(57)【要約】本発明は、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するための併用療法および方法を提供する。この方法は、治療有効量のａ）セルデスレセプター、例えばＦａｓ、と結合する、特異的結合要素、例えばＣＨ−１１、または前記結合要素をコードする核酸および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤、例えばＣＰＴ−１、またはチミジル酸シンターゼ阻害剤、例えばＴＤＸである化学療法剤を別個、逐次的または同時に投与することを含む。相乗的細胞毒性効果が、このような組合せを使用して実証されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための医薬品の製造における、
（ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および
（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤
の使用であって、該癌がｐ５３突然変異と関係がある癌である使用。
【請求項２】
前記癌が１つまたは複数の結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌および骨髄性（例えば骨髄）癌である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記デスレセプターがＦＡＳである、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記結合要素が抗体または抗体断片である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記結合要素が抗ＦＡＳ抗体ＣＨ１１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記化学療法剤が葉酸代謝拮抗薬チミジル酸シンターゼ阻害剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記化学療法剤がＴＤＸまたはイリノテカン（ＣＰＴ−１１）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記特異的結合要素と化学療法剤が１．５を超えるＲＩを生成するのに充分な濃度で提供される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ｐ５３突然変異を有する癌細胞を殺傷する方法であって、治療有効量のａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤を前記細胞に別個、逐次的または同時に投与することを含む方法。
【請求項１０】
ｐ５３突然変異を有する癌細胞を治療する方法であって、治療有効量のａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤をその必要のある哺乳動物に別個、逐次的または同時に投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記癌が１つまたは複数の結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌および骨髄性（例えば骨髄）癌である、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合要素が抗体または抗体断片である、請求項９、１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記デスレセプターがＦＡＳである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合要素が抗ＦＡＳ抗体ＣＨ１１である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学療法剤が葉酸代謝拮抗薬チミジル酸シンターゼ阻害剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学療法剤がＴＤＸまたはイリノテカン（ＣＰＴ−１１）である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記特異的結合要素と化学療法剤が１．５を超えるＲＩを生成するのに充分な濃度で提供される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌の治療において同時、別個または逐次的に使用するための組合せ調製物として、ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）化学療法剤を含む生成物であって、前記化学療法剤がトポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤であり、かつ該癌細胞がｐ５３突然変異を含む生成物。
【請求項１９】
ｐ５３突然変異の存在を特徴とする医薬組成物であって、ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤、および（ｃ）薬剤として許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記癌が１つまたは複数の結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌および骨髄性（例えば骨髄）癌である、請求項１８に記載の生成物または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記結合要素が抗体または抗体断片である、請求項１８または請求項２０に記載の生成物、あるいは請求項１９または請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記デスレセプターがＦＡＳである、請求項１８または請求項２０または２１に記載の生成物、あるいは請求項１９または請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記結合要素が抗ＦＡＳ抗体ＣＨ１１である、請求項１８または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の生成物、あるいは請求項１９または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記化学療法剤が葉酸代謝拮抗薬チミジル酸シンターゼ阻害剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項１８または請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の生成物、あるいは請求項１９または請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化学療法剤がＴＤＸまたはイリノテカン（ＣＰＴ−１１）である、請求項１８または請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の生成物、あるいは請求項１９または請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記特異的結合要素と化学療法剤が１．５を超えるＲＩを生成するのに充分な濃度で提供される、請求項２５に記載の生成物または医薬組成物。
【請求項２７】
ｐ５３突然変異の存在を特徴とする癌を治療するためのキットであって、前記キットがａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤、および（ｃ）（ａ）と（ｂ）を別個、逐次的または同時に投与するための使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、併用療法および治療法におけるその使用に関する。特に本出願は、デスレセプターリガンド、例えばＦＡＳ（ＣＤ９５またはＴＮＦレセプター２）レセプターリガンド、および化学療法剤を用いたｐ５３突然変異を含む癌細胞の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳、食道、結腸直腸、全ての形のＧＩ癌、ならびに頭頚部の癌は非常に悪性であり、全体的な５年の生存率は５０％未満である。これらの患者の臨床結果は、臨床提示の前に転移増殖の可能性を有する、微小転移巣と呼ばれる広く播種した腫瘍細胞の存在によって予め決定される。約５０％の食道癌患者が外科療法を選択され、この患者亜群の３０％が５年生存する。分割放射線療法と組み合わせたネオアジュバント５ＦＵ系化学療法の無作為化臨床試験によって、１０〜２０％の生存率の改善が示されているが、治療群に関する全体的な５年間の結果は３０〜３５％に留まっている。ネオアジュバント治療の結果として、その原発性腫瘍において完全な病的応答を示す患者は、８０％の５年生存率を有する。逆に、５ＦＵ系化学療法に応答しない患者は、外科手術または異なるネオアジュバント化学療法に基づく養生法による初期治療の機会が拒まれる。
【０００３】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、西洋世界では癌による死亡の２番目に高い原因である。約４０〜５０％の結腸癌は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の突然変異を有すると思われる。全てのｐ５３突然変異が絶対的な機能の消失をもたらすわけではないという、ますます多くの証拠が存在する。突然変異タンパク質の機能活性または機能性には、保留野生型活性［４９］、機能の消失［５０］、機能の獲得［５１，５２］、ドミナントネガティブ効果［５３］および温度感受性がある。結腸癌における２つの最も一般的なｐ５３突然変異は、コドンの「ホットスポット」１７５および２４８で起こる。これらのミスセンス突然変異は、ヒスチジンとアルギニンの置換（Ｒ１７５Ｈ突然変異）、またはトリプトファンとアルギニンの置換（Ｒ２４８Ｗ突然変異）をもたらす。
【０００４】
結腸直腸癌を治療するために最も頻繁に使用されている化学療法剤は、フルオロピリミジンである５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるイリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびプラチナ薬剤であるオキサリプラチンである。チミジル酸シンターゼ阻害剤であるトミュデックス（ＴＤＸ）も、進行した結腸直腸癌の治療において依然使用されている。５−ＦＵは酵素チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を阻害することによって主に作用する［４０］。ＴＳはチミジル酸のｄｅ  ｎｏｖｏ合成における重要な酵素であるので、その阻害は細胞内ｄＮＴＰプールの不均衡、およびＤＮＡ合成の阻害をもたらす［４１］。５−ＦＵはＤＮＡおよびＲＮＡに対する直接的な影響も有しており、これがその細胞毒性に貢献する［４２］。ＣＰＴ−１１は、カルボキシエステラーゼによってその活性代謝産物ＳＮ−３８に加水分解されるプロドラッグである［４３］。ＣＰＴ−１１は、トポイソメラーゼＩを阻害することによってその細胞毒性効果を発揮する［４４］。トポイソメラーゼＩ阻害剤は、移動するＤＮＡ複製フォークと衝突し二本鎖ＤＮＡの破壊をもたらす、トポイソメラーゼＩとＤＮＡの間の複合体を安定化させる。オキサリプラチンは、ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）部分とシスプラチン中に存在するアミノ基が置き換わっている、第三世代のプラチナ系細胞毒性薬剤である［４４］。シスプラチンと同様に、オキサリプラチンもＤＮＡ−プラチナ付加物を生じさせるが、オキサリプラチンはシスプラチンほどこれらを形成せず、さらに一層の細胞毒性を示す。オキサリプラチン−ＤＮＡ付加物は、シスプラチン付加物より致命的であることが示唆されている［４５］。トミュデックスは特異的なＴＳ阻害剤である。トミュデックスは還元葉酸担体によって細胞に運ばれ、次いで広範囲のポリグルタミン化を経る。ポリグルタミン化した形は、親化合物より最大１００倍の活性がある［４６］。初期段階のＣＲＣを有する患者におけるアジュバント化学療法剤として、５−ＦＵは単独で広く使用されている［４７］。５−ＦＵとＣＰＴ−１１またはオキサリプラチンの組合せは、進行したＣＲＣを有する患者をケアする標準である［４８］。
【０００５】
それにもかかわらず、結腸直腸癌の治療において使用される化学療法剤の効率の改善にもかかわらず、応答率は最も有効な薬剤の組合せで約４５〜５０％である。
【０００６】
Ｆａｓ／ＣＤ９５レセプターは、４８ｋＤａの腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーの要素である［３６］。ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達メンバーは、それらの細胞質領域の組成に基づいて２つの群に分けることができる。デスレセプター（Ｆａｓ／ＣＤ９５、およびレセプターＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＤＲ４およびＤＲ５）は、レセプターの細胞質部分にデスドメインを含むが、一方他の群は含まない。このデスドメインは、アポトーシスシグナルの伝達に必要不可欠である。ＦａｓデスレセプターとＦａｓＬと呼ばれるその同系リガンドの結合は、レセプターに対するＦＡＤＤおよびカスパーゼ８の漸増、ならびに死誘導シグナル複合体（ＤＩＳＣ）の形成をもたらす［１７］。活性カスパーゼ８は次いでカスパーゼ３を含めた下流の実行カスパーゼを活性化させ、これによってタンパク質のカセットを切断し細胞死をもたらす［３７］。カスパーゼ８は、タンパク質Ｂｉｄを切断することによってミトコンドリア細胞死経路も活性化する。さまざまな化学療法剤が、癌細胞系においてＦａｓ／ＣＤ９５レセプターの上方制御を引き起こすことが示されている。ＵＶ照射を用いて癌細胞系を治療した後のＦａｓ／ＣＤ９５誘導も文書化されている［３８］。化学療法剤がレセプターを誘導する能力は、治療抗体またはペプチドを用いてＦａｓ／ＣＤ９５デスレセプターを標的化して細胞の殺傷を増大させる関心を刺激してきている。
【０００７】
したがって、改善された治療戦略に関する緊急の必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本明細書に記載したように、本発明者らは、抗ＦＡＳ抗体などのデスレセプターリガンドを使用する治療と、５−ＦＵなどのチミジル酸シンターゼ阻害剤、ＣＰＴ−１１などのトポイソメラーゼ阻害剤、ラリトレキセド（ＲＴＸ）またはペメトレキセド（ＭＴＡ、Ａｌｉｍｔａ）などの葉酸代謝拮抗薬、オキサリプラチンなどのプラチナ系細胞毒性薬剤を組み合わせることによって、癌細胞を殺傷する際に相乗効果が得られることを示している。しかしながら本発明者らは、プラチナ系細胞毒性薬剤などのいくつかの化学療法剤に関して、相乗的な細胞毒性効果はｐ５３依存性であることをさらに示している。実施例中に記載したように、このような化学療法剤を含む組合せに関して観察した相乗作用は、対応するｐ５３突然変異細胞に関しては観察されなかった。しかしながら、本発明者らが驚いたことに、デスレセプターリガンドと化学療法剤の組合せを使用して得た相乗的細胞毒性は、ＲＴＸおよびＣＰＴ−１１などのいくつかの化学療法剤に関しても保たれたことが実証された。
【０００９】
したがって、第１の態様において本発明は、ｐ５３突然変異を有する癌細胞を殺傷する方法であって、前記方法が治療有効量のａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤を前記細胞に別個、逐次的または同時に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
第２の態様において本発明は、ｐ５３突然変異を有する癌細胞を治療する方法であって、治療有効量のａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤をその必要のある哺乳動物に別個、逐次的または同時に投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
特異的結合要素と化学療法剤は同時、逐次的または同時に投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、化学療法剤は特異的結合要素の前に投与する。
【００１２】
第３の態様では、癌を治療するための医薬品の製造における、
（ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および
（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤
の使用であって、癌細胞がｐ５３突然変異を含む使用を提供する。
【００１３】
第４の態様では、癌の治療において同時、別個または逐次的に使用するための組合せ調製物として、ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）化学療法剤を含む生成物であって、化学療法剤がトポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤であり、かつ癌細胞がｐ５３突然変異を含む生成物を提供する。
【００１４】
第５の態様によれば、ｐ５３突然変異の存在を特徴とする癌を治療するための医薬組成物であって、ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤、および（ｃ）薬剤として許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
第６の態様では、ｐ５３突然変異の存在を特徴とする癌を治療するためのキットであって、前記キットがａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である化学療法剤、および（ｃ）（ａ）と（ｂ）を別個、逐次的または同時に投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
【００１６】
本発明で使用するのに好ましいチミジル酸シンターゼ阻害剤は、ラリトレキセド（ＴＤＸ）またはペメトレキセド（ＭＴＡ）などの、葉酸代謝拮抗薬チミジル酸シンターゼ阻害剤である。本発明で使用するのに好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤、カンプトテシンなど、ＣＰＴ−１１などである。本発明の好ましい実施形態では、化学療法剤はラリトレキセド（ＴＤＸ）またはペメトレキセド（ＭＴＡ）などの葉酸代謝拮抗薬、あるいはＣＰＴ−１１などのトポイソメラーゼＩ阻害剤である。本発明で使用するのに特に好ましい葉酸代謝拮抗薬およびトポイソメラーゼＩ阻害剤の例は、ＴＤＸおよびイリノテカン（ＣＰＴ−１１）である。文脈が他に要求しない限り、ＣＰＴ−１１に対する言及は、ＣＰＴ−１１またはその活性代謝産物ＳＮ−３８を含むと解釈すべきである。
【００１７】
本発明を使用して、ｐ５３突然変異を有する細胞を含む任意の癌を治療することができる。この突然変異は、部分的または全体的に細胞中のｐ５３を不活性化させる可能性がある。本発明の一実施形態では、ｐ５３突然変異は、ｐ５３を全体的に不活性化させるｐ５３突然変異である。他の実施形態では、ｐ５３突然変異はヒスチジンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ１７５Ｈ突然変異）である。他の実施形態では、ｐ５３突然変異はトリプトファンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ２４８Ｗ突然変異）である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、癌は１つまたは複数の結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌および骨髄性（例えば骨髄）癌である。本発明の特定の実施形態では、癌は結腸直腸癌である。
【００１９】
本発明で使用するための結合要素は、任意のデスレセプターと結合することができる。デスレセプターにはＦａｓ、ＴＮＦＲ、ＤＲ−３、ＤＲ−４およびＤＲ−５がある。本発明の好ましい実施形態では、デスレセプターはＦＡＳである。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、結合要素は抗体またはその断片である。
【００２１】
特に好ましい実施形態では、結合要素はＦＡＳ抗体ＣＨ１１である（Ｙｏｎｅｈａｒａ、Ｓ．、Ｉｓｈｉｉ、Ａ．およびＹｏｎｅｈａｒａ、Ｍ．（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９、１７４７〜１７５６）（例えばＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ニューヨークから市販されている）。
【００２２】
好ましい実施形態では、結合要素は少なくとも１つのヒト定常領域を含む。
【００２３】
使用する結合要素と化学療法剤の濃度は、相乗効果を与えるのに充分な濃度であることが好ましい。相乗作用は、Ｒｏｍａｎｅｌｉによって改変されたＫｅｒｎの方法を使用して、単位より大きいＲＩとして定義することが好ましい（１３，１４）。予想細胞生存率（Ｓｅｘｐ、薬剤Ａ単独で観察した生存率と薬剤Ｂ単独で観察した生存率の積として定義する）と、ＡとＢの組合せに関して観察した細胞の生存率（Ｓｏｂｓ）の比として、ＲＩを計算することができる（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。したがって相乗作用は、単位より大きいＲＩとして定義することができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、前記特異的結合要素と化学療法剤を、１．５より大きい、さらに好ましくは２．０より大きい、最も好ましくは２．２５より大きいＲＩを生成するのに充分な濃度で与える。
【００２５】
したがって、組み合わせた医薬品は好ましいことに、ｐ５３突然変異遺伝子型を有する腫瘍細胞を治療するために使用すると相乗効果を生み出す。
【００２６】
したがって本発明の第７の態様は、ｐ５３突然変異腫瘍細胞を治療する際に使用するための医薬品であって、ＦＡＳレセプターを対象とする少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの癌化学療法剤を含み、化学療法剤がトポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤である医薬品を提供する。
【００２７】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、必要に応じて変更を加えて、それぞれの他の態様と同様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
結合要素
本発明の文脈では「結合要素」は、他の分子、特にレセプター、特にデスレセプターに関する結合特異性を有する分子である。本発明の結合要素、および本発明で使用するための結合要素は任意の成分、例えばデスレセプターと結合することができる抗体またはリガンドであってよい。
【００２９】
抗体
「抗体」は自然のものであれ、あるいは部分的または全体的に合成によって生じたものであれ免疫グロブリンである。この用語は、抗体結合ドメインであるか、あるいはそれと相同的な結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドも含む。これらは天然供給源由来のものであってよく、あるいはそれらは部分的または全体的に合成されたものであってよい。抗体の例は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメイン；およびダイアボディを含む、免疫グロブリンイソ型、ならびにそれらのイソ型のサブクラスおよび断片である。
【００３０】
本発明の結合要素は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体などの抗体、またはその断片であってよい。抗体の定常領域はヒトのクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥだけには限られないが、これらを含めた任意のクラスであってよい。抗体は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に属してよい。ＩｇＧ１が好ましい。
【００３１】
抗体はいくつかの方法で改変することができるので、用語「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する、任意の結合要素または物質を含むものとして解釈すべきである。したがって、この用語は、天然であれあるいは全体的または部分的に合成されたものであれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた、抗体断片、誘導体、抗体の機能相当物および相同体を含む。他のポリペプチドと融合した、免疫グロブリン結合ドメイン、または相当物を含むキメラ分子が、したがって含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３中に記載されている。
【００３２】
完全抗体の断片が結合抗原の機能を果たすことができることは、示されている。このような結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ、Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４〜５４６（１９８９））；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合Ｆａｂ断片を含む２価断片（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、この場合ＶＨドメインとＶＬドメインは、２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成することができるペプチドリンカーによって結合している（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：５８７９〜５８８３（１９８８））；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））である。
【００３３】
本発明で使用するための抗体またはポリペプチドの断片は一般に、少なくとも５〜７個の隣接アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９個の隣接アミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個の隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０個以上の隣接アミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約３０〜４０個以上の連続アミノ酸のアミノ酸残基の伸張部分を意味する。
【００３４】
このような抗体またはポリペプチド、あるいは断片抗体の「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列を変えることによって、例えばタンパク質をコードする核酸を操作することによって、あるいはタンパク質自体を変えることによって改変された抗体またはポリペプチドを意味する。このような天然アミノ酸配列の誘導体は、好ましくはデスレセプター、例えばＦＡＳ中和および／または結合活性を有するペプチドを与えながら、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、添加、欠失および／または置換を含み得る。このような誘導体は、２５個以下のアミノ酸、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１０個以下、さらにより好ましくは４個以下、および最も好ましくは１個または２個のみのアミノ酸の挿入、添加、欠失および／または置換を含むことが好ましい。
【００３５】
用語「抗体」は、「ヒト化」している抗体を含む。ヒト化抗体を作製するための方法は当分野で知られている。方法は、例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号中に記載されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する改変型抗体であってよい。したがって結合要素は、ヒト定常領域を含み得る。
【００３６】
超可変領域以外の可変領域は、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、および／またはモノクローナル抗体に由来してもよい。このような場合、可変領域全体がマウスモノクローナル抗体に由来する可能性があり、その抗体はキメラ化していると言える。キメラ抗体を作製するための方法は当分野で知られている。このような方法は、例えばＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）による米国特許、およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）による米国特許中に記載された方法を含む。米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号をそれぞれ参照のこと。
【００３７】
モノクローナル抗体および他の抗体を入手し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。このような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域および骨格領域に導入することを含み得る。例えばＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞は、産生する抗体の結合特異性を変えることができるかあるいはできない、遺伝的変異または他の変化に施すことができる。
【００３８】
本発明で使用するための典型的な抗体は、ＦＡＳレセプターと結合することができるＣＨ１１のヒト化相当物または抗体の任意のキメラ化相当物、およびキメラ化されておりヒトの治療において使用することができるＦＡＳレセプターを対象とする任意の他の抗体である。さらに典型的な抗体は、ＦＡＳレセプターの細胞外部分と交差反応し、ＦＡＳレセプターと高い親和性で結合し、ＦＡＳレセプターと共に内在化し、あるいはＦＡＳレセプターを介してシグナルを誘発することができる、任意の抗体である。
【００３９】
結合要素の生成
本発明で使用するための結合要素は、化学合成によって全体的または部分的に生成させることができる。結合要素は、充分確立された標準的な液相、または好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができ、これらの一般的記載事項は広範囲で入手可能であり（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ（１９８４）中、Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８４）；およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＢＩ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア中を参照）、あるいは結合要素は、液相法によって、あるいは固相、液相および溶液化学法の任意の組合せによって、例えばそれぞれのペプチド部分を最初に完成させ、次いで望ましく適切な場合は存在する任意の保護基を除去した後に、それぞれの炭酸またはスルホン酸あるいはそれらの反応性誘導体の反応により残基Ｘを導入することによって、溶液中で調製することができる。
【００４０】
本発明で使用するのに適した結合要素を生成する他の好都合な方法は、発現系において核酸を使用することによって、結合要素をコードする核酸を発現させることである。したがって本発明は、癌を治療するための医薬品の製造における、（ａ）セルデスレセプターと結合する特異的結合要素をコードする核酸、および（ｂ）化学療法剤の使用をさらに提供する。
【００４１】
本発明に従い使用するための核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、全体的または部分的に合成することができる。好ましい態様では、本発明で使用するための核酸は、前に定義した本発明の結合要素をコードしている。当業者はこのような核酸に対する置換、欠失および／または付加を決定することができると思われ、これによって本発明で使用するのに適した結合要素がさらに与えられると思われる。
【００４２】
本発明と共に使用するための結合要素をコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参照事項ならびに当分野で知られている技法を使用することによって、当業者により容易に調製することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）、ただしその核酸配列およびクローンが入手可能であるものとする。これらの技法には、（ｉ）例えばゲノム供給源から、このような核酸のサンプルを増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製がある。抗体断片をコードするＤＮＡは、コードＤＮＡを採取すること、発現される部分のいずれかの側の適切な制限酵素認識部位を同定すること、ＤＮＡから前記部分を切断することを含む、当業者に知られている任意の適切な方法で作製し使用することができる。したがってこの部分は、標準的な市販の発現系において適切なプロモーターと動作可能に結合することができる。他の組換え手法は、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅させることである。
【００４３】
例えば部位特異的突然変異誘発を使用して配列に対する修飾を行って、修飾ペプチドの発現をもたらし、あるいは核酸を発現させるために使用する宿主細胞中のコドンの優先度を考慮することができる。
【００４４】
前に記載した少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形の構築体として、核酸は含まれてよい。構築体は、前述の１つまたは複数の構築体を含む組換え宿主細胞中に含まれてよい。核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、発現を好都合に得ることができる。発現による生成の後、特異的結合要素は任意の適切な技法を使用して単離および／または精製し、次いで適切なものとして使用することができる。
【００４５】
本発明に従い使用するための結合要素コード核酸分子およびベクターは、実質的に純粋または相同的な形で、あるいは核酸の場合は、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないか実質的に含まない形で、例えばそれらの自然環境から提供、単離および／または精製することができる。
【００４６】
さまざまな異なる宿主細胞における、ポリペプチドのクローニングおよび発現のための系はよく知られている。適切な宿主細胞には細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドを発現させるために当分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、および他の多くの細胞がある。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００４７】
大腸菌などの原核生物細胞中の抗体および抗体断片の発現は、当分野で充分確立されている。総説に関しては、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：５４５〜５５１（１９９１）を参照のこと。培養中の真核生物細胞における発現も、結合要素を生成するためのオプションとして当業者には利用可能であり、近年の総説に関しては、例えばＲｅｆｆ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３〜５７６（１９９３）；Ｔｒｉｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：５５３〜５６０（１９９５）を参照のこと。
【００４８】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および適切な他の配列を含めた適切な制御配列を含む、適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、例えば適切なファージまたはファージミドであってよい。さらなる詳細に関しては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。核酸を操作するため、例えば核酸構築体の調製、突然変異誘発、塩基配列決定、ＤＮＡの細胞中への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、多くの知られている技法およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）中に詳細に記載されている。
【００４９】
任意の適切な手段によって、核酸を宿主細胞中に導入することができる。導入は任意の利用可能な技法を使用することができる。真核生物細胞に関しては、適切な技法はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、レトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニア、または例えば昆虫細胞、バキュロウイルスを使用するリポソーム仲介トランスフェクションおよび形質導入を含み得る。細菌細胞に関しては、適切な技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含み得る。
【００５０】
当分野でよく知られているように、抗生物質耐性または感受性遺伝子などのマーカー遺伝子は、当該の核酸を含むクローンを同定する際に使用することができる。
【００５１】
導入には、例えば遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を引き起こすことまたはそれを可能にすることが続き得る。
【００５２】
宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に、核酸を組み込むことができる。標準的技法に従いゲノムに関する組換えを助長する配列を封入することによって、組込みを助長することができる。核酸は細胞内の染色体外ベクター上に存在するか、あるいは他の場合は細胞に対して明らかに異種または外来性である可能性がある。
【００５３】
化学療法剤
前に記載したように本発明は、ｐ５３依存的であるＣＨ−１１およびシスプラチンなどの抗腫瘍薬の併用療法に関して実証された相乗作用とは反対に、デスレセプターリガンドおよびトポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤を含む併用療法の相乗的細胞毒性効果は、ｐ５３非依存的であるという驚くべき実証に基づく。
【００５４】
したがって本発明は、ｐ５３突然変異腫瘍を治療するための新規の有効な薬剤の組合せを提供する。
【００５５】
任意の適切なトポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤を、本発明で使用することができる。
【００５６】
チミジル酸シンターゼ阻害剤葉酸代謝拮抗薬の例には、５−ＦＵなどのフルオロピリミジン、ならびにＲＴＸ（ＴＤＸ）およびＭＴＡなどの葉酸代謝拮抗薬がある。トポイソメラーゼ阻害剤の例には、トポイソメラーゼＩ阻害剤、カンプトテシンおよびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤などがある。
【００５７】
本発明で使用するのに好ましいトポイソメラーゼ阻害剤またはチミジル酸シンターゼ阻害剤は、好ましくは１．５を超えるＲＩ、好ましくは２．０を超えるＲＩを有するｐ５３突然変異細胞、例えばｐ５３ヌル細胞において、ＣＨ−１１などのデスレセプターリガンドと組み合わせて相乗的細胞毒性を示す阻害剤である。
【００５８】
１つの特に好ましい実施形態では、阻害剤はＣＰＴ−１１である。
【００５９】
他の特に好ましい実施形態では、阻害剤はＴＤＸである。
【００６０】
治療
「治療」は、ヒトまたは非ヒト動物に利点を与えることができる任意の養生法を含む。治療は既存の条件の観点のものであってよく、あるいは予防的なものであってよい（予防治療）。治療は治癒、軽減または予防効果を含み得る。
【００６１】
「癌の治療」は癌性増殖によって引き起こされる状態の治療を含み、腫瘍性増殖または腫瘍の治療を含む。本発明を使用して治療することができる腫瘍の例は、例えば骨原性および軟性組織肉腫を含めた肉腫、癌、例えば乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、子宮頚癌および卵巣癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、および急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病を含めた白血病、グリオーマおよび網膜芽細胞腫である。
【００６２】
本発明の組成物および方法は、既存の癌の治療および最初の治療または外科手術後の癌の再発の予防において、非常に有用である可能性がある。
【００６３】
投与
結合要素と化学療法剤は同時、別個または逐次的に投与することができる。
【００６４】
別個または逐次的に投与する場合、それらは任意の適切な時間期間以内、例えば互いに１、２、３、６、１２、２４、４８または７２時間以内で投与することができる。好ましい実施形態では、それらを互いに６時間以内、好ましくは２時間以内、より好ましくは１時間以内、最も好ましくは２０分以内で投与する。
【００６５】
好ましい実施形態では、結合要素および化学療法剤は、目的とする投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を一般に含むであろう医薬組成物として投与する。
【００６６】
本発明の結合要素および化学療法剤、ならびに本発明で使用するための結合要素および化学療法剤は、任意の適切な経路によって治療の必要がある患者に投与することができる。正確な用量は、要素（例えば、完全抗体、断片またはダイアボディ）および化学療法剤の正確な性質を含めた、いくつかの要因に依存すると思われる。
【００６７】
いくつかの適切な投与経路には経口、直腸、鼻腔、局所（頬および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下および硬膜外を含む）投与がある（がこれらだけには限られない）。静脈内投与が好ましい。
【００６８】
注射（静脈内）は、組成物の治療投与の主な経路であろうと想定されるが、カテーテルまたは他の外科手術用チューブを介した送達も想定される。粉末配合物からの還元後に、液体配合物を使用することができる。
【００６９】
静脈内注射、または疾患部位への注射用に、活性成分は、発熱性物質を含まず適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形であると思われる。当業者は充分に、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張賦形剤を使用して、適切な溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要に応じて含ませることができる。
【００７０】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形であってよい。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固形担体を含むことができる。液状医薬組成物は一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液状担体を含む。生理食塩水溶液、ブドウ糖または他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールを含むことができる。
【００７１】
結合要素、物質、生成物または組成物は、血液を含む特定の組織中に置かれるミクロスフェア、リポソーム、他のミクロ粒子送達系、または徐放性配合物によって投与することもできる。徐放性担体の適切な例には、シェア品、例えば座薬またはミクロカプセルの形である半透性ポリマーマトリクスがある。移植用またはミクロカプセル状の徐放性マトリクスには、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ−Ａ−００５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２（１）：５４７〜５５６、１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７、１９８１、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５、１９８２）がある。ポリペプチドを含むリポソームは、よく知られている方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８２：３６８８〜３６９２、１９８５；Ｈｗａｎｇら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７７：４０３０〜４０３４、１９８０；ＥＰ−Ａ−００５２５２２；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号。通常リポソームは、脂質含有率が約３０ｍｏｌ．％コレステロールを超える小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、最適な割合のポリペプチド漏出に選択率を調整する。
【００７２】
本発明に従い使用することができる前述の技法およびプロトコル、および他の技法およびプロトコルの例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ、Ａ．（ｅｄ）、１９８０中で見ることができる。
【００７３】
結合要素、物質、生成物または組成物は、腫瘍部位または他の望ましい部位に局所方式で投与することができ、あるいはそれが腫瘍または他の細胞を標的とする方式で送達することができる。抗体または細胞特異的リガンドなどの標的系を使用することによって、標的療法を使用して特定の型の細胞に活性物質をより特異的に送達することができる。標的化はさまざまな理由で、例えば物質が許容できないほど毒性である場合、あるいは物質が多すぎる用量を他に必要とする場合、あるいは物質が他の場合標的細胞に入ることができない場合、望ましい可能性がある。
【００７４】
医薬組成物
前に記載したように本発明は、ｐ５３突然変異の存在を特徴とする癌を治療するための医薬組成物であって、ａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、および（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、またはフルオロピリミジンである化学療法剤を含む医薬組成物に広がる。本発明の医薬組成物、および本発明に従い使用するための医薬組成物は、活性成分以外に、薬剤として許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者によく知られている他の物質を含むことができる。このような物質は非毒性でなければならず、活性成分の有効性に干渉してはならない。担体または他の物質の正確な性質は、経口であってよい投与経路、あるいは例えば静脈内注射による投与経路に依存すると思われる。
【００７５】
配合物は液体、例えばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含む生理食塩水溶液、または乾燥粉末であってよい。
【００７６】
用量
結合要素、物質、生成物または組成物は、「治療上有効な量」で個体に投与することが好ましく、これは個体に対する利点を示すのに充分な量である。投与する実際の量、ならびに投与の割合および時間行程は、治療する性質および重度に依存すると思われる。
【００７７】
本明細書に記載するように、濃度は相乗作用効果を示すのに充分であることが好ましい。治療の処方、例えば用量に関する決定などは、最終的には一般医および他の医療医の責任および裁量の範囲内であり、治療する障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および医師に知られている他の要因を典型的には考慮に入れる。
【００７８】
例えば年齢、性別、体重、治療する状態の重度、投与する活性成分、および投与の経路を含めたいくつかのパラメーターに基づいて、内科医により最適用量を決定することができる。例えば、結合要素に関しては一般に、レセプターの飽和を可能にする血清濃度のポリペプチドおよび抗体が望ましい。約０．１ｎＭを超える濃度が通常は充分である。例えば１００ｍｇ／ｍ２の用量の抗体は、約８日間で約２０ｎＭの血清濃度をもたらす。
【００７９】
大まかなガイドラインとして、抗体の用量は、患者の体重の１ｎｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの量で与えることができる。等しい用量の抗体断片は、同時あるいはより頻繁な間隔で使用して、デスレセプターの飽和を可能にする濃度を超える血清レベルを維持しなければならない。
【００８０】
結合要素の用量は、任意の適切な投与間隔、例えば１日１回、１週間に１回、２回または３回で与えることができる。
【００８１】
例えば、ヒト化抗体の投与の期間は、化学療法剤と組み合わせた１回大量注射から１年間までの毎週の投与であると思われる。考えられる用量は、１ｍｇ／ｋｇ／患者以上である。
【００８２】
化学療法剤の用量は前に記載した要因に依存すると思われるが、正常範囲以内である用量、あるいは好ましくは正常範囲より低い濃度で投与することが好ましく、正常範囲は、他の療法薬剤の不在下で化学療法剤を通常投与する濃度範囲である。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態では、結合要素および化学療法剤は、他の形の化学療法または実際には放射線療法と組み合わせて与えることができることは予想される。
【００８４】
したがって本発明の他の態様では、ｐ５３突然変異癌細胞を殺傷する方法であって、治療有効量のａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、（ｂ）葉酸代謝拮抗薬、チミジル酸シンターゼ阻害剤、またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤、（ｃ）放射線療法治療剤を投与することを含む方法を提供する。
【００８５】
第１１の態様では本発明は、ｐ５３突然変異細胞の存在を特徴とする癌を治療する方法であって、前記方法が治療有効量のａ）セルデスレセプターに結合する特異的結合要素または前記結合要素をコードする核酸、（ｂ）葉酸代謝拮抗薬、チミジル酸シンターゼ阻害剤、またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤、および（ｃ）放射線療法治療剤を、その必要のある哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００８６】
特異的結合要素および放射線療法治療剤は、同時、逐次的または同時に投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、化学療法剤は放射線療法の前に投与する。
【００８７】
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例でさらに記載する。添付の図面について言及する。
【実施例】
【００８８】
材料および方法
細胞培養。全細胞を３７℃において５％ＣＯ２中に保った。ＭＣＦ−７、Ｈ６３０（エクソン１０においてｐ５３突然変異）およびＲＫＯ（野生型ｐ５３）細胞は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランドからのもの）を補った１０％の透析した新生仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ中に保った。Ｍ７ＴＳ９０細胞（６）は、１μｇ／ｍｌのピュロマイシン、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、イングランドからのもの）、および１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃからのもの）を補った「ＭＣＦ−７倍地」中に保った。Ｍ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞（６）は、２００μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を補った「Ｍ７ＴＳ９０倍地」中に保った。外来性ＴＳの発現を誘導するために、１×ＰＢＳ中で３回細胞を洗浄し、テトラサイクリンを欠く増殖培地中でインキュベートした。ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−同質遺伝子型ヒト結腸癌細胞は、親切なことにＢｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ教授（Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）によって与えられた。ＨＣＴ１１６細胞系は、１０％の透析した新生仔ウシ血清、５０μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンン、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補ったマッコイの５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた。
【００８９】
ｐ５３突然変異細胞系
ｐ５３突然変異Ｒ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗを含むプラスミドは、親切なことにＧ．Ｌｏｚａｎｏ教授（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ）によって与えられた。Ｒ１７５Ｈ突然変異はｐ５３遺伝子のコドン１７５に存在し、アルギニンがヒスチジンへとアミノ酸変化している。Ｒ２４８Ｗ突然変異はコドン２４８に存在し、アルギニンがトリプトファンへとアミノ酸変化している。ｐ５３の２４８および２７３突然変異ＨＣＴ１１６細胞系は、適切な突然変異ｐ５３遺伝子を含むプラスミド（ｐＣ５３ＮＮ２４８／２７３突然変異体、Ｇｕｉｌｅｒｍｉｎａ  Ｌｏｚａｎｏ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの親切な贈呈品）、およびピュロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞の二重トランスフェクションによって作製した。１×１０５細胞／皿の密度で、１０％ＦＣＳを補ったｐ９０皿上Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に細胞を播種した。単層が約７０％のコンフルエント状態になった翌日に、トランスフェクションを行った。製造者の使用説明書に従いＧｅｎｅｊｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、１μｇのｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ＤＮＡおよび２０μｇのｐＣ５３ＮＮｐ５３突然変異ＤＮＡを用いて細胞をコトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのピュロマイシンを含む培地において約１４日間、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。コロニーを採取し、抗ｐ５３ｍＡｂ（ＤＯ−１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用するウエスタンブロットによって、およびさらにヌクレオチド塩基配列決定によって突然変異ｐ５３発現に関してアッセイした。ＤＯ−１抗体は、アミノ酸残基１１と２５の間でＮ末端エピトープと結合する。
【００９０】
ノーザンブロット分析。Ｆａｓコード領域（７）と相補的なｃＤＮＡプローブを使用して、前に記載したのと同様にノーザンブロットを行った。均等な充填を、β−チューブリンｃＤＮＡプローブを使用して評価した。
【００９１】
ウエスタンブロッティング。以前に記載されたのと同様に（６）ウエスタンブロットを行った。Ｆａｓ／ＣＤ９５、Ｂｃｌ−２およびＢＩＤ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、カスパーゼ８（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＰＡＲＰ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オクスフォード、イングランド）マウスモノクローナル抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、イングランド）と共に使用した。ＦａｓＬウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に使用した。ＴＳヒツジモノクローナル一次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を、ＨＲＰ結合ロバ抗ヒツジ二次抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、オクスフォード、イングランド）と共に使用した。均等な充填を、β−チューブリンマウスモノクローナル一次抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して評価した。
【００９２】
細胞生存能力アッセイ。細胞の生存能力は、ＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、Ｓｉｇｍａ）アッセイ（１２）によって評価した。細胞生存能力アッセイを実施例１〜５で使用した場合、そのプロトコルは以下の通りであった。薬剤処理の２４時間前に９６ウエルプレート上にウエル当たり２，５００個の細胞で細胞を播種し、次いで一定範囲の濃度の５−ＦＵ、ＲＴＸ、およびＭＴＡで７２時間処理し、その時間の後、アゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体、ＣＨ−１１（ＭＢＬ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）（１０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）をさらに２４時間加えた。ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を次いでそれぞれのウエルに加え、さらに３時間３７℃で細胞をインキュベートした。培養培地を除去し、ホルマザン結晶は２００μｌのＤＭＳＯ中に再吸収させた。９６ウエルマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、イングランド）を使用して、５７０ｎｍにおけるそれぞれのウエルの吸光度を読み取ることによって、細胞生存能力を決定した。細胞生存能力アッセイを実施例６〜１２で使用した場合、そのプロトコルは以下の通りであった。薬剤処理の２４時間前に９６ウエルプレート上にウエル当たり１８００個の細胞で細胞を播種した。一定範囲の濃度の５−ＦＵ（Ｆａｕｌｄｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＵＫ）、ＴＤＸ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＵＫ）、ＣＰＴ−１１（Ａｖｅｎｔｉｓ、ＵＫ）およびオキサリプラチン（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ、ＵＫ）で２４時間細胞を処理し、その時間の後、アゴニストＦａｓモノクローナル抗体、ＣＨ−１１（ＭＢＬ）（２００ｎｇ／ｍｌ）を４８時間加えた。次いで２０マイクロリットル（２０μＬ）のＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれのウエルに加え、さらに３時間３７℃で細胞をインキュベートした。培養培地を除去し、ホルマザン結晶は２００μｌのＤＭＳＯ中に再吸収させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５７０ｎｍにおけるそれぞれのウエルの吸光度を読み取ることによって、細胞生存能力を決定した。
【００９３】
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析を実施例１〜５で使用した場合、以下のプロトコルを使用した。６ウエルの組織培養プレートのウエル当たり１×１０５で、細胞を播種した。２４時間後、５−ＦＵ、ＲＴＸまたはＭＴＡを培地に加え、細胞をさらに７２時間培養し、その時間の後２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を２４時間加えた。採取した細胞のＤＮＡ含量は、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、Ｆ１）を使用して細胞をヨウ化プロピジウム染色した後に評価した。フローサイトメトリー分析を実施例６〜１２で使用した場合、以下のプロトコルを使用した。６ウエルの組織培養プレートのウエル当たり１×１０５で、細胞を播種した。２４時間後、５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１またはオキサリプラチンを培地に加え、細胞をさらに２４時間培養し、その時間の後５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を２４時間加えた。採取した細胞のＤＮＡ含量は、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞をヨウ化プロピジウム染色した後に評価した。ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗ヒトＦａｓ抗体（ＤＡＫＯ）を使用して、レセプターの細胞表面発現を測定した。細胞を回収し、３０分間４℃において抗体（１／２０希釈液）中でインキュベートする前にＰＢＳ中で２回洗浄した。無反応ＦＩＴＣ結合マウスＩｇＧ１抗体は、それぞれのサンプルの陰性対照として使用した。インキュベーションの後、２％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、０．３ｍＬの４％パラホルムアルデヒド中で固定した。次いでＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）でサンプルを分析した。
【００９４】
リアルタイムＰＣＲ
ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ２（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。ＤｙＮＡｍｏ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲキット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）は、二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光染料として使用した。ＰＣＲ条件は９５℃で１０分間の最初の変性ステップ、次に９４℃で１０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で２０秒間の３９サイクル、および７２℃で１０分間の最後の延長からなっていた。増幅産物の特異性を調べるために、それぞれの実験の最後に溶解曲線を含ませた。実験は３連で行って、この技法の再現性を確かにした。実験の終了時に、ＰＣＲ産物を２％臭化エチジウムアガロースゲルに施して、それらの大きさが予想したアンプリコンの大きさと一致したことを確認した。プライマー配列は以下の通りであった：Ｆａｓ（正方向）ＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧ、Ｆａｓ（逆方向）ＣＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧ、１８Ｓ（正方向）ＣＡＴＴＣＧＴＡＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡ、１８Ｓ（逆方向）ＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＣＴ。
【００９５】
統計分析。化学療法剤とＣＨ−１１の間の相互作用の性質は、Ｋｅｒｎによって最初に記載されＲｏｍａｎｅｌｉにより後に改変された（１３，１４）、Ｒ指数（ＲＩ）を計算することによって決定した。予想細胞生存率（Ｓｅｘｐ、薬剤Ａ単独で観察した生存率と薬剤Ｂ単独で観察した生存率の積として定義する）と、ＡとＢの組合せに関して観察した細胞の生存率（Ｓｏｂｓ）の比として、ＲＩを計算する（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。したがって相乗作用は、単位より大きいＲＩとして定義する。Ｒｏｍａｎｅｌｌｉらは、ＲＩ値が２．０付近であるとき（１４）、相乗的相互作用は薬理学的に興味深いものであり得ることを示唆している。ＣＨ−１１のみを用いた処理は細胞生存能力に対してほとんど影響がなかったので、この方法を選択し、５０％有効原理法（１５）およびアイソボログラム法（１６）などの他の方法が適切ではなかったことを意味する。相互作用の統計的有意をさらに評価するために、本発明者らはＳＰＳＳソフトウェアパッケージを使用して一変量ＡＮＯＶＡ分析を設計した。これは薬剤間に相互作用が存在しなかったという無効な仮説に基づく、他のモデルであった。
【００９６】
結果
実施例１．Ｆａｓは５−ＦＵおよびＲＴＸに応答して充分に上方制御される。
ＤＮＡマイクロアレイプロファイリングを使用して、ＭＣＦ−７細胞において５−ＦＵに応答して充分にＦａｓデスレセプターが上方制御されることを、本発明者らは以前同定した（７）。ノーザンブロット分析によって、ＩＣ６０用量（５μＭ）の５−ＦＵを用いた処理後４８時間でＭＣＦ−７細胞において、ＦａｓのｍＲＮＡが上方制御されたことを確認した（図１Ａ）。ＭＣＦ−７細胞におけるＦａｓタンパク質発現を分析することによって、それが５−ＦＵを用いた処理後７２時間で約１２倍上方制御されたことが明らかになった（図１Ｂ）。ＩＣ６０用量（２５ｎＭ）のＲＴＸを用いた処理に応答して、Ｆａｓも充分に上方制御された（７倍まで）（図１Ｂ）。
【００９７】
実施例２．アゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１は、５−ＦＵおよびＲＴＸに応答するアポトーシスを相乗的に活性化させる。
５−ＦＵおよびＲＴＸに対するＭＣＦ−７細胞の応答の仲介におけるＦａｓシグナル伝達経路の役割を調べるために、本発明者らはアゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１を使用した。細胞は７２時間ＩＣ６０用量のそれぞれの薬剤で処理し、その時間の後、さらに２４時間２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で細胞を処理した。５μＭの５−ＦＵ単独の処理は、対照と比較して約６０％の細胞生存能力の低下をもたらした（図１Ｃ）。５−ＦＵとの事前のインキュベーションなしでのＣＨ−１１のみを用いた処理は、わずかに約６％の細胞生存能力の低下を引き起こした。しかしながら、５−ＦＵの次にＣＨ−１１を用いた処理は、約８４％の細胞生存能力の低下をもたらすことが分かった。組合せ処理は２．４０のＲＩ値を有しており、この相互作用が非常に相乗的であったことが示された。このことはＡＮＯＶＡ分析によってさらに確認し、これによって薬剤間の相乗的相互作用が統計上非常に有意であったことを示した（ｐ＜０．０００５）。同様に、７２時間２５ｎＭのＲＴＸ、次に２４時間ＣＨ−１１を用いた処理は、非常に相乗的な細胞生存能力の低下をもたらした（ＲＩ＝２．２２、ｐ＜０．０００５、図１Ｄ）。ＩｇＭイソ型対照抗体は、薬剤処理した細胞の細胞生存能力に対して全く影響がなかった（データ示さず）。
【００９８】
個別に５−ＦＵとＲＴＸで、あるいはＣＨ−１１と組み合わせて処理したＭＣＦ−７細胞におけるアポトーシスの程度を評価するために、本発明者らはヨウ化プロピジウム染色細胞のフローサイトメトリーを行い、サブＧ１／Ｇ０アポトーシス期を分析した。細胞は５−ＦＵまたはＲＴＸで７２時間処理し、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で２４時間処理した。本発明者らは、ＣＨ−１１単独ではアポトーシスに対してほとんど影響がなかったことを見出した（図１ＥおよびＦ）。９６時間５−ＦＵ単独での処理は、５μＭの５−ＦＵに応答する適度な約２倍のアポトーシスの誘導をもたらした（図１Ｅ）。しかしながら、５−ＦＵ処理細胞にＣＨ−１１を加えることによってアポトーシスの劇的な増大、および５μＭの５−ＦＵとＣＨ−１１を用いた共処理の後に約１２倍のアポトーシスの誘導がもたらされた。同様に、ＲＴＸとＣＨ−１１の組合せはアポトーシスの劇的な活性化をもたらし、未処理対照細胞における約１１％、ＲＴＸのみで処理した細胞における約１６％、およびＣＨ−１１のみで処理した細胞における約１８％と比較して、約６０％の細胞が２５ｎＭのＲＴＸとＣＨ−１１の組合せ処理後にサブＧ１／Ｇ０アポトーシス期にあった（図１Ｆ）。５−ＦＵおよびＲＴＸ処理培養物におけるＣＨ−１１によるアポトーシスの活性化を、一定範囲の濃度のそれぞれの薬剤で観察し（図１ＥおよびＦ）、ＣＨ−１１と２つの薬剤の間の相乗的相互作用はアポトーシスの活性化によるものであったことを示した。
【００９９】
本発明者らは次に、他の細胞系においてアポトーシスを活性化するＣＨ−１１の能力を調べた。５−ＦＵを用いたＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋結腸癌細胞の処理は、４８時間後にＦａｓ発現の（１０倍を超える）強力な上方制御をもたらした（図２Ａ）。さらに、５μＭの５−ＦＵ次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた処理は、１．９２のＲＩ値でこの系の細胞生存能力を相乗的に低下させた（ｐ＜０．００５）。同様に、ＲＴＸ処理は７２時間後にＦａｓ発現を劇的に増大させ（図２Ｃ）、一方ＲＴＸ次にＣＨ−１１を用いた処理は、細胞生存能力の非常に相乗的な低下をもたらした（図２Ｄ、ＲＩ＝３．４４、ｐ＜０．０００５）。本発明者らは他のｐ５３野生型結腸癌細胞系、ＲＫＯも調べた。ＭＣＦ−７およびＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞の場合と同様に、５−ＦＵおよびＲＴＸ処理は、処理後４８時間で劇的なＦａｓの上方制御をもたらした（図３ＥおよびＦ）。さらに、５−ＦＵまたはＲＴＸ、次にＣＨ−１１を用いたＲＫＯ細胞の処理は、それぞれ１．７４（ｐ＜０．０００５）および２．３１（ｐ＜０．０００５）のＲＩ値で細胞生存能力を相乗的に低下させた（図３ＦおよびＧ）。これらの結果は、ＣＨ−１１が５−ＦＵおよびＲＴＸ処理したＭＣＦ−７乳癌細胞だけでなく、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＲＫＯ結腸癌細胞のアポトーシスも活性化することを示す。葉酸代謝拮抗薬ＭＴＡを用いた処理はＦａｓ発現を上方制御し、３つ全ての細胞系においてＣＨ−１１と相乗的に相互作用して細胞生存能力を低下させたことも、本発明者らは見出した（データ示さず）。
【０１００】
実施例３．Ｆａｓシグナル変換に対する５−ＦＵおよびＲＴＸの影響。
本発明者らは次に、５−ＦＵおよびＲＴＸに応答するＦａｓシグナル経路の薬剤誘導型の活性化を調べた。ＩＣ６０用量のいずれかの薬剤に応答するＭＣＦ−７細胞においてＦａｓは（１０倍を超えて）充分に上方制御されたが、ＦａｓＬ発現は影響を受けなかった（図３Ａ）。驚くことに、カスパーゼ８、その基質ＢＩＤ共に、プロカスパーゼ８または完全長ＢＩＤのレベルの下方制御の欠如によって示されたように、５−ＦＵまたはＲＴＸ処理細胞において活性化されなかった（図３Ａ）。本発明者らは、５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理した後の、ＭＣＦ−７細胞におけるＦａｓ経路の活性化を後に分析した。Ｆａｓ、プロカスパーゼ８およびＢＩＤ発現のレベルを、５μＭの５−ＦＵで７２時間、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で２４時間処理した細胞において測定し、適切な時間期間５−ＦＵ単独あるいはＣＨ−１１単独で処理した細胞と比較した（図３Ｂ）。ＣＨ−１１単独での処理は、Ｆａｓ、プロカスパーゼ８またはＢＩＤ発現に対して全く影響がなかった（図３Ｂ、レーン２）。既に示したように、５−ＦＵ単独での処理はＦａｓの劇的な上方制御をもたらしたが、プロカスパーゼ８またはＢＩＤ発現に対して全く影響がなく、いずれの分子も活性化されなかったことが示された（図３Ｂ、レーン３）。しかしながら、５−ＦＵとＣＨ−１１を用いたＭＣＦ−７細胞の処理は、これらの細胞におけるプロカスパーゼ８および完全長ＢＩＤの発現の完全な消失によって示されたように、カスパーゼ８とＢＩＤの両方の劇的な活性化をもたらした（図３Ｂ、レーン４）。同様にＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞では、カスパーゼ８の活性化は、５−ＦＵとＣＨ−１１あるいはＲＴＸとＣＨ−１１を用いた共処理後でのみ観察した（図３Ｃ）。さらに、アポトーシスの１つの特徴であるＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ）の切断は、それぞれの薬剤とＣＨ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞でのみ観察された。
【０１０１】
本発明者らは次に、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断の動態を比較した。５μＭの５−ＦＵで７２時間前処理したＭＣＦ−７細胞にＣＨ−１１を加えた６時間後、プロカスパーゼ８のレベルは、時間ゼロと比較して約３倍低下した（図３Ｄ）。
【０１０２】
これと同時に、細胞がアポトーシスを経ることを示すＰＡＲＰ切断が起こった。したがって、カスパーゼ８の活性化と同時にアポトーシスの兆候が起こった。ＣＨ−１１処理後１２時間および１８時間で、プロカスパーゼ８のレベルは、時間ゼロで観察したレベルの５％未満に低下し、カスパーゼ８の強力な活性化が示された。本発明者らはさらに、特異的カスパーゼ８阻害剤ＩＥＴＤ−ｆｍｋを使用して、カスパーゼ８の活性化とアポトーシスの間の相関関係を調べた。５μＭの５−ＦＵで７２時間、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１、１０μＭのＩＥＴＤ−ｆｍｋ、あるいはＣＨ−１１とＩＥＴＤ−ｆｍｋの組合せで２４時間、細胞を前処理した。全ての処理群においてＦａｓは充分に上方制御された（図３Ｄ）。前に示したように、５−ＦＵとＣＨ−１１の組合せは、劇的なカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断をもたらした（図３Ｅ、レーン２）。カスパーゼ８阻害剤を加えることは、５−ＦＵ単独で処理した細胞中のタンパク質発現に対して全く影響がなかった（図３Ｅ、レーン３）。しかしながらＩＥＴＤ−ｆｍｋは、５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理した細胞においてプロカスパーゼ８のプロセシングを阻害した（図３Ｅ、レーン４）。この結果は、カスパーゼ８の活性はＤＩＳＣにおけるプロカスパーゼ８のプロセシングに必要不可欠であり、カスパーゼ８の活性化に関して提案された誘導近似モデルと一致することを示す（１７）。注目すべきことに、カスパーゼ８の活性化を阻害することも、５−ＦＵ／ＣＨ−１１共処理細胞におけるＰＡＲＰ切断を阻害し、これらの細胞のアポトーシスはカスパーゼ８の活性化に依存することが示される。
【０１０３】
実施例４．ＣＨ−１１と５−ＦＵ、ＲＴＸとＭＴＡの間の相乗作用に対するＴＳ誘導の影響。
５−ＦＵおよびＴＳ標的葉酸代謝拮抗薬を用いた処理は、ＴＳ発現を急激に増大させることが示されてきており、これはＴＳがその独自のｍＲＮＡと結合しその翻訳を阻害する負のフィードバック機構の破壊による可能性が最も高い（１８）。これは考えられる耐性の機構を構成し、その理由はＴＳ誘導は酵素活性の回復を容易にすると思われるからである。したがって本発明者らは、５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬仲介のＦａｓの上方制御、ならびにＣＨ−１１とそれぞれの薬剤の間の相乗的相互作用に対する、誘導性ＴＳ発現の影響を調べた。これを行うために本発明者らは、ＴＳトランス遺伝子の転写が培養培地からのテトラサイクリン（ｔｅｔ）の除去後に活性化される、ＭＣＦ−７由来Ｍ７ＴＳ９０細胞系（６）を使用した（図４Ａ）。本発明者らの以前の発見と一致して、Ｍ７ＴＳ９０細胞系におけるＴＳ誘導は、Ｆａｓの５−ＦＵ仲介上方制御ではなく、ＦａｓのＲＴＸおよびＭＴＡ仲介上方制御を無効にした（図４Ｂ）（６）。さらにＴＳトランス遺伝子の誘導は、５−ＦＵとＣＨ−１１の間の相乗的相互作用に対してほとんど影響がなかった（図４Ｃ）。しかしながら、ＴＳ誘導によって、１００ｎＭのＲＴＸとＣＨ−１１、および１μＭのＭＴＡとＣＨ−１１の組合せによって引き起こされる細胞生存能力の相乗的低下が完全になくなった（図４Ｃ）。
【０１０４】
本発明者らは次に、カスパーゼ８の活性化に対する誘導性ＴＳの影響を評価した。本発明者らは、ＴＳ誘導は葉酸代謝拮抗薬とＣＨ−１１の両方を用いる共処理に応答するカスパーゼ８の活性化を無効にしたが、５−ＦＵとＣＨ−１１を用いる共処理に応答するカスパーゼ８の活性化に対しては全く影響がなかったことを見出した（図４Ｄ）。同様にＴＳ誘導は、５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理した細胞ではなく、葉酸代謝拮抗薬とＣＨ−１１で共処理した細胞においてＰＡＲＰのプロセシングを無効にした（図４Ｄ）。５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬で処理したＭ７ＴＳ９０細胞のアポトーシスに対するＴＳ誘導の異なる影響は、薬剤とＣＨ−１１で共処理した細胞においてサブＧ０／Ｇ１期を評価することにより、フローサイトメトリーによってさらに分析した。５−ＦＵとＣＨ−１１を用いた共処理は、Ｍ７ＴＳ９０細胞において劇的な約２０倍のアポトーシスの誘導をもたらし、これはＴＳを誘導すると約１７倍ごくわずかに低下した（図４Ｅ）。対照的に、ＲＴＸとＣＨ−１１の共処理は約１５倍のアポトーシス期の増大をもたらし、これはＴＳ誘導によって約５倍低下した（図４Ｅ）。同様に、ＭＴＡとＣＨ−１１を用いた組合せ処理は劇的な約２６倍のアポトーシスの誘導をもたらし、これは誘導性ＴＳ発現によってほぼ完全になくなった（図４Ｅ）。これらの結果は、葉酸代謝拮抗薬で処理した細胞におけるＦａｓ仲介アポトーシスの活性化は、ＴＳ発現のレベルに非常に依存していたことを示す。対照的に、５−ＦＵ／ＣＨ−１１相互作用は、この細胞系においてＴＳ誘導に対して比較的鈍感であり、非ＴＳ対象効果はこれらの細胞における５−ＦＵの細胞毒性に主に原因があったことが示唆された。
【０１０５】
実施例５．ＣＨ−１１と５−ＦＵ、ＲＴＸとＭＴＡの間の相乗作用に対するｐ５３不活性化の影響。
本発明者らは次に、ＣＨ−１１とそれぞれの薬剤の間で観察した相乗作用におけるｐ５３の役割を調べた。ｐ５３は、転写によるＦａｓ発現（１９）と転写後のＦａｓ発現（２０）の両方の重要な制御物質であることが報告されている。本発明者らは以前に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−Ｅ６を用いたＭ７ＴＳ９０細胞のトランスフェクションによる、ｐ５３ヌルＭ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞の生成を記載した（６）。１０μＭの５−ＦＵ、１００ｎＭのＲＴＸまたは１μＭのＭＴＡを用いたこれらのｐ５３ヌルＭ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞の処理は、Ｆａｓ上方制御をもたらさなかった（図５Ａ）。さらに、親株とは対照的に、５−ＦＵとＣＨ−１１の組合せが細胞生存能力を相乗的に低下させることはなかった（ＲＩ＝０．９７、図５Ｂ）。同様に、ｐ５３の不活性化によって、ＲＴＸとＣＨ−１１の間、およびＭＴＡとＣＨ−１１の間の相乗作用もなくなった（それぞれＲＩ＝０．８５と１．０２、図５Ｂ）。
【０１０６】
本発明者らはさらに、ｐ５３野生型およびヌル同質遺伝子型Ｍ７ＴＳ９０系におけるカスパーゼ８の活性化を比較することによって、薬剤感受性に対するｐ５３不活性化の影響を調べた。カスパーゼ８の活性化は、それぞれの薬剤とＣＨ−１１で共処理したｐ５３ヌルＭ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞中では観察されなかった（図５Ｃ）。対照的に、それぞれの共処理に応答する親ｐ５３野生型細胞系中では、カスパーゼ８は強く活性化された（図５Ｃ）。ｐ５３不活性化は、５−ＦＵとＣＨ−１１を用いた共処理に応答するＰＡＲＰ切断も完全に弱めた（図５Ｃ）。しかしながら、ＰＡＲＰのプロセシングはＲＴＸ／ＣＨ−１１およびＭＴＡ／ＣＨ−１１の組合せで処理したｐ５３ヌル細胞中で明らかであったが、ｐ５３野生型系中より程度は低かった（図５Ｃ）。カスパーゼ８は活性化されなかったので、このことは、ｐ５３ヌル細胞中での葉酸代謝拮抗薬仲介のＰＡＲＰ切断は、ＣＨ−１１によるＦａｓ仲介のアポトーシスの活性化によるものではなかったことを示唆する。実際に本発明者らは、ＲＴＸのみまたはＭＴＡのみを用いた処理に応答してｐ５３ヌル細胞系において、ＰＡＲＰはさらにプロセシングされたことを見出した（データ示さず）。これらの結果は、葉酸代謝拮抗薬を用いた処理は、Ｍ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞中のｐ５３およびＦａｓ非依存性アポトーシスを活性化させたことを示す。ｐ５３ヌル細胞系におけるアポトーシスのフローサイトメトリー分析によって、これをさらに確認した。ＲＴＸ（１００ｎＭ）およびＭＴＡ（１μＭ）は、薬剤処理後９６時間でそれぞれ約８倍および約６倍、Ｍ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞のアポトーシスを有意に誘導した（図５Ｄ）。対照的に、１０μＭの５−ＦＵで処理した後のＭ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞中では、アポトーシスはほとんど観察されなかった（図５Ｄ）。重要なことにＣＨ−１１は、ｐ５３ヌル細胞系においていずれかの薬剤によって誘導されたアポトーシスに対して有意な影響がなかった。
【０１０７】
本発明者らは、ｐ５３ヌルＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞系におけるこれらの薬剤とＣＨ−１１の間の相互作用を調べることによって、代謝拮抗物質誘導型Ｆａｓ仲介アポトーシスを制御する際のｐ５３の役割へとその研究を広げた。この細胞系は、両方のｐ５３対立遺伝子の体性ノックアウトによるＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞系に由来するものであった（２１）。ｐ５３野生型細胞系と比較すると、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞系では５−ＦＵ（図６Ａ）およびＲＴＸ（図６Ｃ）に応答する非常にわずかなＦａｓ誘導が存在し、１０μＭの５−ＦＵおよび５０ｎＭのＲＴＸに応答して約２−３倍のＦａｓ発現の誘導を観察した。さらに、ｐ５３ヌル細胞系では５−ＦＵとＣＨ−１１の間の相乗的相互作用は観察されなかった（ＲＩ＝１．０１、図６Ｂ）。興味深いことに、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞においてＲＴＸとＣＨ−１１の間で有意な相乗的相互作用が依然として観察されたが（ＲＩ＝１．６２、ｐ＝０．０１、図６Ｄ）、これはｐ５３野生型親株において観察した相互作用よりも有意に相乗性が低かった（図２Ｄ、ＲＩ＝３．４４、ｐ＜０．０００５）。これは、ＣＨ−１１に対するＲＴＸ仲介のＨＣＴ１１６細胞の増感は、完全にｐ５３依存性であるわけではないことを示唆する。
【０１０８】
Ｆａｓ仲介アポトーシスを仲介する際のｐ５３の役割を、ｐ５３突然変異Ｈ６３０結腸癌細胞系においてさらに調べた。ｐ５３ヌル細胞系と同様に、Ｆａｓ発現が５−ＦＵ（図６Ｅ）またはＲＴＸ（図６Ｇ）に応答してＨ６３０細胞中で有意に変わることはなかった。５−ＦＵとＣＨ−１１の間で細胞生存能力の相乗的低下は観察されなかったが（図６Ｆ、ＲＩ＝０．９９）、しかしながら、ＲＴＸとＣＨ−１１の間で統計上有意な相乗的相互作用を観察した（図６Ｈ、ＲＩ＝１．６４、ｐ＜０．０００５）。この物質に応答する任意の明らかなＦａｓの上方制御の欠如にもかかわらず、この相互作用を観察し、Ｆａｓ発現がこの細胞系におけるＣＨ−１１に対する感度の唯一の決定要素ではないことが示唆された。
【０１０９】
実施例６．化学療法剤５ＦＵ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンによるＦａｓのｍＲＮＡの誘導はｐ５３依存性である。
今日までの大部分の試験は、Ｆａｓ／ＣＤ９５レセプターはｐ５３依存性であることを確認している。Ｆａｓ遺伝子の第１イントロン内でｐ５３応答性エレメント、およびプロモーター内で３つの推定要素が同定されている［２４，２５］。ＩＣ６０７２ｈｒｓ用量の５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンで２４時間および４８時間処理した、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系のリアルタイムＰＣＲによって、ｐ５３野生型細胞中でこれらの物質に応答したＦａｓのｍＲＮＡ発現の有意な誘導が示された（図７Ａ）。それぞれ２４時間および４８時間で見られたＦａｓのｍＲＮＡの誘導倍数は、５−ＦＵに関して３．８および３．４、ＣＰＴ−１１に関して７．０および２．５、ならびにオキサリプラチンに関して５．８および４．７であった。同様の条件下で処理したＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞系では、有意に低い誘導が見られ、最大の誘導はそれぞれ５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１に関して２倍および１．９倍であり、オキサリプラチンに関しては誘導が見られなかった（図７Ａ）。これらの結果は、これらの化学療法剤によるＦａｓ／ＣＤ９５のｍＲＮＡの誘導はｐ５３依存性であることを示す。
【０１１０】
実施例７．ＣＰＴ−１１処理は、ＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞系においてＦａｓ／ＣＤ９５タンパク質のｐ５３非依存性の誘導をもたらす。
それぞれの化学療法剤を考慮して、本発明者らは処理後のＨＣＴ１１６ｐ５３野生型細胞系における誘導型のＦａｓのｍＲＮＡ発現を調べ、本発明者らはこれがタンパク質発現の誘導として反映されたかどうかを分析した。４８時間の５μＭの５−ＦＵ、５μＭのＣＰＴ−１１および１μＭのオキサリプラチンを用いたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系の処理は、ｐ５３野生型細胞系において３つ全ての化学療法剤によるＦａｓ／ＣＤ９５の有意な誘導をもたらした。この細胞系において観察した誘導は、ｐ５３の誘導と関係があった。対照的に、ｐ５３ヌル細胞系におけるＣＰＴ−１１単独の処理は、４８時間でＦａｓ／ＣＤ９５タンパク質の誘導をもたらした（図７Ｂ）。
【０１１１】
実施例８．アゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１は、ｐ５３非依存式にＣＰＴ−１１およびＴＤＸに応答するアポトーシスを相乗的に活性化させる。
アゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１はＦａｓ／ＣＤ９５レセプターを活性化させ、アポトーシスを引き起こすことが示されている［２６］。ｐ５３突然変異結腸癌細胞系におけるＦａｓ／ＣＤ９５レセプターの上方制御の欠如によって、５−ＦＵとＣＨ−１１の間の相乗的相互作用がなくなった。本発明者らの試験では、一定範囲のそれぞれの化学療法剤５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンを用いてｐ５３野生型およびヌル細胞系の処理、次いで２４時間後の抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）のさらに４８時間の添加は、ｐ５３野生型設定における全ての薬剤に関して有意な相乗作用をもたらしたが、ｐ５３ヌル細胞では、この相乗作用は、トポイソメラーゼＩ阻害剤ＣＰＴ−１１およびチミジル酸シンターゼ阻害剤ＴＤＸを用いてのみ見られた。任意の用量でｐ５３ヌル細胞においてオキサリプラチンを用いると、相乗的相互作用は全く見られず、高用量で５−ＦＵとのごくわずかな相互作用が見られた（図８）。これらの化学療法剤で２４時間、次にＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌでさらに２４時間処理した、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系のヨウ化プロピジウム染色によって、ｐ５３野生型細胞においてそれぞれの薬剤およびＣＨ−１１を用いて相乗的相互作用が見られることを確認し（図９）、一方ｐ５３ヌル細胞設定では、ＣＰＴ−１１単独およびそれより低い程度でＴＤＸ処理した設定は、ＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌを用いて有意な相乗作用をもたらした。
【０１１２】
実施例９．ＣＨ−１１と５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１とオキサリプラチンの間の相乗作用に対するｐ５３不活性化の影響。
その天然リガンドＦａｓＬまたはモノクローナル抗体ＣＨ−１１によるＦａｓ／ＣＤ９５レセプターの活性化は、ＤＩＳＣでのプロカスパーゼ８の漸増および活性化をもたらす。プロカスパーゼ８は、その活性サブユニットｐ４１／４３およびｐ１８に切断される。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ＤＮＡの修復および安定性と通常関係があり、アポトーシス初期中にカスパーゼファミリーの要素によって切断される。
【０１１３】
ＩＣ６０用量のこれらの化学療法剤で２４時間、次に抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）でさらに２４時間処理した、ｐ５３野生型およびヌル細胞系のウエスタンブロット分析は、それぞれの薬剤に関してｐ５３野生型細胞系において、ＰＡＲＰ切断およびプロカスパーゼ８の活性化（および活性ｐ４１／４３およびｐ１８サブユニットの生成）をもたらした（図１０）。ｐ５３ヌル細胞系では、ＣＨ−１１を加えた後のＰＡＲＰ切断およびプロカスパーゼ８の活性化は、ＣＰＴ−１１を用いた処理後のみ見られた。
【０１１４】
実施例１０．ＣＰＴ−１１処理は、ＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞系においてＦａｓ／ＣＤ９５細胞表面発現のｐ５３非依存的誘導を引き起こす。
フローサイトメトリーによって、ｐ５３ヌル細胞系と比較して、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型細胞系においてＦａｓ／ＣＤ９５レセプターの高度な構成的発現を実証した。Ｆａｓ／ＣＤ９５レセプターの誘導の程度は、ウエスタンブロット分析から予想された程度よりはるかに高かった（図７Ｂ）。ｐ５３ヌル細胞系において抗Ｆａｓ抗体と相乗的に相互作用するＴＤＸおよびＣＰＴ−１１の能力は、２４時間これらの物質を用いた処理後のフローサイトメトリーによって、Ｆａｓ／ＣＤ９５レセプターの誘導と関係があった。５−ＦＵとオキサリプラチンのみが、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型細胞系においてレセプターの発現を有意に誘導することができた（図１１Ａ、Ｂ）。
【０１１５】
実施例１１．化学療法剤５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンを用いた処理後のｐ５３突然変異Ｈ６３０およびｐ５３野生型ＲＫＯ細胞系におけるＦａｓ／ＣＤ９５細胞表面発現。
ｐ５３突然変異Ｈ６３０細胞系におけるＦａｓレセプターの誘導は、ＣＰＴ−１１を用いてのみ見られた。４８時間の５−ＦＵ処理もオキサリプラチン処理も、レセプターの有意な上方制御を引き起こすことはなかった（図１２Ａ）。ｐ５３野生型ＲＫＯ細胞系では、ＩＣ５０用量の３つ全ての化学療法剤に応答するＦａｓレセプターの有意な誘導があった（図１２Ａ）。それぞれの細胞系をこれらの化学療法剤で２４時間、次に抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１でさらに４８時間処理すると、Ｈ６３０細胞系においてＣＰＴ−１１の組合せを用いて、有意な相乗作用が明らかであった（図１２Ｂ）。同様の条件下でＲＫＯ細胞系を処理すると、それぞれ３つの薬剤がＣＨ−１１と相乗作用を示した（図１２Ｃ）。
【０１１６】
実施例１２．Ｒ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗｐ５３突然変異細胞系は、化学療法剤５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンに応答する、同質遺伝子型ＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞系と同様のレベルのＦａｓ／ＣＤ９５発現を示す。
図１３中に示すように、Ｒ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗｐ５３突然変異細胞系は、化学療法剤５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンに応答する、同質遺伝子型ＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞系と同様のレベルのＦａｓ／ＣＤ９５発現を示す。図１４中に示すように、相乗的細胞毒性が化学療法剤とＣＨ−１１の組合せに関して示され、この場合化学療法剤は５−ＦＵまたはＣＰＴ−１１であり、オキサリプラチンではなかった。Ｒ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗｐ５３突然変異細胞系は、試験したそれぞれの薬剤の組合せに関してｐ５３ヌル細胞系と同様の応答を示す。
【０１１７】
ＭＣＦ−７乳癌細胞およびＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＰＫＯ結腸癌細胞中では、５−ＦＵ、ならびにＴＳ標的葉酸代謝拮抗薬ＲＴＸおよびＭＴＡに応答してＦａｓデスレセプターは充分に上方制御されることを本発明者らは見出した。しかしながら、これ自体はカスパーゼ８を活性化させるほど充分ではなかった。免疫エフェクター細胞の影響をそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて模倣するために、本発明者らはアゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１を使用した。ＣＨ−１１は５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬処理細胞においてＦａｓ仲介の細胞死を強く活性化させたことを、本発明者らは見出した。さらに、ＣＨ−１１とそれぞれの薬剤の間の相互作用は非常に相乗的であった。本発明者らの結果は、Ｆａｓシグナル経路は５−ＦＵ誘導型の細胞死だけではなく、葉酸代謝拮抗薬誘導型の細胞死の重要なメディエーターでもあることを示唆する。
【０１１８】
ＦａｓＬは薬剤処理後に誘導されなかったが、それはＭＣＦ−７細胞中で充分に発現されたことを本発明者らは見出した。多くの腫瘍細胞がＦａｓＬを過剰発現し、腫瘍ＦａｓＬはＦａｓ感受性免疫エフェクター細胞のアポトーシスを誘導し、これによって抗腫瘍免疫応答を阻害すると仮定されている。この仮定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ  ｖｉｖｏ試験の両方によって支持されている（２４，２５）。ＦａｓＬを過剰発現させる戦略は、腫瘍細胞がＦａｓ仲介アポトーシスに対する耐性を増大させて、オートクリンおよびパラクリン誘導の腫瘍細胞死を防ぐことを必要とする。Ｆａｓシグナリングは、完全長Ｆａｓの膜貫通ドメインを欠く分泌タンパク質でありＦａｓＬとＦａｓの結合を阻害することができる、Ｆａｓスプライシング変異体可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）によって阻害することができる（２６）。同様に、ＦａｓデコイレセプターＤｃＲ３は、高い親和性でＦａｓＬと結合しＦａｓとのその相互作用を阻害する他の分泌タンパク質である（２７）。Ｆａｓ連結の下流部分では、ｃ−ＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質）およびＦＡＰ−１（Ｆａｓ関連ホスファターゼ−１）は、ＦａｓＤＩＳＣでのカスパーゼ８の漸増および活性化を阻害することができる（２８，２９）。５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬を用いた処理に応答するカスパーゼ８の活性化の欠如は、Ｆａｓ仲介のアポトーシスはＭＣＦ−７、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ癌細胞中で阻害され得ることを示唆する。しかしながら、ＣＨ−１１を用いた共処理は、この耐性を克服しＦａｓ仲介のアポトーシスを活性化させるのに充分であった。
【０１１９】
本発明者らの発見によって、新規の抗癌戦略として抗Ｆａｓ抗体と組み合わせて、代謝拮抗物質薬剤を使用する可能性が生じる。ＦａｓＬおよびＦａｓ経路阻害剤を過剰発現しそれによって免疫細胞によるＦａｓ仲介の除去を回避する腫瘍細胞に対して、Ｆａｓの標的化は非常に有用である可能性がある。しかしながら、マウスモデルにおけるＦａｓ抗体またはｒＦａｓＬを用いた全身処理は、肝臓および他の臓器に対する重度の障害を引き起こすことが示されている（３１）。いくつかの近年の試験は、全身毒性を克服するためのｒＦａｓＬの局所投与、または遺伝子療法としてのＦａｓＬ発現ベクターの使用に焦点をおいている（３１）。さらに、マウスモデルにおいて肝細胞毒性ではなかった、新規なアゴニスト性Ｆａｓ標的抗体ＨＦＥ７Ａが近年開発されており、低い毒性のＦａｓ標的抗体を開発することができることが示唆される（３２）。
【０１２０】
ＴＳ阻害剤を用いた処理は、細胞系および腫瘍においてＴＳ発現を急激に誘導することが示されている（１８，３３）。さらに、前臨床および臨床試験は、ＴＳが５−ＦＵに対する感度の重要な決定要素であり、高いＴＳ発現は増大した耐性と相関関係があることを見出している（１，３４）。したがって本発明者らは、テトラサイクリン制御型ＴＳ発現系（Ｍ７ＴＳ９０）を使用して５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬で処理した細胞において、Ｆａｓ仲介のアポトーシスの活性化に対する増大したＴＳ発現の影響を調べた。興味深いことに本発明者らは、５−ＦＵに応答するＣＨ−１１によるアポトーシスの活性化は、増大したＴＳ発現によって影響を受けなかったことを見出した。対照的にＴＳ誘導は、ＲＴＸとＣＨ−１１、およびＭＴＡとＣＨ−１１の間の相乗的相互作用を完全に無効にした。これらの発見はＦａｓ発現と相関関係があり、その上方発現は５−ＦＵ処理細胞ではなく、ＲＴＸおよびＭＴＡ処理細胞におけるＴＳ誘導によってほぼ完全に無効になった。これらの結果は、この細胞系における５−ＦＵ細胞毒性の主な中心は、ＴＳ阻害ではなかったことを示す。実際、本発明者らの以前の試験は、ＲＮＡ中へのフルオロヌクレオチドの誤った取り込みは、この系における５−ＦＵの主な細胞毒性効果であったことを示唆している（６）。したがって、高レベルのＴＳの発現にもかかわらず、いくつかの腫瘍は５ＦＵによるＦａｓ仲介のアポトーシスに対して、依然として敏感である可能性がある。しかしながら高いＴＳ発現は、葉酸系ＴＳ阻害剤に応答するＦａｓ仲介のアポトーシスを阻害する可能性がある。
【０１２１】
いくつかの前臨床試験は、ｐ５３機能の消失が５−ＦＵに対する細胞の感度を低下させることを実証している（６，２１）。さらに、いくつかの臨床試験は、ｐ５３突然変異が５−ＦＵに対する耐性と相関関係があったことを見出しているが、他の試験はこのような関係を見出していない（３４）。本発明者らは、２つのｐ５３野生型およびヌル同質遺伝子型細胞系対：ＭＣＦ−７由来Ｍ７ＴＳ９０およびＭ７ＴＳ９０−Ｅ６系、ならびにＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６ｐ５３−／−系における、薬剤誘導型のＦａｓ仲介のアポトーシスに対するｐ５３不活性化の影響を評価した。ｐ５３不活性化は２つの細胞系で両方の薬剤に応答するＦａｓの上方制御を弱め、５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬で処理した細胞中でのＣＨ−１１によるアポトーシスの活性化を阻害し、ｐ５３はこれらの物質に応答するＦａｓ仲介のアポトーシスの重要な決定要素であることが示された。興味深いことに、ＲＴＸとＣＨ−１１の間のいくつかの相乗作用をＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞系において依然として観察したが、それはｐ５３野生型細胞系と比較して有意に低下した。本発明者らは、ｐ５３突然変異Ｈ６３０結腸癌細胞系において代謝拮抗物質に応答する、Ｆａｓ仲介のアポトーシスの活性化も調べた。ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞系と同様に、薬剤処理の後にＦａｓ誘導をほとんど観察せず、５−ＦＵとＣＨ−１１の間の相乗作用は観察しなかった。しかしながら、ＲＴＸとＣＨ−１１の間の統計上有意な相乗的相互作用を再度観察した。驚くことに本発明者らの結果は、（５−ＦＵではなく）ＲＴＸはＦａｓ仲介のアポトーシスに対して、非機能的ｐ５３を有する少なくともいくつかの癌細胞系を増感させることができることを示唆する。さらに、この影響はＦａｓの上方制御とは無関係であるようであり、増大したＦａｓ発現以外の要因が、この物質に応答するＦａｓ仲介のアポトーシスに対する腫瘍細胞の増感に貢献していることが示唆される。
【０１２２】
結論として本発明者らは、アゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１は、ＭＣＦ−７、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＲＫＯ細胞中での５−ＦＵおよびＴＳ標的葉酸代謝拮抗薬に対するアポトーシス応答を劇的に増大させることを見出している。外来性ＴＳの誘導によって、５−ＦＵではなく葉酸代謝拮抗薬に関するこの相乗的相互作用が無効になるが、しかしながら相互作用の程度は、それぞれの薬剤に関して非常にｐ５３依存的であった。本発明者らの発見は、Ｆａｓシグナル経路は５−ＦＵおよび葉酸代謝拮抗薬仲介の細胞死の重要な制御要素であり、５−ＦＵまたは葉酸代謝拮抗薬に関するＦａｓ経路の標的化は、処理効能を有する可能性があることを示唆する。
【０１２３】
さらに、本発明者らは驚くことに、他の化学療法剤とは対照的に、ＴＤＸなどの葉酸代謝拮抗薬、ＣＰＴ−１１などのトポイソメラーゼＩ阻害剤、および低い程度で、５−ＦＵなどのチミジル酸シンターゼ阻害剤は、ＣＨ−１１などのデスレセプターリガンドと共に併用療法において使用すると、ｐ５３の突然変異と関係がある癌に対して相乗的細胞毒性効果をもたらすことを示している。
【０１２４】
本明細書中で言及した全ての文書は、参照により本明細書に組み込む。記載した本発明の実施形態に対するさまざまな変更形態および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱せずに当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を記載してきたが、特許請求する本発明がこのような特定の実施形態に過度に制限されるはずはないことは、理解されるはずである。実際、当業者には明らかである本発明を実施する記載した形態のさまざまな変更形態は、本発明に含まれるものとする。
【０１２５】
参考文献
1. Longley,D.B., Harkin, D.P., and Johnston, P.G. 5-fluorouracil: mechanisms of action andclinical strategies. Nat Rev Cancer, 3: 330-338,  2003.
2. Hughes,L.R., Stephens, T.C., Boyle, F.T., and Jackman, A.L. Raltitrexed (TomudexTM),a highly polyglutamatable antifolate thymidylate synthase inhibitor, p. 147-165:Humana press, 1999.
3. Shih, C.,Chen, V.J., Gossett, L.S., Gates, S.B., MacKellar, W.C., Habeck, L.L.,Shackelford, K.A., Mendelsohn, L.G., Soose, D.J., Patel, V.F., Andis, S.L.,Bewley, J.R., Rayl, E.A., Moroson, B.A., Beardsley, G.P., Kohler, W., Ratnam,M., and Schultz, R.M. LY231514, a pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-based antifolatethat inhibits multiple folate-requiring enzymes. Cancer Res, 57: 1116-1123,1997.
4. Aherne,G.W., Hardcastle, A., Raynaud, F., and Jackman, A.L. Immunoreactive dUMP andTTP pools as an index of thymidylate synthase inhibition; effect of tomudex(ZD1694) and a nonpolyglutamated quinazoline antifolate (CB30900) in L1210mouse leukaemia cells. Biochem Pharmacol, 51: 1293-1301, 1996.
5. Longley,D.B., Ferguson, P.R., Boyer, J., Latif, T., Lynch, M., Maxwell, P., Harkin,D.P., and Johnston, P.G. Characterization of a thymidylate synthase(TS)-inducible cell line: a model system for studying sensitivity to TS- andnon-TS-targeted chemotherapies. Clin Cancer Res, 7: 3533-3539, 2001.
6. Longley,D.B., Boyer, J., Allen, W.L., Latif, T., Ferguson, P.R., Maxwell, P.J.,McDermott, U., Lynch, M., Harkin, D.P., and Johnston, P.G. The role ofthymidylate synthase induction in modulating p53-regulated gene expression inresponse to 5-fluorouracil and antifolates. Cancer Res, 62: 2644-2649, 2002.
7. Maxwell,P.J., Longley, D.B., Latif, T., Boyer, J., Allen, W., Lynch, M., McDermott, U.,Harkin, D.P., Allegra, C.J., and Johnston, P.G. Identification of5-fluorouracil-inducible target genes using cDNA microarray profiling. CancerResearch, 63, 2003.
12. Mosmann,T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application toproliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 65: 55-63, 1983.
13. Kern,D.H., Morgan, C.R., and Hildebrand-Zanki, S.U. In vitro pharmacodynamics of1-beta-D-arabinofuranosylcytosine: synergy of antitumor activity withcis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Res, 48: 117-121, 1988.
14. Romanelli,S., Perego, P., Pratesi, G., Carenini, N., Tortoreto, M., and Zunino, F. Invitro and in vivo interaction between cisplatin and topotecan in ovariancarcinoma systems. Cancer Chemother Pharmacol, 41: 385-390, 1998.
15. Chou, T.C.and Talalay, P. Quantitative analysis of dose-effect relationships: thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul, 22:27-55, 1984.
16. Kano, Y.,Ohnuma, T., Okano, T., and Holland, J.F. Effects of vincristine in combinationwith methotrexate and other antitumor agents in human acute lymphoblasticleukemia cells in culture. Cancer Res, 48: 351-356, 1988.
17. Salvesen,G.S. and Dixit, V.M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc NatlAcad Sci USA, 96: 10964-10967, 1999.
18. Chu, E.,Koeller, D.M., Johnston, P.G., Zinn, S., and Allegra, C.J. Regulation ofthymidylate synthase in human colon cancer cells treated with 5-fluorouraciland interferon-gamma. Mol Pharmacol, 43: 527-533, 1993.
19. Muller,M., Wilder, S., Bannasch, D., Israeli, D., Lehlbach, K., Li-Weber, M.,Friedman, S.L., Galle, P.R., Stremmel, W., Oren, M., and Krammer, P.H. p53activates the CD95 (APO-1/Fas) gene in response to DNA damage by anticancerdrugs. J Exp Med, 188: 2033-2045, 1998.
20. Bennett,M., Macdonald, K., Chan, S.W., Luzio, J.P., Simari, R., and Weissberg, P. Cellsurface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53-mediated apoptosis.Science, 282: 290-293, 1998.
21. Bunz, F.,Hwang, P.M., Torrance, C.,Waldman, T., Zhang, Y., Dillehay, L., Williams, J., Lengauer, C., Kinzler,K.W., and Vogelstein, B. Disruption of p53 in human cancer cells alters theresponses to therapeutic agents. J Clin Invest, 104: 263-269, 1999.
24. 0'Connell,J., Bennett, M.W., O'Sullivan, G.C., Collins, J.K., and Shanahan, F. The Fascounterattack: a molecular mechanism of tumor immune privilege. Mol Med, 3:294-300, 1997.
25. Bennett,M.W., O'Connell, J., O'Sullivan, G.C., Brady, C., Roche, D., Collins, J.K., andShanahan, F. The Fas counterattack in vivo: apoptotic depletion oftumor-infiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by humanesophageal carcinoma. J Immunol, 160: 5669-5675, 1998.
26. Ruberti,G., Cascino, I., Papoff, G.,and Eramo, A. Fas splicing variants and their effect on apoptosis. Adv Exp MedBiol, 406: 125-134, 1996.
27. Pitti,R.M., Marsters, S.A., Lawrence, D.A., Roy, M., Kischkel, F.C., Dowd, P., Huang,A., Donahue, C.J., Sherwood, S.W., Baldwin, D.T., Godowski, P.J., Wood, W.I.,Gurney, A.L., Hillan, K.J., Cohen, R.L., Goddard, A.D., Botstein, D., andAshkenazi, A. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lungand colon cancer. Nature, 396: 699-703,1998.
28. Krueger,A., Baumann, S., Krammer, P.H., and Kirchhoff, S. FLICE-inhibitory proteins:regulators of death receptor-mediated apoptosis. Mol Cell Biol, 21: 8247-8254, 2001.
29. Sato, T.,Irie, S., Kitada, S., and Reed, J.C. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase thatassociates with Fas. Science, 268: 411-415, 1995.
30. Jiang, S.,Song, M.J., Shin, E.C., Lee, M.O., Kim, S.J., and Park, J.H. Apoptosis in humanhepatoma cell lines by chemotherapeutic drugs via Fas-dependent andFas-independent pathways. Hepatology, 29: 101-110, 1999.
31. Timmer,T., de Vries, E.G., and de Jong, S. Fas receptor-mediated apoptosis: a clinicalapplication? J Pathol, 196: 125-134, 2002.
32. Ichikawa, K., Yoshida-Kato, H., Ohtsuki,M., Ohsumi, J., Yamaguchi, J., Takahashi, S., Tani, Y., Watanabe, M.,Shiraishi, A., Nishioka, K., Yonehara, S., and Serizawa, N. A novel murineanti-human Fas mAb which mitigates lymphadenopathy without hepatotoxicity. IntImmunol, 12: 555-562, 2000.
33. Swain,S.M., Lippman, M.E., Egan, E.F., Drake, J.C., Steinberg,S.M., and Allegra, C.J. Fluorouracil and high-dose leucovorin in previouslytreated patients with metastatic breast cancer. J Clin Oncol, 7: 890-899, 1989.
34. Longley,D.B., McDermott, U., and Johnston, P.G. Clinical significance of prognostic and predictive markers incolorectal cancer. Pharmacogenomics J, 2: 209-216, 2002.
35. Munsch,D., Watanabe-Fukunaga, R., Bourdon, J.C., Nagata, S., May, E., Yonish-Rouach,E., and Reisdorf, P. Human and mouse Fas (APO-1/CD95) death receptor genes eachcontain a p53-responsive element that is activated by p53 mutants unable toinduce apoptosis. J Biol Chem, 275: 3867-3872, 2000.
36. Oehm, A.,et al., Purification and molecular cloning of the APO-1 cell surface antigen, amember of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor superfamily.Sequence identity with the Fas antigen. J Biol Chem, 1992. 267 (15):p.10709-15.
37. Fischer,U., R.U. Janicke, and K. Schulze-Osthoff, Many cuts to ruin: a comprehensiveupdate of caspase substrates. Cell Death Differ, 2003. 10(1): p.76-100.
38. Hill,L.L., et al., Fas ligand: a sensor for DNA damage critical in skin canceretiology. Science, 1999. 285(5429): p.898-900.
39. Santi,D.V., C.S. McHenry, and H. Sommer, Mechanism of interaction of thymidylatesynthetase with 5-fluorodeoxyuridylate. Biochemistry, 1974. 13(3): p.471-81.
40. Danenberg,P.V., Thymidylate synthetase-a target enzyme in cancer chemotherapy. BiochimBiophys Acta, 1977. 473(2): p.73-92.
41. Kufe, D.W.and P.P. Major, 5-Fluorouracil incorporation into human breast carcinoma RNAcorrelates with cytotoxicity. J Biol Chem, 1981. 256(19): p.9802-5.
42. Dancey, J.and E.A. Eisenhauer, Current perspectives on camptothecins in cancer treatment.Br J Cancer, 1996. 74(3): p.327-38.
43. Voigt, W.,et al., Topoisomerase-I inhibitor SN-38 can induce DNA damage and chromosomalaberrations independent from DNA synthesis. Anticancer Res, 1998. 18(5A):p.3499-505.
44. Chaney,S.G., The chemistry and biology of platinum complexes with the1,2-diaminocyclohexane carrier ligand. Int J Oncol, 1995. 6: p.1291-1305.
45.Woynarowski, J.M., et al., Oxaliplatin-induced damage of cellular DNA. MolPharmacol, 2000. 58(5): p.920-7.
46. Jackman,A.L., et al., ICI D1694, a quinazoline antifolate thymidylate synthaseinhibitor that is a potent inhibitor of L1210 tumor cell growth in vitro and invivo: a new agent for clinical study. Cancer Res, 1991. 51(20): p.5579-86.
47. NIHconsensus conference. Adjuvant therapy for patients with colon and rectalcancer. Jama, 1990. 264(11): p.1444-50.
48.Tournigand, C., et al., FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence inadvanced colorectal cancer: a randomized GERCOR study. J Clin Oncol, 2004.22(2): p.229-37.
49. Kong,X.T., H. Gao, and E.J. Stanbridge, Mechanisms of differential activation oftarget gene promoters by p53 hinge domain mutants with impaired apoptoticfunction. J Biol Chem, 2001. 276(35): p.32990-3000.
50. Gurova,K.V., et al., Cooperation of two mutant p53 alleles contributes to Fasresistance of prostate carcinoma cells. Cancer Res, 2003. 63(11): p.2905-12.
51. He, M., etal., A mutant P53 can activate apoptosis through a mechanism distinct fromthose induced by wild type P53. FEBS Lett, 2002. 517(1-3): p.151-4.
52. Pugacheva,E.N., et al., Novel gain of function activity of p53 mutants: activation of thedUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil. Oncogene,2002. 21(30): p.4595-600.
53. Forrester,K., et al., Effects of p53 mutants on wild-type p53-mediated transactivationare cell type dependent. Oncogene, 1995. 10(11): p.2103-11.
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】薬剤なし（Ｃ）または５μＭの５−ＦＵで処理した４８時間後の、ＭＣＦ−７細胞におけるＦａｓのｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す図である。均等な充填は、β−チューブリンのｍＲＮＡ発現を分析することによって評価した。
【図１Ｂ】薬剤なし（Ｃ）、５μＭの５−ＦＵまたは２５ｎＭのＲＴＸで処理した７２時間後の、ＭＣＦ−７細胞におけるＦａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。均等な充填は、β−チューブリンの発現を分析することによって評価した。
【図１Ｃ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（５μＭ）で処理、あるいは５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＭＣＦ−７細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は、非常に相乗的であった（ＲＩ＝２．４０、ｐ＜０．０００５）。
【図１Ｄ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＴＸ単独（２５ｎＭ）で処理、あるいはＲＴＸとＣＨ−１１で共処理したＭＣＦ−７細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は、非常に相乗的であった（ＲＩ＝２．２２、ｐ＜０．０００５）。
【図１Ｅ】５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＭＣＦ−７細胞における、アポトーシスの分析を示す図である。
【図１Ｆ】ＲＴＸとＣＨ−１１で共処理したＭＣＦ−７細胞における、アポトーシスの分析を示す図である。フローサイトメトリーによりサブＧ１／Ｇ０期のヨウ化プロピジウム染色細胞を分析することによって、アポトーシスを評価した。ＭＴＴおよびフローサイトメトリー分析用に、それぞれの化学療法剤で７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図２Ａ】一定範囲の濃度の５−ＦＵで４８時間処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２Ｂ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（５μＭ）で処理、あるいは５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は相乗的であった（ＲＩ＝１．９２、ｐ＜０．００５）。
【図２Ｃ】一定範囲の濃度のＲＴＸで４８時間処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２Ｄ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＴＸ単独（５０ｎＭ）で処理、あるいはＲＴＸとＣＨ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は、非常に相乗的であった（ＲＩ＝３．４４、ｐ＜０．０００５）。
【図２Ｅ】一定範囲の濃度の５−ＦＵで４８時間処理したＲＫＯ細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２Ｆ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（５μＭ）で処理、あるいは５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＲＫＯ細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は相乗的であった（ＲＩ＝１．７４、ｐ＜０．００５）。
【図２Ｇ】一定範囲の濃度のＲＴＸで４８時間処理したＲＫＯ細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２Ｈ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＴＸ単独（５ｎＭ）で処理、あるいはＲＴＸとＣＨ−１１で共処理したＲＫＯ細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は、非常に相乗的であった（ＲＩ＝２．３１、ｐ＜０．０００５）。ウエスタンブロットの均等な充填は、β−チューブリンの発現を分析することによって評価した。それぞれの組合せ処理用に、化学療法剤で７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図３Ａ】７２時間ＩＣ６０用量の５−ＦＵ（５μＭ）およびＲＴＸ（２５ｎＭ）で処理したＭＣＦ−７細胞における、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、プロカスパーゼ８およびＢＩＤ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。均等な充填をβ−チューブリン抗体を使用して評価した。
【図３Ｂ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（５μＭ）で９６時間処理、あるいは５−ＦＵで７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間共処理したＭＣＦ−７細胞における、Ｆａｓ、プロカスパーゼ８およびＢＩＤ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。５−ＦＵとＣＨ−１１の共処理は、プロカスパーゼ８および完全長ＢＩＤのプロセシングにより示されたように、カスパーゼ８およびＢＩＤの活性化をもたらした（レーン４）。
【図３Ｃ】薬剤なし（対照）、５μＭの５−ＦＵまたは５０ｎＭのＲＴＸ単独、あるいは２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１との組合せで処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、プロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３Ｄ】５μＭの５−ＦＵで７２時間、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で示した時間処理したＭＣＦ−７細胞におけるカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断の動態を調べた、ウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３Ｅ】５μＭの５−ＦＵで７２時間、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１、１０μＭのＩＥＴＤ−ｆｍｋ、あるいはＣＨ−１１とＩＥＴＤ−ｆｍｋの組合せで２４時間処理したＭＣＦ−７細胞における、Ｆａｓ、プロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現を分析したウエスタンブロットを示す図である。
【図４Ａ】Ｍ７ＴＳ９０細胞におけるＴＳトランス遺伝子の、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御型発現を示す図である。
【図４Ｂ】１０μＭの５−ＦＵ、１００ｎＭのＲＴＸまたは１μＭのＭＴＡを用いた７２時間の処理に応答するＭ７ＴＳ９０細胞におけるＦａｓ上方制御に対するＴＳ誘導（−ｔｅｔレーン）の影響を分析したウエスタンブロットを示す図である。
【図４Ｃ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下での５−ＦＵ（１０μＭ）またはＲＴＸ（１００ｎＭ）を用いた処理後の、Ｍ７ＴＳ９０細胞の生存能力に対するＴＳ誘導（−ｔｅｔ）の影響を示す、ＭＴＴアッセイを示す図である。
【図４Ｄ】５−ＦＵ（１０μＭ）、ＲＴＸ（１００ｎＭ）またはＭＴＡ（１μＭ）次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で処理したＭ７ＴＳ９０細胞における、カスパーゼ８の活性化および完全長（１１８ｋＤａ）ＰＡＲＰのプロセシングに対するＴＳ誘導の影響を示す図である。
【図４Ｅ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下での５−ＦＵ（１０μＭ）、ＲＴＸ（１００ｎＭ）またはＭＴＡ（１μＭ）で処理したＭ７ＴＳ９０細胞における、アポトーシスの誘導に対する外来性ＴＳ発現の影響を示す図である。フローサイトメトリーによりサブＧ１／Ｇ０期のヨウ化プロピジウム染色細胞を分析することによって、アポトーシスを評価した。ウエスタンブロットの均等な充填は、β−チューブリンの発現を分析することによって評価した。それぞれの組合せ処理用に、化学療法剤で７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図５Ａ】薬剤なし（対照）、１０μＭの５−ＦＵ、１００ｎＭのＲＴＸまたは１μＭのＭＴＡで処理した７２時間後のｐ５３野生型（ｗｔ）Ｍ７ＴＳ９０およびｐ５３ヌル（ｎｌ）Ｍ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図５Ｂ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１と組み合わせた１０μＭの５−ＦＵ、１００ｎＭのＲＴＸまたは１μＭのＭＴＡで処理したｐ５３ヌルＭ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。
【図５Ｃ】５−ＦＵ（１０μＭ）、ＲＴＸ（１００ｎＭ）またはＭＴＡ（１μＭ）次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で処理したＭ７ＴＳ９０（ｗｔ）およびＭ７ＴＳ９０−Ｅ６（ｎｌ）細胞における、プロカスパーゼ８および完全長（１１８ｋＤａ）ＰＡＲＰの発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図５Ｄ】５−ＦＵ（１０μＭ）、ＲＴＸ（１００ｎＭ）またはＭＴＡ（１μＭ）で処理したＭ７ＴＳ９０−Ｅ６細胞における、アポトーシスの誘導に対するＣＨ−１１（２５０ｎｇ／ｍｌ）の影響を示す図である。フローサイトメトリーによりサブＧ１／Ｇ０期のヨウ化プロピジウム染色細胞を分析することによって、アポトーシスを評価した。ウエスタンブロットの均等な充填は、β−チューブリンの発現を分析することによって評価した。それぞれの組合せ処理用に、化学療法剤で７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図６Ａ】４８時間一定範囲の濃度の５−ＦＵで処理したＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図６Ｂ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（１０μＭ）で処理、あるいは５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は相乗的ではなかった（ＲＩ＝１．０１）。
【図６Ｃ】４８時間一定範囲の濃度のＲＴＸで処理したＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図６Ｄ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＴＸ単独（５０ｎＭ）で処理、あるいはＲＴＸとＣＨ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は相乗的であった（ＲＩ＝１．６２、ｐ＝０．０１）。
【図６Ｅ】４８時間一定範囲の濃度の５−ＦＵで処理したＨ６３０細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図６Ｆ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（１０μＭ）で処理、あるいは５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＨ６３０細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は相乗的ではなかった（ＲＩ＝０．９９）。
【図６Ｇ】４８時間一定範囲の濃度のＲＴＸで処理したＨ６３０細胞の、ウエスタンブロット分析を示す図である。
【図６Ｈ】薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＴＸ単独（５０ｎＭ）で処理、あるいは５−ＦＵとＣＨ−１１で共処理したＨ６３０細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。この組合せ処理に関する細胞生存能力の低下は相乗的であった（ＲＩ＝１．４１、ｐ≦０．００５）。ウエスタンブロットの均等な充填は、β−チューブリンの発現を分析することによって評価した。それぞれの組合せ処理用に、化学療法剤で７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図７Ａ】２４時間および４８時間５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンで処理した後の同質遺伝子型のＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系におけるリアルタイムＰＣＲによって、Ｆａｓ／ＣＤ９５のｍＲＮＡの発現を示す図である。遺伝子の発現は、標的遺伝子Ｆａｓと１８Ｓの比としてそれぞれの時間地点で計算した。それぞれの遺伝子の発現は、希釈系を使用してそれぞれの遺伝子に関して作製した標準曲線に従い計算した。
【図７Ｂ】５μＭの５−ＦＵ、５μＭのＣＰＴ−１１および１μＭのオキサリプラチンで２４時間処理した後のＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系における、Ｆａｓおよびｐ５３発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図８】アゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて使用した化学療法剤５−ＦＵ、トミュデックス（ＴＤＸ）、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンのＭＴＴ細胞生存能力アッセイから計算したＲＩ値のグラフを示す図である。予想細胞生存率（Ｓｅｘｐ、薬剤Ａ単独で観察した生存率と薬剤Ｂ単独で観察した生存率の積として定義する）と、ＡとＢの組合せに関して観察した細胞の生存率（Ｓｏｂｓ）の比として、ＲＩを計算することができる（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。相乗作用は、１より大きいＲＩとして定義する。
【図９Ａ】５−ＦＵ（５μＭ）、ＴＤＸ（５０ｎＭ）、ＣＰＴ−１１（５μＭ）およびオキサリプラチン（１μＭ）で２４時間、次いでＣＨ−１１（５０ｎｇ／ｍｌ）でさらに２４時間処理した、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞の、フローサイトメトリー分析を示す図である。
【図９Ｂ】ＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌを含む化学療法剤およびＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌを含まない化学療法剤で処理した、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系に関するサブＧ０／Ｇ１群を示す図である。
【図１０】ウエスタンブロット分析による、ＰＡＲＰ切断およびプロカスパーゼ８の活性化に対する、５−ＦＵ（５μＭ）、ＣＰＴ−１１（５μＭ）およびオキサリプラチン（１μＭ）で既に２４時間処理したＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞にＣＨ−１１  ２００ｎｇ／ｍｌを２４時間加えたことの影響を示す図である。
【図１１Ａ】化学療法剤で処理したＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系における、Ｆａｓ細胞表面発現を示す図である。
【図１１Ｂ】化学療法剤で処理したＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系における、Ｆａｓ細胞表面発現を示す図である。
【図１２Ａ】５−ＦＵ（５μＭ）、ＣＰＴ−１１（５μＭ）およびオキサリプラチン（１μＭ）で４８時間処理したＨ６３０およびＲＫＯ細胞系におけるＦａｓ発現を示す図である。
【図１２Ｂ】Ｈ６３０細胞系においてアゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて使用した、化学療法剤５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンのＭＴＴ細胞生存能力アッセイから計算したＲＩ値を示す図である。
【図１２Ｃ】ＲＫＯ細胞系においてアゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて使用した、化学療法剤５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンのＭＴＴ細胞生存能力アッセイから計算したＲＩ値を示す図である。
【図１３Ａ】ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型、ヌルならびにＲ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗｐ５３突然変異細胞系におけるＦａｓ発現細胞に関する分析を示す図である。
【図１３Ｂ】Ｆａｓデスレセプターを発現した細胞のパーセンテージを示す図である（それぞれのサンプルに関して５０００個の細胞を調べた）。
【図１３Ｃ】ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型、ヌル、Ｒ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗ突然変異細胞系におけるｐ５３タンパク質発現を示す図である。フローサイトメトリー分析用に処理した後に、細胞を採取した。
【図１４Ａ】ＩＣ６０用量の５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンで７２時間処理したＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系、ならびにＲ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗｐ５３突然変異体のＭＴＴアッセイを示す図である。
【図１４Ｂ】ｐ５３野生型およびヌル細胞系、ならびにＲ１７５ＨおよびＲ２４８Ｗｐ５３突然変異系においてアゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて使用した、化学療法剤５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンのＭＴＴ細胞生存能力アッセイから計算したＲＩ値を示す図である。
【図１Ａ】
2007512303.tif 000002
【図１Ｂ】
2007512303.tif 000003
【図１Ｃ】
2007512303.tif 000004
【図１Ｄ】
2007512303.tif 000005
【図１Ｅ】
2007512303.tif 000006
【図１Ｆ】
2007512303.tif 000007
【図２Ａ】
2007512303.tif 000008
【図２Ｂ】
2007512303.tif 000009
【図２Ｃ】
2007512303.tif 000010
【図２Ｄ】
2007512303.tif 000011
【図２Ｅ】
2007512303.tif 000012
【図２Ｆ】
2007512303.tif 000013
【図２Ｇ】
2007512303.tif 000014
【図２Ｈ】
2007512303.tif 000015
【図３Ａ】
2007512303.tif 000016
【図３Ｂ】
2007512303.tif 000017
【図３Ｃ】
2007512303.tif 000018
【図３Ｄ】
2007512303.tif 000019
【図３Ｅ】
2007512303.tif 000020
【図４Ａ】
2007512303.tif 000021
【図４Ｂ】
2007512303.tif 000022
【図４Ｃ】
2007512303.tif 000023
【図４Ｄ】
2007512303.tif 000024
【図４Ｅ】
2007512303.tif 000025
【図５Ａ】
2007512303.tif 000026
【図５Ｂ】
2007512303.tif 000027
【図５Ｃ】
2007512303.tif 000028
【図５Ｄ】
2007512303.tif 000029
【図６Ａ】
2007512303.tif 000030
【図６Ｂ】
2007512303.tif 000031
【図６Ｃ】
2007512303.tif 000032
【図６Ｄ】
2007512303.tif 000033
【図６Ｅ】
2007512303.tif 000034
【図６Ｆ】
2007512303.tif 000035
【図６Ｇ】
2007512303.tif 000036
【図６Ｈ】
2007512303.tif 000037
【図７Ａ】
2007512303.tif 000038
【図７Ｂ】
2007512303.tif 000039
【図８Ａ】
2007512303.tif 000040
【図８Ｂ】
2007512303.tif 000041
【図８Ｃ】
2007512303.tif 000042
【図８Ｄ】
2007512303.tif 000043
【図９Ａ】
2007512303.tif 000044
【図９Ｂ】
2007512303.tif 000045
【図１０】
2007512303.tif 000046
【図１１Ａ】
2007512303.tif 000047
【図１１Ｂ】
2007512303.tif 000048
【図１２Ａ】
2007512303.tif 000049
【図１２Ｂ】
2007512303.tif 000050
【図１２Ｃ】
2007512303.tif 000051
【図１３Ａ】
2007512303.tif 000052
【図１３Ｂ】
2007512303.tif 000053
【図１３Ｃ】
2007512303.tif 000054
【図１４Ａ】
2007512303.tif 000055
【図１４Ｂ】
2007512303.tif 000056
【国際調査報告】
2007512303.tif 000057
2007512303.tif 000058
2007512303.tif 000059
2007512303.tif 000060