(57)【要約】ジフテリア毒素の産生のためのジフテリア菌培地、および毒素を産生させる方法を提供する。その培地は、実質的に動物由来産物を含まず、水、炭水化物源、窒素源、および初期濃度の多数の遊離アミノ酸を含み、各遊離アミノ酸の初期濃度は、毒素の産生を制限しない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来産物を実質的に含まず、かつ下記の成分を含むことを特徴とするジフテリア毒素またはその類似物を産生するためにジフテリア菌株を培養するための培地：
ａ．水；
ｂ；炭化水素源および窒素源；
ｃ；それぞれがジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない初期濃度の複数の遊離アミノ酸。
【請求項２】
全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１記載の培地。
【請求項３】
前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項１記載の培地。
【請求項４】
グルコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項１記載の培地。
【請求項５】
前記窒素源が酵母抽出物を含むことを特徴とする請求項１記載の培地。
【請求項６】
動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の培地。
【請求項７】
ジフテリア菌用の培地であって：
炭水化物源および窒素源、ならびにそれぞれがジフテリア菌によるジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを高めるのに十分な量の少なくとも４つのアミノ酸を含む添加物を含み、動物由来産物を実質的に含まないことを特徴とする培地。
【請求項８】
全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項７記載の培地。
【請求項９】
前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項７記載の培地。
【請求項１０】
前記窒素源が酵母抽出物であうことを特徴とする請求項７記載の培地。
【請求項１１】
アミノ酸濃度が、培地1リットル当たり約0.5gから約1gであることを特徴とする請求項７から９いずれか１項記載の培地
【請求項１２】
動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項７から１１いずれか１項記載の培地。
【請求項１３】
ジフテリア毒素の産生をもたらす条件下で、動物由来産物を実質的に含まずかつ下記成分を含む培地中においてジフテリア菌株を培養する工程を含むことを特徴とするジフテリア毒素またはその類似物を産生する方法：
ａ．水；
ｂ；炭化水素源および窒素源；
ｃ；それぞれがジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない初期濃度の複数の遊離アミノ酸。
【請求項１４】
前記培地が全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記培地がグルコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記窒素源が酵母抽出物を含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
ジフテリア菌株を静止期まで増殖させることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも100Lf/mLのジフテリア毒素またはその類似物の産生が得られることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
ジフテリア毒素またはその類似物を回収して、回収ジフテリア毒素またはその類似物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
回収ジフテリア毒素またはその類似物を精製して、精製ジフテリア毒素またはその類似物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
回収したまたは精製したジフテリア毒素またはその類似物を無毒化して、ジフテリアトキソイドまたはその類似物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するためのワクチンとして前記ジフテリア毒素またはその類似物を製剤化する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記培地が、動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項１３から２３いずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法により調製したワクチンを宿主に投与する工程を含むことを特徴とする、ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫する方法。
【請求項２６】
ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するための請求項２３記載の方法により調製したワクチンの使用。
【請求項２７】
ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するための医薬の調製における請求項２２記載の方法により得たジフテリア毒素またはその類似物の使用。
【請求項２８】
ジフテリア菌株と、動物由来産物を実質的に含まずかつ下記の成分を含むジフテリア毒素またはその類似物を産生するための培地とを含む組成物： 
ａ．水；
ｂ；炭化水素源および窒素源；
ｃ；それぞれがジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない初期濃度の複数の遊離アミノ酸。
【請求項２９】
前記培地が全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３１】
前記培地がグルコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３２】
前記窒素源が酵母抽出物を含むことを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３３】
動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項２８から３２いずれか１項記載の組成物。
【請求項３４】
ジフテリア毒素またはその類似物を産生する方法であって、動物由来産物を実質的に含まない培地中でジフテリア菌の培養物を増殖させ、さらに前記培養物に少なくとも１つの選択アミノ酸を提供して該選択アミノ酸が毒素産生を制限するのを防ぐ工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記培地が酵母抽出物を更に含むことを特徴とする請求項３４記載の方法
【請求項３６】
前記酵母抽出物が、約3g/Lの濃度で存在することを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ジフテリア毒素またはその類似物の産生をもたらすためにアミノ酸含有培地においてジフテリア菌を培養し、その培養の間に少なくとも１つの選択アミノ酸が使い尽くされてジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限する培養方法において、前記培養の間に追加量の前記少なくとも１つの選択アミノ酸の外因性の添加を含み、該少なくとも１つの選択アミノ酸がジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しないことを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの選択アミノ酸が、Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trpおよびイソロイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記培地が酵母抽出物をさらに含むことを特徴とする請求項３７記載の方法
【請求項４０】
前記酵母抽出物が、約3g/Lの濃度で存在することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌増殖培地およびジフテリア毒素の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリアは、グラム陽性好気性桿菌であるジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)の感染によって発生する。この疾患は、ジフテリア菌の毒素産生菌株による上咽頭組織への局所侵襲によって生じる。この微生物は、扁桃腺にまたは鼻咽頭領域内に局在するであろう痛み、出血および壊死を伴う病変を覆う頑丈な繊維素性膜において増殖する。典型的な伝染病であった過去の時代には、この病気は飛沫感染によって広がっていった。ジフテリアから回復した患者でも、抗生物質で完全に治療しなければ、咽喉や上咽頭部に数週間から数ヶ月に亘り毒性細菌を保持していることがある。
【０００３】
ジフテリアの臨床的症状のほとんどは、tox遺伝子を担持するコリネバクテリオプロファージ（corynebacterioprophage）によって産生される強力なジフテリア毒素によるものである。ジフテリア菌にプロファージが感染して溶菌化が起こると、その菌株は毒性を獲得する。非毒性型のジフテリア毒素（トキソイド）での能動免疫によって産生される中和抗体（抗毒素血清）は、ジフテリアを予防することが可能である。現在の免疫学的戦略では、ホルムアルデヒド処理により、ジフテリア毒素を、非毒性であるが抗原性を有するトキソイドに変換することによって調製したジフテリアワクチンを使用する。ジフテリアトキソイドは、世界中での一斉予防接種のために他の免疫成分と多様に組み合わせて使用されている。近年、世界保健機構（WHO）は、幼児の予防接種率の低下、成人におけるジフテリアに対する免疫力の衰退、及びワクチンの供給不足により、世界中でおよそ10万人が発症し、年間8千人が死亡していると推定した。
【０００４】
ジフテリア菌のパーク・ウィリアム8（PW8）菌株は、菌体外毒素を産生させるためにしばしば使用され、化学修飾によってそれからトキソイドが調製される。一般的に、アミノ酸と少量のビタミン、無機塩、マルトースのような炭水化物源を含む培地組成は、細菌の増殖を著しく促進させる。カゼインの酸分解産物やウシ筋肉の酵素（トリプシンまたはパパイン）分解産物などを含む様々な培地が、毒物を産生するのに適している。従来の方法では、細菌は、動物由来のタンパク質性物質を含む培地で培養する。ジフテリア毒素の産生に通常使われている培地はNZ-アミンA型培地であり、これはカゼイン分解産物を含んでいる。最適条件下では、NZ-アミンA型培地を用いて産生される毒素の量は、ライムズ凝集法による測定で180Lf/mLである（非特許文献１−３；本出願全体に亘り、本発明が属する分野の技術水準をより詳細に説明するために様々な参考文献が括弧書きで参照されている。各文献に関する全ての書誌的情報が本明細書の最後に記載されている。それら各参考文献の開示内容は、参照によって本開示に組み込まれる）。
【０００５】
動物由来のタンパク質性物質を用いると、そのような培地を用いて産生されたジフテリア毒素に望ましくない混入物の導入をもたらす可能性がある。
【０００６】
El Lholy ら（1967；非特許文献４）は、キバナルピナス(Lupinus luteus)の発芽した種から調製した栄養培地（大豆抽出物）を、ジフテリア菌の増殖用培地において用いた。ジフテリア菌は良好に増殖したが、ジフテリア毒素の産生は僅かであった。El KohlyおよびKaramya（1979；非特許文献５）は、大豆抽出物中のサポニンが毒素産生の阻害剤であると結論付けた。TahaおよびKholy（1985；非特許文献６）は、水を沸騰させて連続抽出する前に、大豆を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ処理）して、おそらく高圧蒸気殺菌（オートクレーブでの処理）によるトリプシン阻害剤の破壊および連続煮沸による抽出物のサポニン含量の減少により、対照(ミートブロス(meat broth))に匹敵するLf値を有する毒素をもたらす水性抽出物を提供した。大豆ミールのpH4.6での酸抽出は、サポニンおよびトリプシン阻害剤が共にこのpHでは限られた量しか抽出されないため、対照（ミートブロス）のLf値と張り合うLf値を有する抽出物をもたらした。
【０００７】
Wolfeらにより出願されNYCOMED IMAGING ASに譲渡された2000年8月31日公開の特許文献１は、ジフテリア毒素の産生のための培地および方法について記載する。特許文献１に記載されている全ての培地は、乳タンパク質であるカゼインの酸加水分解によって得られたカザミノ酸を含有する。従って、特許文献１に記載の全ての培地は、動物由来のタンパク質性物質を含有する。
【０００８】
Oliveriらにより出願されChiron S.P.A.に譲渡された1998年12月3日公開の特許文献２は、ソイトン(Soytone)を含有するジフテリア毒素の産生のための培地について記載する
非毒性でしばしばCRMs（cross-reacting materials）と称されるジフテリア毒素の類似物(analogs)が報告されている（例えば非特許文献７を参照）。それらの例示として、CEM-197、CEM-9、CRM-45、CRM-102、CRM-103およびCRM-107が挙げられる。
【特許文献１】国際公開第00/50449号パンフレット
【特許文献２】国際公開第98/541296号パンフレット
【非特許文献１】Sundaran, B., Udaya, Y., Rao, B. and Boopathy, R.(2001) Process optimization for enhanced production of diphtheria toxin by submerged cultivation. Journal of Bioscience and Bioengineering 91, No. 2, 123-128.
【非特許文献２】Stainer, D.W. and Scholte, M.J (1973), The production of high potency diphtheria toxin in submerged culture in relatively simple equipment using a semisynthetic medium. Biotechnology and Bioengineering Symposium No. 4, 283-293.
【非特許文献３】Zaki, A.M.(1971) Production of diphtheria toxin in submerged culture. The Journal of the Egyptian Public Health Association 46, No.2, 80-85.
【非特許文献４】El Kohly S., Shaheen Y., and Abdel Fattah, F.(1967). A new modification of lupinus culture medium. The Journal of the Egyptian Public Health Association 42, 1-7.
【非特許文献５】El Kohly S., and Karawya M.S(1979). Preliminary phytochemical and microbiological screening of Lupinus termis Forsk seeds. Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University XVIII No.2:9-15.
【非特許文献６】Taha, F.S. and Kholy, S.E. (1985). Aoybean extracts as culture media for the growth and toxin production of coryneabacterium diphtheriae.  The Journal of the Egyptian Public Health Association 60: 113-126/
【非特許文献７】Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins Ed: Frankel, Marcel Dekker Inc., 1992.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ジフテリア菌の培養およびジフテリア毒素およびその類似物の産生のための、動物性成分を実質的に含まないまたは欠いた増菌培地を提供する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ジフテリア毒素およびその類似物の産生のための増殖培地および方法に関するものである。
【００１１】
本発明の第１の態様において、ジフテリア毒素またはその類似物の産生のための培地を提供し、その培地は、動物由来産物を実質的に含まず、水；炭水化物源および窒素源、ならびに初期濃度の多数の遊離アミノ酸を含み、各遊離アミノ酸の初期濃度は、ジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない濃度である。その培地は、全ての天然アミノ酸を含んでいてよく、また炭水化物源はマルトースを含んでいてよく、また培地はグルコールを含まなくてもよい。窒素源は酵母抽出物を含んでいてよい。その培地は、動物由来産物を欠くものでもよい。
【００１２】
本発明の第２の態様において、ジフテリア菌用の培地を提供し、その培地は、動物由来産物を実質的に含まず、炭水化物源および窒素源、ならびに少なくとも４つのアミノ酸をそれぞれがジフテリア毒素またはその類似物のジフテリア菌による産生レベルを高めるのに十分な量で含む添加物システム(additive system)を含む。その培地は、全ての天然アミノ酸を含んでいてよく、また炭水化物源はマルトースを含んでいてよい。窒素源は酵母抽出物であってよい。適切なアミノ酸濃度は、培地１リットル当たり約0.5gから約１gである。その培地は、動物由来産物を欠くものでもよい。
【００１３】
本発明の第３の態様において、ジフテリア毒素またはその類似物を産生する方法を提供し、その方法は、本明細書に記載の任意の培地中でジフテリア菌株を培養する工程を含む。ジフテリア菌株を静止期まで増殖させてよく、また少なくとも100Lf/mLのジフテリア毒素またはその類似物の産生を得ることができる。ジフテリア毒素またはその類似物を回収し、精製し、さらに無毒化してジフテリアトキソイドを提供することができ、それはジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するためのワクチンとして製剤化される。
【００１４】
別の態様において、本発明はジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫する方法まで及び、その方法は、本発明により提供されたワクチンを宿主に投与することを含む。従って、本発明により提供されたワクチンは、ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するのに用いることができ、さらに本発明により提供されたジフテリア毒素は、ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するための薬剤の調製に用いることができる。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、ジフテリア菌株および本発明により提供される培地を含む組成物を提供する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、ジフテリア毒素またはその類似物を産生する方法を提供し、その方法は、動物由来産物を実質的に含まない培地中において培養ジフテリア菌を増殖させ、さらに少なくとも１つの選択アミノ酸を培地に提供して、その選択アミノ酸の濃度が毒素（またはその類似物）の産生を制限することを防ぐ工程を含む。その培地は、例えば約3g/Lの濃度で、酵母抽出物をさらに含んでいてよい。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、あるレベルのジフテリア毒素またはその類似物を産生するためにアミノ酸を含有する培地中でジフテリア菌を培養し、その培養の間に少なくとも１つの選択アミノ酸が使い尽くされてジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限するような方法における改善を提供し、その改善は、その培養の間に追加量の少なくとも１つの選択アミノ酸の外因性の添加を含み、少なくとも１つの選択アミノ酸がジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない。その少なくとも１つの選択アミノ酸は、Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trpおよびイソロイシンより成る群から選択することができる。
【００１８】
本発明は、図面を参照して以下の記載からさらに理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
NZアミンは、カゼインの酵素消化によって産生されるアミノ酸およびペプチドの供給源である。NZアミンは、アミノ窒素（遊離アミノ酸）および有機窒素（ペプチド）の両方の良好な供給源である。ジフテリアトキソイドの産生用のジフテリア菌培地における別のアミノ酸およびペプチドの供給源は、動物由来のToxiprotone-Dである。それら培地の組成を下記の表に示す。
【００２０】
NZアミン含有培地の組成
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００２１】
動物性成分不含アミノ酸培地の作成
アミノ酸培地の調製において、そのアプローチは、Toxiprotone-D含有培地およびNZ-アミン動物性成分含有培地の両方において各アミノ酸のより高い濃度(mM)を選択して、ジフテリアの増殖および毒素産生を支持することができる培地を作成することである。
【００２２】
ジフテリア菌を、NZ-アミン含有培地において増殖させた。いくつかのアミノ酸が、様々な時間（24、30および41時間）で、発酵の間に使い尽くされることが同定された（表４）。
【表４】
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【００２３】
アミノ酸の消費と毒素産生を関連付けることによって、アミノ酸、Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、IsoおよびLeuを含有する以下の培地を用いて発酵実験を実施した。
【表５】
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【００２４】
しかしながら、それら少数のアミノ酸のみの使用では、細胞増殖または毒素産生をもたらさなかった。
【００２５】
培地（CDM）が全ての天然アミノ酸を含有するように工夫した。そのアミノ酸の全てが非動物源に由来するものである。この培地の組成を以下の表６に示す。
【表６】
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【００２６】
NZアミン培地またはToxiprotone含有培地を用いて20Lスケールで実施したジフテリア菌株の発酵バッチの比較分析
NZアミン含有培地を用いた発酵
第１の前培養において、凍結乾燥した種を、凍結乾燥種からレフラースラント(Loefflers slant)に増殖させ、その際36±2℃で22±2時間培養物を増殖させた。第２の前培養では、22±2時間のインキュベーションの後、スラントからの細胞を100ｍLのNZ培地を含む第１フラスコに移し、36±2℃にて22時間180rpmでインキュベートした。フラスコは、1ｍLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および0.5ｍLの1：2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))も含んでいた。第３の前培養では100ｍLの第１振とうフラスコ(shake flask)から、約5mLの第１培養物を採取し、250ｍLのNZアミン培地に播種し、36±2℃にて22時間180rpmでインキュベートした。その培養は、2.5ｍLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および1.25ｍLの1：2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))も含んでいた。発酵において、第３の前培養物15ｍLを用いて、発酵槽中の15LのNZアミン培地に播種した。その培養は、100.7ｍLの0.32％(w/v)リン酸溶液および125ｍLの1：2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))、および23.44ｍLの硫酸第１鉄七水和物溶液(0.1%(w/v))も含んでいた。発酵は、１つのラッシュトン型タービン羽根を有するBraun発酵槽中、600rpmの攪拌を用い、ヘッドスペースを通した1.57vvmの通気で、36±2℃の調節温度下において実施した。25時間の発酵後、攪拌を800rpmまで上昇させ、発酵槽を0.4barまで加圧した。さらに16時間発酵を継続した。
【００２７】
Toxiprotone含有培地を用いた発酵
第１の前培養において、凍結乾燥した種を、凍結乾燥種から5％ヒツジ血液寒天プレートを用いてbactoトリプトース寒天に増殖させ、その際36±2℃で22±2時間培養物を増殖させた。第２の前培養では、血液寒天培地からの細胞を90ｍLの培地を含む第１フラスコに移し、室温で48時間静止させ、その後36±2℃にて24時間180rpmでインキュベートした。90ｍLの第１振とうフラスコから、約1.6mLの第１培養物を採取し、800ｍLの培地に播種し、36±2℃にて22時間180rpmでインキュベートした。次に、その800ｍLの培養物を用いて、発酵槽中の10Lの培地に播種した。発酵は、２つのラッシュトン型タービン羽根、１つの噴霧器および４つのバッフルを有するNew Brunswick Scientific発酵槽中で実施した。培養物を、36±2℃で0.2vvmの通気を行い220rpmで攪拌した。8時間前から32時間の発酵が完了するまでの間、pHを7.5から7.6の間に調節した。生じたLf/mLは80-90Kf/mLであった。
【００２８】
CDM培地を用いた発酵
第１の前培養
湿式凍結(wet frozen)した種(グリセロール保存)をCDM＋5g/L YE寒天培地で増殖させ、36℃で24時間インキュベートした。
【００２９】
第２の前培養
プレートでの培養物を、5mLのCDM＋3g/L YE培地中に再懸濁させ、その2.5mLを用いて90ｍLのCDM＋3g/LYE培地の入った第１フラスコに播種した。そのフラスコを36℃で24時間、200rpmの一定の振とう下でインキュベートした。第１フラスコは、0.9ｍLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および0.45ｍLの1：2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))も含んでいた。
【００３０】
発酵
第３の前培養物の約800mLを用いて、発酵槽中の10LのCDM＋3g/L YE培地に播種した。100ｍLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および50ｍLの1：2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))および3.4ｍLの硫酸第１鉄七水和物溶液(0.1%(w/v))を発酵物に添加した。発酵は、New Brunswick ScientificまたはBraun発酵槽中、36℃の調節温度下で実施した。プロセスパラメーター：250rpmでの攪拌；0.45vvmでの通気。pHは、5Nの水酸化ナトリウムおよび2.5Mのリン酸を用いて、pHを6.5から7.6の間に調節した。
【００３１】
綿状反応法(Lf試験)およびELISAにより定量した毒素の量を表７に示す。
【表７】
2007513613.tif 000009
【００３２】
マルトース、鉄およびリン酸塩の濃度を様々な組合せで用いて、CDM培地を用いて240Lスケールで発酵を実施した。結果を以下の表８に要約する：
【表８】
2007513613.tif 000010
【００３３】
OD600が15-20の増殖が達成されたが、産生された毒素のレベルは90-100Lf/mLであり、そのレベルは、例えばNZアミンまたはPhytoneのような動物由来のタンパク質性物質を含有する培地を用いた場合に得られるレベルよりも低いものである。
【００３４】
アミノ酸消費の経時的試験は、（例えばAsp、Glu、Asn、Ser、Gln、GlyおよびThrのような）アミノ酸が、20Lのバッチで12時間の発酵の間に使い尽くされ（表９）、毒素発現段階の間に利用できないことを示した。
【表９】
2007513613.tif 000011
【００３５】
これらの結果は、培地に有機または無機窒素を補強しなければならないことを示唆した。
【００３６】
有機および無機窒素の補足に関するスクリーニング
発酵処理の間のアミノ酸消費の経時的試験は、重要なアミノ酸が最初の12-18時間の増殖で使い尽くされ、毒素が産生されるその後の発酵段階では利用できないことを示した。増殖を支持し、さらには毒素合成のための前駆体として培地中のアミノ酸を用いるため、培地に窒素を補足なければならない。酵母抽出物および硫酸アンモニウムを下記のようにCDMに添加した：
ジフテリア菌の増殖およびジフテリア毒素の産生に用いた様々な培地を以下に示す：
ａ）CDM＋5g/Lの酵母抽出物
ｂ）CDM＋5g/Lの硫酸アンモニウム；および
ｃ）その培地中のアミノ酸の濃度の半分を含有する修飾CDM＋5g/Lの酵母抽出物および5g/Lの硫酸アンモニウム。
【００３７】
それらを用いた発酵でのジフテリア毒素の産生を以下の表１０に示す：
【表１０】
2007513613.tif 000012
【００３８】
統計解析(statistical design)(FusionPro(登録商標))を用いて、より高い毒素収率を得るために培地中の様々な成分を最適化する
コンピューター統計解析(「FusionPro」)を用いて、培地組成を最適化した。その解析において、様々な濃度の３つの成分（酵母抽出物、アミノ酸混合物および鉄）を統計解析における入力として用いた。一部実施計画(fractional factorial design)を選択した（下記の表１１を参照）：
【表１１】
2007513613.tif 000013
【００３９】
リン酸塩および塩化カルシウム溶液は一定の変数として維持した。
【００４０】
様々な条件下で実験を実施し、産生毒素の量をELISAで定量した。毒素濃度は約150Lf/mLであるが、産生された毒素は動物性成分を発酵処理で用いた場合よりも純度が高い。図１に示すように、酵母抽出物およびアミノ酸の量のレスポンスグラフを、0.34mL/Lの鉄濃度で、アミノ酸混合物の濃度を２倍にするように外挿した。酵母抽出物濃度(3g/L)およびアミノ酸濃度(2x)の条件下で、毒素の量は等高線プロット分析(contour plot analysis)に従い倍化される。しかしながら、実際には、そうすることは費用を高くし、また培地の浸透圧も高くして細胞の死につながるため、容易に実施することはできない。
【００４１】
統計解析は、毒素収率に重要な変量−相互作用効果があることを示した。最も重要な効果は（図１に示されるように）酵母抽出物−アミノ酸相互作用効果（A*B）である。酵母抽出物およびアミノ酸は、毒素収率に負の効果を有する。酵母抽出物の濃度が高すぎる（すなわち5g/L）と、その条件は細菌増殖を支持するが、毒素産生は支持しない。また、アミノ酸濃度が２倍に上昇すると、この条件は、おそらく浸透圧における不均衡のせいで、増殖に不利な環境を作るであろう。従って、酵母抽出物およびアミノ酸の濃度を、高濃度の毒素の産生のために最適化しなければならない。図５における一般回帰分析(general regression statistics)は、R二乗値(R square value)が0.92であることを示す。このことは、観察された毒素収率データが、「FusionPro」統計解析によって作られた予測毒素収率データに非常に近似することを意味する。
【００４２】
産生される毒素の最適量は、3g/Lの酵母抽出物濃度、１倍のアミノ酸濃度、および0.34mL/Lの鉄濃度で達成される。
【００４３】
上記の発酵実験および増殖および毒素産生段階でのアミノ酸消費のプロファイルに基づき、アミノ酸Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、GlyおよびThrがより速く消費され、毒素発現の段階で利用できないことが観察された。これらは、より高い毒素収率を達成するために、19アミノ酸の全てではなく、FusionPro外挿レスポンスプロットにより２倍濃度で要求される重要なアミノ酸である。従って、毒素合成に対する2倍濃度の重要アミノ酸(修飾CDM1＋3g/L YE)の効果に関する振とうフラスコ実験を実施した。上記の重要アミノ酸の濃度を２倍にすると、１倍濃度の場合（157μg/mL）と比較して毒素レベルが倍加され（289μg/mL）、増殖の間に完全に消費されるこれらアミノ酸が毒素合成のために要求されるという仮定を支持する。これらアミノ酸の２倍濃度の条件を20L発酵槽でスケールアップし、細胞増殖は弱いことが観察された。最適化された動物性成分不含培地は、以下の表１２に示すようにCDM＋3g/Lの酵母抽出物であった。
【表１２】
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【００４４】
ジフテリア毒素の精製および無毒化
10リットルの発酵培養物を４℃、12,500xgで20分間遠心分離し、上清を回収した。次に、上清を0.22μm膜フィルターで濾過して、残留細菌を除去した。4℃で絶え間なく攪拌しながら、濾過した上清に硫酸アンモニウム27％(w/v)を添加し、その後4℃、12,500gで20分間遠心分離した。次の処理のために上清を回収した。この上清に、絶え間なく攪拌しながら硫酸アンモニウム13%(w/v)を添加した。混合物をさらに4℃で一晩攪拌し、その後4℃、125,00gで20分間遠心分離した。得られたペレットを約1000ｍLの0.9％(w/v)生理食塩水中に溶解した。
【００４５】
10ｋDカセットと共に限外濾過ユニットを用いて、0.9％(w/v)生理食塩水に対して上記の毒素溶液をダイアフィルトレーションして、硫酸アンモニウムを除去した。残留物を0.22μm膜フィルターでろ過し、4-8℃で保存した。残留物を無毒化する前に0.9%(w/v)生理食塩水で500Lf/mlに希釈した。ジフテリア毒素は、75％以上の純度であった。室温で20分間絶え間なく攪拌しながら、ホルマリン0.5%(w/v)および0.5%(w/v)重炭酸ナトリウムを、希釈した毒素溶液に添加した。20分後、0.9％(w/v)生理食塩水中の0.913%(w/v)L-リジン溶液を添加し、その混合物を0.22μmの膜フィルターで濾過し、さらに無毒化のために絶え間なく攪拌しながら37℃で6週間インキュベートした。トキソイドは4-8℃で保存した。
【００４６】
動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素およびトキソイドの特徴づけ
動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素およびトキソイドを、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、CDスペクトルの特定、N-末端シークエンシングにおいて分析した。結果は、動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて得られた毒素およびトキソイドが、実質的に区別できないことを示唆する。
【００４７】
全タンパク質濃度は、マイクロプレートBCAアッセイにおいてビシンコニン酸(BCA)を用い、既知濃度の参照標準タンパク質と比較することによって特定した。
【００４８】
SDS PAGE
ジフテリア毒素およびトキソイドの相対分子量(Mr)を特定し；毒素およびトキソイドの純度を評価し；さらにタンパク質バンドの分散パターンを評価するため、SDS-PAGEを実施した。還元条件下において12.5%ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEによりタンパク質を分析した。クーマシーブルーでゲルを染色し、続いてデンシトメトリーで分析した。
【００４９】
図２を参照して、ジフテリア毒素およびトキソイドの相対分子量(Mr)を特定し；毒素およびトキソイドの純度を評価し；さらにタンパク質バンドの分散パターンを評価するために実施したSDS-PAGを示す。還元条件下において12.5%ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEによりタンパク質を分析した。クーマシーブルーでゲルを染色し、続いてデンシトメトリーで分析した。レーンは：１．分子量マーカー(kDa)、250、150、100、75、50、37、25、15、10 kDa；２．ジフテリア毒素、CO3105（動物性成分含有培地）；３．ジフテリア毒素 Diph-20L-40F動物性成分含有培地）；４．ジフテリア毒素  Diph-20L-48F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；５．ジフテリア毒素  Diph-20L-50F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；６．ジフテリア毒素  Diph-20L-55F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；７．ジフテリアトキソイド  CO3152；８．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-40F(動物性成分含有培地)；９．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-48F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；１０．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-50F(CDM＋酵母抽出物含有培地)。
【００５０】
ウェスタンブロット分析
図３を参照して、ジフテリア毒素特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す。試料をSDS−PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、さらにDT-特異的抗体を用いてブロットした。レーンは：１．相対分子量マーカー(kDa)、250、150、100、75、50、37、25、15、10 kDa（BioRad 分子量マーカー）；２．ジフテリア毒素  CO3105；３．ジフテリア毒素  Diph-20L-40F(動物性成分含有培地)；４．ジフテリア毒素  Diph-20L-48F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；５．ジフテリア毒素  Diph-20L-50F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；６．ジフテリア毒素  Diph-20L-55F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；７．ジフテリアトキソイド  CO3152；８．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-40F(動物性成分含有培地)；９．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-48F(CDM＋酵母抽出物含有培地)；１０．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-50F(CDM＋酵母抽出物含有培地)。
【００５１】
N-末端シークエンシング
N-末端配列分析を用いて、N-末端に変化をもたらす任意のタンパク質修飾をモニターした。タンパク質を12.5％ SDS-PAGEゲルで分離し、PVDFのような固体支持体に転写した。逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）により同定する前に、エドマン分解法によりN-末端アミノ酸を遊離および誘導体化した。ジフテリア毒素およびトキソイドの対照ならびに「動物性成分不含毒素／トキソイド」の製造のための予測N-末端配列が観察された。
【表１３】
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【表１４】
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【００５２】
等電点電気泳動(IEF)
参照タンパク質を用いてジフテリア毒素の等電点を評価した。図３を参照して、等電点電気泳動ゲルを示す。レーンは：１．IEF標準−pI=7.80、7.50、7.10、7.00、6.50、6.00、5.10、4.65；２．ジフテリア毒素  CO3105(動物性成分含有培地)；３．ジフテリア毒素  Diph-20L-11(NZアミン含有培地)；４．ジフテリア毒素  Diph-20L-31(CDM＋酵母抽出物含有培地)；５．ジフテリア毒素  Diph-20L-31(CDM＋酵母抽出物含有培地)；６．ジフテリアトキソイド  CO3152(動物性成分含有培地)；７．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-11(CDM＋酵母抽出物含有培地)；８．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-31(CDM＋酵母抽出物含有培地)；９．ジフテリアトキソイド  Diph-20L-33(CDM＋酵母抽出物含有培地)。
【００５３】
CD分光法
円偏光二色性（CD）分析を用いて、様々なロットの配座または二次構造における不一致を特定した。試料の円偏光のための吸光スペクトルをソフトウェアプログラムによって分析して、α−へリックス、β−シート、リバースターンおよびランダムコイル構造の相対割合（％）の組成をもたらす。Jasco CD分光偏光計を用いてジフテリア毒素およびトキソイドを22℃で分析した。
【００５４】
N-末端シークエンシング：タンパク質を12.5％ SDS-PAGEゲルで分離し、PVDFのような固体支持体に転写した。逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）により同定する前に、エドマン分解法によりN-末端アミノ酸を遊離および誘導体化した。
【参考文献】
【００５５】
2007513613.tif 000017
【実施例１】
【００５６】
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、酵母抽出物−アミノ酸相互作用効果によって生じる、毒素収率における可変相互作用効果を示すグラフ。
【図２】図２は、動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素およびトキソイドのSDS-PAGE分析。
【図３】図３は、動物性成分を含有する培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素およびトキソイドのウェスタンブロット分析。
【図４】図４は、動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素およびトキソイドの等電点ゲル分析。
【図５】図５は、動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素の円偏光二色性を示す。
【図６】図６は、動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリアトキソイドの円偏光二色性を示す。
【図７】図７は、200Lスケールで動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリアトキソイドの円偏光二色性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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