(57)【要約】レラキシンスーパーファミリータンパク質B鎖に基づくレラキシンスーパーファミリータンパク質の単量体環式ペプチド類似体およびその製造方法、ならびにそれを含む医薬組成物およびその利用方法について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的と結合し、該生物学的標的の活性を調節するレラキシンスーパーファミリーメンバーのタンパク質のB鎖の単量体環状ペプチド類似体であって、レラキシンスーパーファミリータンパク質が、インスリン、IGF-I、IGF-II、レラキシン1、レラキシン2、レラキシン3、INSL3、INSL4、INSL5、およびINSL6から選ばれ、生物学的標的がインスリンレセプター、IGFR-I、IGFR-II、LGR7、およびLGR8から選ばれる該類似体。
【請求項２】
6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する少なくとも第一および第二アミノ酸残基を選択し、第一および第二アミノ酸を架橋することを含む(ここで、架橋は該類似体を配座的に拘束する。)、レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖のターンまたはループ部分の修飾により生成される請求項1記載の類似体。
【請求項３】
配列番号7に記載の配列から修飾されたINSL3 B鎖類似体である請求項1または請求項2記載の類似体。
【請求項４】
該INSL3類似体が配列番号7に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と21および26位の範囲内の第二アミノ酸の間の架橋により拘束される請求項3に記載の類似体。
【請求項５】
図3のcINSLaで示すINSL3類似体である請求項3または4に記載の類似体。
【請求項６】
図3のcINSLbで示すINSL3類似体である請求項3または4に記載の類似体。
【請求項７】
それぞれ配列番号1、2、および3に記載のレラキシン-1、レラキシン-2、またはレラキシン-3 B鎖配列から修飾されたレラキシン類似体である請求項1または2に記載の類似体。
【請求項８】
該レラキシン類似体が配列番号2に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される請求項7記載の類似体。
【請求項９】
レラキシン類似体が図3のcR1xで示すレラキシン類似体である請求項8記載の類似体。
【請求項１０】
第一および/または第二アミノ酸が架橋に適した代替アミノ酸で置換されている請求項2記載の類似体。
【請求項１１】
該代替アミノ酸の少なくとも1がシステイン残基である請求項10記載の類似体。
【請求項１２】
該代替アミノ酸残基の両方がシステイン残基である請求項11記載の類似体。
【請求項１３】
システイン残基を酸化してシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することにより架橋される請求項12記載の類似体。
【請求項１４】
架橋した第一および第二アミノ酸以外のINSL3またはレラキシンペプチド類似体配列内の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されている請求項1〜13のいずれかに記載の類似体。
【請求項１５】
該類似体の生物学的標的がLGR7および/またはLGR8である請求項1〜14のいずれかに記載の類似体。
【請求項１６】
該生物学的標的の活性が誘発、上方制御、下方制御、またはブロックされる請求項15記載の類似体。
【請求項１７】
レラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖とコンジュゲートする先の請求項のいずれかに記載の類似体。
【請求項１８】
レラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖がレラキシンスーパーファミリータンパク質の対応するA鎖である請求項17記載の類似体。
【請求項１９】
レポーター基とコンジュゲートする請求項1〜18記載の類似体。
【請求項２０】
レポーター基が放射性標識である請求項19記載の類似体。
【請求項２１】
レポーター基が蛍光標識である請求項19記載の類似体。
【請求項２２】
レポーター基が酵素である請求項19記載の類似体。
【請求項２３】
レポーター基が担体である請求項19記載の類似体。
【請求項２４】
レラキシンスーパーファミリータンパク質のペプチド類似体の製造方法であって、
-レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖、レセプター結合サブユニットを得、
-6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する、該タンパク質のレセプター結合サブユニット中のターンおよび/またはループ部分の各反対鎖上の第一および第二アミノ酸を同定し、
-第一アミノ酸と第二アミノ酸の間に、該B鎖、レセプター結合サブユニットの三次元構造を配座的に拘束する架橋を導入することを含む方法。
【請求項２５】
第一および/または第二アミノ酸が架橋に適したアミノ酸で置換される請求項24記載の方法。
【請求項２６】
残基2および8の範囲内に第一アミノ酸および残基21および26の範囲内に第二アミノ酸を有する、配列番号7に記載の配列に基づくINSL3ペプチド類似体を生成する請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
INSL3類似体が図3に示すcINSLaである請求項26記載の方法。
【請求項２８】
INSL3類似体が図3に示すcINSLbである請求項26記載の方法。
【請求項２９】
残基2および8の範囲内に第一アミノ酸および残基21および26の範囲内に第二アミノ酸を有する配列番号2に記載の配列のいずれかに基づくレラキシン-2ペプチド類似体を生成する請求項24または25記載の方法。
【請求項３０】
図3のcR1xで示されるレラキシン類似体を生成する請求項29記載の方法。
【請求項３１】
架橋した第一および第二アミノ酸以外の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該ペプチド類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されているINSL3またはレラキシン類似体を生成する請求項24〜26または29のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
1またはそれ以上の、請求項1〜23のいずれかに記載の類似体またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項３３】
さらに、少なくとも1の医薬的に許容される担体または希釈剤を含む請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３４】
レラキシンスーパーファミリータンパク質メンバーの活性の調節異常を伴う疾患の症状を治療、予防、または改善する方法であって、有効量の請求項1〜23のいずれかに記載のペプチド類似体を患者に投与することを含む方法。
【請求項３５】
該疾患にレラキシンまたはINSL3が介在する請求項34記載の方法。
【請求項３６】
該疾患が、過形成疾患、強皮症、コラーゲンまたはフィブロネクチン形成もしくは破壊の調節不良または異常、腫瘍性疾患、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、雄性または雌性不妊症、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常からなる群から選ばれる、有効量の、請求項1〜23のいずれかに記載のペプチド類似体または請求項32〜33のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与することを含む請求項35記載の方法。
【請求項３７】
該疾患が雌性生殖障害である請求項36記載の方法。
【請求項３８】
該疾患が妊娠関連疾患である請求項36記載の方法。
【請求項３９】
該疾患が生殖発生異常を伴う請求項36記載の方法。
【請求項４０】
該疾患が心臓血管疾患である請求項36記載の方法。
【請求項４１】
該疾患が血管新生疾患である請求項36記載の方法。
【請求項４２】
該疾患が腫瘍性疾患または過形成疾患である請求項36記載の方法。
【請求項４３】
腫瘍性疾患または過形成疾患が甲状腺を含む請求項42記載の方法。
【請求項４４】
該疾患が強皮症である請求項36記載の方法。
【請求項４５】
該疾患が腎疾患である請求項36記載の方法。
【請求項４６】
該疾患がコラーゲンまたはフィブロネクチン形成または破壊の調節不良または異常を伴う請求項36記載の方法。
【請求項４７】
該疾患が雄性または雌性不妊症である請求項36記載の方法。
【請求項４８】
患者のレラキシンまたはINSL3介在性疾患を治療するための医薬の製造における本発明の類似体および/または医薬組成物の使用。
【請求項４９】
該疾患が、過形成疾患、腫瘍性疾患、強皮症、コラーゲンまたはフィブロネクチン形成もしくは破壊の調節不良または異常、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、性腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常である請求項48記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはレラキシンスーパーファミリーのヘテロメリックタンパク質の配座的に拘束された単量体ペプチド類似体、特に、レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖の単量体環状類似体、これら類似体の製造方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レラキシンスーパーファミリーは、現在、比較的高度の配列相同性を有する10のメンバーを含む。これらファミリーメンバーは、インスリン、インスリン様成長因子IおよびII、レラキシン1、2、および3、ならびにインスリン様ホルモンINSL3、4、5、および6を含む。レラキシンスーパーファミリーメンバーは、当該分野でよく説明されている広範囲の生物活性を有する。
【０００３】
インスリンの重要な作用は数十年にわたり記載されてきた。インスリンは細胞代謝に重要な役割を果たす。多くの糖尿病患者は毎日のインスリン投与を必要とする。
【０００４】
レラキシンは、2つの鎖間および1つの鎖内ジスルフィド結合により結合した2つの別個の鎖(AおよびB)を有するインスリン様ペプチドである。レラキシンの作用には、子宮筋収縮阻害能、結合組織のリモデリングの刺激、および産道の組織の柔軟化の誘導が含まれる。さらに、レラキシンは乳腺および乳首の成長と分化を増大し、結合組織の主要成分の一つであるコラーゲンの破壊を誘導する。レラキシンは、コラーゲンの合成を低下させ、コラゲナーゼの放出を増大させる(Unemori et al (1990) J. Biol. Chem. 265, 10682-10685)。これらの知見は、妊娠に関する多くの表現型的特性を示すレラキシン遺伝子ノックアウトマウスの樹立により最近確認された(Zhao et al (1999) Endocrinology 140, 445-453)。機能的に活性なレラキシン遺伝子を欠く雌マウスは恥骨結合の恥骨間靱帯を弛緩および伸張できず、また、子供に授乳することができず、レラキシン野生型またはレラキシンヘテロ接合体の里親の交差里子(cross-foster)にしないかぎり24時間以内に死亡した。
【０００５】
レラキシンには妊娠ホルモン以外の役割があり、雌の生殖系組織以外の組織および細胞に作用することを示唆する証拠が蓄積されてきた。レラキシンは、腎臓、盲腸間膜(mesocaecum)、肺の血管、および末梢血管の拡張(血管拡張)をもたらし、これら組織の血流または還流速度の増大をもたらす(Bani et al (1997) Gen. Pharmacol. 28、13-22)。レラキシンは心拍数、冠動脈血流量の増加も刺激し、糸球体濾過速度および腎血漿流量を増大させる(Bani et al (1997) Gen. Pharmacol. 28,13-22)。レラキシンは、心アナフィラキシーにおけるヒスタミンの放出およびカルシウムの蓄積を阻害し、酸化窒素の合成を促進することもわかってきた(Masini et al.、Br J Pharmacol. 2002 Oct; 137 (3): 337-44)。脳はレラキシンの別の標的組織であり、該ペプチドは血圧および飲水(drinking)に影響を及ぼす脳室周囲器官中のレセプター(Osheroff et al (1991) Proc.Nal. Acad. Sci. U. S. A. 88、6413-6417; Tan et al (1999) Br.J.Pharmacol 127、91-98)と結合することが示された(Parry et al (1990) J Neuroendocrinol. 2,53-58; Summerlee et al (1998) Endocrinology 139,2322-2328; Sinnahay et al (1999) Endocrinology 140、5082-5086)。
【０００６】
繊維の崩壊、結合組織のリモデリング、強皮症、血管拡張、例えば冠状動脈疾患、末梢血管疾患、動脈硬化または他の腎臓毛細血管(capillary)の狭窄に関連する腎臓疾患、または目または末梢指、盲腸間膜、肺、および末梢血管のような身体の他の毛細血管の狭窄、および神経学的修飾に対応する種々の疾患におけるレラキシンの重要な臨床使用が生じる。レラキシンは、血小板凝集の低下およびその巨核球による放出も示唆されており、凝固障害に関連があるかもしれない。
【０００７】
INSLペプチド、例えばINSL3は、性腺の下降を含む種々の生理作用に関与するかもしれない。特にINSL3は、精巣の成熟および下降(Ivell & Hartnung、Mol Hum Reprod 2003, 9 (4): 175-181)、ならびに精細胞の生存、卵胞の発達、および卵母細胞の成熟(Kawamura et al.、2004、PNAS 101、7323-7328)に関与することが示されている。したがって、INSL3アゴニストおよびアンタゴニストの潜在的臨床適用は、生殖(繁殖)障害の治療や受胎能レベルの調節を含む。
【０００８】
INSL3は心臓におけるレラキシン活性の調節に関与しており(Tan et al.、Eur J Pharmacol. 2002 Dec 20; 457 (2-3): 153-60)、心臓血管疾患に重要な調節的役割を果たすかもしれない。
【０００９】
さらに、INSL3多形性は、甲状腺の過形成および腫瘍性疾患であり(Hombach-Klonisch et al.、Int J Oncol 2003 May; 22 (5): 993-1001)、これら病状の病因におけるこのレラキシンスーパーファミリーメンバーの役割を示唆する。
【００１０】
レラキシンスーパーファミリーメンバーの生物学的作用にはホルモンレセプターが介在する。特に、インスリンレセプター、IGF-IおよびIGF-IIレセプター、GPCR135、GPCR142、ならびにLGR7およびLGR8。LGR7は、すべてのヒトレラキシンペプチドと高親和性に結合するが、INSL3に非常に低親和性のレラキシンレセプターである(Bathgate et al.、Trends in Endocrinology and Metabolism 2003, 14：207-213)。LGR8はINSL3と高親和性に結合するINSL3レセプターである。LGR8遺伝子を欠くノックアウトマウスは、INSL3ノックアウトマウスと同じ表現型を持つ。しかしながら、ヒトにおいてLGR8はINSL3に対してより高い親和性を有するが、レラキシンとも結合するであろう(Bathgate et al.、Trends in Endocrinology and Metabolism 2003, 14：207-213)。
【００１１】
LGR8レセプターは導帯(gubernaculum)、卵巣、および精巣に発現し、後者の臓器では精巣下降に対するINSL3の作用を仲介する(Bathgate et al.、Trends in Endocrinology and Metabolism 2003, 14：207-213)。卵巣において、LGR8は卵胞の発達を仲介し、精巣および卵巣では雄性および雌性胚細胞の成熟に関与する(Kawamura et al.、2004、PNAS 101, 7323-7328)。LGR8は、腎臓、骨、末梢血白血球、筋肉、脳、甲状腺、および子宮にも発現する(Hsu et al.、Science、295: 671-674)。したがって、INSL3は、腎および甲状腺機能に対する潜在的作用、脳に対する中枢作用、筋肉機能の調節、骨および血液細胞の機能に対する作用、および子宮に対する生殖作用を有する。
【００１２】
レラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的レセプターと結合するレラキシンスーパーファミリー類似体である類似体の必要性がある。理想的には、そのような類似体には、レラキシンスーパーファミリーメンバーレセプターと結合し、このタンパク質のスーパーファミリーのメンバーの生物活性を誘発し、阻害し、活性化し、または調節するリガンド、例えばアゴニスト、逆アゴニスト、部分アゴニスト、混合アゴニスト/アンタゴニスト、および完全アンタゴニストが含まれよう。レラキシンスーパーファミリータンパク質の類似体は、広範囲の治療的介入の機会をもたらすかもしれない。
(発明の要約)
【００１３】
その最も広い形において、本発明は、レラキシンスーパーファミリータンパク質のメンバーのペプチド類似体、レラキシンタンパク質スーパーファミリーレセプターとの結合活性を有する類似体、該類似体の製造方法、および医薬組成物、治療方法、ならびに該ペプチド類似体の使用に関する。
【００１４】
第一の局面において、該類似体は、インスリン、IGF-I、IGF-II、レラキシン1、レラキシン2、レラキシン3、INSL3、INSL4、INSL5、およびINSL6から選ばれるレラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的と結合する、該レラキシンスーパーファミリーメンバーのタンパク質のB鎖の配座(立体配座)的に拘束された(conformationally constrained)単量体環状ペプチド類似体である。
【００１５】
本発明の単量体ペプチド類似体は、6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する少なくとも第一および第二アミノ酸残基を選択し、第一および第二アミノ酸を架橋することを含む(ここで、該架橋は該類似体を配座的に拘束する。)、レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖のターンまたはループ部分の修飾により生成される。
【００１６】
ある局面において、該単量体類似体は、配列番号7に記載の配列から修飾されたINSL3 B鎖類似体である。
【００１７】
さらなる局面において、該INSL3類似体は、配列番号7に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と21および26位の範囲内の第二アミノ酸の間の架橋により拘束される。
【００１８】
特に好ましい形において、該第一および/または第二アミノ酸は架橋に適したアミノ酸で置換されている。
【００１９】
別の局面において、該単量体類似体は図3のcINSLaで示すINSL3類似体である。
【００２０】
さらなる局面において、該単量体類似体は図3のcINSLbで示すINSL3類似体である。
【００２１】
さらに別の局面において、該単量体類似体はそれぞれ配列番号1、2、および3に記載のレラキシン-1、レラキシン-2、またはレラキシン-3 B鎖配列から修飾されたレラキシン類似体である。
【００２２】
好ましい形において、該単量体類似体は図3のcRlxに示すレラキシン類似体である。
【００２３】
さらなる局面において、単量体レラキシン類似体は、配列番号2に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される。
【００２４】
さらなる形において、架橋した第一および第二アミノ酸以外のINSL3またはレラキシンペプチド類似体配列内の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該単量体類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されている。
【００２５】
さらなる好ましい形において、該単量体類似体は、該レラキシンスーパーファミリーレセプターのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、または逆アンタゴニストである。
【００２６】
別の局面において、本発明の類似体は該レラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖とコンジュゲートされる。
【００２７】
さらなる局面において、本発明の単量体類似体は担体分子、例えば標識化合物、放射性リガンド、放射性ヌクレオチド、免疫療法剤、または他の望ましい化学的部分とコンジュゲートされる。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、レラキシンスーパーファミリータンパク質の単量体ペプチド類似体の製造方法であって、
-レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖、レセプター結合サブユニットを得、
-6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する該タンパク質のレセプター結合サブユニット中のターンおよび/またはループ部分の各反対鎖上の第一および第二アミノ酸を同定し、
-第一アミノ酸と第二アミノ酸の間に、該B鎖、レセプター結合サブユニットの三次元構造を配座的に拘束する架橋を導入することを含む方法を提供することを目指すものである。
【００２９】
特に好ましい形において、該第一および/または第二アミノ酸は架橋に適したアミノ酸で置換される。
【００３０】
ある局面において、該方法は配列番号7に記載の配列に基づくINSL3ペプチド類似体を生成する。
【００３１】
好ましい形において、該方法は図3のcINSLaに示すINSL3類似体を生成する。
【００３２】
別の好ましい形において、該方法は図3のcINSLbに示すINSL3類似体を生成する。
【００３３】
さらなる局面において、該方法は各配列番号1、2、および3に記載の配列のいずれかに基づく単量体レラキシン-1、レラキシン-2、またはレラキシン-3ペプチド類似体を生成する。
【００３４】
好ましくは、該方法は図3のcR1xに示す単量体レラキシン類似体を生成する。
【００３５】
さらなる形において、該方法は、架橋した第一および第二アミノ酸以外の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該ペプチド類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されているINSL3および/またはレラキシン類似体を生成する。
【００３６】
別の局面において、1またはそれ以上の、本発明の単量体類似体およびその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
好ましくは、該医薬組成物はINSL3類似体またはレラキシン類似体を含む。
【００３８】
レラキシンスーパーファミリータンパク質メンバーの活性の調節異常を伴う疾患の症状を治療、予防、または改善する方法であって、有効量の本発明のペプチド類似体を患者に投与することを含む方法。
【００３９】
ある局面において、該疾患は、レラキシンおよび/またはINSL3の発現または活性の調節異常を特徴とする。
【００４０】
別の局面において、本発明は、過形成疾患、腫瘍性疾患、強皮症、コラーゲンまたはフィブロネクチン形成もしくは破壊の調節不良または異常、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常からなる群から選ばれる患者のレラキシンまたはINSL3介在性疾患の症状を治療、予防、または改善する方法であって、有効量の本発明のペプチド類似体を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
さらなる局面において、本発明は、過形成疾患、腫瘍性疾患、強皮症、コラーゲンまたはフィブロネクチン形成もしくは破壊の調節不良または異常、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常からなる群から選ばれる患者のレラキシンまたはINSL3介在性疾患を治療するための医薬の製造における本発明の類似体および/または医薬組成物の使用を予期する。
(図面の説明)
【００４２】
図1：INSL3、cINSLa、およびcINSLb類似体のLGR8レセプターに対する結合の略図。
【００４３】
図2：レラキシン様またはINSL3類似体のLGR7レセプターに対する結合の略図。
【００４４】
図3：天然レラキシンおよびINSL3-B鎖、および設計した典型的類似体の配列および拘束。
【００４５】
図4：天然INSL3レセプター(LGR8)に対するINSL3の反応(cAMP反応により測定)の阻害におけるcINSLaのアンタゴニスト活性の略図。
【００４６】
図5：水およびリン酸緩衝生理食塩水中の有意なαらせん含量を示すcINSLaのCDスペクトルを示す略図。
(詳細な説明)
【００４７】
その最も広い形において、本発明はレラキシンスーパーファミリータンパク質のメンバーのペプチド類似体、レラキシンタンパク質スーパーファミリーレセプターの結合活性を有する該類似体、該類似体の製造方法、および医薬組成物、治療方法、および該ペプチド類似体の使用に関する。
【００４８】
第一の局面において、該類似体は、インスリン、IGF-I、IGF-II、レラキシン1、レラキシン2、レラキシン3、INSL3、INSL4、INSL5、またはINSL6から選ばれるレラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的と結合し、該生物学的標的の活性を調節する、レラキシンスーパーファミリーメンバーのタンパク質のB鎖の配座的に拘束された環状類似体である。
【００４９】
本明細書で用いている用語「調節する」には、限定されるものではないが、レラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的の活性の誘発、レラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的の活性の上方または下方制御、またはレラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的の活性のブロック(阻止)が含まれる。
【００５０】
レラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的には、レセプター、例えば限定されるものではないが、LGR7、LGR8、GPCR135、GPCR142、インスリンレセプター、IGF-1レセプター、およびIGF-IIレセプターが含まれる。
【００５１】
したがって、該類似体は、レラキシンスーパーファミリーレセプターのリガンドでもあり得、該類似体リガンドは、限定されるものではないが、該レセプターのアゴニスト、アンタゴニスト、混合アゴニスト、逆アゴニスト、部分アゴニスト、部分アンタゴニスト、または逆アンタゴニストの活性を含む活性を有し得る。
【００５２】
本発明の環状B鎖ペプチド類似体は、レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖のターンまたはループ部分の修飾、6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する少なくとも第一および第二アミノ酸残基の選択を含む修飾、および第一および第二アミノ酸の架橋(ここで、該架橋は該類似体を立体的に拘束する)により生成される。
【００５３】
ある局面において、該類似体は、配列番号7に記載の配列から修飾されたINSL3 B鎖類似体である。
【００５４】
さらなる局面において、該INSL3類似体は、配列番号7に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と、21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される。さらにより好ましくは、該INSL3類似体は、配列番号7に記載の配列の2、3、4、5、6、7、および8位を含む2および8位の範囲内の第一アミノ酸と、21、22、23、24、25、および26位を含む21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される。
【００５５】
特に好ましい局面において、該B鎖ペプチド類似体は、図3のcINSLaで示されるINSL3類似体である。
【００５６】
さらに別の好ましい形において、該B鎖ペプチド類似体は、図3のcINSLbで示されるINSL3類似体である。
【００５７】
さらに別の局面において、該類似体は、それぞれ配列番号1、2、および3に記載のレラキシン-1、レラキシン-2、またはレラキシン-3 B鎖配列から修飾されたレラキシン類似体である。
【００５８】
さらなる局面において、該レラキシン類似体は、配列番号2に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と、21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される。さらにより好ましくは、該レラキシン類似体は、配列番号2に記載の配列の2、3、4、5、6、7、および8位を含む2および8位の範囲内の第一アミノ酸と、21、22、23、24、25、および26位を含む21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される。
【００５９】
好ましい形において、該B鎖類似体は、図3のCR1xに示すレラキシン類似体である。
【００６０】
特に好ましい形において、該第一および第二アミノ酸は架橋に適したアミノ酸で置換される。
【００６１】
適切な化学的連結基は、0〜20個の炭素原子と0〜10個の異種原子(N、0、S、Pなど)を有し、直鎖または分枝状であり得、飽和、不飽和、および/または芳香族環、単および/または二重結合、および化学基、例えばアミド、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、エーテル、ホスフェート、アミンなどを含む。
【００６２】
B鎖を配座的に拘束するのに用いるアミノ酸置換および架橋の形成は、限定されるものではないが、
(i) N末端窒素とC末端カルボニルの間のアミド結合を介して直接、またはスペーサー基を介して間接的に、例えばMアミノカルボン酸との縮合により、N末端アミンとC末端カルボキシル酸官能性を環化し；
(ii) 2残基の側鎖間の共有結合、例えばリジン残基とアスパラギン酸またはグルタミン酸残基間のアミド結合、または2つのシステイン残基間のジスルフィド結合、または
直接にかまたは上記(i)に記載のスペーサー基を介するシステイン残基とanz-ハロゲン化アミノ酸残基間のチオエーテル結合の形成を介して環化し(該側鎖に関与する残基は、B鎖配列それ自身から誘導されるか、またはこの目的のためにB鎖内に組み込むかまたはそれ上に加えてよい。)；
(iii) 直接にかまたは上記(i)に記載のスペーサー基を介して側鎖(例えばリジンまたはアスパータイト残基の)とC末端カルボニルまたはN末端アミン間のアミド結合の形成を介して環化することを含む種々の方法により得ることができる(該側鎖に関与する残基はB鎖配列それ自身由来であるか、またはこの目的のためのB鎖配列に組み込むかもしくはそれ上に加えてよい。)。
【００６３】
さらに、該B鎖ペプチド類似体は、1またはそれ以上のアミノ酸残基がその対応するDアミノ酸で置換され、該配列中の1またはそれ以上のアミノ酸に置換または修飾がなされ、ペプチド結合を代謝分解により抵抗する構造で置き換えることができ、また、異なる環化拘束および二量体化基を組み込むことができる。
【００６４】
1またはそれ以上のアミノ酸残基がその対応するDアミノ酸で置換される化合物に関して、当業者はレトロ-逆アミノ酸配列を標準的方法により合成することができることを認識している。例えば、Chorev and Goodman、Ace. Chem. Res.、26: 266-273, 1993参照。
【００６５】
Olson et al.、J. Med. Chem.、36：3039-3049 1993は、代謝分解により抵抗性の構造でペプチド結合を置換する例を提供する。
【００６６】
個々のアミノ酸を、類似構造、例えばgem-ジアミノアルキル基またはアルキルマロニル基(末端を修飾または非修飾)、またはアルキル、アシル、またはアミン置換基で置換し、その荷電が修飾される本発明の類似体を製造することもできる。そのような代替構造の使用は、それらが生理的条件下で分解により抵抗性であるため、体内における有意に長い半減期をもたらすことができる。
【００６７】
ペプチド類似体の組み合わせ合成法およびペプチドおよびペプチド類似体のスクリーニング法は当該分野でよく知られている(例えば、Gallop et al.、J. Med. Chem.、37: 1233-1251, 1994参照)。本発明の類似体は、改良された活性、安定性、およびバイオアベイラビリティの化合物を設計および合成するための鋳型として有用である。
【００６８】
アミノ酸置換を用いるのが好ましい場合、該置換は保存的、すなわち、アミノ酸は同様なサイズの同様の荷電特性を有するもので置換される。
【００６９】
本明細書で用いている用語「保存的置換」は、アミノ酸残基を別の生物学的に同様な残基で置換することを示す。保存的置換の例には、ある疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、またはメチオニンで別のものを置換すること、またはある極性残基で別のものを置換、例えばアルギニンでリジンを、グルタミン酸でアスパラギン酸を、グルタミンでアスパラギンを置換することなどを含む。互いに置換することができる中性親水性アミノ酸にはアスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニンが含まれる。用語「保存的置換」には、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いることも含まれる。
【００７０】
したがって、本発明の文脈において、保存的置換は当該分野においてあるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸で置換することと認識されると理解すべきである。典型的保存的置換をWO 97/09433からの以下の表Aに示す。
2007534613.tif 000002
【００７１】
あるいはまた、保存的アミノ酸は下記表Bに示すようにLehninger、[Biochemistry、Second Edition; Worth Publishers、Inc. NY: NY (1975)、pp. 71-77]に記載のごとくグループ分けすることができる。
2007534613.tif 000003
【００７２】
典型的保存的置換を以下の表Cに示す。
2007534613.tif 000004
【００７３】
本発明の環状ペプチド類似体は、本発明のペプチドの、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化、または酸付加塩、アミド、エステル、特にC末端エステル、およびNアシル誘導体の生成により修飾することができる。
【００７４】
該ペプチド類似体は、他の部分と共有または非共有複合体を形成することによりペプチド誘導体を生成するよう修飾することもできる。共有結合複合体は、化学的部分を該ペプチドを含むアミノ酸の側鎖上の官能基またはNまたはC末端と架橋することにより製造することができる。
【００７５】
B鎖ペプチド類似体は、レラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖、好ましくはB鎖の共通性を共有するレラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖とコンジュゲートすることができる。
【００７６】
B鎖ペプチド類似体は、限定されるものではないが放射性標識、蛍光標識、酵素(例えば比色分析または蛍光分析反応を触媒する)、基質、固体マトリックス、または担体(例えばビオチンまたはアビジン)を含むレポーター基とコンジュゲートすることができる。
【００７７】
さらなる形において、所望により第一および第二アミノ酸以外の該ペプチド類似体配列内の1またはそれ以上のアミノ酸を置換し、該類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾する。
【００７８】
本明細書で用いている用語「生物活性」には、限定されるものではないが、生物学的標的に対する結合親和性、生物学的標的のエフェクター活性、およびin vivo安定性が含まれる。
【００７９】
さらなる局面において、本発明は、レラキシンスーパーファミリータンパク質のペプチド類似体の製造方法であって、
-レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖、レセプター結合サブユニットを得、
-6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する該タンパク質のレセプター結合サブユニット中のターンおよび/またはループ部分の各反対鎖上の第一および第二アミノ酸を同定し、
-第一アミノ酸と第二アミノ酸の間に、該B鎖、レセプター結合サブユニットの三次元構造を拘束する架橋を導入することを含む方法を提供することを目指すものである。
【００８０】
特に好ましい形において、該第一および/または第二アミノ酸は架橋に適したアミノ酸で置換される。
【００８１】
ある局面において、該方法は配列番号7に記載の配列に基づくINSL3ペプチド類似体を生成する。
【００８２】
好ましい形において、該方法は図3のcR1x、cINSL3a、またはcINSL3bに示すINSL3類似体を生成する。
【００８３】
さらなる局面において、該方法は各配列番号1、2、および3に記載の配列のいずれかに基づくレラキシン-1、レラキシン-2、またはレラキシン-3ペプチド類似体を生成する。
【００８４】
好ましくは、該方法は図3のcR1xに示すレラキシン類似体を生成する。
【００８５】
さらなる形において、該方法は、架橋した第一および第二アミノ酸以外の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該ペプチド類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されているINSL3またはレラキシン類似体を生成する。
【００８６】
本発明のある局面は、少なくとも1のレラキシンスーパーファミリータンパク質メンバーの生物学的標的の活性を調節する、すなわち、少なくとも1のレラキシンスーパーファミリータンパク質メンバー、特に、LGR7またはLGR8レセプターの作用を通して介在するレラキシンまたはINSL3の活性を誘導または修飾する本発明のB鎖ペプチド類似体の活性を利用する。すなわち、該類似体は、該タンパク質の内因性発現の非存在下でレラキシンスーパーファミリーメンバーの活性を誘導するか、内因性に発現したタンパク質の活性を抑制もしくは拮抗することができる。あるいはまた、本発明の類似体は、レラキシンスーパーファミリーメンバーの存在する生物活性のレベルを上方制御することができる。そのような生物活性には、限定されるものではないがコラーゲンの分解、および乳腺のリモデリング、血管拡張、成長、および分化、血流量および臓器還流量の増加、心拍数の増加、冠動脈血流量の増加、糸球体ろ過速度および腎血漿流量の増加、性腺の成熟、細胞分裂の促進、精細胞の生存、卵胞の発生、および卵母細胞の成熟が含まれる。LGR8は、腎臓、骨、末梢血白血球、筋肉、脳、甲状腺、および子宮にも発現する。したがって、INSL3類似体は、腎臓および甲状腺機能に対する潜在的作用、脳に対する中枢作用、筋肉機能の調節、骨および血液細胞機能に対する効果、および子宮に対する生殖作用を有する。
【００８７】
したがって、レラキシンスーパーファミリータンパク質のあらゆる1またはそれ以上の上記生物活性の修飾には、有効な生物活性干渉量の本発明のB鎖類似体を投与する必要がある。
【００８８】
本発明の臨床適用には、限定されるものではないが、過形成疾患、腫瘍性疾患、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、精子形成調節異常、雄性および雌性不妊症、および性腺下降を含む生殖発生が含まれる。
【００８９】
さらに別の局面において、1またはそれ以上の本発明の類似体およびその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。
【００９０】
本発明の別の局面は、本発明のB鎖類似体およびその医薬的に許容される無毒性塩、および医薬的に許容される固体もしくは液体担体もしくはアジュバントを含む医薬組成物の提供に関する。好ましい医薬組成物は、レラキシンスーパーファミリータンパク質の少なくとも1のメンバーにより誘導される生物活性を阻害もしくは干渉するであろう。特に好ましい医薬組成物は、レラキシンおよび/またはINSL3により誘導される生物活性を阻害するであろう。
【００９１】
そのような担体もしくはアジュバントの例には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、鉱油、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、ショ糖、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、第二リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、増粘剤、安定化剤、懸濁化剤、およびその混合物が含まれる。そのような組成物は溶液、サスペンジョン、錠剤、カプセル、クリーム、軟膏(salve)、エリキシル、シロップ、ウエハー、軟膏(ointment)、または他の常套的形の形であってよい。
【００９２】
該製剤化は投与方法に適するように行われる。本発明ペプチドを含む組成物は活性化合物を約0.1%〜90重量%、最も一般的には約10%〜30%含むであろう。
【００９３】
用量および投与経路は患者の性質、治療する病状に依存するであろうし、担当医師または獣医師の裁量であろう。
【００９４】
適切な経路には、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射、非経口的、局所適用、インプラントなどが含まれる。例えば、有効量の、本発明の単量体単環状ペプチドまたは本発明の二量体二環状ペプチドを、約0.1〜1000μg/kg体重の用量でそれを必要とする生物に投与する。
【００９５】
本発明のB鎖類似体は、治療用組成物として単独または他の治療薬と組み合わせて用いることができよう。
【００９６】
好ましい医薬組成物には、INSL3類似体またはレラキシン類似体が含まれる。
【００９７】
ある局面において、該疾患はレラキシンおよび/またはINSL3発現または活性の調節異常を特徴とする。
【００９８】
前記のように、レラキシンは少なくとも2の生物学的標的：LGR7およびLGR8と結合すると理解されるが、INSL3はLGR8のみを介してその生物学的作用に介在するようである。いかなる特定の理論または作用方法に縛られることなく、LGR7およびLGR8に対する親和性を示すレラキシン様結合活性を有する類似体は、INSL3がレラキシンと共通レセプターを共有するならばレラキシンおよびINSL3の両者の効果を制御する。LGR8がレラキシンとINSL3の両方と結合する事実を考えると、多くのレラキシンの効果はINSL3レベルにより制御される(その逆もある)可能性がある。
【００９９】
別の局面において、本発明は、過形成疾患、腫瘍性疾患、強皮症、コラーゲンまたはフィブロネクチン形成もしくは破壊の制御不良または異常、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、雄性および雌性不妊症、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、性腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常からなる群から選ばれる患者のレラキシンまたはINSL3介在性疾患の症状を治療、予防、または改善する方法であって、有効量の本発明のペプチドを患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１００】
本明細書で用いている用語「妊娠性病状」には、限定されるものではないが、受精、妊娠、出産、および泌乳の病状が含まれる。
【０１０１】
本明細書で用いている用語「レラキシンまたはINSL3介在性」は、レラキシンまたはINSL3が該病状の発生、維持、または進行に関連または関与する病状を表す。
【０１０２】
さらなる局面において、本発明は、過形成疾患、腫瘍性疾患、強皮症、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、雄性および雌性不妊症、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、性腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常からなる群から選ばれる患者のレラキシンまたはINSL3介在性疾患を治療するための医薬の製造における本発明の該類似体および/または医薬組成物の使用を予期する。
【０１０３】
本発明を以下の非限定的実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１０４】
実施例1
方法および材料
INSL3類似体の分子設計
Silicon Graphics O2ワークステーション上のSYBYL分子モデリングソフトウェア(Tripos)を用い、鋳型としてヒト遺伝子2レラキシンB鎖のX線結晶構造からINSL3 B鎖のモデルを設計した(Eigenbrot et al.、1991、J Mol Biol 221: 15-21)。該配列をINSL3の配列に似るように修飾後、Gasteiger-Marsili荷電を用いるTripos力場を用いるエネルギー最小化を行った。得られるエネルギー最小化モデルから、互いに4Å内にCβ原子を有する2残基を同定した(Glu4およびArg26)。次に、これら残基をシステインで置換し、ジスルフィド結合を形成して環状ペプチドcINSLaを得た。
【０１０５】
His12をArgに置換して、Arg-X-X-Arg-X-X-X-Valのレラキシン様結合モチーフを模倣した第二環状類似体cINSLbを形成した。
固相ペプチド合成：
【０１０６】
INSL3類似体の合成を、連続流Fmoc方法論を先に記載のごとく用いて達成した(Dawson et al.、J Peptide Res 53: 542-547, 1999)。固体支持体はFmoc-PAL PEG-PS (PerSeptive Biosystems、USA)であり、HBTU活性化Fmocアミノ酸を全体を通して用いた。Nα-Fmoc脱保護はDMF中の20%ピペリジンを用いた。すべての誘導体はAuspep (Melbourne、Australia)から購入した。固体支持体からペプチドを開裂し、側鎖を脱保護してフェノール、チオアニソール、エタンジチオール、および水存在下(82.5/5/5/2.5/5、v/v)、トリフルオロ酢酸(TFA)で3時間処理して達成した。粗ペプチドを、0.1%水性TFA中のCH3CNの1%/min勾配を用い、Vydac C18カラム(Hesperia、USA)逆相高速液体クロマトグラフィ(RP-HPLC)にかけた。次に、ペプチドを10%ジメチルスルホキシド(DMSO)含有緩衝液で24時間酸化し、反応をHPLCおよび質量分析でモニターした。
特徴付け：
【０１０７】
合成ペプチドの純度を分析的RP-HPLC、および19.5kVの直線モードのBruker Biflex装置(Bremen、Germany)を用いるマトリックス支援レーザー脱離飛行時間(matrix-assisted laser desorption time of flight)(MALDITOF)質量分析により評価した。ペプチドの定量は、GBC装置(Melbourne、Australia)を用いる24時間酸加水分解物のアミノ酸分析によった。
円偏光二色性(CD)分光法：
【０１０８】
CDスペクトルは、1mmパス長セル中室温でJasco J-720装置を用い、二重蒸留水、120mM NaCl pH7.4含有10mMリン酸ナトリウム緩衝液、および分光法グレードのトリフルオロエタノール(TFE)を溶媒として得た。ペプチド濃度を1μMとし、定量的RP-HPLCおよびアミノ酸分析(ref)により測定した。曲線をJascoにより得られたアルゴリズムにより平滑化し、平均残基楕円率([Θ]MR)を分子量を用いてdegreexcm2/dmoleで表現した。CDスペクトル評価は既知のペプチド配座との比較に基づいた(Otvos、L.、Jr. 1996. Neuropeptide protocolsから. Irvine、G. & Williams、C.、Eds. pp 153-161. Humana Press、Totowa、NJ)。
機能的cAMP分析
【０１０９】
ヒトLGR7またはLGR8で安定にトランスフェクトしたヒト293T細胞を種々の処理前に30分間0.25mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX、Sigma)の存在下でプレインキュベーションした。インキュベーション終了時に、よく特徴付けられたcAMP ELISAを用いるcAMPの測定のために細胞を溶解した(Satoko et al.、J Biol Chem、278：7855-7862)。すべての実験を独立したトランスフェクションから得た細胞を用いて少なくとも3回反復した。結果をpmolcAMP/104細胞としてプロットした。
リガンド結合アッセイ：
【０１１０】
33P標識レラキシンのLGR7またはLGR8で安定にトランスフェクトした293T細胞への結合方法は先に記載されている(Satoko et al.、J Biol Chem、278：7855-7862)。データは、トランスフェクトした細胞の少なくとも3の独立したプレートを用いて行ったトリプリケート測定の%特異活性の平均SEMとして表現する。データをPRISMプログラム(Graphpad Inc.、San Diego、USA)の一側競合関数(one-site competition function)を用いてプロットした。
実施例2
【０１１１】
B鎖類似体を生成する組み込み環化拘束(incorporation cycling constraint)のための部位を分子モデリング試験により測定した。レラキシンの場合、B鎖中のβ炭素原子間の距離は、分子モデリングプログラムSybyl(Tripos Inc St Louis MO)を用いてレラキシンのX線結晶構造[6RLX]において測定された。C鎖らせん中の残基25(Met)および該鎖中の残基3(Trp)は、3.855Åのβ炭素とβ炭素の距離を有することがわかった。すなわち、これら残基は、Cysによる置換、次いでジスルフィド結合の形成に適していると考えられた。これは、天然タンパク質と同様の方法で該分子の両端を拘束し、環状レラキシンB鎖模倣cR1xを生じた(図3)。該方法は国際特許出願番号：WO 00/75176およびWO 01/52875に記載されている。
【０１１２】
INSL3の場合は、レラキシン構造内の適切なアミノ酸を置換し、得られたINSL3 B鎖のエネルギー最小化を行ってINSL3の3D構造のモデルを構築した。次に、レラキシン類似体中の置換した残基と隣り合った残基であるGlu4およびArg26ペアを含むCys-Cys拘束の組み込みのための潜在的部位として残基のペアを同定し、環状INSL3模倣cINSLAを得た(図3)。
【０１１３】
ペプチドcR1xおよびcINSLaの生物学的特徴付け後(図3)、ペプチドcINSLaのCys-Cys拘束を組み込むさらなる化合物を製造した。cINSLbと名付けたこの化合物は、INSL3中に存在しない推定レラキシンレセプター結合カセットの類似体を得るためにINSL3配列のHis12がArgで置換されたINSL3ベースの配列であった。
【０１１４】
同じアプローチを用いて、インスリンB鎖類似体、および他のレラキシンスーパーファミリー類似体を製造する。
【０１１５】
いくつかの好ましい態様について詳述してきたが、当業者は本発明の精神または範囲を離れることなく本発明に種々の変更、置換、および改変を行うことができることを理解すべきである。
2007534613.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】INSL3、cINSLa、およびcINSLb類似体のLGR8レセプターに対する結合の略図。
【図２】レラキシン様またはINSL3類似体のLGR7レセプターに対する結合の略図。
【図３】天然レラキシンおよびINSL3-B鎖、および設計した典型的類似体の配列および拘束。
【図４】天然INSL3レセプター(LGR8)に対するINSL3の反応(cAMP反応により測定)の阻害におけるcINSLaのアンタゴニスト活性の略図。
【図５】水およびリン酸緩衝生理食塩水中の有意なαらせん含量を示すcINSLaのCDスペクトルを示す略図。
【図１】
2007534613.tif 000006
【図２】
2007534613.tif 000007
【図３】
2007534613.tif 000008
【図４】
2007534613.tif 000009
【図５】
2007534613.tif 000010
【配列表】
2007534613000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月15日(2006.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007534613000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月22日(2007.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007534613000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月13日(2007.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レラキシンスーパーファミリータンパク質の生物学的標的と結合し、該生物学的標的の活性を調節するレラキシンスーパーファミリーメンバーのタンパク質のB鎖の単量体環状ペプチド類似体であって、レラキシンスーパーファミリータンパク質が、インスリン、IGF-I、IGF-II、レラキシン1、レラキシン2、レラキシン3、INSL3、INSL4、INSL5、およびINSL6から選ばれ、生物学的標的がインスリンレセプター、IGFR-I、IGFR-II、LGR7、およびLGR8から選ばれる該類似体。
【請求項２】
6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する少なくとも第一および第二アミノ酸残基を選択し、第一および第二アミノ酸を架橋することを含む(ここで、架橋は該類似体を配座的に拘束する。)、レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖のターンまたはループ部分の修飾により生成される請求項1記載の類似体。
【請求項３】
配列番号7に記載の配列から修飾されたINSL3 B鎖類似体である請求項1または請求項2記載の類似体。
【請求項４】
該INSL3類似体が配列番号7に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と21および26位の範囲内の第二アミノ酸の間の架橋により拘束される請求項3に記載の類似体。
【請求項５】
図3のcINSLaで示すINSL3類似体である請求項3または4に記載の類似体。
【請求項６】
図3のcINSLbで示すINSL3類似体である請求項3または4に記載の類似体。
【請求項７】
それぞれ配列番号1、2、および3に記載のレラキシン-1、レラキシン-2、またはレラキシン-3 B鎖配列から修飾されたレラキシン類似体である請求項1または2に記載の類似体。
【請求項８】
該レラキシン類似体が配列番号2に記載の配列の2および8位の範囲内の第一アミノ酸と21および26位の範囲内の第二アミノ酸の架橋により拘束される請求項7記載の類似体。
【請求項９】
レラキシン類似体が図3のcR1xで示すレラキシン類似体である請求項8記載の類似体。
【請求項１０】
第一および/または第二アミノ酸が架橋に適した代替アミノ酸で置換されている請求項1〜9のいずれかに記載の類似体。
【請求項１１】
該代替アミノ酸の少なくとも1がシステイン残基である請求項10記載の類似体。
【請求項１２】
該代替アミノ酸残基の両方がシステイン残基である請求項11記載の類似体。
【請求項１３】
システイン残基を酸化してシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することにより架橋される請求項12記載の類似体。
【請求項１４】
架橋した第一および第二アミノ酸以外のINSL3またはレラキシンペプチド類似体配列内の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されている請求項1〜13のいずれかに記載の類似体。
【請求項１５】
該類似体の生物学的標的がLGR7および/またはLGR8である請求項1〜14のいずれかに記載の類似体。
【請求項１６】
該生物学的標的の活性が誘発、上方制御、下方制御、またはブロックされる請求項15記載の類似体。
【請求項１７】
レラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖とコンジュゲートする 請求項1〜16のいずれかに記載の類似体。
【請求項１８】
レラキシンスーパーファミリータンパク質のA鎖がレラキシンスーパーファミリータンパク質の対応するA鎖である請求項17記載の類似体。
【請求項１９】
レポーター基とコンジュゲートする請求項1〜18記載の類似体。
【請求項２０】
レポーター基が放射性標識、蛍光標識、酵素、および担体から選ばれる請求項19記載の類似体。
【請求項２１】
レラキシンスーパーファミリータンパク質のペプチド類似体の製造方法であって、
-レラキシンスーパーファミリータンパク質のB鎖、レセプター結合サブユニットを得、
-6Å以下のαらせんまたはβ鎖炭素分離距離を有する、該タンパク質のレセプター結合サブユニット中のターンおよび/またはループ部分の各反対鎖上の第一および第二アミノ酸を同定し、
-第一アミノ酸と第二アミノ酸の間に、該B鎖、レセプター結合サブユニットの三次元構造を配座的に拘束する架橋を導入することを含む方法。
【請求項２２】
第一および/または第二アミノ酸が架橋に適したアミノ酸で置換される請求項21記載の方法。
【請求項２３】
残基2および8の範囲内に第一アミノ酸および残基21および26の範囲内に第二アミノ酸を有する、配列番号7に記載の配列に基づくINSL3ペプチド類似体を生成する請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
INSL3類似体が図3に示すcINSLaである請求項23記載の方法。
【請求項２５】
INSL3類似体が図3に示すcINSLbである請求項23記載の方法。
【請求項２６】
残基2および8の範囲内に第一アミノ酸および残基21および26の範囲内に第二アミノ酸を有する配列番号2に記載の配列のいずれかに基づくレラキシン-2ペプチド類似体を生成する請求項21または22記載の方法。
【請求項２７】
図3のcR1xで示されるレラキシン類似体を生成する請求項26記載の方法。
【請求項２８】
架橋した第一および第二アミノ酸以外の1またはそれ以上のアミノ酸が所望により該ペプチド類似体の1またはそれ以上の生物活性を修飾するように置換されているINSL3またはレラキシン類似体を生成する請求項21〜23または26のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
1またはそれ以上の、請求項1〜20のいずれかに記載の類似体またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項３０】
さらに、少なくとも1の医薬的に許容される担体または希釈剤を含む請求項29記載の医薬組成物。
【請求項３１】
レラキシンスーパーファミリータンパク質メンバーの活性の調節異常を伴う疾患の症状を治療、予防、または改善するための医薬を製造するための請求項1〜20のいずれかに記載のペプチド類似体の使用。
【請求項３２】
該疾患にレラキシンまたはINSL3が介在する請求項31記載の使用。
【請求項３３】
該疾患が、過形成疾患、強皮症、コラーゲンまたはフィブロネクチン形成もしくは破壊の調節不良または異常、腫瘍性疾患、神経疾患、血管新生疾患、心臓血管疾患、雌性生殖障害、妊娠性病状、腎疾患、炎症性腸疾患、レイノー病、レイノー現象、停留睾丸、雄性または雌性不妊症、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節異常からなる群から選ばれる、有効量の、請求項1〜20のいずれかに記載のペプチド類似体または請求項29または30記載の医薬組成物を患者に投与することを含む請求項31または32記載の使用。
【請求項３４】
腫瘍性疾患または過形成疾患が甲状腺を含む請求項33記載の使用。
【国際調査報告】
2007534613.tif 000022
2007534613.tif 000023