(57)【要約】本発明により、喘息症状を処置するための組成物および方法が提供される。このような組成物および方法では、肺サーファクタントポリペプチドを含む肺サーファクタント混合物が利用される。本発明は、有効量のリン脂質と単離された肺サーファクタントポリペプチドとを含む組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物において喘息を処置または予防する方法に関する。本発明はまた、薬学的に許容される担体、肺サーファクタントポリペプチド、および気管支拡張剤を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において喘息を処置または予防するための医薬の製造のための、肺サーファクタントポリペプチドの使用。
【請求項２】
哺乳動物において喘息を処置または予防する方法であって、有効量のリン脂質と単離された肺サーファクタントポリペプチドとを含む組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記肺サーファクタントポリペプチドが、１０〜６０個の間のアミノ酸残基、および式（ＺａＵｂ）ｃＺｄによって表される、交互に存在する疎水性アミノ酸残基領域と親水性アミノ酸残基領域とのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、
式中、Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、ａは約１から約５までの平均値を有する整数であり、ｂは約３から約２０までの平均値を有する整数であり、ｃは約１から約１０までの整数であり、そしてｄは約０から約３までの整数である、
方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記Ｚが、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、または３−ヒドロキシプロリンである、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記Ｕが、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／または、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、もしくはα−アミノヘキサン酸のようなα−アミノ脂肪族カルボン酸である、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記Ｕが、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸である、方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法であって、前記肺サーファクタントポリペプチドが、以下のアミノ酸配列：
【数１】
2007513180.tif 000020
を含み、
ここで、各Ｘａは、リジンまたはアルギニンから個別に選択され、そして各Ｘｂは、アスパラギン酸またはグルタミン酸から個別に選択される、方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、前記肺サーファクタントポリペプチドが、
【数２】
2007513180.tif 000021
である、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法であって、前記肺サーファクタントポリペプチドが、以下のアミノ酸配列：配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７、を含む、方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法であって、前記組成物が、前記リン脂質の量の約０．１から１０パーセントである量の、肺サーファクタントポリペプチドを含む、方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法であって、前記組成物が、約５０から約９５乾燥重量パーセントのリン脂質を含む、方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、またはホスファチジルエタノールアミンを含む、方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法であって、前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジフタノイルホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトオレオイルホスファチジルコリン、リノレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチイルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ダイズレシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、またはホスファチジン酸を含む、方法。
【請求項１４】
請求項２に記載の方法であって、前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリンとパルミトイル，オレオイルホスファチジルグリセロールとを、約４：１から約２：１のモル比で含む、方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の方法であって、前記組成物が、約２から約２５乾燥重量パーセントの拡散剤をさらに含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記拡散剤が、少なくとも１０炭素原子の脂肪アシル鎖長を有する、脂肪酸または脂肪アルコールである、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記拡散剤が、チロキサポールをさらに含む、方法。
【請求項１８】
前記組成物が吸入によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、液体ボーラスとして肺組織に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が液体組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が乾燥組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物がエアロゾル粒子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記エアロゾル粒子が、約１μｍから約５μｍの空気動力学的中央粒子径を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物において喘息を処置または予防する方法であって、リン脂質と配列番号１〜１８のアミノ酸配列のいずれか１つを有する肺サーファクタントポリペプチドとを含む組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記組成物が、前記リン脂質の約０．１から１０パーセントを含む肺サーファクタントポリペプチドの量を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、前記組成物が、約５０から約９５乾燥重量パーセントのリン脂質を含む、方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法であって、前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、またはホスファチジルエタノールアミンを含む、方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の方法であって、前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジフタノイルホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトオレオイルホスファチジルコリン、リノレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチイルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ダイズレシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、またはホスファチジン酸を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２４に記載の方法であって、前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリンとパルミトイル，オレオイルホスファチジルグリセロールとを、約４：１から約２：１のモル比で含む、方法。
【請求項３０】
請求項２４に記載の方法であって、前記組成物が、約２から約２５乾燥重量パーセントの拡散剤をさらに含む、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記拡散剤が、少なくとも１０炭素原子の脂肪アシル鎖長を有する、脂肪酸または脂肪アルコールである、方法。
【請求項３２】
前記拡散剤が、チロキサポールをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が吸入によって投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、液体ボーラスとして肺組織に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が液体組成物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が乾燥組成物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、約１μｍから約５μｍの空気動力学的中央粒子径を有するエアロゾル粒子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
薬学的に許容される担体、肺サーファクタントポリペプチド、および気管支拡張剤を含む、組成物。
【請求項３９】
前記気管支拡張剤が、アルブテロール、レバルブテロール、テルブタリン、サルメテロール、またはフォルモテロールである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物が肺送達のために処方される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
哺乳動物において喘息を処置または予防する方法であって、該哺乳動物に、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたＫＬ４肺サーファクタントポリペプチドと組み合わせて、有効量のリン脂質を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、サーファクタントポリペプチドの投与を含む、喘息を予防するための薬学的組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
喘息は、多くの場合、気道の炎症および気道過敏性（ＡＨＲ）を特徴とする慢性炎症性疾患である。これは、子供、成人、および高齢者において疾病および死亡の主な原因である。喘息についての現在の治療としては、気管支拡張剤、ステロイド剤の吸入、およびロイコトリエンモディファイヤーでの処置が挙げられる。抗原特異的免疫療法もまた、特定のアレルギー誘発物質に対して患者の感受性を低下させるために使用されている。しかし、このような減感作は、複数の抗原に対して敏感に反応する多くのアレルギー性喘息については効果が薄い可能性がある。同様に、コルチコステロイド剤の吸入には、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカイン応答の抑制に伴う深刻な副作用がある。さらに、現在利用することができる治療法を用いてもなお、最近２０年間にわたって喘息の罹患率は増加し続けている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、より有効ではあるが副作用の少ない新しい喘息治療薬が現在も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、一般的に、喘息症状を処置するための組成物および方法に関する。
【０００５】
本発明の組成物には、少なくとも１種の肺サーファクタントポリペプチドが含まれる。肺サーファクタントポリペプチドは、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄによって示される疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基が交互に存在している領域のアミノ酸配列を有している、約１０個から約６０個のアミノ酸残基を有し得る。ここでは、Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、「ａ」は約１から約５までの整数であり、「ｂ」は約３から約２０までの整数であり、「ｃ」は約１から約１０までの整数であり、そして「ｄ」は約０から約３までの整数である。
【０００６】
例示的な肺サーファクタントポリペプチドにおいては、Ｚは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および／または３−ヒドロキシプロリンであり、そしてＵは、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノ脂肪族カルボン酸（例えば、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸）である。
【０００７】
１つの実施形態においては、肺サーファクタントポリペプチドは、以下の構造のポリペプチドであり得る：
【０００８】
【数３】
2007513180.tif 000002
ここで、各Ｘａは、リジンまたはアルギニンから別々に選択され、そして各Ｘｂは、アスパラギン酸またはグルタミン酸から別々に選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態においては、サーファクタントタンパク質は、以下の配列のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを有する：
【００１０】
【数４−１】
2007513180.tif 000003
。
【００１１】
肺投与のための組成物には、（ｉ）５０〜９５乾燥重量パーセントのリン脂質、（ｉｉ）肺の表面内層中へのリン脂質の取り込みおよび分配を促進するために有効である、２〜２５乾燥重量パーセントの拡散剤、および（ｉｉｉ）０．１から１０乾燥重量パーセントの肺サーファクタントポリペプチド、のサーファクタント混合物が含まれ得る。
【００１２】
特定の例示的実施形態においては、サーファクタント混合物のリン脂質には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とパルミトイル・オレオイル・ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）が、４：１から２：１の間のモル比で含まれる。例示的な拡散剤は、脂肪酸、または少なくとも１０個の炭素原子の脂肪酸アシル鎖長を有している脂肪族アルコールであり、例えば、パルミチン酸またはセチルアルコールである。
【００１３】
本発明のサーファクタント組成物は吸入することができ、また、エアロゾルとして投与することもできる。エアロゾル粒子が液分散から形成される場合は、サーファクタント処方物を、エアロゾル水滴中に分散させることもできる。粒子が乾燥粉末の形態である場合は、粒子は脱水されるか、または実質的に脱水される。エアロゾル粒子は、１〜５μｍの大きさの範囲の空気動力学的中央粒子径を有し得る。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、液体として、例えば、液体のボーラス投与によって投与することもできる。
【００１５】
本発明により、また、哺乳動物において喘息を処置するための方法も提供される。この方法には、本発明の肺サーファクタントポリペプチドを含む治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。当業者は、多くの場合には、組成物を肺組織に直接投与する（例えば、吸入器によって、ネブライザーの使用を通じて、またはエアロゾルとして）ことを選択するであろう。本発明の方法によって処置される喘息の症状は、例えば、急性炎症性喘息、アレルギー性喘息、医原性喘息、および関連する喘息の症状であり得る。
【００１６】
別の態様においては、本発明には、肺サーファクタントポリペプチドを患者に投与する方法が含まれる。投与は吸入によって行うことができる。この方法には、（ｉ）５０〜９５乾燥重量パーセントのリン脂質、（ｉｉ）肺の表面内層中へのリン脂質の取り込みおよび分配を促進するために有効である、２〜２５乾燥重量パーセントの拡散剤、および（ｉｉｉ）０．１から１０乾燥重量パーセントの肺サーファクタントポリペプチドから構成されるサーファクタント混合物を作成することが含まれる。肺サーファクタントポリペプチドは、１０〜６０個の間のアミノ酸残基を有しているポリペプチドであり得、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基が交互に存在している領域のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
例えば、肺サーファクタントポリペプチドは、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄによって示すことができる。ここでは、Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、「ａ」は１〜５の平均値を有し、「ｂ」は３〜２０の平均値を有し、「ｃ」は１〜１０であり、そして「ｄ」は０から３までである。得られる処方物には、１〜８０、または２〜５０乾燥重量パーセントの有効成分が含まれる。
【００１８】
処方物は、粒子状組成物へと変えられ、これらの粒子は１〜５μｍの大きさの範囲の空気動力学的中央粒子径を有する。これらの粒子は、患者の呼吸器に、エアロゾル組成物の形態で、治療有効量で投与される。
【００１９】
いくつかの実施形態においては、処方物は、溶媒中に肺サーファクタントと処方物の他の成分を溶解させるかまたは分散させることによって調製される。溶媒は、水性溶媒であるか、有機溶媒であるか、または混合溶媒である場合もある。処方物は、所望される１〜５μｍのＭＭＡＤの大きさの範囲を有する乾燥粒子を生じるために効果的な条件下で、混合物を噴霧乾燥させることによって、エアロゾル投与用の粒子状組成物へと変えられる。他の実施形態においては、処方物は、液体組成物を凍結乾燥によって乾燥させ、乾燥させた混合物を所望される大きさの範囲の乾燥粒子を形成するように粉砕することによって、エアロゾル投与用の粒子状組成物に変えることができる。
【００２０】
液体粒子または乾燥粒子は、吸入によりエアロゾル形態で投与することができる。処方物はまた、液体分散物の形態、例えば、その中に処方物粒子が分散させられている液滴を形成するようにエアロゾル化される、リポソーム分散物である場合もある。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の記載を参照してさらに完全に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも１つの肺サーファクタントポリペプチドを含む、喘息を処置または予防するための組成物および方法に関する。肺の内部への組成物の送達および分散を助けるために、他の成分（例えば、リン脂質および拡散剤）を含めることができる。
【００２３】
（定義）
以下の用語は、他の場所に明確に記載されていない限りは、以下の意味を有する。
【００２４】
「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基との間での共有結合の形成によって互いに連結することができるアミノ酸残基を意味する。例えば、アミノ酸は、ポリペプチドまたはタンパク質を構成することができる。遺伝子によってコードされるアミノ酸および遺伝子によってはコードされないアミノ酸の両方が想定される。遺伝子によってコードされるアミノ酸は、一般的には自然界に存在しているＬ型である。しかし、Ｄアミノ酸、置換されたアミノ酸（例えば、修飾された側鎖基を有しているアミノ酸）、アミノ酸の異化代謝物および同化代謝物、「レトロ」骨格を有しているアミノ酸、アミノ酸模倣物、または類似体もまた、本発明での使用について想定され、そして本発明に含まれる。標準的なポリペプチドの命名法である、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５７−５９，１９６９にしたがうと、より一般的に見られるアミノ酸残基についての略記は、以下の対応表に示すとおりである。
【００２５】
【表Ａ】
2007513180.tif 000004
【００２６】
注目すべきは、他の場所に明確に示されていない限りは、式によって本明細書中で示されるアミノ酸残基の配列は、通常はアミノ末端からカルボキシ末端に、左から右の方向を有することである。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表に列挙されたアミノ酸、修飾されたアミノ酸、および珍しいアミノ酸（例えば、米国特許法規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）§１．８２２（ｂ）（４）に列挙されているもの（これは引用により本明細書中に組み入れられる））を含むように広く定義される。語句「アミノ酸残基」はまた、遺伝子によってはコードされていないアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、置換されたアミノ酸（例えば、修飾された側鎖基を有しているアミノ酸）、修飾されたアミノ酸（例えば、アミノ酸の異化代謝物、同化代謝物、および、「設計された」側鎖を有しているアミノ酸）、ならびにアミノ酸模倣物または類似体も含むように、広く定義される。
【００２７】
さらに注目すべきは、アミノ酸残基の配列の初めと終わりのダッシュは、一般的に、それぞれ、アミノ末端とカルボキシ末端のラジカル（例えば、ＨおよびＯＨ（水素およびヒドロキシル）への、あるいは、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列への結合を示していることである。加えて、残基の配列の右側の末端にある斜線（／）は、配列が次の行に続くことを示していることに留意すべきである。
【００２８】
「ヒト」は、物質がヒトにおいて実質的には免疫反応を生じないことを意味する。例えば、本発明の肺サーファクタントポリペプチドは、全てがヒトを供給源とするものではない場合があり、また、既知のヒトの肺タンパク質と同一のアミノ酸配列を有していない場合もあるが、このような肺サーファクタントポリペプチドも、これらがヒトにおいて実質的に免疫応答を引き起こさない限りは、「ヒト」と呼ばれる場合がある。
【００２９】
「単離された」は、単離された物質がその自然界における環境から取り出されていることを意味する。いくつかの実施形態においては、「単離された」物質は、組成物中に、または自然界においては見ることができない別の環境に存在する場合がある。例えば、本発明の肺サーファクタントポリペプチドは、たとえそれが他の成分を含む組成物になるように混合されていても、また、ポリペプチドの組み換え生産のために使用される組み換え体である生物の中に存在していても、単離されていることになる場合がある。
【００３０】
「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された際に、アレルギー性の反応または同様の望ましくない反応を生じることのない、分子状物質および組成物を意味する用語である。
【００３１】
「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」は、アミノ酸またはアミノ酸類似体のサブユニットから構成される生体高分子であり、通常は、酵素−基質相互作用または受容体結合リガンド相互作用と一致するペプチドサブユニット間結合または他のサブユニット間結合によって連結された、生物学的タンパク質中で見ることができる２０個の一般的なＬ−アミノ酸のいくつかまたは全てから構成される。タンパク質は、そのサブユニット配列によって示される一次構造を有しており、二次ヘリックス構造またはプリーツ構造を、さらには、全体的な三次元構造を有している場合もある。「タンパク質」は、一般的には比較的大きなポリペプチド、例えば、３０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドを意味し、そして「ペプチド」または「ポリペプチド」はより小さいポリペプチドを意味するが、これらの用語は本明細書中では同義的にも使用される。すなわち、用語「タンパク質」は、より大きなポリペプチド、例えば、３０個以上のアミノ酸を意味する場合があるが、それより小さいポリペプチドを必ずしも排除するわけではない。そして、用語「ポリペプチド」は、より小さいペプチド、例えば、３０個未満のアミノ酸を意味する場合があるが、これにはより大きなタンパク質が含まれる場合もある。
【００３２】
「精製された」は、その物質が、それが作成された環境から取り出されていることを意味する。物質は、部分的または実質的に精製することができ、完全に（１００％）純粋である必要はない。例えば、本発明の肺サーファクタントポリペプチドは、それが、化学的に合成、または組み換えによって合成された後に、未反応の化合物、副生成物、細胞破片、および他の成分のいくつかまたは全てを除去することによって、精製することができる。
【００３３】
「サーファクタント活性」は、脂質だけ混合された場合、または他の有機分子と組み合わせて脂質と混合された場合のいずれかに、気／液界面の表面張力を低下させる、任意の物質（例えば、有機分子、タンパク質、またはポリペプチド）の能力を意味する。測定は、ウィルヘルミー平衡または生体外アッセイによる拍動性泡サーファクトメーター（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ  ｂｕｂｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて行うことができる。例えば、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２３：７１５−７２６（１９７２）に記載されているもの、または本明細書中で説明されるアッセイを参照のこと。これは、タンパク質またはポリペプチドをリン脂質と混合した際の、気−液界面の表面張力の測定を利用する。さらに、一定の肺への流入圧にしたがって、またはその気流での増加の生体内での測定は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎのアッセイ、Ｌｕｎｇ，１５８：５７−６８（１９８０）に記載されているように、容易に行うことができる。このアッセイにおいては、評価される試料が、帝王切開により早産させられたウサギの胎児または子羊に、気管内チューブを通じて投与される。（これらの「未熟児」は、その自身の肺サーファクタントを欠失しており、人工呼吸器でサポートされる）。肺コンプライアンス、血液ガス、および人工呼吸器の圧力の測定により、活性の指数が提供される。ｐｕｌｓａｔｉｎｇ  ｂｕｂｂｌｅの表面張力を下げる能力として評価されるサーファクタント活性の生体外でのアッセイ、およびウサギの胎児を利用する生体内アッセイは、Ｒｅｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１３４：１２５８−１２６５（１９８６）に詳細に記載されている。
【００３４】
「サーファクタント分子」は、サーファクタント活性を有している有機分子を意味し、これは、薬学的に許容される脂質とともに投与された場合には、低いΔＰ値によって明らかにされるように、脂質のみの場合よりも高いサーファクタント活性を有するサーファクタントを形成する。
【００３５】
「自然界に存在している肺サーファクタント」は、成熟した哺乳動物の肺の肺胞上皮の内側を覆う肺サーファクタント（ＰＳ）を意味する。自然界に存在しているＰＳまたは野生型のＰＳは、それが、肺気−液界面の表面張力を低下させるように相互作用するリン脂質とアポタンパク質の両方を含むので、「リポタンパク質複合体」と記載されている。自然界に存在しているサーファクタントには、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）がその主要な成分である、いくつかの脂質種が含まれている。通常は、少なくとも４種のタンパク質ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｄが、自然界に存在している肺サーファクタントの中に存在している。これらの４種のうちＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃは、異なる低い分子量の、比較的疎水性の高いタンパク質であり、サーファクタントリン脂質混合物の界面活性特性を、おそらくは気−液界面に対してバルク相の層状構造からの脂質の移動を促進することによって、そして息を吐く間に脂質の単層を安定化させることによってもまた、高めることが示されている。ＳＰ−Ｂの構造は、荷電したアミノ酸（大部分は塩基性）が別な様式で疎水性である残基のストレッチの中に正確に一定の間隔で存在している点で珍しい。自然界に存在しているＳＰ−Ｂ配列の残基５９〜８０から構成されるドメインについては、これらの荷電した基が生物学的活性に不可欠であることが示されている。さらに、ＤＰＰＣおよびＰＧと組み合わせた場合にこの疎水性−親水性ドメインを真似る、自然界に存在しているペプチドと合成のペプチドは、良好なサーファクタント活性を示す。
【００３６】
自然界に存在しているサーファクタントタンパク質は、層状体の形態で肺上皮細胞の中に蓄えられており、輸送された後、構造転移を受けて管状ミエリンを形成し、その後、気−液界面で単層を生じる。サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、およびＳＰ−Ｃは、これらの構造転移を容易にし、肺胞の膨張および収縮の間に脂質の単層を安定化させることができると考えられている。しかし、分子レベルでの脂質−タンパク質相互作用の完全な理解は現在は十分ではない。
【００３７】
「肺投与」は、肺の任意の表面に薬学的に活性な物質を送達する任意の投与の態様を意味する。送達の態様としては、液体懸濁液としての吸入に適している態様、乾燥粉末「塵」としての吸入に適している態様、または吸引に適している態様、あるいは、エアロゾルを挙げることができるが、これらに限定はされない。
【００３８】
「リン脂質」は、非極性の疎水性末端、グリセロール、またはスフィンゴシン部分、および極性の頭部から構成される、両親媒性脂質を意味する。非極性の疎水性末端は、通常は、飽和脂肪酸基または不飽和脂肪酸基である。極性の頭部は、リン酸基を有しており、これは、多くの場合、窒素を含む塩基に対して結合させられている。
【００３９】
「拡散剤（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、肺の表面内層の中へのリン脂質（単数または複数）の取り込みおよび分配を促進する化合物であり、これは、肺の表面内層で、気−液界面でのリン脂質の拡散を促進する。
【００４０】
「空気動力学的直径」は、特性決定された粒子と同じ沈殿速度を有している等しい単位密度の球形粒子の直径として定義される。すなわち、粒子の形状や大きさにはかかわらず、粒子は、単位密度の球形になるように変えられるとイメージされる。この球体の直径が空気動力学的直径である。したがって、１〜５ミクロンの大きさの空気動力学的直径を有している粒子は、１〜５ミクロンの大きさの範囲の直径を有している単位密度の球状粒子と同じ空気動力学的特性を有する。粒子の空気動力学的特性は、カスケードインパクション、水簸選別機、または細胞の沈降のような従来技術を使用して、実験によって測定することができる。多くの場合には、使用される測定技術は、エアロゾルが使用される状況と最もよく似ている技術である。
【００４１】
粒子の集まりの「空気動力学的中央粒子径」は、粒子の塊の空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）を意味する。すなわち、粒子の塊の半分は、ＭＭＡＤであるかまたはそれより小さく、そして半分はこれより大きい。エアロゾル粒子の分散度は、幾何学的標準偏差（ＧＳＤ）によって定義することができる。全ての粒子が同じ大きさであり同じ形状である場合は、ＧＳＤは１である。３．５のＧＳＤは、高度な分散の粒子の集まりを示す。好ましくは、本発明のエアロゾル粒子は、１から３の間、好ましくは１〜２の間のＧＳＤを生じる条件下で形成される。
【００４２】
「モデルサーファクタント混合物」または「Ｓｕｒｆａｘｉｎ（登録商標）」は、実施例１および２に示されるサーファクタント混合物成分を使用して、本発明にしたがって調製されるサーファクタント混合物を意味する。
【００４３】
（肺サーファクタントポリペプチド）
本発明で使用される肺サーファクタントポリペプチドは、荷電したアミノ酸残基と電荷を有していないアミノ酸残基が交互に存在している領域を有しているアミノ酸残基配列を含むポリペプチドである。疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基が交互に存在している領域を有しているアミノ酸残基配列を含むポリペプチドサーファクタントもまた、本発明の組成物および方法において使用される。肺サーファクタントポリペプチドは、少なくとも約４個、または少なくとも約８個、または少なくとも約１０個のアミノ酸残基を有することができる。このような肺サーファクタントポリペプチドは、一般的には、約６０個を超えないアミノ酸残基の長さであるが、さらに長い、そしてさらには全長の野生型の肺サーファクタントタンパク質もまた、想定される。本発明の組成物および方法において使用することができる肺サーファクタントポリペプチドの例は、米国特許第６，０１３，６１９号、米国特許第５，７８９，３８１号、米国特許第５，４０７，９１４号、米国特許第５，２６０，２７３号、および米国特許第５，１６４，３６９号に記載されている。これらは全て、引用により本明細書中に組み入れられる。
【００４４】
本発明の肺サーファクタントポリペプチドは、式［（荷電した）ａ（電荷を有していない）ｂ］ｃ（荷電した）ｄによって示される、荷電したアミノ酸残基と電荷を有していないアミノ酸残基が交互に存在しているグループを有し得る。ここでは、「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１〜１０であり；そして「ｄ」は０から３である。アミノ酸残基だけから構成されているのではない有機サーファクタント分子は、荷電した構成分子と電荷を有していない（または、親水性／疎水性）構成分子が交互に存在しているグループによって構成される類似の構造を有することが好ましい。
【００４５】
当業者に公知であるように、アミノ酸は、主にアミノ酸側鎖の化学的および物理的特性に応じて、種々のクラスに分類することができる。例えば、いくつかのアミノ酸は荷電しているアミノ酸、親水性アミノ酸、または極性アミノ酸であり得、そして他のアミノ酸は、電荷を有していないアミノ酸、疎水性アミノ酸、または非極性アミノ酸であり得る。極性アミノ酸としては、酸性、塩基性、または親水性側鎖を有しているアミノ酸が挙げられ、そして非極性アミノ酸としては、芳香族、または疎水性側鎖を有しているアミノ酸が挙げられる。非極性アミノ酸は、中でも、脂肪族アミノ酸を含むようにさらに分類することもできる。本明細書中で使用されるアミノ酸のクラスの定義は以下の通りである。
【００４６】
「非極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨにおいては電荷を有していない側鎖を有しているアミノ酸を意味する。これには極性はなく、一般的には、水溶液によってはじかれる。遺伝子によってコードされる疎水性アミノ酸の例としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。いくつかの実施形態においては、システインは非極性アミノ酸である。遺伝子によってはコードされない非極性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡ、Ｃｈａ、ノルロイシン、および／またはα−アミノ脂肪族カルボン酸（例えば、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸）が挙げられる。
【００４７】
「芳香族アミノ酸」は、π電子系が結合させられている少なくとも１つの環（芳香族基）を含む側鎖を有している非極性アミノ酸を意味する。芳香族基は、さらに、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、スルフォニル、ニトロ、およびアミノ基のような置換基で、さらには他の置換基で、置換することもできる。遺伝子によってコードされる芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが挙げられる。一般的に見ることができる、遺伝子によってはコードされない芳香族アミノ酸としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【００４８】
「脂肪族アミノ酸」は、飽和もしくは不飽和の直鎖の側鎖、分岐した側鎖、または環式炭化水素側鎖を有している非極性の電荷を有していないアミノ酸を意味する。遺伝子によってコードされる脂肪族アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅが挙げられる。コードされない脂肪族アミノ酸の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
【００４９】
「極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨにおいて荷電しているかまたは電荷を有さず、そして２つの原子に共有される電子対が一方の原子のより近くに保持される結合を有している側鎖を有する、親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸は、一般的には、親水性であり、このことは、これらが水溶液に結合される側鎖を有しているアミノ酸を有することを意味している。遺伝子によってコードされる極性アミノ酸の例としては、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびセリンが挙げられる。いくつかの実施形態においては、システインは、極性アミノ酸である。遺伝子によってはコードされない極性アミノ酸の例としては、シトルリン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルリジン、およびメチオニンスルフォキシドが挙げられる。
【００５０】
「酸性アミノ酸」は、７未満のｐＫ値の側鎖を有している親水性アミノ酸を意味する。酸性アミノ酸は、一般的には、水素イオンの欠失が原因で、生理学的ｐＨにおいて負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされるアミノ酸の例としては、アスパラギン酸（アスパラギン）およびグルタミン酸（グルタミン）が挙げられる。
【００５１】
「塩基性アミノ酸」は、７以上のｐＫ値の側鎖を有している親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸は、一般的には、ヒドロニウムイオンとの会合が原因で、生理学的ｐＨにおいて正に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。遺伝子によってはコードされない塩基性アミノ酸の例としては、非環式アミノ酸であるオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、およびホモアルギニンが挙げられる。
【００５２】
「イオン性アミノ酸」または「荷電したアミノ酸」は、生理学的ｐＨにおいて電荷を有することができるアミノ酸を意味する。このようなイオン性アミノ酸または荷電したアミノ酸としては、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸が挙げられ、例えば、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒドロキシリジン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒドロキシリジン、Ｌ−オルニチン、またはＬ−３−ヒドロキシプロリンが挙げられる。
【００５３】
当業者に明らかであるように、上記分類は絶対的ではない。いくつかのアミノ酸は、１つ以上の特徴的な性質を示し、したがって、２つ以上のカテゴリーに含めることができる。例えば、チロシンは、非極性の芳香環と、極性のヒドロキシル基の両方を有している。したがって、チロシンは、非極性、芳香族、および極性と記載することができるいくつかの特徴を有している。しかし、非極性の環が支配的であり、その結果、チロシンは一般的には非極性と考えられている。同様に、ジスルフィド結合を形成できることに加えて、システインは非極性の特徴も有している。したがって、疎水性または非極性アミノ酸としては厳密には分類することはできないが、多くの場合において、システインはペプチドに疎水性または非極性を付与するために使用することができる。
【００５４】
上記の遺伝子によってコードされるアミノ酸および遺伝子によってはコードされないアミノ酸の分類は、例示的な目的のためのものにすぎず、本明細書中に記載される肺サーファクタントポリペプチドに含めることができるアミノ酸残基の完全なリストを意味するものではない。本明細書中に記載される肺サーファクタントポリペプチドを作成することについて有用である他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．と、その中で引用されている参考文献の中に見ることができる。アミノ酸残基の別の供給源は、ＲＳＰ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイト（ｗｗｗ．ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ．ｃｏｍ）によって提供されている。本明細書中では具体的には記載されていないアミノ酸は、具体的に記載されているアミノ酸と比較した、既知の性質、ならびに／またはそれらの特徴的な化学的および／もしくは物理的特性に基づいて、上記のカテゴリーに簡単に分類することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、サーファクタントポリペプチドには、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄによって示される、アミノ酸残基が交互に存在しているグループを有している配列が含まれる。ここでは、Ｚは荷電したアミノ酸であり、そしてＵは電荷を有していないアミノ酸であり；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；そして「ｄ」は０から３である。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、Ｚは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および／または３−ヒドロキシプロリンであり、そしてＵは、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノ脂肪族カルボン酸（例えば、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸）である。
【００５７】
別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、式（ＢａＵｂ）ｃＢｄによって示される、アミノ酸残基が交互に存在しているグループの領域を有する。ここでは、Ｂは、ヒスチジン、リジン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンからなる群より別々に選択されるアミノ酸残基であり；そしてＵは、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、およびフェニルアラニンからなる群より別々に選択されるアミノ酸残基である。１つのバリエーションにおいては、Ｂは、コラーゲンに由来するアミノ酸であり、そして５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンからなる群より選択される；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；そして「ｄ」は０から３である。
【００５８】
さらに別の実施形態においては、本発明のサーファクタントポリペプチドには、式（ＢａＪｂ）ｃＢｄによって示されるアミノ酸残基が交互に存在しているグループを有する配列が含まれる。ここでは、Ｂは、ヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンからなる群より別々に選択されるアミノ酸残基であり；そしてＪは、α−アミノ脂肪族カルボン酸であり；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；そして「ｄ」は０から３である。
【００５９】
関連する式の中に「Ｊ」を含む種々の実施形態においては、Ｊは、４個から６個の炭素を有しているα−アミノ脂肪族カルボン酸である。他の実施形態においては、Ｊは、６個以上の炭素（６個を含む）を有しているα−アミノ脂肪族カルボン酸である。なお他のバリエーションにおいては、Ｊは、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、およびα−アミノヘキサン酸からなる群より選択されることが好ましい。
【００６０】
別の実施形態には、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄによって示される、アミノ酸残基が交互に存在しているグループを有している配列を含むサーファクタントポリペプチドが含まれる。ここでは、Ｚは、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群より別々に選択されるアミノ酸残基であり；そしてＵは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、およびＦからなる群より別々に選択されるアミノ酸残基である。いくつかの実施形態においては、Ｕは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、およびＦからなる群より選択されるか、またはＬおよびＣからなる群より選択される。整数「ａ」は、約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；そして「ｄ」は０から３である。
【００６１】
上記の式中、ＺとＵ、ＺとＪ、ＤとＵ、およびＢとＪは、個々の事象について別々に選択されるアミノ酸残基である。さらに、上記の式のそれぞれにおいて、「ａ」は、一般的には、約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は、一般的には、約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；そして「ｄ」は０から３である。
【００６２】
上記の実施形態の１つのバリエーションにおいては、ＺとＢは、荷電したアミノ酸残基である。他の実施形態においては、ＺとＢは、親水性のアミノ酸残基または正に荷電したアミノ酸残基である。１つのバリエーションにおいては、Ｚは、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される。別の実施形態においては、Ｚは、ＲおよびＫからなる群より選択されることが好ましい。なお別に、Ｂは、ヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンからなる群より選択される。別の実施形態においては、Ｂは、コラーゲンを構成するアミノ酸残基であり、５−ヒドロキシリジン（δ−ヒドロキシリジン）、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンからなる群より選択される。別の実施形態においては、Ｂはヒスチジンである。
【００６３】
種々の開示される実施形態においては、ＵとＪは、電荷を有していないアミノ酸残基である。いくつかの実施形態においては、ＵとＪは、疎水性アミノ酸残基である。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｕは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、およびＦからなる群より選択される。別の実施形態においては、Ｕは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、およびＦからなる群より選択される。なお別の実施形態においては、Ｕは、ＬおよびＣからなる群より選択される。種々の実施形態においては、ＵはＬである。
【００６４】
同様に、種々の実施形態においては、Ｂは、ヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンからなる群より選択されるアミノ酸である。あるいは、Ｂは、コラーゲンに由来するアミノ酸からなる群より選択される場合もある。これには、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンが含まれる。
【００６５】
本発明の別の実施形態においては、荷電したアミノ酸および電荷を有していないアミノ酸は、修飾されたアミノ酸の群より選択される。例えば、１つの実施形態においては、荷電したアミノ酸は、２〜３例を挙げると、シトルリン、ホモアルギニン、またはオルニチンからなる群より選択される。同様に、種々の好ましい実施形態においては、電荷を有していないアミノ酸は、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、およびα−アミノヘキサン酸からなる群より選択される。
【００６６】
本発明の種々の実施形態においては、変数「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、および「ｄ」は、荷電した残基または電荷を有していない残基（あるいは、親水性残基または疎水性残基）の数を示す整数である。
【００６７】
いくつかの実施形態においては、「ａ」は、約１から約５の平均値、または約１から約３、または約１から約２、あるいは約１の平均値を有する。
【００６８】
種々の実施形態においては、「ｂ」は、約３から約２０の平均値、または約３から約１２、または約３から約１０、または約４から約８の平均値の整数である。１つの実施形態においては、「ｂ」は約４である。
【００６９】
種々の実施形態においては、「ｃ」は、約１から約１０の平均値、または約２から約１０、または約３から約８、または約４から約８、あるいは約３から約６の平均値の整数である。１つの実施形態においては、「ｃ」は約４である。
【００７０】
種々の実施形態においては、「ｄ」は、約０から約３、または約１から約３の平均値の整数である。１つの実施形態においては、「ｄ」は、約０から約２、または１から２であり；別の実施形態においては、「ｄ」は１である。
【００７１】
アミノ酸残基−−例えば、ＺまたはＵによって示される残基−−が別々に選択されると主張することによって、それぞれの事象について、特定のグループから残基が選択されることが意味される。すなわち、「ａ」が２である場合は、例えば、Ｚによって示される親水性残基のそれぞれが別々に選択され、したがって、例えば、ＲＲ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＫ、ＤＲ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＫなどが含まれ得る。
【００７２】
「ａ」と「ｂ」が平均値を有すると主張することによって、反復配列（例えば、ＺａＵｂ）の中の残基の数は、ペプチド配列内でいくらか変化してもよいが、「ａ」と「ｂ」の平均値は、それぞれ、約１から約５、および約３から約２０であることが意味される。例えば、以下の表１に「ＫＬ８」と記載されるペプチドについて、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄを使用すると、式は、Ｋ１Ｌ８Ｋ１Ｌ８Ｋ１Ｌ２と書くことができる。ここでは、「ｂ」の平均値は６［すなわち、（８＋８＋２）／３＝６］であり、「ｃ」は３であり、そして「ｄ」は０である。
【００７３】
本発明の組成物および方法において使用することができる肺サーファクタントポリペプチドの一例は、配列番号１８である
【００７４】
【数４−２】
2007513180.tif 000005
ここで、各Ｘａは、リジンまたはアルギニンから別々に選択され、そして各Ｘｂは、アスパラギン酸またはグルタミン酸から別々に選択される。
【００７５】
本発明の他の例示的な好ましいポリペプチドが以下の表１に示される。
【００７６】
【表１】
2007513180.tif 000006
１名称は、示したアミノ酸残基の配列についての略記である。
【００７７】
肺胞とのその相互作用を最大にする立体構造を有している、約４個から約６０個のアミノ酸残基の複合ポリペプチドもまた適している。複合ポリペプチドは、本質的には、アミノ酸末端配列とカルボキシ末端配列から構成される。アミノ酸末端配列は、本発明の疎水性領域ポリペプチドまたは疎水性ペプチドのアミノ酸配列を有しており、上記の式において定義された疎水性ポリペプチドを有していることが好ましい。カルボキシ末端配列は、本発明のカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸残基配列を有している。
【００７８】
これらの自然界に存在しているサーファクタントタンパク質（ＳＰ）に由来するか、またはこれらの自然界に存在しているＳＰと類似の特徴を有しているタンパク質およびポリペプチドは、本発明の方法において有用である。記載したように、任意の哺乳動物種から単離されたＳＰを利用することができるが、ウシ、ブタ、およびヒトのサーファクタントが特に好ましい。
【００７９】
自然界に存在しているサーファクタントタンパク質には、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、またはＳＰ−Ｄ、あるいはそれらの断片が単独で、あるいは脂質と組み合わせて含まれている。好ましい断片は、ＳＰ−Ｂのアミノ末端残基１〜２５である。
【００８０】
このような自然界に存在しているサーファクタントタンパク質に関係している多くのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて見ることができる。例えば、ヒトの肺サーファクタント関連タンパク質Ａ１の配列は、登録番号ＮＰ００５４０２（ｇｉ：１３３４６５０４）としてＮＣＢＩデータバースにおいて見ることができる。ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。ヒトＳＰ−Ａ１についてのこの配列は以下に提供される（配列番号１２）。
【００８１】
【数５】
2007513180.tif 000007
ヒトの肺サーファクタント関連タンパク質Ａ２についてのアミノ酸配列は、登録番号ＮＰ００８８５７（ｇｉ：１３３４６５０６）として、ＮＣＢＩデータベースにおいてみることができる。ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。ヒトＳＰ−Ａ２についてのこの配列は、以下に提供される（配列番号１３）。
【００８２】
【数６】
2007513180.tif 000008
ヒトの肺サーファクタント関連タンパク質Ｂについてのアミノ酸配列は、登録番号ＮＰ０００５３３（ｇｉ：４５０６９０５）として、ＮＣＢＩデータベースにおいてみることができる。ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。ヒトＳＰ−Ｂについてのこの配列は、以下に提供される（配列番号１４）。
【００８３】
【数７】
2007513180.tif 000009
さらに、ヒトＳＰ１８（ＳＰ−Ｂ）サーファクタントタンパク質は、本明細書中に記載されるように利用できる。例えば、米国特許第５，４０７，９１４号；同第５，２６０，２７３号；および同第５，１６４，３６９号を参照のこと（これらの開示は、引用により本明細書中に組み入れられる）。
【００８４】
ヒトの肺サーファクタント関連タンパク質Ｃについてのアミノ酸配列は、登録番号Ｐ１１６８６（ｇｉ：１３１４２５）として、ＮＣＢＩデータベースにおいてみることができる。ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。ヒトＳＰ−Ｃについてのこの配列は、以下に提供される（配列番号１５）。
【００８５】
【数８】
2007513180.tif 000010
ヒトの肺サーファクタント関連タンパク質Ｄについてのアミノ酸配列は、登録番号Ｐ５０４０５（ｇｉ：１７０９８７９）として、ＮＣＢＩデータベースにおいてみることができる。ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。ヒトＳＰ−Ｄについてのこの配列は、以下に提供される（配列番号１６）。
【００８６】
【数９】
2007513180.tif 000011
関連するペプチドは、配列スクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミド（配列番号１７）を有しているＷＭＡＰ−１０ペプチド（Ｍａｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）である。別のペプチドは、リジン、アルギニン、またはヒスチジンのポリマーであり、これは、本明細書中に記載されるように、リン脂質の混合物において表面張力の低下を誘導する。
【００８７】
なお別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、０未満の、好ましくは、−１未満もしくは−１に等しい、より好ましくは、−２未満もしくは−２に等しい複合疎水性を有する、アミノ酸残基の配列を有する。ペプチドの複合疎水性値の決定は、当該分野で公知であり、米国特許第６，０１３，６１９号（その開示は引用により本明細書中に組み入れられる）を参照されたい。これらの疎水性ポリペプチドは、ＳＰ１８の疎水性領域の機能を実行する。したがって、１つの好ましい実施形態においては、アミノ酸配列は、ＳＰ１８の荷電した残基および電荷を有していない残基、または疎水性残基および親水性残基のパターンを模倣する。
【００８８】
しかし、本発明のポリペプチドおよび他のサーファクタント分子が、野生型ＳＰ−Ｂ（ＳＰ１８）の配列と同様の配列を有している分子に限定されないことが理解されるべきである。見方を変えれば、最も好ましい本発明のサーファクタント分子のいくつかは、それらが類似したサーファクタント活性と、荷電した残基／電荷を有していない（または、疎水性／親水性）残基が交互に存在している配列を有していることを除いて、特異的なアミノ酸残基の配列に関してＳＰ１８とはほとんどにていない。
【００８９】
本発明の１つの開示される実施形態には、ペプチドを含む調製物が含まれ、これは、塩基性の極性リジン（Ｋ）残基に結合した４個の疎水性ロイシン（Ｌ）残基の反復単位から構成されるヒトＳＰ−Ｂの模倣物である、２１−残基のペプチドである。この例示的なペプチドは、本明細書中では「ＫＬ４」と略記され、以下のアミノ酸残基の配列を有している：
【００９０】
【数１０】
2007513180.tif 000012
。
【００９１】
１つの実施形態においては、ＫＬ４は、リン脂質ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびパルミトイル・オレオイルホスファチジルグリセロール（３：１）およびパルミチン酸と混合され、リン脂質−ペプチド水分散液は「ＫＬ４−サーファクタント」と命名されており、通常、本明細書中でもそのように呼ばれる。ＫＬ４−サーファクタントは、商品名Ｍｏｄｅｌ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅとして市販されている。ＫＬ４−サーファクタントの効力は、様々な実験および臨床試験において、これまでに報告されている。例えば、Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：５６６−５６８（１９９１）；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：８３９５−８４０１（１９９１）；Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  ＆  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１５２：４０４−４１０（１９９６）；およびＲｅｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄ．Ｒｅｓ．，３９：７１５−７２４（１９９６）を参照のこと。
【００９２】
本発明の種々の実施形態においては、ポリペプチド：リン脂質の重量比は、約１：５から約１：１０，０００の範囲であり、好ましくは、約１：７から約１：５，０００、より好ましくは、約１：１０から約１：１，０００、そして最も好ましくは、約１：１５から約１：１００の範囲である。特に好ましい実施形態においては、ポリペプチド：リン脂質の重量比は、約１：３７である。
【００９３】
本発明の担体サーファクタント組成物を調製するために適している合成のポリペプチドは、ポリペプチドの分野の当業者に公知の技術によってアミノ酸から合成することができる。利用することができる多くの技術の素晴らしい概要は、固相ペプチド合成については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９，およびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ＨＯＲＭＯＮＡＬ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ，第２巻、ｐ．４６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８３に、そして伝統的な溶液合成については、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｕｂｋｅ，ＴＨＥ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ，第１巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９６５に見ることができる。
【００９４】
一般的には、これらの方法には、１つ以上のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基を連続的に付加して、ペプチド鎖を成長させることが含まれる。通常は、第１のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な、選択的に除去することが可能な保護基によって保護される。別の選択的に除去することが可能な保護基が、反応性側鎖基を含むアミノ酸（例えば、リジン）について利用される。
【００９５】
実施例１は、サーファクタントペプチドの固相合成を説明する。簡単に説明すると、保護されたかまたは誘導されたアミノ酸が、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を介して、不活性な固体支持体に結合させられる。その後、アミノ基またはカルボキシル基の保護基が選択的に除去され、適切に保護されている相補（アミノまたはカルボキシル）基を有している配列中に次のアミノ酸が混合され、固体支持体にすでに結合させられている残基とアミド結合を形成させるのに適している条件下で反応させられる。その後、アミノ基またはカルボキシル基の保護基が、この新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、その後、次のアミノ酸（適切に保護されたもの）が添加される、などである。全ての所望されるアミノ酸が適正な順序で連結させられた後に、任意の残っている末端保護基および側鎖保護基（ならびに、任意の固体支持体）が、連続的または同時に除去されて、最終的なポリペプチドとされる。次いで、このポリペプチドは、低級脂肪族アルコール中に溶解させられることによって洗浄され、乾燥させられる。乾燥させられたサーファクタントポリペプチドは、所望される場合には、公知の技術によってさらに精製することができる。
【００９６】
本発明のサーファクタントタンパク質およびポリペプチドはまた、組み換えＤＮＡ技術によって生産することもできる。植物または動物である宿主からタンパク質分子を導く手順は、当該分野で一般的に公知である。Ｊｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．，１３６：１０３２（１９８７）；Ｇｌａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１０３２６，（１９８８）を参照のこと。一般的には、適切なプロモーターおよび／またはシグナルペプチドの制御下にタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子配列は、宿主細胞のトランスフェクション用のプラスミドまたはベクターに挿入される。発現されるタンパク質／ポリペプチドは、細胞培養物から単離することができる。
【００９７】
本明細書中に開示される多くの有用なポリペプチド、例えば、ＫＬ４ポリペプチド（配列番号４）が、ペプチド結合を介して連結されている「Ｌ」型の自然界に存在しているアミノ酸を含むことは明らかであるが、アミノ酸側鎖類似体、アミド結合以外の結合（例えば、異なる骨格）を含む分子もまた、有意なサーファクタント活性を呈する場合があり、さらに、他の利点を有する場合もあることも理解されるべきである。例えば、容易には分解しない（例えば、サーファクタント組成物において使用するための）分子を構築することが望まれる場合には、Ｄ−アミノ酸のシリーズを含むポリペプチド分子を合成することが望ましい場合がある。「レトロ」骨格を介して連結された一連のアミノ酸を含む分子、すなわち、カルボキシル末端からアミノ末端の逆方向で構築された内部アミド結合を有する分子もまた、分解させることはより難しく、したがって、本明細書中に記載される種々の適用において有用である場合がある。例えば、以下に、骨格中に「レトロ」結合を有している例示的な分子が示される。
【００９８】
【化１】
2007513180.tif 000013
別のバリエーションにおいては、より「固い」立体構造をとる分子を構築することが望ましい場合がある；これを達成するための１つの手段は、アミノ酸のα−炭素原子に対してメチル基または他の基を付加することである。
【００９９】
上記のように、ＣＨ３基以外の他の基を、α炭素原子に付加することができ、すなわち、本発明のサーファクタント分子は、α炭素にＣＨ３を取り込んでいるものだけには限定されない。例えば、上記の側鎖および分子のいずれかを、α炭素成分で示したＣＨ３基で置換することができる。
【０１００】
本明細書中で使用される場合は、用語、ポリペプチドおよびアミノ酸残基の「類似体」および「誘導体」は、アミノ酸の異化代謝物および同化代謝物、さらには、「自然界に存在している」Ｌ型アミノ酸と呼ばれる、通常見られるものとは異なる結合、骨格、側鎖、または側鎖基を含む分子を含むように意図される。（用語「類似体」および「誘導体」は、本明細書中では同義的に使用することが便利である場合もある。）したがって、アミノ酸を模倣するＤ−アミノ酸分子、および「設計された」側鎖を有しているアミノ酸（すなわち、サーファクタント活性を有している分子中の１つ以上のアミノ酸を置換することができるもの）もまた、本明細書中では、用語「類似体」および「誘導体」に含まれる。
【０１０１】
１つ以上の伸張されたかまたは置換されたＲまたはＲ’基を有しているアミノ酸を含む有用な広い種類のサーファクタント分子もまた、本発明に含まれる。再び、当業者は、得られる分子が本明細書中に記載されるサーファクタント活性を有する限りにおいては、修飾によって本発明の範囲に含まれる分子を生じる、個々のアミノ酸に対する、結合に対する、および／または鎖自体に対する種々の修飾を作成することもできることを、開示から理解するべきである。
【０１０２】
組成物には他の成分を含めることができる。例えば、本発明のサーファクタント混合物には、（ｉ）５０〜９５乾燥重量パーセントのリン脂質、（ｉｉ）肺の表面内層中へのリン脂質の取り込みを促進するために有効である、２〜２５乾燥重量パーセントの拡散剤、および（ｉｉｉ）０．１から１０乾燥重量パーセントの肺サーファクタントポリペプチドが含まれ得る。上記のように、成分は、乾燥形態、溶液形態、または粒子懸濁液の形態で混合することができ、そして、治療薬の添加の前に予め処方することも、また治療薬と共に処方することもできる。
【０１０３】
本発明の組成物において有用なリン脂質には、自然界に存在しているリン脂質および／または合成のリン脂質が含まれる。使用することができるリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、およびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。例示的なリン脂質としてはまた、ホスファチジルコリン（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）Ｃ１２：０、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）Ｃ１４：０、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジフタノイルホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）（Ｃ１８：１）、ジパルミトオレオイルホスファチジルコリン（Ｃ１６：１）、リノレオイルホスファチジルコリン（Ｃ１８：２））、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイル・オレオイル・ホスファチイルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ダイズレシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジン酸も挙げられる。
【０１０４】
具体的には、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであり、ここでは、ジアシル基が対称である場合も、非対称である場合もあり、３個から２８個までの範囲の炭素原子の長さの、最大で６個の不飽和結合を含む、種々のタイプの飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸のいずれかが含まれている。
【０１０５】
１つの好ましいリン脂質は、ＤＰＰＣである。ＤＰＰＣは、今日までに試験された全ての哺乳動物種において主たるリン脂質である。ＤＰＰＣは、空域の上皮細胞（肺胞の２型肺細胞、および今のところは同定されていない気道の細胞）によって合成される。ＤＰＰＣは、細胞内層に分泌されて、拡散して肺胞全体を覆う単分子膜を形成する。空気−細胞内層界面のＤＰＰＣ膜は、その正常な機能を説明する特定の特有の性質を有している：（１）表面全体を覆うように広がる膜は、圧縮、例えば、吐き出しの際に極端に低い表面張力を生じ、それによって、空域への脂質の移動に有利に働く真の力を減少させる；（２）気道または肺胞の大きさは小さくなり、表面張力が比例して小さくなり、それによって、崩壊を防ぐために複数の構造の間で圧平衡を確立する；（３）この両性構造が原因で、膜は疎水性部分と親水性部分の両方とゆるい化学的な会合を形成することができ、その高い圧縮率が原因で、これらの会合は膜の圧縮の際に崩壊させられ得て、それによって界面から上記部分が遊離させられる；そして（４）これらのゆるい化学的会合は、サーファクタントシステム（ＰＧ、例えば、）に見ることができる他の化合物の付加によって修飾することができ、これは、膜上の電荷の分布を変化させることができ、それによって、上記部分（上記（３）に記載されている）が膜から開放される速度を変化させることができる。
【０１０６】
本発明の種々の実施形態においては、脂質成分はＤＰＰＣであり、これには、約５０から約９０重量パーセントのサーファクタント担体組成物が含まれる。本発明の別の実施形態においては、ＤＰＰＣには、約５０から７５重量パーセントのサーファクタント組成物が、不飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、トリアシルグリセロール、パルミチン酸、スフィンゴミエリン、またはそれらの混合物を含む残りと共に含まれる。本発明のなお別の実施形態においては、脂質成分は、ＤＰＰＣとＰＯＰＧの、約４：１から２：１の間の重量比の混合物である。１つの好ましい実施形態においては、脂質成分は、ＤＰＰＣとパルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）の、約３：１の重量比の混合物である。
【０１０７】
ＤＰＰＣと上記の脂質およびリン脂質は、市販によって入手することができるが、当該分野で一般的に公知である公開されている方法にしたがって調製することもできる。混合物のリン脂質成分には、１つ以上のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール、（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）の１つ以上が含まれる。リン脂質中の脂肪族アシル鎖は、好ましくは、少なくとも約７個の炭素原子の長さであり、通常は、１２〜２０個の炭素原子の長さであり、完全に飽和である場合も、また、部分的に不飽和である場合もある。ＤＰＰＣのようなリン脂質は、単独で投与された場合には比較的ゆっくりと空気−細胞内層界面に吸収され、一旦吸収されると、ゆっくりと拡散することが知られている。
【０１０８】
リン脂質（単数または複数）は、サーファクタント混合物の５０〜９５乾燥重量パーセントを構成し、混合物の８０〜９０乾燥重量パーセントを構成することが好ましい。
【０１０９】
特定の機構に限定されることは望まないが、拡散剤は、粒子形態から単層形態へのサーファクタント混合脂質の変化を促進し、肺表面に沿った、および肺の内部への拡散および分配を導くと考えられている。したがって、例えば、サーファクタント処方物がリポソーム形態で肺に投与される場合には、拡散剤は、リボソームの二重層から肺表面の平坦な単層形態へのリポソームリン脂質の変化を促進することにおいて有効である。同様に、サーファクタント処方物が無定形または結晶性の脂質粒子として肺に投与される場合は、拡散剤は、サーファクタント−混合リン脂質の、肺表面の平坦な単層形態への変化を促進することにおいて有効である。
【０１１０】
例示的な拡散剤としては、脂質二重層または脂質の単層の形態と適合性であるが、単独では脂質二重層の形態をサポートすることはできない、リン脂質ではない脂質が挙げられるが、これに限定はされない。例示的な拡散剤としては、リソホスホリピッド；脂肪酸、脂肪酸エステル、および脂肪族アルコール、ならびに、他の単長鎖脂肪族アシル化合物が挙げられる。好ましい拡散剤としては、脂肪酸、および少なくとも約１２個の炭素原子、好ましくは、１５〜２０個の間の炭素原子の鎖の長さを有しているアルキル鎖長の脂肪族アルコールが挙げられる。１つの好ましい拡散剤は、パルミチン酸であり；別の好ましい拡散剤は、セチルアルコールである。
【０１１１】
拡散剤は、サーファクタント混合物の約２から約２５乾燥重量パーセント、または混合物の約１０から約１５乾燥重量パーセントを構成する。８４．５乾燥重量％のＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ（３：１）をもまた含む１つの例示的な混合物には、１２．７５乾燥重量パーセントのパルミチン酸が含まれる。
【０１１２】
本発明で使用される拡散剤は、商業的な供給業者から購入することができる。例えば、パルミチン酸（ＰＡ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から入手することができる。拡散剤はまた、当該分野で一般的に公知である公開されている方法にしたがって調製することもできる。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、組成物には、拡散剤としてチロキサポール（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）を含めることができる。これは、様々な会社から、例えば、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ−Ｗｉｎｒｈｒｏｐ、およびＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓのようないくつかの商品名で購入することができる。チロキサポールは、ホルムアルデヒドおよびオキシランを含む４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール）のポリマーである。チロキサポールは、３０年以上もの間、ヒトの薬理学的処方物において使用されている（Ｔａｉｎｔｅｒ  ＭＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５）２５３：７６４−７６７）。チロキサポールは比較的毒性がなく、他の界面活性剤が溶血性である濃度の何千倍もの濃度でも、赤血球細胞を溶血させることはない（Ｇｌａｓｓｍａｎ  ＨＮ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９５０）１１１：６８８−６８９）。
【０１１４】
他の化合物を、本発明の組成物に含めることができる。これには、喘息症状を処置することと適合する、または喘息症状を処置するために適している化合物が含まれる。同時に投与することができる薬としては、抗アレルギー薬、抗炎症薬、抗微生物薬（抗細菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤を含む）、抗生物質、免疫調節薬、増血剤、ロイコトリエンモディファイヤー、キサンチン、交感神経様作用アミン、粘液溶解薬、コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、およびビタミン剤が挙げられる。他の例としては、気管支拡張剤（例えば、アルブテロール、レバルブテロール（例えば、Ｘｏｐｅｎｅｘ（登録商標））、テルブタリン、サルメテロール、フォルモテロール、および薬学的に許容されるそれらの塩）、抗コリン作用薬（例えば、臭化イプラトロピウム）、いわゆる「肥満細胞安定化剤」（例えば、クロモリンナトリウムおよびネドクロミル）、コルチコステロイド（例えば、フルニソライド、フルチカゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、およびそれらの塩）、インターフェロン（例えば、ＩＮＦ−α、β、およびγ）、粘膜溶解薬（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、およびグアイフェネシン）、ロイコトリエンアンタゴニスト（例えば、ザファールカストおよびモンテルカスト）、ホスホジエステラーゼＩＶ阻害因子、抗生物質（例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、プロテグリン、デフェンシン、およびトブラマイシン）、抗ウイルス薬（例えば、リバビリン、ＲＳＶモノクローナル抗体、ＶＰ１４６３７）、抗結核薬（例えば、イソナイアジド、リファンピン、およびエタンブトール）、ならびに抗真菌薬（例えば、アンホテリシンＢ）が挙げられる。
【０１１５】
（処置方法）
本発明により、喘息（例えば、急性炎症性喘息、アレルギー性喘息、医原性喘息を含む）および関連する喘息の症状を処置するための組成物および方法が提供される。
【０１１６】
喘息は、気道の過敏性の増大を特徴とする症状を改善させることが可能な閉塞性肺疾患（ＲＯＰＤ）であり、その結果、気道の閉塞が生じる。気道の閉塞は、強制呼気の間の通気に対する高い抵抗性として定義される。喘息においては気道の閉塞は、通常、気管支痙攣、気管支壁の浮腫、および細気管支の崩壊によって生じる。喘息を生じる根本的な機構は知られていないが、アドレナリン作動性でありコリン作動性である気道の直径の制御の遺伝性または急性の不安定さが関係している。このような不安定性を表す喘息は、過敏性の気管支を有しており、症状を示していなくとも、気管支収縮が存在している場合がある。さらに、サーファクタント内層気管支気道の障害は、気道の閉塞の誘導に関係しており、これによって、肺胞の過剰な膨張を導く。明らかな喘息の発作は、そのような個体が種々のストレス（例えば、ウイルスによる呼吸器の感染、運動、感情の乱れ、非特異的な要因（例えば、気圧または温度の変化）にさらされる、冷気もしくは刺激物質（例えば、ガソリンのにおい、新しい塗料、および有毒な臭気、またはタバコの煙）を吸入する、特定のアレルギー誘発物質にさらされる、および敏感な個体においてアスピリンまたは亜硫酸塩剤を摂取した際に、生じる場合がある。喘息がアレルギー誘発物質（ほぼ共通して、空中の花粉およびカビ、ハウスダスト、動物のふけ）によって突然生じ、その症状がＩｇＥによって媒介されるヒトは、アレルギー性または「外因性」喘息を有すると言われる。これらは、成人の喘息患者の約１０から２０％を占める；別の３０から５０％は症候性の症状の発現が、非アレルギー性の要因（例えば、感染、刺激物質、情緒的要因）によって引き起こされるようであり、これらの患者は、非アレルギー性または「内因性」喘息を有していると言われる。多くのヒトにおいては、アレルギー性の要因と非アレルギー性の要因のいずれもが深刻である。
【０１１７】
本発明の処置方法では、本発明の肺サーファクタントポリペプチドの少なくとも１つを有しているサーファクタント混合物が使用される。この処方物は、液体処方物であり得るか、または乾燥処方物であり得る。処方物は、吸入用に、例えば、エアロゾルとして、またはネブライザーによる投与のために、処方することができる。あるいは、処方物は液体のボーラス投与用に処方することができる。患者に投与される処方物の量は、通常、約１〜１００ｍｇ／用量、５〜２０ｍｇ／用量であり、例えば、１０ｍｇ／用量である。用量中の有効成分の量は治療有効量であり、例えば、約０．０１ｍｇから５０ｍｇの薬剤、または約０．０１ｍｇから５ｍｇの薬剤である。治療の有効性を最適にし、副作用を最小にするための用量についての調整については、喘息、肺の炎症、および／または喘息の症状を有しているヒト患者についての臨床的研究の動物モデルが含まれ得る、既知の手順にしたがって決定することができる。
【０１１８】
したがって、１つの実施形態においては、本発明では、本発明の肺サーファクタントポリペプチドを含む治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の喘息を処置するための方法が想定される。
【０１１９】
上記のように、本発明は、炎症性成分が含まれていないものを含む、種々の喘息症状を処置するために使用されることが有利である。喘息および関連する気管支の収縮の症状もまた、気管支拡張剤（例えば、アルブテロール、テルブタリン、サルメテロール、フォルモテロール、およびそれらの薬学的に許容される塩）を含むサーファクタント処方物を投与することによって処置できる場合もある。したがって、本発明の組成物にはまた、他の有用な薬剤、例えば、上記の気管支拡張剤、コルチコステロイド、抗喘息薬、ロイコトリエンモディファイヤー、抗生物質、痛みの治療薬、またはポリペプチド（例えば、サイトカイン、およびペプチドホルモン）を含めることもできる。
【０１２０】
（組成物）
本発明のサーファクタント混合物は、種々の許容される組成物に処方することができる。このような薬学的組成物は、哺乳動物宿主（例えば、ヒト患者）に対して、選択された投与経路（すなわち、肺による、または吸入経路による）に適合させられた種々の形態で投与することができる。
【０１２１】
ポリペプチドサーファクタントまたは他の化合物が、安定な毒性のない酸または塩基塩を形成するために十分に塩基性または酸性である場合は、塩としてのこのような化合物の、リン脂質を伴う投与が適切である場合もある。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容される陰イオン（例えば、トシレート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタミン酸塩、およびα−グリセロリン酸塩）を形成する酸を用いて形成された、有機酸付加塩である。適切な無機塩もまた形成させることができ、これには、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、当該分野で周知の標準的な手順を使用して、例えば、アミンのような十分に塩基性である化合物を適切な酸と反応させて生理学的に許容される陰イオンにすることによって、得られる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、またはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた作成される。
【０１２２】
ポリペプチドの薬学的に許容される塩としては、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される（ポリペプチドの遊離のアミノ基を用いて形成される）酸付加塩が挙げられる。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。
【０１２３】
一般的には、組成物中での本発明の肺サーファクタントポリペプチドの濃度は、約０．０１から１０重量パーセントのリン脂質である。
【０１２４】
しかし、一般的には、適切な用量は、１キログラムあたり約０．１から約３００ｍｇのリン脂質、または１キログラムあたり約０．１から約２００ｍｇのリン脂質、例えば、１日あたり体重１キログラムあたり約０．１から約１５０ｍｇのリン脂質まで、例えば、１日あたり体重１キログラムあたり１から約５０ｍｇのリン脂質まで、または、１日あたり体重１キログラムあたり３から９０ｍｇまでのリン脂質の範囲、または、１日あたり体重１キログラムあたり５から６０ｍｇまでのリン脂質の範囲であり、上記の割合（％）で、肺サーファクタントポリペプチドが含まれる。
【０１２５】
理想的には、肺サーファクタントポリペプチドおよびリン脂質は、喘息症状の最適な処置を達成するように投与されるべきである。所望される用量は、便利に、１回の用量の中に提示される場合も、また、適切な間隔（例えば、１日に２回、３回、４回、またはそれ以上の回数）で分けて投与される場合もある。分けられた用量自体を、例えば、別々のおおまかに間隔を空けた多数の投与に；例えば、吸入器からの複数回の吸入に、さらに分けることもできる。
【０１２６】
例えば、いくつかの実施形態においては、１〜２５ｍｇのリン脂質と０．０１から１０重量パーセントの肺サーファクタントポリペプチドを含む、エアロゾル化させられたサーファクタント混合物を、２〜３０分間にわたって肺の内部に堆積させることができる。必要であれば、気管支内の通気を増大させるために処置を繰り返すこともできる。
【０１２７】
本発明での使用が想定されるサーファクタントポリペプチドおよびリン脂質は、喘息または肺の炎症の症状の迅速な緩和が提供されるように、目的の部位（肺）に直接投与することができる。このような投与は、気管支肺胞洗浄、気管内投与、吸入、またはエアロゾル投与によって行うことができる。
【０１２８】
本発明の治療用組成物には、有効成分としてその中に溶解させられたかまたは分散させられた本明細書中に記載されるサーファクタント混合物と共に、生理学的に寛容である担体が含まれる場合もある。好ましい実施形態においては、治療用組成物は、治療目的のために哺乳動物またはヒト患者に投与された場合には、免疫原性ではない。
【０１２９】
その中に有効成分が溶解させられているか分散させられている薬学的組成物の調製は、当該分野において十分に理解されており、処方物に基づく制限は必要ではない。有効成分（肺サーファクタントポリペプチドおよびリン脂質）は、薬学的に許容される、有効成分と適合性である賦形剤と、本明細書中に記載される治療方法での使用に適している量で、混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、緩衝溶液など、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望される場合は、組成物には、有効成分の有効性を高める、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含めることができる。
【０１３０】
液体の担体の例は、有効成分または水以外の物質を含まない滅菌の水溶液、または生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム緩衝液またはトロメタミン緩衝液のような緩衝液、生理食塩水、またはこれらの両方を含む滅菌の水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水または塩化ナトリウム強化トロメタミン緩衝液）である。なおさらに、水性の担体には、２つ以上の緩衝性の塩、さらには、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含めることができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態においては、液体の担体は、Ｔｈａｍ緩衝化システムである。これは、本質的には以下のように調製することができる。酢酸（ＡＲ  Ｓｅｌｅｃｔ，ＡＣＳ，Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）を使用して７．２±０．５のｐＨになるようにｐＨを調節した０．３７ｍｌのＴｈａｍ溶液（トロメタミン注射液、ＮＤＣ００７４−１５９３−０４、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）が、０．３３ｍｌの生理食塩水（０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．３０ｍｌの水（注射用滅菌水、ＵＳＰ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合される。溶液は、滅菌濾過によって滅菌することができる。
【０１３２】
１つの実施形態においては、リン脂質、拡散剤、および肺サーファクタントタンパク質の混合物を意味する「サーファクタント混合物」が調製される。サーファクタント混合物は、リポソーム懸濁液のような脂肪体処方物になるように処理することができる。サーファクタント処方物は、十分に定義されている脂肪体、例えば、サーファクタント混合物と有効な薬剤成分の両方を含む肺サーファクタントポリペプチド、脂質−結晶または無定形の脂肪体が配合されているリポソーム、有機溶媒または有機／水共溶媒、またはそのいくつが脂肪体形態であり、他の成分が溶質形態である分散物中の組成物の溶液を構成する場合がある。
【０１３３】
エアロゾル投与については、サーファクタント処方物の組成および構造要件は、それを、上記脂質および肺サーファクタントポリペプチド成分の全てを含む適切なエアロゾル粒子形態に変えることができるかまたはそのように処理することができることだけである。
【０１３４】
本発明によって想定される種々の処理工程をここで考慮すると、好ましくは脂肪体の水性懸濁液としてのサーファクタント処方物は、乾燥した塊を形成するように凍結乾燥させられ、これは次いで、１〜５μｍの大きさの範囲の空気動力学的中央粒子径を有している乾燥粉末粒子を含む組成物を形成するように、例えば、研磨することによって粉砕される。乾燥粉末粒子は、その後、保存され、そして吸入による処置に、または適切な溶媒中への懸濁に、粒子懸濁液としてのエアロゾル化のために適している、乾燥−粒子エアロゾルを生じるように、適切なエアロゾル化装置において使用される。
【０１３５】
別の実施形態においては、本発明では、使用者が制御することができるネブライザーまたはエアゾライザー（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）によって脂質サーファクタント形成させて、脂肪体形態のサーファクタント処方物を含む水滴エアロゾルとする処理が想定される。この実施形態のサーファクタント処方物の成分を、エアロゾル液滴中に懸濁させられている、規則構造、結晶状、または無定形の脂質粒子中に存在させることもできる。
【０１３６】
なお別の実施形態においては、サーファクタント処方物は、噴霧乾燥によって処理されて、１〜５μｍの大きさの所望される空気動力学的中央粒子径を有している噴霧乾燥させられた粒子とされる。噴霧乾燥させられた粒子は、その後、保存され、そして吸入治療のための、上記のようなエアロゾル化装置において使用者によって使用される。示されているように、粉末状粒子は、乾燥粉末エアロゾルとして投与することができ、また、粒子を水滴の形態にエアロゾル化するための水性媒体中に懸濁させることもできる。あるいは、液体の形態である適切なサーファクタント処方物、例えば、揮発性の生体適合性の液体中に含められている処方物の溶液または懸濁液を、形成された粒子が有効成分の治療的投与のためにすぐに吸入されるエアロゾル化プロセスにおいて形成させることもできる。
【０１３７】
上記のように、本発明の処方物は、溶液処方物として、または粒子処方物として、調製することができる。脂質成分または治療薬、あるいは両方を、水性溶媒、有機溶媒、または混合溶媒中に懸濁させられたリポソーム、結晶、または無定形の脂肪体の中に取り込ませることもできる。
【０１３８】
リポソーム（脂質小胞）の分散物は、例えば、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７−５０８，１９８０に詳細に記載されている技術のような、種々の技術によって行うことができる。本発明のリポソーム様サーファクタント組成物は、一般的には、滅菌されたリポソーム懸濁液である。これらのリポソームは、多区画であるかまたは多層小胞であるか、あるいは、単区画小胞、マクロ小胞であるか、あるいは、他のコロイド状形態である場合もある。多層小胞は通常、最も一般的である。多層小胞（ＭＬＶ）は、好ましくは滅菌条件下で、簡単な脂質膜水和技術によって形成させることができる。
【０１３９】
リポソーム様サーファクタント組成物を生産するための１つの方法には、選択されたリン脂質と共に有機溶媒中にサーファクタントポリペプチドを溶解させること、その後、得られた溶液を水性の緩衝溶液と混合することが含まれる。次いで、得られた分散液は透析されて、有機溶媒が除去される。あるいは、有機溶媒は蒸発および／または減圧することによって除去することもできる。このように作成された乾燥させられた脂質／ポリペプチド混合物は、水性緩衝システム中で再水和させられて、リポソームとされる（Ｏｌｓｏｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５５７：９−２３，１９７９）。
【０１４０】
適切な緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｔｈａｍ緩衝システムなどが挙げられ、使用される。Ｔｈａｍは、Ｔｒｉｓ、トロメタミン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても知られている緩衝剤である。種々の好ましい実施形態においては、組成物は約６．５〜８．０のｐＨ範囲を有する。
【０１４１】
リポソームは、選択された均一な孔の大きさを有しているポリカーボネート膜のシリーズを通じてリポソームの水性分散液を押し出すことによって大きさを等しくされる。膜の孔の大きさは、特に、調製物が同じ大きさの膜を通じて２回以上押し出される場合には、その膜を通じた押し出しによって生じさせられるリポソームの最も大きい大きさにほぼ対応する。このように生産されたリポソームは、０．０３から５ミクロンの範囲であり得る。ホモジナイゼーションおよび超音波処理の方法もまた、１００ｎｍ未満の平均の大きさになるようにリポソームの大きさを小さくするために有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，ＳＰＥＣＩＡＬＩＺＥＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ−ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｐ．Ｔｙｌｅ編，Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６７−３１６頁，１９９０）。
【０１４２】
リポソーム処方の前にリポソーム中に治療薬を取り込ませることが望ましい場合には、これは標準的な技術によって行われ得る。例えば、リポソームが脂質の水和によって形成される場合は、疎水性薬物は、水和させられる脂質混合物中に含めることができ、そして親水性薬物を水和溶液中に取り込ませることができる。親水性化合物、例えば、タンパク質の高いカプセル化効率は、逆蒸発相法を使用することによって得ることができる。ここでは、薬物を含む水性媒体が、部分的に蒸発させられた脂質構造に対して添加される。
【０１４３】
親水性薬物についての高いカプセル化効率を得るための別の方法は、溶媒の注入による方法であり、ここでは、揮発性有機溶媒（例えば、エーテル）中の脂質溶液が、薬物の水溶液中に注入される。高い脂質濃度になるように脂質溶液の持続的な注入を用いることにより、非常に高いカプセル化率（例えば、５０％以上）を得ることができる。
【０１４４】
溶媒の注入には、親水性薬物の水溶液または疎水性薬物の有機溶液の、脂質の共溶媒分散液（サーファクタント混合物成分を含む）への添加が含まれ、これには、水での希釈（ａｑｕｅｏｕｓ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）と有機溶媒の蒸発が同時に、またはその後に付随し、脂質粒子（例えば、薬物が取り込まれているかまたは薬物がカプセル化されているリポソーム）の塊が形成される。
【０１４５】
あるいは、さらに別の有効成分が、予め形成させられたリポソームに添加される場合もある。この場合には、サーファクタントポリペプチド−脂質混合物には、予め形成させられたリポソームが含まれる。化合物が疎水性化合物である場合は、化合物を、水相媒体の分配によって二重膜中に取り込ませるために、リポソームと単純に接触させることができる。イオン化可能な親水性および両親媒性化合物については、予め形成されたリポソームへの高い内部カプセル化を、利用することができる方法にしたがって、ｐＨまたは他のイオン勾配（例えば、アンモニア勾配）に対して薬剤をロードすることによって行うことができる。
【０１４６】
リポソームの処方物は、水滴形態でのエアロゾル化のためには、脂質分散液として保存することができ、また、リポソーム処方物は、凍結乾燥させ、粉末状にして、乾燥粉末エアロゾルとして投与することもできる。あるいは、リポソーム分散液を噴霧乾燥させて、粉末状エアロゾルとしての投与のための、粉末形態の乾燥させた脂質粒子を形成させることもできる。
【０１４７】
フリーズ・ドライ（凍結乾燥）は、溶液または懸濁液から乾燥粉末を作成するための１つの標準的な方法である。例えば、Ｆｒｅｉｄｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１１（１）：１１７−１２２，１９９３；Ｓａｒｂｏｌｏｕｋｉ，Ｍ．Ｎ．ａｎｄ  Ｔ．Ｔｏｌｉａｔ，ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５２（１）：２３−２７，１９９８を参照のこと。凍結乾燥後、乾燥させられたサーファクタント処方物は、例えば、研磨すること、または他の便利な手段によって粉砕されて、所望される大きさの粒子が形成される。
【０１４８】
最近では、液化気体の超臨界特性を利用する技術が、治療用タンパク質を含む微粒子および粉末の作成において使用されている（Ｎｉｖｅｎ，Ｒ．Ｗ．，：ＭＯＤＵＬＡＴＥＤ  ＤＲＵＧ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＷＩＴＨ  ＩＮＨＡＬＡＴＩＯＮ  ＡＥＲＯＳＯＬＳ：ＲＥＶＩＳＩＴＥＤ，Ａ．Ｊ．，Ｈｉｃｋｅｙ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。好ましい結晶傾向と、吸入の目的に適している特徴を有している粒子は、これらの方法によって調製することが出来る。例示的な超臨界液体処理技術としては、超臨界流体急速膨張法（ＲＥＳＳ）、粒子を調製するためのｇａｓ−ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ（ＧＡＳ）沈降の使用、および超臨界流体の溶液によって促進される分散（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ）（ＳＥＤＳ）が挙げられる（米国特許第５，３０１，６４４号；同第５，７０７，６３４号；同第５，７７０，５５９号；同第５，９８１，４７４号；同第５，８３３，８９１号；同第５，８７４，０２９号、および同第６，０６３，１３８号を参照のこと）。
【０１４９】
噴霧乾燥もまた、所望される大きさの乾燥脂質粒子を得るために有利に使用することができる（Ｍａｓｔｅｒ，Ｋ．，ＳＰＲＡＹ  ＤＲＹＩＮＧ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ，第５版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｍａａ，Ｙ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５（８）：７６８−７７５，１９９８；Ｍａａ，Ｙ．Ｆ．，Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２（３）：２１３−２２３，１９９７を参照のこと）。種々の噴霧乾燥方法が特許文献に記載されている。例えば、米国特許第６，１７４，４９６号；同第５，９７６，５７４号；同第５，９８５，２８４号；同第６，００１，３３６号；同第６，０１５，２５６号；同第５，９９３，８０５号；同第６，２２３，４５５号；同第６，２８４，２８２号；および同第６，０５１，２５７号を参照のこと。
【０１５０】
使用することができる１つの噴霧乾燥装置は、乾燥タンクを有しているサイクロン乾燥機である。液体混合物が乾燥タンクに入れられ、温熱ガス（例えば、空気または窒素）、あるいは他の不活性ガスが、タンクの上部に入れられる。供給された液体は、タンクに入ると細分化され、それがタンクの底に移動するにつれて温熱ガスによって乾燥させられ、そこから回収ユニットへと移動させられる。既知の処理パラメーターにしたがい、溶媒、注入速度、および温熱ガスの流速を、所望される大きさの乾燥粒子を生じるように調節することができる。この場合には、例えば、１〜５μｍの範囲の平均流体力学的直径を有している粒子を使用することができる。この手順では、乾燥温度は少なくとも約３７℃であり、好ましくは、４０℃以上であり、１００℃をはるかに上回る場合もある。回収チャンバー内の温度は、加熱された空気の温度よりも実質的に低い。
【０１５１】
疎水性薬物または親水性薬物は、サーファクタント混合物成分をもまた含む適切な共溶媒溶液に添加することができる。得られる混合液は噴霧乾燥させられて、バルクの粉末処方物において所望される大きさの乾燥粒子を生じる。これらの粒子は、その後、パッケージされ、肺に乾燥粒子を投与するためにエアゾライザーにおいて使用されるまで、好ましくは、乾燥条件下で保存される。
【０１５２】
種々の形態を有している無定形粒子と、十分に規定された結晶状の形状を有している結晶状粉末粒子の両方を、粒子の大きさが大きすぎない限りは、利用することができる。いずれのタイプの粒子も本発明に適しているが、粒子は、一旦形成されると、最初の状体で維持されることが好ましい。なぜなら、２つの状体の間の移行は、有効な薬学的成分の化学的および物理的安定性に影響を及ぼす可能性があり、そして吸入装置から分散させられて脱凝集させられる粉末の能力に直接影響を与える可能性があるからである。これらの変化はまた、粒子の薬物動態特性にも影響を与える場合がある。一般的には、結晶形態に移行しやすい無定形粉末の傾向に影響を与える要因としては、湿度、親水性物質の存在、不純物、温度、および時間が挙げられる。結晶状態に移行しやすい無定形粒子の傾向を減少させることができる要因は、タンパク質およびポリマー、ならびに疎水性物質の存在である。移行に影響を与えるこれらのいくつかの要因のうち、最も重要なものは、温度と湿度であり、エアロゾル化の前に適度な保存温度下で乾燥状態で、粒子を保存する必要性が強調される。
【０１５３】
懸濁させられたまたは乾燥させられた粒子を形成する方法にかかわらず、粒子は、１〜５マイクロンの範囲の所望されるＭＭＡＤを生じる条件下で形成される。粒子が肺サーファクタントポリペプチド（単数または複数）を肺の奥深くまで保有しておくことが意図される（例えば、肺の深部組織が罹患している喘息の肺症状の処置のために）場合は、粒子は、好ましくは、１〜３、または１〜２マイクロンの範囲のＭＭＡＤの大きさの範囲であることが圧倒的に好ましい。肺サーファクタントポリペプチドの投与が気道を標的とする場合は、より大きい粒子の大きさ、例えば、３〜５のＭＭＡＤの大きさの範囲がより適切である場合もある。
【０１５４】
処方物がリポソームまたは他の脂質粒子の水性懸濁液である場合は、種々の市販されているネブライザーを使用して、所望されるエアロゾル粒子を得ることができる。通常は、ネブライザーの操作は、約１０〜５０ｐｓｉｇの圧力で行われ、形成される水性粒子は通常、約２〜６マイクロンの範囲である。装置を、既知の操作変数にしたがって、規則的な品質のエアロゾル化させられたリポソームまたは脂質をベースとするリポソームを生じるように制御することもできる。
【０１５５】
リポソームの水性分散液、好ましくは、約２５％〜３０％未満の容積のカプセル化された水を含む比較的うすい分散液のエアロゾル化に適している別の装置では、担体である流体を水性の粒子の細かい霧になるように細分化するために、超音波エネルギーが使用される。超音波ネブライザー装置は、その粒子の大きさが、圧縮空気ネブライザーによって形成される粒子の大きさ（すなわち、約２〜６マイクロン）とほぼ同じである、リポソームエアロゾルの霧を生じることが明らかにされている。
【０１５６】
水溶性の、リポソームを透過できる薬物の投与のために使用されるタイプの濃縮されたリポソーム分散液をエアロゾル化するためには、分散液は最初に担体溶媒と混合されて、エアロゾル化することができる希釈された分散液が形成される。担体溶媒は、水性媒体であり得、この場合、分散液は、例えば、圧縮空気型ネブライザーまたは超音波型ネブライザーによって、噴霧に適している形態になるように希釈されるかまたは適応させられる。添加される添加物の量は、噴霧に適している分散液とするために十分な量であり、例えば、カプセル化された全量の約３０％未満を占める。分散液について、全分散物容量のうちの７０〜７５％が最初にカプセル化された容量であると仮定すると、所定の容量の分散液は、少なくとも１倍または２倍容量の希釈剤で希釈されなければならないことが理解され得る。
【０１５７】
あるいは、サーファクタント成分は、適切な揮発性の生体適合性溶媒（例えば、以下に記載されるもの）中に溶解または懸濁させることができ、そして（ｉ）噴霧乾燥させられた粒子の最初の形成を生じ、そして（ｉｉ）形成されたばかりの粒子の肺への吸入を導く条件下で、適切なエアゾライザー装置から噴霧される。
【０１５８】
このセクションでは、乾燥させられた脂質粒子の空気中に浮遊する懸濁物を生じるように設計された種々の内蔵型投与装置が記載される。本明細書中で定義される場合は、「内蔵型」は、圧縮されたフルオロクロロカーボン高圧ガスの放出によるか、または使用者による装置を通じた、もしくは使用者により装置の内部に作られた吸い込まれる空気の流れによるかのいずれかで作成された、圧力差によって推進される内蔵型装置において粒子のエアロゾルが作られることを意味する。従来の乾燥粉末用の電気で動くエアゾライザーもまた適している。
【０１５９】
液体粒子／高圧ガス懸濁物もまた、高圧ガス中に懸濁させられる定量の乾燥させられた脂質粒子を投与するための、従来の加圧型高圧ガス噴霧装置とともに、本発明において利用することができる。このシステムには適切な高圧ガス中の脂質粒子（例えば、リポソーム）の持続性懸濁液が必要であるので、懸濁液の脂質粒子と高圧ガス成分は、保存の際の安定性について選択されなければならない。
【０１６０】
いくつかのフルオロクロロカーボン高圧ガス溶媒が、内蔵型吸入装置について使用、または提案されている。代表的な溶媒としては、「Ｆｒｅｏｎ  １１」（ＣＣｌ３Ｆ）、「Ｆｒｅｏｎ  １２」（ＣＣｌ２Ｆ２）、「Ｆｒｅｏｎ  ２２」（ＣＨＣｌＦ２）、「Ｆｒｅｏｎ  １１３」（ＣＣｌ２ＦＣＣｌＦ２）などが挙げられる。脂質−粒子／高圧ガス懸濁液を形成させるためには、乾燥させられた脂質粒子が選択された高圧ガスまたは高圧ガス混合物に、全高圧ガスに対して約１から３０重量パーセント、好ましくは、約１０〜２５重量パーセントの最終脂質粒子濃度になるように添加される。薬物が高圧ガス懸濁液の乾燥脂質粒子中にカプセル化されたままである水溶性化合物である場合には、高圧ガス中の脂質粒子の最終濃度は、所定のエアロゾル懸濁液の容量において、選択された定量の薬物を生じるように調節される。したがって、例えば、リポソームが１ｍｇの乾燥リポソーム調製物あたり０．０５ｍｇの肺サーファクタントポリペプチドを含むように処方され、投与される薬物の選択された用量が１ｍｇである場合は、懸濁液は、１エアロゾル用量あたり２０ｍｇの乾燥リポソームを含むように処方される。
【０１６１】
脂質可溶性薬物が処方物中に含められる、すなわち、これが高圧ガス溶媒中に容易に溶解するものである場合は、２つの処方アプローチが可能である。第１のアプローチにおいては、薬物が最初に、乾燥脂質粒子を形成させることにおいて使用される脂質中に含められ、次いでこれらは、上記のように、高圧ガスの容量あたり選択された濃度の薬物を生じる量で高圧ガスに添加される。あるいは、薬物を最初に、選択された薬物濃度で溶媒に添加することもできる。この処方物中の脂質粒子は、「空」の乾燥粒子であり、これは、エアロゾルの形成および溶媒の蒸発の間に薬物についての脂質貯蔵庫としての役割を果たす。空の脂質粒子の最終濃度は、定量の薬物を保持するために適している便利な全脂質用量を生じるように調節される。
【０１６２】
高圧ガスへの脂質−粒子の取り込みもまた、本発明において利用することができる。このシステムでは、定量の肺サーファクタントポリペプチドを含む乾燥させられた脂質粒子が、脱水された形態で送達パケットの中に予めパッケージされる。パケットは、高圧ガス噴霧装置とともに使用されて、空気中に浮遊しているリポソーム粒子の懸濁物中にパケットのリポソーム内容物を噴出させる。
【０１６３】
空気中への脂質−粒子の取り込みもまた、本発明において利用することができる。第３のタイプの送達システムでは、乾燥させられた脂質粒子を取り込むための使用者による吸入によって生じる空気の流れが使用され、使用者の呼吸管の内部にこれらを引き込ませる。操作においては、パケットはノズルに、好ましくは、上記のパケットの「内部」末端のシールを破裂させる様式で、取り付けられ、パケットの他方の末端はシールされてはいない。ここで、使用者は彼または彼女の唇をマウスピースの上に載せ、力強く吸入して、吸入器の中に、および吸入器の中のパイプを通じて空気を迅速に吸い込む。パイプへ吸い込まれた空気はノズルで濃縮され、高速の気流が生じる。これによりパケットの外側、および対流領域に脂質粒子が移動する。気流および取り込まれたリポソームはパドル上にぶつかり、これによって循環、および上昇気流が生じる。したがって、脂質粒子はさらに均一に分布させられ、より広い断面積にまで広がり、直後に、吸入により使用者の呼吸菅に取り込まれる。
【０１６４】
あるいは、脂質粒子は、分散させるために必要な力を提供する装置の内部に保持され、そして患者の呼吸による吸入とは無関係に粉末をエアロゾル化することができる。吸入の操作における投与のタイミングもまた、投与システムに組み込まれているセンサーによって制御することができる場合がある。
【０１６５】
１つの実施形態においては、組成物は、脂質ボーラス投与によって投与することができる。例えば、気管チューブが、肺組織に組成物の液滴を投与するために挿入される場合もある。いくつかの実施形態においては、ボーラス投与は、肺の１箇所に対する投与であって、他の場所に対するものではない場合があり、また、肺の種々の部位を様々なタイミングでボーラス点滴投与によって処置することもできる。
【０１６６】
なお他の実施形態においては、組成物は、肺洗浄によって投与することができる。肺洗浄を行うための手順は、当該分野において利用することができる。例えば、米国特許第６，０１３，６１９号を参照のこと。これは、引用により本明細書中に組み入れられる。例えば、肺洗浄は以下のように行うことができる：
ａ）調節された圧力、好ましくは、約４から２０ｃｍの水で、哺乳動物の肺切開部に人工呼吸器を用いて呼気終末陽圧呼吸（ＰＥＥＰ）を行う工程；
ｂ）１つ以上の肺葉または肺切片に薬学的に許容される水性媒体中に希釈されたサーファクタントポリペプチドを含む洗浄用組成物を染み込ませる工程；そして
ｃ）好ましくは、約２０から１００ｍｍの水銀柱の陰圧を使用して、気管−気管支の吸い込みの短い間隔を使用して、生じた肺の液体を肺から除去する工程。
【０１６７】
通常、染み込ませる工程（ｂ）の前に予め選択される時間（好ましくは、約３０分まで）のＰＥＥＰが行われ、さらに、ＰＥＥＰは、通常、工程（ｂ）と（ｃ）の間、および除去工程（ｃ）の後に予め選択された時間（好ましくは、約６時間まで）、継続して行われる。
【０１６８】
以下の実施例は、本発明を説明するために意図され、限定するようには意図されない。
【実施例】
【０１６９】
（実施例１）
（サーファクタントタンパク質／ポリペプチドの調製）
本発明のサーファクタントポリペプチド（例えば、ＫＬ４）の合成は、種々の公知の合成方法にしたがって行うことができる。以下の手順を例として記載する。
【０１７０】
あるいは、以下の手順もまた、本明細書中に記載したように使用する。サーファクタントペプチドのバッチ（例えば、ＫＬ４ペプチドのバッチ）を合成することにおいて有用である化学物質および試薬としては、以下が挙げられる：
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン（Ｃ１−Ｚ）ＰＡＭ−樹脂（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；
ａ−Ｂｏｃ−ε−（２−クロロ−ＣＢＺ）−Ｌ−リジン（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−Ｈ２Ｏ（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ；Ｂａｃｈｅｍ）；
ジクロロメタン（ＤＣＭ；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，またはＦｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）；
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ）；
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＭＩ）；
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）；
ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ；Ａｌｄｒｉｃｈ）；
Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；Ｂｕｒｄｉｃｋ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）；
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ；Ａｌｄｒｉｃｈ）；
１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；Ａｌｄｒｉｃｈ）；
酢酸無水物（Ａｃ２Ｏ；Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；および
フッ化水素（ＨＦ；Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）。
【０１７１】
ＫＬ４ペプチド（配列番号１）を合成する１つの手段は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を使用してＣｏｕｐｌｅｒ  ２９６  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｖｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上で行われる。「典型的な」合成を以下に記載する。鎖の伸張は、１００ｇのリジン  ＰＡＭ−樹脂上で、以下の表２に記載する手順によって行った。工程７、１０、および１１を除く全ての工程を、自動で行った。
【０１７２】
【表２】
2007513180.tif 000014
ペプチド樹脂が脱保護されたと同時に、適切なアミノ酸誘導体が生じた。適切なアミノ酸を１リットルのＮＭＰに溶解させた。透明な溶液を得た後、ＨＯＢｔを溶液に添加した。ＨＯＢｔを溶解させる際に、ＤＣＣを溶液に添加した。この溶液を、室温で１時間攪拌しながら置いた。この１時間の攪拌の間に、副生成物であるジシクロヘキシル尿素（白色の沈殿）が形成された。この副生成物を、Ｗｈａｔｍａｎの＃１濾紙を使用してブフナー漏斗によって濾過し除去した。その後、濾液を、工程７において手作業でＶｅｇａ  ２９６反応容器の内容物に添加した。
【０１７３】
次いで、合成装置を、工程Ｎｏ．９の完了後に停止するようにプログラムした。ペプチド樹脂のアリコートを、Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ使用者マニュアル、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａ）の定量的ニンヒドリン試験に供した。カップリング効率は、全合成を通じて良好であった。未反応のペプチド樹脂を、ロイシン１２（サイクル９）の後、およびロイシン５（サイクル１６）の後でアセチル化した。それぞれのアセチル化の後、ペプチド樹脂をジクロロメタンで洗浄した（表２、工程１１を参照のこと）。
【０１７４】
合成の最後に、完了したペプチド樹脂を、プログラムの工程１〜３を完了することによって脱保護（Ｂｏｃ基の除去）した（表２）。脱保護したペプチド樹脂を、その後、十分な容量の無水エタノールで洗浄し、Ｐ２Ｏ５上で減圧下で乾燥させた。乾燥した脱保護されたペプチド樹脂の重量は２５６．４８グラムであった。バッチを、０．６４ｍｍｏｌｅ／グラムの置き換えの１００ｇのｔ−Ｂｏｃ−リジン（Ｃｌ−Ｚ）ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を使用して開始したので、負荷は６４ｍｍｏｌに相当した。最初の１００グラムの樹脂を差し引くと、得られた重量は１５６．４８グラムであった。新生の保護されたペプチドの分子量（樹脂上に繋がれたＣ末端リジンを除く）は３０１１．６０４ｇ／ｍｏｌであった。
【０１７５】
ＨＦの切断。ペプチド樹脂の２５６．４８グラムのロットを、３つの大きなアリコートにおいてフッ化水素（ＨＦ）で処理した。Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）のＶ型ＨＦ−Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｐｐａｒａｔｕｓを、液体フッ化水素を使用するペプチド樹脂の切断に使用した。アニソールを、使用する前に蒸留させた。ＨＦは何ら処理することなく使用した。ドライアイス、イソプロパノール、および液体窒素が、冷却目的のために必要であった。
【０１７６】
最初のＨＦについては、およそ８８ｇのＫＬ４ペプチド樹脂を、磁気攪拌バーを入れた１リットルの反応容器に入れた。２５ｍｌの蒸留したアニソールをペプチド樹脂に添加した。システム全体を組立てて、漏れをチェックした後、ＨＦを全体量が約３００ｍｌになるまで反応容器の中に凝縮させた。樹脂からのペプチドの切断を、−４℃で１時間行った。ＨＦの部分的な除去は、１〜２時間、水流吸引機で行った。１〜２時間後、残りのＨＦを高真空（機械的減圧ポンプ）によって１〜２時間かけて除去した。反応容器の温度は、ＨＦの除去プロセスの間を通じて、−４℃に保った。
【０１７７】
その後、ＨＦ装置を大気圧と平衡にし、油状のスラッジを、反応容器の底に見つけた。冷却した無水エーテル（７００ｍｌ、−２０℃にあらかじめ冷却しておいた）を反応容器の内容物に対して添加した。樹脂のクランプを、ガラス製のロッドを使用して、エーテルとともに挽いて粉末状にした。樹脂を沈ませた後、エーテルをデカントした。その後、樹脂を５００ｍｌの室温の無水エーテルで洗浄し、約５分間攪拌した。樹脂を沈ませた後、エーテルをデカントした。樹脂が自由に流動化するまで、樹脂を洗浄した（全部で４〜５回の洗浄）。樹脂をドラフトの中において一晩乾燥させた。
【０１７８】
次いで、得られた乾燥させたＨＦ処理した樹脂の重さを測定し、冷凍庫で保存した。１．０２１グラムの乾燥させたＨＦ処理した樹脂を取り出し、５０ｍｌの５０％酢酸／水で抽出し、３０分間攪拌した。樹脂を、粗い焼結ガラス漏斗を通じて濾過し、濾液を凍結乾燥ビンに回収した。濾液をおよそ２００ｍｌの水で希釈し、シェル凍結させ（ｓｈｅｌｌ  ｆｒｏｚｅｎ）、そして凍結乾燥機上に置いた。１グラムの抽出したＨＦ処理した樹脂により、５６９ｍｇの粗ペプチドが得られた。以下の表（表３）に、残っているＫＬ４ペプチド樹脂の大規模なＨＦ処理をまとめる。全てのＨＦ処理した樹脂を冷凍庫で保存した。
【０１７９】
【表３】
2007513180.tif 000015
精製。ペプチドを、Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｂ分配ＨＰＬＣ（Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）を使用して精製した。このユニットを、Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２０４分光光度計と、Ｋｉｐｐ  ａｎｄ  Ｚｏｎｅｎデュアルチャンネル記録装置に接続した。この分配ＨＰＬＣを、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４サポート、１５〜２０ミクロンが充填されている放射状に圧縮された１０×６０ｃｍのカートリッジと、３００Ａの孔の大きさ（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を含む、Ｗａｔｅｒｓ  ＫＬ２５０  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と繋いだ。溶媒「Ａ」は、水中の０．１％のＨＯＡｃから構成され、溶媒「Ｂ」は、アセトニトリル中の０．１％のＨＯＡｃから構成される。流速を４００ｍｌ／分に設定し、カートリッジを、１５０〜２００ｐｓｉに圧縮し、そして分配ＨＰＬＣシステムの逆圧を５５０〜６００ｐｓｉとした。
【０１８０】
最初のＤｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒの実行のために、ＨＦ＃１より、２０ｇのＨＦ処理した樹脂を、５００ｍｌの氷酢酸中で５分間抽出した。水（５００ｍｌ）を、樹脂／酢酸混合物に添加した。この５０％の酢酸／水溶液をさらに２５分間攪拌した。樹脂を、粗い焼結ガラス濾過器で濾過し除いた。ペプチドを含む濾液を取り、Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒにロードした。使用したＨＰＬＣ勾配は、４５分間において１〜４０％の「Ｂ」であり、その後、７分間はそのまま（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）維持した。この時点で、パーセント「Ｂ」は、１分間に１％上昇し、最終的なパーセントは４４％になった（示さない）。
【０１８１】
画分を手作業で回収し、ＨＰＬＣによって分析した。≧９５％の純度を満たす全ての画分を一緒にプールし、大きなガラス製の容器の中で保存した。以後、この物質を、「ＢＰＳ＃１」と呼ぶ。所望される成分を含むが、９５％以上の純度を満たさない全ての画分を回収し、その後リサイクルした。少なくとも１０回のさらなる分配ＨＰＬＣの実行を、Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒユニット上で行った（データは示さない）。
【０１８２】
逆浸透、凍結乾燥。全量のＢＰＳ＃１はおよそ６０リットルであった。逆浸透を使用して、２リットルの最終容量となるようにペプチド溶液を濃縮した。ペプチドを保持するためのＲ７５Ａ膜を含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｏｄｅｌ  ６０１５逆浸透ユニットを使用した。得られた２リットルのＢＰＳ＃１を、２枚のＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙を使用してブフナー漏斗を通じて濾過し、およそ１１個の凍結乾燥ビンに分け、等量の水で希釈した。凍結乾燥ビンを、シェル凍結させ（ｓｈｅｌｌ  ｆｒｏｚｅｎ）、そして凍結乾燥させた。この手順の最後には、乾燥ＫＬ４ペプチドの全量は４０．２５ｇであった。
【０１８３】
再凍結乾燥。種々の凍結乾燥条件（例えば、ペプチド濃度、凍結乾燥させられる溶媒の組成、凍結乾燥工程の長さ、庫の温度など）により、種々の溶解特性を有している乾燥させられた調製物を得ることができることを見出した。乾燥ＫＬ４ペプチドは、１ｍｇ／ｍｌのクロロホルム：メタノール（１：１）溶液中に可溶であり、１０ｍｇ／ｍｌで≧９０％可溶であることが望ましい。これらの基準が、上記の凍結乾燥工程の最後で満たされていない場合は、ペプチドを再度凍結乾燥することができる。
【０１８４】
典型的な再凍結乾燥を以下に記載する。およそ５ｇのペプチドを、ガラスフラスコ中の２リットルのアセトニトリルに対して攪拌しながらゆっくりと添加する。およそ１分後、３リットルのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加し、その後、５０ｍｌの酢酸（最終酢酸濃度＝１％）を添加する。これを、３７℃で３日間攪拌し、ブフナー漏斗中でＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙を通じて濾過し、凍結乾燥ビンに入れる。次いで、これをドライアイスとイソプロピルアルコールを使用してシェル凍結させ（ｓｈｅｌｌ  ｆｒｏｚｅｎ）、そして凍結乾燥装置上に置いた。凍結乾燥時間を、３日から７日までで変化させた。その後、最終的な乾燥産物の重さを測定し、パッケージし、可溶性の分析および化学的分析のために等量に分けた。
【０１８５】
（実施例２）
（モデルサーファクタント混合物の調製）
材料。１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ），およびパルミチン酸（ＰＡ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手した。アミノ酸配列ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫ（配列番号１）を有するＫＬ４ポリペプチドは、本明細書中に記載したように合成したか、またはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，（Ｄｏｙｌｅｓｔｏｗｎ，ＰＡ）から入手した。使用した全ての塩、緩衝液、および有機溶媒は、利用できる限り高品質のものであった。
【０１８６】
以下の式に基づく組成を有している、４０ｍｇ／ｍＬの全リン脂質を含むサーファクタント組成物のストック溶液を処方した：
ＰＬＴ＝全リン脂質＝ＤＰＰＣ＋ＰＯＰＧ
３  ＤＰＰＣ：１  ＰＯＰＧ
１  ＰＬＴ：０．１５  ＰＡ：０．０２７  ＫＬ４ペプチド。
【０１８７】
上記の式を使用して、全リン脂質１ｍＬあたり２．５から３０ｍｇで、種々の量のパルミチン酸（ＰＡ）およびＫＬ４ペプチドを含むサーファクタント組成物を作成した（表４）。
【０１８８】
【表４】
2007513180.tif 000016
モデルサーファクタント混合物を以下のように作成した。ＫＬ４ペプチド（９ｍｇ）、ＤＰＰＣ（２２５ｍｇ）、ＰＯＰＧ（７５ｍｇ）、およびＰＡ（４５ｍｇ）を、２．５ミリリットル（ｍｌ）の９５％エタノール中に４５℃で溶解させた。次いで、この溶液を７．５ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏに４５℃で、迅速にボルテックスしながら添加し、２ｍｌの５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．２）を添加した。得られた乳状の懸濁液を３７℃で１５分間攪拌し、その後、存在するエタノールを、１００倍量の１３０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．２）緩衝液に対して、３７℃で、透析（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ  ２；１３，０００ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフ）によって除去した。透析を、透析溶液を２回交換して、４８時間続けた。
【０１８９】
加えて、組成物にはさらに、最終産物１ｍＬあたり以下の組成を有している緩衝システム／懸濁液を含めることができる（表５）。
【０１９０】
【表５】
2007513180.tif 000017
このＴｈａｍ緩衝化システムを、本質的には以下のように調製した。７．２±０．５のｐＨとなるように酢酸（ＡＲ  Ｓｅｌｅｃｔ，ＡＣＳ，Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）を使用してｐＨを調節した０．３７ｍｌのＴｈａｍ溶液（トロメタミン注射液、ＮＤＣ  ００７４−１５９３−０４、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を、０．３３ｍｌの生理食塩水（０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．３０ｍｌの水（注射用滅菌水、ＵＳＰ、Ａｂｂｏｔｔ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合した。溶液を滅菌濾過した。
【０１９１】
（参考文献）
【０１９２】
【化２】
2007513180.tif 000018
【０１９３】
【化３】
2007513180.tif 000019
本明細書中に引用されるか、または記載される全ての特許および刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルの指標であり、各々のこのような引用される特許または刊行物は、あたかもそれらが個々にその全体を引用により本明細書中に組み入れられているか、またはその全体において本明細書中に示さているかのように、同じ程度に引用により本明細書中に組み入れられる。出願人らは、本明細書中に、任意のこのような記載されている特許または刊行物からの任意の、および全ての物質および情報を物理的に組み込む権利を有する。
【０１９４】
本明細書中に記載されている特定の方法および組成物は、好ましい実施形態の代表的例であり、本発明の範囲の制限とは意図されない。他の目的、態様、および実施形態は、本明細書を考慮すると当業者に明らかにされ、そして特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に含まれるであろう。種々の置き換えおよび修飾を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書中に開示された本発明に対して行うことができることは、当業者に容易に明らかであろう。本明細書中に適切に例示的に記載されている本発明は、本明細書中で必須であるとは具体的に開示されていない、任意のエレメント（単数または複数）、または制限（単数または複数）が存在しない条件下で行うことができる場合もある。本明細書中に例示的に記載されている方法およびプロセスは、異なる順序の工程で行うことができる場合もあり、そしてこれらは、本明細書または特許請求の範囲において示されている工程の順序に必ずしも限定されない。本明細書中、および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他のものが明確に示されていない限りは、複数形についての言及も含まれる。したがって、例えば、「宿主細胞」との記載には、複数の（例えば、培養物または集団）そのような宿主細胞などが含まれる。いかなる状況でも、本特許は、本明細書中に具体的に開示されている特定の実施例または実施形態または方法に限定されるように解釈されることはない。いかなる状況でも、本特許は、たとえそのような記述が具体的であり、出願人による応答の記載において明確に採用される的確性および制限を伴わなくても、特許商標庁のいずれの審査官または任意の他の職員または従業員によってなされる何らかの記述によって限定されるように解釈されることはない。
【０１９５】
使用されている用語および表現は、限定ではなく記述として使用され、そして示され、記載されている特徴、あるいはその一部の全ての等価物を排除するためのそのような用語および表現の使用する意図はないが、請求される本発明の範囲内で種々の変更を行うことが可能であることは理解される。したがって、本発明は好ましい実施形態と最適な特徴によって具体的に開示されているが、開示される本明細書中の概念の変更およびバリエーションは、当業者によって行われることが出来、またそのような変更およびバリエーションが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれると考えられる。
【０１９６】
本発明は、本明細書中で広く、そして一般的に記載されている。一般的な開示に含まれるより細かな種のそれぞれと、亜種のグループ分けもまた、本発明の一部を形成する。これには、削除された物質が本明細書中に具体的に記載されているかどうかにはかかわらず、その属に由来する任意の対象を除くか、またはそれを除くようにネガティブに制限される限りは、本発明の一般的に記載を含む。
【０１９７】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特徴または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈグループに関して記載されている場合には、本発明は、Ｍａｒｋｕｓｈグループの任意の個々のメンバー、またはＭａｒｋｕｓｈグループのメンバーのサブグループに関しても記載されることが、当業者に理解されるであろう。
【配列表】
2007513180000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月25日(2006.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007513180000001.app
【国際調査報告】
2007513180.tif 000033
2007513180.tif 000034
2007513180.tif 000035
2007513180.tif 000036