(57)【要約】  本発明は、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限又は防止する方法を提供する。本発明は、更に対象における、心房並びに心室性の心不整脈、心不全、及び運動-誘発性心臓突然死を治療及び予防する方法をも提供する。更に、本発明は、心房細動に罹っている又はその候補としての対象における、RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限又は防止する方法における、JTV-519の使用法をも提供する。また、対象における心房並びに心室性の心不整脈及び心不全治療及び予防する方法、並びに運動-誘発性心臓突然死を防止する方法における、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法をも提供する。本発明は、更に心房細動及び心不全を治療並びに予防するのに使用する薬剤の同定方法、及びこれら方法により同定された薬剤をも提供する。
2007530561.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心房細動に罹っている又はその候補者である患者における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法であって、該患者におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量のJTV-519を、該患者に投与する工程を含み、該RyR2が、心房RyR2であることを特徴とする方法。
【請求項２】
該患者において、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、該患者中のホスホリル化されたRyR2のレベルを減じることにより、制限又は防止する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該患者が、ヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効なJTV-519の量が、該患者における心房細動を治療又は予防するのに有効なJTV-519の量である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
該JTV-519が、該患者における、心房細動を治療又は予防する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な該JTV-519の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項1記載の方法。
【請求項７】
心房細動に罹っている又はその候補者である患者内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法における、JTV-519の使用。
【請求項８】
患者における心房細動を治療又は予防する方法であって、該患者における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量のJTV-519を、該患者に投与して、該患者における心房細動を治療もしくは予防する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
該心房細動が、非-持続性の心房細動である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
該患者における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量のJTV-519が、該患者における心房細動を治療又は予防するのに有効なJTV-519の量である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
該JTV-519が、該患者における、心房細動を治療又は予防する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な該JTV-519の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
患者におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止する方法であって、該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量で、薬剤を該患者に投与する工程を含み、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。 
【化１】
2007530561.tif 000108
ここで、Rは、アリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化２】
2007530561.tif 000109
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【化３】
2007530561.tif 000110
ここで、Rは、CO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、Xは、N又はSであり、及びnは、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、かつmは、1又は2である；
【化４】
2007530561.tif 000111
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、Xは、NH又はOである；
【化５】
2007530561.tif 000112
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はHであり、R2は、H、アルキル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、又はアリールである；
【化６】
2007530561.tif 000113
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは、0、1、又は2であり、nは、0又は1である；
【化７】
2007530561.tif 000114
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4は、H、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは、0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
【請求項１４】
該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少が、該患者における、ホスホリル化されたRyR2レベルを減じることによって、該患者内で制限又は防止される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
該患者が、ヒトである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
該患者が、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)に罹っている、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
該患者が、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を患っているか、あるいはその候補である、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
該患者における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な該薬剤の量が、該患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防するのに有効な該薬剤の量である、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
該心不整脈が、心房性不整脈又は心室性不整脈である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
該心房性不整脈が、心房細動である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
該心房細動が、持続性の心房細動である、請求項21記載の方法。
【請求項２２】
該心室性不整脈が、運動-誘発性心室性不整脈である、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
該薬剤が、該患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する、請求項13記載の方法。
【請求項２４】
該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な、該薬剤の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項13記載の方法。
【請求項２５】
該薬剤が、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27、又はS36である、請求項13記載の方法。
【請求項２６】
該薬剤が、S36である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
患者における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止する方法における、薬剤の使用であって、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする使用。 
【化８】
2007530561.tif 000115
ここで、Rは、アリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化９】
2007530561.tif 000116
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化１０】
2007530561.tif 000117
ここで、Rは、CO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、Xは、N又はSであり、及びnは、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【化１１】
2007530561.tif 000118
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、Xは、NH又はOである；
【化１２】
2007530561.tif 000119
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はHであり、R2は、H、アルキル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、又はアリールである；
【化１３】
2007530561.tif 000120
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは、0、1、又は2であり、nは、0又は1である；
【化１４】
2007530561.tif 000121
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4は、H、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは、0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
【請求項２８】
患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防する方法であって、該患者における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量で、薬剤を該患者に投与する工程を含み、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。 
【化１５】
2007530561.tif 000122
ここで、Rは、アリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化１６】
2007530561.tif 000123
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化１７】
2007530561.tif 000124
ここで、Rは、CO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、Xは、N又はSであり、及びnは、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、かつmは、1又は2である；
【化１８】
2007530561.tif 000125
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、Xは、NH又はOである；
【化１９】
2007530561.tif 000126
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はHであり、R2は、H、アルキル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、又はアリールである；
【化２０】
2007530561.tif 000127
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは、0、1、又は2であり、nは、0又は1である；
【化２１】
2007530561.tif 000128
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4は、H、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは、0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
【請求項２９】
患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防する方法であって、該患者における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防するのに有効な量で、薬剤を該患者に投与する工程を含み、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。 
【化２２】
2007530561.tif 000129
ここで、Rは、アリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化２３】
2007530561.tif 000130
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化２４】
2007530561.tif 000131
ここで、Rは、CO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、Xは、N又はSであり、及びnは、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、かつmは、1又は2である；
【化２５】
2007530561.tif 000132
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、Xは、NH又はOである；
【化２６】
2007530561.tif 000133
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はHであり、R2は、H、アルキル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、又はアリールである；
【化２７】
2007530561.tif 000134
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【化２８】
2007530561.tif 000135
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4は、H、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは、0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
【請求項３０】
該心不整脈が、心房性不整脈又は心室性不整脈である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
該心房性不整脈が、心房細動である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
該心室性不整脈が、運動-誘発性心室性不整脈である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
該患者における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を、治療又は予防するのに有効な、該薬剤の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
該薬剤が、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27、又はS36である、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
該薬剤が、S36である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
患者における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を、治療又は予防する方法における、薬剤の使用であって、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする使用。 
【化２９】
2007530561.tif 000136
ここで、Rは、アリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化３０】
2007530561.tif 000137
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルである；
【化３１】
2007530561.tif 000138
ここで、Rは、CO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、Xは、N又はSであり、及びnは、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、かつmは、1又は2である；
【化３２】
2007530561.tif 000139
ここで、Rは、アリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは、0、1、2、又は3であり、及びR'は、アルキル又はシクロアルキルであり、Xは、NH又はOである；
【化３３】
2007530561.tif 000140
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【化３４】
2007530561.tif 000141
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及び、R3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは、0、1、又は2であり、nは、0又は1である；
【化３５】
2007530561.tif 000142
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'は、アルキル、アリール又はアシルであり、R2は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3は、H、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4は、H、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは、0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
【請求項３７】
心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用する薬剤を同定する方法であって、以下の諸工程、
(a) RyR2を含む細胞培養物を得、あるいはこれを生成する工程、
(b) 該細胞と、候補薬剤とを接触させる工程、
(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該細胞を暴露する工程、及び
(d) 該薬剤が、該細胞内で、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
更に、以下の工程：(e) 該薬剤が、該細胞内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
請求項37記載の方法によって同定された薬剤。
【請求項４０】
心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用する薬剤を同定するための方法であって、以下の諸工程、
(a) RyR2を含む動物を得、又はこれを発生させる工程、
(b) 該動物に、候補薬剤を投与する工程、
(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該動物を暴露する工程、及び
(d) 該薬剤が、該動物内で、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
更に、以下の工程、(e) 該薬剤が、該動物内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
請求項40記載の方法によって同定された薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互引照）
本件特許出願は、2004年3月25日付で出願された、米国特許出願第10/809,089号に係る一部継続出願の利益を請求するものであり、該米国特許出願は、2004年1月22日付で出願された、米国特許出願第10/763,498号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2003年10月7日付で出願された、米国特許出願第10/680,988号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2003年6月26日付で出願された、米国特許出願第10/608,723号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2002年11月5日付で出願された、米国特許出願第10/288,606号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2002年12月3日付で発行された米国特許第6,489,125B1である、2000年5月10日付で出願された、米国特許出願第09/568,474号に係る一部継続出願の利益を請求している。これらの内容を、本発明の参考として、ここに組み入れる。
【０００２】
（政府の所有権に関する陳述）
本件発明は、NIH承認番号PO1HL 67849-01の下で、政府による支援を受けて行われたものであった。従って、米国政府は、本件発明に、幾分かの権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
治療法の進歩にも拘らず、鬱血性心不全は、西欧諸国において、依然として大きな死因となっている。米国に限っても、5,000,000名の人々が心不全に罹っており、また約50％という5-年死亡率により特徴付けられる(Levy等, 心不全に係る罹患率及び生存率の長期間の傾向(Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure), N. Engl. J. Med., 2002, 347:1397-402)。
心不全の重要な特徴は、低い心筋の収縮性である(Gwathmey等, 末期段階の心不全に罹っている患者由来の、心筋層における、異常な細胞内カルシウム処理, Circ. Res., 1987, 61:70-76)。健常な心筋及び他の横紋筋においては、リアノジンレセプタ(RyRs)を含む筋小胞体(SR)上のカルシウム-放出チャンネルが、活動電位と筋肉細胞の収縮とのカップリング(即ち、励起-収縮(EC)カップリング)を容易にする。収縮は、カルシウム(Ca2+)がSRから周辺の細胞質に放出された際に、開始される。心不全において、収縮異常は、一部には、心臓の活動電位(AP)が収縮を開始することを可能とする、シグナリングカスケードにおける変化によって生じる。特に、衰えた心臓においては、全細胞のCa2+過渡現象の振幅は減少し(Beuckelmann等, 末期の心不全に罹っている患者由来の単離された心室筋細胞における、細胞内カルシウム処理, Circ., 1992, 85:1046-55; Gomez等, 実験的な心肥大及び心不全における欠損性励起-収縮カップリング, Science, 1997, 276:800-06)、またその持続性が延長される(Beuckelmann等, 末期の心不全に罹っている患者由来の単離された心室筋細胞における、細胞内カルシウム処理, Circ., 1992, 85:1046-55)。
【０００４】
心不全の共通の特徴である心不整脈は、構造的に正常な心臓におけるSR Ca2+の漏洩と関連していることが知られている。これらの場合において、心室性頻拍の誘導及び維持に関する最も一般的なメカニズムは、異常な自動能である。不整脈を開始することが知られている、異常な自動能の一形態は、SR Ca2+の異常な放出に関連し、これが後脱分極の遅延又はDADsを開始する(Fozzard H.A., 後脱分極及び開始された活動, Basic Res. Cardiol., 1992, 87:105-13; Wit & Rosen, 心不整脈の病理生理学的メカニズム, Am. Heart J., 1983, 106:798-811)。DADsは、心臓活動電位の再分極後に起こる、心筋細胞における異常な脱分極である。DADsをもたらす、該異常なSR Ca2+の放出に係る分子的な基礎は、完全には解明されていない。しかし、DADsは、リアノジンによって遮断されることが知られており、これはRyR2が、この異常なCa2+の放出の病因において主要な役割を演じている可能性のあることの証拠を与える(Marban等,フェレットの心室性筋肉における不整脈的遅延及び初期後脱分極のメカニズム, J. Clin. Invest., 1986, 78:1185-92; Song & Belardinelli, ATPが、心筋細胞における開始された活動及び後脱分極を発現する, Am. J. Physiol., 1994, 267:H2005-11)。
【０００５】
ヒトにおける最も一般的な心不整脈は、心房細動(AF)である。これは、罹患率及び死亡率の主な原因を表している(Chugh等, 心房細動の疫学的及び自然の履歴：臨床的意味, J. Am. Coll. Cardiol., 2001, 37:371-78; Falk, R.H., 心房細動, N. Engl. J. Med., 2001, 344:1067-78)。しかし、その臨床的な重要性にも拘らず、AFに関する治療の選択性は限定されており、これは一部には、これに関連する分子的なメカニズムが、殆ど理解されていないという事実によっている。
心臓疾患に罹っている全患者の約50％が、致死性の心不整脈により死亡している。このような致死性の心不整脈は、しばしば事実上心室性である。幾つかの場合において、心臓における心室性不整脈は、急速に「心臓突然死」(SCD)と呼ばれる現象である、致死性のものとなり得る。致死性の心室性不整脈(及びSCD)は、また若者、又は構造的な心疾患に罹っていることが知られていない、その他は健康な個人においても起こり得る。事実、心室性不整脈は、その他は健康な個人における突然死の最も一般的な原因である。
【０００６】
カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)は、構造的に正常な心臓を持つ個体における遺伝性の疾患である。これは、ストレス-誘発性の心室頻拍症、即ちSCDを引き起こす可能性のある致死性の不整脈によって特徴付けられる。CPVTに罹っている対象（患者）において、肉体的な力の発揮及び/又はストレスが、検出可能な構造的心臓疾患の不在下において、SCDに導く、二方向性及び/又は多形型心室頻拍症を誘発する(Laitinen等, 家族性多形型心室頻拍症における、心臓リアノジンレセプタ(RyR2)遺伝子の変異体, Circulation, 2001, 103:485-90; Leenhardt等, 子供におけるカテコールアミン性多形型心室頻拍症：7-年間の追跡調査において21名, Circulation, 1995, 91:1512-19; Priori等, カテコールアミン性多形型心室頻拍症に罹患した患者の、臨床的及び分子的特徴付け, Circulation, 2002, 106:69-74; Priori等, 心臓リアノジンレセプタ遺伝子(hRyR2)の変異体が、カテコールアミン性多形型心室頻拍症の基となっている, Circulation, 2001, 103:196-200; Swan等, 染色体1q42-q43にマッピングされた不整脈性疾患が、構造的に正常な心臓における悪性の多形型心室頻拍症を引き起こす, J. Am. Coll. Cardiol., 1999, 34:2035-42)。
【０００７】
CPVTは、主として常染色体優性遺伝様式で遺伝する。CPVTに罹っている個体は、運動状態にある際に心室性不整脈を示すが、静止状態において不整脈を起こすことはない。結合研究及び直接的配列決定は、CPVTに罹っている個体の、染色体1q42-q43における、ヒトRyR2遺伝子中に変異体の存在を同定した(Laitinen等, 家族性多形型心室頻拍症における、心臓リアノジンレセプタ(RyR2)遺伝子の変異体, Circulation, 2001, 103:485-90; Priori等, 心臓リアノジンレセプタ遺伝子(hRyR2)の変異体が、カテコールアミン性多形型心室頻拍症の基となっている, Circulation, 2001, 103:196-200; Swan等, 染色体1q42-q43にマッピングされた不整脈性疾患が、構造的に正常な心臓における悪性の多形型心室頻拍症を引き起こす, J. Am. Coll. Cardiol., 1999, 34:2035-42)。
3つの型のリアノジンレセプタが存在し、これら全てが、Ca2+チャンネルと強い関連性を持つ。RyR1は、骨格筋中に見出され、またRyR2は、心臓に見出され、またRyR3は、脳内に位置している。タイプ2リアノジンレセプタ(RyR2)が、ECカップリング及び心臓の横紋筋における筋肉収縮にとって必要とされる、主なCa2+-放出チャンネルである。
【０００８】
RyR2チャンネルは、細胞内に多量のCa2+を放出するSRの特定の領域において、高密度のアレイとして詰込まれており、結果として筋肉の収縮を開始する(Marx等, 個々の骨格筋Ca2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の共同的ゲーティング(開閉動作), Science, 1998, 281:818-21)。ECカップリング中には、APゼロ段階における心筋細胞膜の脱分極が、電位-開閉Ca2+チャンネルを活性化する。引続き、これらチャンネルを通過するCa2+の流入が、Ca2+-誘発性Ca2+放出として知られている過程において、RyR2を介するSRからのCa2+-放出を開始する(Fabiato, A., 心臓筋小胞体からの、カルシウム-誘発性カルシウム放出, Am. J. Physiol., 1983, 245:C1-C14; Nabauer等, カルシウム放出の調節は、心筋細胞においては、開閉電荷ではなく、カルシウム電流によって開閉される, Science, 1989, 244:800-03)。このRyR2-媒介、Ca2+-誘発性Ca2+放出は、次に心筋の収縮を司る収縮タンパク質を活性化する。
【０００９】
RyR2は、4つの12,000-ダルトンを持つFK506結合タンパク質(FKBP)、特にFKBP12.6(カルスタビン(calstabin))と結合している、4つの565,000-ダルトンを持つRyR2ポリペプチドを含むタンパク質複合体である。FKBPは、シス-トランスペプチジル-プロリルイソメラーゼであり、これらは幅広く発現されており、また様々な細胞機能を発揮する(Marks, A.R., イムノフィリンの細胞機能, Physiol. Rev., 1996, 76:631-49)。FKBP12タンパクは、密に結合しており、また骨格リアノジンレセプタ、RyR1の機能(Brillantes等, FK506-結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化, Cell, 1994, 77:513-23; Jayaraman等, カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と関連するFK506-結合タンパク, J. Biol. Chem., 1992, 267:9474-77); 心臓リアノジンレセプタ、RyR2 (Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca(2+)-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 1996, 78:990-97); タイプ1イノシトール1,4,5-トリスホスフェートレセプタ(IP3R1)として知られている、関連細胞内Ca2+-放出チャンネル(Cameron等, FKBP12は、ロイシン-プロリン(1400-1401)において該イノシトール1,4,5-トリスホスフェートレセプタを結合し、カルシニューリンをこのFK506-様のドメインに繋留する, J. Biol. Chem., 1997, 272:27582-88); 及びタイプIトランスフォーミング成長因子β(TGFβ)レセプタ(TβRI)(Chen等, FKBP12によるTGFβレセプタの阻害に関するメカニズム, EMBO J., 1997, 16:3866-76)等の機能を調節する。FKBP12.6は、RyR2チャンネルと結合(RyR2サブユニット当たり1分子)し、RyR2-チャンネル機能を安定化し(Brillantes等, FK506-結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化, Cell, 1994, 77:513-23)、また隣接RyR2-チャンネル間の共役的開閉(coupled gating)を容易にして(Marx等, 個々の骨格筋のCa2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の共役的開閉, Science, 1998, 281:818-21)、結果的に心臓サイクルの静止段階における、該チャンネルの異常(迷入的)な活性化を防止する。
【００１０】
RyR2-チャンネルにおける漏洩が、疾患のある心臓及び構造的に正常な心臓両者において、多くの病理的状態と関連していることが明らかである。従って、RyR2の漏洩を修復する方法は、何百万もの患者における心不全、心不整脈、及び心臓突然死を治療し、又は予防することを可能とする。
1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、JTV-519又は4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン一塩酸塩(k201又はICP-カルスタン(Calstan) 100としても知られている)は、カルシウムイオンチャンネルの新規な調節剤である。心筋細胞内のCa2+レベルの調節に加えて、JTV-519は、またモルモットの心室細胞におけるNa+流及び内向き整流K+流をも調節し、またモルモットの心房細胞における遅延-整流K+流を阻害する。これらの研究は、カテコールアミン-誘発心筋障害、心筋障害-誘発性筋原線維過収縮、及び虚血/再灌流障害に対して、JTV-519が、強力な心臓保護作用を持つことを明らかにしている。実験的な筋原線維過収縮モデルにおいて、JTV-519が、プロプラノロール、ベラパミル、及びジルチアゼムよりも、高い心臓保護作用を持つことが立証されている。実験的なデータは、またJTV-519が、動物モデルにおいて、細胞内Ca2+の過剰放出レベルを減じることにより、心室性虚血/再灌流を効果的に防止することを示唆した。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、RyR2が、心房細動、心室性不整脈、及び運動-誘発性心臓突然死を包含する、心不全及び心不整脈を治療し、また予防するためのターゲットであるという、驚くべき発見に基いている。ここにおいて説明するように、本発明者等は、7種の異なるCPVT変異を持つ、突然変異RyR2チャンネルを作成し、その機能を研究した。7種全ての変異体は、運動中に刺激を受けた際に、漏洩性(カルシウムの漏洩)となるチャンネルをもたらすような、機能上の欠陥を有していた。本発明者等の研究は、まず該SRカルシウムの漏洩が、DADを引起すメカニズム明らかにすることである。注目すべきことに、該チャンネルを構成する該変異CPVTチャンネルにおける欠陥が、終末期の心不全、即ち致死性の心不整脈の高い発症率によって特徴付けられる疾患、に罹っている患者の心臓における漏洩性のチャンネルであるように思われる。従って、本発明者等は、CPVTにおけるVTのメカニズムが、心不全におけるVTのメカニズムと同一であることを示した。
【００１２】
本発明者等は、またJTV-519(k201又はICP-カルスタン100)及び他の新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体が、RyR2チャンネルにおける漏洩を修復することをも、ここに開示する。本発明者等が示したように、JTV-519及び関連する誘導体は、FKBP12.6とPKA-ホスホリル化RyR2との結合性、及び変異体RyR2との結合性(変異体RyR2は、FKBP12.6と結合しない場合には、これに対して低いアフィニティーを持つか、あるいは結合しない)を高める。この作用は、致死性心不整脈(心臓突然死(SCD))を開始させ、かつ心不全における心房/心室細動及び心筋機能不全に寄与する、RyR2の漏洩を修理する。
従って、一局面において、本発明は、心房細動に罹っている又はその候補者である対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限もしくは防止するのに有効な量のJTV-519を、該対象に投与することによって、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限もしくは防止する方法を提供するものであり、ここで該RyR2は、心房RyR2である。また、心房細動に罹っている又はその候補者である対象内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限もしくは防止する方法における、JTV-519の使用法をも提供する。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、対象における心房細動を治療もしくは予防する方法を提供するものであり、該方法は、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するのに有効な量のJTV-519を、該対象に投与して、該対象における心房細動を治療もしくは予防する工程を含む。一態様によれば、該対象における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するのに有効な量のJTV-519は、該対象における心房細動を治療もしくは予防するのに有効な、JTV-519の量である。
更に別の態様によれば、対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を該対象に投与することによって、該対象における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止する方法が提供され、ここで該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、以下に列挙する化合物からなる群から選択される：
【００１４】
【化１】
2007530561.tif 000003
【００１５】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【００１６】
【化２】
2007530561.tif 000004
【００１７】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【００１８】
【化３】
2007530561.tif 000005
【００１９】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【００２０】
【化４】
2007530561.tif 000006
【００２１】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである；
【００２２】
【化５】
2007530561.tif 000007
【００２３】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子(ハライド基)であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【００２４】
【化６】
2007530561.tif 000008
【００２５】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【００２６】
【化７】
2007530561.tif 000009
【００２７】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル(カルボン酸基)、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。また、対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するための方法における、これら1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法を提供する。
更に別の局面において、本発明は、対象における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する方法を提供するものであり、該方法は、該対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を該対象に投与する工程を含み、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、以下に列挙する化合物からなる群から選択される：
【００２８】
【化８】
2007530561.tif 000010
【００２９】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【００３０】
【化９】
2007530561.tif 000011
【００３１】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【００３２】
【化１０】
2007530561.tif 000012
【００３３】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【００３４】
【化１１】
2007530561.tif 000013
【００３５】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである；
【００３６】
【化１２】
2007530561.tif 000014
【００３７】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【００３８】
【化１３】
2007530561.tif 000015
【００３９】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【００４０】
【化１４】
2007530561.tif 000016
【００４１】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
更なる局面において、本発明は、対象における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する方法を提供するものであり、該方法は、該対象における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を該対象に投与する工程を含み、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、以下に列挙する化合物からなる群から選択される：
【００４２】
【化１５】
2007530561.tif 000017
【００４３】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【００４４】
【化１６】
2007530561.tif 000018
【００４５】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【００４６】
【化１７】
2007530561.tif 000019
【００４７】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【００４８】
【化１８】
2007530561.tif 000020
【００４９】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである；
【００５０】
【化１９】
2007530561.tif 000021
【００５１】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【００５２】
【化２０】
2007530561.tif 000022
【００５３】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【００５４】
【化２１】
2007530561.tif 000023
【００５５】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である；及び
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。同様に、本発明は、対象における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する方法における、これらの1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法にも関連する。
更に別の局面において、本発明は、心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用する薬剤を同定する方法をも提供するものであり、この方法は、以下の諸工程：(a) RyR2を含む細胞培養物を得、あるいはこれを生成する工程；(b) 該細胞と、候補薬剤とを接触させる工程；(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該細胞を暴露する工程；及び(d) 該薬剤が、該細胞内で、RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。一態様によれば、この方法は、更に、以下の工程：(e) 該薬剤が、該細胞内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む。同様に、本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、及びこの薬剤の、心房細動又は心不全を治療又は予防する方法における使用にも関連する。
【００５６】
更に別の局面によれば、本発明は、心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用するための薬剤を同定する方法を提供するものであり、この方法は以下の諸工程：(a) RyR2を含む動物を得、あるいはこれを発生させる工程；(b) 該動物に、候補薬剤を投与する工程；(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該動物を暴露する工程；及び(d) 該薬剤が、該動物内で、RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を、制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。一態様によれば、この方法は、更に、以下の工程：(e) 該薬剤が、該動物内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む。本発明は、同様にこの方法によって同定された薬剤、及び心房細動又は心不全を治療又は予防する方法における、該薬剤の使用にも係る。
本発明の追加の局面は、以下の記載に照らして明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
プロテインキナーゼ(PKA)による、RyR2のホスホリル化は、「闘争及び逃避」応答の重要な部分であり、これは与えられたトリガーに対して放出されるCa2+の量を増すことにより、心臓のEC-カップリングゲインを高める(Marks, A.R., 心臓の細胞内カルシウム放出チャンネル：心不全における役割, Circ. Res., 2000, 87:8-11)。このシグナリング経路は、ストレスに応答する、交感神経系の活性化が、このストレス応答の代謝要求を満たすのに必要な高い心臓出力をもたらす、メカニズムを与える。カテコールアミンが結合する際に、β1-及びβ2-アドレナリンレセプタは、刺激性G-タンパク、Gαsを介してアデニリルシクラーゼを活性化する。アデニリルシクラーゼは、細胞内環状アデノシン一燐酸(cAMP)レベルを高め、これはcAMP-依存性のPKAを活性化する。RyR2のPKAホスホリル化は、該チャンネル複合体からのカルスタビン2(FKBP12.6)の解離によって、該チャンネルの開放確率を高める。これは、引続きCa2+-依存性活性化に対するRyR2の感受性を高める(Hain等, ホスホリル化は、心筋由来の筋小胞体のカルシウム放出チャンネルの機能を変調する；J. Biol. Chem., 1995, 270:2074-81; Valdivia等, 心臓リアノジンレセプタの迅速適合：Mg2+及びホスホリル化による調節, Science, 1995, 267:1997-2000; Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル由来のFKBP12.6(リアノジンレセプタ)を解離する：心臓機能の低下における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)。
【００５８】
機能低下した心臓(例えば、心不全を患っている患者、及び心不全の動物モデルにおける心臓)は、慢性的なアドレナリン過剰刺激を含む不適応応答によって特徴付けられる(Bristow等, 機能低下したヒトの心臓における、低下したカテコールアミン感受性及びβ-アドレナリンレセプタ密度; N. Engl. J. Med., 1982, 307:205-11)。心不全におけるこの刺激の病原的重要性は、β-アドレナリン刺激及び左心室心筋壁ストレスを低下させ、かつ心室のリモデリングを強力に逆転させる治療上の戦略によって、支持されている(Barbone等, 重篤な心不全に罹っている患者における、左右心室応答対左心室アシストデバイスによる維持の比較：機械的な負荷のない基本的な逆転リモデリングの主な役割；Circulation, 2001, 104:670-75; Eichhorn & Bristow, 医学療法は、慢性的に機能低下した心臓の生物学的な特性を改善できる：心不全の治療における新世紀；Circulation, 1996, 94:2285-96)。心不全においては、慢性的β-アドレナリン刺激は、心臓におけるβ-アドレナリンレセプタの活性化と関連しており、該活性化は、G-タンパクとのカップリングを通して、アデニリルシクラーゼを活性化し、結果的に細胞内cAMP濃度を高める。cAMPは、cAMP-依存性PKAを活性化し、後者は、RyR2の過度のホスホリル化を誘発することが明らかにされている。従って、慢性的な心不全は、慢性的な過アドレナリン状態にあり(Chidsey等, 鬱血性心不全に罹っている患者において使用するための、血漿ノルエピネフリン応答の増強；N. Engl. J. Med., 1962, 267:650)、この状態は、RyR2のPKA過剰ホスホリル化を含む幾つかの病理的結果をもたらす(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)。
【００５９】
該RyR2のPKA過剰ホスホリル化は、心不全における低下した収縮機能及び不整脈増強に寄与する因子として提案された(Marks等, 心不全の進行：プロテインキナーゼは、リアノジンレセプタの過剰ホスホリル化の寄与因子か？Circulation, 2002, 105:272-75; Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)。この仮説と一致して、機能低下した心臓における該RyR2のPKA過剰ホスホリル化は、動物モデル及び心臓の移植を受けた心不全患者両者において、インビボにて、明らかにされた(Antos等, プロテインキナーゼAの構成的(constitutive)活性化に起因する拡張型心筋症及び突然死; Circ. Res., 2001, 89:997-1004; Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76; Ono等, 心不全における異常なCa2+-放出の原因としての、リアノジンレセプタとFKBP12.6との変更された相互作用；Cardiovasc. Res., 2000, 48:323-31; Reiken等, β-アドレナリンレセプタ遮断剤は、心不全における、心臓のカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)構造及び機能を回復させる；Circulation, 2001, 104:2843-48; Semsarian等, L-型のカルシウムチャンネル阻害剤ジルチアゼムは、マウスモデルにおける心筋症を阻害する；J. Clin. Invest., 2002, 109:1013-20; Yano等, 心不全におけるリアノジンレセプタを介する、異常なCa2+の漏れの原因としての、FKBP12.6対リアノジンレセプタの化学量論的な変化；Circulation, 2000, 102:2131-36)。
【００６０】
機能低下した心臓において、PKAによるRyR2の該過度のホスホリル化は、RyR2チャンネル由来の調節性FKBP12.6サブユニットの解離を誘発する(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)。これは、該RyR2チャンネル生物物理学的な特性における、顕著な変化を引起す。このような変化は、高いCa2+-依存性の活性化に対する高い感受性のために、増大された開放確率(Po) (Brillantes等, FK506-結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化； Cell, 1994, 77:513-23; Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca2+-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 1996, 78:990-97); サブコンダクタンス状態をもたらす、該チャンネルの脱安定化；及び不完全なEC-カップリング及び心臓の機能不全をもたらす、該チャンネルの損傷を受けた共役ゲート開閉(Marx等, 個々の骨格筋のCa2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の共役的開閉； Science, 1998, 281:818-21)によって証拠付けられる。従って、PKA-過ホスホリル化RyR2は、低レベルのCa2+-刺激に対して極めて敏感であり、またこれは、それ自身、該過ホスホリル化チャンネルを介するSR Ca2+の漏洩として現れる。
【００６１】
心不全におけるストレスに対する不適応は、該チャンネルの巨大分子複合体由来のFKBP12.6の枯渇をもたらす。これは、Ca2+-誘発性Ca2+放出に対するRyR2の感度の左方へのシフトに導き、結果として、チャンネルは、低〜中度の[Ca2+]においてより活性となる(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76; Yamamoto等, 頻脈-誘発性心不全における心臓の筋小胞体からの異常なCa2+放出; Cardiovasc. Res., 1999, 44:146-55; Yano等, 心不全におけるリアノジンレセプタを介する、異常なCa2+の漏れの原因としての、FKBP12.6対リアノジンレセプタの化学量論的な変化；Circulation, 2000, 102:2131-36)。ある期間に渡り、この増大したRyR2を介する「漏洩」は、該SR Ca2+含有率の、低レベルへの再設定を結果し、これが更に、ECカップリングゲインを減じ、かつ障害を受けた収縮期の収縮能(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)に寄与する。
【００６２】
特に「漏洩性の高い」RyR2チャンネルの亜集団が、心臓サイクルの静止段階、拡張期において、SR Ca2+を放出できる。これは、脱分極後に遅延(DAD)することが知られている心筋細胞膜の脱分極をもたらし、この脱分極が、致死性の心室性心不整脈を誘発することが知られている(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死と関連した、FKBP12.6欠乏及び不完全なカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)。
構造的に正常な心臓において、同様な現象を検討することができる。具体的には、運動及びストレスが、心臓内のβ-アドレナリンレセプタを活性化する、カテコールアミンの放出を誘発することは公知である。β-アドレナリンレセプタの活性化が、RyR2チャンネルの過ホスホリル化に導く。証拠は、またβ-アドレナリンレセプタの活性化に起因する、このRyR2の過ホスホリル化が、変異されたRyR2チャンネルを、心臓サイクルの弛緩段階において、より一層開放性のものとし、結果的に不整脈の発生頻度を高めることを示唆している。
【００６３】
本発明者等は、ここにおいてJTV-519が、後-MI心不全のラットモデルにおける心不全を予防することを示した。この動物モデルにおいて、JTV-519は、拡張期の機能不全を減じることによって、心臓機能を改善し、かつ収縮期の機能を改善した。更に、本発明者等は、RyRチャンネルの骨格筋形状、即ちRyR1も、PKA-過ホスホリル化のために、心不全の骨格筋において不完全(又は漏洩性)であることをも明らかにした(Reiken等, PKAホスホリル化が、骨格筋におけるカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：心不全における不完全な調節(J. Cell Biol., 2003, 160:919-28)。従って、JTV-519は、また心不全患者の骨格筋機能をも改善するであろうことが予想される。それ故、JTV-519は、心不全における2つの主な症状、即ち早期の疲労感及び息切れを治療するための新たな治療法を提供する。該症状は、夫々端部及び横隔膜における骨格筋弱化によって引起される。
【００６４】
上で論じた如く、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)は、構造的に正常な心臓を持つ個体の遺伝性の疾患である。これは、ストレスにより誘発される心室頻拍、突然心臓死(SCD)を引起す可能性のある致死性の不整脈によって特徴付けられる。筋小胞体(SR)上に位置する、RyR2チャンネルにおける変異は、CPVTと結合している。
CPVTに罹っている個体全てが、運動-誘発性心不整脈の可能性を持つ。本発明者等は、前に運動-誘発性心不整脈及び突然死(CPVT患者の)が、RyR2に対するFKBP12.6のアフィニティーの低下に起因することを明らかにした。ここでは、本発明者等は、運動が、アデノシン-3',5'-一燐酸-依存性プロテインキナーゼ(PKA)によるホスホリル化の結果として、RyR2を活性化することを明らかにした。
【００６５】
CPVTにおける致死性の心不整脈に関連する分子的なメカニズムを決定するために、本発明者等は、CPVT-関連変異RyR2チャンネル(例えば、S2246L、R2474S、N4104K、R4497C)を研究した。基本的な条件下で、平坦な脂質二重層において、正常な機能を有する変異RyR2チャンネルは、PKAホスホリル化による活性化に対してより敏感であり、このことは、野生型のチャンネルと比較して、高い活性(開放確率)及び長い開放状態を示す。更に、PKA-ホスホリル化変異RyR2チャンネルは、RyR2チャンネルの生理的な阻害剤であるMg2+による阻害に対して抵抗性であり、またFKBP12.6(閉鎖状態にある該チャンネルを安定化する)に対する低い結合性を示した。これらの発見は、運動中に、該RyR2チャンネルがPKA-ホスホリル化された場合、該変異CPVTチャンネルが、心臓サイクル(拡張期)の弛緩段階においてより開放状態になり易く、そのためにSR Ca2+漏れにより誘発される、不整脈の発生し易さが高くなる。心不全は、世界的に第一の死因であり、RyR2における漏れの修復方法が、何百万もの患者における致死的な不整脈を防止することができる。
【００６６】
本発明者等は、ここにおいて更に、実験薬剤、JTV-519、即ち1,4-ベンゾチアゼピン誘導体が、FKBP12.6遺伝子に対してヘテロ接合性の、マウスにおける致死性の心室性不整脈を防止することを明らかにした。最近、JTV-519が、心不全の動物モデルにおける拡張期のSR Ca2+漏洩を減じることが示された(Yano等, 心不全に対する新規な治療法としての、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)の、FKBP12.6-媒介安定化；Circulation, 2003, 107:477-84; Kohno等, 新規な心臓保護剤、JTV-519が、心不全におけるリアノジンレセプタの不完全なチャンネルゲート開閉制を改善する; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2002, 14:14)。本研究において、本発明者等は、心不整脈モデルにおける、JTV-519の効力及び作用機構を検討した。そのインビボ実験において、本発明者等は、グラム単位の量のJTV-519(4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン一塩酸塩)を必要とした。
【００６７】
心不整脈についてテストするために、FKBP12.6+/-及びFKBP12.6-/-マウスを、以前に記載された運動プロトコールに付した(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死と関連した、FKBP12.6欠乏及び不完全なカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40; Mohler等, アンキリン-B変異体は、タイプ-4長期-QT心不整脈及び心臓突然死を引起す; Nature, 2003, 421:634-39)。88％のFKBP12.6+/-マウス(8匹中7匹)が、このプロトコール中に心室頻拍症(VT)あるいは失神事象を引起したが、JTV-519で予備処置したFKBP12.6+/-マウスの何れも(6匹中0匹)、不整脈又は失神事象を引起さなかった(図1)。更に、90％のFKBP12.6+/-マウス(10匹中9匹)が、運動中に又はその後に死亡したが、JTV-519-処理を施したFKBP12.6+/-マウスの何れも(9匹中0匹)、死亡することはなかった(図1C)。予備処理したFKBP12.6+/-マウスとは対照的に、100％のJTV-519で予備処理したFKBP12.6-/-マウス(5匹中5匹)は、JTV-519で処理したにも拘らず、このストレスプロトコール中にVTを発病し、かつ死亡した(図1C)。これらのデータを一緒に考察すると、JTV-519の抗-不整脈作用にとっては、FKBP12.6が必要であることを示唆している。
【００６８】
JTV-519の抗-不整脈特性を更に特徴付けするために、本発明者等は、FKBP12.6+/+、FKBP12.6+/-及びFKBP12.6-/-マウスを、プログラムを組んだ電気刺激プロトコールに掛けた。VTは、71％のFKBP12.6+/-マウス(7匹中5匹)において、迅速で過酷なペーシングにより誘発されたが、0.5mg/kgのイソプロテレノール(isoproterenol)の注射後には、野生型のFKBP12.6+/+マウス(P<0.05, n=5)では、その誘発は観測されなかった。JTV-519(0.5mg/kg/h)で前処理を施したFKBP12.6+/-マウスは、未処理のFKBP12.6+/-マウスに比して、過酷ペーシング-誘発VTに対して著しく感受性が低かった(7匹中1匹対7匹中5匹；P<0.05)。対照的に、JTV-519で前処理を施したFKBP12.6-/-マウスの67％(6匹中4匹)が、過酷ペーシング中にVTを発病した。
71％のFKBP12.6+/-マウス(7匹中5匹)において、一回の早期拍動によりVTを誘発できた。JTV-519で前処理を施した7匹のFKBP12.6+/-マウスにおいては、VTは観測されなかった。2回の早期拍動プロトコール(S1-S2-S3)を用いた場合、100%の未処理FKBP12.6+/-マウス(7匹中7匹)において、再現性良く、VTを誘発できた。JTV-519による処理は、FKBP12.6+/-マウス(7匹中7匹)において、誘発可能なVTを完全に排除した。JTV-519処理は、FKBP12.6-/-マウスのけるVTを防止できなかったが、このことは、JTV-519の抗-不整脈作用にとって、FKBP12.6が必要であるという概念を、支持している。
【００６９】
以前、本発明者等は、Ser2809におけるRyR2のPKAによるホスホリル化が、RyR2チャンネル由来のFKBP12.6の解離を引起すことを明らかにした(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)。本研究においては、JTV-519(0.5mg/kg/h)による前処理は、FKBP12.6+/-及びFKBP12.6-/-マウスにおけるRyR2のPKA-ホスホリル化の程度に影響を与えなかった(図2)。FKBP12.6+/-マウスに比して、FKBP12.6+/-マウス由来のRyR2複合体は、運動後に、かなりの程度でFKBP12.6を欠乏した(*P<0.05)。しかし、JTV-519による前処理は、運動中に、FKBP12.6+/-マウスにおける、該RyR2巨大分子複合体由来のFKBP12.6の損失を防止した(図2；*P<0.05)。
運動させたFKBP12.6+/-マウス由来のRyR2チャンネルの開放確率(Po)は、運動させたFKBP12.6+/+マウス由来のチャンネルと比較して、大幅に増大した(+/-：0.47±0.12、n=11；+/+：0.04±0.01、n=13；P<0.05)。運動させたFKBP12.6+/-マウスのJTV-519(0.5mg/kg/h)による処理は、未処置の運動させたマウスと比較して、該チャンネルのPoを、大幅に減じる(0.02±0.01、n=13)(図2)。この観測は、該RyR2複合体における高い量のFKBP12.6と一致している(図2)。対照的に、FKBP12.6-/-マウスのJTV-519による処理は、低いPoを示すチャンネルを与えなかった。
【００７０】
RyR2単一チャンネルは、電荷担体としてCa2+を用いて、150nMの低シス(細胞膜性の)[Ca2+]を用いて検討した。これらの条件は、心不整脈を誘発する可能性のある、拡張期のSR Ca2+漏洩を防止するために、該RyR2チャンネルが、低開放確率を持つべきである場合に、拡張期の心臓における条件をシミュレートする。このように、JTV-519処理を施し、運動させたFKBP12.6+/-マウスにおいて観測されたように、大幅なRyR2のPoにおける減少は、該RyR2チャンネルが、拡張期d中に、「漏洩性」とはならないことを示唆しており、このことは、不整脈が観測されなかったことと一致している。
JTV-519がVTを阻害するメカニズムを更に検討するために、本発明者等は、野生型のRyR2(RyR2-WT)チャンネルのPKAホスホリル化を用いて、運動の条件をシミュレートした。PKAでホスホリル化したRyR2チャンネルを、次に増大する濃度のJTV-519の存在下で、FKBP12.6(250nM)と共にインキュベートした。100nM又は1000nMのJTV-519とのインキュベートは、FKBP12.6とPKAでホスホリル化したRyR2との結合を誘発した(図3)。JTV-519は、また変異体RyR2-S2809Dチャンネルに対するFKBP12.6の結合を誘発したが、該チャンネルは、構成的にPKA-ホスホリル化RyR2チャンネルを真似たものである(図3)。
【００７１】
FKBP12.6のPKAでホスホリル化したRyR2チャンネルに対するアフィニティーは、JTV-519の添加によって、大幅に増大した。該チャンネルと結合したFKBP12.6の解離定数(Kds)は、RyR2-WT+PKA+PKI5-24(PKA阻害剤)に対して148±59.0nMであり、RyR2-WT+PKAに対して1972±39.9nMであり、またRyR2+PKA+JTV-519に対して158±56.4nMであった(JTV-519を含むPKA-ホスホリル化チャンネルに対するPKA-ホスホリル化チャンネル、P<0.05, n=2)(図3)。同様な結果が、RyR2-S2809D変異チャンネルを用いて観測された(該チャンネルは、構成的にPKA-ホスホリル化チャンネルを真似たものである)。FKBP12.6の結合に関するKdsは、RyR2-S2809Dに対して2123±104nMであり、またRyR2-S2809D+JTV-519に対して428±39nMであった。RyR2のPKA-ホスホリル化は、該チャンネルを活性化した(Po=0.01±0.002(PKA+PKI; n=11)対Po=0.40±0.02(PKA; n=12; P<0.05)。PKA-ホスホリル化RyR2-WTチャンネルへのFKBP12.6(250nM)の添加は、Poを低下しなかった。しかし、1μMのJTV-519+FKBP12.6の添加は、Poを、非-PKA-ホスホリル化チャンネルに匹敵するレベルまで低下した(Po=0.002±0.001; n=13; P<0.05)。
【００７２】
本発明者等の結果を一緒に考察すると、FKBP12.6+/-マウスにおける高いRyR2開放確率、心室頻拍及び心臓突然死と関連する、該RyR2巨大分子複合体からのFKBP12.6の枯渇は、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、即ちJTV-519による処理によって、逆転される。従って、本発明者等は、心室性不整脈を治療するための新規な分子的メカニズムを確認した。即ち、RyR2のFKBP12.6に対するアフィニティーの増加が、不整脈を誘発する、拡張期のSRカルシウム漏れを防止する。該RyR2巨大分子複合体におけるFKBP12.6の枯渇は、心不全(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)及び遺伝型の運動-誘発性心室性不整脈(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死と関連した、FKBP12.6欠乏及び不完全なカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)における共通の特徴であるから、心臓突然死を誘発する、RyR2における分子的な欠陥を治療するための新規かつ特別な方法を、JTV-519が与えるであろうことが予想される。
【００７３】
上で論じたように、心房細動は、ヒトにおける心不整脈の最も一般的な形態である。これまでに、心房無反応性の短縮を含む、構造的リモデリング及び電気的リモデリング、無反応性の速度-関連適合の喪失(Wijffels等, 心房細動が、心房細動を招く：慢性的に機器を取付けたヤギの覚醒における研究; Circulation, 1995, 92:1954-68; Morillo等, 慢性的急速心房ペーシング：持続性心房細動の新規モデルの、構造的、機能的及び電気生理学的諸特性; Circulation, 1995, 91:1588-95; Elvan等, ペーシング-誘発性心房細動は、イヌにおける洞結節機能を損傷する: 電気生理学的リモデリング; Circulation, 1996, 94:2954-60; Gaspo等, 慢性のイヌモデルにおける、頻拍-誘発性持続的心房細動を引起す機能的なメカニズム; Circulation, 1997, 96:4027-35)及び凹入小波の波長の短縮化が、持続的な頻拍症を伴うことが確認されている(Rensma等, 正常な覚醒したイヌにおける凹入心房性不整脈の励起波の長さ及び感受性; Circ. Res., 1988, 62:395-410)。このリモデリングは、心房細動の発症、維持、及び進行において重要であると思われる。同様に、カルシウム処理が、心房細動の電気的リモデリングにおいてある役割を演じている可能性のあることも示唆されている(Sun等, 持続的な心房頻拍によって引起される、心房収縮機能不全の細胞的メカニズム; Circulation, 1998, 98:719-27; Goette等, 心房細動における電気的リモデリング：タイムコース及びメカニズム; Circulation, 1996, 94:2968-74; Daoud等, ヒトにおける心房細動-誘発性電気的リモデリングに及ぼす、ベラパミル及びプロカインアミドの作用; Circulation, 1997, 96:1542-50; Yu等, ヒトにおける、心房凹入性期間の頻拍-誘発性変化：抗-不整脈薬の速度依存性及び効果; Circulation, 1998, 97:2331-37; Leistad等, 短期間の心房細動後の心房性収縮機能不全は、ベラパミルによって軽減されるが、BAY K8644により高められる; Circulation, 1996, 93:1747-54; Tieleman等, ベラパミルは、心房の頻拍-誘発性電気的リモデリングを軽減する; Circulation, 1997, 95:1945-53)。
【００７４】
変更されたイオン-チャンネル機能に基いた、様々なメカニズムが、AFについて提案されている。例えば、研究は、延長された心房頻拍の設定において、L-型のCa2+流(ICa,L)及び一過性の外向き流れ(Ito)における減少を示した(Yue等, 心房不整脈のイヌモデルにおける、活動電位変化を起こすイオン性リモデリング; Circ. Res., 1997, 81:512-25)。観測されたICa,Lの下方調整が、少なくとも部分的に、AERPの短縮及び無反応性の速度-関連適応を説明できる。これらは両者共に、AFを伴う、該電気的リモデリング過程の特徴である(Yue等, 心房不整脈のイヌモデルにおける、活動電位変化を起こすイオン性リモデリング; Circ. Res., 1997, 81:512-25)。急速心房ペーシングの実験動物モデル及びAFに罹ったヒトの臨床的研究において、ベラパミルが、電気的リモデリングを阻害することを示し、結果としてCa2+の過剰な負荷が、関与していることを示唆した(Daoud等, ヒトにおける心房細動-誘発性電気的リモデリングに及ぼす、ベラパミル及びプロカインアミドの効果; Circulation, 1997, 96:1542-50; Leistad等, 短期間の心房細動後の心房性収縮機能不全は、ベラパミルによって軽減されるが、BAY K8644により高められる; Circulation, 1996, 93:1747-54)。
【００７５】
筋鞘イオンチャンネルが、明らかに心房性頻拍及びAFを伴う、リモデリングにおける重要な役割を演じている一方で、細胞内Ca2+処理の寄与は、十分に探索されていない。しかし、異常な細胞内Ca2+処理は、該リモデリング過程においてある役割を演じていることを示唆する証拠がある。以前の研究は、例えば速度適応性の喪失が、変更された筋鞘イオン電流、例えば、ICa,L及びItoによって完全には説明できないことを明らかにした(Ramirez等, イヌの心房性活動電位の数学的解析：速度、領域因子、及び電気的リモデリング; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2000, 279:H1767-85; Kneller等, 心房性頻拍によるCa2+処理のリモデリング：速度適応性の喪失におけるある役割に係る証拠; Cardiovasc. Res., 2002, 54:416-26)。研究は、細胞内カルシウム処理における頻拍-誘発性変化も、速度適応性の喪失にかなり寄与しており、これはAFの病因にとって重大であると考えられている(Sun等, 持続的な心房頻拍によって引起される、心房収縮機能不全の細胞的メカニズム; Circulation, 1998, 98:719-27; Kneller等, 心房性頻拍によるCa2+処理のリモデリング：速度適応性の喪失におけるある役割に係る証拠; Cardiovasc. Res., 2002, 54:416-26; Hara等, 細動状態にあるイヌの心房における、定常状態及び非-定常状態の活動電位：異常な速度適応及びその可能なメカニズム; Cardiovasc. Res., 1999, 42:455-69)。
【００７６】
以前の研究において、ペーシング-誘発性AFのイヌモデル由来の心房は、AP-持続-速度適応性を喪失し、またAP特性の変更を受けた。これは、リアノジンの存在により逆転できた。これらの観測は、電荷が、少なくとも部分的に、細胞内Ca2+-依存過程から生じることを示唆している(Hara等, 細動状態にあるイヌの心房における、定常状態及び非-定常状態の活動電位：異常な速度適応及びその可能なメカニズム; Cardiovasc. Res., 1999, 42:455-69)。更に、持続的ペーシング-誘発性心房性頻拍を患うイヌの心房においては、Ca2+-トランジェント(transient)に著しい減少が見られる(Sun等, 持続的な心房頻拍によって引起される、心房収縮機能不全の細胞的メカニズム; Circulation, 1998, 98:719-27;)。
Ca2+-トランジェントは、RyR2を介するSRからの、Ca2+-誘発性Ca2+-放出を開始させる、筋鞘へのCa2+の流入に起因するから、以前の研究の結果は、細胞内カルシウム処理における変更が、該頻拍-誘発性リモデリング課程を伴うことを示唆している。このような異常に減少するCa2+-トランジェントは、単離された心房筋細胞の抑制された短縮化を関連しており、このことは、カルシウム処理が、AFを伴う心房性収縮機能不全に寄与することを示している(Sun等, 持続的な心房頻拍によって引起される、心房収縮機能不全の細胞的メカニズム; Circulation, 1998, 98:719-27;)。
【００７７】
ここで論じるように、本発明者等の研究は、カルシウム恒常性が、持続的な心房頻拍及びAFを伴う、該電気的及び収縮リモデリングにおいて重要な役割を演じていることを明らかにする、説得力ある証拠を与える。RyR2によるSR Ca2+ストアの放出は、心筋のCa2+-恒常性の完全な成分としての可能性がある。RyR2の調節は、イヌ及びヒトの心室組織において十分に特徴付けされており、またRyR2は、心不全及び心臓突然死を包含する、心室心筋の疾患と関連している(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76; Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死と関連した、FKBP12.6欠乏及び不完全なカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40; Reiken等, β-遮断剤は、カルシウム放出チャンネル機能を回復し、かつヒトの心不全における心筋性能を改善する; Circulation, 2003, 107:2459-66)。Ca2+-処理が、心房性不整脈においてある役割を演じている旨の証拠があるにも拘らず、心房リアノジンレセプタの調節及び機能は、この設定において十分に特徴付けされていない。特に、本発明以前には、AFにおけるこのチャンネルの役割は、未知であった。
【００７８】
本発明者等は、ここにおいて、心室心筋におけるように、心房性細胞内カルシウム放出チャンネルは、巨大分子複合体として存在することを、確認する。本発明者等の同時-免疫沈降実験の結果は、心房性RyR2が、主な調節性サブユニット、カルスタビン2(FKBP12.6)；ホスファターゼ、PP1及びPP2A；及びPKAの調節性及び触媒的サブユニットと物理的に結合することを示している。更に、本発明者等は、内在性のPKAが、心房性筋小胞体のRyR2を特異的にホスホリル化し、該チャンネル複合体におけるカルスタビン2(FKBP12.6)の枯渇をもたらすことが明らかにされている。これらの発見は、心房における収縮機能の調節が、心室性心筋において観測されたものと同様な様式で、心房性RyR2のPKA-ホスホリル化によって、変調し得ることを示唆している(Brillantes等, FK-506結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 1994, 77:513-523)。
【００７９】
従来の研究において、本発明者等は、RyR2のPKA-ホスホリル化が、イヌのAF心房において、カルスタビン2(FKBP12.6)の枯渇と関連していることを観測した。同様に、本発明者等は、心不全の調節の際に、AFに罹っているヒト由来の心房細胞において、PKA-ホスホリル化が、カルスタビン(FKBP12.6)の枯渇と関連していることをも観測した。この異常なRyR2のPKA-過ホスホリル化の機能上の結果として、心臓における拡張期(低いサイトゾル性Ca2+)をシミュレートする条件において、高い開放確率を示した。このような機能的な異常性は、カルスタビン2(FKBP12.6)の枯渇しているチャンネルの特性である(Brillantes等, FK-506結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 1994, 77:513-523)。AFにおけるこの異常なチャンネル機能は、PKA-過ホスホリル化の調節における、RyR2からのカルスタビン2(FKBP12.6)の喪失が、Ca2+-誘発性Ca2+-放出に対する高い感受性に対して二次的な、拡張期のCa2+-放出を起こし易くする、「漏洩性の高いチャンネル」を与えることを明らかにした、以前の研究結果と一致する(Brillantes等, FK-506結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 1994, 77:513-523; Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca2+-放出チャンネルに及ぼすラパマイシンの効果; Circ. Res., 1996, 78:990-97)。カルスタビン2(FKBP12.6)が存在しない場合、チャンネルが、ユニソン(unison)(共役的ゲート開閉)においてではなく、寧ろ確率的に(ゲートを)開閉することも公知である(Marx等, 個々の骨格筋Ca2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の、共役的ゲート開閉; Science, 1998, 281:818-21)。
【００８０】
証拠は、AFが、典型的に早期の心房性期外収縮により開始され(Bennett & Pentecost, ヒトにおける心房細動の発症及び自然停止のパターン; Circulation, 1970, 41:981-88)、これは、脱分極後に生じることが知られている(Cranefield, P.F., 活動電位、後電位及び不整脈; Circ. Res., 1977, 41:415-23)。該不整脈終了直後の、心房性期外収縮によるAFの再開が観測されており(Timmermans等, 内部心房性除細動後の、心房性不整脈の即座の再開; J. Cardiovasc. Electrophysiol., 1998, 9:122-28; Wellens等, アトリオバータ(Atrioverter): 心房細動を治療するための移植可能なデバイス; Circulation, 1998, 98:1651-56)、また脱分極後の早い時期に、特異的に結合している(Burashnikov & Antzelevitch, 不整脈の終端後即座の心房細動の再誘発は、後期段階3(late phase 3)の、脱分極後の早い時期に誘発され、開始される活性により媒介される; Circulation, 2003, 107:2355-60)ことが観測されている。期外収縮は、特に、短縮された有効な無反応性期間の調節中に、AFを引起し易く(Wang等, イヌにおける心房細動の誘発及び維持を決定する領域的及び機能的因子; Am. J. Physiol., 1996, 271:H148-58)、これは心房性電気的リモデリングを伴うものと類似する。
【００８１】
上で論じたように、「漏洩性の」PKA-過ホスホリル化されたRyR2からの、異常な拡張期のCa2+-放出が、致死性の心室性不整脈を誘発するのに十分な、遅延された脱分極後(DADs)を結果することに関する証拠がある(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死と関連した、FKBP12.6欠乏及び不完全なカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)。機能不全性RyR2カルシウムの処理が、また同様な様式で、AFを開始するように作用するものと考えられる。本発明者等によって観測された、この異常なチャンネル機能は、不整脈と関連する該リモデリング過程に欠くことのできない、機能不全状態にあるカルシウム処理に対して寄与すると共に、AFを誘発するのに必要なDADs源を与えることによって、AFの病因性に寄与する可能性がある。心不全の発症において、AFに罹っているヒト由来の心房性心筋が、PKA-過ホスホリル化され、かつカルスタビン2(FKBP12.6)を喪失したという、ここに示された証拠を提示することにより、機能不全状態にあるRyR2の機能は、部分的に、AF患者における心房性不整脈の頻度を説明できる。
【００８２】
RyR2カルシウム処理における、特定の分子レベルでの欠陥を修復する、JTV-519の能力は、このものを、新規な治療薬として、魅惑的な候補とする。JTV-519の潜在能力は、心不全及び致死性の心室性不整脈を包含する、RyR2の機能不全状態での調節を含む、増大する数の重大な心疾患によって、更に強められる(即ち、PKA-過ホスホリル化及び該チャンネル複合体からのカルスタビン2(FKBP12.6)の喪失は、これら病因に対する重大な寄与因子であり得る)。
JTV-519に関する初期の研究は、その抗-虚血性に焦点が当てられていた(個人的情報、アエタス(Aetas))。しかし、ごく最近、JTV-519が、心房細動のイヌ無菌心膜炎モデルにおける、AFの誘発を阻害することが示された(Kumagai等,イヌ無菌心膜炎モデルにおける、心房細動/粗動に及ぼす、新規な心臓保護薬である、JTV-519の抗-不整脈作用; J. Cardiovasc. Electrophysiol., 2003, 14:880-84)。しかし、この研究は、JTV-519が、AFの誘発及び維持に影響を与えるメカニズムを定義しなかった。
【００８３】
ここにおいて明らかにしたように、本発明者等は、JTV-519(1μM)による処理は、インビトロで、正常なイヌの心筋から単離した、PKA-ホスホリル化RyR2と、組換えカルスタビン2(FKBP12.6)とを結合することを可能とする。PKA-ホスホリル化RyR2と、カルスタビン2(FKBP12.6)との結合は、未処理のチャンネルについては起こらなかった。該チャンネル複合体とカルスタビン2(FKBP12.6)との再結合は、PKA-過ホスホリル化チャンネルにおける正常な機能を回復する。従って、RyR2-チャンネル機能の回復は、Kumagai等により観測された(イヌ無菌心膜炎モデルにおける、心房細動/粗動に及ぼす、新規な心臓保護薬である、JTV-519の抗-不整脈作用; J. Cardiovasc. Electrophysiol., 2003, 14:880-84)ように、AFの誘発及び維持を阻害する、JTV-519の能力においてある役割を演じることができる。
心房細動は、複雑な電気生理学的過程であり、その分子的な病因性は、多因性となる傾向がある。異常な心筋Ca2+-処理は、該発病過程に大きく寄与するものと思われる。本発明者等の研究は、RyR2のPKA-過ホスホリル化に起因する、異常な細胞内Ca2+-放出チャンネル機能が、AFにおけるリモデリング過程に寄与する可能性があり、また不整脈の引き金として機能する、潜在的な可能性がある。
【００８４】
JTV-519を用いた治療及び予防の新規モデル
上記の記載によれば、本発明は、対象内のRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限し又は防止する方法を提供する。ここで使用する「FKBP12.6」とは、「FKBP12.6タンパク」及び「FKBP12.6類似体」両者を含む。ここでは、特に述べない限り、「タンパク」とは、タンパク、タンパクドメイン、ポリペプチド、又はペプチド、及びこれらの任意のフラグメントを含むものとする。「FKBP12.6類似体」は、FKBP12.6の生物学的な活性を持つ、該FKBP12.6タンパクの機能性の変異体であり、これは60%又はそれ以上の、該FKBP12.6タンパクとの、アミノ酸配列相同性を持つものである。更に、ここで使用する用語「FKBP12.6の生物学的な活性」とは、ここに記載するアッセイ条件下で、未-ホスホリル化又は非-過ホスホリル化RyR2と、物理的に会合又はこれらと結合する(即ち、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を持つことが立証されているが、アフィニティーは、FKBP12.6のものとは異なっていても良い、タンパク又はペプチドの活性を意味する。
【００８５】
更に、ここで使用する「RyR2」とは、「RyR2タンパク」(例えば、心房性RyR2タンパク又は心室性RyR2タンパク)及び「RyR2類似体」両者を含む。「RyR2類似体」とは、RyR2の生物学的な活性を持つ、該RyR2タンパクの機能性の変異体であって、これは60%又はそれ以上の、該RyR2タンパクとの、アミノ酸配列相同性を持つものである。ここで使用する「RyR2類似体」とは、RyR2の骨格筋イソ型である、RyR1及びRyR3を包含する。本発明のRyR2は、ホスホリル化されていなくても、ホスホリル化されていても(例えば、PKAによって)、あるいは過ホスホリル化されていても(例えば、PKAにより)よく、好ましくは該RyR2は、ホスホリル化され又は過ホスホリル化されている。更に、ここで使用する用語「RyR2の生物学的な活性」とは、ここに記載するアッセイ条件下で、FKBP12.6と、物理的に会合又はこれと結合する(即ち、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を持つことが立証されているが、アフィニティーは、RyR2のものとは異なっていても良い、タンパク又はペプチドの活性を意味する。
【００８６】
上記のように、この心臓リアノジンレセプタである、RyR2は、4つの12,000ダルトンのFKBP12.6タンパクと結合状態にある、4つの565,000ダルトンを持つRyR2タンパクを含む、タンパク複合体である。FK506結合タンパク(FKBPs)は、広範に発現されている、また様々な細胞機能を果たす、シス-トランス型ペプチジル-プロリルイソメラーゼである。FKBP12.6タンパクは、RyR2としっかりと結合し、かつその機能を調節する。FKBP12.6は、RyR2チャンネルと、RyR2サブユニット当たり1分子宛結合して、RyR2-チャンネル機能を安定化し、しかも隣接するRyR2チャンネル間の共役的ゲート開閉を容易にし、結果として心臓サイクルの静止段階中の、該チャンネルの異常な活性化を防止する。従って、ここで使用する用語「RyR2-結合FKBP12.6」とは、RyR2タンパクサブユニットと結合したFKBP12.6タンパクの分子、又はRyR2のテトラマーと結合状態にあるFKBP12.6のテトラマーを包含する。この用語「RyR2-結合FKBP12.6」とは、またFKBP12.6タンパクの分子と結合している、RyR2タンパクサブユニット又はFKBP12.6のテトラマーと結合状態にある、RyR2のテトラマーをも包含する。従って、「対象内の、RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少」とは、対象内の、FKBP12.6-結合RyR2のレベルにおける減少、及び対象内の、FKBP12.6-RyR2複合体のレベルにおける減少を含む。
【００８７】
本発明の方法によれば、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける「減少」とは、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける検出可能な減少、減衰、又は低下を意味する。該対象において、この減少が、JTV-519(以下に記載するような)を投与することによって、何れにしろ、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルが、JTV-519の不在下において見られるレベルよりも高くなるように、停止され、妨害され、妨げられ、邪魔され、又は低下された場合に、このような減少は、制限され又は防止される。該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6の「レベル」とは、該対象における全体的なレベルを意味し、該対象の血液(循環)、組織、及び細胞(例えば、細胞質又は核)中のRyR2-結合FKBP12.6のレベルを含む。一例として、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6の全体的なレベルにおける減少は、従って、該対象の血液中、組織中、及び/又は細胞中のレベルにおける減少によって達成され得る。
【００８８】
対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルは、公知技術から容易に測定できるもの(例えば、免疫学的な技術、ハイブリッド化分析、免疫沈降、ウエスタン-ブロット分析、蛍光造影技術、及び/又は放射線技術等)を包含する標準的なアッセイ及び技術、並びにここに記載する任意のアッセイ及び検出技術によって検出できる。例えば、タンパクは、当分野において公知の標準的な方法を利用して、対象の細胞から単離及び精製することができる。ここで、該標準的な方法とは、該細胞からの抽出(例えば、該タンパクを可溶化する洗浄剤を用いた抽出、この場合必要ならば、カラム上でのアフィニティー精製を伴う)、クロマトグラフィー(例えば、FTLC及びHPLC)、免疫沈降(抗体を使用)、及び沈殿法(例えば、イソプロパノール及びトリゾール(Trizol)等の試薬を使用)を含むが、これらに限定されない。該タンパクの単離及び精製後には、電気泳動(例えば、SDS-ポリアクリルアミドゲル上)を行っても良い。対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルの減少、あるいはその制限又は阻害は、治療/予防薬(例えば、以下に記載する方法に従って投与される、JTV-519又は他の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体)の投与に先立って検出された、RyR2-結合FKBP12.6の量と、該治療/予防薬の投与後の、適当な時点において検出された量とを比較することによって、決定することができる。
【００８９】
本発明の方法において、対象(例えば、この対象の細胞中)におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルの減少は、例えば該対象におけるFKBP12.6及びRyR2の解離を阻害し；該対象におけるFKBP12.6とRyR2との間の結合性を高め；あるいは該対象におけるRyR2-FKBP12.6複合体を安定化することにより、制限し又は防止することができる。ここで使用する用語「解離の阻害」とは、該対象におけるRyR2分子からのFKBP12.6サブユニットの物理的な解離又は分離を遮断し、減少させ、阻害し、制限し又は防止すること、及び該対象におけるFKBP12.6サブユニットからのRyR2分子の物理的な解離又は分離を遮断し、減少させ、阻害し、制限し又は防止することを含む。更に、ここで使用する用語「結合性を高める」とは、ホスホリル化されたRyR2の、該対象内で、FKBP12.6と物理的に結合する(例えば、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を増強し、高め、又は改善すること、及びFKBP12.6の、該対象内で、ホスホリル化されたRyR2と物理的に結合する(例えば、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を増強し、高め、又は改善することを含む。
【００９０】
更に、本発明の方法では、対象(例えば、この対象の細胞中)におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルの減少は、該対象におけるホスホリル化されたRyR2のレベルを直接減じ、あるいは該対象におけるホスホリル化されたRyR2のレベルを間接的に減じる(例えば、該細胞内のホスホリル化されたRyR2の機能又はレベルを、調節又は変調する酵素(例えば、PKA)又は他の内在性分子で攻撃させる)ことにより、制限し又は防止することができる。好ましくは、該対象におけるホスホリル化されたRyR2のレベルは、本発明の方法により少なくとも10%減じられる。より好ましくは、該ホスホリル化されたRyR2のレベルは、少なくとも20%低下される。
本発明の方法によれば、該RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少が、対象(例えば、この対象の細胞中)において制限され、又は防止される。本発明における該対象は、両生類、鳥類、魚類、哺乳類及び有袋類を包含する任意の動物であり得るが、好ましくは哺乳動物(例えば、ヒト、家畜(飼育されている)動物、例えばネコ、イヌ、サル、マウス又はラット、あるいは商業動物、例えばウシ又はブタ)である。本発明の幾つかの態様において、該対象は、心臓状態を有するか、あるいはその候補者である。「心臓状態」の例は、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を包含する心室性不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全及び運動-誘発性心臓突然死を含むが、これらに制限されない。
【００９１】
心不整脈は、心拍数又は心臓の律動における異常性として現れる、心臓の電気的活性の乱れである。頻拍(例えば、心房、結合部(結節)、心室、及び発作性の頻拍)は、特に心拍数が100/分を越えた場合に見られる、心臓の活動における過度の迅速性と関連している。頻拍性不整脈は、正常な心臓の律動における不規則性と関連する、頻拍である。運動-誘発性心不整脈は、対象が物理的な運動を行った後又はその最中に発症する、心臓状態(例えば、心臓突然死を導く任意のものを包含する、心室細動又は心室性不整脈)である。
心房細動は、頻脈性不整脈の一例である。より具体的には、心房細動は、異常な及び不規則な心臓の律動に関連する状態であり、そこでは、電気シグナルが、該心臓の上部心室又は心房全体を通して、無秩序に発生する。心房細動の共通する症状は、動悸(心臓の急速な、かつ不規則な拍動の不快な意識)を含むが、これらに限定されない。心房細動は、また心臓から脳に移動して卒中を引起す、血栓を発生する恐れがある。心房細動の従来の治療は、危険因子の調節、心拍数を減らし及び/又は該心臓を正常な律動状態に転化するための薬剤の投与、及び血栓に関連する合併症の予防を含む。
【００９２】
心不全は、低下した心臓の収縮機能(収縮能)として現れる状態である。心不全の症状は、息切れ、運動許容度の低下、及び早期の筋肉疲労を包含する。
心臓状態(例えば、心不整脈又は心不全)に関する「候補」は、心臓状態を発生する危険性を持つことが知られている、あるいは該危険性があると思われる、あるいは該状態に罹っていると推定される対象である。心臓状態に関する候補の例は、心不整脈(例えば、頻拍；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を包含する心室性不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)及び/又は心不全に罹っているものと考えられる動物/ヒト；及び心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を包含する心室性不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を発症する危険性のあることが知られている、あるいは該危険性があると思われる、あるいは該状態に罹っていると推定される動物/ヒトを含むが、これらに制限されない。
【００９３】
運動-誘発性心不整脈に関する「候補」は、肉体的な運動中/その後に、心不整脈を発症する危険性のあることが知られている、あるいは該危険性があると思われる、あるいは該状態に罹っていると推定される対象である。運動-誘発性心不整脈に関する「候補」の例は、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)に罹っていることが知られている動物/ヒト；CPVTに罹っているものと推定される動物/ヒト；及び肉体的な運動中/その後の、運動を始めようとしている、現在運動中の、又はまさに運動を完了したものの、心不整脈を発症する危険性のあることが知られている、あるいは該危険性があると思われる、あるいは該状態に罹っていると推定される動物/ヒトを含むが、これらに制限されない。上で論じた如く、CPVTは、構造的に正常な心臓を持つ個体における遺伝的な障害である。これは、ストレス-誘発性心室頻拍症、即ち心臓突然死を引起す恐れのある、致死性の不整脈によって特徴付けられる。CPVTに罹っている対象において、肉体的な力の発揮及び/又はストレスが、検出し得る構造上の心臓疾患のない場合に、心臓突然死(SCD)に導く、二方向性の及び/又は多形性の心室頻拍症を誘発する。CPVTに罹っている個体は、運動した際に心室性不整脈を起こすが、静止中に不整脈を起こすことはない。
【００９４】
本発明の方法において、対象の細胞は、好ましくは横紋筋細胞である。横紋筋は、収縮性筋原線維の繰返し単位(サルコメア)が、該細胞全体に、縞状に(in registry)配列され、光学顕微鏡のレベルで観測できる、横断又は斜走線を与える、筋肉である。横紋筋細胞の例は、随意(骨格)筋細胞及び心筋細胞を含むが、これらに制限されない。好ましい一態様では、本発明の方法において使用する細胞は、ヒトの心筋細胞である。ここで使用する用語「心筋細胞」とは、心筋線維、例えば心臓の心筋層に見られるものを包含する。心筋線維は、境界膜において端部同士が接合している、連続する心臓の筋肉細胞、又は心筋細胞の連鎖で構成される。これらの境界膜は、2種の細胞接合部、即ちこれらの横方向の部分に沿って伸びた、伸縮性デスモソーム、及びギャップ接合体を持ち、その最長のものは、長手方向に沿って配置されている。
【００９５】
本発明の方法では、対象にJTV-519を投与することにより、該対象(例えば、その細胞)の、該RyR2-結合FKBP12.6レベルにおける減少を、制限し又は防止する。故に、次には、該対象の細胞とJTV-519との間の接触が可能となる。k201としても知られている、JTV-519(4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン一塩酸塩)は、一種の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体であり、かつカルシウム-イオンチャンネルの調節剤である。心筋細胞におけるCa2+-レベルの調節に加えて、JTV-519は、モルモットの心室細胞内の、Na+流及び内側整流体K+流を変調し、またモルモットの心房細胞内の、遅延整流体K+流を阻害する。FK506及びラパマイシンは、本発明の対象におけるRyR2-FKBP12.6複合体を安定化する、他の化合物を設計するのに使用できる薬物である。FK506及びラパマイシン両者は、RyR2からFKBP12.6を解離する。これら薬物と構造的に関連性を持つが、逆の作用を持つ化合物を設計し及び/又はスクリーニングすることが可能である。
【００９６】
本発明の方法において、JTV-519は、これと製薬上許容される担体とを含む、治療組成物として、対象に投与することができる。該製薬上許容される担体は、該組成物の他の成分と相溶性であり、かつそのレシピエントにとって有害でないという意味で、「許容できる」ものである必要がある。ここで使用する製薬上許容される担体は、製薬処方物用の材料として使用される、様々な有機又は無機物質から選択され、これらは、鎮痛剤、バッファー、バインダ、崩壊剤、希釈剤、乳化剤、賦形剤、増量剤、滑剤(glidants)、可溶化剤、安定化剤、懸濁剤、張度調節剤、ビヒクル、及び粘度上昇剤として配合することができる。必要ならば、製薬添加剤、例えば酸化防止剤、芳香剤、着色剤、矯味剤、保存剤、及び甘味料を添加することもできる。製薬上許容される担体の例は、特にカルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアガム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、粉末、塩水、アルギン酸ナトリウム、スクロース、デンプン、タルク、及び水を含む。
本発明の製薬処方物は、製薬の分野において周知の方法で製造することができる。例えば、JTV-519を、懸濁液又は溶液として、担体又は希釈剤と併合することができる。場合によっては、1又はそれ以上の副成分(例えば、バッファー、矯味剤、界面活性剤、等)を、添加することもできる。担体の選択は、投薬経路に依存するであろう。
【００９７】
JTV-519は、インビボにおいて、対象内のターゲット細胞(例えば、心筋細胞)を、このJTV-519と接触させることにより、該対象に投与することができる。JTV-519は、タンパク、核酸及びその他の薬物を導入し、また投与するのに利用されている、公知の技術を利用して、該対象の細胞と接触させることができる。これらの細胞とJTV-519とを接触させる(即ち、後者で細胞を治療するための)方法の例は、吸収法、エレクトロポレーション、浸漬、注射、導入、リポソーム放出、トランスフェクション、輸液、ベクタ、及び他の薬物放出ビヒクル、及び方法を含むが、これらに制限されない。該ターゲット細胞が、対象の特定の位置に局在している場合、注射又は幾つかの他の手段(例えば、血液又は他の体液への、JTV-519の導入)によって、該JTV-519を直接該細胞に導入することが望ましい場合がある。該ターゲット細胞は、例えば対象の心臓組織中に含まれていても良く、また公知技術から容易に決定できる、標準的な検出法によって、該対象の心臓組織内で検出することも可能であり、該検出法の例としては、免疫学的な技術(例えば、免疫組織化学的染色法)、蛍光造影技術、及び顕微鏡技術を含むが、これらに制限されない。
【００９８】
更に、本発明のJTV-519は、経口投与、腸管外投与、及び経皮投与を含むが、これらに制限されない、公知の手順でヒト又は動物の対象に投与できる。好ましくは、該JTV-519は、筋膜上、被膜内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、実質、皮下、又は舌下注射、又はカテーテルにより腸管外投与される。一態様によれば、該薬剤は、対象の心臓に挿入されたカテーテルを介する、心臓筋肉にターゲット的放出により、該対象に投与される。
経口投与のためには、JTV-519処方物は、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤として、又は懸濁剤として提供することができる。該処方物は、公知の添加剤、例えばラクトース、マニトール、コーンスターチ、又はポテトスターチを含むことができる。該処方物は、またバインダ、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンと共に処方することもできる。更に、該処方物は、コーンスターチ、ポテトスターチ、又はナトリウムカルボキシメチルセルロース等の崩壊剤と共に処方することもできる。同様に、該処方物は、二塩基性無水燐酸カルシウム又はナトリウムデンプングリコレートと共に、処方することもできる。最後に、該処方物は、たる熊ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤と共に処方することもできる。
【００９９】
腸管外投与(即ち、消化管以外の経路を介する注射による投与)のためには、JTV-519は、好ましくは該対象の血液に対して等張性の無菌水性溶液と組み合わせることができる。このような処方物は、固形活性成分を、生理的に許容される物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、また生理的条件と一致する緩衝されたpHを有する水に溶解して、水性溶液を製造し、次いでこの溶液を滅菌することにより製造できる。この処方物は、単位用量又は多数の用量を含む容器、例えば封止したアンプル又はバイアルビン中に処方できる。この処方物は、筋膜上、被膜内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、実質、皮下、又は舌下を含むが、これらに制限されない注射により、又はカテーテルにより、該対象の心臓内に放出することができる。
経皮投与のためには、JTV-519は、皮膚浸透性増強剤、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、N-メチルピロリドン等と組合わせることができ、これらは皮膚のJTV-519に対する浸透性を増し、かつ該JTV-519が、皮膚を透過して、血流内に浸入することを可能とする。このJTV-519/増強剤組成物は、更にポリマー物質、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン/ビニルアセテート、ポリビニルピロリドン等と組合わせて、塩化メチレン等の溶媒に溶解でき、所定の粘度にまで蒸発させ、次いで支持体材料に適用し、貼付剤を製造することもできる。
【０１００】
本発明の方法によれば、該対象、特に該対象の細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量で、JTV-519を該対象に投与する(及びJTV-519を該対象の細胞と接触させる)ことができる。この量は、既知の手順に従って、当業者が容易に決定でき、該既知の手順は、インビボで確立された滴定曲線の解析、及びここに記載する方法並びにアッセイを含む。該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な、JTV-519の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。好ましくは、JTV-519の量は、約10mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある。
本発明の一態様によれば、該対象は、未だ心不整脈(例えば、頻拍症；心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死等の心臓疾患状態を発症していない。この場合、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な、JTV-519の量は、該対象内の、心臓疾患状態(例えば、心不整脈、心不全又は運動-誘発性心臓突然死)を予防するのに有効なJTV-519の量であり得る。
【０１０１】
ここで使用する用語、「心臓疾患状態を予防するのに有効な」薬物(例えば、JTV-519)の量とは、該心臓状態の臨床的な機能障害又はその症状の発生を防止するのに有効な該薬剤(例えば、JTV-519)の量を包含する。例えば、該心臓疾患状態が、心房細動である場合、心房細動を予防するのに有効なJTV-519の量は、該対象における動悸及び/又は血餅の発生を防止するのに有効なJTV-519の量であり得る。同様に、該心臓疾患状態が、運動-誘発性心不整脈である場合、運動-誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の量は、該対象における運動-誘発性の動悸、失神、心室細動、心室頻拍、及び心臓突然死を防止するのに有効なJTV-519の量であり得る。更に、該心臓疾患状態が心不全である場合、心不全を予防するのに有効なJTV-519の量は、該対象における息切れ、低下した運動許容度、及び早期の筋肉疲労を防止するのに有効なJTV-519の量であり得る。
ある対象における心臓疾患状態を予防するのに有効な、薬物(例えば、JTV-519)の量は、該心臓疾患状態の種類、該対象の体重、該対象の疾患状態の重篤度、及び該薬物(例えば、JTV-519)の投与モードを含む、各場合における特定の因子に依存して変動するであろう。この量は、既知の手順に基いて、当業者が容易に決定でき、該既知の手順は、臨床的な試み、及びここに記載する方法を含む。本発明の一態様によれば、運動-誘発性心不整脈を防止するのに有効な薬物(例えば、JTV-519)の量は、該対象における、運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効な薬物(例えば、JTV-519)の量である。別の態様では、該薬物(例えば、JTV-519)は、該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死等を予防する。
【０１０２】
JTV-519が、RyR2-結合FKBP12.6を安定化し、かつ動的なRyR2のPKA-ホスホリル化と脱ホスホリル化との関連におけるバランスを維持し、かつ回復する能力を持つことから、JTV-519は、また心臓疾患状態の臨床的な症状を示し始めている対象を、治療する上で有用である。該心臓疾患状態の症状が、該対象において十分に早期に観測されている場合には、JTV-519は、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの更なる減少を、制限又は防止する上で有効であり得る。
従って、本発明の他の態様では、該対象は、心臓疾患状態を発現している。例えば、該対象は、かつて運動しており、あるいは現在運動しており、しかも運動-誘発性心不整脈を患っている。このような場合、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効なJTV-519の量は、該対象における、心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、又は心不全)を治療するのに有効な、JTV-519の量であり得る。
【０１０３】
ここで使用する用語、「心臓疾患状態を治療するのに有効な」薬物(例えば、JTV-519)の量とは、該心臓疾患状態の臨床的な機能障害又はその症状を軽減し又は改善するのに有効な該薬剤(例えば、JTV-519)の量を包含する。例えば、該心臓疾患状態が、心房細動である場合、心房細動を治療するのに有効なJTV-519の量は、該対象における動悸及び/又は血餅の発生を防止するのに有効なJTV-519の量であり得る。同様に、該心臓疾患状態が、運動-誘発性心不整脈である場合、運動-誘発性心不整脈を治療するのに有効なJTV-519の量は、該対象における運動-誘発性の動悸、失神、心室細動、及び心室頻拍症を軽減し又は改善するのに有効なJTV-519の量であり得る。更に、該心臓疾患状態が心不全である場合、心不全を治療するのに有効なJTV-519の量は、該対象における息切れ、低下した運動許容度、及び早期の筋肉疲労を軽減又は改善するのに有効なJTV-519の量であり得る。
ある対象における、心臓疾患状態を治療するのに有効な薬物(例えば、JTV-519)の量は、該心臓疾患状態の種類、該対象の体重、該対象の疾患状態の重篤度、及び該薬物(例えば、JTV-519)の投与モードを含む、各場合における特定の因子に依存して変動するであろう。この量は、既知の手順に基いて、当業者が容易に決定することができ、該既知の手順とは、臨床的な試み、及びここに記載する方法を含む。好ましい一態様によれば、該薬物(例えば、JTV-519)は、該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態を治療する。
【０１０４】
本発明は、更にある対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療する方法をも提供する。この方法は、該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態を治療するのに有効な量で、該対象にJTV-519を投与する工程を含む。該対象における、心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療するのに有効なJTV-519の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
【０１０５】
本発明は、またある対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を予防する方法をも提供する。この方法は、該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態を予防するのに有効な量で、該対象にJTV-519を投与する工程を含む。該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を予防するのに有効なJTV-519の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
上記方法の様々な態様において、該運動-誘発性心不整脈は、VTと関連している。好ましい態様において、該VTは、CPVTである。これら方法に関する別の態様では、該対象は、運動-誘発性心臓突然死に関する候補を包含する、運動-誘発性心不整脈に関する候補である。
【０１０６】
更に、上記方法に鑑みて、本発明は、また少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)に罹っている又はその候補である対象内での、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法における、JTV-519の使用法をも提供する。本発明は、またある対象内での、少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療し又は予防する方法における、JTV-519の使用法をも提供する。
【０１０７】
新規なスクリーニング法：
上で議論し、またここに提示した如く、本発明者等のデータは、セリン2809上の、心臓リアノジンレセプタ、RyR2の、タンパクキナーゼA(PKA)によるホスホリル化が、FK506結合タンパク、FKBP12.6を放出することによって、カルシウム放出チャンネルを活性化することを示している。障害のある心臓(心不全のヒトの心臓及びその動物モデルを含む)においては、RyR2が、PKA-ホスホリル化されており、結果として低下したFKBP12.6の結合量を持つ、不完全なチャンネルをもたらし、またカルシウム-誘発性活性化に対して高い感受性を持つ。これら変化の最終的な結果は、該RyR2チャンネルが、「漏洩性」となることである。これらチャンネルの漏れは、もはや十分なカルシウムが、筋小胞体(SR)中には存在せず、結果的に筋肉収縮の強烈な刺激を与える、カルシウムの細胞内貯蔵量の枯渇をもたらす可能性がある。このことは、心筋の弱い収縮をもたらす。このチャンネル漏洩の第二の結果として、RyR2チャンネルは、「拡張期」として知られる、心臓サイクルの静止段階において、カルシウムを放出する。この拡張期におけるカルシウムの放出は、心臓突然死(SCD)を引起す、該心臓の致死的な不整脈(例えば、心室頻拍症及び心室細動)を誘発する恐れがある。
【０１０８】
本発明者等は、また心臓を静止状態に置き、かつ正常化された機能を回復させる、左心室アシストデバイス(LVAD)と呼ばれる、機械的なポンプ輸送デバイスによる、心不全の治療が、RyR2のPKA-過ホスホリル化、及び該チャンネルの正常化された機能の低下と関連していることをも示した。更に、本発明者等は、イヌ(ペーシング-誘発性心不全を持つ)の、β-アドレナリン遮断剤(β-遮断剤)による治療が、RyR2のPKA-過ホスホリル化を反転させることを示した。β-遮断剤は、PKAを活性化する経路を阻害する。これら本発明者等の研究結果から誘導できる結論は、以下のようなものである：RyR2のPKA-ホスホリル化は、該チャンネルの活性を高め、結果的に、該チャンネルの所定のトリガー(活性化剤)に対して、該細胞により多くのカルシウムを放出する。
【０１０９】
ここで更に記載するように、本発明者等は、心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)が、RyR2タンパク(特に、CPVT-関連RyR2変異タンパク)のホスホリル化における増加、及びRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少と関連していることを立証した。このメカニズムを、このような心臓状態の治療並びに予防にとって効果的な薬物の設計に利用できる。該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し、あるいは防止する能力を有する候補薬物は、この活性の制限又は阻害の結果として、該RyR2-関連生物学的事象に及ぼす作用を持つことができ、結果としてこのような心臓状態を治療し又は予防することを可能とする。
従って、本発明は、更に少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療し又は予防するのに使用するための薬剤を、同定する方法をも提供する。この方法は、(a) RyR2を含む細胞培養物を得、あるいはこれを生成する工程；(b) 該細胞と、候補薬剤とを接触させる工程；(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該細胞を暴露する工程；及び(d) 該薬剤が、該細胞内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。
【０１１０】
ここで使用する用語「薬剤」とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸(DNA又はRNAを含む)、抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、分子、化合物、抗生物質、薬物、及びこれらの任意に組合せを含むものとする。RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する薬剤は、天然又は合成薬剤であり得、またRyR2及び/又はFKBP12.6と反応性の(即ち、これらに対してアフィニティーを持ち、あるいは結合し、もしくはこれらを指向する)薬剤であり得る。更にここで使用する如く、「RyR2-含有」細胞は、RyR2又はその誘導体又は類似体が、天然に発現し、又は天然に発生する、細胞(好ましくは、心筋細胞)である。細胞内で、RyR2のホスホリル化を高めることが知られている状態は、PKAを含むが、これに限定されない。
本発明の方法においては、細胞を、ここに記載した、任意の導入並びに投与モードを包含する、薬物/薬剤と細胞との間の接触を行う、標準的な方法の何れかによって、接触させることができる。該細胞内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルは、当業者には公知の、又はここに記載した、任意の方法、分子的な手続き、及びアッセイを含む、公知の手順によって、測定又は検出することができる。本発明の一態様によれば、該薬剤が、該細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し又は阻害する。
【０１１１】
ここで論じるように、RyR2は、横紋筋細胞内で、多くの生物学的な事象に関係している。例えば、RyR2チャンネルは、心筋細胞における、ECカップリング及び収縮能において重要な役割を演じていることが明らかにされている。従って、細胞内のRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し、又は防止するように設計された、治療又は予防薬物が、ECカップリング及び収縮能を包含する、多数のRyR2-関連生物学的事象の調節において有用であり得ることは、明白である。このように、本発明の候補薬剤が、一旦スクリーニングされ、かつRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少に対して、適当な制限又は防止作用を持つことが決定されれば、細胞、特に心筋細胞における、ECカップリング及び収縮能に及ぼすその作用について評価することができる。本発明の治療/予防剤が、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、及び運動-誘発性心臓突然死を包含する、心臓状態を治療し又は予防するのに有用であろうことが予想される。
【０１１２】
従って、本発明の方法は、更に(e) 該候補薬剤とRyR2を含有する細胞の培養物とを接触させる工程；及び(f) 該薬剤が、該細胞内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含むことができる。ここで使用する用語「RyR2-関連生物学的事象」とは、RyR2のレベル又は活性が関連している生化学的又は生理学的な過程を含む。ここに記載したように、RyR2-関連生物学的事象の例は、心筋細胞におけるECカップリング及び収縮能を含むが、これらに制限されない。本発明のこの方法によれば、候補薬剤は、インビトロでの、1又はそれ以上の細胞(好ましくは、心筋細胞)とを接触させることができる。例えば、該細胞の培養物は、該候補薬剤を含む製剤と共にインキュベートすることができる。従って、RyR2-関連生物学的事象に及ぼす該候補薬剤の効果は、任意の生物学的アッセイ、又は免疫ブロット法、単チャンネル記録(single-channel recordings)、及びここに記載する任意の他の方法を含む、当分野において公知の方法により、評価することができる。
【０１１３】
本発明は、更に上記の同定法により同定された薬剤、並びに該薬剤及び製薬上許容される担体を含む薬理組成物をも目的とする。該薬剤は、対象における運動-誘発性心臓突然死を防止するのに、また他のRyR2-関連状態を治療並びに予防するために有用であり得る。ここで使用する、「RyR2-関連状態」とは、RyR2のレベル又は活性が関連している状態、疾患、又は障害であり、またRyR2-関連生物学的事象及び心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を包含する。
該RyR2-関連状態は、該対象に、そこにおける該RyR2-関連状態を治療し又は予防するのに有効な量の該薬剤を投与することによって、該対象内で、治療し又は予防することができる。当業者は、この量を、容易に決定することができる。一態様において、本発明は、ある対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を、該対象における該少なくとも1種の心臓状態を治療し又は予防するのに有効な量で、該対象に該薬剤を投与することによって、治療し又は予防するための方法を提供する。
【０１１４】
本発明は、また心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を、治療し又は予防するために使用する、薬剤を同定するためのインビボ方法をも提供する。この方法は、以下の諸工程：(a) RyR2を含む動物を得、あるいはこれを発生させる工程；(b) 該動物に、候補薬剤を投与する工程；(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該動物を暴露する工程；及び(d) 該薬剤が、該動物内で、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。この方法は、更に、(e) 該薬剤を、RyR2を含有する動物に投与する工程；及び(f) 該薬剤が、該動物内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含むことができる。本発明は、またこの方法により同定された薬剤；該薬剤を含む薬理組成物；及びある対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を、該対象内の該少なくとも1種の心臓状態を治療又は予防するのに有効な量で、該対象に該薬剤を投与することによって、治療し又は予防するための方法をも提供するものである。
【０１１５】
本発明者等の研究は、PKAの活性化を妨害する化合物が、該RyR2チャンネルの活性化を減じ、結果的に該細胞へのカルシウムの放出量を低下するものと予想されることを明らかにした。該FKBP12.6結合サイトにおいて該RyR2チャンネルと結合するが、該チャンネルがPKAによりホスホリル化された場合に、該チャンネルを離れることのない化合物は、またPKAの活性化、又は該RyR2チャンネルを活性化する他のトリガーに応答して、該チャンネルの活性化を減じるものと予想される。このような化合物は、また該細胞へのカルシウムの放出量を低下するであろう。これら発見に鑑みて、本発明は、更に心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療し又は予防するに際して、これらがRyR2の活性化を妨害し又は阻害する点で、有用であり得る薬剤を同定するための、付随的なアッセイをも提供する。
【０１１６】
例として、本発明の診断アッセイは、カルシウム-感受性の蛍光染料(例えば、フルオ-3(Fluo-3)、フラ-2(Fura-2)等)を使用して、該RyR2チャンネルを介する、細胞へのカルシウムの放出についてスクリーニングすることができる。細胞に選択された蛍光染料を添加し、次いでRyR2活性化剤で刺激して、該細胞に添加した化合物が、カルシウム-依存性の蛍光シグナルを減じるか否かを決定することができる(Brillants等, FK506-結合タンパク質による、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 1994, 77:513-23; Gillo等, ネズミの赤白血病細胞における、誘導分化の際のカルシウムの流入; Blood, 1993, 81:783-92; Jayaraman等, チロシンのホスホリル化による、イノシトール1,4,5-トリ燐酸レセプタの調節; Science, 1996, 272:1492-94)。カルシウム-依存性の蛍光シグナルは、光電子増倍管で追跡し、また前に記載されたような適当なソフトウエアを用いて解析できる(Brillants等, FK506-結合タンパク質による、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 1994, 77:513-23; Gillo等, ネズミの赤白血病細胞における、誘導分化の際のカルシウムの流入; Blood, 1993, 81:783-92; Jayaraman等, チロシンのホスホリル化による、イノシトール1,4,5-トリ燐酸レセプタの調節; Science, 1996, 272:1492-94)。このアッセイは、マルチウエルディッシュを用いて、多数の化合物をスクリーニングするために、容易に自動化することができる。
【０１１７】
RyR2-媒介細胞内カルシウム放出のPKA-依存性活性化を阻害する化合物を同定するために、アッセイは、異種発現系、例えばSf9、HEK293、又はCHO細胞内での、組換えRyR2チャンネルの発現を含むことができる(Brillants等, FK506-結合タンパク質による、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 1994, 77:513-23)。RyR2は、β-アドレナリンレセプタによる、同時発現も可能であった。このことは、β-アドレナリンレセプタアゴニストの添加に応答する、RyR2の活性化に及ぼす、化合物の効果を評価することを可能とする。
心不全の程度と関連する、RyR2のPKA-ホスホリル化のレベルをもアッセイし、次いで該RyR2チャンネルのPKA-ホスホリル化を阻害するように設計された、化合物の有効性を決定するのに利用できる。このようなアッセイは、該RyR2タンパクに特異的な抗体の使用に基くものであり得る。例えば、該RyR2チャンネルタンパクは、免疫沈降させ、次いでPKA及び[γ-32P]-ATPにより、逆-ホスホリル化することができる。次いで、該RyR2タンパクに移行する、放射性[32P]標識の量を、リン光造影装置(phosphoimager)を用いて、測定することができる(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)からFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)。
【０１１８】
本発明の別のアッセイは、Ser 2809上でPKA-ホスホリル化された、RyR2を検出する、ホスホエピトープ(phosphor-epitope)-特異的抗体の使用を含む。このような抗体を用いた免疫ブロット法は、心不全及び心不整脈に関する療法の効力を評価するのに使用できる。更に、RyR2 S2809A及びRyR2 S2809Dノック-インマウスを使用して、心不全及び心不整脈に関する療法の効力を評価することができる。このようなマウスは、更に、該RyR2 S2809A変異が、心不全及び不整脈を阻害し、かつ該RyR2 S2809D変異が、心不全及び不整脈をより悪化させることを示すことによって、RyR2のPKA-過ホスホリル化が、心不全及び心不整脈における寄与因子であることの、証拠を与える。
新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体及びその合成方法
1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、特に2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、JTV-519を含む生物学的に活性な分子の製造における、重要な結合遮断物質である。本発明者等は、1,4-ベンゾチアゼピン中間体化合物、例えば7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造するための新規な方法を開発した。この本発明者等の方法は、容易に入手でき、かつ高価でない出発物質を使用し、また高収率で主要な1,4-ベンゾチアゼピン中間体を与える。
【０１１９】
1990年代初期において、Kaneko等(米国特許第5,416,066号; WO 92/12148; JP4,230,681)は、JTV-519が、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の一つ)と、アクリロイルクロリドとを反応させ、次いで得られた生成物と4-ベンジルピペリジンとを反応させることによって、製造できることを開示している。
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び同様な化合物を製造するための2つの方法が、以前に文献において報告されている。その第一の方法は、Kaneko等(米国特許第5,416,066号)に記載されており、これは2,5-ジヒドロキシ安息香酸から出発する、6段階の合成経路を含んでいた。この方法において、2,5-ジヒドロキシ安息香酸は、ジメチル硫酸によって選択的にメチル化された。次いで、生成する化合物を、20時間に渡り、ジメチルチオカルバモイルクロリドと反応させ、更に9時間に渡り高温(270℃)条件に暴露した。この段階の生成物を、メタノール中で20時間に渡り、ナトリウムメトキシドと共に還流した。次いで、この還流段階の生成物を、塩基性条件下で、かつ高温度下で、2-クロロエチルアミンと反応させた。この環化されたアミドを、LiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン中間体の一つ)を製造した。
【０１２０】
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造するための第二の方法は、Hitoshiにより、日本国特許(JP 10,045,706)に記載されている。この方法は、2-ブロモ-5-メトキシベンズアルデヒドを出発物質としていた。この臭化物は、NaSMeで置換し、次いで得られた生成物を、塩素で酸化し、次いで水中で還流して、ジスルフィドジアルデヒドを生成した。このジアルデヒドを2-クロロエチルアミンで処理し、得られた生成物を、還元剤、例えばNaBH4で還元した。生成する化合物を、環化して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを得た。
【０１２１】
始めに、本発明者等は、上記の方法を用いて、該1,4-ベンゾチアゼピン中間体、即ち7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンの製造を試みた。しかし、本発明者等は、Kaneko等(米国特許第5,416,066号)に記載された第一の方法が、高温及び長い反応時間を必要とする合成段階を含むことを見出した。更に、本発明者等は、該第三のチオール化中間体のチオ基が、空気によって容易に酸化されて、ジスルフィド化合物となり、後の環化生成物の合成を不可能にすることを見出した。本発明者等は、またHitoshi(JP 10,045,706)により記載された方法が、Cl2の使用を含み、またNaSMeによる臭化物の置換とは別に、該第一の中間体の製造方法に関する、特許されたもう一つの方法を、使用する必要があることを確認した。
上記問題点を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき、かつ高価でない出発物質から、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造する新規な方法を開発した。本発明者等の方法は、単離並びに精製段階を単純化し、しかも7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び以下の式で示される一般的な構造を持つ他の化合物を含む、様々な1,4-ベンゾチアゼピン中間体を製造するのに利用できる：
【０１２２】
【化２２】
2007530561.tif 000024
【０１２３】
R1=n-MeO、n-MeS、n-アルキル；n=6、7、8、9
R2=アルキル；
R3=アルキル
この方法は、またJTV-519の製造にも利用できる。
従って、上記の観点から、本発明は、以下の式で表される化合物の合成方法を提供する：
【０１２４】
【化２３】
2007530561.tif 000025
【０１２５】
ここで、Rは、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子(halide)であり、またR'は、アルキル、アリール、又はHであり、かつRが2、3、4、又は5-位であり得る場合には、この方法は以下の工程を含む：
(a) 以下の式で表される化合物：
【０１２６】
【化２４】
2007530561.tif 000026
【０１２７】
(ここで、Rは上記の定義通りである)を、場合により触媒の存在下で、還元剤で処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程：
【０１２８】
【化２５】
2007530561.tif 000027
【０１２９】
(ここで、Rは上記の定義通りである)；
(b) 上記段階(a)において製造した化合物を、ジアゾ化剤及びジスルフィドにより処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程：
【０１３０】
【化２６】
2007530561.tif 000028
【０１３１】
(ここで、Rは上記の定義通りである)；
(c) 上記段階(b)において製造した化合物を、活性化剤及びクロロエチルアミンで処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程：
【０１３２】
【化２７】
2007530561.tif 000029
【０１３３】
(ここで、Rは上記の定義通りである)；
(d) 上記段階(c)において製造した化合物を、還元剤と塩基とで処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程：
【０１３４】
【化２８】
2007530561.tif 000030
【０１３５】
(ここで、Rは上記の定義通りである)；及び
(e) 上記段階(d)において製造した化合物を、還元剤で処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程：
【０１３６】
【化２９】
2007530561.tif 000031
【０１３７】
(ここで、Rは上記の定義通りである)。
本発明の方法によれば、上記工程(a)における還元剤はH2であり得る。更に、上記工程(b)におけるジアゾ化剤は、NaNO2であり得、また該工程(b)におけるジスルフィドは、Na2S2であり得る。更に、上記工程(c)におけるクロリドは、SOCl2であり得る。上記工程(d)における還元剤はトリメチルホスフィン(PMe3)であり得、一方該工程(d)における塩基は、トリエチルアミンである。もう一つの態様において、上記工程(e)における還元剤はLiAlH4であり得る。
本発明は、更に、以下の式を有する化合物の合成法を提供する：
【０１３８】
【化３０】
2007530561.tif 000032
【０１３９】
ここで、RはOR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、またRが、2、3、4、又は5-位に存在することができる場合、この方法は、以下に挙げる工程を含む：
(a) 以下の式で表される化合物：
【０１４０】
【化３１】
2007530561.tif 000033
【０１４１】
(ここで、Rは上記の定義通りである)を、3-ブロモプロピオン酸クロリド及び以下の式で表される化合物と反応させ：
【０１４２】
【化３２】
2007530561.tif 000034
【０１４３】
以下の式で表される化合物を製造する工程：
【０１４４】
【化３３】
2007530561.tif 000035
【０１４５】
(ここで、Rは上記の定義通りである)。
一例として、以下の式で表される化合物：
【０１４６】
【化３４】
2007530561.tif 000036
【０１４７】
(ここで、RはOR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、またRが、2、3、4、又は5-位に存在することができる)は、以下のようにして合成することができる：
【０１４８】
【化３５】
2007530561.tif 000037
【０１４９】
R= OR'、SR'、NR'、アルキル、ハロゲン原子；R'=アルキル、アリール、H
Rは2、3、4、又は5-位に位置することができる。
一例として、また実施例9及び以下の反応式1に示すように、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンは、2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸から、以下のようにして製造できる。2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸のニトロ基を、触媒としてPd/Cを使用して、H2により還元して、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸を得る。2-アミノ-5-メトキシ安息香酸は、NaNO2でジアゾ化することができ、また次にNa2S2で処理して、安定なジスルフィド化合物を製造することができる。更に精製することなしに、該安定なジスルフィド化合物をSOCl2で処理し、次いでEt3Nの存在下で、2-クロロエチルアミンと反応させて、アミドを製造する。次いで、このアミド化合物を、以下のように1-ポット(one-pot)法に従って、環化化合物に転化することができる。還元剤(例えば、トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)及び塩基(例えば、トリエチルアミン)を、該アミド化合物のTHF(テトラヒドロフラン)溶液に添加することができる。次いで、生成した反応混合物を、3時間に渡り還流することができる。該還元剤(例えば、トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)は、該ジスルフィド(S-S)をそのモノスルフィド状態に開裂し、引続き該クロリドと分子内環化を行って、環化されたアミドを生成する。次に、この環化されたアミドを、LiAlH4で還元して、1,4-ベンゾチアゼピン中間体、即ち7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造することができる。次いで、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンから、これと3-ブロモプロピオン酸クロリドとを反応させ、次いで得られる化合物と、4-ベンジルピペリジンとを反応させることにより、JTV-519を製造することができる。
【０１５０】
本発明は、更に組成物を提供し、この組成物は、放射性標識したJTV-519を含む。JTV-519の標識は、当分野において公知の様々な異なる放射性標識の一種を用いて、行うことができる。本発明の放射性標識は、例えば放射性同位元素であり得る。該放射性同位元素は、例えば検出可能な放射能を発する任意の同位体であり得、該同位体は、例えば35S、125I、3H又は14Cを含むが、これらに限定されない。該放射性同位元素によって放出される放射能は、当分野において周知の技術によって検出することができる。例えば、放射性同位元素からのγ-輻射線は、ガンマ線造影技術、特にシンチグラフィー造影法を用いて検出できる。
一例として、また実施例10及び以下の反応式2に示すように、放射性標識したJTV-519は、以下のようにして製造できる。JTV-519は、BBr3を用いて、該フェニルリングにおいて、脱メチル化処理することができる。次いで、生成するフェノール化合物を、塩基(例えば、NaH)の存在下において、放射性標識したメチル化剤(例えば、3H-ジメチル硫酸)で、再度メチル化して、3H-標識JTV-519を得ることができる。
本発明は、更にJTV-519に類似する、2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼペンを包含する、新規な1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体を提供する。例として、本発明は、以下の式で表される化合物を提供する：
【０１５１】
【化３６】
2007530561.tif 000038
【０１５２】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０１５３】
【化３７】
2007530561.tif 000039
【０１５４】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０１５５】
【化３８】
2007530561.tif 000040
【０１５６】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；及び
【０１５７】
【化３９】
2007530561.tif 000041
【０１５８】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである。同様に、本発明によれば、更に以下の式で示される、2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン化合物も提供される：
【０１５９】
【化４０】
2007530561.tif 000042
【０１６０】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【０１６１】
【化４１】
2007530561.tif 000043
【０１６２】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【０１６３】
【化４２】
2007530561.tif 000044
【０１６４】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である。
本発明者等の新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物の例は、S7、S-20、S-25、S-27及びS36を含むが、これらに制限されない。好ましくは、本発明の化合物は、S36である。S7、S-20、S-25、S-27及びS36に関する構造は、本発明の図15に見出すことができる。本発明のこれら及びその他の任意の新規化合物は、上記した如き製薬上許容される担体と組合わせることができ、かくして薬理組成物を製造することができる。
本発明は、更にここに記載した如き、新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法をも提供する。例えば、本発明は、以下の式で表される化合物の合成方法を提供する：
【０１６５】
【化４３】
2007530561.tif 000045
【０１６６】
(ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである)。この方法は、以下の諸段階を含む：
(a) 以下の式で示される化合物：
【０１６７】
【化４４】
2007530561.tif 000046
【０１６８】
を、塩化スルホニル化合物(任意の塩化スルホニル誘導体を包含する)及び塩基で処理して、以下の式で表される化合物を生成する段階：
【０１６９】
【化４５】
2007530561.tif 000047
【０１７０】
(b) 場合により、上記段階(a)において生成した化合物を、第一又は第二アミンで処理して、以下の式で示される化合物を製造する段階：
【０１７１】
【化４６】
2007530561.tif 000048
【０１７２】
(ここで、Rは、上記定義通りである)。一態様では、上記段階(a)における該塩化スルホニル化合物は、アルキルスルホニルクロリド、及びアリールスルホニルクロリドからなる群から選択される。もう一つの態様において、上記段階(a)における該塩基は、Et3Nである。更に別の態様では、上記段階(b)における該第一又は第二アミンは、4-ベンジルピペリジンである。
本発明の方法は、更に以下の式で表される化合物を、酸化剤によって酸化して：
【０１７３】
【化４７】
2007530561.tif 000049
【０１７４】
(ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである)、以下の式で示される化合物を製造する段階を含むことができる：
【０１７５】
【化４８】
2007530561.tif 000050
【０１７６】
m=1又は2
(ここで、Rは、上記定義通りであり、mは1又は2である)。本発明の一態様においては、該酸化剤は、過酸化水素である。
例として、また実施例11及び反応式3に示すように、本発明者等は、以下の一般式を持つ化合物の合成方法を開発した：
【０１７７】
【化４９】
2007530561.tif 000051
【０１７８】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである。この一般的な構造を持つ新規な化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンと、アルキルスルホニルクロリド又はアリールスルホニルクロリドとを、塩基、例えばEt3Nの存在下で反応させることにより製造できる。引続き、所望によりその側鎖を伸張する目的で、追加の反応(例えば、4-ベンジルピペリジンの付加)を行うこともできる。反応式3が示すように、2-クロロエタンスルホニルクロリド(例えば、180mg；1.1mM)及びEt3N(例えば、140mg；1.1mM)を、CH2Cl2(例えば、20ml)中の、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)(例えば、194mg；1mM)に、0℃にて添加することができる。次に、この混合物を、攪拌し(例えば、0℃にて2時間)、かつ洗浄(例えば、H2O及び飽和NaHCO3溶液で)することができる。該溶媒の除去は、粗生成物を与え、これはシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製することができる。この構造は、NMRで確認できる。反応式3は、更にこの生成する化合物の側鎖が、この化合物(例えば、28mg；0.1mM)と、4-ベンジルピペリジン(例えば、21mg；0.13mM)とを、CH2Cl2中で反応させることによって、伸張することができる。この反応が完結した後に、過剰量のアミンを、塩基掃去剤(例えば、3-(2-無水琥珀酸)プロピル-官能化処理したシリカゲル、0.5g)によって除去することができる。
本発明は、また以下の式で示される化合物の合成方法をも提供し：
【０１７９】
【化５０】
2007530561.tif 000052
【０１８０】
(ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである)、この方法は、以下の式で表される化合物：
【０１８１】
【化５１】
2007530561.tif 000053
【０１８２】
を、塩基の存在下で、スルホニルクロリド及び第一及び第二アミンによって処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程を含む：
【０１８３】
【化５２】
2007530561.tif 000054
【０１８４】
ここで、Rは、上で定義した通りである。本発明の一態様において、該塩基はEt3Nである。もう一つの態様において、該第一及び第二アミンは、1-ピペロニルピペラジンである。
本発明の方法は、更に以下の式を持つ化合物：
【０１８５】
【化５３】
2007530561.tif 000055
【０１８６】
(ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである)を酸化して、以下の式で表される化合物を製造する段階を含むこともできる：
【０１８７】
【化５４】
2007530561.tif 000056
【０１８８】
m=1又は2
ここで、Rは、上で定義した通りであり、mは1又は2である。一態様において、該酸化剤は、過酸化水素である。
例として、また実施例11及び反応式4に示すように、本発明者等は、以下の式で示される一般的な構造を持つ化合物の合成方法を提供する：
【０１８９】
【化５５】
2007530561.tif 000057
【０１９０】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである。この一般的な構造を持つ新規化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンとスルフリルクロリドとを、塩基(Et3N)の存在下で、1-ポット反応させ、次いで第一又は第二アミンと反応させることにより製造できる。反応式4によって明らかなように、スルフリルクロリド(例えば、15.0mg；0.111mM)及びEt3N(例えば、28.0mg；0.22mM)を、0℃にて、CH2Cl2中の、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(例えば、19.4mg；0.1mM)に添加することができる。該混合物を攪拌(例えば、0℃にて2時間)した後、1-ピペロニルピペリジン(例えば、27mg；0.12mM)を添加することができる。この混合物を、更に2時間攪拌し、次いで洗浄(例えば、H2O及び飽和NaHCO3溶液で)することができる。過剰量のアミンを、塩基掃去剤(例えば、3-(2-無水琥珀酸)プロピル-官能化処理したシリカゲル、0.2g)によって除去することができる。
本発明は、更に以下の式で表される化合物の合成方法を提供する：
【０１９１】
【化５６】
2007530561.tif 000058
【０１９２】
m=1又は2
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である。この方法は、以下の式で表される化合物：
【０１９３】
【化５７】
2007530561.tif 000059
【０１９４】
(ここで、Rは上記の定義通りである)を、酸化剤で処理して、以下の式を持つ化合物：
【０１９５】
【化５８】
2007530561.tif 000060
【０１９６】
m=1又は2
(ここで、Rは上記の定義通りである)を製造する段階を含む。一態様において、該酸化剤は、過酸化水素である。この方法は、またJTV-519を酸化するのに利用することもできる。
本発明は、更に以下の式で表される化合物の合成法をも提供する：
【０１９７】
【化５９】
2007530561.tif 000061
【０１９８】
m=1又は2
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である。この方法は、以下の式で表される化合物：
【０１９９】
【化６０】
2007530561.tif 000062
【０２００】
を、酸化剤で処理して、以下の式で表される持つ化合物：
【０２０１】
【化６１】
2007530561.tif 000063
【０２０２】
m=1又は2
(ここで、Rは上記の定義通りである)を製造する段階を含む。一態様において、該酸化剤は、過酸化水素である。この方法は、またJTV-519を酸化するのに利用できる。
例として、また実施例11及び反応式5に示すように、本発明者等は、以下の式で示される一般的な構造を持つ化合物の合成方法を開発した：
【０２０３】
【化６２】
2007530561.tif 000064
【０２０４】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である。この一般的な構造を持つ新規な化合物は、JTV-519、又はここに記載する本発明に係る新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の一種を、過酸化水素で酸化することによって製造できる。反応式5によって示されるように、MeOH(例えば、5ml)中の、対象とする該1,4-ベンゾチアゼピン化合物(例えば、21mg；0.05mM)を、H2O2(例えば、0.1ml、過剰量)に添加することができる。この混合物を攪拌(例えば、2日間)することができ、また得られる生成物を、シリカゲル上でのクロマトグラフィー(例えば、CH2Cl2:MeOH = 10:1)で精製することができる。
更に、本発明は、以下の式で表される化合物の合成方法を提供する：
【０２０５】
【化６３】
2007530561.tif 000065
【０２０６】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである。この方法は、以下の式で表される化合物：
【０２０７】
【化６４】
2007530561.tif 000066
【０２０８】
を、塩基の存在下で、カルボニルクロリド化合物で処理し、また第一又は第二アミン又はアルコールで処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階を含む：
【０２０９】
【化６５】
2007530561.tif 000067
【０２１０】
ここで、R及びXは、上記定義通りである。一態様において、該カルボニルクロリドは、トリホスゲンである。別の態様では、該塩基はEt3Nである。更に別の態様では、該第一又は第二アミンは、4-ベンジルピペリジンである。
例として、また実施例11及び反応式6に示すように、本発明者等は、以下の式で示される一般的な構造を持つ化合物の合成方法を開発した：
【０２１１】
【化６６】
2007530561.tif 000068
【０２１２】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである。この一般的な構造を持つ新規な化合物は、塩基(Et3N)の存在下で、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンとトリホスゲンとを反応させ、次いで第一又は第二アミン又はアルコールを添加することによって製造できる。
本発明は、更に以下の式で表される、2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法を提供する：
【０２１３】
【化６７】
2007530561.tif 000069
【０２１４】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである。この方法は、以下に列挙する段階を含む：
(a) 以下の式で表される化合物：
【０２１５】
【化６８】
2007530561.tif 000070
【０２１６】
(ここで、R1は上記定義通りである)を、場合により触媒の存在下にて、還元剤で処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階：
【０２１７】
【化６９】
2007530561.tif 000071
【０２１８】
(ここで、R1は上記定義通りである)；
(b) 上記段階(a)において生成した化合物を、ジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階：
【０２１９】
【化７０】
2007530561.tif 000072
【０２２０】
(ここで、R1は上記定義通りである)；
(c) 上記段階(b)において生成した化合物を、活性化剤及びクロロエチルアミンで処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階：
【０２２１】
【化７１】
2007530561.tif 000073
【０２２２】
(ここで、R1、R2及びR3は上記定義通りである)；
(d) 上記段階(c)において生成した化合物を、還元剤及び塩基で処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階：
【０２２３】
【化７２】
2007530561.tif 000074
【０２２４】
(ここで、R1、R2及びR3は上記定義通りである)；及び
(e) 上記段階(d)において生成した化合物を、還元剤で処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階：
【０２２５】
【化７３】
2007530561.tif 000075
【０２２６】
(ここで、R1、R2及びR3は上記定義通りである)。
新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を用いた、治療並びに予防方法
本発明者等の新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物は、JTV-519と、機能特性を共有している。例えば、JTV-519(mwt=423)と同様に、化合物S36(mwt=267)は、カルシウムチャンネルを調節する。事実、S36(カルボン酸)は、カルシウムチャンネルの調節において、JTV-519よりも約10倍も強力である(データは示さない)。しかし、JTV-519とは違って、本発明者等の新規な化合物は、hERGsの活性に対して僅かな遮断性を示すに過ぎない。
迅速遅延整流(I(Kr))チャンネル、即ちカリウムチャンネルは、心臓活動電位の再分極にとって重要である。hERGは、該I(Kr)チャンネルの孔-形成サブユニットである。I(Kr)機能の抑制は、有害薬物作用及び/又はhERGにおける遺伝的な欠陥の結果として、生命を脅かす不整脈の高い危険性をもたらす、長期-QT(LQT)症候群に導く恐れがある。従って、hERGsは、遮断された場合に、心不整脈及び心臓突然死を引起す可能性のある、カリウム-チャンネルサブユニットである。
【０２２７】
本発明者等の化合物は、JTV-519と比較した場合に、hERG(I(Kr))チャンネルの有意に低い遮断性を有する。例えば、図4-7に示したように、本発明者等の化合物の一つであるS36は、JTV-519のhERG遮断活性よりも、約5-倍〜10-倍低い、hERG遮断活性を持つ。本発明者等の化合物は、弱いhERG遮断活性を持つので、これらは、JTV-519よりも毒性が低いものと予想される。
上記記載に基いて、本発明者等の新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物は、JTV-519よりも一層強力であり、また低い毒性を持つ。従って、本発明者等の新規な化合物は、ある対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するための、上記方法の何れかにおいて特に有用であると思われる。ここで、該対象とは、少なくとも1種の心臓状態を患っており、あるいはその候補者を含むものであり、また該心臓状態とは、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、及び運動-誘発性心臓突然死)を含むが、これらに制限されない。また、本発明者等の化合物は、ある対象におけるこのような心臓状態を治療又は予防する方法において、特に有用であると思われる。
従って、本発明は、更に、ある対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量のある薬剤を、該対象に投与することによって、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するための方法をも提供する。本発明の該薬剤は、以下に列挙するものを含む、任意の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体である：
【０２２８】
【化７４】
2007530561.tif 000076
【０２２９】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０２３０】
【化７５】
2007530561.tif 000077
【０２３１】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０２３２】
【化７６】
2007530561.tif 000078
【０２３３】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【０２３４】
【化７７】
2007530561.tif 000079
【０２３５】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである；
【０２３６】
【化７８】
2007530561.tif 000080
【０２３７】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【０２３８】
【化７９】
2007530561.tif 000081
【０２３９】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【０２４０】
【化８０】
2007530561.tif 000082
【０２４１】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である；及び
(h) 上記化合物(a)-(g)の任意の酸化形態にあるもの。また、対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するための方法における、これら薬剤の使用法をも提供する。本発明の一態様においては、該薬剤は、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27及びS36からなる群から選択される。これら薬剤の構造は、図15に見出すことができる。好ましくは、該薬剤はS36である。
【０２４２】
上記のように、該対象は、任意の動物であり得るが、好ましくはヒトである。一態様において、該対象は、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)に罹っている。別の態様では、該対象は、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、及び運動-誘発性心臓突然死)を包含するが、これらに限定されない、少なくとも1種の心臓状態を患っているか、あるいはその候補者である。
本発明の方法において、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、上記のように、該誘導体と、製薬上許容される担体とを含む、治療組成物の一部として、該対象に投与することができる。該誘導体又は薬理組成物は、当分野において公知の及び/又はここに記載する任意の技術によって、該対象に投与することができる。
【０２４３】
本発明の方法によれば、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、ある対象、特にその細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量で、該対象に投与できる(及び該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、該対象の細胞と接触させることができる)。当業者は、この量を、インビボで確立された滴定曲線の解析、及びここに記載する方法及びアッセイを包含する、公知の手順に基いて、容易に決定することができる。該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内であり得、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。好ましくは、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の量は、約10mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある。
【０２４４】
本発明の方法によれば、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少は、該対象におけるホスホリル化されたRyR2のレベルを減じることにより、該対象において制限又は防止することができる。本発明の一態様によれば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)等の心臓状態を、該対象は未だ発症していない。この場合、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の量は、該対象における心臓状態(例えば、心不整脈、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を、予防するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の量であり得る。一態様において、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、該対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を予防する。
【０２４５】
本発明のもう一つの態様においては、該対象は、既に心臓状態を発症している。この場合には、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の量は、該対象における心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の量であり得る。好ましい一態様において、該JTV-519は、該対象における、少なくとも1種の心臓状態を治療する。
本発明は、更に該対象における、心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療又は予防する方法をも提供し、この方法は、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量で、該対象にある薬剤を投与する工程を含む。本発明の該薬剤は、以下に列挙するものを包含する、任意の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体であり得る：
【０２４６】
【化８１】
2007530561.tif 000083
【０２４７】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０２４８】
【化８２】
2007530561.tif 000084
【０２４９】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０２５０】
【化８３】
2007530561.tif 000085
【０２５１】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【０２５２】
【化８４】
2007530561.tif 000086
【０２５３】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである；
【０２５４】
【化８５】
2007530561.tif 000087
【０２５５】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【０２５６】
【化８６】
2007530561.tif 000088
【０２５７】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【０２５８】
【化８７】
2007530561.tif 000089
【０２５９】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である；及び
(h) これら化合物(a)-(g)の任意の酸化形態にあるもの。
本発明は、更に対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療する方法をも提供する。この方法は、該対象に、そこにおける少なくとも1種の心臓状態を治療するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を、該対象に投与する工程を含む。対象における、心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内であり得、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
【０２６０】
本発明は、また対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を予防する方法を提供する。この方法は、該対象における少なくとも1種の心臓状態を予防するのに有効な量で、該対象に1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を投与する工程を含む。対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を予防するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内であり得、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
上記方法によれば、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の例は、以下に列挙するものを包含するが、これらに限定されない：
【０２６１】
【化８８】
2007530561.tif 000090
【０２６２】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０２６３】
【化８９】
2007530561.tif 000091
【０２６４】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである；
【０２６５】
【化９０】
2007530561.tif 000092
【０２６６】
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である；
【０２６７】
【化９１】
2007530561.tif 000093
【０２６８】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである；
【０２６９】
【化９２】
2007530561.tif 000094
【０２７０】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、又はアリールである；
【０２７１】
【化９３】
2007530561.tif 000095
【０２７２】
ここで、R1は該フェニル環上の2、3、4、又は5-位における、H、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、mは0、1、又は2であり、nは0又は1である；
【０２７３】
【化９４】
2007530561.tif 000096
【０２７４】
ここで、R1は、該フェニル環上の2、3、4、又は5-位におけるH、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハロゲン原子であり、及びR'はアルキル、アリール又はアシルであり、R2はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、及びR3はH、アルキル、アルケニル、又はアリールであり、R4はH、ハロゲン原子、アルケニル、カルボキシル、又はO、S、又はNを含有するアルキルであり、及びmは0、1、又は2である；及び
(h) これら化合物(a)-(g)の、任意の酸化形態にあるもの。本発明の一態様においては、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27及びS36からなる群から選択される。好ましくは、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体はS36である。本発明は、また対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症；心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈；心室細動を含む心室不整脈；及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療又は予防するための方法における、これら1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法をも提供する。
【０２７５】
本発明は、またRyR2とFKBP12.6との結合を増強する、他の生物学的に活性な小分子を、正規に又は高い処理量でスクリーニングするための、新規なアッセイをも提供する。特に、本発明は、RyR2とFKBP12.6との結合を増強する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、(a) RyR2の源を得、あるいはこれを生成する工程；(b) 候補薬剤の存在下で、該RyR2をFKBP12.6に暴露する工程；及び(c) 該薬剤が、RyR2とFKBP12.6との結合を増強するか否かを決定する工程を含む。一態様において、該RyR2は、PKA-ホスホリル化されている。他の態様では、該RyR2は、PKA-過ホスホリル化されている。更に別の態様では、該RyR2は、ホスホリル化されていない。
本発明の方法において、該RyR2は、固相、例えばプレート又はビーズ等の固相に固定化される。RyR2-FKBP12.6結合の検出を容易にするために、該FKBP12.6を放射線標識(例えば、32Sを用いて)することができる。更に、増強されたRyR2とFKBP12.6との結合は、FKBP12.6-結合剤を用いて検出することができる。一態様において、該FKBP12.6-結合剤は、抗-FKBP12.6抗体である。本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、並びに対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法；対象における心不全、心房細動又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法；及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における、この薬剤の使用法をも提供する。
【０２７６】
更に、本発明は、RyR2とFKBP12.6との結合を増強する薬剤を同定する方法をも提供し、この方法は、(a) FKBP12.6の源を得、あるいはこれを生成する工程；(b) 候補薬剤の存在下で、該FKBP12.6をRyR2に暴露する工程；及び(c) 該薬剤が、RyR2とFKBP12.6との結合を増強するか否かを決定する工程を含む。一態様において、該RyR2は、PKA-ホスホリル化されている。他の態様では、該RyR2は、PKA-過ホスホリル化されている。更に別の態様では、該RyR2は、ホスホリル化されていない。
本発明の方法において、該FKBP12.6は、固相、例えばプレート又はビーズ等の固相に固定化される。RyR2-FKBP12.6結合の検出を容易にするために、該RyR2を放射線標識(例えば、32Pを用いて)することができる。更に、増強されたRyR2とFKBP12.6との結合は、RyR2-結合剤を用いて検出することができる。一態様において、該RyR2-結合剤は、抗-RyR2抗体である。本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、並びに対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法；対象における心不全、心房細動又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法；及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における、この薬剤の使用法をも提供する。
【０２７７】
例として、また以下の実施例12に示すように、小分子を高処理率にてスクリーニングするための、高効率のアッセイを、標準的な手順を用いて、グルタチオンで被覆した96-ウエルプレート上に、FKBP12.6(例えば、野生型のFKBP12.6又は融合タンパク質、例えばGST-FKBP12.6)を固定化することによって、開発することができた。PKA-ホスホリル化リアノジンレセプタタイプ2(RyR2)を、該FKBP12.6-被覆プレート上に載せ、かつ様々な濃度(10〜100nM)にて、JTV-519類似体及び他の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体と共に30分間インキュベートすることができる。その後、該プレートを洗浄して、未結合のRyR2を除去し、次に抗-RyR2抗体と共にインキュベートする(例えば、30分間)。該プレートを、再度洗浄して、未結合の抗-RyR2抗体を除去し、次に蛍光標識した第二の抗体で処理することができる。該プレートを、結合活性について、自動蛍光プレートリーダによって、読み取ることができる。
あるいはまた、RyR2は、32P-ATPの存在下において、PKA-ホスホリル化することができる。放射性PKA-ホスホリル化RyR2を、様々な濃度(10〜100nM)にて、JTV-519類似体及び他の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の存在下で、該FKBP12.6-被覆96-ウエルプレート上に、30分間適用することができる。該プレートを洗浄して、未結合の放射性RyR2を除去し、次いで自動プレートリーダによって、読み取ることができる。PKA-ホスホリル化RyR2は、また該プレートに塗布し、かつ該類似体及び誘導体の存在下で、32S-標識FKBP12.6と共にインキュベートすることができる。
【実施例】
【０２７８】
本発明を、以下の実施例において説明する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために提示されたものであり、上記の特許請求の範囲に規定された如き、本発明の範囲を何ら限定するためのものであると、理解すべきではない。
実施例1：FKBP12.6-枯渇マウス
FKBP12.6-枯渇マウスを、以前に記載されたように(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)して、発生させた。簡単に説明すれば、ヒトFK506結合タンパク12.6(FKBP12.6)の、ネズミオーソロガス遺伝子に関するマウスゲノムλ-ファージクローンを、完全な長さのネズミcDNAプローブを用いて、DBA/1lacJライブラリーから単離した。3.5kbのネズミゲノムDNAと、PGK-ネオ選択性マーカーで置換することにより、ターゲットベクタを、ネズミFKBP12.6に関する全コード配列を含む、エキソン3及び4を欠失するように設計した(Bennett等, ネズミFK506結合タンパク(FKBP) 12.6遺伝子の同定及び特徴付け; Mamm. Genome, 1998, 9:1069-71)。5.0-kbの5'フラグメント及び1.9-kbの3'フラグメントを、PGK-ネオ及びPGK-TKカセットを持つ骨格ベクタにクローニングした。該DBA/lacJ胚性幹(ES)細胞を、確立されたプロトコールを利用して、成長させ、かつトランスフェクションした。ターゲットES細胞を、まずサザン分析によりスクリーニングし、5つの正のES細胞系を、PCRにより解析して、相同的組換えを確認した。雄性キメラを、雌性DBA/1lacJと交配させ、生殖系列の子孫を、褐色コートカラーによって同定した。生殖系列の子孫を、5'サザン分析を利用して、遺伝子型決定(genotyped)を行った。正のFKBP12.6+/-の雄及び雌を、異種交配させたところ、子孫は、約25％の頻度にて、FKBP12.6-/-マウスを生成した。FKBP12.6-/-マウスは、繁殖力を持つものであった。
【０２７９】
全ての研究は、年齢-及び性別-の一致するFKBP12.6+/+マウスをコントロールとして使用し、FKBP12.6-/-マウスについて行った。以下の素性：DBA/C57BL6交配種、純粋なDBA及び純粋なC57BL6から生育させた、FKBP12.6-/-マウス間には、何ら差が観測されなかった。
実施例2：マウスにおけるテレメトリーによる記録及び運動テスト
FKBP12.6+/+マウス及びFKBP12.6-/-マウスを、インスティチューショナルアニマルケア＆ユースコミッティーオブコロンビアユニバーシティー(Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University)によって承認されたプロトコールに従って飼育し、かつ研究した。マウスを、2.5％イソフルラン吸入麻酔法により麻酔した。歩行可能動物のECGラジオテレメトリーによる記録は、腹腔内移植後、>7日で得られた(Data Sciences International, MN、セントポール)(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)。ストレステストのために、マウスを、疲労するまで、傾斜のある足踏み車上を運動させ、次いでエピネフリン(0.5〜2.0mg/kg)を腹腔内注射した(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)。歩行可能動物の静止期心拍数を、4時間に渡り追跡して平均値を得た。
【０２８０】
実施例3：野生型及びRyR2-S2809D変異体の発現
RyR2(RyR2-S2809D)上のPKAターゲットサイトの突然変異誘発は、以前に記載されたように(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)行った。HEK293細胞を、20μgのRyR2野生型(WT)又は変異型cDNA及び5μgのFKBP12.6 cDNAにより、Ca2+-燐酸沈殿法を用いて、同時トランスフェクションした。RyR2チャンネルを含む小胞を、以前に記載された(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)ようにして調製した。
実施例4：RyR2のPKA-ホスホリル化及びFKBP12.6の結合
心臓SR膜を、以前に記載(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76; Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca(2+)-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 1996, 78:990-97)されたようにして製造した。35S-標識したFKBP12.6を、プロメガ(Promega)社(WL、マディソン)から入手した、TNTTMクイックカップルド転写/翻訳装置を用いて発生させた。[3H]リアノジンレセプタを使用して、RyR2レベルを定量した。100μgのミクロソームを、100μlの10-mMイミダゾールバッファーで希釈し、250-nM(最終濃度)の[35S]-FKBP12.6と共に37℃にて60分間インキュベートし、次いで00μlの氷冷したイミダゾールバッファーで急冷した。サンプルを、100,000gにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファーで3回洗浄した。結合した[35S]-FKBP12.6の量を、ペレットの液体シンチレーションカウンタで測定した。
【０２８１】
実施例5：免疫ブロット
ミクロソーム(50μg)の免疫ブロット分析を、抗-FKBP12.6(1:1,000)、抗-RyR5029(1:3,000)(Jayaraman等, カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と関連した、FK506結合タンパク質; J. Boil. Chem., 1992, 267:9474-77)又は抗-ホスホRyR2-P2809(1:5,000)を用いて、室温にて1時間行った(Reiken等, β-遮断剤は、ヒト心不全症における、カルシウム放出チャンネル機能を回復させ、かつ心筋の性能を改善する; Circulation, 2003, 107:2459-66)。このP2809-ホスホエピトープ-特異的抗-RyR2抗体は、アフィニティー-精製されたポリクローナルウサギ抗体である。これは、Ser2809において、PKA-ホスホリル化されたRyR2に相当する、ペプチドCRTRRI-(pS)-QTSQを用いて、ジムドラボラトリーズ(Zymed Laboratories)(CA、サンフランシスコ)により、オーダーメイドされたものであった。HRP-標識した抗-ウサギIgG(1:5,000希釈；トランスダクションラボラトリーズ(Transduction Laboratories, KY、レキシントン)と共にインキュベートした後、ブロットを、ECL(アマーシャムファルマーシア(Amersham Pharmacia, NJ、ピスカタウエイ)を用いて発現させた。これらの抗体は、また以下の比率：1:4,000(抗-ウサギIgG)；及び1:5,000(抗-RyR2-5029及び抗-FKBP12.6)にて使用することもできる。
【０２８２】
実施例6：単一チャンネル記録
ゲッシ目(マウス又はラット)の心臓由来の本来のRyR2、及び組換えRyR2の単一チャンネル記録は、以前に記載された(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)ようにして、0mVにて、電位-固定条件下で得た。チャンネル記録に使用した対称溶液(symmetric solutions)は、以下の通りであった：トランス区画：HEPES, 250mM/L; Ba(OH)2, 53mM/L(幾つかの実験では、Ba(OH)2をCa(OH)2で置換えた)；pH 7.35；及びシス区画：HEPES, 250mM/L; Tris-塩基、125mM/L; EGTA, 1.0mM/L；及びCaCl2, 0.5mM/L; pH 7.35。特に述べない限り、単一チャンネル記録は、シス区画において、150-nMの[Ca2+]及び1.0mMの[Mg2+]の存在下で行った。リアノジン(5mM)を、このシス区画に適用して、全チャンネルの同一性を確認した。データは、フェッチャン(Fetchan)ソフトウエア(アキソンインスツルメンツ(Axon Instruments), CA、ユニオンシティー)を用いて、デジタル化した電流の読みから解析した。全てのデータは、平均±SEとして表示する。アンペアードスチューデントt-テストを、実験同士の平均値の統計的な比較のために使用した。p<0.05なる値を、統計的に有意なものとした。
【０２８３】
RyR2チャンネルに及ぼすJTV-519の効果は、図1-3及び(以下の)表1に示す。図3において明らかな如く、単一チャンネル研究は、特異的なPKA阻害剤、PKI5-24(C)の存在下における、PKA-ホスホリル化と比較して、PKA-ホスホリル化(D)に伴って、RyR2の高い開放確率を示した。単一チャンネル機能は、JTV-519の存在下で、FKBP12.6と共にインキュベートした、PKA-ホスホリル化RyR2においては、正常化された(E)。最大反応ヒストグラム(右)は、PKA-ホスホリル化RyR2における高い活性と準導電性の開放を示したが、JTV-519及びFKBP12.6で処理した後には、これらを示すことはなかった。図3Fは、PKA-ホスホリル化RyR2と、JTV-519の存在下における、PKA-ホスホリル化RyR2とFKBP12.6とのインキュベションは、RyR2活性化のCa2+-依存性を、右方向にずらすが、これにより、ホスホリル化されていないチャンネルのCa2+-依存性と同様になる。
【０２８４】
【表１】
2007530561.tif 000097
JTV-519で処理したFKBP12.6+/-マウス(n=8)又はコントロール(n=6)、及びJTV-519で処理したFKBP12.6-/-マウス(n=5)における歩行性ECGデータのまとめ。SCL=洞サイクル長(sinus cycle length); HR=心拍数 ms=ミリ秒; bpm=拍動/分; FKBP12.6-/-= FKBP12.6異種接合マウス; FKBP12.6-/-= FKBP12.6枯渇マウス。
【０２８５】
実施例7：心不全のマウスモデル
25匹のスプラーク-ダウレイ(300-400g)マウスを、開胸術によって、左冠動脈結サツを行い、以前に記載されたように心筋梗塞を発生させた(Alvarez等, 後期の後-心筋梗塞は、ラットの心筋細胞にテトラドトキシン-耐性Na+流を誘発する; J. Mol. Cell Cardiol., 2000, 32:1169-79)。簡単に説明すると、ラットを、150mg/kgの腹腔内ケタミン及び15mg/kgのクロルプロマジンとの混合物で麻酔した。換気アシストデバイス及び気管内チューブで呼吸を維持(3ml空気/60ストローク/分)した。中央-左部開胸及び心膜開放後、左主冠動脈を、左側心耳下部の最も遠位部分において、7-0シルク縫合糸で閉じた。擬似手術を施したラット(n=5)を、同様に処置したが、冠動脈の結サツはしなかった。
心筋梗塞の6週後に、心エコー法を用いて、心不全が確認された。JTV-519又は賦形剤(DMSO)を、移植可能な浸透圧輸注ポンプ(アルゼ(Alzet)ミニ-浸透圧ポンプ；デュレクト(Durect)社、CA、クパーチノ)によって、連続的に輸注(0.5mg/kg/h)した。連続処置の4週間後に、心エコー法及び血行動態測定を実施した。動物を殺し、その組織サンプルを採取した。
【０２８６】
上記技術によって、心不全を、左前部の下行冠動脈の結サツにより、ラット内に誘発させた。これは、心筋梗塞をもたらし、これは、4週間以内に、低下した心臓機能を持つ拡張型心筋症を発症した。各々25匹を含む、3群の動物を研究した：擬似手術を施した動物群(コントロール)、心不全+治療(JTV-519)群、及び治療(賦形剤)を施してない心不全症の動物群。4週間に渡りJTV-519で処置すると、心エコー法により測定された如く(図4)、拡張期及び収縮期の機能不全が有意に低下した。このように、JTV-519による治療は、心臓機能を有意に改善し、また虚血-誘発性心不全のラットモデルにおいて、心不全の進行を低減した。
構成性のPKA-ホスホリル化RyR2チャンネルを模倣する、変異RyR2-S2809Dチャンネルを用いて、JTV-519が、該RyR2チャンネルに対するFKBP12.6のアフィニティーを増すことが明らかになった(図5)。より具体的には、JTV-519による処理が、該変異チャンネルに対するFKBP12.6の結合能を高め、結果としてJTV-519が心不全を防止するメカニズムが明らかになった。JTV-519による処理は、また機能不全の心臓のRyR2チャンネルにおける漏れをも防止した(図6)。更に、JTV-519は、PKA-ホスホリル化RyR2及び、用量-依存性様式で、構成性のPKA-ホスホリル化RyR2を模倣する、該変異RyR2-S2809D両者に対する、FKBP12.6の結合性を回復した(図7)。
【０２８７】
実施例8：心房細動のイヌモデル
a) 動物プロトコール
ペースメーカーを、24-26kgの雌の雑種成犬に、以前に記載された技術に従って、移植した(Dun等, 慢性心房細動は、外向きの流れを更に減じることはない。該心房細動は、該流れを増大させる; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2003, 285:H1378-84)。動物を、チオペンタールナトリウム(17mg/kg、i.v.経路)で麻酔し、イソフルラン(1.5-2％)及びO2(2 L/分)で換気した。活性な固定用リードを、皮下にトンネルを設けて、右の心耳及び右心房自由壁に移植し、夫々アイトレル(Itrel)パルス発生装置及びテラ(Thera) 8962ペースメーカー(メドトロニクス(Medtronics), MN, ミネアポリス)と接続した。40％のホルムアルデヒド(0.1-0.3ml)を、ヒス束に注入し、完全なAV遮断を達成した。心室ペースメーカーを、60bpmなる速度にプログラムし、ペーシングプロトコール中ずっとこの速度に維持した。回収した後、心房ペーシングを、600-900bpmなる速度に設定し、46±3日間又は該動物が慢性AF(連続ペーシングのない場合には、AFを>5日として定義した)となるまで維持した。
次いで、これら動物を、ペントバルビタール(30mg/kg)で麻酔し、その心臓を取出した。心房細胞を切取り、即座に液体窒素中でフラッシュ-冷凍し、-80℃にて保存した。
【０２８８】
b) 心臓の収穫
本研究において提示するヒトに関するデータは、インスティチューショナルレビューボードオブザニューヨークプレスバイタリアンホスピタル(Institutional Review Board of the New York Presbyterian Hospital)により承認されたプロトコールの下で、同所性心臓移植に伴う、末期段階の心不全状況下での心房細動に罹っている患者由来の5つのヒトの心臓から得た。更に、データは同様に、移植には適さない3つの正常な心臓から得た。移植の時点において、心臓は、外移植において、低温(4℃)にて、低カルシウム、高カリウム心停止溶液中に保存した。
【０２８９】
c) RyR2の免疫沈澱及び逆ホスホリル化
前に記載されたようにして(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)から、FKBP12.6を解離する：機能不全状態にある心臓の不完全な調節; Cell, 2000, 101:365-376)、左心房(LA)組織から調製した心臓膜(100μg)を、0.5mlのRIPAバッファー(50mMのTris-HCl [pH 7.4]、0.9%のNaCl、0.25%のトライトン(Triton) 100x、5mMのNaF及びプロテアーゼ阻害剤)中に懸濁し、次いでウサギ抗-RyR2抗体と共に4℃にて一夜インキュベートした。プロテインAセファロースビーズを添加し、4℃にて1時間インキュベートした。ビーズを、引続き1xキナーゼバッファー(50mMのTris-HCl、50mMのピペラジン-N,N'-ビス[2-エタンスルホン酸]、8mMのMgCl、及び10mMのEGTA [pH 6.8])で洗浄し、次いで再度1.5xキナーゼバッファー中に懸濁させた。この反応は、PKA(5単位)、100μMのMgATP、及び[γ32P]ATP (NENライフサイエンス(NEN Life Science), ボストン)で開始させ、室温にて8分間インキュベートし、次に5μlの6x重点バッファー(4％のSDS及び0.25MのDTT)で停止させた。サンプルを95℃に加熱し、次いで6%SDS-PAGE上で、サイズ-分画した。RyR2の放射能を、モレキュラーダイナミックホスホイメージャー(Molecular Dynamics Phosphoimager)、及びイメージクワント(Imagequant)ソフトウエア(アマーシャムファルマーシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech), NJ、ピスカタウエイ)を用いて定量化した。これらの値を、免疫沈降したRyR2(免疫ブロット法及びデンシトメトリーによって測定した)の量で割り、[γ32P]ATPシグナルの逆数として表した。
【０２９０】
d) カルスタビン2(FKBP12.6)のJTV-519との再結合
RyR2を心房性SR(100μg)から免疫沈降させ、また上記のように1xキナーゼバッファーで洗浄した。この免疫沈降させたRyR2を、PKA(5単位)及び100μMのMgATPで、室温にてホスホリル化したが、この反応は、8分後に、氷冷したRIPAバッファーで洗浄することによって停止させた。組換えカルスタビン2(FKBP12.6; 200nM)を、引続き室温にて、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、JTV-519(1μM)の存在下又は不在下で、該ホスホリル化したRyR2と共にインキュベートした。この反応系をRIPAバッファーで洗浄した後、タンパクを15％SDS PAGEによりサイズ-分画し、カルスタビン2(FKBP12.6)につき免疫ブロット分析した。
以下にまとめた結果は、実施例8の実験に従って得たものである。
心房RyR2の調節
心房RyR2を、上記の技術に従って、PKA-ホスホリル化した(図8A)。心房RyR2のPKA-ホスホリル化は、同時免疫沈降(図8C)により測定したように、該RyR2巨大分子複合体中の、カルスタビン2(FKBP12.6)の量を減らした。該心房RyR2巨大分子複合体は、以前に心室性RyR2について報告された(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 2000, 101:365-76)ように、カルスタビン2(FKBP12.6)、PKAの触媒サブユニット、PKA調節サブユニット(RII)、PP2A、PP1、及びmAKAP(図8B)を含んでいた。
【０２９１】
心房細動におけるリアノジンレセプタのPKA-過ホスホリル化
免疫沈降させたRyR2のPKA-ホスホリル化は、持続性のある心房細動(AF)を患うイヌ由来の心房細胞中で、コントロール(AFについてn=6、コントロールについてn=6、P<0.001；図9A)と比較して、130％増加した。RyR2と結合したカルスタビン2(FKBP12.6)は、持続性AFを患うイヌ由来の心房細胞中で、コントロール(AFについてn=7、コントロールについてn=6、P<0.0005；図9A)に対して、72％減少した。
同様に、免疫沈降させたRyR2のPKA-ホスホリル化は、心不全発症中の慢性的心房細動に罹っているヒト由来の心房細胞において、コントロール(AFについてn=5、コントロールについてn=3、P<0.002；図9B)と比較して、112％増加した。RyR2と結合したカルスタビン2(FKBP12.6)は、70％減少した(AFについてn=5、コントロールについてn=3、P<0.0001；図9B)。
逆-ホスホリル化及び同時免疫沈降実験の全てに対して、適用したRyR2の全量は、免疫沈降させたRyR2の抗-RyR2-5029抗体を用いて、並行して行った免疫ブロット分析により確認した(図9A及び9B)。
【０２９２】
心臓リアノジンレセプタチャンネル機能
AFに罹っているイヌにおいて観測された、RyR2のPKA-過ホスホリル化の生理的な意味を決定するために、RyR2単一チャンネル測定を、電位固定条件下で、即ち0mVにて、対称的イオン条件を用いて、平坦な脂質二重層中で行った。心房RyR2単一チャンネル特性を、5匹のAFに罹っているイヌ由来の17チャンネル及び5匹のコントロールのイヌ由来の11チャンネルにおいて検討した。コントロールのイヌの何れも高い活性を示さなかったが、AFに罹っているイヌ由来の17チャンネル中の15チャンネル(88％)が、有意に高い開放確率(Po; AF: 0.412±0.07；コントロール：0.008±0.002；P<0.001)及びゲート開閉頻度(Fo; AF: 21.9±4.6；コントロール：1.6±0.6s-1; P<0.002(図10A及び10B)示した。
【０２９３】
JTV-519の存在下におけるカルスタビン2(FKBP12.6)の再結合
JTV-519(1mM)による処置は、正常なイヌの心筋から単離した、PKA-ホスホリル化RyR2に対する、組換えカルスタビン2(FKBP12.6)の結合を可能とする。JTV-519が存在しない場合には、カルスタビン2(FKBP12.6)は、これら実験において、PKA-ホスホリル化RyR2と結合することはできなかった(図11B)。
JTV-519の存在下での、FKBP12.6の再結合の生理的な意味は、平坦な脂質二重層における、RyR2単一チャンネル測定によって明らかとなった。組換えカルスタビン2(FKBP12.6)単独の存在下で、単離されたチャンネルは、高い開放確率(Po)を持ち、また準導電性状態の存在等のかなり異常な挙動を示すことが明らかになった。チャンネル機能におけるこれらの異常性は、特定のPKA阻害剤(PKI)を添加した場合には観測されず、このことは、該チャンネル機能における観測された異常性が、PKAによるRyR2のホスホリル化に特異的なものであることを示している。PKA-ホスホリル化したチャンネルを、組換えカルスタビン2(FKBP12.6)の存在下で、JTV-519で処置した場合には、単一チャンネル測定は、PKIの存在下で観測される結果と同様であった(図11A)。
【０２９４】
実施例9：1,4-ベンゾチアゼピン中間体及びJTV-519
インビボ実験のために、本発明者等は、1g量のJTV-519を必要とした。しかし、報告された1,4-ベンゾチアゼピン中間体、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(以下の反応式1における化合物6)を介して、この化合物を製造しようとした最初の試みは、成功しなかった。この中間体のチオ基は、空気で容易に酸化されて、ジスルフィド化合物となり、これは環化生成物(5)の合成を不可能にする。この問題を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき、かつ高価でない2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸(1)から出発する新規な方法を開発した。この方法を、以下の反応式1に示す。
H2を用い、また触媒としてPd/Cを使用した、この化合物(1)のニトロ基の還元は、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸(2)を、定量的な収率で与えた。この化合物(2)を、NaNO2でジアゾ化し、次いでNa2S2で処理して、80％の収率で、安定なジスルフィド化合物(3)を生成した。更に精製することなしに、該安定なジスルフィド(3)を、SOCl2で処理し、次いでEt3Nの存在下で、2-クロロエチルアミンと反応させ、90％の収率でアミド(4)を得た。この化合物(4)を、THF中で、トリメチルホスフィン及びEt3Nと共に還流することにより、1-ポット法によって、環化された化合物(5)に添加した。この環化されたアミド(5)を、次にLiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(6)を生成した。
反応式1：
【０２９５】
【化９５】
2007530561.tif 000098
【０２９６】
該化合物(6)と3-ブロモプロピオン酸クロリドとを反応させ、次いで得られた生成物を4-ベンジルピペリジンと反応させることにより、JTV-519を製造した。JTV-519の構造は、1H NMRにより確認した。
実施例10：放射性-標識したJTV-519の合成
本発明者等の放射性-標識したJTV-519の新規な合成法を、以下の反応式2に示す。放射性-標識したJTV-519を合成するために、JTV-519を、BBr3を用いて、そのフェニル環において脱メチル化して、フェノール化合物(21)を得た。このフェノール化合物(21)を、塩基(NaH)の存在下で、放射性標識したメチル化剤(3H-ジメチル硫酸)により、再度メチル化して、3H-標識したJTV-519を製造した(反応式2)。
反応式2：
【０２９７】
【化９６】
2007530561.tif 000099
【０２９８】
実施例11：新規1,4-ベンゾチアゼピン誘導体及びその合成方法
本発明者等は、また心不整脈を治療し及び予防するのに使用する、新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体をも開発した。特に、本発明者等は、以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した：
【０２９９】
【化９７】
2007530561.tif 000100
【０３００】
ここで、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである。この一般的な構造を持つ新規化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンとアルキルスルホニルクロリド又はアリールスルホニルクロリドとを、Et3N等の塩基の存在下で、反応させることにより製造した。追加の反応(例えば、4-ベンジルピペラジンの付加)を行って、所望通りに側鎖を伸張することができる。この一般的な方法の代表的な合成を、以下の反応式3に示す。
反応式3から明らかなように、2-クロロエタンスルホニルクロリド(180mg; 1.1mM)及びEt3N(140mg; 1.1mM)を、0℃にて、CH2Cl2(20ml)中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)(194mg; 1mM)に添加した。この混合物を0℃にて2時間攪拌し、H2O及び飽和NaHCO3溶液で洗浄した。該溶媒を除去して、粗生成物(Ia)を得、これをシリカゲル上でのクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル=3:1)により精製した。この合成の収量は280mg、又は95％であった。その構造をNMRにより確認した。
反応式3は、更に化合物(Ia)の側鎖が、この化合物(Ia)(28mg; 0.1mM)とCH2Cl2中の4-ベンジルピペリジン(21mg; 0.13mM)と反応させることにより、伸張されることを示した。該反応が完了した(TLCにより確認)後、過剰量のアミンを塩基掃去剤(3-(2-無水琥珀酸)プロピル官能化したシリカゲル、0.5g)で除去した。1H NMR及びHPLC分析は、生成物(Ib)の純度が、>98％であることを示した。
【０３０１】
【化９８】
2007530561.tif 000101
【０３０２】
反応式3
更に、本発明者等は、以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した：
【０３０３】
【化９９】
2007530561.tif 000102
【０３０４】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルである。この一般的な構造を持つ化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)とスルフリルクロリドとを、塩基(Et3N)の存在下で反応させ、次いで第一又は第二アミンと反応させることにより、製造した。この一般的な方法の代表的な合成例を、以下の反応式4に示す。
反応式4から明らかなように、スルフリルクロリド(15.0mg; 0.111mM)及びEt3N(28.0mg; 0.22mM)を、CH2Cl2(20ml)中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1) (19.4mg; 0.1mM)に、0℃にて添加した。この混合物を0℃にて2時間攪拌した後、1-ピペロニルピペラジン(27mg; 0.12mM)を、添加した。この混合物を、更に2時間攪拌し、次いでH2O及び飽和NaHCO3溶液で洗浄した。過剰量のアミンを、塩基掃去剤(3-(2-無水琥珀酸)プロピル官能化したシリカゲル、0.2g)の添加により除去した。この合成の収量は36mg、又は77％であった。
【０３０５】
【化１００】
2007530561.tif 000103
【０３０６】
反応式4
本発明者等は、また以下の一般的な構造を持つ化合物をも製造した：
【０３０７】
【化１０１】
2007530561.tif 000104
【０３０８】
ここで、R''はCO(CH2)nXR3'2、SO2(CH2)nXR3'2、又はSO2NH(CH2)nXR3'2であり、XはN又はSであり、またnは1、2、又は3である。この一般的な構造を持つ化合物は、JTV-519あるいは上記の新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の一つを、過酸化水素で酸化することにより製造した。この一般的な方法の代表的な合成例を、以下の反応式5に示す。
反応式5が示すように、MeOH(5ml)中の化合物(Ib)(21mg; 0.05mM)を、H2O2(0.1ml、過剰量)に添加した。この混合物を2日間攪拌し、得られた生成物IIIを、シリカゲル上でのクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=10:1)によって精製した。この合成の収量は19mg、又は91％であった。
【０３０９】
【化１０２】
2007530561.tif 000105
【０３１０】
反応式5
最後に、本発明者等は、また以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した：
【０３１１】
【化１０３】
2007530561.tif 000106
【０３１２】
ここで、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、及びnは0、1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、またXはNH又はOである。この一般的な構造を持つ化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)とトリホスゲンとを、塩基(Et3N)の存在下で反応させ、次いで第一又は第二アミンを添加することにより、製造した。この一般的な方法の代表的な合成例を、以下の反応式6に示す。
【０３１３】
【化１０４】
2007530561.tif 000107
【０３１４】
反応式6
実施例12：高い処理量でスクリーニングするためのアッセイ
本発明者等は、生物学的に活性な小分子をスクリーニングするためのアッセイを開発した。これらアッセイは、RyRへのFKBP12.6タンパクの再結合に基いている。
小分子を、高い処理量でスクリーニングするための、高効率のアッセイは、グルタチオンで被覆した96-ウエルプレートに、FKBP12.6(GST-融合タンパク)を固定化することにより開発することができる。PKA-ホスホリル化リアノジンレセプタタイプ2(RyR2)を、該FKBP12.6-被覆プレート上に装入し、様々な濃度(10-100nM)にて、JTV-519類似体と共に、30分間インキュベートする。その後、該プレートを洗浄して、未結合のRyR2を除去し、次に抗-RyR2抗体と共に30分間インキュベートする。該プレートを再度洗浄して、未結合の抗-RyR2抗体を除去し、次に蛍光-標識した第二の抗体で処理する。このプレートを、結合活性に関する、自動的蛍光プレートリーダーにより読取る。
もう一つのアッセイにおいて、RyR2は、32P-ATPの存在下で、PKA-ホスホリル化する。放射性PKA-ホスホリル化RyR2を、様々な濃度(10-100nM)にて、JTV-519類似体の存在下で、30分間、FKBP12.6-被覆96-ウエルプレート上に投入する。該プレートを洗浄して、未結合の放射性標識したRyR2を除去し、次いで自動プレートリーダーにより読取る。
【０３１５】
実施例13：新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、FKBP12.6のRyR2に対する再結合を可能とする：
心臓筋小胞体(SR)を、室温にて、30分間、PKAでホスホリル化し、RyR2複合体からの、FKBP12.6の完全に解離させた。このSR(50mg)を、次に室温にて30分間、250nMのFKBP12.6及びテスト化合物と共にインキュベートした。サンプルを、100,000gにて10分間遠心分離処理し、得られたペレットを、10mMイミダゾールバッファーで3回洗浄した。洗浄後、タンパクを15％PAGEにより分離した。免疫ブロットを、抗-FKBP抗体を用いて発現させた。この研究の結果を、図12に示す。
実施例14：テレメトリー記録及びマウスにおける運動/EKGテスト
研究は、FKBP12.6+/-マウス(介入群)、年齢及び性別の一致するFKBP12.6-/-マウス(正のコントロール)、及びFKBP12.6+/+マウス(負のコントロール)について行った。FKBP12.6タンパクがないこと(FKBP12.6-/-)又はこれが低いこと(FKBP12.6+/-)は、心臓組織における免疫ブロット法によって明らかにされた。
【０３１６】
JTV-519(血漿のターゲット濃度1.0μMにおいて)、又はその誘導体、S36(血漿のターゲット濃度1.0μM又は0.02μM)の、FKBP12.6+/-又はFKBP12.6-/-マウスへの連続的薬物皮下輸注は、ミニ-浸透圧ポンプによって、1.0μl/hなる流量で、運動テスト前の7日間に渡り行った(アルゼットデュレクト社(Alzet Durect Co.), CA、クパーチノ)。マウスを、ケタミン(50μg/kg)及びキシラジン(10μg/kg)を腹腔内注射することにより麻酔し、放射性EKG伝達物質を移植した。歩行性動物のECG放射性テレメトリー記録を、該腹腔内移植後1週間に渡り得た(データサイエンスズインターナショナル(Data Sciences International), MN, セントポール)。標準的な基準を、ECGパラメータを測定するために使用した。
ストレステストのために、マウスを傾斜した足踏み車上で、段階的に、疲労するまで運動させ、次いで最大交感神経刺激を与えるために、エピネフリン(0.2mg/kg)を腹腔内注射した。次いで、歩行性動物の静止期の心拍数を4時間に渡り追跡して平均した。運動テスト後の回復、及び運動後の事象の追跡を、一夜に渡り行った。洞サイクル長(SCL)、及びPR、QRS、及びQT間隔を、測定し、速度-補正したQT間隔(QTc)をミッチェル(Mitchell)の式を用いて算出した。血漿の薬物レベルは、HPLCにより確認した。結果を図13にまとめた。
【０３１７】
実施例15：JTV-519は、心不全のラットモデルにおける心臓の収縮性を改善する
ラットを、左冠動脈の結サツにより、心筋梗塞(MI)に罹らせた。移植可能な浸透圧ポンプ(アルゼットデュレクト社、CA、クパーチノ)を用いた、JTV-519(n=x)又は賦形剤(n=x)による処理は、MI語に直接開始した。心筋の収縮期(Ds)及び拡張期(Dd)の径は、心エコー法を用いて、MIの24時間及び6週間後に、中央-乳頭部で測定し、次いで径短縮率を算出した。図14に示したように、JTV-519による処理は、心不全を患うラットにおける心臓機能を有意に改善した。
以上、本発明を、その明確化及び理解のために、幾分詳細に説明してきたが、当業者は、その開示から、形態及び細部における様々な変更が、添付した特許請求の範囲における本発明の真の範囲を逸脱することなしに、なしえることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３１８】
【図１】図1は、JTV-519が、FKBP12.6+/-マウスにおける運動-誘発性心室不整脈を予防することを立証している。(A) 未処置のFKBP12.6+/-マウス、JTV-519で処置したFKBP12.6+/-マウス、及びJTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウスの代表的な歩行心電図。心拍数、又は測定されたECGパラメータには有意な差は存在しなかった。(B) 上部の記録：運動テストに掛けられ、かつ1.0mg/kgのエピネフリンが注射された、未処置のFKBP12.6+/-マウスについて記録された持続型多形型心室頻拍症の例。中間部の記録：同一のプロトコールに従って、JTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウスの心電図；不整脈は観測されなかった。下部の記録：JTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウスにおける、運動-誘発性心室頻拍症(VT)。点線は、図には示されていない16.31秒間のVTを表す。「P」はP-波を示し、これは心室頻拍に伴う洞調律の徴候である。(C) 夫々JTV-519で処置した、又は処置されていない、FKBP12.6+/-及びFKBP12.6-/-マウスにおける心臓突然死(左)、持続性心室頻拍(>10拍動、中央部)、及び非-持続性心室頻拍(3-10回の異常な拍動、右)の定量結果を示す棒グラフである。JTV-519による処置は、未処置のFKBP12.6+/-マウス(n=10)又はJTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウス(n=5)と比較して、JTV-519で処置したFKBP12.6+/-マウス(n=9)における運動-及びエピネフリン-誘発性不整脈を完全に防止した点に注目すべきである。このことは、JTV-519が、FKBP12.6のRyR2への再結合によって、FKBP12.6+/-マウスにおける不整脈及び突然死を防止することを示唆している。
【０３１９】
【図２】図2は、FKBP12.6+/-マウスにおいて、JTV-519が、RyR2に対するFKBP12.6のアフィニティーを高めることによって、運動-誘発性心臓突然死を防止することを示す。(A-B) 心臓リアノジンレセプタ(RyR2)は、RyR2-5029抗体を用いて免疫沈降させた。図示されているのは、夫々静止状態、及び運動後の、JTV-519の存在下又は不在下の、野生型(FKBP12.6+/+)マウス、FKBP12.6+/-マウス、及びFKBP12.6-/-マウスにおける、定量化した量のRyR2、PKA-ホスホリル化RyR2(RyR2-pSer2809抗体)、及びFKBP12.6を表す免疫ブロット分析(A)及び棒グラフ(B)である。静止条件下では、約70％のFKBP12.6が、FKBP12.6+/-マウスにおけるRyR2と結合している。運動テスト後、RyR2複合体と結合しているFKBP12.6の量は、FKBP12.6+/-マウスでは大幅に減少するが、これはJTV-519で処置することにより救出できた。(C) RyR2単一チャンネルを、運動テスト後及びエピネフリン注射後に得た心臓から単離した。JTV-519で予備処理した、又はしてないFKBP12.6+/-マウス由来のチャンネル、及びJTV-519で予備処理した後のFKBP12.6-/-マウス由来のチャンネルが示されている。RyR2-チャンネル機能は、運動させ、JTV-519で処置したFKBP12.6+/-マウスにおいては正常化されたことに注目すべきである。JTV-519で処置した後の、運動させたFKBP12.6-/-マウス由来の代表的な単一チャンネルは、心臓において、JTV-519の作用のために、FKBP12.6が必要であることを示している。点線は、不完全なチャンネルの開放、又は「準導電性の」開放を表し、FKBP12.6-枯渇RyR2チャンネルの指標である。左側の記録は、5.0秒のデータを示し、一方右側のものは500ミリ秒のデータを表す。図において、Poは、開放確率を；Toは平均開放時間を；Tcは平均閉鎖時間を；及びcはチャンネルの閉鎖状態を表す。(D) 単一RyR2チャンネル(上記参照)の平均開放確率を示す概略的な棒グラフである。JTV-519は、拡張期のカルシウム濃度(150nM)において、運動テスト後のFKBP12.6+/-マウス由来のRyR2の開放確率を大幅に減じる。
【０３２０】
【図３】図3は、JTV-519が、PKA-ホスホリル化RyR2チャンネルに対するFKBP12.6の結合アフィニティーを高めることにより、RyR2-チャンネルゲートの開閉を正常化することを示している。(A,B) イヌ心臓SR膜(A)及び組換えにより発現させたRyR2チャンネル(B)は、以前に記載された(Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca2+-放出チャンネルに及ぼすラパマイシンの効果; Circ. Res., 1996, 78:990-97)ようにして調製した。(A) リアノジンレセプタ(RyR2)は、PKA阻害剤、PKI5-24の存在下又は不在下で、ホスホリル化バッファー(8mMのMgCl2、10mMのEGTA及び50mMのTris/PIPES；pH 6.8)中で、PKA触媒性サブユニット(40U; シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)、MO、セントルイス)でホスホリル化された。サンプルを100,000gにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファー(10mMのイミダゾール；pH 7)で3回洗浄した。組換えにより発現させたFKBP12.6(最終濃度=250nM)を、様々な濃度のJTV-519の存在下又は不在下で、これらサンプルに添加した。60分間のインキュベートの後、サンプルを100,000gにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファーで3回洗浄した。サンプルを95℃に加熱し、SDS-PAGEを用いてサイズ-分画した。該SRミクロソームの免疫ブロットを、以前に記載されたように(Jayaraman等, FK506結合タンパクは、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と結合した; J. Biol. Chem., 1992, 267:9474-77)、抗-FKBP12.6抗体(1:1,000)及び抗-RyR2-5029抗体(1:3,000)を用いて行った。本図は、JTV-519が、FKBP12.6を、(A) PKA-ホスホリル化RyR2(100nMにおいて部分的に結合；1000nMにおいて完全に結合)又は(B) 本質的にPKA-ホスホリル化RyR2チャンネルである、RyR2-S2809D変異チャンネルと結合させる。(C-E) 単一チャンネルの研究は、特異的なPKA阻害剤、PKI5-24の存在下でのPKA-ホスホリル化(C)と比較して、PKA-ホスホリル化後のRyR2の高い開放確率(D)を示している。単一チャンネル機能は、JTV-519の存在下で、FKBP12.6と共にインキュベートしたPKA-ホスホリル化RyR2において正常化された(E)。チャンネル開放は上部であり、ダッシュは完全開放(4pA)のレベルを示し、また「c」は閉じた状態を示す。チャンネルは、圧縮した(5秒、上方の記録)及び拡大した(500ミリ秒、下方の記録)時間尺度で示されており、また記録は0mVにおけるものである。振幅ヒストグラム(右)は、PKA-ホスホリル化RyR2の高い活性及び準導電性開放を明らかにするが、JTV-519及びFKBP12.6で処理した後には、見られなかった。(F) 細胞質[Ca2+]の関数としての、開放確率の正常化されたプロット。JTV-519の存在下で、PKA-ホスホリル化RyR2をFKBP12.6と共にインキュベートすると、Ca2+-依存性のRyR2の活性化を右側にシフトし、ホスホリル化されていないチャンネルのCa2+-依存性と同様になった。
【０３２１】
【図４】図4は、JTV-519が、心不全のラットモデルにおいて、心臓の収縮性を改善することを示す。(A) 心筋拡張期の断面積は、心エコー法を用いて、中央乳頭部において、JTV-519又は賦形剤(コントロール)による処理の4週間後又はその前に測定した。拡張期の機能不全における相対的な増加は、JTV-519によって阻害された。(B) 収縮期の機能は、未処置の動物において低下したが、JTV-519は、心筋梗塞後(MI-後)の心不全ラットにおいて、収縮期の機能を有意に高めた。
【図５】図5は、JTV-519が、心不全ラットにおける、RyR2に対するカルスタビン2(FKBP12.6)のアフィニティーを高めることを明らかにしている。等量のRyR2が、抗-RyR2抗体を用いて免疫沈降された(A)。代表的な免疫ブロット(A)及び棒グラフ(B)は、異なる実験群における、Ser2809におけるRyR2のPKA-ホスホリル化の量(B、左)及びRyR2と結合したカルスタビン2(FKBP12.6)の量(B、右)を示す。心不全において、RyR2は、PKAによって有意にホスホリル化され(B、左)、チャンネル複合体からのカルスタビン2(FKBP12.6)の解離に導く(B、右)。JTV-519による治療は、RyR2のPKA-ホスホリル化状態、並びにRyR2に対するFKBP12.6の結合両者の正常化をもたらす。実験数は、バーで示されている。*P<0.05、HF対擬似；＃P<0.05、HF+JTV-519対HF。
【０３２２】
【図６】図6は、JTV-519が、機能不全状態の心臓におけるRyR2-チャンネルゲート開閉を正常化することを示す。RyR2チャンネルは、擬似手術した(擬似)又は心不全(HF)ラットから単離した。代表的な単一チャンネル記録は、RyR2-チャンネルの開放確率(Po)が、擬似手術したラット(上部)と比較して、機能不全状態の心臓(中央)において大幅に増加したことを示す。4週間に渡る、心不全ラットのJTV-519による処理は、擬似手術した動物のものと同様なレベルまで、チャンネルの開放確率を正常化した。各状態に対して、上方の記録は、5000msのデータを表し、また底部の記録は、200msのデータを表す。チャンネル開放は上部であり、ダッシュはチャンネル開放の完全なレベル(4pA)を示し、また「c」は、該チャンネルの閉じた状態を示す。振幅ヒストグラム(右)は、機能不全状態の心臓由来のRyR2チャンネルにおける、高いPo及び準導電性開放を明らかにした。
【０３２３】
【図７】図7は、JTV-519が、RyR2チャンネルと結合したFKBP12.6(カルスタビン2)を増すことにより、RyR2-チャンネルゲート開閉を正常化することを示す。(A) 野生型RyR2(RyR2-WT)チャンネルは、特異的なPKA阻害剤、PKI5-24の存在下又は不在下で、PKA-ホスホリル化処理し、次いで指示した濃度でのJTV-519の存在下で、カルスタビン2(FKBP12.6)と共にインキュベートした。RyR2の免疫ブロットは、サンプル中に等量のRyR2が存在することを示し、カルスタビン2の免疫ブロットは、JTV-519が、PKA-ホスホリル化RyR2に対して、カルスタビン2を部分的(100nM)又は完全(1000nM)に再結合させることを示す。(B) 構成的にPKA-ホスホリル化RyR2を模倣する、RyR2-S2809Dを、指示した濃度でのJTV-519の存在下で、カルスタビン2と共にインキュベートした。RyR2の免疫ブロットは、サンプル中に等量のRyR2が存在することを示し、カルスタビン2の免疫ブロットは、JTV-519が、RyR2-S2809Dに対して、カルスタビン2を部分的(100nM)又は完全(1000nM)に再結合させることを示す。(C) [35S]-標識カルスタビン2の結合曲線は、JTV-519が、PKA-ホスホリル化RyR2及びRyR2-S2809D変異チャンネルに対する、カルスタビン2の結合アフィニティーを、ホスホリル化されていないRyR2-WTに匹敵するレベルまで増大することを示している。(D-F) 単一チャンネルの研究は、JTV-519(1μM)が、150nM[Ca2+]において、カルスタビン2を再結合することによって、PKA-ホスホリル化RyR2-WTの開放確率(Po)を減じる(Dについてn=11；Eについてn=12；Fについてn=13)ことを示す。チャンネルの開放は、上部であり、ダッシュはチャンネル開放の完全なレベル(4pA)を示し、また「c」は、該チャンネルの閉じた状態を示す。振幅ヒストグラム(右)は、PKA-ホスホリル化RyR2における、高いPo及び準導電性開放を明らかにした。このことは、JTV-519(1μM)及びカルスタビン2(FKBP12.6)で処理した後には観測されなかった。
【０３２４】
【図８】図8は、心房組織における該RyR2巨大分子複合体を示す。(A) RyR2は、心房性筋小胞体(SR)から免疫沈降させ、PKA又は環状アデノシン一燐酸(cAMP)でホスホリル化した。PKA阻害剤(PKI)の添加は、該ホスホリル化反応を完全に遮断した。(B) 該RyR2巨大分子複合体の成分を、心房性SR由来のRyR2で、同時免疫沈降させた。性のコントロールは、心房性SR(50%の免疫沈降(IP)投入量)であった。負のコントロールは、抗原ペプチドで遮断された抗体により免疫沈降されたサンプルを表す。(C) カルスタビン2(FKBP12.6)は、心房性SR由来のRyR2により同時免疫沈降された。SDS-PAGEによるサイズ分画前に、PKIの存在下又は不在下で、PKAによりホスホリル化した。PKA-ホスホリル化は、PKIによる阻害と同様に、該チャンネル複合体からカルスタビン2(FKBP12.6)の解離を生じた。+Cont.(CSR)=心房SR; +Cont.(FKBP)=組換えFKBP; -Cont.=抗原ペプチドで予め吸収された抗体を用いて行ったIP。
【０３２５】
【図９】図9は、心房細動(AF)におけるRyR2のPKA-ホスホリル化を示す。(A) コントロール動物(コントロール；n=6)由来の及び心房細動を患っているイヌ(A Fib; n=6)由来の免疫沈降(IP)されたRyR2を、PKAでホスホリル化した。逆-ホスホリル化実験のために、RyR2に関する免疫ブロットを、並行して行って、各サンプル内で免疫沈降されたRyR2タンパク質の量を測定した。左側の棒グラフは、この逆-ホスホリル化研究の定量化した結果を表す。得られた値は、免疫沈降されたタンパク質の量について調節した、RyR2のPKA-ホスホリル化の相対的な程度を表す。AFに罹っているイヌは、コントロール(AFについてn=6；コントロールについてn=6；P=0.001)と比較して、PKA-ホスホリル化における130%の増加を示した。カルスタビン2(FKBP12.6)は、RyR2により同時免疫沈降させた。同時免疫沈降実験のために、RyR2に関する免疫ブロットを、並行して行い、各サンプルから免疫沈降されたRyR2タンパク質の量を測定した。右側の棒グラフは、この同時免疫沈降実験の定量化した結果を表す。得られた値は、免疫沈降されたタンパク質の量について調節した、RyR2により同時免疫沈降されたカルスタビン2(FKBP12.6)の量を表す。RyR2と結合するカルスタビン2(FKBP12.6)は、コントロール(コントロールについてn=6；AFについてn=7； P<0.0005)と比較して、AFに罹っているイヌにおいて72%の減少を示した。(B) 一連の同様な実験を、心不全を発症した際の心房細動を示す患者由来のヒト心房組織(A Fib; n=5)及び正常な心臓を持つ患者由来の心房組織(コントロール; n=3)を用いて行った。左側の棒グラフは、逆-ホスホリル化研究の定量化した結果を表す。AFに罹っているヒトは、コントロール(A Fibについてn=5; コントロールについてn=3; P=0.002)と比較して、PKA-ホスホリル化において112%の増加を示した。右側の棒グラフは、カルスタビン2(FKBP12.6)の同時免疫沈降実験の結果を表す。AFに罹っているヒトは、RyR2と結合したカルスタビン2(FKBP12.6)の量において、70%の減少を示した(A Fibについてn=5; コントロールについてn=3; P=0.0001)。
【０３２６】
【図１０】図10は、AFにおける変更されたRyR2-チャンネル機能を示す。(A) 上部の記録は、コントロールの左心房由来の代表的なRyR2チャンネルを示し；下部の記録は、AFチャンネルである。これら記録の右側にあるのは、対応する電流の振幅ヒストグラムである。(B) 棒グラフは、コントロールのイヌ(Cont.)及び慢性心房細動を患うイヌ(A Fib)に関する開放確率(Po)及び開放頻度(Fo)の定量した結果を示す。5匹のA Fibを患うイヌ由来の17チャンネル、及び5匹のコントロールのイヌ由来の11チャンネルを研究した。コントロールのイヌ由来のチャンネルは、高い活性を示すことはなかった。これに対して、A Fibを患うイヌ由来の17チャンネルの内の15(88%)は、大幅に増加した開放確率(AF: 0.39±0.07; コントロール: 0.009±0.002; P<0.001)及びゲート開閉頻度(AF: 21.9±4.6s-1; コントロール: 1.6±0.6s-1; P<0.002)を示した。
【０３２７】
【図１１】図11は、JTV-519による処置が、AFにおける正常なRyR2の機能を回復することを立証している。(A) 細胞質Ca2+濃度150nM(拡張期において起こるように)において、及び0.25mMのカルスタビン2(FKBP12.6)の存在下で、イヌの心臓由来の単一RyR2チャンネルの代表的な記録は、PKA-ホスホリル化後における、開放確率(Po)及びゲート開閉頻度の大幅な増加を示す(コントロール: Po=0.3±0.2%, n=6; PKA: Po=14.8±3.2%, n=7; P<0.001)。下方の記録の、より高い時間分解能及び全点ヒストグラムにおいて理解されるように、RyR2のPKA-ホスホリル化は、RyR2からカルスタビン2(FKBP12.6)が解離した際に観測される、部分的な開放(準導電性状態)をもたらす。JTV-519(1.0mM)は、PKA-処理したRyR2と比較して、PKA-ホスホリル化RyR2のチャンネル活性を回復し(Po=0.8±0.3%; n=6; P<0.001)、JTV-519は、またホスホリル化されていないコントロールのチャンネルに見られるように、そのヒストグラムにおける、電流振幅分布の減少を結果した。上方及び下方の記録は、夫々5000ミリ秒及び200ミリ秒の結果を表し；閉じた状態は「c」で示され；完全なチャンネルの開放は、バーで示されているように、4pAへの上向きの屈曲として示され；下方の記録における点線は、部分的な開放の1pAステップを示す。(B) 組換えカルスタビン2(FKBP12.6)を、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、即ちJTV-519の存在下又は不在下において、PKA-ホスホリル化RyR2と共にインキュベートした。抗-カルスタビン2抗体による免疫ブロットは、JTV-519が、PKA-ホスホリル化RyR2に対する、カルスタビン2(FKBP12.6)の結合を可能にすることを明らかにした。JTV-519が存在しない場合には、カルスタビン2の結合は起こらなかった。
【０３２８】
【図１２】図12は、新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体が、0.5nMにて、PKA-ホスホリル化心臓リアノジンレセプタ(RyR2)に対するカルスタビン2(FKBP12.6)の結合を誘発することを示す。上方のパネル：2.0nMの各化合物；下方のパネル：0.5nMの各化合物。
【図１３】図13は、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、S36(図15に示す)が、200nMにおいて、マウス内の心不整脈を阻害することを示す。棒グラフは、指示されているように、薬物処理を施した又は施してない、FKBP12.6+/-マウスにおける、運動テスト中の不整脈事象又は心臓突然死を示す。左側のグラフは、突然死を示し、中央のグラフは、持続性のVTを示し；右側のグラフは、非-持続性のVTを示す。数値は、各群において使用した動物全体の数である。
【図１４】図14は、JTV-519が、心不全のラットモデルにおいて、心臓の収縮性を改善することを立証している。
【図１５】図15は、該誘導体の構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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