(57)【要約】  本発明は、エピトープ集合ライブラリー免疫法（ＥＡＬＩ）と称される、多価エピトープ遺伝子ワクチンを作成する方法に関する。本発明は、多価エピトープのキメラ遺伝子ワクチンをスクリーニングするために、遺伝子シャッフリング及びランダムな集合を用いて、異なるサイズと長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子の発現ライブラリーを作成することに関する。本発明の遺伝子ライブラリーを用いて個体を免疫することにより、高レベルの特異的抗体、特定の種類のサイトカイン、及び個体防御を誘導できた。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程から成る多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンの製法：
ａ）それぞれが、対象である抗原の単一エピトープをコードする、多数の核酸分子を選択し、合成し、ベクターにクローニングする工程、
ｂ）アイソコーダマー連結を用いて、工程ａ）で得たベクター中にランダムに連結した２価エピトープをコードする核酸分子を構築する工程、
ｃ）工程ｂ）で得た２価エピトープをコードする核酸分子から、異なる長さの多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てる工程、
ｄ）異なる長さ域に従って多価エピトープキメラ遺伝子を抽出し、精製し、増幅し、その後、これらの多価エピトープキメラ遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、原核宿主に形質導入し、夫々対応する長さ域の多価エピトープキメラ遺伝子発現ライブラリーを得る工程、
ｅ）各発現ライブラリー内の多価エピトープキメラ遺伝子の差異を検知して、遺伝子ライブラリーの高い多様性を確認する工程、
ｆ）各多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリーを用いて動物を免疫し、多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリー中の遺伝子発現産物の免疫原性を検出する工程、
ｇ）工程ｅ）及び工程ｆ）の結果に従い、適切に組み立てた多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンを含む１ないし２以上の遺伝子ライブラリーを決定する工程、及び
ｈ）高処理能力免疫化学的方法により、工程ｇ）で得た遺伝子ライブラリーから高い免疫原性を持つ多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンをスクリーニングする工程。
【請求項２】
工程ｃ）において、異なる長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てることを、次の２方法を同時に行うことにより実行する請求項１に記載の製法：１）ポリメラーゼ連鎖反応とプライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応、及び２）ランダムに組み立てるためのベクター内のアイソコーダマー連結。
【請求項３】
工程ａ）における対象である抗原が、感染症、腫瘍又は自己免疫疾患に関係する抗原である請求項１に記載の製法。
【請求項４】
工程ａ）における対象である抗原が、Plasmodium falciparumの抗原である請求項３に記載の製法。
【請求項５】
請求項１の製法で得られた多価エピトープキメラ遺伝子ワクチン。
【請求項６】
悪性マラリアに対する遺伝子ワクチンである請求項５に記載の多価エピトープキメラ遺伝子ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、遺伝子ワクチンを人工的に作成する方法に関し、この方法をエピトープ集合ライブラリー免疫法（ＥＡＬＩ）と称する。本発明による方法は、一般的に多価エピトープのキメラ遺伝子ワクチンをスクリーニングするために、遺伝子シャッフリング及びランダムな集合を用いて、異なるサイズと長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子の発現ライブラリーの構築に関与する。
【背景技術】
【０００２】
Stemmerにより開発されたＤＮＡシャッフリング技術が１９９４年にScienceに掲載されて以来、様々な改良された遺伝子シャッフリングのプロトコール（非特許文献１〜３）、付着伸長プロセス法（非特許文献４）、融合酵素作成のための漸増的短縮（incremental truncation法）（非特許文献５）及び一時的鋳型上のランダムなキメラ生成（非特許文献６）等を用いた遺伝子の人工的進化に関する多くの分子育種技術が発展した（非特許文献７）。今日まで、多くの成功例において、分子進化技術の基本原理が、抗生物質の力価を改良するための一般的な生物学的プロテアーゼ、環境汚染物質の分解、ウィルスの再構成、及び医薬品の開発に至る分野で遺伝子を作成又は改変するために適用された。しかしながら、第３世代ヒトワクチンであるＤＮＡワクチンの分野への適用は少ない。多くの専門家は、遺伝子ワクチンに遺伝子シャッフリング技術が成功すれば、がん、自己免疫疾患、及びヒトの健康に深刻に有害な感染症のような疾患に広く適用できると予想しているが（非特許文献８〜１０）、実質的進歩を示す関係文献、特許はない。
【０００３】
遺伝子ワクチンは１９９０年代に進歩した新しい免疫理論と技術を代表し、弱力化したウィルスワクチン及びサブユニットワクチンに次ぐ第３世代のワクチンである（非特許文献１１）。遺伝子ワクチンの技術は、外来性のタンパク質をコードする塩基配列を持つプラスミドＤＮＡを体内に直接注入し、体内で外来性タンパク質を直接発現させ、免疫応答を誘導させることから成り立つ。遺伝子ワクチンは旧来のワクチンと比較すると、長期にわたる免疫応答、体液性免疫と細胞傷害性のＴ細胞応答を同時に引き起こすこと、調製の簡単なこと、利便性、低価格、抗原の安定性、及び移送の便利さ、等々多くの利点を有する。遺伝子ワクチンは、組み換え型サブユニットワクチンで証明された安全性、及び一般的な免疫応答の誘導に対する弱力化したウィルスが持つ高い効率を有するばかりでなく、体内に特異的な免疫応答を誘導する。現在に至るまで、遺伝子ワクチンは、新生児のアレルギー応答や免疫寛容の治療ばかりではなく、ウィルス、バクテリア、及び原虫による感染症、及び癌などの治療に対しても広く使われてきた。インフルエンザ、ＡＩＤＳ、狂犬病、Ｂ型肝炎、結核症、マラリア及びリーシュマニア症の治療に対しても有益な進歩がある（非特許文献１２）。ヒトの健康に深刻な影響を持つ、マラリア原虫、ＨＩＶ及び他の非常に変異性に富むウィルスに関しては、非常に有効なワクチンは存在しない。
【０００４】
ワクチン研究によれば、高い変異性を持つ病原体に対しては、様々な期間、様々な抗原を用いることが必要とされている（非特許文献１３）。複数抗原のワクチンに対して、多くの報告及び特許があり、これらは複数の抗原をもつ単一の合成又は組み換えワクチン、及び多価エピトープのタンパク質ワクチン、又は限られた種類のこのような合成又は組み換えワクチンの組み合わせに集中している。更に、ポリペプチドワクチンの合成は非常に高価であり、このことが実際的な応用を妨げている。今や、幾つかの文献により、多価エピトープのキメラ遺伝子ワクチンが報告されているが、多価エピトープ遺伝子間の人工的及び単一キメラパターンに重点が置かれおり、ポリペプチドワクチンより優れた免疫防御効果は達成されてない。多価組み換えＤＮＡワクチンの構築の際、Plasmodium falciparum（ＭＳＡ−１，ＮＫＮＤ及びＣＳＴ３）の３個の抗原性エピトープが選ばれたことを考慮し、本発明の発明者等は、前もって設計した組み合わせパターンに従い、多価エピトープ遺伝子の異なった構築と組み合わせを行い、多価エピトープの組み合わせには最適の集合があることを見出した（非特許文献１４）。この結果によれば、数個のエピトープ（３以下）の組み合わせの場合は、最適な組み合わせは、個々の集合と構築から手作業で得ることができることが分かった。しかしながら多くのエピトープ（３以上）の組み合わせには多くの可能性があり、上記の方法では複雑で、費用がかかり、多くの作業を必要とするので、実際上集合及び構築を行うことは非現実的である。従って、如何に有効に多価エピトープ遺伝子を設計し、病原体の多変異性を克服するかということが遺伝子ワクチンの開発に要求される（非特許文献１５〜１８）。
【０００５】
ヒト健康に危険な影響を与える悪性マラリアを引き起こすPlasmodium falciparumの生活環（ライフサイクル）は複雑であり、ヒトにおける無性生殖と有性生殖、及び蚊における有性生殖とスポロゾイト形成からなる４段階を有する。ヒトにおいて、赤血球外（肝）及び赤血球段階があり、蚊において生殖母細胞及びスポロゾイト段階がある。Plasmodium falciparumはこの様に複雑な生物学的な形質を持つので、宿主及び医薬品の免疫防御に対し非常に変異性の高い応答を示し、その結果単一の防御的抗原性ワクチンではマラリアに対し有効ではない。
【０００６】
【非特許文献１】Huimin Z.他、Nucleic Acids Research,25(6),1307-1308(1997)
【非特許文献２】Andreas C.他、Nature,391(15),288-291(1998)
【非特許文献３】Miho K. 他、Gene,236,159-167(1997)
【非特許文献４】Huimin Z.他、Nature Biotechnology,16,258-261 (1998)
【非特許文献５】Marc O.他、Nature Biotechnology,17,1205-1209(1999)
【非特許文献６】Wayne M.C. 他、Nature Biotechnology,19, 354-359(2001)
【非特許文献７】Juha P.Int Arch Allergy Immunology,121,173-182(2000)
【非特許文献８】Dewey D.Y.R 他、Biotechnology Progress,16(1),2-16(2000)
【非特許文献９】Phillip A P.他、Current Opinion in Biotechnology,8, 724-733(1997)
【非特許文献１０】Robert G.W.他、Curr Opin Mol Ther,3(1),31-36(2001)
【非特許文献１１】Wolff J.A.他、Science,247,1465-8(1990)
【非特許文献１２】Lai W.C.他、Crit Rev Immunol,18(5),449-84(1998)
【非特許文献１３】Doolan D.L.他、Int J Parasitol,31(8),753-62(2001)
【非特許文献１４】Lin C.T.Chinese J of Biochemistry and Molecular Biology,1999,15(6):974-977
【非特許文献１５】Yu Z.他、Vaccine,16(7),1660-7(1998)
【非特許文献１６】Kumar S.他、Trends Parasitol,18(3),129-35(2002)
【非特許文献１７】Hoffman S.L.他、Dev Biol,104,121-32(2000)
【非特許文献１８】Li M.他、Chin Med J(Engl),112(8),691-7(1999)
【非特許文献１９】Jiang Y.他、Chin Med J(Engl),112(8),686-90(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
プラスモディウムによる臨床的症候は、主に宿主の赤血球細胞内の無性生殖に依っている。赤血球段階ワクチンは、プラスモディウムの特徴的な病原段階を直接狙って設計したものである。マラリアワクチンは、弱力化されたスポロザイト周囲ワクチン、サブユニットワクチン及び合成ペプチドワクチンから成り立つが、多くのワクチンが標的とする多くの抗原が充分な防御効果を持たないのでこれらのワクチンは成功してない。従って、同業者の間で良く認められている様に、望みの防御効果を得るためには、マラリアワクチンを構築する際、多段階で多価のエピトープの組み合わせが必要である。しかしながら、手作業で多段階で多価のワクチンを構築する際、ポリペプチドをコードする遺伝子の量と、連結次数を決める事は困難であり、またエピトープＤＮＡワクチンによる体液性免疫の誘導は、一般的に満足のいくものではなく、これらは解決しなければならない問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１態様としては、多価エピトープキメラワクチンの調製方法の提供であり、この方法は、新しい遺伝子ワクチンを構築するために、ランダムライブラリーにおける遺伝子再結合を用いるもので、以下の諸工程から成る：
ａ）それぞれが、対象である抗原の単一エピトープをコードする、多数の核酸分子を選択し、合成し、ベクターにクローニングする工程、
ｂ）アイソコーダマー連結を用いて、工程ａ）で得たベクター中にランダムに連結した２価エピトープをコードする核酸分子を構築する工程、
ｃ）工程ｂ）で得た２価エピトープをコードする核酸分子から、異なる長さの多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てる工程、
ｄ）異なる長さ域に従って多価エピトープキメラ遺伝子を抽出し、精製し、増幅し、その後、これらの多価エピトープキメラ遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、原核宿主に形質導入し、夫々対応する長さ域の多価エピトープキメラ遺伝子発現ライブラリーを得る工程、
ｅ）各発現ライブラリー内の多価エピトープキメラ遺伝子の差異を検知して、遺伝子ライブラリーの高い多様性を確認する工程、
ｆ）各多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリーを用いて動物を免疫し、多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリー中の遺伝子発現産物の免疫原性を検出する工程、
ｇ）工程ｅ）及び工程ｆ）の結果に従い、適切に組み立てた多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンを含む１ないし２以上の遺伝子ライブラリーを決定する工程、及び
ｈ）高処理能力免疫化学的方法により、工程ｇ）で得た遺伝子ライブラリーから高い免疫原性を持つ多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンをスクリーニングする工程。
【０００９】
本発明の方法によれば、異なるエピトープ間の直列再結合の不均一性を増すために、工程ｃ）において異なる長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てることを、以下の２操作を同時に行うことによって実行することができる：１）ポリメラーゼ連鎖反応とプライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応、及び２）ランダムに組み立てるためのベクター内のアイソコーダマー連結。
【００１０】
本発明の１態様によれば、本発明は本発明の方法により調製した多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンを提供するものであり、前記の多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンは、Plasmodium falciparumに対する多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の原理は図１に説明されている。
本発明の方法によると、所定の抗原は様々な感染症、腫瘍、あるいは自己免疫疾患に関係する如何なる抗原でも良い。抗原エピトープの多くの配列は、本技術分野において既知であり、これらの配列に基づき、工程ａ）において、各核酸分子が所定の抗原の単一エピトープをコードする多数の核酸分子を合成することができる。
【００１２】
所定の抗原の単一エピトープをコードする核酸分子をベクター中にクローン化した後、アイソコーダマー技術を用いる本発明の方法により、単一エピトープをコードするこれらの遺伝子をランダムに組み立て、２価エピトープ遺伝子を作成する。本技術分野において様々なアイソコーダマーが既知であり、これらを本発明の方法において用いる。
【００１３】
本発明の方法によると、２価エピトープを得た後、これらをランダムに組み立てて多価エピトープキメラ遺伝子を作成しなければならない。異なるエピトープ間の直列再結合の不均一性を増すために、本発明の一つの好ましい態様として、以下の２操作を同時に行い、異なる長さの多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てた：１）ポリメラーゼ連鎖反応とプライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応；及び２）ベクター中のアイソコーダマー部位を利用したランダムな連結。
【００１４】
このようにして得られた、ランダムに組み立てられた異なる長さを有する多価エピトープキメラ遺伝子を様々な長さ域に従い分離したが、この長さ域は要求に従い設定されるものであり、また通常数百から数千塩基対の長さである。本発明の１態様において、夫々３００，８００，１２００，２０００及び４０００ｂｐを持つ５群のランダムに組み立てた多価エピトープキメラ遺伝子を分離した。当業者は好みの長さ域を設定できると考えられる。次に、これらの分離した多価エピトープキメラ遺伝子群を、精製し増幅した後、本技術分野で既知の適切な発現ベクターにクローン化することができて、また適切な宿主細胞を形質転換のために用いて、多価エピトープキメラ遺伝子の幾つかの発現ライブラリーを得ることができる。
【００１５】
本発明によると、多価エピトープキメラ遺伝子の発現ライブラリーを得た後、ライブラリーの多様性及びライブラリーの発現産物の免疫原性を検出し、適切に組み立てた多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンから成立する１あるいは２以上の遺伝子ライブラリーを更なるスクリーニングのために選択し、多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンを作成する。ライブラリーの多様性が８５％以上であることが好ましい。適切な組み立てを決定する基準は、ライブラリーの高い多様性と発現産物の高い免疫原性である。更に、特異的免疫型、及び検定したライブラリーによって体内に誘導され作られたサイトカイン、又は動物モデルで引き起こされた交叉防御効果等の、所定の抗原エピトープに関係する免疫的特性を、この基準に含めても良い。
【００１６】
本発明の実施例において、発明者等は、Plasmodium falciparum（表１）に対し高い免疫原性を持つことが文献的に証明されている抗原エピトープアミノ酸配列を選択し、ヒト特異的コードンを用いて、エピトープアミノ酸配列に対応するコード配列を作成した（表２及び３）。１４個のエピトープ断片は繰り返されており、ランダムに結合することで異なる長さを有する人工的抗原ライブラリーを構築できて、ここで各ライブラリーは、何千という異なる組み合わせの人工的抗原を含む。マウスを多価エピトープ遺伝子ライブラリーで免疫した後、血清中に非常に高レベルの特異的抗体を得た。Plasmodium yoeliiマウスモデルを用いて、これらの人工的抗原は交叉免疫防御を引き起こすことが示され、このことは本発明の方法により構築した発現ライブラリーは、現存のライブラリーの難点を克服し、また理想的多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンの基礎を築いたことを示す。実施例６のライブラリーを使った最初のスクリーニング結果から、高処理能力免疫化学的方法により高い免疫原性を有する多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンが得られることが分かった。
【００１７】
ｃＤＮＡ発現ライブラリーとは異なり、本発明に記載されたキメラ遺伝子発現ライブラリーにより個体を免疫することの利点は、多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリーはｃＤＮＡ発現ライブラリー利用に伴う非エピトープＤＮＡ配列の干渉を持たず(Shibui A.他、Res Commun Mol Pathol Pharmacol,109(3-4),147-57(2001);Smooker P.M.他、Vaccine,18(23),2533-40(2000);Johnston S.A.他、Vaccine,15(8),808-9(1997))、また遺伝子ワクチンの安全性を改善している、と言うところにある。また、当業者は、遺伝子機能の解析を容易にするために、遺伝子免疫への標的を選択でき、より早く遺伝子ワクチンを調製でき、また本当に防御効果のあるライブラリー内の遺伝子を認識できる。
【００１８】
以下の実施例において、悪性マラリアに対する多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンを調製した。これらの実施例は、発明を説明することだけを意図したものであり、発明の範囲を制限するものではない。当業者は本発明の方法は、悪性マラリアに対する多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンの調製に限られるものではなく、様々な感染症、腫瘍又は自己免疫疾患に対する遺伝子ワクチンの調製に使うことができると理解する。
本発明を更に以下の図及び実施例によって詳しく説明する。
【実施例１】
【００１９】
<Plasmodium falciparumのエピトープ遺伝子断片の機能的断片のクローニングと配列解析>
１．異なる生活環におけるＢ細胞及びＴｈ細胞のエピトープをコードするＤＮＡ配列の修飾。
Plasmodium falciparumの増殖をより有効に阻害し、マラリアのPlasmodium yoelii動物モデルにおける防御をテストするために、Plasmodium yoeliiの様々な生活環で見出されるものと相同なPlasmodium falciparumの様々な生活環で見出される９個の表面抗原ＭＳＰ−１，ＲＥＳＡ，ＭＳＡ−２，ＡＭＡ−１，ＥＢＡ−１７５，ＬＳＡ−１，ＣＳ．Ｔ３，ＮＫＮＤ及び  ＭＡｇ−１から１４個のエピトープを、報告された文献から選択したが（表１）、ここでエピトープのアミノ酸配列に対応する塩基配列を、ヒト特異的コードンを用いて作成した（表２及び３，塩基配列は太活字で表す）。
【００２０】
２．エピトープ遺伝子断片のためのプライマーの設計と合成。
ａ）上記工程１で作成したエピトープ遺伝子配列に基づき、完全な相補的３’末端を持つ２個のプライマーを設計した（表２及び３，相補的配列は２個のプライマー間の重なり配列である）、またＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩのアイソコダマー部位を、夫々、エピトープ遺伝子配列に対する上流及び下流プライマーに導入した。
ｂ）エピトープ連結の立体的自由度を増すために、様々に連結した抗原エピトープのＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩ連結部位の近傍にＧＬｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ）（配列番号１）の構造を導入した。
ｃ）より長いエピトープ遺伝子断片（Ｅ３（ＭＳＡ２）及びＥ６（ＭＳＡ１）のような）に対しては、２度のアニーリングと伸長により遺伝子の全長を得るために４個のプライマーを用いた。
【００２１】
３．エピトープ遺伝子断片のクローニングと配列解析。
ａ）２個の相補的なプライマー間で一致した配列を、９４℃，３０秒間，４５−６０℃（異なるプライマーのＴｍに依存する），３０秒間及び７２℃，４０秒間，４０サイクルと言うＰＣＲ条件下でアニール及び伸長を行った。
ｂ）増幅産物を１／１０容積の１０Ｍ酢酸アンモニウム及び２倍量の純アルコールにより沈殿させ、その後超純度水に溶かし、ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、等量のフェノール処理を行い、１２０００ｒｐｍ、５分間遠心した。上清を１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の純エタノールにより沈殿させ、超純度水に溶かした。
ｃ）消化した産物を、同じ酵素で消化したベクターＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ  ＩＮｃ）に連結し、その後Ｅ．ｃｏｌｉＳＫ３８３株（ＧＡＴＣメチル化欠損株）に形質導入した。ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩ切断により標的クローンを選択した。
ｄ）標的クローンを、５’−ＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号２）の配列を持ち、またベクターＶＲ１０１２のマルチクローニング部位の上流配列でもある、プライマーＣ０３８Ｐを用いて配列決定した。
【実施例２】
【００２２】
<Plasmodium falciparumのエピトープ遺伝子のランダムな組み立て>
１．ランダムに組み立てた２価エピトープ遺伝子の構築。
非常に相同性の低いエピトープ遺伝子間の一致した領域を作り出すために、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と共にＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩのアイソコーダマー部位を使い、実施例１の工程３でクローン化した個々の単一エピトープ遺伝子を連結して２価エピトープ遺伝子を作った。簡単に説明すると、連結のランダム化と効率改良のために、様々な単一遺伝子を等量混合し、２等分した。一方をＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、他方をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。エピトープ遺伝子を含む２個の消化物からの断片を混合し、連結し、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＫ３８３株に電気形質導入し、２価エピトープ遺伝子のランダム集合を含むクローンを得た。
【００２３】
２．ランダムに組み立てた異なる長さの多価エピトープ遺伝子の構築。
異なるエピトープの再結合の不均一性を増すために、ポリメラーゼ連鎖反応及びアイソコーダマーのランダム連結という２つのプロトコールを用いて、ランダムに組み立てた２価エピトープ遺伝子を構築し、最後にこれら２つのプロトコールからの産物を混合し、異なる長さを持つ５個の多価エピトープ遺伝子ライブラリー（夫々、約３００，８００，１２００，２０００及び４０００ｂｐ）を構築した。
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応による構築
上記工程１に述べた２価エピトープ組み換えプラスミドを混合し、その後ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩで切断し、低融点アガローズゲル上で電気泳動に付した。小断片をＤＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて回収し、濃度を知るためにＯＤ２６０／ＯＤ２８０を測定した。
【００２４】
プライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応の反応システム（５０μｌ）を下記の構成要素により調製した：
混合２価エピトープＤＮＡ                                      １μｌ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）        ２Ｕ
１０Ｘ緩衝液                                                  ５μｌ
ｄＮＴＰ                                                          ８μｌ
ｄ２Ｈ２Ｏ                                                    ３６μｌ
【００２５】
反応条件（２５，３５，４５，５５，６５，７５又は８５サイクル）は下記の通りである。第１の工程：９４℃，３分間；９４℃，３０秒間；４２−５５℃，３０秒間；７２℃，３０秒間；２５サイクル；及び７２℃，１０分間。第２の工程：９４℃，３分間；９４℃，４５秒間；５０−５５℃，４５秒間；７２℃，３０秒間，１秒間／サイクル；１０サイクル；及び７２℃，１０分間。プライマーフリー増幅産物の１％アガローズゲル電気泳動を行い、結果を第２図に示すが、これにより組み立てた多価エピトープ遺伝子断片の長さはサイクル数の増加に伴い増加した。異なる長さの５個のＤＮＡ断片（夫々、約３００，８００，１２００，２０００及び４０００ｂｐ）をゲルから回収し、上流プライマー５’−ＡＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡ−３’（配列番号２）及び下流プライマー５’−ＴＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号４）を用いて、従来型のＰＣＲ反応を行った。反応系はプライマーフリーＰＣＲと同じであり、工程：９４℃，３分間；９４℃，３０秒間；５０℃，３０秒間；７２℃，３０秒間；３０サイクル；及び７２℃１０分間を用いた。  増幅産物を精製し、Wizard PCR Prep Purification Kit (Promega)を用いて濃縮し、ＢｃｌＩで切断し、ＥｃｏＲＶ及びＢｃｌＩで切断したベクターＶＲ１０１２に連結し、連結混合物をＥ．ｃｏｌｉＳＫ３８３株に電気導入した。方法と結果を図１及び図２に示す。
【００２６】
ｂ）アイソコーダマーを用いたランダムな連結
上記工程１の２価エピトープ組み換えプラスミドを混合した。ＢｃｌＩ／ＢａｍＨＩで切断した小断片（エピトープ遺伝子を含む）をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断した大断片（エピトープ遺伝子を含む）と連結し、その後連結混合物を感応細胞ＳＫ３８３に電気導入し、ランダムに組み立てた４価エピトープライブラリーを作成する。同様に、異なる長さを持つ多価エピトープ遺伝子の５個のランダムライブラリー（夫々、約３００，８００，１２００，２０００及び４０００ｂｐ）を構築した。
【実施例３】
【００２７】
<Plasmodium falciparumの多価エピトープキメラ遺伝子の発現ライブラリーの構築>
１．夫々、Ｋｏｚａｋ配列と終結コードンを持つ真核生物発現ベクターＶＲ１０ＡとＶＲ１０Ｔの構築。
真核生物Ｋｏｚａｋ配列を含むプライマー（１Ａ：５’−ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧ−３’ （配列番号５）及び１Ｂ：５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’ （配列番号６））を設計し、自己アニールと伸長を行わせた。ＰＣＲ産物をＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉＳＫ３８３株を受容菌株とするベクターＶＲ１０１２にクローン化し、これにより組み換えプラスミドＶＲ１０Ａを得ることができ、Ｔａｋａｒａバイオテク会社に配列決定を委託した。
【００２８】
次ぎに行うランダム構築後の多価エピトープ遺伝子の機能解析を容易にするために、終結コードンＴＡＡＴＡＡをエピトープＥ６（ＭＳＡ−１）の下流に置いた（表２及び３，遺伝子Ｅ６のプライマー６Ｄ）。プライマー６Ａ，６Ｂ，６Ｃ及び６Ｄを合成し自己アニールと伸長を行わせた。ＰＣＲ産物をＢｃｌＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、受容菌株をＥ．ｃｏｌｉＳＫ３８３株とするベクターＶＲ１０１２にクローン化し、これにより組み換えプラスミドＶＲ１０Ｔを得ることができ、Ｔａｋａｒａバイオテク会社に配列決定を委託した。
【００２９】
２．異なる長さの多価エピトープ遺伝子の５個の発現ライブラリーの構築。
ａ）実施例２の工程２で調製した異なる長さを持つ５個の多価エピトープ遺伝子ライブラリーからのプラスミドＤＮＡをＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた断片（エピトープ遺伝子を含む）を回収し、夫々をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドＶＲ１０Ａ（開始コドンを含む）に連結し、その後組み換えプラスミドを得るために感応細胞ＳＫ３８３に電気導入した。
ｂ）同様に工程ａ）における５個の組み換えプラスミドは、ＢｃｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、終結コドンを持つ上記工程１のベクターＶＲ１０ＴのＤＮＡ断片と連結し、図４に示す様に、異なる長さの多価エピトープ遺伝子（夫々、約３００，８００，１２００，２０００及び４０００ｂｐ）の５個の発現ライブラリー（夫々、Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．４及びＮｏ．５）を構築した。
【００３０】
３．多価エピトープキメラ遺伝子の発現ライブラリーの遺伝子多様性の解析。
Ｎｏ．３及びＮ０．４ライブラリーについて一本鎖高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）を調べた。その結果、図５に示す様に、両ライブラリーのキメラ遺伝子の多様性は９５％（夫々、２４／２５及び２５／２５）以上であった。この検査の工程を以下に記す：
ａ）ライブラリーから無作為に２５クローンを選択し、ベクターＶＲ１０１２のマルチクローニング部位の上流配列のプライマー（Ｃ０３８Ｐ：５’−ＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号７））、及びベクターＶＲ１０１２のマルチクローニング部位の下流配列のプライマー（Ｃ０３９Ｐ：５’−ＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡ−３’（配列番号８））を用いてＰＣＲ（増幅条件：９４℃，３０秒間；５５℃，３０秒間，７２℃，１分間，３０サイクル）を行った。増幅産物を沸騰水中で１０分間インキュベートし、１０分間氷上で冷却し、その後１０Ｘ試料緩衝液と混合した。
【００３１】
ｂ）上記試料を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、５Ｖ／ｃｍで泳動した。電気泳動後、ゲルはガラス上に固定した。
ｃ）ゲルの付いたガラスをペトリ皿に置き、固定緩衝液（１０％氷酢酸ｖ／ｖ）を加え、ゲルを少なくとも２０分間水平に浸けゆっくり振とうさせた。固定後、固定緩衝液を回収し、現像後の固定液として用いた。
ｄ）ゲルを再蒸留水で３回濯いだ。
ｅ）染色液（２ｇＡｇＮＯ３、３ｍｌの３７％ホルムアルデヒド／２Ｌの脱イオン水）を加えて、ペトリ皿を３０分間ゆっくり振とうした。
ｆ）ゲルを再蒸留水で２０秒間濯いだ（注意：濯ぎ時間は余り長すぎない様）。
ｇ）予冷した現像液（６０ｇＮａ２ＣＯ３、３ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、４００μｌの１０ｍｇ／ｍｌチオ硫酸ナトリウム溶液を２Ｌの脱イオン水に加え、温度が１０−１２℃になるまで水槽に置いた）を加え、ゲル中のバンドが見えるまでペトリ皿をゆっくり振とうさせた（通常５−６分間）。
ｈ）現像反応を中止させるために等量の固定液をペトリ皿に加え、ペトリ皿を２−３分間ゆっくり振とうした。
ｉ）ゲルを再蒸留水で３回濯いだ。
ｊ）ゲルを空気乾燥させ、ランプ下で検出した。
【実施例４】
【００３２】
<５個の多価エピトープ遺伝子ライブラリーの免疫原性の検出>
１．異なるライブラリーの多価エピトープ遺伝子を持つ組み換えプラスミドの調製
実施例３の工程２で構築した、異なる長さを持つ多価エピトープ遺伝子ライブラリー（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．４及びＮｏ．５）を含むバクテリアを、夫々プレートから洗い入れ、対応する抗生物質の入ったＬＢ液体培地中で培養した。その後、対応する抗生物質の入った１ＬのＬＢ液体培地に、１：１００の割合で少量の接種菌を加えて接種し、バクテリアは対数期増殖に至るまで培養した。バクテリアを集菌した。プラスミドをＷｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐｓプラスミド抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。ＤＮＡ濃度はＤＵ７０紫外分光器（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてＯＤ２６０／ＯＤ２８０から計算した。
【００３３】
２．多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリーで免疫したマウスの抗血清の調製。
上記工程１で得た遺伝子ワクチンライブラリーの組み換えプラスミドの各種ＤＮＡ１００μｇを、無菌化した生理食塩水を使って、各種ＤＮＡ溶液が等量になるよう調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループを、各グループ３匹の動物を使い、等量の上記ＤＮＡ溶液を両足の上腕骨（大腿骨）四頭筋に注入し免疫した。対照として空のベクター及びＤＮＡなしのブランクを使った。免疫は２週間ごとに合計３回追加免疫を行った。免疫後、各グループから血液試料を摂り出し、ポリクローナル抗血清を集めた。
【００３４】
３．酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）による異なる多価エピトープ遺伝子ライブラリーにより作られた抗体レベルの検出。
陽性対照、陰性対照及びブランク対照存在下に、コーティング抗原として混合エピトープ合成ペプチドを用いた。試験する抗血清の二倍稀釈系列（４００，８００，１６００，３２００，６４００，１２８００，２５６００及び５１２００の様な）を用いた。図６に示す様に、異なる多価エピトープ遺伝子ライブラリーで免疫した後の抗血清の最高稀釈（力価）をＥＬＩＳＡで検知した。この結果、異なる長さの遺伝子ライブラリーは異なる免疫原性を有し、高力価の抗体が産生された。検定のそれぞれの工程を以下に記す：
【００３５】
ａ）コーティング：単一又は混合したエピトープの合成ペプチドをコーティング抗原として用い、０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．２のコーティング緩衝液で望みの濃度（２００ｎｇ／１００μｌ／ウェル）まで稀釈した。ピペットを用いて、各ウェルに１００μｌ加えた後、加湿環境下に４℃一晩又は３７℃４時間プレートを靜置した。プレートを傾けＰＢＳＴで５回濯いだ。
ｂ）ブロッキング：２００μｌの１％ＢＳＡを各ウェルに加え、プレートを３７℃１時間インキュベートした。
ｃ）プレートをＰＢＳＴで５回濯いだ。
ｄ）検査するマウスから得た抗血清の添加：ＰＢＳ溶液で検査する抗血清の２倍稀釈系列を作り、各濃度の稀釈抗血清１００μｌを各ウェルに加えたもの各３検体準備し、４℃一晩インキュベートした。
ｅ）プレートをＰＢＳＴで５回濯いだ。
ｆ）ホースラッディシュペルオキシダーゼでラベルした抗体、即ち馬−抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰの添加：１００μｌのラベルした抗体のＰＢＳ／ＢＳＡ（１：１０００）稀釈液を各ウェルに添加し、加湿環境で３７℃２時間インキュベートした。
ｇ）プレートをＰＢＳＴで５回濯いだ。
ｈ）発色：各ウェルに１００μｌの基質発色緩衝液を加え、プレートを室温で１０分間靜置した。
ｉ）反応停止のために各ウェルに５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えた。
ｊ）４５０ｎｍの吸光度をLabsystems Genesis V3.03系で読み、結果を解析した。
【００３６】
基質発色緩衝液（ｐＨ５．０）
溶液Ａ：１．９２ｇのクエン酸塩（無水）をｄｄＨ２Ｏに加え最終容積を１００ｍｌとした。
溶液Ｂ：７．１６ｇのＮａ２ＨＰＯ４（１２結晶水を含む）をｄｄＨ２Ｏに加え最終容積を１００ｍｌとした。
２．４３ｍｌの溶液Ａ、２．５７ｍｌの溶液Ｂ及び５ｍｌの水を混合し、１０ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０を作った。
発色反応の前に、新鮮な発色緩衝液を調製するために、０．０１５ｍｌの３０％過酸化水素及び０．００４ｇのＴＭＢを１０ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液に加えた。
【００３７】
４．天然型タンパク質を異なる多価エピトープ遺伝子ライブラリーで産生したポリクローナル抗血清で認識するための間接免疫蛍光検定（ＩＦＡ）の検出結果。
異なる多価エピトープ遺伝子ライブラリーにより産生した抗血清が、Plasmodium falciparum 及びPlasmodium yoeliiの天然型タンパク質を認識するか否か決定するために、間接的免疫蛍光検定（ＩＦＡ）を用いた。図７及び８に結果を示す様に、陽性対照存在下で、抗体の認識可能な最大稀釈を決定し、また共焦点顕微鏡を用いて抗体の結合部位を決定した。この検定の個々の工程を以下に記す：
【００３８】
１）Plasmodium falciparumの天然型タンパク質の認識。
ａ）赤血球段階Plasmodium falciparum 3D7（又はＦＣＣ１）（感染率約２％）を含む赤血球細胞を均一にスライド上に広げ、スライドを室温で空気乾燥させた。
ｂ）１００％アセトンを用いて１０分間で細胞を固定した。
ｃ）スライドを室温で空気乾燥させ、蛍光マークペンでマークし、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用い３０分室温処理でブロックを行った。
ｄ）スライドを３回、各１０分間、ＰＢＳで濯ぎ、空気乾燥した。
ｅ）異なる稀釈率（１：５００，１：１０００，１：２０００，１：４０００）の一次抗血清（上記同様マウスからの抗血清）を加え、スライドを加湿環境下、室温で３０分間インキュベートした。ＭＡｂＭ２６−３２を陽性対照として用いた。
ｆ）スライドを３回、各１０分間、ＰＢＳで濯ぎ、空気乾燥した。
ｇ）１：１００に稀釈したＦＩＴＣでラベルした馬−抗マウスＩｇＧを加え、スライドを加湿環境下で３７℃３０分間インキュベートした。
ｈ）スライドを３回、各１０分間、ＰＢＳで濯ぎ、空気乾燥した。
ｉ）５０％グリセロールを用いてスライドをカバースリップで封じ、蛍光顕微鏡又は共焦点蛍光顕微鏡を用いて視覚化した。
【００３９】
２）Plasmodium yoeliiの天然型タンパク質の交叉認識。
ａ）Plasmodium yoelii（感染率約５０％保有）を含む赤血球細胞を均一にスライド上に広げ、スライドを室温で空気乾燥した。
ｂ）他の工程は、上記１）項のPlasmodium falciparumの天然型タンパク質の認識の場合と同じである。
【００４０】
５．様々な多価エピトープ遺伝子ライブラリーにより産生した抗血清のウェスタンブロットによる検出。
様々な多価エピトープ遺伝子ライブラリーにより産生した抗血清がPlasmodium falciparumの天然型抗原を認識することを示すために、実施例４，工程２の抗血清を稀釈し、スパニン処理したPlasmodium falciparumからＳＤＳ−ＰＡＧＥで抽出した寄生体タンパク質を用いたウェスタンブロットに付した。本実施例では多価エピトープライブラリーＮｏ．３を用い、得られた結果からライブラリーＮｏ．３の遺伝子ワクチンで産生した抗血清は、様々なサイズの１０個以上の寄生体タンパク質を認識し、高濃度の抗体を有することが分かった。結果を図９に示した。本実施例の個々の工程は下記の通りである：
【００４１】
ａ）試料の処理：１又は２培養皿のPlasmodium falciparum 3D7株を遠心で集め、ＰＢＳで２回洗浄し、赤血球細胞を壊すために最終濃度０．２％のスパニン処理を行った。その後、沈殿物を２回ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに可溶化し、１０Ｘ試料緩衝液と混合し、沸騰水槽中で１０分間インキュベートした。
ｂ）免疫ブロッティング：処理した試料を分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に電気的に移行(electrotransfer)させ、その膜を３％ＢＳＡにより室温１時間ブロックし、ＰＢＳで３回濯いだ。次ぎに、ＢＳＡで稀釈した遺伝子ライブラリーで産生した一定量の抗血清を加え、膜を室温で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳで３回洗浄後、アルカリホスファターゼでラベルした２次抗体である馬−抗マウスＩｇＧ（Ａｐ−ＩｇＧ）を加え、室温で１時間インキュベートした。膜を３回ＰＢＳで洗浄した。最後に膜をアルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）で１度濯いだ。
ｃ）発色と発色の停止：５ｍｌのアルカリホスファターゼ緩衝液につき３３μｌのニトロブルーテトラゾリウム（７０％ジメチルスルフォキシド中に５０ｍｇ／ｍｌ）及び１６．５μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インド−リル−ホスフェート溶液（１００％ジメチルスルフォキシド中に１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。１０分後、停止緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８），５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）を加えて反応を停止させた。
【実施例５】
【００４２】
<異なるライブラリーからの多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンによるP.yoeliiに対する交叉防御>
悪性マラリアに対する多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンをより効率よく構築するために、発明者等は本発明の遺伝子ワクチンのP.yoelii動物モデルにおける防御効果をテストした。その結果、５個の多価エピトープ遺伝子ライブラリーは全て、程度は異なるが、防御性があることを示し（図１０）、このことがPlasmodium falciparumに対する人工的にシャッフルした遺伝子ワクチンの防御効果に関するin vivo防御モデルに対する基礎を築いた。本実施例の各々の工程を以下に記す：
ａ）P.yoeliiの試料を液体窒素から取り出し、３７℃水槽中で解凍した。試料５００μｌをＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入した。数日後、血液試料を摂り、スライド上に塗布し、メタノールで固定し、ギムザ染色した。感染率を顕微鏡下で計数した。
ｂ）P.yoeliiに感染したマウスの血液を尾から集め、ＣＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ ３．２ｇ，ＫＣｌ ０．０８ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４(１２Ｈ２Ｏ １．１６ｇ，ＫＨＰＯ４ ０．０８ｇ，クエン酸ナトリウム ３．８ｇを水に溶かし（ｐＨ７．２）５００ｍｌに調製）中に落とした。寄生体に感染した赤血球細胞の濃度を血球計算板で計数した。
ｃ）実施例４の工程２で免疫したＢａｌｂ／ｃマウス腹腔に上記の工程で得た血液をマウス当たり２Ｘ１０５感染赤血球の投与量で注入した。
ｄ）３日ごとに、マウス尾から抗血清を集め、スライド上に塗布し、感染率を計算した。更に、対照及び実験群の生存率を観察した。
【実施例６】
【００４３】
<高処理能力免疫化学的方法により得た高い免疫原性を有する多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンのin vivoテスト>
多価エピトープ遺伝子ライブラリー（実施例４）のin vivo免疫原性テスト、及びP.yoelii感染に対する防御テストの結果（実施例５）から、高レベルの免疫応答及び防御力を有する多価エピトープ遺伝子ライブラリーを選択した。高処理能力免疫化学的方法のスクリーニングプロトコールに従い、高い免疫原性を有する幾つかの陽性クローンを得ることができた。陰性遺伝子クローン及び無作為に選んだ空ベクターの存在下で、原核生物発現に対するウェスタンブロットによる検出を行い、マウスの免疫応答に関与するサイトカインＣＤ４及びＣＤ８を検査した。
【００４４】
１．原核生物発現物のウェスタンブロット検出
この結果により、発現した対応するタンパク質をスクリーニングすることで、高い免疫原性のある遺伝子ＳＰ３１２及びＳＰ３５２を得たことが分かる。これら２個の遺伝子を用いて産生した抗体を高稀釈した後でも、尚ウェスタンブロッティングによって陽性のハイブリダイゼーションバンドが検出されるが、低い免疫原性の遺伝子ＳＮ３３，ＳＮ３４及びＳＮ３６及び陰性対照の空のベクターを用いた場合、シグナルのあるバンドは検出されなかった。このことは、多価エピトープ遺伝子ＳＰ３１２及びＳＰ３５２は、遺伝子ＳＮ３３，ＳＮ３４及びＳＮ３６に比べ、高い力価の抗体を産生することを示す（図１１）。
【００４５】
２．マウスの免疫応答に関与するサイトカインＣＤ４及びＣＤ８の検出。
得られた陽性（高免疫原性）遺伝子クローンＳＰ３１２，ＳＰ３５２及びＳＰ４６２をin vivo免疫により確認した。陰性（低免疫原性）遺伝子クローン及び空ベクターの存在下で、Ｂａｌｂ／ｃマウスを３回免疫し、脾臓リンパ球を採取し、フローサイトメトリーを用いてサイトカインＣＤ４及びＣＤ８の検出を行った。この結果、陽性（高免疫原性）遺伝子クローンＳＰ３１２，ＳＰ３５２及びＳＰ４６２は顕著にサイトカインＣＤ４の産生、及び一定レベルのサイトカインＣＤ８の産生を誘導したが、ここで陽性多価エピトープ遺伝子ＳＰ３１２は、ＳＰ３５２又はＳＰ４６２より著しく高いレベルのサイトカインを産生した。これに対し、陰性多価エピトープ遺伝子は、空ベクターと同じ効果を示し、より高い免疫原性をもつ多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンは、高処理能力免疫化学的方法によって得ることができることを示した（図１２）。
【００４６】
表１  本発明で用いた異なる生活環におけるPlasmodium falciparumの抗原のＢ−及びＴｈ−細胞エピトープのアミノ酸配列。
【表１】
2007509837.tif 000002
【００４７】
表２．エピトープ遺伝子クローニングのためのプライマー配列（その１）
【表２】
2007509837.tif 000003
【００４８】
表３．エピトープ遺伝子クローニングのためのプライマー配列（その２）
【表３】
2007509837.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】多価エピトープ遺伝子のランダムな組み立てを示す概念図である。図において、１：幾つかの単一エピトープ遺伝子の取得；２：ランダムな組み立てによる２価エピトープの構築；３：プライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応；４：異なる長さのＤＮＡ断片の抽出と精製、及びキメラ遺伝子ライブラリーの樹立。
【図２】プライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応を用い、異なる条件下でランダムに構築した多価エピトープ遺伝子のグラフであり、以下の様にして得たものである：鋳型としてランダムに集めた２価エピトープ遺伝子の混合物の使用（０．５μｇ／μｌの濃度の試料を夫々、０．５μｌ，１．０μｌ，及び２．０μｌ）、また５０μｌの系において、プライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応は、夫々２５，３５，４５，５５，６５，７５，及び８５サイクル行った。この結果によると、鋳型量が０．５(ｌ（２５０ｎｇ）以下の場合サイクル数が増加するに従い、主要増幅産物のサイズは増加した。６５−７５サイクルを使うと、長さは約２ｋｂであり、８５サイクル以上では、断片長は４ｋｂ以上であった。
【図３】ある真核発現ベクター内の多価エピトープキメラ遺伝子の遺伝子構造を示す。遺伝子発現分析のために、共通のエピトープ配列（即ち、Ｅ６（ＭＳＡ−１））を各多価エピトープ遺伝子の下流に挿入できる。
【図４】異なる多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリー内の遺伝子長の比較を示す。ここでＭ，(／ＨｉｎｄＩＩＩ；１，Ｎｏ．１ライブラリー／ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩの遺伝子；２，Ｎｏ．２ライブラリー／ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩの遺伝子；３，Ｎｏ．３ライブラリー／ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩの遺伝子；４，Ｎｏ．４ライブラリー／ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩの遺伝子；５，Ｎｏ．５ライブラリー／ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩの遺伝子。
【図５】異なる長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリーの遺伝子の多様性解析を示す。ＡはＮｏ．３遺伝子ライブラリーの遺伝子の構造的多様性は、９６％（２４／２５）であることを示し、ＢはＮｏ．４遺伝子ライブラリーの遺伝子の構造的多様性は、１００％（２５／２５）であることを示す。両ライブラリーより２５組み換えクローンをランダムに選択し、ベクターＶＲ１０１２のマルチクローニングサイト上流、下流のプライマーによるＰＣＲを行った。増幅産物を１００℃、１０分間変性し、１０分間氷上に置き、その後ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）のための１０Ｘ試料緩衝液と混合し、バンド間の差異を分析した。
【図６】異なる長さの遺伝子ライブラリーの多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンの混合物で免疫したマウスにおける抗体レベルを示す。８エピトープ（Ｅ２（ＮＫＮＤ），Ｅ３（ＭＳＡ−２），Ｅ５（ＥＢＡ−１７５），Ｅ６（ＭＳＡ−１），Ｅ７（ＬＳＡ−１），Ｅ８（ＣＳ．Ｔ３／ＣＳＰ），Ｅ９（ＭＳＰ−１）及びＥ１１（ＡＭＡ−１））を混合し、ウェル当たり２００ｎｇでミクロプレートの表面を覆った。５個の混合遺伝子ライブラリーを用いて、抗血清を得るために、１００μｇＤＮＡ量でデンドリマーＰＡＭＡＮ  Ｇ９（１：６．５，ｗ／ｗ）を用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。ＯＤ４５０当たりの抗体値を測定するために抗血清を２Ｘ稀釈した。陽性値は対照値の少なくとも二倍の値を持つ。
【図７】異なる長さを持つライブラリーの混合多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンにより作られた対応する抗体の稀釈物中のＩＦＡ検出を示す。５個の遺伝子ライブラリーを用いてＢａｌｂ／ｃマウスを２度１００μｇＤＮＡの濃度で免疫し２Ｘ稀釈の抗血清を得た。陰性対照を標準として用い、陽性値は対照の蛍光強度より著しく異なる蛍光強度を有した。
【図８】共焦点顕微鏡の結果を示す。Ｎｏ．４ライブラリーの混合エピトープ遺伝子ワクチンに対する抗体は、異なるプラスモディウムの天然型の抗原を認識することを示す。Ａ．Plasmodium falciparum 3D7の血液の塗布標本；Ｂ．Plasmodium falciparum FCC1の血液の塗布標本；Ｃ．Plasmodium yoeliiの血液の塗布標本。
【図９】ウェスタンブロットの結果を示す。Ｎｏ．３ライブラリーの混合多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンに対する対応する抗血清は、プラスモディウム３Ｄ７株の天然型の抗原を認識することを示す。１．Spanin非処理の３Ｄ７株の培養；２．Spanin処理の３Ｄ７株の培養；３．対照としての赤血球細胞培養；Ｍ．低分子量マーカー（９７，６６，４５，３０，２０．５，１４．４ｋＤａ）。この結果は、Ｎｏ．３ライブラリーの混合多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンに対する抗血清を３０００Ｘ稀釈後、抗血清は尚Ｓｐａｎｉｎ処理した様々な３Ｄ７抗原を認識できたことを示す。
【図１０】Plasmodium yoeliiに対する、異なるライブラリーからの混合多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンによる交叉防御を示す。併行した対照として空のベクターと生理食塩水存在下で、異なるライブラリーからの混合多価エピトープキメラ遺伝子ワクチン（ライブラリーＮｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．４及びＮｏ．５）を用いて、２Ｘ１０５感染性Plasmodium yoeliiを腹膜注射する前に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群７匹）を３回免疫した。３日に一度死亡マウスを観察した。この結果は、Ｎｏ．２，Ｎｏ．３及びＮｏ．４ライブラリーは防御効果を引き起こし、Ｎｏ．３ライブラリー（約１２００ｂｐを有する）からの多価エピトープ遺伝子の防御率は４２．８％までになったことを示す。
【図１１】高い免疫原性を有する抗原遺伝子の原核生物における発現のウェスタンブロットを示す。図１１Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；図１１Ｂ．ハイブリダイゼーション膜。１．選択した陽性クローンＳＰ３１２；２．ベクター；３．陰性クローンＳＮ３３；４．ＳＮ３４；５．ＳＰ３５２；６．ＳＮ３６．
【図１２】ライブラリーからスクリーニングした陽性（ＳＰ）及び陰性（ＳＮ）クローンにより誘導されたin vivo免疫応答に関与するサイトカインの検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007509837.tif 000013
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月14日(2006.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程から成る多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンの製法：
ａ）それぞれが、対象である抗原の単一エピトープをコードする、多数の核酸分子を選択し、合成し、ベクターにクローニングする工程、
ｂ）アイソコーダマー連結を用いて、工程ａ）で得たベクター中にランダムに連結した２価エピトープをコードする核酸分子を構築する工程、
ｃ）工程ｂ）で得た２価エピトープをコードする核酸分子から、異なる長さの多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てる工程、
ｄ）異なる長さ域に従って多価エピトープキメラ遺伝子を抽出し、精製し、増幅し、その後、これらの多価エピトープキメラ遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、原核宿主に形質導入し、夫々対応する長さ域の多価エピトープキメラ遺伝子発現ライブラリーを得る工程、
ｅ）各発現ライブラリー内の多価エピトープキメラ遺伝子の差異を検知して、遺伝子ライブラリーの高い多様性を確認する工程、
ｆ）各多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリーを用いて動物を免疫し、多価エピトープキメラ遺伝子ライブラリー中の遺伝子発現産物の免疫原性を検出する工程、
ｇ）工程ｅ）及び工程ｆ）の結果に従い、適切に組み立てた多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンを含む１ないし２以上の遺伝子ライブラリーを決定する工程、及び
ｈ）高処理能力免疫化学的方法により、工程ｇ）で得た遺伝子ライブラリーから高い免疫原性を持つ多価エピトープキメラ遺伝子ワクチンをスクリーニングする工程。
【請求項２】
工程ｃ）において、異なる長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てることを、次の２方法を同時に行うことにより実行する請求項１に記載の製法：１）ポリメラーゼ連鎖反応とプライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応、及び２）ランダムに組み立てるためのベクター内のアイソコーダマー連結。
【請求項３】
工程ａ）における対象である抗原が、感染症、腫瘍又は自己免疫疾患に関係する抗原である請求項１又は２に記載の製法。
【請求項４】
工程ａ）における対象である抗原が、Plasmodium falciparumの抗原である請求項３に記載の製法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製法で得られた多価エピトープキメラ遺伝子ワクチン。
【請求項６】
悪性マラリアに対する遺伝子ワクチンである請求項５に記載の多価エピトープキメラ遺伝子ワクチン。
【請求項７】
以下の工程から成る、ワクチン製造のための多価エピトープキメラ遺伝子の製法：
ａ）それぞれが、対象である抗原の単一エピトープをコードする、多数の核酸分子を選択し、合成し、ベクターにクローニングする工程、
ｂ）アイソコーダマー連結を用いて、工程ａ）で得たベクター中にランダムに連結した２価エピトープをコードする核酸分子を構築する工程、
ｃ）工程ｂ）で得た２価エピトープをコードする核酸分子から、異なる長さの多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てる工程、
ｄ）異なる長さ域に従って多価エピトープキメラ遺伝子を選択し、これらの多価エピトープキメラ遺伝子を発現ベクターにクローニングし、夫々対応する長さ域の多価エピトープキメラ遺伝子発現ライブラリーを得る工程、及び
ｅ）各発現ライブラリー内の多価エピトープキメラ遺伝子の差異を検知して、ワクチン製造に用いるための遺伝子ライブラリーの高い多様性を確認する工程。
【請求項８】
工程ｃ）において、異なる長さを持つ多価エピトープキメラ遺伝子をランダムに組み立てることを、次の２方法を同時に行うことにより実行する請求項７に記載の製法：１）ポリメラーゼ連鎖反応とプライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応、及び２）ランダムに組み立てるためのベクター内のアイソコーダマー連結。
【請求項９】
工程ａ）における対象である抗原が、感染症、腫瘍又は自己免疫疾患に関係する抗原である請求項７又は８に記載の製法。
【請求項１０】
工程ａ）における対象である抗原が、Plasmodium falciparumの抗原である請求項９に記載の製法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の製法で得られた多価エピトープキメラ遺伝子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の多価エピトープキメラ遺伝子の発現により得られるタンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】  プライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応を用い、異なる条件下でランダムに構築した多価エピトープ遺伝子のグラフであり、以下の様にして得たものである：鋳型としてランダムに集めた２価エピトープ遺伝子の混合物の使用（０．５μｇ／μｌの濃度の試料を夫々、０．５μｌ，１．０μｌ，及び２．０μｌ）、また５０μｌの系において、プライマーフリーポリメラーゼ連鎖反応は、夫々２５，３５，４５，５５，６５，７５，及び８５サイクル行った。この結果によると、鋳型量が０．５μｌ（２５０ｎｇ）以下の場合サイクル数が増加するに従い、主要増幅産物のサイズは増加した。６５−７５サイクルを使うと、長さは約２ｋｂであり、８５サイクル以上では、断片長は４ｋｂ以上であった。
【国際調査報告】
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