(57)【要約】本発明は、RNA単離のための改善された方法および組成物を提供する。特定の態様において、本発明は、固定組織試料からの完全長RNAの単離のための方法および組成物の使用に関する。本発明は、固定組織試料からRNAを消化および抽出するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、固定組織試料からRNAを単離するための方法：
(a)固定組織試料を、溶解産物を作製するために、ポリアニオンおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液と接触させる段階；
(b)溶解産物からRNAを抽出する段階。
【請求項２】
ポリアニオンがポリカルボキシレートである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリカルボキシレートが、クエン酸ナトリウム、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、1,3,5-シクロヘキサンヘキサカルボン酸、イソクエン酸、およびコハク酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリカルボキシレートがクエン酸ナトリウムである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
消化緩衝液が、約500 μg/mlのプロテイナーゼKと共に、約5%までのSDS、約200 mM TrisCl、pH 7.5、約200 mM NaCl、および約100 mMまでのクエン酸ナトリウムを含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ポリアニオンの消化緩衝液における濃度が約1 mMと約100 mMの間である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
消化緩衝液におけるポリアニオン濃度が約50 mMである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
消化緩衝液がナトリウムをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
消化緩衝液におけるプロテアーゼがプロテイナーゼKである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
消化緩衝液のpHが約7.0と約9.5の間である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
固定組織試料および消化緩衝液の比率が、約1グラムの組織/5 ml 消化緩衝液から約1グラムの組織/25 ml 消化緩衝液までである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
固定組織試料および消化緩衝液の比率が、約1グラムの組織/10 ml 消化緩衝液から約1グラムの組織/20 ml 消化緩衝液までである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
固定組織試料を消化緩衝液と約1時間〜約6時間接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
固定組織試料を消化緩衝液と約4時間接触させる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
接触の温度が約40℃と約55℃の間である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
抽出されたRNAが完全長RNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
抽出されたRNAの少なくとも約20%が実質的に完全長である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
抽出されたRNAの少なくとも約50%が実質的に完全長である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
抽出されたRNAの少なくとも約70%が実質的に完全長である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下を含む段階によりRNAが溶解産物から抽出される、請求項1記載の方法：
(c)溶解産物へアルコール溶液を添加する段階；
(d)溶解産物を無機物支持体に適用する段階；および
(e)RNAを無機物支持体から溶出溶液で溶出する段階。
【請求項２１】
溶解産物が適用された後、無機物支持体を洗浄する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
無機物支持体がガラス繊維フィルターまたはカラムである、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
溶出溶液がEDTAを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
EDTAの濃度が約0.01 mM〜約1.0 mMである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
溶出溶液が約80℃と約100℃の間の温度である、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
段階(c)において溶解産物へ1つまたは複数の塩を添加する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
塩がアルコール溶液の添加の前に添加される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
グアニジニウムが溶解産物へ添加される塩である、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
溶解産物へ添加されるグアニジニウムの量が、約0.5 Mと約3.0 Mの間の溶解産物におけるグアニジニウムの濃度を生じる、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ナトリウム塩もまた溶解産物へ添加される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
RNAが、非アルコール有機溶媒を含む溶液を用いて溶解産物から抽出される、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
非アルコール有機溶媒がフェノールである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
溶解産物から抽出されたRNAの量を定量化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
RNAが増幅反応を用いて定量化される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
抽出されたRNAからcDNA分子を生成する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３６】
固定組織試料がパラフィンに包埋される、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
試料からパラフィンを除去する段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
試料からパラフィンを除去する段階が、包埋された試料を有機溶媒と接触させる段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
以下の段階を含む、固定組織試料由来の完全長RNAの量を測定するための方法：
(a)固定組織試料を、溶解産物を作製するために、ポリカルボキシレートおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液と接触させる段階；
(b)溶解産物へアルコール溶液を添加する段階；
(c)溶解産物を無機物支持体に適用する段階；
(d)完全長RNAを無機物支持体から溶出溶液で溶出する段階；ならびに
(e)溶出されたRNAを増幅する段階。
【請求項４０】
以下のものを含む、固定組織試料から完全長RNAを単離するためのキット：
(a)溶解産物を作製するためのポリカルボキシレートおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液；ならびに
(b)ガラス繊維フィルターまたはカラム。
【請求項４１】
消化緩衝液が以下のものを含む、請求項40記載のキット：約5%までのSDS、約200 mM TrisCl、pH 7.5、約200 mM NaCl、約100 mMまでのクエン酸ナトリウム、および約500 μg/mlのプロテイナーゼK。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、それは、固定組織から高品質および高収率のRNAを単離するための方法ならびに組成物に関係する。
【０００２】
本発明は、2003年7月25日に出願された米国仮特許出願第60/490,325号の優先権を主張し、それは参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００３】
2. 関連技術の説明
RNAは、しばしば、固定組織から単離されるが、ホルムアルデヒドの使用のような組織を固定することに関与する過程のせいで、得られるRNAは断片化される。意味のあるRNA試料の研究のために、RNAの完全性が維持されることが必要である。従って、断片化RNAは、例えば、特定の遺伝子の発現レベルについて、分析されたRNAの解釈されるレベルを偏らせる可能性がある。
【０００４】
動物組織のための防腐剤としてのホルムアルデヒドの使用は、1世紀以上に渡って存在してきた。それは、「硬化させること」により組織の構造を維持すること、および組織を物理的に腐敗させないための抗生物質製剤としての役割を果たすことの利益を与える。これらの二重の作用は、組織を高度に架橋結合させる、組織分子、主としてタンパク質、とのその迅速な化学反応に起因する。これは、構造的硬直性を与え、かつ細胞間および細胞内でより大きな分子の拡散を止める。これは、それが組織自身におけるおよびその内に所有されるいずれの微生物においてもすべての代謝を停止するため、効果的に組織を腐敗させない。抽出されたRNAおよびDNAの使用による遺伝子および遺伝子発現の試験に有効な現行の方法に関して、動物学的および臨床的検体のような保存された試料が、遡及的研究が行われうる豊富な材料を供給する。残念なことに、組織を保存する同じ反応が、それをRNAまたはDNAのどちらの抽出に対しても扱いにくくするように働く。この機能を実行するための手順は、科学的文献に報告されている。しかしながら、これらの手順は、非常に高品質または高収率(類似した起源の固定されていない組織からの収率により判断される場合)のRNAを得る能力において制限されている。
【０００５】
ホルムアルデヒドは、生体高分子における窒素原子間にメチレン架橋結合を形成することにより組織を固定する。これらの化学的付加体の大部分は、タンパク質中にあり、少しのパーセンテージはまた、核酸の塩基を含む。核酸は、限定された数の架橋結合自身に関与するだけでなく、高度に架橋結合したタンパク質「ケージ」の形成の両方により、固定組織に閉じ込められる。固定組織からのRNAの回収への発表されたアプローチは、第一に、酵素的方法によりタンパク質のすべての痕跡を除去することに集中しているが、いくつかはまた、その上、物理化学的方法も試みた。タンパク分解性分解を用いる手順は、主として、プロテイナーゼK、中程度の変性条件の存在下で機能することができるアミノ酸特異性をほとんどもたないプロテアーゼ、に頼っている。この手順の最も一般的な型は、高温(37℃〜65℃)で2% SDSの存在下においてそれを用いることである。
【０００６】
多くの手順は、ホルムアルデヒドにおいて固定組織試料からRNAの回収および分析を可能にすると明言する文献において報告されている(Masuda et al., 1999; Danenberg et al., 米国特許第6,248,535号および第6,428,963号; Fang et al., 2002; Abrahamsen et al., 2003; Liu et al., 2002; Van Deerlin et al., 2002; Karsten et al., 2002; Godfrey et al., 2000; Coombs et al., 1999; Koopmans et al., 1993; Specht et al., 2001を参照されたい)。これらの手順の大部分において、最終分析は、逆転写された抽出RNAからのPCR産物(「RT-PCR」)を見ることにより行われる。これらの手順で増幅された領域(「単位複製配列」)は、必然的に、最大限で数百ヌクレオチド長のみであり、リアルタイムまたは定量的PCRとして知られた手順のバリエーションが用いられる場合には、単位複製配列は、通常、100ヌクレオチドまたはそれ未満である。
【０００７】
これらの手順が適用され、抽出されたRNAが電気泳動により分析された場合、得られたRNAは、百ヌクレオチド範囲での平均サイズをもって大量に断片化されたことは明白であった。おそらく、これらの断片は、RT-PCR分析のための鋳型を供給している。この結果は、断片化RNAのみの除去を保証することにより容易に達成されえたが、トラッピング架橋結合は、得られた断片の平均サイズよりはるかに離れて位置している。一部の著者は、ホルマリン固定の処理それ自体がRNAを断片化すると断言しているが(Krafft et al., 1997)、これは、他の人により否定された(Masuda et al., 1999)。
【０００８】
固定組織由来の極度に断片化されたRNAはまた、クエン酸塩およびグアニジニウムを用いる手順においても得られた(Bock et al., 2001)。さらに、この手順は、β-メルカプトエタノールのような還元剤を含む、高濃度のプロテイナーゼK、クエン酸塩および界面活性剤を用い、断片化RNAの生成を増大させた。この手順の欠点は、RNAの完全性が維持されなかった(完全長ではない)こと、また、それが高品質および高収率のRNAを供給しなかったことである。
【０００９】
細胞に存在するRNAの特定のサブセットに影響を及ぼす傾向にあるどんな過程も、RNAの解釈されるレベルを偏らせうる。明らかに、できる限り完全性を維持しながら、収率を最大にする過程は、RNAおよびDNAの両方を単離するための最も望ましい手順である。従って、高品質の完全長および実質的に完全長のRNAを得ることに加えて、固定組織試料からのRNAの収率を最大にするために、新規なまたは改善された方法が必要とされている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、固定された生体試料から核酸、特にRNAを得るための方法および組成物に関する。本発明は、ポリアニオンを含む消化緩衝液または溶液を用いて試料から、完全長および実質的に完全長RNAを含むRNAについて単離、抽出および濃縮することによりRNAを得るために有効である。
【００１１】
従って、本発明の方法および組成物は、試料からより十分な収量のRNAを得るためだけでなく、試料から完全長RNAに関してより十分な収量を得るために用いられうることが企図される。いくつかの態様において、本発明は、試料由来のどちらのRNAでも、約もしくは少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれらの中の任意の範囲の抽出を可能にする。また、いくつかの態様において、本発明は、試料から抽出されたRNAの約もしくは少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれらの中の任意の範囲が、完全長または実質的に完全長であることを可能にする。用語「実質的に完全長」とは、RNAが少なくとも350ヌクレオチド長であるようにみえるかまたは測定されることを意味する。本発明の方法および組成物は、RNAの抽出を可能にし、抽出されたRNAの少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上が、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上無傷であることも企図される。
【００１２】
「消化緩衝液または溶液」は、細胞の1つまたは複数の成分のような生体試料における、1つもしくは複数の物質を分解または消化する1つもしくは複数の化合物または作用物質を有する緩衝液または溶液(緩衝液は溶液の一種である)であると理解される。本発明の態様において、消化緩衝液または溶液は、溶解された細胞から遊離される内容物を指す溶解産物を生成するために細胞全体に用いられうる。
【００１３】
用語「ポリアニオン」は、-2、-3、-4またはそれ以上のような、それに付随した複数の負電荷を有する化学化合物を指すように、その通常かつ単純な意味に従って用いられる。
【００１４】
特定の態様において、消化緩衝液は、少なくとも1つのカルボキシル基(COO-)を有する化学化合物を指すポリカルボキシレートであるポリアニオンを含む。本発明のポリカルボキシレートは、クエン酸ナトリウム、トランス-アコニット酸、1,2,4-ブタントリカルボン酸、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、1,2,3,4,5,6-シクロヘキサンヘキサカルボン酸、イソクエン酸、トリカルバリル酸、コハク酸、および/またはグルタル酸を含む。一部の場合では、消化緩衝液におけるポリカルボキシレートは、クエン酸ナトリウム、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸、イソクエン酸、およびコハク酸からなる群より選択される。化合物の酸の形態は、溶液においてポリアニオンとして見出され、従って酸の形態への言及は、そのポリアニオンの形態での酸を言及することに相応することが理解されるであろう。特定の態様において、消化緩衝液は、クエン酸ナトリウム(クエン酸Na)を含む。消化緩衝液は、複数のポリアニオン化合物を含み、消化緩衝液において少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のそのような化合物を含みうることが企図される。
【００１５】
いくつかの態様において、消化緩衝液におけるポリアニオンの濃度は、約1 mMと約100 mMの間、または約5 mMと約50 mMの間である。ポリアニオンの濃度は、消化緩衝液において、または試料を含む最終濃度として、約、少なくとも約、もしくは多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 mM、またはそれ以上、またはそれらの中での任意の範囲である。
【００１６】
消化緩衝液は、細胞全体、組織または器官に曝露された場合、細胞溶解産物を生成するために用いられうる。溶解産物は、細胞が溶解されるかまたはその全体性が破壊される場合に結果として生じる。消化緩衝液の成分は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ(特に非リボヌクレアーゼ)、および/または細胞の成分を化学的もしくは酵素的に破壊する他の化合物を含みうる。消化緩衝液は、そのような成分の1つまたは複数を含みうる。本発明の特定の態様において、消化緩衝液は、ペプチド結合の破壊(タンパク分解として公知である)を触媒する酵素であるプロテアーゼ(ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも呼ばれる)を含む。本発明の消化緩衝液におけるプロテアーゼの量は、試料における細胞の溶解を達成しうる有効量であることが企図される。さらなる態様において、プロテアーゼは、プロテイナーゼKであるが、本発明はこの態様に限定されない。プロテアーゼの濃度は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000 μg/ml、またはそれらの中での任意の範囲でありうる。
【００１７】
本発明の消化緩衝液は、さらに、塩を含み、本発明のいくつかの態様において、それはナトリウムである。ナトリウムの濃度は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500 mM、またはそれ以上、またはそれらの中での任意の範囲の間である。ナトリウムは、緩衝液においてNaClとして供給されうる。さらに、それは、ナトリウムを含む複数の化合物を添加することによるような、多重様式で緩衝液において供給されうる。
【００１８】
消化緩衝液の、または消化緩衝液の緩衝剤成分の、または試料を含む消化緩衝液のpHは、約6.5と9.5の間であるが、それは、約、少なくとも約、もしくは多くとも約6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、またはそれらの中での任意の範囲でありうる。
【００１９】
本発明の他の態様において、消化緩衝液における緩衝剤は、TrisClであり、緩衝液において、約、少なくとも約、もしくは多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500 mM、またはそれらの中での任意の範囲の濃度でありうる。とはいえ、他の緩衝剤も同様に用いられうることが企図される。
【００２０】
さらなる態様において、消化緩衝液は界面活性剤を含む。界面活性剤、特に非変性である穏やかなものが試料を可溶化するように働くことができる。界面活性剤は、イオン性または非イオン性でありうる。イオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は、本発明の溶液における使用として特に企図される。緩衝液における界面活性剤の濃度は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%、またはそれらの中での任意の範囲でありうる。界面活性剤の濃度は、界面活性剤が緩衝液に溶けることができる量まででありうることが企図される。
【００２１】
特定の態様において、消化緩衝液は、500 μg/mlのプロテイナーゼKと共に、2% SDS、200 mM TrisCl、pH 7.5、200 mM NaCl、および10 mM クエン酸Naを含む。さらなる態様において、消化緩衝液および/または本発明のいずれの他の段階も、グアニジニウムのような変性剤を含むことが特に企図される。いくつかの態様において、消化緩衝液は、約、もしくは多くとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 M、またはそれ以上、またはそれらの中での任意の範囲の濃度で変性剤を含む。本発明の方法および組成物はまた、断片化されたかもしくは切り詰められたRNA分子を結果として生じる化合物を除外する、またはそれらの量を制限すると理解されているであろう。
【００２２】
本発明の方法と共に用いられる溶液は、濃縮された形態で添加されうるか、またはそれらは、キットにおいて濃縮された形態で供給されうる。溶液は、2x、3x、4x、5x、10xまたは20xでありうる。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は、以下の段階により、固定組織試料からRNAを得るための方法に関する：(a)固定組織試料を、溶解産物を作製するために、ポリアニオンおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液と接触させる段階；(b)溶解産物からRNAを抽出する段階。特定の態様において、ポリアニオンは、クエン酸ナトリウムのようなポリカルボキシレートである。そのような方法は、パラフィンのような非反応物質に包埋されている場合もあるし、されていない場合もあるが、固定された生体試料に対して用いられうる。用語「接触させること」とは、溶液および試料が合わせられることを指しうる、その単純かつ通常の意味をもつと理解されるであろう。それはさらに、用語「インキュベートすること」、「曝露すること」、「浸漬すること」および「混合すること」を含むと理解されるであろう。
【００２４】
本発明のいくつかの態様において、固定組織試料および消化緩衝液の比は、約1グラムの組織/5 ml 消化緩衝液から約1グラムの組織/25 ml 消化緩衝液まで、または約1グラムの組織/10 ml 消化緩衝液から約1グラムの組織/20 ml 消化緩衝液までである。RNAが抽出される任意の生体試料の比は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約1グラムの組織対約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 mlもしくはそれ以上の消化緩衝液、またはそれらの中での任意の範囲であることが企図される。
【００２５】
固定組織は、任意の手段により固定されていてもよく、試料は、任意の生物供給源から得られていてもよい。試料はまた、パラフィンのような非反応物質に包埋されていてもよい。本発明はまた、細胞溶解産物を作製する前にその物質を除去する段階を含む。いくつかの態様において、当業者に周知のことであるが、パラフィンは、試料を、有機溶媒を含む溶液と接触させることにより除去される。
【００２６】
試料が本発明の消化緩衝液と接触する時間量は、約1時間〜約6時間または約4時間でありうる。時間の総計は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間および/もしくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48時間、またはそれ以上、またはそれらの中での任意の範囲でありうることが企図される。
【００２７】
試料および消化緩衝液は、以下の温度を含むか、または少なくとも以下の温度であるか、または多くとも以下の温度でお互いに接触しうる：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃またはそれらの中での任意の範囲。いくつかの態様において、温度は、約40℃と約55℃の間である。そのような温度は、全インキュベーション期間中、維持される場合もあるし、維持されない場合もある。
【００２８】
消化緩衝液とのインキュベーション後、溶解産物は、物理的または機械的装置によるようなホモジナイゼーションを受けうる。
【００２９】
本発明の追加の方法は、アルコールを含む溶液ならびに/または、フェノールおよび/もしくはクロロホルムのような非アルコール有機溶媒を含む溶液を用いて溶解産物からRNAを抽出することに関する。アルコール溶液は、少なくとも1つのアルコールを含むことが企図される。アルコール溶液は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100% アルコール、またはそれらの中での任意の範囲でありうる。特定の態様において、それは、溶解産物を約、少なくとも約、もしくは多くとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90%、またはそれらの中での任意の範囲のアルコール濃度をもつようにさせるために溶解産物へ添加される。特定の態様において、溶解産物へ添加されるアルコール量は、それを約33%のアルコール濃度をもつようにする。他の態様において、溶解産物を含む混合物へ添加されるアルコール量は、混合物における55% アルコールの濃度を与える。アルコールは、限定されるわけではないが、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、およびメタノールを含む。エタノールは、本発明の局面における使用として特に企図される。溶解産物からのRNA抽出は、本発明のいくつかの態様において、RNAをアルコールで沈殿させる段階を含む。小さなRNA分子を単離するための方法および組成物は、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第10/667,126号から得られうる。
【００３０】
非アルコール有機溶媒は、少なくとも1つの非アルコール有機溶媒を含むと理解されるが、それはまた、アルコールを含んでもよい。アルコール溶液に関する上記の濃度は、非アルコール有機溶媒を有する溶液の濃度に適用できる。特定の態様において、1)溶解産物、ならびに2)フェノールおよび/またはクロロホルムの等量が混合される。
【００３１】
いくつかの態様において、溶解産物を消化および/またはホモジナイズした後であり、さらなる単離手順の前に、他の化合物が添加され得る。特定の態様において、アルコールに加えて、塩が溶解産物に添加される。塩は、任意の塩でありうるが、ある態様において、塩は、グアニジニウムもしくはナトリウム、または両方の組み合わせである。溶解産物混合物へ添加される塩の量は、混合物における1つまたは複数の塩の濃度を、約、少なくとも約、もしくは多くとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5 Mまたはそれ以上、またはそれらの中の任意の範囲であるように与えうる。特定の態様において、グアニジニウムは、約0.5 Mと約3 Mの間のグアニジニウムの濃度を与えるように溶解産物へ添加される。従って、ホモジナイゼーション後に溶解産物へ添加されるグアニジニウムの量は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 Mまたはそれらの中で導き出せる任意の範囲であるグアニジニウムの濃度を与える。他の態様において、酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムのようなナトリウム塩もまた、約、少なくとも約、もしくは多くとも約0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 Mまたはそれらの中で導き出せる任意の範囲であるこの塩の濃度を与えるように、ホモジナイゼーション後に溶解産物へ添加される。ある態様において、さらなる単離手順の前に、以下が溶解産物に添加される：1容量 4Mグアニジウム、pH4の0.2容量 Naアセテート、次いで2.75容量（最終容量1.25）エタノール。
【００３２】
溶解産物からのRNAの抽出は、無機物支持体を用いることをさらに含みうる。本発明のいくつかの方法において、アルコールまたは非アルコール有機溶媒溶液と混合されている場合もあるし、混合されていない場合もある溶解産物が無機物支持体に適用され、RNAが支持体から溶出される。無機物支持体は、シリカを含む支持体を含む。いくつかの態様において、シリカはガラスである。支持体は、限定されるわけではないが、カラムおよびフィルターを含む。さらなる態様において、無機物支持体は、ガラス繊維のフィルターまたはカラムである。
【００３３】
または、いくつかの態様において、溶解産物からのRNAの抽出は、非シリカ支持体を含みうる。支持体は、非反応性物質、すなわち、単離または抽出されるべきRNAと化学的に反応しない物質を含みうる。そのような物質は、電気陰性基をもつ重合体または非重合体を含む。いくつかの態様において、物質は、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、メタクリレート、および/もしくはメタクリル酸メチルであるか、またはそれらを有する。
【００３４】
従って、本発明のいくつかの方法は、(c)溶解産物へアルコール溶液を添加する段階；(d)溶解産物を無機物支持体に適用する段階；および(e)無機物支持体からRNAを溶出溶液で溶出する段階を含む。無機物支持体は、溶解産物を適用した後に、1回、2回、3回、4回、5回またはそれ以上、洗浄されうる。洗浄溶液は、いくつかの態様において、アルコールを含み、一部の場合では、それはまた塩を含む。さらなる態様において、溶液は、約または少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%のアルコール濃度を含む。特定の態様において、アルコールはエタノールである。追加の態様において、洗浄溶液における塩濃度は、約、または少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0 M、またはそれ以上、またはそれらの中での任意の範囲である。洗浄は、周囲温度を含めて、約、または少なくとも約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115もしくは120℃、またはそれらの中で導き出せる任意の範囲である温度で実施されうる。
【００３５】
RNAは、無機物支持体から溶出溶液で溶出されうる。いくつかの態様において、溶出溶液は、EDTAを含む。溶出溶液におけるEDTAの濃度は、約0.01 mM〜約1.0 mMの間、または約0.05 mMと約0.5 mMの間である。特定の態様において、溶出溶液におけるEDTAの濃度は、約0.1 mMである。溶出溶液が添加される場合、溶出溶液および/もしくは無機物支持体は、室温でありうるか、または約80℃と約100℃の間の温度まで加熱されうる。いくつかの態様において、温度は、約、または少なくとも約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115もしくは120℃、またはそれらの中で導き出せる任意の範囲である。
【００３６】
RNAが抽出された後、個々のもしくは特定のRNA分子および/またはRNA分子のプールは（単離されたRNAの全集団と同様に）、追加の反応および/またはアッセイに供されうる。いくつかの場合では、これらの反応および/またはアッセイは、RNAの、またはRNAから生成されたDNA分子の増幅を含む。例えば、RT-PCRは、特徴付けられうる分子を生成するために用いられうる。
【００３７】
いくつかの態様において、特定のRNA分子またはRNA集団は、定量化され得、特に完全長RNAである。定量化は、1つもしくは複数の増幅反応またはRNaseプロテクションアッセイ法を含むもののような、当業者に公知の任意の手順を含む。これらの手順は、定量的逆転写酵素-PCR(qRT-PCR)を含む。いくつかの態様において、単離されたRNAの特徴付けが行われる。cDNA分子は、抽出されたRNAから生成される。他の特徴付けおよび定量化アッセイ法は、本発明の一部として企図される。本発明の方法および組成物は、完全長RNAが定量化および特徴付けされるのを可能にする。
【００３８】
RNAはまた、アレイにおいて、またはアレイで用いるcDNAを生成するために用いられうる。他のアッセイ法は、分光測光法、電気泳動法およびシーケンシング法の使用を含む。
【００３９】
本発明はまた、上記で考察された方法を実行するためのキットおよび/または上記で考察された組成物を含むキットを含む。いくつかの態様において、本発明のキットは、以下のもの(上記で考察された組成物と一致している)の1つまたは複数を含む：ポリカルボキシレートおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液；ガラス繊維フィルターまたはカラム；溶出緩衝液；洗浄緩衝液；アルコール溶液；リボヌクレアーゼ阻害剤；ならびにcDNA構築試薬(逆転写酵素のような)；RNAの増幅のための試薬。
【００４０】
本発明の組成物および/または方法に関して考察された任意の態様、加えて実施例における任意の態様は、キットの一部であるように特に企図されている。
【００４１】
本明細書に記載された任意の方法または組成物の任意の態様は、本明細書に記載された任意の方法または組成物の任意の他の態様に関して実行されうることが企図される。
【００４２】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明確に示されていない限り、または代替物が相互排除的でない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、開示は、代替物のみを指す定義と「および/または」を支持する。
【００４３】
本出願を通して、用語「約」は、値が、その値を測定するために用いられる装置または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００４４】
長年に渡る特許法に従って、特許請求の範囲または明細書において語「含むこと」と共に用いられる場合の語「1つの(a)」および「1つの(an)」は、明確に言及されない限り、1つまたは複数を示す。
【００４５】
本発明の他の対象、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を示しているとはいえ、本発明の真意および範囲内の様々な変化および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるであろうことから、例証としてのみ与えられることは理解されるべきである。
【００４６】
例証的態様の説明
本発明は、固定組織から高品質(完全長RNAのような)および高収率でRNAを単離するためにポリカルボン酸の存在下でプロテイナーゼKを用いる最適化された手順を提供することにより、当技術分野において公知であるようなRNA単離の現行の手順の欠点を克服する。
【００４７】
I. RNAを含む組織試料の固定化
本発明の手順として企図されているような組織試料は、固定組織試料である。用いられうる固定液は、限定されるわけではないが、沈殿剤、または非沈殿剤の固定液を含みうる。2つの一般に用いられる固定剤は、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドである。しかしながら、他の固定液が、組織試料を固定する際に用いられ、これらは、限定されるわけではないが、酢酸、ホルマリン、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、三酸化クロム、エタノール、塩化第二水銀、メタノール、グルタルアルデヒド、およびピクリン酸を含む。固定液およびそれらの使用の例は、Sambrook et al. (2000); Maniatis et al. (1989); Ausubel et al. (1994); Jones et al. (1981); 米国特許第5,260,048号、第4,946,669号、第5,196,182号に見出され、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている。
【００４８】
組織試料は、約1時間、約2時間、約4時間、約6時間、約8時間、約10時間、約12時間、もしくはそれ以上の時間；または約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、もしくは約1週間、約2週間、約3週間；または約1ヶ月、約2ヶ月、約4ヶ月、約6ヶ月、約8ヶ月、約10ヶ月；または約1年もしくはそれ以上の年の間、固定されうる。
【００４９】
固定組織試料の例は、限定されるわけではないが、心臓、脳、精巣、肺、骨格筋、ならびに脾臓、肝臓および腎臓を含む。
【００５０】
さらになお、固定組織は、パラフィンのような非反応性物質に包埋される場合もあるし、包埋されない場合もある。本発明の方法および組成物は、それが包埋されていようがされていまいが、任意の固定された細胞または組織試料に適用されうる。
【００５１】
II. 消化緩衝液
消化緩衝液は、細胞の構成要素を分解するために用いられる。固定組織試料は、RNAの抽出および分析の前に消化されうることが、本発明において企図される。これを達成するために、様々な消化緩衝液が用いられ、様々な濃度およびpHの様々な成分が、溶解産物を作製するために消化緩衝液に用いられうる。
【００５２】
消化緩衝液のような緩衝液を作製する際用いられる様々な基剤は、当技術分野において周知である。消化緩衝液は、Tris、TrisHCl、Trisホウ酸、Hepes、またはリン酸緩衝基剤を含みうるが、そのようなものに限定されるわけではない。そのような基剤はさらに、約10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250 mMまたはそれ以上の濃度を含みうる。そのような基剤は、様々なpHでありうる。
【００５３】
消化緩衝液またはその成分のpHは、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5またはそれ以上でありうる。
【００５４】
限定されるわけではないが、NaCl、LiCl、またはKClのような、塩は、消化緩衝液に用いられうる。これらの塩はまた、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000 mM、またはそれ以上の様々な濃度で消化緩衝液に含まれうる。一部の場合では、塩は用いられない。適切な緩衝液のリストおよび消化緩衝液を作製する方法について、例えば、Harlow and Lane (1988); Sambrook et al. (2000); Maniatis et al. (1989)を参照されたい。
【００５５】
様々な界面活性剤が、固定組織試料から溶解産物を作製するために消化緩衝液に用いられうる。界面活性剤は、陰イオン性および陽イオン性界面活性剤を含むイオン性、または非イオン性でありうる。非イオン性界面活性剤の例は、Triton X系(Triton X-100、Triton X-100R、Triton X-114、Triton X-450、Triton X-450R)のようなトリトン、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン(9)ドデシルエーテル、ジギトニン、IGEPAL CA630、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド(βOG)、n-ドデシル-β、C12EO7、Tween 20、Tween 80、ポリドカノール、n-ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)、NP-40、C12E8(オクタエチレングルコールn-ドデシルモノエーテル)、ヘキサエチレングリコールモノ-n-テトラデシルエーテル(C14EO6)、オクチル-β-チオグルコピラノシド(オクチルチオグルコシド、OTG)、エマルゲン(Emulgen)、およびポリオキシエチレン10ラウリルエーテル(C12E10)を含む。イオン性界面活性剤(陰イオン性または陽イオン性)の例は、デオキシコレート、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、N-ラウリルサルコシン、および臭化セチルメチルアンモニウム(CTAB)を含む。いくつかの態様において、尿素が、消化緩衝液において、別の界面活性剤の有無にかかわらず、添加されうる。界面活性剤は、少なくとも0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、10%、20%またはそれ以上のような様々な濃度でありうる。消化緩衝液に用いられうる界面活性剤の例は、Harlow and Lane (1988); Sambrook (2000); Maniatis et al. (1989)に見出され、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている。
【００５６】
消化はさらに、溶解産物の品質を向上させるために、複数の酸性基を有するポリアニオンを含む。そのようなポリアニオンは、限定されるわけではないが、トランス-アコニット酸；1,2,4-ブタントリカルボン酸；1,4-シクロヘキサンジカルボン酸；1,2,3,4,5,6-シクロヘキサンヘキサカルボン酸；1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸；イソクエン酸；トリカルバリル酸；コハク酸；およびグルタル酸を含みうる。
【００５７】
消化緩衝液はさらに、細胞における核酸を単離するために細胞を溶解するプロテアーゼまたはペプチダーゼを含みうる。プロテアーゼは、タンパク質鎖の末端からアミノ酸を切り離すエキソペプチダーゼか、またはタンパク質内のペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼのいずれかである。典型的には、プロテアーゼはさらに、セリンプロテアーゼ(例えば、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、サブチリシン、およびプロテイナーゼK)；システイン(チオール)プロテアーゼ(例えば、ブロメライン、パパイン、カテプシン、寄生虫のプロテアーゼ、および細菌毒性因子)；アスパラギン酸プロテアーゼ(例えば、ペプシン、カテプシン、レニン、真菌およびウイルスのプロテアーゼ)；ならびにメタロプロテアーゼ(例えば、サーモリシン)のように、機構により分類される。プロテイナーゼKは、市販されており、ほんの少しの切断特異性しかもたない非常に耐熱性のプロテアーゼであると理解されているように、核酸単離および抽出手順に容易に用いられる。プロテイナーゼKの市販調製物に関して、最終濃度は、典型的には、0.05〜1.0 mg/mlの範囲である。溶解されるべき試料の関連においてのプロテイナーゼKの最終濃度は、約、多くとも約、または少なくとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50 mg/ml、またはそれ以上でありうることが企図される。
【００５８】
III. RNA抽出手順
本発明はさらに、パラフィン包埋組織からRNAを単離する方法を提供する。全RNAを単離するための多くの方法は、当業者に周知である。例えば、Chomczynski and Sacchi (1987)を参照されたい。この課題を達成するための方法は、全RNAを抽出しうるTrizol試薬(Gibco Life Technologies)の使用を用いる場合がある。Trizol手順は、ブレンダーにおける試料のホモジナイゼーション、続いてフェノールを主成分とするTrizol試薬での抽出を含む。その後、RNAは、イソプロピルアルコールで沈殿し、リボヌクレアーゼを含まない水または0.5% SDSに再溶解される前にエタノールで洗浄される。
【００５９】
他の方法は、RNAzol(Gibco BRL)、TriReagent(商標)(Molecular Science)、QiagenのRNEasy Total RNA Isolationキット(Qiagen)、Quickprep(商標)Total RNA Extractionキット(Amersham Bioscience)、またはRNAの単離のための任意の他の製造プロトコールのような当技術分野において公知の製品の使用を用いうる。RNA抽出の他の方法は、限定されるわけではないが、チオシアン酸グアニジンおよびトリフルオロ酢酸セシウム(CSTFA)方法、塩酸グアニジニウム方法、または塩化リチウム-SDS-尿素方法を含む。RNA抽出の方法の例として、Sambrook et al. (2000); Maniatis et al. (1989); Ausubel et al. (1994)を参照されたい。
【００６０】
RNAは、様々な固定組織試料から抽出されうる。そのような組織試料は、脳、頭、首、胃腸管、肺、肝臓、膵臓、乳房、精巣、子宮、膀胱、腎臓、心臓の組織を含みうるが、そのような組織に限定されるわけではない。
【００６１】
固体支持体はまた、固定組織試料からRNAを抽出するために、および抽出されたRNAを維持または保存するために用いられうる。そのような固体支持体は、限定されるわけではないが、スピン、カラム、スピンフィルター、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、溶出カラムもしくは装置、濾過カラムもしくは装置、注射器および/または他の容器手段を含みうる。そのような支持体はさらに、プラスチックもしくはガラスビーズ、またはセルロースのような重合体を含みうる。例えば、Sambrook et al. (2000)またはManiatis et al. (1989)を参照されたい。
【００６２】
IV. 固定組織試料由来のRNAの使用
A. 固定組織試料由来のRNAの定量化
固定組織試料から得られたRNAは、様々な方法により分析または定量化されて、完全長生成物が得られていることを確かめうる。RNAを定量化または分析する方法が、本明細書に提供されている。RNAを定量化または分析するための一般的な方法は、Sambrook et al. (2000)またはManiatis et al. (1989)に見出されうる。下記に提供されているのは、固定組織試料由来のRNAを用いることについての例であるが、これらの例は、限定を意味するものではない。
【００６３】
1. 定量的PCR
本発明は、試料におけるRNAを定量化するための定量的PCR−より具体的には、定量的RT-PCR−に頼る。方法は、半定量的または完全定量的でありうる。
【００６４】
2つのアプローチ、競合定量的PCR(商標)およびリアルタイム定量的PCR(商標)は、両方とも、標準RNAの段階希釈物の増幅から作図された標準曲線との比較により試料における標的遺伝子濃度を測定する。しかしながら、それらは、これらの標準曲線がどのように作成されるかにおいて実質的に異なる。競合QPCRにおいて、内部競合物質RNAは、段階希釈された標準試料および未知の(環境の)試料の両方へ既知の濃度で添加される。共増幅後、内部競合物質および標的PCR(商標)産物の比率が、標準希釈物および未知試料の両方について計算され、標準希釈物の最初のRNA濃度に対する競合-標的PCR(商標)産物比率をプロットする標準曲線が作図される。競合物質およびRNAの等しい増幅効率を仮定すれば、環境試料における後者の濃度は、この標準曲線から外挿されうる。
【００６５】
リアルタイムQPCRにおいて、増幅産物の蓄積は、RNAの標準希釈物および未知量のRNAを含む試料の両方において連続的に測定される。標準曲線は、産物の特定の閾値を生じるために必要なPCR(商標)サイクルの数(Ct)と、標準試料における最初の鋳型濃度を相関させることにより作図される。試験試料において、標的PCR(商標)産物蓄積は、標準曲線からの標的RNA濃度の内挿を可能にする同じCt後に測定される。リアルタイムQPCRは、日常的分析中にRNAのより迅速かつ容易な測定を可能にするのだが、競合QPCRは、依然として、環境試料における定量化についての重要な代替法のままである。標的RNAとの既知量の競合物質RNAの共増幅は、標準希釈物に明らかに存在しない阻害性基質および大量のバックグラウンドRNAの存在による増幅効率のサンプル間の変動を修正しうる直観的な方法である。
【００６６】
QPCRのもう一つの型は、定量的に応用されたPCR(商標)である。しばしば、「相対定量的PCR」と呼ばれるが、この方法は、特定の核酸の相対濃度を測定する。本発明に関して、RT-PCRは、固定組織試料から単離されたRNA試料に実施される。
【００６７】
PCR(商標)において、増幅されるRNAの分子の数は、いくつかの試薬が限界になるまで、反応のサイクルごとにほぼ2に等しい率で増加する。その後は、増幅率は、サイクル間で増幅された標的の増加がないところまで、ますます減少していく。サイクル数がX軸にあり、増幅されたRNAの濃度の対数がY軸にあるグラフがプロットされる場合には、特徴のある形の曲線が、プロットされた点を接続することにより形成される。第一サイクルから始まり、線の傾きは、正で一定である。これは、曲線の直線部であると言われる。試薬が限界になった後、線の傾きは、減少し始めて、最後にはゼロになる。この点における増幅RNAの濃度は、ある固定値に漸近する。
【００６８】
PCR(商標)増幅の直線部におけるRNAの濃度は、反応が始まる前の標的の出発濃度に正比例する。同じ数のサイクルを完了し、かつそれらの直線的範囲である、PCR(商標)反応におけるRNAの増幅産物の濃度を測定することにより、最初のRNA混合物における特定の標的配列の相対的濃度を測定することが可能である。RNA混合物が、異なる組織から単離されたRNAから合成されたcDNAである場合には、標的配列が導き出された特定のmRNAの相対存在量が、それぞれの組織について測定されうる。PCR(商標)産物の濃度と相対的RNA存在量の間のこの正比例は、PCR(商標)反応の直線範囲においてのみ真実である。
【００６９】
曲線の平坦部におけるRNAの最終濃度は、反応混合物の試薬の可用度により決定され、標的DNAの最初の濃度とは無関係である。それゆえに、RNA種の相対存在量がRNA集団の収集物についてRT-PCRにより測定されうる前に満たされなければならない第一条件は、増幅されたPCR(商標)産物の濃度は、PCR(商標)反応がそれらの曲線の直線部にある場合にサンプリングされなければならないことである。
【００７０】
特定のRNA種の相対存在量を測定することに成功するために定量的RT-PCR実験について満たされなければならない第二条件は、増幅可能なcDNAの相対濃度は、ある独立標準に対して正規化されなければならないことである。RT-PCR実験の目的は、試料におけるすべてのRNA種の平均存在量に対する特定のRNA種の存在量を測定することである。
【００７１】
競合PCR(商標)についてのたいていのプロトコールは、およそ標的と同じ存在量である内部PCR(商標)標準を利用する。PCR増幅の産物がそれらの直線相中にサンプリングされる場合には、これらのストラテジーは有効である。反応が平坦相に近づきつつある場合に産物がサンプリングされる場合には、少ない方の存在量の産物は、相対的に、過剰に表示されるようになる。示差的な発現についてRNA試料を調べる場合のような、多くの異なるRNA試料についてなされた相対存在量の比較は、RNAの相対存在量における差を、それらが実際にあるより少なく発現させるように変形させることになる。これは、内部標準が標的よりずっと豊富にある場合には、重大な問題ではない。内部標準が標的より豊富である場合には、直接的線形比較がRNA試料間でなされうる。
【００７２】
上記の論考は、臨床的に得られた材料のRT-PCRアッセイ法についての理論考察を記載している。臨床試料に内在する問題は、それらが変わりやすい量であること(正規化を問題のあるものにする)、およびそれらが変わりやすい品質であること(信頼性のある内部対照、好ましくは標的より大きいサイズの共増幅を必要とする)である。内部標準が標的cDNA断片より大きい増幅可能なcDNA断片であり、かつ内部標準をコードするRNAの存在量が、標的をコードするRNAよりおおよそ5〜100倍高い、内部標準との相対定量的RT-PCRとして、RT-PCRが実行される場合には、これらの問題の両方ともが克服される。このアッセイは、それぞれのRNA種の絶対存在量ではなく、相対存在量を測定するものである。
【００７３】
他の試験は、外部標準プロトコールでのより伝統的な相対定量的RT-PCRアッセイ法を用いて実施されうる。これらのアッセイ法は、それらの増幅曲線の直線部においてPCR(商標)産物をサンプリングする。サンプリングについて最適であるPCR(商標)サイクルの数は、各標的cDNA断片について経験的に決定されなければならない。さらに、様々な組織試料から単離された各RNA集団の逆転写酵素産物は、等濃度の増幅可能なcDNAについて注意深く正規化されなければならない。アッセイは、絶対mRNA存在量を測定するため、この考慮は、非常に重要である。絶対RNA存在量は、正規化された試料においてのみ、示差的な遺伝子発現の測定として用いられうる。増幅曲線の直線範囲の経験的決定およびcDNA調製物の正規化は、単調で時間のかかる過程であるが、その結果生じるRT-PCRアッセイ法は、内部標準での相対定量的RT-PCRアッセイ法から導かれるものより優秀でありうる。
【００７４】
この優位性の一つの理由は、内部標準/競合物質なしに、試薬のすべてが、増幅曲線の直線範囲における単一PCR(商標)産物へ変換されることができ、それに従って、アッセイの感度を増加させることである。もう一つの理由は、たった1つのPCR産物で、電気泳動ゲル上での産物のディスプレイまたは別のディスプレイ方法が、より複雑ではなくなり、バックグラウンドがより少なく、かつ解釈するのがより容易であることである。
【００７５】
2. 変性アガロースゲル電気泳動
固定組織試料から抽出されたRNAは、変性ゲルシステムを用いるアガロースゲル電気泳動により定量化されうる。いずれの異常な結果も、ゲルに関する問題または分析中のRNAに関する問題に起因しうるため、陽性対照はゲル上に含まれるべきである。RNA分子量マーカー、無傷であることがわかっているRNA試料、または両方は、この目的のために用いられうる。濃縮手順に用いられた出発RNAの試料を含むこともいい考えである。
【００７６】
ノーザンブロッティングのためのAmbionのNorthernMax(商標)試薬は、変性アガロースゲル電気泳動に必要とされるすべてを含む。これらの製品は、使いやすさ、安全性、および低バックグラウンドについて最適化されており、それらは、使用の詳細な説明書を含む。NorthernMax(商標)試薬を用いることの代替法は、参照により本明細書に組み入れられているが、「Current Protocols in Molecular Biology」、セクション4.9(Ausubel et al., 1994)に記載された手順を用いることである。それは、Northern-Max方法より困難でかつ時間がかかるが、類似した結果を与える。
【００７７】
3. Agilent 2100 Bioanalyzer
固定組織試料から抽出されたRNAはまた、キャピラリー電気泳動システムを用いる電気泳動の手順により分析されうる。本発明において、Caliper RNA 6000 LabChip KitおよびAgilent 2100 Bioanalyzerが用いられる。このシステムは、50 ng/μlと250 ng/μlの間の濃度におけるRNA溶液で最も良く実行する。典型的な濃縮されたRNA試料の1 μlを添加することが、通常、優良な実行のために適切である。RNA分析についてRNA 6000 LabChip Kitと共に提供されている使用説明書に従う。
【００７８】
4. UV吸光度によるRNA収量の評価
RNAの濃度および純度は、調製物のアリコートをTE(10 mM Tris-HCl、pH 8、1 mM EDTA)または水に希釈し(通常は、1:50〜1:100希釈)、分光光度計において260 nmおよび280 nmで吸光度を読み取ることにより、測定されうる。
【００７９】
1のA260は、40 μg RNA/mlに相当する。RNAの濃度(μg/ml)は、それゆえに、A260 × 希釈係数 × 40 μg/mlと掛け算することにより計算される。以下は典型的な例である。
【００８０】
10 μg 全RNAからの典型的収量は、3〜5 μgである。試料が25 μlに再懸濁される場合、これは濃度が120 ng/μlと200 ng/μlの間で変動することを意味している。プレップの1 μlを、49 μlのTEへ1:50に希釈する。A260 = 0.1。RNA濃度 = 0.1 × 50 × 40 μg/ml = 200 μg/mlまたは0.2 μg/μl。濃度を測定するために1 μlを使った後に残っているプレップの24 μlがあるので、残りのRNAの総量は、24 μl × 0.2 μg/μl = 4.8 μgである。
【００８１】
5. RiboGreen(登録商標)でのRNA収量の評価
蛍光に基づいたアッセイ法もまた、RNAの定量化に用いられうる。例えば、Molecular ProbesのRiboGreen(登録商標)RNA定量化のための蛍光に基づいたアッセイ法は、RNA濃度を測定するために用いられうる。RiboGreen試薬は、核酸を結合するにおいて>1000倍の蛍光増感および高量子収量(0.65)を示し、フルオレセインに近い励起および発光極大値をもつ。結合されていない色素は、本質的に非蛍光性であり、大きな吸光係数をもつ(67,000 cm-1 M-1)。RiboGreenアッセイ法は、標準蛍光計、フィルター蛍光計、または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、1.0 ng/ml RNAほどの検出を可能にする−臭化エチジウムで達成される感度を200倍、上回る。RiboGreen試薬についての直線定量化範囲は、RNA濃度において3桁に及ぶ。
【００８２】
B.固定組織試料由来RNAの他の使用
固定組織から得られたRNAは、マイクロアレイテクノロジーを用いて分析されうる。例えば、遺伝子アレイのようなアレイは、遺伝子特異的プローブのコレクションが定められた位置にスポットされている固体支持体である。プローブは、RNA試料のような核酸試料の集団からハイブリダイゼーションにより相補的な標識された標的を限局化する。遺伝子アレイについての最も一般的な使用の一つは、RNA集団の全体的な発現パターンの比較である。典型的には、2つまたはそれ以上の組織試料から単離されたRNAが用いられうる。RNAは、標識されたcDNA集団を産生するために、標識ヌクレオチドおよび標的特異的、オリゴdT、またはランダム配列のプライマーを用いて逆転写される。cDNAは、鋳型RNAから変性され、同一のアレイにハイブリダイズする。各アレイにおけるハイブリダイズしたシグナルは、検出および定量化される。各遺伝子特異的スポットから放射されるシグナルは、集団間で比較される。試料における異なるレベルで発現された遺伝子は、異なる量の標識cDNAを生成し、これは、結果として、異なる量のシグナルをもつアレイ上のスポットを生じる。
【００８３】
RNA集団の標識cDNAへの直接的変換は、それが簡単かつおおむね酵素的偏向による影響がないため、広く用いられる。しかしながら、直接的標識は、中程度にまれな標的がアレイ分析により検出されるのに十分な標識産物を生じるために大量のRNAを必要とする。たいていのアレイプロトコールは、2.5 gのポリAまたは50 gの全RNAを逆転写に用いることを推奨している(Duggan, 1999)。この多くのRNAを単離することができない研究者について、全体的な増幅手順が用いられてきた。
【００８４】
これらの全体的な増幅スキームで最もよく引用されるのは、アンチセンスRNA(aRNA)増幅である(米国特許第5,514,545号および第5,545,522号)。アンチセンスRNA増幅は、5'末端にT7 RNAポリメラーゼコンセンサスプロモーター配列のような転写プロモーターを有するオリゴdTプライマーでRNA試料を逆転写することを含む。第一鎖逆転写は、一本鎖cDNAを生成する。第一鎖cDNA合成後、cDNAにハイブリダイズする鋳型RNAは、部分的に分解されて、RNAプライマーを生じる。RNAプライマーは、次いで、転写プロモーターを有する二本鎖DNAを生成するように伸長される。集団は、適切なRNAポリメラーゼで転写されて、cDNA由来の配列を有するRNA集団を生じる。転写は、各DNA鋳型から生成される何十〜何千個というRNAを生じるため、実質的な増幅は達成されうる。RNAは、転写中に標識されて、アレイ分析に直接的に用いられうるか、または標識されていないaRNAは、標識dNTPで逆転写されて、アレイハイブリダイゼーションのためのcDNA集団を生じうる。いずれの場合においても、標識された標的の検出および分析は当技術分野において周知である。用いられうる増幅の他の方法は、限定されるわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標)と呼ばれている；米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号、ならびにInnis et al., 1988を参照されたい)；および欧州特許出願第320,308号、米国特許第4,883,750号、第5,912,148号に開示されたリガーゼ連鎖反応(「LCR」)を含む。PCT出願第PCT/US87/00880号に記載された、Qβレプリカーゼもまた、増幅方法として用いられうる。RNAのような核酸の増幅のための方法は、米国特許第5,843,650号、第5,846,709号、第5,846,783号、第5,849,546号、第5,849,497号、第5,849,547号、第5,858,652号、第5,866,366号、第5,916,776号、第5,922,574号、第5,928,905号、第5,928,906号、第5,932,451号、第5,935,825号、第5,939,291号、第5,916,779号および第5,942,391号、英国特許出願第2 202 328号に、ならびにPCT出願第PCT/US89/01025号、PCT出願第WO 89/06700号、PCT出願第WO 88/10315号、欧州特許出願第329 822号、Kwoh et al., 1989; Frohman, 1994; Ohara et al., 1989;およびWalker et al., 1992に開示されており、それぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００８５】
cDNAライブラリーもまた構築され、固定組織試料から抽出されたRNAに関して分析するために用いられうる。そのようなライブラリーの構築およびそのようなライブラリーを用いるRNAの分析は、Sambrook et al. (2000); Maniatis et al. (1989); Efstratiadis et al. (1976); Higuchi et al. (1976); Maniatis et al. (1976); Land et al. (1981); Okayama et al. (1982); Gubler et al. (1983); Ko (1990); Patanjali et al. (1991); 米国特許出願第20030104468号に見出され、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている。
【００８６】
本発明の方法およびキットは、大量スクリーニングのために用いられうる。RNAまたはDNAのライブラリーは、本発明の方法および組成物を用いて作製されうる。このライブラリーは、その後、マイクロアレイを含む高処理量アッセイ法に用いられうる。本発明者らにより特に企図されることは、Hacia et al. (1996)およびShoemaker et al. (1996)により記載されるようなチップに基づいた核酸テクノロジーである。簡単には、これらの技術は、多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的方法を含む。固定プローブアレイを使用することにより、高密度アレイとして標的分子を分離し、これらの分子をハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングするチップテクノロジーを用いることができる(Pease et al., 1994;およびFodor et al., 1991も参照されたい)。本明細書に用いられる場合の用語「アレイ」は、核酸の組織的な配列を指す。例えば、望ましい供給源(例えば、ヒト成人脳)を代表する核酸集団は、望ましいスクリーニング手順が標的遺伝子を検出するかもしくは枯渇させるように利用され得、かつ単一のマルチウェルのプレートへ分配されうる最小数のプールへと分けられる。アレイは、以下のものを含む、望ましいmRNA供給源から得られる核酸集団の水性懸濁液からなりうる：複数の個々のウェルを含むマルチウェルプレートで、個々のウェルはそれぞれ、核酸集団の異なる内容の水性懸濁液を含んでいる。アレイ、それらの使用、およびそれらの実行の例は、米国特許第6,329,209号、第6,329,140号、第6,324,479号、第6,322,971号、第6,316,193号、第6,309,823号、第5,412,087号、第5,445,934号、および第5,744,305号に見出され得、それらは参照により本明細書に組み入れられている。
【００８７】
マイクロアレイは、当技術分野において公知であり、配列において遺伝子産物(例えば、cDNA、mRNA、cRNA、ポリペプチド、およびそれらの断片)に対応するプローブが、既知の位置で、特異的にハイブリダイズまたは結合することができる表面からなる。一つの態様において、マイクロアレイは、各位置が、遺伝子によりコードされる産物(例えば、タンパク質またはRNA)についての別々の結合部位を表し、かつ結合部位が、生物体のゲノムにおける大部分またはほとんど全ての遺伝子の産物について存在しているアレイ(すなわち、行列)である。好ましい態様において、「結合部位」(以下、「部位」)は、特定の同族cDNAが特異的にハイブリダイズできる核酸または核酸類似体である。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、完全長cDNA、完全長未満のcDNA、または遺伝子断片でありうる。
【００８８】
核酸または類似体は、ガラス、プラスチック(例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製されうる固体支持体に付着している。核酸を表面へ付着させるための好ましい方法は、Schena et al., 1995aにより一般的に記載されているように、ガラスプレート上にプリントすることによる。DeRisi et al., 1996; Shalon et al., 1996；Schena et al.,1995bも参照されたい。例えば、マスキングによるマイクロアレイを作製するための他の方法(Maskos et al., 1992)もまた用いられうる。原則として、任意の型のアレイ、例えば、ナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット（その全体が全目的のために組み入れられる、Sambrook et al.,1989を参照されたい）が用いられうるが、当業者により認識されているように、非常に小さなアレイは、ハイブリダイゼーション容量がより小さいため好ましいだろう。
【００８９】
バイオチップの使用もまた企図され、標識された分子または分子のプールの、バイオチップ上に固定された標的へのハイブリダイゼーションを含む。
【００９０】
V. キット
本発明のさらなる態様において、固定組織試料からの完全長RNAの単離のためのキットが提供されている。本明細書に記載された組成物のいずれかがキットに含まれうる。非限定的例において、組織試料を固定する、固定組織試料からRNAを消化および抽出するため、ならびに得られたRNAを分析または定量化するための試薬がキットに含まれうる。従って、キットは、適切な容器手段に、本明細書に開示された試薬のいずれかを含む。それはまた、消化緩衝液または抽出緩衝液のような1つまたは複数の緩衝液、および結果生じたRNAを単離するための成分を含みうる。組織を固定するための試薬および組織を包埋するための試薬もまた、キットに含まれうる。
【００９１】
キットの成分は、水性媒体中、または凍結乾燥された形態のいずれかでパッケージされうる。キットの容器手段は、一般的に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器手段を含み、その中へ、成分が配置され得、好ましくは適切に等分されうる。キットに複数の成分がある場合(それらは、いっしょにパッケージされうる)、キットはまた、一般的に、第二、第三、または追加の成分が別々に配置されうる他の追加の容器を含む。しかしながら、成分の様々な組み合わせは、バイアル中に含まれうる。本発明のキットはまた、典型的には、委託販売として厳重な制限下における、RNAを収容できる手段および任意の他の試薬容器を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形または中空成形プラスチック容器を含みうる。キットの成分が1つおよび/または複数の液体溶液中で供給される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。
【００９２】
しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として供給されうる。試薬および/または成分が乾燥粉末として供給される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により元に戻されうる。溶媒はまた、別の容器手段において供給されうることが構想される。容器手段は、一般的に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、および/または他の容器手段を含み、それらの中へ核酸製剤が配置され、好ましくは適切に割り当てられる。キットはまた、滅菌した、薬学的に許容される緩衝液および/または他の希釈剤を収容できる第二の容器手段を含みうる。
【００９３】
そのようなキットはまた、抽出されたRNAの単離を容易にする成分を含みうる。それはまた、RNAを保存もしくは維持するか、またはその分解から保護する成分を含みうる。そのような成分は、RNAseを含まないものでありうるか、またはRNAseから保護しうる。そのようなキットは、一般的に、適切な方法で、個々の試薬または溶液ごとに別々の容器を含む。
【００９４】
キットはまた、キット成分を用いるため、およびキットに含まれない任意の他の試薬の使用のための使用説明書を含む。使用説明書は、実行されうる変化を含みうる。
【００９５】
VI.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。後に続く実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分機能しうる、本発明者らにより発見された技術を代表しており、従って、その実施についての好ましい様式を構成するとみなされうることは、当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を鑑みれば、多くの変化が、開示されている特定の態様においてなされ、かつなお、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似した結果を得ることができることは、認識すべきである。
【００９６】
実施例1
手順
RNAを含む組織の固定化
2つの固定剤、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドが試験された。パラホルムアルデヒドは、リン酸緩衝食塩水(PBS、50 mM リン酸Na緩衝液、pH 7.5、150 mM NaCl)中に4% 最終濃度で用いられ、ホルムアルデヒドは、類似した緩衝液(「10% 中性緩衝ホルマリン」、NBF、Protocol(商標)Formalin(カタログ番号305-510)、Fisher Diagnostics, Middletown, VAから)中に3.7% 最終濃度で用いられた。いずれの固定液についても、用いられた固定手順は、特定された時間の間、0〜8℃で、屠殺されたばかりのマウスから切除された組織の試料を浸漬することを必要とした。固定の時間は、各試料において特定される。試料は、固定液中に保存されるか、または標準方法においていくつかの変化のエタノールおよびキシレンの通過後、パラフィンブロックへ移されるかのいずれかであった。組織試料は、以下の溶液において脱水された：
i)  70% エタノール  1時間、
ii)  80% エタノール  1時間、
iii)  90% エタノール  1時間、
iv)  100% エタノール(I)  2時間、
v)  100% エタノール(II)  2時間、
vi)  100% エタノール(III)  一晩。
この手順後に、以下の溶液中における組織のクリアリングおよび包埋の段階が続いた：
i)  エタノール/キシレン(1:1)  1時間、
ii)  キシレン  2時間、
iii)  キシレン  2時間、
iv)  キシレン/パラフィン(1:1、55〜60℃)  2時間、
v)  パラフィン；55〜60℃  2時間、
vi)  パラフィン；55〜60℃  2時間、
vii)  パラフィン；55〜60℃  1時間。
最終段階は、パラフィン型におけるパラフィンでのブロックの包埋を含んだ。これは、試料が少なくとも半年間、安定であることを可能にした。
【００９７】
RNA抽出
パラフィンからの抽出について、組織は、50℃で5分間、2つの変化のキシレンに浸漬され、その後、試料は、消化緩衝液中に置かれた。固定液にまだ保存された組織について、試料は、以下のとおり、一連のエタノール溶液に浸漬された：組織は、氷上であらかじめ冷却された30% EtOHの2〜5 ml中へ置かれ(より大きい組織は5 mlを必要とする)、氷上で10 min、インキュベートされ、その後、氷上であらかじめ冷却された40% EtOHの同じ容量へ移され、さらに10 min、氷上でインキュベートされた。この過程は、10%増加していく増加量のEtOHで、100%に達するまで繰り返された。組織は、4℃で少なくとも一晩、100% EtOHに浸漬された。最終段階において、組織は、溶液(EtOH、ホルマリン、またはキシレン)から取り出され、ペーパータオル上で乾燥させられた。その後、組織試料は、200 mM TrisCl、pH 7.5、200 mM NaCl、10 mM クエン酸Na、2% SDSおよび0.5 mg/ml PKを含む消化緩衝液へ移された。
【００９８】
組織対消化緩衝液の比は、1:10〜20の範囲に収まった。試料は、試料が完全に分散するまで、通常には10〜30 s、ホモジナイズされた。これは、高速度でのローター-ステーターホモジナイザーで、最も便利に実施された。その後、試料は、プロテイナーゼKがタンパク質の大部分を消化して除去することを可能にする1〜6時間の有効範囲をもって、4時間、50〜52℃でインキュベートされた。このインキュベーション後、溶解産物は、100% EtOHの2分の1容量の添加により、エタノールにおいて33%にされた。または、インキュベーション後、グアニジニウムおよび酢酸ナトリウム(pH 4)のようなナトリウム塩が、約2 M グアニジニウム(400 μlの4 M GuSCNが400 μl 溶解産物へ添加される)および約0.1 Mと0.2 Mの間の酢酸ナトリウム(2 M 酢酸ナトリウム、pH 4の80 μlが400 μl 溶解産物へ添加された)の濃度を生じるように溶解産物へ添加された；その後は、エタノールが、可溶化混合物をガラス繊維フィルターに適用する前に、55% エタノールである溶液を生じるように添加された(1.1 ml エタノール)。
【００９９】
試料は、混合され、その後、RNAqueousガラス繊維フィルターに適用され、室温(RT)で1 min、最大限(13,200 rpm)で回転させられた。フロースルーは捨てられた。700 μl 洗浄溶液1(1.6 M チオシアン酸グアニジニウム、0.2% N-ラウリルサルコシン、10 mM クエン酸ナトリウム、40 mM 2-メルカプトエタノール、0.3 M 酢酸ナトリウム、pH 7.2)がフィルターに適用され、続いて、室温(RT)で1 min、最大限(13,200 rpm)で遠心分離された。500 μl 洗浄溶液2/3(80% エタノール、0.1 M NaCl、4.5 mM EDTA、10 mM Tris、pH 7.5)がフィルターに適用され、室温(RT)で1 min、最大限(13,200 rpm)で遠心分離された。それぞれからのフロースルーは捨てられ、試料を含むフィルターは、最大速度で1 min、回転させられた。その後、フィルターは、新しい収集チューブへ移された。95〜100℃まで加熱された30 μlの0.1 mM EDTAがフィルターに適用された。試料は、RTで30 s、最大速度で回転させられた。この溶出(30 μlの熱い0.1 mM EDTA溶液を適用し、30 s、最大遠心速度で回転させて通過させる)は繰り返され、溶出物は、すぐに分析されるか、または分析されるまで-20℃で保存されるかのいずれかであった。分析は、以下のセクションに記載されているように行われた。-20℃での延長保存と明らかな違いはない。
【０１００】
実施例2
電気泳動によるRNAの分析
RNA試料は、2つの異なる電気泳動手順により調べられた。第一は、エチジウム染色パターン、および特定のmRNA(具体的には、GAPDHおよびβ-アクチン)についての目立たないバンドの存在について探索しうるノーザンブロットを作成する能力の両方を提供するアガロースゲルシステム(NorthernMax Gly, Ambion)であった。第二は、キャピラリー電気泳動システム(2100 Bioanalyzer, Agilentで用いられるRNAチップ、Caliper Technologies Corp.)であった。この分析は、下記で考察された実施例に関して適用された。
【０１０１】
実施例3
定量的RT-PCR(リアルタイムまたはQRT-PCR)によるRNAの分析
特定のmRNAの存在は、定量的またはリアルタイムRT-PCRの使用を通して定量化された(Higuchi et al., 1993; Bustin, 2000)。実際の増幅反応中に特定のmRNAについて最初に鋳型にされたPCR産物の存在をモニターすることにより、異なる試料におけるこれらの特定のmRNAの相対的レベルが確かめられた。本研究について、4つのmRNA、GAPDH、Recc1、FASおよびDDPKが標的にされた。それぞれについて、以下のRT-PCRプライマーおよびプローブが用いられた。
【０１０２】
GAPDH−マウス(Mus musculus)グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapd)、mRNA。アクセッション番号NM_008084；単位複製配列−60 nt；mRNAサイズ−1.23 kb；mRNAにおける標的領域：396〜455；プローブ415〜434
2007500009.tif 000002
；プライマー−フォワード：
2007500009.tif 000003
およびリバース：
2007500009.tif 000004
Recc1−マウス複製因子C(Recc1)、mRNA；アクセッション番号NM_011258；単位複製配列−83 nt；mRNAサイズ−4.68 kb；mRNAにおける標的領域：2122〜2204；プローブ2156〜2176
2007500009.tif 000005
；プライマー−フォワード：
2007500009.tif 000006
およびリバース：
2007500009.tif 000007
FAS−マウス脂肪酸シンターゼ(Fasn)、mRNA；アクセッション番号NM_007988；単位複製配列−122 nt；mRNAサイズ−8.36 kb；mRNAにおける標的領域：6857〜6978；プローブ6915〜6937
2007500009.tif 000008
；プライマー−フォワード：
2007500009.tif 000009
およびリバース：
2007500009.tif 000010
DDPK−マウスプロテインキナーゼ、DNA活性化、触媒ポリペプチド(protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide)(Prkdc)、mRNA；アクセッション番号NM_011159；単位複製配列−127 nt；mRNAサイズ−12.65 kb；mRNAにおける標的領域：3101〜3227；プローブ3157〜3179
2007500009.tif 000011
；プライマー−フォワード：
2007500009.tif 000012
およびリバース：
2007500009.tif 000013
【０１０３】
試料を比較するために、10 μlのRNA試料(組織の等価量から調製された)が2 μl ランダム十量体(RetroScriptキット、Ambionから)と混合され、80℃で3 min、インキュベートされた。このインキュベーション後、8 μlのマスターRT混合物(8 μlあたり：2 μl 10X RT緩衝液、4 μl dNTP混合物(各2.5 mM)、1 μl(10 U)リボヌクレアーゼ阻害剤(RIP)、および1 μl(100 U)モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV-RT；すべて、RetroScriptキット、Ambionから))が添加され、すべてのRNAをcDNAへ転写するように1時間、50℃でインキュベートされた。qPCRの前に、MMLV-RTは、92℃で10 minのインキュベーションにより不活性化されるか、または-20℃で保存される。
【０１０４】
qPCRについて、このcDNA混合物の2 μlは、SuperTaq RealTime(商標)キット(Ambion)に提供される構成要素、加えて定量化されるべき特定のmRNAについてのプライマーおよびプローブを用いる18 μlのPCR Master Mix[18 μlあたり、2 μl 10X RealTime緩衝液、2 μl dNTP混合物(各2.5 mM)、3 μl 25 mM MgCl2、0.4 μl 50X ROX、0.2 μl SuperTaq(1U)、0.4 μl プローブ(5 μM、最終100 nM)、1 μlの特異的プライマーセット(各10 μM、各最終500 nM)、および9 μl 水]に添加された。これは、その後、ABI 7000リアルタイム装置および以下の熱サイクリング条件を用いるPCR中にモニターされた：95℃で10 min；その後、95℃で15 sec、続いて60℃で60 secを40サイクル。
【０１０５】
実施例4
固定マウス肝臓の消化の経時変化
消化は、27日間固定されたマウス肝臓試料上で行われた。消化は、50℃で標準条件に従って行われ、200 μl アリコートがさまざまな時間に取り出され、前に記載されているようにRNAについて抽出された。各時点からの等価量のRNA試料が、その後、Agilent Bioanalyzer 2100 RNAチップ上で電気泳動により分析され、分光光度法で定量化された。2100 RNAチップデータは、全RNA質量の定量化を可能にし、それは、各試料のOD260から計算されたものと比較された。図1は、両方のこれらの手順により測定されている質量のゆるやかな増加を示している。試料の質量は、2時間まで急速に上昇し、その後、3〜5時間、よりずっとゆるやかに増加した。7時間および一晩(o/n)消化時間の両方は、RNAの余分の量を与えているように思われる。しかしながら、これらの試料の等価量(増加する質量入力を示す)が、GAPDH、FAS、Recc1およびDDPKについてqRT-PCRにかけられた場合、サイクル閾値が各試料について消化の時間に対してプロットされている図2に示されているように、サイクル閾値は、それに応じて下降しなかった。消化の経過中、生存可能な鋳型mRNAの収量における漸増的増加のみが3時間後に得られることは明らかである。この平坦相中、遺伝子間のΔCtが比較的一定にとどまっていることも注目され、消化の時間は、様々な遺伝子の集団的表示にほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。
【０１０６】
実施例5
手順の比較
Masuda et al. (1999)は、MgCl2を含むプロテイナーゼK消化溶液を含み、有機抽出およびエタノール沈殿を用いて終結させた、それらの手順を用いて固定試料から完全長RNA(電気泳動ゲル上のrRNAバンドの存在から判断される)を得ることができることを報告した。従って、14週間、固定されていたマウス肝臓について、上記のようにクエン酸Naの存在下でタンパク分解性消化を行い、固相抽出段階で終わる本発明の手順は、Masuda et al. (1999)に記載された寸分違わない手順と比較された。組織は、切り刻まれて、消化溶液においてホモジナイズされ、消化条件は、各手順により特定されているように従った−Masuda手順について45℃で1時間、および本発明について50℃で4時間。消化後、RNAは、各手順により特定されているように、有機または固相抽出により抽出され、Masuda調製物からのエタノールペレットは、本発明の手順において溶出するために用いられたのと同じ容量(60 μl)に再溶解された。各試料について、等容積量(組織の等価質量からの)を用いる、エチジウム染色ゲル上およびAgilent Bioanalyzer 2100 RNAチップ電気泳動方法により、二連で調べられた。Bioanalyzerエレクトロフェログラムは、図3に示されている。RNAqueous方法により得られた組織の非固定試料由来のRNAのプロファイルが、参照を提供するために同様に示されている。上方の分子量範囲における物質の存在が、非固定および本発明の試料の両方において明らかであり、標準プロファイルに見られたrRNAピークに類似しているピークが試料にあることを見ることができる。
【０１０７】
この直接的定性評価に加えて、Agilent 2100 RNAチップ方法は、全RNA質量の定量化にも用いられ、各試料のOD260から計算されたものと比較された。これらの方法から、Masudaプロトコールからの収量は、ODによる0.187±0.027 μg RNA/mg組織、およびBioanalyzerによる0.083±0.025であったが、本発明の方法からの収量は、同じ方法による、0.183±0.064および0.191±0.047であった。Masudaプロトコールからのより少ないBioanalyzerの数は、Bioanalyzer分析では見ることができないモノヌクレオチドおよびジヌクレオチドを含む、ずっと多い断片化が存在することを示した。これはさらに、qRT-PCRによりFASのレベルを分析することにより支持された。この方法により、Masuda試料についてのサイクル閾値は、351.1±2.4であったが、本発明の試料についてたった26.8±2.1であり、およそ2∧(35.1-26.8)=315倍多い量の本発明の試料における増幅可能なFAS mRNAを示している。
【０１０８】
さらに、Masudaプロトコールは、組織の1 mgあたり0.101 μgのRNAを与え、131 ntのピークサイズ、および350 ntより大きいサイズ範囲における曲線下のたった1%の面積をもつ。これは、類似した収量(0.153 μg/mg組織)をもつが、18Sおよび28S rRNA(28Sについての実際のサイズは約5000 ntであるはずである)を示す約1830 ntおよび3130 ntにおける2つのピークを示し、350 ntより大きい領域において曲線下の86%の面積を有する、固定されていない(「凍結」)組織からのプレップと対比されうる。本発明者らの技術を用いる試料も、類似した収量(0.191+/-0.047 μg/mg組織)を与えるが、350 ntより大きいその面積の79.1+/-1.3%を示し、〜2060および〜3390、修飾されたrRNAとして道理に合ったサイズ、においてピークを示す(小さなピークはいっそう大きい)。
【０１０９】
実施例6
異なる温度におけるクエン酸塩対Mg++の効果
同一の成分を含む2つの消化緩衝液(200 mM TrisCl、pH 7.5；200 mM NaCl；2% SDS；0.5 mg/ml PK)は、さらに、1.5 mMでのMgCl2かまたは10 mMでのクエン酸Naのいずれかを有するように作製された。同じ固定されたマウス肝臓の別々の小片が、これらの緩衝液のいずれかへ入れられ、ホモジナイズされ、その後、それぞれは、3つの部分に分割され、3つの異なる温度、42℃、50℃および65℃、で4時間、インキュベートされた。消化段階後、RNAは、上記の固相方法により抽出された。
【０１１０】
試料は、アガロースゲルおよびBioanalyzer 2100の両方における電気泳動により調べられた。Bioanalyzerおよび260 nmにおける吸光度からの定量化は、試料が、おおよそ等価で、OD260による1グラム組織あたり約0.8 mg RNAおよびBioanalyzerによる約半分のそれを有することを示した。外観は変化しやすく、65℃でインキュベートされた試料は明らかに分解された。42℃および50℃試料の等価量は、GAPDH mRNAについてqRT-PCRにかけられ、どちらの温度においても、クエン酸Naとインキュベートされた試料は、より多くの生存可能なmRNAが存在した(より低いCt、図4)。
【０１１１】
実施例7
異なるpHにおける消化の効果
TrisCl以外のすべての成分が標準緩衝液(200 mM TrisCl、pH 7.5；200 mM NaCl；10 mM クエン酸Na、2% SDS；0.5 mg/ml PK)におけるのと同じである、2つの追加の消化緩衝液が作製された。これらの2つは、pH 7.5での200 mM TrisClを、pH 9.0での200 mM TrisClまたはpH 6.0での200 mM MES(Na+)と置き換えられ、pH 6、pH 7.5、またはpH 9における選択的消化緩衝液を供給した。同じ固定されたマウス腎臓試料の3つの小片が分けられ、これらの3つの消化溶液のそれぞれへホモジナイズされ、その後、50℃でインキュベートされた。試料は、4時間目および一晩のインキュベーション後、取り出され、RNAは、記載されているようにガラス繊維フィルターを通して抽出された。試料は、質量収量のアガロースゲル、Bioanalyzer 2100 RNAチップおよびOD260測定により調べられた。pH 6試料はすぐに分解したが、pH 7.5およびpH 9の試料は、4時間目において同程度であったが、一晩インキュベーション後、pH 9は、目に見えるほど、より分解された。OD260およびAgilent Bioanalyzerデータからの質量収量もまた、pH 7.5が最適であることを示した(図5)。
【０１１２】
実施例8
消化におけるNaClの効果
NaCl以外のすべての成分が標準緩衝液(200 mM TrisCl、pH 7.5；200 mM NaCl；10 mM クエン酸Na、2% SDS；0.5 mg/ml PK)におけるのと同じである、3つの追加の消化緩衝液が作製された。追加の緩衝液は、200 mM NaClを100 mM、400 mM、または塩なしと置き換えられた。固定されたマウス肝臓試料の4つの小片が、これらの消化緩衝液のそれぞれにおいて別々にホモジナイズされ(同じ最終の組織：緩衝液比で)、試料は50℃でインキュベートされた。特定の時間において、各消化物の等しいアリコートが取り出され、RNAが記載されているようにガラス繊維フィルターを通して抽出された。試料は、アガロースゲル電気泳動により調べられ、RNAの品質は、試料間で有意に異なるようには思われなかったが、ゼロの塩の試料は、可視の生成物を示さなかった。すべての試料は、組織の1グラムあたりのRNAの質量収量を導き出すOD260測定により定量化された。これは、図6に示され、いくらかのNaClはRNAの優れた抽出に必須であるが、塩含有緩衝液のいずれについても収量間の差は極小であることを示している。得られたRNAの品質への可能性のある効果を見るために、2つの最良の濃度、0.2 Mおよび0.4 M NaClが選択され、2時間、3時間、および4時間の時点が、上記のようにqRT-PCRにより測定されているように、Recc1およびFAS RNAのレベルについて調べられた。このデータは、図7に示されており、これらの2つの濃度間の効果をほとんど示さないが、0.2 Mが、わずかに有利である可能性がある。
【０１１３】
実施例9
クエン酸塩の代替
クエン酸Naは、トリカルボン酸、クエン酸のナトリウム塩である。複数の酸性基の存在を有する他の一般的に用いられる試薬もまた、それらもまたこの増強を与えうるかどうかを見るために試験された。9つの化合物が選択された：トランス-アコニット酸；1,2,4-ブタントリカルボン酸；1,4-シクロヘキサンジカルボン酸；1,2,3,4,5,6-シクロヘキサンヘキサカルボン酸；1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸；イソクエン酸；トリカルバリル酸；コハク酸；およびグルタル酸。消化溶液は、クエン酸Naなしに作製され(200 mM TrisCl、pH 7.5；200 mM NaCl；2% SDS；0.5 mg/ml PK)、固定されたマウス肝臓の小片が、この溶液にホモジナイズされた。ホモジネートは、その後、10個のアリコートへ分割され、それぞれの10分の1容量が、試験されるべきポリ酸の1 M ストックを添加された。すべての試料は、50℃で4時間、インキュベートされ、その後、通常の手順においてのようにRNAについて準備された。これらの試料のそれぞれは、Bioanalyzer 2100において収量および出現の両方について調べられた。以下の表は、クエン酸塩試料と比較したそれらの出現の評価、加えてそれぞれの質量収量を与える。
【０１１４】
2007500009.tif 000014
(0 = クエン酸Naに匹敵；+ = クエン酸Naより優れている；- 〜 --- = クエン酸Naより段々と劣っている)
【０１１５】
化合物1,4-シクロヘキサンジカルボン酸およびイソクエン酸の両方は、この手順において十分に機能しているようにみえ、他のポリカルボキシレートも同様であることが期待されるであろう。
【０１１６】
実施例10
パラフィン包埋組織
3ヶ月間、固定されたマウス肝臓および腎臓組織の試料は、上記のようにパラフィンブロックへ変えられた。これらの試料は、かみそりで切り刻まれ、以下の3つの異なる方法で消化溶液にホモジナイズされた：パラフィンで覆われた小片の直接的ホモジナイゼーションによる；50℃でのキシレンの2回の5 min 浸漬で脱パラフィンされた小片のホモジナイゼーションによる；および50℃で20 min キシレン浸漬での脱パラフィン、続いて無水エタノール中での3 min 浸漬でのエタノールへの移動による。すべての3つの手順は、各組織についての分析を受け入れられるRNAを与える。マウス心臓、脳、精巣、肺、骨格筋、および脾臓の固定試料も、上の実施例で実証されている肝臓および腎臓と同様に、この手順に用いることに成功した。
【０１１７】
実施例11
クエン酸塩濃度およびSDSの効果
標準プロトコールのとおり、4つのマウス肝臓が採取され、NBF中に24時間、固定され、パラフィンに包埋された。パラフィンでの1週間後、各肝臓は、過剰パラフィンを削り取り、その後液体窒素下で徹底的に破砕された。パラフィン/組織粉末は、完全にパラフィンを除去するために、2回のキシレン浸漬および2回のエタノール浸漬を受け、その後、第二のエタノールスラリーが、チューブあたり〜100 mg 組織で9つのチューブへ分配され、組織はペレットにされて、過剰なエタノールは、消化媒体を添加する前に除去された。消化は、pH 7.5での200 mM TrisClを加えた上の緩衝液のそれぞれにおける0.5 mg/ml プロテイナーゼKで、50℃で3時間であった。
【０１１８】
消化後、4 M チオシアン酸グアニジニウム(GuSCN)の等容量および2 M 酢酸Na、pH 4の10分の1が、エタノールの1.25容量と混合する前に、添加された。これは、RNAqueous(登録商標)プロトコールおよび上の実施例1に記載されているように、ガラス繊維フィルター装置(Ambion RNAqueous(登録商標)キットから)に適用され、1.7 M GuSCN/70% エタノールで1回、その後、洗浄液2および3で、洗浄され、溶出された。結果生じたRNA試料は、Agilent Bioanalyzer 2100 RNAチップ上で分析され、28 rRNAのパーセンテージが測定された(図8)。「Yバー」列は、4つの肝臓の平均を示し、「S」列は、標準偏差を示す。これらの条件下での最適なクエン酸塩濃度は、〜50 mM(log=1.7)であり、一方、SDSのこれらの条件下における最適濃度は、〜3.5%であった。
【０１１９】
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【０１２０】
本明細書に開示および主張されたすべての組成物ならびに/または方法ならびに/または装置は、本開示に照らせば、過度の実験なしに、作製かつ実行されうる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されているが、本発明の概念、真意および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物および/または方法および/または装置に、ならびに方法の段階においてまたは方法の段階の順序において、バリエーションが適用されうることは、当業者に明らかであると思われる。より具体的には、本明細書に記載された作用物質の代わりに、化学的および生理学的の両方に関連している特定の作用物質が用いられても、同じまたは類似した結果が達成されるだろうことは、明らかであると思われる。当業者に明らかであるすべてのそのような類似した代用物および改変は、添付された特許請求の範囲により定義された本発明の真意、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【０１２１】
参考文献
以下の参考文献は、明確に、参照により本明細書に組み入れられている。
2007500009.tif 000016
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2007500009.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の1つまたは複数への参照により、より良く理解されうる。
【図１】2つの異なる電気泳動手順−アガロースゲルシステム(OD)およびキャピラリー電気泳動システム(Aglient)−を用いて測定された質量のゆるやかな増加を示している。
【図２】GAPDH、FAS、Recc1、およびDDPKについてqRT-PCRにかけられた試料は、サイクル閾値において急降下を示さなかった。サイクル閾値は、各試料についての消化の時間に対してプロットされている。
【図３】Bioanalyzerエレクトロフェログラムは、14週間、固定されたマウス肝臓について、クエン酸Naの存在下でのタンパク分解性消化を行い、固相抽出段階で終わる手順の、Masuda et al. (1999)に記載された寸分違わない手順との比較を示す。
【図４】異なる温度におけるクエン酸塩対Mg++の効果。
【図５】異なる温度における消化の効果。
【図６】消化へのNaClの効果。すべての試料は、組織の1グラムあたりRNAの質量収量を導き出すOD260測定により定量化された。
【図７】得られたRNAの品質への効果が、qRT-PCRにより測定されたRecc1およびFAS RNAのレベルについて、2時間、3時間および4時間の時点における0.2 Mおよび0.4 M NaClについて示されている。
【図８】結果生じたRNA試料は、Agilent Bioanalyzer 2100 RNAチップ上で分析され、28 rRNAのパーセンテージが測定された。「Yバー」列は、4つの肝臓の平均を示し、「S」列は、標準偏差を示す。これらの条件下での最適なクエン酸塩濃度は、〜50 mM(log=1.7)であり、一方、SDSのこれらの条件下における最適濃度は、〜3.5%であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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