(57)【要約】本発明は、ｐｃｋＡ遺伝子が修飾または欠失されている、発現タンパク質を生産する改変された能力を有するように遺伝的に操作された細胞を提供する。特に本発明は、１つ以上の染色体遺伝子が修飾または不活性化された（例えば、ｐｃｋＡ）関心のあるタンパク質の増強された発現を示すバチルス種のようなグラム陽性細菌に関し、好ましくは１つ以上の染色体遺伝子（例えば、ｐｃｋＡ）がバチルス染色体から修飾または欠失されている。更なるいくつかの態様において、対応する野生型バチルス宿主染色体から１つ以上の常在染色体領域が修飾および／または欠失される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾ｐｃｋＡ遺伝子を含む微生物。
【請求項２】
前記ｐｃｋＡ遺伝子が欠失していることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化されていることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
グラム陽性細菌である請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
前記グラム陽性細菌がバチルス（Bacillus）種であることを特徴とする請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
非修飾ｐｃｋＡ遺伝子を有する微生物と比較して、少なくとも１つの関心のあるタンパク質の改善された発現を示すことを特徴とする請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
前記バチルス種内の少なくとも１つの常在染色体領域が変異バチルス株を生産するために修飾されており、ここで前記変異バチルス株が前記バチルス種と比較して前記関心のあるタンパク質をより高レベルで発現することを特徴とする請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
前記変異バチルス株が前記関心のあるタンパク質をコードするヘテローグなポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
変異バチルス株がバチルス・スブチリス（B. subtilis）であることを特徴とする請求項７に記載の微生物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの修飾された常在染色体領域が、ブロファージ領域、抗菌領域、制御領域、多隣接単一遺伝子領域、およびオペロン領域からなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の微生物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの修飾された常在染色体領域が、ＰＢＳＸ領域、皮膚領域、ブロファージ７領域、ＳＰβ領域、プロファージ１領域、プロファージ２領域、プロファージ３領域、プロファージ４領域、プロファージ５領域、プロファージ６領域、ＰＰＳ領域、ＰＫＳ領域、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ領域、ＤＨＢ領域およびそれらの断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの修飾された常在染色体領域が欠失により修飾されていることを特徴とする請求項１０に記載の微生物。
【請求項１３】
前記欠失が１つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片を含み、ここで前記常在染色体領域が約０．５〜５００キロ塩基を含むことを特徴とする請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記ｐｃｋＡ遺伝子の欠失を含む改変バチルス株。
【請求項１５】
少なくとも１つのプロテアーゼを生産することを特徴とする請求項１４に記載の改変バチルス株。
【請求項１６】
前記プロテアーゼがスブチリシン（subtilisin）であることを特徴とする請求項１４に記載の改変バチルス株。
【請求項１７】
前記スブチリシンが、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびそれらの変異体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６に記載の改変バチルス株。
【請求項１８】
ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択された少なくとも１つの染色体遺伝子における少なくとも１つの欠失を更に含むことを特徴とする請求項１４に記載の改変バチルス株。
【請求項１９】
ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子における少なくとも一つの突然変異を含むことを特徴とする請求項１８に記載の改変バチルス株。
【請求項２０】
前記突然変異がｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２を含むことを特徴とする請求項２０に記載の改変バチルス株。
【請求項２１】
外来配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ構築体を更に含むことを特徴とする請求項１４に記載の改変バチルス株。
【請求項２２】
前記外来配列が少なくとも１つの選択マーカーおよび前記ｐｃｋＡ遺伝子を含むことを特徴とする請求項２１に記載の改変バチルス株。
【請求項２３】
前記外来配列が、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ  ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択された少なくとも一つの遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載の改変バチルス株。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの選択マーカーが前記遺伝子の２つの断片間に位置していることを特徴とする請求項２３に記載の改変バチルス株。
【請求項２５】
前記外来配列が選択マーカーおよび少なくとも１つのホモローグ・ボックスを含み、ここで該ホモロジー・ボックスが前記選択マーカーの５’および／または３’末端に隣接することを特徴とする請求項２１に記載の改変バチルス株。
【請求項２６】
前記外来配列が前記改変バチルス株のゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項２１に記載の改変バチルス株。
【請求項２７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、および配列番号３３からなる群より選択される核酸配列に示される少なくとも１つの配列を含む単離核酸。
【請求項２８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択されるアミノ酸をコードする単離核酸配列。
【請求項２９】
選択マーカー、およびｃｓｓＳ遺伝子、ｃｓｓＳ遺伝子断片またはこれらのホモローグ配列のいずれかを含む外来配列を含む精製されたＤＮＡ構築体。
【請求項３０】
前記選択マーカーが前記ｃｓｓＳ遺伝子の２つの断片間に位置していることを特徴とする請求項２９に記載のＤＮＡ構築体。
【請求項３１】
前記外来配列が、前記選択マーカーの５’および／または３’末端に隣接する、少なくとも１つのホモロジー・ボックスを更に含むことを特徴とする請求項２９に記載のＤＮＡ構築体。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項２９に記載のＤＮＡ構築体。
【請求項３３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号３０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むことを特徴とする請求項２９に記載のＤＮＡ構築体。
【請求項３４】
請求項２９に記載のＤＮＡ構築体で形質転換された宿主細胞。
【請求項３５】
大腸菌およびバチルス細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記外来配列が前記宿主細胞における染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
微生物により少なくとも１つのタンパク質の生産を増強する方法であって、
ａ）微生物宿主細胞を提供する工程、
ｂ）改変株を生産するために前記宿主細胞におけるｐｃｋＡ遺伝子を不活性化する工程、および
ｃ）前記タンパク質の発現に適した条件下で前記改変株を成長させる工程
を含む方法。
【請求項３８】
前記改変株により発現された前記タンパク質を回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞が大腸菌およびバチルス細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される少なくとも一つの染色体遺伝子を不活性化する工程を更に含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記タンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの染色体遺伝子が挿入不活性化により不活性化されていることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
関心のあるタンパク質を発現する改変バチルス株を得るための方法であって、ｐｃｋＡ遺伝子を含む外来遺伝子を含むＤＮＡ構築体でバチルス宿主細胞を形質転換する工程含み、ここで前記外来配列が改変バチルス株を生産するために前記バチルス宿主細胞の染色体に組み込まれ、更に１つ以上の染色体遺伝子が不活性化されており、および少なくとも１つの関心のあるタンパク質の発現に好適な成長条件下で前記改変バチルス株を成長させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記バチルス宿主細胞が、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レントゥス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・スブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（B．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・クラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・スブチリスからなる群より選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記バチルス宿主細胞が組換え宿主細胞であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記改変バチルス株により生産される前記関心のあるタンパク質が回収されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ構築体が更に選択マーカーを含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記選択マーカーが、前記バチルス宿主細胞の前記染色体へ前記外来配列を組み込んだ上で前記外来配列から切り出されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記外来配列が、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を更に含み、ここで前記ＤＮＡ構築体がバチルス宿主細胞の染色体に組み込まれ、前記バチルス宿主細胞の前記染色体上に存在する１つ以上の遺伝子の欠失をもたらすことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＤＮＡ構築体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＤＮＡ構築体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号３０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
増強されたプロテアーゼ生産を有するバチルス・スブチリス株を得るための方法であって、ＤＮＡ構築体によりバチルス・スブチリス宿主細胞を形質転換する工程、改変バチルス・スブチリス株を生産するために、ＤＮＡ構築体と、バチルス・スブチリス染色体からｐｃｋＡが欠失したバチルス・スブチリス染色体の相同領域との相同組換えを可能にする工程、および前記プロテアーゼの発現に好適な条件下で改変バチルス・スブチリス株を成長させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５５】
ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子が前記バチルス・スブチリスの染色体から欠失していることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記プロテアーゼが、ホモローグプロテアーゼおよびヘテローグプロテアーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記プロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記スブチリシンが、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびそれらの変異体からなる群より選択されることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記改変バチルス・スブチリス株が、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子における一つの突然変異を更に含むことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記突然変異がｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２を含むことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記改変バチルス・スブチリス株が、１つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片の欠失を含み、ここで前記常在染色体領域が約０．５〜５００キロ塩基を含むことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＤＮＡ構築体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡ構築体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号３０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法であって、選択マーカーを含むＤＮＡ構築体および不活性化する染色体セグメントをバチルス宿主細胞に導入する工程、ここで改変バチルス株を生産するために、前記ＤＮＡ構築体はバチルス宿主株の染色体に組み込まれ、前記バチルス宿主株からの常在染色体領域またはその断片の欠失を生じ、および前記バチルス宿主株における関心のあるタンパク質の発現に比較して前記改変バチルス株における関心のあるタンパク質の発現が大きくなるのに好適な条件下で前記改変バチルス株を成長させる工程を含む方法。
【請求項６５】
前記関心のあるタンパク質を回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記改変バチルス株から前記選択マーカーを切り出す工程を更に含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記常在染色体領域が、ＰＢＳＸ、皮膚、ブロファージ７、ＳＰβ、プロファージ１、プロファージ２、プロファージ３、プロファージ４、プロファージ５、プロファージ６、ＰＰＳ、ＰＫＳ、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ、ＤＨＢおよびそれらの断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記改変バチルス株が少なくとも２つの常在染色体領域の欠失を含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記関心のあるタンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記バチルス宿主株が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択されることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記改変バチルス・スブチリス株が、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される１つの遺伝子における少なくとも一つの突然変異を更に含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記突然変異がｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２を含むことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法であって、少なくとも１つのバチルス細胞から核酸を得る工程、少なくとも１つの関心のある遺伝子を同定するために前記バチルス細胞からの核酸についてトランスクリプトームＤＮＡアレイ分析を行う工程、ＤＮＡ構築体を生産するために前記少なくとも１つの関心のある遺伝子を修飾する工程、および改変バチルス株を生産するためにバチルス宿主細胞に前記ＤＮＡ構築体を導入し、ここで改変されていないバチルスにおける関心のあるタンパク質の発現に比較して前記関心のあるタンパク質の発現が増強されるような条件下で、前記改変バチルス株が関心のあるタンパク質を生産することができることを特徴とする工程を含む方法。
【請求項７５】
前記関心のあるタンパク質が、アミノ酸生合成経路および生分解経路からなる群より選択される少なくとも１つの生化学経路に関係していることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１つの生分解経路が働かない（disable）ことを特徴とする請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記生分解経路が関心のある遺伝子の転写のために働かないことを特徴とする請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記バチルス宿主細胞が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択されることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記関心のあるタンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法であって、少なくとも１つのバチルス細胞から少なくとも１つの関心のある遺伝子を含む核酸を得る工程、前記関心のある遺伝子を含む増幅断片プールを生産するために前記断片を増幅する工程、ＤＮＡ構築体を生産するために前記増幅断片を結合する工程、改変バチルス株を生産するためにバチルス宿主細胞に前記ＤＮＡ構築体を直接的に形質移入し、ここで前記改変バチルス株がｐｒｐＣ、ｓｉｇＤ、およびｔｄｈ／ｋｂｌからなる群より選択される修飾遺伝子を含むことを特徴とする工程、改変されていないバチルスにおける前記関心のあるタンパク質の発現に比較して前記関心のあるタンパク質の発現が増強されるような条件下で、前記改変バチルス株を培養する工程を含む方法。
【請求項８２】
前記バチルス宿主細胞が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択されることを特徴とする請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記関心のあるタンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐｃｋＡ遺伝子が修飾または除去された発現タンパク質を生産するために改変された能力を有するように遺伝子操作されている細胞を提供する。特に本発明は、１つ以上の染色体遺伝子が修飾および／または不活性化された（例えば、ｐｃｋＡ）、および好ましくは１つ以上の染色体遺伝子（例えば、ｐｃｋＡ）が修飾および／またはバチルス染色体から除去された関心のあるタンパク質の増強された発現を示すバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。いくつかの更なる態様において、１つ以上の常在染色体領域は修飾および／または対応する野生型バチルス宿主染色体から除去されている。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学は、産業バイオリアクター、細胞工場として、および食品発酵において用いられる微生物の改良を可能にしてきた。特にバチルス種は多数の有用なタンパク質および代謝産物を生産および分泌する（ズコウスキー、「商業的価値を有する生産物の生産」、ドイおよびＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ編『バチルスの生物学−産業への応用』、バターワース・ハイネマン社刊、ストーンハム、マサチューセッツ州、３１１頁−３３７頁［１９９２年］）。産業に用いられる最も一般的なバチルス種は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびバチルス・スブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。それらのＧＲＡＳ（一般的に認識された安全性）の地位のために、これらバチルス種の菌株は食品および製薬産業において用いられるタンパク質生産用の天然の候補者である。重要な生成酵素には、α−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、およびアルカリ（またはセリン）プロテアーゼが含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、バチルス宿主細胞におけるタンパク質生産の理解が進化したとはいえ、これらタンパク質の発現を増大するための方法の必要性が依然として残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要約
本発明はｐｃｋＡ遺伝子が修飾または除去された発現タンパク質を生産するため改変された能力を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。特に本発明は、１つ以上の染色体遺伝子が修飾および／または不活性化された（例えば、ｐｃｋＡ）、および好ましくは１つ以上の染色体遺伝子（例えば、ｐｃｋＡ）が修飾および／またはバチルス染色体から除去された関心のあるタンパク質の増強された発現を示すバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。いくつかの更なる態様において、１つ以上の常在染色体領域は修飾および／または対応する野生型バチルス宿主染色体から除去されている。いくつかの好ましい態様において本発明は、バチルスにおける少なくとも一つの関心のあるタンパク質の改善された発現および／または分泌のための方法および組成物を提供する。
【０００５】
特に好ましい態様において、本発明はバチルスにおける少なくとも１つの関心のあるタンパク質の改善された発現および／または分泌のための手段を提供する。これらの態様においてより特別に、本発明は、修飾および／または不活性化された遺伝子が菌株生存のために必要でないバチルス宿主株における１つ以上の染色体遺伝子の修飾および／または不活性化に関する。１つ以上の染色体遺伝子の修飾および／または不活性化の一つの結果は、対応する非改変バチルス宿主株よりも高レベルの関心のあるタンパク質を発現することが可能な改変バチルス株が生産されることである。
【０００６】
さらに別の態様において本発明は、欠失常在染色体領域が株菌生存のために必要でないバチルス宿主株における染色体ＤＮＡの広範な領域を除去するための手段を提供する。１つ以上の常在染色体領域の除去の一つの結果は、対応する非改変バチルス株よりも高レベルの関心のあるタンパク質を発現することが可能な改変バチルス菌株が生産されることである。いくつかの好ましい態様においてバチルス宿主株は、関心のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主株である。いくつかの特に好ましい態様において、改変バチルス菌株は、バチルス・スブチルス菌株である。以下に詳述するように、欠失常在染色体領域は、プロファージ領域、抗微生物（例えば、抗菌）領域、調節領域、多隣接単一遺伝子領域およびオペロン領域を含むが、これらに限定されない。
【０００７】
いくつかの態様において、本発明はバチルス種細胞からの関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法と組成物を提供する。いくつかの好ましい態様において、この方法は、改変バチルス菌株を生産するためにバチルス宿主株におけるｐｃｋＡ遺伝子を不活性化する工程、適切な培養条件の下で改変バチルス菌株を増殖する工程、および対応する非改変バチルス宿主株と比べてタンパク質の発現が増強される改変バチルスにおいて関心のあるタンパク質が発現可能な工程を含む。他の態様において、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群から選択される１つ以上の追加的な染色体遺伝子は、改変バチルス菌株を産生するためにバチルス宿主株において不活性化され、適切な培養条件の下で改変バチルス菌株を増殖し、および対応する未改変バチルス宿主株に比べてタンパク質の発現が増強される改変バチルス菌において少なくとも一つの関心のあるタンパク質の発現を可能とする。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質は相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）タンパクであり、一方で他の態様において関心のあるタンパク質は異種（ｈｅｔｅｌｏｇｏｕｓ）タンパクである。いくつかの態様において、１つ以上の関心のあるタンパク質が生産される。いくつかの好ましい態様において、バチルス種はバチルス・スブチルス菌株である。また更なる態様において、染色体遺伝子の不活性化は、改変バチルス菌株を生産するための遺伝子の欠失を含む。追加的な態様において、染色体遺伝子の不活性化は挿入不活性化を含む。いくつかの好ましい態様において、関心のあるタンパク質は酵素である。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方で他の態様において、関心のあるタンパク質は抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群から選択される。
【０００８】
更に追加的な態様において、本発明はｐｃｋＡ遺伝子の欠失を含む改変バチルス菌株を提供する。一方、他の態様において改変バチルス菌株は更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤの群より選択された１つ以上の染色体遺伝子における欠失を含む。いくつかの態様において、改変菌株はプロテアーゼ生産バチルス菌株である。別の態様において、改変バチルス菌株はスブチリシン生産菌株である。更に他の態様において、改変バチルス菌株は、さらにｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択された遺伝子における突然変異を含む。
【０００９】
更なる態様において、本発明は外来配列を含むＤＮＡ構築体を提供する。いくつかの態様において外来配列には、選択マーカーおよびｐｃｋＡ遺伝子を含む遺伝子および／または遺伝子断片が含まれる。更なる態様において、外来配列はさらにｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ、ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群から選択される遺伝子および／遺伝子断片を含む。別の態様において、選択マーカーは二つの遺伝子断片の間に位置している。他の態様において、外来配列は選択マーカーおよび該マーカーの５’および／または３’末端に隣接するホモロジーボックスを含む。追加的な態様において、宿主細胞はＤＮＡ構築体を用いて形質転換される。更なる態様において、宿主細胞は大腸菌（大腸菌）またはバチルス細胞である。いくつかの好ましい態様において、ＤＮＡ構築体は宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００１０】
また本発明は、本発明のＤＮＡ構築体を用いて、バチルス宿主細胞を形質転換することを含む関心のあるタンパク質を発現する改変バチルス菌株を得るための方法を提供する。ここでＤＮＡ構築体はバチルス宿主細胞の染色体に組み込まれており、１つ以上の染色体遺伝子が不活性化されている改変バチルス菌株を産生し、および少なくとも一つの関心のあるタンパク質の発現のために、適切な培養条件下で改変バチルス菌株を増殖する。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質は、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方で他の態様において関心のあるタンパク質は、抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群より選択される。更に追加的な態様において、バチルス宿主菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レントゥス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・スブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・クラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からなる群より選択され、好ましくはバチルス・スブチルスである。いくつかの態様において、バチルス宿主菌株は組み換え宿主である。更に追加的な態様において、関心のあるタンパク質は回収される。更なる態様において、選択マーカーは改変バチルスから切り出される。
【００１１】
更に本発明は、関心のあるタンパク質を発現する改変バチルス菌株を得る方法を提供する。いくつかの態様において前記方法は、選択マーカーおよびｐｃｋＡを含む外来配列を含むＤＮＡ構築体を用いてバチルス宿主を形質転換する工程を含む。更なる態様において外来配列はさらに、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を含む。ここでＤＮＡ構築体は、バチルス宿主細胞の染色体へ組み込まれ、１つ以上の遺伝子の欠失をもたらし、改変バチルス菌株を獲得し、および関心のあるタンパク質の発現のために適切な培養条件下で改変バチルス菌株を増殖する。
【００１２】
いくつかの代替的な態様において、本発明は外来配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。ここで外来配列には、選択マーカーおよびｃｓｓＳ遺伝子、ｃｓｓＳ遺伝子断片またはそれらと相同配列が含まれる。いくつかの態様において、選択マーカーは、遺伝子の二つの断片の間に位置する。他の態様において、外来配列は選択マーカーおよび該マーカーの５’および／または３’末端に隣接するホモロジーボックスを含む。更に他の態様において、宿主細胞はＤＮＡ構築体を用いて形質転換される。追加的な態様において、宿主細胞は大腸菌またはバチルス細胞である。また、更なる態様において、ＤＮＡ構築体は宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００１３】
また本発明は、増強されたプロテアーゼ生産を示すバチルス・スブチルス菌株を得るための方法を提供する。いくつかの態様において、前記方法は以下の工程を含んでいる。すなわち、本発明に従ってＤＮＡ構築体を用いてバチルス・スブチルス宿主細胞を形質転換する工程、ＤＮＡ構築体とｐｃｋＡが除去されているバチルス染色体の相同領域との相同組換を可能とする工程、改変バチルス・スブチルス菌株を得る工程、およびプロテアーゼの発現のための適切な条件下で改変バチルス菌株を増殖する工程である。更なる態様において、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦおよびｒｏｃＤの遺伝子の少なくとも一つが、バチルス染色体から欠失され、改変バチルス・スブチルス菌株を獲得し、プロテアーゼの発現のための適切な条件下で改変バチルス菌株を増殖する。いくつかの態様において、プロテアーゼ生産バチルスは、スブチリシン生産菌株である。他の態様において、プロテアーゼは異種プロテアーゼである。更なる態様において、前記プロテアーゼ生産株にはさらに、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される遺伝子における突然変異が含まれる。いくつかの態様において、不活性化は遺伝子の挿入不活性化を含む。
【００１４】
更に本発明は、一つのｐｃｋＡの欠失を含む改変バチルス・スブチルス菌株を提供する。ここで、前記改変バチルス・スブチルス菌株は、少なくとも一つの関心のあるタンパク質の発現が可能である。更なる態様において、少なくとも一つの関心のあるタンパク質の発現が可能である改変バチルス・スブチルス菌株は、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦおよびｒｏｃＤからなる群より選択される一つ以上の染色体遺伝子の欠失を含む。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質は酵素である。いくつかの更なる態様において、関心のあるタンパク質は異種タンパクである。
【００１５】
いくつかの態様において本発明は、１つ以上の常在染色体領域またはその断片の欠失を含む改変バチルス菌株を提供する。ここで、前記常在染色体領域は約０．５から５００キロベース（ｋｂ）を含み、および改変バチルス菌株は、基本的に同一の培養条件下で増殖する場合、対応する未改変バチルス菌株に比べて関心のあるタンパク質の増強された発現レベルを有する。いくつかの好ましい態様において、これらの改変バチルス菌株はｐｃｋＡ遺伝子の欠失を含む。
【００１６】
さらに追加的な態様において本発明は、ＰＢＳＸ領域、皮膚（ｓｋｉｎ）領域、プロファージ７領域、ＳＰβ領域、プロファージ１領域、プロファージ２領域、プロファージ３領域、プロファージ４領域、プロファージ５領域、プロファージ６領域、ＰＰＳ領域、ＰＫＳ領域、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ領域、ＤＨＢ領域およびそれらの断片からなる群より選択される常在染色体領域の少なくとも一つの欠失を含むプロテアーゼ生産バチルス菌株を提供する。
【００１７】
更なる態様において、本発明はバチルスにおける少なくとも一つの関心のあるタンパク質の発現を増強するための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、選択マーカーおよび不活性化染色体断片を含むＤＮＡ構築体をバチルス宿主菌株に導入することによって生産された改変バチルスを得、ここでＤＮＡ構築物はバチルス染色体へ組み込まれる工程、バチルス宿主細胞からの常在染色体領域またはそれらの断片の欠失をもたらす工程、および、適切な培養条件下で改変バチルス菌株を増殖し、ここで関心のあるタンパク質の発現が未改変バチルス宿主細胞に対応している場合と比べて、関心のあるタンパク質の発現が、改変バチルス菌株においてより大きい工程を含む方法である。
【００１８】
また本発明は、バチルス菌株から少なくとも一つの関心のあるタンパク質を得るための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、選択マーカーおよび不活性化染色体部分を含むＤＮＡ構築体を用いてバチルス宿主細胞を形質転換し、ここでＤＮＡ構築体はバチルス菌株の染色体に組み込まれ、改変バチルス菌株を形成するために常在染色体領域またはそれらの断片の欠失をもたらす工程、関心のあるタンパク質の発現を可能とする適切な培養条件下で改変バチルス菌株を増殖する工程、および関心のあるタンパク質を回収する工程を含む方法である。
【００１９】
また本発明は、有益な突然変異をスクリーニングおよび／または同定するためのＤＮＡマイクロアレイデータの利用手段を提供する。いくつかの特に好ましい態様において、これらの突然変異はｐｃｋＡ遺伝子を含む。更なる態様において、突然変異はｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦおよびｒｏｃＤからなる群より選択される遺伝子を含む。いくつかの好ましい態様において、これらの有益な突然変異は、所定のアミノ酸生合成経路および生分解経路の同時発現に関するトランスクリプトームの証拠、および／または分解経路がより高い実績の菌株をもたらすという証拠、および／または生合成経路の過剰発現がより高い実績の菌株をもたらすという証拠に基づく。追加的な様態において、本発明は、有益な突然変異を提供するためのＤＮＡマイクロアレイデータの利用手段を提供する。いくつかの好ましい態様において、これらの突然変異はｐｃｋＡ遺伝子を含む、他方更なる態様において、アミノ酸生合成経路が非均衡で、全経路の過剰発現が親（すなわち、野生型および／または出発）菌株よりも高い実績を提供する場合、これらの突然変異はｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦおよびｒｏｃＤからなる群より選択される遺伝子を含む。更に本発明は、糖新生遺伝子の不活性化を通じて菌株生産を改善するための手段を提供する。これらの好ましいいくつかの態様において、不活性化された糖新生遺伝子は、ｐｃｋＡ、ｇａｐＢ、およびｆｂｐ〜なる群より選択される。
【００２０】
本発明は、少なくとも一つのバチルス由来の関心のあるタンパク質の発現を増強するための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、関心のあるタンパク質を生産することが可能な改変バチルス菌株を得、ここで改変バチルス菌株は不活性化されたｐｃｋＡ染色体遺伝子を有し、および発現が未改変バチルス宿主菌株における関心のあるタンパク質の発現と比べて増強されている関心のあるタンパク質が改変バチルス菌株により発現されるような条件下で改変バチルス菌株を増殖する工程を含む方法である。更なる態様において改変バチルス菌株は更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦおよびｒｏｃＤからなる群より選択される少なくとも一つの不活性化された染色体遺伝子を含み、発現が未改変バチルス宿主菌株における関心のあるタンパク質の発現と比べて増強される。関心のあるタンパク質が改変バチルス菌株によって発現されるような条件下で改変バチルス菌株を増殖する。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質は相同タンパクおよび異種タンパクからなる群より選択される。いくつかの態様において、関心あるタンパクは、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方で他の態様において関心のあるタンパク質は抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群より選択される。いくつかの特に好ましい態様において、関心のあるタンパク質はプロテアーゼである。いくつかの追加的な態様において、改変バチルス菌株はｐｃｋＡの欠失によって得られ、一方で他の態様において、改変バチルス菌株は更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ、ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される１つ以上の染色体遺伝子の欠失によって得られる。
【００２１】
また本発明は、本発明に記述された方法を用いて得られる改変バチルス菌株を提供する。いくつかの好ましい態様において、改変バチルス菌株はｐｃｋＡ遺伝子の染色体欠失を含み、一方、他の態様において改変バチルス菌株は更にｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ、ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される１つ以上の染色体遺伝子の欠失を含む。いくつかの態様において、１つより多くのこれらの染色体遺伝子が除去されている。いくつかの特に好ましい態様において、改変菌株はバチルス・スブチルス菌株である。追加的な好ましい態様において、改変バチルス菌株は、プロテアーゼ生産菌株である。いくつかの特に好ましい態様において、プロテアーゼはスブチリシンである。更に追加的な態様において、スブチリシンはスブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびそれらの変異体からなる群より選択される。また更なる態様において、改変バチルス菌株は更に、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子、または複数の突然変異を含む。いくつかの特に好ましい態様において、改変バチルス菌株は更に関心のある異種タンパクを含む。
【００２２】
また本発明は、ｐｃｋＡ遺伝子を含むＤＮＡ構築体を提供する。追加的な態様において、本発明は、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ、ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ、それらの遺伝子断片、およびそれらとの相同配列からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を更に含むＤＮＡ構築体を提供する。いくつかの好ましい態様において前記ＤＮＡ構築体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも一つの核酸を含む。いくつかの態様において前記ＤＮＡ構築体は、更に少なくとも一つの関心のあるタンパク質をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
また本発明は、ＤＮＡ構築体を含むプラスミドを提供する。更なる態様において、本発明はＤＮＡ構築体を含むプラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、前記宿主細胞は、バチルス細胞および大腸菌細胞からなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、前記宿主細胞はバチルス・スブチルスである。いくつかの特に好ましい態様において、ＤＮＡ構築体は宿主細胞の染色体に組み込まれている。他の態様において、ＤＮＡ構築体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号３０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。追加的な態様において、ＤＮＡ構築体はさらに少なくとも一つの選択的マーカーを含む。ここで前記選択的マーカーは、遺伝子断片またはそれらと相同な遺伝子配列によってそれぞれの横に位置する。
【００２４】
また本発明は、関心のあるタンパク質をコードする核酸を含む外来配列を含んだＤＮＡ構築体、およびｐｃｋＡ遺伝子のコーディング領域に直接隣接する配列と８０〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むホモロジーボックスを用いてそれぞれに隣接した選択マーカーを提供する。追加的な態様において、外来配列は更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を含む。いくつかの態様において、前記ＤＮＡ構築体はさらに、遺伝子のコード配列に隣接する少なくとも一つの核酸を含む。また本発明は、ＤＮＡ構築体を含むプラスミドを提供する。更なる態様において、本発明は、ＤＮＡ構築体を含むプラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、前記宿主細胞は、バチルス細胞および大腸菌細胞からなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、宿主細胞はバチルス・スブチルスである。いくつかの特に好ましい態様において、前記ＤＮＡ構築体は宿主細胞の染色体に組み込まれる。更に好ましい態様において、前記選択マーカーは宿主細胞染色体から切り出されている。
【００２５】
本発明は更に、強化されたプロテアーゼ生産を有する改変バチルス菌株を得るための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、本発明の少なくとも一つのＤＮＡ構築体を用いたバチルス宿主細胞を形質転換し、ここでＤＮＡ構築体における関心のあるタンパク質はプロテアーゼであり、およびＤＮＡ構築体は、少なくとも一つの遺伝子が改変バチルス菌株を生産するために不活性化されるような条件下でバチルス宿主細胞の染色体に組み込まれる工程、および強化されたプロテアーゼ生産が得られるような条件下で改変バチルス菌株を増殖する工程を含む方法である。いくつかの特に好ましい態様において、前記方法は更にプロテアーゼを回収する工程を含む。他の好ましい態様において、少なくとも一つの不活性化遺伝子は改変バチルス菌株の染色体から欠失される。本発明はまた、本発明に記述した方法を用いて生産される改変バチルス菌株を提供する。いくつかの態様において、バチルス宿主菌株は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、バチルス・ラトゥス、バチルス・クラウシ、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、前記バチルス宿主細胞はバチルス・スブチルスである。
【００２６】
本発明はまた、改変バチルスにおける増強されたプロテアーゼの発現のための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、本発明のＤＮＡ構築体を用いてバチルス宿主細胞を形質転換する工程、ＤＮＡ構築体およびバチルス宿主細胞の染色体領域の相同組換えを可能とし、ここで改変バチルス菌株を生産するために少なくとも一つのバチルス宿主細胞の染色体遺伝子が不活性化される工程、およびプロテアーゼの発現のために好適な条件下で改変バチルス菌株を増殖し、ここでプロテアーゼの生産が形質転換に先立つバチルス・スブチルス宿主とくらべて改変バチルス・スブチルス宿主においてより大きい工程を含む方法である。いくつかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはスブチリシンである。追加的な態様において、前記プロテアーゼは組み換えプロテアーゼである。さらに更なる態様において、不活性化は、少なくとも一つの遺伝子の欠失により達成される。また更なる態様において、不活性化は少なくとも一つの遺伝子の挿入不活性化により達成される。本発明はまた、本発明に記述される方法を用いて得られた改変バチルス菌株を提供する。いくつかの態様において、改変バチルス菌株は不活性化されたｐｃｋＡ遺伝子を含む。追加的な態様において、改変バチルス菌株はさらに、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ、ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群より選択された少なくとも一つの不活性化される遺伝子を含む。いくつかの好ましい態様において、不活性化された遺伝子は欠失により不活性化されている。追加的な態様において、改変バチルス菌株は更に、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＱ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される遺伝子における少なくとも一つの突然変異を含む。いくつかの好ましい態様において、前記突然変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。また更なる態様において、前記菌株は組み換えプロテアーゼ生産菌株である。いくつかの好ましい態様において、前記改変バチルス菌株は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、バチルス・ラトゥス、バチルス・クラウシ、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。
【００２７】
本発明はまた、１つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片の欠失を含む改変バチルス菌株を提供する。ここで常在染色体領域は、約０．５ｋ〜５００ｋｂを含み、および改変および未改変バチルス菌株が基本的に同じ培養条件下で増殖する場合、改変バチルス菌株は対応する未改変バチルス菌株と比べて強化された関心のあるタンパク質の発現レベルを有する。好ましい態様において、前記改変バチルス菌株はバチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、バチルス・ラトゥス、バチルス・クラウシ、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、前記改変バチルス菌株は、バチルス・スブチルス、バチルス・リケニフォルミス、およびバチルス・アミロリケファシエンスからなる群より選択される。いくつかの特に好ましい態様において、改変バチルス菌株はバチルス・スブチルス菌株である。また更なる態様において、前記常在染色体領域はＰＢＳＸ領域、皮膚領域、プロファージ７領域、ＳＰβ領域、プロファージ１領域、プロファージ２領域、プロファージ３領域、プロファージ４領域、プロファージ５領域、プロファージ６領域、ＰＰＳ領域、ＰＫＳ領域、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ領域、ＤＨＢ領域、およびそれらの断片からなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、二つの常在染色体領域またはそれらの断片は欠失されている。いくつかの態様において、少なくとも一つの関心のあるタンパク質は、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方、他の態様において関心のあるタンパク質は、抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群から選択される。また、追加的な態様において、関心のあるタンパク質はプロテアーゼである。いくつかの好ましい態様において、プロテアーゼはスブチリシンである。いくつかの特に好ましい態様において、スブチリシンはスブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびそれらの変異体からなる群より選択される。更に好ましい態様において、前記バチルス宿主細胞は組み換え菌株である。いくつかの特に好ましい態様において、前記改変バチルス菌株は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される遺伝子における少なくとも一つ突然変異を含む。いくつかの好ましい態様において、前記突然変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００２８】
本発明は更に、ＰＢＳＸ領域、皮膚領域、プロファージ７領域、ＳＰβ領域、プロファージ１領域、プロファージ２領域、プロファージ３領域、プロファージ４領域、プロファージ５領域、プロファージ６領域、ＰＰＳ領域、ＰＫＳ領域、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ領域、ＤＨＢ領域、およびそれらの断片からなる群より選択される常在染色体領域の欠失を含むプロテアーゼ生産バチルス菌株を提供する。いくつかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはスブチリシンである。いくつかの態様において、前記プロテアーゼは異種プロテアーゼである。いくつかの特に好ましい態様において、前記改変バチルス菌株は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、バチルス・ラトゥス、バチルス・クラウシ、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。追加的な態様において、バチルス菌株はバチルス・スブチルス菌株である。
【００２９】
また本発明は、バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を強化する、以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、選択マーカーおよび不活性化された染色体部分を含んだＤＮＡ構築体をバチルス宿主菌株へ導入し、ここでＤＮＡ構築体はバチルス宿主菌株の染色体に組み込まれ、改変バチルス菌株を生産するためにバチルス宿主細胞からの常在染色体領域またはその断片の欠失をもたらす工程、および好適な条件下で改変バチルス菌株を増殖し、ここで関心のあるタンパク質の発現が、改変されてないバチルス宿主細胞における関心のあるタンパク質の発現に比べて改変バチルス菌株においてより大きい工程を含む方法である。いくつかの好ましい態様において、前記方法は更に関心のあるタンパク質を回収する工程を含む。いくつかの態様において、前記方法は更に改変バチルス菌株から選択マーカーを切り出す工程を含む。追加的な態様において、前記常在染色体領域はＰＢＳＸ、皮膚、プロファージ７、ＳＰβ、プロファージ１、プロファージ２、プロファージ３、プロファージ４、プロファージ５、プロファージ６、ＰＰＳ、ＰＫＳ、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ、ＤＨＢ、およびそれらの断片からなる群より選択される。更なる態様において、前記改変バチルス菌株は少なくとも二つの常在染色体領域の欠失を含む。いくつかの好ましい態様において、関心のあるタンパク質は酵素である。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方、他の態様において関心のあるタンパク質は、抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群から選択される。いくつかの態様において、前記バチルス宿主菌株はバチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。本発明はまた、本発明に記述した方法を用いて生産された改変バチルス菌株を提供する。
【００３０】
また本発明は、バチルス菌株から関心のあるタンパク質を得るための、以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、選択マーカーおよび不活性化された染色体部分を含むＤＮＡ構築体を用いてバチルス宿主細胞を形質転換し、ここで前記ＤＮＡ構築体はバチルス菌株の染色体に組み込まれ、改変バチルス菌株を生産するために常在染色体領域またはその断片の欠失を生じる工程、関心のあるタンパク質の発現を可能とする好適な培養条件下で改変バチルス菌株を増殖する工程、および関心のあるタンパク質を回収する工程を含む方法である。いくつかの好ましい態様において、関心のあるタンパク質は酵素である。いくつかの特に好ましい態様において、バチルス宿主は関心のあるタンパク質をコードする異種遺伝子を含む。追加的な態様において、バチルス宿主細胞はバチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、前記常在染色体領域はＰＢＳＸ、皮膚、プロファージ７、ＳＰβ、プロファージ１、プロファージ２、プロファージ３、プロファージ４、プロファージ５、プロファージ６、ＰＰＳ、ＰＫＳ、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ、ＤＨＢ、およびそれらの断片からなる群より選択される。いくつかの特に好ましい領域において、前記改変バチルス菌株はさらに、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏｌｌＥ、およびｏｐｐＡからなる群より選択される遺伝子における少なくとも一つの突然変異を含む。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される酵素である。いくつかの特に好ましい態様において、酵素はプロテアーゼである。いくつかの好ましい態様において、関心のあるタンパク質は酵素である。他の態様において、関心のあるタンパク質は、抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群から選択される。
【００３１】
更に本発明はバチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を強化するための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、少なくとも一つのバチルス細胞から核酸を得る工程、少なくとも一つの関心ある遺伝子を同定するために、前記バチルス細胞由来の核酸についてトランスクリプトームＤＮＡアレイ分析を行う工程、ＤＮＡ構築体を生産するために少なくとも一つの関心のある遺伝子を修飾する工程、および改変バチルス菌株を生産するためにＤＮＡ構築体をバチルス宿主細胞に組み込む工程を含む方法である。ここで前記改変バチルス菌株は、改変されてないバチルスにおける関心のあるタンパク質の発現に比べて、関心のあるタンパク質の発現が強化されるような条件下で関心のあるタンパク質を生産することが可能である。いくつかの態様において、関心のあるタンパク質は、アミノ酸生合成経路および生分解経路を含む群より選択される少なくとも一つの生化学的経路と関連する。いくつかの態様において、前記方法は少なくとも一つの生分解経路の無効化することを含む。いくつかの態様において、生分解経路は、関心ある遺伝子の転写のために無効になる。しかしながら、このことにより、前記方法が関心のあるタンパク質の強化された発現が引起こす細胞内部における他の生化学的経路の修飾に利用されると考えられるように、本発明がこれらの経路に制限されることを意味しない。いくつかの特に好ましい態様において、前記バチルス宿主は関心のあるタンパク質をコードする異種遺伝子を含む。追加的な態様において、前記バチルス宿主細胞はバチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。いくつかの態様において、前記関心のあるタンパク質は酵素である。いくつかの好ましい態様において、前記関心のあるタンパク質はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方、他の態様において関心のあるタンパク質は、抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群から選択される。
【００３２】
更に本発明は、バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を強化するための以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、少なくとも一つのバチルス細胞から少なくとも一つの関心のある遺伝子を含む核酸を得る工程、前記核酸を断片化する工程、前記少なくとも一つの関心のある遺伝子を含む増幅された断片のプールを生産するために前記断片を増幅する工程、ＤＮＡ構築体を生産するために前記増幅した断片を結合する工程、改変バチルス菌株を生産するために前記ＤＮＡ構築体をバチルス宿主細胞へ直接的に形質転換する工程、および改変されていないバチルスにおける前記関心のあるタンパク質の発現と比べて、前記関心のあるタンパク質の発現が強化されるような条件下で前記改変バチルス菌株を増殖する工程を含む方法である。いくつかの好ましい態様において、前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応の利用を含む。いくつかの態様において、改変バチルス菌株は、ｐｒｐＣ、ｓｉｇＤ、およびｔｄｈ／ｋｂｌからなる群より選択される修飾遺伝子を含む。いくつかの特に好ましい態様において、前記バチルス宿主は関心あるタンパク質をコードする異種遺伝子を含む。追加的な態様において、前記バチルス宿主細胞は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択される。いくつかの態様において、前記関心のあるタンパク質は酵素である。いくつかの好ましい態様において、前記関心のあるタンパク質はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択され、一方、他の態様において関心のあるタンパク質は、抗体、ホルモンおよび成長因子からなる群より選択される。
【００３３】
更に本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、および配列番号３３からなる群より選択される核酸配列に示された配列を含む単離核酸を提供する。
【００３４】
また本発明は、アミノ酸をコードする単離核酸配列を提供する。ここで前記アミノ酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択される。
【００３５】
更に本発明は単離アミノ酸配列を提供する。ここで前記アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号３８、配列番号２６、配列番号２２、配列番号５７、配列番号２４、配列番号２８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３６、および配列番号３４からなる群より選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
図面の簡単な説明
図１．パネルＡおよびＢは、本発明によって提供される１つの方法（「方法１」実施例１を参照されたい）の一般的な概念図を示す。この方法において、遺伝子に隣接する領域および／または常在染色体領域は野生型バチルス染色体外で増幅され、制限酵素（少なくともＢａｍＨＩを含む）を用いて切断され、およびｐＪＭ１０２へ結合される。前記構築体は大腸菌によりクローン化され、そのプラスミドは単離され、ＢａｍＨＩを用いて線状化され、相補末端を用いて抗菌マーカーに結合される。大腸菌における再度のクローンニングの後、液体カルチャーが培養され、バチルス宿主菌株（好ましくはコンピテントなバチルス宿主菌株）の形質転換プラスミドＤＮＡを単離するために使用される。
【００３７】
図２は、本発明のいくつかの態様に従ったＤＮＡカセットの構築において使用されるプライマーの位置を示す。この図は本発明で使用したプライマー表記システムの説明を提供する。プライマー１および４は、欠失の存在を点検するために使用される。これらのプライマーは、「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＵＦ−ｃｈｋ」および「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＵＲ−ｃｈｋ−ｄｅｌ」と呼ばれる。ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＵＦ−ｃｈｋはまた、染色体におけるカセットの存在の陽性チェック用の、抗菌マーカー（プライマー１１：例えば、ＰＢＳＸ−ＵＲ−ｃｈｋ−Ｄｅｌと呼ばれる）内のリバースプライマーを用いたＰＣＲ反応において使用される。プライマー２および６は、前記上流隣接領域を増幅するために使用される。これらのプライマーは「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＵＦ」および「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＵＲ」と呼ばれ、ブラック・バーティカル・バー（ｂｌａｃｋ  ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｂａｒ）における組換え制限部位を含む。プライマー５および８は下流隣接領域の増幅に使用される。これらのプライマーは「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＤＦ」および「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＤＲ」と呼ばれる。これらのプライマーは、連結およびクローニング用の操作されたＢａｍＨＩ部位、あるいはＰＣＲ融合用のバチルス・スブチルス染色体の適切な部分と相同である２５塩基対テイルのいずれかを含むことが可能である。いくつかの態様において、プライマー３および７はＰＣＲ溶解によって作製されたカセットの場合と同様、カセットを融合するために使用されるが、一方、他の態様において挿入の存在を点検するために使用される。これらのプライマーは「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＵＦ−ｎｅｓｔｅｄ」および「ＤｅｌｅｔｉｏｎＸ−ＤＲ−ｎｅｓｔｅｄ」と呼ばれる。いくつかの態様において、「抗菌マーカー」に対応する配列は、Ｓｐｃ耐性マーカーであり、除去される領域はｃｓｓＳ遺伝子である。
【００３８】
図３は、本発明の一つの方法（「方法２」、実施例２を参照されたい）の一般的な概念図である。隣接領域は、選択マーカー配列に相補的な配列の２５ｂｐを含むように操作される。前記選択マーカー配列はまた、１つの隣接領域のＤＮＡに相補的な２５ｂｐ末端を含む。隣接領域の末端付近のプライマーは、単一の反応管において、全３つのテンプレートを増幅するために使用され、それによって融合断片が作られる。この融合断片またはＤＮＡ構築体は、コンピテントなバチルス宿主菌株に直接形質転換される。
【００３９】
図４は、バチルスＤＨＢ欠失クローンの電気泳動ゲルを示す。レーン１および２は、プライマー１および１１を用いて増幅されたＤＨＢ欠失を保有する二つの菌株、および不活性化された染色体部分の上流からフレオマイシンマーカーへ増幅された１．２ｋｂバンドを示す。レーン３はこの反応についての野生型コントロールを示す。非特異的な増幅のみが観察される。レーン４および５は、プライマー９および１２を用いて増幅されるＤＨＢ欠失菌株を示す。この２ｋｂバンドは、不活性化された染色体部分の抗菌領域を通じて下流部分以下まで増幅する。レーン６はこの反応のための負のコントロールであり、バンドは示されてない。レーン７および８は、プライマー１および４を用いて増幅される欠失菌株を示し、図によりＤＨＢ領域が欠落していることが確認できる。レーン９は野生型コントロールである。
【００４０】
図５は、ｓｌｒがｓｌｒ遺伝子の欠失をもたらすフレオマイシン（ｐｈｌｅｏ）マーカーによって置換されるバチルス・スブチルス（野生型）の生産菌株の二つのクローンのゲル電気泳動を示す。レーン１および２は、位置１および１１におけるプライマーを用いて増幅されたクローンを示す。レーン３は、同一のプライマーを用いて増幅された野生型染色体ＤＮＡである。１．２ｋｂバンドは、挿入について観察される。レーン４および５は、位置９および１２におけるプライマーを用いて増幅されたクローンを示す。レーン６は、同一のプライマーを用いて増幅された野生型染色体ＤＮＡである。正しい形質転換体は２ｋｂバンドを含む。レーン７および８は、位置２および４におけるプライマーを用いて増幅されたクローンを示す。レーン９は、同一のプライマーを用いて増幅された野生型染色体ＤＮＡである。欠失菌株についてバンドは観察されないが、約１ｋｂのバンドが野生型において観察される。参照は、プライマー位置の説明のために図２でなされる。
【００４１】
図６は、ｃｓｓＳがスペクチノマイシンマーカーを染色体へ組み込むことにより不活性化されるバチルス・スブチルス（野生型）の生産菌株のクローンの電気泳動ゲルを示す。レーン１は組込みのないコントロールであり、約１．５ｋｂ小さい。
【００４２】
図７は、バチルス・スブチルス野生型菌株（未改変）および対応する種々の欠失を有する改変バチルス・スブチルス菌株を含む振動フラスコの培養液から測定された、改善されたスブチリシン分泌を示す棒グラフを示す。プロテアーゼ活性（ｇ／Ｌ）は、１７、２４、および４０時間後に測定、または２４時間および４０時間で測定された。
【００４３】
図８は、バチルス・スブチルス野生型菌株（未改変）および対応する改変欠失菌株（−ｓｂｏ）および（−ｓｌｒ）における振動フラスコの培養液から測定された、改善されたプロテアーゼ分泌を示す棒グラフを示す。プロテアーゼ活性（ｇ／Ｌ）は、１７、２４、および４０時間後に測定された。
【００４４】
図９は、コントロール菌株およびｐｃｋＡ欠失菌株によって作られた円光の写真を示す。
【００４５】
図１０．パネルＡは、時間ごとの（「ＥＦＴ」は発酵経過時間のことを言う）最小培地で培養された親菌株およびｐｃｋＡ菌株の光学密度のグラフを示す。このグラフが示すように、ｐｃｋＡ欠失菌株は親菌株よりも短い期間でより多くの増殖を生じた。図１０．パネルＢは、時間ごとのグラム／リッターで表示された栄養培地で培養された親菌株およびｐｃｋＡ欠失菌株の力価のグラフを示す。図１０．パネルＣは、栄養培地で培養された親菌株およびｐｃｋＡ欠失菌株の炭素生産のグラフを示す。このパネルに示されるように、ｐｃｋＡ欠失菌株は炭素利用においてより効率的であった。
【００４６】
発明の説明
本発明は、発現タンパクを生産するために改変された能力を有するように遺伝子操作されている細胞を提供する。特に本発明は、１つ以上の染色体遺伝子が不活性化あるいは修飾された、少なくとも一つの関心のあるタンパク質の強化された発現を示すバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。特に好ましい態様において、ｐｃｋＡ遺伝子は不活性化あるいは修飾される。いくつかの好ましい態様において、１つ以上の染色体遺伝子は修飾および／またはバチルス染色体から欠失されている。いくつかの更なる態様において、１つ以上の常在染色体領域は、対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失されている。好ましい態様において、少なくともｐｃｋＡ遺伝子を含む領域は、バチルス染色体から欠失される。
【００４７】
定義
本発明で言及される全ての特許および出版物は、それらの特許および出版物において開示された全ての配列を含めて、参照により明示的に本発明に組み込まれる。特記のない限り、本発明で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する（例えば、シングレトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）他、「微生物学および分子生物学辞典」第２版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク［１９９４年］、およびヘイおよびマーハム（Ｈａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ）「ハーパーコリンズ生物学辞典」ハーパーペレニアル社、ニューヨーク［１９９１年］を参照。どちらも当業者に本発明で使用される多くの用語の一般的辞書を提供する）。本発明において記述されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験に用いることが可能であったとしても、その好ましい方法および材料が記述されている。数値域は、範囲を定義した数値を含む。本発明および添付のクレームにおいて使用されるように、単数形には、文中に他に明確な指定がない限り、複数の意味が含まれる。従って、例えば、「宿主細胞」にはそのような宿主細胞の複数個が含まれる。
【００４８】
特記のない限り、核酸は５’から３’方向に左から右に、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向に左から右へ、それぞれ記述される。本発明で提供される見出しは、全体として本明細書の参照により含まれ得る本発明の種々の様相または態様に限定されない。次に定義する用語は全体として明細書の参照によってより充分に定義される。
【００４９】
本発明で使用される「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主または発現媒体として働く能力を有する細胞のことを言う。本発明の好ましい態様において、宿主細胞はバチルス種または大腸菌細胞である。
【００５０】
本発明で使用される「バチルス属」には、バチルス・スブチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・クラウシ、バチルス・ハロデュランス、バチルス・メガテリウム、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラウトゥス、およびバチルス・チューリンギエンシスが含まれるがこれらに限定されない、当業者に知られて「バチルス」属内の全ての種が含まれる。バチルス属は、分類上の再編成が進行中であることが知られている。従って、この属には、現在「ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と命名されているバチルス・ステアロテルモフィルスのような生物体が含まれるが、これに限定されない再編成されている種が含まれることを意図している。酸素の存在下における耐性内生胞子の生産は、バチルス族の重要な特徴であると考えられる。もっとも、この特徴はまた近年命名されたアリサイクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アムフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テルモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびヴィルギバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも当てはまる。
【００５１】
本発明で使用される「核酸」は、センスまたはアンチセンス鎖を示すか否かにかかわらず、二本鎖または単鎖であり得るゲノム起源または合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡと同様に、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片または部分のことを言う。遺伝子コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列は所定のタンパク質をコードすることができると理解される。
【００５２】
本発明で使用される「遺伝子」という用語は、コード化領域（例えば、個々のコード化部分（ｅｘｏｎｓ）間の介在配列（ｉｎｔｒｏｎｓ）同様、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）またはリーダー配列および３’非翻訳（３’ＵＴＲ）またはトレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）配列）に先立つおよび続く領域を含み、または含み得ないポリペプチド鎖を生産することに関与するＤＮＡの染色体部分を意味する。
【００５３】
いくつかの態様において前記遺伝子は、ワクチンおよび抗体と同様に、成長因子、サイトカイン、リガンド、レセプターおよび阻害剤のような、治療上重要なタンパク質またはペプチドをコードする。前記遺伝子は、酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼおよびグルコアミラーゼのようなカルボハイドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼおよびリパーゼ）のような商業的に重要な工業上のタンパク質またはペプチドをコードすることができる。しかしながら、このことにより本発明がいかなる特定の酵素またはタンパク質に制限されることを意味しない。いくつかの態様において関心のある遺伝子は自然発生遺伝子であり、一方、他の態様においてそれは突然変異遺伝子または合成遺伝子である。
【００５４】
本発明で使用される「ベクター」という用語は、細胞において複製でき、および新しい遺伝子またはＤＮＡ部分を細胞に運ぶことができる任意の核酸のことを言う。従って、この用語は、異なる宿主細胞間へ移送するように作られた核酸構築体のことを言う。「発現ベクター」は、異質細胞における異種ＤＮＡ断片を組込み、および発現する能力を有するベクターのことを言う。多くの原核生物および真核生物の発現ベクターは商業的に入手できる。適切な発現ベクターの選択は当業者の有する知識の範囲内である。
【００５５】
本発明で使用される「ＤＮＡ構築体」、「発現カセット」および「発現ベクター」という用語は、標的細胞（すなわち、上記のように、ベクター、ベクター要素が存在する）における特定の核酸の転写を可能にする一連の特別な核酸要素を用いた、組換え的にまたは合成的に生成された核酸構築体のことを言う。組換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片に組み込むことが可能である。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも転写される核酸配列およびプロモーターが含まれる。いくつかの態様において、ＤＮＡ構築体にはまた、標的細胞の特定の核酸の転写を可能とする一連の特別な核酸要素が含まれる。ある態様において、本発明のＤＮＡ構築体は本発明で定義された選択マーカーおよび不活性化された染色体を含む。
【００５６】
本発明で使用される「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」および「ＤＮＡ構築体」は、配列を宿主細胞または生物体へ導入するために使用されるＤＮＡのことを言う。形質転換ＤＮＡは、配列を宿主細胞または生物体へ導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡはＰＣＲまたは任意のその他の適切な技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。いくつかの好ましい態様において、前記形質転換ＤＮＡは外来配列を含み、一方、他の好ましい態様において更にホモロジーボックスに隣接した外来配列を含む。また更なる態様において、前記形質転換ＤＮＡは末端（すなわち、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列またはフランクス（ｆｌａｎｋｓ））に追加される他の非相同配列を含む。この末端は、例えばベクターへの挿入のように、形質転換ＤＮＡが閉じた環を形成するように閉環できる。
【００５７】
本発明で使用される「プラスミド」という用語は、クローニング・ベクターとして使用される環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡのことを言い、それは多くの細菌およびいくつかの真核生物において染色体外自己複製遺伝因子を形成する。いくつかの態様において、プラスミドは宿主細胞のゲノムに組み込まれるようになる。
【００５８】
本発明で使用される「単離された」および「精製された」と言う用語は、自然に関連する少なくとも一つの成分から除去された核酸またはアミノ酸（または他の成分）のことを言う。
【００５９】
本発明で使用される「増強された発現」は、関心のあるタンパク質の増強された生産を含むように広く解釈される。増強された発現は、本発明の教示に従って改変されてない、しかし基本的に同一の培養条件下で増殖された対応する宿主菌株における通常の発現レベルを上回る発現である。
【００６０】
いくつかの好ましい態様において、「増強」は所望の特性の増大をもたらす任意の修飾によって達成される。例えば、いくつかの特に好ましい態様において、本発明は親菌株（例えば、野生型および／または出発菌株）よりも大量のおよび／または高品質の関心あるタンパク質を生産する増強された菌株のような、タンパク質生産を増強するための手段を提供する。
【００６１】
本発明で使用される「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生産される工程のことを言う。前記工程には、転写および翻訳の両方が含まれる。
【００６２】
核酸配列の細胞への導入についての文脈において本発明で使用される「導入された」という用語は、核酸配列を細胞へ移入するために適切な任意の方法のことを言う。そのような導入方法には、プロトプラスト融合、形質移入、形質転換、接合、および形質導入が含まれるが、これらに限定されるわけではない（例えば、フェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）他、「遺伝学」、ハードウッド（Ｈａｒｄｗｏｏｄ）他編『バチルス』、プレナム出版社、［１９８９年］５７−７２頁を参照されたい）。
【００６３】
本発明で使用される「形質転換された」および「安定的に形質転換された」という用語は、そのゲノムに組み込まれた非天然型（異種の）ポリヌクレオチド配列を有する、または少なくとも二世代にわたり維持されるエピソームプラスミドとして有する細胞のことを言う。
【００６４】
本発明で使用される「外来配列」は、バチルス染色体に導入されるＤＮＡ配列のことを言う。いくつかの好ましい態様において、外来配列はＤＮＡ構築体の部分である。好ましい態様において、外来配列は１つ以上の関心のあるタンパク質をコードする。いくつかの態様において、外来配列は形質転換される細胞のゲノムにすでに存在するか否かの配列を含む（すなわち、それは相同的または異種的な配列となり得る）。いくつかの態様において、外来配列は関心のある１つ以上のタンパク質、遺伝子、および／または突然変異または修飾された遺伝子をコードする。他の態様において、外来配列は、野生型の機能遺伝子またはオペロン、突然変異した機能遺伝子またはオペロン、または非機能的遺伝子またはオペロンをコードする。いくつかの態様において、非機能的配列は遺伝子機能の混乱のために遺伝子に組込まれることが可能である。いくつかの態様において外来配列は１つ以上の機能的な野生型遺伝子をコードし、一方、他の態様において外来配列は１つ以上の機能的な突然変異遺伝子をコードし、および更に追加的な態様において外来配列は１つ以上の非機能的な遺伝子をコードする。他の態様において、外来配列は形質転換される宿主細胞の染色体にすでに存在する配列をコードする。好ましい態様において、外来配列にはｐｃｋＡ遺伝子が含まれる、一方、他の好ましい態様において、外来配列には更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｐｈｒＣ、ｓｉｇＢ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ  ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ、およびそれらの断片からなる群より選択された少なくとも一つの遺伝子が含まれる。更なる態様において、外来配列は選択マーカーを含む。更なる態様において、外来配列は二つのホモロジーボックスを含む。
【００６５】
いくつかの態様において、前記外来配列にはホルモン、酵素および成長因子が含まれるがこれに限定されない少なくとも１つの異種タンパクをコードする。他の態様において、前記酵素にはプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、フェノールオキシダーゼ、パーミアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコース、イソメラーゼ、ラッカーゼ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのようなヒドロラーゼが含まれるが、これに限定されない。
【００６６】
本発明で使用される「ホモロジーボックス」は、バチルス染色体における配列と相同である核酸配列のことを言う。より具体的には、ホモロジーボックスは、本発明に従って不活性化される遺伝子または遺伝子の部分に直接隣接するコード領域と、約８０から１００％の間の配列同一性、約９０から１００％の間の配列同一性、または約９５から１００％の間の配列同一性を有する上流または下流領域である。これらの配列は、バチルス染色体においてＤＮＡ構築体が組み込まれる場所を指示し、およびバチルス染色体のどの部分が外来配列によって置き換えられるかを指示する。他方、本発明を限定するものではないが、ホモロジーボックスは約１塩基対（ｂｐ）から２００キロ塩基（ｋｂ）を含むことができる。好ましくはホモロジーボックスには、約１ｂｐ〜１０ｋｂ、１ｂｐ〜５．０ｋｂ、１ｂｐ〜２．５ｋｂ、１ｂｐ〜１．０ｋｂ、および０．２５ｋｂから２．５ｋｂが含まれる。またホモロジーボックスには、約１０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ、および０．１ｋｂが含まれ得る。いくつかの態様において、選択マーカーの５’および／または３’末端はホモロジーボックスに隣接し、ここでホモロジーボックスは遺伝子のコード領域に直接隣接する核酸配列を含む。
【００６７】
本発明で使用される「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」という用語は、宿主細胞において発現が可能なヌクレオチド配列のことを言い、そこで選択可能マーカーの発現は、対応する選択的試薬の存在または必須栄養素の欠如下において成長する能力を発現遺伝子を含む細胞に与える。
【００６８】
本発明で使用される「選択可能マーカー」および「選択マーカー」という用語は、ベクターを含むそれらの宿主の選択を容易にする宿主細胞における発現を可能とする核酸（例えば、遺伝子）のことを言う。そのような選択可能マーカーの事例には、抗菌剤が含まれるがこれに限定されない。従って、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が関心のある外来ＤＮＡを取り込み、または他のいくつかの反応が生じたことを示す遺伝子のことを言う。典型的には、選択可能マーカーは、形質転換の間どんな外因性の配列も受け取らなかった細胞から外因性ＤＮＡを含む細胞を区別することを可能とするために、抗菌薬耐性または代謝優位性を宿主細胞に与える遺伝子である。「常在選択可能マーカー」は形質転換される微生物の染色体に位置している。常在選択可能マーカーは、形質転換ＤＮＡ構築体における選択可能マーカーと異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは当業者に周知である。上記に示したように、好ましくは前記マーカーは抗菌薬耐性マーカーである（例えば、ａｍｐＲ、ｐｈｌｏＲ、ｓｐｅｃＲ、ｋａｎＲ、ｅｒｙＲ、ｔｅｔＲ、ｃｍｐＲ、およびｎｅｏＲである。例えば、Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ「遺伝子」１６７巻、３３５−３３７頁［１９９５年］、パルメロス（Ｐａｌｍｅｒｏｓ）他、「遺伝子」２４７巻、２５５−２６４頁［２０００年］、およびＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ他、「遺伝子」２４巻、３３１−３４１頁［１９８３年］を参照されたい）。いくつかの特に好ましい態様において、本発明はクロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、バチルス・リケニフォルミスゲノムに存在する耐性遺伝子だけでなく、ｐＣ１９４に存在する遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、染色体的に組み込まれたカセットおよび組み込みプラスミドの染色体増幅を含む態様においてだけでなく、本発明において特に有用である（例えば、ＡｌｂｅｒｔｉｎｉおよびＧａｌｉｚｚｉ、「バクテリオロジー」１６２巻、１２０３−１２１１頁［１９８５年］およびスタールおよびフェラーリ（Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒｉ）「ジャーナル．オブ・バクテリオロジー」１５８巻、４１１−４１８頁［１９８４年］を参照されたい）。この自然発生のクロラムフェニコール耐性遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示す。
【００６９】
【表１】
2007532114.tif 000003
【００７０】
このクロラムフェニコール耐性タンパクの推定アミノ酸配列は、
【表２】
2007532114.tif 000004
【００７１】
本発明に従ったその他の有用なマーカーには、トリプトファンのような栄養要求性マーカーおよびβ−ガラクトシダーゼのような検出マーカーが含まれるが、これに限定されない。
【００７２】
本発明で使用される「プロモーター」は、下流遺伝子の転写を指示するために機能する核酸配列のことを言う。好ましい態様において前記プロモーターは、そこにおいて標的遺伝子が発現される宿主細胞に好適である。前記プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「コントロール配列」とも称される）と共に、所定の遺伝子を発現するために必要である。一般に、前記転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれるがこれに限定されない。
【００７３】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「操作可能に結合」される。例えば、分泌リーダー（すなわちシグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌物に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチド用のＤＮＡと操作可能に結合される。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすとき、コード配列に操作可能に結合される。または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために位置するとき、コード配列に操作可能に結合される。一般に、「操作可能に結合される」というのは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、および分泌リーダーの場合、近接しており、リーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。結合は、都合のよい制限酵素認識部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは従来の実施に従って用いられる。
【００７４】
「不活性化」の用語には、ｐｃｋＡ遺伝子単独の、またはｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ、ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ染色体遺伝子の１つ以上と組合わせた機能的発現を防ぐ任意の方法が含まれ、ここで前記遺伝子または遺伝子産物はその既知の機能を発揮することができない。不活性化または増強は、核酸遺伝子配列における欠失、置換（例えば、突然変異）、中断、および／または挿入を含む任意の適切な手段を経由して生じる。ある態様において、不活性化された遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物活性において対応する変化を有する切断されたタンパク質である。いくつかの態様において、生物活性における変化は活性の増大であり、一方、好ましい態様において前記変化は生物活性の喪失をもたらす。いくつかの態様において、改変バチルス菌株は、好ましくは安定で非可逆性の不活性化をもたらす１つ以上の遺伝子の不活性化を含む。
いくつかの好ましい態様において不活性化は欠失によって達成される。いくつかの好ましい態様において、前記遺伝子は相同組換えによって欠失される。例えば、いくつかの態様において、ｓｏｂが欠失されるべき遺伝子であるとき、ホモロジーボックスの両横に隣接する選択マーカーを有する外来配列を含むＤＮＡ構築体が用いられる。ホモロジーボックスは染色体のｓｂｏ遺伝子領域に隣接する核酸と相同であるヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ構築体は、バチルス宿主染色体の相同配列に整列し、ダブルクロスオーバ現象においてｓｂｏ遺伝子は宿主染色体から切り出される。
【００７５】
本発明で使用される遺伝子の「欠失」は、コード配列全体の欠失、コード配列の一部の欠失、または隣接領域を含むコード配列の欠失のことを言う。染色体に残った配列が遺伝子の所望の生物活性を提供するならば、欠失は部分的であり得る。コード配列の隣接領域には、５’および３’末端において１ｂｐ〜約５００ｂｐを含むことが可能である。隣接領域は５００ｂｐよりも大きくなり得るが、好ましくは本発明に従って不活性化、または欠失される領域における他の遺伝子を含まないことになる。結局、欠失された遺伝子は実効的に非機能的である。簡単に言えば、「欠失」は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ除去されている（すなわち、非存在である）ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化と定義される。従って、「欠失突然変異体」はそれぞれの野生型生物よりも少ないヌクレオチドまたはアミノ酸を有する。
【００７６】
本発明の更に他の態様において、ＤＮＡアレイ分析（例えば、本発明に記述されるようなトランスクリプトーム分析）によって決定される不適切な時における遺伝子活性の欠失は生成タンパクの増強された発現を示す。いくつかの好ましい態様において本発明はｐｃｋＡ遺伝子の欠失を提供し、一方、代替的な好ましい態様においてｇａｐＢ、ｆｂｐ、および／またはａｌｓＤを含む群より選択される一つ以上の遺伝子の欠失は原料利用の効率改善のために改良された菌株を提供する。本発明で使用される「トランスクリプトーム分析」は、遺伝子転写の分析のことを言う。
【００７７】
本発明の他の態様において、遺伝子は、この欠失が所望の生産物の増大した発現をもたらす制限された配列の欠失によって「最適化される」と考えられる。本発明のいくつかの好ましい態様において、トリプトファンオペロン（すなわち、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦの遺伝子を含む）は、ＴＲＡＰ結合ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列の欠失によって最適化される（ヤングその他、ジャーナル・オブ・モル・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）２７０巻、６９６−７１０頁［１９９７年］を参照されたい）。この欠失は宿主菌株からの所望の生成物の発現を増加させるために考慮される。
【００７８】
他の好ましい態様において、不活性化は挿入によるものである。例えば、いくつかの態様において、ｐｃｋＡが不活性化される遺伝子である時、ＤＮＡ構築体は選択マーカーによって中断されたｐｃｋＡ遺伝子を有する外来配列を含む。前記選択マーカーは、ｐｃｋＡをコードする配列の部分の両横に位置することとなる。前記ＤＮＡ構築体は、宿主染色体におけるｐｃｋＡ遺伝子と基本的に同一の配列と一致し、ダブル・クロスオーバー現象においてｐｃｋＡ遺伝子は選択マーカーの挿入によって不活性化される。簡単に言えば「挿入」または「追加」は、天然由来の配列と比してそれぞれ１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の追加をもたらす、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化である。
【００７９】
他の態様において、活性化はベクターとしてプラスミドを用いたシングルクロスオーバー現象における挿入によるものである。例えば、ｐｃｋＡ染色体遺伝子は、遺伝子または遺伝子コード配列の一部および選択マーカーを含むプラスミドと共に整列される。いくつかの態様において、選択マーカーは遺伝子コード配列内部または遺伝子から分離したプラスミドの一部に位置する。前記ベクターはバチルス染色体に組み込まれ、前記遺伝子はコード配列におけるベクターの挿入によって不活性化される。
【００８０】
代替的な態様において、不活性化は遺伝子の突然変異のために生じる。突然変異遺伝子の方法は当業者に周知であり、部位特異的突然変異、ランダム突然変異の生成、およびギャップド−デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ）法を含むが、これに限定されない（例えば、米国特許ＵＳ４，７６０，０２５号、モリング（Ｍｏｒｉｎｇ）他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ）．２巻：６４６頁［１９８４年］、およびクレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）その他、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．）、１２巻：９４４１頁［１９８４年］を参照されたい）。
【００８１】
本発明で使用される「置換」は異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸それぞれの置換の結果として生じる。
【００８２】
本発明で使用される「相同遺伝子」は、相互に対応し、相互に同一または非常に類似するが通常関連種からの遺伝子のペアのことを言う。この用語には、遺伝子の複製によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）だけでなく、種分化によって分離される遺伝子（すなわち新種の発展）（例えば、オーソログ遺伝子）が含まれる。
【００８３】
本発明で使用される「オーソログ」および「オーソログ遺伝子」は、種分化による共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から進化した異なる種における遺伝子のことを言う。典型的には、オーソログは進化の過程において同一の機能を保つ。オーソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測へ利用される。
【００８４】
本発明で使用される「パラログ」および「パラログ遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子のことを言う。オーソログが進化の過程を通じて同一の機能を保持するのに対して、いくつかの機能がしばしば起源の機能に関連しているとは言え、パラログは新機能を進化させている。パラログ遺伝子の具体例には、全てのセリンプロテイナーゼであり、同一種内で同時に発生するトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびトロンビンをコード化する遺伝子が、含まれるがこれに限定されない。
【００８５】
本発明で使用される「ホモローグ」は、好ましい同一性を有する配列の類似性または同一性のことを言う。このホモローグは、当該技術分野で既知の標準的技術を用いて決定される（例えば、スミスおよびウォーターマン、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁［１９８１年］、ニードルマンおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁［１９７０年］、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁［１９８８年］、ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウエア・パッケージ（ジェネティクス・コンピューターグループ、マジソン、ウイスコンシン州）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡのようなプログラム、およびデブロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２巻：３８７−３９５頁［１９８４年］を参照されたい）。
【００８６】
本発明で使用される「類似配列」は、遺伝子の機能がバチルス・スブチルス菌株１６８から命名された遺伝子と実質的に同一である。更に類似遺伝子は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％のバチルス・スブチルス菌株１６８遺伝子の配列との配列同一性を含む。代替的に、類似配列はバチルス・スブチルス１６８領域において見出される遺伝子の７０〜１００％と一致し、および／またはバチルス・スブチルス１６８染色体における遺伝子と一致する領域において見出された少なくとも５〜１０の遺伝子を有する。追加的な態様において、１つ以上の上記の特性はその配列に当てはまる。類似配列は、配列アラインメントの既知の方法によって決定される。一般的に使用されるアラインメント法は、前述および以下の通りＢＬＡＳＴであるが、配列をアラインすることに利用できる他の方法もまた存在する。
【００８７】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進歩的ペアワイズ・アラインメントを用いて関連する配列グループから多数の配列アラインメントを生成する。それはまたアラインメントを作るために用いられるクラスター関係を示す系統図をプロットすることが可能である。ＰＩＬＥＵＰは、フェングおよびドゥートル（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、３５巻：３５１−３６０頁、［１９８７年］）の進歩的アラインメント法の簡易化された方法を用いる。この方法は、ヒギンスおよびシャープ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１−１５３頁［１９８９年］によって記述された方法と類似である。３．００のデフォルト・ギャップ・ウェイト、０．１０のデフォルト・ギャップ・レングス・ウエイトを含む有益なＰＩＬＥＵＰパラメータには、末端ギャップが荷重されている。
【００８８】
他の有用なアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、アルツシュル他（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３−４１０頁、［１９９０年］、およびカーリン他．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：５８７３−５７８７頁［１９９３年］）によって記述されている。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（アルツシュル他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６巻：４６０−４８０頁［１９９６年］）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかのサーチ・パラメータを用いるが、それらのほとんどはデフォルト値に設定される。調整パラメータは次の値を用いて設定される：すなわち、重複スパン＝１、重複フラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１である。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータはダイナミック値であり、特定の配列の組成および関心ある配列が検索される特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体によって設定される。しかしながら、前記値は感度を増大するように調整することができる。Ａ％のアミノ酸配列同一性値は、アラインされた領域における「より長い」配列の残基の総数で除した同一残基に符合する数によって決定される。「より長い」配列は、アラインされた領域における最も実際の残基を有する配列である（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって導入されたギャップは無視される）。
【００８９】
従って「パーセント（％）核酸配列同一性」は、核酸数値に示される配列のヌクレオチド残基と同一の候補配列におけるヌクレオチド残基のパーセンテージと定義される。好ましい方法は、重複スパンおよび重複フラクショそれぞれ１および０．１２５で、デフォルト・パラメータに設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを使用する。
【００９０】
前記アラインメントはアラインされる配列におけるギャップの導入を含むことができる。更に、核酸数値のそれよりも多いかまたは少ないヌクレオシドを含む配列については、ホモローグのパーセンテージはヌクレオシド総数に対するホモローグヌクレオシド数に基づいて決定されることになる。従って、例えば、配列のホモローグは本発明で同定された配列のものよりも短く、以下に議論するように、より短い配列におけるヌクレオシドの数を用いて決定されることになる。
【００９１】
本発明で使用される「ハイブリダイゼーション」と言う用語は、当該技術分野に既知である塩基対形成を通じて核酸鎖が相補鎖に結合する過程のことを言う。
【００９２】
中程度から高程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のもとで、二つの配列が特異的に相互にハイブリダイズするなら、核酸配列は参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズする」と見なされる。ハイブリダイゼーションの条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的にはＴｍ−約５℃（プローブのＴｍより５℃下回る）で生じる。「高度ストリンジェンシー」とは、Ｔｍより約５℃から１０℃下回るところでの、「中度ストリンジェンシー」とは、プローブのＴｍより約１０℃から２０℃下回るところでの、および「低度ストリンジェンシー」とはＴｍより約２０℃から２５℃下回るところで生じる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション・プローブとの、厳密なまたはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用することができ、他方、中度または低度ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモローグを同定または検出するために使用することができる。
【００９３】
中度および高度ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションの条件は、当該技術分野で周知である。高度ストリンジェンシー条件の具体例には、４２℃での５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡでのハイブリダイゼーション、それに続く室温、２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳによる２回の洗浄、および４２℃、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける二回の追加の洗浄が含まれる。中度ストリンジェンシー条件の具体例には、３７℃、２０％のホルムアミド含有溶液中、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％のデキストラン硫酸塩および２０ｍｇ／ｍｌの変成、せん断されたサケ精子ＤＮＡにおける一晩のインキュベーション、それに続く約３７−５０℃での１×ＳＳＣにおけるフィルターの洗浄が含まれる。プローブの長さなどの調整要素に必要である温度、イオン強度等の調整方法は当業者に既知である。
【００９４】
本発明で使用される「組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」には、異種核酸配列の導入によって修飾された、または修飾された細胞から生成した細胞またはそのベクターへの言及が含まれる。従って、例えば組み換え細胞は、細胞の未処理（非組み換え型）内において同一型が認められない遺伝子を発現し、または計画的な人間の介入の結果として発現し、または全く発現しない条件下で、そうでなければ異常に発現される未処理遺伝子を発現する。「組み換え」、「再結合」および「組換えられた」核酸の生成は、一般的にキメラ遺伝子を生じる二つ以上の核酸断片の集合である。
【００９５】
好ましい態様において、変異ＤＮＡ配列は少なくとも一つのコドンにおいて、部位飽和突然変異を用いて生成される。更なる態様において、変異ＤＮＡ配列は野生型配列と、４０％より高い、４５％より高い、５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６５％より高い、７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、または９８％より高い相同性を有する。代替的な態様において、変異ＤＮＡは、例えば照射、ニトロソグアニジンなどの任意の既知の変異原性操作を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。次に、所望のＤＮＡ配列は単離され、本発明の操作された方法に用いられる。
【００９６】
代替的な態様において、前記形質転換ＤＮＡ配列には外来配列が存在しないホモロジーボックスが含まれる。この態様において、二つのホモロジーボックス間の内因性ＤＮＡ配列を欠失することが望ましい。更に、いくつかの態様において、形質転換配列は野生型であり、一方、他の態様においてそれらは変異または修飾配列である。更に、いくつかの態様において、前記形質転換配列は相同であり、一方他の態様においてそれらは異種性である。
【００９７】
本発明で使用される「標的配列」と言う用語は、外来配列が宿主細胞ゲノムに挿入されることが望ましい配列をコードする宿主細胞におけるＤＮＡ配列のことを言う。いくつかの態様において、標的配列は機能的な野生型遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の態様において標的配列は機能的な変異遺伝子またはオペロン、または非機能的な遺伝子またはオペロンをコードする。
【００９８】
本発明で使用される「フランキング配列」は、議論されている配列（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃについては、遺伝子ＢにＡおよびＣ遺伝子配列が隣接している）の上流または下流にある任意の配列のことを言う。好ましい態様において、前記外来配列はその両横にホモロジーボックスが隣接する。他の態様において、前記外来配列およびホモロジーボックスは、その両横にスタッファー配列が隣接するユニットを含む。いくつかの好ましい態様において、フランキング配列は一方の横（３’または５’）にのみ存在するが、好ましい形態においてそれは両横に位置する配列が隣接する。各ホモロジーボックスの配列はバチルス染色体における配列に相同である。これらの配列は、バチルス染色体のどこで新しい構築体が組み込まれ、およびバチルス染色体のどの部分が外来配列によって置換されることになるかを指示する。好ましい態様において、選択マーカーの５’および３’末端は、不活性化染色体部分の切片を含むポリヌクレオチド配列に隣接する。いくつかの態様においてフランキング配列は単一側（３’または５’）にのみ存在し、一方、好ましい態様においてそれは隣接する配列の両側に存在する。
【００９９】
本発明で使用される「スタッファー配列」という用語は、ホモロジーボックス（典型的には、ベクター配列）の横に位置する任意の特別なＤＮＡのことを言う。しかしながら、前記用語は任意の非相同ＤＮＡ配列を含む。任意の理論によって限定されないことを前提として、スタッファー配列はＤＮＡ取り込みを開始する細胞に重要でない標的を提供する。
【０１００】
本発明で使用される「突然変異体ライブラリ」という用語は、それらのゲノムのほとんどが同一でありながら、１つ以上の遺伝子の異なった相同体を含む細胞の母集団のことを言う。そのようなライブラリは例えば、改変された形質を有する遺伝子またはオペロンを同定するための方法へ利用される。
【０１０１】
本発明で使用される「ハイパー・コンピテント」および「スーパー・コンピテント」という用語は、細胞母集団の１％以上が染色体ＤＮＡ（例えば、バチルスＤＮＡ）を用いて形質転換できることを意味する。代替的に前記用語は、細胞母集団の１０％より多くが自己複製プラスミド（例えば、バチルス・プラスミド）を用いて形質転換できる細胞母集団の言及に用いられる。好ましくは、スーパー・コンピテント細胞は、野生型または親細胞母集団について観察されるよりも大きな比率で形質転換される。スーパー・コンピテントおよびハイパー・コンピテントは、本発明において互換的に使用される。
【０１０２】
本発明で使用される「増幅」および「遺伝子増幅」という用語は、増幅された遺伝子が当初ゲノムにおいて存在した遺伝子より高いコピー数で存在するようになるように、特定のＤＮＡ配列が不均一に複製される工程のことを言う。いくつかの態様において、薬剤（例えば、阻止可能酵素の阻害剤）の存在下で増殖による細胞の選択は、薬剤の存在の下で増殖のために必要とされる遺伝子産物をコードする内因性遺伝子の増幅、またはこの遺伝子産物をコードする外因性（すなわち、取り込み）配列の増幅によって必要とされる遺伝子産物をコードする内因性遺伝子の増幅、または両方の増幅をもたらす。
【０１０３】
「増幅」は、鋳型特異性を伴う核酸複製の特別な場合である。それは非特異的鋳型複製（すなわち、鋳型に依拠するが特異的鋳型に依拠しない複製）と対比される。鋳型特異性は、本発明では複製の忠実度（すなわち、適切なヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性と区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」特異性として記述される。標的配列は、それらが他の核酸から送別されることを追及するという意味で「標的」である。増幅技術は、当初この選別のために設計された。
【０１０４】
本発明で使用される「共増幅」は、他の遺伝子配列（すなわち、発現ベクター内に含まれるような１つ以上の非選択的遺伝子含む遺伝子配列）とつなぎ合わせた増幅可能マーカーの単一細胞への導入、および細胞が増幅可能マーカーおよびその他の非選択可能遺伝子配列の両方を増幅するために適切な選択圧力の適用のことを言う。増幅可能マーカーは他の遺伝子配列と物理的に連結し、または代替的に、一方は増幅可能マーカーを含み、他方は非選択可能マーカーを含む二つの分離したＤＮＡ断片を同一の細胞に導入することができる。
【０１０５】
本発明で使用される「増幅可能マーカー」、「増幅可能遺伝子」および「増幅ベクター」という用語は、適切な培養条件下で遺伝子の増幅を可能とする遺伝子をコードする遺伝子、またはベクターのことを言う。
【０１０６】
「鋳型特異性」は酵素の選択によりほとんどの増幅技術において達成される。増幅酵素は、それらが利用される条件下で、核酸の異種混合において核酸の特異的配列のみを加工することになる酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１ＲＮＡはレプリカーゼにとって特異的鋳型である（例えば、カシャン（Ｋａｃｉａｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９巻：３０３８頁［１９７２年］を参照されたい）。その他の核酸はこの増幅酵素によって複製されない。同様にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素は自らのプロモーターに対して厳密な特異性を有する（チャンバーリン（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ）他、Ｎａｔｕｒｅ２２８巻：２２７頁［１９７０年］を参照されたい）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの場合、連結接合部にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質および鋳型の間のミスマッチがあると、前記酵素は二つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連合しない。（ウーおよびワルラス（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ）、ゲノミクス、４巻：５６０頁［１９８９年］を参照されたい）。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能するそれらの能力によって、プライマーにより結合され、またそれゆえ定義された配列に関して高い特異性を示すことが知られる。前記高温は、非標的配列を用いたハイブリダイゼーションではなく、標的配列を用いたプライマーハイブリダイゼーションに向いた熱力学的条件をもたらす。
【０１０７】
本発明で使用される「増幅可能な核酸」の用語は、任意の増幅法によって増幅することが可能な核酸のことを言う。「増幅可能な核酸」は通常「サンプル鋳型」を含むと考えられる。
【０１０８】
本発明で使用される「サンプル鋳型」と言う用語は、「標的」（以下に定義される）の存在について分析されるサンプル由来の核酸のことを言う。対照的に「バックグラウンド背景鋳型」は、サンプルに存在可能または不可能なサンプル鋳型以外の核酸に関して用いられる。背景鋳型は、最も頻繁に偶発的である。それはキャリーオーバーの結果、またはサンプルから精製排除されることが追求される核酸不純物の存在に依っている。例えば、検出されるべき生物体以外の生物体からの核酸は、試験サンプルにおけるバックグラウンドとして存在することができる。
【０１０９】
本発明における「プライマー」と言う用語は、精製された制限消化物における場合のように自然発生であるか、合成的生産かに拘わらず、核酸鎖と相補的であるプライマー伸長生産物の合成が誘発される条件下に置かれる場合（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメターゼのような誘発剤の存在下、および適切な温度およびｐＨで）、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドのことを言う。前記プライマーは増幅において最大限の効率を得るために好ましくは単鎖であるが、代替的に二重鎖でもよい。二重鎖の場合、前記プライマーは、伸張生産物の調製に用いられる以前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、前記プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。前記プライマーは、誘発剤の存在下で拡張生産物の合成を準備するために充分に長くなくてはならい。前記プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および手法の用途を含む多数の要素に依存する。
【０１１０】
本発明で使用される「プローブ」と言う用語は、精製された制限消化物におけるように自然発生であるか、または組換え的にまたはＰＣＲ増幅によって合成的に生産されたかに拘わらず、関心ある他のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチド（すなわち一つのヌクレオチド配列）のことを言う。一つのプローブは、単鎖または二重鎖であることが可能である。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、および単離に有用である。本発明に用いられる任意のプローブは、酵素（例えば、酵素組織化学アッセイと同様にＥＬＩＳＡ）、蛍光、放射、および発光システムを含むがそれに限定されない任意の検出システムにおいて検出可能であるために、任意の「レポーター分子」で標識化されることが考慮されている。本発明は、任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
【０１１１】
本発明で使用される「標的」と言う用語は、ポリメラーゼ連鎖反応に言及して用いられる場合、ポリメラーゼ連鎖反応のために用いられるプライマーによって結合される核酸の領域のことを言う。従って、「標的」は他の核酸配列から選別されることが追求される。「断片」は、標的配列内における核酸の領域として定義される。
【０１１２】
本発明で使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と言う用語は、米国特許ＵＳ．４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号および４，９６５，１８８号の方法のことを言い、これらは参照により本発明に組み込まれる。この方法には、クローニングまたは精製をしないゲノムＤＮＡの混合における標的配列部分の濃度を高めるための方法が含まれる。標的配列を増幅するためのこの工程は、望ましい標的配列を含むＤＮＡ混合物に対し大過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入すること、その後にＤＮＡポリメラーゼの存在下で温度サイクリングの正確な繰り返しを行うことからなる。２つのプライマーは、二重鎖標的配列の各鎖に対して相補的である。効果的な増殖のために、前記混合物は変性され、次に前記プライマーは標的分子内の相補配列にアニール（ａｎｎｅａｌ）される。アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）に続いて、前記プライマーは新しい一対の相補鎖を形成するように、ポリメラーゼを用いて延長される。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ延長の工程は、望ましい標的配列の増幅された切片の高い濃度を得るために、幾度も繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリング、および延長は、１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が存在し得る）。増幅された望ましい標的配列の切片の長さは相互のプライマーの相対的位置によって決定され、従ってこの長さはコントロール可能なパラメータである。この工程を繰り返すため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と言われる。望ましい増幅された標的配列の切片は、混合物において主要な配列（濃度の点で）となり、それらは「ＰＣＲ増幅された」と称される。
【０１１３】
本発明で使用される「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型および増幅酵素を除いた増幅に必要とされる試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファー等）のことを言う。典型的には、他の反応成分と共に増幅試薬は、反応槽（試験管、マイクロウエル等）に置かれ、含まれる。
【０１１４】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡの特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なった方法（例えば、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン酵素結合体検出、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰのような３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅切片への組み込み）によって検出できる水準まで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、プライマー分子の適切なセットを用いて増幅することが可能である。特に、ＰＣＲ工程によって生成された増幅部分は、それ自体が続くＰＣＲ増幅にとっての効率的な鋳型である。
【０１１５】
本発明で使用される「ＰＣＲ生産物」、「ＰＣＲ断片」および「増幅生産物」という用語は、変性、アニーリングおよび延長のＰＣＲ工程を２回以上完了後に得られた化合物の混合物のことを言う。これらの用語は１つ以上の標的配列の１つ以上の部分の増幅がある場合を含む。
【０１１６】
本発明で使用される「ＲＴ−ＰＣＲ」と言う用語は、ＲＮＡ配列の複製および増幅のことを言う。この方法において逆転写は、熱安定性ポリメラーゼが採用される一つの酵素操作を最も頻繁に用いるＰＣＲと結合し、これは米国特許ＵＳ５，３２２，７７０号に記述され、参照により本発明に取り込まれる。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡ鋳型はポリメラーゼの逆転写活性によりｃＤＮＡに変換され、次にポリメラーゼの重合活性を用いて増幅される（すなわち、他のＰＣＲ方法におけるように）。
【０１１７】
本発明で使用される「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、特定のヌクレオチド配列上に、またはそれに近接して、それぞれが二重鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素のことを言う。
【０１１８】
「制限部位」は、所与の制限エンドヌクレアーゼによって認識および切断されたヌクレオチド配列のことを言い、それはしばしばＤＮＡ断片の挿入の部位である。本発明の一定の態様において、制限部位は選択マーカーおよびＤＮＡ構築体の５’および３’末端的に操作される。
【０１１９】
本発明で使用される「不活性染色体切片（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ）」には、二つの部分が含まれる。各部分には、本発明で定義されるように常在染色体領域に直接に隣接する上流または下流ゲノム染色体ＤＮＡと相同であるポリヌクレオチドが含まれる。「直接に隣接する」とは、不活性染色体切片を含むヌクレオチドに常在染色体領域を特徴付けるヌクレオチドが含まれないことを意味する。前記不活性染色体切片は、バチルス染色体のどこでＤＮＡ構築体が組み込まれ、およびバチルス染色体のどの部分が置換されることになるかを指示する。
【０１２０】
本発明で使用される「常在染色体領域（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｒｅｇｉｏｎ）」および「常在染色体領域の断片」は、本発明のいくつかの態様において、バチルス宿主細胞から欠失されたバチルス染色体の切片のことを言う。一般に、「切片（ｓｅｇｍｅｎｔ）」「領域（ｒｅｇｉｏｎ）」「部分（ｓｅｃｔｉｏｎ）」および「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、本発明において殆ど同義に使用される。いくつかの態様において欠失された切片には既知の機能を有する１つ以上の遺伝子が含まれる、一方、他の態様において欠失された切片には未知の機能を有する１つ以上の遺伝子が含まれ、およびその他の態様において欠失された切片には既知および未知の機能を有する遺伝子の組合せが含まれる。いくつかの態様において、常在染色体領域またはそれらの断片には、２００またはそれ以上もの遺伝子が含まれる。
【０１２１】
いくつかの態様において、常在染色体領域またはそれらの断片は一定の条件下で必要な機能を有するが、しかしその領域は実験室条件下のバチルス菌株の生存にとって必要ではない。好ましい実験室条件には、発酵槽、プレート培地上のシェイクフラスコ等における、標準温度および雰囲気条件（例えば、好気性の）での増殖などの条件が含まれるが、これに限定されない。
【０１２２】
常在染色体領域またはそれらの断片には、約０．５ｋｂ〜５００ｋｂ、約１．０ｋｂ〜５００ｋｂ、約５ｋｂ〜５００ｋｂ、約１０ｋｂ〜５００ｋｂ、約１０ｋｂ〜２００ｋｂ、約１０ｋｂ〜１００ｋｂ、約１０ｋｂ〜５０ｋｂ、約１００ｋｂ〜５００ｋｂ、約２００ｋｂ〜５００ｋｂのバチルス染色体の範囲を含むことができる。他の側面において、常在染色体領域またはその断片が欠失されているとき、改変バチルス菌株の染色体は、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％の対応する未改変バチルス宿主染色体を含むことができる。好ましくは、本発明に従って改変バチルス菌株の染色体には、約９９〜９０％、９９〜９２％、および９８〜９４％の対応する未改変バチルス宿主菌株染色体ゲノムが含まれることになる。
【０１２３】
本発明で使用される「菌株生存度」は、生殖生存度のことを言う。常在染色体領域またはその断片の欠失は、実験室条件下で改変バチルス菌株の分裂および生存に有害に影響しない。
【０１２４】
本発明で使用される「改変バチルス菌株」は、遺伝的に操作されたバチルス種のことを言う。ここで実質的に同一の培養条件下で増殖された対応する未改変バチルス宿主菌株における同一の関心あるタンパク質の発現および／または生産と比べて、関心あるタンパク質は増強された発現および／または生産レベルを有する。いくつかの態様において、増強された発現レベルは１つ以上の染色体遺伝子の不活性化からもたらされる。ある態様において、増強された発現レベルは、１つ以上の染色体遺伝子の欠失からもたらされる。いくつかの態様において、改変バチルス菌株は、１つ以上の欠失された常在染色領域またはその断片を有する遺伝的に操作されたバチルス種である。ここで実質的に同一の培養条件下で増殖された対応する未改変バチルス宿主菌株と比べて、関心あるタンパク質は増強された発現または生産レベルを有する。代替的な態様において、増強された発現レベルは、１つ以上の染色体の挿入不活性化によってもたらされる。いくつかの代替的な態様において、増強された発現レベルは、活性増加または他の最適化された遺伝子によってもたらされる。いくつかの好ましい態様において、不活性遺伝子はｐｃｋＡ遺伝子であり、一方、代替的な好ましい態様において前記不活性遺伝子は更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｐｈｒＣ、ｓｉｇＢ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤからなる群から選択される。
【０１２５】
一定の態様において前記改変バチルス菌株は二つの不活性遺伝子を含み、一方、他の態様において三つの不活性遺伝子、四つの不活性遺伝子、五つの不活性遺伝子、六つの不活性遺伝子またはそれ以上が存在する。従って不活性遺伝子の数は、特定の遺伝子数に限定されることを意図しない。いくつかの態様において、前記不活性遺伝子は相互に隣接しており、一方、他の態様においてそれらはバチルス染色体の別々の領域に位置する。いくつかの態様において、不活性染色体遺伝子は一定の条件下で必要な機能を有するが、しかし実験室条件で前記遺伝子はバチルス菌株生存度にとって必要ではない。好ましい実験室条件には、微生物の増殖に適切な、発酵槽、シェイクフラスコ、プレート培地等での培養などの条件が含まれるが、これに限定されない。
【０１２６】
本発明で使用される「対応する未改変バチルス菌株」は、常在染色体領域またはその断片が欠失または修飾され、改変菌株が由来する宿主菌株である（例えば、出発菌株および／または野生型菌株）。
【０１２７】
本発明で使用される「染色体組込み」と言う用語は、それによって外来配列が宿主細胞（例えば、バチルス）の染色体に導入される工程のことを言う。形質転換ＤＮＡの相同領域は、染色体の相同領域をアラインする。続いて、ホモロジーボックス間の配列は、二重クロスオーバー（すなわち相同組換え）において外来配列によって置換される。本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ構築体の不活性染色体切片の相同部分は、バチルス染色体の常在染色体領域の隣接相同領域をアラインする。続いて、常在染色体領域は二重クロスオーバ（すなわち相同組換え）において、ＤＮＡ構築体によって欠失される。
【０１２８】
「相同組換え」は、同一の、またはほぼ同一のヌクレオチド配列部位において、二つのＤＮＡ分子または対の染色体間のＤＮＡ断片の交換を意味する。好ましい態様において、染色体組込みは相同組換えである。
【０１２９】
本発明で使用される「相同配列」は、比較のために最適にアラインしたとき、他の核酸またはポリペプチド配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有する核酸またはポリペプチドを意味する。いくつかの態様において相同配列は８５％および１００％の間の配列同一性を有し、一方、他の態様において９０％および１００％の間の配列同一性があり、より好ましい態様において９５％および１００％の配列同一性がある。
【０１３０】
本発明で使用される「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列またはそれらの部分のことを言う。「タンパク質」「ペプチド」および「ポリペプチド」の用語は、互換的に使用される。
【０１３１】
本発明で使用される「関心あるタンパク質」および「関心あるポリペプチド」は、所望の、および／または評価されているタンパク質／ポリペプチドのことを言う。いくつかの態様において関心あるタンパク質は細胞内に発現し、一方、他の態様においてそれは分泌性ポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドには、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解（ｃｅｌｌｕｌｙｔｉｃ）酵素、酸化還元酵素、および植物細胞壁分解酵素から選択される酵素が含まれるが、これに限定されない。より好ましくは、これらの酵素には、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ぺルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、およびキチナーゼが含まれるが、これに限定されない。本発明のいくつかの特に好ましい態様において、関心あるポリペプチドはプロテアーゼである。いくつかの態様において、関心あるタンパク質は、シグナルペプチド（すなわち、分泌タンパク質上のアミノ末端基延長）に融合する分泌性ポリペプチドである。殆ど全ての分泌性タンパクは、細胞膜を越えた前駆タンパクへのターゲティングおよび転位において重要な役割を演じるアミノ末端基タンパク延長を用いる。この延長は、細胞膜移動の間、または細胞膜移動直後に続いて、シグナルペプチダーゼによってタンパク質分解により除去される。
【０１３２】
本発明のいくつかの態様において、関心あるポリペプチドは、ホルモン、抗体、成長因子、受容体等から選択される。本発明に含まれるホルモンは、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、性腺刺激ホルモン、バソプレッシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどであるが、これらに限定されない。成長因子には、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１３まで）、インターフェロン、コロニー刺激因子等のサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。抗体には、抗体を生産するために望ましい任意の種から直接に得られた免疫グロブリンが含まれるが、これに限定されない。更に、本発明は修飾された抗体を含む。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体もまた本発明に含まれる。特に好ましい態様において、前記抗体はヒト抗体である。
【０１３３】
本発明で使用される「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク」と言う用語は、宿主細胞において自然由来でないタンパク質およびポリペプチドのことを言う。異種タンパクの例には、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼを含むヒドロラーゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トウトメラーゼまたはムターゼのようなイソメラーゼ、トランスファラーゼ、キナーゼ、およびフォファターゼのような酵素が含まれる。いくつかの態様において、前記タンパク質は、ワクチンおよび抗体と共に、成長因子、サイトカイン、リガンド、受容体および阻止剤を含むが、これらに限定されない治療上重要なタンパク質またはペプチドである。更なる態様において、前記タンパク質は商業的に重要な工業的タンパク質／ペプチドである（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼおよびグルコアミラーゼのようなカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、およびリパーゼ）。いくつかの態様において、前記タンパク質をコードする遺伝子は自然由来の遺伝子であり、一方、他の態様において突然変異および／または合成遺伝子が用いられる。
【０１３４】
本発明で使用される「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク」は、細胞における未処理または自然発生のタンパク質およびポリペプチドのことを言う。好ましい態様において、前記細胞はグラム陽性細胞であり、一方、特に好ましい態様において前記細胞はバチルス宿主細胞である。代替的な態様において、相同タンパクは大腸菌を含むがこれに限定されない他の生物体によって産生された天然タンパクである。本発明は、組換えＤＮＡ技術を経由して相同タンパクを生産する宿主細胞を含む。
【０１３５】
本発明で使用される「オペロン領域」には、通常のプロモーターから単一転写単位として転写され、共制御（ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）におかれる隣接遺伝子の一群が含まれる。いくつかの態様において、前記オペロンには調節遺伝子が含まれる。最も好ましい態様において、ＲＮＡレベルで高度に発現するが、しかし未知のまたは不要な機能を有するオペロンが使用される。
【０１３６】
本発明で使用される「多数隣接単一遺伝子領域」は、少なくとも二つの遺伝子のコード領域が直列に生じ、およびいくつかの態様において、コード領域に先行および続く介在配列を含む。いくつかの態様において抗菌領域を含む。
【０１３７】
本発明で使用される「抗菌領域」は、抗菌タンパクをコードする少なくとも一つの遺伝子を含む領域である。
【０１３８】
発明の詳細な説明
本発明は、ｐｃｋＡ遺伝子が修飾または欠失された発現タンパク質を生産するために改変された能力を有するように遺伝子操作されている細胞を提供する。特に本発明は、１つ以上の染色体遺伝子が修飾および／または不活性化された（例えば、ｐｃｋＡ）、および好ましくは１つ以上の染色体遺伝子（例えば、ｐｃｋＡ）が、修飾および／またはバチルス染色体から欠失された関心のあるタンパク質の増強された発現を有するバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。いくつかの更なる態様において、１つ以上の常在染色体領域は修飾および／または対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失されている。好ましい態様において、そのような欠失は関心あるタンパク質の改善された生産のような利点を提供する。
【０１３９】
Ａ．遺伝子欠失
上述したように、本発明には大きな染色体欠失と同様に、単一または多数の遺伝子欠失および／または突然変異を含む態様が含まれる。
【０１４０】
いくつかの好ましい態様において、本発明は外来配列からなるＤＮＡ構築体を含む。ＤＮＡ構築体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築され、ＤＮＡ構築体がバチルス染色体に組み込まれるようになるためにコンピテント・バチルス宿主へ構築体が直接クローニングされる。例えば、ＰＣＲ融合および／または連結は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ構築体を組み立てるために採用することが可能である。いくつかの態様においてＤＮＡ構築体は非プラスミド構築体であり、一方、他の態様においてそれはベクター（例えば、プラスミド）に組み込まれる。いくつかの態様において、環状プラスミドが用いられる。好ましい態様において、環状プラスミドは適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築体を分裂させない酵素）を用いるために設計される。しかし、直鎖状プラスミドもまた本発明において使用される（図１を参照されたい）。しかし、当該技術分野に既知の他の方法が本発明における使用に適切である（例えば、ペレゴ（Ｐｅｒｅｇｏ）「バチルス・スブチルスにおける遺伝子操作のための組込みベクター」、ソネンシェイン（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ他編、『バチルス・スブチルスおよびその他グラム陽性菌』、アメリカン・ソサエティー・フォー・ミクロバイオジー、ワシントンＤＣ、［１９９３年］を参照されたい）。
【０１４１】
いくつかの態様において、外来配列は選択マーカーを含む。いくつかの好ましい態様において、外来配列には染色体ｐｃｋＡ遺伝子が含まれ、他方他の好ましい態様において外来配列には更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｐｈｒＣ、ｓｉｇＢ，ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ、またはこれらの任意の遺伝子の断片（単独または組合わせた）からなる群から選択された染色体遺伝子が含まれる。追加的な態様において外来配列には相同ｐｃｋＡ遺伝子配列が含まれ、一方、他の態様において外来配列には更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｐｈｒＣ、ｓｉｇＢ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、および／またはｒｏｃＤ遺伝子配列からなる群から選択される少なくとも一つの追加的な相同配列が含まれる。相同配列は、外来配列に含まれることが可能なｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｐｈｒＣ、ｓｉｇＢ，ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｐｃｋＡ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ遺伝子またはそれらの遺伝子断片と、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、または８０％の配列同一性を有する核酸配列である。好ましい態様において、相同配列を含む外来配列は、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｐｈｒＣ、ｓｉｇＢ，ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｐｃｋＡ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、またはｒｏｃＤ遺伝子またはこれら遺伝子の任意の遺伝子断片と少なくとも９５％の配列同一性を含む。更に他の態様において、前記外来配列は遺伝子配列の断片を有する５’および３’末端に隣接する選択マーカーを含む。いくつかの態様において、選択マーカーおよび遺伝子、遺伝子断片またはそれとの相同配列を含むＤＮＡ構築体が宿主細胞に形質転換される場合、選択マーカーの位置が遺伝子をその意図された目的に対して機能しないようにする。いくつかの態様において、前記外来配列は遺伝子のプロモーター領域に位置する選択マーカーを含む。他の態様において、前記外来配列は遺伝子のプロモーター領域の後ろに位置する選択マーカーを含む。更に他の態様において、前記外来配列は遺伝子のコード領域に位置する選択マーカーを含む。更なる態様において、前記外来配列は両末端におけるホモロジーボックスが隣接する選択マーカーを含む。また更なる態様において、前記外来配列はコード配列の転写および／または翻訳を妨げる配列を含む。更に追加的な態様において、前記ＤＮＡ構築体は、構築体の上流および末端で組換えられた制限部位を含む。
【０１４２】
前記ＤＮＡ構築体はベクターに組み込まれても、またはプラスミドＤＮＡの存在なしに用いられても、微生物の形質転換に用いられる。任意の形質転換に適切な方法は本発明に用いられると考えられる。好ましい態様において、前記ＤＮＡ構築体の少なくとも一つのコピーが宿主バチルス染色体に組み込まれる。いくつかの態様において、本発明の１つ以上のＤＮＡ構築体が宿主細胞の形質転換に用いられる。例えば、１つのＤＮＡ構築体はｓｌｒ遺伝子の不活性化に用いることができ、もう一つの構築体はｐｈｒＣ遺伝子の不活性化に用いることができる。勿論、更なる組合わせが本発明によって考慮および提供される。
【０１４３】
いくつかの好ましい態様において、前記ＤＮＡ構築体はまた、関心あるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これらの好ましい態様のいくつかにおいて、前記ＤＮＡ構築体にはまた、関心あるタンパク質をコードする配列と操作可能に結合する構成的または誘発的プロモーターが含まれる。関心あるタンパク質がプロテアーゼであるいくつかの好ましい態様において、前記プロモーターは、ｔａｃプロモーター、ａβ−ラクタマーゼ・プロモーター、またはａｐｒＥプロモーターからなる群より選択される（デボア（ＤｅＢｏｅｒ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：２１−２５頁［１９８３年］）。しかし、このことは、当業者に既知の任意の適切なプロモーターが本発明での使用されるとき、本発明が任意の特定のプロモーターに限定されることを意図していない。それにも拘わらず、特定の好ましい態様において、前記プロモーターはＢ．スブチルスａｐｒＥプロモーターである。
【０１４４】
バチルス種の形質転換に関して多くの方法が知られる。実際にプラスミド構築体およびプラスミドの大腸菌への形質転換を含むバチルスの染色体を改変する方法は、よく知られている。殆どの方法において、プラスミドは引き続き大腸菌から単離され、バチルスに形質転換される。しかし、大腸菌のような介在微生物を用いることは重要ではなく、いくつかの好ましい態様において、前記ＤＮＡ構築体はコンピテント・バチルス宿主へ直接に形質転換される。
【０１４５】
いくつかの態様において、周知のバチルス・スブチルス菌株１６８は本発明において使用される。実際、この菌株のゲノムは充分に特徴付けられてきた（クンスト（Ｋｕｎｓｔ）他、ネイチャー、３９０巻：２４９−２５６頁［１９９７年］、ヘンナー（Ｈｅｎｎｅｒ）他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４巻、５７−８２頁［１９８０年］を参照のされたい）。前記ゲノムは、一つの４２１５ｋｂ染色体からなる。他方、本発明で用いられる配位は１６８菌株のことを言い、本発明にはバチルス菌株との類似配列が含まれる。
【０１４６】
いくつかの態様において、前記外来染色体配列はｐｃｋＡ遺伝子を含み、一方、代替的な態様において外来染色体配列には更に、ｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ／ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ遺伝子の断片およびそれらとの相同配列からなる群から選択される一つ以上の遺伝子が含まれる。Ｂ．スブチルス１６８由来のこれらの遺伝子のＤＮＡコード配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号３７、配列番号２５、配列番号２１、配列番号５０、配列番号２９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号３５、配列番号３３において提供される。
【０１４７】
上述のように、いくつかの態様において、ｐｃｋＡを単独でまたはｓｂｏ、ｓｌｒ、ｙｂｃＯ、ｃｓｎ、ｓｐｏｌｌＳＡ、ｓｉｇＢ，ｐｈｒＣ、ｒａｐＡ、ＣｓｓＳ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＦ、ｔｄｈ、ｋｂｌ、ａｌｓＤ、ｓｉｇＤ、ｐｒｐＣ、ｇａｐＢ、ｆｂｐ、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦ、およびｒｏｃＤ遺伝子、それらの遺伝子断片、またはそれらとの相同配列とｐｃｋＡの組合わせを含む外来配列にはコード領域が含まれ、またさらに染色体コード領域に直に隣接する配列を含む。いくつかの態様において、コード領域に隣接する配列には、約１ｂｐ〜２５００ｋｂ、１ｂｐ〜１５００ｂｐ、約１ｂｐ〜１０００ｂｐ、約１ｂｐ〜５００ｂｐ、および１ｂｐ〜２５０ｂｐの範囲が含まれる。コード領域に隣接する配列を含む核酸配列の数は、遺伝子コード配列の各末端において異なってもよい。例えば、いくつかの態様において、コード配列の５’末端は２５ｂｐ未満を含み、コード配列の３’末端は１００ｂｐより多く含む。これらの遺伝子および遺伝子産物は以下に示される。本発明で使用される番号付けは、スブチリスト（ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ）において用いられているものである（モッツァー（Ｍｏｓｚｅｒ）他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４１巻、２６１−２６８頁［１９９５年］を参照されたい）。
【０１４８】
Ｂ．スブチルスのｓｂｏコード配列を以下に示す。
【表３】
2007532114.tif 000005
【０１４９】
Ｓｂｏの推定アミノ酸配列は、
【表４】
2007532114.tif 000006
【０１５０】
ある態様において、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約３８３４８６８〜３８３５２１９ｂｐにおいて見出された遺伝子領域は、本発明を用いて欠失された。約３８３５０８１〜３８３５２０９において見出されるｓｂｏコード領域は、スブチリシンＡ、いくつかのグラム陽性菌に対して活性を有する抗菌剤を生産する（チェング（Ｚｈｅｎｇ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１巻：７３４６−７３５５頁［１９９４年］を参照されたい）。
【０１５１】
Ｂ．スブチルス１６８のｓｌｒコード配列を以下に示す。
【表５】
2007532114.tif 000007
【０１５２】
Ｓｌｒの推定アミノ酸配列は、
【表６】
2007532114.tif 000008
【０１５３】
ある態様において、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約３５２９０１４〜３５２９６０３ｂｐにおいて見出された配列は、本発明を用いて欠失された。ｓｌｒコード配列は染色体の約３５２９１３１〜３５２９５８６において見出される。
【０１５４】
Ｂ．スブチルス１６８のｐｈｃＣコード配列を以下に示す。
【表７】
2007532114.tif 000009
【０１５５】
ＰｈｒＣの推定アミノ酸配列は、
【表８】
2007532114.tif 000010
【０１５６】
更に、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約４２９５３１〜４２９６５０ｂｐにおいて見出されるコード領域は、コード配列の４２９５９１における選択マーカーの挿入によって不活性化された。
【０１５７】
Ｂ．スブチルス１６８のｓｉｇＢコード配列を以下に示す。
【表９】
2007532114.tif 000011
【０１５８】
ＳｉｇＢの推定アミノ酸配列は、
【表１０】
2007532114.tif 000012
【０１５９】
更に、コード配列はＢ．スブチルス１６８染色体の約５２２４１７〜５２３２０８５ｂｐにおいて見出される。
【０１６０】
Ｂ．スブチルス１６８のｓｐｏｌｌＳＡコード配列を以下に示す。
【表１１】
2007532114.tif 000013
【０１６１】
ｓｐｏｌｌＳＡの推定アミノ酸配列は、
【表１２】
2007532114.tif 000014
【０１６２】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約１３４７５８７〜１３４８７１４ｂｐにおいて見出される。
【０１６３】
Ｂ．スブチルス１６８のｃｓｎコード配列を以下に示す。
【表１３】
2007532114.tif 000015
【０１６４】
Ｃｓｎの推定アミノ酸配列は、
【表１４】
2007532114.tif 000016
【０１６５】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約２７４７２１３〜２７４８０４３ｂｐにおいて見出される。
【０１６６】
Ｂ．スブチルス１６８のｙｂｃＯコード配列を以下に示す。
【表１５】
2007532114.tif 000017
【０１６７】
ＹｂｃＯの推定アミノ酸配列は、
【表１６】
2007532114.tif 000018
【０１６８】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約２１３９２６〜２１４０９０ｂｐにおいて見出される。
【０１６９】
Ｂ．スブチルス１６８のｒａｐＡコード配列を以下に示す。
【表１７】
2007532114.tif 000019
【０１７０】
ＲａｐＡの推定アミノ酸配列は、
【表１８】
2007532114.tif 000020
【０１７１】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約１３１５１７９〜１３１６３１２ｂｐにおいて見出される。
【０１７２】
Ｂ．スブチルス１６８のＣｓｓコード配列を以下に示す。
【表１９】
2007532114.tif 000021
【０１７３】
Ｃｓｓの推定アミノ酸配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセス番号０３２１９３）は、
【表２０】
2007532114.tif 000022
【０１７４】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約３３８４６１２〜３３８６７７４ｂｐにおいて見出される。
【０１７５】
Ｂ．スブチルス１６８のＦｂｐタンパク（フルクトース−１，６−バイオフォスファターゼ）のｆｂｐコード配列を以下に示す。
【表２１】
2007532114.tif 000023
【０１７６】
Ｆｂｐタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表２２】
2007532114.tif 000024
【０１７７】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約４１２７０５３〜４１２９０６５ｂｐにおいて見出される。
【０１７８】
Ｂ．スブチルス１６８のａｌｓＤタンパク（アルファ−アセト乳酸デカルボキシラーゼ）のａｌｓＤコード配列を以下に示す。
【表２３】
2007532114.tif 000025
【０１７９】
ＡｌｓＤタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表２４】
2007532114.tif 000026
【０１８０】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約３７０７８２９〜３７０８５９３ｂｐにおいて見出される。
【０１８１】
Ｂ．スブチルス１６８のｇａｐＢタンパク（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のｇａｐＢコード配列を以下に示す。
【表２５】
2007532114.tif 000027
【０１８２】
ＧａｐＢタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表２６】
2007532114.tif 000028
【０１８３】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約２９６６０７５〜２９６７０９４ｂｐにおいて見出される。
【０１８４】
Ｋｂｌタンパク（２−アミノ−３−ケトブツレートＣｏＡリガーゼ）のＫｂｌコード配列を以下に示す。
【表２７】
2007532114.tif 000029
【０１８５】
Ｋｂｌタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表２８】
2007532114.tif 000030
【０１８６】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約１７７０７８７〜１７７１９６２ｂｐにおいて見出される。
【０１８７】
Ｂ．スブチルス１６８のｐｃｋＡタンパク（フォスフォエノルピルベート  カルボキシキナーゼ）のｐｃｋＡコード配列を以下に示す。
【表２９】
2007532114.tif 000031
【０１８８】
ｐｃｋＡタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表３０】
2007532114.tif 000032
【０１８９】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約３１２８５７９〜３１３０１５９ｂｐにおいて見出される。
【０１９０】
Ｂ．スブチルス１６８のｐｒｐＣタンパク（プロテイン  フォスファターゼ）のｐｒｐＣコード配列を以下に示す。
【表３１】
2007532114.tif 000033
【０１９１】
ｐｒｐＣタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表３２】
2007532114.tif 000034
【０１９２】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約１６４９６８４〜１６５０４４５ｂｐにおいて見出される。
【０１９３】
Ｂ．スブチルス１６８のｒｏｃＡタンパク（プロリン−５  カルボキレート  デハイドロゲナーゼ）のｒｏｃＡコード配列を以下に示す。
【表３３】
2007532114.tif 000035
【０１９４】
ＲｏｃＡタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表３４】
2007532114.tif 000036
【０１９５】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約３８７７９９１〜３８７９５３５ｂｐにおいて見出される。
【０１９６】
Ｂ．スブチルス１６８のｒｏｃＤタンパク（オルニチン  アミノトランスフェラーゼ）のｒｏｃＤコード配列を以下に示す。
【表３５】
2007532114.tif 000037
【０１９７】
ＲｏｃＤタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表３６】
2007532114.tif 000038
【０１９８】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約４４３３２８〜４１４４５３０ｂｐにおいて見出される。
【０１９９】
Ｂ．スブチルス１６８のｒｏｃＦタンパク（アルギナーゼ）のｒｏｃＤコード配列を以下に示す。
【表３７】
2007532114.tif 000039
【０２００】
ＲｏｃＦタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表３８】
2007532114.tif 000040
【０２０１】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約４１４０７３８〜４１４１６２５ｂｐにおいて見出される。
【０２０２】
Ｂ．スブチルス１６８のＴｄｈタンパク（スレオニン  ３−デハイドロゲナーゼ）のＴｄｈコード配列を以下に示す。
【表３９】
2007532114.tif 000041
【０２０３】
Ｔｄｈタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表４０】
2007532114.tif 000042
【０２０４】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約１７６９７３１〜１７７０７７１ｂｐにおいて見出される。
【０２０５】
トリプトファンオペロン制御領域および遺伝子ｔｒｐＥ（配列番号４８）、ｔｒｐＤ（配列番号４６）、ｔｒｐＣ（配列番号４４）、ｔｒｐＦ（配列番号５０）、ｔｒｐＢ（配列番号４２）、およびｔｒｐＡ（配列番号４０）のコード配列を以下に示す。オペロン制御領域に下線を引いた。ｔｒｐＥ発端（ＡＴＧ）は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ発端（これらもまた、表示順に太字で示す）と同様に太字で示す。
【０２０６】
【表４１】
2007532114.tif 000043
【０２０７】
【表４２】
2007532114.tif 000044
【０２０８】
ＴｒｐＡタンパク（トリプトファン合成酵素（アルファサブユニット））の推定配列は、
【表４３】
2007532114.tif 000045
【０２０９】
ＴｒｐＢタンパク（トリプトファン合成酵素（ベータサブユニット））の推定配列は、
【表４４】
2007532114.tif 000046
【０２１０】
ＴｒｐＣタンパク（インドール−３−グルセロールリン酸シンターゼ）の推定配列は、
【表４５】
2007532114.tif 000047
【０２１１】
ＴｒｐＤタンパク（アントラニル酸フォスフォリボスルトランスフェラーゼ）の推定配列は、
【表４６】
2007532114.tif 000048
【０２１２】
ＴｒｐＥタンパク（アントラニル酸シンターゼ）の配列は、
【表４７】
2007532114.tif 000049
【０２１３】
ＴｒｐＦタンパク（ホスホリボシル・アトラニル酸イソメラーゼ）の推定配列は、
【表４８】
2007532114.tif 000050
【０２１４】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約２３７０７０７〜２３７６８３４ｂｐ（第一ｂｐ＝２３７６８３４、最終ｂｐ＝２３７０７０７）において見出される。
【０２１５】
Ｂ．スブチルス１６８のｙｃｇＭタンパク（プロリン酸化酵素に類似）のｙｃｄＭコード配列を以下に示す。
【表４９】
2007532114.tif 000051
【０２１６】
ＹｃｄＭタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表５０】
2007532114.tif 000052
【０２１７】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約３４４１１１〜３４５０１９ｂｐにおいて見出される。
【０２１８】
Ｂ．スブチルス１６８のｙｃｇＮタンパク（１−ピロリン−５−カルボン酸デハイドロゲナーゼ）のｙｃｇＮコード配列を以下に示す。
【表５１】
2007532114.tif 000053
【０２１９】
ＹｃｇＮタンパクの推定アミノ酸配列は、
【表５２】
2007532114.tif 000054
【０２２０】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約３４５０３９〜３４６５８３ｂｐにおいて見出される。
【０２２１】
Ｂ．スブチルス１６８のｓｉｇＤタンパク（ＲＮＡポリメラーゼ鞭毛、運動性、走化性および自己分解シグマ因子）のｓｉｇＤコード配列を以下に示す。
【表５３】
2007532114.tif 000055
【０２２２】
ＳｉｇＤの推定アミノ酸配列は、
【表５４】
2007532114.tif 000056
【０２２３】
更に、コード領域はＢ．スブチルス１６８染色体の約１７１５７８６〜１７１６５４７ｂｐにおいて見出される。
【０２２４】
上記のように、他のバチルス宿主に見い出される不活性化された類似遺伝子は、本発明で使用されると考えられる。
【０２２５】
いくつかの好ましい態様において宿主細胞はバチルス属の一員であり、一方、いくつかの態様において関心あるバチルス菌株は好アルカリ性である。多数の好アルカリ性バチルス菌株が知られている（米国特許ＵＳ５，２１７，８７８号、およびアウンストラップ他、ＰｒｏｃＩＶ  ＩＦＳ：Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２９９−３０５頁［１９７２年］）。いくつかの好ましい態様において、関心あるバチルス菌株は工業用バチルス菌株である。工業用バチルス菌株の例には、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、およびバチルス・アミロリケファシエンスが含まれるが、これに限定されない。更なる態様において、バチルス宿主菌株は、上述のバチルス属内の他の生物体と同様、バチルス・レントゥス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、バチルス・チューリンギエンシス、バチルス・クラウシ、およびバチルス・メガテリウムからなる群から選択される。いくつかの特に好ましい態様において、バチルス・スブチルスが用いられる。他の適切な菌株が本発明における使用に考慮されるが、例えば、米国特許ＵＳ５，２６４，３６６号および４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）は、本発明で使用される多種のバチルス宿主菌株を記述している。
【０２２６】
工業用菌株には、バチルス種の非組換え菌株、自然由来の菌株の突然変異、または組換え菌株が可能である。好ましくは、前記宿主菌株は、関心あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主に導入されている組換え宿主菌株である。更に好ましい宿主菌株は、バチルス・スブチルス宿主菌株、およびとりわけ組換えバチルス・スブチルス宿主菌株である。１Ａ６（ＡＴＣＣ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３からＰＢ１７５８まで、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ３９，０８７）、ＡＴＣＣ２１３３２、ＡＴＣＣ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ１１０、およびＰＥＰ２１１菌株（例えば、ホック（Ｈｏｃｈ）他、遺伝学、７３巻、２１５−２２８頁［１９７３年］、米国特許ＵＳ４，４５０，２３５号、ＵＳ４，３０２，５４４号、および欧州特許ＥＰ０１３４０４８号を参照されたい）を含むがこれに限定されない多数のバチルス・スブチルス菌株が知られている。発現宿主としてのバチルス・スブチルスの使用は、パルバ他およびその他（Ｐａｌｖａ他、遺伝子、１９巻、８１−８７頁［１９８２年］、またファーネストックおよびフィッシャー（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６５巻：７９６−８０４頁［１９８６年］、およびワン（Ｗａｎｇ）他、遺伝子、６９巻、３９−４７頁［１９８８年］も参照されたい）により更に記述されている。
【０２２７】
バチルス菌株を生産する工業用プロテアーゼは特に好ましい発現宿主を提供する。いくつかの好ましい態様において、本発明におけるこれら菌株の使用は、更なる効率およびプロテアーゼ生産の強化を提供する。プロテアーゼの二つの遺伝子タイプは、典型的にはバチルス種、すなわち、中性（または「メタロプロテアーゼ」）およびアルカリ（または「セリン」）プロテアーゼによって分泌される。セリンプロテアーゼは、活性部位に本質的なセリン残基があるペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。セリンプロテアーゼは、２５，０００〜３０，０００の幅の分子量を有する（プリースト、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４１巻、７１１−７５３頁［１９７７年］）。スブチリシンは、本発明における使用にとって好ましいセリンプロテアーゼである。バチルス・スブチリシンの広範な種類は、例えば、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、およびスブチリシン３０９が、同定され、および配列決定されている（例えば、ＥＰ４１４２７９Ｂ号、ＷＯ８９／０６２７９号、およびスタール（Ｓｔａｈｌ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１５９巻、８１１−８１８頁［１９８４年］を参照されたい）。本発明のいくつかの態様において、バチルス宿主菌株は、突然変異（例えば、変異体）プロテアーゼを生産する。多数の引用文献が変異プロテアーゼの事例と参照を提供する（例えば、ＷＯ９９／２０７７０号、ＷＯ９９／２０７２６号、ＷＯ９９／２０７６９号、ＷＯ８９／０６２７９号、ＲＥ３４，６０６号、米国特許ＵＳ４，９１４，０３１号、米国特許ＵＳ４，９８０，２８８号、米国特許ＵＳ５，２０８，１５８号、米国特許ＵＳ５，３１０，６７５号、米国特許ＵＳ５，３３６，６１１号、米国特許ＵＳ５，３９９，２８３号、米国特許ＵＳ５，４４１，８８２号、米国特許ＵＳ５，４８２，８４９号、米国特許ＵＳ５，６３１，２１７号、米国特許ＵＳ５，６６５，５８７号、米国特許ＵＳ５，７００，６７６号、米国特許ＵＳ５，７４１，６９４号、米国特許ＵＳ５，８５８，７５７号、米国特許ＵＳ５，８８０，０８０号、米国特許ＵＳ６，１９７，５６７号、および米国特許ＵＳ６，２１８，１６５号を参照されたい）。
【０２２８】
更に他の態様において、好ましいバチルス宿主は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、およびｄｅｇＱの遺伝子の少なくとも１つにおける突然変異または欠失を含むバチルス種である。好ましくは、前記突然変異はｄｅｇＵ遺伝子においてであり、より好ましくは突然変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（ムサデク（Ｍｓａｄｅｋ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻、８２４−８３４頁［１９９０年］、およびオルモス（Ｏｌｍａｓ）他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２５３巻、５６２−５６７［１９９７年］を参照されたい）。最も好ましい宿主菌株は、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）突然変異を有するバチルス・スブチルスである。更なる態様において、前記バチルス宿主は、ｓｃｏＣ４（コールドウェル（Ｃｏｌｄｗｅｌｌ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、７３２９−７３４０頁［２００１年］を参照されたい）、ｓｐｏｌｌＥ（アリゴーニ（Ａｒｉｇｏｎｉ）他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１巻、１４０７−１４１５頁［１９９９年］を参照されたい）、ｏｐｐＡまたはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（ペレーゴ（Ｐｅｒｅｇｏ）他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５巻、１７３−１８５頁［１９９１年］を参照されたい）における突然変異または欠失を含む。実際、ｏｐｐＡにおける突然変異として同一の表現型を生じさせるｏｐｐオペロンにおける任意の突然変異は、本発明の改変バチルス菌株のいくつかの態様において利用されることになると考えられる。いくつかの態様においてこれらの突然変異は単独で生じ、一方、他の態様において突然変異の組合せが存在する。いくつかの態様において、本発明の改変バチルスは、上記の遺伝子の１つ以上の突然変異を既に含むバチルス宿主菌株から得られる。代替的な態様において、本発明の改変バチルスは、上記の遺伝子の１つ以上の突然変異を含むように更に組み替えられる。
【０２２９】
更に他の態様において、外来配列は二つのｌｏｘＰ部位（クーンおよびトレス（Ｋｕｈｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０巻、１７５−２０４頁［２００２年］を参照されたい）の間に位置する選択マーカーを含み、次に抗菌剤がＣｒｅタンパクの活動によって欠失される。いくつかの態様において、これは、相同隣接ＤＮＡおよび抗菌を含む外来ＤＮＡを構築するために用いられるプライマーにより決定される天然ＤＮＡの欠失と同様、単一のｌｏｘＰの挿入をもたらす。
【０２３０】
当該業者は、バチルス細胞へのポリヌクレオチド配列の導入に関する適切な方法を十分知っている（例えば、フェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）他、「遺伝子学」ハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）他編『バチルス』所収、プレナム出版社［１９８９年］５７−７２頁を参照されたい。また、ソーンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５７巻、７１８−７２６頁［１９８４年］、ホック（Ｈｏｃｈ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、９３巻、１９２５−１９３７頁［１９６７年］、マン（Ｍａｎｎ）他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３巻、１３１−１３５頁［１９８６年］、およびホルボヴァ（Ｈｏｌｕｂｏｖａ）、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０巻、９７頁［１９８５年］、バチルス・スブチルスに関しては、チャン（Ｃｈａｎｇ）他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１６８巻、１１−１１５頁［１９７９年］、バチルス・メガテリウムに関しては、ヴォロビエヴァ（Ｖｏｒｏｂｉｅｖａ）他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、７巻、２６１−２６３頁［１９８０年］、バチルス・アミロリケファシエンスに関しては、スミス他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５１巻、６３４頁［１９８６年］、バチルス・チューリンギエンシスに関しては、フィッシャー他、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３９巻、２１３−２１７頁［１９８１年］およびバチルス・スファエリクス（ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に関しては、マクドナルド、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３０巻、２０３頁［１９８４年］を参照されたい）。実際、プロトプラスト形質転換および会合、形質移入、およびプロトプラスト融合を含む形質転換の方法は既知であり、本発明における使用に好適である。形質転換の方法は、本発明によって提供されるＤＮＡを宿主細胞に導入するために特に好ましい。
【０２３１】
一般的に使用される方法に加えて、いくつかの態様において宿主細胞は直接形質転換される（すなわち、中間細胞は、宿主細胞への導入に先立ってＤＮＡ構築体を増幅するために、または別の工程で、用いられない）。ＤＮＡ構築体の宿主細胞への導入には、プラスミドまたはベクターへの挿入をしないで宿主細胞へＤＮＡを導入するための、当該技術分野に既知の物理的、化学的方法が含まれる。そのような方法には、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、裸のＤＮＡ、リポソームなどが含まれるが、それに限定されない。追加的な態様において、ＤＮＡ構築体は、プラスミドへ挿入されないで、プラスミドと一緒に共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）される。更なる態様において、選択マーカーは当該技術分野で知られる方法により改変バチルス菌株から欠失される（スタール（Ｓｔａｈｌ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８巻、４１１−４１８頁［１９８４年］、およびパルメロス（Ｐａｌｍｅｒｏｓ）他、遺伝子、２４７巻、２５５−２６４頁［２０００年］を参照されたい）。
【０２３２】
いくつかの態様において宿主細胞は、二つ以上の遺伝子が宿主細胞で不活性化されている改変バチルス菌株を生産するために、本発明に従って１つ以上のＤＮＡ構築体を用いて形質転換される。いくつかの態様において、二つ以上の遺伝子が宿主細胞染色体から欠失される。代替的な態様において、二つ以上の遺伝子はＤＮＡ構築体の挿入によって不活性化される。いくつかの態様において不活性化された遺伝子は隣接しており（不活性化が欠失に依るものか、および／または挿入に依るものかに拘わらず）、一方、他の態様においてそれらは隣接遺伝子ではない。
【０２３３】
欠失、および細胞内および細胞外発現ポリペプチドの活性の測定については、当業者に既知の多数のアッセイがある。特にプロテアーゼについては、２８０ｎｍにおける吸光度で、またはフォリン法を用いた比色分析で測定されるカゼインまたはヘモグロビン由来の酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがある（例えば、バーグメイヤー（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）他、「酵素分析の方法」５巻、『ペプチダーゼ、プロテイナーゼおよびそれらの阻害剤』、Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ社、ワインハイム［１９８４年］を参照されたい）。他のアッセイは、発色基質の可溶化を含む（例えば、ワード（Ｗａｒｄ）「プロテイナーゼ」、Ｆｏｇａｒｔｙ編『微生物酵素およびバイオテクノロジー』所収、アプライド・サイエンス社、ロンドン［１９８３年］、２５１−３１７頁を参照されたい）。他のアッセイ例には、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアリニド・アッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸・ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が含まれる。当業者に既知の多数の追加的な参考文献が、適切な方法を提供している（例えば、ウエルス（Ｗｅｌｌｓ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１巻、７９１１−７９２５頁［１９８３年］、クリスチャンソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２３巻、１１９−１２９頁［１９９４年］、およびシャ（Ｈｓｉａ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４２巻、２２１−２２７頁［１９９９年］を参照されたい）。
【０２３４】
宿主細胞における関心あるタンパク質の分泌レベルの決定および発現タンパクの検出の手段には、タンパク質に対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた免疫アッセイの使用が含まれる。具体例には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。しかし、他の方法が当業者に既知であり、関心あるタンパクの評価において使用される（例えば、ハンプトン（Ｈａｍｐｔｏｎ）他、『血清学的方法−実験室マニュアル』、ＡＰＳ出版社、セントポール、ミネソタ州［１９９０年］、およびマドックス（Ｍａｄｄｏｘ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５８巻、１２１１頁［１９８３年］を参照されたい）。いくつかの好ましい態様において、関心あるタンパク質の分泌は、対応する未改変の宿主におけるよりも本発明を用いて得られた改変菌株においてより高い。当該技術分野に既知であるように、本発明を用いて生産された改変バチルス細胞は、細胞カルチャー由来の関心あるポリペプチドプチドの発現および回収に好適な条件下で維持され、培養される（例えば、ハードウッドおよびカッティング（Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ）編集、『バチルスの分子生物学的方法』、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社［１９９０年］を参照されたい）。
【０２３５】
Ｂ．大きな染色体欠失
上述のように、単一および多遺伝子欠失に加えて、本発明は大きな染色体欠失を提供する。本発明のいくつかの好ましい態様において、常在染色体領域またはそれらの断片は、改変バチルス菌株を生産するためにバチルス宿主細胞から欠失される。いくつかの態様において、前記常在染色体領域には、プロファージ領域、抗菌領域（例えば、抗生剤領域）、制御領域、多隣接単一遺伝子領域および／またはオペロン領域が含まれる。本発明で言及される常在染色体領域を示す座標は、バチルス・スブチルス菌株１６８染色体マップに従って特定される。数は通常、それが存在するならば、リボソーム結合部位の発端と、またはコード領域の末端と関連しており、通常は存在可能なターミネータを含まない。菌株１６８のバチルス・スブチルスのゲノムは周知であり（クンスト（Ｋｕｎｓｔ）他、ネイチャー、３９０巻、２４９−２５６頁［１９９７年］、ヘンナー（Ｈｅｎｎｅｒ）他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４巻、５７−８２頁［１９８０年］を参照のされたい）、一つの４２１５ｋｂ染色体からなる。しかし、本発明もまた、任意のバチルス菌株由来の類似配列を含む。特に好ましくは、他のＢ．スブチルス菌株、Ｂ．リケニフォルミス菌株、およびＢ．アミロリケファシエンス菌株である。
【０２３６】
いくつかの態様において、前記常在染色体領域にはプロファージ切片およびそれらの断片が含まれる。「プロファージ切片」は、ウイルスのＤＮＡが正常細菌遺伝子から効果的に区別できない細菌染色体へ挿入されているウイルスのＤＮＡである。前記Ｂ．スブチルスのゲノムは、多数のプロファージ切片からなり、これらの切片は感染性ではない（シーマン（Ｓｅａｍａｎ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３巻、６０７−６１３頁［１９６４年］、およびスティクラー（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ）他、Ｖｉｒｏｌ．、２６巻、１４２−１４５頁［１９６５年］）。バチルス・スブチルスのプロファージ領域の任意の１つが欠失されることが可能であっても、参照は、以下の限定されない実施例のためになされる。
【０２３７】
本発明のいくつかの態様において欠失される一つのプロファージ領域は、「皮膚」要素の間に入るシグマＫである。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約２６５２６００ｂｐ（ｓｐｏｌＶＣＡ）から２７００５７９ｂｐ（ｙｑａＢ）において見出される。本発明を用いて、染色体の２６５３５６２ｂｐ〜２６９９６０４ｂｐに対応する約４６ｋｂの切片が欠失された。この要素は、ｓｐｏｌＶＣＢおよびｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子の間のＳＩＧＫ  ＯＲＦ内に位置する祖先テンペレートファージの残留物と考えられている。しかし、本発明が、欠失領域に関与する任意の特定の機構または作用様式に限定されることを意味しない。前記要素は、推定リボソーム結合部位を有する５７の読み取り枠を包含することが証明されている（タケマル他、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、１４１巻、３２３−３２７頁［１９９５年］を参照されたい）。母細胞における胞子形成の間、前記皮膚要素は切り出され、ｓｉｇＫ遺伝子の再構築を導く。
【０２３８】
欠失に適切なもう一つの領域は、プロファージ７領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約２７０１２０８ｂｐ（ｙｒｋＳ）〜２７４９５７２ｂｐ（ｙｒａＫ）において見出される。本発明を用いて、染色体の２７０１０８７ｂｐ〜２７４９６４２ｂｐに対応する約４８．５ｋｂの切片が欠失された。
【０２３９】
更なる領域は、皮膚＋プロファージ７領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約２６５２１５１ｂｐ〜２７４９６４２ｂｐにおいて見出される。本発明を用いて、約９７．５ｋｂ切片が欠失された。この領域はまた介在ｓｐｏＩＩＣ遺伝子を含む。皮膚／プロファージ７領域には、以下の遺伝子が含まれるが、これに限定されない。すなわち、ｓｐｏＩＶＣＡ―ＤＮＡ組換え体、ｂｌｔ（多剤耐性）、ｃｙｐＡ（シトクロムＰ４５０様酵素）、ｃｚｃＤ（陽イオン排出系膜タンパク）、およびｒａｐＥ（応答調節因子アスパラギン酸ホスファターゼ）である。
【０２４０】
更に他の領域はＰＢＳＸ領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約１３１９８８４ｂｐ（ｘｋｄＡ）〜１３４７４９１ｂｐ（ｘｌｙＡ）において見出される。本発明を用いて、染色体の１３１９６６３ｂｐ〜１３４８６９１ｂｐに対応する約２９ｋｂの切片が欠失された。正常の非誘発条件下で、このプロファージ要素は感染性ではなく、および殺菌性でない（Ｗ２３およびＳ３１のような、少数の感受性株を除いて）。それはマイトマイシンＣにより誘導性であり、ＳＯＳ反応により活性化され、ファージ様粒子の放出によって細胞融解をもたらす。このファージ粒子は細菌染色体ＤＮＡを含み、ＤＮＡを注入することなく感受性細菌を殺す（Ｃａｎｏｓｉ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３９巻：８１−９０頁［１９７８年］）。この領域には以下の遺伝子の限定されないリストが含まれる。すなわち、ｘｔｍＡ−Ｂ、ｘｋｄＡ−ＫおよびＭ−Ｘ、ｘｒｅ、ｘｔｒＡ、ｘｐｆ、ｘｅｐ、ｘｈｌＡ―ＢおよびｘｌｙＡである。
【０２４１】
更なる領域は、ＳＰβ領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約２１５０８２４ｂｐ（ｙｏｄＵ）〜２２８６２４６ｂｐ（ｙｐｑＰ）において見出される。本発明を用いて、染色体の２１５１８２７ｂｐ〜２２８５２４６ｂｐに対応する約１３３．５ｋｂの切片が欠失された。この要素は、その機能が依然として特徴付けられていないテンペレート・プロファージである。しかしながら、この領域における遺伝子には、推定胞子外皮タンパク（ｙｏｄＵ、ｓｓｐＣ、ｙｏｋＨ）、推定ストレス反応タンパク（ｙｏｒＤ、ｙｐｐＱ、ｙｐｎＰ）、およびｙｏｍオペロンの一員のような胞子外皮タンパクにおける遺伝子およびストレス反応遺伝子とのホモローグを有する他の遺伝子が含まれる。他の遺伝は、ｙｏｔ、ｙｏｓ、ｙｏｑ、ｙｏｐ、ｙｏｎ、ｙｏｍ、ｙｏｚ、ｙｏｌ、ｙｏｋ、ｙｐｏ、およびｙｐｍを含むこの領域である。
【０２４２】
追加的な領域は、プロファージ１領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約２０２０９８ｂｐ（ｙｂｂＵ）〜２２００１５ｂｐ（ｙｂｄＥ）において見出される。本発明を用いて、染色体の２０２１１２ｂｐ〜２２０１４１ｂｐに対応する約１８．０ｋｂの切片が欠失された。この領域における遺伝子は、ＤＮＡアルキル化およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット５をコードするｎｄｈＦに対する順応的反応を示すＡｄａＡ／Ｂオペロンを含む。
【０２４３】
更なる領域は、プロファージ２領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約５２９０６９ｂｐ（ｙｄｃＬ）〜５６９４９３ｂｐ（ｙｄｅＪ）において見出される。本発明を用いて、染色体の５２９０６７ｂｐ〜５６９５７８ｂｐに対応する約４０．５ｋｂの切片が欠失された。この領域における遺伝子には、ｒａｐＩ／ｐｈｒＩ（応答調節因子アスパラギン酸ホスファターゼ）、ｓａｃＶ（納豆菌の転写調節因子）、およびｃｓｐＣが含まれる。
【０２４４】
他の領域は、プロファージ３領域である。本発明を用いて、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約６５２０００ｂｐ〜６６４３００ｐに対応する約５０．７ｋｂの切片が欠失された。
【０２４５】
更に他の領域は、プロファージ４領域である。この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約１２６３０１７ｂｐ（ｙｊｃＭ）〜１３１３６２７ｂｐ（ｙｊｏＡ）において見出される。本発明を用いて、染色体の１２６２９８７ｂｐ〜１３１３６９２ｂｐに対応する約２．３ｋｂの切片が欠失された。
【０２４６】
追加的な領域は、プロファージ５領域である。本発明を用いて、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約１８７９２００ｂｐ〜１９０００００ｂｐに対応する約２０．８ｋｂの切片が欠失された。
【０２４７】
他の領域は、プロファージ６領域である。本発明を用いて、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約２０４６０５０ｂｐ〜２０７８０００ｂｐに対応する約３１．９ｋｂの切片が欠失された。
【０２４８】
更なる態様において、前記常在染色体領域には、１つ以上のオペロン領域、多隣接単一遺伝子領域、および／または抗菌性領域が含まれる。いくつかの態様において、これらの領域には以下が含まれる。
【０２４９】
ＰＰＳオペロン領域
この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約１９５９４１０ｂｐ（ｐｐｓＥ）〜１９９７１７８ｂｐ（ｐｐｓＡ）において見出される。本発明を用いて、染色体の約１９６０４０９〜１９９８０２６ｂｐに対応する約３８．６ｋｂの切片が欠失された。このオペロン領域は、抗菌性合成に関与し、プリパスタチン合成酵素をコードする。
【０２５０】
ＰＫＳオペロン領域
この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約１７８１１１０ｂｐ（ｐｋｓＡ）〜１８５７７１２ｂｐ（ｐｋｓＲ）において見出される。本発明を用いて、染色体の約１７８１７９５〜１８５７９８５ｂｐに対応する約７６．２ｋｂの切片が欠失された。この領域は、ポリケチドシンターゼをコードし、抗菌性合成に関与する（スコッチ（Ｓｃｏｔｔｉ）他、遺伝子、１３０巻、６５−７１頁［１９９３年］）。
【０２５１】
ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫオペロン領域
この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約３５１３１４９ｂｐ（ｙｖｆＦ）〜３５２８１８４ｂｐ（ｙｖｅＫ）において見出される。本発明を用いて、染色体の約３５１３１３７〜３５２８８９６ｂｐに対応する約１５．８ｋｂの切片が欠失された。この領域は、推定多糖類をコードする（ダルトワ（Ｄａｒｔｏｉｓ）他、バチルスに関する第７回国際会議（１９９３年）、パスツール研究所［１９９３年］、５６頁を参照されたい）。この領域には以下の遺伝子が含まれる。すなわち、ｙｖｆＡ−Ｆ、ｙｖｅＫ−Ｔ、およびｓｌｒである。Ｂ．スブチルス１６８染色体の約３５２９０１４〜３５２９６０３ｂｐにおいて見出されるｓｌｒ遺伝子領域は、約５８９ｂｐ切片を含む。この領域はｙｖｆＦ−ｙｖｅＫオペロンの制御領域である。
【０２５２】
ＤＨＢオペロン領域
この領域は、Ｂ．スブチルス１６８染色体の約３２７９７５０ｂｐ（ｙｕｋＬ）〜３２９３２０６ｂｐ（ｙｕｉＨ）において見出される。本発明を用いて、染色体の３２７９４１８〜３２９２９２０ｂｐに対応する約１３．０ｋｂの切片が欠失された。この領域は、カテコール性シデロフォン２，３−ジヒドロキ安息香酸−グリシン−スレオニン三量体エステルバシリバクチンをコード化する（メイ（Ｍａｙ）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、７２０９−７２１７頁［２００１年］を参照されたい）。この領域には以下の遺伝子が含まれる。すなわち、ｙｕｋＬ、ｙｕｋＭ、ｄｈｂＡ−Ｃ，ＥおよびＦ、およびｙｕｉＩ−Ｈである。
【０２５３】
上述のように、前記領域は欠失されるべき好ましい常在染色体領域の具体例であり、一方、本発明のいくつかの態様において、前記領域の断片もまた欠失される。いくつかの態様において、そのような断片は常在染色体領域の約１％〜９９％の範囲を含む。他の態様において、断片は常在染色体領域の約５％〜９５％の範囲を含む。さらに追加的な態様において、断片は常在染色体領域の少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、および１０％を含む。
【０２５４】
Ｂ．スブチルス１６８染色体における染色体位置を参照して削除されるべき常在染色体領域の断片の更なる非制限的な具体例は、以下を含む。すなわち、
ａ）皮膚領域について
i）ｙｑｃＣからｙｑａＭを含む、約２６６６６６３から２６９３８０７の座標位置、および、
ii）ｒａｐＥからｐｈｒＥを含む、約２６５８４４０〜２６５９６８８の座標位置、
ｂ）ＰＢＳＸプロファージ領域について
i）ｘｋｄＡからｘｋｄＸを含む、約１３２００４３〜１３４５２６３の座標位置、および、
ii）ｘｋｄＥからｘｋｄＷを含む、約１３２６６６２〜１３４５１０２の座標位置、
ｃ）ＳＰβ領域について
i）ｙｏｄＶからｙｏｎＡを含む、約２１４９３５４〜２２３７０２９の座標位置、
ｄ）ＤＨＢ領域について
i）ｄｈｂＦからｄｈｂＡを含む、約３２８２８７９〜３２９１３５３の座標位置、
ｅ）ｙｖｆＦからｙｖｅＫ領域について
i）ｙｖｆＢからｙｖｅＱを含む、約３５１６５４９〜３５２２３３３の座標位置、
ii）ｙｖｆＦからｙｖｅＫを含む、約３５１３１８１〜３５２８９１５の座標位置、および、
iii）ｙｖｅＱからｙｖｅＬを含む、約３５２１２３３〜３５２８２０５の座標位置、
ｆ）プロファージ１領域について
i）ｙｂｃＯからｙｂｄＥを含む、約２１３９２６〜２２００１５の座標位置、および、
ii）ｙｂｃＰからｙｂｄＥを含む、約２１４１４６〜２２００１５の座標位置、
ｇ）プロファージ２領域について
i）ｒａｐＩからｃｓｐＣを含む、約５４６８６７〜５５９００５の座標位置、および
ｈ）プロファージ４領域について
i）ｙｊｃＭからｙｄｊＪを含む、約１２６３０１７〜６７５４２１の座標位置、である。
【０２５５】
欠失に適切な常在染色体領域の断片の数は、断片が同定された常在染色体領域よりも少ないｂｐｓからのみなることが可能であるために、多数である。更に、多くの同定された常在染色体領域は多数の遺伝子を含む。当業者は、どの常在染色体領域の断片が、特定の応用での使用に対する欠失に適切であるかを容易に決定することができる。
【０２５６】
常在染色体領域の定義は、定義された切片に多くの隣接ヌクレオチドを除外するほど厳格ではない。例えば、ＳＰβ領域は本発明においてＢ．スブチルス１６８染色体の座標の約２１５０８２４〜２２８６２４６に位置すると定義され、一方、常在染色体領域は領域の両側に、更に１０〜５０００ｂｐ、更に１００〜４０００ｂｐ、または更に１００〜１０００ｂｐを含むことが可能である。領域の両側の多数のｂｐは、欠失の標的とされる常在染色体領域に含まれないもう一つの遺伝子の存在によって制限される。
【０２５７】
上述のように、本発明で開示された特定の領域の位置は、Ｂ．スブチルス１６８染色体で参照される。バチルス菌株由来の他の類似領域は、常在染色体領域の定義に含まれる。類似領域が任意のバチルス菌株において見出すことが可能であるのに対し、特に好ましい類似領域はバチルス・スブチルス菌株、バチルス・リケニフォルミス菌株およびバチルス・アミロリケファシエンス菌株に見出される。
【０２５８】
一定の態様において、１つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片は、バチルス菌株から欠失される。しかしながら、１つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片の欠失は、欠失を含む菌株の生殖依存度に有害に影響しない。いくつかの態様において、二つの常在染色体領域またはそれらの断片が欠失される。追加的な態様において、三つの常在染色体領域またはそれらの断片が欠失される。更に他の態様において、四つの常在染色体領域またはそれらの断片が欠失される。更なる態様において、五つの常在染色体領域またはそれらの断片が欠失される。他の態様において、１４もの常在染色体領域またはそれらの断片が欠失される。いくつかの態様において前記常在染色体領域またはそれらの断片は隣接し、他方、他の態様においてそれらはバチルス染色体の別個の領域に位置する。
【０２５９】
欠失された常在染色体領域またはそれらの断片を含むバチルス属の任意の一員の菌株が、本発明において利用される。いくつかの好ましい態様において、前記バチルス菌株は、Ｂ．スブチルス菌株、Ｂ．アミロリケファシエンス菌株、Ｂ．レントゥス菌株、およびＢ．リケニフォルミス菌株からなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、前記菌株は工業用バチルス菌株、最も好ましくは工業用Ｂ．スブチルス菌株である。更に好ましい態様において、前記改変バチルス菌株はプロテアーゼ生産菌株である。いくつかの特に好ましい態様において、それはプロテアーゼ酵素をコード化するポリヌクレオチドを含むようにあらかじめ組み換えられているＢ．スブチルス菌株である。
【０２６０】
上述のように、常在染色体領域またはそれらの断片が欠失されているバチルス菌株は、本発明において「改変バチルス菌株」と呼ばれる。本発明の好ましい態様において、前記改変バチルス菌株は、関心あるタンパク質の増強された発現レベルを示す（すなわち、関心あるタンパク質の発現が、同一の培養条件下で培養された対応する未改変バチルス菌株と比較して、増強される）。
【０２６１】
増強の一つの測定法は関心あるタンパク質の分泌である。いくつかの態様において、関心あるタンパク質の生産は対応する未改変バチルス菌株と比べて、少なくとも０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、４．０％、５．０％、８．０％、１０％、１５％、２０％、および２５％またはそれ以上増強される。他の態様において、１リットル当たりに生産されたタンパク質をグラム単位で測定した場合、関心あるタンパク質の生産は、対応する未改変バチルス菌株と比べて、約０．２５％〜２０％、約０．５％〜１５％、および約１．０％〜１０％の間で増強される。
【０２６２】
常在染色体領域またはその断片の欠失を含む本発明により提供される改変バチルス菌株は、以下の手段を含むがこれに限定されない任意の適切な方法を用いて生産される。ある一般的な態様において、ＤＮＡ構築体はバチルス宿主に導入される。ＤＮＡ構築体は、不活性化染色体切片を含み、いくつかの態様において更に選択マーカーを含む。好ましくは、選択マーカーは不活性化染色体切片のある部分に、５’および３’末端の双方で隣接する。
【０２６３】
いくつかの態様において、不活性化染色体切片は好ましくは欠失されるべき常在染色体領域（または前記領域の断片）の直ぐ上流および下流に隣接したヌクレオチドと１００％の配列同一性を有し、常在染色体領域の上流および下流ヌクレオチドと約７０％〜１００％、約８０％〜１００％、および約９５％〜１００％の間の配列同一性を有する。不活性化染色体切片の各部分は、未改変宿主における常在染色体領域を用いた相同組換えを提供するために、常在染色体領域の十分な５’および３’隣接配列を含まなければならない。
【０２６４】
いくつかの態様において、前記不活性化染色体切片の各部分は、約５０〜１０，０００塩基対（ｂｐ）を含む。しかし、より低いまたはより高いｂｐ部分は、本発明において使用される。好ましくは、各部分は、約５０〜５０００ｂｐ、約１００〜５０００ｂｐ、約１００ｂｐ〜３０００ｂｐ、１００ｂｐ〜２０００ｂｐ、約１００〜１０００ｂｐ、約２００〜４０００ｂｐ、約４００〜３０００ｂｐ、約５００〜２０００ｂｐ、および、また約８００〜１５００ｂｐである。
【０２６５】
いくつかの態様において、選択マーカーおよび不活性常在染色体切片を含むＤＮＡ構築体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み合わせられ、つぎにＤＮＡ構築体がバチルス染色体へ組み込まれるようになるために、前記構築体のコンピテント・バチルス宿主へ直接クローニングされる。例えば、ＰＣＲ融合および／または連結は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ構築体の組立てに適切である。いくつかの態様において、前記ＤＮＡ構築体は非プラスミド構築体であり、一方、他の態様においてそれはベクターに組み込まれる（すなわち、プラスミド）。いくつかの態様において環状プラスミドが使用され、およびこの環状プラスミドは適当な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築体を分裂させない酵素）を用いて切断される。従って、線状プラスミドは、発明において使用される（例えば、図１、およびペレーゴ（Ｐｅｒｅｇｏ）『バチルス・スブチルスにおける遺伝子操作に関する組込ベクター』、ソネンシャイン（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ）他編、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ワシントンＤＣ、［１９９３年］を参照されたい）。
【０２６６】
いくつかの態様において、ＤＮＡ構築体またはベクター、好ましくは不活性化染色体切片を含むプラスミドは、未改変宿主における常在染色体領域またはその断片を用いた相同組換えを提供するために、常在染色体切片またはそれらの断片の５’および３’隣接配列（ｓｅｑ）の十分な量を含む。他の態様において、ＤＮＡ構築体は構築体の上流および下流末端において操作された制限部位を含む。本発明に従って有用で、座標位置に従って同定されたＤＮＡ構築体の非制限的な例には、以下が含まれる。すなわち、
【０２６７】
１．ＰＢＳＸ領域の欠失のためのＤＮＡ構築体：［ｙｊｑＢ末端およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含んでいる完全ｙｊｐＣを含む５’隣接配列１３１８８７４〜１３１９８６０ｂｐ］−マーカー遺伝子−［ターミネータおよびｐｉｔの上流部分を含む３’隣接配列１３４８６９１〜１３４９６５６ｂｐ］。
【０２６８】
２．プロファージ１領域の欠失のためのＤＮＡ構築体：［ＲＢＳおよびターミネータを含む完全ｇｌｍＳおよびｙｂｂＵＲＢＳを含む５’隣接配列２０１２４８〜２０２１１２ｂｐ］−マーカー遺伝子−［ＲＢＳを含む完全ｙｂｇｄを含む３’隣接配列２２０１４１〜２２１１９５ｂｐ］。
【０２６９】
３、プロファージ２領域の欠失のためのＤＮＡ構築体：［ｙｄｃＫ末端、ｔｒｎＳ−Ａｓｎ、ｔｒｎＳ−Ｓｅｒ、ｔｒｎＳ−Ｇｌｕ、ｔｒｎＳ−Ｇｌｎ、ｔｒｎＳ−Ｌｙｓ、ｔｒｎＳ−Ｌｅｕ１およびｔｒｎＳ−ｌｅｕ２である完全ｔＲＮＡｓを含む５’隣接配列５２７９２５〜５２９０６７ｂｐ］−マーカー遺伝子−［完全ｙｄｅＫおよびｙｄｅＬの上流部分を含む３’隣接配列５６９５７８〜５７１０６２ｂｐ］。
【０２７０】
４、プロファージ４領域の欠失のためのＤＮＡ構築体：［ｙｊｃＭの部分を含む５’隣接配列１２６３１２７〜１２６４２７０ｂｐ］−マーカー遺伝子−［ＲＢＳを含むｙｊｏＢの部分を含む３’隣接配列１３１３６６０〜１３１４５８３ｂｐ］。
【０２７１】
５、ｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ領域の欠失のためのＤＮＡ構築体：［ｓｉｇＬの部分、完全ｙｖｆＧおよびｙｖｆＦの発端を含む５’隣接配列３５１２０６１〜３５１３１６１ｂｐ］−マーカー遺伝子−［完全ｓｌｒおよびｐｎｂＡの発端を含む３’隣接配列３５２８８９６〜３５２９８１０ｂｐ］。
【０２７２】
６、ＤＨＢオペロン領域の欠失のためのＤＮＡ構築体：［ターミネータを含むａｌｄの末端、ＲＢＳを含む完全ｙｕｘＩ、ＲＢＳおよびターミネータを含む完全ｙｕｋＪ、およびｙｕｋＬの末端を含む５’隣接配列３２７８４５７〜３２８０２５５ｂｐ］−マーカー遺伝子−［ＲＢＳを含むｙｕｉＨの末端、ＲＢＳおよびターミネータを含む完全ｙｕｉＧ、およびターミネータを含むｙｕｉＦの上流末端を含む３’隣接配列３２９２９１９〜３２９４０７６ｂｐ］。
【０２７３】
ＤＮＡ構築体がベクターに組み込まれるか、またはプラスミドＤＮＡの存在なしに使用されるかに拘わらず、それは微生物、好ましくは大腸菌細胞またはコンピテント・バチルス細胞に導入される。
【０２７４】
プラスミド構築体およびプラスミドの大腸菌への形質転換に関与するバチルス細胞へのＤＮＡの導入の方法はよく知られている。前記プラスミドは続いて大腸菌から単離され、バチルスへ形質転換される。しかし、大腸菌のような介在微生物を用いることは重要ではなく、いくつかの態様においてＤＮＡ構築体またはベクターが直接バチルス宿主へ導入される。
【０２７５】
好ましい態様において、前記宿主細胞はバチルス種である（例えば、米国特許ＵＳ５，２６４，３６６号、米国特許ＵＳ４，７６０，０２５号、およびＲＥ３４，６０６０を参照されたい）。いくつかの態様において、関心あるバチルス菌株は好アルカリ性バチルスである。多数の好アルカリ性バチルス菌株が知られる（例えば、米国特許ＵＳ５，２１７，８７８号、およびアウンストラップ（Ａｕｎｓｔｒｕｐ）他、ＰｒｏｃＩＶ  ＩＦＳ：Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２９９−３０５頁［１９７２年］）。特に関心あるバチルス菌株の他のタイプは、工業用バチルス菌株の細胞である。工業用バチルス菌株の例には、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、およびバチルス・アミロリケファシエンスが含まれるが、これに限定されない。更なる態様において、バチルス宿主菌株は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・スブチルス、バチルス・レントゥス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、バチルス・チューリンギエンシス、バチルス・クラウシ、およびバチルス・メガテリウムからなる群より選択される。特に好ましい態様において、バチルス・スブチルス細胞が用いられる。
【０２７６】
いくつかの態様において、工業用宿主菌株は、バチルス種の非組換え菌株、自然発生のバチルス菌株の突然変異体、および組換えバチルス宿主菌株からなる群より選択される。好ましくは、宿主菌株は、関心あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主にあらかじめ導入される場合、組換え宿主菌株である。更に好ましい宿主菌株は、バチルス・スブチルス宿主菌株、およびとりわけ組換えバチルス・スブチルス宿主菌株である。多数のバチルス・スブチルス菌株が知られており、本発明の使用に好適である（例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３からＰＢ１７５８まで、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ３９，０８７）、ＡＴＣＣ２１３３２、ＡＴＣＣ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ１１０、およびＰＥＰ２１１菌株；ホック（Ｈｏｃｈ）他、遺伝学、７３巻、２１５−２２８頁［１９７３年］、米国特許ＵＳ４，４５０，２３５号、米国特許ＵＳ４，３０２，５４４号、および欧州特許ＥＰ０１３４０４８号；パルバ（Ｐａｌｖａ）他、遺伝子、１９巻、８１−８７頁［１９８２年］、ファーネストックおよびフィッシャー（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６５巻、７９６−８０４頁［１９８６年］、およびワン（Ｗａｎｇ）他、遺伝子、６９巻、３９−４７頁［１９８８年］を参照されたい）。発現宿主として特に関心あるのは、工業用プロテアーゼ生産バチルス菌株である。これらの菌株を用いることによってプロテアーゼ生産に見られる高い効率は、本発明の改変バチルス菌株によって更に増強される。
【０２７７】
バチルス菌株を生産する工業用プロテアーゼは、特に好ましい発現宿主を提供する。いくつかの態様において、本発明におけるこれら菌株の使用は、効率およびプロテアーゼ生産における更なる増強を提供する。上記のように、プロテアーゼの二つの一般的タイプがあり、それらは典型的にバチルス種、すなわち中性（または「メタロプロテアーゼ」）およびアルカリ（または「セリン」）プロテアーゼによって分泌される。また、上記のように、スブチリシンは、本発明における使用にとって好ましいセリンプロテアーゼである。広範なバチルス・スブチリシンは、例えば、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、およびスブチリシン３０９が、同定され、および配列決定されている（例えば、ＥＰ４１４２７９Ｂ号、ＷＯ８９／０６２７９号、およびスタール（Ｓｔａｈｌ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５９巻、８１１−８１８頁［１９８４年］を参照されたい）。本発明のいくつかの態様において、バチルス宿主菌株は、突然変異（例えば、変異体）プロテアーゼを生産する。多数の引用文献が変異プロテアーゼの例および参照を提供する（例えば、ＷＯ９９／２０７７０号、ＷＯ９９／２０７２６号、ＷＯ９９／２０７６９号、ＷＯ８９／０６２７９号、ＲＥ３４，６０６号、米国特許ＵＳ４，９１４，０３１号、米国特許ＵＳ４，９８０，２８８号、米国特許ＵＳ５，２０８，１５８号、米国特許ＵＳ５，３１０，６７５号、米国特許ＵＳ５，３３６，６１１号、米国特許ＵＳ５，３９９，２８３号、米国特許ＵＳ５，４４１，８８２号、米国特許ＵＳ５，４８２，８４９号、米国特許ＵＳ５，６３１，２１７号、米国特許ＵＳ５，６６５，５８７号、米国特許ＵＳ５，７００，６７６号、米国特許ＵＳ５，７４１，６９４号、米国特許ＵＳ５，８５８，７５７号、米国特許ＵＳ５，８８０，０８０号、米国特許ＵＳ６，１９７，５６７号、および米国特許ＵＳ６，２１８，１６５号を参照されたい）。
【０２７８】
更に他の態様において、好ましいバチルス宿主は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、およびｄｅｇＱの遺伝子の少なくとも１つにおける、突然変異または欠失を含むバチルス種である。好ましくは、前記突然変異はｄｅｇＵ遺伝子におけるものであり、より好ましくは前記突然変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（ムサデク（Ｍｓａｄｅｋ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻、８２４−８３４頁［１９９０年］、およびオルモス（Ｏｌｍａｓ）他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２５３巻、５６２−５６７頁［１９９７年］を参照されたい）。最も好ましい宿主菌株は、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）突然変異を有するバチルス・スブチルスである。更なる態様において、前記バチルス宿主は、ｓｃｏＣ４（コールドウェル（Ｃｏｌｄｗｅｌｌ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、７３２９−７３４０頁［２００１年］を参照されたい）、ｓｐｏｌｌＥ（アリゴーニ（Ａｒｉｇｏｎｉ）他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１巻、１４０７−１４１５頁［１９９９年］を参照されたい）、ｏｐｐＡまたはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（ペレーゴ（Ｐｅｒｅｇｏ）他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５巻、１７３−１８５頁［１９９１年］を参照されたい）における突然変異または欠失を含む。実際、ｏｐｐＡ遺伝子における突然変異として同一の表現型を生じさせるｏｐｐオペロンにおける任意の突然変異は、本発明の改変バチルス菌株のいくつかの態様において利用されることになると考えられる。いくつかの態様において、これらの突然変異は単独で生じ、一方、他の態様において突然変異の組合せが存在する。いくつかの態様において、本発明の改変バチルスは、上記の遺伝子の１つ以上における突然変異を既に含むバチルス宿主菌株から得られる。代替的な態様において、本発明の改変バチルスは、上記の遺伝子の１つ以上の突然変異を含むように更に操作されている。
【０２７９】
いくつかの態様において、二つ以上のＤＮＡ構築体がバチルス宿主細胞に導入され、改変バチルスにおける二つ以上の常在染色体領域の欠失をもたらす。いくつかの態様において、これらの領域は隣接している（例えば、皮膚とプロファージ７領域）が、他方、他の態様において前記領域は離れている（例えば、ＰＢＳＸ領域およびＰＫＳ領域、皮膚領域およびＤＨＢ領域、またはＰＫＳ領域、ＳＰβ領域およびｙｖｆＦ−ｙｖｅＫ領域）。
【０２８０】
当業者は、ポリヌクレオチド配列を細菌（例えば、大腸菌およびバチルス）細胞に導入する適切な方法について十分知っている（例えば、フェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）他、「遺伝学」、ハードウッド（Ｈａｒｄｗｏｏｄ）他編『バチルス』、プレナム出版社、［１９８９年］５７−７２頁を参照されたい。更に、ソーンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５７巻、７１８−７２６頁［１９８４年］、ホック（Ｈｏｃｈ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、９３巻、１９２５−１９３７頁［１９６７年］、マン（Ｍａｎｎ）他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３巻、１３１−１３５頁［１９８６年］、およびホルボヴァ（Ｈｏｌｕｂｏｖａ）、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０巻、９７頁［１９８５年］、バチルス・スブチルスに関しては、チャン（Ｃｈａｎｇ）他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１６８巻、１１−１１５頁［１９７９年］、バチルス・メガテリウムに関しては、ヴォロビエヴァ（Ｖｏｒｏｂｉｅｖａ）他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、７巻、２６１−２６３頁［１９８０年］、バチルス・アミロリケファシエンスに関しては、スミス他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５１巻、６３４頁［１９８６年］、バチルス・チューリンギエンシスに関しては、フィッシャー他、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３９巻、２１３−２１７頁［１９８１年］、およびバチルス・スファエリクスに関しては、マクドナルド、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３０巻、２０３頁［１９８４年］を参照されたい）。実際、プロトプラスト形質転換および会合、形質移入、およびプロトプラスト融合を含む形質転換の方法は既知であり、本発明における使用に好適である。形質転換の方法は、本発明によって提供されるＤＮＡ構築体を宿主細胞に導入するために特に好ましい。
【０２８１】
共通に使用される方法に加えて、いくつかの態様において宿主細胞は直接形質転換される（すなわち、中間細胞は、宿主細胞への導入に先立ってＤＮＡ構築体を増幅するために、または別の工程で、用いられない）。ＤＮＡ構築体の宿主細胞への導入には、プラスミドまたはベクターへの挿入をしないで宿主細胞へＤＮＡを導入するための、当該技術分野に既知の物理的、化学的方法が含まれる。そのような方法には、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、裸のＤＮＡ、リポソームなどが含まれるが、それらに限定されない。追加的な態様において、ＤＮＡ構築体は、プラスミドへ挿入されないで、プラスミドと一緒に形質転換される。更なる態様において、選択マーカーは、当該技術分野で知られる方法により改変バチルス菌株から欠失、または実質的に切り出される（スタール（Ｓｔａｈｌ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８巻、４１１−４１８頁［１９８４年］、およびパルメロス（Ｐａｌｍｅｒｏｓ）他、遺伝子、２４７巻、２５５−２６４頁［２０００年］に記述されている、パルメロス他の保存的部位特異的組換え（ＣＳＳＲ）法を参照されたい）。いくつかの好ましい態様において、宿主染色体からのベクターの分離は、染色体における隣接領域を放置し、一方、常在染色体領域を除去する。
【０２８２】
いくつかの態様において宿主細胞は、二つ以上の遺伝子が宿主細胞で不活性化されている改変バチルス菌株を生産するために、本発明に従って１つ以上のＤＮＡ構築体を用いて形質転換される。いくつかの態様において、二つ以上の遺伝子が宿主細胞染色体から欠失される。代替的な態様において、二つ以上の遺伝子はＤＮＡ構築体の挿入によって不活性化される。いくつかの態様において不活性化された遺伝子は隣接し、（不活性化が欠失に依るものか、および／または挿入に依るものかに拘わらず）一方、他の態様においてそれらは隣接遺伝子ではない。
【０２８３】
上記のように、細胞内および細胞外発現ポリペプチドの活性検出および測定については、当業者に既知の多数のアッセイがある。特にプロテアーゼについては、２８０ｎｍにおける吸光度またはフォリン法を用いた比色分析で測定されたカゼインまたはヘモグロビン由来の酸可溶性のペプチドの放出に基づくアッセイがある（例えば、バーグメイヤー（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）他、「酵素分析の方法」、５巻、『ペプチダーゼ、プロテイナーゼおよびそれらの阻害剤』、Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ社、ワインハイム［１９８４年］を参照されたい）。他のアッセイは、発色基質の可溶化を含む（例えば、ワード（Ｗａｒｄ）「プロテイナーゼ」、Ｆｏｇａｒｔｙ編『微生物酵素およびバイオテクノロジー』所収、アプライド・サイエンス社、ロンドン［１９８３年］２５１−３１７頁を参照されたい）。他のアッセイの具体例には、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアリニド・アッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が含まれる。当業者に既知の多数の追加的な引用文献が適切な方法を提供している（例えば、ウエルス（Ｗｅｌｌｓ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１巻、７９１１−７９２５頁［１９８３年］、クリスチャンソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２３巻、１１９−１２９頁［１９９４年］、およびシャ（Ｈｓｉａ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４２巻、２２１−２２７頁［１９９４年］を参照されたい）。
【０２８４】
更に上記のように、宿主細胞における関心あるタンパク質の分泌レベルの決定および発現タンパクの検出の手段には、タンパク質に対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた免疫アッセイの使用が含まれる。具体例には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。しかし、他の方法は当業者に既知であり、関心あるタンパクの評価において使用される（例えば、ハンプトン（Ｈａｍｐｔｏｎ）他、『血清学的方法−実験室マニュアル』、ＡＰＳ出版社、セントポール、ミネソタ州［１９９０年］、およびマドックス（Ｍａｄｄｏｘ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５８巻、１２１１頁［１９８３年］を参照されたい）。いくつかの好ましい態様において、関心あるタンパク質の分泌は、対応する未改変の宿主におけるよりも本発明を用いて得られた改変菌株においてより高い。当該技術分野に既知であるように、本発明を用いて生産された改変バチルス細胞は、細胞カルチャーからの関心あるポリペプチドプチドの発現および回収に適切な条件下で維持され、培養される（例えば、ハードウッドおよびカッティング（Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ）編集、『バチルスの分子生物学的方法』、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社［１９９０年］を参照されたい）。
【０２８５】
当該技術分野で既知であるように、細菌はインキュベーションの間の増殖および多種のタンパク質の合成のために、一定の炭素源を利用する。多くの場合、炭素源のコストが重要な要素になり、細胞によるその使用の最適化が菌株改良の共通の目標であるために、経済的側面が関係する。本発明で記述したように転写アレイを、関心あるプロテアーゼを生産するバチルス・スブチルス菌株の発酵の分析のために用いた。これらの実験の間、いくつかの代謝反応を同定し（例えば、ｐｃｋＡ）、それらの修飾はがグリコースおよびその他の炭素源を利用するためにバチルス・スブチルスの効率を改善することが認められた。特に関心あるのは、オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸塩に転換する補充反応であり、それはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋＡ）酵素（ＥＣ４．１．１．４９）によって触媒される。これは、一定の培養条件下で無益回路であり得ると考えられている。ｐｃｋＡの役割をより完全に分析するために、ｐｃｋＡ領域における欠失を含むバチルス・スブチルス構築体を、本発明で記述されたＰＣＲ融合方法を用いて調製した。細胞増殖、炭素収率、およびプロテアーゼ生産に対するこれらの欠失の効果を分析した。ｐｃｋＡ欠失突然変異体菌株は、複合培地に存在する炭素の利用において（バイオマスになる少なくとも１０％炭素の増大で示されるように）より効率的であり、プロテアーゼ生産はこの培地において（細胞あたりで）影響されなかった。しかし、最小培地において、突然変異ｐｃｋＡ菌株は、コントロール菌株と比べてプロテアーゼおよび細胞をより多く生産することができることがわかった。実施例６により詳述するように、ｐｃｋＡ欠失菌株、ＫＨＢ５は、ＬＡ＋１．６％スキムミルクプレート上で、コントロール親菌株、ＦＮＡハイパー１よりも大きなハロを作ることができた（すなわち、親菌より多くのプロテアーゼが突然変異によって生産された）。更に、前記ｐｃｋＡ欠失菌株、ＫＨＢ５は最小培地で、コントロール親菌株、ＦＮＡハイパー１よりも高い光学密度に達することが出来た（すなわち、唯一の炭素源としてのグルコースを用いて）。これらの結果は、突然変異菌株が同量の炭素から親菌株よりも多くの細胞を生産したことを示している。
【０２８６】
本発明を実施する様式や方法は、以下の実施例の参照により当業者により充分に認識される。前記実施例は、本発明またはそこで示されたクレームの範囲を制限する任意の方法を意味するものではない。
【実施例】
【０２８７】
実験
以下の実施例は、本発明のある好ましい態様および側面を明示およびさらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されない。
【０２８８】
以下の実験開示において、以下の略語を適用する。すなわち、℃（摂氏温度）、ｒｐｍ（分当たりの回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｎｇ（ナノグラム）、μｌ（マイクロリットル）、ｍｌ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、μｍ（マイクロメートル）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（ユニット）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）（時間）、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学密度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２］）、ＰＥＧ（ポリエチレン・グリコール）、ＥＴＦ（経過発酵時間）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＳＤＳ（ドデシル塩酸ナトリウム）、Ｔｒｉｓ（トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）、ｗ／ｖ（容積に対する重量）、ｖ／ｖ（容積／容積）、ＬＡ培地（リットル当たりのディフコ社製トリプトンペプトン２０ｇ、ディフコ社製イースト抽出物１０ｇ、ＥＭサイエンス社製塩化ナトリウム１ｇ、ＥＭサイエンス社製寒天１７．５ｇ、１リットルについてｄＨ２０）、ＬＡ＋１．６％スキムミルクプレートは以下の化合物を含む：ディフコ社製トリプトン１０ｇｍ、ディフコ社製イースト抽出物５ｇｍ、塩化ナトリウム０．５ｇｍ、１７．５ｇｍの寒天、および最終容積１リットルの蒸留水）。ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック・ラボラトリー社、パロアルト、カリフォルニア州）、Ｄｉｆｃｏ（ディフコ・ラボラトリー社、デトロイト、ミシガン州）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬまたはＧｉｂｃｏＢＲＬ（ライフテクノロジー社、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インヴィトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＮＥＢ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、マサチューセッツ州）、Ｓｉｇｍａ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）、Ｔａｋａｒａ（タカラバイオ社、大津、日本）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｏｓｈｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ホフマン・ラ・ロシュ社の事業部、バーゼル、スイス）、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＥＭサイエンス社、ギブスタウン、ニュージャージー州）、Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン・クローニング・システムズ社、ラヨラ、カルフォルニア州）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州）である。
【０２８９】
実施例  １
欠失菌株の作成
この実施例は、図１にも示されている「方法１」を記述する。この方法において、バチルス菌株に形質転換されることになるＤＮＡ構築体を保有するｐＪＭ１０２プラスミドベクターを生産するために、大腸菌を使用した。（上記ペレーゴ（Ｐｅｒｅｇｏ）を参照されたい）。欠失部位の５’および３’末端に直接隣接する領域を、ＰＣＲ増幅した。バチルス・スブチルス染色体と相同である３１塩基対、およびプライマーの５’末端由来の６塩基対に位置する６塩基対制限酵素部位を含む長さ約３７塩基対になるように、ＰＣＲプライマーを設計した。構築体の上流および下流末端の特異な制限部位、およびクローニングに用いるための二つの断片間のＢａｍＨｌ部位を操作するために、プライマーを設計した。抗菌マーカー用のプライマーは、断片の両末端にＢａｍＨｌ部位を有した。可能であれば、欠失した常在染色体領域のプロモーターを除去するように、しかし、直ぐ隣接区域に全てのターミネータを残すように、ＰＣＲプライマーを設計した。染色体配列、遺伝子位置決め、およびプロモータおよびターミネータ情報の一次資料は、クンスト他（９９７年、上記参照）から、また当業者に既知のＳｕｂｔｉＬｉｓｔワールドワイドウエブサーバーからも得た（例えば、モッツァー他、上記参照）。多数の欠失を、本発明を用いて作成した。この方法により作られた欠失からのプライマー配列のリストを、表１に示す。プライマー表記システムの説明のために図２にも参照を作成した。
【０２９０】
【表５５】
2007532114.tif 000057
【０２９１】
【表５６】
2007532114.tif 000058
【０２９２】
この方法において、８４μＬの水、１０μＬのＰＣＲバッファ、１μＬの各プライマー（すなわち、ＰＫＳ−ＵＦおよびＰＫＳ−ＵＲ）、２μＬのｄＮＴＰｓ、１μＬの野生型バチルス染色体ＤＮＡ鋳型、および１μＬのポリメラーゼを含む１５０ｍＬエッペンドルフ管において１００μＬのＰＣＲ反応を行なった。使用したポリメラーゼには、Ｔａｑプラス精密ポリメラーゼおよびＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）が含まれた。反応は以下のプログラムを用いて、Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲエクスプレスサーモサイクラーにおいて行なった。サンプルを、最初に９４℃で５分間加熱し、次に５０℃を維持するまで冷却した。ポリメラーゼをこの時点で添加した。２５サイクルの増幅は、９５℃で１分、５０℃で１分、および７２℃で１分からなった。最後の７２℃で１０分は完全な伸長を確実なものとした。サンプルは分析のために４℃を保持した。
【０２９３】
ＰＣＲの完了後、正しい大きさでバンドが存在するかを点検するために、１０μＬの各反応物をインビトロゲン社製１．２％アガロースＥゲルにおいて、６０ボルトで３０分間操作した。本発明で記述される全てのゲル電気泳動の方法にはこの条件を用いた。バンドが存在した場合、反応管の残部は製造会社の取扱説明書に従ってキアゲン社製キアクイック（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、次に適当な制限酵素ペアを用いて切断した。消化は、９μＬの水、２μＬの１０×ＢＳＡ、２μＬの適当なＮＥＢ制限バッファ（２０００−０１ＮＥＢカタログおよび技術参照に従って）、５μＬの鋳型、および１μＬの核制限酵素からなる２０μＬの反応として、３７℃で１時間行なった。例えば、ＰＢＳＸ上流断片およびＣｓｓＳ上流断片を、ＮＥＢ（ニューイングランドビオラボズ社製）制限バッファＢにおいて、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断した。消化された断片を、ゲル電気泳動および製造業者の取扱説明書に従ってキアゲン社製キアクイック（登録商標）ゲル抽出キットを用いた抽出により精製した。図５および６は、種々の欠失の結果を表すゲルを示す。
【０２９４】
断片のプラスミド・ベクターへの連結は、製造業者の取扱説明書に従ってタカラ連結キット、またはＴ４ＤＮＡリガーゼ（反応内容物：５μＬの各挿入断片、１μＬの切断ｐＪＭ１０２プラスミド、３μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼバッファおよび１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ）のいずれかを使用して二段階で行なった。最初に、切断上流および下流断片を、一晩１５℃でｐＪＭ１０２プラスミドポリリンカーにおいて、特異制限部位へ連結し、環状プラスミドを再形成するために共通のＢａｍＨＩ部位で結合した。前記ｐＪＭ１０２プラスミドを各欠失に適当な特異制限部位を用いて切断し（表２を参照されたい。ｃｓｓＳ、Ｘｂａｌ、およびＳａｃｌについて用いた）、および上記のように連結に先立って精製した。再環化プラスミドを、製造会社のワン・ショット形質転換プロトコルを用いて、インビトロゲンの「トップ・テン」大腸菌細胞に形質転換した。
【０２９５】
形質転換体を、１．５％の寒天（ＬＡ）プラス青／白スクリーニング用のＸ−ｇａｌを含む５０ｐｐｍのカルバニシリンを用いて凝固したルリア・バータニ培地において選択した。クローンを選択し、一晩３７℃で、５ｍＬのルリア・バータニ培地（ＬＢ）プラス５０ｐｐｍのカルバニシリンにおいて増殖させ、プラスミドをキアゲン社製のキアクイック（登録商標）ミニプレプキットを用いて単離した。制限分析は、プラスミドから約２ｋｂバンドを取除くために、挿入部の各末端において制限部位を用いて切断することにより挿入部の存在を確認した。挿入部を有する確認済みのプラスミドを、上記のように消化反応において線状化するためにＢａｍＨＩを用いて切断し（第二制限酵素の代わりに追加的に１μＬの水を用いて）、再環化を防ぐために１時間３７℃で１μＬの牛腸およびエビのホスファターゼを用いて処理し、表２に記載のように、抗菌耐性マーカーに結合した。抗菌マーカーをＢａｍＨＩを用いて切断し、結合に先立って製造業者の取扱説明書に従い、キアゲン・ゲル抽出キットを用いて洗浄した。このプラスミドを、選択に適当なように５ｐｐｍのフレオマイシン（ｐｈｌ）または１００ｐｐｍのスペクチノマイシン（ｓｐｃ）を用いて、前のように大腸菌にクローンした。単離されたプラスミドにおけるマーカーの挿入の確認を上記のようにＢａｍＨＩを用いた制限分析によって行なった。バチルス・スブチルスへの形質転換に先立って、前記プラスミドを二重のクロスオーバー現象を確実にするためにＳｃａｌを用いて線状化した。
【０２９６】
【表５７】
2007532114.tif 000059
【０２９７】
実施例  ２Ａ
大腸菌をバイパスするためのＰＣＲ融合を用いたＤＮＡ構築体の作成
この実施例は、図３にも示されている「方法２」を記述する。プライマーを抗菌マーカーのプライマー配列と相補的である２５ｂｐ「テイル」を用いて設計したことを除いて、方法１と同様に上流および下流の断片を増幅した。「テイル」は、本発明において直接増幅される配列と相同ではないが、もう一つのＤＮＡ配列と相補的なプライマーの５’末端の塩基対と定義される。同様に、抗菌剤を増幅するプライマーは、前記断片のプライマーと相補的である「テイル」を含む。任意の所与の欠失について、前期欠失Ｘ−ＵＦｆｕｓおよび欠失Ｘ−ＵＲｆｕｓは相互に相補体である。これはまた、ＤＦ−ｆｕｓおよびＤＦ−ｆｕｓプライマーセットについても当てはまる。更に、いくつかの態様において、これらのプライマーはプラスミド・ベクター作成用の方法１において用いられるものと類似する制限酵素部位を有する（表３および米国特許ＵＳ５，０２３，１７１を参照されたい）。表３はＰＣＲ融合による欠失構築体の作成に有用なプライマーのリストを提供する。表４はＰＣＲ融合による欠失構築体の作成に有用なプライマーの追加リストを提供する。しかし、この表において、全ての欠失構築体ｐｈｌｅｏＲマーカーを含むことになる。
【０２９８】
【表５８】
2007532114.tif 000060
【０２９９】
【表５９】
2007532114.tif 000061
【０３００】
【表６０】
2007532114.tif 000062
【０３０１】
表３および４に収載した断片を、上記のようにゲル電気泳動法によりサイズ確認した。正しい場合、各１μＬの上流、下流、および抗菌耐性マーカー断片を、前記欠失Ｘ−ＵＦおよび欠失Ｘ−ＤＲプライマーまたは収載されたネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを用いて単一の反応管に入れた。ネステッドプライマーは、上流または下流断片の内部部分と相同であるＤＮＡの２５塩基ペアであり、通常断片の外側末端から約１００塩基ペアである（図２を参照されたい）。ネステッドプライマーの利用は、しばしば融合の成功を増す。ＰＣＲ反応成分は、８２μＬの水が追加の鋳型容器を補うために用いられることを除き、上記のものと同様であった。前記ＰＣＲ反応条件は、７２℃の伸長が３分まで延長されることを除いては、上記のものと同じであった。伸長の間、抗菌耐性遺伝子を、上流および下流の断片の間で融合した。この融合断片は、任意の精製工程なしに、または製造業者の取扱説明書に従って行なわれる単一のキアゲン・キアクイック（登録商標）ＰＣＲ精製を用いて、直接バチルスに形質転換することができる。
【０３０２】
実施例  ２Ｂ
大腸菌をバイパスするためにＰＣＲ融合を用いたｐｃｋＡ欠失構築体の作成
上記欠失に加えて、ｐｃｋＡもまた修飾される。前記ＰＣＲプライマーｐｃｋＡＵＦ、ｐｃｋＡ−２Ｕｒｆｕｓ、ｓｐｃｆｆｕｓ、ｓｐｃｒｆｕｓ、ｐｃｋＡ  ＤｆｆｕｓおよびｐｃｋＡ  ＤＲを、鋳型としてＢ．スブチルス１６８誘導体の染色体ＤＮＡおよびｐＤＧ１７２６（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ他、遺伝子、１６７巻（１−２）、３３５−３３６頁［１９９５年］を参照されたい）を使用したＰＣＲおよびＰＣＲ融合反応に用いた。前記プライマーを表５に示す。これらの欠失変異体の構築に用いる方法は、上述の方法１と同じであった。
【０３０３】
【表６１】
2007532114.tif 000063
【０３０４】
実施例  ３
大腸菌クローニング段階をバイパスするためのＰＣＲ断片の連結を用いたＤＮＡ構築体の作成およびバチルス・スブチルスの直接形質転換
この実施例において、ＰＣＲ断片の連結を用いたＤＮＡ構築体を作成およびバチルスの直接形質転換の方法（「方法３」）を記述する。具体例によって、連結方法を示すためにｐｒｐＣ、ｓｉｇＤ、およびｔｄｈ／ｋｂｌの修飾を示す。実際にｓｉｇＤ、およびｔｄｈ／ｋｂｌを１つの方法により、およびｐｒｐＣを代わりの方法で構築した。
【０３０５】
Ａ．Ｔｄｈ／ＫｂｌおよびＳｉｇＤ
Ｂ．スブチルス染色体のｔｄｈ／ｋｂｌ領域に隣接する上流および下流断片を、隣接ＤＮＡの内側プライマーをタイプＩＩの制限部位を含むように設計したこと以外は方法１の記述と同様のＰＣＲにより増幅した。ｌｏｘＰ−スペクチノマイシン−ｌｏｘＰカセットのプライマーを、隣接し相補的に突出した同じタイプＩＩ制限部位を用いて設計した。左側面および右側面について特異な突出は、ＤＮＡに隣接する上流および下流の間の抗菌カセットの直接的な連結を可能とした。全てのＤＮＡ断片を適当な制限酵素を用いて消化し、前記断片を製造業者の取扱説明書を使用してキアゲン社製キアクイック（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。この精製に続いて、ＢｉｏＲａｄ  Ｐ−６ゲルを含む１ｍＬのスピンカラムで脱塩し、２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。断片を、サバント・スピード・バックＳＣ１１０システムを用いて１２４〜２５０ｎｇ／μＬまで濃縮した。各断片０．８〜１μｇの３つの小片の連結を、１４〜１６℃で１６時間、１５〜２５μＬの反応容積で、１２Ｕ  Ｔ４リガーゼ（ロシュ社製）を用いて行なった。所望の連結生産物の総収量は、アガロースゲル上における標準ＤＮＡラダーとの比較計算で、反応当たり１００ｎｇより大であった。この連結混合物を形質転換反応のために精製をしないで使用した。この構築体用のプライマーを以下の表６に示す。
【０３０６】
【表６２】
2007532114.tif 000064
【０３０７】
ｓｉｇＤ欠失用の構築体が、ｔｄｈ／ｋｂｌの構築体に近接して続いた。ｓｉｇＤ用の構築体に用いられるプライマーを表７に示す。
【０３０８】
【表６３】
2007532114.tif 000065
【０３０９】
Ｂ．ＰｒｐＣ
ＰＣＲの連結によるＤＮＡ分子を作成する追加的な実施例により、遺伝子ｐｒｐＣの部分的インフレーム欠失を含むバチルスの直接形質転換用のＤＮＡ断片を増幅した。ｐｒｐＣ遺伝子を含むＢ．スブチルス染色体ＤＮＡのＡ３９５３ｂｐ断片を、プライマーｐ９５およびｐ９６を用いるＰＣＲで増幅した。前記断片を特異制限部位ＰｆｌＭＩおよびＢｓｔＸＩにおいて開裂した。これにより、三つの断片、上流、下流、および中央の断片が生成した。後者は欠失された断片であり、ｐｒｐＣ遺伝子の内部に位置する１７０ｂｐ〜なる。前記消化混合物を、キアゲン社製キアクイック（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、続いてＢｉｏＲａｄ社製Ｐ−６ゲルを含む１ｍＬのスピンカラムにおいて脱塩し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。第二ＰＣＲ反応において、ゲノムＤＮＡ断片における部位と相補的な開裂部位をともに有する、ＢｓｔＸＩ部位を含むプライマーおよびＰｆＩＭＩを含む下流プライマーを用いて、抗菌カセット、ｌｏｘＰ−スペクチノマイシン−ｌｏｘＰを増幅した。前記断片をＰｆＩＭＩおよびＢｓｔＸＩを用いて消化し、上記染色体断片について記述したように精製した。上流、抗菌カセット、および下流断片の三つの小片の連結を、上記ｔｄｈ／ｋｂｌのように行なった。所望の連結生産物の収量は同様であり、連結生産物を下記に詳述するように、ｘｙｌＲｃｏｍＫコンピテント・バチルス・スブチルスの形質転換のための更なる処理をしないで用いた。
【０３１０】
【表６３】
2007532114.tif 000066
【０３１１】
Ｃ．キシロース誘導コンピテント宿主細胞の連携したＤＮＡを用いる形質転換
部分的遺伝子型ｘｙｌＲｃｏｍＫを有する宿主株バチルス・スブチルスの細胞を、１％のキシロースを含むルリア・バータニ培地における２時間の培養によって形質転換受容性（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）にした。これは、米国特許出願番号０９／９２７，１６１号、（出願日２００１年８月１０日）に記述されており、１のＯＤ５５０まで参照により本発明に組み込まれる。この培養物は６時間培養から播種した。全培養物は３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で培養した。０．３ｍＬの分量を、丸底型２ｍＬ管において培養液および３０％グリセロールの１：１混合物として凍結し、将来使えるように液体窒素において保存した。
【０３１２】
形質転換のために、凍結したコンピテント細胞を３７℃で解凍し、解凍完了後直ちに連結反応混合物からのＤＮＡを管当たり５〜１５μＬのレベルで添加した。次に管を３７℃で６０分間１４００ｒｐｍ（テクマル社製（Ｔｅｋｍａｒ）ＶＸＲ  Ｓ−１０）で振とうした。形質転換混合物を１００ｐｐｍのスペクチノマイシンを含む８ｃｍのＬＡプレート上に希釈しないで１００ｕＬの分割量でとった。一晩の培養の後、形質転換体をルリア・バータニ培地（１００ｐｐｍスペクチノマイシン）に移し、当該技術分野で知られているように実施されるゲノムＤＮＡ分離のために３７℃で増殖した（例えば、ハードウッドおよびカッティング、『バチルスの分子生物学的方法』、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、［１９９０年］２３頁を参照されたい）。典型的には、５ｕＬの連結反応混合物を形質転換体に用いる場合、１００ｕＬの形質転換混合物から４００〜１４００の形質転換体を得た。
【０３１３】
抗菌マーカーを外来配列における二つのｌｏｘＰ部位の間に位置させた時、Ｃｒｅタンパク発現できるｃｒｅ遺伝子を含むプラスミドを用いる菌株の形質転換によって前記マーカーを除去することができた。細胞を３７℃〜４０度で培養したｐＣＲＭ−ＴＳ−ｐｌｅｏ（以下を参照されたい）を用いて形質転換し、ＬＡ上にとり、コロニーが形成した後に１００ｐｐｍスペクチノマイシンを含むＬＡ上にパッチ（ｐａｔｃｈ）した。マーカーの喪失を、所定の遺伝子に適するプライマーを用いたＰＣＲアッセイによって確認した。
【０３１４】
【表６５】
2007532114.tif 000067
【０３１５】
【表６６】
2007532114.tif 000068
【０３１６】
【表６７】
2007532114.tif 000069
【０３１７】
Ｄ．トランスクリプトームＤＮＡアレイ法
上述の方法に加えて、トランスクリプトームＤＮＡアレイ法を本発明の突然変異体の発生において用いた。最初に標的ＲＮＡを、当該技術分野に既知であるグアニジン酸フェノール抽出によりバチルス菌株より回収し（例えば、ファレル（Ｆａｒｒｅｌｌ）、『ＲＮＡ方法論』（第２編）、アカデミック・プレス社、サンディエゴ、８１頁を参照されたい）、ｄｅＳａｉｚｉｅｕ他（ｄｅＳａｉｚｉｅｕ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２巻、４６９６−４７０３頁［２０００年］）から採用された方法および本発明で記述された方法により時間ポイントをビオチン標識ｃＤＮＡに逆転写した。総ＲＮＡ（２５ｍｇ）を１００ｍＬの反応において、一晩３７℃で培養した。反応は、１×ギブコ社製ファーストストランド・バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４０ｍＭランダム六量体、各０．３ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．１２ｍＭのｄＡＴＰ、０．３ｍＭのビオチン−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ０、２５００ユニットスーパースクリプトＩＩ逆転写（ロシュ社製）。ＲＮＡを除去するために、前記反応を０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液とし、６５℃で３０分間培養した。前記反応をＨＣｌを用いて中和し、核酸を２．５Ｍ酢酸アンモニウムを含むエタノールにおいて−２０℃で沈殿させた。ペレットを洗浄し、空気乾燥し、水中に再懸濁し、ＵＶ分光法により定量化した。反応収量は、約２０〜２５ｍｇビオチン標識ｃＤＮＡであった。
【０３１８】
ｃＤＮＡの１２ｍｇを、３７℃で１０分間、３、７５ミリユニットのＤＮａｓｅＩＩを含む３３ｍＬ１×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌバッファ（アマーシャム−ファルマシア社製♯２７−０９０１−０２）において断片化した。ＤＮａｓｅを熱不活性化後に、３％アガロースゲル上で２ｍｇの断片化ｃＤＮＡを泳動することにより断片化を評価した。ビオチン含有ｃＤＮＡは、常に２５〜１２５ヌクレオチドの大きさに分布した。残りの１０ｍｇのｃＤＮＡをアフィメトリクス社製バチルス・ジーン・チップ・アレイへハイブリダイズした。
【０３１９】
ハイブリダイゼーションを、示唆された試薬供給装置を用いてアフィメトリクス・エクスプレッション・アナリシス・テクニカル・マニュアル（アフィメトリクス社製）に記述の通り行なった。短時間に、１０ｍｇの断片化ビオチン標識ｃＤＮＡを２２０ｍＬのハイブリダイゼーション反応混液に添加した。ハイブリダイゼーション反応混液は、１００ｍＭのＭＥＳ（Ｎ−モルフォリンエサンネスフォン酸）、１ＭのＮａ＋、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、５ｍｇ／ｍＬの総イーストＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのにしん精子ＤＮＡ、５０ｐＭのコントロールのオリゴヌクレオチド（ＡＦＦＸ−Ｂ１）である。反応混液を９５℃で５分間加熱し、５分間で４０℃で冷却し、微粒子を除去するために短時間遠心分離し、２００ｍＬをそれぞれ予め暖め洗浄した（１×ＭＥＳバッファ＋５ｍｇ／ｍｌイーストＲＮＡ）ジーンチップカートリッジに注入した。アレイを４０℃で一晩回転した。
【０３２０】
サンプルを除去し、アレイに非ストリンジェントな洗浄バッファ（６×ＳＳＰＥ、０．０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）を充填し、非ストリンジェントおよびストリンジェントな（０．１ＭのＭＥＳ、０．１Ｍ［Ｎａ＋］、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）洗浄バッファを用いて、プロトコルＥｕｋ−ＧＥ−ＷＳ２によりアフィメトリクス・フルイディクス・ステーション上で洗浄した。アレイを３段階で染色した。すなわち（１）ストレプトアビジン、（２）ビオチンで標識された抗ストレプトアビジン抗体、（３）ストレプトアビジン−フィコエリトリン複合体、である。
【０３２１】
アレイにおけるシグナルを、３−ｍｍピクセル分解能を有する５７０ｎｍレーザー光線を用いてヒューレット・パッカード遺伝子アレイ・スキャナーで検出した。４３５１ＯＲＦプローブ・セットのシグナル強度を計り、時間経過実験を含む全時間ポイントにわたって規格化した。次に、これらのシグナルを、試験中の遺伝子の相対的発現レベルを推定するために比較した。スレオニン生合成遺伝子および分解性遺伝子を同時に転写し、非効率なスレオニン利用を示した。分解性スレオニン経路の欠失は、所望の生産物の発現を改善した（表７を参照されたい）。本発明は、スレオニンの生合成および分解性プロフィールと類似している転写プロフィールを用いて経路を修飾するための手段を提供する。従って、本発明はまた、バチルス菌株を最適化するためにスレオニンと類似する転写プロフィールを用いた経路の修飾を利用する。いくつかの好ましい態様において、ｒｏｃＡ、ｙｃｇＮ、ｙｃｇＭ、ｒｏｃＦおよびｒｏｃＤからなる群より選択される一つ以上の遺伝子は欠失または修飾される。本発明において記述されるように本発明の利用は、ｓｉｇＤレギュロンが転写されるという驚くべき発見をもたらした。この遺伝子の欠失は、所望の生産物のよりよい発現をもたらす（表７を参照されたい）。
【０３２２】
これらの予備的な実験、ヒスチジン要求性宿主株におけるｐｃｋＡの欠失、「ＫＨ５」は、振とうフラスコ中の最小培地で増殖する菌株における改良または害悪をもたらさなかった。しかし、本発明はｐｃｋＡ欠失の利用または修飾、および／またはｇａｐＢおよび／またはｆｂｐの欠失または修飾との組み合わせを通じて菌株タンパク生産を改良する手段を提供する。更に、本発明の開発中に、トリプトファン生合成経路遺伝子が不均衡な転写を示すことが観察された。従って、本発明は、親（すなわち野生型および／または出発菌株）と比べて、改良された菌株が所望の生産物の改良された発現を提供するために、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、および／またはｔｒｐＦからなる群から選択されるもののように、遺伝子の増大した転写を示す菌株を生産することに利用されると考えられる。実際、任意の組合せにおけるこれらの遺伝子の修飾は、所望の生産物の改良された発現を導くと考えられる。更に、追加的な実験（以下の実施例６に記述される）は、ｐｃｋＡ遺伝子の不活性化は、欠失菌株において発達した、改良された炭素利用効率により増大したタンパク質発現を導くことを示した。
【０３２３】
Ｅ．発酵
上述の構築体を用いて生産された菌株の分析により、以下の発酵が導かれた。１４Ｌ規模の培養をＢＩＯＬＡＦＩＴＴＥ（登録商標）発酵槽において行なった。７リットル当たりの培地の構成成分を表９に掲載する。
【０３２４】
【表６８】
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【０３２５】
前記槽を７５０ｒｐｍで攪拌し、気流を分当たり１１リットルに調節し、温度は３７℃、およびｐＨはＮＨ４ＯＨを用いて６．８に維持した。６０％グルコース溶液を、発酵の最後まで分当たり０．５〜２．１グラムの線状ランプで約１４時間から供給開始した。発生気体（ｏｆｆ−ｇａｓｓｅｓ）を質量分析法によりモニターした。炭素収支および効率を、供給グルコース、タンパク質生産物の収量、細胞質量収量、ブロスにおける他の炭素、および発生ＣＯ２より計算した。突然変異菌株を、改善を判断するために親菌株と比較した。実際、以下の実施例６に記述するように、いくつかの菌株におけるｐｃｋＡの修飾は、関心あるタンパク質の増大した生産を導いた。いくつかの好ましい態様において、追加的な遺伝子を、ｇａｐＢ、ａｌｓＤ、および／またはｆｂｐ〜なる群より選択する。
【０３２６】
実施例４
改変バチルス菌株を得るための宿主細胞の形質転換
一旦ＤＮＡ構築体を、上述の方法１または２により作成し、それを適切なバチルス・スブチルス実験室菌株に形質転換した（例えば、ＢＧ２０３６またはＢＧ２０９７、任意のコンピテントバチルス即時型宿主細胞を、本発明の方法において使用することが可能である）。細胞を適当に０．５ｐｐｍフレオマイシンまたは１００ｐｐｍスペクチノマイシンの選択培地においてプレートした（フェラーリおよびミラー、「バチルスの発現：グラム陽性モデル」、『遺伝子発現システム：発現技術に関する自然の利用』所収、６５−９４頁［１９９９年］）。実験室菌株を、バチルス・スブチルス生産宿主菌株２回またはＢＧ３５９４および次にＭＤＴ９８−１１３、１回に形質転換する欠失を有する染色体ＤＮＡ源として使用した。単一コロニーを単離するために形質転換体をストリーク（ｓｔｒｅａｋ）し、採取および５ｍＬのＬＢプラス適当な抗菌剤において一晩増殖させた。染色体ＤＮＡを、当該技術分野に知られているように単離を行なった（たとえばハードウッド他、上記を参照されたい）。
【０３２７】
組込みＤＮＡ構築体の存在を、上述の成分および条件を用いた３つのＰＣＲ反応により確認した。例えば、二つの反応は、あるケースにおいては、欠失カセットの外部から抗菌遺伝子に（プライマー１および１１）および他の場合には、挿入全体を通じて（プライマー１および１２）領域の増幅を設計した。第３の点検は欠失カセットの外部から欠失領域に（プライマー１および４）領域を増幅した。図４は最初の二つの場合であり第３ではないバンドを示す適正クローンを示す。野生型バチルス・スブチルス染色体ＤＮＡを、全ての反応における負のコントロールとして用い、第３のプライマーセットを用いたバンドのみ増幅した。
【０３２８】
実施例５
振とうフラスコ・アッセイ−プロテアーゼ活性の測定
一旦ＤＮＡ構築体をコンピテント・バチルス・スブチルス菌株に安定的に組み込むと、スブチリシン活性を振とうフラスコ・アッセイにより測定し、活性を野生型レベルと比較した。アッセイは、当該技術分野に既知のスブチリシン生産に好適な５０ｍＬの増殖培地を含む２５０ｍｌのバッフル・フラスコにおいて行なった（クリスチャンソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２３巻、１１９−１２９頁［１９９４年］、およびシャ（Ｈｓｉａ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４２巻、２２１−２２７頁［１９９６年］を参照されたい）。培地に５０μＬの８時間８ｍＬの培養物を播種し、３７℃で４０時間、２５０ｒｐｍで振とうして増殖させた。次に、プロテアーゼ活性アッセイのために１ｍＬのサンプルを１７、２４および４０時間目で採取した。プロテアーゼ活性を、モナーク・オートマチック・アナライザーを用いて４０５ｎＭで測定した。サンプルを２回バッファーにおいて、１：１１（３．１３１ｇ／Ｌ）に希釈した。正しい機械のキャリブレーションを保障するコントロールとして、一つのサンプルを１：６（５．５８５ｇ／Ｌ）、１：１２（２．７９３ｇ／Ｌ）および１：１８（１．８６２ｇ／Ｌ）に希釈した。図７は、種々の改変バチルス・スブチルスクローンに於けるプロテアーゼ活性を示す。図８は、バチルス・スブチルス野生型菌株（未改変）および対応する改変欠失菌株（−ｓｂｏ）および（−ｓｌｒ）における振とうフラスコの培養液から測定した改善したプロテアーゼ分泌を表すグラフを示す。プロテアーゼ活性（ｇ／Ｌ）を１７、２４および４０時間後に測定した。
【０３２９】
また、細胞密度を６００のＯＤで分光光度測定を用いて測定した。計測時間において、サンプルに関して有意差は観察されなかった（データは示してない）。
【０３３０】
実施例６
ｐｃｋＡ欠失構築体
この実施例において、本発明のｐｃｋＡ欠失突然変異体が追加的に記述される。実施例２Ｂに示したように、ｐｃｋＡ欠失構築体を、大腸菌使用の要件を回避するためにＰＣＲ融合法を用いた実施例２Ｂにおける記述のように生産をした。この実施例において、実施例に従って生産した欠失突然変異体を修飾した。前記ＰＣＲプライマーであるｐｃｋＡ−１、ｐｃｋＡ−２、ｐｃｋＡ−３、ｐｃｋＡ−４、ｐｃｋＡ−５、およびｐｃｋＡ−６（表５を参照されたい）を、鋳型としてバチルス・スブチルスＢＧ２８１６および１６８ｐＤＧ１７２６（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ他、遺伝子、１６７巻、（１−２）３３５−３３６頁［１９９５年］を参照されたい）の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ融合反応に使用した。これらの欠失突然変異体の構築において使用した方法は、上述の方法１と同じである。
【０３３１】
ＰＣＲ融合を、ｐｃｋＡ上流−ｓｐｅｃ−ｐｃｋＡ下流のＤＮＡカセットを生成した３つの異なったＤＮＡ上で、上述のように行なった（１．９９８ｋｂ）。ＰＣＲ融合のストラテジーは、以下の通りである。
【式１】
【０３３２】
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【０３３３】
結果によると、１．９８８ｋｂＰＣＲを融合断片を示す予期された単一断片が、正確に組立てられた。このカセットは、次に、「ｐＫＨ５」（４．９ｋｂ）を生成するために、ＰＣＲ−ｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にサブクローニングした。ｐＫＨ５の構築をＰＣＲおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化パターン結果により確認した。次にｐＫＨ５を、Ｓｃａｌにより消化し、ＫＨ５およびＫＨＢ５を構築するために、ＢＧ２８１６（ΔｎｐｒＥ、ΔａｐｒＥ、ｈｉｓ）およびプロテアーゼ生産Ｂ・スブチルス菌株（「ＦＮＡハイパー１」：ΔａｐｒＥ：：スブチリシン−Ｃｍ、ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏｌｌＥ３５０と命名されたコントロール菌株）の形質転換に用いた。形質転換された細胞を、１００ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＬＡプレート上に置き、３７℃で一晩培養した。形質転換体を抗生物質抵抗により組込むために選択し、更にＰＣＲにより分析した。分析されたＫＨ５の全形質転換体をダブル・クロスオーバー組込みとして同定した。ＫＨ５の染色体ＤＮＡを単離し、ＫＨＢ５を構築するためにＦＮＡハイパー１を形質転換するために用いた。
【０３３４】
ＫＨ５の遺伝子型は、ＢＧ２８１６、ΔｐｃｋＡ：：ｓｐｅｃであり、ＫＨＢ５の遺伝子型はＦＮＡハイパー１、ΔｐｃｋＡ：：ｓｐｅｃであった。ｐｃｋＡ欠失菌株およびコントロールｐｃｋＡ野生型菌株を比較するために、いくつかの実験をｐｃｋＡ欠失菌株の特徴づけのために行なった。図９は、ＬＡ＋１．６％スキムミルク培地上のｐｃｋＡ欠失菌株およびコントロール菌株により生成されたすき通った「ハロ」を示す写真を示す。この図に示されるように、前記ｐｃｋＡ欠失菌株（ＫＨＢ５）は、コントロール菌株（ＦＮＡハイパー１）よりもわずかに大きなハロを生成した。
【０３３５】
図１０のパネルＡは、親菌株（ＦＮＡハイパー１）および実施例３のＥに記述したような最小培地において増殖したｐｃｋＡ欠失菌株の光学密度を示すグラフを示す。このグラフによって示されるように、ｐｃｋＡ欠失菌株は、親菌株よりも短い期間でより多く増殖した。図１０のパネルＢは、親菌株および時間を通じてｇ／リットルで表された複合培地に基づくソイミール−グルコースにおいて増殖したｐｃｋＡ欠失菌株の力値を示すグラフを示す。図１０のパネルＣは、親菌株および複合培地に基づくソイミール−グルコースにおいて増殖したｐｃｋＡ欠失菌株の炭素収量を示すグラフを示す。このパネルに示されるように、前記ｐｃｋＡ欠失菌株は、炭素のグラムベースで生産されたプロテアーゼ量に基づく炭素利用においてより効率的であった。
【０３３６】
この炭素収量を以下の数式に基づいて計算した。
【数１】
2007532114.tif 000072
【０３３７】
ｐｃｋＡ欠失突然変異菌株は、複合培地に存在する炭素を利用することでより効率的であった（バイオマスになる炭素において少なくとも１０％の増大を示すことによって示唆されているように）にも拘わらず、プロテアーゼ生産はこの培地において影響されなかった（細胞当たりベースにおいて）。しかし、最小培地において、突然変異ｐｃｋＡ欠失菌株は、コントロール菌株と比較してより多くのプロテアーゼおよび細胞を生産することが可能であることが分かった。本発明においてより詳細に議論されたように、ＬＡ＋１．６％スキムミルクプレート上で、ｐｃｋＡ欠失菌株であるＫＨＢ５はコントロール親菌株（ＦＮＡハイパー１）よりも大きいハロを形成することができた（すなわち、親よりも突然変異によってより多くのプロテアーゼが生産された）。更に、ｐｃｋＡ欠失菌株であるＫＨＢ５は、最小培地（すなわち、唯一の炭素源としてグルコースを用いて）において、コントロール親菌株（ＦＮＡハイパー１）よりも高い光学密度に達する事ができた。これらの結果は、同じ炭素量から、ｐｃｋＡ突然変異菌株が親菌株よりも多くの細胞を生産することを示す。
【０３３８】
上記明細書において言及した全ての出版物および特許は、参照により本発明に組み込まれる。発明の前記の方法およびシステムの種々の修飾が、本発明の範囲と精神から逸脱しないことは、当業者にとって明らかである。本発明が特定の好ましい態様に関連して記述さたにもかかわらず、本発明はそのような特定の態様に過度に限定するべきでないことを理解すべきである。実際に、発明を実施するための前記の様式の種々の修飾は、本発明の範囲において目的とされる技術および／または関連した分野の当業者にとって明白である。
【図面の簡単な説明】
【０３３９】
【図１】本発明によって提供される１つの方法（実施例１）の一般的な概念図を示す図である。
【図２】本発明によって提供される１つの方法（実施例１）の一般的な概念図を示す図である。
【図３】本発明のいくつかの態様に従ったＤＮＡカセットの作成において使用されるプライマーの位置を示す図である。
【図４】本発明の一つの方法（実施例２）の一般的な概念図を示す図である。
【図５】バチルスＤＨＢ欠失クローンの電気泳動ゲルを示す図である。
【図６】バチルス・スブチルス（野生型）の生産菌株の二つのクローンのゲル電気泳動を示す図である。
【図７】バチルス・スブチルス（野生型）の生産菌株のクローンの電気泳動ゲルを示す図である。
【図８】バチルス・スブチルス野生型菌株（未改変）および対応する種々の欠失を有する改変バチルス・スブチルス菌株を用いた振動フラスコの培養液から測定された、改善されたスブチリシン分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図９】バチルス・スブチルス野生型菌株（未改変）および対応する改変欠失菌株（−ｓｂｏ）および（−ｓｌｒ）の振動フラスコの培養液から測定された、改善されたプロテアーゼ分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１０】制御菌株およびｐｃｋＡ欠失菌株によって作られた円光写真を示す図である。
【図１１】時間を通じて（「ＥＦＴ」は発酵経過時間のことを言う）最小培地で培養された親菌株およびｐｃｋＡ菌株の光学濃度を示すグラフを示す図である。
【図１２】時間を通じてグラム／リッターで表示された富栄養培地で培養された親菌株およびｐｃｋＡ欠失菌株の力価を示すグラフを示す図である。
【図１３】富栄養培地で培養された親菌株およびｐｃｋＡ欠失菌株の炭素生産を示すグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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