(57)【要約】【解決手段】  本発明は生物学的活性化合物を同定するためのアッセイに関するものであり、特にｍＲＮＡの安定性への作用を有する化合物を同定するためのレポーター遺伝子アッセイに関する。より具体的には、本発明は、リポーター遺伝子発現系及び前記発現系を有する細胞株に関するものである。本発明は更に、不安定化ｍＲＮＡ化合物に関するものである。【選択図】      図３Ａ
2007530058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ発現ベクターであって、
ｉ）検出可能シグナルを有する１若しくはそれ以上のタンパク質のコード配列を有する第１のＤＮＡ配列と、
ｉｉ）動作可能なように前記コード配列と結合した１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び１若しくはそれ以上の発現制御配列と、
ｉｉｉ）１若しくはそれ以上の天然発生遺伝子に由来する１若しくはそれ以上のｍＲＮＡ不安定配列に相当する第２のＤＮＡ配列を有する前記３’ＵＴＲ配列を挿入した異種不安定配列ＤＮＡと
を有するＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
請求項１のＤＮＡ発現ベクターにおいて、前記異種不安定配列ＤＮＡは、前記天然発生遺伝子の前記ｍＲＮＡ不安定配列に隣接する配列に相当するＤＮＡをさらに有するものである。
【請求項３】
請求項１のＤＮＡ発現ベクターにおいて、前記異種不安定配列ＤＮＡは、約１０〜約１５００ヌクレオチドの長さである。
【請求項４】
請求項２のＤＮＡ発現ベクターにおいて、前記異種不安定配列ＤＮＡは、前記天然発生遺伝子から得られる前記３’ＵＴＲの全体或いは実質的に一部に相当するＤＮＡを有するものである。
【請求項５】
請求項２のＤＮＡ発現ベクターにおいて、前記異種不安定配列ＤＮＡは、前記天然発生遺伝子のコード領域からの１若しくはそれ以上のＣＲＤに相当するＤＮＡを有するものである。
【請求項６】
請求項１のＤＮＡ発現ベクターであって、前記１若しくはそれ以上の天然発生遺伝子は、サイトカインコード化遺伝子、ケモカインコード化遺伝子、核転写因子コード化遺伝子、オキシゲナーゼコード化遺伝子、プロトオンコジーン、前初期遺伝子、細胞周期制御遺伝子、及びアポトーシスに関与した遺伝子の群から選択されるものである。
【請求項７】
請求項１のＤＮＡ発現ベクターであって、前記１若しくはそれ以上の天然発生遺伝子は、ＡＰＰコード化遺伝子、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｋｒｏｘ−２０、ｎｕｒ−７７、ｚｉｆ２６８、ｂｃｌ−２、Ｂ−ＩＦＮ、ｕＰＡ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉｌ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦα、ｓｙｎｌ、β２−ＡＲ、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、ＭＩＰ−２α、Ｇｒｏ−γ、ＭＩＰ−２β、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、コラゲナーゼ、Ｐ−グリコプロテイン、ＭＤＲ、ＭＲＰｓ、Ｐγｈｌ、ｐｆ  ｍｄｒ、ＣＯＸＩＩ、内皮リパーゼ、コレステリルエステル転送タンパク質、β−アドレナリン受容体、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、Ｂ細胞阻害アルファにおけるカッパ光ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子、ＩＦＮ−γ誘導タンパク質１０ｋＤ、シクロフィリンＦ、ＩＬ−１０受容体アルファ、ＡＵＦ１、トリステトラプロリン、及びユビキチン特異的プロテアーゼ１８の群から選択されるものである。
【請求項８】
請求項１のＤＮＡ発現ベクターを有する宿主細胞。
【請求項９】
安定に導入された細胞株であって、
ｉ）検出可能シグナルを有する第１のタンパク質をコード化した第１のＤＮＡ配列、１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び前記第１のＤＮＡ配列に動作可能であるように結合した１若しくはそれ以上の発現制御配列、及び前記３’ＵＴＲ配列を挿入した異種不安定配列ＤＮＡを有するＤＮＡ発現ベクターであって、前記不安定配列ＤＮＡは１若しくはそれ以上の天然発生遺伝子由来の１若しくはそれ以上のｍＲＮＡ不安定配列に相当する第２のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ発現ベクターと、、
ｉｉ）検出可能シグナルを有する第２のタンパク質をコード化した制御ＤＮＡ配列を有する制御ＤＮＡ発現ベクターと、操作可能であるように前記制御ＤＮＡ配列に結合した１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び１若しくはそれ以上の発現制御配列と
を有する安定に導入された細胞株。
【請求項１０】
ｍＲＮＡの安定性に作用する１若しくはそれ以上の化合物のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験化合物の不在下で検出可能シグナルを有するタンパク質を発現することが可能なＤＮＡ発現ベクターを提供する工程であって、前記発現ベクター及び前記タンパク質のコードから転写されたｍＲＮＡは、異種ｍＲＮＡ不安定化配列の少なくとも１つの複製を有するものである、前記ＤＮＡ発現ベクターを提供する工程と、
ｉｉ）前記ＤＮＡ発現ベクターを少なくとも１つの試験化合物と接触させる工程であって、この工程は、試験化合物の不在下で前記ＤＮＡ発現系が検出可能シグナルを有する前記タンパク質を発現することが可能なものである前記接触させる工程と、
ｉｉｉ）前記検出可能シグナルを測定する工程と、
ｉｖ）前記測定された検出可能シグナルをコントロールと比較する工程であって、
前記コントロールとの比較において前記測定された検出可能シグナルの減少は、ｍＲＮＡの安定性が減少した化合物を示し、更に前記コントロールとの比較において前記測定された検出可能シグナルの増加は、ｍＲＮＡの安定性が増加した化合物を示すものである前記測定された検出可能シグナルをコントロールと比較する工程と
を有するスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法において、前記コントロールは、前記試験化合物の不在下において前記ＤＮＡ発現ベクターからの前記検出可能シグナルを測定する工程を有するものである。
【請求項１２】
請求項１０の方法において、前記コントロールは、第２の検出可能シグナルを有する第２のタンパク質を発現することが可能なコントロール発現ベクターを前記試験化合物と接触させる工程と、前記第２の検出可能シグナルを測定する工程とを有するものである。
【請求項１３】
請求項１０の方法において、前記化合物は、該化合物のｍＲＮＡ分解誘導能力に関してスクリーニングされているものであり、前記コントロールとの比較において前記測定された検出可能シグナルの減少は、ｍＲＮＡの分解を誘導する化合物を示しているものである。
【請求項１４】
２若しくはそれ以上の化合物によって誘導されたｍＲＮＡの分解度の比較方法であって、
（ｉ）試験化合物の不在下において検出可能シグナルを有するタンパク質を発現することが可能なＤＮＡ発現ベクターを提供する工程であって、前記発現ベクター及び前記タンパク質のコードから転写された前記ｍＲＮＡは、異種ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つの複製を有するものである前記提供する工程と、
（ｉｉ）試験化合物不在の条件下において、前記ＤＮＡ発現ベクターを個別に２若しくはそれ以上の試験化合物と接触させる工程であって、前記ＤＮＡ発現系は前記検出可能シグナルを有するタンパク質の発現が可能なものである、前記接触させる工程と、
（ｉｉｉ）各試験化合物の存在下において前記検可能シグナルを測定する工程と、
（ｉｖ）前記測定された検出可能シグナルを比較する工程であって、低く測定された検出可能シグナルはｍＲＮＡのより大きな分解度を示すものである前記比較する工程と
を有する比較方法。
【請求項１５】
不安定化ｍＲＮＡの化合物をスクリーニングする定量法であって、
（ｉ）検出可能シグナルを有する第１のタンパク質をコード化した第１のＤＮＡ配列と、操作可能であるように前記ＤＮＡ配列及び結合した１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び１若しくはそれ以上の発現制御配列と、前記３’ＵＴＲ配列に挿入された異種不安定配列ＤＮＡを有するＤＮＡ発現ベクターとであって、前記不安定配列ＤＮＡは１若しくはそれ以上の天然発生遺伝子から誘導される１若しくはそれ以上のｍＲＮＡ不安定配列に相当する第２のＤＮＡ配列を有するものである、前記ＤＮＡ発現ベクターと、
（ｉｉ）検出可能シグナルを有する制御タンパク質をコード化した制御ＤＮＡ配列と、１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び操作可能であるように前記制御ＤＮＡ配列と結合した１若しくはそれ以上の発現制御配列とを有する制御ＤＮＡ発現ベクターと、
を有する測定系。
【請求項１６】
請求項１５の測定系において、前記ＤＮＡ発現ベクター及び前記制御ＤＮＡ発現ベクターは、安定に導入された異なる細胞株において提供されるものである。
【請求項１７】
請求項１５の測定系において、前記ＤＮＡ発現ベクター及び前記制御ＤＮＡ発現ベクターは、安定に導入された同じ細胞株において提供されるものである。
【請求項１８】
ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす化合物を同定するために化合物のライブラリーをスクリーニングする高度スループット方法であって、
（ｉ）試験化合物の不在下において検出可能シグナルを有するタンパク質を発現することが可能なＤＮＡ発現ベクターを有する安定に導入された細胞株を提供する工程であって、前記発現ベクター及び善意タンパク質のコードから転写された前記ｍＲＮＡは異種ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つの複製を有するものである、前記提供する工程と、
（ｉｉ）前記細胞株と成長培地とを含む１若しくはそれ以上の多ウェルプレートのウェルを播種する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞株の細胞が成長し、検出可能シグナルを有する前記タンパク質を発現することが可能である条件下において、１若しくはそれ以上の前記多ウェルプレートを維持する工程と、
（ｉｖ）前記細胞を１若しくはそれ以上の試験化合物と接触させる工程と、
（ｖ）前記検出可能シグナルを測定する工程と、更に
（ｖｉ）前記測定可能シグナルをコントロールと比較する工程であって、
前記コントロールとの比較において前記測定された検出可能シグナルの減少は、ｍＲＮＡの安定性が減少した化合物を示し、前記コントロールとの比較において前記測定された検出可能シグナルの増加は、ｍＲＮＡの安定性が増加した化合物を示すものである、前記比較する工程と
を有する高度スループット方法。
【請求項１９】
不安定化ｍＲＮＡの化合物をスクリーニングする測定系を含むキットであって、
（ｉ）検出可能シグナルを有するタンパク質をコード化した第１のＤＮＡ配列と、操作可能であるように前記第１のＤＮＡ配列と結合した１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び１若しくはそれ以上の発現制御配列と、３’ＵＴＲ配列に挿入された異種不安定配列ＤＮＡとを有する１若しくはそれ以上のＤＮＡ発現ベクターであって、前記不安定配列ＤＮＡは１若しくはそれ以上の天然発生遺伝子由来の１若しくはそれ以上のｍＲＮＡ不安定化配列に相当する第２のＤＮＡ配列を有するものである、前記１若しくはそれ以上のＤＮＡ発現ベクターと、
（ｉｉ）検出可能シグナルを有する第２のタンパク質をコード化した制御ＤＮＡ配列と、操作可能であるように前記制御ＤＮＡ配列と結合した１若しくはそれ以上の３’ＵＴＲ配列及び１若しくはそれ以上の発現制御配列とを有する制御ＤＮＡ発現ベクターと、選択的に、
（ｉｉｉ）使用方法説明書と
を有するキット。
【請求項２０】
請求項１９のキットであって、このキットは、更に
１若しくはそれ以上の細胞株を有するものである。
【請求項２１】
請求項１９のキットであって、前記ＤＮＡ発現ベクター及び前記制御ＤＮＡ発現ベクターは、安定に導入された異なる細胞株において提供されるものである。
【請求項２２】
請求項１９のキットにおいて、前記ＤＮＡ発現ベクター及び前記制御ＤＮＡ発現ベクターは、安定に導入された同じ細胞株において提供されるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
現在の発明は生物的試金の分野と特にｍＲＮＡの安定性に効果をもたらす生物学的に活動的な混合物の同一証明のための試金に関連している。
【背景技術】
【０００２】
ｍａｍｍａｌｉａｎ細胞のメッセンジャー  ＲＮＡの表現は非常に調整される。  伝統的に、重点は遺伝子がｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌのレベルで調整されるメカニズムを明瞭にすることに置かれた；  し、ｍＲＮＡの定常レベルは半減期または低下率にまた依存している。    ｍＲＮＡの安定性の変更は多くのｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ遺伝子の表現のレベルの調整の重要な役割を担い、異なったメカニズムはｍＲＮＡの転換の規則のために提案された  （Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｙｅｎ，  １９８９，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  １：１２１；  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，  ２０００，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  １０：１９３；  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３：３２０；  Ｒｏｓｓ，  Ｊ．  １９９５，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５９：４２３；  Ｓａｃｈｓ，  Ａ．Ｂ．，  １９９３，  Ｃｅｌｌ  ７４：４１３；  Ｓｔａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１７；  Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２：２３７）。但し、ｍＲＮＡの安定性の規則は複雑である。    規則は最終的にｍＲＮＡの安定性順序の決定要因の処理の要因の相互作用に影響を及ぼす複雑な信号のｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎの細道の介入と同様、ｍＲＮＡで順序の要素自体をのｎｕｃｌｅａｓｅｓの活発化、含むことができる。
【０００３】
最近、それはＲＮＡの半分の生命の規則が遺伝子発現の堅い制御の重大な役割を担うこと、そしてｍＲＮＡの低下が非常に管理されたプロセスであることますます明白になった。ＲＮＡの不安定はトランスクリプション率の変更に急流をｍＲＮＡのコピーのレベルの規則または可能にする。いくつかの重大な細胞要因、例えばトランスクリプションはｃのｍｙｃのような考慮する、正規関数を行うためにまたはｃｙｔｏｋｉｎｅｓのようなホストの免疫反応にかかわる遺伝子プロダクトは、あるように一時的だけ要求される。これらの要因のためにコードするｍＲＮＡｓの一時的な安定は要求されたときこれらのメッセージの蓄積そして翻訳が望ましい細胞要因を表現するようにする；  、これらのｍＲＮＡｓの急速な回転率が効果的におよび限るｎｏｎｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ、通常状態の下で一方「細胞要因のｏｆｆの表現を転換しなさい。従って、異常なｍＲＮＡの転換は通常劇的に細胞特性を変更できる変えられた蛋白質のレベルをもたらす。
【０００４】
ｍＲＮＡの安定は炎症性ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、成長因子およびある特定の原始ｏｎｃｏｇｅｎｅｓの表現にかかわる主要な規定するメカニズムのようである。病気にかかった州では、病気関係した要因のｍＲＮＡの半減期そしてレベルはｍＲＮＡ安定のためにかなり増加する（Ｒｏｓｓ，  Ｊ．  １９９５，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５９：４２３；  Ｓａｃｈｓ，  Ａ．Ｂ．，  １９９３，  Ｃｅｌｌ  ７４：４１３；  Ｓｔａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１７；  Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２：２３７）．  トランスクリプション率およびｍＲＮＡの安定性はｃ−ｍｙｃおよびｃＦＯＳのような一時的に表現された遺伝子、およびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ  ３、ＴＮＦのおよび  ＧＭ−ＣＳＦ  のような  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  のために頻繁に堅くそして同等に調整される。  さらに、ｍＲＮＡ安定の異常な規則は望ましくない細胞の変形、炎症性応答を損なう例えば腫瘍の形成を、か不適当もたらす細胞要因の不必要な蓄積をおよびティッシュもたらすことができる。
【０００５】
ｍＲＮＡの安定性を制御するメカニズムが理解される様子はまったくないが、順序の地域は不安定それらを含んでいるｍＲＮＡｓで相談するようであるいくつかのｍＲＮＡｓで識別された。  これらの順序の地域は「ｍＲＮＡ不安定順序」のとここに言われる。  例えば、いくつかの即時の早い遺伝子を含むある特定の遺伝子および炎症性ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、例えばＩＬ  １のおよびＴＮＦののためにコードする遺伝子の３  ’  ＵＴＲ  （３  ’未翻訳の地域）にある典型的なｍＲＮＡの不安定順序はＡＲＥｓ  （ａｄｅｎｙｌａｔｅ／ｕｒｉｄｙｌａｔｅ  （ＡＵの）豊富な要素）である。最もよく特徴付けられたＡＵ豊富な要素はショウＫａｍｅｎいわゆる箱またはである  ＡＵＵＵＡ  ｍｏｔｉｆ  （Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，  １９８６，  Ｃｅｌｌ  ４６：６５９）．  多数ＡＵＵＵＡ順序（の近似性またはタンデム）またはＡＵ豊富な地域はｍＲＮＡの不安定で関係した。  例えば、次に識別される文献の参照で記述されているｍＲＮＡの不安定順序は順序のモチーフの１つ以上のコピーを、例えばから選ばれて含んでいる：  ＡＵＵＵＡ；  ＵＡＵＵＵＡＵ；  ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ），  ａｎｄ  ＡＵＵＵＡＵＵＵＡ．    普通、不安定の決定要因として作用するために、ＡＵＵＵＡのモチーフは少なくとも１つを形作るタンデムで整理されるべきであるＵＵＡＵＵＵＡＵ／ＡＵ／Ａ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （Ｌａｇｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４：７９８４）。
【０００６】
次の出版物はｍＲＮＡの不安定順序およびＡＲＥｓの含み、（最低）いくつかのｍＲＮＡの不安定順序の識別と同様、ｍＲＮＡの不安定化のための条件を、および配列しなさい順序のモチーフの広汎な議論を含んでいる、
それらを含んでいる遺伝子。
【０００７】
Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，  Ｃｅｌｌ，  １９８６，  ４６：６５９-６６７  （ＧＭ-ＣＳＦ）；
Ｓｈｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  &  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １９９１，  １５：２２１-２３１  （ｃ-ｆｏｓ）；
Ｓａｃｈｓ，  Ｃｅｌｌ，  １９９３，  ７４：４１３-４２１  （Ｒｅｖｉｅｗ．  ”Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ
Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”）；
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９４，  １４：４１６-４２６  （ｃ-ｆｏｓ）；
Ａｋａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  １９９４，  ８３：３１８２-３１８７  （ＧＭ-ＣＳＦ  ｅｔｃ．）；
Ｎａｎｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９４，  １４：４９２０-４９２０  （ｕＰＡ）；
Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９４，  ２６９：２８５９１-２８５９７  （ＩＬ-３）；
Ｌａｇｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９４，  １４：７９８４-７９９５  （ｇｅｎｅｒａｌ）；
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９５，  １５：２２３１-２２４４  （ｙｅａｓｔ）；
Ｚｕｂｉａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９５，  １５：２２１９-２２３０  （ｇｅｎｅｒａｌ）；
Ｗｉｎｓｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９５，  １５：３７９６-３８０４  （ｃ-ｆｏｓ，  ＧＭ-ＣＳＦ）；
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９５，  １５：５７７７-５７８８  （ｃ-ｆｏｓ，  ＧＭ-ＣＳＦ）；
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＩＢＳ，  １９９５，  ２０：４６５-４７０  （ｒｅｖｉｅｗ）；
Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  ２７１：２７４６-２７５３  （ＶＥＧＦ）；
Ｋａｓｔｅｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １９９６，  ８：７５１-７６１；
Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２：２１１２０-２１１２７  （ＴＮＦ(）；
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９７，  １８：４６１１-４６２１  （ｇｅｎｅｒａｌ）；
Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ２７３：３２２３-３２２９  （ｈｕｍａｎ  (２-Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）；
Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ２７３：１３７８１-１３７８６  （ＴＮＦ(）；
Ｃｈｅｎ，  Ｃ．-Ｙ．  ａｎｄ  Ｓｈｙｕ，  Ａ．-Ｂ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９４，  １４：８４７１-８４８２；および
Ｋｌａｕｓｎｅｒ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １９９３，  ７２：１９-２８。
【０００８】
この基礎的な情報は現在の発明への可能な関連性であると志願者が信じる情報を発表するために提供される。先行する情報のうちのどれかが現在の発明に対して前芸術を構成する入場は必ずしも意図されていない、解釈されるべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
現在の発明の目的はｍＲＮＡの安定性に影響を与える混合物を識別するために試金を提供することである。現在の発明の面に従って、そこにＤＮＡの表現のベクトル構成提供される：最初のＤＮＡ順序１つ以上の探索可能な信号を持っている蛋白質のためのコード配列から成り立つ；  １つ以上の３’ＵＴＲ順序は前述のコード配列と１つ以上表現の制御シーケンス有効に、関連付け、  １つ以上に対応する第２  ＤＮＡ順序から成り立つ前述の３’ＵＴＲ順序に挿入された異種不安定順序のＤＮＡは１つ以上の自然発生する遺伝子からｍＲＮＡの不安定順序得た。
【００１０】
発明の別の面に従う、提供されたａが固定してｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ細胞構成ライン構成をある：  探索可能な信号を持っている最初の蛋白質を符号化する最初のＤＮＡ順序から成り立つＤＮＡの表現のベクトルは言われた最初ＤＮＡ順序と１つ以上の３  ′  ＵＴＲ順序１つ以上表現の制御シーケンス有効に関連付け、異種不安定順序のＤＮＡは３つの′  ＵＴＲ順序、１つ以上に対応する第２  ＤＮＡ順序から成り立つ言われた不安定順序のＤＮＡ言われるに１つ以上の自然発生する遺伝子から得られたｍＲＮＡの不安定順序挿入した；  そして探索可能な信号を持っている第２蛋白質を符号化する制御ＤＮＡ順序から成り立つ制御ＤＮＡの表現のベクトルおよび１つ以上の３  ′  ＵＴＲ順序は前述の制御ＤＮＡ順序とおよび１つ以上表現の制御シーケンス有効に関連付けた。
【００１１】
発明の別の面に従って、そこにステップから成り立つｍＲＮＡの安定性に影響を与えなさい１つ以上に混合物を選別する方法提供される：
ｉ）蛋白質は異種ｍＲＮＡの不安定順序で少なくとも１枚のコピーを構成することを言われた表現のベクトルから転写され、符号化する言われるかｍＲＮＡテスト混合物がない時探索可能な信号を持っている蛋白質を表現することができるＤＮＡの表現のベクトルを提供する
ｉｉ）テスト混合物がない時、言われたＤＮＡの表現システムが探索可能な信号を持っている言われた蛋白質を表現することができるという条件の下の少なくとも１つのテスト混合物との言われたＤＮＡの表現のベクトルの連絡
ｉｉｉ）測定の言われた探索可能な信号；および
ｉｖ）制御と測定された探索可能な信号を比較すること
言われた制御と比較される測定された探索可能な信号の減少が示すか言われた制御と比較される測定された探索可能な信号のｍＲＮＡの安定性そして増加を減らす混合物はｍＲＮＡの安定性を高める混合物を示す。
【００１２】
発明の別の面に従って、そこにステップをで構成する２つ以上の混合物によって引き起こされるｍＲＮＡの低下の範囲を比較するために方法提供される：
ｉ）蛋白質は異種ｍＲＮＡの不安定順序で少なくとも１枚のコピーを構成することを言われた表現のベクトルから転写され、符号化する言われるかｍＲＮＡテスト混合物がない時探索可能な信号を持っている蛋白質を表現することができるＤＮＡの表現のベクトルを提供する、
ｉｉ）テスト混合物がない時、言われたＤＮＡの表現システムが探索可能な信号を持っている言われた蛋白質を表現することができるという言われたＤＮＡの表現のベクトルに別に２つ以上と連絡して条件の下で混合物をテストしなさい
ｉｉｉ）各テスト混合物の前の測定の言われた探索可能な信号；および
ｉｖ）手段探索可能な信号の比較；より低い手段探索可能な信号がｍＲＮＡの低下のすばらしい範囲を示すか。
【００１３】
発明の別の面に従って、そこにｍＲＮＡ  の構成を不安定にする混合物のための選別に試金システム提供される：
ｉ）探索可能な信号、一つ以上の３’  ＵＴＲ  順序を持っている最初の蛋白質を符号化する最初のＤＮＡ  順序から成り立つＤＮＡ  の表現のベクトルは一つ以上の自然に起こる遺伝子から一つ以上有効に前述のＤＮＡ  順序と、及び前述の３’  ＵＴＲ  順序に挿入された異種不安定順序のＤＮＡ  関連付けられた表現の制御シーケンス一つ以上に対応する第２  ＤＮＡ  順序から成り立つ前述の不安定順序のＤＮＡ  ｍＲＮＡ  の不安定順序得；および
ｉｉ）探索可能な信号を持っている制御蛋白質を符号化する制御ＤＮＡ  順序から成り立つ制御ＤＮＡ  の表現のベクトル及び一つ以上の３’  ＵＴＲ  順序は前述の制御ＤＮＡ  順序と及び一つ以上表現の制御シーケンス有効に関連付けた。
【００１４】
発明の別の面に従って、ｍＲＮＡ  の構成の安定性に影響を与える混合物を識別するためにそこに混合物の図書館を選別する為に高い効率方法提供される：
ｉ）ａを提供することは固定して蛋白質は異種ｍＲＮＡの不安定順序で少なくとも１枚のコピーを構成することを言われた表現のベクトルから転写され、符号化する言われるかｍＲＮＡテスト混合物がない時探索可能な信号を持っている蛋白質を表現することができるＤＮＡの表現のベクトルから成り立つ細胞ラインをｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ；
ｉｉ）前述の細胞との成長媒体から成り立つ一つ以上のｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  の版の井戸を再接種して並べなさい；
ｉｉｉ）維持は前述の細胞ラインの細胞が探索可能な信号を持っている前述の蛋白質を育て、表現するようにする条件の下で一つ以上のｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  の版を言った；
ｉｖ）連絡して一つ以上の細胞は混合物をテストする；
ｖ）手段の前述の探索可能な信号；および
ｖｉ）制御と手段探索可能な信号を比較すること；
前述の制御と比較される手段探索可能な信号の減少が示すか前述の制御と比較される手段探索可能な信号のｍＲＮＡの安定性そして増加を減らす混合物はｍＲＮＡの安定性を高める混合物を示す。
【００１５】
発明の別の面に従って、そこに、前述の試金システム構成にキット試金システムから成り立つｍＲＮＡ  を不安定にする混合物のための選別提供される：
ｉ）一つ以上探索可能な信号、一つ以上の３’  ＵＴＲ  順序を持っている蛋白質を符号化する最初のＤＮＡ  順序から成り立つＤＮＡ  の表現のベクトルは一つ以上の自然に起こる遺伝子から一つ以上有効に前述の最初ＤＮＡ  順序と、及び前述の３’  ＵＴＲ  順序に挿入された異種不安定順序のＤＮＡ  関連付けられた表現の制御シーケンス一つ以上に対応する第２  ＤＮＡ  順序から成り立つ前述の不安定順序のＤＮＡ  ｍＲＮＡ  の不安定順序得；および
ｉｉ）探索可能な信号を持っている第２蛋白質を符号化する制御ＤＮＡ順序から成り立つ制御ＤＮＡの表現のベクトルは前述の制御ＤＮＡ順序と一つ以上の３’ＵＴＲ  順序一つ以上表現の制御シーケンス有効に関連付け；  そして任意に
ｉｉｉ）使用説明。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
Ｔ彼は少なくとも１  つのｍＲＮＡ  の不安定順序および任意に順序に対応するＤＮＡ  と共同してレポーターの遺伝子を構成する不安定のｍＲＮＡ  を並べるＤＮＡ  の表現システムを発明を提供する示す。このＤＮＡ  は”不安定順序ＤＮＡ”  のとか”ｉｓＤＮＡ”  言われ、普通ある自然に起こる遺伝子（”源遺伝子”  の）  の３’ＵＴＲ  かコーディングの地域にある源の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ  の安定性に影響を与えると知られ、ヌクレオチド順序から成り立つ。従って、発明の表現システムに組み込まれるｉｓＤＮＡ  は３’  ＵＴＲ  または一つ以上で３’  ＵＴＲ  の片源の遺伝子の全体の３’ＵＴＲ  に対応する順序か相当な部分を構成できる。ｉｓＤＮＡ  は一つ以上単一の源の遺伝子、または源の遺伝子の大多数から得られる不安定順序（及び任意に並ぶ地域）  から成り立つかもしれない。現在の発明の表現システムは５’  及び３’  未翻訳の地域を含む適切な３’ａｎｄ  ５’  遺伝子の並ぶ順序とともに普通レポーターの遺伝子を、構成する（ＵＴＲｓ）。現在の発明の表現システムでは、ｉｓＤＮＡ  はレポーターの遺伝子と関連付けられる３’  ＵＴＲ  に挿入される。従って、ｉｓＤＮＡ  はレポーターの遺伝子と関連付けられる３’ＵＴＲ  のＤＮＡ  に異種である。
【００１７】
ｍＲＮＡ  の安定性に影響を与える混合物を識別するそれ以上の発明は試金のＤＮＡ  の表現システムの使用を提供する。それに応じて、現在の発明はテスト混合物がない時探索可能な信号を持っている蛋白質を表現することができるＤＮＡ  の表現システムがテスト混合物の前でテスト混合物および探索可能な信号と測定され、制御と比較される連絡されるｍＲＮＡ  の安定性に影響を与える混合物の同一証明に方法を提供する。
【００１８】
発明の方法はｍＲＮＡ  の不安定順序を含んでいるｍＲＮＡｓ  の不安定を促進する混合物の同一証明のために合わせられる。組合わせの混合の図書館を含む混合物の個々の混合物そして図書館を、選別するのにレポーターの遺伝子の試金が使用されるかもしれない。鉛混合物を識別するのに最初のラインスクリーニングの試金としてレポーターの遺伝子の試金が使用され、例えば薬効がある化学鉛の最適化のｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ  プログラムから作り出される混合物を比較するために混合物の活動を促進するｍＲＮＡ  の不安定を比較するか、または量を示すのに使用されるかもしれない。
【００１９】
従ってｍＲＮＡ  の不安定順序を含んでいるｍＲＮＡｓ  の不安定を促進する混合物が主題のそのようなｍＲＮＡｓ  の低下を使用することができ、防ぎか、または不適当なｍＲＮＡ  の蓄積を逆転させ、そしてそれにより不必要な蛋白質の表現引き起こすのに、例えば不必要なｃｙｔｏｋｉｎｅ  の表現を減らすか、または防ぐ。そのような混合物に不適当なｍＲＮＡ  安定および蓄積および結果として生じる望ましくない蛋白質の表現含む病状か病気の予防法で潜在的な薬物の適用がや処置ある。
【００２０】
他では定義されて、技術的な、科学的な言葉すべてはこの発明が属する芸術で通常の技術の１  つによって一般に理解されるとここに持っている同じ意味を使用しなかった。一般に、専門語は細胞培養、分子生物学、選別法、および核酸化学で実験室のプロシージャここに使用し、後で記述されている混合の同一証明はそれらの有名及び芸術で一般に雇われてである。標準的な技術はベクトル、組換えの核酸方法、細胞培養および変形の準備のために普通使用される。
【００２１】
技術およびプロシージャは芸術および様々な一般参照で従来の方法に従って一般に行われる（一般に見なさい，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８３）  蛍光性の技術のため）．  標準的な技術は化学統合、化学分析、および生物的試金のために使用される。次の意味があるために、次の言葉に発表中雇われるように、特記されない場合は、理解される。
【００２２】
定義
ここに使用されるように言葉”オリゴヌクレオチド、”  はリボ核酸（ＲＮＡ）  またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）  のどれである場合もあるヌクレオチドの順序を、示す。
【００２３】
ここに使用されるように言葉”レポーター遺伝子、”  は探索可能な蛋白質を符号化する遺伝子を、示す。レポーターの遺伝子によって符号化される探索可能な蛋白質はそうかもしれない例えば、蛍光蛋白質か探索可能な信号を与える適切な基質か他の物質と反応することができるかもしれない。
【００２４】
ここに使用されるように言葉”探索可能な信号、”  は直接または間接的に検出することができる信号を、示す。普通、探索可能な信号は分光、光化学、生化学的な、ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  、または化学薬品の平均によって検出することができる。探索可能な信号は直接作り出されるかもしれないか、または適した”共役”  との反作用か相互作用によって間接的に作り出されるかもしれない（例えば、基質、抗体、ｌｉｇａｎｄ  、および同類）。
【００２５】
ここに使用されるように言葉”テスト混合物、”  は発明の試金そして方法に従ってテストし、含むことができる限られないために、有機金属混合物、ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  、オリゴヌクレオチド、ペプチッド、蛋白質、有機化合物、金属、過渡的な金属の複合体、および小さい分子を、示す混合物（例えば、ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ  及び非ｎｏｎ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  混合物）。
【００２６】
言葉”不安定順序”  はｍＲＮＡ  の安定性を調整することができるヌクレオチド順序を示す。現在の発明の文脈では、”不安定順序”  は不安定正常な生理学的な条件、不安定生理学に異常の下でｍＲＮＡ  で相談する相談するが、または少しがある、または否、正常な生理学的な条件の下のｍＲＮＡ  の安定性に対する効果に重点を置いたりある圧力の条件の下でｍＲＮＡ  の安定性を高めるヌクレオチド順序と同様、条件、ヌクレオチド順序の下でｍＲＮＡ  でヌクレオチド順序を含める。生理学に異常、または、条件圧力一般に制御の要因相関的で正常な生理学的な状態の存在、不在または転位を含みなさい。
【００２７】
言葉”制御の要因”  は（に限られなくて）  酸素、温度、およびライトを含む変更可能な要因を示す。
【００２８】
言葉は”に”  ”対応し、に対応する、ＤＮＡ  順序がＲＮＡ  順序の直接同等及び逆にであるか”  ＤＮＡ  順序とＲＮＡ  順序間の関係を記述するのにここに使用されている、すなわち”Ｔ”  の基盤がＤＮＡ  順序に起こるとき２  つの順序はＲＮＡ  の同等順序の”Ｕ”  の基盤と同一但し例外としてそれ取り替えられるである。実例のために、ＲＮＡ  順序”ＵＡＵＡＣ”  はＤＮＡ  順序”ＴＡＴＡＣ  に対応する。”  同様に、ＤＮＡ  順序”ＧＴＴＣＡ”  はＲＮＡ  順序”ＧＵＵＣＡ  に対応する。”
遺伝子についてここに使用されるように”自然に”  起こることは遺伝子が性質で見つけることができるという事実を、示す。例えば、隔離することができる性質の源から実験室の人によって計画的に変更されないし、有機体にある遺伝子は（を含むウイルス）  自然に起こっている。
【００２９】
ここに使用されるように、言葉は”についての”  をａ  ＋  １０％  わずかな値からの変化参照する。それはとりわけを参照されるかどうかそのような変化が常にここに提供されるある特定の価値で含められること理解されるべきである。
【００３０】
ここの他の化学言葉は参照によってここに組み込まれる化学言葉（ＥＤ  Ｐａｒｋｅｒ  、Ｓ．  １９８５  年、ＭｃＧｒａｗ？Ｈｉｌｌ  、サンフランシスコ）  のＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  辞書によって例証されるように芸術で慣習的な使用法に従って、使用される。
【００３１】
１．ＤＮＡの表現システム
現在の発明のＤＮＡ  の表現システムは少なくとも１  つのｍＲＮＡ  の不安定順序に対応するＤＮＡ  （ｉｓＤＮＡ）  すなわち不安定順序のＤＮＡ  と関連付けられるレポーターの遺伝子から成り立つ。レポーターの遺伝子および準のｉｓＤＮＡ  は適切な細胞ラインを変形させるのにレポーターの遺伝子によって符号化される蛋白質を表現する為に平均を提供するために使用に適したベクトルの内で普通構成される。ｓｉｎｇｌｅ．ｃｅｌｌラインは１つのベクトルと変形させることができるか、またはベクトルの組合せと変形するかもしれない。後の場合では、各ベクトルはｍＲＮＡｓの多様性の安定性の混合物の効果を識別するのに細胞ラインが試金で続いて使用することができることそのような物別のレポーターの遺伝子およびｉｓＤＮＡを組み込むことができる。
【００３２】
１．１  ｉｓＤＮＡ  順序
発明の表現システムで含められるｉｓＤＮＡは一つ以上から得られる少なくとも１つのｍＲＮＡ  の不安定順序に対応するＤＮＡ源の遺伝子から成り立つ。ｉｓＤＮＡは更にそれから転写されるｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ源の遺伝子またはｍＲＮＡの不安定順序を並べる地域に対応するＤＮＡから成り立つかもしれない。従って、発明の１具体化にｉｓＤＮＡは約１０から長さ約１５００のヌクレオチドにある。
【００３３】
１．１．１源の遺伝子
現在の発明に従って、ｉｓＤＮＡは一つ以上に対応するＤＮＡを一つ以上から源の遺伝子得られるｍＲＮＡの不安定順序、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの安定性に影響を与える順序を含むと知られているすなわち遺伝子構成する。上示されるように、ｍＲＮＡの不安定順序はＵＴＲｓの特に多数の一時的に表現された遺伝子の３’ＵＴＲｓ、を含む、ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ、核トランスクリプション要因、原始ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、即時の早い遺伝子、細胞周期の制御の遺伝子、オキシゲナーゼおよび遺伝子含まれるおよび制御のａｐｏｐｔｏｓｉｓ  で識別された。従ってそのような遺伝子は現在の発明の目的のための源の遺伝子として役立つことができる。ｍＲＮＡ  の不安定が配列する特定の源の遺伝子の例を非限ることは含んでいるＡＰＰ  、ＶＥＧＦ  、ｂｃｌ−２．ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃＦＯＳのｃ−ｍｙｃ、ｃ６  月、ｋｒｏｘ−２０、ｎｕｒ−７７  、ｚｉｆ２６８  、ｂｃｌ−２  のｂＩＦＮ、ｕＰＡ、ＩＬ１のためにコードする遺伝子をか。得ることができる、ＩＬ  １ｂ  、ＩＬ−２  、ＩＬ−３  、ＩＬ−４  、ＩＬ−５  、ＩＬ−６  、ＩＬ−７  、ＩＬ−８  、ＩＬ−９  、ＩＬ−１０  、ＩＬ−１１  、ＩＬ−１３  、ＴＮＦａ  のｓｙｎｌ  、ｂ２−ＡＲ  、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  、ＶＣＡＭ−１  、ＩＣＡＭ−１  、刺激の活動のアルファ）  、Ｇｒｏ−ｂ（ＭＩＰ−２  Ｇｒｏ−ａ  （ｍｅｌａｎｏｍａ  の成長のか。）  、グログ（ＭＩＰ−２はか。）  、ＭＭＰ−１  、ＭＭＰ−２のコラゲナーゼ、Ｐ糖蛋白質（ＭＤＲ）、ＭＲＰｓ  、ｍｄｒ）  、ＣＯＸＩＩ  のｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  リパーゼ、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌｅｓｔｅｒ  の移動蛋白質、ｂ  ｂ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  受容器、ＭＩＰ  １ａ  、ＭＩＰ  １ｂ  、ＭＣＰ−１  、ＭＣＰ−２  のＢ  細胞の抑制剤のアルファ（ＮＦＫＢＩＡ）  のｋａｐｐａ  ライトポリペプチドの遺伝子の増強物の核要因Ｐ？ｈ１  （ｐｆ  の、ＩＦＮ  か。誘引可能な蛋白質１０  のｋＤ  （ＩＰ−１０）  、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ｆ  、ＩＬ−１０  受容器アルファ、ＡＵＦ１  、ｔｒｉｓｔｅｔｒａｐｒｏｌｉｎｅ  、およびｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  の特定のプロテアーゼ１８。
【００３４】
さらに、不安定順序はある遺伝子のコーディングの地域の内で識別された。例えば、ｃ−ｍｙｃ  のｍＲＮＡ  の安定性に影響を与える２  つの不安定順序の地域はあった；  １  つは３’−ＵＴＲ  で見つけられるＡＵ−ｒｉｃｈ  の要素であり、他はコーディングの地域の内で見つけられ、コーディングの地域の不安定の決定要因（ＣＲＤ）  と言われるおよそ２５０  のヌクレオチドの地域である（、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  等の遺伝子Ｄｅｖ．  、１９９２  年、６：６４２−６５４  見なさい）  。従って、現在の発明の目的のために、ｃ−ｍｙｃ  の遺伝子は少なくとも２  つの不安定順序の源として役立つ。
【００３５】
現在の発明の１  具体化では、一つ以上のｍＲＮＡ  の不安定順序の構成をＡＵ？ｒｉｃｈ  の要素含んでいる、またはＡＲＥｓ  選ばれる源の遺伝子は。ＡＲＥｓ  の例は含んでいるが、に、ＡＵＵＵＡ  限られない；  ＵＡＵＵＵＡＵ；  ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）  およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡ  。現在の発明の目的のために適したＡＲＥｓ  を含んでいる源の遺伝子の例を非限って表１  で提供される。ＡＲＥｓ  は表１  で示されるように基本的なＡＵＵＵＡ  のｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  の一致順序の整理そして数によって互いとこれらの遺伝子で異なる見つけた。
【００３６】
別の具体化では、コーディングの地域の決定要因から成り立つ源の遺伝子は選ばれる（またはＣＲＤ）  。この具体化に従って、源の遺伝子はまたある一つ以上を構成するかもしれない。
【００３７】
Ａ興味の病気で関係する蛋白質のためにコードする源の遺伝子は選ばれるかもしれない。  従って、例えば、特定の病気プロセスの病因学にかかわるｃｙｔｏｋｉｎｅかｏｎｃｏｇｅｎｅのためにコードする源の遺伝子から得られるｍＲＮＡの不安定順序は選ぶことができる。  これらのｍＲＮＡの不安定順序に対応するｉｓＤＮＡから成り立つ表現システムはｃｙｔｏｋｉｎｅまたはｏｎｃｏｇｅｎｅのｍＲＮＡを不安定にするこうして、あり、混合物を検出するために有用である準の病気プロセスの処置に有用。  例えば、ＩＬ−１の処置のための鉛混合物は慢性関節リウマチのような病気を、仲介したまたは骨関節炎はＩＬ−１  ｍＲＮＡの不安定順序から成り立つＤＮＡの表現システムを使用して、検出されるかもしれない。  ある特定の源の遺伝子からのｍＲＮＡｓの高められた安定性と関連付けられる病気はまた表１で示される。
【００３８】
【表１】
2007530058.tif 000003
【００３９】
１．１．２  ｍＲＮＡ  の不安定順序
ｉｓＤＮＡ  は１  つのｍＲＮＡ  の不安定順序に対応するＤＮＡ  から成り立つことができるかまたは２  つまたはより多くの不安定順序に対応するＤＮＡ  から成り立つことができる。現在の発明の１  具体化に従って、ｉｓＤＮＡ  は１  そして約１２  のｍＲＮＡ  の不安定順序の間でに対応するＤＮＡ  を構成する。不安定順序はタンデム繰り返しとして、または他の例えばのヌクレオチド順序と普通一緒にあり、または適切な並置のそれから部分（例えば普通金豊富なモチーフからの少なくとも４  つの連続したヌクレオチドを含んでいる）  、例えば介入であるかもしれ。代わりに、不安定順序はＣＲＤ  である場合もあるまたはそれから分解しなさい。なお、ｉｓＤＮＡ  順序はあるそれぞれの並ぶ順序のまたはのない一つ以上のＣＲＤ  、一つ以上から成り立ち。１  具体化では、ｉｓＤＮＡ  はを伴ってである符号化の不安定順序一つ以上をＣＲＤ  の片、構成できる。
【００４０】
発明の別の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも１  つをある含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも２  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも３  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも４  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも５  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも６  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも７  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも８  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも９  つＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも１０  ＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも１１  ＡＲＥｓ  を含んでいる。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は１２  ＡＲＥｓ  多数を含んでいる。
【００４１】
発明の代わりとなる具体化では、不安定順序は関連した並ぶ地域とともに源の遺伝子で少なくとも１  ＣＲＤ  を、構成する。発明の別の具体化では、不安定順序は並ぶ地域のない少なくとも１  ＣＲＤ  を構成するかもしれない。更に別の具体化では、不安定順序はＣＲＤ  の、または並ぶ順序ののない片一つ以上を構成するかもしれない。
【００４２】
普通ｉｓＤＮＡ  が得られるｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも約５０  の連続的なヌクレオチドまで少なくとも約１０  を構成し。従って、発明の１  具体化で、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも１０  の連続的なヌクレオチドを構成する。発明の別の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも２０  の連続的なヌクレオチドを構成する。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも３０  の連続的なヌクレオチドを構成する。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも４０  の連続的なヌクレオチドを構成する。発明のそれ以上の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は少なくとも５０  の連続的なヌクレオチドを構成する。
【００４３】
前に述べられるように、ｉｓＤＮＡ  は一つ以上から得られる少なくとも１  つのｍＲＮＡ  の不安定順序に対応するＤＮＡ  を源の遺伝子構成し、長さ約１０  のヌクレオチドから長さ約１５００  のヌクレオチドにある場合もある。発明の１  具体化では、ｉｓＤＮＡ  は約２０  から長さ約１２００  のヌクレオチドにある。それはｉｓＤＮＡ  の長さがどの並ぶ地域でも含まれているべきであるどうか、また構成する不安定順序の数そしてタイプに左右されること芸術で巧みな１  つに容易に明白である。従って、発明の別の具体化に、ｉｓＤＮＡ  は約２０  から長さ約２００  のヌクレオチドにある。発明の更に別の具体化では、ｉｓＤＮＡ  は約２０  から長さ約５００  のヌクレオチドにある。代わりとなる具体化では、ｉｓＤＮＡ  は約５００  から長さ約１５００  のヌクレオチドにある。それ以上の具体化では、ｉｓＤＮＡ  は約５００  から長さ約１２００  のヌクレオチドにある。
【００４４】
現在の発明の別の具体化では、ｍＲＮＡ  の不安定順序は同一のモチーフの整理かグループからの選ばれる異なったモチーフの組合せを含んでいる：  ＡＵＵＵＡ；  ＵＡＵＵＵＡＵ；  ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）  およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡ。
【００４５】
上示されるように、現在の発明によって熟視される不安定順序は少しがある、または否、正常な生理学的な条件の下のｍＲＮＡ  の安定性に対する効果に含んでいるが、ある圧力の条件の下でｍＲＮＡ  の安定性を高めるヌクレオチド順序。例えば、減少された酸素の前でＶＥＧＦ  のｍＲＮＡ  の安定性を高める人間のＶＥＧＦ  の遺伝子の３’  ＵＴＲ  で見つけられるＶＥＧＦ  の低酸素症の範囲はありであり、ｍＲＮＡ  を安定させるために機能する（ｓｅｅ，  Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  １９９８，  ９：４６９−４８１）．  現在の発明の１  具体化では、ｉｓＤＮＡ  はＶＥＧＦ  の低酸素症の範囲ですべて、または部品を、構成する。
【００４６】
現在の発明のｉｓＤＮＡ  は制限の片、またはｄｅ  ｎｏｖｏ  によっての総合されるヌクレオチド順序として３’  ＵＴＲ  か適切な源の遺伝子のコーディングの地域から、例えば、構成するＰＣＲ  かＲＴ−ＰＣＲ  によって発生させる順序として一つ以上をｍＲＮＡ  の不安定順序得られるかもしれない。ｉｓＤＮＡ  はｍＲＮＡ  の不安定順序を関連した並ぶ地域とともに一つ以上含んでいる、または源の遺伝子または一つ以上の３’  ＵＴＲ  で源の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の片相当な部分を構成できる適切な源の遺伝子順序のｅｎｔｉｒｅ／ｗｈｏｌｅ  ３’  ＵＴＲ  に対応する順序から成り立つことができるか。ｉｓＤＮＡ  が源の遺伝子からの一つ以上のＣＲＤ  から成り立つとき同様に、ｉｓＤＮＡ  は関連した並ぶ順序の一つ以上のＣＲＤ  を含んでいる、または全体のＣＲＤ  、とまたは関連した並ぶ順序のないから成り立つか、またはとまたは並ぶ順序のないＣＲＤ  で片を、構成するコーディングの地域で部分を構成できるコーディングの地域でより小さい部分を構成できるコーディング順序で相当な部分を構成できるか。
【００４７】
現在の発明の１  具体化では、表現システムは一つ以上の３’ＵＴＲ  かコーディングの地域からグループから選ばれる源の遺伝子得られる一つ以上に対応するｉｓＤＮＡ  順序をｍＲＮＡ  の不安定順序構成する：ＡＰＰ，  ｂｃｌ−２α，  ｃ−ｍｙｃ，  ＴＮＦα，  ＩＬ−１βそして  ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡｓ．  別の具体化では、一つ以上は上示される源の遺伝子人間の遺伝子である。人間の３’ＵＴＲｓ  の部分に対応する代表的な順序  ＡＰＰ，  ｂｃｌ−２α，  ｃ−ｍｙｃ，  ＴＮＦα，  ＩＬ−１β，  ＶＥＧＦ，  そして人間のＶＥＧＦ  の低酸素症の範囲はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  として表２  で、提供される：  １，  ２  、３  、４  、５  、６  、７  および８  。従って、発明の別の具体化で表現システムで含められるｉｓＤＮＡ  順序はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  のどれでもで述べられるように全体の順序を構成する：  １，  ２  、３  、４  、５  、６  、７  か８  。発明のそれ以上の具体化で表現システムで含められるｉｓＤＮＡ  順序はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  のどれでもで述べられるように順序で片を構成する：  １，  ２  、３  、４  、５  、６  、７  か８  。現在の発明のそれ以上の具体化では、表現システムで含められるｉｓＤＮＡ  順序はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  のどれでもで述べられるように少なくとも１０  の連続したヌクレオチドを構成する：  １，  ２  、３  、４  、５  、６  、７  か８  。
【００４８】
【表２−１】
2007530058.tif 000004
【００４９】
【表２−２】
2007530058.tif 000005
【００５０】
【表２−３】
2007530058.tif 000006
【００５１】
１．１．３並ぶ順序
独自性の考慮によって行えばＣＲＤ  の並ぶ順序は別の不安定順序の結合蛋白質の存在によって、金豊富なモチーフを含む細胞プロセスのための選択率の達成の１  つのアプローチあるかもしれない。ＡＲＥｓ  と相互に作用している細胞質ｍＲＮＡ  結合蛋白質は規定するＴＲＡＮＳ  要因として機能すると考えられる。ｍＲＮＡ  への結合は安定するか、または不安定にする効果を示す。
【００５２】
上記に基づかせていて、巧みな職人は不安定順序の長さと同様、いくつかのモチーフがｍＲＮＡ  の安定性に影響を与える混合物の同一証明のためのＤＮＡ  の表現システムの準備で考慮されるかもしれないことを理解する。１  つは更に並ぶ順序が並べる順序の性質によってコーディングまたは非コーディング順序を構成するかもしれないことを理解する。現在の発明はこうして自然に起こる源の遺伝子またはｍＲＮＡ  のｍＲＮＡ  を並べる順序とともに一つ以上にｍＲＮＡ  の不安定順序対応するＤＮＡ  から成り立つｉｓＤＮＡ  を熟視する。ｉｓＤＮＡ  から成り立つこれらの並ぶ順序を含んでいる表現システムが不安定順序および並ぶ順序が得られた源ｇｅｎｅ／ｍＲＮＡ  のための特定性の混合物のために選別するのに使用することができる。
【００５３】
並ぶ順序は発明の表現システムで源の遺伝子の全体の３’ＵＴＲ  順序、または３’ＵＴＲ  順序の相当な部分からｉｓＤＮＡ  の順序を得ることによって含めることができる。なお、ｉｓＤＮＡ  は、全体か相当な３’ＵＴＲ  に加えて、同じか別の源の遺伝子のコーディングの地域からのそれから一つ以上のＣＲＤ  、か片を、含むためにかもしれない。ｅｎｔｉｒｅ／ｗｈｏｌｅ  ３’ＵＴＲ  順序が停止ｃｏｄｏｎ  からの地域を普通まで約示すかまたは含んでいることが順序をｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ  間、３’ＵＴＲ  の相当な部分は長さで含む、に、約６００  のヌクレオチドまで約１０  から構成する順序限られるかもしれない。従って、発明の他の具体化で３’ＵＴＲ  の相当な部分は約１０  約１００  までまたは約１０  約２００  まで、または約２０  約１００  まで、または約２０  から約２００  まで構成する順序を含めるまたは約２０  から約停止ｃｏｄｏｎ  までのまたは含んでいることからの地域の長さ約６００  のヌクレオチドへの、順序をｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ。
【００５４】
同様に、ｉｓＤＮＡ  は一つ以上のＣＲＤ  とともにコーディングの地域で”相当な部分”  を構成できる。コーディングの地域はように遺伝子の開始と停止ｃｏｄｏｎ  間の地域定義される。コーディングの地域の相当な部分は長さで含み、に、少なくとも１  ＣＲＤ  を組み込む約６００  のヌクレオチドまで約１０  から構成する順序限らないことができるが。発明の１  具体化では、コーディングの地域の相当な部分は約１０  から少なくとも１  のＣＲＤ  を組み込む約１００つのヌクレオチドに構成する順序を含める。他の具体化では、コーディングの地域の相当な部分は約１０  約２００  まで、または約２０  約１００  まで、または約２０  約２００  まで、または約２０  からの少なくとも１  ＣＲＤ  を組み込む約６００  のヌクレオチドに順序を含んでいる。
【００５５】
上記述されている発明の規模の内に３’ＵＴＲ  及びコーディング順序の片はまたある。従って、現在の発明の１  具体化で、片は少なくとも８つの連続的なヌクレオチドを構成する。発明の他の具体化では、片は少なくとも１０  、か少なくとも１５、か少なくとも２０  、か少なくとも２５  、か少なくとも３０  、か少なくとも３５  、か少なくとも４０  、か少なくとも４５  、か少なくとも５０  の連続的なヌクレオチドを構成する。
【００５６】
芸術で巧みな１  つはそれをまだ特定性ｍＲＮＡ  の不安定のｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｓ）  で自然に起こる遺伝子で見つけられるそれらと大幅に同一相談するかもしれないである並ぶ順序認める。従って現在の発明は片が少なくとも１  つのｍＲＮＡ  の不安定順序から成り立てば源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の地域と大幅に同一である３’ＵＴＲ  片を熟視する。従って、発明の１  具体化で、現在の発明のヌクレオチドの片は片が少なくとも１  のｍＲＮＡ  の不安定順序を含んでいれば少なくとも１０％  へ源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の少なくとも９０％  である順序の長さを含める。発明の別の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも１０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも２０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも３０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも４０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも５０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも６０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも７０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも８０％  である順序の長さを構成する。発明のそれ以上の具体化では、現在の発明のヌクレオチドの片は源の遺伝子の３’ＵＴＲ  の長さの少なくとも９０％  である順序の長さを構成する。
【００５７】
発明の他の具体化では、片が不安定順序を並べる順序とともに少なくとも１  つの不安定順序を含んでいれば、発明の片に少なくとも６０％  、か少なくとも７０％  、か少なくとも７５％  、か少なくとも８０％  、か少なくとも８５％  、か少なくとも９０％  、か少なくとも９５％  、か少なくとも９７．５％  、か３’ＵＴＲ  またはコーディングの地域のそれの少なくとも９９％  順序のアイデンティティがある。
【００５８】
１．２不安定順序の効力
上記の記述を提供されて、巧みな職人は不安定にする混合物を識別する為の発明のＤＮＡ  の表現のベクトルの使用の容易に特定の３’ＵＴＲ  不安定順序を設計できる。そのような不安定順序は、順序適切な場合には混合結合の特定性ｍＲＮＡ  の不安定順序を並べる相談するおよび少なくとも１  つのｍＲＮＡ  の不安定順序から成り立つ。
【００５９】
発明の３’ＵＴＲ  不安定順序の効力をテストするためには、遺伝子表現の調査を含む分析は熟視される。さらに、他人は芸術で巧みな労働者に親友を理解される分析する、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ  、実時間ＲＴ−ＰＣＲ  の北のしみの分析、ＲＮａｓｅ  の保護は、しみの分析およびｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  基づかせていた技術に点しみを付けるか、または細長い穴をつける。他の分析は知られている混合物とテストすることを更にｍＲＮＡ  の不安定をもたらす機能のために含むかもしれない。例えば発明の３’ＵＴＲｓ  の側面図を描くために、異常なｍＲＮＡ  の不安定をもたらすと知られている混合物は遺伝子表現（賢人）  の調査の連続分析で使用することができる。ｍＲＮＡ  の安定性に影響を及ぼすことができる混合物はｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  、トコフェロール、ｒｅｔｉｎｏｉｃ  酸、サリドマイド、ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  、およびｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  （ＲＡＡ）  を含んでいる。ＲＡＡ  は３’ＵＴＲｓ  でショウＫａｍｅｎ  箱かＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる原始ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  を含むいくつかのｍＲＮＡｓ  の低下を、促進するようである。
【００６０】
１．３レポーターの遺伝子
色々なレポーターの遺伝子は現在の発明の表現システムで遺伝子が探索可能な蛋白質を符号化すれば使用することができる。現在の発明に従って、探索可能な蛋白質は探索可能な信号を直接作り出すことが（例えば、吸光度の蛍光信号、変更、燐光性信号、薬剤の抵抗または感受性、ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｓｍ  、および同類）  または適した”共役”  との反作用か相互作用によって可能の１  である（例えば、基質、抗体、ｌｉｇａｎｄ  、および同類）  。検出を許可するために必要ならば共役は分類することができる。
【００６１】
様々なレポーターの遺伝子は芸術で知られている（、例えば、分子クローニングを見なさい：  実験室マニュアル，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  ｅｄ．  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  １９８９；  ｖａｒｉｏｕｓ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅｓ）．  適したレポーターの遺伝子の例は含みが、に限られないし、符号化の酵素、キナーゼのようなそれら、（を含むアルカリホスファターゼ（ＡＰ  及び分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ））  ホスファターゼ、それから緑の蛍光蛋白質または派生物のような符号化の蛍光か燐光性蛋白質、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ  、か。ガラクトシダーゼ、ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ  、ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  の過酸化酵素、クロロアムフェニコールのトランスフェラーゼ、ブドウ糖オキシダーゼ、シンセターゼ、そしてそれら（赤い蛍光蛋白質、礁の珊瑚の蛍光蛋白質、高められた蛍光蛋白質および不安定にされた蛍光蛋白質のような）。
【００６２】
レポーターの遺伝子が酵素を符号化するとき、酵素自体は探索可能かもしれないまたは間接的に酵素のレベルを測定するのに酵素の活動が使用されるかもしれない。現在の発明の１  具体化では、レポーターの遺伝子は酵素を符号化する。発明の別の具体化では、レポーターの遺伝子はｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  蛋白質かか。
【００６３】
ガラクトシダーゼ蛋白質を符号化する。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ  は芸術で知られ、北アメリカのホタルのような有機体、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  のｐｙｒａｌｉｓ  から得ることができる；  海のパンジー、Ｒｅｎｉｌｌａ  のｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ；  そして細菌、ビブリオのｆｉｓｃｈｅｒｉ。
【００６４】
１．４  表現のベクトル
分子生物学の分野で巧みなそれらは色々表現のベクトルが発明のＤＮＡ  の表現システムを提供するのに使用することができることを理解する。例えば、細胞の安定したｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  のために適したいくつかのベクトルは公衆に利用できる、会う、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  等に；  そのような細胞ラインを組み立てる為の方法はＡｕｓｕｂｅｌ  等でまた利用できる、例えば、公に。ベクトルはプラスミッド、ウイルスの粒子、バクテリオファージ、等の形に、例えば、あるかもしれない。そのようなベクトルは含んでいるが、に、染色体、ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  そして総合的なＤＮＡ  順序、ＳＶ４０  の例えば、派生物限られない；  細菌のプラスミッド；  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ；  イーストプラスミッド；  ベクトルはｖａｃｃｉｎｉａ  のようなプラスミッドおよびｐｈａｇｅ  ＤＮＡ  、ウイルスのＤＮＡ  、アデノウィルス、家禽のｐｏｘ  のウイルス、およびｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  の組合せから得た。但しホストでｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ  そして実行可能である限り、他のベクトルかプラスミッドは使用されるかもしれない。
【００６５】
適切なＤＮＡ  順序は色々なプロシージャによってベクトルに挿入されるかもしれない。大将では、ＤＮＡ  順序は芸術で知られているプロシージャによって適切な制限のｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  の場所に挿入される。そのようなプロシージャおよび他は芸術で巧みなそれらの規模の内であると考えられる。  現在の発明の表現のベクトルはｍＲＮＡ  の統合を指示するために有効に適切な表現制御ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｓ）  につながるレポーターの遺伝子から成り立つ。そのような促進者の代表的な例として、そこに述べられるかもしれない：  リットルかＳＶ４０  促進者、Ｅ．  大腸菌のラックまたはｔｒｐ  、ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  またはｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  細胞またはウイルスの遺伝子の表現を制御すると知られているｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ＰＬ  の促進者および他の促進者。ベクトルはまた増幅の表現のための適切な順序が含まれるかもしれない。
【００６６】
それ以上の発明は探索可能な信号持っている蛋白質の表現に遺伝子が促進者や増強物の地域を含む適切な表現制御から成り立つ準の５’  及び３’  ＵＴＲ  順序とともに蛋白質のアミノ酸順序のためのＤＮＡ  のコーディングを構成する及びｉｓＤＮＡ  順序を提供するか遺伝子のコーディングから成り立つレポーターの遺伝子のＤＮＡ  の表現システムを。ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  順序及び他の表現の制御シーケンスの適切な選択は芸術の熟練労働者の範囲の内に問題よく、発明の本質的な一部分にならない。従って例えばｍａｍｍａｌｉａｎ  細胞の表現のためにＳＶ４０  、ＣＭＶ  またはＨＳＶ  のようなウイルスの促進者か。Ｉ  促進者は使用されるかもしれない。
【００６７】
さらにｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  の還元酵素、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  またはｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  細胞培養のためのネオマイシンの抵抗、またはＥ．  大腸菌のテトラサイクリンまたはａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  の抵抗のような変形させた宿主細胞の選択に表現型特性を提供するために、表現のベクトルは遺伝子を含むかもしれない。
【００６８】
ｉｓＤＮＡ  はレポーターの遺伝子の３’  ＵＴＲ  に普通挿入される。従って例えば、ｉｓＤＮＡ  順序は天然レポーターの遺伝子の３’  ＵＴＲ  の適した制限の場所に挿入される。適切な制限の酵素の場所はレポーターの遺伝子３’ＵＴＲ  にｉｓＤＮＡ  の挿入を許可するために芸術で知られている標準的な技術を使用して３’ＵＴＲ  順序やｉｓＤＮＡ  順序に導入されるかもしれない。
【００６９】
１．５  宿主細胞
宿主細胞はこの発明の表現のベクトルと遺伝的に（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  か、または変形させるまたはｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）  設計されるかもしれない。設計された宿主細胞は活動化の促進者、かｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ  を選ぶ為に適切ように変更される慣習的な栄養媒体で培養することができる。文化条件は、温度、ｐＨ  および同類のような、前にに選ばれる宿主細胞と使用されるそれら通常巧みな職人に明白である。ＤＮＡ  の表現システムは固定して変形させた細胞ラインのような適切に変形させた細胞ラインの形に細胞によって基づかせている表現システム、便利に、であるかもしれない。宿主細胞はｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  またはｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  宿主細胞であるかもしれない。
【００７０】
適切なホストの代表的な例として、そこに述べられるかもしれない：  細菌の細胞、Ｅ．  大腸菌のような、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  サルモネラストレプトミセス；  イーストのようなｆｕｎｇａｌ  細胞；  ショウジョウバエＳ２  及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９  のような昆虫の細胞；  ＣＨＯ  、ＣＯＳ  またはＢｏｗｅｓ  のｍｅｌａｎｏｍａ  のような動物の細胞；  アデノウィルス；  植物の細胞、等。適切なホストの選択は教授からの芸術で巧みなそれらの規模の内であるとここに考えられる。
【００７１】
宿主細胞は不安定にすることを望むｍＲＮＡ  によってのためにコードされる蛋白質を表現する細胞と同じ一般的な細胞のタイプであるかもしれない。従って例えば発明の試金がｃｙｔｏｋｉｎｅ  のためのｍＲＮＡ  のコーディングを不安定にする混合物の同一証明に使用するべきなら、使用される宿主細胞は普通質問のｃｙｔｏｋｉｎｅ  を作り出す細胞へ同じであるまたは同じような細胞のタイプかもしれない細胞または細胞ラインである。例えば、ｍｏｎｏｃｙｔｅ  かｍｏｎｏｃｙｔｅ？ｌｉｋｅ  の細胞ラインはｃｙｔｏｋｉｎｅ  を不安定にする混合物、例えばＩＬ  のために試金のために宿主細胞として（ＴＨＰ−１  のような）  使用されるかもしれないか。１ｓｓ  のｍＲＮＡ  。ｏｎｃｏｇｅｎｅ  のために有用な細胞ライン及び他の癌関連遺伝子のｍＲＮＡ  の不安定の試金は、例えばＣＯＬＯ  ２０５  、ＫＢ−３１  、ＫＢ−８５１１  、ＤＵ１４５  、ＨＣＴ１１６  、ＭＣＦ７  、ＭＣＦ７／ＡＤＲ  、ＭＤＡ？ＭＢ？２３１  、ＭＤＡ？ＭＢ？４３５  およびＭＤＡ？ＭＢ？４３５／ＴＯ  ある。細胞はｃｙｔｏｋｉｎｅ  を不安定にする混合物の同一証明のための発明の試金の宿主細胞として使用のために、例えばＩＬ  並ぶか。１ｓｓ  のｍＲＮＡ  はＴＨＰ  であるか。Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．  著記述されている１  つの細胞ライン（例えば、１９９１  型の、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  、４７：  ２２？３０）  及び同じようなｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  の例えば人間の白血病、細胞並ぶ。
【００７２】
ｍＲＮＡ  の不安定化のメカニズム、およびこれに於いてのｍＲＮＡ  の不安定順序の役割は、十分に理解されないが、不安定にする混合物のほかの他の要因の存在およびｍＲＮＡ  の不安定順序がｍＲＮＡ  の不安定化に起こるように要求されること明確である；  例えば前に識別された文献の参照で論議される。従って現在の発明の１  具体化ではそのような他の要因および補足物を提供するか、またはｍＲＮＡ  の不安定化をもたらすために混合物およびｍＲＮＡ  の不安定順序の相互作用を完了する宿主細胞は選ばれる。ｍＲＮＡ  の不安定化に必要な細胞要因の提供された高められたレベルにｍＲＮＡ  の不安定化を、例えば高めるように変形させた宿主細胞は刺激されるか、または別の方法で活動化させるかもしれない。例えば、増進された結果は発明の試金で区別された変形させた宿主細胞が使用されれば得られるかもしれない。例えば、変形させたＴＨＰ？１  細胞の場合には、よい結果は変形させたＴＨＰ  得ることができるか。１  細胞は？ＩＦＮ  及びＬＰ  とＴＨＰ  のために正常なように育ち、区別され、そして刺激されるか。例で以下記述されている１  細胞、例えば。
【００７３】
２．ｍＲＮＡ  の安定性に影響を与える混合物を識別する為の試金そして方法
発明の別の具体化ｍＲＮＡ  の構成を不安定にする混合物の同一証明のための試金システム；  上定義されるレポーターの遺伝子のＤＮＡ  の表現システム、および構成する制御ＤＮＡ  の表現システム；  遺伝子が適切な表現の制御要素から成り立つ機能ｍＲＮＡ  の不安定順序に欠けている準の５’  及び３’  ＵＴＲ  順序とともに蛋白質のアミノ酸順序のためのＤＮＡ  のコーディングを構成するが、か探索可能な信号を持っている蛋白質の表現のための遺伝子のコーディングはに提供される。
【００７４】
レポーターの遺伝子のＤＮＡ  の表現システムおよび制御ＤＮＡ  の表現システムは両方固定しての形にｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  細胞ラインをあるかもしれない。
代わりに、レポーターの遺伝子表現システムはｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ  として使用されるテスト混合物がない時テストするテスト混合物の存在そして不在でテストされるかもしれない。発明の別の具体化に制御ＤＮＡ  の表現システムはまたレポーターの遺伝子のＤＮＡ  の表現システムと同じ細胞ラインにあるかもしれない。制御ＤＮＡ  の表現システムはレポーターの遺伝子表現システムによってのためにコードされる蛋白質と異なっているコードし探索可能な蛋白質のためにこの場合の前にように、制御ＤＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  システムが機能ｍＲＮＡ  の不安定順序に欠けている。
【００７５】
発明の試金でｍＲＮＡ  を不安定にする混合物の存在は制御と比較して混合物の前で表現システムから作り出される蛋白質によって与えられる探索可能な信号の大きさの減少によって示される；  混合物によるレポーターの遺伝子のｍＲＮＡ  の不安定化は蛋白質の表現の減少およびこうして信号の大きさの減少をもたらす。発明の試金の使用のための適した制御は対応するＤＮＡ  の表現システム、すなわち含んでいる探索可能な蛋白質の表現のための順序のコーディングをから成り立つが、レポーターの遺伝子のＤＮＡ  の表現システムにｍＲＮＡ  の不安定順序に対応する順序を含んでいない。制御ＤＮＡ  の表現のレポーターの遺伝子表現システムと同一であるｍＲＮＡ  の不安定順序に対応するＤＮＡ  はｍＲＮＡ  の不安定順序として取除かれるか、削除されるか、または他では不具になった。制御ＤＮＡ  の表現システムはまた変形させた細胞ライン、普通同じ宿主細胞ライン、例えばＴＨＰ  から得られる固定して変形させた細胞ラインの形にあるかもしれないか。レポーターの遺伝子として１  つの細胞ラインは、細胞ラインを変形させた。
【００７６】
現在の発明のＤＮＡ  の表現システムはｍＲＮＡ  を不安定にすることができるスクリーニングの混合物に使用することができる。従って、発明の１  具体化でそこにｍＲＮＡ  の低下の構成を引き起こす混合物の同一証明そしてスクリーニングに方法提供される：  コードする蛋白質のために表現システムから転写され、ｍＲＮＡ  がｍＲＮＡ  の不安定順序の最少の１  枚のコピーで構成するか混合物の不在で探索可能な信号を持っている蛋白質を表現することができるテスト混合物の存在の探索可能な信号を測定し、得られる制御と結果を比較するＤＮＡ  の表現システムが付いている混合物に連絡する。
【００７７】
例えば、ｍＲＮＡ  を不安定にすることができる混合物はｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  のフォーマットの発明のＤＮＡ  の表現のベクトルと培養細胞によって固定してｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  識別することができる。夜通しの孵化の後で、ｍＲＮＡ  を不安定にする機能のために選別される混合物は適切な集中の井戸、か集中および適した期間のｃｏｍｐｏｕｎｄ（ｓ）  の前でｉｎｃｕｂａｔｅｄ  扱われた細胞の範囲に加えることができる（例えば、約４  のそして約１６  時間間で）  。孵化の後で、ＤＮＡ  の表現システムのレポーターの遺伝子によって作り出される信号を検出するために必要などの試薬でも井戸に加えられ、それぞれで発生する信号の量はよく測定される（例えば、適切な探知器と共の多版の読者の使用によって）  。信号の量は制御、制御についてテスト混合物の効力を定めるために単独で溶質か培養基と扱われる例えば、細胞とそれから比較される。
【００７８】
それらの表現のためにある圧力の条件の下で正常な生理学的な条件増加の下でｍＲＮＡ  の安定性に安定性影響を与えない不安定、表現システムから成り立つ細胞服従しなければならない配列するから成り立つシステムがテストｃｏｍｐｏｕｎｄ（ｓ）  の付加前の圧力の条件にことが芸術で巧みな労働者によって理解される。従って、例えば、ＶＥＧＦ  の低酸素症の範囲から成り立つ表現システムのために細胞はテスト混合物の付加前の低い酸素の条件に服従しなければならないすなわち制御の要因（酸素）  はｍＲＮＡ  を不安定にする機能のために混合物をテストする前に減らなければならない。
【００７９】
発明の別の具体化ではコードする蛋白質のために表現システムから転写され、ｍＲＮＡ  が各テスト混合物の存在の探索可能な信号を測定し、得られる信号を比較するｍＲＮＡ  の不安定順序の最少の１  枚のコピーで構成するか別に混合物の不在で探索可能な信号を持っている蛋白質を表現することができるＤＮＡ  の表現システムが付いている混合物に連絡するから成り立つｍＲＮＡ  の低下を引き起こす混合物の比較のための方法はに提供される。この方法は存在がｍＲＮＡ  の低下のすばらしい範囲を引き起こすより低い手段探索可能な信号で起因する混合物と２  つまたはより多くの混合物によって引き起こされるｍＲＮＡ  の低下の範囲を比較する。
【００８０】
レポーターの遺伝子によって作り出される探索可能な信号を検出するおよび／または測定する方法は芸術で有名、関連した文献で広く記述されている。用いられた方法は選ばれたレポーターの遺伝子に依存して、適切な方法の選択は芸術の労働者の通常の技術の内にある。上示されるように、探索可能な信号はレポーターの遺伝子によって符号化される蛋白質によって直接作り出されるかもしれないか、または間接的に作り出されるかもしれない。
【００８１】
芸術で巧みな１  つは直接探索可能な信号が付加的な部品を、信号の検出を可能にするために試薬、ライト、および同類を誘発する基質のような要求するかもしれないことを理解する。間接的に探索可能な信号は探索可能な蛋白質に普通その”共役”  の使用をとりわけ結合する含む直接探索可能なラベルに付すか、またはつながれ。そのような共役を総合する為の連結化学は芸術で有名である。探索可能な蛋白質と共役の間の不良部分は普通化学または性質の身体検査である。そのような結合の組の例は含んでいるが、に、抗原及び抗体限られない；  ａｖｉｄｉｎ／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  及びビオチン；  ｈａｐｔｅｎｓ  のために特定のｈａｐｔｅｎｓ  及び抗体；  受容器及び受容器の基質；  酵素および酵素の補足因子／基質、および同類。お好みであれば共役は知られていた技術を使用して類縁のマトリックスに更に付すかもしれない。
【００８２】
共役と使用されるかもしれない直接探索可能なラベルの例は含んでいるが、に、蛍光一部分（フルオレスセインを含む蛍光染料のようなおよび派生物、テキサスの赤、ローダミンおよび派生物、ｄａｎｓｙｌ  、ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ  、または蛍光染料を含んでいるビードまたはｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）  、電子密な一部分、探傷、ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｓ  化学ルミネセンスの一部分（ｌｕｍｉｎｏｌ  を含むｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  そして２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  のような、）  、磁気（３Ｈ  、１２５．Ｉ  、３５Ｓ  、１４Ｃ  、３２Ｐ  または３３Ｐ  のような）  、熱量測定ラベル、核酸の（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  臭化物、ＳＹＢＲ  の緑のような）  限られない（コロイド金のようなまたはガラスかプラスチック着色されるビード）。
【００８３】
信号検出は色々知られていた方法の１  つによって、分光、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  、光化学、生化学的な、ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  、電気の、光学上昇温暖気流を含んで進むことができるまたは化学平均、目視検差、または色に基づく分子を追跡する他の方法は、充満か類縁大きさで分類する。従って信号が蛍光一部分のためにそうなったものであるところで、例えば、検出はライトの適切な波長および生じる蛍光性の検出の螢光色素の刺激によって顕微鏡検査、目視検差、写真フィルムによって、使用、電荷結合素子（ＣＣＤｓ）  または光電子増倍管および光電管、および同類、デジタルカメラのような電子探知器の例えば行う、場合もある。シンチレーションカウントを含む冷光を、検出するために同じような方法は用いることができる。信号がｒａｄｉｏｌａｂｅｌ  のためにある一方、検出のための平均はシンチレーション計数装置及び放射線写真法を含んでいる。
【００８４】
２．１  ｍＲＮＡ  の低下を引き起こすことができる混合物
ｍＲＮＡの不安定順序を含んでいる、ｍＲＮＡｓの不安定を促進する混合物は現在の発明の試金を使用して識別することができる。  従ってそのような混合物がｍＲＮＡｓの低下を使用されるかもしれ、防ぎか、または不適当なｍＲＮＡの蓄積を逆転させ、そしてそれにより減るか、または不必要な蛋白質引き起こすのに、例えばｃｙｔｏｋｉｎｅ、表現を防ぐ。  そのような混合物は不適当なｍＲＮＡ安定および蓄積および結果として生じる望ましくない蛋白質の表現含む病状である、か病気の予防法のために調剤上可能性としては有用か処置。
【００８５】
従って即刻の発明は現在の発明に従って現在の発明の方法、またはＤＮＡ  の表現システムまたは試金システムの使用によって確認可能なｍＲＮＡ  を不安定にする混合物を提供する。
【００８６】
３．ＤＮＡ  の表現システムの適用
３．１  高効率の分析
芸術で巧みな１  つはスクリーニングのステップで使用される技術が高効率の分析の容易に合わせることができることを認める。高効率スクリーンは大多数のサンプルを同時に処理する利点を提供し、かなり多数のサンプルを選別するために必要な時間を減らす。従ってｍＲＮＡ  の安定性に影響を与える混合物を識別するために現在の発明は混合物の図書館を選別する為の高効率方法の使用を熟視する。
【００８７】
高効率のスクリーニングのために、反作用の部品は通常多容器のキャリアかプラットホームで、同時に監視されるべき別のテストサンプルを含んでいる反作用の大多数を可能にするそれぞれｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  のｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  の版のような収容される。スクリーニング工程の効率を高めるために現在の発明はまた非常に自動化された高効率スクリーンを熟視する。多くの高効率のスクリーニングまたは試金システムは大いにより速い効率の時間に終ってｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  にサンプル、適切な探知器のｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  のｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ  およびｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  の読書を、書式作成する液体の分配の、時限孵化ピペットで移すサンプル及び試薬のような多くのプロシージャのためのオートメーションの機能があるように、今利用できる商業的に。
【００８８】
３．２  公式／キット
現在の発明のＤＮＡ  の表現システムか試金を含んでいるＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ／ｋｉｔｓ  は芸術の知られていた技術によって準備することができる。現在の発明はｍＲＮＡ  を不安定にする混合物の識別で使用のためのレポーターの遺伝子の試金を含んでいるキットをその上に提供する。キットの内容はｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  、キットはその上にｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  部品の再構成のための適した溶媒を含むことができる。キットの個々の部品は別の容器で包まれ、そのような容器によって関連付けられて、指示のリストである場合もある。
【００８９】
３．３  薬物の構成
現在の発明の、または現在の発明に従ってＤＮＡの表現システムを用いて方法によってか試金システム識別される混合物は不適当なｍＲＮＡ安定および結果として生じる望ましくない蛋白質の表現または蓄積含む病状である、か病気の予防法のための可能性としては有用な医薬品か処置。  従って現在の発明は識別された混合物で１つ以上を構成する薬物の構成を提供する。
【００９０】
現在の発明の薬物の構成そして薬物は口頭で、原則的に、非経口的に、吸入かスプレーによってまたは直腸に慣習的で無毒な受諾可能なキャリア、アジェバントおよび車を調剤上含んでいる適量の単位の公式で管理されるかもしれない。    ここに使用されるように非経口的な言葉はｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ注入、ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ、筋肉内、ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌの注入または注入の技術を含んでいる。    調剤上活動的な混合物か塩はそれから受諾可能なキャリアや希釈剤やアジェバントおよび、お好みであれば、他の有効成分と共同して調剤上１つ以上の無毒かもしれない。
【００９１】
現在の発明に従って現在の発明の方法、またはＤＮＡ  の表現システムまたは試金システムの使用によって識別される混合物は不適当なｍＲＮＡ  安定および結果として生じる望ましくない蛋白質ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  を含む病状である、または病気の予防法または処置のための可能性としては有用なｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  。従って現在の発明は識別された混合物で一つ以上を構成する薬物の構成を提供する。現在の発明の薬物の構成そして薬物は口頭で、原則的に、非経口的に、吸入かスプレーによってまたは直腸に慣習的で無毒な受諾可能なキャリア、アジェバントおよび車を調剤上含んでいる適量の単位の公式で管理されるかもしれない。ここに使用されるように非経口的な言葉はｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  注入、ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  、筋肉内、ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ  の注入または注入の技術を含んでいる。調剤上活動的な混合物か塩はそれから受諾可能なキャリアと共同して一つ以上の無毒な調剤上あるかもしれないおよび／または希釈剤やアジェバントおよび、お好みであれば、他の有効成分は、タブレットとして、口頭使用のために、例えばトローチ適したである、形態に薬物の構成菱形、水様か油性懸濁液、分散性の粉または微粒、乳剤堅くか柔らかいカプセル、またはシロップまたはエリクシルかもしれない。口頭使用のために意図されている構成は薬物の構成の製造のために芸術に知られている方法に従って準備され、優雅で、美味しい準備を調剤上提供するために維持の代理店甘くなる代理人、ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  代理人、着色の代理人のグループから選ばれる一つ以上の代理店を含むかもしれない。タブレットは適した無毒な受諾可能な結合剤が付いている混和で有効成分をを含む、カルシウム炭酸塩、炭酸ナトリウム、ラクトーゼ、カルシウム隣酸塩またはナトリウム隣酸塩のような例えば、不活性の希釈剤、調剤上含んでいる；  粒状になること及び崩壊の、トウモロコシ澱粉のような代理人、またはアルギン酸；  澱粉、ゼラチンまたはアカシア、およびマグネシウムのステアリン酸塩、ステアリン酸またはタルクのような代理店に、油を差すことのような結合代理店。タブレットは光沢が無い場合もあるかまたは胃腸地域の崩壊そして吸収を遅らせ、長期にわたる支えられた行為を提供するためにそれにより知られていた技術によって塗られるかもしれない。例えば、ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ  またはｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒａｔｅ  のような時間の遅れ材料は用いられるかもしれない。
【００９２】
口頭使用のための薬物の構成はまたとして有効成分がピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油のような水かオイル媒体と混合されるか有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば、カルシウム炭酸塩と、カルシウム隣酸塩かカオリン混合される、または柔らかいゼラチンカプセルかもしれないか堅いゼラチンカプセルとして示される。
【００９３】
口頭使用のための薬物の構成はまたとして有効成分がピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油のような水かオイル媒体と混合されるか有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば、カルシウム炭酸塩と、カルシウム隣酸塩かカオリン混合される、または柔らかいゼラチンカプセルかもしれないか堅いゼラチンカプセルとして示される。
【００９４】
水様の懸濁液は混和で活動的な混合物をとの含んでいる適した結合剤を含む、例えば、中断代理店、ナトリウムカルボキシメチルセルロースのような、メチルのセルロース、ｈｙｄｒｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ナトリウムのアルジネート、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、トラガカントゴムおよびアラビアゴム；  自然発生するリン脂質、例えば、レシチン、または脂肪酸、例えば、ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｅｎｅのステアリン酸塩、または長い鎖の脂肪性のエチレン酸化物の縮合生成物が付いているアルキレンの酸化物の縮合生成物のような分散するまたは湿潤剤部分的なエステルが付いているエチレン酸化物のアルコール、例えば、ｈｅｐｔａ−ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ、か縮合生成物は脂肪酸およびヘキシット脂肪酸およびヘキシットの無水物の例えば、ポリエチレンのｓｏｒｂｉｔａｎのｍｏｎｏｏｌｅａｔｅから得られた部分的なエステルが付いているエチレン酸化物の例えばから、ポリオキシエチレンのソルビトールのｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ、または縮合生成物得た。水様の懸濁液はまた１つ以上の防腐剤、例えばエチル、かｎ−ｐｒｏｐｙｌ  ｐヒドロキシ安息香酸塩の１含むかもしれない、またはより多くの着色の代理人、１つ以上の香料添加剤かサッカロースまたはサッカリンのような１つ以上の甘くなる代理人。
【００９５】
油性懸濁液は植物油、例えば、落花生オイル、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油、または液体パラフィンのようなミネラルオイルで有効成分を中断することによって作り出すことができる。油性懸濁液は厚化の代理人、例えば、蜜蝋、堅いパラフィンまたはｃｅｔｙｌ  アルコールを含むかもしれない。美味しい口頭準備を提供するために上述べられるそれらのような甘くなる代理店および／またはｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  代理店は加えられるかもしれない。これらの構成はアスコルビン酸のような酸化防止剤の付加によって維持することができる。
【００９６】
水の付加によって水様の懸濁液の準備のために適した分散性の粉および微粒はディスパーシングか湿潤剤、中断代理店および一つ以上の防腐剤を混和の有効成分に与える。適したディスパーシングまたは湿潤剤および中断代理店は上記されるそれらによって既に例証される。付加的な甘く結合剤、例えば、風味を付け、着色の代理店甘くなることは、またあるかもしれない。
【００９７】
発明の薬物の構成はまたｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  乳剤の形にあるかもしれない。オイル段階は植物油であるかもしれない例えば、オリーブ油か落花生オイル、またはミネラルオイルは、例えば、液体パラフィン、またはそれこれらのオイルのであるかもしれない混合物。適した乳状になる代理店はｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ゴム、例えば、アラビアゴムまたはゴムのトラガカントゴムであるかもしれない；  ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  リン脂質、例えば、大豆の豆、レシチン；  またはエステルか部分的なエステルは脂肪酸およびヘキシットの無水物、例えば、ｓｏｒｂｉｔａｎ  のｍｏｎｏｌｅａｔｅ  、およびエチレン酸化物、例えば、ポリオキシエチレンのｓｏｒｂｉｔａｎ  のｍｏｎｏｌｅａｔｅ  が付いている前述の部分的なエステルの縮合生成物から得た。乳剤はまた甘く及びｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  代理店を含むかもしれない。
【００９８】
シロップ及びエリクシルは甘くなる代理人、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはサッカロースと作り出されるかもしれない。そのような公式はまたｄｅｍｕｌｃｅｎｔ  、防腐剤およびｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  および着色の代理店含むかもしれない。
【００９９】
薬物の構成は生殖不能のｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  水様かｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  懸濁液の形にあるかもしれない。この懸濁液は上記されるそれらのような適したディスパーシングまたは湿潤剤そして中断代理店を使用して知られていた芸術に従って作り出されるかもしれない．    生殖不能の注射可能な準備はまた１，３ブタンジオールの解決として無毒な親によって受諾可能な希釈剤の生殖不能の注射可能な解決または懸濁液または溶媒、例えば、であるかもしれない。    用いられるかもしれない溶媒および受諾可能な車は含んでいるが、に、水、信号器の解決限られなかったり、解決および等張の塩化ナトリウムの解決信号器の泌乳しなかった。  他の例は、溶媒として通常または中断媒体用いられる、および色々柔和な固定オイルを含む、例えば、総合的なモノラルかｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓある生殖不能の、固定オイル。  さらに、ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｓの準備のオレイン酸酸の発見の使用のような脂肪酸。
【０１００】
薬物の構成を準備する他の薬物の構成そして方法は芸術で知られ、例えば、記述されている"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ"  （ｆｏｒｍｅｒｌｙ  "Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"）；  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ  （２０００）。
【０１０１】
ここに記述されている発明のよりよい理解を得るためには次の例は述べられる。これらの例がイラストラティブ目的だけのためであることが理解されるべきである。従って、それらはどうにかこの発明の規模を限るべきでない。
【０１０２】
実施例
Ｋａｓｔｅｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １９９６，  ８：７５１-７６１），  前にｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  が（次に示されている）  不安定ＡＵ？ｒｉｃｈ  の要素を通ってｍＲＮＡ  の（相談することを混合物）  モチーフは遺伝子の３’  未翻訳の地域にｍＲＮＡ  の不安定に応じて置いた（３  ’  ＵＴＲ）  示される。例のためＡＲＥｓ  すべてを削除された含んでいるおよび生じるＩＬ？１ｓｓ？ＡＵ  のＤＮＡ  は表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  だったＩＬ？１ｓｓ  の３’  ＵＴＲ  の１−５  、区分。固定してＴＨＰ  をｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  か。この構造物を含んでいる１  細胞はＲＮａｓｅ  の保護方法（Ｋａｓｔｅｌｉｃ  等のｉｂｉｄ  は。）  によって分析されたそしてＡＵ？ｌｅｓｓ  の示されていた抵抗はｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の方のＲＮＡ  を得た。
【０１０３】
ＩＬ  の３’ＵＴＲ  か。１ｓｓ  ｍＲＮＡ  は３  によってがタンデムにの合計をある６  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフ含んでいる（図１）  を見なさい。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  レポーターの遺伝子の試金の構造の場合、私達は３  つのタンデム繰り返しを含んでいるかどれが図１  で示されている下線を引かれた順序から成り立つ片しか使用しなかった。
【０１０４】
【化１】
2007530058.tif 000007
【実施例１】
【０１０５】
例１：  ｐＧＬ２  Ｎｅｏ３０  及び安定した細胞ラインの構造
安定した統合のためのベクトルをＴＨＰ  に得るためか。１  細胞、ＸｈｏＩ  か。（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ３’ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  を表現する）  ｐＧＬ２？Ｃｏｎｔｒｏｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  のＳａＩＩ  の場所にｐＭＣ１ｎｅｏＰｏｌｙＡ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）  から得られた新抵抗力がある遺伝子のＳａＩＩ  の片はｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  あった。この生じるプラスミッドはｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  と呼ばれた。（３  つのタンデムＡＵＵＵＡ  のモチーフを含み、ＩＬ？１ｓｓ  ３’ＵＴＲ  順序を並べる）  ３０ｂｐ  片は２  つの補足の総合的なオリゴヌクレオチドの焼きなましによって図２）  がＰｆｌＭＩ  の制限の場所を使用してｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  にｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  あったことを得た（見なさい。これはｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０  （図３．Ａ）  で起因する。図２  はｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  のＰｆＩＭＩ  の場所にｌｉｇａｔｉｏｎ  に使用する３  つのタンデムＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいるＩＬ？１ｓｓ  ３’ＵＴＲ  順序を示す。（図３Ｂ）  表現のベクトルｐＧＬ２βｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  にｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０  及びｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  でｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子と同じ促進者（ＳＶ４０）  が運転するｌａｃＺ  の遺伝子、プラスミッドｐＧＬ２？ｓｓ？ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  が含んでいないｍＲＮＡ  の不安定順序をあるが。ｌａｃＺ  の遺伝子はｐＳＶ  ベータガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）  のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  の制限のダイジェストから得られ、ｐＧＬ２Ｃｏｎｔｒｏｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  の場所にｓｕｂｃｌｏｎｅｄ。
【０１０６】
ＴＨＰ−１  細胞はｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  によってｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  及びｐＧＬ２  ｓｓ  ガラクトシダーゼのベクトルと（制御細胞ラインを発生させるため）  またはｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０  及びｐＧＬ２  ｓｓ  ガラクトシダーゼのベクトルとそれからｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  あった。１．３ｍＭ  のＫＨ２ＰＯ４  、７．３６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  、２．４４ｍＭ  のＫＣｌ  、１２４ｍＭ  のＮａＣｌ  、５ｍＭ  のブドウ糖、９．６４．Ｍ  のＭｇＣｌ２  および１６．Ｍ  のＣａＣｌ２  ｐＨ  ７．２  の１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  は（２５０Ｖ  、６９０．Ｆ  および不明確な抵抗）  ０．４ｃｍ  のキュヴェットを使用してＢｉｏ  ラド遺伝子のＤＮＡ  の２０．ｇ  とｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｐｕｌｓｅｒ  あった。細胞は１０％ＦＢＳ  、（Ｌ  グルタミン）  ２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ  、Ｇ４１８  （ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）  の５０．Ｍ  の２  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  および６００．ｇ／ｍｌ  を含んでいるＲＰＭＩ  媒体で続いて培養された。
【０１０７】
ＴＨＰ−１  細胞へのｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０  そしてｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  の後で、Ｇ４１８  抵抗力がある安定した細胞ラインはＧ４１８  の選択によって得られ、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動のために試金された。Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  の細胞ラインはまた内部制御として役立つことができるｓｓ  ガラクトシダーゼの活動のために試金された（例５  を次に見なさい）  。各ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  の１  つの細胞ラインはそれ以上の分析のために選ばれた；  ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０／  のｐＧＬ２  ｓｓ  ガラクトシダーゼの細胞ラインはクローン第５３  とクローン第６３  として及びｐＧＬ２＿Ｎｅｏ／  のｐＧＬ２  ｓｓ  ガラクトシダーゼの細胞ライン言われた。内生ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動は正常なＴＨＰ−  １  の細胞で検出できない。  ティッシュの文化及びｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動の測定は下記に記されているように遂行された。
【０１０８】
ティッシュ文化：
人間のｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  白血病の細胞を並べたり、クローンとして作る第５３  をｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  、６３  は１１０  Ｕ／ｍｌ  のペニシリン、１００  ．ｇ／ｍｌ  のストレプトマイシン、２  ミリメートルＬ−Ｇｌｎ  および２  ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３  と補われるＲＰＭＩ  媒体で育つ。Ｈｅａｔ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＦＢＳ  （５％）  は使用の前に加えられる。細胞は５  ｘ  １０５／ｍｌ  の密度に育ち、１００  Ｕ／ｍｌ  （最終的な集中）  とγＩＦＮ  区別するために引き起こされる。後で３  時間、ＬＰ  （５．ｇ／ｍｌ  最終的な集中）  の１０  ．ｌ  は加えられる。今回ポイントは時間０  示される。混合物は示されるようにＬＰ  の付加の後で別々の機会に加えられる。
【０１０９】
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動の測定：
９６  の健康な版の使用にシステムを合わせるためには、細胞はＰａｃｋａｒｄ  の平底のＲＰＭＩ  の中型の欠乏のフェノール赤（ＡＭＩＭＥＤ）  の白いポリスチレンのｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ  （猫第６００５１８０）  で育った。細胞は５  時ｘ  １０４／ｗｅｌｌ  でめっきされた。細胞の処置の後で、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  はＰａｃｋａｒｄ  Ｌｕｃ  ライトシステムを使用して測定された（１００  Ｕ／ｍｌ  の最終的な集中への５  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  、ｇＩＦＮ  （１０００Ｕ／ｍｌ  、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  、第１０５０４９４）  およびＬｕｃ  ０．２５％  の（ｖ／ｖ）  ライトの増強物の細胞の懸濁液への２０５．ｌ．  の最終的な容積の製造業者の指示に従って猫第６０１６９１  １）  は簡潔に、加えられた。３  時間の孵化のＬＰ  （５０．ｇ／ｍｌ  シグマ、Ｌ？８２７４）  の後で弾力性５．ｇ／ｍｌ  の最終の集中に加えられた。細胞は平底の白いポリスチレンのｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ  （Ｐａｃｋａｒｄ  の猫に５  ｘ  １０４／１００  ．ｌ／ｗｅｌｌ  でそれからめっきされた。第６００５１８０）  及び１６  時間ｉｎｃｕｂａｔｅｄ  。混合の解決または標準車の５  ．ｌ  はそれから加えられ、細胞は示されるように更にｉｎｃｕｂａｔｅｄ  。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の基質の解決の１００  ．ｌ  は加えられ、版はＴｏｐＳｅａｌ？Ａ  のｐｒｅｓｓ？ｏｎ  の付着力のシーリングフィルム（Ｐａｃｋａｒｄ  猫で覆われた。２２．ｏＣ  のＰａｃｋａｒｄ  の上の計算のシンチレーション計数装置との冷光を測定する前の第６００５１８５）  。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  信号は少なくとも９０  分の間安定していた。
【０１１０】
２つの細胞ライン、（ａ）第５３および（ｂ）  ６３のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの活動の微分のの依存した誘導はテストされ、得られる結果はｆｉｇｓ．  ４  ａおよびｂ．で示されている。  両方のクローンではｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの表現の明瞭な誘導は、試金の時中の活動の維持のハイレベル観察された。  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのこの高く、一定した表現はｍＲＮＡの不安定を引き起こす混合物の効果を分析した場合留意されるべきである。  ｍＲＮＡの低下が野生タイプＴＨＰ−  １の細胞の状態とは違うｄｅ  ｎｏｖｏのトランスクリプションが付いている一定した競争に、ＩＬ−１sのｍＲＮＡの場合には、ハイレベル１６時間得られたＬＰの付加の後のある。  １つはｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの場合にはｒａｄｉｃｉｃｏｌのアナログａの場合には次に見なさい、トランスクリプションが高く残るのでｍＲＮＡの不安定にする薬剤のより弱い効果を見ると、ように観察された期待する。
【実施例２】
【０１１１】
例２：  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡおよび蛋白質の半分の生命
ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  蛋白質の安定性を通って潜在的なｍＲＮＡ  の不安定にする代理店のための試金のための最適のひとときを定めるためにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  蛋白質の活動を使用してｍＲＮＡ  の低下を測定するためにはｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の酵素の半減期を知っていることは重要である。可能性はｍＲＮＡ  が蛋白質の長い半減期のために低下できること高い酵素活動主張できるある。従って私達はｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  の抑制剤のアクチノマイシンＤ  （行為ｄ）  か翻訳の抑制剤のの付加の後のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）  分析した。図５  はことを２０．ｇ／ｍｌ  行為の前で示す。２０  ．Ｍ  の前のと同様、Ｄ  はＣＨＸ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動急速に低下し、孵化の８  時間後にｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  （１ｍＭ）  によって達成された阻止と対等なレベルに達した。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の酵素のこの比較的短い半減期の故に、混合の付加の後の８  時間には早くもｍＲＮＡ  の低下の活動のための物質を査定することは安全である。
【実施例３】
【０１１２】
例３：  ｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の効果
ＴＨＰ？１  細胞ライン、クローンＮｏ．  。６３  及び５３  はｇＩＦＮ  と育ち、区別され、そして正常なＴＨＰ？１  細胞と同一のＬＰ  と刺激される。ＬＰ  及び細胞のエキスの付加がそれから後で８  時間取られたまたは加えられた１６  時間後Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  は示されるように。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動は５０％  ＋／？１７％  の時として阻止による平均の１  つのＭ  のｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  によってｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の５ｘ１０？６Ｍ  まで制御クローン第５３  に効果をもたらさなかった一方９３％  大きかった、図６  禁じられた（固体棒はクローン第５３  、開いた棒クローン第６３  を示す）。
【０１１３】
１  ミリメートルのｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログと扱われたとき興味深く、（開いた棒）  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  のより低い表現のためにそうなったものまたはＡＵ？ｒｉｃｈ  の要素によって仲介されるｍＲＮＡ  の低下プロセスの特異的に表現されたか、または変更された部品の介入を表している画一的なクローン第６３  はＡ  はｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動（図７  の固体棒クローン第５３  を）  の限られた減少しか示さなかった示す。全く、ゲルの遅滞はＩＬ？１ｓｓ  のＡＵ？ｒｉｃｈ  ３’  ＵＴＲ  の２４１  ｂｐ  を使用してｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  が示されていないｇＩＦＮ  によって引き起こされた微分または修正を用いる付加的な蛋白質の結合を示したように実験する（）。
【０１１４】
区別されたクローン第６３  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動の集中の依存した阻止は図８  で、示されている。ｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の集中はまたトランスクリプションの細胞毒性か抑制的な活動のために５ｘ  １０？６  Ｍ  より高く制御クローン（第５３）  を禁じた。
【実施例４】
【０１１５】
例４：  選択された多数の化合物に対するアッセイの適用
いくつかの指定物質への試金の適用  いくつかの指定物質は例３  で記述されているように発明の試金の活動のために大幅にテストされた（区別された細胞のために）  。得られる結果は表３  で次に与えられる。Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ  （方式ＩＩ  を次に見なさい）  及びｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  はｍＲＮＡ  の安定性に対する明確な効果を示した；  テストされた他の混合物は使用された試金で活動を示さなかった。
【０１１６】
【化２】
2007530058.tif 000008
【０１１７】
【表３】
2007530058.tif 000009
【実施例５】
【０１１８】
例５：  単一セルラインを使用して試金の適用
前の例では、テスト混合物は２  つの別々の細胞ライン（クローンＮｏ．  の活動の比較によって試金された。５３  及び６３）  。但し、クローン６３  は２  個の別々のプラスミッドとｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  あった：  １  個のプラスミッド（ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０）  はＳＶ４０  促進者および他のプラスミッド（ｐＧＬ２？ｓｓ？ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  の図３Ｂ）  によって運転された３０  のｂｐ  の不安定順序のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子を含んでいたりＳＶ４０  促進者が運転したｌａｃＺ  の遺伝子を含んでいたｍＲＮＡ  の不安定順序を含んでいなかったが。この細胞ラインのｓｓ？ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  の活動はｍＲＮＡ  の不安定順序によるｍＲＮＡ  の不安定を促進する混合物への細胞の露出によって影響されるべきでない。その結果、１  つは刺激された細胞対刺激されない細胞でｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動を単に比較し、これらの同じ細胞でｓｓ？ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  の活動を比較することによってｍＲＮＡ  の不安定の活動を持っている混合物のために選別べきである。従って、クローン６３  の（刺激され、刺激されない細胞）  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動そしてｓｓ？ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  の活動のｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の効果はクローン６３  及びクローン５３  の刺激され、刺激されない細胞のｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の効果と比較された。
試金は前の例で記述されているように行われた。表４  ショークローン６３  及び５３  の？ＩＦＮ／ＬＰＳ  の刺激され、刺激されない細胞のｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  の様々な集中のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動。活動は制御の％  で与えられ、細胞数のために制御される３  つの独立した実験の平均に基づいていた。表５  はクローン６３  及び５３  の刺激され、刺激されない細胞でｓｓ？ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  の活動を示したものだ。活動は制御の％  で与えられ、細胞数のために制御される３  つの独立した実験の平均に基づいていた。それは表５  の活動的な混合物としてｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  を識別しようことデータから明確こと表４  の試金、そしてである。
【０１１９】
【表４】
2007530058.tif 000010
【０１２０】
【表５】
2007530058.tif 000011
【実施例６】
【０１２１】
例６：  ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルの構造
例にある様々な不安定順序のクローニングを促進するために付加的な制限の酵素の場所を含むようにプラスミッドｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  は７−１４  次の通り変更された（次に）。
【０１２２】
２  つのｕｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄのオリゴヌクレオチド、Ｎ／Ｎ−ＴＫ５Ｐ：
【化３】
2007530058.tif 000012
【０１２３】
及びＮ／Ｎ−ＴＫ３Ｐ：
【化４】
2007530058.tif 000013
【０１２４】
は、アニールされ、ＰｆｌＭ１  にｌｉｇａｔｅｄ  ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ  を一直線に並べた。アニールされたオリゴヌクレオチドは（大胆及びイタリック体で示されている）  ＮｏｔＩ  及び（大胆、イタリック体および下線で示されている）  ＮｄｅＩ  のための制限の酵素の場所を形作った含んでいる小さい多数のクローニング場所を。付加的で独特な制限の場所を含むためにこの小さい多数のクローニング場所が拡大することができることが注意されるべきである。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  の生じるプラスミッドの多数のクローニングのオリエンテーションはＤＮＡ  の配列によって場所、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  、確認された。
【実施例７】
【０１２５】
例７：  人間のＡＰＰ  の不安定順序の構造
この例で使用されたＡＰＰ  順序はＡｌｚｈｅｉｍｅｒ  の病気（ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号に対応するａｍｙｌｏｉｄ  Ａ４  前駆物質のための人間のｍＲＮＡ  から得られた：  Ｙ００２６４  の位置：  ＨＳＡＦＰＡ４）  。アミロイドＡ４  の前駆物質順序の３’  ＵＴＲ  は５  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。人間の多数のティッシュのＤＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  のＭＴＣ  のパネルＩ  、Ｋ１４２０−１  の源：  頭脳は）  ３  ’  プライマー、ＴＫ−ＡＰＰ−３Ｐ  、５  ’  プライマー、ＴＫ−ＡＰＰ−５Ｐ  およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１２６】
ＴＫ−ＡＰＰ−３Ｐ：
【化５】
2007530058.tif 000014
【０１２７】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。３３０９  から３３３１  まで人間のＡＰＰ  順序と同一の順序は大胆で示されている。潜在的なｐｏｌｙＡ  信号順序は３０８１．．３０８６  及び３０９０．．３０９５  にある。
【０１２８】
ＴＫ−ＡＰＰ−５Ｐ：
【化６】
2007530058.tif 000015
【０１２９】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。２２４０  から２２６４  まで人間のＡＰＰ  順序と同一の順序は大胆で示されている。
【０１３０】
生じるＤＮＡ  の片は図９  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）  で示され、位置２２４０  からの人間のアミロイドＡ４  の前駆物質蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の１０９３  のヌクレオチドを（停止ｃｏｄｏｎ  は２２３５  にあり）  、及び表しまで、第３  推定のｐｏｌｙＡ  信号順序（３３３２．．３３３７）  の公正上流にである位置３３３１  含んでいる。片は５  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。この片はシャトルのベクトルとして使用されたｐＣＲ  鈍いＩＩ−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られた鈍終りだった。ＮｏｔＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルは人間のアミロイドＡ４  の前駆物質蛋白質の遺伝子でｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される５  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例８】
【０１３１】
例８：  人間のｂｃｌ−２  の構造か。長い不安定順序
この例で使用されたｂｃｌ  ２  アルファ順序はｌｅｕｋａｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  の病気（ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号に対応するＢ  細胞２  の（ｂｃｌ−２）  原始ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  のための人間のｍＲＮＡ  から得られた：  Ｍ１３９９４  の位置：  ＨＵＭＢＣＬ２．Ａ）  。ｂｃｌ  ２  アルファ順序の３’  ＵＴＲ  は３  つがタンデムにある８  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。人間のＨＬ−６０  細胞からの総ＲＮＡ  は（激しいｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  白血病）  ３’  プライマー、ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＬ  および指数ＩＩ  のＲＮａｓｅ  Ｈ−  の逆のｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して転写された逆だった。生じる最初繊維によって総合されたＤＮＡ  はそれから３’  プライマー、ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＬ  、５’  プライマー、ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ５Ｐ  、およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１３２】
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＬ：
【化７】
2007530058.tif 000016
【０１３３】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。３０４１  から３０６１  まで人間のｂｃｌ  ２  アルファ順序と同一の順序は大胆で示されている。このｍＲＮＡ  の３’ＵＴＲ  は非常に長く、位置５０８６  に伸びる。
【０１３４】
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ５Ｐ：
【化８】
2007530058.tif 000017
【０１３５】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。２１７６  から２１９４  まで人間のｂｃｌ  ２  アルファ順序と同一の順序は大胆で示されている。停止ｃｏｄｏｎ  は位置２１７６  にある。
【０１３６】
生じるＤＮＡ  の片は図１０  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）  で示され、位置２１７６  からのｂｃｌ  ２  アルファ蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の８８９  のヌクレオチドを（停止ｃｏｄｏｎ  は２１７６  にあり）  、及び表しまで、位置３０６１  含んでいる。片は６  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。この片は拡大の高い忠誠ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ）  と増幅された。３’  Ａ  の突出部分があるプロダクトはｐＣＲ  ＸＬ  ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られ、シャトルのベクトルとして使用した。ＮｏｔＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される最初の６  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる人間のｂｃｌ  ２  アルファ蛋白質の遺伝子で３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例９】
【０１３７】
例９：  人間のｂｃｌ−２．ａｌｐｈａ  の構造は不安定順序をショートさせる
例９：  この例で使用されたｌｅｕｋａｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  の病気（ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号に対応するＢ  細胞２  の（ｂｃｌ−２）  原始ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  のための人間のｍＲＮＡ  から人間のｂｃｌ−２．ａｌｐｈａ  の短い不安定のＳｅｑｕｅｎｃｅＴｈｅ  のｂｃｌ  ２  アルファ順序の構造は得られた：  Ｍ１３９９４  の位置：  ＨＵＭＢＣＬ２．Ａ）  。ｂｃｌ  ２  アルファ順序の３’  ＵＴＲ  は３  つがタンデムにある８  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。人間のＨＬ−６０  細胞からの総ＲＮＡ  は（激しいｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  白血病）  ３’  プライマー、ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＳ  および指数ＩＩ  のＲＮａｓｅ  Ｈ−  の逆のｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して転写された逆だった。生じる最初繊維によって総合されたＤＮＡ  はそれから３’  プライマー、ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＳ  、５’  プライマー、ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ５Ｐ  、およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１３８】
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＳ：
【化９】
2007530058.tif 000018
【０１３９】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。２８４８  から２８７８  まで人間のｂｃｌ  ２  アルファ順序と同一の順序は大胆で示されている。
【０１４０】
このｍＲＮＡ  の３’ＵＴＲ  は非常に長く、位置５０８６  に伸びる。  ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ５Ｐ：
【化１０】
2007530058.tif 000019
【０１４１】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。２１７６  から２１９４  まで人間のｂｃｌ  ２  アルファ順序と同一の順序は大胆で示されている。停止ｃｏｄｏｎ  は位置２１７６  にある。
【０１４２】
生じるＤＮＡ  の片は図１１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）  で示され、位置２１７６  からのｂｃｌ  ２  アルファ蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の６９６  のヌクレオチドを（停止ｃｏｄｏｎ  は２１７６  にあり）  、及び表しまで、位置２８７８  含んでいる。片は５  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。この片は拡大の高い忠誠ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ）  と増幅された。３’  Ａ  の突出部分があるプロダクトはｐＣＲ  ＸＬ  ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られ、シャトルのベクトルとして使用した。ＮｏｔＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される最初の５  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる人間のｂｃｌ  ２  アルファ蛋白質の遺伝子で３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例１０】
【０１４３】
例１０：  人間のｃ−ｍｙｃ  の不安定順序の構造
この例で使用されたｃ−ｍｙｃ  順序はｐ６７  及びｐ６４  ｍｙｃ  蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号のための人間のｃ−ｍｙｃ  の遺伝子から得られた：  Ｄ１０４９３  及びＤ９０４６７  の位置：  ＨＵＭＭＹＣＫＯＢ）  。人間のｃ−ｍｙｃ  のｇｅｎｏｍｉｃ  構成はｐ６７  に及びｐ６４  に共通の３’ＵＴＲ  が４  つを含んでいることをあることを隔離されたＡＵＵＵＡ  順序示す。両方の蛋白質（ヌクレオチド６６２８−７１９０）  の末端のｅｘｏｎ  はＢｅｒｎｓｔｅｉｎ  等が記述しているコーディングの地域の不安定の決定要因（ｃｒｄ）  として知られている６０  アミノ酸の範囲を含んでいる。（Ｇｅｎｅｓ  及びＤｅｖ．  、１９９２  年、６  、６４２−６５２）  ７００８  から停止ｃｏｄｏｎ  （７１９０）  への。人間のＨＬ−６０  細胞からの総ＲＮＡ  は（激しいｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  白血病）  ３’  プライマー、ｈｃｍｙｃ−ＴＫ３Ｐ  および指数ＩＩ  のＲＮａｓｅ  Ｈ−  の逆のｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して転写された逆だった。生じる最初繊維によって総合されたＤＮＡ  はそれから３’  プライマー、ｈｃｍｙｃ−ＴＫ３Ｐ  、５’  プライマー、ｈｃｍｙｃ−ＴＫ５Ｐ  、およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１４４】
ｈｃｍｙｃ−ＴＫ３Ｐ：
【化１１】
2007530058.tif 000020
【０１４５】
は、ＮｄｅＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。７６３６  から７６５８  まで人間のｃ−ｍｙｃ  順序と同一の順序は大胆で示されている。２  つのｐｏｌｙＡ  信号順序は７４８５．．．７４９０  そして７６２６．．．  ７６３１  にある。
【０１４６】
ｈｃｍｙｃ−ＴＫ５Ｐ：
【化１２】
2007530058.tif 000021
【０１４７】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。６９８４  から７００５  までｃｍｙｃ  順序と同一の順序は大胆で示されている。
【０１４８】
生じるＤＮＡ  の片は図１２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）  で示され、位置６９８４  からの人間のｃ−ｍｙｃ  蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の６７５  のヌクレオチドを、及び表しまで、位置７６５８  含んでいる。片は４  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。片は拡大の高い忠誠ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ）  と増幅された。３’  Ａ  の突出部分があるプロダクトはｐＣＲ  ＸＬ  ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られ、シャトルのベクトルとして使用した。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される４  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる人間のｃ−ｍｙｃ  蛋白質の遺伝子で３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例１１】
【０１４９】
例１１：  人間のＴＮＦａ  の不安定順序の構造
この例で使用されたＴＮＦａ  のｍＲＮＡ  順序は人間の腫瘍壊死要因（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ＴＮＦ  、メンバー２）  の（ＴＮＦ）  からｍＲＮＡ  （ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号得られた：  ＮＭ＿０００５９４  の位置：  ＴＮＦ）  。このｍＲＮＡ  の３’  ＵＴＲ  に９  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフがある。（？ＩＦＮ／ＬＰＳ  と区別される）  人間のＴＨＰ−１  細胞からの総ＲＮＡ  は隔離され、逆は３’  プライマー、ＴＫＨＴ３Ｐ  および指数ＩＩ  のＲＮａｓｅ  Ｈ−  の逆のｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して転写された。生じる最初繊維によって総合されたＤＮＡ  はそれから３’  プライマー、ＴＫＨＴ３Ｐ  、５’  プライマー、ＴＫＨＴ５Ｐ  、およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１５０】
ＴＫＨＴ３Ｐ：
【化１３】
2007530058.tif 000022
【０１５１】
は、ＮｄｅＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。１６４０  年から１６６０  年までＴＮＦａｌｐｈａ  人間の順序と同一の順序は大胆で示されている。潜在的なｐｏｌｙＡ  信号順序は１６４７．．１６５２  にある。ｐｏｌｙＡ  の尾の付加は１６６６  年か１６６９  年に起こる。
【０１５２】
ＴＫＨＴ５Ｐ：
【化１４】
2007530058.tif 000023
【０１５３】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。８６９  から８９０  までＴＮＦａ  人間の順序と同一の順序は大胆で示されている。
【０１５４】
生じるＤＮＡ  の片は図１３  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）  で示され、位置８６９  からの人間のＴＮＦａ  蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の７９２  のヌクレオチドをに、及び表し、位置１６６０  年含んでいる。片は９  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。片はシャトルのベクトルとして使用されたｐＣＲ  鈍いＩＩ−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られた鈍終りだった。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される９  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる人間のＴＮＦａ  蛋白質の遺伝子で３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例１２】
【０１５５】
例１２：  人間のＩＬ  １ｂ  不安定順序の構造
この例で使用されたＩＬ  １ｂ  ｍＲＮＡ  順序はベータｐｒｏｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  のための人間の遺伝子から得られた（ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号：  Ｘ０４５００，  の位置：  ＨＳＩＬ１Ｂ）  。このｍＲＮＡ  の３’  ＵＴＲ  に６  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフがある。（？ＩＦＮ／ＬＰＳ  と区別される）  人間のＴＨＰ−１  細胞からの総ＲＮＡ  は隔離され、逆は３’  プライマー、ＨＩＬ１Ｂ３  および指数ＩＩ  のＲＮａｓｅ  Ｈ−  の逆のｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して転写された。生じる最初繊維によって総合されたＤＮＡ  はそれから３’  プライマー、ＨＩＬ１Ｂ３  、５’  プライマー、ＨＩＬ１Ｂ５  、およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１５６】
ＨＩＬ１Ｂ３：
【化１５】
2007530058.tif 000024
【０１５７】
は、ＮｄｅＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。人間のＩＬ−１  と同一の順序は大胆で示されているか。８９１７  から８９３６  まで順序。潜在的なｐｏｌｙＡ  信号順序は８９２５．．．  ８９３０  にある。
【０１５８】
ＨＩＬ１Ｂ５：
【化１６】
2007530058.tif 000025
【０１５９】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。人間のＩＬ−１  と同一の順序は大胆で示されているか。８３３７  から８３５７  まで順序。
【０１６０】
生じるＤＮＡ  の片は図１４  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）  で示され、位置８３３７  からの人間のＩＬ  １ｂ  蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の６００  のヌクレオチドを、及び表しまで、位置８９３６  含んでいる。片は６  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。片はシャトルのベクトルとして使用されたｐＣＲ  鈍いＩＩ−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られた鈍終りだった。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される６  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる人間のＩＬ  １ｂ  蛋白質の遺伝子で３’  ＵＴＲ  を構成する。
【実施例１３】
【０１６１】
例１３：  人間のＶＥＧＦ  の不安定順序の構造
この例で使用された管のｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  成長因子（ＶＥＧＦ）  のｍＲＮＡ  順序はＶＥＧＦ  （ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号のための人間の遺伝子から得られた：  ＡＦ０２２３７５）  。このｍＲＮＡ  の３’  ＵＴＲ  に８  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフ、単一コピーのすべての現在がある。ＶＥＧＦ  のｍＲＮＡ  にまた３’ＵＴＲ  （Ｃｌａｆｆｅｙ  等１９９８  年、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  にある報告された低酸素症引き起こされたｍＲＮＡ  の安定性の地域がある。細胞９：４６９−４８１）  。人間の多数のティッシュのＤＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  のＭＴＣ  のパネルＩ  、Ｋ１４２０−１  の源：  胎盤は）  ３  ’  プライマー、ＴＫ−ＶＡＵ−３Ｐ  、５  ’  プライマー、ＴＫ−ＶＡＵ−５Ｐ  およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１６２】
ＴＫ−ＶＡＵ−３Ｐ：
【化１７】
2007530058.tif 000026
【０１６３】
は、ＮｄｅＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。３１２４  から３１４６  までＶＥＧＦ  順序と同一の順序は大胆で示されている。このｍＲＮＡ  の３’ＵＴＲ  は非常に長く、位置３１６６  に伸びる。潜在性のｐｏｌｙＡ  の付加順序であるかもしれないか何が３１３９．．３１４４  にそこに位置３１５５  で始まるｐｏｌｙＡ  の尾のようで。
【０１６４】
ＴＫ−ＶＡＵ−５Ｐ：
【化１８】
2007530058.tif 000027
【０１６５】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。２０６２  年から２０８５  年までＶＥＧＦ  順序と同一の順序は大胆で示されている。停止ｃｏｄｏｎ  は位置１２７５  年にある。
【０１６６】
生じるＤＮＡ  の片は図１５  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）  で示され、位置２０６２  年からの人間のＶＥＧＦ  蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の１０８７  のヌクレオチドを（停止ｃｏｄｏｎ  は１２７５  年にあり）  、及び表しまで、位置３１４６  含んでいる。片は７  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる。片はシャトルのベクトルとして使用されたｐＣＲ  鈍いＩＩ−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られた鈍終りだった。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ  ／ＮｄｅＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される７  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフを含んでいる人間のＶＥＧＦ  蛋白質の遺伝子で３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例１４】
【０１６７】
例１４：  人間のＶＥＧＦ  の低酸素症の範囲の不安定順序の構造
この例で使用された管のｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  成長因子（ＶＥＧＦ）  のｍＲＮＡ  順序はＶＥＧＦ  （ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号のための人間の遺伝子から得られた：  ＡＦ０２２３７５）  。このｍＲＮＡ  の３’  ＵＴＲ  に８  つのＡＵＵＵＡ  のモチーフ、単一コピーのすべての現在がある。ＶＥＧＦ  のｍＲＮＡ  にまた３’ＵＴＲ  （Ｃｌａｆｆｅｙ  等１９９８  年、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  にある報告された低酸素症引き起こされたｍＲＮＡ  の安定性の地域がある。細胞９：４６９−４８１）  。人間の多数のティッシュのＤＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  のＭＴＣ  のパネルＩ  、Ｋ１４２０−１  の源：  胎盤は）  ３  ’  プライマー、ＴＫ−Ｖ−３Ｐ  、５  ’  プライマー、ＴＫ−Ｖ−５Ｐ  およびプラチナＰｆｘ  のＤＮＡ  のポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して増幅されたＰＣＲ  だった。
【０１６８】
ＴＫ−Ｖ−３Ｐ：
【化１９】
2007530058.tif 000028
【０１６９】
は、ＮｄｅＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。１７３０  年から１７５２  年までＶＥＧＦ  順序と同一の順序は大胆で示されている。このｍＲＮＡ  の３’ＵＴＲ  は非常に長く、位置３１６６  に伸びる。潜在性のｐｏｌｙＡ  の付加順序であるかもしれないか何が３１３９．．３１４４  にそこに位置３１５５  で始まるｐｏｌｙＡ  の尾のようで。
【０１７０】
ＴＫ−Ｖ−５Ｐ：
【化２０】
2007530058.tif 000029
【０１７１】
は、ＮｏｔＩ  の制限の場所を含む付加的な５’  順序を含んでいる。１６０１  年から１６２２  年までＶＥＧＦ  順序と同一の順序は大胆で示されている。停止ｃｏｄｏｎ  は位置１２７５  年にある。
【０１７２】
生じるＤＮＡ  の片は図１６  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）  で示され、位置１６０１  年からの人間のＶＥＧＦ  蛋白質の遺伝子の３’  ＵＴＲ  の１５２  のヌクレオチドを（停止ｃｏｄｏｎ  は１２７５  年にあり）  、及び表しまで、位置１７５２  年含んでいる。片は報告された低酸素症の範囲を含んでいる。片はシャトルのベクトルとして使用されたｐＣＲ  鈍いＩＩ−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  にクローンとして作られた鈍終りだった。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ  の片はシャトルのベクトルから消化され、ＮｏｔＩ  ／ＮｄｅＩ  によって一直線に並べられたｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の表現のベクトルにｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  。生じるＤＮＡ  の表現のベクトルはｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  で使用されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の遺伝子の３’ＵＴＲ  に挿入される報告された低酸素症の範囲を含んでいる人間のＶＥＧＦ  蛋白質の遺伝子で３’ＵＴＲ  を構成する。
【実施例１５】
【０１７３】
例１５：  か。ガラクトシダーゼのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  相談制御プラスミッドの構造
制御プラスミッドを準備するため、ｐＴＫ−Ｈｙｇ  のプラスミッド（ＧｅｎＢａｎｋ  の受入番号：  ＢＤ  のＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  から得られたＵ４０３９８  は）  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  の抵抗の相談の遺伝子および規定する要素を並べる独特な制限の場所を導入するために変更された。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  このカセットが第２  プラスミッドのＳａｌＩ  の場所にクローンとして作られるので、ＴＫ  のｐｏｌｙＡ  信号を含んでいるＨｙｇｒ  のＨＳＶ−ＴＫ  の促進者、遺伝子およびＨＳＶ  の片を並べるためにｐＧＬ２  か。ガラクトシダーゼ、ＳａｌＩ  及びＸｈｏＩ  の制限は場所選ばれた。２  プライマー、ＴＫＳＦ  およびＴＫＳＲ  はアニールされ、ＰｆｌＭＩ  にｌｉｇａｔｅｄ  ｐＴＫ−Ｈｙｇ  （２８７９  及び２９２８  にあるＰｆｌＭＩ  の場所）  を一直線に並べた。
【０１７４】
ＴＫＳＦ：
【化２１】
2007530058.tif 000030
【０１７５】
は大胆で、識別されるＳａｌＩ  の認識部位を含んでいる。
【０１７６】
ＴＫＳＲ：
【化２２】
2007530058.tif 000031
【０１７７】
は大胆で、識別されるＳａｌＩ  の認識部位を含んでいる。
【０１７８】
生じるｐＴＫ−Ｈｙｇ−ＳａｌＩ  のプラスミッドはＨｉｎｄＩＩＩ  と、一直線に並べられ、子牛の腸のホスファターゼ（ＣＩＰ）  とｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  。２  プライマー、ＴＫＸＦ３
【化２３】
2007530058.tif 000032
【０１７９】
およびＴＫＸＲ３
【化２４】
2007530058.tif 000033
【０１８０】
はＨｉｎｄＩＩＩ  に一直線に並べたｐＴＫ−Ｈｙｇ／ＳａｌＩ  （元のｐＴＫ−Ｈｙｇ  のベクトルの１０３７  年にあるＨｉｎｄＩＩＩ  の場所）  をアニールされ、ｌｉｇａｔｅｄ。生じるプラスミッドはｐＴＫ−Ｈｙｇ−ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  として識別された。
【０１８１】
ＴＫＸＦ３：
【化２５】
2007530058.tif 000034
【０１８２】
は大胆で、識別されるＸｈｏＩ  の認識部位を含んでいる。
【０１８３】
ＴＫＸＲ３：
【化２６】
2007530058.tif 000035
【０１８４】
は大胆で、識別されるＸｈｏＩ  の認識部位を含んでいる。
【０１８５】
ｐＧＬ２  か。ガラクトシダーゼのプラスミッドを準備するためには（図３Ｂ  を見なさい）  、ｐＳＶ  か。ガラクトシダーゼのベクトル（Ｐｒｏｍｅｇａ）  のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  の制限のダイジェストから得られたか。
ガラクトシダーゼ相談カセット（３７３１ｂｐ）  はＣＩＰ  扱われるの背骨のプラスミッドおよびＡｍｐｒ  、ｆ１  ｏｒｉ  およびＳＶ４０  促進者順序含んでいるｐＧＬ２  制御ベクトル（Ｐｒｏｍｅｇａ）  からの〜３１０４ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  のＤＮＡ  の片にクローンとして作られた。
【０１８６】
ｐＴＫ−Ｈｙｇ−ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  のプラスミッドはＳａｌＩ  及びＸｈｏＩ  と一直線に並べられた。一直線に並べられたＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  相談カセットを、含んでいる〜１８４０ｂｐ  ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  の片はｌｉｇａｔｅｄ  、ＳａｌＩ  にｐＧＬ２  か。ガラクトシダーゼのプラスミッドをｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  。ｐＧＬ？ｇａｌ−ＴＫｈｙｇＳＸ  （８６８３ｂｐ）  として識別された生じる制御プラスミッド（図１７）  は制限のダイジェスト及びＤＮＡ  の配列によって確認された。
【０１８７】
すべてのパテント、出版された特許出願およびこの指定で参照される同じ範囲への全体の参照によってデータベースの記入項目を含む出版物の発表は、とりわけ各々のそのような個々のパテント、出版物、およびデータベースの記入項目がとりわけそしてそれぞれ参照によって組み込まれるために示されたように組み込まれる。
【０１８８】
こうして記述されている発明それはの具体化同じが多くの方法で変わるかもしれないこと明らかである。そのような変化は芸術で巧みな１  つに明らかが次の要求の規模の内に含まれているように意図されているありなさいのような及びすべての修正発明の精神そして規模からの出発とみなされるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１はＩＬ−１ｓｓ  ３’  ＵＴＲ  のＤＮＡ  順序を示す。
【図２】図２は例１  でｍＲＮＡ  の不安定順序として使用される３０  のｂｐ  の片を示す。
【図３Ａ】図３ＡはｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０  及びｐＧＬ２？Ｃｏｎｔｒｏｌ  のためのプラスミッドの図表を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはｐＧＬ２  か。ガラクトシダーゼのためのプラスミッドの図表を示す。
【図４】図４  はクローン第５３  及び（ｂ）  クローン第６３  のための（ａ）  微分の時にわたるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動のグラフを示す。
【図５】図５  示すｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の半分の生命のグラフを、４  およびクローン第５３  及び６３  のための混合物の付加がｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  （ＲＡＡ）  と扱った８  時間後、アクチノマイシン行為Ｄ  はＤ  は（。）  そしてｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ  （ＣＨＸ）。
【図６】図６  クローン第５３  （固体棒）  及び６３  からのｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動のショーグラフはｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  （ＲＡＡ）  の様々な集中と（開いた棒）  扱った。
【図７】図７  画一的な、区別されたクローン第５３  および（開いた棒）  １？Ｍ  のｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  （ＲＡＡ）  の８  時間の処置のクローン第６３  のための（固体棒）  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動のショーグラフ。
【図８】図８  ショーｒａｄｉｃｉｃｏｌ  のアナログＡ  （ＲＡＡ  の８  時間の処置の後の区別されたクローン第６３  のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  の活動の集中の依存した阻止のグラフ）。
【図９】図９はＤＮＡ  の構造物が人間のＡＰＰ  ３’ＵＴＲ  から得たョー。
【図１０】図１０はＤＮＡ  の構造物が人間のｂｃｌ−２．ａ  長い３’ＵＴＲ  から得たョー。
【図１１】図１１はシＤＮＡ  の構造物が人間のｂｃｌ−２．ａ  短い３’ＵＴＲ  から得たョー。
【図１２】ＤＮＡ  の構造物が人間のｃ−ｍｙｃ  ３’ＵＴＲ  から得た図１２  ショー。
【図１３】ＤＮＡ  の構造物が人間のＴＮＦａ  ３’ＵＴＲ  から得た図１３  ショー。
【図１４】ＤＮＡ  の構造物が人間のＩＬ  １ｂ  ３’ＵＴＲ  から得た図１４  ショー。
【図１５】ＤＮＡ  の構造物が人間のＶＥＧＦ  ３’ＵＴＲ  から得た図１５  ショー。
【図１６】ＤＮＡ  の構造物が人間のＶＥＧＦ  の低酸素症の範囲３’  ＵＴＲ  から得た図１６  ショー。
【図１７】図１７はｐＧＬｂｇａｌ制御プラスミッドを−  ＴＫｈｙｇＳＸ示す。
【図１】
2007530058.tif 000036
【図２】
2007530058.tif 000037
【図３Ａ】
2007530058.tif 000038
【図３Ｂ】
2007530058.tif 000039
【図４】
2007530058.tif 000040
【図５】
2007530058.tif 000041
【図６】
2007530058.tif 000042
【図７】
2007530058.tif 000043
【図８】
2007530058.tif 000044
【図９】
2007530058.tif 000045
【図１０】
2007530058.tif 000046
【図１１】
2007530058.tif 000047
【図１２】
2007530058.tif 000048
【図１３】
2007530058.tif 000049
【図１４】
2007530058.tif 000050
【図１５】
2007530058.tif 000051
【図１６】
2007530058.tif 000052
【図１７】
2007530058.tif 000053
【配列表】
2007530058000001.xml
【国際調査報告】
2007530058.tif 000061
2007530058.tif 000062
2007530058.tif 000063
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