-L-グルタミン酸塩溶液を投与した。対照群及び処置群の動物（2×14動物）の1つを外科手術1週間後に屠殺し、癒着の長さを測定した。残りの2群動物（2×10動物）は、評価プロセスを受ける前の4週間、飼育した。
【００５９】
異なった処置群の癒着量の差を測定するために、クラスカル・ワリス検定を使用し、個々の群を比較するために、マン・ホイットニーU検定を使用した。
【００６０】
腹膜チャレンジ後の1週間及び1ケ月に、対応する対照群と比べて、癒着の進行が顕著に減少した（**p≦0.01）（マン・ホイットニーU検定）。対照群では1ケ月後に、顕著ではないが際立った減少(p=0.235)が得られたが、その時点まで、処置群では何の差異もなかった。
【００６１】
損傷それ自体から異なった位置での、化合物の大量の堆積物に関連する癒着は見出だされなかった。24時間後、ポリ-L-リジン及びポリ-L-グルタミン酸塩を与えた動物は、腹膜損傷の上に重厚な保護層を呈し、腹膜表面の残りの部分では薄いフィルムを呈した。しかしながら、FITZ-標識化合物は、1日後には損傷中に見えるに過ぎなかったが、損傷上及び損傷の内側にも検出することができた。6日間の観察期間の最後まで、堆積物は徐々に再構築された。
【００６２】
実施例２
食作用及び粒子取り込み指数
ポリ-L-リジン及びポリ-L-グルタミン酸塩(40 μg/ml)及び/又は蛍光発光粒子（1 μm）でのインキュベーション0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、16時間及び24時間後に、マウス由来の腹膜寄生マクロファージについて、in vitroで食作用の時間経過を試験した。
【００６３】
10 mlの冷DMEM溶液による腹部洗浄により、マクロファージ試料を採取した。培地中の試料を直ちに、1200 rpmで10分間、遠心した。細胞をFBS及びペニシリン/ストレプトマイシン含有DMEMに再懸濁し、48ウェルの細胞培養プレートに各ウェルに5×105細胞を播いた。1.5時間後に、非癒着細胞を洗浄し、試験薬物（ポリ-L-リジン+ポリ-L-グルタミン酸塩）と共に粒子（100/細胞）を40 μg/mlの濃度で12×5ウェルに添加し、粒子のみを残りの12×5ウェルに添加した。更に、負の対照群を各時点で実行した。細胞をインキュベートし（37℃、5％CO2）、評価時間に、250 μl  5 mM EDTA及び同体積の2％パラホルムアルデヒドを用いて分離し、固定した。細胞サイズ(前方散乱, FSC)、粒度(側散乱, SSC)及び蛍光強度(FL3チャンネル)が、各測定で1.5×104細胞を記録したときに、FACS分析(FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA)を行った。マニュアルで特定されるゲートでは、貪職細胞/総マクロファージの比を、各時点での5ウェル及び処置群（対照群及びポリ-L-リジン+ポリ-L-グルタミン酸塩）からのデータのパーセント平均で示した。
【００６４】
非処置細胞はより多くの粒子を取り込んだ。従って、蛍光強度(FL3)及びSSCの最高プラトー（平均）レベルを100％として設定した。取り込まれる粒子の量について言及するため、全ての測定は、プラトーレベルの平均パーセンテージとして示し、粒子取り込み指数と称した。
【００６５】
食作用のプラトーを試験するために、マン・ホイットニーU検定を用い、処置群のペア(それぞれ、対照群、及びポリ-L-リジン+ポリ-L-グルタミン酸塩)の食作用及び粒子取り込み指数の差を試験するために、ウィルコキソン・シグネド・ランクス検定を用いた。
【００６６】
非処置マクロファージの食作用指数が、約5時間で食作用のプラトーに達したが（4時間と5時間との差は、微々たるレベル以下、すなわちp=1に減少した）、処置群は同一の効果を得るのに8時間を要した。（8時間と10時間の差は微々たるもので、p=0.058であった。）24時間後の食作用指数では、低いが有意な差(p=0.043)が得られた（それぞれ、97.3％、94.3％）。
【００６７】
取り込み指数の時間経過は、マクロファージによって貪食された粒子の数が1時間と2時間の間に顕著になったことを示す(p=0.008)。対照細胞群は、16時間と24時間の間にプラトーに達したが（12時間と24時間の指数には微々たる差があった(p=0.841)）、処置細胞群は、試験した最初の24時間に、全くプラトーに達しなかった。更に、取り込み粒子の数は、全ての時間で処置群では顕著に低かった(p=0.043)。
【００６８】
フローサイトメトリーは、マクロファージが試験化合物粒子を貪食し、これは、著しい細胞成長及び大きな食胞をもたらした、ことを証明した。
【００６９】
実施例３
透過型電子顕微鏡
上記の2つの健常非処置動物から腹膜マクロファージを採取し、細胞培養プレート(Thermanox, Naperville, Il, USA)に播いた。細胞を1.5時間後に洗浄し、DMEM溶液で補充したポリ-L-リジン+ポリ-L-グルタミン酸塩(40 μg/ml）を順に添加し、24時間インキュベーションした。インキュベーション培地を除き、細胞を2.5％リン酸緩衝グルタルアルデヒドで固定し、Milloning'sリン酸水溶液で濯いだ。四酸化オスミウム中で試料を後固定し、次いで等級エタノールで脱水し、Araldite 50キットに埋め込んだ。ダイヤモンドナイフで垂直断片を得、LKB Ultrastainerで酢酸ウラニル及びクエン酸鉛により染色した。JEOL 1200 EX透過型電子顕微鏡（TEM）で試料を試験した。
【００７０】
電子顕微鏡は、マクロファージが試験化合物粒子を貪食し、著しい細胞成長を示し及び大きな食胞を形成する、ことを証明した。
【００７１】
実施例４
走査型電子顕微鏡
1日及び7日後の8つの処置（4）及び非処置（4）動物から、腹膜標本及び創傷を得、細胞培養を上記のように行った。試料を、室温で、2.5％リン酸緩衝グルタルアルデヒド中で固定し、次いで1％OsO4中で後固定した。LEO 420電子顕微鏡で試験する前に、試料をアセトンで脱水し、臨界乾燥し、金でスパッタ被覆した。
【００７２】
SEMデータは、中皮細胞が第一日目から化合物表面を覆った、ことを示した。
【００７３】
実施例５
組織学
8動物を開腹し、ポリ-L-リジン+ポリ-L-グルタミン酸塩を腹腔内投与した。手術の1日、2日、3日及び6日後に、2動物を屠殺し、創傷を摘出した。それを直ちに冷凍し、包埋し、得られた断片を直ぐに7 μmのスライスにカットした。このスライスを室温で30分間、暗闇で乾燥し、100 μg/lの4’,6'-ジアミノ-2-フェニルインドール塩酸塩（DAPI）溶液で10分間染色した。FITZ及びDAPIフィルタを用いて蛍光顕微鏡を行い、画像をデジタル式に組み合わせた（OpenLab, Improvosion）。周囲の部屋の光及びUV照明と併せて、透過型照明を用いて、摘出した創傷の拡大写真を撮った。
【００７４】
組織的研究は、添加した材料が第1日目の創傷に存在することを示した。更に、マトリックスが完全に再構築されるまで、毎日、より多くの細胞を検出した。
【００７５】
実施例６
生分解性
健常な非手術動物を実施例1のように腹腔内的に処置し、2ケ月後に屠殺した。ポリ-L-リジン及びグルタミン酸塩の目に見える残渣は検出できなかった。1ケ月の追跡では、ポリ-L-リジン+ポリ-L-グルタミン酸塩の2倍量を用いることによって同様な結果が得られ、これにより生分解性が支持された。しかしながら、7日目の評価では化合物に関連するいくらかの別の癒着を引き起こした。
【００７６】
実施例７
生分解性
1％及び2％リソゾーム、ポリ-L-グルタミン酸塩、ポリ-L-リジン、及びポリ-L-グルタミン酸塩、及び0.25％ヒアルロン酸の水溶液を新たにつくった。次いで、リソゾーム、ポリグルタミン酸塩、リソゾーム+ポリグルタミン酸塩、及びポリリジン+ポリグルタミン酸塩の溶液を実施例1の動物に投与した。外科手術1週間後の腹部癒着の程度は、対照群に比べて4つの処置群で顕著に減少した。しかしながら、ヒアルロン酸では目立った変化は認められなかった(p=0.264)。組み合わせは、不溶性の生成物を与えるようである。
【００７７】
実施例８
ポリ-L-リジンのみの効果
0.5％のポリ-L-リジンの水溶液を新たにつくり、実施例1の動物に投与した。ポリ-L-リジンのみのこのような投与は、30分以内、すなわち麻酔からさめる前に、痙攣及び死を招いた。症状は、カルシウムチャンネルの開口の効果に関連するようであり、血漿レベルが急速に減少した。
【００７８】
実験法の概要は以下のとおりである：
a. 10匹のマウスの背中の両側に標準的な熱損傷をつくった。1つの創傷を当該組成物で処置し、他を対照群とした。処置創傷では、感染速度が減少し、より早く治癒し、後遺症もほとんど見られなかった。
b. 10匹のラットの背中の各々の側に、1 cmの長さの切開を行った。1つの切開を当該組成物で満たし、他を対照群とした。処置創傷では、何事もなくかつより早く、治癒が観察された。
c. 10匹のラットの肝臓及び脾臓に標準的切開を行った。別の10匹のラットを対照群とした。処置動物では、出血量が顕著に減少した。処置は欠陥を接着し、より早い治癒をもたらし、かつほとんど後遺症を引き起こさなかった。
d. いくつかの方法、例えば酢酸注入、メトトレキサート及び硫酸デキストランによってラットで、結腸粘膜炎症及び創傷が減少した。当該組成物で炎症表面及び創傷を「塗った」。炎症が減少し、治癒の向上が観察された。
e. 当該組成物でヒト鼻粘膜創傷及び感染を処置した。損傷の迅速洗浄及び治癒が観察された。
f.ヒト褥瘡を当該組成物によって処置した。
【国際調査報告】
2007517027.tif 000002
2007517027.tif 000003
2007517027.tif 000004
2007517027.tif 000005