(57)【要約】  本発明は、好ましくは配列番号１、配列番号２、および配列番号７に記載の抗炎症薬としてのＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規の使用を提供する。活性成分としてＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む炎症状態の治療のための薬学的組成物およびその治療方法を記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症薬としてのＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項２】
炎症誘発性サイトカイン放出のサプレッサーとしてのＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項３】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、およびＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、請求項１および請求項２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥに指向するヌクレアーゼ耐性アンチセンスヌクレオチドである、請求項１および請求項２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、配列番号１、配列番号２、および配列番号７のいずれか一つに記載の配列を有するＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３および請求項４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
解熱薬としてのＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項７】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、およびＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＡＣｈＥのインヒビターが、配列番号１、配列番号２、および配列番号７のいずれか一つに記載の配列を有するＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記炎症誘発性サイトカインが、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８のいずれか一つである、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記炎症誘発性サイトカインがＩＬ−１βである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記炎症誘発性サイトカインの放出が、ストレス、細菌感染、薬物、照射、ＡＣｈＥインヒビターへの曝露、脳卒中、自己免疫疾患、化学物質頻回曝露感度、および任意の年齢依存性累積損傷のいずれか一つによって誘発される、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
活性成分としてＡＣｈＥ発現のインヒビターを含み、任意選択的に、薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、必要とする哺乳動物被験体の炎症応答を誘発する容態の治療のための薬学的組成物。
【請求項１３】
活性成分としてＡＣｈＥ発現のインヒビターを含み、任意選択的に、薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、必要とする哺乳動物被験体の関節、中枢神経系、胃腸管、心内膜、心膜、肺、眼、皮膚、および尿生殖器系の炎症の治療および／または予防のための薬学的組成物。
【請求項１４】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、またはＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、請求項１２および請求項１３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物被験体がヒトであり、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが配列番号１および配列番号７のいずれか一つに記載のＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記哺乳動物被験体が非ヒト哺乳動物であり、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが配列番号２に記載のＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
約０．００１μｇ／ｇと約５０μｇとの間の有効成分の投薬量を必要とする被験体に毎日使用する、請求項１２〜請求項１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記治療および／または予防が、約０．０１〜約５．０μｇ／ｇの投薬量の有効成分を投与する工程を含む、請求項１２〜請求項１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記治療および／または予防が、約０．１５〜約０．５０μｇ／ｇの投薬量の有効成分を投与する工程を含む、請求項１２〜請求項１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、およびＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、請求項１２〜請求項１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物の調製のためのＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項２１】
治療有効量のＡＣｈＥ発現のインヒビターまたは請求項１２〜請求項１９のいずれか一項に記載の組成物を必要とする哺乳動物被験体に投与する工程を含み、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、およびＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、炎症応答を誘発する容態の治療方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物被験体がヒトであり、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが配列番号１および配列番号７のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物被験体が非ヒト哺乳動物であり、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが配列番号２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記容態が、ストレス、細菌感染、薬物、照射、ＡＣｈＥインヒビターへの曝露、脳卒中、自己免疫疾患、化学物質頻回曝露感度、および任意の年齢依存性累積損傷のいずれか一つから選択される、請求項２１〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症薬分野に関する。より詳細には、本発明は、特に、関節、中枢神経系、胃腸管、心内膜、心膜、肺、眼、皮膚、および尿生殖器系の治療および／または予防のための抗炎症薬としてのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）ヌクレオチド配列のコードドメインにターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規の使用を提供する。
【０００２】
連邦政府資金による研究
本研究は、米国陸軍研究所および米国陸軍資材コマンド（ＵＳ  Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｍｍａｎｄ）（ＤＡＭＤ）１７−９９−１−９６４７（１９９９年７月〜２００４年８月）および高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）Ｎ６６００１−０１−Ｃ−８０１５（２００１年５月〜２００４年５月）から資金援助を受けた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本出願を通して記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として十分に援用され、本明細書中で引用した全ての引例が含まれる。
【０００４】
炎症は、病原体の侵入からの防御ならびに種々の型の損傷後の治癒および回復過程で重要な役割を果たす。しかし、過剰な炎症反応は有害であり、自己免疫疾患、神経変性、敗血症、外傷、および他の病的状態を引き起こし得るので、炎症応答の規模および持続時間は厳重に制御されなければならない。炎症反応の制御は、免疫応答（特に、抗炎症性サイトカインの分泌）および神経内分泌因子、特に、下垂体−副腎軸の活性化および糖質コルチコイドの分泌の両方によって媒介されることが長きにわたり認識されている。最近、神経機構も炎症応答の制限に関与することが明らかになっている。特に、コリン作動性ニューロンが急性炎症を阻害し、それにより、急速で局在化し、且つ適合性の抗炎症反射系が得られることが見出された（Ｔｒａｃｙ，２００２）。末梢で、アセチルコリン（ＡＣｈ）は、主に、遠心性迷走神経によって放出される。アセチルコリンは、炎症誘発性サイトカインＴＮＦα、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、およびＩＬ−１８の産生を減少させるが、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を減少させない（Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，８５３−８５９］）。相互に、ＩＬ−１は、ＰＣ１２細胞およびラット皮質の両方でＡＣｈＥを過剰産生させ（Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，１４９−１５５）、ループ閉じ、それにより、ＡＣｈはＩＬ−１を抑制し、ＡＣｈＥ産生の誘導を消耗させることが示唆される。
【０００５】
哺乳動物の脊髄内で、介在ニューロンのいくつかのサブセットは、一斉に同調した運動ニューロンの活動への集中した皮質入力を翻訳するように機能する（Ｎｏｇａ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，２２０３−２２１７；Ｐｈｅｌｐｓ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２９１，９−２６；Ｓｈｅｒｒｉｆｆ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｚ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６３４，１５０−１５４；Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ，Ｓ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．８０，２４７５−２４９４；Ｐｒｕｔ，Ｙ．＆  Ｆｅｔｚ，Ｅ．Ｅ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，５９０−５９４）。この複雑に制御された経路のアロスタティックな崩壊は、種々のストレッサー（グリシン作動薬（ストリキニン）もしくはコリン作動薬（サクシニルコリン）が含まれる）の存在下または筋無力性クリーゼもしくは麻酔後の影響下で起こり得る（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ８，２８３−２８９；Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｂ．＆  Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４，１９０９−１９１８；Ｓｕｂｒａｍｏｎｙ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ９，６４−６８；Ｋｒａｓｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎ．Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈ．４４，５２５−５３４）。これらおよび他の急性ストレッサーは、大きな（ｍａｓｓｉｖｅ）振戦および痙性麻痺を誘導し、おそらく脊髄運動ニューロンにおけるコリン作動性ホメオスタシスを持続するように作用する品質管理過程の不具合を反映し得る。これらのコリン作動性神経伝達の調整に加えて、損傷および化学的ストレッサーは共に脊髄における炎症誘発性サイトカイン（例えば、実験精髄損傷後のＩＬ−１β）またはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の有機リン酸エステルの上方制御を誘導する（Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７５９，１９０−１９６；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２２，３５５−３６２；Ｄｙｅｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １６９，１７７−１８５）。したがって、炎症誘発性サイトカインの末梢放出におけるコリン作動性制御により（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｂｅｒｎｉｋ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５，７８１−７８８；Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ，Ｌ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，４５８−４６２；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１５，１５７５−１５７６）、コリン作動性アロスタシスが中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンにおいても炎症誘発応答を制御するのに役立つかどうかという疑問が呼び起こされる。
【０００６】
脊髄運動ニューロンがＡＣｈに対して応答するので、推測される品質管理過程はコリン作動性神経伝達の際に調節効果を発揮するはずである。品質管理過程は迅速に機能する必要があるので、短命の分子が関与する可能性が高い。さらに、広範囲にするために、提案された機構は幅広く多様なストレッサーの存在下で誘導される可能性が高い。通常は稀なストレス誘導性アセチルコリンエステラーゼ変異型ＡＣｈＥ−Ｒは、このような応答のインデューサーからの全ての要求を満たす。ＡＣｈＥ−Ｒは、心理学的、化学的、および物理的ストレス下で過剰産生される（Ｓｏｒｅｑ，Ｈ．＆  Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｓ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２，２９４−３０２に概説されている）。並行ストレス応答は、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）（Ｋａｕｆｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，３７３−３７７）およびゲノム的に関連した小胞アセチルコリン輸送体（ＶＡＣｈＴ）（Ｗｅｉｈｅ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，３５４７−３５５２）の下方制御に関与し、これらは共にアセチルコリンの産生および小胞封入を制限する一方でその分解を促進する。これにより、多くのストレスに関連するコリン作動性過興奮が下方制御される。より長い範囲では、このストレス応答は、コリン作動性神経伝達のアゴニストおよびアンタゴニストの両方に対する過敏症（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，５０８−５１２）ならびにＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡのアンチセンス崩壊下で除去され得る異常な運動活性（Ｃｏｈｅｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７，８７４−８８５）に関連する。したがって、脊髄運動ニューロンによるストレス管理の重要な構成要素としてＡＣｈＥ−Ｒレベルの精巧に調節された制御として現れる。ＡＣｈレベルを抑制するＡＣｈＥ−Ｒの過剰発現により、ＩＬ−１産生が増加する。これが事実である場合、ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１７（２），２１４−２２）により、ＡＣｈレベルが増加し、ＣＮＳニューロンにおける炎症誘発性サイトカインレベルが減少するであろう。
【０００７】
対照的に、特に脳内でのサイトカインの並行炎症応答および産生により、アルツハイマー病（Ａｒｅｎｄｔ，Ｔ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １０２：７２３−６５）、多発性硬化症（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｎｔ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｓｏｃ．８：３９５−４０９）、後天性免疫不全症候群（Ｎａｖｉａ，Ｂ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９：５１７−２４）、および感染症（Ｃａｐｕｒｏｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｓｙｃｈｏ．Ｍｅｄ．２９：２９１−７）のような病状に起因する記憶機能の疾患関連変化が、少なくとも部分的に免疫活性化によって媒介されることが示唆されている（Ｒａｃｈａｌ  Ｐｕｇｈ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．２５：２９−４１；Ｍａｉｅｒ  Ｓ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｌ．Ｒ．（１９９８）Ｐｓｙｃｈｏ．Ｒｅｖ．１０５：８３−１０７；Ｙｉｒｍｉｙａ  Ｒ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１０：４７０−４７６；Ｙｉｒｍｉｙａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ，７８：３７９−３８９。ヒト（癌およびＣ型肝炎患者が含まれる）（Ｃａｐｕｒｏｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍ．Ｍｅｄ．６３：３７６−８６；Ｍｅｙｅｒｓ  Ｃ．Ａ．（１９９９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６１：７５−８１）および実験動物（Ｇｉｂｅｒｔｉｎｉ  Ｍ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４０２：２０７−１７；Ｏｉｔｚｌ  Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６１３：１６０−３）のサイトカイン誘導性記憶障害は、この概念を支持する。したがって、学習および記憶に影響を与えることが知られている多くの他のストレスの多い刺激（Ｋｉｍ  Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｄ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：４５３−６２）のように、炎症は記憶機能を顕著に変化させることができる。内毒素（リポ多糖類）（全てのグラム陰性細菌の外膜で見出される複合糖脂質）の投与は、ヒトにおける感染に対する急性宿主応答の認知的所産（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）の評価に役立つ。内毒素投与により、発熱、倦怠、ならびにサイトカイン（特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１、およびＩＬ−１ｒａ、およびコルチゾール）（概説については、Ｂｕｒｒｅｌｌ  Ｒ．（１９９４）Ｃｉｒｅ．Ｓｈｏｃｋ  ４３：１３７−５３を参照のこと）およびプロテアーゼ（Ｆａｈｍｉ  Ｈ．ａｎｄ  Ｃｈａｂｙ  Ｒ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２３：２４３−５８）の産生および分泌の増加が誘導される。健常なヒトでは、内毒素誘導性サイトカイン分泌は、言語および非言語陳述記憶機能の障害に相関する（Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５８：４４５−５２）。
【０００８】
記憶障害および深在性の神経行動症状および神経内分泌症状も実験動物におけるサイトカインの内毒素誘導性分泌に相関すると報告されている（Ｈａｕｓｓ−Ｗｅｇｒｚｙｎｉａｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １１：１７５９−６３；Ｐｕｇｈ  Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ．Ｉｍｍｕｎ．１２：２１２−２９；Ｓｈａｗ  Ｋ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２４：４７−５４）。これらの所見によりサイトカインが記憶に対する内毒素の影響の媒介に関与すると示唆される一方で、これらのサイトカインの活動に関連する神経伝達経路はほとんど知られていない。本発明者らは、中枢神経系（ＣＮＳ）でコリン作動性応答が認識機能のいくつかの重要な態様（注意力、学習、および記憶が含まれる）で顕著に関与するので、コリン作動性過程が内毒素応答に関連するという可能性を調査し始めた（概説については、Ｌｅｖｉｎ  Ｅ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ  Ｂ．Ｂ．（１９９８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）１３８：２１７−３０；Ｓｅｇａｌ  Ｍ．ａｎｄ  Ａｕｅｒｂａｃｈ  Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１０８５−９１を参照のこと）。さらに、内毒素は、脳のコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を減少させ（Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８８：１９３−２００）、これは精神的ストレスの効果と類似している（Ｋａｕｆｅｒ（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ）。末梢では、内因性およびが陰性アセチルコリン（ＡＣｈ）は、内毒素刺激ヒトマクロファージからの炎症誘発性サイトカインの放出を弱める（Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ（２０００）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｂｅｒｎｉｋ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｔｒａｃｅｙ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。ＡＣｈ加水分解酵素であるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、ＡＣｈＥがＡＣｈレベルを制御し、ＡＣｈＥインヒビターが臨床的および実験的パラダイムの両方において認識機能を改善するので、これらの突起に特に関連する可能性があると見なされた（Ｐａｌｍｅｒ  Ａ．Ｍ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：４２６−３３；Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  Ｍ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ４：３４９−５６）。さらに、ＡＣｈＥの過剰発現は、急性および慢性のストレスの多い発作によって誘発され（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、トランスジェニックマウスで証明されるように、進行性記憶障害を誘導する（Ｂｅｅｒｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１０６３−７１）。
【０００９】
ＡＣｈＥ遺伝子発現のストレス誘導性転写活性化は、通常は稀な「読み過ごし」ＡＣｈＥスプライス変異型の蓄積に関連する（Ｓｏｒｅｑ  ａｎｄ  Ｓｅｉｄｍａｎ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。短期では、過剰なＡＣｈＥ−Ｒはストレス誘導性コリン作動性過興奮を誘導し（Ｋａｕｆｅｒ（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、長期では、コリン作動性アゴニストおよびアンタゴニストに対する過敏症を誘導する（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。ＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒの両方を過剰発現するマウスは、樹状細胞が漸増し、且つ脊椎が消失し（Ｂｅｅｒｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２４４１−５１）、不安応答が変化する（Ｅｒｂ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：６３８−４６）。さらに、これらのマウスは、早期発症性の社会的認識の欠損およびストレスの多い発作に対する応答性の悪化を示す。これらを、従来の抗コリンエステラーゼ治療によって短期間で改善することができるか、ＡＣｈＥ−ＲのｍＲＮＡの破壊を特異的に誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドによってより長い期間で改善することができ（Ｃｏｈｅｎ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、ＡＣｈＥ−Ｒが主な原因であることが示唆される。したがって、ＡＣｈＥ−Ｒ産生により、認識に対して正の効果および負の効果の両方が得られ得る。
【００１０】
学習および記憶におけるコリン作動性機構の役割、ストレス応答におけるＡＣｈＥ−Ｒの関与、ＡＣｈによる炎症誘発性サイトカイン産生の抑制、および記憶機能に対する内毒素の影響により、内毒素誘導性記憶の変化におけるＡＣｈＥ−Ｒの関与が示唆される。ストレスの多い発作により、末梢（例えば、小腸）でもＡＣｈＥ−Ｒ産生が誘導され、嫌悪刺激に対する応答におけるこの産生の誘導の失敗により、比較的穏やかなストレッサーに対して過敏症を引き起こす（Ｓｈａｐｉｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：１２７３−１２８１）。これにより、末梢ＡＣｈＥの調整が内毒素誘導性の認識の変化の代替マーカーとしても役立ち得るという可能性が高まった。しかし、血漿では、ＡＣｈＥ−Ｒのタンパク質分解性切断により、造血ストレス応答を容易にする短い免疫陽性Ｃ末端ペプチドが血清中に出現する（Ｇｒｉｓａｒｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７，９３−１０５）。したがって、本発明者らは、健常なヒトボランティアにおけるＡＣｈＥ活性およびＡＣｈＥ−Ｒ切断に対する内毒素投与の影響を調査し、これらのパラメータ間の潜在的な相関関係、サイトカインまたはコルチゾールの分泌、および記憶機能における経時変化を検討した。海馬および前頭葉前方構造の協奏的機能による事実および事象の意識的にアクセス可能な記録に関与する陳述記憶に加えて（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、本発明者らは、認識機能に必要な情報の一時的保存および操作に関与する作業記憶に対する内毒素の影響およびＡＣｈＥ切断とのその相互作用を評価し（Ｂａｄｄｅｌｅｙ  Ａ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：５５６−９）、前頭葉前方コリン作動性機構に関与することが示されている（Ｆｕｒｅｙ  Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：２３１５−９）。
【００１１】
非常に低濃度での優れた特異性および作用の治療薬の予想により、種々のｍＲＮＡに対してターゲティングされるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＮ）の開発が刺激される。細胞のＲＮＡプロセシング機構へのアクセス、特定の細胞型と使用される化学的防御様式との間の潜在的な相違が依然として問題である。目的の細胞がＣＮＳ内に存在する場合、アクセスの問題は、血液脳関門の存在によってより悪化する（Ｔａｖｉｔｉａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，４６７−４７１）。それにもかかわらず、霊長類でさえもいくつかの試みが成功している（Ｋａｓｕｙａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．７５−７６，３１９−３２５；Ｍｉｚｕｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１，１７７２−１７７９）。本発明者らは、培養ラット細胞およびヒト細胞（Ｇａｌｙａｍ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１１，５１−５７；Ｇｒｉｓａｒｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、生きたマウス（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｓｈｏｈａｍｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８，２２８−２３６）、ならびにラット（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）におけるストレス誘導性の変化後に正常な細胞機能および生理学的機能に回復することができるストレス誘導性ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡのアンチセンス抑制を以前に証明している。これらの全研究における試験結果が標的タンパク質およびｍＲＮＡの直接的測定に制限される一方で、作業仮説により、コリン作動性均衡のアンチセンス回復に対する抗炎症効果が予想された。ここでは、本発明者らは、カニクイザルにおける注射ストレス下でのストレス誘導性過剰産生および正常なＡＣｈＥ−Ｒレベルの選択的ＡＳ−ＯＮ回復に取り組むことを目的とした実験結果を報告する。所見は、ＡＳ−ＯＮ応答に対する特定のニューロン型の感受性の相違および脊髄ニューロンにおけるコリン作動性均衡の回復後のＩＬ−１βおよびＩＬ−６の付随する抑制を証明する。
【００１２】
本発明者らは、以前に、ＡＣｈＥの一般的なコード領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＣｈＥ−Ｒ産生の抑制に有用であることを見出している（ＷＯ  ９８／２６０６２を参照のこと）。特に、本発明者らは、重症筋無力症治療のためのＡＣｈＥ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を示している（ＷＯ  ０３／００２７３９およびＵＳ  １０／４０２，０１６）。
【００１３】
本発明者らの本明細書中に記載の結果に基づいて、本発明は、新規の抗炎症薬としてのＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ配列に対して指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規の使用を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的および利点は、説明するにつれて明らかとなる。
【特許文献１】ＷＯ  ９８／２６０６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
第一の態様では、本発明は、抗炎症薬としてのＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用について言及する。好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、以下の配列の任意の一つを有するＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである：
５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ  ３’（配列番号１）；
５’−ＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２）；および
５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡ＊Ｃ＊Ｃ*  ３’（配列番号７）（配列中、三つの３’末端残基は、２−Ｏ−メチル基で修飾されている（＊））。
【００１６】
別の態様では、本発明は、炎症誘発性サイトカイン放出のサプレッサーとしての本明細書中に定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用を提供する。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、活性成分として上記定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターを含む、炎症応答を誘発する容態の治療のための薬学的組成物を提供することを意図する。任意選択的に、組成物は、添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む。好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、ＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、アンチセンスヌクレオチドは、配列番号１に記載の配列を有する。
【００１８】
なおさらなる態様では、本発明は、活性成分として上記定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターを含み、任意選択的に、添加剤、キャリア、および／または希釈剤のいずれか一つをさらに含む、関節、中枢神経系、胃腸管、心内膜、心膜、肺、眼、皮膚、および尿生殖器系の炎症の治療および／または予防のための薬学的組成物を提供する。好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の配列を有する。
【００１９】
本明細書中に定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターは、本発明の薬学的組成物の調製で使用すべきである。
【００２０】
最後に、本発明は、有効量の本明細書中に定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターまたは活性成分として本明細書中に定義のように調製したＡＣｈＥ発現のインヒビターを含む組成物を投与する工程を含む、炎症応答を誘発する容態の治療方法を教示する。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法で使用すべきＡＣｈＥ発現のインヒビターは、より好ましくは、配列番号１に記載の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
明白にするために、以下の略語および用語を本明細書中で定義する。
【００２３】
−ＡＣｈＥ：アセチルコリンエステラーゼ
−ＡＣｈＥ−Ｒ：アセチルコリンエステラーゼの「読み過ごし」変異型またはイソ型、そのｍＲＮＡは偽イントロンＩ４を含む。
【００２４】
−ＡＣｈＥ−Ｓ：アセチルコリンエステラーゼのシナプス変異型またはイソ型
−ＡＳ−ＯＮ：アンチセンスオリゴヌクレオチド
−ＣＮＳ：中枢神経系
−ＥＮ１０１：（ＡＳ３とも呼ぶことができる）ヒト、ラット、またはマウスのＡＣｈＥ  ｍＲＮＡに対してターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチド（それぞれｈＥＮ１０１、ｒＥＮ１０１、またはｍＥＮ１０１）
−Ｅ３０１：（ｍＥＮ１０１とも呼ぶことができる）マウスのＡＣｈＥ  ｍＲＮＡに対してターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチド
−ｉ．ｖ．：静脈内
−ｉ．ｐ．：腹腔内
−ｏ．ｇ．：経口摂食
−ｐ．ｏ．：経口
アンチセンスオリゴヌクレオチド：ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ配列に対して本質的に逆の相補配列を含むヌクレオチド。ヌクレオチドは、好ましくは、オリゴヌクレオチドであるが、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはその混合物も本発明によって意図される。そのヌクレアーゼ耐性を増強するため、その膜横断能力を改善するため、またはその両方のためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは線状であり得るか、二次構造を含み得る。リボザイム活性などの酵素活性も含み得る。
【００２５】
コリン作動性アロスタシスおよびＣＮＳ炎症過程が相互関連するかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ｈＥＮ１０１（配列番号１）（ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡの破壊を誘導する２’−オキシメチル化アンチセンスオリゴヌクレオチド）で一週間毎日処置した後のカニクイザル由来の脊髄ニューロンを研究した。ｈＥＮ１０１は、血漿ＡＣｈＥ活性のストレス誘導性増加を防止し、ニューロンのＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびインターロイシン１βおよび６レベルを用量および細胞サイズ依存性要旨生きで選択的に抑制した。対照的に、ＶＡＣｈＴおよびＣｈＡＴレベルは、全ての取扱ったストレスを受けたサルで用量依存性に減少し、対応する遺伝子の明らかな調節が示された。これらの所見は、霊長類ＣＮＳにおけるコリン作動性アロスタシスと炎症応答との間の原因となる関係を暗示し、これらの両障害の管理のためのＡＣｈＥ−Ｒ蓄積へのアンチセンス介入が示唆される。
【００２６】
第一の態様では、本発明は、抗炎症薬としてのＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用について言及する。
【００２７】
本明細書中で定義するように、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、特に、そのｍＲＮＡとの相互作用によってＡＣｈＥ遺伝子の発現を遮断または妨害することができる任意の薬剤である。したがって、インヒビターは、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉様の二本鎖ヌクレオチド配列、またはＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレアーゼ耐性を示す。
【００２８】
好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡを選択的に阻害し、その結果として選択的にＡＣｈＥ−Ｒイソ型の発現を阻害する。これに関して、可溶性ＡＣｈＥ−Ｒイソ型を阻害することができる任意の薬剤はまた、抗炎症薬であり得る。したがって、ＡＣｈＥ−Ｒの発現および機能を遮断することができる推定分子は、抗炎症薬であろう。
【００２９】
実施例１に示すように、処置サルの血漿中のＢｕＣｈＥレベルは、有意に変化せず、ＡＣｈＥのみに対する選択的アンチセンス効果の概念を支持する。血漿ＡＣｈＥ活性およびニューロンＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ標識は共に、１５０μｇ／ＫｇのｈＥＮ１０１で処置したサルで増加し、毎日の試験での産生の増加を反映していた（表１およびデータ示さず）。あるいはまたは加えて、ｈＥＮ１０１のｐ．ｏ．投与のためのカニューレ挿入に関連する穏やかなストレスが原因であり得る。より高用量の５００μｇ／Ｋｇ  ｈＥＮ１０１で同様に処置したサルにおける血漿ＡＣｈＥ活性の抑制から示されるように、ｈＥＮ１０１の非存在下での血漿ＡＣｈＥの増加はより高くなる可能性が高いであろう。この低ｈＥＮ１０１用量下での血漿ＡＣｈＥの薬物誘導性の減少で見かけ上３時間の遅延が認められたが、おそらく、その標的タンパク質合成のアンチセンス薬による防止を反映している。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの霊長類ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡの短い半減期をさらに示し、このことは、本発明者らおよび他の以前の所見と一致する（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，９７２７−９７３３）。
【００３０】
ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ陽性ニューロン画分、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ標識の強度、およびＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ標識過程を有する細胞画分は全てアンチセンス治療下で減少した（図２Ａ〜２Ｊおよび３Ａ〜３Ｃ）。アンチセンス抑制に対するＡＣｈＥ−Ｒ過剰産生のニューロン感受性は、細胞体のサイズに反比例して現れ、おそらく、異なる膜および／または代謝特性、異なる細胞体積、およびこれらの特性の寄与の組み合わせを反映する。さらに、ＶＡＣｈＴおよびＣｈＡＴのアンチセンス依存性減少は、小胞再利用の減速を示す可能性が高く（Ｓｏｒｅｑ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９６８８−９６９２）、コリン作動性神経伝達のペースを潜在的に調整する。ナイーブ条件下で、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡはＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡよりも多数の脊髄神経突起で出現し、ラット脊髄前角でＶＡＣｈＴ標識に類似のパターンが得られた（Ｗｅｉｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。予想されるように、ｈＥＮ１０１処置は、ニューロンＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡを使用すると有効性が高く、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡを使用すると有効性がずっと低い。しかし、ニューロンＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡ標識強度の減少は、ニューロンＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡレベルの限定的減少も反映している可能性が高かった。ｈＥＮ１０１処置下で、過程中のＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡは減少し、ストレス下でのげっ歯類および霊長類のＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡ転写物の樹状突起転座の共通の経口が示唆された（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。この相違により、ナイーブサルが実際にストレス下に無いという概念（動物数が厳格に制限されている研究における重要な事実）がさらに強調された。処置サルの神経突起におけるＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡの減少は、治療および／または薬物で誘導することができる。処置から７日後、一次ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡ転写物からストレス誘導性アンチセンス抑制性ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡへのシフトを、神経突起中に視覚化することができる（図２Ａ〜２Ｊ）。
【００３１】
好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、以下の配列の任意の一つを有するＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである：
５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ  ３’（配列番号１）；および
５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡ＊Ｃ＊Ｃ＊  ３’（配列番号７）（配列中、三つの３’末端残基は、２−Ｏ−メチル基で修飾されている（＊））
配列番号１または配列番号７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中でＥＮ１０１またはｈＥＮ１０１ともいう。
【００３２】
ＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、過去に本発明者らによって説明されており（ＷＯ  ０３／００２７３９）、神経筋病変である重症筋無力症の治療で十分に効果があることが示された（出願人の同時係属ＵＳ１０／４０２，０１６）。本発明者らの本明細書中に記載の結果では、実施例５および図４に示すように、ＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１βの放出を減少させることができた。
【００３３】
実施例１に示すように、運動ニューロン中のＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡレベルの影響は最小であった。しかし、脊髄のより小さなニューロン中のＡＣｈＥ−Ｒ産生の消失は、ＶＡＣｈＴおよびＣｈＡＴのストレス誘導性減少にもかかわらず、処置組織内のＡＣｈシグナル伝達を潜在的に増加させた（Ｋａｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。これにより、ＡＣｈＥ−ＲはＣＮＳにおけるＡＣｈレベルの調節における主な役割を担うと考えられる。他の所見は、脊髄介在ニューロンの電気生理学的活動パターンの大きな変動性および（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ（１９９６）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）脊髄介在ニューロン中の運動前に支持された（ｐｒｅｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｅｄ）遅延活動（Ｐｒｕｔ  ａｎｄ  Ｆｅｔｚ（１９９９）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）を示す。本発明者らにより、小細胞（おそらく、介在ニューロン）内でのＡＣｈＥ−Ｒレベルの最も大きな変動性が認められ、これらの調整はこれらのニューロン間の広範な電気生理学的変動性に寄与し得ることが示唆された。したがって、通常の条件下で、脊髄の後角に局在した小コリン作動性ニューロン中のＡＣｈＥ−Ｒ発現は、運動ニューロン活動（例えば、運動反射）の制御に寄与し得る。運動ニューロンへのコリン作動性入力に影響を与えるＣ末端構造は、運動ニューロン自体に接近して発生すると見なされた（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ（１９９９）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。この研究により、この起源が腰髄の前角および中間帯に存在するＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ陽性介在ニューロンおよび小コリン作動性ニューロンに帰すると考えられる。運動ニューロン細胞体周囲のＶＡＣｈＴ標識Ｃ末端数は、取扱った全動物で減少した。この所見により、この減少は取扱いストレス（ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ）に帰するとされ、これは海馬ニューロン中のＣｈＡＴおよびＶＡＣｈＴ  ｍＲＮＡのストレス誘導性減少と一致した（Ｋａｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。
【００３４】
さらなるＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドも記載されており、ｍＥＮ１０１について実施例１６で証明するように、潜在的に、ｈＥＮ１０１と同一の抗炎症効果を有する。これらは、マウスおよびラットのＡＣｈＥ相同配列由来のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、以下の配列を有する：
ｍＥＮ１０１  ５’−ＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２）［Ｇｒｉｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｑ，（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（４）：３５１−９］
ＥＮ３０１とも呼ばれる。
【００３５】
ｒＥＮ１０１  ５’−ＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＣ−３’（配列番号３）
ｈＥＮ１０３  ５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号４）
［Ｇｒｉｓａｒｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９（１）：７８８−９５］
実施例１６は、どのようにしてｍＥＮ１０１（ＥＮ３０１）の投与によって脳内のＡＣｈＥ−Ｒレベルを減少することができたのかを証明する。これを、血液脳関門の横断の際に直接行うことができるか、マクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を抑制する末梢ＡＣｈＥレベルの減少、ＡＣｈレベルの増加によって間接的に行うことができる。
【００３６】
したがって、別の態様では、本発明は、炎症誘発性サイトカイン放出のサプレッサーとしての本明細書中に定義のＡＣｈＥのインヒビターの使用を提供する。好ましくは、ＡＣｈＥのインヒビターは、配列番号１、配列番号２、および配列番号７のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、ＡＣｈＥのインヒビターは、配列番号１または配列番号７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
公知の炎症誘発性サイトカインは、特に、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８である。好ましくは、ＩＬ−１βは、配列番号１、配列番号２、および配列番号７のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって抑制されるべき炎症誘発性サイトカインである。
【００３８】
炎症誘発性サイトカイン放出を、後天的な化学的起源または遺伝子起源の因子によって誘発することができる。特に、これらは、ストレス、細菌感染、薬物、照射、ＡＣｈＥインヒビターへの曝露、脳卒中、自己免疫疾患、化学物質頻回曝露感度、または任意の年齢依存性累積損傷であり得る。
【００３９】
炎症誘発性サイトカイン放出を誘発する公知の条件は、細菌感染、薬物、照射、ＡＣｈＥインヒビターへの曝露、脳卒中、自己免疫疾患、化学物質頻回曝露感度、または任意の年齢依存性累積損傷である。
【００４０】
ＡＣｈＥ−ＲのＡＳ−ＯＮ阻害後のストレス誘導性脊髄ＩＬ−１β過剰産生および脊髄ＩＬ−１β抑制は、ＣＮＳ中の抗炎症応答のコリン作動性調節の概念を支持する。このスキームにしたがって、「ストレスを与えられた」ニューロンは、高レベルのＡＣｈＥ−Ｒを産生し、ＡＣｈを減少させ、通常の条件下でＩＬ−１βを発現しないＣＮＳニューロン中のＩＬ−１βを連続的に産生する。ストレス誘導性ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制により、ＡＣｈレベルが増加し、その後ＣＮＳニューロン中でのＩＬ−１β産生を抑制することができる。ＣＮＳ内での炎症応答のこのようなコリン作動性調節は、コリン作動性不均衡下（例えば、有機リン酸化合物への曝露）での炎症誘発性サイトカインの増加（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｄｙｅｒ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）およびコリン作動性均衡の回復下（例えば、アンチセンス処置下、図６を参照のこと）での同一のサイトカインの減少の両方を説明することができる。これにより、保守的なＡＣｈＥインヒビター（ピリドスチグミン）と比較したＥＮ１０１を毎日経口投与したＥＡＭＧラットにおける生存状態および臨床状態の改善が新規に理解される（Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００３）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。
【００４１】
ＩＬ−１βは、Ｃｏｌ２遺伝子発現の抑制によって軟骨細胞で炎症を誘導することが公知である（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１７２２；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２８５９；Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２：８５；Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：２３３６；Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６８７；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：４４２８）。したがって、本明細書中に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩＬ−１β放出の阻害により、軟骨が再生され得る。したがって、本発明はまた、軟骨再生のインデューサーとしての本明細書中に定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用を提供する。
【００４２】
本発明で抗炎症薬として使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレアーゼ耐性を示す。所与のオリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ耐性を付与する改変が多数存在する。例えば、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合のホスホロチオエート結合への置換、一つまたは複数のヌクレオチドの２’−水酸基の２’−Ｏ−メチル基への置換、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の３’末端への生理学的条件下でループ構造を形成することができるヌクレオチド配列の付加によってオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にすることができることを開示したＷＯ９８／２６０６２を参照する。ループ形成構造の例は、配列５’ＣＧＣＧＡＡＧＣＧであり、これは、ヌクレオチド耐性を付与するために所与のアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することができる。
【００４３】
ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドは、一般に、安全且つ副作用が無いと見なされる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエートとして有効であり、部分的に２’−Ｏ−メチル保護オリゴヌクレオチドとしてより有効であることが見出されている。ＷＯ９８／２６０６２は、約２０のヌクレオチド間結合のうち三つのホスホロチオエート結合を含むＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドが、一般に、約１μＭと１０μＭとの間の濃度で使用することが安全であることを教示している。しかし、長期適用については、分解した場合に有毒な基を放出しないオリゴヌクレオチドが好ましいかもしれない。これらには、２’−Ｏ−メチル保護オリゴヌクレオチドが含まれるが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは含まれない。ホスホロチオエート保護における２’−Ｏ−メチル保護のさらなる利点は、ＡＣｈＥ抑制に必要なオリゴヌクレオチド量が減少することである。この相違は、２’−Ｏ−メチル保護オリゴヌクレオチドを使用した場合に得られる二重鎖の安定性の改善に関連すると考えられる（Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．＆  Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，６９９１−７，（１９９８））。２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのより高い有効性についての別の説明としては、この修飾によりオリゴヌクレオチド鎖の細胞膜の貫通を促進することができるということである。２’−Ｏ−メチル保護のさらなる利点は、ヌクレアーゼ媒介分解に対する保護がより優れており、それにより、この方法で保護されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用な寿命が延長されることである。
【００４４】
さらに、上記定義のＡＣｈＥのインヒビターを、解熱薬として使用することもできる。好ましくは、ＡＣｈＥのインヒビターは、配列番号１、配列番号２、および配列番号７のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
麻酔薬に応答して、神経の調節により、体温の急速な低下が誘導される。実施例１２に示すように、宿主ＡＣｈＥ−Ｒが上昇したトランスジェニックマウスは、株、性、および年齢適合コントロールと比較して、本質的により高い体温を示す。さらに、その体温は、麻酔下で高温が維持され、調節の悪化およびＡＣｈＥ−Ｒと発熱応答との一時的関連を示す。したがって、ＡＣｈＥ−Ｒ発現のインヒビターはまた、炎症反応の特徴を示す体温上昇の低下に効果がある。
【００４６】
本発明によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投薬量は、処置した哺乳動物被験体の体重１ｇあたり約０．００１〜５０μｇオリゴヌクレオチドである。好ましくは、投薬量は、約０．０１〜約５．０μｇ／ｇである。より好ましくは、投薬量は、約０．０５〜約０．７μｇ／ｇである。したがって、ラット、サル、およびヒトの最適な投薬量範囲は、５０〜５００μｇ／ｇ処置被験体体重である。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、活性成分として上記定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターを含む、必要とする哺乳動物被験体の炎症応答を誘発する容態の治療のための薬学的組成物を提供することを意図する。任意選択的に、組成物は、薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む。好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、ＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４８】
より好ましくは、哺乳動物被験体はヒトであり、アンチセンスヌクレオチドは配列番号１および配列番号７のいずれか一つに記載の配列を有する。
【００４９】
あるいは、哺乳動物被験体は非ヒト哺乳動物であり、アンチセンスヌクレオチドは配列番号２および配列番号３のいずれか一つに記載の配列を有する。
【００５０】
なおさらなる態様では、本発明は、活性成分として上記定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターを含み、任意選択的に、薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、必要とする哺乳類動物被験体の関節、中枢神経系、胃腸管、心内膜、心膜、肺、眼、皮膚、および尿生殖器系の炎症の治療および／または予防のための薬学的組成物を提供する。好ましくは、ＡＣｈＥ発現のインヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
より好ましくは、哺乳動物被験体はヒトであり、アンチセンスヌクレオチドは配列番号１および配列番号７のいずれか一つに記載の配列を有する。
【００５２】
あるいは、哺乳動物被験体は非ヒト哺乳動物であり、アンチセンスヌクレオチドは配列番号２および配列番号３のいずれか一つに記載の配列を有する。
【００５３】
上記定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターは、本発明の薬学的組成物の調製で使用すべきである。
【００５４】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、薬学的組成物の形態で提供される。組成物は、注射、局所投与、または経口摂取で用いる。
【００５５】
あるいは、本発明の薬学的組成物は、活性成分として、本発明で定義の少なくとも二つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその機能的アナログ、誘導体、もしくはフラグメントの組み合わせを含み得る。
【００５６】
「アナログおよび誘導体」は、核酸分子の「フラグメント」、「変異型」、「アナログ」、または「誘導体」を意味する。本発明の任意のオリゴヌクレオチド配列などの分子の「フラグメント」は、分子の任意のヌクレオチドサブセットをいうことを意味する。このような分子の「変異型」は、全分子またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似する天然に存在する分子をいうことを意味する。分子の「アナログ」は、パラロガスまたはオルソロガスな分子（例えば、それぞれ同一の種由来または異なる種由来の相同分子）であり得るが、これらに限定されない。
【００５７】
注射による本発明の薬学的組成物の好ましい使用は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、および筋肉内注射である。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、一般に、緩衝剤（その浸透圧を調整する薬剤）および、任意選択的に、例えば、風味、色、または潤滑性などを薬学的組成物に付加するための当該分野で公知の一つまたは複数のキャリア、賦形剤、および／または添加剤を含む。
【００５９】
好ましい緩衝剤は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５〜８．０）からなり、溶液を浸透圧についても調整したＴｒｉｓである。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、アンチセンスを、滅菌蒸留水または滅菌生理食塩水に懸濁する。
【００６１】
キャリアには、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（例えば、微結晶性セルロース、およびキサンタンガムなど）が含まれ得る。潤滑剤には、硬化ヒマシ油などが含まれ得る。
【００６２】
局所投与のための薬学的組成物には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、ドロップ、座剤、スプレー、液体、または粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水溶液、粉末または油性の基剤、および増粘剤などが必要とされ得るか望ましい。
【００６３】
経口投与用組成物には、粉末または顆粒、水性媒体または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤、または結合剤も望ましい。
【００６４】
非経口、鞘内、または脳室内投与のための組成物および処方物には、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤（透過増強剤、キャリア化合物、および他の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤などであるが、これらに限定されない）も含み得る滅菌水溶液が含まれ得る。
【００６５】
本発明の薬学的組成物には、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有処方物が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物を、種々の成分（予備形成液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体が含まれるが、これらに限定されない）から生成することができる。
【００６６】
単位投薬形態で都合良く存在することができる本発明の薬学的組成物を、製薬産業で周知の従来技術に従って調製することができる。このような技術は、有効成分を薬学的キャリアまたは賦形剤と組み合わせる工程を含む。一般に、有効成分と液体キャリアまたは微粉化固体キャリアまたはその両方との均一且つ密な組み合わせ、必要に応じて、その後の生成物の成形によって処方物を調製する。このような組成物を、多数の可能な投薬形態のいずれか（錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座剤、および浣腸剤などであるが、これらに限定しない）に処方することができる。本発明の組成物を、水性もしくは非水性懸濁液または混合媒体としても処方することができる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる）をさらに含み得る。懸濁液はまた、安定剤も含み得る。
【００６７】
本発明の一つの実施形態では、薬学的組成物を、フォームとして処方し、使用することができる。薬学的フォームには、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、およびリポソームなどの処方物が含まれるが、これらに限定されない。基本的に事実上類似しているが、これらの処方物は、最終生成物の成分および硬度が異なる。
【００６８】
一つの実施形態では、本発明の薬学的組成物を、約０．００１μｇ／ｇと約５０μｇとの間の投薬量の有効成分をこのような治療を必要とする被験体に毎日使用する。好ましくは、治療および／または予防は、約０．０１〜約５．０μｇ／ｇの投薬量の有効成分を投与する工程を含む。最も好ましくは、有効成分の投薬量は、約０．０５〜約０．７０μｇ／ｇであり、さらに最も好ましくは、投薬量は、必要とする被験体の１ｇあたり０．１５〜０．５０μｇである。
【００６９】
当業者は、体液または組織中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの測定された滞留時間および濃度に基づいて投与の繰返し率を容易に評価することができる。首尾の良い処置後、病状の再発を予防するために、オリゴヌクレオチドを、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で一日一回またはそれ以上から２０年毎に一回投与する維持療法を患者に施すことが望ましいかもしれない。
【００７０】
薬学的組成物の調製は当該分野で周知であり、多くの論文およびテキストブックに記載されている（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．ｅｄ．（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの特に１５２１〜１７１２を参照のこと）。
【００７１】
本明細書中に記載の結果は、霊長類ＣＮＳ神経伝達に影響を与える生物アンチセンス応答を最初に証明している（実施例１）。アカゲザルにおける陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）画像化研究により、ホスホチオエート薬と比較して、脳内で制限されているが、比較的長期間持続する２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドが証明された（Ｔａｖｉｔｉａｎ（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。さらに、げっ歯類よりも霊長類の血液脳関門を容易に通過することができ、これは、本発明者らの最近の所見と一致する（Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２１：６７５−６９１）。
【００７２】
ヒトＡＣＨＥ配列をターゲティングするアンチセンス薬（実施例を参照のこと）は、マウス（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）およびラット（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）における対応する薬剤と同一のナノモル用量にてカニクイザルで有効なようである。頭部損傷マウスの場合のように、長期ＡＣｈＥ−Ｒ過剰産生は、ＡＣｈＥ−Ｒ産生のアンチセンス抑制下での改善に感受性を示す歩行障害コントロールに関連する（Ｓｈｏｈａｍｉ（２０００）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。現在の研究では実験動物数が制限されているにもかかわらず、静脈内および経口投与様式の両方で有効なようであり、用量依存性は、１５０μｇ／Ｋｇ／日で経口投与したｈＥＮ１０１と比較して５００μｇ／Ｋｇ／日でのより顕著な効果を反映した。
【００７３】
最後に、本発明は、治療有効量の本明細書中に定義のＡＣｈＥ発現のインヒビターまたは活性成分として上記のように調製したＡＣｈＥ発現のインヒビターを含む組成物を必要とする哺乳動物被験体に投与する工程を含む、炎症応答を誘発する容態の治療方法を教示する。
【００７４】
好ましくは、本発明の方法で使用すべきＡＣｈＥ発現のインヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、哺乳動物被験体はヒトであり、アンチセンスヌクレオチドは配列番号１および配列番号７のいずれか一つに記載の配列を含む。
【００７５】
あるいは、哺乳動物被験体は非ヒト哺乳動物であり、アンチセンスヌクレオチドは配列番号２および配列番号３のいずれか一つに記載の配列を有する。
【００７６】
治療有効量（投与量）は、治療すべき病状の重症度および応答性、数日から数ヵ月に及ぶ治療単位、または治癒するまでもしくは病態の減衰が達成されるまでの期間に依存する。最適な投与スケジュールを、患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適な投薬量、投与法、および繰り返し率を容易に決定することができる。最適投薬量は、各オリゴヌクレオチドの相対効力に依存して変化し、一般に、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで有効であることが見出されるＥＣ５０に基づいて評価することができる。
【００７７】
変異型の特異性、低用量、およびアンチセンス薬の長期持続有効性は、急性ストレス誘導性症状および炎症応答の妨害の両方において保守的な薬物よりも明らかに有利であり得るので、神経変性の予防に有利であり得る。これらの考慮は、種々の病態（筋萎縮性側索硬化症（Ｓｈａｗ，Ｐ．Ｊ．＆  Ｅｇｇｅｔｔ，Ｃ．Ｊ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４７  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｉ１７−２７）、筋無力症候群（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、キンジストロフィ（Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ−Ｄｉａｚ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５２：１１０７−１１１４）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４：６２９−６３４）、および敗血症媒介性重症疾患多発神経障害（Ｈｕｎｄ，Ｅ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４８：９２９−９３４）が含まれる）に関連し得る。したがって、霊長類ＣＮＳニューロンにおける炎症応答のコリン作動性弱化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）のアンチセンス促進により、興味深い治療上の利点を得ることができる。
【００７８】
実施例６〜１１に示すように、健常なボランティアへの低用量の内毒素の投与により、炎症誘発性サイトカインおよびコルチゾールの分泌が誘導され、コリン作動性ホメオスタシスに障害が生じ、記憶が変化する。心理学的（Ｍａｅｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３１３−８）および物理的（Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２１３−７）ストレッサーは、同様にヒトにおける炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６が含まれる）の産生に関連する。ストレスの多い刺激への曝露により、一般にコリン作動性ホメオスタシス、特にＡＣｈＥ−Ｒの産生および細胞分布に対して計り知れない影響を発揮する。したがって、サイトカインとコリン作動性ホメオスタシスの変化（ＡＣｈＥ−Ｒ調整を反映する）との間の相互作用および記憶機能に対するこれらの相互作用の影響を研究するための有効なモデルとして実験内毒素血症が現れる。疾患の自覚的感覚は関与しなかったので、内毒素誘導性の記憶の変化は、感知される身体的疾患に関連する窮迫に帰し得ない。認められた記憶の変化の選択性は、他によるコルチゾールが注意力、実行機能、または覚醒に影響を与えないという報告と一致した（Ｉｕｐｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：１１７−３９）。
【００７９】
図１１は、パラメータ間の関係を測定および仮定した異なるパラメータについての速度論的追跡をまとめたスキームを示し、サイトカインの誘導、ホルモン分泌、ＡＣｈＥ調整、および得られた記憶の変化の間の潜在的に原因となる関係を予想した。興味深いことに、第一の試験期間中の陳述記憶の内毒素誘導性障害が最も高く、サイトカイン分泌と正に相関するのに対して、作業記憶の改善は処置から３時間で明らかとなり、サイトカイン分泌との相関関係は示されなかった。対照的に、両記憶変化型は、ＡＣｈＥ−Ｒ切断と有意に相関するが、作業記憶に関するコリン作動性コントロールは陳述記憶よりも早く開始されるようである（３時間対９時間の注射後、それぞれ図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。
【００８０】
以前の報告は、健常なボランティアへの内毒素投与後（Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、サイトカイン（特に、インターフェロンおよびインターロイキン−２）治療後（Ｍｅｙｅｒｓ  Ｃ．Ａ．（１９９９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６１：７５−８１；Ｃａｐｕｒｏｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍ．Ｍｅｄ．６３：３７６−８６）、ウイルス（例えば、インフルエンザ）感染後（Ｃａｐｕｒｏｎ（１９９９）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、またはコルチゾール投与後（ｄｅ  Ｑｕｅｒｖａｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：３１３−４）に陳述記憶の減少を報告している。本研究では、陳述記憶能力の内毒素誘導性減少は、最初の試験期間のみにおけるサイトカイン分泌と関連した。対照的に、サイトカイン濃度がベースラインに戻るが、ＡＣｈＥ活性とＡＣｈＥ−Ｒ切断との間の相違は内毒素と偽薬条件との間で依然として最大である場合、これは、最後の期間でのＡＣｈＥ活性およびＡＣｈＥ−Ｒ切断レベルと関連した。これらの所見により、免疫媒介性過程が初期内毒素誘導性記憶障害で顕著であるのに対して、後期の効果はおそらくコリン作動系によって媒介されることを示唆することができる。
【００８１】
この研究は、内毒素曝露後の記憶機能の変化が炎症誘発性サイトカインおよびＡＣｈＥ−Ｒ切断の誘導に同時に関連することを証明する。これらの変化が生じうる一時的経路は、コリン作動性神経伝達の変化およびサイトカイン分泌の増加を含む（図１１）。これらは、特に脳内の炎症過程（例えば、脳卒中、脳外傷、および欠陥性痴呆などの神経変性疾患）を含む多数の病状と関連する（ＭｃＧｅｅｒ  Ｐ．Ｌ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅｒ  Ｅ．Ｇ．（１９９５）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２１：１９５−２１８；Ｓａｉｔｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．２２：Ｓ２５７−９；Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ）。例えば、閉鎖性頭部外傷により、ＴＮＦ−αおよび他の炎症誘発性サイトカインが産生され（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｔｒｅｍｂｏｖｌｅｒ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１９：７９１−５）、脳内にＡＣｈＥ−Ｒが過剰に蓄積する（Ｓｈｏｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。本明細書中に示した所見により、サイトカイン−コリン作動性相互作用が、これらの条件に付随する記憶の変化で重要な役割を果たし、能力の改善を妨害することなく対応する記憶障害に反作用する新規の予防的処置および治療上の処置の開発を洞察することができることが示唆される。
【００８２】
開示および記載のように、本発明は、本明細書中に開示の特定の例、工程段階、および材料に制限されず、それにより、工程段階および材料をいくらか変化させることができると理解すべきである。本明細書中で使用した専門用語を特定の実施形態を説明することのみを目的として使用し、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ制限されるので、本発明を制限することを意図しないことも理解すべきである。
【００８３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、文脈中で明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることを留意しなければならない。
【００８４】
本明細書および特許請求の範囲全体で、文脈上で他の意味を必要としない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形形態は、規定の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むが、いかなる他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群も排除しないことを意味すると理解される。
【００８５】
以下の実施例は、本発明の態様の実施における本発明者らが使用した技術の代表である。これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態の例であると認識すべきであり、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および意図する範囲から逸脱することなく多数の修正形態を実施することができると認識する。
【００８６】
実施例
本研究を導く基本的作業仮説は、ニューロンＡＣｈＥ変異型、ＣｈＡＴ、およびＶＡＣｈＴのレベルおよび組成の刺激誘導性調整は共に霊長類運動ニューロンにおけるコリン作動性ホメオスタシスの維持に寄与することである。この予想されるニューロンＡＣｈＥ−Ｒの過剰産生ならびにＣｈＡＴおよびＶＡＣｈＴの抑制も穏やかなストレス下にある（例えば、取扱いまたは注射）。この仮説を試験するために、本発明者らは、血漿ＡＣｈＥ活性を測定し、ｈＥＮ１０１で処置したか処置していないカニクイザルの腰髄切片中のＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ、ＣｈＡＴ、およびＶＡＣｈＴを標識した。運動行動、臨床的徴候、または心電図の一般的追跡によって評価したところ、一週間のナノモル用量のｈＥＮ１０１の毎日の投与後にｈＥＮ１０１処置サルの運動機能の変化は示されなかった。処置に関連する毒性または炎症の影響は、白血球（ＷＢＣ）数または死後に認められず、このオリゴヌクレオチドによって誘導された調整がそのアンチセンス効果の結果のみを反映し、このような影響下でのコリン作動性均衡の一般的維持を示すことが示唆された。ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡに対するその特異性のために、本発明者らは、ｈＥＮ１０１が末梢ＡＣｈＥのレベルおよび／または組成物を変化させると予想した。本発明者らは、運動ニューロン中のＡＣｈＥ、ＣｈＡＴ、およびＶＡＣｈＴレベルが取扱いストレス下で変化するかどうかをさらに予想し、そうであれば、ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制によりニューロンＩＬ−１β蓄積が減少数かどうかを予想する。
【００８７】
実験手順
霊長類脊髄におけるｈＥＮ１０１の抗炎症効果の研究で使用した実験手順
動物：１５月齢の実験用交配カニクイザルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（ＵＫ）Ｌｔｄ．から提供された。ＵＫにおける動物実験の関連規則にしたがって、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）でアンチセンス投与を行った。
【００８８】
試験物質：ヒト（ｈ）ＨＰＬＣ精製ＧＬＰグレードＥＮ１０１（キャピラリー電気泳動によって検証したところ、純度９５％）を、Ａｖｅｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。一次ｈＥＮ１０１配列５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡ＊Ｃ＊Ｃ＊３’（配列番号１）は、三つ全てのＡＣｈＥ変異型と共通のエクソン２内のＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ  ０００６６５、ヌクレオチドの位置は７３３−７５２）のコード配列と相補的である（Ｓｏｒｅｑ，Ｈ．＆  Ｚａｋｕｔ，Ｈ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｂｅｎ  Ａｚｉｚ−Ａｌｏｙａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，２４７１−２４７５）。三つの３’末端残基（＊）を、２’位でオキシメチル基を使用してヌクレアーゼからの攻撃に対して保護した。修飾した３’末端塩基内のｈＥＮ１０１を示す配列を、配列番号７に示す。凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、滅菌二回蒸留水中に再懸濁し（２４ｍｇ／ｍｌ）、−２０℃で保存した。
【００８９】
アンチセンス薬のためのいくつかの化学的保護様式は、現在ヒト研究において臨床試験されている（最近の概説については、Ｏｐａｌｉｎｓｋａ，Ｊ．Ｂ．＆  Ｇｅｗｉｒｔｚ，Ａ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：５０３−５１４を参照のこと）。本研究で使用した化学的保護プロトコール（すなわち、三つの３’末端２’−オキシメチル基）は、オリゴヌクレオチドがその非保護部分にＲＮアーゼＨを補充する能力の維持を組み合わせる一方で、２’−Ｏ−メチル基を介してハイブリッド形成結合を強化し（Ｓｏｒｅｑ  ａｎｄ  Ｓｅｉｄｍａｎ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）、改善された腸透過性を付与する（Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９６：８９０−７）。この保護スキームのさらなる利点は、保護された３’末端の除去により露出したままになり、それ故に容易に分解される脆弱なオリゴヌクレオチドが得られるという点である。他のＡＳ−ＯＮと異なり（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｆ．（２００２）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２：２１５−２２４；Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．＆  Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：４５０３−４５１０；Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２２８−１２３３）、この場合、段階的な核酸分解性の（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）破壊によって短縮ＯＮ薬の非特異的相互作用は導かれない。
【００９０】
ｈＥＮ１０１安定性：−２０±５℃、４±℃、および２５±２℃（相対湿度は６０±５％）での保存中の凍結乾燥ｈＥＮ１０１の安定性を、暗闇でＨＰＬＣによって試験した。各保存条件由来のこれらのサンプルを、３、６、および９ヶ月後に回収し、これらの安定性をＨＰＬＣによって分析した。ｈＥＮ１０１は、これらの保存条件下で、−２０℃にて少なくとも６ヶ月間安定であることが見出された。
【００９１】
ｈＥＮ１０１の投与：三組の１．５〜２．５Ｋｇのカニクイザル（雄１頭および雌１頭）に、以下のようにｈＥＮ１０１を７日間投与した：経口摂食による１５０μｇ／Ｋｇ／日／ｏｓ（ｐ．ｏ．）（０．９％生理食塩水中に１５μｇ／ｍｌ）を毎日もしくは５００μｇ／Ｋｇを毎日（ｐ．ｏ．、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌ）、または静脈内（ｉ．ｖ．）注射（生理食塩水中に１００μｇ／ｍｌ）。血漿サンプルを、処置第二日目の後の示した時間で取り出し、使用するまで−２０℃で維持した。毎日の処置から一週間後、動物を安楽死させ、腰髄調製物を、標準的な手順によってパラフィン包埋した。一頭のナイーブサルをコントロールとして使用した。
【００９２】
毒物検査：ｈＥＮ１０１の潜在的毒性を、処置中および処置後にＨｕｎｔｉｎｇｄｏｎで試験した。そのうちで示したパラメータは、体重、食品消費、一般的な運動様式（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）、心電図記録法、血圧、血球数、プロトロンビン時間、および準的な血液化学（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７臨床化学分析器）であった。死後の所見には、臓器重量、ヘマトキシリンのスキャンニング、ならびに脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脊髄、および胃のエオシン染色切片が含まれていた。
【００９３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成：組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、７μｍのパラフィン包埋切片に切断した。腰髄切片を脱パラフィンし、連続エタノール希釈を使用して再水和し、プロテイナーゼＫで透過処理した（１０μｇ／ｍｌ、３７℃で１０分）。スライドを、ヒトＡＣＨＥ偽イントロン４またはエクソン６にそれぞれ相補的な５’ビオチン化した完全に２’−オキシメチル化したＡＣｈＥ−ＲまたはＡＣｈＥ−Ｓ特異的５０量体ｃＲＮＡプローブに曝露した（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂｅｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。以下のプローブを使用した：
−ヒトＡＣｈＥ−Ｒプローブ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ  ７１１２９の８８〜３８ヌクレオチド位；配列番号５）：
５’−ＣＵＡＧＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＵＵＡＣＡＣＵＧＧＣＧＧＧＣＵＣＣＣＡＣＵＣＣＣＣＵＣＣＵＣ−３’；
−ヒトＡＣｈＥ−Ｓプローブ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ  ０００６６５の２０７１〜２０２２ｍヌクレオチド位；配列番号６）：
５’−ＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＵＣＧＧＧＧＵＧＧＧＧＵＧＧＧＧＡＵＧＧＧＣＡＧＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＵＣＧＵＣＵ−３’。
【００９４】
１０μｇ／ｍｌプローブ、５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、５０μｇ／ｍｌヘパリン、および５０％ホルムアミドを含む３７５ｍＭ塩化ナトリウム、３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を含むハイブリッド形成混合物中にて５２℃で一晩ハイブリッド形成を行った。スライドを洗浄して非ハイブリッド形成プローブを除去し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０および２ｍＭレバミゾール（非特異的染色を抑制するために使用したアルカリホスファターゼインヒビター）を含む１％スキムミルクでブロッキングし、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼとインキュベートした（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）。検出のためにＦａｓｔ  Ｒｅｄ基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【００９５】
免疫組織化学：再水和脊髄切片を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でのマイクロ波処理によって熱誘導性抗原回復に供した。非特異的結合を、４％ナイーブヤギまたはロバ血清を含む０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳによってブロッキングした。スライドを、同一の緩衝液で希釈した一次抗体とインキュベートした（１時間、室温、一晩、４℃）。切片をリンスし、同一の緩衝液で希釈した（２００倍）ビオチン抱合二次抗体とインキュベートした（３時間、室温）。一次抗体を、ウサギポリクローナル抗ＶＡＣｈＴ（１：１００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、ヤギポリクローナル抗ＣｈＡＴ（１：５０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ヤギ抗ＩＬ−１β（１：２０，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とインキュベートした。ビオチン化二次抗体は、ロバ抗ウサギ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびロバ抗ヤギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）であり、共に２００倍希釈で使用した。抗ＶＡＣｈＴおよびＣｈＡＴ抗体についてはＦａｓｔ  Ｒｅｄ基質を使用し、抗ＩＬ−１β抗体についてはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して検出した。
【００９６】
共焦点顕微鏡法：Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ４０Ｘ１．３液浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５倒立顕微鏡（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）に連結したＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ  １０２４共焦点スキャンヘッド（Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅｄ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ．）を使用して実施した。Ｆａｓｔ  Ｒｅｄを４８８ｎｍで励起し、５８０ｄｆ３２干渉フィルター（５８０±１６ｎｍ）によって発光を測定した。免疫標識切片を、０．５μｍ毎にスキャンし、投影図をＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４．０（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）ソフトウェアを使用して分析した。
【００９７】
コリンエステラーゼ活性の測定：血漿サンプルを、マルチウェルプレートリーダーに適合させたコリンエステラーゼ触媒活性測定に供した（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９６１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，８８−９９）。アセチルコリン（ＡＴＣｈ）加水分解率を、５×１０−５Ｍのブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）インヒビターであるテトライソプロピルピロホスホラミド（イソ−ＯＭＰＡ）との３０分間の予備インキュベーション後に測定した。総血漿コリンエステラーゼ活性を、インヒビターの非存在下で測定した。
【００９８】
ＡＣｈＥ−Ｒ、サイトカイン、および記憶との間の関係の研究で使用した実験手順
記憶研究の被験体：１０人の男性被験体が、独立した倫理委員会によって承認された研究に参加した。被験体の要件ならびに身体的および精神医学的スクリーニングを、他の場所に記載した（Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。本研究は、以前の計画に含まれる被験体のサブセットを含み、これに血清ＡＣｈＥおよび作業記憶試験を加えたものである。経験豊富な精神科医によるインタビューにより、ＤＳＭ−ＩＶにしたがって第一軸精神障害の存在および病歴を排除した（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９４）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）。スクリーニング手順を首尾よく合格し、インフォームドコンセント書類に署名した被験体のみが参加資格があると見なされた。包括的評価を行い、これはバランスの取れた無作為の二重盲検の交差法を使用して、臨床研究施設で多数の身体検査および神経心理検査を実施した各被験体を含んでいた。
【００９９】
記憶試験の手順。全技術装置（採血デバイスが含まれる）を、遮音実験室に隣接した部屋に格納した。各被験体は、試験セッションに２０日間を要し、各実験セッション前に研究施設で一晩過ごした。その最初の夕方の到着時の適応について一連の神経心理学検査（記憶、学習、および注意力の評価）を行い、その後の練習効果を最小にした（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ，Ｊ．Ｋ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｒｅｖ．３：２３５−４８）。これらの試験の別のバージョンを、実験セッションで使用した。翌朝、一方のセッションでの断続的採血および内毒素の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（０．８ｎｇのサルモネラ・アボルタス・エクイ内毒素／Ｋｇ体重）または他の場合の同体積の０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液の静脈内（ｉ．ｖ．）注射のために、静脈内カニューレを前肘前腕静脈に挿入した。被験体の半分に最初に生理食塩水を投与し、残りの半分に最初に内毒素注射を行って注射の順序のバランスをとった。いずれの年齢、就学年数、または体重においても治療順序によって定義される群の間で有意差は認められなかった。実験者および被験体を、群の割り当てについて盲検化した。各セッション中、被験体を、注射から１〜２時間後、３〜４時間後、および９〜１０時間後の三回試験した。ｉ．ｖ．注射前のベースラインおよび各試験期間の開始時に採血した。サーミスタプローブを使用して直腸温度を継続的に測定した。自己報告した医師の疾患症状（頭痛、筋肉痛、震え、吐気、呼吸困難、および疲労）を、５ポイントＬｅｉｋａｒｔスケール（０−症状なし、４−非常に重篤な症状）を使用した問診票によって試験期間の終了時に評価した。
【０１００】
サルモネラ・アボルタス・エクイ内毒素：ヒト用に調製されたこの内毒素は、タンパク質および核酸を含まない滅菌溶液として利用可能であった。使用した内毒素調製物は、他のグループの種々の研究（Ｂｕｒｒｅｌｌ  Ｒ．（１９９４）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）および１９９１年から１００を超える被験体を含むＭａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙでの研究（Ｐｏｌｌｍａｃｈｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４：１０４０−５）で安全性が証明されている。
【０１０１】
ＡＣｈＥおよびその分解産物、サイトカイン、ならびにコルチゾールの血漿レベル：Ｎａ−ＥＤＴＡおよびアプロチニンを含む試験管に採血し、直ちに遠心分離した。血漿を等分し、−８０℃で凍結した。ＡＣｈＥの触媒活性を、１×１０−５Ｍのテトライソプロピルピロホスホラミド（イソ−ＯＭＰＡ）（血清ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）の選択的インヒビター）の存在下でのアセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）加水分解能力として測定した（Ｓｏｒｅｑ  Ｈ．ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ  Ｄ．（２０００）：Ｎｏｖｅｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｉｎ：Ｇｉａｃｏｂｉｎｉ  Ｅ．（ｅｄ．）Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ，ｐｐ  ４７−６１）。内毒素誘導性の相違を、内毒素の非存在下での活性を引くことによって計算したが、この場合、各個体をそのコントロールとして使用し、時間を毎日慎重に適合させた。ＡＣｈＥ−Ｒの濃度および完全性を評価するために、血漿タンパク質（４０μｇ）を、完全な変性条件下で４〜２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ニトロセルロースフィルターにブロットし、ウサギ抗ＡＣｈＥ−Ｒ抗体（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８６４７−８６５２）およびペルオキシダーゼ抱合免疫グロブリンとインキュベートし、ＥＣＬ（商標）検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）、デンシトメトリー分析、および記載の定量（Ｓｈｏｈａｍｉ（２０００）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）に供した。コルチゾールの血漿レベルを、放射免疫アッセイによって決定し、サイトカインおよび可溶性サイトカイン受容体の血漿レベルを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイによって評価した（Ｍｕｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｒ９４７−５５）。血管内皮細胞中のＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびそのタンパク質産物の標識：報告されるように非特異的腎臓血管炎または腎臓拒絶後に起因する臨床的炎症を有するか有さない患者の手術で取り出した生検由来のパラフィン包埋組織切片を使用して、ｍＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびＡＣｈＥ−Ｒタンパク質の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成および免疫組織化学を行い、定量した（Ｃｏｈｅｎ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．；Ｐｅｒｒｙ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：８４２８−８４４１）。
【０１０２】
免疫標識タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析：ブロッティングした膜における抗ＡＣｈＥ−Ｒ抗体によって標識されたタンパク質およびペプチドを同定するために、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を使用した。基質：酵素比が２００：１のＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｙｔｉｃｕｓ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）由来のエンドプロテアーゼＬｙｓＣを使用して、ゲル溶離ペプチドのタンパク質分解を行った。４Ｍ尿素を含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中にて３０℃で分解した。
【０１０３】
神経心理学的評価：対話想起試験を使用して陳述記憶を評価した（Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ  Ｌ．Ｍ．（１９９５）：Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＣｏｇｖａＳｙｓｔ  Ｓｔｏｒｙ  Ｒｅｃａｌｌ  ｔｅｓｔ  ＣｏｇｎｉＳｙｓｔ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）。被験体に２５項目の対話をプレゼンテーションの直後および３０分後に記憶から繰り返すように要求した。正確な逐語的想起の総数を計数した。記憶期間および作業記憶を、Ｄｉｇｉｔ  Ｓｐａｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＆  ｂａｃｋｗａｒｄ（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｄ．（１９８７）：Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ，Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｅ  Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）を使用して評価した。被験体に正しいプレゼンテーション順序（正方向条件−期間の評価）または逆の順序（逆方向条件−作業記憶の評価）のいずれかで二つのリスト毎に数字が増加する数字のリストを繰り返すように要求した。正確に繰り返したリスト数を計数した。Ｒｕｆｆ  ２＆７抹消検査を使用して注意力を評価した（Ｒｕｆｆ  Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ  Ｃ．Ｃ．（１９９６）：Ｒｕｆｆ  ２  ＆  ７  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ：Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｍａｎｕａｌ．Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｕｔｚ，ＦＬ）：被験体に、文字間または数字間のいずれかに無作為に置かれた数字２および数字７のいずれかに印をつけるように指導した。５分間の試験における正確な応答数を計数した。
【０１０４】
統計分析：ＡＣｈＥ活性、ＡＣｈＥ−Ｒレベル、および神経心理学的能力に対する治療効果に関する主な仮説を、反復測定による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して試験した。反復測定によるＡＮＯＶＡを使用して、身体疾患の症状、サイトカインおよびコルチゾールの血漿レベル、ならびに体温に対する治療効果も試験した。有意性レベルを、ｐ＝０．０５の棄却限界に設定した（両側）。有意な治療−時間相互作用が見出されたときはいつでも、示唆されるように、簡潔な効果を分析し（Ｗｉｎｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｒｎｅｎｔａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，３ｒｄ  ｅｄ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、テューキーの調整を適用した。
【０１０５】
ＡＣｈＥ活性、ＡＣｈＥ−Ｒレベル、ならびに生理学的（サイトカインおよびコルチゾールの分泌）および神経心理学的パラメータにおける偽薬から内毒素条件への変化の間の関連を評価するために、ピアソンの相関係数を計算した。
【０１０６】
通常の分布からの逸脱がないことがいずれかの従属変数で明白であった。Ｚスコアを使用して一変量外れ値は見出されず、マハラノビスの距離を使用して多変量外れ値は見出されなかった（Ｔａｂａｃｈｎｉｃｋ  Ｂ．Ｇ．ａｎｄ  Ｆｉｄｅｌｌ  Ｌ．Ｓ．（２００１）Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，４ｔｈ  ｅｄ．Ａｌｌｙｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。被験体内効果についての共分散の任意の非均一性を調整するために、本発明者らは、ホイン・フェルト法を使用して調整されるｐ値を使用した（Ｎｏｒｕｓｉｓ  Ｍ．Ｊ．（１９９４）ＳＰＳＳ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ６．１．ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）。ＳＰＳＳ１０を使用して分析した。
【０１０７】
分析したニューロンのＡＣｈＥ−ＲおよびＩＬ−１β陽性画分の分析のために二つの関連サンプルについてウィルコクスンの線形順位検定を使用し、各群の少なくとも四つの切片について測定した。ＳＡＳ８．０ソフトウェアを使用して約０．０５またはそれ未満のｐ値が得られた場合、相違は有意であると見なした。脊髄切片中のＶＡＣｈＴ含有末端の数および体積の分析のためにスチューデントｔ検定を使用した。
【実施例１】
【０１０８】
実施例１：処置による脊髄運動ニューロン中のＶＡＣｈＴおよびＣｈＡＴ標識の減少。  ＶＡＣｈＴが神経小胞にＡＣｈを負荷する場合、ＡＣｈＴは、運動ニューロンで囲まれたコリン作動性（Ｃ）末端中に予想どおり濃縮された（Ｗｅｉｈｅ（１９９６）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。ナイーブ状態と比較して、ｈＥＮ１０１処置サル由来の脊髄運動ニューロン（細胞直径＝４０μｍ）の共焦点顕微鏡の投影図は、細胞あたりＶＡＣｈＴ陽性Ｃ末端の平均数で小さいが有意な用量独立性減少（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）を示し（（図１Ａ、１Ｂ）、これにより、Ｃ末端のＡＣｈ負荷に対する取扱いストレスの影響が示唆される。ＶＡＣｈ−Ｔ標識Ｃ末端は、コントロール切片と比較して、１５０μｇ／Ｋｇ／日のｐ．ｏ．投与下で有意に小さく（６０μｍ３未満）（図１Ｂおよび１Ｃ、ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）、おそらく、小胞へのＶＡＣｈＴの転位および／またはＶＡＣｈＴ安定性の変化を反映する。
【０１０９】
ＶＡＣｈＴ産生は大部分がＣｈＡＴと同時調節され（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，２１８−２２４）、これは、両者が一つの遺伝子複合体（いわゆる、「コリン作動性遺伝子座」）から産生されるからである（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０９，６９−８２）。運動ニューロンのＣ末端のＣｈＡＴ染色は、実際、ＶＡＣｈＴ染色で認められた変化と類似の変化を示した（データ示さず）。さらに、抗ＣｈＡＴ抗体は、コントロール切片においていくつかの分配細胞を標識し（図１Ｄ）、これらから運動ニューロンにコリン作動性末端が出現する（Ｂａｒｂｅｒ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２２９，３２９−３４６）。ｈＥＮ１０１処置サル由来の腰髄切片は、投与量または投与様式と無関係に、ＣｈＡＴ陽性分配細胞の染色強度を顕著に減少させ（図１Ｅ）、ＡＣｈ産生の取扱いストレス関連抑制および小胞再循環の減速をさらに示す。
【実施例２】
【０１１０】
実施例２：血漿ＡＣｈＥ−Ｒ活性のストレス誘導性減少のＥＮ１０１による予防
ｈＥＮ１０１投与の第二日目に採取した血漿サンプル中のコリンエステラーゼ活性を測定した。血漿中のＡＴＣｈ加水分解は、大部分が血清ＢｕＣｈＥ（一般的に変化しないままである非相同ｍＲＮＡによってコードされる一次血清コリンエステラーゼ）に起因する。しかし、血漿はまた、小さいが有意なＡＣｈＥ活性を含み（Ｚａｋｕｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  ６１，７２７−７３７）、この活性は、５×１０−５ＭのＢｕＣｈＥ特異的インヒビター（イソ−ＯＭＰＡ）の存在下での予備インキュベーション後に測定可能である。ＡＣｈＥ活性は、１５０μｇ／ＫｇのＥＮ１０１のストレスの多い経口投与から５時間以内に、処置前（投与前）の値と比較して増加し（表１）、これは、潜在的に取扱い下での産生の増加を反映している。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの霊長類ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡの短い半減期をさらに示し、このことは、以前の所見と一致する（Ｃｈａｎ（１９９１）ｉｄ  ｉｂｉｄ；Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。より高い経口用量（５００μｇ／Ｋｇ）のＥＮ１０１によって増加が有効に抑制され、５００μｇ／ＫｇのＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与後ではなおさらにより抑制され（表１）、これはおそらくＡＣｈＥ−Ｒ合成の用量依存性ｈＥＮ１０１防止を反映する。
【表１】
2007509186.tif 000002
血漿ＡＣｈＥ活性の処置関連増加のｈＥＮ１０１誘導性の防止
【実施例３】
【０１１１】
実施例３：サル脊髄ニューロン中のＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡに対するＥＮ１０１の影響
ｈＥＮ１０１にて１日一回で７日間処置したカニクイザル由来の腰髄のパラフィン包埋切片を、高分解能蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）に供した。変異型特異的ＦＩＳＨプローブ（図２Ａ）により、多数の穿刺（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）領域および縦長の筋、おそらく神経突起を通過した断面および縦長の区域でＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ標識を超えるＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡが明らかとなった（図２Ｂ〜２Ｃ）。この相違は、統計的に有意ではないにもかかわらず、通常の条件下でのマウス神経突起中でＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡを示すが、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡを示さない以前の所見と一致する（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。より高い経口およびｉ．ｖ．用量により、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ標識が減少した（より低用量の図２Ｅと比較した図２Ｇおよび２Ｉ）。ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡ標識ニューロンは、ＥＮ１０１誘導性の抑制は制限され（図２Ｄと比較した図２Ｈおよび２Ｊ）、神経突起標識が減少した（図２Ｆ、２Ｈ、および２Ｊ）。アカゲザルにおける陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）画像化研究により、ホスホチオエート薬と比較して、２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドの制限されているが比較的有効な脳への透過が証明された（Ｔａｖｉｔｉａｎ（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。さらに、げっ歯類よりも霊長類の血液脳関門を容易に通過することができる（Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ２１：６７５−９１）。それにもかかわらず、これは、霊長類ＣＮＳ神経伝達に影響を与える生物アンチセンス応答を最初に証明している。
【０１１２】
マウス（Ｃｏｈｅｎ（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）およびラット（Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００３）ｉｄ  ｂｉｄ．）における対応する薬剤と同一のナノモル用量で、ヒトＥＮ１０１の送達は、ラットでそうであったように、カニクイザルにおいて静脈内投与様式および経口投与様式の両方で有効なようであった（Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００３）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。動物数が制限されているにもかかわらず、用量依存性は、１５０μｇ／Ｋｇ／日の経口投与ｈＥＮ１０１と比較して５００μｇ／Ｋｇ／日でのより顕著な効果を反映した。
【実施例４】
【０１１３】
実施例４：ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡのアンチセンス破壊は、神経細胞形質サイズと反比例する
ヘマトキシリン−エオシン染色脊髄切片中の類似のサイズのニューロン（図３Ａ）を、その細胞体の直径にしたがって以下の三つのサイズ群に分類した（図３Ｂ）：運動ニューロン（＝４０μｍ、総計数ニューロンの２０〜３５％、前角および中間帯中の運動核に局在）、中間サイズのニューロン（２０〜４０μｍ、約６０％、脊髄全体、主に前角および中間帯に分散している）、小型ニューロン（１０〜２０μｍ、５〜２０％、主に後角中に存在する）。各群由来のＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ標識細胞画分を、小サイズおよび中間サイズのＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞（直径４０μｍ未満）の隣接切片中で評価し、ナイーブ状態と比較して４倍であった（小細胞についてはｐ＝０．０５７、ウィルコクスン検定）。
【０１１４】
ＡＣｈＥ−Ｒ陽性のより小さなニューロン画分は、１５０μｇ／Ｋｇ／日処置と比較してより高いｈＥＮ１０１経口用量下で有意に減少し（ｐ＝０．０３３、ウィルコクスン検定）、ｉ．ｖ．投与ではなおさらに減少した（ｐ＝０．０１５）。中間サイズの画分は、１５０μｇ／Ｋｇ／日のｐ．ｏ．投与と比較して、１５０μｇ／Ｋｇ／日のｉ．ｖ．投与後に有意に減少した（ｐ＝０．０３０）。染色強度の減少により、運動ニューロンにおける一定のアンチセンス効果が示唆されたが、同時に、有効性は比較的限定される。しかし、いかなる処置によっても標識された巨大細胞体の全画分の減少は識別できなかった（ｐ＞０．１００）。これは、おそらく、明確な膜および／または代謝特性、異なる細胞体積、またはこれらの性質の寄与の組み合わせを反映する。ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡについて、巨大陽性細胞体数は変化しないままであるのに対して、陽性の小サイズおよび中間サイズのニューロンは、ナイーブと比較して低用量または高用量のｈＥＮ１０１のいずれかでそれぞれ５０％および２０％減少した。ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡの変化についての見かけ上の用量独立性は、これらの変化がアンチセンス駆動ではないという仮説と一致するが、おそらく、ＡＣｈＥ−ＳからＡＣｈＥ−Ｒへのスプライシングの変化に対する取扱いストレスの影響を反映し得る（Ｋａｕｆｅｒ（１９９８）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。
【実施例５】
【０１１５】
実施例５：ニューロン炎症誘発性サイトカインのｈＥＮ１０１抑制
ｈＥＮ１０１処置サル由来の腰髄切片は、ナイーブ切片よりも高い巨大サイズおよび中間サイズのＩＬ−１β陽性細胞体の画分を含んでおり、ストレス誘導性炎症応答が示唆された（図４Ａ、それぞれｐ＝０．０５１および０．０３４、ウィルコクスン検定）。１５０μｇ／Ｋｇ／日のｐ．ｏ．処置サルと比較して、５００μｇ／Ｋｇ／日のｈＥＮ１０１のｉ．ｖ．処置サル由来の切片で、より低いＩＬ−１β標識細胞体の画分が示された（図４Ａ、両サイズ群について、ｐ＝０．０６７、ウィルコクスン検定）。関連分析は、中間サイズではニューロンＡＣｈＥ−ＲとＩＬ−１βレベルとの間に推定相関関係が認められたが、巨大細胞では認められなかった（図４Ｂ、データ示さず）。ＩＬ−６標識も、５００μｇ／Ｋｇのｐ．ｏ．処置マウスと比較して５００μｇ／Ｋｇ  ｈＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与後に有意に抑制された（図４Ｃ、中間ニューロンおよび巨大ニューロンについてそれぞれｐ＝０．０３および０．０１５）。
【実施例６】
【０１１６】
実施例６：内毒素は、ＡＣｈＥ−Ｒの活性および完全性の障害を誘導する
内毒素投与により、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）インヒビター（イソ−ＯＭＰＡ）の存在下でのＡＴＣｈ加水分解率の定量によって測定したところ、血漿ＡＣｈＥ活性が時間依存性に減少した。この減少は、有意な処置−時間相互作用を示した（図５Ａ）（Ｆ（２，１６）＝３．９４、ｐ＝０．０４）。生理食塩水投与（偽薬）により、ＡＣｈＥ活性は変化せず、注射ストレスまたは概日作用によって誘導されるという可能性が排除された。加水分解活性の低下は、潜在的に、ＡＣｈＥタンパク質の喪失を反映する。この可能性を試験するために、電気泳動によって分離した血漿タンパク質を、ＡＣｈＥ−Ｒに固有のＣ末端ペプチドについて選択的な抗体と免疫反応させた（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。これらの抗体は、６６ｋｄタンパク質（全長ＡＣｈＥ−Ｒである可能性が高い）および見かけ上のサイズが６．５ｋＤのより短いペプチドを標識した。ストレスを与えたマウスの血清における並行標識パターン（Ｇｒｉｓａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）により、これがＡＣｈＥ−Ｒの免疫陽性Ｃ末端切断産物であることが示唆された。内毒素投与により、僅かであるが持続的なＡＣｈＥ−Ｒ切断産物の増加が誘導された（図５Ｂ、５Ｃ）。この増加は、統計的有意性に達しなかった（治療効果については、Ｆ（１，８）＝２．３２、ｐ＝０．１６）（図５Ｃ）。しかし、処置から９時間後、内毒素誘導性のＡＣｈＥ活性の減少は、内毒素誘導性のＡＣｈＥ−Ｒ切断の増加と有意に相関した（ｒ＝−０．６５）（図５Ｄ）。
【実施例７】
【０１１７】
実施例７：ＡＣｈＥ−Ｒ切断産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析
ＡＣｈＥ−Ｒ切断産物をさらに特徴づけるために、より大きな血清サンプル（１８０μｇ／レーン）を、電気泳動によって分離した。抗ＡＣｈＥ−Ｒ抗体で標識したバンドと同時移動したタンパク質バンドをゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供した。より大きなバンドの溶離産物は、主に血清アルブミンから構成されると同定され（分子量６９３６７）、これはＡＣｈＥ−Ｒがヒト血清タンパク質のこのサイズ画分中の唯一の副成分であるという仮定と一致した。しかし、切り出したバンドから溶離したより短いペプチドは、分子量が３６１３〜３６１５の単一ピークを示した。図６は、この溶離ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロフィールを示す。ペプチドの性質の計算により、算出分子量が３６１４であるＡＣｈＥ−ＲのＣ末端から３６残基の推定タンパク質分解的切断部位を位置づけた。これらの想定下で、ＡＣｈＥ−Ｒ転換部位に対して上流のアスパラギン残基とアルギニン残基との間で切断され得る（図６）。
【０１１８】
いくつかの個体由来のゲル溶離産物中に並行サイズのペプチドが認められ、矛盾のない切断過程が証明された。ＬｙｓＣタンパク質分解は、このペプチドをさらに短くできなかった。エドマン分解は成功せず、これはおそらくＮ末端の遮断に起因し、材料の不足により、さらなる実験を回避した。したがって、質量分析アプローチにより、ヒトＡＣｈＥスプライスイソ型の間で逸脱するＣ末端スプライス部位付近の内毒素ストレス下でヒト血漿中のＡＣｈＥ−Ｒ切断部位が示されたが、結論に至っていない。
【実施例８】
【０１１９】
実施例８：血管内皮細胞は、ＡＣｈＥ−Ｒを産生する
血漿ＡＣｈＥ−Ｒの潜在的な細胞型起源を求めて、本発明者らは、炎症疾患（腎臓血管炎）を罹患しているか罹患していない患者由来のヒト組織に対して蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）および免疫組織化学を行った。血管内皮細胞は、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｃｒＮＡおよび抗ＡＣｈＥ−Ｒ抗体の両方での標識を示した（図７Ａ、７Ｂ）。シグナル強度の定量により、炎症性血管炎を罹患しているか罹患していない患者におけるＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡレベルとＡＣｈＥ−Ｒタンパク質レベルとの間で著しい類似性が明らかとなり、その結果、ｍＲＮＡ標識があまり明らかでない組織も僅かなタンパク質標識を示した（図７Ｃ）。これにより、連続的血漿ＡＣｈＥ−Ｒ産生の推定部位としてニューロンニコチン酸アセチルコリン受容体も有する血管内皮細胞が示された（Ｈｅｅｓｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：５２７−３６）。
【実施例９】
【０１２０】
実施例９：ＡＣｈＥ−Ｒ切断はサイトカイン分泌と関連する
内毒素により、コルチゾール、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６の血漿レベルの一過性の有意な増加が誘導されるが（図８Ａ〜８Ｃ）、使用した用量では、内毒素は身体の疾患または行動疾患の症状の主観的評価に対していかなる有意な結果ももたらさない（Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇ（２００１）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。認識機能または知的機能に対する主観的ＣＮＳの非影響下での末梢サイトカインレベルの選択的増加により、これらの条件下での記憶機能の変化が主観的内毒素誘導性変化を反映することが示唆された。第一および第二の試験期間中にコルチゾールレベルが増加し、第一の試験期間中にＴＮＦ−αおよびＩＬ−６がピークになり、その後減少し、第二の期間中に直腸温度がピークになった（示さず）。これらの時間依存性効果は、有意な治療−時間相互作用を反映した（それぞれＦ（２，１６）＝４１．２、１０．６、１０．５、３．２、全てｐ＜０．０５、Ｈ−Ｆ）。
【０１２１】
各試験期間中、相関分析により、試験個体の生化学的応答と機能的応答を比較することができた。したがって、内毒素誘導性ＡＣｈＥ−Ｒ切断（内毒素条件から偽薬条件までの一定の個体の変化として計算）は、最後の試験期間中にコルチゾール分泌と有意（ｐ＜０．０５）且つ正に相関した（ｒ＝０．７０）（図８Ａ）。ＡＣｈＥ−Ｒ切断は、第一の試験期間中にＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌と有意（ｐ＜０．０１）且つ負に相関するが（それぞれ、ｒ＝０．７２および−０．６６）（図８Ｂ、８Ｃ）、その後の試験期間中では相関しなかった。
【実施例１０】
【０１２２】
実施例１０：ＡＣｈＥ−Ｒ切断は、陳述記憶の内毒素誘導性障害と関連する
内毒素の投与により、全試験期間中に陳述記憶試験で能力が減少した。これは、対話項目の即時想起の減少（Ｆ（１，８）＝６．５、ｐ＝０．０３）（図９Ａ）および遅延対話想起の減少（Ｆ（１，８）＝３．５、ｐ＝０．０９）を反映していた（データ示さず）。対話項目の即時想起および遅延想起の内毒素誘導性の減少は有意であり（ｐ＜０．０５）、第一の試験期間中にＴＮＦ−αおよびＩＬ−６分泌と負に相関するが（ｒ＝−０．５９〜−０．６７）、他の試験期間中では相関せず（データ示さず）、これらにより、陳述記憶の内毒素誘導性障害におけるさらなる機構の潜在的関与が示唆された。最後の試験期間では、対話項目の即時想起の内毒素誘導性の減少は有意であり（ｐ＜０．０５）、且つＡＣｈＥ−Ｒ切断と負に関連し（ｒ＝−０．６３）（図９Ｂ）、おそらく連続的に抑制されたサイトカイン産生と組み合わせた結果として起こるＡＣｈレベルの増加が陳述記憶を妨害することを示す。この概念は、サイトカインレベルが既に減少しているが、より早い試験期間中では減少していない場合、最後の試験期間中にＡＣｈＥ活性が減少する陳述記憶障害の正の（ｒ＝０．６８）関連によって支持された（図９Ｃ）。
【実施例１１】
【０１２３】
実施例１１：ＡＣｈＥ−Ｒ切断の作業記憶との関連
内毒素投与により、作業記憶機能の有意な改善を誘導し、これは、全試験期間中の数字短期間逆方向復唱スコアの増加を反映した（Ｆ（１，８）＝１２．３、ｐ＝０．００８）（図１０Ａ）。数字短期間順方向復唱試験（記憶期間を評価する）は有意に変化しないか、注意力試験（Ｒｕｆｆ  ２＆７抹消検査）は明らかであり（データ示さず）、認められた相違の選択性が強調された。
【０１２４】
作業記憶機能の内毒素誘導性の改善は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６またはコルチゾールの分泌に有意に関連しないが、ＡＣｈＥ−Ｒ切断と負に関連した。第二および第三の試験期間中の関連は有意であった（＜０．０５）（それぞれｒ＝−０．８４および−０．６４）（図１０Ｂ、データ示さず）。したがって、ＡＣｈＥ−Ｒ切断の内毒素誘導性の上昇がより高い（且つ、おそらくＡＣｈレベルの増加がより高い）被験体は、作業記憶機能の内毒素誘導性の改善がより低く、且つ陳述記憶の内毒素誘導性障害がより高かった。
【実施例１２】
【０１２５】
実施例１２：ＡＣｈＥ−Ｓトランスジェニックマウスは、体温の上昇を示す。
【０１２６】
発熱は、より高い循環炎症誘発性サイトカインレベルの結果の一つである。ヒトシナプスＡＣｈＥ（ｈＡＣｈＥ−Ｓ）の構成性発現（Ｂｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）および結果として起こるマウスＡＣｈＥ−Ｒの過剰発現（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）が動物における炎症誘発性サイトカインの放出に影響を与えるかどうかを検証するために、本発明者らは体温を測定した。５匹のトランスジェニックＦＶＢ／Ｎ  ｈＡＣｈＥ−ＳおよびｍＡＣｈＥ−Ｒを過剰発現する雌（３〜５月齢）は、体温の変化を誘導するために投与した麻酔から５分後と５５分後との間に測定した体温を有していた。グラフに示すように（図１２Ａ〜Ｂ）、体温は処置時間が経過するにつれて減少した。興味深いことに、トランスジェニックマウスの平均体温は、コントロールマウスよりも常に２℃高かった。これにより、その遺伝性のコリン作動性不均衡が体温調節を悪化させたと示唆される。これらの所見は、パラオクソンの投与に対するこれらのトランスジェニックマウスの低体温応答障害を記載した本発明者らの以前の報告と一致する（Ｂｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ｉｄ  ｉｂｉｄ．）。
【実施例１３】
【０１２７】
海馬中のＬＰＳ誘導性ＩＬ−１分泌および血清中のＩＬ−１およびＴＮＦ−α分泌に対するタクリンの影響
雄Ｃ５７マウスに、生理食塩水またはタクリン（１．５ｍｇ／Ｋｇ）のいずれかを注射し（ｉ．ｐ．）、その直後に、生理食塩水またはＬＰＳ（１．０ｍｇ／Ｋｇ）のいずれかを注射した（ｎ＝５動物／群）。２時間後、マウスを、２４μｇネムブタール／マウスで深く麻酔し、心臓穿刺によって採血し、海馬を切り出し、５００μｌのＲＰＭＩ＋１００ＫＩＵアプロチニンを含むチューブに入れた。海馬中のＩＬ−１βレベル（図１３Ａ）ならびに血清中のＩＬ−１β（図１３Ｂ）およびＴＮＦ−α（図１３Ｃ）のレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価した。ＬＰＳは、海馬および血清のＩＬ−１βの有意な増加を誘導したが、タクリン処置マウスでは有意に弱められた。対照的にタクリンは、血清中のＬＰＳ誘導ＴＮＦ−α分泌を小さく且つ非有意に弱めた。
【実施例１４】
【０１２８】
実施例１４：海馬中のＬＰＳ誘導性ＩＬ−１分泌および血清中のＩＬ−１およびＴＮＦ−α分泌に対するリバスティグミンの影響
雄Ｃ５７マウスに、生理食塩水または三つの用量のリバスティグミン（０．５、１．５、および３．０ｍｇ／Ｋｇ）の一つのいずれかを注射し（ｉ．ｐ．）、その直後に、生理食塩水またはＬＰＳ（１．０ｍｇ／Ｋｇ）のいずれかを注射した（ｎ＝５動物／群）。２時間後、マウスを、２４μｇネムブタール／マウスで深く麻酔し、心臓穿刺によって採血し、海馬を切り出し、５００μｌのＲＰＭＩ＋１００ＫＩＵアプロチニンを含むチューブに入れた。ＩＬ−１βレベルおよびＴＮＦ−αレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価した。ＬＰＳは、海馬ＩＬ−１βの有意な増加を誘導したが、高用量のリバスティグミンのみによって有意に弱められた（図１４Ａ）。血液中のＬＰＳ誘導性ＩＬ−１β分泌は、１．５ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／Ｋｇのリバスティグミンの用量によって用量依存的に抑制された（図１４Ｂ）。血液中のＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α分泌は、より高い用量でさえもリバスティグミン処置に影響を受けなかった。（図１４Ｃ）。
【実施例１５】
【０１２９】
手術に起因するストレスの感情および認識効果のメディエーターとしてのサイトカイン
いくつかの一連の証拠は、ストレスは種々の認識機能（記憶が含まれる）に影響を与えることを示す。特に、ストレスへの曝露により、陳述記憶を悪化させることが見出された一方で、手続き記憶はインタクトなままであった。ストレスは多くの免疫機能（サイトカインの産生および分泌が含まれる）に影響を及ぼすことも周知である。種々のストレッサーへの曝露後、ヒトおよび実験動物の両方においてＩＬ−２の減少に付随して末梢ＩＬ−６ならびにＩＬ−１βおよびＴＮＦαが増加する。
【０１３０】
ストレスの感情および認識への影響をの媒介におけるサイトカインの役割を試験するために研究をデザインした。以下のストレスの多い二つの状況型を、同一の被験体で調査した：精神的ストレス−手術を待っている間（すなわち、手術当日の朝）および手術ストレス−手術後。
【０１３１】
２０人の全体的に健常なボランティアに、包括的神経心理学試験群（小手術前後の感情パラメータおよび認識パラメータを評価する）を受けさせた（腹腔鏡下胆嚢摘出術またはヘルニア）。各被験体を、以下の三つの状況で試験した：（ａ）手術数日前（ベースライン＝ｔ０、（ｂ）手術当日の朝＝ｔ１、（ｃ）手術後＝ｔ２。各セッションで血液サンプルを採取し、サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の血清レベルを測定した。１５人のコントロール被験体に同一の手順を施した。
【０１３２】
手術当日の朝に、不安レベル（ＳＴＡＩ）（図１５Ａ）および鬱レベル（ＤＡＣＬ）（図１５Ｂ）が有意に増加した（それぞれＦ（２，８２）＝３．８７１、ｐ＜０．０２５、およびＦ（２，８２）＝１１．１８９、ｐ＜０．０００１）。疲労レベルおよび痛みレベルは変化しなかった（それぞれ、１５Ｃおよび１５Ｄ）。手術後の朝に、鬱はさらに増加したが、不安は増加せず、それと同時に、痛みおよび疲労が有意に増加した（それぞれ、Ｆ（２，８０）＝２４．５８８、ｐ＜０．０００１およびＦ（２，８０）＝１０．１４８、ｐ＜０．０００１）。
【０１３３】
認識パラメータ（図１５Ｅ〜１５Ｈ）に関して、手術当日の朝に、試験は、単語リスト想起課題（ＨＶＬＴ）の能力の有意な低下を示した（Ｆ（２，７０）＝４．１２０、ｐ＜０．０２１）。手術後の朝に、単語リスト想起および複雑な数字の認識に関与する視覚的記憶課題（ＭＣＧ）の能力のさらなる低下が見出された（Ｆ（２，７０）＝３．９７３、ｐ＜０．０２３）。
【０１３４】
各パラメータのために（心理学的能力、サイトカインレベルなど）、各ストレスの多い状況（ｔ１、ｔ２）とベースライン（ｔ０）との間の相違を計算した。サイトカインレベルと心理学的変数との間のピアソン相関を計算した（図１６Ａ〜Ｃ）。
【０１３５】
手術当日の朝に（ｔ１）、ＩＬ−１βレベルの増加と鬱状態の進行との間に有意な相関関係が存在した（ｒ＝０．５２５）（図１６ｂ）。
【０１３６】
手術後の朝（ｔ２）、ＩＬ−１レベルの増加と即時および遅延論理的記憶（対話想起試験）の悪化との間に有意な相関関係が存在した（それぞれ、ｒ＝−０．６２７および−０．５３２）。ＩＬ−６レベルの増加と用語リスト想起（ＨＶＬＴ）試験における遅延想起の改善との間（ｒ＝０．３８６）および即時と遅延した複雑な数字想起試験（ＭＣＧ）の改善との間（それぞれ、ｒ＝０．５０２および０．５９０）に有意な相関関係が得られた。ＩＬ−６が有意に増加した（Ｆ（２，３８）＝２９．１１４、ｐ＜０．０００１）（図１６Ｃ）。
【実施例１６】
【０１３７】
実施例１６：ＥＮ３０１処置マウスの脳におけるＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡの選択的消失
実験手順
３月齢のＦＶＢ／Ｎ雌マウスに、５００μｇ／ＫｇのＥＮ３０１（ｎ＝７）または賦形剤（ＰＢＳ、ｎ＝６）を毎日腹腔内注射した。ＥＮ３０１は、配列番号２に記載のｍＥＮ１０１に対応する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスＡＣｈＥエクソン２配列のエクソン２内の配列にターゲティングする。ＥＮ３０１を、動物試験のために比較的大量にＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで産生させた。処置を３日間連続で継続し、４日目にマウスを屠殺した。脳を採取し、液体窒素で急速冷凍し、−７０℃で保存した。
【０１３８】
脳から全ＲＮＡを抽出し、マウスＡＣｈＥ  ｃＤＮＡのエクソン２の共通配列またはＡＣｈＥ−Ｓ変異型に特異的なエクソン６中の固有の配列をターゲティングするプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。サイクル２５、３１、および３５の５０μｌのＰＣＲ反応混合物から５μｌのサンプルを取出した。サンプルを、１．５％アガロースゲルで泳動した。３１サイクル後のエクソン２配列に特異的なＰＣＲの結果を、図１７Ａに示す。写真を撮影し、ＰｈｏｔｏＳｈｏｐソフトウェアを使用して蛍光を定量し、結果をヒストグラムに示した（図１７Ｂ〜１７Ｃ）。
【０１３９】
結果：本発明の目的は、ＥＮ３０１処置下でＡＣｈＥ遺伝子発現の減少を試験することであったが、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡレベルが維持され、これはコリン作動性神経伝達の維持を反映する。
【０１４０】
ＲＮＡ量に対する正規化により、ＥＮ３０１処置脳は、共通の転写レベルで有意な２５％減少（＝０．０１、スチューデントｔ検定）を示したのに対し（図１７Ｂ）、Ｓ変異型は非有意な１７％増加を示し（図１７Ｃ）、これは、非処置脳と比較してｍＲＮＡの総量からのＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡの比較的より大きな画分を反映する。
【０１４１】
ＡＣｈＥ−Ｓ：共通（Ｓ／Ｃｏｍ）転写物の間の比は、ＥＮ３０１処置脳において、Ｓ／Ｃｏｍ比が有意に増加することを示した（０．６５〜０．９８）。したがって、異なるプライマー対は異なる効率で機能し得るので、分析した転写物の絶対量の比較のためにＲＴ−ＰＣＲデータを使用することができなかった。しかし、これらの二つの試験は同方向に向かっている（すなわち、ＥＮ３０１処置脳でＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡは減少するがＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡは減少せず、処置下でＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡの相対濃度が増加するが、有意ではない）ことは、この薬剤が脳遺伝子発現にも影響を及ぼすという概念を支持する。
【０１４２】
この結果は、ＥＮ３０１処置によってＥＮ３０１処置脳中にＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡが選択的に分布されながら本質的に改変されていないＡＣｈＥ−Ｓレベルが維持されるという結論に至る。このような効果を発揮するために、ＥＮ３０１が必ずしも血液脳関門を通過する必要はないことに留意のこと。むしろ、末梢ＡＣｈＥレベルの減少により、アセチルコリンレベルが増加し、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１）のマクロファージによる産生が抑制される（Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２１，３８４−８）。ＩＬ−１はＡＣｈＥ遺伝子発現を促進し（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，１４９−１５５）、末梢炎症誘発性サイトカインが脳に影響を与えることが知られているので（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）、このような効果により、脳内のＡＣｈＥ−Ｒレベルを最終的に減少させる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１Ａ−Ｆ】処置したサルのコリン作動性末端および分配細胞（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ）におけるＶＡＣｈＴ蓄積の減少。
【０１４４】
図１Ａ：抗ＶＡＣｈＴ抗体で免疫標識した（白）脊髄運動ニューロン（細胞の直径＝４０μｍ）の共焦点顕微鏡の投影図。標識末端の総体積および細胞あたりの平均数を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して測定し、各処置の結果（１、２、３、および４）を、図１Ｂおよび１Ｃに示すグラフにプロットした。
【０１４５】
図１Ｂ：標識末端（切片で検出された全運動ニューロンが含まれる）の体積の平均値および細胞あたりの平均数。
【０１４６】
図１Ｃ：標識末端（切片で検出された全運動ニューロンが含まれる）の体積の個体群分布（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）および細胞あたりの平均数。
【０１４７】
図１Ｄ：図１Ｂ、１Ｃ分析の平均値（±平均の評価標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅａｎ））。有意な減少を、アスタリスクでマークする（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）。
【０１４８】
図１Ｅ：中心管に極めて近接して局在したナイーブ脊髄由来の分配細胞中の抗ＣｈＡＴ抗体での免疫標識（矢印）。バックグラウンド染色のためにヘマトキシリンを使用した。
【０１４９】
１Ｆ：ナイーブサル（１）、１５０μｇ／Ｋｇ／日のｈＥＮ１０１の経口投与後（ｐ．ｏ．）（２）、５００μｇ／Ｋｇ／日のｈＥＮ１０１の経口投与後（３）、および５００μｇ／Ｋｇ／日のｈＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与後（４）のより高い倍率のＣｈＡＴ陽性分配細胞。用量と無関係の取扱いにより、末端の体積および密度の両方の減少が誘導されることに留意のこと。
【０１５０】
略語：ｎ、ナイーブ；Ｔｅｒｍ．、末端；ｖｏｌ．、体積；Ｐａｒｔ．Ｃｅ．、分配細胞；Ｃｅｎｔ．Ｃａｎ．、中心管。
【図２Ａ−Ｊ】サル脊髄ニューロンにおけるｈＥＮ１０１による選択的ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡの抑制。
【０１５１】
図２Ａ：エクソンをコードするヒトＡＣＨＥ遺伝子ならびに二つのその別の転写物、シナプスＡＣｈＥ−Ｓ（Ｓ）ｍＲＮＡおよびストレス関連ＡＣｈＥ−Ｒ（Ｒ）ｍＲＮＡの図である。Ｓ転写物は、エクソン２、３、４、および６を含むのに対し、Ｒ転写物は、エクソン２、３、４、５、および偽イントロン４’を含む。これらの特徴は、アスタリスクで示した転写物特異的プローブを調製するのに役立つ。
【０１５２】
図２Ｂ：切開したサル腰髄上のサンプリング部位を、矢印で示す。
【０１５３】
図２Ｃ〜Ｊ：腰髄由来の組織切片を、記載の用量のｈＥＮ１０１でのｐ．ｏ．およびｉ．ｖ．投与での治療から７日後に調製した。記載のプローブを使用したニューロン標識パターンを比較するために使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を示す。核を、ＤＡＰＩ染色で視覚化した（白）。試験切片と全細胞数および／または一般的組織学との間の相違はなかった。ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡ標識は神経突起切片においてのみ治療後に有意な変化が示されたのに対して（２Ｄと比較した２Ｆ、２Ｈ、および２Ｊ）、ニューロンＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ標識は細胞体で顕著に減少したことに留意のこと。
【０１５４】
図２Ｃ：処置なし、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１５５】
図２Ｄ：処置なし、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１５６】
図２Ｅ：１５０μｇ／ｋｇ／日のＥＮ１０１のｐ．ｏ．投与での処置、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１５７】
図２Ｆ：１５０μｇ／ｋｇ／日のＥＮ１０１のｐ．ｏ．投与での処置、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１５８】
図２Ｇ：５００μｇ／ｋｇ／日のＥＮ１０１のｐ．ｏ．投与での処置、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１５９】
図２Ｈ：５００μｇ／ｋｇ／日のＥＮ１０１のｐ．ｏ．投与での処置、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１６０】
図２Ｉ：５００μｇ／ｋｇ／日のＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与での処置、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【０１６１】
図２Ｊ：５００μｇ／ｋｇ／日のＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与での処置、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡに特異的な染色。
【図３Ａ−Ｃ】ニューロンＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ抑制の細胞サイズ依存有効性。
【０１６２】
図３Ａ：腰髄およびその三つの区画の図：中間帯および中心管で分けられた前角および後角。
【０１６３】
図３Ｂ：腰髄の中間帯中の代表的な領域の組織染色（ヘマトキシリンおよびエオシン）。三つの細胞を以下のその神経細胞形質の直径にしたがってマークする：１０〜２０μｍ（矢印、これらの細胞の大部分は後角に存在する）、２０〜４０μｍ（アスタリスク）、および＝４０μｍ（矢印）。
【０１６４】
図３Ｃ：異なる治療計画下での三つのサイズ群由来のＡＣｈＥ−Ｒ陽性ニューロンの画分を示す。差し込み図：ｐ．ｏ．での１５０μｇ／ｋｇ／日の投与計画から採取した異なるサイズ群由来の代表的ニューロン。カラムは、複数の切片中の全腰髄の灰白質の反復分析を示す各サイズ群における平均ＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞±ＳＥＭを示す。星印は、有意差を示す（ｐ＜０．０５、ウィルコクスン検定）。
【０１６５】
略語：Ｃｅｎｔ．Ｃａｎ．、中心管；Ｄ．ｈ．、後角；Ｉ．ｚ．、中間帯；Ｖ．Ｈ．、前角；ｐｏｓ．ｃｅ．、陽性細胞；ｓｉ．ｇｒ．、サイズ群；Ｃｅ．Ｂｏ．Ｄｉａｍ．、細胞体の直径。
【図４Ａ−Ｃ】ＡＣｈＥ−Ｒ発現を伴うアンチセンス介在下でのストレス誘導性ニューロン炎症誘発性サイトカインの抑制。
【０１６６】
図４Ａ：異なる治療計画下での中間および大きなサイズのＩＬ−１β陽性脊髄ニューロンの画分を示す（複数の切片中の腰髄の前角および中間帯の反復分析を示すカラム±ＳＥＭ）。差し込み図：ｐ．ｏ．での５００μｇ／Ｋｇ／日の投与計画から採取した代表的な中間サイズおよび大きなサイズの陽性ニューロン。＊＊Ｐ≦０．０５、＊＊：Ｐ＝０．０６７。
【０１６７】
図４Ｂ：異なるｈＥＮ１０１処置におけるＡＣｈＥ−ＲとＩＬ−１β陽性中間サイズ細胞（２０〜４０μｍ）の平均画分の間の相関関係を示すグラフ。大きなサイズの細胞（４０μｍ超）は、このような相関関係を示さなかった（Ｒ２＝０．１７７８）。
【０１６８】
図４Ｃ：ＩＬ−６陽性脊髄ニューロン画分を、本質的に４Ａと同様に評価した。５００μｇ／Ｋｇ／日のＥＮ１０１で処置したサルの脊髄ニューロン中のＩＬ−１βおよびＩＬ−６両方の減少に留意のこと。
【０１６９】
略語：ｐｏｓ．ｃｅ．、陽性細胞。
【図５Ａ−Ｄ】ＡＣｈＥ活性のヒト血漿レベルおよびＡＣｈＥ−Ｒ切断の経時変化。
【０１７０】
図５Ａ：加水分解活性：注射後の示した間隔にて内毒素または生理食塩水（偽薬）を二回注射した１０人のボランティアの血漿ＡＣｈＥ活性（平均±ＳＥＭ）を示す。注射前（ベースライン）ＡＣｈＥレベルを、各個体の１００％と見なした。アスタリスクは、統計上の相違を示す（ｐ＜０．０５）。
【０１７１】
図５Ｂ：免疫ブロット：一個体の連続的結果を示す。血漿サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動に供し、ブロットを抗ＡＣｈＥ−Ｒ抗体で免疫反応させた。６．５ｋＤａのＡＣｈＥ−Ｒ切断産物に留意のこと。左のレーンは、偽薬注射に対する応答を示す；右のレーンは、内毒素に応答したＡＣｈＥ−Ｒ切断の増加を示す。
【０１７２】
図５Ｃ：デンシトメトリー強度。ベースラインの％としての内毒素および偽薬で処置した個体の血漿中の迅速に移動するＡＣｈＥ−Ｒ切断産物の平均値（平均±ＳＥＭ）を示す（Ａに記載）。
【０１７３】
注釈：内毒素処置被験体のＡＣｈＥ−Ｒ切断の増加は、ＡＣｈＥ活性の減少と同時に現れた。
【０１７４】
図５Ｄ：関連分析。最後の試験期間（ｔ＝９時間）の間の内毒素下でのＡＣｈＥ−Ｒ切断の増加およびＡＣｈＥ活性の減少の間に高度に有意な負の関連（相関係数、ｒ＝−０．６５）が現れた。各点は、一個体を示す。
【０１７５】
略語：Ａｃｔ．、活性；ｂａｓ．、ベースライン；Ｈ．ｐ．ｉｎｊ．、注射後（時間）；Ｔ．ｐ．ｉｎｊ．、注射後の時間；Ｐｌａｃ．、偽薬；Ｅｎｄｏｔ．、内毒素；Ｃｌｅａｖ．Ｐｒｏｄ．、切断産物。
【図６】ゲル溶離バンドの質量分析。抗ＡＣｈＥ−Ｒ抗体と免疫反応したゲル溶離による迅速に移動したバンドの電子スプレー質量分析の結果を示す。主なペプチドの分子量が３６１３〜３６１５であることに留意のこと。予測質量の計算により、ＡＣｈＥ−ＲのＣ末端から３６残基のタンパク質分解切断部位（示した配列中のアスパラギン残基とアルギニン残基との間）が推定され、推定切断部位を矢印で示し、転換部位を星印で示した。
【０１７６】
略語：Ｒｅｌ．ａｂｕｎｄ．、相対存在量。
【図７Ａ−Ｃ】ＡＣｈＥ−Ｒは、種々の組織由来のヒト血管内皮細胞中に発現する。
【０１７７】
図７Ａ：ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ。炎症過程（皮膚過敏性血管炎；ピンク色でラベリングし、赤い矢印で示す）を罹患したヒト血管内皮細胞の切片に対するＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡ変異型に選択的な５’ビオチン化ｃＲＮＡプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成の結果を示す。
【０１７８】
図７Ｂ：ＡＣｈＥ−Ｒタンパク質。ＡＣｈＥ−ＲのＣ末端ペプチドでターゲティングした抗体（赤色の矢印）で標識した血管炎患者由来のヒト腎臓血管内皮細胞の免疫顕微鏡写真を示す。
【０１７９】
図７Ｃ：画像分析。定義した強度範囲内の赤色ピクセルの比率としての腎臓、皮膚、および筋肉の血管内皮細胞における平均ＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびＡＣｈＥ−Ｒタンパク質の標識強度（それぞれ黒色および白色のカラム）（平均値±ＳＥＭ）を示す。
【０１８０】
略語：ｐｒｏｔ．、タンパク質；ｉｎｔ．、強度；ｋ．ｒｅｊ．、腎臓拒絶；ｋ．ｖａｓ．、腎臓血管；ｎｏｎｓｐｅｃ．、非特異的；ｎ．ｅｎｄ．、正常な内皮；ｍ．筋肉、ｈｙｐ．ｖａｓｃ．、過敏性血管炎。
【図８Ａ−Ｃ】ＡＣｈＥ−Ｒ切断とコルチゾールおよびサイトカインの変化との間の二方向性の関係。
【０１８１】
内毒素または偽薬で処置した１０人の患者のコルチゾール、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６の血漿レベルにおける経時変化の平均±ＳＥＭ（左）ならびにこれらの変化とＡＣｈＥ−Ｒ切断（Ｃ末端ＡＣｈＥ−Ｒ切断産物のデンシトメトリー法による定量によって測定）との間の示した時点での関連（右）を示す。
【０１８２】
図８Ａ：コルチゾール。
【０１８３】
図８Ｂ：ＴＮＦ−α。
【０１８４】
図８Ｃ：ＩＬ−６。
【０１８５】
略語：ｒ、相関関数；ｔ、注射後の時間；Ｐｌａｃ．、偽薬；ｅｎｄ．、内毒素；Ｈ．ｐ．ｉｎｊ．、注射後の時間（時間）；Ｃｌｅａｖ．ｐｒｏｄ．、切断産物。
【図９】：内毒素は、陳述記憶を悪化させる。治療後の示した時間に処置した内毒素および偽薬の即時対話想起試験（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔｏｒｙ  ｒｅｃａｌｌ  ｔｅｓｔ）の能力についての平均±ＳＥＭならびに注射から９時間後のこれらの値の変化とＡＣｈＥ−Ｒ切断（ｂ）およびＡＣｈＥ活性（ｃ）との関係を示す。
【０１８６】
略語：Ｉ．ｓ．ｒ．、即時対話想起；ｐｌａｃ．、偽薬；ｅｎｄｏｔ．、内毒素；Ｈ．ｐ．ｉｎｊ．、注射後の時間；ｃｌｅａｖ．ｐｒｏｄ．、切断産物；ａｃｔ．、活性。
【図１０】作業記憶における内毒素誘導性障害。内毒素および偽薬処置個体についての期間バックグラウンド試験（ｓｄｐａｎ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｅｓｔ）の能力値（平均±ＳＥＭ）（ａ）ならびに注射から３時間後のこの能力の変化とＡＣｈＥ−Ｒ切断との関連（ｂ）を示す。
【０１８７】
略語：ｒ、相関係数；ｔ、注射後の時間（時間）；Ｓ．ｂ．、短期間逆方向復唱（ｓｐａｎ  ｂａｃｋｗａｒｄ）；ｃｌｅａｖ．ｐｒｏｄ．、ｐｌａｃ．、偽薬；ｅｎｄｏｔ．、内毒素；Ｈ．ｐ．ｉｎｊ．、注射後の時間（時間）；ｃｌｅａｖ．ｐｒｏｄ．、切断産物；ａｃｔ．、活性。
【図１１Ａ−Ｃ】スキーム−内毒素は、記憶に対する相関するサイトカイン−コリン作動性の影響を誘導する。本研究で調査し、記憶過程の変化および処置後観察期間におけるこれらの変化の動的改変を説明する細胞および生化学的事象を示す。矢印の濃淡は、関連過程の相対強度を反映する。
【０１８８】
図１１Ａ：処置１時間後：内毒素は、サイトカイン、コルチゾール、およびプロテアーゼの放出を誘導する。サイトカインの上昇は、医学的側頭葉関連現象である陳述記憶の障害と関連する。コルチゾールは、血漿中の免疫陽性ＡＣｈＥ−Ｒ量を上昇させるＡＣｈＥ−Ｒ産生を誘導する。血管ＡＣｈは、シナプス間隙に放出され、ニューロンの電気生理学に影響を及ぼし、新皮質関連特性である作業記憶を改善することができる。周囲中、ＡＣｈは、マクロファージにおけるサイトカイン産生を抑制し始める（円形の矢印）。
【０１８９】
図１１Ｂ：処置３時間後：プロテアーゼは、ＡＣｈＥ−Ｒから３６アミノ酸長のＣ末端フラグメントを放出してさらなる破壊を開始し、その後ＡＣｈＥ活性を減少させる。内毒素は既に消失し、ＡＣｈはサイトカイン産生を有効に抑制する；ＡＣｈレベルの増加（分泌の増加およびＡＣｈＥの加水分解活性の減少を反映する）は、おそらく作業記憶の活性化に関連するのに対して、ＡＣｈＥ−Ｒ切断産物の増加は、作業記憶の改善の低下に関連する。
【０１９０】
図１１Ｃ：処置９時間後：コルチゾールも消失する。しかし、ＡＣｈＥの持続的であるが緩やかな減少はおそらくＡＣｈ増加による陳述記憶の悪化および作業記憶の活性化に関連する。ＡＣｈＥ−Ｒ切断産物の安定した増加は、陳述記憶の悪化がより大きく、且つ作業記憶の改善がより小さいことの両方に関連する。
【０１９１】
略語：ｉｎｃ．ｌｅｖ．、レベルの増加；ｄｅｃ．ｌｅｖ．、レベルの減少；ｃｌｅａｖ．Ｐｒｏｄ．、切断産物。
【図１２Ａ−Ｂ】トランスジェニックマウスは、野生型マウスよりも高い体温を示す。
【０１９２】
図１２Ａ：各マウスの経時的体温を示すグラフであり、四角はトランスジェニックマウスを示し、円はコントロールを示すグラフ。
【０１９３】
図１２Ｂ：各群（トランスジェニック群またはコントロール群）の経時的平均体温を示し、菱形はトランスジェニックマウスを示し、四角はコントロールを示すグラフ。
【０１９４】
略語：Ａｎ．Ｔ．、肛門温度；Ａｖｅｒ．Ａｎ．Ｔ．、平均肛門温度；Ｔ．ｐ．ａｎｅｓｔ．、麻酔後の時間。
【図１３Ａ−Ｃ】海馬中のＬＰＳ誘導性ＩＬ−１分泌および血清中のＩＬ−１およびＴＮＦ−α分泌に対するタクリンの影響。
【０１９５】
図１３Ａ：海馬中のＩＬ−１βレベルを示すグラフ。
【０１９６】
図１３Ｂ：血清中のＩＬ−１βレベルを示すグラフ。
【０１９７】
図１３Ｃ：血清中のＴＮＦ−αレベルを示すグラフ。
【０１９８】
略語：ｐｒｏｔ．、タンパク質；ｓｅｒ．、血清；ｓａｌ．、生理食塩水。
【図１４Ａ−Ｃ】海馬中のＬＰＳ誘導性ＩＬ−１分泌および血清中のＩＬ−１およびＴＮＦ−α分泌に対するリバスティグミンの影響。
【０１９９】
図１４Ａ：海馬中のＩＬ−１βレベルを示すグラフ。
【０２００】
図１４Ｂ：血清中のＩＬ−１βレベルを示すグラフ。
【０２０１】
図１４Ｃ：血清中のＴＮＦ−αレベルを示すグラフ。
【０２０２】
略語：ｐｒｏｔ．、タンパク質；ｓｅｒ．、血清；ｓａｌ．、生理食塩水。
【図１５Ａ−Ｈ】感情および認識パラメータに対する手術ストレスの影響。
【０２０３】
図１５Ａ：不安に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２０４】
図１５Ｂ：鬱病に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２０５】
図１５Ｃ：疲労に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２０６】
図１５Ｄ：痛みに対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２０７】
図１５Ｅ：単語リストの想起に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２０８】
図１５Ｆ：単語リストの認識に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２０９】
図１５Ｇ：対話想起に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２１０】
図１５Ｈ：数字想起に対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２１１】
略語：Ｃｏｎｔ．、コントロール；ｓｔｒ．、ストレス；Ｔ．、時間；Ａｎｘ．：不安、Ｄｅｐ．、鬱病；Ｆａｔ．、疲労；Ｐ．、痛み；Ｗ．Ｌ．Ｒ．、単語リストの想起、Ｗ．Ｌ．Ｒｅｃｏｇ．、単語リストの認識；Ｓ．Ｒ．、対話想起；Ｆｉｇ．Ｒ．、数字想起。
【図１６Ａ−Ｃ】サイトカインレベルに対する手術ストレスの影響。
【０２１２】
図１６Ａ：ＩＬ−１レベルおよびＩＬ−６レベルに対する手術ストレスの影響を示すグラフ。
【０２１３】
図１６Ｂ：ＩＬ−１と鬱病との間の相関関係。
【０２１４】
図１６Ｃ：サイトカインと認識パラメータとの間の相関関係。
【図１７Ａ−Ｃ】ＥＮ３０１処置の際のＡＣｈＥ発現の減少。
【０２１５】
図１７Ａ：ＲＴ−ＰＣＲ反応の分析（３１ＰＣＲサイクル後のＡＣｈＥエクソン２産物）。左から右：レーン１、マーカー；レーン２〜８、ＥＮ３０１処置マウス由来のサンプル；レーン９〜１４、ＰＢＳ処置マウス由来のサンプル。
【０２１６】
図１７Ｂ：マウスＡＣｈＥ  ｃＤＮＡのエクソン２中の共通配列をターゲティングするプライマーを使用したＰＣＲ反応で得られた結果の定量分析を示すヒストグラム。
【０２１７】
図１７Ｃ：ＡＣｈＥ−Ｓ変異型に固有のエクソン６中の配列をターゲティングするプライマーを使用したＰＣＲ反応で得られた結果の定量分析を示すヒストグラム。
【０２１８】
略語：ｃ．ｄ．、共通ドメイン；Ａｒｂ．Ｕ．、任意単位；ｓａｌ．、生理食塩水。
【図１Ａ−Ｆ】
2007509186.tif 000003
【図２Ａ−Ｊ】
2007509186.tif 000004
【図３Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000005
【図４Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000006
【図５Ａ−Ｄ】
2007509186.tif 000007
【図６】
2007509186.tif 000008
【図７Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000009
【図８Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000010
【図９】
2007509186.tif 000011
【図１０】
2007509186.tif 000012
【図１１Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000013
【図１２Ａ−Ｂ】
2007509186.tif 000014
【図１３Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000015
【図１４Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000016
【図１５Ａ−Ｈ】
2007509186.tif 000017
【図１６Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000018
【図１７Ａ−Ｃ】
2007509186.tif 000019
【配列表】
2007509186000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月26日(2006.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症誘発性サイトカイン放出の抑制のための薬学的組成物の調製におけるＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用であって、前記組成物が、任意選択的に、薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、ＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項２】
熱の予防または解熱のために体温を低下させるための薬学的組成物の調製におけるＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用であって、前記組成物が、任意選択的に、薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、ＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項３】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、およびＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、請求項２および請求項３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥに指向するヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその機能的アナログ、誘導体、もしくはフラグメントである、請求項２および請求項３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、配列番号１、配列番号２、および配列番号７のいずれか一つに記載の配列を有するＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその機能的アナログ、誘導体、もしくはフラグメントである、請求項４および請求項５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記炎症誘発性サイトカインが、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８のいずれか一つである、請求項２および請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記炎症誘発性サイトカインがＩＬ−１βである、請求項９に記載の使用。
【請求項８】
前記炎症誘発性サイトカインの放出が、ストレス、細菌感染、薬物、照射、ＡＣｈＥインヒビターへの曝露、脳卒中、自己免疫疾患、化学物質頻回曝露感度、および任意の年齢依存性累積損傷のいずれか一つによって誘発される、請求項２および請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、必要とする哺乳動物被験体の炎症応答を誘発する容態の治療のための薬学的組成物の調整におけるＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項１０】
薬学的に許容可能な添加剤、キャリア、および／または希釈剤をさらに含む、必要とする哺乳動物被験体の関節、中枢神経系、胃腸管、心内膜、心膜、肺、眼、皮膚、および尿生殖器系の炎症の治療および／または予防のための薬学的組成物の調整におけるＡＣｈＥ発現のインヒビターの使用。
【請求項１１】
前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが、ＡＣｈＥ特異的リボザイム、ＡＣｈＥ遺伝子のＲＮＡ干渉用のＲＮＡ配列、またはＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか一つである、請求項１２および請求項１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記哺乳動物被験体がヒトであり、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが配列番号１および配列番号７のいずれか一つに記載のＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１３】
前記哺乳動物被験体が非ヒト哺乳動物であり、前記ＡＣｈＥ発現のインヒビターが配列番号２に記載のＡＣｈＥに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬学的組成物を約０．００１μｇ／ｇと約５０μｇとの間の投薬量の有効成分を必要とする被験体に毎日使用する、請求項１２〜請求項１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
約０．０１〜約５．０μｇ／ｇの投薬量の有効成分を投与する工程を含む、請求項１２〜請求項１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
約０．１５〜約０．５０μｇ／ｇの投薬量の有効成分を投与する工程を含む、請求項１２〜請求項１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記容態が、ストレス、細菌感染、薬物、照射、ＡＣｈＥインヒビターへの曝露、脳卒中、自己免疫疾患、化学物質頻回曝露感度、および任意の年齢依存性累積損傷のいずれか一つから選択される、請求項１２および請求項１４〜請求項１９のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
2007509186.tif 000020
2007509186.tif 000021
2007509186.tif 000022
2007509186.tif 000023
2007509186.tif 000024