(57)【要約】  ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測するためのアルゴリズムを製造する方法。また提供されるのは、ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測する方法および、このようなアルゴリズムを使用して、特定の標的遺伝子の発現を阻害する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測するためのアルゴリズムの作成法であって：
ａ)少なくとも１個の標的遺伝子に相補的な配列を含む複数のＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を実験的に決定し；そして
ｂ)該データセットを使用して人工的神経網をトレーニングする
ことを含む方法。
【請求項２】
ＲＮＡｉ効力を、該標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量の測定により決定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡｉ効力をレポーター遺伝子アッセイにより決定する、請求項１また２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡｉ試薬がレポータータンパク質をコード化する融合ｍＲＮＡの３'−ＵＴＲをターゲティングする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
異なる融合ｍＲＮＡからのデータを標準化できる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１００個のＲＮＡｉ試薬、好ましくは少なくとも１０００個のＲＮＡｉ試薬の効力を決定する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該ＲＮＡｉ試薬の配列が無作為に選択されている、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該ＲＮＡｉ試薬の配列が、標的ｍＲＮＡと結合するのに十分な相補性を有する１５から３０ヌクレオチド長の領域を有する、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡｉ試薬の相補領域が標的遺伝子の対応領域に対して１個または数個のミスマッチを含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮＡｉ試薬がｓｉＲＮＡである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡｉ試薬がｓｈＲＮＡである、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡｉ試薬がｍｉＲＮＡである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかの方法により得られたアルゴリズム。
【請求項１４】
請求項１３記載のアルゴリズムを含む、コンピュータ読み取り可能貯蔵媒体。
【請求項１５】
請求項１３記載のアルゴリズムおよびコンピュータハードウェアを含み、コンピュータシステム。
【請求項１６】
ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測する方法であって：
ａ)ある標的遺伝子に対して相補性の領域を含む複数のＲＮＡｉ試薬配列を提供し；
ｂ)該ＲＮＡｉ試薬配列に対してトレーニングした請求項１３記載のアルゴリズムを神経回路網を使用して作動させ；そして
ｃ)有効であると予測されるＲＮＡｉ試薬配列(複数もある)を選択する
ことを含む、方法。
【請求項１７】
ある標的遺伝子の発現を阻害する方法であって：
ａ)ある標的遺伝子に対して相補性の領域を含む複数のＲＮＡｉ試薬配列を提供し；
ｂ)該ＲＮＡｉ試薬配列に対してトレーニングした請求項１３記載のアルゴリズムを神経回路網を使用して作動させ；
ｃ)有効であると予測されるＲＮＡｉ試薬配列(複数もある)を選択し；
ｄ)ｃ)で選択したＲＮＡｉ試薬(複数もある)を合成し；そして
ｅ)標的遺伝子を発現する細胞をｄ)のＲＮＡｉ試薬(複数もある)に暴露する
ことを含む、方法。
【請求項１８】
ｃ)で選択されたＲＮＡｉ試薬が一定の閾値を超える、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般にＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)の分野に、および特に人工神経回路網によりトレーニングしたアルゴリズムを使用した高いＲＮＡｉ効力のＲＮＡｉ試薬を得る方法に関する。
【０００２】
技術分野  Elbashirらが、合成短鎖干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)がＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)機構を介して、哺乳動物細胞における特異的ｍＲＮＡを下方制御する能力を証明してから［例えば、Elbashir et al., Nature, Vol. 411, pp. 494-498 (2001);およびCaplen et al., PNAS, Vol. 98, No. 17, pp. 9742-9747 (2001)参照］、この技術はある遺伝子の特異的下方制御により誘導される表現型の探索により遺伝子機能を研究するための研究ツールとして使用が増えてきている。特に、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉タイプの試薬の手段による遺伝子サイレンシング実験は標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部の知識しか必要しないないため、特定の生物のゲノムが既知になれば、例えば治療標的発見に関連する表現型のために、全ての遺伝子について、ＲＮＡｉ実験およびスクリーニングを設計することが予想可能である。このゲノム全体にわたるアプローチは、ＲＮＡｉ試薬の設計のための明細を決定する。実際、的外れのサイレンシングを避けるための特異性パラメーターが特に重要になってきている。また、個々のｓｉＲＮＡの効力についての特徴付けは、もはや予想可能である。結果として、効力予測アルゴリズムが、ゲノム全体にわたる表現型スクリーニングのためのＲＮＡ遺伝子サイレンシング実験の適用に必要である。
【０００３】
アンチセンスとの類似性、標的近接性がｓｉＲＮＡの効力に重要な役割を有することが示唆されている。Kretschmer-Kazemi et al., Nucleic Acids Res., Vol. 31, No. 15, pp. 4417-4424 (2003)参照。最近、他の研究［Anastasia Khvorova, Cell, Vol. 115, pp. 209-216 (2003)参照］が、アンチセンス鎖の５'およびアンチセンス鎖の領域９−１４の著しく内部安定性の低いｄｓＲＮＡのような、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ効力の引き金を引くのに必要ないくつかの配列を明らかにしている。これらの発見は、ｓｉＲＮＡ効力と二本鎖内在的熱力学的安定性の関係の統計学的解析により得られた。該研究は、３７５個の無作為に選択したｓｉＲＮＡの３個の異なる標的に対するｓｉＲＮＡ効力に基づいた。
【０００４】
ＲＮＡｉ機構が十分に特徴付けされておらず、多くの付加的パラメーターがｓｉＲＮＡ効力に影響し得るとの事実を考えて、配列−活性相関のより良い理解のために、より多くの機能的データセットを獲得することは有益であろう。
【０００５】
発明の概要
一つの局面において、本発明は、ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測するためのアルゴリズムを製造する方法であって：
ａ)複数のＲＮＡｉ試薬のレポータータンパク質読出しを下方制御する効力を実験的に決定し；そして
ｂ)該効力データセットを人工神経回路網のトレーニングに使用する
ことを含む方法に関する。
【０００６】
他の局面において、本発明は、本発明の方法により得たアルゴリズムに関する。
【０００７】
他の局面において、本発明は、ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測する方法であって：
ａ)ある標的遺伝子に対して相補性の領域を含む複数のＲＮＡｉ試薬配列を提供し；
ｂ)本発明に従いトレーニングした人工神経回路網を該ＲＮＡｉ試薬配列に適用し；そして
ｃ)有効であると予測されるＲＮＡｉ試薬配列(複数もある)を選択する
ことを含む、方法に関する。
【０００８】
他の局面において、本発明はある標的遺伝子の発現を阻害する方法であって：
ａ)ある標的遺伝子に対して相補性の領域を含む複数のＲＮＡｉ試薬配列を提供し；
ｂ)本発明に従いトレーニングした人工神経回路網を該ＲＮＡｉ試薬配列に適用し；
ｃ)有効であると予測されるＲＮＡｉ試薬配列(複数もある)を選択する；
ｄ)ｃ)で選択したＲＮＡｉ試薬(複数もある)を合成し；
ｅ)標的遺伝子を発現する細胞をｄ)のＲＮＡｉ試薬(複数もある)に暴露し；そして
ｆ)ＲＮＡｉ試薬または、標的遺伝子の下方制御により誘導され得る他の表現型の活性を測定する
ことを含む、方法を提供する。
【０００９】
図面の説明
図１：標準化データセットの例。ＹＦＰ  ｍＲＮＡの３'−ＵＴＲをターゲティングする７９個のｓｉＲＮＡを、レポーター融合ｍＲＮＡと共トランスフェクトした(Ｈ１２９９、５０nM、５０時間に読出し)。灰色棒は３'−ＵＴＲターゲティングｓｉＲＮＡ、黒色棒はポジティブおよびネガティブコントロールである。ネガティブコントロールは、任意に１０％効力と、ポジティブコントロールは９０％効力と設定した。各ｓｉＲＮＡ抗力をこれらのコントロールに従い標準化した。
図２：スクリーニングデータのフィルタリングを説明する。
図３：トレーニングしたセットについての予測対スクリーニングの比較。
図４：試験したセットについての予測対スクリーニングの比較。
図５：トレーニングセットのサイズからの予測−測定相関(試験セット上の)の依存性。
【００１０】
発明の詳細な記載
ここで引用する全ての特許出願、特許および文献は、その全体を引用により本明細書に包含する。
【００１１】
本明細書で使用する用語“ＲＮＡｉ試薬”および“オリゴリボヌクレオチド”は交換可能に使用され、リボ核酸(ＲＮＡ)またはデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)のオリゴマーまたはポリマーまたはそれらの模倣物を意味する。該ＲＮＡｉ試薬はまた修飾リボヌクレオチド残基を含み得る。適当な修飾は当分野で既知である。例えば、Uhlmann, Current Opin. Drug Discovery Dev., Vol. 3, No. 2, pp. 203-213 (2000);およびUhlmann and Peyman, Chem. Rev., Washington, DC, Vol. 90, No. 4, pp. 543-584 (1990)参照。用語ＲＮＡｉ試薬は一本鎖および二本鎖核酸分子の両方を含む。二本鎖核酸分子は、２個の別々の鎖から成るか、または二本鎖構造を形成できる２個の領域と、２個の領域の間にヘアピンループを形成するスペーサー領域を含む１個の鎖から成り得る。ＲＮＡｉの文脈で、該ＲＮＡｉ試薬は好ましくは二本鎖構造であり、標的遺伝子に相補的な配列を含む。しかしながら、本発明は二本鎖構造に限定されず、またＲＮＡｉを誘導できる一本鎖ＲＮＡｉ試薬を含む。Schwarz et al., Mol. Cell, Vol. 10, No. 3, pp. 537-548 (2002)参照。
【００１２】
第一の局面において、本発明はＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測するためのアルゴリズムを製造する方法であって：
ａ)複数のＲＮＡｉ試薬のレポータータンパク質読出しを下方制御する効力を実験的に決定し；そして
ｂ)該効力データセットを人工神経回路網のトレーニングに使用する
ことを含む方法を提供する。
【００１３】
一つの態様において、ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を予測するためのアルゴリズムを製造する方法は：
ａ)少なくとも１個の標的遺伝子に相補的な配列を含む複数のＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を実験的に決定し；
ｂ)ａ)で実験的に決定したＲＮＡｉ効力で該ＲＮＡｉ試薬の効力のデータセットを産生し、ここで、該データセットは得られたが、異なるターゲット(レポーター融合ｍＲＮＡ)が、特異的ポジティブおよびネガティブコントロールの手段により標準化可能な共通タンパク質読出しを有し；そして
ｃ)該読出しを使用して人工神経網をトレーニングする
工程を含む。
【００１４】
本発明の内容において、用語アルゴリズムは、データに自動的に提供でき、コンピュータ上で実行されるコードとして提供できる、一連の方程式および一連のルールを意味する。
【００１５】
“ＲＮＡｉ効力”または“効力”は専門用語であり、あるｓｉＲＮＡが、あるタンパク質またはｍＲＮＡを、それらのアッセイへのトランスフェクション後に下方制御する相対的能力を意味する。典型的に、ｓｉＲＮＡの効力は、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの測定により決定し、通常ネガティブコントロールのパーセントとして表される。故に、高い効力は、ＲＮＡｉ試薬が、標的遺伝子の発現を効率的に阻害する、すなわち低下させることができることを意味し、一方低い効力は標的遺伝子の発現が阻害されないかわずかにしか阻害されないことを意味する。有効なＲＮＡｉ試薬は標的遺伝子の発現をネガティブコントロールと比較して５０％を超えて、好ましくは６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、最も好ましくは９０％を超えて阻害する。
【００１６】
本発明のＲＮＡｉ試薬は、ＲＮＡｉ実験法に適したＲＮＡｉ試薬である。ＲＮＡｉに適当な様々なタイプのＲＮＡｉ試薬が当分野で既知である。Dykxhoorn et al., Nature Rev., Vol. 4, pp. 457-467 (2003)参照。このようなＲＮＡｉ試薬は、標的遺伝子に相補的な配列を含む。本発明の内容の範囲内で、標的遺伝子への相補性は、配列が、プレ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡを含む、標的遺伝子のＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡに相補性であることを意味する。用語“標的遺伝子”は、細胞、組織または生体内で発現される、すなわち、ＲＮＡに転写される全てのＤＮＡ配列を含むことを意図する。発現された配列は、必ずしもタンパク質に翻訳される必要はなく、例えばまたプレ−ｍＲＮＡ、制御ＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含む。標的遺伝子に相補的な配列は典型的に約１９−２３ヌクレオチド長であるが、またさらに長くてもよい。好ましくは、該相補配列は５０ヌクレオチド長未満、より好ましくは１５−３５ヌクレオチド長または１８−２５ヌクレオチド長である。該相補配列は、好ましくは標的遺伝子の対応配列と１００％同一であり、すなわち、該相補配列と標的遺伝子の対応配列の間に、ミスマッチが存在しない。ある態様において、該相補配列は、ミスマッチがＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ活性を無くさないならば、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のマッチを含み得る。ＲＮＡｉに使用するためのＲＮＡｉ試薬は、好ましくは二本鎖であり、２個の別々の鎖から成るが、ヘアピンループを形成する１個の鎖から成ってもよい。ＲＮＡｉ試薬の二本鎖ＲＮＡ領域はミスマッチおよびｍｉＲＮＡ様機構での機能を含み得る。ＲＮＡｉを仲介するＲＮＡｉ試薬のタイプの例は、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ(ｍｉｃｒｏＲＮＡ)もしくは小ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)である。
【００１７】
一段階で、本発明の方法に従い、複数のＲＮＡｉ試薬のＲＮＡ効力を、実験的に決定する。一般に、提供されるＲＮＡｉ試薬の数とアルゴリズムの品質の間に正の相関があるため、多数のＲＮＡｉ試薬を提供することは有利である。しかしながら、ＲＮＡｉ試薬合成およびＲＮＡｉ効力の実験的決定は高価で時間がかかるとの実際的理由のため、ＲＮＡ効力の実験的決定のためのＲＮＡｉ試薬の数をできるだけ少なく維持することが望まれ得る。しかしながら、ＲＮＡｉ試薬の数は、それ以下ではアルゴリズムが正確にトレーニングできない最小値以下であってはならない。好ましい態様において、少なくとも１０個のＲＮＡｉ試薬、少なくとも５０個のＲＮＡｉ試薬または少なくとも１００個のＲＮＡｉ試薬が提供され、より好ましい態様において少なくとも２００個のＲＮＡｉ試薬、少なくとも５００個のＲＮＡｉ試薬、少なくとも１０００個のＲＮＡｉ試薬または少なくとも２０００個のＲＮＡｉ試薬が提供される。他の好ましい態様において、１００００個未満のＲＮＡｉ試薬、好ましくは５０００個未満のＲＮＡｉ試薬またはより好ましくは３０００個未満のＲＮＡｉ試薬が提供される。他の好ましい態様において、該ＲＮＡｉ試薬は無作為に選択される。該ＲＮＡｉ試薬は重複していてもいていなくてもよく、好ましい態様において、該ＲＮＡｉ試薬は重複していない。該ＲＮＡｉ試薬は、標的遺伝子に相補性の領域を含む。数個のＲＮＡｉ試薬は、同じ標的遺伝子に相補性の領域を含み、重複し、または重複していない。一つの特定の態様において、全てのＲＮＡｉ試薬は、同じ標的遺伝子に相補性の領域を含み、重複し、または重複していない。他の態様において、該ＲＮＡｉ試薬は１個より多い標的遺伝子、好ましくは少なくとも２個の標的遺伝子、少なくとも５個の標的遺伝子または少なくとも１０個の標的遺伝子に相同性の領域を含む。
【００１８】
本発明の他の好ましい態様において、工程ａ)で提供されるＲＮＡｉ試薬配列を、ＲＮＡｉ特異性について前スクリーニングした。“ＲＮＡｉ特異性”または“特異性”は専門用語であり、本発明の内容においては、ＲＮＡｉ試薬の選択性、すなわち、ＲＮＡｉ試薬が、細胞、組織または生体中で発現される他の遺伝子の発現を阻害または減少することなく特定の標的遺伝子の発現を選択的に阻害または減少する能力に関する。理想的に、特異的ＲＮＡｉ試薬は標的遺伝子の発現のみを阻害し、細胞、組織または生体中で発現される全ての他の遺伝子の発現に影響を与えない。この目的のために、該特異的ＲＮＡｉ試薬は、有利に標的遺伝子に完全に相補性の配列、すなわち、標的配列に対してミスマッチなしの相補配列を含むが、該細胞または生体において発現される全ての他の遺伝子に完全に相補性の配列は含まず、すなわち、該相補配列は細胞、組織または生体で発現される標的遺伝子以外の全ての配列に対して少なくとも１個のミスマッチ、好ましくは少なくとも２個のミスマッチ、より好ましくは少なくとも３個のミスマッチを有する。ＲＮＡｉ試薬の特異性の前選択は、例えばコンピュータで目的のＲＮＡｉ試薬の配列を、ある細胞、組織または生物について、データベースで利用可能な全ての既知の発現配列と、配列比較のための適当なソフトウェアを使用して比較することにより行うことができる。
【００１９】
ＲＮＡｉ試薬のＲＮＡｉ効力を実験的に決定するのに適した多くの方法が当分野で既知である。一般に、ある標的遺伝子への相補領域を含む二本鎖ＲＮＡｉ試薬を、標的遺伝子を発現している細胞内にトランスフェクトする。トランスフェクションのために、例えばエレクトロポレーション、トランスフェクションの助剤としてのカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーの使用のような異なる方法を使用し得る。次いで、細胞を標的遺伝子を発現させる適当な条件下にインキュベートする。標的遺伝子の発現を、続いて、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような適当な技術を使用してまたはレポータータンパク質の測定により、測定する。好ましい態様において、レポーターをコードする融合ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡとコトランスフェクトする。好ましくは、標的ヌクレオチド配列をレポーターコード配列の３'−ＵＴＲに挿入する。すなわち、該標的は翻訳されず、その下流制御には生物学的影響はない。好ましい態様において、該レポータータンパク質は黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)である。他の態様において、ネガティブおよびレポーター特異的コントロール、すなわち、レポータータンパク質のコード領域をターゲティングし、それにより該レポータータンパク質を３'−ＵＴＲ挿入断片と無関係に同程度にサイレンシングするｓｉＲＮＡを使用し、各ｓｉＲＮＡで得られたレポータータンパク質の発現レベルと、ネガティブコントロールおよびレポーター特異的ポジティブコントロールの発現レベルの比較を可能にする。ｓｉＲＮＡの全てについて測定した発現レベルそれ自体を比較し、１個の単一均質データセットに貯蔵できる。基本的に、全ての種類の細胞をトランスフェクションに使用できるが、しかしながら、好ましい態様において、該細胞は真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞および最も好ましくはヒト細胞である。
【００２０】
各ｓｉＲＮＡとポジティブおよびネガティブコントロールで観察された阻害の比較により(標準化とも呼ぶ)、実験的に決定したＲＮＡｉ効力と相関する実験的効力スコアを、各ＲＮＡｉ試薬について創成し、実験のデータセットに編集できる読出しを導く。好ましい態様において、該実験的スコアをレポータータンパク質の測定により得る。好ましくは実験的読出しの全てのデータが、同じ条件下の１種の実験設定に由来する。該データは、好ましくは、ｍＲＮＡレベルではなくタンパク質レベルの測定に基づき、すなわち、標的遺伝子により発現されるタンパク質の量をＲＮＡｉ試薬の暴露に際して測定し、ｍＲＮＡの量ではない。本発明によりＲＮＡｉ効力を実験的に決定するための典型的実験設定は、下記実施例に記載する。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、レポーターアッセイをＲＮＡｉ活性の実験的決定に使用する。本発明に従うレポーターアッセイは、共通の実験的読出しで広範囲の一連の標的に対する多数のｓｉＲＮＡのスクリーニングを可能にする。このようなアッセイは、Huesken et al., Nucleic Acids Res., Vol. 31, No. 17, p. e102 (2003)に記載されている。簡単に言うと、完全長レポーター遺伝子と、３'−非翻訳領域に挿入された目的の標的領域を含むｍＲＮＡ融合転写産物構築物を提供する。例えば、ルシフェラーゼおよび蛍光レポーター遺伝子を構築物に使用できる。ＲＮＡｉ効力を試験すべきＲＮＡｉ試薬は、３'−非翻訳領域に挿入された目的の配列の相補鎖を含む。該ＲＮＡｉ試薬を、次いで適当なトランスフェクション法で、一過性にまたは構成的に該レポーター遺伝子構築物を発現する細胞内にトランスフェクトし、該レポーター遺伝子の発現を可能にする適当な条件下で培養する。該レポーター遺伝子により発現されたタンパク質のレベルを次いで測定する。このようなアッセイは、共通の読出しで広範囲の一連の標的に対する多数のＲＮＡｉ試薬のタンパク質レベルでのＲＮＡｉ効力の測定を可能にする。すなわち、産生されたデータセットは均質であり、効力データを各々互いに比較できる。
【００２２】
上記データセットを人工神経回路網のトレーニングに使用する。人工神経回路網は当分野で既知であり(例えば、Zell, Simulation neuronaler Netzwerke, Addison Wesley (1994);およびRumelhart and McLelland, Parallel Distributed Processing, Vol.1, MIT Press, Cambridge, MA (1986)を参照)、そして、例えば、http://www-ra.informatik.uni-tuebingen.de/SNNSから入手可能である。統計学的情報を、人工神経回路網によりｓｉＲＮＡ配列アンチセンス鎖から抽出し、スクリーニング指標と相関させる。最終的に、トレーニングした回路網を任意にインプットした配列に適用し、‘可能性’スクリーニング指標を概算できる。例えば、説明の目的で、誤差逆伝搬トレーニング７−８を共なう３層フィードフォワード回路網を使用できる。インプット層は順番になったノードの４レーンを有し、図２参照のこと。核塩基の種類の種類毎に１レーンあり、常に異なる塩基の種類の４ノーが同じインプット配列位置を参照する。位置の番号はインプット配列の長さである。任意の時点で、トレーニング中および／または適用中、任意の特定位置の正確に１個のノードが活性化される。並んだレーンに沿った活性は、次いでインプット配列を示す。活性化ノードのシグナルをインプット層から第２層(隠れユニットの層とも呼ぶ)に伝達する。この伝達の間、０または１のいずれかのインプット層のシグナルは、異なって加重され、隠れユニットのシグナルに加算される。同様に、隠れユニットのシグナルは、第三かつ最終層のノードに進む。加重値は、統計学的知識を示す記憶エレメントである。最初に、加重値を無作為に設定し、真のスクリーニングシグナルから離れたｓｉＲＮＡアンチセンス配列の出力シグナルをもたらす。現在の回路網出力シグナルと実験値の差異を全ての加重値を変えるために使用して、差異を減らす。誤差逆伝搬は、第二層の隠れユニットについての‘真の’標的シグナルを有するとして、回路網の所定の位置に来る。
【００２３】
本発明の他の局面は、コンピュータハードウェアおよび本発明のアルゴリズムを含む、コンピュータシステムを提供する。本発明のさらなる局面は、本発明のアルゴリズムを含むコンピュータ読み取り可能媒を提供する。
【００２４】
本発明の他の局面は、ある標的遺伝子に対して、ＲＮＡｉ効力の高い見込み、すなわち、予め選択した標的遺伝子の発現を阻害する高い見込みを有するＲＮＡｉ試薬を提供する。故に、設計した一定数のＲＮＡｉ試薬について、ＲＮＡｉ試薬を無作為に設計したときよりも、ＲＮＡｉ試薬の設計にこの方法を使用して、高い割合が有効であろう。逆に言えば、標的遺伝子の発現を特異的に阻害するために有用な高いＲＮＡｉ効力の一定数のＲＮＡｉ試薬を発見するために設計およびスクリーニングすべきＲＮＡｉ試薬が少ない。一つの態様において、本発明の方法は：
ａ)ある標的遺伝子に対して相補性の領域を含む複数のＲＮＡｉ試薬配列を提供し；
ｂ)トレーニングした本発明のアルゴリズムを、神経回路網を使用してＲＮＡｉ試薬配列に適用し；そして
ｃ)有効であると予測されるＲＮＡｉ試薬配列(複数もある)を選択する
工程を含む。
【００２５】
第一工程において、標的とすべき遺伝子、すなわちＲＮＡｉにより阻害すべき遺伝子に相補的な配列を含む複数の候補ＲＮＡｉ試薬配列を選択する。該ＲＮＡｉ試薬を、特異性または特定の配列モチーフの存在もしくは非存在についてプレスクリーニングし得る。それらは重複または非重複であり得る。一つの態様において、該候補ＲＮＡｉ試薬を無作為に選択する。第二工程において、第一工程で提供されたＲＮＡｉ試薬の効力を、本発明のアルゴリズムでトレーニングした神経回路網を使用して予測する。次工程で、有効であると予測されたＲＮＡｉ試薬配列を選択する。例えば、３個または５個または１０個の最も有効なＲＮＡｉ試薬を選択できる。あるいは、一定閾値スコアを超える予測スコアの全ＲＮＡｉ試薬配列を選択する。好ましい態様において、該閾値スコアは少なくとも０.７、少なくとも０.７５、少なくとも０.８または少なくとも０.８５である。選択したＲＮＡｉ試薬を、次に、それらのＲＮＡｉ効力について実験的にアッセイできる。故に、次工程で、活性であると予測された配列を含むＲＮＡｉに適したＲＮＡｉ試薬を合成する。好ましい態様において、該ＲＮＡｉ試薬を化学的に合成する。当業者は、例えば、既知の固相合成の技術を介した、このようなオリゴヌクレオチドの化学合成法を熟知している。しかしながら、該ＲＮＡｉ試薬はまたインビトロ転写またはベクターベースの合成のような生化学法を使用しても合成できる。標的遺伝子を発現する適当な細胞を、次に合成ＲＮＡｉ試薬(または、ベクターベースの系の場合は目的の配列を含むベクター)に曝すことができ、適当な条件下でインキュベートし、標的遺伝子の発現レベルを適当な方法で測定できる。コントロールとして、目的の配列に曝されていない細胞の標的遺伝子レベルを比較できる。
【００２６】
下記実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために包含し、本発明を限定する意図はない。
【００２７】
実施例
本発明を説明するアプローチにおいて、３４種の異なるｍＲＮＡをターゲティングする３,０００個を超えるｓｉＲＮＡを、細胞アッセイにおいて効力をスクリーニングしている。この研究の一つの特徴は、その後の効力−配列相関の分析のための、均質データセットの産生である。これは、融合ｍＲＮＡレポーターアッセイの使用により可能である。Huesken et al. (2003), supra参照。このアッセイにおいて、標的配列がレポーターｍＲＮＡの３'−ＵＴＲに挿入されている場所であるレポータータンパク質について、レポーター融合ｍＲＮＡをコードするプラスミドをトランスフェクトし、続いて、ＲＮＡｉ試薬をトランスフェクションする。すなわち：
ａ)標的配列の下方制御の結果は、生物学的意義を有しない；
ｂ)全てのアッセイにおいて、効力読出しはタンパク質レベルであり、試験の全てにおいて同じレポータータンパク質についてであり、効力データは異なる読出しにより偏っていない；そして
ｃ)全アッセイでの共通ポジティブおよびネガティブコントロールの使用は、全効力データの標準化を可能にする。
【００２８】
人工神経回路網を、この均質効力データセットの配列効力相関を調査するために使用している。結果として、トレーニングした人工神経回路網が、何らかのｓｉＲＮＡを、ヌクレオチド配列のみを基本にして予測できる。ＲＮＡ干渉経路を介して作用する遺伝子サイレンシング試薬の効果についての配列必要条件として、このアプローチは、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのような他のＲＮＡｉ試薬に適用できるであろう。
【００２９】
ＲＮＡｉ試薬
本試験で使用したＲＮＡｉ試薬は、１９塩基対形成ＲＮＡ領域と各鎖の３'にジデオキシヌクレオチドオーバーハングを有する２１量体二本鎖ＲＮＡｉ試薬であった。センス鎖のこのオーバーハングは系統的にジチミジンであり、一方、アンチセンスのオーバーハングは標的に相補的であるように設計されたジデオキシヌクレオチドであった。
【００３０】
スクリーニング法：ｅＹＦＰ  ｍＲＮＡ融合レポーターアッセイ
レポーター発現クローンの構築
増強されたシアンおよび黄色蛍光タンパク質(ｅＣＦＰ、ｅＹＦＰ)デュアルレポーターベースのベクターｐＮＡＳ−０９２(Huesken et al. (2003), supraに記載)を、目的のｃＤＮＡまたはＥＳＴの挿入のためにｅＹＦＰの停止コドンの後に複数のクローニング部位を含むように構築した。該ｅＣＦＰレポーターは、伸長因子１アルファ(ＥＦ−１α)プロモーター下に駆動される測定の標準化のために働き、ｅＹＦＰレポーターは、ＣＭＶプロモーター下に駆動するｓｉＲＮＡの活性のモニターに使用した。ベクターの由来はｈＣＭＶおよびＥＦ−１αプロモーターを含むプラスミドｐＢｕｄＣＥ４(Invitrogen)であった。ｐＮＡＳ−０９２をｐｅＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)由来のｅＣＦＰ遺伝子の挿入により、かつ、ｐｅＦＰ−Ｎ１(Clontech)由来のｅＹＦＰ遺伝子を、クローニング部位(ＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ)を担持する合成ＤＮＡフラグメントと共に移動することにより産生した。ｐＮＡＳ−０９２に使用した合成ＤＮＡ配列決定により確認した。別のクローニング法について、ｐＮＡＳ−０９２を、ｅＹＦＰ停止コドンの後にａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２クローニング部位を製造者(Invitrogen)のプロトコールに従って挿入することによりGatewayＴＭ目的ベクターｐＮＡＳ−０９７に変換した。最終レポーターアッセイに使用した全プラスミドは、クローニング部位にｃ−ＤＮＡをライゲーション(ｐＮＡＳ−０９２)または組み換え(ｐＮＡＳ−０９７)により挿入ことにより構築した。
【００３１】
細胞系および細胞培養
ヒト非小細胞肺癌腫細胞系Ｈ−１２９９(ＣＲＬ−５８０３)をＡＴＣＣ(Rockville, MD)から購入した。Ｈ−１２９９細胞を５％加湿ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清＋１％Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０培地(Life Technologies)に維持した。Ｈ１２９９細胞は分裂し、トランスフェクション４８時間前に８０％サブコンフルエント段階に到達した。細胞をトランスフェクションの１日前にトリプシン処理し、洗浄し、黒色９６ウェルアッセイプレート(Costar、透明底)に等しく(５０μL)分配した。
【００３２】
参照遺伝子(細胞内標準化)を有するデュアルレポーター構築物での蛍光タンパク質アッセイ。
【００３３】
プラスミドトランスフェクション
リポフェクタミン−ＰＬＵＳ試薬をＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ(２２ng／μLプラスミド、４.４mL／mLリポフェクタミン−ＰＬＵＳ)で希釈したプラスミドとインキュベートし、次いで、この混合物をＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉで１１倍希釈した。リポフェクタミンをＨＥＰＥＳ(２０mM、ｐＨ７.２)で予め１.３倍希釈し、さらにＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ(２６.６μL／mLリポフェクタミン)で２８.６倍に希釈し、１５分維持した。両方の混合物を１：１で合わせ１５分インキュベートし、さらにＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉで１０倍希釈した。培地を吸引し、１００μLを細胞に添加した(０.２μL／mLリポフェクタミン−ＰＬＵＳ、１３.３μL／mLリポフェクタミン、１ng／μLプラスミド)。２時間後、５０μL  ｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物を細胞に添加し、それをさらに２時間インキュベートした。
【００３４】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
オリゴフェクタミンをＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ(６０μL／mL)で希釈し、混合し、３０分、室温でインキュベートした。ｓｉＲＮＡをハイブリダイズしたストック溶液からハイブリダイゼーション緩衝液(３０mM  ＨＥＰＥＳ、１００mM  酢酸カリウム、２mM  酢酸マグネシウム：ｐＨ７.６３、室温で。アニーリング２分、９０℃、続いて１時間、３７℃)で６００μＭに希釈した。希釈したオリゴフェクタミンおよびｓｉＲＮＡを２容量＋１容量で合わせ、１５分インキュベートした。ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン混合物をさらにＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉで１：１希釈し、細胞(５０μL)上に移した(最終濃度０.７ng／μLプラスミド、１０μL／mLオリゴフェクタミン、５０nM  ｓｉＲＮＡ)。培地を除去し、フェノールレッド非添加１０％ウシ胎児血清＋１％Ｌ−グルタミン含有１００μL標準ＲＰＭＩ培地に置き換え、３日間、３７℃でインキュベートした。蛍光を２４時間間隔で測定した。ｅＣＦＰおよびｅＹＦＰの蛍光を、各々励起フィルター４３６／２０nmおよび放出フィルター８０／３０nmならびに励起フィルター５００／２５nmおよび放出フィルター５３５／３０nmで測定した。ｅＹＦＰ／ｅＣＦＰ蛍光計数の指標はｅＹＦＰ活性／細胞数当量を示す。ｅＹＦＰレポーターアッセイでのこのデータ収集のために、ポジティブ標準(ＹＦＰ−特異的ｓｉＲＮＡＮＡＳ−１２８４２／５８)およびネガティブ標準(ルシフェラーゼｓｉＲＮＡＮＡＳ−８５４８／９)の全ｓｉＲＮＡ処置をトリプリケートで行った。標準ｓｉＲＮＡｓ  ＮＡＳ−１２８４２／５８処置の標準偏差を計算し、９.１％であることが判った。
【００３５】
標的選択
第一に、３４種の異なる挿入断片を含むレポータープラスミドを選択した。挿入断片のサイズは３４４ヌクレオチドから３７８４ヌクレオチドの間で変化した。
【００３６】
ｓｉＲＮＡ配列設計
７９個のｓｉＲＮＡ／プレートで、我々は合計３１６０を有した。配列を挿入断片が無作為に働く(walk)ように設計し、様々なサイズの重複を可能にした(０−２０塩基対)。２７kbのサイズの挿入断片で、３１６０  ｓｉＲＮＡの規則的に選択した位置でさえ、ｓｉＲＮＡ配列に著しい重複(１３塩基対)をもたらした。長いポリヌクレオチド伸長(５個またはそれ以上の連続的ヌクレオチド)の配列は考慮しなかった。長い挿入断片の場合、７９個のｓｉＲＮＡの２セットを設計した。
【００３７】
合計３１６０セットのｓｉＲＮＡ配列を、その核成分について確認した。テトラヌクレオチドまでの全ての可能性のあるモチーフがｓｉＲＮＡ配列セットに存在することが判明した。
【００３８】
スクリーニング形式
各ｓｉＲＮＡプレートは７９個のｓｉＲＮＡ、ネガティブコントロール(抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡＮＡＳ−８５４９)、２個のレポーター特異的ｓｉＲＮＡ(抗ＹＦＰ  ｓｉＲＮＡＮＡＳ−１２８４２およびＮＡＳ−１２８４７)を含む。コントロールｓｉＲＮＡを一つのバッチからトリプリケートでピペット輸送した。８ウェルが空のままであり、“プラスミドのみ”のネガティブコントロールとして使用するつもりであった。
【００３９】
ｓｉＲＮＡ活性データのフィルタリングおよび標準化(図２参照)
各プレートを、デュプリケートでアッセイし、ＹＦＰレベルを２回の時点で蛍光測定により測定した。各プレートについて、デュプリケート内の直線相関関係、ならびにポジティブおよびネガティブコントロールの阻害レベルを確認した。デュプリケート内の相関が０.７より優れており、かつ、ネガティブコントロールと比較してポジティブコントロールがＹＦＰを少なくとも６０％下方制御したとき、データを受理した(図３参照)。５アッセイからのデータが、このフィルターで拒絶された。残りのデータセット(２７１７配列)をトレーニングセットおよび試験セットに分け、さらに各ｓｉＲＮＡを個々に確認し、デュプリケート内で３０％より高い変動を示すｓｉＲＮＡを除外した。すなわち、データの約１５％がさらに除外された。残ったデータ点をデータセットの結果に対して標準化し、ノイズ特性を減少させた。最終データセットはトレーニングセットに２１０９配列および試験セットに２３４配列含んだ。全てのデータ点Ｓ(ｉ)(式中、ｉはデータ点を示す)を、アフィン系Ａ
Ｔ(ｉ)＝Ａ(Ｓ(ｉ))＝(Ｔ＿高−Ｔ＿低)／(Ｓ＿高−Ｓ＿低)×(Ｓ(ｉ)−Ｓ＿低)＋Ｔ＿低
〔式中、ネガティブコントロールの元のシグナルはＳ＿低であり、Ｔ＿低を得るために標準化した(我々はＴ＿低＝０.１＝１０％と設定)〕により標準化した。同様な定義はポジティブコントロールシグナルＳ＿高およびその変換されたＴ＿高(０.９＝９０％に設定)である。
【００４０】
人工神経回路網トレーニング(図３参照)
ｓｉＲＮＡ配列データをインプット層に提供し、スクリーニングレポーターシグナルを、回路網ノード間の加重値の調製に使用する。各ｓｉＲＮＡ配列およびそのスクリーニング測定は合計１０回提示する。全データ点の１回の提示後、回路網の加重値を、０.１の学習率および０.１の運動量と同調してアップデートする。Zell, Simulation Neuronaler Netzwerke, Addison Wesley (1994)参照。加重値の５個の異なる初期化に基づき、得られた５個のトレーニングした回路網加重値は異なるが、全５個の回路網は、一致して、わずかに変化した予測出力を示した。最終出力は、全５個の回路網の各々の出力ノードのシグナルの平均により達成した。我々は、平均出力を、単純にするために、個々の回路網の何らかの特性を考察する代わりに、‘該’回路網の‘該’出力と呼ぶ。
【００４１】
予測値の性能の評価(図４参照)
トレーニングした回路網は、０.６３の相関関係で実験的阻害活性を予測したが、トレーニングセットに適用したとき、０.６６５の幾分高い相関を示した。図３は２個の一致を示すグラフである。予測および実験値の相関に加えて、該アルゴリズムの性能は、実験的に活性なｓｉＲＮＡと予測的に活性なｓｉＲＮＡについての閾値の設定により評価できる。実験的に活性なｓｉＲＮＡの閾値は７５％標準化効力(０.７５)に設定した。予測的に活性なｓｉＲＮＡの閾値は、０.８を超えるスコアに設定した。これらの閾値は、真陰性(予測的不活性であり、不活性)、偽陰性(予測的に不活性であるが、活性)、偽陽性(予測的に活性であるが、不活性)および真陽性(予測提起に活性であり、活性)配列の４種の象限を含んだ。予測値性能は、その感受性および選択性により測定できる。
予測値感受性＝真陽性／(真陽性＋偽陰性)＝０.２６
予測値選択性＝真陽性／(真陽性＋偽陽性)＝０.７１
【００４２】
これらの値は、予測した配列が、(上記で定義した通り)活性の７１％確実性を有することを示す。この値は、３５％の配列が活性であった、全ての試験で観察されたヒット率と比較すべきであった。また、予測値は、２６％の活性配列を同定するであろう。
【００４３】
予測値性能に対するトレーニングセットのサイズの影響(図５参照)
該トレーニングデータはトレーニングのために完全に取る必要はなく、それは減衰するセットサイズでＢＩＯｐｒｅｄ予測性能の減少調査を可能にする。試験セットのサイズは一定であった。相関(図５参照)は、トレーニングセットの減少と共に一貫してゆっくり減少した。２６５データ点ほど少ないトレーニングデータセットは、まだ約０.５３の相関を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】標準化データセットの例。ＹＦＰ  ｍＲＮＡの３'−ＵＴＲをターゲティングする７９個のｓｉＲＮＡを、レポーター融合ｍＲＮＡと共トランスフェクトした(Ｈ１２９９、５０nM、５０時間に読出し)。灰色棒は３'−ＵＴＲターゲティングｓｉＲＮＡ、黒色棒はポジティブおよびネガティブコントロールである。ネガティブコントロールは、任意に１０％効力と、ポジティブコントロールは９０％効力と設定した。各ｓｉＲＮＡ抗力をこれらのコントロールに従い標準化した。
【図２】スクリーニングデータのフィルタリングを説明する。
【図３】トレーニングしたセットについての予測対スクリーニングの比較。
【図４】試験したセットについての予測対スクリーニングの比較。
【図５】トレーニングセットのサイズからの予測−測定相関(試験セット上の)の依存性。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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