(57)【要約】新規なＲＮアーゼ及び従来既知のＲＮアーゼを組換えにより作成する方法を開示している。該新規なＲＮアーゼはヒト腫瘍細胞に対して活性である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のリボヌクレアーゼをコード化するＤＮＡを含んでいるベクター。
【請求項２】
ベクターがｐＥＴ１１ｄプラスミドである請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ベクターがｐＥＴ２２ｂプラスミドである請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のリボヌクレアーゼをコード化するＤＮＡを含んでいるベクター。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のリボヌクレアーゼをコード化するＤＮＡを含んでいるベクター。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のリボヌクレアーゼをコード化するＤＮＡを含んでいるベクター。
【請求項７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のリボヌクレアーゼをコード化するＤＮＡを含んでいるベクター。
【請求項８】
組換えによって作成されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項９】
組換えによって作成され、そして最初のメチオニン残基を切除した後のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１０】
組換えによって作成されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１１】
組換えによって作成され、そして最初のメチオニン残基を切除した後のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１２】
組換えによって作成されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１３】
組換えによって作成され、そして最初のメチオニン残基を切除した後のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１４】
組換えによって作成されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１５】
組換えによって作成され、そして最初のメチオニン残基を切除した後のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１７】
請求項１６のタンパク質を保存的に修飾した変異体。
【請求項１８】
宿主中で発現したときに、請求項１６のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項１９】
宿主中で発現したときに、請求項１７のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２１】
請求項２０のタンパク質を保存的に修飾した変異体。
【請求項２２】
宿主中で発現したときに、請求項２０のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項２３】
宿主中で発現したときに、請求項２１のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２５】
請求項２４のタンパク質を保存的に修飾した変異体。
【請求項２６】
宿主中で発現したときに、請求項２４のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項２７】
宿主中で発現したときに、請求項２５のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３１】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３２】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３４】
請求項３３のタンパク質を保存的に修飾した変異体。
【請求項３５】
宿主中で発現したときに、請求項３３のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項３６】
宿主中で発現したときに、請求項３４のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３８】
請求項３７のタンパク質を保存的に修飾した変異体。
【請求項３９】
宿主中で発現したときに、請求項３７のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項４０】
宿主中で発現したときに、請求項３８のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項４１】
請求項３７のタンパク質及び７１位においてシステイン残基に結合している標的部分を
含んでいる複合タンパク質。
【請求項４２】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４３】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４４】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４５】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４６】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４７】
Ｎ−末端においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の少なくとも最初のそして最大では全ての残基を順序正しく有するリーダー配列によって先行されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸配列を有する融合タンパク質。
【請求項５０】
請求項４９のタンパク質を保存的に修飾した変異体。
【請求項５１】
宿主中で発現したときに、請求項４９のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項５２】
宿主中で発現したときに、請求項５０のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項５３】
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のタンパク質又はその保存的修飾変異体、及びｂ）標的部分を含んでいる融合タンパク質。
【請求項５４】
タンパク質及び標的部分に連鎖しているリンカー配列を更に含んでいる請求項５３の融合タンパク質。
【請求項５５】
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０の融合タンパク質又はその保存的修飾変異体、及びｂ）７１位に在るシステイン残基に結合している標的部分を含んでいる複合融合タンパク質。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のリボヌクレアーゼをコード化するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のＤＮＡを含んでいるベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品に関するものであり、そして特にヒトにおける腫瘍の処置のための医薬品に関するものである。最も直接的な意味では、本発明は生物活性を有するリボヌクレアーゼ（「ＲＮａｓｅｓ」）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある種のリボヌクレアーゼが特定のヒト腫瘍細胞に対して活性を有することは知られている。例えば、本願出願人による米国特許第5,559,212号には、今日では登録商標「ＯＮＣＯＮＡＳＥ」として知られているリボヌクレアーゼ医薬品で、現在第III相臨床試験の対象となっているランピルナーゼ（ranpirnase）が開示されそして特許請求されている。そして本願出願人による米国特許第6,239,257 B1号は、膵臓リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーに属し、それぞれが２種のヒト癌腫細胞株に対して活性を有する４種のリボヌクレアーゼタンパク質を開示している。
【０００３】
目下の興味は、特定の関心のある細胞受容体に移送するための「標的」医薬品に向けられている。それは、所望する細胞に好適に誘引される標的部分を選択し、そして該標的部分を医薬品に（複合(conjugation)又は融合(fusion)により）結合させることにより達成することができる。
【０００４】
本願出願人による米国特許第6,175,003 B1号は、「システイン化（cysteinizing）」することによって治療的に活性なリボヌクレアーゼを標的とする一般的概念について論じている。ランピルナーゼの場合は、これは標的部分を７２位のシステイン残基に複合(conjugating)させることにより達成することができる。このアプローチは有望でありそしてなお研究中ではあるが、複合体(conjugate)のための規制認可を得ることは難しく、そして融合タンパク質の方が規制認可を得ることへのより容易な途であると、一般的には信じられている。
【０００５】
ランピルナーゼのＮ−末端残基はピログルタミン酸である。これはＮ−末端を「阻止(blocks)」し、即ち、他のアミノ酸残基が該Ｎ−末端の左側に結合することを不可能としている。それ故、ランピルナーゼのＮ−末端に標的部分を結合させることにより融合タンパク質を作成することは不可能である。一方、ピログルタミン酸残基を除去し、そしてランピルナーゼ第２部位にあるアスパラギン酸残基に標的部分を結合させることは可能ではあるが、ピログルタミン酸残基を除去すると、ランピルナーゼの活性が失われてしまう。
【０００６】
しかしながら、上記で引用した米国特許第6,239,257 B1号に開示されているリボヌクレアーゼは、ある特定のヒト癌細胞に対して活性を有するのみならず、「阻止された(blocked)」Ｎ−末端を欠いている。それ故、これらのリボヌクレアーゼはＮ−末端の終点に標的部分を結合させることによって標的融合タンパク質を作成するために用いることができる可能性がある。
これらのタンパク質を組換えによって製造するための方法を提供することは有益であろう。
また、標的融合タンパク質に形成され得る生物活性タンパク質を提供することも有益であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一面では、米国特許第6,239,257 B1号に開示されたタンパク質を、組換えによ
って製造するための方法を提供するものである。
本発明の他の一面は、ヒト癌細胞に対して活性があり、そして組換えによって製造することができる新規なタンパク質を提供するものである。このタンパク質の一つは、標的部分により容易に複合させるために「システイン化」されたものである。
【０００８】
組換えによって製造するときは、米国特許第6,239,257 B1号に開示されたタンパク質の一つは、いくつかの異なるリーダー配列が該タンパク質のＮ−末端に結合された場合であってもヒト癌細胞に対して活性を維持している。該リーダー配列は、関心のあるタンパク質のＤＮＡが挿入されたベクターの部分を形成する。以下に示すように、そのようなリーダー配列は、米国特許第6,239,257 B1号に開示されたリボヌクレアーゼタンパク質ファミリーのいかなるもののＮ−末端に結合されたときでも、該タンパク質の生物活性には影響を与えないという、説得力のある証拠がある。
【０００９】
〔好適な実施例の詳細な説明〕
本発明は、以下の典型的なそして非制限的な図面を参照することにより、より良く理解することができる。
一般的な製法を、以下の実施例１、２及び３において使用しているが、それは米国特許第6,239,257 B1号中の２３２５ｐ４、２３２５ｐ６及び２７２８と同定されたタンパク質の組換え製造に関するものである。当該製法を、最初に概説的に、そしてその後により詳細に記載する。その後に、各実施例を挙げる。
【００１０】
一般的段階では、各遺伝子に対して１４個（上部ＤＮＡ鎖を表す７個及び下部ＤＮＡ鎖を表す７個）のオリゴヌクレオチドを合成した。当該オリゴヌクレオチドは以下の点に注意してデザインされた。
ａ）アニーリング後に、相補的なオリゴヌクレオチドが各対の５’末端においてオーバーハング(overhang)を有し、それぞれのオーバーハングの長さは７個のオリゴヌクレオチド分であり；そして
ｂ）当該オーバーハングのそれぞれは、オリゴヌクレオチドの不適正対合(unfitting pair)の１対のオーバーハングを含めて、少なくとも３個のヌクレオチドの誤対合(mismatches)を有している。
【００１１】
完全長遺伝子の両鎖を現わす７対のオリゴヌクレオチドを、アニーリング後に得ることができた。当該二重鎖のオリゴヌクレオチドを３つの工程で連結して、興味有るタンパク質の完全長ＤＮＡを形成させた。この完全長ＤＮＡをその後ＰＣＲの対象とした。当該ＰＣＲプライマーは以下の点から選択した：
ａ）該遺伝子の５’末端においてXbaI制限部位を、そして該遺伝子の３’末端においてBamHI制限部位を取り込むため。これらの部位は、該遺伝子を当該部位においてpET-11d プラスミドベクター中にクローン化することができるように選択した。
ｂ）該遺伝子の最初のヌクレオチドの直前に翻訳開始コドンを含めるため。
ｃ）該遺伝子の最終コドンの最後のヌクレオチドの直後に翻訳終結コドンを取り込むため。
【００１２】
このようにして作成した精製遺伝子を、XbaI及びBamHI制限部位間においてpET11dプラスミドベクター中に挿入した。挿入することができたクローンを同定し、そして組換えタンパク質の発現に用いた。
【００１３】
それぞれの場合、発現したタンパク質は、−１位に付加的なメチオニン残基を有していた。これをエロモナス(Aeromonas)アミノペプチダーゼを用いてin vitroで切断し、所望のタンパク質を得た。
より詳細には、それぞれの場合に１４個のオリゴヌクレオチドを合成し、そして、Geno
sys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, Texas) を用いてゲル精製した。各オリゴヌクレオチドに、New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts)製のＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ酵素及びその反応緩衝液を用いて、５’末端においてリン酸化を行なった。所望のＤＮＡを、フェノール：クロロホルム溶液（Eastman Kodak Company, Rochester, NY）を用いて抽出し、そして取り込まれなかったｒＡＴＰをエタノール沈殿により除去した。
【００１４】
相補性オリゴヌクレオチドの各溶液（各２０μｇ、計４０μｇ）を混合し、そしてアニールして二重鎖オリゴヌクレオチドを形成した。アニーリングは、相補性オリゴヌクレオチドを含んでいるチューブを沸騰水を含んでいるビーカー中に置き、そしてその後にそのビーカーを穏やかに撹拌しつつ約１８時間、低温室に置くことにより行なった。
【００１５】
アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドを、その後Genomed Inc. (Research Triangle Park, North Carolina) 製のジェットソルブＤＮＡ抽出キット(Jetsorb DNA extraction kit) を用いてアガロースゲル精製を行なった。二重鎖オリゴヌクレオチド（それぞれ約１０μｇ）を混合し、そして、New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts)製のＴ４ ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて、１６℃で１８時間、それぞれ異なる３つの工程で互いに連結させた。上述したように、各連結反応混合液中のＤＮＡはフェノール：クロロホルム溶液を用いて抽出し、その後にエタノールで沈殿させた。この結果、興味有るタンパク質の完全長二重鎖ＤＮＡを作成することができた。
【００１６】
当該所望する遺伝子である生成物は、ＰＣＲを用いて増幅し、そしてジェットソルブＤＮＡ抽出キットを用いてアガロースゲルにより精製した。その後精製した遺伝子をXbaI及びBamHI制限酵素で消化し、そしてStratagene(La Jolla, Carfornia) 製のXbaI及びBamHI制限酵素で消化してあるpET-11dプラスミドベクター(Novagen) 中に連結した。（pET-11d ベクター並びにXbaI及びBamHI制限部位の使用は、好適である理由のみであって必須ではない。他のベクター及び他の制限部位をも代わりに使用することができる。）
【００１７】
その後、当該連結した反応混合液を用いて、E.coli ＸＬ１−Blue株（Stratagene）のコンピテント細胞へ形質転換させた。当該クローンについて、プラスミドＤＮＡ標品中に挿入された所望するタンパク質のＤＮＡを、制限酵素分析法により同定した。当該組換えプラスミドＤＮＡをその後下記のように発現宿主に形質転換させて、標的遺伝子を発現させた。
【００１８】
E.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞(Novagen, Madison, WI) を発現宿主として使用し、そして当該プラスミドＤＮＡで形質転換した（他の発現宿主を代わりに使用することもできる）。該組換えタンパク質は、ＩＰＴＧによる誘導によって発現した。発現したタンパク質の大部分は封入体(inclusion bodies) 中にあり、そしてその他は可溶性画分中に存在していた。
【００１９】
当該組換えタンパク質を精製するために、下記のように変更したSchultz及びBaldwin (Protein Science 1, 910-916, 1992)の方法を用いて、封入体を含んでいる細菌のペレットを再懸濁し、超音波処理し、そして遠心分離した。当該封入体を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含んでいる５０ｍＭのTris-HCl緩衝液、ｐＨ８.５で洗浄し、そして遠心分離した。ペレットに含まれているタンパク質を、その後１００ｍＭトリシン緩衝液、ｐＨ８.５中の６Ｍグアニジン−ＨＣｌで変性させた。その後、当該タンパク質を、０.１Ｍの還元グルタチオンを添加し続いて窒素ガスを通気しつつ室温で３時間インキュベートすることによって、還元しそして完全に変性させた。その後、該タンパク質を、超純水(nanopure water)で１０倍に希釈し、続いて４〜５℃で１８時間インキュベートすることにより、再成した。当該再成されたタンパク質を、その後ＳＰ−セファローズ(SP-Sepharose) の陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。該ＳＰ−セファローズカラムは、０.１５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.０中の塩化ナトリウム直線勾配（０〜０.３Ｍ）で溶出した。最後に、当該精製したタンパク質の等質性を、１０〜２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検定した。これらの工程は、所望するタンパク質の収率を増大するために好適ではあるが、これらは本発明にとっては必ずしも必要ではなく、そして省略することもできる。
遂に、上述したように、−１位の最初のメチオニン残基を、エロモナスアミノペプチダーゼによってin vitroで切断した。この方法により所望するタンパク質が生成された。
【００２０】
〔実施例１〕
ｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４プラスミドＤＮＡの合成、クローン化及び発現
実施例１は、米国特許第6,239,257 B1号に記載の２３２５ｐ４で、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、そしてそのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であると同定されたタンパク質に関するものである。
最初の工程において、オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を、上述したように合成しそして精製した。
【００２１】
次の工程において（図１の上部に表示しそして上記に詳細に記載）、オリゴヌクレオチドの対を混合しそしてアニールして、二重鎖オリゴヌクレオチドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６及びＡ７を作成した。
その後これらアニールしたオリゴヌクレオチドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６及びＡ７を、上述したようにアガロースゲルで精製した。その後当該アニールしそして精製したオリゴヌクレオチドを混合し、上述した方法を用いて、図１の中央に表示したそれぞれ異なる３つの連結工程によって互いに連結した。この方法により完全長ＤＮＡが作成された。
【００２２】
該完全長ＤＮＡ１μｇを、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を用いたＰＣＲの対象とした。上述したように、当該プライマーは、遺伝子をｐＥＴ１１ｄベクターに挿入するためのXbaI及びBamHI制限部位を提供する。
該２３２５ｐ４タンパク質の遺伝子を、上述したようにアガロースゲルで精製した。精製した２３２５ｐ４遺伝子をXbaI及びBamHI制限酵素で消化し、そして上述したようにｐＥＴ１１ｄプラスミドベクターに連結した。
その後、上述したように、該連結した反応混合液を、E.coli ＸＬ１−Blueコンピテント細胞へ形質転換させるために使用し、そして当該組換えプラスミドｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ ＤＮＡを用いて、上述したように該発現宿主が該標的遺伝子を発現するように形質転換させた。
【００２３】
発現したタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に表示したアミノ酸配列を有し、その中では、付加的なＮ−末端メチオニン残基に、２３２５ｐ４タンパク質の最初のアミノ酸であるリシンが続いていた。当該Ｎ−末端の付加的なメチオニン残基を上述したように切断して、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有する２３２５ｐ４組換えタンパク質を得た。
米国特許第6,239,257 B1号に記載されているように、２３２５ｐ４タンパク質は、ヒト顎下腺(submaxillary gland) 癌（Ａ−２５３）、及びヒト膀胱癌（Ｔ−２４）細胞の成
長を抑制した。
【００２４】
〔実施例２〕
ｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ６プラスミドＤＮＡの合成、クローン化及び発現
実施例２は、米国特許第6,239,257 B1号に記載の２３２５ｐ６で、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７であり、そしてそのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８であると同定されたタンパク質に関するものである。
最初の工程において、オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２を、上述したように合成しそして精製した。
【００２５】
次の工程において（図２の上部に表示しそして上記に詳細に記載）、オリゴヌクレオチドの対を混合しそしてアニールして、二重鎖オリゴヌクレオチドＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４を作成した。
これらアニールしたオリゴヌクレオチドＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４を、上述したようにアガロースゲルで精製した。当該アニールしたオリゴヌクレオチドを混合し、そして上述した方法を用いて、図２の中央に表示したそれぞれ異なる３つの連結工程によって互いに連結した。この方法により完全長ＤＮＡが作成された。
【００２６】
該完全長ＤＮＡ１μｇを、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を用いたＰＣＲの対象とした。上述したように、当該プライマーは、遺伝子をｐＥＴ１１ｄプラスミドベクターに挿入するためのXbaI及びBamHI制限部位を提供する。
該二重鎖完全長のＰＣＲ生成物、即ち、該２３２５ｐ６タンパク質の遺伝子をアガロースゲルで精製し、そしてXbaI及びBamHI制限部位においてｐＥＴ１１ｄプラスミドベクターに連結したが、これらに使用した全ての方法は上述している。
その後、上述と同様の方法を用いて、E.coli ＸＬ１−Blueコンピテント細胞へ形質転換させ、そして当該組換えプラスミドｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ６ ＤＮＡを用いて、該発現宿主（E.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)コンピテント細胞）が該標的遺伝子を発現するように形質転換させた。
【００２７】
発現したタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に表示したアミノ酸配列を有し、この中において、付加的なＮ−末端メチオニン残基に、２３２５ｐ６タンパク質の最初のアミノ酸であるリシンが続いていた。当該Ｎ−末端の付加的なメチオニン残基を上述したように切断して、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を有する２３２５ｐ６組換えタンパク質を得た。
米国特許第6,239,257 B1号に記載されているように、２３２５ｐ６タンパク質は、ヒト顎下腺癌（Ａ−２５３）、及びヒト膀胱癌（Ｔ−２４）細胞の成長を抑制した。
【００２８】
〔実施例３〕
ｐＥＴ１１ｄ−２７２８ｐ６プラスミドＤＮＡの合成、クローン化及び発現
実施例３は、米国特許第6,239,257 B1号に記載の２７２８で、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４であり、そしてそのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５であると同定されたタンパク質に関するものである。
最初の工程において、オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９を、上述したように合成しそして精製した。
【００２９】
次の工程において（図３の上部に表示しそして上記に詳細に記載）、オリゴヌクレオチドの対を混合しそしてアニールして、二重鎖オリゴヌクレオチドＡ１５、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０及びＡ２１を作成した。
これらアニールしたオリゴヌクレオチドＡ１５、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０及びＡ２１を、その後上述したようにアガロースゲルで精製した。該アニールしたオリゴヌクレオチドを混合し、そして上述した方法を用いて、図３の中央に表示したそれぞれ異なる３つの連結工程によって互いに連結した。この方法により完全長ＤＮＡが作成された。
【００３０】
該完全長ＤＮＡ１μｇを、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９を用いたＰＣＲの対象とした。上述したように、当該プライマーは、遺伝子をｐＥＴ１１ｄプラスミドベクターに挿入するためのXbaI及びBamHI制限部位を提供する。
【００３１】
該二重鎖完全長のＰＣＲ生成物、即ち、該２７２８タンパク質の遺伝子をアガロースゲルで精製し、そしてｐＥＴ１１ｄプラスミドベクターに連結したが、これらに使用した全ての方法は上述している。
その後、上述と同様の方法を用いて、E.coli ＸＬ１−Blueコンピテント細胞へ形質転換させ、そしてその組換えプラスミドＤＮＡ ｐＥＴ１１ｄ−２７２８を用いて、発現宿主細胞（E.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)コンピテント細胞）が該標的遺伝子を発現するように形質転換させた。
【００３２】
発現したタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に表示したアミノ酸配列を有し、この中において、付加的なＮ−末端メチオニン残基に、２７２８タンパク質の最初のアミノ酸であるリシンが続いている。該Ｎ−末端の付加的なメチオニン残基を上述したように切断して、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４を有する２７２８組換えタンパク質を得た。
米国特許第6,239,257 B1号に記載されているように、２７２８タンパク質は、ヒト顎下腺癌（Ａ−２５３）、及びヒト膀胱癌（Ｔ−２４）細胞の成長を抑制した。
【００３３】
〔実施例４〕
ｐＥＴ２２ｂ−２３２５ｐ４ＤＮＡの合成及びクローン化
上述したように、米国特許第6,239,257 B1号に記載の２３２５ｐ４と同定されたタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列とを有している。ｐＥＴ２２ｂ−２３２５ｐ４ＤＮＡを作成する方法は図４中で説明している。
上述したｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４プラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ１１ｄベクターにクローン化した２３２５ｐ４ＤＮＡにより構成）を、ＰＣＲにおける正及び逆ＤＮＡプライマーを用いた増幅の鋳型として使用して、MscI及びBamHI制限部位間においてｐＥＴ２２ｂプラスミド中にクローン化するのに適した型である２３２５ｐ４ＤＮＡを作成した。
【００３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０を有するように構築した正プライマーを、該遺伝子の５’末端にMscI制限部位を取り込むようにデザインした。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を有するように構築した逆プライマーは、該遺伝子の３’末端にBamHI制限部位に隣接する終止コドンを有するようにデザインした。これらのプライマーをＰＣＲ増幅の一工程中に使用した。その後増幅したＤＮＡを、MscI及びBamHI制限酵素で消化し、そしてMscI及びBamHI制限酵素
で消化してあるｐＥＴ２２ｂプラスミド中にクローン化した。当該新に構築したプラスミドをｐＥＴ２２ｂ−２３２５ｐ４プラスミドＤＮＡと命名した。
【００３５】
〔実施例５〕
ｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ａプラスミドＤＮＡの合成、クローン化及び発現
ｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ ＤＮＡの４４位のイソロイシン残基を、位置指定(site-directed)突然変異誘発によりバリンに置換することによって、ｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ａ ＤＮＡを合成した。２３２５ｐ４ａタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２のヌクレオチド配列とを有している。
【００３６】
プライマーは、ａ）５’末端にXbaI制限部位を、そして、ｂ）BamHI制限部位に隣接する終止コドンを３’末端に含むＤＮＡフラグメントが発生するようにデザインし、そして４４位のイソロイシン残基をバリンに変換するようにミスマッチ プライマーを合成した。当該２３２５ｐ４ａの完全長遺伝子を、パーキン エルマー ＤＮＡ高温サイクラー（Parkin Elmer DNA thermal cycler）、ＰＣＲ試薬、及びＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＰＣＲ増幅の２つの工程によって作成した。
【００３７】
図５に示すように、ＰＣＲ増幅の第一工程において、鋳型としてｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ａを用いて、２つの異なるＰＣＲ反応を行なった。最初のＰＣＲ反応において、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４を用いて増幅を行ない、そして第二のＰＣＲ反応において、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３を用いて増幅を行なった。これら２つのＰＣＲ反応により２個の重複したＤＮＡフラグメントを得たが、双方共にプライマー ミスマッチを経由して導入された重複領域に同一の突然変異を有していた。
【００３８】
ＰＣＲ増幅の第二工程において、当該２個の重複した半対(half)-ＤＮＡフラグメントをプライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と一緒に混合し、所望の突然変異を含んでいる完全長２３２５ｐ４ａＤＮＡを作成した。その後、該増幅した完全長２３２５ｐ４ａＤＮＡをゲル精製し、そしてXbaI及びBamHI制限酵素で消化し、次いでXbaI及びBamHI制限酵素で切断してあるｐＥＴ１１ｄプラスミドにクローン化した。この新たに構築したプラスミドをｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ａ ＤＮＡと命名した。
組換え２３２５ｐ４ａタンパク質を、上記の実施例１、２及び３に記載したと同様の方法でE.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)コンピテント細胞を用いて発現させ、そして精製した。この発現したタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を有しているが、その最初のメチオニン残基をエロモナスアミノペプチダーゼを用いてin vitroで切断することにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有するタンパク質を得ることができた。該タンパク質はＡ−２５３細胞に対して活性を有していた。
【００３９】
〔実施例６〕
ｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ＤＮＡの合成、クローン化及び発現
本願出願人による米国特許第6,175,003 B1号は、治療的に活性なリボヌクレアーゼの「システイン化（cystenizing）」について一般的概念を論じている。上記に引用した米国特許第6,239,257 B1号に開示されている２３２５ｐ４タンパク質を「システイン化（cystenize）」することは、そこに標的部分が容易に結合するために有利であろう。該２３２５ｐ４タンパク質は、位置指定(site-directed )突然変異誘発により７１位のトレオニン残基をシステインで置換することによりシステイン化され、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５及びヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６を有する２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１が作成された。
【００４０】
プライマーは、ａ）５’末端にXbaI制限部位を、そして、ｂ）BamHI制限部位に隣接す
るように、３’末端に終止コドンを含むＤＮＡフラグメントが発生するようにデザインし、そしてミスマッチ プライマーは７１位のトレオニン残基をシステインに変換するように合成した。当該２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１の完全長遺伝子は、パーキン エルマー ＤＮＡ高温サイクラー（Parkin Elmer DNA thermal cycler）、ＰＣＲ試薬、及びＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＰＣＲ増幅の２つの工程によって作成した。
【００４１】
図６に示すように、ＰＣＲ増幅の第一工程において、鋳型としてｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４ＤＮＡを用いて、２つの異なるＰＣＲ反応を行なった。最初のＰＣＲ反応において、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８を用いて増幅を行ない、そして第二のＰＣＲ反応において、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７を用いて増幅を行なった。これら２つのＰＣＲ反応により２個の重複したＤＮＡフラグメントを得たが、双方共にプライマー ミスマッチを経由して導入した重複領域に同一の突然変異を有していた。
【００４２】
ＰＣＲ増幅の第二工程において、当該２個の重複した半対(half)−フラグメントをプライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と一緒に混合して、所望の突然変異を含んでいる完全長２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ＤＮＡを作成した。その後、該増幅した完全長２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ＤＮＡをゲル精製し、そしてXbaI及びBamHI制限酵素で消化し、次いでXbaI及びBamHI制限酵素で切断してあるｐＥＴ１１ｄプラスミドにクローン化した。この新たに構築したプラスミドをｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ ＤＮＡと命名した。
【００４３】
組換え２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１タンパク質を、上記の実施例１、２及び３に記載したと同様の方法でE.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)コンピテント細胞を用いて発現させ、そして精製した。この発現したタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列を有しているが、その最初のメチオニン残基をエロモナスアミノペプチダーゼを用いて in vitro で切断することによりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のアミノ酸配列を有するタンパク質を得ることができた。該タンパク質はＡ−２５３細胞に対して活性を有していた。
極めて明白に、標的部分は、２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１タンパク質の７１位のシステイン残基に結合することができ、興味ある特定の細胞受容体に指向させることができる。この適当な標的部分の選択は当該技術分野における当業者の技術常識である。
【００４４】
〔実施例７〕
ｐＥＴ２２ｂ−ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１プラスミドＤＮＡの合成、クローン化及び発現
ｐＥＴ２２プラスミドベクターにクローン化した融合遺伝子（ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ ＤＮＡ）を合成し、そして発現させた。当該組換えにより作成したｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のヌクレオチド配列を有していた。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０は、１７６残基の長さで、そして、ａ）ｈＥＧＦタンパク質配列（残基１〜５３）；ｂ）リンカー配列（残基５４〜６２）；及びｃ）２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１タンパク質配列（残基６３〜１７６）から構成されていた。
【００４５】
当該ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１の完全長遺伝子を、図７に示すように、パーキン エルマー ＤＮＡ高温サイクラー（Parkin Elmer DNA thermal cycler）、ＰＣＲ試薬、及びＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅の三工程によって合成した。増幅の鋳型としてｐＥＴ２２ｂ−ｈＥＧＦ ＤＮＡ及びｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ ＤＮＡを用いた。
【００４６】
該ＰＣＲ増幅の第一工程において、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２及びＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７４を用いた増幅のための鋳型として、プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｈＥＧＦ ＤＮＡを用いた。該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のプライマーは、ｈＥＧＦのＣ−末端ヌクレオチド配列を有し、次いでリンカーのヌクレオチド配列を有していた。
【００４７】
該ＰＣＲ増幅の第二工程においては、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３を用いた増幅のための鋳型として、プラスミドｐＥＴ１１ｄ−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ ＤＮＡを用いた。上述したように該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のプライマーは、３’末端にBamHI制限部位に隣接して終止コドンが発生するようにデザインしてある。該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のプライマーは、当該リンカーのヌクレオチド配列を有し、次いで２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ ＤＮＡのＮ−末端ヌクレオチド配列を有していた。
【００４８】
これら２つのＰＣＲ反応により２個の重複したＤＮＡフラグメントを得た。ＰＣＲ増幅の第三工程において、当該２個の重複したフラグメントをプライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と一緒に混合して、完全長ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１プラスミドＤＮＡを作成した。増幅した完全長ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１プラスミドＤＮＡを、上記したようにアガロースゲル精製し、BamHI制限酵素で消化し、そして最後にMscI及びBamHI制限酵素で切断してあるｐＥＴ２２ｂプラスミドに結合した。
この新たに構築したプラスミドをｐＥＴ２２ｂ−ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ＤＮＡと命名した。
【００４９】
E.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)コンピテント細胞にｐＥＴ２２ｂ−ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１ プラスミドＤＮＡを形質転換させ、そして上記の実施例１、２及び３に記載したと同様に該組換えタンパク質を発現させた。発現したタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸配列を有していた。このタンパク質はＡ−２５３細胞に対して活性を有していた。
【００５０】
〔実施例８〕
ｐＥＴ２２ｂ−２３２５ｐ４プラスミドからのタンパク質の発現
上記の実施例１において論述したように、E.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)コンピテント細胞中においてｐＥＴ２２ｂ−２３２５ｐ４プラスミドから２３２５ｐ４タンパク質を発現させたときに驚くべき結果が得られた。４つの異なる生物活性タンパク質を発現し、そしてそれらの全てがＡ−２５３細胞に対して活性を有していた。これらの最初のものは２３２５ｐ４タンパク質であり、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示してあるアミノ酸配列を有していた。
【００５１】
第二番目のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２のアミノ酸配列を有する２残基長のリーダー配列によって先行されているものであった（それ故、この第二番目のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を有する）。第三番目のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸配列を有する７残基長のリーダー配列によって先行されているものであった（それ故、この第三番目のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のアミノ酸配列を有する）。第四番目のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸配列を有する２２残基長のリーダー配列によって先行されているものであった（それ故、この第四番目のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のアミノ酸配列を有する）。当該各リーダー配列は、ｐＥＴ２２ｂベクターのｐｅｌＢリーダー配列から誘導されたものである。
【００５２】
当該技術分野における専門家にとっては、これら４種のタンパク質の全てが活性を維持していたという事実は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の７残基長のリーダー配列における少な
くとも１個そして最大全ての残基によって順序正しく先行された２３２５ｐ４タンパク質により構成されているいかなるタンパク質も、同様に活性を有するという強力な証拠となるものである。そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の２２残基長のリーダー配列における少なくとも１個そして最大全ての残基によって順序正しく先行された２３２５ｐ４タンパク質により構成されているいかなるタンパク質についても、同様のことが言える。言い換えると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のリーダー配列は２３２５ｐ４タンパク質の活性に影響しないが故に、これらリーダー配列を短くした変異体も、２３２５ｐ４タンパク質のＮ−末端に同様に結合した場合、２３２５ｐ４タンパク質の生物活性には影響しないものと、如何なる当業者も予想するであろう。
【００５３】
更に、２３２５ｐ６及び２７２８タンパク質が同様に、Ａ−２５３及びＴ−２４細胞に対して活性を有するとすれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６リーダー配列の全て又は同様に短くした短縮部を、２３２５ｐ４タンパク質のＮ−末端、２３２５ｐ６タンパク質のＮ−末端、又は２７２８タンパク質のＮ−末端に付加したときには、同様に生物活性を有するタンパク質が産生されるであろうことを、当業者は結論付けることができるであろう。このことは、当該タンパク質が高度に相同(homologous)であり、そして同一の癌細胞に対して同様の活性を有するが故である。
もっとも、１又はそれ以上の好適な実施例を上記に記載しているが、本発明は以下の請求の範囲によってのみ定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】米国特許第6,239,257 B1号中の２３２５ｐ４と同定されたタンパク質の組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図２】米国特許第6,239,257 B1号中の２３２５ｐ６と同定されたタンパク質の組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図３】米国特許第6,239,257 B1号中の２７２８と同定されたタンパク質の組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図４】ｐＥＴ２２ｂ−２３２５ｐ４ＤＮＡの組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図５】米国特許第6,239,257 B1号中の２３２５ｐ４ａと同定されたタンパク質の組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図６】２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１タンパク質の組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図７】ｈＥＧＦ−リンカー−２３２５ｐ４−Ｃｙｓ７１融合タンパク質の組換えによる製造方法を説明しているフローチャートである。
【図１】
2007530002.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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