(57)【要約】  植物材料からのテアニン抽出を、一連の抽出、吸着、及び濾過工程を通して高めるための方法。より特には、開示されたのは、植物材料からテアニンを単離するための方法であり、これは：ａ）植物材料を溶媒とさせてテアニンを含む抽出物を得る工程；ｂ）テアニン抽出物を吸着剤と接触させてテアニン含有溶出液を得る工程；及びｃ）テアニン溶出液に濾過工程を受けさせてテアニンに富む抽出物を得る工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物材料からテアニンを単離するための方法であって：
ａ）前記植物材料を溶媒と接触させてテアニンを含む抽出物を得る工程；
ｂ）前記テアニン抽出物を吸着剤と接触させてテアニン含有溶出液を得る工程；及び
ｃ）前記テアニン含有溶出液に濾過工程を受けさせてテアニンに富む抽出物を得る工程を特徴とする方法。
【請求項２】
前記テアニン抽出物を吸着剤と接触させる前記工程が：
ｉ）前記吸着剤を容器中の前記テアニン抽出物に加えること；
ｉｉ）前記吸着剤と前記テアニン抽出物を混合すること；及び
ｉｉｉ）前記テアニン溶出液を前記吸着剤から分離することからなることを特徴する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記テアニン抽出物を吸着剤と接触させる前記工程がカラム抽出であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
植物材料からテアニンを単離するための方法であって：
ａ）前記植物材料を溶媒と接触させてテアニンを含む抽出物を得る工程；
ｂ）前記テアニン抽出物をマイクロフィルターにかけ、及びテアニン含有保持液を保持する工程；
ｃ）前記テアニン含有保持液を吸着剤と接触させてテアニン含有溶出液を得る工程；及び
ｄ）前記テアニン含有溶出液に濾過工程を受けさせてテアニンに富む抽出物を得る工程を特徴とする方法。
【請求項５】
前記テアニン含有保持液を吸着剤と接触させることが：
ｉ）前記テアニン含有保持液を水で希釈すること；
ｉｉ）前記吸着剤を容器中の前記希釈されたテアニン含有保持液に加えること；
ｉｉｉ）前記吸着剤と前記テアニン含有保持液を混合すること；及び
ｉｖ）前記テアニン溶出液を前記吸着剤から分離することからなることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記テアニン抽出物をマイクロフィルターにかけた後に、限外濾過、ナノ濾過、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される第２の濾過方法が続くことを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物材料が茶の葉であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒が、水、エタノール、及びこれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、前記溶媒が水とエタノールとの混合物であり、前記溶媒が前記溶媒の２０重量％未満のエタノールであり、より好ましくは前記溶媒が水であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記吸着剤が、ポリマー樹脂であり、好ましくはポリアミドであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記テアニンに富む抽出物が、更に濃縮されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物材料から天然テアニンの濃縮された抽出を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアニン、又は５−Ｎ−エチルグルタミンは、非タンパク質アミノ酸である。テアニンは、天然にはまれであり、茶の葉（カメリア・シネンシス（Camellia sinesis））及びツバキ（Camellia）の他の種、並びに食用のニセイロガワリ茸（Xerocomus badius）中に最も一般的に見出される。それは、茶の木の葉の約２重量％の範囲まで見出される。それは、茶の抽出物の中で、フェノール部分と密接に関連していることが通常見出され、及び茶のポリフェノールの渋みを緩和すると一般に考えられている。
【０００３】
近年、テアニンは詳しく研究されており、心臓血管の健康及び癌治療の分野において治療上の利益にますます関連していることが見出されている。特に、テアニンは、血圧を下げるのに役立ち及び化学療法薬の効果を高めることが見出されている。テアニンはまた、精神的及び身体的な息抜きを促進し、及び眠気を催さずにストレスや不安を減少するという評判がある。そのため、植物材料からテアニンを抽出するためのより有効な方法を開発することへの要求があり、そしてこれは様々な食品、飲料、サプリメントなどに組み込まれ、追加の治療上の価値を提供することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書に開示された方法を用いることにより、テアニンの収率が高められることを出願者は驚くべきことに発見した。即ち、本発明の方法は、テアニンの増加した量の生成を可能にする。現在の茶の方法は、廃棄された茶材料からテアニンを抽出する、相対的に簡単な溶解度に基づく方法を用いている。結果として、現在の天然のテアニンの調製品は、一般にわずか２０〜３０％のテアニンを含有する。その上、テアニンは典型的にはポリフェノールを含有する調製品から効率的に分離することはできない。本明細書に記載されるように、吸着物質の使用によりポリフェノール構成要素をテアニンから分離することにより、結果として得られるテアニンに富む抽出物は、ブリックスの測定に基づいて、出発組成物の少なくとも約２倍の濃度を含有することを、本発明の発明者は意外にも発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様では、本発明は、ａ）植物材料を溶媒と接触させてテアニンを含む抽出物を得ること；ｂ）テアニン抽出物を吸着剤と接触させてテアニン含有溶出液を得ること；及びｃ）テアニン含有溶出液に濾過工程を受けさせてテアニンに富む抽出物を得ることを含む、植物材料からテアニンを単離するための方法に関する。更に、テアニン溶出液が濾過工程を受けた後、結果として得られるテアニンに富む抽出物は、任意に、イオン交換クロマトグラフィー又は当業者に既知のいずれかのその他の濃縮技術を介して濃縮されることができる。
【０００６】
本発明の別の態様では、本発明の方法はその他の茶の加工方法を補足するために用いられてもよい。この実施形態では、さもなければ茶の加工において廃棄物として処分される材料が本発明の方法を受けて有用なテアニンに富む抽出物を提供する。この場合、茶の抽出物は、前述の抽出工程（ａ）の後ではあるが、前述の吸着剤の工程（ｂ）の前に、マイクロフィルターにかける工程を受けてもよく、及び任意に、その後ナノ濾過又は限外濾過工程を受けてもよい。これらの初期濾過工程の結果として得られるテアニン含有保持液は、次に混ぜ合わされ、及び吸着剤に接触され、濾過を受け、及び任意に濃縮されてテアニンに富む抽出物を得てもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
Ａ．定義
本明細書で使用する時、用語「含む」とは、本発明の生成物及び方法において、様々な構成要素、及び処理工程を組み合わせて使用できることを意味する。それ故に、用語「含む」は、より制限的な用語「から本質的になる」及び「からなる」を包含する。
【０００８】
本明細書で使用する時、用語「テアニンを含む抽出物」及び「テアニン抽出物」は、同義的に用いられ、本明細書に記載されるような、初期抽出工程の生成物を指す。
【０００９】
本明細書で使用する時、用語「濾過」は、限外濾過又はナノ濾過のいずれかを指すために用いられる。一般に、「透過物」はフィルターを自由に通過する構成成分であるが、一方「保持液」はフィルターにより保持される構成成分である。テアニンを収集する以外の目的で茶を加工する時、透過物よりむしろ保持液が、テアニンの供給源として用いられる。
【００１０】
本明細書で使用する時、用語「マイクロフィルターにかける」は、限外濾過及びナノ濾過より大きい孔径を有する濾過膜を用いる方法を指す。マイクロフィルターにかけることは、テアニン抽出物又は溶出液が、約０．４５μｍ未満の孔径を有するフィルターを通す濾過を受けることを伴う。
【００１１】
本明細書で使用する時、用語「ナノ濾過」は、限外濾過方法で典型的に用いられるものより小さい分子量又は孔径を有する濾過膜を用いる方法を指す。限外濾過と同様に、ナノ濾過は、特定の分子の大きさを超える抽出物又は溶出液の構成成分の部分を拒絶するが、一方より小さい大きさのものは通過させる。本発明の方法に用いるのに好適なナノ濾過膜は、好ましくは、約０．００１２〜約０．００８ａｇ（約７００〜約５０００ダルトン）（約１７〜約４０オングストロームの範囲の孔径に相当する）の公称分画分子量を有するポリマーから製造される。特に好ましいナノ濾過膜は、約０．００１３〜約０．００３３ａｇ（約８００〜約２０００ダルトン）（約１８〜約２７オングストロームの範囲の孔径に相当する）の公称分画分子量を有するポリマーから製造される。この孔径は、一般に、非酸化フェノール化合物に膜を通過させるが、一方酸化フェノール化合物は保持する。
【００１２】
本明細書で使用する時、用語「植物材料」は、ツバキの種、好ましくは、茶の葉（カメリア・シネンシス（Camellia sinesis））、並びに食用のニセイロガワリ茸（Xerocomus badius）、及び当業者に既知のいずれかのその他の天然のテアニン供給源を意味する。
【００１３】
本明細書で使用する時、用語「二級アミノ酸」は、植物材料に見出されるテアニン以外のタンパク質及び非タンパク質のアミノ酸の両方を包含することを意味する。
【００１４】
本明細書で使用する時、用語「実質的に含まない」は、テアニン抽出物を吸着剤と接触させた後、結果として得られるテアニン含有溶出液中のポリフェノールの総含有量が、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、及びより好ましくは少なくとも約８８％低減されることを意味する。ポリフェノールの総量は、「リンモリブデン酸−リンタングステン酸試薬を用いる総フェノール物質の比色分析（Colorimetry of total phenolics with phophomolybdic-phosphotungstic acid reagents）」、ワイン醸造学及びブドウ栽培の米国誌（American Journal of Enology and Viticulture）、３、１４４〜１５８（１９６５年）に記載されるＶ．Ｌ．シングルトン（V.L.Singleton）及びＪ．Ａ．ロッシ（J.A.Rossi）の方法を用いて決定される。
【００１５】
本明細書で使用する時、用語「テアニン含有溶出液」、「テアニン溶出液」は、同義的に用いられ、本明細書に記載されるように、吸着剤に露出された後で収集された所望のテアニン含有構成成分を指す。こうした吸着工程は、カラム吸着であってもよいし、又は当業者に既知のいずれかのその他の吸着手段であってもよい。
【００１６】
本明細書で使用する時、用語「テアニンに富む抽出物」は、ブリックスの測定、即ちテアニン／ブリックスに基づいて、出発組成物の少なくとも約２倍、及び好ましくは少なくとも約２．５倍のテアニン濃度を有する抽出物を意味する。この濃度は、Ｈ．ゲーデル（H.Godel）、Ｐ．サイツ（P.Seitz）、及びＭ．ベルホーフ（M.Verhoef）の方法を用いることにより決定され、これは「ＯＰＡ及びＦＭＯＣ−ＣＩのプレカラム（percolumn）誘導体化の組み合わせを用いる自動化アミノ酸分析（Automated amino acid analysis using combined OPA and FMOC-CI percolumn derivatization）」、ＬＣ．ＧＣインターナショナル（LC.GC International）、５（２）、４４〜４９（１９９２年）に論じられている。その上、本明細書に記載されるテアニンに富む抽出物は、ポリフェノールを実質的に含まない。
【００１７】
本明細書で使用する時、用語「テアニン含有保持液」は、限外濾過又はナノ濾過後にフィルターの上流側に残るテアニン含有構成成分を意味する。こうしたテアニン含有保持液は、茶の加工の焦点がテアニンを収集することではなく、それよりむしろ茶を含有する組成物自体の製造である時には（例えば、高いカテキン濃度を有する茶組成物が望ましい場合）、テアニンの供給源として用いられる。
【００１８】
本明細書で使用する時、用語「限外濾過」は、分子量が少なくとも約０．０１６〜少なくとも約０．１６ａｇ（約１０，０００〜少なくとも約１００，０００ダルトン）の分子が通過できる孔径を有する開放された濾過膜を用いる濾過方法を意味する。典型的には、限外濾過は、大きい分子量の多糖類及びタンパク質を除去するが、酸化フェノール物質は除去しない。
【００１９】
本明細書で使用する時、用語「水」は、脱イオン水、逆浸透水、蒸留水、又はこれらの混合物のいずれかを意味するが、しかしながら脱イオン水が好ましい。
【００２０】
本明細書で用いられるすべての分量、割合、比率、及びパーセンテージは、特に指定のない限り、重量によるものとする。
【００２１】
Ｂ．方法
本発明は、植物材料から得られる非タンパク質アミノ酸テアニンの量を濃縮するための方法に関する。
【００２２】
１．植物材料からのテアニンの初期抽出
本発明の方法の第１工程は、植物材料を溶媒と接触させてテアニンを含む抽出物を得ることを伴う。本発明に用いられる植物材料は、茶の葉（カメリア・シネンシス（Camellia sinesis））及びツバキ（Camellia）の他の種、食用のニセイロガワリ茸（Xerocomus badius）、又は当該技術分野において既知のテアニンの他のいかなる天然供給源の内のものであることができる。しかしながら、本明細書に用いられる植物材料は、好ましくは茶の葉であり、及びより好ましくは緑茶の葉である。好ましい抽出方法は、温水中に茶の葉を浸すことを伴う。茶の葉は、約７０〜１００℃（約１５８〜２１２°Ｆ）、好ましくは約７５〜９０℃（約１６７〜１９４°Ｆ）、及びより好ましくは約８０〜８５℃（約１７６〜１８５°Ｆ）の温水、及び組み合わされた茶の葉を用いて抽出されるが：水の比は約１：１５〜約１：２０であり、即ち用いられる茶の葉の１ｋｇ毎に約１５〜２０ｋｇの温水が用いられる。茶の葉は、温水中に約３０〜４５分間浸漬され、その後濡れた葉が、１枚以上の層のモスリン布、又は漉すための他の同様な材料を通して濾過され、テアニン抽出物が収集される。次に濡れた葉は、別の、その体積の温水で再抽出され、及び約３０〜４５分間更に浸漬されてもよい。茶の葉は再度濾過されて取り除かれ、及びテアニン抽出物が収集される。次に２つのテアニン抽出物が混合され、更なる加工に備える。例えば、好適な抽出手順を開示する、米国特許第５，８７９，７３３号（エカナヤケ（Ekanayake）ら、１９９９年３月９日発行）を参照のこと。
【００２３】
２．抽出物の吸着剤への露出
１つの実施形態では、前工程から結果として得られるテアニン抽出物は、その後吸着剤に暴露され、この吸着剤はテアニン及び二級アミノ酸を、他の関連する物質、例えばポリフェノール、ペクチン、及びタンパク質から分離する。この結果は、前述の関連するポリフェノールを実質的に含まないテアニン含有溶出液である。この吸着工程を実行する好ましい方法は、カラム・クロマトグラフィーである。しかしながら、当業者に一般に既知のいずれかの同様な分離方法も受け入れることができる。例えば、テアニン抽出物及び吸着剤は、溶媒の媒質中で組み合わされ及び完全に混合されてもよい。
【００２４】
前述のように、好ましくはカラム・クロマトグラフィーが、テアニン抽出物中の他の構成成分からテアニンを分離するために用いられる。カラム・クロマトグラフィーを介して分離するために、好ましくはガラス又はプラスチック製の不活性カラムが、最初に吸着剤又はカラム充填剤により充填される。吸着剤物質は、多様な疎水性カチオン性物質のいずれかであってもよいが、しかしながらポリマー樹脂、例えばポリアミド、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルピロリドン、又はポリクラール（Polyclar）（登録商標）が好ましい。次にカラムは、好ましくは水溶性であり及び水と混合された時に２相を形成しない溶媒と共に平衡化される。方法のこの段階で使用される溶媒は、好ましくは、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、アセトンの希釈液、プロパノール、その他の同様なアルコール、及びこれらの混合物から選択される。より好ましくは、溶媒は水とエタノールの混合物を含む。更により好ましくは、溶媒混合物は、溶媒の約８０重量％未満、好ましくは約４０重量％未満、及びより好ましくは約２０重量％未満のエタノールを含む。別の実施形態では、溶媒は水を含む。
【００２５】
次に、テアニン抽出物はカラムに注ぎ込まれ、吸着されていない又は十分に吸着されていない構成成分、即ちテアニンが溶媒により溶出される最初の構成成分である。例えば更なるエタノールの添加により溶媒強度が増すと、より強く吸着された構成成分が、カラム中の吸着剤物質から放出され、及び溶媒により溶出される。この方法は、所望の物質の分離、及びテアニン含有溶出液の生成を可能にする。
【００２６】
３．テアニン含有溶出液の濾過
次に、テアニン含有溶出液は濾過工程を受けて、更なる高分子量物質、例えば多糖類、ペクチン、及びタンパク質を除去し、溶出液のテアニン濃度を更に高める。上に定義されるように、この濾過工程は限外濾過又はナノ濾過のいずれかであってもよい。これらの濾過方法の各々は、以下に記載される。
【００２７】
ナノ濾過は、テアニン溶出液をナノ濾過膜と接触させて濾過されたテアニンに富む抽出物を提供することを伴う。本発明によるナノ濾過は、より高い分子量の物質、例えば多糖類、ペクチン、及びタンパク質を除去する。
【００２８】
ナノ濾過工程は、テアニン溶出液が、約３０℃〜約５０℃（約８６°Ｆ〜約１２２°Ｆ）、好ましくは約３５℃〜約５０℃（約９５°Ｆ〜約１２２°Ｆ）、及びより好ましくは約４５℃〜約５０℃（約１１３°Ｆ〜約１２２°Ｆ）の温度である間に実行されることが好ましい。これは、「茶のクリーム」の形成を回避する。茶のクリームは、カフェイン、フェノール物質、及びその他の高分子量物質、例えば多糖類の熱い可溶性錯体である。それは、紅茶の抽出物中に広範囲に見出され、緑茶の抽出物中には、はるかにより狭い範囲で見出される。しかしながら、効率的な濾過を確実にするために茶のクリームの形成を回避することが有益である。
【００２９】
効率的なナノ濾過は、典型的には、テアニン溶出液を、吸着剤物質への暴露後及びナノ濾過の直前に温めることにより達成される。テアニン溶出液がこの温度範囲内である間にこのナノ濾過工程を実行することは、２つの点で有益である。温度が、約３７℃（１００°Ｆ）より実質的に低い場合には、所望のアミノ酸、例えばテアニンは、残りの酸化ポリフェノールと錯体化してより大きい分子を形成する可能性があり、その結果これは、テアニン溶出液のナノ濾過の間に膜によって除去される。逆に、テアニン溶出液の温度が約６０℃（１４０°Ｆ）をはるかに超える場合には、酸化及びその他の錯体反応のために、テアニン溶出液中で錯体化された酸化物質がより多く形成され得る。
【００３０】
ナノ濾過が実行される時の圧力は、本発明の方法において考慮すべき別の要因である。ナノ濾過が実行される時の圧力は、所望の加工を達成するために、膜を通ってテアニン溶出液の適切な流れを提供するように好ましくは十分に高い。しかしながら、系からかなりの量の水を除去しないように、即ち過剰の濃縮を好ましくは回避するように、圧力はそれほど高くないほうがよい。典型的には、本発明によるナノ濾過は、膜の上流側に適用される、約６８９ｋＰａ〜約２０６８ｋＰａ（約１００ｐｓｉ〜約３００ｐｓｉ）、好ましくは約１２０６ｋＰａ〜約１７２３ｋＰａ（約１７５ｐｓｉ〜約２５０ｐｓｉ）の静水圧下で実行される。
【００３１】
本発明の方法に用いるのに好適なナノ濾過膜は、約０．００１１〜約０．００８ａｇ（約７００〜約５０００ダルトン）（約１７〜約４０オングストロームの範囲の孔径に相当する）の公称分画分子量を有するポリマーから製造される。好ましいナノ濾過膜は、約０．００１３〜約０．００３ａｇ（約８００〜約２０００ダルトン）（約１８〜約２７オングストロームの範囲の孔径に相当する）の公称分画分子量を有するポリマーから製造される。適切な公称分画分子量又は孔径を有する膜を使用することにより、膜の公称孔直径より分子の大きさが小さい、テアニン溶出液中の所望の構成成分は、多量の水（透過物として既知である）と共に、したがって膜を強制的に通過させられて下流側に堆積するが、一方膜の公称孔直径より分子の大きさが大きい望ましくない分子（保持液として既知である）は膜によって拒絶されてその上流側に残留する。
【００３２】
ナノ濾過膜を製造する際に用いられるポリマーの種類はまた、本発明の方法の要因である。好適なポリマーは、テアニン溶出液中の所望の構成成分（即ち、テアニン）に親和力をそれほど持たないものである。酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーは、これらのナノ濾過膜を製造するために通常好適である。
【００３３】
テアニン溶出液がナノ濾過を受ける場合は、結果として得られるテアニンに富む抽出物を冷却することが望ましい。前述のように、テアニン溶出液は、ナノ濾過の前に典型的には温められる。典型的には、結果として得られるテアニンに富む抽出物は、約１６℃（６０°Ｆ）以下、好ましくは約７℃（４５°Ｆ）以下の温度まで冷却される。
【００３４】
時間と共に、ナノ濾過膜は、より高分子量の構成成分の量が増え続けるために目詰まりする場合があり、これは除去され及び保持される。これは、典型的には、透過物の流速が低下することによって立証される。又、膜が目詰まりするにつれて、その処理効率も低下する。それ故に、ナノ濾過膜は、定期的に洗浄又は交換されることによって処理効率を維持することができ、テアニン溶出液中の望ましくない、より高分子量の構成成分が適切な度合いまで除去されることを確実にできる。
【００３５】
ナノ濾過と同様に限外濾過は、テアニン溶出液を限外濾過膜と接触させて濾過されたテアニンに富む抽出物を提供することを伴う。限外濾過は、分子量が少なくとも約０．０１６〜少なくとも約０．１６６ａｇ（少なくとも約１０，０００〜少なくとも約１００，０００ダルトン）の分子が通過できる孔径を有する開放された濾過膜を用いる。本発明による限外濾過は、大きい分子量の多糖類及びタンパク質であるが、一般に、酸化フェノール物質ではないような中程度の分子量物質を除去する。
【００３６】
限外濾過を使用する時、テアニン溶出液は、一般に、約３０℃〜約５０℃（約８６°Ｆ〜約１２２°Ｆ）、好ましくは約３５℃〜約５０℃（約９５°Ｆ〜約１２２°Ｆ）、及びより好ましくは約４５℃〜約５０℃（約１１３°Ｆ〜約１２２°Ｆ）の温度で濾過することができる。又、この温度は、前述のような「茶のクリーム」の形成を回避するのに役立つ。限外濾過に必要な残りの条件及び装置は、ナノ濾過について以上に記載されたものと同じである。
【００３７】
４．更なる濃縮のための任意工程
ひとたびテアニン溶出液が、前述の濾過方法の１つを受けると、結果として得られるテアニンに富む抽出物は、任意にそれに、イオン交換クロマトグラフィー及び電気透析を含む、更なる非限定的濃縮方法を受けさせることにより、更に濃縮することができる。多くの技術を受け入れることができるが、イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。
【００３８】
イオン交換クロマトグラフィーでは、荷電した物質は、反対の電荷を持つカラム物質を介して分離される。交換体カラムのイオンの基は、マトリックスに共有結合し、及び緩衝剤中に存在する低濃度の対イオンにより補われている。試料がカラムに加えられる時、弱く結合した対イオンとの交換が起こる。
【００３９】
イオン交換クロマトグラフィーは、アミノ酸が多価のアニオン又はカチオンであるという事実を用いている。強い酸性のｐＨ条件下では、アミノ酸は、カルボキシ基の解離の抑制及びアミノ基のプロトン化の結果としてカチオンとして存在する。約１２のｐＨ値においては、アミノ酸基が遊離塩基であり、カルボキシ基が解離するため、アミノ酸はアニオンとして存在する。塩の濃度を低く保つ限り、アミノ酸の総計電荷（正味荷電）によって、それらを対応する荷電した固定相に結合することは可能である。
【００４０】
イオン交換クロマトグラフィーの実際の適用中に、交換体がほとんどイオン化し及びバイオポリマーが過剰の正又は負の電荷を含有するｐＨ値、例えばそれらのｐＩ値（等電点）の付近でないｐＨ値に関して動作することは有益である。
【００４１】
過剰に高い塩濃度は、交換体への有効な結合がもはや起こり得ないように、アミノ酸表面上の電荷の遮蔽を生じる場合がある。結合分子は、増加する塩の勾配の助けで、その後置換されるため、異なる電荷のアミノ酸が分離され得る。アミノ酸が電荷を失う時、カラムからのアミノ酸の脱着は、塩濃度の増加又はｐＨ変化によってのみ始まる。より高い電荷密度を有する物質は、相応してより強くカラムに結合され、一方他の物質は迅速に溶出する。
【００４２】
本発明では、イオン交換樹脂は最初に水和され、及びいずれかの浮遊する樹脂ビーズはカラムを塞がないように除去される。次に結果として得られる樹脂のスラリーは、好ましくはガラス又はプラスチック製のカラム中に注入され、及び３〜４カラムの体積の水をカラムに通すことにより、しっかりと充填される。次に、カラムは、塩化ナトリウム、塩酸、又は同様な溶液を、溶出液が酸性から中性に変わるまで（逆もまた同様）通すことにより再生される。カラムは、再度３〜４カラムの体積の水により洗浄されて、過剰の酸又は塩を除去される。テアニンに富む抽出物は、例えば塩酸を用いて酸性、即ちｐＨ約２〜３にされ、カラムに通される。再度洗浄してすべての酸又は塩を除去した後、カラムは増加するｐＨの緩衝剤で溶出される。更に高められたテアニンに富む抽出物が収集され及び濃縮される。
【００４３】
テアニンを更に高める別の受け入れることができる方法は、電気透析法である。電気透析法は、電子膜法であって、その中でイオンは、電位の傾きの影響下で、１つの溶液から他方にイオン透過膜を通って運ばれる。イオンの電荷は、イオン交換ポリマーにより製造された膜を通してそれらが動かされることを可能にする。２つの末端電極の間に電圧を印加することは、このために必要な電位場を生成する。電気透析法に用いられる膜は、正又は負の電荷を有するイオンを選択的に運び、及び反対の電荷のイオンを拒絶する能力を有するため、電気透析法は、反対の電荷を有する物質の濃縮、除去、又は分離に有用である。
【００４４】
電気透析法に用いられるイオン透過膜は、本質的にイオン交換樹脂のシートである。それらは通常またその他のポリマーを含有して機械的強度及び可撓性を高める。カチオン交換膜の樹脂構成成分は、ポリマー鎖に化学結合した負に帯電した基を有する。固定電荷の反対の電荷を有するイオンは、これらの部位で自由に交換される。対イオンの濃度は相対的に高く、そのため対イオンは、電流の大部分を膜を通して運ぶ。ポリマー鎖に結合した固定電荷は、同じ電荷のイオン、この場合アニオンに反発する。膜中のそれらの濃度は相対的に低いため、アニオンは、カチオン透過膜を通して電流のわずかな小部分を運ぶ。正の固定電荷のポリマー鎖への結合はアニオン透過膜を形成し、これは負のイオンを選択的に運ぶ。
【００４５】
好適な濃縮方法の更なる例には、テアニンに富む抽出物を、その出発体積の約１０分の１に濃縮し、それを約１０℃（約５０°Ｆ）にまで冷却し、及び２体積のイソプロパノールを加えることが挙げられる。テアニン及び溶液からのその他の残留するアミノ酸沈殿物は、及び再結晶化により更に精製することができる。アベリアン（Abelian）らの「不動化シュードモナス・ニトロレジューセンズ（nitroreducens）細胞によるテアニン製造の新規方法（A Novel Method of Production of Theanine by Immobilized Pseudomonas nitroreducens Cells.）」生物科学、生命工学、及び生化学（Bioscience Biotechnology and Biochemistry）、５７（３）、４８１〜４８３（１９９３年）を参照のこと。
【００４６】
５．別の実施形態
本発明の別の実施形態では、茶の抽出物は最初にマイクロフィルターにかける工程を受けることができ、その後、任意のナノ濾過又は限外濾過工程が続き、及び結果として得られるテアニン含有保持液は、この保持液を吸着剤と接触させる前に混ぜ合わされることができる。この別の実施形態では、マイクロフィルターにかけること及びナノ濾過／限外濾過工程のパラメーターは、透過物よりむしろ保持液を用いて更なるテアニンの濃縮が生じることを除いて、上述のものと同じである。これは、この別の実施形態では、テアニンを抽出することが、方法の主な焦点でない場合があるためである。この別の実施形態は、テアニン含有保持液が「廃棄」物質と考えられる、即ち茶の加工の目的が、テアニン以外の茶の構成成分を得ることである茶の加工において有用である。
【００４７】
１つのこうした実施形態において、茶の抽出物は、最初にマイクロフィルターにかける工程を受ける。マイクロフィルターにかけることは、茶の抽出物を、約０．４５μｍ未満の孔径を有するマイクロフィルター膜と接触させることを伴い、及びナノ濾過の説明において記載されたのと同じ温度条件下で実行される。しかしながら、その他の濾過方法と異なり、マイクロフィルターにかけることはより低圧で、典型的には約３４５ｋＰａ（５０ｐｓｉ）未満で実行されるべきである。透過物は更なる加工のためにフィルターを通過し、一方テアニンを含有し及び以前は「廃棄物」と考えられた保持液が保持される。
【００４８】
マイクロフィルターにかけた後、透過物は任意に、透過物中に見出されるその他の茶の構成成分を分離するためにナノ濾過又は限外濾過を受ける。テアニンは、保持液中で再度収集される。
【００４９】
ひとたび前述の濾過工程が完了すると、テアニン含有保持液は混ぜ合わされ、及びテアニン含有物は次に、前述の方法により、吸着、濾過、及び任意に、濃縮を介して更に高められ及び濃縮される。
【００５０】
６．テアニンに富む抽出物の使用
植物材料に前述の実施形態の１つを受けさせた後、結果として得られるテアニンに富む抽出物は次に食品及び飲料、例えば茶及び茶抽出物、好ましくは緑茶及び緑茶抽出物のテアニン濃度を高めるために用いられてもよい。更に、テアニンは栄養補助食品などに用いられてもよい。
【実施例】
【００５１】
実施例１：「廃棄」物質を用いることにより緑茶の葉抽出物中のテアニンを高めること
約２００ｇの業務用加工品質の緑茶の葉が、約１６００ｇの脱イオン水により、約７５〜８５℃（約１６７〜１８６°Ｆ）でおよそ４５分間抽出される。結果として得られるスラリーが、２層のモスリン布を通して濾過され、及び約１２００ｇの粗製茶抽出物を生成する。残留する葉は、脱イオン水により前述の条件下で再抽出され、及び再度モスリン布を通して濾過される。茶抽出物は混ぜ合わされ、及び０．４５μｍのプリーツフィルター（０．１３６ｍ2（１．５ｆｔ2）、ポリプロピレン−ポリエステル支持体上のアクリルコポリマー）を介してマイクロフィルターにかける。結果として得られる透過物は、次にミリポア（Millipore）（登録商標）の０．００１６ａｇ（１０００ダルトン）分画分子量（ＭＷＣＯ）のフィルターを用いてナノ濾過を受ける。結果として得られる透過物は次に、色がより薄く及び苦味が軽減した澄んだ茶の抽出物を生成するために用いられる。テアニンを含有するこれらの濾過からの保持液は混ぜ合わされて、約２００ｍＬの体積及び約９．８°のブリックスを有するテアニン含有保持液を生成する。このテアニン抽出物は、約７００ｍｇ／Ｌのテアニン濃度を有する。テアニン抽出物はまた稠度が粘稠であり、そのため脱イオン水により１：１の比で希釈され、及び次の工程の供給物として用いられる。
【００５２】
アンバーライトＸＡＤ  １６ＨＰ（Amberlite XAD １６ＨＰ）（登録商標）（ローム・アンド・ハース（Rohm & Haas））がカラム（２．５ｃｍ内径×７５ｃｍ高さ）中に充填されて、約３５０ｍＬのカラム体積を与える。カラムは約４〜５カラムの体積の脱イオン水により洗浄される。前述の抽出工程からの希釈されたテアニン抽出物が、貫通するまでカラム中に注ぎ込まれる（約１００ｍＬ）。カラムが最初に脱イオン水により溶出されて、テアニン及びその他の多糖類を包含する非フェノール物質を除去する。溶出液がエタノールにより沈殿又は白濁反応を与えない時には、水の溶出は停止される。この溶出液は、約２５７ｍｇ／Ｌのテアニン及び約６ｍｇ／ｍＬの茶多糖類を含有する。それは次に、０．００１６ａｇ（１０００ダルトン）ＭＷＣＯ膜を用いてナノ濾過されて、高分子量の非フェノール物質がテアニンから分離される。テアニンに富む抽出物が、約９．８°ブリックスの元の溶液の値まで濃縮される時、それは、約６５００ｍｇ／Ｌのテアニン濃度を生じ、９倍を超える濃縮効果を示す。それは、茶ポリフェノールが実質的にない。テアニンに富む抽出物は、澄んだ茶抽出物に加えられてそのテアニン濃度を高めてもよいし、あるいはテアニンに富む抽出物は、イオン交換クロマトグラフィーにより更なる浄化を受けてもよい。
【００５３】
実施例２：ナノ濾過を用いる濃縮
加工品質の緑茶の葉が脱イオン水により約４５〜５５℃（約１１３〜１３１°Ｆ）で抽出される。水と茶の葉の比は、約２５：１である。この抽出は約１．５時間継続し、及び結果として得られるテアニン抽出物はモスリンの布を用いて濾過される。残留する茶の葉は、次にもう一度上記のように抽出され、及びこの２回目のテアニン抽出物がモスリン布を用いる濾過により除去される。２つのテアニン抽出物が混ぜ合わされ、及びそれらの中のテアニン含有量は約２２５ｍｇ／Ｌであると決定される。このテアニン抽出物が次にポリアミド−１１（ＩＣＮバイオケミカルズ（ICN Biochemicals））を含有するカラム中に注ぎ込まれる。
【００５４】
カラムを調製するために、ポリアミドは最初に脱イオン水中に懸濁され、及び浮遊粒子は除去される。次にそれはカラム（２．５ｃｍ内径×７５ｃｍ高さ、３３０ｍＬ）中に充填され、及び約５カラム体積の脱イオン水によって洗浄される。カラムは水により最初に溶出され、次いでポリフェノールを実質的に含まないテアニン溶出液の部分が収集される。これらの部分は混ぜ合わされ、及び０．００１６ａｇ（１０００ダルトン）のＭＷＣＯ膜を用いるナノ濾過を受けて、高分子量の非フェノール物質をテアニンから分離する。テアニンに富む抽出物は、また小さい分子量の物質を含有してもよいが、真空下で濃縮され及びカチオン交換クロマトグラフィーを受ける。結果として得られるテアニンは濃縮される。
【００５５】
実施例３：マイクロフィルターにかけること及びナノ濾過（Nanofilration）を用いる非茶葉植物材料の濃縮
非茶葉植物材料を用いる時には材料は最初に湯通しされて、内因性フェノール物質の酸化を防ぎ及び可溶性物質が容易に抽出されるように細胞膜を変性する。湯通しは、植物材料を集め、及び酵素を非活性化させ及び細胞膜を変性して細胞構成要素を容易に浸出させるために、それに蒸す又は釜入り（熱を組織に伝えるために熱い金属表面で繰り返し接触させる）の方法を受けさせることにより行われる。次に植物材料は、温水により、植物組織のところで約８０〜８５℃（約１７６〜１８５°Ｆ）で：約１：８の水の比で抽出される。工程の間、植物材料は、水中で混ぜ合わされるか、又は挽いて粉にされ及び攪拌しながら水中に懸濁される。この最初の抽出は約４５分〜約１時間継続され、次いで抽出物はモスリン布を通して濾過される。残留物は、上記と同じ比で温水中に再懸濁され、前のように再抽出される。第２の抽出物は、前述の標準的濾過技術を用いて析出される。これらの２つのテアニン抽出物は、次に混ぜ合わされ及びマイクロフィルターにかける工程を受けて粒子状物質を除去され、及び微生物の総数を低減される。このマイクロフィルターにかけられたテアニン抽出物は、次に、上述の実施例２における新しく製造されたテアニン抽出物と同じ方式で処理される。
【００５６】
実施例４：ナノ濾過を用いる濃縮
約４０ｇの業務用加工品質の緑茶の葉が、約３２０ｇの脱イオン水により、約７５〜８５℃（約１６７〜１８６°Ｆ）で約４５分間攪拌しながら抽出される。スラリーが、次に２層のモスリン布を通して濾過されて、約２４０ｇの粗製テアニン抽出物を生成する。残留する葉は、３２０ｇの脱イオン水により、約７５〜８５℃で約４５分間再抽出される。スラリーが２層のモスリン布を通して再度濾過される。２つのテアニン抽出物は混ぜ合わされ、及び０．４５μｍのプリーツフィルター（０．１３６ｍ2（１．５ｆｔ2）、ポリプロピレン−ポリエステル支持体上のアクリルコポリマー）を介して濾過を受ける。次に、約３５０ｍＬの予め洗浄されたアンバーライトＸＡＤ  １６ＨＰ（Amberlite XAD １６ＨＰ）（登録商標）（ローム・アンド・ハース（Rohm & Haas））が、４５０ｍＬの上記のテアニン抽出物に加えられる。この組み合わせは約３０分間静かにスラリーにされ、及び上清液体が濾過して除去される。結果として得られるテアニン溶出液は、フェノール化合物を実質的に含まない。
【００５７】
テアニンは、この上清に、０．００１６ａｇ（１０００ダルトン）ＭＷＣＯ膜であって、高分子量非フェノール物質をテアニンから分離する膜を用いてナノ濾過工程を受けさせることにより更に精製される。結果として得られるテアニンに富む抽出物は濃縮され、及び約１０℃（約５０°Ｆ）に冷却される。それは次に２体積のイソプロパノールと混合される。結果として得られる沈殿したテアニン及びその他のアミノ酸は、再結晶化によって更に精製される。
【００５８】
実施例５：限外濾過を用いるテアニンの濃縮
約１２０ｇの業務用加工品質の緑茶の葉が、約９６０ｇの脱イオン水により、約７５〜８５℃（約１６７〜１８６°Ｆ）で約４５分間攪拌しながら抽出される。スラリーが、次に２層のモスリン布を通して濾過されて、約７２０ｇの粗製テアニン抽出物を生成する。残留する葉は次に、約９６０ｇの脱イオン水により、約７５〜８５℃で約４５分間再抽出され、次いで２層のモスリン布を通して濾過される。２つのテアニン抽出物が混ぜ合わされ、及び約３０分間、１０４７ｒａｄ／ｓ（１０，０００ｒｐｍ）で遠心分離される。透明な上清が次に、遠心管から注意深くデカントされる。結果として得られるテアニン抽出物は次にポリアミドカラム上でクロマトグラフィーを受ける。ポリアミドは最初に脱イオン水中に懸濁され、及び浮遊粒子は除去される。次にポリアミドは３３０ｍＬのカラム（２．５ｃｍ内径×７５ｃｍ高さ）中に充填され、及び約５カラム体積の脱イオン水によって洗浄される。ポリアミドカラム上でテアニン抽出物を吸着後、カラムは水で溶出され、及びポリフェノールを実質的に含まないテアニン溶出液が収集される。このテアニン溶出液は、また多糖類及びタンパク質のようなその他の高分子量非フェノール物質を含有してもよく、次に約０．０１６ａｇ（１０，０００ダルトン）の分画分子量を有する膜を用いる限外濾過を受ける。結果として得られるテアニンに富む抽出物は、また低分子量アミノ酸を含有してもよく、真空下で濃縮され、約１０℃（約５０°Ｆ）に冷却され、及び２体積のイソプロパノールと混合される。沈殿したテアニン及びその他のアミノ酸は、再結晶化によって更に精製される。
【００５９】
「発明を実施するための最良の形態」で引用したすべての文献は、その関連部分において本明細書に参考として組み込まれるが、いかなる文献の引用も、それが本発明に対する従来技術であることを認めるものと解釈すべきではない。
【００６０】
本発明の特定の実施形態を例示し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【国際調査報告】
2007509145.tif 000002
2007509145.tif 000003
2007509145.tif 000004