(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、免疫応答性ターゲット細胞への抗原の送達用フルオロカーボンベクタに関する。更に、本発明は、フルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト及び動物のワクチン及び免疫治療薬としての抗原に結合するこのようなベクタの使用に関する。【選択図】図１
2007532614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−Ｌのフルオロカーボンベクタ又はこれらの誘導体において、ｍ＝３から３０、ｎ＜＝２ｍ＋１、ｙ＝０から１５、ｘ＜＝２ｙ、（ｍ＋ｎ）＝３から３０であり、Ｌが抗原に対する共有結合を促進するためのリガンドであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ。
【請求項２】
構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒのフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト又はこれらの誘導体において、ｍ＝３から３０、ｎ＜＝２ｍ＋１、ｙ＝０から１５、ｘ＜＝２ｙ、（ｍ＋ｎ）＝３から３０であり、Ｓｐが選択的化学的スペーサ部分であり、Ｒが抗原であることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項３】
構造
2007532614.tif 000008
の請求項２に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｓｐが選択的化学的スペーサ部分であり、Ｒが抗原であることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項４】
構造
2007532614.tif 000009
の請求項２に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｓｐが選択的化学的スペーサ部分であり、Ｒが抗原であることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項５】
構造
2007532614.tif 000010
の請求項２に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｓｐが選択的化学的スペーサ部分であり、Ｒが抗原であることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項６】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒがウイルス、バクテリア、寄生虫、自家タンパク質、又は癌抗原由来の抗原であることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項７】
請求項２から６のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒがタンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭水化物又は脂質、又はこれらの組み合わせであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項８】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒが一又はそれ以上のウイルスタンパク質由来のエピトープを具えることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項９】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒが一又はそれ以上のヒト免疫不全ウイルスタンパク由来のエピトープを具えることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項１０】
請求項２から５のいずれか１項に記載のコンストラクトにおいて、Ｒが７から７０のアミノ酸から成るペプチドであることを特徴とするコンストラクト。
【請求項１１】
請求項２から５のいずれか１項に記載のコンストラクトにおいて、Ｒが少なくとも一のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、又はＢ細胞エピトープを具えることを特徴とするコンストラクト。
【請求項１２】
請求項２から５のいずれか１項に記載のコンストラクトにおいて、Ｒが２以上、又は、より多くの重複エピトープを具えることを特徴とするコンストラクト。
【請求項１３】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、ＲがＨＩＶエピトープであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項１４】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒが２００４年のロスアラモス国立研究所のデータベースから選択されたペプチド、又はフラグメント、誘導体、相同体又はこれらの組み合わせであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項１５】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、ＲがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６、又はフラグメント、誘導体、相同体又はこれらの組み合わせであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項１６】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒが一又はそれ以上のＨＩＶ  ｅｎｖエピトープであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項１７】
請求項１３に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒがアミノ酸シークエンスＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ−ＮＨ２を有するＨＩＶ  ｅｎｖエピトープペプチドであることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項１８】
抗原と非共有結合した請求項１に記載のフルオロカーボンベクタ。
【請求項１９】
請求項２から５のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトにおいて、Ｒが多重エピトープ及び／又は融合ペプチドを具えることを特徴とするフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト。
【請求項２０】
請求項２から１９に記載の一又はそれ以上のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトを具える予防又は治療製剤において、一又はそれ以上の薬学上許容できる担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントと選択的に組み合わされることを特徴とする予防又は治療製剤。
【請求項２１】
請求項２０に記載の予防又は治療製剤において、非経口、経口、経眼、経腸、経鼻、経皮、局所、又は経膣投与用に調合された予防又は治療製剤。
【請求項２２】
液体、固体、エアロゾル又はガスである請求項２０に記載の予防又は治療製剤。
【請求項２３】
請求項２０から２２のいずれか１項に記載の予防又は治療製剤において、ムラミルペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧ、モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、オイルインウォータアジュバント、ウォータインオイルアジュバント、アルミニウム塩、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）、リポソーム、微粒子、サポニン、サイトカイン、又は細菌毒素及びトキソイドから成る群より選択されたアジュバントを含むことを特徴とする予防又は治療製剤。
【請求項２４】
予防ワクチン又は免疫治療医薬品の調整時の、請求項２から１９のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクト、又は請求項２０から２３のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２５】
請求項２から１９のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトの調整時の、請求項１に記載のフルオロカーボンベクタの使用。
【請求項２６】
請求項２４に記載の使用において、前記ワクチン又は製造物が、非経口、経口、経眼、経腸、経鼻、経皮、局所、又は経膣投与用であることを特徴とする使用。
【請求項２７】
これを必要としている対象の治療又は免疫の方法が、請求項２から１９のいずれか１項に記載の効果的な量のコンストラクト、又は請求項２０から２３のいずれか１項に記載の製剤を投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２８】
これを必要としている対象の免疫応答を刺激する方法が、請求項２から１９のいずれか１項に記載の効果的な量のコンストラクト、又は請求項２０から２３のいずれか１項に記載の製剤を投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法において、前記対象が、ほ乳類、好ましくはヒトであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法において、前記コンストラクト又は製剤が、抗ウイルス療法と組み合わされることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法において、前記コンストラクト又は製剤が、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）で投与されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のフルオロカーボンベクタ、又は請求項２から１９のいずれか１項に記載のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトの薬としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫化方法の新規な抗原デリバリコンストラクト及びこの使用に関する。特に、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに対する免疫化に有用なコンストラクトに関する。
【０００２】
本発明の背景
最近のほ乳類の免疫学的応答の我々の理解の最近の進歩により、免疫療法を使用して、予防接種及び疾患の管理及び治療を通じて、ヒトのある種の疾患を予防してきた。免疫学的診療を通じて取り組まれてきたこの種の疾患は、病原菌、癌、アレルギ及び自己免疫疾患によって引き起こされる疾患を含む。これらの場合、最も一般的には、医学的治療の前提は、適切な免疫認識細胞への抗原を効果的に送達することである。例えば、予防接種は、野生株ウイルスの全抗原を有するウイルスの生きている弱毒化株の投与によって、世界中で天然痘を根絶することに成功した。同様に、インフルエンザ血清型ｂバクテリアによる感染症は、バクテリアの細胞壁由来のポリサッカリド抗原を基礎としたワクチンの開発後に、西側諸国では顕著に減少した。更に、ヒトメラノーマ等の癌は、腫瘍特異性抗原の源として、メラノソームタンパク質ｇｐ１００から誘導された細胞アジュバント及び合成ペプチドのような自己樹木状細胞（ＤＣ）を使用する免疫療法に反応し、細胞性免疫応答を生じる。
【０００３】
自己抗原に対する自己寛容は、破壊性免疫応答の標的である特異神経抗原の注入によって、実験的自己免疫脳脊髄炎の治療で復元することができる。従って、特異度は、長期間の免疫抑制の必要無しに、このような治療によって提供されることができる。
【０００４】
感染症について、これがＩｇＭ、ＩｇＧ又はＩｇＡが介在するかに関わらず、投与された抗原に対して増加した抗体は、病原菌又はこれから分泌された毒素を無毒化することができた場合に、病害対策が最も飛躍的に進歩する。同様に、自己免疫疾患は、自己抗体の作用を改善できる抗原を用いて治療されてきた。しかしながら、ウイルス感染細胞、癌細胞及び細胞内バクテリアを寄生させる細胞を根絶するためには、細胞性免疫応答も必要とされる。例えば、細胞内ウイルス（例えば、レトロウイルス、オンコルナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パポバウイルス及び風疹ウイルス）は、抗体を暴露することなく複製して、隣接する細胞に拡散することができる。細胞媒介免疫の重要性は、一次Ｔ細胞欠乏症の子供がこれらのウイルスを除去することができないことによって高まるが、無傷細胞媒介免疫以外の免疫グロブリン欠乏症の患者は、このハンディキャップに苦しんでいない。少しの、しかし重要なバクテリア、菌類、原虫及び寄生虫は、宿主細胞内で生存し、複製する。これらの微生物は、マイコバクテリア（結核菌及びハンセン病）、レジオネラ（レジオネラ症）、リケッチア（ロッキー山発疹熱）、クラミジア、リステリア菌、ブルセラ菌、トキソプラズマ原虫、リーシュマニア、トリパノソーマ、カンジダ菌、クリプトコッカス、ロドトルラ及びニューモシスティスを含む。細胞内部に生存することによって、これらの微生物は、循環する抗体に寄りつかない。先天性免疫応答も効果的ではない。これらの微生物に対する主要な免疫防御は、ＣＤ８＋細胞溶解Ｔリンパ球及びＣＤ４ヘルパＴリンパ球を含む細胞媒介免疫である。
【０００５】
効果的で持続する細胞媒介免疫応答を誘発することができるワクチン及び免疫療法の開発は、ワクチン学における一つの重要な挑戦である。特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の予防及び治療用の、安全で有効なワクチンの開発は、ワクチン候補が、耐性があり、耐久性がある、疾患関連細胞免疫を刺激することができないことによって、妨げられている。
【０００６】
細胞内病原菌又は癌細胞の根絶に関与する宿主細胞媒介免疫応答は、Ｔｈ１応答と呼ばれる。これは、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−２等の免疫刺激サイトカインと同様に免疫エフェクタメカニズムの活性化を導く細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＴヘルパリンパ球（ＨＴＬ）の導入によって特徴付けられる。最近、ウイルス感染の管理におけるＴｈ１応答の重要性は、近年Ｌｕ他（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４））によって示されている。個人に感染した慢性ＨＩＶ−１を使ったこの臨床研究は、ウイルス量の抑制とＨＩＶ−１−特異ＩＬ−２−又はＩＦＮ−ガンマ−発現ＣＤ４＋Ｔ細胞と、特異ＨＩＶ−１ＣＤ８＋エフェクタ細胞応答の双方との間の正相関を実証した。ワクチン及び免疫治療によって導入された細胞免疫を増進するための、最新の免疫学的戦略は、病原菌の生きている弱毒化バージョンの開発及び適切な抗原又はこのような抗原をコードするＤＮＡを送達するための生きているベクタの使用を含む。このようなアプローチは、ますます厳しくなる規制環境で、安全性の要件によって制限される。更に、製造プロセスの拡張性及びコストの増加から生じる問題は、しばしば生物起源の製品の実用化を制限する。
【０００７】
このコンテクストで、ペプチドの使用に基づいて、合理的に合成された合成ワクチンは、新規な予防ワクチン及び免疫治療の潜在候補として、多大な注目を受けてきた。Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープは、適応免疫システムによって認識される免疫原の活性部分のみを表している。Ｔ又はＢ細胞エピトープ領域に及ぶ小さなペプチドを、シークエンスが誘導された天然抗原と最終的に交差反応をする免疫応答を導入するための免疫原として使用できる。ペプチドは、非常に魅力的な抗原である。というのも、ペプチドは、化学的に明確であり、高い安定性があり、Ｔ及びＢ細胞エピトープを含むように設計することができるからである。ＣＴＬ及びＴヘルパエピトープを含む、Ｔ細胞エピトープは、広範な個体群範囲を達成することができる方法で、ＭＨＣ分子を結合する能力に基づいて選択することができる（Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，Ｍａｒｓｈ，Ｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．２０００）。更に、適切なＴ及びＢ細胞エピトープを選択する能力は、免疫応答を、（ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びマラリア等の）高シークエンス変異性によって特徴付けられる、病原菌の多重保存エピトープに向けることができる。
【０００８】
Ｔリンパ球応答を刺激するために、ワクチン又は免疫療法生成物に含有される合成ペプチドは、好ましくは、細胞に存在する抗原及び特に樹木状細胞によって内在化されるべきである。樹木状細胞（ＤＣｓ）は、一次Ｔ細胞媒介免疫応答の開始で重大な役割を果たす。これらの細胞は、様々な機能に関連した２つの主要な成熟の段階が存在する。未熟樹枝状細胞（ｉＤＣｓ）は、大部分の組織、又は循環に存在し、炎症部位内に補充される。これらは、高次に特殊化した抗原捕捉細胞であり、抗原摂取及び食作用に含まれる多量のレセプタを表している。次の抗原捕捉及びプロセシングについて、ｉＤＣｓは、リンパ節又は脾臓の局所Ｔ細胞部位に移動する。このプロセスの間、ＤＣｓは、免疫賦活成熟Ｄｃｓ（ｍＤＣｓ）になる抗原捕捉能力を失う。
【０００９】
樹木状細胞は、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合したペプチド抗原に対する宿主の免疫応答を開始する細胞を、効率的に表している。それらは、未感作ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を準備することができる。抗原プロセシング及び提示経路の最新のモデルによれば、外因性抗原は、細胞を表す抗原の細胞内区画に吸収される。ここで、この抗原は、ペプチドに分解され、これらのいくつかはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。次いで、成熟ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、ＣＤ４Ｔリンパ球への提示のために細胞表面に輸送される。対照的に、内因性抗原は、細胞質に輸送される前に、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）の作用によって細胞質内で分解され、ここで、それらは、新生ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。次いで、ペプチドに複合された安定ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞表面に輸送され、ＣＤ８ＣＴＬを刺激する。また、外因性抗原も、交差提示と呼ばれるプロセスのプロフェッショナルＡＰＣｓによってＭＨＣクラスＩ分子に存在してよい。細胞外抗原含有ファゴソームは、小胞体と融合してよく、抗原は、ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に取り込むのに必要な機構を得る。しかしながら、遊離ペプチドは、しばしばそれ自身で免疫原に乏しいと認識されている（Ｆｉｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６）。
【００１０】
ペプチドワクチン又は療法の有効性を最適化するために、種々のワクチン戦略が開発され、ＭＨＣクラスＩ経路を目標とし、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を発現させるために、抗原提示細胞に抗原を誘導する。合成デリバリシステムの例として、脂肪酸アシル鎖は、ＣＴＬ活性を導入するために、ＭＨＣクラスＩ細胞内区画にエピトープを送達する手段として、ペプチドに共有結合している。例えば、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質由来のエピトープを発現するペプチドに結合されたモノパルミトイル鎖を有するこのリポペプチドは、米国特許第５，８７１，７４６号に記載されている。その他の技術は、エピトープを細胞内区画に送達し、これによってＣＴＬｓを誘発することを目的として、送達している。これらは、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、ＴＡＴ及びその誘導体、ＤＮＡ、ウイルスベクタ、ウイロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）及びリポソームを含む。しかしながら、これらのシステムは、非常に弱いＣＴＬ反応を発現させるか、毒性問題に関連するか、又は商業規模での製造を複雑且つ高価にするかである。
【００１１】
従って、細胞免疫応答を発現させることを意図したワクチン及び薬の開発において、抗原の細胞内送達を導く改良型ベクタについての必要性が認識されている。免疫治療又はワクチンのコンテクストでのベクタは、抗原を宿主の免疫応答細胞に輸送し、又は導くことが可能であるいずれかの作用物質である。フッ素化界面活性剤は、水素化対応物よりも低い臨界ミセル濃度を有し、従って、相当する炭化水素分子よりも低濃度で、ミセル構造内に自己組織化することが示されている。この物理化学的性質は、水中で自己組織化し、界面で集まるフッ素化両親媒性分子の傾向を劇的に増加させるフッ素化鎖に関連した強い疎水性相互作用及び弱いファン・デル・ワールス相互作用に関する。この高分子構造の形成は、細胞、例えば、抗原提示細胞によって細胞内摂取を促進する（Ｒｅｉｃｈｅｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，７９８９−７９９７）。更に、フッ素化鎖が、界面活性剤に導入されるとき、溶血作用は、強力に減少し、しばしば抑制され（Ｒｉｅｓｓ，Ｊ．Ｇ．；Ｐａｃｅ，Ｓ．：Ｚａｒｉｆ，Ｌ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１９９１，３，２４９−２５１）、従って、細胞毒性が減少する。
【００１２】
本発明は、投与された抗原の免疫原生を強化するために、新規なフルオロカーボンベクタを使用することによって、免疫応答細胞に抗原を送達する問題を克服しようとする。フルオロカーボンベクタは、パーフルオロカーボン又は混合フルオロカーボン／炭化水素ラジカルから誘導された一又はそれ以上の鎖を具えてよく、飽和又は不飽和であってよく、各鎖は３から３０の炭素原子を有する。共有結合、反応基、又はリガンドによって抗原にベクタを結合するために、ベクタの構成要素として、例えば−ＣＯ−、−ＮＨ−、Ｓ、Ｏが組み込まれる、或いはいずれかの他の好適な基が含まれる；共有結合を実現するためのこのようなリガンドの使用はこの分野ではよく知られている。反応基は、フルオロカーボン分子のいずれの位置に配置されてもよい。抗原に対するフルオロカーボンベクタの結合は、天然に存在する、又は抗原のいずれの部分に導入された−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２等の官能基によって達成されてよい。この結合の例は、アミド、ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル及びオキシム結合を含む。代替的に、非共有結合が使用されてよく、例えば、イオン性相互作用は、フルオロカーボンベクタのペプチド抗原やカルボン酸のヒスチジン残渣と共に結合するカチオンを介して形成されてよい。
【００１３】
選択的に、スペーサ要素（ペプチド性又は非ペプチド性）は、抗原提示細胞内でプロセシングするためのフルオロカーボン要素からの抗原の開裂を可能にして、抗原の立体的提示を最大限に利用するために組み込まれてよい。また、スペーサは、分子の合成の補助をし、その安定性及び／又は可溶性を促進するために組み込まれてよい。スペーサの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リシン又はアルギニン等のアミノ酸を含む。これらは、タンパク質分解酵素及び炭化水素によって開裂してよい。
【００１４】
従って、第１の態様では、本発明は、化学構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−Ｌ、又はその誘導体、ここで、ｍ＝３〜３０、ｎ＜＝２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ＜＝２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０、Ｌは抗原に対する共有結合を促進するためのリガンドである、を有するフルオロカーボンを提供する。
【００１５】
本発明のコンテクストで、「誘導体」は、化合物が、ここに記載された抗原を送達することができるような比較的少数の修飾のフルオロカーボン化合物をいう。従って、例えば、多くのフッ素部分が、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ等の他のハロゲン部分と置換され得る。加えて、多くのフッ素部分がメチル基と置換し、ここで議論されているように、依然として分子の性質を保持することができる。
【００１６】
特に、上記の式の実施例では、ベクタは、次の式（Ｉ）：
2007532614.tif 000003
のパーフルオロウンデカン酸、
【００１７】
又は、代替的には、次の式（ＩＩ）：
2007532614.tif 000004
の２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−パーフルオロウンデカン酸、
【００１８】
又は、次の式（ＩＩＩ）：
2007532614.tif 000005
のヘプタデカフルオロ−ペンタデカン酸であってよい。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、ベクタ抗原コンストラクトＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒを提供しており、ここで、Ｓｐは選択的な化学的スペーサ部分であり、Ｒは抗原である。
【００２０】
ベクタに結合される抗原は、ヒトを含む動物の免疫応答を促進することができるいずれかの抗原である。好ましくは免疫応答が宿主に有益な効果を有する。抗原は、ウイルス、バクテリウム又はマイコバクテリウム、寄生虫、真菌、又はいずれの病原菌又は自家抗原又はアレルゲンから誘導されてよい。
【００２１】
ウイルスの例は、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）又は−２、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルスＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む。
【００２２】
バクテリア及びマイコバクテリアの例は、限定はされないが、ヒト型結核菌、レジオネラ、リケッチア、クラミジア、及びリステリアを含む。
【００２３】
寄生虫の例は、限定はされないが、熱帯熱マラリア原虫及びその他のマラリア原虫科を含む。
【００２４】
真菌の例は、限定はされないが、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス、ロドトルラ及びニューモシスティスを含む。
【００２５】
自家又は自己抗原は、限定はされないが、癌、肺癌に発現するＨＥＲ−２／ｎｅｕ、メラノーマに発現するｇｐ１００又はＭＡＧＥ−３、結腸経腸癌に発現するＰ５３、及び多くのヒト癌によって発現するＮＹ−ＥＳＯ−１又はＬＡＧＥ−１に結合した抗原を含む。
【００２６】
アレルゲンは、限定はされないが、蜂に対する激しい反応に関連するホスホリパーゼＡ２（ＡＰＩｍ１）、ハウスダストダニであるヤケヒョウダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）に対する反応に関連するＤｅｒｐ−２、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｆ、Ｄｅｒ  ｐ５及びＤｅｒ  ｐ７、ゴキブリアレルゲンＢｌａ  ｇ２及び主要なシラカンバ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １を含む。
【００２７】
従って、実施例において、本発明は、ベクタ抗原コンストラクトであって、この抗原はウイルス、バクテリウム、マイコバクテリウム、寄生虫、真菌、自家タンパク質又はアレルゲン由来の抗原である、又は意味するベクタ抗原コンストラクトを提供する。
【００２８】
抗原は、免疫学的に認識できるエピトープを表すならば、タンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭水化物、脂質又はこれらの組み合わせであってよい。このような抗原は、天然タンパク質からの精製によって誘導されてよく、又は、組み換え技術、又は化学的合成によって製造されてよい。抗原の製造方法は、技術的によく知られている。更に、抗原も抗原ペプチド又はタンパク質をエンコードするＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを含む。
【００２９】
従って、更なる実施例において、本発明は、ベクタ抗原コンストラクトであって、この抗原がタンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭化水素又は脂質又はこれらの組み合わせであるベクタ抗原コンストラクトを提供する。
【００３０】
免疫学的に活性であるコンストラクトについて、抗原は、一又はそれ以上のエピトープを具えなければならない。本発明で使用されるペプチド又はタンパク質は、好ましくは、少なくとも７、より好ましくは９〜１００のアミノ酸、最も好ましくは、約１５〜３５のアミノ酸のシークエンスを含む。好ましくは、ペプチドを有するエピトープのアミノ酸シークエンスが選択されて、水性溶媒での分子の溶解度を強化する。更に、ベクタに接合しないペプチドの末端を変化させて、ミセル、ラメラ、細管又はリポソーム等の多分子構造の形成を介してコンストラクトの溶解度を高めてよい。例えば、ミセルの自発的なアッセンブリを促進するために、正に帯電したアミノ酸をペプチドに加えることができた。ペプチドのＮ末端又はＣ末端をベクタに結合して、コンストラクトを作ることができる。コンストラクトの大規模な合成を促進するために、ペプチドのＮ又はＣ末端アミノ酸残渣を修飾することができる。所望のペプチドがペプチダーゼによる開裂に敏感である場合、直鎖ペプチド結合は、非開裂可能なペプチド模倣剤によって置換することができる。このような結合及び合成方法は、この分野ではよく知られている。
【００３１】
具体例として、ペプチドＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ−ＮＨ２は、ＨＩＶ−１のＥｎｖ（３０１−３２２）タンパク質由来のエピトープを表し、これは、免疫学的に活性であることが示されている。これは本発明の更に別の実施例を表す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照）。
【００３２】
１以上の抗原をリガンドに結合する前に互いに結合させてよい。１つのこのような例は、融合ペプチドの使用であり、ここで、広宿Ｔヘルパエピトープを、ペプチド、炭化水素、又は核酸であってよい一重又は多重ＣＴＬエピトープ又は一重又は多重Ｂ細胞エピトープに共有結合させてよい。一例として、広宿Ｔヘルパエピトープは、ＰＡＤＲＥペプチド、破傷風トキソイドペプチド（８３０−８４０）又はインフルエンザ血球凝集素、ＨＡ（３０７−３１９）とすることができる。
【００３３】
従って、別の実施例では、ベクタ抗原コンストラクトは、１つであり、ここで、Ｒは、結合された１つ以上のエピトープ又は抗原である。また、エピトープは線状に重複していてもよく、これによって、濃厚多特異エピトープのクラスタを作る。
【００３４】
フルオロカーボンに特徴的な強い非共有分子間相互作用に起因して、抗原もベクタと非共有結合してよく、抗原提示細胞によって好ましく処理される目的を更に達成する。
【００３５】
また、本発明は、一又はそれ以上のフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトを具えるワクチン及び免疫療法を提供する。適切な免疫応答を発現するのにより効果的である可能性が高いので、この型の多成分生成物は望ましい。例えば、ＨＩＶ免疫療法の最適な製剤は、種々のＨＩＶタンパク質由来の多数のエピトープを具えてよい。この場合、各エピトープは、一般的なフルオロカーボンベクタに結合されてよく、又は、各エピトープは、専用ベクタに結合することができる。代替的に、多重エピトープは、様々な病原菌に対して免疫を与えるために、製剤に組み込まれてよい。多成分生成物は、一又はそれ以上のベクタ抗原コンストラクトを含んでよく、より好ましくは２から約２０、最も好ましくは３から約８のこのようなコンストラクトを含んでよい。
【００３６】
本発明の組成は、選択的に、一又はそれ以上の薬学的に許容された担体及び／又はアジュバントを伴う抗原に結合したフルオロカーボンベクタを具える。免疫応答を更に増強することのできるこのようなアジュバントは、限定はされないが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧ、モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、オイルインウォータアジュバント、ウォータインオイルアジュバント、アルミニウム塩、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）、リポソーム、微粒子、サポニン、サイトカイン、又は細菌毒素及びトキソイドを含んでよい。他の有用なアジュバントは、当業者によく知られているであろう。必要ならば、担体の選択は、多くは、組成物を送達する投与方法の機能である。本発明で、組成物は、いずれの好適な投与の経路及び手段で製剤されてよい。薬学的に許容された担体又は賦形剤は、経口、経眼、経腸、経鼻、局所（口腔及び舌下を含む）、経膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈、皮内を含む）投与に好適な製剤に使用されるものを含む。
【００３７】
製剤は、例えば、液体、固体、エアロゾル、又は気体といったあらゆる好適な形状で投与されてよい。例えば、経口製剤は、エマルジョン、シロップ又は溶液又は錠剤又はカプセルの形状を取ってよく、これは、胃での分解から有効成分を保護するために腸溶性被覆されてよい。経鼻製剤は、スプレ又は溶液であってよい。経皮製剤は、特定のデリバリシステムに適応されてよく、パッチを具えてよい。注射用製剤は、希釈水又は他の薬学的に許容された溶媒又は懸濁剤の溶液又は懸濁液であってよい。
【００３８】
従って、更なる態様において、本発明は、好適な担体及び／又はアジュバント付の又は無しのベクタ抗原コンストラクトを具える予防薬又は治療製剤を提供する。
【００３９】
患者に投与するワクチン又は免疫治療薬の適正な用量は、診療所で決められるであろう。しかしながら、参考のために、好ましい投与経路に依存するが、好適なヒトへの投与量は、１から１０００μｇであってよい。免疫学的効果を達成するためには、反復投与が望ましく、必要ならば、一般的には、２から１２週間間隔で投与される。より長期に渡って免疫応答の促進が必要な場合、３ヶ月から５年間の反復投与が適用されてよい。
【００４０】
製剤は、他の有効成分とベクタ抗原コンストラクトを組み合わせて、一以上のワクチン又は医薬品の投与に作用する。２又はそれ以上の活性剤の共投与によって、相乗効果も観察できる。ＨＩＶ感染症の治療において、一のこのような医薬は、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）である。
【００４１】
その他の態様では、本発明は：
ｉ）    これらの疾患又は症候の治療又は予防用薬剤の調製における本明細書で記載されている免疫原生コンストラクトの使用。
ｉｉ）  本明細書に記載されたコンストラクト又は製剤の投与に続く免疫応答の誘導による治療方法。
ｉｉｉ）フルオロカーボンベクタ及びフルオロカーボンベクタ抗原コンストラクトの薬への使用。
を提供する。
【００４２】
例１
フルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の合成
次のフルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を合成した：
ＦＡＶＳ−Ｉ−ＥＮＶ：ＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ−Ｃ８Ｆ１７（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｋ−ＮＨ２
ＦＡＶＳ−２−ＥＮＶ：ＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ−Ｃ８Ｆ１７（ＣＨ２）６ＣＯ−Ｋ−ＮＨ２
ＦＡＶＳ−３−ＥＮＶ：ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＫ−ＣＯ（ＣＨ２）２−（ＰＥＧ）４−Ｃ８Ｆ１７（ＣＨ２）６ＣＯ−Ｋ−ＮＨ２
ここで、標準的なアミノ酸１文字コードを使用し、ＰＥＧはＣＨ２−ＣＨ２−Ｏである。ＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫは、ヒト免疫不全ウイルスのＥＮＶ（３０１−３２２）である。
【００４３】
Ｎｓｃ（２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル）、又はＦｍｏｃ（（９−フルオレニルメチルカルボニル）アミノ酸を使用するリンクアミド樹脂（Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ  ｌｏａｄｉｎｇ））上でＡＢＩ４３０又はＡＢＩ４３３自動ペプチド合成装置でペプチド合成を実施した。ＨＯＣｔ（６−クロロ−１−オキシベンゾトリアゾール）及びＤＩＣ（１，３−ジイソプロピルカルボジイミド）との結合を促進し、Ｆｍｏｃ／Ｎｓｃ脱保護をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）の２０％ピペリジンを使用して実施した。各サイクルの一部として、分離したＮ末端を無水酢酸でキャップした。樹脂から及び同時に起こる側鎖脱保護由来のペプチドの開裂を、ＴＦＡ、水及びＴＩＳ（ジイソプロピルシラン）（９５：３：２）を使用して、冷却したジエチルエーテル内の沈殿による生成物の粗分離を用いて達成した。ジュピタＣ５（Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ５）又はルナＣ１８（２）（ＬＵＮＡ  Ｃ１８（２））カラム（２５０×２２ｍｍ）を使用する分取ＨＰＬＣによって精製を実施し、ペプチド質量を質量分析法によって確認した。
【００４４】
勾配溶離下で、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）（Ｃ５，２５０×４．６ｍｍ，３００Ａ，５μｍ）製のカラムを使用するＨＰＬＣ（ＨＰ１０５０）によって実験を行う前に、ペプチドの純度を確認した。溶媒Ａ（水９０％、アセトニトリル１０％、ＴＦＡ０．１％）、溶媒Ｂ（水１０％、アセトニトリル９０％、ＴＦＡ０．１％）。３０分以内にＢの勾配０から１００％を使用し、カラム温度は４０℃であった。ＵＶ検出器の波長を２１５ｎｍに調節した。各ケースにおけるフルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の純度は、９０％以上であった。
【００４５】
凍結乾燥ベクタ−ペプチド含有密封サンプルの化学的安定性を、コンパレータとしての未誘導ペプチド（ＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ−ＮＨ２）と共に、４℃、２０℃及び４０℃で評価した。時間が経ったときの安定性を上記の条件を使用するＨＰＬＣによって測定した。このデータを図１及び２に示す。
【００４６】
各ペプチド複合体について、Ｔ＝０で見られたのと同様の保持時間で溶離するシングルピークがあり、４０℃でのインキュベートで２７日後に、分解の徴候は観察されなかった。
【００４７】
例２
フルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の物理化学的分析
（ｉ）溶解性
医薬製剤に有用な濃度の水溶液中のフルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の安定性を確認した。乾燥凍結ペプチド粉末を、種々の濃度でＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）に溶解することによって、２０℃で、ペプチドの溶液を調製した。次いで、調製した溶液を１分間ボルテックスした。アリコートを収集し、溶液の残りを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各ペプチドの２５μｌアリコートの連続希釈液を含有する９６−ウエルの培養皿に、溶液Ａ（水酸化ナトリウム０．１Ｍ溶液５０ｖｏｌ，のビシンコニン酸（ｂｉｃｉｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、炭酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム）及びＢ（４％硫酸銅溶液、１ｖｏｌ．）を含有するＢＣＡ常用試薬２００μｌを加えた。３７℃で４５分間インキュベートし、１０分間冷却した後、この吸光度を５７０ｎｍで測定した。この培養皿を、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒマルチラベルカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって分析した。各ペプチドについて、較正曲線をプロットし、これを使用して、ｎｍｏｌ／ｍｌで表される、溶解成分のペプチド濃度を決定した。データを表１に示す。全ペプチドが、マウス免疫化研究に使用される抗原の濃度で、完全に可溶であることが分かった。
【００４８】
2007532614.tif 000006
表１：タンパク質分析方法によって実施された溶解性分析の要約
【００４９】
（ｉｉ）臨界ミセル濃度
生理学的リン酸緩衝生理食塩水のフルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の臨界ミセル濃度を、８−アニリノ−１−ナフタレン−スルホン酸（ＡＮＳ）と結合する染料によって決定した。３００μｇペプチド／ｍｌ溶液から出発して、連続倍数希釈のＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）のペプチド及びペプチド−ベクタ溶液を２０℃で調製し、ここから２００μｌをマイクロプレートのウエルに加えた。次いで、ＰＢＳにすぐに溶解したＡＮＳ４０μｌを、各ウエルに加えた。２分後、このプレートを３５５ｎｍで励起し、Ｖｉｃｔｏｒマイクロプレート蛍光光度計で４６０ｎｍで走査した。比率（サンプルの蛍光強度／ブランクの蛍光強度）を線形目盛対対数目盛の濃度でプロットした。データを図３に示す。
【００５０】
（ｉｉｉ）粒子サイズ分析
４８８ｎｍに調整したアルゴンレーザ（Ｕｎｉｐｈａｓｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を装備したＭａｌｖｅｒｎ  ４７００Ｃ準光散乱スペクトロメータ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｌｔｄ，ＵＫ）で、粒子サイズ分析を実施した。サンプルを温度２５℃に保持した。レーザは、角度依存測定のために種々の検出形状を有する。９０°及び６０°の角度で測定を実施した。ろ過した０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水にペプチドを溶解して５００ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度にし、１分間ボルテックスすることによって、溶液を調製した。次いで、溶液をキュベット（容積１ｍｌ）に分配した。１５分後に、９０°の角度で測定を実施した（図４）。Ｋｃｏｕｎｔ値出力は、検出された粒子の数に比例する；確実なサイズ分配測定を得ることを確実にするために、全ケースで、Ｋｃｏｕｎｔは＞１０であった。
【００５１】
2007532614.tif 000007
表２：ＰＢＳのミセル溶液の粒子サイズ
【００５２】
例３
（ｉ）フルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の免疫原性
特定病原体未感染のマウス（６−８週  雌  Ｂａｌｂ／ｃ）をＨａｒｌａｎ（ＵＫ）から購入した。ペプチドＥＮＶ、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ、ＦＡＶＳ−２−ＥＮＶ又はＦＡＶＳ−３−ＥＮＶをＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）に溶解した。各投与量を、アミノ酸分析から得られた正味ペプチド含有量に基づいた１ｍｌ当たり５０ｎｍｏｌのペプチドに標準化した。マウス（１グループ当たり３匹）を、ＰＢＳの体積１００μｌ、ｐＨ７．２の５０ｎｍｏｌペプチドで、肩甲骨間部分に皮下予防注射をした。３回の投与量を１０日間の間隔で投与した。完全フロインドアジュバント（アジュバントの等しい容積に乳化したＰＢＳの５０ｎｍｏｌペプチド）と混合した起爆用量の遊離ペプチド及び追加抗原投与量の不完全フロインドアジュバントを投与されるマウスのグループは、陽性対象となった。１０日後、最後の免疫化マウスが犠牲になり、脾臓を切除して、ペプチドに対する細胞性免疫応答を評価した。免疫応答の発達の進行を決定するために、１回及び２回の投与量のペプチドを投与するマウスのグループも準備した。
【００５３】
誘導ペプチド（ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）によって初回抗原刺激を受けたｉｎ  ｖｉｖｏ細胞応答を、細胞を生成するペプチド特異ＩＦＮ−ガンマ、より具体的には、次の免疫化を起こすペプチド特異ＣＤ８＋Ｔリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ頻度を数え上げるために、新鮮な脾臓細胞上のＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。細胞免疫化応答（Ｔヘルパ及びＣＤ８Ｔ細胞活性）の両要素を対象とするために、ＣＤ８エピトープ（Ｐ１８−Ｉ１０として知られるＨ−２Ｄｄ−制限ＭＨＣクラスＩ）に相当するよく知られたＴ−ヘルパエピトープ及びＥＮＶ（３１１−３２０）ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩというより短いペプチドを含有するＥＮＶ（３０１−３２２）ＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫペプチドを用いて、脾臓細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激した。
【００５４】
各グループのマウスから脾臓を蓄積し、脾臓細胞を分離した。数える前に、細胞をＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄した。次の修正で製造者の指示によって、Ｄｉａｃｌｏｎｅキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、フランス）を使用して、マウスＩＦＮ−ｇ  Ｅｌｉｓｐｏｔ分析を実施した。５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃で１８時間、１０％ウシ胎仔血清を補給された培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０）、５μＭβ−メルカプトエーテル、５ｍＭグルタミンのペプチド（１０、１、０ｍｇ／ｍｌのＴヘルパＥＮＶ（３０１−３２２）又はＰ１８−Ｉ１０ＣＴＬエピトープ）の適切な濃度を有するＰＶＤＦボトムウエル（９６−ウエルマルチスクリーン（登録商標）−ＩＰマイクロプレート−ミリポア）を被覆した抗ＩＦＮ−ガンマ抗体に、５×１０５／ウエルの細胞密度で、脾臓細胞の複製培養を分配した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＥＬＩｓｐｏｔ  ｒｅａｄｅｒ  ｕｎｉｔを使用して、スポットを数えた。結果は、バックグラウンド除去後（＜１０スポット）、各条件で得られた平均値に相当する。１ミリオン入力脾臓細胞に対するスポット形成ユニット（ＳＦＣ）として結果を示す。
【００５５】
（ｉｉ）フルオロカーボンペプチドによってｉｎ  ｖｉｖｏ初回刺激を受けたＴリンパ球の性質（ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞分離）
２．５×１０６／ウエルの細胞密度で、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、１μｇ／ｍｌのＴヘルパＥＮＶ（３０１−３２２）又はＰ１８−Ｉ１０ＣＴＬペプチドと、４８−ウエルマイクロプレートに分配した。３日で、組み換えマウスＩＬ−２、５ｎｇ／ｍｌを各ウエルに加えた。７日で、前刺激脾臓細胞を取り、ＲＰＭＩ  １６４０で３回洗浄し、製造者の指示によりモノクローナルラット抗マウスＣＤ８ａ及びＣＤ４抗体（ＭＡＣＳ、Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＵＫ）と接合した電磁ビーズを使用する電磁細胞分類によって計数及び分離した。培養媒体（ＲＰＭＩ−１６４０、β−メルカプトエタノール５μＭ、グルタミン、非必須アミノ酸、５％ＣＯ２雰囲気で３７℃で１２時間、１０％ウシ胎仔血清を追加したピルビン酸ナトリウム）のペプチド１ｍｇ／ｍｌと、ＰＶＤＦボトムウエル（９６−ウエルマルチスクリーン（登録商標）−ＩＰマイクロプレート−ミリポア）を被覆した抗体の複製で、ＣＤ４及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、２．５×１０５／ウエルの細胞密度で分配した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＥＬＩｓｐｏｔ  ｒｅａｄｅｒ  ｕｎｉｔを使用して、スポットを数えた。結果は、バックグラウンド除去後（＜１０スポット）、各条件で得られた平均値に相当する。１ミリオン入力脾臓細胞に対するスポット形成ユニット（ＳＦＣ）として結果を示す。
【００５６】
ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、ＦＡＶＳ−ペプチドコンストラクトは、抗原に単一ｉｎ  ｖｉｖｏ暴露後に、長いＥＮＶペプチド（ＥＮＶ３０１−３２２）と短いＥＮＶペプチド（Ｐ１８−Ｉ１０ＣＴＬエピトープ）の双方に対して強細胞免疫化応答を受けることができる（図５Ａ及びＢ）。図６は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＥＮＶ−特異Ｔ細胞の双方を効果的にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激したことを示す。
【００５７】
ＦＡＶＳ−ペプチドで刺激後応答の強度は、フロインドアジュバントに乳化した天然ペプチドで免疫化されたマウスから得られた応答と同様の範囲であった。図６に要約されているように、ＥＮＶ−特異Ｔ細胞反応は、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ製剤（図５Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）で第１及び第２ブースト後、明らかに増幅された。
【００５８】
これは、明らかに、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ経路に到達するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞に存在する抗原によって溶解するＦＡＶＳ−ペプチドの能力を示す。これによって、強い細胞免疫化応答を刺激する。
【００５９】
例４
合成アジュバントと共投与されるフルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の免疫原生
ＦＡＶＳ−ペプチド、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶの定量的、定性的免疫原生に対する合成免疫刺激の潜在インパクトを評価するために、単独で、或いはムラブチドと共に注入した。ムラブチド（Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン−Ｏ−ｎ−ブチル−エステル；ムラミルジペプチドの合成誘導体及びＮＯＤ−２アゴニスト）は、先天性免疫メカニズムを活性化する合成免疫増強剤であり、免疫原（”Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｍｕｒａｂｕｔｉｄｅ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”，  Ｇ．Ｂａｈｒ，ｉｎ：”Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”，ｅｄｓ  Ｈａｃｋｅｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｎ（２００４），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）と組み合わせる時に、細胞及び体液反応の双方を増強することが知られている。
【００６０】
特定病原体未感染のマウス（６−８週  雌  Ｂａｌｂ／ｃ）をＨａｒｌａｎ（ＵＫ）から購入した。ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶコンストラクトを、２つの異なる投与量レベル、コンストラクト５０ｎｍｏｌを投与される１グループ及びコンストラクト５ｎｍｏｌを投与した第２グループ、を使用した。マウス（１グループ毎に３匹）を単独、又はＰＢＳ１００μｌ、ｐＨ７．２の全体積のムラブチド１００μｇと組み合わせて、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶを有する肩甲骨間部の皮下に免疫化した。これらの投与量を１０日間隔で投与した。ムラブチド単独を投与される対照グループも準備した。
【００６１】
１０日後、最後の免疫化マウスが犠牲になり、脾臓を切除して、ＴヘルパＥＮＶ（３０１−３２２）又はＰ１８−Ｉ１０ＣＴＬエピトープペプチド対する細胞性免疫応答を評価した。例３に記載されているように、摘出した脾臓で、インターフェロン−ガンマＥｌｉｓｐｏｔ及びＴｈ−１及びＴｈ−２サイトカイン測定を実施した。簡潔に言えば、５％ＣＯ２雰囲気下で、３７℃で１８時間、培養培地で、適正な濃度のペプチド（ＴヘルパＥＮＶ（３０１−３２２）又はＰ１８−Ｉ１０ＣＴＬエピトープ１０又は０μｇ／ｍｌ）で、脾臓細胞を培養した。次いで、ＩＦＮ−ｇ  Ｅｌｉｓｐｏｔ分析を実施した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＥＬＩｓｐｏｔ  ｒｅａｄｅｒ  ｕｎｉｔを使用して、このスポットを数えた。この結果は、バックグラウンド除去後（＜１０スポット）、各条件で得られた平均値に相当する。１ミリオン入力脾臓細胞に対するスポット形成ユニット（ＳＦＣ）として結果を表す（図７）。
【００６２】
５ｎｍｏｌの投与量のＦＡＶＳ−１−ＥＮＶで免疫化されたマウスから、ＥＮＶ（３０１−３２２）ペプチドで再刺激された新鮮な脾臓細胞で、多重サイトカイン測定（ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）を実施した。２４時間及び４８時間で、上清を採集した。Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ（登録商標）  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｒｒａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）によって開発された多重フォーマットによるサイトカイン特異サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、各レベルの細胞培養上清のサイトカイン（ＩＬ２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）を測定した。結果をｐｇサイトカイン／ｍｌで表した。
【００６３】
単独で投与されたＦＡＶＳ−１−ＥＮＶは、主にＴｈ−１サイトカイン生成物（すなわち、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇ）を生じさせ、低レベルのＴｈ−２サイトカインをも製造することが示された。製剤内にムラブチドを含有することは、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３等の高レベルのＴｈ−２サイトカインを有する、より均衡のとれたＴｈ−１／Ｔｈ−２反応を誘導した。
【００６４】
例５
粘膜投与されたフルオロカーボン誘導ペプチド（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の免疫原性
特定病原体未感染のマウス（６−８週  雌  Ｂａｌｂ／ｃ）をＨａｒｌａｎ（ＵＫ）から購入した。
【００６５】
０．０１Ｍ  ＰＢＳ単独、或いはムラブチド１００μｇと組み合わせたＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ（マウス１匹当たり５０ｎｍｏｌ）を、投与間隔１０日で、鼻腔内に２度投与した。マウスを幾分イソフルレンで麻酔した（Ｉｓｏｆｌｏ、Ｓｏｌｖａｙ、ＵＫ）。可溶性ペプチド溶液２０μｌ（１０μｌ／鼻腔）をマイクロピペットを使用して投与した。対照グループにはＰＢＳのみを投与した。各投与するグループは、６匹の動物を具えた。二酸化炭素窒息によって、最後に投与後１０日でマウスは犠牲になった。各グループのマウスについて脾臓を切除し、貯蔵し、脾臓細胞を分離した。計数前に、細胞をＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄した。Ｔｈｏｍａｓ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｌｉｄｅを使用して計数を実施した。個々のマウス由来の脾臓細胞を、５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で１８時間、培養培地で適正な濃度のペプチド（ＴヘルパＥＮＶ（３０１−３２２）又はＰ１８−Ｉ１０ＣＴＬエピトープ１０又は０μｇ／ｍｌ）で培養した。次いで、ＩＦＮ−ｇ  Ｅｌｉｓｐｏｔ分析を例３に記載されたＤｉａｃｌｏｎｅキットを使用して実施した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＥＬＩｓｐｏｔ  ｒｅａｄｅｒ  ｕｎｉｔを使用して、このスポットを数えた。この結果は、バックグラウンド除去後（＜１０スポット）、各条件で得られた平均値に相当する。１ミリオン入力脾臓細胞に対するスポット形成ユニット（ＳＦＣ）として結果を示す。データは、６匹のマウスの平均を示す。
【００６６】
ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独又はムラブチドと組み合わせて鼻腔内に免疫化された１グループ当たり全６匹のマウスは、ロバスト全身性Ｔ細胞応答を引き起こした。ムラブチドとの組み合わせは、Ｔ細胞を生成するＩＦＮ−ガンマの頻度を適切に増加した（図９）。
【００６７】
例６
標本ＨＩＶペプチド
ＨＩＶ用予防薬及び治療ワクチンを生成するためのフルオロカーボンベクタに結合する候補ペプチドは、次の一又はそれ以上のペプチド又はそのフラグメント、相同体（対応するコンセンサス、限定されないが、２００４年のロスアラモス国立研究所のデータベースに参照されるクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ等の異なるクレードを表すＨＩＶ−１由来の祖先又はセントラルツリーシークエンスを含む）、又はこれらの天然及び非天然変異体を含んでも良いが、排他的に必要ではない。標準１文字及び３文字アミノ酸コードを使用した。相同体は、参照シークエンスと比較して少なくとも５０％同一性を有する。好ましくは、相同体は、天然産シークエンスと８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一性を有する。以下に提供されるシークエンスは、長さ３５アミノ酸である。一又はそれ以上のエピトープを含有するこれらのシークエンスのフラグメントも、フルオロカーボンベクタに結合するための候補ペプチドである。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｌ
ＷＫＧＥＧＡＷＩＱＤＮＳＤＩＫＷＰＲＲＫＡＫＩＩＲＤＹＧＫＱＭＡＧ
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【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２
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【００７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３
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【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ４
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【００７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ５
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【００７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ６
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【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ７
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【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ８
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【００７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ９
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【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１０
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【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１１
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【００７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１２
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【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１３
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【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１４
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【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１５
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【００８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１６
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【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１７
ＡＳＶＬＳＧＧＥＬＤＲＷＥＫＩＲＬＲＰＧＧＫＫＫＹＫＬＫＨＩＶＷＡＳＲ
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【００８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１８
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【００８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１９
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【００８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２０
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【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１
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【００８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２２
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【００９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２３
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【００９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２４
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【００９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２５
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【００９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２６
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【００９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２７
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【００９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２８
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【００９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２９
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【００９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３０
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【００９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３１
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【００９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３２
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【０１００】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３３
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Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ
【０１０１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３４
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【０１０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３５
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【０１０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３６
ＧＬＧＱＨＩＹＥＴＹＧＤＴＷＡＧＶＥＡＩＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩＧ
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
【０１０４】
ＨＩＶ用予防薬又は治療ワクチンに含有する候補ペプチドは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ又はＲｅｖのいずれかの組み合わせの、これらの構造又は機能ドメインのいずれかに由来するペプチドであってよい。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
例は、図を参照する。
【０１０６】
【図１】図１は、Ｔ＝０で、種々のペプチド及びコンストラクトのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、４０℃で２７日間保存された種々のペプチド及びコンストラクトのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、２つのペプチド、ＦＡＶＳ−３−ＥＮＶ及びＦＡＶＳ−１−ＥＮＶについての臨界ミセル濃度評価を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、種々のペプチドコンストラクトについて表す２０時間後の準光散乱スペクトロメータによる粒子サイズ分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、種々のペプチドコンストラクトについて表す２０時間後の準光散乱スペクトロメータによる粒子サイズ分析を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、種々のペプチドコンストラクトについて表す２０時間後の準光散乱スペクトロメータによる粒子サイズ分析を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、単一免疫化（Ａ、Ｂ）、第１ブースト（Ｃ、Ｄ）及び第２ブースト（Ｅ、Ｆ）後にマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、単一免疫化（Ａ、Ｂ）、第１ブースト（Ｃ、Ｄ）及び第２ブースト（Ｅ、Ｆ）後にマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、単一免疫化（Ａ、Ｂ）、第１ブースト（Ｃ、Ｄ）及び第２ブースト（Ｅ、Ｆ）後にマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、単一免疫化（Ａ、Ｂ）、第１ブースト（Ｃ、Ｄ）及び第２ブースト（Ｅ、Ｆ）後にマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、単一免疫化（Ａ、Ｂ）、第１ブースト（Ｃ、Ｄ）及び第２ブースト（Ｅ、Ｆ）後にマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、単一免疫化（Ａ、Ｂ）、第１ブースト（Ｃ、Ｄ）及び第２ブースト（Ｅ、Ｆ）後にマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、種々のフルオロカーボン−ペプチドコンストラクトによるｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激を受けたＴリンパ球の性質を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、種々のフルオロカーボン−ペプチドコンストラクトによるｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激を受けたＴリンパ球の性質を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、又はムラブチドと組み合わせて、３回注入した後のマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、又はムラブチドと組み合わせて、３回注入した後のマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図８Ａ】ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、或いはムラブチドと組み合わせて、３回の注入後のサイトカイン測定。
【図８Ｂ】ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、或いはムラブチドと組み合わせて、３回の注入後のサイトカイン測定。
【図８Ｃ】ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、或いはムラブチドと組み合わせて、３回の注入後のサイトカイン測定。
【図８Ｄ】ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、或いはムラブチドと組み合わせて、３回の注入後のサイトカイン測定。
【図８Ｅ】ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、或いはムラブチドと組み合わせて、３回の注入後のサイトカイン測定。
【図８Ｆ】ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、或いはムラブチドと組み合わせて、３回の注入後のサイトカイン測定。
【図９Ａ】図９Ａは、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、又はムラブチドと組み合わせて、２回の経鼻投与後のマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＦＡＶＳ−１−ＥＮＶ単独、又はムラブチドと組み合わせて、２回の経鼻投与後のマウスで、ｅｘ  ｖｉｖｏＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価された細胞免疫応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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