(57)【要約】  本発明は、診断を行うために４つのＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７のうちの少なくとも一の使用、若白髪の素因の診断のための方法、診断及び診断用キットを目的として４つのマーカーの対立遺伝子を検出するための手段の使用、マーカーｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０によって定義されるハプロタイプに基づいた若白髪の素因の診断のための方法、並びに、非ヒト哺乳動物の若白髪の素因の診断のためにＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４及びｒｓ３６５２９７によって定義されるヒト第９染色体上の領域に相同な非ヒト哺乳動物のすべて又は一部の領域に対応する、少なくも１８の連続したヌクレオチドを含有してなる少なくとも一のポリヌクレオチド断片の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の若白髪の素因の診断のための、以下のマーカー：ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択される少なくとも一つのヒト第９染色体のＳＮＰマーカーの使用。
【請求項２】
ＳＮＰ ｒｓ３０６５３４のＴ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２のＴ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＳＮＰ ｒｓ５７５９１６のＧ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＳＮＰ ｒｓ３６５２９７のＴ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
以下のマーカー：ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択した少なくとも一のヒト第９染色体のＳＮＰマーカーの対立遺伝子を個体の遺伝子材料の試料において決定されることを含む、個体の若白髪の素因の診断方法。
【請求項７】
診断を確立するために他の個体のマーカーの対立形質型をマーカーの対立形質型と比較されるという付加的な工程を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記他の個体が若白髪ではない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記他の個体が若白髪である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記他の個体が診断される個体と血縁関係にある個体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＮＰ ｒｓ３０６５３４のＴ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２のＴ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＮＰ ｒｓ５７５９１６のＧ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＮＰ ｒｓ３６５２９７のＴ対立形質型は若白髪の素因を示唆する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
個体の若白髪の素因の診断のために、個体の遺伝子材料の試料においてヒト第９染色体のＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための手段の使用であり、該マーカーが以下のマーカー：ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択されるものである使用。
【請求項１６】
前記手段が核酸プローブである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記プローブが放射性マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと結合したものである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ３０６５３４のＴ対立形質型が測定可能となる、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２のＴ対立形質型が測定可能となる、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ５７５９１６のＧ対立形質型が測定可能となる、請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ３６５２９７のＴ対立形質型が測定可能となる、請求項１５に記載の使用。
【請求項２２】
若白髪の素因を診断するためのキットであって、
・マーカーｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択されるヒト第９染色体のＳＮＰマーカーの対立遺伝子をヒト遺伝子材料の試料において検出するための手段と
・陽性対照又は陰性対照
とを含んでなるキット。
【請求項２３】
前記プローブが一の対立遺伝子と特異的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記プローブが放射性マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと結合したものである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ３０６５３４のＴ対立形質型が測定可能となる、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２のＴ対立形質型が測定可能となる、請求項２２に記載の使用。
【請求項２７】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ５７５９１６のＧ対立形質型が測定可能となる、請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
前記手段によりＳＮＰ ｒｓ３６５２９７のＴ対立形質型が測定可能となる、請求項２２に記載の使用。
【請求項２９】
個体の若白髪の素因の診断方法であり、以下の３つのヒト第９染色体のＳＮＰマーカー：ｒｓ ３７３９９０２、ｒｓ ２５８３８０５及びｒｓ ３７７０９０の対立遺伝子を、これら３つのＳＮＰと比較して該個体のハプロタイプを決定するために、該個体の遺伝子材料の試料において検出することを含んでなる方法。
【請求項３０】
診断を確立するために、３つのＳＮＰによって形成されるハプロタイプを他の個体のものと比較するという付加的な工程を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記他の個体が若白髪でない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記他の個体が若白髪である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記他の個体が診断される個体と血縁関係にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
個体の若白髪の素因の診断のために、該個体の遺伝子材料の試料におけるヒト第９染色体のＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための手段の使用であって、該マーカーがｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０である使用。
【請求項３５】
前記手段が核酸プローブである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記プローブが放射性マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと結合したものである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
若白髪の素因の診断のためのキットであって、ヒト遺伝子材料の試料において以下のヒト第９染色体のＳＮＰマーカー：ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０の対立遺伝子を検出する手段を含んでなるキット。
【請求項３８】
陽性対照又は陰性対照をさらに含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記手段がそれぞれのＳＮＰマーカーの一対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記プローブが放射性マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと結合したものである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
非ヒト哺乳動物において若白髪の素因を診断するために、ＳＮＰマーカーｒｓ ３０６５３４及びｒｓ ３６５２９７によって定義されるヒト第９染色体の領域に相同な非ヒト哺乳動物の領域のすべて又は一部に一致する配列の少なくとも１８の連続したヌクレオチドを含有してなる少なくとも一のポリヌクレオチド断片の使用。
【請求項４２】
前記哺乳動物はウマである、請求項４１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
加齢の効果である成長が止まらないという先入観を無くす又は軽減することをするであろう。かかる状況下で、見栄えの悪いと考えられる白髪を、着色シャンプーを用いて消失させることが一般的となっており、今後もそうであろう。しかし、そのような処置は現象の影響を効果的に排除することができるものの、原因に対する効果は全くないことが明らかである。このため、その解決策は一時的なもので、頻繁に繰り返さなければならない。
【０００２】
かかる状況下で、本発明者等は、全く新しいアングル、すなわち遺伝学から白髪又はしらがの出現を探求することを選択した。
実際、その遺伝学的な観点からの白髪の探求は色素脱失の深いメカニズムに灯りをともす。また、これにより白髪に関与する遺伝子を同定することができる。この同定はヘアケアの分野で、化粧品、治療又は診断の双方に対しての広い応用範囲への扉を開く。
遺伝子連鎖分析による白髪の原因となるゲノム領域を調べることは全く新規であり、他の研究では白髪の生化学を解読する試みをしている。
【０００３】
本発明者等は若白髪（ＰＣ）又は人生の早い時期での白髪の出現は遺伝的なものであるとの長い間信じられてきた仮説に賛同している。人によっては毛髪の早期の白髪化の家系的性質が明らかに観察される。
逆遺伝学的方法を実施する際の考えられる障害は表現型の正確な定義に関する。研究下では表現型の完全な定義があることがは極めて重要である。この場合、遺伝子同定の確実に成功させるために、表現型の分類に対する厳格なプロトコルを使用して家族を選択することによって、本発明で使用される試料の選択と組成化を行った。２５歳前で白髪があり、３０歳で頭髪の半分がグレイの個体のみを「若白髪」の表現型とした。
【０００４】
更に、第一に、若白髪は一遺伝子的由来ではなくむしろ多重遺伝子由来であり、第二に、環境因子が表現型に影響を持つ可能性が非常に高い。実際、対象体は、若白髪の素因となる一群の原因を定義する必要がある。この点で、逆遺伝子学は通常遺伝学者によって推奨される手法ではない。よって、発明者によるこの方法の使用は新規である。
【０００５】
これらの研究の結果、発明者等は、まず初めに白髪に関連している可能性が最も高い遺伝子を含む染色体及び／又はゲノム領域を定めることができた。本出願において、白髪に統計的に関与する第９染色体の遺伝子ＤＤＸ３１及びＧＴＦ３Ｃ４内に多型を証明した。
本発明の目的は、第一に、若白髪の素因に関連するｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７と称する４つのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）の同定、第二に、若白髪の素因に関連するハプロタイプを定義する多型ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０の組み合わせの同定に基づく。また、本発明は化粧品、治療及び診断の分野における方法及びキットへのこれらマーカーの使用に関する。
【０００６】
治療及び化粧品の分野では、本発明は、診断を行うための４つのＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７の少なくとも一の使用、若白髪の素因の診断のための方法、診断するための４つのマーカーの対立遺伝子を検出するための手段の使用、及び診断のためのキットに連続的に関連する。
また、本発明は、マーカーｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０に定義されるハプロタイプに基づく若白髪の素因の診断のための手段にも関する。
最後に、本発明はまた、マーカーｒｓ ３０６５３４とｒｓ ３６５２９７間を含有するヒト第９染色体の領域に相同な非ヒト哺乳動物のゲノム領域内に含有する情報の使用に基づく、非ヒト哺乳動物における若白髪の素因の診断に関する。
【０００７】
用語説明
本発明において使用される用語は次の意味を持つ。
「ポリヌクレオチド断片」なる用語は、少なくとも２つのヌクレオチドの線状連鎖から生じる任意の分子を意味し、該分子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖でありうる。よって、それは二本鎖ＤＮＡ分子、一本鎖ＤＮＡ分子、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ-ＲＮＡ三本鎖又は任意の他の組み合わせでありうる。ポリヌクレオチド断片は天然に生じる組換え体又は合成分子でありうる。ポリヌクレオチド断片は相補鎖を含む場合、相補性は必ずしも完全ではないが、異なる鎖間の親和性は、二本鎖間にワトソン-クリック型の安定結合をするのに十分な程度である。
【０００８】
塩基対形成は好ましくはワトソン-クリック型のものであるが、フーグスティーン又は逆フーグスティーン型対形成のような他の型もまた可能である。
分子の配列Ｓは、Ｓの塩基の配列が次の方法：
１−  同一性による、又は
２−  チミンの一部又は全てをウラシルに変える他は、同一性による、又は
３−  相補性による、又は
４−  チミンの一部又は全てをウラシルに変える他は、相補性による
方法の一つを用いて与えられたＤＮＡ分子のものから推定できるならば、与えられたＤＮＡ分子の配列に「対応する」と考えられる。
【０００９】
更に、二つの配列は、先の方法（相補性又は同一性で、Ｔ／Ｕ交換を伴うか伴わない方法）の一つで１０中１未満、好ましくは１００中１未満の誤差を全体で導入しているならば「対応している」と考えられる。その結果、長さの変動最大値は許容誤差幅に従って１０％であり、好ましくは長さの差は１％未満であるので、２つの分子は類似の長さも必要である。
この定義は、２分子が、特にその骨格に関して同じ性質を持っているとは仮定していない。それはその配列の対応にのみ関係している。
例を挙げると、２つの同一のＤＮＡ配列は互いに「対応する」。
同様に、その２つの配列が実質的に同一ならば、つまり９０％を越えて同一ならば、それらは対応する。任意のＤＮＡ分子の翻訳から得られるＲＮＡ配列はそのＤＮＡ分子の配列に「対応する」。同様に、例えばＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドのような合成配列はＤＮＡ配列に対応しうる。同じことが、ＤＮＡ配列とその配列を標的として持つアンチセンスＲＮＡ配列の間でも言える。
【００１０】
同じ方針で、ＤＮＡ分子の配列Ｓは、その配列Ｓが方法１又は３だけを用いて与えられたＤＮＡ分子のものから推定できるならば、与えられたＤＮＡ分子の配列に「対応する」。同じ自由裁量が、これらのプロセス中に誤差を導入する可能性に関して許容される。つまり２つのＤＮＡ配列は、全体としてそれらが１０中１未満、好ましくは１００中１未満の誤差を相補性又は同一性プロセス中に導入するならば、「対応している」状態のままである。
【００１１】
「遺伝子マーカー」は検出可能なＤＮＡ配列である。ヒト遺伝学では、マーカーは異なった個体によって異なった形態を取り得る特定のＤＮＡ配列である。このマーカー多型により系統学の分岐に沿ったその伝達に追随することが可能になる。
従来のマーカーは大きく２つに分類することができる。すなわちマイクロサテライトマーカーとＳＮＰ（一塩基多型）である。
マイクロサテライトは比較的簡単なモチーフ、通常はジ、トリ又はテトラヌクレオチドによって構成された反復ＤＮＡ配列である。反復数は個体ごとに与えられたモチーフによって変化し、数ユニット（ジヌクレオチドに対して最小１２）から百を超えるまで変わり得る。その配列は殆ど無作為な形でゲノム全体に分散しているが、個体毎に同一の位置に分散している。それらは非常に豊富であり（１００００ヌクレオチド＝１０ｋｂ毎に約一つ）、非常に多形性である。タンデム反復の長さ（反復の数）変動がマーカーを構成する。よって、上記マイクロサテライト配列は遺伝子マーカーとして広く使用されている。
【００１２】
通常、共存以外にマイクロサテライトマーカーと遺伝子間に明確なリンクはない。現在の知識によれば、ある種の疾患に関連する遺伝子内マーカーの幾つかの稀な場合は別にして、タンデム反復の長さは遺伝子の役割には関連していない。本発明において、マイクロサテライトマーカーは若白髪に関連する遺伝子を局在化させる道具である。マーカーにおけるよりも遺伝子における多形性が更に低いので、対立遺伝子は同じマイクロサテライトマーカーの数個の対立遺伝子によって表される。
染色体における特定のＤＮＡ配列の局在化を定める種々の方法が存在する。測定の物理的単位は塩基対の数である。しかし、センチモルガンがしばしば使用され、組換えの単位であり、よって物理的測定値よりむしろ遺伝的測定値である。同じ染色体上の２つの特定の配列は、減数分裂の間の組み換えに百回に一度変異すれば１センチモルガン分離している。１センチモルガンはおよそ１０６塩基対に等価である。
【００１３】
染色体に沿って特定のＤＮＡ配列を局在化させるための他の方法は、位置が完全に決定され知られている染色体上に存在するマーカーとその位置とを比較することからなる。広く使用されているマーカーは、非常に完全なマップが存在しているマイクロサテライトマーカーである。特に、ＧＤＢ（ゲノムデータベース）はマイクロサテライトを含むＤＮＡの特異的かつ特徴ある指標であるＳＴＳ（配列標識部位）をとりわけ記録するものとして世界中に知られているデータベースである。コードＤｘＳｘｘｘｘ  (例えばＤ６Ｓ２５７)は上記マーカーを特定する作用をし、ＧＤＢ内に受入番号として使用される。上記コードは、ＧＤＢのみがそのタイプのコードを使用するので明確で普遍的な同定手段である。そのようなマイクロサテライトマーカーは約１０ｋｂ毎に見出すことができるので、それをフレーム化するマイクロサテライトマーカーを示すことによって、約１０ｋｂに対して各配列の位置を定めることができる。
【００１４】
ＳＮＰ（一塩基多型）はＤＮＡ中の一塩基に影響を及ぼす多型である。これはヒトゲノムにおける多型の最も広範囲の型であり、また伝達の間の高安定性によって特徴付けられる。上記多型の大部分は機能的な意味を持たない。約１ＳＮＰは１００塩基対毎にカウントされる。そのＳＮＰを知ることにより、ヒトゲノムのマップを樹立することが可能になる。よって、ＳＮＰは真のゲノムマーカーになる。更に、それらは変異するのが遅く、反回性に再出現する機会は殆どない。
【００１５】
ＳＮＰは様々な、無償のアクセス可能なバンク、特にＧＤＢに目録化され、参照される。確実に位置が明らかなＳＮＰ：ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６、ｒｓ３６５２９７、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０に隣接するヒトゲノム配列を図１２に示す。
染色体領域の「２マーカー間（又は２つのマーカー間を含有する、又は２つのマーカーを含んでなる）」という用語は、その２マーカー間に、終端、マーカー配列を含有する全配列を意味する。
【００１６】
逆遺伝学では、インデクスが、変異遺伝子又は与えられた対立遺伝子によって誘導されると思われる表現型の伝達を、同じ家族における既知のマーカーの伝達と比較することから遺伝子の起源を局在化することができる。表現型とマーカーの同時分離に関するデータにより遺伝連鎖解析を実施することが可能になる。
表現型とマーカーの同時伝達は表現型に起因する遺伝子とマーカーが染色体上で互いに物理的に近いことを示唆している。連鎖は、それを持つ家族の遺伝子とマーカーの伝達モデルを分析することにより決定される。
【００１７】
連鎖解析は遺伝子の欠陥又は改変形態を持つマーカーのある種の形態の同時伝達に依存する。しかし、それは先ず第一の工程中に表現型が遺伝子の欠陥又は改変型に関連するという意味で間接的な分析である。ある種の表現型をあてがう際の誤差は研究を損なう。第二に、その研究は統計学に基づいており、その統計学は集団のサンプルの分析に依存し、よってサンプリング法である。最後に、マーカーの特定の対立遺伝子を遺伝子のアレル（実際には表現型）に関連付けることができる場合、関連は家族間サンプルに対して演繹的にのみ有効であることに留意すべきである。
連鎖解析の結果はマーカーと疾患の遺伝子座の間の連鎖度合いに明確に依存している。５センチモルガン(５ｃＭ)は診断のための最小の連鎖であると考えられる。５ｃＭ連鎖とは、正しい結論に到達するのに９５％の機会があり、マーカーと疾患の遺伝子座の間に２０中１だけ組み換えが生じることを意味する。
【００１８】
本発明における「遺伝子」という用語は、厳密にコードしている部分だけではなく非コード化部分、例えば関連したイントロン及び５’及び３’端の調節部分、ＵＴＲ（未翻訳領域）、特にプロモーター又はプロモーター群、エンハンサー等々を意味する。
「ハプロタイプ」は生物の遺伝子材料に存在する対立遺伝子の組み合わせである。対立遺伝子の組み合わせには無作為な組み合わせによる理論上の頻度よりも高頻度に存在するものもある。したがって、このハプロタイプを「連鎖不平衡（ＬＤ）」に存在するとみなす。
表現型を有するヒトにおいてこの多型の頻度が、２つの事象が独立しているときに算出される頻度より高い場合、多型が表現型の出現に「統計学的に関連している」とみなす。
【００１９】
本発明者等は若白髪に関与する第９染色体に属する染色体領域を同定した。特に本発明者等は、本発明の多型と称されるこの染色体領域に属するある種の多型の意味を決定した。
【００２０】
第一の態様では、本発明は、本発明者等が若白髪にそれぞれ関与しているとして同定したヒト第９染色体のＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７に関する。これらのマーカーは第９染色体上のマイクロサテライトマーカーD９S２９０とテロメア領域（長腕のテロメア）によって区切られた染色体領域に属し、遺伝子ＤＤＸ３１及びＧＴＦ３Ｃ４内に位置する。
【００２１】
本発明は、個体の若白髪の素因の診断のための、ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択される少なくとも一つのヒト第９染色体のＳＮＰマーカーの使用に関する。これらＳＮＰの様々な対立遺伝子は図１２に図示する。
本発明において、個体がその家族集団から見て２５歳前に白髪があり、３０歳前で頭髪の５０％がグレイである場合に、若白髪であるとみなす。
【００２２】
「白髪」の表現型において環境因子が「若白髪」の表現型に大きく関与することは確実なので、本発明の目的は、そのような表現型を引き起こすリスク、すなわち若白髪の素因を評価することである。
若白髪の素因とは、若白髪になる集団の割合より高い割合で若白髪になる可能性を意味する。若白髪の形質を有する確率が平均的確率の３倍に等しい場合（西ヨーロッパの白人ではおよそ１％）、素因と言える。
【００２３】
本発明の好適な実施態様では、診断のために４つの単一マーカーを用いる。
本発明の他の実施態様では、診断を確立するために少なくとも２、３又は４のＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７が用いられる。若白髪は目に見える多因子の病気であるため、実際は様々なマーカーから得た情報を組み合わせることがとても参考になることがある。おそらく、マーカーｒｓ３７３９９０２は少なくとも２つのマーカーのすべての組み合わせに現れる。おそらく、個体は２０歳以下のヒトか、若白髪の身体的な徴候を示さない個体である。
【００２４】
本発明の使用は、診断される個体の遺伝子材料に存在するＳＮＰマーカーの対立遺伝子を特に検出することを含んでもよい。診断される個体のＤＮＡを含有するヒト身体の何れの抽出物でも遺伝子材料として適する。特に血液試料や皮膚細胞や毛髪でもよい。
遺伝子材料を含有する試料は、本発明の診断方法を行うために適する少量の血液でもよい。他の体液の試料も本発明に用いてもよい。個体由来の細胞の使用もまた考えられ得る。
分子生物学者に周知の従来の手法を用いて選択されるマーカーの対立遺伝子の検出を行ってもよい；ハイブリダイゼーション試験は特にこの種の工程においてとても一般的である。ＰＣＲによる増幅試験もまたとても広く知られており、９６又は３８４個の試料を含むプレート上で行うことができる。
【００２５】
おそらく、ＳＮＰ ｒｓ３０６５３４のＴ対立遺伝子の存在により個体の若白髪の素因を推察できる。一方、ＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２を用いる場合、若白髪の素因を推察することができるＴ対立遺伝子が存在する。ＳＮＰ ｒｓ５７５９１６の場合、若白髪の素因に影響するＧ対立遺伝子が存在する。最後に、マーカーＳＮＰ ｒｓ３６５２９７を用いる場合、個体の若白髪の素因に影響するＴ対立遺伝子が存在する。
【００２６】
また、本発明は、個体の若白髪の素因の診断方法を包含する。この診断方法は、前記個体の遺伝子材料の試料におけるＳＮＰマーカーの対立遺伝子の検出を含んでなる。本発明のこの態様では、ＳＮＰマーカーはヒト第９染色体のＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択される。実際、本発明はこれらマーカーの対立遺伝子と若白髪の形質との間に存在する統計学的関連を実証した。
「若白髪」の表現型は次世代に受け継がれるので、個体、影響を受けるその親や近親者にとって、症状が現れる前に同じように影響を受けるかどうかを明らかにすることは重要であると思われる。本発明の診断方法は、１８歳以下の個体にも完全に適する。
【００２７】
「遺伝子材料の試料」なる用語は上記に説明した通りである。当分野の技術者は実施する個体の不快を最小限に考慮し、この診断試験に用いることができる試料を決定することができるであろう。必要であれば、他の遺伝的試験とこの診断試験を組み合わせることもできるであろう。
本発明の方法によれば、診断を確立するために単一ＳＮＰの対立遺伝子のみを検出することも可能である。しかしながら、本発明の好適な実施態様では、前記方法は、診断を確立するために挙げた４つのＳＮＰのうち少なくとも２つのＳＮＰの対立遺伝子を決定することを含む。好ましくは、３つのＳＮＰのうち少なくとも１つがＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２である。
【００２８】
個体の若白髪の素因の診断又は該診断を確立するために、該個体で決定した対立遺伝子を他の個体（一又は複数）における同じマーカー（一又は複数）の対立遺伝子（これを対照とする）と比較することが有用である。これらの個体は明らかに若白髪であるか、逆に、明らかに若白髪でない。特に、彼らは３０歳以上の個体であり、明らかに白髪がない。
また、診断される個体と同じ地理的領域にある個体、又は診断される個体と血縁関係にある個体、例えば彼／彼女の親や彼／彼女の同胞などを対照として選択することが有用である。
【００２９】
マーカーｒｓ３０６５３４の対立遺伝子がこの方法によって決定される場合、このマーカーの対立遺伝子がＴである時に素因が推察されるのが望ましい。
マーカーｒｓ３７３９９０２の対立遺伝子が決定される場合、Ｔ対立遺伝子により若白髪の素因が推察され得る。
マーカーｒｓ５７５９１６の場合、このマーカーのＧ対立遺伝子により若白髪の素因が示唆される。
最後に、本発明の方法によりＳＮＰ ｒｓ３６５２９７の対立遺伝子が決定される場合、Ｔ対立遺伝子の存在において若白髪の素因が推察されるであろう。
【００３０】
また、本発明は、若白髪の素因の診断のためのＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための手段の使用に関連する。本発明の使用では、前記手段によって、診断されるべき個体の遺伝子材料の試料において少なくとも一のＳＮＰの対立遺伝子を検出することが可能である。対立遺伝子を検出するのに望ましいＳＮＰは、以下の４つのヒト第９染色体のＳＮＰマーカー：ＳＮＰ ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択される。
この使用に変法では、少なくとも２つの手段を用いて４つのＳＮＰのうちの一の対立遺伝子を検出する。他の変法では、様々な手段、好ましくは４つのＳＮＰのうちの３つの対立遺伝子を検出するための手段又は４つのＳＮＰの対立遺伝子を検出するための手段を用いて、ＳＮＰ ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７の少なくとも２つの離れたＳＮＰの対立遺伝子を検出することが可能である。
【００３１】
また、手段の使用によりＳＮＰ ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択したＳＮＰの２つの対立遺伝子を検出することができることが考えられ得る。最後に、全段落に記載の様々な手段を組み合わせて使用することも有用であろう。
好ましくは、複数の手段のうちの少なくとも一によってＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２の対立遺伝子を決定することができる。
【００３２】
ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための手段として、ＤＮＡ又はＲＮＡの試料の配列を決定することができる配列決定装置が特に含まれる。ＳＮＰの対立遺伝子を決定するために、ストリンジェントな条件下にて対立遺伝子の一のみとハイブリダイズして他のものとハイブリダイズしない核酸プローブを用いることも考慮される。上記の４つのＳＮＰマーカーは実際に双対立遺伝子である。
厳密な相補鎖の場合のみに試料とプローブがハイブリダイゼーションすることができる高度にストリンジェントな条件は当分野の技術者によって決定することができる。それは特にプローブの長さに依存する。塩濃度（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）、非特異的物質（例えばシャケ精子）及び温度が上昇する場合にストリンジェンシーは増加する。
【００３３】
例えば、そのようなプローブはヒト第９染色体上のＳＮＰマーカー周辺領域（及び／又は含む領域）に一致するポリヌクレオチド断片である。通常そのような断片は１０ないし５０ヌクレオチドを含む長さ、好ましくは１２ないし３５ヌクレオチド又は１５ないし２５ヌクレオチドである。天然に生じるないしは合成したＤＮＡ又はＲＮＡの断片でもよい。
ＤＮＡ多型を検出することができる他の手段又は方法（アレノタイピング又はジェノタイピング）が周知であり、オリゴヌクレオチドが固定されたチップマイクロアレイが用いられる。
【００３４】
また、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅手順によってＤＮＡ多型を検出することもできる。この場合、例えば、一度に何十もの試料（３８４）を処置することができるマイクロアレイチップの工程を含むＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分光測定技術から開発された技術を用いる。この方法のはじめの工程では、分析すべきＳＮＰを含むＤＮＡ断片を標的として試料をＰＣＲによって増幅する。次いで、伸長反応（ＳＮＰに近いプライマーから始まる）を行う。伸長の長さは対立遺伝子の存在に依存するであろう（なぜなら一対立遺伝子の場合では対立遺伝子がないことことを認識してジデオキシヌクレオチドマーカーｄｄＮＴＰによって伸長が遮断される）。対立遺伝子がない場合の伸長（例えばＡ）とＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによって検出される他の対立遺伝子の場合の伸長（例えばＧ）との間でサイズが異なり（小さい、通常１ないし４ヌクレオチドの違い）、これを記録し例えばジェノタイプＡＡ又はＡＧ又はＧＧとタイピングすることができる。得られた結果は「ＭａｓｓＡＲＲＡＹ」法の方法で処理することができる。
【００３５】
他の従来のジェノタイピング手法は以下の文献に示されている：Tang K, 等 (1999) 「Chip-based genotyping by mass spectrometry」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 10016-10020；Bansal 等 (2002) 「Association testing by DNA pooling - An effective initial screen」, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Dec. 24; 99 (26): 16871-16784；Werner, M. 等 「Large scale determination of SNP allele frequencies in DNA pools using MALDI-TOF mass spectrometry」, Hum. Mutat. 2002 Jul.; 20 (1): 57-64；Stoerker J, Mayo 等 「Rapid genotyping by MALDI-monitored nuclease selection from probe libraries」, Nat. Biotechnol. 2000 Nov.; 18 (11): 1213-1216。
【００３６】
他の方法が当業者に周知であり、特に多型の近傍のプライマーの後に伸長した結果生じる多型部位の近傍にあるＤＮＡのミニ配列に基づくものがある。また、リアルタイムＰＣＲによって試料に存在するＳＮＰの対立遺伝子に関する情報を得ると予測される。
処置する試料の数や対立遺伝子の決定にかけられる費用に応じて、当業者は考えられる又は利用可能な多くの技術のうちどの技術を用いるかを考えるだろう。
【００３７】
核酸プローブを用いる場合、検出用試薬、例えば放射線マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと適宜結合させる。
一実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってｒｓ３０６５３４の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このＳＮＰのＴ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、該マーカーのＣ対立遺伝子を検出することができる。
他の実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってマーカーｒｓ３７３９９０２の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このマーカーのＴ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、Ａ対立遺伝子を検出することができる。このマーカーは本発明の目的に非常に好ましい。
他の実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってｒｓ５７５９１６の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このマーカーのＧ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、Ｃ対立遺伝子を検出することができる。
【００３８】
他の実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってｒｓ３６５２９７の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このマーカーのＴ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、Ｇ対立遺伝子を検出することができる。
また、本発明は、若白髪の素因の診断のためのキットに関する。本発明のキットは、個体の遺伝子材料の試料においてＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための少なくとも一の手段を含んでなる。本発明では、その対立遺伝子を検出しようとするＳＮＰマーカーはヒト第９染色体上に存在する以下のＳＮＰマーカー：ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択される。
【００３９】
また、前記キットは記載したように陽性対照又は陰性対照を含む。陽性対照は、遺伝子材料が若白髪の素因を示唆していることを意味する。陰性対照は、遺伝子材料が若白髪の素因がないことを示唆していることを意味する。
前項に詳述したように、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための手段は特に配列決定装置及びストリンジェントな条件下で一対立遺伝子とハイブリダイズし他にはハイブリダイズしない核酸プローブを意味する。また、ある条件下でＰＣＲによって得た産物のサイズが増幅された対立遺伝子ごとに異なるサイズとなるようなすべてのプライマーを含む。この場合、この手段によってＳＮＰの両対立遺伝子を同時に検出することが可能であり、個体がホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが示される。
【００４０】
プローブを用いる場合、例えばそれらはヒト第９染色体上のＳＮＰマーカー周辺領域に一致するポリヌクレオチド断片である。通常、そのような断片は１０ないし５０のヌクレオチドを含む長さ、好ましくは１２ないし３５、又は１５ないし２５のヌクレオチドである。それは天然に生じるないしは合成したＤＮＡ又はＲＮＡの断片でもよい。プローブは適宜支持体（チップマイクロアレイ）上に固定する。使用するストリンジェントな条件は既に前項で述べた。
核酸プローブは検出用試薬、例えば放射線マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと適宜結合させる。
【００４１】
本発明のキットの好適な実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってｒｓ３０６５３４の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このマーカーのＴ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、該マーカーのＣ対立遺伝子を検出することができる。
他の実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってマーカーｒｓ３７３９９０２の対立遺伝子を検出することができる。このマーカーは本発明の目的に非常に好ましいマーカーである。好ましくは、このマーカーのＴ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、Ａ対立遺伝子を検出することができる。
他の実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってｒｓ５７５９１６の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このマーカーのＧ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、Ｃ対立遺伝子を検出することができる。
【００４２】
他の実施態様では、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出する手段によってｒｓ３６５２９７の対立遺伝子を検出することができる。好ましくは、このマーカーのＴ対立遺伝子を検出することができる；あるいは、Ｇ対立遺伝子を検出することができる。
また、本発明のキットにおいて４つのＳＮＰのうちの一の対立遺伝子を検出することができる少なくとも２つの手段を組み合わせることが有用である。それは例えば、それぞれＳＮＰ ｒｓ３０６５３４のＣ対立遺伝子を検出可能とする２つの異なるプローブである。他の変法では、前記キットはＳＮＰ ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７のうちの少なくとも２つの異なる対立遺伝子を検出することができる様々な手段、好ましくは４つのＳＮＰのうちの３つの対立遺伝子を検出するための手段、又は４つのＳＮＰの対立遺伝子を検出するための手段を含んでなる。好ましくは、少なくとも一の手段によりＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２の対立遺伝子を検出することができる。
【００４３】
また、前記キットがＳＮＰ ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７から選択したＳＮＰの両対立遺伝子を検出することができる手段を含んでなることが考えられる。例えば、前記キットは、ｒｓ３７３９９０２のＴ対立遺伝子を検出する第一手段と、同じＳＮＰマーカーのＡ対立遺伝子を検出する第二手段を含んでなる。
また、本発明のキットは前項で述べたような異なる手段の組み合わせを含んでもよい。好ましくは、本発明のキットは一緒に梱包された少なくとも３つの構成成分を含んでなる。また、本発明のキットは１０００未満、好ましくは４００未満の異なる構成成分を含む。
【００４４】
第二の態様では、本発明は、若白髪の素因に関連するハプロタイプを形成するとして発明者等によって同定されたヒト第９染色体上のＳＮＰマーカーｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０に関連する。これらのマーカーは第９染色体上のマイクロサテライトマーカーD９S２９０とテロメア領域（長腕のテロメア）によって区切られた染色体領域に属し、遺伝子ＤＤＸ３１及びＧＴＦ３Ｃ４内に位置する。
本発明者等は、これら３つのマーカーの特定の対立遺伝子が通常の頻度より有意に高い頻度で若白髪になる個体に見られることを示し、ＨＡＰ２５-２７と称する若白髪関連ハプロタイプを定義する。
【００４５】
本発明は、個体の若白髪の素因の診断のための方法を包含する。この診断方法は、３つのＳＮＰマーカーに関連する個体のハプロタイプを同定するために該個体の遺伝子材料の試料においてこれら３つのＳＮＰマーカーの対立遺伝子を決定することを含んでなる。
個体の若白髪の素因の診断又は該診断を確立するために、該個体で決定したハプロタイプＨＡＰ２５-２７を他の個体（一又は複数）のハプロタイプ（これを対照（一又は複数）とする）と比較することが有用である。これらの個体は明らかに若白髪であるか、逆に、明らかに若白髪でない。特に、彼らは３０歳以上の個体であり、明らかに白髪がない。
また、診断される個体と同じ地理的領域にある個体、又は診断される個体と血縁関係にある個体、例えば彼／彼女の親や彼／彼女の同胞などを対照として選択することが有用である。
【００４６】
若白髪の個体において有意に高頻度に見られる特定のハプロタイプは、これら同じハプロタイプを示す個体の若白髪の素因の可能性と実質的に同義である。
また、本発明は、若白髪の素因の診断のための、ハプロタイプＨＡＰ２５-２７を定義する３つのマーカーｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０の対立遺伝子を検出するための手段の使用に関する。本発明の使用では、前記手段により診断される個体の遺伝子材料の試料においてＳＮＰ ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０の対立遺伝子を検出することができる。
【００４７】
本発明の第一の態様に関連する項目で詳述したように、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子を検出するための手段には特に、配列決定装置（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、ＰＣＲ用プライマー、及び、ストリンジェントな条件下にて対立遺伝子の一のみとハイブリダイズして他のものとハイブリダイズしない核酸プローブが包含される。上記の３つのＳＮＰマーカーは実際に双対立遺伝子である。
例えばそのようなプローブはヒト第９染色体上のＳＮＰマーカー周辺領域に一致するポリヌクレオチド断片である。通常、そのような断片は１０ないし５０のヌクレオチドを含む長さ、好ましくは１２ないし３５、又は１５ないし２５のヌクレオチドである。それは天然に生じるないしは合成したＤＮＡ又はＲＮＡの断片でもよい。プローブは適宜支持体（チップマイクロアレイ）上に固定する。使用するストリンジェントな条件は既に前項で述べた。
【００４８】
核酸プローブは検出用試薬、例えば放射線マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと適宜結合させる。ハプロタイプの３つのマーカーの対立遺伝子を検出するために３つの異なるプローブを用いる場合、３つの異なる検出用試薬、例えば異なる波長で発光する３つの蛍光物質を用いることが有用である。
好適な使用では、３つのＳＮＰのそれぞれの対立遺伝子を検出するために３つの異なる手段から構成される。あるいは、３つ以上の異なる手段から構成されてもよく、特に一のＳＮＰの一及び同じ対立遺伝子を検出するための少なくとも２つの手段、又は、一及び同じＳＮＰの対立遺伝子のそれぞれを検出するための２つの手段を用いることができる。
また、上述した異なる手段のいかなる組み合わせも包含される。
【００４９】
好ましくは、本発明に使用される手段によりマーカーｒｓ３７３９９０２のＴ対立遺伝子、マーカーｒｓ２５８３８０５のＧ対立遺伝子及びマーカーｒｓ３７７０９０のＴ対立遺伝子を検出することができる。
あらゆる他の組み合わせ、例えばマーカーｒｓ３７３９９０２のＴ対立遺伝子、マーカーｒｓ２５８３８０５のＣ対立遺伝子及びマーカーｒｓ３７７０９０のＣ対立遺伝子も本発明で考慮されることを注記する。
実際、例えば、診断を確立するために、ハプロタイプ（Ｔ、Ｃ、Ｃ）の存在を検出することと同様にハプロタイプ（Ｔ、Ｇ、Ｔ）がないことを検出することも参考になりうる。
【００５０】
また、本発明は若白髪の素因の診断のためのキットに関連する。本発明のキットは、個体の遺伝子材料の試料においてＳＮＰマーカーｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０の対立遺伝子を検出するための手段を含む。これらＳＮＰマーカーはヒト第９染色体上に存在し、特定のハプロタイプを明確にすることができ、統計学的に若白髪に関連しているため、症状が現れる前の個体の若白髪の素因を示唆する。
前記キットは、記載したように必須ではないが陽性対照又は陰性対照を含んでもよい。陽性対照は若白髪の素因を示唆する遺伝子材料、例えば若白髪のヒトから採取したＤＮＡ試料を意味する。陰性対照は若白髪の素因がないことを示唆する遺伝子材料である。定義では、キットに存在する４つのマーカーの対立遺伝子を検出するための手段によって、陰性対照に適応する場合は陰性の結果となり、一方陽性対照に適応する場合は陽性の結果となる。
【００５１】
前項に詳述したように、ＳＮＰの対立遺伝子を検出するための手段は、特に、配列決定装置、プライマー、及び、ストリンジェントな条件下にて対立遺伝子の一のみとハイブリダイズして他のものとハイブリダイズしない核酸プローブを意味する。
例えばそのようなプローブはヒト第９染色体上のＳＮＰマーカーに隣接する領域に一致するポリヌクレオチド断片である。通常、そのような断片は１０ないし５０のヌクレオチドを含む長さ、好ましくは１２ないし３５、又は１５ないし２５のヌクレオチドである。それは天然に生じるないしは合成したＤＮＡ又はＲＮＡの断片でもよい。それらは適宜支持体（例えばチップマイクロアレイ）上に固定する。
【００５２】
核酸プローブは検出用試薬、例えば放射線マーカー、酵素マーカー、発光性マーカー又は蛍光性マーカーと適宜結合させる。
また、本発明のキットにおいて３つのＳＮＰの対立遺伝子を検出することができる３つ以上の手段を組み合わせることも有用である。例えば、本発明の第二の態様でのキットは、例えば、それぞれマーカーｒｓ３７３９９０２のＴ対立遺伝子を検出することができる２つの異なるプローブを含んでもよい。
また、前記キットは３つのＳＮＰのうちの一、２又は３つすべての両対立遺伝子を検出することができる手段を含む。例えば、前記キットはマーカーｒｓ３７３９９０２のＴ対立遺伝子を検出することができる第一の手段と、この同じマーカーのＡ対立遺伝子を検出することができる第二の手段、並びにマーカーｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０の２つの対立遺伝子のうちの一を検出することができる他の２つの手段を含んでもよい。
【００５３】
また、本発明のキットは前項で述べたような異なる手段の組み合わせを含みうる。好ましくは、本発明のキットは一緒に梱包された少なくとも３つの構成成分を含んでなる。また、本発明のキットは１０００未満、好ましくは４００未満の異なる構成成分を含む。
また、本発明で挙げた６つのＳＮＰによって示される多型以外の変異（配列変異）についてＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４及びｒｓ３６５２９７に隣接するヒト第９染色体の領域を検索することも本発明で考えられる。実施例４は参考となる変異を決定するための手法を図示したものである。ヒト第９染色体上のマーカーｒｓ３０６５３４とｒｓ３６５２９７の間の領域の検索によって見つかった変異（例えば実施例４に開示した変異）は、若白髪の形質のマーカーとして有用であり得る。前記変異を検出する手段は、本発明の使用及び方法におけるＳＮＰ ｒｓ３０６５３４、ｒｓ３７３９９０２、ｒｓ５７５９１６及びｒｓ３６５２９７の対立遺伝子を検出手段と同じように用いてよい。
【００５４】
第三の態様では、本発明は、他の非ヒト哺乳動物の若白髪（又は毛の早期白色化）の診断に関連する若白髪の素因についての第９染色体内の多型についての結果の応用に関する。この場合、若白髪の遺伝学的診断は、ＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４及びｒｓ３６５２９７に隣接するヒト第９染色体の領域に相同である該哺乳動物のゲノム領域により示される情報に基づく。
この態様では、本発明は、非ヒト哺乳動物において若白髪の素因を診断するために、ＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４及びｒｓ３６５２９７に隣接するヒト第９染色体の領域に相同な非ヒト哺乳動物のゲノム染色体領域のすべて又は一部に一致する配列の少なくとも１８の連続したヌクレオチドを含有してなる少なくとも一のポリヌクレオチド断片の使用に関する。
【００５５】
ＳＮＰマーカーｒｓ３０６５３４及びｒｓ３６５２９７に隣接するヒト第９染色体の領域に相同な非ヒト哺乳動物のゲノム染色体領域（境界を含む）は、本明細書において「相同領域」と称する。
本発明のこの特徴では、ウマ毛の早期白色化を診断するために、非ヒト哺乳動物はウマであることが好ましい。
本発明は、最小で１８ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を包含しており、該配列は少なくとも一部の相同領域に対応しており、若白髪の素因を診断することができる。
【００５６】
本発明で参照されるポリヌクレオチド断片は染色体の断片に対応する。この断片の長さは最小で１８ヌクレオチド、最大では対象とする相同領域の全長に及ぶ。好ましくは、前記断片は１８以上のヌクレオチド数を有する。特に好ましい長さは１８ないし１００００ヌクレオチド、好ましくは３０ないし８０００ヌクレオチドを含む。
このヌクレオチド断片の化学性質を考慮すると、一本鎖ないしは二本鎖、環状ないしは線状ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又は前記のポリヌクレオチド断片の定義による他の任意の分子でもよい。好ましくは、診断される哺乳動物の遺伝子材料と相互作用しうる分子である。
記載したようなポリヌクレオチド断片は天然に生じるないしは合成されたものでもよく、異なる起源の二本鎖からなる「二重」分子である場合にはポリヌクレオチド断片は一方の一部と他方の一部でもよい。本発明に包含される異なる例では、ポリヌクレオチド断片は単離されたものであり、精製工程を経るものであり得る。また、例えば他の生物体内で合成された組み換え断片でもよい。好適な例では、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅され、精製されたＤＮＡ断片である。
【００５７】
本発明の使用は、診断される哺乳動物の遺伝子材料内の相同領域に存在するＳＮＰマーカーの対立遺伝子を決定することを特に含んでなる。非ヒト哺乳動物のＤＮＡを含有する哺乳動物体からの何れの抽出物も遺伝子材料として適する。特に血液試料、又は皮膚細胞又は毛髪でもよい。
遺伝子材料を含む試料は、本発明の方法を行うために好適な一滴の血液でもよい。他の体液試料を本発明に用いてもよい。前記哺乳動物由来のわずかな細胞を用いることもできる。
【００５８】
本発明に包含される他の特定のコンストラクトでは、本発明の第一の使用はプローブに関連するポリヌクレオチド断片の使用である。中でもこの特質により細胞外培地から細胞へ、ないしは細胞質から核への該断片の局在化をモニターすることや、ＤＮＡないしはＲＮＡないしはタンパク質との相互作用を明確にすることが可能となる。また、プローブは断片の分解をモニターすることもできる。該プローブは好ましくは天然の蛍光性、放射性又は酵素性のものである。当分野の技術者はモニターしようとする特質に応じて好適にプローブを選択するであろう。
【００５９】
本発明の使用に用いられるポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション試験、配列決定、マイクロ配列決定又はミスマッチ検出試験に用いられ得る。
本発明の断片は少なくとも１８の連続したヌクレオチドを含んでおり、この１８ヌクレオチドは相同領域のすべて又は一部に対応する配列を構成する。
他の特定の場合では、記載した断片は相同領域の遺伝子の一以上のエキソンに対応しうる。
相同領域のすべて又は一部に少なくともその配列の一部が対応する様々なポリヌクレオチド断片、例えば異なる配列ないしは少なくとも一部異なる２ないし３のポリヌクレオチド断片を用いることができる。
【実施例】
【００６０】
実施例１
遺伝的観点から白髪を探求するために、ＤＮＡ分離研究を、白髪が人生の非常に早い時期に現れた家族に対して実施した。この遺伝子追跡が最も高い確率で成功するようにするために、研究のための試料の構成は表現型の属性決定及び家族の選択についての厳密なプロトコールを用いて決定した。若白髪(ＰＣ)表現型は、白髪を有する２５歳未満の個体で３０歳で頭髪の半分がグレイである個体のみの属性であった。その家族を分離解析でのその統計的成績に基づいて研究のために残した。
試料の統計と表現型の確認に基づいて事前に選別を行ったところ、１２組の家族を連鎖研究に選択し、有益な個体（ＰＣ形質を持つ者と持たない者）のそれぞれの末梢血試料からＤＮＡを調製した。
【００６１】
３つの主要な期間に従って研究を行った：
期間１：研究の有望性の決定。最も有益な家族の最初の選択は連鎖解析シミュレーションによって実施した。
期間２：予め選択された家族の表現型を医学的に確認し血液試料を収集する。この検証キャンペーンにより、研究のための候補家族の新規リストを作成した。新しい連鎖シミュレーションによって訂正された試料の有望性を推定することができた。
期間３：ヒトゲノム全体に対するＰＣについての全遺伝子解析。ＰＣ形質に連鎖する領域を検出するための２２の常染色体及びＸ染色体のDNAについての家族分離解析。
【００６２】
ＰＣ形質を伝達するパラメータを固定するか又は固定しないで実施した一連の解析から、潜在的な遺伝子座が、第９染色体上のマイクロサテライトマーカーD９S２９０とテロメア領域（長腕のテロメア）の間に認められた。該遺伝子座（染色体９ｑ３１-ｑ３２）は若白髪に連鎖していることを示唆する。
この研究、特にパラメトリック／ノンパラメトリック解析で得られたスコア間の不一致は、若白髪が主な効果を持つ少数の遺伝子によって引き起こされているのではなく、むしろ数個の素因遺伝子の作用を含む多因子性システムによって制御されていることを示唆する。
【００６３】
実施例２：ＳＮＰ（一塩基多型）を用いた対象とする領域の解析 
実施例１に提供した研究に続いて、発明者等は、若白髪に関与する遺伝子を証明するために、ＳＮＰに基づいた技術を使用して、第９染色体上の領域の解析を続けた。
ＳＮＰ(一塩基多型) はヒトゲノムにおいて特に広範で非常に安定である多型の形態を表す。ＳＮＰの数は１００ヌクレオチドごとにおよそ１ＳＮＰであると推定され、これにより、ＳＮＰを使用してヒトゲノムの真の地図を樹立することが可能になる。ＳＮＰは、特にそれらがコード化領域、調節領域、又はゲノムの他の非コード化領域にあるかどうか、多型性がコード化アミノ酸を変更するかどうか等々に応じて、しばしば様々なカテゴリーに分類される。
【００６４】
「ヒトゲノムプロジェクト」によって、ＳＮＰはよりよく知られかつ記録され、ゲノム(ＧＤＢ)中にその位置が知られている。
様々な方法を開発して、しばしば点突然変異を検出するために使用される方法(ＲＦＬＰ-ＰＣＲ、特異的対立遺伝子のオリゴマーを用いたハイブリダーゼーション、ミニ-シークエンシング、直接シークエンシング等々)に基づいて、様々な個体間のこれらの多型を明らかにした。
本出願において、本発明者等は候補SNPの異なる対立遺伝子を検出するためにＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ法(マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法) を使用した。この方法の更なる詳細は当業者に周知であり、それらは多くの印刷物 に記載されている(Stoerker J等, Nat Biotechnol 2000, Nov;18(11): 1213-6及びTang K等, Proc Natl Acad Sci USA 1999 Aug, 96, 10016-20)。
【００６５】
第一段階において、発明者等はＳＮＰを用いて解析される第９染色体の領域を非常に正確に定義した。第二工程において、この領域に属するおよそ１０００のＳＮＰをある基準(候補ＳＮＰインシリコ)に基づいて予め選択し、次の実験的確証工程のために２３２を選択した。次の工程において、発明者等は若白髪の異なった個体及び「コントロール」個体からＤＮＡを集めて異なったグループにした後、２３２から選択された１６７のＳＮＰを使用してこれらの異なるグループの遺伝子型を決めた。この遺伝子型決定（ジェノタイピング）の最後に、この結果から個体のジェノタイピングを行うために３３つのＳＮＰを定めることができた。
種々の工程が以下のセクションにおいてより詳細に記載されており、図１に図示する。
【００６６】
１-  ＳＮＰにより解析される領域の定義
第一段階において、本発明者等は、この研究の間に選択された１２組の家族に対して行ったマイクロサテライトマーカーを用いた解析によって得た結果(実施例１参照)から第９染色体上の対象領域をより正確に定義した。
「領域Ｂ」と記された第９染色体上の領域は、その染色体位置と、次の工程のためにこの領域を定める最適な精度と安全性を得るために３つの他のタイプの座標によって定義した。
領域Ｂ：染色体位置：９ｑ３４.１３−９ｑ３４.３ (qter)
Ｄ９Ｓ２９０マーカーとテロメアｑとの間
ＳＮＰ ｒｓ２０９６０７１とＳＮＰ ｒｓ１３７８９５５との間
位置123'405'258bp* と133'021'490bp*との間
＊配列の位置(塩基対ｂｐに関する)は、２００１年１２月に公開されたヒトゲノムベータベースのバージョンの関数として表す(すなわちNCBI Build 28)。
【００６７】
２- ＳＮＰ候補(インシリコ)及び確証(実験的)の調査
上述のＢ領域から出発して、第二工程は、領域のマーカーの地図を得るために、この領域に属するＳＮＰのコレクションを決定することから構成された。これらのマーカーはまた領域の全長を均一にかつ等距離になるように定めた。異なるＳＮＰ間の距離は平均３０ｋｂに固定された。この操作はこれらの基準を満たすおよそ１０００のＳＮＰを選択することによって実施した(インシリコＳＮＰ候補)。
第一工程の間に予め選択されたＳＮＰのうち、およそ９０％のＳＮＰは使用可能であることがわかった。「使用可能」なる用語は、通常の試薬を使用して増幅可能であることを意味する。選択されたＳＮＰを、９２の対照個体(ヒト多型性研究センターからの個体)に対して解析し、それぞれのＳＮＰに対して少なくとも２の対立遺伝子の存在を確証した(多形性確証)。
この実験的選択により、少なくとも１０％の最も珍しい対立遺伝子の対立遺伝子頻度を示すＳＮＰのみを選択した。この方法を使用して、Ｂ領域の２３２のＳＮＰを確認した。
【００６８】
３-  ＤＮＡの集積（プール）
遺伝子型同定（ジェノタイピング）能力を増大させるために、プール化方策をＤＮＡについて実施した。この方法の力は様々な刊行物に報告されている(特にWerner等, Hum Mutat 2002 Jul; 20(1):57-64、Bansal等, Proc Natl Acad Sci USA 2002, Dec 24;99(26): 16871-4)。
プール化を実施するために「若白髪」(ＰＣ)形質の様々な個体及び対照個体からＤＮＡをプールした。プール化は、個体が他の個体と比較して結果に重要な影響を与えないことを保証するために、ＤＮＡの各々が等モルの形で表されるようにして実施した。このために、各ＤＮＡの正確な濃度を、個体から採取した様々な試料での「ピコグリーン」法を使用して測定した。
グループは、以下の方法で各個体に帰す「白髪強度の表現型スコア」を考慮して構成した。
第一工程では、２種類の基準を定義し、２のスコア値を示すものを第一基準、１のスコア値を示すものを第二基準とした。
【００６９】
一次基準は２つある(それぞれに対してスコア値＝２), つまり：(i) １８歳以下で最初に白髪； (ii) ３０歳でかなりの白髪混じりである。
３つの二次基準がある(それぞれに対してスコア値＝１), つまり：(i) ２５歳以下で最初に白髪；(ii) ３０歳で黒い白髪混じり; (iii) 若白髪の家族発症。
各々の診断基準を用いて各個体のスコアを加えることは、若白髪の表現型強度のスコアを各個体にあてがうことができることを意味する。
表現型スコアに応じて幾つかの異なったグループを定義することもまたできる。罹患個体のなかで、７２の個体が４又は５以上のスコアを有しており、１３２の個体が２以上の表現型スコアを有していた。
【００７０】
グループAI：このグループは４又は５の表現型スコアを持つ７２のＰＣ個体からのDNAからなる。
グループAII：このグループは２、３、４又は５の表現型スコアを持つ１３２のＰＣ個体からのDNAからなる。
グループBI及びBII：これらのグループはＰＣ個体のものに近い地理的起源の対照個体からのＤＮＡからなる。これらの対照個体に対しては、選択基準は、(i) ４０歳以上の年齢；(ii) 対照個体に白髪の徴候なし；(iii) 白髪の家族発症なしであった。グループAI又はAIIからの個体との対形成（マッチング）の基準は、１８歳の同一の地理的起源、同性及び同一の毛髪色であった。
【００７１】
このようにして、表現形質(ＰＣ)による罹患対非罹患対を除いて、グループAIの各ＰＣ個体は近い又は同一の地理的起源のグループBIの対照個体によって表された。これは、グループAIIの各個体についても同じであった。
異なったグループの構成を図２に模式的に示す。
罹患被験者及び対照被験者の臨床的診断の厳格な方法の使用により、表現型データの質の信頼性が保証される。
更に、本発明者等によって決められた規則に従った厳密なマッチングにより、プールに集積されるか個々に比較されるかにかかわらず、これら個体からのゲノムデータを比較する統計的解析の妥当性が保証される。
【００７２】
４-  グループ化した／プールしたＤＮＡの遺伝子型決定（ジェノタイピング）のためのSNPの選択
工程２において確認される２３２のうち、１６７のＳＮＰを新規の選択工程において選択した。この新規の選択はSNP間の間隔に基づいており、平均３０〜５０ｋｂとして固定した。
次の工程に使用される種々のＳＮＰを以下の表に示した。またこれらの表には、リストを完全にするために、次の工程に加えられる４の付加的なＳＮＰが含まれている。これらの付加的な４のＳＮＰは、領域ＡのＳＮＰ番号８６、９７、１３１及び１３７である。
Ｂ領域の１７１のＳＮＰは、Ｂ領域に沿って(テロメアｐからテロメアｑへ)増えるように番号が付されており、それらは均一にかつ等距離に存在する。
【００７３】
領域Ｂ：
2007517515.tif 000002
2007517515.tif 000003
【００７４】
５-  プールしたDNAの遺伝子型決定（ジェノタイピング）
工程４で選択した１７１のＳＮＰに対して、次の工程では、表現型の深刻度及び早期性に依存してプールした４つのグループのＤＮＡに対して、その対立形質、つまり、対立遺伝子の各々の頻度を決定することを行った(工程３の４つのグループの定義及び図２を参照のこと)。
両対立遺伝子の対立遺伝子頻度を、４グループのＳＮＰの各々に対して決定した。グループAI及びBI又はAII及びBII間の対立遺伝子頻度の標準偏差の統計的有意差を、有意差を表す「ｐ」値によって推定した。ｐ値が低くなればなるほど、標準偏差がいっそう統計的に有意になる。
実験は３回繰り返し(３ＰＣＲ)、３回のＰＣＲの各々をＭＡＬＤＩ-ＴＯＦを使用して５回試験し、信頼性のある平均値を得た。
【００７５】
図３は、各ＳＮＰについてＢ領域上で得られた結果(Ｂ領域に沿って１〜１７１の番号が付されている)を例証している。縦座標には１／ｐが示されているが、５００より大きい値(すなわちｐ＜０．００２)は５００までを最大とした。
表１に得られた結果をまとめた：
表１：プールの遺伝子型決定、陽性ＳＮＰの番号
2007517515.tif 000004
【００７６】
これらの結果には、全てが０．０５未満の有意なｐを有するクラスター、すなわち少なくとも３つの連続したＳＮＰが(すなわちヒトゲノム上において互いに物理的に近接して)存在していることが示されている(「陽性ＳＮＰ」と称される)。これらのクラスターのいくつかを図３に示す。
表２にＢ領域におけるＳＮＰ分布の種々の特徴をまとめた：
表２：Ｂ領域中の陽性ＳＮＰの分布特性
2007517515.tif 000005
【００７７】
単離されたクラスターに分布する又は二重「スポット」として分布する陽性ＳＮＰにより検出されたＢ領域の異なる遺伝子は、予測遺伝子を含む候補遺伝子の第一シリーズを構成する。リストは次の通りである：
領域Ｂ：
DDX31, GTF3C4, C9ORF9, TSC1, ABL1, LOC57109, FREQ, ADAMTS13, LAMC3, SURF5, SURF6, FCN2, FCN1, OLFM1, VAV2, ABO, CELL, SARDH。
より詳細な分析を実施し、ENSEMBL(ENSEMBL, v.8.30a.1 17, 2002年9月)を使用して、陽性SNPにより重複した遺伝子の新規のリストを作製した。このリストには陽性SNPにより重複した遺伝子(コード化された非翻訳領域ＵＴＲ、及びイントロン)が含まれ、調節領域に位置する陽性ＳＮＰに近接した遺伝子を除く。
【００７８】
イントロン：
Q96RU3, ABL1, LAMC3, Q96MA6, Q9NXK9, Q9GZR2, VAV2, COL5A1, KCNT1, Q8WX41
ENSEMBLを用いた予測遺伝子についての新規の解析により、次の結果が付与された：
2007517515.tif 000006
以下の表には、NCBI Build 28(Dec 2001)から出発したクラスター、ダブルスポット(ＤＳ)及び個々の陽性ＳＮＰにおける、Ｂ領域での予測遺伝子を示す。「ＣＤＳ」とはコード化配列を示し、「ｔｘ」とは転写物を示す。
【００７９】
2007517515.tif 000007
2007517515.tif 000008
2007517515.tif 000009
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【００８０】
６-  個々のＤＮＡを遺伝子型決定（ジェノタイピング）するためのSNPの選択
プールされたＤＮＡの遺伝子型を決定するために用いられる１７１のＳＮＰのうち、３３を個々のＤＮＡの遺伝子型を決定するために選択した。選択したＳＮＰは、プールされたものの遺伝子型を決定する場合、統計的有意差、すなわちAI-BI、AII-BII又はAI-BIIについてｐ＜０．０５を有する。
選択されたＳＮＰのリスト及びＡ-Ｂ比較を、図４に示す。
表３に得られた結果をまとめた：
表３：プールされたものの遺伝子型決定結果後の陽性ＳＮＰの選択
2007517515.tif 000011
【００８１】
個々の遺伝子型を決定するための３３のＳＮＰの選択を、クラスター、対形成(２つの連続した陽性ＳＮＰ)、及び「ダブルスポット」形成(陰性ＳＮＰから分離された２つの陽性SNP)に存在するSNPに絞った。図５は選択された３３のＳＮＰ分布を例証する。
プールにおける(個々ではない)対立遺伝子頻度の推定値が「偽」陽性となり、プールが２００未満のＤＮＡを含有している場合、この傾向が高い。この結果、単離された陽性ＳＮＰが部分的に推定されるだけでなく、対照(BI及びBII)と不一致であった。
３３のＳＮＰを、すべての入手可能なＤＮＡ(ＰＣ表現型を有する１８７個体とＰＣ表現型を有さない１８６の対照個体)上で個々に解析した。
【００８２】
選択した３３のＳＮＰのうち１６ＳＮＰはクラスター中にあり、６ＳＮＰはダブルスポット中にあり、１２ＳＮＰは別々の陽性であった（単離された陽性ＳＮＰ）。
この個々の遺伝子型を決定することにより、異なるグループで観察される対立遺伝子頻度及び遺伝子型決定を正確に算出することができる。またこれらのデータにより、「クラスター」中で組織化された陽性ＳＮＰで観察されるハプロタイプの分布を比較することができる。「ハプロタイプ」なる用語は、共に伝わる傾向にある対立遺伝子の組合せを意味する。
これらの一連のデータを総合解析することにより、ＰＣ形質との関連性を示すＳＮＰ又はＳＮＰ群、すなわち集団において、この形質を高頻度に伝わる対立遺伝子又は一組の対立遺伝子を決定することができた。
【００８３】
７-  連鎖不均衡（ＬＤ）の研究
連鎖不均衡を、解析される染色体上のハプロタイプ相に関するデータがない状態で、GenePopプログラムを使用して解析した。
連鎖不均衡とは、個体頻度の積により予測される頻度より高い頻度で、２つの遺伝子(対立遺伝子)が一緒に分離する状態のことである。これは、２つの遺伝子が統計学的に予測されるよりも高い頻度で一緒に分離するために、該遺伝子は独立しておらず、よって同じ染色体上に互いに近接して位置する対立遺伝子間に非独立性があることを意味する。
この連鎖不平衡を解析することにより、対立遺伝子の同時分離が単一の無作為事象によって起こる同時分離から逸脱する幾つかのマーカーによって表されるＤＮＡのブロックを定義することができる。この状況はこのブロックによる組み換えの不在又は欠損によって生じる。連鎖不平衡を表す領域のサイズは染色体領域によって変わり、１０ｋｂから２００ｋｂにわたって延びるように思われる。結果を図６に示す。
【００８４】
８-  各ＳＮＰについての対立遺伝子／遺伝子型頻度の比較
この対立遺伝子／遺伝子型頻度の比較を、若白髪のグループ(１ないし５)と対照体のグループにおいて、各ＳＮＰに対して行った。得られた結果を以下の表及び図７に示す。
「ｃｏｎ-ｃｏｎ」列は、異なるグループの対照個体の間の比較を示す。「ａｆｆ」列は、全ての罹患又は対照グループと、各グループの罹患個体との比較を示す。
2007517515.tif 000012
【００８５】
９-  結論
この結果から引き出すことのできる主な結論は以下の通りである：
第一に、プール解析と個々の遺伝子型解析（ジェノタイピング）で見出された観察との間にはかなりの類似性がある。
大きな「クラスター」が確認された。
Ｂ領域では、若白髪形質に強く関連した連鎖不均衡における間隔が明らかになった(SNP 418620 からSNP 2526008、位置126'544'533 nt から位置126'745'296 nt、すなわち２０１ｋｂの大きさ)。このクラスターには、遺伝子ＤＤＸ３１、ＧＴＦ３Ｃ４及びＱ９６ＭＡ６が含まれる。
陽性ハプロタイプ又は陽性ＳＮＰのクラスターに関連した間隔において同定された遺伝子又は予測遺伝子は以下の通りである：
【００８６】
ハプロタイプ２７
＞ＦＲＥＱ
産物上のPubMed：フレクエニンホモログ/ マウス・オルソルグ: Freq 
開始(染色体上の位置)：124490317  終了(染色体上の位置)：124554366 
＞NT_030046.18
開始(染色体上の位置)：124458070  終了(染色体上の位置)：124489558 
＞NT_030046.17
開始(染色体上の位置)：124371672  終了(染色体上の位置)：124452860 
【００８７】
ハプロタイプ９７-１００
＞ＧＴＦ３Ｃ５
産物上の PubMed：一般的な転写因子 IIIC、ポリペプチド5 
開始(染色体上の位置)：127480920  終了(染色体上の位置)：127508694
＞ＣＥＬ
産物上のPubMed：カルボキシルエステルリパーゼ (胆汁塩-刺激)
開始(染色体上の位置)：127512178  終了(染色体上の位置)：127522054 
＞ＣＥＬＬ
産物上のPubMed：カルボキシエステルリパーゼ様 (胆汁塩-刺激)
開始(染色体上の位置)：127532733  終了(染色体上の位置)：127537549 
＞ＦＳ
産物上のPubMed：フォルスマンシンテターゼ
開始(染色体上の位置)：127603661  終了(染色体上の位置)：127614093 
＞ＡＢＯ血液群 (トタンスフェラーゼ A, アルファ)
開始(染色体上の位置)：127907180  終了(染色体上の位置)：127924298 
【００８８】
ハプロタイプ８６-９２
＞ＢＡＲＨＬ１  
＞ＤＤＸ３１  
＞ＧＴＦ３Ｃ４  
＞Ｑ９６ＭＡ６ (アデニル酸シクラーゼ)
【００８９】
実施例３：ハプロタイプ８６-９２領域の詳細な解析
実施例２に示した研究に続いて、本発明者等は、若白髪に関連する対立遺伝子を検出するためにＳＮＰに基づく技術を用いてハプロタイプ８６-９２によって定義される第９染色体上の領域の解析を続けた。
【００９０】
１- この領域の５の新規ＳＮＰの追加
ハプロタイプ８６-９２の領域において、実施例２で行った個々の遺伝子型決定の結果に見られるように、以下の５ＳＮＰを保存した：
SNP 86: 418620；SNP 88: rs302919；SNP 90: 932886；
SNP 91: 429269；SNP 92: 2526008
第一段階では、本発明者等は前述のリストを完全にするためにこの領域内に新規の５ＳＮＰを決めた。この５つの付加的ＳＮＰは、既に他の研究グループによってその多型が確認されているＳＮＰから選択した。
この５つの付加的ＳＮＰは第９染色体上の既に挙げた５のＳＮＰと比較して相対的位置として86a、86b、86c、86d及び91aと番号を付した（テロメアｐからテロメアｑへ向かって）。
SNP 86a: 306537；SNP 86b: 3739902；SNP 86c: 371169；
SNP 86d: 3780813；SNP 91a: rs106906
定義した１０ＳＮＰの場合、「ｐ値」、すなわちグループAIとBIとの間の統計学的な偏差を算出した（AI：表現型スコア４又は５のＰＣ個体、及びBI：グループAIのヒトに関連した対照；正確な定義については実施例２を参照のこと）。図８に得られた結果を示す。
【００９１】
２- この領域の３０の新規ＳＮＰの追加
先の工程の結果、特に「若白髪」表現形質と領域８６-９２の連鎖に関する陽性の結果から、本発明者等はより有用な一組のＳＮＰを用いてこの領域を検索した。
したがって、この領域の３０の新規のＳＮＰをまとめた。図１１に、これら３０の付加的ＳＮＰの名称、１〜３０の番号、並びに既に定義された１０のＳＮＰと比較して第９染色体上の相対的な位置を示す。また、この表は３０の付加的ＳＮＰと既に選択された１０のＳＮＰの合計について１〜４０の再番号付けを示す。
３０の付加的ＳＮＰの場合、本発明者等はグループAIの個体とグループBIの個体との間の統計学的な偏差であるｐ値も算出した。図９に得られた結果を示す。
【００９２】
最後に、本発明者等は領域８６-９２をカバーする４０のＳＮＰについて得られたｐ値の結果をまとめた。この結果を図１０に示す。この図では、ＳＮＰを含む横座標軸は第９染色体上のＳＮＰ間の実際の間隔を考慮して目盛りを付けた。
また、図１１にｐ値を示す（実際はログｐ）。０．００１より小さいｐ値は有意な連鎖を示唆すると思われる。
図１１に示す結果の解析により、４つのＳＮＰが２．３より大きい関連値ログｐを有する非常に注目すべき結果であることが示された。そのＳＮＰは：ｒｓ３０６５３４(ＳＮＰ  １６／４０)；ｒｓ３７３９９０２(ＳＮＰ  ２５／４０)；ｒｓ５７５９１６(ＳＮＰ  ３０／４０)及びｒｓ３６５２９７(ＳＮＰ  ３１／４０)である。したがって、若白髪形質と関連した値を示すＳＮＰは特に若白髪の診断に関するいかなる使用にも向いている。
【００９３】
３- ハプロタイプの解析
本発明者等は領域８６-９２のＳＮＰが最終的に２つの領域、つまり連鎖不均衡にある領域８６-８８と領域９０-９２に分布されることを明らかにした。
したがって、本発明者等は若白髪形質に関する２つのハプロタイプの関連性を研究した。その結果を図１３の２つの表に示す。この図では関連性が非常に有意である（ｐ＜１０−５）であることが明らかである。
ハプロタイプで得られた結果とマーカーｒｓ３７３９９０２について得られた結果（ログｐ＞３）から、本発明者等は、若白髪と特に近い連鎖を示すより明確なハプロタイプを決定するためにより正確にＳＮＰｒｓ３７３９９０２の近接領域を解析した。したがって、本発明者等はＳＮＰ２５〜２７によって定義されるハプロタイプＨＡＰ２５-２７を確認することができた（図１０参照）。その若白髪との連鎖スコアは非常に高かった。ハプロタイプに関与する２５〜２７の３つのＳＮＰはｒｓ３７３９９０２、ｒｓ２５８３８０５及びｒｓ３７７０９０である。
【００９４】
実施例４：領域Ｂ８６-８８における変異検索
Ｂ８６-８８領域のコード配列及び非コード配列における変異検索
密集したＳＮＰマーカーを用いた形質ＰＣの事例-対照研究によって得られた強い関連性は、先の実施例に示したように第９染色体のおよそ６０ｋｂの領域をカバーしている。この領域には２つの遺伝子、ＤＤＸ３１とＧＴＦ３Ｃ４が存在する。さらにＰＣ形質におけるこの領域の潜在的機能的役割を研究するために、本発明者等は両候補遺伝子のコード領域とスプライシング領域（ＤＤＸ３１、２０のエキソン；ＧＴＦ３Ｃ４、５のエキソン）における変異の検索を行った。
また、ＤＤＸ３１とＧＴＦ３Ｃ４の第一エキソンの間の５００ｂｐの領域にある２つの遺伝子の全５'ＵＴＲ領域を配列決定した。この領域はＤＤＸ３１とＧＴＦ３Ｃ４遺伝子のプロモータを含むと思われる。
加えてまた、本発明者等は、機能的役割（遺伝子発現の調節、ＤＮＡの構造など）を有するかもしれない６０ＫｂのＰＣ関連領域にあるこれら遺伝子のコード領域（保存された非遺伝子(Conserved Non Genic)領域、ＣＮＧ、Dermitzakis等 Science 2003を参照）の外に存在する（マウスと比較して）高度に保存された領域の配列も決定した。
【００９５】
方法
エキソン、イントロン-エキソン結合部及び非コード配列のＤＮＡを、それぞれのゲノム部位に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲによってそれぞれ別々に増幅した。
サンガー法によるＤＮＡ直接配列決定によってデータを求めた。ＰＣＲ産物はそれぞれ精製してジデオキシ終末反応を行った。配列決定した断片は自動１６キャピラリーＤＮＡ分析機(Applied Biosystems, model 3100)によって分析した。
配列決定データは、様々な配列を一緒に比較することができるＤＮＡ配列アライメントプログラムを用いて分析した。
対照配列（ヒトゲノムプロジェクトによって得られた配列）から変化したすべてのヌクレオチドを記録した。非サイレント変異又は機能的に重要な影響を及ぼしうる変異のすべてを事例と対照集団において検索した。
直接配列決定法ないしはＳＮＰ遺伝子型決定（ジェノタイピング）(Pyrosequencing)の何れかによって集団検索を行った。
【００９６】
ＤＮＡ試料
本発明者等は、ＰＣ固体と対照個体のＤＮＡの解析を行った。影響を受けた固体は第９染色体のこの領域とＰＣ形質との連鎖を示す６の家族から得たものである。追加の６固体は高い表現型スコアを示すものの中から選んだ（実施例２を参照、白髪強度の表現型スコアの定義についてはポイント３）。前段階で除外されるＰＣ形質の追加の６対照個体も分析に加えた。
【００９７】
結果
ＰＣ、対照又はそれぞれの両グループにおいて多くのＤＮＡ変異が明らかとなった。遺伝子ＤＤＸ３１とＧＴＦ３Ｃ４は同様のサイズのコード領域を有しているが（８５１対８２２残基）、ＧＴＦ３Ｃ４よりもＤＤＸ３１においてより多くの変異が記録された（７対２変異）。
2007517515.tif 000013
ヌクレオチドの位置はコード配列の開始を目安とする、すなわち、「ｃ.４１３」はコード配列の第４１３番目のヌクレオチドを意味し、第１番目のヌクレオチドはコドンＡＴＧの「Ａ」である。
ＩＶＳは「介在配列」を意味する、すなわち、エキソン「ＩＶＳ４＋」は第４エキソンに接するイントロン３を意味し、「ＩＶＳ４−」第４エキソンに接するイントロン５を意味する。「ＩＶＳ４＋１５＿１７」はエキソン４とエキソン５の間のイントロン、すなわち第４エキソンに接するイントロン３の第１５、１６及び１７番目のヌクレオチドを意味する。
「Ａ８００Ｔ」及び「Ｉ７９９Ｖ」はアミノ酸配列の変異である。
【００９８】
エキソン変異
遺伝子ＤＤＸ３１では、本発明者等は、スプライシング部位に近い位置にある４つのエキソン性変異（エキソン２、１３及び２０）と３つのイントロン性変異を同定した（スプライシング部位から１−２０ｂｐの距離にある）。
遺伝子ＧＴＦ３Ｃ４では、本発明者等は、スプライシング部位に近い２つのエキソン性変異（エキソン２、３）を同定し、イントロン性変異は同定されなかった。
遺伝子ＤＤＸ３１のエキソン２０では非サイレント変異のみが見つかった。コドン７９９の変異によりアミノ酸残基イソロイシンからバリンへのタンパク質ＤＤＸ３１内の翻訳変異（Ｉ７９９Ｖ）を示した。また、このヌクレオチド変異は多型（ＳＮＰ ｒｓ３０６５４７として周知）として周知であり、１２のうち６の影響を受けた個体のＤＮＡにおいてヘテロ接合体として見られ；６個体ではこの変異（Ｖ７９９）をホモ接合体を示す。Ｉ７９９Ｖは６対照体のすべてにおいてヘテロ接合体として同定された。全体として、試験した個体の事例群（６４個体）と対照群（６４個体）の間で遺伝子型及び対立遺伝子型それぞれの頻度に有意な差は見られなかった（表）。
2007517515.tif 000014
【００９９】
集団の一事例個体において、遺伝子ＤＤＸ３１のエキソン２０において他の非サイレントミスセンス変異（コドン８００、アラニンからスレオニンへの変異、Ａ８００Ｔ）がヘテロ接合体で見られた。この変異Ａ８００Ｔの潜在的効果を予測するために、大集団の事例(affected)個体（６４）及び対照個体（６４）を分析したところ、ＰＣ個体又は対照個体の何れにもこのＤＮＡ変異の他のキャリアは見つからなかった。ＤＮＡ配列は小極性アミノ酸による小アミノ酸の置換をコードする。マウスの相同タンパク質ｄｄｘ３１残基もヒトではアラニンであるがスレオニンとなっているので、進化の過程において位置８００の残基は保存されていない。
2007517515.tif 000015
【０１００】
イントロン変異
他の興味ある変異は、遺伝子ＤＤＸ３１のイントロン４内のＣＴＣＣＴＣタンデムリピートモチーフにおける三ヌクレオチドＣＴＣの欠損である（ＩＶＳ４＋１５＿１７ｄｅｌＣＴＣ）。興味深いことに、試験した事例個体と対照個体の任意の個体において欠損したＣＴＣをホモ接合体として見られない。
欠損-対立遺伝子についてヘテロ接合体に持つキャリアの頻度の差は、対照個体の９．２６％（１６２リード）及びスコア１〜４のＰＣ個体と混合個体(Piebaldism)のグループの平均遺伝子型頻度７．６５％と比較して、スコア５の患者グループで２３．８％と最も高かった。
2007517515.tif 000016
【０１０１】
予測されるプロモータ領域（ＣｐＧアイランドにおいて）
両５'ＵＴＲに位置する介在配列では変異が検出されなかった（遺伝子ＧＴＦ３Ｃ４及びＤＤＸ３１はＡＴＧコドンから正方向に近接している）。この領域はＣＰＧアイランドと称される。
【０１０２】
保存された非遺伝子領域
また、本発明者等は、この遺伝子座で同定される保存された非遺伝子配列（ＣＮＧ）を解析した。１２の事例＋６の対照集団で解析した２０のＣＮＧ配列のうち、ＤＤＸ３１-ＣＮＧｈｓ８と称される唯一の変異がＣＮＧ内で同定された。それは遺伝子ＤＤＸ３１のイントロン１８内に存在する(IVS18+3781-4397／ IVS19-1677-2293)。
１７７の事例ＤＮＡ及び７１の対照ＤＮＡの遺伝子型頻度と対立遺伝子型頻度の比較解析により、ヘテロ接合性遺伝子型、すなわち対立遺伝子ＣとＴとの組み合わせ遺伝子型が表現型スコア５の事例(affected)個体で見られた（４５％対３２％）。このＣＮＧはヒトからマウス、ニワトリ及びマフグ(purple puffer)に高度に保存されている。
2007517515.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＳＮＰに基づく技術を使用した、Ｂ領域の解析における異なる工程での要約フローチャート。
【図２】４組のプールの構成。プールAI及びAIIは 若白髪の個体から構成される。二組の対照プールBI及びBIIは若白髪の個体の起源及び年齢に関して「交差した」個体から構成される。
【図３】領域Ｂに対してプール上で試験された１７１のSNPの有意差を示すグラフ。SNPは、領域Ｂに沿って１〜１７１まで番号を付して横座標に示し(テロメアｐからテロメアｑ)、各SNPは平均３０kb領域でその隣接部から離間している。１／ｐ値は縦座標上にあり、ｐは統計的有意差である。しかしながら、５００より多い１／ｐ(すなわちｐ＜０．０２)でも５００までを最大とする。
【図４】個体のジェノタイピングのために選択した３３のSNPを示す表。第１列にはそれらの番号(先の工程において、テロメアｐからテロメアｑまでのＢ領域に沿って１〜１７１の番号を付す)を示す。第２列にはSNPの名称を示す。次の列には、ｐ値に関連した種々のＡ-Ｂの比較(AI-BI；AII-BII；AI-BII)の値を示す。注釈「Ｍ」は０．０５未満の有意差「ｐ」値を示す。最後の列は、前記SNPにより重複しうる遺伝子を示す。
【図５】個体のジェノタイピングのために選択した３３のSNPを示す表。第１列には染色体上の位置を示し、第２列にはそれらの識別子を示し、次の列にはそれらの番号(先の工程において、テロメアｐからテロメアｑまでのＢ領域に沿って１〜１７１の番号を付す)を付与する。次の列には、SNPがクラスター又はダブルスポットに存在するか否かを示している。
【図６】Ｂ領域における連鎖不均衡の結果を示す略図。同時に２つ取り込むSNP間の関連の有意差をカラーコードにより示す。
【図７】SNP／表現型の組み合わせに光をあて、「若白髪」と対照グループにおけるＢ領域の各SNPに対する対立遺伝子／遺伝子型（ジェノタイプ）の頻度を比較するグラフ。関連した遺伝子はSNPと共に横座標に示される。
【図８】対象とする領域における第一工程で使用した１０のＳＮＰについてのログｐ値（ｐは「ｐ値」である）を示すグラフ。「ｐ値」は、スコア４又は５を表す白髪個体とグループ４及び５の個体に相当する対照個体との間でのハプロタイプ頻度の比較によって得た。また、グラフは２つのハプロタイプ８６-８８と９０-９２の間の解離を示す。横座標上のＳＮＰ間のスペーシングは任意であり、ＳＮＰ内の距離に比例しない。ＳＮＰが位置している領域内の遺伝子もまたそうである。
【図９】対象とする領域における第二工程で付加した３０のＳＮＰについてのログｐ値（ｐは「ｐ値」である）を示すグラフ。変数は図８のものと同じである。３０のＳＮＰについて１〜３０のＳＮＰの番号を横座標に示す。（３０のうち）ＳＮＰの数とＳＮＰの識別子との対応は図１１の表で説明する（旧番号ＤＧＭ ＳＮＰ＃）。さらに、横座標Ｘの目盛りは互いのＳＮＰの相対的位置を表すものではない。
【図１０】対象とする領域における４０のＳＮＰ（１０＋３０）についてのログｐ値（ｐは「ｐ値」である）を示すグラフ。試験した合計４０のＳＮＰについて１〜４０のＳＮＰの番号を横座標に示す。（４０のうち）ＳＮＰの数とＳＮＰの識別子との対応は図１１、右側の表で説明する（分析番号）。Ｘの目盛りは第９染色体の物理的地図上での互いのＳＮＰの相対的位置を表す。連鎖が最も有意な領域を示す。
【図１１】対象とする領域（領域Ｂ８６-９２）で試験した４０のＳＮＰを表に挙げる。第１列はBuild NCBI 28 (hg 10 Dec2001 NCBI Build 28)に基づく「Freeze of UCSC of December 2001」に従って第９染色体上のいくつかのＳＮＰの位置を示し、第２列はBuild NCBI 31 (November 2002)に基づくENSEMBL配列ライブラリ バージョンV14.31.1に従って位置を示す。以降の列は、ＳＮＰのＧＤＢ識別子、実施例３の第一段階（１０＋３０）におけるＳＮＰの番号、第二段階（４０）におけるＳＮＰの番号、最後は関連の値（ログｐ）をそれぞれ示す。
【図１２】本発明の６つのＳＮＰについて、第９染色体上に隣接する配列並びに発見されたＳＮＰの２つの対立遺伝子を示す。
【図１３】２つのハプロタイプの関連値を表に示す（Ｓ．Ｅ．は標準誤差を指す）。実際、ＳＮＰ８６-８８及び９０-９２は最終的に連鎖不均衡にある２つの領域に位置している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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