(57)【要約】本発明は、単離された遺伝子操作された宿主細胞であって、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて遺伝子操作されている宿主細胞を提供する。宿主細胞における酵素の合成によって、酵素の基質の生合成経路中間体への変換が生じ、中間体は遺伝子操作されている宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される。本発明はさらに、本遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物およびキットを提供する。本宿主細胞は、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するのに有用である。本発明はさらに、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定する方法を提供する。2007507234.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定する方法：
a）遺伝子操作された宿主細胞に候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入することによって試験細胞を産生する工程であって、ここで、遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路中間体を産生し、中間体は遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される、工程；および
b）試験細胞の増殖に対する候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程であって、ここで、増殖阻害における低下は、候補遺伝子産物が生合成経路の中間体に関与する生合成経路において活性を有することを示す、工程。
【請求項２】
外因性核酸が2つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
外因性核酸が、遺伝子操作された宿主細胞とは異なる種の細胞から単離される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
外因性核酸が、真核生物細胞または原核生物細胞から単離される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
外因性核酸が、原生動物、植物、真菌、藻類（alge）、酵母、爬虫類、両生類、哺乳動物、海洋微生物、海洋無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、クモ形類、古細菌および真正細菌から選択される生物体の細胞から単離される、請求項3記載の方法。
【請求項６】
生物体のゲノムが、生物体からの核酸の単離の前に変異される、請求項3記載の方法。
【請求項７】
外因性核酸がcDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
外因性核酸がcDNAライブラリーである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
外因性核酸がゲノムDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
外因性核酸がゲノムDNAライブラリーである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
外因性核酸が合成DNAである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
合成DNAがポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子操作された宿主細胞が、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作されており、遺伝子操作された宿主細胞における酵素の合成が、酵素の基質の生合成経路の中間体への変換を生じる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子操作された宿主細胞が原核生物細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
原核生物細胞が大腸菌（Escherichia coli）である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子操作された宿主細胞が真核生物細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
真核生物細胞が酵母細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
試験細胞から外因性核酸を単離する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
増殖阻害において低下を示す試験細胞から増殖阻害された試験細胞を、浮遊密度分離により分離する工程；および、増殖阻害の低下を示す試験細胞から外因性核酸を単離する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
生合成経路がテルペン生合成経路であり、かつ中間体がプレニル二リン酸である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子操作された宿主細胞がアセチルCoAをプレニル二リン酸に変換させる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子操作された宿主細胞が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子操作された宿主細胞が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子操作された宿主細胞が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸塩をプレニル二リン酸に変換する、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作され、かつ遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸塩の存在下で培養される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作され、かつ遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸塩の存在下で培養される、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子操作された宿主細胞が、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作され、かつ遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸塩の存在下で培養される、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
プレニル二リン酸がモノプレニル二リン酸である、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
プレニル二リン酸がポリプレニル二リン酸である、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
ポリプレニル二リン酸が、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ゲラニルファルネシル二リン酸、ヘキサプレニル二リン酸、ヘプタプレニル二リン酸、オクタプレニル二リン酸、ソラネシル（solanesyl）二リン酸、およびデカプレニル二リン酸から選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
遺伝子操作された宿主細胞が1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸をプレニル二リン酸に変換する、請求項21記載の方法。
【請求項３４】
プレニル二リン酸がモノプレニル二リン酸である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
プレニル二リン酸がポリプレニル二リン酸である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
遺伝子操作された宿主細胞が1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子操作された宿主細胞が、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
試験細胞がメチルエリトリトールの存在下で増殖される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
決定工程が、試験細胞を含む液体培養物の光学密度をモニターすること、または生存可能な試験細胞を同定することによる、請求項1記載の方法。
【請求項４０】
以下の工程を含む、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定する方法：
a）複数の遺伝子操作された宿主細胞に、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を各々が含む複数の外因性核酸を導入することによって、複数の試験細胞を産生する工程であって、ここで、遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路中間体を産生し、中間体は遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される、工程；および
b）試験細胞の増殖に対する候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程であって、ここで増殖阻害における低下は、生合成経路の中間体に関与する生合成経路において活性を有する候補遺伝子産物を同定する、工程。
【請求項４１】
宿主細胞が、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作されており、ここで、宿主細胞における酵素の合成が、酵素の基質の生合成経路の中間体への変換を生じ、中間体が遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４２】
宿主細胞が原核生物細胞である、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４３】
宿主細胞が真核生物細胞である、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４４】
宿主細胞が植物細胞である、請求項43記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４５】
遺伝子操作された宿主細胞がアセチルCoAをプレニル二リン酸に変換させる、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４６】
遺伝子操作された宿主細胞が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項45記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４７】
ヌクレオチド配列の一つまたは複数が誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項46記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４８】
ヌクレオチド配列の一つまたは複数が構成的プロモーターに機能的に連結される、請求項46記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４９】
遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸塩をプレニル二リン酸に変換する、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５０】
遺伝子操作された宿主細胞がメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項45記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５１】
ヌクレオチド配列の一つまたは複数が誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項50記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５２】
ヌクレオチド配列の一つまたは複数が構成的プロモーターに機能的に連結される、請求項50記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５３】
宿主細胞が1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸をプレニル二リン酸に変換する、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５４】
宿主細胞が、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル3-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル二リン酸/ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される、請求項53記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５５】
核酸が染色体外で維持される、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５６】
核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５７】
宿主細胞が一つまたは複数のテルペン生合成経路酵素およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されており、ライブラリーは、複数のメンバーの遺伝子操作された宿主細胞を含み、かつ各メンバーが異なるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作されている、遺伝子操作された宿主細胞のライブラリー。
【請求項５８】
請求項41記載の遺伝子操作された宿主細胞を含むキット。
【請求項５９】
生合成経路の酵素をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列が誘導性プロモーターに機能的に連結され、かつプロモーターを活性化する誘導因子をさらに含む、請求項58記載のキット。
【請求項６０】
請求項57記載の遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーを含むキット。
【請求項６１】
テルペンシンターゼを合成する陽性の対照細胞をさらに含む、請求項60記載のキット。
【請求項６２】
以下の工程を含む、細胞中の代謝経路を阻害する因子を同定する方法：
a）試験細胞と試験因子とを接触させる工程であって、ここで、試験細胞は代謝経路中間体を産生し、中間体は試験細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および
b）試験細胞の増殖に対する因子の効果を、もしあれば決定する工程であって、ここで、増殖阻害における低下は、因子が代謝経路を阻害することを示す、工程。
【請求項６３】
因子は試験細胞に導入されている外因性核酸であって、外因性核酸は候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ決定工程は、試験細胞の増殖に対する候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程を含み、ここで、増殖阻害における低下は、候補遺伝子産物が代謝経路の中間体に関与する代謝経路を阻害することを示す、請求項62記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生合成経路に関与する遺伝子の同定および単離の分野に、そして詳細には、テルペノイド生合成に関与する遺伝子の同定および単離にある。
【０００２】
相互参照
本出願は、その出願の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2003年9月29日提出の米国仮特許出願第60/507,220号の恩典を主張する。
【０００３】
連邦政府支援の研究に関する声明
米国政府は、米国国立科学財団（National Science Foundation）によって授与された助成金番号BES9911463に従って、本発明において特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
イソプレノイドは、共通の生合成起源、すなわち単独の代謝前駆体、イソペンテニル二リン酸（IPP）を有する天然の産物の極めて大きくかつ多様な群を構成する。少なくとも20,000のイソプレノイドが記載されている。当然ながら、イソプレノイドは、いわゆるイソプレン（C5）単位から構成される。イソプレノイドに存在するC原子の数は、5で割ることができる（C5、C10、C15、C20、C25、C30、およびC40）；しかしながら変則的なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されている。イソプレノイド化合物はまた、「テルペン」または「テルペノイド」とも呼ばれる。イソプレノイドの重要なメンバーとしては、カロテノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイドおよびヘミテルペンが挙げられる。カロテノイドとしては、例えば、多くは抗酸化剤として機能するリコペン、βカロテンなどが挙げられる。セスキテルペノイドとしては、例えば、抗マラリア活性を有する化合物であるアルテミシニンが挙げられる。ジテルペノイドとしては、例えば、癌の化学療法剤であるタキソールが挙げられる。
【０００５】
生合成経路に関与する遺伝子の同定および特徴づけは、基本研究および応用研究において重要である。生合成経路に関与する遺伝子の同定は典型的には、この経路に有害に影響する変異遺伝子を同定することおよびこの変異遺伝子を単離することによって行なわれる。このようなプロセスは、時間を浪費し、かつ労力を要し、そして多くの場合、対象となる生合成経路に直接関係しない遺伝子を同定することになる。新規な生合成経路遺伝子を同定するために用いられる他の標準的な方法は、以前に発見された遺伝子と同様のヌクレオチド配列を有する遺伝子の同定を含む。しかしながら、これらの方法は限界がある。なぜなら、未発見の生合成経路の遺伝子産物は、公知の生合成経路の遺伝子産物と同様の配列を保有しないかもしれないからである。従って、生合成経路に関与する遺伝子を同定する方法が当技術分野において必要である。本発明はこの必要性に取り組むものである。
【０００６】
文献
Martin et al. Nature Biotechnology 21(7):796-802(2003);Wang and Ohnuma(2000)Biochim.Biophys.Acta.1529:33-48;TrappおよびCroteau(2001)Genetics 158:811-832;Back and Chappell(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6841-6845;米国特許公開番号20030148479。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、単離された遺伝子操作された宿主細胞であって、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞を提供する。宿主細胞における酵素の合成は、酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体はこの遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される。本発明はさらに、本遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物およびキットを提供する。本宿主細胞は、生合成経路における活性を有する遺伝子産物を同定するために有用である。本発明はさらに、生合成経路における活性を有する遺伝子産物を同定する方法を提供する。
【０００８】
定義
本明細書において交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。従って、この用語としては、限定はしないが、一本鎖、二本鎖または複数鎖のDNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の化学的もしくは生化学的に改変された、非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられる。
【０００９】
本明細書において用いる場合、「オペロン」および「単一転写単位」という用語は、交換可能に用いられて、一つまたは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）によって協調して調節される2つまたはそれ以上の連続するコード領域（RNAまたはタンパク質のような遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列）を指す。本明細書において用いる場合、「遺伝子産物」という用語は、DNAによってコードされるRNAまたはタンパク質をいい、遺伝子は典型的には、タンパク質をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含み、かつイントロンおよび他の非コードヌクレオチド配列もまた含んでもよい。
【００１０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、ポリマー形態の任意の長さのアミノ酸をいい、これには、コードされたアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変されるかまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００１１】
「天然に存在する」という用語は、核酸、細胞または生物体に適用して本明細書において用いる場合、天然に見出される核酸、細胞または生物体をいう。例えば、天然の供給源から単離され得、かつ実験室でヒトによって意図的に改変されていない、生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然に存在している。一般に、「天然に存在する」という用語は、核酸、細胞または生物体であって、非病理学的（病気でない）個体に存在する、その種に代表的であるような核酸、細胞または生物体をいう。
【００１２】
「組み換え体」とは本明細書において用いる場合、特定のDNAまたはRNA配列が、天然の系において見出される相同な配列から識別可能である構造的なコード配列もしくは非コード配列を有する構造を生じる、クローニング、制限および/または連結の工程の種々の組み合わせの産物であることを意味する。一般的には、構造的なコード配列をコードするDNA配列を、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドからアセンブルして、組み換え転写単位において発現し得る合成遺伝子を得ることができる。このような配列は、真核生物の遺伝子に典型的に存在する、内部の非翻訳配列によって中断されないオープンリーディングフレーム、またはイントロンの形態で提供され得る。関連の配列を含むゲノムDNAも用いられ得る。翻訳されないDNAの配列は、オープンリーディングフレームから5’側または3’側に存在してもよく、ここではこのような配列は、コード領域の操作も発現も邪魔しない。
【００１３】
従って、例えば、「組み換え体」のポリヌクレオチドまたは核酸という用語は、天然に存在しないか、または2つの別々に分けられた配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせはしばしば、化学合成方法によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技術によって達成される。このような技術は通常、同じアミノ酸または保存的アミノ酸をコードしているが、典型的には配列認識部位を導入するかまたは除去している、重複コドンでコドンを複製するために行なわれる。または、この技術は所望の機能の核酸セグメントを一緒に繋いで、機能の所望の組み合わせを生成するために行なわれる。「組み換え体」ウイルスまたはウイルスRNAという用語は、天然に存在しないか、または2つもしくはそれ以上の別々のウイルスの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせはしばしば、化学合成方法によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば遺伝子操作技術によって達成される。
【００１４】
「構築物」とは、組み換えの核酸、一般には組み換えDNAであって、特定のヌクレオチド配列（単数または複数）の発現の目的のために生成されているもの、または他の組み換えヌクレオチド配列の構築において用いられるべきものを意味する。
【００１５】
同様に、「組み換えポリペプチド」とは、天然に存在しないか、もしくは2つの別々に分けられたアミノ酸配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるポリペプチドまたはポリタンパク質をいう。この人工的な組み合わせは、上記のような組み換えDNA技術の標準的な技術によって達成されてもよく、すなわち、組み換えポリペプチドは、組み換えポリヌクレオチドによってコードされてもよい。従って、組み換えポリペプチドは、組み換えポリヌクレオチドの全てまたは一部によってコードされるアミノ酸配列である。
【００１６】
本明細書において用いる場合、「外因性核酸」という用語は、天然には所与の細菌、生物体または細胞によって通常は産生されない核酸をいう。
【００１７】
「DNA調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、宿主細胞におけるコード配列の発現および/またはコードされたポリペプチドの産生を提供および/または調節する、転写および翻訳の制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどをいう。
【００１８】
「形質転換」という用語は、「遺伝子操作」と本明細書において交換可能に用いられ、細胞において、新規な核酸（すなわち、その細胞に対して外因性のDNA）の導入後に誘導される永続的または一過性の遺伝的変化をいう。遺伝的な変化（「改変、操作（modification）」は、宿主細胞のゲノムへの新規なDNAの組み込み、または新規なDNAのエピソームのエレメントとしての一過性もしくは安定な維持のいずれかによって達成され得る。細胞が哺乳動物細胞である場合、永続的な遺伝的変化は一般に、細胞のゲノムへのDNAの導入によって達成される。
【００１９】
「機能的に連結される」とは、そのように記載される構成要素がその意図される方式で機能することを可能にする関係である並列状態をいう。例えば、プロモーターは、このプロモーターがその転写または発現に影響する場合、コード配列に対して機能的に連結されている。本明細書において用いる場合、「異種プロモーター」および「異種制御領域」という用語は、自然状態では特定の核酸と通常関連しないプロモーターおよび他の制御領域をいう。例えば、「コード領域に対して異種の転写制御領域」とは、自然状態ではコード領域と通常は会合していない転写制御領域である。
【００２０】
「宿主細胞」とは本明細書において用いる場合、インビボまたはインビトロの真核生物細胞、原核生物細胞、または単細胞として培養された多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株）を指し、この真核生物または原核生物の細胞は、核酸（例えば、一つまたは複数の生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター）のレシピエントとして用いられ得るか、または用いられきて、かつこの核酸によって遺伝子操作されている元の細胞の子孫を含む。単独細胞の子孫は、自然の、偶発的なまたは意図的な変異に起因して、元の親と形態学的に、またはゲノムもしくは総DNA相補体で完全に同一である必要はない。「組み換え宿主細胞」（「遺伝子操作された宿主細胞」とも呼ばれる）は、核酸、例えば、一つまたは複数の生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入されている宿主細胞である。同様に、本原核生物宿主細胞は、適切な原核生物宿主細胞への外因性の核酸、例えば、この原核生物宿主細胞に対して外来である核酸の導入のおかげで遺伝子操作された原核生物宿主細胞（例えば、細菌）である；かつ本真核生物宿主細胞は、適切な真核生物宿主細胞への外因性の核酸、例えば、この真核生物宿主細胞に対して外来である核酸の導入によって遺伝子操作された真核生物宿主細胞である。
【００２１】
本明細書において用いる場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞であって、そのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にあるものを記載することを意味する。単離された遺伝子操作された宿主細胞は、遺伝子操作された宿主細胞の混合集団に存在し得る。
【００２２】
発現カセットは、転写開始領域、対象となるタンパク質のコード領域、および転写終止領域を含んで調製されてもよい。転写制御領域としては、遺伝子操作された宿主細胞において対象となるタンパク質を過剰発現するプロモーターと；誘導性因子を培養培地に添加したとき対象となるタンパク質のコード領域の転写が誘導されるような誘導性発現を提供する制御領域が挙げられる。
【００２３】
本明細書において用いる場合、「代謝性経路」という用語は、異化経路および同化経路を含む。同化経路は、エネルギーを要するプロセスである、より低分子からより高分子を構築する工程を含む。異化経路は、しばしばエネルギーを放出する、高分子を壊す工程を含む。同化経路は、本明細書においては、「生合成経路」と呼ばれる。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「プレニル二リン酸」という用語は、「プレニルピロリン酸」と交換可能に用いられ、単一のプレニル基を有するモノプレニル二リン酸（例えば、IPPおよびDMAPP）、ならびに2つまたはそれ以上のプレニル基を含むポリプレニル二リン酸を含む。モノプレニル二リン酸は、イソペンテニルピロリン酸（IPP）およびその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）を含む。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「テルペンシンターゼ」という用語は、テルペノイド化合物が産生されるように、IPP、DMAPPまたはポリプレニルピロリン酸を酵素的に改変する任意の酵素を指す。「テルペンシンターゼ」という用語は、イソプレノイドへのプレニル二リン酸の変換を触媒する酵素を含む。
【００２６】
「ピロリン酸塩」という言葉は、本明細書において、「二リン酸塩」と交換可能に用いられる。従って、例えば、「プレニル二リン酸」および「プレニルピロリン酸」という用語は、交換可能である；「イソペンテニルピロリン酸」および「イソペンテニル二リン酸」という用語は交換可能に用いられる；ファルネシル二リン酸」、「ファルネシルピロリン酸」という用語は交換可能である；などである。
【００２７】
「メバロン酸経路」または「MEV経路」という用語は、本明細書において、MEV経路中間体を通じてアセチルCoAをIPPに変換する生合成経路をいうために用いられる。
【００２８】
「1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸経路」または「DXP経路」という用語は、グリセルアルデヒド-3-リン酸およびピルビン酸をDXP経路中間体を通じてIPPおよびDMAPPに変換する経路をいうために本明細書において用いられる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「プレニルトランスフェラーゼ」という用語は、「イソプレニル二リン酸シンターゼ」および「ポリプレニルシンターゼ」（例えば、「GPPシンターゼ」、「FPPシンターゼ」、「OPPシンターゼ」など）という用語と交換可能に用いて、種々の鎖の長さのプレニル二リン酸の形成を生じる、イソペンテニル二リン酸とアリルプライマー基質との連続した1’-4縮合を触媒する酵素を指す。
【００３０】
核酸は、この核酸の一本鎖型が、適切な条件の温度および溶液イオン強度の下で他の核酸に対してアニーリングし得る場合、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAのような別の核酸に対して「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、周知であり、かつSambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989),特にその第11章および表11.1；ならびにSambrook,J. and Russell,W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(2001)に例証される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、適度に類似のフラグメント、例えば関係の遠い生物体由来の相同な配列から、極めて類似のフラグメント、例えば、関係の近い生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子についてスクリーニングするために調節され得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄によって、ストリンジェンシー条件を決定する。1セットの例示的な条件は、一連の洗浄を用いるが、これは、6×SSC（ここでSSCは、0.15M NaClおよび15mMクエン酸緩衝液である）で開始し、0.5%SDSを室温で15分間用い、次いで2×SSC、0.5% SDSを45℃で30分間繰り返し、次いで0.2×SSC、0.5%SDSを用いて50℃30分間で2回繰り返す。他のストリンジェントな条件は、より高い温度を用い、ここでは、洗浄は、0.2×SSC中での最後の2回の30分の洗浄の温度以外は上記と同一であり、0.5%SDSは60℃に上昇させた。別のセットの高度にストリンジェントな条件は、2つの最終洗浄を0.1×SSC、0.1%SDS中で65℃で用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、50℃またはそれ以上でかつ0.1×SSC（15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、溶液：50％ホルムアミド、5×SSC（150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハート溶液、10％硫酸デキストランおよび20μg/ml変性剪断サケ精子DNA中での42℃で一晩のインキュベーション、引き続く約65℃での0.1×SSC中でのフィルターの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記の代表的な条件の程度に少なくともストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。
【００３１】
ハイブリダイゼーションには、2つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチはあり得る。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのTm値が大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（高いTmに相当する）は、以下の順序で低下する。RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。100ヌクレオチド長より長いハイブリッドについては、Tmを算出するための式が誘導されている（Sambrookら、前記、9.50-9.51を参照されたい）。それより短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が、さらに重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrookら、前記、11.7-11.8を参照されたい）。一つの態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長さは少なくとも約15ヌクレオチド；少なくとも約20ヌクレオチド；または少なくとも約30ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度は、プローブの長さのような因子に従って任意で調節され得るということを認識する。
【００３２】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、同様の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリンおよびトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の基はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システインおよびメチオニンである。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリンおよびアスパラギン-グルタミンである。
【００３３】
「合成核酸」は、当業者に公知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構築ブロックからアセンブルされ得る。これらの構築ブロックは、連結およびアニーリングされて、遺伝子セグメントを形成し、次いでこれが酵素的にアセンブルされて、全体的遺伝子を構築する。「化学的に合成された」とは、DNAの配列に関して、この構成要素のヌクレオチドがインビトロでアセンブルされることを意味する。DNAの手技による化学的合成は、十分に確立された手順を用いて達成されてもよく、または自動的な化学合成は、多数の市販の機械のうちの1つを用いて行なってもよい。核酸のヌクレオチド配列は、宿主細胞のコドンによるバイアスを反映するためにヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適発現のために改変され得る。当業者は、コドン用法が宿主によって支持されるコドンに対して偏向される場合、首尾よい発現の尤度を評価する。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用される宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づき得る。
【００３４】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定のパーセントの「配列同一性」を有するということは、整列された場合、塩基またはアミノ酸の割合が2つの配列を比較した場合、同じであるということを意味する。配列類似性は、多数の異なる方式で決定され得る。配列同一性を決定するためには、配列は、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTでワールド・ワイド・ウェブにまたがって利用可能な、BLASTを含む方法およびコンピュータープログラムを用いて整列され得る。例えば、Altschul et al.(1990),J.Mol.Biol.215:403-10を参照されたい。別のアラインメントアルゴリズムは、Oxford Molecular Group, Inc.の完全所有の子会社であるMadison,Wisconsin,USAのGenetics Computing Group(GCG)パッケージにおいて利用可能なFASTAである。アラインメントのための他の技術は、Methods in Enzymology, Vol. 266の方法:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed. Doolittle, Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAの1部門であるAcademic Press, Inc.,に記載されている。特に対象となるのは、配列におけるギャップを可能にするアラインメントプログラムである。Smith-Watermanは、配列アラインメントにおけるギャップを可能にするアルゴリズムの1タイプである。Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)を参照されたい。また、NeedlemanおよびWunschのアラインメント法を用いるGAPプログラムを利用して配列を整列させてもよい。J.Mol.Biol.48:443-453(1970)を参照されたい。
【００３５】
本発明をさらに記載する前には、本発明は、記載される特定の態様に限定されず、従って当然ながら変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を記載する目的のためだけであり、限定を意図するものでなないことも理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【００３６】
ある範囲の値を示す場合、各々の間に存在する値は、文脈が明確に他を示すのでない限り下限の単位の10分の1まで、その範囲の上限と下限との間、そしてその言及される範囲における任意の他の言及される値または間に存在する値が本発明に包含されることが理解される。これらのさらに小さい範囲の上限および下限は、独立して、さらに小さい範囲に含まれてもよく、そしてまた、言及される範囲における任意の特に包含される限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。言及される範囲がその限界の1方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００３７】
他に規定しない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるのと同様であるかまたは等価な任意の方法および材料がまた、本発明の実践または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料はここに記載されている。本明細書に言及される全ての刊行物は、この方法および/または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れられ、これと関連してこの刊行物が引用される。
【００３８】
本明細書において、そして添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの（a、an）」および「この、その（the）」とは、この文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の指示対象を含むことが注目されるべきである。従って、例えば、「1つの生合成中間体」についての言及は、複数のこのような中間体を含み、「1つの核酸」についての言及は、複数のこのような核酸を含み、そして「この遺伝子操作された宿主細胞」についての言及は、一つまたは複数の遺伝子操作された宿主細胞および当業者に公知のその等価物などについての言及を含む。
【００３９】
本明細書に記載される刊行物は、本出願の出願日前には単にその開示のために提供されている。本明細書においては、本発明が先行発明の効力によってこのような刊行物に先行するという権利を有さないと承認すると解釈されるものはない。さらに、示される公開日は、正確な公開日とは異なってもよいが、これは個々に確認される必要はないかもしれない。
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は一般に、（a）遺伝子操作された宿主細胞に、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入することによって試験細胞を産生する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、生合成経路中間体を産生し、この中間体が、この遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程とを含む。この試験細胞の増殖阻害における低下は、この外因性核酸が、生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることを示す。
【００４１】
本発明はさらに、単離された、遺伝子操作された宿主細胞と；遺伝子操作された宿主細胞のライブラリーとを提供する。本遺伝子操作された宿主細胞とは、一つまたは複数の生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作され、遺伝子操作された宿主細胞を形成する宿主細胞である。宿主細胞における生合成経路の酵素（単数または複数）の合成は、この酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体は、この遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される。本発明はさらに、本遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物およびキット；ならびに本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーを含む組成物およびキットを提供する。
【００４２】
本発明は、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は一般に、（a）遺伝子操作された宿主細胞に、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入することによって試験細胞を産生する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、テルペン生合成経路中間体を産生し、この中間体が、この遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程とを含む。増殖阻害における低下は、この外因性核酸が、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることを示す。
【００４３】
図1は、ポリプレニル二リン酸ゲラニル二リン酸（GPP）、ファルネシル二リン酸（FPP）およびゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）を生成するための、プレニルトランスフェラーゼによる、イソペンテニル二リン酸（IPP）および/またはその異性体であるジメチルアリル二リン酸（DMAPP）の改変に関与するイソプレノイド経路を示す。GPPおよびFPPはさらに、それぞれ、テルペンシンターゼによって改変されてモノテルペンおよびセスキテルペンを生成する；かつGGPPはさらにテルペンシンターゼによって改変されてジテルペンおよびカロテノイドを生成する。IPPおよびDMAPPは2つの経路：メバロン酸（MEV）経路および1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸（DXP）経路のうちの1つによって生成される。図2は、MEV経路を模式的に示しており、ここではアセチルCoAはIPPへの一連の反応を介して変換される。図3は、DXP経路を模式的に示しており、ここではピルビン酸およびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸は、一連の反応を介してIPPおよびDMAPPに変換される。植物細胞以外の真核生物細胞は、MEVイソプレノイド経路を用いてアセチルコエンザイムA（アセチル-CoA）をIPPに排他的に変換し、これは引き続いてDMAPPに異性化される。植物は、イソプレノイド合成のために、MEV経路および非メバロン酸経路の両方、またはDXP経路を用いる。原核生物は、いくつかを除いて、DXP経路を用いて、分岐点を通じて別々にIPPおよびDMAPPを産生する。
【００４４】
遺伝子操作された宿主細胞
本発明は、遺伝子操作された宿主細胞；遺伝子操作された宿主細胞のライブラリー；ならびに遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物およびキットを提供する。本遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路の酵素（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸（単数または複数）で遺伝子操作されている単離された宿主細胞である；この遺伝子操作された宿主細胞は、コードされた生合成経路の酵素（単数または複数）を産生し、この酵素（単数または複数）は、生合成経路の中間体への酵素の基質の変換を生じる。適切な条件下でインビトロで培養された場合、本遺伝子操作された宿主細胞は、遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するか、またはこの遺伝子操作された宿主細胞の死滅を誘導するのに有効な量で生合成経路中間体を産生する。遺伝子操作された宿主細胞は、以下にさらに詳細に記載されるような、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するために有用である。
【００４５】
適切な条件下においてインビトロで培養された場合、本遺伝子操作された宿主細胞は、対照の細胞、例えば、生合成経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されていない同じ細胞において産生される生合成経路中間体の量よりも多い量で、細胞内において生合成経路中間体を産生する。従って、例えば、本遺伝子操作された宿主細胞は、対照の細胞、例えば、生合成経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されていない同じ細胞において産生される生合成経路中間体の量よりも、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍、またはそれ以上多い生合成経路中間体を産生する。本遺伝子操作された宿主細胞が、対照の細胞よりも多い生合成経路中間体を産生するか否かは、標準的な方法を用いてこの中間体のレベルを測定することによって容易に決定される。
【００４６】
適切な条件下においてインビトロで培養された場合、本遺伝子操作された宿主細胞は、毒性、例えば、増殖阻害および/または死亡誘導である量で、細胞内において生合成経路中間体を蓄積する。本遺伝子操作された宿主細胞が細胞内で生合成経路中間体を増殖阻害である量で蓄積するか否かは、遺伝子操作された宿主細胞の液体培養物の光学密度をモニターすることによって容易に決定される。本遺伝子操作された宿主細胞が細胞内で生合成経路中間体を、この遺伝子操作された宿主細胞の死亡を誘導する量で蓄積するか否かは、細胞の生存度をモニターすることによって、例えば、この細胞を適切な増殖培地を含有する寒天上にこの細胞の培養の間種々の時点で平板培養すること、および形成されたコロニーの数（例えば、コロニー形成単位、cfu）をカウントすることによって容易に決定される。
【００４７】
本遺伝子操作された宿主細胞によって産生される生合成経路の酵素は、いくつかの態様において、対照の細胞、例えば、生合成経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されていない同じ細胞によって産生されるこのような酵素のレベルよりも高いレベルで産生される。従って、例えば、本遺伝子操作された宿主細胞によって産生される生合成経路の酵素は、いくつかの態様において、対照の細胞、例えば、生合成経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されていない同じ細胞によって産生されるこのような酵素のレベルよりも、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも2倍、または少なくとも5倍、またはそれ以上多いレベルで産生される。
【００４８】
他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞によって産生される生合成経路の酵素は、対照の細胞、例えば、生合成経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されていない同じ細胞によって産生される酵素よりも、触媒的により活性である。
【００４９】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、一つまたは複数の生合成経路の酵素（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み；この核酸は、染色体外で維持され、例えば、エピソームで維持される。例えば、いくつかの態様において、この核酸は、この遺伝子操作された宿主細胞のゲノムに組み込まれないプラスミドまたは他の発現ベクターである。他の態様において、この核酸は、遺伝子操作された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みとしては、複数の並列の組み込み、複数の非並列の組み込み、標的化組み込み、およびランダな組み込みが挙げられる。
【００５０】
宿主細胞
遺伝子操作された宿主細胞は、多くの態様において、単細胞生物であるか、または単一の細胞として培養中で増殖される。いくつかの態様において、宿主細胞は真核生物細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、限定はしないが、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、および藻類細胞が挙げられる。適切な真核生物宿主細胞としては、限定はしないが、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピチア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピチア・コクラマ（Pichia koclamae）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピチア・オプンティア（Pichia opuntiae）、ピチア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピチア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピチア・グエルクム（Pichia guercuum）、ピチア・ピジペリ（Pichia pijperi）、ピチア・スチプチス（Pichia stiptis）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア属（Pichia sp.）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cervisiae）、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces sp.）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニダランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルケノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フサリウム属（Fusarium sp.）、フサリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、クラミドモナス・レインハルドッティ（Chlamydomonas reinhardtii）などが挙げられる。
【００５１】
他の態様において、遺伝子操作された宿主細胞は原核生物細胞である。適切な原核生物細胞としては、限定はしないが、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、などの任意の種々の実験室株が挙げられる。例えば、Carrier et al.(1992)J.Immunol.148:1176-1181;米国特許第6,447,784号;およびSizemore et al.(1995)Science 270:299-302を参照されたい。本発明において使用され得るサルモネラ（Salmonella）の株の例としては、限定はしないが、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）およびサルモネラ・チフィムリウム（S.typhimurium）が挙げられる。適切なShigella株としては、限定はしないが、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、およびシゲラ・ディセンテリア（Shigella disenteriae）が挙げられる。典型的には、実験室株は、非病原性の株である。他の適切な細菌の非限定的な例としては、限定はしないがシュードモナス・プディタ（Pseudomonas pudita）、シュードモナス・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）などが挙げられる。
【００５２】
遺伝子操作された宿主細胞を生成するためには、一つもしくは複数の生合成経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸が、限定はしないがエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクションなどを含む確立された技術を用いて、宿主細胞に安定にまたは一過性に導入される。安定なトランスフェクションのためには核酸は一般に、選択マーカー、例えば、任意のいくつかの周知の選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性などをさらに含む。
【００５３】
多くの態様において、宿主細胞を遺伝子操作する核酸は、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。適切な発現ベクターとしては、限定はしないが、バキュロウイルスベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40、単純ヘルペスウイルスなど）、P1ベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体および対象となる特定の宿主（例えば、大腸菌および酵母）に特異的な任意の他のベクターが挙げられる。従って、例えば、生合成経路遺伝子産物（単数または複数）をコードする核酸は、生合成経路遺伝子産物（単数または複数）を発現するための種々の発現ベクターのうちのいずれか1つに含まれる。このようなベクターとしては、染色体、非染色体および合成のDNA配列が挙げられる。
【００５４】
多くの適切な発現ベクターが当業者に公知であり、かつ多くが市販されている。以下のベクターが例として提供される；細菌の宿主細胞については:pQEベクター(Qiagen)、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、λ-ZAPベクター(Stratagene);pTrc99a、pKK223-3、pDR540、およびpRIT2T(Pharmacia);真核生物宿主細胞については:pXTl、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLSV40 (Pharmacia)。しかしながら、宿主細胞と適合される限り、任意の他のプラスミドまたは他のベクターが用いられてもよい。
【００５５】
生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は発現ベクター中で適切な発現制御配列（単数または複数）（プロモーター）に機能的に連結されて、コードされた遺伝子産物の合成を指向する。利用される宿主/ベクター系に依存して、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む多数の適切な転写および翻訳制御エレメントが発現ベクター中で用いられ得る（例えば、Bitter et al.(1987)Methods in Enzymology,153:516-544を参照されたい)。
【００５６】
原核生物宿主細胞における使用のために適切なプロモーターとしては、限定はしないが、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター;trpプロモーター;lacオペロンプロモーター;ハイブリッドプロモーター、例えば、lac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター;trcプロモーター;tacプロモーターなど;araBADプロモーター;インビトロ調節プロモーター、例えば、ssaGプロモーターまたは関連のプロモーター(例えば、米国特許出願第20040131637号),pagCプロモーター(PulkkinenおよびMiller, J.Bacteriol., 1991:173(1):86-93;Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992;89(21):10079-83)、nirBプロモーター(Harborne et al.(1992)Mol Micro.6:2805-2813)、など(例えば、Dunstan et al.(1999)Infect.Immun.67:5133-5141;McKelvie et al.(2004)Vaccine22:3243-3255;およびChatfield et al.(1992)Biotechnol.10:888-892を参照されたい);σ70プロモーター、例えば、コンセンサスσ70プロモーター(例えば、GenBankアクセッション番号AX798980、AX798961、およびAX798183を参照されたい);静止期プロモーター、例えば、dpsプロモーター、spvプロモーターなど;病原性アイランドSPI-2由来プロモーター(例えば、W096/17951を参照されたい);actAプロモーター(例えば、Shetron-Rama et al.(2002)Infect.Immun.70:1087-1096を参照されたい);rpsMプロモーター(例えば、Valdivia and Falkow(1996).Mol.Microbiol.22:367-378を参照されたい);tetプロモーター(例えば、Hillen, W.およびWissmann, A.(1989)In Saenger, W.およびHeinemann, U.(eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan, London,UK, Vol.10,pp.143-162);SP6プロモーター(例えば、Melton et al.(1984)Nucl.Acids Res.12:7035-7056を参照されたい);などが挙げられる。
【００５７】
適切な真核生物プロモーターの非限定的な例としては、CMV極初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。この発現ベクターはまた、翻訳開始および転写終止のためのリボソーム結合部位を含んでもよい。この発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。
【００５８】
さらに、発現ベクターは、多くの態様において、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質、例えば、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性など、または大腸菌のような原核生物宿主細胞においてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などを提供する、一つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含む。
【００５９】
一般的には、組み換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、例えば、大腸菌のアンピリシン耐性遺伝子、サッカロミセス・セレビシエTRP1遺伝子など；および生合成経路遺伝子産物をコードする配列の転写を指向する高度発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）、α因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックプロテインのような糖分解酵素をコードするオペロンに由来し得る。
【００６０】
多くの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、この生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結される。誘導性プロモーターは、当技術分野において周知である。適切な誘導性プロモーターとしては、限定はしないが、バクテリオファージλのpL;Plac;Ptrp;Ptac(Ptrp-lacハイブリッドプロモーター);イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)-誘導性プロモーター、例えば、lacZプロモーター;テトラサイクリン誘導性プロモーター;アラビノース誘導性プロモーター、例えば、PBAD(例えば、Guzman et al(1995)J.Bacteriol.177:4121-4130);キシロース誘導性プロモーター、例えば、Pxyl(例えば、Kim et al.(1996)Gene 181:71-76を参照されたい);GAL1プロモーター;トリプトファンプロモーター;lacプロモーター;アルコール誘導性プロモーター、例えば、メタノール誘導性プロモーター、エタノール誘導性プロモーター;ラフィノース誘導性プロモーター;熱誘導性プロモーター、例えば、熱誘導性λPLプロモーター、熱感受性リプレッサーによって制御されるプロモーター(例えば、CI857-抑制λベース発現ベクター（CI857-repressed lambda-based expression vectors）;例えば、Hoffmann et al.(1999)FEMS Microbiol Lett.177(2):327-34を参照されたい);などが挙げられる。
【００６１】
多くの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに対して機能的に連結される。原核生物細胞における使用のために適切な構成的プロモーターは、当技術分野において公知であり、かつこれらに限定しないが、σ70プロモーター、例えば、コンセンサスσ70プロモーターが挙げられる。
【００６２】
酵母では、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多数のベクターが用いられ得る。概説については、Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish.Assoc. & Wiley Interscience, Ch.13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987,Acad.Press,N.Y., Vol.153,pp.516-544;Glover, 1986, DNA Cloning, Vol.II,IRL Press,Wash.,D.C., Ch.3;およびBitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology,Eds.Berger & Kimmel,Acad.Press,N.Y., Vol.152,pp.673-684;およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols.I and IIを参照されたい。構成的な酵母プロモーター、例えば、ADHもしくはLEU2、または誘導性プロモーター、例えばGALが用いられ得る(Cloning in Yeast, Ch.3, R.Rothstein In:DNA Cloning Vol.11, A Practical Approach, Ed. DM Glover,1986,IRL Press,Wash.,D.C.)。または、酵母染色体への外来DNA配列の組み込みを促進するベクターが用いられ得る。
【００６３】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路における単一の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。他の態様において、本宿主細胞は、生合成経路における、2つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される。例えば、この核酸は、いくつかの態様において、生合成経路における第一および第二の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、この核酸は、生合成経路における第一、第二、および第三の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、この核酸は、生合成経路における第二、第三、および第四の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、この核酸は、生合成経路における第三、第四、および第五の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、この核酸は、生合成経路における第四、第五、および第六の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、この核酸は、生合成経路における第一、第三、および第五の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
宿主細胞を遺伝子操作して生合成経路における2つまたはそれ以上の遺伝子産物を発現させる場合、2つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、いくつかの態様において、各々別の発現ベクターに含まれる。宿主細胞を遺伝子操作して生合成経路における2つまたはそれ以上の遺伝子産物を発現させる場合、この2つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、いくつかの態様において、単一の発現ベクターに含まれる。2つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が単一の発現ベクターに含まれる場合、いくつかの態様において、このヌクレオチド配列は、共通の制御エレメント（例えば、プロモーター）に機能的に連結され、例えば、共通の制御エレメントは単一の発現ベクター上の全ての生合成経路遺伝子産物コードヌクレオチドの発現を制御する。
【００６５】
いくつかの態様において、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能的に連結される。他の態様において、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上の生合成経路遺伝子産物が、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列によってコードされる場合、このヌクレオチド配列の1つは、誘導性プロモーターに機能的に連結され、そして他のヌクレオチド配列の一つまたは複数が、構成的プロモーターに機能的に連結される。
【００６６】
テルペン生合成経路酵素をコードする核酸を用いて遺伝子操作された宿主細胞
テルペン生合成経路遺伝子産物を発現するために遺伝子操作された宿主細胞の説明は以下である。以下の説明は、例を提供することを意図しており、限定を意図していないことに注意すべきである。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、テルペン生合成経路における遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された原核生物宿主細胞である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、テルペン生合成経路における遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された真核生物宿主細胞である。
【００６７】
テルペン生合成経路において、毒性中間体（例えば、本遺伝子操作された宿主細胞において蓄積された場合、細胞増殖を阻害、および/または細胞死を誘導する中間体）としては、限定はしないが、HMG-CoA、IPP、DMAPP、およびポリプレニル二リン酸（例えば、GPP、FPP、GGPP、GFPP、HexPP、HepPP、OPP、SPP、DPP、NPP、UPP、など)が挙げられる。
【００６８】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路において活性である遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞が、MEV経路における遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である場合、この宿主細胞は、MEV経路の酵素をコードする内因性遺伝子を欠く細胞である。他の態様において、この宿主細胞は、機能的な内因性MEV経路を有する；しかしながら、内因性MEV経路は、増殖を阻害するかまたは毒性であるレベルのテルペン生合成経路中間体は産生しない。
【００６９】
他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路において活性である遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞が、DXP経路における遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である場合、この宿主細胞とは、DXP経路の酵素をコードする内因性遺伝子を欠く細胞である。他の態様において、この宿主細胞は、機能的な内因性DXP経路を有する；しかしながら、内因性DXP経路は、増殖を阻害するかまたは毒性であるレベルのテルペン生合成経路中間体は産生しない。
【００７０】
いくつかの態様において、各々のテルペン生合成経路遺伝子産物は、別々の核酸上でコードされる。他の態様において、2つまたはそれ以上のテルペン生合成経路遺伝子産物が、1つの発現ベクター上でコードされる。例えば、いくつかの態様において、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列が、別々の核酸上に、例えば、別の発現ベクター上に存在する。他の態様において、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIのうちの2つまたはそれ以上をコードするヌクレオチド配列が、単一の核酸上に、例えば、単一の発現ベクター上に存在する。別の例で、いくつかの態様において、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列が、別の核酸上に存在する。他の態様において、2つまたはそれ以上の1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列が、単一の核酸上に、例えば、単一の発現ベクター上に存在する。
【００７１】
いくつかの態様において、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能的に連結される。他の態様において、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上の生合成経路遺伝子産物は、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列によってコードされ、このヌクレオチド配列の1つが誘導性プロモーターに機能的に連結され、かつ他のヌクレオチド配列の一つまたは複数が構成的プロモーターに機能的に連結される。例えば、いくつかの態様において、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼのうちの、一つもしくは複数をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて、宿主細胞は遺伝子操作され、1つのヌクレオチド配列（例えば、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列）は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、かつ1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに対して機能的に連結される。別の非限定的な例として、ある実施例では、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPK、およびIDIのうちの、一つもしくは複数をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて、宿主細胞は遺伝子操作され、1つのヌクレオチド配列、1つのヌクレオチド配列（例えば、アセトアセチル-CoAチオラーゼをコードするヌクレオチド配列、またはMKをコードするヌクレオチド配列）は誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、かつ他のMEV経路の酵素のうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列が構成的プロモーターに対して機能的に連結される。
【００７２】
いくつかの態様において、テルペン生合成経路の酵素のうちの2つまたはそれ以上が単一の転写単位（「オペロン」）に配置される。これらの態様のいくつかにおいて、テルペン生合成経路の酵素をコードするオペロン中のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターに対して機能的に連結される。他の態様において、テルペン生合成経路の酵素をコードするオペロンのヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに対して機能的に連結される。このようなオペロンの例示的、非限定的な例については、例えば、図13を参照されたい。
【００７３】
MEV経路
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路（図2）において活性である遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの態様において、MEV経路の遺伝子産物の各々は、別の核酸上でコードされる。他の態様において、MEV経路遺伝子産物の2つまたはそれ以上が単一の核酸上にコードされる。いくつかの態様において、各々のテルペン生合成経路遺伝子産物は、別の核酸上でコードされる。他の態様において、2つまたはそれ以上のテルペン生合成経路遺伝子産物が、発現ベクター上にコードされる。例えば、いくつかの態様において、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列は、別々の核酸上に存在する。他の態様において、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIのうちの2つまたはそれ以上をコードするヌクレオチド配列が、単一の核酸上に、例えば、単一の発現ベクター上に存在する。
【００７４】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、テルペン合成のメバロン酸（MEV）経路の最初の3つの酵素であり（図2を参照されたい）、メバロン酸の合成を行なう、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMGS）、およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMGR）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。別の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、テルペン生合成経路における最後の3つの酵素であり、かつIPPを生じる（図2を参照されたい）、メバロン酸キナーゼ（MK）、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（MPD）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、MK、PMK、MPD、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（IDI）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。
【００７５】
他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、MK、PMK、およびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される宿主細胞である。他の態様において、宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMKおよびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞である。対象となる特定の態様において、この遺伝子操作された宿主細胞は、原核生物細胞である。
【００７６】
対象となる特定の態様において、遺伝子操作された宿主細胞とは、MEV経路遺伝子産物をコードする核酸で遺伝子操作される原核生物細胞である。従って、いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、MK、PMKおよびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、MK、PMKおよびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMKおよびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。
【００７７】
典型的には、上記のように、MEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクターである。広範な種々の発現ベクターが当技術分野において公知であり、かつ多数の適切な発現ベクターが本明細書において上記で考察されている。多くの態様において、発現ベクターとは、原核生物細胞における使用に適切であるベクターである。いくつかの態様において、MEV経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能的に（例えば、誘導性プロモーターの転写制御下に）連結される。誘導性プロモーターは、当技術分野において周知であり、多数の適切な誘導性プロモーターが本明細書において上記で考察される。
【００７８】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）であり、このヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸は、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、MK、PMKおよびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）であり、このヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸は、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）であり、このヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸は、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸が、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである第一の核酸；ならびに、MK、PMKおよびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸が、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである第二の核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸が、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである第一の核酸；ならびに、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結され、この核酸が、原核生物細胞において核酸の発現を果たすための使用に適切な発現ベクターである第二の核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。いくつかの態様において、この誘導性プロモーターはPLACプロモーターである。
【００７９】
これらの態様のいくつかにおいて、ヌクレオチド配列は、単一の転写単位（「オペロン」に整列される。例えば、図13を参照されたい。例えば、いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、単一の転写単位に整列され、かつ誘導性プロモーターに対して機能的に連結された、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、単一の転写単位に整列され、かつ誘導性プロモーターに対して機能的に連結された、MK、PMK、およびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、単一の転写単位に整列され、かつ誘導性プロモーターに対して機能的に連結された、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、上記のオペロンの2つを用いて遺伝子操作されている原核生物細胞（例えば、大腸菌）である。
【００８０】
MEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において公知であり、かつ任意の公知のMEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を用いて、本遺伝子操作された宿主細胞を生成することができる。例えば、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。以下は、MEV経路遺伝子産物をコードする公知のヌクレオチド配列の非限定的な例であり、カッコ内は各々のMEV経路酵素のGenBankアクセッション番号および生物体である。アセトアセチル-CoAチオラーゼ:(NC＿000913 REGION:2324131..2325315;大腸菌)、(D49362;パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）)、および(L20428;サッカロミセス・セレビシエ);HMGS :(NC＿001145.相補体19061..20536;サッカロミセス・セレビシエ)、(X96617;サッカロミセス・セレビシエ)、(X83882; シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）)、(AB037907;キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola）)、および(BT007302;ヒト（Homo sapiens）);HMGR :(NM＿206548;キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）)、(NM＿204485;ニワトリ（Gallus gallus）)、(AB015627;Streptomyces sp.KO-3988)、(AF542543;ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）)、(AB037907;Kitasatospora griseola)、(AX128213、短縮型HMGRをコードする配列の場合;サッカロミセス・セレビシエ)、および(NC＿001145:相補体(115734..118898;サッカロミセス・セレビシエ));MK:(L77688;シロイヌナズナ)、および(X55875;サッカロミセス・セレビシエ);PMK:(AF429385;バラゴムノキ（Hevea brasiliensis）)、(NM＿006556; ヒト)、(NC＿001145.相補体712315..713670;サッカロミセス・セレビシエ);MPD:(X97557;サッカロミセス・セレビシエ)、(AF290095;エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）)、および(U49260;ヒト);およびIDI:(NC＿000913＿3031087..3031635;大腸菌)、および(AF082326;ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）)。
【００８１】
任意の公知のMEV経路の酵素のコード配列は、このコードされた酵素のアミノ酸配列において標的化された変化を生じるように、当技術分野において公知の種々の方法において変化され得る。変種MEV経路酵素のアミノ酸は通常、任意の公知のMEV経路の酵素のアミノ酸配列に対して実質的に同様であり、すなわち、少なくとも1アミノ酸ずつ異なり、かつ少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、または少なくとも20アミノ酸ずつ異なってもよいが、典型的には、約50アミノ酸を超えない。この配列の変化は、置換であっても、挿入であっても、または欠失であってもよい。例えば、以下に記載されるように、このヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞のコドンのバイアスについて変更され得る。さらに、このコードされたタンパク質において保存的なアミノ酸変化を生じる、一つまたは複数のヌクレオチド配列の相違が導入されてもよい。
【００８２】
DXP経路
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路（図3）において活性である遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの態様において、DXP経路の遺伝子産物の各々は、別の核酸上でコードされる。他の態様において、DXP経路遺伝子産物の2つまたはそれ以上が単一の核酸上にコードされる。一般に、DXP経路の遺伝子産物をコードする核酸は発現ベクターである。多くの態様において、DXP経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結される。
【００８３】
例えば、いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ（「Dxs」）、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ（「IspC」）、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ（「IspD」）、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ（「IspE」）、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ（「IspF」）、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（「IspG」）、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ（「IspH」）（DXP経路の酵素1〜7）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて改変された宿主細胞である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ（DXP経路の酵素3〜7）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作された宿主細胞である。
【００８４】
対象となる特定の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、真核生物細胞（例えば、酵母細胞）である。従って、いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ（「Dxs」）、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ（「IspC」）、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ（「IspD」）、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ（「IspE」）、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ（「IspF」）、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（「IspG」）、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ（「IspH」）（DXP経路の酵素1〜7）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作された真核生物細胞（例えば、酵母細胞）である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞とは、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ（DXP経路の酵素3〜7）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作された真核生物細胞（例えば、酵母細胞）である。
【００８５】
プレニルトランスフェラーゼ
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、上記のような、一つまたは複数のテルペン生合成経路遺伝子産物（例えば、MEV経路酵素、またはDXP経路酵素）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むように遺伝子操作される。これらの態様において、この遺伝子操作された宿主細胞は、プレニルトランスフェラーゼを合成し、その産物が遺伝子操作された宿主細胞の増殖阻害である。
【００８６】
プレニルトランスフェラーゼは、種々の鎖の長さのプレニル二リン酸の形成を生じるIPPの連続した縮合を触媒する酵素の広範な群を構成する。適切なプレニルトランスフェラーゼとしては、約5イソプレン単位〜約6000イソプレン単位以上、例えば、約5イソプレン単位〜約10イソプレン単位、約10イソプレン単位〜約15イソプレン単位、約15イソプレン単位〜約20イソプレン単位、約20イソプレン単位〜約25イソプレン単位、約25イソプレン単位〜約30イソプレン単位、約30イソプレン単位〜約40イソプレン単位、約40イソプレン単位〜約50イソプレン単位、約50イソプレン単位〜約100イソプレン単位、約100イソプレン単位〜約250イソプレン単位、約250イソプレン単位〜約500イソプレン単位、約500イソプレン単位〜約1000イソプレン単位、約1000イソプレン単位〜約2000イソプレン単位、約2000イソプレン単位〜約3000イソプレン単位、約3000イソプレン単位〜約4000イソプレン単位、約4000イソプレン単位〜約5000イソプレン単位、または約5000イソプレン単位〜約6000イソプレン単位以上を有するイソプレノイド化合物を形成する、IPPとアリルプライマー基質との縮合を触媒する酵素が挙げられる。
【００８７】
適切なプレニルトランスフェラーゼとしては、限定はしないが、ゲラニル二リン酸（GPP）シンターゼ、ファルネシル二リン酸（FPP）シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）シンターゼ、ヘキサプレニル二リン酸（HexPP）シンターゼ、ヘプタプレニル二リン酸（HepPP）シンターゼ、オクタプレニル（OPP）二リン酸シンターゼ、ソラネシル二リン酸（SPP）シンターゼ、デカプレニル二リン酸（DPP）シンターゼ、チクルシンターゼおよびガッタ・パーチャシンターゼを含むE-イソプレニル二リン酸シンターゼ；ならびに、限定はしないが、ノナプレニル二リン酸（NPP）シンターゼ、ウンデカプレニル二リン酸（UPP）シンターゼ、デヒドロドリチル（dehydrodolichyl）二リン酸シンターゼ、エイコサプレニル二リン酸シンターゼ、天然ゴムシンターゼ、および他のZ-イソプレニル二リン酸シンターゼを含むZ-イソプレニル二リン酸シンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
様々な種由来の多数のプレニルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列が公知であり、かつ本遺伝子操作された宿主細胞の生成における使用のために用いられるか、または改変され得る。プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、ヒトファルネシルピロリン酸シンターゼmRNA(GenBankアクセッション番号J05262;ヒト);ファルネシル二リン酸シンターゼ(FPP)遺伝子(GenBankアクセッション番号J05091;サッカロミセス・セレビシエ);イソペンテニル二リン酸:ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ遺伝子(J05090; サッカロミセス・セレビシエ);WangおよびOhnuma(2000)Biochim.Biophys.Acta1529:33-48;米国特許第6,645,747号;シロイヌナズナファルネシルピロリン酸シンターゼ2(FPS2)/FPPシンターゼ2/ファルネシル二リン酸シンターゼ2(At4g17190)mRNA(GenBankアクセッション番号NM＿202836);Ginkgo bilobaゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(ggpps)mRNA(GenBankアクセッション番号AY371321);シロイヌナズナゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(GGPS1)/GGPPシンターゼ/ファルネシルトランスフェラーゼ(At4g36810)mRNA(GenBankアクセッション番号NM＿119845);ファルネシル、ゲラニルゲラニル、ゲラニルファルネシル、ヘキサプレニル、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼのシネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）遺伝子(SelF-HepPS)(GenBankアクセッション番号AB016095);などを参照されたい。
【００８９】
いくつかの態様において、宿主細胞は、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される。例えば、いくつかの態様において、宿主細胞は、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ならびにGPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される。1つの非限定的な例として、いくつかの態様において、宿主細胞は、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびファルネシルトランスフェラーゼシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される。
【００９０】
他の態様において、宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される。例えば、いくつかの態様において、宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびGPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される。1つの非限定的な例として、いくつかの態様において、宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；ならびに、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、およびファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸で遺伝子操作される。
【００９１】
いくつかの態様において、宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作される。例えば、いくつかの態様において、宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ、ならびにGPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作される。
【００９２】
いくつかの態様において、宿主細胞は、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作される。例えば、いくつかの態様において、宿主細胞は、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、ならびにGPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を用いて遺伝子操作される。
【００９３】
コドン用法
いくつかの態様において、生合成経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列が特定の宿主細胞についてのコドン優先性を反映するように改変される。例えば、ヌクレオチド配列はいくつかの態様において、酵母コドン優先性のために改変される。例えば、BennetzenおよびHall（1982）J.Biol.Chem.257（6）:3026-3031を参照されたい。別の非限定的な例として、ヌクレオチド配列は、他の態様において、大腸菌コドン優先性のために改変される。例えば、GouyおよびGautier(1982)Nucleic Acids Res.10(22)：7055-7074；Eyre-Walker(1996)Mol.Biol.Evol.13(6)：864-872を参照されたい。またNakamura et al.（2000）Nucleic Acids Res.28(1):292も参照されたい。
【００９４】
さらなる遺伝子操作
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、テルペン生合成経路の遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、一つまたは複数の核酸を含むように遺伝子操作されており；かつテルペン生合成経路中間体の産生の強化を達成するようにさらに遺伝子操作されており、および/または内因性のテルペン生合成経路遺伝子が機能的に無効にされるように、さらに遺伝子操作されている、宿主細胞である。「機能的に無効にされる」という用語は、内因性のテルペン生合成経路遺伝子の文脈において本明細書において用いる場合、テルペン生合成経路遺伝子の遺伝子操作であって、この操作が、この遺伝子によってコードされる遺伝子産物の産生を生じるが、これが正常レベル未満で産生され、および/または非機能的である操作をいう。
【００９５】
内因性テルペン生合成経路の中間体の産生を強化する遺伝子操作としては、限定はしないが、この宿主細胞におけるホスホトランスアセチラーゼのレベル、および/または活性の低下を生じる遺伝子操作が挙げられる。テルペン生合成経路中間体の細胞内濃度は、アセチル-CoAの細胞内濃度を増大することによって上昇される。大腸菌は、細胞内アセチル-CoAの有意な画分をアセトンの形態で培地中に分泌する。アセチル-CoAを酢酸塩に形質転換することを担う第一の酵素であるホスホトランスアセチラーゼptaをコードする遺伝子を欠くことは、酢酸塩の分泌を減少させる。原核生物宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼのレベル、および/または活性を減少させる遺伝子操作は特に有用であり、ここではこの遺伝子操作された宿主細胞は、一つまたは複数のMEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作された宿主細胞である。
【００９６】
いくつかの態様において、原核生物宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼのレベルの低下を生じる遺伝子操作は、ホスホトランスアセチラーゼをコードする原核生物宿主細胞内因性pta遺伝子を機能的に無効にする遺伝的改変である。pta遺伝子は、移動性遺伝子エレメント（例えば、トランスポゾンなど）の挿入；この遺伝子産物が作製されないか、または短縮されてアセチル-CoAを酢酸塩に変換するのよう機能しないような、この遺伝子の全てまたは一部の欠失の挿入；この遺伝子産物が作製されないか、または短縮されて、アセチル-CoAを酢酸塩に変換するのに機能しないような、この遺伝子の変異；この遺伝子産物が作製されないような、このpta遺伝子の発現を制御する一つまたは複数の制御エレメントの欠失または変異；などを含む、任意の種々の方法において機能的に無効にされ得る。
【００９７】
いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞の内因性のpta遺伝子は欠失される。遺伝子を欠失するための任意の方法が用いられ得る。pta遺伝子を欠失するための方法の1つの非限定的な例は、λRed組み換えシステムの使用による。DatsenkoおよびWanner(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97(12):p.6640-5。pta遺伝子は、いくつかの態様において、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチドを含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞（例えば、大腸菌）から欠失される。pta遺伝子は、いくつかの態様において、MK、PMK、MPDおよびIPPをコードするヌクレオチドを含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞（例えば、大腸菌）から欠失される。pta遺伝子は、いくつかの態様において、MK、PMK、MPD、IPPおよびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチドを含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞（例えば、大腸菌）から欠失される。
【００９８】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、MEV生合成経路遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、一つまたは複数の核酸を含むように遺伝子操作され；かつ内因性DXP生合成経路遺伝子が機能的に無効にされるように、さらに遺伝子操作されている宿主細胞である。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞は、DXP生合成経路遺伝子産物（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、一つまたは複数の核酸を含むように遺伝子操作され；かつ内因性MEV生合成経路遺伝子が機能的に無効にされるように、さらに遺伝子操作されている宿主細胞である。
【００９９】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞が、一つまたは複数のMEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）で遺伝子操作される原核生物宿主細胞である場合、この宿主細胞は、一つまたは複数の内因性DXP経路遺伝子が機能的に無効にされるようにさらに遺伝子操作されている宿主細胞である。機能的に無効にされ得るDXP経路遺伝子は、以下のDXP遺伝子産物のいずれかをコードする、一つまたは複数の遺伝子を含む：1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ。
【０１００】
内因性DXP経路遺伝子は、移動性遺伝子エレメント（例えば、トランスポゾンなど）の挿入；この遺伝子産物が作製されないか、または短縮されて、酵素的に不活性であるようなこの遺伝子の全てまたは一部の欠失；この遺伝子産物が作製されないか、または短縮されて酵素的に非機能性であるような、この遺伝子の変異；この遺伝子産物が作製されないような、この遺伝子の発現を制御する一つまたは複数の制御エレメントの欠失または変異；などを含む、任意の種々の方法で機能的に無効にされ得る。
【０１０１】
他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞が、一つまたは複数のDXP経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）で遺伝子操作される原核生物宿主細胞である場合、この宿主細胞は、一つまたは複数の内因性MEV経路遺伝子が機能的に無効にされるようにさらに遺伝子操作される。機能的に無効にされ得る内因性のMEV経路遺伝子は、以下のMEV遺伝子産物のいずれかをコードする、一つまたは複数の遺伝子を含む：HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDI。内因性のMEV経路遺伝子は、移動性遺伝子エレメント（例えば、トランスポゾンなど）の挿入；この遺伝子産物が作製されないか、または短縮されて酵素的に不活性であるような、この遺伝子の全てまたは一部の欠失；この遺伝子産物が作製されないか、または短縮されて酵素的に非機能性であるような、この遺伝子の変異；この遺伝子産物が作製されないようなこの遺伝子の発現を制御する、一つまたは複数の制御エレメントの欠失または変異；などを含む、任意の種々の方法で機能的に無効にされ得る。
【０１０２】
本遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物
本発明はさらに、本遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物を提供する。本組成物は、本遺伝子操作された宿主細胞を含み；かつ、いくつかの態様において、一つまたは複数のさらなる成分を含み、この成分は、部分的にこの遺伝子操作された宿主細胞の意図される使用に基づいて選択される。適切な成分としては、限定はしないが、塩；緩衝液；安定化剤；プロテアーゼ阻害剤；細胞膜および/または細胞壁保存化合物、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシドなど；細胞に適切な栄養培地などが挙げられる。
【０１０３】
遺伝子操作された宿主ライブラリー
本発明は、遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーを提供する。本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーを含み、その各々のメンバーが種々の生合成経路の酵素（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む、種々の核酸（単数または複数）を含む。多くの態様において、本ライブラリーにおける、この遺伝子操作された宿主細胞は微生物細胞である。いくつかの態様において、この細胞は、単細胞実体としてインビトロの細胞培養中で増殖され得る真核生物細胞（例えば、前記において説明されるような酵母細胞、藻類細胞、哺乳動物細胞など）である。他の態様において、この細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞である。
【０１０４】
本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、約2メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約50メンバーの遺伝子操作された宿主細胞を含み、そのメンバーの宿主細胞の各々が核酸を含み、この核酸が種々の生合成経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、約2メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約4メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約4メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約6メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約6メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約8メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約8メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約10メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約10メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約12メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約12メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約14メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約14メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約16メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約16メンバーの細菌〜約18メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約18メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約20メンバーの遺伝子操作された宿主細胞、約20メンバーの遺伝子操作された宿主細胞〜約50メンバー、またはそれ以上の遺伝子操作された宿主細胞を含み、そのメンバーの遺伝子操作された宿主細胞の各々が核酸を含み、この核酸が、他のメンバーの遺伝子操作された宿主細胞由来の、種々の生合成経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０５】
典型的には、複数の各々のメンバーの宿主細胞がこのライブラリーに存在し、例えば、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、2つまたはそれ以上のメンバーの宿主細胞を含み、ここで各々のメンバーの遺伝子操作された宿主細胞の約10〜約102、約102〜約104、約104〜約106、または約106〜約108個以上がこのライブラリーに存在する。
【０１０６】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、2つまたはそれ以上のメンバーの遺伝子操作された宿主細胞を含み、この遺伝子操作された宿主細胞の各々がテルペン生合成経路における種々の酵素を含む。以下は非限定的な例である。
【０１０７】
遺伝子操作された原核生物宿主細胞ライブラリー
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、遺伝子操作された細菌のライブラリーである。本遺伝子操作された細菌のライブラリーは、約2メンバーの細菌〜約50メンバーの細菌を含み、そのメンバーの細菌の各々が核酸を含み、この核酸が種々のプレニルシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、約2メンバーの細菌〜約4メンバーの細菌、約4メンバーの細菌〜約6メンバーの細菌、約6メンバーの細菌〜約8メンバーの細菌、約8メンバーの細菌〜約10メンバーの細菌、約10メンバーの細菌〜約12メンバーの細菌、約12メンバーの細菌〜約14メンバーの細菌、約14メンバーの細菌〜約16メンバーの細菌、約16メンバーの細菌〜約18メンバーの細菌、約18メンバーの細菌〜約20メンバーの細菌、約20メンバーの細菌〜約50メンバーの細菌、またはそれ以上を含み、そのメンバーの遺伝子操作された細菌の各々が核酸を含み、この核酸が、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。典型的には、複数の各々のメンバーの遺伝子操作された細菌がこの集団に存在し、例えば、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、2つまたはそれ以上のメンバーの細菌を含み、ここで各々のメンバーの遺伝子操作された細菌の約10〜約102、約102〜約104、約104〜約106、または約106〜約108個以上がこのライブラリーに存在する。
【０１０８】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、この各々がメバロン酸キナーゼ（MK）、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（MPD）、およびイソプレニル二リン酸イソメラーゼ（IDI）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の異なるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸を含む。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、その各々がアセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMGS）、およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMGR）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸を含む。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、その各々が、一つまたは複数の核酸であって、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸を含む。
【０１０９】
いくつかの態様において、各々のメンバーの細菌は、第一の核酸であって、この第一の核酸が、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸であり、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列が、共通の制御エレメントに対して機能的に連結される第一の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸を含む。いくつかの態様において、このメンバーの細菌の各々は、第一の核酸であって、この第一の核酸が、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸であり、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列が、共通の制御エレメントに対して機能的に連結され、この制御エレメントが誘導性プロモーターである第一の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸を含む。
【０１１０】
いくつかの態様において、このメンバーの遺伝子操作された細菌の各々は、第一の核酸であって、この第一の核酸が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸であり、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列が共通の制御エレメントに対して機能的に連結される第一の核酸を含む。いくつかの態様において、このメンバーの遺伝子操作された細菌の各々は、第一の核酸であって、この第一の核酸が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGSおよびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸であり、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGSおよびHMGRをコードするヌクレオチド配列が共通の制御エレメントに対して機能的に連結され、この制御エレメントが誘導性プロモーターである第一の核酸を含む。
【０１１１】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、その各々が、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（「DXP経路の酵素1〜6」）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸を含む。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、その各々がDXP経路の酵素1〜6およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸を含む。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、その各々が4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（「DXP経路の酵素3〜6」）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸を含む。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの細菌を含み、その各々がDXP経路の酵素3〜6およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの細菌由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸を含む。他の態様において、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）、またはDXP経路の酵素3〜6（および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）は、共通の制御エレメント、例えば、誘導性プロモーターに機能的に連結されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１２】
例えば、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、2つまたはそれ以上のメンバーを含み、その各々のメンバーが、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【０１１３】
以下は、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーの非限定的な例であり、ここでは遺伝子操作された宿主細胞は細菌である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み；この第二のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【０１１４】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも3つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、第三のメンバーの細菌が、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１１５】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも4つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；第三のメンバーの細菌が、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第四のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１１６】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも5つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第五のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１１７】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも6つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１１８】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも7つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第七のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１１９】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも8つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み、この第六のメンバーは、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第八のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２０】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも9つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み、この第六のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第八のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第九のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２１】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも10個のメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌はMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み、この第六のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第八のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第九のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第十のメンバーの細菌は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２２】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGSおよびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸とを含み；ならびに、第二のメンバーの細菌は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGSおよびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸とを含み、この第二の細菌中の第三の核酸はこの第一の細菌における第三の核酸によってコードされるプレニルトランスフェラーゼとは異なるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸とを含み；ならびに、第二のメンバーの細菌は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸とを含み、この第二の細菌中の第二の核酸は、この第一の細菌における第二の核酸によってコードされるプレニルトランスフェラーゼとは異なるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（総称して「DXP経路の酵素1〜6」と呼ばれる）、および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２５】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも3つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２６】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも4つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２７】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも5つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２８】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも6つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第六のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１２９】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌ライブラリーは、少なくとも7つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第七のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１３０】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌のライブラリーは、少なくとも8つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーは、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第八のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１３１】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌のライブラリーは、少なくとも9つのメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）のヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第八のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第九のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１３２】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌のライブラリーは、少なくとも10個のメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第八のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第九のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第十のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１３３】
他の態様において、本遺伝子操作された細菌のライブラリーは、少なくとも2つメンバーの遺伝子操作された細菌を含み、この第一のメンバーの細菌は、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール、2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（総称して「DXP経路の酵素3〜6」と呼ばれる）、および任意でイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸とを含み；ならびに、この第二のメンバーの細菌は、DXP経路の酵素3〜6および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸を含み、この第二の細菌中の第二の核酸は、この第一の細菌における第二の核酸によってコードされるプレニルトランスフェラーゼとは異なるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
遺伝子操作された真核生物宿主細胞ライブラリー
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞のライブラリーは、遺伝子操作された真核生物宿主細胞ライブラリーである。いくつかの態様において、本遺伝子操作された真核生物宿主細胞は、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピチアなど）である。以下の説明は酵母細胞を例証するが；本遺伝子操作された真核生物宿主細胞ライブラリーは、遺伝子操作された酵母細胞には決して限定されないことが理解されるべきである。
【０１３５】
本遺伝子操作された酵母ライブラリーは、約2つのメンバーの酵母〜約50個のメンバーの酵母細胞を含み、その各々のメンバーの酵母細胞が核酸を含み、この核酸は種々のプレニルシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、例えば本遺伝子操作された酵母ライブラリーは、約2つのメンバーの酵母細胞〜約4つのメンバーの酵母細胞、約4つのメンバーの酵母細胞〜約6つのメンバーの酵母細胞、約6つのメンバーの酵母細胞〜約8つのメンバーの酵母細胞、約8つのメンバーの酵母細胞〜約10個のメンバーの酵母、約10個のメンバーの酵母細胞〜約12個のメンバーの酵母細胞、約12個のメンバーの酵母細胞〜約14個のメンバーの酵母細胞、約14個のメンバーの酵母細胞〜約16個のメンバーの酵母細胞、約16個のメンバーの酵母細胞〜約18個のメンバーの酵母細胞、約18個のメンバーの酵母細胞〜約20個のメンバーの酵母細胞、または約20個のメンバーの酵母細胞〜約50個のメンバーの酵母細胞、またはそれ以上を含み、その各々の遺伝子操作された酵母細胞のメンバーが、他のメンバーの酵母細胞由来の種々のプレニルシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。典型的には、各々のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞の複数がこのライブラリーに存在し、例えば、本遺伝子操作された酵母ライブラリーは、2つまたはそれ以上のメンバーの酵母細胞を含み、各々のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞の約10〜約102個、約102〜約104個、約104〜約106個、または約106〜約108個以上がこのライブラリーに存在する。
【０１３６】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの酵母細胞を含み、その各々がMK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの酵母細胞由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸を含む。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの酵母細胞を含み、その各々がアセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGSおよびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの酵母細胞由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸を含む。
【０１３７】
いくつかの態様において、遺伝子操作された酵母細胞の各々のメンバーは、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸であって、このヌクレオチド配列の少なくとも1つが誘導性プロモーターに対して機能的に連結される核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とを含む。いくつかの態様において、各々のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸であって、このヌクレオチド配列の少なくとも1つが誘導性プロモーターに対して機能的に連結される核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とを含む。
【０１３８】
いくつかの態様において、遺伝子操作された酵母細胞の各々のメンバーは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、およびHMGRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、このヌクレオチド配列の少なくとも1つが誘導性プロモーターに対して機能的に連結される核酸を含む。
【０１３９】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、その各々が、DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸とを含む。他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、その各々が、DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸；ならびに、他のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞由来の種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸とを含む。いくつかの態様において、DXP経路の酵素1〜6、またはDXP酵素の経路3〜6のうちの1つをコードするヌクレオチド配列の少なくとも1つが誘導性プロモーターに対して機能的に連結される。
【０１４０】
例えば、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーは、2つまたはそれ以上のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、その遺伝子操作された酵母細胞の各々のメンバーの核酸は、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。本遺伝子操作された細菌のライブラリーの任意の上記の特異的な実施例は、この遺伝子操作された宿主細胞が酵母であるように改変されてもよい。
【０１４１】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された酵母細胞ライブラリーは、少なくとも2つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（総称して「DXP経路の酵素1〜6」と呼ばれる）、および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４２】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞ライブラリーは、少なくとも3つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４３】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞ライブラリーは、少なくとも4つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；そしてこの第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４４】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞ライブラリーは、少なくとも5つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第五のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４５】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞ライブラリーは、少なくとも6つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第六のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４６】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞ライブラリーは、少なくとも7つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第七のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４７】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞のライブラリーは、少なくとも8つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーは、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第八のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４８】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞のライブラリーは、少なくとも9つのメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）のヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第八のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第九のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１４９】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞のライブラリーは、少なくとも10個のメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第三のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第四のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第五のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第六のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第七のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第八のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；この第九のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含み；ならびに、この第十のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素1〜6（および任意でまた、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【０１５０】
他の態様において、本遺伝子操作された酵母細胞のライブラリーは、少なくとも2つメンバーの遺伝子操作された酵母細胞を含み、この第一のメンバーの酵母細胞は、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール、2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（総称して「DXP経路の酵素3〜6」と呼ばれる）、および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とを含み；ならびに、この第二のメンバーの酵母細胞は、DXP経路の酵素3〜6および任意でまたイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸；GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択されるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とを含み、この第二の酵母細胞中のさらなる核酸は、この第一の酵母細胞におけるこのさらなる核酸によってコードされる、プレニルトランスフェラーゼとは異なるプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
さらなる遺伝子操作
他の態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーにおける細胞は、テルペン生合成経路の酵素（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とで遺伝子操作され、かつこの遺伝子操作された宿主細胞に対して増殖阻害するテルペン生合成経路中間体の細胞内濃度を増大させる、一つまたは複数の遺伝子操作をさらに含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーにおける遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作される宿主細胞、および一つまたは複数の内因性のDXP経路の遺伝子が機能的に無効にされるように遺伝子操作されている宿主細胞である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーにおける遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路の酵素（単数または複数）をコードする、一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されて、一つまたは複数の内因性のDXP経路の遺伝子が機能的に無効にされるように遺伝子操作されている原核生物宿主細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼをコードする内因性遺伝子、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼをコードする内因性遺伝子、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼをコードする内因性遺伝子、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼをコードする内因性遺伝子、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼをコードする内因性遺伝子、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼをコードする内因性遺伝子のうちの一つまたは複数が、例えば、この遺伝子の全てまたは一部を欠失させることによって、機能的に無効にされる。例えば、いくつかの態様において、IspC遺伝子の全てまたは一部が欠失される。
【０１５３】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーにおける遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作されており、かつ一つまたは複数の内因性のMEV経路の遺伝子が機能的に無効にされるように遺伝子操作されている宿主細胞である。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーにおける遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路の酵素をコードする核酸で遺伝子操作され、かつ一つまたは複数の内因性のMEV経路の遺伝子が機能的に無効にされるように遺伝子操作されている真核生物宿主細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、アセトアセチル-CoAチオラーゼをコードする内因性遺伝子、HMGSをコードする内因性遺伝子、HMGRをコードする内因性遺伝子、MKをコードする内因性遺伝子、PMKをコードする内因性遺伝子、およびMPDをコードする内因性遺伝子のうちの一つまたは複数が、例えば、この遺伝子の全てまたは一部を欠失させることによって、機能的に無効にされる。
【０１５４】
いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーにおける遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路の酵素（単数または複数）をコードする一つまたは複数の核酸で遺伝子操作され、そしてアセチルCoAの細胞内濃度が増大されるように遺伝子操作されている原核生物宿主細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、この原核生物宿主細胞における内因性pta遺伝子が例えば、この宿主細胞におけるpta遺伝子の全てまたは一部を欠失させることによって、無効にされる。
【０１５５】
本遺伝子操作された宿主細胞を含む組成物
本発明はさらに、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーを含む組成物を提供する。本組成物は、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーを含み；かついくつかの態様において、一つまたは複数のさらなる成分を含み、この成分は、遺伝子操作された宿主細胞の意図される使用に、一部は基づいて選択される。適切な組成物としては、限定はしないが、塩；緩衝液；安定化剤；プロテアーゼ阻害剤；細胞膜および/または細胞壁保護化合物、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシドなど；細胞に適切な栄養培地；などが挙げられる。
【０１５６】
スクリーニング方法
本発明は、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定する方法を提供する。この方法は一般に、（a）遺伝子操作された宿主細胞に対して、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入することによって試験細胞を産生する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路中間体を産生し、この中間体は、この遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される、工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程を含む。増殖阻害における低下によって、この外因性核酸が生合成経路における活性を有する遺伝子産物をコードすることが示される。
【０１５７】
この生合成経路中間体は、この試験細胞の増殖を阻害する量でこの遺伝子操作された宿主細胞において産生され、例えば、この中間体の細胞内濃度がこの試験細胞の増殖を阻害する。典型的には、この中間体は試験細胞中において、遺伝子操作されていない対照の宿主細胞の増殖速度と比較して、またはこの中間体の増殖阻害量の合成をもたらさない条件下で培養されるこの試験細胞の増殖速度と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％、またはそれ以上まで、この試験細胞の増殖を阻害する量で蓄積する。いくつかの態様において、この中間体はこの試験細胞に対して致死的、例えば、この試験細胞の死滅を誘導する量において、この試験細胞中で細胞内に蓄積される。
【０１５８】
この試験細胞は、この生合成経路中間体が増殖阻害および/または死亡誘導である量において細胞内で蓄積されるような条件下で、インビトロで培養される。いくつかの態様において、この試験細胞は、生合成経路において酵素の基質の存在下で培養される。他の態様において、この試験細胞は、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列であって、誘導性プロモーターの制御下であるヌクレオチド配列の発現を誘導する誘導因子の存在下で培養される。
【０１５９】
この中間体が、試験細胞の増殖を阻害する量でこの試験細胞に存在するか否かは、細胞の増殖阻害を決定するための任意の標準的な方法を用いて決定され得る。例えば、増殖は頻繁に、細胞が液体培地中で増殖される場合、光学密度の増大として測定され；かつ増殖阻害は、この中間体の増殖阻害量を生じる遺伝子操作された宿主細胞の液体培地の光学密度（例えば、600nmでの）と、この中間体の増殖阻害量を生じる同じ遺伝子操作された宿主細胞の液体培地の光学密度とを比較することによって決定され得る。増殖阻害はまた、適切な増殖培地を含有する寒天上に平板培養された細胞のコロニーサイズを視覚検査することによっても決定され得る。
【０１６０】
本スクリーニング方法は、遺伝子操作された宿主細胞に外因性の核酸を導入して、試験細胞を産生する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、生合成経路中間体が増殖阻害量で産生される際に、増殖阻害を示す宿主細胞である工程を含む。この中間体を改変する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸が、遺伝子操作された宿主細胞に導入される場合、この試験細胞の増殖阻害が軽減される。従って、増殖阻害の低下によって、この外因性核酸が生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることが示される。増殖阻害の低下としては、増殖阻害の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％以上の低下が挙げられる。いくつかの態様において、この生合成経路において活性を有する遺伝子産物は、増殖阻害を軽減し、その結果、細胞増殖の速度は、この中間体が産生されないような条件下で増殖されるときの、この遺伝子操作された細胞の細胞増殖の速度まで回復される。
【０１６１】
いくつかの態様において、例えば、この外因性の核酸が複数の外因性の核酸（例えば、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリー、核酸の集団であって、各々が異なるアミノ酸配列を有するテルペンシンターゼをコードする集団、など）である場合、この外因性の核酸を、複数の遺伝子操作された宿主細胞に導入して、複数の試験細胞を形成する。この試験細胞は、いくつかの態様において、この中間体が増殖阻害および/または死亡誘導量で細胞内に蓄積されるような条件下で、液体培養中で増殖される；生合成経路において活性な一つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、外因性の核酸を含む試験細胞は、生合成経路において活性な、一つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、外因性の核酸を含まない試験細胞よりも速く増殖するか、または生合成経路において活性な、一つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性の核酸を含む、試験細胞は生きているが、生合成経路において活性な一つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、外因性の核酸を含まない試験細胞は死滅する。
【０１６２】
いくつかの態様において、この中間体は、遺伝子操作された宿主細胞の死滅を生じる量で試験細胞中で産生される。これらの態様の多くにおいて、生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターの制御下にあり、その結果このプロモーターは、実質的に導入されず、中間体は産生されないか、またはこの中間体は、遺伝子操作された細胞を殺傷しない量で産生される。多くの態様において、この生合成経路遺伝子産物は、培養培地に添加される基質を消費するものであり、その結果この基質の非存在下では、実質的に中間体は産生されないか、またはこの中間体は、増殖阻害しない量で産生される。これらの態様のいくつかにおいて、この方法は、遺伝子操作された宿主細胞に対して、この中間体を改変する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入する工程；例えば、この培養培地に誘導因子を添加することによって、この中間体を改変する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の発現を誘導する工程；ならびに、細胞死に対するこの核酸の効果を、もしあれば決定する工程とを含む。これらの態様において、生合成経路の基質の存在下においてインビトロ培養物中で増殖されるが、ただし外因性核酸は導入されていない遺伝子操作された宿主細胞は、この生合成経路中間体の細胞内蓄積の際に死滅する対照の細胞として役立つ。多くの態様において、細胞死に対する外因性核酸の効果を決定する工程は、この中間体によって殺傷されない遺伝子操作された宿主細胞を同定する工程、例えば、生残細胞を同定する工程を含む。生残細胞の同定は、生残細胞を増殖させることによって容易に達成される。
【０１６３】
例えば、遺伝子操作された宿主細胞が細菌である場合、生残細胞がコロニーを形成し、死亡細胞は形成しない細菌培養培地を含む寒天上に、この細胞を平板培養することによって、生残細胞は同定される。この遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞のような真核生物細胞である場合、生残細胞がコロニーを形成し、死亡細胞は形成しない酵母培養培地を含む寒天上に、この細胞を平板培養することによって、生残細胞は同定される。この遺伝子操作された宿主細胞が単細胞実体として増殖する哺乳動物細胞のような真核生物細胞である場合、生残細胞は、適切な培養培地中でこの細胞を培養すること、および生残細胞を増殖させることによって同定される。この遺伝子操作された宿主細胞が、単細胞実体として増殖する哺乳動物細胞のような真核生物細胞である場合、生残細胞はまた、蛍光標示式細胞分取を用いて、例えば、生存細胞と死亡細胞との間を識別する任意の多数の方法を用いて、例えば、死亡細胞を染色するためにヨウ化プロピジウムを用いて同定され得る。
【０１６４】
いくつかの態様において、十分確立された方法を用いて、浮遊密度分離によって生きた試験細胞を死滅した試験細胞から分離する。いくつかの態様において、試験細胞を2つの群に分けて、第一群は代謝的に不活性な細胞（例えば、死滅した細胞）および有糸分裂的に不活性な細胞を含み；ならびに、第二群は、有糸分裂が活性な細胞（例えば、生存細胞）および代謝的に活性な細胞を含む。例えば、Glaser et al. (1989)J.Bacteriol.171：4992を参照されたい。生合成経路中間体誘導性増殖阻害において低下を示す細胞は、有糸分裂的に活性、および/または代謝的に活性であることが期待される。増殖阻害を示す試験細胞、例えば、外因性核酸によってコードされる遺伝子細胞による増殖阻害から救済されない試験細胞は、有糸分裂的に不活性、および/または代謝的に不活性であることが期待される。
【０１６５】
いくつかの態様において、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するための本スクリーニング方法は、（a）複数の遺伝子操作された宿主細胞（例えば、インビトロ培養物中の遺伝子操作された宿主細胞）に対して、候補遺伝子産物をコードする外因性核酸を導入して試験細胞を形成する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、かつこの試験細胞における酵素の合成は、この酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体は、この試験細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される、工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程であって、増殖阻害における低下によって、この外因性核酸がこの生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることが示される工程を含む。
【０１６６】
いくつかの態様において、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するための本スクリーニング方法は、（a）インビトロ培養物中の複数の遺伝子操作された宿主細胞に対して、各々が候補遺伝子産物をコードする複数の外因性核酸を導入して試験細胞を形成する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、かつこの試験細胞における酵素の合成は、この酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体は、この試験細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される、工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程であって、増殖阻害における低下によって、この外因性核酸がこの生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることが確認される工程を含む。
【０１６７】
いくつかの態様において、生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するための本方法は、（a）インビトロ培養物中の複数の遺伝子操作された宿主細胞に対して、各々が候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、複数の外因性核酸を導入して試験細胞を形成する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞は、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、かつこの試験細胞における酵素の合成は、この酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体は、この試験細胞の死滅を誘導するのに有効な量で産生される、工程；および（b）外因性核酸が導入されている対照の細胞における細胞死を検出する際に、この中間体誘導性の細胞死を生き残る試験細胞を検出する工程であって、試験細胞の生存は、生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードする外因性核酸を同定する工程を含む。従って、中間体誘導性の細胞死を生き残る試験細胞は、この生合成経路において活性を有する候補遺伝子産物を含む。
【０１６８】
いくつかの態様において、この生合成経路の酵素の基質をインビトロ培養培地に添加する。他の態様において、この遺伝子操作された細胞は、この生合成経路の酵素の基質を産生する。
【０１６９】
いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、宿主細胞に対して、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することによって遺伝子操作され、この遺伝子操作された宿主細胞における生合成経路の酵素の合成によって、この酵素の基質の生合成経路中間体への変換が生じ、この中間体は、この細胞中で産生されるか、および/またはこの細胞の増殖を阻害するのに有効である量でこの細胞中で蓄積される。いくつかの態様において、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導性因子に対して応答性である誘導性プロモーターの制御下にある。これらの態様において、誘導性因子が培養培地に添加され、生合成経路酵素は、誘導性因子の添加後に合成され、かつ生合成経路中間体は、この細胞中で産生されるか、および/またはこの細胞の増殖を阻害するのに有効である量でこの細胞中で蓄積される。いくつかの態様において、誘導性因子および生合成経路の酵素の基質の両方が、培養培地に添加される。
【０１７０】
他の態様において、遺伝子操作された細胞は、この細胞における生合成経路中間体の合成に影響する、一つまたは複数の遺伝子を変異させることによって遺伝子操作され、その結果この生合成経路中間体は、この細胞中で産生されるか、および/またはこの細胞の増殖を阻害するのに有効である量でこの細胞中で蓄積される。
【０１７１】
代謝性経路を阻害する因子を同定する方法
いくつかの態様において、本発明は、遺伝子操作された宿主細胞であって、代謝性経路中間体が、この細胞中で産生されるか、および/またはこの細胞の増殖を阻害するのに有効である量でこの細胞中で蓄積される宿主細胞において、代謝性経路を阻害する因子を同定する方法を提供する。従って、いくつかの態様において、本発明は、細胞において代謝性経路を阻害する因子を同定する方法を提供し、この方法は一般に、（a）試験細胞と試験因子とを接触させる工程であって、この試験細胞が代謝経路中間体を産生し、この中間体がこの試験細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの因子の効果を、もしあれば決定する工程を含む。増殖阻害における低下は、この因子が代謝経路を阻害することを示す。いくつかの態様において、この代謝性経路は、生合成経路である。他の態様において、この代謝性経路は同化作用の経路である。
【０１７２】
「候補因子」、「試験因子」、「因子」、「物質」、および「化合物」という用語は、本明細書において交換可能に用いられる。候補因子とは、多くの化合物のクラスを包含し、いくつかの態様において、合成、半合成、または天然に存在する無機もしくは有機の分子を包含する。候補因子とは、合成または天然の化合物の大きなライブラリーにおいて見出されるものである。例えば、合成化合物ライブラリーはMaybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall,UK）、ComGenex（South San Francisco,CA）およびMicroSource（New Milford,CT）から市販されている。希少な化学ライブラリーは、Aldrich（Milwaukee,Wis.）から入手可能であり、かつまた用いることもできる。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーはPan Labs（Bothell,WA）から入手可能であり、また容易に再生産可能である。
【０１７３】
候補因子とは、いくつかの態様において、50ダルトンより多く、約2,500ダルトン未満の分子量を有する低分子の有機または無機の化合物である。候補因子は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでもよく、かつ少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含んでもよく、かつ少なくとも2つの官能基を含んでもよい。候補因子は、上記の官能基の一つまたは複数で置換される、環式の炭素もしくは複素環式の構造および/または芳香族もしくはポリ芳香族の構造を含んでもよい。候補因子はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはその組み合わせを含む生体分子の中でも見出される。
【０１７４】
いくつかの態様において、試験因子は試験細胞に導入される外因性核酸である。これらの態様において、この方法は一般に、遺伝子操作された宿主細胞に対して、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性の核酸を導入することによって、試験細胞を産生する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が代謝性経路の中間体を産生し、この中間体がこの遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および、この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程を含み、増殖阻害における低下は、この候補遺伝子産物がこの代謝経路の中間体に関与する代謝経路を阻害することを示す。代謝経路を阻害し、それによってこの代謝性経路媒介性の増殖阻害を軽減する遺伝子産物の非限定的な例としては、限定はしないが、増殖阻害中間体を産生する代謝性経路における酵素を阻害するタンパク質；増殖阻害中間体を産生する代謝経路における、一つまたは複数の酵素をタンパク質分解するタンパク質；非毒性の前駆体を増殖阻害中間体へと破壊する（例えば、修飾する）タンパク質；増殖阻害中間体を転写および/または翻訳のレベルで産生する、代謝経路を下方制御する転写制御エレメント；増殖阻害中間体を修飾するタンパク質などが挙げられる。
【０１７５】
代謝性経路を阻害する因子を同定するための上記の方法を用いて同定される因子は、例えば、コレステロール生合成経路、昆虫フェロモン生合成経路などを含む種々の代謝経路を阻害するために有用である。
【０１７６】
試験細胞からの外因性核酸の単離
いくつかの態様において、この方法はさらに、試験細胞から外因性核酸であって、本スクリーニング方法において、増殖阻害を軽減する外因性核酸を単離する工程をさらに含む。試験細胞から外因性核酸を単離する方法は当技術分野において周知である。適切な方法としては、限定はしないが、当技術分野において標準的である任意の多数のアルカリ溶解方法が挙げられる。
【０１７７】
いくつかの態様において、生存している試験細胞は、密度勾配遠心分離によって死んだ試験細胞から分離され、この生存および/または有糸分裂的に活性な試験細胞は、死滅および/または有糸分裂的に不活性な試験細胞の浮遊密度と異なる浮遊密度を有する。次いで、外因性核酸は生存しているか、または有糸分裂的に活性な試験細胞から単離される。
【０１７８】
候補遺伝子産物のさらなる特徴づけ
いくつかの態様において、本スクリーニング方法はさらに、候補遺伝子産物をさらに特徴付ける工程を含む。これらの態様において、代謝経路（例えば、生合成経路または同化作用経路）において活性を有する、一つまたは複数の候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、外因性の核酸を試験細胞から単離する；この遺伝子産物（単数または複数）は、細胞において、および/またはインビトロの無細胞転写/翻訳系において発現される。いくつかの態様において、外因性核酸は、ヌクレオチド配列分析に供され、かつこの遺伝子産物のアミノ酸配列が、このヌクレオチド配列から推定される。いくつかの態様において、この遺伝子産物のアミノ酸配列は、アミノ酸配列の公的なデータベースにおいて他のアミノ酸配列と比較され、公知のタンパク質のアミノ酸配列に対して同一である任意の有意なアミノ酸配列が存在するか否かが決定される。さらに、この遺伝子産物（単数または複数）は、細胞において、および/またはインビトロの無細胞転写/翻訳系において発現され；ならびに、代謝経路中間体または他の代謝物に対するこの遺伝子産物の効果が分析される。
【０１７９】
例えば、以下にさらに詳細に考察されるように、いくつかの態様において、本スクリーニング方法は、テルペン代謝経路、例えば、テルペン生合成経路において活性を有する候補遺伝子産物を同定する。ある遺伝子産物がテルペン生合成経路において活性であるか否かは、任意の公知の方法を用いて容易に決定される。例えば、テルペン生合成経路遺伝子産物が、テルペンシンターゼである場合、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、遺伝子操作された宿主細胞に導入される、そして外因性核酸を含む遺伝子操作された宿主細胞は、この遺伝子操作された宿主細胞が候補遺伝子産物についての基質である中間体を産生し、この候補遺伝子産物がこの中間体の改変を触媒して、ある産物を形成するような条件下で培養される。候補遺伝子産物がテルペンシンターゼである場合、この産物は、テルペノイド化合物である。テルペノイド化合物を同定する方法は当技術分野において周知であり、かつこの産物のガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）の分析を含む。推定のテルペノイド化合物の保持時間および質量スペクトルを公知のテルペノイド化合物の保持時間および質量スペクトルと比較することによって、この推定のテルペノイド化合物の同定が可能になる。
【０１８０】
外因性核酸
遺伝子操作された宿主細胞への導入のために適切である外因性核酸としては、限定はしないが、細胞から単離された天然に存在する核酸；細胞からの単離の前後に改変されている（例えば、変異によって）天然に存在する核酸；合成核酸、例えば、核酸の化学的合成の標準的方法を用いて実験室で合成されるか、または組み換え方法によって生成された核酸；インビトロで細胞もしくは無細胞系のいずれかにおいて増幅されている、合成または天然に存在する核酸；などが挙げられる。
【０１８１】
遺伝子操作された宿主細胞への導入のために適切である外因性核酸としては、限定はしないが、ゲノムDNA；RNA；細胞から単離されたmRNAの相補的DNA（cDNA）コピー；組み換えDNA；およびインビトロで、例えば、DNA合成のための標準的な無細胞インビトロ方法を用いて合成されるDNAが挙げられる。
【０１８２】
いくつかの態様において、外因性核酸は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかの細胞から作製されるcDNAライブラリーである。いくつかの態様において、外因性核酸は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかの細胞から作製されるゲノムDNAライブラリーである。いくつかの態様において、外因性核酸は、生合成経路において活性を有する、2つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１８３】
他の態様において、外因性核酸は、核酸のライブラリーであって、各々が、公知の生合成経路の酵素のアミノ酸配列とは、約1アミノ酸〜約50アミノ酸、例えば約1アミノ酸〜約5アミノ酸、約5アミノ酸〜約10アミノ酸、約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、約20アミノ酸〜約30アミノ酸、約30アミノ酸〜約40アミノ酸、または約40アミノ酸〜約50アミノ酸ずつ異なるアミノ酸配列を含む、生合成経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸ライブラリーである。他の態様において、外因性核酸とは、核酸のライブラリーであって、各々が、公知のテルペンシンターゼのアミノ酸配列とは、約1アミノ酸〜約50アミノ酸、例えば約1アミノ酸〜約5アミノ酸、約5アミノ酸〜約10アミノ酸、約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、約20アミノ酸〜約30アミノ酸、約30アミノ酸〜約40アミノ酸、または約40アミノ酸〜約50アミノ酸ずつ異なるアミノ酸配列を含むテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸ライブラリーである。
【０１８４】
核酸は、いくつかの態様において、宿主細胞に導入される前に変異される。核酸を変異する方法は、当技術分野において周知であり、十分確立された化学的変異方法、放射線誘発性変異誘発、および合成の間に核酸を変異する方法を含む。DNAを変異する化学的な方法としては、化学的変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（EMS）、メタンスルホン酸メチル（MMS）、N-ニトロソ尿素（ENU）、N-メチル-N-ニトロ-N’-ニトロソグアニジン、4-ニトロキノリンN-オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ICR-170、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、エチレンオキシド、ジメチルニトロソアミン、7,12ジメチルベンズアントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファンなどに対するDNAの曝露が挙げられる。放射線変異誘発性因子としては、紫外線照射、γ-照射、X線、および高速中性子衝撃が挙げられる。変異はまた例えば、紫外光とともにトリメチルソラレンを用いて核酸に導入されてもよい。移動性DNAエレメント、例えば、転移性のエレメントのランダムまたは標的化された挿入は、変異を生成するための別の適切な方法である。変異は、例えば、エラー・プローン（error-prone）PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて、無細胞のインビトロ系における増幅の間に核酸に導入されてもよい。変異は、DNAシャッフリング技術（例えば、エキソン・シャッフリング、ドメイン・スワッピングなど）を用いてインビトロで核酸に導入されてもよい。変異はまた、細胞におけるDNA修復酵素の欠損の結果として核酸に導入されてもよく、例えば、変異DNA修復酵素をコードする変異遺伝子の細胞における存在によって、細胞のゲノムにおける高頻度の変異（すなわち、約1変異/100遺伝子〜1変異/10,000遺伝子）が生じることが期待される。DNA修復酵素をコードする遺伝子の例としては、限定はしないが、MutH、MutS、MutLおよびMutU、および他の種におけるそのホモログ（例えば、MSH1-6、PMS1-2、MLH1、GTBP、ERCC-1など）が挙げられる。核酸を変異する方法は当技術分野において周知であり、かつ任意の公知の方法が使用のために適切である。例えば、Stemple（2004）Nature 5:1-6；Chiang et al. (1993)PCR Methods Appl 2(3)：210-217;Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-51；ならびに米国特許第6,033,861号および同第6,773,900号を参照されたい。
【０１８５】
多くの態様において、外因性核酸は、発現ベクター中に導入される。原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における使用のために適切な発現ベクターは、当技術分野において公知であり、かつ任意の適切な発現ベクターが用いられ得る。適切な発現ベクターは、上記のとおりである。
【０１８６】
核酸の供給源
上記のとおり、外因性核酸は、いくつかの態様において、その天然の環境において細胞または生物体から単離される。いくつかの態様において、細胞または生物体の核酸は、核酸が細胞または生物体から単離される前に変異される。他の態様において、外因性核酸は、インビトロで無細胞系において合成される。
【０１８７】
遺伝子操作された宿主細胞へ導入するために適切な外因性核酸としては、遺伝子操作された宿主細胞由来の様々な種の細胞または生物体から単離される核酸が挙げられる。外因性核酸の適切な供給源としては限定はしないが、任意の6つの界、例えば、細菌（例えば、真正細菌）；古細菌；原生動物；真菌；植物界；および動物界の細胞または生物体が挙げられる。外因性核酸の適切な供給源としては、限定はしないが、藻類（例えば、緑藻、紅藻、緑藻類（glaucophytes）、藍藻）を含む、原生動物界の植物様のメンバー；原生動物の真菌様メンバー、例えば、粘菌、水生菌類など；原生動物の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫（例えば、ユーグレナ属（Euglena））、アメーバ類（例えば、アメーバ）、胞子虫類（例えば、アピコンプレクサ（Apicomplexa）、ミクソゾア（Myxozoa）、微胞子虫（Microsporidia））、および繊毛虫（例えば、ゾウリムシ属（Paramecium））が挙げられる。外因性核酸の適切な供給源としては、真菌界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが任意の門のメンバー：担子菌門（Basidiomycota）（ホウキタケ；例えば、ハラタケ属（Agaricus）、テングタケ属（Amanita）、ヤドリタケ属（Boletus）、カンテレラス（Cantherellus）など）；子嚢菌門（Ascomycota）（sac真菌、例えば、酵母属菌を含む）；ミコフィコフィタ（Mycophycophyta）（地衣類）；接合菌門（Zygomycota）（接合真菌類）；および不完全菌門（Deuteromycota）が挙げられる。外因性核酸の適切な供給源としては、植物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、任意の以下の門のメンバーが挙げられる。コケ植物門（Bryophyta）（例えば、コケ類）、ツノゴケ門（Anthocerotophyta）（例えば、マツモ類）、ヘパティコフィタ（Hepaticophyta）（例えば、ゼニゴケ類）、リコフィタ（Lycophyta）（例えば、ヒカゲノカズラ類）、スフェノフィタ（Sphenophyta）（トクサ類）、プシロフィタ（Psilophyta）（例えば、マツバラン、ホウキラン（whisk ferns））、シダ植物門（Ophioglossophyta）、シダ門（Pterophyta）（例えば、シダ）、ソテツ植物（Cycadophyta）、イチョウ門（Gingkophyta）、マツ植物門（Pinophyta）、マオウ門（Gnetophyta）および被子植物門（Magnoliophyta）（例えば、顕花植物）。外因性核酸の適切な供給源としては、動物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、以下の任意の門のメンバーが挙げられる。海綿動物門（海面動物）；板形動物門（Placozoa）；直遊動物門（海洋無脊椎動物の寄生生物）；菱型動物門（Rhombozoa）；刺胞動物門（Cnidaria）（サンゴ、アネモネ、クラゲ、シーペン、ウミシイタケ、有毒クラゲ（sea wasps）；有櫛動物門（クシクラゲ）；扁形動物門（Platyhelminthes）（扁形動物）；紐形動物門（Nemertina）（紐形動物）；Nガソストムリダ（Ngathostomulida）（ジャウドワーム（jawed worms））p 腹毛動物；輪形動物門（Rotifera）；鰓曳動物門（Priapulida）；動吻動物門（Kinorhyncha）；胴甲動物門（Loricifera）；鉤頭動物門（Acanthocephala）；内肛動物門（Entoprocta）；線形動物門（Nemotoda）；類線形動物門（Nematomorpha）；有輪動物門（Cycliophora）；軟体動物門（Mollusca）（軟体動物）；星口動物門（Sipuncula）（ピーナッツ・ワーム（peanut worms）；環形動物門（Annelida）（環形動物）；緩歩動物門（Tardigrada）（クマムシ）；有爪動物門（Onychophora）（カギムシ類（velvet worms）；節足��物門（Arthropoda）（以下の亜門を含む。鋏角亜門（Chelicerata）、多足亜門（Myriapoda）、六脚亜門（Hexapoda）および甲殻亜門（Crustacea）、ここで鋏角亜門は例えば、クモ綱、節口綱（Merostomata）、およびウミグモ綱を含み、多足亜門は、例えば、唇脚綱（ムカデ類）、倍脚綱（ヤスデ類）、エダヒゲムシ綱（Paropoda）およびコムカデ綱（Symphyla）を含み、六脚亜門は、昆虫を含み、そして甲殻亜門は、エビ、オキアミ、フジツボ（エボシガイ）などを含む；箒虫動物門（Phoronida）；外肛動物門（Ectoprocta）（コケムシ類（moss animals））；腕足動物門（Brachiopoda）；棘皮動物（Echinodermata）（例えば、ヒトデ、シャリンヒトデ（sea daisies）、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリトル・バスケット（brittle baskets）など）；毛顎動物門（ヤムシ）；半索動物（ギボシムシ）；および脊索動物門（Chordata）。脊索動物門の適切なメンバーとしては、以下：尾索動物亜門（ホヤ類；これにはホヤ綱（Ascidiacea）、サルバ綱（Thaliacea）およびオタマボヤ綱（Larvacea）が挙げられる）；頭索動物亜門（Cephalochordata）（ナメクジウオ）；メクラウナギ綱（Myxini）（メクラウナギ（hagfish））；および脊椎動物亜門（Vertebrata）の亜門の任意のメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えば、ヤツメウナギ目のメンバー（ヤツメウナギ）、軟骨魚綱（Chondrichthyces）（軟骨魚類）、Actinopterygii（条鰭亜綱）（条鰭類）、Actinista（シーラカンス）、肺魚亜綱（Dipnoi）（肺魚）、爬虫綱（Reptilia）（爬虫類、例えば、ヘビ、アリゲータ、クロコダイル、トカゲなど）、鳥類（トリ類）；および哺乳綱（哺乳動物）が挙げられる。適切な植物としては、任意の単子葉植物および任意の双子葉植物が挙げられる。
【０１８８】
従って、例えば、適切な細胞としては、限定はしないが原生動物、植物、真菌、藻類、酵母、爬虫類、両生類、哺乳類、海洋微生物、海洋無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、クモ形動物、古細菌および真正細菌を含む生物体由来の細胞が挙げられる。
【０１８９】
適切な原核生物細胞としては、細菌（例えば、真正細菌）および古細菌が挙げられる。適切な古細菌としては、メタン生成菌、高度好塩菌、高度好熱菌などが挙げられる。適切な古細菌としては限定はしないが、クレンアーキオタ（Crenarchaeota）(例えば、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、デフルフロコッカス・モビリス（Defulfurococcus mobilis）、ピロディクティム・オクルタム（Pyrodictium occultum）、サーモフィルム・ペンデンス（Thermofilum pendens）、サーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）)、ユリアーキオータ（Euryarchaeota）(例えば、サーモコッカス・セレル（Thermococcus celer）、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Methanococcus thermolithotrophicus）、メタノコッカス・ジャンアッシィ（Methanococcus jannaschii）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、メタノバクテリウム・フォルミシカム（Methanobacterium formicicum）、メタノサームス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）、アルカエオグロバス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）、ハロフェラックス・ボルカニィ（Haloferax volcanni）、メタノサルシナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサエタ・コンシリィ（Methanosaeta concilli）、メタノスプリリラム・フンガティ（Methanospririllum hungatei）、メタノマイクロビウム・モバイル（Methanomicrobium mobile）)、およびコルアーキオタ（Korarchaeota）のグループの任意のメンバーが挙げられる。適切な真正細菌としては、限定はしないが、水素発生細菌（Hydrogenobacteria）、好熱性藍藻（Thermotogales）、緑色非硫黄細菌（Green nonsulfphur bacteria）、デノコッカス群（Denococcus Group）、シアノバクテリア（Cyanobacteria）、紅色光合成細菌（Purple bacteria）、プランクトミセス（Planctomyces）、スピロヘータ（Spirochetes）、緑色硫黄細菌（Green Sulphur bacteria）、サイトファーガ（Cytophagas）、およびグラム陽性細菌(例えば、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、ミクロコッカス属（Micrococcus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、ヘリコバクテリウム属（Helicobacterium sp.）、クリストリジウム属（Clostridium sp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma sp.）、バシラス属（Bacillus sp.）など)の任意のメンバーが挙げられる。
【０１９０】
いくつかの態様において、核酸は、生物体から採取された組織；生物体から単離された特定の細胞または細胞の群；などから単離される。例えば、生物体が植物である場合、いくつかの態様において、核酸は木質部、師部、形成層、葉、根などから単離される。生物体が動物である場合、核酸は、いくつかの態様において、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織など）から、または特定の細胞タイプ（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、島細胞、Tリンパ球、Bリンパ球など）から単離される。
【０１９１】
単細胞の生物体または多細胞の生物体から単離された細胞のいずれかの細胞、および多細胞の生物体は、いくつかの態様において、核酸（例えば、mRNA）が細胞または生物体から単離される前に、一つまたは複数の内部シグナルまたは外部シグナルに曝露される。遺伝子発現に影響する外部および内部のシグナルとしては、限定はしないが、細菌（例えば、マイコバクテリウム属、シゲラ属（Shigella）、クラミジア属（Chlamydia）など）、原生動物(例えば、トリパノソーマ属（Trypanosoma spp.）、プラスモジウム（Plasmodium spp.）、トキソプラズマ（Toxoplasma spp.）など)、真菌、酵母(例えば、カンジダ属（Candida spp.）)、またはウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、口蹄疫ウイルス、エプスタイン・バーウイルスなどのような哺乳動物細胞に感染するウイルス；植物細胞に感染するウイルス；などを含む）を含む微生物による細胞の感染；昆虫（例えば、ハダニ、アブラムシ、タバコ・ワーム（tobacco worm）など）による植物の感染；水の差し止め（例えば、植物の水の差し止め）；ストレス；クモ形類の動物での植物の感染；創傷（例えば、植物の葉、幹または根を傷つけること）；細胞が維持されている培地のpHの変化、または内部pHの変化；細胞または多細胞の生物体の正常な範囲に対して過剰な熱；細胞または多細胞の生物体の正常な範囲に対して過剰な低温；ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質のようなエフェクター分子；経口接種薬または投与薬物；細胞表面レセプターのリガンド；細胞内に存在するレセプター、例えば核レセプターのリガンド；低酸素；光；暗野；リポポリサッカリド（LPS）、ヤマゴボウマイトジェンを含むがこれに限定されない分裂促進因子；抗原；睡眠パターン；電荷；細胞が維持されている培地のイオン濃度、または内部イオン濃度であって、例示的なイオンとしてはナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、カルシウムイオンなどが挙げられる；栄養物の有無；金属イオン；転写因子；腫瘍抑制因子；細胞間接触；などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
細胞または生物体から核酸を単離する方法は、当技術分野において周知である。いくつかの態様において、ゲノムDNAは細胞または生物体から単離される。他の態様において、RNAは、細胞または生物体から単離され；およびRNA（例えば、mRNA）のcDNAコピーはインビトロで合成される。
【０１９３】
多くの態様において、細胞または生物体から単離されたmRNAのcDNAライブラリーは、外因性核酸の供給源として用いられる。いくつかの態様において、cDNAライブラリーは、挿入されたcDNAが候補遺伝子産物の単離を容易にするタグを含むように構成されている発現ベクターを用いて構築される。
【０１９４】
合成核酸
いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞に導入されている核酸は、合成核酸であり、これには組み換え核酸、インビトロの無細胞系において合成された核酸を含む。核酸を合成する方法は当技術分野において周知である。いくつかの態様において、合成核酸は、種々の公知の生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。これらの態様のいくつかでは、外因性核酸は、上記の方法のいずれかを用いて変異される。
【０１９５】
いくつかの態様において、合成核酸は、天然に存在するテルペンシンターゼまたは他の親のテルペンシンターゼとは、アミノ酸配列において一つまたは複数のアミノ酸が異なるテルペンシンターゼ、例えば、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。「親のテルペンシンターゼ」とは、比較のための参照点として役立つテルペンシンターゼである。変種テルペンシンターゼは、コンセンサスなテルペンシンターゼおよびハイブリッドテルペンシンターゼを含む。いくつかの態様において、合成核酸は、コンセンサスなテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、合成核酸は、ハイブリッドのテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１９６】
変種テルペンシンターゼ
いくつかの態様において、合成核酸は、変種テルペンシンターゼ、例えば、天然に存在するテルペンシンターゼ、または他の親のテルペンシンターゼとはアミノ酸配列において、一つもしくは複数のアミノ酸が異なるテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、変種テルペンシンターゼは、天然に存在する親のテルペンシンターゼのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、またはそれ以上のアミノ酸が異なる。いくつかの態様において、変種テルペンシンターゼは、天然に存在する親のテルペンシンターゼのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、約20アミノ酸〜約25アミノ酸、約25アミノ酸〜約30アミノ酸、約30アミノ酸〜約35アミノ酸、約35アミノ酸〜約40アミノ酸、約40アミノ酸〜約50アミノ酸、または約50アミノ酸〜約60アミノ酸、またはそれ以上異なる。
【０１９７】
いくつかの態様において、天然に存在するテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、任意の種々の十分に確立された方法を用いて変異され、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が得られる。適切な変異誘発方法としては、限定はしないが、前記に記載されるように、化学変異方法、放射線誘発性変異誘発、および合成の間の核酸変異方法が挙げられる。従って、例えば、天然に存在するテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、上記のように化学的変異誘発物質に曝露されるか、または放射性変異誘発物質に供されるか、またはエラー・プローンPCRに供され、かつこの変異誘発された核酸は、上記のような遺伝子操作された宿主細胞（単数または複数）に導入される。細菌の「ミューテーター」株を用いるランダムな変異誘発のための方法はまた、当技術分野において周知であり、かつ変種テルペンシンターゼを生成するために用いられ得る。例えば、Greener et al.,「An Efficient Random Mutagenesis Technique Using an E. coli Mutator Strain」, Methods in Molecular Biology, 57:375-385(1995)を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する飽和突然変異技術もまた周知であり、かつ用いられ得る。例えば、米国特許第6,171,820号を参照されたい。変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、テルペン生合成経路中間体による増殖阻害を軽減する能力によって同定される。
【０１９８】
テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知であり、かつ任意の公知のテルペンシンターゼコードヌクレオチド配列を変更して本方法における使用のための合成核酸を生成することができる。例えば、以下のテルペンシンターゼコードヌクレオチド配列、それに続く、そのGenBankアクセッション番号およびそれが同定された生物体は公知であって、改変されてもよい。(-)-ゲルマクレン（germacrene）DシンターゼmRNA(AY438099;バルサムポプラの亜種（Populus balsamifera subsp.）ヤマウルシ（trichocarpa x ウラジロハコヤナギ（Populus deltoids））;E,E-α-ファルネセンシンターゼmRNA(AY640154;キュウリ（Cucumis sativus）);1,8-シネオールシンターゼmRNA(AY691947;シロイヌナズナ);テルペンシンターゼ5(TPS5)mRNA(AY518314;トウモロコシ（Zea mays）);テルペンシンターゼ4(TPS4)mRNA(AY518312;トウモロコシ);ミルセン/オシメン（ocimene）シンターゼ(TPS10)(At2g24210)mRNA(NM＿127982;シロイヌナズナ);ゲラニオールシンターゼ(GES)mRNA(AY362553;バジル（メボウキ）（Ocimum basilicum）);ピネンシンターゼmRNA(AY237645;シトカトウヒ（Picea sitchensis）);ミルセンシンターゼle20 mRNA(AY195609;キンギョソウ（Antirrhinum majus）);(E)-β-オシメンシンターゼ(Oe23)mRNA(AY195607;キンギョソウ);E-β-オシメンシンターゼ mRNA(AY151086;キンギョソウ);テルペンシンターゼ mRNA(AF497492;シロイヌナズナ);(-)-カンフェンシンターゼ(AG6.5)mRNA(U87910;アメリカオオモミ（Abies grandis）);(-)-4S-リモネンシンターゼ遺伝子(例えば、ゲノム配列)(AF326518;アメリカオオモミ);δ-サイレンスシンターゼ遺伝子(AF326513;アメリカオオモミ);アモルファ-4,11-ジエンシンターゼ mRNA(AJ251751;クソニンジン（Artemisia annua）);E-α-ビサボレンシンターゼ mRNA(AF006195;アメリカオオモミ);γ-フムレン（humulene）シンターゼ mRNA(U92267;アメリカオオモミ);δ-セリネン（selinene）シンターゼ mRNA(U92266;アメリカオオモミ);ピネンシンターゼ(AG3.18)mRNA(U87909;アメリカオオモミ);ミルセンシンターゼ(AG2.2)mRNA(U87908;アメリカオオモミ);など。
【０１９９】
いくつかの態様において、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸とは、適切なハイブリダイゼーション条件下で任意の公知のテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする合成核酸である。いくつかの態様において、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸とは、適切なハイブリダイゼーション条件下で、天然に存在するテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする合成核酸である。いくつかの態様において、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸は、公知のテルペンシンターゼコードヌクレオチド配列に対して約95％未満のヌクレオチド配列同一性を有する、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、この変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、公知のテルペンシンターゼコードヌクレオチド配列に対して約90％〜約95％、約85％〜約90％、約80％〜約85％、約75％〜約80％、約70％〜約75％、約65％〜約70％、約60％〜約65％、約55％〜約60％、または約50％〜約55％以下のヌクレオチド配列同一性を有する。
【０２００】
いくつかの態様において、変種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、公知のテルペンシンターゼのアミノ酸配列に対して約50％〜約55％、約55％〜約60％、約60％〜約65％、約65％〜約70％、約70％〜約75％、約75％〜約80％、約80％〜約85％、約85％〜約90％、または約90％〜約95％のアミノ酸配列同一性を有するテルペンシンターゼをコードする。多数のテルペンシンターゼのアミノ酸配列が当技術分野において公知である。
【０２０１】
例えば、以下のテルペンシンターゼのアミノ酸配列が、各々が同定された生物体とともにカッコ内に示されるGenBankアクセッション番号として見出されており、以下が各々のテルペンシンターゼである。(-)-ゲルマクレンDシンターゼ(AAR99061;バルサムポプラの亜種 トリカルパ（trichocarpa） x ポプラ・デルトイド（Populus deltoids）);D-カジネン（cadinene）シンターゼ(P93665;リクチメン（Gossypium hirsutum）);5-エピ-アリストロシェーン（aristolochene）シンターゼ(Q40577;タバコ（Nicotiana tabacum）);E,E-α-ファルネセンシンターゼ(AAU05951;キュウリ);1,8-シネオールシンターゼ(AAU01970;シロイヌナズナ);(R)-リモネンシンターゼ1(Q8L5K3;レモン（Citrus limon）);syn-コパリル二リン酸シンターゼ(AAS98158;イネ（Oryza sativa）);タキサジエン（taxadiene）シンターゼ(Q9FT37;チュウゴクイチイ（Taxus chinensis）;Q93YA3;ヨーロッパイチイ（Taxus bacca）;Q41594;タイヘイヨウイチイ（Taxus brevifolia）);D-カジネンシンターゼ(Q43714;ワタ（Gossypium arboretum）);テルペンシンターゼ5(AAS88575;トウモロコシ);テルペンシンターゼ4(AAS88573;トウモロコシ);テルペノイドシンターゼ(AAS79352;ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）);ゲラニオールシンターゼ(AAR11765;メボウキ);ミルセンシンターゼle20 (AAO41727;キンギョソウ);5-epi-アリストロシェーンシンターゼ37(AAP05762;ニコチアナ・アテヌアタ);(+)-3-カレン（carene）シンターゼ(AAO73863;オウショウトウヒ（Picea abies);(-)-カンフェンシンターゼ(AAB70707;アメリカオオモミ);アビエタジエン（abietadiene）シンターゼ(AAK83563;アメリカオオモミ);アモルフ-4,11-ジエンシンターゼ(CAB94691;クソニンジン);トリコジエンシンターゼ(AAC49957;クワ暗斑病菌（Myrothecium roridum）);γ-フムレンシンターゼ(AAC05728;アメリカオオモミ);δ-セリネンシンターゼ(AAC05727;アメリカオオモミ);など。
【０２０２】
コンセンサスなテルペンシンターゼ
いくつかの態様において、合成核酸は、コンセンサスなアミノ酸配列を含むテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。コンセンサスなアミノ酸配列は、3つまたはそれ以上のアミノ酸配列を整列させること、およびこの配列のうち少なくとも2つによって共有されるアミノ酸を同定することによって誘導される。いくつかの態様において、コードされたテルペンシンターゼは、2つまたはそれ以上の天然に存在する植物テルペンシンターゼのコンセンサスな配列の決定から誘導されたコンセンサスな配列を含む。いくつかの態様において、このコードされたテルペンシンターゼは、2つまたはそれ以上の天然に存在する動物テルペンシンターゼのコンセンサスな配列の決定から誘導されたコンセンサスな配列を含む。いくつかの態様において、このコードされたテルペンシンターゼは、2つまたはそれ以上の天然に存在する細菌のテルペンシンターゼのコンセンサスな配列の決定から誘導されたコンセンサスな配列を含む。いくつかの態様において、このコードされたテルペンシンターゼは、2つまたはそれ以上の異なる界、門、綱、目、科、属または種に由来する2つまたはそれ以上の天然に存在するテルペンシンターゼのコンセンサスな配列の決定から誘導されたコンセンサスな配列を含む。非限定的な例として、コンセンサスなテルペンシンターゼのアミノ酸配列は、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の異なる植物種由来の（-）リモネンシンターゼを比較することによって導かれる。別の非限定的な例としては、コンセンサスなテルペンシンターゼのアミノ酸配列は、(E)-α-ビサボレンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、δ-セリンシンターゼおよび、アビエタジエンシンターゼのアミノ酸配列を比較することによって導かれる（例えば、Bohlmann et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:4126-2133を参照されたい)。
【０２０３】
ハイブリッドのテルペンシンターゼ
いくつかの態様において、合成核酸は、ハイブリッドのテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ハイブリッドのテルペンシンターゼは、2つまたはそれ以上の異なるテルペンシンターゼ由来のアミノ酸配列を含む。
【０２０４】
いくつかの態様において、ハイブリッドのテルペンシンターゼは、N末端からC末端の順序で、第一のテルペンシンターゼの約2〜約90、例えば、約2〜約5、約5〜約7、約7〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、約25〜約30、約30〜約35、約35〜約40、約40〜約45、約45〜約50、約50〜約55、約55〜約60、約60〜約65、約65〜約70、約75〜約80、約80〜約85、または約85〜約90の連続するアミノ酸；そして第二のテルペンシンターゼの約2〜約90、例えば、約2〜約5、約5〜約7、約7〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、約25〜約30、約30〜約35、約35〜約40、約40〜約45、約45〜約50、約50〜約55、約55〜約60、約60〜約65、約65〜約70、約75〜約80、約80〜約85、または約85〜約90の連続するアミノ酸を含み、ここでこの第一および第二のテルペンシンターゼは異なる。
【０２０５】
いくつかの態様において、ハイブリッドのテルペンシンターゼはさらに、第一および第二のテルペンシンターゼとは異なる第三のテルペンシンターゼの約2〜約90、例えば、約2〜約5、約5〜約7、約7〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、約25〜約30、約30〜約35、約35〜約40、約40〜約45、約45〜約50、約50〜約55、約55〜約60、約60〜約65、約65〜約70、約75〜約80、約80〜約85、または約85〜約90の連続するアミノ酸を含む。
【０２０６】
さらに他の態様において、ハイブリッドのテルペンシンターゼはさらに、第一、第二、および第三のテルペンシンターゼとは異なる第四のテルペンシンターゼの約2〜約90、例えば、約2〜約5、約5〜約7、約7〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、約25〜約30、約30〜約35、約35〜約40、約40〜約45、約45〜約50、約50〜約55、約55〜約60、約60〜約65、約65〜約70、約75〜約80、約80〜約85、または約85〜約90の連続するアミノ酸を含む。
【０２０７】
1つの非限定的な例として、ハイブリッドのテルペンシンターゼは、Tspa遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー；Tspb遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー；Tspc遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー；Tspd遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー；Tspe遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー；Tspf遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー；またはTspg遺伝子ファミリーの2つまたはそれ以上のメンバー由来のアミノ酸を含む。例えば、Bohmann et al.(1998)（前記）；およびDudareva et al.(2003)The Plant Cell 15：1277-1241を参照されたい。
【０２０８】
ハイブリッドのテルペンシンターゼは、限定はしないがエキソン・シャッフリング、ドメイン・スワッピングなどを含む、任意の公知の方法を用いて生成され得る。エキソン・シャッフリング方法は、当技術分野において周知である。例えば、Nixon et al.（1997）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1069-1073；Fisch et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93（15）：7761-7766を参照されたい。ハイブリッドのテルペンシンターゼをコードする核酸を生成する方法は、当技術分野において周知であり；かつ任意の公知の方法が用いられ得る。例えば、Meyerhans et al.「DNA recombination using PCR」Nucleic Acids Res.18:1687-1691(1990);Klug et al.(1991)「Creating chimeric molecules by PCR directed homologous DNA recombination.」Nucl.Acids Res. 19(10):2793;Ho et al.「Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction」Gene 77:51-59(1989);Calogero et al.「In vivo recombination and the production of hybrid genes」Microbiol.Lett.97:41-44(1992);および米国特許第6,653,072号、同第6,177,263号を参照されたい。
【０２０９】
1つの非限定的な例として、Tspdタイプのテルペンシンターゼであるγ-フムレンおよびδ-セリニンをコードするエキソンをシャッフリングして、ハイブリッドのテルペンシンターゼを生成し得るが、例えば、ここではγ-フムレン遺伝子のエキソンIX、XおよびXI、ならびにδ-セリニン遺伝子のエキソンXII、XIIIおよびXIVを含む合成核酸が生成される。多くのテルペンシンターゼ遺伝子のエキソン/イントロン構造が公知であり、かつ公開されている。例えば、TrappおよびCroteau(2001)Genetics 168:811-832;およびCseke et al.(1998)Mol Biol.Evol.15(11):1491-8を参照されたい。
【０２１０】
ハイブリッドのテルペンシンターゼは、ドメイン・スワッピング方法によって生成されてもよい。テルペンシンターゼの機能的なドメインは当技術分野において公知である。例えば、BackおよびChappell((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6841-6845)を参照されたい。例えば、タバコの5-エピ-アリストロシェーンシンターゼ遺伝子のエキソン4は、タバコテルペンシンターゼの優勢な反応産物の産物特異性を付与するアミノ酸配列をコードする；一方で、ヒヨス・ムティカス（Hyoscyamus muticus）のベティスピラジエン（vetispiradiene）シンターゼ遺伝子のエキソン6は、ヒヨス属のテルペンシンターゼの優勢な反応産物の産物特異性を付与するアミノ酸配列をコードする。
【０２１１】
生合成経路遺伝子産物
本方法を用いて同定され得る生合成経路遺伝子産物としては、ある中間体を産生する生合成経路において活性を有する遺伝子産物であって、この中間体を産生する原核生物または真核生物の宿主細胞に対して増殖阻害（例えば、毒性）である遺伝子産物が挙げられる。
【０２１２】
1つの非限定的な例では、サッカロミセス・セレビシエHMG-CoAシンターゼを発現する大腸菌は増殖阻害するレベルでHMG-CoAを蓄積する。HMG-CoAレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性の核酸は、HMG-CoAの蓄積によって生じる増殖阻害を軽減する。
【０２１３】
別の非限定的な例として、原核生物宿主細胞は、抗生物質（毒性、または増殖阻害、中間体）を産生する生合成経路における遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される。外因性の核酸は、遺伝子操作された宿主細胞に導入され；かつ抗生物質耐性を与える遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、この抗生物質によって生じる増殖阻害を軽減する能力によって同定される。この実施例では、遺伝子産物としては、細胞からの抗生物質の持ち出しをもたらすタンパク質；およびこの細胞の増殖をもはや阻害しないようにこの抗生物質を改変する酵素が挙げられる。
【０２１４】
テルペン生合成経路
本発明は、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は一般に、（a）遺伝子操作された宿主細胞に、候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、一つまたは複数のテルペン生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、この宿主細胞中の酵素（単数または複数）の合成がこの酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体が、この宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および（b）この宿主細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程とを含む。増殖阻害における低下は、この外因性核酸が、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることを示す。
【０２１５】
宿主細胞の増殖を阻害するテルペン生合成経路中間体としては、限定はしないが、IPP、DMAPP、およびポリプレニル二リン酸（例えば、GPP、FPP、GGPP、GFPP、HexPP、HepPP、OPP、SPP、DPP、NPP、UPP、など)が挙げられる。
【０２１６】
いくつかの態様において、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するための本スクリーニング方法は、（a）インビトロ培養物中の複数の遺伝子操作された宿主細胞に、候補遺伝子産物をコードする外因性核酸を導入して試験細胞を産生する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、テルペン生合成経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、この試験細胞におけるこの酵素の合成が、この酵素の基質のテルペン生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体が、この試験細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程であって、増殖阻害における低下は、この外因性核酸が、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードすることを示す工程を含む。
【０２１７】
いくつかの態様において、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するための本スクリーニング方法は、（a）インビトロ培養物中の複数の遺伝子操作された宿主細胞に、複数の外因性核酸であって、この各々が候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入して、試験細胞を形成する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、テルペン生合成経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、この試験細胞におけるこの酵素の合成が、この酵素の基質のテルペン生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体が、この試験細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される工程；および（b）この試験細胞の増殖に対するこの候補遺伝子産物の発現の効果を、もしあれば決定する工程であって、増殖阻害における低下によって、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードする外因性核酸が同定される工程を含む。
【０２１８】
いくつかの態様において、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するための本スクリーニング方法は、（a）インビトロ培養物中の複数の遺伝子操作された宿主細胞に、複数の外因性核酸であって、この各々が候補遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を導入して試験細胞を形成する工程であって、この遺伝子操作された宿主細胞が、テルペン生合成経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、この試験細胞におけるこの酵素の合成が、この酵素の基質のテルペン生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体が、この試験細胞の死滅を誘導するのに有効な量で産生される工程；および（b）外因性核酸が導入されていない対照の細胞における細胞死を検出する際に、中間体誘導性の細胞死を生き残る試験細胞を検出する工程であって、試験細胞の生存によって、テルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物をコードする外因性核酸が同定される工程を含む。従って、中間体誘導性の細胞死を生き残る試験細胞は、テルペン生合成経路において活性を有する候補遺伝子産物を含む。
【０２１９】
いくつかの態様において、生合成経路酵素の基質がインビトロ培養培地に添加される。いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作され、この生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターの制御下にある。これらの態様において、誘導因子が培養培地に添加される。いくつかの態様において、誘導因子および基質の両方が培養培地に添加される。
【０２２０】
本発明の方法によって同定され得るテルペンシンターゼ遺伝子の1つの非限定的な例は、アモルファジエン・シンターゼ遺伝子である。同定しようとする機能的な生合成の遺伝子がテルペンシンターゼ遺伝子である場合、この外因性核酸の供給源は、いくつかの態様において、イソプレノイドを産生する細胞または生物体である。他の態様において、この外因性核酸は合成核酸である。
【０２２１】
テルペン生合成経路における中間体は典型的には、IPP、DMAPP、またはポリプレニル二リン酸のようなプレニル二リン酸である。ポリプレニル二リン酸としては限定はしないが、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ゲラニルファルネシル二リン酸、ヘキサプレニル二リン酸、ヘプタプレニル二リン酸、オクタプレニル二リン酸、ソラネシル二リン酸、デカプレニル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、デヒドロドリチル二リン酸、天然ゴム、およびZ-イソプレニル二リン酸が挙げられる。
【０２２２】
プレニル二リン酸中間体の濃度が特定のレベルに達する場合、遺伝子操作された宿主細胞は増殖阻害を示し、これは細胞死、細胞DNAの変異、または細胞の静止期への進行によって達成され得る。遺伝子操作された宿主細胞の増殖阻害は、外因性核酸がテルペンシンターゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む場合に軽減される。テルペンシンターゼは細胞中で産生されて、プレニル二リン酸中間体の改変を触媒し、その結果この中間体がもはや増殖阻害せず、および/またはこの中間体のレベルが増殖阻害しないレベルに低下される。従って、遺伝子操作された宿主細胞が増殖阻害の軽減を示す状況では、この外因性核酸を単離して特徴付けする。
【０２２３】
増殖阻害を軽減する外因性核酸は、単離されて、テルペンシンターゼ、および/または中間体もしくは下流産物を改変する他の酵素をコードするヌクレオチド配列の存在について特徴付けされる。例えば、外因性核酸によってコードされるテルペンシンターゼは、プレニル二リン酸の変換を触媒してテルペンを形成する。
【０２２４】
非限定的な例として、本スクリーニング方法を用いて同定されるテルペンシンターゼは、上記に列挙される例示的なプレニル二リン酸を触媒して、以下のテルペンを形成する。IPPは、テルペンシンターゼによって改変されて、5炭素のヘミテルペンを形成する；DMAPPは、テルペンシンターゼによって改変されて、5炭素のヘミテルペンを形成する；GPPは、テルペンシンターゼによって改変されて、10炭素のモノテルペンを形成する；FPPは、テルペンシンターゼによって改変されて、15炭素のセスキテルペンを形成する；かつGGPPは、テルペンシンターゼによって改変されて、20炭素のジテルペンを形成する。当然ながら、この列挙は単に例示であること、および特許請求される本発明の方法は、任意のプレニル二リン酸の改変を触媒するテルペンシクラーゼ遺伝子を同定するために用いられ得ることが理解される。
【０２２５】
遺伝子操作された宿主細胞から単離されるテルペンの量は、遺伝子操作された宿主細胞において生成されたプレニル二リン酸の量に依存するので、プレニル二リン酸の量の増大は、結果として宿主微生物から単離されるテルペンの量を増大させる。
【０２２６】
本発明の方法がテルペン生合成経路において活性を有する遺伝子産物を同定するためのスクリーニング方法である場合、遺伝子操作される宿主細胞は、いくつかの態様において、アセチル-CoAまたはメバロン酸塩をプレニル二リン酸に変換するように操作される。
【０２２７】
いくつかの態様において、本スクリーニング方法は、テルペンシンターゼの産物を改変する候補遺伝子産物を特定する。例えば、crtN遺伝子は、Heliobacillus mobilis (Xiang et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14851-14856)において、カロテノイド生合成経路の一部であるジアポフィトエン・デヒドロゲナーゼをコードすることが見いだされた。従って、いくつかの態様において、本スクリーニング方法は、テルペン生合成経路において活性である複数（2つまたはそれ以上）の遺伝子産物を同定する。例えば、いくつかの態様において、本スクリーニング方法は、テルペン生合成経路における複数の酵素をコードするオペロンを同定する。
【０２２８】
例示的な態様
任意の上記の遺伝子操作された細胞は、本スクリーニング方法において用いられ得る。いくつかの態様において、本遺伝子操作された細胞ライブラリーは、本スクリーニング方法において用いられる。以下は、本スクリーニング方法における本遺伝子操作された細胞の使用の非限定的な例である。
【０２２９】
いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、IDI、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む原核生物細胞であって、このヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結された転写単位の一部であり、このプレニルトランスフェラーゼは、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される。誘導因子が培地に添加されるとき、酵素が合成されて、ポリプレニル二リン酸中間体の増殖阻害（例えば、毒性または細胞死誘導）量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、ポリプレニル二リン酸中間体誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３０】
例えば、いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、IDI、およびFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む原核生物細胞であり、このヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結された転写単位の一部である。誘導因子が培地に添加されるとき、酵素が合成されて、テルペン生合成経路中間体FPPの増殖阻害（例えば、毒性または細胞死誘導）量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、FPP誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３１】
他の態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結された転写単位の一部である第一の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸であって、このプレニルトランスフェラーゼが、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される第二の核酸を含む原核生物細胞である。典型的には、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列はまた、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列に対して機能的に連結された誘導性プロモーターと同じか、または異なる誘導因子によって誘導され得る誘導性プロモーターに対して機能的に連結される。この誘導因子（単数または複数）が培地に添加されるとき、酵素が合成されて、テルペン生合成経路ポリプレニル二リン酸中間体の毒性量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、ポリプレニル二リン酸中間体誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３２】
いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、MK、PMK、MPD、IDI、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む原核生物細胞であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結された転写単位の一部であり、このプレニルトランスフェラーゼは、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される。この誘導因子およびメバロン酸塩が培地に添加されるとき、この酵素が合成されて、ポリプレニル二リン酸中間体の増殖阻害（例えば、毒性または細胞死誘導）量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、ポリプレニル二リン酸中間体誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３３】
例えば、いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、MK、PMK、MPD、IDIおよびFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む原核生物細胞であり、このヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに対して機能的に連結された転写単位の一部である。誘導因子およびメバロン酸塩が培地に添加されるとき、この酵素が合成されて、テルペン生合成経路中間体FPPの増殖阻害（例えば、毒性または細胞死誘導）量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、FPP誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３４】
他の態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸であって、このヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに対して機能的に連結された転写単位の一部である第一の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸であって、このプレニルトランスフェラーゼが、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される第二の核酸を含む原核生物細胞である。典型的には、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列はまた、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列に対して機能的に連結された誘導性プロモーターと同じか、または異なる誘導因子によって誘導され得る誘導性プロモーターに対して機能的に連結される。この誘導因子（単数または複数）およびメバロン酸が培地に添加されるとき、酵素が合成されて、テルペン生合成経路ポリプレニル二リン酸中間体の毒性量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、ポリプレニル二リン酸中間体誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３５】
他の態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）であって、このヌクレオチド配列が誘導性プロモーターに対して機能的に連結されている核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸であって、このプレニルトランスフェラーゼが、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される第二の核酸を含む原核生物細胞である。誘導因子が培地に添加されるとき、酵素が合成されて、テルペン生合成経路ポリプレニル二リン酸中間体の毒性量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、ポリプレニル二リン酸中間体誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３６】
他の態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）であって、このヌクレオチド配列が誘導性プロモーターに対して機能的に連結されている核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸であって、このプレニルトランスフェラーゼが、GPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される第二の核酸を含む原核生物細胞である。誘導因子およびメチルエリトリトールが培地に添加されるとき、酵素が合成されて、テルペン生合成経路ポリプレニル二リン酸中間体の毒性量が産生される。死滅が対照の細胞で検出されるとき、ポリプレニル二リン酸中間体誘導性の死滅からの生き残りは、外因性核酸が導入された試験細胞で検出される。いくつかの態様において、この外因性核酸は、試験細胞から単離される。
【０２３７】
生合成経路中間体の細胞内濃度の増大
いくつかの態様において、生合成経路中間体の細胞内濃度（例えば、遺伝子操作された宿主細胞における中間体の濃度）が増大される。この中間体の細胞内濃度は、限定はしないが、生合成経路の基質の培養培地中での濃度の増大；生合成経路において活性である酵素の触媒活性の増大；生合成経路において活性な酵素の基質（例えば、一次基質）の細胞内濃度の増大；などを含む多数の方法で増大され得る。
【０２３８】
培養培地中での基質の量の増大
いくつかの態様において、本方法における使用のための遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路における遺伝子産物を産生するように遺伝子操作される。これらの態様のいくつかでは、テルペン生合成経路中間体の細胞内濃度は、培養培地中のメバロン酸の量を増大することによって増大される。培養培地中のメバロン酸塩の濃度は一般に、約1mM〜約50mM、例えば、約1mM〜約5mM、約5mM〜約10mM、約10mM〜約20mM、約20mM〜約30mM、約30mM〜約40mM、または約40mM〜約50mMの範囲である。
【０２３９】
いくつかの態様において、本方法における使用のための遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路における遺伝子産物を産生するように遺伝子操作される。従って、いくつかの態様において、この遺伝子操作された宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸をプレニル二リン酸に変換し得る。いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。これらの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸の豊富な増殖培地中に配置され、これによってこの遺伝子操作された宿主細胞の増殖が阻害されるまでプレニル二リン酸の細胞内濃度が増大される。培養培地中の1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸の濃度は一般に約1mM〜約50mM、例えば、約1mM〜約5mM、約5mM〜約10mM、約10mM〜約20mM、約20mM〜約30mM、約30mM〜約40mM、または約40mM〜約50mMの範囲である。他の態様において、この宿主である遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。これらの態様において、遺伝子操作された宿主細胞は、メチルエリトリトールの豊富な増殖培地中に入れられて、これによってこの遺伝子操作された宿主細胞の増殖が阻害されるまでプレニル二リン酸の細胞内濃度が増大される。培養培地中のメチルエリトリトールの濃度は一般に約1mM〜約50mM、例えば、約1mM〜約5mM、約5mM〜約10mM、約10mM〜約20mM、約20mM〜約30mM、約30mM〜約40mM、または約40mM〜約50mMの範囲である。
【０２４０】
生合成経路において活性を有する酵素の触媒活性の増大
いくつかの態様において、生合成経路の中間体の細胞内濃度は、この中間体の産生をもたらす生合成経路における酵素の触媒活性の増大によって増大される。例えば、本方法における使用のための遺伝子操作された宿主細胞が、MEV経路における遺伝子産物を産生するように遺伝子操作される場合、MKおよび/またはPMKおよび/またはMPDをコードするヌクレオチド配列は、このコードされたMKおよび/またはPMKおよび/またはMPDが触媒活性の増大を有するように改変され、その結果、増殖阻害量のテルペン生合成経路中間体が増大される。
【０２４１】
触媒活性の増大を示す、種々のテルペン生合成経路酵素（例えば、MKおよび/またはPMKおよび/またはMPD）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、任意の種々の方法を用いて、例えば、ランダム変異導入法（例えば、化学的変異導入法、放射線誘発性変異導入法、PCRベースの変異導入法などを用いる）によって生成される。
【０２４２】
ヌクレオチド配列が、触媒活性の増大を示す、種々のテルペン生合成経路酵素（単数または複数）（例えば、MKおよび/またはPMKおよび/またはMPD）をコードするか否かは、容易に決定され得る。例えば、触媒活性の増大を示す、改変テルペン生合成経路の酵素（単数または複数）（例えば、MKおよび/またはPMKおよび/またはMPD）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、原核生物または真核生物の宿主細胞に導入される。培養培地におけるメバロン酸塩の存在において、他の細胞よりも速い速度での増殖阻害を示す細胞は、触媒活性の増大を示す、改変テルペン生合成経路の酵素（単数または複数）（例えば、MKおよび/またはPMKおよび/またはMPD）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。例えば、触媒活性の増大を示す、改変テルペン生合成経路の酵素（単数または複数）（例えば、MKおよび/またはPMKおよび/またはMPD）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、以下のように同定され得る。遺伝子操作された宿主細胞が細菌のような原核生物細胞である場合、この遺伝子操作された宿主細胞は、この中間体が産生されるような条件下でインビトロで培養され；かつこの細菌は、固体の細菌培養培地上に平板培養される。この中間体の細胞内濃度が細胞増殖を阻害する場合、増殖阻害を示す細菌細胞のコロニーサイズは、増殖阻害を示さない細菌細胞のコロニーサイズよりも小さい。より小さいコロニーが、いくつかの態様において、触媒活性の増大を有するテルペン生合成経路酵素をコードする核酸を含む。
【０２４３】
同様のスキームを行なって、触媒活性の増大を示す、DXP経路における改変テルペン生合成経路酵素（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を同定することができる。遺伝子操作された宿主細胞を、（a）1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸；(b)2-C-メチル-D-エリトリトール-4-リン酸；（c）4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトール-2-リン酸；（d）2-C-メチルエリトリトール-2,4-シクロ二リン酸；および（e）1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル-4-二リン酸シンターゼのような1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸（DXP）経路の産物の産生の増大についてスクリーニングしてもよく、その結果このクローンから単離されたDXP経路遺伝子が、プレニル二リン酸の増大した量を産生し得る細胞を操作するために、宿主微生物中に導入される改良されたDXP経路の遺伝子として選択される。
【０２４４】
一次基質の細胞内産生の増大
いくつかの態様において、プレニル二リン酸中間体の濃度は、宿主細胞における一次基質（例えば、アセチル-CoA、メバロン酸塩、ピルビン酸塩、グリセルアルデヒド-3-リン酸など）の濃度を増大することによって増大される。例えば、いくつかの態様において、MEV経路を通過する流動である、増殖阻害するテルペン生合成経路中間体の細胞内濃度は、MEV経路の普遍的な前駆体であるアセチル-CoAの産生を増大することによって増大される。アセチル-CoAの産生の増大は、培養培地におけるグルコースの濃度を増大することによって達成される。
【０２４５】
他の態様において、宿主細胞におけるアセチル-CoAの細胞内濃度は、宿主細胞中のホスホトランスアセチラーゼのレベルおよび/または活性を減少させることによって増大される。いくつかの態様において、宿主細胞におけるホスホトランスアセチラーゼのレベルは、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子を非機能的にすることによって低下される。Pta遺伝子は、移動性遺伝子エレメント（例えば、トランスポゾンなど）の挿入；この遺伝子産物が作成されないか、または短縮されてアセチル-CoAを酢酸に変換するには非機能的であるような、この遺伝子の全てまたは一部の欠失；この遺伝子産物が作成されないか、または短縮されてアセチル-CoAを酢酸に変換するには非機能的であるような、この遺伝子の変異；この遺伝子産物が作成されないような、pta遺伝子の発現を制御する一つまたは複数の制御エレメントの欠失または変異；などを含む任意の種々の方法で非機能的にされ得る。大腸菌は細胞内アセチル-CoAの大きな画分を酢酸塩の形態で培地中に分泌する。Holms(1986)Curr Top Cell Regul.28:69-105。アセチル-CoAを酢酸塩に変換することを担う第一の酵素であるホスホトランスアセチラーゼ、ptaをコードする遺伝子を欠失することによって、グルコースの増大率を低下しながら、有意に酢酸分泌を低下させて、ピルビン酸、乳酸および他の代謝物の分泌を増大させることが示されている。Chang(1999)J.Bacteriol.181(21):6656-63。
【０２４６】
いくつかの態様において、遺伝子操作された宿主細胞のpta遺伝子は欠失される。遺伝子を欠失させるための任意の方法が用いられ得る。Pta遺伝子を欠失させるための1つの非限定的な例は、λRed組み換え系の使用による。DatsenkoおよびWanner(2000)Proc.Natl.Acad Sci U S A97(12):p.6640-5。Pta遺伝子は、いくつかの態様において、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞（例えば、大腸菌）から欠失される。pta遺伝子はいくつかの態様において、MK、PMK、MPD、およびIPPをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞（例えば、大腸菌）から欠失される。pta遺伝子はいくつかの態様において、MK、PMK、MPD、IPP、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作される宿主細胞（例えば、大腸菌）から欠失される。
【０２４７】
いくつかの態様において、本方法における使用のための遺伝子操作された宿主細胞は、DXP経路における遺伝子産物を産生するように遺伝子操作される。従って、いくつかの態様において、この遺伝子操作された宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸をプレニル二リン酸に変換し得る。これらの態様において、この遺伝子操作された宿主細胞は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸の豊富な増殖培地中に配置され、これによってこの遺伝子操作された宿主細胞の増殖が阻害されるまでプレニル二リン酸の細胞内濃度が増大される。プレニル二リン酸の細胞内濃度は、グリセルアルデヒド3-リン酸またはピルビン酸の産生を増大することによって、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸（DXP）経路を通じた流動を増大することによって増大される。
【０２４８】
キット
本発明はさらに、本スクリーニング方法を実行するためのキットを提供する。本キットは少なくとも1つの遺伝子操作をされた宿主細胞を含み、この宿主細胞は、生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子操作されている。適切な培養条件下では、遺伝子操作された宿主細胞における酵素の合成は、この酵素の基質の生合成経路中間体への変換を生じ、この中間体は、この遺伝子操作された宿主細胞の増殖を阻害するのに有効な量で産生される。いくつかの態様において、このキットはさらに生合成経路の酵素の基質を含む。
【０２４９】
いくつかの態様において、本キットは、任意の上記の本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーを含む。いくつかの態様において、本遺伝子操作された宿主細胞ライブラリーのメンバーの遺伝子操作された宿主細胞は、別々の容器（例えば、バイアル）で提供される。いくつかの態様において、本キットは、2つまたはそれ以上の別々の容器を備え、その各々が遺伝子操作された宿主細胞を含み、この遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作されている細胞であり、各々のメンバーの遺伝子操作された宿主細胞は、種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本キットは2つまたはそれ以上の別の容器を含み、その容器の各々が、DXP経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸；ならびに、プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作されている遺伝子操作された宿主細胞を含み、各々のメンバーの遺伝子操作された宿主細胞は、種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、遺伝子操作された宿主細胞のメンバーは、別々の容器には含まれず；代わりに、遺伝子操作された宿主細胞のメンバーは、同じ容器中に混合された集団としてパッケージされる。
【０２５０】
いくつかの態様において、本キットは、本発明の細菌ライブラリーを含み、このライブラリーは2つまたはそれ以上のメンバーを含み、その各々のメンバーは、MEV経路の酵素をコードするヌクレオチド配列、ならびにGPPシンターゼ、FPPシンターゼ、GGPPシンターゼ、GFPPシンターゼ、HexPPシンターゼ、HepPPシンターゼ、OPPシンターゼ、SPPシンターゼ、DPPシンターゼ、NPPシンターゼ、およびUPPシンターゼから選択される種々のプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を含むように遺伝子操作されている細菌である。従って、例えば、いくつかの態様において、本キットは、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第一の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第二の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第三の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第四の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第五の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第六の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第七の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第八の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第九の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸で遺伝子操作された第十の細菌；MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第十一の細菌を含む。
【０２５１】
他の態様において、本キットは、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第一の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第二の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第三の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第四の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第五の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第六の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第七の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第八の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第九の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第十の細菌；アセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作された第十一の細菌を含む。
【０２５２】
遺伝子操作された宿主細胞がMEV経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）で遺伝子操作されている原核生物細胞である上記の態様のいくつかにおいて、この宿主細胞は機能的に不能にされた内因性のpta遺伝子、例えば、内因性pta遺伝子の全てまたは一部の欠失をさらに含む。遺伝子操作された宿主細胞がMEV経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）で遺伝子操作されている原核生物細胞である上記の態様のいくつかでは、この宿主細胞は機能的に不能にされた内因性のDXP経路遺伝子、例えば、IspC遺伝子の全てまたは一部の欠失をさらに含む。
【０２５３】
他の態様において、本キットは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ（DXP経路の酵素1〜7）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第二の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第三の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第四の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第五の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第六の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第七の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第八の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第九の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）とを含む。
【０２５４】
他の態様において、本キットは、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ、およびイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸シンターゼ（DXP経路の酵素3〜7）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第二の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第三の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第四の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第五の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第六の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第七の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第八の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第九の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜7をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）とを含む。
【０２５５】
他の態様において、本キットは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（DXP経路の酵素1〜6）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第二の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第三の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第四の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第五の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第六の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第七の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第八の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第九の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素1〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）とを含む。
【０２５６】
他の態様において、本キットは、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリトリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-二リン酸シンターゼ（DXP経路の酵素3〜6）をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；FPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第二の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GGPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第三の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；GFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第四の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HexPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第五の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；HepPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第六の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；OPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第七の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；SPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第八の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；DPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第九の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；NPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）；DXP経路の酵素3〜6をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸と；UPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸とで遺伝子操作される第十一の真核生物細胞（例えば、酵母細胞）とを含む。
【０２５７】
遺伝子操作された宿主細胞が、DXP経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単数または複数）で遺伝子操作されている真核生物細胞である上記の態様のいくつかにおいて、この宿主細胞は機能的に不能にされた内因性のMEV経路遺伝子、例えば、内因性MEV経路遺伝子の全てまたは一部の欠失、例えば内因性のMK遺伝子の全てまたは一部の欠失をさらに含む。
【０２５８】
典型的には、遺伝子操作された宿主細胞の複数の各々のメンバーが集団に（または各々別のバイアルに）存在し、例えば、本遺伝子操作された宿主細胞集団は、2つまたはそれ以上のメンバーの宿主細胞を含み、各々の遺伝子操作された宿主細胞の約10〜約102、約102〜約104、約104〜約106、または約106〜約108個、またはそれ以上を含む。いくつかの態様において、この細胞は真核生物細胞である。他の態様において、この細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞である。
【０２５９】
本キットはいくつかの態様において、生合成経路の基質、例えば、メバロン酸またはメチルエリトリトールをさらに含む。本キットはいくつかの態様において、本スクリーニング方法の正の対照として役立つ遺伝子操作された宿主細胞をさらに含み、この対照の遺伝子操作された宿主細胞は、MEV経路またはDXP経路の遺伝子産物、プレニルトランスフェラーゼおよび公知のテルペンシンターゼをコードする一つまたは複数の核酸を含み、この公知のテルペンシンターゼは、プレニルトランスフェラーゼの産物を改変するものである。非限定的な例として、いくつかの態様において、正の対照の遺伝子操作された宿主細胞は、MK、PMK、MPK、FPPシンターゼ、およびアモルファジエンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、一つまたは複数の核酸を含む原核生物細胞である。別の非限定的な例として、いくつかの態様において、正の対照の遺伝子操作された宿主細胞はDXP経路の酵素1〜7（または3〜7、または1〜6、または3〜6）、FPPシンターゼおよびアモルファジエンシンターゼをコードする、一つまたは複数の核酸を含む真核生物細胞（例えば、酵母細胞）である。
【０２６０】
いくつかの態様において、このキットは本スクリーニング方法の実施におけるキットの構成要素（単数または複数）の用法を記載している使用説明書をさらに含む。これらの指示は、本キットに種々の形態で存在してもよく、一つまたは複数がキットに存在し得る。これらの指示が存在し得る1つの形態は、適切な媒体または非印刷物上に印刷された情報として、例えば、この情報が印刷された紙片（単数または複数）、このキットの包装中、添付文書中などである。さらに別の方法は、コンピューター読み取り可能な媒体、例えば、この情報が記録されているディスケット、コンパクトディスク（CD）などである。他の適切な媒体としては、視聴覚の媒体、例えば、デジタル多用途ディスク（DVD）、ビデオテープなどが挙げられる。存在し得るさらに別の方法は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して用いられ得るウェブサイトのアドレスである。任意の便利な手段がこのキットに存在してもよい。
【０２６１】
実施例
以下の実施例は、本発明を実施および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定する意図はなく、以下の実験が行なわれる実験の全てであるかとか唯一のものであるということを示すわけでもない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を保障する労力が払われているが、ある程度の実験誤差および逸脱は考慮されるべきである。他に示さない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の温度であり、圧力は大気圧であるかその近辺である。標準的な略語は例えば、bp、塩基対（単数または複数）；kb、キロベース（単数または複数）；pl、ピコリットル（単数または複数）；sまたはsec、秒（単数または複数）；min、分（単数または複数）、hまたはhr、時間（単数または複数）；aa、アミノ酸（単数または複数）；nt、ヌクレオチド（単数または複数）；などを用いてもよい。
【０２６２】
実施例1：メバロン酸（MEV）経路における中間体を合成するように遺伝子操作された大腸菌を用いるテルペンシンターゼ遺伝子の同定
方法および材料
株および培地
E coli DH10Bをクローニングおよびイソプレノイド発現の株として用いた。用いた菌株およびプラスミドは表1に示す。大腸菌 DH10B:Gibco-Life Technologies;大腸菌 DYM1:Kuzuyama et al.(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.63:776-778;pCR4:Invitrogen;pTrc99A:Pharmacia;pBBRlMCS-3:Kovach et al.(1995)Gene 166:175-176;pBAD33:Guzman et al.(1995)J.Bacteriol.177:4121-4130;pAC-LYC04:Cunningham et al.(1994)6 :1107-1121。
【表１】
2007507234.tif 000003
【０２６３】
表1では、ApRはアンピシリン耐性を示し、TcRはテトラサイクリン耐性を示し、そしてCmRは、クロラムフェニコール耐性を示す。
【０２６４】
用いられるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーのヌクレオチド配列は以下のとおりである。
2007507234.tif 000004
【０２６５】
増殖研究のために、種々の組み換え経路を発現する培養物の光学密度（OD）をマイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax、Molecular Devices)を用いて、連続的に振盪しながら37℃でインキュベートした96ウェルのプレート中のLBブロスの200μlの培養物から測定した。（±）-メバロノラクトンは、Sigma-Aldrich(St. Louis、MO)から購入し、そして2-C-メチル-D-エリトリトールは、Duvold et al. Duvold et al.(1997)Tetrahedron Lett.38:4769-4772のプロトコールに従ってシトラコン無水物から合成した。ispC変異体大腸菌株DYM1(Kuzuyama et al.(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.63:776-778)を用いて、合成のメバロン酸オペロンの機能を試験した。DYM1株を、0.5mMのメチルエリトリトール（ME）を含有するLB培地上で増殖させて、形質転換されたDYM1細胞を、試験培地上でそれらを振盪する前に、MEを補充したプレート上で最初に回復させた。オペロンの機能を試験するために用いた培地は、1容積の2M DL-メバロノラクトンと1.02容積の2M KOHとを混合して37℃で30分間インキュベートすることによって調製した1mM DL-メバロン酸を補充した。Campos(2001)Biochem.J.353 :59-67。
【０２６６】
アモルファジエンシンターゼ遺伝子の合成
合成のアモルファジエンシンターゼ（ADS）遺伝子は、Calcgene (HaleおよびThompson(1998)Protein Exper.Purif.12:185-188(1998))を用いて設計され、このシンターゼのタンパク質配列は、Mercke et al.(Mercke et al.(2000)Arch.Biochem.Biophys.381:173-180)によって単離された。合成ADSのヌクレオチド配列は図12A〜C(配列番号23および24)に示される。ADS遺伝子をアセンブルするために、84個の重複するオリゴヌクレオチド(Gibco BRL)の各々を、最終濃度100μMまでdH20中に溶解した。混合物は、各々の個々のオリゴヌクレオチドの10μLを合わせることによって調製した。ADSの2ステップPCRアセンブリにおける最初のPCR反応物は、100μL、1×Pfuポリメラーゼ緩衝液(20mM Tris-HCl pH8.8、2mM MgS04 10mM KC1、10mM(NH4)2SO4、0.1% Triton X100、0.1% mg/mL BSA)、0.25mMの各々のdNTP、1μMのオリゴヌクレオチド混合物および5U Pfuポリメラーゼ（Stratagene)を含んだ。PCRサイクルのプログラムは94℃で30秒間、40℃で2分間、72℃で10秒間、それに続いて40サイクルの94℃15秒間、40℃30秒間、72℃20秒間＋1サイクルあたり3秒であった。第二のPCR反応物は、100μL中に、33μLの第一のアセンブリの反応物、1×Pfu緩衝液、0.25mMの各々のdNTPおよび5U Pfuポリメラーゼを含んだ。このアセンブリの第二の工程のPCRプログラムは以下のとおりであった：94℃で30秒間、40℃で10秒間、72℃で10秒間、それに続いて25サイクルの94℃15秒間、40℃30秒間、72℃45秒間＋1サイクルあたり1秒。1.7kbの範囲のDNAスメアをゲル精製して、100μL中に、1×Pfu緩衝液、0.25mMの各々のdNTP、250nMの各々の2つの外側プライマー（T-1およびB-42）、10μLのゲル生成したDNAおよび5U Pfuポリメラーゼを含む第三および最終のPCR反応についてのテンプレートとして用いた。このPCRプログラムは40サイクルの94℃45秒間、および72℃で4分間、それに続いて最終工程が72℃10分間であった。予想される1.7kbのバンドをゲル精製して、この遺伝子配列中に設計された5'-NcoIおよび3'-XmaI部位を用いてpTrc99A中に連結して、これによってpADSを生成した。点突然変異を排除して機能的遺伝子を生成するためには2回の部位指向性変異誘発が必要であった。
【０２６７】
DXP経路のオペロンの構築
大腸菌のdxs遺伝子を、重複伸長ならびにPCRプライマーdxsl、dxs2、ippHplおよびippHp2（プライマー配列については上記を参照）を用いて、pAC-LYC04(Cunningham et al.(1994)Plant Cell 6:1107-1121)由来のIPPイソメラーゼ遺伝子（ippHp）に対してスプライシングした。大腸菌 ispA遺伝子は、プライマーispalおよびipsa2を用いてPCRによって単離して、ippHpに対して3’側のNcoI部位に連結した。3つの遺伝子DXPオペロンをプライマーSOE-fおよびispa2を用いて増幅して、pMevTのKpnI-PstI部位にクローニングして、これによってMevTオペロンをSOE4オペロンで置き換えた。
【０２６８】
メバロン酸経路オペロンの構築
サッカロミセス・セレビシエのメバロン酸経路は、2つ別々の独立して発現されるオペロンとして操作した。生合成経路の最後の3つの酵素であるメバロン酸キナーゼ（MKまたはERG12）、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMKまたはERG18）およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（MPDまたはERG19）をコードする遺伝子を、上記に示されるPCRプライマーを用いて、サッカロミセス・セレビシエの染色体DNA調製物からPCRによって単離した。個々の遺伝子を重複伸長を用いてプライマーMK-f、MK-r、PMK-f、PMK-r、MPD-fおよびMPD-rから一緒にスプライシングした（MevB、図13）。メバロン酸経路の最初の3つの酵素である大腸菌由来のアセトアセチル-CoAチオラーゼ（AACTまたはatoB）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMGSまたはERG13）および短縮バージョンの3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAレダクターゼ（Polakowski et al.(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol.49:66-71）(tHMGR1)をコードする遺伝子を単離して、以下のプライマー:atoB-f、atoB-r、HMGS-f、HMGS-r、tHMGR-fおよびtHMGR-rを用いて単独のオペロンとして一緒にスプライシングした（MevT、図13）。個々の遺伝子は、Pfu DNAポリメラーゼおよび標準的なPCRプロトコールを用いてPCRを介して単離した。合成オペロンを、3’A-オーバーハングの付加後にpCR4(InvitrogenのTAベクター)中に連結して、正覚性を確認するために配列決定した。MevBオペロンをpBBRlMCS-3 (Kovach et al.(1995)Gene 166:175-176)のPstI部位に連結して、pMevBを生成した。idi遺伝子を、プライマーidi-fおよびidi-rを用いてMevBに対して3’側のXmaI部位に連結した。MBIオペロンをpBBRlMCS-3のsalI-SacI部位に移動してpMBIを生成した。大腸菌由来のispA遺伝子を、プライマーispa-fおよびispa-rを用いてpMBIのSacI-SacII部位に連結して、これによってpMBISを産生した。MevTオペロンをpBAD33(Guzman et al.(1995)前記)のXmaI-PstI部位に連結した。このオペロンをPLACプロモーターの制御下に置くために、araC-PBAD NsiI-XmaIフラグメントをpBBR1MCSのNsiI-XmaIフラグメントで置き換えてこれによってpMevTを生成した。pLac33を生成するために、MevTオペロンをSalIを用いてpMevTから切り出した。
【０２６９】
アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、短縮HMGR、MK、PMK、MPD、IDI、およびFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号25、26、27、28、29、30、34、および35として示される。MevTオペロン、MevBオペロン、MBIオペロン、およびMBISオペロンのヌクレオチド配列は、図13に模式的に示されるとおり、それぞれ配列番号32、33、36、および37として示される。5'〜3'の方向で、IDI、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、およびMPDをコードするヌクレオチド配列を含む単一のオペロンは配列番号31として示される。この単一のオペロンは、PBADプロモーター(nt1-18)、および以下についてのコード配列を含む。IDI(nt97-642)、アセトアセチル-CoAチオラーゼ(nt684-1865)、HMGS(nt1882-3354)、短縮型HMGR(nt3371-4876)、MK(nt4907-6235)、PMK(nt6251-7603)、およびMPD(nt7619-8806)。
【０２７０】
アモルファジエンのGC-MS分析
種々の株によるアモルファジエン産生は、2つのイオン、分子イオン（204m/z）および189m/zイオンについてのみスキャンニングすることによってMartin et al.(Martin et al.(2001)Biotechnol.Bioeng.75:497-503)において記載されるとおりGC-MSによって測定した。細胞はLB培地中で37℃で2時間増殖させて、0.5mM IPTGおよび種々の濃度の（±）-メバロン酸の同時の添加によってADSおよびメバロン酸経路を発現するように誘導した。アモルファジエン濃度は、カリオフィレン標準曲線および2つの化合物のイオン189および204m/zの相対的な量を用いてカリオフィレン当量に変換した。セスキテルペン  カリオフィレンは、Sigma-Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。
【０２７１】
細胞内プレニルピロリン酸の放射性HPLC分析
細胞内IPP＋DMAPPおよびFPPのレベルを(R)-[5-3H]-メバロン酸(39 Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences、Boston MA)を補充した休止期細胞懸濁アッセイを用いて測定した。細胞は0.5mM IPTGを用いて誘導し、次いでLBブロス中で37℃で約0.6のOD600まで細胞を増殖させて、回収し、1回洗浄して、100mM KPO4緩衝液（pH7.4）中で20-X濃度まで懸濁した。未標識（±）-メバロン酸（10mM）および3H放射性標識（R）-メバロン酸（60μCi）を8mLの細胞懸濁液に添加して37℃でインキュベートした。1.5mLのアリコート由来の細胞を冷KPO4緩衝液を用いて2回洗浄して、細胞内IPP＋DMAPPおよびFPPを、1mLのメタノール：クロロホルム（2:1）を用いて細胞ペレットから抽出した。細胞抽出物は、Fujii et al.（Fujii et al.（1982）Biochem.Biophys.Acta 712：716-718）によって以前に記載されたとおりジャガイモアシッドホスファターゼを用いて脱リン酸化した。プレニルアルコールを、ZhangおよびPoulter（（1993）Anal.Biochem.213：356-361）の方法を用いてHPLC（Agilent Technologies model 1100）によって逆相C-18カラム（4.5mm×250mm 5μの粒子サイズ、Alltech）で分離して、流入シンチレーションカウンター（flow-through scintillation counter）（Packard BioScience,Radiomatic model 500TR）を用いて検出した。
【０２７２】
結果
S.セレビシエ MEV経路を発現するように遺伝子操作している大腸菌
アモルファジエンシンターゼに供給されるFPP基質の細胞内濃度を増大するために、サッカロミセス・セレビシエ由来のメバロン酸依存性イソプレノイド経路をコードする遺伝子をオペロンにアセンブルして大腸菌において発現させた。8つの遺伝子の生合成経路を操作する作業を簡単にするために、本発明者らは、この遺伝子を2つのオペロンに分けて、「トップ」および「ボトム」と呼んだ。このトップのオペロンであるMevTは、偏在する前駆体アセチル-CoAを3つの酵素的工程で（R）-メバロン酸に変換させる（図13）。ボトムのオペロンは、構築物に依存して（R）-メバロン酸をIPP、DMAPPおよび/またはFPPに変換する（図13）。異種の経路の機能を試験するために、イソプレノイド合成を欠く大腸菌株（株DYM1）を、3つの異なるボトムのオペロン構築物pMevB、pMBIおよびpMBISを発現するプラスミドで形質転換した(図13)。株DYM1は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼをコードするispC遺伝子を欠いており(Kuzuyama et al.(1999)前記)、従って内因性のイソプレノイド生合成経路における中間体である2-C-メチル-D-エリトリトール4-リン酸を合成できない（図3)。予想どおり、全ての株は2-C-メチル-D-エリトリトール（ME）の存在下で増殖するが、pMBIまたはpMBISを保有し、pMevBを保有しない株のみがMEの非存在下で1mMのメバロン酸を補充されたプレート上で増殖する。これらの結果によって、合成のMBIおよびMBISオペロンは機能的であって、大腸菌の増殖に必要なIPPおよびDMAPPを供給することができるということが確認された。DXP経路は、分岐点からIPPおよびDMAPPを細胞に供給するので、ispCにおける変異は、両方のピロリン酸前駆体の合成を阻害する。大腸菌はその染色体上にIPPイソメラーゼ遺伝子の非必須のコピーを維持するが、この遺伝子の発現は、IPPのみがMevBオペロンによって供給されるときに大腸菌の増殖を支持するには低すぎると考えられる。
【０２７３】
メバロン酸経路を終了して簡便かつ安価な炭素供給源からセスキテルペン前駆体を合成することを可能にするためには、メバロン酸イソプレノイド経路の残りの3つの遺伝子(atoB、HMGSおよびtHMGR)を発現するpMevTプラスミドを、pMBIまたはpMBISのいずれかを用いて同時形質転換した。アセチル-CoAからのイソプレノイドの合成のための完全な経路を一緒にコードする2つのオペロンの同時発現は、メバロン酸の非存在下でさえispC欠失を補完することが可能であって、このことはMevTオペロンが機能的であることを示す。
【０２７４】
メバロン酸からのアモルファジエン合成
アモルファジエンの高レベル産生を達成するため、およびテルペンシンターゼへのFPPの供給がアモルファジエン収量を制限していたか否かを決定するため、メバロン酸経路を大腸菌におけるアモルファジエン合成に共役させた。MBISボトムオペロンと同時発現されるADS遺伝子を保有する細胞を内因性メバロン酸を補充された培地中で増殖させた。培養抽出物のGC-MS分析によって、これらの培養物からのピークアモルファジエン濃度は、最大40mMメバロン酸の濃度まで、培地に添加されたメバロン酸の量に比例することが明らかになった。これらの結果によってMBISオペロンからの流動は、アモルファジエン産生を用いられる最高のメバロン酸濃度で制限しなかったことが示された。40mMメバロン酸を補充された培養物はピーク濃度3.4μgのカリオフィレン当量/mL/OD600を生じ、これは、それぞれ内因性DXP経路および操作されたDXP経路よりも40倍および11倍大きい。経時的なアモルファジエン濃度の低下は、ヘッドスペースへの揮発性テルペンの損失に起因しており、このことはこれらの報告された産生値が確実に過小評価されていることを意味する。
【０２７５】
アモルファジエンシンターゼが発現されなかった対照の培養物中では10mMより多いメバロン酸の添加の際に重篤な増殖阻害が観察された。この阻害の原因を検討するために、漸増する濃度の外因性メバロン酸を補充された培地中のpMKPMK、pMevB、pMBIまたはpMBISのプラスミドのいずれかを保有する株から大腸菌 DH10Bの増殖を測定した。この培地への5mMのメバロン酸の添加はpMevBを保有する細胞の増殖を阻害したが、この濃度のメバロン酸は、pMKPMK、pMBIまたはpMBISを保有する細胞の増殖に影響しなかった。メバロン酸の非存在下、または1mMメバロン酸を補充した培地でのオペロンの発現は、増殖のごくわずかな低下しか生じなかった。従って、このデータは、メバロン酸経路を通じる高い流動を有する細胞で生じるIPPの蓄積が毒性であり、正常な細胞増殖を阻害することを示す。同じ株での細胞内プレニルピロリン酸のプールを比較するために、種々のメバロン酸オペロン構築物を保有する得られた細胞に放射性標識したメバロン酸を供給して、標識された代謝物を追跡した。MevBを発現する株はIPPを蓄積したがFPPを蓄積せず、一方、MBIおよびMBIS株はFPPを蓄積したが細胞内IPPの測定可能なレベルは蓄積しなかった。アモルファジエンシンターゼの同時発現は、細胞内FPPの減少によって示されるように、MBIS宿主において蓄積した過剰なFPPプールを消費した。
【０２７６】
MBISを発現する細胞は、FPPを蓄積して、10mMメバロン酸の存在下で増殖阻害を示したので、アモルファジエンシンターゼの同時発現は、揮発性のテルペンオレフィンへ細胞内プレニルピロリン酸中間体をチャネリングすることによって増殖阻害を軽減するということが想定される。増殖阻害は、ADS遺伝子を欠く株においてのみ、10〜40mMのメバロン酸およびIPTGの添加の約2時間後に観察された。対照的に、IPTG誘導性プロモーターの制御下でMBISオペロンおよびシンターゼ遺伝子の両方を同時発現する細胞は、全てのメバロン酸濃度において正常な増殖速度を示した。これらの培養物からのアモルファジエン産生は、外因性メバロン酸の添加と比例して増大し、このことはアモルファジエンへのFPPの変換が増殖阻害を最小化するのに重要な役割を果たすという結論をさらに支持する。まとめると。これらのデータによって、操作されたメバロン酸経路は、高レベルのピロリン酸前駆体を産生するということが強力に示唆される。しかしながら、テルペンオレフィンへこの経路中間体を導くためのIPPイソメラーゼ、FPPシンターゼおよびテルペンシンターゼの非存在下では、毒性レベルの細胞内ピロリン酸、特にIPPが蓄積され得る。
【０２７７】
テルペンシンターゼをコードする外因性核酸は、テルペン生合成経路中間体誘導性の増殖阻害を軽減する
大腸菌は、上記のとおり、サッカロミセス・セレビシエのMEV経路を発現するように遺伝子操作され、そしてメバロン酸の豊富な増殖培地において増殖される。対照の細胞を増殖阻害についてスクリーニングした。この細胞をイソプレノイド産生生物体由来の核酸で遺伝子操作した。この細胞はMEV経路における中間体を産生し、この中間体は細胞において蓄積して、細胞の増殖を阻害した。外因性核酸を増殖阻害細胞に導入して、増殖阻害の軽減についてスクリーニングした。次いで生存細胞をテルペンシンターゼ遺伝子についてスクリーニングした。結果を図4〜6に示す。
【０２７８】
図4
pTRC99A発現ベクターを保有する大腸菌の三連の培養物は、この培養培地に存在する種々の濃度のメバロン酸を用いてpBBRlMCS-2プラスミドからメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、IPPイソメラーゼおよびFPPシンターゼをコードする遺伝子を発現する。
【０２７９】
図5
FPPをセスキテルペンアモルファジエンへ変換するアモルファジエンシンターゼの遺伝子を含むpTRC99A骨格、pTRCADS発現ベクターを保有する大腸菌の三連の培養物。
【０２８０】
図6
大腸菌の混合集団は最初は等しく、FPPをアモルファジエンに変換し得る細菌およびFPPをアモルファジエンに変換できない細菌によって示される。細菌の両方の集団は等しく、培養物中に存在するメバロン酸をFPPに変換し得る。
【０２８１】
実施例2：外因性核酸のテルペンシンターゼ遺伝子活性を特定する
大腸菌は、例えば、実施例1に記載されたとおりに、誘導性プロモーターの制御下でMEV経路の酵素MK、PMK、MPD、およびIDIを発現するように遺伝子操作される。対照の遺伝子操作された細胞を、メバロン酸の豊富な増殖培地中で増殖して、細胞死、細胞DNAの変異または細胞の静止期への進入を伴い得る増殖阻害についてモニターする。試験の遺伝子操作された細胞は、例えば、テルペンシンターゼおよびテルペンシンターゼから下流の酵素を含む、テルペン生合成経路遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み得る外因性核酸で形質転換される。外因性核酸は、単細胞生物の細胞から単離されたmRNAから生成されたcDNAライブラリー；多細胞生物の細胞から単離されたmRNAから生成されたcDNAライブラリー；傷つけられるか、昆虫に感染されるか、クモ形類動物に感染されるか、水欠乏に供されるか、または別のタイプのストレスに供された植物の細胞から単離されたmRNAから生成されたcDNAライブラリー；合成のテルペンシンターゼコード核酸のライブラリー；などである。形質転換試験細胞におけるMEV経路遺伝子の発現は、培養培地への誘導因子（例えば、IPTG）の添加によって誘導される。次いで形質転換された試験細胞をメバロン酸を含有する培地中で増殖して、増殖阻害の軽減についてスクリーニングする。例えば、試験宿主細胞が毒性のテルペン生合成経路中間体を生残する能力に対するこの外因性核酸の効果は、生残細胞を同定することによって決定される。次いで生きている細胞をテルペンシンターゼ遺伝子活性についてスクリーニングする。
【０２８２】
実施例3：遺伝子操作された大腸菌細胞におけるプレニル二リン酸の産生の増大
大腸菌は、例えば、実施例1に記載されたとおりに、誘導性プロモーターの制御下でMEV経路の酵素MK、PMK、MPD、IDIおよびFPPシンターゼを発現するように遺伝子操作される。誘導因子（例えば、IPTG）およびメバロン酸を増殖培地に添加し、次いで細胞を増殖阻害についてスクリーニングする。誘導因子およびメバロン酸の添加後種々の時点で、LB-寒天プレートに細胞を平板培養する。小さいコロニーを形成する細胞をさらに、触媒活性の増大を有するMEV経路遺伝子産物の産生について分析する。
【０２８３】
実施例4：枯草菌（Bacillus subtilis）6051ゲノムDNAのライブラリー由来のテルペン生合成経路中間体を改変している遺伝子産物をコードする核酸の単離
イソプレンを産生する細菌枯草菌 6051由来のゲノムライブラリーを、操作した（遺伝子操作した）大腸菌株におけるpTrc99Aプラスミドから発現させて、上昇したレベルのIPPおよびDMAPPを産生させた。操作されたスクリーニング株は、実施例1に記載されたように、pBBR1MCSプラスミドからメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、およびIPP/DMAPPイソメラーゼをコードする核酸を発現した。メバロン酸は、増殖培地中に10mMの濃度で存在した。数回の増殖後、yhfRまたはnudFのいずれかを有するゲノムフラグメントを含むプラスミドのみがゲノムライブラリーにおいて見出された。このデータは図7〜9に示される。
【０２８４】
図7：IPPおよびDMAPPの過剰産生に起因する増殖阻害
pBBR1MCS-2プラスミドからメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、およびIPPイソメラーゼをコードする遺伝子を発現する大腸菌の三連の培養物を、培養培地中に存在する種々の濃度のメバロン酸の存在下で増殖させた。この細胞はまた、pTRC99A発現ベクターを保有する。
【０２８５】
図8：yhfRの発現による増殖阻害の軽減
三連の培養物を設定したが、これはpTRC99AをpYhfRで置き換えた以外は、図7に示されるものと同じであった。pYhfRプラスミドは、遺伝子yhfRを含むpTrc99A骨格である。yhfR遺伝子は、枯草菌 6051由来のゲノムDNAを含むプラスミドライブラリーから単離した。研究されたメバロン酸の全ての濃度についてこの系で増殖阻害は観察されなかった。
【０２８６】
図9：nudFの発現による増殖阻害の軽減
三連の培養物を設定したが、これはpTRC99AをpC9bで置き換えた以外は、図7に示されるものと同じであった。pC9bプラスミドは、遺伝子nudFを含むpTrc99A骨格である。nudF遺伝子は、枯草菌 6051由来のゲノムDNAを含むプラスミドライブラリーから単離された。研究されたメバロン酸の全ての濃度についてこの系では増殖阻害は観察されなかった。
【０２８７】
実施例5：増大した発現および/または活性を有するメバロン酸イソプレノイド経路遺伝子を同定する
大腸菌は、毒性中間体を産生するサッカロミセス・セレビシエのMEV経路の一部を発現するように操作する。この毒性中間体を産生する対照の細胞を、細胞死または変異のいずれによってもよいが増殖阻害についてスクリーニングする。この細胞を、基質として毒性中間体を用いる1つの遺伝子または複数の遺伝子で形質転換して、増殖阻害の軽減についてスクリーニングする。次いで、生きている細胞を発現の改善および/または形質転換された遺伝子の活性についてスクリーニングする。
【０２８８】
特定の例として、ヒドロキシメチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）の蓄積は、操作された大腸菌に対して毒性である。図10および図11において実証されるように、操作された大腸菌におけるプラスミドpHMGSからのサッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAシンターゼの発現は、HMG-CoAの蓄積および大腸菌の増殖阻害をもたらす。HMG-CoAレダクターゼを発現する第二のプラスミド（pHMGR）の大腸菌の操作された株への導入によって、HMG-CoAの蓄積が排除されて、増殖阻害が軽減される（図10および11を参照されたい）。
【０２８９】
図10：別の発現ベクター上で異種遺伝子を発現しない（対照）か、サッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAシンターゼ単独（pHMGSおよび空のベクター）か、またはサッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAシンターゼおよびHMG-CoAレダクターゼ（pHMGS & pHMGR)の両方を発現する大腸菌の培養物
HMG-CoAシンターゼ単独の発現は大腸菌の細胞増殖を阻害したが、HMG-CoAレダクターゼのさらなる発現は増殖阻害を軽減した。
【０２９０】
図11：別の発現ベクター上で異種遺伝子を発現しない（対照）か、サッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAシンターゼ単独（pHMGSおよび空のベクター）か、またはサッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAシンターゼおよびHMG-CoAレダクターゼ（pHMGS & pHMGR)の両方を発現する大腸菌の培養物の代謝分析物
HMG-CoAシンターゼ単独を発現する大腸菌は、HMG-CoAを蓄積した。HMG-CoAレダクターゼおよびHMG-CoAシンターゼの両方を発現する大腸菌は経時的にHMG-CoAを蓄積しなかった。
【０２９１】
本発明はその特定の態様に関して記載されているが、種々の変化を行なうことが可能であり、そして等価物が本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の目的、趣旨および範囲に対して、特定の状況、物質、組成物、プロセス、工程段階または工程に多くの改変を適合させることが可能である。このような改変の全てが本明細書に添付される特許請求の範囲内であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】イソペンテニル二リン酸（IPP）およびジメチルアリル二リン酸（DMAPP）から、テルペン生合成経路中間体のポリプレニル二リン酸ゲラニル二リン酸（GPP）、ファルネシル二リン酸（FPP）およびゲラニルゲラニル二リン酸（GGPPP）の産生を生じる、イソプレノイド代謝経路の模式図である。
【図２】IPPの産生のためのメバロン酸（MEV）経路の模式図である。
【図３】IPPおよびジメチルアリルピロホスフェート（DMAPP）の産生のためのDXP経路の模式図である。
【図４】FPPの過剰産生に起因する、遺伝子操作された大腸菌細胞の増殖阻害を示す。
【図５】メバロン酸の全濃度における、セスキテルペンシンターゼ遺伝子の存在の結果として、遺伝子操作された大腸菌の増殖阻害の軽減を示す。
【図６】混合集団においてFPPを消費し得る細菌の富化を示す。
【図７】IPPおよびDMAPPの過剰産生に起因する、増殖阻害を示す。
【図８】yhfRの発現による増殖阻害の軽減を示す。
【図９】nudFの発現による増殖阻害の軽減を示す。
【図１０】サッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAレダクターゼの過剰発現によるHMG-CoAによって生じる大腸菌の増殖阻害の軽減を示すグラフである。
【図１１】テルペン生合成経路中間体HMG-CoAによる、増殖阻害に対するサッカロミセス・セレビシエ HMG-CoAレダクターゼの同時発現の効果を示すグラフである。
【図１２】図12A〜Cは、アモルファジエンシンターゼをコードする合成核酸のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】MevT、MevB、MBI、およびMBISオペロンを模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007507234.tif 000022