(57)【要約】  本発明は、特にセンサーなどの支持体上にインジケーター分子を固定化するための、固定化法に関し、また、インジケーター分子をその表面に固定化させたセンサーに関する。支持体の表面でのポリマーとの機械的に絡み合った相互貫入ネットワークによる、また、インジケーター分子の帯電部分と支持体の表面上のイオン性基とのイオン結合による、支持体上への高分子インジケーター分子の非共有結合形の固定化を開示する。
2007532901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子インジケーターを支持体に非共有結合的に結びつける方法であって：
（ａ）少なくとも１種のポリマーを含んだ支持体表面を提供し；
（ｂ）該ポリマーの完全性を変化させて、少なくとも１つの絡み合い領域を形成する緩んだポリマー鎖を提供し;
（ｃ）少なくとも１種の高分子インジケーター又はそのモノマーを提供し；
（ｄ）該高分子インジケーターを前記少なくとも１つの絡み合い領域と絡み合わせるか、又は、前記少なくとも１つの絡み合い領域と絡み合う重合生成物を形成するよう、前記モノマーの逐次重合を起こさせ；
（ｅ）該緩んだポリマー鎖を引き締めて、表面固定化されたインジケーター分子を生成させること
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ｃ）における高分子インジケーター分子が、部分的又は完全に重合したインジケーター分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種の高分子インジケーター分子のモノマーを（ｃ）において提供し、（ｄ）において逐次重合させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
支持体の表面が疎水性又は親水性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
支持体の表面が疎水性であり、高分子インジケーターが親水性である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
支持体がセンサー又は光導波路の表面である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ポリマーの完全性を、溶媒を加えることによって変化させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
緩んだポリマー鎖を、溶媒の実質的な除去によって引き締める、請求項７記載の方法。
【請求項９】
溶媒が、エタノール、２−メトキシエタノール、ジメチルホルムアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、又はこれらの混合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
溶媒が、親水性高分子インジケーターの親水性モノマーである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
親水性モノマーと高分子インジケーター分子のさらなるモノマーとの重合により、緩んだポリマー鎖を引き締める、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
親水性モノマーが、２−ヒドロキシエチルメタクリレート又は塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
高分子インジケーター分子のさらなるモノマーが、ビス−カルボキシレートビス−ボロネート−アントラセンを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
高分子インジケーターが少なくとも１つの参照部位を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
参照部位がエキシマー部位である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
エキシマー部位が、天然高分子インジケーターの三次構造から生じるエキシマー部位である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
参照部位が少なくとも１種の参照分子を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
高分子インジケーターを１種又はそれより多い架橋剤によって架橋させる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
１種又はそれより多い架橋剤が、エチレングリコールジメチルアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ｐ−トルエンスルホン酸、又はこれらの混合物である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種の高分子インジケーター分子が少なくとも１つの絡み合い領域と絡み合った後に、前記少なくとも１種の高分子インジケーターを別の高分子インジケーター分子に架橋させる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種の高分子インジケーター分子を、前記少なくとも１種の高分子インジケーター分子のモノマーの逐次重合の間に架橋させる、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種のポリマーを含んだ表面；及び
高分子インジケーター分子;
を含むグラフトであって、前記高分子インジケーターが、支持体の前記少なくとも１種のポリマーの少なくとも１つの鎖と安定的に絡み合っている前記グラフト。
【請求項２３】
グラフトの一部になっている高分子インジケーター分子の特性が、グラフトの一部になる前の前記高分子インジケーター分子の特性に実質的に一致している、請求項２２記載のグラフト。
【請求項２４】
表面がセンサーの表面である、請求項２２記載のグラフト。
【請求項２５】
グラフトが連続的なＩＰＮである、請求項２２記載のグラフト。
【請求項２６】
グラフトがＩＰＮである、請求項２２記載のグラフト。
【請求項２７】
インジケーター分子をセンサーに非共有結合的に結びつける方法であって：
（ａ）少なくとも１種の強イオン性基を含んだ表面を有する支持体を提供し；
（ｂ）該支持体の該イオン性基の電荷とは反対の電荷を有する、少なくとも１種の帯電した残基を含んだ少なくとも１種のインジケーター分子を、前記表面に加え；そして
（ｃ）前記インジケーター分子を、該支持体の前記イオン性基と前記少なくとも１種の帯電した残基との間のイオン結合によって、前記支持体上に固定化すること
を含む、前記方法。
【請求項２８】
イオン性基がアニオン性基であり、少なくとも１種の帯電した残基が正電荷を帯びた残基である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
イオン性基がスルホネートである、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
イオン性基を、スルホネートとメチルメタクリレートとのコポリマーによって提供し、前記コポリマーが表面上にコーティングを形成する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
媒質中における分析物の存在又は濃度を調べるためのセンサーであって：
センサー本体、前記センサー本体は、前記センサー本体を取り囲んでいる外部表面を有しており、前記外部表面は少なくとも１種のポリマーを含む；
前記媒質中における分析物の存在に応じて少なくとも１つの測定可能な特性を変化させる高分子インジケーター分子；及び
前記インジケーター分子の前記少なくとも１つの特性の前記変化を測定し、前記インジケーター分子の前記変化を示す出力信号を発する検出器；
を含み、前記高分子インジケーター分子が、前記外部表面の前記少なくとも１種のポリマーの少なくとも１つの鎖と安定的に絡み合っている、前記センサー。
【請求項３２】
センサーが光学センサーである、請求項３１記載のセンサー。
【請求項３３】
ポリマーがポリメチルメタクリレートである、請求項３１記載のセンサー。
【請求項３４】
分析物が、グルコース、酸素、二酸化炭素、酸化窒素、毒素、ｐＨ、イオン、一価カチオン、及び二価カチオンである、請求項３１記載のセンサー。
【請求項３５】
媒質中における分析物の存在又は濃度を調べるための光学ベースのセンサーであって：
光学的な伝達が可能なセンサー本体、前記センサー本体は、前記センサー本体を取り囲んでいる外部表面を有しており、前記外部表面は少なくとも１種のポリマーを含む；
前記センサー本体中にて放射線を発する、前記センサー本体中の放射線源；
分析物の存在又は濃度によって影響を受ける光学特性を有する高分子インジケーター分子、前記高分子インジケーター分子は、前記放射線源から進んでくる放射線を受容すべく前記センサー本体上に配置されていて、放射線を前記センサー本体に伝える；及び
前記センサー本体中に組み込まれていて、前記センサー本体中にて放射線を受け取るべく配置されていて、前記インジケーターエレメントから受容される放射線に対応した信号を発する感光性エレメント；
を含み、前記高分子インジケーター分子が、前記センサー本体の前記外部表面の前記少なくとも１種のポリマーの少なくとも１つの鎖と安定的に絡み合っている、前記センサー。
【請求項３６】
高分子インジケーターを支持体に非共有結合的に結びつける方法であって：
（ａ）少なくとも１種のポリマーを含んだ支持体表面を提供し；
（ｂ）該ポリマーの完全性を変化させて、少なくとも１つの絡み合い領域を形成する緩んだポリマー鎖を提供し；
（ｃ）少なくとも１種の高分子インジケーター又はそのモノマーを提供し；そして
（ｄ）該高分子インジケーターを前記少なくとも１つの絡み合い領域と絡み合わせるか、又は、前記少なくとも１つの絡み合い領域と絡み合う重合生成物を形成するよう、前記モノマーの逐次重合を起こさせること
を含む、前記方法。
【請求項３７】
方法が、（ｅ）緩んだポリマー鎖を引き締めて、表面固定化されたインジケーター分子を生成させる工程、をさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
（ｃ）における高分子インジケーター分子が、部分的又は完全に重合したインジケーター分子である、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１種の高分子インジケーター分子のモノマーを（ｃ）において提供し、（ｄ）において逐次重合させる、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
支持体の表面が疎水性又は親水性である、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、固定化法、特にインジケーター分子を光学センサーなどの支持体上に固定化するための固定化法に関し、また、その表面上にインジケーター分子を固定化させたセンサーに関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
米国特許第5,356,417号は、インジケーター分子と感光性エレメントを含んだ蛍光ベースの検出装置（例えば、光検出器）を開示している。本発明の分野という観点から大まかに言うと、インジケーター分子は、その１つ又はそれより多い光学特性が、分析物の局所的存在によって影響を受ける分子である。インジケーター分子は、グルコース、酸素、毒素、医薬品や他の薬物、ホルモン、及び他の代謝性分析物等の、多様な分析物を測定するのに使用されている。これらのインジケーター分子は、それらの作用がベースになっている化学原理に基づいて分類されることが多い。例えば、多くのインジケーターの作用〔米国特許第6,344,360号（該特許の開示内容を参照により本明細書中に援用する）に開示されている作用など〕は、ルミネセンス（特に蛍光）の原理に基づいている。米国特許第6,344,360号は、一定の糖が存在することでその蛍光発光の強度が増大する蛍光ランタニド金属キレート錯体を含有した蛍光インジケーター分子を開示している。他のカテゴリーのインジケーター分子としては、分析物が存在すると色が変化する比色分析用インジケーター分子や、特定の波長において吸光度が変化するインジケーター分子などがある。
【０００３】
インジケーター分子は、その化学組成と特性が広範囲にわたっている。例えば、インジケーター分子は、モノマーであっても、もしくはポリマーであっても、及び/又は、親水性であっても、もしくは疎水性であってもよい。
【０００４】
インジケーター分子は、支持体の表面に結びつけることによって支持体（センサーの表面など）上に固定化されている。不活性なポリマー支持体上にインジケーター分子を固定化することは特定の難題をもたらす。なぜなら、こうした支持体は、インジケーター分子に対する結びつき箇所を提供するために変性を施すか、あるいはインジケーター分子に対する結びつき箇所を提供するよう選定しなければならないからである。
【０００５】
分子は、種々の方法で支持体上に固定化することができる。固定化は、支持体と固定化される分子との間の共有結合に基づくことが多い。固定化を容易にするためには、一般には不活性支持体を避ける。不活性支持体は、支持体を酸化して反応性部位をつくり出すのに前処理（例えば、紫外線又は硝酸等の強酸による前処理）を必要とするからである。これらの前処理には一般に、固定化物質の不安定性に対する懸念や強酸の取り扱いなどの好ましくないことが付きものである。したがって当該分子を結びつけるために、一般には、より容易に変性することができる支持体（例えばポリアクリルアミド支持体）が選定される。ポリアクリルアミド支持体は、例えば、反応性アミン基（ヘプテン、ペプチド、炭水化物、及びオリゴヌクレオチドを含めた種々の分子の結びつきを可能にする）を介して結びつけることによって容易に変性することができる。
【０００６】
光学センサー上に分子（例えばインジケーター分子）を固定化する際には、幾つかの独特な難題がもたらされる。例えば、固定化の方法が光学センサーの機能を阻害しないことが重要である。さらに、一定の固定化法は支持体の変色を起こすことがあり、したがって光導波路としての機能を阻害することがある。さらに、公知の固定化法は、表面のバブリング（bubbling）やリップリング（rippling）を引き起こすことによって表面の光学特性を変えることがあり、したがってセンサーの光学経路を混乱させ、あるいはまた材料の特性に悪影響を及ぼすこともある。したがって、インジケーター分子を固定化用支持体上に固定化させる上での改良法が常に求められている。こうしたニーズは、インジケーター分子をセンサー本体（特に、長期のインプラントとして使用される光学センサー本体）上に固定化させるという状況において特に顕著である。
【０００７】
発明の要旨
第１の側面において、本発明は、高分子インジケーター分子を支持体に非共有結合的に結びつける方法に関する。本発明の方法は、（ａ）少なくとも１種のポリマーを含んだ支持体表面を提供し；（ｂ）ポリマーの完全性を変化させて、少なくとも１つの絡み合い領域を形成する緩んだポリマー鎖を提供し；（ｃ）少なくとも１種の高分子インジケーター又はそのモノマーを提供し；（ｄ）高分子インジケーター又はそのモノマーの重合生成物を絡み合い領域と絡み合わせ；そして、（ｅ）緩んだポリマー鎖を引き締めて、表面固定化されたインジケーター分子を生成させること、を含む。本発明のこの第１の側面においては、（ｃ）における高分子インジケーター分子は、部分的に重合したインジケーター分子であっても、あるいは完全に重合したインジケーター分子であってもよい。これとは別に、（ｃ）における少なくとも１種の高分子インジケーター分子のモノマーは、連続的なＩＰＮ（相互貫入高分子ネットワーク：interpenetrating polymer network）を形成するよう、（ｄ）において逐次重合させてもよい。
【０００８】
ポリマー鎖は、例えば、エタノール、２−メトキシエタノール、ジメチルホルムアミド、親水性高分子インジケーターのモノマー（例えばＨＥＭＡ）、又はこれらの混合物等の溶媒によって緩めることができる。ポリマー鎖は、それぞれ、溶媒を除去することによって、あるいは親水性高分子インジケーター中へのモノマーの重合によって、再び引き締めることができる。本発明のこの側面においては、支持体の表面が疎水性であってもよく、高分子インジケーター分子が親水性であってもよい。支持体は、センサーの表面であっても、あるいは光導波路の表面であってもよい。高分子インジケーター分子は、１つ又はそれより多い参照部位（reference regions）を有していてもよい。これらの参照部位はエキシマー部位（excimer regions）であってもよく、あるいは少なくとも１種の参照分子（reference region）を含んでいても、又は少なくとも１種の参照分子からなっていてもよい。高分子インジケーター分子はさらに、支持体中にて高分子インジケーター分子を次々に架橋する１種又はそれより多い架橋剤を含んでよい。
【０００９】
第２の側面において、本発明はグラフトに関する。グラフトは、少なくとも１種のポリマーと高分子インジケーター分子を含んだ表面を含むのが好ましい。本発明のグラフトは、高分子インジケーター分子が、支持体中にて少なくとも１種のポリマーの少なくとも１つの鎖間で安定的に絡み合っていることを特徴とする。本発明の一態様によれば、グラフト中の高分子インジケーター分子は、グラフトの一部ではない同一の高分子インジケーター分子（ネイティブ分子）の特性と実質的に一致する一定の特性を有する。こうした特性としては、分析物もしくはその参照部位（例えばエキシマー部位）に対する分子の親和性（ネイティブ分子においては、分子の一次構造及び／又は三次構造の結果であってよい）を含むが、これに限定されない。グラフトの表面がセンサーであってもよい。
【００１０】
第３の側面において、本発明は、インジケーター分子をセンサーに非共有結合的に結びつける別の方法に関する。本発明の方法は、（ａ）少なくとも１種の強イオン性基を含んだ表面を有する支持体を提供すし；（ｂ）支持体のイオン性基の電荷とは反対の電荷を有する、少なくとも１種の帯電した残基を含んだ少なくとも１種のインジケーター分子を前記表面に加え；そして、（ｃ）前記インジケーター分子を、支持体の前記イオン性基と前記少なくとも１種の帯電した残基との間のイオン結合によって前記支持体上に固定化すること、を含む。イオン性基は、例えば、アニオン性基（特にスルホネート）であってもよい。少なくとも１種の帯電した残基は、例えば正電荷を帯びた残基であってもよい。イオン性基は、支持体の表面にコーティングを形成するコポリマーの一部分（例えば、スルホネートやメチルメタクリレート）であってもよい。
【００１１】
第４の側面において、本発明は、媒質中における分析物の存在又は濃度を調べるためのセンサーに関する。本発明のセンサーは、センサー本体、前記センサー本体を取り囲んでいるポリマー外部表面を有するのが好ましい；そして、媒質中における分析物の存在に応じて少なくとも１つの測定可能な特性を変化させる高分子インジケーター分子、を含む。本発明のセンサーはさらに、インジケーター分子からの放射線を検出し、インジケーター分子の少なくとも１つの特性の変化に対応した電気信号（分析物の存在又は濃度を示している）を発する検出器をさらに含む。このセンサーにおいては、高分子インジケーター分子は、センサー表面の少なくとも１種のポリマーの少なくとも１つの鎖間で安定的に絡み合うことができる。本発明のセンサーは、媒質中の１種以上の当該分析物（例えばグルコース）を検出すべく造られた光学センサーであってよい。好ましい態様においては、センサーの表面がポリメチルメタクリレートから製造される。
【００１２】
図面の簡単な説明
本明細書中に援用され、また本明細書の一部を形成している添付図面は、本発明の種々の態様を実証しており、発明の具体的な説明と併せると、本発明の原理を説明するのに、また当業者が本発明を実施・利用するのを可能にするのに役立つ。図面において、同じ参照番号は、同一であるか又は機能的に類似の要素を示している。さらに、参照番号の最も左の数字は、参照番号が最初に現われる図面を識別している。
【００１３】
発明の具体的な説明
インジケーター分子のための支持体（例えばセンサーデバイス）は、一定の設計要件を満たさなければならない。光学センサーのハウジングの場合、一般には、透光性と耐久性を有しているのが望ましい。この結果、支持体の表面（光導波路として作用することができる材料で造ってもよい）は、その表面に結びつけることが望まれるインジケーター分子の特性とはかなり異なった一組の特性を有する場合が多い。さらに、この一組の特性は、センサーが作動する環境とは異なることが多い。例えば、支持体は非常に疎水性であることが多いが（例えば、センサー内でのマイクロ電子機器を保護するために）、インジケーター分子は非常に親水性であることができる。このことは、分析物を水性媒質中で検出しようとする場合には特に望ましい。本発明の一定の態様は、支持体とインジケーター分子の特性の差異にもかかわらず、またインジケーター分子の性能に悪影響を及ぼすことなく、高分子インジケーター分子を含めたインジケーター分子の効果的な固定化を達成することに関する。本発明の一定の態様は、実際にこれらの差異を利用し、これらの差異を増大させ、及び／又は、固定化が達成されるよう、これらの差異をつくり出しさえする。
【００１４】
本発明においては種々のインジケーター分子を使用することができる。本発明によるインジケーター分子は、分析物の局所的な存在によって影響を受ける少なくとも１つの特性（例えば蛍光）を有する分子である。このようなインジケーター分子は、その作用が、これらに限定されないが、ルミネセンス（例えば、蛍光やリン光）、吸光度、及び比色分析を含めた幾つかの原理に基づいている。本発明のインジケーター分子としては、モノマー分子、ならびに、水溶性の高分子インジケーター分子などの高分子インジケーター分子が挙げられる。例えば、米国特許出願第10/187,903号及び米国特許公開第2002/0127626もしくは第2003/0082663号に記載の化合物〔グルコースに対する少なくとも２つの認識エレメント(recognition elements)を有する〕を本発明において使用することができる。さらに、米国特許第6,344,360号に記載の蛍光ランタニド金属錯体、又は米国特許第5,503,770号に記載の蛍光フェニルボロニック（phenylboronic）化合物も、本発明において使用することができる。これらの特許及び特許出願の開示内容は参照により本明細書中に援用する。しかしながら、当業者には周知のことであるが、他のいかなる適切なインジケーター分子も同様に使用することができる。
【００１５】
本発明のインジケーター分子は、一般には、１種又はそれより多い分析物に対して特異的である。例えば、好ましい態様において、インジケーター分子はグルコースに対して特異的である。他の態様において、インジケーター分子は、酸素、二酸化炭素、酸化窒素、毒素、ｐＨ、イオン、一価カチオン、及び二価カチオンに対して特異的である。しかしながら、当業者には周知のことであるが、本発明を使用して、種々の他の分析物を検出及び／又は測定することができる。
【００１６】
本発明の一定の態様において、モノマー分子（例えば、上記の特許と特許出願に記載のモノマー分子）を、伸び拡がった支持体ポリマーの存在下で重合させることによって、あるいはポリマーに結びつけることによって、水溶性の高分子インジケーター分子を含めた高分子インジケーター分子に転化させる。本発明による“高分子インジケーター分子”又は“高分子インジケーター”は、インジケーター分子として作用する分子であり、別のタイプの１種又はそれより多い分子と部分的もしくは完全に重合（例えば共重合）していることから高分子である。本発明の観点からのポリマーは、モノマーのあらゆる重合生成物（複雑なものと単純なもの）だけでなくオリゴマーも含む。本発明による“水溶性の高分子インジケーター分子”（ＷＳＭＩＭ）は、全体として実質的に親水性である高分子インジケーター分子である。ＷＳＭＩＭを得るために、適切な認識モノマー（recognition monomer）を親水性モノマーと共重合させることができる。適切な親水性モノマーの例としては、メタクリルアミド、一定のメタクリレート、ビニル化合物、多糖類、ポリアミド、ポリアミノ酸、親水性シラン又は親水性シロキサン、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、あるいは他の一般的なヒドロゲル成分、ならびに２種又はそれより多いモノマーの混合物などがあるが、これらに限定されない。モノマーインジケーター分子と親水性モノマーとの共重合によって得られる高分子インジケーター分子の例が、米国特許公開第2003/0013204号、第2003/0013202号、第2003/0008408号、第2003/0003592号、及び第2002/0039793号、ならびに米国特許出願第10/187,903号に記載されている（これらの特許文献を参照により本明細書中に援用する）。
【００１７】
適切な親水性モノマーの性質と割合は、例えば米国特許公開第2003/0013204号に記載の多くのファクターにしたがって変わる。好ましい態様において、水溶性の高分子インジケーター分子は、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）とビス−カルボキシレートビス−ボロネート−アントラセンとのコポリマーである。さらに別の好ましい態様において、水溶性の高分子インジケーター分子は、塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム（ＭＡＰＴＡＣ）とビス−カルボキシレートビス−ボロネート−アントラセンとの、約５：１〜８０：１の割合でのコポリマーである。
【００１８】
好ましい態様において、本発明の高分子インジケーター分子は、エキシマー部位（エシキマー発光部位とも呼ばれる）等の参照部位を有する。本発明による“エキシマー部位”は、高分子インジケーター分子の、エキシマー効果をもたらす部位を表わしている。連続した特定のエキシマー部位は、分子の一次構造の直接的な結果として存在する。しかしながら、分子が三次構造をとると（３−Ｄ配置）、分子内にさらなるエキシマー部位がつくり出されることがある。本発明の文脈における“エキシマー効果”とは、エキシマー部位を有する分子の、より長い波長の特徴的な発光を表わしている。エキシマー効果について分子論的考え方の基礎が、例えば米国特許公開第2003/0013204号（参照により本明細書中に援用する）に記載されている。
【００１９】
前述したように、エキシマー部位は、分析物濃度の変化には応答しないが、分析される系の他の側面（例えば、励起強度、温度、及びｐＨなど）に応答する。結果として、エキシマー部位を有するインジケーター分子は、インジケーターとして、及び内部基準として機能することがある。例えば、インジケーター波長（すなわち、分析物によって影響を受ける波長）での発光強度は、選定された帯域通過フィルターを介して、エキシマー波長での発光強度から光学的に分離することができる。こうして得られる値により、蛍光発光特性に影響を及ぼす阻害ファクター（例えば、酸素による蛍光の消光、ドリフト、光退色、分解、及びｐＨの誤差など）が修正される。長期のインビボ使用における周囲条件は、頻繁な変化にさらされることに繋がるので、エキシマー部位を有するインジケーター分子は、長期のインプランテーションを伴う使用に対して特に有用である。したがって、エキシマー部位を含んだ分子は、本発明の好ましい態様の一部である。米国特許公開第2003/0013204号、第2003/0013202号、第2003/0008408号、第2003/0003592号、及び第2002/0039793号（これらの特許文献は参照により本明細書中に援用する）は、このような分子の例を記載している。
【００２０】
本発明の別の態様において、高分子インジケーター分子は、１種又はそれより多い参照分子を含む。参照分子は、例えば、個々のインジケーター分子とは異なる波長において発光し、分析物濃度の変化には応答しないが、分析される系の他の側面（例えば、励起強度、温度、及びｐＨなど）に応答する蛍光分子である。
【００２１】
図１Ａと１Ｂは、それぞれ、本発明による典型的なＷＳＭＩＭ１００の一次構造と三次構造を示している。このような分子の三次構造は、一般には、水性環境において達成されることがある最も低いエネルギー配置によって決定される。分子は、示されている態様においては、エキシマー発光部位１０１を有しており、そのうちの幾つかは、分子１０２の折りたたみによってつくり出される。こうしたエキシマー発光部位においては、芳香族構造の２種の平面状分子（例えばフルオロフォア）が同一平面配置にて配向しており、重なり合ったｐｉ電子軌道を有する。この結果、親化学種１０３に対して特徴的な波長とは異なる波長にて１種又はそれより多い発光を生じる。例えば、平面状の蛍光化学種の場合、脱カップリングした化学種の波長と比較して、脱カップリングした化学種より実質的に低いエネルギーの波長にて、特徴的なダウンフィールド発光（downfield emission）が起こる。前述したように、こうした特徴的な発光は、変わりやすい周囲条件を補正するのに使用することができる。
【００２２】
本発明の一定の態様において、適切なｐＨにて少なくとも１つの、強く正又は負に帯電した部分を有するインジケーター分子が好ましい。ある部分が強い負電荷又は正電荷を帯びるのを可能にするｐＨは、当該部分の特性に直接依存する。好ましい態様において、当該部分を、インジケーター分子が使用される環境に応じて選択することができる。したがって好ましい態様において、“適切なｐＨ”は、選択された環境における一般的なｐＨであってよい。したがって好ましい態様において、一般には中性である体液中に入れ込むセンサーというインビボ用途の場合、中性ｐＨにて強イオン性のインジケーター分子が好ましい。例えば、中性付近のｐＨ値においては、アミン部分は強く正に帯電しており、このｐＨにおいて強く負に帯電しているスルホネートと強力なイオン結合を形成することができる。
【００２３】
インジケーター分子は、適切なｐＨにて強く正又は負に帯電した部分を本質的に含有するインジケーター分子であっても、あるいは、例えば、強く正又は負に帯電した１つ又はそれより多い部分を含有する分子（例えば、ＭＡＰＴＡＣや塩化２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムなど）に結びつけることによって、こうした部分を含むよう変性されたインジケーター分子であってもよい。
【００２４】
図５Ａと５Ｂは、強く正に帯電した１つ又はそれより多い部分を含有する典型的なカチオン性高分子インジケーター分子を示している。図５Ａは特に、強く正に帯電した部分５１１を複数含有するカチオン性の高分子インジケーター分子５１０を示している。図５Ｂは、強く正に帯電した部分５２２を１つ有するカチオン性高分子インジケーター分子５２０を示している。図５Ａの分子は、分子全体５１０にわたって分布されている、正に帯電した多数の部分（例えばアミン部分）の結果として正に帯電している。これとは対照的に、図５Ｂの分子５２０は、例えばアミン部分の形で末端正電荷５２２だけを含有している。これら２つの図面において文字“ｎ”で表わされているように、分子は、図面に示されているよりかなり長い。図示のインジケーター分子はさらに、分子の一次構造において存在するエキシマー発光部位１０１を有する。このような部位を有するインジケーター分子を使用することの利点は、前述したとおりである。
【００２５】
好ましい態様において、インジケーター分子が固定化される支持体（ここでは“固定化用支持体”と呼ぶ）がセンサーである。適切なセンサーの例が、米国特許第5,517,313号、第5,910,661号、及び第5,894,351号（これら特許の開示内容を参照により本明細書中に援用する）に記載されている。適切な埋め込み可能なセンサーの例が、米国特許第6,330,464号、第6,011,984号、第6,304,766号、及び第6,400,974号、ならびに米国特許出願公開第2002/0026108号（これら特許文献の開示内容を参照により本明細書中に援用する）に開示されている。しかしながら、当業者には周知のことであるが、他のセンサーも使用することができる。
【００２６】
好ましい態様において、固定化用支持体は、光学的に伝送可能なポリマー材料から作製することができる。好ましいポリマー材料としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のアクリルポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリスチレン、及びポリカーボネート（例えば、ＬＥＸＡＮの商標で販売されているもの）などがあるが、これらに限定されない。最も好ましい材料はＰＭＭＡである。
【００２７】
本発明による、インジケーター分子を結びつけた支持体とセンサーは、多種多様な分野において使用することができる。例えば、生理緩衝液もしくは生理液（例えば、血液、血漿、血清、間質液、脳脊髄液、尿、唾液、眼液、リンパ液、涙、又は汗）中のより低いレベル又はより高いレベルのグルコースを検出するのに使用することができ、したがって、糖尿病や副腎機能障害等の疾患を診断もしくは監視するための有用な情報が得られる。他の用途も、種々の文献(例えば米国特許出願公開第2003/0082663号)中に記載されている。しかしながら、本発明による、インジケーター分子を結びつけた支持体とセンサーは、長期にわたるインビボ使用（例えば、長期のインプラント）に対して特に有用である。
【００２８】
図２Ａと２Ｂは、本発明において使用できる典型的な固定化用支持体を示している。図２Ａと２Ｂは特に、典型的な電子光学検出デバイスのマイクロ電子部品２０５を収容したポリマー・エンケースメント２０４を示している。マイクロ電子部品２０５は、例えば、放射線源２０２や検出器２０１等のマイクロ電子部材を含んでよい。１つの好ましい態様において、放射線源２０２はＬＥＤであるが、他の放射線源も使用することができる。さらに、１つの好ましい態様において、検出器２０１は感光性のエレメント（例えば光検出器）であるが、他の検出デバイスも使用することができる。典型的な電子光学検出デバイス中に収容することができるマイクロ電子部品が、米国特許第6,330,464号（該特許の開示内容を参照により本明細書中に援用する）に記載されている。
【００２９】
図２Ｂにより詳細に示されているように、固定化用支持体の表面２０６は、織り交ざっていて絡み合ったポリマー構造物２０７（例えばＰＭＭＡの鎖）を含む。このポリマー構造物は、本発明の１つの態様において、その周囲に対して堅くてしっかりした疎水性の境界をもたらし、反応に対して不活性である。
【００３０】
本発明の一定の側面において、高分子インジケーター分子の特性（特に、分析物に対する親和性）、及び／又は、高分子インジケーター分子の参照部位〔例えばエキシマー部位（元の分子においては、分子の一次構造と三次構造の結果である）〕に実質的に影響を及ぼすことなく、高分子インジケーター分子と支持体とを絡み合わせる。インジケーター分子の特性を保持すれば、インジケーター分子の検出能力が悪影響を受けることはない。他の好ましい態様において、高分子インジケーター分子が分析物結合部位に近づくのを極めに容易にするような仕方で、高分子インジケーター分子が支持体に結びつけられる。
【００３１】
１つの好ましい態様において、バルク支持体材料の特性も、固定化後に実質的に保持される。これにより、支持体の主要な機能（例えば、マイクロ電子部品のエンケースメント）は、固定化によって悪影響を受けることはない。好ましい態様において、この目的は、固定化のための非共有結合的な機械的絡み合いに依拠することによって達成される。
【００３２】
別の好ましい態様において、分析物の拡散距離（diffusion distance）を比較的短く保持する、という仕方にてインジケーター分子を支持体と関連させる。例えば、分析物の拡散距離は、約２００ミクロン以下（好ましくは１５０ミクロン以下、さらに好ましくは１２５ミクロン以下）にて保持されるか、あるいは約８０ミクロン以下（さらに好ましくは約５０ミクロン以下、及び一定の場合にはわずか約１ミクロン以下）にて保持される。拡散距離を比較的短く保持すると、インジケーター分子が結合しているセンサーの応答時間が比較的短く保持される。応答時間は、例えば約８分未満であり、好ましくは約６分未満であり、さらに好ましくは約５分未満である。１つの非限定的な態様において、水性媒質中のグルコースの検出に対しては、約１００ミクロン以下の拡散距離と約５分以下の応答時間が望ましい。別の非限定的な態様において、酸素ガスの検出に対しては、約５０ミクロンの拡散距離と約５０ミリ秒の応答時間が望ましい。インジケーター分子の応答時間を比較的短く保持すると、例えばセンサーの場合、所定の分析物の濃度及び／又は存在についてのクロースタイム乃至リアルタイムのモニタリングが可能となる。
【００３３】
本発明の１つの側面において、支持体上に固定化しようとする高分子インジケーター分子は親水性であってよい。本発明のこの側面の好ましい態様において、高分子インジケーター分子の親水性が、支持体への固定化後に実質的に保持される。別の好ましい態様において、高分子インジケーターは、高分子インジケーターのミクロ環境を十分に親水性に（好ましくは、高分子インジケーター全体の大部分への、自由でたっぷりした拡散アクセスを可能にするほどに十分な親水性に）保持する、という仕方で支持体と関連している。本発明のこの側面のさらに別の好ましい態様において、高分子インジケーターは、疎水性の支持体材料が分析物の拡散距離に及ぼす疎水性の影響を最小限に抑える、という仕方で支持体と関連している。さらに別の好ましい態様において、高分子インジケーター分子は、固定化後に、水性の周囲媒質へと外向きに配向される。上記の態様は、支持体−インジケーター構造物が、水性環境中の分析物を検出すべく適切に造られていることを示している。
【００３４】
光学的検出デバイスにおいては、一般には、明確な光学経路を有すること、及びセンサーを種々の波長に曝露できることが望ましい。したがって、本発明の１つの態様は、光学的な不純物を導入することなく、インジケーター分子をセンサーに固定化する方法を含む。本発明の別の態様において、固定化されたインジケーター分子は、それが曝露される全ての波長において、光線による分解に対して抵抗性がある。
【００３５】
固定化されたインジケーター分子の高スループットの製造に関して、一般には、製造法が効率的で、スケールアップすることができることが望ましく、また固定化されるインジケーターが製造上のストレスに耐えられることが望ましい。したがって本発明の１つの態様において、固定化法は、スケールアップしてもインジケーターの使用に関して極めて効率的（固定化反応の収率）である。本発明の別の態様において、固定化法を容易にスケールアップすることができ、支持体−インジケーター構造物を高いスループットにて製造することができる。本発明のさらに別の態様において、支持体−インジケーター構造物は、滅菌法及び製造操作時に施すべき洗浄サイクルに耐えることができる。
【００３６】
高感度での用途（例えば、インビボ使用向けのセンサー）においては、一般には、製品の品質が一定していることが望ましい。したがって本発明の１つの態様において、固定化法は高度の“同一性”を考慮に入れており、これによりキャリブレーションと信号のプロセシングにおいてデバイスによる一貫性が確保される。
【００３７】
特に、長期使用の用途（例えばセンサーインプラント）においては、インジケーターがその周囲に悪影響を及ぼさないこと、あるいは一般的な周囲条件によって不活性化されないことが重要である。したがって本発明の１つの側面において、固定化インジケーター分子は、センサーのエンケースメント／導波路の固体表面と密に且つ直接的に結びついており、これによって局所環境へのインジケーターの重大な漏れが防止される。別の好ましい態様において、固定化インジケーター分子は、インビボの分解作用に対してかなり抵抗性が高い。本発明のさらに別の好ましい態様において、支持体−インジケーター分子構造物は、意図する使用環境において予想される力に耐えるだけの十分な機械的保全性を有する。
【００３８】
本発明の１つの側面において、高分子インジケーター分子を、グラフトを形成する支持体上のポリマー構造物と絡み合わせることによって、高分子インジケーター分子を支持体に結びつけることができる。本発明の文脈での“グラフト”は、少なくとも１種の高分子インジケーター分子と、好ましくは支持体ネットワークの表面近くに位置しているポリマー鎖の少なくとも一部とによって形成させることができるＩＰＮ（相互貫入高分子ネットワーク）である。本発明の文脈でのＩＰＮは２種又はそれより多いポリマーの組み合わせ物であり、少なくとも１種のポリマーが、他のポリマーの短時間の存在にて合成及び／又は架橋され、このときこれらのポリマー間に共有結合は全く生成しない。詳細については後述するが、好ましい態様において、本発明のＩＰＮは逐次重合によって製造することができ、これにより連続的なＩＰＮが得られる。別の好ましい態様において、本発明のＩＰＮは、部分的又は完全に重合した高分子インジケーター分子と、支持体のポリマー構造物とを絡み合わせることによって製造される〔これにより、本発明の文脈における、いわゆる相互貫入高分子ネットワーク(“ＩＰＮ”)が得られる〕。
【００３９】
グラフトを製造する上での第１の工程は、支持体の表面に絡み合い領域を生成させることである。本発明による“絡み合い領域”は、逐次的な相互貫入重合によって、部分的もしくは完全に重合した高分子インジケーター分子と絡み合うことができるよう支持体のポリマー鎖が緩められている、支持体の表面近くの領域であってよい。
【００４０】
絡み合い領域とグラフトは、種々の方法で生成させることができる。例えば、１つの態様において、支持体材料に対する溶媒としても作用する高分子インジケーター分子のモノマー成分〔好ましくは、ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）等の親水性モノマー成分〕によって、絡み合い領域を形成するよう支持体表面上のポリマー鎖が緩められる。本発明のこの側面の１つの態様において、支持体表面上のポリマー鎖の緩みを引き起こした、高分子インジケーター分子の親水性モノマー成分と、最終的に高分子インジケーター分子を形成する残りの成分とを重合させることによってグラフトが作製される。絡み合いは、絡み合い領域を通して重合を進行させて、連続的なＩＰＮを形成させることで達成される。この重合により、重合した高分子インジケーター分子と支持体との間に機械的なロックがつくり出される。高分子インジケーター分子の成分の重合はさらに、緩んだポリマー鎖との絡み合いも引き起こす。１つの態様によれば、ポリマー鎖は、例えば図４Ａと４Ｂに関して説明されているように引き締めることができる。ポリマー鎖の引き締めは、例えば、溶媒の除去、乾燥、又は他の方法によって達成することができる。
【００４１】
本発明の好ましい態様において、重合反応は、例えばＶＡ−０４４（WAKO Chemical Co., 日本）等のラジカル開始剤を使用する。さらに別の好ましい態様において、例えば、ＥＧＤＭＡ（エチレングリコールジメチルアクリレート）、ＴＭＰＴＭＡ（トリメチロールプロパントリメタクリレート）、又はｐ−トルエンスルホン酸等の１種又はそれより多い架橋剤を重合反応混合物に加えて、支持体中にて高分子インジケーター分子を架橋させることができる。好ましい態様において、高分子インジケーター分子の架橋によりループが形成され、一方、緩められた支持体材料が別のループを形成し、このループが高分子インジケーター分子のループと絡み合う。
【００４２】
グラフト中での高分子インジケーター分子の架橋は、全体としてより高い信頼性のインジケーター分子の結びつきを達成することを目的としている。さらに別の好ましい態様において、重合反応はモールド〔例えば、図６Ａ〜６Ｄに示されているものと類似のＤＥＬＲＩＮ（登録商標）モールド〕中にて行うことができる。
【００４３】
図３と４に示す本発明の別の態様において、溶媒によって支持体材料を緩め、部分的もしくは完全に重合した高分子インジケーター分子を、支持体材料上のモノマー混合物の絡み合い領域と絡み合わせることによってグラフトが作製される。１つの態様において、溶媒と高分子インジケーター分子の混合物に架橋剤を加え、この架橋剤により、高分子インジケーター分子相互の架橋を起こさせる。架橋は絡み合いの前に起こるが、一定の態様においては、絡み合いが起こった後でも続き、これによってさらなる安定性がもたらされる。
【００４４】
図３Ａは、マイクロ電子部品２０５のためのポリマー・エンケースメントを固定化用支持体として有するセンサー２０４を示している。図３Ｂは、このようなポリマー・エンケースメントの表面２０６の拡大図である。本態様において、表面は、しっかりと織り交ざっていて絡み合った長鎖ポリマー（例えばＰＭＭＡ）を含む。図３Ｂから図３Ｃに向かっている矢印は、エンケースメント材料の表面の、しっかりと織り交ざった配置から緩んだ配置への移行を示している。好ましい態様において、ループ３０８が絡み合い領域を構成する。こうした移行は、これらに限定されないが、エタノール、２−メトキシエタノール、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＨＥＭＡ、又はこれらの混合物等の溶媒で表面を処理することによって達成される。しかしながら、当業者には周知のことであるが、選択する支持体材料に応じて、支持体の表面を攻撃して絡み合い領域を形成できる他のいかなる物質も使用することができる。
【００４５】
図４Ａは、例えば図３Ａ〜３Ｃに示されている仕方でつくり出すことができる絡み合い領域３０８を含んだ支持体２０６の表面を示している。図４Ａはさらに、高分子インジケーター分子１００のような高分子を示している。この高分子を、絡み合い領域形成物質と一緒に、あるいは適切な絡み合い領域形成物質が支持体上に絡み合い領域をつくり出した後に、このような支持体を含有する反応容器に加える。高分子１００は、例えば単純な拡散によって絡み合い領域３０８と絡み合う。高分子インジケーター分子の絡み合いを、支持体の全表面にわたって実質的に均一に達成するためには（例えば、米国特許第6,330,464号に記載の豆形センサーデバイス）、拡散を進行させる。好ましい態様において、高分子インジケーターと支持体は共に、絡み合い領域形成物質に対して少なくとも部分的に溶解しうる。１つの態様において、高分子インジケーター分子は、絡み合い領域との相互作用時において部分的に重合する。
【００４６】
別の態様において、高分子インジケーター分子は、絡み合い領域との相互作用時において完全に重合する。図４Ａと４Ｂとの間の矢印は、支持体材料２０７が実質的にその最初の引き締まった配置に戻るときに、高分子１００が支持体の表面に確実に固定化されることを示している。このプロセスにおいては、高分子１００が図４Ｂに示すように捕捉され、支持体の表面にしっかり固定化される。好ましい態様において、このプロセスは、絡み合い領域生成物質を強力に除去することによって達成される。
【００４７】
本発明の別の態様において、絡み合い領域生成物質が時間の経過とともに蒸発していく。さらに別の態様において、支持体を酸素の存在下で乾燥して重合反応（酸素によって阻止される）を遅くし、これによって、絡み合い領域を通しての高分子インジケーター分子の拡散が容易になる。
【００４８】
本発明の別の態様において、インジケーター分子をイオン結合によって支持体に固定化かることができる。イオン結合は、イオンの静電引力に基づいている。
【００４９】
イオン電荷を有する適切なインジケーター分子については前述した。これらのインジケーター分子は、モノマーであっても、あるいはポリマーであってもよい。図５Ａを参照すると、高分子インジケーター分子の全体にわたって分布した電荷５１１を有する、適切な高分子インジケーター分子５１０が示されている。この分子は、分子全体にわたって分布している、多数の正に帯電した部分５１１（例えばアミン部分）によって正に帯電している。これとは対照的に、図５Ｂに示されている分子５２０は、末端の正電荷５２２だけを含んでいる。しかしながら、前述したように、本発明においては、適切なｐＨ範囲にて正電荷又は負電荷を有するいかなるインジケーター分子も使用することができる。好ましい態様において、ほぼ中性のｐＨにて強い正電荷又は負電荷を有するインジケーター分子が好ましい。
【００５０】
本発明にしたがってイオン結合によってインジケーター分子を固定化するための適切な支持体材料については前述したとおりであり、例えばＰＭＭＡなどがある。しかしながら、適切なｐＨ範囲においてイオン性であるいかなる支持体材料も使用することができる。このような支持体材料は、一般には、このようなｐＨ範囲においてイオン性ではないが、このようなｐＨ範囲において本質的にイオン性であってもよい。一般には、支持体材料は、イオン性となるよう変性を施すことができる。例えば、支持体材料は、一定のｐＨ範囲において、支持体に結びつけようとする適切なインジケーター分子の電荷と反対の電荷を有するように変性することができる。１つの態様において、スルホネートは、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）と共重合させると、イオン交換樹脂技術からの公知の方法にしたがって非イオン性の支持体に共有結合する。本発明においては、スルホネート以外のイオン性基も使用することができる。例えば、本発明においては、これらに限定されないが、メチルスルホネート、スルホン酸、スルホイソブチル、及びスルホエチル等の、他の適切な強いアニオン性基も使用することができる。本発明においては、これらに限定されないが、第四アンモニウム、第四級アミン、メチルトリメチルアンモニウム、及びジメチルエタノールアミン等の強いカチオン性基も使用することができる。好ましい態様において、これらの基は、中性付近のｐＨにおいてイオン性である。上記の好ましい態様において、イオン性基は支持体に共有結合させることができるが、イオン性基は、支持体をスルホネートとメチルメタクリレート（ＭＭＡ）とのコポリマーで被覆することによって、あるいは一定の態様によってはガラスもしくはガラス様のコーティングによってもたらされる。しかしながら本発明においては、アクリレートコポリマー等の他のポリマーも使用することができる。
【００５１】
本発明の１つの態様にしたがって支持体に被覆する方法を図６Ａ〜６Ｄに示す。図６Ａは、豆形センサー６００、及びセンサー６００の形状とぴったり合うような寸法に作製することができる内面６１２を有するモールド６１１を示している。図６Ｂに示すように、センサー６００をモールド６１１中に挿入すると、センサーの表面６０６とモールドの内面６１２との間にわずかな隙間が残る。図６Ｃは、この隙間を満たすために、イオン交換基を含有するコーティング６１４（例えばＭＭＡ−スルホネートコポリマー）をモールドにどのようにして施すかを示している。次いで、例えば加熱によって硬化させて、図６Ｄに示すような被覆されたセンサーデバイス６１５を得る。図６Ｄは、強いアニオン性のコーティング６１４を有するセンサーデバイス６１５を示している。前述したように、コーティングのアニオン性基は、インジケーター分子のカチオン性基（例えばアミン基）とイオン結合を形成することができる。しかしながら、当業者には周知のことであるが、コーティングは、ディッピング法や噴霧法（これらに限定されない）を含めた種々の方法で施すことができる。
【００５２】
図７Ａ〜７Ｃは、イオン結合の形成、及びこれによって起こる、正に帯電した高分子インジケーター分子のセンサー表面本体への固定化を示している。特に、図７Ａは、表面全体にわたって均一に分布したアニオン性基６１６を有するコーティング６１４を含んだデバイス615を示している。図７Ｂは、分子全体にわたって均一に分布した正電荷５１１を有する高分子インジケーター分子５１０を示している。センサー支持体上の負電荷６１６と、高分子インジケーター分子５１０上の正電荷５１１との引力により、単純なイオン交換反応にて、支持体表面への高分子インジケーター分子の固定化が可能となる。したがって、図７Ｃに示すように、支持体がもつ強いアニオン性電荷と、高分子インジケーター分子がもつ強いカチオン性電荷とを含んだあるｐＨ値を有する溶液中にて、高分子インジケーター分子を支持体と接触させることによって、高分子インジケーター分子を支持体上に固定化することができる。高分子インジケーター分子は、分子全体にわたって分布した正電荷を有しているので、これらの正電荷は、支持体７１７上の多数の負電荷と結合を形成することができる。
【００５３】
図８Ａ〜８Ｃは、図７Ａ〜７Ｃに示したのと類似の固定化プロセスを示している。しかしながら、高分子インジケーター分子５２０は、図７Ｂに示す分子のような、分子全体にわたっている正電荷とは対照的に、末端正電荷５２２だけを有している。したがって、図８Ｂの高分子インジケーター分子が、イオン交換反応によってアニオン性の支持体６１５に結びつくと、各インジケーター分子の末端正電荷と、支持体上の負に帯電した個別の基との間のイオン結合によって、インジケーター分子の末端が支持体に結びつく（８１８）。
【００５４】
実施例Ｉ
本発明の１つの態様にしたがってグラフトを製造する手順の例を以下に説明する。
【００５５】
ＨＥＭＡ（９５．８％）、架橋剤としてのＥＧＤＭＡ（エチレングリコールジメタクリレート）（０．２％）、及びアクリル酸（４％）を含む溶液Ａを調製した。蛍光性のモノマーインジケーター分子（例えばビス−カルボキシレートビス−ボロネート−アントラセン）を１４ｍｇ／ｍｌ（最大で約２８ｍｇ／ｍｌ）にて溶液Ａに加えて“溶液１”を作製した。次いで、３００μｌの溶液１を７００μｌの蒸留した脱イオン水に加えて“溶液２”（白色ゲル）を得た。ＶＡ−０４４（WAKO Chemical Co., 日本）（フリーラジカル、水溶性の開始剤分子）を“溶液２”に加えて“溶液３”を作製した。
【００５６】
他方、固定化用支持体（本実施例ではＰＭＭＡコア）をＵＶＯＣＳ（モデル＃Ｔ０６０６のオゾンチャンバー）中にて３０分にわたってオゾンに曝露して、支持体の表面上に、湿潤を促進するためのヒドロキシル基を生成させた。２つの部分からなるＤＥＬＲＩＮ（登録商標）モールドの接触面に、バルブ用グリースの薄いコーティングを施した。モールドの２つの部分を合わせ、３つのホースクランプ（９〜２２．２ｍｍ）を使用してロックし、モールドの底部ホールにゴム栓を詰めた。モールドに２００μｌの溶液３を装入した。センサーモールド（本実施例では内径０．２０３インチ（０．５１６ｃｍ）のモールド）の内部寸法を、グラフトの厚さが確実に約１００μｍとなるように選定した。センサーのブルノーズ端が最初にモールドに入っていき、そしてセンサーの光学部品がモールドの壁面に対向し、エアボイドの形成を避けつつモールド継ぎ目に対して垂直となるように、オゾン処理したＰＭＭＡコアをモールド中に装入した。次いでモールドをシールした。約５０℃で約１〜２４時間（好ましくは３〜１６時間）加熱して、白色ゲルポリマーのグラフトを得た。５０℃にてさらなる時間（例えば３時間）にわたって加熱すると、ＨＥＭＡモノマーがある時点においてＰＭＭＡに貫入し、ＩＰＮを生成させるための、ＰＭＭＡポリマーとの織り交ざりが進行した。引き続きＰＭＭＡコアをモールドから取り出し、ＰＢＳ保存液（リン酸塩緩衝生理食塩溶液）中に入れた。
【００５７】
(実施例II
本発明の別の態様にしたがってグラフトを製造する手順の例を以下に説明する。
【００５８】
５００ｍｇのモノマーインジケーター分子（例えばビス−カルボキシレートビス−ボロネート−アントラセン）を、ＨＥＭＡとアクリル酸（重量比９０：１０）とを含んだ５ｇの溶液に加えて、“溶液１”を作製した。しかしながら、全体として異なった親水性が達成されるよう、またエキシマー部位の存在が制御できるよう、モノマーの相対的なモル比を変えることができる。モノマーインジケーター分子と親水性モノマーとの相対的な濃度は、例えば、５ｇの溶液Ａに対して７５０ｍｇ〜２５０ｍｇのインジケーターの範囲であってよい。ＡＩＢＮ（２，２’−アゾ−ビス−イソブチロニトリル，９８％）を１重量％の量にて“溶液１”に加えて“溶液２”を作製した。“溶液２”と、エタノールと２−メトキシエタノール（重量比７０：３０）を含んだ溶液とを、１：１０の重量比で混合して“溶液３”を作製した。エタノールと２−メトキシエタノールを含んだ溶液を加えて重合反応を起こさせ、最終的にはＰＭＭＡの表面を攻撃させて、絡み合い領域を生成させた。“溶液３”を窒素雰囲気下（予備重合反応を妨げる酸素を追い出すため）にて約５６℃で約２４時間加熱することでＡＩＢＮ開始剤を活性化させ、これによってモノマーの重合を起こさせてポリマーを生成させた。こうした得られた“溶液４”は、一般には、種々の長さのポリマーのほかに未反応のモノマーも含有した。“溶液４”と架橋剤であるｐ−トルエンスルホン酸（０．３３３重量％）とを混合した。本混合物を暗所で２時間静置して“溶液５”を得た。ＰＭＭＡコアを“溶液５”中に浸漬し、次いで空気に曝露された状態にて、暗所に２４時間静置した。ＰＭＭＡコアを１００〜１１０℃にて３時間キュアーして、残留している溶媒を追い出した。表面に機械的に固定されなかった過剰の反応物質は、洗浄・仕上げ工程において洗い落とした。
【００５９】
本発明の種々の実施／バリエーションについて説明してきたが、理解しておかなければならないことは、これらの態様／バリエーションは、単に例として説明されているだけであって、これらに限定されないという点である。したがって本発明の範囲は、上記の代表的な態様のいずれかによって限定されるべきではなく、特許請求の範囲及びそれらの均等物にしたがって規定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、本発明による水溶性高分子インジケーター分子の一次構造と三次構造の概略図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の一態様にしたがってインジケーター分子を固定化するための固定化用支持体を示している。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、溶媒の添加による、固定化用支持体の表面における絡み合い領域の生成を示している。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、重合した高分子インジケーター分子が絡み合い領域を通して拡散するメカニズム、及び絡み合い領域の引き締めを示している。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、１つ又はそれより多い正に帯電した部分とエキシマー部位とを含有する高分子インジケーター分子を示している。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本発明の一態様による、イオン性基を含有するコポリマーで支持体を被覆するためのメカニズムを示しており、図６Ｄは、図６Ａ〜６Ｃに示されているメカニズムの最終物品を示している。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、分子全体にわたって分布している正電荷を有する高分子インジケーター分子が、表面にアニオン性基を有するセンサーの本体にどのようにして結びつくかを示している。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、末端正電荷を有する高分子インジケーター分子が、表面にアニオン性基を有するセンサーの本体にどのようにして結びつくかを示している。
【図１】
2007532901.tif 000003
【図２Ａ】
2007532901.tif 000004
【図２Ｂ】
2007532901.tif 000005
【図３】
2007532901.tif 000006
【図４】
2007532901.tif 000007
【図５Ａ】
2007532901.tif 000008
【図５Ｂ】
2007532901.tif 000009
【図６】
2007532901.tif 000010
【図７】
2007532901.tif 000011
【図８】
2007532901.tif 000012
【国際調査報告】
2007532901.tif 000013
2007532901.tif 000014
2007532901.tif 000015
2007532901.tif 000016
2007532901.tif 000017