(57)【要約】  本発明は、炎症によって誘導された、血液脳関門機能における初期の動的変化を起こしている脳微小血管内皮細胞で、その発現が変調されている新規の核酸、及びそれによってコードされているポリペプチドに関する。本明細書では、そのようなポリペプチドを、リポ多糖感応性（ＬＰＳＳ）のポリペプチドと呼ぶ。これらの核酸及びポリペプチドは、そのような生物作用を必要とする哺乳動物における血液脳関門特性を制御する方法において有用となりうる。これには、血液−脳／網膜関門における障害、（眼を含めた）脳の障害、及び末梢血管症害の診断及び治療が含まれる。加えて、本発明は、抗ＬＰＳＳポリペプチド性の抗体又はリガンドの診断プローブ、脳血液関門標的指向剤、又は治療薬としての使用、及び、ＬＰＳＳポリペプチドのリガンド、又は発現、活性化、若しくは生理活性の変調因子の診断プローブ、治療薬、又は薬物送達促進物質としての使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを、内皮細胞中で改変するステップを含む、内皮細胞の透過性を変調する方法。
【請求項２】
前記ＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルが、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現レベルを調節することによって改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを増加させることによって、内皮細胞の透過性を低下させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによる制御下にある、発現ベクターを内皮細胞に導入することによって増加させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号２２、１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び２１に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを低下させることによって、内皮細胞の透過性を低下させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記アンチセンスヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによる制御下にある、発現ベクターを前記内皮細胞に導入することによって低下させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号２２、１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び２１に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを増加させることによって、内皮細胞の透過性を増加させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによる制御下にある、発現ベクターを内皮細胞に導入することによって増加させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを低下させることによって、内皮細胞の透過性を増加させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記アンチセンスヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによる制御下にある、発現ベクターを前記内皮細胞に導入することによって低下させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記内皮細胞が微小血管系細胞、好ましくは脳微小血管系細胞である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象の微小血管内皮細胞において、配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを薬理学的に改変することを含み、前記改変が、前記微小血管透過性変性障害の症候を軽減するのに十分である、対象の微小血管透過性変性障害を治療又は予防する方法。
【請求項１３】
配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子が遺伝子療法ベクターであり、遺伝子療法ベクター中で、前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の発現を内皮細胞中、好ましくは微小血管内皮細胞中で推進できるプロモーターによって制御されている、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２２、１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び２１に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニストを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含み、好ましくは、前記アンタゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号２２、１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び２１に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記アンチセンスヌクレオチド配列の発現を、内皮細胞中、好ましくは微小血管内皮細胞中で推進できるプロモーターによって、制御されている、遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物を対象に治療有効量投与するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記微小血管透過性障害が、脳血管症害（ＣＶＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管関連痴呆、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ウシスポンジ様脳症（ＢＳＥ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脳損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病などの神経変性障害；敗血性ショック、肝性脳症、（糖尿病性）高血圧、糖尿病性微小血管症、睡眠病、ホイップル疾患、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、アスパルチルグリコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、球型細胞性白質ジストロフィー、クラッベ病、糖原病ＩＩ型、ポンペ病、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピド症Ｉ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピド症ＩＩ／ＩＩＩ型、Ｉ細胞病、ムコリピド症タイプＩＩＩＣ、偽ハーラー多発性ジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、多種スルファターゼ欠損症、ニューロンセロイド脂褐素症、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、ピクノディソストーシス、シンドラー疾患タイプＶＩＩ、シンドラー病、シアル酸貯蔵病、子癇、及び子癇前症などのＣＮＳ要素を有する末梢障害；うつ病、自閉症、不安、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、神経精神性全身性紅斑性狼瘡、双極性障害、統合失調症、及び他の精神病などの神経精神障害；脳腫瘍、癲癇、偏頭痛、ナルコレプシー、不眠、慢性疲労症候群、高山病、脳炎、髄膜炎、及びエイズ関連痴呆などの他のＣＮＳ障害；並びに、血管腫瘍、増殖性硝子体網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新生血管形成に関連した子宮内膜症、バルーン血管形成後の再狭窄、瘢痕組織過剰生産、末梢血管疾患、高血圧、炎症性血管炎、レイノー病、レイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、静脈血栓症、リンパ管炎、リンパ水腫、創傷治癒、組織修復、虚血性再潅流損傷、狭心症、心筋梗塞、心臓慢性症状、鬱血性心不全などの心不全、加齢性黄斑変性、及び骨粗鬆症などの血管形成関連障害から成る群より選択される、請求項１２から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む医薬組成物を、微小血管透過性を増加させるのに有効な量、対象に投与するステップを含む、対象における微小血管透過性を可逆的に増加させる方法。
【請求項２０】
前記ＬＰＳＳポリペプチドが、配列番号２２、１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び２１に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子が遺伝子療法ベクターであり、前記遺伝子療法ベクター中で、前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって制御されている、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニストを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含み、好ましくは、前記アンタゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記アンチセンスヌクレオチド配列の発現を内皮細胞中、好ましくは微小血管内皮細胞中で推進できるプロモーターによって制御されている、遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＮＳ又は微小血管系の障害を患っているか、又は発症する危険のある患者に治療薬又は診断薬を投与することによって、ＣＮＳ又は微小血管系の障害を治療又は診断する方法であって、治療薬又は診断薬、或いはその薬学的に許容される担体が標的指向剤に結合され、前記標的指向剤が、配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドに特異的に結合する薬剤である方法。
【請求項２５】
前記ＬＰＳＳポリペプチドが、配列番号２２、１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つ、より好ましくは配列番号２２又は２１に示すアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象における微小血管透過性の状態を診断する方法であって、
（ａ）配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードする核酸配列の、対象における微小血管内皮での発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）前記核酸配列の発現レベルを、前記核酸配列の発現レベルに関する基準値と比較するステップと
を含み、好ましくは、前記基準値が健康な個体の微小血管内皮での発現レベルの平均値である方法。
【請求項２７】
前記核酸配列の発現レベルが、前記核酸配列によってコードされるＬＰＳＳポリペプチドの量を定量化することによって間接的に測定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
複数の核酸配列の発現レベルが比較される、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
発現レベルが、対象から得られた試料中でｅｘ  ｖｉｖｏに測定される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
微小血管透過性障害を診断する方法、又は微小血管透過性障害に対する罹病性を診断する方法である、請求項２６から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記微小血管透過性障害が、脳血管症害（ＣＶＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管関連痴呆、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ウシスポンジ様脳症（ＢＳＥ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脳損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病などの神経変性障害；敗血性ショック、肝性脳症、（糖尿病性）高血圧、糖尿病性微小血管症、睡眠病、ホイップル疾患、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、アスパルチルグリコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、球型細胞性白質ジストロフィー、クラッベ病、糖原病ＩＩ型、ポンペ病、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピド症Ｉ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピド症ＩＩ／ＩＩＩ型、Ｉ細胞病、ムコリピド症タイプＩＩＩＣ、偽ハーラー多発性ジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、多種スルファターゼ欠損症、ニューロンセロイド脂褐素症、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、ピクノディソストーシス、シンドラー疾患タイプＶＩＩ、シンドラー病、シアル酸貯蔵病、子癇、及び子癇前症などの、ＣＮＳ要素を有する末梢障害；うつ病、自閉症、不安、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、神経精神性全身性紅斑性狼瘡、双極性障害、統合失調症、及び他の精神病などの神経精神障害；脳腫瘍、癲癇、偏頭痛、ナルコレプシー、不眠、慢性疲労症候群、高山病、脳炎、髄膜炎、及びエイズ関連痴呆などの他のＣＮＳ障害；並びに、血管腫瘍、増殖性硝子体網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新生血管形成に関連した子宮内膜症、バルーン血管形成後の再狭窄、瘢痕組織過剰生産、末梢血管疾患、高血圧、炎症性血管炎、レイノー病、レイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、静脈血栓症、リンパ管炎、リンパ水腫、創傷治癒、組織修復、虚血性再潅流損傷、狭心症、心筋梗塞、心臓慢性症状、鬱血性心不全などの心不全、加齢性黄斑変性、及び骨粗鬆症などの血管形成関連障害から成る群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
微小血管透過性を回復させる治療の有効性を評価する方法である、請求項２６から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
微小血管内皮細胞の透過性を変調できる物質を同定する方法であって、
（ａ）配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードする、１つ又は複数の核酸を発現できる試験細胞集団を用意するステップと；
（ｂ）試験細胞集団を前記物質に接触させるステップと；
（ｃ）配列番号２２、１〜２１、及び２３〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列の発現レベルを、前記物質と接触した試験細胞集団で測定するステップと；
（ｄ）前記核酸配列の前記発現を、前記物質に接触していない試験細胞集団における、前記核酸配列の発現レベルと比較するステップと；
（ｅ）前記物質に接触した試験細胞集団と、前記物質に接触していない試験細胞集団との間で、前記核酸配列の発現レベルに相違が生じる物質を同定するステップ
とを含む方法。
【請求項３４】
前記核酸配列の発現レベルが、前記核酸配列によってコードされるＬＰＳＳポリペプチドの量を定量することによって間接的に測定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
複数の核酸配列の発現レベルが比較される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
試験細胞集団が内皮細胞、好ましくは血管内皮細胞、より好ましくは微小血管内皮細胞、最も好ましくは脳微小血管内皮細胞を含む、請求項３３から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
試験細胞集団が哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞を含む、請求項３３から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記物質に接触した試験細胞集団、及び前記物質に接触していない試験細胞集団が、一細胞集団、好ましくは一細胞系、より好ましくは一細胞に由来する、請求項３３から３７までのいずれか一項に記載の方法
【請求項３９】
試験細胞集団がヘルパー細胞集団と共培養され、試験細胞集団がフィルターの片側の面で培養され、ヘルパー細胞集団が前記フィルターの反対側の面で培養され、好ましくは、ヘルパー細胞集団が星状細胞を含む、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３３から３９までのいずれか一項に記載の方法で同定された物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症によって誘導される血液脳関門機能における初期の動的変化を起こしている脳微小血管内皮細胞で、その発現が変調されている新規の核酸、及びそれによってコードされているポリペプチドに関する。本明細書では、これらのポリペプチドを、「リポ多糖感応性」ポリペプチド（ＬＰＳＳポリペプチド）と呼ぶ。本発明はさらに、血液脳関門の特性の制御を、そのような生物学的作用を必要とする哺乳動物で行うのに有用な方法に関する。これには、血液−脳／網膜関門における障害、（眼を含めた）脳の障害、及び末梢血管症害の診断及び治療が含まれる。加えて、本発明は、ＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体又はリガンドの、診断プローブ、脳血液関門標的指向剤、又は治療薬としての使用、並びにＬＰＳＳポリペプチドの発現、活性化、又は生理活性についてのリガンド又は調整因子の、診断プローブ、治療薬、又は薬物送達促進物質としての使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロンが適切に機能するには、厳密に調節された細胞外環境が必要である。この不可欠かつ明確な微小環境は、星状細胞（又はアストログリア）と呼ばれる脳細胞を慎重に扱うことによって局所的に維持される。血液組成と、脳の細胞外区画の組成との間における可変的で顕著な相違に対応するため、中枢神経系（ＣＮＳ）はまた、多数の血液−ＣＮＳ関門、すなわち、血液−脳関門、血液−脳脊髄液（ＣＳＦ）関門、軟膜血管−ＣＳＦ関門、上衣境界、及びグリア境界によって、そしてまた、血液−網膜関門、血液−神経関門、及び血液−脊椎関門によって、全身の血液循環から保護されている。血液脳関門（ＢＢＢ）は、他の血液−ＣＮＳ関門と比較した場合、１０００倍大きな表面積を有するので、最も重要な血液−ＣＮＳ関門と考えられている。ＢＢＢは、ＣＮＳ中の毛細血管を覆う緊密な内皮細胞層を特徴とする。この場合でも、星状細胞が、毛細血管に「グリア足突起（ｇｌｉａｌｆｏｏｔ）」を張り出すことによって、これらの内皮細胞のＢＢＢ特性を誘導する主要因子となっている。
【０００３】
具体的には、ＢＢＢは、イオン（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋）、水、栄養物、代謝物質、神経伝達物質（グルタミン酸、トリプトファン）、血漿タンパク質（アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン）、免疫系由来の細胞、及び生体異物（薬物）の、脳内への、そして、脳からの輸送を調節する。脳内の毛細血管内皮は、末梢毛細血管に比べて特有の性質を有する。それは、間隙の狭い密着結合を有し、窓構造がなく、飲作用活性が低く、かつ連続した基底膜を有する。密着結合の間隙が狭いことによって、電気抵抗が１５００〜２０００  Ｏｈｍ．ｃｍ２と高くなっている。さらに、これらの内皮細胞は、負の表面電荷を有し、負に荷電した化合物を反発する。それらは、化合物を分解する多くのミトコンドリア及び酵素と、栄養物及び他の化合物を、脳内に、そして、脳から能動的に輸送する、多様で選択的な輸送システムとを有する。健常状態下において、ＢＢＢは、薬物又は内在性化合物の脳内への移行を調節しているだけではなく、末梢器官に比べて細胞浸潤も低下している。正常な内皮細胞層は、血小板及び白血球の接着を防ぎ、凝固系の活性化を阻止する血栓抵抗性の表面を有する。高度に特殊化した脳微小血管内皮細胞は、脳を免疫監視から隔離する緊密な関門を形成し、ＣＮＳへの移動を数種類の単核細胞（活性化されたＴ細胞など）のみに許している。健全なＣＮＳにおいて主要組織適合複合体抗原の発現が低く、抗原提示細胞の数が少ないこと、並びに、ＣＮＳには完全に発達したリンパ脈管構造が適切に配管されていないという事実によって、脳は「免疫隔離（ｉｍｍｕｎｏｓｅｃｌｕｄｅｄ）」部位となっている。
【０００４】
ＢＢＢの解剖学的基礎に関する現在の理解によると、ＢＢＢは、末梢ホルモン（例えば、コルチゾール、アドレナリン）及び局所ホルモン（例えば、サイトカイン、ケモカイン）の影響を受けて、動的に調節されている器官として機能する。星状細胞に加えて、周皮細胞、ニューロン、及び免疫系細胞などの他のいくつかの細胞も、ＢＢＢの特性に影響を与えている。それに加えて、この内皮は、凝血、血管緊張（ｖａｓｏｔｏｎｕｓ）の制御、抗原提示、及び、基底膜の、例えば成長因子による制御などの他の過程にも関与している。詳細には、脳炎及び大脳炎、並びに脳腫瘍における血管形成などの疾病状態下で、活性化された内皮が重要な役割を果たしている。
【０００５】
一般的には、ＢＢＢは、脳の恒常性を保護するために機能する器官と見なすことができる。したがって、ＢＢＢの機能不全が、大部分の脳障害で中心的役割を果たしていることも驚くことではない。いくつか例を挙げると以下の通りである。
ｉ．大脳の血管原性浮腫は、血漿タンパク質及び水が血液から脳組織に漏出した結果として誘導される疾患（炎症）である。これは、脳卒中、脳内感染、頭部外傷、脳腫瘍、及び多発性硬化症などの障害における死亡及び能力障害の主要原因となっている。浮腫によって、脳が、頭蓋という堅固な環境の中で膨張する。この結果引き起こされる頭蓋内圧の上昇によって、その後、脳ヘルニアが引き起こされることがあり、それに続いて呼吸などの不可欠な脳機能の機能不全が起こり、そして未処置のままであった場合には、重度の障害、昏睡、及び死に至る。
ｉｉ．多発性硬化症では、活性化された自己反応性のＴ細胞が活性化されたＢＢＢを通過する。ＣＮＳ内部で、これらのＴ細胞が、ミエリンを標的とした炎症反応を誘導し、それによってＢＢＢの破壊も引き起こされる。そうすると、自己抗体及び補体因子が破壊されたＢＢＢを通過し、それによって、脱髄過程が導かれる。そして今度は、ミエリン断片がＢＢＢを逆に通過して周辺に漏出し、そこで、さらに多くの自己反応性Ｔ細胞を活性化し、さらに自己抗体の産生を増加させる。
ｉｉｉ．細胞外液におけるイオン及び神経伝達物質の微妙な均衡を保持し損なうと、ニューロン性シグナル伝達障害が起こり、それによって認知機能障害、神経精神障害、又はてんかん発作が起こる。
ｉｖ．ＢＢＢを通して毒性タンパク質を血流中に除去する機能の障害が、最近、アルツハイマー病などの神経変性障害、並びに、ヤコブ病及びＢＳＥなどのプリオン病の発病機序と関連付けられている。これらのようなタンパク質の病的な蓄積によって、神経細胞死、及びそれに続く認知機能の障害が導かれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＢＢＢの機能不全を治癒することは、脳の障害を治療する新たな道を開くものである。脳障害は欧米における罹病及び障害の主要要因である。炎症によって誘導される、血液脳関門機能における初期の動的変化を起こしている脳微小血管内皮細胞で、その遺伝子の発現が変調されている新規ＬＰＳＳポリペプチドの同定及び特徴付けは、このような要求を満たすのに有用であることが明らかになるであろう。
【０００７】
脳障害の治療に望ましい薬物は、ＢＢＢ治癒作用を有するものであるが、それに加えて、適切に機能するＢＢＢは、免疫反応を媒介するリンパ球が脳に移行するのを阻止又は低減させるのにも不可欠である。また、転移癌細胞の脳への移行に関しても同じことが言える。炎症によって誘導される、血液脳関門機能における初期の動的変化を起こしている脳微小血管内皮細胞で、その遺伝子の発現が変調されている新規ＬＰＳＳポリペプチドの同定及び特徴付けを行うことが、このような要求を満たすのに有用であることが明らかになるであろう。
【０００８】
しかし、ＢＢＢは、脳への生体異物（薬物及び診断用薬など）の送達も制限し、それによって、脳障害の古典的な薬物治療（すなわち、ニューロンが対象とされる）が困難となっている。したがって、血液によって運搬され、かつ膜を透過しない薬物を、ＢＢＢを可逆的に開くことによって脳に送達するために、ＢＢＢの透過性を操作すること、又は、内在的なＢＢＢ輸送システムを介して薬物を選択的に脳に向けて送達することも望まれている。血液−睾丸関門、及び血液−胎盤関門を通過する薬物送達に関しても同じことが言える。炎症によって誘導される、血液脳関門機能における初期の動的変化を起こしている脳微小血管内皮細胞で、その遺伝子の発現が変調されている新規ＬＰＳＳポリペプチドの同定及び特徴付けを行うことが、このような要求を満たすのにも有用であることが明らかになるであろう。
【０００９】
血管障害に冒された、脳以外の器官、又は目の微小血管においてＢＢＢ特性を操作することも望まれる。末梢微小血管へのＢＢＢ特性の導入は、（微小）血管障害、病的な血管形成、血液−睾丸関門不全又は血液−胎盤関門不全を伴う状態、並びに、肺水腫、細菌内毒素によって引き起こされるショック、過剰繊維素溶解（ｈｙｐｅｒｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）、及びアナフィラキシーショックなどの状態で有益であろう。炎症によって誘導される、血液脳関門機能における初期の動的変化を起こしている脳微小血管内皮細胞で、その遺伝子の発現が変調されている新規ＬＰＳＳポリペプチドの同定及び特徴付けを行うことが、このような要求を満たすのにも有用であることが明らかになるであろう。
【００１０】
脳の星状細胞が、血管周囲に終端を張り出すことによって（ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄ  ｆｅｅｔ）脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）にＢＢＢ特性を誘導していることが、長い間知られていた（Ａｒｔｈｕｒら、１９８７年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第４３３巻、１５５〜１５９頁；ＪａｎｚｅｒとＲａｆｆ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２５巻、２５３〜２５７頁）。星状細胞調整培地（ＡＣＭ）によって、これらの誘導作用の一部が再現できるので、この誘導が可溶性因子によって引き起こされることも長い間知られていた（Ｔｉｏら、１９９０年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、第２８（２〜４）巻、２８９〜３００頁）。ＢＣＥＣでＡＣＭ媒介性の関門誘導の諸相を模擬できるいくつかの候補分子が同定されており、これらには、ＴＧＦβ、ＧＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、及びステロイドが含まれる。他の研究者は、この因子はタンパク質でも、ペプチドでもなく、鉄一酸化窒素付加体を含有すると結論している（Ｆｅｄｅｒｉｃｉら、１９９５年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、第６４（３）巻、１００８〜１０１５頁；Ｒｅｇｉｎａら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１５４０（３）巻、２３３〜２４２頁）。したがって、いくつかの研究グループの活動にもかかわらず、原因となっている星状細胞由来の因子は、まだ同定されていないと結論できる。
【００１１】
以前の実験で、発明者らは、ＡＣＭに曝露された初代単離ＢＣＥＣが、基本的なＢＢＢ特性の多くを培養液中で保持していることを見出した（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、第１２（３）巻、２１５〜２２２頁）。細胞培養ウェルの底面に初代培養の脳星状細胞を導入することによって、上記挿入フィルター上（ｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｉｎｓｅｒｔｓ  ａｂｏｖｅ）で培養したＢＣＥＣ単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が、ＡＣＭのみで培養したＢＣＥＣ単層の約１５０％に増大した。さらに、挿入フィルター（ｔｈｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｉｎｓｅｒｔ）の底面の側、すなわち、ＢＣＥＣの近傍で星状細胞を培養した場合、ＴＥＥＲが倍率３〜８で増大した。加えて、フルオレセインナトリウム（ＦＬＵ、分子量３７６Ｄａ）及びＦＩＴＣ標識されたデキストラン（ＦＤ４、分子量４ｋＤａ）の傍細胞間輸送（ｐａｒａｃｅｌｌｎｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）が、ＡＣＭのみで培養されたＢＣＥＣの約５０％に減少した。結論として、星状細胞がＢＣＥＣに直接接触しない場合でも、それらがＢＣＥＣにどれだけ近接しているかによって、効果の規模が決定された（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上）。
【００１２】
ＴＥＥＲは、ＢＣＥＣ間の密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を通して行われる、小イオンの透過性を定量する、高感度な計測値である。したがって、ＴＥＥＲは密着結合の機能性を表すものであるが、これはＢＢＢの主要な特徴であると考えられる。ＴＥＥＲの絶対値は、主として、細胞間にある密着結合の量及び複雑さに依存している。同様にこれは、大きな親水性化合物の傍細胞間輸送にとっての限定因子でもある。
【００１３】
発明者らが追加して行った研究では、挿入フィルターの底面側で培養された星状細胞によって、１）ＢＣＥＣにおけるＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ、多剤耐性に関与する薬物流出ポンプ）の発現が、最初の継代の後でも維持（又は（再）誘導）されたこと（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２０００年、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、第１７（１０）巻、１１９８〜１２０５頁）；２）ビンブラスチンで誘導されるＢＢＢ破壊に対する感受性（Ｐｇｐ機能性アッセイ）が低減されたこと（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２０００年、同上）；３）フィルターの側底（ＣＮＳ）側から頂端（血液）側へのＰｇｐ基質の能動輸送が誘導され、その一方でＢＣＥＣ単層培養では、ＰｇｐがＢＣＥＣ単層培養で発現されていたという事実にもかかわらず、この能動輸送が観測されなかったこと（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２０００年、同上）；及び、４）ＬＰＳで誘導されたＢＣＥＣ破壊に対する保護的な応答が媒介されたこと（Ｇａｉｌｌａｒｄ、２０００年（ａ）、ライデン大学博士号論文、８１〜９７頁）が判明した。ＡＣＭ単独では、これらの効果は、いずれも誘導されなかった。ＢＣＥＣにＢＢＢ特性を誘導するには、挿入フィルターの底面側に星状細胞が物理的にかつ近接して存在している（ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｘｉｍａｔｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ）方が、ＡＣＭのみの場合よりも明らかに効果的である。
【００１４】
したがって、ＢＢＢの特性を制御する手段、或いは、炎症によって誘導される、ＢＢＢ機能における初期の動的変化に対する細胞応答と、そのような変化に対する組織応答とを特定し調整する手段を提供する更なる製品、方法、及びアッセイが求められている。そのような製品、方法、及びアッセイは、上述したものなど、医療上の多数の状態及び操作に有益なものであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
定義
本明細書において、「ポリペプチドの活性、又は定常状態レベルの改変」とは、健常個体における正常活性又は定常状態と比較した、そのポリペプチドによって生じる生物活性又はそのタンパク質の定常状態レベルの検出可能な変化を意味する。
【００１６】
本明細書では、「アゴニスト」を、生物活性、好ましくはポリペプチド、受容体、又はそのリガンドの生物活性を模擬する任意の分子として定義する。アンタゴニストは、そのような生物活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子である。
【００１７】
血管の「治療」という用語は、とりわけ、個体における１つ若しくは複数の症候を低減若しくは緩和させること、１つ若しくは複数の症候が悪化若しくは進行するのを阻止すること、回復を促進すること、又は予後を改善すること、及び／又は、疾患に罹っていない個体を疾患から予防すること、並びに、既存の疾患の進行を遅延又は低下させることを指す。所与の個体に関して、症候の改善、悪化、退行、又は進行は、客観的又は主観的な尺度によって測定できる。治療の有効性は、罹患率又は死亡率の改善（例えば、選択された集団の生存曲線の伸長）として測定できる。
【００１８】
内皮／血管関門の透過性が増大するということは、それを通じた漏出が大きくなるということである（すなわち、緊密度が低下し、透過性が高まる）。内皮／血管関門の透過性が低下するということは、それがより緊密であるということである（すなわち、漏出が減少し、透過性が低下する）。したがって、血管を治療するということは、血管の透過性を低下させることを意味し、一方、薬物送達を増加させるには、血管の透過性を増加させる必要がある。ＢＣＥＣ−星状細胞共培養されたＢＣＥＣで上方制御される本発明のＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大（）に関与する。ＢＣＥＣ−星状細胞共培養されたＢＣＥＣで下方制御される本発明のＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）に関与する。ＢＣＥＣ単層培養と、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養との間で示差的に上方又は下方制御される本発明のＬＰＳＳポリペプチドは、炎症性の刺激から回復する能力に関与する（図２）。
【００１９】
内皮透過性の調整
第１の態様において、本発明は、内皮細胞の透過性を調整する方法に関する。この方法は、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性又は定常状態レベルを内皮細胞中で改変することを含む。本明細書における配列同一性又は類似性の定義は後述する通りである。
【００２０】
内皮細胞は、好ましくは血管内皮細胞であり、より好ましくは微小血管内皮細胞である。内皮細胞は、血液−脳関門、血液−網膜関門、血液−神経関門、血液−脊椎関門などの血液−中枢神経系（ＣＮＳ）関門の１つを構成するかその一部である、微小血管内皮細胞であることが最も好ましく、その中でも、脳の微小血管内皮細胞が最も好ましい。
【００２１】
そのような内皮関門細胞の特徴付けは、例えば、特異的な内皮細胞マーカー、若しくは特異的な関門マーカーによって、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｅｘ  ｓｉｔｕ（すなわち単離された毛細血管中）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができるが、関門機能アッセイによってもよい。より詳細には、内皮細胞は、ｉｎ  ｓｉｔｕでのそれらの形態、すなわち連続的に連結された単層（又は最大３層まで）の内皮細胞で形成され、連続的な基底膜で囲まれている直径約１０〜２０μｍの管様構造であって、血管周囲周皮細胞が存在し、星状細胞終末がその上に張り出している構造によって特徴付けされてもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕ及びｅｘ  ｓｉｔｕの両方、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、関門様内皮細胞は、厚さが１〜５μｍであり、多数のミトコンドリアを有し、密着結合で連結され、細胞間間隙がなく、開口（ｔｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）もなく、そして、飲食作用小胞も極わずかしかないが、これは例えば、電子顕微鏡検査によって観測できる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、毛細血管構造を、それらの培養中の形態、すなわち、直径が約１０〜２０μｍであり、長さが５０〜２００μｍの間にある管様構造によって特徴付けることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、内皮細胞を、それらの培養中の形態、すなわち、楕円形の核を中心に有する、丸石形状（例えば、毛細血管の外で、集塊を形成して成長している場合）及び紡錘形状（集密状態の場合）によって特徴付けることができ、これらは、例えば位相差顕微鏡で観測できる。これらは、一般的な内皮細胞特異的マーカー及び機能のパネルを用いることによって特徴付けることもでき、そのようなマーカー及び機能には、例えば、内皮特異的な分化クラスター（ＣＤ）抗原（ＶＣＡＭ（ＣＤ１０６）、ＣＤ３１、ＥＮ−４、ＩＣＡＭ、Ｅ−セレクチン、ＰＥＣＡＭ、ＲＢＡ）、カドヘリン、インテグリン、アクチン、ビメンチン、第ＶＩＩＩ因子関連抗原（ｖＷＦ）、コラーゲンＩ及びＩＶ、フィブロネクチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子の発現；非血栓形成性；低白血球接着性；血管作用性化合物（酸化窒素、エンドセリン−１、及びプロスタサイクリン）の放出；ＤｉＩ標識されたアセチル化低密度リポタンパク質（Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）の取り込み；レクチン結合；並びに、アンギオテンシン変換酵素、アルカリホスファターゼ、モノアミン酸化酵素、及び陰イオン部位の存在がある。加えて、密着結合又は密着結合関連タンパク質（ＺＯ−１）、及び参照化合物（例えば、エバンスブルー（アルブミンに結合する）、マンニトール、ショ糖、フルオレセイン、デキストラン、アルブミン、ＡＩＢなど）の限定的な傍細胞間輸送における可視化；小胞輸送の不在；ＰＡＬＥなどの非関門マーカーの不在；γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）の発現；Ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）、多剤耐性タンパク質１〜７、グルコース輸送体、ヌクレオシド輸送体、有機陰イオン輸送体、及び大型中性アミノ酸輸送体の発現及び機能性；トランスフェリン受容体、インシュリン成長因子受容体、スカベンジャー受容体の発現及び機能性；Ｆ−アクチンの外縁部局在性；並びに、多数のミトコンドリアの発現などの典型的な関門マーカー及び機能を用いることができる。但し、これらのいずれも内皮細胞に特異的でない。これらのマーカーの（機能的）発現は、例えば、分子生物学的、生化学的、（免疫）組織（細胞）化学的技法によって、また、既知の基質、リガンド、及び／又は阻害剤を用いた機能アッセイによって測定できる。これらのマーカーに関しては、国際的な科学雑誌に記載及び総説がある（ｄｅ  Ｂｏｅｒら、１９９９年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、第８（１）巻、１〜４頁；Ｈｏｆｍａｎら、２００１年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、第４２（５）巻、８９５〜９０１頁；Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９９７年、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．、第２９（３）巻、１３０〜８頁；Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９９９年、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．、第４２（５）巻、５９６〜６０２頁；Ｖｏｒｂｒｏｄｔら、１９８６年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第３９４（１）巻、６９〜７９頁；Ｄａｉら、２００２年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第９５４（２）巻、３１１〜３１６頁）
【００２２】
本明細書において、内皮細胞の透過性とは、化合物（これはイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋）、水、栄養物（例えば、ブドウ糖、アミノ酸）、代謝物質、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸、トリプトファン）、ホルモン、ペプチド、血漿タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、サイトカイン、成長因子）、細胞、及び生体異物（例えば、薬物、診断マーカー）でありうる）が、管腔から管腔外方向又はその逆方向へ、内皮細胞を横切って拡散しうる容易さ、又は、内皮細胞の中に若しくはこれを横切って（能動的に）輸送される際の容易さの尺度を意味すると理解される。内皮細胞の透過性の変化は、所与の化合物（それは、栄養物（例えば、ブドウ糖、アミノ酸）、代謝物質、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸、トリプトファン）、ホルモン、ペプチド、血漿タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、サイトカイン、成長因子）、細胞、及び生体異物（例えば、薬物、診断マーカー）でありうる）の、内皮における生体内変換の結果としても起こりうる。透過性の変調には、透過性の増強及び低減の両方が含まれる。透過性は、実施例に記述するように、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができ、かつ好都合である。ＴＥＥＲは、細胞間の密着結合を通じてイオンの透過性を定量する高感度な測定方法である。本発明の方法において、内皮細胞の透過性の変調は、少なくとも２０、５０、１００、３００、又は１０００％のＴＥＥＲ変化を引き起こす変調である（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２０００年（ｂ）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、第１２（２）巻、９５〜１０２頁）。透過性を測定する他の方法には、例えば、輸送体系における既知の基質、リガンド、及び／又は阻害物質を用いた分子生物学技法、生化学技法、（免疫）組織（細胞）化学技法、又は機能アッセイによる、例えば、透過性の制御に関与する上述の内皮／関門マーカーの（機能的）発現変化を実証することが含まれる。より詳細には、透過性の変化は、密着結合発現の減失、細胞間間隙の出現、開口、及び／又は、飲食作用小胞の数及び局在性によって実証でき、これらは、例えば、電子顕微鏡検査によって観測できる（Ｈｏｆｍａｎら、２００１年、同上）。ＺＯ−１、ＰＡＬ−Ｅ、ＲＢＡ、Ｆアクチン、第ＶＩＩＩ因子関連抗原（ｖＷＦ）、γ−ＧＴＰ、Ｐｇｐ、グルコース輸送体、ＰＥＣＡＭ、インテグリン、カドヘリン−５、トランスフェリン受容体、レクチン結合部位、又はアルカリ性ホスファターゼなどの、内皮の透過性に関与する内皮細胞マーカーの発現レベルの変化は、すべて、内皮透過性の変化を示すものである（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、１９９９年、同上；Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９９７年、同上；Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９９９年、同上；Ｔｉｏら、１９９０年、同上；Ｖｏｒｂｒｏｄｔら、１９８６年、同上；Ｄａｉら、２００２年、同上）。参照化合物（例えば、マンニトール、ショ糖、フルオレセイン、デキストラン、アルブミン）の限定的傍細胞間輸送の機能アッセイ、及び、内皮細胞層を通過したＰｇｐ基質（ローダミン１２３��ビンブラスチンなど）又はトランスフェリンの極性で能動的かつ阻害可能（例えば、ベラパミル、ＰＳＣ−８３３、温度によって）な輸送も、内皮透過性の変化を示すものである（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２０００年、同上；Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上）。
【００２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、内皮細胞の透過性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの状況に関して上述した通りに、透過性の制御に関与する内皮／関門マーカーの（機能的）発現の変化を実証する（例えば、輸送体系における既知の基質、リガンド、及び／又は阻害物質を用いた分子生物学技法、生化学技法、（免疫）組織（細胞）化学技法、又は機能アッセイによって）ことによって測定できる。さらに、脳内摂取指標（ＢＵＩ、Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ、１９７０年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第２４（２）巻、３７２〜３７６頁）、脳排出指標（ＢＥＩ、Ｋａｋｅｅら、１９９６年、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒａｐ．第２７７（３）巻、１５５０〜１５５９頁）、ｉｎ  ｓｉｔｕ潅流（Ｔａｋａｓａｔｏら、１９８４年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第２４７（３  Ｐｔ．２）巻、Ｈ４８４〜４９３頁）、単一経路又は複数経路の脳潅流（Ｂｒｏｄｉｅら、１９６０年、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．、第１３０巻、５１９〜５２８頁）、ＣＳＦ試料採取（単位インパルス応答、ｖａｎ  Ｂｒｅｅら、１９８９年、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ、第１７（４）巻、４４１〜４６２頁）、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ、Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅら、１９９８年、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１２４（７）巻、１４１３〜１４１８頁）、磁気共鳴技法（ＭＲＩ、ＭＲＳ、Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９９年、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、第８９３巻、２１４〜２４２頁）、定量的オートラジオグラフィー（ＱＡＲ、Ｓｍｉｔｈ、１９８９年、「脳−血液関門及びその操作の意味（Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」、第１巻；「基礎科学的側面（Ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｓｐｅｃｔｓ）」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．、ＥＡ  Ｎｅｕｗｅｌｔ編集、８５〜１１８頁）、及び脳微小透析法（ｄｅ  Ｌａｎｇｅら、２０００年、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．第４５（２〜３）巻、１２５〜１４８頁）などの（免疫）組織（細胞）化学技法、又はいくつかのｉｎ  ｖｉｖｏ試料採取法によって、内在性参照化合物（例えば、フィブリノーゲン、ＩｇＧ）、又は（蛍光標識又は放射性同位元素標識された）外来性参照化合物（例えば、エバンスブルー（アルブミンに結合する）、マンニトール、ショ糖、フルオレセイン、デキストラン、アルブミン、ＡＩＢ）の血液浸出を測定することもできる。
【００２４】
本発明の方法では、好ましくはＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを、例えば、ＬＰＳＳポリペプチドを外来性の供給源から内皮細胞へ供与することによって、或いは、例えばＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体など、ＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニスト又は阻害物質を内皮細胞に添加することによって、ポリペプチド自体のレベルで改変することができる。外来性の供給源からＬＰＳＳポリペプチドを供給するためには、以下に記述するように、適当な宿主細胞中でＬＰＳＳポリペプチドをコードする核酸を発現することによって、ＬＰＳＳポリペプチドを生成するのが好都合であろう。ＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体を、後述するように取得することもできる。
【００２５】
別法として、ＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルは、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現レベルを調節することによって、改変することもできる。ヌクレオチド配列の発現レベルは、内皮細胞内で調節されるのが好ましい。ＬＰＳＳポリペプチドの発現レベルは、ＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、上記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記ヌクレオチド配列が制御されている発現ベクターを内皮細胞内に導入することによって上方制御することができる。ＬＰＳＳポリペプチドの発現レベルは、ＬＰＳＳポリペプチドをコードする内在性ヌクレオチド配列をトランス活性化することができる因子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、内皮細胞内に導入することによって上方制御することもできる。
【００２６】
別法として、ＬＰＳＳポリペプチドの発現レベルは、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンス分子を、細胞に供給することによって下方制御することができる。アンチセンス分子は、そのままで提供することもでき、また、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、かつ、上記アンチセンスヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されている発現ベクターを、内皮細胞内に導入することによって提供することもできる。ＬＰＳＳポリペプチドの発現レベルは、ＬＰＳＳポリペプチドをコードする内在性ヌクレオチド配列をトランス抑制できる因子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、内皮細胞内に導入することによって下方制御することもできる。
【００２７】
したがって、ＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルの変調は、通常、以下のようにして行うことができる。
１．遺伝子発現を増加させることによって、例えば、
（ａ）ＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、その中でプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター；
（ｂ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体をコードするヌクレオチド配列が、その中でプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター；
（ｃ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体のアゴニストをコードするヌクレオチド配列が、その中でプロモーターＬＰＳＳに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター；
（ｄ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体のアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列が、その中でプロモーターＬＰＳＳに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター
を提供することによって、
２．任意の機能的ＲＮＡ分子を提供することによって、遺伝子発現を低減させることによって、例えば、最近、Ｆａｍｕｌｏｋら（２００２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２０（１１）巻、４６２〜４６６頁）によって概説されているように、
（ａ）ＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸分子；
（ｂ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体をコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸分子；
（ｃ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸分子；
（ｄ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸分子；
（ｅ）ＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸配列が、その中でプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター；
（ｆ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体をコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸配列が、その中でプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター；
（ｇ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸配列が、その中でプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター；
（ｈ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸配列が、その中でプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクター又は遺伝子療法ベクター
を含めた機能的ＲＮＡ分子を提供することによって、
３．アゴニストによって、例えば、
（ａ）ＬＰＳＳポリペプチドの完全又は部分アゴニスト、例えば、
（ｉ）天然リガンド；
（ｉｉ）ＬＰＳＳポリペプチド又はその断片；
（ｉｉｉ）ペプチド模倣物質；
（ｉｖ）アゴニスト抗体又は抗体断片；
（ｖ）小分子、又は他の薬物など；
（ｂ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体の完全又は部分アゴニスト、例えば、
（ｉ）天然リガンド；
（ｉｉ）ＬＰＳＳポリペプチド又はその断片；
（ｉｉｉ）ペプチド模倣物質；
（ｉｖ）アゴニスト抗体又は抗体断片；
（ｖ）小分子、又は他の薬物など
を含めたアゴニストによって、
４．アンタゴニストによって、例えば、
（ａ）ＬＰＳＳポリペプチドの完全又は部分アンタゴニスト、例えば、
（ｉ）天然アンタゴニスト；
（ｉｉ）ＬＰＳＳポリペプチド断片；
（ｉｉｉ）ペプチド模倣物質；
（ｉｖ）アンタゴニスト抗体若しくは抗体断片、又は中和抗体若しくは抗体断片；
（ｖ）小分子、又は他の薬物など；
（ｂ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体の部分又は逆アゴニスト、例えば、
（ｉ）天然リガンド；
（ｉｉ）ＬＰＳＳポリペプチド断片；
（ｉｉｉ）ペプチド模倣物質；
（ｉｖ）抗体又は抗体断片；
（ｖ）小分子、又は他の薬物など；
（ｃ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体の完全又は部分アンタゴニスト、
（ｉ）ＬＰＳＳポリペプチド受容体の天然アンタゴニスト；
（ｉｉ）ＬＰＳＳポリペプチド断片；
（ｉｉｉ）ペプチド模倣物質；
（ｉｖ）アンタゴニスト抗体若しくは抗体断片、又は中和抗体若しくは抗体断片；
（ｖ）小分子、又は他の薬物など
を含めたアンタゴニストによって、行うことができる。
【００２８】
したがって、本発明の方法では、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを増加させることによって、内皮細胞の透過性を低下させることが好ましい。透過性の低減は、下方制御されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、並びに示差的に上方制御されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを増加させることによって行うのがさらに好ましい。ＬＰＳＳポリペプチドの活性又は定常状態レベルの増強は、上述した方法のいずれによって行ってもよく、例えば、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、上記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記ヌクレオチド配列が制御されている発現ベクターを内皮細胞内に導入することによって行うこともできる。
【００２９】
別法として、本発明の方法では、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを低下させることによって、内皮細胞の透過性を低下させることができる。透過性の低減は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを低下させることによって行うのがさらに好ましい。ＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルの低減は、上述した方法のいずれによって行ってもよく、例えば、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、かつ、上記アンチセンスヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されている発現ベクターを内皮細胞内に導入することによって、そのＬＰＳＳポリペプチドの活性又は定常レベルを低下させることができる。
【００３０】
本発明の方法では、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを増加させることによって、内皮細胞の透過性を増加させることができる。透過性の低減は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを低下させることによって行うのがさらに好ましい。ＬＰＳＳポリペプチドの活性又は定常状態レベルの増強は、上述した方法のいずれによって行ってもよく、例えば、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、上記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記ヌクレオチド配列が制御されている発現ベクターを内皮細胞内に導入することによって行うこともできる。
【００３１】
別法として、本発明の方法では、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを低下させることによって、内皮細胞の透過性を増加させることができる。透過性の低減は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを増加させることによって行うのがさらに好ましい。ＬＰＳＳポリペプチドの活性又は定常状態レベルの低減は、上述した方法のいずれによって行ってもよく、例えば、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、かつ、上記アンチセンスヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されている発現ベクターを内皮細胞内に導入することによって、そのＬＰＳＳポリペプチドの活性又は定常レベルを低下させることができる。
【００３２】
微小血管透過性変性障害の治療又は予防
別の態様では、本発明は、対象の微小血管透過性変性障害を治療又は予防する方法に関する。この方法は、対象の微小血管内皮細胞における、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常状態レベルを薬理学的に改変することを含む。この改変は、上記微小血管透過性変性障害の症状を軽減するのに十分なものであることが好ましい。この方法は、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチド、又は、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は、本明細書において上述したＬＰＳＳポリペプチドの活性若しくは定常状態レベルを改変するのに有効な別の物質を含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与することを含むことが好ましい。この方法では、ＬＰＳＳポリペプチドが、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。透過性の低減は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるＬＰＳＳポリペプチドの活性、又は定常レベルを増加させることによって行うのがさらに好ましい。この核酸分子は、上記ヌクレオチド配列の発現を内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞で推進できるプロモーターによって、上記ヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターであることが好ましい。
【００３３】
別法では、この治療方法は、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニストを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含む方法であり、好ましくは、上記アンタゴニストがＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体である。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含む方法によっても、同じ効果を実現することができる。この遺伝子療法ベクターは、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、かつ、上記アンチセンスヌクレオチド配列の発現を内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞で推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されているものが好ましい。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１，１３，１４，及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５，１２，１５，１６，及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。
【００３４】
本発明の治療方法では、毛細血管透過性障害は、脳血管症害（ＣＶＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管関連痴呆、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ウシスポンジ様脳症（ＢＳＥ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脳損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病などの神経変性障害；敗血性ショック、肝性脳症、（糖尿病性）高血圧、糖尿病性微小血管症、睡眠病、ホイップル疾患、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、アスパルチルグリコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、球型細胞性白質ジストロフィー、クラッベ病、糖原病ＩＩ型、ポンペ病、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピド症Ｉ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピド症ＩＩ／ＩＩＩ型、Ｉ細胞病、ムコリピド症タイプＩＩＩＣ、偽ハーラー多発性ジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、多種スルファターゼ欠損症、ニューロンセロイド脂褐素症、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病タイプＣ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、ピクノディソストーシス、シンドラー疾患タイプＶＩＩ、シンドラー病、シアル酸貯蔵病、子癇、及び子癇前症などの、ＣＮＳ要素を有する末梢障害；うつ病、自閉症、不安、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、神経精神性全身性紅斑性狼瘡、双極性障害、統合失調症、及び他の精神病などの神経精神障害；脳腫瘍、癲癇、偏頭痛、ナルコレプシー、不眠、慢性疲労症候群、高山病、脳炎、髄膜炎、及びエイズ関連痴呆などの他のＣＮＳ障害；並びに、血管腫瘍、増殖性硝子体網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新生血管形成に関連した子宮内膜症、バルーン血管形成後の再狭窄、瘢痕組織過剰生産、末梢血管疾患、高血圧、炎症性血管炎、レイノー病、レイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、静脈血栓症、リンパ管炎、リンパ水腫、創傷治癒、組織修復、虚血性再潅流損傷、狭心症、心筋梗塞、心臓慢性症状、鬱血性心不全などの心不全、加齢性黄斑変性、及び骨粗鬆症などの血管形成関連障害から成る群より選択されることが好ましい。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、対象の毛細血管透過性を可逆的に増加させる方法に関する。この方法は、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチド、又は、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は、本明細書において上述したＬＰＳＳポリペプチドの活性若しくは定常状態レベルを改変するのに有効な別の物質を含む医薬組成物を、毛細血管の透過性を増加させるのに有効な量、対象に投与するステップを含む。このＬＰＳＳポリペプチドは、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。この核酸分子は、上記ヌクレオチド配列の発現を、内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞で推進できるプロモーターによって、上記ヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターであることが好ましい。この方法では、毛細血管透過性の増大における可逆性を、上記ヌクレオチド配列を一過性でのみ発現できる遺伝子療法ベクター（下記参照）、及び／又は、上記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーター、好ましくは誘導プロモーターを用いることによって実現するのが好ましい。この誘導プロモーターは、小さい有機又は無機の化合物を投与することによって誘導できるプロモーター（下記参照）であることがさらに好ましい。
【００３６】
別法として、対象の毛細血管透過性を可逆的に増加させる方法は、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニストを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップを含み、アンタゴニストがＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体である方法が好ましい。このアミノ酸配列は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されたものがさらに好ましい。同様に、この方法は、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、かつ、上記アンチセンスヌクレオチド配列の発現を、内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞で推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物を、対象に治療有効量投与するステップも含み得る。このアミノ酸配列は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。
【００３７】
血液によって運搬され、かつ膜を透過しない薬物を脳に送達させたい場合には、対象の毛細血管透過性を可逆的に増加させる方法の適用が有利となり得る。この薬物は、血液−脳関門又は他の生理的な関門において、通常、非透過性であるか、又は少なくとも透過性が十分でない、薬学的に、獣医学的に、又は診断上有用ないかなる化合物、又は化合物の組成物でもよい。その点以外で薬物の薬理学的性質は重要ではない。したがって、本発明は、広範囲の薬物を、脳−血液関門などの、生理的な関門を通過させて送達するのに有用である。しかし、本発明のこの態様によって送達するものの主要候補の中には、メトトレキセート、アドリアマイシン、シスプラチン、及び他の抗腫瘍薬、又は本明細書において以下（例えば２４〜２７頁を参照：日本語翻訳文である本書の３９〜４５頁に相当する）に定義する細胞毒性薬物などの抗腫瘍化合物；ＮＧＦ、ＲＤＮＦ、及びＣＮＴＦなど、神経変性疾患の治療に使用される成長因子；造影剤、特に抗体ベースのもの；並びに、脳−血液関門を通過できない神経伝達物質アンタゴニスト又はアゴニスト（ある種のＮＭＤＡ受容体遮断薬など）があろうと予期される。
【００３８】
米国以外のほとんどの国では、さらに別の態様において、本発明は、微小血管透過性変性障害の治療用又は予防用薬剤を製造するための、本発明の化合物の様々な使用に関する。例えば、そのような一態様において、本発明は、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチド、又は、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は、本明細書において上述したＬＰＳＳポリペプチドの活性若しくは定常状態レベルを改変するのに有効な別の物質の、微小血管透過性変性障害を治療又は予防するための組成物を製造するための使用に関する。このＬＰＳＳポリペプチドは、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。このアミノ酸配列は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。この核酸分子は、上記ヌクレオチド配列を含み、上記ヌクレオチド配列の内皮細胞中での発現を推進できるプロモーターによって上記ヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターであることが好ましい。配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニストも、微小血管透過性変性障害を治療又は予防するための組成物の製造に用いることができ、このアンタゴニストは、好ましくはＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体である。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。
【００３９】
別法として、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、上記アンチセンスヌクレオチド配列の発現を、内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞で推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターも、微小血管透過性変性障害を治療又は予防するための組成物の製造に用いることができる。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。
【００４０】
微小血管透過性変性障害を治療するための薬物を製造するための、本発明の化合物の上記使用において、障害は、好ましくは上述の微小血管透過性変性障害である。
【００４１】
同様に、米国以外のほとんどの国では、さらに別の態様において、本発明は、対象の毛細血管透過性を可逆的に増加させる薬物又は組成物を製造するための、本発明の化合物の様々な使用に関する。この化合物は、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチド、又は、そのＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は、本明細書において上述したＬＰＳＳポリペプチドの活性若しくは定常状態レベルを改変するのに有効な別の物質であることが好ましい。このＬＰＳＳポリペプチドは、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、及び２２に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、及び１７）、示差的に下方制御されているシグナル伝達経路（配列番号１８）、並びに上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。この核酸分子は、ＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を、内皮細胞中、好ましくは微小血管内皮細胞中で推進できるプロモーターによって、上記ヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターであることが好ましい。
【００４２】
別法として、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドのアンタゴニストも、対象の毛細血管透過性を可逆的に増加させる組成物の製造に用いることができ、このアンタゴニストは、好ましくはＬＰＳＳポリペプチドに対する抗体である。このアミノ酸配列は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。または、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２３、２４、及び２５に示すアミノ酸配列から成る群より選択される１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制できるアンチセンスヌクレオチド配列を含み、上記アンチセンスヌクレオチド配列の発現を、内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞で推進できるプロモーターによって上記アンチセンスヌクレオチド配列が制御されている遺伝子療法ベクターも、対象の毛細血管透過性を可逆的に増加させる組成物の製造に用いることができる。このアミノ酸配列は、下方調節されている分泌因子（配列番号２、３、４、及び２３）、下方調節されているシグナル伝達経路（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１）、示差的に上方調節されているシグナル伝達経路（配列番号１９）、下方調節されている受容体及び接着性分子（配列番号２０）、及び示差的に上方調節されている代謝酵素（配列番号２３〜２５）から成る群より選択されるものがさらに好ましい。好ましくは、この遺伝子療法ベクターが一過性発現用のベクター（下記参照）であり、かつ／又は、このプロモーターが好ましくは誘導プロモーターである。誘導プロモーターは、小分子の有機又は無機の化合物を投与することによって誘導できるプロモーター（下記参照）であることがさらに好ましい。
【００４３】
微小血管内皮関門の標的化
さらに別の態様では、本発明は、治療薬は若しくは診断薬、例えば向神経活性薬、又はその薬学的に許容される担体を、配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドに対して標的化して、ＣＮＳ又は微小血管系の障害を患っているか、又は発症する危険がある患者に投与することによって、ＣＮＳ又は微小血管系の障害を治療又は診断する方法に関する。この向神経活性薬、又はその担体は、配列番号１、５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有する、上方制御されているＬＰＳＳポリペプチドを標的としたものが好ましい。このアミノ酸配列は、上方制御されている分泌因子（配列番号１、１３、１４、及び２２）、上方制御されているシグナル伝達経路（配列番号５、１２、１５、１６、１７、及び１９）、上方制御されている受容体及び接着性分子（配列番号２１及び２２）、並びに上方制御されている代謝酵素（配列番号、２３〜２５）のアミノ酸配列から成る群より選択されるものがさらに好ましい。なお一層に好ましいのは、配列番号２１又は２２に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有する、上方制御されているＬＰＳＳポリペプチドである。
【００４４】
この標的指向剤は、ＬＰＳＳポリペプチド、タンパク質、若しくはペプチドに対する抗体、ＬＰＳＳポリペプチドアゴニスト、ＬＰＳＳポリペプチドアンタゴニスト、又はＬＰＳＳポリペプチドに特異的に結合するペプチド模倣物質、小分子、若しくは別の化合物でありうる。本明細書で使用する場合、「特異的な結合」という用語は、非特異的な相互作用と、測定可能な相違を有する結合を意味する。特異的な結合の測定は、例えば、ある分子の結合を、対照分子の結合と比較して測定することによって可能であり、対照分子は、通常、結合活性を持たない類似構造の分子、例えば、特異的結合配列を欠失した、大きさが同じ程度のペプチドである。その分子の、ＬＰＳＳポリペプチドに対する親和性が、対照分子に対する親和性より測定可能に高い場合には、特異的な結合が存在している。結合の特異性は、例えば、標的との結合が既知である対照分子と、競合させることによって測定できる。本明細書で使用する場合、「特異的な結合」という用語には、低親和性及び高親和性の両方の特異的な結合が含まれる。特異的な結合を示すことができるものには、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性の標的指向剤がある。例えば、標的指向剤の結合部位がＬＰＳＳポリペプチドに複数ある場合には、毛細血管内皮を標的とするのに、低親和性の標的指向剤が有用でありうる。特異的な結合は、高親和性の標的指向剤、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、又は少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有する標的指向剤も示すことができ、標的指向剤は、少なくとも約１０−１１Ｍ又は１０−１２ＭのＫｄを有する場合もある。低親和性及び高親和性の両方の標的指向剤が、毛細血管内皮を標的化するのに有用である。
【００４５】
標的指向剤は、治療薬又はその薬学的に許容される担体に結合させることが好ましい。本明細書では、「結合体」を、共有結合によって連結されている２つの物質（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）から成るものと定義する。本発明との関連においては、通常、本明細書で上記に定義した標的指向剤が第１の物質であろう。また、それに対して第２の物質は、ＣＮＳ又は微小血管系の障害の治療又は診断に使用する治療用又は診断用の部分（ｍｕｉｅｔｙ）すなわち分子又は構造などでありうる。そのような治療用又は診断用の部分は、例えば、以下のような抗腫瘍薬又は細胞毒性薬物などの抗腫瘍化合物、すなわち、
アルキル化剤、例えば、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）、ＨＮ２）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｖａｎ（商標）、Ｅｎｄｏｘａｎａ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ）、クロランブシル（リューケラン（登録商標））、メルファラン（フェニルアラニンマスタード、Ｌ−サルコリシン、アルケラン（登録商標）、Ｌ−ＰＡＭ））、ブスルファン（マイレラン（登録商標）））、チオテパ（トリエチレンチオホスホルアミド）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標）、ＣＣＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（ザノサル（登録商標））など；植物アルカロイド、例えば、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、ビンブラスチン（ベルパン（登録商標）、Ｖｅｌｂｅ（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））など；
代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）、メルカプトプリン（ピュリネソール（登録商標）、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−ＴＧ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（サイトサール−Ｕ（登録商標）、Ａｒａ−Ｃ（登録商標））、アゼチジン（Ｍｙｌｏｓａｒ（登録商標）、５−ＡＺＡ）など；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメゲン（登録商標））、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、イダルビシン（イダマイシン（登録商標））、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ピカマイシン（ミトラマイシン、ミトラチン（登録商標））、マイトマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））など、並びに他の抗細胞増殖薬（ａｎｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ヒドロキシ尿素（ハイドレア（登録商標））、プロカルバジン（Ｍｕｔａｌａｎｅ（商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ（登録商標））、エトポシド（ベプシド（登録商標）、ＶＰ−１６−２１３）、アムサルクリン（Ａｍｓａｒｃｒｉｎｅ）（ＡＭＳＡ、ｍ−ＡＭＳＡ）、ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ（登録商標））など；ゲフィチニブ（ＺＤ１８３９又はイレッサ（商標））及びメシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）又はグリベック（登録商標））；原発脳腫瘍、又は体性腫瘍（ｓｏｍａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）の脳転移を治療するための、抗体（リツキサン（登録商標）すなわちリツキシマブ；ハーセプチン（登録商標）すなわちトランスズマブ；ゼバリン（登録商標）すなわちイブリツモマブチウキセタン（放射性同位元素標識）；エルビタックス（登録商標）すなわちセツキシマブ；アバスチン（商標）、すなわち  ベバシズマブ又はｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）、及びサイトカイン（イントロン（登録商標）すなわちα−インターフェロン；プロリュウキン（登録商標）ＩＬ−２すなわちアルデスロイキン）を含む、抗癌剤；
例えば、神経変性障害に関連する神経炎症を治療するための、抗体（エンブレル（登録商標）すなわちエタネルセプト；レミケード（登録商標）すなわちインフリキシマブ；シムレクト（登録商標）すなわちバシリキシマブ；ゼナパックス（登録商標）すなわちダシリツマブ；キネレット（登録商標）すなわちアナキンラ；ゾレア（登録商標）すなわちオマリズマブ；ヒューミラ（登録商標）すなわちアダリムマブ；アンテグレン（登録商標）すなわちナタリズマブ；ルーファブ（商標）すなわちラニビツマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）；ラプティバ（商標）すなわちエファリズマブ）、並びに、インターフェロンα、インターフェロンβ（アボネックス（登録商標）すなわちインターフェロンβ−１ａ；βセロン（登録商標）／ベタフェロン（登録商標）又はインターフェロンβ−１ｂ；レビーフ（登録商標）すなわちインターフェロンβ−１ａ）、インターフェロンγ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＴＮＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：リューカイン（登録商標）すなわちサルグラモスチム）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：ニューポジェン（登録商標）すなわちフィルグラスチン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来性成長因子（ＰＤＧＦ）などのサイトカインを含む抗炎症薬；
例えば神経変性障害を治療するための、神経栄養因子（例えば、ＮＧＦすなわち神経成長因子；ＢＤＮＦすなわち脳由来神経栄養因子；ＮＴ３すなわちニューロトロフィン−３；ＮＴ４すなわちニューロトロフィン−４；ＮＴ５すなわちニューロトロフィン−５；ＲＤＧＦすなわち網膜由来増殖因子；ＣＮＴＦすなわち繊毛神経栄養因子；アクチビン；ｂＦＧＦすなわち塩基性線維芽細胞成長因子；ａＦＧＦすなわち酸性線維芽細胞成長因子；ＧＤＮＦすなわちグリア細胞由来神経栄養因子、ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）すなわちアルテミンすなわちエノビン（ｅｎｏｖｉｎ）、パーセフィン、ニュールツリン；ＣＴＧＦすなわち結合組織成長因子；ＥＧＦすなわち上皮成長因子）；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）（プロクリット（登録商標）／イープレックス（登録商標）すなわちエリスロポイエチンα；エポジェン（登録商標）すなわちエリスロポイエチン；ネオレコルモン（登録商標）すなわちエリスロポイエチンβ；アラネスプ（登録商標）すなわちダルベポエチンα）；成長ホルモンすなわちソマトトロピン（ヒューマトロープ（登録商標）；プロトロピン（登録商標）；ニュートロ  ピン（登録商標）；セロスティム（登録商標）；サイゼン（登録商標））；抗ＮｏｇｏＡ  Ｍａｂ（ＩＮ−１）；ＮｏｇｏＡアンタゴニストであるＮｏｇｏ６６阻害剤（ＮＥＰ１−４０）；例えば、リソソーム蓄積症（に関連した神経症状）又は他の神経変性障害を治療するための、酵素（例えば、セレザイム（登録商標）すなわちグルコセレブロシダーゼ；アルドラザイム（商標）すなわちラロニダーゼ；Ａｒｙｐｌａｓｅ（商標）すなわちアリールスルファターゼＢ；Ｉ２Ｓすなわちイズロン酸−２−スルファターゼ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ；フェニラーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｓｅ）；アスパルチルグルコサミニダーゼ；酸性リパーゼ；システイン輸送体；Ｌａｍｐ−２；α−ガラクトシダーゼＡ；酸性セラミダーゼ；α−Ｌ−フコシダーゼ；ｓｓ−ヘキソサミニダーゼＡ；ＧＭ２活性化タンパク質欠損症；α−Ｄ−マンノシダーゼ；ｓｓ−Ｄ−マンノシダーゼ；アリールスルファターゼＡ；サポシンＢ；ノイラミニダーゼ；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ；ホスホトランスフェラーゼ７−サブユニット；ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ；Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ；ガラクトース６−スルファターゼ；Ｏ−ガラクトシダーゼ；ヒアルロノグルコサミニダーゼ；複数のスルファターゼ；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ；トリペプチジルペプチダーゼＩ；酸性スフィンゴミエリナーゼ；コレステロール輸送；カテプシンＫ；αガラクトシダーゼＢ；シアル酸輸送体；ＳＯＤすなわち銅／Ｚｎ超酸化物ジスムターゼ）；
ソマトスタチン、オキシトシン、バソプレッシン、ガラニン、ＶＩＰ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、サブスタンスＰ、ボンベシン、モチリン、グリセンチン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）など、脳に作用するホルモン及び神経伝達物質；並びにペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、エンドルフィン、エンケファリン、ニューロテンシン、ニューロメジンＫ、ニューロメジンＬ、カルシトニン関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、エンドセリン、ＡＮＰ（「心房性ナトリウム利尿ペプチド」）、ＢＮＰ（「脳性ナトリウム利尿ペプチド」）、ＣＮＰ（「Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド」）、ＰＡＣＡＰ（「下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」）などの神経ペプチド及びその誘導体；造影剤、特に抗体ベースのもの；脳血液関門を通過しない、神経伝達物質のアンタゴニスト又はアゴニスト（ある種のＮＭＤＡ受容体遮断薬など）；以下のような抗生物質、すなわち、アミノグルコシド、例えば、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ホーチマイシン、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン（ｔｒｏｓｐｅｃｔｏｍｙｃｉｎ）；アムフェニコール、例えば、アジダムフェニコール（ａｚｉｄａｍｆｅｎｉｃｏｌ）、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、及びテイマフェニコール（ｔｈｅｉｍａｐｈｅｎｉｃｏｌ）；
アンサマイシン、例えば、リファミド（ｒｉｆａｍｉｄｅ）、リファンピン、リファマイシン、リファペンチン、リファキシミン；β−ラクタム、例えば、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、オキサフェム（ｏｘａｐｈｅｍｓ）、ペニシリン；リンコサミド、例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン；
マクロライド、例えば、クラリスロマイシン、ディルスロマイシン（ｄｉｒｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、エリスロマイシンなど；ポリペプチド、例えば、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシンなど；テトラサイクリン、例えば、アピサイクリン（ａｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン（ｃｌｏｍｏｃｙｃｌｉｎｅ）など；２，４−ジアミノピリミジン、ニトロフラン、キノロン及びその類似体、スルホンアミド、スルホンなどの合成抗菌因子；以下のような抗真菌薬、すなわち、ポリエン、例えば、アムホテリシンＢ、カンジサイジン、デルモスタチン（ｄｅｒｍｏｓｔａｔｉｎ）、フィリピン、フンギクロミン、ハチマイシン、ハミシン（ｈａｍｙｃｉｎ）、ルセンソマイシン（ｌｕｃｅｎｓｏｍｙｃｉｎ）、メパルトリシン（ｍｅｐａｒｔｒｉｃｉｎ）、ナタマイシン、ナイスタチン、ペチロシン、ペリマイシン（ｐｅｒｉｍｙｃｉｎ）；アリルアミン、例えば、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィンなどの合成抗真菌薬；イミダゾール、例えば、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、クロルミダゾール（ｃｈｌｏｒｍｉｄａｚｏｌｅ）など、チオカルバミド酸エステル、例えば、トルシクラート、トリアゾール、例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、テルコナゾール；以下のような駆虫薬、すなわち、アレコリン、アスピジン、アスピジノール、ジクロロフェン、エンベルキン（ｅｍｂｅｌｉｎ）、コーシン（ｋｏｓｉｎ）、ナフタリン、ニクロサミド、ペレチエリン、キナクリン、アラントラクトン、アモカルザイン（ａｍｏｃａｒｚｉｎｅ）、アモスカナート、アスカリドール、ベフェニウム、ビトスカナート、四塩化炭素、カルバクロール、シクロベンダゾール（ｃｙｃｌｏｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、ディエチルカルバマジンなど；以下のような抗マラリア薬、すなわち、アセダプソン、アモジアキン、アルテエテル（ａｒｔｅｅｔｈｅｒ）、アルテメテル、アルテミシニン、アーテスネート、アトバクオン、ベベリン、ベルベリン、チラータ、クロルグアニイド、クロロキン、クロルプロガウニル（ｃｈｌｏｒｐｒｏｇａｕｎｉｌ）、キナ皮、シンコニジン、シンコニン、シクログアニル、ゲンチオピクリン、ハロファントリン、ハイドロキシクロロキン、メフロキン塩酸塩、３−メチルアルサセチン、パマキン、プラスモシド（ｐｌａｓｍｏｃｉｄ）、プリマキン、ピリメタミン、キナクリン、キニーネ、キニーネ、キノシド（ｑｕｉｎｏｃｉｄｅ）、キニーネ、ヒ酸水素２ナトリウム；以下のような抗原虫薬、すなわち、アクラニル（ａｃｒａｎｉｌ）、チニダゾール、イプロニダゾール、エチルスチバミン、ペンタミジン、アセタルゾン、アミニトロゾール、アニソマイシン、ニフラテル、チニダゾール、ベンジダゾール（ｂｅｎｚｉｄａｚｏｌｅ）、スラミンなど；ポリペプチド（好ましくは、ネプリリシン、及び本明細書において上述したタンパク質、ペプチド、酵素、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、及び成長因子）をコードする遺伝子（発現ベクター及び／又はプロモーター、好ましくはＧＦＡＰプロモーター及び／又はγ−ＧＴＰプロモーターも含める）、又はポリペプチドに対するアンチセンスＤＮＡ；並びに���ンチセンスプローブ（核酸又はペプチド核酸）でありうる。治療用又は診断用の部分と標的指向剤とを直接的に結合するのに加えて、そのような治療用又は診断用の部分は、ナノ粒子、リポソーム、又はナノゲルなどのナノ容器中に封入することもでき、この場合、標的指向剤がそのようなナノ容器に共有結合によって結合されていることが好ましい。ナノ容器へのそのような結合は、直接的であっても、又は、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、若しくは他の有機重合体などの、周知の重合体結合剤のいずれを介するものであってもよく、かつ、単独の標的指向剤との結合でも、血液脳関門及び脳の細胞膜にあるインシュリン、鉄結合性グロブリン、ＩＧＦ、レプチン、ＬＲＰ（１Ｂ）、又はＬＤＬ受容体を標的とした周知の血液脳関門指向性部分のいずれと組み合わせてもよい。標的（ＰＥＧ）化されたリポソームを含む、そのような医薬組成物の生成に関する詳細が、米国特許第６，３７２，２５０号に記載されている。
【００４６】
標的指向剤を治療用又は診断用の部分と結合させる様々な方法が当技術分野で知られている。そのような方法には、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６年、「バイオコンジュゲート技法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によって記載されたもの、及び、米国特許第６，１８０，０８４号及び米国特許第６，２６４，９１４号に記載のものがあり、さらに、例えば、応用免疫学で慣行的に使用されている、担体タンパク質にハプテンを連結するのに使用される方法が含まれる（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８年、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。場合によって、結合の際に、例えば、結合操作、又はその際に用いられた化学基によっては、標的指向剤、又は治療用若しくは診断用の部分が有効性又は機能性を失っているのが認められる。しかし、結合を行う方法には、実に様々なものがあるので、当業者ならば、結合される物質の有効性又は機能性に全く影響を与えないか、又はほとんど与えない結合方法を見出すことができる。
【００４７】
標的指向剤を治療用又は診断用の部分と結合させる適当な方法には、例えばカルボジイミド結合が含まれる（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ及びＷｉｌｃｈｅｋ、１９８０年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第７０巻、１５１〜１５９頁）。別法として、参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれている、Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、７２６９〜７２７３頁（１９９６年）；及びＮａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻、１７９４〜１７９９頁（１９９８年）の記載の通りに、部分を標的指向剤に結合させることもできる。使用するのが適切でありうる別の結合方法には、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化を行い、それに続いて、適当な反応剤による還元的アルキル化及びグルタルアルデヒド架橋を行う方法がある。
【００４８】
標的指向剤及び治療用部分の両方が（ポリ）ペプチドである場合には、特に有利な結合方法を適用することができる。そのような場合、２つの物質を、標的指向剤と治療用ペプチドとの両方のアミノ酸配列を含む単一（ポリ）ペプチド鎖として合成することができる。標的指向剤及び治療用ペプチドのアミノ酸配列の合計が５０、８０、又は１００アミノ酸を超えない場合には、結合体を、本明細書において上述した固相ペプチド合成法によって合成することができる。別法として、それらのアミノ酸配列の合計が、より大きい場合には、標的指向剤及び治療用ペプチドを含む単一（ポリ）ペプチド鎖を、本明細書において以下に概説する組換え発現技法によって生成してもよい。そのような場合には、例えば、標的指向剤及び治療用ペプチドのそれぞれをコードする２つの核酸配列を、インフレームとなるように、作用可能に連結させて、単一のオープンリーディングフレームを形成させることができる。その後、この単一のオープンリーディングフレームを含有する核酸配列は、適当な宿主で発現させるために、適当な発現ベクターに挿入することができ、後に、宿主から結合体を回収して、任意選択で、本明細書において以下に記述する通りに、さらに精製してもよい。これらの方法では、標的指向性ペプチドを、治療用ペプチドのいずれの端に配置しても、又はその両端に配置してもよく、或いは、各ペプチドの機能又は有効性に悪影響を与えない１箇所又は複数の位置で、治療用ペプチドのアミノ酸配列中に挿入してもよい。当業者ならば、通常の方法を用いて、その治療用ペプチドにおける、標的指向性ペプチドの最適の位置を決定することができる。
【００４９】
微小血管透過性の診断
さらに別の態様では、本発明は、対象の微小血管透過性の状態を診断する方法に関する。そのような方法は、好ましくは、（ａ）配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードする核酸配列の、対象における微小血管内皮での発現レベルを測定するステップと、（ｂ）上記核酸配列の発現レベルを、上記核酸配列の発現レベルに関する基準値と比較するステップとを含む。好ましくは、上記基準値は健康な個体の微小血管内皮での発現レベルの平均値である。上記核酸配列の発現レベルは、上記核酸配列によってコードされているＬＰＳＳポリペプチドの量を定量することによって、間接的に測定することができる。好ましい方法では、複数の核酸配列の発現レベルを比較する。複数の核酸配列を分析する場合には、下記及び実施例に記述する通りに、相補的な核酸を含むマイクロアレイを用いてこれを行うと好都合である。発現レベルは、対象から取得した試料中で、ｅｘ  ｖｉｖｏで測定してもよい。この方法は、微小血管透過性が上記のものでありうる微小血管透過性障害を診断する方法、又は微小血管透過性障害に対する罹病性を診断する方法であることが好ましい。この方法は、微小血管透過性を回復させる処置の有効性を評価するのに用いることもできる。
【００５０】
内皮透過性を変調できる物質を得るためのスクリーニング
さらに別の態様では、本発明は、毛細血管内皮細胞の透過性を変調することができる物質を同定する方法に関する。この方法は、（ａ）配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸を発現できる試験細胞集団を用意するステップと、（ｂ）試験される物質を含む組成物に、試験細胞集団を接触させるステップと、（ｃ）配列番号１〜２５に示すアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するＬＰＳＳポリペプチドをコードする核酸配列の発現レベルを、物質と接触した試験細胞集団で測定するステップと、（ｄ）上記核酸配列の上記発現を、物質と接触していない試験細胞集団における、上記核酸配列の発現レベルと比較するステップと、（ｅ）物質に接触した試験細胞集団と、物質に接触していない試験細胞集団との間で、上記核酸配列の発現レベルに相違が生じる物質を同定するステップとを含むことが好ましい。この方法では、上記核酸配列の発現レベルを、上記核酸配列によってコードされているＬＰＳＳポリペプチドの量を定量することによって、間接的に測定することができる。複数の核酸配列の発現レベルを比較してもよい。好ましい方法では、試験細胞集団が、内皮細胞、好ましくは血管内皮細胞、より好ましくは微小血管内皮細胞、最も好ましくは脳の微小血管内皮細胞を含む。試験細胞集団中の細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であることが好ましい。この方法では、物質に接触した試験細胞集団、及び物質に接触していない試験細胞集団が、一細胞集団、好ましくは一細胞系、より好ましくは一細胞に由来することが好ましい。さらに別の好ましい方法では、試験細胞集団はヘルパー細胞集団と共培養され、試験細胞集団がフィルターの片側の面で培養され、ヘルパー細胞集団が上記フィルターの反対側の面で培養され、好ましくは、ヘルパー細胞集団が星状細胞を含む。
【００５１】
本発明の方法での使用に好ましいＬＰＳＳポリペプチド
本発明者らは、示差特異的に発現する、血管透過性の低下に関与するポリペプチドをここに開示する。したがって、これらのポリペプチドを、本発明者らは、「リポ多糖感応性」ポリペプチド又はＬＰＳＳポリペプチドと呼ぶ。ＬＰＳＳポリペプチドは、血液脳関門の機能性の制御に関与する、いくつかの異なったタイプの機構に関与している。これらには、分泌因子、シグナル伝達経路、受容体、接着性分子、及び代謝酵素が含まれる。ＬＰＳＳポリペプチド及びこれらの機構について、以下により詳細に論じる。既知である場合、又は適用可能である場合には、各ＬＰＳＳポリペプチドについて、以下の情報を付与される。
・そのＬＰＳＳポリペプチドをコードしているアミノ酸配列（配列表）；
・受容体、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト；
・アゴニストＬＰＳＳポリペプチド又は断片；
・ＬＰＳＳポリペプチド受容体の完全又は部分アゴニスト；
・アゴニストペプチド模倣物質；
・アゴニスト抗体又は抗体断片；
・アゴニスト小分子、又は他の薬剤；
・アンタゴニストＬＰＳＳポリペプチド断片；
・アンタゴニストペプチド模倣物質；
・アンタゴニスト小分子、又は他の薬剤；
・アンタゴニスト抗体若しくは抗体断片、又は中和抗体若しくは抗体断片；
・ＬＰＳＳポリペプチド受容体の部分アゴニスト又は逆アゴニスト；
・ＬＰＳＳポリペプチド受容体の完全又は部分アンタゴニスト。
当業者ならば、これらの物質のそれぞれが、本明細書に記載した本発明の方法に適用しうるものであると理解するであろう。
【００５２】
分泌性ポリペプチド
本発明の実施形態では、細胞外に分泌されるか、又は細胞外で作用するＬＰＳＳポリペプチド（ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、結合タンパク質など）を、血液脳関門の透過性の特異的変調又はモニタリングに用いるのが好ましい。本発明者らは、示差特異的に発現する、そのような新規のポリペプチドのいくつかを同定したが、これらには、プレＢ細胞コロニー促進因子（ｐｒｅ−Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｏｌｏｎｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、骨形成タンパク質４、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６、へパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ジフテリア毒素受容体）、及びホスホリパーゼＡ２グループＶＩＩが含まれる。これらを、別の項（それぞれ受容体及び接着性分子の項、及び代謝酵素の項）で論じるジフテリア毒素受容体（配列番号２２）及びホスホリパーゼ  Ａ２グループＶＩＩ（配列番号２３）を除いて、以下により詳細に論じる。
【００５３】
ＰＢＥＦの遺伝子（配列番号１；ＬＰＳＳ０１）は、プレＢ細胞コロニー促進因子をコードし、ＢＣＥＣ単層培養中及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養中の両方において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。プレＢ細胞コロニー促進因子は、初期のＢ系列前駆細胞に作用するサイトカインであり、幹細胞因子（ＭＧＦ）及びインターロイキン７（ＩＬ７）のプレＢ細胞コロニー形成活性を増強する。血液脳関門を構成する細胞で、ＰＢＥＦの遺伝子又はプレＢ細胞コロニー促進因子がＬＰＳによる改変を受けていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＰＢＥＦ遺伝子産物（プレＢ細胞コロニー促進因子）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。プレＢ細胞コロニー促進因子活性の低減は、ＰＢＥＦ遺伝子のアンチセンス抑制によって行うのが好都合であろう。一方、プレＢ細胞コロニー促進因子活性の増強は、細胞内にＰＢＥＦ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性プレＢ細胞コロニー促進因子に曝露することによって行うのが好都合であろう。加えて、Ｏｇｎｊａｎｏｖｉｃら（２００１年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第２６（２）巻、１０７〜１１７頁）によって、プレＢ細胞コロニー促進因子に対する有用な抗体が開発されており、これを診断用又は治療用に用いることができる。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＰＢＥＦ遺伝子に相補的な核酸、及びＰＢＥＦタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００５４】
ＢＭＰ４遺伝子（配列番号２、３、及び４；ＬＰＳＳ０２）は、骨形成タンパク質４をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで下方制御されている（表１及び表２）。下方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。骨形成タンパク質４（別名、骨形成タンパク質２Ｂ（ＢＭＰ２Ｂ又はＢＭＰ２Ｂ１）、又はＺＹＭＥ）は、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一部をなす骨形成タンパク質ファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーには、成長因子及び分化因子の大きなファミリーが含まれている。骨形成タンパク質は、元々、脱ミネラル化された骨抽出物が骨格外部位において、軟骨内骨化（ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する能力によって同定されたものである。この特定のファミリーメンバーは、ヒトにおける軟骨内骨化の開始において重要な役割を果たしており、その発現の低下は、遺伝性障害である進行性骨化性線維形成異常症を含めた様々な骨疾患に関連している。この遺伝子の５’非翻訳領域における選択的スプライシングが記載されており、すべて同一のタンパク質をコードしている３種の変種が記載されている。血液脳関門を構成する細胞で、ＢＭＰ４遺伝子又は骨形成タンパク質４の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＢＭＰ４遺伝子産物（骨形成タンパク質４）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。骨形成タンパク質４活性の低減は、ＢＭＰ４遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いは骨形成タンパク質４の阻害物質であるＮｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎに内皮細胞を曝露することによって行うのが好都合であろう。一方、骨形成タンパク質４活性の増強は、細胞内へのＢＭＰ４遺伝子の導入によって、或いは外来性の骨形成タンパク質４に内皮細胞を曝露することによって行うのが好都合であろう。加えて、英国、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ社によって骨形成タンパク質４に対する有用な抗体が販売されており、これを診断用又は治療用に用いることもできる。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＢＭＰ４遺伝子に相補的な核酸、及びＢＭＰ４タンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００５５】
ＬＴＢＰ２の遺伝子（配列番号１３；ＬＰＳＳＯ６）は、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２（以前には、ＬＴＢＰ３として知られていた）は、細胞外マトリックスにおけるＴＧＦβの結合に関与しており、ＴＧＦβの機能を調節する重要な一機構として機能している。ＬＴＢＰ２の変異が、非定型マルファン症候群における２つの症例で同定されている。血液脳関門を構成する細胞で、ＬＴＢＰ２遺伝子、又は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＬＴＢＰ２遺伝子産物（潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２活性の低減は、ＬＴＢＰ２遺伝子のアンチセンス抑制によって行うのが好都合であろう。一方、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２活性の増強は、細胞内にＬＴＢＰ２遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性の潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２に曝露することによって行うのが好都合であろう。加えて、Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）によって潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２に対する有用な抗体が販売されており、これを診断用又は治療用に用いることもできる。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＬＴＢＰ２遺伝子に相補的な核酸、及びＬＴＢＰ２タンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００５６】
ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子（配列番号１４；ＬＰＳＳ０７）は、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６をコードし、ＢＣＥＣ単層培養中及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養中の両方において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６（別名、腫瘍壊死因子刺激遺伝子−６タンパク質すなわちＴＳＧ６、又はヒアルロン酸結合タンパク質、又は腫瘍壊死因子誘導性タンパク質６、又は腫瘍壊死因子α誘導性タンパク質６）は、ヒアルロナン結合ドメインを含有する分泌タンパク質であり、したがって、ヒアルロナン結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ヒアルロナン結合ドメインは、細胞外マトリックスの安定性と、細胞移動とに関与していることが知られている。このタンパク質は、インタ−α−インヒビター（ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＩαＩ）と安定した複合体を形成し、それによって、ＩαＩのセリンプロテアーゼ阻害活性を促進することが示されているが、ＩαＩは、炎症に関連しているプロテアーゼネットワークにおいて重要である。この遺伝子の発現は、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１、及びＬＰＳによって、正常な線維芽細胞、末梢血単核細胞、滑膜細胞、及び軟骨細胞で誘導されることがある。この発現は、力学的な刺激によって血管平滑筋細胞内で誘導されることもあり、プロテオグリカン合成及び凝集と相関していることが判明している。ＴＮＦＡＩＰ６は接着受容体ＣＤ４４に類似している。血液脳関門を構成する細胞内で、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、又は腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子産物（腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６活性の低減は、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＴＮＦＡＩＰ６タンパク質に対する抗体の使用によって行うのが好都合であろう。腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６活性の増強は、細胞内にＴＮＦＡＩＰ６遺伝子導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性の腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子に相補的な核酸、及びＴＮＦＡＩＰ６タンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００５７】
シグナル伝達経路
本発明の実施形態では、脳血液関門の透過性を特異的に変調するのに、細胞内信号伝達経路に関与するポリペプチドを用いることが好ましい。本発明者らは、示差特異的に発現するいくつかの新規のポリペプチドを同定したが、これらには、網膜細胞芽腫結合タンパク質６、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγ、ＭＡＲＣＫＳ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ａｌａｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｃ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＧＴＰ−結合タンパク質ＲＨＯ６、フォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１、カルレティキュリン前駆体、及びＧタンパク質共役型受容体誘導タンパク質が含まれる。これらについて以下に、より詳細に論じる。
【００５８】
ＲＢＢＰ６遺伝子（配列番号５；ＬＰＳＳ０３）は、網膜細胞芽腫結合タンパク質６をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。網膜細胞芽腫結合タンパク質６（別名、ＲＢＱ−１又はＤＫＦＺｐ７６１Ｂ２４２３）は、偏在的に発現される核タンパク質であり、細胞増殖を調節する網膜細胞芽腫タンパク質に直接的に結合するいくつかのタンパク質の１つである。このタンパク質は、リン酸化が過少の網膜細胞芽腫タンパク質と選択的に相互作用を行う。血液脳関門を構成する細胞で、ＲＢＢＰ６遺伝子、又は網膜細胞芽腫結合タンパク質６の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＲＢＢＰ６遺伝子産物（網膜細胞芽腫結合タンパク質６）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。網膜細胞芽腫結合タンパク質６活性の低減は、ＲＢＢＰ６遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＲＢＢＰ６タンパク質に対する抗体を用いることによって行うのが好都合であろう。一方、網膜細胞芽腫結合タンパク質６活性の増強は、細胞内にＲＢＢＰ６遺伝子を導入することによって、或いは内皮細胞を外来性の網膜細胞芽腫結合タンパク質６に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＲＢＢＰ６遺伝子に相補的な核酸、及びＲＢＢＰ６タンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００５９】
ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子（配列番号６、７、８、９、１０、及び１１；ＬＰＳＳ０４）は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγをコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで下方制御されている（表１及び表２）。下方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγ（別名、ＣＡＭＫ、ＣＡＭＫＧ、ＣＡＭＫ−ＩＩ、ＭＧＣ２６６７８）は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼファミリーに属し、さらにＣａ（２＋）／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼサブファミリーに属する。カルシウムシグナル伝達は、グルタミン酸作動性シナプスの可塑性に関するいくつかの側面に重要である。この酵素は、哺乳類細胞では、α、β、γ、及びδの４本の異なった鎖によって構成されている。この遺伝子の産物はγ鎖である。６種類の異なったアイソフォームをコードする６種類の選択的スプライシング変種の特徴付けがこれまでに行われている。異なったアイソフォームをコードするさらに別の選択的スプライシング変種が記載されているが、完全長でのそれらの特性はまだ決定されていない。血液脳関門を構成する細胞で、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子、又はカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγの発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子産物（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγ）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγ活性の低減は、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＣＡＭＫ２Ｇタンパク質に対する抗体を用いることによって行うのが好都合であろう。カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγ活性の増強は、細胞内にＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩγに曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子に相補的な核酸、及びＣＡＭＫ２Ｇタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。加えて、部分的にカルシウム非依存性となっているＣａＭＫＩＩｇａｍｍａＢの変異体であるＣａＭＫＩＩｇａｍｍａＢ＊（Ｔ２８７Ｄ）を発現するトランスジェニックマウスがＢｕｉら（２０００年、Ｃｅｌｌ、第１００（４）巻、４５７〜６７頁）によって作製されており、これも、本発明の実施形態において、血液脳関門を特異的に調査するのに有用でありうる。
【００６０】
ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ遺伝子（配列番号１２；ＬＰＳＳ０５）は、ＭＡＲＣＫＳをコードし、ＢＣＥＣ単層培養中及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養中の両方において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。ＭＡＲＣＫＳ（Ｆ５２、又はＭＡＲＣＫＳ様タンパク質若しくはＭＬＰ若しくはＭＬＰ１、又はＭＡＲＣＫＳ関連タンパク質すなわちＭＲＰとしても知られている）は、カルモジュリンシグナル伝達と、プロテインキナーゼＣシステムとを共役させる機能を有し、中枢神経系の発生に関与している。血液脳関門を構成する細胞で、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ遺伝子、又はＭＡＲＣＫＳの発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ遺伝子産物（ＭＡＲＣＫＳ）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。ＭＡＲＣＫＳ活性の低減は、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＭＡＣＭＡＲＣＫＳタンパク質に対する抗体によって行うのが好都合であろう。一方、ＭＡＲＣＫＳ活性の低減は、細胞内にＭＡＣＭＡＲＣＫＳ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のＭＡＲＣＫＳに曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ遺伝子に相補的な核酸、及びＭＡＣＭＡＲＣＫＳタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。さらに、Ｗｕら（１９９６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９３（５）巻、２１１０〜２１１５頁）によって、Ｆ５２欠失が作製されており、これも、本発明の実施形態において、血液脳関門を特異的に調査するのに有用でありうる。
【００６１】
ＲＨＯ６遺伝子（配列番号１５；ＬＰＳＳ０８）は、ＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６をコードし、ＢＣＥＣ単層培養中及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養中の両方において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。ＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６（別名、ｒｏｕｎｄ１、ＲＮＤ１）は、アクチン細胞骨格及び細胞接着の調節に関与している。ＲＨＯ６は、ＡＲＨＥ（別名、ＲＮＤ３、Ｒｈｏ８、又はＲｈｏＥ）に対して高い類似性を有する。血液脳関門を構成する細胞で、ＲＨＯ６遺伝子又はＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＲＨＯ６遺伝子産物（ＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。ＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６活性の低減は、ＲＨＯ６遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＲＨＯ６タンパク質に対する抗体によって行うのが好都合であろう。ＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６活性の増強は、細胞内にＲＨＯ６遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のＧＴＰ結合タンパク質ＲＨＯ６に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＲＨＯ６遺伝子に相補的な核酸、及びＲＨＯ６タンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００６２】
ＰＤＣ遺伝子（配列番号１６及び１７；ＬＰＳＳ０９）は、フォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。フォスデューシン（フォスデューシン様タンパク質若しくはＰｈＬＰ１、又は松果腺フォスデューシン、又はＧβγ結合タンパク質、又は３３ｋＤＡ光伝達タンパク質（３３ｋＤＡ  ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はＰＨＤ、又はＭＥＫＡとしても知られている）は、網膜の桿細胞における外側セグメント及び内側セグメントに局在する。フォスデューシンは、視覚における光伝達の調節、又は光受容体代謝の統合に関与している可能性がある。フォスデューシンは、網膜Ｇタンパク質トランスデューシンのβ及びγサブユニットと相互作用することによって、光伝達カスケードの変調を行う。２種類の選択的スプライシングされた転写産物変種が記載されている。これらの変種によってコードされているアイソフォームの１つであるフォスデューシン様オーファンタンパク質は、Ｇタンパク質に結合しない。フォスデューシンタンパク質及びそのアイソフォームは、他の組織にも存在しており、それらの組織ではシグナル伝達経路に関与している可能性がある。このタンパク質をコードする遺伝子は、網膜色素変性症及びアッシャー症候群タイプＩＩに関与している可能性のある候補遺伝子の１つである。血液脳関門を構成する細胞で、ＰＤＣ遺伝子又はフォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＰＤＣ遺伝子産物（フォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。フォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１活性の低減は、ＰＤＣ遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＰＤＣタンパク質に対する抗体を用いることによって行うのが好都合であろう。フォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１活性の増強は、細胞内にＰＤＣ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のフォスデューシンアイソフォームフォスデューシン様タンパク質／オーファン１に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＰＤＣ遺伝子に相補的な核酸、及びＰＤＣタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００６３】
ＣＡＬＲ遺伝子（配列番号１８；ＬＰＳＳ１０）は、カルレティキュリン前駆体をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで示差的に下方制御されている（表１及び表２）。ＢＣＥＣ単層培養と、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養との間で示差的に下方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、ＬＰＳ刺激から回復する能力に関与する。（図２）カルレティキュリン（別名、自己抗原Ｒｏ、又は乾燥症候群抗原Ａ若しくはＳＳＡ、又はｃＣ１ｇＲ）は、小胞体の内腔で主要なＣａ（２＋）結合（貯蔵）タンパク質として機能する多機能タンパク質である。このタンパク質は核内にも見出されており、これはこのタンパク質が転写調節にも役割を持つことを示唆するものである。カルレティキュリンは、合成ペプチドＫＬＧＦＦＫＲに結合するが、これは、核受容体スーパーファミリーのＤＮＡ結合ドメインにあるアミノ酸配列にほとんど同一のものである。カルレティキュリンは、抗Ｒｏ／ＳＳＡ抗体を含有する、全身性狼瘡及びシェーグレン患者の特定の血清中にある抗体に結合し、種相互でよく保存されており、また、小胞体及び筋小胞体に局在しており、そこでカルシウムに結合していると思われる。カルレティキュリンのアミノ末端は、グルココルチコイド受容体のＤＮＡに結合ドメインと相互作用し、この受容体がそれに特異的なグルココルチコイド応答エレメントに結合するのを阻止する。カルレティキュリンは、アンドロゲン受容体がそれのホルモン応答性ＤＮＡエレメントに結合するのを阻害することもでき、アンドロゲン受容体及びレチノイン酸受容体の転写活性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することもでき、さらにレチノイン酸で誘導される神経細胞分化も阻害することができる。すなわち、カルレティキュリンは、核ホルモン受容体による遺伝子転写調節の重要な変調因子として作用することができる。全身性紅斑性狼瘡は、カルレティキュリンに対する自己抗体力価の増大に関連しているが、カルレティキュリンはＲｏ／ＳＳ−Ａ抗原ではない。以前の論文では、カルレティキュリンがＲｏ／ＳＳ−Ａ抗原として言及されていたが、これは後に反証された。ヒト・カルレティキュリンに対する自己抗体力価の増大は、ＩｇＧ及びＩｇＭ両クラスの完全先天性心ブロックの乳児にも見られる。血液脳関門を構成する細胞で、ＣＡＬＲ遺伝子又はカルレティキュリン前駆体の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＣＡＬＲ遺伝子産物（カルレティキュリン前駆体）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。カルレティキュリン前駆体活性の低減は、ＣＡＬＲ遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＣＡＬＲタンパク質に対する抗体を用いることによって行うのが好都合であろう。カルレティキュリン前駆体活性の増強は、細胞内にＣＡＬＲ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のカルレティキュリン前駆体に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管���過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＣＡＬＲ遺伝子に相補的な核酸、及びＣＡＬＲタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００６４】
Ｃ８ＦＷ遺伝子（配列番号１９；ＬＰＳＳ１１）は、Ｇタンパク質共役型受容体誘導タンパク質をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで示差的に上方制御されている（表１及び表２）。ＢＣＥＣ単層培養と、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養との間で示差的に上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、ＬＰＳ刺激から回復する能力に関与する（図２）。Ｃ８ＦＷ（別名、ＧＩＧ２）は、分裂促進経路によって調節されるこのリンタンパク質の暫定的遺伝子記号、及び名称である。このＧタンパク質共役型受容体誘導タンパク質は、プロテインキナーゼに対する類似性を有する。血液脳関門を構成する細胞で、Ｃ８ＦＷ遺伝子又はＧタンパク質共役型受容体誘導タンパク質の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、Ｃ８ＦＷ遺伝子産物（Ｇタンパク質共役型受容体誘導タンパク質）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。Ｇタンパク質共役型受容体誘導タンパク質活性の低減は、Ｃ８ＦＷ遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはＣ８ＦＷタンパク質に対する抗体を用いることによって行うのが好都合であろう。一方、Ｇタンパク質共役型受容体誘導タンパク質活性の増強は、細胞内にＣ８ＦＷの遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のＧタンパク質共役型受容体誘導タンパク質に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、Ｃ８ＦＷ遺伝子に相補的な核酸、及びＣ８ＦＷタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００６５】
受容体及び接着分子
本発明の実施形態では、脳−血液関門の透過性を特異的に変調するのに、膜（シグナル伝達又はインタナリゼーション）受容体、又は（シグナル伝達）接着分子として機能するポリペプチドを用いることが好ましい。本発明者らは、示差特異的に発現するいくつかの新規のポリペプチドを同定したが、これらには、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４、成長ホルモン受容体、及びジフテリア毒素受容体（へパリン結合性上皮成長因子様成長因子）が含まれる。これらについて、以下に、より詳細に論じる。
【００６６】
ＣＸＣＲ４遺伝子（配列番号２０；ＬＰＳＳ１２）は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで下方制御されている（表１及び表２）。下方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。ケモカイン受容体４は、ＣＸＣサイトカインに結合するＧタンパク質共役型受容体である。このタンパク質は、細胞内カルシウム流動を媒介する。ケモカイン受容体４は、ＭＡＰＫの活性化、アポトーシス、走化性、組織生成及び器官発生、免疫反応、炎症反応、浸潤性増殖、神経発生、ウイルスに対する反応、及び病原性（このタンパク質はＨＩＶ−１が細胞に進入する際の補助受容体である）に関与している。このタンパク質は、どのような特性を研究しているかによって、神経ペプチドＹ受容体Ｙ３（ＮＰＹ３Ｒ）；ヒュージン（ｆｕｓｉｎ）；白血球由来７回膜貫通ドメイン受容体（ＬＥＳＴＲ）；脾臓７回膜貫通セグメント受容体；リポ多糖（ＬＰＳ）関連タンパク質３（ＬＡＰ３）と呼ばれ、他にも様々な名称がある（ＨＭ８９、ＮＰＹＲ、ＨＳＹ３ＲＲ、ＮＰＹＹ３Ｒ、Ｄ２Ｓ２０１Ｅなど）。血液脳関門を構成する細胞で、ＣＸＣＲ４遺伝子又はケモカイン受容体４の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＣＸＣＲ４遺伝子産物（ケモカイン受容体４）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。ケモカイン受容体４活性の低減は、ＣＸＣＲ４遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いは、ＣＸＣＲ４タンパク質に対する抗体を含むケモカイン受容体４アンタゴニストによって行うのが好都合であろう。一方、ケモカイン受容体４活性の増強は、細胞内にＣＸＣＲ４遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のケモカイン受容体４アゴニストに曝露することによって行うのが好都合であろう。これまでに以下のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、すなわち、ペプチド化合物（Ｔ２２、Ｔ１３４、Ｔ１４０、ＡＬＸ４０−４Ｃ、ＣＧＰ６４２２２）、バイサイクラム誘導体（ＡＭＤ３１００）、中和抗体（１２Ｇ５、４４７１７−１１１）、及び天然アンタゴニスト（ＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質）が記載されている（Ｓａｃｈｐａｔｚｉｄｉｓら、２００３年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７８（２）巻、８９６〜９０７頁；Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑら、２００１年、Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｃｈｅｍ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第１２（補１）巻、１９〜３１頁；Ｔａｍａｍｕｒａら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、第２５３（３）巻、８７７〜８８２頁）。これまでに以下のＣＸＣＲ４アゴニスト、すなわちペプチド化合物（ＲＳＶＭ、ＡＳＬＷ）、及び天然アゴニスト（間質細胞由来因子１α及びβ（ＣＸＣＬ１２）が記載されている（Ｓａｃｈｐａｔｚｉｄｉｓら、２００３年、同上）。加えて、英国Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ社によって、組換え型のヒトＣＸＣＬ１２及びマウスＣＸＣＬ１２、並びにケモカイン受容体４に対する有用な抗体及びそのリガンドＣＸＣＬ１２が販売されており、これらも診断用又は治療用に用いることができる。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＣＸＣＲ４遺伝子に相補的な核酸、及びＣＸＣＲ４タンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００６７】
ＧＨＲ遺伝子（配列番号２１；ＬＰＳＳ１３）は、成長ホルモン受容体をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。生物学的に活性な成長ホルモンは、それの膜貫通型受容体（ＧＨＲ）に結合し、これが二量体化して、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ１）の合成及び分泌に至る細胞内シグナル伝達経路を活性化する。血漿中では、ＩＧＦ１は可溶性のＩＧＦ１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に結合する。標的細胞で、この複合体が活性化するシグナル伝達経路は、成長を導く分裂促進反応及び同化反応を引き起こす。ＧＨＲは、成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）としても知られているが、ＧＨＢＰは、ＧＨＲの細胞外ホルモン結合領域に由来し、循環中で成長ホルモンに結合した状態を保持し、循環中で成長ホルモンの安定化に機能する。血液脳関門を構成する細胞で、ＧＨＲ遺伝子又は成長ホルモン受容体の発現がＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、以前には報告されておらず、血液脳関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。したがって、ＧＨＲ遺伝子産物（成長ホルモン受容体）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。成長ホルモン受容体活性の低減は、ＧＨＲ遺伝子のアンチセンス抑制によって、成長ホルモン受容体アンタゴニスト（高濃度の成長ホルモンも含まれるが、これは、後でアンタゴニストとして作用する）によって、又はＧＨＲタンパク質に対する抗体によって行うのが好都合であろう。一方、成長ホルモン受容体活性の増強は、細胞内にＧＨＲ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性の成長ホルモン受容体アゴニスト（成長ホルモンなど）に曝露することによって行うのが好都合であろう。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＧＨＲ遺伝子に相補的な核酸、及びＧＨＲタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００６８】
ＤＴＲ（別名、ＨＢＧＦＬ）遺伝子（配列番号２２；ＬＰＳＳ１４）は、ジフテリア毒素受容体（別名、ヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子）をコードし、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養中において、ＬＰＳへの２時間の曝露の後、ＢＣＥＣで上方制御されている（表１及び表２）。上方制御されるＬＰＳＳポリペプチドは、血管透過性の増大に関与する。
【００６９】
ジフテリア毒素受容体（ＨＢ−ＥＧＦ、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子前駆体、又はジフテリア毒素感受性、ＤＴＳとしても知られている）は、ジフテリア毒素（ＤＴ）の受容体であるが、これは、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）の溶原性菌株によって生成される強力な外毒素、ＤＴ、５８ｋＤａタンパク質であって、感受性の哺乳類細胞を殺す多機能タンパク質である。これは、ジスルフィド結合されている２つのタンパク質断片によって構成されているが、中毒の過程には、それらの両方が必要である。Ａ断片は、真核伸長因子２のＡＤＰ−リボシル化を触媒し、それによってタンパク質合成を阻害する。Ｂ断片は、毒素が細胞に結合する原因であり、Ａ断片が細胞質ゾルに侵入するのを促進するのに不可欠である。細胞表面の特異的なＤＴ受容体の存在は、１９７３年に初めて実証され、今では、ＤＴが、受容体介在性エンドサイトーシスによって感受性の哺乳類細胞に進入することが知られている。最初のステップでは、ＤＴがＤＴＲに結合し、それに続いて、毒素：受容体複合体が被覆小窩の中にインタナリゼーションされ、そして、Ａ断片が細胞質ゾル中に移行する。実際には、ＤＴ毒素は、細胞受容体に結合した後、エンドサイトーシスされ、このエンドサイトーシス小胞中にある間は、酸性ｐＨ環境にさらされている。酸性のｐＨによって、毒素分子の構造変化が誘導され、これによって、膜への挿入と、細胞質ゾルへの移行と行うための原動力が提供される。すべての哺乳類細胞が等しくＤＴに感受性であるわけではない。例えば、ベロ細胞などのサル腎臓細胞は感受性が高く、一方、例えば、ヒト、ウサギ、モルモット、及びハムスターの細胞は中程度に感受性であり、マウス及びラットの細胞は抵抗性を有する。ニワトリ細胞もＤＴに感受性である。実施例２で例示するように、ＤＴは、ウシＢＣＥＣに対して、（準）ナノモル濃度の範囲で毒性を有し、これは濃度依存性であり、かつ、頂端側及び側底面での曝露の後の時間にも依存性を有する。
【００７０】
ＨＢ−ＥＧＦは、最初、１９９０年に、マクロファージから分泌されるヘパリン結合性成長因子として同定された。ＥＧＦファミリーの他のメンバーと同様に、ＨＢ−ＥＧＦは、ｅｒｂクラスのＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）分子に結合することによって、その生物作用を及ぼす。ＨＢ−ＥＧＦは、２種類のＥＧＦ受容体サブタイプ、すなわちＨＥＲ１及びＨＥＲ４を活性化して、細胞表面のＨＳＰＧに結合する。しかし、ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦを含めたＥＧＦファミリーのほとんどのメンバーとは異なり、高親和性でヘパリンに結合する。ヘパリンは、シグナル伝達を行うＥＧＦ−Ｒに対するＨＢ−ＥＧＦの結合を増強すると考えられ、細胞の移動と及び増殖を含めた、成長因子による標的細胞に対する生物作用の変調も行っている可能性がある。ＨＢ−ＥＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞、及び上皮細胞に対しては、分裂促進性を有するが、内皮細胞に対してはその作用がない。さらに、ＨＢ−ＥＧＦは、上皮細胞によって産生され、これらの細胞に対して自己分泌型成長因子として作用する。ＨＢ−ＥＧＦは、耐熱性を有する陽イオン性タンパク質であって、ヘパリン親和性クロマトグラフィーカラムから１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出する分子量約２２ｋＤａのタンパク質である。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現は、例えば、酸化、虚血、浸透圧（高濃度のグルコース、又は高浸透圧）、電気、及び機械的な（剪断）ストレスに反応して、そして、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−α）、ＬＰＳ、成長因子（ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ）、リゾ−ホズファチジルコリン、塩化第二水銀、ホルボールエステル、Ｃａイオノフォア、血清、トロンビン、エンドセリン−１、アンジオテンシンＩＩ、リポタンパク質、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、α−アドレナリン作動性アゴニスト、及び、ＭｙｏＤ、Ｒａｆ、ｖ−Ｈａ−ｒａｓなどの転写因子への曝露の後に強い上方制御を受ける。可溶性の成熟ＨＢ−ＥＧＦは、膜固定された、より大きな前駆体からマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、特にＭＭＰ−３）及びＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０／クズバニアン、ＡＤＡＭ１２／メルトリン−α、及びＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ（ＴＮＦα転換酵素）を含めたジスインテグリン及びメタロプロテアーゼファミリー）によるタンパク質分解性のプロセシングによって生成される。この過程は、細胞外ドメイン切断（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ）と呼ばれ、ＵＶ光、ＩＬ−１β、アニソマイシン、ソルビット、ＬＰＳ、過酸化水素、フェニレフリン、エンドセリン−１、アンジオテンシンＩＩ、インシュリン様成長因子−１、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）によって、プロテインキナーゼＣδの活性化を介して、さらに、その後ＡＤＡＭ９／ＭＤＣ９／メルトリン−γの細胞質ドメインに結合することによって、或いは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）によって、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ及び低分子量ＧＴＰａｓｅ  Ｒａｃのシグナル伝達経路を介して、又は、ストレス誘導性及び炎症性サイトカイン誘導性のｐ３８  ＭＡＰＫ媒介経路によって、誘導又は上方制御される（Ｔａｋｅｎｏｂｕら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．���ｈｅｍ．、第２７８巻、１７２５５〜１７２６２頁；Ｕｍａｔａら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、３０４７５〜３０４８２頁；Ａｓａｋｕｒａら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第８巻、３５〜４０頁）。プロＨＢ−ＥＧＦシェディングは、ヒドロキサム酸ベースのＫＢ−Ｒ８３０１、全般的ＭＭＰ阻害剤（ＴＩＭＰを含めた）、ＢＢ−９４（バチマスタット）などのＭＭＰ阻害剤、ＡＤＡＭ１２阻害剤ＫＢ−Ｒ７７８５、並びにＡＤＡＭ１０阻害剤ＸＬ７８４及びＸＬ０８１、又はこれらの類似体によって阻害される。ＴＰＡによって誘導性されるシェディングは、ＰＫＣ阻害剤Ｒｏ−３１−８２２０によって、ＬＰＡによって誘導されるシェディングは、ＭＥＫアンタゴニストＰＤ９８０５９によって、そしてｐ３８  ＭＡＰＫによって媒介されたシェディングは、ＳＢ２０３５８０によって阻害される（Ｔａｋｅｎｏｂｕら、２００３年、同上）。タンパク質分解による膜からの切断過程の後でも、依然として、かなりの量のＨＢ−ＥＧＦ前駆体が、切断されずに細胞表面に残留している（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９５年、第１２９巻、１６９１〜１７０５頁）。
【００７１】
ＨＢ−ＥＧＦは、胚盤胞の着床、及び創傷治癒などの様々な正常生理過程、並びに、腫瘍成長、ＳＭＣ肥大、及びアテローム硬化症などの疾病過程に関与するものとして意味づけられている。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現は、血管の内皮細胞及び平滑筋細胞、炎症細胞（ＮＫ細胞がほとんど）、骨格筋及び心筋、腎臓メサンギウム細胞、ケラチン生成細胞、小腸、脳（ニューロン及びグリア細胞）、全関節、栄養芽層、胚盤胞、卵巣及び子宮、胎盤、皮膚、リンパ節、膀胱、並びに腫瘍細胞（神経こう腫も含まれる）を含めた様々な組織で実証されている。
【００７２】
最近、ＨＢ−ＥＧＦ前駆体がジフテリア毒素の受容体として機能することが判明した（Ｎａｇｌｉｃｈら、１９９２年、Ｃｅｌｌ、第６９巻、１０５１〜１０６１頁）。ＨＢ−ＥＧＦ前駆体は、ヒト、サル、ラット、及びマウスを含めた種で、同様の組織分布で発現されるが、ラット及びマウスはＤＴに対して抵抗性を有し、これは、ヒト及びサルでＤＴによって特異的に認識される配列（ＨＢ−ＥＧＦにある、ＤＴに対する受容体結合ドメイン）中にある、齧歯動物ＨＢ−ＥＧＦへのＤＴの結合を減弱させるアミノ酸置換のためである（Ｍｉｔａｍｕｒａら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、１０１５〜１０１９頁）。最近では、ＡＡ１４１（Ｇｌｕ１４１）が、ＤＴの結合及び毒素感受性に極めて重要な残基であることが示されている（Ｈｏｏｐｅｒ及びＥｉｄｅｌｓ、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ、第２２０巻、６７５〜６８０頁）。その後、Ｍｉｔａｍｕｒａら（１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７２巻、２７０８４〜２７０９０頁）が、ＤＴの結合及び毒素感受性に重要な残基をさらに２つ（アミノ酸１１５（Ｐｈｅ１１５）及びアミノ酸１２７（Ｌｅｕ１２７））発見した。ＤＴ非感受性の種（マウス、ラット）、及びＤＴ感受性の種（チャイニーズハムスター、ウサギ、ブタ、サル、ヒト、及びニワトリ）全体におけるＨＢ−ＥＧＦのＤＴ−受容体結合ドメイン（アミノ酸１０６〜１４７）の配列を、表３に示す。
【表１】
2007528698.tif 000002
【００７３】
へパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、並びにＣＤ９／ＤＲＡＰ２７及びα３−β１−インテグリンなどの他の付随タンパク質は、ＤＴＲの、そのリガンドに対する親和性を増加させることによって、ＤＴＲ機能を変調する（ＨＢ−ＥＧＦの、その受容体に対する結合に対しても同様（Ｓｈｉｓｈｉｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、第４９巻、２９５７８〜２９５８５頁）。抗ＣＤ９／ＤＲＡＰ２７モノクローナル抗体（ＩｇＧ１：ＡＬＢ−６及びＴＰ８２、ＩｇＧ２ａ：ＢＵ１６及び００７、並びにＭＡＢ１２０６）は、ヒト細胞に対するＤＴの結合及び毒性を阻害する（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９５年、同上；Ｍｉｔａｍｕｒａら、１９９２年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第１１８巻、１３８９〜１３９９頁；Ｉｗａｍｏｔｏら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、２０４６３〜２０４６９頁）。
【００７４】
ＤＴＲ遺伝子（又はジフテリア毒素受容体（別名、ヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子）が、血液脳関門を構成する細胞で発現するという発見（実施例１及び２に例示する通り）、及び、ＤＴＲの生物活性が、疾患刺激（ＬＰＳに関しては、実施例１及び３に例示する通り）、へパリン結合（外来性のへパリンに対する曝露に関しては、実施例３に例示する通り）、アンタゴニスト（ＣＲＭ１９７（ＤＴの競合的アンタゴニスト）に関しては、実施例２に、そして、可溶性ＨＢ−ＥＧＦ（ＤＴの非競合的アンタゴニスト）には、実施例２及び４に例示する通り）、細胞外ドメイン切断の阻害剤（マトリックスメタロプロテイナーゼＢＢ−９４（すなわち、バチマスタット）に対する曝露に関しては、実施例３に例示する通り）、又はこれらの組合せ（実施例３に例示する通り）によって改変されるという発見は、血液脳関門及びそれを越えた先、並びに／又は細胞内画、特にリソソームに、薬物を特異的に送達する新たな機会を提供するものである。ＤＴＲ遺伝子産物（すなわち、ヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門を標的にする能力を変調するのに有用である。ＤＴＲ（のレセプター結合領域）に特異的に結合する任意のリガンド（ＤＴ（の部分）、ＤＴのＢ断片（の部分）、ＣＲＭ１９７（の部分）（実施例４に例示する通り）、又は任意の他のリガンド）が、本発明の実施形態において、脳血液関門を標的として薬物を送達するのに有用である。
【００７５】
例えば、ペプチド及びタンパク質を、膜を通して細胞質中に運ぶ担体として、タンパク質毒素（又はその非毒性誘導体）を使用するという一般概念は新規なものではない（この主題に関しては、Ｓａｎｄｖｉｇ及びｖａｎ  Ｄｅｕｒｓ（２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、第１８巻、１〜２４頁）の最近の総説を参照されたい）。ＤＴは、その受容体ＨＢ−ＥＧＦに結合した後、受容体媒介性エンドサイトーシスと呼ばれる過程によってインタナリゼーションされる。受容体媒介性エンドサイトーシス／トランスサイトーシスは、選択的に脳を薬物の標的とする安全かつ有効な積荷運搬輸送機構としてよく知られている（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、２００２年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．、第１巻、１３１〜１３９頁）。しかし、例えば、トランスフェリン受容体に関して記載されたように、受容体媒介性エンド／トランスサイトーシスを用いた機構によって、薬物を脳血液関門を通してＣＮＳに直接運搬するのに、ＤＴＲの特異的リガンドを使用するということは、以前には認識されていなかったことである。事実、薬物をＣＮＳに運搬するのには、破傷風毒素タンパク質の非毒性Ｃ断片（ＴＴＣ又はＴｅｔ４５１）、及び破傷風毒素タンパク質の非毒性誘導体（Ｇｌｕ２３４をＡｌａで置換）のみが利用されているが、これらは、末梢神経終末内への取り込みと、それに続く、その細胞体への逆向性軸索輸送、及び中枢ニューロンへの経シナプス移行とが関与する、明らかに特有（脳血液関門における受容体媒介性エンド／トランスサイトーシスと比べて）の作用機構によるものである（米国特許第５，７８０，０２４号、及びそこに引用されている参考文献、並びに、Ｌｉら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７６巻、３１３９４〜３１４０１頁に記載されている）。ラット脳のニューロン、グリア細胞、及び血管における、ＨＢ−ＥＧＦの構成的発現及び疾患誘導性の発現については、Ｍｉｓｈｉｍａら（１９９６年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、第２１３巻、１５３〜１５６頁）Ｎａｋａｇａｗａら（１９９８年、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第１０８巻、２６３〜２７２頁）Ｈａｙａｓｅら（１９９８年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第７８４巻、１６３〜１７８頁）及びＴａｎａｋａら（１９９９年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第８２７巻、１３０〜１３８頁）によって既に以前に記載されているが、これらの筆者はだれも、ＤＴＲリガンドに結合されている薬物を、脳内のこれらの細胞（の中の細胞内区画）を標的として送達する機会を認識しなかった。このような認識の欠落は、齧歯動物のＨＢ−ＥＧＦがＤＴの受容体ではないという事実によって最も良く説明される。事実、齧歯動物では、受動拡散の後に、ＤＴによって脳内の腫瘍細胞が効果的に殺されることがある（Ａｒｇｕｅｌｌｏら、１９９６年、Ｂｌｏｏｄ．、第８７（１０）巻、４３２５〜４３３２頁）としても、脳腫瘍の微小血管を通したＤＴの透過性は、他の巨大タンパク質の透過性と等しいか、又はさらに低いものである（Ｗｒｏｂｅｌら、１９９０年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、第７２（６）巻、９４６〜９５０頁）。したがって、これらの研究は、ＨＢ−ＥＧＦの自己分泌性及びジャクスタクリン性の成長因子及び接着因子としての特性に関してのみ報告したものであった。さらに驚いたことに、受容体媒介性エンド／トランスサイトーシスに関する、中枢神経系薬物送達の有名な専門家（この主題に関する科学的及び総説的論文／書籍、特許、並びに特許出願を多数公開しているＰａｒｄｒｉｄｇｅ及びＲａｐｏｐｏｒｔも含まれる）も、脳に薬物送達するための利用可能な技術に関する包括的な概説を提供し、参考文献として本明細書に含まれている、「生理的に保護された部位を標的とするための、生物活性化合物とアミノ酸及びアミノ酸誘導体との共有結合体（Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｉｔｅｓ）」と題した最も最近に公開された米国特許出願の筆者であるＹａｔｖｉｎら（米国特許出願公開第２００３００８７８０３号）も、ＤＴＲリガンドに結合されている薬物を、脳内の細胞（の中の細胞内区画）を標的として送達する機会を認識しなかった。
【００７６】
ＤＴＲを、その天然リガンドであるＤＴを用いて薬物の標的とすることは、感受性の哺乳類細胞に対してＤＴが極めて毒性であるという事実によって望ましくないものとなっている。しかし、ＤＴのＢ断片（の部分）、又はＣＲＭ１９７（ＤＴの非毒性変異体タンパク質）（の部分）を含めた、ＤＴの非毒性部分が同定されたことによって、ＤＴＲを介して安全かつ効果的に薬物を脳に送達する道が開かれた。種痘プログラム（例えば、インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型オリゴ糖のＣＲＭ１９７結合ワクチン（ＨｉｂＴｉｔｅｒ（商標））；肺炎球菌の７価結合ワクチン（プリブナール（商標））；髄膜炎菌Ｃオリゴ糖の結合ワクチン（Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）及びＭｅｎｉｎｇｔｅｃ（商標）））で、既に何百万人もの人々（赤ん坊、幼児、青年、及び成人）に対するヒトへの使用に、ＣＲＭ１９７に結合された多糖が安全に適用されているため、ＣＲＭ１９７が最も好ましい。これらの適用から、ＣＲＭ１９７タンパク質が、糖の安全かつ効果的なＴ細胞依存性担体であることが公知となっている。同様に、ＣＲＭ６６（交差反応性６６ｋＤａタンパク質）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）及びＬＲＰ  １Ｂに特異的に結合する、緑膿菌外毒素Ａの不活性型変異体であり、同じ受容体に結合するｐ９７（メラノトランスフェリン）に関して、Ｄｅｍｅｕｌｅら（２００２年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第８３（４）巻、９２４〜９３３頁）によって記載されている通り、同様の様式で、脳血液関門を通して薬物を送達するのに利用することができる（国際開第ＷＯ０３００９８１５号）。
【００７７】
ＣＲＭ１９７は、毒素産生性コリネファージ（ｃｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ）（β）のニトロソグアニジン突然変異生成によって生み出された毒素非産生性ファージ（β１９７ｔｏｘ−）に感染したジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生される（Ｕｃｈｉｄａら、１９７１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２３３巻、８〜１１頁）。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、それとは構造遺伝子中の単一塩基変化（グアニンからアデニンへ）によって相違している。この単一塩基変化は、成熟タンパク質におけるアミノ酸置換（アミノ酸５２：グリシンからグルタミン酸へ）を引き起こし、ジフテリア毒素の毒性特性を消失させる。
【００７８】
ワクチンの中の担体タンパク質は以下の概念に基づいて発見された。完全な（ただし、不活性化されている）ウイルス又は細菌を用いたワクチン接種は、効果的であるが多くの欠点と副作用とを有する。このような理由から、ウイルス及び細菌の免疫原性部分（又は模倣体）のみを用いたワクチン接種プロトコール、（例えば、（多）糖又は莢膜タンパク質）が開発された。しかし、そのようなワクチンは、集団内で感染の危険が最も高い部分、すなわち、免疫防御をＴ細胞応答に頼っている、Ｂ細胞性免疫障害を有する個体、高齢者、及び２歳未満の乳児では、効果が最も少ない。そのようなワクチンは、Ｔ細胞性免疫応答の誘導能が弱く、この標的集団には、ウイルス及び細菌の免疫原性部分を、Ｔ細胞応答を誘導できる免疫原に転換することが、適切な防御を生み出す鍵となる。そのような免疫原は、ウイルス及び細菌の免疫原性部分を、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ホルマリン化されたＤＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの適当なタンパク質担体に連結することによって、非特異的な作用機序によって生成されることが発見された。事実、ここでは、ジフテリアトキソイド結合体の作用機序は、リンパ球上のＤＴＲへの結合によって媒介される効果と連結されていない。残留しているいかなるジフテリアトキソイド結合体の毒性も回避するために、後に、ジフテリアトキソイドがＤＴ（ＣＲＭ１９７）の非毒性変異体に置換されている。担体タンパク質の使用が非特異的な作用機序に基づいているという考えは、ＣＲＭ１９７結合体ワクチンの有効性の試験がＤＴ非感受性のマウスで慣行的に行われているという事実によってさらに裏付けられている。Ｇｕｐｔａら（１９９７年、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１５巻、１３４１〜１３４３頁）は、ＣＲＭ１９７結合ワクチンの免疫原性が、ＤＴ非感受性のマウスと、ＤＴ応答性のモルモットとの間で、大きな相違を示すことがあるのを明らかにしたが、これは、ＤＴ感受性の種では、ＣＲＭ１９７結合ワクチンが、ＤＴＲ媒介性の特異的な細胞内取り込みを実際に利用していることを示すものである。
【００７９】
受容者の血清中にＤＴ（の受容体結合ドメイン）に対する中和抗体が存在する（以前にジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ＤＴ（Ｂ断片）（の部分）、又はＣＲＭ１９７のＣＲＭ１９７（の部分）（若しくはなんらかの他の非毒性ＤＴ（の部分））に曝露されたか、又はジフテリア菌に対するワクチン接種によって）場合があり、これらが、ＣＲＭ１９７（又は、ＤＴ結合ドメインに特異的に結合する任意の他の化合物）に結合されている薬物の、ＤＴＲ上における特異的な結合を阻止して、それによって、薬物送達システムの総合的な有効性を低下させることもある。そのような中和抗体は、受容者を有効かつ最小の量の遊離ＣＲＭ１９７、又は中和抗体上のＤＴ結合ドメインに特異的に結合する任意の他の化合物（ＤＴ（Ｂ断片）（の部分）又はＣＲＭ１９７断片（の部分）、小分子、ペプチド、模倣物質、抗イディオタイプ抗体など）に曝露することによって、薬物送達システムを適用する前に不活性化することが好ましい。
【００８０】
さらに、脳血液関門を構成する細胞で、ＤＴＲの遺伝子又はジフテリア毒素受容体（別名、へパリン結合性上皮成長因子様成長因子）の発現が、ＬＰＳによって改変されていたという驚くべき発見は、脳血液関門の機能性を改変又はモニターする新たな機会を提供するものである。加えて、ＤＴＲ遺伝子産物（すなわち、ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子）の生物活性に変化を与えるいかなる薬剤も、本発明の実施形態において、血液脳関門の透過性を特異的に変調するのに有用である。ジフテリア毒素受容体（ヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子）活性の低減は、ＤＴＲ遺伝子のアンチセンス抑制によって、或いはヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子のアンタゴニスト又はＤＴＲタンパク質に対する抗体によって行うのが好都合であろう。一方、ジフテリア毒素受容体（ヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子）活性の増強は、細胞内にＤＴＲ遺伝子を導入することによって、或いは、内皮細胞を外来性のヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子に曝露することによって行うのが好都合であろう。加えて、英国、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ社によって、組換型ヒトＨＢ−ＥＧＦ、及びＨＢ−ＥＧＦに対する有用な抗体が販売されており、これらを診断用又は治療用に用いることもできる。本発明の実施形態では、この遺伝子の発現の変化を、血管透過性状態の診断用に用いることもできる。この目的には、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に相補的な核酸、及びＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体の両方が適用できる。
【００８１】
本発明の実施形態において、脳血液関門の透過性を特異的に検査するために、実験の容易さと、適切な動物疾患モデルの利用性とを大幅に促進させるには、ヒト様ＨＢ−ＥＧＦのトランスジェニックマウス、又はノックイン（ＫＩ）マウスを作製することが極めて好ましい。ヒト様ＨＢ−ＥＧＦのトランスジェニックマウスは、構成的に活性な（例えば、腫瘍）プロモーター、又は組織特異的プロモーター、好ましくはＧＦＡＰ及び／又はγ−ＧＴＰプロモーターの制御下でヒトＤＴＲ遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦをコードする）を導入して、この遺伝子の脳及び／又は脳血管での発現を得ることによって、遺伝子操作することができる。しかし、エキソン２及び３が、ジフテリア毒素に対する受容体結合領域のヒト配列を含有し、好ましくは、正及び負の選択マーカー配列を含有するように遺伝子操作されたＨｅｇｆ１遺伝子（マウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子をコードし、その内在性プロモーターの制御下にある）をＥＳ細胞に相同組換によって導入するのが最も好ましい。ジフテリア毒素に対する受容体結合領域のコード配列は、エキソン２の終わりと、エキソン３の始めとに見出されている。このために、ＰＡＣライブラリー、好ましくはｐＰＡＣ４ライブラリー（１２９／ＳｖｅｖＴＡＣｆＢｒ株）からマウスゲノムＤＮＡクローンを得る。ターゲッティングベクターでは、元の第２及び第３エキソンが、ジフテリア毒素に対する受容体結合領域のヒト特異的配列で、遺伝子操作によって置換されており、これによって、ジフテリア毒素応答性の受容体結合領域が生成される。イントロン２の中、又はエキソン３の下流に、ＬｏｘＰ部位によって挟まれたＰＧＫ推進性のｎｅｏカセットが存在する。胚幹細胞（１４Ｅ）の電気穿孔を行い、外部プローブを用いたサザンブロット分析によって、相同組換を行ったクローンを選択した。ジフテリア毒素に対する受容体結合領域のヒト配列の存在は、ヒト特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、好ましくはそれに続く、制限酵素による消化に加えて、エキソン２及び３の配列決定分析も行うことによって試験される。ターゲッティングされたＥＳ細胞を胚盤胞に注入して、キメラ動物を生成する。変異対立遺伝子の伝達に関して、Ｆ１アグーチ子孫の遺伝子型決定を行い、ヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＋ＮＥＯトランスジェニック系統を産生する。ヘテロ接合ヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＋ＮＥＯマウスを、ＥｌｌＡ−Ｃｒｅ系統（Ｌａｋｓｏら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３（１２）巻、５８６０〜５８６５頁）のマウスと交配させ、ＮＥＯカセットを除去する。これらの方法によって、生殖系列への伝達を獲得し、ヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＫＩトランスジェニック系統を確立する。マウスをさらに５世代、Ｃ５７ＢＩ／６Ｊと交配させる。ヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＫＩのホモ接合体と、ｗｔ同腹仔とを、その後の分析に用いる（約９７％がＣ５７Ｂｌ６Ｊバックグランド）。このようにして、多数の免疫不全マウスが、ヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＫＩマウスで、腫瘍の異種間移植体を成長させるために、本発明での使用に利用可能となる。これらのマウスには、ヌードマウス、ｓｃｉｄマウス、並びに、ｒａｇ−１及びｒａｇ−２遺伝子を欠失したマウスが含まれるが、これらに限定されない。特定の遺伝子座の突然変異の結果として、様々なタイプの免疫不全となっている他の動物に関しては、ウェブサイトｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｔｃｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕで見ることができる。これらのマウスを、前述のヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＫＩマウスと交配させて、免疫機能を欠損しており、かつヒト様ＨＢ−ＥＧＦを発現する子孫を産生する。さらに、ＣＲＭ１９７のような、外来性の担体タンパク質に対する免疫原性反応（例えば、中和抗体もたらす反応）を行わないマウスも、これらのマウスの中にいると予測される。さらに、前述のヒト様ＨＢ−ＥＧＦ  ＫＩマウス（元のマウス及び／又は免疫不全マウス）を、当技術分野で、疾患モデルとして有用であると記載されているトランスジェニック／ＫＩマウスの任意のノックアウト動物と交配させて、疾患表現型と、ＣＲＭ１９７のような外来性の担体タンパク質に対して応答性との両方を有する子孫を産生する。同様にして、トランスジェニックラット及びブタも産生することができる。
【００８２】
配列同一性
本明細書では、「配列同一性」を、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列、又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列相互における、それらの配列を比較することによって決定される関連性（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）として定義する。また、当技術分野において、「同一性」は、場合によっては、そのような配列のストリング相互の一致率によって決定される、アミノ酸又は核酸配列相互の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列相互の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定されるものではないが、「コンピューター分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；「バイオコンピューティング：情報学及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；「配列データのコンピューター解析、第一部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ）」、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；「分子生物学における配列決定分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年；及び「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、第４８巻、１０７３頁（１９８８年）に記載のものを含めた公知の方法によって容易に計算することができる。
【００８３】
同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列相互の一致率が最も大きくなるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムにコードされている。２つの配列相互の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２（１）巻、３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ、第２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０年））が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から一般に利用可能である（「ＢＬＡＳＴマニュアル」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．、ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＢ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０年））。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性の決定に用いることができる。
【００８４】
ポリペプチド配列の比較に好ましいパラメータには、以下のものが含まれる。すなわち、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３〜４５３（１９７０年）；比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年）のＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；及びギャップ長ペナルティ：４。これらのパラメータを用いた有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐによる「Ｏｇａｐ」プログラムとして、一般に利用可能である。前述のパラメータは、アミノ酸比較用のデフォルトパラメータである（エンドギャップ（ｅｎｄ  ｇａｐ）に対するペナルティがないことも併せて）。
【００８５】
核酸比較用の好ましいパラメータには以下のものが含まれる。すなわち、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３〜４５３（１９７０年）；比較マトリックス：一致＝＋１０、不一致＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３。核酸比較用のデフォルトパラメータは、上述のＭａｄｉｓｏｎ，ＷＩ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐによる「Ｏｇａｐ」プログラムとして利用可能である。
【００８６】
アミノ酸類似性の程度を決定する際、当業者は、任意選択で、当業者には明白であろう、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオニンであり；アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；そして、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示するアミノ酸配列の置換性変種は、開示された配列中で、少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なった残基が挿入されているものである。アミノ酸変化は、保存的なものが好ましい。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は以下の通りである。すなわち、Ａｌａからｓｅｒ；Ｍｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｉｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｕからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ，ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕである。
【００８７】
ポリペプチドを組換え生成するための組換え技法及び方法
本発明での使用に供するポリペプチドは、組換え技法を用いて調製することができ、そのような組換え技法では、注目しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適当な宿主細胞で発現される。したがって、本発明は、上記に定義した核酸分子又はヌクレオチド配列を含むベクターの使用にも関する。ベクターは、そのベクターに適した宿主でのベクターの増殖を確実にする複製開始点（又は自己複製配列）を含む複製ベクターである。別法として、ベクターは、例えば相同組換などを介して、宿主細胞ゲノム中に挿入することが可能なものである。特に好ましいベクターは、その中で、上記に定義したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、そのベクターの宿主細胞における、コード配列の発現を指示できるプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクターである。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、１つ又は複数の遺伝子の転写を制御するのに機能し、転写方向との関係において、その遺伝子の転写開始部位の上流にあり、かつ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と、転写開始部位と、限定されるものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、並びに、そのプロモーターからの転写量の調節に直接又は間接的に作用することが当業者に公知である他のいかなるヌクレオチド配列も含めたなんらかの他のＤＮＡ配列との存在によって構造的に特定される核酸断片を指す。「構成的」なプロモーターは、ほとんどの生理条件及び発生状態下で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、生理条件又は発生状態に応じて調節されるプロモーターである。「組織特異的」なプロモーターは、特定のタイプの分化細胞／組織のみで活性である。
【００８９】
発現ベクターによって、上記に定義したＬＰＳＳポリペプチドを、組換え技法を用いて調製することが可能となるが、この技法では、注目しているＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適当な細胞、例えば、培養細胞又は多細胞生物の細胞で発現する。組換え技法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）、並びに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１、同上）などに記載されており、これらの両方を全体として、参照により本明細書に組み込む。また、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、第８２巻、４８８頁（部位特異的突然変異について記載する）、及び、Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３２８巻、７３１〜７３４頁、又はＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９８５年）、Ｇｅｎｅ、第３４巻、３１５頁（カセット突然変異生成について記載する）も参照されたい。
【００９０】
通常、所望のポリペプチドをコードする核酸が発現ベクターで用いられる。「発現ベクター」という句は、そのような配列と適合性を有する宿主で、遺伝子の発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を全般的に指す。これらの発現ベクターには、通常、少なくとも、適当なプロモーター配列が含まれ、さらに、任意選択で、転写終結シグナルが含まれる。本明細書に記載した、発現に影響を与えるのに必要、又は有用である追加因子も用いることができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養に導入でき、かつその中で発現できるＤＮＡ構築物に組み入れる。詳細には、ＤＮＡ構築物は、細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞宿主での複製に適したものであるか、又は、例えば、哺乳類、植物、昆虫、例えばＳｆ９、酵母、真菌、若しくは他の真核生物の培養細胞系に導入できるものである。
【００９１】
特定の宿主への導入用に調製されたＤＮＡ構築物は、通常、その宿主によって認識される複製系と、所望のポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ断片と、ポリペプチドをコードするセグメントに作用可能に連結した転写及び翻訳の開始及び終止調節配列とを含む。ＤＮＡセグメントは、それが別のＤＮＡセグメントと機能的に関係するように配置されているときに、「作用可能に連結」されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列に作用可能に連結されているのは、それが、その配列の転写を刺激する場合である。シグナル配列のＤＮＡが、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作用可能に連結されているのは、それが、ポリペプチドの分泌に関与するプレプロタンパク質として発現される場合である。通常、作用可能に連結されているＤＮＡ配列は、相互に連続しており、シグナル配列の場合には、相互に連続的であり、かつリーディイングフェイズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にある。しかし、エンハンサーは、それらが転写を制御するコード配列と連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位か、又は、その代わりに挿入されたアダプター若しくはリンカーにおけるライゲーションによって行われる。
【００９２】
通常、適当なプロモーター配列の選択は、そのＤＮＡセグメントの発現用に選択された宿主細胞に依存する。適当なプロモーター配列の例には、当技術分野で周知の原核細胞プロモーター、及び真核細胞プロモーターが含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、同上を参照）。転写制御配列には、通常、宿主によって認識される異種のエンハンサー又はプロモーターが含まれる。適当なプロモーターの選択は宿主によるが、ｔｒｐ、ｌａｃ、及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、並びに解糖酵素プロモーターなどのプロモーターは、公知かつ利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、同上を参照）。発現ベクターは、複製系、並びに転写及び翻訳の調節配列を、利用するポリペプチドをコードするセグメントのための挿入部位と共に含む。細胞系と発現ベクターとの、機能しうる組合せの例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年、同上）、並びにＭｅｔｚｇｅｒら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、３１〜３６頁に記載されている。例えば、適当な発現ベクターは、酵母、例えば分裂酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、及び細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））で発現することができる。したがって、宿主細胞は、原核細胞宿主細胞でも、真核宿主細胞でもよい。宿主細胞は、液体中での培養に適した宿主細胞でも、固形培地上での培養に適したものでもよい。宿主細胞は、上記に定義したＬＰＳＳポリペプチドを産生する方法に用いられる。この方法は、このポリペプチドの発現に有用な条件下で宿主細胞を培養するステップを含む。場合によっては、この方法は、このポリペプチドの回収を含むことがある。このポリペプチドは、様々なクロマトグラフィー法を含めた、当技術分野においてそれ自体で公知の標準的なタンパク質精製技法によって、例えば、培養液から回収することができる。
【００９３】
別法では、宿主細胞は、トランスジェニック植物又は動物（好ましくは非ヒト動物）などの多細胞生物の一部をなす細胞である。トランスジェニック植物は、その細胞の少なくとも一部に、上記に定義したベクターを含む。トランスジェニック植物を産生する方法は、例えば、米国特許第６，３５９，１９６号及びそれに引用されている参考文献に記載されている。そのようなトランスジェニック植物は、上記に定義したＬＰＳＳポリペプチドを生成する方法であって、その細胞に上記ベクターを含むトランスジェニック植物の部分、又はそのようなトランスジェニック植物の子孫の部分を回収するステップを含み、上記植物部分が上記ポリペプチドを含有し、さらに、任意選択で上記植物部分からポリペプチドを回収する方法に使用できる。そのような方法は、米国特許６，３５９，１９６号及びそれに引用されている参考文献に記載されている。同様に、トランスジェニック動物は、その体細胞及び生殖細胞内に上記に定義したベクターを含む。トランスジェニック動物は、非ヒト動物であることが好ましい。トランスジェニック動物を産生する方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０１／５７０７９号、及びそれに引用されている参考文献に記載されている。そのようなトランスジェニック動物は、上記に定義したＬＰＳＳポリペプチドを生成する方法であって、上記ベクターを含むトランスジェニック動物、又はその、メスの子孫からの体液を回収するステップを含み、上記体液が上記ポリペプチドを含有し、任意選択で、上記体液から上記ポリペプチドを回収する方法に使用できる。そのような方法は、国際公開第ＷＯ０１／５７０７９号、及びそれに引用されている参考文献に記載されている。上記ポリペプチドを含有する体液は、血液であることが好ましく、又は乳であることがより好ましい。
【００９４】
ポリペプチドを調製する別の方法に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳システムを利用するものがある。ポリペプチドをコードするＤＮＡを、上述の通り、発現ベクターにクローニングする。その後、発現ベクターを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、翻訳する。翻訳産物を、直接用いることもできるが、最初に、精製することもできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で生じるポリペプチドは、継承したミクロソームの存在によってある程度の翻訳後修飾が起こる場合もあるが、通常は、ｉｎ  ｖｉｖｏ合成されたポリペプチドに存在する翻訳後修飾を含有しない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によってポリペプチドを合成する方法は、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、「分子クローニング技法への案内（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９８７年に記載されている。
【００９５】
遺伝子療法
本発明のいくつかの態様は、上記に定義したヌクレオチド配列を含む、遺伝子療法に適した発現ベクターの使用に関する。遺伝子療法に適したベクターは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻、２５〜３０頁；Ｗａｌｔｈｅｒ及びＳｔｅｉｎ、２０００年、Ｄｒｕｇ、第６０巻、２４９〜７１頁；Ｋａｙら、２００１年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第７巻、３３〜４０頁；Ｒｕｓｓｅｌｌ、２０００年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第８１巻、２５７３〜６０４頁；Ａｍａｄｏ及びＣｈｅｎ、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８５巻、６７４〜６頁；Ｆｅｄｅｒｉｃｏ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１０巻、４４８〜５３頁；Ｖｉｇｎａ及びＮａｌｄｉｎｉ、２０００年、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、第２巻、３０８〜１６頁；Ｍａｒｉｎら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、第３巻、３９６〜４０３頁；Ｐｅｎｇ及びＲｕｓｓｅｌｌ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１０  巻、４５４〜７頁；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ、１９９９年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第８０巻、３０４９〜６４頁；Ｒｅｉｓｅｒ、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻、第９１０〜３頁；及びこれらに引用されている参考文献に記載されている。
【００９６】
特に適した遺伝子療法ベクターには、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる。これらのベクターは、広範な分裂性及び非分裂性の細胞型に感染する。さらにアデノウイルスベクターは、高レベルの導入遺伝子発現が可能である。しかし、アデノウイルスベクター及びＡＡＶベクターは、細胞侵入後にエピソームとして存在するため、これらのウイルスベクターは、上述の通り、導入遺伝子の一過性発現のみが必要な治療応用に最も適している（Ｒｕｓｓｅｌｌ、２０００年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第８１巻、２５７３〜２６０４頁）。好ましいアデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００年、同上）によって概説されているように、宿主反応が低下するように改変されているものである。
【００９７】
通常、遺伝子療法ベクターは、発現されるＬＰＳＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むという意味で、上述した発現ベクターと同様であり、上記ヌクレオチド配列が、上述の通り、適当な調節配列に作用可能に連結されているだろう。そのような調節配列は、少なくともプロモーター配列を含むだろう。上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、遺伝子療法ベクターから発現させるのに適したプロモーターには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の中初期プロモーター（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来、ラウス肉腫ウイルス由来、又はＨＴＬＶ−１由来のものなどのウイルス性末端反復配列プロモーター（ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。
【００９８】
いくつかの誘導プロモーター系は、小さい有機又は無機の化合物を投与することによって誘導できると記載されている。そのような誘導プロモーターには、メタロチオネインプロモーターなど、重金属によって（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ、第２９６巻、３９〜４２頁；Ｍａｙｏら、１９８２年、Ｃｅｌｌ、第２９巻、９９〜１０８頁）、Ｒｕ−４８６（プロゲステロンアンタゴニスト）によって（Ｗａｎｇら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、８１８０〜８１８４頁）、ステロイドによって（Ｍａｄｅｒ及びＷｈｉｔｅ、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、５６０３〜５６０７頁）、テトラサイクリンによって（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、５５４７〜５５５１頁；米国特許第５，４６４，７５８号；Ｆｕｒｔｈら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、９３０２〜９３０６頁；Ｈｏｗｅら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７０巻、１４１６８〜１４１７４頁；Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、第１４巻、１６６９〜１６７９頁；Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９２巻、６５２２〜６５２６頁）、並びに、ｔｅｔＲポリペプチド、ＶＰ１６の活性化ドメイン、及びエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインで構成される多キメラトランス活性化因子に基づくｔＴＡＥＲシステムによって（Ｙｅｅら、２００２年、米国特許第６，４３２，７０５号）制御されるものが含まれる。
【００９９】
これらの遺伝子療法ベクターは、任意選択で、第２のタンパク質、又はさらに別のタンパク質をコードする、第２のヌクレオチド配列、又は、１つ若しくは複数のさらに別のヌクレオチド配列を含んでもよい。第２のタンパク質、又はさらに別のタンパク質は、その発現構築物を含有する細胞の同定、選択、及び／又はスクリーニングを可能にする（選別可能な）マーカータンパク質でもよい。この目的に適したマーカータンパク質には、例えば、蛍光タンパク質のＧＦＰ、並びに、選別可能なマーカー遺伝子のＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地上での選別用）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢによる選別用）、Ｔｎ５アミノグルコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８による選別用）、及び、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキセートによる選別用）、並びに、低親和性神経成長因子遺伝子のＣＤ２０がある。これらのマーカー遺伝子を入手するための供給源、及びそれらの使用方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ（２００１年）、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ）」（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供されている。
【０１００】
別法として、第２のヌクレオチド配列、又はさらに別のヌクレオチド配列は、必要と思われる場合に、対象を、トランスジェニック細胞から治癒できるようにするフェイルセイフ機構を提供するタンパク質をコードするものでもよい。そのようなヌクレオチド配列は、しばしば自殺遺伝子と呼ばれるが、プロドラッグを、そのタンパク質が発現するトランスジェニック細胞を殺すことができる有害物質に変換できるタンパク質をコードする。そのような自殺遺伝子に適したものの例には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子、又は、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の１つが含まれるが、どちらの場合でも、対象のＩＬ−１０トランスジェニック細胞を殺すプロドラッグとして、ガンシクロビルを用いることができる（例えば、Ｃｌａｉｒら、１９８７年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第３１巻、８４４〜８４９頁）。
【０１０１】
遺伝子療法ベクターは、以下に定義する適当な薬学的担体を含む医薬組成物に処方することが好ましい。
【０１０２】
抗体
本発明のいくつかの態様は、上記に定義した本発明のＬＰＳＳポリペプチドに特異的に結合する抗体、又は抗体断片の使用に関する。所与のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片を生成する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、並びに、国際公開第ＷＯ９１／１９８１８号；国際公開第ＷＯ９１／１８９８９号；国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号；国際公開第ＷＯ９２／０６２０４号；国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号；及び米国特許第６，４２０，１１３号、並びにこれらに引用されている参考文献に記載されている。本明細書で使用する場合、「特異的な結合」という用語には、低親和性及び高親和性の両方の特異的な結合が含まれる。特異的な結合を示すことができるものには、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性の抗体又は抗体断片がある。特異的な結合は、抗体又は抗体断片、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、又は少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有する抗体又は抗体断片も示すことができ、或いは、少なくとも約１０−１１Ｍ又は１０−１２ＭのＫｄを有する場合もある。
【０１０３】
ペプチド模倣物質
ＬＰＳＳポリペプチド又はＬＰＳＳポリペプチド受容体に特異的に結合するペプチド様分子（ペプチド模倣物質と呼ばれる）又は非ペプチド分子、及び、本明細書に定義した本発明の方法のいずれかに適用できるペプチド模倣物質又は非ペプチド分子も、例えば、本明細書に参照により組み込まれている米国特許第６，１８０，０８４号に詳細に記載されている、当技術分野においてそれ自体で公知の方法を用いることによって同定することができる。そのような方法には、例えばペプチド模倣物質、ペプチド、ＤＮＡ、又はｃＤＮＡの発現ライブラリー、コンビナトリアル化学ライブラリー、及び、特に有用である、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。これらのライブラリーは、ＬＰＳＳポリペプチド又はその受容体のアゴニスト及びアンタゴニストを得るために、これらのライブラリーを、実質的に精製されたＬＰＳＳポリペプチド、ＬＰＳＳポリペプチド受容体、その断片、又はその構造類似体に接触させることによって、スクリーニングすることができる。
【０１０４】
医薬組成物
本発明は、さらに、上記に定義したＬＰＳＳポリペプチド、抗体、又は遺伝子療法ベクターを、活性成分として含む医薬製剤にも関する。この組成物は、活性成分に加えて、少なくとも薬学的に許容される担体を含むことが好ましい。
【０１０５】
一部の方法では、哺乳類、昆虫、若しくは微生物の細胞培養、トランスジェニック哺乳動物の乳、又は他の供給源から精製された、本発明のポリペプチド又は抗体を、精製された形態で、薬学的担体と共に医薬組成物として投与する。ポリペプチドを含む医薬組成物を生成する方法は、米国特許第５，７８９，５４３号及び第６，２０７，７１８号に記載されている。好ましい形態は、目的とする投与及び治療応用の方法に依存する。
【０１０６】
薬学的担体は、ポリペプチド、抗体、又は遺伝子療法ベクターを患者に送達するのに適したいかなる適合性の非毒性物質でもよい。滅菌水、アルコール、油脂、ワックス、及び不活性固体を、担体として用いることもできる。薬学的に許容される補助剤、緩衝剤、分散剤、及び同様のものを、医薬組成物に組み込むこともできる。
【０１０７】
医薬組成物における、本発明のＬＰＳＳポリペプチド又は抗体の濃度は、広範に、すなわち、約０．１重量％未満から、通常は、少なくとも約１重量％であり、最大２０重量％又はそれより多い量まで変動しうるものである。
【０１０８】
経口投与用には、カプセル剤、錠剤、及び粉末薬などの固体剤形、又は、エリキシール、シロップ、及び懸濁液などの液体剤形で活性成分を投与することができる。活性成分は、グルコース、ラクトース、蔗糖、マンニトール、デンプン、セルロース、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムサッカリン、滑石、炭酸マグネシウム、及び同様のものなどの不活性成分及び粉末担体と共にゼラチンカプセル中に封入することができる。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散性、及び他の望ましい特性を提供するために添加することができる追加の不活性成分の例には、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン粉末、食用白インク、及び同様のものがある。圧縮錠剤を製剤するためには、同様の希釈剤を用いることができる。錠剤及びカプセル剤は、両方とも徐放性製剤として製造することができ、それによって何時間にも及ぶ薬物の持続放出を提供することができる。圧縮錠剤は、なんらかの不快な味を遮蔽し、また、大気から錠剤を保護する目的で、糖コーティング又はフィルムコーティングすることができ、或いは、胃腸管での選択的な崩壊を目的として、腸溶コーティングすることもできる。経口投与用の液体剤形は、患者の受容性を増大させつために、着色及び風味を含有することができる。
【０１０９】
ＬＰＳＳポリペプチド、抗体、又は遺伝子療法ベクターは、非経口投与するのが好ましい。非経口投与用の製剤に用いるポリペプチド、抗体、又はベクターは、無菌でなければならない。滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後で、無菌濾過膜を通して濾過することによって容易に実現される。ＬＰＳＳポリペプチド、抗体、又はベクターを投与する非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、頭蓋内、鞘内、経皮、鼻腔、口腔、直腸、又は膣経路による注射又は注入に一致したものである。ポリペプチド、抗体、又はベクターの投与は、注入又はボーラス注入によって継続的に行う。静脈注入用の典型的な組成物は、任意選択で２０％アルブミン溶液を補充した、無菌の０．９％  ＮａＣｌ又は５％グルコース１０〜５０ｍｌと、ＬＰＳＳポリペプチド、抗体、又はベクター１〜５０μｇとを含有するように調製できよう。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば、無菌緩衝液１〜１０ｍｌと、本発明のＬＰＳＳポリペプチド、抗体、又はベクター１〜１００μｇとを含有するように調製されよう。非経口投与できる組成物を調製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、１９８０年）（あらゆる目的に、参照により全体として組み込む）を含めた様々な情報源で、より詳細に記載されている。
【０１１０】
治療応用には、この医薬組成物を、毛細血管透過性障害を患う患者に、症状の重度を低下させるのに、かつ／又は、症状がさらに進行するのを予防又は停止するのに十分な量投与する。これを達成するのに適した量を、「治療有効量」又は「予防有効量」と定義する。そのような有効用量は、状態の重度と、患者の全般的な健康状態とに依存するだろう。通常、治療有効量又は予防有効量は、毛細血管の透過性を、正常で、病気のない健康な個体に見られる平均レベルにまで回復させる用量であることが好ましい。
【０１１１】
この方法では、通常、ＬＰＳＳポリペプチド又は抗体を、約１μｇ／ｋｇ患者体重の用量で、１週間に１回又はそれより多く、患者に投与する。１週間あたりの用量が１０μｇ／ｋｇを超えることも頻繁にある。投与計画は、１週間あたり１０μｇ／ｋｇから、１週間あたり少なくとも１ｍｇ／ｋｇまでの範囲に及ぶことがある。通常、投与計画は、１週間あたり１０μｇ／ｋｇ、１週間あたり２０μｇ／ｋｇ、１週間あたり３０μｇ／ｋｇ、１週間あたり４０μｇ／ｋｇ、１週間あたり６０μｇ／ｋｇ、１週間あたり８０μｇ／ｋｇ、及び１週間あたり１２０μｇ／ｋｇである。好ましい投与計画では、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、又は４０μｇ／ｋｇを、１週間あたり１回、２回、又は３回投与する。治療は、非経口経路で投与することが好ましい。
【０１１２】
マイクロアレイ
本発明の別の態様は、上記に定義した核酸、ポリペプチド、又は抗体を含むマイクロアレイ（又は、他の高スループットスクリーニング装置）に関する。マイクロアレイは、核酸、アミノ酸配列、又はこれらの混合物を分析するために、１つ又は複数の固定された核酸又はポリペプチドの断片を含有する固形担体又は担体である（例えば、国際公開第ＷＯ９７／２７３１７号、国際公開第ＷＯ９７／２２７２０号、国際公開第ＷＯ９７／４３４５０号、欧州特許第０７９９８９７号、欧州特許第０７８５２８０号、国際公開第ＷＯ９７／３１２５６号、国際公開第ＷＯ９７／２７３１７号、国際公開第ＷＯ９８／０８０８３号、並びに、Ｚｈｕ及びＳｎｙｄｅｒ、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、第５巻、４０〜４５頁）。核酸を含むマイクロアレイは、例えば、上述した遺伝子型又は発現パターンを分析する方法で適用できる。ポリペプチドを含むマイクロアレイは、それらのポリペプチドと相互作用する基質、リガンド、又は他の分子の適当な候補を検出するのに用いることができる。抗体を含むマイクロアレイは、上述したポリペプチドの発現パターンを分析する方法で使用できる。
【実施例】
【０１１３】
１．方法及び物質
１．１．細胞培養
１．１．１．ウシ脳毛細血管の単離
脳毛細血管は、屠殺場で、新たに殺された動物から得たウシ（コウシ）の脳から単離した。脳は、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＬＰＳＳ、１．１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）に入れて、実験室まで輸送した。髄膜及び白質を除去し、灰白質を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化した（５６℃、３０分）牛胎児血清（ＤＭＥＭ＋Ｓ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に収集した。ＤＭＥＭには、高濃度のＤ−グルコース（４．５ｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ３（３．７ｇ／ｌ）、及びＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）を配合し、追加してＭＥＭ非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、硫酸ストレプトマイシン（０．１ｇ／ｌ）、及びペニシリンＧナトリウム（１０００００ｕ／Ｉ）を含有させた。血管断片をウィートンホモジナイザを用いて、手操作の均質化によって調製し、続いて、１５０μｍのナイロンメッシュ上に捕捉した。この血管を、コラゲナーゼＣＬＳ３（２１０Ｕ／ｍｌ）、トリプシンＴＲＬ（９１Ｕ／ｍｌ）、及びＤＮＡｓｅ  Ｉ（１７０Ｕ／ｍｌ、最終濃度）を含むＤＭＥＭ＋Ｓ中、３７℃で、１時間消化し、続いて、２００μｍのナイロンメッシュを通して濾過した。脳毛細血管画分は、凍結混和液（１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む牛胎児血清（ＦＣＳ））中に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１１４】
１．１．２．星状細胞の単離
星状細胞は、ウィスター系ラットの新生仔（Ｈａｒｌａｎ  Ｂ．Ｖ．社、Ｚｅｉｓｔ、オランダ）から単離した。単離された皮質を断片化し、０．０１６％（ｗ／ｖ）トリプシンＥＤＴＡ（最終濃度）を含むＤＭＥＭ（ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）で完全に緩衝させ、ＮａＨＣＯ３は含んでいない）中、３７℃で、水浴中に振盪させながら（８０ｒｐｍ、３０分間）インキュベートした。この懸濁液を、１２０及び４５μｍのナイロンメッシュを通してそれぞれ濾過した。この細胞懸濁液を、３日間、加湿インキュベーター（Ｎａｐｃｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｔｕａｌａｔｉｎ、ＯＲ、米国）内で、１０％ＣＯ２を含む混合空気中、３７℃で、２５０ｍｌのプラスチック組織培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂ．Ｖ．社、Ａｌｐｈｅｎ  ａ／ｄ  Ｒｉｊｎ、オランダ）中のＤＭＥＭ＋Ｓで培養した。その後、培地は、一日おきに新しくした。７日間の培養の後、振盪している（８０ｒｐｍ）浴槽中で、培養を室温で終夜、振盪することによって、星状細胞以外の細胞を除去した。２日後に、培養物を、０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡを用いて、１：３の分割比で、ポリ−Ｄ−リシンコーティングされたフラスコ（１０μｇ／ｍｌ  ポリ−Ｄ−リシン溶液を終夜、撹拌し、空気乾燥させ、ＬＰＳＳ（３回）で洗浄した）中に継代させた。集密状態になったときに、星状細胞培養上清を、一日おきに、２〜４週間収集し、無菌濾過し、−２０℃で保存した。共生培養を行うために、２週間目の培養を継代させ、液体窒素中の凍結混和液中に保存した。
【０１１５】
１．１．３．脳毛細血管の示差的播種及びＢＣＥＣの培養
コラーゲンコーティング（ヒト胎盤タイプＩＶ、１０μｇ／ｍｌを含む０．１％（ｖ／ｖ）酢酸溶液中に２時間、そして、ＬＰＳＳで３回洗浄）及びヒト血漿フィブロネクチンコーティング（１０μｇ／ｍｌを含むＬＰＳＳ溶液、３０分間）された２５０ｍｌのプラスチック組織培養フラスコ中に、脳毛細血管を播種し、インキュベーター中に、４時間置いて、血管を付着させた。その後、培養液を増殖培地（５０％（ｖ／ｖ）星状細胞培養上清を含み、１２５μｇ／ｍｌヘパリンが補充されているＤＭＥＭ＋Ｓ）に置換し、増殖中の細胞、主としてＢＣＥＣ、及びいくらかの周皮細胞を、１０％  ＣＯ２、３７℃で、培養した。
【０１１６】
１．１．４．フィルター上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢの調製
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルは、コラーゲンコーティングされた（上記参照）トランスウェル（登録商標）ポリカーボネートフィルター（表面積；０．３３ｃｍ２、孔径：０．４μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）上で調製した。約７０％集密の状態のとき（脳毛細血管の播種後の４又は５日目）に、内皮細胞用のトリプシン−ＥＤＴＡ（１ｍｌあたり、ブタトリプシン５００  ＢＡＥＥ単位、及びＥＤＴＡ  １８０μｇ）で約１分間処置し、周皮細胞の大部分を、基質に接着した状態に残して、ＢＣＥＣを継代させた。ＢＣＥＣと星状細胞との共培養は、フィルターの底面に１フィルターあたり４５０００星状細胞の密度で播種した星状細胞を用いて調製した。星状細胞は、ＢＣＥＣを継代させる２又は３日前に、８分間置いて、フィルターの底面に付着させた。ＢＣＥＣは、１フィルターあたりの３００００ＢＣＥＣの密度で播種した。ＢＣＥＣ＋星状細胞共培養を、最初の２日間は、１２５μｇ／ｍｌ  ヘパリンを補充したＤＭＥＭ＋Ｓ中で、そして、後の２日間は、ＤＭＥＭ＋Ｓ中で、緊密な単層培養になるまで培養した。ＢＣＥＣ単層培養は、それに従って培養したが、培養液には５０％（ｖ／ｖ）の星状細胞培養上清を添加した。
【０１１７】
１．２．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）による遺伝子発現解析
１．２．１．総ＲＮＡの単離
ＢＣＥＣ＋星状細胞共培養の場合には、ＢＣＥＣのＲＮＡを単離する前に、トランスウェル（登録商標）フィルターの側底面をこすり落とすことによって星状細胞を除去した。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いてＢＣＥＣ（＜５％の周皮細胞を含む（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上））から単離した。これのために、細胞培地を除去し、トランスウェル（登録商標）フィルターあたりの４０μｌの溶解緩衝液で置換した。その後、溶解物を再懸濁して、複数（１２〜１８）のトランスウェル（登録商標）フィルターから収集した。この際、製造会社が推奨する、動物細胞から総ＲＮＡを単離する操作手順に従った。細胞溶解液を均質化するのには、ＱｌＡｓｈｒｅｄｄｅｒを用いた。必要な場合には、酢酸ナトリウム及びエタノールを用いて総ＲＮＡを濃縮した。
【０１１８】
１．２．２．標識ＲＮＡの調製
総ＲＮＡから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）遺伝子発現解析用の、ビオチン化されたｃＲＮＡを調製するための以下のプロトコールは、「アフィメトリクスＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ）」（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）に記載されている製造会社の推奨に従って行った。簡潔には、１試料あたりの６〜１６μｇの総ＲＮＡを用い、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｃｈｏｉｃｅシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、米国）を使用して二本鎖ｃＤＮＡを合成した。第１鎖合成には、Ｔ７−ｄＴ２４プライマー、及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）を用いた。第２鎖合成には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）を用いた。その後、二本鎖ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出（フェーズロックゲル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を使用した）を用いて精製し、それに続いて、酢酸アンモニウム及びエタノールによる沈殿を行った。ビオチン化ｃＲＮＡは、ＢｉｏＡｒｒａｙ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ（商標）ＲＮＡ転写物標識キット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ、米国）を用いて、３７℃で５時間インキュベーションすることによって、ｃＤＮＡからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写で合成した。標識されたｃＲＮＡは、その後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）のＲＮＡクリーンアッププロトコールを用いて精製した。その後、標識されたｃＲＮＡ１５〜２０μｇを、断片化緩衝液（４０ｍＭ  トリス酢酸（ｐＨ８．１）、１２５ｍＭ  ＫＯＡｃ、３０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ）中で、９４℃に、３５分間、加熱することによって断片化した。
【０１１９】
１．２．３．ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ハイブリダイゼーション
標識された、かつ断片化されたｃＲＮＡは、製造会社が推薦する条件下で、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２及びＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）にハイブリッド形成させた。ｃＲＮＡは、調製物の質を確認するために、最初にＴｅｓｔ２Ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）にハイブリッド形成させた。手短かに言うと、ｃＲＮＡを、ハイブリダイゼーション混和液（１ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液、１００μｇ／ｍｌニシン精液、アセチル化ＢＳＡ  ５０μｇ／ｍｌ、対照オリゴヌクレオチドＢ２、及び真核細胞ハイブリダイゼーション対照）に希釈し、変性させ、その後、４５℃、６０ｒｐｍで、１６時間、ハイブリッド形成させた。ハイブリダイゼーションの後、アレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）液体ステーション４００を用いて、ストレプトアビジンフィコエリトリンで染色した。アレイ上の蛍光シグナルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）スキャナーを用いて測定した。
実施例１
【０１２０】
ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養において、並びに両者の間で示差的に発現する「リポ多糖感応性」遺伝子の同定
以前の実験（参考文献として含まれている、Ｇａｉｌｌａｒｄ（２０００年（ａ）、同上）に詳述されている）において、発明者らは、星状細胞及び（リポ多糖（ＬＰＳ）によって模擬される）炎症過程が、発明者らのＢＢＢの動的共培養モデルで相反する効果を示すことを見出した。簡潔には、星状細胞は関門の機能性を強化し、一方、ＬＰＳはそれを低下させる。さらに、星状細胞はＬＰＳからの回復過程を引き起こすが、これは、星状細胞の物理的な存在なしには（すなわち、ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養では）、観測されなかったものである。最後に、この回復過程は、タンパク質合成に依存しており、これは、特定の遺伝子転写が必要であること示すものである。図２に、この実験手法の詳細を図式的に示す。
【０１２１】
関与しているＬＰＳＳ遺伝子と、回復過程におけるそれらの関与とを同定するために、子ウシ脳から初代単離された脳毛細血管から培養された発明者らのＢＣＥＣに、４種類の異なった細胞培養条件を用いた（詳細には、参考文献として含まれている、Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上の通り、また簡潔には、本明細書における「１．１．細胞培養」の通り）。１）５０％ＡＣＭの挿入フィルター（ｆｉｌｔｅｒ  ｉｎｓｅｒｔｓ）上のＢＣＥＣ単層培養（図１ａ：ＢＣＥＣ−ＡＣＭ）；２）５０％ＡＣＭの挿入フィルター上のＢＣＥＣ単層培養、頂上で１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（血清型０５５：Ｂ５）に２時間曝露した；３）新生ラットから初代単離された脳星状細胞が挿入フィルターの底面で培養されている挿入フィルター上のＢＣＥＣ単層培養（図１ｂ；  ＢＣＥＣ−星状細胞）；４）新生ラットから初代単離された脳星状細胞が挿入フィルターの底面で培養されている挿入フィルター上のＢＣＥＣ単層培養、頂上で１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（血清型０５５：Ｂ５）に２時間曝露した。ＬＰＳで処置されたＢＣＥＣ（条件２と４）を、未処置のＢＣＥＣ（条件１及び３）で得られた結果と比較した。
【０１２２】
ＬＰＳに２時間曝露した後で、ＢＢＢの機能性を、電流を通し、電位を測定する電極を備えた電気抵抗システム（ＥＲＳ）（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ、米国）を用いて、フィルターを通じてＴＥＥＲによって評価した。ＴＥＥＲ（Ｏｈｍ・ｃｍ２）は、読み取り画面に表示された電気抵抗から細胞のいない、コラーゲンコーティングされたフィルターの電気抵抗と、フィルター表面積に関する補正とを引くことによって計算した。底面に星状細胞がいるのみの、コラーゲンコーティングされたフィルターを通したＴＥＥＲは、ほとんどゼロであった（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上）。
【０１２３】
ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養を通した平均ＴＥＥＲは、ＬＰＳに曝露する前には２９．３＋／−２．１  Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１２）であり、ＬＰＳ曝露の２時間後には、２１．２＋／−４．２  Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１８）に低下した。結果のグラフ表示には、図３ａを参照のこと。対応のないｔ検定（ｐ＞０．０５）によれば、ＴＥＥＲのこの低下を有意なものと見なすことがことはできない。同様に、未処置のＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養と比べて、ＴＥＥＲは７２．４＋／−１４．３％（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１８）まで低下した（グラフ表示には、図３ｂを参照）
【０１２４】
ＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通した平均ＴＥＥＲは、ＬＰＳに曝露する前には１４９．８＋／−５．４  Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１８）であり、ＬＰＳ曝露の２時間後には、６５．５＋／−２．１  Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１８）に低下した。結果のグラフ表示には、図４ａを参照のこと。対応のないｔ検定（ｐ＜０．０００１）によれば、ＴＥＥＲのこの低下は、極めて有意なものと見なすことができる。同様に、未処置のＢＣＥＣ−星状細胞共培養と比べて、ＴＥＥＲは４３．７＋／−１．４％（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１８）まで低下した（グラフ表示には、図４ｂを参照）。
【０１２５】
すべての実験条件（ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養＋／−ＬＰＳ、及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養＋／−ＬＰＳ）に関して、ＲＮＡ単離、ｃＲＮＡ標識、及びハイブリッド形成プロトコールを三重に行い、また、すべての試料を、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２及びＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイの両方で分析した。得られた強度データの一次解析には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイスイート５．０と、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータマイニングツール２．０とを用いた。それ以降の分析には、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、米国）を用いた。グローバルスケーリングでは、各チップに関するデータが、ユーザが規定した標的強度に合わせた尺度とするが、これを行うことによって、実験相互の比較ができるようにした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイスイート５．０によって、すべての試料に「存在しない」と判定された遺伝子は、それ以降の分析から除外した。適用可能である場合には、「三重」の試料のすべてで「存在している」又は「わずかに存在している」と判定された遺伝子のみ、それ以降の分析に含めた。統計的に有意な相違を示して発現した遺伝子（対照ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養と、ＬＰＳで処置されたＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養との間で；対照ＢＣＥＣ−星状細胞共培養と、ＬＰＳで処置されたＢＣＥＣ−星状細胞共細胞との間で；ＬＰＳで処置されたＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養と、ＬＰＳで処置されたＢＣＥＣ−星状細胞共培養との間で）を同定するために、マン・ホイットニー検定を行った。ｐ値が＜０．０５であった場合には、その相違が統計的に有意であると見なした。さらに、ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養と、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養との間のＬＰＳ効果に関しては、平均強度値に基づいて、倍率変化を計算した（２倍以上の変化のみが、生物学的に重要であると見なした）。
【０１２６】
同定された遺伝子を、本明細書において、「リポ多糖感応性（ＬＰＳＳ）」の遺伝子と呼び、それに従って（ＬＰＳＳ０１〜ＬＰＳＳ２５）コードして、表１に提示する。配列番号、ＬＰＳ効果（示差的な発現の増減（ｄｉｆ＋又はｄｉｆ））、一般に利用可能なデータベースで参照するための受入コード（ＲｅｆＳｅｑ）、遺伝子記号、及びそのＬＰＳＳ遺伝子に関する記述（タイトル又は遺伝子名）も含まれる。同定された各ＬＰＳＳ遺伝子に関して、それに特有の結果を表２に提示する。
実施例２
【０１２７】
ＢＣＥＣ−星状細胞共培養におけるＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）の特性決定
脳血液関門におけるＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）の特性決定を行うために、子ウシ脳から初代単離した脳毛細血管から培養したＢＣＥＣを、新生ラットから初代単離された脳星状細胞が挿入フィルターの底面で培養されている挿入フィルター上の単層培養として用いた。（図１ｂ；ＢＣＥＣ−星状細胞、詳細には、参考文献として含まれている、Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上の通り、また簡潔には、本明細書における「１．１．細胞培養」の通り）。発明者らが用いたのは以下の通りである。１）フィルターの頂端側（血液）で様々な濃度（１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまで）のＤＴに曝露されたＢＣＥＣ（結果を図５に示す）；２）１と同様だが、ＤＴへの曝露が、フィルターの側底面（脳）で行われる（結果を図６に示す）；３）ＢＣＥＣがフィルターの頂端側でＤＴに曝露される前に、ＤＴの受容体結合領域に結合することによって、ＤＴＲの非競合的アンタゴニストとして作用する可溶性ＨＢ−ＥＧＦに、様々な濃度（０．１〜１０μｇ／ｍｌの）でプレインキュベート（室温１時間）されたＤＴ  １００ｎｇ／ｍｌに、曝露されたＢＣＥＣ（結果を図７に示す）；４）ＤＴに対する受容体結合領域に結合することによって、ＤＴＲの競合的アンタゴニストとして作用するＣＲＭ１９７で、５μｇ／ｍｌ、１時間前処置され、その後、１００ｎｇ／ｍｌのＤＴに曝露されたＢＣＥＣ（結果を図８に示す）。
【０１２８】
ＤＴに曝露した後、毎時間に、ＢＢＢの機能性を、電流を通し、電位を測定する電極を備えた電気抵抗システム（ＥＲＳ）（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）を用いて、フィルターを通したＴＥＥＲによって評価した。ＴＥＥＲ（Ｏｈｍ・ｃｍ２）は、読み取り画面に表示された電気抵抗から細胞のない、コラーゲンコーティングされたフィルターの電気抵抗と、フィルター表面積に関する補正とを引くことによって計算した。底面に星状細胞がいるのみの、コラーゲンコーティングされたフィルターを通したＴＥＥＲは、ほとんどゼロであった（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上）。ＴＥＥＲに対する効果を、処置された対照フィルターに対して正規化し、そのように表す。
【０１２９】
１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまでのＤＴに、頂端側で曝露された後では、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲが、濃度及び時間依存的に低下したが、終夜のインキュベーション時間では、１ｎｇ／ｍｌという低濃度でさえ有毒であった（図５）。これらの結果は、ＤＴが、ＢＣＥＣによってその頂端部位から効果的に摂取され、ＢＣＥＣ内で、毒性効果を現しうることを示すものである。
【０１３０】
２５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでのＤＴに、側底面で曝露された後では、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲが、濃度及び時間依存に低下し、等モル頂端濃度又は量のＤＴと比べた場合、これらの効果は、それらより約１時間早く起こっている（図６）。これらの結果は、頂端での曝露と比べた場合、ＤＴは、側底面の部位からの方が、より効果的にＢＣＥＣによって摂取されることを示すものである。
【０１３１】
可溶性ＨＢ−ＥＧＦでプレインキュベートされたＤＴ  １００ｎｇ／ｍｌに頂端で曝露された後のＢＣＥＣ−星状細胞共培養に対するＤＴの毒性効果は、濃度依存的に低下を示した（図７）。事実、１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴを、１０μｇ／ｍｌの可溶性ＨＢ−ＥＧＦでプレインキュベートすることによって、ＤＴによって誘発されるＢＣＥＣに対する毒性効果が、終夜の評価の後でさえ、完全に阻止されていた。これらの結果は、事前にＤＴをその可溶性受容体に特異的に結合させることによって、ＢＣＥＣにおけるＤＴ摂取が効果的に遮断され、それによって、ＤＴが、ＢＣＥＣ内で毒性効果を発揮できないようになることを示す。
【０１３２】
ＢＣＥＣがＣＲＭ１９７でプレインキュベートされた後では、１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに頂端で曝露された後の、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養に対する毒性効果が低下していた（図８）。これらの結果は、ＤＴＲにＣＲＭ１９７を事前に、特異的に結合させることによって、ＢＣＥＣにおけるＤＴ摂取が効果的に拮抗され、それによって、ＤＴがＢＣＥＣ内で毒性効果を発揮するのに利用可能なＤＴＲが低減されていることを示す。
実施例３
【０１３３】
ＢＣＥＣ−星状細胞共培養における、ＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）生物活性の変調
脳血液関門におけるＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）の生物活性の変調を行うために、子ウシ脳から初代単離した脳毛細血管から培養したＢＣＥＣを、新生ラットから初代単離された脳星状細胞が挿入フィルターの底面で培養されている挿入フィルター上の単層培養として用いた。（図１ｂ；ＢＣＥＣ−星状細胞、詳細には、参考文献として含まれている、Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上の通り、また簡潔には、本明細書における「１．１．細胞培養」の通り）。発明者らが用いたのは以下の通りである。１）ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに曝露される前に、ＤＴに対する受容体結合領域で立体配座変化を誘導することによって、ＤＴＲにおけるＤＴ結合のエンハンサーとして作用するヘパリン（１２５μｇ／ｍｌ）で、１時間前処置されたＢＣＥＣ（結果を図９に示す）；２）ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに曝露される前に、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（血清型０５５：Ｂ５）に頂端で２時間曝露され、それによって、ＤＴＲの発現レベルが増大しているＢＣＥＣ（結果を図１０に示す）；３）ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに曝露される前に、細胞外ドメイン切断の過程に関与するＭＭＰの阻害剤として作用する、１０μＭ  ＢＢ９４（バチマスタット）に頂端で１時間曝露され、それによって、細胞膜でのＤＴＲの利用性が増大しているＢＣＥＣ（結果を図１０に示す）；４）ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌのＤＴに曝露される前に行う、ＬＰＳ（２）及びＢＢ９４（３）の併用であって、それによって、ＤＴＲの細胞膜での発現レベル及び利用性の両方が増大する、ＬＰＳ（２）及びＢＢ９４（３）の併用（結果を図１０に示す）。
【０１３４】
ＤＴに曝露した後、毎時間に、ＢＢＢの機能性を、電流を通し、電位を測定する電極を備えた電気抵抗システム（ＥＲＳ）（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）を用いて、フィルターを通したＴＥＥＲによって評価した。ＴＥＥＲ（Ｏｈｍ・ｃｍ２）は、読み取り画面に表示された電気抵抗から細胞のいない、コラーゲンコーティングされたフィルターの電気抵抗と、フィルター表面積に関する補正とを引くことによって計算した。底面に星状細胞がいるのみの、コラーゲンコーティングされたフィルターを通したＴＥＥＲは、ほとんどゼロであった（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上）。ＴＥＥＲに対する効果を、処置された対照フィルターに対して正規化し、そのように表す。
【０１３５】
ＢＣＥＣをヘパリンでプレインキュベートした後では、１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに頂端で曝露された後のＢＣＥＣ−星状細胞共培養に対する毒性効果が増大しており、それによって、その効果が、未処置の対照より約１時間早く起こった（図９）。これは、１０倍高い濃度のＤＴの後に測定される毒性レベルと一致するものである。これらの結果は、ＢＣＥＣにおけるＤＴ摂取がヘパリンによって効果的に増強されることを示す。
【０１３６】
ＢＣＥＣをＬＰＳ又はＢＢ９４でプレインキュベートした後では、１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに頂端で曝露された後のＢＣＥＣ−星状細胞共培養に対する毒性効果が中程度に増加しており、それによって、その効果が、未処置の対照より早く起こった（図１０）。さらに、ＢＣＥＣをＬＰＳ及びＢＢ９４の両方とプレインキュベートした場合では、１００ｎｇ／ｍｌ  ＤＴに頂端で曝露された後のＢＣＥＣ−星状細胞共培養に対する毒性効果が増加しており、それによって、その効果が、未処置の対照や、別々に処置されたＢＣＥＣよりかなり早く起こった（図１０）。これらの結果は、ＢＣＥＣにおけるＤＴ摂取がＬＰＳ（おそらく、ＤＴＲ発現の増強によって）、及びＢＢ９４によって（おそらく細胞外ドメイン切断を抑制することによって増加するＤＴＲの利用性によって）、効果的に増強されること、そして、これらが相加効果であることを示す。
実施例４
【０１３７】
ＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）を介した脳血液関門を標的とする薬物送達；ｉｎ  ｖｉｔｒｏ摂取試験
ＬＰＳＳＩ４（ＤＴＲ）を介した脳血液関門を標的とする薬物送達の可能性を評価するために、子ウシ脳から初代単離された脳毛細血管から培養されたＢＣＥＣを、９６ウェルプレート中での単層培養として用いた（詳細には、参考文献として含まれている、Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上の通り、また簡潔には、本明細書における「１．１．細胞培養」の通り）。発明者らが用いたのは以下の通りである。１）重量／重量比１０：１で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、４０ｋＤａ酵素）に結合されているタンパク質（ＣＲＭ１９７、ＢＳＡ、及びホロトランスフェリン（ＴｒＦ））（図１１）；２）重量／重量比１０：１でＨＲＰに結合されているＣＲＭ１９７、及び、ＣＲＭ１９７の受容体結合領域に結合することによって、ＤＴＲ媒介性の摂取に対する非競合的アンタゴニストとして作用する可溶性ＨＢ−ＥＧＦ  １０μｇ／ｍｌでプレインキュベート（室温１時間）された、重量／重量比１０：１でＨＲＰに結合されているＣＲＭ１９７（図１２）；３）能動摂取測定用、３７℃及び４℃の、ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム（図１４）。４℃の方の実験では、摂取実験を開始する前に１時間、冷蔵庫でＢＣＥＣを冷やした。この特定の実験では、最後の２日間、ＢＣＥＣを、ＨＥＰＥＳで完全に緩衝されたＤＭＥＭ＋Ｓで成長させた；４）能動摂取測定用のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム、及びＨＲＰ担持ＢＳＡコートＰＥＧリポソーム；５）ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム、及び、ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームに対する受容体結合領域に結合することによって、ＤＴＲにおける競合的アンタゴニストとして作用する遊離ＣＲＭ１９７  ５０μｇ／ｍｌで１時間、前処置されたＢＣＥＣ上のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム（図１６）。
【０１３８】
タンパク質は、製造会社の使用説明に従って、ＨＲＰ結合キットによってＨＲＰに結合した（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ、米国）。さらに、結合タンパク質は、セファクリルＳ−２００ＨＲマトリックスを充填したＨｉＰｒｅｐ１６／６０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、イギリス）で精製した。
【０１３９】
リポソーム（１００ｎｍ）は、本質的に、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａら（１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１４１９巻、３５３〜３６３頁）に従って調製し、２：１の比率でＥＰＣ−３５及びコレステロールからなり、２．５％  ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ及び２．５％  ＰＥＧ２０００−マレイミド−ＰＥを含み、１リポソームあたり約３〜６０のＣＲＭ１９７タンパク質と結合している。簡潔には、有機溶剤を蒸発させた後、脂質フィルムを１μｍｏｌ  ＰＬあたり０．３ｍｇのＨＲＰを含有するＨＢＳ  ｐＨ６．５中に再懸濁し、リポソームを一連のフィルター（２００〜５０ｎｍ）を通して３〜５回押し出した。ＣＲＭ１９７は、Ｂｌｏｅｍｅｎら（１９９５年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、第３５７巻、１４０〜１４４頁）に従い、ＳＡＴＡを用いて、チオール基で修飾した。ＣＲＭ１９７及びＳＡＴＡ（モル比１：８）を、一定の振盪の下、室温で１時間インキュベートした。遊離ＳＡＴＡは、３０ｋＤａのカットオフフィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ社）上で遠心することによって除去した。ＰＥＧ２０００−マレイミド−ＰＥに結合させる直前に、４５分間、室温で、０．１Ｍ  ヒドロキシルアミン（ｐＨ７．４）とインキュベートすることによって、チオール基を活性化（脱保護）した。チオール基の量及び安定性は、  エルマン試薬を（Ｅｌｌｍａｎ、１９５９年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、第８２巻、７０〜７７頁）用いて測定した。ＨＲＰをプレロードされたリポソームは、後挿入法（ｐｏｓｔ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）法に従って、ＣＲＭ１９７結合ＰＥＧ２０００でコーティングした（Ｉｄｅｎら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１５１３（２）巻、２０７〜２１６頁）。簡潔には、２．５％  ＣＲＭ１９７結合ＰＥＧ２０００−マレイミド−ＰＥ、及び２．５％  ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥのミセルを、予め形成させたＨＲＰ担持リポソーム中に、４０℃のインキュベーション、２時間の間に移行させ、その後、セファデックスＣＬ４Ｂカラム上で分離させ、超遠心（６００００ｇ、３０分、１０℃）を用いて濃縮した。特定の実験（各実施例で指示される）では、本明細書に上述したプロトコールを行うのに、ＣＲＭ１９７をＢＳＡで置換し、これは、対照リポソームとして機能する。調製後に、リン脂質含量を、Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂａｒｒｏｗに従って測定し、タンパク質含量を、Ｂｉｏｒａｄ（登録商標）タンパク質アッセイ（ブラッドフォードの改変法）で測定した。ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームは、１リポソームあたり３．３個のタンパク質を含有し、ＢＳＡコートＰＥＧリポソームは、１リポソームあたり２６．９個のタンパク質を含有した。さらに、サイズ（ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームでは１１２ｎｍ、及びＢＳＡコートＰＥＧリポソームでは１０４ｎｍ）、及び多分散度（ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームでは０．２１、ＢＳＡコートＰＥＧリポソームでは０．０８）を、Ｍａｌｖｅｒｎ４７００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、イギリス）を用いた動的光散乱によって測定した。ゼータ電位（ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームでは−１８．６＋／−０．７、ＢＳＡコートＰＥＧリポソーム−２５．２＋／−１１．２）は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ３０００ＨＳａゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、イギリス）で測定した。
【０１４０】
結合タンパク質のＨＲＰ活性、リポソームのＨＲＰ含量、及び細胞溶解液試料中のＨＲＰ含量は、適切な検量線を備えた標準的な比色分析法を用いて検出した。細胞及びリポソームの溶解は、０．１％  デオキシコール酸Ｎａ水溶液４０μｌによって行った（冷ＰＢＳで細胞を徹底的に洗浄した後）。
【０１４１】
非結合型ＨＲＰにおける５μｇ／ｍｌに相当する濃度のＨＲＰ結合タンパク質で、ＢＣＥＣをインキュベートした後では、ＢＳＡ−ＨＲＰ及びトランスフェリン−ＨＲＰ結合体に比べて、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体がＢＣＥＣによって優先的に摂取された（図１１）。これらの結果は、４０ｋＤａの積荷に結合されたＣＲＭ１９７が、ＢＣＥＣによって特異的に摂取されたことを示す。
【０１４２】
１０μｇ／ｍｌの可溶性ＨＢ−ＥＧＦでプレインキュベートされたＢＣＥＣを、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ−結合体（非結合型ＨＲＰにおける５μｇ／ｍｌに相当する濃度）でインキュベートした後では、ＢＳＡ−ＨＲＰ結合体の特異的摂取に比べて、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体の特異的摂取が完全に阻害された（図１２）。これらの結果は、４０ｋＤａの積荷に結合されたＣＲＭ１９７が、ＤＴＲによって媒介された摂取過程を介してＢＣＥＣによって特異的に摂取されたことを示す。
【０１４３】
遊離ＨＲＰにおける５μｇ／ｍｌに相当する濃度のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームで、ＢＣＥＣをインキュベートした後では、４℃での摂取と比べた場合（図１４）、そして、とりわけ、ＨＲＰ担持ＢＳＡコートＰＥＧリポソームの摂取と比べた場合（図１５）、３７℃のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームが、ＢＣＥＣによって能動的に摂取されており、そして、５０μｇ／ｍｌの遊離ＣＲＭ１９７で１時間、前処置されたＢＣＥＣによる、ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームの摂取量に比べた場合（図１６）、ＤＴＲによって特異的に媒介されている。併せて、これらの結果は、ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームが、ＢＣＥＣ表面のＤＴＲによって能動的かつ特異的に摂取されることを示す。
実施例５
【０１４４】
ＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）を介した脳血液関門の通過先を標的とする薬物送達；ｉｎ  ｖｉｔｒｏのトランスサイトーシス試験
トランスサイトーシスによる、ＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）を介した、脳血液関門薬物の通過先を標的とする送達の可能性を評価するために、子ウシ脳から初代単離した脳毛細血管から培養したＢＣＥＣを、新生ラットから初代単離された脳星状細胞が挿入フィルターの底面で培養されている挿入フィルター上の単層培養として用いた。（図１ｂ；ＢＣＥＣ−星状細胞、詳細には、参考文献として含まれている、Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上の通り、また簡潔には、本明細書における「１．１．細胞培養」の通り）。この実施例で記載するトランスサイトーシス実験では、ＢＣＥＣ−星状細胞共培養ＢＣＥＣ−星状細胞共培養の緊密さを劇的に増加させるために（すなわち、傍細胞漏出を減少させるために）、最後の２又は３日間、細胞を、３１２．５μＭ  ８−（４−クロロフェニルチオ（ＣＰＴ））−ｃＡＭＰ、及び１７．５μＭ  ＲＯ−２０−１７２４を含むＨＥＰＥＳで完全に緩衝されているＤＭＥＭ＋Ｓ中で処置した。発明者らが用いたのは以下の通りである。１）３７℃及び４℃における、能動的かつ特異的なトランスサイトーシス測定用の、標的指向性部分として作用するＣＲＭ１９７、及び重量／重量比２：１で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、４０ｋＤａ酵素）に結合されている制御タンパク質として作用するＢＳＡ（図１３）；４℃の方の実験では、輸送実験を開始する前に１時間、冷蔵庫でフィルターを冷やし；２）特異的なトランスサイトーシス測定用のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム、及びＨＲＰ担持ＢＳＡコートＰＥＧリポソーム（図１７）。
【０１４５】
ＢＢＢの機能性を、電流を通し、電位を測定する電極を備えた電気抵抗システム（ＥＲＳ）（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）を用いて、フィルターを通したＴＥＥＲによって評価した。ＴＥＥＲ（Ｏｈｍ・ｃｍ２）は、読み取り画面に表示された電気抵抗から細胞のいない、コラーゲンコーティングされたフィルターの電気抵抗と、フィルター表面積に関する補正とを引くことによって計算した。底面に星状細胞がいるのみの、コラーゲンコーティングされたフィルター内外のＴＥＥＲは、ほとんどゼロであった（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００１年、同上）。
【０１４６】
タンパク質は、製造会社の使用説明に従って、ＨＲＰ結合キットによってＨＲＰに結合した（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、米国）。さらに、結合タンパク質は、セファクリルＳ−２００ＨＲマトリックスを充填したＨｉＰｒｅｐ１６／６０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、イギリス）で精製した。
【０１４７】
リポソーム（１００ｎｍ）は、本質的に、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａら（１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１４１９巻、３５３〜３６３頁）に従って調製し、２：１の比率でＥＰＣ−３５及びコレステロールからなり、２．５％ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ及び２．５％ＰＥＧ２０００−マレイミド−ＰＥを含み、１リポソームあたり約３〜６０のＣＲＭ１９７タンパク質と結合している。簡潔には、有機溶剤を蒸発させた後、脂質フィルムを１μｍｏｌ  ＰＬあたり０．３ｍｇのＨＲＰを含有するＨＢＳ  ｐＨ６．５中に再懸濁し、リポソームを一連のフィルター（２００〜５０ｎｍ）を通して３〜５回押し出した。ＣＲＭ１９７は、Ｂｌｏｅｍｅｎら（１９９５年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、第３５７巻、１４０〜１４４頁）に従い、ＳＡＴＡを用いて、チオール基で修飾した。ＣＲＭ１９７及びＳＡＴＡ（モル比１：８）を、一定の振盪の下、室温で１時間インキュベートした。遊離ＳＡＴＡは、３０ｋＤａのカットオフフィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ社）上で遠心することによって除去した。ＰＥＧ２０００−マレイミド−ＰＥに結合させる直前に、４５分間、室温で、０．１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７．４）とインキュベートすることによって、チオール基を活性化（脱保護）した。チオール基の量及び安定性は、エルマン試薬を（Ｅｌｌｍａｎ、１９５９年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、第８２巻、７０〜７７頁）用いて測定した。ＨＲＰをプレロードされたリポソームは、後挿入法に従って、ＣＲＭ１９７結合ＰＥＧ２０００でコーティングした（Ｉｄｅｎら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１５１３（２）巻、２０７〜２１６頁）。簡潔には、２．５％ＣＲＭ１９７結合ＰＥＧ２０００−マレイミド−ＰＥ、及び２．５％ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥのミセルを、予め形成させたＨＲＰ担持リポソーム中に、４０℃のインキュベーション、２時間の間に移行させ、その後、セファデックスＣＬ４Ｂカラム上で分離させ、超遠心（６００００ｇ、３０分、１０℃）を用いて濃縮した。特定の実験（各実施例で指示される）では、本明細書に上述したプロトコールを行うのに、ＣＲＭ１９７をＢＳＡで置換し、これは、対照リポソームとして機能する。調製後に、リン脂質含量を、Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂａｒｒｏｗに従って測定し、タンパク質含量を、Ｂｉｏｒａｄ（登録商標）タンパク質アッセイ（ブラッドフォードの改変法）で測定した。ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームは、１リポソームあたり３．３個のタンパク質を含有し、ＢＳＡコートＰＥＧリポソームは、１リポソームあたり２６．９個のタンパク質を含有した。さらに、サイズ（ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームでは１１２ｎｍ、及びＢＳＡコートＰＥＧリポソームでは１０４ｎｍ）、及び多分散度（ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームでは０．２１、ＢＳＡコートＰＥＧリポソームでは０．０８）を、Ｍａｌｖｅｒｎ４７００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、イギリス）を用いた動的光散乱によって測定した。ゼータ電位（ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームでは−１８．６＋／−０．７，ＢＳＡコートＰＥＧリポソーム−２５．２＋／−１１．２）は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ３０００ＨＳａゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、イギリス）で測定した。
【０１４８】
ＣＲＭ１９７若しくはＢＳＡに結合しているＨＲＰ、又はＣＲＭ１９７若しくはＢＳＡのいずれかに結合しているＨＲＰ担持ＰＥＧリポソームを、挿入フィルターの頂端側に添加し、このフィルターを、暖かい（又は、ＨＲＰ結合タンパク質には、冷たい）ＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ＋Ｓ  ２５０μｌを含有する新しいウェルに移した。ＨＲＰ結合タンパク質、又はＣＲＭ１９７若しくはＢＳＡのいずれかに結合しているＨＲＰ担持ＰＥＧリポソームの、ＢＣＥＣの管腔遠位側（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）での再エンドサイトーシスを阻止するために、毎時間、最長４時間まで、この操作を反復した。側底面区画にトランスサイトーシスされたＨＲＰの集積ＨＲＰ活性は、適切な検量線曲線を有する標準的な比色分析法を用いて検出した。
【０１４９】
ＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通した平均ＴＥＥＲは、８−４−ＣＰＴ−ｃＡＭＰ及びＲＯ−２０−１７２４による処置の後、１４９．８＋／−５．４  Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、ｎ＝１８）から、８３４＋／−７７  Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、ｎ＝２４）に増大した。未処置の細胞と、そのような処置を受けた細胞との間で、ＤＴ感受性における相違は観測されなかった（データは示されていない）。
【０１５０】
非結合型ＨＲＰにおける５μｇ／ｍｌに相当する濃度のＨＲＰ結合タンパク質で、ＢＣＥＣをインキュベートした後では、ＢＳＡ−ＨＲＰ結合体に比べて、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体が優先的にＢＣＥＣを通過してトランスサイトーシスされた（図１３）。４℃におけるＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体の輸送レベルは、３７℃及び４℃におけるＢＳＡ−ＨＲＰ結合体と同じであった（図１３）。これらの結果は、４０ｋＤａのタンパク質積荷に結合されている場合でも、ＣＲＭ１９７が特異的かつ能動的に活脳血液関門を通過してトランスサイトーシスされることを示す。
【０１５１】
遊離ＨＲＰにおける５μｇ／ｍｌに相当する濃度の、ＣＲＭ１９７若しくはＢＳＡに結合しているＨＲＰ担持ＰＥＧリポソームで、ＢＣＥＣをインキュベートした後では、ＢＳＡコートＰＥＧリポソームに比べた場合、ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームが優先的にＢＣＥＣを通過してトランスサイトーシスされた（図１７）。これらの結果は、約１００ｎｍのリポソームに結合しているときでさえ、ＣＲＭ１９７は、４０ｋＤａのタンパク質積荷を、特異的に脳血液関門の反対側に送達できることを示す。
実施例６
【０１５２】
ＬＰＳＳ１４（ＤＴＲ）を介した脳血液関門の通過先を標的とする薬物送達：モルモットでのｉｎ  ｖｉｖｏ脳内分布試験
若いオスのモルモット（Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ社、ＨｓｄＰｏｃ：ＨＤ、２５０〜３００ｇ）における、ＨＲＰに結合されているＣＲＭ１９７又はホロトランスフェリン（ＴｒＦ）（重量／重量比２：１）の脳摂取を、結合体の頚動脈内ボーラス注入（非結合型ＨＲＰにおける５００μｇ／ｍｌに相当する濃度で１．５ｍｌ）から１．５時間後に測定し、等濃度の遊離ＨＲＰと比較した。タンパク質は、製造会社の使用説明に従って、ＨＲＰ結合キットによってＨＲＰに結合した（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、米国）。さらに、結合タンパク質は、セファクリルＳ−２００ＨＲマトリックスを充填したＨｉＰｒｅｐ１６／６０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、イギリス）で精製した。簡潔には、空気／酸素混合物（２：１）中で、イソフルラン吸入（誘導に４％、維持に１〜１．５％）によって、動物を麻痺させた。血液試料採取及び薬物投与用に、カニューレを頚動脈蛇行に挿入した。タンパク質を注射した１．５時間後に、４％  イソフルラン（１〜２分）で、動物を深く麻痺させ、続いて、血管から血液を除去するために、食塩水による動物全体（脳も含まれる）の潅流を、心臓大動脈を介して行った（＜５分）。直後に、動物を斬首し、その後の分析用に脳を頭蓋骨から取り出した。すべての血液が除去されている（脳の目視検査に基づく）脳のみを、その後の分析に用いた。
【０１５３】
潅流されている脳（及び、潅流されていない対照脳１個）の皮質を解剖し、重さを量った。直後に、皮質断片を均質化し、ホモジネートの半分容積を、１２０μｍのナイロンメッシュを通して濾過した。完全なホモジネートに加えて、濾液（血管構造を含有する）及び溶離液（脳の実質細胞を含有する）の両方も用いて、３種類の脳皮質試料（すなわち、完全なホモジネート（図１８では、「ホモジネート」と表記する）、脳実質（図１８では、「実質」と表記する）、及び、脳血管構造（図１８では、「毛細血管」と表記する））中にトランスサイトーシスされたＨＲＰのＨＲＰ活性の分析を行った。組織／細胞は、０．１％  Ｎａ−デオキシコール酸塩水溶液（最終濃度）によって溶解させ、その後、遠心されたホモジネートの透明な上清中で、適切な検量線と、上清の希釈及びタンパク質量の補正とを有する標準的な比色分析法を用いて、ＨＲＰ活性を検出した。
【０１５４】
潅流されている脳（及び潅流されていない対照脳（すなわち、ＨＲＰ又はＨＲＰ結合体が注射されていない）の１個）における約０．５ｃｍの中枢通過切片（耳から耳）を切除し、イソペンタン中で直接急速凍結させ、マイナス８０℃で使用するまで保存した。組織切片は、低温維持装置上で１４μｍの凍結切片に切った。切片の一部は空気固定して、ＨＲＰ（又は、潅流されていない対照脳の場合には、内在性ペルオキシダーゼ）活性を、ＴＭＢ（ペルオキシダーゼ基質キットＴＭＢ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）によって、直接、３０分間染色し、脱イオン水で、５分間洗浄し、一連のエタノール及びキシレン（９０％エタノール２ｘ１分；１００％エタノール２ｘ１分；キシレン２ｘ１分）中で脱水し、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社）中に包埋した。他の切片は、４％パラホルムアルデヒド中で固定し（１５分）、脳におけるＣＲＭ１９７分布を、マウス抗ジフテリア毒素１：１０（ＯＢＴ０７４６、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓＤｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ社）及び二次ＨＲＰ−ヤギ−抗マウス抗体１：２５０（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｎｎｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）によるジフテリア毒素の免疫組織化学によって染色した。この一次抗体によって、純粋なタンパク質試料中、及びＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合ホモジネート試料中の両方で、ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ１９７ＨＲＰ結合体を、ドットブロットによるパイロット実験で選択的に染色することが可能であった（データは示されていない）。内在性ペルオキシダーゼを、遮断（０．３％Ｈ２０２及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中で２０分間）して、非特異的な染色を、５％正常ヤギ血清によって阻止した。二次抗体のＨＲＰ活性を、ＴＭＢ（ペルオキシダーゼ基質キットＴＭＢ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）によって、１０分間染色し、脱イオン水で、５分間、洗浄し、一連のエタノール及びキシレン（９０％エタノール２ｘ１分；１００％エタノール２ｘ１分；キシレン２ｘ１分）中で脱水し、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社）中に包埋した。対比染色は、行わなかった。
【０１５５】
ＨＲＰに結合されているＣＲＭ１９７及びＴｒＦ（どちらも非結合型ＨＲＰにおける５００μｇ／ｍｌに相当する濃度）、そして等濃度の遊離ＨＲＰを、モルモットに注入した１．５時間後には、ＣＲＭ１９７ＨＲＰ結合体が注入された動物における３種類の脳皮質ホモジネート試料すべて（すなわち、完全なホモジネート（図１８では、「ホモジネート」と表記する）、脳実質（図１８では、「実質」と表記する）、及び、脳血管構造（図１８では、「毛細血管」と表記する））で、ＨＲＰ活性が観測された（図１８）。脳における血液の絶対的な不在（これは、以下に記載する凍結切片中でも確認された）に基づいて、３匹の動物からのデータがこの分析に含まれていた。ＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された動物、及び遊離ＨＲＰ注入された動物から得たすべて試料で、ＨＲＰ活性レベルが検出限界より低かった（両群とも、ｎ＝２、脳中に血液が全くないことに基づいて選択した後（これは、以下に記載するように凍結切片でも確認した）。これらの結果は、４０ｋＤａの積荷（すなわち、ＨＲＰ）に結合されたＣＲＭ１９７は、脳皮質で特異的に摂取され、遊離ＨＲＰ、及びＴｒＦに結合されたＨＲＰは、そうではないことを示す。残念ながら、対照（すなわち、０．５ｍｌ食塩水）を注入された動物でも時間につれて変化した、血液中に存在する高レベルの内在性ペルオキシダーゼ（おそらく、すべての動物で観測された、食塩水の注入容積による一時的な軽い溶血反応による）のため、注入されたＨＲＰ結合体及び遊離ＨＲＰの血漿中動態を、ＨＲＰの標準的な比色分析法に基づいて測定することができなかった。そのため、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体の脳皮質分布容積を計算することができなかった。
【０１５６】
灌流されていない対照脳の凍結切片における内在性ペルオキシダーゼ活性を、直接、ＴＭＢで染色した後では、切片全体で、血管染色パターンの特有かつ強い特徴が観察された。このパターンの典型的な例を、図１９、パネルＡに示す。図１９のパネルＢから理解できるように、心臓大動脈を介した食塩水による潅流操作によって、この内在性ペルオキシダーゼ活性を完全に除去することができた。これらの結果は、血漿試料中ＨＲＰの標準的な比色分析で既に観測されたように、内在性ペルオキシダーゼによる干渉が血液中に実際に存在することを示す。遊離ＨＲＰを注入された動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢ染色された凍結切片は、十分に灌流されている対照脳と同様に、目に見える染色を示さなかった（図１９、パネルＣ及びＤは、２匹の異なった動物の代表的な写真を示す）。しかし、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体を注入された動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢ染色された凍結切片は、小血管との結合に特徴的な染色パターンを示した（図１９、パネルＥ及びＦは、代表的な写真を示す（Ｅ及びＦは同一の動物のものである））。さらに、これらの動物では、血管を通過して血管外遊出した（すなわち、輸送された）ＨＲＰに特徴的な、いくつかの明確な染色領域が、切片全体にわたって観測された（図１９、パネルＦ、Ｇ、及びＨは、３匹の異なった動物の代表的な写真を示す）。対照的に、ＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢ染色された凍結切片は、小血管との結合に特徴的な染色パターンを、わずかに（もしあるとしたら）、非常に薄く示した（図１９、パネルＩ及びＪ、並びにＫ及びＬは、２匹の異なった動物の代表的な写真をそれぞれ２枚ずつ示す）。併せて、これらの結果は、脳皮質ホモジネートから得られるデータと一致しており、再度、４０ｋＤａの積荷（すなわちＨＲＰ）に結合されたＣＲＭ１９７は、脳皮質で特異的に摂取され、遊離ＨＲＰ及びＴｒＦに結合されたＨＲＰはそうでないことを示すものである。
【０１５７】
脳におけるＣＲＭ１９７分布が、マウス抗ジフテリア毒素抗体による、ジフテリア毒素の免疫組織化学で染色されている凍結切片は、切片全体にわたって均質的な分布パターンを薄く示した（図２０、パネルＡ及びＤは、２つの倍率における、同じ動物の代表的な写真を示す）。遊離ＨＲＰを注入された動物、及びＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された動物では、この染色パターンが観測されなかった（図２０、パネルＢ及びＥ、並びにＣ及びＦは、同じ動物の代表的な写真をそれぞれ２つの倍率で示す）。併せて、これらの結果は、ＣＲＭ１９７（切断されていても、また、まだＨＲＰに結合していても）が、脳で摂取されることを示す。
【０１５８】
すべての例示的方法を考慮し、さらに、それらを本明細書に含まれている、ＤＴＲに関する利用可能な従来技術と併用した場合、脳血液関門中への薬物の送達、及びこれを通過する送達の作用機序として、以下のものが提案される。薬物又はリポソーム結合担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）のＢドメインの、ジフテリア毒素受容体に対する特異的な結合に続いて、担体タンパク質／薬物複合体がエンドサイトーシスされる。ｐＨ変化によって引き起こされる、担体タンパク質の立体配座変化により、担体タンパク質／薬物複合体のＴドメインが、エンドソーム膜中に挿入され、それに続いて、Ａドメイン（薬物複合体を含む）が細胞質ゾル中に移行する。その後、薬剤及び担体タンパク質（切断されているか、又は依然として結合している）が、脳血液関門を通過して輸送される。エンドソームの一部は、最終的に、リソソーム中に入ることが多いので、この作用機序は、治療薬をリソソームに送達する方法としても有用である。この場合には、特に、酵素（例えば、リソソーム蓄積症を患っている患者で欠失している酵素）との結合体が関心の対象となる。
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【表２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養（パネルａ）を有する挿入フィルター、及びＢＣＥＣ−星状細胞共培養（パネルｂ）を有する挿入フィルターの詳細を模式的に表す図である。
【図２】ＢＢＢをｉｎ  ｖｉｔｒｏでリポ多糖（ＬＰＳ）に曝露した後に起こる事象の詳細を模式的に表す図である。ＢＣＥＣは５０％ＡＣＭ中の単層培養として、又は星状細胞との共培養として培養した。星状細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＢＢＢ性能を増大させた（第１相）。ＬＰＳによる疾患誘導は、ＢＣＥＣ単層培養を破壊した（第２相）が、ＢＣＥＣ＋星状細胞共生培養は、回復することができた（第３相）。この回復相をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で完全に阻害することができたので、この回復過程には、タンパク質の新規合成が関与する。
【図３】ＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養を通したＴＥＥＲに対する、２時間のＬＰＳへの曝露の影響を、Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、パネルａ）、及び対照（すなわち、未処置のＢＣＥＣ−ＡＣＭ単層培養）に対する％（平均＋／−標準誤差、パネルｂ）で表して、示す図である。
【図４】ＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲに対する、２時間のＬＰＳへの曝露の影響を、Ｏｈｍ・ｃｍ２（平均＋／−標準誤差、パネルａ）、及び対照（すなわち、未処置のＢＣＥＣ−星状細胞共培養）に対する％（平均＋／−標準誤差、パネルｂ）で表して、示す図である。
【図５】フィルターの頂端（血液）側で様々な濃度（１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまで）のＤＴに曝露されたＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲ（対照に対する％の平均として表される）に対する影響を示す図である。
【図６】フィルターの側底（脳）側で様々な濃度（２５ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで）のＤＴに曝露されたＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲ（対照に対する％の平均として表される）に対する影響を示す図である。
【図７】フィルターの頂端側でＤＴの曝露が行われる前に、様々な濃度（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）の可溶性ＨＢ−ＥＧＦでプレインキュベート（室温１時間）された１００ｎｇ／ｍｌのＤＴに曝露されたＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲ（対照に対する％の平均として表される）に対する影響を示す図である。可溶性ＨＢ−ＥＧＦは、ＤＴの受容体結合ドメインに結合することによって、ＤＴＲの非競合的アンタゴニストとして作用する。
【図８】ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌのＤＴに曝露される前に、５μｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７で１時間前処置されたＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲ（対照に対する％の平均として表される）に対する影響を示す図である。ＣＲＭ１９７は、ＤＴに対する受容体結合領域に結合することによってＤＴＲの競合的アンタゴニストとして作用する。
【図９】ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌのＤＴに曝露される前に、ヘパリン（１２５μｇ／ｍｌ）で１時間前処置されたＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲ（対象に対する％の平均として表される）に対する影響を示す図である。ヘパリンは、ＤＴに対する受容体結合ドメインで立体配座変化を誘導することによって、ＤＴＲにおけるＤＴ結合の促進物質として作用する。
【図１０】ＢＣＥＣが１００ｎｇ／ｍｌのＤＴに曝露される前に、頂端で１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（血清型０５５：Ｂ５）に２時間曝露され、それによって、ＤＴＲの発現レベルが増大しているか、或いは、１０μＭ  ＢＢ９４（バチマスタット）に１時間曝露され、それによって、細胞膜上でのＤＴＲの利用性が増大しているか、或いは、ＬＰＳ及びＢＢ９４の組合せに曝露され、それによって、細胞膜上での発現レベルと、ＤＴＲの利用性との両方が増大しているＢＣＥＣ−星状細胞共培養を通したＴＥＥＲ（対象に対する％の平均として表される）に対する影響を示す図である。ＢＢ９４は、細胞外ドメイン切断の過程に関与するＭＭＰの阻害剤として作用する。
【図１１】５μｇ／ｍｌの非結合型ＨＲＰに相当する濃度のＨＲＰ結合タンパク質（ＣＲＭ１９７、ＢＳＡ、及びホロトランスフェリン）に曝露した後における、ＢＣＥＣ溶解液中のＨＲＰ活性を示す図である。
【図１２】１０μｇ／ｍｌの可溶性ＨＢ−ＥＧＦとプレインキュベートされた、ＨＲＰ結合ＣＲＭ１９７、ＨＲＰ結合ＢＳＡ、及びＨＲＰ結合ＣＲＭ１９７に、５μｇ／ｍｌの非結合型ＨＲＰに相当する濃度で、曝露した後における、ＢＣＥＣ溶解液中のＨＲＰ活性を示す図である。可溶性ＨＢ−ＥＧＦは、ＣＲＭ１９７の受容体結合ドメインに結合することによって、ＤＴＲ媒介性摂取の非競合的アンタゴニストとして作用する。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏの脳血液関門を通した、ＨＲＰ結合ＣＲＭ１９７の能動的かつ選択的なトランスサイトーシス（すなわち、５μｇ／ｍｌの非結合型ＨＲＰに相当する濃度の、ＨＲＰ結合ＣＲＭ１９７（円付きの線）、及びＨＲＰ結合ＢＳＡ（正方形付きの線）に、３７℃（黒塗り記号付きの線）及び４℃（白塗り記号付きの線）で、頂端で曝露された後の、基底側区画におけるＨＲＰ活性）を示す図である。
【図１４】遊離ＨＲＰ５μｇ／ｍｌに相当する濃度の、ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７でコーティングされたＰＥＧリポソームに、３７℃及び４℃（能動摂取を阻害する）で曝露された後における、ＢＣＥＣ溶解液中のＨＲＰ活性を示す図である。この図は、ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームがＢＣＥＣによって能動的に摂取されることを示す。
【図１５】遊離ＨＲＰ５μｇ／ｍｌに相当する濃度のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム又はＨＲＰ担持ＢＳＡコートＰＥＧリポソーム（担体特異性を測定する）のいずれかに曝露された後における、ＢＣＥＣ溶解液中のＨＲＰ活性を示す図である。この図は、ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームがＢＣＥＣによって特異的に摂取されることを示す。
【図１６】遊離ＨＲＰ５μｇ／ｍｌに相当する濃度のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームに曝露された後における、ＢＣＥＣ溶解液中のＨＲＰ活性を、５０μｇ／ｍｌの遊離ＣＲＭ１９７で１時間前処置されたＢＣＥＣでの摂取と比較して（ＤＴＲの特異的な関与を測定する）示す図である。この図は、ＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームが、実際に、ＢＣＥＣによってＤＴＲを介して特異的に摂取されることを示す。
【図１７】ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソームを介してｉｎ  ｖｉｔｒｏの脳血液関門を通過する、ＨＲＰの選択的なトランスサイトーシスを示す図である（すなわち、頂端で、５μｇ／ｍｌの遊離ＨＲＰに相当する濃度のＨＲＰ担持ＣＲＭ１９７コートＰＥＧリポソーム（円付きの線）及びＨＲＰ担持ＢＳＡコートＰＥＧリポソーム（正方形付きの線、担体特異性を測定する）への曝露が行われた後の側底区画でのＨＲＰ活性）。
【図１８】ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体を注入された動物の、３種類の脳皮質ホモジネート試料（すなわち、完全なホモジネート（「ホモジネート」と表記する）、脳実質組織（「実質組織」と表記する）、及び、脳血管（「毛細血管」と表記する））におけるＨＲＰ活性を示す図である。ＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された動物、及び遊離ＨＲＰ注入された動物から得たすべての試料で、ＨＲＰ活性レベルがＨＲＰアッセイの検出限界より低かった。これらの結果は、４０ｋＤａの積荷（すなわちＨＲＰ）に結合されたＣＲＭ１９７のみが、脳皮質で特異的に摂取され、遊離ＨＲＰ、及びＴｒＦに結合されたＨＲＰは、そうではないことを示す。
【図１９】（パネルＡ）内在性ペルオキシダーゼ活性が、直接、ＴＭＢによって染色された、灌流されていない対照脳（切片全体にわたる、血管に特徴的な明確で強い染色パターンに留意されたい）；  （パネルＢ）内在性ペルオキシダーゼ活性が、直接、ＴＭＢによって染色された、十分に灌流されている対照脳（心臓大動脈を介した食塩水による潅流操作によって、パネルＡで見られた内在性ペルオキシダーゼ活性を、完全に除去できたことに留意されたい）；  （パネルＣ及びＤ）遊離ＨＲＰを注入された２匹の動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢ染色された凍結切片（十分に灌流されている対照脳と同様、目に見える染色が観測できないことに留意されたい）；  （パネルＥ及びＦ）ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体を注入された動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢによって染色された２種類の凍結切片（小血管との結合に特徴的な染色パターン、及び、血管を通過して血管外遊出した（すなわち、輸送された）ＨＲＰに特徴的な明確な染色領域に留意されたい）；  （パネルＧ及びＨ）ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体を注入された２匹の動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢ染色された凍結切片（再度、血管を通過して血管外遊出した（すなわち、輸送された）ＨＲＰに特徴的な明確な染色領域に留意されたい）；  （パネルＩ及びＪ）ＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢによって染色された２種類の凍結切片（小血管との結合に特徴的なわずかな（あるとしても）非常に薄い染色パターンに留意されたい）；  （パネルＫとＬ）ＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された別の動物の、十分に灌流されている脳の、ＴＭＢによって染色された２種類の凍結切片（再度、小血管との結合に特徴的なわずかな（あるとしても）非常に薄い染色パターンに留意されたい）  の代表的な写真である。併せて、これらの結果は、４０ｋＤａの積荷（すなわちＨＲＰ）に結合されたＣＲＭ１９７は、脳皮質で特異的に摂取され、遊離ＨＲＰ、及びＴｒＦに結合されたＨＲＰは、そうではないことを示す。脳皮質凍結切片の倍率はすべて４０ｘである。
【図２０】（パネルＡ及びＤ）マウス抗ジフテリア毒素抗体による、ジフテリア毒素の免疫組織化学によって、ＣＲＭ１９７を染色された、ＣＲＭ１９７−ＨＲＰ結合体を注入された動物の凍結切片（切片全体にわたって均質的に分布する薄い染色パターンに留意されたい、パネルＡ：倍率２０ｘ、パネルＤ：倍率１００ｘ）；  （パネルＢ及びＥ）マウス抗ジフテリア毒素抗体による、ジフテリア毒素の免疫組織化学によって、ＣＲＭ１９７を染色された、遊離ＨＲＰを注入された動物の凍結切片（上記染色パターンが欠失しているのに留意されたい、パネルＢ：倍率２０ｘ、パネルＥ：倍率１００ｘ）；  （パネルＣ及びＦ）マウス抗ジフテリア毒素抗体による、ジフテリア毒素の免疫組織化学によって、ＣＲＭ１９７を染色された、ＴｒＦ−ＨＲＰ結合体を注入された動物の凍結切片（再度、上記染色パターンが欠失しているのに留意されたい、パネルＣ：倍率２０ｘ、パネルＦ：倍率１００ｘ）  の代表的な写真である。併せて、これらの結果は、ＣＲＭ１９７（切断されていても、また、まだＨＲＰに結合していても）が、脳で摂取されることを示す。
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月13日(2007.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＳ又は血管系障害を患っているか、又は発症する危険のある患者において、内皮細胞脈管関門の透過性(permeability of an endothelial cell vascular barrier)に関連するＣＮＳ又は血管系障害を治療又は予防するための医薬の製造における、治療薬及び薬学的に許容される担体の使用であって、
該治療薬又は該担体が、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）感受性（ＬＰＳＳ）ポリペプチドに特異的に結合する標的指向分子に結合され、
該ＬＰＳＳポリペプチドが、
(a) 内皮細胞において、ＬＰＳへの暴露によって、上方制御若しくは下方制御され、
(b) 配列番号１〜２５の何れか１つに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つことを特徴とする、使用。
【請求項２】
前記血管系障害が、中枢神経系の微小血管障害であって、その中枢神経系の微小血管内皮細胞が、血液脳関門（ＢＢＢ）、血液−脳脊髄液関門、血液−網膜関門、血液−神経関門、及び血液−脊椎関門を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記標的指向分子が前記ＢＢＢを標的とし、前記ＬＰＳＳペプチドが脳微細管内皮細胞ペプチドである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記治療薬又は前記担体が、
(a) 非特異的若しくは特異的なタンパク質―タンパク質相互作用、
(b) 共有結合、
(c) 非共有結合、又は
(d) 配位化学結合
によって、直接、前記標的指向分子に結合され、
任意に、該結合が、該治療薬及び該標的指向分子に結合されるスペーサー又はリンカーを介して影響を受ける、請求項１から３の何れか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記治療薬−標的指向分子結合体、又は前記担体−標的指向分子結合体が、組換え融合体又はハイブリッドポリペプチドである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＬＰＳＳが受容体であり、前記治療薬が、該受容体に対するリガンド又はアゴニストである、請求項１から５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記受容体が、細菌毒素受容体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
(a) 前記細菌毒素受容体が、配列番号２２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つ、ジフテリア毒素受容体又はそのホモログであり、
(b) 前記標的指向分子が、該ジフテリア毒素受容体又はそのホモログに対するリガンドである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記標的指向分子が、
(a) ジフテリア毒素ペプチド鎖の非毒性部分、
(b) ジフテリア毒素Ｂ鎖の全部若しくは一部、
(c) ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の非毒性変異体の全部若しくは一部、及び
(d) 低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰ及びＬＲＰ１Ｂに特異的に結合する、緑膿菌外毒素Ａ(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)の交差反応性変異体６６ｋＤａタンパク質（ＣＲＭ６６）
からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
標的細胞上の前記ジフテリア毒素受容体の発現又は生物学的活性のレベルが、前記微小血管障害、同時発生症状、又は該発現若しくは該生物学的活性を増加させることが知られている投与物質によって、増大され、
該同時発生症状又は該投与物質が、酸化的ストレス、虚血性ストレス、浸透圧性ストレス、電気的ストレス、機械的ストレス若しくはせん断応力、サイトカイン、増殖因子、リゾ−ホスファチジルコリン、塩化第２水銀、ホルボールエステル、Ｃａ++イオノフォア、血清、トロンビン、エンドセリン−１、アンギオテンシンＩＩ、リポプロテイン、血小板活性因子、α―アドレナリンアゴニスト、転写因子、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＣＤ９／ＤＲＡＰ２７、α３β１−インテグリン、マトリックスメタロプロテナーゼインヒビター、ＢＢ−９４（batimastat）、ＡＤＡＭ１２若しくはＡＤＡＭ１０のインヒビター、ＰＫＣインヒビター、ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼインヒビター、及びＭＡＰキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
前記治療薬−標的指向分子結合体の前記受容体若しくはそのホモログへの結合が、受容体―リガンド複合体を形成し、それが、内皮細胞によって、エンドソーマルコンパートメント及びライソソーマルコンパートメントへ取り込まれ、その後、該治療薬又はその複合体が内皮細胞質ゾルへ放出され、前記関門を含む内皮細胞層を通って該治療薬又はその複合体が経細胞輸送される、請求項６から１０の何れか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記治療薬が、
(a) 抗癌薬、化学治療薬、抗悪性腫瘍薬、抗増殖薬又は細胞障害性小分子薬；
(b) バイオ抗癌剤；
(c) モノクロナール抗体；
(d) サイトカイン又は増殖因子；
(e) 神経炎症阻害剤；
(f) 神経栄養因子；
(g) 酵素；
(h) 脳活性ホルモン、神経ペプチド
(i) ＢＢＢを通過しない、神経伝達物質又は神経伝達物質アゴニスト若しくはアンタゴニスト；
(j) 抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗原虫薬又はその他の駆虫薬；
(k) ポリペプチド産物を発現する治療用核酸ベクター；
(l) アンチセンス核酸若しくはペプチド核酸；
(m) 機能性ＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項１から１１の何れか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記治療薬が、ナノ容器に包まれており、前記標的分子が、該ナノ容器に結合されている、請求項１から１２の何れか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ナノ容器が、前記治療薬が共有結合されている、ナノ粒子、リポソーム又はナノゲルである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬が、静脈、腹腔、筋肉、動脈、及び髄腔からなる群から選択される経路で、又は経皮、鼻腔、口腔、直腸若しくは膣の経路で、継続的注入又は一括注射で投与するためのものである、請求項１から１４の何れか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬は、
(a) 神経変性障害；
(b) 神経精神障害；
(c) 脳腫瘍、癲癇、偏頭痛、ナルコレプシー、不眠、慢性疲労症候群、高山病、脳炎、髄膜炎、及びエイズ関連痴呆からなる群から選択されるＣＮＳ障害；
(d) 血管形成関連障害；
(e) 心臓障害又は虚血再灌流障害；
(f) 炎症又は自己免疫障害；
(g) 加齢性黄斑変性；
(h) 骨粗しょう症；
(i) リソソーム貯蔵障害；又は
(j) 創傷治癒及び組織修復
からなる群から選択される障害を治療するためのものである、請求項１から１５の何れか１項に記載の使用。
【請求項１７】
治療薬若しくは診断薬と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物であって、
該治療薬若しくは診断薬、又は該担体が、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）感受性（ＬＰＳＳ）ポリペプチドに特異的に結合する標的指向分子に結合され、
該ＬＰＳＳポリペプチドが、
(a) 内皮細胞において、ＬＰＳへの暴露によって、上方制御若しくは下方制御され、
(b) 配列番号１〜２５の何れか１つに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１８】
前記治療薬若しくは診断薬、又は前記担体が、
(a) 非特異的若しくは特異的なタンパク質―タンパク質相互作用、
(b) 共有結合、
(c) 非共有結合、又は
(d) 配位化学結合
によって、直接、前記標的指向分子に結合され、
任意に、該結合が、該治療薬及び該標的指向分子に結合されるスペーサー又はリンカーを介して影響を受ける、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記治療薬若しくは診断薬−標的指向分子結合体、又は前記担体−標的指向分子結合体が、組換え融合体又はハイブリッドポリペプチドである、請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ＬＰＳＳが受容体であり、前記治療薬若しくは診断薬が、該受容体に対するリガンド又はアゴニストである、請求項１７から１９の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記受容体が、細菌毒素受容体である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
(a) 前記細菌毒素受容体が、配列番号２２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つ、ジフテリア毒素受容体又はそのホモログであり、
(b) 前記標的指向分子が、該ジフテリア毒素受容体又はそのホモログに対するリガンドである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記標的指向分子が、
(a) ジフテリア毒素ペプチド鎖の非毒性部分、
(b) ジフテリア毒素Ｂ鎖の全部若しくは一部、
(c) ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の非毒性変異体の全部若しくは一部、及び
(d) 低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰ及びＬＲＰ１Ｂに特異的に結合する、緑膿菌外毒素Ａ(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)の交差反応性変異体６６ｋＤａタンパク質（ＣＲＭ６６）
からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
(I) 前記治療薬が、
(a) 抗癌薬、化学治療薬、抗悪性腫瘍薬、抗増殖薬又は細胞障害性小分子薬；
(b) バイオ抗癌剤；
(c) モノクロナール抗体；
(d) サイトカイン又は増殖因子；
(e) 神経炎症阻害剤；
(f) 神経栄養因子；
(g) 酵素；
(h) 脳活性ホルモン、神経ペプチド
(i) ＢＢＢを通過しない、神経伝達物質又は神経伝達物質アゴニスト若しくはアンタゴニスト；
(j) 抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗原虫薬、又はその他の駆虫薬；
(k) ポリペプチド産物を発現する治療用核酸ベクター；
(l) アンチセンス核酸若しくはペプチド核酸；
(m) 機能性ＲＮＡ分子
からなる群から選択され、
(II)  前記診断薬が、造影剤又は抗体である、請求項１７から２３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記治療薬又は診断薬が、ナノ容器に包まれており、前記標的分子が、該ナノ容器に結合されている、請求項１７から２４の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ナノ容器が、前記治療薬又は診断薬が共有結合されている、ナノ粒子、リポソーム又はナノゲルである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
治療薬又は診断薬を、内皮細胞血管関門の中へ及び／又は内皮細胞血管関門を通過して送達するための標的指向分子としての機能に対する能力について、候補物質を評価し又はスクリーニングする方法であって、
該標的指向分子は、配列番号１〜２５の何れか１つに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つリポポリサッカライド（ＬＰＳ）感受性（ＬＰＳＳ）ポリペプチドに特異的に結合するものであり、
内皮細胞上に発現している該ＬＰＳＳポリペプチドに特異的に結合し、該細胞によって取り込まれ、且つ／又は該細胞を通って経細胞輸送される能力について試験することを含み、
該試験物質が、
(a) 該細胞に特異的に結合し、該細胞内への受容体特異的取り込みを受け、且つ／又は該細胞を通って経細胞輸送され、
(b) 該細胞上に発現している該ＬＰＳＳに特異的に結合する既知の物質との競合アッセイにおいて、該既知物質の結合、取り込み、及び／又は経細胞輸送の量を低減させるか、或いは該既知物質が毒性の場合に、該既知物質の毒性を低減させる場合には、
該候補物質が、該標的指向分子としての機能に対する能力を有すると結論付ける、方法。
【請求項２８】
前記物質が、前記治療薬又は診断薬に結合されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＬＰＳＳが、細菌毒素受容体である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌毒素受容体が、ジフテリア毒素受容体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌毒素受容体が、標的組織の内皮細胞上に恒常的に（constitutively）発現されている、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記受容体が、
(a) ニューロン、グリア細胞及びアストロサイトからなる群から選択される脳細胞；
(b) 脳及びその他の微小血管内皮細胞；
(c) 平滑筋細胞、炎症細胞、ＮＫ細胞、リンパ節細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、腎臓メサンギウム細胞、ケラチノサイト若しくは他の皮膚細胞、小腸細胞、全関節(whole joints)由来の細胞、栄養芽細胞、卵巣細胞、子宮細胞、胎盤細胞及び膀胱細胞；又は
(d) 癌細胞
上に恒常的に発現されている、請求項２９から３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記内皮細胞が、ヒト細胞である、請求項２７から３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記内皮細胞が、ヒト化細菌毒素受容体を発現する非ヒト哺乳類細胞である、請求項２７から３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
治療薬又は診断薬として、内皮細胞血管関門の中へ又は内皮細胞血管関門を通過して送達される能力について、候補物質を評価し又はスクリーニングする方法であって、
配列番号１〜２５の何れか１つに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つリポポリサッカライド（ＬＰＳ）感受性（ＬＰＳＳ）ポリペプチドに特異的に結合する、標的指向分子に結合された際に、該物質が該細胞内へ取り込まれ、且つ／又は該細胞を通って経細胞輸送されるかを試験することを含み、
該結合された試験物質が、該細胞に特異的に結合し、該細胞内への受容体特異的な取り込みを受け、且つ／又は該細胞を通って経細胞輸送される場合には、
該候補物質が、治療薬又は診断薬として、内皮細胞血管関門の中へ又は内皮細胞血管関門を通過して送達される能力を有すると結論付ける、方法。
【請求項３６】
前記ＬＰＳＳが、細菌毒素受容体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細菌毒素受容体が、ジフテリア毒素受容体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌毒素受容体が、標的組織の内皮細胞上に恒常的に（constitutively）発現されている、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記受容体が、
(a) ニューロン、グリア細胞及びアストロサイトからなる群から選択される脳細胞；
(b) 脳及びその他の微小血管内皮細胞；
(c) 平滑筋細胞、炎症細胞、ＮＫ細胞、リンパ節細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、腎臓メサンギウム細胞、ケラチノサイト若しくは他の皮膚細胞、小腸細胞、全関節(whole joints)由来の細胞、栄養芽細胞、卵巣細胞、子宮細胞、胎盤細胞及び膀胱細胞；又は
(d) 癌細胞
上に恒常的に発現されている、請求項３６から３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記内皮細胞が、ヒト細胞である、請求項３５から３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記内皮細胞が、ヒト化細菌毒素受容体を発現する非ヒト哺乳類細胞である、請求項３５から３９の何れか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2007528698.tif 000138
2007528698.tif 000139
2007528698.tif 000140
2007528698.tif 000141
2007528698.tif 000142
2007528698.tif 000143