(57)【要約】本発明は、患者の血液のサンプルもしくは血漿のサンプルにおいて、または凝固因子のサンプルにおいて、トロンビン生成を測定するための、キットを提供する。このキットは、凍結乾燥した組織因子／リン脂質複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を含む。本発明はまた、このキットのための試薬を調製するためのプロセスを提供する。このキットは、サンプルにおけるトロンビン生成を測定するための方法において使用され得、この方法において、例えば、外因性凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子）に対するインヒビターを発達させた患者に対して、インヒビターバイパス剤を投与した後に、トロンビン生成速度論における変化を検出することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおけるトロンビン生成を測定するためのキットであって、該キットは、
凍結乾燥した組織因子（ＴＦ）／リン脂質（ＰＬ）複合体、および
蛍光標識を有するトロンビン基質とＣａＣｌ２との凍結乾燥混合物、
を備える、キット。
【請求項２】
請求項１に記載のキットであって、前記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体中のＴＦ濃度は、約５ｐＭ〜約１０００ｐＭの範囲である、キット。
【請求項３】
請求項１に記載のキットであって、前記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体中のＰＬ濃度は、約１μＭ〜約１００μＭの範囲である、キット。
【請求項４】
請求項１に記載のキットであって、前記ＴＦまたはその少なくとも機能的部分は、天然起源または組換え起源である、キット。
【請求項５】
請求項１に記載のキットであって、前記ＰＬは、天然起源または合成起源である、キット。
【請求項６】
請求項１に記載のキットであって、前記ＰＬは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびそれらの混合物からなる群より選択される、キット。
【請求項７】
請求項６に記載のキットであって、ＰＣ／ＰＳの重量比は、約６０／４０〜約９５／５の範囲にある、キット。
【請求項８】
請求項６に記載のキットであって、ＰＣ／ＰＳ／ＰＥの重量比は、リン脂質の全量に基づいて約６０／２０／２０〜約７８／１７／５の範囲にある、キット。
【請求項９】
請求項１に記載のキットであって、少なくとも１つのトロンビン標準物をさらに備える、キット。
【請求項１０】
請求項１に記載のキットであって、前記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体は、支持体に固定されている、キット。
【請求項１１】
請求項１に記載のキットであって、前記蛍光標識を有するトロンビン基質とＣａＣｌ２との凍結乾燥混合物は、支持体に固定されている、キット。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のキットであって、前記支持体は、バイアルの内側表面、またはＥＬＩＳＡプレートのウェルもしくはＥＬＩＳＡストリップのウェルである、キット。
【請求項１３】
凍結乾燥した組織因子（ＴＦ）／リン脂質（ＰＬ）複合体を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）約２００ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲にある直径を有するリン脂質小胞を、押出しによって調製する工程；
（ｂ）該リン脂質小胞を凍結乾燥して粉末を得る工程；
（ｃ）該粉末を注射用水で再構成し、それを組織因子と混合する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた混合物を凍結および融解して、ＴＦ／ＰＬ複合体を形成する工程；
（ｅ）該ＴＦ／ＰＬ複合体を、約４℃にて約２４時間〜約７２時間インキュベートすることによって安定化する工程；および
（ｆ）該ＴＦ／ＰＬ複合体を凍結乾燥する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプロセスであって、工程（ｅ）と工程（ｆ）との間において、前記ＴＦ／ＰＬ複合体が、適切な「すぐに使用可能な」濃度になるまで希釈される、プロセス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプロセスであって、工程（ｆ）におけるＴＦ／ＰＬ複合体は、凍結乾燥によって支持体に固定される、プロセス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセスであって、前記支持体は、バイアルの内側表面、またはＥＬＩＳＡプレートのウェルもしくはＥＬＩＳＡストリップのウェルである、プロセス。
【請求項１７】
請求項１３に記載のプロセスであって、工程（ｆ）におけるＴＦ／ＰＬ複合体は、保存剤を全く伴わずに凍結乾燥される、プロセス。
【請求項１８】
蛍光標識を有するトロンビン基質とＣａＣｌ２との凍結乾燥混合物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）蛍光標識を有するトロンビン基質を、適切な溶媒中に溶解する工程；
（ｂ）ＣａＣｌ２を添加し、該蛍光標識を有するトロンビン基質とＣａＣｌ２とから形成した沈殿物を溶解する工程；および
（ｃ）該蛍光標識を有するトロンビン基質とＣａＣｌ２との凍結乾燥混合物を凍結乾燥する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプロセスであって、工程（ｃ）において、前記混合物は、凍結乾燥によって支持体に固定される、プロセス。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプロセスであって、前記支持体は、バイアルの内側表面、またはＥＬＩＳＡプレートのウェルもしくはＥＬＩＳＡストリップのウェルである、プロセス。
【請求項２１】
サンプルにおけるトロンビン生成を測定するための方法であって、該方法は、
（ａ）凍結乾燥した組織因子（ＴＦ）／リン脂質（ＰＬ）複合体、および蛍光標識を有するトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、および該トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物と接触させる工程；ならびに
（ｃ）該サンプルにおけるトロンビン生成を測定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記サンプルは、全血と、血漿と、止血活性を有する、天然起源由来、合成起源由来、または組換え起源由来の精製タンパク質を含む混合物とからなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、患者の血液サンプルもしくは患者の血漿サンプルにおいて、または凝固因子サンプルにおいて、トロンビン生成を測定するためのキットに関する。本発明はまた、このキットのための試薬を調製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血友病Ａは、遺伝性血液凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）（凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ））障害である。血友病Ａは、血漿タンパク質である第ＶＩＩＩ因子の活性欠損によって引き起こされる。第ＶＩＩＩ因子は、血液の凝固特性に影響を与える。血友病Ａ患者についての標準的処置は、その不完全な凝固因子を置換するための第ＶＩＩＩ濃縮物の注入である。しかし、置換療法の間に第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビターを発達させる血友病Ａ患者は、結果的に、上記の治療に対して応答せず、活性化凝固因子を含む調製物（いわゆる、バイパス剤）で処置され、バイパス機構を介して第ＶＩＩＩとは無関係に止血を達成する。活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）（例えば、ＦＥＩＢＡ（第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性−血漿由来ＡＰＣＣ）（これは、内因性経路または共通経路を誘発する）と、活性化第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）（例えば、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（組換えＦＶＩＩａ））（これは、外因性経路を介して作用すると想定されている）との両方が、第ＶＩＩＩ因子インヒビター患者を処置するための好ましい選択肢である。
【０００３】
上記薬物の直接的モニタリングは、いずれの処置レジメンに関しても不可能である。なぜなら、上記バイパス剤の活性化された成分が、止血系のタンパク質とすぐに相互作用して、凝固カスケードの活性化を誘発するからである。すべての既存のアッセイは、代理マーカーを測定する。その代理マーカーは、上記バイパス剤の効力を評価するためには限定された価値しかない。なぜなら、その特異性および感度は、具体的なアッセイ条件に依存するからであり、そしてこれらのアッセイは、その止血系の全体的活性状態に関して何の情報も提供しないからである。
【０００４】
上記凝固カスケードの最終的目標は、プロトロンビンからトロンビンへの変換である。トロンビンは、その後、フィブリノーゲンの活性化によって血餅形成を誘導する。従って、トロンビンの生成は、止血における血漿の中心的機能である。現在、血漿サンプルのトロンビン形成能力を定量的に評価する慣用的試験は、存在しない。凝固時間（例えば、プロトロンビン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、およびトロンビン凝固時間（ＴＣＴ））は、全体的トロンビン生成を反映しない。なぜなら、トロンビンの大部分は、凝固の瞬間の後に形成され、従って、それらのトロンビンは、凝固亢進状態に対して、そしておそらく凝固低下状態に対しても、非感受性であるからである。上記ＰＴＴ試験は、外因性経路および共通経路の凝固時間を測定し、ａＰＴＴ試験は、内因性経路および共通経路の凝固時間を測定する。一方、ＴＣＴ試験は、共通経路の凝固時間を測定するにすぎない。非特許文献１は、初めて、内因性トロンビンの能力の評価によって患者の血漿におけるトロンビン生成を測定することを示唆した。トロンビンの生成は、動的プロセスである。実際のトロンビン濃度は、活性化反応および不活性化反応の速度に依存し、従って、出血を制御する止血系の効率を反映する。非特許文献２は、トロンビンの能力を、凝固の誘導後に血漿がトロンビンを形成する全体的能力として定義し、このパラメーターをあらゆる抗凝固形態の感度が良い指標として使用することを提唱した。
【０００５】
非特許文献３は、そのようなトロンビン生成アッセイを、第ＶＩＩＩ因子インヒビターを有する患者の血漿における、活性化プロトロンビン複合体濃縮物、プロトロンビン複合体濃縮物、および第ＶＩＩａの、第ＶＩＩＩ因子バイパス活性のインビトロでの評価のために使用した。そのようなアッセイを第ＶＩＩＩ因子バイパス剤の効力を評価するために使用した他の報告もまた存在するが、その技術的に複雑さが原因で、それらのアッセイは、慣用的使用に至るまで普及していない。
【０００６】
トロンビン生成アッセイはまた、非特許文献４によって記載されたが、凍結乾燥成分は、使用されなかった。さらに、凍結乾燥は、組織因子の活性を減少させるという一般的意見が存在する。
【０００７】
公知の先行技術アッセイはすべて、そのアッセイを使用する前に成分が部分的にのみ投与され得るという不利点を有する。従って、多くの調製工程が、これらのアッセイを使用するためには必要であり、それによって、そのアッセイは、厄介となり、そして取り扱い時のミスに影響を受けるようになる。さらに、これらのアッセイは、時間がかかる。
【非特許文献１】Ｈｅｍｋｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９８６，５６：９〜１７
【非特許文献２】Ｈｅｍｋｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９５，７４：１３４〜１３８
【非特許文献３】ＳｕｌｔａｎおよびＬｏｙｅｒ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９９３，１２１：４４４〜４５２
【非特許文献４】Ｔｕｒｅｃｅｋら、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．，２００３，３３：１６〜２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、患者の血液サンプルまたは血漿サンプルにおいて、トロンビン生成の速度論における変化（例えば、処置依存性変化）を検出および決定するのを可能にして、上記問題を克服する、試験系についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の目的は、患者の血液サンプルもしくは血漿サンプルにおいて、または凝固因子サンプルにおいて、トロンビン生成を測定するためのキットを提供することである。そのキットは、凍結乾燥した組織因子（ＴＦ）／リン脂質（ＰＬ）複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物、を備える。さらに、本発明のキットはまた、任意の補助剤（例えば、緩衝液、塩（例えば、ＣａＣｌ２）、トロンビン標準物、ＦＥＩＢＡ標準物など）を、凍結形態または凍結乾燥形態にて備え得る。本発明のキットは、任意の形状にて（例えば、支持体に固定された状態で）存在し得る。
【００１０】
驚くべきことに、凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物は、サンプルにおけるトロンビン生成を測定するための、簡単で、効率が良く、迅速で、かつ再現性があるアッセイ系を提供することが見出された。本発明のキットは、凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を、容易に分離可能な凍結乾燥形態にて少なくとも提供し、それにより、試験されるべきサンプルを添加することだけしか、必要ではない。本願キットの凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物はまた、支持体（例えば、バイアルの内側表面、またはマイクロタイタープレートのウェル）に固定され得、それにより、このトロンビン生成アッセイは、従来のＥＬＩＳＡから公知であるアッセイ形式にされ、それにより、このトロンビン生成アッセイは、非常に簡便な型のアッセイとなる。本発明のキットは、凍結した成分を使用する先行技術のアッセイと少なくとも同じ感度を、上記トロンビン生成アッセイにおいて提供する。従って、本発明のキットを用いて実施されるトロンビン生成アッセイによって、患者の止血系の全体的活性状態の迅速な診断が可能である。さらに、例えば、患者に対してバイパス治療剤を投与した後に、トロンビン生成速度論における処置依存性変化を検出することが可能である。それにより、処置間隔および治療剤の用量を最適にして、過剰投与に起因する血栓性合併症を回避することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の一実施形態は、サンプルにおけるトロンビン生成を測定するためのキットであり、このキットは、凍結乾燥した組織因子（ＴＦ）／リン脂質（ＰＬ）複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を備える。
【００１２】
用語「サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、生物学的流体（例えば、ヒトまたは動物の全血または血漿（例えば、血球濃縮血漿もしくは無細胞血漿））を指す。このサンプルは、健常個体から得られても、または血液凝固障害（特に、処置していないか処置中である、ＦＶＩＩＩインヒビターの存在に関連する障害）を有すると疑われる個体もしくはその血液凝固障害を有する個体から得られてもよい。このサンプルは、新たに調製されても、凍結条件（例えば、無細胞サンプルの場合）において存在してもよい。このサンプルはまた、天然起源の精製タンパク質、合成起源の精製タンパク質、もしくは組換え起源の精製タンパク質、および／または止血活性を有する他の調製物／試薬の混合物からなり得る。
【００１３】
凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体におけるＴＦとＰＬとの重量比は、その目的に依存して変動する。トロンビン生成アッセイのためには、一般的に、低量のＴＦおよび低量のＰＬが、好ましい。本発明の好ましい実施形態において、上記ＴＦ／ＰＬ複合体におけるＴＦの濃度は、約５ｐＭ〜約１０００ｐＭの範囲にあり、かつ／または上記ＴＦ／ＰＬ複合体におけるＰＬの濃度は、約１μＭ〜約１００μＭの範囲にある。
【００１４】
上記ＴＦ／ＰＬ複合体におけるＴＦは、全長組織因子またはその少なくとも機能的部分のいずれかである。その組織因子は、天然起源であっても、組換え起源であってもよい。表現「その少なくとも機能的部分」とは、上記組織因子のうちの、全長組織因子と同じ機能を示すあらゆる部分を意味する。好ましい実施形態において、ヒト全長組換え組織因子が、使用される。
【００１５】
上記ＴＦ／ＰＬ複合体のＰＬは、合成起源であっても、天然起源であってもよい。上記ＰＬ小胞の組織は、その凝固関与度（すなわち、生理的血液凝固におけるその役割）に依存する。本発明の好ましい実施形態において、上記リン脂質は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびそれらの混合物からなる群より選択される。好ましくは、上記リン脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＰＯＰＳ）、および１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、ＰＣ／ＰＳの重量比は、リン脂質の全量に基づいて約６０／４０〜約９５／５の範囲にあり、ＰＣ／ＰＳ／ＰＥの重量比は、リン脂質の全量に基づいて約６０／２０／２０〜約７８／１７／５の範囲にある。
【００１６】
上記ＴＦ／ＰＬ複合体、ならびにトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物が、個別にかまたは一緒に、支持体上に固定され得る。用語「固定される」とは、単に凍結乾燥によるか、または支持体との相互作用または結合（例えば、直接的に共有結合もしくはリンカー分子を介する結合）による、支持体への固定を包含する。好ましくは、上記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物が、支持体に一緒に凍結乾燥される。上記固定は、上記成分（例えば、ＴＦ、ＰＬ，およびトロンビン基質）の生物学的活性が実質的に維持される様式で実施される。用語「支持体」とは、いかなる具体的な限定も示さず、この用語は、例えば、不活性材料（例えば、有機ポリマー（例えば、ポリアミドまたはビニルポリマー（例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、およびポリビニルアルコール、もしくはこれらの誘導体））、または天然ポリマー（例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、キチン、およびポリアミノ酸）、あるいは無機材料（例えば、ガラス）であり得る、ポリマー材料）の表面を指す。上記支持体は、任意の形状および形態（例えば、バイアルの内側表面および底部、マイクロキャリア、粒子、膜、ストリップ（ｓｔｒｉｐ）、紙、フィルム、真珠、またはプレート（例えば、ウェルを有するマイクロタイタープレート）であり得る。
【００１７】
本発明において使用されるトロンビン基質は、当該分野で公知であり、好ましくは、トロンビンに対して非常に特異的であるべきであり（すなわち、他の凝固酵素との交差反応が実質的に存在しないか、または無視し得る）、そして好ましくは、長期運動性を可能にするためにトロンビンに対して低親和性（高Ｋｍ）を有すべきである。上記トロンビン基質は、標識部分を含み、上記標識部分は、トロンビンによって切断され得る。この部分の標識は、蛍光標識であっても、放射性標識であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、上記トロンビン基質の標識部分は、フルオロフォアを含む。さらに、上記標識部分は、好ましくは、ペプチド（例えば、ジペプチドまたはトリペプチド）を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態によると、上記キットは、少なくとも１つのトロンビン標準物を基準としてさらに備える。
【００１９】
本発明はまた、凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を調製するためのプロセスに関し、このプロセスによって、上記凍結乾燥プロセスの間に活性が維持される、非常に活性があるＴＦを取得することが可能である。
【００２０】
上記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を調製するためのプロセスは、
（ａ）約２００ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲にある直径を有するリン脂質小胞を、好ましくは、当該分野において公知である任意の方法（例えば、押出しまたは超音波処理）によって調製する工程；
（ｂ）上記リン脂質小胞を凍結乾燥して粉末を得る工程；
（ｃ）上記粉末を注射用水で再構成し、それを組織因子と混合する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた混合物を凍結および融解して、ＴＦ／ＰＬ複合体を形成する工程；
（ｅ）上記ＴＦ／ＰＬ複合体を、約４℃にて約２４時間〜約７２時間インキュベートすることによって安定化する工程；そして必要に応じて、上記ＴＦ／ＰＬ複合体を、適切な「すぐに使用可能な」濃度になるまで希釈する工程；および
（ｆ）上記ＴＦ／ＰＬ複合体を凍結乾燥する工程；
を包含する。
【００２１】
本発明のＴＦ／ＰＬ複合体を調製するためのプロセスにおいて、保存剤の添加は、必須ではない。保存剤を使用すると、アッセイの準備に、より時間がかかりかつ高価になる。さらに、これらの保存剤のうちのいくつか（例えば、アルブミン）は、適切ではない。なぜなら、アルブミンは、多くのタンパク質と相互作用し、それによってそのアッセイに負の影響を及ぼすからである。
【００２２】
上記プロセスの工程（ｄ）において、上記凍結および融解のサイクルは、好ましくは、上記組織因子を、上記リン脂質小胞とともに約−２０℃にて一晩凍結すること、その後、室温にて約３０分間融解することによって、実行される。
【００２３】
本発明は、トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を調製して、容易に水に溶解可能な調製物を生じるためのプロセスを包含する。先行技術において公知であるトロンビン基質調製物は、適切な緩衝液（しばしば、ＤＭＳＯを含む）中における初期溶解と、その後の水によるさらなる希釈とを必要とする。その後、その先行技術のトロンビン基質調製物へとＣａＣｌ２を添加すると、溶解し難く従って使用しにくい沈殿物を生じる。
【００２４】
上記のトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を調製するためのプロセスは、
（ａ）上記トロンビン基質を、適切な溶媒中に溶解する工程；
（ｂ）ＣａＣｌ２を添加し、上記トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含んで形成した沈殿物を溶解して、特に、透明な溶液を得る工程；および
（ｃ）上記トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を凍結乾燥する工程；
を包含する。
【００２５】
上記工程（ｂ）における溶解は、好ましくは、約３７℃の温度にて、透明な溶液が出現するまで実行される。
【００２６】
さらに、本発明は、（例えば、患者から取得した）サンプルにおけるトロンビン生成を測定するための方法に関し、この方法は、
（ａ）凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、および上記のようなトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を提供する工程；
（ｂ）上記サンプルを、上記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体、および上記のトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物と接触させる工程；ならびに
（ｃ）上記サンプルにおけるトロンビン生成を測定する工程；
を包含する。
【００２７】
本発明のキットを使用する場合、蛍光標識部分を有するトロンビン基質が使用される限り、遊離したフルオロフォアの蛍光強度の進展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）が、連続的にモニターされ得る。蛍光強度（蛍光単位（ＦＵ））の進展の速度が、各読取りについて算出され（ＦＵ／分）、そしてこれは、トロンビン標準物による基質変換速度を測定することにより調製される基準曲線を使用して、トロンビン等価物濃度（ｎＭ）へと変換され得る。
【００２８】
本発明のキットおよび方法は、上記トロンビン生成を介して血液凝固カスケードの１つ以上の凝固因子をアッセイすることについて、非常に感度が高い。従って、本発明のキットおよび方法は、任意の凝固因子の活性を増加または減少させることにより止血に影響を与える任意の処置をモニターするため（例えば、ＦＶＩＩＩバイパス剤またはビタミンＫアンタゴニストによる処置のモニタリングのため）に使用され得る。さらに、治療剤（例えば、バイパス治療剤）による処置のモニタリングによって、これらの治療剤の処置間隔および投与の最適化が可能になり、過剰投与に起因する血栓性合併症を回避することが補助される。
【００２９】
さらに、本発明のキットの凍結乾燥試薬は、凍結した成分を使用するアッセイと比較して、長い有効期限を有しかつ再現性が高い。さらに、本願アッセイキットを使用することによって、希釈工程が必要とされない。このことによって、このようなアッセイキットの取り扱いは、より簡単かつ快適になる。
【００３０】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証されるが、以下の実施例に限定はされない。
【実施例】
【００３１】
（実施例１：凍結したＴＦ／ＰＬ複合体および凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体の調製）
リン脂質小胞（ＴＦ／ＰＬ複合体）を有する組織因子を、組換え全長ＴＦ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ，ＵＳＡ）および合成ＰＬ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）を使用することによって、調製する。この調製は、以下の工程を包含する。
【００３２】
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＰＯＰＳ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から構成されるリン脂質小胞を、Ｈｏｐｅら（Ｈｏｐｅ  ＭＪ，Ｂａｌｌｙ  ＭＢ，Ｗｅｂｂ  Ｇ，Ｃｕｌｌｉｓ  ＰＲ：「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｔｒａｐｐｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８１２：５５，１９８５）」の押し出し方法によって、２つの積層ポリカーボネートフィルター（孔径１０００ｎｍ）を備えたＬｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）の押し出しデバイスを使用して、調製する。その小胞調製物を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）で濃度１．２７ｍＭまで希釈し、５％（ｗ／ｖ）スクロースを添加した後に凍結乾燥する。その凍結乾燥した粉末を蒸留水で再構成した後、上記小胞は、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により測定した場合に平均直径２６０ｎｍを有する。
【００３３】
（ＴＦと上記ＰＬ小胞との複合体化）
２ｎｍ〜７００ｎＭのＴＦと８５０μＭ  ＰＬ小胞との出発混合物を、−２０℃にて一晩凍結し、その後、室温にて３０分間融解し、そしてＴＢＳで６．７倍希釈する。そのＴＦ／ＰＬ小胞を、４℃にて４８時間〜１６８時間平衡化させ、アリコートの状態で凍結するか、または０．５％スクロースの存在下および５％スクロースの存在下もしくはスクロース非存在下で凍結乾燥する。第二の選択肢として、上記ＴＦ／ＰＬ小胞を４０倍に希釈して、適切な作業濃度の３．２μＭ  ＰＬおよび種々のＴＦ濃度を得、これを、アリコートの状態で凍結するか、または０．５％スクロースの存在下および５％スクロースの存在下もしくはスクロース非存在下で凍結乾燥する。
【００３４】
（表１．凍結乾燥サイクルのコアデータ）
【００３５】
【表１】
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図１は、上記凍結乾燥サイクルの間の温度変化を示す。
【００３６】
（実施例２：種々の血漿サンプルにおける、凍結したＴＦ／ＰＬ複合体または凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発されるトロンビン生成）
上記トロンビン生成は、１８ｐＭ  ＴＦおよび３．２μＭ  ＰＬを含んで上記のように調製されたＴＦ／ＰＬ複合体によって誘発され、そのＰＬは、８０重量％のＤＯＰＣおよび２０重量％のＰＯＰＳという比から構成される。上記凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を、注射用水中に（最終濃度１８ｐＭ  ＴＦおよび３．２μＭ  ＰＬになるまで）溶解し、この水溶液１０μＬを、１５ｍＭ  ＣａＣｌ２と予め混合した５０μＬの１ｍＭトロンビン基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に添加する。比較のために、１０μＬの凍結したＴＦ／ＰＬ複合体（１８ｐＭ  ＴＦおよび３．２μＭ  ＰＬ）を、５０μＬの上記トロンビン基質と混合する。４０μＬの血漿サンプルを添加すると、反応が開始する。上記成分を、３７℃にてインキュベートする。
【００３７】
上記トロンビン基質は、生じたトロンビンによって切断され、フルオロフォア含有部分が遊離される。上記蛍光強度の増加（これは、生じたトロンビンの濃度に比例する）を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＦＬ６００（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）を励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４６０ｎｍにて使用して１分間毎に１２０分まで自動読取りすることによって、３７℃にて連続的にモニターする。
【００３８】
蛍光強度［蛍光単位（ＦＵ）］の進展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の速度を、各読取りについて算出し（ＦＵ／分）、そしてこれを、上記血漿サンプルの代わりに添加した精製トロンビンによる基質変換速度を測定することにより調製される基準曲線を使用して、トロンビン等価物濃度（ｎＭ）へと変換する。
【００３９】
凍結したＴＦ／ＰＬ複合体（１８ｐＭ  ＴＦおよび３．２μＭ  ＰＬを含む）の誘発効果と、凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体（１８ｐＭ  ＴＦおよび３．２μＭ  ＰＬを含む）の誘発効果とを、正常ヒト血漿（ＦＡＣＴ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋｓ，ＫＳ，ＵＳＡ）、ＦＶＩＩＩインヒビター血漿（ＦＥＩＢＡを含まない）、およびＦＶＩＩＩインヒビター血漿（０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成される）（両方ともにＢａｘｔｅｒ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａからの製品）を使用することによって、比較する。
【００４０】
上記トロンビン生成曲線が、図２において示される。
【００４１】
（実施例３：種々の組成の凍結したＴＦ／ＰＬ複合体のトロンビン生成誘発効果と、種々の組成の凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体のトロンビン生成誘発効果との比較）
上記ＴＦ／ＰＬ複合体を、実施例１に記載されるように調製するが、そのＴＦ／ＰＬ複合体は、濃度３．２μＭの種々のリン脂質と、１８ｐＭ  ＴＦまたは８９ｐＭ  ＴＦとから構成される。上記ＴＦ／ＰＬ複合体を、アリコートの状態で凍結するか、または実施例１に記載される凍結乾燥サイクルにてスクロースを用いずに凍結乾燥する。
【００４２】
（表２．ＴＦ／ＰＬ複合体の組成）
【００４３】
【表２】
2007530963.tif 000003
ＰＣ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）
ＰＳ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＰＯＰＳ）
ＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）。
【００４４】
トロンビン生成曲線を、上記のように測定する。最も特徴的なパラメーターであるピークトロンビン（すなわち、トロンビンの形成および不活化の時間経過の間に測定される最大トロンビン濃度）を、上記ＴＦ／ＰＬ複合体の関数として算出して描く。図３は、上記凍結したＴＦ／ＰＬ複合体または凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発された後に、正常ヒト血漿、ＦＶＩＩＩインヒビター血漿（ＦＥＩＢＡを含まない）、およびＦＶＩＩＩインヒビター血漿（０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成される）において測定された、ピークトロンビン濃度を示す。
【００４５】
トロンビン生成が、上記凍結したＴＦ／ＰＬ複合体または凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発されたか否かを調査した血漿サンプルのいずれにおいても、差は存在しなかった。
【００４６】
（実施例４：マイクロタイタープレートのウェルにおける、ＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物の凍結乾燥）
上記トロンビン生成アッセイを、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実行する。従って、上記ＴＦ／ＰＬ複合体、および／または上記トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を、マイクロタイタープレートのウェルにおいて、個別にかまたは一緒に、直接凍結乾燥する。上記２つの成分をマイクロタイタープレートのウェルにおいて一緒に凍結乾燥する場合、試験されるべき血漿サンプルのみしか、このようなすぐに使用可能な実施形態において添加する必要がない。図４は、上記ＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を、マイクロタイタープレートのウェルにおいて個別に凍結乾燥しようと一緒に凍結乾燥しようと、得られるトロンビン生成曲線およびピークトロンビン濃度に差は存在しないことを示す。
【００４７】
（実施例５：上記トロンビン生成アッセイの感度）
上記トロンビン生成アッセイは、単独または集団の状態にあるいかなる凝固因子に対しても非常に感度が高い。従って、上記アッセイはまた、置換治療および（例えば、ＦＶＩＩＩバイパス剤との）複合治療の効力を決定するためにも使用し得る。図５において観察されるように、上記アッセイは、低活性範囲において（通常の凝固アッセイおよび発色アッセイの一般的検出限界である０．０１Ｕ／ｍＬ未満の凝固因子さえ）特に感度が高い。重篤な血友病者（すなわち、０．０１Ｕ／ｍＬ未満のＦＶＩＩＩ活性またはＦＩＸ活性を有する患者）の間では出血傾向において差が存在するので、この低範囲における上記因子の活性を測定する能力は、これらの患者の自然発生的出血リスクを回避することを補助する。
【００４８】
（実施例６：トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結した水溶性混合物、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥した水溶性混合物の調製）
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ／ＨＣｌトロンビン基質を、１７５ｍＭ  ＮａＣｌと１０％  ＤＭＳＯとを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．３５）中に５分間の磁気攪拌によって溶解し、その後、ＣａＣｌ２を添加する。この時点で沈殿物が出現する。この沈殿物は、３７℃にて１５分間激しく攪拌した後に室温にて１時間ゆっくり攪拌することによって、溶解し得る。生じる透明な溶液は、５ｍＭトロンビン基質および７５ｍＭ  ＣａＣｌ２という最終濃度から構成される。この溶液を、１７５ｍＭ  ＮａＣｌを含む（ＤＭＳＯを含まない）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．３５）でさらに希釈して、１ｍＭトロンビン基質および１５ｍＭ  ＣａＣｌ２という最終濃度にし、アリコートの状態で凍結するか、または凍結乾燥して、注射用水中に溶解した後「すぐに使用可能な」溶液を取得し得る。また、上記の濃縮溶液（すなわち、５ｍＭトロンビン基質および７５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む、溶液）を、アリコートの状態で凍結するか、または凍結乾燥し、必要に応じて、使用前に適切な濃度へと希釈し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＴＦ／ＰＬ複合体の凍結乾燥サイクルの間の温度変化を示す。主要乾燥期間と、最大で低室温２０℃までの遅い昇温期間との間に、小さな勾配の温度変化を含む、長期継続する凍結乾燥サイクルは、ＴＦ／ＰＬ複合体の生物学的活性を保存する。
【図２】図２は、種々の血漿サンプルにおいて、凍結したＴＦ／ＰＬ複合体または凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発されたトロンビン生成曲線を示す。凍結したＴＦ／ＰＬ複合体と、凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体との間において、トロンビン生成（時間に対するトロンビン濃度の曲線として示される）に差は存在しないことが、示される。ＴＦ／ＰＬ複合体が、スクロース（安定剤として使用される）の非存在下で凍結乾燥されようと、スクロース存在下で凍結乾燥されようと、トロンビン生成において差は存在しない。（Ａ）凍結したＴＦ／ＰＬ複合体を用いる正常ヒト血漿。（Ｂ）凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いる正常ヒト血漿。（Ｃ）凍結したＴＦ／ＰＬ複合体を用いるＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｄ）凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いるＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｅ）凍結したＴＦ／ＰＬ複合体を用いる、０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成したＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｆ）凍結したＴＦ／ＰＬ複合体を用いる、０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成したＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｇ）凍結したＴＦ／ＰＬ複合体を用いる、１Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成したＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｈ）凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いる、１Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成したＦＶＩＩＩインヒビター血漿。符号は、スクロースなし：黒四角；０．５％スクロース：白三角；５％スクロース：アスタリスクを示す。
【図３】図３は、ピークトロンビンの比較を示す。ピークトロンビンは、トロンビンの形成および不活化の時間経過の間に観察される最高トロンビン濃度である。このピークトロンビンは、種々の組成の凍結したＴＦ／ＰＬ複合体または凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発された後に、ＦＥＩＢＡを用いない状態および０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成した状態の、正常ヒト血漿およびＦＶＩＩＩインヒビター血漿において測定される。（Ａ）低量のＴＦを含むＴＦ／ＰＬ複合体を用いる正常ヒト血漿。（Ｂ）高量のＴＦを含むＴＦ／ＰＬ複合体を用いる正常ヒト血漿。（Ｃ）低量のＴＦを含むＴＦ／ＰＬ複合体を用いるＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｄ）高量のＴＦを含むＴＦ／ＰＬ複合体を用いるＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｅ）低量のＴＦを含むＴＦ／ＰＬ複合体を用いる、０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成したＦＶＩＩＩインヒビター血漿。（Ｆ）高量のＴＦを含むＴＦ／ＰＬ複合体を用いる、０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成したＦＶＩＩＩインヒビター血漿。符号は、凍結した試薬−１−；凍結乾燥した試薬−２−を示す。
【図４】図４は、上記ＴＦ／ＰＬ複合体、およびトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物が、マイクロタイタープレートのウェルにおいて個別に凍結乾燥されようが、一緒に凍結乾燥されようが、得られるトロンビン生成曲線と、これらの曲線から得られるピークトロンビン濃度とにおいて差は存在しないことを示す。（Ａ）０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成されたＦＶＩＩＩインヒビター血漿において得られるトロンビン生成曲線の比較。凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を用いて測定した曲線（黒丸）と；マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥されたＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を用いて測定した曲線（アスタリスク）と；凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥されたトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を用いて測定した曲線（白四角）と；マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥させたＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥させたトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を用いて測定した曲線（黒三角）との比較。（Ｂ）マイクロタイタープレートのウェルにおいて個別にかまたは一緒に凍結乾燥させた試薬を用いて誘発された、ＦＥＩＢＡを用いないＦＶＩＩＩインヒビター血漿ならびに０．５Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成されたＦＶＩＩＩインヒビター血漿および１Ｕ／ｍＬ  ＦＥＩＢＡで再構成されたＦＶＩＩＩインヒビター血漿において、正常ヒト血漿において測定されたパネルＡから誘導されたピークトロンビン濃度の比較。符号は、凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を用いて測定された、−１−；マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥されたＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、トロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む凍結乾燥混合物を用いて測定された、−２−；凍結乾燥したＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥されたトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を用いて測定された、−３−；マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥させたＴＦ／ＰＬ複合体を用いて誘発され、マイクロタイタープレートのウェルにおいて凍結乾燥させたトロンビン基質とＣａＣｌ２とを含む混合物を用いて測定された、−４−。
【図５】図５は、ＦＶＩＩＩ活性およびＩＸ活性に対する上記トロンビン生成アッセイの感度を示す。（Ａ）ピークトロンビンの第ＶＩＩＩ因子活性依存性変化。この図の拡大部分は、０．１Ｕ／ｍＬよりも低いＦＶＩＩＩ活性の値を示す。（Ｂ）ピークトロンビンの第ＩＸ活性依存性変化。この図の拡大部分は、０．１Ｕ／ｍＬよりも低いＦＩＸ活性の値を示す。
【図１】
2007530963.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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