(57)【要約】アポトーシスの作用から哺乳動物を保護するためのフラジェリンの使用を記載する。より詳細には、本発明は、ストレス（例えば、放射線および癌処置）への曝露から哺乳動物を保護するためのフラジェリンの使用に関する。癌の処置における化学療法および放射線療法に関連する副作用を軽減する治療剤の必要性が、引き続き存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、他の関連する利点を提供する。本発明は、アポトーシスを誘発する１つ以上の処置から患者を保護する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的に受容可能な量の薬剤を含む組成物を、患者に投与する工程を包含する。
2007513183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線の影響から哺乳動物を保護する方法であって、該方法は、薬学的有効量のフラジェリンを含む組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記組成物が、放射線防護剤と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記放射線防護剤が、抗酸化剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗酸化剤が、アミホスチンおよびビタミンＥからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記放射線防護剤が、サイトカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記サイトカインが、幹細胞因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
アポトーシスを誘発する１つ以上の処置または状態から患者を保護する方法であって、該方法は、薬学的有効量のフラジェリンを含む組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記処置が、癌処置である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記処置が、化学療法または放射線療法である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記処置が、放射線、創傷、中毒、感染および温度ショックからなる群より選択されるストレスである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラジェリンが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの種に由来する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号６０／５２６，４６０号（２００３年１２月２日出願）、米国仮出願番号６０／５２６，４６１号（２００３年１２月２日出願）、米国仮出願番号６０／５２６，４９６号（２００３年１２月２日出願）、および米国仮出願番号６０／５２６，６６６号（２００３年１２月２日出願）（これらの内容は、参考として本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アポトーシスの作用から哺乳動物を保護するためのフラジェリンの使用に関する。より詳細には、本発明は、ストレス（例えば、放射線および癌処置）への曝露から哺乳動物を保護するためのフラジェリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
正常細胞から腫瘍細胞への進行は、成長抑制刺激に対する耐性ならびに成長因子およびホルモンへの依存の欠如を含む、成長調節の負のメカニズムの損失に関与している。放射線または細胞傷害性薬剤に基づく従来の癌処置は、正常細胞および悪性細胞の成長制御の差異に依存する。従来の癌処置は、細胞を苛酷な遺伝毒性ストレス下に置く。これらの条件下では、大多数の正常細胞は停止するので救済されるが、腫瘍細胞は分裂し続けて死ぬ。
【０００４】
しかしながら、従来の癌処置ストラテジーの性質は、正常な急速に分裂する組織またはアポトーシスを起こしやすい組織が危険に曝されるような性質のものである。これらの正常な急速に分裂する細胞に対する損傷は、癌処置の周知の副作用を引き起こす（感受性の組織：造血、小腸、毛嚢）。このような組織の生来の感受性は、癌細胞がしばしば自殺（アポトーシス）機構の欠損を獲得し、そして、正常な感受性組織に死をもたらすこれらの治療手技が、癌細胞に損傷を与えない場合があるという事実によって、複雑になる。癌治療の副作用を最小にする従来の試みは、（ａ）腫瘍細胞を処置に対してより感受性にすること、（ｂ）癌治療を腫瘍細胞に対してより特異的にすること、または（ｃ）処置（例えば、エリトロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＫＧＦ）の後の正常組織の再生を促進させること、に基づく。
【０００５】
癌の処置における化学療法および放射線療法に関連する副作用を軽減する治療剤の必要性が、引き続き存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、アポトーシスを誘発する１つ以上の処置から患者を保護する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的に受容可能な量の薬剤を含む組成物を、患者に投与する工程を包含する。薬剤は、フラジェリンであってもＴＧＦβであってもよく、このＴＧＦβは潜在性ＴＧＦβであってもよい。処置は、癌処置であり得、この癌処置は化学療法であっても放射線療法であってもよい。
【０００７】
本発明はまた、構成的に活性なＮＦ−κＢ癌に罹患している哺乳動物を処置する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的に受容可能な量の薬剤を含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。薬剤は、フラジェリンであってもＴＧＦβであってもよく、このＴＧＦβは潜在性ＴＧＦβであってもよい。薬剤は、癌の処置の前に投与されても、処置と同時に投与されても、または処置の後に投与されてもよい。処置は、化学療法であっても放射線療法であってもよい。
【０００８】
本発明はまた、癌の処置に起因して正常組織に損傷を受けている哺乳動物を処置する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的に受容可能な量の薬剤を含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。薬剤は、フラジェリンであってもＴＧＦβであってもよく、このＴＧＦβは潜在性ＴＧＦβであってもよい。薬剤は、癌の処置の前に投与されても、処置と同時に投与されても、または処置の後に投与されてもよい。処置は、化学療法であっても放射線療法であってもよい。
【０００９】
本発明はまた、ストレスに起因して正常組織に損傷を受けている哺乳動物を処置する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的に受容可能な量の薬剤を含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。薬剤は、フラジェリンであってもＴＧＦβであってもよく、このＴＧＦβは潜在性ＴＧＦβであってもよい。薬剤は、哺乳動物が罹患する疾患に対する処置の前に投与されても、処置と同時に投与されても、または処置の後に投与されてもよい。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物における細胞の老化を調節する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的に受容可能な量の薬剤を含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。薬剤は、フラジェリンであってもＴＧＦβであってもよく、このＴＧＦβは潜在性ＴＧＦβであってもよい。薬剤は、哺乳動物が罹患する疾患に対する処置の前に投与されても、処置と同時に投与されても、または処置の後に投与されてもよい。
【００１１】
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤、化学療法剤、および必要に応じて薬学的に受容可能なアジュバント、希釈剤、またはキャリアを含む薬学的組成物に関する。薬剤は、フラジェリンであってもＴＧＦβであってもよく、このＴＧＦβは潜在性ＴＧＦβであってもよい。
【００１２】
本発明はまた、ＮＦ−κＢの誘導因子についてスクリーニングする方法に関し、この方法は、疑わしい誘導因子をＮＦ−κＢで活性化される発現系に添加する工程、および別に、コントロールをＮＦ−κＢで活性化される発現系に添加する工程を包含し、これによって、ＮＦ−κＢの誘導因子が、ＮＦ−κＢで活性化される発現のレベルを増加させる能力によって確認される。
【００１３】
本発明はまた、放射線の影響からこの哺乳動物を保護する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢを誘導する薬学的有効量の薬剤を含む組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する。薬剤はフラジェリンであり得、このフラジェリンはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの１種に由来し得る。組成物は、放射線防護剤と組み合わせて投与され得る。放射線防護剤は抗酸化剤であり得、この抗酸化剤はアミホスチンであってもビタミンＥであってもよい。放射線防護剤はまた、サイトカインであり得、このサイトカインは幹細胞因子であってもよい。
【００１４】
本発明は、アポトーシスを誘発する１つ以上の処置または状態から患者を保護する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢフラジェリンを誘導する薬学的有効量の薬剤を含む組成物を、該患者に投与する工程を包含する。薬剤はフラジェリンであり得、このフラジェリンはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの１種に由来し得る。処置は癌処置であり得、この癌処置は化学療法であっても放射線療法であってもよい。状態はストレスであり得、このストレスは放射線、創傷、中毒、感染および温度ショックであり得る。
【００１５】
本発明はまた、アポトーシスのモジュレーターについてスクリーニングする方法に関し、この方法は、疑わしいモジュレーターを細胞ベースのアポトーシス系に添加する工程、および別に、コントロールを細胞ベースのアポトーシス系に添加する工程を包含し、これによって、アポトーシスのモジュレーターが、アポトーシスの速度を変更する能力によって確認される（この疑わしいモジュレーターは、哺乳動物の寄生体に由来する）。
【００１６】
本発明はまた、ＮＦ−κＢのモジュレーターについてスクリーニングする方法に関し、この方法は、疑わしいモジュレーターをＮＦ−κＢで活性化される発現系に添加する工程、および別に、コントロールをＮＦ−κＢで活性化される発現系に添加する工程を包含し、これによって、ＮＦ−κＢのモジュレーターが、ＮＦ−κＢで活性化される発現率を変更する能力によって確認される（この疑わしいモジュレーターは、哺乳動物の寄生体に由来する）。寄生体は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａが挙げられるが、これらに限定されない種であり得る。
【００１７】
本発明はまた、ＴＧＦβのモジュレーターについてスクリーニングする方法に関し、この方法は、疑わしいモジュレーターをＴＧＦβで活性化される発現系に添加する工程、および別に、コントロールをＴＧＦβで活性化される発現系に添加する工程を包含し、これによって、ＴＧＦβのモジュレーターが、ＴＧＦβで活性化される発現率を変更する能力によって確認される（この疑わしいモジュレーターは、哺乳動物の寄生体に由来する）。ＴＧＦβは、潜在性ＴＧＦβであってもよい。寄生体は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａが挙げられるが、これらに限定されない種に由来し得る。
【００１８】
本発明はまた、ｐ５３のモジュレーターについてスクリーニングする方法に関し、この方法は、疑わしいモジュレーターをｐ５３で活性化される発現系に添加する工程、および別に、コントロールをｐ５３で活性化される発現系に添加する工程を包含し、これによって、ｐ５３のモジュレーターが、ｐ５３で活性化した発現の速度を変更する能力によって確認される（この疑わしいモジュレーターは、哺乳動物の寄生体に由来する）。寄生体は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａが挙げられるが、これらに限定されない種に由来し得る。
【００１９】
本発明はまた、本明細書中に記載される任意のスクリーニング方法によって確認されるモジュレーターに関する。本発明はまた、本明細書中に記載されるモジュレーターを含む組成物に関する。この組成物は、薬学的に受容可能な量の本明細書中に記載されるモジュレーターを含む薬学的組成物であり得る。
【００２０】
本発明はまた、癌を処置する方法に関し、この方法は、アポトーシスを増強するモジュレーターを含む薬学的組成物を、このような処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する。
【００２１】
本発明はまた、アポトーシスを誘発する１つ以上の処置から患者を保護する方法に関し、この方法は、アポトーシスを阻害するモジュレーターを含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。この１つ以上の処置は、癌処置であり得る。癌処置は、化学療法であっても放射線療法であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、ストレス（化学療法、放射線療法および放射線が挙げられるが、これらに限定されない）によって引き起こされるアポトーシスから正常細胞および組織を保護することに基づく。細胞におけるアポトーシスを制御している、以下の２つの主要な機構が存在する：ｐ５３経路（プロアポトーシス）およびＮＦ−κＢ経路（抗アポトーシス）。両経路は、腫瘍において頻繁に調節解除される：すなわち、ｐ５３は通常失われ、一方、ＮＦ−κＢは構成的に活性になる。従って、正常細胞におけるｐ５３の阻害およびＮＦ−κＢの活性化は、癌処置のようなストレスによって引き起こされる死から正常細胞を保護し得るが、腫瘍細胞はこれらの制御機構が調節解除されているので、腫瘍細胞を処置に対してより耐性にすることはない。このことは、ｐ５３およびＮＦ−κＢに関する従来の見解（ｐ５３およびＮＦ−κＢが、それぞれ、活性化および抑制のための標的と見なされる）と矛盾する。
【００２３】
本発明は、アポトーシスから正常細胞を保護するために、ＮＦ−κＢ活性を誘導することに関する。哺乳動物におけるＮＦ−κＢ活性の誘導によって、正常細胞は、癌処置および温熱療法；放射線の有害な線量への曝露（例えば、原子力発電所、防衛産業または放射性医薬品製造の労働者、および兵士）；ならびに細胞の老化で生じる、細胞性ストレスに起因するアポトーシスから保護され得る。ＮＦ−κＢは多くの腫瘍細胞において構成的に活性であるので、ＮＦ−κＢ活性の誘導は、腫瘍細胞に有益な効果をもたらすことなく、アポトーシスから正常細胞を保護し得る。一旦、正常細胞が修復されると、ＮＦ−κＢ活性は正常レベルに回復され得る。ＮＦ−κＢ活性は、細網内皮系（免疫系を含む）、腸の上皮、および毛包のような、放射線感受性および化学療法感受性の組織を保護するために誘導され得る。
【００２４】
ＮＦ−κＢ活性の誘導因子は、いくつかの他の用途にも用いられ得る。種々の厳しい条件（放射線、創傷、中毒、感染、老化、および温度ショックが挙げられるが、これらに限定されない）に対する哺乳動物の曝露によって引き起こされる病理学的結果および死は、プログラム細胞死（アポトーシス）の誘導または生物活性タンパク質、サイトカインの放出のような、ストレス応答の正常な生理的機構の活性から生じ得る。
【００２５】
アポトーシスは、傷ついた細胞および遺伝学的に損傷を受けた細胞を組織から「取り除く」ために通常機能するが、一方、サイトカインは、病原体に対して生物体の防御系を動員する機能を果たす。しかしながら、重症の条件下では、両方のストレス応答機構は、単独で死因となり得る。例えば、放射線による致死は、造血系、免疫系および消化器系において生じる大規模なｐ５３媒介性アポトーシスから生じ得る。ＮＦ−κＢの合理的な薬理学的調節により、厳しいストレス条件下での生存を増加させ得る。これらの因子の制御は、損傷した器官からの細胞の炎症応答および生死決定の両方の制御を可能にし得る。
【００２６】
ＮＦ−κＢの保護的役割は、以下をコードする同義遺伝子の転写活性化によって媒介される：ａ）両方の主要なアポトーシス経路をブロックする抗アポトーシスタンパク質、ｂ）ＨＰおよび他の幹細胞の増殖および生存を誘導するサイトカインおよび成長因子、ならびにｃ）ＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ−２）のようなＲＯＳを除去する強力な抗酸化タンパク質。従って、放射線防護のためのＮＦ−κＢの一時的な活性化によって、癌患者におけるアポトーシスの抑制のみならず、同時免疫賦活性効果（この効果は、ＮＦ−κＢの活性化がＴｏｌｌ様レセプターの活性化を介して到達される場合に、達成され得る）に起因して、二次癌の発生率を低減する能力をも達成することが可能であり得る。
【００２７】
標的としてのＮＦ−κＢ経路の別の魅力的な特性は、候補放射線防護剤と見なされ得る多数の天然因子によるその活性化である。これらの中で、複数の病原体に関連する分子パターン（ＰＡＭＰ）がある。ＰＡＭＰは、宿主生物中に見出されず、病原体の大集団に特徴的であり、かつ容易に変異され得ない分子である。ＰＡＭＰは、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）、先天性免疫のキーセンサーエレメントによって認識される。ＴＬＲは、免疫細胞の遊走および活性化を直接またはサイトカイン放出を通じて誘導することにより、免疫系の第１警告機構として作用する。ＴＬＲは、ホモおよびヘテロダイマーとしてはたらくことが公知である、Ｉ型膜タンパク質である。リガンド結合の際に、ＴＬＲは、ＭｙＤ８８タンパク質（大部分のＴＬＲに不可欠なシグナル伝達アダプター）を補充する。続くシグナル伝達カスケードは、（ｉ）ＮＦ−κＢ経路の活性化、および（ｉｉ）Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を含むＭＡＰＫの活性化を含む効果をもたらす。Ｔｏｌｌ様レセプターリガンドによるＮＦ−κＢ経路の活性化は、可能性のある放射線防護剤として魅力的なリガンドを作製する。サイトカインと異なり、多くのＰＡＭＰが、ＴＬＲの活性化以外にほとんど影響がなく、従って、副作用を生じる可能性は低い。さらに、多くのＰＡＭＰはヒトに存在する。
【００２８】
ＴＬＲはすべて、それらの免疫細胞活性化の機能と合致して、脾臓および末梢血白血球中で発現され、他のリンパ器官および白血球のサブセットにおいて、よりＴＬＲ特異的な発現パターンを有する。しかしながら、ＴＬＲはまた、身体の他の組織および器官中でも発現される。例えば、ＴＬＲ１は遍在的に発現され、ＴＬＲ５はＧＩ上皮および内皮においても見出され、一方、ＴＬＲ２、６、７および８は肺において発現されることが公知である。
【００２９】
（１．定義）
本明細書中で使用される技術用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であり、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のものを指示しない限り、複数の対象を包含することが留意されるべきである。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「投与する」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投与を記載するために使用される場合、薬剤の単回投与または複数回投与を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「アナログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈中で使用される場合、アミノ酸の従来の組み合わせからの１つ以上の非標準アミノ酸または他の構造変異体を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および単鎖抗体、ダイアボディー、二重特異性抗体、２官能性抗体およびそれらの誘導体を含む、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥのクラスの抗体、あるいはそれらのフラグメントまたは誘導体を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはこのエピトープに由来する配列に対して十分な結合特異性を示す、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製した抗体、またはそれらの混合物であり得る。抗体はまた、キメラ抗体であり得る。抗体は、当該分野で公知の１つ以上の化学物質成分、ペプチド成分、またはポリペプチド成分の付着によって誘導体化され得る。抗体は、化学物質成分と結合体化され得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「アポトーシス」とは、細胞小器官の完全性を保持しながらの細胞体積の漸進的な縮小；光学顕微鏡または電子顕微鏡によって観察されるようなクロマチンの凝縮（すなわち、核の凝縮）；および／または遠心沈降アッセイによって決定されるようなヌクレオソームサイズのフラグメントへのＤＮＡ切断を含む細胞死の形態をいう。細胞の膜完全性が、食細胞によるインタクトな細胞フラグメント（「アポトーシス体」）の貪食で失われる場合（例えば、膜小疱形成）、細胞死が起こる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」は、アポトーシス刺激に対する耐性によって特徴付けられる任意の状態を意味する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「癌処置」は、当該分野で公知の癌の任意の処置（化学療法および放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「との組み合わせ」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投与およびさらなる処置手段を記載するために使用される場合、この薬剤は、さらなる処置の前に投与されても、同時に投与されても、または後に投与されても、あるいはこれらの組み合わせで投与されてもよいことを意味する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈中で使用される場合、一次構造（アミノ酸およびアミノ酸アナログ）以外が異なるペプチドまたはポリペプチドを意味する。例証として、誘導体は、グリコシル化（翻訳後修飾の１つの形態）されることによって異なり得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、異種の系における発現によるグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物活性が保持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明に従う誘導体である。他の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ末端またはＣ末端を有する融合ペプチドまたは融合ポリペプチド、ペグ化されたペプチドまたはポリペプチド、脂質部分を伴うペプチドまたはポリペプチド、アルキル化されたペプチドまたはポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を介して他のペプチド、ポリペプチドまたは化学物質に連結されるペプチドまたはポリペプチド、および当該分野で理解されるようなさらなる改変体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「フラジェリン」は、任意の供給源（任意の細菌種を含むが、これらに限定されない）由来のフラジェリンを意味する。フラジェリンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの１種に由来し得る。また具体的には、前記フラジェリンのフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、または誘導体；およびそれらの組み合わせも企図される。本明細書中に記載される種々のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログまたは誘導体は、野生型フラジェリンに５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈中で使用される場合、約８〜約５０アミノ酸長のペプチドを意味する。フラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸長であり得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ホモログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈中で使用される場合、共通の進化上の祖先を共有するペプチドまたはポリペプチドを意味する
本明細書中で使用される場合、用語「潜在性ＴＧＦβ」は、活性型ではないＴＧＦβの前駆体を意味する。潜在性ＴＧＦβは、活性ＴＧＦβおよび潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）を含むＴＧＦβの前駆体であり得る。潜在性ＴＧＦβはまた、潜在性ＴＧＦβ結合タンパク質に連結したＬＡＰを含み得る。潜在性ＴＧＦβはまた、大きな潜在性複合体であり得る。さらに、潜在性ＴＧＦβは、活性ＴＧＦβへの転換速度またはＴＧＦβに転換される能力が低下しているように改変された、潜在性ＴＧＦβであり得る。改変された潜在性ＴＧＦβは、例えば、活性ＴＧＦβへの転換を阻止するかまたは減少させるＴＧＦβ変異体であり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「ＴＧＦβ」は、活性または潜在性のＴＧＦβの任意のアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４またはＴＧＦβ５、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。また具体的には、前記ＴＧＦβアイソフォームのフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、または誘導体、およびそれらの組み合わせも企図される。本明細書中に記載される種々のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログまたは誘導体は、ＴＧＦβアイソフォームに５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」または「処置すること」は、ある状態からの哺乳動物の保護に関する場合、その状態を予防すること、抑制すること、抑圧すること、または除去することを意味する。状態の予防は、その状態の発生前に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を包含する。状態の抑制は、その状態の誘導後であるがその臨床的所見の前に、哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を包含する。状態の抑圧は、その状態が軽減されるかまたは維持されるように、その状態の臨床所見の後に、哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を包含する。状態の除去は、哺乳動物がもはやその状態を受けることのないように、その状態の臨床所見の後に、哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を包含する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍細胞」は、アポトーシス刺激に対する耐性によって特徴付けられる任意の細胞を意味する。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「改変体」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈中で使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。本発明の目的のために、「生物活性」としては、特異的抗体によって結合される能力が挙げられるが、これに限定されない。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸に置換することは、典型的に小さな変更への関与として当該分野で認識される。これらの小さな変更は、当該分野において理解されるように、１つには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考察することによって同定され得る。Ｋｙｔｅｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７．１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、アミノ酸の疎水性および電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換し、かつタンパク質機能を依然として保持し得ることは、当該分野で公知である。１つの局面において、∀２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにするために用いられ得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考察は、そのペプチドの最大局所平均親水性（抗原性および免疫原性と十分に相関すると報告されている有用な手段）の算出を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中に参考として援用される）。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該分野において理解されるように、生物活性（例えば、免疫原性）を保持するペプチドを生じ得る。１つの局面において、置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行なわれる。アミノ酸の疎水性指標および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この観察と一致して、生物学的機能に互換性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸（特に、これらのアミノ酸の側鎖）の相対的類似性に依存することが理解される。
【００４５】
（２．処置方法）
（ａ．構成的に活性なＮＦ−κＢ腫瘍）
本発明は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する治療有効量の薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、構成的に活性なＮＦ−κＢ癌に罹患する哺乳動物を処置する方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤は、癌処置と組み合わせて投与され得る。
【００４６】
薬剤は、化学療法および放射線療法のような他の抗癌処置と同時にかまたはメトロノームのように投与され得る。用語「同時の」または「同時に」は、本明細書中で使用される場合、他の抗癌処置および本発明の化合物が、互いに４８時間以内に、好ましくは２４時間以内に、より好ましくは１２時間以内に、なおより好ましくは６時間以内に、そして最も好ましくは３時間以内に施与されることを意味する。用語「メトロノームのように」とは、本明細書中で使用される場合、化学療法と異なる時点で、かつ、反復投与および／または化学療法レジメンに対して特定の頻度で、化合物を投与することを意味する。
【００４７】
薬剤は、癌処置への曝露前の任意の時点（曝露の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。薬剤は、癌処置への曝露後の任意の時点（曝露の約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。
【００４８】
癌処置は、細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤、あるいはその組み合わせの投与を含み得る。細胞傷害性薬剤は、（１）ＤＮＡを複製する細胞の能力を妨げること、ならびに（２）癌細胞において細胞死および／またはアポトーシスを誘導することによって、癌細胞が増殖するのを防ぐ。細胞増殖抑制剤は、細胞増殖を調節する細胞のシグナル伝達のプロセスを調節するか、妨げるか、または阻害することによって、そして時には低い連続的レベルで作用する。
【００４９】
細胞傷害性薬剤として用いられ得る化合物のクラスとしては、以下が挙げられる：アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼンが挙げられるが、これらに限定されない）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブチル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルマスティン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロマイド；代謝拮抗剤（葉酸拮抗薬、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン；天然物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカインおよびエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、エピルビシン、イダルビシン、シトシンアラビノシド、パクリタキセル（パクリタキセルは、Ｔａｘｏｌ（登録商標）として市販されている）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（好ましくは、ＩＮＦ−α）、エトポシド、およびテニポシド。
【００５０】
他の増殖性細胞傷害性薬剤は、ナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびドロロキサフィンである。
【００５１】
微小管に作用する薬剤は、細胞の有糸分裂を妨げ、その細胞毒性活性について当該分野で周知である。本発明において有用である微小管に作用する薬剤としては、アロコルヒチン（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ３３４１０）、ドラスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）、マイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ＮＳＣ１２５９７３）、Ｔａｘｏｌ（登録商標）誘導体（例えば、誘導体（例えば、ＮＳＣ６０８８３２）、チオコルヒチンＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステイン（ＮＳＣ８３２６５）、硫酸ビンブラスチン（ＮＳＣ４９８４２）、硫酸ビンクリスチン（ＮＳＣ６７５７４）、天然および合成のエポチロン（エポチロンＡ、エポチロンＢ、およびジスコデルモリドが挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：２００９を参照のこと））エストラムスチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４などが挙げられるが、これらに限定されない。このような薬剤の例はまた、Ｂｕｌｉｎｓｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１０：３０５５  ３０６４；Ｐａｎｄａ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０５６０−１０５６４；Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３３４４−３３４６；Ｎｉｃｏｌａｏｕ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：２６８−２７２；Ｖａｓｑｕｅｚ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：９７３−９８５；ａｎｄ  Ｐａｎｄａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７１：２９８０７−２９８１２においても記載される。
【００５２】
以下のような細胞傷害性薬剤もまた適切である：エピドフィロトキシン；抗腫瘍性酵素；トポイソメラーゼインヒビター；プロカルバジン；ミトキサントロン；シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ配位化合物；生物応答調節剤；成長抑制物質；抗ホルモン治療薬；ロイコボリン；テガフール；および造血成長因子。
【００５３】
使用され得る細胞増殖抑制剤としては、ホルモンおよびステロイド（合成アナログを含む）：１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニソロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
他の細胞増殖抑制剤は、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターのような抗血管形成物質であり、そして他のＶＥＧＦインヒビター（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体ならびにＺＤ６４７４およびＳＵ６６６８のような小分子）も含まれる。Ｇｅｎｅｔｅｃｈからの抗Ｈｅｒ２抗体も利用され得る。適切なＥＧＦＲインヒビターは、ＥＫＢ−５６９（不可逆インヒビター）である。ＥＧＦＲに免疫特異的なＩｍｃｌｏｎｅ抗体Ｃ２２５、およびｓｒｃインヒビターもまた含まれる。
【００５５】
アンドロゲン依存性の癌腫を非増殖性にするカソデックス（登録商標）（ビカルタミド、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）もまた、細胞増殖抑制剤として使用するのに適している。細胞増殖抑制剤のなお別の例は、エストロゲン依存性の乳癌の増殖または成長を阻害する、抗エストロゲンのタモキシフェン（登録商標）である。細胞増殖性シグナルの伝達のインヒビターは、細胞増殖抑制剤である。代表的な例としては、上皮細胞増殖因子インヒビター、Ｈｅｒ−２インヒビター、ＭＥＫ−１キナーゼインヒビター、ＭＡＰＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３インヒビター、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、およびＰＤＧＦインヒビターが挙げられる。
【００５６】
種々の癌（以下が挙げられるが、これらに限定されない）は、本発明に従って処置され得る：膀胱癌（促進的な転移性の膀胱癌を含む）、乳癌、大腸癌（結腸直腸癌を含む）、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞および非小細胞肺癌ならびに肺腺癌を含む）、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、尿生殖路の癌、リンパ系の癌、直腸癌、喉頭癌、膵臓癌（膵外分泌腺癌を含む）、食道癌、胃癌、胆嚢癌、子宮頸癌、甲状腺癌、および皮膚癌（扁平上皮癌を含む）を含む癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞性リンパ腫、細網肉腫、およびバーキットリンパ腫を含む、リンパ系統の造血腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、および前骨髄性白血病を含む、骨髄性系列の造血腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む、中枢神経系および末梢神経系の腫瘍；繊維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞状癌、および奇形癌を含む他の腫瘍。好ましい実施形態において、本発明は、胃腸管の癌を処置するために用いられる。
【００５７】
（ｂ．癌処置による副作用の処置）
本発明はまた、構成的に活性なＮＦ−κＢ癌の処置に起因して正常組織に損傷を受けている哺乳動物を処置する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する治療有効量の薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤は、上記の癌処置と組み合わせて投与され得る。
【００５８】
（ｃ．細胞の老化の調節）
本発明はまた、哺乳動物における細胞の老化を調節する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する治療有効量の薬剤を哺乳動物に投与する工程を包含する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤は、他の処置と組み合わせて投与され得る。
【００５９】
薬剤は、他の処置の施与前の任意の時点（施与の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。薬剤は、他の処置の施与後の任意の時点（施与の約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。
【００６０】
（ｄ．ストレスの処置）
本発明はまた、ストレスに起因して正常組織に損傷を受けている哺乳動物を処置する方法に関し、この方法は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する治療有効量の薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤は、他の処置と組み合わせて投与され得る。ストレスは、任意の原因（放射線、創傷、中毒、感染、および温度ショックが挙げられるが、これらに限定されない）に起因し得る。
【００６１】
ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物は、ストレスへの曝露前の任意の時点（曝露の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物は、ストレスへの曝露後の任意の時点（曝露の約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。
【００６２】
（ｅ．放射線）
本発明はまた、放射線への曝露の影響からの細胞の保護に関する。電離放射線による正常細胞の損傷および死は、被曝細胞に対する直接放射線誘導性の損傷と、放射線誘導性のストレスに対して活性な遺伝的にプログラムされた細胞反応（自殺死またはアポトーシスを生じる）との組み合わせである。アポトーシスは、いくつかの放射線感受性の器官（すなわち、造血系および免疫系、消化管の上皮など）において生じる大量の細胞消失に重要な役割を果たし、その不全は、生物体の全体的な放射線感受性を決定する。
【００６３】
電離放射線（ＩＲ）への曝露は、短期であっても長期であってもよく、単回線量としてまたは複数回線量として、全身にまたは局所的に適用され得る。従って、原発事故または軍事攻撃は、単回高線量の全身照射（時には、放射性同位元素での長期中毒が続く）への曝露を含み得る。被移植体の血液前駆体を造血器官から「取り除く」ことによって、ドナーの骨髄のために造血器官を準備する必要がある場合、骨髄移植のための患者の前処置について同じことが言える（適用される線量を厳密に制御して）。癌処置は、全身照射として適用された場合、致死線量を大幅に超える局所照射の複数回線量を含み得る。放射性同位元素での中毒または処置は、標的器官（例えば、１２５Ｉの吸入の場合、甲状腺）の放射線に対する長期の局所被曝を生じる。最終的に、生物学的作用の重症度が著しく異なる電離放射線の多くの物理的形態が存在する。
【００６４】
分子および細胞レベルでは、放射線粒子は、ＤＮＡ、タンパク質、細胞膜および他の巨大分子構造中に切断および架橋を生じ得る。電離放射線はまた、フリーラジカルおよび活性酸素種（ＲＯＳ）を生じさせることによって、細胞成分に二次損傷を誘導する。複数の修復系（例えば、ＤＮＡの完全性および忠実度を回復するいくつかのＤＮＡ修復経路、ならびにフリーラジカルおよびＲＯＳを除去し、酸化されたタンパク質および脂質を減少させる抗酸化作用のある化学物質および酵素）が、この損傷の影響を弱める。細胞のチェックポイント系は、ＤＮＡ欠損を検出し、そして損傷が修復されるかまたは成長停止もしくはプログラム細胞死（アポトーシス）に細胞を委ねるとの結論に達するまで、細胞周期進行を遅延させる。
【００６５】
放射線は、低線量の軽度な変異原性および発癌性作用から、高線量によってほとんど瞬時に死滅させるまでの範囲で、哺乳動物生物体に損傷を与え得る。生物体の全体的な放射線感受性は、細胞代謝回転速度の高い細網内皮系、生殖器系および異なる上皮を含むいくつかの感受性の組織において発生する病理学的変化によって決定される。
【００６６】
死に至るγ線照射の急性の病理学的結果は、異なる線量について異なり、各々の特定の線量に対する生物体の感受性の閾値を規定する特定の器官の機能不全によって決定される。従って、比較的低い線量での致死性は骨髄形成不全から生じ、一方、中程度の線量は胃腸（ＧＩ）症候群を誘導することによってより速く死滅させる。非常に高い放射線照射量は、ニューロンの変性を誘発するほとんど瞬時の死を引き起こし得る。
【００６７】
放射線の急性毒性の期間を生存する生物体は、曝露された器官（例えば、腎臓、肝臓または肺）において照射の数ヶ月後および数年後に発症する放射線誘導性の発癌および線維症を含む長期の間接的な影響を受け得る。
【００６８】
細胞内ＤＮＡは、直接的および間接的な（フリーラジカルベースの）機構によって、種々の型のＤＮＡ損傷（遺伝毒性ストレス）を引き起こすＩＲの主要な標的である。全ての生物体は、放射線の損傷を受けたＤＮＡを有効に回復し得るＤＮＡ修復系を維持し；ＤＮＡ修復プロセスにおけるエラーは、変異を引き起こし得る。
【００６９】
腫瘍は、一般にγ放射線に対してより感受性であり、正常組織に対して比較的低い損傷をもたらす複数の局所的線量で処置され得る。それにもかかわらず、いくつかの場合において、正常組織の損傷は、癌処置のためのγ放射線の適用における限定要因である。従来の３次元等角のまたはさらにより集中的なＢｅａｍＣａｔｈ送達による癌治療の間のγ線照射の使用はまた、照射の蓄積作用によって引き起こされ、骨髄および胃腸（ＧＩ）管のような急速に再生する正常組織の幹細胞の損傷を誘導する、線量限定毒性も有する。
【００７０】
高線量では、放射線誘導性の致死は、いわゆる造血および胃腸の放射線症候群に関連する。造血症候群は、血液およびリンパ系の再生を不可能にする、造血細胞およびそれらの前駆体の損失を特徴とする。通常、感染（免疫抑制の結果）、出血および／または貧血の結果として死に至る。ＧＩ症候群は、腸管上皮における（おもに、小腸における）大量の細胞死によって引き起こされ、その後に腸壁の崩壊ならびに菌血症および敗血症による死が続く。造血症候群は通常、比較的低線量の放射線で優勢であり、そしてＧＩ症候群よりも遅れて死に至る。
【００７１】
従来、放射線防護剤は、代表的には抗酸化剤（合成および天然の両方）であった。より最近に、サイトカインおよび成長因子が、放射線防護剤のリストに加えられた；これらの放射線防護の機構は、感受性の組織の再生への影響を促進する結果であると考えられている。しかしながら、いくつかのサイトカインは、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）およびメタロチオネインのような、細胞の抗酸化タンパク質の発現を誘導するので、放射線防護剤の両方の群間に明瞭な機能的差異はない。
【００７２】
特定の薬剤のための保護の測定は、線量変更係数（ＤＭＦまたはＤＲＦ）によって示される。ＤＭＦは、放射線防護剤で処置された被験体および未処置のコントロール被験体を、ある範囲の放射線量で照射し、次いで、生存またはいくつかの他のエンドポイントを比較することによって決定される。ＤＭＦは、通常３０日間の生存について計算され（ＬＤ５０／３０薬物処置をＬＤ５０／３０ビヒクル処置で除算）、細網内皮系の保護を数量化する。胃腸系保護を評価するために、ＬＤ５０およびＤＭＦが６日間または７日間の生存について計算される。本明細書中に提供されるＤＭＦ値は、他に指示がない限り３０日間である。
【００７３】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、細胞レベルでおよび生物体全体として、強い生存促進活性を有する。致死線量を超える放射線に応答して、ＮＦ−κＢの誘導因子は、急性の放射線被曝による主要な死因である胃腸症候群および造血症候群の両方を阻害する。これらの特性の結果として、ＮＦ−κＢの誘導因子は、自然放射線事象および原発事故の影響を処置するために用いられ得る。さらに、ＮＦ−κＢの誘導因子は、すべての現在公知の放射線防護剤とは異なる機構で作用するので、ＮＦ−κＢの誘導因子は、他の放射線防護剤と組み合わせて用いられ得、それによって、電離放射線からの保護の規模を劇的に増大させ得る。
【００７４】
従来の放射線防護剤（例えば、フリーラジカルのスカベンジャー）とは対照的に、抗アポトーシス剤は、放射線媒介性の一次損傷を減少しなくてもよいが、一次損傷に対する活性細胞反応に関する二次事象に対して（従って、既存の防御線を補完して）作用してもよい。ｐ５３（哺乳動物細胞における放射線応答の重要な媒介物質）の薬理学的インヒビターであるピフィスリン−αは、この新しいクラスの放射線防護剤の例である。しかしながら、ｐ５３インヒビターの活性は、細網内皮系の保護に限定され、消化管（胃腸症候群）における防護効果を有さず、従って、これらの化合物の治療的価値が減少する。より広範囲の活性を有する抗アポトーシスの医薬品が、切実に必要とされる。
【００７５】
ＮＦ−κＢの誘導因子を放射線防護剤として用いて、現在利用可能な手段（遮蔽および既存の生体保護剤の適用）によって達成可能なレベルを超えて人体の放射線抵抗性を増大させることによって、耐放射線量の程度を拡大し得、そして機内での核事故または大規模な太陽粒子線事象の場合に、乗組員生存の機会を大幅に増加させ得る。ＮＦ−κＢ誘導因子であるフラジェリンは、１．５を越える概算のＤＭＦ（３０日間の生存）によって、現在報告されているいかなる天然化合物よりも有効である。
【００７６】
ＮＦ−κＢの誘導因子はまた、例えば中枢神経系および生殖器において、低線量照射によって引き起こされる取り替えがきかない細胞の消失を処置するのにも有用である。ＮＦ−κＢの誘導因子はまた、脱毛を含む、化学療法に関連する副作用を処置するために、癌化学療法の間に用いられ得る。
【００７７】
１つの実施形態において、哺乳動物は、ＮＦ−κＢの誘導因子を含む治療有効量の組成物を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、放射線への曝露に対する処置を受ける。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物は、１つ以上の放射線防護剤と組み合わせて投与され得る。１つ以上の放射線防護剤は、放射線被曝の影響を処置する任意の薬剤（抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャーおよびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。
【００７８】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、ＤＮＡおよび他の細胞構造における損傷に応答して、放射線誘導性のプログラム細胞死を阻害し得る；しかしながら、ＮＦ−κＢの誘導因子は、細胞での損傷に対処しなくてもよく、また変異を阻止しなくてもよい。フリーラジカルおよび活性酸素種（ＲＯＳ）は、変異および他の細胞内の損傷の主要な原因である。抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーは、フリーラジカルによる損傷の予防に有効である。ＮＦ−κＢの誘導因子および抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーの組み合わせにより、放射線に被曝した哺乳動物に、あまり広範でない損傷、より高い生存、および健康の改善がもたらされ得る。本発明の実施において用いられ得る抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーとしては、シスチン、システアミン、グルタチオンおよびビリルビンのようなチオール類；アミホスチン（ＷＲ−２７２１）；ビタミンＡ；ビタミンＣ；ビタミンＥ；ならびにインディアンホーリーバジル（カミメボウキ）、オリエンチンおよびバイセニンのようなフラボノイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
ＮＦ−κＢの誘導因子はまた、放射線感受性の幹細胞集団を補充および／または保護することによって放射線防護を付与するいくつかのサイトカインおよび成長因子と組み合わせて投与され得る。最小の副作用での放射線防護は、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ−３リガンド、およびインターロイキン−１フラグメントであるＩＬ−１ｂ−ｒｄの使用によって達成され得る。防護は、幹細胞の増殖の誘導（すべての上記サイトカイン）、および幹細胞のアポトーシスの予防（ＳＣＦ）によって達成され得る。処置により、照射の前に白血球およびその前駆体の集積が可能になり、従って、照射後の免疫系のより迅速な再構成が可能になる。ＳＣＦは、１．３〜１．３５の範囲のＤＭＦで、致死的に照射されたマウスを効率的に救済し、胃腸症候群に対しても有効である。Ｆｌｔ−３リガンドはまた、マウス（７０〜８０％のＬＤ１００／３０での３０日間の生存、ＤＭＦ＞１．２に相当）およびウサギにおいて強力な保護を提供する（１５、１６）。
【００８０】
いくつかの因子は、本来サイトカインではないが、免疫細胞の増殖を刺激し、ＮＦ−κＢの誘導因子と組み合わせて用いられ得る。５−ＡＥＤ（５−アンドロステンジオール）は、サイトカインの発現を刺激し、そして細菌およびウイルス感染に対する耐性を増加させるステロイドである。照射の２４時間前にマウスに５−ＡＥＤを皮下注射することにより、ＤＭＦ＝１．２６で生存が改善された。トリクロロ（ジオキソエチレン−Ｏ，Ｏ’−）テルル酸アンモニウム（ＡＳ−１０１）のような合成物もまた、多数のサイトカインの分泌を誘導するために、かつＮＦ−κＢの誘導因子との組み合わせのために用いられ得る。
【００８１】
成長因子およびサイトカインはまた、胃腸症候群に対する保護を提供するために用いられ得る。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、腸粘膜における増殖および分化を促進し、そして腸陰窩における照射後の細胞生存を増加させる。造血性サイトカインおよび放射線防護剤ＳＣＦはまた、腸幹細胞の生存および関連する短期の生物体生存を増加させ得る。
【００８２】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、胃腸（ＧＩ）症候群および造血症候群の両方に対する保護を提供し得る。１５Ｇｙの全身の致死線量照射に被曝したマウスは、大部分がＧＩ症候群で死亡したので、ＮＦ−κＢの誘導因子およびＧＩ症候群の１つ以上のインヒビターを含む組成物は、より有効であり得る。本発明の実施において用いられ得るＧＩ症候群のインヒビターとしては、ＳＣＦおよびＫＧＦのようなサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物は、放射線への曝露前の任意の時点（曝露の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物は、放射線への曝露後の任意の時点（放射線への曝露の約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得る。
【００８４】
（３．薬剤）
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤に関する。薬剤は、人工的に合成された化合物であっても、天然に存在する化合物であってもよい。薬剤は、低分子量化合物、ポリペプチドまたはペプチド、あるいはそのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体または誘導体であってもよい。
【００８５】
薬剤はまた、ＮＦ−κＢを誘導するサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ６、ＴＮＦおよびＴＧＦβを含むが、これらに限定されない）であり得る。薬剤はまた、プロスタグランジンであり得る。薬剤はまた、成長因子（ＫＧＦおよびＰＤＧＦが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。薬剤はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する抗体であり得る。
【００８６】
（ａ．フラジェリン）
１つの実施形態において、薬剤はフラジェリンであり、これは、細菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｎｉｍｕｒｉｕｍのようなＳａｌｍｏｎｅｌｌａの種が挙げられるが、これらに限定されない）由来であり得る。下記の実施例において示されるように、フラジェリンは、細胞レベルでおよび生物体全体として強力な生存促進活性を有する。
【００８７】
有益な特性を有するＮＦ−κＢの誘導因子（例えば、フラジェリン）のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、または誘導体は、フラジェリンのドメイン構造に基づいた合理性に基づく設計によって得られ得る。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラジェリンのドメイン構造は、文献に記載される（図１９）。フラジェリンは、Ｎ末端およびＣ末端に保存ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を有し、かつ中央の超可変ドメイン（Ｄ３）を有する（Ｓａｍａｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ、２００１、Ｅａｖｅｓ−Ｐｙｌｅｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ、２００１ａ）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉヒンジ（ＮＤ１−２／ＥＣＨ／ＣＤ２）によって分離されるアミノＤ１およびＤ２ならびにカルボキシルＤ１およびＤ２を含む組換えタンパク質での結果は、Ｄ１およびＤ２が、ＥＣＨエレメントに連結された場合に生物活性であることを示す。このキメラ（ヒンジ単独ではない）は、２つの腸上皮細胞株においてＩκＢαの分解、ＮＦ−κＢの活性化、ならびにＮＯおよびＩＬ−８の産生を誘導した。保存されていないＤ３ドメインは、鞭毛フィラメントの表面上に存在し、主要な抗原性エピトープを含む。フラジェリンの強力な炎症誘発性の活性は、高度に保存されたＮ末端およびＣ末端のＤ１およびＤ２領域に存在し得る。
【００８８】
（ｂ．ＮＦ−κＢの寄生誘導因子）
フラジェリンの特性は、ＮＦ−κＢのさらなるモジュレーターが寄生体中に見出され得ることを示唆している。アポトーシスの抑制に依存する多くの寄生体が存在する。なぜなら、これらの寄生体は、宿主の細胞がなければ生存できないためである。これらの生物体は、抗アポトーシス因子を分泌することにより、宿主生物において有効に存続するために適応してきた可能性がある。進行腫瘍と同様に、これらの因子を分泌する生物体は、自らの生存を増大させること、および宿主のストレス応答防御機構との衝突を解決することが可能であり得る。
【００８９】
寄生生物体または共生生物体由来の抗アポトーシス因子は、何百万年という適応を経て、生存度に影響を及ぼす宿主生物体への悪影響を最小限にする。結果として、これらの因子は、さらなる改変の必要性がたとえあるにしても、ほとんどなく、そのままの状態で直接用いられても、最小限に改変して用いられてもよい。これらの因子は、化学療法および放射線療法に関連する副作用のような、ストレス媒介性のアポトーシスを処置するのに有用であり得る。
【００９０】
本発明はまた、ＮＦ−κＢのモジュレーターを同定するために寄生体をスクリーニングする方法に関する。候補モジュレーターは、ヒトまたは非ヒト霊長動物の寄生体由来であり得る。寄生体は、好ましくは宿主の細胞外寄生体である。寄生体はまた、共生体であり得る。本発明のモジュレーターが単離され得る寄生体としては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＣｈｌａｍｙｄｉａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられるが、これらに限定されない。これらのモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニング方法を用いて、ならびに生化学的および遺伝的選択アプローチによって、インビトロ試験で、細胞死保護剤で、およびインビボで、同定され得る。
【００９１】
（４．組成物）
本発明はまた、治療有効量のＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物に関する。組成物は、当該分野で周知の方法を用いて生成され得る、薬学的組成物であり得る。上記のように、ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物は、アポトーシスに関連する状態（放射線への曝露、癌処置からの副作用、ストレスおよび細胞老化が挙げられるが、これらに限定されない）の処置のために哺乳動物に投与され得る。組成物はまた、放射線防護剤または化学療法薬が挙げられるがこれらに限定されない、さらなる薬剤を含み得る。
【００９２】
（ａ．投与）
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、舌下に、経皮に、直腸に、口腔粘膜に、局所的に、吸入によって、口腔投与によって、またはこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、任意の様式で投与され得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、および関節内が挙げられるが、これらに限定されない。獣医学の使用については、組成物は、通常の獣医学の実施に従って適切に受容可能な処方物として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な、投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。
【００９３】
（ｂ．処方物）
本発明の組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、結合剤、フィラー、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤が挙げられるがこれらに限定されない、従来の賦形剤を含み得る。結合剤としては、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、デンプンの粘質物およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。フィラーとしては、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石、ポリエチレングリコール、およびシリカが挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤としては、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない）。錠剤は、当該分野で周知の方法に従ってコーティングされ得る。
【００９４】
本発明の組成物はまた、水性または油性の懸濁液、液剤、乳剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない液体処方物であり得る。組成物はまた、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として処方され得る。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水系ビヒクルおよび防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない添加物を含み得る。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および硬化食用脂が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエート、およびアラビアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。非水系ビヒクルとしては、食用油、扁桃油、ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。防腐剤としては、ｐ−オキシ安息香酸メチルまたはプロピルおよびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の組成物はまた、坐剤として処方され得、これは、坐剤基剤（カカオバターまたはグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。本発明の組成物はまた、吸入用に処方され得、これは、乾燥粉末として投与され得る形態（溶液、懸濁液、または乳剤が挙げられるが、これらに限定されない）かまたは噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタン）を用いたエアロゾルの形態であり得る。本発明の組成物はまた、クリーム、軟膏剤、ローション剤、ペースト、薬用硬膏剤、パッチ、または膜が挙げられるがこれらに限定されない、水性または非水系ビヒクルを含む、経皮処方物を処方され得る。
【００９６】
本発明の組成物はまた、非経口投与（注射または連続注入による投与が挙げられるが、これらに限定されない）のために処方され得る。注射のための処方物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液の形態であり得、かつ、処方剤（懸濁剤、安定剤、および分散剤が挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。組成物はまた、適切なビヒクル（滅菌した、発熱物質を含まない水が挙げられるが、これに限定されない）での再構成のための粉末形態で提供され得る。
【００９７】
本発明の組成物はまた、デポー製剤としても処方され得、これは移植によってかまたは筋肉内注射によって投与され得る。これらの組成物は、適切なポリマー材料または疎水性材料とともに（例えば、受容可能な油中の乳剤として）、イオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）処方され得る。
【００９８】
（ｃ．投薬）
治療で使用するのに必要な薬剤の治療有効量は、処置される状態の性質、ＮＦ−κＢ活性の誘導が所望される期間、ならびに患者の年齢および状態に応じて変化し、そして主治医によって最終的に決定される。しかしながら、一般に、成人のヒトの処置に使用される用量は、代表的には１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。用量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇであり得る。所望の用量は、単回投与で、または適切な間隔で投与される複数回投与として（例えば、１日当たり２回、３回または４回以上の小用量に分けて）、都合良く投与され得る。複数回投与は、しばしば所望されるか、または必要である。なぜなら、正常細胞におけるＮＦ−κＢ活性は、一旦薬剤が投与されなくなると、減少し得るからである。
【００９９】
ＮＦ−κＢの誘導因子の投薬量としては、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇが挙げられるがこれらに限定されない、任意の投薬量であり得る。
【０１００】
（５．スクリーニング方法）
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する因子を同定する方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する因子は、疑わしいＮＦ−κＢ活性の誘導因子をＮＦ−κＢで活性化される発現系に添加する工程、このＮＦ−κＢで活性化した発現のレベルをコントロールと比較する工程を包含する方法によって同定され得、これにより、ＮＦ−κＢ活性の誘導因子は、ＮＦ−κＢで活性化される発現系のレベルを増加させる能力によって確認される。
【０１０１】
候補因子は、ライブラリー（すなわち、化合物の収集物）内に存在し得る。このような因子は、例えば、発現ライブラリー内のＤＮＡ分子によってコードされ得る。候補因子は、馴化培地または細胞抽出物中に存在する。他のこのような因子としては、「小分子」として当該分野で公知の化合物が挙げられ、この小分子は、１０５ダルトン未満、好ましくは１０４ダルトン未満、そしてさらにより好ましくは１０３ダルトン未満の分子量を有する。このような候補因子は、複数の所定の化学反応に従って調製される合成因子（例えば、ペプチド）を含む、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供され得る。このようなライブラリーの多様な組み合わせが、確立された手順に従って調製され得、そして候補因子のライブラリーのメンバーが、本明細書中に記載されるように同時にかまたは連続的にスクリーニングされ得ることが、当業者に理解される。
【０１０２】
スクリーニング方法は、インビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイおよびインビボアッセイを含む種々の型式で実施され得る。任意の細胞が、細胞ベースのアッセイで用いられ得る。好ましくは、本発明での使用のための細胞としては、哺乳動物細胞、より好ましくはヒトおよび非ヒト霊長動物細胞が挙げられる。細胞ベースのスクリーニングは、ＮＦ−κＢの活性化のための代理マーカーを発現する遺伝子改変された腫瘍細胞を用いて行なわれ得る。このようなマーカーとしては、細菌β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび変異型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。代理マーカーの発現量は、当該分野で標準の技術（比色定量、発光定量および蛍光定量が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて測定され得る。
【０１０３】
疑わしいモジュレーターが、例えば混合によって細胞に添加される条件は、アポトーシスまたはシグナル伝達を妨害する他の調節化合物が本質的に存在しない場合に、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を受け得る条件である。有効な条件としては、細胞増殖を可能にする適切な培地、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。適切な培地は、代表的には、成長因子ならびに同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸塩源、ならびに適切な塩、鉱物、金属および他の栄養素（例えば、ビタミン）を含む固体または液体培地であり、かつ細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を示し得るように培養され得る有効な培地を含む。例えば、哺乳動物細胞について、培地は、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含み得る。
【０１０４】
細胞は、組織培養フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿が挙げられるがこれらに限定されない、種々の容器中で培養され得る。培養は、細胞に適した温度、ｐＨおよび二酸化炭素含量で行なわれる。このような培養条件はまた、当該分野の技術の範囲内にある。
【０１０５】
疑わしいモジュレーターを細胞に添加する方法としては、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞発現（すなわち、裸の核酸分子、組換えウイルス、レトロウイルス発現ベクターおよびアデノウイルス発現を含む発現系を用いて）、イオン対形成剤の使用および細胞透過化処理のための界面活性剤の使用が挙げられる。
【０１０６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例証される複数の局面を有する。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１）
（Ｐ５３欠失は、マウスにおけるＧＩ症候群の進行を加速した）
哺乳動物の電離放射線（ＩＲ）による死の根本原因は、放射線量に依存する。９〜１０Ｇｙ以下の線量では、マウスは、おもに致死的な骨髄欠乏性造血（ＨＰ）症候群により、１２〜２０日後に死ぬ。この線量では、照射されたマウスは、骨髄移植によって致死から救済され得る。１５Ｇｙを超える線量を受けた動物は、処置後７〜１２日の間（造血症候群によってこれらの動物が殺傷され得る前）に、損傷と小腸−胃腸（ＧＩ）症候群との合併症により死ぬ（Ｇｕｄｋｏｖ  ＆  Ｋｏｍａｒｏｖａ  ２００３）。ＨＰ症候群およびＧＩ症候群の両方の場合において、組織の致死損傷は、大規模なｐ５３依存性のアポトーシスに起因する（Ｐｏｔｔｅｎ  １９９２、Ｍｅｒｒｉｔｔ  １９９４、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９５、Ｐｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９４）。この観察により、本発明者らは以前に、ｐ５３が放射線誘発性の死の決定要因であり得ることを示唆し得た。一貫して、ｐ５３欠損マウスは、ＨＰ症候群によって死に至らしめる放射線量に対して耐性であり（Ｗｅｓｔｐｈａｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ｋｏｍａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）、６〜１１Ｇｙのγ放射線を受ける野生型の動物の死亡率は、小分子ｐ５３インヒビターであるピフィスリンα（ＰＦＴ）によるｐ５３の一時的な薬理学的阻害によって低減され得る（Ｋｏｍａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。遺伝毒性ストレスに対して組織を感作する因子としてのｐ５３の定義は、実験的な化学療法または放射線の結果として生じる脱毛（脱毛症）のｐ５３依存性を実証することによってさらに強化された（Ｂｏｔｃｈｋａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ、２０００）。従って、以前の観察に基づいて、ｐ５３がより高線量のＩＲの後の致死性のＧＩ症候群の発症に重要な役割を果たし続けることが予想され得る。驚くべきことに、ｐ５３欠損は、致死性の胃腸症候群を引き起こす、より高線量のＩＲに対してマウスを感作する（図１１）。ＩＲの後のｐ５３欠損上皮の陰窩における継続的な細胞増殖は、損傷を受けた陰窩の細胞の促進的な死および絨毛の急速な破壊と相関する。ｐ５３は、小腸の陰窩に成長停止を誘導し、それによって腸の完全性を維持することによって（図１２）、生存を延長する。従って、ｐ５３のプロアポトーシス機能は造血症候群を促進し、一方、ｐ５３の成長停止機能は胃腸症候群の発症を遅らせる。
【０１０８】
小腸における細胞集団の動態は、非常に詳細に分析されている。腸の上皮における細胞増殖は、幹細胞および初期増殖性前駆体が位置する陰窩に限定される。２、３回の細胞分裂の後、既に分化した陰窩幹細胞の子孫は、絨毛の先端で脱落させられる絨毛を持ち上げる。マウスの小腸において、細胞の全「運行（ｔｒｉｐ）」（増殖区画から絨毛の先端へ）は、通常３〜５日の間かかる（Ｐｏｔｔｅｎ  １９９２、Ｐｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００２、Ｓｏｍｏｓｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。γ放射線に対する小腸の反応は、病理形態学的レベルで十分に検討されてきたが、一次事象を含むＧＩ致死の正確な原因は、依然として不明瞭なままである。死は、上皮陰窩細胞の損傷および続いて起こる絨毛の裸出（結果として、流体および電解質平衡異常、菌血症および内毒素血症を引き起こす）の直接の結果として生じ得る。炎症および間質の応答のほかに、内皮細胞機能不全が、死亡率に寄与する重要な因子であるようである（Ｐｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ｓｏｍｏｓｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。要約すると、ＩＲ誘導性のＨＰ症候群からの保護方法と同程度に有効であることを示されたｐ５３の薬理学的抑制は、ＧＩ症候群に対しては（有害ではないにしても）役に立たない。従って、別の機構（例えば、ＮＦ−κＢの活性化および引き続く細胞死の阻害）に依存する小腸の上皮の放射線防護への代替アプローチを開発することが必要である。
【０１０９】
（実施例２）
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染はＮＦ−κＢを活性化する）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染は、強力なＩＫＫおよびＮＦ−κＢ活性化ならびに炎症誘発性遺伝子プログラムの活性化を引き起こす（Ｅｌｅｗａｕｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９９）。従来の研究から、腸上皮細胞の約３０〜４０％は、培養腸上皮細胞における代表的なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の間に感染することが示唆される（Ｖａｌｄｉｖｉａ  ｅｔ  ａｌ、１９９６）。本発明者らは、いかにして約３０％の宿主細胞の細菌感染が、ＴＮＦα処置の用量のようにほぼ全ての宿主細胞においてＮＦ−κＢの活性化に相当するＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を生じさせ得るかという問題に取り組むことにした。
【０１１０】
この現象を詳細に試験するために、ＨＴ２９細胞を、プラスミドｐＦＭ１０．１（これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓａＨプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードし、一旦細菌が宿主細胞に侵入した場合にのみ機能する（Ｖａｌｄｉｖｉａ  ｅｔ  ａｌ、１９９７））で形質転換した野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで、５０のＭＯＩで１時間、感染させたかまたは偽感染させた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに侵入された細胞は、ＧＦＰ発現の直接蛍光顕微鏡観察によって検出した。ｐ６５（ＲｅＩＡ）局在化を、ＦＩＴＣ結合体化ロバ抗ウサギ抗体で検出されるウサギ抗ｐ６５抗体の間接的な免疫蛍光検査法によってモニターした。ＤＡＰＩは核を染色するために用いた。
【０１１１】
図１Ａにおいて見られるように、ＧＦＰ発現は、細胞の約３０〜４０パーセントに生じる。次に本発明者らは、未処理（偽感染）細胞、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染細胞またはＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された細胞におけるＮＦ−κＢサブユニットｐ６５（ＲｅｌＡ）の局在化を試験した。Ｐ６５（ＲｅｌＡ）は未処理の細胞の細胞質に局在化したのに対し、ｐ６５（ＲｅｌＡ）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染細胞またはＴＮＦα処理細胞の核に局在化した（図１Ｂ）。これらの結果から、たとえ少数の細胞のみが感染したとしても、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染は実質的に全ての細胞におけるＮＦ−κＢを活性化することを示している。
【０１１２】
（実施例３）
（フラジェリンはＮＦ−κＢを活性化する）
培養中の腸上皮細胞のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染は、およそ３０％の感染しか引き起こさなかったが、ほぼ全ての細胞においてＮＦ−κＢの活性化を引き起こしたので、本発明者らは、ＮＦ−κＢの活性化が、侵入プロセスによってではなく、細菌構造成分または細菌によって産生される産物の宿主細胞認識に応答したものであると予想した。侵入自体は、以前に考えられていたように（１６）、炎症誘発性の遺伝子プログラムの活性化に必要ではないことが実証されている。この可能性を調べるために、未処理かまたは２０分間煮沸したかのいずれかの滅菌濾過されたＳ．ｄｕｂｌｉｎ培養液を用いてＨＴ２９腸上皮細胞をチャレンジし、そしてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、曝露の４５分後に調製した全細胞抽出物（ＷＣＥ）の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってモニターした（３、４０）。両方の条件下での培養液に対してＮＦ−κＢの強力な活性化が観察されたことから、活性化因子は熱安定性であることが示された。
【０１１３】
未変性の滅菌濾過された濃縮培養液を、続いてＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫで処理したか、または１００ｋＤａのセントリコンフィルター上で粗くサイズ分画した。次いで、多様に処理した培養液を用いてＨＴ２９腸上皮細胞をチャレンジし、４５分後にＷＣＥを調製し、そしてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性をＥＭＳＡによって分析した（図２Ａ）。示されるように、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １１０３によるかまたは培養液（上清）への曝露によるＨＴ２９細胞の直接感染は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を誘導し、一方、活性誘導因子は、プロテアーゼ消化に感受性であることが見出され、かつ１００ｋＤａフィルターによって保持された（図２Ａ）。ＮＦ−κＢ誘導活性の同一性をさらに決定するために、滅菌濾過された濃縮ブロス培養物を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル透過クロマトグラフィー（図２Ｂ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（図２Ｃ）によって分画した。クロマトグラフィー画分のアリコートを、ＨＴ２９細胞においてＮＦ−κＢを活性化する能力についてアッセイし、そしてＥＭＳＡによって分析した。クーマシーブルー染色したゲル（図２Ｂ、上部パネル）から見られるように、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性の増加（図２Ｂ、下方パネルのレーン４〜６）は、およそ５５ｋＤａのタンパク質の存在量の増加と一致した。ＰＯＲＯＳ  ＨＱマトリックス上の陰イオン交換クロマトグラフィーおよび図のように漸増する塩勾配を用いる結合タンパク質の溶出（図２Ｃ）により、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を誘導する活性が、存在量の増加した５５ｋＤａタンパク質を含むクロマトグラフィー画分に一致することを示した（図２Ｃの上部パネルおよび示さないデータ）。図２Ｃにおいて観察された溶出画分を、分取用の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で濃縮して分画し、Ｂ１〜Ｂ６に相当するバンドをゲルから切り出し、これらのタンパク質を溶出し、沈殿させ、再生し、そしてＨＴ２９細胞を刺激するために使用した。これらの細胞由来の全細胞抽出物を、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を誘導する活性についてアッセイし、そして５５ｋＤａタンパク質に相当するバンド２（Ｂ２）（図２Ｃの下方パネル）のみがＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を誘発し得、一方、塩勾配の初めまたは終わりからの緩衝液は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を活性化できなかった。
【０１１４】
ゲルのタンパク質バンドＢ１〜Ｂ６に相当するタンパク質およびブランク領域を、ペプチド配列決定のためにさらに処理した。Ｂ２に相当するタンパク質のトリプシン消化およびエレクトロスプレーイオントラップＬＣ／ＭＳによる分析により、２１個のペプチドのアミノ酸配列を同定した。フラジェリン（２１個のペプチドによる７５パーセントの有効範囲）は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性の誘導と一致するタンパク質として明白に同定された（図３）。
【０１１５】
（実施例４）
（フラジェリンは腸上皮細胞においてＮＦ−κＢを活性化するのに必要とされる）
フラジェリンが実際に、腸上皮細胞を直接細菌感染に曝露した後かまたは病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの濾過した培養液に曝露した後にＮＦ−κＢの活性化の誘発を引き起こした因子であったか否かを決定するために、本発明者らは、無鞭毛のＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、病原性Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ  ２２２９株、同質遺伝子的Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ  ２２２９  ＳｏｐＥ−変異体、同質遺伝子的Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ  ２２２９  ＳｏｐＢ−変異体、同質遺伝子的Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ  ２２２９  二重ＳｏｐＥ−／ＳｏｐＢ−変異体（ＳＥ１ＳＢ２株）、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １１０３株、および同質遺伝子的Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｆｌｉＣ：：Ｔｎ１０挿入変異体（８６株）およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １１０３同質遺伝子的二重変異体ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−から、感染性細菌および煮沸して濾過した培養液を調製した。ＳｏｐＥは、宿主細胞中に注入されて細胞骨格の再構成ならびに結果としてのＭＡＰＫ経路、ＳＡＰＫ経路およびＮＦ−κＢ経路の活性化を惹起する小さなＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  Ｒａｃ１およびＣｄＣ４２のための交換因子としてはたらくタンパク質をコードする、病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａバクテリオファージであり（７、１５）、一方、ＳｏｐＢは、イノシトールリン酸ホスファターゼとして機能し、細胞骨格の再構成に関与し、そして宿主細胞の塩素イオン分泌を刺激する、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａタンパク質である（４４）。細菌および培養液を用いてＨＴ２９腸上皮細胞をチャレンジし、ＷＣＥ抽出物を４５分後に調製し、そしてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株はＮＦ−κＢを活性化し得、一方、フラジェリンを産生しないＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株（示されるようなｆｌｉＣおよびｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−変異体）はＮＦ−κＢも活性化しなかった（図４ＡおよびＢ）。Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５αは無鞭毛であり、フラジェリンを産生せず、ＮＦ−κＢを活性化しない。本発明者らはまた、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎの直接感染が、図４Ａにおいて観察されるように、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも常に高い程度までＮＦ−κＢを活性化する一方で、両方の種からの培養液が、ＮＦ−κＢをほとんど等しく十分に活性化したことに、多くの実験によって気づいた（図４Ｂ）。この違いは、おそらくＳ．ｄｕｂｌｉｎが、感染の間にＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも多くのフラジェリンを細胞培養培地へ放出することによると本発明者らは考える。なぜなら、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの両方からフラジェリンを精製し、そしてクロマトグラフィーで精製した同量のフラジェリンを添加することにより、類似のＮＦ−κＢ活性化プロフィールを生じたからである。注目すべきは、単一の第Ｉ相フラジェリンｆｌｉＣ：：Ｔｎ１０挿入変異体で観察されたＮＦ−κＢのごくわずかな活性化（図４ＡおよびＢの最終レーンの隣）（これはおそらく、第ＩＩ相フラジェリン（ｆｌｊＢから）の極めて制限された発現による）と比較して、二重フラジェリン遺伝子変異体はＮＦ−κＢを活性化することが完全に不可能なことであるが、ここで遺伝学的に用いられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株は、フラジェリン産生の相をシフトできないかまたはめったにシフトしない。フラジェリンは、腸上皮細胞の直接感染の際にＮＦ−κＢ経路の活性化に必要であるようなので、フラジェリンはまた、腸上皮細胞の病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の際に活性化される他の主要な分裂促進的なストレス活性化シグナル伝達経路の主要な決定要因でもあり得る可能性があるようであった。腸上皮細胞の直接Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染は、ＪＮＫ活性化を生じ（８）、そしてまたＩＫＫによるＮＦ−κＢの活性化も生じる（３）。
【０１１６】
（実施例５）
（フラジェリンは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ストレス活性化プロテインキナーゼおよびＩＫＫシグナル伝達経路の活性化を誘発する）
腸上皮細胞は管腔表面の侵入に対する見張りとしてはたらき、そしてＩＬ−８のようなケモカイン遺伝子およびマクロファージ化学誘引剤タンパク質１（ＭＣＰ１）炎症誘発性サイトカイン遺伝子（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１およびＩＬ−６）の産生によって、この領域へのエフェクター免疫細胞の誘引を調整する（１、４〜６）。これらの遺伝子の発現は、ＭＡＰＫ、ＳＡＰＫおよびＩＫＫシグナル伝達経路によるシグナルの伝達に応答して活性化される転写因子の作用に主として依存する。ＮＦ−κＢは、炎症誘発性遺伝子プログラムの中心的なレギュレーター／アクチベーターと考えられるので、本発明者らは、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａでの腸上皮細胞の感染または精製フラジェリンに対する腸上皮細胞の曝露による腸上皮細胞の感染と比較して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの非フラジェリン産生変異株がＭＡＰＫ、ＳＡＰＫおよびＩＫＫシグナル伝達経路の活性化に及ぼす影響を試験するために決定した。野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでのＨＴ２９細胞の感染は、ＪＮＫおよびＩＫＫのそれぞれの基質であるＧＳＴ−ｃＪｕｎ１−７９およびＧＳＴ−ＩκＢα１−５４を用いて、ＪＮＫおよびＩＫＫについての免疫ブロット（ＩＢ）分析または抗体特異的免疫キナーゼアッセイ（ＫＡ）における活性化表示リン特異的抗体を用いて決定されるように、ＭＡＰＫ  ＥＲＫ１および２、ＳＡＰＫ  ｐ３８およびＪＮＫおよびＩＫＫの活性化を生じた（図５）。興味深いことには、ＭＡＰＫ刺激は、４５分から活性化の減退が始まるので本来一過性であるが、ｐ３８、ＪＮＫおよびＩＫＫ活性は、１時間にわたって経時的に増加する。図４で見られるように、ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａはまた、ＩＫＫおよびＮＦ−κＢ活性を誘導しなかった（図５に示されるように）。驚くべきことに、ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、ＳＡＰＫ  ｐ３８およびＪＮＫを誘導せず、ＭＡＰＫをわずかに短時間（１５分間）活性化した。ＳｏｐＥおよびＳｏｐＥ２のような他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａタンパク質は、小さなＧＴＰアーゼＲａｃおよびＣｄＣ４２を活性化し得、かつこれらのＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼは、ＪＮＫおよびｐ３８の活性化と関連しているが（７、８、１４、１５）、フラジェリン陰性株では機能しないようなので、この結果は不可解である。
【０１１７】
ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、ゲンタマイシン保護／侵入アッセイによって決定されるように、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株と比較してＨＴ２９細胞に侵入できなかった。フラジェリンｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体は、ＨＴ２９細胞に侵入する能力において４桁の差異を示した。この点をさらに実証するために、本発明者らは、野生型ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（１３４株）のいずれかでＨＴ２９細胞を感染させ、両方の株を、プラスミドｐＦＭ１０．１（これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓａＨプロモーターの制御下でＧＦＰをコードし、一旦細菌が宿主細胞に侵入した場合にのみ機能する（１０、３６））で形質転換した。野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、ＨＴ２９細胞を明らかに感染させ得たが（ＧＦＰ、図５Ｂ）、一方、フラジェリン変異細菌は、ＧＦＰ発現の欠如によって証明されるように（図５Ｂ）、ＨＴ２９細胞に侵入できなかった。フラジェリンは十分であるか否か、または他の細菌的に産生されるタンパク質が侵入に必要であるか否かを決定するために、本発明者らは、精製フラジェリンまたは滅菌濾過された培養液あるいは両方の組み合わせのいずれかを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体でチャレンジしたＨＴ２９細胞に添加し、侵入についてアッセイした。腸上皮細胞は、精製フラジェリンおよび／または培養液とｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異株２との試験されたすべての組み合わせを用いても侵入されなかった。ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２およびＳｉｐＡまたは細菌インターナリゼーションの開始に重要な役割を果たす他のＳｉｐタンパク質（７、１４、１５、４５、４６）のような細菌的に産生されるタンパク質を送達するために、フラジェリン遺伝子とＩＩＩ型分泌系の有効性との間に直接的な因果関係があるとは考えられない。さらに、腸上皮細胞におけるｐ６５（ＲｅｌＡ）の核局在化を刺激するフラジェリンの有効性を評価するために、本発明者らは、精製フラジェリンでＨＴ２９細胞をチャレンジし、間接免疫蛍光法を用いてｐ６５（ＲｅｌＡ）局在化を試験し、そしてほぼすべての細胞においてｐ６５（ＲｅｌＡ）の核局在化を見出した（図５Ｂに示されるように）。
【０１１８】
示されるような曝露後の種々の時間でＷＣＥを調製し、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡでアッセイした場合、ＨＴ２９細胞の時間依存性様式でのＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）処理について観察された結果（図６Ａ）と同様に、精製フラジェリン（０．５μｇ／ｍｌ）は、ＨＴ２９細胞においてＮＦ−κＢを強力に活性化した。ＭＡＰＫおよびｐ３８キナーゼの活性化をモニターするために活性化特異的リン抗体を用いた、これらの同じ抽出物におけるＭＡＰＫ、ＳＡＰＫおよびＩＫＫシグナル伝達経路の分析（図６Ｂ）、またはＪＮＫおよびＩＫＫ活性についての抗体特異的免疫沈降キナーゼアッセイにより、ＪＮＫおよびＩＫＫ活性は１時間までずっと増加していたが、ｐ３８およびＭＡＰＫ（ＥＲＫ１および２）活性は３０分でピークに達し、１時間までに著しくより低いレベルに低下し始めたことが示された（図６Ｂに示されるように）。精製フラジェリン曝露に応答する腸上皮細胞におけるＭＡＰＫ、ＳＡＰＫおよびＩＫＫのシグナル伝達分子である、ＥＲＫ１＆２、ｐ３８、ＪＮＫおよびＩＫＫの活性化プロフィールは、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに感染した腸上皮細胞における活性化プロフィールと著しく類似していた（図５Ａ）。これらの観察から、本発明者らは、ここで試験したシグナル伝達経路（ＭＡＰＫ、ＳＡＰＫおよびＩＫＫ）の一時的な活性化（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染における初期事象を反映する）が、フラジェリンに対する腸上皮細胞の認識および応答によってほとんど排他的に決定されると結論する。
【０１１９】
本発明者らは、有鞭毛のＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたは無鞭毛のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染に対するフラジェリン単独の影響を区別するために、腸上皮細胞における炎症誘発性サイトカイン遺伝子発現の一時的なパターンに対する精製フラジェリンおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａに存在するフラジェリンの影響をさらに検討することにした。ＨＴ２９細胞を、未処理のままか、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激したか、またはフラジェリン（０．５μｇ／ｍｌ）で刺激したか、あるいは野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｆｌｉＣ／ｆｌｊＢ二重変異体（５０のＭＯＩで）で感染させた。処理または感染後の示された時間の後に、ＨＴ２９細胞を氷冷ＰＢＳ中に収集し、細胞ペレットをトリゾール中に溶解し、ＲＮＡを精製し、そして第１鎖ｃＤＮＡを調製するのに用いた（実験手順を参照のこと）。ｃＤＮＡのアリコートを、ＩＬ１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＭＣＰ１およびβ−アクチン遺伝子特異的プライマー（注文に応じて入手可能な配列）を用いる半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応に用い、そして産物を、エチジウムブロマイドを含む１．２％アガロースゲル上で分画した。公知のＮＦ−κＢ標的遺伝子ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＭＣＰ１の発現は、ＴＮＦαまたは精製フラジェリン曝露に応答して増加した（図６Ｃ）。野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染はまた、これらの同じ遺伝子の活性化も生じたが、ＴＮＦαおよびＭＣＰ１の発現は、相対的に一過性であり、感染直後に生じた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体は、ＩＬ−１β、ＩＬ−８およびＴＮＦα発現を誘導できなかったが、ＭＣＰ１発現は、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって誘導されるレベルよりも低いレベルであるが誘導され、そしてまた、ＭＣＰ１の発現は本質的に一過性ではなく、時間経過を通じて継続した（９時間）（図６Ｃ）。β−アクチンの発現レベルは、比較のための内部標準としての機能を果たした。興味深いことに、ＮＦ−κＢの標的遺伝子ではないＩＬ−１αは、すべての処理によるＨＴ２９細胞チャレンジに応答して刺激された。明らかに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体は、ＩＬｌα発現を生じる他の未知のシグナル伝達経路を活性化し得る。
【０１２０】
（実施例６）
（フラジェリンは、ＭｙＤ８８依存性の様式でＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を活性化する）
フラジェリンは、炎症誘発性遺伝子の活性化と一致して必須のシグナル伝達経路を活性化し得、この活性が、ＴＮＦαのようなサイトカイン（これに対する機能的細胞表面レセプターが存在する全ての細胞を活性化する）の作用によく似ていたので（図１および図５Ｃにおけるｐ６５［ＲｅＩＡ］核局在化を参照のこと）、本発明者らは、フラジェリン曝露に応答してＮＦ−κＢ経路を活性化するＴｏｌｌ様レセプター（公知の病原体パターン認識レセプター）の能力を試験することにした。この仮説を試験するために、本発明者らは、ドミナントネガティブＭｙＤ８８（アミノ酸１５２〜２９６）（４７）を発現するアデノウイルスがＨＴ２９細胞におけるフラジェリン媒介性のＮＦ−κＢ活性化に及ぼす影響を試験した。ＭｙＤ８８は、ＩＬ−１レセプターおよび公知のすべてのＴＬＲによって利用されるアダプタータンパク質であり、これは、細胞質のシグナル伝達ドメインによってＩＬ−１と相同性を共有し、ＮＦ−κＢ経路の即時の活性化に必要である（４８、４９）。ＨＴ２９細胞におけるＤＮ−ＭｙＤ８８の発現は、ＩＬ−１またはフラジェリン曝露（ＮＦ−κＢのＴＬＲ媒介性の活性化の作用と一致している）に応答してＥＭＳＡ分析によってアッセイされるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性の活性化をブロックした。この可能性をさらに検討するために、本発明者らは、最初に野生型ＭｙＤ８８−／−およびＴＬＲ２−／−／ＴＬＲ４−／−ＭＥＦ（Ｓ．Ａｋｉｒａ（Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｏｓａｋａ，  ＪＡ）からの寄贈）を用いてＭｙＤ８８の役割を確認し、そしてフラジェリンまたは直接の野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染に応答しかつＮＦ−κＢの活性化を生じるＴＬＲのうちの２つの潜在的な役割を調べた（図７）。野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染は、野生型ＭＥＦおよびＴＬＲ欠損ＭＥＦ（レーン２および１５）の両方においてＮＦ−κＢを強力に活性化するが、この活性化は、ＭｙＤ８８欠損ＭＥＦ（レーン１０）において若干不完全である。３つの型すべての細胞を、濃縮して滅菌濾過した野生型Ｓ．ｄｕｂｌｉｎまたは二重ＳｏｐＥ−／ＳｏｐＢ−同質遺伝子的変異体Ｓ．ｄｕｂｌｉｎのＳＥ１ＳＢ２株の培養液でチャレンジすると、野生型ＭＥＦおよびＴＬＲ２／４二重欠損細胞においてＮＦ−κＢが活性化されたが、ＭｙＤ８８欠損細胞においてＮＦ−κＢは活性化されなかった（レーン１１および１２をレーン３、４、６、７、１６および１７と比較する）。ＮＦ−κＢは、精製フラジェリン（０．５μｇ／ｍｌ）に曝露することによって野生型ＭＥＦにおいて強力に活性化され、従って、これらの実験においてＬＰＳがＮＦ−κＢの活性化に関与する可能性が除外される。ＮＦ−κＢ活性化の主要な誘因としてのＬＰＳの除外は、ＴＬＲ２／４二重欠損ＭＥＦの強力な活性化（レーン１６および１７）によってももたらされる。ＴＬＲ２および４は、細菌のリポペプチド、ペプチドグリカン、特定のＬＰＳおよびグラム陰性ＬＰＳにそれぞれ応答する（５０〜５２）。ＩＬ−１刺激により、ＩＬ−１およびフラジェリン媒介性のシグナルの伝達におけるＭｙＤ８８の機能要件を確認した。
【０１２１】
フラジェリン認識においてＴＬＲが果たし得る役割をさらに規定するために、本発明者らは、フラジェリン曝露に対して通常ほとんど応答しない細胞においてＮＦ−κＢを活性化する過剰発現ＴＬＲの能力についてアッセイした。精製フラジェリンにわずかに応答する細胞を選択することにより、フラジェリンが使用するシグナル伝達成分およびアダプターが存在しかつ有効であること、ならびにこの制限因子はフラジェリンに応答するレセプターのみである可能性が高いことを保証した。本発明者らは、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＩＬ−１刺激に応答してＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を活性化したが、フラジェリン曝露に応答してはほとんど活性化しなかったことを見出し、そしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞の方がトランスフェクション効率が高いので、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を選択してさらに使用する。アミノ末端ＦＬＡＧエピトープタグ化ＴＬＲ１〜９（Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ（ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖ．）およびＲ．Ｕｌｅｖｉｔｃｈ（ＴＳＲＩ）からの親切な寄贈）（４２、４３）を、２×ＮＦ−κＢ依存性プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子とともに一過性トランスフェクションしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で過剰発現させ、未処理、フラジェリン（０．５μｇ／ｍｌ）またはＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）に応答するルシフェラーゼの発現を測定した。ＴＬＲ５は、その発現が細胞のフラジェリンチャレンジに顕著に応答した唯一のＴＬＲであった（表１）。
【０１２２】
ＴＬＲ５はフラジェリンがＮＦ−κＢを活性化するのを媒介するＴＬＲであるという可能性をさらに確定するために、本発明者らは、ＴＩＲドメインに保存されたトリプトファンに対する各ＴＬＲのカルボキシル部分の欠失によるドミナントネガティブなシグナル伝達変異体を構築した。ＩＬ−１レセプターにおける類似の変異は、ＮＦ−κＢ活性化を引き起こすそのレセプターの能力を抑止する（５４、５５）。各々のＤＮ−ＴＬＲを逆クローニングＴＬＲ５（ＡＳ−ＴＬＲ５）と共に、哺乳動物の発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。変異体タンパク質はすべて十分に発現された。各ＤＮ−ＴＬＲの哺乳動物発現ベクターおよび空の発現ベクターを、２×ＮＦ−κＢ  Ｌｕｃと共に、フラジェリンに非常によく応答するＨＴ２９細胞中に、以前に記載したように（３）トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、未処理のままか、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激したか、または精製フラジェリン（０．５μｇ／ｍｌ）で刺激した。レポーター遺伝子発現は、トランスフェクトされた細胞のＴＮＦα刺激に応答するＤＮ−ＴＬＲ発現によって影響されないことが観察された（図８Ａ）；しかし、ＤＮ−ＴＬＲ５またはアンチセンスＴＬＲ５構築物のいずれかの発現のみが、フラジェリン媒介性のレポーター遺伝子活性化をそれぞれほぼ５０％および２５％阻害し（図８Ｂ）、一方、ＤＮ−ＴＬＲ２もまた、フラジェリン媒介性のレポーター発現を軽度に阻害することが見出された。これらの結果は、ＴＬＲ５が、フラジェリンの細胞表面認識に関与し、ＮＦ−κＢ活性化を引き起こすシグナル伝達経路を開始することを示唆する。ＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子活性化に対するＤＮ−ＴＬＲ２の影響は、非特異的であり得る。なぜなら、ＤＮ−ＴＬＲ２の発現は、他のＤＮ−ＴＬＲと比較して、ＴＮＦα媒介性のレポーター活性化も阻害したからである。ＤＮ−ＴＬＲ２はまた、ＴＬＲ２およびＴＬＲ５の両方が共有し得る未知のアダプタータンパク質について競合し得る。いずれにしても、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４は、図７に示された結果によって、フラジェリン媒介性のＮＦ−κＢ活性化に必要でないことが示された。
【０１２３】
（実施例７）
（フラジェリン媒介性のＮＦ−κＢの活性化は、ＴＬＲのサブセットの発現の増加を引き起こす）
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたは精製フラジェリンでの腸上皮細胞の刺激は、炎症誘発性の遺伝子プログラムの活性化を引き起こした（図６Ｃ）。本発明者らは、ＴＬＲ遺伝子の発現もフラジェリン刺激細胞において変更されるか否かを調べることにした。ＨＴ２９細胞を精製フラジェリン（０．５μｇ／ｍｌ）で処理し、刺激の３時間後に未処理細胞および処理細胞から全ＲＮＡを単離し、このＲＮＡを用いて第１鎖ｃＤＮＡを作製した。無刺激の細胞またはフラジェリン刺激細胞から調製したＴＬＲおよび第１鎖ｃＤＮＡの各々に対する遺伝子特異的プライマーを用いる半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用してＤＮＡ産物を生成し、このＤＮＡ産物を、エチジウムブロマイドを含む１．２％アガロースゲル上で分画した。ＴＬＲ２、３および７は、フラジェリン刺激の後に発現が増加した（図９）。他のＴＬＲの発現パターンは、内部存在量コントロールとしての役割を果たすβ−アクチン発現と変わりがなかった。
【０１２４】
ＴＬＲ５は、フラジェリンに十分に応答しない細胞において発現される。本研究等（２２、３３）により、ＴＬＲ５を、フラジェリンがＮＦ−κＢを活性化するのを媒介する有望なＴＬＲであると確認した。以前の報告では、ＴＬＲ５の機能を確認するために用いた細胞中のＴＬＲ５の存在または存在量に関する決定を行わなかった（２２、３３）。本発明者らは、フラジェリンによるチャレンジに応答しないかまたは不十分に応答する細胞において、ＴＬＲ５タンパク質が存在しないかまたは大幅に減少したかを決定することにした。多くの細胞株におけるＴＬＲ５の存在量を、ＴＬＲ５特異的抗体を用いる免疫ブロット分析によって試験し、そしてこれらの細胞から調製されたＷＣＥにおいて、精製フラジェリンがＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を誘導する能力と比較した。腸上皮細胞株Ｔ８４およびＨＴ２９を、肺腺癌細胞株Ａ５４９、ヒト子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａ、ラージＴ抗原ＨＥＫ２９３Ｔを発現するヒト胚腎臓細胞株、および膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇと同様に用いた。ＴＬＲ５タンパク質は、ＴＬＲ５特異抗体を用いた免疫ブロットによって試験されたすべての細胞株において検出された（図１０Ａ）。Ｔ８４細胞は最も高い存在量を示したが、他の細胞株の発現レベルは類似しており、２倍より大きくは異ならないように見えた（図１０Ａ）。無刺激の細胞、ＴＮＦαおよびフラジェリン刺激細胞におけるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、各細胞型から調製したＷＣＥのＥＭＳＡアッセイによって分析した（図１０Ｂ）。ＨＴ２９およびＡ５４９細胞は、フラジェリンおよびＴＮＦα刺激に対して強力に応答したが、一方、ＨｅＬａ、２９３ＴおよびＴ９８Ｇ細胞は、フラジェリン刺激に対してほとんど応答しない（ＨｅＬａ、２９３Ｔ）か、または全く応答しなかった（Ｔ９８Ｇ）。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合複合体の信頼性は、ｐ６５特異的抗体を用いて、ＮＦ−κＢのＤＮＡ：タンパク質複合体をスーパーシフトさせて決定した。興味深いことには、ＴＬＲ５を発現するいくつかの細胞は、全く応答しないかまたは非常に不十分に応答する。これは、原形質膜でのレセプターの存在の欠如および細胞内局在化、これらの細胞株のＴＬＲ５遺伝子における不活化または有害な変異、あるいは必要な補助レセプターまたはアダプタータンパク質の欠如または低い存在量のいずれかに起因し得る（ＴＬＲ４およびその補助レセプター／アダプターＭＤ２（３０、５６、５７）についていくつかの細胞における場合と同様に）。ＩＬ−１は、試験した全ての細胞株においてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を活性化し得るので、ＮＦ−κＢに対するＭｙＤ８８の下流のシグナル伝達装置がインタクトであるように見える。
【０１２５】
（実施例８）
（組換えフラジェリンの単離）
組換えフラジェリンがＮＦ−κＢを誘導し得たことを確認するために、ＮＦ−κＢ応答性のルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を担持するレポーター細胞を用いて、活性について試験した。レポーター構築物は、Ｈｓｐ７０の最小プロモーターと結合したＥ−セレクチンプロモーター由来の３つのＮＦ−κＢ結合部位を含んでおり、ＮＦ−κＢの検出に慣例的に用いられる。ルシフェラーゼ活性は、培地中へのフラジェリンの添加の６時間後に細胞溶解物中で測定した。ＴＮＦαを陽性コントロールとして用いた。代表的な実験の結果を図１３に示し、組換えフラジェリンがＮＦ−κＢを活性化し得ることを示す。
【０１２６】
（実施例９）
（フラジェリンは、ＩＲ誘導性のＧＩ症候群によって引き起こされるマウスの死を遅延させる）
上記のように、フラジェリンはＮＦ−κＢの強力なアクチベーターであり、アポトーシス死のインヒビターとして作用し得ると考えられる。ＮＦ−κＢを誘導し得るサイトカインが放射線防護剤として作用するので、本発明者らは、フラジェリンもまた放射線防護剤として機能し得るか否かを試験した。
【０１２７】
１５Ｇｙのγ放射線でのマウスの全身照射により、胃腸管の放射線誘導性の損傷の従来のモデルを提供するＧＩ症候群から８日以内に死に至る（上記参照）。フラジェリンがＩＲから胃腸上皮を保護し得るか否かを試験するために、本発明者らは、１５Ｇｙの放射線の後のマウス死亡率の動態に対する静脈内注射したフラジェリンの影響を試験した。本発明者らは、ある範囲のフラジェリン用量（そのすべてが、文献から調査した最も高い耐線量（３００μｇ／マウス、Ｅａｙｅｓ−Ｐｙｌｃｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ、２００１ｂ）よりも著しく低かった）を用いた。照射を処置の４時間後に行った。代表的な実験の結果を図１４に示す。予想通り、コントロール照射マウス（静脈内にＰＢＳを投与した）は、処置後５〜８日の間に死んだが、一方、フラジェリンを投与した動物は、顕著により長く生存した；動物の生存の延長は、フラジェリンの用量と相関した。照射後７日目の小腸の病理形態学的分析により、フラジェリン処置群とコントロール群との間の劇的な差異が明らかになる（図１５）。０．２ｍｇ／ｋｇのフラジェリンの静脈内、腹腔内および皮下送達の後に１３Ｇｙの照射を行うと、類似の保護度が得られ、８５〜９０％のマウスの３０日間の生存をもたらした（データは示さず）。最適な投薬実験のために、本質的には上記のように実験を行なったが、但し、１３Ｇｙ照射を用い、送達経路を変化させた。
【０１２８】
（実施例１０）
（フラジェリンは、致死的なＩＲ誘導性の造血症候群からマウスを救済する）
本発明者らは、次に、致死的なＧＩ毒性を生じ得ない、より低い放射線量（通常、１１Ｇｙ以下）によって実験的に誘導される、ＨＰ症候群によるマウスのＩＲ誘導性の死に対して、フラジェリンが効果を有するか否かを試験した。実験は、上記の実験（図１４および１５）と同様に行ったが、但し、マウスは１５Ｇｙの代わりに１０Ｇｙを受け、この線量は、コントロール群において１３日目までに１００％の致死を引き起こした（図１６）。フラジェリン処置群（５μｇ／マウス）は、この線量のＩＲからの完全な防護を示し、このことは、フラジェリン媒介性の放射線防護が、ＧＩのみならずＨＰのＩＲ誘導性症候群に対しても作用することを示す。
【０１２９】
（実施例１１）
（フラジェリンの防護効果に対する時間依存性）
処置の時間に対するフラジェリンの放射線防護活性の依存性を評価するために、１３Ｇｙのγ線照射前の異なる時間にマウスに注射した。このような実験うち１つの結果を、図１７に示す。得られた結果から、フラジェリンは、処置の１〜４時間前に注射した場合、１３Ｇｙからの放射線防護剤として有効であるが、照射の２４時間前に注射した場合、もはや有効ではないことを示す。
【０１３０】
処置の時間に対するフラジェリンの放射線防護活性の依存性を評価するために、γ線照射の瞬間に対するいくつかの時点でマウスに注射した。５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）のＣＢＬＢ−５０１、またはコントロールマウスについては５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の細菌ＲＮＡポリメラーゼの腹膜腔内注射を用いて、本質的に上に説明したように実験を行った。実験をＮＩＨスイスマウス系統で行なった。この結果は、フラジェリン−５０１が、処置の１時間または２時間前に注射された場合、１３Ｇｙ照射後に約９０％生存をもたらすことを示す（図１７）。明確にするために１時間前のグラフのみを示すが、両方の時点（１時間前および２時間前）ともに同様の程度および動態の生存が得られる。４時間の時点では、やや低い防護を示す。照射の２４時間前に注射されたフラジェリンは、１３Ｇｙが誘導する死に対して防護効果を有さなかった。
【０１３１】
興味深いことには、１０Ｇｙのγ線照射の２４時間前のフラジェリンの投与は、１００％の防護をもたらした。マウスにおける１３Ｇｙ照射は、主としてＧＩ症候群による死を誘導するが、１０Ｇｙ誘導性の死は、おもに造血症候群によって媒介される。従って、１０Ｇｙ照射からのこのような長期の防護は、フラジェリンおよび／または長寿命の二次サイトカインによって誘導される造血幹細胞の増殖および生存の増強によって媒介され得る。
【０１３２】
（実施例１２）
（フラジェリンについてのＬＤ５０／３０、ＬＤ５０／７およびＤＭＦの決定）
本発明者らは、フラジェリンについての放射線量依存的な防護の評価を得た。上に示されるように（図１７）、フラジェリンでの処置は、１０Ｇｙのγ線照射（この線量は、造血症候群による死を引き起こす）に対する１００％の防護および１３Ｇｙ（造血症候群およびＧＩ症候群の両方による死を引き起こす）での９０％の３０日間生存に十分であった。フラジェリン５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）を用い、照射の１時間前に腹腔内注射して、上述のように実験を行なった。
【０１３３】
しかしながら、１５Ｇｙでは、１００％の７日間の生存の後、１３日後に遅延死が続き（０％の３０日間の生存）、一方、コントロール群は、７日目までにＧＩ症候群に完全に屈した（図１８）。
【０１３４】
【化１】
2007513183.tif 000003
１５Ｇｙ照射後のＣＢＬＢ−５０１処置群の死亡率の動態は、造血症候群によって引き起こされる死を示唆する、１０Ｇｙでのコントロール群の死亡率の動態によく似ている。これらの結果により、フラジェリンは、ＬＤ５０／３０が約１３．５〜１４Ｇｙであり、ＤＭＦ３０が約１．７５〜１．８であると評価される。この放射線防護の程度は、報告されたいかなる天然化合物よりも顕著に高い。
【０１３５】
【表１】
2007513183.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染症が、非感染の細胞においてさえもＮＦ−κＢの核局在化を引き起こすことを示す。ＨＴ２９細胞をカバーグラス上で増殖させ、そして偽感染させたか、未処理のままか、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで感染させたか、またはＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。パネルＡ：ＨＴ２９細胞を、感染した宿主細胞内でのみ活性なｓｓａＨプロモーターからＧＦＰを発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＳＪＷ１１０３Ｇ株で、１００のＭＯＩで感染させたか、または偽感染させた。細胞を、明視野顕微鏡法（ＢＦ）を用いて撮影し、そして図のようにＧＦＰまたはＤＡＰＩ染色を検出するために免疫蛍光法を用いて撮影した。感染した細胞を明らかにするために、画像を組み合わせた（オーバーレイ）。パネルＢ：ＨＴ２９細胞を、未処理のままか、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの１１０３株で感染させたか、またはＴＮＦαで処理した。示されるような種々の条件下でのＮＦ−κＢ  ｐ６５（ＲｅｌＡ）の局在化を、間接免疫蛍光法によってモニターした。細胞を明視野顕微鏡法（ＢＦ）によって可視化し、細胞核をＤＡＰＩで染色し、そしてｐ６５（ＲｅｌＡ）をＦＩＴＣで可視化した。ＤＡＰＩ染色は、組み合わせ（オーバーレイ）の可視化をより識別しやすくするために、赤に擬似着色した。
【図２】図２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ培養液中のタンパク質因子が、ＮＦ−κＢ活性化を引き起こすことを示す。パネルＡ：１００倍濃縮したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ培養液を示されるように処理するか、または感染性の細菌を示されるように使用して、ＨＴ２９細胞をチャレンジした。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、処理の４５分後に調製した全細胞抽出物から、ＥＭＳＡによってアッセイした。ＮＦ−κＢのＤＮＡ：タンパク質複合体の信頼性を、ｐ６５（ＲｅｌＡ）特異的抗体スーパーシフトおよびｐ５０特異的抗体スーパーシフトを用いて決定した。パネルＢ：濃縮したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ培養液（ＩＮ）を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上のゲルパーミエーションによるクロマトグラフィーに付した。溶出されたタンパク質画分を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分画によって分析し、クーマシーブルー（ＣＢ）染色によって可視化した。クロマトグラフィー用の分子量マーカーおよびゲル上の分子量マーカーを示す：図のような各画分のアリコートを用いてＨＴ２９細胞を刺激し、そして：得られたＷＣＥを、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析した。パネルＣ：濃縮したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ培養液（ＩＮ）を、ＰＯＲＯＳ  ＨＱマトリックス上の陰イオン交換クロマトグラフィーによるクロマトグラフィーに付した。タンパク質を、図のように増加するＮａＣｌ勾配で溶出し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、そしてクーマシーブルー（ＣＢ）染色によって可視化した。図のような各画分のインプットおよびアリコートを用いてＨＴ２９細胞を刺激し、得られたＷＣＥを、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析した。２連の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから単離したゲルのタンパク質バンドＢ１〜Ｂ６およびブランク部分に相当する溶出物質を、最初と最後のＮａＣｌ緩衝液の濃度勾配からの緩衝液サンプルとともに用いてＨＴ２９細胞を刺激し、得られたＷＣＥを、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析した。
【図３】図３は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ培養液中のＮＦ−κＢ活性化因子が、質量分析によって同定されるように、フラジェリンであることを示す。トリプシンで消化したバンド２のミクロキャピラリーＨＰＬＣタンデム質量分析。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａペプチドに相当するピークを番号付けし、そして、そのピークが右に相当する番号付きペプチド配列と同定される。
【図４】図４は、フラジェリン変異体がＮＦ−κＢを活性化できないことを示す。パネルＡ：非感染細胞（ＵＮ）から、５０のＭＯＩで図のような野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎまたはＳｏｐＥ−変異体、ＳｏｐＢ−変異体、ＳｏｐＥ−／ＳｏｐＢ−二重変異体、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １１０３株、ｆｌｉＣ−変異体（ｆｌｉＣ：：Ｔｎ１０）、ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−二重変異体でのＨＴ２９細胞の直接感染の４５分後に調製されるＷＣＥにおけるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてのＥＭＳＡアッセイ。パネルＢ：図のように、非感染細胞（ＵＮ）から、または野生型細菌および変異体細菌からの滅菌濾過された濃縮培養液でのＨＴ２９細胞のチャレンジの４５分後に調製されるＷＣＥにおけるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてのＥＭＳＡアッセイ。
【図５】図５は、フラジェリンが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の間の複数のシグナル伝達経路を活性化するのに必要であり、そしてＮＦ−κＢの核局在化を引き起こすことを示す。パネルＡ：ＨＴ２９細胞を、図のように、未処理のままか、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）またはアニソマイシン［Ａｎ］（２０μｇ／ｍｌ）／ＰＭＡ（１２．５ｎｇ／ｍｌ）の混合物で１５分間刺激したか、あるいは野生型（ＷＴ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １１０３株またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの二重ｆｌｉＣ−／ｆｌｊＢ−変異体１３４株で感染させた。ＷＣＥを、指示された時間に、またはＴＮＦ処理細胞については１０分に、またはアニソマイシン／ＰＭＡ処理細胞については１５分に調製し、そしてこのＷＣＥを、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を分析するためにＥＭＳＡにおいて使用したか、あるいはＩＫＫおよびＪＮＫキナーゼのそれぞれの基質ＧＳＴ−ＩκＢα１−５４およびＧＳＴ−ｃＪｕｎ１−７９に対する活性を測定するために抗ＩＫＫ抗体または抗ＪＮＫ抗体を用いる免疫キナーゼ活性（ＫＡ）において使用した（図のように）。各抽出物由来の等量（４０μｇ）のタンパク質の免疫ブロット（ＩＢ）分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画し、ＰＶＤＦ膜に移し、そして図のようにバルクのＩＫＫ、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８を検出するために、示した抗体でプローブした。活性化ＥＲＫおよびｐ３８を検出するためにＥＲＫおよびｐ３８に対するリン特異的抗体を用いる免疫ブロット分析を示す。パネルＢ：フラジェリン変異体ＳａｌｍｏｎｅｌｌａがＨＴ２９細胞に感染できないこと、およびＨＴ２９細胞の精製フラジェリン刺激が間接免疫蛍光法によって決定されるようにＮＦ−κＢ核ｐ６５（ＲｅｌＡ）局在化を引き起こすことを示す、免疫蛍光法。カバーグラス上で増殖したＨＴ２９細胞を示す処理の画像は、図１ＡおよびＢにおけるものと本質的に同じである。ＤＡＰＩ染色の擬似着色を使用して、ＤＡＰＩ染色された核およびｐ６５核局在化の両方の可視化を増強した。
【図６】図６は、精製フラジェリンが、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染のシグナル伝達経路および炎症誘発性遺伝子発現を模倣する、腸上皮細胞におけるシグナル伝達経路および炎症誘発性遺伝子発現を活性化することを示す。ＨＴ２９細胞を、未処理のままか、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）またはアニソマイシン［Ａｎ］（２０μｇ／ｍｌ）／ＰＭＡ（１２．５ｎｇ／ｍｌ）の混合物で１０分間処理したか、あるいはフラジェリン（ｌμｇ／ｍｌ）で指示された時間処理した。ＷＣＥを調製し、そしてこのＷＣＥを、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析し、活性化を検出するためにＥＲＫまたはｐ３８に対するリン特異的抗体を用い、そして図のようにバルクキナーゼの存在量を検出するために図５Ａに記載されるようにキナーゼ特異的抗体を用いて、免疫キナーゼ活性（ＫＡ）または免疫ブロット分析によって分析した。パネルＡ：ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を検出するためのＥＭＳＡ。パネルＢ：図５ＡにおけるようなＩＫＫ、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼ活性およびタンパク質存在量を検出するための免疫ブロットアッセイおよびキナーゼアッセイ。パネルＣ：未処理の細胞、野生型のおよびフラジェリン二重変異体のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ感染した細胞、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）またはフラジェリン（１ｍｇ／ｍｌ）で刺激された細胞の炎症誘発性遺伝子発現の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＨＴ２９細胞を、示された処理の後で示された時間に回収し、そして単離されたＲＮＡを用いて、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＭＣＰ１およびβ−アクチンに対する遺伝子特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応において続いて使用される第１鎖ｃＤＮＡを作製した。β−アクチンは、発現パターンを正規化するための標準物として使用した。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分画し、そしてエチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【図７】図７は、フラジェリン媒介性のＮＦ−κＢの活性化がＭｙＤ８８依存性であることを示す。感染性の野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ（１００のＭＯＩ）、ＩＬ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）、精製フラジェリン（１μｇ／ｍｌ）（図に示されるように）、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎおよびＳｏｐＥ−／ＳｏｐＢ−二重変異体Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎのＳＥ１ＳＢ２株（Ｓ２、図に示されるように）由来の滅菌濾過して濃縮した１００ｋＤａフィルター保持上清（ｓｐｔ）を用いて、図のように野生型、ＭｙＤ８８−／−ノックアウトまたはＴＬＲ２−／−／ＴＬＲ４−／−／ダブルノックアウトＭＥＦをチャレンジした。ＷＣＥを処理の４５分後に調製し、そしてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を分析するためにＥＭＳＡによって試験した。ＩＬ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）を陽性コントロールとして用いて、ＭｙＤ８８機能をモニターした。
【図８】図８は、ＴＬＲ５がフラジェリン媒介性のＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性を阻害することを示す。ＨＴ２９細胞を、示されたＤＮ−ＴＬＲ哺乳動物の発現ベクターまたはアンチセンスＴＬＲ５（ＡＳ  ＴＬＲ５）（２μｇ／ウェル）、２×ＮＦ−κＢ  Ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ／ウェル）、空のベクターｐＣＤＮＡ３．１ＤＮＡで４μｇの総ＤＮＡ／ウェルに調整された正規化のためのｐＲＬ−ＴＫ  Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（５０ｎｇ／ウェル）を用いて、６ウェル皿において３連でトランスフェクトした。パネルＡ：無刺激の細胞（明るい陰影付け）およびＴＮＦα（ｌ０ｎｇ／ｍｌ）処理細胞（暗い陰影付け）における、２×ＮＦ−κＢ  Ｌｕｃレポーター遺伝子の発光量比。溶解物を刺激の１２時間後に調製した。代表的な実験の結果が示される。パネルＢ：図８ＡにおけるようにトランスフェクトされたＨＴ２９細胞をフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で処理し、そして細胞溶解物を図８Ａにおけるように調製して分析した。代表的な実験の結果が示される。
【図９】図９は、腸上皮細胞のフラジェリン刺激がＴＬＲ遺伝子のサブセットの活性化を引き起こすことを示す。ＨＴ２９細胞は、フラジェリン（ｌｍｇ／ｍｌ）で刺激され、そしてＲＮＡは、３時間後にトリゾールを用いて単離され、第１鎖ｃＤＮＡを作製するために用いられた。示されるような各ＴＬＲについて、遺伝子特異的プライマーを用いて生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物が描写される。β−アクチンは、発現パターンの正規化のための標準として用いられた。
【図１０】図１０は、ＴＬＲ５が多数の細胞型において発現され、そしてフラジェリンに対して可変性の応答を有すること示す。パネルＡ：全細胞抽出物を無刺激のＴ８４、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅＬａ、２９３ＴおよびＴ９８Ｇ細胞から調製して８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画し、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移して免疫ブロット分析（ＩＢ）のために抗ＴＬＲ５抗体でプローブした。タンパク質負荷を抗アクチン抗体でプローブすることによって試験した。パネルＢ：ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅＬａ、２９３ＴおよびＴ９８Ｇ細胞を、未処理のままか（−−）、フラジェリン（Ｆ）またはＴＮＦα（Ｔ）で処理し、ＷＣＥを４５分後に調製し、そしてＥＭＳＡで使用してＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性をモニターした。ＮＦ−κＢバンドシフトの信頼性は、ｐ６５（ＲｅｌＡ）特異的抗体との複合体のスーパーシフトで試験した。
【図１１】図１１は、ｐ５３欠失がマウスにおけるＧＩ症候群の進行を加速させたことを示す。パネルＡ：ＰＦＴα（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射は、γ放射線の単回の９Ｇｙ線量および分割累積放射線量の１２．５Ｇｙ（５×２．５Ｇｙ）からＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（他に示されない限り、以下で６〜８週齢雄が用いられた）を保護する。ＰＦＴαは、ＩＲの単回の１２．５Ｇｙ線量および２５Ｇｙ線量で処置されたマウスの生存に影響しない：（代表的な実験の結果を示す；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ４０００  Ｃｉセシウム１３７供給源を毎分４Ｇｙの線量率で用いた）。パネルＢ：野生型マウスおよびｐ５３ヌルＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、低（１０Ｇｙ）および高（ｌ５Ｇｙ）線量のγ放射線に対する相対感度が異なる：野生型マウスは、ｐ５３ヌルマウスと比較して、１０Ｇｙに対してより感受性であったが、１５Ｇｙに対してより耐性であった。パネルＣ：１１Ｇｙの全身γ線照射で処置したマウスに、野生型マウスまたはｐ５３ヌル同系Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス由来の１．５×１０７個の骨髄細胞を１２時間後に注射した。（この線量は、再構成されていないコントロール群のマウスにおいて１００％の死亡率を引き起こす）。２ヶ月後、造血の完全な回復後に、動物は、１５Ｇｙの全身γ放射線で処置され、骨髄におけるｐ５３の状態が異なる２群の間で死亡率に差異を示さなかった。パネルＤ：１５Ｇｙのγ放射後の示された時点での野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの小腸に対する傷害の動態を比較することにより、ｐ５３ヌルマウス（ヘマトキシリン−エオシン染色したパラフィン切片；１２５倍の倍率）において促進された損傷を示す。２４時間のパネルは、陰窩の部分（重症のアポトーシス）がｐ５３欠乏性の上皮においてではなく野生型の上皮において明らかである場合、ＴＵＮＥＬ染色のイメージを含む。
【図１２】図１２は、野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの小腸における細胞増殖および生存の動態を示す。パネルＡ：ＩＲで処置後の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの腸における増殖速度の比較。（左）１５Ｇｙのγ放射線で処置されたかまたは未処置の、１４Ｃ−チミジン（１匹当たり１０μＣｉ）を腹腔内に注射された、４週齢の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの全身切片（１．７倍の倍率）のオートラジオグラフ（Ｗｅｓｔｐｈａｌ  ｅｔ  ａｌ、１９９７）。矢印は腸を指す。（右）１５Ｇｙのγ放射後の異なる時点での野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの小腸におけるＢｒｄＵ取り込みの比較。マウスを屠殺する２時間前にＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、そして免疫染色を前述のように行った（Ｗａｔｓｏｎ  ＆  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ、２０００）。９６時間のパネルのフラグメントは、より高い倍率（×４００）で示される。パネルＢ：１５Ｇｙのγ放射後の異なる時点での野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの小腸における陰窩当たりのＢｒｄＵ陽性細胞の数の比較。３匹の動物を各時点につき分析し、５つの回腸断面を各動物から調製し、微視的に分析して、陰窩および絨毛の数を評価した。陰窩中のＢｒｄＵ陽性細胞の数を、２００倍の倍率下で無作為な５視野において計数し（１００〜３０個の陰窩）、そしてＢｒｄＵ陽性細胞の平均数をプロットした。パネルＣ：１５Ｇｙのγ放射後の異なる時点の間の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの小腸におけるＢｒｄＵ標識細胞の数および位置のトレース。ＢｒｄＵを照射の３０分前に注射し、そしてマウスを示した時点で屠殺した。標識細胞の陰窩から絨毛までの遊走の加速、続いて急速な消失が、ｐ５３ヌルマウスにおいて観察された。
【図１３】図１３は、組換えフラジェリンが、ＮＦ−κＢを活性化可能であることを示す。
【図１４】図１４は、フラジェリンが放射線からマウスを保護する能力を試験する代表的な実験を示す。Ｃ５６ＢＬ６マウス（６週齢雄、１群当たり１０匹の動物）に、ＰＢＳ中の２．０μｇ（０．１ｍｇ／ｋｇ）または５μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のフラジェリンを静脈内に注射した。４時間後に、マウスを１５Ｇｙで照射し、そしてマウスの生存を毎日モニターした。
【図１５】図１５は、０．２５ｍｇ／ｋｇのフラジェリンを静脈内に注射されたかまたはされずに１５Ｇｙのγ放射線で処置されたマウスの小腸上皮の組織学的切片（ＨＥ染色された）を示す。コントロールマウスにおける陰窩および絨毛の完全な破壊は、フラジェリン処置動物由来の組織のほぼ正常な形態とは対照的である。
【図１６】図１６は、１０Ｇｙの全身γ放射線に対するマウスの感受性に及ぼすフラジェリンの影響を示す。
【図１７】図１７は、１３Ｇｙ（左）および１０Ｇｙ（右）の全身γ放射線に対するマウスの感受性に及ぼす、照射前の示した時間に静脈内注射したフラジェリンの影響を示す。
【図１８】図１８は、１０、１３および１５Ｇｙの全身γ放射線に対するマウスの感受性に及ぼすフラジェリンの影響を示す。
【図１９】図１９は、細菌性フラジェリンのドメイン構造を示す。Ｆ４１のＣａバックボーントレース、疎水性コア分布および構造情報。ドメインＤ１、Ｄ２ａ、Ｄ２ｂおよびＤ３を規定する４つの異なる疎水性コア。すべての疎水性側鎖原子は、Ｃａ主鎖と共に示される。側鎖原子は色分けされる：Ａｌａ、黄色；Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌ、橙色；ＰｈｅおよびＴｙｒ、紫色（炭素原子）および赤色（酸素原子）。ｃ、フラジェリンのアミノ酸配列中の種々の構造上の特色の位置および領域。上から下に：Ｆ４１フラグメント（青色）；３つのβ−葉状折り畳み構造（ｆｏｌｉｕｍ  ｆｏｌｄ）（茶色）；α−ヘリックス（黄色）、β−構造（緑色）、およびβ−回旋（紫色）を含む二次構造分布；５０番目の残基ごとのチックマーク（青色）；ドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３；プロトエレメント内の軸方向サブユニット接触領域（シアン）；十分に保存されたアミノ酸配列（赤色）および可変領域（スミレ色）；異なる高次コイルのエレメントを生成するＦ４１中の点変異を示す。下部の文字は、変異体エレメント：Ｌ（Ｄ１０７Ｅ、Ｒ１２４Ａ、Ｒ１２４Ｓ、Ｇ４２６Ａ）、Ｌ型直鎖；Ｒ（Ａ４４９Ｖ）、Ｒ型直鎖；Ｃ（Ｄ３１３Ｙ、Ａ４１４Ｖ、Ａ４２７Ｖ、Ｎ４３３Ｄ）、ｃｕｒｌｙ３３の形態を示す。（Ｓａｍａｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００１）。
【図３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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