(57)【要約】  本発明は、上皮創傷を予防・治療するためのレクチンＫＭ＋を含む医薬組成物に関する。  本発明は、また、植物（ナガミパンノキ：Artocarpus integrifolia）または薬剤調合用組換体（ヘテロ発現）から得られるレクチンＫＭ＋の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レクチンＫＭ＋を含有するという事実を特徴とする、上皮創傷の出現を防ぐ医薬組成物。
【請求項２】
レクチンＫＭ＋を含有するという事実を特徴とする、上皮創傷を治療する医薬組成物。
【請求項３】
前記上皮創傷は皮膚創傷を備えてなることを特徴とする、請求項１または２のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記上皮創傷は角膜創傷を備えてなることを特徴とする、請求項１または２のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項５】
レクチンＫＭ＋を含有するという事実を特徴とする、免疫調節用の医薬組成物。
【請求項６】
レクチンＫＭ＋を含有するという事実を特徴とする、医薬組成物。
【請求項７】
レクチンＫＭ＋を含有するという事実を特徴とする、殺虫剤。
【請求項８】
レクチンＫＭ＋を含有することを特徴とする、薬剤。
【請求項９】
レクチンＫＭ＋を含有することを特徴とする、殺虫剤。
【請求項１０】
創傷を治療するための薬剤の調合時にあることを特徴とするレクチンＫＭ＋の、瘢痕剤としての使用。
【請求項１１】
免疫調節性薬剤の調合時にあることを特徴とするレクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１２】
化学的または物理的攻撃に起因する創傷を避けるための薬剤の調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１３】
抗菌薬剤の調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１４】
抗ウイルス性薬剤の調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１５】
抗寄生虫性薬剤の調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１６】
抗真菌性薬剤の調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１７】
殺虫剤の調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１８】
マンノースの調合時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項１９】
マンノースを含有するプロテインの精製または検出時にあることを特徴とする、レクチンＫＭ＋の使用。
【請求項２０】
天然形態のｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われるという事実を特徴とする、レクチンＫＭ＋発現方法。
【請求項２１】
他のプロテイン及びペプチドと融合するｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われるという事実を特徴とする、レクチンＫＭ＋発現方法。
【請求項２２】
ペプチドと融合するｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われるという事実を特徴とする、レクチンＫＭ＋発現方法。
【請求項２３】
原プロテインの一部と融合するｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われるという事実を特徴とする、レクチンＫＭ＋発現方法。
【請求項２４】
前記有機体が原核生物または真核生物を備えているという事実を特徴とする、請求項２０〜２３のいずれか記載の発現方法。
【請求項２５】
前記原核生物がバクテリアを備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項２６】
前記バクテリアが大腸菌（Escherichia coli）を備えているという事実を特徴とする、請求項２５記載の発現方法。
【請求項２７】
前記バクテリアがカウロバクター（Caulobacter）を備えているという事実を特徴とする、請求項２５記載の発現方法。
【請求項２８】
前記バクテリアが組み換えウィルスに感染するという事実を特徴とする、請求項２５記載の発現方法。
【請求項２９】
前記真核生物がサッカロマイセス（Saccharomyces）を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項３０】
前記サッカロマイセス（Saccharomyces）がＳセレビシエ（S. cerevisiae）を備えているという事実を特徴とする、請求項２８記載の発現方法。
【請求項３１】
前記シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）がＳポンベ（S. pombe）を備えているという事実を特徴とする、請求項２８記載の発現方法。
【請求項３２】
前記真核生物がピチア（Pichia）を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項３３】
前記ピチア（Pichia）がＰパストラルス（P. pastoral）を備えているという事実を特徴とする、請求項３１記載の発現方法。
【請求項３４】
前記ピチア（Pichia）がメタノーリカＰ（P. methanolica）を備えているという事実を特徴とする、請求項３１記載の発現方法。
【請求項３５】
前記真核生物が植物を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項３６】
前記植物が遺伝子組み換えのものであるという事実を特徴とする、請求項３４記載の発現方法。
【請求項３７】
前記植物が組み換えウィルスに感染するという事実を特徴とする、請求項３５記載の発現方法。
【請求項３８】
前記真核生物が植物細胞を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項３９】
前記真核生物が動物細胞を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項４０】
前記動物が遺伝子組み換えのものを備えているという事実を特徴とする、請求項３８記載の発現方法。
【請求項４１】
前記動物が哺乳動物を備えているという事実を特徴とする、請求項３８または３９記載の発現方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物細胞が使用されるという事実を特徴とする、請求項４０記載の発現方法。
【請求項４３】
前記動物が昆虫を備えているという事実を特徴とする、請求項３８記載の発現方法。
【請求項４４】
前記真核生物が遺伝子組み換え動物及び哺乳動物細胞を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項４５】
前記真核生物が昆虫細胞を備えているという事実を特徴とする、請求項２４記載の発現方法。
【請求項４６】
ｐＤＥＳＴ１４ベクターにおいてサブクローン化されたｃＤＮＡから行われるという事実を特徴とする、大腸菌（E. Coli）におけるレクチン発現方法。
【請求項４７】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を備えることを特徴とする、ＤＮＡベクター。
【請求項４８】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤはＥＰＦＳＧＰＫであるという事実を特徴とする、請求項４６記載のＤＮＡベクター。
【請求項４９】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤはＫＬＰＹＫＮであるという事実を特徴とする、請求項４６記載のＤＮＡベクター。
【請求項５０】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤはＡＩＧＶＨＭＡであるという事実を特徴とする、請求項４６記載のＤＮＡベクター。
【請求項５１】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を備えることを特徴とする、レクチン遺伝子を含むベクター。
【請求項５２】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を備えることを特徴とする、組み換え有機体。
【請求項５３】
このプロテインの一部を含んでいるという事実を特徴とする、請求項５１記載の組み換え有機体。
【請求項５４】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）の対合を特徴とする、ＤＮＡ配列。
【請求項５５】
レクチンＫＭ＋アミノ酸配列のうち一つを体系化することを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項５６】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を備えていることを特徴とする、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテイン。
【請求項５７】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）と、そのイソ型とを備えていることを特徴とする、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテイン。
【請求項５８】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤはＥＰＦＳＧＰＫであるという事実を特徴とする、請求項５５または５６のいずれか記載のナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテイン。
【請求項５９】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤはＫＬＰＹＫＮであるという事実を特徴とする、請求項５５または５６記載のいずれか記載のナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテイン。
【請求項６０】
図１〜９に関連するシーケンスＩＤはＡＩＧＶＨＭＡであるという事実を特徴とする、請求項５５または５６記載のいずれか記載のナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテイン。
【請求項６１】
ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２においてサブクローン化されたｃＤＮＡから行われるという事実を特徴とする、Ｓセレビシエ（S. cerevisiae）におけるレクチンＫＭ＋発現方法。
【請求項６２】
ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンＫＭ＋プロテインを体系化する不確定なＤＮＡ配列を含むという事実を特徴とする、ベクター発現プラスミド。
【請求項６３】
ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンＫＭ＋遺伝子に関する情報を用いるという事実を特徴とする、請求項６１記載の発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮創傷を予防・治療するためのレクチンＫＭ＋を含む医薬組成物に関する。
本発明は、また、植物（ナガミパンノキ：Artocarpus integrifolia）または薬剤調合用組換体（ヘテロ発現）から得られるレクチンＫＭ＋の使用を含む。
レクチンは、自然界に分布するプロテインまたはグリコプロテインであり、糖質が選択的及び可逆的に結合する。ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）(ジャカ)の種子から、ジャカリン及びＫＭ＋の２つのレクチンを単離した。これらはアルトカルパイン（artocarpine）とも呼ばれている。レクチンＫＭ＋は、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）の種子の食塩水抽出液から得られる。種子の食塩水抽出液におけるＤ−マンノースの割合は小さく（全プロテインの０．５％）、選択的に団結される。これに対し、同食塩水抽出液に含まれるＤ−ガラクトースのリガンド（ligant）レクチンは、ジャカリンに達する高濃度（全プロテインの３０％）である。レクチンＫＭ＋の関連研究において、その精製方法の標準化について開示があり、固定化糖質の入ったカラムにおいて、種子の食塩水抽出液をニ段階で親和性クロマトグラフィーに供する。第1の抽出において、ジャカリンを枯渇させて固定化Ｄ−ガラクトースに吸着させる。Ｄ−マンノースの溶液を用いた枯渇抽出に続いて、Ｄ−マンノースのカラム内でクロマトグラフィーが行われ、レクチンを避ける。この方法により、レクチンは均一に調整され、主要構造の決定や、結晶化してプロテインの３次元構造を決定しようとする試みに使用されてきた。精製方法によって得られたレクチンは少量であるため、結晶化は困難である。というのは、３次元構造は分子構造模型化の提案だからである。ヒト好中球の吸引は、ＫＭ＋の最初の生物学的特性であり、1994年にSaint-of-Oliveira達によって、生体外及び生体内の分析によって発見された。レクチンのための好中球の刺激作用のために開放された現象の分子分析によると、ＫＭ＋が細胞表面のグリカン（glicane）を認識し、そのグリカンへのリンクが細胞を活性化させ、レクチンの高濃度の小さなファームへの移動を誘導することが確認されている。ＫＭ＋に誘導された好中球の移動によって、ハプトタクシー（haptotaxy）と見なす場合、レクチンが四価になるという事実により、ＫＭ＋糖質の認識のドメインは、好中球の表面及び細胞外マトリックスのラミニングリコプロテインに入る橋を形成することができる。従って、調整された細胞移動に理想的な条件が確立される。相互作用のこのモデルは、誘導された細胞移動のガレクチン３及びＭＮＣＦとしての内生レクチンへの誘導に適用できることがDias-Baruffi et alによって1999年に明らかになっている。ＫＭ＋と好中球の表面のグリカンとの相互作用によって、細胞のシグナルの付随回答を開放することができるという解説から、レクチンが他の免疫性細胞を活性化し、免疫化プロセスにおいてアジュバントに対応することが推察される。ネズミの腹膜ソケットの細胞は、ＫＭ＋の刺激作用下で多量のインターフェロンガンマーを製造し、この製造は、間接的に高濃度のセクレタート（secretated）Ｉ１−１２に誘導され、ＫＭ＋と、腹膜細胞の準備中に含まれるマクロファージの表面とがリンクすることが検証されている。シトシン（Citocines）のそのようなプロフィールとして、標準ＴＨ１の免疫性回答の確立と互換性があり、知覚可能なパトゲン（patogen）回答ＴＨ１に対する免疫化において、ＫＭ＋をアジュバントとして使用することによって結果的に得られる利益を調べることを選んだ。選��されたモデルは、パトゲン(ＢＡＬＢ／ｃ)に非常に影響を受けやすい種であるネズミのリーシュマニア感染である。感染の前に、動物にはリーシュマニア（ＳＬＡ）関連の溶性抗原調剤を注射し、それ以外にはＫＭ＋を注射した。Ｌ．メジャーの研究によると、ＫＭ＋を接種した動物は、標準の感受性を寄生虫に対する抵抗力の標準で代用し、またプロフィールＴＨ１用に製造されたシトシンの標準ＴＨ２を反転させた。従って、ＫＭ＋の投与は、特定のタイプのパトゲンに対して有効になるように、免疫性の反応に介在することができる。寄生虫の抗原の付随投与のこの独立した効果が伝達された時、ＫＭ＋にはアジュバントのかわりに免疫性モジュレーター特性があると考えられる。ＫＭ＋の厳密な精製によって得られる生成物が少量であり、ＫＭ＋の優れた生物学的特性が、広範囲の適用を可能にする生物学的投資を課すので、レクチンを体系化するＤＣＮｃＡからこのレクチンの組換え体に到達するように、クローン化及び特徴づけを進めることを選択した。このようにして組換えレクチンが入手可能になると、火傷の治療薬や、多種多様な創傷の瘢痕化促進剤や、その他の薬剤及び／または生物学的使用に適用することができるようになる。ジャカの種子の全ＲＮＡから抽出されたＤＣＮｃＡのライブラリが構築された（ナガミパンノキ：Artocarpus integrifolia）。ＤＣＮｃＡｓは、ライフテクノロジー（Life Technology）のベクターpSPORT-Pの指示方法でクローン化される。このような約13000のクローンから成るライブラリは、96のウェル(A01〜H12)の136のプレートに組織され、各クローンのグリセロール（glicerol）における供給を含む。Rose et al. (1999年)のレクチンＫＭ＋のアミノ酸シーケンス、及びジャカリンレクチン及びＫＭ＋のアミノ酸シーケンスの配列（図１）によると、ＫＭ＋の領域及びジャカリンの明瞭が定義され、変質したオリゴヌクレオチドが引き寄せられる（オリゴ10、オリゴ11、オリゴ12、図２）。マトリックスのＰＣＲによって、ＤＣＮｃＡのクローンのコマンドの混合液から（A01ポジションの136のクローンの混合液、A02ポジションの136のクローンの混合液、以降順にH12ポジションの136のクローンの混合液まで）ジャカ種子のＤＣＮｃＡライブラリーの選択が行われる。第１プレートIは各ウェルのクローンの96136混合液を含み、ＰＣＲの増幅のＤＮＡのソースとして使用される。最初のＰＣＲの増幅は、オリゴヌクレオチドSP6（ベクターpSPORT-Pにおける現在のシーケンスとして）及びオリゴ12から成される。アガロースゲル電気泳動法で分析した96の増幅結果のうち、500の塩基対(bp)と同等あるいはそれ以上のサイズのバンドを製造した28の反応を、一秒分析にかけた。28の選択したクローンの混合液を、オリゴヌクレオチドT7（ベクターpSPORT-Pにおける現在のシーケンスとして）及びオリゴ10を使用した増幅用ＤＮＡソースとして使用した。その結果によると、８つの分析された混合液において、待機サイズ（500bp以上）のバンドの存在が明らかになった。これらの混合液のうちの３つを、１／３秒分析のために選び、この時間の間、第１及び第２回の分析で得られたフラグメントを再増幅したが、オリゴヌクレオチドは別のもの（オリゴ11及び12）を使用した。３つの混合液（E07,G07,F08ポジション）の増幅により、各混合��の中に、待機サイズのバンドが現出し、ＫＭ＋のＤＣＮｃＡのクローンの存在が確認できた。136のオリジナルプレートのうち、Iは各ウェルにおいてＤＣＮｃＡのクローン一つだけを含み、グリセロール内の供給のアリクウォットを除去し、順に、96ウェルの新しいプレートにおいて培養を開始した。この段階では、E07及びF07ポジションのクローンのみを使用した（F08は作業を簡易化するため分析しなかった）。E07ポジションの136クローンは新プレートで確認され、また新マトリックスの集合の開始点となった。この第２のマトリックスは、同じラインまたは同じカラムに置かれた全クローンの混合液となり、全部で36の混合液となった（図３）。これらの混合液はオリゴT7及び11を使用したPCRの増幅用のＤＮＡのソースに使用された。増幅の結果により、ＫＭ＋のＤＣＮｃＡのクローンのポジション（A*12またはpLL30及びE*01またはpLL29）を定義することができ、これらはオリジナルライブラリのプレートから取り除かれ、ＤＮＡ及びシーケンシングの準備に使用された（図４）。図５は３つの相異なるアミノ酸シーケンスの配列を示しており、ＫＭ＋３つのイソ型に対応する（そのうちの一つはプロテインのシーケンシングを通過したものであり、他の２つはクローンpLL29及びpLL30のヌクレオチドのシーケンスから導き出されるアミノ酸シーケンス）。プロテインＫＭ＋のイソ型、ヘテロ発現のそのような型の結果、抗ＫＭ＋（anti-ＫＭ＋）、リンクの選択性は、糖質のフロントからパネルを試験したとき、ポリクローン（policlonal）抗体Ｄ−マンノース及びトリマンノシドMan alfa1-3[Man alfa1-6]Manに対する抗原フロントを維持した。生体外及び生体内において、好中球の移動を誘導したり、標準ＴＨ１のシトシンを製造するようにネズミの腹膜細胞を誘導することが可能であった。以下の図は請求の一部である。図１：レクチンＫＭ＋及びジャカリンのアミノ酸シーケンスの配列。図２：オリゴヌクレオチドの構築のために選択されたＫＭ＋の領域のアミノ酸シーケンス。図３：３つのプレートから成る計画したマトリックスの概略図。図４：アミノ酸pLL29及びシーケンスから導き出されるプラスミド内のＫＭ＋の現ＤＣＮｃＡのヌクレオチドシーケンス。図５：プラスミドpLL29及びpLL30のＤＣＮｃＡから導き出されるアミノ酸シーケンス、及びプロテインの分析及びデーダベース（Pink et al. 1999年）から得られるアミノ酸シーケンス。図６：アンドコリ（And coli）の組換えプロテインＫＭ＋及び製造されたGst-ＫＭ＋と、Ｓセレビシエ（S. cerevisiae）で製造されたプロテインＫＭ＋の対応バンドを表すウエスタンブロット（Western blot）の結果メンブラン。図７：ジャカ種子由来のレクチンＫＭ＋と、ヘテロシステムにおける発現で得られるレクチンＫＭ＋（レクチン組換えＫＭ＋）とから得られるグリコプロテイン（ペルオキシダーゼ）のリンク活動の比較を表したグラフ。図８：組換え植物のＫＭ＋あるいはＫＭ＋とグリコプロテイン（ペルオキシダーゼ）のリンクに関するモノサッカライドＤ−マンノースに対する特定の阻害を表すグラフ。図９：レクチンＫＭ＋または単なる賦形剤を塗布したラットの背中の翼状火傷の写真。本願は、レクチンＫＭ＋を含む上皮創傷の治療・予防用医薬組成物に関する。有利には、皮膚創傷を含む上皮創傷を��む。好ましくは、上皮創傷は角膜創傷を含む。より有利には、本願は、レクチンＫＭ＋を含む免疫調節用の医薬組成物を含む。更に好ましくは、本願は、レクチンＫＭ＋を含む医薬組成物を含む。更に有利には、本願は、レクチンＫＭ＋を含む殺虫剤組成物を含む。好ましくは、本願はレクチンＫＭ＋を含む薬剤を含む。有利には、本願は、レクチンＫＭ＋を含む殺虫剤を含む。更に好ましくは、本願は、免疫調節性薬剤の調合においてレクチンＫＭ＋の使用を含む。有利には、本願は、化学的または物理的攻撃に起因する翼状創傷の予防・治療のための薬剤調合におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に有利には、本願は、抗菌薬剤の調合におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に好ましくは、本願は、抗ウイルス性薬剤の調合におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に好ましくは、本願は、抗寄生虫性薬剤の調合時におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。有利には、本願は、抗真菌性薬剤の調合時におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に有利には、本願は、殺虫剤組成物の調合時におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。好ましくは、本願は、マンノースの認識にレクチンＫＭ＋の使用含む。更に好ましくは、本願は、マンノースを含むプロテインの精製にレクチンＫＭ＋を使用することを含む。更に好ましくは、本願は、天然形態のＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列に影響を受けるレクチンＫＭ＋の発現方法に関する。有利には、本願は、他のプロテイン及びペプチドと融合する時にＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において影響を受けるレクチンＫＭ＋の発現方法を述べている。更に有利には、レクチンＫＭ＋の発現方法は、他のペプチドと融合する時にＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において影響を受ける。好ましくは、原プロテインの一部と融合する時にＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において影響を受ける。更に有利には、発現方法は、原核生物または真核生物を含む有機体を含む。好ましくは、発現方法は、バクテリアを含む原核生物を含む。更に好ましくは、発現方法は、大腸菌（Escherichia coli）を含むバクテリアを含む。更に好ましくは、発現
方法は、カウロバクター（Caulobacter）を含むバクテリアを含む。好ましくは、発現方法は、組み換えウィルスに感染したバクテリアを含む。有利には、発現方法は、サッカロマイセス（Saccharomyces）を含む真核生物を含む。更に有利には、発現方法は、Ｓセレビシエ（S. cerevisiae）を含むサッカロマイセス（Saccharomyces）を含む。好ましくは、発現方法は、Ｓポンベ（S. pombe）を含むシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）を含む。更に好ましくは、発現方法は、ピチア（Pichia）を含む真核生物を含む。更に好ましくは、発現方法は、Ｐパストラル（P. pastoral）を含むピチア（Pichia）を含む。有利には、発現方法は、メタノーリカＰ（methanolicaＰ）を含むピチア（Pichia）を含む。更に有利には、発現方法は、植物を含む真核生物を含む。更に有利には、発現方法は、遺伝子組み換え植物を含む。好ましくは、発現方法は、組み換えウィルスに感染した植物を含む。更に好ましくは、発現方法は、植物細胞を持つ真核生物を含む。更に好ましくは、発現方法は、動物を含む真核生物を備える。有利には、発現方法は、遺伝子組み換えを含む動物を備える。さらに有利には、発現方法は、哺乳類を含む動物を備える。好ましくは、発現方法は、哺乳動物細胞の機能を備える。更に好ましくは、発現方法は、動物遺伝子組換え及び哺乳動物細胞を含む真核生物を備える。有利には、発現方法は、昆虫細胞を含む真核生物を備える。好ましくは、アンドコリ（And Coli）におけるレクチンの発現方法は、ｐＤＥＳＴ１４ベクターにおいてサブクローン化されたＤＣＮｃＡに影響を受ける。更に好ましくは、関連ＤＮＡのベクターは、図１〜９のシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を含む。有利には、ＤＮＡベクターは、図１〜９の関連するシーケンスＩＤとＰＦＳＧＰＫを含む。有利には、ＤＮＡベクターは、図１〜９の関連するシーケンスＩＤＫＬＰＹＫＮを含む。有利には、ＤＮＡベクターは、図１〜９の関連するシーケンスＩＤＩＧＶＨＭを含む。更に有利には、ベクターＩは、図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を含むレクチンの遺伝子を含む。好ましくは、組換え有機体は、図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を含む。更に好ましくは、組換え有機体は、このプロテインの一部を含んでいる。有利なことに、ＤＮＡ配列は図１〜９に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）と共にpareamentを作成することが出来る。ヌクレオチドの優先的な配列は、レクチンＫＭ＋のアミノ酸配列の一つを体系化することが出来る。ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のより優先的なレクチンプロテインは、それに対する配列に言及している。図１〜９に関連したＩＤ。有利には、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテインは、それに対する配列に言及している。引用された図１〜９に関連したＩＤ及びイソ型のいくつか。ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）の優先的なレクチンプロテインは、それに対する配列に言及している。引用された図１〜９に関連したＩＤ及びイソ型のいくつか。Ｓセレビシエ（S. cerevisiae）におけるレクチンＫＭ＋の発現のより優先的な方法は、ベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２においてＤＣＮｃＡサブクロナードから達成されることが出来る。有利には、発現のプラスミドは、挿入物として、ナガミパンノ���（Artocarpus integrifolia）のレクチンプロテインＫＭ＋に対して体系化するＤＮＡ配列を含むことが出来る。より有利には、発現のプラスミドはナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia）のレクチンＫＭ＋の遺伝子に関連する情報を利用することが出来る。自身でそのレクチンＫＭ＋を観測し、マクロファージを促す性質を介してＩ１−１２を製造し、Ｌ．メジャーのための感染に対抗した保護効果を達成し、パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）の感染に対するブラジリエンシス（brasiliensis）抵抗は効果的なＴｈ１反応に左右されることを自身で知っており、ネズミにおけるＫＭ＋の予防接種の効果はＰ．ブラジリエンシス（brasiliensis）のパン種をもって拒否されると評価される。一群の動物は、ＫＭ＋を注入され、その無細胞抗原（CFA）処置をＰ．ブラジリエンシス（brasiliensis）の単離されたＰｂ１８から結合させる、またはさせない。他のグループの動物は、ＣＦＡのみを注入され、グループコントロールはＰＢＳを受けた。この動物は、Ｐ．ブラジリエンシス（brasiliensis）の有毒な単一のパン種をもって静脈内に感染し、次の期間で、エスプレニック細胞（esplenic cell）の増殖した反応や、肺損傷の組織肺及び組織病理におけるコロニーのフォーマット単位（CFU）の回復を含む、さまざまなパラメーターがどの程度であるか、モニターされている。プロリフェラクティブ（proliferactive）の低下、感染の適切な反応は、毎日ＫＭ＋を予防接種された動物において元の状態に立ち戻られる。組織肺におけるコロニーのフォーマット単位の回復は成し遂げられ、毎日ＫＭ＋を予防接種された動物の肺のコロニーの比例した量は、レクチンを摂取していない動物の肺において得られたものより劣っていることが立証される。肺の組織病理学によると、毎日ＫＭ＋を予防接種されたネズミは、何も処置を受けていなくても、肉芽腫の大きさや極めて少ない数を示した。そうした結果が示唆することには、ＫＭ＋はＰ．ブラジリエンシス（brasiliensis）に関する感染のコースに積極的に介入し、またファンジック抗原免疫のいかなるプロセスも独立させた場合、そうした免疫調整が生じる。レクチンＫＭ＋は、酸性リノール酸が加えられている、あるいは加えられていない石油ゼリーの基剤における軟膏剤に、またプロピレン・グリコールの基剤の調整に組み込まれた。これは、従来の皮膚病学の基剤（オイルにおける著しい乳化水、水における親水性ジェル乳液、軟膏ヒドロフォビックス（hidrofobics）、軟膏）に組み込むことも出来るし、同様に、より解放する精密化されたシステムに組み込むことも可能で、皮膚吸収のプロモーション材料（著しいプロピレン・グリコール、酸性オレイン酸、ピロリドン（pirrolidona）、エタノール(etanol)、ジメチルスルホキシド（dimetilsulfoxido）、及びフォスフォリピデス（fosfolipides））を、多数の乳剤、ミクロン及びナノ乳剤または乳剤サクロミカス（sucromicas）リポサムズ（lipossomes）、トランスファーサムズ（transferssomes）、エソサムズ（ethossomes）、及び他のタイプの小胞、ナノサムズ（nanossomes）、として、他のミクロン及びナノ粒子（nanoparticulados）システムを超えて、ミクロン及びナノカプセル、ミクロン及びナノエスフェア（nanoespheres）として含み、あるいは含まず、及び賦形剤Ｉはサイクロデクストリン（ciclodextrine）、過飽和溶液との含有物として、同含有物のセラミド、液体、複合クリスタルを含み、マイクロ分子との調整はジェル及びフィルムの形成を可能とする。よりいっそう浸透を改善するためには、（著しくエスターとして）材料の親薬剤を得て、それをロッキングヒドロ（hidro）と共に残して、薬剤からの解放のため肌において続きの変換の角膜層における浸透のために、より脂肪親和性が調整される。薬剤のリリースのこれら全ての医薬フォーム及びシステムは、著しくは、経皮性パウダージェクト（それは、ガスショックヘリウムの超音波のために、皮膚の一番深い層に角膜層を介して粒子を発射する）、イントラジェクト（ファブリック皮下のための皮膚を介して、ある用量の定式化を考案するため、ガス源圧縮窒素を使用する）、極微針、イオントフォレーゼ（iontoforese）、エレクトロポレーション（eletroporaction）及び高電圧（100から1000ボルト）、ソノフォレーゼ（sonoforese）として、決められた所望のアクションに関し材料のパフォーマンスをより高めるディバイスに置かれる。ＫＭ＋のための炎症細胞の激しい流入は、レクチンが、周知のように病原体の入り口の重要なドアに相当する傷ついた皮膚表面に適用されることに対して、抗菌作用を有するという仮説に基づく。二次感染は、大きく焼けた際に生じ、皮膚表面を連続して広範囲に失うことと同様、患者の死の最も多い原因に相当する。レクチンによって引き起こされた好中球の流入が感染発生を減らすという仮説をテストするために、ネズミは背部に熱攻撃を与えられ、局所をＫＭ＋を含む軟膏Ｉで処理した。注目後になされたＫＭ＋のアクションで驚くべきことは、軟膏ONEを適用して数時間すると、二次感染に効果があることに関係なく、傷つけられた組織の早い再生に関連していた。死出血領域がないことから、あるいは織り込まれた筋肉を表面に見せる深い創傷がないことから（賦形剤のみが与えられ、）未処置の動物から、ＫＭ＋で対処された動物を区別する。再生が素早くなされた場合に創傷の縁が素早く閉じる一方で、外傷が早くに瘢痕化し、局部の再上皮化及び発毛の復活が現れる。表面的な、あるいは深い創傷、広いあるいは小さな直径の異なる焼成、加熱に対する解説の時間、乾式あるいは湿加熱の使用など、様々な特徴の沢山の実験が繰り返された。全ての実験状況において、動物がＫＭ＋の局部的な適用を受けている場合、図９では２つのグループの動物の背部領域の写真が示されており、５つは局部的にレクチンＫＭ＋で処理され（３塗布）、他の５つは賦形剤だけで処理され（３塗布）ている。全ては写真の２４時間前に背中に熱傷を受けている。ＫＭ＋で対処されたネズミ（下の写真のシリーズ）は保護された組織を有しており、一方で賦形剤のみを投与されたネズミ（上の写真のシリーズ）局部的な死出血創傷を呈している。組織にＫＭ＋を適用する飛躍的で有益な作用は、熱攻撃に苦しんでいる場合には明白である。
【図面の簡単な説明】
【０００２】
明細書の段落番号［０００１］を参照。
【図１】
2007528869.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月18日(2007.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然形態のｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われることを備えた、レクチン発現方法。
【請求項２】
他のプロテイン及びペプチドと融合するｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われることを備えた、レクチン発現方法。
【請求項３】
ペプチドと融合するｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われることを備えた、レクチン発現方法。
【請求項４】
原プロテインの一部と融合するｃＤＮＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において行われることを備えた、レクチン発現方法。
【請求項５】
前記レクチンがジャカリン関連ファミリー（ベータ・プリズム  レクチンとも呼ばれる）のメンバーである、請求項１、２、３及び４のいずれか記載のレクチン発現方法。
【請求項６】
前記レクチンがジャカリン関連ファミリーのメンバーを結び付けるＤ−マンノースである、請求項１、２、３、４及び５のいずれか記載のレクチン発現方法。
【請求項７】
前記レクチンがＫＭ＋（artocarpinとも呼ばれる）である、請求項１、２、３、４、５及び６のいずれか記載のレクチン発現方法。
【請求項８】
前記有機体が原核生物または真核生物を備えている、請求項１〜５のいずれか記載の発現方法。
【請求項９】
前記原核生物がバクテリアを備えている、請求項６記載の発現方法。
【請求項１０】
前記バクテリアが大腸菌（Escherichia coli）を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項１１】
前記バクテリアがカウロバクター（Caulobacter ）を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項１２】
前記バクテリアが組み換えウィルスに感染する、請求項７〜９のいずれか記載の発現方法。
【請求項１３】
前記真核生物がサッカロマイセス（Saccharomyces ）を備えている、請求項６記載の発現方法。
【請求項１４】
前記サッカロマイセス（Saccharomyces ）がＳセレビシエ（S. cerevisiae ）を備えている、請求項１１記載の発現方法。
【請求項１５】
前記シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces ）がＳポンベ（S. pombe）を備えている、請求項１１記載の発現方法。
【請求項１６】
前記真核生物がピチア（Pichia）を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項１７】
前記ピチア（Pichia）がＰパストラルス（P. pastoral ）を備えている、請求項１６記載の発現方法。
【請求項１８】
前記ピチア（Pichia）がメタノーリカＰ（P. methanolica）を備えている、請求項１６記載の発現方法。
【請求項１９】
前記真核生物が植物を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項２０】
前記植物が遺伝子組み換えのものである、請求項１９記載の発現方法。
【請求項２１】
前記植物が組み換えウィルスに感染する、請求項１９記載の発現方法。
【請求項２２】
前記真核生物が植物細胞を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項２３】
前記真核生物が動物細胞を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項２４】
前記動物が遺伝子組み換えのものを備えている、請求項２３載の発現方法。
【請求項２５】
前記動物が哺乳動物を備えている、請求項２３記載の発現方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物細胞が使用される、請求項２３記載の発現方法。
【請求項２７】
前記動物が昆虫を備えている、請求項２３記載の発現方法。
【請求項２８】
前記真核生物が遺伝子組み換え及び哺乳動物細胞を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項２９】
前記真核生物が昆虫細胞を備えている、請求項７記載の発現方法。
【請求項３０】
ｐＤＥＳＴ１４ベクターにおいてサブクローン化されたｃＤＮＡから行われることを備えた、原核生物における、請求項１〜４のいずれか記載のレクチン発現方法。
【請求項３１】
前記原核生物がバクテリアを備えている、請求項３０記載のレクチン発現方法。
【請求項３２】
前記バクテリアが大腸菌（Escherichia coli）を備えている、請求項３１記載のレクチン発現方法。
【請求項３３】
前記バクテリアがカウロバクター（Caulobacter ）を備えている、請求項３１記載のレクチン発現方法。
【請求項３４】
前記レクチンがＫＭ＋（あるいはartocarpin）である、請求項２９〜３０のいずれか記載のレクチン発現方法。
【請求項３５】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤを備えている、ＤＮＡベクター。
【請求項３６】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤはＥＰＦＳＧＰＫである、請求項３１記載のＤＮＡベクター。
【請求項３７】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤはＫＬＰＹＫＮである、請求項３１記載のＤＮＡベクター。
【請求項３８】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤはＡＩＧＶＨＭＡである、請求項３１記載のＤＮＡベクター。
【請求項３９】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤを備えた、レクチン遺伝子を含むベクター。
【請求項４０】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤを備えた、組み換え有機体。
【請求項４１】
このプロテインの一部を含んでいるという事実を備えた、請求項３６記載の組み換え有機体。
【請求項４２】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤの対合を備えた、ＤＮＡ配列。
【請求項４３】
レクチンアミノ酸配列のうち一つを体系化することを備えた、ヌクレオチド配列。
【請求項４４】
前記レクチンがＫＭ＋（あるいはartocarpin）である、請求項３９記載のヌクレオチド配列。
【請求項４５】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤを備えた、レクチンプロテイン。
【請求項４６】
前記レクチンプロテインがナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）から成る、請求項４１記載のレクチンプロテイン。
【請求項４７】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤと、そのイソ型とを備えている、レクチンプロテイン。
【請求項４８】
前記レクチンプロテインがナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）から成る、請求項４３記載のレクチンプロテイン。
【請求項４９】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤはＥＰＦＳＧＰＫである、請求項４１〜４４のいずれか記載のレクチンプロテイン。
【請求項５０】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤはＫＬＰＹＫＮである、請求項４１〜４４のいずれか記載のレクチンプロテイン。
【請求項５１】
図１〜８に関連するシーケンスＩＤはＡＩＧＶＨＭＡである、請求項４１〜４４のいずれか記載のレクチンプロテイン。
【請求項５２】
ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２においてサブクローン化されたｃＤＮＡから行われることを備えた、真核生物または原核生物におけるレクチン発現方法。
【請求項５３】
前記レクチンがＫＭ＋（あるいはartocarpin）である、請求項４８記載のレクチン発現方法。
【請求項５４】
前記原核生物がバクテリアである、請求項４８または４９記載のレクチン発現方法。
【請求項５５】
前記バクテリアがＳセレビシエ（S. cerevisiae ）である、請求項５０記載のレクチン発現方法。
【請求項５６】
レクチンプロテインを体系化する不確定なＤＮＡ配列を備えた、ベクター発現プラスミド。
【請求項５７】
前記レクチンプロテインがＫＭ＋（あるいはartocarpin）である、請求項５２記載のベクター発現プラスミド。
【請求項５８】
レクチン遺伝子に関する用途情報を備えた、請求項５２または５３の発現プラスミド。
【請求項５９】
前記レクチン遺伝子がＫＭ＋である、請求項５４の発現プラスミド。
【請求項６０】
前記レクチンＫＭ＋遺伝子がナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）から成る、請求項５４または５５の発現プラスミド。
【請求項６１】
請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンを備えた、上皮創傷を防ぐ、または治療する医薬組成物。
【請求項６２】
前記上皮創傷は皮膚創傷である、請求項５７記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記皮膚創傷は角膜創傷である、請求項５８記載の医薬組成物。
【請求項６４】
請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンを備えた、免疫調節用の医薬組成物。
【請求項６５】
請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンを備えた、殺虫剤。
【請求項６６】
請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンを備えた、薬剤。
【請求項６７】
創傷を治療するための薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの、瘢痕剤としての使用。
【請求項６８】
免疫調節性薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項６９】
創傷を避けるための薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７０】
前記創傷が化学的または物理的攻撃に起因する、請求項７４または７５記載のレクチンの使用。
【請求項７１】
抗菌薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７２】
抗ウイルス性薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７３】
抗寄生虫性薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７４】
抗真菌性薬剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７５】
殺虫剤の調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７６】
マンノースの調合を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【請求項７７】
マンノースを含有するプロテインの精製または検出を備えた、請求項４１〜５１のいずれかに記載のレクチンの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、上皮創傷を予防・治療するためのレクチンＫＭ＋を含む医薬組成物に関する。
本発明は、また、植物（ナガミパンノキ：Artocarpus integrifolia ）または薬剤調合用組換体（ヘテロ発現）から得られるレクチンＫＭ＋の使用を含む。
レクチンは、自然界に分布するプロテインまたはグリコプロテインであり、糖質が選択的及び可逆的に結合する。ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）( ジャカ) の種子から、ジャカリン及びＫＭ＋の２つのレクチンを単離した。これらはアルトカルパイン（artocarpine ）とも呼ばれている。レクチンＫＭ＋は、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）の種子の食塩水抽出液から得られる。種子の食塩水抽出液におけるＤ−マンノースの割合は小さく（全プロテインの０．５％）、選択的に団結される。これに対し、同食塩水抽出液に含まれるＤ−ガラクトースのリガンド（ligant）レクチンは、ジャカリンに達する高濃度（全プロテインの３０％）である。レクチンＫＭ＋の関連研究において、その精製方法の標準化について開示があり、固定化糖質の入ったカラムにおいて、種子の食塩水抽出液をニ段階で親和性クロマトグラフィーに供する。第1 の抽出において、ジャカリンを枯渇させて固定化Ｄ−ガラクトースに吸着させる。Ｄ−マンノースの溶液を用いた枯渇抽出に続いて、Ｄ−マンノースのカラム内でクロマトグラフィーが行われ、レクチンを避ける。この方法により、レクチンは均一に調整され、主要構造の決定や、結晶化してプロテインの３次元構造を決定しようとする試みに使用されてきた。精製方法によって得られたレクチンは少量であるため、結晶化は困難である。というのは、３次元構造は分子構造模型化の提案だからである。ヒト好中球の吸引は、ＫＭ＋の最初の生物学的特性であり、1994年にSaint-of-Oliveira 達によって、生体外及び生体内の分析によって発見された。レクチンのための好中球の刺激作用のために開放された現象の分子分析によると、ＫＭ＋が細胞表面のグリカン（glicane ）を認識し、そのグリカンへのリンクが細胞を活性化させ、レクチンの高濃度の小さなファームへの移動を誘導することが確認されている。ＫＭ＋に誘導された好中球の移動によって、ハプトタクシー（haptotaxy ）と見なす場合、レクチンが四価になるという事実により、ＫＭ＋糖質の認識のドメインは、好中球の表面及び細胞外マトリックスのラミニングリコプロテインに入る橋を形成することができる。従って、調整された細胞移動に理想的な条件が確立される。相互作用のこのモデルは、誘導された細胞移動のガレクチン３及びＭＮＣＦとしての内生レクチンへの誘導に適用できることがDias-Baruffi et alによって1999年に明らかになっている。ＫＭ＋と好中球の表面のグリカンとの相互作用によって、細胞のシグナルの付随回答を開放することができるという解説から、レクチンが他の免疫性細胞を活性化し、免疫化プロセスにおいてアジュバントに対応することが推察される。ネズミの腹膜ソケットの細胞は、ＫＭ＋の刺激作用下で多量のインターフェロンガンマーを製造し、この製造は、間接的に高濃度のセクレタート（secretated）Ｉ１−１２に誘導され、ＫＭ＋と、腹膜細胞の準備中に含まれるマクロファージの表面とがリンクすることが検証されている。シトシン（Citocines ）のそのようなプロフィールとして、標準ＴＨ１の免疫性回答の確立と互換性があり、知覚可能なパトゲン（patogen ）回答ＴＨ１に対する免疫化において、ＫＭ＋をアジュバントとして使用することによって結果的に得られる利益を調べることを選んだ。選択されたモデルは、パトゲン( ＢＡＬＢ／ｃ) に非常に影響を受けやすい種であるネズミのリーシュマニア感染である。感染の前に、動物にはリーシュマニア（ＳＬＡ）関連の溶性抗原調剤を注射し、それ以外にはＫＭ＋を注射した。Ｌ．メジャーの研究によると、ＫＭ＋を接種した動物は、標準の感受性を寄生虫に対する抵抗力の標準で代用し、またプロフィールＴＨ１用に製造されたシトシンの標準ＴＨ２を反転させた。従って、ＫＭ＋の投与は、特定のタイプのパトゲンに対して有効になるように、免疫性の反応に介在することができる。寄生虫の抗原の付随投与のこの独立した効果が伝達された時、ＫＭ＋にはアジュバントのかわりに免疫性モジュレーター特性があると考えられる。ＫＭ＋の厳密な精製によって得られる生成物が少量であり、ＫＭ＋の優れた生物学的特性が、広範囲の適用を可能にする生物学的投資を課すので、レクチンを体系化するＤＣＮｃＡからこのレクチンの組換え体に到達するように、クローン化及び特徴づけを進めることを選択した。このようにして組換えレクチンが入手可能になると、火傷の治療薬や、多種多様な創傷の瘢痕化促進剤や、その他の薬剤及び／または生物学的使用に適用することができるようになる。ジャカの種子の全ＲＮＡから抽出されたＤＣＮｃＡのライブラリが構築された（ナガミパンノキ：Artocarpus integrifolia ）。ＤＣＮｃＡｓは、ライフテクノロジー（Life Technology ）のベクターpSPORT-Pの指示方法でクローン化される。このような約13000 のクローンから成るライブラリは、96のウェル(A01〜H12)の136 のプレートに組織され、各クローンのグリセロール（glicerol）における供給を含む。Rose et al. (1999 年) のレクチンＫＭ＋のアミノ酸シーケンス、及びジャカリンレクチン及びＫＭ＋のアミノ酸シーケンスの配列（図１）によると、ＫＭ＋の領域及びジャカリンの明瞭が定義され、変質したオリゴヌクレオチドが引き寄せられる（オリゴ10、オリゴ11、オリゴ12、図１）。マトリックスのＰＣＲによって、ＤＣＮｃＡのクローンのコマンドの混合液から（A01 ポジションの136 のクローンの混合液、A02 ポジションの136 のクローンの混合液、以降順にH12 ポジションの136 のクローンの混合液まで）ジャカ種子のＤＣＮｃＡライブラリーの選択が行われる。第１プレートI は各ウェルのクローンの96136 混合液を含み、ＰＣＲの増幅のＤＮＡのソースとして使用される。最初のＰＣＲの増幅は、オリゴヌクレオチドSP6 （ベクターpSPORT-Pにおける現在のシーケンスとして）及びオリゴ12から成される。アガロースゲル電気泳動法で分析した96の増幅結果のうち、500 の塩基対(bp)と同等あるいはそれ以上のサイズのバンドを製造した28の反応を、一秒分析にかけた。28の選択したクローンの混合液を、オリゴヌクレオチドT7（ベクターpSPORT-Pにおける現在のシーケンスとして）及びオリゴ10を使用した増幅用ＤＮＡソースとして使用した。その結果によると、８つの分析された混合液において、待機サイズ（500bp 以上）のバンドの存在が明らかになった。これらの混合液のうちの３つを、１／３秒分析のために選び、この時間の間、第１及び第２回の分析で得られたフラグメントを再増幅したが、オリゴヌクレオチドは別のもの（オリゴ11及び12）を使用した。３つの混合液（E07,G07,F08 ポジション）���増幅により、各混合液の中に、待機サイズのバンドが現出し、ＫＭ＋のＤＣＮｃＡのクローンの存在が確認できた。136 のオリジナルプレートのうち、I は各ウェルにおいてＤＣＮｃＡのクローン一つだけを含み、グリセロール内の供給のアリクウォットを除去し、順に、96ウェルの新しいプレートにおいて培養を開始した。この段階では、E07 及びF07 ポジションのクローンのみを使用した（F08 は作業を簡易化するため分析しなかった）。E07 ポジションの136 クローンは新プレートで確認され、また新マトリックスの集合の開始点となった。この第２のマトリックスは、同じラインまたは同じカラムに置かれた全クローンの混合液となり、全部で36の混合液となった（図２）。これらの混合液はオリゴT7及び11を使用したPCR の増幅用のＤＮＡのソースに使用された。増幅の結果により、ＫＭ＋のＤＣＮｃＡのクローンのポジション（A*12またはpLL30 及びE*01またはpLL29 ）を定義することができ、
これらはオリジナルライブラリのプレートから取り除かれ、ＤＮＡ及びシーケンシングの準備に使用された（図３）。図４は３つの相異なるアミノ酸シーケンスの配列を示しており、ＫＭ＋３つのイソ型に対応する（そのうちの一つはプロテインのシーケンシングを通過したものであり、他の２つはクローンpLL29 及びpLL30 のヌクレオチドのシーケンスから導き出されるアミノ酸シーケンス）。プロテインＫＭ＋のイソ型、ヘテロ発現のそのような型の結果、抗ＫＭ＋（anti- ＫＭ＋）、リンクの選択性は、糖質のフロントからパネルを試験したとき、ポリクローン（policlonal）抗体Ｄ−マンノース及びトリマンノシドMan alfa1-3[Man alfa1-6]Man に対する抗原フロントを維持した。生体外及び生体内において、好中球の移動を誘導したり、標準ＴＨ１のシトシンを製造するようにネズミの腹膜細胞を誘導することが可能であった。以下の図は請求の一部である。図１：レクチンＫＭ＋及びジャカリンのアミノ酸シーケンスの配列と、オリゴヌクレオチドの構築のために選択されたＫＭ＋の領域のアミノ酸シーケンス。図２：３つのプレートから成る計画したマトリックスの概略図。図３：アミノ酸pLL29 及びシーケンスから導き出されるプラスミド内のＫＭ＋の現ＤＣＮｃＡのヌクレオチドシーケンス。図４：プラスミドpLL29 及びpLL30 のＤＣＮｃＡから導き出されるアミノ酸シーケンス、及びプロテインの分析及びデーダベース（Pink et al. 1999年）から得られるアミノ酸シーケンス。図５：アンドコリ（And coli）の組換えプロテインＫＭ＋及び製造されたGst-ＫＭ＋と、Ｓセレビシエ（S. cerevisiae ）で製造されたプロテインＫＭ＋の対応バンドを表すウエスタンブロット（Western blot）の結果メンブラン。図６：ジャカ種子由来のレクチンＫＭ＋と、ヘテロシステムにおける発現で得られるレクチンＫＭ＋（レクチン組換えＫＭ＋）とから得られるグリコプロテイン（ペルオキシダーゼ）のリンク活動の比較を表したグラフ。図７：組換え植物のＫＭ＋あるいはＫＭ＋とグリコプロテイン（ペルオキシダーゼ）のリンクに関するモノサッカライドＤ−マンノースに対する特定の阻害を表すグラフ。図８：レクチンＫＭ＋または単なる賦形剤を塗布したラットの背中の翼状火傷の写真。本願は、レクチンＫＭ＋を含む上皮創傷の治療・予防用医薬組成物に関する。有利には、皮膚創傷を含む上皮創傷を含む。好ましくは、上皮創傷は角膜創傷を含む。より有利には、本願は、レクチンＫＭ＋を含む免疫調節用の医薬組成物を含む。更に好ましくは、本願は、レクチンＫＭ＋を含む医薬組成物を含む。更に有利には、本願は、レクチンＫＭ＋を含む殺虫剤組成物を含む。好ましくは、本願はレクチンＫＭ＋を含む薬剤を含む。有利には、本願は、レクチンＫＭ＋を含む殺虫剤を含む。更に好ましくは、本願は、免疫調節性薬剤の調合においてレクチンＫＭ＋の使用を含む。有利には、本願は、化学的または物理的攻撃に起因する翼状創傷の予防・治療のための薬剤調合におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に有利には、本願は、抗菌薬剤の調合におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に好ましくは、本願は、抗ウイルス性薬剤の調合におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に好ましくは、本願は、抗寄生虫性薬剤の調合時におけるレクチンＫＭ＋の使���を含む。有利には、本願は、抗真菌性薬剤の調合時におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。更に有利には、本願は、殺虫剤組成物の調合時におけるレクチンＫＭ＋の使用を含む。好ましくは、本願は、マンノースの認識にレクチンＫＭ＋の使用含む。更に好ましくは、本願は、マンノースを含むプロテインの精製にレクチンＫＭ＋を使用することを含む。更に好ましくは、本願は、天然形態のＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列に影響を受けるレクチンＫＭ＋の発現方法に関する。有利には、本願は、他のプロテイン及びペプチドと融合する時にＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において影響を受けるレクチンＫＭ＋の発現方法を述べている。更に有利には、レクチンＫＭ＋の発現方法は、他のペプチドと融合する時にＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において影響を受ける。好ましくは、原プロテインの一部と融合する時にＤＣＮｃＡまたはゲノム配列または人工配列から、有機体において影響を受ける。更に有利には、発現方法は、原核生物または真核生物を含む有機体を含む。好ましくは、発現方法は、バクテリアを含む原核生物を含む。更に好ましくは、発現方法は、大腸菌（Escherichia coli）を含むバクテリアを含む。更に好ましくは、発現方法は、カウロバクター（Caulobacter）を含むバクテリアを含む。好ましくは、発現方法は、組み換えウィルスに感染したバクテリアを含む。有利には、発現方法は、サッカロマイセス（Saccharomyces ）を含む真核生物を含む。更に有利には、発現方法は、Ｓセレビシエ（S. cerevisiae ）を含むサッカロマイセス（Saccharomyces ）を含む。好ましくは、発現方法は、Ｓポンベ（S. pombe）を含むシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces ）を含む。更に好ましくは、発現方法は、ピチア（Pichia）を含む真核生物を含む。更に好ましくは、発現方法は、Ｐパストラル（P. pastoral ）を含むピチア（Pichia）を含む。有利には、発現方法は、メタノーリカＰ（methanolica Ｐ）を含むピチア（Pichia）を含む。更に有利には、発現方法は、植物を含む真核生物を含む。更に有利には、発現方法は、遺伝子組み換え植物を含む。好ましくは、発現方法は、組み換えウィルスに感染した植物を含む。更に好ましくは、発現方法は、植物細胞を持つ真核生物を含む。更に好ましくは、発現方法は、動物を含む真核生物を備える。有利には、発現方法は、遺伝子組み換えを含む動物を備える。さらに有利には、発現方法は、哺乳類を含む動物を備える。好ましくは、発現方法は、哺乳動物細胞の機能を備える。更に好ましくは、発現方法は、動物遺伝子組換え及び哺乳動物細胞を含む真核生物を備える。有利には、発現方法は、昆虫細胞を含む真核生物を備える。好ましくは、アンドコリ（And Coli）におけるレクチンの発現方法は、ｐＤＥＳＴ１４ベクターにおいてサブクローン化されたＤＣＮｃＡに影響を受ける。更に好ましくは、関連ＤＮＡのベクターは、図１〜８のシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を含む。有利には、ＤＮＡベクターは、図１〜８の関連するシーケンスＩＤとＰＦＳＧＰＫを含む。有利には、ＤＮＡベクターは、図１〜８の関連するシーケンスＩＤＫＬＰＹＫＮを含む。有利には、ＤＮＡベクターは、図１〜８の関連するシーケンスＩＤＩＧＶＨＭを含��。更に有利には、ベクターＩは、図１〜８に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を含むレクチンの遺伝子を含む。好ましくは、組換え有機体は、図１〜８に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）を含む。更に好ましくは、組換え有機体は、このプロテインの一部を含んでいる。有利なことに、ＤＮＡ配列は図１〜８に関連するシーケンスＩＤ（Seqs. ID）と共にpareament を作成することが出来る。ヌクレオチドの優先的な配列は、レクチンＫＭ＋のアミノ酸配列の一つを体系化することが出来る。ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）のより優先的なレクチンプロテインは、それに対する配列に言及している。図１〜８に関連したＩＤ。有利には、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）のレクチンプロテインは、それに対する配列に言及している。引用された図１〜８に関連したＩＤ及びイソ型のいくつか。ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）の優先的なレクチンプロテインは、それに対する配列に言及している。引用された図１〜８に関連したＩＤ及びイソ型のいくつか。Ｓセレビシエ（S. cerevisiae ）におけるレクチンＫＭ＋の発現のより優先的な方法は、ベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２においてＤＣＮｃＡサブクロナードから達成されることが出来る。有利には、発現のプラスミドは、挿入物として、ナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）のレクチンプロテインＫＭ＋に対して体系化するＤＮＡ配列を含むことが出来る。より有利には、発現のプラスミドはナガミパンノキ（Artocarpus integrifolia ）のレクチンＫＭ＋の遺伝子に関連する情報を利用することが出来る。自身でそのレクチンＫＭ＋を観測し、マクロファージを促す性質を介してＩ１−１２を製造し、Ｌ．メジャーのための感染に対抗した保護効果を達成し、パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）の感染に対するブラジリエンシス（brasiliensis）抵抗は効果的なＴｈ１反応に左右されることを自身で知っており、ネズミにおけるＫＭ＋の予防接種の効果はＰ．ブラジリエンシス（brasiliensis）のパン種をもって拒否されると評価される。一群の動物は、ＫＭ＋を注入され、その無細胞抗原（CFA ）処置をＰ．ブラジリエンシス（brasiliensis）の単離されたＰｂ１８から結合させる、またはさせない。他のグループの動物は、ＣＦＡのみを注入され、グループコントロールはＰＢＳを受けた。この動物は、Ｐ．ブラジリエンシス（brasiliensis）の有毒な単一のパン種をもって静脈内に感染し、次の期間で、エスプレニック細胞（esplenic cell ）の増殖した反応や、肺損傷の組織肺及び組織病理におけるコロニーのフォーマット単位（CFU ）の回復を含む、さまざまなパラメーターがどの程度であるか、モニターされている。プロリフェラクティブ（proliferactive）の低下、感染の適切な反応は、毎日ＫＭ＋を予防接種された動物において元の状態に立ち戻られる。組織肺におけるコロニーのフォーマット単位の回復は成し遂げられ、毎日ＫＭ＋を予防接種された動物の肺のコロニーの比例した量は、レクチンを摂取していない動物の肺において得られたものより劣っていることが立証される。肺の組織病理学によると、毎日ＫＭ＋を予防接種されたネズミは、何も処置を受けていなくても、肉芽腫の大きさや極めて少ない数を示した。そうした結果が示唆することには、ＫＭ＋はＰ．ブラジリエ���シス（brasiliensis）に関する感染のコースに積極的に介入し、またファンジック抗原免疫のいかなるプロセスも独立させた場合、そうした免疫調整が生じる。レクチンＫＭ＋は、酸性リノール酸が加えられている、あるいは加えられていない石油ゼリーの基剤における軟膏剤に、またプロピレン・グリコールの基剤の調整に組み込まれた。これは、従来の皮膚病学の基剤（オイルにおける著しい乳化水、水における親水性ジェル乳液、軟膏ヒドロフォビックス（hidrofobics ）、軟膏）に組み込むことも出来るし、同様に、より解放する精密化されたシステムに組み込むことも可能で、皮膚吸収のプロモーション材料（著しいプロピレン・グリコール、酸性オレイン酸、ピロリドン（pirrolidona ）、エタノール(etanol)、ジメチルスルホキシド（dimetilsulfoxido）、及びフォスフォリピデス（fosfolipides））を、多数の乳剤、ミクロン及びナノ乳剤または乳剤サクロミカス（sucromicas）リポサムズ（lipossomes）、トランスファーサムズ（transferssomes）、エソサムズ（ethossomes）、及び他のタイプの小胞、ナノサムズ（nanossomes）、として、他のミクロン及びナノ粒子（nanoparticulados）システムを超えて、ミクロン及びナノカプセル、ミクロン及びナノエスフェア（nanoespheres）として含み、あるいは含まず、及び賦形剤Ｉはサイクロデクストリン（ciclodextrine ）、過飽和溶液との含有物として、同含有物のセラミド、液体、複合クリスタルを含み、マイクロ分子との調整はジェル及びフィルムの形成を可能とする。よりいっそう浸透を改善するためには、（著しくエスターとして）材料の親薬剤を得て、それをロッキングヒドロ（hidro ）と共に残して、薬剤からの解放のため肌において続きの変換の角膜層における浸透のために、より脂肪親和性が調整される。薬剤のリリースのこれら全ての医薬フォーム及びシステムは、著しくは、経皮性パウダージェクト（それは、
ガスショックヘリウムの超音波のために、皮膚の一番深い層に角膜層を介して粒子を発射する）、イントラジェクト（ファブリック皮下のための皮膚を介して、ある用量の定式化を考案するため、ガス源圧縮窒素を使用する）、極微針、イオントフォレーゼ（iontoforese ）、エレクトロポレーション（eletroporaction ）及び高電圧（100 から1000ボルト）、ソノフォレーゼ（sonoforese）として、決められた所望のアクションに関し材料のパフォーマンスをより高めるディバイスに置かれる。ＫＭ＋のための炎症細胞の激しい流入は、レクチンが、周知のように病原体の入り口の重要なドアに相当する傷ついた皮膚表面に適用されることに対して、抗菌作用を有するという仮説に基づく。二次感染は、大きく焼けた際に生じ、皮膚表面を連続して広範囲に失うことと同様、患者の死の最も多い原因に相当する。レクチンによって引き起こされた好中球の流入が感染発生を減らすという仮説をテストするために、ネズミは背部に熱攻撃を与えられ、局所をＫＭ＋を含む軟膏Ｉで処理した。注目後になされたＫＭ＋のアクションで驚くべきことは、軟膏ONE を適用して数時間すると、二次感染に効果があることに関係なく、傷つけられた組織の早い再生に関連していた。死出血領域がないことから、あるいは織り込まれた筋肉を表面に見せる深い創傷がないことから（賦形剤のみが与えられ、）未処置の動物から、ＫＭ＋で対処された動物を区別する。再生が素早くなされた場合に創傷の縁が素早く閉じる一方で、外傷が早くに瘢痕化し、局部の再上皮化及び発毛の復活が現れる。表面的な、あるいは深い創傷、広いあるいは小さな直径の異なる焼成、加熱に対する解説の時間、乾式あるいは湿加熱の使用など、様々な特徴の沢山の実験が繰り返された。全ての実験状況において、動物がＫＭ＋の局部的な適用を受けている場合、図８では２つのグループの動物の背部領域の写真が示されており、５つは局部的にレクチンＫＭ＋で処理され（３塗布）、他の５つは賦形剤だけで処理され（３塗布）ている。全ては写真の２４時間前に背中に熱傷を受けている。ＫＭ＋で対処されたネズミ（下の写真のシリーズ）は保護された組織を有しており、一方で賦形剤のみを投与されたネズミ（上の写真のシリーズ）局部的な死出血創傷を呈している。組織にＫＭ＋を適用する飛躍的で有益な作用は、熱攻撃に苦しんでいる場合には明白である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０００２】
【図１】レクチンＫＭ＋及びジャカリンのアミノ酸シーケンスの配列と、オリゴヌクレオチドの構築のために選択されたＫＭ＋の領域のアミノ酸シーケンス。
【図２】３つのプレートから成る計画したマトリックスの概略図。
【図３】アミノ酸pLL29 及びシーケンスから導き出されるプラスミド内のＫＭ＋の現ＤＣＮｃＡのヌクレオチドシーケンス。
【図４】プラスミドpLL29 及びpLL30 のＤＣＮｃＡから導き出されるアミノ酸シーケンス、及びプロテインの分析及びデーダベース（Pink et al. 1999年）から得られるアミノ酸シーケンス。
【図５】アンドコリ（And coli）の組換えプロテインＫＭ＋及び製造されたGst-ＫＭ＋と、Ｓセレビシエ（S. cerevisiae ）で製造されたプロテインＫＭ＋の対応バンドを表すウエスタンブロット（Western blot）の結果メンブラン。
【図６】ジャカ種子由来のレクチンＫＭ＋と、ヘテロシステムにおける発現で得られるレクチンＫＭ＋（レクチン組換えＫＭ＋）とから得られるグリコプロテイン（ペルオキシダーゼ）のリンク活動の比較を表したグラフ。
【図７】組換え植物のＫＭ＋あるいはＫＭ＋とグリコプロテイン（ペルオキシダーゼ）のリンクに関するモノサッカライドＤ−マンノースに対する特定の阻害を表すグラフ。
【図８】レクチンＫＭ＋または単なる賦形剤を塗布したラットの背中の翼状火傷の写真。
【国際調査報告】
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