(57)【要約】本発明はインターカレーティング染料で標識化されたプローブを用いる核酸増幅測定方法に関する。より詳しくは、本発明は、ｉ）核酸、前記核酸の増幅のためのプライマー対、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅実時間測定方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸本に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが連結された核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項２】
前記蛍光染料は、蛍光プローブの５’末端、３’末端、または塩基配列の中間部位の少なくとも一部に標識化されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項３】
前記蛍光プローブの３’末端から複製が開始しないように、前記３’末端が遮断されていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項４】
前記蛍光染料が、アクリジンホモダイマー（Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）およびその誘導体、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）およびその誘導体、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，７−ＡＡＤ） 及びその誘導体、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ） 及びその誘導体、ＡＣＭＡ（９−ａｍｉｎｏ−６−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙａｃｒｉｄｉｎｅ） 及びその誘導体、ＤＡＰＩ及びその誘導体、ジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ） 及びその誘導体、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ） 及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）及びその誘導体、エチジウムモノアジド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅ） 及びその誘導体、ヘキシジウムアイオダイド（Ｈｅｘｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ） 及びその誘導体、ビスベンジマイド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ， Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）及びその誘導体、ヘキスト３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）及びその誘導体、ヘキスト３４５８０（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０） 及びその誘導体、ヒドロオキシスチルバミジン（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ）及びその誘導体、ＬＤＳ７５１（ＬＤＳ ７５１）及びその誘導体、プロピジウムアイオダイド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ， ＰＩ）及びその誘導体、およびサイダイス（Ｃｙ−ｄｙｅｓ）誘導体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項５】
前記蛍光プローブに標識化される蛍光染料は塩基配列内の塩基の代わりに挿入および置換されることにより標識化されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項６】
前記蛍光プローブは、前記プライマーが結合されたターゲット核酸の塩基から１ないし１５塩基の範囲で離れている少なくとも一部領域と混成化されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項７】
前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが１０〜４０塩基からなることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項８】
前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが配列番号１〜２２からなる群から選択される一つの配列番号で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅実時間測定用蛍光プローブ。
【請求項９】
ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；
ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；
iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；
iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；
v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；
vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；
vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；
viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅実時間測定方法。
【請求項１０】
前記vii）段階がvi）段階と同時に実施されることを特徴とする、請求項９に記載の核酸増幅実時間測定方法。
【請求項１１】
ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；
ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；
iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；
iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；
v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；
vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；
vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；
viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；
ix）核酸の初期量が知られた試料を使用して、前記i）段階ないしviii）段階の実行によって得られる核酸の初期量のログ値と初期量に当たる限界周期との間の相関関係を示す標準検量曲線を規定する段階と；
x）前記ix）段階で得た標準検量曲線を参照して、前記ｉ）段階ないしviii）段階で得た限界周期に対応するログ値に基づき、前記核酸の初期量を求める段階と；を含む試料内の核酸初期量測定方法。
【請求項１２】
前記vii）段階がvi）段階と同時に実施されることを特徴とする、請求項１１に記載の試料内の核酸初期量測定方法。
【請求項１３】
i）核酸増幅のためのプライマー対と；
ii）二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと；
iii）核酸ポリメラーゼと；
iv）４種のヌクレオチド単量体と；を含む核酸増幅用組成物。
【請求項１４】
前記蛍光染料は、蛍光プローブの５’末端、３’末端、または塩基配列の中間部位の少なくとも一部に標識化されることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１５】
前記蛍光プローブの３’末端から複製が開始しないように、前記３’末端が遮断されていることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１６】
前記蛍光染料が、アクリジンホモダイマー（Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）およびその誘導体、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）およびその誘導体、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，７−ＡＡＤ） 及びその誘導体、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ） 及びその誘導体、ＡＣＭＡ（９−ａｍｉｎｏ−６−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙａｃｒｉｄｉｎｅ） 及びその誘導体、ＤＡＰＩ及びその誘導体、ジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ） 及びその誘導体、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ） 及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）及びその誘導体、エチジウムモノアジド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅ） 及びその誘導体、ヘキシジウムアイオダイド（Ｈｅｘｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ） 及びその誘導体、ビスベンジマイド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ， Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）及びその誘導体、ヘキスト３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）及びその誘導体、ヘキスト３４５８０（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０） 及びその誘導体、ヒドロオキシスチルバミジン（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ）及びその誘導体、ＬＤＳ７５１（ＬＤＳ ７５１）及びその誘導体、プロピジウムアイオダイド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ， ＰＩ）及びその誘導体、およびサイダイス（Ｃｙ−ｄｙｅｓ）誘導体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１７】
前記蛍光プローブに標識化される蛍光染料は塩基配列内の塩基の代わりに挿入および置換されることにより標識化されることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１８】
前記蛍光プローブは、前記プライマーが結合されたターゲット核酸の塩基から１ないし１５塩基の範囲で離れている少なくとも一部領域と混成化されることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１９】
前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが１０〜４０塩基からなることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項２０】
前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが配列番号１〜２２からなる群から選択される一つの配列番号で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項２１】
前記核酸増幅用組成物が真空乾燥されたことを特徴とする、請求項１３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項２２】
ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、逆転写反応用プライマーと、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；
ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を４２℃〜５０℃の温度まで加熱することで、一本鎖のｃＤＮＡを合成する段階と；
iii）前記ii）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖のｃＤＮＡから逆転写反応用プライマーと逆転写酵素を分離する段階と；
iv）前記iii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度徐々に冷却させることで、前記一本鎖の核酸で前記プライマー対をアニーリングする段階と；
v）前記iv）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖の核酸を複製する段階と；
vi）前記v）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；
vii）前記vi）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；
viii）前記vii）段階で得られた溶液から発光される蛍光量を測定する段階と；
ix）前記v）段階ないしviii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅測定方法。
【請求項２３】
前記viii）段階が前記vii）段階と同時に実施されることを特徴とする、請求項２２に記載の核酸増幅測定方法。
【請求項２４】
ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、逆転写反応用プライマーと、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；
ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を４２℃〜５０℃の温度まで加熱することで、一本鎖のｃＤＮＡを合成する段階と；
iii）前記ii）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖のｃＤＮＡから逆転写反応用プライマーと逆転写酵素を分離する段階と；
iv）前記iii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度徐々に冷却させることで、前記一本鎖の核酸で前記プライマー対をアニーリングする段階と；
v）前記iv）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖の核酸を複製する段階と；
vi）前記v）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；
vii）前記vi）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；
viii）前記vii）段階で得られた溶液から発光される蛍光量を測定する段階と；
ix）前記v）段階ないしviii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；
x）核酸の初期量が知られた試料を使用して、前記i）段階ないしix）段階の実行によって得られる核酸の初期量のログ値と初期量に当たる限界周期との間の相関関係を示す標準検量曲線を規定する段階と；
xi）前記x）段階で得た標準検量曲線を参照して、前記ｉ）段階ないしix）段階で得た限界周期に対応するログ値に基づき、前記核酸の初期量を求める段階と；を含む試料内の核酸初期量測定方法。
【請求項２５】
前記viii）段階がvii）段階と同時に実施されることを特徴とする、請求項２４に記載の試料内の核酸初期量測定方法。
【請求項２６】
i）核酸増幅のためのプライマー対と；
ii）逆転写反応用プライマーと；
iii）二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと；
iv）核酸ポリメラーゼと；
iv）４種のヌクレオチド単量体と；を含む核酸増幅用組成物。
【請求項２７】
前記蛍光染料は、蛍光プローブの５’末端、３’末端、または塩基配列の中間部位の少なくとも一部に標識化されることを特徴とする、請求項２６に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項２８】
前記蛍光プローブの３’末端から複製が開始しないように、前記３’末端が遮断されていることを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項２９】
前記蛍光染料が、アクリジンホモダイマー（Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）およびその誘導体、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）およびその誘導体、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，７−ＡＡＤ） 及びその誘導体、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ） 及びその誘導体、ＡＣＭＡ（９−ａｍｉｎｏ−６−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙａｃｒｉｄｉｎｅ） 及びその誘導体、ＤＡＰＩ及びその誘導体、ジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ） 及びその誘導体、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ） 及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）及びその誘導体、エチジウムモノアジド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅ） 及びその誘導体、ヘキシジウムアイオダイド（Ｈｅｘｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ） 及びその誘導体、ビスベンジマイド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ， Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）及びその誘導体、ヘキスト３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）及びその誘導体、ヘキスト３４５８０（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０） 及びその誘導体、ヒドロオキシスチルバミジン（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ）及びその誘導体、ＬＤＳ７５１（ＬＤＳ ７５１）及びその誘導体、プロピジウムアイオダイド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ， ＰＩ）及びその誘導体、およびサイダイス（Ｃｙ−ｄｙｅｓ）誘導体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３０】
前記蛍光プローブに標識化される蛍光染料は塩基配列内の塩基の代わりに挿入および置換されることにより標識化されることを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３１】
前記蛍光プローブは、前記プライマーが結合されたターゲット核酸の塩基から１ないし１５塩基の範囲で離れている少なくとも一部領域と混成化されることを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３２】
前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが１０〜４０塩基からなることを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３３】
前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが配列番号１〜２２からなる群から選択される一つの配列番号で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３４】
前記核酸増幅用組成物が真空乾燥されたことを特徴とする、請求項２７に記載の核酸増幅用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターカレーティング染料で標識化されたプローブを用いる核酸増幅測定方法に関する。より詳しくは、本発明は、ｉ）核酸、前記核酸の増幅のためのプライマー対、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅実時間測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下ＰＣＲという）によれば、主にＰＣＲ後の産物をアガロースゲルから分離しＰＣＲ産物を分析して、増幅された部分のみの大きさに関連する情報のみを得ることができたし、増幅部位の塩基配列に対する推測のみが可能であった。
【０００３】
また、アガロースゲル上での分離されたＰＣＲ産物バンドの特異性が疑わしい場合には、当該バンドを切り取って塩基配列を分析するか、同位元素で標識化されたプローブを使用してサザーンブロット分析（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行わなければならなかった。
【０００４】
この場合、増幅された部位長さの遺伝情報のほかに、バンドの特異性も確認することができるが、このような実験過程には２〜３日ほどの長時間がかかり、特異性に関する確信を有するために、プローブ結合に必要な相同性程度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を多くの条件で調節しなければならない欠点があった。
【０００５】
したがって、これら方法が持っている終点検出方法（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）の欠点を克服するために、ＰＣＲの各サイクルで得られるシグナルを分析して、試料内に存在する核酸の正確な濃度を計算し、特異的プローブを使用することにより、迅速で正確であり、敏感度の高いＰＣＲ結果を得るために開発された技術が実時間ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）である。
【０００６】
ＰＣＲ法が有する利点である、少量の核酸を迅速で特異性あるように増幅する点に正確な定量分析機能を付け加えた実時間ＰＣＲは単純に繰り返される多くの過程を自動化し、全ての誤差介入可能性を減らして、結果的に正確で迅速な結果を得ることができる方法である。
【０００７】
実時間ポリメラーゼ連鎖反応のためには、全体反応を観察するために蛍光レポーター染料を使用することになるが、蛍光レポーターは使用方法によって非特異的でも特異的でもあり得る。
【０００８】
このような蛍光染料は、増幅周期ごとに増幅産物が蓄積するに比例して増加する。増幅の初期には蛍光の増加が感知されないが、一定回数以上の増幅が進むことにより蓄積された蛍光量が初めて機器に感知され始める。
【０００９】
このように蛍光量が最低感知可能水準（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｌｅｖｅｌ）を超えて、感知可能な程度に著しく増加する時点の増幅周期数を限界周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ、Ｃ（Ｔ）））と言う。
【００１０】
核酸初期量のログ値と核酸を実時間ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するときに当たる限界周期との間には直線的に比例する関係を有する。
したがって、核酸の初期量を既に知っている試料を用いて、ログ値と限界周期を測定して標準検量曲線を得ることができ、この標準検量曲線を用いれば、未知試料に存在する核酸の初期量を正確に算出することができる。
【００１１】
一方、実時間ＰＣＲの各サイクルで得られる試料を分析し、試料に存在する正確な濃度を計算する、現在まで知られた従来の方法としては、Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：３７６１−３７７６） 方法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｔｙａｇｉ ＆ Ｋｒａｍｅｒ １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：３０３−３０９， ＵＳＰ５，１１９，８０１，ＵＳＰ５，３１２，７２８） 方法、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ などのような二本鎖のＤＮＡに挿入される挿入試薬（ｉｎｔｅｒｃｈａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を利用する方法、および隣接混成化プロブを利用する混成化プロブ方法（ＵＳＰ５，２１０，０１５）などがある。
【００１２】
ＴａｑＭａｎを用いる方法は、既存のポリメラーゼ連鎖反応と類似するが、５’末端にはレポーター染料（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｙｅ；６−ＦＡＭ， ＪＯＥ， ＶＩＣ， ＨＥＸ， ＴＥＴ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ， Ｃｙ−ｄｙｅｓ）を付け、３’ 末端には消光体（ｑｕｅｎｃｈｅｒ；ＴＡＭＲＡ）を付けたＴａｑＭａｎプローブを使用する方法である。
【００１３】
ここで、プローブの３’末端は遮断されているので、３’方向のＤＮＡ合成は進まなく、よってプローブがプライマーの役割をすることはできない。ネイティブＴａｑは５’ヌクレアーゼ活性を有し（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）ＤＮＡ合成中に鋳型ＤＮＡに水素結合されている下部ＤＮＡを除去する機能をする。
【００１４】
Ｔａｑ酵素のこのような活性は、下部ＤＮＡの５’末端が二本鎖でなければならなく、Ｔａｑは上部の合成されるＤＮＡの３’−ＯＨに結合されていなければならない（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．， Ｊ．Ｍａｒｍａｒｏ， ａｎｄ Ｓ．Ｆｌｏｏｄ．１９９５． Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｅ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｔａｑｍａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ５’ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎｅｗｓ． ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ， ＣＡ）。
【００１５】
ここで、プライマーからＤＮＡ合成が生じ、プローブはＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性によって除去される。この際、蛍光の強さ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＦＩ）は、レポーター染料と消光体染料間の距離（Ｒ）の６乗に反比例し、プローブが除去される前には、レポーター染料のシグナルが消光体染料の蛍光エネルギー転移現象（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）によって抑制され、プローブの５’末端が除去されて消光体染料から遊離されれば、レポーター染料は発光し、シグナルは増加することになる。
【００１６】
増幅されるＤＮＡの量に正確に比例して、レポーター染料から出るシグナルも増加し、ターゲットＤＮＡの１分子が合成されるとき、プローブも１分子ずつ除去され、究極にはＴａｑＭａｎプローブを完全に分解してレポーター染料を消光体染料で分解させ、ターゲット配列を完全に増幅させることになる（ＵＳＰ５，７６３，１８１、 ＵＳＰ５，６９１，１４６など）。
【００１７】
ＴａｑＭａｎプローブを用いる方法は、既存の方法のようにゲル分析を行わないから、バンドが見られないので、大きさに関する情報はないが、特異性が非常に高いＴａｑＭａｎを用いるため、3時間程度の１回反応で増幅された産物の配列情報を確認することができ、試料中の核酸の量を正確に測定することができる。
【００１８】
しかし、ＴａｑＭａｎプローブの製作の際、２０塩基長さ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するので、距離が遠くて完璧に蛍光を遮断することができないし、製作しにくいし、コストの高い欠点がある。
【００１９】
ほかの方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブによる分析方法がある。これは、特異的ＤＮＡ配列を分析するか、生きている細胞内ＲＮＡを探知するのに使用される。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブはヘアピン状のオリゴヌクレオチドプローブであって、その分子のループ部は既に知られたターゲット核酸配列に相補的な一本鎖のＤＮＡ分子であり、ステム部はプローブ配列の両端に二つの相補的なアーム配列をアニーリングさせることで作る（Ｔｙａｇｉ，Ｓ． ａｎｄ Ｆ，Ｒ， Ｋｒａｍｅｒ．１９９６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ−ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９）。
【００２０】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブは、５’末端に結合されるレポーター蛍光染料をテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミンレッド（Ｒｏｄａｍｉｎ Ｒｅｄ）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ）などから選択し、３’末端には非蛍光消光体としてＤＡＢＳＹＬ［４−（４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ］）を使用して混成化された形態で蛍光を発しないようにしてプローブの検出を単純化した点を特徴とするプローブを言う。
【００２１】
この際、ステム部分は、染料と消光体染料が互いに近くに位置して蛍光を消光させる機能をする。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎがターゲット分子と衝突するとき、アーム配列そのものによって形成されたハイブリッドよりも長くて安定したハイブリッドを形成することになり、蛍光はそれ以上消光体に近接していなく、蛍光放出が簡単に検出される。
【００２２】
しかし、前記方法によれば、生きている細胞内のターゲット検出のように、プローブをターゲットハイブリッドから分離することが不便であるだけでなく（Ｍａｔｓｕｏ，Ｔ．１９９８． Ｉｎ ｓｉｔｕ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３７９：１７８−１８４）、プローブの長さも少なくとも３０〜４０塩基配列を要求するので、プローブの製作が容易でなく、コスト高になる欠点がある。
【００２３】
さらにほかの分析方法は、隣接混成化プローブを用いる方法である。隣接混成化プローブを用いる方法には、二つの特別にデザインされたプローブが使用され、二つのプローブ配列は、増幅されるＤＮＡ断片上でターゲット配列上に頭−尾配置（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に混成化できるようにデザインされている。
【００２４】
一つのプローブの３’末端には蛍光供与体が付いており、ほかのプローブの５’末端には受容体蛍光が付いているので、互いに近くに混成化される場合に限り、蛍光エネルギー転移現象が起こって供与体の放射光が受容体の励起光として作用することができる。
【００２５】
すなわち、近接した供与体蛍光が光源によって励起されれば、伝達されたエネルギーによって受容体蛍光が蛍光を発し、その量は増幅産物に付いたプローブ量に比例する。この方法は、ポリメラーゼ増幅産物を同定するのに相当な特異性を提供するＤＮＡ探知と単一塩基変異の確認に使用される（ＵＳＰ５，２１０，０１５）。
【００２６】
しかし、この方法は、プライマーが最終に四つ要求されるから、過程が複雑で、特異性が落ちる問題点がある（Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｌ．Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．１９８５． Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｐ．２４５−２５６． Ｉｎ Ｄ．Ｔ． Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ ａｎｄ Ｓ． Ｆｌａｋｏｗ（Ｅｄｓ．）， Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００２７】
最後に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ， Ｆｏｅｒｓｔ ３３２２８、Ｅｔｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＥｔＢｒ） などのインターカレーティング染料を利用する方法がある。
インターカレーティング染料を用いる方法は、インターカレーティング染料が二本鎖のＤＮＡに結合する特徴があって特別なターゲット配列がなくても結合するので、特定のターゲット試料ではない広範囲な試料に適用することができる。
【００２８】
また、プローブを核酸から分離しやすいので、過程が簡単で、プローブの製作が難しくないという利点がある。また、調節が容易であるので、探知段階を指定してシグナルを得ることができる。
【００２９】
しかし、プライマーのみの増幅産物、非特異的増幅産物などが多く発生してバックグラウンドノイズが生成され、二本鎖のＤＮＡでも同様な蛍光を発散するので、反応後には融解曲線分析（ｂｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって各産物の融解温度（Ｔｍ）を確認し、得ようとするターゲットが正確に得られたかを確認しなければならない煩わしさがある（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．， Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．， Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｒ．１９９２． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ４１３ ， Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．， Ｆｏｃｋｌｅｒ，Ｃ．， Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．， ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．，１９９３． ｋｉｎｅｔｉｃ ＰＣＲ：Ｒｅａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６）。
【００３０】
したがって、プローブの製作が容易で分析過程が簡単であるとともに、前記インターカレーティング染料を用いる分析方法の欠点を克服して、増幅核酸の分析をより正確で迅速に行える実時間ＰＣＲの核酸増幅測定方法の開発に対する必要性が高くなっている。
【発明の開示】
【００３１】
[技術課題]
本発明の目的は、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸本に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが連結された核酸増幅実時間測定用蛍光プローブを提供することである。
【００３２】
本発明のほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅実時間測定方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらにほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；ix）核酸の初期量が知られた試料を使用して、前記i）段階ないしviii）段階の実行によって得られる核酸の初期量のログ値と初期量に当たる限界周期との間の相関関係を示す標準検量曲線を規定する段階と；x）前記ix）段階で得た標準検量曲線を参照して、前記ｉ）段階ないしviii）段階で得た限界周期に対応するログ値に基づき、前記核酸の初期量を求める段階と；を含む試料内の核酸初期量測定方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらにほかの目的は、i）核酸増幅のためのプライマー対と；ii）二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと；iii）核酸ポリメラーゼと；iv）４種のヌクレオチド単量体と；を含む核酸増幅用組成物を提供することである。
【００３５】
本発明のさらにほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、逆転写反応用プライマーと、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を４２℃〜５０℃の温度まで加熱することで、一本鎖のｃＤＮＡを合成する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖のｃＤＮＡから逆転写反応用プライマーと逆転写酵素を分離する段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度徐々に冷却させることで、前記一本鎖の核酸で前記プライマー対をアニーリングする段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖の核酸を複製する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；viii）前記vii）段階で得られた溶液から発光される蛍光量を測定する段階と；ix）前記v）段階ないしviii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅測定方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらにほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、逆転写反応用プライマーと、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を４２℃〜５０℃の温度まで加熱することで、一本鎖のｃＤＮＡを合成する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖のｃＤＮＡから逆転写反応用プライマーと逆転写酵素を分離する段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度徐々に冷却させることで、前記一本鎖の核酸で前記プライマー対をアニーリングする段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖の核酸を複製する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；viii）前記vii）段階で得られた溶液から発光される蛍光量を測定する段階と；ix）前記v）段階ないしviii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；x）核酸の初期量が知られた試料を使用して、前記i）段階ないしix）段階の実行によって得られる核酸の初期量のログ値と初期量に当たる限界周期との間の相関関係を示す標準検量曲線を規定する段階と；xi）前記x）段階で得た標準検量曲線を参照して、前記ｉ）段階ないしix）段階で得た限界周期に対応するログ値に基づき、前記核酸の初期量を求める段階と；を含む試料内の核酸初期量測定方法を提供することである。
【００３７】
本発明のさらにほかの目的は、i）核酸増幅のためのプライマー対と；ii）逆転写反応用プライマーと；iii）二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと；iv）核酸ポリメラーゼと；iv）４種のヌクレオチド単量体と；を含む核酸増幅用組成物を提供することである。
【００３８】
前記のような本発明の目的は、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された核酸増幅実時間測定用蛍光プローブを提供することによって達成される。
【００３９】
前記蛍光プローブは、３’末端部位から重合反応が起こらないように遮断されたものが望ましく、１０〜４０塩基からなるオリゴヌクレオチドであることが望ましい。
望ましくは、前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが配列番号１ないし配列番号２２よりなる群から選択される一つの配列番号で表示される塩基配列を含む。
【００４０】
また、蛍光染料はとしてはインターカレーティング染料が使用され、これらの例としてはアクリジンホモダイマー（Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）およびその誘導体、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）およびその誘導体、７−アミノアクチノマイシン（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，７−ＡＡＤ） 及びその誘導体、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ） 及びその誘導体、ＡＣＭＡ（９−ａｍｉｎｏ−６−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙａｃｒｉｄｉｎｅ） 及びその誘導体、ＤＡＰＩ及びその誘導体、ジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ） 及びその誘導体、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ） 及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）及びその誘導体、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）及びその誘導体、エチジウムモノアジド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅ） 及びその誘導体、ヘキシジウムアイオダイド（Ｈｅｘｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ） 及びその誘導体、ビスベンジマイド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ， Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）及びその誘導体、ヘキスト３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）及びその誘導体、ヘキスト３４５８０（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０） 及びその誘導体、ヒドロオキシスチルバミジン（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ）及びその誘導体、ＬＤＳ７５１（ＬＤＳ ７５１）及びその誘導体、プロピジウムアイオダイド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ， ＰＩ）及びその誘導体、およびサイダイス（Ｃｙ−ｄｙｅｓ）誘導体よりなる群から選択されることが望ましい。
【００４１】
前記蛍光染料は、蛍光プローブの前記蛍光プローブの５’末端、３’末端、または塩基配列の中間部位の少なくとも一部に前記蛍光染料が標識化されたものから選択して使用することができ、前記蛍光染料が標識化されるというのは蛍光染料がプローブ内の塩基配列の塩基の代わりに挿入または置換されることを意味する。
【００４２】
本発明のほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅実時間測定方法を提供することにより達成される。
【００４３】
前記核酸増幅実時間測定方法において、前記vii）段階はvi）段階と同時実施することができる。また、前記蛍光プローブは、前記プライマーの３’末端から１塩基ないし１０塩基の範囲内の少なくとも一部と混成化できる。
【００４４】
本発明のさらにほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記二本鎖の核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記プライマー対を前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱して前記一本鎖の核酸を複製する段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を５０℃〜７０℃の温度まで冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液から発光する蛍光量を測定する段階と；viii）前記vi）段階ないしvii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；ix）核酸の初期量が知られた試料を使用して、前記i）段階ないしviii）段階の実行によって得られる核酸の初期量のログ値と初期量に当たる限界周期との間の相関関係を示す標準検量曲線を規定する段階と；x）前記ix）段階で得た標準検量曲線を参照して、前記ｉ）段階ないしviii）段階で得た限界周期に対応するログ値に基づき、前記核酸の初期量を求める段階と；を含む試料内の核酸初期量測定方法によって達成される。
【００４５】
限界周期（Ｃ（Ｔ））は一定回数以上の増幅が進むにしたがい、蓄積された蛍光量が最低感知可能水準を超えて感知される時点の増幅周期である。
線形度（Ｒ＿２）は、ターゲット核酸の初期量のログ値と実時間ＰＣＲから得た限界周期との間の比例的関係を意味する。
【００４６】
標準検量曲線において、線形度（Ｒ＿２）が１．０に近くになるほど、未知の試料に存在する核酸の初期量を正確に計算することができる。未知試料の核酸の初期量は標準検量曲線を参照することで分かる。
【００４７】
標準検量曲線は既知の試料の核酸の初期量のログ値と前記i）段階ないしviii）段階の実施によって得られた限界周期を測定することで得ることができる。
本発明のさらにほかの目的は、i）核酸増幅のためのプライマー対と；ii）二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと；iii）核酸ポリメラーゼと；iv）４種のヌクレオチド単量体と；を含む核酸増幅用組成物を提供することにより達成される。
【００４８】
前記核酸増幅用組成物は真空乾燥された形態に製造できる。
本発明のさらにほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、逆転写反応用プライマーと、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を４２℃〜５０℃の温度まで加熱することで、一本鎖のｃＤＮＡを合成する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖のｃＤＮＡから逆転写反応用プライマーと逆転写酵素を分離する段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度徐々に冷却させることで、前記一本鎖の核酸で前記プライマー対をアニーリングする段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖の核酸を複製する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；viii）前記vii）段階で得られた溶液から発光される蛍光量を測定する段階と；ix）前記v）段階ないしviii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；を含む核酸増幅測定方法を提供することにより達成される。
【００４９】
本発明のさらにほかの目的は、ｉ）核酸と、前記核酸の増幅のためのプライマー対と、逆転写反応用プライマーと、二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと、４種のヌクレオチド単量体と、核酸ポリメラーゼとを含む緩衝溶液を製造する段階と；ii）前記i）段階で製造された緩衝溶液を４２℃〜５０℃の温度まで加熱することで、一本鎖のｃＤＮＡを合成する段階と；iii）前記ii）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖のｃＤＮＡから逆転写反応用プライマーと逆転写酵素を分離する段階と；iv）前記iii）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度徐々に冷却させることで、前記一本鎖の核酸で前記プライマー対をアニーリングする段階と；v）前記iv）段階で得られた溶液を７０℃〜７４℃の温度まで加熱することで、前記一本鎖の核酸を複製する段階と；vi）前記v）段階で得られた溶液を９３℃〜９６℃の温度まで加熱することで、前記複製された核酸を一本鎖の核酸に分離する段階と；vii）前記vi）段階で得られた溶液を５０℃〜５７℃の温度まで徐々に冷却させることで、前記蛍光プローブを前記一本鎖の核酸でアニーリングする段階と；viii）前記vii）段階で得られた溶液から発光される蛍光量を測定する段階と；ix）前記v）段階ないしviii）段階を少なくとも１回以上繰り返す段階と；x）核酸の初期量が知られた試料を使用して、前記i）段階ないしix）段階の実行によって得られる核酸の初期量のログ値と初期量に当たる限界周期との間の相関関係を示す標準検量曲線を規定する段階と；xi）前記x）段階で得た標準検量曲線を参照して、前記ｉ）段階ないしix）段階で得た限界周期に対応するログ値に基づき、前記核酸の初期量を求める段階と；を含む試料内の核酸初期量測定方法を提供することにより達成される。
【００５０】
本発明のさらにほかの目的は、i）核酸増幅のためのプライマー対と；ii）逆転写反応用プライマーと；iii）二本鎖の核酸にインターカレートされれば蛍光量が変化する蛍光染料と前記核酸の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとが連結された蛍光プローブと；iv）核酸ポリメラーゼと；iv）４種のヌクレオチド単量体と；を含む核酸増幅用組成物を提供することにより達成される。
【００５１】
本発明の逆転写酵素はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを意味する。この酵素はＲＮＡからｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を合成する。
逆転写酵素は通常腫瘍を引き起こすＲＮＡウィルス、またはＲＮＡウィルスで感染された細胞で発見される。この酵素は通常ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するための遺伝子操作実験に使用される酵素である。
【００５２】
望ましくは、本発明の逆転写酵素はＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ−２（Ｒｏｕｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ２）逆転写酵素、またはＴＴＨ（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
【００５３】
本発明において、核酸がＲＮＡである場合は、逆転写酵素を使用して、先にｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡに第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドを混成化し、ポリメラーゼを用いて複製を行う。
【００５４】
その後、複製された核酸を一本鎖に分離し、蛍光プローブのインターカレーションによって蛍光量を測定する。
したがって、本発明によれば、ターゲット核酸がＲＮＡである場合にも、核酸の増幅を定量的に測定することができる。
【００５５】
本発明は実時間増幅反応によって増幅されたターゲット核酸分子の核酸ポリメラーゼによる核酸の増幅を均質的に分析および検出し、定量的に測定することができる新規の方法である。オリゴヌクレオチドに標識化された蛍光染料二本鎖の核酸に挿入されることにより蛍光を放出するインターカレート作用によってＤＮＡ増幅産物の量に比例的に蛍光が発生するので、核酸の増幅を定量的に検出することができる。
【００５６】
本発明の核酸増幅定量方法は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＤＮＡとＲＮＡ反応の多様な形態をモニタする方法に用いることができる。たとえば、本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、混成化反応（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、分裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）、組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）および合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）だけでなく、塩基配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、変異検出（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、鉛濃度測定、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびタンパク質測定用バイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｄ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、Ｐｒｏｔｅｉｎ）分野に適用することができる。
[有利な効果]
以上説明したように、本発明は、直接塩基間にインターカレーティング染料が結合するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ， Ｆｏｅｒｓｔ３３２２８、Ｅｔｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＥｔＢｒ）などの核酸増幅実時間測定方法とは異なり、より正確に増幅核酸を分析することができ、反応後に融解曲線分析によって各産物の融解度を確認する必要がなくて所要時間を格段に短縮させる。
【００５７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。下記の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明を制限するためのものではない。
本発明の前記目的およびほかの利点は添付素面を参照する好適な実施例の詳細な説明からより明らかに理解できる。
[最良の様態]
実施例１．ゲノムＤＮＡ抽出
ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて結核菌であるマイコバクテリウムチューバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のゲノムＤＮＡをつぎのように抽出した。
【００５８】
喀痰５ｍｌにオガワ培地（３００ｍｌ製造の際、ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ １ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、蒸溜水１００ｍｌ、ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ２００ｍｌ、ｇｌｙｃｅｒｉｎ ６ｍｌ、ｍａｌａｃｈｉｔｅ ｇｒｅｅｎ ２％ 溶液６ｍｌ）から得た結核菌をトリス緩衝液（ＴＥ（８．０））１ｍｌと３００μｌのプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，２０μｇ／μｌ）が混合された溶液に混ぜ合わせる。
【００５９】
その後、分解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；４Ｍ Ｕｒｅａ）４ｍｌを入れて混合し、６５℃で撹拌してから２０分間放置した後、これに結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；７Ｍ Ｇｕａｎｄｉｎｅ ＨＣｌ）６ｍｌを入れ、６５℃で混合し、２０分間放置した後、イソプロパノール２．７５ｍｌを入れて混合した後、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００６０】
一つのカラム当たり７５０μｌの上澄液をガラス繊維の入っているバインディングカラム（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）チューブに入れ、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶出液を除去し、ついでバインディングカラムチューブに洗浄緩衝液Ｉ（５Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）７５０μｌを入れ、１２，０００で１分間遠心分離して溶出液を除去した。
【００６１】
さらに、バインディングカラムチューブに洗浄緩衝液■（２０ｍＭ ＮａＣｌ
）７５０μｌを入れ、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行って溶出液を除去した。バインディングカラムチューブに残っている洗浄緩衝液を除去するために、さらに１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
【００６２】
その後、ガラス繊維の入っているバインディングカラムを１．５ｍｌチューブに移して入れた後、溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ；１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ）１００μｌを入れ、常温で５分間放置した。そして、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行って溶出液を回収した。回収されたＤＮＡは実施例４ないし９に使用した。
【００６３】
実施例２．ＤＮＡ ｇｒｅｅｎホスホラミダイトの合成
米国特許第６０８０８６８号に開示された方法に従って、つぎの化学式１のような蛍光物質の結合されたホスホラミダイトを合成した。化学式１のように蛍光染料が結合されたホスホラミダイトを本明細書でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトと命名し、オリゴヌクレオチドの合成の際、所望位置に下記の蛍光染料で標識化することにより本発明で使用される蛍光プローブを合成した。
【００６４】
【化１】
2007530033.tif 000002
ここで、ｎは２、３、４、５であり、Ｒ1は−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒであり、Ｒ2はＨ、ＯＨ、ＮＯ2である。ＣＥＰはｃｙａｎｏ ｅｔｈｏｘｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ＤＭＴはｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌを示す。
【００６５】
実施例３．プライマーおよびプローブのデザイン
本発明のプライマーおよびプローブを製造するにおいて、結核菌であるマイコバクテリウムチューバキュロシス由来のｒｐｏＢ遺伝子に対する塩基配列を使用した。
【００６６】
その後、前記遺伝子を検出し得る特異的オリゴヌクレオチドをＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ２．１（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）というプライマーおよびプローブデザインプログラムを使用して設計した（配列番号１〜５、配列番号８〜１７、配列番号１９〜２２）。その結果を表１および表２に示した。
【００６７】
下記表１および表２の配列番号８〜１２は５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化された蛍光プローブであり、内容項目に表記された数字は塩基の数を示す。たとえば、２９は、オリゴヌクレオチドが総２９塩基からなり、２９塩基での化学的置換または挿入によって３’末端から２８塩基の５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたものを示す。
【００６８】
配列番号１３〜１７は、塩基配列の中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化したオリゴヌクレオチドであり、内容項目に表記された数字は塩基の数を示す。たとえば、２８は、オリゴヌクレオチドが総２８塩基からなり、化学的置換または挿入によってプローブの３’末端から１０番目塩基でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化したものを示す。
【００６９】
配列番号２１は３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化したオリゴヌクレオチドであり、内容項目に表記された数字は塩基の数を示す。たとえば、２３は、オリゴヌクレオチドが総２３塩基からなり、化学的置換または挿入によって末端５’から２２塩基の３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化したものを示す。
【００７０】
配列番号２２は５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化したオリゴヌクレオチドであり、内容項目に表記された数字は塩基の大きさを示す。たとえば、２４は、オリゴヌクレオチドが総２４塩基からなり、１番目および２４番目塩基で挿入または置換されることにより３３塩基の５’末端および３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化したものを示す。
【００７１】
一方、特定長さの増幅産物のための核酸増幅反応のためには二つのオリゴヌクレオチドが必要であり、これはフォワードプライマーおよびリバースプライマーともいう。下記の表１および表２において、Ｆはｆｏｒｗａｒｄを意味し、Ｒはｒｅｖｅｒｓｅを意味する。表１および表２のオリゴヌクレオチド塩基配列のうち、配列番号１ないし２、配列番号３ないし４、配列番号６ないし７、配列番号１９ないし２０をプライマーとして使用した。
【００７２】
そして、配列番号８ないし１７、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の少なくとも一つを蛍光プローブとして選択して使用した。このプローブは塩基配列が前記核酸の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、前記プライマーが結合されたターゲット核酸の塩基から１ないし１５塩基の範囲で離れている少なくとも一部領域と混成化できる。
【００７３】
配列番号１３ないし１７において、オリゴヌクレオチドの３’末端から１０番目塩基はＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで置換されており、オリゴヌクレオチドは増幅されたＤＮＡの相補的塩基配列と混成化できる。その概略図は図２に示す。
【００７４】
配列番号２１および配列番号２２において、配列番号２１の３’末端と配列番号２２の５’末端はＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化され、前記塩基配列は増幅されたＤＮＡと混成化されるようにデザインした。
【００７５】
一方、実時間ＰＣＲの各サイクルから得られる試料を分析して試料内の核酸の正確な量を測定するための従来の方法は、Ｔａｑｍａｎ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：３７６１−３７７６）、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（Ｔｙａｇｉ ＆ Ｋｒａｍｅｒ １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：３０３−３０９， ＵＳＰ５，１１９，８０１， ＵＳＰ５，３１２，７２８）などがある。表１および表２の配列番号５はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法で使用した。
【００７６】
下記の表３は蛍光染料の波長別目録である。各蛍光染料は特有の励起波長および放出波長を持っている。表３の値は最適の励起波長を意味する。
オリゴヌクレオチド配列
【００７７】
【表１】
2007530033.tif 000003
オリゴヌクレオチド配列
【００７８】
【表２】
2007530033.tif 000004
蛍光染料の波長別目録
【００７９】
【表３】
2007530033.tif 000005
実施例４．ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドの検討
前記表１および表２のオリゴヌクレオチド配列は核酸合成システムＥＸＰＥＤＩＴＥ（ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｍｅｓ社製）によって合成した。核酸合成システムによって合成されたオリゴヌクレオチドはＡｘｉｍａ−ＬＮＲ（Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）という高分子質量分析器によって分子量を確認した。
【００８０】
高分子質量分析器であるＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｏｒｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｒｕｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｏｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）は、オリゴヌクレオチドの質量を確認することにより、予想される分子量と測定された分子量を分析して、脱プリン反応（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）オリゴヌクレオチド、Ｎ−１ ｆａｉｌｅｄオリゴヌクレオチド、いろいろの変形オリゴヌクレオチドの変形比（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を正確に測定する装備である。
【００８１】
５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するこの実施例は、前記表１および表２に表示したオリゴヌクレオチド配列のうち、配列番号８ないし１２から少なくとも一つを選択して使用した。
【００８２】
図３は配列番号８に対して高分子質量分析器を用いた分子量測定結果を示すもので、予想される分子量（８９４１．２ｇ／ｍｏｌｅ）と測定された分子量（８９１４．６ｇ／ｍｏｌｅ）に有意性があることが確認できた。図３において、Ｘ軸は測定されたオリゴヌクレオチドの分子量を電荷で割った値を示すもので、これは正確なオリゴヌクレオチドの分子量を測定するためであり、Ｙ軸は測定されたオリゴヌクレオチドの感度を１００％に換算して示した値である。
【００８３】
レーン１は測定しようとするオリゴヌクレオチドの分子量を意味し、レーン２は安定化エネルギー状態である基底状態から励起状態へのエネルギー転換の際、電荷が放出して２価イオン状態になるので、分子量を２で割った値に対する測定分子量を示す。
【００８４】
高分子質量分析器によって合成されたオリゴヌクレオチドの質量および精製純度が確認されたＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドは蛍光分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＲＦ−５３０１ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）によって放出および励起波長帯を確認した。
【００８５】
また、高分子質量分析器によって合成されたオリゴヌクレオチドの質量および精製純度が確認されたＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドは実時間遺伝子増幅装置であるＯｐｔｉｃｏｎTM ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ（ＭＪ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ）を用い、融解曲線の作成によって、二本鎖の核酸にインターカレートされることにより、蛍光量が変化する効果を確認した。
【００８６】
この実施例は、前記表１および表２に表示したオリゴヌクレオチドのうち、配列番号８ないし１７の少なくとも一つを選択して使用し、ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドと混成化され、ＤＮＡ二本鎖にインターカレートされて発生する蛍光感度を確認するために、相補的オリゴヌクレオチドである配列番号１８を用いた。
【００８７】
蛍光分光光度計を用いた、ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドの適正放出および励起波長帯を確認するために、二つの１５ｍｌチューブを準備した。
【００８８】
チューブ１には、２．９ｍｌＴＥＭ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０， 最終３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）と １００μｌ配列番号１０（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）を入れて最終３ｍｌ になるようにした後、混合し、チューブ２には２．８ｍｌＴＥＭ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，最終３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）と １００μｌ配列番号１０（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、および１００μｌ配列番号１８（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）を入れ、それぞれ最終３ｍｌになるようにした後、それぞれ９４°で５分間変性させた後、チューブ１は氷上に放置した。
【００８９】
チューブ２は、混成化反応のために常温で徐々に冷却させた後、蛍光分光光度計によって、放出／励起波長帯がそれぞれ４７５ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし４７５ｎｍ／５００ｎｍ〜 ６００ｎｍ、４８０ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし４８０ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍ、４８５ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし４８５ｎｍ／５００ｎｍ 〜６００ｎｍ、４９０ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし４９０ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍ、４９５ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし４９５ｎｍ／５００ｎｍ 〜６００ｎｍ、５００ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし５００ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍ、５０５ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし５０５ｎｍ／５００ｎｍ 〜６００ｎｍ、５１０ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし５１０ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍ、５１５ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし５１５ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍ、５２０ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし５２０ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍ、および５２５ｎｍ／４５０ｎｍ〜８００ｎｍないし５２５ｎｍ／５００ｎｍ〜６００ｎｍの条件で、ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対してスキャンした。
【００９０】
蛍光分光光度計による測定において、相補的オリゴヌクレオチドを添加するか添加しない条件で共に放出波長が高くなるほど励起される蛍光感度値が増加することを確認することができ、相補的オリゴヌクレオチドを添加した条件に対する励起蛍光値が添加しなかった条件に対する励起蛍光値より増加することが確認できた。
【００９１】
二本鎖の核酸にインターカレートされることにより蛍光量が変化する効果を確認することができ、かつ励起蛍光波長値のシフティング（ｓｈｉｆｔｉｎｇ）効果も確認することができた。そして、放出波長は、５０５ｎｍ〜５１５ｎｍの条件で適正励起蛍光感度値を確認することができ、適正励起波長は５３０ｎｍ〜５４０ｎｍの条件で確認することができた。
【００９２】
図５は配列番号１０または配列番号１０と１８の混成化物に対する放出波長を５０５ｎｍにし、励起波長を５００ｎｍ〜６５０スキャン条件に対する反応結果を示すもので、５００ｎｍ〜５３０ｎｍで励起される蛍光感度値が増加するが、以後６５０ｎｍまで励起される蛍光感度値が減少することを確認することができた。
【００９３】
図５において、Ｘ軸は励起される蛍光感度値を測定しようとする設定スキャン波長（ｎｍ）を示し、Ｙ軸は各スキャン波長（ｎｍ）で測定される蛍光感度値を示す。レーン１は、配列番号１０に対する放出波長値を５０５ｎｍにしたとき、励起される蛍光値を示すものであり、レーン２は、配列番号１０と１８の混成化物に対する放出波長値を５０５ｎｍにしたとき、励起される蛍光値をグラフで示すものである。
【００９４】
実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｏｎＴＭ，ＭＪ Ｒｅａｓｅｒｃｈ社製）を用いるＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドに対する二本鎖の核酸にインターカレートされることにより蛍光量が変化する効果を確認するために、二つの実時間遺伝子増幅装置用チューブを準備した。
【００９５】
チューブ１には、４９μｌＴＥＭ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，最終３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）と １μｌ配列番号１０（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）を入れ、最終５０μｌになるようにした後、混合し、チューブ２には、４８μｌＴＥＭ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，最終 ３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）と１μｌ配列番号１０（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、および１μｌ配列１８（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）を入れ、それぞれ最終に５０μｌになるようにした後、実時間遺伝子増幅装置を稼働した。
【００９６】
実時間遺伝子増幅装置の稼働条件は、 ９４℃で５分間予め変性した後、２５℃で５分間予め冷却し、ついで２５℃から９５℃まで１℃ずつ増加しながら、１℃増加するごとに４０秒間留めた後、蛍光値をスキャンした。
【００９７】
実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｏｎＴＭ，ＭＪ Ｒｅａｓｅｒｃｈ社製）による測定において、相補的オリゴヌクレオチドを添加するか添加しない条件で共に反応温度が増加するほど傾向値が減少することを確認することができた。
【００９８】
また、相補的オリゴヌクレオチドを添加した条件に対する測定蛍光値が添加しなかった条件に対する測定蛍光値より大きな変化幅を確認することができる。この測定蛍光値の差はインターカレートされることにより蛍光量が変化する効果を意味する。
【００９９】
図６は、配列番号１０または配列番号１０と１８の混成化物に対する実時間遺伝子増幅装置を用いて、反応温度２５℃から９４℃までに対する融解曲線を作成した結果を示すものである。図６において、Ｘ軸は反応温度を示し、Ｙ軸はそれぞれの温度条件にたいして測定される蛍光感度値を示す。レーン１は配列番号１０に対する反応温度による測定された蛍光値を示すものであり、レーン２は配列番号１０と１８の混成化物に対して反応温度による測定された蛍光値を示すものである。
【０１００】
実施例５．５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いるＰＣＲ反応
プライマーとは、ＰＣＲ反応で増幅しようとするターゲット核酸分子の大きさに対する特定の塩基配列をいう。プローブとは、ＰＣＲ反応でターゲット核酸分子の配列で構成され、特定の塩基配列によるプライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、５’末端、３’末端または塩基配列中間のいずれか一部位が蛍光染料で蛍光標識化されたものをいう（表１および表２参照）。
【０１０１】
陽性対照群は、ＰＣＲ反応において、現在プローブを用いて実時間ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）の各サイクルで得られる試料を分析し、試料に存在する正確な濃度を計算する現在まで知られた従来の方法であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法に対するプローブ（表１の配列番号）を適用することにより、ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブの有効性を間接的に確認することができる指標となる。
【０１０２】
クリーンタック（Ｃｌｅａｎ Ｔａｑ）ポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを内在する遺伝子の５’欠損によって５’エクソヌクレアーゼ活性を排除させた高活性および熱安定性を格段に増大させたポリメラーゼであり、実時間ＰＣＲによる検出の際、５’末端で蛍光標識化されたプローブにおいてタックポリメラーゼ（Ｔａｑ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の５’エクソヌクレアーゼ活性による非特異性効果を排除しようとした。
【０１０３】
本実施例は、前記表１および表２に表示したオリゴヌクレオチド配列のうち、配列番号１および２を選択してプライマーとし、配列番号８〜１２の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド塩基配列を選択してプローブとし、陽性対照群はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ方法を適用して、配列番号３と４をプライマーとし、配列番号５をプローブとして使用した。
【０１０４】
実時間ＰＣＲのために実時間反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプライマーに対するＰＣＲ反応条件を、１回反応当たり２０μｌ反応液を製造した。１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、２．５ｍＭ ｄＧＴＰ、２．５ｍＭ ｄＣＴＰ、２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に２ｍＭ、２．５ｍＭおよび３ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１ないし２をそれぞれに０．５μＭとなるように入れる。
【０１０５】
その後、５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号８ないし１２をそれぞれ０．５μＭ、１．０μＭ、２．５μＭおよび５．０μＭとなるようにしれた後、クリーンタックポリメラーゼ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）をそれぞれの反応チューブに０．２Ｕ（ｕｎｉｔ）となるように入れ、実施例１で精製された結核ＤＮＡ２μｌをそれぞれの反応チューブに入れた後、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウン（ｓｐｉｎ−ｄｏｎｗ）を行った。
【０１０６】
陽性対照群としてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ方法を適用し、１０ｘ反応液（２００Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００Ｍ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、２．５ｍＭ ｄＧＴＰ、２．５ｍＭ ｄＣＴＰ、２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2を最終に２．５ｍＭとなるように入れた後、プライマーである配列番号３ないし４をそれぞれに０．５μＭとなるように入れた後、蛍光標識されたプローブである配列番号５を０．２５μＭとなるように入れた。
【０１０７】
その後、クリーンタックポリメラーゼをそれぞれの反応チューブに０．２Ｕとなるように入れた後、実施例１で精製された結核ＤＮＡ２μｌをそれぞれの反応チューブに入れ、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合し、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１０８】
そして、下記の反応条件に基づき、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｏｃｎTM，ＭＪ社製）を使用して、３段階実時間ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
陽性対照群プローブ反応としては、９４℃で５分間予め変性した後、９５℃で３０秒間変性し、５０℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸張する全体反応を周期として４５回繰り返し行ったが、本発明の反応としては、９４℃で５分間予め変性し、９５℃で３０秒間変性し、５３℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸張する全体反応を周期として４５回繰り返し行った。
【０１０９】
前記各条件でＰＣＲ反応の際、前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。
図７は配列番号８に対する０．５μｌ、１．０μｌ、２．５μｌ、および５．０μＭオリゴヌクレオチド濃度別条件とＭｇＣｌ2 ２ｍＭの条件に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応結果を示すもので、レーン１〜４は順にＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド濃度０．５μｌ、１．０μｌ、２．５μｌおよび５．０μｌに対する反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフを示すものである。
【０１１０】
図８は陽性対照群の反応結果を示すもので、実時間ポリメラーゼ連鎖反応条件による反応結果からも反応周期が進むにしたがい蛍光値の増加を確認することができた。図８において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。レーン１および２はプローブ濃度０．２５μＭに対する同一条件反復に対する反応周期別蛍光値に対するグラフ結果を示すもんどえある。
【０１１１】
また、前記実時間ポリメラーゼ連鎖反応によるＰＣＲ反応物に対するゲル電気泳動を行って反応物を確認したが、まず２ｇアガロースゲルを製造するために、ガラス瓶に２ｇアガロース（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）を入れ、１００ｍｌとなるように０．５Ｘ ＴＢＥ電気泳動緩衝液を入れた後、完全に溶解されるように加熱、撹拌した。
【０１１２】
６０℃程度に冷却させた後、４μｌエチジウムブロマイド染色試薬（ＥｔＢＲ，１０ｍｇ／ｍｌ）を入れた後、コーム（ｃｏｍｂ）が挿入されたキャスティングトレーにゲルを注ぎ、３０分間室温で放置してゲルを固めた後、固まったゲルをＡｇａｒｏＰｏｗｅｒTM（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）に入れ、０．５Ｘ ＴＢＥ電気泳動緩衝液を、ゲルが浸るように入れた。
【０１１３】
ＰＣＲ反応物５μｌにローディングバッファー（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）１μｌを混合した後、ピペットを用いてアガロースゲルのウェルに入れた。その後、電圧をかけて電気泳動を行った後、ＵＶ投射器（ＵＶ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）に電気泳動したゲルを載せ、デジタルカメラであるＩｍａｇｅｒ IIITM（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）で結果を撮影した。本発明の方法による増幅産物の大きさは１２７塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）であり、陽性対照群に対する増幅産物の大きさは１５０塩基対である。
【０１１４】
前記ゲル電気泳動の結果も図７および図８に一緒に示した。図７において、レーン５は５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド０．５μＭに対するゲル電気泳動の結果であり、レーン６は５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド１．０μＭ、レーン７は５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド２．５μＭ、レーン８は５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド５．０μＭに対するゲル電気泳動の結果を示す。
【０１１５】
レーン９は１００ｂｐサイズマーカーを示す。図８において、レーン３およびレーン４は陽性対照群プローブ０．２５μＭに対する同一条件の反復に対するゲル電気泳動の結果を示す。レーン５は１００ｂｐサイズマーカーを示す。
【０１１６】
実施例６．塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いるＰＣＲ反応
本実施例は前記表１および表２に表示したオリゴヌクレオチドのうち、配列番号１と２を選択してプライマーとし、配列番号１３ないし１７の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド塩基配列を選択してプローブとして使用した。
【０１１７】
実時間ＰＣＲのために、実時間ポリメラーゼ連鎖反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件を、１回当たり２０μｌ反応液で製造した。１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに１．５ｍＭ、２ｍＭおよび２．５ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１ないし２をそれぞれに０．５ｍＭとなるように入れた。
【０１１８】
その後、ターゲット核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド配列番号１３ないし１７をそれぞれ０．５μＭ、１．０μＭおよび５．０μＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）をそれぞれの反応チューブに入れた後、実施例１で精製された結核ＤＮＡ１．５μｌをそれぞれの反応チューブに入れた後、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１１９】
そして、下記ＰＣＲ反応条件に基づき、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｏｃｎTM，ＭＪ社製）を使用して、３段階実時間ポリメラーゼ連鎖反応を行った。９４℃で５分間予め変性した後、９５℃で３０秒間変性し、５６℃で５０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸張する全体反応を周期として４６回繰り返し行った
前記条件で各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。
【０１２０】
図９は配列番号１６に対する０．５ｍＭと１．０ｍＭオリゴヌクレオチド濃度別条件とＭｇＣｌ2１．５ｍＭ条件に対する反応結果を示すもので、実時間ポリメラーゼ連鎖反応条件による反応結果は、反応周期が進むにしたがい蛍光値の増加を確認することができた。
【０１２１】
図９において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。レーン１は塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド０．５ｍＭに対する反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフ結果であり、レーン２は塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド１．０μｌに対する反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフ結果を示すものである。
【０１２２】
そして、ＰＣＲ反応物に対する結果を前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作し、ゲル電気泳動を行ってＰＣＲ反応物を確認した。塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ検出用プライマーに対する増幅産物の大きさは１２７塩基対である。
【０１２３】
前記ゲル電気泳動の結果も図９に示した。図８において、レーン３は塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド０．５μｌに対するゲル電気泳動結果であり、レーン４は塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチド１．０μｌに対するゲル電気泳動の結果である。レーン５は１００ｂｐサイズマーカーを示す。
【０１２４】
実施例７．５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いる定量ＰＣＲ反応
陰性対照群は、ＰＣＲ反応において、ターゲット核酸分子である試料ＤＮＡの代わりに蒸留水を添加してＰＣＲ反応を行ったもので、ＰＣＲ反応時に発生する外部要因による汚染有無を間接的に確認し得る指標となる。
【０１２５】
実施例４で確認された反応条件に基づき、結核ＤＮに対する順次濃度別定量実時間ポリメラーゼ連鎖反応を進めた。実施例２で製作されたオリゴヌクレオチド塩基配列１ないし２をプライマーとし、配列番号８ないし１２の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド塩基配列をプローブとし、下記の条件によってＰＣＲ反応を行った。
【０１２６】
実時間ＰＣＲのために反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件を、１回反応当たり２０μｌ反応液で製造した。１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に２ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１ないし２をそれぞれに０．５μＭとなるように入れた。
【０１２７】
その後、ターゲット核酸増幅用オリゴヌクレオチドであるプライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号１０を５．０μＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼをそれぞれの反応チューブに０．２Ｕとなるように入れた後、実施例１で精製された結核ＤＮＡを順次希釈して反応チューブに２μｌ入れた後、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行い、陰性対照群としては結核ＤＮＡの代わりに蒸留水を入れた。
【０１２８】
下記反応条件に基づき、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｃｏｎTM，ＭＪ社製）で３段階実時間ＰＣＲ反応を行った。９４℃で５分間予め変性し、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸張する全体反応を周期として４５回繰り返し行った。前記条件でＰＣＲ反応を行った後、前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。その後、作成された定量ＰＣＲ反応条件別増幅曲線に対するログ値を取り、限界周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ，Ｃ（Ｔ））を設定した後、標準検量曲線を作成し、定量ＰＣＲ反応に対する線形度を作成した。
【０１２９】
前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作してゲル電気泳動を行い、その結果ＰＣＲ反応物を確認した。５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ検出用プライマーに対する増幅産物の大きさは１２７塩基対である。
【０１３０】
図１０に示すように、左側のグラフは実時間でＰＣＲ反応物に対する結核ＤＮＡ順次希釈条件別増幅曲線からログ値を取った後、限界周期（Ｃ（Ｔ）））を設定したものを示す。右側のグラフは結核ＤＮＡ順次希釈条件別に設定された限界周期に基づき、結核ＤＮＡ順次希釈条件に対する標準検量曲線を示す。
【０１３１】
陰性対照群対比、結核ＤＮＡを含む陽性群反応条件でＰＣＲ反応が経過するにしたがい結核ＤＮＡ順次希釈条件別定量的蛍光値の増加を確認することができ（左側のグラフ）、図１０において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。
【０１３２】
レーン１は反応チューブ当たり結核ＤＮＡ ６ｎｇ、レーン２は結核ＤＮＡ ２ｎｇ、レーン３は結核ＤＮＡ ５００ｐｇ、レーン４は結核ＤＮＡ １２５ｐｇ、レーン５は結核ＤＮＡ ３１．３ｐｇ、レーン６は結核ＤＮＡ ７．８ｐｇ、そしてレーン７は１．９５ｐｇのＰＣＲ反応に対する蛍光値を示す。
【０１３３】
図１１は結核ＤＮＡ順次希釈条件別の本発明によるゲル電気泳動結果を示すもので、レーン１は反応チューブ当たり結核ＤＮＡ ６ｎｇ、レーン２は結核ＤＮＡ ２ｎｇ、レーン３は結核ＤＮＡ ５００ｐｇ、レーン４は結核ＤＮＡ １２５ｐｇ、レーン５は結核ＤＮＡ ３１．３ｐｇ、レーン６は結核ＤＮＡ ７．８ｐｇ、レーン７は結核ＤＮＡ １．９５ｐｇ、レーン８は陰性対照群に対するＰＣＲ反応に対するゲル電気泳動の結果を示すものであり、レーン９は１００ｂｐサイズマーカーを示すものである。
【０１３４】
実施例８．塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いる定量ＰＣＲ反応
実施例５で確認された反応条件に基づき、結核ＤＮＡに対する順次濃度別定量実時間ポリメラーゼ連鎖反応を進めた。実施例２で製作されたオリゴヌクレオチド配列番号１ないし２をプライマーとし、配列番号１３ないし１７の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド配列をプローブとしてＰＣＲ反応を行った。
【０１３５】
実時間ＰＣＲのために、実時間ポリメラーゼ連鎖反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件を、１回反応当たり２０μｌ反応液で製造した。１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に１．４ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーであるプライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号１６を１．０μＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼをそれぞれの反応チューブに０．１２Ｕとなるように入れた後、実施例１で精製された結核ＤＮＡを順次希釈してそれぞれの反応チューブに２μｌ入れた後、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行い、陰性対照群としては結核ＤＮＡの代わりに蒸留水を入れた。
【０１３６】
そして、下記ＰＣＲ反応条件に基づき、実施例６と同様にＰＣＲ反応を行った。９４℃で５分間予め変性し、９５℃で２０秒間変性し、５５℃で４０秒間アニーリングし、そして７２℃で３０秒間伸張する全体反応を周期として５０回繰り返し行った。前記ＰＣＲ反応を行った後、前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。
【０１３７】
ついで、作成された定量ＰＣＲ反応条件別増幅曲線に対するログ値を取り、限界周期を設定し後、標準検量曲線を作成し、定量ＰＣＲ反応に対する線形度を作成した。
そして、前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作し、ゲル電気泳動を行ってＰＣＲ反応物を確認した。塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ検出用プライマーに対する増幅産物の大きさは１２７塩基対である。
【０１３８】
図１２に示すように、左側のグラフは実時間でＰＣＲ反応物に対する結核ＤＮＡ順次希釈条件別増幅曲線からログ値を取った後、限界周期を設定したものを示す。右側のグラフは結核ＤＮＡ順次希釈条件に対する設定された限界周期に基づき、結核ＤＮＡ順次希釈条件に対する標準検量曲線を示す。
【０１３９】
陰性対照群対比、結核ＤＮＡを含む陽性群反応条件でＰＣＲ反応が経過するにしたがい結核ＤＮＡ順次希釈条件別定量的蛍光値の増加を確認することができ（左側のグラフ）、標準検量曲線に対する線形度（Ｒ＿２）は０．９９９３であることを確認した（右側のグラフ）。
【０１４０】
図１２において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。レーン１は反応チューブ当たり結核ＤＮＡ ６ｎｇ、レーン２は結核ＤＮＡ ２ｎｇ、レーン３は結核ＤＮＡ ５００ｐｇ、レーン４は結核ＤＮＡ １２５ｐｇ、レーン５は結核ＤＮＡ ３１．３ｐｇのＰＣＲ反応に対する蛍光値を示す。
【０１４１】
図１３は結核ＤＮＡ順次希釈条件別実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果を示すもので、レーン１は反応チューブ当たり結核ＤＮＡ ６ｎｇ、レーン２は結核ＤＮＡ ２ｎｇ、レーン３は結核ＤＮＡ ５００ｐｇ、レーン４は結核ＤＮＡ １２５ｐｇ、レーン５は結核ＤＮＡ ３１．３ｐｇ、レーン６は陰性対照群を示すものであり、レーン７は１００ｂｐサイズマーカーを示すものである。
【０１４２】
実施例９．５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いる交差汚染実験
ラムダＤＮＡはラムダファージ（Ｃｉ８５７ Ｓａｍ７）で感染されたｈｅａｔ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｌｙｓｏｇｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ（ｄａｍ−，ｄｃｍ−）から分離精製されたＤＮＡである。
【０１４３】
実施例４で確認された反応条件に基づき、５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブに対する交差汚染（ｃｒｏｓｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）反応を進めた。
【０１４４】
本実施例は、配列番号８ないし１２の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド配列をプローブとして選択し、配列番号１ないし２をプライマーとして使用して結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応を進め、配列番号６ないし７をプライマーとして使用してラムダＤＮＡに対して実時間ＰＣＲを進めた。
【０１４５】
実時間ＰＣＲのために、チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件を、１回反応当たり２０μｌ反応液で製造した。結核ＤＮＡ反応のための組成として、１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に２ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１ないし２をそれぞれに０．５μＭとなるように入れた。
【０１４６】
その後、ターゲット核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号１０を２．５ｍＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼをそれぞれの反応チューブに０．２Ｕとなるように入れた後、実施例１で精製された結核ＤＮＡ２μｌを入れ、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れた後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１４７】
交差汚染検討のための反応としては、１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に２ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号６ないし７をそれぞれに０．５μＭとなるように入れた。
【０１４８】
その後、ターゲット核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号１０を２．５μＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼをそれぞれの反応チューブに０．２Ｕとなるように入れた後、ラムダＤＮＡ １０ｐｇを入れ、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１４９】
そして、下記ＰＣＲ反応条件に基づき、実時間ＰＣＲ反応を行った。９４℃で５分間予め変性し、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸張する全体反応を周期として４４回繰り返し行った。前記条件で前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。そして、ＰＣＲ反応物に対する結果から、前記実施例と同様な方法でアガロースゲルを製作してゲル電気泳動を行い、その結果、ＰＣＲ反応物を確認した。
【０１５０】
図１４は配列番号１０を共通に添加した後、結核ＤＮＡラムダＤＮＡをそれぞれ異なる鋳型で交差汚染反応に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応結果を示すもので、結核ＤＮＡに対しては反応周期が進むにしたがい蛍光値が増加することを確認することができ、ラムダＤＮＡに対しては反応周期が進むにしたがる蛍光値の変化は確認することができなかった。図１４において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。
【０１５１】
レーン１は結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別蛍光値に対するグラフ結果を示すものであり、レーン２はラムダＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別蛍光値に対するグラフ結果を示すものである。
【０１５２】
そして、ＰＣＲ反応物に対する結果を、前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作してゲル電気泳動を行うことで確認した。５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ検出用プライマーに対する結核ＤＮＡの増幅産物の大きさは１２７塩基対であり、交差汚染反応に対するラムダＤＮＡの増幅産物の大きさは１００ｂｐである。
【０１５３】
図１４において、レーン３は結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果であり、レーン４はラムダＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果であり、レーン５は１００ｂｐサイズマーカーを示す。
【０１５４】
実施例１０．塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いる交差汚染実験
実施例５で確認された反応条件に基づき、塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブに対する交差汚染反応を進めた。
【０１５５】
本実施例は、実施例２で製作されたオリゴヌクレオチド配列番号１３ないし１７の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド塩基配列をプローブとして選択し、配列番号１ないし２をプライマーとして使用し、結核ＤＮＡに対する実時間ＰＣＲを進め、配列番号６ないし７をプライマーとして使用してラムダＤＮＡに対して実時間ＰＣＲを進めた。
【０１５６】
実時間ＰＣＲのために、実時間ポリメラーゼ連鎖反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件を、１回反応当たり２０μｌ反応液で製造した。結核ＤＮＡ反応のための組成として、１０ｘ反応液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に１．５ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１ないし２をそれぞれに０．５μＭとなるように入れた。
【０１５７】
その後、核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号１６を１．０μＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）をそれぞれの反応チューブに０．１５Ｕとなるように入れ、実施例１で精製された結核ＤＮＡ１．５μｌを入れ、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１５８】
交差汚染検討のための反応としては、１０ｘ反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）２μｌと２０ｍＭ ＭｇＣｌ2をそれぞれに最終に１．５ｍＭとなるように入れた後、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号６ないし７をそれぞれに０．５μＭとなるように入れた。
【０１５９】
その後、ターゲット核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号１６を１．０μＭとなるように入れた後、クリーンタックポリメラーゼをそれぞれの反応チューブに０．１５Ｕとなるように入れ、ラムダＤＮＡ １０ｐｇを入れた後、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１６０】
そして、下記ＰＣＲ反応条件に基づき、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｃｏｎTM，ＭＪ社製）で３段階実時間ＰＣＲ反応を行った。９４℃で５分間予め変性し、９５℃で３０秒間変性し、５６℃で５０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸張する全体反応を周期として４６回繰り返し行った。
【０１６１】
前記条件で前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。そして、ＰＣＲ反応物に対する結果を、前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作してゲル電気泳動を行うことで確認した。
【０１６２】
図１５は、配列番号１６を共通に添加した後、結核ＤＮＡとラムダＤＮＡをそれぞれ異なる鋳型で交差汚染反応に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応結果を示すもので、結核ＤＮＡに対しては反応周期が進むにしたかう蛍光値の増加を確認することができ、ラムダＤＮＡに対しては反応周期が進むにしたがう蛍光値の変化は確認することができなかった。図１５において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。
【０１６３】
レーン１は結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別蛍光値に対するグラフ結果を示すものであり、レーン２はラムダＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別蛍光値に対するグラフ結果を示すものである。
【０１６４】
そして、前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作してゲル電気泳動を行うことで確認し、その結果、ＰＣＲ反応物を確認した。塩基配列中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ検出用プライマーに対する結核ＤＮＡの増幅産物の大きさは１２７ｂｐであり、交差汚染反応に対するラムダＤＮＡの増幅産物の大きさは１００ｂｐである。
【０１６５】
図１５において、レーン３は結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果であり、レーン４はラムダＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果であり、レーン５は１００ｂｐサイズマーカーを示すものである。
【０１６６】
実施例１１．３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いるＰＣＲ反応
ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼは、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼが内在する３’→５’ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を排除したポリメラーゼであり、実時間ポリメラーゼ連鎖反応による検出の際、３’末端で蛍光標識化されたプローブにおいて、５’→３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性による非特異性効果を排除しようとした。
【０１６７】
本実施例において、前記表１および表２に表示したオリゴヌクレオチド配列のうち、配列番号１９と２０を選択してプライマーとし、配列番号２１を選択してプローブとして使用した。
【０１６８】
実時間ＰＣＲのために、反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件、１回反応当たり２０μｌ反応液で製造した。１０ｘ反応液（１００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８，オリゴヌクレオチド２５℃），２ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）３μｌと２０ｍＭ ＭｇＳＯ4をそれぞれに最終に２ｍＭ、３ｍＭおよび４ｍＭとなるように入れ、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１９ないし２０をそれぞれに０．６ｕＭとなるように入れた。
【０１６９】
ターゲット核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的な塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号２１をそれぞれ１．０μＭと２．５μＭとなるように入れた後、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）をそれぞれの反応チューブに０．２５Ｕとなるように入れ、実施例１で精製された結核ＤＮＡ０．５μｌをそれぞれの反応チューブに入れた後、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１７０】
そして、下記ＰＣＲ反応条件に基づき、３段階実時間ＰＣＲを行った。ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブの適用反応としては、９４℃で６分間予め変性し、９５℃で３０秒間変性し、５３℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で５０秒間伸張する全体反応を周期として５０回繰り返し行った。
【０１７１】
前記各条件でＰＣＲ反応を行った後、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器で前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。
【０１７２】
図１６は配列番号２１に対する１．０μＭ濃度条件とＭｇＣｌ2 ２ｍＭの条件に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応結果を示すもので、実時間ポリメラーゼ連鎖反応条件による反応結果は、反応周期が進むにしたがい蛍光値の増加を確認することができた。図１６において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。
【０１７３】
レーン１は３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブの濃度１．０μＭと結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフ結果を示すものであり、レーン２は３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブの濃度１．０μＭと蒸留水に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフ結果を示すものである。
【０１７４】
そして、ＰＣＲ反応物に対する結果を、前記実施例４と同様な方法アガロースゲルを製作してゲル電気泳動を行うことで確認した。３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブ検出用プライマーに対する増幅産物の大きさは１１８ｂｐである。図１６に示すように、レーン３はレーン１に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果であり、レーン４はレーン２に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果である。
【０１７５】
実施例１２．両端（５’末端および３’末端）でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブを用いるＰＣＲ反応
ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼは、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼが内在する３’→５’ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を排除したポリメラーゼであり、実時間ポリメラーゼ連鎖反応による検出の際、３’末端で蛍光標識化されたプローブにおいて、５’→３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性による非特異性効果を排除しようとした。
【０１７６】
本実施例において、前記表１および表２に表示したオリゴヌクレオチド配列のうち、配列番号１９と２０を選択してプライマーとし、配列番号２２を選択してプローブとして使用した。実時間ＰＣＲのために、反応用チューブを準備し、それぞれのプライマーとプローブに対するＰＣＲ反応条件を、１回反応当たり２０μｌで製造した。
【０１７７】
１０ｘ反応液（１００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８，オリゴヌクレオチド２５℃）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＮＥＢ社製）２μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合液（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、それぞれ）３μｌと２０ｍＭ ＭｇＳＯ4をそれぞれに最終に２ｍＭ、３ｍＭおよび４ｍＭとなるように入れ、ターゲット核酸増幅用プライマーである配列番号１９ないし２０をそれぞれに０．６μＭとなるように入れる。
【０１７８】
その後、ターゲット核酸増幅用プライマーに隣接して増幅されるターゲット核酸分子に相補的塩基配列で構成され、実時間ポリメラーゼ反応のための５’末端と３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで蛍光標識化されたプローブである配列番号２２をそれぞれ１．０μＭと２．５μＭとなるように入れた後、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）をそれぞれの反応チューブに０．２５Ｕとなるように入れた後、実施例１で精製された結核ＤＮＡ ０．５μｌをそれぞれの反応チューブに入れ、最終の２０μｌ反応体積に対する残量として蒸留水を入れ、これを混合した後、マイクロ遠心分離器でスピンダウンを行った。
【０１７９】
そして、下記ＰＣＲ反応条件に基づき、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器（ＯｐｔｉｃｏｎTM，ＭＪ社製）で３段階実時間ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブの適用反応としては、９４℃で６分間予め変性し、９５℃で３０秒間変性し、５３℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で５０秒間伸張する全体反応を周期として５０回繰り返し行った。
【０１８０】
前記各条件でＰＣＲ反応を行った後、実時間ポリメラーゼ連鎖反応器で前記各サイクルのアニーリング段階ごとに蛍光値を測定し、測定されたデータから実時間でＰＣＲ反応物に対する増幅曲線を作成した。
【０１８１】
図１７は配列番号２２に対する１．０μＭ濃度条件とＭｇＣｌ2 ２ｍＭの条件に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応結果を示すもので、実時間ポリメラーゼ連鎖反応の条件による反応結果は、反応周期が進むにしたがい蛍光値の増加を確認することができた。図１７において、Ｘ軸はＰＣＲ反応サイクルを示し、Ｙ軸は測定された蛍光値を示す。
【０１８２】
レーン１は５’末端および３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブの濃度を１．０μＭにし、結核ＤＮＡに対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフ結果を示すものであり、レーン２は５’末端および３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたプローブの濃度を１．０μＭにし、蒸留水に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応器による反応周期別に確認された蛍光値に対するグラフ結果を示すものである。
【０１８３】
そして、ＰＣＲ反応物に対する結果を、前記実施例４と同様な方法でアガロースゲルを製作してゲル電気泳動を実施することで確認した。５’末端および３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ検出用プライマーに対する増幅産物の大きさは１１８ｂｐである。図１７に示すように、レーン３はレーン１に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果であり、レーン４はレーン２に対する実時間ポリメラーゼ連鎖反応物に対するゲル電気泳動の結果である。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１−２】本発明の好適な実施例による方法の概略図である。
【図３】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対する高分子質量分析器によって測定された分子量を示す。
【図４】塩基配列の中間でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対する高分子質量分析器によって測定された分子量を示す。
【図５】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドとこれに相補的なオリゴヌクレオチドを混成化反応した後、蛍光分光光度計によって５００ｎｍ〜６５０ｎｍで測定された蛍光値を示す。
【図６】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドとこれに相補的なオリゴヌクレオチドを混成化した後、反応物に対し、実時間遺伝子増幅装置（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ）を用いて反応温度別に測定した融解曲線の蛍光値を示す。
【図７】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図８】陽性対照群に対するＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図９】塩基配列の中間ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１０】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対する定量ＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化および標準検量曲線を示す。
【図１１】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対する定量ＰＣＲ反応後の増幅産物に対するアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１２】塩基配列の中間ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対する定量ＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化および標準検量曲線を示す。
【図１３】塩基配列の中間ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対する定量ＰＣＲ反応後の増幅産物に対するアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１４】５’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するラムダＤＮＡ交差汚染ＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１５】塩基配列の中間ＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するラムダＤＮＡ交差汚染ＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１６】３’末端でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１７】両端（５’末端および３‘末端）でＤＮＡ ＧＲＥＥＮホスホラミダイトで標識化されたオリゴヌクレオチドに対するＰＣＲ反応後の増幅産物の蛍光値変化およびアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図１】
2007530033.tif 000006
【図２】
2007530033.tif 000007
【図３】
2007530033.tif 000008
【図４】
2007530033.tif 000009
【図５】
2007530033.tif 000010
【図６】
2007530033.tif 000011
【図７】
2007530033.tif 000012
【図８】
2007530033.tif 000013
【図９】
2007530033.tif 000014
【図１０】
2007530033.tif 000015
【図１１】
2007530033.tif 000016
【図１２】
2007530033.tif 000017
【図１３】
2007530033.tif 000018
【図１４】
2007530033.tif 000019
【図１５】
2007530033.tif 000020
【図１６】
2007530033.tif 000021
【図１７】
2007530033.tif 000022
【国際調査報告】
2007530033.tif 000023
2007530033.tif 000024
2007530033.tif 000025