(57)【要約】遺伝子、細胞などの生体物質を効率よく有効に生体内に注入するシステムを提供することが課題である。生体内への生体物質の注入の際に、一定範囲の速度以内の速度で加速し、その後一定範囲内の速度を維持することによって、その生体物質を生体内に注入することが予想外に達成されたことによって解決された。従って、本発明は、生体物質を含む薬液注入方法であって、該生体物質を含む薬液を、一定範囲内の速度を維持しながら該生体物質を含む薬液の注入する工程；を包含する、方法ならびにこれを実現する装置を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）注入手段内に含まれる、生体物質を含む薬液を、一定範囲内の速度で被検体に注入する工程；
を包含する、生体物質を含む薬液の注入方法。
【請求項２】
前記一定範囲の速度は、前記生体物質の生物学的活性を保持することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一定範囲内の速度は、約２０ｍｌ／分以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一定範囲内の速度は、約１０ｍｌ／分未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一定範囲内の速度は、約１ｍｌ／分以上であり、約１０ｍｌ／分未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｂ）前記生体物質を含む薬液を、一定範囲内の加速度で加速して前記一定範囲内の速度にする工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記一定範囲内の加速度は、前記生体物質の生物学的活性を保持することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記一定範囲内の加速度は、約１ｍｍ／秒２〜約１５ｍｍ／秒２の範囲内にある、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記注入手段のボディの内径は、約１ｍｍ〜約３０ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記注入手段の先端の管体の内径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体物質は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子、細胞、組織ならびに臓器からなる群より選択される物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体物質は、細胞であり、前記速度は、約１ｍｌ／分〜約２０ｍｌ／分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体物質は、細胞であり、前記速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、
Ｃ）前記生体物質を含む薬液の速度を、一定範囲内の加速度で減速しながら、実質的にゼロにする工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記減速の加速度の絶対値は、約１ｍｍ／秒２〜約１５ｍｍ／秒２の範囲内にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記注入は、心臓の治療または予防のために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ａ）一定範囲内の速度で注入手段内に含まれる生体物質を含む薬液を被検体に注入する工程；
を包含する、生体物質を含む薬液を用いた臓器治療方法。
【請求項１８】
生体物質を含む薬液の注入システムであって、
Ａ）該生体物質を含む薬液を、目的の生体内に注入する手段；および
Ｂ）該生体物質を含む薬液の注入を、該生体物質を含む薬液の注入速度を一定範囲内に維持し得るよう調節する手段、
を備える、システム。
【請求項１９】
前記一定範囲の速度は、前記生体物質の生物学的活性を保持することを特徴とする、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記一定範囲内の速度は、約２０ｍｌ／分以下である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記一定範囲内の速度は、約１０ｍｌ／分未満である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記一定範囲内の速度は、約１ｍｌ／分以上であり、約１０ｍｌ／分未満である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記調節する手段は、前記生体物質を含む薬液を一定範囲内の加速度で加速し得るよう調節し得る、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２４】
前記一定範囲内の加速度は、前記生体物質の生物学的活性を保持することを特徴とする、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記一定範囲内の加速度は、約１ｍｍ／秒２〜約１５ｍｍ／秒２の範囲内にある、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記注入手段のボディの内径は、約１ｍｍ〜約３０ｍｍである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２７】
前記注入手段の先端の管体の内径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２８】
前記注入手段は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子、細胞、組織ならびに臓器からなる群より選択される少なくとも１つの物質に対して有害な影響を与えないことを特徴とする、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２９】
前記生体物質は、細胞であり、前記速度は、約１ｍｌ／分〜約２０ｍｌ／分である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記生体物質は、細胞であり、前記速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項３１】
前記注入手段の断面積は、約５ｍｍ２〜約１５０ｍｍ２である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項３２】
前記注入は、心臓の治療または予防のためのものである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項３３】
Ａ）該生体物質を含む薬液を、目的の生体内に注入する手段；および
Ｂ）該生体物質を含む薬液の注入を、該生体物質を含む薬液の注入速度を一定範囲内に維持し得るよう調節する手段、
を備える、生体物質を含む薬液を用いた臓器治療システム。
【請求項３４】
薬液が充填可能であり、先端部に薬液吐出用のノズル部を備えたシリンダと、外部からの操作により、該シリンダ内に入れられた薬液を、実質的に一定の速度を保ちながら該ノズル部から押し出す押出手段と、を有する、薬液注入装置。
【請求項３５】
前記押出手段が、前記シリンダ内に移動可能に配置され外周にネジ部が形成されたプランジャーと、
該シリンダの内面に提供される該プランジャーのねじ部に噛み合う溝部とを有する、
請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項３６】
前記押出手段が、前記シリンダ内に移動可能に配置されたプランジャーと、該プランジャーの先端部に設けられた栓とを有し、
該プランジャーは、一定の速度および／または加速度以上の速度および／または加速度により収縮し得るばね状弾性体により構成される、請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項３７】
前記押出手段が、シリンダ内に配置されるプランジャーと該プランジャーの先端部に配置された弾性体とを有し、該弾性体が一定の速度および／または加速度以上の速度および／または加速度により収縮し得るばね状弾性体により構成されている、
請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項３８】
前記押出手段が、前記シリンダ内に移動可能に配置され外周にねじ部が形成されたプランジャーと、該シリンダの内面に提供され該プランジャーのねじ部に噛み合う溝部と
該プランジャーの先端部に提供された弾性体とを有し、
該プランジャーを回転することにより、該プランジャーの先端部でシリンダ内の薬液が押し出され、一定の速度および／または加速度以上の速度および／または加速度よりも大きいときに、該ばね状弾性体が、圧縮され得る、請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項３９】
前記押出手段が、シリンダの内周部に配置された膨張体と、
該膨張体内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段と、
を有し、実質的に一定の速度および／または加速度の非圧縮性流体が該充填手段により膨張体内に充填される、請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項４０】
前記押出手段が、シリンダの後端部に装着された中空の膨張体を有し、該膨張体内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段と、を有し、実質的に一定の速度および／または加速度の非圧縮性流体が該充填手段により膨張体内に充填される、請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項４１】
前記押出手段が、シリンダ内に移動可能に装着されるプランジャーと、該プランジャーを一定速度でシリンダ内に挿入し得る駆動手段と、を有する、請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項４２】
前記薬液が細胞を含む液体である、請求項３４に記載の薬液注入装置。
【請求項４３】
細胞療法のための細胞を含む薬液を注入するシステムであって、
Ａ）目的の生体に対して該細胞を含む薬液を注入するための注入手段；および
Ｂ）該細胞を含む薬液の注入を調節して、該細胞を含む薬液の注入速度が、一定の範囲に維持され得る、調節する手段
を備える、システム。
【請求項４４】
細胞療法のための薬液注入装置であって、
細胞；
該細胞を収容するためのシリンダであって、液薬が薬液が充填可能であり先端部に薬液吐出用のノズル部を備えたシリンダ；および
外部からの操作により該シリンダ内に入れられた薬液を、実質的に一定の速度を保ちながら該ノズル部から押し出す押出手段
を備える、薬液注入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療技術分野、特に、再生・移植医療の分野に関する。より特定すると、本発明は、所望の生体物質を生体内に注入する技術に関する。本発明はまた、一定の速度を保持しながら薬液を注入できる装置に関し、詳しくは、細胞を含む液体を体内へ比較的低速度で注入するための薬液注入装置に関する。以下に発明の詳細な説明を記載する。
【背景技術】
【０００２】
近年の再生医療、移植医療、遺伝子医療などの高度医療の発展に伴い、細胞、核酸分子、タンパク質などの生体物質を直接生体に注入して治療、予防などを行う医療が発展しつつある。このような技術は、今後再生技術、移植技術、遺伝子治療などの技術がますますの発展を見せると、より実際の臨床の現場で重要度が増すことが考えられる。
【０００３】
例えば、循環器系の分野では、高齢化、虚血性心疾患の増加にともない、従来の経皮的冠動脈血行再建術の適応とならない重症例は増加の一途をたどっている。入退院を繰り返すことによる医療コストの増大と「クオリティ  オブ  ライフ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）」の低下が大きな問題となっており、かかる症例に対する画期的な治療法の開発が望まれる。
【０００４】
循環器疾患は、内科的外科的治療法の革新とともに治療成績は向上しつつあるが、高度重症例では移植、人工臓器などの普遍性の低い置換型治療以外に未だ治療法が確立されておらず、臓器不全症状の不可逆的進行をくい止められないままに、ほとんど救命し得ないのが現状である。加えて、このような重症例を治療した場合、高額な治療費および介護費等の医療費はもとより、後遺症を有した患者を受け入れるための社会資本の整備に必要なコストは膨大なものとなり、すでに困窮したわが国の医療経済を圧迫している。したがって、再生医療のようなコストパフォーマンスの高い有効かつ安価な新規治療法の確立とその産業化、ならびにそれを支える基盤医療産業の育成は、医療のみならず社会・経済的にも極めて緊急課題である。世界ではポストゲノム・バイオテクノロジーの実用化時代に突入しており、循環器領域においても再生医療は、すでに現実のものとして国際的にも研究開発競争が熾烈化している。特に、元来再生能力がないと考えられる心臓にこそ、再生医学を応用する価値が高いと考えられ、現在、多くの研究者がこの分野に参入し、精力的に研究が展開されている。細胞、核酸分子などを用いて従来の薬物治療および臓器移植医療では治療できなかった組織・臓器の損傷並びに難病の根本的な修復・再生をおこなう、いわゆる「再生医療」は、これまでの医療概念を根底から変革しつつあり、その確立は難治病の治療を進める上で今や必須の課題である。世界においては、再生医療は現実の医療として発展しているだけでなく、米国を中心に産業化の段階がはじまり、再生医療の経済的価値の認識とともにその競争は熾烈化している。他方、我が国の再生医療の研究開発状況をみると、これまで組織・細胞工学を中心とした基礎研究開発が中心で、医療としての可能性がようやく見えてきているが、産業との接点が十分でないことによる問題が指摘されている。このような状況において、わが国の医療産業を活性化するために、再生医療のための技術開発を大規模・総合的に行うことにより新しい高付加価値型産業の基盤を確立することは、社会的重要性および緊急性の面から極めて重要と考えられる。
【０００５】
しかし、ヒトに臨床応用するには、細胞源の開発のみならず、開発された細胞の大量、安全培養システム、開発された細胞の治療用デバイスの開発などまだ解決すべき多くの課題が残されている。臨床で使用する細胞源に関しては、自己拍動を有する細胞、非自己拍動細胞、さらには遺伝子導入により形質転換させた筋細胞を培養して、それを正常心筋または傷害された心筋組織へ直接注入する方法が動物実験で試みられている。心筋細胞を心筋組織に生着させることに成功した実験報告もある。また、骨格筋芽細胞を移植した臨床症例では心機能の改善も認められている。現状では、心筋再生治療に用いられる細胞には、心筋自身の再生を目的とした自己骨格筋由来の筋芽細胞および、自己骨髄単核球細胞があげられる。このうち後者においては、既に国内でも下肢および心臓において臨床研究が開発されているが、分化が多岐にわたる骨髄単核球細胞を直接移植することには遠隔成績および副作用も含めて懸念も多い。かかる観点から、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞等からの分化細胞など、臨床的に意味のある移植用細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することが必要である。治療用デバイスに関しては、従来、遺伝子治療等でもデリバリーシステムについては考慮されてきたが、その研究開発の多くは遺伝子を導入するための運び屋であるベクターに注がれてきた。しかし、組織、細胞への親和性が高く、導入効率がよいベクターが開発されても患部へのデリバリーシステムは不可欠である。
【０００６】
細胞および遺伝子にダメージを与えず生存した状態で、細胞の移植および遺伝子導入することは困難である。実際、現在行われている遺伝子治療、細胞治療の多くは体表面から注射針を使用した患部への直接注入によりなされている。しかし、注射針を使用した手技による患部への直接注入は治療効果の面から見ると、その治療効果が充分に発揮されたとは見られない。これらの治療の際にも、細胞内の遺伝子にダメージを与え細胞核が崩壊し、細胞がプログラムに従って死ぬアポトーシスを引き起こしていることが考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
シリンジなどで代表される薬液注入装置は、従来から種々のものが提案されている。しかし、従来の装置は薬液の注入速度や注入時の加速度等を考慮しておらず、手動操作で薬液を注入する際に、薬液の速度、加速度などが比較的高く、又は変動する。
【０００８】
従って、体内での活性度が注入時の薬液の速度、加速度等に依存し得る細胞を含む液体を体内へ注入する装置として、従来の装置は適当ではなく、一定の速度を保持しながら薬液を注入できる簡易な装置が望まれていた。
【０００９】
（発明の要旨）
上記課題は、生体内への生体物質の注入の際に、一定範囲の加速度以内の加速度で加速し、その後一定範囲内の速度を維持することによって、その生体物質を生体内に注入することが予想外に達成されたことによって解決された。
【００１０】
本発明はまた、上記の実情に着目してなされたものであり、その目的とするところは、一定の速度または加速度を保持しながら薬液を注入できる薬液注入装置を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、細胞を含む液体を体内へ注入するのに適した薬液注入装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの局面において、本発明は、Ａ）注入手段内に含まれる、生体物質を含む薬液を、一定範囲内の速度で被検体に注入する工程を包含する、生体物質を含む薬液の注入方法を提供する。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲の速度は、上記生体物質の生物学的活性を保持することを特徴とする。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の速度は、約２０ｍｌ／分以下である。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の速度は、約１０ｍｌ／分未満である。
【００１６】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の速度は、約１ｍｌ／分以上であり、約１０ｍｌ／分未満である。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、上記方法は、Ｂ）上記生体物質を含む薬液を、一定範囲内の加速度で加速して上記一定範囲内の速度にする工程をさらに包含する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の加速度は、上記生体物質の生物学的活性を保持する。
【００１９】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の加速度は、１ｍｍ／秒２〜１５ｍｍ／秒２の範囲内にある。
【００２０】
本発明の１つの実施形態において、上記注入手段のボディの内径は、約１ｍｍ〜約３０ｍｍ、好ましくは、約３ｍｍ〜約１３ｍｍである。
【００２１】
本発明の１つの実施形態において、上記注入手段の先端の管体の内径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、好ましくは、約０．２５ｍｍ〜約１ｍｍである。
【００２２】
本発明の１つの実施形態において、上記生体物質は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子、細胞、組織ならびに臓器からなる群より選択される物質を含む。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、上記生体物質は、細胞であり、上記速度は、約１ｍｌ／分〜約２０ｍｌ／分である。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、上記生体物質は、細胞であり、上記速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分である。
【００２５】
本発明の１つの実施形態において、上記方法は、さらに、Ｃ）上記生体物質を含む薬液の速度を、一定範囲内の加速度で減速しながら、実質的にゼロにする工程を包含する。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、上記減速の加速度の絶対値は、１ｍｍ／秒２〜１５ｍｍ／秒２の範囲内にある。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、上記注入は、心臓の治療または予防のために行われる。
【００２８】
本発明の別の局面において、Ａ）一定範囲内の速度で注入手段内に含まれる生体物質を含む薬液を被検体に注入する工程を包含する、生体物質を含む薬液を用いた臓器治療方法が提供される。
【００２９】
本発明の別の局面において、生体物質を含む薬液の注入システムであって、Ａ）該生体物質を含む薬液を、目的の生体内に注入する手段；およびＢ）該生体物質を含む薬液の注入を、該生体物質を含む薬液の注入速度を一定範囲内に維持し得るよう調節する手段、
を備える、システムが提供される。本システムは、細胞療法のために使用され得る。本システムによって得られる細胞療法によって、細胞生存のおける予想外に顕著な効果が達成された。
【００３０】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲の速度は、上記生体物質の生物学的活性を保持する。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の速度は、約２０ｍｌ／分以下である。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の速度は、約１０ｍｌ／分未満である。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の速度は、約１ｍｌ／分以上であり、約１０ｍｌ／分未満である。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において、上記調節する手段は、生体物質を含む薬液を一定範囲内の加速度で加速し得るよう調節し得る。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の加速度は、上記生体物質の生物学的活性を保持する。
【００３６】
本発明の１つの実施形態において、上記一定範囲内の加速度は、１ｍｍ／秒２〜１５ｍｍ／秒２の範囲内にある。
【００３７】
本発明の１つの実施形態において、上記注入手段のボディの内径は、約１ｍｍ〜約３０ｍｍ、好ましくは、約３ｍｍ〜約１３ｍｍである。
【００３８】
本発明の１つの実施形態において、上記注入手段の先端の管体の内径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、好ましくは、約０．２５ｍｍ〜約１ｍｍである。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、上記注入手段は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子、細胞、組織ならびに臓器からなる群より選択される少なくとも１つの物質に対して有害な影響を与えない。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、上記生体物質は、細胞であり、上記速度は、約１ｍｌ／分〜約２０ｍｌ／分である。
【００４１】
本発明の１つの実施形態において、上記生体物質は、細胞であり、上記速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分である。
【００４２】
本発明の１つの実施形態において、上記注入手段の断面積は、約０．０１ｍｍ２〜約１０００ｍｍ２、好ましくは、約１ｍｍ２〜約５００ｍｍ２、より好ましくは、約５ｍｍ２〜約１５０ｍｍ２である。
【００４３】
本発明の１つの実施形態において、上記注入は、心臓の治療または予防のためのものである。
【００４４】
本発明の１つの局面にしたがうと、Ａ）該生体物質を含む薬液を、目的の生体内に注入する手段；およびＢ）該生体物質を含む薬液の注入を、該生体物質を含む薬液の注入速度を一定範囲内に維持し得るよう調節する手段、を備える、生体物質を含む薬液を用いた臓器治療システムが提供される。本装置は、細胞療法のために使用され得る。本装置によって得られる細胞療法によって、細胞生存のおける予想外に顕著な効果が達成された。
【００４５】
本発明の別の局面にしたがうと、薬液が充填可能であり、先端部に薬液吐出用のノズル部を備えたシリンダと、外部からの操作により、該シリンダ内に入れられた薬液を、実質的に一定の速度を保ちながら該ノズル部から押し出す押出手段と、を有する、薬液注入装置が提供される。本装置は、細胞療法のために使用され得る。本装置によって得られる細胞療法によって、細胞生存のおける予想外に顕著な効果が達成された。
【００４６】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、上記シリンダ内に移動可能に配置され外周にネジ部が形成されたプランジャーと、該シリンダの内面に提供される該プランジャーのねじ部に噛み合う溝部とを有する。
【００４７】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、上記シリンダ内に移動可能に配置されたプランジャーと、該プランジャーの先端部に設けられた栓とを有し、該プランジャーは、一定の速度および／または加速度以上の速度および／または加速度により収縮し得るばね状弾性体により構成される。
【００４８】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、シリンダ内に配置されるプランジャーと該プランジャーの先端部に配置された弾性体とを有し、該弾性体が一定の速度および／または加速度以上の速度および／または加速度により収縮し得るばね状弾性体により構成されている。
【００４９】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、上記シリンダ内に移動可能に配置され外周にねじ部が形成されたプランジャーと、該シリンダの内面に提供され該プランジャーのねじ部に噛み合う溝部と該プランジャーの先端部に提供された弾性体とを有し、該プランジャーを回転することにより、該プランジャーの先端部でシリンダ内の薬液が押し出され、一定の速度および／または加速度以上の速度および／または加速度よりも大きいときに、該ばね状弾性体が、圧縮され得る。
【００５０】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、シリンダの内周部に配置された膨張体と、該膨張体内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段とを有する。実質的に一定の速度および／または加速度で非圧縮性流体が該充填手段により膨張体内に充填される。
【００５１】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、シリンダの後端部に装着された中空の膨張体を有し、該膨張体内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段とを有する。実質的に一定の速度および／または加速度で非圧縮性流体が該充填手段により膨張体内に充填される。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において、上記押出手段が、シリンダ内に移動可能に装着されるプランジャーと、該プランジャーを一定速度でシリンダ内に挿入し得る駆動手段と、を有する。
【００５３】
本発明の１つの実施形態において、上記薬液が細胞を含む液体である。
【００５４】
本発明の別の局面において、細胞療法のための細胞を含む薬液を注入するシステムであって、Ａ）目的の生体に対して該細胞を含む薬液を注入するための注入手段；およびＢ）該細胞を含む薬液の注入を調節して、該細胞を含む薬液の注入速度が、一定の範囲に維持され得る、調節する手段を備える、システムが提供される。
【００５５】
本発明の別の局面において、細胞療法のための薬液注入装置であって、細胞；該細胞を収容するためのシリンダであって、薬液が充填可能であり先端部に薬液吐出用のノズル部を備えたシリンダ；および外部からの操作により該シリンダ内に入れられた薬液を、実質的に一定の速度を保ちながら該ノズル部から押し出す押出手段を備える、薬液注入装置が提供される。
【発明の効果】
【００５６】
本発明の作用は以下の通りである。
【００５７】
本発明の薬液注入装置は、薬液が充填可能であり先端部に薬液吐出用のノズル部を備えたシリンダと、外部からの操作により該シリンダ内に入れられた薬液を、実質的に一定の速度を保ちながら該ノズル部から押し出す押出手段と、を有することにより、薬液の注入時に、シリンダ内の薬液に一定以上の圧力が作用することを防止できる。
【００５８】
したがって、本明細書に記載の発明は、以下の（１）〜（３）を提供するという利益を可能にする：（１）遺伝子、細胞などのような生体物質を含む薬液を生物体に効率的かつ効果的に注入しつつ、その速度および／または加速度を一定に保つことにより、その生体物質に損失を与えることなく、細胞移植療法の治療効果のおける改善が期待し得ることが可能となる、方法およびシステム；（２）身体に薬液を注入する間、注入の速度および／または加速度を実質的に変えることなく維持して、それによって、例えば、細胞含む液体がその身体に注入される場合、細胞における注入圧の悪影響が最小限に抑えられる、装置；ならびに（３）細胞を含む液体を身体に注入するのに適した単純な構造を有する薬液注入装置。
【００５９】
本発明におけるこれらまたはその他の利点は、添付の図を参照しながら、以下の発明の詳細な説明を読み、理解することにより、当業者にとって明らかなものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００６１】
（定義）
本明細書において「生体物質」および「生体分子」は、互換可能に使用され、生体に関連する物質をいう。そのような生体物質を含む試料（サンプル）を、本明細書において特に生体試料（生体サンプル）ということがある。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。従って、生体分子および生体物質は、生体から抽出される物質を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子および生体物質の定義に入る。そのような生体分子および生体物質には、細胞、組織、臓器の一部または全部、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書では、生体物質は、好ましくは、医学的効果のある細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００６２】
（細胞）
本明細書において使用される「細胞」（Ｃｅｌｌ）は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。このような場合、遺伝子改変に用いられる遺伝子は、そのままでまたは発現すると薬効を示すものであり得る。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６３】
本発明において使用される細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。そのような細胞は、移植目的に使用されるものであってもよい。好ましくは、細胞は、注入が企図される生体に適合していることが有利であり、より好ましくは、その生体と同種同系であることがさらに有利である。さらに好ましくは、その生体由来の細胞を用いることが、免疫反応の観点から有利である。
【００６４】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書において使用され得る幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞もまた、幹細胞であり得る。用語「胚性幹細胞」とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される幹細胞は、目的の処置ができる限り、胚性幹細胞であっても、組織幹細胞であってもよい。
【００６５】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００６６】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし、間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。ＥＳ細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６７】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、目的の処置を達成することができる限り、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００６８】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。
【００６９】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、樹立された細胞および初代培養細胞の両方が使用され得る。
【００７０】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血球、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本明細書において使用される細胞は、目的の処置をすることができる限り、上記のどのような細胞であってもよい。本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。
【００７１】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明を用いて組織が注入される場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。本明細書において組織が注入される場合、そのような組織としては、目的の処置をすることができる限り、上記のどのような組織であってもよい。
【００７２】
本発明により注入される生体物質が臓器またはその一部である場合、どのような臓器でも用いられ得る。本発明により注入される組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７３】
本発明により細胞が注入される場合、細胞は、その細胞に適切な培地および培養法を用いて培養することができる。そのような培地および培養法としては、以下に示すような当該分野において周知の技術を用いて調製することができる。例示的な培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）（参考文献として、Ｈ．Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５５）、Ｒ．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６，１９５９）が使用され得るがそれらに限定されない。例示的な培養法としては、任意の技術を用いることができる。例えば、コラゲナーゼ処理による成体心室筋分離としては、Ｔ．Ｋｏｎｏ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７８，３９７（１９６９）、幼若心筋細胞の分離培養については、Ｋ．Ｇｏｓｈｉｍａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，８，２１７（１９７６）、骨格筋細胞培養については、Ｉ．Ｅ．，Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４０，１２７３  （１９６３）、骨髄細胞培養については、三浦恭定：血液幹細胞、虫害医学社、東京、１９８３、コロニー形成による培養については、Ｐｌｕｚｅｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓａｃｈｅｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６６，３１９（１９６５）、およびＢｒｅｄｌｅｙ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，４４，２８７  （１９６６）、造血幹細胞間質細胞の相互作用による長期増殖培養法については、Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｌａｊｔｈａ，Ｌ．Ｇ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１，３３５（１９７７）などを参照のこと。
【００７４】
（他の生体物質）
本発明の注入法は、他の生体物質においても応用することができる。
【００７５】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明で用いられるポリペプチドは、注入が意図される生体内において少なくとも１つの生物学的活性、好ましくは薬効を発揮することができる。
【００７６】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、注入が意図される生体内において少なくとも１つの生物学的活性、好ましくは薬効を発揮することができる。あるいは、本発明で用いられるポリヌクレオチドは、転写および／または翻訳されると注入が意図される生体内において少なくとも１つの生物学的活性、好ましくは薬効を発揮することができるものであってもよい。
【００７７】
本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシング（選択的スプライシング）の産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００７８】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００７９】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのキナーゼなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのキナーゼなどの遺伝子）の配列をクエリ配列（問合せ配列）として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００８０】
本明細書において「フラグメント」および「一部」（部分）とは、互換可能に使用され、ある生体物質の全部（全長ポリペプチド、全長ポリヌクレオチド、臓器全体、細胞全体など）に関して言及するとき、その一部のことをいう。従って、「フラグメント」および「一部」は、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの場合、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または、例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。本発明により注入されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの生体物質は、そのようなフラグメントまたは一部であってもよい。
【００８１】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。本発明により注入される化合物は、どのようなものであってもよいが、生体内に注入されると生物学的活性および／または薬効を示すものであることが好ましい。
【００８２】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明により注入される生体物質は、複合分子であってもよい。
【００８３】
本明細書において「単離された」生体物質（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生体物質が天然に存在する生物体の細胞内の他の生体物質（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。本発明により注入される生体物質は、このような単離されたものであってもよい。
【００８４】
本明細書において「精製された」生体物質（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生体物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生体物質におけるその生体物質の純度は、その生体物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本発明により注入される生体物質は、このような精製されたものであってもよい。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生体物質が存在することを意味する。  
【００８６】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、細胞などの生体物質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性、増殖活性、細胞分裂活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を、抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。幹細胞であれば、多能性を有することなどが挙げられる。具体的には、例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００８７】
本明細書において「生物学的活性を保持する」とは、生体物質に関して言及されるとき、上述のように定義されるその生物学的活性が、少なくとも１種類について、生体物質が調製されたときの生物学的活性を、通常少なくとも約５０％維持することをいう。この数値は、所望の生物学的活性に関し、通常使用されるアッセイによって決定される数値に基づく。従って、発現が所望されるポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチドの発現頻度が指標とされ、細胞が注入される場合、その細胞の増殖活性が指標とされる。また、ポリペプチドの場合、そのポリペプチドの活性（例えば、酵素活性）に依存して決定される。そのような生物学的活性は、上述のように当該分野において周知の技術によって測定され、その測定値によって生物学的活性の保持に関する判定がなされ得る。
【００８８】
（一般生化学・分子生物学・細胞生物学の技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、細胞生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，Ｇｏｓｄｅｎ，Ｒ．Ｇ．：  Ｆｅｔａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｒ．Ｇ．ｅｄ．），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９２、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７、幹細胞・クローン研究プロトコール、中辻憲夫編、羊土社（２００１）などに記載されており、これらは本明���書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００８９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９０】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体へ生体物質（特に細胞）を有効に投与する方法を提供する。そのような生体物質は、組成物中に混入することができ、そのような組成物は、治療組成物、処置組成物、予防組成物などであり得る。好ましい局面において、生体物質は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。
【００９１】
本明細書において「診断上有効な量」、「予防上有効な量」、「処置（または治療）上有効な量」および「予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）および予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータ（例えば、被験体の状態、疾患の状態、投与する生体物質、生体物質に用いられる媒体（培地、緩衝液など）、注入デバイスなど）を参酌しながら決定することができる。
【００９２】
本明細書では、例えば、心機能に関連して「改善（する）」とは、本発明の方法を用いて細胞を生体内（例えば、冠動脈内）へ投与することで、例えば、移植の５週間後までに（好ましくは移植の２週間後までに）に少なくとも次の一つが起こることを意味する：少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍の移植領域内の毛細血管密度の増加；少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％または２５％の経壁的瘢痕領域の減少；少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％、または２５％の経壁的瘢痕の厚さの増加；少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％の、左心室容積／体重比の減少、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、または１５％の収縮期圧または拡張期圧の上昇；または少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％、または２５％の拍出画分の増加。
【００９３】
本発明の処置の対象が、心臓以外のものであっても、当業者は、その対象に応じて、当該分野において周知の基準を用いて、その効果を評価することができる。そのような心臓以外の対象としては、例えば、脳神経、肺、肝臓、足、脚、褥瘡部などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような評価基準を選択する際に参照することができる文献としては、例えば、メルクマニュアル（最新版）などの標準的な文献を参照することができる。そのような評価のための具体的なものとしては以下が挙げられる。
【００９４】
末梢血管疾患（慢性閉塞性動脈硬化症・ビュルガー病）を持つ以下の患者について、骨髄細胞の移植が適応され得る：Ｆｏｎｔａｉｎｅ分類  ＩＩＩ度およびＩＶ度、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ慢性虚血肢臨床分類ＩＩ度４群、ＩＩＩ度５群および６群に属し、安静時痛または虚血性潰瘍・壊死を有する患者で、著しく生活の質が障害されており血行再建術の適応が無く、将来切断が予想される患者。
【００９５】
例えば、松原らは  ５  大学の共同研究として「骨髄細胞移植を用いた虚血性心疾患（狭心症・心筋梗塞）・末梢性血管疾患（ＡＳＯ・ビュルガー病）への血管新生治療（Ｊ−ＴＡＣＴ：Ｊａｐａｎ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）」プロジェクトチームを発足させ，昨年  ７  月より１１例のＡＳＯ患者（糖尿病合併  ８例、透析患者  ３例）に同方法を施行した。対象はすべてＦｏｎｔａｉｎｅＩＩＩ〜ＩＶ度の虚血下肢で，これまでの外科的・内科的治療によっても下肢虚血改善が認められなかった症例である。コントロール不良の糖尿病・網膜症，悪性腫瘍の合併例は含まれていない。
【００９６】
全身麻酔下で自家骨髄液を５００〜７００ｍｌ採取後，骨髄単核球を分離し，約１０億個の細胞を虚血下肢の筋肉内約４０か所に分割注入した。その結果，上腕と下肢の血圧比（ＡＢＰＩ：ａｎｋｌｅ  ｂｒａｃｈｉａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｄｅｘ）は移植前の平均０．２６から移植２８日後には０．４１へと有意に上昇した（図１）。ＡＢＰＩで０．１以上の上昇（国際血管外科学会での臨床カテゴリーの「改善」）が得られたのは，１１例中８例であった。虚血下肢の安静時疼痛は１１例中１０例で完全に消失した。無痛歩行時間は２．０分から５．３分へ２．５倍以上増加した。プレシスモグラフィによる下肢血流量は１６．１ｍＬ／分から２倍以上の３６．５ｍＬ／分へ有意に上昇した。血管造影でも著明な血流増加が観察された。経皮酸素分圧は２５ｍｍＨｇから約２倍の４９ｍｍＨｇへ有意に上昇した。皮膚温も２８．５℃から３０．０℃へ有意に上昇した。
【００９７】
移植局所の炎症・発赤は認められず，ＶＥＧＦ、ＨＧＦおよびＦＧＦの血中濃度、白血球・血小板数は変化しなかった。
【００９８】
第２相試験では無作為化対照二重盲検を行た。骨髄移植群において、ＡＢＰＩが０．９７増加し、対照末梢血単核球群のＡＢＰＩ０．０２４より有意差を認めた。
【００９９】
これらの結果から，虚血下肢への自家骨髄細胞移植は安全で有効な血管新生療法と考えられる。
【０１００】
Ｆｏｎｔａｉｎｅ分類に関して：閉塞性動脈硬化症には、症状で重症度を判定する「フォンテン分類」という方法があり、次のようにＩ度からＩＶ度に分類されている：
・「Ｉ度」−−−−−−−最も軽い段階で、「手足に冷えやしびれ」が現れる。
・「ＩＩ度」−−−−−−「間歇性跛行」という症状が現れる。これは、”ある程度の距離を歩くと足に痛みが起きて歩けなくなるが、しばらく休むと、また歩けるようになる”という症状である。
【０１０１】
歩くときは、足の筋肉は安静時よりも多くの酸素を必要とする。ところが、足の血管に動脈硬化が起きていると、十分な量の血液を送り込めないために、足の筋肉が酸素不足になり、痛みが起きる。
【０１０２】
続けて歩ける距離は、血流障害の程度による。程度が比較的軽ければ２００〜３００ｍ、症状が進んでくると５０ｍ程度で歩けなくなる。
・「ＩＩＩ度」−−−−−「安静時疼痛」といって、じっとしていても、末梢組織の血流不足により、手足が痛むようになる。痛みのために睡眠が妨げられることもある。
・「ＩＶ度」−−−−−−最も進行した状態で、血流障害の起きた部位に潰瘍や壊疽が起きる。痛みが激しく、ひどい場合には、骨や筋肉の腱などが露出してしまうこともある。
【０１０３】
「ＡＰＩ」について−−足の血圧と手の血圧との比率により、足に起こっている閉塞性動脈硬化症の重症度を調べる検査である。通常は足の血圧は手の血圧の１．０〜１．２倍程度である。足の血管に動脈硬化が起こっていると、足の血圧が低くなる。０．８程度になると間歇性跛行（ＩＩ度）が、０．６程度になると安静時疼痛（ＩＩＩ度）、０．４程度になると潰瘍や壊疽（ＩＶ度）が起こりやすくなる。
【０１０４】
「サーモグラフィ」について−−皮膚の温度を測定する検査である。どの部分の温度がどの程度低くなっているかで、血流障害の有無や、障害の起きている部位がわかる。
【０１０５】
本発明が対象とする動物は、生体物質の投与を目的とするものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が対象であり得る。最も好ましくはヒトが対象であり得る。
【０１０６】
本明細書において、細胞、核酸分子、ポリペプチドなどが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、細胞の場合は、培地）などをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１０７】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、活性成分（例えば、細胞であり得る）を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与され得る。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１０８】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０９】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０１１０】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
【０１１１】
本発明の、細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなどは、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、安定化剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。
【０１１２】
賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
【０１１３】
吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１４】
安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１５】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
【０１１６】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１７】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１８】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１９】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２０】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２１】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２２】
細胞が製剤として調製される場合、細胞の生存を支持する薬剤（例えば、炭水化物、サイトカイン、ビタミンなどの成分など）を含ませてもよい。
【０１２３】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２４】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的とする注入部位における媒体と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
【０１２５】
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【０１２６】
別の実施形態において、本発明において、注入は静脈内または皮下で行われ得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。
【０１２７】
本明細書において、投与方法は、任意の非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、上述のような液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【０１２８】
本発明において、非経口の投与経路としては、冠動脈内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経鼻、経直腸、経膣、経皮、経胆管および経膵管などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、冠動脈内注射が選択され得る。
【０１２９】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【０１３０】
様々な公知の送達系が用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。生体物質は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、生体物質は、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することができる。冠動脈への投与が所望される場合、図１に示されるような、本発明の例示的システムである、ポリイミドチューブ（好ましくはＰＴＦＥコーティングされる）にＮｉＴｉ製針が接続されたシステムを用いて、冠動脈内に注入することができる。
【０１３１】
特定の実施形態において、細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなどの生体物質または組成物は、処置の必要な領域（例えば、心臓、冠動脈など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。本発明において、好ましくは、抗体を含むタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０１３２】
別の実施形態において、細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、化合物などの生体物質または組成物は、小胞（ベシクル）、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  ｅｄｓ．，Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．  ３５３−３６５  （１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｓｕｐｒａ  ３１７−３２７頁を参照のこと）。
【０１３３】
さらに別の実施形態において、細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、化合物などの生体物質または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ  ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０  （１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：  １０５（１９８９）；Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（Ｖｏｌ  ＩＩ，Ｃｈｐｔ．６．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４．），第２巻，１１５−１３８頁（１９８４）、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照）。
【０１３４】
本発明の方法において使用される細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１３５】
本発明において、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなどの生体物質の投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇなどであり得る。
【０１３６】
本発明において、細胞が投与される場合、その投与量は、細胞種、処置の目的、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、約１×１０３細胞〜約１×１０８細胞であり、好ましくは、約１×１０４細胞〜約１×１０７細胞などであり得る。従って、１回に投与する量としては、例えば、約１×１０３細胞〜１×１０８細胞の間であり得る。
【０１３７】
本明細書中、「投与する」または「注入する」とは、交換可能に用いられ、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、化合物、細胞などの生体物質またはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞または組織に取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈管を通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与（併用）は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１３８】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１３９】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果または目的とする処置に関連する疾患（例えば、遺伝子治療、移植治療、再生治療、細胞移植治療など）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。
【０１４０】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。このキットは、注入装置を含んでいてもよい。
【０１４１】
毒性研究もまた、組成物の投与の影響を測定することによって行われ得る。例えば、毒性研究は、以下のような適切な動物モデルにおいて行われ得る：（１）化合物がマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、使用され得る）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、赤血球および白血球の数、血球組成物ならびにリンパ球と多形核細胞との割合について分析する。各々の投薬レジメンについての結果とコントロールとの比較は、毒性が存在するか否かを示す。
【０１４２】
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究を行い得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９−２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常な病気または毒性の直接的な証拠のために全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、組織が組織学的に試験される。体重の減少または血液成分の減少を引き起こす化合物は、主要な器官に対する有害作用を有する化合物と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その化合物は好ましくない。
【０１４３】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、本発明は遺伝子治療（遺伝子療法）に用いられる核酸分子を投与するために有用である。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１４４】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１４５】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：  ５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：  １９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１４６】
したがって、本発明では、所望の目的を達成するための治療用タンパク質などをコードする核酸分子を用いた遺伝子治療が有用であり得る。
【０１４７】
（注入手段）
本明細書において「注入手段」とは、生体物質を生体内に注入することができる手段をいい、例えば、シリンジ、カテーテル、針、チューブ、内視鏡などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、本発明の装置において、注入手段は、生体物質を生体内に注入することができる限り、どのような材料を用いても、および形状であってもよい。注入手段の材料としては、注入の対象となる生体に有害な影響を与えない任意の固体材料、あるいは注入の対象となる生体に有害な影響を与えない材料でコーティングされた固体材料が挙げられる。従って、そのような注入手段の材料としては、例えば、そのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、生分解性ポリマー（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬＡ）、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）、糖、タンパク質、脂質などが挙げられるがそれらに限定されない。注入手段は、複数の異なる材料から形成されていてもよい。生体適合性であるかどうかは、例えば、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）等の拒絶反応をみることにより確認することができる。あるいは、本発明において使用される注入手段は、生体の一部となることができる成分を含んでいていもよい。そのような成分としては、例えば、シリコーン、セラミック、タンパク質、脂質、核酸、糖（炭水化物）およびそれらの複合体が挙げられるがそれに限定されない。本発明の注入手段は、流速を一定範囲内に保持することができるものであれば、本発明の効果を達成することができることから、どのようなものであっても使用することができる。本発明の注入手段がシリンジ、カテーテル、針、チューブなどの形状をとる場合、そのような形状の注入手段のボディの内径は、通常、約１ｍｍ〜約３０ｍｍであるが、本発明においては、注入手段のボディの内径に拘らず流速のみを制御することによって本発明の効果（例えば、細胞生存率の維持）が奏されることが判明していることに留意すべきである。注入手段のボディの内径は、ハンドリングの側面から、好ましくは３ｍｍ（例えば、約０．５ｍｌのシリンジ）〜１３ｍｍ（例えば、５．０ｍｌのシリンジ）であることが有利であるが、それに限定されない。そのような具体的な内径例としては、１．０ｍｌのシリンジの内径（約４．７ｍｍ）、３．０ｍｌ（約９．５ｍｍ）などが挙げられるがそれらに限定されない。注入手段の先端の管体（例えば、針カテーテルのシャフト）の内径は、特に制限はないが、例えば、０．１ｍｍ〜１０ｍｍであり得、約０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍであることが好ましいが、本発明においては、注入手段の先端の管体の内径に拘らず流速のみを制御することによって本発明の効果（例えば、細胞生存率の維持）が奏されることが判明していることに留意すべきである。注入手段およびその先端の管体の材質は、ＰＴＦＥであることが好ましいがそれに限定されない。
【０１４８】
本明細書において「先端の管体」とは、上記注入手段において、ボディの先端に接続可能であって、注入が意図される被検体へと接続可能であり、ボディ中の注入用の液体を投与することができる手段をいう。そのような管体としては、例えば、針カテーテル、チューブなどが挙げられるがそれらに限定されない。通常、先端の管体は、注入手段の一部を構成する。
【０１４９】
本明細書において注入手段の「ボディ」とは、注入手段の主要部を形成し、薬液を保持することができる部分をいう。そのようなボディとしては、シリンジ本体などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１５０】
本明細書において使用される支持体は、標的とされる被検体にとって毒性であるような成分が生体物質を含む溶液中に溶出しない限りどのような材料から製造されていてもよい。
【０１５１】
本明細書において「コーティング」とは、支持体などにおいて使用される場合、その支持体がある別の物質によって覆われる状態をいう。従って、コーティングは、コーティングがされる支持体と相互作用をすることができる物質を用いて行うことができる。コーティングによって、支持体は、その支持体自体の物質が外界（例えば、空気）と触れなくなるように処理されていてもよいが、支持体とコーティング物質とがある程度相互作用する状態を保持するのであれば、外界と触れなくなるほどにコーティングされていなくてもよい。そのようなコーティングの程度は、任意であり、当業者は、当該分野において周知の技法を用いて調整することができる。そのようなコーティング技術は、例えば、高分子機能材料シリーズ医療機能材料  共立出版株式会社に記載されている。
【０１５２】
本明細書において「速度」とは、特に言及しない限り、細胞を含む薬液の注入速度を指し、流速とも言う。本明細書では、流速を一定にすることが重要であることが見出され、その効果が予想外に見出された。流速は線速度で表すこともできることから、本発明では、速度として通常流速を意味するが、特に言及する場合は、線速度を指すこともあることが理解される。
【０１５３】
本明細書において「加速度」は、特に言及しない限り線加速度で表される。速度と加速度との関係は、本明細書の他の場所に詳細に記載されており、当業者は容易にその関係を理解することが理解される。
【０１５４】
本明細書において注入の速度および／または加速度を「調節する手段」とは、注入手段に接続され得、接続されたとき、注入手段の薬液などの注入速度および／または加速度を調節することができる手段をいう。本発明のシステムにおいて好ましい注入手段は、生体物質を含む薬液の注入を、一定範囲内の加速度で加速し得、該生体物質を含む薬液の注入速度を一定範囲内に維持し得るよう構成される。そのような加速度および速度の調節は、当該分野において周知の技術を組み合わせて構成することができる。そのような調節を達成する手段としては、例えば、マイクロインジェクター（極微量定流量実験装置）、ペリスタティックポンプなどが挙げられるがそれに限定されない。そのような周知技術としては、例えば、生命工学シリーズ１、生命機械工学  三輪敬之編、裳華房、１９９２に記載されるがそれらに限定されない。これらの文献は、その全部が本明細書において参考として援用される。
【０１５５】
上述の加速度および速度の調節は、手動で行うことも可能であるが、好ましくは、自動で行うことが有利である。自動で制御することにより、手動では生じがちな突発的な速度および／または加速度の急変を抑制することができるからである。そのような自動で制御する手段としては、例えば、本発明の薬液注入装置などが挙げられ、好ましいが、それ以外で制御可能な物を用いてもよい。
【０１５６】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１５７】
１つの局面において、本発明は、生体物質を含む薬液注入方法を提供する。この方法は、Ａ）生体物質を含む薬液を、一定範囲の加速度で加速しながら、目的の生体内に注入する工程；およびＢ）一定範囲内の速度に達した後に、一定範囲内の速度を維持しながら該生体物質を含む薬液の注入を継続する工程；を包含する。
【０１５８】
ここで、生体物質としては、生体との適合性を有する限りどのような物質もが利用され得る。本発明は、生体への投与を目的としているからである。好ましくは、そのような生体物質は、医学的効果（例えば、治療効果、予防効果、予後効果など）があるものが有利であり得る。１つの実施形態において、そのような生体物質は、細胞、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される、少なくとも１つのものを含み得る。特に、細胞の生体内への注入では、従来の方法では、細胞の生存性に問題があり、幹細胞などの貴重な細胞資源を有効に活用することができなかった。本発明では、細胞の生存性を損なわずに細胞を生体内に注入することができる。したがって、そのような効果は従来では達成できなかった顕著なものである。このような生体内注入における有効性の上昇の効果は、他の生体物質（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、他の薬剤）でも、本発明により奏されることから、本発明は、生体物質一般において有用である。
【０１５９】
本発明において、加速度は、生体物質を損傷しない程度の加速度以下であり、かつ、注入の時間が顕著に長過ぎないように高い加速度で行うことが好ましい。そのような生体物質を損傷しない程度の加速度の上限としては、例えば、３０ｍｍ／秒２、好ましくは、２０ｍｍ／秒２、より好ましくは１５ｍｍ／秒２、もっとも好ましくは１０ｍｍ／秒２であり得る。上限値は、注入される生体物質によって変動し得るが、当業者は適宜その上限を設定することができる。下限値もまた、当業者が適宜設定することができる。そのような下限値としては、例えば、約０．１ｍｍ／秒２、好ましくは０．５ｍｍ／秒２、より好ましくは１ｍｍ／秒２、さらに好ましくは５ｍｍ／秒２であり得る。したがって、好ましい一定範囲の加速度の範囲は、このような下限値と上限値との任意の組合せであり得る。このような一定範囲の加速度の範囲の例としては、例えば、１ｍｍ／秒２〜１５ｍｍ／秒２であり得る。
【０１６０】
本発明において、速度もまた、一定の範囲であることが好ましくあり得る。特に、速度の上限は、細胞などの生体物質を損傷しない程度であることが好ましい。従来細胞などを注入する場合、速度については、考証されたことがなかった。そのため、手動で生体物質を注入した場合に、その有効性が著しく落ちる結果となっていた。本発明は、そのような従来技術の欠点を克服し、細胞などの有効性の維持に問題のある生体物質でさえ、その有効性を維持しつつ生体内に注入することができ、ひいては、実施例において例示的に実証されるように顕著な治療または予防効果を達成した。さらにいえば、シリンジの内径、容量などのサイズに依存することなく、一定範囲の速度（この場合、流速）で細胞などの生体物質を注入することによって細胞にダメージを実質的に与えることなく、生体内に注入することができるようになった。このような非依存性は、圧力などのパラメータを考慮する物理学的な常識を考慮すると、予想外のことであり、その意味でも、予想外の効果を奏するといえる。
【０１６１】
従って、本発明のある実施形態において、このような速度の上限としては、好ましくは２０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分であり、より好ましくは約１０ｍｌ／分未満であり、さらに好ましくは約８ｍｌ／分であり得る。速度の下限値もまた、生体内への注入量などを考慮してある一定以上であることが好ましく、そのような下限値は、当業者が適宜決定することができる。したがって、好ましい一定範囲の速度は、下限として例えば、０．１ｍｌ／分が挙げられ、速度範囲としては、好ましくは、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分であり得るが、これに限定されることはない。本発明では、シリンジポンプでの最低レベルおよび流速の上限を設定することが本発明において必要である。下限を決定する要因としては、例えば、浮遊細胞ではない付着細胞などでは、懸濁状態が長時間になると、細胞の生存率そのものに影響を与えると考えられることから、注入量と注入時間を考慮して当業者が適宜決定することができる。従って、本発明では、注入速度の上限を決定することがもっとも重要である。
【０１６２】
好ましい実施形態において、本発明において注入される生体物質は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子、細胞、組織ならびに臓器からなる群より選択される物質を含む。１つの好ましい実施形態では、生体物質は、遺伝子治療に用いられる核酸分子であり得る。別の好ましい実施形態では、生体物質は、再生治療に用いられる細胞であり得る。
【０１６３】
細胞を注入する特定の実施形態において、本発明において、加速度は、１ｍｍ／秒２〜１５ｍｍ／秒２の範囲内にあり、速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分であることが好ましい。このような加速度および／または速度を一定範囲内に維持することによって、細胞に顕著な損傷を与えずに生体内に注入することができることが本発明によって初めて達成された。
【０１６４】
遺伝子治療を目的とする核酸分子を注入する特定の実施形態において、本発明では、加速度は、１〜１５ｍｍ／秒２の範囲内にあり、速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分である。このような加速度および／または速度を一定範囲内に維持することによって、治療または予防効果に関連する、核酸分子の発現に顕著な障害を与えずに生体内に注入することができることが本発明によって初めて達成される。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、生体物質を含む薬液の注入システムを提供する。このような注入システムは、Ａ）該生体物質を含む薬液を、一定範囲の加速度以内で加速しながら、目的の生体内に注入する手段；およびＢ）一定速度に達した後に、一定範囲内の速度を維持しながら該生体物質を含む薬液の注入を継続する手段、を備える。本システムは、細胞療法のために使用され得る。本システムによって達成さる細胞療法は、細胞生存に関して顕著な効果を達成した。
【０１６６】
ここで、注入手段としては、一定範囲の加速度および／または一定の範囲の速度を維持することができる手段であれば、どのような手段でも用いることができる。当業者は、そのような手段を当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。あるいは、市販の手段を組み合わせて用いてもよい。従って、そのような手段は、生体物質を注入することができる限り、どのような材質のものであってもよい。本発明は、生体への投与を目的としていることから、好ましくは、そのような材質としては、生体適合性の材料を含むことが有利である。
【０１６７】
注入手段が一定範囲の加速度を維持するためには、特に、上限を制限することが好ましい。このように加速度を一定範囲内に維持するには、上限になったときに検知するセンサーおよび上限になったときに加速度を抑制する機構を備えることが好ましい。好ましくは、上述のように、本発明の方法では、一定範囲の加速度は、１ｍｍ／秒２〜１５ｍｍ／秒２の範囲内にあることが有利であることから、そのような加速度を維持することができる手段であることが好ましい。加速度は、圧力などの他の物理学的パラメータによって決定することができることから、そのような範囲の加速度を維持する装置は、本発明の装置として例示されているものおよびその等価物が挙げられる。
【０１６８】
注入手段が、一定範囲内の速度を維持するためには、上限を特に制限する必要があることから、上限になったときに停止させる機構を備えることが好ましい。このように速度を一定範囲内に維持するには、流速を測定する手段および測定値が上限になったときに流速を制限する手段が必要である。好ましくは、上述のように、本発明の方法では、一定範囲内の速度は、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分であることが有利であることから、そのような速度を維持することができる手段であることが好ましい。そのような範囲の速度を維持する装置としては、本発明の装置として例示されているものおよびその等価物が挙げられる。
【０１６９】
本発明の装置およびシステムで注入される生体物質としては、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子、細胞、組織ならびに臓器からなる群より選択される物質が挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体物質が効率よく、かつ、有効性を実質的に損なわずに生体内に注入することができたことは、再生医療、移植、遺伝子治療において得に顕著な効果をもたらすといえる。特に、細胞に関して、注入速度自体を制限することでその生存性（例えば、細胞増殖活性）を実質的に損なわずに生体内に注入することができたことは、従来知られておらず、予測すらされていなかったことであり、その意味で、本発明は、予想外の効果をもたらすといえる。
【０１７０】
好ましい実施形態において、本発明のシステムにおける注入手段のボディの内径は、通常、約１ｍｍ〜約３０ｍｍであるが、本発明においては、注入手段のボディの内径に拘らず流速のみを制御することによって本発明の効果（例えば、細胞生存率の維持）が奏されることが判明していることに留意すべきである。注入手段のボディの内径は、ハンドリングの側面から、好ましくは３ｍｍ（例えば、約０．５ｍｌのシリンジ）〜１３ｍｍ（例えば、５．０ｍｌのシリンジ）であることが有利であるが、それに限定されない。そのような具体的な内径例としては、１．０ｍｌのシリンジの内径（約４．７ｍｍ）、３．０ｍｌ（約９．５ｍｍ）などが挙げられるがそれらに限定されない。注入手段の先端の管体（例えば、針カテーテルのシャフト）の内径は、特に制限はないが、例えば、０．１ｍｍ〜１０ｍｍであり得、約０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍであることが好ましいが、本発明においては、注入手段の先端の管体の内径に拘らず流速のみを制御することによって本発明の効果（例えば、細胞生存率の維持）が奏されることが判明していることに留意すべきである。
【０１７１】
（例示的な機構の説明）
本発明は、注入時に注入加速度および注入速度を制御することにより細胞内および遺伝子にダメージを与えず生存した状態で細胞の移植や遺伝子導入を可能とするシステムにより達成され、本発明はまた、そのようなシステムにも関する。
【０１７２】
（本発明の薬液注入装置例）
以下、本発明を、図面を参照して説明する。
【０１７３】
図２〜図１４に示すように、薬液注入装置Ａは、薬液が充填可能であり、先端部に薬液吐出用のノズル部１２を備え、後端部に開口部１４を有するシリンダ１０と、外部からの操作により、該シリンダ１０内に入れられた薬液を、実質的に一定の速度または加速度を保ちながらノズル部１２から押し出す押出手段２と、を有する。
【０１７４】
シリンダ１０は、円筒状に形成され、ガラスあるいは透明なプラスチックで形成することができる。シリンダ１０には通常、薬液の充填量を示すメモリが付けられている。
【０１７５】
図２および図３に示す実施例では、押出手段２は、シリンダ１０内に移動可能に配置され外周にネジ部２２が形成されたプランジャー２０と、該シリンダ１０の内面に形成され該プランジャー２０のネジ部２２に噛み合う溝部１６とを有する。該プランジャー２０の先端部にはシリンダ１０の内面に液密的に当接する栓２４が配置されている。プランジャー２０の後端部には把持部２６が設けられ、この把持部２６を持ってプランジャー２０を回転させることにより、該プランジャー２０のネジ部２２がシリンダ１０内面の溝部１６に噛み合ってプランジャー２０がシリンダ１０前方へ移動し、栓２４でシリンダ１０内の薬液を押し出すことによりノズル部１２から薬液が押し出される。
【０１７６】
このノズル部１２には薬液を体内へ導くためのチューブ４が接続されている。
【０１７７】
シリンダ１０の先端部には薬液の速度または加速度を測定するための速度または加速度計測器（または圧力計）６がシリンダ１０内と連通する状態で取り付けられている。シリンダ１０の後端部にはプランジャー２０のネジ部２２とシリンダ１０の溝部１６との噛み合いを解除可能なハンドル等の解除手段８が設けられており、この解除手段８を右方向へ回動することにより、プランジャー２０のネジ部２２がシリンダ１０の溝部１６に係合し、左方向へ回動することにより、その係合を解除できるように構成されている。シリンダ１０に設けた溝部１６は、通常は、シリンダ１０の一部、例えば、シリンダ１０の後部内面にのみ設けられる。
【０１７８】
本発明で使用される薬液としては、例えば、細胞を含む液体が好適であるが限定されない。
【０１７９】
図４に示す薬液注入装置Ａは、前記押出手段２が、シリンダ１０内に移動可能に配置されたプランジャー２０と、該プランジャー２０の先端部に設けられた栓２４とを有する。このプランジャー２０は一定の速度または加速度以上の速度または加速度により収縮し得るばね状弾性体により構成されている。ばね状弾性体としては、金属、樹脂、ゴム、及びゲルなどの材料にて構成できる。プランジャー２０の後端部にはフランジ等の把持部２６が設けられている。
【０１８０】
プランジャー２０を手動操作によりシリンダ１０内に一気に押し込んだ場合でも、プランジャー２０がばね定数の定める一定の速度または加速度により一定の押し込み力以上の力を受けると、図５（Ａ）に示すように、プランジャー２０が収縮するため、シリンダ１０内の薬液の速度または加速度は一定以上になることはない。そして、図５（Ｂ）に示すように、プランジャー２０のばね定数に応じた一定の押し込み力により、薬液がノズル部１２から体内へ注入される。
【０１８１】
図６および図７に示す薬液注入装置Ａは、押出手段２が、シリンダ１０内に配置されるプランジャー２０と、該プランジャー２０の先端部に配置された弾性体２８とを有する。この実施例では、弾性体２８が、上記で説明したように、一定の速度または加速度以上の速度または加速度により収縮し得るもので構成できる。この実施例においても、手操作による過剰な薬液の注入を弾性体２８の収縮によって抑えることができる。弾性体２８の先端部には栓２４が形成されている。
【０１８２】
図８に示す薬液注入装置Ａは、前記押出手段２が、シリンダ１０内に移動可能に配置され外周にネジ部２２が形成されたプランジャー２０と、該シリンダ１０の内面に形成され該プランジャー２０のネジ部２２に噛み合う溝部１６と、さらにプランジャー２０の先端部に装着された弾性体３０とを有する。弾性体３０は一定の速度または加速度以上の速度または加速度により収縮し得るもので構成されている。弾性体３０の先端部には栓２４が形成されている。
【０１８３】
フランジを手で持ってプランジャー２０を回転することにより、ネジ部２２が溝部１６と噛み合いプランジャー２０がシリンダ１０内を進む。これにより急激な注入操作を防止できる。さらに、弾性体３０がそのばね定数に応じて収縮することで、一定の押し込み力により一定の速度または加速度で薬液を注入できる。
【０１８４】
図９に示す薬液注入装置Ａは、前記押出手段２が、シリンダ１０の内周面に配置された膨張体３４と、該膨張体３４内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段３６と、を有する。膨張体３４はゴム、エラストマー等で形成することができ、シリンダ１０の内周面全面に亘って筒状に配置されている。この膨張体３４とシリンダ１０の内壁面との間で空間部３８が形成されている。シリンダ１０の後端部には、非圧縮性流体をその供給源から空間部３８内へ供給するための流路（図示せず）が形成されている。図１０に示すように、空間部３８内に、実質的に一定の速度または加速度の非圧縮性流体が充填手段３６により充填されると、シリンダ１０内の体積が減少することで薬液がノズル部１２から一定の速度または加速度で押し出される。
【０１８５】
図１１に示す薬液注入装置Ａは、前記押出手段２が、シリンダ１０の後端部に装着された中空の膨張体４０と、該膨張体４０内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段３７とを有する。図１２に示すように、実質的に一定の速度または加速度の非圧縮性流体を該充填手段３７により膨張体４０内へ充填することにより、シリンダ１０内の体積が減少し薬液がノズル部１２から押し出される。
【０１８６】
図１３に示す薬液注入装置Ａは、前記押出手段２が、シリンダ１０内に移動可能に装着されるプランジャー２０と、該プランジャー２０を一定速度でシリンダ１０内に挿入し得る駆動手段と、を有する。
【０１８７】
この実施例では、駆動手段は、プランジャー２０の後端部に固定されたプレート４２と、回転軸４６と、この回転軸４６を回転させるためのフランジ４８と、を有する。該回転軸４６はプレート４２に設けられた雌ネジに螺合した雄ネジ４４を有する。回転軸４６の先端は、シリンダ１０に固定された基板５０に軸支されている。
【０１８８】
フランジ４８を手で回転させることにより回転軸４６が回転してプレート４２およびプランジャー２０を移動させ、シリンダ１０内の薬液をノズル部１２から一定の速度または加速度で押し出すことができる。
【０１８９】
図１４に示す実施例では、駆動手段は、プランジャー２０の後端部に固定された可動部５２と、この可動部５２との間でキャビティ５４を形成し得る固定部５６と、該キャビティ５４内に非圧縮性流体を充填し得る充填手段５５と、を有する。可動部５２はシリンダ１０に固定された基板５８にロッド６０によってスライド可能に支持されている。
【０１９０】
充填手段５５から非圧縮性流体をキャビティ５４内へ充填すると、可動部５２およびプランジャー２０が移動することで、シリンダ１０内の薬液がノズル部１２から一定の速度または加速度で押し出される。
【０１９１】
（本発明のシステム構成例）
１つの具体的なシステム構成例を掲げる。本発明の細胞、ポリペプチド、遺伝子などを含む薬液注入システムは、以下の構成を含み得る。
【０１９２】
（１）各種シリンジを取りつけられ、シリンジプランジャーの動作をプログラム制御できるプランジャー押出し装置。
【０１９３】
（２）（１）のシリンジに取りつけ可能で、先端に針が付いた剛性と柔軟性を持つシャフトからなる体内へ入るマイクロカテーテル。
【０１９４】
このような構成の例を図１５に示す。図１５では、注入コントロールパネル１５０１、シリンジ固定部１５０２、シリンジ１５０５、注入部１５０８、針付きマイクロカテーテル１５０６などが備えられている。注入装置は、１５０３のネジ溝付き軸を回転させることにより、１５０４の板がコントロールパネルにて制御されて、シリンジを押す方向に動作する。シリンジは、クランプによって固定可能である。
【０１９５】
（本発明のシステムの注入時のプログラム例）
本発明のシステムの注入時のプログラムについて説明する。ここで、注入時のシリンジプランジャーの線速度をｖ（ｍ／秒）、注入時間（秒）とする。１ｍｌシリンジを使用し２５ｍｌ／分の条件での本発明のシステムの注入時間および線速度の詳細を図１６に示す。
【０１９６】
この場合、設定流速２５ｍｌ／分に到達するまで、言いかえるとシリンジプランジャーの速度０．０２ｍ／秒に到達するまでの経過時間をｔ（秒）として２秒経過させる。この場合シリンジプランジャー加速度ａ（ｍ／秒２）はｄｖ／ｄｔで表され０．０１ｍ／秒２となる。その後は等速運動となり加速度は発生しない。流量に応じて、設定流速に到達するまでの経過時間を変化させることによりシリンジプランジャーの加速度を一定値以下に保持し、その後等速運動となり加速度は発生しないことが可能となる。又、本システムを使用した場合シリンジの断面積をＳ（ｍ２）とすると、設定流速（ｍ３／分）とシリンジプランジャー加速度、設定流速に到達するまでの経過時間  ｔ（秒）との間には次の関係式がある。
【０１９７】
設定流速（ｍ３／分）＝Ｓ（ｍ２）・１０６・ａ・ｔ・６０
これらの関係式から、今回の実験でのシリンジプランジャーの加速度は０．００１〜０．０１５ｍ／秒２となる。本システムの注入時のプログラムを使用した注入操作を行っても細胞増殖能は低下することなく、ダメージはないと言える。又、加速度を制御することにより、急激な流速の立ち上りを防止することによって、細胞内および遺伝子にダメージを与えず生存した状態で細胞の移植や遺伝子導入することができる。
【０１９８】
１ｍｌシリンジを使用し３８ｍｌ／分の条件での手打した場合の注入時間および線速度の詳細を図１７に示す。
【０１９９】
この場合、設定流速３８ｍｌ／分に到達するまで、言いかえるとプランジャーの線速度０．０５ｍ／秒に到達するのに０．５秒経過した。この場合加速度はｄｖ／ｄｔで表され０．１ｍ／秒２となる。この場合は、手打ちによる０．１ｍ／秒２加速度での注入は細胞にダメージを与え、注入後の増殖能が抑制されると考えられる。又、加速度が高いので急激な流速の立ち上りが発生し細胞内および遺伝子にダメージを与える。
【０２００】
（本発明のシステムの例示における注入時のプログラムフロー）
（１）初期設定：流速値の入力、シリンジ内径の入力、経過時間ｔ（秒）の入力
（２）スタートボタンによりシステムスタート
（３）タイマースタート
（４）目標シリンジプランジャー加速度ａ（ｍ／秒２）を自動計算。上限加速度を超えた場合はエラーメッセージを出して、（１）に戻る。
（５）シリンジプランジャーの移動スタート
（６）シリンジプランジャーの移動量を計測、タイマーからの時間と２次微分回路からシリンジプランジャー加速度を得る。加速度が上限値より大きければ（５）の移動速度を下げる。加速度が上限値より小さければ、（５）の移動速度を上げる。
（７）タイマーが経過時間ｔ（秒）において、シリンジプランジャーの移動量を計測、タイマーからの時間と１次微分回路から流速値を計算。初期設定値との偏差が±５％以内であれば、シリンジプランジャーの移動を継続。偏差が±５％を越えればエラーメッセージを出して、（１）に戻る。
（８）シリンジプランジャーの移動量を計測、終端を検知した場合は、ストップメッセージを出して、（１）に戻る。
【０２０１】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２０２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。動物の取り扱いは、大阪大学において規定される基準を遵守した。
【０２０３】
（実施例１）
液体が細管内を通過する際に生じる圧力損失は、液体の粘度、細胞の種類、デバイスの長さ、シリンジのサイズによって大きく影響されると考えられる。本実施例では、注入操作中の圧力損失に関する知見を得る目的で、ダミー細胞含有薬液およびシリンジ（インジェクター）を用いて、各種注入条件にて注入実験を行った。
【０２０４】
詳細に述べると、本システムおよびシリンジを用いた手注入にて表１および図１に示す装置を使い、細胞含有薬液を表２に示す各種注入条件にて注入した。シリンジを用いた手注入は、実験前に加速度を測定し１００ｍｍ／秒２あることがわかった。
【０２０５】
（細胞調製）
試料としてラット骨格筋芽細胞（初代培養細胞）を、培地（ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ）、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン５０単位／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを補充）中で、５％ＣＯ２中、３７℃で維持した。
【０２０６】
（測定）
注入後の細胞薬液を採取し、トリパンブルー染色法により即時的細胞活性を、並びに  ＭＴＴ法により経時的な細胞活性を調査した。上述のように作製したデバイスのサンプルを用いて細胞薬液サンプルを注入した。デバイス長さ、注入速度、シリンジサイズの変化に伴い、注入直後の細胞の変化および経時的細胞の変化を検討した。以下にトリパンブルー染色法、およびＭＴＴ法について述べる。
【０２０７】
・トリパンブルー染色法
注入操作直後の細胞薬液にトリパンブルーを滴下し混合した。トリパンブルー染色色素により染色される細胞を死細胞と判定した。トリパンブルーは、生存細胞計数のための色素排除手順において使用するために推奨される染色法の一つである。この方法は、使用される特定の色素を生細胞が取り込まず、死細胞は取り込むという原理に基づくものである。
【０２０８】
トリパンブルーでの染色後、顕微鏡で細胞をカウントし、評価した。
【０２０９】
・ＭＴＴ法
細胞内のミトコンドリアの脱水素酵素によりテトラゾリウム塩がホルマザンに還元されることに由来する細胞活性の評価法である。ホルマザンについては、生成量と細胞数がよく対応し、また特定波長の吸光特性示すため、試料の吸光度を測定するだけで、容易に生存細胞数の計測が行うことができる。また、細胞内ミトコンドリアの代謝活性を測定するために比較的初期の細胞死を検出することができる。
【０２１０】
【表１】
2007507244.tif 000002
【０２１１】
デバイスＩ、ＩＩの概要
内外層    ＰＴＦＥ  コーティング      
ＳＵＳφ０．０２５ｍｍ４条コイルブレーディング    
ポリイミドチューブの先端にＮｉＴｉ製針を設置    
内径  φ０．４７ｍｍ    外径  φ０．６２ｍｍ
【０２１２】
【表２】
2007507244.tif 000003
【０２１３】
注入操作直後の細胞死のトリパンブルー染色法の結果を表３に示す。
【０２１４】
【表３】
2007507244.tif 000004
【０２１５】
※試料Ｎｏ．３６はコントロール。また、薬液の初期細胞濃度を示す。
ＭＴＴ法による注入経時後の細胞増殖率を示す典型的な結果を図１８Ａ〜図１８Ｄに示す。
【０２１６】
トリパンブルー染色法の試験結果より、注入操作前の薬液の細胞濃度（試料Ｎｏ．１１）の生細胞濃度５６００００（細胞／ｍｌ）、死細胞数  ０（細胞／ｍｌ）に対して、各試料の注入直後の生細胞濃度は８００００〜９９００００（細胞／ｍｌ）の範囲となった。これにより、各注入速度での注入直後における即時的な細胞死は起こらないという結果が得られた。
【０２１７】
そこで、注入操作による細胞へのダメージを経時的に観察するため、ＭＴＴ法による細胞増殖能の評価を行った。この方法では、表２において採用したもののうち、次の流速を採用した。
１）    ５ｍｌ／分（本システム）        Ｉ    ３ｍｌ  シリンジ
２）    ５ｍｌ／分（本システム）        Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ
３）    ９ｍｌ／分（本システム）        Ｉ    ３ｍｌ  シリンジ
４）    ９ｍｌ／分（本システム）        Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ
５）  ２０ｍｌ／分（本システム）        Ｉ    ３ｍｌ  シリンジ
６）    約３８ｍｌ／分（手注入）        Ｉ    １ｍｌ  シリンジ
７）    ５ｍｌ／分（本システム）      ＩＩ    ３ｍｌ  シリンジ
８）    ５ｍｌ／分（本システム）      ＩＩ    ５ｍｌ  シリンジ
９）    ９ｍｌ／分（本システム）      ＩＩ    ３ｍｌ  シリンジ
１０）  ９ｍｌ／分（本システム）      ＩＩ    ５ｍｌ  シリンジ
１１）  約３８ｍｌ／分（手注入）      ＩＩ    １ｍｌ  シリンジ
１２）  コントロール  注入操作なし。
【０２１８】
この結果を図１８Ａに示す。これによると、注入操作後の細胞増殖能について、コントロールと同等の増殖能を示すグループと、それより劣るグループが発生した。前者は本システムで注入を行ったものである。後者は１ｍｌシリンジにて手注入（注入速度：３８ｍｌ／分）を行ったものである。
【０２１９】
別の系を用いて、同様の実験を行った。この実験では、以下を用いた。
１）コントロール  注入操作なし（本システム）    
２）５ｍｌ／分（本システム）                    Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝１
３）９ｍｌ／分（本システム）                    Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝１
４）１０ｍｌ／分（本システム）                  Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
５）２０ｍｌ／分（本システム）                  Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
６）３８ｍｌ／分（手注入）                      Ｉ    １ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
結果を図１８Ｂに示す。このように、流速が１０ｍｌ／分未満のときに、コントロール（注入操作なし）と同程度の細胞増殖能が保たれていることが分かる。また、２０ｍｌ／分以下の流速であっても、従来の手注入よりも顕著に細胞増殖能が亢進されていることが分かる。
【０２２０】
次に、別の流速系を用いて、同様の実験を行った。この実験では、以下を用いた。
１）コントロール  注入操作なし（本システム）  
２）１ｍｌ／分（本システム）                  Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
３）２ｍｌ／分（本システム）                  Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
４）２０ｍｌ／分（本システム）                Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
５）３８ｍｌ／分（手注入）                    Ｉ    １ｍｌ  シリンジ  ｎ＝３
この結果を図１８Ｃに示す。流速は、１０ｍｌ／分未満であれば、遅い分には特に問題なく使用できることが明らかになった。したがって、本発明は、上限速度にのみ留意すれば、後は、下限の流速としては、実地の試験において注入時間に時間がかかりすぎるかどうかを考慮するだけで、実施することができることが明らかになった。
【０２２１】
上記に加え、ヒト筋芽細胞を同様に培養して用いて、以下の流速での注入の細胞増殖における影響を考察した。
１）  コントロール（注入なし）            
２）  ９ｍｌ／分（本システム）            Ｉ    ５ｍｌ  シリンジ  ｎ＝１
３）  ３８ｍｌ／分（手注入）              Ｉ    １ｍｌ  シリンジ  ｎ＝１
この結果を、図１８Ｄに示す。このようにヒト細胞でも、１０ｍｌ／分未満の流速において、注入する場合、細胞増殖能がほとんど低下しないことが分かった。
【０２２２】
これらの結果より、本システムでの注入操作を行っても細胞増殖能は低下することなく、ダメージはないと言える。しかし、一定速度を超えた流速で注入することにより（１ｍｌシリンジ、約３８ｍｌ／分）通常の２０％程度にまで増殖能が低下することがわかった。他方で、２０ｍｌ／分以下であれば、細胞増殖能は、治療効果を顕著な損失なしに保持したまま細胞を注入することができた。まとめると細胞に実質的にダメージを与えないと考えられる速度範囲としては、約２０ｍｌ以下であることが明らかになった。また、細胞の増殖率にほとんど影響を与えない速度範囲としては、約１０ｍｌ／分未満であることが明らかになった。
【０２２３】
この一定範囲の速度の効果は、シリンジの種類にかかわらず、しかもシリンジの内径にもほとんど影響されないことが予想外に見出された。したがって、本発明は、速度、すなわち流速を一定範囲内に保つことによって、細胞の増殖能を維持しながら注入することができる技術を予想外に提供することになる。このような現象は、現在までにまったく報告されておらず、しかも、物理学的な理論からも予測困難なことであり、その効果は顕著である。
【０２２４】
しかも、影響を受けるパラメータが速度のみであり、このような速度の調節は、通常の知識を有する医師または医療従事者でも容易に理解することができる。したがって、本発明は、簡便に効率よく細胞を体内に注入することができる技術を提供することになる。
【０２２５】
（実施例２）
各種細胞を用いた注入実験を行った。臨床応用を考える上で実際に心臓にカテーテルによって送達され得る可能性の高いヒト細胞としては、筋芽細胞、骨髄細胞、線維芽細胞が考えられる。本実施例では、これらのモデルとして、ラット線維芽細胞を用いて実験を行った。線維芽細胞は、比較的衝撃に強い細胞として知られており、したがって、本発明では、最低限のレベルを調べるためのコントロールとして用いた。これらを実施例１と同じようにデバイスより注入し、細胞死および細胞増殖に対するダメージを検討した。トリパンブルーの染色によりこれらの生存状態を判定した。
【０２２６】
使用した細胞薬液サンプルは以下のとおりである。
【０２２７】
ラット線維芽細胞（初代培養細胞）を培地（ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ）＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン５０単位／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを補充）中で、５％ＣＯ２中、３７℃で維持した。
【０２２８】
【表４】
2007507244.tif 000005
【０２２９】
同様に、細胞増殖速度を測定したところ、２０ｍｌ／分では実質的な細胞損傷は見られなかったのに対して、それを超える流速では、若干の損傷が見られた。また、３５ｍｌ／分の場合は、実施例１と同様約２０％の細胞増殖率にとどまっていた。
【０２３０】
これらの結果から、細胞薬液などの生体物質の生体内への注入には、その傷害性を抑えるために、加速度および／または速度を一定範囲内にとどめる必要があることが判明した。特に、２０ｍｌ／分以下に速度をとどめることがどのような細胞にとっても有効であることが明らかになった。
【０２３１】
（実施例３：細胞注入速度と増殖曲線のさらなる検討）
細胞注入速度による細胞増殖曲線への影響を、実施例１および２に記載されるプロトコールに従い、以下の表５の条件を用いて、増殖曲線を調べた。
【０２３２】
【表５】
2007507244.tif 000006
【０２３３】
結果を図１９に示す。この結果から明らかなように、３８ｍｌ／分の流速では、顕著に増殖が悪化するのに対して、２０ｍｌ／分以下の流速では顕著に増殖曲線が改善することがわかる。
【０２３４】
（先端の管体の影響）
次に、シャフト（先端の管体）の内径についても影響を測定した。シャフト（先端の管体）の内径として０．１ｍｍ〜１ｍｍのものを測定した。いずれの場合も、実施例１および２での速度を達成することができる。しかも、シャフトの内径は、細胞増殖率にはほとんど影響しないことが明らかになった。従って、本発明は、シャフトの内径には実質的に関係なく、細胞を生きたまま生体内に注入することができるということが予想外に判明した。
【０２３５】
（実施例４）
注入流速の各設定値と、実際の流出流速との相関関係を理解するために、次の実験を行った。
【０２３６】
測定方法  ：本発明のシステムにて一定流速で注入した時の水の流出流速を測定する。
【０２３７】
実験試料  ：
（１）内径φ０．３８ｍｍ  全長１５００ｍｍ  ＰＴＦＥチューブ（２７Ｇ針付き）
（２）内径φ０．３０ｍｍ  全長１５００ｍｍ  ＰＴＦＥチューブ（２７Ｇ針付き）
（３）内径φ０．４６ｍｍ  全長１５００ｍｍ  ＰＴＦＥチューブ（２７Ｇ針付き）
（４）内径φ０．３８ｍｍ  全長１５００ｍｍ  ＰＴＦＥチューブ（針なし）
上記、実験方法にて行った結果を以下表６および図２０に示す。
【０２３８】
【表６】
2007507244.tif 000007
【０２３９】
以上の結果より、本システムの注入速度の設定値に対して、実際に流出してくる流速との関係式が得られた。ここでは本システムの注入流速設定値に対して、やや遅い流速で流出することがわかったが実質的には影響を考慮する必要はないことが明らかになった。また、この結果より、流速の減少は今回使用した実験試料の内径や針の有無にはよらず、すべての実験試料に対して同様であることがわかった。
【０２４０】
（実施例５）
次に、動物モデルを使用した注入実験を行った。従来の心臓手術では、心室内から心蔵内部をマッピングして注入することが行われている。三次元でのマッピングのためのデバイスは、数千万円と効果であり、かつ、高度なトレーニングが要求されることから、扱うことが困難である（日本においては、３０人程度のみが操作可能であるといわれている）。手術時間も、最低で２時間必要とされており、注入時針を固定できない、さらに針の心筋に対する反力が大きいなどの欠点があり、心筋に入れにくいとされている。出血または壁貫通の可能性もあり、安定した手術とはいえない。また、不整脈も報告されている。
【０２４１】
そこで、本発明を冠動脈に対して適用することを試みた。冠動脈であれば、ＰＴＣＡの技術さえあれば、使用可能であることから、その応用範囲は格段に広まることになる。操作概要としては、冠動脈を３次元空間上のレールとして使用することができ、バルーンカテーテルにて正確に位置を決めることができる。
【０２４２】
以下に、本実施例における詳細な手順を記載する。使用したデバイスは、図２１に示す。挿入の様子を図２２および図２３に示す。
【０２４３】
６ｋｇのビーグル犬を全身麻酔下に、正中切開により開胸した。腕頭動脈よりアプローチを行なった。透視下にワイヤーは左冠動脈に挿入可能であった。左冠動脈口に注入カテーテルを挿入した。イヌ冠動脈に比べて注入カテーテルが太いことから、１．５ｃｍだけ挿入することができた。バルーンを心内腔に向けて挿入し、注入針を出した。針が出ていると思われる部位で、造影剤のプールが見られた。もれ出た造影剤により冠動脈が造影された。さらに臨床応用を想定し、体重４０ｋｇのブタを用いて実験を行なった。４０ｋｇのブタを全身麻酔下で大腿動脈より穿刺し、カテーテルを挿入した。冠動脈を同定し、挿入を行い、バルーンを心内腔に向けて挿入し、注入針を出した。針が出ていると思われる部位で、造影剤のプールが認められ、漏れでた造影剤で冠動脈が造影されることを確認した。
【０２４４】
（結果）
上記実施例の結果を、図２４に示す。ビーグル犬を犠死（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させると、図２４から明らかなように、心臓を外表面より観察すると、針が別の方向に向いており、外側に突き破って染色液が漏れ出てはいないこと、針が出ていたと思われる領域の心筋組織において緑色の染色液の存在が確認された。
【０２４５】
このように、実際に動物実験において、本発明の注入システムが効率よく機能することが明らかになった。
【０２４６】
（実施例６：薬液注入装置を利用した注入治療）
次に、本発明の薬液注入装置を用いて実際の細胞治療を行う。図２に示す装置を作製し、これを用いて、実施例５に示すような実験系において速度を調整しながら、細胞を注入する実験を行なった。この装置を使用して、実施例５に示すような実験系において、速度を調節しつつ細胞注入実験を行った。
【０２４７】
この装置は、細胞の注入速度を１ｍｌ／分〜２０ｍｌ／分の間に調節することができることが確認された。この装置を用いて実施例５のように実験を行なったところ、同様の結果が得られ、実際に効率よく生存性を失わずに細胞が注入されていることが確認される。
【０２４８】
このように、本発明の装置を用いても実施例５と同様の実験を行なうことができることが確認される。
【０２４９】
（実施例７：人体における虚血肢への骨髄細胞移植）
ＣＤ３４＋／Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ＋／レクチン＋細胞を、Ｔａｔｅｉｓｈｉ−Ｙｕｙａｍａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２００２；３６０：４２７-４３５に従って調製する。簡潔に述べると、骨髄単核球細胞（ＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離法によって単離する。２種類の洗浄工程の後に、細胞を、１０  ｍＬのＸ  ｖｉｖｏ−１０  ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に再懸濁する。この細胞懸濁物は、異種細胞集団からなり、この集団は、造血幹細胞を含む。この造血幹細胞は、抗ヒトＣＤ３４（ＦＩＴＣ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ＣＤ４５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣＤ１３３に対して直接的に結合体化した抗体を使用するＦＡＣＳ分析法によって決定される。総じて、平均値として約５〜１０×１０６のＣＤ３４／ＣＤ４５陽性細胞を、患者に対して注入する。この調製した細胞は、骨髄単核細胞として使用される。
【０２５０】
これらの骨髄単核細胞を、実施例５および６に記載の手順に従って注入するが、患者（ヒト）に適合させる目的でスケールアップする。本明細書中における臨床試験は、ＴＡＣＴ試験と呼ばれる。
【０２５１】
結果として、この骨髄単核細胞が、首尾よい様式にてその患者（ヒト）の虚血肢に注入されることが確認される。
【０２５２】
（実施例８：ヒトにおける急性心筋梗塞部位への骨髄細胞移植）
本実施例において、骨髄単核細胞を、ヒトにおける急性心筋梗塞部位に注入する。骨髄単核細胞を、実施例７に記載の手順に従って調製する。この骨髄単核細胞を、実施例５および実施例６、必要であれば、Ａｓｓｍｕｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００２；１０６：  ３００９−３０１７に従って急性心筋梗塞部位に注入するが、患者（ヒト）に適応するためにスケールアップする。明細書中における臨床試験は、ＴＡＣＴ試験と呼ばれる。
【０２５３】
結果として、この骨髄単核細胞が、首尾よい様式にてその患者（ヒト）の虚血肢に注入されることが確認される。
【０２５４】
（実施例９：人体における虚血肢への骨格筋細胞移植）
心筋と違って、骨格筋は、サテライト細胞（筋衛星細胞；Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）の存在に起因して、損傷後に再生・修復する能力を有している。これらのサテライト細胞は、筋肉の損傷に応答して活性化されると、増殖・分化する。骨格筋芽細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され得る単核化された単能性前駆細胞である。自己骨格筋芽細胞を利用することの利点は、その入手しやすさ、移植プロセスに対する免疫的な障壁がないこと（このことによって、ドナー細胞が宿主に受容されることを可能にするために免疫抑制することの必要性が排除される）、腫瘍形成の危険性を低減することである。同時に、これらのサテライト細胞は、血管形成性サイトカインおよび増殖因子を送達して血管形成および筋形成（ａｎｇｉｏｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝的に改変され得る。
【０２５５】
本実施例において、このような骨格筋芽細胞がヒトにおける所望の部位に効率よく送達され得るか否かを試験する。
【０２５６】
このような骨格筋芽細胞は、実施例５および実施例６に記載の手順、必要に応じて、Ｈａｉｄｅｒ，Ｋｈ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ  Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４に記載の手順に従って急性心筋梗塞部位に注射されるが、患者（ヒト）に対して適合させるためにスケールアップされる。
【０２５７】
自己骨格筋芽細胞を、四頭筋から採取して、細胞増殖のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された。培養プロセスにおいて、２億〜５億の細胞が、採取する（陽性デスミン染色４０〜８０％）。ＮＯＧＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ−Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｗａｔｅｒｌｏｏ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、１億〜３億の細胞を、その梗塞部位に経心内膜的に注射する。
【０２５８】
本発明の注入方法を用いる筋芽細胞の移植によって、損傷を受けた心臓における顕著な機能改善に得られることが示される。
【０２５９】
（実施例１０：人体における虚血肢への脂肪細胞組織−間葉系幹細胞移植）
分離精製した液状脂肪（Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ；ＰＬＡ）細胞を、ヒトにおける虚血肢を治療するために使用する。
【０２６０】
ＰＬＡ細胞を、以前の研究報告（Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７，２１１-２２６）にて記載されたように、ヒトの未処理液状脂肪吸引物（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）から採取して、培養する。簡潔に述べると、未処理の液状脂肪を、夾雑性の破砕物および赤血球を除去するまで完全に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。この洗浄した吸引物を、ＰＢＳ中の０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、緩やかに攪拌しながら３０分間にわたって３７℃で処理する。このコラゲナーゼを、等量のＤＭＥＭ／１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）で不活性化して、その下澄み液を低速で１０分間に亘って遠心分離した。これらの細胞ペレットを、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳに再懸濁して、破砕物を除去するために１００μｍメッシュフィルターで濾過する。その濾液を、上述されるように遠心分離し、従来型の組織培養プレートにプレーティングする。
【０２６１】
これらのＰＬＡ細胞を、実施例５および実施例６に記載の手順に従って、虚血肢に注入する。
【０２６２】
本発明の注入方法を使用してＰＬＡ細胞を移植すると、損傷を受けた肢における顕著な機能改善が生じることが示される。
【０２６３】
（実施例１１：人体における虚血肢への臍帯血細胞の移植）
本実施例において、臍帯血細胞は、人体の処置のために使用され得る。このような臍帯血細胞を、対宿主性移植片病を回避するために使用し、骨髄細胞を用いる場合よりもずっと安全に移植がなされることを可能にする。さらに、臍帯血は、多くの若い細胞を含み、再生医療において使用が望まれるものである。
【０２６４】
人体における臍帯血および末梢血のサンプルを、以下にように調製する。臍帯血の採取を、胎児の分娩した後、胎盤がまだ子宮内にある間にその切断された臍帯の母体側端から行う。通常は、臍帯から採取した血液を４８時間以内に使用する。その臍帯血を手で絞ることによって、抗凝血薬として１０ｍｌのＣＰＤ−Ａを含む滅菌したフラスコに血液を出す。採取は、標準的な分娩手順に手を加えることなく産婦人科の職員の様々な者により実施される。血液体積として１８ｍｌに満たないサンプルは、廃棄する。採取後に、臍帯血サンプルは、室温で貯蔵され、２４〜４８時間以内に処理される。白血球除去輸血サンプルを、造血細胞悪性腫瘍に対する移植目的でアフェレーシス手順を受けて５名の動員処置をうけた（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）成人患者から得る。上述のプロトコールは、大阪大学医学部の規定を遵守するものであり、採取前にインフォームドコンセントを経ている。
【０２６５】
これらの血球は、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを使用して約２倍に希釈され、この希釈された血球のうち２０ｍｌを、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に撒いて、３００×ｇで３０分間にわたって遠心分離する。軟膜上清を採取して、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを使用して４℃で２５０×ｇにて洗浄して、血小板を取り除いた。得られた低密度細胞を、ＭＡＣＳ磁性ビーズカラム法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に供して、ＣＤ３４＋細胞を分離・精製する。この低密度細胞懸濁物に、ブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＣＤ３４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、４℃で１５分間にわたってインキュベートする。０．５％  ＢＳＡ−５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを、１０分間にわたって２５０×ｇで４℃にて遠心分離することより洗浄するために使用する。再懸濁後に、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を、それらに添加して、４℃で１５分間にわたってインキュベートした。完了後に、同様の洗浄工程および再懸濁工程を実施して、磁性ビーズカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に供して、吸着していない細胞を溶出させる。プランジャーを吸着した細胞を採取するために使用して、ＣＤ３４＋単核画分として使用する。カラムの各々を通過するときに、このよう溶離した細胞の数および生存性を、Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞カウントチャンバを使用してトリパンブルー排除試験によって評価した。
【０２６６】
その臍帯血細胞を、実施例５および実施例６に記載の手順に従って虚血肢に注射する。
【０２６７】
本発明の注入方法を使用する臍帯血細胞の移植によって、損傷を受けた四肢において顕著な機能改善が得られることが示される。
【０２６８】
（実施例１２：人体における心筋梗塞部位への臍帯血細胞の移植）
次に、臍帯血細胞が、ヒトにおける心筋梗塞を処置するために、この用途における本発明の注入方法を使用することにより使用され得ることが、本実施例によって実証する。臍帯血細胞は、実施例１１に従って調製される。
【０２６９】
この臍帯血細胞を、実施例５および実施例６の手順に従って患者（ヒト）の心筋梗塞部位に注射する。
【０２７０】
本発明の注入方法を使用する臍帯血細胞の移植によって、心筋梗塞部において顕著な機能改善が得られることが示される。
【０２７１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０２７２】
本発明は、ホストに対する組成物の有効な投与を達成し、これは、移植、遺伝子療法、再生医療などにとって必須のものであり、本発明は、これらの分野に関連する産業にとって有用であることが理解される。
【０２７３】
他の種々の改変物が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者にとって明らかであり、それらは、当業者によって容易に実施される。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書の記載に限定されることなく、広義に解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】本発明の代表的な装置である実施例１において用いられる装置例。
【図２】本発明の薬液注入装置の一実施形態の断面図である。
【図３】図２で示した薬液注入装置の概略断面図である。
【図４】本発明の薬液注入装置の他の実施形態の断面図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、図４で示す薬液注入装置の作用説明図である。
【図６】本発明の薬液注入装置のさらに他の実施形態の断面図である。
【図７】図６で示す薬液注入装置の作用説明図である。
【図８】本発明の薬液注入装置のさらに他の実施形態の断面図である。
【図９】本発明の薬液注入装置のさらに他の実施形態の断面図である。
【図１０】図９で示す薬液注入装置の作用説明図である。
【図１１】本発明の薬液注入装置のさらに他の実施形態の断面図である。
【図１２】図１１で示す薬液注入装置の作用説明図である。
【図１３】本発明の薬液注入装置のさらに他の実施形態の断面図である。
【図１４】図１４は、本発明の薬液注入装置のさらに他の実施形態の断面図である。
【図１５】図１５は、本発明の薬液注入システムの構成例である。
【図１６】図１６は、本発明のシステムの注入時間および線速度の詳細例を示す。
【図１７】図１７は、１ｍｌシリンジを使用し３８ｍｌ／分の条件での手打した場合の注入時間および線速度の詳細例を示す。
【図１８Ａ】ＭＴＴ法による注入経時後の細胞増殖率を示す典型的な結果例（Ａ〜Ｃ＝独立した系でのラット筋芽細胞による細胞増殖率を示す例。Ｄ＝ヒト筋芽細胞）。
【図１８Ｂ】ＭＴＴ法による注入経時後の細胞増殖率を示す典型的な結果例（Ａ〜Ｃ＝独立した系でのラット筋芽細胞による細胞増殖率を示す例。Ｄ＝ヒト筋芽細胞）。
【図１８Ｃ】ＭＴＴ法による注入経時後の細胞増殖率を示す典型的な結果例（Ａ〜Ｃ＝独立した系でのラット筋芽細胞による細胞増殖率を示す例。Ｄ＝ヒト筋芽細胞）。
【図１８Ｄ】ＭＴＴ法による注入経時後の細胞増殖率を示す典型的な結果例（Ａ〜Ｃ＝独立した系でのラット筋芽細胞による細胞増殖率を示す例。Ｄ＝ヒト筋芽細胞）。
【図１９】ＭＴＴ法による注入経時後の細胞増殖率を示す別の結果例（ラット線維芽細胞）。
【図２０】実施例４における結果例。
【図２１】実施例５で使用したデバイス例。
【図２２】デバイスの心臓への挿入例。
【図２３】デバイスの心臓への挿入例。
【図２４】実施例５の実験結果。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2007507244.tif 000028
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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