(57)【要約】  本発明は、肺癌細胞についてRB2/p130によりモジュレートされる分子指標のセット、およびRB2/p130遺伝子発現系または該系によりコードされるタンパク質を用いて哺乳動物の肺癌細胞における遺伝子または遺伝子発現パターンをモジュレートするかどうかを決定する方法を、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RB2/p130遺伝子発現系または該系によりコードされるタンパク質を用いてヒト被験者の肺癌細胞における遺伝子または遺伝子発現パターンをモジュレートするかどうかを決定する方法であって、
PCNA、MKK3、B-MYB、CCNF、BUB1B、PLK、NIK、KNSL2、PCSK7、CCNB2、GPRK6、HCFC1、PFAS、DNMT1、KPNA2、STK15、TIEG、BUB1 ELK1、UMPK、PMI、CAMKK2、GSK3B、HADHSC、POLD1、NOL1、EMK1、GRP-R、XRCC3、CHK、MAGEA3/6、PPM1G、TRAF5、ABCF2、TEAD4、PIM1、CCND1、CDR2、PSMB2およびRAF1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現産物を含む、肺癌細胞についてRb2/p130によりモジュレートされる分子指標を提供すること；
ヒト被験者の肺癌細胞中で発現された遺伝子を決定すること；ならびに
ヒト被験者の肺癌細胞中で発現された遺伝子が前記の少なくとも1つの遺伝子と同一であることが決定された場合には、RB2/p130遺伝子発現系またはそのタンパク質を用いてヒト被験者の肺癌細胞中の遺伝子もしくは遺伝子発現パターンをモジュレートすること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
選択される前記遺伝子がB-MYB、PCSK7、STK15、ELK1、NOL1、MAGEA3/6、PIM1、CCND1、CDR2、およびRAF1である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト被験者が非小細胞肺癌についての治療後である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療が、外科的手術、化学療法、放射線治療およびRB2/p130遺伝子治療またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は2003年9月30日に提出された米国仮出願第60/507,677号の利益を請求するものであり、その出願の内容は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腫瘍学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は肺癌細胞においてRB2/p130によりモジュレートされる分子指標（molecular signature）、ならびにRB2/p130によりモジュレートされる分子指標を用いた肺癌の診断および予後診断に関する。本発明はまた、肺癌細胞における遺伝子産物の発現を調節するためのRB2/p130の使用のための戦略にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本願におけるいかなる科学文献の引用または特定も、そのような文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを自認するものとして解釈されるべきではない。
【０００４】
肺癌は、世界中で癌による死亡の主要な原因の一つである。肺癌の高い死亡率はおそらく、少なくとも部分的には、乳癌、前立腺癌、および結腸癌と比較して、初期段階およびより治療可能な段階で疾患を診断するための標準的な臨床手順が欠如していることからもたらされるものである(Wiestら、1997)。この疾患、特に進行した疾患の診断は、極端に悪い予後とも関連する。気管支原性癌の大部分は、4つの組織学的タイプに分類することができる：すなわち、小細胞肺癌、腺癌、扁平上皮肺癌、および大細胞癌。小細胞肺癌は別個の存在であるが、他の3つの組織学的サブタイプの挙動は類似しており、このためこれらは非小細胞肺癌(NSCLC)型に分類される。NSCLCは、肺の悪性腫瘍のほぼ80％を占め、それは悪い予後と関連している。
【０００５】
疾患が進行段階に到達するまで臨床症状が認められないことが多いため、初期の検出は困難である。現在では、胸部X線の使用、唾液中に含まれる細胞型の分析および気管支通過の試験を用いて診断の助けとしている。治療計画は、癌の型および段階により決定され、これは外科手術、放射線治療および／または化学療法を含む。それらは分子的特異性を欠いているため、これらの治療計画は全面的に有効というわけではない。例えば、癌の化学療法における主要な問題は、腫瘍細胞を根絶させながら同時に正常細胞に対する損傷を最小化するのに十分な濃度で、薬物などの治療剤を送達することである。かくして、多くの研究室における研究は、腫瘍細胞への遺伝子の標的化された送達のための抗体、サイトカイン、およびウイルスなどのより特異的な系の設計に向けられている。それらの生物特異性のために、そのような系は理論的には腫瘍に治療剤を送達することができる。
【０００６】
実際、肺癌は正常な細胞の増殖、分化、およびアポトーシスを制御する経路の脱調節をもたらす細胞の分子的変化の結果であることが当業界では公知である。癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子などの種々の遺伝子が、この疾患においては突然変異しているか、または異常な発現パターンを有することが判明している。また、肺癌における遺伝子治療の可能性を示すいくつかの遺伝子も報告されている(例えば、米国特許第6,663,856号および同第6,797,702号を参照されたい)。遺伝子治療プログラムにおいて用いられる遺伝子の潜在的治療効果を媒介する分子マーカーが利用可能である場合、それは肺癌に対する好適な遺伝子治療の選択を容易にすることによって治療効果を最大化し、毒性を最小化することができる。従って、肺癌について公知の治療用遺伝子の各々によって調節されている遺伝子を同定し、その発現産物を、肺癌細胞において発現される遺伝子をモジュレートするのに好適な治療用遺伝子を選択するための分子指標として使用できるようにすることが、当業界で必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たし、他の関連する利点をさらに提供する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明においては、肺癌細胞においてRb2/p130によってモジュレート（modulate）される分子指標（molecular signature）のセットが見出された。肺の組織サンプル中で同定された分子指標またはマーカーは、Rb2/p130を使用してその分子指標物を発現する遺伝子をモジュレートするための基礎を提供する。
【０００８】
従って、一般的な態様においては、本発明は、RB2/p130(遺伝子発現系またはpRb2/p130によりコードされるタンパク質のいずれか)を用いて哺乳動物の被験体の肺癌細胞における遺伝子または遺伝子発現パターンをモジュレートするかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、肺癌細胞に関するRB2/p130によりモジュレートされる分子指標を提供することを含む。この分子指標は、以下の遺伝子のうち1つ以上の発現産物を含む：PCNA、MKK3、B-MYB、CCNF、BUB1B、PLK、NIK、KNSL2、PCSK7、CCNB2、GPRK6、HCFC1、PFAS、DNMT1、KPNA2、STK15、TIEG、BUB1 ELK1、UMPK、PMI、CAMKK2、GSK3B、HADHSC、POLD1、NOL1、EMK1、GRP-R、XRCC3、CHK、MAGEA3/6、PPM1G、TRAF5、ABCF2、TEAD4、PIM1、CCND1、CDR2、PSMB2およびRAF1。前記方法はさらに、ヒト被験者の肺癌細胞中で発現された遺伝子を決定し、哺乳動物の被験体の肺癌細胞中で発現された遺伝子が上記に列挙した遺伝子のうちの1つ以上と同一であると認められた場合には、RB2/p130を用いて哺乳動物の被験体の肺癌細胞における遺伝子または遺伝子発現パターンをモジュレートすることを含む。例えば、この遺伝子は、B-MYB、PCSK7、STK15、ELK1、NOL1、MAGEA3/6、PIM1、CCND1、CDR2、およびRAF1などの遺伝子のセットであってもよく、これらは全て疾患と関連している。前記哺乳動物は、非小細胞肺癌についての治療前または治療後のものであってよく、治療は外科手術、化学療法、放射線治療およびRB2/p130遺伝子治療またはこれらの治療の組合せであってよい。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞においてRb2/p130によりモジュレートされる分子指標またはマーカーのうちのいくつかの発見、および非小細胞肺癌細胞における遺伝子または遺伝子発現パターンをモジュレートするためのRb2/p130の投与の基礎としての該分子指標の使用に基づく。
【００１０】
癌における細胞表現型の変化は、該細胞の遺伝子発現における1個以上の変化の結果であることが多い。いくつかの遺伝子は、腫瘍細胞においては発現されるが、正常細胞においては発現されない。さらに、異なる遺伝子が癌の増殖を直接的または間接的に誘導するが、他の遺伝子は癌の増殖を直接的または間接的に抑制する。実際、肺癌の235個の試料におけるRbファミリーメンバー(pRb/p105、p107、およびpRb2/p130)の発現パターン(Baldiら、1996)およびヒトの肺癌の158個の試料におけるpRb2/p130の発現パターンの免疫組織化学的分析により、腫瘍の組織学的等級、転移の発生とpRb2/p130の発現レベルとの間に逆相関関係が認められることが示された(Baldiら、1997)。該組織学的等級とpRb/p105、p107およびpRb2/p130の発現との間の統計学的に有意な逆相関が、扁平上皮細胞癌患者の微小針吸引生検において認められた(Minimoら、1999)。
【００１１】
本明細書に記載の発明は、Rb2/p130によりモジュレートされるNSCLC細胞中で発現された遺伝子のセットの同定に関する。一態様においては、本発明は、肺癌細胞における発現がモジュレートされうる(下方調節または上方調節されうる)遺伝子の同定されたセットを提供することによって、細胞増殖、腫瘍転移、再発、または死亡により定義される臨床的結果を予測し得る予後判定を単純化する。
【００１２】
RB2/p130のタンパク質およびアミノ酸配列ならびにpRb2/p130の発現構築物は当業界で公知である(例えば、米国特許第5,532,340号を参照されたい)。例えば、発現構築物を得るために、Rb2/p130の完全長cDNA配列を好適なレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター(MSCVneoEBおよびMSCVPac)中にサブクローニングすることができ、そのような発現ベクターは当業者には公知である。
【００１３】
本発明においては、RNA発現の表現型の特定を、RB2/p130発現により下方調節される特定の遺伝子を同定するために分析した3200個を超える遺伝子についての定量的発現データから作製された高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて実施した。発現遺伝子セットは、限定されるものではないが、以下の実施例などのいくつかの用途を有しうる。この発現遺伝子セットは、肺癌のよりきめ細かな診断を可能にし、医師が個々の患者の必要性に応じて治療を調整することができるようにするための、肺癌患者の予後診断ツールとして用いることができる。本発明はまた、NSCLC癌治療の前、途中、および後の患者における肺癌の進行または回復を判定することにより、NSCLC治療の有効性を評価することもできる。前記発現遺伝子セットの別の用途は、標的化治療のための疾患経路探索に関する生物工学および製薬業界の研究においても存在しうる。本発明は、肺癌における遺伝子発現の変化を同定することができ、また、これを用いて肺癌を治療するための候補薬剤を発掘し、試験することもできる。
【００１４】
本明細書で用いる場合、被験体はヒトであるが、霊長類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびげっ歯類などの非ヒト哺乳類も意図される。好ましくは、前記被験体は、肺癌を有することが疑われるか、または肺癌を有すると診断されたヒトである。肺癌を有することが疑われる被験体を同定する方法としては、物理的試験、被験体の家族の既往歴、被験体の既往歴、肺癌生検、または超音波断層撮影、磁気共鳴画像化法、磁気共鳴分光測定などの様々な画像化技術が挙げられる。肺癌に関する従来の診断方法および肺癌診断の臨床概要は医学業界の当業者には周知である。
【００１５】
本明細書で用いる場合、子宮内膜組織サンプルは、関連する医学業界における通常の知識を有する者にとって周知である方法を用いて子宮内膜組織生検から得られた組織である。いくつかの場合にはこの生検からのサンプルは増幅することなくRNA発現を評価するのに十分なものでありうるが、別の場合においては小さい生検領域内の好適な細胞の欠如によりRNA変換および／もしくは増幅方法または核酸分子の分離を増強するための他の方法の使用が必要になる場合もある。そのような方法は当業者には周知であり、限定されるものではないが、直接的RNA増幅、RNAからcDNAへの逆転写(RT-PCR)、cDNAの増幅、または放射標識された核酸の作製が挙げられる。
【００１６】
本発明の文脈においては、「肺癌細胞における遺伝子(または核酸分子のセット)の発現を決定する」とは、組織サンプルにおける核酸またはタンパク質発現の分析により、該組織サンプル中のRNA転写物を同定することを意味する。本明細書で用いる場合、「セット」は、本明細書の表2に列挙される所与のカテゴリーに分類される遺伝子群を指す。いくつかの実施形態においては、セットは1個以上のカテゴリーまたはこれらのカテゴリーの組合せを含んでもよい。
【００１７】
肺癌被験体からのサンプル中の核酸分子のセットの発現を、非癌性である肺組織のサンプル中の核酸分子のセットの発現と比較することができる。本明細書で用いる場合、非癌性肺組織は、医学業界における通常の知識を有する者により、限定されるものではないが、組織染色および顕微鏡分析などの標準的な診断方法に基づいて肺癌の証拠を有さないと決定された組織を意味する。
【００１８】
本発明においては、マイクロアレイ技術の標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて、核酸発現のパターンを評価し、核酸マーカー発現を同定する。DNAチップ技術および遺伝子チップ技術などの他の名称によっても知られるマイクロアレイ技術は当業者には周知であり、限定されるものではないが、固定された基質上に特定された核酸プローブのアレイを取得し、リポーター分子(例えば、放射活性物質、化学発光物質、またはフルオレセイン、Cye3-dUTP、もしくはCye5-dUTPなどの蛍光タグ)を用いた標的分子を標識化し、前記プローブへ標的核酸をハイブリダイゼーションし、そして標的-プローブハイブリダイゼーションを評価することに基づく。標的配列と完全に一致する核酸配列を有するプローブは、一般的には、完全でない一致を有するプローブよりも強力なリポーター-分子シグナルの検出をもたらすであろう。マイクロアレイ技術は当業者には周知である。本発明はまた、肺癌の細胞または組織中の分子指標を分析するためのタンパク質マイクロアレイも意図する。
【００１９】
いくつかの例においては、前記マイクロアレイデータを、半定量的RT-PCR分析、ノーザンブロット分析および／またはウェスタンブロット分析を用いて検証することができる。これらの検証法は、好ましくは、特定のpRb2/p130標的遺伝子の遺伝子発現レベルの測定が望まれる場合に用いられる。
【実施例】
【００２０】
以下の非限定的な実施例およびデータは、本発明の方法に関する種々の態様および特徴を例示するために、および当業者に対するさらなる指針として提供されるものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００２１】
実施例1：H23肺腺癌細胞系に対するRB2/p130アデノウイルス形質導入の効果
ヒト肺腺癌細胞系H23は以前に記載されている(Claudioら、2000)。共通の5型アデノウイルスにより形質転換されたパッケージング細胞系293(一次胚性ヒト腎臓細胞)も以前に記載されている(Claudioら、1999)。H23細胞を、10％ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミンを補給したDMEM中で維持した。293細胞を、10％熱不活化ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミンを補給したDMEM中で維持した。
【００２２】
アデノウイルスを、以前に記載されたように(Claudioら、1999、Davisら、1998)、RB2/p130遺伝子の完全長ORFをpAd.CMV-Link1ベクター中にサブクローニングして、Ad.CMV-RB2/p130ウイルスを形成させることにより作製した。pAd.CMV-Link1ベクター単独(Ad-CMVウイルスを作製するため)を、陰性対照として用いて、トランスジーンを送達することなくウイルス感染のみの効果をアッセイした。アデノウイルスを、以前に記載のように(Claudioら、1999)、増幅させ、精製し、力価測定した。
【００２３】
指数増殖するH23細胞またはAd-CMVまたはAd-CMV-Rb2/p130で形質導入されたH23細胞のフローサイトメトリー分析(FACS)を、以前に記載のように(Claudioら、1996)行った。簡単に述べると、5 x 105個の細胞を播種し、24時間後、細胞を50 MOI(感染多重度)のアデノウイルスを用いて形質導入した。形質導入の48時間後、細胞を回収し、Coulterのフローサイトメーターを用いて分析した。
【００２４】
ノーザンブロット分析のために、H23細胞を60％の集密度まで増殖させた後、RB2/p130遺伝子を担持するアデノウイルスの50 MOIまたは対照Ad-CMVで感染させた。14時間後、培地を交換し、形質導入から48時間で細胞を回収した。H23細胞、H23-Ad-CMVおよびH23-Ad-CMV-Rb2/p130形質導入細胞に由来するDNAseで処理された総RNAを、TRIzol(Life Technologies, Inc, Grand Island, NY)を用いて、製造業者のプロトコルに従って抽出した。ノーザンブロット分析を、以前に記載のように(Claudioら、1994)実施した。
【００２５】
指数増殖するH23細胞またはAd-CMVもしくはAd-CMV-Rb2/p130で形質導入したH23細胞のウェスタンブロット分析を、以前に記載のように(Claudioら、1999)行った。抽出物を、Bradford分析(Bio-Rad Laboratories, Inc., Melville, New York)およびクマシーブルーゲル染色によってタンパク質含量について標準化した。一次抗B-MYB、E2F-1、KPNA2、MKK3、NIK、PCNA、PLK、RAF1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)、抗MAGE-A (Upstate, Lake Placid, NY)および抗HSP70 (Oncogene Science, Cambridge, MA)を、製造業者の説明書に従って用いた。
【００２６】
H23細胞を、4個の10 cm組織培養皿中に、5 x 105の密度でプレーティングした。細胞を50 MOIの対照Ad-CMVまたはAd-CMV-RB2/p130で形質導入し、48時間後に回収した。2個の組織培養皿を用いて、mRNAを抽出した。1個の組織培養皿を用いて、タンパク質を抽出し、1個をFACS分析に用いた。
【００２７】
RB2/p130で形質導入されたサンプルのノーザンブロット分析により、対照に関して20倍を超えるRB2/p130転写物の発現の増強が示された(図1a)。ウェスタンブロット分析により、Ad-CMV-RB2/p130で形質導入した細胞中でpRb2/p130の発現が100倍を超えて増強されることが示された(図1b)。H23細胞におけるpRb2/p130の増強された発現の効果を確認するために、本発明者らはFACS分析を行った。図2は、アデノウイルスRb2/p130形質導入により、対照(54％)と比較して、81.2％の細胞が細胞周期のG0/G1期に集積したことを示している。
【００２８】
実施例2：ヒト肺腺癌細胞系におけるpRb2/p130の増強された発現後のオリゴヌクレオチドマイクロアレイによるアッセイ
RNAサンプルを分析に供する前に、対応する細胞培養物の複製プレートから調製したタンパク質抽出物を、ウェスタンブロットを用いてpRb2/p130の予想される発現増強について分析した。オリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイは、Mergen (Mergen Ltd. San Leandro, CA)から購入した。ExpressChip H05000 DNAマイクロアレイシステムを、この試験に用いた。このアレイは、種々の異なるプロセスに関与する3200個を超える遺伝子を含む。H23細胞(親細胞)、形質導入の48時間後にAd-CMVもしくはAd-CMV-RB2/p130細胞系で形質導入されたH23細胞に由来するDNaseにより処理された総RNA(20μg)を、製造業者のプロトコルに従ってTRIzol (Life Technologies, Inc, Grand Island, NY)を用いて抽出した。RNAの完全性を、ホルムアルデヒドゲル電気泳動により、分解の欠如について検証した。ビオチン標識されたcRNAプローブ調製、ハイブリダイゼーションおよびアレイ走査を、Mergen Labeling/Hybridization/Detection Serviceを用いて行った。
【００２９】
データの獲得およびデータの分析を、Imageneソフトウェア(Biodiscovery Inc., Marina del Rey, CA)およびMergenのExpressData(商標)ソフトウェア(Mergen Ltd. San Leandro, CA)を用いて行った。簡単に述べると、データを局所バックグラウンド補正および標準化のために処理した。各遺伝子のRaw-Spotは、スポットの平均シグナル値から局所バックグラウンドの平均シグナル値を差し引いて算出した。局所バックグラウンドを除去した後、Imax値を65,000に設定した。標準化係数(N)を、対照集団またはサンプル生スポット値(spot raw value)に適用して、スライド-スライドおよびプローブ-プローブ偏差について補正した。(Raw spot/N)<Imaxである場合のみ標準化係数を適用し、それ以外は値をImaxに設定した。0以下の標準化された値は分析から排除した。親細胞系に関してアデノウイルス形質導入(Ad-CMV)により調節される遺伝子を分析から除去した。45,000を超える平均強度を有するスポットを比率分析について除外した。両チャンネルについて、局所バックグラウンドの平均を下回る補正値をを用いて算出された発現比率は用いなかった。分析した遺伝子の発現比率は、RB2/p130で形質導入されたH23細胞の遺伝子発現値を、親H23細胞またはAd-CMVで形質導入されたH23細胞のものと比較して、算出した。2倍以上のレベルの標的遺伝子の発現比率を、多くの文献に従って、有意であるとみなした。
【００３０】
H23細胞に、Ad-CMVまたはAd-CMV-RB2/p130で形質導入した。48時間後、H23細胞、H23-Ad-CMV細胞またはH23-Ad-CMV-RB2/p130細胞に由来する20μgのDNA不含の総RNAを逆転写し、二本鎖cDNAを鋳型として用いて、Cy3標識されたcRNAプローブを作製した後、種々の異なるプロセスに関与する3200個を超える遺伝子を含むMergenのH05000オリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイにハイブリダイズさせた。分析は、Mergen Ltd, San Leandro, CAにより行った。マイクロアレイ実験を、H23細胞 対 H23-Ad-CMV細胞；H23-Ad-CMV細胞 対 H23-Ad-CMV-RB2/p130細胞；およびH23細胞 対 H23-Ad-CMV-RB2/p130細胞を比較して行った。重複実験を、前記細胞からの単一の総RNA調製物について行った。
【００３１】
この試験においては、40個の遺伝子を2.0倍を超えて下方調節した(表1)。図3は、H23-Ad-CMV細胞 対 H23-Ad-CMV-RB2/p130細胞およびH23細胞 対 H23-Ad-CMV-RB2/p130細胞における3263個の遺伝子の示差的発現のプロットを示す。全体として、スポットされた遺伝子の大多数の発現はRB2/p130により変化しなかった。モジュレートされた遺伝子を、コードされたタンパク質の十分記録され確立された生物学的または病理学的機能に基づいて、表2中で分類した。pRb2/p130により下方調節された遺伝子は主に以下のカテゴリーに属する発現を増強させた：細胞分裂、シグナル伝達および細胞間コミュニケーション、細胞構造および運動性、遺伝子発現、代謝、および疾患。
【００３２】
実施例3：半定量的RT-PCRおよびウェスタンブロット分析を用いるオリゴヌクレオチドマイクロアレイアッセイの検証
RT-PCRを用いて、本研究における標的遺伝子発現を分析した。各サンプルに由来する、DNaseにより処理された総RNAの2μgアリコートを、製造業者のプロトコルに従ってM-MLV逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて一本鎖cDNAへと逆転写した。各サンプルから得られた同じcDNA産物を、標的遺伝子およびβ-アクチン(Act-β)/HPRTハウスキーピング遺伝子に対して調製されたプライマーセットを用いるその後のPCR増幅に用いた。β-アクチンおよびHPRT遺伝子の増幅を、二重内部対照として用いた。サンプルと各ハウスキーピング遺伝子との比率を算出し、サンプル濃度における初期変動について、反応効率に関する対照として標準化した。プライマー配列を、http://www-genome.wi.mit.eduにてオンライン上で入手可能なソフトウェアPrimer 3 (Steve Rozen, Helen J. Skaletskyにより開発された)を用いて設計した。プライマー配列は、要求に応じて提供することができる。PCRの反応条件は、試験した各遺伝子産物について個々に最適化し、PCRサイクル数が産物の線形増幅の範囲内になるように設定した。
【００３３】
各実験においては、可能性のあるDNA夾雑物を、逆転写酵素を反応混合物から除外した対照反応により確認した。PCR産物を、臭化エチジウム染色された1.5％のアガロースゲル上にロードした。PCR産物の濃度測定分析を、Alpha Imagerシステム(Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA)、およびhttp://rsb.info.nih.gov/ij/にてオンライン上で入手可能なImageJ v1.29ソフトウェア(Wayne Rasbandにより開発された)を用いて行った。全てのPCR産物を、QIAquick PCR精製キット(Qiagen, Santa Clarita, CA)を用いて精製し、その正体を、Applied biosystem Model 373A DNA配列決定装置で配列分析のためのジデオキシターミネーター反応化学を用いる自動化されたDNAフォワードおよびリバースシークエンスにより検証した。
【００３４】
recLic B-GFP構築物を用いて形質転換された大腸菌（E. coli）dH5α細胞を、LB培地中での一晩培養プロセスにより培養または発酵させた。発酵を12時間継続し、104の細胞密度で収穫した。2リットルの細胞培養物または発酵培地を1リットルの容器／ボトルに分割し、10,000 rpmにて30分間、遠心分離機中で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを用いて担体タンパク質を回収した。
【００３５】
特異的pRb2/p130標的遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するために、半定量的RT-PCR分析を用いた。マイクロアレイ分析により同定された40個から無作為に選択された11個の遺伝子の群を分析した。本発明者らは、BMYB、Cyc B2、Cyc D1、GRPR、KPNA2、MKK3、NIK、PCNA、PIM、PLK、およびRAF-1のRT-PCR下方調節により、これを確認した(図4)。PCNA、MKK3、B-MYB、およびNIKなどのマイクロアレイ分析中で高度に下方調節される(6〜17倍の範囲)遺伝子は、半定量的RT-PCR分析において7〜3.5倍の同程度の下方調節を示した。マイクロアレイ分析においてやはり下方調節されるが、より低い程度である遺伝子、例えば、RAF-1、PIM1、CycD1、GRPR、KPNA2、およびCycB2は、半定量的RT-PCR分析において3.4〜2.0倍の同程度の下方調節を示した。マイクロアレイ分析において高い下方調節率を示したPLKでは、半定量的RT-PCRによりそれを確認することができなかった。事実、PLKは、RT-PCRによりほとんど2倍の差異がある発現レベルを示した。RT-PCR分析により試験された11個の転写的に下方調節された遺伝子のうち、7個の遺伝子のみ(B-MYB、KPNA2、MKK3、NIK、PLK、およびRAF-1)が、pRb2/p130の発現増強に際して1.9〜3.0倍の比率というより低いレベルで発現されることがウェスタンブロット分析により認められた。MAGE遺伝子ファミリーは4つのクラスターに分けられる23個の関連遺伝子から構成され、MAGE-Aサブファミリーはそのコード配列において同一性の高い12個の遺伝子を含むので、本発明者らはこの遺伝子ファミリーについてRT-PCEを実施することができなかったが、本発明者らは増強されたpRb2/p130発現に対するMAGEA-3/6の一時的な下方調節をウェスタンブロット分析により確認することができた。驚くべきことに、マイクロアレイ分析において高度に下方調節されたPCNAは、RT-PCRにおいてもモジュレートされるようであるが、pRb2/p130発現の増強に際してタンパク質発現の変化を示さなかった。しかしながら、PCNAは急速に増殖する腫瘍において細胞のS期からM期へ、またG0期へと拡張されうる比較的長い半減期を有することが示されている。
【００３６】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者のレベルを示すものである。本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み入れられると特定かつ個々に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。本発明を特定の実施形態に対して参考文献と共に説明したが、これらの方法および組成物における変更を用いることができ、本発明を本明細書に特異的に記載されたものと同様に実施することができることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲内に包含される全ての改変を含む。
【表１】
2007507233.tif 000002
【００３７】
【表２】
2007507233.tif 000003
2007507233.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】アデノウイルスを介するRB2/p130の過剰発現を示す。H23、H23-Ad-CMVおよびH23-Ad-CMV-RB2/p130非小細胞肺癌細胞系におけるRB2/p130のノーザンブロットおよびウェスタンブロット分析(aおよびb)を示す。
【図２】H23細胞におけるpRb2/p130発現の増強の効果を示す。H23-Ad-CMV(a)およびH23-Ad-CMV-Rb2/p130(b)感染細胞のFACS分析を示す。Rb2/p130の過剰発現により、空のアデノウイルス(54％)と比較して、81.2％の細胞が細胞周期のG0/G1期に集積した。この分析は、同等の結果で3回行った。
【図３】H23 対 H23-Ad-CMV、およびH23-Ad-CMV 対 H23-Ad-CMV-RB2細胞における遺伝子発現の包括的比較を示す。各ドットは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上の1個の単一エレメントのCy3蛍光強度に対応する。発現の2倍の変化を、2と付記した平行線で示す。
【図４】半定量的RT-PCRによる11個の選択された遺伝子のオリゴヌクレオチドマイクロアレイの結果の検証を示す。RT-PCRを、H23、H23-Ad-CMVおよびH23-Ad-CMV-Rb2/p130非小細胞肺癌細胞系のDNase処理された総RNAを用いて行った。B-MYB(194 bp)、Cyc B2(217 bp)、Cyc D1(463 bp)、GRPR(377 bp)、KPNA2(304 bp)、MKK3(219 bp)、NIK(317 bp)、PCNA(420 bp)、PIM1(324 bp)、PLK(154 bp)およびRAF1(280 bp)遺伝子の増幅断片を示す。ACT-β(626 bp)およびHPRT(349 bp)遺伝子を内部対照として用いて、同じサンプルから増幅した。
【図５】ウェスタンブロット分析によるオリゴヌクレオチドマイクロアレイデータの検証を示す。H23、H23-Ad-CMVおよびH23-Ad-CMV-Rb2/p130細胞からのタンパク質抽出物100μgをSDS-PAGEゲル上にロードし、抗B-MYB、E2F-1、MAGEA 3/6、MKK3、NIK、PCNA、PLKおよびRAF1抗体を用いて免疫ブロッティングした。抗HSP-70を内部対照として用いた。この分析は同等の結果で2回行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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