(57)【要約】  軟骨様組織の生体外での生成方法が開示される。前記方法は、細胞外基質の二価カチオン依存性成分（BCDM）および／または軟骨成熟の阻害活性が選択的に除去されているヒト血清の存在下での軟骨形成細胞の培養を含む。結果として得られる軟骨様組織は、治療を受けるものまたは動物における軟骨および／または骨軟骨欠損の修復に使用することができる。
2007502127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外基質の二価カチオン依存性成分（BCDM）および／または軟骨成熟の阻害活性がヒト血清から選択的に除去されている該ヒト血清の存在下で軟骨形成細胞を培養する段階、
を含む、生体外で軟骨様組織を生成させる方法。
【請求項２】
前記阻害活性が、軟骨の増殖および／または成熟を阻害する1つの因子または複数の因子であり、好ましくは軟骨基質の生成を阻害する1つの因子または複数の因子である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記1つの阻害因子または複数の阻害因子が、100,000ダルトン未満、好ましくは75,000ダルトン未満、さらに好ましくは50,000ダルトン未満、最も好ましくは25,000ダルトン未満の分子量を有する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記1つの因子または複数の因子が、10,000ダルトン未満、好ましくは8,000ダルトン未満の分子量を有する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記軟骨形成細胞が、コンドロイチン硫酸塩、インターロイキン、脂質、グルコサミン、硫酸ヘパリン、TGFβ、IGF-1、好ましくはIGF-1 long R3、デキサメタゾン、FGF2およびPDGFββからなる群から選択される因子の存在下で培養される、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
前記軟骨形成細胞が軟骨細胞である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【請求項７】
前記軟骨細胞が、アルギネートゲルに播種され、
ａ）  軟骨細胞への分化、および
ｂ）  細胞外基質の生合成およびアセンブリー
にとって十分な時間培養された軟骨形成細胞に由来する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記軟骨形成細胞を、アルギネートゲルに播種する前に足場依存性増殖により増殖させる、請求項6記載の方法。
【請求項９】
前記軟骨形成細胞が、組織生検に、間充織幹細胞または間質細胞に由来する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
前記軟骨形成細胞がヒトまたは動物に由来する、請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１１】
前記軟骨形成細胞が、好ましくはチャンバーであってその閉鎖空間が部分的に多孔質であるかまたは半透過性である限定された空間において培養される、請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１２】
前記チャンバーが、少なくとも部分的に骨および／または骨代替材料、特にヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムでできている、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記BCDMが、閉鎖空間における培養の前、特に前記軟骨形成細胞の増殖後に、単離された軟骨形成細胞に添加される、請求項11〜12のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞外基質の二価カチオン依存性成分が、軟骨細胞培養液、好ましくはアルギネートの軟骨細胞培養液から単離される、請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
前記生体外で生成される軟骨様組織、または軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物が、さらなる段階において機械的な処理に付される、請求項1〜14のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１６】
前期軟骨様組織、または前記軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する前記化合物の表面に対して、平行および垂直の成分を有する前記機械的処理の力が適用される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記軟骨様組織、または前記軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する前記化合物が、断続的な圧縮／変形サイクルによって機械的な刺激に付される、請求項15〜16のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法により得られる、生体外軟骨様組織、または前記軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物。
【請求項１９】
請求項18記載の生体外軟骨様組織、または前期軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物を含む、軟骨および／または骨軟骨欠損を修復するためのインプラント。
【請求項２０】
請求項18記載の生体外軟骨様組織および／または請求項19記載のインプラントが、前記軟骨および／または骨軟骨欠損に適用される／移植される、治療を受けるものの軟骨および／または骨軟骨欠損を治療する方法。
【請求項２１】
前記治療を受けるものがヒトまたは動物である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
生体外軟骨様組織が自家組織である、請求項20〜21のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階：すなわち
ａ）実質的に多角形の形状の組織パッチ、特に請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法により得られた軟骨様組織を含む組織パッチを供給する段階、および
ｂ）実質的に閉じた組織表面を形成するような方法で、前記多角形組織パッチを並べて配置する段階、
を含む、実質的に閉じた組織表面を形成するために、いくつかの組織パッチを接合する方法。
【請求項２４】
使用される組織パッチが組織／骨複合体の一部である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記組織パッチがカーブした円周線を含む、請求項23〜24のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２６】
請求項23〜25のいずれか1つに記載の方法により得られる、実質的に閉じた組織表面。
【請求項２７】
請求項26記載の組織表面を含むインプラント。
【請求項２８】
前記インプラントが軟骨様／骨複合体である、請求項27記載のインプラント。
【請求項２９】
前記インプラントがインターロッキングエッジ（interlocking edges）を含む、請求項27〜28のいずれか1つに記載のインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外（in vitro）で軟骨様組織を生成させる方法、およびヒトおよび動物における軟骨および／または骨軟骨欠損を治療するための本発明の軟骨様組織を含むインプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷または変性疾患の結果として頻繁に起こる関節軟骨損傷は、自然に治癒せず、しばしば進行性の軟骨変性を引き起こす。この問題は、失われた組織を再生するのに必要な軟骨細胞の移動能力の欠失として見られ、従って局所化した軟骨組織欠損に対して可能性を有する治療は軟骨細胞の移植である。  
【０００３】
異なる方法として、軟骨細胞を欠損領域に播種することが可能である。特に多くの注目を集めている技術の1つは、欠損を覆うように縫合した骨膜の下へ軟骨細胞懸濁液を注入することに基づく（非特許文献1）。その他の方法では、軟骨欠損の修復のための移植片として、種々の生体材料のキャリアーと一緒に軟骨細胞が使用される（非特許文献2）。さらに、生体外での細胞の前培養に使用される種々の方法により、生存能力がありかつ移植可能なコンストラクトを作製するという興味深い可能性が開かれつつある。これらの方法により作製される軟骨は、天然の軟骨とは大きく異なる。
【非特許文献１】Brittberg et al,N. Engl. J. Med 331: 889-895,1994
【非特許文献２】Cao Y. et al. , J Biomater Sci Polym Ed 9: 475-487,1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、ヒトおよび動物における軟骨および／または骨軟骨欠損への移植のための、軟骨様組織の生体外での生成に関する改善された方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って本発明の全般的な目的は、生体外で軟骨様組織を生成させる方法に関する。前記方法は、軟骨形成細胞（chondrogenic cells）のBCDM（細胞外基質の二価カチオン依存性成分）および／またはヒト血清の存在下での培養を含み、前記ヒト血清からは軟骨の成熟および／または増殖の阻害活性が選択的に除去されている。
【０００６】
ヒト血清における前記阻害活性は、好ましくは軟骨の増殖および／または成熟を阻害する1つの因子または複数の因子であり、さらに好ましくは培養細胞における軟骨基質の生成を阻害する1つの因子または複数の因子である。
【０００７】
軟骨の成熟、好ましくは軟骨基質の生成を阻害する前記の1つの因子または複数の因子は、好ましくは100,000ダルトン未満、さらに好ましくは75,000ダルトン未満、その上さらに好ましくは50,000ダルトン未満、最も好ましくは25,000ダルトン未満の分子量を有する。
【０００８】
特に好ましい実施態様において、前記1つの因子または複数の因子は、10,000ダルトン未満、さらに好ましくは8,000ダルトン未満の分子量を有する。
【０００９】
特に好ましい実施態様において、前記軟骨形成細胞は、さらにコンドロイチン硫酸塩、好ましくはコンドロイチン-4-硫酸塩および／またはコンドロイチン-6-硫酸塩、インターロイキン、特にインターロイキン4、脂質、グルコサミン、硫酸ヘパリン、TGFβ、IGF-1、好ましくはIGF-1 long R3、デキサメタゾン、FGF2およびPDGFββからなる群から選択される因子を含む培地で培養される。これらの因子は、単独でまたは組み合わせて培地に添加することができる。さらに好ましい実施態様において、前記軟骨形成細胞は軟骨細胞である。好ましくは、前記軟骨細胞は、アルギネートゲルに播種され、
ａ）  骨細胞への分化、および
ｂ）  細胞外基質の生合成およびアセンブリー、
にとって十分な時間培養された軟骨形成細胞に由来する。
【００１０】
好ましい実施態様においては、前記軟骨形成細胞をアルギネートゲルに播種する前に、足場依存性増殖により増殖させる。前記軟骨形成細胞は、好ましくは組織生検にまたは間充織幹細胞に、さらに好ましくはヒトに由来する。
【００１１】
好ましい実施態様において、前記軟骨形成細胞は、好ましくはチャンバーである閉鎖空間内で培養され、その閉鎖空間は部分的に多孔質であるかまたは半透過性である。好ましくは前記チャンバーは、少なくとも部分的に骨および／または骨代替材料、特にヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムでできている。
【００１２】
さらに好ましい実施態様において、前記BCDMは、閉鎖空間における培養の前、特に前記軟骨形成細胞の増殖後に、アルギネートから単離回収した細胞に添加される。前記細胞外基質の二価カチオン依存性成分（BCDM）は、好ましくは軟骨細胞培養液、さらに好ましくはアルギネートの軟骨細胞培養液から単離される。
【００１３】
もう1つの好ましい実施態様において、生体外で生成される軟骨様組織、または前期軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物は、さらなる工程において機械的な処理に付される。
【００１４】
好ましい実施態様において、前記機械的処理の力は、前記軟骨様組織、または前期軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する前記化合物の表面に対して平行および垂直の成分を有する。好ましくは前記軟骨様組織、または前期軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物は、断続的な圧縮／変形サイクルによって機械的な刺激に付される。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法により入手できるまたは得られる生体外軟骨様組織、または前期軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物に向けられる。
【００１６】
また本発明のさらなる目的は、本発明の方法により得ることができる生体外軟骨様組織、または前期軟骨様組織および骨または骨代替物を形成する化合物を含む、軟骨および／または骨軟骨欠損を修復するためのインプラントに関する。
【００１７】
さらに本発明は、本発明の生体外軟骨様組織および／または本発明のインプラントが、前記軟骨および／または骨軟骨欠損に適用される／移植される、治療を受けるものにおける軟骨および／または骨軟骨欠損を治療する方法に関する。好ましくは、前記治療を受けるものはヒトであり、前記生体外軟骨様組織は自家組織である。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は実質的に閉じた組織表面を形成するために、いくつかの組織パッチを接合する方法に関する。前記方法は、以下の段階：すなわち
ａ）実質的に多角形の形状の組織パッチ、特に本発明の方法により得られた軟骨様組織を含む組織パッチを供給する段階、および 
ｂ）実質的に閉じた組織表面を形成するような方法で、前記多角形組織パッチを並べて配置する段階、
を含む。
【００１９】
使用される組織パッチは、好ましくは組織／骨複合体の一部である。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法により得ることができる実質的に閉じた組織表面にある。
【００２１】
本発明のさらにもう1つの目的は、本発明の前記組織表面を含んでなるインプラントにある。好ましくは、前記インプラントは軟骨様／骨複合体である。
【００２２】
以下の詳細な説明により、本発明はよく理解され、上述により説明されたもの以外の目的が明らかになる。前記の説明は付属の図を参照する。
【００２３】
＜本発明の実施態様＞ 
本発明の方法は、軟骨形成細胞がBCDMおよび／または改質した（modified）ヒト血清の存在下で培養されることを特徴とする。
【００２４】
語句「改質したヒト血清」は、阻害活性、好ましくは軟骨成熟、好ましくは軟骨基質生成に対する1つの阻害因子または複数の阻害因子、が選択的に除去されているヒト血清を表す。前記の軟骨の増殖および／または成熟を阻害する1つの因子または複数の因子は、毒性作用を有する可能性がある。前記改質したヒト血清は、例えば血清の透析、または種々の血清画分を回収する血清の分画により製造することができ、それらの生体外での新規軟骨生成および／または成熟を刺激する能力は試験される。所望の効果を示す血清画分はその後プールされ、本発明の方法において使用される。
【００２５】
前記BCDMは、アルギネートビーズにおいて培養された軟骨細胞から単離することができる。典型的な単離方法は、以下の段階：
ａ）クエン酸塩を含む緩衝液によるアルギネートビーズの可溶化、
ｂ）細胞含有ペレットおよび上清を得るための、前記溶液の遠心分離、
ｃ）アルギネートを沈殿させるための、二価カチオン（例えば塩化カルシウム）の前記上清への添加、
ｄ）アルギネートをペレットにするための前記溶液の遠心分離、および
ｅ）BCDMを含む上清の回収、
を含む。
【００２６】
前記培養軟骨細胞は、ヒトまたは任意の動物に由来するものでよい。
【００２７】
前記コンドロイチン硫酸塩、好ましくはコンドロイチン-4-硫酸塩および／またはコンドロイチン-6-硫酸塩は、種々の供給源に由来することができ、市販のものを利用することができる。本明細書において使用される、インターロイキン、脂質、TGFβ、IGF-1、硫酸ヘパリン、グルコサミン、デキサメタゾン、FGF2およびPDGFββという語句は、それらの機能的アナログおよびフラグメントを含む。これらの因子は当業者に公知であり、種々の供給源から単離することができ、または組換え法により作製することができる。本発明の方法に使用することができる培地はまた、生体外での細胞培養のために通常使用されるさらなる因子を含むことができる。前記因子は当業者に公知であり、市販のものを利用することができる。
【００２８】
生体外で生成した軟骨様組織の機械的処理は、それにより軟骨様組織が、処理されない軟骨に比べて改善された特性をもつようになり、従って治療を受けるものにおける軟骨および／または骨軟骨欠損への移植に特に適している。
【００２９】
臨床応用のために、生体外で生成させた軟骨様組織は、例えば可変的形態のインプラントを形成するために組織／骨複合体と組み合わせて使用することができる。組織／骨複合体として使用することができる適当な材料は、当業者に公知であり、例えばリン酸三カルシウムを含む。本発明の組織パッチ／プラグは、例えば骨成長を増強する因子で被覆されてもよい。前記因子は当業者に公知であり、例えば骨形成タンパク質を含む。
【００３０】
図4Aおよび4Bは、本発明による典型的な骨軟骨インプラントを示す。図4Aのインプラントは多角形プラグの形態を有し、図4Bのインプラントは円盤型の骨軟骨プラグである。骨軟骨プラグは組織部分1および適当な組織／骨複合体で作られる部分2を含む。
【００３１】
図1は、本発明の方法の好ましい実施態様のフローチャートを示す。この好ましい実施態様において、軟骨形成細胞、好ましくは軟骨細胞のアルギネートでの細胞培養は、改質したヒト血清の存在下で培養される。この段階の結果として得られる細胞はその後、さらなる任意の段階において、BCDMの存在下で培養される。
【００３２】
図2A〜2Cは、生体外における種々の条件下で培養された軟骨細胞の表現型の概略図を示す。
【００３３】
図5において六角形の組織パッチを示す。本発明の組織パッチ／プラグは、実質的に閉じた表面を形成するために接合することができる実質的に多角形の形状を有することができる。本明細書において使用される語句「実質的に多角形の形状」は、カーブした円周線を含む形状を包含する。2つの典型的なカーブした円周線を有する実質的に多角形のパッチが図8AおよびBに示されている。
【００３４】
図6は六角形の組織パッチ／プラグにより形成される閉じた組織表面を示す。このような生体外で形成された組織表面は、その後外科医により患者の軟骨および／または骨軟骨損傷に移植される。本発明の閉じた組織表面は、患者の損傷における単独のプラグの移植およびそれらのアセンブリーの場合と比較して、患者の損傷に容易に移植することができる。患者の損傷の大きさおよび形状に依存して、閉じた組織表面は生体外でのアセンブリーが可能であり、患者に単一段階で容易に移植することができる。
【００３５】
本発明の組織パッチ／プラグまたはインプラントは、患者の損傷に移植された場合に安定であるためにインターロッキングエッジ（interlocking edges）を含むことができる。典型的なインターロッキングエッジは、例えばラフニングエッジ（roughened edges）、らせん状エッジまたは切り込みである。典型的なインターロッキングエッジを有する典型的なプラグ／インプラントを図7AおよびBに示す。
【００３６】
本発明を実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００３７】
＜実施例 I ―BCDMの作製＞
予備研究を、屠殺した若い（6〜18月齢）仔ウシ由来のフレッシュな軟骨細胞を用いて行った。
【００３８】
（培養条件）
全層関節軟骨は中手指節関節より摘出される。軟骨の薄片は、5%のウシ胎児血清を含むDMEM/F12（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）において、0.4%のプロナーゼ（Calbiochem製, La Jolla, Calif.）を用いて37℃で90分間消化され、その後0.025%のヒストリチクス菌由来コラゲナーゼ P（Roche Diagnostics製, Mannheim, Germany）を用いて37℃で16時間消化される。前記消化物はその後、40μmのセルストレーナー（Beckton Dickinson製, Frank- lin Lakes, N. J.）を通してろ過される。その後、軟骨細胞は遠心分離によって回収され、0.15 M NaClにおける滅菌済みアルギネート（Kelton LV製, Kelco, Chicago,. USA）の1.2%溶液に、4x106 細胞／mlの密度で再懸濁される。細胞懸濁液は22ゲージ針にゆっくりと通され、102 mM塩化カルシウム溶液に滴下される。新しく形成したビーズをこの溶液において10分間重合させ、その後0.15 M NaClで2回洗浄し、引き続きDMEM/F12で2回洗浄する。その後、前記ビーズはDMEM/F12、50μg/ml ゲンタマイシン、10% FCS、有効量の付加的な増殖因子および25μg/mlアスコルビン酸（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）からなる完全培地に移される。培養は、5% CO2に調節された加湿された雰囲気中で37℃に保たれ、培地は2日に1回新しい培地に交換される。
【００３９】
14日培養後、培地を除去し、55 mM クエン酸ナトリウム、0.15 M NaCl、pH 6.8において、37℃で10分間インキュベートすることにより、ビーズを溶解させる。細胞懸濁液が遠心分離により回収される。細胞結合性基質（cell-associated matrix）とともに細胞を含むペレットが55 mM クエン酸ナトリウム、0.15 M NaCl、pH 6.8に再懸濁され、再び37℃で10分間インキュベートされる。遠心分離による回収後、細胞結合性基質とともに細胞を含むペレットが100% FCSに再懸濁され、最終的な細胞スラリーが作製される。
【００４０】
（BCDM調製の実施例）
ビーズを溶解させたものからの上清が全量回収され（65 ml）、2日間0.9% NaClに対して透析される。
【００４１】
これにCaCl2を添加し（最終濃度 0.155 M）、撹拌しながら一晩アルギネートを沈殿させ、引き続き4,000rpmで遠心分離を行う。
【００４２】
上清をとり、PM10の限外ろ過（10,000mwtで分画）を通して、緩衝液を0.9%NaClに交換する。その結果得られる溶液は粘性液体であり、これは0.22μmフィルターを通してろ過滅菌される。BCDMは、前記細胞スラリーを強化するために、前記細胞およびそれらの細胞結合性基質と混合してもよい。あるいは、粘性のBCDMは細胞懸濁液と混合する前に、speed vac（Savant Instruments製, Formingdale, NY）を用いて濃縮および／または乾燥することもできる。
【００４３】
＜実施例II−ヒト軟骨細胞におけるヒト血清の阻害効果の実証＞
予備研究を、厳格な倫理的ガイドラインに従い、剖検において外側大腿顆（lateral femoral condyle）から得られた、正常なヒト軟骨由来の軟骨細胞を用いて行った。
【００４４】
（培養条件）
全層関節軟骨はヒトの遺体からの外側大腿顆より摘出される。軟骨の薄片は、5%のヒト血清を含むDMEM/F12（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）において、0.4%のプロナーゼ（Calbiochem製, La Jolla, Calif.）を用いて37℃で90分間消化され、その後0.025%のヒストリチクス菌由来コラゲナーゼ P（Roche Diagnostics製, Mannheim, Germany）を用いて37℃で16時間消化される。前記消化物はその後、40μmのセルストレーナー（Beckton Dickinson製, Frank- lin Lakes, N. J.）を通してろ過され、軟骨細胞が遠心分離によって回収される。
【００４５】
前記軟骨細胞をDMEM/F12、50μg/ml ゲンタマイシン、10% ヒト血清、有効量の付加的な増殖因子および25μg/mlアスコルビン酸（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）からなる完全培地に再懸濁し、組織培養用プラスチックに1x104 細胞／mlの密度で播き、そして培養は、5% CO2に調節された加湿された雰囲気中で37℃に保たれ、培地は2日に1回新しい培地に交換される。細胞がコンフルエントに達する時点、およそ16〜18日で、細胞を、ハンクス平衡塩溶液（Sigma製, St. Louis, USA）で3回洗浄し、ハンクス平衡塩溶液におけるトリプシン／EDTA（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）と37℃で10分間インキュベートすることによって回収する。その後、10%のヒト血清を含むDMEM/F12を添加することにより消化は停止し、細胞数が計測される。
【００４６】
その後、細胞は遠心分離によって回収され、0.15 M NaClにおける滅菌済みアルギネート（Kelton LV製, Kelco, Chicago,. USA）の1.2%溶液に、4x106 細胞／mlの密度で再懸濁される。細胞懸濁液は22ゲージ針にゆっくりと通され、102 mM塩化カルシウム溶液に滴下される。新しく形成するビーズをこの溶液において10分間重合させ、その後0.15 M NaClで2回洗浄し、引き続きDMEM/F12で2回洗浄する。その後、前記ビーズはDMEM/F12、50μg/ml ゲンタマイシン、25μg/mlアスコルビン酸（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）および結果の部分において詳説されるような種々の濃度のヒトおよびウシ胎児血清からなる完全培地に移される。培養は、5% CO2に調節された加湿された雰囲気中で37℃に保たれ、培地は2日に1回新しい培地に交換される。
【００４７】
（アルギネートビーズにおける、処理14日後の基質生合成の特性評価）
35Sタンパク質ラベリングによる生合成活性の評価
処理の14日後に、3つのビーズを取り、50μCi/mlの35Sを含む300μlの完全培地で16時間インキュベートする。前記ビーズは一晩パパイン消化され、その後8Mの塩酸グアニジンで抽出される。その結果得られた溶液はPD10カラムで分画され、各画分に含まれる放射能が液体シンチレーションカウンティングにより定量化される。各サンプルの一部分をDNA含量の定量化のために使用し、すべてのデータはDNA含量に対して標準化される。
【００４８】
（結果）
ヒト軟骨細胞をアルギネートゲルにおいて培養し、種々の血清濃度で14日間処理した。10％ヒト血清（HS）をコントロールとして使用した。生合成活性は上述の記載のように解析した。10%または15%のいずれかのFCSにより、コントロールの約350%まで合成活性が上昇した。10% FCSへの5% HSの添加により、この増加は10% HS単独と同等のレベルまで劇的に減少した（図3参照）。この減少は、ヒト軟骨細胞におけるFCSの有用な効果を封じることができる阻害活性を示している。
【００４９】
＜実施例III−アルギネートから単離回収した細胞スラリーからの軟骨様組織インプラントの生成＞
細胞スラリーおよびBCDMの作製は、実施例IおよびIIにおいて記載されているとおりに行われる。粘性BCDMは、細胞スラリー量6に対してBCDM量1の比率で細胞スラリーと混合される。その結果得られた懸濁液は、厚さ2 mmおよび直径20 mmのシリコン型に入れられる。インプラントの基礎はシリコン（軟骨欠損の場合）、または骨または骨代替物（骨軟骨欠損の場合）でよい。前記インプラントはその後、金属フレームで適当な場所にしっかりと置かれる、滅菌した透析チューブ（MWCO 14,000）で覆われる。その後前記インプラントを6ウェルプレートに入れ、DMEM/F12、50μg/ml ゲンタマイシン、10% ヒト血清、25μg/mlアスコルビン酸（Gibco Invitrogen製, Basel, Switzerland）からなり、有効量の付加的な増殖因子および／またはコンドロイチン硫酸塩-4および／またはコンドロイチン硫酸塩-6を含む完全培地を入れる。培養は、5% CO2に調節された加湿された雰囲気中で37℃に保たれ、培地は2日に1回新しい培地に交換される。7〜14日後に透析膜を除去し、前記インプラントは必要に応じてさらなる期間培養される。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様が示されそして記載されているが、本発明はこれらに限定されるものではなく、その他の種々の態様および実施も本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図1は生体外軟骨様組織の生成方法のフローチャートを示す。
【図２】図2Aは単層培養における軟骨細胞の表現型を模式的に示す。図2Bは3次元培養系に播種した直後の、単層軟骨細胞の表現型を模式的に示す。図2Cは3次元培養の一定時間後の軟骨細胞の表現型を模式的に示し、細胞外基質の増加が見られる。
【図３】図3は、軟骨基質合成における、16時間のラベリング時間後の35Sの取り込みに対する、ヒト血清の阻害効果を示す；
【図４】図4Aは典型的な多角形の骨軟骨プラグを示す。図4Bは典型的な円盤型の骨軟骨プラグを示す；
【図５】図5は典型的な多角形の組織パッチを示す；
【図６】図6は本発明の多角形組織パッチにより形成される組織表面を示す；
【図７】図7AおよびBは、典型的なインターロッキングエッジを有する組織プラグを示す；
【図８】図8AおよびBは、典型的なカーブした円周線を含む実質的に多角形の組織パッチを示す。
【図１】
2007502127.tif 000003
【図２Ａ】
2007502127.tif 000004
【図２Ｂ】
2007502127.tif 000005
【図２Ｃ】
2007502127.tif 000006
【図３】
2007502127.tif 000007
【図４Ａ】
2007502127.tif 000008
【図４Ｂ】
2007502127.tif 000009
【図５】
2007502127.tif 000010
【図６】
2007502127.tif 000011
【図７Ａ】
2007502127.tif 000012
【図７Ｂ】
2007502127.tif 000013
【図８Ａ】
2007502127.tif 000014
【図８Ｂ】
2007502127.tif 000015
【国際調査報告】
2007502127.tif 000016
2007502127.tif 000017
2007502127.tif 000018
2007502127.tif 000019
2007502127.tif 000020
2007502127.tif 000021