(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病に関連する重篤な疾患を有するヒト以外のトランスジェニック動物に関する。本動物は、アルツハイマー病の治療のための化合物を発見するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスＰＳ１タンパク質上の変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐに対応する変異の少なくとも１つを有するプレセニリン１タンパク質をコードする核酸配列を示す非ヒト動物。
【請求項２】
前記変異が同型接合状態にあることを特徴とする、請求項１に記載の動物。
【請求項３】
動物が両方の変異を有することを特徴とする、請求項１及び２のどちらかに記載の動物。
【請求項４】
ＡＰＰをコードする遺伝子の全部又は一部をコードする核酸配列も含む、請求項１から３の一項に記載の動物。
【請求項５】
動物が、非変異ＰＳ１を発現する動物の内因性ＰＳ１量に匹敵する変異ＰＳ１量を発現することを特徴とする、請求項１から４の一項に記載の動物。
【請求項６】
変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐを有する前記プレセニリン１タンパク質がネズミ起源であることを特徴とする、請求項１から５の一項に記載の動物。
【請求項７】
前記ＡＰＰタンパク質がＡＰＰ７５１であり、ヒト起源であることを特徴とする、請求項４から６の一項に記載の動物。
【請求項８】
前記ＡＰＰ７５１タンパク質がヒト起源であり、スウェーデン変異及びロンドン変異を示すことを特徴とする、請求項４から７の一項に記載の動物。
【請求項９】
動物がげっ歯類であることを特徴とする、請求項１から８の一項に記載の動物。
【請求項１０】
動物がマウス、ラット又はウサギであることを特徴とする、請求項１から９の一項に記載の動物。
【請求項１１】
動物が、配列番号２の配列を含むタンパク質を産生することを特徴とする、請求項１から１０の一項に記載の動物。
【請求項１２】
動物がそのゲノム中で配列番号１の核酸配列を示すことを特徴とする、請求項１から１１の一項に記載の動物。
【請求項１３】
ＡＰＰをコードする前記遺伝子の発現が外因性プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項４から１２の一項に記載の動物。
【請求項１４】
動物がニューロンの欠損を示すことを特徴とする、請求項１から１３の一項に記載の動物。
【請求項１５】
動物が、約０．９を超えるＡｂｅｔａ４２／全Ａｂｅｔａ比を示すことを特徴とする、請求項１から１２の一項に記載の動物。
【請求項１６】
前記変異プレセニリン１タンパク質が内因性であることを特徴とする、請求項１から１５の一項に記載の動物。
【請求項１７】
請求項１から１６の一項に記載の動物に由来する細胞又は細胞系。
【請求項１８】
Ｍ２３３Ｔ−変異形態及びＬ２３５Ｐ−変異形態のネズミプレセニリン１遺伝子をコードする核酸配列を含む細胞又は細胞系。
【請求項１９】
請求項１から１６の一項に記載の動物に由来する胚性幹細胞。
【請求項２０】
それぞれ２３３位及び２３５位におけるアミノ酸変異ＭからＴ及びＬからＰを有するマウスＰＳ１タンパク質。
【請求項２１】
配列番号２の配列を含むことを特徴とする、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
それぞれ２３３位及び２３５位におけるアミノ酸変異ＭからＴ及びＬからＰを有するマウスＰＳ１タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
配列番号１の配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
アルツハイマー病治療用化合物を実証するための請求項１から１６の一項に記載の動物の使用。
【請求項２６】
−請求項１から１６の一項に記載の動物に試験化合物又は試験化合物の混合物を投与する段階と、
−ヒトにおいて観察される神経病理学を再現する１個以上の特徴的マーカーの進展を観察する段階と
を含む、神経変性疾患の治療用化合物を実証する方法。
【請求項２７】
−請求項１から１６の一項に記載の動物から抽出された細胞を化合物又は化合物の混合物と接触させる段階と、
−細胞ホモジネート中のホールセル又は細胞成分分画に対する前記化合物の効果を測定する段階と
を含む、神経変性疾患の治療用化合物を実証する方法。
【請求項２８】
アルツハイマー病治療用化合物を実証するための請求項２０及び２１のどちらかに記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、アルツハイマー病（ＡＤ）のモデルであるトランスジェニック動物に関する。本願はこれらの動物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、高齢者人口の多くが罹患する進行性神経変性疾患である。この疾患は、臨床用語では記憶喪失及び認知機能の低下、神経病理学的用語ではニューロンの明白な欠損、脳内の細胞内神経原線維沈着物の存在及びアミロイド斑を形成するβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の細胞外沈着物の存在を特徴とする。
【０００３】
アミロイド斑は、Ａβペプチド前駆体（ＡＰＰ）のタンパク質分解プロセス中に生成する４０又は４２残基を含むＡβペプチドで主に構成されている。Ａβの細胞外沈着物は、アルツハイマー病に関係する疾患にきわめて特異的である。これは、家族型（ＦＡＤ）を含めてアルツハイマー病のすべての型の早期及び不変の特性である。家族型は比較的早期（３０から６０歳）に出現し、ＦＡＤ症例の５％はＡＰＰ遺伝子の変異のためであり、８つの単一又は二重のミスセンス変異が特定されており、ＦＡＤ症例の５０から７０％はプレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子の変異のためであり、１００を超える異なる変異がこれまで特定されており、それよりも稀なＦＡＤ症例はプレセニリン２遺伝子の変異のためであり、２個のミスセンス変異が報告されている。これら３個の遺伝子の変異は、ＡＰＰのタンパク質分解における変化を誘発し、それによってＡβ、特に長い型のＡβ４２が過剰産生され、アルツハイマー病の散発型に類似した病的症状及び症候が早期に出現することが判明した。
【０００４】
アルツハイマー病の病理のある特性を表現するための動物モデルは文献にすでに記載されている。
【０００５】
これらの動物モデルは、第１に、ＡＰＰ遺伝子に変異を有するトランスジェニックマウスである。これらは、アルツハイマー病に類似した病的症状を１歳から発症する。したがって、変異Ｖ７１７Ｆを有するヒトＡＰＰを過剰発現するＰＤＡＰＰマウスは、加齢とともに脳内にＡβ沈着物が発生するが、斑自体の位置以外にニューロンの欠損を示さない（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．  １７（１８）：７０５３−７０５９）。この現象は「斑効果」と称される。
【０００６】
同様に、ヒトアイソフォームＡＰＰ  Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン変異のＡＰＰＳｗ）を発現するＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．  Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌ）２５７６マウスは、アミロイドタイプ沈着物を示すが、ニューロンの欠損を示さない（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ  ５６：６９５−９７３）。
【０００７】
Ｃａｌｈｏｕｎ等（１９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：７５５−７５６）による研究においては、ニューロンの欠損は、ヒトＡＰＰの変異アイソフォームを発現するＡＰＰ２３トランスジェニックマウス１４から１８月齢においてアミロイド斑近傍のある脳領域に見られた。このニューロンの欠損は、小さく、比較的老齢の動物に発生し、特に、以前に観察された「斑効果」に対応し得る斑の近傍において発生するので、この観察については議論の余地がある。また、これは、現行動物モデルがアルツハイマー病の病的症状の公知の全特性、とりわけニューロンの欠損と完全な類似度を示さないことを明らかにする最近の解説において言及されておらず、又は、ほとんど言及されていない（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，  ２００２，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １６０：  ４０９−４１１）。
【０００８】
また、ＰＳ１遺伝子に変異を有するトランスジェニックマウスが知られている。これらは、アルツハイマー病型の病的症状を示さないようであるが、高度に病原性であると認識されている多量のＡβ４２ペプチド（野生型ＰＳ１の２倍）を示す。
【０００９】
また、マウスＰＳ１遺伝子にＦＡＤ変異Ｐ２６４Ｌ又はＭ１４６Ｌを有する（「ノックイン」）上記トランスジェニック動物モデルにおいては、変異ＰＳ１タンパク質は安定に発現されない（Ｓｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２０：  ８７１７−８７２６；  Ｆｌｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  Ａｇｉｎｇ  ２３：  ３３５−３４８；  Ｒｏｚｈｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  ２３：  １８７−１９４）。これらのマウスは多量のＡβ４２ペプチドも示す。
【００１０】
国際公開第０２／０００８４０７号は、Ｐ２６４Ｌ変異を導入することによってプレセニリンをコードする遺伝子が変異されたかかるトランスジェニックマウスを記載している。
【００１１】
Ａβ４２型の形成におけるＰＳ１タンパク質の役割のために、ＡＰＰ及びＰＳ１遺伝子に変異を有する二重トランスジェニックマウスも作成された。上記単一トランスジェニックのように、これらのマウスはＡβ沈着物を示すがニューロンの欠損を示さない（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５７：３３１−３３９）。
【００１２】
したがって、アルツハイマー病の既存の動物モデルは、アルツハイマー病を含めて神経変性疾患の主要な特性であるニューロンの欠損を再現することに失敗しているので、満足の行くものではない。
【００１３】
したがって、出願人は、ニューロンの欠損を含めて、アルツハイマー病の主要な特性を示す動物を生成することに努力した。
【００１４】
マウスにおいてＰＳ１タンパク質をコードする遺伝子中に特異的変異を導入し、それらをヒトＡＰＰ遺伝子を過剰発現するマウスと交雑させることによってかかる動物が得られることが判明した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明の第１の側面は、マウスＰＳ１タンパク質上の変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐに対応する２つの変異の少なくとも１つを有するプレセニリン１をコードする少なくとも１個の核酸配列を、有利にはそのゲノム中で示す非ヒト動物に関する。
【００１６】
かかる動物は両方の変異を有することが有利である。
【００１７】
変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐを有するＰＳ１タンパク質はネズミ起源であることが好ましい。
【００１８】
変異プレセニリン１タンパク質は内因性であることが特に好ましい。
【００１９】
したがって、本発明による動物は、配列番号２の配列を含むタンパク質を産生することが有利である。本発明による動物は、配列番号３の配列を有するタンパク質を産生することが好ましい。本発明による動物は、そのゲノム中に配列番号１の核酸配列又は配列番号８の配列を含むことが有利である。
【００２０】
配列番号１、配列番号２及び配列番号８の各配列は、配列番号４、配列番号５及び配列番号９の野生型配列に導入された変異からそれぞれ生じる。配列番号５の配列は、マウス野生型プレセニリン１タンパク質の残基２２９から２３７の配列である。配列番号９の配列はプレセニリン１タンパク質、すなわち非変異である。
【００２１】
本発明による動物はＡＰＰ、好ましくはヒトＡＰＰを同時発現することが有利である。かかる遺伝子は１つ以上のＦＡＤ変異を含むことができる。したがって、ＡＰＰ遺伝子の変異は、これまで文献に記載されたさまざまな変異の１つとすることができる。ＡＰＰ遺伝子の変異は、「スウェーデン」（Ｓ）、「ロンドン」（Ｌ）及び「オランダ」（Ｄ）変異の単独又は組み合わせから選択することができる。
【００２２】
これらの変異は文献に詳細に記載されており、以下の改変によって一般に特徴づけられる。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
ロンドン変異には、ＡＰＰ７７０に対して７１７位に位置するイソロイシン以外のすべての置換、例えば、変異Ｖ  ７１７  Ｇ及びＶ  ７１７  Ｆも含まれる。
【００２５】
本発明に使用することができるＡＰＰはさまざまなアイソフォームとすることができ、特に６９５、７５１及び７７０型、又は例えばアイソフォームＡＰＰ９９などの切断型とすることができると理解される（後者のスウェーデン変異を除く）。
【００２６】
前記動物は、ＡＰＰ７５１をコードする遺伝子の全部又は一部をコードする核酸配列も有利にはそのゲノム中に含むことが有利である。ＡＰＰ７５１タンパク質はヒト起源であることが有利である。これは、変異Ｋ６７０Ｎ及びＭ６７１Ｌ（スウェーデン）及びＶ７１７Ｉ（ロンドン）を示すことが好ましい。
【００２７】
本発明においては、ＡＰＰ遺伝子は、ニューロン中でそれを強く発現する配列、特に外因性プロモーターなどの転写促進配列の制御下に置かれることが有利である。プロモーター配列としてはＨＭＧプロモーター（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：  ２０，  ８３８９）、また、ＰＤＧＦプロモーター（Ｓａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１），  Ｃｅｌｌ  ６４，  ２１７−２７）、Ｔｈｙ−１プロモーター（Ｌｕｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，  ４６８８−９９）及びプリオン遺伝子プロモーター（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １，  ９８６−９７）を最も特別に挙げることができる。
【００２８】
本発明の特に有利な実施態様によれば、動物モデルは、Ｔｈｙ１プロモーターの制御下にありＳ、Ｄ及び／又はＬ変異を有するＡＰＰ遺伝子を含む。
【００２９】
したがって、本発明による動物は、配列番号７の配列を含むタンパク質を産生することが好ましい。本発明による動物は、配列番号６の核酸配列を示すことができる。
【００３０】
本発明による動物は、ヒトタンパク質ＡＰＰ７５１ＳＬをコードする核酸配列を有するトランスジェニックマウスＴｈｙＡＰＰ（ＴＧ５３）と変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐを有するマウスＰＳ１タンパク質をコードする核酸配列を有するトランスジェニックマウスとの交雑に由来するトランスジェニックマウスであることが好ましい。
【００３１】
本発明による動物は、早期のニューロンの欠損である神経変性疾患の最も重要な特性の１つを初めて再現するものである。
【００３２】
さらに、本発明による動物は、これらの病的症状に対して従来記述された他の特性も示す。本発明による動物は、２月齢、特に６月齢から明瞭に見ることができるアミロイド斑の早期沈着を示す。
【００３３】
本発明による動物は、２×１／２月齢から約０．９を超えるＡβ４２型と全Ａβ型の比Ａβ４２／Ａβも示す。かかる比は、文献に記載された他のトランスジェニックマウスの比よりもきわめて高い。
【００３４】
６月齢マウスにおいてすでに見ることができるニューロンの欠損は１０ヶ月ではきわめて顕著である。
【００３５】
ＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ）は、アポトーシスに関与するｅＩＦ２をリン酸化するストレス活性化キナーゼである。
【００３６】
ＰＫＲは、本発明による１０月齢ＡＰＰ×ＰＳ１ＫＩマウスの海馬（ニューロンの欠損が起こる構造）中で検出される。ＰＫＲは、さらにニューロンの欠損が観察されない１２月齢ＡＰＰ×ＰＳ１Ｍ１４６Ｌトランスジェニックマウスの海馬では検出されない。
【００３７】
本発明による動物は、その新規特性のために、アルツハイマー病患者において認められる障害の、既述のモデルよりも完全で代表的な研究モデルになる。したがって、これらの動物は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療用化合物の神経保護特性を実証するのに特に適切である。
【００３８】
本発明による動物は、同型接合状態のｐｓ１の変異体対立遺伝子及び異型接合状態のＡＰＰの変異体対立遺伝子を有することが好ましい。しかし、前記動物の同じ特性は、異型接合状態の２個の変異ｐｓ１対立遺伝子の１個及び異型接合状態のＡＰＰの変異体対立遺伝子を有するが、さほど顕著でない表現型又は後で出現する表現型を有する動物において記述することができる。
【００３９】
本発明による動物の別の利点は、このトランスジェニックマウスによって発現される変異ＰＳ１タンパク質量が、非変異ＰＳ１を発現する通常の（非トランスジェニック）マウスによって通常発現される内因性ＰＳ１タンパク質量と同じであることである。本発明による動物は、この特性によって、ＰＳ１タンパク質の過剰発現なしに神経変性疾患の治療用化合物を実証するのに有利な研究モデルになっている。
【００４０】
これらの化合物は、特に、その特性の１つ以上を改変若しくは調節することによって、転写、転写後、翻訳若しくは翻訳後レベルにおけるＰＳ１遺伝子の調節に対する、又はＰＳ１タンパク質自体に対する作用を有する化合物、相互作用相手若しくはＰＳ１タンパク質標的に対して類似の作用を有する化合物、又はＡＰＰ、より広範には、神経変性プロセス中にＰＳ１及びＡＰＰによって惹起されるシグナルの下流の任意の分子の調節に対する作用を有する化合物とすることができる。
【００４１】
本発明では動物はげっ歯類などの哺乳動物であることが有利である。特に、それらはマウス、ラット又はウサギである。
【００４２】
マウス及びそれらを得るための構築体は当業者に公知の方法によって得られる。
【００４３】
これらは、従来の遺伝子導入技術によって得ることができる。遺伝子導入方法の１つを説明する例として、実施例に記載されたとおり、改変遺伝子を含む遺伝子構築体をマウス胚性幹細胞へエレクトロポレーションにより導入する方法及び選択後に所望の遺伝子現象を有する細胞をレシピエント胚盤胞に導入する方法を挙げることができる。これに関し、本発明による変異ＰＳ１動物は、核酸を含む発現カセットのエレクトロポレーションによって得られる。この核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）でも相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）でもよいＤＮＡであることが好ましい。
【００４４】
ゲノムの改変は、「ノックイン」による１個以上の遺伝子の変更又は改変の結果とすることができる。この改変は、従来の変更又は変異誘発物質の作用によることができ、或いはおそらく部位特異的変異誘発によって実施することができる。本発明では、変異ｐｓ１遺伝子に関しては、以下の実施例に記載されるとおり、部位特異的変異誘発によって前もって変異された導入遺伝子を有するターゲティングベクターを用いた相同組換えを含むことが好ましい。
【００４５】
変異ＡＰＰタンパク質を発現する動物は、遺伝子構築体を接合体の核に微量注入することによって得られる。
【００４６】
二重トランスジェニック動物は、変異ｐｓ１動物と変異ＡＰＰ動物を交雑させることによって得られる。
【００４７】
本発明による動物は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療用化合物の神経保護特性を実証するために有利に使用することができる。これらの化合物は、化学分子、ペプチド又はタンパク質分子、抗体、キメラ分子とすることができ、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムとすることもできる。実証された化合物は、薬剤組成物を得るためにそのまま又は薬剤として許容されるビヒクルと組み合わせて薬用生成物として使用することができる。それらは、特に、等張性無菌食塩水溶液（リン酸水素ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はかかる塩の混合物）、又は必要に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加して注射用溶質を構成することができるようにした乾燥、特に凍結乾燥組成物とすることができる。注射は、定位的、局所的、経口的、非経口的、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮的などに投与することができる。
【００４８】
したがって、本発明の別の主題は、少なくとも以下の段階、すなわち、
−  本発明による動物に試験化合物又は試験化合物の混合物を投与する段階と、
−  ヒトにおいて観察される神経病理学を再現する１個以上の特徴的マーカーの進化を観察する段階と
を含む、神経変性疾患の治療用化合物を実証する方法に関する。
【００４９】
本発明の別の主題は、少なくとも以下の段階、すなわち、
−  本発明による動物から抽出された細胞を化合物又は化合物の混合物と接触させる段階と、
−  細胞ホモジネート中のホールセル又は細胞成分分画に対する前記化合物の効果を測定する段階と
を含む、神経変性疾患の治療用化合物を実証する方法に関する。
【００５０】
本発明の別の主題は、本発明の２種類の動物の一方に由来する生物学的製剤に関し、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療用化合物を実証するためのそれらの使用にも関する。「生物学的製剤」という用語は、特に細胞、タンパク質抽出物、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は抗体を意味する。
【００５１】
したがって、本発明の一主題は、上記動物に由来する細胞又は細胞系、特に胚性幹細胞である。
【００５２】
本発明の一主題は、それぞれ２３３位及び２３５位におけるアミノ酸変異ＭからＴ及びＬからＰを有するマウスＰＳ１タンパク質でもある。かかるタンパク質は配列番号２の配列を含むことが有利であり、配列番号３の配列を有することが好ましい。
【００５３】
本発明の別の主題は、それぞれ２３３位及び２３５位におけるアミノ酸変異ＭからＴ及びＬからＰを有するマウスＰＳ１タンパク質をコードする核酸である。
【００５４】
特許請求の範囲によるかかる核酸は、配列番号１の配列又は配列番号８の配列を含むことが有利である。
【００５５】
本発明の一主題は、これらの核酸に相補的な配列及びこれらの核酸又はそれらに相補的な配列を含むベクターでもある。
【００５６】
本発明の別の側面は、神経変性疾患の治療用化合物の神経保護特性を実証するためのこれらのタンパク質の使用に関する。
【００５７】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらの実施例のみに限定されない。
【００５８】
これらの実施例において、記述された結果は、ＰＳ１ＫＩマウスの利点を実証し、また、ＰＳ１ＫＩ×ＡＰＰモデルはこれまで知られている神経変性疾患の主要な特性を表現する利点を有するので、治療戦略におけるＰＳ１ＫＩ×ＡＰＰモデルの好ましい使用を明確に支持する。
【００５９】
実施例
【実施例１】
【００６０】
突然変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐを持つ標的化ベクターの構築。
【００６１】
この目的は、残基Ｍ２３３をＴに、残基Ｌ２３５をＰに改変するように、マウスＰＳ１遺伝子のエクソン７に２つの突然変異を導入することであった。この２つの新しいコドンは、早期発症アルツハイマー病患者（ＦＡＤ）で同定される突然変異に対応する。
【００６２】
Ｋｗｏｋら（１９９７  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８；１５７−４２）及びＣｈａｍｐｉｏｎら（１９９６、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ７，１５８２−４）に記載の方法と同様の２ステップ突然変異誘発法を用いて、ＰＳ１ノックイン（ＰＳ１ＫＩ）マウス系列を作出した。
【００６３】
本方法は、マウスｐｓ１遺伝子のコドン２３３及び２３５に核酸の変化がある標的化ベクターを構築することを目的とした（図１Ａ参照）。
【００６４】
簡潔に述べると、λバクテリオファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号９４６３１３）において構築した１２９ＳｖＪマウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、マウスＰＳ１遺伝子の１７ｋｂゲノムフラグメントを単離した。制限酵素を用いて消化し、配列決定を行い、マウスＰＳ１遺伝子の利用可能な部分配列（Ｍｉｔｓｕｄａら、１９９７、ＪＢＣ  ２７２，２３４８９−９７）と比較することにより分析を行い、このフラグメントがマウスＰＳ１遺伝子のイントロン５からエクソン１１の領域を含有することが分かった。イントロン５の一部、エクソン６、イントロン６、エクソン７及びイントロン７の一部を含有する９．８Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサブフラグメントを、プラスミド  ｐＧＥＭ  １１Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｒａｎｃｅ）にサブクローニングした（図１Ａ）。Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、エクソン７を含有するＤＮＡフラグメントにおいてこの２つのコドンの突然変異誘発を遂行し、ヌクレオチドの配列決定を行うことにより確認した。
【００６５】
エクソン６を含有する７Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントをクローニングすることにより、相同的組み換えベクターのロング（５’）アームを得た。ショート（３’）アームは、それ自身、突然変異誘発を行ったエクソン７を含有する１．８Ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをサブクローニングすることにより得られた。ポジティブ選択カセット（ｐＭＣＩ−Ｎｅｏカセット）を、エクソン７の５’にある、イントロン６、位置−４７０ｂｐに位置するＸｂａＩ部位に導入した（図１Ａ参照）。
【実施例２】
【００６６】
ＰＳ１ＫＩを含有するＥＳ細胞の作製
ＮｏｔＩで消化することにより実施例１で述べた標的化ベクターを線状にし、Ｄｒ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｂａｂｉｎｅｔ，Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅにより提供された胚性幹（ＥＳ）細胞株  ＣＫ３５へとエレクトロポレーション法によって導入した。
【００６７】
この細胞を以前に述べられているようにして（Ｗ．Ｗｕｒｔｓ及びＡ．Ｊｏｙｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｌ．  Ｊｏｙｎｅｒ（編者）による。），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．第２版（２０００年２月１５日））、培養した。
【００６８】
相同性組み換えを有し得る４３０個の細胞クローンをＧ４１８存在下で選択した。以前に述べられているようにして（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８９）、ロングアーム組み換えドメインの外側に位置するＰＳ１プローブを用いて、サザンブロッティングによりこれらのクローンのゲノムＤＮＡを分析した（図１Ａ）。このように、ＰＳ１遺伝子に所望する変異を有する４個の細胞クローンを同定することができた。これらの細胞クローンを用いて、ＰＳ１ＫＩトランスジェニックマウス系列を樹立した。
【実施例３】
【００６９】
ＰＳ１ＫＩマウス系列の構築
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの胚盤胞にクローン  １８Ｃ５を注入した。
【００７０】
得られたキメラマウスのうち５匹が、生殖系列に対するｐｓ１突然変異対立遺伝子の伝達を示した（従って、これらの子孫も）。
【００７１】
これらの創始動物から、ＰＳ１ＫＩマウス系列が、純粋な１２９ＳＶ遺伝的バックグラウンド及び混合型１２９ＳＶ−Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドにおいて樹立された。
【００７２】
ヘテロ接合（Ｈｅ）又はホモ接合（Ｈｏ）状態における突然変異誘発ＰＳ１ＫＩ対立遺伝子の存在について、２３０ｂｐのｐｓ１プローブを用いてサザンブロッティングにより調べた（図１Ｂ）。この突然変異マウスは生存能力及び繁殖力を有する。
【実施例４】
【００７３】
ＰＳ１ＫＩ系列におけるＰＳ１のアッセイ
安楽死後、マウスの脳を取り出し、秤量した。一方の半球を免疫組織化学（後固定）のために保存し、もう一方を凍結して、次に、Ｐｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーを用いて、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する緩衝溶液（０．３２Ｍ  スクロース、４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）２ｍｌ中で氷上で個々にホモジェナイズした。ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によりタンパク質濃度を測定した。このホモジェネートを−８０℃にて保存した。
【００７４】
ＰＳ１を検出するために、脳タンパク質抽出物  ２５μｇを５６℃にて２０分間、８Ｍ  尿素及び５０ｍＭ  ジチオスレイトールを含有するＬａｅｍｍｌｉ  ローディング緩衝液中でインキュベーションを行った。このタンパク質をＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液中でのＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分画した。ニトロセルロースフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）上にタンパク質を転写した後、感度を上げるためにそのフィルターをＰＢＳ中で５分間加熱し、すぐにスキムミルク粉末  ５％（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳＴ（０．０５％  ＰＢＳ（Ｖ／Ｖ）、Ｔｗｅｅｎ  ２０）緩衝液で１時間飽和させ、ＰＢＳＴ緩衝液のみの中で、４℃にて一晩、一次抗体とともにインキュベーションを行った。ＰＢＳＴ中  １／１００００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗−ＩｇＧ（抗−マウス）抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を用い、その後に製造者の使用説明書に従い化学発光による検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、一次抗体の結合を検出した。ＰＳ１の検出に対しては、１／１００００希釈で、一次抗体  ＭＡＢ１５６３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＳＡ）を使用した。半定量的分析に対しては、ＧｅｎｅＧｎｏｍｅ  １６ビット  ＣＣＤカメラ（Ｓｙｎｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｉｒｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて発光シグナルをデジタル化し、Ｇｅｎｅｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を用いて解析した。１レーンあたりホモジェネート  ２．５μｇから１０μｇの試料を用いて作成した標準曲線を用いてそのシグナルの直線性を確認した。
【００７５】
免疫ブロッティングによるこの分析を行うことで、突然変異誘発ＰＳ１のＣ末端フラグメントの発現レベルが正常のままであり、ＰＳ１ＫＩ２３３／２３５マウスにおいて低下しないことを確認することができた（図１Ｃ）。
【実施例５】
【００７６】
ＰＳ１ＫＩ及びＡＰＰ系列の交配によるＰＳ１ＫＩｘＡＰＰ系列の作出
Ｔｈｙ−１プロモーターの制御下で、Ｓｗｅｄｉｓｈ（突然変異  Ｋ６７０Ｎ；Ｍ６７１Ｌ）及びＬｏｎｄｏｎ（Ｖ７１７Ｉ）ＦＡＤ突然変異を有するヒト型  ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡを過剰発現するトランスジェニックマウスの系列とＰＳ１ＫＩマウス（実施例１から実施例４に記載）を交配させた。特許明細書ＷＯ０１／２０９７７に記載されているようにして、突然変異を有するヒト型  ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡを過剰発現するマウスを得た。
【００７７】
次の全ての実験において、遺伝的バックグラウンドの多様性によるあらゆる影響を最小限に抑えるために、同じ遺伝的バックグラウンドを有するマウスを使用した。
【実施例６】
【００７８】
免疫電気化学発光法によるトータルＡβ及びＡβ４２アミロイドペプチドのアッセイ
脳内のＡβの全体的貯留量（可溶型及び凝集又は不溶型）を定量するために、脳ホモジェネートの分注物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中の塩酸グアニジン（ＧＨ）の９Ｍ溶液  ２体積で処理した。１５分間の超音波破砕を３回行い、１時間このホモジェネートを混合し、次いで、５００００ｇで４℃にて２時間遠心した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ／ｖ）を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中でこのグアニジン抽出物を１／２０に希釈した。次に、免疫電気化学発光（Ｙａｎｇら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１２（２），１９３−１９４）により、２種類の抗−Ａβペプチドマウスモノクローナル抗体（４Ｇ８及び６Ｅ１０）及びＯｒｉｇｅｎ  Ｍ８  Ａｎａｌｙｚｅｒ  リーダー（ＩＧＥＮ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｉｎｃ．Ｏｘｆｏｒｄ）を用いて、Ｋｈｏｒｋｏｖａら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８２，１５９−１６６（１９９８））により改変されたプロトコルに従い、この分画におけるＡβペプチドの濃度を測定した。
【００７９】
供給者のプロトコル（ＩＧＥＮ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ）に従い、ＴＡＧ−ＮＨＳエステルを用いて、Ａβペプチドの残基１７−２４エピトープを認識するモノクローナル抗体４Ｇ８（Ｓｅｎｅｔｅｋ  ＰＬＣ）に対して、ルテニウム標識（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）を行う。Ｒｕ−４０８及びビオチン化抗体  ６Ｅ１０、Ａβペプチドのエピトープ１−１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ  ＰＬＣ）を脳の可溶性分画と接触させ、Ｏｒｉｇｅｎリーダーを用いてＲｕ−４Ｇ８／Ａβ／６Ｅ１０−ビオチンの３つからなる複合体を定量する。一連の合成ペプチドＡβ（Ｂａｃｈｅｍ）を使用して、各実験を較正する。ナノグラム／ｇ（脳組織の初期重量）で、ペプチドＡβ量を計算する。
【００８０】
位置４２（Ａβ４２）で終わるＡβペプチドの型を特異的に測定するために、抗体６Ｅ１０の代わりにＡβ４２  Ｃ−末端に特異的に結合するモノクローナル抗体２２Ｆ９を用いた（Ｗｉｒｔｈｓら、２００２、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１２，２７５−２８６）。
【００８１】
結論として、ｐｓ１ノックイン（ＰＳ１−ＫＩ）遺伝子の存在により、次のことが起こる。
【００８２】
脳内でのＡβ（図２Ａ）及びＡβ４２（図２Ｂ）の沈着が加速化する。ＰＳ１ＫＩ対立遺伝子がホモ接合状態で存在する場合さらにより顕著な影響がある（遺伝子−用量効果）。ＰＳ１ＫＩ（Ｈｏ）の影響は、明細書ＷＯ０１／２０９７７で既に述べられているＰＳ１Ｍ１４６Ｌを過剰発現するトランスジェニックマウスでの場合よりも際立っている。
【００８３】
β４２末端を示すＡβペプチドの割合が大幅に増加し、ＰＳ１ＫＩ突然変異がホモ接合状態である場合は、図２Ｃ（Ａβ４２／トータルＡβ比は、２．５ヶ月齢で０．９２であり、対して、ＰＳ１ＫＩがない場合は０．２５であり、ＰＳ１ＫＩ対立遺伝子が１つのみ存在する場合は中間値０．７０となる：遺伝子−用量効果）で示すように、Ａβの大部分に相当する。β４２末端で終わるＡβペプチド種が本ペプチドの最も病的な型に相当することが文献的に認められている。したがって、ＰＳ１ＫＩｘＡＰＰ系列は、病的な型が特に強化されたモデルに相当する。
【実施例７】
【００８４】
免疫組織化学によるＡβペプチド沈着の分析
免疫組織化学／組織学実験のために、取り出し、次いで４％パラフォルムアルデヒド中で後固定した後、２０％（Ｐ／Ｖ）スクロースを含有する０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ／Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）中で４℃にて一晩、脳の半分ずつを抗凍結保護する。次いで、ドライアイス中  −３０℃の温度に維持したイソペンタン中で１分間、それらを凍結させる。−３０℃に温度調節されたクライオスタット（ＬＥＩＣＡ  ＣＭ３０００）において薄切した２５μｍ厚の切片を、最後に０．０２Ｍ  ＰＢＳ緩衝液中に置き、次いで４℃にて保存する。
【００８５】
これらの切片において、アビジンにカップリングしているホースラディッシュペルオキシダーゼがビオチン化されている、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）の形成を含む検出システムを用いて、Ａβペプチドの免疫酵素的検出を行った。簡潔に述べると、ブロッキング緩衝液（０．１％  トライトン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中、１０％  正常ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））中で３０分間インキュベーションした後、組織中に存在するエンドペルオキシダーゼを除去するために、脳切片を０．３％  Ｈ２Ｏ２溶液に接触させる。次いで、これらの切片を０．３％  トライトン及び２％  正常血清を含有する一次抗体溶液中でインキュベーションする（４℃にて一晩）。使用する抗−Ａβ一次抗体（４Ｇ８、Ｓｅｎｅｔｅｋ）（Ａβペプチドの残基１７から２４に対するモノクローナル抗体）をビオチン化する。したがって、リンス後、製造者の使用説明書に従い（Ｖｅｃｔａｓｔｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、その切片を直接ＡＢＣ複合体に１時間接触させる。ペルオキシダーゼ酵素のための色原体として３，３’−ジアミノベンジジンを使用した。
【００８６】
このようにして、免疫組織化学により、脳半分のホモジェネートに対する生化学的アッセイで既に検出されている、ＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩ  Ｈｏダブルトランスジェニックマウスの脳におけるＡβペプチドの異常沈着の加速が確認された。特に、脳半分の切片において得られたＡβ免疫標識の顕微鏡での分析から、これらのマウスの脳実質でＡβペプチド沈着プロセスの加速化が起こっていることが明らかとなった。実際に、ＡＰＰ７５１ＳＬマウスにおいては、最初の沈着が６ヶ月齢前後で大脳皮質及び海馬で現れるが（図３）、一方で、同型接合状態のＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩ  ダブルトランスジェニックマウスでは２ヶ月齢から検出することができる。ＡＰＰ７５１ＳＬシングルトランスジェニックマウスと比較して、６ヶ月齢ダブルトランスジェニックマウス（ＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩ  Ｈｏ）では海馬及び大脳皮質においてＡβ沈着の密度が明らかにより高い。さらに、その沈着はより広く分布しており、特に、視床及びまた橋でも既に沈着が検出される（図３）。
【００８７】
加齢に伴い、特に、１０ヶ月齢において、沈着の密度及びまたサイズがＡＰＰ７５１ＳＬシングルトランスジェニックマウスの脳において上昇する（図４）。これらの沈着は視床に存在するので、その分布もまたより広がっている。１０ヶ月齢のＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩ  Ｈｏダブルトランスジェニックマウスにおいて、Ａβペプチド沈着プロセスの同様の進行が、海馬、大脳皮質、視床及び橋において観察される。線条体において最初の沈着をわずかに検出することができる（図４）。一方、小脳は、Ａβ沈着プロセスがまだ起こっていない。注目すべきは、１０ヶ月齢のＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（ｎ＝４）の脳では、Ａβペプチド沈着が検出されないことである。
【実施例８】
【００８８】
組織学及び免疫組織化学による神経細胞欠損の分析
病的Ａβ４２ペプチドが非常に高い割合で存在することから、ＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩ  Ｈｏ系列において、Ａβペプチド沈着プロセスの加速化の他に、神経細胞欠損が加齢に伴い発現するか否かを分析することとした。このために、脳組織切片において神経細胞消失の視覚化を可能にする３種類の染色を行った：ａ）Ｃｒｅｓｙｌ  ｖｉｏｌｅｔ（クレシルバイオレット）を用いた組織学、これは、ニッスル小体（粗面小胞体のリボソームに会合する細胞小器官）を染色し、脳切片において全神経細胞及びグリア細胞を明らかにすることができるようにする；ｂ）メチルグリーンを用いた組織学、これは、全細胞のＤＮＡを染色する；ｃ）ＢＩＰを用いた免疫組織化学、これは、小胞体の内在シャペロンタンパク質の、細胞における発現を明らかにする。
【００８９】
Ｃｒｅｓｙｌ  ｂｉｏｌｅｔ（クレシルバイオレット）染色の場合は、ゼラチンで被覆したスライド上に脳組織切片をマウントし、次いで、蒸留水中０．５％  Ｃｒｅｓｙｌ  ｂｉｏｌｅｔ（Ｃ  １７９１、Ｓｉｇｍａ）溶液中で１０分間インキュベーションを行う。酸性溶媒中でリンスした後、その切片を最後に脱水する。
【００９０】
メチルグリーン染色の場合は、ゼラチンで被覆したスライド上に切片をマウントし、蒸留水中１％  メチルグリーン（Ｍ５０１５、Ｓｉｇｍａより）溶液中で１０分間インキュベーションを行い、リンスし、次いで脱水する。
【００９１】
ＢＩＰ免疫組織化学（ポリクローナル抗体、ＳＰＡ−８２６、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）の場合は、ＡＢＣ複合体中でインキュベーションする前にビオチン化二次抗体（ヤギで作製した抗−ウサギＩｇＧ抗体、Ｖｅｃｔｏｒ）の溶液中で切片をさらにインキュベーション（周囲温度にて１時間）することを除き、プロトコルは、Ａβペプチド免疫組織化学に対して適用したもの（上記参照）と同一である。
【００９２】
様々な組織学／免疫組織化学マーカーを用いた、顕微鏡による分析から、ＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスの脳において、海馬の錐体細胞層、特にＣＡ１の厚さが低下することが明らかとなった（ｎ＝３／３）（図５及び６）。この厚さの低下から、神経細胞死のプロセスが存在し、それが１０ヶ月齢において既によく確立されていることが示唆される。６ヶ月において、神経細胞死は１／３のマウスの脳に存在するが、このことから、神経毒プロセスが早期に始まることが示唆される（図８）。２つの病的プロセス、すなわち脳におけるＡβペプチドの異常蓄積及び影響を受けている神経細胞、の海馬、特にＣＡ１における平行した分析から、細胞外沈着の蓄積よりも細胞内のＡβ蓄積（Ｔｈｙ−１ＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１  Ｍ１４６Ｌマウスにおいて既に述べられている現象）の神経毒プロセスにおいて起こり得る役割が示唆される（図７）。実際に、ＣＡ１にまだ存在している神経細胞は、異常に高いＡβペプチド発現を示す。さらに、ＣＡ１における神経細胞に対する影響が、細胞外沈着を欠く領域において明らかに存在する。ＣＡ１での神経細胞死のプロセスにおいて、推定される遺伝子−用量効果の存在に注目すべきである。神経細胞での影響はまた、１つのＰＳ１ＫＩ対立遺伝子のみを有する非常に老齢（＞１５ヶ月）のＡＰＰ７５１ＳＬｘＰＳ１ＫＩマウスにおいても見られた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１Ａ：ネズミｐｓ１遺伝子並びに野生型エキソン７（上の線）及び使用されたターゲティングベクター（中間の線）の周囲の主要な制限酵素切断部位の構造の図表示。コドン変異Ｍ２３３Ｔ及びＬ２３５Ｐの変異エキソン７における変異（＊）を生じるヌクレオチド塩基の変化は点線枠で示されている。ネオマイシン（Ｎｅｏ）抵抗カセットを含む変異対立遺伝子ＰＳ１ＫＩは下線上に示されている。新生仔を特定するために使用された２３０ｂｐプローブの位置も示されている。  図１Ｂ：さまざまなマウスにおける野生型ＷＴ対立遺伝子（９．２ｋｂのバンド）、異型接合的ＰＳ１ＫＩ（Ｈｅ、二重バンド）対立遺伝子及び同型接合的ＰＳ１ＫＩ（７．４ｋｂのＨｏバンド）対立遺伝子を識別するための２３０ｂｐプローブを用いたサザンブロット。  図１Ｃ：ＰＳ１タンパク質の発現レベルがＰＳ１ＫＩ対立遺伝子の変異の存在によって変わらないことを示すＰＳ１のＣ末端断片の免疫ブロット。
【図２】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ：  ２．５、４、６及び１０月齢におけるそれぞれ全Ａβ、Ａβ４２及び全Ａβ／Ａβ４２比の定量化。
【図３】ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  ＨｏマウスにおけるＡβペプチドの沈着プロセスの加速。６ヶ月における脳内のＡβペプチドの細胞外沈着物の領域分布を示すプレート。画像は、３匹のＡＰＰ７５１ＳＬマウス（図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ）及び３匹のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図３Ｄ、３Ｅ及び３Ｆ）におけるＡβ免疫標識（Ａｂ  ４Ｇ８）を示す。免疫標識によれば、ＡＰＰ７５１ＳＬマウスの皮質（Ｃｘ）及び海馬（Ｈｐ）においてまだ稀ではあるが最初の沈着が６ヶ月で出現する。これと比較して、同じ年齢のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスにおいては、沈着物の数はこれらの領域において大きく増加する。これらのマウスにおいては、沈着物は視床（Ｔ）中にかなりの量ですでに存在することに留意されたい。
【図４】Ａβペプチドの沈着プロセスの加齢による進行１０ヶ月における脳内のＡβ沈着物の領域分布を示すプレート。これらの画像は２匹のＡＰＰ７５１ＳＬマウス（図４Ａ及び４Ｂ）及び２匹のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図４Ｃ及び４Ｄ）に対応する。ＡＰＰ７５１ＳＬマウスにおいては、免疫標識によって、１０月齢での皮質（Ｃｘ）及び海馬（Ｈｐ）における沈着物の数及びサイズが６月齢よりもかなり増加し、視床において最初の沈着が出現したことが示される（図３参照）。沈着物の密度及びサイズも、ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスの皮質、海馬及び視床において１０ヶ月でより大きくなる。これらのマウスにおいては、線条体（Ｓｔ）中に少数の沈着を検出できることに留意されたい。
【図５】ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  ＨｏマウスのＣＡ１におけるニューロン死プロセス。１０月齢ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスの海馬中の罹患した錐体ニューロンを示すプレート。画像は、２匹のＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図５Ａ及び５Ｂ）、２匹のＡＰＰ７５１ＳＬマウス（図５Ｃ及び５Ｄ）及び２匹のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図５Ｅ及び５Ｆ）の海馬におけるクレシルバイオレット染色を低倍率で示す。海馬中の錐体細胞層の密度及び厚さは、１０月齢ＡＰＰ７５１ＳＬマウスとＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスにおいては定性的に同等である。一方、それらは、同年齢ではＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスにおいて、特にアンモン角の層１（ＣＡ１）において明らかに減少する。青く染色された小細胞（グリア型細胞）の数は、ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスの海馬において増加しているように見えることに留意されたい。
【図６】ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  ＨｏマウスのＣＡ１におけるニューロン死プロセス。別のニューロンマーカー、メチルグリーン及びＢＩＰ免疫標識を使用した、１０月齢におけるＣＡ１中の罹患したニューロンを示すプレート。画像は、非トランスジェニックマウス（図６Ａ）、ＰＫＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図６Ｂ）、ＡＰＰ７５１ＳＬマウス（図６Ｃ）及びＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図６Ｄ）のＣＡ１におけるメチルグリーン染色を高倍率で示す。画像は、ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図６Ｅ）及びＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図６Ｆ）のＣＡ１におけるＢＩＰ免疫標識を高倍率で示す。非トランスジェニック、ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏ及びＡＰＰ７５１ＳＬマウスに比較して、ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  ＨｏマウスのＣＡ１領域においては、メチルグリーンで染色された神経細胞の数が明らかに減少する。この二重トランスジェニックマウスの海馬の実質において、染色されたグリア型細胞がかなりの数で検出されることは注目すべきである。ＢＩＰ免疫標識によって、１０月齢ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  ＨｏマウスのＣＡ１において錐体ニューロンがかなり失われることも確認される。
【図７】ＣＡ１におけるニューロン死及びＡβペプチドの細胞内沈着。１０月齢における２つの病理学的プロセス、すなわち、罹患したニューロン及びＡβペプチドの異常な脳内蓄積を示すプレート。画像は、２匹のＡＰＰ７５１マウス（図７Ａ及び７Ｂ）及び２匹のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図７Ｅ及び７Ｆ）におけるＡβ免疫標識をＣＡ１において高倍率で示す。画像は、ＡＰＰ７５１マウス（図７Ｃ及び７Ｄ）、ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図７Ｇ及び７Ｈ）及び２匹のＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（７１及び７Ｊ）におけるクレシルバイオレット染色をＣＡ１において高倍率で示す。１０月齢では、単一ＡＰＰ７５１ＳＬマウスとＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏ二重の両方において、Ａβの細胞外沈着物がＣＡ１中のニューロン層のどちらかの側で主に認められた。一方、（ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスにおける層にすべて沿ったニューロンに対する明白な効果を特徴とする、図７Ｃ及び７Ｄ）ＣＡ１において、（Ａβペプチドの異常な神経細胞内蓄積に対応する、矢印参照）顆粒状の外観を有するＡβ免疫標識は、ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスにおいてより強く見える。これは６月齢にも当てはまる（図８参照）。
【図８】ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  ＨｏマウスのＣＡ１におけるニューロン死プロセスの早期発生６月齢における海馬のＣＡ１領域を示すプレート。画像は、３匹のＡＰＰ７５１マウス（図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ）及び３匹のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図８Ｇ、８Ｈ及び８Ｉ）におけるＡβ免疫標識をＣＡ１において高倍率で示す。画像は、ＡＰＰ７５１マウス（図８Ｄ、８Ｅ及び８Ｆ）及びＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウス（図８Ｊ、８Ｋ及び８Ｌ）におけるクレシルバイオレット染色を示す。６月齢において、ＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスにおける海馬のＣＡ１領域は、グリア型細胞（図８Ｌ）数の増加に伴うすでにかなりの数のＡβの細胞外沈着物（図８Ｉ）、Ａβの強い細胞内顆粒状標識（矢印参照）及びクレシルバイオレットで染色されたニューロンの欠損を特徴とする。他の２匹のＡＰＰ７５１ＳＬ×ＰＳ１ＫＩ  Ｈｏマウスの場合、クレシルバイオレットで染色されたＣＡ１ニューロン層はほとんど乱れていない（図８Ｊ）かまったく乱れていない（図８Ｋ）ように見える。これらの２匹のマウスでは、３匹目のマウス（図８Ｉ）よりも細胞内Ａβ免疫標識が弱く、散在している（図８Ｇ及び８Ｈ）ように見えることに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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