(57)【要約】  本発明は、既存の癌遺伝子とは相同性を示さない新規の癌原遺伝子ＨＰＰ１（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ１）及びこれによってコードされるタンパク質に関するものである。この新規癌原遺伝子は、多様な癌の診断、形質転換動物の製造及びアンチセンス（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ）遺伝子治療などに有効に利用され得る。
2007528483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌診断のためのマーカーとして配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒト癌原タンパク質を含む癌診断用組成物。
【請求項２】
癌診断のためのマーカーとして配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒト癌原タンパク質をコーディングするヒト癌原遺伝子を含む癌診断用組成物。
【請求項３】
上記ヒト癌原遺伝子は配列番号：１の塩基番号１６ないし１６２０に該当する塩基配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の癌診断用組成物。
【請求項４】
上記ヒト癌原遺伝子は配列番号：１の塩基配列であることを特徴とする請求項２に記載の癌診断用組成物。
【請求項５】
癌診断のためのマーカーとして配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒト癌原タンパク質を含む癌診断用キット。
【請求項６】
癌診断のためのマーカーとして配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒト癌原タンパク質をコーディングする癌原遺伝子を含む癌診断用キット。
【請求項７】
上記癌原遺伝子は配列番号：１の塩基番号１６ないし１６２０に該当する塩基配列及び配列番号：１の塩基配列からなる群より選択された何れか一つであることを特徴とする請求項６に記載の癌診断用キット。
【請求項８】
配列番号：１の塩基番号１６ないし１６２０に該当する塩基配列及び配列番号：１の塩基配列からなる群より選択された癌原遺伝子から転写されたｍＲＮＡの配列に相補的な塩基配列を有し、上記癌原遺伝子の発現を抑制するためにｍＲＮＡに結合する癌治療または予防用アンチセンス遺伝子。
【請求項９】
請求項８のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量及び薬剤学的に許容可能な担体を含有する癌及び転移の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、新規癌原遺伝子及びこれによってコードされるタンパク質に関するものであり、より詳しくは、多様な癌の診断に用いられるヒト癌原遺伝子（以下、ＨＰＰＩ癌原遺伝子と称する）及びこれによってコードされるタンパク質に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ヒトを含む高等動物は、約１００、０００個の遺伝子を有しているが、これらのうち約１５％のみが各々の個体で発現される。従って、いかなる遺伝子が選択されて発現されるかによって生命のすべての現象、即ち、発生、分化、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化及びアポプトシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）などが決められる（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７‐９７１，１９９２）。
【０００３】
腫瘍発生のような病理学的現象は、遺伝子変異過程によって誘発され結局遺伝子発現の変化をもたらす。従って、相異なる細胞の間で現れる遺伝子発現同士の比較は多様な生物学的現象を理解する上で基本的で効果的な接近方法であるといえる。例えば、リアンとパーディー（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７‐９７１，１９９２）によって提案されたｍＲＮＡ鑑別展開（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）方法は、現在腫瘍抑制遺伝子や細胞分裂周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）に係る遺伝子及びアポプトシスに係る転写調節遺伝子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ）などを探索する上で有効に用いられており、また一つの細胞で起こる多様な遺伝子の相互関連性の究明にも多様に活用されている。
【０００４】
腫瘍発生に対する多様な研究結果をまとめると、特定染色体部位の喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）、癌原遺伝子の活性化及びｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の不活性化などのような種々の遺伝的変化が腫瘍組織に蓄積されてヒト腫瘍を起こすと報告された（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ ６４： ２３５‐２４８，１９９１； Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ ６４： ２４９‐２７０，１９９１）。さらに、癌の１０ないし３０％は癌原遺伝子が増幅されることによって活性化され起こると報告されており、癌原遺伝子の活性化は多くの癌の病因学研究に重要な役割を果たし、これを明らかにすることが要求されている。
【０００５】
そこで、本発明者らは、子宮頸部癌の発生メカニズムを癌原遺伝子の水準で接近した結果、ヒト癌原遺伝子タンパク質１（ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＨＰＰ１）と名付けられた癌原遺伝子が、癌細胞にのみ特異に発現が増加されるということがわかった。上記癌原遺伝子は、白血病、リンパ腫、大腸癌、肺癌、皮膚癌、 腎臓癌、乳房癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、肝癌、及び子宮頸部癌などのような種々の癌の診断、予防及び治療に効果的に用いられ得る。
【０００６】
〔発明の概要〕
本発明の主たる目的は、新規な癌原遺伝子を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、上記癌原遺伝子を含む組換えベクター及びそれによって形質転換された微生物を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、上記癌原遺伝子によってコードされるタンパク質を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、上記癌原遺伝子を含む癌診断用キットを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、上記タンパク質を含む癌診断用キットを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、上記癌原遺伝子から誘導されるものに相補的な塩基配列を有するアンチセンス遺伝子を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、上記アンチセンス遺伝子を用いて癌及びその転移を予防するか治療する方法を提供することである。
【００１３】
上記目的によって、本発明では配列番号のヌクレオチド配列を有する新規癌原遺伝子を提供する。
【００１４】
上記の他の目的に従って、本発明では上記癌原遺伝子を含む組換えベクター及びそれによって形質転換された微生物を提供する。
【００１５】
上記のさらに他の目的に従って、上記癌原遺伝子由来の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。
【００１６】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の新規癌原遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるヒト癌原遺伝子タンパク質１ （Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ＨＰＰ１）は、配列番号：１で記載される１、７９２ｂｐ長さのＤＮＡ配列を有する。
【００１７】
配列番号：１の塩基配列において、ヌクレオチド番号１６ないし１６２０部位（１６１８‐１６２０：終了コドン）に該当する開放型読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、全体タンパク質コーディング領域であって、それから誘導される予測アミノ酸配列は配列番号：２に示されており、５３４個のアミノ酸からなっている（以下、「ＨＰＰ１タンパク質」と称する）。
【００１８】
コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によってまたは本発明の上記癌原遺伝子を発現させようとする特定生物で好まれるコドンを考慮して、配列番号：１のＤＮＡ配列はコーディング領域から発現される発癌タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われることができ、コーディング領域を除いた部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形または修正が行われることができて、そのような変形遺伝子も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は上記配列番号：１の癌原遺伝子と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチド及び上記遺伝子の断片をも含む。ここで、「実質的に同一のポリヌクレオチド」とは、本発明の癌原遺伝子と８０％以上、望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有することを意味する。
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は５３４個のアミノ酸からなっており配列番号：２で記載されたアミノ酸配列を有して大きさは約６０ｋＤａである。しかし、上記タンパク質のアミノ酸配列でも同様にタンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内でアミノ酸の置換、付加または欠失が行われることができ、目的によってタンパク質の一部のみが使用されることもある。そのような変形されたアミノ酸配列及びそれらの断片も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は上記発癌タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びその断片をも含む。ここで、「実質的に同一のポリペプチド」とは、配列番号：２のアミノ酸配列と８０％以上、望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有することを意味する。
【００１９】
本発明の癌原遺伝子ＨＰＰ１及びタンパク質はヒトの癌組織から分離したり、公知のＤＮＡまたはペプチド合成方法によって合成することもできる。また、このように製造された遺伝子を当分野に公知された微生物発現用ベクターに挿入して発現ベクターを製造した後これを適切な宿主細胞、例えば、大腸菌または酵母細胞などに導入し得る。
【００２０】
例えば、癌原遺伝子ＨＰＰ１で大腸菌ＤＨ５αを形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、これから得られたＤＨ５α／ＨＣＣ‐１１／ｐＣＥＶ‐ＬＡＣを、２００２年１２月５日付で、特許手続のための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ； ＫＣＴＣ、住所：Ｋｏｒｅａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２ Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）に寄託番号第ＫＣＴＣ １０３９７ＢＰ号として寄託した。
【００２１】
ベクター制作の際には、用いられた宿主細胞の種類によってプロモーター、ターミネータなどのような発現調節配列、自家複製配列及び分泌シグナルなどを適宜選択して組み合わせることができる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、ノーザンブロット（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）などの分析方法で正常子宮頸部組織では発現がほとんど確認されなかった反面、子宮頸部癌組織と子宮癌細胞株ではその過発現が確認されるので、子宮癌を誘発する強力な発癌遺伝子として判断される。また、癌転移リンパ節組織で発現が増加されることから癌転移を誘発する癌転移関連遺伝子とも判断される。子宮頸部癌のような上皮性組織の他にも、本発明の癌原遺伝子は、白血病、リンパ腫、大腸癌、皮膚癌、肺癌、腎臓癌、乳房癌、卵巣癌、胃癌、肝癌及び子宮頸部癌などのような多くの他の癌腫瘍で高く発現される。従って、本発明の癌原遺伝子は多様な癌の発生に共通した発癌遺伝子であると判断され、多様な癌の診断、形質転換された動物の製造及びアンチセンス（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ）遺伝子治療などに有効に利用され得る。
【００２３】
上記癌原遺伝子を用いた癌の診断方法は、例えば、上記癌原遺伝子の全部または一部をプローブを用いて対象者の体液から分離した核酸とハイブリッド化した後、当分野で公知の多様な方法でこれを検出することによって、対象者が本発明の癌原遺伝子を有しているかどうかを判断する過程を含む。上記プローブを放射線同位元素または酵素などで標識することによって容易に癌原遺伝子ＨＰＰ１の存在を確認することができる。従って、本発明では上記癌原遺伝子の全部または一部を含む癌診断用キットをも提供する。
【００２４】
形質転換動物は本発明の癌原遺伝子を哺乳動物、例えば、鼠などの哺乳類動物に導入することによって製造でき、この遺伝子を少なくとも８細胞期以前の受精卵段階で導入することが望ましい。このように製造された形質転換動物は、発癌性物質または化学療法の薬物のような抗癌性物質の探索などに有用に用いられ得る。
【００２５】
本発明は遺伝子治療にも有効であり、従って本発明は上記新規癌原遺伝子ＨＰＰ１により誘導されたｍＲＮＡ相補的塩基配列を含むアンチセンス遺伝子をも提供する。
【００２６】
本発明は、また、遺伝子治療に効果的なアンチセンス遺伝子を提供する。本願において、「アンチセンス遺伝子（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ ｇｅｎｅ）」とは、配列番号：１の癌原遺伝子またはその一部の塩基配列を有する癌原遺伝子ＨＰＰ１から転写されるｍＲＮＡの一部または全部と相補的な配列を有するポリヌクレオチであって、上記ｍＲＮＡのタンパク質結合部位に結合して癌原遺伝子の開放型読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）の発現を抑制できる配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２７】
本発明はまた、その範囲内に本発明のアンチセンス遺伝子の治療効果量を患者に投与することによって癌を治療または予防する方法を含む。
【００２８】
本発明のアンチセンス遺伝子治療において、本発明のアンチセンス遺伝子は通常の方法で患者に投与されて癌原遺伝子の発現を予防する。例えば、文献（Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：１７５‐１８２，１９９８）の方法に従ってアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）をポリ‐Ｌ‐リシン誘導体と静電気的引力によって混合し、この混合体を患者に静脈投与する。
【００２９】
本発明の範囲にはまた、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または必要に応じて他の添加剤とともに本発明のアンチセンス遺伝子を活性成分として含む抗癌組成物が含まれる。本発明の薬剤学的組成物を注射剤として製剤化することが望ましい。
【００３０】
実際に投与されるＨＰＰ１アンチセンス遺伝子の量は、治療される症状、投与経路、患者の年齢及び体重、症状の重症度のような種々の関連因子を考慮して決める。
【００３１】
本発明の癌原遺伝子ＨＰＰ１から発現されるタンパク質は、診断道具として有用な抗体を生産するのに有用に有用できる。本発明の抗体は、本発明の癌原遺伝子から発現された配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を用いて当分野で公知の方法にとってモノクロナルの抗体またはポリクロナルの抗体として製造でき、このような抗体を用いて当分野で公知の酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ； ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ； ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、ポリアクリルアミドゲル上のウエスタンブロットまたは免疫ブロットなどの方法によって対象者の体液試料の中に上記タンパク質が発現されたかを確認することによって癌を診断することができる。従って、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を含む癌診断キットも本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
また、本発明の癌原遺伝子を用いて持続的に増殖し得る癌細胞株を確立することができ、このような細胞株は、例えば、上記癌原遺伝子が形質導入された繊維母細胞を用いてヌードマウスなどに形成させた腫瘍組織から製造できる。このような癌細胞株は抗癌剤などの探索に有用に利用することができる。
【００３３】
下記実施例は本発明をより詳しく説明するものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
【００３４】
〔実施例１〕：腫瘍細胞の培養及び総ＲＮＡの分離
（段階１）腫瘍細胞培養
子宮摘出術（ｈｙｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）を受けた子宮筋腫患者から正常の子宮頸部（ｅｘｏｃｅｒｖｉｃａｌ）組織、そして以前に抗癌療法と放射線治療を受けなかった子宮癌患者から手術の際に原発性子宮頸部腫瘍組織及び転移リンパ節腫瘍組織を取った。ヒト子宮頸部癌細胞株としてＣＵＭＣ‐６（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６２： ２３０‐２４０，１９９６）を用いた。
【００３５】
上記組織及びＣＵＭＣ‐６細胞株から得られた細胞を２ｍＭ グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び１０％ ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）が含有されたウエイマウス（Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ） ＭＢ ７５２／１培養液（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。実験に用いた培養細胞は指数的増殖過程の細胞であってトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）染色によって９５％以上の生存度を示す細胞を用いた（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」 ２ｎｄ Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。
（段階２）ＲＮＡの分離及びｍＲＮＡの鑑別展開法
商業的に販売されるシステムであるＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，ドイツ）を用いて、段階１で得られた組織標本及び細胞から総ＲＮＡを抽出した。メッセージクリーンキット（Ｍｅｓｓａｇｅ ｃｌｅａｎ ｋｉｔ，ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ，ＭＡ）を用いてＲＮＡからＤＮＡ汚染源を除去した。
【００３６】
〔実施例２〕：鑑別展開逆転写重合酵素連鎖反応（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ‐ＰＣＲ）
鑑別展開逆転写は、上記リアンとパーディーによって記述された逆転写‐重合酵素連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を若干変形して行った。
【００３７】
まず、実施例１の段階１で得られた総ＲＮＡ ０．２μｇずつに固定されたオリゴ‐ｄＴプライマーとして配列番号：３で記載される塩基配列を有するＨ−Ｔ１１Ａ固定プライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅ ｋｉｔ，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて逆転写を行った。
【００３８】
次いで、０．５ｍＭ[α‐３５Ｓ] ｄＡＴＰ（１２００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）の存在の下で、同一の固定プライマー及び無作為５’１１プライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔｓ １‐５）Ｈ‐ＡＰ１ないし４０の中、配列番号：４で記載される塩基配列を有するＨ‐ＡＰ３３プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃で４０秒間反応後４０℃で２分、７２℃で４０秒を４０回反応させて最終延長（ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）のために７２℃で５分間さらに反応させた。得られたＰＣＲ産物を６％ ポリアクリルアミドシーケンシングゲルに溶解した後、放射能写真を用いて相違な発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）程度を示すバンドの位置を確認した。
【００３９】
乾燥したゲルから１８１塩基対（ｂｐ）大きさのバンド、ＣＡ３３６ ｃＤＮＡ（配列番号：１の１５６９‐１７４９ ｂｐ）を切取った。１５分間加熱してＣＡ３３６ ｃＤＮＡを溶出させた後、［α‐３５Ｓ］標識されたｄＡＴＰ（１２００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）及び２０μＭ ｄＮＴＰを用いなかったことを除いては上記と同一のプライマー及び同一の条件でＰＣＲを行なって再増幅させた。
【００４０】
〔実施例３〕：クローニング
上記で得られた再増幅されたＣＡ３３６ ＰＣＲ産物をＴＡクローニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて製造社の方法に従ってｐＧＥＭ‐Ｔ ＥＡＳＹベクターに挿入した。
（段階１）連結反応
実施例２で得られた再増幅されたＣＡ３３６ ＰＣＲ産物２μＬ、ｐＧＥＭ‐Ｔ ＥＡＳＹベクター（５０ｎｇ）１μＬ、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ １０Ｘ 緩衝液 １μＬ及びＴ４ リガーゼー（３ ｗｅｉｓｓ ｕｎｉｔｓ／μＬ； Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ）１μＬを０．５ｍｌ試験管に入れた後、蒸留水を加えて最終体積が１０μＬになるようにした。連結反応混合物は１４℃で一晩中培養した。
（段階２）ＴＡクローニング形質転換
ＴＡクローニング形質転換は次のように行われた。
【００４１】
大腸菌ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を１０ｍｌのＬＢブロス（バクト‐トリプトン １０g、バクト‐酵母抽出物 ５g、ＮａＣｌ ５g）中で６００ｎｍでの光学密度が約０．３ないし０．６になるまで培養した。培養混合物を氷に約１０分間放置した後、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄液を取除き、細胞を収集した。収集した細胞ペレットを１０ｍｌの氷冷０．１Ｍ ＣａＣｌ２に３０分ないし１時間露出させてコンペテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を製造した。結果物を４℃で４０００ｒｐｍで１０分間さらに遠心分離して上澄液を取除き、細胞を収集して２ｍｌの氷冷０．１Ｍ ＣａＣｌ２に懸濁した。
【００４２】
コンペテント細胞懸濁液２００μＬを新しいマイクロフュズ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）チューブに移し、これに段階１で製造した連結反応産物２μＬを加えた。混合物を４２℃の 水浴槽（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で９０秒間培養した後、０℃で急冷した。これに、ＳＯＣ培地（バクト‐トリプトン２．０ｇ，バクト‐酵母抽出物 ０．５ｇ，１Ｍ ＮａＣｌ １ｍｌ，１Ｍ ＫＣｌ ０．２５ｍｌ，ＴＤＷ ９７ｍｌ，２Ｍ Ｍｇ２＋ １ｍｌ，２Ｍ グルコース １ｍｌ）８００μＬを加え、混合物を３７℃で２２０ｒｐｍの回転振盪培養器で４５分間培養した。
【００４３】
３７℃培養器に予め入れておいた、エンピシリンを含むＬＢプレートにＸ‐ｇａｌ （４０ｍｇ／ｍｌ ジメチルホルムアミドに貯蔵）２５μＬをガラス棒で拡散させた後、これに２５μＬの形質転換された細胞を入れてさらにガラス棒で拡散させ、３７℃で一晩中培養した。培養後形成された白色コロニーを３〜４個選択してエンピシリンを含むＬＢプレートに各々の選択されたクローンを植えた。プラスミドを製造するためにこれらのうち挿入が確認されたコロニー、即ち、形質転換された大腸菌 ＪＭ１０９／ＣＡ３３６を選択して１０ｍｌのテリフィックブロス（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ； ＴＤＷ ９００ｍｌ、バクト‐トリプトン １２ｇ、バクト‐酵母抽出物 ２４ｇ、グリセロール ４ｍｌ、０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．７２Ｎ Ｋ２ＨＰＯ４ １００ｍｌ）で培養した。
【００４４】
〔実施例４〕：組換えプラスミドＤＮＡの分離
ウイザードフラスミニプレップスＤＮＡ精製キット（ＷｉｚａｒｄＴＭＰｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて製造社の指針書に従って形質転換された大腸菌からＣＡ３３６プラスミドＤＮＡを分離した。
【００４５】
分離されたＤＮＡの一部をＥＣｏＲＩ酵素で処理した後、２％ ゲルで電気泳動を行ってＣＡ３３６部分配列がプラスミドに挿入されたことを確認した。
【００４６】
〔実施例５〕：ＤＮＡ塩基配列分析
実施例２で得られたＣＡ３３６ ＰＣＲ産物を通常の方法に従って増幅させた後、クローニングして再増幅させたＣＡ３３６ ＰＣＲ断片をシケナーゼバージョン２．０ＤＮＡ配列分析キット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ； Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）を用いてジデオキシ鎖終結法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）に従って配列分析を行った。
【００４７】
上記ＤＮＡの塩基配列は配列番号： １のヌクレオチド番号 １５６９ ないし１７４９に該当し、本願に「ＣＡ３３６」と命名した。
【００４８】
５’無作為プライマーＨ‐ＡＰ３３及び３’Ｈ‐Ｔ１１Ａ固定プライマーを用いて上記で得られた１８１ ｂｐ ｃＤＮＡ 断片、即ち、ＣＡ３３６を鑑別展開逆転写重合酵素連鎖反応（ＤＤＲＴ‐ＰＣＲ）を行い、電気泳動で確認した。
【００４９】
図１に示されたように、ｃＤＮＡ断片（ＣＡ３３６）は、転移リンパ節組織及びＣＵＭＣ‐６細胞では発現されたが、正常組織では発現されなかった。
【００５０】
〔実施例６〕：ＨＰＰ１ 癌原遺伝子の全体ｃＤＮＡ配列分析
３２Ｐ‐標識されたＣＡ３３６ ｃＤＮＡをプローブを用いたプラークハイブリッド化（ｐｌａｑｕｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）でバクテリオファージλｇｔ１１ ヒト肺胎児繊維母細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８３： １３７‐１４６，１９８９）をスクリーニングした。上記ヒト肺胎児繊維母細胞 ｃＤＮＡライブラリーからｐＣＥＶ‐ＬＡＣ ベクター内の全体ＨＰＰ１ ｃＤＮＡ クローンを得た。このベクターは２００１年５月５日付で登録番号第ＡＹ１９７６１２号としてアメリカ遺伝子銀行（ＧｅｎｅＢａｎｋ）に登録された（公開日：２００４年５月１日）。
ＨＰＰ１は配列番号：１の１７９２ｂｐ配列を有し、配列番号：１の塩基配列において、ＨＰＰ１癌原遺伝子の全体開放型読み枠は配列番号：２のタンパク質をコードするヌクレオチド番号１６から１６２０に対応すると仮定した。
【００５１】
ファージからλｐＣＥＶ ベクターに挿入されたＨＰＰ１ クローンをＮｏｔ Ｉ切断によってエンピシリン耐性ｐＣＥＶ‐ＬＡＣファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターの形態に分離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８３： １３７‐１４６，１９８９）。
【００５２】
上記ＨＰＰ１遺伝子を含むｐＣＥＶ‐ＬＡＣベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼーで連結してＨＰＰ１プラスミドＤＮＡを製造し、連結されたクローンで大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。
【００５３】
上記から得られた大腸菌形質転換体ＤＨ５α／ＨＣＣ‐１１／ｐＣＥＶ‐ＬＡＣを特許手続のための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２００２年１２月５日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＫＣＴＣ、住所：Ｋｏｒｅａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２ Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ ）に寄託番号第ＫＣＴＣ １０３９７ＢＰ号として寄託した。
【００５４】
〔実施例７〕：ノーザンブロット分析
実施例１と同様に、正常子宮頸部組織、子宮頸部癌組織、子宮癌転移リンパ節組織及びヒト子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５５０）及びＣＵＭＣ‐６から総ＲＮＡを抽出した。各々の組織及び細胞株から抽出した変性された総ＲＮＡ２０μｇずつを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ‐Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）に移した。レジプライムＩＩ（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ）無作為プライム標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を用いて製造した３２Ｐ‐標識された無作為プライムされたＨＰＰ１全体ｃＤＮＡプローブでブロットをハイブリッド化した。ノーザンブロット分析を２回繰り返して行い、その結果は濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて定量化し、β‐アクチン（ａｃｔｉｎ）で標準化した。
【００５５】
図２ａは、正常子宮頸部組織、子宮頸部癌組織、子宮頸部癌転移リンパ節組織及び子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉ及びＣＵＭＣ‐６）におけるＨＰＰ１ ｃＤＮＡプローブを用いてノーザンブロット分析結果を示したものであり、図２ｂは同一の試料をβ‐アクチンプローブを用いてハイブリッド化したものである。図２ａからわかるように、ＨＰＰ１癌原遺伝子は子宮頸部癌組織、及び子宮頸部癌細胞株においては顕著に遺伝子発現が増加したが、正常子宮頸部組織においては子宮頸部発現程度が非常に低かった。
【００５６】
図３ａは、正常ヒトの脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝、小腸、胎盤、肺及び抹消血液白血球（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるＨＰＰ１ ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析結果を示したものである。図３ｂは、同一の試料をβ‐アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡの存在を確認したものである。図３ａからわかるように、ＨＰＰ１ ｍＲＮＡ （約１．８ｋｂ）は正常組織においては殆ど発現されなかったり弱く発現されている。
【００５７】
図４ａは、ヒト癌細胞株、ＨＬ‐６０、ＨｅＬａ、Ｋ‐５６２、ＭＯＬＴ‐４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９及びＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＨＰＰ１癌原遺伝子の発現の可否を確認したノーザンブロット分析結果を示したものである。図４ｂは、同一の試料をβ‐アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡの存在を確認したものである。図４ａからわかるように、ＨＰＰ１は大腸癌細胞ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９及び皮膚癌細胞株Ｇ３６１で過発現され、特に前骨髄細胞白血病細胞株ＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄白血病細胞株Ｋ‐５６２、リンパ球白血病細胞株ＭＯＬＴ‐４、バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンプ種細胞株Ｒａｊｉ において高い水準で転写された。
【００５８】
図５ａは、ヒトの腎腸、乳房、大腸、卵巣、胃、肝癌組織及びこれらの各々の正常組織において本発明のＨＰＰ１癌原遺伝子の発現の可否を確認したノーザンブロット分析の結果を示したものである。 図５ｂは、同一の試料をβ‐アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡの存在を確認したものである。ＨＰＰ１はヒト癌組織において高い水準で発現される反面、正常組織においては非常に弱く発現されることが観察された。
【００５９】
〔実施例８〕：ＨＰＰ１癌原遺伝子を大腸菌に形質感染させた後発現されるタンパク質の大きさの決定
配列番号：１のＨＰＰ１癌原遺伝子の全体をｐＥＴ‐３２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の多重‐クローニング部位内ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素 部位に挿入した後、生成されたｐＥＴ‐３２ｂ（＋）／ＨＰＰ１ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＡＴＣＣ ４７０９２）に形質感染させた。ｐＥＴ‐３２ｂ（＋）ベクターの多重‐クローニング部位の前部位には発現タンパク質であるＴｒｘ・Ｔａｇ、Ｈｉｓ・Ｔａｇ及びＳ・Ｔａｇが挿入されている。形質感染された大腸菌をＬＢブロスで振盪培養した後、これを１／１００に希釈し、さらに３時間培養した。これに１ｍＭのイソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂｅｔａ‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ‐ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ； ＩＰＴＧ，Ｓｉｇｍａ）を添加してタンパク質生産を誘導した。
【００６０】
ＩＰＴＧ誘導前後の培養液中の大腸菌細胞を超音波粉砕した後、１２％ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）。図６は、ｐＥＴ‐３２ｂ（＋）／ＨＰＰ１ベクターで形質感染された大腸菌ＢＬ２１菌株のタンパク質発現様子をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで確認した結果であって、ＩＰＴＧ誘導後約８０ｋＤａの融合タンパク質バンドが明確に観察された。この８０ｋＤａ融合タンパク質はｐＥＴ‐３２ｂ（＋）／ＨＰＰ１ ベクターに挿入されている約２１ｋＤａ大きさのＴｒｘ・Ｔａｇ、Ｈｉｓ・Ｔａｇ及びＳ・Ｔａｇタンパク質と約６０ｋＤａのＨＰＰ１タンパク質を含有している。
以上のように、本発明の実施の形態が説明されたが、本発明の属する分野の通常の知識を持つ者により多様な変形または修正が行われ得ることは明らかであり、これらは添付の請求の範囲により定められる本発明の範囲に含まれることと解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、正常の子宮頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移リンパ節腫瘍組織及びＣＵＭＣ‐６癌細胞におけるＣＡ３３６ ＤＮＡ断片の発現の可否を確認した鑑別展開の逆転写重合酵素連鎖反応（ＤＤＲＴ‐ＰＣＲ）の結果である。
【図２ａ】図２ａは、子宮頸部癌組織における本発明のＨＰＰ１癌原遺伝子の発現の可否を確認したノーザンブロットの分析結果である。
【図２ｂ】図２ｂは、図２ａと同様なサンプルをβ‐アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図３ａ】正常のヒト１２‐列多重組織におけるＨＰＰ１癌原遺伝子の発現の可否を確認したノーザンブロットの分析結果である。
【図３ｂ】図３ｂは、図３ａと同様なサンプルをβ‐アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図４ａ】図４ａは、ヒト癌細胞株におけるＨＰＰ１癌原遺伝子の発現の可否を確認したノーザンブロットの分析結果である。
【図４ｂ】図４ｂは、図４ａと同様なサンプルをβ‐アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図５ａ】図５ａは、ヒト腎臓、乳房、大腸、卵巣、胃、肝及び子宮頸部の腫瘍組織及び各々の正常組織における発現されたＨＰＰ１癌原遺伝子に対するノーザンブロットの分析結果である。
【図５ｂ】図５ｂは、図５ａと同様なサンプルをβ‐アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図６】図６は、ＨＰＰ１癌原遺伝子を大腸菌に形質導入した後、ＩＰＴＧ誘導以前及び以後に発現されるタンパク質の大きさをドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）電気泳動結果である。
【図１】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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