(57)【要約】【課題】  植物病に対する拮抗作用を有する新規な枯草菌株、これを含む植物病防除用の微生物製剤、及び該微生物製剤を用いて植物病を生物学的に防除する方法を提供する。【解決手段】  本発明による新規な枯草菌（Bacillus subtilis）ＥＢ１２０菌株は、オオムギうどん粉病、キュウリうどん粉病、トウガラシ炭疽病、イネいもち病、トマト灰色かび病、トマト疫病、及び小麦赤さび病を含む多様な植物病の防除のための強い拮抗作用を有するので、植物病の生物学的な防除に有用である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病に対して拮抗作用を有する枯草菌（Bacillus subtilis）ＥＢ１２０菌株（ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ）の生物学的純粋培養液。
【請求項２】
枯草菌 ＥＢ１２０菌株（ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ）又はこれから由来した物質を有効成分として含むことを特徴とする植物病防除用の微生物製剤。
【請求項３】
前記物質が、枯草菌ＥＢ１２０菌株の培養液全体と、前記培養液のブタノール抽出物と、枯草菌ＥＢ１２０菌株の胞子、からなる群から選択されることを特徴とする請求項２記載の植物病防除用の微生物製剤。
【請求項４】
前記植物病が、オオムギうどん粉病、キュウリうどん粉病、トウガラシ炭疽病、イネいもち病、トマト灰色かび病、トマト疫病、及び小麦赤さび病からなる群から選択されることを特徴とする請求項２記載の植物病防除用の微生物製剤。
【請求項５】
枯草菌 ＥＢ１２０菌株（ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ）又は請求項２の微生物製剤を効果的な量で植物に適用する段階を含むことを特徴とする植物病の防除方法。
【請求項６】
前記植物病が、オオムギうどん粉病、キュウリうどん粉病、トウガラシ炭疽病、イネいもち病、トマト灰色かび病、トマト疫病、及び小麦赤さび病からなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の植物病の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病に対する拮抗作用（antagonistic activity）を有する新規な枯草菌株（Bacillus subtilis）、これを含む植物病防除用の微生物製剤、及び該微生物製剤を用いて植物病を生物学的に防除する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物耕作の際農薬を用いない場合、３０％から最高１００％までの収穫量の減少が起こる問題があるので、収穫量の増加のためには農薬の使用が必須的である。しかし、化学合成農薬の乱用は、土壌、水質及び農産物汚染、毒性、生態系撹乱、抵抗性菌株の出現など色々の問題を引き起こす。このような問題点を解決するための一つの方法は、拮抗微生物を用いた生物農薬（Biopesticide）を開発することである。生物農薬は植物抽出物、微生物、天敵、天然生理活性物質及び遺伝子組換え生物（ＧＭＯ；genetically modified organism）などに大別される。生物農薬は化学合成農薬に比べてより安全で且つ生分解性が高く、開発費用も少ない。
【０００３】
生物農薬、特に微生物殺菌剤（fungicide）に対する研究はこの７０余年の間植物病理学の主要分野としてこつこつと進行されており、その結果、この１０年間４０余種以上の製品が開発されてきた。
【０００４】
一方、グラム陽性細菌であるバチルス（Bacillus）属細菌は、シュードモナス属（genus Pseudomonas）と同様に広く研究されて商用化された細菌である。バチルス属細菌は生物学的活性のある２次代謝産物を生産し、熱に対して安定であり熱安定性が良く、かつまた劣悪な環境に抵抗性を有する内生胞子（endospore）を形成する。グスタフソン社（Gustafson Inc.）は畝間及び綿花と落花生の種子を処理するために枯草菌株を用いた微生物殺菌剤を開発し、これはコディアック（Kodiak）という商品名として市販されている（Backmanら、Improving Plant Productivity with Rhizosphere Bacteria, pp. 3-8, 1994）。また、２００１年には枯草菌とバチラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)との混合物を用いたバイオイールド（Bio Yield）という商品名の微生物殺菌剤が市販された。中国ではバチルス属の多くの菌株が収穫量増進のために使用されている。のみならず、バイエル社（Bayer Inc.）はバチラスＦＺＢ  ２４菌株を含む土壌伝染病防除剤を開発しており、米国Taensa社は同一の菌を用いた微生物殺菌剤を出した。
【０００５】
また、米国AgraQuest社は枯草菌ＱＳＴ７１３菌株を用いた微生物殺菌剤であるセレナーデ（Serenade；商品名）を開発した。この微生物殺菌剤は枯草菌株を用いた他の製品とは異なり、灰色かび病（gray mold）、立枯病（damping-off）及びうどん粉病（powdery mildew ）を含む４０種以上植物病に対して効果がある。この拮抗微生物は競争、寄生、抗生作用及び誘導抵抗性の発現などの多様な機作によって様々な植物病を防除することと知られており、イチュリン（iturin）、プリパスタチン（plipastatin）及びサーファクチン（surfactin）の３つのグループを含む抗生物質であって、３０種以上のリポペプタイド（lipopeptide）を生産する（Ritter, Chemical & Engineering News, 81；30-35、2003）。
【０００６】
韓国では、１９７０年代初から収穫後に朝鮮人参の根腐れ（root rot）の生物学的防除研究を始めてトウガラシ疫病、キュウリやイチゴのフザリウム立枯病（Fusarium wilt）、ゴマ立枯病、及び灰色かび病の生物学的防除に関する研究が行われている。しかし、効果の不安定性、製剤化の困難、低い生産性などの理由で成功した例がない現状である。バチルス属の菌株を用いた韓国内における最初の微生物殺菌剤は(株)グリーンバイオテック（Greenbiotech Co. Ltd.）によって開発された“トップシード”（Topseed）である。しかし、このトップシードはうどん粉病のみに対して効果があるので、その使用対象に多くの制限がある。
【０００７】
それで、本発明者らは、広範囲な植物病に対して強力な殺菌活性を示す新たな殺菌剤を開発するため努力したところ、トウガラシから分離した植物内生細菌である枯草菌ＥＢ１２０菌株がオオムギうどん粉病及びキュウリうどん粉病を始めとしてトウガラシ炭疽病、イネいもち病、トマト灰色かび病、トマト疫病、及び小麦赤さび病など種々の植物病に対して拮抗作用があることを見出して、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は植物病に対して拮抗作用を有する新規な枯草菌株を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記菌株を含む植物病防除用の微生物製剤を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、前記微生物製剤を用いて植物病を防除する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明では植物病に対して拮抗作用を有する枯草菌（Bacillus subtilis）ＥＢ１２０菌株（ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ）を提供する。
【００１２】
前記他の目的を達成するために、本発明では前記菌株又はこれから由来した拮抗活性物質を有効成分として含む植物病防除用の微生物製剤を提供する。
【００１３】
前記また他の目的を達成するために、本発明では前記微生物製剤を用いて植物病を防除する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は植物病に対する広範囲な拮抗作用を示す新規な枯草菌（Bacillus subtilis）ＥＢ１２０菌株（ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ）を提供する。
【００１５】
本発明による新規な菌株は、トウガラシの葉から分離される。菌株の形態的特性、生化学的特性及び１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列解釈の結果は、当該菌株が枯草菌に属することを示す。この新規な菌株は枯草菌ＥＢ１２０（Bacillus subtilis EB120）と命名され、２００４年１月６日付で特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約により韓国生命工学研究院遺伝子銀行（KCTC; Korean Collection for Type Cultures）（アドレス：韓国大田広域市儒城区魚隱洞５２番地３０５−３３韓国生命工学研究院（KRIBB; Korea Research Institution of Bioscience and Biotechnology））に寄託番号第ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ号として寄託された。
【００１６】
本発明による枯草菌ＥＢ１２０菌株は、次のような形態学的及び生化学的特徴を示す。即ち、枯草菌ＥＢ１２０菌株は、トリプシン大豆寒天培地（triptic soy agar medium）上で薄く広がって育ち、単一コロニーの場合、小さな雪花状となる（図１参照）。また、枯草菌ＥＢ１２０菌株はバチルス属に属し、グラム染色反応、水酸化カリウム（ＫＯＨ）テスト、カタラーゼ（catalase）及びオキシダーゼ（oxidase）テストにおいて陽性反応を示し、熱安定性のある内生胞子を形成し、澱粉及びカゼイン（casein）に対する加水分解能を有する。更に、マルトトリオース（maltotriose）の場合を除いて、枯草菌ＥＢ１２０菌株及びＡＴＣＣ６０５１菌株は同一の糖利用性を示す。
【００１７】
また、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列解釈の結果は、本発明による枯草菌ＥＢ１２０菌株が枯草菌と９９％の配列相同性をもつ配列番号１の塩基配列を有することを示す。
【００１８】
このような特性を有する枯草菌ＥＢ１２０菌株はオオムギうどん粉病及びキュウリうどん粉病、トウガラシ炭疽病、イネいもち病、トマト灰色かび病、トマト疫病、及び小麦赤さび病などを含む植物病防除のための幅広くかつ強い拮抗作用を示す。
【００１９】
従って、本発明による枯草菌ＥＢ１２０菌株は植物病防除のための微生物製剤として用いられることができる。菌株そのものもこのような微生物製剤として使用可能である。また、前記微生物製剤は菌株の培養液、それから得られた溶媒抽出物或いは単一の内生胞子を担体と混合した後、粉末、ペレット、顆粒又は溶液などに剤形化して製造することができる。本発明で使用可能な担体としては、水、ホワイトカーボン、カオリンなどがあるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明による微生物製剤を用いて、植物が生長している土壌又は成長中の植物を処理することで、植物病による植物成長阻害及びこれに起因する枯れ死を防除するが可能である。
【００２１】
本発明による枯草菌ＥＢ１２０菌株は、対象植物に対して１．０×１０4cells／ml乃至１．０×１０10cells／ml、好ましくは１．０×１０6cells／ml乃至１．０×１０9cells／mlの量で処理される。
【実施例】
【００２２】
以下、添付図面を参照して本発明による好適な実施形態をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに制限されるものではない。
【００２３】
実施例１：枯草菌ＥＢ１２０菌株の分離
新鮮なトウガラシの葉５ｇを０．１％トゥイーン（Tween）２０が添加された２％ＮＡＯＣｌに１０秒間浸漬させてトウガラシの葉の表面を滅菌した。このように滅菌した葉に４５ｍlの滅菌水を加えた後、乳棒と乳鉢ですって１ｍlを取り、蒸留水を用いて１：１０、１：１００及び１：１０００にそれぞれ希釈した。各希釈液２００μlを４０μｇ／ｍlのシクロヘキシミド（cycloheximide）を含むトリプシン大豆寒天培地（tryptic soy agar medium）に散布した後、３０℃でバクテリアコロニーが形成するまで培養した。培地からコロニーを取って新鮮な栄養寒天培地（nutrient agar medium）に接種し、３〜４回継代培養してバクテリアの菌株の単一コロニーを分離した。
【００２４】
実施例２：枯草菌ＥＢ１２０菌株の同定
実施例１で分離された細菌の菌株の同定は菌株の形態学的及び生化学的特性、並びに１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解釈を用いて行った。
【００２５】
（１）形態学的及び生化学的特性
前記分離された菌株は、トリプシン大豆寒天培地上で薄く広がって育ち、単一コロニーの場合は小さな雪花状に形成される（図１）。前記分離された菌株はグラム染色反応及び水酸化カリウム（ＫＯＨ）テストにおいて陽性反応を示すことから枯草菌属に属することがわかり、カタラーゼ（catalase）テスト及びオキシダーゼ（oxidase）テストにおいて陽性反応を示し、また内生胞子を形成し、澱粉及びカゼイン（casein）を加水分解した。
【００２６】
また、ＧＮ２マイクロプレート（購入先：米国バイオログ社（Biolog Inc.））を用いて糖利用性を調査し、その結果を下記の表１に示した。比較菌株としては枯草菌の亜種（Bacillus subtilis subsp. subtilis）ＡＴＣＣ６０５１菌株（購入先：韓国生命工学研究院の遺伝子銀行）を用いた。
【表１】
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【００２７】
前記表１から明らかなように、マルトトリオースを除いては、枯草菌ＥＢ１２０菌株及びＡＴＣＣ６０５１菌株は同一の糖利用性を示す。即ち、両菌株ともアルブチン（albutin）、セロビオース（cellobiose）、Ｄ−フラクトース（D-fructose）、α−Ｄ−グルコース（α-D-glucose）、Ｄ−マンニトール（D-mannitol）、Ｄ−マンノース（D-mannose）、Ｄ−プシコース（D-psicose）、スクロース（sucrose）、及びＤ−トレハロース（D-trehalose）を全て利用したが、対照菌株である枯草菌の亜種（Bacillus subtilis subsp. subtilis）ＡＴＣＣ６０５１菌株は本発明の分離菌株とは異なり、マルトトリオースをも利用した。
【００２８】
（２）１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列解釈
１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列解釈の結果、分離された菌株が枯草菌の配列と９９％の配列相同性を有する配列番号１の塩基配列を有することが分かった。
【００２９】
このような結果は分離された菌株が枯草菌の新規な菌株であることを証明する。この新規な菌株は枯草菌ＥＢ１２０と命名され、２００４年１月６日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託番号第ＫＣＴＣ  １０５７８ＢＰ号として寄託された。
【００３０】
実施例３：植物病に対する菌株の防除活性の検定
枯草菌ＥＢ１２０菌株（以下、“ＥＢ１２０”と称する）のトマト灰色かび病、トマト疫病、キュウリ炭疽病及びオオムギうどん粉病に対する防除活性を調べるために、ＥＢ１２０で対象植物を処理し、２４時間後に植物病原菌を接種した。
【００３１】
具体的に、ＥＢ１２０を滅菌された２００ｍlのトリプシン大豆液体培地（Tryptic soy broth、Becton and Dickinson社）に接種し、３０℃にて３日間１５０ｒｐｍで振湯培養した。培養液を、蒸留水を用いて１：３及び１：９の比率で希釈した後、３０ｍlの培養液及び希釈液をそれぞれ１００μｇ／ｍlのキサンタン・ガムと混合した。トマト、オオムギ及びキュウリはそれぞれ２葉期（2nd leaf stage）、１葉期（1st leaf stage）及び２葉期に至るまで園芸用真土を７０％ほど盛ったプラスチック鉢で温室条件（２５±５℃）のもとに１週乃至３週間耕作生育させた後、前記混合物で各対象植物を処理し、大気中で乾燥させ、２４時間常温で放置した。
【００３２】
引き続き、各病原菌の発病誘導は次のように行った。つまり、トマト疫病及びトマト灰色かび病は、疫病菌（Phytophthora infestans、入手先：韓国江陵大学校）の胞子嚢（５×１０４胞子嚢／ｍl）から抽出した遊走の懸濁液及び灰色かび病菌（Botrytis cinerea、入手先：韓国化学研究院）の胞子懸濁液（５×１０５胞子／ｍl）をそれぞれ２葉期のトマト幼苗の葉に噴霧処理して２０℃の恒湿室内で発病を誘導した。そして、キュウリ炭疽病は、２葉期のキュウリ幼苗の葉に炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare、入手先：農業化学技術院）の胞子懸濁液（１０６胞子／ｍl）を処理した後、２日間湿室で発病を誘導した後、２５℃の恒温恒湿室で３日間発病させた。また、オオムギうどん粉病は、１葉期のオオムギ幼苗の葉に宿主植物から継代培養されたうどん粉病菌（Blumeria graminis f. sp. hordei、入手先：韓国化学研究院）の胞子を接種した後、２０℃の恒温室で発病させた。
【００３３】
対照群としては、菌株培養液を含有しないキサンタン・ガム溶液（１００μｇ／ｍl）３０ｍlで処理したものを使用し、比較群としては、各当該病原菌に対して防除効果を有する化学物質であるクロロタロニル（chlorothalonil）（購入先：Sungbo Chemical Co., Ltd.）、ジチアノン（Dithianon）（購入先：Hankook Samgong Co., Ltd.）、ジクロフルアニド（Dichlofluanid）（購入先：Dongbu Hannong Chemical Co., Ltd.）及びベノミル（Benomyl）（購入先：Dongyang Chemical Industry Co., Ltd.）で処理した群を用いた。
【００３４】
各オオムギうどん粉病、キュウリ炭疽病、トマト灰色かび病、及びトマト疫病の発病程度は、各病原菌を接種してからそれぞれ７日、５日、３日、及び４日後に接種された葉に対して胞子形成阻害による病斑面積率又は白化現象や壊死現象による病斑面積率を評価することで調査した。病防除効果（防除価）は下記の式１に基づいて算出し、その結果を下記の表２に示した。
【数１】
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【００３５】
前記式１において、ＩＤＵＣＧは無処理対照群の発病度を示し、ＩＤＴＥＧは処理群の発病度を示す。
【表２】
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【００３６】
前記表２から明らかなように、ＥＢ１２０はトマト疫病、トマト灰色かび病およびオオムギうどん粉病に対して優れた防除活性を示すことがわかる。
【００３７】
実施例４：植物病に優れた拮抗作用を示す最適培地の選別
ＥＢ１２０の防除活性物質の生産のための最適培地を選別するために、色々な培養培地を用いた培養実験を下記のように行った。
【００３８】
ＥＢ１２０を下記の表３に記載の６種類の液体培地に接種した後、３日間３０℃にて１５０ｒｐｍで振湯培養した。各培養液を、蒸留水を用いて１：３及び１：９の比率で希釈した。各希釈溶液にキサンタン・ガムを１００μｇ／ｍlの濃度で添加した後、実施例３に記載の方法によりオオムギうどん粉病を誘発させて病防除効果を測定した。その結果を下記の表３に示した。
【表３】
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【００３９】
前記表３から明らかなように、ＥＢ１２０のオオムギうどん粉病に対する防除活性はトリプシン大豆液体培地で培養した場合が最適であることが分かる。
【００４０】
実施例５：枯草菌ＥＢ１２０菌株のキュウリうどん粉病に対する防除効果
ＥＢ１２０をトリプシン大豆液体培地に接種した後、３日間３０℃にて１５０ｒｐｍで振湯培養した。これを、蒸留水を用いて１：１０、１：２５、１：５０、１：１００及び１：２００の比率で希釈した。各希釈溶液に２５０μｇ／ｍlのトゥイーン２０を添加した後、７葉期のキュウリの葉面を噴霧処理した。
【００４１】
比較群として、市販されているうどん粉病防除用の微生物殺菌剤の「トップシード」（購入先：(株)グリーンバイオテック（Greenbiotech Co. Ltd.）を、蒸留水を用いて１：１０、１：２５、１：５０、１：１００及び１：２００の比率で希釈した希釈溶液と、細菌剤として知られたフルシラゾール（Flusilazole、購入先：Dongbu Hannong Chemical Co., Ltd.）とを対象キュウリ処理のため用いた。対照群としてはトゥイーン２０溶液のみで処理したキュウリを使用した。
【００４２】
前記噴霧処理１週日後、菌株培養液の希釈溶液及び比較群の試料を対象キュウリに２次処理し、２次処理してから７日後に実施例３に記載の方法と同様な方法によってうどん粉病に対する病防除効果を測定した。うどん粉病は温室に存在する病原菌（Sphaerotheca fuligenea）による自然的な発生を誘導した。
【００４３】
前記実験過程は２回行い、１回目及び２回目の実験の結果をそれぞれ下記の表４に示した。
【表４】
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【００４４】
前記表４から明らかなように、ＥＢ１２０培養液の全ての希釈溶液がキュウリうどん粉病に対して優れた防除活性を示し、２００倍に希釈したＥＢ１２０希釈溶液で処理した場合であっても、有効な水準の防除効果を示すことが判明した。また、既存のうどん粉病防除用の微生物殺菌剤であるトップシードと比較するとき、希釈倍数が５０倍以下の希釈溶液処理群ではトップシード処理群と同等以上の効果を示すことが分かった。図２はＥＢ１２０のキュウリうどん粉病に対する防除活性を示す図である。トゥイーン２０溶液のみで処理した対照群の場合、うどん粉病の病徴が多く現われたことに対し、枯草菌ＥＢ１２０菌株の培養液で処理した実験群のキュウリの葉においては病徴をほとんど見出すことができなかった。
【００４５】
実施例６：枯草菌ＥＢ１２０菌株培養液、これの酢酸エチル及びブタノール抽出物における植物病に対する防除活性のインビボテスト
ＥＢ１２０が生産する物質の防除活性を測定するために、ＥＢ１２０培養液、これの酢酸エチル及びブタノール抽出物における植物病に対する防除効果を下記のように実験した。
【００４６】
ＥＢ１２０をトリプシン大豆液体培地に接種した後、３０℃にて１５０ｒｐｍで３日間振湯培養し、９０００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。上澄液を同量の酢酸エチルで２回抽出して酢酸エチル抽出物を得、これを減圧濃縮した。また、ブタノール抽出物を前記酢酸エチル抽出物と同様な方法により得た。各抽出試料から、培養液４０ｍlに該当する量を取った後、酢酸エチル抽出試料は４ｍlのアセトンで溶解し、ブタノール抽出試料は２ｍlのメタノールで溶解した。両溶液をトゥイーン２０（２５０μｇ／ｍl）溶液で希釈して最終容積４０ｍlを作製した。
【００４７】
一方、ＥＢ１２０の培養上澄液４０ｍlに２５０μｇ／ｍlのトゥイーン２０を添加した。
【００４８】
各溶液をトウガラシ、イネ、トマト、コムギ、及びオオムギに噴霧し、１日経過後病原菌であるトウガラシ炭疽病（ＰＡＮ）、イネいもち病（ＲＣＢ）、イネ紋枯病（ＲＳＢ）、トマト灰色かび病（ＴＧＭ）、トマト疫病（ＴＬＢ）、小麦赤さび病（ＷＬＲ）、及びオオムギうどん粉病（ＢＰＭ）を接種して病防除効果を調べた。
【００４９】
各病原菌の発病誘導において、トマト灰色かび病、トマト疫病、及びオオムギうどん粉病は前記実施例３に記載の方法と同様な方法によって行った。
【００５０】
一方、トウガラシ炭疽病は、発芽させたトウガラシ種子を直径７．０ｃｍの鉢に播種した後、８葉期まで温室で育った唐辛子にトウガラシ炭疽病原菌（Colletotrichum coccodes、入手先：韓国高麗大学校）の胞子懸濁液（５×１０５胞子／ｍl）を噴霧処理した後、恒湿室内で２日間処理してから、２５℃の恒温恒湿室で２日間培養して発病を誘導した。
【００５１】
イネいもち病は、２葉期の幼苗にイネいもち病原菌（Magnaporthe gisea、入手先：韓国ソウル大学校）の胞子懸濁液（５×１０５胞子／ｍl）を噴霧して接種した後、２５℃の湿室内で一日間放置してから、２５℃の恒温室で５日間培養して発病を誘導した。
【００５２】
イネ紋枯病は、３葉期の幼苗にイネ紋枯病原菌（Thanatephorus cucumeris、入手先：韓国化学研究院）が７日間培養された培地（ふすま９０ｇ、米ぬか１５ｇ、蒸留水１００ｍl）を接種して２５℃の湿室内で４日間処理したのち、２５℃の恒温室で４日間培養して発病を誘導した。
【００５３】
小麦赤さび病は、１葉期の幼苗に活物寄生菌（Puccinia recondita 、入手先：韓国化学研究院）の胞子をトゥイーン２０溶液（２５０μｇ／ｍl）に０．６７ｇ胞子／lの濃度に懸濁した胞子懸濁液を噴霧処理して一日間２０℃の湿室内で処理した後、恒温室へ移して培養して発病を誘導した。
【００５４】
トウガラシ炭疽病に対しては、病原菌を接種してから４日後に、イネいもち病に対しては病原菌を接種してから５日後に、小麦赤さび病及びイネ紋枯病に対しては病原菌を接種してから７日後に病斑面積率（％）を調査し、実施例３の方法によって病防除効果（防除価）を測定した。その結果は下記の表５に示した。
【表５】
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【００５５】
前記表５から明らかなように、ＥＢ１２０培養液の酢酸エチル抽出物は植物病に対してほとんど効果がなかったが、これのブタノール抽出物はＥＢ１２０菌株の培養上澄液と同様にオオムギうどん粉病、トウガラシ炭疽病、イネいもち病、トマト灰色かび病、トマト疫病、小麦赤さび病の全ての植物病に対してＥＢ１２０菌株の培養上澄液と同等又はそれ以上の高い防除活性を示した。これによって、本発明によるＥＢ１２０が生産する防除活性物質は比較的に高い極性を有する物質であることが分かった。
【００５６】
実施例７：枯草菌ＥＢ１２０菌株が生産する防除活性物質の温度に対する安定性調査
ＥＢ１２０が生産する物質の温度に対する安定性を調査するために、培養上澄液とこれのブタノール抽出物を様々な温度、すなわち４℃、常温、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、１００℃、及び１２１℃で予め処理した後、病原菌を接種することにより病原菌株の菌糸伸張阻害程度を調査した。
【００５７】
具体的に、ＥＢ１２０培養上澄液と前記実施例６で得られたブタノール抽出物を、４℃及び常温では２４時間、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、及び７０℃では５時間、１００℃及び１２１℃では１５分間予め処理した。培養上澄液は蒸留水を用いて１：２の比率で希釈し、ブタノール抽出物はメタノールに２００ｍｇ／ｍlの濃度で溶解させた。各試料５０μlを直径８ｍｍのペーパーディスク（paper disk）に噴霧して乾燥させた。イネいもち病原菌（Magnaporthe gisea、入手先：ソウル大学校）を注ぎ平板法（pour-plating method）によって接種されたジャガイモ寒天培地上に移した後、２５℃で３日間培養した。ついで、各ペーパーディスクを取り周囲の阻害区域の直径を測定することで、菌糸伸張阻害効果を測定した。
【００５８】
図３に示したように、イネいもち病においてＥＢ１２０から生産された代謝物質に対して影響を受ける他のパターンの３つの領域は次の通りである。完全に菌糸生育が阻害される部位（完全阻害部位）と、空中菌糸は成長できずに培地の内側へ菌糸が育つ部位（部分阻害部位）と、空中菌糸が育って、空中菌糸が培地に吸着したように見える部位（空中菌糸の影響部位）とがある。これによって、ＥＢ１２０は少なくとも３つ以上の防除活性物質を生産することが分かることができる。
【００５９】
また、ＥＢ１２０が生産する防除活性物質は温度に関係なくほぼ均一な程度の菌株成長阻害効果を示すことが認められる（図４）。これによって、ＥＢ１２０が生産する防除活性物質は熱に対して比較的安定であることが分かる。図４において、黒色の棒は完全阻害部位を、灰色の棒は部分阻害部位を、そして白色の棒は空中菌糸の影響部位をそれぞれ示している。
【００６０】
一方、枯草菌ＥＢ１２０菌株の培養液のブタノール抽出物の熱処理によるイネいもち病原菌（Magnaporthe gisea）の成長阻害程度を観察した結果、培養液のブタノール抽出物に対しては培養上澄液とは異なり、空中菌糸の影響部位が現われなかった。この結果は空中菌糸の影響部位のパターンを示す防除活性物質は相異なる２つのパターンを示す防除活性物質よりも非極性であることを示す。なお、図５はブタノール抽出物も熱処理温度に関係なく均一な菌糸伸張阻害活性を示すグラフである。
【００６１】
以上、本発明の好適な実施例について詳述したが、本発明の範囲は前述した実施例に制限されることはなく、特許請求範囲に記述された本発明の技術的思想を逸脱しないカテゴリ内で当業者によって多様な修正又は変更が可能であることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】トリプシン大豆寒天培地で培養された枯草菌ＥＢ１２０菌株の写真である。
【図２】枯草菌ＥＢ１２０菌株のキュウリうどん粉病に対する抗真菌活性を示す写真である。
【図３】枯草菌ＥＢ１２０菌株のイネいもち病菌に対する菌糸伸張阻害活性を示す写真である。
【図４】枯草菌ＥＢ１２０菌株の培養液の熱安定性を示すグラフである。
【図５】枯草菌ＥＢ１２０菌株の培養液のブタノール抽出物の熱安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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