(57)【要約】  本発明は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微生物を炭酸カルシウムを用いてｐＨ安定化されており、３〜１５ｇ／ＬのＣａＣＯ３を含む発酵培地において培養し、その後ＰＵＦＡを微生物及び／または培地から単離することによるＰＵＦＡを産生するための最適方法に関する。本発明は特に、異なるＣａＣＯ３含量を有する新規な最適化培地に関する。適当量のＣａＣＯ３を使用することにより、この方法はｐＨをコントロールすることなくヤブレツボカビ微生物を発酵させることができるように発酵中かなり簡素化され得、大量のＤＨＡをバイオマス中の高い油含量で得ることができ、これによりＰＵＦＡ産生が実質的に改良され、かなり簡素化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）属の微生物をＣａＣＯ３以外の他のｐＨ安定化手段を殆ど添加せず、好ましくはＣａＣＯ３以外の他のｐＨ安定化手段を添加せずに発酵培地において培養する前記微生物の培養方法。
【請求項２】
微生物が乾燥バイオマスの重量単位あたり２５重量％以上、好ましくは３５重量％以上、非常に特に好ましくは４５重量％以上の油を産生する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が乾燥バイオマスの重量単位あたり１０重量％以上、好ましくは１４重量％以上、特に好ましくは１８重量％以上、非常に特に好ましくは２２重量％以上のＤＨＡを産生する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物が乾燥バイオマスあたり１％以上、好ましくは２％以上、特に好ましくは３％以上、非常に特に好ましくは４％以上のＤＰＡを産生する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
３〜１５ｇ／Ｌ、好ましくは４〜１２ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１０ｇ／Ｌ、非常に特に好ましくは７．５±０．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３を培地に添加する請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
培地がグルコース、コーンスティープリカー、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム及びリン酸水素カリウムを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
培地が３〜１０、好ましくは５〜７のｐＨを有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
培養を１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で実施する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
培養を１〜１０日間、好ましくは３〜９日間実施する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
微生物がシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）属またはウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属に属している請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法
【請求項１１】
微生物がウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
微生物がシゾキトリウム種ＳＲ  ２１である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヤブレツボカビ目の微生物を培養するための専らＣａＣＯ３をｐＨ安定化手段として含む培地の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも２０面積（％）、好ましくは少なくとも３０面積（％）、特に好ましくは少なくとも４０面積（％）のＤＨＡ含量を有する油。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも３面積（％）、好ましくは少なくとも６面積（％）、特に好ましくは少なくとも９面積（％）のＤＰＡ含量を有する油。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも９０％の純度を有するＤＨＡ。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも９０％の純度を有するＤＰＡ。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロスから分離して得ることができるバイオマス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のバイオマスを含む動物飼料。
【請求項２０】
請求項１８に記載のバイオマスを含むヒトのための栄養食料。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
各種ＰＵＦＡ（ポリ不飽和脂肪酸）、特にω−３脂肪酸（ｎ−３脂肪酸）はヒト栄養の必須成分である。
【０００２】
しかしながら、大部分の工業国ではｎ−３脂肪酸の供給は不十分である。対照的に、食事中の脂肪の全量及び飽和脂肪酸やｎ−６脂肪酸の摂取はかなり多い。これは、食事の組成が変化したためであり、この変化は特に最近約１５０年間に生じており、工業国での主な死亡原因である心血管疾患のような各種の慢性文明病の出現とリンクしている（A.P.Simopoulos, Am.J.Clin.Nutr., 70:560-569(1999)）。一方で、多数の研究から、ｎ−３脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を多く摂取すると心血管リスクを大きく低下できることが判明している（GISSI-Prevenzione Investigators (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico), Dietary supplementation with n-3 polysaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-pevenzione trial., Lancet, 354:447-455(1999)；Burrら, Effects of changes in fat, fish, and fiber intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART), Lancet, 2:757-761(1989)）。従って、多くの各種機構(ＷＨＯ、ＦＡＯ、ＡＨＡ、ＩＳＳＦＡＬ、英国栄養財団等)はｎ−３脂肪酸をより多く摂取することを推奨している（Kris-Ehertonら, Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease,Circulation, 2747-2757(2002)）。
【０００３】
ＰＵＦＡ、特にｎ−３脂肪酸のソースは特に、海洋冷水魚及びそこから抽出される油だけでなく、海洋微生物もある。海洋微生物は、魚と比較してコスト的に有利でコントロールされる条件下でＰＵＦＡを産生するために使用され得るという利点を有している。発酵産生は、魚またはそこから抽出される魚油に関してしばしば記載されている汚染リスクを与えない（S.F.Olsen, Int..J..Epidemiol.,1279-80(2001)）。加えて、抽出した油の組成は、生物及び培養条件を選択することにより明確に影響され得、魚及び魚産物に関して記載されているような（Gamez-Mezaら, Lipids, 639-42(1999)）季節変動を受けない。
【０００４】
ｎ−３  ＰＵＦＡを産生させるのに適した微生物は、例えばビブリオ属の細菌（例えば、ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ））；渦鞭毛虫類（渦鞭毛植物）、特にクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えばＣ・コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））；またはストラメノパイルス（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）（例えば、グロッソマスティクス（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ）、黄色藻類（Ｐｈａｅｏｍｏｎａｓ）、ピオグイオクリシス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ピングイオコッカス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｏｃｃｕｓ）やポリドクリシス（Ｐｏｌｙｄｏｃｈｒｙｓｉｓ）のようなピンギオ藻網）の中にある。ＰＵＦＡの発酵産生のための好ましい微生物は、ストラメノパイルス（すなわち、ラビリンツラ類)、特にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｃｈｙｔｒｉｉｄｅａ）、並びにジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属及びウルケニア属に属する。
【０００５】
上記した微生物の幾つかが脂肪酸を工業的に産生するために使用され得ることは公知であり、対応方法も記載されている。従って、国際特許出願公開第91/07498号パンフレットはシゾキトリウム属及びヤブレツボカビ属の生物を用いるＰＵＦＡの産生を開示している。国際特許出願公開第91/11918号パンフレットはクリプテコジニウム・コーニイを用いるＰＵＦＡの産生を開示している。国際特許出願公開第96/33263号パンフレット及び対応の欧州特許出願公開第0 823 475号明細書はシゾキトリウム属の微生物を用いるＰＵＦＡの産生を開示しており、国際特許出願公開第98/03671号パンフレットはウルケニア属の微生物を用いるＰＵＦＡの産生を開示している。
【０００６】
上記した微生物、特にラビリンツア門の天然生息地は海洋である。従って、これらの微生物は通常塩含有培地において培養されている。なお、本発明の目的で海水の塩含量は３２〜３５ｇ／Ｌ及び９０〜９５％のナトリウム及び塩素含量として定義される。ヤブレツボカビまたはシゾキトリウムのような海洋微生物を培養するための典型的な培地は海水を主成分としている（例えば、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）７９０  Ｂｙ＋培地［酵母抽出物１．０ｇ、ペプトン１．０ｇ、Ｄ＋グルコース５．０ｇ、海水１Ｌ］）。しかしながら、ヤブレツボカビ目の微生物が非常に低い塩分濃度の培地において生き延びることができることも公知である。しかしながら、７．５〜１５‰の塩分濃度に相当する７．５〜１５ｇ／Ｌの塩の限界以下では、その成長は非常に遅く、低塩分濃度範囲で中間最大レベルなしであると記載されている。最適成長率は上記した塩分濃度限界を超えたときのみ達成される（Fanら, Botanica Marina, 45:50-57(2002)）。
【０００７】
発酵方法において頻繁に直面する問題は、代謝産物が出現し及び／または個々の培地成分が消費される結果として培養中ｐＨが大きく変化することである。これは、海洋微生物を発酵させるための塩を多く含む培地に特に当てはまる。このため、上記発酵ではｐＨ調節手段がしばしば必要である。しかしながら、大規模発酵の場合、ｐＨコントロールはかなりのコスト高を招く。この点で、追加成分の導入のために使用され得る酸及び塩基を添加するための追加容器が必要である。更に、ｐＨ値を調節するための滴定は技術的にコントロールされなければならない。ＰＵＦＡを工業規模で得るためのラビリンツア門の発酵に関して、ｐＨ値をコントロールした培養方法が当業界で使用されている。
【０００８】
しかしながら、細胞培養において一般的な緩衝系を用いてｐＨ値をコントロールすることは不利である。例えばＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ及びＭＯＰＳの緩衝能は、そのｐＫａ値が７以上であるのでＰＵＦＡ発酵のために必要なｐＨ範囲では不十分である。加えて、潜在的に反応性の第１級アミンであるＴＲＩＳは７．５未満のｐＨ範囲では好ましくない緩衝液であり、各種生物学的反応に積極的に関与する恐れがある。同様に頻繁に使用されている緩衝剤であるリン酸緩衝液は２価カチオンの存在下で溶液から析出する特性を有しており、またリン酸を必要または消費する発酵法のためには間違った選択である。酢酸緩衝液は、緩衝範囲が狭く、発酵中に代謝されるために適当でない。更に、多くの代替緩衝系はコストが高いために経済的でない。
【０００９】
従って、上記技術水準に照らして、本発明の目的は海洋微生物のための新規で簡単且つ経済的な培養方法を提供することである。本発明により、方法のコントロールがかなり簡素化されなければならない。費用効果とは別に、方法は高純度のＰＵＦＡを高収率で産生できなければならない。
【００１０】
上記目的及び明瞭に記載されていないが序の欄に記載されている関係から容易に推論または推察され得る更なる目的は本発明の請求の範囲に規定する主題により達成される。
【００１１】
ヤブレツボカビ目の微生物を培養するための有利な方法は請求項１に記載されている方法により提供される。この方法は、ｐＨ値が専らＣａＣＯ３により安定化されており、３〜１５ｇ／ＬのＣａＣＯ３を含む培地において培養し、可能ならばその後微生物及び／または培地からＰＵＦＡを単離することを含む。
【００１２】
本発明は更に、高純度ＰＵＦＡを産生する方法を含む。
【００１３】
本発明によれば、好ましいＰＵＦＡはＤＨＡ、ＤＰＡ及びＥＰＡである。
【００１４】
特に、上記した方法により培養した微生物は、乾燥バイオマスあたり１０％以上、好ましくは１４％以上、非常に特に好ましくは１８％以上のＤＨＡを産生する。
【００１５】
特に、上記した方法により培養した微生物は、乾燥バイオマスあたり１％以上、好ましくは２％以上、非常に特に好ましくは３％以上のＤＰＡを産生する。
【００１６】
ＰＵＦＡは、培養後微生物(バイオマス)及び／または培地からＰＵＦＡを単離することにより高い純度及び収率で得ることができる。
【００１７】
更に、本発明は、本発明の培養方法により得られるバイマスの産生方法を含む。
【００１８】
このバイオマスは、全ての考えられる限りの方法で使用され得る。特に、このバイオマスは、例えば乾燥形態（乾燥バイオマス）で直接食料または動物飼料として使用され得る。
【００１９】
加えて、本発明はまた、本発明の培養方法を実施し、微生物及び／または培地から油を単離することにより得られる油タイプを含む。
【００２０】
特に、これは多く他の好ましい用途とは別にヒト栄養のために有利に使用され得る油タイプである。
【００２１】
本発明の条件下で、微生物は、乾燥バイオマスの重量単位あたり３０重量％以上、好ましくは３５重量％以上の油の産生を示す。
【００２２】
本発明によれば、油は、当業者に公知のヤブレツボカビ目の通常脂肪酸スペクトルに相当する少なくとも７０％の中性脂質及び少なくとも２％のリン脂質の割合であると理解される。中性脂質は少なくとも８０％のトリグリセリド及び他の成分（例えば、ジアシルグリセリド、ステロール等）より構成されている。更に、トリグリセリドの重量分率は約９５％の脂肪酸及び５％のグリセリンからなる。
【００２３】
ｐＨ値を特に調節することなく、特に高グルコース消費で速く成長できる条件下でＰＵＦＡを産生するために海洋微生物が発酵できることはかなり驚くべきことであった。海洋微生物の発酵において適当なｐＨコントロールが非常に迅速に失われると培地が酸性化し、それにより成長が止まる条件では特にそうである（実施例1及びZ.Y.Wen及びF.Chen, Biotechnology Advances, 21:273-294(2003)参照）。
【００２４】
本発明の方法は、驚くことに他のｐＨ値安定化手段を添加することなくなし得る。トリスまたはリン酸緩衝液のような緩衝系を用いる経済的に利用可能な培養方法は発明者らに公知でないが、本発明によれば、ｐＨ値安定化手段は培養中に達成するｐＨ値に依存して調節される添加タンクからの酸または塩基の添加；及び培地それ自体中の緩衝系の使用の両方であると理解される。
【００２５】
本発明の方法によれば、ＣａＣＯ３はｐＨ値安定化のための必須手段である。それでも、ある条件下ではｐＨ値を調節するために培地に酸または塩基を添加することが必要なことがある。ＣａＣＯ３がｐＨ安定化のための必須手段である限りこの添加も本発明に含まれる。例えばｐＨ値が微生物の例外的に迅速な成長のために培養中特定目的値以下に低下するならば、この目的値は酸または塩基を添加することにより一次的に調節され得る。ただし、この添加はｐＨ値調節の必須手段ではない。
【００２６】
用語「ｐＨ値調節」、「ｐＨ値コントロール」または「ｐＨ値安定化」は本発明において同義的に使用される。
【００２７】
必須手段はＣａＣＯ３である。いずれも本発明に従ってＣａＣＯ３を添加するが、酸を添加してまたは添加せずに測定され得るｐＨ値の差は１以下、好ましくは０．７５以下、特に好ましくは０．５以下、非常に特に好ましくは０．２以下、最も好ましくは０．１以下である。前記した酸及び／または塩基の添加は本発明による微量の酸及び／または塩基の添加であると理解され、これも本発明に含まれる。
【００２８】
酸及び／または塩基の添加を必要としない培養系が好ましい。
【００２９】
加えて、多くの代替緩衝系は、炭酸カルシウムの使用に比して費用が高いために不経済である。
【００３０】
ヤブレツボカビ目の微生物を培養するための緩衝剤としての炭酸カルシウムの高効率は驚くことである。なぜならば、形成された二酸化炭素は発酵中の緩衝能を低下させる水中溶解度が低いからである。
【００３１】
驚くことに、本発明の炭酸カルシウム安定化培地を使用するとき、グルコースが完全に消費されるまでの発酵が可能であり、更にはバイオマス中のＰＵＦＡの割合が有意に増加する。更に驚くことは、グルコース利用及びこれに関連してＰＵＦＡ産生が促進され、よって空時収率が向上することである。
【００３２】
本発明まで、別のｐＨ値安定化手段を使用することなく、炭酸カルシウムでｐＨ安定化させた培地を用いてヤブレツボカビ目の微生物においてｎ−３脂肪酸を生産するために公知の発酵方法は利用されていなかった。
【００３３】
ＰＵＦＡは、少なくとも２個の二重結合を含む＞Ｃ１２の鎖長を有するポリ不飽和長鎖脂肪酸である。本発明の方法に従って産生されるＰＵＦＡは特にｎ−３脂肪酸及びｎ−６脂肪酸である。
【００３４】
本発明において、ｎ−３脂肪酸（オメガ−３脂肪酸、ω−３脂肪酸）は少なくとも２個以上の二重結合を含み、第１二重結合がアルキル末端から数えてＣ３とＣ４炭素間にある＞Ｃ１２の鎖長を有するポリ不飽和長鎖脂肪酸であると理解される。従って、ｎ−６脂肪酸の場合第１二重結合がアルキル末端から数えてＣ６とＣ７炭素間にある。
【００３５】
ラビリンツア門に属する微生物は本発明の方法に従うＰＵＦＡの産生のために考えられる。ヤブレツボカビ目（ヤブレツボカビ科）の微生物が好ましい（T.E.Lewis, P.D.Nichols, T.A.McMeekin, The Biotechnological Potential of Thraustochytrids, Marine Biotechnology,S.580-587(1999)及びD.Porter, Phylum Labryinthulomycota in Handbook of protoctista: the structure, cultivation, habitats, and life histories of the eukaryotic microorganisms and their descendants exclusive of animals, plants, and fungi: a guide to the algae, ciliates, foraminifera, sprorozoa, water molds, and other protoctists,編集者:L.Margulis,J.O.Corliss,M Melkonian及びD.J.Chapman,編集コーディネーター:H.I.McKhann,Jones and Bartlett Publishers, ISBN 0-86720-052-9,S.388-398(1990)）。ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属及びウルケニア属の微生物が特に好ましい。これらの中で、シゾキトリウム、ヤブレツボカビ及びウルケニアが非常に特に好ましい。特に好ましいのは、ジャポノキトリウム種（ＡＴＣＣ  ２８２０７）、ヤブレツボカビ・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）（特に、ＡＴＣＣ  ２８２１１及びＡＴＣＣ  ３４３０４）、ヤブレツボカビ・ロセウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２８２１０）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ２０８９０、ＡＴＣＣ  ２０８９１、ＡＴＣＣ  ２０８９２及びＡＴＣＣ  ２６１８５）、シゾキトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２８２０９）、シゾキトリウム種（ＡＴＣＣ  ２０８８８及びＡＴＣＣ  ２０８８９）、シゾキトリウムＳＲ２１及びウルケニア種（ＳＡＭ  ２１７９及びＳＡＭ  ２１８０）である。
【００３６】
本発明の方法に適当な微生物は野生型形態、そこから誘導される変異体及び株、並びに対応生物の組換え株である。本発明は特にＰＵＦＡの産生を増加させるために変異体または組換え株を含む。
【００３７】
本発明の微生物は、液体または固体培地に上記生物の前培養物を接種することにより培養される。
【００３８】
ヤブレツボカビ目の微生物に適した培養技術は当業者に公知である。通常、排他的ではないが、培養は対応容器において水性発酵により実施される。この種の発酵のための典型的な容器の例には、振とうフラスコまたはバイオリアクター（例えばＳＴＲ（撹拌式タンク反応器））またはバブルカラムが含まれる。培養は、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、特に好ましくは２５〜３０℃、更に特に好ましくは２７〜２９℃、特に２８±０．５℃の温度で実施される。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様では、ｐＨ安定化培地の炭酸カルシウム含量は３〜１５ｇ／Ｌ、好ましくは４〜１２ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１０ｇ／Ｌの範囲の値に対応する。非常に特に好ましい炭酸カルシウム含量は７．５±０．５ｇ／Ｌである。
【００４０】
更に好ましくは、ｐＨ安定化培地は１つ以上の炭素源及び１つ以上の窒素源を含む。ヤブレツボカビ目の微生物を培養するための炭素源及び窒素源として使用可能な物質は当業者に公知である。
【００４１】
使用可能な炭素源の例は、炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、可溶性デンプン、フコース、グルコサミン、デキストラン、グルタミン酸、糖蜜、グリセリンまたはマンニトール）、油脂または植物加水分解物である。
【００４２】
使用可能な天然窒素源の例は、ペプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、肉抽出物、カザミノ酸、コーンスティープリカーまたは大豆であり、使用可能な有機窒素源の例はグルタメート及び尿素であり、無機窒素源（例えば、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム）も窒素源として使用され得る。
【００４３】
炭酸カルシウムに加えて、ｐＨ安定化培地は、ヤブレツボカビ目の微生物の培養を助けるために当業者に公知の全ての他の成分、特に無機塩（例えば、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＭｏまたはＺｎ）を含み得る。リン酸塩（例えば、リン酸水素カリウム）、塩化物（例えば、塩化マグネシウム）、硫酸塩（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄または硫酸ナトリウム）を例示することができる。更に使用可能な無機塩は、例えばハロゲン化物（例えば、臭化カリウムまたはヨウ化カリウム）及び他の炭酸塩（例えば、炭酸水素ナトリウム）である。
【００４４】
可能ならば、培地は追加の多量栄養素及び微量栄養素、例えばアミノ酸、プリン、ピリミジン、コーンスティープリカー、タンパク質加水分解物、ビタミン（水溶性及び／または水不溶性）及び当業者に公知の他の培地成分を含み得る。所要により、消泡剤を添加してもよい。培地は複合成分を含んでいても、または化学的に規定されていてもよい。
【００４５】
微生物の成長または生産性に対して悪影響がない限り、各成分の量は変更可能である。当業者は、微生物の要件に応じて個々の事例で組成を容易に決定することができる。通常、炭素源は最高３００ｇ／Ｌの濃度で添加され、窒素源は１〜３０ｇ／Ｌの濃度である。好ましくは、窒素源は培地の炭素含量に応じて調節される。
【００４６】
特に好ましいｐＨ値安定化培地はグルコース、酵母抽出物、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及びリン酸カリウムを含む。
【００４７】
培地のｐＨ値は、発酵開始前に対応する酸または塩基を添加することにより３〜１０、好ましくは４〜８、特に好ましくは５〜７、非常に特に好ましくは約６に設定する。
【００４８】
培地はその後滅菌される。培地の滅菌方法は当業者に公知であり、高圧蒸気滅菌及び滅菌濾過が例示され得る。
【００４９】
培養は、通常当業者には公知のように回分、流加モードまたは連続的に実施され得る。
【００５０】
回分または流加培養は通常１〜１２日間、好ましくは２〜１０日間、特に好ましくは３〜９日間実施する。
【００５１】
培地成分は培地に個々に、または混合物として添加され得る。混合物を予め調製することも可能である。前記成分（特に、炭素源及び窒素源）または特定の培地添加物は培養前または培養中に添加され得る。添加は２回または複数回繰り返され得、或いは連続的にも実施され得る。
【００５２】
産生したＰＵＦＡは通常中性脂肪（例えば、トリアシルグリセリド）または極性脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルイノシトール）の形態で利用可能である。
【００５３】
本発明の目的で、用語「ＰＵＦＡ」、「ｎ−３脂肪酸」または「ｎ−３活性物質」は、対応脂肪酸が存在し得る全ての考えられ得る形態、すなわち遊離脂肪酸、エステル、トリグリセリド、リン脂質または他の誘導体の形態を有すると理解される。これらの物質は全て以下の説明においてまとめられ、これらの用語は同義的に使用される。更に、ＰＵＦＡは、培養から単離する前またはその後に例えば適当な酵素（リパーゼ）を用いて化学的または生体触媒エステル交換により変換され、濃縮され得る。
【００５４】
発酵微生物または培地からのＰＵＦＡの単離及び脂肪酸スペクトルの分析は当業者に公知の一般的な手順（U.N.Wanasundara, J.Wanasundara, F.Shahidi, Omega-3 fatty acid concentrates: a review of production technologies, Seafoods - Quality, Technology and Nutraceutical Applications, S.157-174(2002)）を用いて実施される。
【００５５】
本発明の方法の基礎をなすｐＨ安定化発酵培地を以下幾つかの実施例により説明する。しかしながら、発酵培地及び本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００５６】
専ら異なる量のＣａＣＯ３によりｐＨ安定化させた各種培地においてＰＵＦＡを産生するためのウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株の発酵
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）において培養した。
【００５７】
培地組成：
発酵培地：グルコース            １５０ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー    ３．７５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                ３ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４                １ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        １ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ０．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４            ５ｇ／Ｌ；
５０ｍＬフラスコあたりのＣａＣＯ３添加：培地１．１    ０ｇ／Ｌ
培地１．２    １ｇ／Ｌ
培地１．３    ２ｇ／Ｌ
培地１．４    ５ｇ／Ｌ
培地１．５    １０ｇ／Ｌ；
ｐＨ値をＮａＯＨ及びオートクレーブで６．０に設定。
【００５８】
培養条件：温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ。
【００５９】
９６時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表１】
2007512809.tif 000002
【００６０】
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９をｐＨを十分に安定化させていない発酵培地中で発酵させると、ｐＨ値が急激に低下する結果として発酵中グルコース消費が減速し、成長が止まる（培地１．１〜１．３参照）。大量のＣａＣＯ３緩衝液のみが培養中のｐＨ値を安定化させる（培地１．４及び１．５）。このように、ＣａＣＯ３濃度を上昇させると培養中のグルコース消費も多くなる。ｐＨ値が安定化し、それにともなってグルコース消費が多くなるので、高いバイオマス値が得られ、その結果上記した条件下で約２ｇ／Ｌ×ｄという高いＤＨＡ空時収率が得られる。
【実施例２】
【００６１】
グルコース限界までの専ら異なる量のＣａＣＯ３によりｐＨ安定化させた各種培地においてＰＵＦＡを産生するためのウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株の発酵
グルコースが完全に消費するまでウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）において培養した。
【００６２】
培地組成：
発酵培地：グルコース            １５０ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー    ３．７５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                ３ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４                １ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        １ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ０．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４            ５ｇ／Ｌ；
５０ｍＬフラスコあたりのＣａＣＯ３添加：培地１．４    ５ｇ／Ｌ
培地１．５    １０ｇ／Ｌ；
ｐＨ値をＮａＯＨ及びオートクレーブで６．０に設定。
【００６３】
培養条件：温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ。
【００６４】
１４４．５時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表２】
2007512809.tif 000003
【００６５】
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９をそれぞれ５ｇ／Ｌ、１０ｇ／ＬのＣａＣＯ３で緩衝させた培地中で発酵させると、ｐＨ値が大きく低下することなくグルコース限界まで培養することができる。これにより得られたバイオマス及びバイオマスあたりのＤＨＡの割合は、グルコースの完全消費に相当する約５８〜６４ｇ／Ｌのバイオマス及び２０〜２２％のＤＨＡ／ＤＢＭで非常に高い。ＣａＣＯ３濃度が高い（１０ｇ／Ｌ）と、バイオマスあたりの必須ＰＵＦＡ  ＤＨＡは低いＣａＣＯ３（５ｇ／Ｌ）に比して僅かに低下するが、大量のバイオマスが得られることが分かる。しかしながら、得られるＤＨＡ空時収率は両方の濃度でほぼ同一のままである。
【実施例３】
【００６６】
最適化培養条件下でＰＵＦＡを産生するためのウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株の培養
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）においてグルコースが完全に消費するまで培養した。７．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３濃度及び修飾前培養により発酵が最適化された。ＤＨ１培地中の静置培養の代わりに前培養を用いる場合、同一培地で振とう培養を用いた（４８時間、１５０ｒｐｍ及び２８℃）。
【００６７】
培地組成：
前培養培地：ＤＨ１培地
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物(ｇ／Ｌ)          ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
トロピックマリン(ｇ／Ｌ)    ：１６．６５［ドイツ国ワールテンベルクに所在のＤｒ．Ｂｉｅｎｅｒ  ＧｍｂＨ］；
ＨＣｌでｐＨ値を６．０に設定；
発酵培地：グルコース            １５０ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー    ３．７５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                ３ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４                １ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        １ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ０．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４            ５ｇ／Ｌ；
５０ｍＬフラスコあたりのＣａＣＯ３添加：培地１．６    ７．５ｇ／Ｌ；
ｐＨ値をＮａＯＨ及びオートクレーブで６．０に設定。
【００６８】
培養条件：温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ。
【００６９】
９９．７５時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表３】
2007512809.tif 000004
【００７０】
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９をまずＤＨ１培地において２８℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養する最適化発酵条件を用いて、ＤＨＡ空時収率を３．５ｇ／Ｌ×ｄ以上に実質的に向上できた。これは主に急速な成長の結果であり、よってグルコース限界は１００時間未満に達成した。発酵培地中に７．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３を使用すると、最適化培養に必要なｐＨ安定化を得ることができる。１０ｇ／ＬのＣａＣＯ３により高いバイオマス値が得られ、５ｇ／ＬのＣａＣＯ３でより高いＤＨＡ値が得られた実施例２の結果から、７．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３を使用した。従って、ＤＨＡ産生（すなわち、できるだけ高いＤＨＡ含量を有するバイオマスをできるだけ大量）のための最適ＣａＣＯ３濃度は５〜１０ｇ／ＬのＣａＣＯ３と推定された。ｐＨ値の安定化に加えて、本発明の発酵培地を使用すると驚くことにグルコース限界時に３ｇ／Ｌ×ｄ以上という高いＤＨＡ空時収率が得られる。この場合、実施例２と同等のバイオマス値が得られ、達成された乾燥バイオマスあたりのＤＨＡの割合及びＤＨＡ量は高かった（１０％以上）。
【実施例４】
【００７１】
ＣａＣＯ３によりｐＨを安定化させた及び安定化させていない培地においてＰＵＦＡを産生するためのウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株の発酵
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株をグルコースが完全に消費するまで５Ｌ容量の発酵装置において培養した。
【００７２】
培地組成：
発酵培地：グルコース            １５０ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー    ３．７５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                ３ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４                １ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        １ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ０．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４            ５ｇ／Ｌ；
ｐＨコントロールありの発酵の場合：Ｈ３ＰＯ４及びオートクレーブでｐＨ値を４．０に設定；
ｐＨコントロールなしの発酵の場合：ＮａＯＨ及びオートクレーブに加えて７．５ｇ／のでＣａＣＯ３でｐＨ値を６．０に設定。
【００７３】
培養条件：温度：２８℃、換気：０．８ｖｖｍ。
【００７４】
ｐＨコントロールあり及びｐＨコントロールなしの発酵
【表４】
2007512809.tif 000005
【００７５】
本発明のＣａＣＯ３安定化発酵培地を使用すると、５Ｌ発酵規模でもウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９をｐＨコントロールなしでグルコース限界まで培養できる。十分量のＣａＣＯ３を使用すると、グルコース消費が促進される結果としてより速く成長する。加えて、大量のバイオマスが得られる。更に、これに関連して、バイオマスあたり高割合のＤＨＡ及び高量のＤＨＡが発酵中得られる。これにより、ｐＨコントロールした発酵に比してＣａＣＯ３緩衝発酵の場合ＤＨＡ空時収率が１５％以上有意に上昇する。
【実施例５】
【００７６】
７．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３により安定化した発酵培地１．６においてＰＵＦＡを産生するためのシゾキトリウム種ＳＲ  ２１の発酵
シゾキトリウム種ＳＲ  ２１株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）においてグルコースが完全に消費するまで培養した。
【００７７】
培地組成：
前培養培地：ＧＹ培地
グルコース(ｇ／Ｌ)      ：３０．０
酵母抽出物(ｇ／Ｌ)      ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
トロピックマリン(ｇ／Ｌ)：１６．６５［ドイツ国ワールテンベルクに所在のＤｒ．Ｂｉｅｎｅｒ  ＧｍｂＨ］
ＨＣｌでｐＨ値を６．０に設定；
発酵培地：グルコース            １５０ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー    ３．７５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                ３ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４                １ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        １ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ０．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４            ５ｇ／Ｌ；
５０ｍＬフラスコあたりのＣａＣＯ３添加：培地１．６    ７．５ｇ／Ｌ；
ｐＨ値をＮａＯＨ及びオートクレーブで６．０に設定。
【００７８】
培養条件：温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ。
【００７９】
９６時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表５】
2007512809.tif 000006
【００８０】
本明細書に記載されているＣａＣＯ３を用いてｐＨ安定化されている培地により、ラビリンツア門に属する他の生物の場合もＰＵＦＡの産生が最適化する。よって、本発明の主題をなす培地において微生物シゾキトリウム種ＳＲ２１株を発酵させることが可能である。ＳＲ２１の場合必須ＰＵＦＡのＤＨＡの空時収率はウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９（実施例３参照）の場合よりも僅かに低いが、ｎ−３  ＰＵＦＡ  ＤＨＡに比して総乾燥バイオマスの１５％（ｗ／ｗ）以上である。この実施例は、本発明の主題をなす最適化されているｐＨ安定化培地により他のラビリンツア門の生物でもＰＵＦＡ産生のためにｐＨコントロールなしに発酵できることを示している。
【国際調査報告】
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