(57)【要約】  本発明は、二本鎖の形で対合した核酸の鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法であって、少なくとも前記二本鎖を、疑われるミスマッチと特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１個の化合物と接触させ、そして前記ミスマッチを分析方法でアッセイする工程からなる二本鎖の形で対合した核酸の鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法に関する。本発明はまた、遺伝病及び癌の素因の診断並びに前記の病気及びヒト乳癌などの癌の診断及び予後診断における使用に関する。本発明はまた、特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物を、点突然変異が遺伝病又は前記の病気の高められた素因と感があるか関係があると推定される遺伝子に関する核酸配列を有するＤＮＡ断片と一緒に含有する化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖の形で対合した核酸の鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法であって、少なくとも、
−  液状媒体中で、少なくとも一つのミスマッチを含むと疑われる前記二本鎖を、前記ミスマッチと特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と接触させ（但し、前記化合物は、前記媒体に少なくとも１ｇ/ｌの濃度で存在させる）、そして
−  前記ミスマッチについて分析方法でアッセイする
ことのみからなる工程からなる二本鎖の形で対合した核酸の鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法。
【請求項２】
二本鎖の形で対合した核酸の鎖が全部又は一部が相補的である２つのＤＮＡ鎖である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つのヘテロ二本鎖を含むと疑われる核酸試料について電気泳動へテロ二本鎖分析“ＥＨＤＡ”を行う方法であって、少なくとも
−  液状媒体中で、少なくとも一つのヘテロ二本鎖を含むと疑われる前記核酸試料を、前記ヘテロ二本鎖の少なくとも一つのミスマッチと特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１個の化合物と接触させ（但し、前記化合物は、前記媒体に少なくとも１ｇ/ｌの濃度で存在させる）、
−  前記ヘテロ二本鎖の存在についてその電気泳動移動度によりアッセイする
ことのみからなる工程からなる少なくとも一つのヘテロ二本鎖を含むと疑われる核酸試料について電気泳動ヘテロ二本鎖分析“ＥＨＤＡ”を行う方法。
【請求項４】
核酸試料を変性させ、それをヘテロ二本鎖及びホモ二本鎖の両方を得るのに都合のよい条件で再生させる予備工程を含んでなる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
液状媒体中で核酸の一本鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法であって、少なくとも
（ａ）少なくとも一つの突然変異を含むと疑われる前記核酸を、固体支持体にグラフトされた核酸プローブと接触させ、
（ｂ）前記の核酸の鎖の少なくとも一部を前記グラフト核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、
（ｃ）ハイブリダイズしなかった鎖を洗浄し、そして
（ｄ）前記突然変異について分析方法でアッセイする
ことのみからなる工程〔但し、工程ａ）及び／又はｃ）は、前記突然変異と特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物の存在下で行ない、前記化合物は少なくとも１ｇ/ｌの濃度で存在させる〕
からなる液状媒体中で核酸の一本鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法。
【請求項６】
前記の核酸の鎖が一本鎖ＤＫＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、あるいは核酸の合成又は天然類似体である請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記の特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物が、水素結合に適した少なくとも２個基を塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及びＵの少なくとも一つと誘引相互作用を生じるのに適合する配向、極性及び間隔で含有するものである請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物がヌクレオチドの重合反応を妨害することができない及び／又は新たに重合したＤＮＡ鎖に組み込まれることができないものである請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、５個未満のヌクレオチドの長さを有する一つのオリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、塩基又はこれらの混合物である請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが３個未満のヌクレオチド、好ましくは２個未満のヌクレオチドの長さを有するものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、チミジン及びこれらの混合物の中から選択されるものである請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチド又はヌクレオシドの混合物中のオリゴヌクレオチド又はヌクレオシドが相互に塩基対合相互作用をすることができないものである請求項９、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物がシチジンとチミジンを含有するか又はシチジンとアデノシンを含有するか又はグアノシンとチミジンを含有するか、あるいはグアノシンとアデノシンを含有するものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が少なくとも１０ｇ/ｌ、好ましくは少なくとも２５ｇ/ｌの濃度で使用される請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物がさらに少なくとも１個の置換基をもつものである請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記置換基が前記化合物において次の変化：
−  溶解性の増大、
−  荷電の変化、又は
−  溶媒との摩擦の変化
の少なくとも一つを誘導するものである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アッセイすべき突然変異が点突然変異である請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記突然変異をハイブリダイゼーションアッセイによってアッセイする請求項１、２及び５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記突然変異を、液状分離媒体を使用する電気泳動分析でアッセイする請求項１〜４及び６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記液状分離媒体が少なくとも１種の重合体を前記媒体の全重量の少なくとも１重量％、好ましくは少なくとも３重量％の濃度で含有するものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記液状分離媒体が少なくともＮ，Ｎ−ジ置換ポリアクリルアミド及びＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群から選択される重合体を含有するものであり、この場合の前記のＮ置換基がＣ１〜Ｃ１２アルキル基、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、メトキシ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及びヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から選択されるものである請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記の液状分離媒体が数種の重合体セグメントからなる少なくとも１種の重合体を含有するものであり、前記重合体が不規則ブロック共重合体型又は不規則櫛形重合体型のものであり且つ異なる化学的又は位相学的性質をもつ重合体セグメント同士の間で確立された結合点を平均して少なくとも３個有するものである請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記重合体が、前記分離媒体内でチャンネル壁に対して特異的親和性を示す少なくとも１種の重合体セグメントと、前記分離媒体内でチャンネル壁に対してほとんど又は全く親和性を示さない少なくとも１種の重合体セグメントとを含有するものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記重合体がアクリルアミド又は置換アクリルアミドを含有するものである請求項２０〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
特異的点突然変異と関係があるか又は関係があると推測される遺伝病又は癌の素因を診断するかあるいは前記の遺伝病又は癌を診断又は予後診断するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２６】
前記の病気が少なくともヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ）における点突然変異と関係があるものである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１ｇ／１の濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と少なくとも１種の液状分離媒体とを含有する組成物。
【請求項２８】
前記化合物が請求項７〜１６のいずれか１項に記載のものである請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記液状分離媒体が請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のものである請求項２７又は請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記液状分離媒体が、さらに少なくとも
−  篩い分け重合体、
−  親水性重合体、及び
−  界面活性重合体
の中から選択される化合物を含有するものである請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
点突然変異が病気又は病気の高められた素因と関係があるか又は関係があると推定される遺伝子に関連した核酸配列を有する少なくとも一つのＤＮＡ断片と、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物とを含有する組成物であって、前記化合物が請求項７〜１６のいずれか１項に記載のものである組成物。
【請求項３２】
少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、“分子標識”と呼ばれるＤＮＡプローブとして作用する一対の分子又は基とを含有する組成物であって、前記化合物が請求項７〜１６のいずれか１項に記載のものである組成物。
【請求項３３】
点突然変異が病気又は病気の高められた素因と関係があるか又は関係があると推定される遺伝子に関連した核酸配列を有する核酸又はその類似体のスクリーニングに有用なキットであって、少なくとも請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の組成物を含有するキット。
【請求項３４】
少なくとも、
−  前記核酸のポリメラーゼ連鎖反応を、少なくとも２種のプライマーと、ヌクレオチド又はその類似体と特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物のプールとの存在下で行ない（但し、前記化合物は少なくとも１ｇ/ｌの総合濃度であり且つポリメラーゼ連鎖反応を妨害することができないものである）、そして
−  そのようにして得られたＤＮＡ断片を分析及び／又は定量する
ことのみからなる工程からなる突然変異について核酸をアッセイする方法。
【請求項３５】
前記化合物が請求項７〜１６のいずれか１項に記載のものである請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸内の突然変異、特に二本鎖の形の核酸内の点突然変異をアッセイする改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム科学の最近の発達は、人の健康及びバイオテクノロジーの向上に少なからぬ期待を抱かせている。
【０００３】
医薬では、例えば、遺伝病及び癌の理解及び診断、又は感染性微生物の研究は、ＤＮＡ及び核酸の分析にますます依存している。
【０００４】
バイオテクノロジーもまた、分子遺伝学的及び核酸高速処理分析にますます依存している。特に、個体間の遺伝子の違いのマッピングは、法医学検査、医学応用、バイオテクノロジー及び食品産業にますます重要性を増している。
【０００５】
例えば、異常タンパク質をもたらす突然変異の検出は、病気の遺伝原因を特定するのに不可欠であり得る。多数の遺伝性病的状態は、発症前にＤＮＡの構造分析法を使用して診断し得る。癌の研究において、例えば、乳癌の著しい増加を招くと認められているＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子の突然変異の研究が、現在、大規模に行なわれている。遺伝子ＡＰＣもまた、結腸直腸癌の有力な素因となることが知られている。遺伝学的スクリーニング(genetic screening)もまた、多数の遺伝性疾患について、幼時に又は場合によっては胎内で実施することができる、現在、７００種類の遺伝病が特定されており、その中には、サラセミア（すなわち地中海貧血症）又はミオパチー（すなわち筋障害）がある。
【０００６】
特に癌で生じるような後天性遺伝性疾患の特定及び詳細な分析もまた、腫瘍の“遺伝子地図作成”法を用いてより効率的で且つ個別的な処理について期待を抱かせている。突然変異及び遺伝的変異性の大規模な遺伝学的スクリーニング（“ゲノタイピング”とも呼ばれる）もまた、薬理ゲノム学的アプローチにおいて治療のための新しい標的を見出すために、病気と遺伝子の間の相関関係を調べるのに最も重要である。
【０００７】
遺伝学的スクリーニングはまた、病原体の検出、例えば医薬、食品産業、獣医学又はバイオテロリズム用途における特定の病原種の特定に使用することもできる。例えば、食品産業では、出発原料又は食品中の遺伝子組換え生物“ＧＭＯ”の検出は、高まりつつある関心事である。
【０００８】
従って、ＤＮＡ断片における突然変異を野生型と比較して正確で、再現可能で且つ信頼性のある方法で検出する方法の必要性が存在する。
【０００９】
ＤＮＡ分子は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットの線状重合体である。それぞれのヌクレオチドは、共通の環状糖分子（これは隣接するヌクレオチドの糖にリン酸基によって結合される）と、塩基と呼ばれる種々の環状置換基の一つとからなる。リン酸エステルと塩基の組み合わせは、ヌクレオシドと呼ばれる。天然起源由来のＤＮＡ中に一般に認められる４種類の塩基は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミジン（以下、それぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴという）である。個体のＤＮＡ中のこれらの塩基の線状配列は、その“ゲノム”である。ゲノムは、コード化領域（これは、タンパク質を合成するための情報を有する）、遺伝子発現を調節するための領域、及びいわゆる“非コード化”領域を含み、その役割は完全には理解されていない。
【００１０】
二本鎖ＤＮＡ、すなわち全ての細胞性生物の染色体においてＤＮＡによって採用される形において、２つのＤＮＡ鎖は、内側に配向した塩基を有する精密ならせん構造で絡み合い、相対する鎖由来の塩基同士の間で相互作用を可能にする。２つの鎖は、主として、特定の塩基対の構造の相補性によって塩基同士の間で認められる水素結合によって精密なアラインメントで一緒に保持される。この構造相補性は、特に水素結合の一定の数と配向をもたらす塩基それぞれの置換基の化学的性質と配置によって決定される。従って、二本鎖ＤＮＡでは、標準的に、一つの鎖のそれぞれのＡは、相対する鎖由来のＴと、２つの水素結合を伴って生じる誘引相互作用を有し、またそれぞれのＧは、相対するＣと、３個の水素結合を伴って生じる誘引相互作用を有する。原則として、これらは、複製が配偶子（減数分裂）に関する場合には、ＤＮＡ分子が複製され、厳密なコピーが細胞の再生（有糸分裂）中に細胞の子孫、又は個体の子孫に伝えられることを確実にする。
【００１１】
場合によっては、誤った塩基対合が複製中に生じ、これは新しい鎖のさらなる複製の後に、親ＤＮＡ分子の配列と遺伝性の１個の塩基の違いを含有する配列を有する二本鎖ＤＮＡ子孫をもたらす。このような遺伝性の変化は、遺伝子突然変異と呼ばれるか、又はさらに詳しくはこの場合には“点突然変異”と呼ばれる。遺伝子突然変異の地図作成は、実質的に同じ（すなわち、相同性の）塩基配列を含有するＤＮＡ分子同士の間の配列の違いの検出と、比較される分子中の配列の幾つかのサブセット内のこれらの配列の相違の物理的局在の両方を含む。ＤＮＡ配列の変化は、非コード化領域に影響を及ぼし得る。特に、短い縦列反復（ＳＴＲ）又は一塩基多型（ＳＮＰ）などの高多様性（highly variable）が、非コード化領域に存在し、ゲノタイピングに極めて有用である。
【００１２】
点突然変異、特に置換を検出することは、特に興味深い。その理由は、これらが極めて局在化されており、しかも多くの発生においてこれらの位置は演繹的に(a priori)予め知ることができないからである。実際に、病気と関係がある多くの突然変異について、突然変異の正確な位置は演繹的に知られておらず、遺伝子（一般に数千又は何万もの塩基に相当する）の全コード化配列は完全に選別されねばならない。
【００１３】
核酸分析のための現在の最も重要な方法は、キャピラリー電気泳動及びハイブリダイゼーションアレイ（“ＤＮＡ又はＲＮＡチップ”とも呼ばれる）である。この二つの方法は、どちらかといえば補完的である：ハイブリダイゼーション法は、小さな配列の超高速処理評価及び半定量的評価にうまく適合しており、これに対して電気泳動は、大きな分子又は断片の高分解能(high resolution)、再現性及び分析について相変わらず問題にされないままである。“ラボラトリーオンチップ”又は“マイクロ流体システム”と呼ばれる別のシステムもまた開発中であり、しかも核酸の分析においてより簡単で、より経費効率が高く且つより高速な処理分析について見込みがある。
【００１４】
突然変異の位置が知られている場合には、主として一塩基プライマー伸長法、ハイブリダイゼーションアレイ法又は定量ＰＣＲ法を使用する。
【００１５】
一塩基プライマー伸長法では、配列決定反応は、プライマーからの伸長を所定の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）が前記プライマーの後をたどる場合にのみ開始することができる条件で行なわれる。同じ反応をそれぞれの塩基について行い、伸長の検出を慣用の配列決定電気泳動で行なう。
【００１６】
ハイブリダイゼーションアレイ法では、点突然変異を含み且つ全ての予測される突然変異を有する種々の“プローブ”ＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを、“チップ”の表面にアレイ状に配置し、試験するために標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の存在下に入れる。適当なハイブリダイゼーション条件で、標的は厳密に相補的な配列を有するプローブとのみハイブリダイズし、従って標的の配列を特定することが期待される。このアプローチに関する主な問題は、変異プローブと正常な（野生型）プローブとの間のハイブリダイゼーションエネルギー差が特に置換の場合にはどちらかといえば低いものであり得ることである。従って、“イエス又はノー”の回答を得るための最適条件をみつけることが難しく、シグナルの差はどちらかといえばわずかであり得る。この問題は、ハイブリダイゼーションアレイの比較的低い再現性と組み合わさって、著しい誤り率をもたらす。また、ハイブリダイゼーション自由エネルギーは、どちらかといえば配列に強く左右される。それは、例えば、高ＧＣ含有率を有する配列についてより高い。従って、高ＧＣ含有率及びミスマッチを有する二本鎖は、同じ長さをもつが低いＧＣ含有率を有する完全な二本鎖よりも実際に高い親和性を有し得る。従って、不可能ではないにしても、単一のアレイで多数の異なる配列を同時に試験するための独特な一組のハイブリダイゼーション条件（温度及び緩衝液）を得ることは極めて困難である。.
ハイブリダイゼーションアレイにおいてマッチ対(matched pair)とミスマッチ対の間の選択性を高めるために種々のアプローチが提案されている。例えば、Maskos et al., Nucleic Acids  Research, 21, 4663-4669, 1993では、緩衝液の厳密な選択に努力が払われているが、限られた効果しか上げていない。Chiariら（HPCE 2003, San Diego, CA, Jan 17-22, 2003）には、ＤＮＡプローブの代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）使用するハイブリダイゼーション法が提案されている。ＰＮＡは、核酸同属体であり、ペプチド（リン酸の代わり）骨格を与える。塩基対当たりのハイブリダイゼーションエネルギーは、ＰＮＡ／ＤＮＡ対では均等のＤＮＡ／ＤＮＡ対よりも高い。その理由は、ＰＮＡ主鎖は中性であり、そのために電気的反発が抑制されるからである。また、ＰＮＡの使用は、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし、従って点突然変異の場合において、マッチ対とミスマッチ対の間の会合エネルギーの差を大きくすると思われる。しかし、ＰＮＡ類は、極めて高価であり、高密度アレイを構築するための主要な方法はＰＮＡ化学に置き換えることができない。Mogensらの国際公開第WO00/56916号パンフレットには、別のクラスのＤＮＡ類似体、すなわちロックド(locked)核酸（ＬＮＡ）の使用が記載されている。ＬＮＡ類は、主鎖が二環式である核酸である。ＬＮＡ類は、天然ＤＮＡよりも相補的ＤＮＡに対してより強い親和性を有し、しかもまたミスマッチに対してより高い選択制を示す。しかし、コスト及び高密度アレイを調製する困難性などのＰＮＡによってもたらされる問題も、ＬＮＡについて存在する。
【００１７】
事実、プライマー伸長法又はハイブリダイゼーション法は、ゲノム上の位置が知られていない突然変異の研究に十分に適合していないと思われる。
【００１８】
従って、従来の重要な努力は、キャピラリー電気泳動により点突然変異を検出するための効率的で、迅速で且つ安価な方法を見出すことを目的としてなされてきている（概説については、例えばEighetti, P.G., Gelfi, C., in “Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis, Heller, C, Ed., Chromatographia CE series, Vol 1 Vieweg press, 1997, 255-271を参照)。現在利用し得る主要な方法は、“直接配列決定法”及び“一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）”と呼ばれる。
【００１９】
アプローチ“直接配列決定法”では、遺伝子全体を、それぞれの患者について完全に配列決定する、有力であるが高価な方法である。また、ヘテロ接合体が存在するために、変異した患者の配列は≪純粋≫ではなく、データの解釈は慣用の配列決定についてのように簡単ではない。最も重要なことであるが、遺伝子全体及びフランキング領域は選別すべき患者又は個体それぞれについて完全に配列決定されねばならないことから、この方法は時間が長く、しかも費用がかかるかかる。
【００２０】
簡単であるという理由で広く使用されているアプローチ“一本鎖高次構造多型”（ＳＳＣＰ）では、二本鎖ＤＮＡを変性させ、次いでそれぞれの一本鎖がそれ自体で崩壊するような条件で迅速に再生させる。次いで、未変性鎖と変異鎖の間の移動度の差を、電気泳動で分析する。あいにく、移動度の差は、ＤＮＡの特定の配列、及び突然変異の位置に応じてロット(lot)を変化することができる。例えば、ＤＮＡの折りたたみを異なる経路に誘導する突然変異は、移動度において大きな差をもたらすであろうし、これに対して突然変異、例えばループのチップでの突然変異は、本質的に変化をもたらさないであろう。この感度の一貫性のなさは、この方法が比較的多数の偽陰性を生じることから、この方法を診断に極めて魅力のないものにする。国際公開第WO00/20853号パンフレットには、選択された条件を用いて幾つかのＳＳＣＰ分離をそれぞれの試料について行なう改良されたＳＳＣＰ法が提案されている。感度は著しく改善されるが、分析の時間及び複雑さが相当に増大する。
【００２１】
最後に、一連のその他の突然変異検出方法はヘテロ二本鎖の形成又は解離に基づいていることが認められる。
【００２２】
ホモ二本鎖と対照的にヘテロ二本鎖は、一方の鎖の塩基配列が他方の鎖の塩基配列に完全に相補的でない二本鎖ＤＮＡである。すなわち、これは“ミスマッチ”とも呼ばれる相補的でない塩基対を少なくとも一つ含有する。ヘテロ二本鎖は、ＤＮＡ複製中に、エラーがＤＮＡポリメラーゼ酵素によってなされ且つ非相補的塩基が複製されつつあるポリヌクレオチド鎖に付加される場合に形成され得る。また、ヘテロ二本鎖は、ＤＮＡ損傷の修復中にも形成され得る。ヘテロ二本鎖のさらなる複製は、理想的には、ヘテロ接合体であるホモ二本鎖を生成するであろう、すなわちこれらのホモ二本鎖は、元の親ＤＮＡ鎖に比べて改変された配列を有するであろう。
【００２３】
遺伝病又は病気の遺伝素因の大部分は、病気に冒された人が関係のある遺伝子について一つの正常コピーと一つの変異コピーとを正確に有するようなものである。前記遺伝子の配置を含むＤＮＡ断片はＰＣＲによって増幅されると、両方の遺伝子が増幅される。増幅されたＤＮＡが変性され、次いで徐々に再生される場合には、４種類の二本鎖ＤＮＡが得られる、すなわち：２つの最初の対立遺伝子（正常な対立遺伝子と変異した対立遺伝子）のＤＮＡに対応する２つのホモ二本鎖と、一方の対立遺伝子由来の一つの鎖と他方の対立遺伝子由来の（ほとんどの）相補的鎖を混合する２つのヘテロ二本鎖が得られる。これらのヘテロ二本鎖は、突然変異の位置で、ミスマッチ“バブル(bubbble)”を含有する。これらのミスマッチ“バブル”は、一般に次の方法の一つで調べられる：
“変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）”と呼ばれる方法では、二本鎖ＤＮＡは変性条件の濃度勾配を含むゲル中で分離されるので、これらのＤＮＡは電気泳動中に融解するであろう。二本鎖ＤＮＡと融解ＤＮＡの移動度は異なることから、この方法は融解の正確な位置に極めて敏感である。ヘテロ二本鎖は、対応するホモ二本鎖よりも迅速に融解する傾向があり、このように識別することができる。ゲル又はキャピラリーフォーマットにおけるこの方法の種々の変形が提案されており、あるものは高感度を達成している。しかし、種々の塩基対含有率を有する二本鎖は、種々の温度で融解するので、それぞれの断片について濃度勾配範囲は正確に調整しなければならない。また、前記濃度勾配ゲルの調製はそれ自体極めて要求が厳しく且つ大きな労力を必要とするので、この方法を診断又は大規模スクリーニングについて使用することは実行不可能である。
【００２４】
酵素又は化学切断に基づいたその他の方法、例えば酵素cleavase、Ｔ４エンドヌクレアーゼ、又は四酸化オスミウムによる方法も提案されている。例えば、米国特許出願第1996/0714626号明細書に記載されている酵素切断の原理は、ミスマッチの位置で特異的に切断を得ること及び得られた断片のサイズを最後に分析することである。高感度が報告されているが、この方法は特別な化学工程を伴い且つＳＳＣＰに関しては、その反応は配列に依存する。米国特許出願第1994/0334612号明細書に記載されている関連方法は、特異タンパク質による突然変異の認識及び得られるＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを伴う。この方法もまた、高価な酵素を必要とし、そのプロトコールは極めて複雑である。
【００２５】
“変性条件の勾配でのクロマトグラフィー(chromatography in a gradient of denaturating condition)”（ＤＨＰＬＣ）と呼ばれる第三の方法は、ＤＧＧＥの原理と比較的に似た原理に従うが、変性条件の勾配は一時的なものであり、ＨＰＬＣ装置で自動化することができる。再生された（ホモ二本鎖及び、適切な場合にはヘテロ二本鎖）ＤＮＡはＨＰＬＣカラムに吸着され、ＤＮＡの変性（これはヘテロ二本鎖については若干早く生じる）はＤＮＡの放出とカラム出口での検出をもたらす（例えば、Wagner, T., Stoppa-Lyonnet, D., Fleischmann, E., Muhr, D., Pages, S., Sandberg, T., Caux, V., Moeslinger, R., Langbauer, G., Borg, A., Oefher, P., Genomics, 1999, 62, 369-376を参照)。しかし、ＤＨＰＬＣの全プロセスは、ＨＰＬＣ（これは一度に一つの試料だけを分析することができる）の連続性のために、大きな遺伝子を選別しなければならない場合には長い。
【００２６】
国際公開第WO03/031580号パンフレットには、ＤＨＰＬＣ法の改良が記載されている。この発明は、試験混合物中のヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子とホモ二本鎖ＤＮＡ分子とを分離するためのクラマトグラフ方法に関する。一つの具体的態様において、この方法は：
（ａ）試験混合物を逆相分離媒体に加え；（ｂ）工程（ａ）の媒体を、少なくとも一つの窒素含有移動相添加剤を含有する移動相を用いて溶出することを含む（但し、溶出は前記ヘテロ二本鎖を少なくとも部分的に変性させるのに有効な条件下で行ない且つ溶出はヘテロ二本鎖のホモ二本鎖からの分離又は少なくとも部分的な分離をもたらす）。溶出は、添加剤に予め選択された濃度及び予め選択された温度で行なうことが好ましい。好ましい窒素含有添加剤の例としては、ベタイン、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩及びコリンが挙げられる。この改良は、Ａ／Ｔ置換などの検出することが困難な点突然変異についてＤＨＰＬＣの感度を高めるが、分離の速度を向上させないし、分析すべきそれぞれの断片について変性勾配を適合させなければならないというつまらない要件を取り除かない。
【００２７】
“電気泳動へテロ二本鎖分析”（ＥＨＤＡ）と呼ばれる別の方法は、ヘテロ二本鎖対に現れるミスマッチに関連した≪変性バブル≫又は≪ループ≫によって誘導される移動度の差を、非変性条件中での電気泳動で直接測定する。試料を非変性条件での電気泳動で分離する場合には、ヘテロ二本鎖分子上の局部的“ミスマッチバブル”の存在が二本鎖の可撓性の幾何学における相違をもたらし、これはホモ二本鎖と比べて移動度の相違をもたらす。分析すべきＤＮＡが正常な二本鎖断片と突然変異断片を与える場合には（すなわち、ＤＮＡが抽出される生物が対応するＤＮＡ断片についてヘテロ接合体である場合には)、多数のピーク（２個〜４個）が電気泳動図に現れるであろう。ＥＨＤＡ法の能力は、ミスマッチバブルが存在するために、主として移動速度のわずかな相違を検出することができることに依存する。この方法は、簡単であり、迅速であるが、これまでその検出感度はＤＧＧＥ又はＤＨＰＬＣの感度よりも劣り、診断に適しているとは考えられなかった。
【００２８】
この方法に対する改良は、二本鎖核酸の融点を下げ且つ変性バブルのサイズを大きくすることが知られている尿素などの添加剤を使用することからなっている。しかし、このような添加剤は、実際には以下の実施例５で例証されるようにミスマッチの分解能(resolution)の減少をもたらす。
【００２９】
ＥＨＤＡに対する別の種類の改良は、ホモ二本鎖とヘテロ二本鎖の電気泳動分離のためにアクリルアミド主鎖とＰＤＭＡ側鎖とを有するブロック共重合体からなる液状分離媒体の使用を必要とする。ＰＤＭＡブロックは、どちらかといえば疎水性であり、前記重合体を壁及び主鎖に結合するのに使用され、親水性であり、“ブラシ”のように緩衝液中に伸び、しかもその他の巨大分子を寄せつけない(Barbier, フランス国特許出願第00/08526号明細書、これは参考することにより本明細書に含まれる)。これは、慣用のＥＨＤＡよりもよい解像度と、ＤＨＰＬＣに匹敵する突然変異に対する感度を可能にする。また、この方法は、キャピラリーアレイ電気泳動において実施することができ、従って高速処理をもたらすことができる。しかし、この改良にもかかわらず、全ての突然変異が検出できるとは限らず、さらなる改良が必要である。
【００３０】
最後、米国特許出願第2002/0055109号明細書には、一本鎖結合タンパク質を用いて少なくとも一つの内部一本鎖領域を含んでいるヘテロ二本鎖の単離方法が記載されている。二本鎖ＤＮＡに比べて一本鎖ＤＮＡに対して選択的親和性を有する一本鎖結合タンパク質は、大腸菌ＳＳＢ、ファージＴ４の遺伝子３２の産物、アデノウイルスＤＢＰ及び仔ウシ胸腺ＵＰ１から選択される。しかし、このような方法は、極めて局部的な突然変異、例えば一塩基ミスマッチに対する突然変異、あるいはただ一つのヌクレオチド又は極めて少数のヌクレオチドの挿入又は欠失を検出するのに適していない。
【００３１】
従って、最小限の作業者技能で迅速に、正確に及び容易に実施し得る方法において生じる検出工程をできるだけ少なくするゲノムＤＮＡなどの核酸中の少なくとも一つの一塩基の相違を直接に検出するための簡単で且つ極めて特異的な方法に対する要求が未だに存在している。
【発明の開示】
【００３２】
まさに、本発明の目的は、核酸中の突然変異、特に未知の突然変異の検出を向上させる新規な方法を提供することにある。
【００３３】
その要旨の一つにおいて、本発明は、二本鎖の形で対合した核酸の鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法であって、少なくとも
−  液状媒体中で、少なくとも一つのミスマッチを含むと疑われる前記二本鎖を、前記ミスマッチと特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１個の化合物と接触させ（但し、前記化合物は、前記媒体に少なくとも１ｇ/ｌの濃度で存在させる）、そして
−  前記ミスマッチを分析方法でアッセイする
ことのみからなる工程からなる二本鎖の形で対合した核酸の鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法に関する。
【００３４】
二本鎖の形で対合した核酸の鎖は、全部又は一部が相補的である２つのＤＮＡ鎖である。
【００３５】
一つの具体的態様によれば、本発明の方法は、分析方法として、電気泳動分析の使用を必要とする。
【００３６】
別の具体的態様によれば、本発明の方法は、分析方法として、例えばＤＮＡチップなどのハイブリダイゼーションアレイの使用を必要とする。
【００３７】
本発明は、別の要旨によれば、少なくとも一つのヘテロ二本鎖を含むと疑われる核酸試料について電気泳動へテロ二本鎖分析“ＥＨＤＡ”を行う方法であって、少なくとも
−  液状媒体中で、少なくとも一つのヘテロ二本鎖を含むと疑われる前記核酸試料を、前記ヘテロ二本鎖の少なくとも一つのミスマッチと特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と接触させ（但し、前記化合物は、前記媒体中の少なくとも１ｇ/ｌの濃度で存在させる）、
−  前記ヘテロ二本鎖の存在をその電気泳動移動度によりアッセイする
ことのみからなる工程からなる少なくとも一つのヘテロ二本鎖を含むと疑われる核酸試料について電気泳動ヘテロ二本鎖分析“ＥＨＤＡ”を行う方法に関する。
【００３８】
核酸試料が最初に種々の対立遺伝子に対応する相同鎖を含有する場合には、本発明の方法は、核酸試料を変性させ、それをヘテロ二本鎖及びホモ二本鎖の両方を得るのに都合のよい条件で再生させる予備工程を含んでなる。
【００３９】
別の要旨によれば、本発明は、液状媒体中で核酸の一本鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法であって、少なくとも
ａ）少なくとも一つの突然変異を含むと疑われる前記核酸を、固体支持体にグラフトされた核酸プローブと接触させ、
ｂ）前記の核酸の鎖の少なくとも一部を前記グラフト核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、
ｃ）ハイブリダイズしなかった鎖を洗浄し、そして
ｄ）前記突然変異を分析方法でアッセイする
〔但し、工程ａ）及び／又はｃ）は、前記突然変異と特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物の存在下で行ない、前記化合物は少なくとも１ｇ/ｌの濃度で存在させる〕
ことのみからなる工程からなる液状媒体中で核酸の一本鎖について少なくとも一つの突然変異の有無をアッセイする方法に関する。
【００４０】
本発明の方法は、特異的点突然変異と関係があるか又は関係があると推測される病気の素因の診断あるいはこのような病気の診断又は予後診断に特に有用である。
【００４１】
従って、本発明は、さらに遺伝病又は癌の素因の診断あるいは前記の病気又は癌の診断又は予後診断における前記方法の使用に関する。
【００４２】
本発明はまた、前記の方法の前記の病気の治療における使用に関する。
【００４３】
特に、関連する病気としては、特異的点突然変異と関係があるか又は関係があると推測される多数の癌、例えばメラノーマ、眼球メラノーマ、白血病、星状細胞腫、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、筋肉腫、胆管癌、扁平上皮癌、並びに膵臓、乳房、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸及び直腸の癌を挙げ得る。
【００４４】
別の要旨によれば、本発明は、少なくとも、
−  前記核酸のポリメラーゼ連鎖反応を、少なくとも２種のプライマーと、ヌクレオチド又はその類似体と特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物のプールとの存在下で行ない（但し、前記化合物は少なくとも１ｇ/ｌの総合濃度であり且つポリメラーゼ連鎖反応を妨害することができないものである）、そして
−  そのようにして得られたＤＮＡ断片を分析及び／又は定量する
ことのみからなる工程からなる突然変異について核酸をアッセイする方法に関する。
【００４５】
別の要旨によれば、本発明は、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、“分子標識”と呼ばれるＤＮＡプローブとして作用する一対の分子又は基とを含有し、前記化合物が本発明の化合物である組成物を提供する。
【００４６】
好ましい実施態様において、分子標識対に含有される分子又は基の少なくとも一つは、核酸又は核酸類似体と会合する。
【００４７】
別の要旨によれば、本発明はまた、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、少なくとも１種の液状分離媒体とを含有する組成物を提供する。
【００４８】
特に、本発明はまた、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、少なくとも１種の重合体化合物（前記重合体は本発明に従って定義されるものである）とを含有する組成物を提供する。
【００４９】
さらに詳しくは、前記の液状分離媒体は、少なくとも
−  篩い分け（sieving）重合体、
−  親水性重合体、及び
−  界面活性重合体
の中から選択される化合物を含有していてもよい。
【００５０】
特に、本発明はまた、点突然変異が病気又は病気の高められた素因と関係があるか又は関係があると推定される遺伝子に関連した核酸配列を有する核酸又はその類似体のスクリーニングに有用なキットであって、少なくとも前記の組成物、すなわち本発明に従って定義されるような少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、重合体とを含有する組成物を含有するキットに関する。
【００５１】
特に、前記キットは、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、本発明に従って定義されるような少なくとも１種の液状分離媒体とを含有し得る。
【００５２】
特に、本発明のキットは、突然変異、特に少なくとも点突然変異についてＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２のようなヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ）のスクリーニングに特に有用である。
【００５３】
別の要旨によれば、本発明はまた、点突然変異が病気又は病気の高められた素因と関係があるか又は関係があると推定される遺伝子に関連した核酸配列を有する少なくとも一つのＤＮＡ断片と、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物とを含有する組成物を提供する。
【００５４】
特に、このような組成物は、ヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ）に関連した核酸配列を有する少なくとも一つのＤＮＡ断片と、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物とを含有し得る。
【００５５】
特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物
本発明によれば、特にミスマッチに含まれるヌクレオチドと“特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物”としては、“塩基”Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ及びＣの少なくとも一つと誘引相互作用を生じさせるのに適合する配向、極性及び間隔において水素結合に適した基を少なくとも２個与える化合物が挙げられる。
【００５６】
本発明によれば、前記ミスマッチと特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物は、特に塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕを用いて形成されるヌクレオチドと特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物である。
【００５７】
すなわち、本発明に従って考慮される化合物は、少なくとも一つの特定の塩基に対して特異的に指向する相互作用を示すことができる。例えば、幾つかの化合物は、アデニンに対して特異的な塩基対合相互作用を示し得、その他の化合物はシトシン対して特異的な塩基対合相互作用を示し得る。
【００５８】
本発明の化合物は、単独で使用してもよいし又はヘテロ二本鎖のミスマッチに関与する核酸の塩基と特異的な塩基対合相互作用をすることができる別の１個又は数個の化合物との混合物で使用してもよい。
【００５９】
好ましい具体的態様において、前記化合物は、例えば一本鎖鋳型上でポリメラーゼの作用によって行なわれるような核酸の酵素重合に組み込まれることができないように選択される。従って、前記化合物は、ヌクレオチドの重合反応を妨害することができない及び／又は新たに重合されるＤＮＡ鎖に組み込まれることができない。この方法によって、前記化合物は、突然変異の検出を高めることができるばかりではなく、重合反応を著しく妨害することができる。
【００６０】
本発明に従って考慮される化合物の作用のメカニズムは、公知の添加剤のメカニズムと比べて極めて予想外である
この有益な効果の解釈は、変性バブルと塩基対合相互作用を行なうことによって、本発明の化合物はミスマッチバブルを安定化させ、このようにしてヘテロ二本鎖とホモ二本鎖の間の幾何学の相違を大きくするということである。この相互作用は、分析方法においてホモ二本鎖に比べてヘテロ二本鎖の挙動の相違をもたらすのに十分に効果的である。
【００６１】
分析方法が電気泳動法である場合には、ヘテロ二本鎖の移動度は、ホモ二本鎖に比べて一部変更され、このようにして一方の二本鎖を他方の二本鎖から識別することを可能にする。両方の化合物は同じ保持時間又は親和性を持たないであろう。
【００６２】
分析方法がハイブリダイゼーション法である場合には、その誘起効果はホモ二本鎖に比べるとヘテロ二本鎖の安定性の低下である。この安定性の差は、少数のミスマッチ、例えば置換により生じるミスマッチ（これはハイブリダイゼーションアレイにおいて検出することが最も困難な突然変異である）に特に敏感である。この特定の具体的態様によれば、本発明の化合物は、ハイブリダイゼーション中に、さらに詳しくはハイブリダイゼーション媒体中に及び／又は前記の洗浄工程中に、特にハイブリダイズしなかった鎖を除去するために使用される洗浄溶液中に存在させ得る。
【００６３】
核酸と非特異的に相互作用する化合物、例えば尿素又はその他の変性剤又はカオトロピック溶媒もまた、変性バブルの可能性を大きくするが、このようにミスマッチに対応しない二重らせんに沿って種々の場所でも変性バブルの可能性を大きくする可能性が極めて高く、これは電気泳動分析の場合にピークを幅広くし且つ生じる分離を部分的に変える。
【００６４】
本発明の場合には、ミスマッチ分離能(resolution)の増大は、対照的に、ヌクレオチドと特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物をについて特に顕著である。極めて意外なことであるが、主として極めて限定された数の塩基対合相互作用を示す化合物（化合物当たり一塩基対合相互作用が十分である）を用いるこの効果は、興味があり、これに対して一塩基プライマー伸長法のような従来技術における突然変異の検出方法は、分子当たり多数の塩基対合相互作用、典型的には少なくとも１２個の塩基対合相互作用を得ることができる“プライマー”を使用した。
【００６５】
本発明の別の予測されない特徴は、試験すべき核酸と特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物は、従来技術において塩基対合化合物に一般的に使用されるようにより高い濃度で最もよい性能を示して使用されることである。
【００６６】
特に、前記化合物は、突然変異をアッセイするために前記化合物（１種又は複数）を核酸と接触させるのに使用される液状媒体１リットル当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇ、最も好ましくは少なくとも２５ｇの合算濃度で使用される。
【００６７】
“合算濃度”とは、例えば数種の化合物を使用する場合の前記化合物の合計濃度、すなわち合算濃度はそれぞれの化合物の濃度の合計であると解釈される。
【００６８】
本発明の化合物（１種又は複数）の濃度は、分析すべき核酸含有する媒体の全容量に対して表される。
【００６９】
本発明の具体的態様によれば、前記化合物は、さらに少なくとも一つの置換基を有していてもよい。
【００７０】
勿論、前記の置換基は、相互作用を生じる塩基に関与するアミノ基及びＯＨ基に対して有意な影響を及ぼさないか又は最小限の影響を及ぼすために選択されることが好ましい。
【００７１】
このような置換基としては、前記化合物において、特に次の変化：
−  溶解度の増大、
−  電荷の変化、及び／又は
−  溶媒との摩擦の変化
の少なくとも一つを誘導し得る。
【００７２】
本発明を実施するために集め得る置換基の例として、例えばポリオキシエチレンオキシドのような重合体状置換基、例えばポリエチレングリコールのようなオリゴマー状置換基、例えば、デキストラン、水溶性セルロース化合物、アルコール鎖、天然又は合成ペプチド又はポリペプチドのような親水性置換基、例えば、四級アンモニウム塩及び硫酸塩のような帯電置換基、及び／又は電荷の中から選択される置換基を挙げ得る。
【００７３】
本発明の一つの具体的態様において、前記化合物は抗体とは異なる。
【００７４】
別の具体的態様において、前記化合物は酵素とは異なる。
【００７５】
別の具体的態様において、前記化合物はタンパク質とは異なる。
【００７６】
好ましい具体的態様によれば、このような化合物は、５個未満のヌクレオチド、好ましくは３個未満のヌクレオチド、さらに好ましくは２個未満のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、塩基又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【００７７】
このような化合物の非限定的な例は：
−  塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）及びチミン（Ｔ）、
−  非置換塩基において塩基対合相互作用を招く種々の置換基、特にアミノ基及びＯＨ基に影響を及ぼさない置換基を有するアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミン、
−  塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕを用いて形成されるヌクレオシド、
−  塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕを用いて形成されるヌクレオチド、
−  オリゴヌクレオチド類似体及び種々に置換されたオリゴヌクレオチド、並びに
−  これらの混合物
である。
【００７８】
多数の好ましい用途において、前記化合物は、１個の一塩基対合単位を含有する。この場合、“塩基対合単位”とは、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ又はＣの一つと一塩基対合相互作用をすることができる分子状基を意味する。
【００７９】
また、“ヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”又は“ヌクレオシド”という用語は、本明細書において、プリン又はピリミジン部分、リボース又はデオキシリボース糖部分、及びリン酸エステル基、又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内部のヌクレオチドの場合にはリン酸ジエステル結合からなる化合物を意味する個々の化学種又は種々の化学種を示すのに使用される。
【００８０】
また、“ヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”及び“ヌクレオシド”という用語は、本明細書において、少なくとも一つの修飾、例えば(a)別の結合基、(b)プリンの類似体、（ｃ）ピリミジの類似体、又は（ｄ）糖の類似体を含有する“修飾された化学種”を包含するのに使用される。
【００８１】
また、“ヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”及び“ヌクレオシド”という用語は、本明細書において、溶解度を増大させるため、電荷を変化させるため、又は溶媒中での摩擦を一部変更させるために選択される少なくとも一つの置換基を含有する“置換された化学種”を包含するのに使用される。例えば、これらは、重合体状又はオリゴマー状の親水性置換基及び／又は電荷を有するヌクレオチド又はヌクレオシドであってもよい。
【００８２】
具体的態様によれば、前記化合物は、ヌクレオシド アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、チミジン及びこれらの混合物の中から選択されるヌクレオシドである。
【００８３】
好ましくは、前記化合物は、少なくとも１ｇ/ｌ、好ましくは少なくとも１０ｇ/ｌ、最も好ましくは少なくとも２５ｇ/ｌの濃度のシチジンである。
【００８４】
好ましくは、前記化合物は、少なくとも１ｇ/ｌ、好ましくは少なくとも１０ｇ/ｌ、最も好ましくは少なくとも２５ｇ/ｌの濃度の チミジンである。
【００８５】
さらに好ましくは、前記化合物は、それぞれ少なくとも１ｇ/ｌ、好ましくは少なくとも１０ｇ/ｌ、最も好ましくは少なくとも２５ｇ/ｌの濃度のシチジンとチミジンの混合物である。
【００８６】
しかし、これらは入手可能性の理由から都合のよい単なる例であるが、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体と特異的な塩基対合相互作用をすることができるその他の多数の化合物が当業者によって組み立てられることができ、本発明の枠内に入ることが認められるべきである。
【００８７】
二本鎖を、核酸と特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも２種類の化合物と接触させる具体的態様によれば、これらの化合物は試験すべき核酸又は核酸類似体との塩基対合相互作用に相変わらず十分に利用し得るように塩基対合相互作用を相互に行なわないことが都合がよい。
【００８８】
例えば、本発明の方法は、シチジンとチミジン、又はシチジンとアデノシン、又はグアノシンとチミジン、あるいはグアノシンとアデノシンばかりではなく、例えばチミジンとアデノシン、又はシチジンとグアノシンも都合よく使用する。
【００８９】
核酸又は核酸同属体の鎖
核酸又は核酸同属体の鎖とは、天然の一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイゼーションすることができる一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、あるいは核酸の合成又は天然類似体を意味する。
【００９０】
一つの具体的態様によれば、本発明の方法は、（１）生物学的試料から単離されたゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡの分子と（２）野生型ＤＮＡに相補的な核酸プローブの分子との間にミスマッチが存在するか否かを、分子（１）と分子（２）が相互にハイブリダイズして二本鎖を形成する場合に調べるのに使用し得る。
【００９１】
例えば、二本鎖は、ヒト生物学的試料から単離されたＢＲＣＡ１遺伝子ゲノムＤＮＡ又はＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡと、ヒト野生型ＢＲＣＡ１遺伝子ＤＮＡに相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションに由来し得る。
【００９２】
勿論、本発明の領域内で、前記の相補的鎖は、対合又は部分対合した二重らせんのような組成で存在し得る。
【００９３】
特に、非限定的例として、本発明の文脈において、“核酸又は核酸同属体の相同性鎖”は、例えばＥＨＤＡにおいて遭遇するようなヘテロ二本鎖対を示し得るが、固体支持体に結合され、この固体支持体に接触させる溶液に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡ鎖と少なくとも部分的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドも示し得る。後者の場合には、本発明をハイブリダイゼーションアレイに適用するのに特に適している。
【００９４】
二本鎖の形で対合しているか又はしていない核酸の鎖は、一般に核酸試料に由来する。
【００９５】
好ましくは、前記の核酸試料は（＋）鎖と（−）鎖の混合物を含有する。
【００９６】
具体的態様において、本発明の方法に従って１回の試験で分析すべき試料は、種々の長さの核酸断片を含有していてもよい。好ましい具体的態様において、それぞれの型の断片の長さは、その他の断片の長さと、少なくとも１０個の塩基、好ましくは少なくとも２０個の塩基、典型的には５０個の塩基だけ異なる。
【００９７】
最初の核酸試料が一本鎖核酸分子と二本鎖核酸分子との混合物を含有する場合には、特許請求した方法は、一本鎖核酸分子を除去する予備及び追加の工程を含んでいてもよい。
【００９８】
最初の核酸試料が主としてＲＮＡを含有する場合には、二本鎖cＤＮＡは、最初に、当業者に公知の方法を使用して合成される。次いで、単一の遺伝子又は限定された一組の遺伝子から誘導される関心事のcＤＮＡは、前記の二本鎖cＤＮＡ試料から選択的に増幅される。好ましくは、増幅の方法は、標的とされたポリヌクレオチド試料を得るのに使用される。直線又は対数的増幅方法は、例えばリガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）及び 核酸配列に基礎を置いた増幅法（ＮＡＳＢＡ）などの方法を使用し得る。
【００９９】
同様に、最初の核酸試料が主としてゲノムＤＮＡを含有する場合には、標的とするＤＮＡ試料はＰＣＲで得ることが好ましい。
【０１００】
本発明は、特定の限定なしに核酸を含有する生物学的試料全てを包含する。さらに詳しくは、本発明の生物学的試料は、細胞、組織、器官、骨髄穿刺液のような固定されているか又は固定されていない外科又は生検試料、あるいは生物学的液体、例えば体液、例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、並びに呼吸器官、腸管及び生尿殖器路の種々の外部分泌物、涙、唾液、乳、白血球細胞、並びに細胞培養上清が起源である。前記試料の起源は、動物（好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト)、植物、ウイルス、細菌、原生動物又は真菌類であり得る。前記試料は、真核細胞生物、原核生物、又は無細胞であってもよい。生物学的試料に含まれる細胞は、特に組織、器官、生物学的液体又は生検に由来する場合には、利用できる細胞の個数を増加させることを目的として培養することができる。前記試料は、単一型細胞又は混合細胞型由来の細胞を含有し得る。細胞、組織及び検体は、正常な個人あるいは病気又は疾患を病む患者に由来するものであってもよい。病気又は疾患は、例えば、癌、神経変性疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患、免疫疾患、体重障害例えば肥満症などであり得る。個々の細胞、細胞型、病理学的細胞、発生又は病気の進行の個々の状態の細胞が、本発明に包含される。
【０１０１】
本発明の範囲内で、少数の塩基対、例えば１個の塩基置換、１個の塩基挿入又は欠失に影響を及ぼす１つ又は幾つかの突然変異、あるいはさらに一般的には前記のＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ類似体の長さのより小さい部分のみに影響を及ぼす置換、挿入又は欠失を除いて相補的配列を有する２つのＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ類似体を、“部分的に相補的”と呼ぶ。
【０１０２】
突然変異
本発明の方法は、点突然変異をアッセイするのに特に都合がよい。
【０１０３】
点突然変異の結果は、ＤＮＡによってコード化される遺伝情報に関連して配列変化の位置及び効果に依存して無視し得るものから致死にまで及び得、それは病気又は病気の素因の原因であり得る場合が多い。塩基Ａ及びＧはプリンであり、これに対してＴ及びＣはピリミジンである。ＤＮＡにおける正常な塩基対合（ＡとＴ、ＧとＣ）は１個のプリンと１個のピリミジンを必要とするのに対し、大部分の共通一塩基突然変異は、一方のプリン又はピリミジンの他方のプリン又はピリミジンによる置換（例えば、ＡのＧによる置換、又はＴのＣによる置換）、すなわち“トランジッション”と呼ばれる突然変異の一つの型を伴う。プリンがピリミジンに置換されるか、又はその逆である突然変異は、それほど頻繁に起こらず、“トランスバージョン”と呼ばれる。また、複製プロセスの幾つかの段階でＤＮＡ二本鎖の鎖で生じる１個の塩基の付加又は欠失からなる点突然変異にも遭遇し得る。このような突然変異は、１個の塩基の“挿入”又は“欠失”とそれぞれ呼ばれ、遺伝暗号のタンパク質への翻訳に対する影響により“フレームシフト”突然変異としても知られている。また、多数の塩基対に影響を及ぼすより大きな突然変異も生じ、これは遺伝医学において重要であり得る。特に、幾つかの突然変異は、可変サイズの挿入又は欠失を招く反復ＤＮＡ領域での複製機構の“ずれ”により生じ得る。
【０１０４】
本発明によれば、検出可能な点突然変異としては、不適正な塩基対合が生じる欠失突然変異、挿入突然変異、及び置換突然変異が挙げられる。
【０１０５】
二本重鎖の形で対合した核酸の２つの相同鎖の間の相違が、１個のヌクレオチドの相違あるいは小さな挿入又は欠失にある場合には、ミスマッチ二本鎖が形成される。本発明の方法は、ミスマッチ二本鎖を検出するのに特に効果的である。
【０１０６】
さらに詳しくは、本発明の方法は、点突然変異が病気又は病気の高められた素因と関係があるか又は関係があると推定されている遺伝子に関連した核酸配列を有するＤＮＡ断片のスクリーニングに特に有用である。前記の病気は、種々の種類の癌、遺伝病又は病気の高められた素因、例えば、例としてサラセミア、心臓血管疾患、筋障害、癌、及びより一般的には遺伝学的に遺伝性の病気であり得る。関連遺伝子及び集団内で罹患率を有するこのような病気の非網羅リストを、例として以下の表に示す。このリストは、本発明の範囲を限定すると考えられるべきではないが、本明細書ではヒトの健康における本発明の応用の範囲が遺伝学の進歩と共に多く及び絶え間なく広がることを明らかにするために提案する。
【０１０７】
癌性疾患の高められた素因と関連がある遺伝子、その診断が本発明の応用の特別な範囲を構成する限定的リスト
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特に、本発明の方法は、突然変異についてＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２のようなヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ）のスクリーニングに特に有用である。
【０１０８】
本発明の方法によれば、野生型ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２遺伝子座の変化を検出し得る。また、本発明の方法は、野生型ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２遺伝子座を検出し、このようにしてＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２遺伝子座で癌の素因がないことを確認することによって行ない得る。
【０１０９】
前述のように、本発明はまた、点突然変異が病気又は病気の高めれた素因と関係があるか又は関係があると推定されている遺伝子に関連した核酸配列を有するなくとも１個のＤＮＡ断片と、少なくとも１ｇ/ｌの濃度で及び前記の濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物とを含有する組成物にに関する。
【０１１０】
特定の具体的態様によれば、前記核酸配列はヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ）に関する。
【０１１１】
分析方法
本発明の一つの具体的態様によれば、分析方法は、電気泳動分析法、特に液状分離媒体を使用する電気泳動分析法である。
【０１１２】
さらに詳しくは、ミスマッチ、特にヘテロ二本鎖を有する核酸は、非変性条件でのキャピラリー電気泳動又はマイクロチャンネルにおける電気泳動で検出される。
【０１１３】
本発明は、以下の理由によりキャピラリー電気泳動又はマイクロチャンネルにおける電気泳動に特に都合がよい。
【０１１４】
本発明は、特に置換のようなミスマッチを検出することが困難なために、電気泳動分析の感度を著しく向上させる。
【０１１５】
本発明は、配列決定よりもさらに迅速な分離を可能にする。
【０１１６】
本発明は、種々の方法の多重化を可能にし、従ってさらに高速処理を高める。
【０１１７】
好ましい具体的態様において、多重化は、同じ試験において種々の長さを有する断片を組み合わせることによって達成することができる：ホモ二本鎖とヘテロ二本鎖は、一般に類似した移動度を有することから、ホモ二本鎖とヘテロ二本鎖の数種の組み合わせは、十分に異なるサイズを有する複数の断片を混合することによって、１回の試験で分離し、同定することができる。典型的に、前記断片は、１０〜１００ｂｐ、好ましくは２０〜１００ｂｐの因子までサイズが異なっていななければならない。.
前記の一つと組み合わせることができる別の好ましい具体的態様において、多重化は、種々の波長の蛍光を有する標識をもつ種々の試料を、例えば種々の蛍光標識プライマーを用いるＰＣＲを使用して調製することによって行なうことができる。種々の試料の増幅は１回の反応で行なうことができ、得られた混合物を１回の電気泳動操作で分析することができる。ＤＮＡ配列決定又は断片分析用に設計された幾つかのキャピラリー電気泳動装置、例えばＡＢＩ３１０、３１００、３７００、又はAmersham製“Megabace”は、生成物を種々の蛍光発光波長を用いて同時に分析することができる。
【０１１８】
最後に、多重化はまた、種々の試料を幾つかの連続投入を行なうことによって達成することができる。この原理は、種々のサイズの断片の分離についての原理と同じである：例えば配列決定とは対照的に、１個の断片のみの電気泳動分析は、数種の試料を、適当なシフトされた開始時間を用いて、１回の試験で分離することができるように、電気泳動によって提供される分離ウインドウの極めて限られた部分を使用することを使用する。
【０１１９】
別の具体的態様において、ヘテロ二本鎖断片の分離は、本発明に記載のような組成物の存在下でＤＧＧＥで行なうことができるし、又はこれと同じ種類の組成物の存在下でＤＨＰＬＣで行なうことができる。
【０１２０】
本発明はまた、少なくともｌｇ／１の濃度及び前記のような濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、電気泳動分析用の重合体状液状媒体とを含有する組成物に関する。
【０１２１】
前記の重合体状液状媒体としては、種(species)の分離に有用な少なくとも１種の重合体が挙げられる。
【０１２２】
“重合体”という用語は、特徴的な方法で一緒に共有結合された小さいモノマーサブユニットからなる大きな分子の集合体を示すことを目的とする。“単独重合体”は、１種類の単量体サブユニットのみから調製される重合体である。“共重合体”は、２種類以上の単量体サブユニットから調製される重合体をいう。本明細書で使用するように、“重合体”という用語は、単独重合体と共重合体を含む。“単分散”重合体溶液とは、溶液中の重合体分子が実質的に同じ分子量をもつことを意味する。典型的に、単分散重合体は1.2よりも小さい分子量分布、好ましくは1.1よりも小さい分子量分布を有する。“多分散”重合体溶液とは、溶液中の重合体分子が種々の分子量の有意な分布を有することを意味する。
【０１２３】
一つの具体的態様によれば、本発明の重合体としては、Ｎ，Ｎ-ジ置換ポリアクリルアミド、Ｎ-モノ置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ポリアクリルアミドの代表的な置換基としては、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基；ハロ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基；メトキシ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基；ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基などが挙げられる。好ましくは、ハロ置換基はフルオロ基であり、ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基はモノ置換される。上記の単量体置換基は、得られる重合体が水溶性であるように選択されることが理解される。さらに好ましくは、代表的な置換基は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基；ハロ置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル基；メトキシ置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル基；及びヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル基からなる群から選択される。
【０１２４】
具体的態様によれば、液状分離媒体は、Ｎ，Ｎ-ジ置換 ポリアクリルアミド及びＮ-置換ポリアクリルアミド（但し、前記のＮ置換基は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、メトキシ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及びヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から選択される）からなる群から選択される少なくとも１種の重合体を含有する。
【０１２５】
具体的態様によれば、前記重合体はアクリルアミド又は置換アクリルアミドを含有する。
【０１２６】
線状アクリルアミドは、当業者に周知のＤＮＡ電気泳動用の篩い分け重合体である。それは高親水性であり、良好な篩分け特性を有するが、界面活性ではない。
【０１２７】
別の具体的態様によれば、前記の電気泳動法及び組成物又はキットは、国際公開第WO02/01218号パンフレット（本明細書に参考として含まれる）に記載の液状分離媒体の使用を伴う。さらに具体的には、この液状分離媒体は、幾つかの重合体セグメントからなる少なくとも１種の重合体を含有する。前記の重合体は、不規則ブロック共重合体型のものであるか又は不規則櫛形重合体型のものであり且つ種々の化学的性質又はトポロジー性の重合体セグメント同士の間で確立された接合点を平均して少なくとも３個有する。
【０１２８】
一つの特に好ましい具体的態様は、本発明の共重合体内で、前記分離媒体内で固体支持体又はチャンネル壁に対して特異的な親和性を示す少なくとも１種類の重合体セグメントと、前記の媒体中で固体支持体又はチャンネル壁に対して親和性をほとんど又は全く示さない少なくとも１種類の重合体セグメントとを提供することにある。
【０１２９】
この種の重合体セグメントを存在させると、本発明の媒体がチャンネルの壁への種の吸着及び／又は電気浸透を低下させることを可能にする。
【０１３０】
好ましい具体的態様において、本発明に従って使用される液状分離媒体は、少なくとも１種の重合体を、前記媒体の全重量の少なくとも１重量％、特に少なくとも３重量％、さらに詳しくは少なくとも４重量％の濃度で含有する。
【０１３１】
別の具体的態様によれば、前記重合体は、アクリルアミド主鎖とポリメタクリルアミド（ＰＤＭＡ）側鎖を有するブロック共重合体である。
【０１３２】
以下の重合体が、本発明に最も特に適している：
−  櫛形共重合体型の共重合体であって、その骨格がデキストラン、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール又は(Ｎ，Ｎ)-ジメチルアクリルアミド型であり且つその表面にアクリルアミド、置換アクリルアミド又は(Ｎ，Ｎ)-ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、あるいはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）共重合体型、あるいはまたオキサゾリン又はオキサゾリン誘導体の単独重合体又は共重合体の側鎖セグメントがグラフトされている櫛形共重合体型の共重合体；
−  骨格に沿ってポリオキシエチレン型のセグメントとポリオキシプロピレン型のセグメントを交互に有するか、又はポリオキシエチレン型のセグメントとポリオキシブチレン型のセグメントを交互に有するか、あるいはさらに一般的にはポリエチレンのセグメントと、ポリオキシエチレンよりも明らかに疎水性であるポリエーテル型のセグメントとを交互に有する不規則遂次ブロック共重合体型の非感熱性共重合体；
−  骨格に沿って、一方では、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール又はジメチルアクリルアミド型のセグメントと、（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、ＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）共重合体型、あるいはまたオキサゾリン又はオキサゾリン誘導体の単独重合体又は共重合体のセグメントを交互に有する不規則遂次ブロック共重合体型の共重合体；
−  不規則櫛形重合体型の重合体であって、その骨格がアガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）重合体型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダム共重合体型、オキサゾリン及びオキサゾリン誘導体、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖又はエーテルオキシド型であり且つその表面にアガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアミド（ＤＭＡ）、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）重合体型、DMA/AGEランダム共重合体型、オキサゾリン及びオキサゾリン誘導体、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖又はエーテルオキシド型の側鎖セグメントがグラフとされている不規則櫛形重合体形の重合体；
−  不規則櫛形重合体形の重合体であって、その骨格がアクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアミド（ＤＭＡ）、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）重合体型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダム共重合体型、オキサゾリン及びオキサゾリン誘導体、デキストラン、アガロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖又はエーテルオキシド型であり且つ短鎖疎水性側鎖セグメント、例えばアルキル鎖、芳香族誘導体、フルオロアルキル、シラン又はフルオロシランを有する不規則櫛形重合体型の重合体。
【０１３３】
ポリヌクレオチドにおいて二本鎖又は二次構造の形成を防止することが望まれる場合には、変性剤のような別の成分を、本発明の液状分離媒体の具体的態様に含めてもよい。好ましい変性剤としては、ホルムアミド、例えば４０〜９０％ホルムアミド、尿素、例えば６〜８Ｍ尿素、ピロリドンのような商業的に入手し得るラクタム類などが挙げられる。それを電気泳動で使用するための指針は、周知の分子生物学文献、例えばSambrook et al, Molecualr Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory、New York, 1989)に見出し得る。
【０１３４】
また、大部分の用途において、本質的に中性である本発明の重合体を使用することが好ましいことが認められるべきである。しかし、それはある種の用途に有用であり得、特に電荷と疎水性部分の両方を含有する種の吸着を避けるために、計画的に帯電されている、好ましくは帯電において前記の種と反対に帯電されている本発明の重合体を選択するために有用であり得る。
【０１３５】
典型的に、ｐＨを調節するための緩衝液系もまた、電荷担持成分として使用し得る。代表的な緩衝液としては、有機酸、例えばクエン酸、酢酸又はギ酸の水溶液；両性イオン電解質、例えばＴＥＳ（Ｎ-トリス［ヒドロキシメチル］-２-アミノエタンスルホン酸）、ＢＩＣＩＮＥ（N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]グリシン）、ＡＣＥＳ（２-［２-アミノ-２-オキシエチル）-アミノ］エタンスルホン酸）、又はグリシルグリシンの水溶液；無機酸、例えばリン酸の水溶液；及び有機塩基、例えばＴｒｉｓ （トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）緩衝液、例えばSigma社から入手できる緩衝液が挙げられる。緩衝液濃度は、例えば、約１ｍＭから１Ｍまでの間で広く変化させることができるが、典型的には約２０ｍＭである。慣用のキャピラリー電気泳動用途の代表的な緩衝溶液としては、次のものが挙げられる：
（ｉ）一本鎖ポリヌクレオチド分離用のｐＨ７.６を有する0.1ＭＴｒｉｓ、0.25Ｍホウ酸、７Ｍ尿素；又は
（ｉｉ）二本鎖ポリヌクレオチド分離用の0.089Ｍ Ｔｒｉｓ、0.089Ｍホウ酸、0.005Ｍ ＥＤＴＡ。非両性イオン緩衝液系については、好ましくはＰＤＭＡ又はポリビニルピロリドンが表面相互作用成分として用いられる。
【０１３６】
電気泳動分離媒体の篩分け成分もまた使用し得る。
【０１３７】
代表的な篩分け重合体としては、線状ポリオキシド；ポリエーテル、例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド及びこれらの共重合体；ポリアクリルアミド；ポリメタクリルアミド；ポリビニルピロリドン；ポリビニルオキサゾリン；及び種々の水溶性の親水性重合体、例えば水溶性天然ゴム、例えばデキストラン；水溶性セルロース化合物、例えばメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、及び共重合体並びにこれらの重合体混合物が挙げられる。好ましくは、このような重合体は、約0.5％〜10％(ｗ：ｖ)の範囲の濃度で使用される。
【０１３８】
本発明に従って使用される共重合体の調製に関しては、調製は慣用の重合又は共重合法で実施し得る。
【０１３９】
別の具体的態様において、分析方法は、ハイブリダイゼーション型の方法である。核酸 プローブ又は核酸同属体は、ドメインのアレイとして表面に配置してもよい。このようなシステムはハイブリダイゼーションアレイを形成する。本発明はこの文脈において興味深い。なぜならば、それは完全にマッチした対と、ミスマッチを有する対の間の安定性を高めるからである。この増強は、ハイブリダイゼーションアレイにおいて検出するのが最も困難な突然変異であるより少ないミスマッチ、例えば置換から生じるミスマッチに特に敏感である。
【０１４０】
別の具体的態様において、核酸プローブ又は核酸同属体は、粒子又はビーズの表面に配置されていてもよい。この方法で、試料を、本発明において定義される化合物の存在下で、多数の種々に標識したビーズと接触させる。それぞれのプローブは、例えば国際公開第WO99/37814号パンフレットに記載のように、一つの標識又は複数の標識の組み合わせを有するビーズ又は粒子の全体に結合される。この方法において、多数のプローブに対する単一試料のハイブリダイゼーションは、１バッチで行なうことができ、ハイブリダイズした標的の配列は、これらが結合する標識又はビーズにより独特に特定することができる。
【０１４１】
さらに一般的には、本発明に従って考慮される化合物は、標的核酸上のプライマーのアニーリング、又はこのような標的核酸上でポリメラーゼの作用を必要とする核酸を増幅又は検出する全ての方法において、小さな配列の相違を示す核酸同士の間の相違を増幅するのに都合がよい。
【０１４２】
別の具体的態様によれば、本発明は、突然変異について核酸をアッセイする方法であって、少なくとも
−  少なくとも２種類のプライマーと、ヌクレオチド又はその類似体と特異的な塩基対合相互作用をすることができる化合物のプールとの存在下で、前記核酸上でポリメラーゼ連鎖反応を行い（但し、前記化合物は、少なくとも１ｇ/ｌの合算濃度で存在し且つポリメラーゼ連鎖反応を妨害することができないものである）、そして
−  そのようにして得られたＤＮＡ断片を分析又は定量する
ことからなる工程からなる突然変異について核酸をアッセイする方法を提案する。
【０１４３】
このような方法は、プライマー配列とミスマッチを示す核酸上のプライマーの安定性を低下させることができ、このようにして完全にマッチした増幅と不完全にマッチした増幅との間の増幅の相違を高めることができることから、定量的又は競争ＰＣＲの構成において、あるいはＰＣＲの使用において特に興味深い。
【０１４４】
突然変異と関係があるミスマッチした塩基対の効果を増大させることができるために、本発明はまた、例えばBonnet G, Tyagi S, Libchaber A, and Kramer FR (1999) “Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes”, Proc Natl Acad Sci USA 96, 6171-6176に記載のように、“分子標識”と呼ばれるＤＮＡプローブを使用して突然変異を検出するための方法及び組成物と関連して特に適している。このようなＤＮＡプローブは、ステム・ループ構造を形成し得且つ内部で消光した(quenched)発蛍光団を有し得る一本鎖ＤＮＡ分子である。これらは、相補的核酸に結合した場合にのみ蛍光を放つ。
【０１４５】
特に、分子標識は、第一の蛍光分子又は基と、エネルギーを前記第一の蛍光分子又は基に移動することができるか、あるいは前記の蛍光分子又は基から蛍光を消光することができる第二の分子又は基との組み合わせであり、これらの分子標識は、例えばMarras SAE, Kramer FR, and Tyagi S (1999) “Multiplex detection of single-nucleotide variations using molecular beacons”, Genet Anal 14, 151-156に記載のように、単一ヌクレオチド変異を検出するのに使用されている。
【０１４６】
従って、本発明はまた、前記のような濃度及び少なくとも１ｇ/ｌの濃度で特異的な塩基対合相互作用をすることができる少なくとも１種の化合物と、“分子標識”と呼ばれるＤＮＡプローブとして作用する一対の分子又は基とを含有する組成物を提案する。
【０１４７】
別の具体的態様において、本発明はまた、前記に定義したような液状分離媒体を含有してなる組成物を提案する。
【０１４８】
液状分離媒体は、さらにまた、篩分け重合体、親水性重合体及び界面活性重合体の中から選択される少なくとも１種の化合物を含有する。
【０１４９】
以下に示す図面及び実施例を、本発明の非限定的例示として示す。
【０１５０】
図面
図１、２及び３：チミジンの存在下又は不存在下での、それぞれ異なる点突然変異を有し、且つ配列番号４（図１）、配列番号５（図２）及び配列番号６（図３）に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の種々の断片の分離を表す電気泳動図（実施例１参照）。
【０１５１】
図４及び５：シチジンの存在下又は不存在下での、配列番号２（図４）及び配列番号６（図５）に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ２及びＢＲＣＡ１の断片を含む図１の分離と同じ分離の電気泳動図（実施例２参照）。
【０１５２】
図６：本発明の特異的な塩基対合相互作用をすることができる種々の化合物の存在下又は不存在下での、配列番号２に示す遺伝子ＢＲＣＡ２の断片の分離を表す電気泳動図の間での分解能の比較（実施例３参照）。
【０１５３】
図７及び８：種々の濃度のシチジンの存在下での図２及び３の分離に類似した分離を示す電気泳動図（実施例４参照）。
【０１５４】
図９：尿素の存在下又は不存在下での配列番号３及び配列番号１に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の断片の分離を表す対照電気泳動図（実施例５）。
【０１５５】
図１０：チミジン2.5％及びシチジン2.5％の存在下又は不存在下での配列番号６に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１の断片の分離を表す電気泳動図（実施例６）。
【０１５６】
図１１：ＧＣ富化領域に点突然変異を有する配列番号７に示すＲＢ１の断片の分離を表す電気泳動図。
【０１５７】
図１２：サイズの多重化によってＢＣｌ／Ｅｘ１５断片（ＢＲＣＡ１）を用いた１回の試験を表す電気泳動図。
【０１５８】
図１３：配列番号７、すなわちＲＢ１遺伝子のエクソンのＣＧ富化領域を表す表である。
【０１５９】
図１４：実施例８に従って検出したＢＣｌ／Ｅｘ１５断片の配列を増幅するために使用したプライマーを表す表である。
【実施例】
【０１６０】
分離に使用した全ての断片は、ヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に由来する。
【０１６１】
遺伝子、断片を増幅するのに使用したプライマーの配列を表１に記載した。配列番号４及び配列番号５と命名した突然変異に関して、関係している点突然変異は、考慮される遺伝子の一番近い端から１８番目の位置及び１５番目の位置にそれぞれ置かれる。置換の型、断片サイズ、配列（プライマー領域に下線を付す）、エクソン及び遺伝子を次の表に示す。突然変異の位置をブラック体で示す。
【０１６２】
液状分離媒体の共重合体は、国際公開第WO02/01218号パンフレットに開示された製造方法に従って製造した。これらの共重合体は良好な篩分け特性を有し、界面活性である。
【０１６３】
表１
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実施例１
下記の試料の間の種々の置換の検出の比較：
−  Tris(50 mM) Taps (50 mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)18 ５g/100mL＋sybrgreen 1X（分子プローブ)、及び
−  Tris (50 mM) Taps (50 mM) EDTA (2 mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)18 ５g/100mL＋チミジン 2.5g/100mL＋sybrgreen 1X
開始剤−単量体比R0＝0.015及びA0＝0.01を有するPDMA側鎖〔但し、Ro＝[R-SH]/[PDMA]及び Ao＝[KPS]/[PDMA]である〕と、P(AM-PDMA)18は、[(NH4)2S2O8]/[AM]＝0.1％及び[Na2S2O8]/[AM]＝0.015％を用いてV. Barbier, B.A. Buchholz, A.E. Barron, J.L. Viovy, Electrophoresis, 23, 1441, (2002)) に示されているプロトコールに従って製造した。
【０１６４】
分離は、ABI 310（applied biosystem）中で、30℃で行なった。無処理(bare)溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5kＶ 30秒間)。予備電気泳動を12.2ｋＶで５分間行なった。分離は、12.2ｋＶで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。配列番号４（置換 1019_80）、配列番号５（1019_50）及び配列番号６（2542）の点突然変異を調べた。分解能がチミジンの使用で向上したこと（図２及び３）及びP(AM-PDMA)18 ５g/100 mLについて検出されなかった配列番号５（置換1019_50)がP(AM-PDMA)18 5 g/100 mL＋チミジン 2.5 g/100 mLについて検出されたことを明確に観察することができた（図２）。それぞれの置換について、ヘテロ接合体患者由来の試料をホモ接合体の試料と比較した。得られたデータは、2.5 g/100 mlの濃度でのチミジンの添加が、ホモ接合体ＤＮＡとヘテロ接合体ＤＮＡの間の分解能を増大することを明確に実証し、突然変異の存在の明確な検出を提供した（ヘテロ接合体電気泳動図の多重ピーク)。
【０１６５】
実施例２
下記の試料の間の種々の欠失の検出の比較：
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋sybrgreen 1X（分子プローブ)、及び
−  Tris (50mM) Taps (50 mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)18 ５g/100mL＋シチジン2.5g/100mL＋sybrgreen 1X
開始剤−単量体比R0＝0.015及びA0＝0.01を有するPDMA側鎖と、P(AM-PDMA)20は、[(NH4)2S2O8]/[AM]＝0.1％及び[Na2S2O8]/[AM]＝0.015％を用いて（V. Barbier, B.A. Buchholz, A.E. Barron, J.L. Viovy, Electrophoresis, 23, 1441, (2002)) に示されているプロトコールに従って製造した。  
分離は、ABI 310（applied biosystem）中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。配列番号２(置換 2501)及び配列番号６(2542)の点突然変異を調べた。P(AM-PDMA)20 ５g/100mLについて検出されなかった点突然変異が、P(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン 2.5g/100mLについて検出され（図４）、また配列番号６（置換2542）の突然変異の分解能が、P(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン2.5g/100mLを使用することによってP(AM-PDMA)20 ５g/100mLに比べて向上した(図５)。それぞれの置換について、ヘテロ接合体患者由来の試料をホモ接合体の試料と比較した。得られたデータは、2.5 g/100 mlの濃度でのシチジンの添加が、ホモ接合体ＤＮＡとヘテロ接合体ＤＮＡの間の分解能を増大することを明確に実証し、突然変異の存在の明確な検出を提供した（ヘテロ接合体電気泳動図の多重ピーク)。
【０１６６】
実施例３
下記の試料の間の種々の置換の検出の比較：
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋sybrgreen 1X（分子プローブ)、
−  Tris (50mM) Taps (50mM) EDTA (２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋チミジン ５g/100mL＋sybrgreen 1X、
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン ５g/100 mL＋sybrgreen 1X、
及び：
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋チミジン2.5g/100mL＋シチジン2.5g/100mL＋sybrgreen 1X
分離は、ABI 310（applied biosystem）中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。配列番号２(置換 2501)の点突然変異を調べた。この置換は、P(AM-PDMA)20 ５g/100mLについて検出されなかった（ただ一つのピーク）。点突然変異がP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン2.5g/100mL及びP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋チミジン2.5g/100mLについて検出され（２ピーク）且つresolutionがP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋チミジン2.5g/100mL＋シチジン2.5g/100mLについて向上した（３ピーク）(図６)。それぞれの置換について、ヘテロ接合体患者由来の試料をホモ接合体の一つと比較した。同じヌクレオチド濃度で、分解能はシチジン単独又はチミジン単独についてよりも、シチジンとチミジンの同量の混合物で用いた場合よりもよかった。これは、分離媒体中に種々のヌクレオチドと塩基対合相互作用を達成することができる２種類の添加剤化合物を有する試料について相乗効果を実証する。
【０１６７】
実施例４
下記の試料の間の種々の置換の検出の比較：
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン 0.05g/100 mL＋sybrgreen 1X、
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン １g/100 mL＋sybrgreen 1X、
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋シチジン 2.5g/100 mL＋sybrgreen 1X、
分離は、ABI 310（applied biosystem）中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。配列番号５（置換1019_50）及び配列番号６（1019_80）の点突然変異を調べた。両方の点突然変異は、１g/100mL又はそれ以下のチミジン濃度については検出されなかったが、2.5g/100mLのチミジン濃度については検出された（２ピーク）(図７及び８)。
【０１６８】
実施例５
下記の試料の間の種々の置換の検出の比較：
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)５ ５g/100mL＋sybrgreen 1X、
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)５ ５g/100mL＋尿素15g/100mL＋sybrgreen 1X、
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)５ ５g/100mL＋尿素24g/100mL＋sybrgreen 1X、
分離は、ABI 310（applied biosystem）中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。配列番号３（置換1019）及び配列番号１（2383）の点突然変異を調べた。両方の点突然変異は、尿素をマトリックスに添加しなかった場合には検出され、マトリック中の尿素濃度が15g/100mLである場合には検出されなかった。マトリック中の尿素濃度が24g/100mLである場合には、配列番号１（2383）の突然変異は未だ検出されず、また配列番号５（1019）は尿素を存在させない場合のように低い分解能で検出された(図９)。これは、従来技術において突然変異の分解能に提案されている二本鎖ＤＮＡの変性を促進するが核酸との塩基対合相互作用をもたらすことができないことが知られている添加剤、例えば尿素が、実際に有害であるヘテロ二本鎖の分解能に影響を及ぼし、本発明の添加剤の効果と逆であることを実証する。
【０１６９】
実施例６
下記の試料の間の配列番号６（置換2542）の点突然変異の検出の比較：
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中の線状ポリアクリルアミド５g/100mL＋sybrgreen 1X (分子プローブ)、及び
−  Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中の線状ポリアクリルアミド５g/100mL＋チミジン2.5g/100mL＋シチジン2.5g/100mL＋sybrgreen 1X
分離は、ABI 310（Applied Biosystem）中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を、使用前にChiari M, Cretich M, Horvath J, Electrophoresis, 2000, 21, 1521-1526に示されているプロトコールに従って被覆した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。図６は、分解能がヌクレオシドを用いて向上したという観察を明らかに示す。ヘテロ接合体患者由来の試料をホモ接合体の一つと比較した。
【０１７０】
実施例７
ＲＢ１遺伝子のエクソン８のＧＣ富化領域における置換の検出
Ｃ→Ｔ転移（命名コード g 59695 Ｃ→Ｔ/arg 255 stop）の型のこの突然変異は、前記遺伝子のＧＣ富化領域に停止コドンを導入し、従って有害な突然変異である。これは高頻発性の突然変異であり、従って網膜芽細胞種の診断の検出に重要であるが、DHPLCでは検出されない。
【０１７１】
分離は、Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋チミジン2.5g/100mL＋シチジン2.5g/100mL＋sybrgreen 1Xを用いてABI 310（applied biosystem)中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。図１１は、２つの連続する試験について突然変異の検出を表す。図１３は、ボルドー体で示したプライマーを有する単位複製配列の配列を表す（配列番号７）。
【０１７２】
実施例８
同じ試験での多重突然変異の検出を可能にするサイズ多重化
分離は、Tris(50mM) Taps (50mM) EDTA(２mM)の緩衝液中のP(AM-PDMA)20 ５g/100mL＋sybrgreen 1Xを用いてABI 310（applied biosystem)中で、30℃で行なった。無処理溶融シリカキャピラリー（polymicro）、内径50μｍ、長さ61cm（検出ウインドウまで50cm）を使用した。注入は、動電学的である(2.5 kV 30秒間)。予備電気泳動を12.2 KVで５分間行なった。分離は、12.2 kVで行なった。それぞれの試験の後に、新たな重合体溶液をキャピラリーに10分間注入した。  
試料は、２μLのPCR生成物を５μLの純水（milliQ)と穏やかに混合することによって調製した。  
図１２は、254 bp、358 bp、480 bp及び627bpの大きさのBC1/Ex15断片（BRCA1遺伝子)を用いた単一の試験を、有効長さ50cm、内経50μｍのキャピラリーで30℃及び200 V/cmで行なったことを表す。突然変異は全ての断片について同じであり、大きさのみが一方のピークから他方のピークまで異なった。全ての突然変異が検出された。断片の特徴を図１４に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】チミジンの存在下又は不存在下での、それぞれ異なる点突然変異を有し且つ配列番号４に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の種々の断片の分離を表す電気泳動図である。
【図２】チミジンの存在下又は不存在下での、それぞれ異なる点突然変異を有し且つ配列番号５に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の種々の断片の分離を表す電気泳動図である。
【図３】チミジンの存在下又は不存在下での、それぞれ異なる点突然変異を有し且つ配列番号６に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の種々の断片の分離を表す電気泳動図である。
【図４】シチジンの存在下又は不存在下での、配列番号２に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ２及びＢＲＣＡ１の断片を含む図１の分離と同じ分離の電気泳動図である。
【図５】シチジンの存在下又は不存在下での、配列番号６に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ２及びＢＲＣＡ１の断片を含む図１の分離と同じ分離の電気泳動図である。
【図６】本発明の特異的な塩基対合相互作用をすることができる種々の化合物の存在下又は不存在下での、配列番号２に示す遺伝子ＢＲＣＡ２の断片の分離を表す電気泳動図である。
【図７】種々の濃度のシチジンの存在下での図２の分離に類似した分離を示す電気泳動図である。
【図８】種々の濃度のシチジンの存在下での図３の分離に類似した分離を示す電気泳動図（実施例４参照）。
【図９】尿素の存在下又は不存在下での配列番号３及び配列番号１に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の断片の分離を表す対照電気泳動図である。
【図１０】：チミジン2.5％及びシチジン2.5％の存在下又は不存在下での配列番号６に示すヒト遺伝子ＢＲＣＡ１の断片の分離を表す電気泳動図である。
【図１１】ＧＣ富化領域に点突然変異を有する配列番号７に示すＲＢ１の断片の分離を表す電気泳動図である。
【図１２】サイズの多重化によってＢＣｌ／Ｅｘ１５断片（ＢＲＣＡ１）を用いた１回の試験を表す電気泳動図である。
【図１３】配列番号７、すなわちＲＢ１遺伝子のエクソンのＣＧ富化領域を表す表である。
【図１４】実施例８に従って検出したＢＣｌ／Ｅｘ１５断片の配列を増幅するために使用したプライマーを表す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007513637.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007513637.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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