(57)【要約】  免疫刺激性核酸を有する陽イオン性リポソームは先天性免疫応答を刺激することが示され、そして抗体依存性細胞傷害及び標的細胞溶解を劇的に向上させるために、このようなリポソーム核酸及び処置用抗体の相乗的組み合わせが提供される。
2007509040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における強化された抗体依存性細胞傷害応答を刺激するための組成物であって、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームとの組み合わせでの処置用抗体を含んで成る、前記組成物。
【請求項２】
前記免疫刺激性核酸が少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンがメチル化されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫刺激性核酸が核酸配列５'ＴＡＡＺＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３'（ＯＤＮ１ｍ）（配列番号：４）を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫刺激性核酸が核酸配列５'ＴＴＣＣＡＴＧＡＺＧＴＴＣＣＴＧＡＺＧＴＴ３'（ＯＤＮ２ｍ）（配列番号：３１）を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記陽イオン性リポソームが完全に前記核酸を内包している、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記処置用抗体が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗ＣＤ２０抗体モノクローナル抗体がＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記処置用抗体が抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより活性化された哺乳類ＮＫ細胞であって、腫瘍関連抗原に対する処置用抗体のＦｃ部分に結合している、前記活性化されたＮＫ細胞。
【請求項１２】
前記免疫刺激性核酸が少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳類被験体における標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害を誘導する改善された方法であって、前記方法が、以下の：
ａ）免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを用いてｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで被験体のＮＫ細胞を活性化すること；及び
ｂ）標的細胞抗原に対する処置用抗体を用いてｉｎ ｖｉｖｏで前記標的細胞をオプソニン化すること；
を含み、ここで、前記活性化ＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで前記処置用抗体のＦｃ部分に結合している、前記方法。
【請求項１４】
前記免疫刺激性核酸が少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が腫瘍細胞であり、前記標的細胞抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞を溶解する方法であって、前記腫瘍細胞を有する患者に処置用抗体及び免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを投与することを含み、ここで、前記処置用抗体が前記腫瘍細胞と関連する抗原を対象とし且つ抗体依存性細胞傷害をもたらすために前記陽イオン性リポソームがｉｎ ｖｉｖｏで患者のＮＫ細胞を動員及び活性化する、前記方法。
【請求項１７】
前記免疫刺激性核酸が少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記陽イオン性リポソームが前記処置用抗体の前に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて癌患者を処置する改善された方法であって、前記改善が免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを用いて前記患者を前処置することを含み、ここで、前記前処置が抗体依存性細胞傷害をもたらすために患者のＮＫ細胞の動員及び活性化を引き起こす、前記方法。
【請求項２０】
前記免疫刺激性核酸が少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌がリンパ腫であり、そして前記モノクローナル抗体がリツキシマブである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が乳癌であり、そして前記処置用抗体がトラスツズマブである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳類患者において標的細胞の溶解に適切なキットであって、標的細胞抗原に対する処置用抗体及び免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを含んで成る、前記キット。
【請求項２４】
前記処置用抗体及び前記陽イオン性リポソームが別々のバイアルにおいて提供される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記免疫刺激性核酸が少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記標的細胞が腫瘍細胞であり、そして前記標的細胞抗原が腫瘍関連抗原である、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年１０月４日付けで出願された米国特許仮出願第（未定）号；及び２００４年２月６日付けで出願された米国特許仮出願第６０／５４２,７５４号；及び２００３年１０月１１日付けで出願された米国特許出願第６０／５１０,７９９号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、抗体処置、そしてさらに具体的には、先天性免疫応答を刺激することによるそれらの効果を強化することに関する。
【背景技術】
【０００３】
先天性免疫は、感染後又は癌の発生後に急速に起こるそれらの免疫応答を指す。それらは病原体又は悪性細胞に対する前感作を伴わずに開始し、抗原特異的ではなく、マクロファージなどの食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞傷害性細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞によって直接的に介在され、同様に、これらの細胞によって産生されたサイトカインにより間接的に介在される。適応免疫は、初期感染又は癌発生後の発達に幾分かの時間を要し、且つ免疫細胞の学習を伴い、その結果、高度に特異的で、極めて強力且つ長寿命の応答の発達をもたらすそれらの応答を指す。これは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴリンパ球及び抗体産生Ｂリンパ球により介在される。これらのラインに沿って、適応免疫応答は細胞性（ＣＴＬにより介在されるもの）又は体液性（抗体が介在する応答）いずれかに分類され、ヘルパーＴリンパ球は両方の応答を促進する。同時に、急速な先天性免疫応答は、疾患の早期拡大を抑制するのに機能し、そして適応免疫応答の発達を促進し、一方、極めて強力で、特異的且つ長寿命の適応応答は疾患の除去及び再発の防止に貢献する。
【０００４】
先天性免疫及び適応免疫は独立の現象としてしばしば考えられてきたが、例えば先天性免疫応答が適応免疫を開始するという事実を含め、それらをつなげる多くの橋（ｂｒｉｄｇｅ）が存在する。それらを関連付ける別の方法は、抗体依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）として知られているプロセスを経由する。ＡＤＣＣは、主にＮＫ細胞及びマクロファージといった先天性免疫システムの細胞が、表面に抗体を結合させている標的細胞（すなわち、オプソニン化された細胞）を特異的に認識し、そして攻撃することを可能とするプロセスを伴う。これは、抗体のＦｃ領域を認識しそして結合するこれらの先天性免疫細胞上の特異的受容体の存在により介在される。この結合は、標的細胞の認識を可能にし、そして標的細胞の殺傷を引き起こすその細胞の細胞傷害機序も誘発する。
【０００５】
癌免疫療法の有望且つ急速に発達している領域は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を利用し、腫瘍の根絶を目的として免疫エフェクター機序を利用することに集中している。マウス由来の抗体のヒト型化における進歩は、この分子に対する拒絶免疫応答を減少させ又は実質的に排除することにより、これらの分子の処置薬としての実用性を大いに改善してきた。これらの中で典型的なものは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（転移性肺癌に対して開発されたＣＤＲ移植抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）、及びＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（非ホジキンリンパ腫のためのキメラ型抗ＣＤ２０抗体）である。
【０００６】
作用の具体的様式は各抗体に対して異なるが、それらは一般的に直接的作用（例えば、成長又は生存又はアポトーシスの直接的誘導に必要な細胞表面の受容体の関与の遮断）と間接的作用（例えば、免疫介在性応答の誘導）の組み合わせである。これらの免疫介在性作用は、特異的にＡＤＣＣの介在及び補体介在性溶解の誘導を含む。不運なことに、ｍＡｂｓはその特異性が極度に高いという有利性を有しているが、それらの可能性は有限である。従って、当業界においては、それらの投与により生み出される抗腫瘍免疫応答の効力を強化することで、この部類の処置薬の効果を改善する著しい必要性が残されている。
【０００７】
関連文献の要約
当業界では、１又は複数の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含有するオリゴヌクレオチドは、有効な免疫刺激剤として説明されてきた。例えば、米国特許第６,１９４,３８８号；６,２０７,６４６号；６,２３９,１１６号；６,６５３,２９２号；６,４２９,１９９号；及び６,４２６,３３４号を参照されたい。脊椎動物のＤＮＡで見いだされるメチル化シトシン残基の頻度が高くなると、メチル化ＣｐＧｓが脊椎動物の免疫システムにおいて重要な応答を誘導するのを妨げるであろうという認識が原因で、一般に、メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドの潜在的免疫刺激特性の大部分が見落とされてきた。Ｍｅｓｓｉｎａ他 , Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４７：１７５９（１９９１）を参照されたい。潜在的免疫刺激性を有する遊離型メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドに関するいくつかの報告がなされてきたが、それらの基礎をなすデータの分析はそれらの活性の広範な主張をサポートしていない。国際公開第０２／０６９３６９号（データは多重メチル化ＣｐＧを有するオリゴヌクレオチドの制限された活性を実証している）を参照されたい。最近では、オリゴヌクレオチドなどの脂質カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）が適応免疫応答におけるそれらの免疫刺激特性を改善することが示されてきている。例えば、同時係属米国特許出願第１０／４３７,２７５号を参照されたい。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
驚いたことに、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームと併せて抗体を投与することで、標的細胞の溶解をもたらす抗体処置の効果を劇的に向上できることが発見された。本明細書中で最初に実証されているように、処置用抗体及びこのようなリポソーム核酸の同時投与は、標的細胞溶解における強力な相乗的向上を提供する。理論により拘束されるものではないが、陽イオン性リポソームによる免疫刺激性核酸の送達が、先天性免疫応答そして特に抗体依存性細胞傷害の顕著な強化をもたらすようである。
【０００９】
従って、一つの側面において、本発明は抗体依存性細胞傷害を強化しそして被験体中で標的細胞の溶解を介在するための組成物を提供する。ここでこの組成物は、処置用抗体及び免疫刺激性核酸、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、より好ましくは少なくとも１つのＣｐＧモチーフ含むＯＤＮ、そして最も好ましくは少なくとも１つのメチル化ＣｐＧを含むＯＤＮを含んだ陽イオン性リポソーム、を含んで成る。具体的実施態様においいて、ＯＤＮは核酸配列５'ＴＡＡＺＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３'（ＯＤＮ１ｍ）（配列番号:４）を含んで成る。別の具体的実施態様において、ＯＤＮは核酸配列５'ＴＴＣＣＡＴＧＡＺＧＴＴＣＣＴＧＡＺＧＴＴ３'（ＯＤＮ２ｍ）（配列番号:３１）を含んで成る。核酸は、陽イオン性リポソームと複合体を形成し又は陽イオン性リポソームによりカプセル化されることができ、好ましくは陽イオン性リポソームにより完全にカプセル化される。
【００１０】
処置用抗体はモノクローナル又はポリクローナルであることができ、そして病原体抗原及び腫瘍関連抗原を含む着目の任意の標的抗原を対象にすることができる。本明細書中で説明する組成物及び方法において使用する好ましい処置用抗体としては、抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、抗ＣＤ３３抗体（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、抗ＣＤ５２抗体（例えば、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥＧＦ−Ｒ抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、抗ＨＬＡ−ＤＲ１０β抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗Ｔ細胞抗体（Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、ＯＫＴ３（登録商標））などが挙げられる。
【００１１】
別の側面において、本発明は、哺乳類の被験体中の標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害を誘導する改善された方法を提供する。この改善された方法は、免疫刺激性核酸、好ましくはメチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームを用いてｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで被験体のＮＫ細胞を活性化すること、及び標的細胞抗原に対する処置用抗体を用いてｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞をオプソニン化することを含んでなる；ここで、活性化されたＮＫ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで処置用抗体のＦｃ部分に結合する。好ましい実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞であり、そして標的細胞抗原は腫瘍関連抗原である。
【００１２】
腫瘍細胞を溶解するための方法もまた提供される。この方法は、処置用抗体及び免疫刺激性核酸、好ましくは少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームを、腫瘍細胞を有する患者に投与することを含む。ここで、抗体依存性細胞傷害をもたらすために処置用抗体は腫瘍細胞に関連する表面膜抗原に結合し、陽イオン性リポソームは患者のＮＫ細胞を動員し（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）そして活性化する。処置用抗体及び陽イオン性リポソームは同時に又は順に投与することができる。特に好ましい実施態様においては、陽イオン性リポソームは抗体より前に投与する。
【００１３】
本明細書中では、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて癌患者を処置するための改善された方法も提供される。この改善は、免疫刺激性核酸、好ましくはメチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームを用いて患者を前処置することを含む。ここで、この前処置は、抗体依存性細胞傷害をもたらすために患者のＮＫ細胞の動員及び活性化を引き起こす。具体的実施態様において、癌はリンパ腫であり、モノクローナル抗体はリツキシマブである。別の具体的実施態様において、癌は乳癌であり、処置用抗体はトラスツズマブである。
【００１４】
更なる側面において、本発明は、被験体中の標的細胞の溶解を介在するためのキットを提供する。このキットは、標的細胞抗原に対する処置用抗体及び免疫刺激性核酸、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、より好ましくは少なくとも１つのＣｐＧモチーフ含むＯＤＮ、そして最も好ましくは少なくとも１つのメチル化ＣｐＧを含むＯＤＮを含んだ陽イオン性リポソームを含んで成る。処置用抗体及び陽イオン性リポソームは、同一の又は別々のバイアルにおいて提供することができる。好ましい実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞であり、標的細胞抗原は腫瘍関連抗原である。
【００１５】
本発明は、免疫刺激性核酸、好ましくは少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームによりｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで活性化された処置用の哺乳類ＮＫ細胞にも関連する。ここで、この活性化されたＮＫ細胞は、腫瘍関連抗原に対する処置用抗体のＦｃ領域に結合する。本明細書中では、腫瘍細胞を溶解するための方法も提供される。この方法は、上記の腫瘍関連抗原に対する処置用抗体及び活性化された哺乳類ＮＫ細胞を含む。
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書中で説明されている本発明は、抗体処置の効果の劇的な向上に関する。ここでこの向上は、所望の標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を顕著に増加させるための、処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与を含む。本明細書中で実証されているように、対象の陽イオン性リポソームの投与は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージの動員、増殖及び／又は活性化を引き起こす。ＮＫ細胞及びマクロファージの２つは、ＡＤＣＣ活性に関与する主なエフェクター集団である。
【００１７】
従って、１つの側面において、本発明は、標的抗原に対する免疫応答、より好ましくは先天性免疫応答、そしてさらにより好ましくはＡＤＣＣ応答を刺激するための方法及び組成物を提供する。１つの実施態様において、ＮＫ細胞の動員、増殖及び活性化を誘導する組成物及び方法が提供される。本明細書中で説明されているように、対象の組成物の投与後に、特に脾臓のＮＫ細胞の劇的且つ急速な再分布が観察され、それらを高い腫瘍負荷部位へのホーム（ｈｏｍｅ）及び局在に利用することができる末梢血液ＮＫコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の増殖を引き起こす。ＮＫ細胞のこの急速な動員及び増殖と同時に、ＮＫ細胞集団の急速な活性化が起こることが、細胞活性化マーカーの発現及び上昇した細胞溶解活性の両方により決定された。対象の組成物を用いた処理は、末梢血液及び脾臓コンパートメントから得たＮＫ細胞の表面上におけるＣＤ６９などの活性マーカーの発現を上昇させた。
【００１８】
本明細書中で実証されているように、未処理動物から得た細胞と比較して、対象の方法により得た活性化されたＮＫ細胞が細胞溶解活性を強化することが、４時間のクロム遊離細胞傷害性アッセイにおける標準的標的細胞であるＹＡＣ−１に対する活性により決定された。興味深いことに、対象の脂質製剤により活性化された細胞は、Ｐ８１５腫瘍細胞系に対する強化された細胞傷害性を示さなかった。この標的細胞は、サイトカイン活性化キラー細胞における強化された活性の検出にしばしば使用される。これは、核酸及びサイトカイン両方がＮＫ細胞を活性化し、そしてより高い細胞溶解活性を誘導する一方で、その得られた活性は質的に異なることを示唆しており、これら２つの活性ストラテジーは相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）及び／又は相乗的である可能性を高めている。さらに、これらの核酸活性化免疫細胞はＡＤＣＣ活性のレベルの強化を介在した。腫瘍細胞の表面上の抗原に対するｍＡｂｓの存在が、未処理動物から得た免疫細胞の腫瘍細胞を認識し破壊する能力を強化することを見いだしたのと同時に、陽イオン性リポソームで調製された核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの投与が、様々な組織コンパートメントから得た免疫細胞によるＡＤＣＣ活性の劇的且つ相乗的な強化をもたらし、ｍＡｂｓの存在下で腫瘍細胞に対する細胞傷害性を上昇させた。細胞分離実験により実証されているとおり、この強化されたＡＤＣＣ活性がそのＮＫ細胞集団内にほぼ完全に備わっていた。
【００１９】
従って、別の側面において、本発明は抗体により介在される免疫応答（特にＡＤＣＣを含む）を強化することで、抗体処置の活性を増強しそれによりそれらの処置効果を増強するための組成物及び方法を提供する。本明細書中で説明される組成物及び方法は、ＡＤＣＣ機序により既に作用する抗体活性を増大させることができ、また付加的なエフェクター機序を代替経路によって作用するそれらの抗体に加えることができ、そして非処置用抗体に抗腫瘍活性を潜在的に付与することができる。好ましい実施態様においては、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは抗体処置と組み合わされて、抗体処置の標的に対するより強力な免疫応答を誘導する。この組成物によっては、サイトカインなどの付加的な成分、付加的な処置薬及び／又は他の成分を用いるが、これらの付加的な成分は全ての使用に対して必要というわけではない。
【００２０】
本明細書中で実証されているように、対象の免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与が、いくつかの許容された動物モデルにおいて、様々なｍＡｂｓの効果を強化することを見出した。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系であるＮａｍａｌｗａを用いてチャレンジし、そして免疫刺激性核酸及び様々な用量の抗ＣＤ２０ｍＡｂを含む陽イオン性リポソームで処理したＳＣＩＤマウスのヒト異種移植モデルにおいては、ｍＡｂｓ単独（１８−３１％ ＩＬＳ）又は核酸単独（寿命が１１２％増加）を用いて処理した未処理の動物と比較して、その組み合わせによる処理がこれらの動物の生存を強化すること（寿命又はＩＬＳにおいて、＞２７０％の増加）を見出した。同様に、Ｃ５７ＢＩ／６−ＥＬ４胸腺腫静脈及び皮下モデルにおいて、脂質で調製された核酸及びｍＡｂ（この場合、ガングリオシドＧＤ２に対して特異的な）の組み合わせが、どちらの単独処理よりも、生存の強化及び腫瘍成長の阻害においてそれぞれ処置上の有利性を示した。
【００２１】
本発明は、製剤及びその使用方法を提供する。これは、特にメチル化オリゴヌクレオチドを含む核酸、そしてより詳細にはメチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有する核酸が、それらを陽イオン性リポソーム中に含有させることによって、ｉｎ ｖｉｖｏで劇的に先天性免疫応答を強化することができるという発見に基づいている。
【００２２】
１つの実施態様において、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。好ましい実施態様において、核酸は１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここでこのＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されている。具体的実施態様において、核酸は配列５'ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３'（ＯＤＮ１ｍ）を含む。代わりの実施例において、核酸は少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここでこのＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンはメチル化されている。さらなる実施態様において、配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンがメチル化されている。別の具体的実施態様において、核酸は配列５'ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ３'（ＯＤＮ２ｍ）を含む。別の実施態様において、核酸は複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここでこのＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つはメチル化シトシンを含む。本明細書中で実証されているように、メチル化シトシンを含む唯一のＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸、又はこのＣｐＧジヌクレオチドの唯一の若しくは２〜３のシトシンがメチル化されている多くのＣｐＧジヌクレオチドを利用して、先天性免疫応答の効果的な刺激を獲得することができる。
【００２３】
本発明の多様な製剤の詳細な製造方法、使用方法及び試験方法については、以下及び本明細書中で引用されている引用文献（それらの全ては引用文献として組み込まれている）において説明されている。
【００２４】
略語及び定義
下記の略語は本明細書中で使用される：
【００２５】
ＲＢＣ、赤血球；
【００２６】
ＤＤＡＢ、Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロマイド；
【００２７】
ＤＯＤＡＣ、Ｎ,Ｎ−ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド；
【００２８】
ＤＯＰＥ、１,２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；
【００２９】
ＤＯＳＰＡ、２,３−ジオレイロキシ−Ｎ−（２（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート；
【００３０】
ＤＯＴＡＰ、１,２−ジオレオイロキシ−３−（Ｎ,Ｎ,Ｎ,−トリメチルアミノ）プロパンクロライド；
【００３１】
ＤＯＴＭＡ、１,２−ジオレイロキシ−３−（Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロライド；
【００３２】
ＯＳＤＡＣ、Ｎ−オレイル−Ｎ−ステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド；
【００３３】
ＲＴ、室温；
【００３４】
ＨＥＰＥＳ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；
【００３５】
ＦＢＳ、ウシ胎児血清；
【００３６】
ＤＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグルス培地；
【００３７】
ＰＥＧ−ＤＭＧ  ３−Ｏ−[２'−（ｗ−モノメトキシポリエチレン グリコール２０００）スクシノイル］−１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール
【００３８】
ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ14、１−Ｏ−（２'−（オメガ-メトキシポリエチレングリコール）サクシノイル）−２−Ｎ−ミリストイル-スフィンゴシン；
【００３９】
ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ20、１−Ｏ−（２'−（オメガ-メトキシポリエチレングリコール）サクシノイル）−２−Ｎ−アラキドイル-スフィンゴシン；
【００４０】
ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；
【００４１】
ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；
【００４２】
ＥＧＴＡ、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−テトラ酢酸；
【００４３】
ＳＦ−ＤＭＥＭ、無血清ＤＭＥＭ；
【００４４】
ＮＰ４０、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール；
【００４５】
１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
【００４６】
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；及び
【００４７】
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）。
【００４８】
本明細書中で使用される技術的及び科学的用語は、特段の断りのない限り、本発明が関係する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中で、当業者に知られた多様な方法論について言及される。言及されるそのような知られた方法論を説明する刊行物及び他の資料はそっくりそのまま本明細書中に引用文献として組み込まれている。組換えＤＮＡ技術の一般的原理について説明している標準的な引用文献としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ,Ｊ.,他 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ; Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ２ｄ Ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｐｌａｎｖｉｅｗ, Ｎ.Ｙ.（１９８９）; Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ, Ｍ,Ｊ., Ｅｄ., Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ: Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ, ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ, Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）; Ｊｏｎｅｓ, Ｊ., Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ, Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）; Ａｕｓｔｅｎ, Ｂ. Ｍ. 及び Ｗｅｓｔｗｏｏｄ, Ｏ.Ｍ.Ｒ., Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ, ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ, Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）、が挙げられる。本発明を実施する上で、当業者に知られた任意の適切な材料及び／又は方法を使用することができる；しかし、好ましい材料及び／又は方法が説明されている。以下の記載及び実施例において言及される材料、試薬等は、特段の断りのない限り商業的な供給源から入手可能である。当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限活用できるだろう。本出願で引用される（引用文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属特許出願を含む）すべての引用文献の全内容は、本明細書により引用文献として明確で援用される。
【００４９】
本明細書中で提供される組成物及び方法は、少なくとも1つの免疫刺激性核酸、好ましくは少なくとも1つのメチル化核酸、より好ましくは少なくとも1つのメチル化オリゴヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも1つのメチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含んだ陽イオン性リポソームを含む。具体的実施態様において、メチル化シトシン残基はその配列中に位置するＣｐＧジヌクレオチドモチーフの一部である。ＣｐＧは少なくとも１つのシトシンの４位の炭素（４−ｍＣ）又は５位の炭素（５−ｍＣ）に付着したメチル基又はヒドロキシメチル基を含む。さらなる実施態様において、Ｈｅｎｒｙ他の２０００ Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｅｘｐ. Ｔｈｅｒ. ２９２: ４６８、 Ｚｈａｏ他の１９９９ Ｂｉｏｏｒｇ. Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ. ９: ３４５３、Ｚｈａｏ他の２０００ Ｂｉｏｒｇ Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ. １０: １０５１において説明されているように、メチル化核酸配列はデオキシリボース又はリボース糖部分のメチル化修飾を選択的に又は付加的に含むことができる。特に好ましい実施態様において、ＯＤＮは、非メチル化形態において免疫刺激活性を有し且つ免疫刺激性配列（「ＩＳＳ」）と名づけられたメチル化核酸配列を含む。
【００５０】
本明細書中で使用される「処置用抗体」は、対象の処置において有利な効果を提供する、任意の合成、組み換え、又は天然の抗体を指す。免疫エフェクター機序によるその後の溶解のために、所望の標的細胞の表面膜抗原に結合し、標的細胞をオプソニン化することができる、処置用抗体が特に好ましい。適切な抗体処置薬は、腫瘍関連抗原及び病原体抗原に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む。典型的な処置用抗体としては、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥＧＦ−Ｒ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ１０β抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗Ｔ細胞受容体抗体、などが挙げられる。
【００５１】
本明細書中で使用される「標的細胞抗原」は、処置用抗体を対象にすることができ、そしてＡＤＣＣ応答を対象にし且つ刺激することができる、着目の抗原を指す。好ましい抗原は表面膜抗原であり、腫瘍関連抗原及び病原体抗原を含む。
【００５２】
本明細書中で使用される「腫瘍関連抗原」は、腫瘍又は癌細胞に関連する分子又は成分（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物及び／又はＤＮＡ）であり、ＭＨＣ分子との関連において抗原提示細胞表面上に提示された場合、免疫応答を引き起こすことができる。腫瘍関連抗原は、自己抗原、並びに動物に投与した場合に特異的に癌と関連しないかもしれないが、それでもなお癌の成長に対する免疫応答の促進及び／又は癌の成長を減少させる他の抗原を含む。自己免疫応答の潜在的リスクに鑑みると、対象のワクチン中での自己抗原の使用は、乳房、前立腺、精巣、メラニン細胞などの決定的でない組織に限定することができる。より具体的な実施態様は本明細書中で提供される。
【００５３】
本明細書中で使用される「微生物抗原」は微生物の抗原である。微生物には、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生生物及び感染性真菌を含むがこれらに限定されない。微生物抗原は、無傷の微生物及び天然の単離物、断片又はそれらの誘導体、天然の微生物抗原と同一又はこれに類似した合成成分であって、好ましくは（天然の微生物抗原がそれに由来する）対応する微生物に特異的な免疫応答を誘導するものであることができる。好ましい実施態様において、成分は、もしそれが天然の微生物抗原に対する（体液性及び／又は細胞性の）免疫応答を誘導するならば、天然の微生物抗原に類似する。天然の微生物抗原に類似する成分又は抗原は、当業者に周知である。天然の微生物抗原に類似する成分の制限されない例は、ポリサッカライド抗原のペプチド模倣体である。より具体的な実施態様は、本明細書中で提供される。
【００５４】
本明細書中で使用される「対象」又は「宿主」は、免疫系を有する雄性又は雌性の生物、好ましくは動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、なおより好ましくはげっ歯類、最も好ましくはヒトを指す。対象のさらなる例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ及びラットが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される「患者」は、癌又は病原体感染などの病状（例えば、疾患又は病気）に対する処置を必要とする対象を指す。
【００５５】
本明細書中で使用される「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、生物において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはげっ歯類において、最も好ましくはヒトにおいてということを指す。
【００５６】
本明細書中で使用される「免疫刺激性の」、「免疫刺激活性」又は「免疫応答を刺激する」及びそれらの文法的な同義語は、免疫応答を誘導、増加、強化、又は調節する、或いは他の方法で免疫応答に関して有益な効果を提供することを指す。好ましくは、そして従来技術中で報告されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験結果における広い変動に鑑みて、所定の製剤及び核酸配列の免疫刺激活性は、本明細書に記載の適切なｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて決定される。
【００５７】
本明細書中で使用される「アジュバント」は、免疫応答の刺激を刺激又は強化することのできる任意の物質を指す。いくつかのアジュバントは免疫系の細胞を活性化することができ、例えば、アジュバントは免疫系の細胞にサイトカインを産生させ、そして分泌させることができる。免疫細胞の活性化を引き起こすことのできるアジュバントの例としては、Ｑ.サポナリア（Ｑ. ｓａｐｏｎａｒｉａ ｔｒｅｅ）の樹皮から精製されたサポニン、例えばＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画の２１番目のピーク中に溶出する糖脂質；Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ., Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ, Ｍａｓｓ.）；ポリ（ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー;Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ, ＵＳＡ）；モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ; Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ., Ｈａｍｉｌｔｏｎ, Ｍｏｎｔ.）のようなリポポリサッカライド誘導体、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ; Ｒｉｂｉ）及びトレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ; Ｒｉｂｉ）；ＯＭ-１７４（リピッドＡに関連したグルコサミンジサッカライド；ＯＭ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ, Ｍｅｙｒｉｎ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；及びレイシュマニア伸長因子（精製レイシュマニアタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ, Ｓｅａｔｔｌｅ, Ｗａｓｈ.）が挙げられるが、これらに限定されない。伝統的なアジュバントは当業界において周知であり、例えばリン酸アルミニウム又はヒドロキシド塩（「ミョウバン」）を含む。
【００５８】
「免疫刺激」又は「免疫応答の誘導」は介入に対する免疫系細胞又は成分の直接又は間接的な応答として広く特徴づけられている。これらの応答は免疫系細胞（Ｂ細胞，Ｔ細胞，樹状細胞、ＡＰＣ，マクロファージ，ＮＫ細胞，ＮＫＴ細胞等）の活性化、増殖又は分化、マーカーの発現の上方制御もしくは下方制御、血清中へのサイトカイン、インターフェロン、ＩｇＭおよびＩｇＧの放出、巨脾腫（脾臓の細胞質の増大を含む）、各種臓器の過形成および混合細胞性浸潤を含む多くの方法で測定することができる。さらに刺激又は応答は先天性の免疫細胞系細胞でも後天性免疫系細胞（たとえば、正常な弱い抗原を含有するワクチンによる）でもよい。本明細書中で実証されているように、対象のリポソーム核酸の投与は、ＮＫ細胞、マクロファージ及び先天性免疫システムのその他の重要な免疫エフェクター細胞の増殖及び活性化の両方を引き起こす。１つの実施態様において、その組成物はＡＤＣＣなどの免疫エフェクター機序の改善における使用を見出す。好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、処置用抗体との組み合わせで使用する場合に相乗作用をもたらす。
【００５９】
本発明の組成物及び方法は、免疫刺激性核酸を含んだリポソーム、そしてより好ましくは、陽イオン性リポソームを含む。このようなリポソームは、当業界で周知であり、単層リポソーム小胞、多重膜リポソーム小胞、脂質複合体及び脂質粒子を含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書中では、１の脂質含有膜を有するリポソームは「単一層」と呼ばれる。複数の脂質含有膜を有するリポソームは、本明細書中では「多重層」と呼ばれる。本明細書中で使用される「脂質二重層」は、２の層を有する、脂質含有膜を指す。好ましい実施態様において、リポソームは多重層である。免疫刺激性核酸は、陽イオン性リポソームと複合体を形成するか又は陽イオン性リポソームによりカプセル化されることができ、そして最も好ましくは、陽イオン性脂質小胞内で完全にカプセル化される。
【００６０】
核酸
本発明の組成物及び方法における使用に適切な核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチド、より好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）、そして最も好ましくはＩＳＳを含むＯＤＮ（「ＩＳＳ ＯＤＮ」）である。好ましいＩＳＳは、例えば、ヘアピン型２次構造を導くいくつかのパリンドローム（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ., 他（１９９２） Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４８: ４０７２−４０７６、を参照されたい）、又はＣｐＧモチーフ、及びその他の既知のＩＳＳの特徴を含む（マルチ−Ｇドメインなど、国際公開第９６／１１２６６号を参照されたい）。特に好ましい実施態様において、核酸はメチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。
【００６１】
本明細書中で使用される「核酸」は、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基及び交換可能な有機塩基に結合した糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）を含む分子であり、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））又は置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））のいずれかである）を指す。核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。好ましくは、核酸はオリゴリボヌクレオチドであり、より好ましくはＯＤＮである。核酸は、ポリヌクレオシド、すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を除いたもの、及び他の任意の有機塩基を含むポリマーであることもできる。
【００６２】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり、５−５０ヌクレオチド（「ｎｔ」）の範囲の長さである。しかしながら、例えば、５００−５０,０００塩基対（「ｂｐ」）の範囲の大きな二本鎖プラスミドＤＮＡを含む任意のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００６３】
本発明の組成物及び方法において有用な核酸は、知られた供給源から得ることができ、又は当業界において周知の方法を用いて単離することができる。核酸はまた、同様に当業界において周知の組換え方法又は合成方法によって調製することもできる。そのような核酸はその後、脂質粒子中に内包することができ、そして得られた組成物は本明細書中に記載された本発明の方法を用いて免疫刺激活性について試験することができる。
【００６４】
ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のためには、核酸は（例えば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを介した）分解に対して耐性であることができる。ステムループのような二次構造は核酸を分解に対して安定化させることができる。或いは、核酸の安定化はリン酸塩骨格の修飾によって達成することができる。好ましい安定化された核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオエート修飾された骨格（ＰＳ）を有する。ホスホロチオエートはホスホラミデート又はＨ−ホスホネートの化学作用のいずれかを用いる自動化された技術を利用して合成することができる。例えば、米国特許第４,４６９,８６３号中で説明されているように、アリール−ホスホネート及びアルキル−ホスホネートを生成することができ；そしてアルキルホスホトリエステル（米国特許第５,０２３,２４３号及びヨーロッパ特許第０９２,５７４号で説明されているように、荷電した酸素部分がアルキル化された）は、商業的に入手可能な試薬を用いて自動化された固相合成法によって調製することができる。他のＤＮＡ骨格の修飾方法及び置換方法が説明されている（Ｕｈｌｍａｎｎ 及び Ｐｅｙｍａｎ, Ｃｈｅｍ. Ｒｅｖ. ９０:５４４, １９９０; Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ, Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ. １:１６５, １９９０）。しかし、本明細書中で実証されているように、このような修飾は、本発明の方法及び組成物の利用に対して必須ではない。
【００６５】
したがって、本発明の組成物及び方法において有用なオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、並びにそれらを相互に組み合わせたもの及び／又はそれらとホスホジエステルオリゴヌクレオチドを組み合わせたものなどの修飾されたリン酸骨格を有することができる。さらに、他の修飾オリゴヌクレオチドとしては：アルキル−アリールリン酸塩及びアリールリン酸塩（その中の荷電したホスホネートの酸素がアルキル又はアリール基で置換されている）のような非イオン性ＤＮＡアナログ、その中の荷電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステルが挙げられる。細胞性免疫応答が望まれる場合にはＰＯ ＯＤＮが好ましい、一方体液性免疫応答が望まれる場合には、ＰＳ ＯＤＮのような修飾ＯＤＮが好ましい。
【００６６】
塩基、糖又は結合部分への他の多くの化学的修飾もまた有用である。塩基はメチル化又は非メチル化であってよい。好ましい実施態様において、メチル基又はヒドロキシメチル基が、少なくとも１つのシトシンの４位の炭素（４−ｍＣ）又は５位の炭素（５−ｍＣ）に結合している。好ましくは、メチル化シトシンは、核酸配列中のＣｐＧモチーフ内に位置する。或いは又はさらに、糖部分は、従来技術において説明されているように、メチル基で修飾することができる。
【００６７】
本発明の組成物及び方法において有用なヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように患者／対象のｍＲＮＡに相補的なものであることができ、或いはそれらは外来又は非相補的なもの（例えば、このヌクレオチド配列は患者／対象のゲノムに特異的にハイブリダイズしない。）であることができる。ヌクレオチド配列は発現されることができ、そして得られた発現産物はＲＮＡ及び／又はタンパク質であることができる。さらに、そのようなヌクレオチド配列は適切なプロモーター及び発現要素に連結することができ、発現ベクターに含まれることができる。本明細書中で使用される「非配列特異的」という用語は、非相補的であり、発現産物をコードしない核酸配列を指す。
【００６８】
本発明の核酸は、当業界において周知の任意の多数の方法を用いてデノボ合成することができる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ, Ｓ.Ｌ., 及び Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ, Ｍ.Ｈ. Ｔｅｔ. Ｌｅｔ. ２２:１８５９, １９８１）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ 他., Ｔｅｔ. Ｌｅｔ. ２７:４０５１−４０５４, １９８６; Ｆｒｏｅｈｌｅｒ 他., Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄ. Ｒｅｓ. １４:５３９９−５４０７, １９８６,; Ｇａｒｅｇｇ 他., Ｔｅｔ. Ｌｅｔ. ２７:４０５５−４０５８, １９８６, Ｇａｆｆｎｅｙ 他., Ｔｅｔ. Ｌｅｔ. ２９:２６１９−２６２２, １９８８）である。これらの化学反応は、市場で入手可能な多様な自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置によって実施することができる。また、ＣｐＧジヌクレオチドもプラスミド中で大量に産生することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ, Ｔ. 他., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９８９を参照されたい）。そのようなプラスミドはまた、ＤＮＡワクチンの場合の抗原をコードする遺伝子のように、発現される他の遺伝子をコードすることもできる。オリゴヌクレオチドは制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いるもののような既知の技術を利用して、現存の核酸配列（例えば、ゲノム又はｃＤＮＡ）から調製することもできる。
【００６９】
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のためには、例えば脂質成分又は核酸成分などの組成物の成分を含む本発明の組成物は、標的細胞（例えば、Ｂ細胞、単核球細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の表面とのより高い親和性での結合及び／又は標的細胞による細胞取り込みの増加をもたらす分子と結合させることができる。この組成物の成分を含む本発明の組成物は、当業界において周知の技術を用いて所望の分子とイオン結合又は共有結合させることができる。プロテインＡ、カルボジイミド、及びＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの多様なカップリング剤又は架橋剤を使用することができる。
【００７０】
生物中における核酸配列の免疫刺激活性は、例えば、問題の配列と他の免疫刺激剤（例えば、他のアジュバント又はＩＳＳなど）との比較など；或いは、問題の配列の免疫刺激活性の検出又は測定（例えば、宿主の防御機構の活性化又は免疫系成分の活性化の検出又は測定など）など、の単純な実験により決定することができる。そのようなアッセイは当業界において周知である。また、当業者は、本明細書中説明された及び／又は当業界において知られたありきたりのアッセイを使用して、着目の特定の哺乳動物種に対して有用な最適のオリゴヌクレオチドを同定する方法も知っているであろう。
【００７１】
本発明の組成物及び方法における使用に適した特定のＯＤＮの核酸配列は、米国特許出願第６０／３７９,３４３号、同第０９／６４９,５２７号、国際公開第０２／０６９３６９号、同第０１／１５７２６号、米国特許第６,４０６,７０５号及びＲａｎｅｙ 他, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ, ２９８:１１８５−１１９２（２００１）において説明されており、それらは全て本明細書中に引用文献として組み込まれている。ＯＤＮの典型的な配列は、表１に示した核酸配列を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法において使用するＯＤＮはホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格又はホスホロチオエート（「ＰＳ」）骨格、及びＣｐＧモチーフ中に少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
【表１】
2007509040.tif 000003
【表２】
2007509040.tif 000004
【表３】
2007509040.tif 000005
【００７２】
リポソーム
リポソーム及びそれらを調製する方法は当業界で周知であり、そして任意の多くのリポソーム製剤が本明細書中で有利な使用を見出すことができ、米国特許第６,４６５,４３９号；同第６,３７９,６９８号；同第６,３６５,６１１号；同第６,０９３,８１６号、及び第６,６９３,０８６号において説明されているものを含み、それらの開示は本明細書中に引用文献として組み込まれている。好ましいリポソームは陽イオン性脂質を含むリポソームであり、そしてさらにより好ましくは、本明細書中で説明される陽イオン性脂質小胞製剤及び例えば米国特許第５,７８５,９９２号；同第６,２８７,５９１号；６,２８７,５９１ Ｂ１；同時係属米国特許出願第６０／３７９,３４３号、及び同時係属米国特許出願第０９／６４９,５２７号においてより完全に説明される陽イオン性脂質小胞製剤であり、それらは全て本明細書中に引用文献として組み込まれている。
【００７３】
特に好ましい実施態様において、陽イオン性リポソームは、２０：２５：４５：１０モル／モルの比率のＤＳＰＣ、ＤＯＤＭＡ、Ｃｈｏｌ、及びＰＥＧ−ＤＭＧを含む。本明細書中で使用されているように、モル量の各脂質は脂質が列挙されたのと同じ順番で与えられる（例えば、ＤＳＰＣ対ＤＯＤＭＡ対Ｃｈｏｌ対ＰＥＧ−ＤＭＧの比率は２０ＤＳＰＣ：２５ＤＯＤＭＡ:４５Ｃｈｏｌ：１０ＰＥＧ−ＤＭＧ又は「２０：２５：４５：１０」である）。別の実施態様において、ＤＳＰＣはＰＯＰＣで、ＤＯＤＭＡはＤＯＤＡＰで、そしてＰＥＧ−ＤＭＧはＰＥＧＣｅｒ１４又はＰＥＧＣｅｒ２０で置換することができる。
【００７４】
「脂質」という用語は、脂肪酸エステルであって水中では不溶性であるが多くの有機溶媒中では溶解性であるという特徴を有する、有機成分の群を指す。それらは通常少なくとも３つのクラス：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」；及び（３）ステロイド及び脂質の操作により誘導体化された成分などの「誘導体化脂質」、に分けられる。広く多様な脂質を本発明とともに使用することができ、そのうちのいくつかが以下で説明される。
【００７５】
「荷電された脂質」という用語は、正電荷若しくは負電荷を有する脂質種を指すか、又は正味で中性に荷電されず、かつ脂質が見つかる溶液のｐＨとの関連を一般的に必要とする双性イオンである脂質種を指す。
【００７６】
生理的ｐＨにおいて正に荷電された脂質としては、Ｎ,Ｎ−ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロマイド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＴＡＰ」）；３ｂ−（Ｎ−（Ｎ',Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）及びＮ−（１,２−ジミリスチロキシプロプ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられる、これらに限定されない。さらに、本発明において使用されることのできる多くの陽イオン性脂質の市販調製物が入手可能である。これらは、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, Ｕ.Ｓ.Ａ.から商業的に入手可能な、ＤＯＴＭＡ及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）を含む陽イオン性リポソームである）；及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（商業的に入手可能な、Ｎ−（１−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）を含む陽イオン性リポソームである）；を含む。
【００７７】
いくつかの正に荷電された脂質が滴定可能であり、すなわち、それらは生理的ｐＨ又はその付近でｐＫａを有し、弱酸性条件下で強く陽イオン性であり、生理的ｐＨで弱く（又は非）陽イオン性であるという本発明に対して意味ある結果を有する。このような正に荷電された脂質としては、Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＭＡ）、及び１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＭＤＭＡもまた、有用な滴定可能な陽イオン性脂質である。
【００７８】
生理的ｐＨにおいて陰イオン性に荷電された脂質としては、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）−ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルリン酸、ジパルミトイルリン酸、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
いくつかの負に荷電された脂質が滴定可能であり、すなわち、それらは生理的ｐＨ又はその付近でｐＫａを有し、弱塩基性条件下で強く陰イオン性であり、生理的ｐＨで弱い（又は非）陰イオン性であるという本発明に対して意味ある結果を有する。こうした負に荷電した脂質は、本明細書中で開示される原理に基づいて当業者により同定されうる。
【００８０】
「中性脂質」という用語は、生理的ｐＨにおいて荷電されない形態又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの任意の脂質種を指す。このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールが挙げられる。
【００８１】
本発明において使用される特定の好ましい脂質製剤としては、ＰＥＧ−脂質又は（ＡＴＴＡ−脂質のような）ポリアミドオリゴマー−脂質（ＡＴＴＡ−脂質など）、及び他の立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｂａｒｒｉｅｒ）又は「ステルス」−脂質、界面活性剤などのような凝集防止成分が挙げられる。そのような脂質は、米国特許第４,３２０,１２１号、同第５,８２０,８７３号、同第５,８８５,６１３号、国際公開第９８／５１２７８号、及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願第０９／２１８,９８８号中で説明され、これらはすべて本明細書中に引用文献として組み込まれている。これらの脂質及び界面活性成分は、反対に荷電された脂質及び処置剤を含む製剤の沈殿及び凝集を防止する。これらの脂質はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける循環寿命を向上させるのに用いることもでき（Ｋｌｉｂａｎｏｖ 他.（１９９０） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ, ２６８（１）: ２３５−２３７を参照されたい）、又はそれらはｉｎ ｖｉｖｏにおける製剤からの迅速な交換のために選択されることができる（米国特許第５,８８５,６１３号を参照されたい。これは本明細書中に引用文献として組み込まれている）。
【００８２】
本発明の好ましい実施態様は、交換可能な立体障害脂質を用いる。（米国特許第５,８２０,８７３号、同第５,８８５,６１３号及び米国特許出願第０９／０９４５４０及び米国特許第６,３２０,０１７号中で説明されている。それらのすべては引用文献として本明細書中で援用される。）ＰＥＧ２０００−ＣｅｒＣ１４及びＡＴＴＡ８−ＣｅｒＣ１４のような交換可能な立体障害脂質は、対象／患者に投与されると急速に脂質粒子の外側の一重層から交換する立体障害脂質である。そのような各脂質は、アシル鎖の長さ、飽和度、立体障害部分のサイズ、膜組成物及び血清組成物などを含む多様な因子に依存する、粒子から交換される速度に特徴を有する。上記の特許出願書類中で説明されているように、そのような脂質は粒子形成の間の凝集の防止において有用であり、投与の際それらの粒子からの促進された離脱は、プログラム可能な膜融合性及び粒子不安定化活性のなどの利益を提供する。
【００８３】
いくつかのリポソームが、特定の標的細胞又は標的組織へのリポソームの局在化を促進するように設計されたターゲティング部分を用いることができる。ターゲティング部分は製剤中又は製剤後に脂質粒子の外側の二重層に結合させることができる（すなわち、直接的な結合、疎水性相互作用又は別の方法によって）。これらの方法は当業界において周知である。さらに、いくつかのリポソームは、ＰＥＡＡ、ヘマグルチニン、他のリポペプチドなどの膜融合性ポリマー（米国特許第６,４１７,３２６号及び米国特許出願第０９／６７４,１９１号を参照されたい。それらすべては引用文献として本明細書中で援用される。）、及びｉｎ ｖｉｖｏでの及び／又は細胞内のデリバリーに有用な他の特徴を用いることができる。
【００８４】
他の好ましい実施態様において、本発明のリポソームはスフィンゴミエリン及びコレステロール（「スフィンゴソーム」）を含む。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法中で使用されるリポソームはスフィンゴミエリン及びコレステロールから成り、酸性のリポソーム内ｐＨを有する。スフィンゴミエリン及びコレステロールを含む脂質粒子は、他の製剤と比較していくつかの利点を有する。スフィンゴミエリン／コレステロールの組み合わせは、試験した他のリポソーム製剤よりも延長された循環寿命を有し、酸加水分解に対して大いに安定であり、顕著により良好な薬物保持特性を有し、腫瘍等へのより良好な負荷特性を有し、顕著により良好な抗腫瘍効力を示すリポソームを生成する。
【００８５】
好ましい実施態様において、本発明のリポソームは式Ｉの陽イオン性成分、及び少なくとも１つの下記の中性脂質を含む（そして米国特許第５,７８５,９９２号中で完全に説明されている。これは本明細書中で引用文献として組み込まれている。）。好ましい実施態様において、本発明のＬＮＡ製剤は、式Ｉの陽イオン性成分及び少なくとも１つの下記の中性脂質を含む（そして米国特許第５,７８５,９９２号中で完全に説明されている。これは本明細書中で引用文献として組み込まれている。）。
【化１】
2007509040.tif 000006
【００８６】
式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＣ1〜Ｃ3；アルキルである。Ｙ及びＺはアルキル鎖又はアルケニル鎖であって、それぞれ独立して以下の：−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−又は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ−であり、ただし、Ｙ及びＺが両方とも−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ではない。ｎ及びｑという文字は３〜７の間の整数を表し、一方ｍ及びｐという文字は４〜９の間の整数を表し、ただし、合計であるｎ＋ｍ及びｑ＋ｐがそれぞれ１０〜１４の間の整数である。シンボルＸ-は医薬として許容可能な陰イオンを表す。上記の式において、二重結合の配向性はシス又はトランスのいずれでもよいが、シスアイソマーが一般的に好ましい。
【００８７】
別の好ましい実施態様において、陽イオン性リポソームは式Ｉのものであり、ここで、Ｒ1及びＲ2はメチルであり、そしてＹ及びＺはそれぞれ独立して以下の：−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2−又は−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−である。好ましい実施態様において、Ｒ1及びＲ2はメチルであり；Ｙ及びＺはそれぞれ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−であり；ｎ及びｑは両方とも７であり；そしてｍ及びｐは両方とも５である。別の好ましい実施態様において、陽イオン性の成分はＤＯＤＡＣ（Ｎ,Ｎ−ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド）である。ＤＯＤＡＣは当業界において知られており、界面活性剤及びシャンプー中に添加剤として広く使用されている成分である。ＤＯＤＡもまた、他の界面活性剤と共にリポソーム組成物中の共存脂質として使用される（Ｔａｋａｈａｓｈｉ,他，ＧＢ２１４７２４３を参照されたい）。
【００８８】
本発明の陽イオン性リポソーム中の中性脂質は、典型的には界面活性剤中で使用され、又はミセル若しくはリポソームの形成のために使用される任意の多様な中性脂質であることができる。本組成物において有用な中性脂質の例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロシドであるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本組成物はジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド又はスフィンゴミエリンである中性脂質の１又は複数を含むだろう。これらの中性脂質中のアシル基は、好ましくはＣ10〜Ｃ24の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基はラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。特に好ましい実施態様においては、中性脂質は１,２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであろう。
【００８９】
陰イオンＸ-は、同様に医薬として許容可能な任意の多様な陰イオンであることができる。これらの陰イオンは、例えばＢｒ-、Ｃｌ-、Ｆ-、Ｉ-、硫酸、リン酸、酢酸、硝酸、安息香酸、クエン酸、グルタミン酸、及び乳酸を含む、有機イオン又は無機イオンであることができる。好ましい実施態様において、Ｘ-はＣｌ-又はＡｃＯ-である。
【００９０】
本明細書中で説明される他の成分に加えて、本発明の組成物は医薬として許容可能な担体を含むことができる。医薬として許容可能な担体は当業界において周知である。担体の選択は、投与される特別な組成物並びにその組成物の投与に使用される特別な方法により部分的に決定される。好ましくは、薬剤担体は溶液中、水又は生理食塩水中に存在する。
【００９１】
本発明の組成物において、陽イオン性成分の中性脂質に対する比率は、好ましくは約２５：７５（陽イオン性成分：中性脂質）から好ましくは７５：２５（陽イオン性成分：中性脂質）の範囲内にあり、又は好ましくは約５０：５０である。
【００９２】
本発明の組成物中で使用される陽イオン性成分は、標準的な合成反応（Ｍａｒｃｈ, Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ４ｔｈ Ｅｄ., Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮＹ, Ｎ.Ｙ.（１９９２）を参照されたい。これは本明細書中に引用文献として組み込まれている。）を用いる当業者に知られた方法によって調製することができる。例えば、ＯＳＤＡＣの合成は、最初に、アミンの還元的アルキル化となる条件下でホルムアルデヒドとシアノボロハイドライドナトリウムでオレイルアミンを処理することによって実施することができる。このアプローチは、ジメチルオレイルアミンを提供し、これは対応するアンモニウム塩を形成するためにその後ステアリルブロマイドでアルキル化されることができる。陰イオン交換によりＯＳＤＡＣが形成される。ジメチルオレイルアミンはまた、大過剰のジメチルアミンによってオレイルブロマイドを処理し、さらに上記のように誘導体化することによっても合成することができる。
【００９３】
両方の脂肪酸鎖が不飽和である陽イオン性成分（すなわち、ＤＯＤＡＣ）については、以下の一般的な手順を使用することができる。不飽和脂肪酸（すなわち、オレイン酸）は、塩化オキサリル、塩化チオニル、ＰＣｌ3又はＰＣｌ5などの試薬によってそれに対応するアシルクロライドに変換することができる。アシルクロライドは不飽和アミン（すなわち、オレイルアミン）で処理されて、対応するアミドを提供することができる。例えば、水素化アルミニウムリチウムによるアミドの還元は、両方のアルキル基が不飽和長鎖アルキル基である二級アミンを提供する。二級アミンはその後、メチルヨーダイドなどのアルキルハライドで処理されて四級アンモニウム成分を提供することができる。その後、陰イオン交換は所望の医薬として許容可能な陰イオンを有する陽イオン性成分を提供するために実施することができる。アルキルアミン前駆体は、同様の様式で合成することができる。例えば、アルキルハライドを大過剰のアンモニアのメタノール溶液で処理することにより、精製後に必要なアミンが産生されるだろう。或いは、適当なカルボン酸をオキサリルクロライドで処理することによって生成されたアシルクロライドは、アンモニアと反応してアミドを産生することができる。ＬｉＡｌＨ4によるアミドの還元は必要なアルキルアミンを提供するだろう。
【００９４】
好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物はミセル又はリポソームとして製剤される。本発明の陽イオン性成分及び中性脂質を含むミセルは、当業界において周知の方法によって調製することができる。本組成物のミセル製剤に加えて、本発明はリソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンポリオキシエチレン結合体、セラミド−ポリオキシエチレン結合体又はホスファチジン酸−ポリオキシエチレン結合体などの他の種を含むミセル製剤をも提供する。
【００９５】
本発明の組成物において使用されるポリオキシエチレン結合体は、結合基（すなわち、ホスファチジン酸又はホスファチジルエタノールアミン）と適切に官能化されたポリオキシエチレン誘導体とを結合させることによって調製されることができる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンはオメガ−メトキシポリエチレングリコールコハク酸塩と結合してホスファチジルエタノールアミンポリオキシエチレン結合体を提供することができる（例えば、Ｐａｒｒ, 他, Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９５:２１−３０（１９９４）を参照されたい。これは本明細書中に引用文献として組み込まれている。）。
【００９６】
本発明の組成物及び方法中で使用するための中性脂質の選択は、一般的には、例えば、リポソームのサイズ及び血流中でのリポソームの安定性などを考慮することによって導かれる。上記のように、リポソーム中の中性脂質成分は２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジル−エタノールアミン）である。多様な鎖長および飽和度の多様なアシル鎖基を有する脂質は、入手可能であり、又は周知の技術によって単離又は合成することができる。一般的に、濾過滅菌のために、リポソームが約０．３ミクロン未満に寸法決めしなければならない場合には特別に、より飽和度の低い脂質はより容易に寸法決めすることができる。１つの群の実施態様において、炭素鎖の長さがＣ14〜Ｃ22の範囲である飽和脂肪酸を含む脂質が好ましい。別の群の実施態様においては、炭素鎖の長さがＣ14〜Ｃ22の範囲のモノ又はジ不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。
【００９７】
本発明の組成物及び方法中で有用なリポソームはまた、スフィンゴミエリン又は、セリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質から構成されることもできる。本発明において有用なさらに他のリポソームは、コレステロール、ジグリセリド、セラミド、ホスファチジルエタノールアミンポリオキシエチレン結合体、ホスファチジン酸−ポリオキシエチレン結合体、又はポリエチレングリコール−セラミド結合体（例えば、ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ１４又はＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０）を含むだろう。リポソームの寸法決め及び濾過滅菌において使用される方法は以下で検討される。
【００９８】
リポソームを調製するための多様な方法が当業界において知られている（例えば、Ｓｚｏｋａ 他, Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｂｉｏｅｎｇ. ９:４６７（１９８０） 、米国特許第４,２３５,８７１号、同第４,５０１,７２８号、同第４,８３７,０２８号、ｔｈｅ ｔｅｘｔ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ, Ｍａｒｃ Ｊ. Ｏｓｔｒｏ, ｅｄ., Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｉｎｃ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９８３, Ｃｈａｐｔｅｒ 1, 及びＨｏｐｅ, 他, Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ. Ｌｉｐ. ４０:８９（１９８６）を参照されたい。これらのすべては引用文献として本明細書中で援用される。）。１つの知られた方法は、不均質なサイズの多重層小胞を産生する。この方法において、小胞を形成する脂質は適切な有機溶媒又は溶媒系に溶解され、そして真空下又は不活性ガス中で乾燥されて、脂質の薄膜を形成する。必要ならば、この膜は３級ブタノールなどの適切な溶媒中に再溶解され、そして次に凍結乾燥されて、より均一な脂質混合物を形成する。この混合物は、より簡単に水和される粉末様形態である。この膜は水性の緩衝溶液で覆われ、典型的には１５−６０分の間振とうすることによって水和される。得られた多重層小胞の大きさの分布は、より強く攪拌する条件下で脂質を水和することにより、又はデオキシコレートなどの可溶化界面活性剤を添加することにより、より小さいサイズへと移行しうる。
【００９９】
リポソームの調製に続いて、リポソームは所望のサイズ範囲及び比較的狭いリポソームサイズ分布を達成するような大きさに作ることができる。約０.２〜０.４ミクロンのサイズ範囲は、リポソーム懸濁液が慣用のフィルター、典型的には０.２２ミクロンのフィルターを通る濾過によって滅菌されることを可能とする。仮にリポソームが約０.２〜０.４ミクロンまで小さくなっていれば、濾過滅菌法はハイスループット基礎（ｂａｓｉｓ）で実施することができる。
【０１００】
リポソームの大きさを所望の寸法とするために、いくつかの技術を利用できる。１つの定寸法（ｓｉｚｉｎｇ ｍｅｔｏｄ）は米国特許第４,７３７,３２３号中で説明されており、これは本明細書中に引用文献として組み込まれている。浴槽超音波処理又はプローブ超音波処理によるリポソーム懸濁液の超音波処理は、約０.０５ミクロン未満のサイズの小さな単一層小胞まで革新的に寸法を減少させる。ホモジェナイズは、大きなリポソームからより小さいリポソームへ断片化するための剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジェナイズ方法においては、多重層小胞は標準的なエマルジョンホモジェナイザーを介して、選ばれたリポソームサイズ、典型的には約０.１〜０.５ミクロンの間であることが観察されるまで再循環される。両方法において、粒子のサイズ分布は、慣用のレーザービームによる粒子サイズの識別によってモニターすることができる。
【０１０１】
小孔ポリカーボネート膜又は非対称のセラミック膜を通してリポソームを押し出すことも、比較的明確なサイズ分布にリポソームサイズを減少させるための有効な方法である。典型的には、懸濁液は所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、１又は複数回膜を通して循環させられる。リポソームは、リポソームサイズを徐々に減少させるために、引き続いてより孔の小さい膜を通して押し出されることができる。本発明における使用のために、約０.０５ミクロン〜約０.１５ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。
【０１０２】
以下においてさらに説明されるように、本発明の組成物は任意の知られた投与ルートによって対象に投与することができる。いったん細胞に吸着すると、リポソーム（先に説明された複合体を含む）は細胞のある部分によってエンドサイトーシスされ、細胞膜と脂質を交換し、又は細胞と融合することができる。複合体のポリアニオン性部分の転位又は取り込みは、これらの経路の任意の１つを介して行われうる。特に、融合が起こる場合、リポソーム膜は細胞膜に統合され、リポソームの内容物が細胞内流体と結合することができる。
【０１０３】
以下で詳細に説明されるように、特定の細胞型を標的とするために、処置成分であることもできる付加的な成分を、本発明のリポソームに加えることができる。例えば、リポソームは、特異的細胞型上にのみ存在するエピトープ、例えば癌関連抗原などに結合するモノクローナル抗体又はその結合断片に結合されて、全身投与の後リポソームを標的する手段を提供することができる。或いは、標的細胞型の表面受容体に結合するリガンドは、リポソームに結合しうる。リポソームを標的するための別の手段も、本発明で用いることができる。
【０１０４】
リポソームを含む溶媒から遊離薬剤を取り除くために必要とされうる分離ステップの後に、リポソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞に対し投与するため、医薬として許容される担体中で所望の濃度とされる。多くの医薬として許容される担体は、本発明の組成物及び方法において用いることができる。例えば、水、緩衝液、０.４％生理食塩水、０.３％グリシンなどの様々な水性担体を使用することができ、そして安定性を強化するため、例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの糖タンパク質を含むことができる。一般的に、通常の緩衝化生理食塩水（１３５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）は、医薬として許容される担体として使用されるだろうが、他の適切な担体でも十分である。これらの組成物は、例えばろ過などの慣用のリポソーム滅菌技術によって滅菌できる。組成物は、大体の生理条件が必要とされるとき、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤などの医薬として許容される補助的な物質を含むことができ、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどである。これらの組成物は、上記の技術によって滅菌するか又は滅菌条件下で製造することができる。得られた水溶液は、使用のために包装するか、又は無菌条件下でろ過し凍結乾燥することができる。この凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌水溶液と混合される。
【０１０５】
担体中のリポソームの濃度は変化しうる。好ましい態様において、リポソーム濃度は約０.１〜２００ｍｇ/ｍｌである。当業者は、異なるリポソーム成分での又は特定の患者に対する処置を最適化するために、これらの濃度を変える方法を知っているだろう。例えば濃度を高くして、処置に伴う流体負荷を低下させることができる。
【０１０６】
対象の細胞は、通常、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの投与により本発明の組成物にさらされる。本明細書中で説明される好ましい態様においては、本発明の組成物は、例えば静脈投与により全身投与され、筋肉内、皮下、及び局所投与も考慮される。或いは、鼻腔内又は気管内投与を使用することもできる。気管内投与は液体として提供することができ、好ましくはエアロゾルとして提供することができる。噴霧器を使用して、例えば直径７０〜１００μｍの液滴のエアロゾルを作ることができる。一般的に、液滴のサイズはリポソームのサイズより大きくされるべきであることが理解されるだろう。
【０１０７】
患者に対する複数回投与が考慮される。処置の投与量計画は、疾患及び患者の条件により決定されるだろう。免疫刺激組成物を含む処置用成分による標準的処置は、当業界において周知であり、処置成分を含むリポソームによる処置の指針として役立ちうる。処置期間及び処置計画は、当業者に周知の方法により変わりうるが、一般的に循環時間の増大、及びリポソームの漏出の減少は、投与量を以前使用した投与量から下方修正することを許容する。本発明のリポソームの投与量は、臨床条件及び処置を受ける動物の又は患者のサイズに依存して変わりうる。内包されない処置用成分の標準的投与量は、リポソームに内包される成分の投与量に対する指針として役に立ちうる。いくつかの場合において投与量は変わりうるが、典型的には投与量は処置過程において一定であるだろう。処置中に標準的な生理的パラメーターを評価し、本発明のリポソームの投与量を変えるために使用することができる。
【０１０８】
抗体処置
本発明の好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、例えば腫瘍関連抗原及び病原体抗原を含む着目の標的抗原に対する抗体処置と組み合わせて投与される。特に好ましい実施態様において、抗体処置は腫瘍関連抗原を対象とする。本明細書中で使用される「組み合わせて」という文言は、同一の製剤中又は別々の製剤中のいずれかでの、対象の薬剤の同時投与又は連続投与を指す。
【０１０９】
本明細書中で説明及び実証される実施態様において、抗体処置薬と対象の陽イオン性リポソームの組み合わせは、強力な先天性免疫応答、及び特に強力な抗体依存性の細胞傷害性応答の誘導において相乗的作用を提供する。この相乗的作用は、抗体の標的特異的なオプソニン化能力を備えた対象の粒子により獲得される、先天性免疫エフェクター細胞の劇的な増殖及び活性化によってもたらされる。それは同時に、より大きな効力を有する先天性免疫応答を提供する。このように、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソーム及び抗体処置薬は、１つの製剤で一緒に投与することができ、又は別個の組成物として動物に同時投与することができる。さらに、免疫応答は、同一の製剤の一部として又は同時投与プロトコルの一部としてのいずれかで、サイトカインなどの付加的な免疫アジュバントを含めることによってさらに強化することができるが、アジュバントなどの含有は効果的応答の誘導に必要というわけではない。
【０１１０】
適切な抗体処置は、腫瘍関連抗原及び病原体抗原、特に表面膜抗原に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む。典型的な抗体処置薬としては、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）などの抗ＣＤ２０抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）などの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥＧＦ−Ｒ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ１０抗体、抗ＭＵＣ１抗体などが挙げられる。
【０１１１】
着目の抗体処置の一例を、それらを使用するための医学的適応症と共に表２に記載する。記載された抗体処置薬は他の適応症における使用を見出すこともできる。
【表４】
2007509040.tif 000007
【０１１２】
下記の実施例において、対象の陽イオン性リポソーム組成物は、効力及び相乗的処置効果を向上させるために、抗体処置薬と組み合わされる。
【０１１３】
本発明における使用に適切な抗原の例としては、ポリペプチド抗原、及びＤＮＡ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。抗原の特異的な例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、はしか、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核、及び風疹の抗原である。好ましい実施態様において、抗原は組換えＢ型肝炎抗原である。他の側面において、抗原は組換えＡ型肝炎抗原である。別の側面において、抗原は腫瘍抗原である。そのような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−1、ＥＢＶ抗原及びバーキットリンパ腫に関連する抗原である。さらなる側面において、抗原は組換えチロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原である。当業者は、本発明における使用に適切な他の抗原を知っているであろう。
【０１１４】
対象の発明における使用に適切な腫瘍関連抗原は、単一の腫瘍型を示し、数種の腫瘍型で共有し、及び／又は正常の細胞に比べて腫瘍細胞において独占的に又は過剰に発現しうる、突然変異した及び突然変異していない分子の両方を含む。タンパク質及び糖タンパク質に加えて、炭化水素、ガングリオシド、糖脂質及びムチンの発現の腫瘍特異的パターンもまた実証されてきた。上記のＭｏｉｎｇｅｏｎ。対象の癌ワクチン中で使用される典型的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び腫瘍細胞独自の突然変異又は再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚遺伝子の産物、癌胎児性抗原、組織特異的（しかし、腫瘍特異的でない）分化抗原、成長因子受容体、細胞表面の炭化水素残基、外来のウイルスタンパク質並びに多数の他の自己タンパク質が挙げられる。
【０１１５】
腫瘍関連抗原の具体的実施態様としては、例えば、Ｒａｓ ｐ２１プロトオンコジーンのタンパク質産物、腫瘍サプレッサーｐ５３及びＢＣＲ−ａｂｌオンコジーン、並びにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、Ｃａｓｐａｓｅ８、及びベータカテニンなどの突然変異抗原；ガレクチン４、ガレクチン９、カルボニックアンヒドラーゼ、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２及びＫＳＡなどの過剰発現された抗原、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などの癌胎児性抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの自己抗原及びＭａｒｔ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２などのメラニン細胞分化抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１、及びＰＳＭ−Ｐ２などの前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥなどの再活性化された胚遺伝子産物並びにＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２、及びＳＣＰ１などの他の癌精巣抗原；Ｍｕｃ−１及びＭｕｃ−２などのムチン；ＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３などのガングリオシド、中性糖脂質及びルイス（ｙ）及びグロボ−Ｈ（ｇｌｏｂｏ−Ｈ）などの糖タンパク質；そしてＴｎ,トンプソン−フリードリッヒ抗原（ＴＦ）及びｓＴｎなどの糖タンパク質が挙げられる。完全な細胞及び腫瘍細胞ライセート並びにそれらの免疫原性の部分、並びにＢ細胞リンパ腫に対して使用されるＢリンパ球のモノクローナル増殖において発現される免疫グロブリンイディオタイプもまた、本明細書中で腫瘍関連抗原に含められる。
【０１１６】
病原体としては、哺乳動物、より特別にはヒトに感染する感染性ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。感染性ウイルスの例としては：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ-１（また、ＨＴＬＶ-ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ-ＩＩＩ/ＬＡＶ、又はＨＩＶ-ＩＩＩとも称される）；及び他の単離体、例えばＨＩＶ-ＬＰ）；ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、リノウイルス、エコウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす種）；トガウイルス科（例えばウマ・脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング・ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラ・ウイルス）；パラミキソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ハシカウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ・ウイルス）；ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタ・ウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロ・ウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オービウイルス、及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；肝炎ウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペス・ウイルス科（単純ヘルペス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペス・ウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニア・ウイルス、ポックス・ウイルス）；及びイリドウイルス科（例えば、アフリカ・ブタ・熱ウイルス）；および未分類ウイルス（例えば、海面上脳症の病理学的病原体、δ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口的に伝染する（つまり、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
また、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌も、脊椎動物において抗原として働く。このようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ属、ブドウ球菌属、及び連鎖球菌属が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス属、及びサルモネラ属が挙げられるが、これらに限定されない。感染性細菌の特異的な例としては、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリア・エスピーエス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ）（例えば、エム. ツベルクロシス（Ｍ. ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム. アビウム（Ｍ. ａｖｉｕｍ）、エム. イントラセルラー（Ｍ. ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、エム. カンサイ、（Ｍ. ｋａｎｓａｉｉ）、エム. ゴルドナエ（Ｍ. ｇｏｒｄｏｎａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ネイセリア・ゴノロエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ネイセリア・メニンジチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトジーン（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（グループAストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ストレプトコッカス・アガラクチー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｅ）（グループＢストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ストレプトコッカス（ビリダン・グループ）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｇｒｏｕｐ））、ストレプトコッカスファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス（アナエロビック エスピーエス.）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｐｓ.））、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター・エスピー.,（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.）、エンテロコッカス・エスピー.,（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.）、ヘモフィリス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｅｎｚａｅ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、コリーネバクテリウム・ジフテリア（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリーネバクテリウム・エスピー.,（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.）、エリシペロスリックス・ルーシオパチー（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・ペルフリンガー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、クロストリジウム・テンターニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲン（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・マルトシーダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイド・エスピー（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ.）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネマ・ペルテヌー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リッケットシア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、及びアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
さらなる病原体の例としては、哺乳動物、より特別にはヒトに感染する感染性真菌が挙げられるが、これらに限定されない。感染性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、及び三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）などのマラリア原虫が挙げられる。他の感染性生物（つまり、原生生物）としては、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。
【０１１９】
他の薬剤成分
本発明のいくつかの好ましい実施態様は、例えば薬剤又は生理活性薬剤などの、さらに他の処置用薬剤を含む。これらの追加の成分は、直接付加的な処置上の利益又は付加的な免疫を刺激する上での利益を提供することができる。幅広い様々な処置用成分は、本発明の組成物及び方法により送達することができる。処置用成分の例としては、核酸、タンパク質、ペプチド、腫瘍退縮薬、抗感染薬、抗不安薬、向精神薬、免疫調節薬、向イオン性薬、ゲロニン等の毒素、及び真核生物タンパク質合成の阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の脂質成分における内包のための好ましい処置用成分は、親油性の陽イオンである。これらの中には、リポソームの脂質２重層に分離することができ、それゆえ膜形成のリポソームと関連することができる親油性の分子のクラスに属する処置用薬剤が存在する。処置用成分の更なる例としては、プロスタグランジン、アンホテリシンＢ、メトトレキセート、シスプラチン及びその誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びそのエステル、ビタミンＥ、コルチゾン、デキサメタゾン及びそのエステル、βメタソン・バレレート（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｖａｌｅｒｅｔｅ）、及び他のステロイド、フッ化キノロン、抗細菌シプロフロキサシン及びその誘導体、並びにアルカロイド成分及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。アルカロイド誘導体の中には、スワンソニン及びビンカ・アルカロイドのメンバー並びに半合成誘導体、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、エトポシド・ホスフェート、及びテニポシドが存在する。この群の中では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワンソニン（ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ）が、特に好ましい。スワンソニン（Ｃｒｅａｖｅｎ 及び Ｍｉｈｉｃｈ, Ｓｅｍｉｎ. Ｏｎｃｏｌ. ４: １４７（１９７７））は、骨髄増殖を刺激する能力を有する（Ｗｈｉｔｅ 及び Ｏｌｄｅｎ, Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ. ３: ８３（１９９１））。スワンソニンは、また、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＴＮＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びインターフェロン（Ｎｅｗｔｏｎ, Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ. １: ３７３（１９８９）; Ｏｌｄｅｎ, Ｋ., Ｊ.Ｎａｔｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ., ８３: １１４９（１９９１））を含む複数のサイトカインの生産を刺激する。さらに、スワンソニンは、報告によるとＢ細胞及びＴ細胞免疫を誘導し、ナチュラルキラーＴ細胞及びマクロファージに誘導されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の破壊を誘導する。そしてインターフェロンと混ぜたとき、スワンソニンは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、大腸ガン及びメラノーマガンに対する直接的な抗腫瘍活性を有する（Ｄｅｎｎｉｓ, Ｊ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ５０: １８６７（１９９０）; Ｏｌｄｅｎ, Ｋ., Ｐｈａｒｍ. Ｔｈｅｒ. ４４: ８５（１９８９）; Ｗｈｉｔｅ 及び Ｏｌｄｅｎ, Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., １０: １５１５（１９９０））。本発明の組成物及び方法において有用な他のアルカロイドとしては、パクリタキセル（タキソール）及びその合成誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。追加の薬剤成分としては、当業界に知られている任意の���理活性薬剤であって、脂質粒子に取り込まれうる薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
これらの追加の薬剤成分は、本明細書中に説明される陽イオン性リポソームに内包させるか又は他の方法でこれに結合させることができる。或いは、本発明の組成物は、処置用抗体を含む陽イオン性リポソームと結合しない薬剤又は生理活性物質を含むことができる。本明細書中で説明されているように、このような薬剤又は生理活性物質は別のリポソーム中に存在するか又は同時投与されることができる。
【０１２１】
キット
本発明の組成物は、キットとして提供することができる。１つの実施態様において、キットは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを含む。好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸はメチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。さらに好ましい実施態様において、キットは免疫刺激性核酸及び処置用抗体を含む陽イオン性リポソームを含む。好ましい実施態様において、キットは、一方のバイアルに免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを、そして別のバイアルに処置用抗体を含む。さらに好ましい実施態様において、キットは免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソーム及び処置用抗体を同一のバイアル中に含む。
【０１２２】
組成物の製造
本発明の組成物の製造は任意の技術によって達成することができるが、エタノール透析又界面活性剤透析法が最も好ましく、本明細書中に引用文献としてそれぞれ援用される下記の刊行物、特許、及び特許出願において詳述されている：米国特許第５,７０５,３８５号；同第５,９７６,５６７号；米国特許出願第０９／１４０,４７６号；米国特許第５,９８１,５０１号；同第６,２８７,５９１号；国際公開第９６／４０９６４号；及び同第９８／５１２７８号。これらの製造方法は、脂質粒子に内包された処置剤、好ましくは脂質−核酸粒子を含む免疫刺激性組成物の小規模及び大規模の製造を提供する。この方法はまた、優れた薬剤特性を有するそのような粒子を作り出す。
【０１２３】
当業界で周知の任意の多くの手段を用いて、抗原又は細胞傷害物質などの付加的な成分を、本発明の陽イオン性リポソームに添加することができ、例えば：１）製剤プロセス中における受動的内包（例えば、この成分をＯＤＮを含有する溶液中に添加されることができる）；２）エタノール脂質混合物中への糖脂質及び他の抗原性脂質の添加及び本明細書中に記載のエタノールに基づくプロトコルを用いた製剤；３）脂質小胞中への挿入（例えば、小胞と抗原−脂質ミセルをインキュベートすることによって形成された脂質小胞中に、抗原−脂質を加えることができる）；及び４）抗原又は他の成分を製剤後に添加することができる（例えば、カップリング、ここで、リンカー部位を有する脂質が、製剤される粒子へと含まれ、そしてリンカーは製剤後に活性化されて、所望の抗原と結合する）を含む。標準的なカップリング及び架橋方法論は、当業界において周知である。代わりの調製は、抗原を、核酸を含まない陽イオン性リポソームに取り込み、そしてこれらのリポソームは、対象への投与に先立って、リポソーム核酸と混合される。
【０１２４】
本発明の方法中で使用される組成物の特徴付け
本発明の組成物及び方法中で使用されるリポソームの好ましい特徴は下記のとおりである。
【０１２５】
本発明の好ましいリポソームは、十分な内部空間を内包する脂質膜 （一般的にリン脂質二重層）外部を含む。これらのリポソームは、本明細書中で時々、脂質膜小胞とも呼ばれ、平均直径５０〜２００ｎｍ、好ましくは６０〜１３０ｎｍを有する小粒子である。静脈投与に対しては、比較的均一のサイズの粒子が最も好まれ、ここで９５％の粒子が、平均３０ｎｍ以内である。核酸及び他の生理活性薬剤は、内部空間に含まれるか、又は内包膜の内表面と結合される。
【０１２６】
本明細書中で使用される「完全に内包される」は、リポソーム中の核酸が、血清にさらされた後又は遊離ＤＮＡを有意に分解するヌクレアーゼ・アッセイの後に、有意に分解されないことを意味する。完全に内包されるシステムでは、通常１００％の遊離核酸を分解する処置において、好ましくは２５％未満の粒子核酸が分解され、より好ましくは１０％未満そして最も好ましくは、５％未満の粒子核酸が分解される。或いは、完全な内包は、Ｏｌｉｇｒｒｅｎ（登録商標）アッセイにより判断することができる。完全な内包はまた、粒子が血清安定であるということ、つまり、ｉｎ ｖｉｖｏ投与された際、それらが成分部分に即座に分解しないということを意味する。
【０１２７】
本発明の組成物のこれらの特徴は、本発明の好ましい粒子を、ＤＯＴＭＡ/ＤＯＰＥ（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））製剤などの脂質―核酸凝集体（陽イオン性複合体又はリポプレックスとしても知られる）から区別する。これらの複合体／凝集体は、一般的にかなり大きい（＞２５０ｎＭ）直径であり、それらは、完全にはヌクレアーゼ切断に耐えない。それらは、一般的にはｉｎ ｖｉｖｏ投与の際、徐々に分解する。これらのタイプの陽イオン性脂質―核酸複合体は、例えば筋肉内、腹腔内、及びくも膜下内投与、及びより好ましくは鼻腔内投与などの局所的及び領域的な使用に対して適したリポソーム組成物を提供することができる。
【０１２８】
本発明の脂質組成物は、広い範囲の薬剤：脂質の比率において製剤することができる。本明細書中で使用される「薬剤対脂質比率」は、規定された体積の調製物中の処置用核酸の量（すなわち、内包され、そして血液にさらされたとき即座に分解されない核酸の量）を、同じ体積中の脂質の量で割った比率を指す。これは、モル対モル若しくは重量対重量、又は重量対モルに基づいて決定することができる。薬剤対脂質比率は、所与の投与量の核酸と会合される脂質投与量を決定することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、約０.０１〜０.２５（ｗｔ/ｗｔ）の範囲の薬剤：脂質比率を有する。
【０１２９】
適応症、投与及び用量
本発明の組成物及び方法は、免疫系の刺激を必要とする任意の患者又は生物における使用を意図したものである。このような必要性は、腫瘍学、炎症、関節炎及びリューマチ、免疫不全障害などのほとんどの医学分野を包含するが、これらに限定されない。当業者は、本明細書の開示に基づいて効力を試験するために適切な適応症を選択することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は、下記の実施例で説明した腫瘍症などの腫瘍症（病理学的又は潜在的に病理学的な任意の新形成細胞の増殖）を処置するために使用される。
【０１３０】
本発明の組成物の対象への投与は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの方法を含む任意の方法によることができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの方法は局所的、部分的又は全身的適用を含むことができる。好ましい実施態様において、この組成物は、粒子が患者のＢ細胞、マクロファージ又は脾臓細胞に到達できるように、及び／又は粒子がリンパ球の増殖を刺激し、該患者においてＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮｇ及び／又はＩｇＭの分泌ができるように、静脈内投与される。この組成物は、それぞれの構成部分を混合させた単一製剤として投与することができる。本発明のこの側面の実施態様は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの処置用抗体との同時投与を含む。
【０１３１】
或いは、製剤の成分は同時投与することができる。本明細書中で使用されているように、「同時投与」は、本明細書中で実証されている強化されたＡＤＣＣ応答を提供するのに十分な短い時間内で、陽イオン性リポソーム及び処置用抗体を投与することを意味する。一般的に、抗体による標的細胞のオプソニン化に先立って先天性免疫エフェクター細胞の動員及び活性化を可能とするために、免疫刺激性核酸を有する陽イオン性リポソームが処置用抗体の前に投与されるだろう。別々の同時投与による組み合わせた成分の免疫刺激の利益を提供するための典型的な時間は、１日〜７日以内、１２時間〜７２時間以内、より好ましくは４８時間以内、そして最も好ましくは２４時間〜４８時間以内である。本発明のこの側面の好ましい実施態様は、処置用抗体の投与前に免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを投与することを含む。或いは、陽イオン性リポソーム組成物は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期に依存して、処置用抗体の投与後に投与することができる。適切な半減期（例えば、２日〜５日）を有する抗体は、陽イオン性リポソームの投与前に投与することができる。
【０１３２】
本明細書中で説明されるｉｎ ｖｉｖｏでの研究で実証されているように、動物の腫瘍の状態は、処置用抗体と組み合わせた陽イオン性リポソームによる免疫刺激に応答する能力に影響をえず、腫瘍のない動物及び腫瘍を持つ動物から得た血液免疫細胞又は脾臓免疫細胞は同様に応答する。これらの組成物に対するｉｎ ｖｉｖｏでの応答は、投与レベル及び投与方式の両方に依存するようである。リポソーム核酸製剤の濃度を５ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇに増加させるｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、末梢血液ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を徐々に上昇させた。投与方式に関して、単回投与は、注射後２４時間〜４８時間をピークに、５日〜７日の間ＮＫ活性及びＡＤＣＣ活性を上昇させた。興味深いことに、複数回投与は有益ではなかった：３日〜４日間の複数回投与は、単回投与と比較して、ＮＫ活性又はＡＤＣＣ活性のいずれも全く強化しなかった。しかし、例えば１週間に１回又は２回といった、より長期間での投与は若干付加的な利益をもたらした。
【０１３３】
本発明の組成物は、任意の知られた投与経路で投与することができる。１つの実施態様において、本発明の組成物は静脈注射によって投与される。別の実施態様においては、筋肉内又は皮下注射が用いられ、この方法ではより大きなサイズの（１５０〜３００ｎｍ）リポソームを使用することができる。結局、高価な排出段階の必要性を減らし又は除くことができ、リポソームを循環させる必要がないため、リポソーム成分の選択をより安価な材料に偏らせることができる。例えば、Ｃｈｏｌ量を減少させることができ、ＤＳＰＣをより柔軟なもの（例えば、ＰＯＰＣ又はＤＭＰＣ）に置換することができ、そしてＰＥＧ−脂質をより安価なＰＥＧ−アシル鎖に置換することができる。さらなる実施態様においては、本発明の組成物は、気道内注入又は鼻腔内吸入などによって、気道を介して投与される。
【０１３４】
当業者は、例えば補体の活性化、凝集、腎毒性、肝臓酵素アッセイなどの、製剤の可能性のある毒性を同定する方法を知っているであろう。そのような毒性は、生物間で異なりうる。
【０１３５】
組成物の医薬調製物は通常、送達様式を改善又は補助する追加の担体を用いる。典型的には、本発明の組成物は標準的な生理食塩水又は標準的な薬剤実務（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って選択されたリン酸緩衝液などの生理学的に許容可能な担体中で投与されるだろう。他の適切な担体としては、水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、などが挙げられ、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性の強化のための糖タンパク質を含む。
【０１３６】
陽イオン性リポソームの用量は、所望の脂質用量、所望の核酸用量、及び組成物の薬剤：脂質の比率に依存する。当業者は本明細書中に提供された情報に基づいて適切な用量を選択することができる。同様に、本明細書中での使用のために考えられた処置用抗体の免疫処置プロトコルは、当業界で周知であり及び／又は当業者により簡単に確かめられる。
【０１３７】
特に、当業者は、本明細書中に説明される投与量に基いて、対象、特に哺乳動物、及びより特別にヒトに対する投与量の計算方法を知っているだろう。ある動物から別の動物への（例えば、マウスからヒトへの）投与量を変換するための特異的変換因子は、当業界で周知であり、そして、例えばＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎウェブサイト：ｗｗｗ.ｆｄａ.ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ａｎｉｍａｌｆｒａｍｅ.ｈｔｍ（腫瘍学ツール部門において）で十分に説明されており、本明細書中で引例として援用される。遊離核酸を有する既知の免疫刺激性組成物と比較して、本発明の免疫刺激性組成物及び方法は、低減された核酸量をｉｎ ｖｉｖｏにおける強化された免疫応答の刺激に利用することができる。さらに、本明細書中で実証されるように、陽イオン性リポソームと抗体の相乗的組み合わせは、優れた効力を維持したまま、より少量の抗体での使用も可能とする。
【０１３８】
本発明の製剤中の核酸量は、一般的に、約０.００１〜６０ｍｇ/ｋｇ（投与量あたりの核酸ｍｇ/マウスの体重ｋｇ）の間で変化するだろう。静脈（ｉ.ｖ.）投与の好ましい実施態様においては、本発明の組成物及び方法は、約１〜５０ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは約５〜２０ｍｇ/ｋｇを利用する。皮下（ｓ.ｃ.）投与の好ましい実施態様においては、本発明の組成物及び方法は、約１〜１０ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは約１〜５ｍｇ/ｋｇ、通常は約３〜５ｍｇ/ｋｇを利用する。本発明脂質粒子と会合される抗原量は、好ましくは約０.０４〜４０ｍｇ/ｋｇであり、より好ましくは約０.０４〜４ｍｇ/ｋｇである。上記で説明するように、当業者は、上記で同定された周知変換因子及び更なる経験的試験に基づいて、本明細書中で説明される所与の投与量を考慮して、他の哺乳動物に適した投与量を容易に決定することができる。
【０１３９】
本発明の製剤は、医薬として許容される溶液中で投与することができる。この溶液は、医薬として許容される濃度の塩、緩衝材、保存剤、相性の良い担体、アジュバント、及び任意に他の処置用成分を型通りに含むことができる。
【０１４０】
処置における使用については、本発明の免疫刺激性組成物の有効量は、適切な標的細胞による取り込みを可能にする任意の方法で、対象に投与することができる。本発明の免疫刺激性組成物の「投与」は、当業者に既知の任意の方法により達成されうる。投与の好ましい経路としては、非経口注射（例えば、皮下、皮内、静脈、非経口、腹腔内、くも膜下腔内、など）、及び粘膜、鼻腔内、気管内、吸入、及び直腸内、膣内；又は経口、経皮（例えば、パッチを介して）が挙げられるが、これらに限定されない。注射は、ボーラス又は持続注入であることができる。
【０１４１】
例えば、本発明の組成物は、筋肉内又は皮内注射、又は他の非経口的手段により、又は表皮に「遺伝子銃」を適用することにより、投与することができる。本発明の組成物は、例えば吸入、局所的に、静脈、経口、移植、経直腸、又は経膣によっても投与することができる。適切な液体又は固体医薬調製物の形態は、例えば、注射又は吸入のための水溶液又は生理食塩水であり、エンコクレート（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）され、微小金粒子上に被膜され、そして噴霧される。薬剤送達のための本方法の簡単な文献については、Ｌａｎｇｅｒ, Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： １５２７−１５３３,１９９０を参照されたい。これは本明細書中で引用文献として援用される。
【０１４２】
医薬組成物は、好ましくは投与量単位で調製され、そして投与される。液体投与量単位は、注射又は他の非経口投与のためのバイアル又はアンプルである。固体投与量単位は錠剤、カプセル、及び坐薬である。患者の処置のために、成分の活性、投与の方式、免疫化の目的（つまり、予防又は処置）、疾患の性質及び重篤度、患者の年齢及び体重に依存して、異なる投与量が必要だろう。所与の投与量での投与は、個々の投与量単位の又はその他のいくつかの少ない投与量単位の形態における単回投与によって、両方実施することができる。本明細書中で説明されるように、数週又は数ヶ月離れた特定の間隔での用量の複数回投与は、先天性免疫応答を促進するのに有利であろう。
【０１４３】
適切な緩衝剤としては、酢酸及びその塩（１〜２％ｗ/ｖ）；クエン酸及びその塩（１〜３％ｗ/ｖ）；ホウ酸及びその塩（０.５〜２.５％ｗ/ｖ）；及びリン酸及びその塩（０.８〜２％ｗ/ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロライド（０.００３〜０.０３％ｗ/ｖ）；クロロブタノール（０.３〜０.９％ｗ/ｖ）：パラベン類（０.０１〜０.２５％w・ｖ）、及びチメロサール（０.００４〜０.０２％ｗ/ｖ）が挙げられる。
【０１４４】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、医薬として許容される担体中に任意に含まれる。本明細書中で使用される「医薬として許容される担体」は、ヒト又は他の哺乳動物への投与に適している、１又は複数の相性の良い固体又は液体の賦形剤、希釈剤、又は内包物質を指す。本明細書中で使用される「担体」は、天然又は合成の有機成分又は無機成分を指す。担体は、適用を容易にするために活性成分と混ぜ合わせられる。本発明の免疫刺激性組成物の成分は、所望の医薬効力を実質的に損なうような相互作用が生じない方法で、本発明の成分とそして互いに混ぜ合わせることができる。
【０１４５】
非経口投与に適した組成物は、滅菌水性調製物を都合よく含み、これは受容者の血液と等張でありうる。許容される溶媒及び溶剤の中には、水、リンゲル溶液、リン酸緩衝生理食塩水及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油（ｆｉｘｅｄ ｏｉｌ）は、溶媒又は懸濁溶媒として慣用的に利用される。この目的のために、合成モノ-又はジ-グリセリドを含む、任意の無刺激性（ｂｒａｎｄ）の固定化ミネラルオイル又は固定化非ミネラルオイルを使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用を見出す。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｅａｓｔｏｎ, Ｐａにおいて見出すことができる。
【０１４６】
様々な投与経路が利用できる。選択される特定の方式は、もちろん特定のアジュバント又は選択される抗原、対象の年齢及び一般的な健康状態、処置される特定の条件、及び処置効力に必要とされる投与量に依存するだろう。本発明の方法は、一般的に、医学的に許容される任意の投与方式、つまり、臨床上許容されない拒絶効果を引き起こすことなく、有効レベルの免疫応答を生じさせる任意の方式を使用して実行することができる。好ましい投与方式は、上記で検討される。
【０１４７】
組成物は、単位投与量形態において都合よく提供することができ、薬学分野に周知である任意の方法により調製することができる。全ての方法は、１又は複数の付属成分から構成される担体とその成分を関連させる段階を含む。一般的に、組成物は、均一かつ密接にその成分と、液体担体、微粉化した固体担体、又はその両方とを関連させ、そしてもし必要ならその産物の形を整えることにより調製される。
【０１４８】
他の送達系は、時間−放出、遅延放出、又は持続放出の送達系を含むことができる。このようなシステムは、成分の繰り返しの投与を避けることができ、被験者及び医師に対する利便性を増大させる。多くのタイプの放出送達系が利用でき、そして当業者に知られている。それらは、例えばポリ（ラクチド-グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸及びポリ酸無水物などの、ポリマーを基礎とする系を含む。薬剤を含む前述のポリマーの微小カプセルについては、例えば米国特許第５,０７５,１０９号で説明されている。送達系は、例えばコレステロール、コレステロール・エステルなどのステロール、及び例えばモノグリセリド- ジグリセリド-及びトリグリセリドなどの脂肪酸又は中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（Ｓｙｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドを基礎とする系；ワックスコーティング；慣用の結合剤及び賦形剤使用する加圧された錠剤；部分的に融合された移植錠などである非ポリマー系を含むことができる。具体的な例としては、（ａ）米国特許第４,４５２,７７５号、第４,６７５,１８９号、及び第５,７３６,１５２号に記載で説明されている、本発明の物質がマトリックス中の形態に含まれる侵食（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ）系、及び（ｂ）米国特許第３,８５４,４８０号、５,１３３,９７４号、及び５,４０７,６８６号中で説明されている、活性成分が制御された割合でポリマーから浸透する拡散系、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポンプにを基礎とするハードウェア送達系を使用することができ、それらのいくつかは移植に適用される。
【実施例】
【０１４９】
材料及び方法
下記の実施例において使用される脂質成分及び核酸成分は、本明細書中で説明された。下記の実施例で使用される陽イオン性リポソームの好ましい実施態様は、ＰＯＰＣ：ＣＨ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ−ＤＭＧが２０：４５：２５：１０の比率で構成される陽イオン性リポソームである。
【０１５０】
下記の実施例において使用される全てのＯＤＮｓは、特に断りのない限り、ホスホジエステル骨格を有する。本明細書中で使用される「遊離」という用語は、脂質核酸組成物中に存在しないＯＤＮを指す。
【０１５１】
使用されるプラスミドＤＮＡは、ルシフェラーゼ発現プラスミド、ｐＣＭＶｌｕｃ１８（ｐＣＭＶＬｕｃとも呼ばれる）であった。プラスミドをＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で産生し、以前説明したとおりに単離、精製した（Ｗｈｅｅｌｅｒ, Ｊ. Ｊ., Ｐａｌｍｅｒ, Ｌ., Ｏｓｓａｎｌｏｕ, Ｍ., ＭａｃＬａｃｈｌａｎ, Ｉ., Ｇｒａｈａｍ, Ｒ. Ｗ., Ｚｈａｎｇ, Ｙ.Ｐ., Ｈｏｐｅ, Ｍ. Ｊ., Ｓｃｈｅｒｒｅｒ, Ｐ., ＆ Ｃｕｌｌｉｓ, Ｐ. Ｒ.（１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ.６, ２７１−２８１.）。（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ Ｉ, Ｔａｍ Ｐ, ＭａｃＬａｃｈｌａｎ Ｉ, Ｇｒａｈａｍ ＲＷ, Ｓａｒａｖｏｌａｃ ＥＧ, Ｊｏｓｈｉ ＰＢ. Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｉｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ. １９９９; ６: ４０３−４１１.も参照されたい。）
【０１５２】
ホスホジエステル（ＰＯ）及びホスホロチオエート（ＰＳ）ＯＤＮは、Ｈｙｂｒｉｄｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（マサチューセッツ州、ミルフォード）から購入し、又はＩｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カナダ、バンクーバー、バーナビー）において標準的な技術により製造した。メチル化ＯＤＮは、Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（アメリカ合衆国）、Ｉｎｃ（カリフォルニア州、ヘイワード）において標準的な技術により製造した。骨格組成物は、31Ｐ−ＮＭＲによって確認した。全てのＯＤＮについて、特に内毒素を分析し、０.０５ＥＵ／ｍｇ未満を含有させた。
【０１５３】
実施例１
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを介在し、そしてＮＫ及びＬＡＫを活性化する能力を調べるために設計された。
【０１５４】
材料及び方法
マウス。本実験では、本実験の時までに８−９週齢（２２〜２５ｇ）の６０Ｃ３Ｈ雌性マウスを使用した。これらの動物を４つの群で飼育した。
【０１５５】
投与量。５つの時点において、３つの処理群と１つのコントロールが存在した。試験サンプル及びコントロールの投与は、体重に依存した注射体積（例えば、２０ｇマウスには２００ｍｌ、２５ｇマウスには３５０ｍｌなど）で尾静脈注射により行った。動物は、注射毎にＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型又はＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]遊離型又はＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの２０ｍｇＯＤＮ／ｋｇの投与を受けるだろう；ＰＢＳ中において２ｍｇ／ｍｌで。
【０１５６】
採取。マウスの脾臓及び血液を採取した（滅菌条件は必要でない）。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０１５７】
データ分析。血液及び脾臓細胞は、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）及び／又はマウス抗ヒトＩｇＧ１）の存在下及び不在下で、Ｐ８１５、ＹＡＣ−１、Ｄａｕｄｉ標的細胞に対するＣＴＬ／ＡＤＣＣアッセイに使用され、そしてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下及び不在下でＳＫＢＲ−３標的細胞に対するＣＴＬ／ＡＤＣＣアッセイに使用されるだろう；そして、ＮＫ及び単球／マクロファージ活性（ＤＸ５／ＣＤ１６−ＣＤ６９、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１６−ＣＤ６９、Ｍａｃ−３／ＣＤ１６−ＣＤ６９）をＦＡＣＳで分析されるだろう。
【０１５８】
結果。ＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]遊離型又はＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの単回投与後の、有力なエフェクター細胞の増殖／移行。全ての３つの投与は、一日目までに脾臓における総ＮＫ集団の著しい減少を引き起こし、そしてこの減少は１日−５日を通してほとんど変化せずに持続した。最も高い効果はＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型（コントロールレベルの１１％から４％まで減少）であり、次にＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム（６％まで）であり、そして最も低い影響はＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]遊離型（７％まで）であった（図１Ａ）。同時に、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４] 遊離型は血液ＮＫ集団に影響を与えなかった；ＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型は１日目で血液中のＮＫの増加（５０％）を引き起こし、２日−５日でコントロールレベル（〜１０％）まで戻った；ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＮＫ血液集団における影響は周期的のようであり、最も高いレベルは〜３０％であった（図１Ｂ）。
【０１５９】
ＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]遊離型又はＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの単回投与後の、エフェクター細胞活性（ＣＤ６９の発現）。ＣＤ６９の発現レベルを、特定の細胞集団のＣＤ６９発現細胞の％により評価した。脾臓におけるＮＫ細胞の総数がＯＤＮ注射により減少しているが（図２Ａ）、全ＮＫ集団のＣＤ６９＋ＮＫ細胞の％は増加する（図２Ｂ）；ＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型及びＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームは、同様の活性レベルを引き起こす（１日目のコントロール群の５０％から８０〜９０％まで上昇し、その後２日目〜５日目で６０％まで減少）。
【０１６０】
４時間ＣｒアッセイにおけるＹａｃ−１標的の殺傷により測定したＮＫ活性化。遊離型ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]のＩＶ投与は、注射後２４時間で脾臓細胞においてピーク活性（２５％のＣｒ放出）を引き起こし、その後２日目〜４日目で１５〜２０％レベルまで減少する（図３Ａ）。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームは、Ｃｒ放出を３５〜４０％まで上昇させ、そして注射後２４〜７２時間まで上昇を引き伸ばし、４日目までに遊離型ＯＤＮのレベルまで減少する。遊離型ＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳは、１日目〜３日目はＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームと同じレベルのＣｒ放出を示し、４日〜５日目ではより緩やかな減少であった。血液においては（図３Ｂ）、遊離型ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]は、Ｙａｃ−１標的に対して活性を刺激せず、そしてＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームによる刺激は２日目〜３日目でピークに達し（２８〜３３％Ｃｒ放出）、４日目〜５日目までにコントロールレベルまで回復する。ＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型は、非常に異なった刺激のプロファイルを示し、１日目で最初のピークに達し、２日目〜３日目でコントロールレベルまで戻り、そして４日目〜５日目で第二のピークに達した。
【０１６１】
実施例２
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを介在し、そしてＮＫ及びＬＡＫを活性化する能力を調べるために設計された。
【０１６２】
マウス。本実験の時までに６〜８週齢（２０〜２２ｇ）の４０Ｃ３Ｈ雌性マウス。これらの動物を３つ及び４つの群で飼育した。
【０１６３】
投与量。５つの時点において、２つの処理群と１つのコントロール群。試験サンプル及びコントロールの投与は、体重に依存した注射体積（例えば、２０ｇマウスには２００ｍｌ、２５ｇマウスには３５０ｍｌなど）で尾静脈注射により行った。動物は、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]遊離型は、ＰＢＳにおいて２ｍｇ／ｍｌで調製されたＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの２０ｍｇＯＤＮ／ｋｇの投与を受けるだろう。
【０１６４】
採取。滅菌条件でマウスの血液、肝臓、リンパ節、及び脾臓を採取した。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０１６５】
製剤。陽イオン性リポソームは、予備成形小胞（ＰＦＶ）技術を用いて生成し、エタノールを利用した。改質（ｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＰＦＶは、２回通過のために１００ｎｍフィルターの上の２００nmフィルターを通して押し出された。
【０１６６】
データ分析．グループＡにおいて（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激、グループ６ａ及びｂ）：脾細胞（コントロール及びサイトカイン又はＯＤＮにより刺激された）は、０、１、２、３日目での抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｍ−ａ−ＣＤ２０）の存在下及び不在下におけるＰ８１５、ＹＡＣ−１及び（Ｄａｕｄｉ／ＭＣＦ−７／ＳＫ−ＢＲ−３）標的細胞に対する５１Ｃｒ放出により、表現型及び活性化（ＤＸ５／ＣＤ１６又はＣＤ６９及びＣＤ１１ｂ／ＣＤ１６又はＣＤ６９及びＭａｃ−３／ＣＤ１６又はＣＤ６９）及び活性を、フローサイトメトリーにより分析されるだろう。
【０１６７】
グループＢにおいて（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激、グループ１〜５）：血液細胞、脾細胞、リンパ節細胞又は肝細胞は、抗ＣＤ２０抗体（マウス抗ヒト、ＩｇＧ１）の存在下及び不在下におけるＰ８１５、ＹＡＣ−１及びＤａｕｄｉ標的細胞に対するＡＤＣＣアッセイに使用され、そしてＮＫ及び単球／マクロファージ活性化（ＤＸ５／ＣＤ１６−ＣＤ６９、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１６−ＣＤ６９、Ｍａｃ−ｓ／ＣＤ１６−ＣＤ６９）がＦＡＣＳで分析されるだろう。
【０１６８】
結果。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与は、ＮＫ細胞活性化を誘導し、Ｙａｃ−１細胞からのＣｒ放出の増加に反映されているが、Ｐ８１５標的からのＣｒ放出における増加はなかった（図３Ｃ及びＤ）：ＹＡＣ−１細胞においては、単回投与における細胞の活性化は全ての４つの臓器に対して同じパターンを有している：２４時間〜４８時間で顕著に上昇し、その後７２時間で減少するか（脾臓、肝臓）又は４８時間及び７２時間で緩やかに減少する（リンパ節、血液）。７２時間までに顕著に減少するが、依然としてエフェクター活性はコントロール群のものよりも高い。２回目の投与は、脾臓及びリンパ節から単離した細胞に対して有益ではないようであり、そして肝臓及び血液細胞に対してはわずかに活性を増加させた。
【０１６９】
Ｙａｃ−１殺傷に対する主なエフェクター集団は、ＮＫ細胞であるようである（図３Ｅ）：ＡＤＣＣにおいて最も高い影響を有するエフェクター集団を同定するために、コントロール及びいくつかの時点の脾細胞をＮＫ細胞単離カラム（ポジティブ選択）に通し、元の集団と平行して単離物及び通過流出物をＣｒアッセイに使用した。単離手順により、コントロール群、２４時間群、７２時間−シングル群及び７２時間−ダブル群それぞれの単離物において、初期の４〜７％から２５％、１５％、４５％及び２５％まで、全集団におけるＮＫ細胞の量が増加した。ＮＫ単離物は１０倍低いＥ：Ｔ比においてでも初期の画分よりわずかに高いレベルのＣｒ放出を生み出すが、それは主なエフェクター集団としてＮＫ細胞を単離する全く正当な理由ではないだろう。しかし、同時に通過流出物が初期の画分と同じＥ：Ｔ比で実質的に不活性であるという事実は、この結論を支持する。
【０１７０】
ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与がＮＫ細胞のＡＤＣＣ能を増加させることが、Ｄａｕｄｉ細胞（マウス及びヒト化抗体）に対して実証され、そしてＳＫＢＲ−３細胞（ヒト化抗体）に対してはより小さな程度であることが実証される（図４Ａ）。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）及びマウス抗ＣＤ２０抗体の比較性能は、異なる器官から得たエフェクターに対して異なる：マウス抗体は血液細胞のＡＤＣＣを介在する能力においてＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）よりも優れており、脾臓及び肝臓に対してはわずかに優れており、そしてリンパ節に対しては違いがない。誘導されるＡＤＣＣのレベルは、肝臓において最も高く、次に脾臓と血液であり、最も低いレベルはリンパ節である。３日間の時間経過におけるＡＤＣＣの発達は、４つの全ての器官から得たエフェクターに対して同じである：２４時間及び４８時間では上昇し、その後７２時間で減少する（依然としてコントロールよりも高いが）。製剤の２回目の注射により、２４〜４８時間の時点のレベルまで肝細胞及び血液細胞のＡＤＣＣレベルは回復したが、リンパ節に対するＡＤＣＣは向上せず、脾細胞に対してはさらに減少する。製剤注射におけるＡＤＣＣの全体的な増加は、エフェクター細胞の供給源に依存して、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）に対しては１０〜１５％の上昇であり、そしてマウス抗ＣＤ２０に対しては１５〜２０％の上昇であった。
【０１７１】
Ｄａｕｄｉ／抗ＣＤ２０系におけるＡＤＣＣに対する主なエフェクター集団は、ＮＫ細胞のようである（図４Ｂ）。ＡＤＣＣにおいて最も高い影響を有するエフェクター集団を同定するために、コントロール及びいくつかの時点の脾細胞をＮＫ細胞単離カラム（ポジティブ選択）に通し、元の集団と平行して単離物及び通過流出物をＣｒアッセイに使用した。単離手順により、コントロール群、２４時間群、７２時間−シングル群及び７２時間−ダブル群それぞれの単離物において、初期の４〜７％から２５％、１５％、４５％及び２５％まで、全集団におけるＮＫ細胞の量が増加した。Ｄａｕｄｉ：ＮＫ単離物は１０倍低いＥ：Ｔ比においてでも初期の画分よりわずかに高いレベルのＣｒ放出を生み出すが、それは主なエフェクター集団としてＮＫ細胞を単離する全く正当な理由ではないだろう。しかし、同時に通過流出物が初期の画分と同じＥ：Ｔ比で実質的に活性を欠いているという事実は、この結論を支持する。
【０１７２】
実施例３
この一連の実験は、腫瘍を有しない及び腫瘍を有するマウスにおけるＮＫ及びＬＡＫ活性及びＡＤＣＣを介在する能力を評価するために設計された。
【０１７３】
マウス。本実験において、８〜９週齢（２０〜２２ｇ）の２０ Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０１７４】
投与量。４つの処理群が存在した。２つの群においては、各マウスは２００ｍｌのＰＢＳ（ＩＶ）中の１０５ Ｂ１６／ＢＬ６細胞を受けた。１０日後、腫瘍を有しない処理群及び腫瘍を有する処理群のマウスは、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの静脈内（ｉ.ｖ.）尾静脈注射を受けた；体重に基づいた体積（２０ｇマウスに対しては２００ｍｌ、２５ｇマウスに対しては２５０ｍｌ、など）。動物は、注射毎にＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの２０ＯＤＮ／ｋｇの投与を受けた；製剤をＨＢＳにおいて２ｍｇ／ｍｌで調製した。
【０１７５】
採取。動物を４８時間後に屠殺し、そして器官（脾臓、血液、及び肺）を採取した（滅菌条件である必要はない）。滅菌条件は必要でない。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０１７６】
データ分析。血液、脾細胞（元の集団、ＮＫ単離物及び通過流出物）を、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の存在下及び不在下において、ＹＡＣ−１、Ｄａｕｄｉ標的細胞に対するＣＴＬ／ＡＤＣＣアッセイに使用した；そしてＮＫ及び単球／マクロファージ活性化（ＤＸ５／ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−３及びＣＤ１６／ＣＤ６９／ＩＬ１２−Ｒ）をＦＡＣＳで分析した。血漿サンプルをＩＦＮｇ及びＩＬ−１２に対するＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【０１７７】
結果。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの注射がＮＫ細胞のかなりの活性化を誘導することを、腫瘍を有しない動物及び腫瘍を有する動物双方におけるＹａｃ−１標的に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性レベルによって測定した。ＴＦ及びＴＢ群の脾臓ＮＫ細胞に対するＹａｃ−１殺傷の基準レベルは同じであった；血液ＮＫ細胞に関しては、それらのＹａｃ−１に対する活性は、ＴＢ群においてわずかに低かった（図５Ａ）。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの注射は、Ｍ１４細胞（ヒト黒色腫）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺傷をも直接的及び抗体を介在して刺激した（図５Ｂ及び５Ｃ）。脾臓においては、ＴＦコントロールと比較してＴＢコントロール群におけるＡＤＣＣレベルが増加した。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームによる処理における、直接的及び抗体を介在した殺傷の刺激のレベルは、ＴＢ及びＴＦ動物において同じであった。血液においては、Ｍ１４細胞に対する直接的及び抗体依存的な細胞傷害性のＴＢ及びＴＦ基準レベルに違いはなかった；一方、ＴＢマウスにおいてＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームによる処理は、直接的な殺傷を高いレベルで誘導し、そして抗体依存的殺傷を低いレベルで誘導した。
【０１７８】
実施例４
この一連の実験は、ＮＫ及びＬＡＫ活性及びＡＤＣＣ（Ｃ３Ｈマウス）を介在する能力のための、注射投与量及び投与方式（ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム）を調べるために設計された。
【０１７９】
マウス。この実験においては、８〜９週齢（２２〜２５ｇ）の５０ Ｃ３Ｈ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０１８０】
投与量。様々な時点における、１つのコントロールと１つの投与群が存在した。試験サンプル及びコントロールの投与を、体重に依存した（例えば、２０ｇのマウスに対して２００ｍｌ、２５ｇのマウスに対して３５０ｍｌ、など）注射体積で静脈性尾静脈により行った。動物は、１０／２０／３０／４０ｍｇＯＤＮ／ｋｇの投与量のＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームを受けた；ＨＢＳ中において１，２，３及び４ｍｇ／ｍｌで調製された。
【０１８１】
採取。マウスの血液及び脾臓を採取した。滅菌条件である必要はない。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０１８２】
データ分析。血液及び脾細胞は、抗ＣＤ２０抗体の存在下及び不在下にけるＹＡＣ−１、Ｄａｕｄｉ標的細胞に対するＣＴＬ／ＡＤＣＣアッセイに使用された；そしてＮＫ及び単球／マクロファージの増殖／活性化（ＤＸ５／ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−３及びＣＤ１６／ＣＤ６９／ＩＬ１２−Ｒ）をＦＡＣＳで分析した。血漿はＩＦＮｇ及びＩＬ−１２に対するＥＬＩＳＡに使用されることとなる。
【０１８３】
結果。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの投与は、未処理動物における細胞活性と比較して、試験された全ての投与量でＮＫ活性を強化した（図６Ａ及びＢ）。ＩＶ投与量を増加することにより、脾臓ＮＫ細胞と比較して、血液ＮＫ細胞の活性化が平行して増加することが、Ｙａｃ−１標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害活性により測定された（図６Ｂ）。その活性は５〜１０ｍｇ／ｍｌで最大となりその後減少する（図６Ａ）。これは脾臓から末梢血液への細胞の移動に起因しているのかもしれない。脾臓及び血液両方におけるＮＫ活性の傾向は、これらの細胞のＡＤＣＣを介在する能力にも反映された。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの投与量の増加により、抗ＣＤ２０抗体の存在下でのＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性能の増加が平行して生じる一方で（図７Ｂ）、脾臓ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣ活性は５〜２０ｍｇ／ｋｇで最大になりその後減少した（図７Ａ）。予想されたとおり、処理された動物は、未処理動物から得た細胞と比較して、ＡＤＣＣ活性の劇的な強化を示し、そして、抗体の不在下において全ての群の細胞溶解活性は最小であった。
【０１８４】
投与量に加えて、ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＮＫ及びＡＤＣＣ活性における効果は、投与方式に依存することも見出された。単回投与と比較して、４２〜７２時間以内のリポソームＯＤＮ１ｍの複数回投与は、活性を強化しなかった（図８）。しかし、より長期間の複数回投与は、若干活性を強化した。週１回の投与方式での陽イオン性リポソームＯＤＮ１ｍの投与は、脾臓（図９Ａ）及び血液（図９Ｂ）それぞれにおいて、抗ＣＤ２０抗体の存在下でのＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性の穏やか且つ顕著な強化を生じさせることが見出された。この活性は抗体の存在に依存していた。
【０１８５】
実施例５
この一連の実験は、ＡＤＣＣの処置モデルにおいて、Ｒｉｔｉｘｉｍａｂと組み合わせたＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの有効性を調べるために設計された。
【０１８６】
マウス。この実験においては、６〜８週齢（２０〜２２ｇ）の５０ ＳＣＩＤ Ｃ．Ｂ−１７Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０１８７】
処理。様々な時点における、１つのコントロール群と９つの処理群が存在した。コントロール群を、５×１０6のＮａｍａｌｗａ細胞でＩＶチャレンジし、ＨＢＳで処理された。４つの処理コントロール群は、５×１０6のＮａｍａｌｗａ細胞でＩＶチャレンジを受け、そして５、１０，２０又は４０ｍｇ／用量で週に１回Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いたＩＶ処理を受けた。１つの処理コントロール群を、５×１０6のＮａｍａｌｗａ細胞でＩＶチャレンジし、週に２回１０ｍｇ／ｋｇでＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。４つの処理群は、５×１０6のＮａｍａｌｗａ細胞でＩＶチャレンジを受け、週に２回１０ｍｇ／ｋｇでＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射で処理され、そして５、１０、２０又は４０ｕｇ／用量で週に１回Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体で処理された。
【０１８８】
投与量。動物は、ＰＢＳ中において１ｍｇ／ｍＬで調製されたＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、１０ｍｇＯＤＮ／ｋｇの投与量を受けた。
【０１８９】
腫瘍成長。Ｎａｍａｌｗａ細胞を、本実験の開始前にｉｎ ｖｉｔｒｏで３〜５代継代の間培養した。本実験に用いたフラスコは、採取時に５０〜６０％の細胞密集度を示した。この単一細胞懸濁液を、氷上の５０ｍＬコニカルチューブに移した。いったん全ての細胞を採取したら、それらを１０００ｒｐｍ、５分間、４℃で１×滅菌ハンクス液中で洗った。細胞を数え、生存率が９０％超の場合に限り使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で２００ｍＬあたり５×１０6細胞数（２．５×１０7細胞数/ｍＬ）となるように希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスｉ.ｖ.内に（尾静脈を通して）移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に２回体重を測定した。
【０１９０】
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。ＣＯ2吸入によりマウスを屠殺した。分析は体重及び安楽死の時期に基づいた。癌の動物モデルにおける主体（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）のＡＤＣＣの証明として、ＭＳＴ（平均生存期間）を用いて抗腫瘍効力を判断した。週２回動物の体重を測定した。この投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
【０１９１】
結果。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系のＮａｍａｌｗａでチャレンジしたＳＣＩＤマウスでの効力試験において、抗ＣＤ２０抗体のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）及びＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームとの組み合わせでの処理が、抗体又はリポソームＯＤＮ１ｍ単独のいずれかによる処理と比較して、抗腫瘍効力の強化をもたらすことが、強化された生存により判断された（図１０Ａ）。未処理動物は１６日の平均生存期間を有し、一方１０又は２０ｍｇの抗体で処理した動物はそれぞれ２０日及び２１日の平均生存期間を有し（２５％及び３１％の寿命の増加（％）又はＩＬＳ（％））、そしてリポソームＯＤＮ１ｍ単独で処理した動物は３４日の平均生存期間を有した（１１２％のＩＬＳ（％））。しかし、１０又は２０ｍｇいずれかのＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）とリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせで処理した動物は、６７日の異常な平均生存期間を有していた（ＩＬＳ（％）＞３２５％）（図１０Ｂ）。
【０１９２】
実施例６
この一連の実験は、癌の同系動物モデルにおいて（ＥＬ４腫瘍細胞をＣ５７ＢＩ／６マウスにＩＶ投与）、ＡＤＣＣ適用のために抗ＧＤ２モノクローナル抗体と共に投与された免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの抗腫瘍効力を評価するために設計された。
【０１９３】
マウス。本実験において、１０〜１２週齢（２０ｇ〜２２ｇ）の３０ Ｃ５７ＢＩ／６雌性マウスを用いた。これらの動物を５つの群で飼育した。６つのマウスの群が存在した。
【０１９４】
処理。動物を、５×１０4のＥＬ４細胞でＩＶチャレンジした。１つの群は未処理（ＨＢＳ）であり、他方の５つは５又は１０ｍｇ／ｋｇ（体重に基づいて）の投与量のＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を週２回受けた。３つの群も、２０ｍｇ／マウス（０．２５０ｍｇ／ｍｌストックの８０ｍｌ）でＧＤ２抗体のＩＶ注射を週１回受けた。
【０１９５】
投与量。動物は、注射毎にＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮ／ｋｇ投与量を受けた；製剤はＰＢＳ中において０．５ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬで調製された。
【０１９６】
腫瘍成長。本実験の開始前に、ＥＬ４細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで３〜５代継代の間培養した。単一細胞懸濁液を氷上の５０ｍＬコニカルチューブに移した。いったん全ての細胞を採取して、それらを１,０００ｒｐｍ、５分間、４℃で１×滅菌ハンクス液中で洗った。細胞数を数え、生存率が９０％超の場合のみ使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で２００ｍＬあたり５×１０4細胞数（２．５×１０5細胞数/ｍＬ）となるように希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をＩＶ投与した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。
【０１９７】
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。ＣＯ2吸入によりマウスを屠殺した。分析は生存曲線に基づいた。癌の同系モデルにおいて、モノクローナル抗体と共に投与されたＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの抗腫瘍効果を発揮する効力を評価するために、ＭＳＴ（平均生存期間）が用いられた。週２回動物の体重を測定した。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
【０１９８】
結果。同系Ｃ５７ＢＩ／６−ＥＬ４胸腺腫ＩＶ及びＳＣ腫瘍モデルにおける効力研究において、腫瘍関連抗原ＧＤ２を認識する抗体とＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームとの組み合わせでの処理は、抗体又はリポソームＯＤＮ１ｍのいずれかの単独処理と比較して、抗腫瘍効力の強化をもたらした。Ｃ５７ＢＩ／６−ＥＬ４ ＳＣモデルにおいては、２０ｍｇ／ｋｇの抗ＧＤ２抗体と５ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮとの組み合わせでの処理は、同等の用量の抗ＧＤ２抗体又はリポソームＯＤＮ１ｍ単独での処理と比較して腫瘍成長の優れた阻害をもたらした（図１１Ａ）。全ての処理は、未処理の動物と比較して腫瘍成長の阻害をもたらした。同様に、Ｃ５７ＢＩ／６−ＥＬ４ＩＶ腫瘍モデルにおいては、抗ＧＤ２抗体及びリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの処理はそれぞれの単独での処理と比較して効力の強化がもたらされることが、強化された生存により判断された（図１１Ｂ）。未処理の動物は１７日の平均生存期間を有し、一方、抗ＧＤ２抗体とリポソームＯＤＮ１ｍ単独で処理された動物は、それぞれ２４日及び２３日の平均生存期間を有した（３５％及び４１％のＩＬＳ（％））。抗体とリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの処理は、３１日の異常な平均生存期間をもたらした（８２％超のＩＬＳ（％））（図１１Ｃ）。
【０１９９】
実施例７
この一連の実験は、注射投与方式（ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム及びＯＤＮ２［配列番号:１]ＰＳ遊離型）のＮＫ及びＬＡＫ活性並びにＡＤＣＣを介在する能力を評価するために設計された（Ｃ３Ｈマウス）。
【０２００】
マウス。本実験において、実験の時期までに８〜９週齢（２２〜２５ｇ）の６０ Ｃ３Ｈ雌性マウスを用いた。動物を５つの群で飼育した。
【０２０１】
処理。様々な時点における１つのコントロール群及び１つの処理群が存在した。マウスは体重に基づいた体積（２０ｇのマウスに対して２００ｍＬ、２５ｇのマウスに対して２５０ｍＬ、など）で、静脈性（ｉ.ｖ.）尾静脈注射を受けた。
【０２０２】
採取。血液及び脾臓を採取した。滅菌条件は必要とされなかった。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０２０３】
投与量。動物は注射毎にＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの２０ｍｇＯＤＮ／ｋｇの投与量を受けた；製剤はＰＢＳ中において２ｍｇ／ｍｌで調製された。
【０２０４】
データ分析。血液細胞及び脾細胞を、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）及び／又はマウス抗ヒトＩｇＧ１）の存在下及び不在下でのＰ８１５、ＹＡＣ−１、Ｄａｕｄｉ標的細胞に対するＣＴＬ／ＡＤＣＣアッセイ並びにＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下及び不在下でのＳＫＢＲ−３標的細胞に対するＣＴＬ／ＡＤＣＣアッセイに使用した；そしてＮＫ及び単球／マクロファージ活性化（ＤＸ５／ＣＤ１６−ＣＤ６９、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１６−ＣＤ６９、Ｍａｃ−３／ＣＤ１６−ＣＤ６９）をＦＡＣＳで分析した。
【０２０５】
結果。図８Ｂで示された結果は、投与方式の重要性に関する実施例４で記載された結論を支持する。図８Ａで見られるように、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの単回注射は５日間のＡＤＣＣ活性の強化をもたらし、投与後２４〜４８時間後ピークが現れた。２４、４８又は７２時間内の２回投与は、血液又は脾臓それぞれにおけるこの刺激動態を変化させず、ＡＤＣＣ活性の強化は単回又は２回注射のいずれに対しても同様である。
【０２０６】
実施例８
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームのＡＤＣＣ介在能力並びにＢｒＤｕ取り込み実験に用いるＮＫ細胞の増殖及び動員を容易にする能力を調べるために設計された。
【０２０７】
マウス。本実験の時期までに８〜９週齢（２０〜２２ｇ）の３６ Ｃ３Ｈ雌性マウス。これらの動物を３つの群で飼育した。
【０２０８】
投与量。２つの時点において、２つの処理群と１つのコントロールが存在した。試験サンプル及びコントロールの投与は、体重に依存した注射体積（例えば、２０ｇのマウスに対して２００ｍｌ、２５ｇのマウスに対して２５０ｍｌ、など）で静脈性尾静脈注射により行った。１つ目の群において、動物は遊離型ＯＤＮ２［配列番号:１]の２０ｍｇＯＤＮ／ｋｇを受けた。２つ目の群においては、動物はＰＢＳ中において２ｍｇ／ｍｌで調製されたＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの２０ｍｇＯＤＮ／ｋｇ投与量を受けた。コントロール群においては、動物はＨＢＳを受けた。いずれの処理群においても、４つのサブグループが存在した。各処理投与方式に対する４つのサブグループのうち２つは、４８時間で回収され、残りのサブグループは１６８時間で回収された。各時点において、１つのサブグループは全期間においてＢｒＤｕで標識し、そして他のサブグループは処理の最後の１８時間においてＢｒＤｕで標識した。
【０２０９】
採取。血液、骨髄及び脾臓を採取した。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０２１０】
製剤。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームを、予備成形小胞（ＰＦＶ）技術及び、実用的エタノール（ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｅｔｈａｎｏｌ）を用いて生成した。改質（ｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＰＦＶは、２回通過のために１００ｎｍフィルターの上の２００ｎｍフィルターを通して押し出された。
【０２１１】
データ分析。全ての群の細胞について、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりＮＫ細胞中へのＢｒＤｕの取り込みを分析した。全期間、４８時間又は１６８時間の間ＢｒＤｕで標識した細胞を、標識する期間のＮＫ細胞の全増殖を判断するのに用いた。ＮＫ細胞が分裂すると、ヌクレオチドアナログであるＢｒＤｕは新たに形成されたＤＮＡ中に取り込まれる。処理の最後の１８時間においてＢｒＤｕで標識された細胞は、処理後４８時間又は１６８時間に増殖した細胞の比率を決定するのに用いた。
【０２１２】
結果。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与は、コントロールと比較して血液中の全ＮＫ細胞の増加に反映されるＮＫ細胞集団の増殖を誘導する（図１２Ａ）。これらのデータは、末梢血液における２日の時点までのＮＫ細胞集団の急速な増殖を示す。７日までには、ＮＫ細胞集団はコントロールと同じになり、これは増殖の大部分が早期の２日の時点で生じ、７日までにはコントロールレベルまで減少することを示している。
【０２１３】
ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソーム及び遊離型ＯＤＮ２のＩＶ投与は、ＮＫ細胞の増殖を誘導し、これはＮＫ細胞へのＢｒＤｕの取り込みの増加に反映される（図１２Ｂ）。２日目の時点（４８時間）において、リポソームＯＤＮ１ｍで処理した動物は、ＮＫ細胞増殖においてコンロトール（１．２５％から２９．３２％まで）を超えておよそ２２５０％の増加を示し、そして全期間においてＢｒＤｕが存在する場合には遊離型ＯＤＮを超えて５０％超（１９．０１％から２９．３２％まで）の増加を示した。さらに、処理の最後の１８時間の間において、リポソームＯＤＮ１ｍはコントロール（１．３７％から２１．５４％まで）よりも１４７２％超の細胞増殖を示した。その後７日目まで増殖は減少し、ＮＫ細部集団はコントロールよりもほんのわずか良かった。最後に、図１２Ｃは、血液中に存在する全ＮＫ細胞数と比較した、増殖に起因するＮＫ細胞のパーセンテージを説明している。ほんの１２％が増殖に起因するコントロール及び遊離型ＯＤＮ２で処理した動物における６０％と比較して、２日後の陽イオン性リポソームＯＤＮ１ｍによる処理後に存在するＮＫ細胞のおよそ８０％は増殖に起因する。
【０２１４】
実施例９
この一連の実験は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との組み合わせでのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおいてＡＤＣＣを強化する有効性を調べるために設計された。
【０２１５】
マウス。本実験において、８〜９週齢（２０〜２２ｇ）の７５ Ｃ３Ｈ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０２１６】
処理。いくつかの時点における、１つのコントロール群と４つの処理群が存在した。各群を、２００ｕｌ体積中の１０３ ３８Ｃ１３−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ細胞でＩＶチャレンジした。コントロール群はＨＢＳで処理した。１つの処理群は、３週間の間週に１回５０ｍｇ／用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で処理した。別の処理群は、２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム及び５０ｕｇ／用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＩＶ注射で週に１回処理した。付加的処理群は、２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]遊離型又はＯＤＮ２ｍ［配列番号:１]ＰＳ遊離型の１つのＩＶ注射を受けた。
【０２１７】
腫瘍成長。実験開始前に、３８Ｃ１３−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで３〜５代継代の間培養した。この細胞を採取して、単一細胞懸濁液を氷上の５０ｍＬコニカルチューブに移し、そして１４００ｒｐｍ、５分間、４℃で１回滅菌ハンクス液中において洗った。細胞を数え、生存率が９０％超の場合のみ使用した。細胞を滅菌ハンクス液中で２００ｕｌ（ＩＶ）あたり１×１０3まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスのＩＶ中に移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に２回体重を測定した。
【０２１８】
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。ＣＯ2吸入によりマウスを屠殺した。分析は体重及び安楽死の時期に基づいた。癌の動物モデルにおける主体のＡＤＣＣの証明として、抗腫瘍効力を判断するためにＭＳＴ（平均生存期間）を用いた。週２回この動物の体重を測定した。この投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
【０２１９】
結果。これらのデータは、ヒト抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現させるために導入されたマウスリンパ腫細胞系の３８Ｃ１３でチャレンジしたＣ３Ｈマウスでのこの同系腫瘍モデルにおいて、ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の抗腫瘍効力の強化に効果的であることを示している（図１３Ａ）。５０ｍｇ／マウスの投与量でのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の単独投与は、１４％の少しの寿命の増加をもたらし（図１３Ｂ）、一方、５０ｍｇ／マウスのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との組み合わせでの遊離型ＯＤＮ１ｍの２０ｍｇ／ｋｇの投与は、コントロールを超えて５４％まで少しのさらなる寿命の増加をもたらした。驚いたことに、５０ｍｇ／マウスのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との組み合わせでの遊離型ＯＤＮ２ＰＳの２０ｍｇ／ｋｇの投与は、本明細書中で試験された条件下では寿命を増加させなかった。しかし、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との組み合わせでの２０ｍｇ／ｋｇＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームの投与は、相乗的に作用して、抗腫瘍の効力を強化し、未処理のコントロールを超えて４００％の寿命の増加をもたらした。これらのデータは、リポソームＯＤＮ１ｍがＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と相乗的に作用し、その活性は遊離型ＯＤＮ２ＰＳ又はＯＤＮ１ｍそれぞれより優れていることを示している。
【０２２０】
導入された３８Ｃ１３細胞系においてＨｅｒ２／ｎｅｕが機能的役割を有さないことが予想されるだろうという事実を考慮すると、このモデルは特に興味深い。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による処置の候補であるヒト乳癌及び卵巣癌において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは過剰発現され、そして成長因子の結合において腫瘍細胞の増殖をもたらす増殖及び生存シグナルを変換する受容体として機能する。これらの細胞に対して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は２つの方法で抗腫瘍作用を発揮する。この２つの方法は、１）成長因子の結合をブロックし、そして細胞表面の発現を下方制御して、これによりこれらの生存／増殖シグナルを妨げること；及び２）ＡＤＣＣなどによる免疫介在性破壊のためにその細胞を標的とすること、による。しかし、Ｈｅｒ２／ｎｅｕが成長因子受容体としての機能を全く有さないと予想されるこれらの導入された３８Ｃ１３細胞の場合、抗腫瘍作用は多分ＡＤＣＣ活性に単独で直接的に起因するだろう。従って、シグナル機序としてのＡＤＣＣは顕著な抗腫瘍活性を発揮することができ、そして腫瘍細胞を認識し結合するが、それら自身では処置活性を全く有しないか又は少ししか有しないモノクローナル抗体の使用の可能性を上げるという強力な証拠を、このモデルは提供する。
【０２２１】
実施例１０
この一連の実験は、抗ＧＤ２モノクローナル抗体との組み合わせでのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおいてＡＤＣＣを強化する有効性を調べるために設計された。
【０２２２】
マウス。本実験において、１０〜１２週齢（２０〜２２ｇ）の３０ Ｃ５７ＢＩ／６雌性マウスを用いた。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０２２３】
処理。１つのコントロール群と５つの処理群が存在した。各群を５×１０5のＥＬ４細胞でＳＣチャレンジした。コントロール群をＨＢＳで処理した。２つの処理群は、週２回、５又は１０ｍｇ／ｋｇ（体重に基づいた）の投与量で単独のＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。３つの処理群は、５又は１０ｍｇ／ｋｇの投与量（体重に基づいた）での週２回のＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射及び２０ｕｇ／用量での週１回の抗ＧＤ２抗体のＩＶ注射を受けた。
【０２２４】
腫瘍成長。本実験の開始前に、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで３〜５代継代の間培養した。細胞を採取し、そして単一細胞懸濁液を氷上の５０ｍＬのコニカルチューブに移し、滅菌ハンクス液中において１４００ｒｐｍ、５分、４℃で１×洗った。細胞を数え、そして生存率が９０％超の場合に使用した。細胞を希釈して、滅菌ハンクス液中で２００ｕｌ（ＩＶ）あたり５×１０5細胞数とした。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスＳＣ中へ移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に２回体重を測定した。
【０２２５】
データ分析。本研究の間は１日おきにキャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて一次腫瘍容積を測定した。本研究の間は１日おきに、長さ（ｍｍ）、幅（ｍｍ）、及び高さ（ｍｍ）の測定を行った。腫瘍容積は以下の２つの式から計算した：
腫瘍容積（ｍｍ3）＝（Ｌ×Ｗ2）／２
腫瘍容積（ｍｍ3）＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）×ｐ／６
【０２２６】
腫瘍容積がおよそ２０００ｍｍ3に達した時又は腫瘍細胞注射後約１５日でマウスを屠殺した。投与期間中の動物の任意の拒絶反応を観察した。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時にも、それらを安楽死させた。
【０２２７】
結果。２０ｍｇ／動物での抗ＧＤ２抗体又は１０若しくは２０ｍｇ／ｋｇでのＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのいずれかの単独での投与は、腫瘍成長のごく穏やかな阻害を引き起こした。２０ｍｇ／動物の抗ＧＤ３抗体との組み合わせでの１０又は２０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍの投与は、コントロール動物及び抗ＧＤＸ２又はリポソームＯＤＮ１ｍの単独で処理したものと比較して、抗ＧＤ２抗腫瘍活性の穏やかな強化を引き起こした（図１４Ａ）。興味深いことに、ごく穏やかな活性の強化が見られたが、抗体の存在下及び不在下のどちらにおいても、リポソームＯＤＮ１ｍを受けた動物の２５〜６０％において比較的高い頻度での腫瘍の退化が観察された（図１４Ｂ）。腫瘍退化が後に続く腫瘍成長の動態は、最終的に腫瘍の完全な退化の原因であろう適応免疫応答の発達を示唆した。これがその場合であるかを評価するために、腫瘍が退化した動物の抗原特異的細胞性免疫応答又は体液性免疫応答を分析した。
【０２２８】
実施例１１
この一連の実験は、抗ＧＤ２モノクローナル抗体との組み合わせでのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおけるＡＤＣＣを強化する能力及び二次免疫応答の発達を容易にする能力を調べるために設計された。
【０２２９】
マウス。実施例１０で説明された処理の後に生存する動物。
【０２３０】
採取。マウスの脾臓及び血漿を採取した。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０２３１】
データ分析。採取した脾細胞を、マイトマイシンＣで処理したＥＬ４腫瘍細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。次に、Ｃｒ放出アッセイにより脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞を殺傷する能力を分析した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、血漿サンプルに腫瘍細胞を認識しそして結合することのできる抗体が存在するかを試験した。
【０２３２】
結果。これらの研究のデータは、抗原特異的細胞性応答及び体液性応答の両方に関して二次適応免疫応答の発達を示す。図１５Ａで示されているように、ＥＬ−４腫瘍をＳＣ中に投与された動物から単離した脾細胞はリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの処理後に完全に退化し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激され、未処理動物の脾細胞と比較して、クロム放出アッセイにおいて抗原特異的な様式でＥＬ−４腫瘍細胞を溶解する能力が強化されることが実証された。さらに、これらの同一の動物から単離されそしてフローサイトメトリーにより分析された血清は、ＥＬ−４腫瘍細胞を認識しそして結合することのできる免疫グロブリンの存在を明らかにした、図１５Ｂ。これらの結果の両方は、初期の腫瘍チャレンジを完全に消去することが可能なそれらの動物における二次的な抗原特異的、抗腫瘍適応免疫応答の発達を示す。これらのデータは、腫瘍特異的抗原との組み合わせでのリポソームＯＤＮ１ｍを用いた処理が長期持続的、抗原特異的適応免疫応答の発達をもたらし、そして疾患再発の長期予防を発達させることの可能性を高めることができることを示す。
【０２３３】
実施例１２
この一連の実験は、同系動物モデルにおいて、抗ＰＳモノクローナル抗体と共に投与されたＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるＡＤＣＣを強化する抗腫瘍効力を評価するために設計された。
【０２３４】
マウス。本実験においては、１０〜１２週齢（２０〜２２ｇ）の３８ Ｃ５７ＢＩ／６雌性マウスを使用した。これらの動物を５つのグループで飼育した。
【０２３５】
処理。１つのコントロール群と５つの処理群が存在した。各群を、１×１０5のＥＬ−４細胞でＳＣチャレンジした。コントロール群はＨＢＳで処理した。１つの処理群は、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム（体重に基づいた）のＩＶ投与を受けた。１つの処理群は、週に１回、５０ｕｇ／ｍｌで抗ＰＳ抗体のＩＶ注射を受けた。付加的な処理群は、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム（体重に基づいた）のＩＶ投与及び、週に１回、５０ｕｇ／用量で抗ＰＳ２抗体又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のいずれかのＩＶ投与を受けた。
【０２３６】
腫瘍成長。本実験の開始前に、ＥＬ４細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで３〜５代継代の間培養した。単一細胞懸濁液を氷上の５０ｍＬコニカルチューブに移した、いったん全ての細胞が採取されたら、それらを滅菌ハンクス液中において１０００ｒｐｍ、５分、４℃で１×洗った。細胞を、その生存率が９０％超の場合に使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で１００ｍＬあたり１０5細胞数（１×１０6細胞数／ｍＬ）まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をｓｃ投与した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。
【０２３７】
データ分析。投与する間、動物の任意の拒絶反応を観察した。一次腫瘍容積はキャリパーを用いて測定した。本研究の間は１日おきに、長さ（ｍｍ）、幅（ｍｍ）、及び高さ（ｍｍ）の測定を行うだろう。腫瘍容積は以下の２つの式から計算した：
腫瘍容積（ｍｍ3）＝（Ｌ×Ｗ2）／２
腫瘍容積（ｍｍ3）＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）×ｐ／６
【０２３８】
腫瘍容積がおよそ２０００ｍｍ3に達した時、又は腫瘍細胞注射後約１５日で、又は生体動物園のスタッフ（ｖｉｖａｒｉｕｍ ｓｔａｆｆ）の判断によりマウスを屠殺した。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時にも、それらを安楽死させた。ＣＯ2吸入によりマウスを屠殺した。
【０２３９】
結果。これらのデータは、ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与がＣ５７ＢＩ／６マウス中のマウス胸腺腫細胞系ＥＬ−４を用いたこの同系ｓｃ腫瘍モデルにおいて、抗脈管形成抗体の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。この抗体は、腫瘍血管系及び腫瘍細胞の両方で高く発現することが見出された脂質である、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して特異的である。抗ＰＳ抗体の５０ｍｇ／マウスでの単独投与は、腫瘍成長において全く適切な効果を有さなかった。同様に、１０ｍｇ／ｋｇの投与量でのリポソームＯＤＮ１ｍの単独投与は、腫瘍成長のごく穏やかな阻害をもたらした。しかし、図１６に示されているように、１０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの５０ｍｇ／マウスの抗ＰＳ抗体の投与は、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらした。事実、平均腫瘍容積が１６日目までにおよそ１８００ｍｍ3まで増加した後に、腫瘍の退化が観察され、平均容積は２１日目までに１０００ｍｍ3まで減少し、そして最終的には検出可能な腫瘍の完全な除去がもたらされた。
【０２４０】
実施例１３
この一連の実験は、抗ＰＳ抗体との組み合わせでのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるＡＤＣＣを強化する効力を調べるために設計された。
【０２４１】
マウス。本実験においては、８〜９週齢（２０〜２２ｇ）の７２ Ｃ３Ｈ雌性マウスを使用した。これらの動物を３又は４つの群で飼育した。
【０２４２】
処理。様々な時点における、１つのコントロール群と３つの処理群が存在した。各群を、５０ｕｌ容積において３×１０3の３８Ｃ１３細胞でＩＶチャレンジした。コントロール群をＨＢＳで処理した。１つの処理群は、３週間の間、週に１回、１５ｕｇ／用量の抗ＰＳ抗体で処理した。別の処理群は、週に１回２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム及び１５ｕｇ／用量の抗ＰＳ抗体のＩＶ注射により処理した。さらなる処理群は、２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。
【０２４３】
腫瘍成長。本実験の開始までに、細胞は３１代継代であった。細胞を採取して、単一細胞懸濁液を氷上の１０ｍＬコニカルチューブに移し、そして滅菌ＰＢＳ中で１０００ｒｐｍ、５分、４℃で１×洗った。細胞は、その生存率が９０％超の場合に使用した。細胞を、滅菌ＰＢＳ中（各濃度に対して２ｍＬ）で、５０ｕｌあたり３×１０3細胞数（２０×１０3及び６０×１０3細胞数／ｍｌ）まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスＳＣ中へ移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に２回腫瘍サイズ及び体重を測定した。
【０２４４】
データ分析。本研究の間は１日おきにキャリパーを用いて一次腫瘍容積を測定した。腫瘍容積がおよそ２０００ｍｍ3（Ｌ×Ｗ×Ｗ／２）に達した時又は生体動物園のスタッフの判断によりマウスを屠殺した。マウスを観察し、疾患進行の兆候が表れた時に安楽死させた。
【０２４５】
結果。これらのデータは、ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与が、Ｃ５７ＢＩ／６マウス中のマウスリンパ腫細胞系３８Ｃ１３を用いたこの同系ｓｃ腫瘍モデルにおいて抗脈管形成抗体の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。この抗体は、腫瘍血管系及び腫瘍細胞の両方で高く発現することが見出される脂質である、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して特異的である、図１７。１５ｍｇ／マウスの投与量での抗ＰＳ抗体の単独投与及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量でのリポソームＯＤＮ１ｍの単独投与は両方とも、未処理のコントロール動物と比較して腫瘍成長における穏やかな阻害効果を発揮することが見出された。しかし、１０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの１５ｍｇ／マウスの抗ＰＳ抗体の投与は、未処理のコントロール動物及びどちらかの物質単独で処理した動物の両方と比較して、腫瘍成長の顕著な阻害がもたらされた。
【０２４６】
実施例１３
この一連の実験は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとの組み合わせでのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるＡＤＣＣを強化する効力を調べるために設計された。
【０２４７】
マウス。本実験においては、６〜８週齢（２０〜２２ｇ）の５０ ＳＣＩＤ Ｃ.Ｂ−１７ Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０２４８】
処理。２つの抗体コントロール群と３つの処理群が存在した。各群を、５×１０6のＤａｕｄｉ細胞でＩＶチャレンジした。コントロール群は、週に１回、５ｕｇ／用量及び４０ｕｇ／用量で処理した。１つの処理群は、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇでのＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。付加的な処理群は、週に２回の１０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソーム、及び週に１回の５ｕｇ／用量又は４０ｕｇ／用量でのＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体のＩＶ注射を受けた。
【０２４９】
腫瘍成長。本実験の開始前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤａｕｄｉ細胞を３〜５代継代の間培養した。本実験で使用したフラスコは、採取の時５０〜６０％の細胞密集度を示した。単一細胞懸濁液を氷上の５０ｍＬコニカルチューブに移した。いったん細胞が採取されたら、それらを１×滅菌ハンクス液中で１００ｒｐｍ、５分、４℃で洗った。細胞は、その生存率が９０％超の場合に使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で２００ｍＬあたり５×１０6細胞数（２．５×１０7細胞数／ｍＬ）まで希釈した。いったん全ての細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスＩＶ中（尾静脈により）に移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に２回体重を測定した。
【０２５０】
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。ＣＯ2吸入によりマウスを屠殺した。分析は体重及び安楽死の時期に基づいた。癌の動物モデルにおける主体のＡＤＣＣの証明として、ＭＳＴ（平均生存期間）を用いて抗腫瘍効力を判断した。週２回動物の体重を測定した。この投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
【０２５１】
結果。これらのデータは、ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与が、ＳＣＩＤマウス中のヒトＢ細リンパ腺腫細胞系であるＤａｕｄｉを用いたこの異種腫瘍モデルにおいて、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。５及び４０ｍｇ／マウスの投与量でのＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の単独投与は、未処理動物と比較して、それぞれ２５０及び１２０％超の寿命の増加において効果的であり、一方、１０ｍｇ／ｋｇの投与量でのリポソームＯＤＮ１ｍの投与はほぼ３５０％の寿命の増加をもたらした。しかし、１０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの５及び４０ｍｇ／マウスのＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の投与は、４５０％超の寿命の強化された増加をもたらした、図１８。これらのデータは、組み合わせの群における動物は悪性疾患に負けずに安楽死させられたという事実を考慮するとより印象的である。両方の組み合わせの群における全ての動物は、見掛けは健康であり、安楽死の時点でも疾患の兆候はなかった。従って、この組み合わせは寿命においてさらに高い顕著な効果を有し、そして４７０％は非常に控えめな推定値であると予測することができた。
【０２５２】
実施例１４
この一連の実験は、リポソームＯＤＮとＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との間のＭＣＦ−７ ｈｅｒ２／ｎｅｕの腫瘍成長を阻害する相乗作用を、強化されたＡＤＣＣ活性を介して調べるために設計された。
【０２５３】
マウス。本実験においては、６〜８週齢（２０〜２２ｇ）の５０ ＳＣＩＤ Ｃ.Ｂ−１７ Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０２５４】
処理。１つのコントロール群と７つの処理群が存在した。各群を、５０ｕｌ中で１×１０7のＭＣＦ−７細胞でＳＣチャレンジした。コントロール群はＨＢＳで処理した。処理群の１組は、３週間の間、週に２回、１０又は２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。別の処理群は、１０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム及び５０ｕｇの無関係の抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂのＩＶ注射を受けた。処理群の別の組は、５０ｕｇ／用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）又は７５ｕｇ／用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の１つを受けた。付加的な処理群は、週に２回の２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム及び週に１回の５０ｕｇ／用量又は７５ｕｇ／用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＩＶ注射を受けた。腫瘍細胞で動物をチャレンジする期間のある１日に、ＭＣＦ−７腫瘍細胞が成長するのにエストロゲンが必要であるので、各動物に１７−ｂ−エストラジオール錠剤を移植した。
【０２５５】
腫瘍成長。ＭＣＦ−７細胞は、本実験の開始前にｉｎ ｖｉｔｒｏで３〜５代継代の間培養した。この単一細胞懸濁液は、氷上の５０ｍＬコニカルチューブに移した。いったん全ての細胞が採取されると、１０００ｒｐｍ、５分間、４℃で滅菌ハンクス液中で１×洗った。細胞の生存率が９０％超の場合に限り、それらを使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で５０ｍＬあたり１０×１０6細胞数（２００×１０6細胞数/ｍＬ）まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をＳＣ投与した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。週に２回、腫瘍の大きさを測定した。
【０２５６】
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少＞２０％の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。ＣＯ2吸入によりマウスを屠殺した。ＡＤＣＣ発達に対するＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]の最適な投与量を選択するために、ＭＳＴ（メディアン腫瘍サイズ）を用いた。週に２回動物の体重を測定した。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]投与の投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
【０２５７】
結果。これらのデータは、ＯＤＮ１ｍ含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与が、ＳＣＩＤマウス中のヒト乳癌細胞系であるＭＣＦ−７を用いたこの異種腫瘍モデルにおいてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。５０及び７５ｍｇ／マウスの投与量でのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の単独投与は、未処理のコントロール動物と比較して、それぞれ８７％及び８９％で腫瘍サイズを減少させるのに効果的であり、一方、１０及び２０ｍｇ／ｋｇの投与量でのリポソームＯＤＮ１ｍの単独投与は３４％及び５４％の腫瘍サイズの減少をもたらした、図１９。しかし、２０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍとの組み合わせでの５０及び７５ｍｇ／マウスの投与量でのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の投与は、ＭＣＦ−７腫瘍成長の完全な阻害をもたらし、検出可能な腫瘍はなかった。予測されたとおり、腫瘍細胞を認識しない無関係な抗体（この場合はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））との組み合わせでの１０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍの投与は、等量の陽イオン性リポソームＯＤＮ１ｍの単独と比較して、腫瘍成長の阻害を強化しなかった。さらに、コントロール群、無関係の抗体の群、１０及び２０ｍｇ／ｋｇのリポソームＯＤＮ１ｍの群並びに５０ｍｇ／動物のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の群における全ての動物、そして７５ｍｇ／動物の群の８０％の動物は、腫瘍負荷を示し、一方、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びリポソームＯＤＮ１ｍの組み合わせで処理した群の全ての動物は全く腫瘍がなかったという事実によって、リポソームＯＤＮ１ｍのこの動物モデルにおいてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の抗腫瘍効果を強化する能力がさらに実証された。
【０２５８】
実施例１５
２つの独立した腫瘍モデルを用いたこの一連の実験は、腫瘍部位へのＮＫ細胞の移行を評価するために設計された。
【０２５９】
ＥＬ−４腫瘍モデル
マウス。本実験においては、８〜９週齢（２０〜２２ｇ）の６５ Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ雌性マウスを使用した。これらの動物を５つの群で飼育した。
【０２６０】
処理。２つの処理群が存在した。各群を、５０ｕｌのＰＢＳ中の５×１０5のＥＬ−４細胞でＳＣチャレンジした。最初の処理群は腫瘍を有しており、ＨＢＳで処理された。２番目の群は腫瘍を有しており、そして２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。
【０２６１】
採取。腫瘍を採取した、滅菌条件は必要ない。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０２６２】
製剤。免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、予備成形小胞（ＰＦＶ）技術を用いて生成し、エタノールを利用した。改質（ｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＰＦＶは、２回通過のために１００ｎｍフィルターの上の２００nmフィルターを通して押し出された。
【０２６３】
データ分析。腫瘍から得た細胞は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、ＮＫ細胞数の活性化（ＤＸ５の発現により）及び活性化状態（ＣＤ１６の発現により）を分析した。
【０２６４】
３８Ｃ１３腫瘍モデル
マウス。本実験においては、８〜９週齢（２０〜２２ｇ）の３０ ＣＨ３雌性マウスを使用した。これらの動物を３つの群で飼育した。
【０２６５】
処理。３つの処理群が存在した。最初の群は腫瘍がなく、週に１回、２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ注射を受けた。腫瘍を持つ各群を、１００ｕｌのＰＢＳ中のＭＭＣ（マイトマイシンＣ）で前処理した１×１０6の３８Ｃ１３細胞を用いてＳＣチャレンジした。腫瘍を持つマウスの１つの群はＨＢＳで処理された。腫瘍を持つマウスの２番目の群は、週に１回、２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソーム（体重に基づいた）のＩＶ注射を受けた。
【０２６６】
採取。腹膜洗浄、滅菌条件は必要ない。組織を分離し、そして細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析用に回収した。
【０２６７】
製剤。ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームは、予備成形小胞（ＰＦＶ）技術を用いて生成し、エタノールを利用した。改質（ｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＰＦＶは、２回通過のために１００ｎｍフィルターの上の２００nmフィルターを通して押し出された。
【０２６８】
データ分析。腹膜洗浄から得た細胞は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、ＮＫ細胞数（ＤＸ５の発現により）及び活性化状態（ＣＤ１６の発現により）を分析した。
【０２６９】
結果。これらの２つの研究のデータは、未処理動物と比較して、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのｉｖ投与がＮＫ細胞の腫瘍負荷部位へのホーミングをもたらし、疾患部位のこれらの免疫エフェクター細胞の数を効果的に増加させることを示している。ＮＫ細胞ホーミングのこの現象は、２つの異なる動物モデルにおいて実証された。ＳＣ固形ＥＬ−４腫瘍を持つＣ５７ＢＩ／６動物においては、未処理動物と比較して、活性化されたＮＫ細胞の強化されたレベル（ＤＸ−５ ＮＫ表現型マーカー及びＣＤ１６活性化マーカーの発現により評価された）が、腫瘍組織において処理後４〜７日に検出され、コントロール動物におけるたった２.３％と比較して腫瘍中の細胞の５.３％もの高い割合を占めていた、図２０Ａ。同様に、腫瘍中のＮＫ細胞の活性化状態の評価は、ｉｖ投与が腫瘍内のＮＫ細胞の活性化の強化をもたらし、未処理動物のたった３７％と比較して、腫瘍内のＮＫ細胞の６６％（図２０Ｂ）がリポソームＯＤＮ１ｍの投与後に活性化されることも実証した。
【０２７０】
ＩＰ ３８Ｃ１３腫瘍を持つＣ３Ｈ動物においては、腹膜洗浄における活性化されたＮＫ細胞の数の評価（ＤＸ−５ ＮＫ表現型マーカー及びＣＤ６９活性化マーカーの発現により評価された）は、未処理のコントロールの動物と比較して、陽イオン性リポソームＯＤＮ１ｍのＩＶ投与後の腫瘍負荷部位へのホーミングが強化されることも実証した。活性化されたＮＫ細胞の数が、未処理で腫瘍を持つ動物において、全単離細胞のおよそ１．２％で一定のままである一方で、ＩＶ投与は腫瘍のない動物の腹膜腔中の活性化されたＮＫ細胞の数の穏やかな増加をもたらし、４８時間で３％まで増加する、図２１。しかし、腫瘍を持つ動物では、リポソームＯＤＮ１ｍの投与後に、活性化されたＮＫ細胞含有量が４８時間でおよそ６％まで増加した。
【０２７１】
これらの研究の両方のデータは、ＯＤＮ１ｍ［配列番号:４]含有陽イオン性リポソームのＩＶ投与が腫瘍負荷部位中の活性化されたＮＫ細胞の数を効果的に増加させることを実証している。この観察結果は関連しており、つまり、これらの細胞が必要とされ且つ最も効果的であろう疾患部位に対してこれらの細胞により発揮される効果的な免疫活性を濃縮する。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｂは、Ｃ３Ｈマウスの血液及び脾臓におけるＮＫ細胞の増殖／動員における、免疫刺激性核酸及び免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの効果を示している。図１Ａは、脾臓細胞における総ＮＫ集団に対する結果を示している。
【図１Ｂ】図１Ａ−Ｂは、Ｃ３Ｈマウスの血液及び脾臓におけるＮＫ細胞の増殖／動員における、免疫刺激性核酸及び免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの効果を示している。図１Ｂは、血液ＮＫ集団に対する結果を示している。
【図２Ａ】図２Ａ−Ｂは、血液及び脾臓におけるＣＤ６９マーカーを使用するＮＫ細胞活性化における、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの効果を示している。図２Ａは、脾臓細胞における総ＮＫ集団に対する結果を示している。
【図２Ｂ】図２Ａ−Ｂは、血液及び脾臓におけるＣＤ６９マーカーを使用するＮＫ細胞活性化における、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの効果を示している。図２Ｂは、血液ＮＫ集団に対する結果を示している。
【図３Ａ】図３Ａ−Ｅは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより誘導される強化されたＮＫ細胞溶解活性を示している。図３Ａは、脾臓におけるＹａｃ−１細胞からのＣｒの放出を示している。
【図３Ｂ】図３Ａ−Ｅは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより誘導される強化されたＮＫ細胞溶解活性を示している。図３Ｂは、血液におけるＹａｃ−１細胞からのＣｒの放出を示している。
【図３Ｃ】図３Ａ−Ｅは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより誘導される強化されたＮＫ細胞溶解活性を示している。図３Ｃは、脾臓におけるＹａｃ−１細胞及びＰ８１５細胞からのＣｒの放出を示している。
【図３Ｄ】図３Ａ−Ｅは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより誘導される強化されたＮＫ細胞溶解活性を示している。図３Ｄは、血液におけるＹａｃ−１細胞及びＰ８１５細胞からのＣｒの放出を示している。
【図３Ｅ】図３Ａ−Ｅは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより誘導される強化されたＮＫ細胞溶解活性を示している。図３Ｅは、単離されたＮＫ細胞の存在下における、Ｙａｃ−１細胞からのＣｒの放出を示している。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｂは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより活性化されたＮＫ細胞がＡＤＣＣ活性を介在することを示している。図４Ａは、血液におけるＤａｕｄｉ細胞からのＣｒの放出を示している。
【図４Ｂ】図４Ａ−Ｂは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより活性化されたＮＫ細胞がＡＤＣＣ活性を介在することを示している。図４Ｂは、単離されたＮＫ細胞の存在下におけるＤａｕｄｉ細胞からのＣｒの放出を示している。
【図５Ａ】図５Ａ−Ｃは、腫瘍を持つマウス及び腫瘍のないマウスにおいて、ＹＡＣ及びＭ１４標的細胞の両方を用いたＮＫ及びＡＤＣＣ活性化を強化する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの能力を説明する。図５Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＹａｃ−１に対する細胞傷害レベルにより測定した、脾臓及び血液ＮＫ細胞の活性化を示している。
【図５Ｂ】図５Ａ−Ｃは、腫瘍を持つマウス及び腫瘍のないマウスにおいて、ＹＡＣ及びＭ１４標的細胞の両方を用いたＮＫ及びＡＤＣＣ活性化を強化する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの能力を説明する。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭ１４細胞に対する細胞傷害レベルにより測定した、脾臓ＮＫ細胞の活性化を示している。
【図５Ｃ】図５Ａ−Ｃは、腫瘍を持つマウス及び腫瘍のないマウスにおいて、ＹＡＣ及びＭ１４標的細胞の両方を用いたＮＫ及びＡＤＣＣ活性化を強化する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの能力を説明する。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭ１４細胞に対する細胞傷害レベルにより測定した、血液ＮＫ細胞の活性化を示している。
【図６Ａ】図６Ａ−Ｂは、脾臓及び血液における強化されたＮＫ活性とＹＡＣ−１細胞との対比に関する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの用量応答データを示している。図６Ａは、脾臓ＮＫ細胞の活性を示している。
【図６Ｂ】図６Ａ−Ｂは、脾臓及び血液における強化されたＮＫ活性とＹＡＣ−１細胞との対比に関する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの用量応答データを示している。図６Ｂは、血液ＮＫ細胞の活性を示している。
【図７Ａ】図７Ａ−Ｂは、脾臓及び血液における抗ＣＤ２０抗体の存在下におけるＤａｕｄｉ細胞に対する強化されたＡＤＣＣ活性に関する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの用量応答データを示している。図７Ａは、脾臓細胞におけるＡＤＣＣ活性を示している。
【図７Ｂ】図７Ａ−Ｂは、脾臓及び血液における抗ＣＤ２０抗体の存在下におけるＤａｕｄｉ細胞に対する強化されたＡＤＣＣ活性に関する、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの用量応答データを示している。図７Ｂは、血液におけるＡＤＣＣ活性を示している。
【図８Ａ】図８Ａ−Ｂは、脾臓及び血液におけるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の存在下でのＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性における、単回投与方式と複数回投与方式とを対比した効果を示している。
【図８Ｂ】図８Ａ−Ｂは、脾臓及び血液におけるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の存在下でのＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性における、単回投与方式と複数回投与方式とを対比した効果を示している。
【図９Ａ】図９Ａ−Ｂは、脾臓及び血液おけるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の存在下でのＤａｕｄｉ細胞に対するＮＫ及びＡＤＣＣ活性における、単回投与方式と２回投与方式とを対比した効果を示している。図９Ａは、脾臓細胞におけるＡＤＣＣ活性を示している。
【図９Ｂ】図９Ａ−Ｂは、脾臓及び血液おけるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の存在下でのＤａｕｄｉ細胞に対するＮＫ及びＡＤＣＣ活性における、単回投与方式と２回投与方式とを対比した効果を示している。図９Ｂは、血液におけるＡＤＣＣ活性を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａ−Ｂは、ＳＣＩＤ／Ｎａｍａｌｗａモデルにおける処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの強化された効力を実証する。図１０Ａは、処理したマウスの生存曲線を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−Ｂは、ＳＣＩＤ／Ｎａｍａｌｗａモデルにおける処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの強化された効力を実証する。図１０Ｂは、処理したマウスの平均寿命の増加を示している。
【図１１Ａ】図１１Ａ−Ｃは、Ｃ５７Ｂｌ／ＥＬ−４ ＳＣ及びＩＶ腫瘍モデルにおける処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの強化された効力を実証する。図１１Ａは、処理したマウスにおける阻害された腫瘍の成長を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−Ｃは、Ｃ５７Ｂｌ／ＥＬ−４ ＳＣ及びＩＶ腫瘍モデルにおける処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの強化された効力を実証する。図１１Ｂは、処理したマウスにおける強化された生存を示している。
【図１１Ｃ】図１１Ａ−Ｃは、Ｃ５７Ｂｌ／ＥＬ−４ ＳＣ及びＩＶ腫瘍モデルにおける処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの強化された効力を実証する。図１１Ｃは、処理したマウスの平均寿命の増加を示している。
【図１２】図１２Ａ−Ｃは、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを介在しそしてＮＫ細胞の増殖及び動員を容易にする能力を実証している。図１２Ａは、血液における総ＮＫ細胞の増加を示している。図１２Ｂは、ＮＫ細胞の増殖における増加を示している。図１２Ｃは、血液中に存在するＮＫ細胞の総数と比較した、増殖に起因するＮＫ細胞のパーセンテージを示している。
【図１３Ａ】図１３Ａ−Ｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを強化する能力を実証している。図１３Ａは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、強化された抗腫瘍効力を示している。
【図１３Ｂ】図１３Ａ−Ｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを強化する能力を実証している。図１３Ｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを用いて処理したマウスの寿命の増加を示している。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、抗ＧＤ２と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを強化する能力を実証している。図１４Ａは抗ＧＤ２と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、強化された抗腫瘍効力を示している。図１４Ｂは、処理したマウスの腫瘍の退化を示している。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、抗ＧＤ２と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ＡＤＣＣを強化する能力及び二次免疫応答の発達を促進する能力を実証している。図１５Ａは、処理したマウスから単離した脾細胞のＥＬ−４腫瘍細胞を溶解する能力を示している。図１５Ｂは、処理したマウスの血清における、ＥＬ−４腫瘍細胞に結合する免疫グロブリンの存在を示す。
【図１６】図１６は、抗ＰＳと組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームで処理したマウスにおける、腫瘍成長の阻害を示す。
【図１７】図１７は、抗ＰＳと組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームで処理したマウスの腫瘍成長における阻害を実証している。
【図１８】図１８は、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームで処理した、癌性腫瘍を有するマウスの寿命の増加を実証している。
【図１９】図１９は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳癌細胞系であるＭＣＦ−７を用いて、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与が、異種腫瘍モデルにおけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の抗腫瘍効力の強化に効果的であることを示している。
【図２０】図２０Ａ−Ｂは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与が、ＮＫ細胞の腫瘍部位へのホーミングを引き起こすことを示している。図２０Ａは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームによる処理後の、ＳＣ固形ＥＬ−４腫瘍を有するＣ５７ＢＩ／６動物における活性化されたＮＫ細胞の強化レベルを示している。図２０Ｂは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与後の、腫瘍内のＮＫ細胞の強化された活性を示している。
【図２１】図２１は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与後の、ＮＫ細胞の活性化及び腫瘍負荷部位への強化されたホーミングを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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