(57)【要約】本発明は、幹細胞、好ましくは多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）を投与することによりリソソーム酵素を被験体に提供する方法に関する。本発明はさらに幹細胞を投与することによるリソソーム蓄積症の処置方法に関する。本発明はまた、効果的な量のリソソーム酵素を被験体に提供する工程を包含する、被験体中の基質の蓄積を調節するための方法に関する。上記幹細胞は、Ｏｃｔ−３／４陽性であり、かつ内胚葉系統の細胞、外胚葉系統の細胞および中胚葉系統の細胞を生じ得、そしてリソソーム酵素を提供する。
2007513188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体にリソソーム酵素を提供するための方法であって、該方法は、幹細胞を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該幹細胞は、Ｏｃｔ−３／４陽性であり、かつ内胚葉系統の細胞、外胚葉系統の細胞および中胚葉系統の細胞を生じ得、そして該幹細胞は、リソソーム酵素を提供する、方法。
【請求項２】
リソソーム蓄積症を処置するための方法であって、リソソーム蓄積症を有する被験体に幹細胞を投与する工程を包含し、ここで、該幹細胞は、Ｏｃｔ−３／４陽性であり、かつ内胚葉系統の細胞、外胚葉系統の細胞および中胚葉系統の細胞を生じ得、そそして該幹細胞は、投与後に、該疾患を処置するのに効果的な量のリソソーム酵素を発現する、方法。
【請求項３】
被験体中の基質の蓄積を調節するための方法であって、該方法は、該蓄積を調節するために効果的な量のリソソーム酵素を該被験体に提供する工程を包含し、ここで、該リソソーム酵素は、該被験体に投与された幹細胞により提供され、そして該幹細胞は、Ｏｃｔ−３／４陽性であり、かつ内胚葉系統の細胞、外胚葉系統の細胞および中胚葉系統の細胞を生じ得る、方法。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の方法であって、前記リソソーム酵素が、以下：β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２活性化因子、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、酸性リパーゼ、スルファターゼ類、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−サルフェートスルファターゼ、ヘパランスルファミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチルＣｏＡグルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、カテプシンＫ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、シアル酸トランスポーター、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、カテプシンＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼＩからなる群から選択される、方法。
【請求項５】
前記リソソーム蓄積症が、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク症、ムコリピドーシス、ＩＩ型糖原病およびセロイド脂褐素症からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、前記リソソーム蓄積症が、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス変種Ｂ／Ｂ１および変種Ｏ、異染性白質萎縮症、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン−ピック病、ファーバー病、ウォルマン病、オースティン病、Ｉ型ムコ多糖症、シャイエ病、ハーラー−シャイエ病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー−ラミー病、スライ病、ピクノダイソストーシス、アスパルチルグルコサミン尿、フコース蓄積症、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、シンドラー病、Ｋａｎｚａｋｉ病、Ｉ型ムコリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、ＩＩ型糖原病、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病、ヤンスキー−ビールショースキー病、バッテン病、クッフス病、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７およびＣＬＮ８座の変異により特徴付けられる病状、シアル酸蓄積症、サラ病およびメチルマロン酸性尿症からなる群から選択される、方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法であって、前記基質が、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、シアル酸、ＧＭ１−ガングリオシド、ＧＭ２−ガングリオシド、ガラクトシルセラミド、スルファチド、ガラクトシルスフィンゴリピド、グルコセラミド、セラミド、スフィンゴミエリン、α−マンノシド、β−マンノシド、フコシド、アスパルチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グリコーゲン、コレステロールエステル、骨由来のペプチドおよびサポシンからなる群から選択される、方法。
【請求項８】
前記調節が、被験体中における前記基質の減少を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、グリコサミノグリカンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素が、α−Ｌ−イズロニダーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞またはその分化子孫が前記被験体の器官に投与され、これによって、該幹細胞またはその分化子孫が該器官にリソソーム酵素を提供する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１２】
前記器官が内臓器官である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記内臓器官が、心臓、肺、筋肉、腎臓、脾臓、回腸、結腸、脳、肝臓および眼からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞またはその分化子孫が、前記器官の存在する細胞との接触を介して該器官に移植されて、リソソーム酵素を提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、局所注入、カテーテル投与、全身注入、腹腔内注射、胎盤内注射、子宮内注射、頭蓋内注射、非経口投与、動脈内注射および側脳室への注射からなる群から選択される方法により投与される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体がムコ多糖症を有する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ムコ多糖症がハーラー病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞を被験体に胎内で提供する工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与の方法が、胎児の臍静脈への直接的注射、胎児の肝臓への直接的注射、腹腔内注射、胎盤内注射および子宮内注射からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が、前記被験体の最初のトリメスターにおいて投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞が、前記被験体の最初のトリメスターにおいて、腹腔内注射により投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞が、ＭＡＰＣの単離された集団である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞を遺伝的に改変する工程をさらに包含する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２４】
リソソーム酵素に対する基質の望ましくない蓄積を処置するための医薬を調製するための幹細胞の使用であって、ここで、該幹細胞は、Ｏｃｔ−３／４陽性であり、かつ内胚葉系統の細胞、外胚葉系統の細胞および中胚葉系統の細胞を生じ得、そして幹細胞は、リソソーム酵素を提供する、使用。
【請求項２５】
前記基質の蓄積がリソソーム蓄積症をもたらす、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記リソソーム蓄積症が、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク症、ムコリピドーシス、ＩＩ型糖原病およびセロイド脂褐素症を包含する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記幹細胞が、ＭＡＰＣの単離された集団である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
前記医薬が、薬学的に許容される担体を包含する、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとで、本明細書において参考として援用される２００３年１２月４日出願の米国仮出願第６０／５２７，２４９号の優先権を主張する。
【０００２】
（政府権利の陳述）
本研究は、米国国立衛生研究所の補助金Ｎｏ．Ｒ０１−ＨＬ４９９９７により支援を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有しよう。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、幹細胞、好ましくは多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）を投与することによりリソソーム酵素を提供する方法に関する。さらに、本発明は、幹細胞を投与することによりリソソーム蓄積症を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
リソソーム蓄積症は、リソソームの酸ヒドロラーゼ欠乏をもたらす４０を超える劣性遺伝病のグループである（非特許文献１）。個人的には稀であるが、リソソーム蓄積症は７７００誕生あたり一回の発生を有する。そのような病気として、多くの他の中でもゴーシェ病、ファブリー病、ニーマン−ピック病、Ｉ型〜ＶＩＩ型ムコ多糖症、Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ病が挙げられる。リソソーム酵素活性の損失はリソソーム内の未分解基質の累積的な蓄積をもたらし、オルガネラの鬱血とそれに続く細胞、組織および器官の機能不全、そしてしばしば死をもたらす。リソソーム蓄積症は、多様な器官システムに、その多くで誕生前に影響を与え、非可逆的な欠陥をもたらす。代謝蓄積症の臨床的な処置は骨髄移植および酵素補充療法に限定されている（非特許文献２）。
【０００５】
酵素補充療法は、機能的リソソーム酵素の患者への投与をともなう。投与後、補充酵素は肝臓により全身循環へと分泌される。隣接細胞および離れた細胞の両方が、その分泌酵素を、事実上すべての細胞の表面に存在する主にマンノース−６−ホスフェートレセプターを通じて再捕捉する（非特許文献３）。酵素の局在的投与は欠乏細胞において少なくとも一部の酵素集団を補給することができる。しかし、これらの酵素は一般的に短い循環細胞内半減期を有し、治療は比較的大量の関連酵素の規則的な非経口投与を必要とする。
【０００６】
酵素補充療法は、ある種のリソソーム蓄積症を処置する場合に特に効果的である。例えば、ゴーシェ病とファブリー病の処置における酵素補充はこれらの病気の非神経病症候を逆戻りさせるのに効果的である（非特許文献４；非特許文献５）。しかし、Ｉ型ムコ多糖症（すなわち、ＭＰＳ−ＩＨ；ハーラー症候群）等の多くのリソソーム蓄積症において、酵素の補充は、注入されたドナータンパク質に対して潜在的な免疫原応答をもたらしうる。さらに、全身に投与された酵素は、ＣＮＳおよび骨格系等、発達において後に生じる部位に到達できない。よって、酵素補充療法は、これらの代謝蓄積症の多くに関連した神経学的徴候や骨格疾患の修正には効果的でない。
【０００７】
遺伝子標的法も、酵素を患者に供給するために用いられている。しかし、限定された結果が現在まで観察されている。遺伝子標的法（レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター等の標的用ベクターによる）は、肺、肝臓または骨髄等の標的器官に対する十分な供給をもたらすことができる（非特許文献６；非特許文献７）。さらに、標的用ベクターの静脈内供給は肝臓からの高レベルの酵素分泌および他の侵された組織での再取り込みをもたらし得る。
【０００８】
しかし、遺伝子標的法は欠点も有する。所望の酵素の発現は一過性であり、数週間内に基礎レベルに戻りうる。また、酵素に対する細胞毒性Ｔリンパ球により仲介される炎症性応答も観察されている。さらに、血管／脳関門の通過を達成することの困難性やＣＮＳの静止性細胞の十分な発現を誘導することの困難性を所与とすれば、さらに重篤な欠乏、例えばＣＮＳで起こる欠乏の修正は起こりそうにない。１つの研究において、ＡＡＶベクターを用いる直接の頭蓋内注射は、ＶＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ  ＶＩＩ）のネズミモデルにおける認識欠損の中程度の修正のもたらしただけである（非特許文献８）。
【０００９】
骨髄移植はリソソーム蓄積症の処置に対する別の潜在的な治療方法である。骨髄移植は、患者の造血系を健康な免疫適合性ドナーの幹細胞により再構成して、長期の酵素供給源を確立する（非特許文献９）。リソソーム蓄積症を有する数百人の患者が移植により長年処置されている。例えば、骨髄移植による非神経病性ゴーシェ病の処置は症状のほとんど完全な逆転をもたらした（非特許文献１０）。
【００１０】
骨髄移植は、ＭＰＳ−ＩＨ等、他のリソソーム蓄積症の処置にさらに限定された効果を有する。骨髄移植は、病気のいくつかの、しかし全てではない有害な効果を逆転できる（上記の非特許文献１０）。移植により処置されない場合、患者は、角膜、中央神経系、肝臓、脾臓、肺、心臓、筋肉、腱および骨におけるヘパリン硫酸およびデルマタン硫酸、グリコサミノグリカン蓄積のために悪化し続けるだろう。神経学的改善の程度は、患者の年齢、移植時の発達比率、および移植後に得られる酵素の量に関連付けられる（非特許文献１１；非特許文献１２）。若い移植片受容者は、典型的にはＣＮＳを安定化して、またはその悪化を遅らせて、内臓器官がクリアになることを経験する。不幸にも、骨格系および多くのＣＮＳ欠陥は移植後に影響を受けずにいる。
【００１１】
骨髄移植および酵素補充研究の結果は、すべてでないが、ほとんどの欠陥が患者に酵素を供給することによって修正できることを実証する。しかし、うまく移植された患者での骨格およびＣＮＳ欠陥の修正の失敗は、必要とされる部位（すなわち、骨またはＣＮＳ）でのリソソーム酵素の濃度が不十分であるか、または損傷が非可逆的であることを示す。ＭＰＳ−ＩＨ患者は典型的には正常な酵素レベルの＜０．１３％を有する。しかし、α−Ｌ−イズロニダーゼに関してヘテロ接合体である患者において、臨床的に侵されていない白血球および繊維芽細胞を作るために酵素レベルのわずかに３％だけが必要である（非特許文献１３）。このことは、低いレベルの補充酵素のみが必要であり、骨格およびＣＮＡ出現の修正を達成することができないことは、これら部位で利用可能な酵素の非常に低いレベルによるものであることを示唆する。
【００１２】
発達の初期に補充酵素を供給することは、ＣＮＳと骨格の異常のさらに高い修正をもたらすかもしれない。胎内（ｉｎ  ｕｔｅｒｏ）移植とも知られる子宮内移入は、妊娠中に起こる不可逆的な欠陥の修正を最適化する最も初期の機会を提供する（非特許文献１４）。初期の妊娠胎児は免疫学的に未熟で、外来抗原を許容して、免疫抑制の必要性なしに、同種または異種の細胞の受容を許容する。したがって、免疫学的または代謝的な再構築が誕生前に可能である。
【００１３】
重篤な免疫不全病を有する患者は子宮内移入により修正できるが、リソソーム蓄積症を有する患者はこれらの操作から利点を受けるように思われない。子宮内移植により処置されたＭＰＳ−ＩＨを有するわずかに二人の患者が報告されている（非特許文献１５）。蓄積症に対して免疫不全に対する子宮内移植間の結果の差異は、免疫担当ドナー細胞（すなわち、リンパ系細胞）が免疫不全病を有する受容者に顕著な競合的増殖利点を有するという事実に関連する。リソソーム酵素を発現するドナー細胞（すなわち、造血幹細胞（ＨＳＣ）または骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ））は、該酵素を欠如する細胞より勝る増殖または生存の有利な点を持たない。
【００１４】
リソソーム蓄積症の動物モデルはこの観察を確証している。ＭＰＳ  ＶＩＩマウスの研究において、レトロウイルスベクターによりマークされた同系の胎児肝臓造血幹細胞、またはヒトβ−グルクロニダーゼ（“ｇｕｓ”）トランスジーンを構成的に過剰発現する同種ドナー細胞はわずかに０．１％の移植を生じた（非特許文献１６）。幹細胞と前駆細胞を豊富にすることで、２ヶ月齢で顕著に高いｇｕｓ活性を生じ、病気の発症を遅らせ、胎児生命初期の酵素発現が病気の進展を遅らせることを示唆する。造血幹細胞またはドナー胎児肝臓細胞の子宮内移入は、皮質ニューロンおよびグリア等の組織において（非特許文献１７）ならびに肝臓において（非特許文献１８）、ＧＡＧ蓄積を緩和する。
【００１５】
また、ＭＰＳ−ＩＨ欠乏のイヌモデルを用いて、子宮内移植により導入された造血幹細胞の治療可能性を評価した（非特許文献１９）。同原の骨髄細胞を、α−Ｌ−イズロニダーゼを発現するように遺伝子的に修飾して、胎内で成熟前胎児イヌに移植した。α−Ｌ−イズロニダーゼもプロウイルス特異的転写物も、ＭＰＳ−ＩＨイヌの血液や骨髄白血球に検出されなかった。しかし、形質導入された造血前駆細胞は受容胎児に移植でき、造血に寄与でき、α−Ｌ−イズロニダーゼに対する免疫学的非応答性を誘導できた。イヌにおける造血幹細胞遺伝子移入の治療可能性は、プロウイルスα−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子発現の不十分な維持と遺伝子的に修正された循環白血球の低いレベルとにより制限されているように思えた。
【非特許文献１】Ｗｒａｉｔｈ，「Ｊ．Ｅ．Ｄｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕｒｏｌ．」４３（２００１）：６３９−６４６
【非特許文献２】Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．およびＳｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．」１０（２００３）：１２７５−１２８１
【非特許文献３】Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，「Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｉｅａｓｅｓ．」、Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｉ．，Ｌａｎｔｏｓ，Ｐ．Ｋ．（編）Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ’ｓ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ａｒｎｏｌｄ：Ｌｏｎｄｏｎ，（２００２）ｐｐ．６５３−７３５
【非特許文献４】Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｎ．Ｊ．ら，「Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．」１１３（２００２）：１１２−１１９
【非特許文献５】Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｒら，「ＪＡＭＡ」２８５（２００１）：２７４３−２７４９
【非特許文献６】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．ら，「Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．」６（２００２）：１７９−１８９
【非特許文献７】Ｄｕ，Ｈ．ら，「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．」１３（２００２）：１３６１−１３７２
【非特許文献８】Ｆｒｉｓｅｌｌａ，Ｗ．Ａ．ら，「Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．」３（２００１）：３５１−３５８
【非特許文献９】Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｃ．Ｇ．「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．」，Ｆａｉｒｂａｉｒｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｔｅｓｔａ，Ｎ．Ｇ．（編）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．第８巻：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｋｌｅｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．（１９９９）ｐ．１３−５６
【非特許文献１０】Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅ，Ｐ．Ｍ．ら，「Ｌａｎｃｅｔ」３４５（１９９５）：１３９８−１４０２
【非特許文献１１】Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃ．ら，「Ｂｌｏｏｄ」８７（１９９６）：４８９４−４９０２
【非特許文献１２】Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃ．ら，「Ｂｌｏｏｄ」９１（１９９８）：２６０１−８
【非特許文献１３】Ｓｃｏｔｔ，Ｈ．Ｓ．ら，「Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．」６（１９９５）：２８８−３０２
【非特許文献１４】Ｆｌａｋｅ，Ａ．Ｗ．およびＺａｎｊａｎｉ，Ｅ．Ｄ．「Ｂｌｏｏｄ」９４（１９９９）：２１７９−２１９１
【非特許文献１５】Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｊ．およびＣａｒｒｉｅｒ，Ｅ．「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｓ」１１０（２００２）：１７７−２１１
【非特許文献１６】Ｃａｓａｌ，Ｍ．Ｌ．ら，「Ｂｌｏｏｄ」９７（２００１）：１６２５−１６３４
【非特許文献１７】Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら，「Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．」２７（５）（２００１）：８６１−８７３
【非特許文献１８】Ｃａｓａｌ，Ｍ．Ｌ．，「Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．」４７（６）（２０００）：７５０−７５６
【非特許文献１９】Ｌｕｔｚｋｏ，Ｃ．ら，「Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．」（１９９９）１０：１５２１−１５３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、リソソーム蓄積症の処置に対する改良方法の必要が当分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、幹細胞を、標的細胞のリソソーム中の基質を代謝するリソソーム酵素を提供するのに効果的な量で投与することにより該細胞中の基質の蓄積を調節する（例えば、防止または低下する）、リソソーム蓄積症の処置に関する。幹細胞、好ましくは多能性成体前駆細胞（「ＭＡＰＣ」）を投与して、リソソーム酵素をインビボで提供する。本発明の方法に使用される幹細胞は、内胚葉、外胚葉および中胚葉由来の細胞を生じることのできる細胞である。
【００１８】
失われた酵素または欠乏酵素を基質の蓄積を有する組織または複数の組織に提供して、基質の酵素的触媒（すなわち、代謝または分解）を可能とすることにより、該蓄積を防止、減少または除去する。
【００１９】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、被験体にリソソーム酵素を提供する方法に関し、この方法は、幹細胞を被験体に投与する工程を包含し、この幹細胞はリソソーム酵素を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、リソソーム蓄積症を処置する方法に関し、この方法は、リソソーム蓄積症を有する患者に幹細胞を投与する工程を包含し、この幹細胞は上記病気を処置するのに効果的な量のリソソーム酵素を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、被験体中の基質の蓄積を調節する工程に関し、この工程は、上記基質の蓄積を調節するのに効果的な量のリソソーム酵素を被験体に投与する工程を包含し、このリソソーム酵素は、被験体に投与された幹細胞によって提供される。ここで用いられる「基質」は、一種類以上のリソソーム酵素に対するリソソーム基質をいう。好ましくは、調節は、基質の蓄積（例えば、所望とされない蓄積レベルおよび／またはリソソーム関連状態のない被験体での蓄積レベルよりも高い蓄積レベル）の防止、減少または除去からなる。
【００２２】
問題のリソソーム酵素は、本発明の幹細胞における正常な遺伝子発現により作ることができる。さらに、細胞は、例えば、リソソーム酵素をコードする遺伝子のさらなるコピーを含むか、および／または内因性遺伝子を過剰発現させるように遺伝子改変することができる。
【００２３】
リソソーム酵素として、β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２活性化因子、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、酸性リパーゼ、スルファターゼ類、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−サルフェートスルファターゼ、ヘパランスルファミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチルＣｏＡグルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、カテプシンＫ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、シアル酸トランスポーター、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、カテプシンＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼおよび／またはトリペプチジルペプチダーゼＩであってよいが、これらに限定されない。
【００２４】
リソソーム蓄積症は、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク症（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｏｓｅｓ）、ムコリピドーシス、ＩＩ型糖原病およびセロイド脂褐素症であってよいが、これらに限定されない。さらに具体的に、該病気は、ＧＭ１ガングリオシドーシス（Ｌａｎｄｉｎｇ肺）、ＧＭ２ガングリオシドーシス変種Ｂ／Ｂ１（Ｔａｙ−Ｓａｃｈ病）および変種Ｏ（ザントホフ病）、異染性白質萎縮症、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン−ピック病（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ファーバー病、ウォルマン病、オースティン病、ムコ多糖症のＩ型（ハーラー病またはハーラー症候群）、シャイエ病、ハーラー−シャイエ病、ＩＩ型（ハンター病）、ＩＩＩ型（サンフィリポ病、ＩＩＩ  Ａ〜Ｄ型、ＩＶ型（モルキオ病）、ＩＶ  ＡおよびＢ型、ＶＩ型（マロトー−ラミー病）、ＶＩＩ型（スライ病）、ＩＸ型、ピクノダイソストーシス（ｐｙｃｎｏｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、アスパルチルグルコサミン尿、フコース蓄積症、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、シンドラー病、Ｋａｎｚａｋｉ病、Ｉ型ムコリピドーシス（シアリドーシス）、ＩＢ型ムコリピドーシス（ガラクトシアリドーシス）およびＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型（ムコリピドーシス）、ＩＩ型糖原病（ポーンプ病により特徴付けられる）、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病、ヤンスキー−ビールショースキー病、バッテン病、クッフス病、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７およびＣＬＮ８座の変異により特徴付けられる病状、および／または他のリソソーム蓄積症、例えばシアル酸蓄積症（小児型、サラ病）およびメチルマロン酸性尿症であってよいが、これらに限定されない。１つの実施形態において、病気はムコ多糖症である。別の実施形態において、病気はムコ多糖症（Ｉ型）（例えば、ハーラー病またはハーラー症候群）である。
【００２５】
基質として、デルマタン硫酸；ヘパリン硫酸；ケラタン硫酸；ヒアルロン酸；シアル酸；ＧＭ１−ガングリオシド；ＧＭ２−ガングリオシド；ガラクトシルセラミド；スルファチド；ガラクトシルスフィンゴリピド；グルコセラミド；セラミド；スフィンゴミエリン；α−マンノシド；β−マンノシド；フコシド；アスパルチルグルコサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミン；グリコーゲン；コレステロールエステル；骨由来のペプチド；および／またはサポシン類であってよいが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、基質はグリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンとして、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸およびケラタン硫酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、酵素はα−Ｌ−イズロニダーゼである。
【００２７】
１つの実施形態において、幹細胞またはその分化子孫を被験体の該器官に投与して、幹細胞またはその分化子孫がリソソーム酵素を器官に提供する。
【００２８】
好ましくは、器官は、心臓、肺、筋肉、腎臓、脾臓、回腸、結腸、脳、肝臓および眼等の、しかしこれらに限定されない内臓器官である。好ましくは、幹細胞またはその分化子孫を、リソソーム酵素を提供するように、器官の存在する細胞に接触させることにより器官に移植する。
【００２９】
本発明の幹細胞（またはそれらの子孫）は、カテーテル投与、全身注射、腹腔内注射、胎盤内注射、子宮内注射、頭蓋内注射、非経口投与、動脈内注射および側脳室への注射等の局所注射により投与することができる。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の幹細胞を被験体に胎内投与する。被験体への胎内投与は、胎児の臍静脈または肝臓への直接の注射、腹腔内注射、胎盤内注射または子宮内注射により実施できる。好ましくは、本発明の幹細胞は始めの３ヶ月間に腹腔内注射により投与する。好ましい実施形態において、幼児が本発明の方法により処置される。処置は、出生後の幼児または胎内のときに本発明の幹細胞を投与することによるものであってよい。
【００３１】
１つの実施形態において、幹細胞を被験体に投与する前に、該細胞を、例えばリソソーム酵素をコードする外因性遺伝子を含み、および／または内因性遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変する。本発明の１つの実施形態において、外因性遺伝子または過剰発現する内在性遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２活性化因子、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、酸性リパーゼ、スルファターゼ類、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−サルフェートスルファターゼ、ヘパランスルファミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチルＣｏＡグルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、カテプシンＫ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、シアル酸トランスポーター、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、カテプシンＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼおよび／またはトリペプチジルペプチダーゼＩ等の、しかしこれらに限定されないリソソーム酵素をコードする。別の実施形態において、外因性ＤＮＡ配列は、変更ゲノムを有する幹細胞またはその子孫が未変更ゲノムを有する幹細胞から分化できるように発現する選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコードする遺伝配列を含む。マーカーの例として、緑、赤または黄色の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲｍ）、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
別の実施形態は、リソソーム酵素の基質の望まない蓄積を処置する医薬品を調製するための幹細胞の使用を提供する。１つの実施形態において、リソソーム酵素の蓄積はリソソーム蓄積症をもたらす。
【００３３】
本発明の他の特徴は、下記の開示に開示されるか、またはそれから明らかであり、本発明の範囲内にある。
【００３４】
例示であって、本発明を記載された特定の実施形態に限定することを意図するものではない下記の詳細な説明は、ここに編入される添付の図面に関連して理解されよう。ここでは、本発明の多様な好ましい特徴と実施形態を、限定するものではない実施例により、および添付の図面を参照して説明する。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
（定義）
ここで用いられる下記の用語は下記の意味により定義される。
【００３６】
「幹細胞」は、内胚葉、外胚葉および中胚葉由来の細胞を生じることのできる細胞をいう。「ＭＡＰＣ」とは１タイプの幹細胞である。別のものは「胎児性幹細胞」である。
【００３７】
「生殖層」は、内胚葉、中胚葉および外胚葉からなる初期胚の原腸形成の結果として形成された三主要層である。胚芽性生殖層は、すべての組織と器官が由来する起源である。内胚葉は、例えば、咽頭、食道、胃、腸および関連する腺（例えば、唾液腺）、肝臓、呼吸経路および胃腸管の上皮内面、膵臓および肺の起源である。中胚葉は、例えば、平滑筋および横紋筋、結合組織、血管、心筋系、血液細胞、骨髄、骨格、生殖器官および排出器官の起源である。外胚葉は、例えば、表皮（皮膚の表皮層）、感覚器官、脳、脊髄等の全神経系および神経系の外にある全成分の起源である。
【００３８】
「ＭＡＰＣ」は、多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の頭字語である。それは、自己更新可能であり、かつ分化の際にすべての三主要生殖層（内胚、中胚および外胚）の細胞を生じることのできる多分化能性非ＥＳ、非ＥＧ、非生殖細胞をいう。（ＭＡＰＣ単離、特性付けおよび調製の説明に関して文献の援用により具体的に編入される）ＷＯ０１／１１０１１として公開され、米国特許出願第１０／０４８，７５７号として出願されたＰＣＴ／ＵＳ００／２１３８７および（ＭＡＰＣ単離、特性付けおよび調製の説明に関して援用により具体的に編入される）ＷＯ０２／０６４７４８として公開され、米国特許出願第１０／４６７，９６３号として出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２を参照されたい。胚芽性幹細胞と同じく、ＭＡＰＣはそれらを主要細胞型と明示する多くの細胞マーカーを発現する。例えば、ヒトＭＡＰＣがそれらについて調べられ、Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘ−１、Ｒｏｘ−１、Ｓｏｘ−２を発現し、ＭＡＰＣの集団はＳＳＥＡ−４を発現する。
【００３９】
ＭＡＰＣに関する「多分化能」は、分化の際にすべての三主要生殖層（内胚、中胚および外胚）の細胞を生じる能力をいう。
【００４０】
「前駆細胞」は、それらの最終的に分化した子孫のすべての特徴ではないが、一部の特徴を有する幹細胞の分化中に作られる細胞である。定義される前駆細胞は子孫に託されるが、特定のまたは最終的に分化する細胞型には託されない。頭字語「ＭＡＰＣ」に用いられる「前駆」（“ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ”）との用語はこれらの細胞を特別な由来に限定するものではない。
【００４１】
「豊富にする」（“ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ”）とは、出発培養物または調製物において、１タイプの細胞が別タイプの細胞よりも増加させられていること意味する。
【００４２】
「単離された」とは、インビボで細胞に結合している１つ以上の細胞または１つ以上の細胞成分と結合していない細胞をいう。例えば、細胞の単離集団はここで以下に示すように多様な程度までに精製された細胞集団であってよい。
【００４３】
「被験体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトである。本発明の被験体は、未誕生（例えば、胎児または胎）または新生の被験体であってよいが、これらに限定されない。哺乳類として、ヒト、農場動物、スポーツ動物および愛玩動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「処置」または「処置する」とは、肉体的または病気に関連する損傷および／または被験体の肉体的または病気に関連する損傷の症状の処置、予防、緩和または抑制を含む。さらに「処置する」とは、被験体中の基質の望まない蓄積の処置、防止、緩和または抑制を含む。
【００４５】
「効果的な量」とは、所望の局所的または全身的効果を提供する量を意味する。例えば、効果的な量は、有益または所望の臨床的または非臨床的結果を達成するのに十分な量である。
【００４６】
ここで用いられるように、リソソーム酵素を受けていて、「それを必要とする」被験体は、リソソーム蓄積症を有するか、またはリソソーム蓄積症を発症する危険のある被験体である。さらに、リソソーム酵素を受けていて、「それを必要とする」被験体は、望まれない量の基質を有する被験体である。
【００４７】
「リソソーム蓄積症」は、リソソーム酵素の欠乏のために、リソソーム酵素基質の存在または蓄積が起こって、望まれない効果（例えば、基質の異常な蓄積または異常な基質の生産）が生じる病気である。リソソーム酵素は異常な量で作られる（例えば、酵素が被験体内にまったく発現しないか、低いレベルで発現するか、または高いレベルで発現する）か、または例えば変異か不適切なタンパク質の折畳みのために異常に機能する。
【００４８】
「リソソーム酵素」は細胞のリソソーム区画に含まれる加水分解酵素であり、そこに含まれる細胞副産物を代謝する。
【００４９】
ここで用いられる「基質」とは、一種類以上のリソソーム酵素のリソソーム基質をいう。
【００５０】
「基質の蓄積を調節する」とは、リソソーム酵素の未代謝または不適切に代謝された基質の量を調節することである。調節は、基質の蓄積（例えば、リソソーム蓄積症をもたらす基質の蓄積ならびに被験体に対して発病的ではないが、所望のレベルではない基質の蓄積）の減少、除去または防止を含む。
【００５１】
「移植」とは、問題の組織の存在する細胞への接触によってインビボでの幹細胞の該組織への取り込みをいう。
【００５２】
「分化因子」とは、細胞因子をいい、好ましくは分化を誘導する成長因子または血管形成因子をいう。この文脈において用いられる類似の用語は「サイトカイン」である。サイトカインは、ＭＡＰＣまたは本発明の他の幹細胞、前駆細胞または分化細胞等の帰還（ｈｏｍｉｎｇ）等の細胞移動を誘導または増強する細胞因子を言及することもできる。
【００５３】
この開示において、「含む／包含する」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）、「含む」（“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”）および「有する」（“ｈａｖｉｎｇ”）等は、米国特許法でそれらに帰される意味を有し、「含む」（“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”）等を意味することができ；「から基本的になる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”または「基本的になる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ”）は同じく米国特許法に帰される意味を有し、その用語は幅広い解釈ができ、明示物の基本的または新規な特徴が、明示物以上の存在によって有害に変更されない限り、明示物以上の存在を許容する。
【００５４】
他の定義が本開示にわたって適当な文脈で現われよう。
【００５５】
（本発明の方法）
１つの実施形態において、本発明は、発明の幹細胞が該被験体の細胞中の望まれない基質蓄積を調節するのに効果的な量のリソソーム酵素を提供するように、発明の幹細胞を、それを必要とする被験体に投与することによりリソソーム蓄積症を処置する方法に関する。好ましくは、幹細胞はＭＡＰＣである。
【００５６】
本発明のリソソーム蓄積症は下記の病状に細分することができる：スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク症、ムコリピドーシス、ＩＩ型糖原病およびセロイド脂褐素症および「他」のカテゴリーにはいるもの（Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５４：５０５−１２；Ｎａｔｈａｎ  ａｎｄ  Ｏｓｋｉ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｃｙ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，（２００３）Ｃｈａｐｔｅｒ  ３５，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ）。ほとんど全てのリソソーム蓄積症は常染色体劣性である。これに対して２つの注記される例外はファブリー病およびハンター症候群であり、これらはＸ結合性である。
【００５７】
スフィンゴリピドーシスは下記の病気を含むが、これらの病気に限定されない：ＧＭ１ガングリオシドーシス（Ｌａｎｄｉｎｇ肺；β−ガラクトシダーゼ欠乏）、ＧＭ２ガングリオシドーシス変種Ｂ／Ｂ１（Ｔａｙ−Ｓａｃｈ病；ヘキソサミニダーゼＡ欠乏）および変種Ｏ（ザントホフ病；ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ欠乏）、異染性白質萎縮症（アリールファターゼＡ欠乏）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ欠乏）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ欠乏）、ゴーシェ病（β−グルコシダーゼの欠乏）、ニーマン−ピック病（Ａ、Ｂ、Ｃ；スフィンゴミエリナーゼ欠乏）、ファーバー病（セラミダーゼの欠乏）、ウォルマン病（酸性リパーゼの欠乏）、およびオースティン病（複数のスルファターゼの欠乏）。
【００５８】
ムコ多糖症は下記の病気を含むが、これらの病気に限定されない：Ｉ型（ハーラー病またはハーラー症候群）、シャイエ病（α−Ｌ−イズロニダーゼの欠乏）、ハーラー−シャイエ病、ＩＩ型（ハンター病；イズロニダーゼ−２−サルフェートスルファターゼ欠乏）、ＩＩＩ型（サンフィリポ病、ＩＩＩ  Ａ〜Ｄ型（それぞれ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼまたはＮ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼの欠乏）、ＩＶ型（モルキオ病）、ＩＶ  Ａ型（Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファートスルファターゼ欠乏）およびＢ（β−ガラクトシダーゼ欠乏）、ＶＩ型（マロトー−ラミー病；アリールスルファターゼＢ欠乏）、ＶＩＩ型（スライ病；β−グルクロニダーゼ欠乏）、ＩＸ型（ヒアルロニダーゼ欠乏）およびピクノダイソストーシス（ケテプシンＫ欠乏）。
【００５９】
糖タンパク症は下記の病気を含むが、これらの病気に限定されない：アスパルチルグルコサミン尿（Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼの欠乏）、フコース蓄積症（α−フコシダーゼの欠乏）、α−マンノシドーシス（α−マンノシダーゼ欠乏），β−マンノシドーシス（β−マンノシダーゼ欠乏）、シンドラー病およびＫａｎｚａｋｉ病（シンドラー病およびＫａｎｚａｋｉ病の両方に関してα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたはα−ガラクトシダーゼＢ）。
【００６０】
ムコリピドーシスは下記の病気を含むが、これらの病気に限定されない：Ｉ型（シアリドーシス；α−ノイラミニダーゼ欠乏）、ＩＢ型（ガラクトシアリドーシス；カテプシンＡ欠乏）およびＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型（ムコリピドーシス；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ）。ＩＩ型糖原病は、例えばポーンプ病により特徴付けられる（α−１，４−グルコシダーゼまたは酸性マルターゼの欠乏）。
【００６１】
セロイド脂褐素症は、例えば、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病（パルミトイルプロテインチオエステラーゼ欠乏）、ヤンスキー−ビールショースキー病（トリペプチジルペプチダーゼＩ欠乏）、バッテン病（ＣＬＮ３タンパク質欠乏）、クッフス病、およびＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７およびＣＬＮ８座の変異により特徴付けられる病状を含む。
【００６２】
他のリソソーム蓄積症として、シアル酸蓄積症（小児型、サラ病；シアル酸担体の欠乏）およびメチルマロン酸性尿症（ビタミンＢ１２担体タンパク質の欠乏）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
ムコ多糖症、例えばＩ型ムコ多糖症（ハーラー病またはハーラー症候群）には本発明の方法による処置を施すことができる。
【００６４】
リソソーム酵素として、β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２活性化因子、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、酸性リパーゼ、スルファターゼ類、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−サルフェートスルファターゼ、ヘパランスルファミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチルＣｏＡグルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、カテプシンＫ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、シアル酸トランスポーター、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、カテプシンＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼＩを挙げることができるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、該酵素はα−Ｌ−イズロニダーゼである。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の幹細胞またはその分化子孫の投与は、１つ以上のリソソーム酵素が量および／または機能において欠乏する１つ以上の器官に対して直接行われる。本発明の方法は、心臓、肺、筋肉、腎臓、脾臓、回腸、結腸、脳、肝臓および眼等、しかし、これらに限定されない内臓器官に対するリソソーム酵素の供給によく適する。本発明の方法は、骨格系およびＣＮＳ等の非内臓器官にリソソーム酵素を提供することもできる。好ましくは、本発明の幹細胞は移植される（すなわち、器官の存在する細胞と接触すると器官に取り込まれる）ことにより、必要とされるリソソーム酵素を被験体に提供する。リソソーム酵素は本発明の幹細胞により分泌され、例えば、エンドサイトーシス、レセプター仲介取り込み、および／またはピノサイトーシスによりネイティブの細胞に取り込まれる。
【００６６】
例えば、ムコ多糖症において、体のすべての細胞に存在するリポソーム区画中の特定のリソソーム加水分解酵素は不活性である。通常、各酵素はその基質中の特定の化学結合に対して高い特異性を有するハイドロラーゼとして機能するだろう。（通常、酵素により分解する）グリコサミノグリカンは、ムコ多糖症に苦しむ被験体の細胞に蓄積し、細胞の構造や機能を損傷する。本発明の方法にしたがえば、酵素を発現する本発明の幹細胞はリソソームハイドロラーゼを放出する。繊維芽細胞等の周囲細胞の表面レセプターは、その酵素を、その炭化水素部分の認識によりピックアップすることができる。特に、α−Ｌ−イズロニダーゼは本発明の幹細胞により分泌され、さらなる全身的プロセスを受けることなく活性がある。
【００６７】
酵素量は公知の方法にしたがって本発明の方法により処置された被験体中でモニターすることができる。一般的に、酵素検出の好ましい方法は基質アッセイである。基質アッセイは、例えば、基質を用いて酵素活性を検定することからなり、基質は酵素の直接的な作用により色素を直線的に放出し、これを次に比色法により定量する。本発明の方法により処置された被験体中の補充酵素の存在は、酵素ｍＲＮＡの測定（例えば、逆転写酵素ＰＣＲまたはノーザンブロット）によるか、細胞溶解物中の酵素の検出（例えば、ウエスタンブロット）により検出することもできる。
【００６８】
基質は、（α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ガラクトサミン−４−スルファターゼおよび／またはβ−グルクロニダーゼにより代謝される）デルマタン硫酸；（α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡグルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼおよび／またはβ−グルクロニダーゼにより代謝される）ヘパリン硫酸；（Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼおよび／またはβ−ガラクトシダーゼにより代謝される）ケラタン硫酸；（ヒアルロニダーゼにより代謝される）ヒアルロン酸；（ノイラミニダーゼおよび／またはシアル酸トランスポーターにより代謝される）シアル酸；（β−ガラクトシダーゼにより代謝される）ＧＭ１−ガングリオシド；（β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２活性化因子により代謝される）ＧＭ２−ガングリオシド；（ガラクトシルセラミニダーゼにより代謝される）ガラクトシルセラミド；（アリールスルファターゼＡおよびＢにより代謝される）スルファチド；（α−ガラクトシダーゼＡにより代謝される）ガラクトシルスフィンゴリピド；（β−グルコシダーゼにより代謝される）グルコセラミド、（セラミダーゼにより代謝される）セラミド；（スフィンゴミリナーゼにより代謝される）スフィンゴミエリン；（α−マンノシダーゼにより代謝される）α−マンノシド；（β−マンノシダーゼにより代謝される）β−マンノシド；（フコシダーゼにより代謝される）フコシド；（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼにより代謝される）Ｎ−アセチル−β−グルコサミン；（α−ガラクトシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼにより代謝される）Ｎ−アセチルガラクトサミン；（α−グルコシダーゼにより代謝される）グリコーゲン；（酸性リパーゼにより代謝される）コレステロールエステル；（カプテプシンＫにより代謝される）骨由来のペプチド；（カテプシンＡにより代謝される）ガラクトシアル酸；および（パルミトイルプロテインチオエステラーゼにより代謝される）サポシン類であってよいが、これらに限定されない。
【００６９】
表１〜６を、リソソーム蓄積症、それらの関連する酵素および対応する基質の概略として提供する。
【００７０】
【表１】
2007513188.tif 000003
【００７１】
【表２】
2007513188.tif 000004
【００７２】
【表３】
2007513188.tif 000005
【００７３】
【表４】
2007513188.tif 000006
【００７４】
【表５】
2007513188.tif 000007
【００７５】
【表６】
2007513188.tif 000008
（ｉ．グリコサミノグリカン蓄積の低減または防止方法）
１つの実施形態において、本発明は、リソソーム酵素を提供することによりリソソーム酵素が幹細胞によって提供されるグリコサミノグリカン蓄積の調節に関する。例えば、酵素はα−Ｌ−イズロニダーゼであってよい。
【００７６】
グリコサミノグリカンの蓄積は、β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２活性化因子、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、酸性リパーゼ、スルファターゼ類、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−サルフェートスルファターゼ、ヘパランスルファミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチルＣｏＡグルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、カテプシンＫ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、シアル酸トランスポーター、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、カテプシンＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼＩ等の、しかし、これらに限定されないリソソーム酵素を提供することにより調節することができる。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、発明の幹細胞を投与することによりムコ多糖症（例えば、ハーラー病（ハーラー症候群とも称する））を処置または予防する方法に関する。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は、幹細胞またはその分化子孫を器官に提供する工程を包含する、１つ以上のリソソーム酵素を欠乏する１つ以上の器官におけるグリコサミノグリカンの蓄積を調節する方法に関する。器官は、心臓、肺、筋肉、腎臓、脾臓、回腸、結腸、脳、肝臓および眼等の、しかしこれらに限定されない内臓器官であってよい。リソソーム酵素は、骨格系およびＣＮＳ等の非内臓器官に提供することもできる
（ｉｉ．グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）蓄積の検出方法）
問題の組織中のグリコサミノグリカン蓄積の存在は、クレアチンの比色アッセイ法等の比色法を用いるか、ジメチルメチレンブルー色素を用いて検出することができる。リソソーム蓄積症は、それが存在する場合、酵素活性の関数である。したがって、ＧＡＧ蓄積は、リソソーム酵素発現または活性の減少、低減または緩和と一般的に考えられる。これは、α−Ｌ−イズロニダーゼ（「ＩＤＵＡ」）等の精製酵素に、コンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸等のその生理学的物質、または４−メチルウンベリフェロン等の合成基質を与え、その酵素活性を比色または蛍光アッセイにより測定することによって測定できる。色の変化は、例えば、分光光度計で検出することができ、一方、蛍光は分光蛍光計で測定でき、この場合、分光蛍光計は生成物の励起波長と発光波長を検出する。
【００７９】
グリコサミノグルカンは、薄層クロマトグラフィー、ガス／液体クロマトグラフィーにより正確に測定することもでき、もしくは、それらを四級アンモニウム塩により沈殿させて電気泳動により分画することもできる。ＩＤＵＡ等のリソソーム酵素の発現は、中でも、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学のような標準的な方法を用いて検出できる。支持するデータは、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる酵素のｍＲＮＡの測定から、および例えばウエスタンブロットによる細胞溶解物中のタンパク質の検出から得ることができる。しかし、酵素の直接の活性は色素を直線的に放出し、これを次に比色法により定量できるので、上記の比色アッセイを用いて酵素活性を検出することが好ましい。
【００８０】
（ｉｉｉ．幹細胞）
幹細胞は、広範囲の、おそらくは無限の増殖可能性を有し、２つ以上の細胞子孫に分化し、移植の際に組織を再集団化する細胞と定義される。典型的な幹細胞は胎児性幹（ＥＳ）細胞である。なぜなら、それは無制限の自己更新性を有し、すべての組織タイプに分化できるためである。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内細胞塊に由来するか、または内移植後胎芽（胎児性生殖細胞、すなわちＥＧ細胞）からの原始生殖細胞に由来する。ＥＳおよびＥＧ細胞はマウスから得られ、さらに最近では非ヒト霊長類およびヒトからも得られている。マウス胚盤胞または他の動物の胚盤胞に導入された場合、ＥＳ細胞はマウス（動物）の全組織に寄与することができる。出生後の動物に移植された場合、ＥＳおよびＥＧ細胞は奇形腫を作る。ＥＳ（およびＥＧ）細胞は抗体ＳＳＥＡ１（マウス）およびＳＳＥＡ４（ヒト）との陽性染色により同定することができる。
【００８１】
分子レベルでは、ＥＳおよびＥＧ細胞は、これらの未分化細胞に高度に特異的な多くの転写因子を発現する。これらにはｏｃｔ−４とｒｅｘ−１が挙げられる。ＬＩＦ−Ｒおよび転写因子ｓｏｘ−２とｒｏｘ−１も発見されている。ｒｏｘ１とｓｏｘ−２は非ＥＳ細胞でも発現する。Ｏｃｔ−４遺伝子（ヒトにおけるＯｃｔ−３）はヒトにおいて少なくとも２つのスプライス変異体のＯｃｔ３ＡとＯｃｔ３Ｂへと転写される。Ｏｃｔ３Ｂスプライス変異体は多くの分化細胞に見られるが、Ｏｃｔ３Ａスプライス変異体（以前にＯｃｔ３／４と命名されたもの）は未分化胎児性幹細胞に特異的であることが報告されている。
【００８２】
Ｏｃｔ−４（ヒトにおけるＯｃｔ３）は、前原腸形成胚芽、初期切断段階胚芽、胚盤胞の内細胞塊の細胞、および胎児性がん腫（ＥＣ）細胞で発現する転写因子であり（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ９５：３７９−９１，１９９８）、細胞が分化するように誘導されたときにダウンレギュレーションを受ける。Ｏｃｔ−４の発現は、胚形成および分化の初期段階の決定に役割を果たしている。Ｏｃｔ−４は、Ｒｏｘ−１と組合わされて、ＥＳを未分化に維持するために必要でもあるＺｎ−フィンガータンパク質Ｒｅｘ−１の転写活性化を引き起こす（Ｒｏｓｆｊｏｒｄ  Ｅ，Ｒｉｚｚｉｎｏ  Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０３：１７９５−８０２，１９９７；Ｂｅｎ−Ｓｈｕｓｈａｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：１８６６−７８，１９９８）。さらに、ＥＳ／ＥＣで発現し、さらに他のさらに分化された細胞でも発現するＳｏｘ−２は、ＥＳ／ＥＣの未分化状態を保持するために、Ｏｃｔ−４とともに必要とされる（Ｕｗａｎｏｇｈｏ  Ｄ，Ｒｅｘ  Ｍ，Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  ＥＪ，Ｐｅａｒｌ  Ｇ，Ｈｅａｌｙ  Ｃ，Ｓｃｏｔｔｉｎｇ  ＰＪ，Ｓｈａｒｐｅ  ＰＴ，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．，４９：２３−３６（１９９５））。ネズミＥＣ細胞および原始生殖細胞の維持はＬＩＦの存在を必要とするが、この必要性はヒトおよび非ヒト霊長類ＥＳ細胞に対してはそれほど明確ではない。
【００８３】
本発明の方法を実施するために用いられる幹細胞は、すべての三生殖層に由来する細胞子孫を生じることのできる細胞をいう。好ましくは、幹細胞はＭＡＰＣである。公知の他の幹細胞、例えばここに記載されたものが使用のためにも望ましい。
【００８４】
「ＭＡＰＣ」は、非胚芽組織に由来するものであるが、インビトロまたはインビボで分化の際、すべての三生殖層（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞子孫を生じることのできる（子孫多分化能性の定義）細胞をいう。この文脈において、それらは胎児性幹細胞と等しく、骨髄から単離される間葉系幹細胞とは異なる。これらの細胞の生物学的潜在性は、マウス、ラット等の多様な動物モデルおよびラットまたはＮＯＳ／ＳＣＩＤマウスへのヒト幹細胞の異種移植において立証された（Ｒｅｙｅｓ，Ｍ．ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ（２００１）Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３８：２３１−３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２３３−５；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．，３０（８）：８９６−９０４）。この細胞集団のクローン潜在性の的確な実証において、遺伝子マークされた単一のＭＡＰＣがマウスの胚盤胞に注入され、胚盤胞が内移植され、胎が出産予定日まで発達させられた（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３）：４１−９）。高度にキメラである動物での出生後分析はすべての組織と器官（肝臓等）の再構成を示す。２回の染色実験は、遺伝子マークされた幹細胞はこれらの動物において、顕著な比率の明らかに機能的な心筋細胞に寄与することを実証する。これらの動物は、胎生学的状態または成体状態のいずれにおいても心臓の異常または不規則性を示さなかった。異常や器官の機能不全はこれら動物のいずれにも観察されなかった。
【００８５】
この細胞は、ＭＡＰＣおよび特にヒト組織からのそれらの単離の説明に関して本文に編入される米国特許出願第１０／０４８，７５７号および同第１０／４６７，９６３号で広く特性付けられている。ＭＡＰＣは細胞表面マーカー発現に関して広く特性付けられており、ＧｌｙＡ、ＣＤ４４、ＣＤ４５およびＨＬＡの細胞表面発現に関して陰性である。
【００８６】
ＭＳＣと生物学的および抗原的に異なるＭＡＰＣは、ＭＳＣよりも原始的な前駆細胞集団を代表し、上皮性、内皮性、神経性、筋原性、造血性、骨原性、肝臓原性、軟骨原性および脂肪原性の子孫を含む分化能力を示す（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ｃ．Ｍ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２（１１）：ｐ．５０２−８，Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９（５）ｐ．５４３−５６）。よって、ＭＡＰＣは、成体幹細胞を魅力あるものとする他の特性を保持しつつ、ＥＳ細胞の広い生物学的適応特性に負けない新しい種類の成体幹細胞を代表する。例えば、ＭＡＰＣは、それらの分化可能性を失うことなく無限の培養が可能であり、テラトーマ形成の証拠なしにＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスで、十分で長期の移植と複数の発達子孫に沿った分化を示す（Ｒｅｙｅｓ，Ｍ．ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ（２００１）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，９３８：ｐ．２３１−３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２３３−５）。ＥＳ細胞に似た複製老化から逃れる能力（他の成体幹細胞タイプではみられない性質）はこれらの細胞を臨床または研究使用する細胞発展方法の重要な要素である。
【００８７】
ＭＡＰＣは当初骨髄から単離されたが、引き続いて脳、筋肉および帯血等の他の組織から確立された（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３０（８）：ｐ．８９６−９０４）。骨組織からの付着細胞は、低血清（２％）、デキサメタゾン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦおよび他の添加物を含有する培地で豊富にさせ、高集団の二倍となるまで増殖させる。初期の培養点において、さらなる不均一性が集団中に検出されるが、多くの付着ストローマ細胞は細胞二倍３０あたりで複製老化を受け、細胞のさらに均一な集団が発展し続け、長いテロメア長を維持する。
【００８８】
ヒトのＭＡＰＣは、ＭＡＰＣの特性付けに関して具体的に援用される米国特許出願第１０／０４８，７５７号（８ページの２３〜３２行目；９ページの１〜２２行目；２１ページの１９〜３２行目；２２ページの１〜２７行目；２５ページの２０〜３１行目；２６ページ〜２８ページの１〜１３行目、２０〜２５行目；２９ページの１〜２１行目を参照）および米国特許出願第１０／４６７，９６３号（９ページの２９〜３２行目；１０ページの１〜２５行目を参照）に記載されている。
【００８９】
ＭＡＰＣは、Ｏｃｔ−４および高レベルのテロメラーゼを構成的に発現する細胞としてさらに特性付けられている（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：４１−４９）。ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物に由来するＭＡＰＣは、末期の継代細胞においてさえ非常に高いレベルのテロメラーゼを発現することが現在までに知られている唯一の正常な非悪性の体細胞（すなわち、非胚細胞）であると思われる。テロメラーゼはＭＡＰＣにおいて伸張し、それらは核型的には正常である。哺乳動物に注入されたＭＡＰＣは移動して複数の器官で同化することができる。ＭＡＰＣは自己更新型幹細胞である。そのようなものとして、それらは自己更新状態または問題の器官と適合性のある分化状態のいずれかで器官の再集団化に有用性がある。それらは、損傷したか、死んだか、または遺伝的か後天的病気のために異常な機能を有する細胞タイプと置き換わる能力を有する。
【００９０】
ＭＡＰＣは他の哺乳動物で同定されている。例えば、ネズミのＭＡＰＣは、ネズミＭＡＰＣの説明に関して具体的に編入される米国特許出願第１０／０４８，７５７号（２８ページの１５〜１８行目を参照）および米国特許出願第１０／４６７，９６３号（２２ページの２５〜３２行目；２３ページの１〜３２行目を参照）にも記載されている。
【００９１】
ＭＡＰＣ単離の方法は、記載された単離法の説明に関して具体的に編入される米国特許出願第１０／０４８，７５７号（１０ページの１７〜３２行目；１１ページの１〜１２行目；２２ページの２９〜３２行目；２３ページの１〜３２行目；２４ページの１〜２８行目；７１ページの２８〜３２行目；７２ページ〜７４ページの１〜２７行目）および米国特許出願第１０／４６７，９６３号（２６ページの１３〜３４行目；２７ページ〜２８ページの１〜２７行目）に記載されている。
【００９２】
ＭＡＰＣは、骨髄、筋肉、脳、脊髄、臍帯血液等の血液、または皮膚等の複数の起源から単離することができる。ＭＡＰＣを単離するために、骨髄単核細胞は、当業者に公知の標準的な手段により得ることのできる骨髄穿刺から得ることができる（例えば、Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，ＧＦ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．７９（１１）：１６９９−７０９；Ｂａｔｉｎｉｃ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．６（２）：１０３−７）。
【００９３】
ＭＡＰＣは骨髄（または肝臓および脳等の他の器官）内に存在するが、共通する白血球抗原ＣＤ４５または赤芽球特異的グリコホリン−Ａ（Ｇｌｙ  Ａ）を発現しない。骨髄細胞の混合集団をＦｉｃｏｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ分離に供することができる。
【００９４】
次に、細胞を、抗ＣＤ４５および抗ＧｌｙＡ抗体を用いる陰性選択に供して、ＣＤ４５＋とＧｌｙＡ＋細胞の集団を除去し、残っている約０．１％の骨髄単核細胞を回収する。細胞はフィブロネクチン被覆ウエルに塗布し、２〜４週間、下記に記載のように培養することもでき、その後に細胞からＣＤ４５＋とＧｌｙＡ＋細胞を除去する。
【００９５】
もしくは、陽性選択を使用して、白血球阻害因子（ＬＩＦ）レセプター等の細胞特異的マーカーの組み合わせを用いて細胞を単離することができる。陽性および陰性の両方の選択技術が当業者に公知であり、陰性選択目的に適する多くのモノクローナル抗体とポリクローナル抗体も公知であり（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ，Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．（１９９５）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、多くの供給者から市販されている。
【００９６】
また、細胞集団の混合物からの哺乳類細胞の分離技術は、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第５，７５９，７９３号（磁気分離）、Ｂａｓｃｈら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６：２６９（イムノアフィニテフィークロマトグラフィー）およびＷｙｓｏｃｋｉとＳａｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９７８）７５：２８４４（蛍光活性化細胞選別）にも記載されている。
【００９７】
ＭＡＰＣの培養方法は、記載された培養方法に関して具体的に編入される米国特許出願第１０／０４８，７５７号（２３ページの２５〜３２行目）および米国特許出願第１０／４６７，９６３号（２６ページの１８〜２９行目）に記載されている。
【００９８】
回収されたＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞を、５ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約７〜１０ｎｇ／ｍｌ）血清フィブロネクチンまたは他の適当なマトリックス被覆で被覆された培養皿に塗布することができる。細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来の成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）上皮成長因子（ＥＧＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、または１００〜１０，０００ＩＵ（好ましくは約１，０００ＩＵ）ＬＩＦを補い、１００〜１０−８Ｍデキサメタゾンまたは他の適当なステロイド、２〜１０μｇ／ｍｌリノール酸および０．０５〜０．１５μＭアスコルビン酸を有するダルベッコの最少基本培地（ＤＭＥＭ）または他の適当な細胞培養培地に維持することができる。他の適当な培地として、例えば、ＭＣＤＢ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭおよびＲＰＭＬがあげられる。細胞は、血清なしで、１〜２％のウシ胎児血清の存在下に、または例えば１〜２％ヒトＡＢ血清または同原血清中に維持することができる。細胞が培養される密度は約５００／ｃｍ２〜１０，０００／ｃｍ２の範囲で変えることができる。約５００／ｃｍ２以下では、細胞はよく成長せず、細胞死を受け始める。１０，０００／ｃｍ２以上では、細胞は多分化能性を失い始める。好ましい維持密度は約２，０００細胞／ｃｍ２である。
【００９９】
幹細胞の使用に関する問題は、単離された幹細胞集団の純度である。例えば、骨髄細胞は、所望の効果を得るために十分な程度まで精製できる細胞の混合集団からなる。当業者は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等のよく知られた多様な方法を用いて、集団中のＭＡＰＣのパーセントを容易に決定することができる。ＭＡＰＣを含む集団中の純度の好ましい範囲は、約５０〜５５％、５５〜６０％および６５〜７０％である。さらに好ましくは、純度は約７０〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％；最も好ましくは、純度は約８５〜９０％、９０〜９５％および９５〜１００％である。しかし、約２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％および４５〜５０％の等の低い純度を有する集団も有用でありうる。ＭＡＰＣの純度は、集団内の遺伝子発現プロフィールにしたがって決定することができる。投与量は当業者により容易に調節することができる（例えば、純度の減少は投与量の増加を必要とするだろう）。
【０１００】
本発明の方法にしたがう使用のための他の幹細胞は、すべての三生殖層に由来する細胞子孫を生じることのできる幹細胞であり、そのような細胞としてここで記載の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＡＰＣに関して、本発明に有用な他の幹細胞は、約５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％および６５〜７０％の純度を有する細胞の集団からなる。より具体的には、純度は約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％；最も好ましくは、純度は約８５〜９０％、９０〜９５％および９５〜１００％である。
【０１０１】
米国特許第６，０９０，６２５号および米国特許出願第２００３０１６６２７２号は、多分化能性であると述べられた未分化細胞を開示する。
【０１０２】
米国特許第５，８２７，７３５号は、多分化能性であると述べられた間葉系幹細胞を開示する。間葉系幹細胞は、分化するように誘導された場合に、繊維芽細胞ならびに自発的に収縮する多核構造物を形成することができる。
【０１０３】
非胎児性または出生後の動物細胞または組織に由来し、かつ自己更新および内胚葉、外胚葉および中胚葉子孫に分化しうる多分化能性（例えば、内胚葉、外胚葉および中胚葉子孫を生じうる）と述べられた胎児様幹細胞が米国特許出願第２００３０１６１８１７号に開示されている。
【０１０４】
米国特許第６，２００，８０６号および同第５，８４３，７８０号は、１年を超える期間にわたってインビトロ培養で増殖すると述べられ、染色体が正倍数性であり長期培養で変化しない核型を維持し、培養の間じゅう内胚葉、中胚葉および外胚葉組織の誘導体へと分化する潜在能力を維持し、繊維芽細胞フィーダー層上で培養された場合分化が抑制される霊長類（ヒトを含む）胎児性幹細胞を言及する。
【０１０５】
米国特許出願第２００１００２４８２５号および同第２００３０００８３９２号は、１年を超える期間にわたってインビトロ培養で増殖すると述べられ、ヒト種に特徴的なすべての染色体が存在し、長期培養で変化しない核型を維持し、培養の間じゅう内胚葉、中胚葉および外胚葉組織の誘導体へと分化する潜在能力を維持し、繊維芽細胞フィーダー層上で培養された場合分化が抑制されるヒト胎児性幹細胞を開示する。
【０１０６】
米国特許出願第２００３０１１３９１０号は、１年を超える期間にわたってインビトロ培養で増殖すると述べられ；細胞が正倍数性であり培養中変化しない核型を維持し；培養の間じゅう内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する細胞種へと分化する潜在能力を維持し、繊維芽細胞フィーダー層上で培養された場合分化が抑制される多分化能性非胎児性幹細胞を開示する。
【０１０７】
米国特許出願第２００３００７３２３４号は、少なくとも８ヶ月間のインビトロ培養後に正常な胎児性幹細胞表現型を維持することのできると述べられたクローナルヒト胎児性幹細胞系を開示する。
【０１０８】
米国特許第５，９１４，２６８号は、造血細胞、その前駆細胞および子孫への発達のために多分化能性であると述べられた多分化能性細胞集団を開示する。この多分化能性細胞集団は、胎児性幹細胞集団を培養して胚質体細胞集団を得て、次に該胚質体細胞集団を、多分化能性集団を作るのに効果的な条件下に培養することにより得られる。培養条件は胎児性芽球細胞培地を含む。
【０１０９】
米国特許出願第２００３０１５７０７８号は、単離された多分化能性前間充織、前造血前駆幹細胞を言及する。そのような細胞は、誘導成長因子およびサイトカインに対する増殖応答性により、およびそれらの形態学的および細胞化学的特徴により決定された間充織表現型と造血表現型の両方に分化する潜在能力を有すると述べられている。
【０１１０】
米国特許出願第２００３０１６１８１７号は、帯血液以外の、幹細胞の臍帯マトリックス起源から単離された幹細胞からなる培養単離物において、該単離物が分化全能の不死幹細胞からなる培養単離物を言及する。これらの細胞単離物は、１年を超える期間にわたってインビトロ培養で増殖可能と述べられ；ヒト種に特徴的なすべての染色体が存在し、長期培養で著しく変化しない核型を維持でき；培養の間じゅう内胚葉、中胚葉および外胚葉組織の誘導体へと分化する潜在能力を維持すると述べられている。
【０１１１】
米国特許出願第２００３０１８０２６９号は、多数の胎児様幹細胞を補った、産後の胎盤および臍帯血液からの幹細胞または前駆細胞からなる組成物を開示する。これらの細胞は、ｏｃｔ−４＋、ＡＢＣ−ｐ＋、ＳＳＥＡ３−およびＳＳＥＡ４−であると述べられている。同様に、米国特許出願第２００３００３２１７９号は、単離された産後の胎盤およびそれから単離された、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋の表現型を示すと述べられている細胞を開示する。
【０１１２】
米国特許出願第２００２０１６８７６３号および同第２００３００２７３３１号はホモ接合幹細胞を開示する。これらの幹細胞は、２つの卵母細胞または２つの精子細胞を融合し、卵形成中は第二の極体の突き出しを妨げ、次に第二の極体の突き出しと自発的な自己複製を適当な条件下で行うか、または２つの精子または２つの一倍体卵核を脱核卵母細胞に移入することにより、有糸分裂で活性化されたホモ接合減数分裂Ｉ後二倍体生殖細胞から作られることが述べられている。この後に、該活性化ホモ接合減数分裂Ｉ後二倍体生殖細胞を培養して、胎盤胞様塊を形成し、この胎盤胞塊の内細胞塊からホモ接合幹細胞を単離する。
【０１１３】
米国特許出願第２００２００９０７２２号は、哺乳類の卵母細胞または受精接合体（細胞質体ドナー）に由来する細胞質断片を調製する方法から得られたと述べられている、どの哺乳動物種から取ることができる細胞質体断片と細胞または核質（核ドナー）との融合物である多分化能性細胞集団を開示する。
【０１１４】
米国特許出願第２００２０１４２４５７号は、生体組織または臍血から単離された細胞であって、造血または間葉系幹細胞よりも原始的であり、内胚葉、中胚葉および外胚葉等の三生殖層のすべてに分化すると述べられている細胞を開示する。
【０１１５】
未分化のヒト胎児性幹細胞が米国特許出願第２００２０１６０５０９号に開示されている。この細胞は、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原およびＴＲＡ１−６０等、ヒト多分化能性幹細胞のマーカーに対して免疫反応性があり、ｏｃｔ−４を発現すると述べられている。
【０１１６】
米国特許出願第２００２０１６４７９４号は、ヒト臍帯血、胎盤血および／または新生児からの血液試料に由来する限定されない体幹細胞（ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＵＳＳＣ））を記載する。この体幹細胞は、間充織細胞または前駆細胞、造血子孫幹または前駆細胞、神経幹または前駆細胞または内皮幹または前駆細胞とは異なるが、これら細胞に分化できることが述べられている。
【０１１７】
非マウス胎児性幹細胞の単離集団が米国特許出願第２００２０１８８９６３号に開示されている。これらの標的ＥＳ細胞は、標的胎に由来する細胞を、マウスＥＳ細胞等の非標的ＥＳ細胞とともに培養することにより得られると述べられている。
【０１１８】
米国特許出願第２００３０２１９８６６号は、脱分化幹細胞または「幹細胞様細胞」と述べられたものを開示する。
【０１１９】
米国特許出願第２００３０２１９８９８号は、哺乳類の多分化能性幹細胞（ＭＳＣｓ）を開示する。これらの細胞は、あまり発達性のない分化細胞からさらに発達性のある分化細胞を作る方法により得ることができる。
【０１２０】
米国特許出願第２００３０１２４７２０号は、多分化能性があり生殖系列の適格な哺乳類幹細胞であると述べられたものを開示する。
【０１２１】
米国特許出願第２００３００８２８０３号は、Ｃｄｋ２等の細胞周期を変えるキナーゼの活性または発現レベルを調節することにより作られる、哺乳類（ヒトであってよい）由来の多分化能性または多分化能性関連細胞であると述べられたものを開示する。
【０１２２】
米国特許出願第２００２００８１７２４号は、胎児性幹細胞および胚質体（ＥＢｓ）の分解により単離された、胎児性幹細胞由来の細胞培養物であると述べられたものを記載する。
【０１２３】
米国特許出願第２００２００８１７２４号および同第２００２０１３７２０４号は、基本的にフィーダー細胞を含まない、霊長類の多分化能性幹（ｐＰＳ）細胞を増殖することからなる組成物であると述べられたものを開示する。
【０１２４】
米国特許出願第２００３００３２１７７号は、多分化能性または多分化能性関連細胞中で細胞分化調節分子の発現および／または活性を操作することにより分化可能性を調節する方法により得られた多分化能性または多分化能性関連細胞であると述べられたものを開示する。
【０１２５】
米国特許出願第２００３００８７４３１号は、生育不能な前胚芽に由来する細胞からなる複合胎盤胞（ＣＢｓ）から単離された幹細胞系であると述べられたものを開示する。ＣＢｓは、生育不能な前胎芽を非核形成細胞および個々の核形成細胞または細胞群に解離し；ｂ）非凝集の生育不能な前胚芽からの個々の単核細胞または単核細胞群の単離；ｃ）ホストの透明帯中の生育不能な前胎芽から単離された単核細胞または単核細胞群の集合；およびｄ）細胞の増殖および分化を可能とするように帯に包まれた細胞集合体を培養することにより作られる。
【０１２６】
本出願人は、文献の援用により、幹細胞の単離、特性付けおよび調製の説明に関して上記のすべての文献をここに具体的に編入する。
【０１２７】
本発明の方法によれば、問題のリソソーム酵素を、本発明の幹細胞における正常な遺伝子発現により作ることができる。さらに、本発明の幹細胞が問題のリソソーム酵素をコードする１つ以上の遺伝子のさらなるコピーを含むか、または内因性遺伝子を過剰発現するように幹細胞を遺伝子改変することができる。遺伝子改変幹細胞は、組換えタンパク質の強力な発現を指令するプロモーターの制御下に酵素をコードするＤＮＡを含んでよい。もしくは、該細胞は、条件が高度に制御された調節または酵素の発現のタイミングを必要とする誘導プロモーターまたは他の制御機構により調節される遺伝子を発現する。
【０１２８】
本発明の幹細胞は、それらの未修飾形に提供されるか、または治療効果を提供できる１つ以上の遺伝子を発現するように遺伝子設計してよい。
【０１２９】
例えば、本発明の幹細胞は、なかでも、β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、β−グルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、酸性リパーゼ、多スルファターゼ欠乏、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−サルフェートスルファターゼ、ヘパランスルファミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、カテプシンＫ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、カテプシンＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼＩ等のリソソーム酵素をコードする不均一ＤＮＡを含有することができる。特定の酵素の選択は、処置すべきリソソーム蓄積症の具体的な種類に依存するだろう。
【０１３０】
本発明の幹細胞は、単離された不均一ＤＮＡまたはＲＮＡを当業者に公知の多様な方法によって細胞に導入することにより、（好ましくはリソソーム酵素をコードする）不均一ＤＮＡを含むように遺伝子改変することができる。これらの方法は一般的に下記の４つのカテゴリーに分類することができる：（１）レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルスおよびウシパピローマウイルス等のＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクターの使用を含むウイルス導入；（２）リン酸カルシウムトランスフェクションおよびＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法等の化学的導入；（３）リポソーム、赤血球細胞ゴーストおよびプロトプラスト等のＤＮＡ充填膜ベシクルを用いる膜融合導入；および（４）マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは直接の「ネイキッド」ＤＮＡ導入等の物理的導入技術。
【０１３１】
本発明の幹細胞は、前選択された単離ＤＮＡの挿入により、または前選択された単離ＤＮＡによる細胞ゲノムのセグメントの置換または拡大により遺伝子改変することができ、または細胞の細胞ゲノムの少なくとも一部の欠失または不活性化により改変することができる。細胞ゲノムの少なくとも一部の欠失または不活性化は、均一組換え等の、しかし、これに限定されない多様な手段により達成することができる。一般的に、「均一組換え」とは、ＤＮＡのセグメントを、同一またはほとんど同一の他のセグメントにより置換することである。例えば、外因性ＤＮＡ分子を均一的に組換えるとは、分子のセグメント、好ましくは挿入用の所望のヌクレオチド配列に隣接するセグメントを、該外因性ＤＮＡ分子またはその一部が幹細胞ゲノムに挿入されるように幹細胞の均一ゲノムＤＮＡ配列と物理的に交換することである。均一組換えの概説に関して、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．９６８−９９７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５（３）：７０−７６を参照されたい。さらに、文献の援用により均一組換えの方法に関する全開示がすべて本文中に編入される米国特許第５，７８３，３８５号、同第５，７３３，７６１号および同第５，６４１，６７０号を参照されたい。さらに、非均一組換えの方法も、例えば米国特許第６，６２３，９５８号、同第６，６０２，６８６号、同第６，５４１，２２１号、同第６，５２４，８２４号、同第６，５２４，８１８号、同第６，４１０，２６６号、同第６，３６１，９７２号（文献の援用により非均一組換えの方法に関する全開示がすべて本文中に編入される）に記載されているように公知である。
【０１３２】
変更ゲノムは、変更ゲノムを有する前駆細胞またはその子孫が未変更ゲノムを有する前駆細胞から分化されうるように発現されるスクリーニング可能または選択可能なマーカー遺伝子の遺伝配列を含有してよい。例えば、マーカーは、緑、赤、黄色の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼであってよいが、これらの実施例に限定されない。
【０１３３】
１つ以上の前選択ＤＮＡ配列の挿入は、均一組換えによるか、または宿主細胞ゲノム中へのウイルス組込みにより達成することができる。また、所望の遺伝子配列は、プラスミド発現ベクターおよび核局在化配列を用いて、細胞、特にその核に組込むことができる。ポリヌクレオチドを核に向けさせる方法は当分野で記載されている。問題とする遺伝子を、化学薬品／薬物を用いて正または負に誘導させ、所与の薬物／化学薬品の投与後に除去するプロモーターを用いるか、または（細胞膜等の、しかしこれに限定されない）特定の細胞区分中での（タモキシフェン応答性変異エストロゲンレセプター等の、しかしこれに限定されない）化学薬品による誘導を可能とするようにラベルすることのできるプロモーターを用いて遺伝子材料を導入することができる。
【０１３４】
標的遺伝子またはポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを、単離または培養多分化能性幹細胞に導入するためにリン酸カルシウムトランスフェクションが用いられ、これは当業者にとってＤＮＡ導入の標準的な方法である。ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションも当業者に公知であり、一時的なトランスフェクションが望ましい場合、しばしばより効率的であるために、リン酸カルシウムトランスフェクションよりも好ましいであろう。本発明の細胞は単離細胞であるために、マイクロインジェクションは遺伝子物質を細胞に導入するために特に効果的でありうる。この方法は、所望の遺伝子材料を直接核に供給して、注入されたポリヌクレオチドの細胞質およびリソソーム分解を避けるので有利である。この技術は、トランスジェニック動物で生殖系列の修飾を達成するために効果的に用いられている。本発明の幹細胞は、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを用いて遺伝的に修飾することもできる。
【０１３５】
細胞を遺伝的に修飾するためのＤＮＡまたはＲＮＡのリポソーム輸送は、ポリヌクレオチドと安定な複合体を形成するカチオン性リポソームを用いて実施することができる。リポソーム複合体の安定化のために、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＱ）を加えることができる。リポソーム導入用の市販の試薬として、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎは、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニア塩化物およびＤＯＰＥの混合物である。リポソームは大きなピースのＤＮＡを運ぶことができ、ポリヌクレオチドを分解から一般的に守り、特定の細胞または組織を標的とすることができる。カチオン性脂質仲介遺伝子導入の効率は、水疱性口炎ウイルスエンベロープ（ＶＳＶ−Ｇ）の精製Ｇ糖タンパク質等の精製ウイルス成分または細胞エンベロープ成分を組込むことにより増強することができる。リポポリアミン被覆ＤＮＡを用いて、主要な確立された哺乳類細胞系へのＤＮＡの供給に効果的であると示された遺伝子導入技術を用いて、標的ＤＮＡを本発明の幹細胞に導入することができる。
【０１３６】
次に、ネイキッドプラスミドＤＮＡは、本発明の幹細胞から分化した細胞から形成された組織塊に直接注入することができる。この技術はプラスミドＤＮＡを骨格筋組織に導入するために効果的であることが示されており、この場合、マウス骨格筋での発現が一回の筋内注射後の１９ヶ月を超える期間観察された。迅速に分裂する細胞はネイキッドプラスミドＤＮＡをさらに効果的に取り込む。したがって、プラスミドＤＮＡによる処置前に細胞分裂を促進することは有利である。さらに、微小発射遺伝子導入が、遺伝子を本発明の幹細胞にインビトロまたはインビボで導入するために用いることができる。微小発射遺伝子導入の基本的な操作はＪ．ＷｏｌｆｆによりＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９４４）の１９５ページに記載された。同様に、微小粒子注射技術がすでに記載されており、方法は当業者に公知である。シグナルペプチドをプラスミドＤＮＡに結合して、該ＤＮＡをさらに効率的な発現のために核に向けさせることができる。
【０１３７】
ウイルスベクターを用いて本発明の幹細胞およびそれらの子孫を遺伝的に改変する。既に記載した物理的方法が用いられるようにウイルスベクターを用いて、標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子またはリボザイム配列等の１つ以上の核酸を細胞に投与することができる。ウイルスベクターおよびＤＮＡを細胞に運ぶためにそれらを使用する方法は当業者によく知られている。本発明の細胞を遺伝的に変えるために用いることのできるウイルスベクターの具体例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アルファウイルスベクター（例えば、シンドビスベクター）およびヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
（ｉｖ．幹細胞の投与）
本発明の幹細胞またはそれらの子孫は、カテーテル投与、全身注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、筋内、肝臓内、非経口投与、動脈内注射、側脳室への注射または胎盤内注射等の局所注射により投与することができる。例えば、ＭＡＰＣは公知の多様な方法により被験体に投与することができる。好ましくは、投与は、外科的心筋内注射、経心内膜注射、冠状血管内注射、経血管注射、筋内注射および／または静脈内注射等の、しかし、これらに限定されない注射による。注射は、所望の器官系、例えば、骨髄、肝臓、心臓組織またはその血管へ直接向けることができる。本発明の幹細胞は、マトリックス系組成物等の組織設計構造または肝臓または腎臓補助装置等の生物人工的器官の形で投与することができる。
【０１３９】
静脈内注射は細胞投与の最も簡単な方法であるが、幹細胞の帰還（“ｈｏｍｉｎｇ”）に対する高い依存度が、それら細胞が問題の組織（例えば、心筋）に到達するために必要とされる。当業者により容易に決定される注意深く調節された投与量はこの投与方法を増強する。
【０１４０】
あるサイトカインは、ＭＡＰＣまたはそれらの分化細胞の損傷筋肉組織部位への移動を変えるか、影響を与えることができる。幹細胞の障害筋肉組織への「帰還」は、成長および機能に有利な環境に内移植細胞を集中させるので必須である。さらに急性の状態では、幹細胞を末梢的もしくは局所的に循環系を経て投与することができる。帰還シグナルが強くない場合、細胞の部位への直接の注入はさらに有利な結果をもたらすだろう。帰還を促進するためにサイトカインによる患者の前処置は、本発明の方法で意図される別法である。さらに、外因性因子（例えば、サイトカイン、分化因子および抗細胞死因子）を、ＭＡＰＣ前、後または同時に投与することができる。例えば、同時投与の形は、投与前にＭＡＰＣ懸濁培地中の問題の因子を組み合わせることからなるものであろう。投与量は変えることができ、最初の投与後に次の投与を含んでよい。
【０１４１】
当業者は、組成物中および本発明の方法で投与すべき細胞の量および任意の添加物、ベヒクルおよび／または担体の量を容易に決定できる。典型的には、（活性のある幹細胞および／またはサイトカインに加えて）添加物は、リン酸緩衝塩溶液中、０．００１〜５０重量％溶液の量で存在し、有効成分は、約０．０００１〜約５重量％、好ましくは約０．０００１〜約１重量％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５重量％または約０．００１〜約２０重量％、好ましくは約０．０１〜約１０重量％、最も好ましくは約０．０５〜約５重量％などのマイクログラムからミリグラムのオーダーで存在する。もちろん、動物またはヒトに投与される組成物に関して、および投与の特定の方法に関して、適当な動物モデル、例えばマウス等のげっ歯類での致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定する等により毒性、および適当な応答を引き出す組成物の投与量、組成物中の成分濃度および組成物投与のタイミングを決定することが望ましい。そのような決定は当業者の知識、本開示およびここで挙げられた文献から、過度な実験を必要としない。連続投与の時間は過度な実験なしに確かめることができる。
【０１４２】
本発明の治療組成物を投与する場合、一般的に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方されよう。注射に適する医薬処方物として、滅菌水溶液および分散液が挙げられる。担体は、溶媒、または例えば、水、塩溶液、リン酸緩衝塩溶液、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む分散媒であってよい。
【０１４３】
さらに、抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤および緩衝液等の、組成物の安定性、滅菌性および等張性を向上させる多様な添加物を用いることができる。微生物の作用の防止は、多様な抗微生物および抗真菌物質、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確保することができる。多くの場合、等張性物質、例えば糖、塩化ナトリウム等を含ませることが望ましいだろう。注射可能な薬学形の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することにより達成することができる。しかし、本発明によれば、使用されるどのベヒクル、希釈剤または添加物も細胞と適合性のあるものでなければならない。
【０１４４】
滅菌注射可能溶液は、必要とされる量の適当な溶媒中で、本発明の実施に利用される細胞に、必要により多様な量の他の成分を配合することにより調製することができる。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明の幹細胞を最初に投与し、その後、さらなる投与により幹細胞が保持できる。例えば、本発明の幹細胞を注射の一方法により投与し、その後に異なるか同じ種類の方法によりさらに投与することができる。好ましくは、本発明の幹細胞は酵素が適当なレベルに達するまで腹腔内注射により投与することができる。次に、患者の酵素レベルを、例えば、静脈内注射により保持することができるが、患者の状態に依存しながら、他の投与形を用いることができる。本発明の幹細胞またはそれらの子孫は、カテーテル投与、全身注射、頭蓋内注射、動脈内注射、非経口投与、側脳室への注射、胎盤内注射または子宮内注射等の局所注射により胚に投与することができる。
【０１４６】
本発明の幹細胞は、マトリックス系組成物等の組織設計構造の形態で投与することができる。細胞を、それを必要とする被験体へ導入する場合に細胞生存を潜在的に高める方法は、本発明の幹細胞またはそれらの問題の分化子孫をバイオポリマーまたは合成ポリマーマトリックスへ取り込むことである。被験体の状態に基づいて、注射部位は、傷跡や他の傷害のために細胞接種や増殖に適さないことが明らかになることもある。バイオポリマーの例として、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲンおよびプロテオグリカンと混合された細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これは、含まれるサイトカインまたは分化因子を用いるか、または用いずに作ることができよう。さらに、これらは懸濁物中にあってよいが、流れに供される部位での残留時間は公称である。別のものは、細胞バイオポリマー混合物の裂け目内に取り込まれた細胞を有する三次元ゲルである。再び、分化因子またはサイトカインは細胞内に含ませることができる。これらは、ここに記載の多様な経路による注射により配置させることができる。
【０１４７】
本発明の幹細胞の治療用の使用に関する問題は、最適効果を達成するために必要な細胞の量である。同原単核骨髄細胞の現在のヒト研究において、１〜４×１０７個の細胞の実験的範囲が用いられ、勇気付けられる結果が得られている。しかし、問題の組織に注入される細胞の量を最適化するために異なるシナリオが必要であろう。例えば、投与される細胞の量は処置される被験体に応じて変えられるだろう。好ましい実施形態において、１０４〜１０８個、さらに好ましくは１０５〜１０７個および最も好ましくは３×１０７個の本発明の幹細胞および任意に５０〜５００μｇ／ｋｇ／日のサイトカインをヒト被験体に投与することができる。しかし、基質の望まれない蓄積が始まるために、効果的な量と考えられる正確な決定は被験体ごとに異なる因子、例えば被験体の大きさ、年齢、標的器官、および時間の長さに基づいてよい。したがって、投与量は、この開示および当分野での知識から当業者により容易に確かめることができる。
【０１４８】
処置が病気のプロセスの期間および有効性に比例する期間を有するように、ヒト被験体は一般的にマウスまたは他の実験動物よりも長期間処置されることに注意されたい。投与は、数日の期間にわたって単回投与または複数回投与であってよい。例えば、当業者は、この開示およびここで開示された文献および当技術の知識からの技術により、過度な実験をすることなしに、動物実験、例えば、ラット、マウス、イヌ等から、ヒトへとスケールアップすることができる。通常、処置は病気プロセスの期間および薬剤有効性および処置される被験体に比例する期間を有する。
【０１４９】
本発明の幹細胞からなる組成物の実施例として、懸濁液等の投与用液体調製物；および滅菌懸濁液または乳濁液等の注射可能な投与用調製物が挙げられる。そのような組成物は、適当な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理学的食塩水、グルコース、デキストロース等との混合物であってよい。組成物は凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路および所望の調製物に基づき、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加剤、防腐剤、香料剤、色剤等の補助物質を含むことができる。“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ”、第１７版、１９８５年（この内容は、本明細書において参考として援用される）などの標準的なテキストで調べて、過剰な実験なしに適当な調製物を作ることができる。
【０１５０】
本発明の組成物は、液体調製物、例えば、選択されたｐＨに緩衝性を持たせてよい等張水溶液、懸濁液、乳濁液または粘性組成物として提供するのが便利である。通常、液体調製物は、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのがさらに幾分か便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのさらに長い接触時間を提供する適当な粘度範囲内で処方することができる。
【０１５１】
適当な担体および他の添加剤の選択は正確な投与経路および特定の投与形、例えば液体投与形の性質（例えば、組成物を溶液、懸濁液、ゲルまたは他の液体形、例えば時間放出形または液体充填形に処方すべきかどうか）に基づくだろう。
【０１５２】
溶液、懸濁物およびゲルは、細胞以外に大量の水（好ましくは精製滅菌水）を含んでよい。少量の他の成分、例えば、ｐＨ調整剤（例えば、ＮａＯＨ等の塩基）、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤およびゲル化剤（例えば、メチルセルロース）も存在してよい。組成物は等張性であってよく、すなわち血液および涙と同じ浸透圧を有することができる。
【０１５３】
本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容される物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機または有機の溶質を用いて達成してよい。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液に特に好ましい。
【０１５４】
所望であれば、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を用いて選択されたレベルに維持できる。メチルセルロースは容易かつ経済的に利用でき、とりかかるのに容易であるために好ましい。他の適当な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は選択された薬剤に依存し、増粘剤の量は選択された粘度を達成するように用いられる。粘性組成物はそのような増粘剤の添加により溶液から調製することができる。
【０１５５】
薬学的に許容される防腐剤または細胞安定剤を用いて組成物の寿命を高めることができる。好ましくは、防腐剤が必要な場合、本発明に記載されたように本発明の幹細胞の生存性または有効性に影響を与えない組成物を選択することは十分に当業者の範囲内にある。
【０１５６】
当業者は、組成物の成分が化学的に不活性であるように選択すべきことを理解するだろう。これは、化学的および薬学的原理の当業者に問題を示さないか、もしくは、この開示およびここに挙げられた文献から、標準的な教科書を参照することにより、または簡単な実験により（過度な実験はともなわない）、問題を容易に回避することができる。
【０１５７】
特定の患者の年齢、性別、体重および状態および投与に用いられる組成物形（例えば、固体対液体）を考慮しながら、医療および獣医技術の当業者によく知られた投与量と技術により組成物を投与することができる。ヒトまたは他の哺乳類のための投与量は、本開示、ここで挙げられた文献および当分野での知識から、過度な実験なしに決定することができる。
【０１５８】
初期の投与の適当な投与計画およびさらなる投与量またはその連続的な投与の投与計画も変更可能であり、投薬計画は初期の投与およびその後の投与を含むが、それにもかかわらず、当業者により、本開示、ここで挙げられた文献および当分野での知識から確かめることができる。
【０１５９】
（ｖ．幹細胞の被験体への胎内投与）
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の幹細胞を投与することによりリソソーム酵素を被験体に胎内において提供する方法に関する。
【０１６０】
本発明の幹細胞の被験体への胎内投与は、胎児の臍静脈または肝臓への直接の注射、腹腔内注射、胎盤内注射、または胚への子宮内注射により実施できる。好ましくは、本発明の幹細胞は、６ヶ月間以内に開始する腹腔内注射により投与する。好ましくは、腹腔内投与は最初の３ヶ月に開始する。
【０１６１】
好ましい実施形態において、小児は本発明の方法により処置する。処置は、本発明の幹細胞を、産後の小児または胎内にあるうちに投与することにより行ってよい。
【０１６２】
子宮切開術または他の方法のいずれかにより細胞の直接の可視化によるか、または細胞がドナー細胞の容易な検出を可能とするマーカーとともに形質導入された場合に本発明の幹細胞の成功する周生期導入が実施され評価できる。周生期導入は超音波ガイダンスと組み合わせて用いることもできる（Ｓｕｒｂｅｋ，Ｄ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８７：９６０−３）。母方細胞または胎児細胞が胎盤を横断しているうちに、ほとんどが胎盤により除去されると思われる。よって、非母方注入が望ましい。
【０１６３】
ヒトおよび大型哺乳動物（ヤギ、ヒツジ）における胎内注入は最初の３ヶ月に実施するのが最も好ましい。胎内移植は公知であり、その技術は本明細書において参考として援用される（Ｃａｒｒｉｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４（４）：６２７−６３３；Ｃａｒｒｉｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６（１２）：４６８１−４６９０）。本発明の幹細胞は発達の初期に投与することもでき、これが、大きな移植片およびここに開示のリソソーム蓄積症に関連した出生前誕生欠損の修正をもたらすことができる。
【０１６４】
本発明の幹細胞は、第一および第二の３ヶ月間に胎児血液中に容易に検出することができる。よって、幹細胞注入は各器官系の発達中に行うことができ、ここで注入のタイミングが各器官系に特異的な期間に対応させることができる。細胞は、後に必要とされるときに（すなわち、傷害時に）利用可能な「プール」、それらの分化子孫または他の幹細胞前駆体を確立しないかもしれないので、最適な投与は誕生前および誕生後両方で複数の幹細胞注入を必要とするだろう。
【０１６５】
（ｖｉ．ＭＡＰＣの分化）
本発明の方法にしたがって、ＭＡＰＣまたはそれらの分化子孫を投与してリソソーム酵素を提供することができる。ＭＡＰＣはインビボで提供、分化させることができ、または投与前にエクスビボで分化させることができる。
【０１６６】
本発明のＭＡＰＣは、中胚葉、外胚葉および内胚葉起源の少なくとも１つの分化細胞タイプを形成するように誘導することができる。例えば、ＭＡＰＣは、少なくとも骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄ストローマ細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、造血細胞、グリアル細胞、神経細胞、オリゴデンドサイト、皮膚細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、島細胞、腸管細胞または腎臓細胞系を形成するように分化誘導できる能力を有する。
【０１６７】
よって、本発明の方法は、ＭＡＰＣの分化子孫の投与を提供し、ここで子孫細胞は、骨細胞、軟骨、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄、ストローマ、骨格筋、平滑筋、心筋、内皮細胞、上皮細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、造血細胞、グリアル細胞、神経細胞、オリゴデンドサイト、皮膚細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、島細胞、腸管細胞または腎臓細胞、または表皮の関連構造物（例えば、毛包）からなってよい。ここに記載のＭＡＰＣに由来する分化子孫を、欠乏または減少リソソーム酵素活性の特定の器官または器官系に直接投与することができる。
【０１６８】
ＭＡＰＣを、適当な増殖または分化因子、ケモカインおよびサイトカインを用いて、関与子孫および組織特異的細胞タイプを形成するように誘導分化できる。ＭＡＰＣはインビボまたはエクスビボで分化させることができる。ＭＡＰＣまたはその分化子孫は、好ましい細胞タイプへの分化を促進するためにサイトカインおよび増殖／分化因子の存在下に共投与することができる。これは、例えば特定の器官または器官系の移植が望ましい場合に有利でありうる。細胞は培養で分化できるか、または胎児中の器官または器官系の発達の進展にしたがってサイトカインおよび分化因子とともに共注入することができる。
【０１６９】
骨芽細胞を形成するために、集密的ＭＡＰＣは約１０−６〜１０−８Ｍ（好ましくは１０−７Ｍ）デキサメタゾン、β−グリセロホスフェートおよび５〜２０ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）アスコルビン酸とともに培養することができる。骨芽細胞の存在は、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（ＣａＰＯ４の銀還元）を用いるか、または骨シアロタンパク質、オステオネクチン、オステオポンチンおよびオステオカルシンに対する（免疫組織化学またはウエスタンブロットにより検出可能な）抗体を用いて検出することができる。培養の１４〜２１日後、＞８０％の細胞がこれらの抗体で陽性に染色する。
【０１７０】
軟骨芽細胞への分化を達成するために、ＭＡＰＣをトリプシン処理し、マイクロマス懸濁培養物中５０〜１００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＴＧＦ−β１を補った無血清ＤＭＥＭ中で培養することができる。軟骨の小さな凝集体が、トルイジンブルーで陽性に染色するチューブの底に検出することができる。Ｉ型コラーゲンは、当初マイクロマス全体にわたって検出することができるが（５日目）、約１４日後では、原線維軟骨の外側層で検出されるのみである。ＩＩ型コラーゲンは約５日後に検出可能となり、およそ１４日までにマイクロマスを強く染色する。骨シアロタンパク質の染色は外側原線維軟骨層で陰性または最小限に陽性であった。可変染色はオステオネクチン、オステオカルシンおよびオステオポンチンに対して可視化することができる。ＩＩ型コラーゲンの存在は、ウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲにより確認することができる。さらに、５日後に回収された細胞でのＲＴ−ＰＣＲは軟骨に特異的な転写因子であるＣＡＲＴ１とＣＤ−ＲＡＰ１の存在を示すことができる。
【０１７１】
脂肪細胞の分化を誘導するために、約１０−７〜約１０−６Ｍ（好ましくは約１０−７Ｍ）デキサメタゾン、約５０〜約２００μｇ／ｍｌ（好ましくは約１００μｇ／ｍｌ）インシュリン、または約２０％ウマ血清を補った培地を用いることができる。脂肪細胞の分化は、光学顕微鏡による検査、オイル−レッドによる染色、またはリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ａＰ２）、またはパーオキシソーム増殖因子活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲ）の検出により検出することができる。細胞マーカーの検出法は当業者に公知であり、例えば、ＰＰＡＲγに結合するトログリタゾン（ＴＲＯ）およびロシグリタゾン（ＲＳＧ）等の特定のリガンドを用いる検出を含むことができる。
【０１７２】
骨格筋細胞分化を誘導するために、集密的ＭＡＰＣは、ＭＡＰＣ膨張培地中、約１〜約３μＭ（好ましくは約３μＭ）の５−アザシチジンで２４時間処理することができる。次に、培養物を上記のＭＡＰＣ培地に維持することができる。分化をウエスタンブロットおよび免疫組織化学により評価することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨格筋分化は、当業者に公知の標準的技術を用いる免疫組織化学もしくはウエスタンブロットおよび市販の抗体を用いて、Ｍｙｆ−５、Ｍｙｏ−Ｄ、Ｍｙｆ−６、ミオゲニン、デスミン、骨格アクチンおよび骨格ミオシンの逐次的発現を検出することにより示すことができる。５−アザシチジンによる誘導の５日後、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏ−ＤおよびＭｙｆ−６転写因子を約５０％の細胞中に検出することができる。１４〜１８日後、Ｍｙｏ−Ｄは有意に低いレベルで発現されるが、Ｍｙｆ５およびＭｙｆ６は維持した。デスミンおよび骨格アクチンは、誘導後４日目の初期に検出することができ、骨格ミオシンは約１４日後に検出することができる。免疫組織化学により、７０〜８０％の細胞が約１４日後に成熟筋肉タンパク質を発現する。５−アザシチジンによる処理は、培養の一週目中に、Ｇａｔａ４およびＧａｔａ６の発現をもたらした。さらに、低いレベルのトロポニン−Ｔが約二日目以降から検出することができた。平滑筋アクチンは、誘導後２日目に検出することができ、１４日間維持した。２０％ウマ血清を加えた場合、筋原細胞の筋管への融合を見ることができる。二重免疫蛍光を用いて、形質導入筋原細胞は、異なる側方筋細胞と融合することができた。
【０１７３】
また、平滑筋は、成長因子を含まず、高濃度（約５０〜約２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を補った無血清培地でＭＡＰＣを培養することにより誘導することができる。細胞は好ましくは分化の開始時に集密的でなければならない。デスミン、平滑筋に特異的なアクチンおよび平滑筋に特異的なミオシンの発現を当業者に公知の標準的な方法により検出することによって、最終分化平滑筋細胞を同定することができる。平滑筋アクチンは約２日目以降および平滑筋ミオシンは約１４日以降に検出することができる。約７０％の細胞は抗平滑筋アクチンとミオシン抗体により陽性に染色する。ミオゲニンの存在は４日目以降およびデスミンは６日以降に見ることができる。Ｍｙｆ５とＭｙｆ６タンパク質は、２〜４日後にも検出することができ、約１５日目まで持続する。
【０１７４】
心筋分化は、約５〜約２００ｎｇ／ｍｌ（約１００ｎｇ／ｍｌ）の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を、前記のように成長因子を含まない標準的な無血清培地に加えることにより達成することができる。集密的ＭＡＰＣを３μＭ（好ましくは、約３μＭ）５−アザシチジンと１０−５〜１０−７（好ましくは１０−６Ｍ）レチン酸とにさらし、次にＭＡＰＣ膨張培地で培養することができる。もしくは、ＭＡＰＣをこれら誘導体の１つのみまたは両者の組み合わせとともに培養し、次に５０〜２００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ２または５〜２０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＢＭＰ−４および１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の組み合わせを有する無血清培地で培養することができる。心筋細胞に一致するタンパク質の発現はこれらの条件下で観察することができる。Ｇａｔａ４とＧａｔａ６はだいたい２日目の初期に発現し、およそ１５日目まで持続する。心臓トロポニン−Ｔは４日後、および心臓トロポニン−Ｉはおよそ６日目から発現するが、ＡＮＰは約１１日後に検出することができる。これらの心臓タンパク質は、１５日目に免疫組織化学により＞７０％の細胞に検出された。転写因子Ｍｙｆ６はおよそ２日目から見ることができる。デスミンの発現は６日目およびミオゲニンの発現は２日目に始まりうる。骨格アクチンも検出された。培養物を＞３週間維持すると、細胞はシンチウムを形成することができる。培養物中で起こる稀な自発的収縮が観察でき、これは数ｍｍの距離にわたって広がった。
【０１７５】
内皮細胞を形成するために、ＭＡＰＣを、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを有するＭＡＰＣ培地で無血清にて培養する。次に、細胞表面上のＣＤ３４の出現が見られ、細胞は１４日目までにｖＷＦを発現する。さらに、分化内皮細胞はＴｉｅ、Ｔｅｋ、Ｆｌｋ１およびＦｌｔｌ、ＰＥＣＡＭ、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンおよびＣＤ３６を発現する。ＶＥＧＦ誘導細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはＩＶ型コラーゲンを用いて培養した場合、血管形成が見られる。
【０１７６】
造血細胞を形成するために、ネズミとヒト再集合幹細胞をエクスビボで支持することのできる胎児肝臓由来の間充織細胞系であるＡＦＴ０２４フィーダー層によって順化された１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦと５％ＦＣＳを有するＰＤＧＦ−ＢＢとＥＧＦを含有するＭＡＰＣ培地中のＩＶ型コラーゲンにＭＡＰＣを再塗布することができる。これらの培地から回収された細胞は、ＲＴ−ＰＣＲにより検出可能なｃ−Ｋｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇａｔａ２およびＧ−ＣＳＦ−Ｒを発現するが、ＣＤ３４は発現しない。造血は胎児性内臓の内胚葉により放出される因子により誘導されるため、ヒトＭＡＰＣは、ヒトＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＴｐｏおよびＥｐｏの存在下にβ−Ｇａｌ＋ネズミＥＢｓとともに培養することができる。ＭＡＰＣをＩＬ−１ａ、ＦＣＳおよびウマ血清とともにインキュベートすることにより、「ストローマの」分化を誘導することができる。これらの細胞が造血を支持することを実証するために、フィーダー細胞を２，０００ｃＧｙで照射し、ＣＤ３４＋帯血液細胞を塗布してフィーダーに接触させることができる。１、２および５週間後、子孫をメチルセルロースアッセイで再塗布してコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数を決定することができる。ＣＦＣの３〜５倍発現はおよそ２週間後に見られ、ネズミの胎児肝臓由来のフィーダーＡＦＴ０２４と接触したＣＤ３４＋細胞の培養物と同じように、ＣＦＣの保持がおよそ５週目に見られる。
【０１７７】
造血支持フィーダーＡ−ＦＴ０２４により順化されたＥＧＦを含むＭＡＰＣ媒体中でＶＥＧＦ、造血サイトカインのＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ，ＴｐｏおよびＥｐｏで誘導されたＭＡＰＣはグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性アストロサイト、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）陽性オリゴデンドロサイトおよび神経フィラメント陽性ニューロンへと分化した。ＥＧＦとＰＤＧＦ−ＢＢとともに培養されたヒト骨髄由来のＭＡＰＣの＜５０％集密的培養物を５０〜５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ２を含む培地に切り替えると、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロンを発現する細胞への分化は２〜４週後に見ることができる。培養の二週間後、細胞はＧＦＡＰ陽性、ＧａｌＣ陽性および神経フィラメント−２００陽性である。３週間後、さらに少ない細胞がＧＦＡＰまたはＧａｌＣ陽性であるが、細胞はβ−チュブリン−ＩＩＩ、神経フィラメント−６８、神経フィラメント−１６０、神経フィラメント−２００、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）および微小管関連タンパク質−２（ＭＡＰ２）に対して陽性に染色することができる。ＧＡＢＡ、パルブアルブミン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡ−デカルボキシラーゼおよびトリプトファンヒドロキシラーゼは検出されない。１ニューロンにつき神経突起の数は分化後の２、３〜４週から増加した。アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびニューロンの特性を有する細胞への分化は、ＦＧＦ２処理の、しかし未分化ではないＭＡＰＣ中で、ウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ分析によりＧＦＡＰ、ミエリン塩基タンパク質（ＭＢＰ）および神経フィラメント−２００の存在を実証することによって確認することができる。
【０１７８】
グリオブラストーマ細胞系から最初に単離されたＦＧＦ−９は培養でグリア細胞の増殖を誘導することができる。ＦＧＦ−９は、大脳皮質、海馬、黒質、脳幹の運動核およびプルキンエ細胞層のニューロンにインビボで見られる。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）ＦＧＦ−９およびＥＧＦとともに３週間培養した場合、ＭＡＰＣはアストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびＧＡＢＡ作動性およびドーパミン作動性ニューロンを作ることができる。ＣＮＳ発達中、ソーニックヘッジホッグと組み合わせて中／後脳境界においておよび吻側前脳により発現したＦＧＦ−８は中脳および前脳のドーパミン作動性ニューロンの分化を誘導する。ＭＡＰＣが５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）ＦＧＦ−８およびＥＧＦとともに３週間培養すると、ドーパミン作動性ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンの両者が作られたことがわかった。ＦＧＦ−１０は脳中に非常に低い量で見られ、その発現は海馬、視床、中脳および脳幹に限定され、ここではグリア細胞ではなく、ニューロンに優先的に発現する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）ＦＧＦ−１０およびＥＧＦ中の３週間のＭＡＰＣの培養は、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを作ることができるが、ニューロンを作ることはできない。ＦＧＦ−４は脊索によって発現され、中脳を地域に分けるために必要である。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）ＦＧＦ−４とＥＧＦで３週間処理されると、ＭＡＰＣはアストロサイトとオリゴデンドロサイトに分化するが、ニューロンには分化しない。
【０１７９】
脳に特異的に発現し、インビボまたはインビトロで神経発達に影響を与える他の成長因子として、脳由来の神経組織栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経組織栄養因子（ＧＤＮＦ）および絨毛性神経組織栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられる。ＢＤＮＦは、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞およびニューロン前駆体のニューロンへのインビトロ分化を促進し、馬肉幹細胞のインビボでの神経突起成長を促進する神経成長因子ファミリーのメンバーである。黒質のドーパミン作動性ニューロンの生存を助けるＢＤＮＦの公知の機能にしたがって、ＭＡＰＣを５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）ＢＤＮＦおよびＥＧＦで処理すると、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンへの排他的分化が見られた。ＧＤＮＦはＴＧＦ−スーパーファミリーのメンバーである。初期の神経生成において、ＧＤＮＦは前部神経外胚葉で発現し、それがニューロン発達で重要な役割を果たしていることを示唆する。ＧＤＮＦは末梢神経と筋肉において運動ニューロンの生存を促進し、神経組織栄養能力と分化能力を有する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）ＧＤＮＦがＭＡＰＣをＧＡＢＡ作動性ニューロンとドーパミン作動性ニューロンに分化するように誘導できることがわかった。絨毛性ガングリオンから始めて単離されたＣＮＴＦはサイトカインのｇｐ１３０ファミリーのメンバーである。ＣＮＴＦは発達の初期でニューロンの生存を促進する。胎児性ラット海馬培養物において、ＣＮＴＦはＧＡＢＡ作動性ニューロンとコリン作動性ニューロンの数を増加させた。さらに、それはＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞死を妨げ、ＧＡＢＡ取り込みを促進する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＣＮＴＦの濃度は、ＭＡＰＣに対して同じＧＡＢＡ作動性誘導を及ぼして、ＣＮＴＦへの曝露のおよそ３週間後にＧＡＢＡ作動性ニューロンに排他的に分化させることができる。
【０１８０】
上皮細胞は、集密的ＭＡＰＣを１０ｎｇ／ｍＬ肝臓細胞成長因子（ＨＧＦ）のみ、またはケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）と組み合わせて処理することにより作ることができる。およそ１４日後、ＨＧＦレセプター、サイトケラチン８，１８および１９を発現した大きな上皮細胞を見ることができる。サイトケラチン−１９の存在は、胆汁上皮への起こりうる分化を示唆する。マトリックスのフィブロネクチンからコラーゲンゲルまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）への変更は、上皮細胞の形態を有するサイトケラチン−１８発現細胞の発生を向上させることができる。
【０１８１】
本発明の他の幹細胞は、よく知られた方法にしたがって分化させることができる。例えば、分化は、米国特許第５，７３３，７２７号および同第６，０１５，６７１号（そこで記載された分化方法に関して文献の援用によりここに具体的に編入する）に開示された方法にしたがって進めることができる。さらに、上記方法のパラメーターを、ＭＡＰＣ以外の本発明の幹細胞に適するように調節することは十分に当業者の技量の十分な範囲内にある。
【０１８２】
分化細胞を同定し、次にそれらを未分化の細胞から分離する方法は当分野でよく知られた方法により実施することができる。分化するように誘導された細胞は、分化細胞の数が未分化細胞の数を超えさせる条件下に細胞を選択的に培養することにより同定することができる。同様に、分化細胞は、細胞の大きさ、細胞プロセス（すなわち、樹状突起および／または分枝の形成）の数、および細胞内オルガネル分布の複雑性等、未分化細胞に存在しない形態学的な変化と特性により同定することができる。細胞レセプターや経膜タンパク質等の特異的な細胞表面マーカーの発現により分化細胞を同定する方法も意図する。これらの細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を用いて分化細胞を同定することができる。これらの細胞の検出は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、免疫蛍光および酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により達成することができる。特定遺伝子の転写アップレギュレーションの観点から、分化細胞はしばしば未分化細胞とは異なる遺伝子発現レベルを示す。逆転写ポリメラーゼ鎖リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、分化に応じる遺伝子発現の変化をモニターすることもできる。同様に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリゼーションおよび蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリゼーション等の技術を用いて、特定の細胞または組織のｍＲＮＡレベルを検出することができる。さらに、マイクロアレイ技術およびｐｒｏｔｅｏｍｉｃアレイを用いる全ゲノム分析を用いて分化細胞を同定することができる。
【０１８３】
したがって、分化細胞がいったん同定されたら、それらを必要であれば未分化細胞から分離することができる。上記に詳細に説明した同定方法は、ＦＡＣＳ、優先的細胞培養方法、ＥＬＩＳＡ、磁気ビーズおよびそれらの組み合わせ等の分離方法も提供する。ＦＡＣＳを用いて細胞表面抗原発現に基づいて細胞を同定分離することができる。
【０１８４】
下記の実施例は、本発明の細胞をどのように製造し、使用するかについての完全な開示と説明を当業者に提供するために示されるものであり、発明者が発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１８５】
（実施例１：重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）受容動物中のＭＡＰＣ移植）
ｌａｃＺレポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を含むＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６マウスの骨髄からＭＡＰＣを単離した。これらの単核骨髄細胞は内胚葉、中胚葉および外胚葉生殖層に分化することができる。骨髄単核細胞（ｎ＝２、８週齢）から、ＣＤ４５およびＧｌｙＡ陽性細胞をマイクロ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて除去した。ＣＤ４５−、ＧｌｙＡ−細胞を、６０％のＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）からなる培地（１×インシュリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）および１０−４Ｍアスコルビン酸−２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、フィブロネクチン（ＦＮ；Ｓｉｇｍａ）上の１００Ｕペニシリンおよび１０００Ｕストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、ラミニン、ＩＶ型コラーゲンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）＋２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、さらに表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）およびに白血病阻害因子（ＬＩＦ；すべてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をそれぞれ２５ｎｇ／ｍｌ補った培地）に接種した。３週間の培養後に、残りのＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞を選択し、１０細胞／ウエルで継代培養し、０．５〜１．５×１０３細胞／ｃｍ２で維持した。１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦを有するＦＮ上で培養したＭＡＰＣはＤＣ３、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ｃ−Ｋｉｔおよび主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ陰性の、発現された低いレベルのＦｌｋ１およびＳｃａ１および高いレベルのＣＤ１３およびＳＳＥＡ−１であった。
【０１８６】
ＭＡＰＣを、胎芽日１５／１６胎児ＢＡＬＢ／ｃ−ＳＣＩＤマウス、または０〜５日の範囲の新生ＢＡＬＢ／ｃ−ＳＣＩＤマウスに注入した。マウスをＭＡＰＣの導入の１０、２０および３０週間後に殺し、組織を、移植に関して免疫組織化学および定量的ＰＣＲにより調べた。通常の麻酔下に、正中線腹腔切開を実施し、妊娠ＢＡＬＢ／ｃ−ＳＣＩＤマウス（Ｅ１５／１６およびＥ１６／１７）の子宮を露出させた。個々の胎児の直接的な可視化後、（５〜１０μｌのＰＢＳ中の）１×１０６個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣを絨毛性膜および子宮壁を横切って胎児肝臓柔組織にゆっくりと注入した。
【０１８７】
受容動物の組織試料はＯＣＴ中、−８０℃で冷凍保存した。約６μｍ厚みの新鮮な凍結切片をガラススライドに乗せ、アセトン中、１０分間室温で固定し、イソタイプの血清中で２０分間インキュベートした。凍結切片を、β−ガラクトシダーゼ（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗β−ガラクトシダーゼ抗体、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に関して染色し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣ由来細胞の受容動物中の正確な組織学的位置を調べた。組織は、下記の組織特異的抗原の１つに対する抗体とともにＦＩＴＣ結合抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いて２回の色免疫蛍光によりＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣ由来細胞の組織特異的特性付けについても調べた。全サイトケラチンは肺および結腸の上皮ならびに脾臓および皮膚を染色し、アルブミンとサイトケラチン−１８は肝臓を染色した。抗マウスＩｇＧ  Ｃｙ３複合体（すべてＳｉｇｍａから入手）および核カウンターステイン（ＴＯ−ＰＲＯ−３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。工程の間では、スライドをＰＢＳで洗浄した。スライドを共焦点蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｊａｐａｎ）により調べた。共焦点像の三次元再構成のＺ−スタックシリーズを用いて２つの独立した細胞の単一のオーバーレイから真の陽性細胞から区別した。
【０１８８】
Ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣの周生期導入を受けたマウスのアルブミン染色で示されるように、ＭＡＰＣは肝臓に移植した。対照的に、ＢＡＬＢ／ｃ−ＳＣＩＤマウスはアルブミンを発現しなかった。ＭＡＰＣの存在はｌａｃＺ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）染色により確認された。脳中、ＮＦ−２００染色は陰性であり、ＭＡＰＣはニューロンに分化しないことを示した。しかし、ＧＦＡＰ染色は非常に明るく、アストロサイト細胞タイプの存在を確認した。ＭＡＰＣ移植がｌａｃＺ−ＦＩＴＣ染色により肺にも観察された；しかし、これらの細胞はサイトケラチンに対して陰性であり、ＭＡＰＣのＩＵＴ導入は、上皮細胞タイプへの分化に帰結しないことを示した。肺移植と同じように、ＭＡＰＣは腸に存在した；しかし、サイトケラチン染色も陰性であり、ＭＡＰＣは腸上皮に分化しないことを示した。ＭＡＰＣは心筋および骨格筋ならびに脾臓と皮膚にも見られた。
【０１８９】
個々の組織中の全Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣ移植を、ＮｅＯＲ遺伝子に関する定量的ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．６（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて測定した。ＮｅＯＲ遺伝子の増幅の反応条件は下記の通りであった：最初の変性後（９５℃、１０分間）、２μｌのＤＮＡ溶液、１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１５０ｎＭの各プライマーによる２工程ＰＣＲ（９５℃、１５分間および６０℃、６０秒間）の４０サイクル。ＮｅｏＲＰＣＲプライマーはＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウエアバージョン１．０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて下記のように設計した：ＮｅｏＲ−フォワード：ＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴ（配列番号１）、ＮｅｏＲ−リバース：ＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＡＴＧ（配列番号２）。コントロールのハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子増幅の反応条件は下記の通りであった：最初の変性（９５℃、１０分間）後、２μｌのＤＮＡ溶液、１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１００ｎＭの各プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による２工程ＰＣＲ（９５℃、１５分間および６０℃、６０秒間）の４０サイクル。結果を表７に示す。
【０１９０】
（表７：ＢＡＬＢ／ｃ−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＡＰＣ移植の定量的ＰＣＲ）
【０１９１】
【表７】
2007513188.tif 000009
Ｎｅｏｒ増幅は、各試料のためにＲｏｓａ２６  ＭＡＰＣおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅に標準化した。
【０１９２】
（実施例２：ハーラー症候群のネズミモデルでのＭＡＰＣ注入）
α−Ｌ−イズロニダーゼを欠乏するマウス（ＩＤＵＡ−／−；ＭＰＳ−１Ｈ）は検出可能なＩＤＵＡを持たず、骨格およびＣＮＳの異常を導くＧＡＧｓの増加レベルを持ち、進行する粗さを示す。ＭＡＰＣは基本的にＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｒｏｓａ２６マウスから実施例１に記載のように単離し、コントロールまたはＭＰＳ−１Ｈマウスに胚芽日Ｅ１５／１６または出生後日１〜３（Ｅ１５／１６の投与量：１胎児あたり百万細胞、出生後投与量：体重１グラムあたり２１５，０００または４５０，０００細胞）に注入した。ＭＡＰＣを１０、２０および３０週間で組織に帰還させた。
【０１９３】
尿を１１週から２５週まで毎週集めてＧＡＧ排出を測定した。新生日２／３ＭＰＳ−１Ｈ  ＭＡＰＣ受容動物（ｎ＝６）は、年齢に合った新生ＭＰＳ−１Ｈマウス（ｎ＝５）に比較してＧＡＧの有意に減少した排出（ｐ＜０．０５）を示した（図１）。処置マウスは出生後１０、２０および３０週目に殺し、多様な組織をＧＡＧレベルとＩＤＵＡレベルについて測定した。比色アッセイを用いて、尿中のＧＡＧレベルを測定した。およそ１５μｌの未希釈尿のアリコートを採取し、次に３５μｌのｄＨ２Ｏ、１００μｌのピクリン酸溶液（ピクリン酸の１：１０希釈物）、１００μｌの７．５ｇ／ＬのＮａＯＨ溶液のアリコートを準備した。各試料を反転により混合し、２０分間攪拌した。２０分間発色させ、２００μｌの試料溶液を９６ウエルプレートに移した。吸収をλ＝５３０ｎｍで、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ分光光度計によりモニターした。尿中のＧＡＧレベルを評価し、各尿試料に対してクレアチン値に標準化した。
【０１９４】
組織ＧＡＧｓが、１，９ジメチルメチレンブルー色素結合比色アッセイを用いて組織ホモゲネート中に検出され、全タンパク質含量に対して標準化された。組織ホモゲネート試料を０．２４Ｍ塩化グアニジニウム中に１：１０に希釈した。尿をアッセイする場合、尿も０．２４Ｍ塩化グアニジニウムで希釈した。試料のアリコートを９６ウエルプレートに入れ、２００μｌのＤＭＭＢ色素（５ｍｌの９５％エタノール中の１６ｍｇの１，９−ジメチルメチレンブルー塩化物；１ＬのｄＨ２Ｏに加えられた２ｍｌのギ酸および２ｇのギ酸ナトリウム；ＤＭＭＢ溶液をそのギ酸溶液に加える）を試料に加えた。試料をλ＝５５０ｎｍで読み、次にλ＝６５０ｎｍで読んだ。すべての値はブランク溶液から引かれ、濃度の知られているスタンダードに対して標準化した。次に、調節した吸光度をＡ６５０からＡ５５０を引くことにより計算した。
【０１９５】
ＭＰＳ−１Ｈコントロールマウスに標準化された平均ＧＡＧ値は、胎児および新生の両方のＭＰＳ−１Ｈ  ＭＡＰＣ受容動物において多くの組織で有意に減少した。調べられた各組織において、ＧＡＧ含量は、ＭＰＳ−１Ｈコントロールに比較して、ＭＰＳ−１Ｈ＋ＭＡＰＣで減少し、肺、筋肉、脾臓、回腸および脳におけるＣ５７ＢＬ／６マウスの値に近づくか、到達した。それよりも低い効果が腎臓、肝臓および結腸で観察された。
【０１９６】
胎内ＭＡＰＣ注入されたマウスからの肝臓におけるＧＡＧｓの減少した蓄積をグラフの形式で示す（図２と図３）。ＩＤＵＡレベルは図２に示されるように観察された。さらに、ＭＡＰＣが注入されたＭＰＳ−１Ｈマウスからの脳、心臓および脾臓中の減少したＧＡＧの蓄積もグラフの形式で示す（図６、図７および図８）。まず、組織の重量を計り、次に組織を冷凍チューブ中でホモゲナイズすることにより組織溶解物を調製した。ホモゲネートを遠心し、５０μｌの上清をエッペンドルフチューブ中の５０μｌのＤＨ２Ｏに加えた。次に、１ｍＬのＤＭＭＢ色素を加えた。試料を３０分間攪拌し、次に１０分間遠心（１０，４０００ｒｐｍ）した。色素を排出し、ペレットを解離剤（Ｂｌｙｓｃａｎ）によって再懸濁して、未結合の色素を遊離させた。各試料の２００μＬのアリコートを９６ウエルプレートウエルに（トリプリケートにて）加えた。組織中のＧＡＧレベルを検出するために、試料を、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーを用いて６５０ｎｍのＡＢＳで読んだ。血漿または血液試料が用いられる場合、５％ＦＢＳを有する３ｍｌのＲＰＭＩ培地を０．５ｍｌの血液に加え、３０秒間１５，０００ｒｐｍで遠心した。上層を抽出し、次にＩＤＵＡアッセイに用いた。
【０１９７】
ＩＤＵＡアッセイのために、組織溶解物を、０．０２Ｍトリス塩基、０．２５ＭのＮａＣｌおよび０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ７．４）からなる溶解緩衝液で１：１０にて希釈した。基質溶液は、まず、４２ｍｇのＢＳＡ、６ｍｌの０．１Ｍジメチルグルタレート（ＤＭＧ）および１２μｌの１．０Ｍメタ重亜硫酸水素ナトリウムを含む２×希釈緩衝液を作ることにより調製した。基質保存溶液は、０．１Ｍジメチルグルタレート緩衝液に溶解した２ｍｇのＬ−４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−イズロニドシクロヘキシルアンモニウム塩からなる。次に、基質保存溶液を２５０μｌの２×希釈緩衝液に加えた。すべての組織溶解物を氷上に置き、次にそのアリコートを基質溶液に加えた。次に、試料を３７℃の水槽中でインキュベートした。反応は１４００μｌのグリシン緩衝液（１ＬのｄＨ２Ｏ中の溶解１５ｇグリシンおよび１３．２５ｇのＮａ２ＣＯ３、ＮａＯＨでｐＨ１０．７に調節）を加えることにより停止させた。次に、各試料を黒の平底の９６ウエルプレートに加えて、蛍光をＢｉｏｓｃａｎ  Ｃｈｅｍｅｌｅｏｎプレートリーダーで、励起＝３６０ｎｍおよび発光４２５ｎｍで検出した。
【０１９８】
図３に示されるように、各ドットは、組織により分類された１動物中の値を表わす。コントロール動物は、グラフの右側部分の黒いダイアモンドにより表わす。ラインをＢ６の最大蓄積およびＭＰＳ−１Ｈマウスの最低蓄積のレベルで引かれる。記号（正方形、円、三角）は実験動物を殺すときの年齢を示している。値はＩＤＵＡ−／−または野生型コントロールの％である。ＭＡＰＣを１０６細胞／胎児で投与し、胚芽日１５／１６に注入した。肝臓ＧＡＧｓの類似の減少は、ＭＡＰＣがＭＰＳ−１Ｈマウスに出生後注入された場合に見られた（図４）。値はＩＤＵＡ−／−コントロールの％（ｎ＝５）、ｐ＝０．０２７で表わす。ＭＡＰＣを０．２１５×１０６または０．４５×１０６細胞／体重グラムの投与量で、出生後日１〜３に投与した。
【０１９９】
また、ＧＡＧ蓄積は心臓組織において評価した（図５）。上記のように、各ドットは組織により分類された１動物中の値を表わす。コントロール動物は右側に黒いダイアモンドとして示す。ラインはＢ６の最大蓄積およびＭＰＳ−１Ｈマウスの最低蓄積のレベルで引かれる。記号（正方形、円、三角）は実験動物を殺すときの年齢を示している
さらに、エコーカルジオグラムを実施して心臓機能を評価した。Ｂ６コントロールと比較して、ＭＰＳ−１Ｈマウスは左心室末端心拡張直径および縮率％の有意な減少と左心室質量の減少を示し、不十分な心筋収縮性を示す。さらに、大動脈不全（エコーカルジオグラムに検出された異常な流れにより検出）がＭＰＳ−１Ｈマウス（１０匹中１０匹）に見られたが、Ｂ６コントロールには見られなかった。ＭモードＥＣＨＯは、Ｂ６コントロールに対するＭＰＳ−１Ｈマウスの厚い心臓壁に関連した心臓機能不全を示した。コントロールＢ６マウスの心臓組織ではなく、ＭＰＳ−１Ｈマウスの心臓組織のＧＡＧ蓄積が免疫組織化学により決定された。ＭＡＰＣ注入は大動脈不全の発生を減少させた。実際、１１実験マウスのうち６匹が大動脈不全を持たなかった（表８）。
【０２００】
【表８】
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さらに、ＭＡＰＣ移植を免疫組織化学により検定した。受容動物の組織標本はＯＣＴ中、−８０℃で冷凍保存した。約６μｍ厚みの新鮮な凍結切片をガラススライドに乗せ、アセトン中、１０分間室温で固定し、イソタイプの血清中で２０分間インキュベートした。凍結切片を、β−ガラクトシダーゼ（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗β−ガラクトシダーゼ抗体、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に関して染色し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣ由来細胞の受容動物中の正確な組織学的位置を調べた。
【０２０１】
組織は、下記の組織特異的抗原の１つに対する抗体とともにＦＩＴＣ結合抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いて２回の色免疫蛍光によりＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣ−由来細胞の組織特異的特性付けについても調べた。全サイトケラチンは肺および結腸の上皮に用い、アルブミンとサイトケラチン−１８は肺のために用いた。抗マウスＩｇＧ  Ｃｙ３複合体（すべてＳｉｇｍａから入手）および核カウンターステイン（ｙｏｙｏ−１、ＰＩ）。工程の間では、スライドをＰＢＳで洗浄した。スライドを共焦点蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７０．Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｊａｐａｎ）により調べた。共焦点像の三次元再構成のＺ−スタックシリーズを用いて２つの独立した細胞の単一のオーバーレイから真の陽性細胞を区別した（陰性コントロール：ＭＰＳ−１Ｈ肝臓組織のヨウ化プロピジウムとｌａｃＺ染色；陽性コントロール：Ｒｏｓａ２５肝臓）。ＭＰＳ−１ＨマウスのＲｏｓａ２６ＭＡＰＣの周生期注入は、β−ガラクトシダーゼ染色による顕著な移植を示した。肺組織において、ＭＰＳ−１Ｈ陰性コントロールマウスは鮮明でないβ−ｇａｌ発現を有する一方で、Ｒｏｓａ２６マウスはβ−ｇａｌに対して明るい染色を有した。核はＤＮＡ特異的色素であるＹｏｙｏ−１（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により染色した。周生期に投与されたＭＡＰＣは肺において移植を示す。
【０２０２】
さらに、個々の組織における全Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｒｏｓａ２６  ＭＡＰＣ移植を、ＬａｃＺ遺伝子に関する定量的ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．６（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて測定した。ｌａｃＺ遺伝子のフォワードプライマーは以下の通りである：５’−ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’（配列番号３）。リバースプライマー配列は、５’−ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号４）である。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の３４サイクルであった。
【０２０３】
本発明の限定を意図するものではないが、組織障害は誘導シグナルまたは許容される環境を提供して、ＭＡＰＣを誘引し、それらの生存と拡大を促進する。ルシフェラーゼおよびＤｓＲＥｄ２にトランスジェニックである１０６ＭＡＰＣを４日齢の顔静脈からＭＰＳ−１Ｈイヌに注入した。ルシフェリンの腹腔内注射後、毎週５分間マウスの像を取った。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて冷光活性を分析し、擬似色スキームを用いてルシフェラーゼ活性を示した。ＭＰＳ−１Ｈマウス中のＭＡＰＣのリアルタイムトラッキングの結果は、ＭＡＰＣが、ＷＴ（コントロール）マウスとは対照的に７〜１４間の数で増加したことを示す。したがって、組織中のＧＡＧの異常なレベルがＭＡＰＣ移植を支持するだろう。
【０２０４】
前記事項はその実施形態に関連して説明してきたが、多くの詳細は説明の目的のために提示されたものであり、本発明はさらなる実施形態の影響を受け、ここに記載の詳細の一部は本発明の基本的な原理から離れずにかなり変えてもよいことは当業者に明らかであろう。
【０２０５】
本文に挙げられた各出願と特許、ならびに出願と特許のそれぞれに挙げられた各文献（各公布特許遂行中の「出願引用文献」）およびこれら出願および特許の優先権に対応し、および／またはそれを請求する各ＰＣＴおよび外国の出願または特許、および各出願引用文献で挙げられた各文献は参照によって本文中に編入する。さらに一般的には、文献一覧または本文自体のいずれかでここに挙げられ、これらの各文献ならびにここに挙げられた各文献（製造業者の明細、指示書等）が参照により本文中に編入する。特に、２０００年８月４日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２１３８７号（２００１年２月１５日にＷＯ０１／１１００１１として公告されたもの）および２００２年２月１４日出願のＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２号（２００２年８月２２日にＷＯ０２／０６４７４８として公告されたもの）（これらの内容は、本明細書において参考として援用される）を参照されたい。
【０２０６】
（文献）
全ての引用文献は、本明細書においてあたかも全体が示されるように、参考として援用される。
【０２０７】
【化１】
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【０２０８】
【化２】
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【０２０９】
【化３】
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【０２１０】
【化４】
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【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】図１は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＢ６およびＭＰＳ−１Ｈマウスの尿中ＧＡＧレベルの減少を示すグラフである。
【図２】図２は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＢ６、ＭＰＳ−１ＨマウスおよびＭＰＳ−１Ｈマウスのα−Ｌ−イズロニダーゼレベル（左のグラフ）と肝臓ＧＡＧ蓄積（右のグラフ）のグラフを示す。
【図３】図３は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＢ６およびＭＰＳ−１Ｈマウスの肝臓ＧＡＧ蓄積のドットグラフである。
【図４】図４は、誕生後にＭＡＰＣ注入を受けたＢ６およびＭＰＳ−１Ｈマウスの肝臓ＧＡＧ蓄積を示す棒グラフである。
【図５】図５は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＢ６およびＭＰＳ−１Ｈの心臓ＧＡＧ蓄積のドットグラフである。
【図６】図６は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＭＰＳ−１Ｈマウスの脳中ＧＡＧレベルの減少を示すグラフである。（ｘ軸上に挙げられた）個々のマウスからの全タンパク質（ＴＰ）あたりのＧＡＧ（ｙ軸）が示される。範囲：明るいパターン範囲のＭＰＳ−１Ｈ（ＤＵＡ−／−）マウスおよび灰色領域のＢ６ＷＴコントロール。一匹を除いてＭＡＰＣ処置マウスは正常な脳ＧＡＧレベルを有した。
【図７】図７は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＭＰＳ−１Ｈマウスの心臓中ＧＡＧレベルの減少を示すグラフである。（ｘ軸上に挙げられた）個々のマウスからの全タンパク質（ＴＰ）あたりのＧＡＧ（ｙ軸）が示される。範囲：明るいパターン範囲のＭＰＳ−１Ｈ（ＤＵＡ−／−）マウスおよび灰色領域のＢ６ＷＴコントロール。ほとんどのマウスで、心臓ＧＡＧは＜ＭＰＳ−１Ｈレベルであり、約５０％がＷＴコントロールを超えない値を有した。
【図８】図８は、胎内ＭＡＰＣ注入を受けたＭＰＳ−１Ｈマウスの脾臓中ＧＡＧレベルの減少を示すグラフである。（ｘ軸上に挙げられた）個々のマウスからの全タンパク質（ＴＰ）あたりのＧＡＧ（ｙ軸）が示される。範囲：明るいパターン範囲のＭＰＳ−１Ｈ（ＤＵＡ−／−）マウスおよび灰色領域のＢ６ＷＴコントロール。脾臓ＧＡＧは、ＭＰＳ−１ＨとＷＴコントロールとの間のレベルまで減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月15日(2006.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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