(57)【要約】  被験体における造血の阻害方法を提供する。該方法は、被験体においてカスパーゼ−８の発現または活性をダウンレギュレーションし、それにより被験体において造血を抑制することにより行なわれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ−８の発現または活性を被験体においてダウンレギュレーションし、それにより、被験体における造血を阻害することを含む被験体における造血の阻害方法。
【請求項２】
前記カスパーゼ−８の発現または活性の前記ダウンレギュレーションが、
（ａ）カスパーゼ−８に結合する分子；
（ｂ）カスパーゼ−８を切断する酵素；
（ｃ）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド；
（ｄ）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム；
（ｅ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｆ）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体
（ｇ）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子
（ｈ）カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクター；および／または
（ｉ）内在性カスパーゼ−８の内生的産生を阻害するためのベクター
により行なわれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列が配列番号：１６に記載されたものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が抗体または抗体断片である請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記抗体断片がＦａｂまたはＳｃＦｖ断片である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋおよびＤＥＶＤ−ｆｍｋからなる群より選択されるカスパーゼ−８インヒビターである請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の配列が配列番号：１５に記載されたものである請求項２記載の方法。
【請求項８】
被験体においてカスパーゼ−８シグナル伝達経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドの発現または活性をダウンレギュレーションし、それにより、被験体における造血を阻害することを含む被験体における造血の阻害方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ９およびＣＡＳＰ１０からなる群より選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
カスパーゼ−８の発現または活性を、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害を有する被験体の造血性細胞内においてダウンレギュレーションし、それにより、前記障害を処置することを含む造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置方法。
【請求項１１】
前記障害が、急性骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性前リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および崩壊性白血病からなる群より選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記カスパーゼ−８の発現または活性の前記ダウンレギュレーションが、
（ａ）カスパーゼ−８に結合する分子；
（ｂ）カスパーゼ−８を切断する酵素；
（ｃ）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド；
（ｄ）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム；
（ｅ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｆ）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体；
（ｇ）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子；
（ｈ）カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクター；および／または
（ｉ）内在性カスパーゼ−８の内生的産生を阻害するためのベクター
により行なわれる請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列が配列番号：１６に記載されたものである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が抗体または抗体断片である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体断片がＦａｂまたはＳｃＦｖ断片である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋおよびＤＥＶＤ−ｆｍｋからなる群より選択されるカスパーゼ−８インヒビターである請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の配列が配列番号：１５に記載されたものである請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
化学療法をさらに含む請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
放射線療法をさらに含む請求項１０記載の方法。
【請求項２０】
前記造血性細胞を１種類以上の成長刺激因子に曝露することをさらに含む請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
骨髄移植をさらに含む請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
前記骨髄移植が自己型である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記骨髄移植が同種異系型である請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）造血性細胞を被験体から単離すること；および
（ｂ）前記造血性細胞を、カスパーゼ−８の発現または活性を前記造血性細胞内でダウンレギュレーションすることができる分子に曝露し、それにより、骨髄代償療法に適した造血性細胞集団を作製すること
を含む骨髄代償療法に適した造血性細胞集団の作製方法。
【請求項２５】
前記カスパーゼ−８の発現または活性の前記ダウンレギュレーションが、
（ａ）カスパーゼ−８に結合する分子；
（ｂ）カスパーゼ−８を切断する酵素；
（ｃ）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド；
（ｄ）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム；
（ｅ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｆ）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体；
（ｇ）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子；
（ｈ）カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクター；および／または
（ｉ）内在性カスパーゼ−８の内生的産生を阻害するためのベクター
により行なわれる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列が配列番号：１６に記載されたものである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が抗体または抗体断片である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体断片がＦａｂまたはＳｃＦｖ断片である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋおよびＤＥＶＤ−ｆｍｋからなる群より選択されるカスパーゼ−８インヒビターである請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の配列が配列番号：１５に記載されたものである請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）造血性細胞をドナーから単離すること；
（ｂ）前記造血性細胞を、カスパーゼ−８の発現または活性を前記造血性細胞内でダウンレギュレーションすることができる分子に曝露すること；および
（ｃ）前記造血性細胞をレシピエントに移植し、それにより、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害を処置すること
を含む造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置方法。
【請求項３２】
前記カスパーゼ−８の発現または活性の前記ダウンレギュレーションが、
（ａ）カスパーゼ−８に結合する分子；
（ｂ）カスパーゼ−８を切断する酵素；
（ｃ）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド；
（ｄ）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム；
（ｅ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｆ）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体；
（ｇ）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子；
（ｈ）カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクター；および／または
（ｉ）内在性カスパーゼ−８の内生的産生を阻害するためのベクター
により行なわれる請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列が配列番号：１６に記載されたものである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が抗体または抗体断片である請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体断片がＦａｂまたはＳｃＦｖ断片である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋおよびＤＥＶＤ−ｆｍｋからなる群より選択されるカスパーゼ−８インヒビターである請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の配列が配列番号：１５に記載されたものである請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
前記ドナーが前記レシピエントである請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
前記ドナーが前記レシピエントに対して同種異系である請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
前記障害が、急性骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性前リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および崩壊性白血病からなる群より選択される請求項３１記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｂ）が、前記造血性細胞を１種類以上の成長刺激因子に曝露することをさらに含む請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
包装材料と、該包装材料内に含まれた医薬組成物であって造血の調整における使用が確認され、かつ活性成分として、カスパーゼ−８の活性または発現を被験体において変更することができる薬剤、および薬学的に許容し得る担体を含有する前記医薬組成物とを含んでなる製造物品。
【請求項４３】
前記薬剤が、前記カスパーゼ−８の前記発現または活性を少なくとも部分的に阻害することができる請求項４２記載の製造物品。
【請求項４４】
前記薬剤が、
（ａ）カスパーゼ−８に結合する分子；
（ｂ）カスパーゼ−８を切断する酵素；
（ｃ）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド；
（ｄ）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム；
（ｅ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｆ）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体；
（ｇ）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子；
（ｈ）カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクター；および／または
（ｉ）内在性カスパーゼ−８の内生的産生を阻害するためのベクター
からなる群より選択される請求項４３記載の製造物品。
【請求項４５】
造血の阻害のための医薬の製造における、カスパーゼ−８の発現または活性のダウンレギュレーターの使用。
【請求項４６】
造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害を処置するためのカスパーゼ−８の発現または活性のダウンレギュレーターの使用。
【請求項４７】
前記障害が、急性骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性前リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および崩壊性白血病からなる群より選択される請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
前記カスパーゼ−８の発現または活性の前記ダウンレギュレーションが、
（ａ）カスパーゼ−８に結合する分子；
（ｂ）カスパーゼ−８を切断する酵素；
（ｃ）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド；
（ｄ）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム；
（ｅ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｆ）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体；
（ｇ）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子；
（ｈ）カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクター；および／または
（ｉ）内在性カスパーゼ−８の内生的産生を阻害するためのベクター
により行なわれる請求項４５または４６記載の使用。
【請求項４９】
前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列が配列番号：１６に記載されたものである請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が抗体または抗体断片である請求項４８記載の使用。
【請求項５１】
前記抗体断片がＦａｂまたはＳｃＦｖ断片である請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
前記カスパーゼ−８に結合する分子が、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋおよびＤＥＶＤ−ｆｍｋからなる群より選択されるカスパーゼ−８インヒビターである請求項４８記載の使用。
【請求項５３】
前記低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の配列が配列番号：１５に記載されたものである請求項４８記載の使用。
【請求項５４】
化学療法をさらに含む請求項４５または４６記載の使用。
【請求項５５】
放射線療法をさらに含む請求項４５または４６記載の使用。
【請求項５６】
前記造血性細胞を１種類以上の成長刺激因子に曝露することをさらに含む請求項４５または４６記載の使用。
【請求項５７】
骨髄移植をさらに含む請求項４５または４６記載の使用。
【請求項５８】
前記骨髄移植が自己型である請求項５７記載の使用。
【請求項５９】
前記骨髄移植が同種異系型である請求項５７記載の使用。
【請求項６０】
造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置のための医薬の製造におけるカスパーゼ−８シグナル伝達に関与する少なくとも１つのポリペプチドのダウンレギュレーターの使用。
【請求項６１】
前記障害が、急性骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性前リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および崩壊性白血病からなる群より選択される請求項６０記載の使用。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ９およびＣＡＳＰ１０からなる群より選択される請求項６０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血を調整するための方法および製造物品に関し、より詳しくは、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害（たとえば、白血病など）を処置するために用いられ得る方法および製造物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中を循環している形態学的に認識可能であり、かつ機能的な能力を有する細胞としては、赤血球、好中球、好酸球および好塩基球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球ならびに血小板が挙げられる。これらの成熟造血性細胞は、要求に応じて、それぞれの系統の形態学的に認識可能な分裂前駆細胞（たとえば、赤血球系では赤芽球、顆粒球系では骨髄芽球、前骨髄球および骨髄球ならびに血小板では巨核球など）から派生し、置き換えられる。前駆細胞は、２つの主な亜集団：幹細胞および前駆細胞に大別され得る、より始原的な細胞から生じる（概説については、Broxmeyer, H. E., 1983, CRC Critical Review in Oncology/Hematology 1:227-257を参照のこと）。
【０００３】
造血性細胞の制御不能な増殖または過形成は、生命にかかわる種々の疾患（なかでも最も注目すべきものは白血病）と関連している。白血病は、骨髄および血液の悪性癌である。これは、血球細胞の制御不良の増殖および成長を特徴とする。一般的な型の白血病は、４つの類型：急性または慢性の骨髄性で骨髄の骨髄性成分（白血球、赤血球、巨核球）が関与するもの、および急性または慢性のリンパ性でリンパ系統の細胞が関与するものに分類される。
【０００４】
急性白血病は、急速に進行する疾患であり、骨髄および血液内で未熟で機能のない細胞（芽細胞）の大量蓄積をもたらす。この増殖の結果、骨髄は、もはや正常な赤血球および白血球ならびに血小板を充分に生成することができなくなる。その結果、急性白血病を患う個体は、貧血で、感染しやすくなり、制御不能な出血をもたらし得る不完全な凝固プロセスを示す。対照的に、慢性白血病は、よりゆっくりと進行し、無規制な増殖、したがって、多種多様な成熟（分化）細胞の顕著な過剰増殖に至る。
【０００５】
白血病の標準的な処置は、通常、化学療法、放射線療法および／または骨髄移植を伴う。骨髄移植組織の２つの主な型は、自己型（患者自身の骨髄を用いる）および同種異系型（適合するドナー由来の骨髄を用いる）である。放射線療法は、高エネルギー放射線の使用を伴い、通常、すべての白血病細胞を死滅させるために骨髄移植前に施される。白血病における化学療法は、通常、２種類以上の抗癌剤の組合せを伴う。また、白血病の新しい処置としては、多剤耐性の逆転（悪性細胞が化学療法薬の障害性効果を回避する（および抗療性または再発をもたらす）のを可能にする機序を低減させる薬剤の使用を伴う）；およびモノクローナル抗体を用いる生物学的療法（この場合、毒素を、悪性細胞が提示する相補的な抗原と反応する抗体に結合させる）；またはインターフェロン、インターロイキンなどのサイトカインが挙げられる。最近、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置するための薬物グリベック（ノバルティス（Novartis））がＦＤＡにより承認された。
【０００６】
総合的に、白血病の処置は非常に複雑であり、白血病の型および患者の状態に依存する。治療に耐性のある患者は、いつ耐性が現れたかに関係なく、低い生存率を示す。
【０００７】
また、白血病患者は、しばしば、造血性細胞の致命的な過剰増殖（これは、現在利用可能な治療法の効率をかなり低下させる）に苦しむ。したがって、白血病患者における造血の抑制は、他の治療法の前または他の治療法と組み合わせたとき、処置の結果を有効に改善できることが期待されている。
【０００８】
しかしながら、現行の処置プログラムでの結果の改善にもかかわらず、すべての型の白血病の処置の新規なアプローチのための研究が継続されている。
【０００９】
したがって、白血病および異常な造血プロセスに関連する種々の他の障害を処置するための新規な治療アプローチの必要性が広く認識されており、これを有することが非常に好都合であり得る。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の一態様によれば、被験体においてカスパーゼ−８の発現または活性をダウンレギュレーションし、それにより、被験体における造血を阻害することを含む、被験体における造血の阻害方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、被験体においてカスパーゼ−８シグナル伝達経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドの発現または活性をダウンレギュレーションし、それにより、被験体における造血を阻害することを含む、被験体における造血の阻害方法が提供される。
【００１２】
本発明のまた別の態様によれば、カスパーゼ−８の発現または活性を、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害を有する被験体の造血性細胞内においてダウンレギュレーションし、それにより、該障害を処置することを含む、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の態様によれば、骨髄代償療法に適した造血性細胞集団の作製方法が提供される。該方法は、造血性細胞を被験体から単離し、該造血性細胞を、カスパーゼ−８の発現または活性を前記造血性細胞内でダウンレギュレーションすることができる分子に曝露し、それにより、骨髄代償療法適した造血性細胞集団を作製することにより行なわれる。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置方法が提供される。該方法は、（ｉ）造血性細胞をドナーから単離し、（ii）該造血性細胞を、カスパーゼ−８の発現または活性を該造血性細胞内でダウンレギュレーションすることができる分子に曝露し、（iii）該造血性細胞をレシピエントに移植し、それにより、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害を処置することにより行なわれる。
【００１５】
本発明のまたさらなる態様によれば、包装材料と、造血の調整における使用が確認された医薬組成物であって、該包装材料内に含まれた該医薬組成物とを含んでなる製造物品が提供される。該医薬組成物は、活性成分として、カスパーゼ−８の活性または発現を被験体において変更することができる薬剤、および薬学的に許容し得る担体を含有する。
【００１６】
以下に記載する本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によれば、カスパーゼ−８の発現または活性のダウンレギュレーションは、（ｉ）カスパーゼ−８に結合する分子、（ii）カスパーゼ−８を切断する酵素、（iii）カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、（iv）カスパーゼ−８をコードする転写物を特異的に切断するリボザイム、（ｖ）カスパーゼ−８転写物を特異的に切断する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；（vi）カスパーゼ−８の少なくとも触媒性または結合性部分の非機能性類似体および（vii）カスパーゼ−８の活性化または基質結合を妨げる分子からなる群より選択される薬剤により行なわれる。
【００１７】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、カスパーゼ−８に結合する分子は抗体または抗体断片である。
【００１８】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、抗体断片はＦａｂまたはＳｃＦｖ断片である。
【００１９】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、カスパーゼ−８に結合する分子は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋおよびＤＥＶＤ−ｆｍｋからなる群より選択されるカスパーゼ−８インヒビターである。
【００２０】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の配列は配列番号：１５に記載されたものである。
【００２１】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、少なくとも１つのポリペプチドは、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ９およびＣＡＳＰ１０からなる群より選択される。
【００２２】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列は配列番号：１６に記載されたものである。
【００２３】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、該障害は、急性骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性前リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および崩壊性白血病からなる群より選択される。
【００２４】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置は、化学療法をさらに含む。
【００２５】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置は、放射線療法をさらに含む。
【００２６】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置は、造血性細胞を１種類以上の成長刺激因子に曝露することをさらに含む。
【００２７】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置は、骨髄移植をさらに含む。
【００２８】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、骨髄移植は自己型である。
【００２９】
記載した好ましい実施態様におけるまたさらなる特徴によれば、ドナーはレシピエントである。
【００３０】
本発明は、造血を制御可能に調整し、したがって、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の有効な処置を可能にするための方法および製造物品を提供することにより、現在知られている形態の欠点にうまく対処するものである。
【００３１】
また、本発明は、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置のため、および造血の阻害のための医薬の製造における、本発明によるカスパーゼ−８のダウンレギュレーターの使用を提供する。
【００３２】
また、本発明は、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置のため、および／または造血の阻害のための医薬の製造における、カスパーゼ−８シグナル伝達に関与する少なくとも１つのポリペプチド（たとえば、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ９およびＣＡＳＰ１０）のダウンレギュレーターの使用を教示する。
【００３３】
特に記載のない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。矛盾が生じる場合は、本明細書（定義を含む）が支配する。また、材料、方法および実施例は、一例にすぎず、限定を意図しない。
【００３４】
本発明を、添付の図面を参照しながら、単に例示の目的で本明細書において説明する。図面に対する詳細な以下の具体的な言及により、示される特定の内容は、例示のため、および本発明の好ましい実施態様の例示的記載を目的とするにすぎず、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される記載と考えられるものを提供するために示したことを強調する。これに関連し、本発明の構造的詳細を、本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に示す試みはしておらず、本記載内容は、図面と合わせると、本発明のいくつかの態様がどのようにして実際に具現化され得るかが当業者に自明となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、造血に関連する障害の処置に使用され得る方法および製造物品に関する。より詳しくは、本発明は、造血性細胞内においてカスパーゼ−８の発現または活性を調節することによる造血の調整に関する。
【００３６】
本発明による造血の調整の原理および操作は、図面および付随する記載内容を参照すると、よりよく理解されよう。
【００３７】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載される詳細事項または実施例によって例示される詳細事項への適用に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施態様が可能であり、種々の方法で実行および実施することができる。また、本明細書で用いる語法および専門用語は、説明を目的とし、限定するものとみなされるべきでないことを理解されたい。
【００３８】
カスパーゼ（システインアスパラギン酸プロテアーゼ）ファミリーの酵素は、真核生物細胞におけるプログラムされた死の起始において中心的な役割を果たす（１）。カスパーゼ酵素は、特定のタンパク質基質を切断し、これにより、タンパク質の機能が消去されるか、または誘発される。カスパーゼは、アポトーシス死をもたらし得る一連の機能性および構造的変化を起こすことができることが知られている。このようなカスパーゼは、特定のインデューサーによって選択的に活性化され得、種々の異なる外部シグナルおよび細胞内シグナルによる細胞死プログラムの開始を可能にする。最近、いくつかの研究により、ある種のカスパーゼは、非アポトーシス機能にも役割を果たし得ることが示された（２−８）。
【００３９】
カスパーゼ−８（さらなる説明は、GeneCard GC02P200822(http://www.rzpd.de/cards/index.html）を参照のこと）は、ＴＮＦファミリーのリガンドによる細胞死誘導におけるその役割が知られている。このカスパーゼは、２つのタンデムＮ末端細胞死エフェクタードメインを介してＭＯＲＴ１／ＦＡＤＤと呼ばれるアダプタータンパク質に結合し、これが、こんどは、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターの細胞内ドメインまたは該レセプターに結合する他のアダプタータンパク質のいずれかに直接結合する。このような会合によるカスパーゼ−８の活性化は、これらのレセプターが誘導する細胞死プロセスを開始することが示されている（9-10, 26;Salmena Lら Genes Dev. 17:883-895, 2003; Olson N. E.ら J. Immunol. 170:6065-6072,2003）。最近、Chanら（Nature 419:395, 2002）は、自己免疫性リンパ組織増殖性症候群に関連する症状を有する患者において、カスパーゼ−８変異を確認した。これらの患者由来のＴ、ＢおよびＮＫ細胞は、活性化における欠陥を示し、これは、カスパーゼ−８がリンパ球活性化に関与することを示す。Olsonら（The Journal of Immunology 170: 6065-6072, 2003）は、カスパーゼ−８が種々の刺激によってＢ細胞活性化を増大させたこと、およびカスパーゼ−８に対して選択的なインヒビターがＢ細胞増殖を阻止したことを報告した。さらに、カスパーゼ−８活性は、刺激されたＢリンパ球が細胞周期に入るのに必要とされることが示された。カスパーゼ−８遺伝子のノックアウトは、子宮内致死的であり（Varfolomeevら(11)により報告）、これは、この酵素が胚発達に必須であることを示すが、成体マウスにおけるカスパーゼ−８の役割の評価のためのその有用性を縮小する。
【００４０】
本発明を実施した際、本発明者らは、予期せずして、マウスの造血性細胞におけるカスパーゼ−８遺伝子のノックアウトが、造血におけるカスパーゼ−８の中心的役割を示す驚くべき意外な知見をもたらすことを見出した。以下に続く実施例の項の実施例２〜７に示すように、成体マウスの造血細胞におけるカスパーゼ−８の欠如により、骨髄造血性前駆細胞の生成がかなり障害を受け、骨髄細胞が被照射マウスの脾臓でコロニー形成する能力をかなり低下させた（実施例３）。さらにまた、カスパーゼ−８ノックアウトは、骨髄細胞が被照射キメラマウスにおいて再構成する能力をかなり低下させた（実施例４）。また、カスパーゼ−８ノックアウトによって刺激剤によるＢリンパ球の活性化が障害され（実施例５）、単球前駆体のマクロファージへの分化が阻害され（実施例６）、そして胚の造血が障害された（実施例７）。総合的に、これらの結果は、カスパーゼ−８が造血性細胞の形成および発育に必須であることを明白に示す。
【００４１】
いくつかの研究により、カスパーゼが非アポトーシス機能に関与することが示されたが（２〜８、２６）、これらの報告は、いずれも、造血におけるカスパーゼ−８の関与をなんら記載も示唆もしていない。最近、Varfolomeevら(11)は、マウスにおけるカスパーゼ−８遺伝子（Ｃａｓｐ８）のホモ接合ノックアウトは子宮内致死的であること、およびその胚は心筋発達障害および赤血球の密集性蓄積を示したことを報告した。しかしながら、成体マウスにおけるカスパーゼ−８の非アポトーシス性効果は、Varfolomeevらのホモ接合カスパーゼ−８ノックアウトマウスを用いても、見出されなかった。
【００４２】
したがって、本発明の一態様によれば、造血の阻害方法が提供される。該方法は、カスパーゼ−８の発現または活性を造血性細胞においてダウンレギュレーションし、それにより、被験体における造血を阻害することにより行なわれる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「造血」は、幹細胞からの増殖および／または分化に関与する血球細胞の形成および成長をいう。造血は、本明細書において以下にさらに記載するように、インビボで（すなわち、被験体の骨髄で）起こるが、造血の阻害は、本明細書において以下にさらに記載するインビボおよびエキソビボ（インビトロ）の両アプローチにより行なわれ得る。
【００４４】
本明細書で使用する場合、語句「発現または活性を阻害する」は、カスパーゼ−８の発現（転写および／または翻訳）または活性（たとえば、酵素による結合またはリガンドによる結合）を部分的または完全に阻害することをいう。好ましくは、本発明によるカスパーゼ−８発現の阻害は、カスパーゼ−８のスプライスバリアントα１およびα２（それぞれ配列番号：２１および２３）を標的化するが、活性の阻害は、これらの配列にコードされるポリペプチド（それぞれ配列番号：２０および２２）を標的化する。
【００４５】
造血性細胞においてカスパーゼ−８の活性をダウンレギュレーションするために、いくつかの異なるアプローチを用いることができる。
【００４６】
たとえば、カスパーゼ−８活性の阻害は、カスパーゼ−８に特異的に結合することができる抗体または抗体断片などの薬剤によりなされ得、細胞への進入を可能にする様式で修飾され得る。好ましくは、該抗体は、カスパーゼ−８の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基をいう。
【００４７】
エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な表面分子（たとえば、アミノ酸または炭化水素側鎖など）の集団からなり、通常、特異的な三次元の構造的特徴および特異的な帯電特性を有する
カスパーゼ−８の好ましいエピトープは、触媒性部位（たとえば、システイン３６０周囲）またはカスパーゼ−８のアダプタータンパク質ＦＡＤＤとの会合領域（すなわち、アミノ酸２〜１８３にわたって存在する細胞死エフェクタードメイン領域）を含有するものである。
【００４８】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、インタクトな分子およびその機能性断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）を含む。これらの機能性抗体断片は、以下のように定義する。（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含む断片であり、完全な抗体の酵素パパインによる消化によってインタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部分を生成させることにより作製され得る。（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体のペプシンによる処理後、還元によってインタクトな軽鎖および重鎖の一部分を生成させることにより得られ得る抗体分子の断片である。１つの抗体分子につき、２つのＦａｂ’断片が得られる。（３）（Ｆａｂ’）２は、完全な抗体を酵素ペプシンで処理する（その後の還元は行なわない）ことにより得られ得る抗体の断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって互いに結合した２つのＦａｂ’断片の二量体である。（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に作製した断片と定義される。（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、適当なポリペプチドリンカーで連結された軽鎖の可変領域と重鎖可変領域を、遺伝子工学的に融合された単鎖の分子として含有する遺伝子工学的に作製した分子である。
【００４９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにその断片の作製方法は、当該技術分野において周知である（たとえば、Harlow および Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988（引用により本明細書に組み込まれる）を参照）。本発明における使用に好適な、カスパーゼ−８に結合する市販のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、Linscott's Directory of Immunological and Biological Reagents, 第１２版, 2002-2003 (Publisher:W. D. Linscott, Petaluma, California）に開示されている。これらとしては、モノクローナル抗体クローン番号１１８６（ＩｇＧ１）、ＩＣ１２（ＩｇＧ１）、８ＣＳＰ０１（ＩｇＧ１）、８ＣＳＰ０２（ＩｇＧ１）、８ＣＳＰ０３（ＩｇＧ１）、ＦＬＩＣＥ１（ＩｇＧ１）、ＦＬＩＣＥ３（ＩｇＧ１）、ＦＬＩＣＥ４−１−２０（ＩｇＧ１）、８９−２（ＩｇＧ２ａ）、ＣＡＳ８（ＩｇＭ）、１１Ｇ１０（切断カスパーゼ−８）、８４３．１１（ヒトカスパーゼ−８）、ＩＨ１０Ｅ４Ｈ１０（ヒトカスパーゼ−８  ＩｇＧ２ａ−ＲＡＴ）、１２Ｆ５（ヒトカスパーゼ−８、ＩｇＧ２ｂ）、５Ｄ３（ヒトカスパーゼ−８、ＩｇＧ２ｂ）、５Ｆ７（ヒトカスパーゼ−８、ＩｇＧ２ｂ）、Ｓ５ＦＬＧ（ヒトカスパーゼ−８、ＩｇＧ２ｂ）、５７Ｆ（ヒトカスパーゼ−８、ＩｇＧ２ｂ）、７９Ａ１３３７（ヒトカスパーゼ−８  １７６〜４６０断片、ＩｇＧ）、および５Ｄ３（ヒト／マウスカスパーゼ−８  １８０〜４６０断片、ＩｇＧ２ｂ）が挙げられる。
【００５０】
本発明による抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解により、または大腸菌もしくは哺乳動物細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）において該断片をコードするＤＮＡを発現させることにより調製することができる。抗体断片は、慣用法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。たとえば、抗体断片は、ペプシンを用いた抗体の酵素による切断によって、Ｆ（ａｂ’）２で示される５Ｓ断片を提供することにより作製され得る。この断片を、チオール還元剤を使用し、任意に、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基の保護基を使用することにより、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生成させることができる。あるいはまた、ペプシンを用いた酵素による切断により、２つの一価のＦａｂ’断片とＦｃ断片とが直接生成される。これらの方法は、たとえば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにそれらに記載された参考文献（これらの特許は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126(1959)］も参照のこと。抗体を切断する他の方法（たとえば、一価の軽／重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断など、または他の酵素的、化学的または遺伝子工学的な手法）もまた、断片が、インタクトな抗体に認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
【００５１】
Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら［Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62(1972)］に記載のように、非共有結合性であり得る。あるいはまた、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されたものであっても、グルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋されたものであってもよい。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有する。このような単鎖抗原結合性タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含有する構造遺伝子を構築することにより製造される。該構造遺伝子を発現ベクター内に挿入し、続いて、これを、大腸菌などの宿主細胞に導入する。
【００５２】
カスパーゼは細胞質ゾル内酵素であるため、本発明により用いられる抗体は、好ましくは、造血細胞に送達可能な、または造血細胞内で発現可能な抗体断片である。したがって、ｓｃＦｖ  Ａｂコード配列は、好ましくは、造血性細胞における抗カスパーゼ−８  ｓｃＦｖ断片の発現に好適なベクター内に含まれる（以下に記載する発現ベクターの構築に関する詳細を参照）。好適なｓｃＦｖ発現ベクターは、たとえば、ｐＩＧ６［Ge: Anibody Engineering (Boreback C. A. K 編）第２版 pp 229-261, 1995 Oxford university］であり得、ｐＦａｂ５ｃまたはｐｃＤＮＡ３．１は、Khosharにより記載されている（PNAS 99:1002-1007, 2002）。
【００５３】
組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドと共に単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖの作製方法は、たとえば、Whitlow および Filpula, Methods 2:97-105(1991);Birdら, Science 242:423-426(1988); Packら, Bio/Technology 11:1271-77(1993)；および米国特許第４，９４６，７７８号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５４】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小限の認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。かかる遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用い、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。たとえば、Larrick および Fry [Methods, 2:106-10(1991)] を参照のこと。
【００５５】
非ヒト（たとえば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖もしくは断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２または抗体の他の抗原結合性の部分配列）のキメラ分子であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。ヒト化抗体としては、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（たとえば、マウス、ラットまたはウサギなど）（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基と置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基と置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても外来性ＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見られない残基を含有し得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含有し、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒトイムノグロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが関連するヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものに対応する。また、最適には、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンもの）の少なくとも一部分を含む［Jonesら, Nature, 321:522-525(1986); Riechmannら, Nature 332:323-329(1988);および Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)］。
【００５６】
非ヒト抗体のヒト化の方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば外来性残基とよばれ、典型的には、外来性可変ドメインから採用される。本質的に、ヒト化は、Winterおよび共働者［Jonesら, Nature, 321:522-525(1986); Riechmannら, Nature 332:323-327(1988); Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536(1988)］の方法にしたがって、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって行なわれ得る。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなものより実質的に短いヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列で置き換えられている。実際面では、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基（あるいはいくつかのＦＲ残基）が、齧歯類抗体内の類似部位由来の残基で置き換えられたヒト抗体であり得る。
【００５７】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの当該技術分野において公知の種々の手法を用いて作製することができる［Hoogenboom および Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marksら, J. Mol. Biol., 222:581(1991)］。Coleら および Boernerらの手法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985) および Boernerら, J. Immunol., 147(1):86-95(1991)］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物（たとえば、マウス）に導入することにより作製することができる。チャレンジされると、ヒト抗体産生が観察され、これは、ヒトにおいて見られるものと、すべての点（遺伝子再編成、鎖合成および抗体レパートリーなど）において非常に類似する。このアプローチは、たとえば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および以下の科学雑誌：Marksら, Bio/Technology 10,: 779-783(1992); Lonbergら, Nature 368: 856-859(1994); Morrison, Nature 368 812-13(1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51(1996);Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826(1996);および Lonberg および Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13,65-93(1995)に記載されている。
【００５８】
カスパーゼ−８活性の阻害はまた、カスパーゼ−８の公知のペプチドインヒビター（たとえば、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＩＥＤＴ−ｆｍｋ、ＤＥＶＤ−ｆｍｋなど）を利用することにより、またはカスパーゼ−８の触媒性部位と相互作用することができるポリペプチド配列由来の任意のペプチドインヒビター（たとえば、基質類似体）またはウイルス性カスパーゼ阻害性タンパク質Ｃｒｍ−Ａおよびｐ３５由来の分子、またはカスパーゼ−８の細胞性インヒビターｃＦＬＩＰ由来またはその種々のウイルス性ホモログ由来の分子により行なわれ得る。さらなるインヒビターを同定するために使用され得る適当な生化学的／分子的アプローチの記載は、本明細書において以下に提供する。
【００５９】
カスパーゼ−８のさらなるインヒビターは、分子設計アプローチを用い、Blanchardら（Structure 7:1125-1133, 1999）およびWattら（Structure 7:1135-1143, 1999）により記載されたカスパーゼ−８の三次元分子構造を利用することにより、ならびにChouら（FEBS 419:49-54, 1997）により創出された基質結合モデルを利用することにより同定することができる。
【００６０】
また、カスパーゼ−８活性は、カスパーゼ−８を亜細胞細胞小器官／位置に移動させ、かつその生物学的効果の発揮を不能にするタンパク質、たとえば、「二機能性アポトーシス調節因子」（ＢＡＲ）（ミトコンドリアと会合したカスパーゼ−８の局在を指令するタンパク質）（Stegh AHら J Biol Chem. 2002 277:4351-60）により阻害され得る。
【００６１】
カスパーゼ−８の造血性細胞における発現のダウンレギュレーションは、いくつかの分子的アプローチの任意の１つを用いて行ない得る。
【００６２】
たとえば、カスパーゼ−８転写は、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を利用するＲＮＡ干渉により阻害され得る。ＲＮＡ干渉は、２段階のプロセスであり、第１段階は、開始段階とよばれるもので、投入ｄｓＲＮＡが、おそらく、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーの構成員であるＤｉｃｅｒ（これは、ｄｓＲＮＡ（直接、または導入遺伝子またはウイルスにより導入）をＡＴＰ依存的にプロセッシング（切断）する）の作用によって、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化される。逐次的な切断事象がＲＮＡを、各々、２ヌクレオチドの３’突出端を有する１９〜２１  ｂｐ  二重らせん（ｓｉＲＮＡ）に分解する［Hutvagner および Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002);および Bernstein Nature 409:363-366(2001)］。
【００６３】
エフェクター段階では、ｓｉＲＮＡ二重らせんは、ヌクレアーゼ複合体に結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重らせんのＡＴＰ依存的巻き戻しは、ＲＩＳＣの活性化に必要とされる。次いで、活性なＲＩＳＣは、相同な転写物を、塩基対相互作用により標的化し、ｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチド断片に切断する［Hutvagner および Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002);Hammondら(2001) Nat. Rev. Gen. 2:110-119(2001); ならびに Sharp Genes. Dev. 15:485-90(2001)］。切断機構は、なお解明の余地があるが、研究により、各ＲＩＳＣは、単一のｓｉＲＮＡおよびＲＮアーゼを含むことが示された（Hutvagner および Zamore, Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232, 2002）。
【００６４】
ＲＮＡｉの顕著な効力のため、ＲＮＡｉ経路内における増幅工程が示唆されている。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを作製し得る投入ｄｓＲＮＡのコピーにより、または形成されるｓｉＲＮＡの複製により起こり得る。あるいはまた加えて、増幅は、ＲＩＳＣの多数回の代謝回転事象により行なわれ得る［Hammondら Nat. Rev. Gen. 2:110-119(2001), Sharp Genes. Dev. 15:485-90(2001); Hutvagner および Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002)］。ＲＮＡｉに関するさらなる情報については、以下の概説 Tuschl ChemBiochem. 2:239-245(2001); Cullen Nat. Immunol. 3:597-599(2002);および Brantl Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25(2002) を参照のこと。
【００６５】
本発明での使用に好適なＲＮＡｉ分子の合成は、以下のようにして行なわれ得る。第１に、カスパーゼ−８  ｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列のＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンする。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの発生を潜在的ｓｉＲＮＡ  標的部位として記録する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、オープンリーディングフレームから選択され、これは、非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質接合性部位を多く含むためである。ＵＴＲ結合性タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合と相互作用し得る［Tuschl ChemBiochem. 2:239-245］。しかしながら、５’ＵＴＲに指向されたｓｉＲＮＡが細胞性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％減少を媒介し、タンパク質レベルを完全になくした（abolish）ＧＡＰＤＨについて示されたように（www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html）、非翻訳領域に指向されるｓｉＲＮＡもまた有効であり得ることは認識されよう。
【００６６】
第２に、潜在的標的部位を、任意の配列アラインメントソフトウェア（たとえば、ＮＣＢＩサーバーから入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）など）を用いて、適切なゲノムデータベース（たとえば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列との有意な相同性を示す推定標的部位を選出する。
【００６７】
適格な標的配列をｓｉＲＮＡ合成用の鋳型として選択する。好ましい配列は低含量のＧ／Ｃを含むものである。それは、これらが、遺伝子サイレンシングの媒介において、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有するものと比べ、より有効であることが証明されているためである。いくつかの標的部位は、好ましくは、評価用標的遺伝子の長さ内で選択される。選択したｓｉＲＮＡのより良好な評価のため、陰性対照は、好ましくは、組合せで使用される。陰性対照ｓｉＲＮＡは、好ましくは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を欠く。したがって、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列が、好ましく使用されるが、任意の他の遺伝子に対して有意な相同性はまったく示さないものとする。本発明の教示にしたがってカスパーゼ−８発現をダウンレギュレーションするために使用することができるｓｉＲＮＡ配列は、配列番号：１５を含む。
【００６８】
本発明の教示にしたがう使用に適したカスパーゼ−８  ｓｉＲＮＡ配列は、マウスにおいて急性肝不全を予防できることが示された（Zenderら,(PNAS 13:7797-7802,2003)）。ｓｉＲＮＡの全身性適用により、肝臓におけるカスパーゼ−８の発現が阻害され、それにより、ＦＡＳ（ＣＤ９５）媒介性アポトーシスが抑制された。さらにまた、ＲＮＡ干渉による生存の改善は、カスパーゼ−８  ｓｉＲＮＡを急性肝不全進行中に適用した場合であっても有意であった。
【００６９】
カスパーゼ−８をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤は、カスパーゼ−８のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡｚｙｍｅ分子である。ＤＮＡｚｙｍｅは、一本鎖および二本鎖の標的配列のどちらも切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Breaker, R. R. および Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S. W. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262）。ＤＮＡｚｙｍｅの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡｚｙｍｅは、各々７〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインと隣接する、１５デオキシリボヌクレオチドの触媒性ドメインを有する。この型のＤＮＡｚｙｍｅは、その基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン混合配列で効果的に切断することができる（Santoro, S. W. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199）ＤＮＡｚｙｍｅの概説については、Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002) ］を参照のこと。
【００７０】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する、合成によって作製したＤＮＡｚｙｍｅの構築および増幅の例は、Joyceらの米国特許第６，３２６，１７４号に開示されている。ヒトウロキナーゼレセプターに対して指向された同様の設計のＤＮＡｚｙｍｅは、最近、ウロキナーゼレセプター発現を阻害し、結腸癌細胞転移をインビボでうまく阻害することが観察された（Itohら, 2002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org）。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂ１癌遺伝子に相補的なＤＮＡｚｙｍｅは、癌遺伝子発現を白血病細胞において首尾よく阻害し、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合において自己骨髄移植組織の再発率を低下させた。
【００７１】
カスパーゼ−８発現の阻害はまた、カスパーゼ−８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズし、それにより、カスパーゼ−８転写物の翻訳を特異的に阻害することができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いることにより行なわれ得る。
【００７２】
カスパーゼ−８発現を効率的に阻害するために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに重要な２つの点を考慮して行なわれなければならない。第１の点は、オリゴヌクレオチドを適切な細胞の細胞質内に送達することであり、第２の点は、細胞内の指定のｍＲＮＡに、その翻訳を阻害する様式で特異的に結合するオリゴヌクレオチドを設計することである。
【００７３】
従来技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型に効率的に送達するために使用され得るいくつかの送達ストラテジーを教示している［たとえば、Luft, J Mol Med 76:75-6,1998; Kronenwettら, Blood 91:852-62,1998; Rajurら, Bioconjug Chem 8:935-40, 1997; Lavigneら, Biochem Biophys Res Commun 237:566-71,1997;および Aokiら, Biochem Biophys Res Commun 231:540-5), 1997を参照のこと］。
【００７４】
また、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的改変のエネルギー特性の説明となる熱力学サイクルに基づいて、その標的ｍＲＮＡに対して最も高いと予測される結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムもまた使用可能である［たとえば、Waltonら Biotechnol Bioeng 65:1-9, 1999を参照のこと］。
【００７５】
かかるアルゴリズムは、アンチセンスアプローチを細胞において実施するために首尾よく使用されている。たとえば、Waltonらによって開発されたアルゴリズムは、科学者らが、ウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計するのを可能にした。同じ研究グループは、つい最近、細胞培養物内において、３種のモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならにびラットｇｐｌ３０）に対する、合理的に選択したオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性（速度論的ＰＣＲ技術により評価）は、ほとんどすべての場合において（ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学成分を有する２つの細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含む）有効であることが証明されたことを報告した。
【００７６】
また、インビトロ系を用いた特異的オリゴヌクレオチドの設計および効率の予測のためのいくつかのアプローチも公表された（Matveevaら, Nature Biotechnology 16,1374-1375, 1998）。
【００７７】
いくつかの臨床試験により、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性および活性が実証された。たとえば、癌の処置に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが首尾よく使用されており（Holmundら, Curr Opin Mol Ther 1:372-85, 1999）、一方で、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３およびＢｃｌ−２による血液悪性腫瘍（hematological malignancy）の処置は、臨床試験に入り、患者に耐容性であることが示された（Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1:297-306, 1999）。
【００７８】
つい最近、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介型抑制は、マウスモデルにおいて、ヒト癌細胞の胸膜播種を阻害することが報告された（Unoら, Cancer Res 61:7855-60, 2001）。
【００７９】
したがって、現在一致している認識は、上記のようなアンチセンス技術分野における最近の発展は、非常に正確なアンチセンス設計アルゴリズムおよび多種多様なオリゴヌクレオチド送達系の作製をもたらし、当業者が、過度な試行錯誤実験に頼ることなく、既知配列の発現のダウンレギュレーションに適したアンチセンスアプローチを設計および実施することが可能にするということである。
【００８０】
アンチセンス配列は、カスパーゼ−８をコードする転写物を切断し、それにより、該転写物の機能性カスパーゼ−８への翻訳を妨げることができるリボザイム配列を含み得る。かかるリボザイムは、固相オリゴヌクレオチド合成を用いて容易に合成可能である。
【００８１】
リボザイムは、ますます、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害に使用されるようになっている［Welchら,“Expression of ribozymes in gene transfer systems to modulate target RNA levels” Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct;9(5):486-96］。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するためのリボザイムの設計が可能なことにより、これらは、基礎研究と治療適用の両方において、有益なツールとなっている。治療分野では、リボザイムは、感染性疾患におけるウイルス性ＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子および遺伝性障害における特定の体細胞変異を標的化するために利用されている［Welchら,“Ribozyme gene therapy for hepatitis C virus infection.”Clin Diagn Virol. 1998 Jul 15;10(2-3):163-71.］。最も注目すべきことは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子療法プロトコルが、すでに、フェーズ１臨床試験に入っていることである。つい最近、リボザイムは、トランスジェニック動物試験、遺伝子標的確認および経路解明に使用されている。いくつかのリボザイムが、臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で試験された最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路の重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子レセプター）の形成を特異的に阻害する。リボザイムファーマシューテイカル社（Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.）ならびに他の企業により、動物モデルにおいて抗血管新生治療の重要性が実証された。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するよう設計されたリボザイムであり、細胞培養物アッセイにおいて、Ｃ型肝炎ウイルス性ＲＮＡを減少させるのに有効であることがわかった（リボザイムファーマシューテイカル社−ウェブホームページ）。
【００８２】
これは、発現可能なインヒビター（たとえば、抗体断片、アンチセンスなど）が、組換え技術を用いて合成され得、たとえば注射により造血性細胞に直接提供され得ることを記載しているが、かかる分子はまた、哺乳動物細胞における結合組織特異的転写または誘導転写の指向に適したプロモーター配列の転写制御下に位置する、該インヒビターをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いることにより、造血性細胞内で直接発現させることもできる。
【００８３】
本発明での使用に好適な構成プロモーターは、ほとんどの環境条件下でほとんどの細胞型（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）など）で機能性である（すなわち、転写を指向することができる）配列を含む。本発明での使用に好適な組織特異的プロモーターは、造血性細胞において機能性である配列を含み、例としては、たとえば、Clark および Gordon(Leukoc Biol. 63:153-68, 1998); Steinら(Cancer 15:2899-902, 2000);ならびにHormasら,(Curr Top. Microbiol. Immunol. 211:159-64,1996）により記載されたプロモーター配列が挙げられる。本発明での使用に好適な誘導性プロモーターとしては、たとえば、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Srourら, hromb. Haemost. 90:398-405, 2003）が挙げられる。
【００８４】
本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物、真核生物または好ましくは両者における複製および組込みに適したものにするさらなる配列を含む（たとえば、シャトルベクター）。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー）ならびに転写および翻訳ターミネーター（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
【００８５】
真核生物用プロモーターは、典型的には、２つの型の認識配列：ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含む。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置し、ＲＮＡ合成を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの指向に関与すると考えられている。その他の上流プロモーターエレメントにより、転写が開始される割合が決定される。
【００８６】
エンハンサーエレメントは、連結された相同または非相同プロモーターから１０００倍まで転写を刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流または上流に位置する場合、活性である。ウイルス由来の多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲を有し、種々の組織において活性である。たとえば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に適している。
【００８７】
本発明に適した他のエンハンサー／プロモーターの組合せとしては、ポリオーマウイルス、ヒトもしくはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの、マウス白血病ウイルス、マウスもしくはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなどの種々のレトロウイルス由来の末端反復配列（long term repeat)が挙げられる。Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1983（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００８８】
また、Ｓｃｆｖなどのポリペプチドインヒビターの翻訳効率を増大するために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに付加してもよい。２つの異なる配列エレメントが正確かつ効率的ポリアデニル化に必要とされ、それらは、ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵまたはＵ高含有配列、および１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する高度に保存された６ヌクレオチド配列ＡＡＵＡＡＡである。本発明に適した終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる。
【００８９】
既に記載したエレメントに加え、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増加させること、または組換えＤＮＡを有する細胞の確認を容易にすることを目的とした他の特殊エレメントを含み得る。たとえば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの余分な染色体複製を促進するＤＮＡ配列を含む。このようなウイルス性レプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミド上に保有された遺伝子または宿主細胞のゲノム内の遺伝子のいずれかによって提供される場合に限り、エピソームにより複製される。
【００９０】
ベクターは、真核生物レプリコン含んでいても含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択マーカーを用い、真核生物細胞内で増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含有しない場合、エピソームによる増幅は可能でない。そのかわり、組換えＤＮＡが遺伝子工学的に操作した細胞のゲノム内に組み込まれ、ここでプロモーターが所望の核酸の発現を指向する。
【００９１】
本発明の発現ベクターは、たとえば、内部リボソーム侵入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）などの、単一のｍＲＮＡから数種類のタンパク質の翻訳を許容するさらなるポリヌクレオチド配列、およびプロモーターキメラポリペプチドのゲノム組込みのための配列をさらに含み得る。
【００９２】
哺乳動物用発現ベクターの例としては、限定されないが、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（インビトロジェン（Invitrogen）から入手可能）、ｐＣＩ（プロメガ（Promega）から入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラテジーン（Strategene）から入手可能）、ｐＴＲＥＳ（クローンテック（Clontech）から入手可能）、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。
【００９３】
また、レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターも本発明により使用することができる。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡ挙げられ、エプスタインバールウイルス由来のベクターとしては、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ+、ｐＭＴＯ１０／Ａ+、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核生物細胞における発現が有効であることが示された他のプロモーターの指示下でタンパク質を発現させる任意の他のベクターが挙げられる。
【００９４】
ウイルスは、多くの場合、宿主防御機構を回避するように進化した、非常に特殊化された感染因子である。典型的には、ウイルスは、特定の細胞型に感染して増殖する。ウイルス系ベクターの標的化特異性は、その所定の細胞型を特異的に標的化するという天然の特異性を利用したものであり、それにより、組換え遺伝子を感染細胞内に導入する。したがって、本発明で使用されるベクターの型は、形質転換された細胞型に依存する。形質転換された細胞型にしたがう好適なベクターの選択能力は、充分当業者の能力の範囲内であり、したがって、選択の考慮事項の一般的な記載は本明細書に提供しない。たとえば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）を用いて標的化し得る。
【００９５】
組換えウイルス系ベクターは、側方感染および標的化特異性などの利点を提供するため、カスパーゼ−８インヒビターのインビボ発現に有用である。側方感染は、たとえばレトロウイルスのライフサイクルにおいて固有であり、単一の感染細胞が、近接細胞に出芽し、感染する多くの子孫ビリオンを生じる過程である。その結果、そのほとんどが最初は元のウイルス性粒子に感染しなかった広い領域が急速に感染した状態となる。これは、感染因子が娘子孫にのみに伝染する垂直型の感染とは対照的である。また、側方に伝染することができないウイルスベクターを作製することができる。この特徴は、所望の目的が、特定の遺伝子をいくつかの限局標的細胞にのみ導入することである場合、有用であり得る。
【００９６】
造血性細胞特異的発現に適した構築物のさらなる記載は、Malikら(Blood 15:86:2993-3005, 1995) に記載されている。
【００９７】
カスパーゼ−８の内在性インヒビターの内生的産生を誘導および／または増強するためのベクターを、インヒビターの発現に対して通常サイレントである細胞、または充分でない量のインヒビターを発現する細胞において使用することはまた、本発明にしたがって予測される。ベクターは、該インヒビターを発現することが所望される細胞において機能性である調節配列を含有し得る。かかる調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーを含有する。次いで、調節配列を、ゲノムの正しい遺伝子座内に相同組換えによって導入し、これにより、調節配列が、その発現の誘導または増強が必要とされる遺伝子と作動可能に連結される。この手法は、通常、「内在性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）とよばれ、たとえば、国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【００９８】
当業者には、同じ手法を用いて、すなわち、負の調節エレメント（たとえば、サイレンシングエレメントなど）をカスパーゼ−８の遺伝子座内に導入することによって（これにより、カスパーゼ−８発現のダウンレギュレーションまたは抑制がもたらされる）、カスパーゼ−８発現を停止させることも可能なことは理解されよう。当業者には、カスパーゼ−８発現のかかるダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患を予防および／または処置するためのカスパーゼ−８インヒビターの使用と同じ効果を奏することが理解されよう。
【００９９】
種々の方法が、本発明の発現ベクターを造血性細胞内に導入するために使用され得る。かかる方法は、一般的に、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992), in Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md.(1989), Changら, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich.(1995), Vegaら, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich.(1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass.(1988) および Gilboaら ［Biotechniques 4(6):504-512, 1986］に記載されており、たとえば、安定もしくは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルス系ベクターによる感染が挙げられる。また、陽性／陰性選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照のこと。
【０１００】
ウイルス性感染による核酸の導入は、ウイルスの感染性の性質によってより高いトランスフェクション効率が得られ得るため、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなどの他の方法に比べて、いくつかの利点が提供される。
【０１０１】
インヒビターを発現させるために用いられる発現構築物は、好ましくは、造血性細胞内で、これらの細胞内での排他的かつ制御可能な発現を可能にする様式で構築および導入されることは、認識されよう。たとえば、排他的に造血性細胞を形質転換し得るウイルス性発現ベクターを用いることにより、またはかかる細胞をエキソビボで形質転換することにより、および誘導プロモーター配列を発現構築物内で用いることにより（上記の例を参照のこと）、これらの細胞において排他的かつ制御可能な発現が達成され得る。
【０１０２】
かかる発現ストラテジーは、造血に対して正確な制御（したがって、造血性細胞数の調節）を可能にするため、白血病処置の状況において使用される場合に特に、好都合である。
【０１０３】
造血は、好ましくは、本発明にしたがって上述のカスパーゼ−８特異的インヒビターを用いることにより阻害されるが、カスパーゼ−８は、細胞ポリペプチドによって誘発され、これが細胞ポリペプチドを誘発するため、造血はまた、活性化状態となるために結合すべきこれらポリペプチド（たとえば、アダプタータンパク質ＦＡＤＤなど）の発現または活性をダウンレギュレーションすることによっても阻害され得ることは認識されよう。また、活性部位システインがセリンで置き換えられたカスパーゼ−８変異体などの、カスパーゼ−８の酵素的に不活性な誘導体によっても阻害され得る。
【０１０４】
前述のように、カスパーゼ−８発現または活性のダウンレギュレーションは、培養造血性細胞をダウンレギュレーション剤に曝露することによりインビトロで、またはかかる薬剤を被験体に投与することによりインビボで行なわれ得る。これらのインビボおよびインビトロアプローチは、種々の造血に関連する障害を処置するために用いることができる。
【０１０５】
したがって、本発明の別の態様によれば、造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害の処置方法が提供される。該方法は、本明細書において先に記載したアプローチのいずれか１つを用い、カスパーゼ−８の発現または活性を被験体の造血性細胞においてダウンレギュレーションすることにより行なわれる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、語句「造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害」は、１つ以上の型の造血性細胞の異常な高増殖速度を特徴とする任意の疾患をいう。例としては、白血病（たとえば、急性骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性前リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、崩壊性白血病など）、自己免疫性疾患、リンパ組織増殖性障害およびアレルギーが挙げられる。
【０１０７】
ダウンレギュレーションをエキソビボで行なう場合、造血性細胞は、造血障害に罹患し、カスパーゼ−８インヒビターで処置された個体の骨髄細胞から、または骨髄細胞の移動後の循環系から単離する。骨髄細胞の単離は、少量の骨髄を個体の腸骨稜から米国特許第４，４８１，９４６号および同第４，４８６，１８８号などに記載の手順を用いて吸引することにより行なわれ得る。単離した骨髄試料は、さらなる使用のために、培養または保存し得る。骨髄細胞の保存は、好ましくは、液体窒素中での凍結保存により、米国特許第４，１０７，９３７号および同第４，１１７，８８１号に記載の手順を用いて行なわれる。続いて、骨髄細胞を、本明細書において先に記載したもの（たとえば、ＲＮＡｉ）などのカスパーゼ−８ダウンレギュレーション剤の存在下で培養する。好ましくは、該細胞は、ウシ胎児血清またヒト血清高含有フィッシャー培地（ギブコ（GIBCO））を加えた標準的なＮｕｎｃ培養プレート内で成長させ、３７℃で５〜６％  ＣＯ2雰囲気下でインキュベートする。培養中、細胞はまた、細胞の成熟を刺激するために、成長／分化刺激剤（たとえば、ＩＬ１〜７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ１３〜１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、スロンボポエチン、幹細胞因子およびｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド）に曝露させてもよい。いずれの場合も、いったん造血性細胞が、たとえば未熟な血球細胞の密度またはカスパーゼ活性の低下に基づく過剰増殖活性の低下を示したら、これらをレシピエントに、好ましくは静脈注入により投与する。移植後、レシピエントを、血球細胞および血小板計測数に基づく骨髄細胞の再構築について、周知のモニター手順を用いてモニターする。
【０１０８】
カスパーゼ−８活性の造血性細胞におけるインビボダウンレギュレーションは実施がより困難であるが、本明細書において先に記載したような造血性細胞において直接発現される阻害剤、あるいはまた、標的部位に結合するか、骨髄に直接注射される阻害剤の使用は、かかる細胞においてカスパーゼ−８を効率的にダウンレギュレーションするために利用され得る。阻害剤の骨髄への直接注射は、阻害剤の標的造血性細胞への速やかな散在を提供するため、全身性投与よりも好ましい。骨髄への注射による該薬剤の投与は、好ましくは、米国特許第５，４５１，２１０号に記載のような解除式伸縮性針を用いて行なわれる。
【０１０９】
あるいはまた、カスパーゼ−８阻害剤は、リポソーム担体により標的細胞に送達され得る。本明細書で使用される用語「リポソーム」は、水性区画を内包する脂質二重層により形成された水性媒体中の球状粒子をいう。リポソームは、種々の治療目的、特に、治療剤を標的細胞に全身性投与により運搬するために有効に使用されている。好ましくは、カスパーゼ−８インヒビターは、米国特許第６，０４３，０９４号に記載のものなどのリポソーム内に封入される。好ましいリポソームは、造血性細胞の表面に特異的に結合することができるよう選択した親和性部分を含む外側表面を含む（記載したように、たとえば、ＣＤ３４リガンド、ＧＭ−ＣＳＦレセプターリガンド、ＩＬ−４レセプターリガンド、ＭＵ−１ヘマトポエチンレセプターリガンドまたはＣＤ３３リガンド（米国特許第６，５９９，５０５号に記載のものなど））。好ましいリポソームは、標的表面との相互作用から親和性部分を遮蔽することができる親水性ポリマーコートをさらに含む。親水性ポリマーコートは、リポソーム内で放出可能な結合を介して表面脂質成分に共有結合したポリマー鎖で構成される。所望のリポソーム生体内分布が達成された後、放出剤を投与し、リポソーム内の放出可能な結合の大部分の切断を引き起こし、親和剤を標的表面に曝露する。
【０１１０】
あるいはまた、カスパーゼ−８インヒビターを、封入されたインヒビターを標的細胞の細胞質内に送達することができる膜融合リポソーム（たとえば、米国特許第６，２２４，９０４号に記載のものなど）内に封入してもよい。カスパーゼ−８活性のインビボダウンレギュレーションに適した製剤のさらなる記載は、本明細書において以下に提供する。
【０１１１】
本発明の教示にしたがう造血障害処置は、白血病細胞を有効に破壊するため、好ましくは、標準的な化学療法および／または放射線療法と組み合わせる。また、該処置の後、健常造血性細胞の回復が刺激されるように、被験体に１種類以上の成長刺激因子を提供してもよい。好適な成長刺激剤としては、ＩＬ１〜７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ１３〜１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン、エリスロポエチン、スロンボポエチン、幹細胞因子およびｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンドが挙げられる。あるいはまた加えて、該処置の後、被験体において健常幹細胞の新たな成長が促進されるように、本明細書において先に記載した手順を用い、自己または同種異系いずれかの骨髄細胞の移植を行なってもよい。
【０１１２】
上述したカスパーゼ−８ダウンレギュレーション剤は、直接被験体に、または単離した造血性細胞自体に、または医薬組成物の一部（活性成分）として投与され得る。
【０１１３】
本明細書において使用する場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載の１種類以上の活性成分または薬剤と、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分との調製物をいう。医薬組成物の目的は、化合物の生物体への投与を容易にすることである。
【０１１４】
以下、語句「生理学的に許容し得る担体」および「薬学的に許容し得る担体」は、互換的に使用され得、生物体に対して有意な刺激を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤をいう。アジュバントは、これらの語句に含まれる。
【０１１５】
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質をいう。賦形剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類および数種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１１６】
薬物の製剤化および投与のための手法は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA，最新版（引用により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。
【０１１７】
投与の好適な経路としては、たとえば、経口、経直腸、経粘膜、特に経皮、腸または非経口送達（筋肉内、皮下および髄内注射など）ならびに鞘内、直接脳質内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼球内注射が挙げられ得る。
【０１１８】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量または治療投薬量は、まず、インビトロ細胞培養アッセイからから概算され得る。好ましくは、所望の濃度または力価を達成する投薬量が動物モデルにおいて策定され得る。かかる情報を用い、ヒトにおいて有用な投薬量をより正確に決定することができる。
【０１１９】
本明細書に記載の活性成分の毒性または治療的効能は、標準的なインビトロ製薬手順により、細胞培養物または実験動物において測定され得る。これらのインビトロ細胞培養アッセイおよび動物試験から得れらたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を策定するために使用することができる。用量は、使用する剤形および用いる投与経路に応じて異なり得る。正確な処方、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（たとえば、Fingl,ら, 1975,“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1 p.1を参照のこと）。
【０１２０】
投薬の量および間隔は、個体の体重および脂肪分に実質的に影響を与えるのに充分な活性成分のレベルに個々に調整し得る。所望の効果を達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。血漿濃度を測定するために、検出アッセイを使用することができる。
【０１２１】
処置対象の状態の重篤度および応答性に応じて、投薬は、１回、または数日間から数週間持続する処置過程をともなって、または治癒するまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまでの複数回の投与であり得る。
【０１２２】
投与される組成物の量は、もちろん、処置対象の被験体、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存性である。
【０１２３】
本発明の組成物は、所望により、活性成分を含有する単位投薬形態を１つ以上含み得るパックまたはディスペンサーデバイス（たとえば、ＦＤＡ承認キットなど）にて提示され得る。パックは、たとえば、金属またはプラスチックのホイル（たとえば、ブリスターパック）を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示書が添付されてもよい。パックまたはディスペンサーにはまた、政府機関による医薬品の製造、使用または販売規制により指示された形態の容器に関連する通知が添付されてもよく、該通知は、組成物の形態またはヒト用もしくは獣医用投与の該機関による承認を反映する。かかる通知は、たとえば、処方薬について米国食品医薬品局により承認されたラベル表示、または承認製品挿入物であり得る。適合性のある医薬用担体内に製剤化された本発明の調製物を含有する組成物はまた、適切な容器内に調製および配置され、先にさらに詳述したように、適応症状の処置のためのラベルが貼られる。
【０１２４】
好ましくは、医薬組成物は、全身的ではなく局所に、たとえば、造血性細胞などの細胞をエキソビボで曝露することにより、または医薬組成物を直接患者の骨髄内に注射することにより投与される。本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法によって、たとえば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、微粒化、乳化、カプセル封入、内包または凍結乾燥方法によって製造され得る。
【０１２５】
したがって、本発明にしたがう使用のための医薬組成物は、慣用的な様式で、活性成分の薬学的に使用可能な調製物への加工処理を容易にする１種類以上の生理学的に許容し得る担体（賦形剤および補助剤を含む）を用いて製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１２６】
したがって、本発明は、造血の調整および造血に関連する疾患の処置のための新規なアプローチを提供する。
【０１２７】
本発明の所見は、カスパーゼ−８の造血性細胞の増殖への関与を示唆するため、カスパーゼ−８の発現または活性をアップレギュレーションする薬剤を、被験体において造血を促進するために使用できることが考えられ得ることは、認識されよう。したがって、カスパーゼ−８発現レベルのアップレギュレーションは、被験体に、被験体においてカスパーゼ−８の少なくとも機能性部分を発現するように設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列を送達することにより行なわれ得る。
【０１２８】
カスパーゼ−８の少なくとも機能性部分を発現することができるポリヌクレオチド構築物を作製するため、カスパーゼ−８をコードするポリヌクレオチドセグメントまたはその部分を、哺乳動物細胞の形質転換およびカスパーゼ−８の形質転換細胞内での発現の指向に適した発現ベクター系内にライゲートし得る。好適な発現ベクター、プロモーターおよび形質転換方法の記載は、本明細書において先に提供している。
【０１２９】
カスパーゼ−８は、さらに、被験体において内在性カスパーゼ−８の発現を増加させることにより、または内在性カスパーゼ活性を増加させることによりアップレギュレーションされ得る。これは、たとえば、カスパーゼ−８のプロモーター内のＣｐＧアイランドの脱メチル化を強いる薬物によりなされ得る。
【０１３０】
カスパーゼ−８をアップレギュレーションすることができる薬剤は、ＡＩＤＳ、癌、悪液質または糖尿病などの造血性細胞不全を特徴とする障害を処置するために使用され得る。本明細書において先に記載した方法の実施および／または本明細書において先に記載した医薬組成物および製造物品の作製を容易にするため、本発明は、さらに、白血病などの造血に関連する障害の処置のための新規な薬物候補の同定方法を提供する。該薬物候補の同定方法は、複数の分子を、カスパーゼ−８発現または好ましくは活性を少なくとも部分的に阻害することができる分子についてスクリーニングすることを含む。スクリーニングは、抗体系阻害アッセイ、競合性リガンド結合阻害アッセイまたは酵素活性阻害アッセイを用いて行なわれ得る。スクリーニングは、好ましくは、カスパーゼ−８の酵素活性を、米国特許第６，３４２，６１１号に記載されたようなハイスループットスクリーニングアッセイを用いて評価することにより行なわれる。簡単には、このアッセイでは、蛍光発生／蛍光性部分で標識されたカスパーゼ−８特異的基質を用いる。標識された基質がカスパーゼ−８に曝露されると、レポーター分子が切断され、これが、こんどは、蛍光の発光をもたらす。また、インヒビター分子も反応混合物中に存在する場合、蛍光発光のレベルは、競合アッセイの場合のように、酵素のみの処理（陰性対照）に比べて減少する。蛍光発光における定量的な差は、標準的な蛍光光度計を用いて正確に測定することができ、その方法は、候補カスパーゼ−８インヒビターのハイスループットスクリーニングを実施するために容易に調整可能である。インヒビターの特異性を測定するため、選択したカスパーゼ−８インヒビターを、１つ以上のさらなる類似のアッセイ（しかし、これらは、１種類以上の異なるカスパーゼ酵素（陽性対照）およびそのそれぞれの特異的基質を含む）に曝露する。
【０１３１】
カスパーゼ−８インヒビターのスクリーニングは、合成カスパーゼ特異的基質の切断を迅速かつ定量的に検出する市販のカスパーゼ−８蛍光キットであるＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）（クローンテック）を用いることにより簡便に行なわれ得る。
【０１３２】
いったんインヒビターが同定されたら、その細胞浸透能力および哺乳動物に対するその毒性を測定するためにさらなる解析を行なう。必要であれば、適当な薬物候補は、その細胞浸透性を増大し、かつ毒性を減少させるために、そのカスパーゼ−８阻害活性に実質的に影響を与えることなく修飾される。
【０１３３】
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、以下の限定を意図しない実施例の試験を行なうと、当業者に自明となろう。加えて、上記に示し、かつ以下の特許請求の範囲に請求した本発明の種々の実施形態および態様の各々について、以下の実施例において実験的裏づけが見出されよう。
【実施例】
【０１３４】
次に、上記の記載とともに非限定的に本発明を説明する以下の実施例について言及する。
【０１３５】
一般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において用いられる実験手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。かかる技術は、文献に充分に説明されている。たとえば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual”Sambrookら,(1989);“Current Protocols in Molecular Biology”I〜III巻 Ausubel, R. M.編(1994); Ausubelら,“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York(1988); Watsonら,“Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birrenら,(編)“Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, 1〜4巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, I〜III巻 Cellis, J. E.編(1994);“Current Protocols in Immunology”I〜III巻 Coligan J. E.編(1994); Stitesら,(編),“Basic and Clinical Immunology”(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell および Shiigi(編),“Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York(1980) を参照のこと; 利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献にさらに記載されている。たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait, M. J.編(1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames, B. D., および Higgins S. J.編(1985);“Transcription and Translation”Hames, B. D.および Higgins S. J.編(1984);“Animal Cell Culture”Freshney, R. I.編(1986);“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press,(1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B.,(1984) ;“Methods in Enzymology”1-317巻, Academic Press;“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA(1990); Marshakら,“Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)および Parfittら(1987). Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res 2(6), 595-610を参照のこと；これらのすべては、引用により、本明細書に完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書中に提供されている。本発明における手順は、当該技術分野において周知であると考え、読み手の便益のために提供する。本明細書に含まれるすべての情報は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
実施例１
カスパーゼ−８条件付きノックアウトマウスの作製
成体組織におけるカスパーゼ−８の機能を解明するため、および既述のカスパーゼ−８ノックアウトモデル［カスパーゼ−８遺伝子のノックアウトは、子宮内（in uteru）で致死的であることが知られている（１１）］の諸制限を克服するため、新規なカスパーゼ−８ノックアウトモデルを開発した。
【０１３７】
Varfolomeev（１１）に既述のようにして、マウスカスパーゼ−８遺伝子（Ｃａｓｐ８）および隣接領域を含むＤＮＡ断片を、配列番号：１９のマウスカスパーゼ−８から単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター内にクローン化した。Ｃａｓｐ８標的化用構築物を、ｌｏｘＰ  部位（配列番号：１７〜１８）をカスパーゼ−８遺伝子の第１エキソンの上流に、２つのｌｏｘＰ部位に隣接するＮＥＯｒ＋ＴＫ（チミジンキナーゼ）カセットをエキソン２の下流に挿入することにより合成した（図１のａに示す）。
【０１３８】
Ｃａｓｐ８標的化用構築物を、ＮｏｔＩで線状化し、Ｒ１胚性幹（ＥＳ）細胞内にエレクトロポレーションによって導入した後、形質転換されたＥＳ細胞をＧ４１８で選択した。次いで、形質転換ＥＳクローンを、エキソン５と６のあいだに位置するエキソン１，３’プローブ０．６  ｋｂの上流に位置する０．９  ｋｂの標的化用構築物５’プローブの５’アームの上流で３’アームの下流の領域由来のゲノムＤＮＡプローブを用いたサザンブロット解析により、相同組換えについてスクリーニングした。次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを、スーパーコイルＣｒｅ（環組換え酵素）発現性構築物（ＥＦｌａ−ＧＦＰｃｒｅ／ｐＢＳ５００； Gagneten, S.ら, Nucleic Acids Res, 1997.25:3326-31, 1997）でトランスフェクトした後、ガンシクロビルで選択した。トランスフェクション後、Ｃａｓｐ８fl/+  ＥＳ細胞を選択し、ＭＦ−１胚盤胞と集結させてキメラマウスを作製した。このキメラマウスをＭＦ−１マウスと交配し、条件付きカスパーゼ−８対立遺伝子（Ｃａｓｐ８fl/+）を保有するヘテロ接合子孫を得た。
【０１３９】
ホモ接合Ｃａｓｐ８flox/floxマウスを、ヘテロ接合ｃａｓｐ８fl/+マウスと交雑することにより作製した。Ｃｒｅ陽性カスパーゼ−８陰性マウス（Ｃｒｅ−Ｃａｓｐ８+/-）を、Ｃａｓｐ８ヘテロ接合完全ノックアウトマウス（Ｃａｓｐ８+/-）をトランスジェニックＭｘ１−Ｃｒｅマウス、Ｔｉｅ１−ＣｒｅまたはＣＤ１９  Ｃｒｅ［それぞれ、α／βインターフェロン（Kuhnら, Science 269:1427-1429, 1995）、Ｔｉｅ１プロモーター（Gustafssonら , J. Cell Science 114:671-76, 2001）およびＣＤ１９プロモーター（Rickertら Nuc. Aci. Res. 25:1317-1318,1997）の制御下でＣｒｅを発現する］と交配することにより作製した。カスパーゼ−８条件付きノックアウトマウス（Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-）を、Ｃａｓｐ８fl/flをＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８+/-マウスと交配することにより作製した。Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+動物（これも同じ交配により生まれた）を、実験対照同腹子として使用した。
【０１４０】
ＣｒｅリコンビナーゼのＭｘ１−Ｃｒｅにおける発現を誘導するため、マウスに、２５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ二本鎖ポリ（Ｉ）−ポリ（Ｃ）ＲＮＡ（ｐＩ−ｐＣ；シグマ（Sigma）、セントルイス、ＭＯ）を１回または３回、２日間にわたって腹腔内注射した。
【０１４１】
Ｃｒｅ導入遺伝子および条件付き対立遺伝子の遺伝子スクリーニングを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析によりテイルＤＮＡを用いて行なった。ＰＣＲ解析に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを表１に示す。Ｃｒｅ遺伝子型を、表１に示すＣＲＥ特異的オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：ｌ〜２）を用いることにより調べ、一方、Ｃａｓｐ８fl/+およびＣａｓｐ８fl/-遺伝子型は、表１に示すＣａｓｐ８特異的オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：３〜６）を用いて調べた。
【０１４２】
【表１】
2007509132.tif 000002
【０１４３】
上記の増幅反応の条件は、以下の通りとした：９５℃で５分間の後、３３サイクル（各々、９４℃で４５秒間、６５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間、最後のサイクルは７２℃で１０分間（Ｃｒｅの場合）からなる）；９５℃で５分間の後、３０サイクル（各々、９４℃で４５秒間、６０℃で６０秒間および７２℃で６０秒間、最後のサイクルは７２℃で１０分間（カスパーゼ−８+/-およびｆｌｏｘの場合）からなる。
【０１４４】
サザンブロットおよびＰＣＲ解析により、ｌｏｘＰ隣接カスパーゼ−８対立遺伝子は、Ｃｒｅ遺伝子を保有するマウスにおいてのみ欠失し、ｐＩ−ｐＣにより誘導されたことが確認された（図１ｂ〜ｃに示す）。
【０１４５】
実施例２
マウスにおけるカスパーゼ−８のノックアウトは、造血性前駆細胞を障害する
材料および方法：
動物：条件付きカスパーゼ−８ノックアウトマウスＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-およびその対照同腹子Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+を、本明細書において先に記載したようにして作製した。
【０１４６】
インビトロアッセイ：骨髄（ＢＭ）細胞をマウス大腿骨から採取し、単独細胞として懸濁した。次いで、核形成細胞を計測し、懸濁液を、２％ＦＢＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で１ｍｌあたり２×１０5細胞に希釈した。各アッセイでは、２×１０4細胞を、ＩＬ−３、ＩＬ−６、幹細胞因子（ＳＬＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む１ｍｌのメチルセルロース培地（Ｍ３４３４；ステム  セル  テクノロジー（Stem Cell Technologies））と混合し、次いで、培養皿内にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ2の加湿チャンバ内でインキュベートした。１０〜１４日間のインキュベーション後、赤芽球形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位  顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）およびコロニー形成単位顆粒球−赤芽球−巨核球マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）前駆体を、コロニー形態により計測した。コロニー同一性を確認するため、いくつかのコロニーを、ライト・ギムザ染色によって時々解析した。ＣＦＵ−プレＢを、ＩＬ−７を加えたメチルセルロース培地（Ｍ３６３０；ステム  セル  テクノロジー）中に懸濁されたＢＭ細胞をプレーティングすることにより解析し、上記のようにしてインキュベートし、７日後のコロニーについて計測した。
【０１４７】
結果：
機能性ＢＭ造血性前駆細胞のレベルは、インビトロアッセイにより測定したところ、ｐＩ−ｐＣまたはインターフェロンを注射したＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-（条件付きカスパーゼ−８ノックアウト）マウスにおいてかなり減少した。したがって、カスパーゼ−８ノックアウトマウスから得たＢＭ細胞からインビトロで生成したコロニーの総数は、対照（Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+）マウスよりも７〜８倍低かった（図２のｂ）。同様に、カスパーゼ−８ノックアウトマウスから得たＢＭ細胞からインビトロで生成した骨髄コロニーおよびプレＢコロニーの数は、対照（Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+）マウスよりも１５〜２０倍低かった（図２のｃ〜ｄ）。
【０１４８】
明らかに、造血性細胞からのカスパーゼ−８遺伝子の欠失は、これらの細胞がインビトロで発育する能力を顕著に障害する。
【０１４９】
実施例３
マウスにおけるカスパーゼ−８のノックアウトは、骨髄細胞が脾臓内で増殖する能力を障害する
材料および方法
動物：条件付きカスパーゼ−８ノックアウトマウスＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-およびその対照同腹子Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+を、本明細書において先に記載したようにして作製し、ｐＩ−ｐＣを３回注射してＣｒｅリコンビナーゼを誘導した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをレシピエントマウスとして使用した。
【０１５０】
インビボコロニー形成単位−脾臓（ＣＦＵ−Ｓ）アッセイ：ＢＭ細胞を、マウスの大腿骨から採取し、成熟Ｔ細胞をＢＭ細胞調製物から、ＭＡＣＳにより、抗マウスＣＤ４およびＣＤ−８マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク（Miltenyi Biotech））を用いて除去した。次いで、単独細胞懸濁液を５×１０5細胞／ｍｌに希釈し、０．２ｍｌアリコート（１×１０5細胞）を、被照射（８．５Ｇｙ、１３７Ｃ源）１０週齢マウスの尾静脈内に注射した。各実験につき、５匹のレシピエントを各ドナー遺伝子型に対して使用した。マウスに、その飲料水中に加えた抗生物質（６．７ｍｇ／ｌのシプロキシン）を投与した。レシピエントを、移植の８〜１３日後に致死させ、その脾臓の重量を測定し、ブワン溶液中で固定した後、肉眼によりコロニーを計測した。
【０１５１】
結果：
Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-から得たＢＭ細胞を移植された被照射マウスの脾臓における造血系ＣＦＵの数は、かなり減少した（約９０％）（図３のａ〜ｃ）。したがって、ＢＭ細胞におけるカスパーゼ−８の欠失は、これらの細胞が脾臓内で確立する能力を顕著に低下させる。
【０１５２】
実施例４
カスパーゼ−８のノックアウトは、骨髄細胞の移植可能性を障害する
４つの処置群の照射キメラマウス：（ｉ）Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-  ＢＭ細胞で再構成した正常（Ｃａｓｐ８+/+）マウス；（ii）Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+ＢＭ細胞で再構成したＣａｓｐ８+/+マウス；（iii）Ｃａｓｐ８+/+ＢＭ細胞で再構成したＣｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス；および（iv）Ｃａｓｐ８+/+ＢＭ細胞で再構成したＣｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+マウスを作製した。再構成後、すべてのマウスをｐＩ−ｐＣで処理した後、そのＢＭ造血性前駆体レベルを、前記実施例２に記載のインビトロコロニーアッセイにより評価した。ｐＩ−ｐＣの正常（Ｃａｓｐ８+/+）マウスのキメラ（Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-ＢＭで再構成した）への注射は、インビトロで生成したいくつかの造血系ＣＦＵの数において劇的な低下をもたらした（図３のｅ）。対照的に、他の処置群の照射キメラマウスでは、いずれも有意な減少は観察されなかった（図３のｄ）。
【０１５３】
実施例５
カスパーゼ−８のノックアウトは、Ｂ細胞刺激を抑止する
材料および方法：
ＢＭ細胞は、試験動物の大腿骨、脛骨および寛骨から精製した。赤血球を、ＡＣＫバッファー中で２分間のインキュベーションにより除去した。細胞を低温ＦＡＣＳバッファー（０．１％アジ化ナトリウムを加えたＰＢＳ中２％ＦＣＳ）中で洗浄し、５分間、室温（ＲＴ）で、抗ＦＣγ抗体とともにインキュベートし、染色用抗体の非特異的結合をブロックした。細胞を、抗ＩｇＭ、抗Ｂ２２０および抗ＣＤ４３抗体で１５分間、氷上で染色した。細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、取得された死細胞を排除した。細胞取得は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおいて、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて行なった。分取目的のため、細胞を前記のようにして操作し、さらに、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにて、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分取した。分取後、細胞を遠心沈降させ、ＰＣＲ反応チューブ内の２０μｌのＨ2Ｏ中に再懸濁させた。次いで、細胞試料を１０分間、９５℃でインキュベートした後、５μｌのプロテアーゼＫ（ＰＫ：２ｍｇ／ｍｌ原液）を添加して５６℃で１時間インキュベーションした。ＰＫを変性させるため、チューブを再度、１０分間、９５℃でインキュベートし、ＰＣＲ混合物（Ｔａｑ、プライマー、バッファー）を、前記のようにして各々のチューブに添加した。増幅されたＤＮＡを、２％アガロースゲル上で分離し、ＣＤ１９  Ｃｒｅによりカスパーゼ−８欠失のレベルを測定した。脾臓細胞を、ＦＡＣＳにより、前記のようにして、抗ＣＤ３、Ｂ２２０およびＩｇＭ抗体を用いて解析した。刺激実験では、Ｂ細胞は、ＣＤ４３ビーズを用いたＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク）により消極的に精製された。細胞を計測し、９６ウェル丸底プレート内の１０μｇ／ｍｌ  ＩｇＭまたは１μｇ／ｍｌ  ＣＤ４０またはＬＰＳ  ５μｇ／ｍｌを含む培地（１０％ＦＢＳ、Ａｍｐ／Ｓｔｒｅｐ、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ）中に、５×１０5細胞／ウェルの濃度で三連でプレーティングした。４日後、細胞の生存を、ＦＡＣＳ解析によりＰＩおよび抗Ｂ２２０抗体  を用いて調べた。細胞の残りを、ＣＦＳＥにより、ＰＢＳ中で５分間、室温にて１０7細胞／ｍｌの濃度で標識した。標識を、１容量の１００％  ＦＢＳで停止させ、種々の刺激性化合物（以下に記載）を１０6細胞／ウェルの濃度で加えた培地にプレーティングする前に、細胞を培地で２回洗浄した。細胞増殖を、ＦＡＣＳによりＰＩを用いて解析し、死細胞を排除した。
【０１５４】
結果：
本発明の試験によるデータは、カスパーゼ−８が、特定のＢ細胞サブセットのホメオスタシスに関与することを示す。ＬＰＳで刺激すると、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８  Ｆ／−マウス由来のＢ細胞は増殖の停止を示すが、対照Ｆ／＋由来細胞は、以前として影響を受けないままである。この現象は、ＣＤ４０またはＢ細胞レセプター刺激（ＩｇＭ刺激）と比べ、ＬＰＳ刺激において特有のようである。これは、カスパーゼ−８がＬＰＳシグナル伝達経路、特に、ＬＰＳ刺激に最も影響されるＢ細胞サブセットにおいて特有の役割を有することを示し得る。
【０１５５】
実施例６
カスパーゼ−８のノックアウトは単球前駆体の分化を阻害する
材料および方法：
動物：条件付きノックアウトマウスＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-（ｆｌｏｘｅｄ  Ｃａｓｐ８のｐＩ−ｐＣ誘導性欠失）およびその対照同腹子Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+を、前記の実施例１に記載のようにして作製した。条件付きノックアウトマウスＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-（骨髄単球系統細胞におけるｆｌｏｘｅｄ  Ｃａｓｐ８の構成的欠失）およびその対照同腹子（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+）は、以下のようにして作製した。Ｃｒｅ陽性カスパーゼ−８陰性マウス（Ｃｒｅ−Ｃａｓｐ８+/-）は、Ｃａｓｐ８ヘテロ接合完全ノックアウトマウス（Ｃａｓｐ８+/-）をトランスジェニックＬｙｓＭ−Ｃｒｅマウス［骨髄単球系統の細胞においてのみＣｒｅを発現する（１３）］と交配することにより作製した。条件付きノックアウトマウスＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-は、Ｃａｓｐ８fl/flをＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８+/-マウスと交配することにより作製した。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+動物（これも同じ交配により生まれた）を、実験対照同腹子として使用した。
【０１５６】
細胞培養：骨髄マクロファージの初代培養物を、３〜４月齢マウスの大腿骨から単離した。単離したＢＭ細胞を、２０％Ｍ−ＦＣＳおよび３０％Ｌ９２９細胞ならし培地を加えたＤＭＥＭ成長培地（ギブコ  ＢＲＬ）内で培養した。一晩培養後、非接着細胞を回収し、新たな培地中に再懸濁した。アリコート２．５×１０5細胞をマイクロウェルプレート内で培養し、７〜１０日間、３７℃、５％ＣＯ2で、成長培地中で（３日間ごとに交換）インキュベートした。インキュベーション後、接着ＢＭ細胞密度を、メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）試験により（本質的に J Immunol Methods. 89:271 に記載のようにして）推定した。それに応じて、培養皿をＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の１０μｌのアリコートを各ウェルに加えた。プレートを４時間インキュベートした後、１ウェルあたり１００μｌのＤＭＳＯを加え、５４０ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダーにより解析した。
【０１５７】
腹膜細胞を、マウス腹膜腔を２％Ｍ−ＦＣＳを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマ、１０ｍｌ／マウス）でリンスすることにより回収した。次いで、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した後、１０％Ｍ−ＦＣＳ、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁した。次いで、細胞を、６ｃｍ培養皿（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｃ．）上に、３×１０6細胞／ウェルの密度でプレーティングし、２〜４時間、３７℃、５％ＣＯ2で２〜４時間インキュベートしてマクロファージ接着を行なわせた。
【０１５８】
欠失効率のＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ確認：ゲノムＤＮＡを、接着性培養腹腔マクロファージまたは骨髄由来マクロファージから溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）を用いて、および脾臓試料から溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣＩ、０．１ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）を用いて抽出した。ＤＮＡを、配列番号：６〜８（以下の表２）に示されるプライマーを用いたＰＣＲ解析に供した。ＰＣＲ増幅条件は以下のとおりとした：９５℃で５分間の後、３３サイクル（各々、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒、最後のサイクルは７２℃で１０分間からなる）。
【０１５９】
より定量的な評価のため、欠失の程度をリアルタイムＰＣＲにより評価した。該アッセイは、１０ｎｇ  ＤＮＡ、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプローブおよび１０μｌのＴａｑｍａｎ  ２×ＰＣＲ  マスターミックス（アプライドバイオシステム（Applied Biosystems））を含む２０μｌの反応容量において行なった。ＰＣＲ反応（９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間の４０サイクル）は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｉｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ (ＰＥ  アプライドバイオシステム）を用いて行なった。使用したカスパーゼ−８オリゴヌクレオチドプライマーを表２（配列番号：９〜１０）に示す。
【０１６０】
カスパーゼ−８遺伝子レベルを、同じＤＮＡ試料中に存在するＮＩＫ遺伝子を定量することにより標準化した。ＮＩＫ遺伝子定量は、表２（配列番号：１１〜１２）に示すＮＩＫプライマーおよびカスパーゼ−８定量で使用したものと同様のＰＣＲ増幅条件を用いて行なった。
【０１６１】
【表２】
2007509132.tif 000003
【０１６２】
３種類のオリゴヌクレオチド：センス、アンチセンスおよびプローブをリアルタイムＰＣＲに使用した。これらはすべて、標的遺伝子（カスパーゼ−８およびＮＩＫ）に特異的であり、それに結合することができる。プローブは、レポーター色素を５’末端に、クエンチャー色素を３’末端に有するオリゴヌクレオチドである。蛍光レポーター色素（ＦＡＭ）が、５’末端に共有結合しており、レポーターは、３’末端に結合したＭＧＢにより消光される。プローブがインタクトな場合、クエンチャー色素がレポーター色素の蛍光を吸収し、蛍光発光は起こらない。Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により、プローブがハイブリダイズしてレポーター色素がクエンチャーから分離され、蛍光発光の増加がもたらされる。ＰＣＲ増幅中、目的の標的が存在する場合、プローブが標的に特異的にアニーリングする。Ｔａｑポリメラーゼがプローブを切断し、蛍光発光を増加させる。この蛍光の増加は、サイクルごとに測定され、増幅プロセスの直接的な結果である。
【０１６３】
反応の閾値サイクル（Ｃｔ）を、ΔＲｎ（ΔΔＲｎ＝Ｒｎ+−Ｒｎ-、式中、Ｒｎ＋は、各時点における生成物の蛍光発光であり、Ｒｎ-は、ベースラインの蛍光発光である）対サイクル数プロットから計算し、カスパーゼ−８遺伝子レベルにおける偏差を、以下の計算：フォールド変化＝２-ΔΔCt、式中、ΔΔＣｔ＝（Ｃｔcasp8−ＣｔNIK）試料DNA−（Ｃｔcasp8ＣｔNIK）非欠失対照DNAを用いてＮＩＫのものと比較した。
【０１６４】
各試料のカスパーゼ−８遺伝子の欠失％を、２-ΔΔCt値から、以下の計算：欠失％＝（１−２-ΔΔCt）×２００を用いて推定した。
【０１６５】
結果：
ＢＭ細胞を、条件付きノックアウトマウス（Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-）および対照（Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+）マウス（ｐＩｐＣを注射しておいた）から単離した。細胞を、Ｍ−ＣＳＦの存在下で培養し、単球前駆体のマクロファージへの分化を刺激した。その結果、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-培養物では、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+培養物と比べ、実質的にほとんどの細胞が接着せず、マクロファージ形態が得られなかった（図７のａ）。したがって、これは、カスパーゼ−８が、インビトロでのＭ−ＣＳＦ誘導性マクロファージ分化に必要とされることを示す。
【０１６６】
条件付きノックアウトマウスＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウスおよびその対照同腹子ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-から単離したＢＭ細胞を、Ｍ−ＣＳＦを添加していない成長培地中で培養し、造血系コロニー形成について、前記の実施例２に記載の手順を用いて比較解析した。ノックアウトマウス由来の培養物において得られた骨髄性ＣＦＵの密度は、対照マウス由来の培養物におけるＣＦＵ密度（データ示さず）と有意差はなかった。したがって、これは、ノックアウトマウスにおける骨髄性前駆体機能が正常であったことを示す。しかしながら、インビトロ分化を刺激するためにＭ−ＣＦＳを細胞培養物に与えた場合、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-由来培養物では、対照培養物と比べ、実質的にほとんどの細胞がマクロファージに分化しなかった（図７のｂ〜ｃ）。
【０１６７】
ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス由来のＢＭ細胞の培養物からサンプリングした接着性マクロファージをＰＣＲにより解析した。ＰＣＲ解析により、ｆｌｏｘｅｄカスパーゼ−８対立遺伝子はこれらの細胞で欠失していなかったことが明らかになった（図７のｄ）。
【０１６８】
細胞死マーカーアネキシンＶによる培養物の染色により、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-由来の培養物において、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+由来培養物において観察されたものよりかなり高密度の陽性染色非接着性単球細胞が得られた（図７のｅ）。これらの所見は、単球前駆体のマクロファージへのインビトロ分化がカスパーゼ−８発現を必要とすること、およびこの酵素を発現しない細胞は死滅することを示す。
【０１６９】
ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウスの腹腔滲出液（ＰＥＣ）由来のマクロファージは、それぞれ、ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子のおよそ９０％および５０％欠失を示した（図７のｆ）。これらの所見は、単球前駆体のマクロファージへのインビボ分化がカスパーゼ−８発現を必要とすること、およびカスパーゼ−８発現の廃止がマクロファージの成長および／または生存を構成することを示す。
【０１７０】
したがって、前記所見は、マウスにおけるカスパーゼ−８のノックアウトが、マクロファージへの単球前駆体分化を阻害することを明白に示す。
【０１７１】
実施例７
カスパーゼ−８のノックアウトはマウスの胚の造血を障害する
材料および方法：
動物：条件付きノックアウトマウスＴｉｅ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-（第８日の胚由来内皮細胞においてｆｌｏｘｅｄ  Ｃａｓｐ８の構成的欠失；造血性系統細胞の１３％において活性なプロモーター）およびその対照同腹子（Ｔｉｅ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+）を、以下のようにして作製した。Ｃｒｅ陽性カスパーゼ−８陰性マウス（Ｃｒｅ−Ｃａｓｐ８+/-）は、Ｃａｓｐ８ヘテロ接合完全ノックアウトマウス（Ｃａｓｐ８+/-）をトランスジェニックＴｉｅ１−Ｃｒｅマウス［内皮細胞においてのみＣｒｅを発現する；Gustafssonら, J. Cell Sci. 114:671-676, 2001］と交配することにより作製した。条件付きノックアウトマウスＴｉｅ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-は、Ｃａｓｐ８fl/flをＴｉｅ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８+/-マウスと交配することにより作製した。Ｔｉｅ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+動物（これも同じ交配により生まれた）を、実験対照同腹子として使用した。
【０１７２】
インビトロ造血系コロニーアッセイ：Ｅ１０．５卵黄嚢および全胚を切り出し、機械的に破砕し、１５ｍｍナイロンメッシュで濾過した。細胞生死判別をトリパンブルー染色により調べた。５×１０4生存細胞の試料を、メチルセルロースおよびサイトカインを含むＲＰＭＩ培地中にプレーティングし、３７℃でインキュベートし、７日後、評点した。
【０１７３】
結果：
Ｔｉｅ−１  Ｃｒｅトランスジェニックマウスは、初期胚段階の内皮細胞においてＣｒｅを構成的に発現する。ｃａｓｐ８flox/floxマウスと、Ｔｉｅ１プロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス系との交雑は、Ｔｉｅ１−Ｃｒｅ／ｃａｓｐ８fl/-マウスの胚致死をもたらした。マウスは、第１０．５〜１１．５日胚のとき死亡し、心筋発達不全、赤血球の密集性蓄積および卵黄嚢脈管構造の発達不全を示し、これらはすべて、カスパーゼ−８ノックアウトマウスが、内皮細胞欠陥により死亡したことを示す。全載免疫組織化学検査ＰＥＣＡＭ（ＣＤ−３１内皮特異的抗体）染色を用いたＥ１１．５  Ｔｉｅ１−Ｃｒｅ／ｃａｓｐ８fl/-胚および卵黄嚢始原血管網目構造の解析により、卵黄嚢リモデリングがこれらの動物において不完全であることが示された。
【０１７４】
造血系コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、Ｃａｓｐ８-/-マウス（カスパーゼ−８ノックアウト）から回収され得なかった。一方、造血系ＣＦＵは、条件付きノックアウトＴｉｅ１−Ｃｒｅ／ｃａｓｐ８fl/-から回収され得たが、対照Ｔｉｅ１−Ｃｒｅ／ｃａｓｐ８fl/+と比べてＣＦＵは少なかった（表３）。
【０１７５】
【表３】
2007509132.tif 000004
【０１７６】
Ｔｉｅ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウスにおける胚の造血系ＣＦＵのコロニー数の減少は、造血が、Ｔｉｅ−１カスパーゼ−８ノックアウトマウスの胚において障害されたことを示し、造血プロセスにおけるカスパーゼ−８の役割をさらに実証する。
【０１７７】
結論として、本明細書において先に記載した結果は、カスパーゼ−８が、造血の調節において重要な役割を果たし、したがって、造血障害、特に白血病などの造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害を処置するための標的として利用できることを明白に示す。
【０１７８】
明確にするため別々の実施態様において記載した本発明のある特定の諸特徴は、単一の実施態様において組み合わせで提供され得ることは認識されよう。また、逆に、簡潔にするため単一の実施態様において記載した本発明の種々の特徴は、単独または任意の適当な下位の組み合わせで使用され得る。
【０１７９】
結論として、本明細書において先に記載した結果は、カスパーゼ−８が、造血の調節において重要な役割を果たし、したがって、造血障害、特に造血性細胞の過剰増殖を特徴とする障害（たとえば、白血病など）を処置するための標的として利用できることを明白に示す。
【０１８０】
明確にするため別々の実施態様において記載した本発明のある特定の諸特徴は、単一の実施態様において組み合わせで提供され得ることは認識されよう。また、逆に、簡潔にするため単一の実施態様において記載した本発明の種々の特徴は、単独または任意の適当な下位の組み合わせで使用され得る。
【０１８１】
本発明を、その具体的な実施態様とともに記載したが、多くの代替、改良および変形が当業者に自明であることは明白である。したがって、かかる代替、改良および変形はすべて、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれることを容認するものとする。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許もしくは特許出願が、具体的に個々に示されて引用により本明細書に組み込まれているかのように、同程度に、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、本出願におけるいずれの参考文献の引用または特定は、かかる参考文献が本発明に対する従来技術として有効であることの許可と解釈されないものとする。
【０１８２】
番号により引用した参考文献
（さらなる参考文献は、上記に挙げる）
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【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１のａ〜ｃは条件付きカスパーゼ−８ノックアウトマウスの作製を示す。図１のａは、Ｃａｓｐ８標的化用構築物の模式図であり、カスパーゼ−８遺伝子エキソンを黒四角で示し、制限部位の位置を縦線で示す。図１のｂは、Ｃａｓｐ８+/-マウスと交雑させたＣａｓｐ８fl/+マウスの子孫から得たテイル（tail）ＤＮＡのサザンブロット解析を示す。ＤＮＡは、ＥｃｏＲＶで消化し、０．８％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜上にブロットし、エキソン１の上流に位置する０．９ｋｂの５’プローブとハイブリダイズさせた。図１のｃは、一般的なＣｒｅ−Ｃａｓｐ８+/-トランスジェニックマウスと交雑させたＣａｓｐ８fl/+マウスの子孫から得たテイルＤＮＡのサザンブロットおよびＰＣＲ解析を示す。サザンブロット解析では、ＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化し、０．８％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜上にブロットし、エキソン５と６の間に位置する３’プローブ  ０．６ｋｂとハイブリダイズさせた。ＰＣＲ解析では、ＤＮＡを、配列番号：１〜２に記載のプライマーを用いて増幅した。サザンブロット解析およびＰＣＲ解析は、Ｃｒｅを発現した（テイルＤＮＡに対するＰＣＲで示される）ｆｌｏｘｅｄマウスのみが、カスパーゼ−８欠失を示した（６．８  Ｋｂ断片により示される）ことを示す。したがって、これは、ｌｏｘＰ隣接Ｃａｓｐ８遺伝子座のＣｒｅ媒介性欠失を示す。
【図２】図２のａ〜ｄは、造血性前駆細胞のインビトロでの発育に対するカスパーゼ−８欠失の影響を示す。図２のａは、骨髄（ＢＭ）細胞のＰＣＲ（写真）およびリアルタイムＰＣＲ解析を示す。ＢＭ細胞は、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（ｐｌ−ｐＣで処理してＣｒｅ発現（ｗ．  ｐｌ−ｐＣ）を誘導させておいたか、または未処理（ｗ／ｏ  ｐｌ−ｐＣ）のいずれか）から得た。図２のｂは、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+マウス（黒棒）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（白棒）から得たＢＭ細胞からインビトロで生成したコロニーの総数を示す棒グラフである。マウスは、Ｃｒｅ発現を誘導するためのＩＦＮ−αでの処理をしておいたもの、または処理なしのいずれかとした。図２のｃは、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（ｐＩ−ｐＣで処理しておいた）から得たＢＭ細胞からインビトロで生成した骨髄系コロニーを示す写真である。図２のｄは、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+マウス（黒棒）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（白棒）（ｐＩ−ｐＣで処理しておいた）から得たＢＭ細胞からインビトロで生成した骨髄系コロニーおよびプレＢ細胞コロニーの数を示す棒グラフである（総数：骨髄系コロニー形成単位の総数；ＢＦＵ−Ｅ：赤芽球形成単位；ＣＦＵ−ＧＭ：顆粒球マクロファージコロニー形成単位；ＣＦＵ−Ｍｉｘ：顆粒球赤芽球巨核球マクロファージコロニー形成単位）。
【図３】図３のａ〜ｃは、カスパーゼ−８ノックアウトのＢＭ（骨髄）細胞の脾臓における発育能力に対する影響を示す。図３のａは、ｐＩｐＣ注射Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+（ｆｌ／＋）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-（ｆｌ／−）のＢＭ細胞で再構成したレシピエントマウスの脾臓、ならびに非再構成対照マウス（ｃｏｎ）の脾臓の一般的な外観を示す写真である。図３のｂは、ｐＩｐＣ注射Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+マウス（白棒）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（黒棒）のＢＭ細胞を有するレシピエントマウスの脾臓におけるコロニーの総数を示す棒グラフである。図３のｃは、ｐＩｐＣ注射Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+マウス（薄い灰色棒）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ｆfl/-（濃い灰色棒）のＢＭ細胞を有するレシピエントマウスの脾臓ならびに非再構成対照マウス（黒棒）の脾臓の重量を示す棒グラフである。図３のｄ〜ｅは、カスパーゼ−８の造血性前駆体の機能に対する細胞自律的役割を示す。図３のｄは、被照射Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+（黒棒）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（白棒）のＢＭ細胞の培養物中の骨髄系コロニーの総数を示す棒グラフである。マウスには、ｐＩ−ｐＣを注射し（３回、１回または０回）、正常Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ−５．１）マウスから得たＢＭ細胞を移植しておいた。図３のｅは、被照射Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ−５．１）マウスのＢＭ細胞の培養物中の骨髄系コロニーの総数を示す棒グラフである。マウスには、Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+（黒棒）およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス（白棒）から得たＢＭ細胞を移植し、ｐＩ−ｐＣを注射しておいた（３回、１回または０回）。
【図４】図４のａ〜ｅは、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）および対照（Ｆ／＋）マウスの骨髄（ＢＭ）細胞の表現型解析および遺伝子型解析を示す。図４のａ〜ｄは、Ｂ２２０、ＩｇＭおよびＣＤ４３に対する抗体を用いたヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性（生細胞）ＢＭ  Ｂ細胞のＦＡＣＳ解析であり、プロＢ（Ｂ２２０低／ＩｇＭ-／ＣＤ４３+）、プレＢ（Ｂ２２０低／ＩｇＭ-／ＣＤ４３-）、未成熟（Ｂ２２０低／ＩｇＭ+／ＣＤ４３-）および成熟再循環Ｂ（Ｂ２２０高／ＩｇＭ+／ＣＤ４３-）細胞を明示する。異なるＢＭ  Ｂ細胞集団を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ解析ソフトウェアによりゲーティングし、各集団の割合を求めた。結果（図４のａ〜ｂ）は、対照（Ｆ／＋）マウスと比べ、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）における再循環成熟Ｂ細胞の割合の低下を示す。ＢＭ  Ｂ細胞の異なる集団をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより分取し、ＰＣＲ解析を、直接、分取細胞において行ない、欠失したカスパーゼ−８対立遺伝子のレベルを求めた（図４のｅ）。このＰＣＲ解析は、この欠失が主に、プレＢ細胞期と未成熟Ｂ細胞期の間で起こり、成熟Ｂ細胞期において約９０〜９５％の最大欠失に達することを示す。対照（Ｆ／＋）マウスと比べ、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）において欠失率に差は見られなかった。
【図５】図５のａ〜ｅは、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）および対照（Ｆ／＋）マウスの脾臓細胞の表現型解析および遺伝子型解析を示す。図５のａ〜ｄは、ＣＤ３、Ｂ２２０およびＩｇＭに対する抗体で染色した生脾臓細胞のＦＡＣＳ解析である。これらの結果は、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）脾臓Ｂ細胞において、Ｂ２２０＋／ＩｇＭ低−陰である細胞がより多くあることを示す（図５のｃ〜ｄ）。これは、カスパーゼ−８が、特定のＢ細胞サブセットにおいて必須の因子であることを示し得る。図５のｅは、精製脾臓Ｂ細胞から抽出したＤＮＡのＰＣＲ解析であり、これは、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）においても対照（Ｆ／＋）マウスにおいても、ＤＮＡレベルで高レベルのカスパーゼ−８対立遺伝子の欠失が存在することを示す。
【図６】図６のａ〜ｇは、Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）および対照（Ｆ／＋）マウスの刺激された精製脾臓Ｂ細胞の表現型解析および遺伝子型解析を示す。図６のｂ〜ｇは、ＩｇＭ（図６のｂ〜ｃ）、ＣＤ４０（図６のｄ〜ｅ）およびＬＰＳ（図６のｆ〜ｇ）での刺激の４日後におけるＣＦＳＥ標識脾臓Ｂ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。これらの結果は、ＬＰＳ刺激を受けると、ＣＤ１９  Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８ノックアウト（Ｆ／−）Ｂ細胞は、その増殖能力が不完全となることを示す。図６のａは、４日間刺激した精製脾臓Ｂ細胞のＰＣＲ解析を示し、細胞の刺激後のカスパーゼ−８対立遺伝子の欠失のレベルが実験未使用の（naive）初代脾臓細胞における欠失のレベルと類似することを示す（図５のｅ）。
【図７】図７のａ〜ｆは、カスパーゼ−８遺伝子欠失のマクロファージ前駆体分化に対する影響を示す。図７のａは、ｐＩ−ｐＣ注射Ｍｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+およびＭｘ１−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウスのＢＭ細胞をＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養した後の細胞接着の程度を示す。図７のｂ〜ｅは、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウスのＢＭ細胞をＭ−ＣＳＦとともに培養することにより生成したマクロファージの特徴を示す。図７のｂは、７日間培養後の接着細胞の外観を示す。図７のｃは、表示した期間培養した後の接着細胞の収量を示す（ＭＴＴアッセイによる）；白棒：ｆｌ／＋マウスの細胞；黒棒；ｆｌ／−マウスの細胞。図７のｄは、７日間の培養期間後、培養皿への接着が見られた細胞において、ＰＣＲ（上）およびリアルタイムＰＣＲ（下の数字）により評価したｆｌｏｘｅｄカスパーゼ−８対立遺伝子の欠失の程度を示す。図７のｅは、５日間の培養期間後の非接着細胞のＦＡＣＳ解析を示す。解析により、マクロファージマーカーＣＤ１１ｂの発現およびアネキシンＶマーカーの存在が示されている。複数回の試験において、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-由来の培養物において観察された死細胞の程度は、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+由来の培養物よりも有意に高かった。図７のｆは、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/+マウス由来およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｃａｓｐ８fl/-マウス由来の腹膜マクロファージにおけるｆｌｏｘｅｄカスパーゼ−８対立遺伝子欠失の程度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月28日(2006.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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【国際調査報告】
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