(57)【要約】  本発明は、新たに同定されたサイクリックＡＭＰ応答エレメントアクティベータータンパク質(ＣＲＥＡＰタンパク質)を記載する。本明細書では、該タンパク質が、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の予防、処置または改善のための新規治療剤の開発のための適切な薬剤標的であると考えられる。本発明は、該病理学的状態を予防、処置または改善するための方法、およびそのためのＣＲＥＡＰタンパク質活性および／またはＣＲＥＡＰ遺伝子発現に阻害性効果を有するモジュレーターを含む医薬組成物に関する。本発明はまたＣＲＥＡＰタンパク質活性および／またはＣＲＥＡＰ遺伝子発現を阻害できる化合物を同定することを含む、該病理学的状態の処置に治療的に有用な化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善するための方法であり、必要とする対象に、有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを投与することを含む、方法。
【請求項２】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターがＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該モジュレーターが、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターがＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善する方法であり、必要とする対象に、有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターがＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害する、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の予防、処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であり、候補モジュレーターのＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する能力をアッセイすることを含む、方法。
【請求項２２】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該方法が、さらに、同定したＣＲＥＡＰ阻害性モジュレーターが、該病理学的状態のインビトロ、エキソビボまたはインビボモデルおよび／または該病理学的状態の対象での臨床試験で観察される病理学的影響を回復させる能力をアッセイすることを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の予防、処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であり、候補モジュレーターがＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害する能力をアッセイすることを含む、方法。
【請求項２９】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該方法が、さらに、同定したＣＲＥＡＰ阻害性モジュレーターが、該病理学的状態のインビトロ、エキソビボまたはインビボモデルおよび／または該病理学的状態の対象での臨床試験で観察される病理学的影響を回復させる能力をアッセイすることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰモジュレーターを、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を、必要とする対象において予防、処置または改善するのに有効な量で含む、医薬組成物。
【請求項３６】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３８】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３９】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項４０】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項４１】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４２】
該モジュレーターが、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４３】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害できるものである、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項４４】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４５】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、ＣＲＥＡＰモジュレーターでの処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して上昇したｍＲＮＡレベルを有する対象を、ＣＲＥＡＰモジュレーター処置に適した候補者であるとする、方法。
【請求項４６】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、ＣＲＥＡＰモジュレーターでの処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して上昇したレベルを有する対象を、ＣＲＥＡＰモジュレーター処置に適した候補者であるとする、方法。
【請求項４８】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善する方法であり：
(ａ)対象におけるＣＲＥＡＰ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルをアッセイし；そして、
(ｂ)コントロールと比較してＣＲＥＡＰ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルが上昇した対象に、該病理学的状態を予防、処置または改善するのに十分な量のＣＲＥＡＰモジュレーターを投与する
ことを含む、方法。
【請求項５０】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
生物学的サンプル中のＣＲＥＡＰタンパク質のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを検出するための診断用キットであり：
(ａ)ＣＲＥＡＰのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；
(ｂ)(ａ)に相補的なヌクレオチド配列；
(ｃ)ＣＲＥＡＰポリペプチド、またはそのフラグメント；
(ｄ)ＣＲＥＡＰポリペプチドに対する抗体；または
(ｅ)ＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物
を含み、ここで、成分(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)または(ｅ)が、実質的構成要素を構成し得る、キット。
【請求項５５】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるＣＲＥＡＰアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５７】
請求項５６記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸配列。
【請求項５８】
配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるＣＲＥＡＰアミノ酸配列から成る、単離ポリペプチド。
【請求項５９】
請求項５８記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸配列。
【請求項６０】
生物のＣＲＥＡＰ遺伝子によりコードされる、単離ＣＲＥＡＰポリペプチド。
【請求項６１】
請求項６０記載のＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離ＤＮＡ。
【請求項６２】
請求項５７記載の単離核酸のフラグメントを含む、ベクター分子。
【請求項６３】
１個またはそれ以上の転写制御配列を含む、請求項６２記載のベクター分子。
【請求項６４】
請求項６３記載のベクター分子を含む、宿主。
【請求項６５】
請求項５６記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項６６】
ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメントである、請求項６５記載の抗体フラグメント。
【請求項６７】
ポリクローナル抗体である、請求項６５記載の抗体。
【請求項６８】
モノクローナル抗体である、請求項６５記載の抗体。
【請求項６９】
請求項５６記載のポリペプチドを産生する方法であり、配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるアミノ酸を含むポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらすことを含む、方法。
【請求項７０】
該方法がさらに該細胞により産生されたポリペプチドを回収することを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
該外来ポリヌクレオチドが、配列番号１、１５および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
請求項５６記載のポリペプチドを産生する方法であり、配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるアミノ酸から成るポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらすことを含む、方法。
【請求項７３】
該方法がさらに該細胞により産生されたポリペプチドを回収することを含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
該外来ポリヌクレオチドが、配列番号１、１５および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
ヒトＣＲＥＡＰタンパク質のアミノ酸領域１−２６７、２８９−５３８、３５６−５８０および５７５−６５０のフラグメントをコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、ベクター分子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質(ＣＲＥＢ)、活性化転写因子１(ＡＴＦ１)およびｃＡＭＰ応答エレメントモジュレーター(ＣＲＥＭ)は、塩基性領域ロイシンジッパー(ｂＺＩＰ)転写因子スーパーファミリーに属するタンパク質に属する密接に関連したサブグループである。それらは、ホルモン、増殖因子、神経ペプチドおよび神経伝達物質、カルシウム、低酸素症および酸化的ストレスのような種々の細胞外刺激により作用を発揮する転写制御の中心的メディエーターである。ほとんどがＣＲＥＢでの試験を介して、これらのタンパク質のキナーゼ−誘導性ドメイン(ＫＩＤ)における保存されたセリン残基のリン酸化が、細胞増殖制御および分化、代謝、生殖および発育、ニューロン活性の制御および免疫制御に関与する標的遺伝子のスペクトルの転写的活性化をもたらすことがよく知られている。すべてのこれらの標的遺伝子は、保存されたシス−作用サイクリックＡＭＰ応答エレメント(ＣＲＥ)を共有し、これはＴＧＡＣＧＴＣＡのパリンドローム配列または、中心配列ＴＧＡＣを有するＣＲＥの半分の部位を含むその非対称変異体を有する(Mayr B, Montminy M., Nat Rev Mol Cell Biol 2001 Aug;2(8):599-609参照)。
【０００２】
転写制御は、リン酸化ＣＲＥＢ／ＣＲＥＭ／ＡＴＦ１ホモ−および／またはヘテロダイマーが、ｂＺＩＰドメインを介してＣＲＥ部位に結合し、一方、ＫＩＤドメインが２６５ｋＤ  ＣＲＥＢ結合性タンパク質ＣＢＰまたはｐ３００および関連するＰｏｌ  II基底転写機構を転写開始部位の近位に集めるときに、起こる。
【０００３】
莫大な量の研究が、ＣＲＥＢ／ＣＲＥＭ／ＡＴＦ１を活性化するための細胞刺激と連結する分子を同定するために行われている。これらのアクティベーターの複雑さは、ＣＲＥＢリン酸化のためのキナーゼの試験により例示される。当初は、ＣＲＥＢは、ｃＡＭＰを増加させ、それが続いてＣＲＥＢリン酸化のためのタンパク質キナーゼＡ(ＰＫＡ)を活性化するものである、細胞外刺激の排他的な転写メディエーターと考えられていた。しかしながら、その後の研究により、ＣＲＥＢタンパク質はまた増殖因子に応答してｐｐ９０ＲＳＫにより、マイトージェンおよびストレスに応答してＭＳＫ−１により、Ｃａ＋＋増加に応答してＣＡＭＫ  II／IVにより、ならびに低酸素症および生存シグナルに応答してＡＫＴによりリン酸化されることが確認された。これらの研究から、ＣＲＥＢ／ＣＲＥ／ＡＴＦ１ファミリータンパク質の活性化の制御が、細胞の情況に依存した態様(cell context-dependent manner)で、広範囲な種類の細胞外刺激からの適当な細胞性アウトプットの産生における、特異性および感受性を確実にすることが非常に複雑であることは明白である。
【０００４】
我々は、ここで、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現を活性化するタンパク質のための、１１,０００から１５,０００遺伝子の転写産物に相当する、完全長ヒトｃＤＮＡクローンの大きなコレクションのゲノム−規模の細胞ベースの機能的スクリーニングの結果を記載する。データは、以前に機能が知られていない遺伝子であり、ここでＣＲＥＡＰ１と改名されたＫＩＡＡ０６１６を含む、数個の現在まで同定されていないＣＲＥアクティベーターを示唆する。出願人は、また、ＣＲＥＡＰ１に構造および活性が類似のさらに２個のヒトタンパク質(ここでＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３と名付けた)ならびにマウスおよびキイロショウジョウバエ同族体を発見し、これらのすべては、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現を制御する遺伝子の現在まで知られていないファミリーのメンバーである。
【０００５】
出願人はまた、ＣＲＥＡＰ１が、ホスホエノールピルビン酸(phosphoenolpyrovate)カルボキシキナーゼ(ＰＥＰＣＫ)、アンフィレギュリン(amphiregulin)ならびにＩＬ−８およびＥｘｏｄｕｓ−１／ＭＩＰアルファのようなケモカインを含む他のタンパク質の強力なインデューサーであることを驚くべきことに発見したことをここで報告する。そのこと自体、本発明のＣＲＥＡＰタンパク質が、そのプロモーター領域にＣＲＥ部位(複数もある)を含む遺伝子の異常な活性化に関連した病理学的状態の処置、ならびに、ＰＥＰＣＫ、アンフィレギュリンおよびケモカイン、特にＩＬ−８およびＥｘｏｄｕｓ−１／ＭＩＰアルファの異常な活性化に関連した状態の処置のための新規な薬剤標的として使用できると考えられる。これらの状態は、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛および他の炎症性および自己免疫疾患ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性状態を含むが、これらに限定されない。
【０００６】
本発明はまたＣＲＥＡＰ活性を阻害または増強するおよび／またはＣＲＥＡＰ遺伝子発現を阻害または増強するモジュレーターを同定する方法、ならびに、ヒトおよび獣医の患者のこれらの状態の処置のためのこのようなモジュレーターの使用も提供する。本発明はまた該モジュレーターを含む医薬組成物も提供する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ＣＲＥ−依存性転写のアクティベーターならびにケモカインのインデューサーである、新規タンパク質ファミリー(ここではＣＲＥＡＰと呼ぶ)の発見に関する。そのこと自体、ここでは、このタンパク質ファミリーのメンバーは、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛、および他の炎症性および自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善するための新規治療の開発のための適当な標的であると考えられる。加えて、ＣＲＥＢ機能の損失が学習の障害および神経変性と関連しているため、ＣＲＥＡＰタンパク質のアゴニストは、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性疾患の予防、処置または改善に有用である可能性がある。故に、一つの局面において、本発明は、該状態の予防、処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であって：ａ)候補モジュレーターの、ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害または増強するおよび／またはＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害または増強する能力を、インビトロ、エキソビボまたはインビボでアッセイすることを含み、さらに、ｂ)同定したＣＲＥＡＰモジュレーターが、該病理学的状態のインビボ、エキソビボまたはインビトロモデルおよび／または該病理学的状態の対象での臨床試験で観察される病理学的影響を回復させる能力をアッセイすることを含んでよい、方法に関する。
【０００８】
他の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善する方法であり、有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを、それを必要とする対象に投与することを含み、ここで、該モジュレーターが、例えば、任意の１個またはそれ以上の該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害または増強し、または、任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害または増強するものである(ここで、該ＣＲＥＡＰタンパク質はＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される)、方法に関する。
【０００９】
一つの態様において、本モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである。さらなる態様において、本モジュレーターはＣＲＥＡＰタンパク質またはそれに対する抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである。本発明のさらなる態様において、同モジュレーターは、ＣＲＥＡＰタンパク質のペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである。ここでは、本明細書に記載の１個またはそれ以上のモジュレーターを同時に投与し得ると考えられる。
【００１０】
他の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を処置、予防または改善する方法であり、それを必要とする対象に有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。一つの態様において、該モジュレーターはＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害または増強するか、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害または増強し、ここで、該ＣＲＥＡＰタンパク質はＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される。一つの態様において、本モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡらなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである。さらなる態様において、本モジュレーターは、ＣＲＥＡＰタンパク質に対する抗体またはペプチド模倣物もしくはそれらのフラグメントを含み、ここで、該抗体または模倣物は、例えば、該ＣＲＥＡＰタンパク質の酵素活性または他の活性を阻害できる。ここでは１個またはそれ以上の該タンパク質に対する１個またはそれ以上のモジュレーターを同時に投与し得ることも考えられる。
【００１１】
他の局面において、本発明は、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰモジュレーターを、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を、必要とする対象において予防、処置または改善するのに有効な量で含み、該モジュレーターがＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害または増強でき、および／またはＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害または増強でき、ここで、ＣＲＥＡＰタンパク質がＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択されるものである、医薬組成物に関する。さらなる態様において、本モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰ発現を阻害するように設計されているものである。さらなる態様において、本モジュレーターは、ＣＲＥＡＰタンパク質に対する抗体もしくはそのペプチド模倣物、またはそれらのフラグメントを含み、ここで、該抗体または模倣物は、例えば、該ＣＲＥＡＰタンパク質の酵素活性または他の活性を阻害できる。
【００１２】
他の局面において、本発明は、ＣＲＥＡＰタンパク質を含む医薬組成物に関する。
【００１３】
さらに別の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を処置、予防または改善する方法であり、それを必要とする対象にＣＲＥＡＰタンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００１４】
他の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、ＣＲＥＡＰモジュレーターまたは外来ＣＲＥＡＰタンパク質での処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して上昇したレベルを有する対象を、処置に適した候補者であるとする、方法に関する。
【００１５】
さらに別の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰモジュレーターまたは外来ＣＲＥＡＰタンパク質での処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して上昇したｍＲＮＡレベルを有する対象を、処置に適した候補者であるとする、方法に関する。
【００１６】
さらに別の局面において、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を処置、予防または改善する方法であって：(ａ)対象におけるＣＲＥＡＰ  ｍＲＮＡおよび／またはＣＲＥＡＰタンパク質レベルをアッセイし、そして(ｂ)コントロールと比較してｍＲＮＡおよび／またはＣＲＥＡＰタンパク質のレベルが異常な対象に、該病理学的状態を予防、処置または改善するのに十分な量のＣＲＥＡＰモジュレーターまたは外来ＣＲＥＡＰタンパク質を投与することを含む、方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の局面において、患者由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現またはＣＲＥＡＰタンパク質もしくはそのフラグメントのレベルを検出するために必要な要素を含むアッセイ方法およびキットを提供し、該キットは、例えば、ＣＲＥＡＰタンパク質、またはそのフラグメントに結合する抗体またはペプチド模倣物、またはＣＲＥＡＰポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを含む。好ましい態様において、このようなキットは、キット要素を使用すべき方法を詳述した指示書も含む。
【００１８】
本発明はまた、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の処置、予防または改善のための医薬の製造における、ＣＲＥＡＰモジュレーターまたは外来ＣＲＥＡＰタンパク質の使用に関する。好ましくは、該病理学的状態は自己免疫疾患または神経変性疾患である。一つの態様において、該モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質は、ＣＲＥＡＰ遺伝子発現を阻害するために設計されている。さらに別の態様において、該モジュレーターは、ＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントは、例えば、酵素活性または他のＣＲＥＡＰ活性を阻害できる。別の態様において、該モジュレーターは、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質のペプチド模倣物を含み、ここで、該模倣物は例えば酵素活性または他のＣＲＥＡＰ活性を阻害できる。
【００１９】
本発明はまた、医薬として使用するための外来ＣＲＥＡＰタンパク質またはＣＲＥＡＰタンパク質のモジュレーターに関する。一つの態様において、該モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ異常の物質を含み、ここで、該物質はＣＲＥＡＰ発現を阻害するために設計されている。さらに別の態様において、該モジュレーターは、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰに対する抗体またはＣＲＥＡＰのペプチド模倣物、またはそれらのフラグメントを含み、ここで、該抗体、模倣物またはそのフラグメントは、例えば、酵素活性または他のＣＲＥＡＰ活性を阻害できる。別の態様において、該モジュレーターは、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質のペプチド模倣物を含み、ここで、該模倣物は、例えば酵素活性または他のＣＲＥＡＰ活性を阻害できる。
【００２０】
ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３の正確なポリヌクレオチド配列がこれまで記載されていなかったため、ここでは、本発明はまた配列番号１６および配列番号２５に各々記載するアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドも提供すると考える。さらに、本発明は、配列番号１６および配列番号２５に記載のアミノ酸配列から成る単離ポリペプチドおよびそのフラグメントを提供する。本発明のこの局面によると、ヒト起源の新規ポリペプチドならびに生物学的に、診断的にまたは治療的に有用なそのフラグメント、変異体、同族体および誘導体、フラグメントの変異体および誘導体、および前記のアナログが提供される。
【００２１】
本発明はまた本明細書に記載のＣＲＥＡＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸、特に、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３およびそれらの同族体およびフラグメントおよび／または等価物または配列番号１５および配列番号２４に記載のヌクレオチド配列を有する核酸と実質的に類似の核酸の利用を可能にする。好ましい態様において、同単離ＤＮＡは、本発明のＤＮＡの少なくともフラグメントを含む、特に配列番号１、配列番号１５または配列番号２４に記載のヌクレオチド配列から成るＤＮＡを含む、ベクター分子の形を取る。
【００２２】
本発明の他の局面は、前記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体および誘導体、変異体および誘導体のフラグメント、および前記のアナログを産生する方法を提供する。本発明のこの局面の好ましい態様において、前記ＣＲＥＡＰタンパク質を産生方法であり、このようなポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらし、所望により発現したポリペプチドを回収することを含む、方法を提供する。
【００２３】
本発明のこの局面の好ましい態様において、配列番号２、配列番号１６、または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、またはこれらから成るポリペプチドを産生する方法であり、配列番号２、配列番号１６、配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸を含むまたはこれらから成るポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらし、所望により発現したポリペプチドを回収することを含む、方法を提供する。好ましくは、このような方法のすべてにおいて、外来ポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列、または配列番号２４に記載のヌクレオチド配列を含む、またはこれらから成る。本発明の他の局面によると、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、とりわけ、研究、生物学、臨床および治療目的で使用するための製品、組成物、工程および方法を提供する。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、インビトロで増殖できる宿主細胞、好ましくは脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞、または細菌細胞を提供し、それらは、培養による増殖により、配列番号２、配列番号１６、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントを産生でき、ここで、細胞は転写制御ＤＮＡ配列(好ましくはヒトＣＲＥＡＰ転写制御配列以外)を含み、ここで、転写制御配列は、配列番号２、配列番号１６、配列番号２５に記載のアミノ酸配列のポリペプチド、または、ＣＲＥＡＰタンパク質の活性部分およびフラグメントのアミノ酸配列を含むが、これらに限定されないそのフラグメントをコードするＤＮＡの転写を制御する。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の核酸を、処置を必要とする対象の１個またはそれ以上の組織に挿入し、同核酸によりコードされる１個またはそれ以上のタンパク質が、その組織内の細胞により発現およびまたは分泌される結果を得る、方法に関する。
【００２６】
図面の説明
図１は、ＣＲＥＡＰ１が非常に保存的なタンパク質であり、強力な転写活性化ドメインを含むことを図説する。ヒトＣＲＥＡＰ１のアミノ酸配列および予測されるマウス、ｆｕｇｕおよびキイロショウジョウバエＣＲＥＡＰ１関連遺伝子を示す。同一および非常に保存的なアミノ酸を網掛けする。保存的な、可能性のあるＰＫＡリン酸化部位を四角で囲む。最初の配列はヒト、二番目はマウス、三番目はフグおよび四番目はキイロショウジョウバエを示す。
【００２７】
図２は、ヒトおよびキイロショウジョウバエＣＲＥＡＰタンパク質に対応する完全長ｃＤＮＡのアミノ酸配列を図説する。アミノ酸を、ClustalWを使用して整列させ、保存的アミノ酸を網掛けする。
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の本発明は、記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に、それらが変化し得るため、限定することを意図するものではない。また、本明細書で使用する用語は、特定の態様を記載するだけの目的であり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定する意図はないことは理解されるべきである。
【００２９】
特記しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の通常の技術者が、共通して理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似のまたは等価な方法および材料のすべてが、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法、装置および材料をここに記載する。本明細書に記載のすべての刊行物は、本発明と関連して使用するはずである、同刊行物に記載されている材料および方法を記載し、開示する目的のために、引用して本明細書に包含させる。
【００３０】
本発明の実施に際し、分子生物学における多くの慣用の技術を使用する。これらの技術は公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.)；Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.)；Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.)；Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins)；Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.)；Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.)；Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press)；Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning;the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory)；およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)に説明されている。
【００３１】
【表１】
2007523608.tif 000002
【表２】
2007523608.tif 000003
【表３】
2007523608.tif 000004
【００３２】
本明細書および特許請求の範囲で使用されている単数形は、内容から明らかに異なることが指示されない限り、複数形も含む。故に、例えば、一つの“抗体”に関する言及は、当業者に既知の１個またはそれ以上の抗体およびその等価物を含む。加えて、ＣＲＥＡＰタンパク質または“ＣＲＥＡＰ”の言及は、特に断りのない限り、本明細書に記載のＣＲＥＡＰタンパク質の１個またはそれ以上、特に、タンパク質のＣＲＥＡＰファミリーに属するため、本明細書に示すヒトＣＲＥＡＰ１−３ポリペプチドの任意の１個またはそれ以上を含む。
【００３３】
物質(例えば“ＣＲＥＡＰモジュレーター”)がＣＲＥＡＰタンパク質を“調節”する能力は、物質がＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害または増強するおよび／または該タンパク質の任意の１個またはそれ以上の発現を阻害または増強する能力を含むが、これらに限定されいない。このようなモジュレーターは、ＣＲＥＡＰ活性のアゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む。このような調節はまた他のタンパク質、例えば、関連調節タンパク質またはＣＲＥＡＰにより修飾されるタンパク質が、ＣＲＥＡＰタンパク質と相互作用を起こす能力に影響することを含む。
【００３４】
本明細書で使用する“アゴニスト”の用語は、ポリペプチド(例えばＣＲＥＡＰポリペプチド)を直接または間接的に調節し得て、かつ、該ポリペプチドの生物学的活性を増加する、分子(すなわちモジュレーター)を意味する。アゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、または他の分子を含んでよい。遺伝子の転写またはタンパク質の生化学的機能を増強するモジュレーターは、各々、転写を増加させるか、または該タンパク質の生化学的特性または活性を刺激するものである。
【００３５】
本明細書で使用する“アンタゴニスト”または“インヒビター”なる用語は、ポリペプチド(例えばＣＲＥＡＰポリペプチド)を直接または間接的に調節し得て、かつ該ポリペプチドの生物学的活性を遮断または阻害する、分子(すなわちモジュレーター)である。アンタゴニストおよびインヒビターは、タンパク質、核酸、炭水化物、または他の分子を含む。発現またはタンパク質の生化学的機能を阻害するモジュレーターは、各々、遺伝子の発現を、または該タンパク質の生物学的活性を減少させるものである。
【００３６】
本明細書に記載の“核酸配列”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントまたは一部であり、かつ、一本鎖または二本鎖であり得て、センスまたはアンチセンス鎖に相当するゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する“アンチセンス”なる用語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に粗補的なヌクレオチド配列を意味する。“アンチセンス鎖”なる用語は、“センス”鎖と相補的な核酸鎖を意味する。アンチセンス分子は、目的の遺伝子(複数もある)を逆配向で、相補鎖の合成が可能であるウイルスプロモーターにライゲートすることによる合成を含む、任意の方法で産生できる。細胞に挿入したら、この転写された鎖を、細胞により産生された天然配列と合わせ、二本鎖を形成する。これらの二本鎖を、次いでさらなる転写または翻訳のいずれかを遮断する。“ネガティブ”なる呼び方をアンチセンス鎖を意味するために使用することがあり、“ポジティブ”をセンス鎖を意味するために使用することがある。
【００３８】
本明細書で意図される通り、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡは、それに対して阻害性分子を設計したタンパク質の選択したヌクレオチド配列が、内因性ＣＲＥＡＰ産生の特定の阻害をもたらすことができるように、ＣＲＥＡＰ発現を阻害するために設計する。例えば、ＣＲＥＡＰ１ヌクレオチド配列の知識は、過度の実験を行うことなく、ＣＲＥＡＰ  ｍＲＮＡと最も強くハイブリダイズするアンチセンス分子を設計するために使用し得る。同様に、リボザイムを、目的のタンパク質の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するために合成できる(Cech. J. Amer. Med Assn. 260:3030 (1988))。遺伝子発現の標的阻害に使用するためのこのような分子を設計する技術は、当業者に既知である。
【００３９】
本明細書に記載のＣＲＥＡＰタンパク質は、ヒトまたはすべての他の種由来の、ヒトＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３ポリペプチドを含むがこれらに限定されず、これらのポリペプチドのすべての形、不完全形、同族体、イソ型、前駆体形、完全長ポリペプチド、上記のいずれかのタンパク質配列またはフラグメントを含む融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。目的のフラグメントは、例えば、アミノ酸３５６−５８０を含む、正常ＣＲＥＡＰ機能の特に重要なアミノ酸を含むフラグメントである。ＣＲＥＡＰ１、およびその変異体の配列は、GenBank、受託番号ＮＭ＿０２５０２１およびＡＢ０１４５１６に見ることができる。ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３の完全で正確な配列は、出願人の知るところでは、以前には記載されていない；部分配列は、GenBank(ＣＲＥＡＰ２受託番号ＸＭ＿１１７２０１(ＤＮＡ)およびＸＰ＿１１７２０１(タンパク質)およびＣＲＥＡＰ３受託番号ＡＫ０９０４４３(ＤＮＡ)およびＢＡＣ０３４２４(タンパク質))に見ることができる。ＣＲＥＡＰの同族体は、本明細書に記載のもの、および、当業者に明らかであるものを含み、本発明の範囲内に包含すべきであることを意味する。ＣＲＥＡＰタンパク質は、ゲノムＤＮＡライブラリーのようなすべての天然に存在する種から単離されたもの、ならびに、発現系を含む宿主細胞から遺伝子的に操作されたもの、または、例えば、自動ペプチド合成装置を使用した化学合成により、または、このような方法の組み合わせにより産生したものを含むと考えられる。このようなポリペプチドを単離および産生する手段は当分野で十分理解されている。
【００４０】
本明細書で使用する“サンプル”または“生物学的サンプル”なる用語は、その最も広い意味で使用する。対象由来の生物学的サンプルは、血液、尿または、ＣＲＥＡＰタンパク質の活性もしくは遺伝子発現がアッセイできる他の生物学材料を含み得る。
【００４１】
本明細書で使用する“抗体”なる用語は、そのままの分子ならびにそのフラグメント、例えばエピトープ決定基を結合できるＦａ、Ｆ(ａｂ')２、およびＦｖを意味する。本明細書に記載するＣＲＥＡＰポリペプチドと結合する抗体は、免疫原として目的の小ペプチドを含む完全なポリペプチドまたはフラグメントを使用して製造できる。動物を免疫するのに使用するポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳由来であるかまたは化学的に合成してよく、望ましいならば担体タンパク質とコンジュゲートしてよい。ペプチドと化学的に結合する一般的に使用される担体は、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンを含む。次いで、結合したペプチドを動物(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)の免疫に使用する。
【００４２】
本明細書で使用する“ヒト化抗体”は、ヒト抗体とより似せるために非抗原結合領域のアミノ酸が置換されているが、まだ元の結合能を有する、抗体分子を意味する。
【００４３】
ペプチド模倣物は、正常のポリペプチドの機能を模倣できる、対象ポリペプチドの決定的な残基の知識に基づいて製造する合成されたペプチドまたは非ペプチド剤である。ペプチド模倣物は、ポリペプチドのそのレセプターまたは他のタンパク質への結合を妨害でき、故にポリペプチドの正常の機能を妨害する。例えば、ＣＲＥＡＰ模倣物は、正常のＣＲＥＡＰ機能を妨害する。
【００４４】
“治療的有効量”は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の処置、予防または改善に十分な薬剤の量である。
【００４５】
本明細書で使用する“関連調節タンパク質”および“関連調節ポリペプチド”は、本明細書に記載の慣用法を使用して当業者が同定し得る、ＣＲＥＡＰタンパク質の調節に関与するポリペプチドを意味する。
【００４６】
“ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態”は：骨関節症、ＣＯＰＤ、乾癬、喘息、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛、および他の炎症性および自己免疫疾患ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性状態のような状態を含むが、これらに限定されない。異常な活性化は過剰な活性化、例えば、ＣＲＥＡＰタンパク質をコードするｍＲＮＡが上方制御されている、またはこれらの遺伝子のタンパク質産物が、絶対量の増加または特異的活性の増加のいずれかにより細胞内で増強した活性を有する状態、ならびに、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の下方制御または異常に低いケモカイン活性の状態を含み得る。
【００４７】
ここで意図されるように、本発明は、本明細書に記載のＣＲＥＡＰ遺伝子および遺伝子産物を使用し、ＣＲＥ−依存性遺伝子を各々誘導または抑制するアゴニストおよびアンタゴニストを発見する方法を含む。本明細書で使用されている“ＣＲＥ−依存性”遺伝子が、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ２、ＣＲＥ−ＢＰａのようなＣＲＥ−結合性タンパク質を介して働く、サイクリックａｍｐ応答エレメントに依存性の遺伝子を含む(レビューのために、Lonze, B., and Ginty, D. (2002)Neuron 35, 605;Muller FU, Neumann J, Schmitz W., Mol Cell Biochem 2000 Sep;212(1-2):11-7 and Mayr B, Montminy M.Nat Rev Mol Cell Biol 2001 Aug;2(8):599-609参照)。これらの遺伝子は、ＰＥＰＣＫ、脱共役タンパク質−１、ガラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼのような神経調節分子ならびにインシュリンおよびアンフィレギュリンを含む増殖因子のような代謝制御にきわめて重要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。ＣＲＥＡＰにより活性化されるケモカインは、ＩＬ−８およびＥｘｏｄｕｓ１／ＭＩＰ３アルファを含み、ＣＲＥにより活性化されるケモカインはＭＩＰ−１ベータを含む(Proffitt et al., 1995, Gene 152:173-179;およびZhang et al., 2002;J. Biol Chem, 277:19042-19048)。
“対象”は、ヒトまたは非ヒト生物のすべてを意味する。
【００４８】
その最も広い意味において、“実質的に類似”または“等価物”なる用語は、本明細書でヌクレオチド配列と関連して使用するとき、参照ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味し、ここで、例えば発生するポリペプチド機能に影響しないアミノ酸のみ変化する点で、対応する配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードする。望ましくは、実質的に類似のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。実質的に類似ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間の同一性の割合は、少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００４９】
参照ヌクレオチド配列に“実質的に類似”のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡ中、５０℃で、さらに２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄してハイブリダイズし、より望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡ中、５０℃で、さらに１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄してハイブリダイズし、さらに望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡ中、５０℃で、さらに０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄してハイブリダイズし、好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡ中、５０℃で、さらに０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄してハイブリダイズし、より好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡ中、５０℃で、さらに０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃で洗浄してハイブリダイズし、まだ等価物遺伝子産物をコードする。一般的に、ハイブリダイゼーション条件は高い(highly)ストリンジェントまたはあまり高くない(less highly)ストリンジェントであってよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(“オリゴ”)である場合、高いストリンジェントの条件は、例えば、６×ＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウム、３７℃(１４−塩基オリゴ)、４８℃(１７−塩基オリゴ)、５５℃(２０−塩基オリゴ)、および６０℃(２３−塩基オリゴ)での洗浄を意味する。種々の組成の核酸のためのこのようなストリンジェンシーの適当な範囲は、前掲のManiatis et al.に加えて、Krause and Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200:546-556に記載されている。
【００５０】
“ｍＲＮＡの増加した転写”は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有する個体の適当な組織または細胞中の、本発明のＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする天然の内因性ヒト遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡのコントロールレベルと比較して多い量、特に、このような状態を有しない対象における対応する組織で見られるより、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、最も好ましくは少なくとも約１００倍のｍＲＮＡの量である。このようなｍＲＮＡの増加したレベルは、該状態を有する個体において、健常個体と比較して、最終的にこのようなｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の増加したレベルをもたらす。
【００５１】
本明細書で使用する“宿主細胞”なる用語は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などにより細胞内に挿入された異種ＤＮＡを含む、原核生物または真核生物細胞を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する“異種”は、“異なる天然起源”を意味するか、または非天然状態を意味する。例えば、宿主細胞が他の生物由来の、特に他の種由来のＤＮＡまたは遺伝子で形質転換されているとき、該遺伝子は宿主細胞にとって異種であり、また、その遺伝子を持つ宿主細胞の子孫にとっても異種である。同様に、異種は、同じ天然の本来の細胞型であるが、非天然状態で、例えば、異なるコピー数でまたは異なる調節エレメントの制御下に存在するものに由来するおよびそれに挿入されたヌクレオチド配列を意味する。
【００５３】
“ベクター”分子は、異種核酸をその中に挿入でき、それが次いで、適当な宿主細胞に導入できる、核酸分子である。ベクターは、好ましくは１個またはそれ以上の複製起点を有し、かつ、組み換えＤＮＡを挿入できる１個またはそれ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、それを有しないものから選択できる簡便な手段を有し、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および(主に酵母および細菌内の)“人工染色体”を含む。
【００５４】
“プラスミド”は、一般に、本明細書では、当業者によく知られた慣用標準命名法にしたがい、小文字ｐで始まり、大文字および／または数字がその後に続いている。本明細書に記載の出発プラスミドは市販されているか、制限されずに公的に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから、既知の、公開された方法の日常的な適用により構築できる。本発明によって使用できる多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは既知である、当業者が容易に利用可能である。さらに、当業者は、本発明での使用に適した任意の数の他のプラスミドを構築し得る。本発明におけるこのようなプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構築および使用は、本明細書から当業者には容易に明らかとなろう。
【００５５】
“単離”なる用語は、物質がその本来の環境(例えば、それが天然に存在するとき、その天然環境)から除かれることを意味する。例えば、生存動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存するいくつかのまたはすべての物質から分かれた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえ、その後その天然の系に再挿入しても、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得ておよび／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得て、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないため、まだ単離されている。
【００５６】
本明細書で使用する“転写制御配列”なる用語は、それらが操作可能に結合しているタンパク質コード核酸配列の転写を、誘導、抑制、またはその他の方法で制御する、ＤＮＡ配列、例えばイニシエーター配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列を意味する。
【００５７】
本明細書で使用する“ヒト転写制御配列”は、それらが各々のヒト染色体で見られるように、本発明のＣＲＥＡＰタンパク質の任意の１個またはそれ異常をコードするヒト遺伝子と関連して通常見られるこれらの転写制御配列のいずれかである。
【００５８】
本明細書で使用する“非ヒト転写制御配列”は、ヒトゲノムでは見られないすべての転写制御配列である。
【００５９】
本明細書で使用する本発明のポリペプチドの“化学誘導体”は、通常その分子の一部ではない付加的な化学部分を含む、本発明のポリペプチドである。このような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学半減期などを改善し得る。同部分は、あるいは、分子の毒性を減少させ、分子の望ましくないいずれかの副作用を排除し、または減弱するなどし得る。このような効果を仲介し得る部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980)に記載されている。
【００６０】
本発明は、以前は公的データベースで“ＫＩＡＡ０６１６”と呼ばれ、現在まで機能が未知であったタンパク質が、ＣＲＥ−活性化タンパク質であるとの発見に基づく。本明細書でＣＲＥＡＰ１を言及すると、一般的なＣＲＥ−依存性転写の活性化に加えて、このポリペプチドはまた種々の疾患関連遺伝子、例えばケモカイン、酵素、例えばＰＥＰＣＫおよび増殖因子、例えばアンフィレギュリンも誘導できる。
【００６１】
加えて、公的データベースのサーチにより、以前に機能に関する言及なしに寄託された２個のｃＤＮＡおよびタンパク質(誤りがあるおよび／または部分的配列のみにもかかわらず)であるＸＰ＿１１７２０１およびＦＬＪ００３６４が、ＣＲＥＡＰ１と類似の活性を有するタンパク質をコードすることが示された。そのこと自体、本発明が、本明細書に詳細を説明する、本明細書でＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３と名付け、タンパク質の新規ＣＲＥＡＰファミリーに属する、現在まで記載されていなかった正確なヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
故に、本発明は、配列番号１６および配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、配列番号１６および配列番号２５に記載のアミノ酸配列から成る、単離ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、例えば、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質であってよい。ＣＲＥＡＰ１を含む融合タンパク質もまたここで意図される。
【００６３】
本発明はまた、特にＣＲＥＡＰタンパク質、特に、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３をコードする、単離核酸またはヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子も含む。好ましくは、本発明の単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子は、配列番号１６または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。同様に好ましいのは、配列番号１６または配列番号２５に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする、単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子である。
【００６４】
本発明はまた：(ａ)ＣＲＥＡＰタンパク質、特にヒトＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３またはそのフラグメントおよび／またはその相補体(すなわち、アンチセンス)のヌクレオチド配列を含むベクター；(ｂ)ベクター分子、好ましくは転写制御配列を含むベクター分子、特に、コード配列の発現を指示する調節エレメントと制御可能に結合している前記ＣＲＥＡＰタンパク質のいずれかのコード配列を含む発現ベクター；および(ｃ)ここに記載のベクター分子、または宿主細胞中のコード配列の発現を指示する調節エレメントと操作可能に結合している前記ヌクレオチド配列のいずれかの少なくともフラグメントを含む、遺伝子操作された宿主細胞も包含する。本明細書で使用する調節エレメントは誘導性および非−誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動および制御することが当業者に既知の他のエレメントを含むが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は脊椎動物宿主細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞、例えばヒト細胞または齧歯類細胞、例えばＣＨＯもしくはＢＨＫ細胞であってよい。同様に好ましいのは、宿主細胞は細菌宿主細胞、特に大腸菌細胞であってよい。
【００６５】
特に好ましいのは、インビトロで増殖でき、そして、培養で増殖すると、ＣＲＥＡＰポリペプチド、特に配列番号２、１６または２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する、宿主細胞、特に上記の型のものであり、ここで、該細胞は、該ポリペプチドをコードする天然内因性ヒト遺伝子の転写制御配列ではない少なくとも１個の転写制御配列を含み、ここで、該１個またはそれ以上の転写制御配列は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御する。
【００６６】
本発明はまた本明細書に記載のすべての核酸配列のフラグメントも含む。ＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする核酸配列のフラグメントは、完全長遺伝子を単離するため、および、類似の生物学的活性のＣＲＥＡＰ遺伝子と高配列類似性を有する他の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも約３０塩基対を有し、例えば、約３０から約５０塩基対、約５０から約１００塩基対、約１００から約２００塩基対、または２００塩基対以上を含んでよい。プローブはまた、完全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、および、調節およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全ＣＲＥＡＰ遺伝子を含むゲノムクローンまたは複数のクローンの同定に使用してよい。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための、既知のＤＮＡ配列を使用したＣＲＥＡＰ遺伝子の単離を含む。本発明の遺伝子と相補的名配列を有する標識オリゴヌクレオチドを使用してヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするか決定する。
【００６７】
上記の遺伝子配列に加えて、このような配列の同族体が補明細書で記載されており、特に、キイロショウジョウバエ、マウスおよびフグ・ルブリプルズ(Fugu rubripres)由来のＣＲＥＡＰタンパク質が同定されている(下記実施例参照)。さらなる同族体は、当分野で既知の分子生物学的技術により、過度の実験なしに同定され、容易に単離できる。さらに、このような遺伝子産物の１個またはそれ以上のドメインに高い相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝子座に遺伝子が存在してもよい。これらの遺伝子は、類似の技術により同定し得る。
【００６８】
例えば、ＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする本発明の単離ヌクレオチド配列を標識し、目的の生物から得たｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用し得る。ハイブリダイゼーション条件は、ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が由来する生物と異なるタイプの生物に由来するとき、低いストリンジェンシーであろう。あるいは、標識フラグメントを使用して、目的の生物に由来するゲノムライブラリーを、同様に、適当なストリンジェントの条件を使用してスクリーニングしてよい。このような低いストリンジェンシーの条件は当業者に既知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する特手員生物に依存して予想通りに変化する。このような条件に関する手引きとして、例えば、上記引用のSambrook et al. 参照のこと。
【００６９】
さらに、以前は未知であった発現が異なる(differentially expresses)遺伝子タイプの配列を、目的の遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計した２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマー・プールを使用したＰＣＲを行うことにより、単離し得る。反応用鋳型は、発現が異なる遺伝子の対立遺伝子を発現することが既知の、または発現することが疑われるヒトまたは非ヒト細胞型または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写により得たｃＤＮＡであってよい。
【００７０】
ＰＣＲ産物をサブクローン化および配列決定し、増幅した配列が、発現が異なる遺伝子様核酸配列の配列を示すことを確認する。ＰＣＲフラグメントを次いで使用して、種々の方法により完全長ｃＤＮＡクローンを単離し得る。例えば、増幅したフラグメントを標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用し得る。あるいは、標識したフラグメントを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。
【００７１】
ＰＣＲ技法を、完全長ｃＤＮＡ配列の単離に使用してもよい。例えば、ＲＮＡを、標準方にしたがい、適当な細胞または組織源から単離し得る。逆転写反応を、ＲＮＡ上で、第一鎖合成のプライミングのために増幅したフラグメントのほとんどの５'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い得る。得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、次いで、標準的末端トランスフェラーゼ反応を使用して、グアニンで“切断(tailed)”してよく、同ハイブリッドをＲＮＡａｓｅ  Ｈで消化し、第二鎖合成を次いでポリ−Ｃプライマーで誘導する。故に、増幅したフラグメントの上流のｃＤＮＡ配列は、単離が容易であり得る。使用し得るクローニング法の復習のために、例えば、Sambrook et al., 1989, 前掲を参照のこと。
【００７２】
同定した遺伝子が正常であるか、または野生型遺伝子である場合、この遺伝子を使用して、この遺伝子の変異対立遺伝子を単離し得る。このような単離は遺伝的基礎を有することが知られているまたは疑われる工程および疾患において好ましい。変異対立遺伝子を、炎症または免疫応答に関与する遺伝子型を有することが既知であるかまたは疑われる個体から単離し得る。変異対立遺伝子および変異対立遺伝子産物を次いで下記の診断アッセイ系に使用し得る。
【００７３】
変異遺伝子のｃＤＮＡを、例えば、当業者に既知の技術であるＰＣＲを使用することにより、単離し得る。この場合、第一ｃＤＮＡ鎖を、オリゴ−ｄＴ  オリゴヌクレオチドを変異対立遺伝子を有することが推定される個体において発現していることが既知のまたは疑われる組織から単離したｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより、および、新しい鎖を逆転写酵素により伸長することにより合成し得る。ｃＤＮＡの第二鎖を、次いで、正常遺伝子の５'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成する。これらの２つのプライマーを使用して、本産物を次いでＰＣＲにより増幅し、適当なベクターにクローン化し、当業者に既知の方法を介したＤＮＡ配列分析に付す。変異遺伝子と正常遺伝子のＤＮＡ配列を比較することにより、変異遺伝子産物の機能の損失または変更の原因となる変異(複数もある)を確認できる。
【００７４】
あるいは、変異対立遺伝子を有することが疑われるまたは既知の個体において目的の遺伝子を発現することが既知のまたは疑われる組織からのＤＮＡまたはＲＮＡを各々使用して、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを構築し、スクリーニングできる。正常遺伝子またはその任意の適当なフラグメントを次いで標識し、プローブとして使用して、ライブラリー中の対応する変異対立遺伝子を同定する。この遺伝子を含むクローンを次いで当分野で慣用的に実施されている方法により精製し、上記のような配列分析に付す。
【００７５】
さらに、発現ライブラリーを、変異対立遺伝子を有することが疑われるまたは既知の個体において目的の遺伝子を発現することが既知のまたは疑われる組織から単離したＤＮＡまたは合成したｃＤＮＡを使用して、構築できる。この方法において、推定される変異組織から産生された遺伝子産物を発現し、標準抗体スクリーニング法を、正常遺伝子産物に対して産生した抗体と組み合わせて、下記のようにスクリーニングし得る。(スクリーニング法に関して、例えば、Harlow, E. and Lane, eds., 1988, “Antibodies:A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor参照。)変異が、変更された機能を有する遺伝子産物由来(例えば、ミスセンス変異由来)である場合、抗体のポリクローナルセットは、変異遺伝子産物と交差反応するようである。このような標識抗体とのそれらの反応を介して検出したライブラリークローンを精製し、上記のような配列分析に付すことができる。
【００７６】
本発明は、配列番号１、１５、２４、２６、２８、３１のいずれかに記載のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを含む。
【００７７】
さらに、本発明は、機能的に等価な遺伝子産物に相当するタンパク質を含む。このような等価な発現が異なる遺伝子産物は、上記の発現が異なる遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列内に、アミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでよいが、沈黙変化をもたらし、故に、機能的に等価な発現が異なる遺伝子産物を産生する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性を基にして行い得る。
【００７８】
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；正に荷電した(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む；そして負に荷電した(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。本明細書で使用する“機能的等価物”は、上記の発現が異なる遺伝子配列によりコードされる内因性の発現が異なる遺伝子産物と実質的に類似のインビボまたはインビトロ活性を示すことができるタンパク質またはポリペプチドを意味し得る。“機能的等価物”はまた内因性の発現が異なる遺伝子産物の対応する部分がするのと実質的に類似した方法で、他の細胞性または細胞外分子と相互作用できるタンパク質またはポリペプチドも意味する。例えば、“機能的に等価”なペプチドは、イムノアッセイで、抗体の、内因性タンパク質の対応するペプチド(すなわち、アミノ酸配列が“機能的に等価”なペプチドを達成するために修飾されたペプチド)に対する、または内因性タンパク質それ自体に対する結合を減少でき、ここで、抗体は、内因性タンパク質の対応するペプチドに対して産生した。機能的に等価なペプチドは、対応するペプチドの前記結合を、少なくとも約５％、好ましくは約５％から１０％、より好ましくは約１０％から２５％、さらにより好ましくは約２５％から５０％、および最も好ましくは約４０％および５０％まで減少する。
【００７９】
本明細書に記載のデータは、特定のポリペプチドフラグメントが、タンパク質のＣＲＥＡＰファミリーの活性に重要であることを示唆する。ＣＲＥＡＰ１−３に関して、これらの領域は特に保存的なアミノ末端２００アミノ酸およびカルボキシ末端１００アミノ酸であり、この各々は数個の保存的なドメインである。特に好ましい本発明のポリペプチドは、例えば各タンパク質の末端７５アミノ酸；例えば、アミノ酸１から７５の領域、より具体的に、ＣＲＥＡＰ１に関してはアミノ酸フラグメント１−６８、ＣＲＥＡＰ２に関してはアミノ酸フラグメント１−７４およびＣＲＥＡＰ３に関してはアミノ酸フラグメント１−６６のような、進化の過程で保存された領域に対応するまたはそれに含まれるアミノ酸配列を含むものである。
【００８０】
故に、これらのＣＲＥＡＰペプチドフラグメントならびに本明細書に記載のＣＲＥＡＰポリペプチドの活性部分をコードする核酸のフラグメント、および該フラグメントを含むベクターもまた本発明の範囲内である。本明細書で使用するＣＲＥＡＰポリペプチドの活性部分をコードする核酸のフラグメントは、ＣＲＥＡＰポリペプチドの完全なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であり、かつ、本明細書で定義のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を有するペプチド(すなわち、ＣＲＥＡＰタンパク質の少なくとも１個の生物学的活性を有するペプチド)である。一般的に、ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を有するペプチドをコードする核酸は、成熟タンパク質をコードする塩基対から選択される。しかしながら、ある場合には、ＣＲＥＡＰタンパク質の核酸のリーダー配列部分のペプチドのすべてまたは一部を選択することが望ましいことがある。これらの核酸はまたリンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位および分子クローニング、発現または精製に有用な他の配列を含んでよく、または、ＣＲＥＡＰタンパク質の少なくとも１個の生物学的活性を有する組み換えペプチドを含んでよい。ＣＲＥＡＰペプチドフラグメントならびにＣＲＥＡＰタンパク質の活性を有するペプチドフラグメントをコードする核酸は、慣用法で得ることができる。
【００８１】
加えて、これらのペプチドフラグメントに対する抗体を、上記のように製造できる。これらのポリペプチドフラグメントへの、該ペプチドの免疫原性を増加し得る修飾(例えば、アミノ酸置換)も使用し得る。同様に、当業者に既知の方法を使用して、ＣＲＥＡＰタンパク質の該ペプチドを修飾し、シグナルまたはリーダー配列を包含させるか、または分子操作を容易にするためにリンカーまたは他の配列とコンジュゲートさせてよい。
【００８２】
本発明のポリペプチドは、当分野で既知の技術を使用した組み換えＤＮＡ法により製造し得る。したがって、本発明のポリペプチドを産生する方法であり、配列番号２、１６、２５、２７、２９および３０、好ましくは配列番号２、１６および２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらすことを含む、方法を提供する。所望により、該方法は、さらに該細胞により産生されたポリペプチドを回収することを含む。このような方法の好ましい態様において、該外来ポリヌクレオチドは、配列番号２、１６、２５、２７、２９および３０に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする。好ましくは、該外来ポリヌクレオチドは、配列番号１、１５、２４、２６、２８および３１のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
故に、各々のポリペプチド配列をコードする核酸の発現により、本発明のポリペプチドおよびペプチドを産生する方法が、本明細書に記載されている。当業者に既知の方法を使用して、タンパク質−コード配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含む、発現ベクターを構築できる。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えを含む。例えば、Sambrook et al., 1989, 前掲、およびAusubel et al., 1989, 前掲に記載の技術参照。あるいは、発現が異なる遺伝子タンパク質配列をコードできるＲＮＡを、例えば、合成装置を使用して化学的に合成し得る。例えば、引用してその全体を本明細書に包含させる“Oligonucleotide Synthesis”, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford参照。
【００８４】
種々の宿主−発現ベクター系を使用して、本発明の発現が異なる遺伝子コード配列を発現してよい。このような宿主−発現系は、目的のコード配列が産生され、そして、続いて精製される媒体を示し、また、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトしたとき、本発明の発現が異なる遺伝子タンパク質をインサイチュで発現し得る、細胞も示す。これらは、発現が異なる遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)のような微生物；発現が異なる遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えばサッカロマイセス、ピキア)；発現が異なる遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させたまたは形質転換した昆虫細胞系；組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイク・ウイルス、ＴＭＶ)で感染させた、またはタンパク質コード配列を含むプラスミド(例えば、Ｔｉプラスミド)を含む組み換えベクターで形質転換した植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネイン・プロモーター)または哺乳類ウイルスのゲノム由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター、またはＣＭＶプロモーター)を含む組み換え発現構築物を含む、哺乳類細胞系(例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３)を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明のＣＲＥＡＰタンパク質の、細胞による、該細胞由来であるＣＲＥＡＰ−コード遺伝子からの発現も行うことができる。このような発現は、例えば、すべて引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,６４１,６７０；５,７３３,７６１；５,９６８,５０２；および５,９９４,１２７に詳述されている。米国特許５,６４１,６７０；５,７３３,７６１；５,９６８,５０２；および５,９９４,１２７のいずれかの方法により、ＣＲＥＡＰを発現するように誘導されている細胞は、組織中のＣＲＥＡＰの局所濃度を増加させるために、生存動物の所望の組織にインプラントできる。このような方法は、例えば、ＣＲＥＢ機能の損失が起きている神経変性状態に治療的意義を有し、そのこと自体、アゴニストおよび／または外来ＣＲＥＡＰタンパク質は該状態の予防、処置または改善に有用であり得る。
【００８６】
細菌系において、多くの発現ベクターが、有利には、発現されるタンパク質の意図する使用に応じて、選択し得る。例えば、大量のこのようなタンパク質を産生すべきであるとき、抗体の産生またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、例えば、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルでの発現を指示するベクターが望ましいことがある。この点に関して、ヘキサヒスチジン標識を含む融合タンパク質を、多くのメーカー(例えばQiagen, Valencia, CA)が提供しているため、使用し得る(Sisk et alk, 1994:J. Virol 68:766-775)。このようなベクターは、融合タンパク質を産生できるように、タンパク質−コード配列を、個々に、ベクターに、ｌａｃ  Ｚコード領域の領域内にライゲートした、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109;Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509)；などを含むが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターをまた使用し、外来ポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として発現してよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、融解細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続く、遊離グルタチオン存在下での溶出により精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計する。
【００８７】
プロモーター領域は、任意の望ましい遺伝子から、候補プロモーターフラグメント、すなわち、プロモーターを含むかもしれないフラグメントを挿入するために、制限部位または複数の制限部位の下流に、プロモーター領域を欠くレポーター転写単位、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“ＣＡＴ”)、またはルシフェラーゼ転写単位を含むベクターを使用して選択できる。例えば、ベクターへの、ＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位へのプロモーター−含有フラグメントの挿入は、標準ＣＡＴアッセイで検出できるＣＡＴ活性の産生を生じさせる。この目的に適したベクターは既知であり、容易に入手可能である。２個のこのようなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。故に、本発明のポリヌクレオチドの発現用プロモーターは、既知であり、かつ容易に入手可能なプロモーターだけでなく、レポーター遺伝子を使用して、前記技術により容易に得ることができるプロモーターも含む。
【００８８】
既知の細菌プロモーターの中で、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適しているのは、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、Ｔ５  ｔａｃプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーターである。既知の真核生物プロモーターの中で、この観点で適しているのは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、前記および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(“ＲＳＶ”)のようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネイン・プロモーターである。
【００８９】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用できる、いくつかの昆虫系のうちの１個である。ウイルスは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖させる。コード配列を、個々に、ウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に置く。コード配列の十分な挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組み換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質様コートを欠くウイルス)の産生をもたらす。これらの組み換えウイルスを次いで使用して、挿入遺伝子が発現するヨトウガ細胞の感染に使用する。(例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584；Smith, 米国特許４,２１５,０５１参照)。
【００９０】
哺乳類宿主細胞において、多くのウイルス−ベースの発現系を利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列にライゲートし得る。このキメラ遺伝子を、次いで、アデノウイルスゲノムにインビトロまたはインビボ組み換えにより挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域Ｅ１またはＥ３)への挿入は、生存可能であり、所望のタンパク質を感染宿主で発現できる、組み換えウイルスをもたらす。(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照)。特定の開始シグナルはまた挿入された遺伝子コード配列の効率のよい翻訳のために必要であるかもしれない。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む全遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合、付加的な翻訳制御シグナルは必要としないかもしれない。しかしながら、遺伝子コード配列の一部のみを挿入するとき、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルを提供すべきである。さらに、開始コドンは、望むコード配列のリーディング・フレームと一致すべきである。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、種々の起源であり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサー・エレメント、転写ターミネーターなどの挿入により増強し得る。(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照)。他の一般的な系はＳＶ４０、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに基づく。宿主細胞中で発現させるための適当なベクターおよびプロモーターの選択は、既知の方法であり、発現ベクター構築、ベクターの宿主への挿入、および宿主中での発現それ自体に必要な方法は、当業者に慣用的である。一般的に、組み換え発現ベクターは複製の起点、下流構造配列の転写を指示する非常に発現された遺伝子由来のプロモーター、およびベクターに曝した後に、ベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含む。
【００９１】
加えて、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を所望の特定の形態に修飾し、加工する宿主細胞株を選択し得る。このようなタンパク質産物の修飾(例えば、グリコシル化)および加工(例えば、開裂)は、タンパク質の機能に重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後加工および修飾の特徴的かつ特定の機構を有する。適当な細胞系または宿主系を、発現された外来タンパク質の正確な修飾および加工を確実にするために選択できる。この目的のために、一次転写物の適当な加工、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化の細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用し得る。このような哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明はまたＣＲＥＡＰタンパク質の活性を有する組み換えＣＲＥＡＰペプチドおよびペプチドフラグメントを有する。“組み換えタンパク質”なる用語は、一般に、ＣＲＥＡＰ活性フラグメントをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、それを次に異種タンパク質を産生するために宿主細胞の形質転換に使用するものである、組み換え技術により産生される、本発明のタンパク質を意味する。特に、ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を有する組み換えペプチドフラグメントは、ＣＲＥＡＰ１、２または３の保存的アミノ末端２００アミノ酸またはカルボキシ末端１００アミノ酸を含む、ＣＲＥＡＰタンパク質フラグメントを含む。該フラグメントは、ＣＲＥＡＰ１に関してはアミノ酸フラグメント１−２６７および５７５−６５０、ＣＲＥＡＰ２に関してはアミノ酸フラグメント１−２８０および６１５−６９３およびＣＲＥＡＰ３に関してはアミノ酸フラグメント１−２７９および５４５−６１９を、ならびに、上記の通りのヒトＣＲＥＡＰ１−３のアミノ酸１−７５の領域を含むフラグメントを含む。
【００９３】
本発明の組み換えタンパク質はまたＣＲＥＡＰおよび異なるポリペプチドのキメラまたは融合タンパク質を含み、それは当業者に既知の方法で製造し得る(例えば、Current Protocols in Molecular Biology;Eds Ausubel et al. John Wiley & Sons;1992;PNAS 85:4879 (1988)参照)。
【００９４】
組み換えタンパク質の長期の、高収率の産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、発現が異なる遺伝子タンパク質を安定に発現する細胞系を操作し得る。ウイルス複製の起点を含む発現ベクターを使用することよりも、宿主細胞を、適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)により制御され、かつ選択可能マーカーを含むＤＮＡで形質転換できる。外来ＤＮＡの挿入に続いて、操作した細胞を、１−２日間強化培地で増殖させ、次いで、選択培地に移してよい。組み換えプラスミド中の選択可能マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドにその染色体内に安定して統合され、増殖して座を形成し、それが次に細胞系にクローン化および拡張できるこの方法は、発現が異なる遺伝子タンパク質を発現する細胞系の操作に有利に使用し得る。このような操作した細胞系は、発現されたタンパク質の内因性活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【００９５】
多くの選択系を使用でき、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, et al., 1980, Cell 22:817)遺伝子を各々ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞に使用できるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性を、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ(Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567;O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147)の遺伝子に関する選択の基礎として使用できる。
【００９６】
別の融合タンパク質系が、ヒト細胞系で発現された非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976)。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子のオープン・リーディング・フレームが６個のヒスチジン残基から成るアミノ−末端標識に翻訳的に融合するように、ワクシニア組み換えプラスミドにサブクローン化されている。組み換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムに負荷し、ヒスチジン−標識タンパク質をイミダゾール−含有緩衝液で選択的に溶出する。
【００９７】
下記のようなアッセイ系の要素として使用するとき、本発明のタンパク質を、タンパク質と試験物質の間で形成された複合体の検出が容易になるように、直接的または間接的に標識してよい。種々の適当な標識系を使用してよく、１２５Ｉのような放射性同位体；基質に暴露したときに、検出可能な熱量測定的シグナルまたは光を産生する酵素標識系；および蛍光標識を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
組み換えＤＮＡ法を、このようなアッセイ系のための本発明のタンパク質の産生に使用するとき、標識、固定、検出および／または単離を促進できる、融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【００９９】
間接的標識は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する標識した抗体のようなタンパク質の使用を含む。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーから産生されたフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
本明細書に記載のＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の処置のための治療用薬剤の開発の薬剤標的として有用であることも考えられる。このような状態は、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、乾癬、喘息、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛、および他の炎症性および自己免疫疾患ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性状態を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
ケモカインに加えて、データはまたＣＲＥＡＰタンパク質が、ＰＥＰＣＫおよびアンフィレギュリンのような他の遺伝子を誘導できることも示唆する。アンフィレギュリンは、癌に関連するＥＧＦ様増殖因子である。ＰＥＰＣＫはグルコース合成の制限因子であり、それ自体糖新生に必要であり、その遮断は、糖尿病の処置のための治療的アプローチであると一般に考えられている。そのこと自体、本明細書では、本発明のモジュレーターで処置し得る病理学的状態は、これらのタンパク質の異常な活性または発現に関連する状態を含むと考えられる。
【０１０２】
さらに別の局面において、本発明は、上記病理学的状態を処置、予防または改善するのに有用なモジュレーターを同定する方法であり：ａ)候補モジュレーターがＣＲＥＡＰ活性を阻害または増強するおよび／またはＣＲＥＡＰ発現を阻害または増強する能力を、インビトロ、エキソビボまたはインビボでアッセイすることを含み、さらに、ｂ)同定したＣＲＥＡＰモジュレーターが、該病理学的状態のインビボ、エキソビボまたはインビトロモデルおよび／または該病理学的状態の対象での臨床試験で観察される病理学的影響を回復させる能力をアッセイすることを含んでよい、方法に関する。
【０１０３】
慣用のスクリーニングアッセイ(例えば、インビトロ、エキソビボおよびインビボ)を使用し、ＣＲＥＡＰタンパク質活性を阻害または増強するおよび／またはＣＲＥＡＰ発現を阻害または増強するモジュレーターを同定し得る。対象におけるＣＲＥＡＰ活性およびＣＲＥＡＰレベルを、対象由来の生物学的サンプルを使用して、アッセイできる。ＣＲＥＡＰ遺伝子発現(例えばｍＲＮＡレベル)をまた、例えば、慣用のノーザン分析または市販のマイクロアレイを含む、当業者に公知の方法の一つを使用して決定し得る。さらに、ＣＲＥＡＰレベルおよび／または関連調節タンパク質レベルに対する試験化合物の効果を、ＥＬＩＳＡ抗体−ベースのアッセイまたは蛍光標識反応アッセイで検出できる。これらの技術は、ハイスループット・スクリーニングに容易に利用可能であり、当業者に公知である。
【０１０４】
これらの試験から集めたデータを使用して、上記の病理学的状態の処置に治療的に有用なモジュレーターを同定し得る；例えば阻害性物質をさらに慣用の該病理学的状態のインビトロまたはインビボモデルおよび／または該病理学的状態を有するヒトでの臨床試験においてさらに慣用法にしたがってアッセイし、該病理学的状態をインビボで処置、予防または改善する該化合物の能力を評価する。
【０１０５】
本発明は、ＣＲＥＡＰポリペプチドの活性部分の重要な情報を利用可能とすることにより、ＣＲＥＡＰ機能のモジュレーター、例えば、小分子アゴニストまたはアンタゴニストの開発を、当業者に既知の理論的薬剤設計を用いることにより、可能にする。
【０１０６】
他の局面において、本発明は、本明細書に記載の病理学的状態を予防、処置または改善する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを含む、医薬組成物を投与することを含む方法に関する。このようなモジュレーターは、ＣＲＥＡＰポリペプチドまたはそのフラグメントを指向する抗体を含む。ある特に好ましい態様において、医薬組成物は、ヒトＣＲＥＡＰポリペプチドまたはヒトＣＲＥＡＰポリペプチドの一部に非常に選択的な抗体を含む。ＣＲＥＡＰタンパク質に対する抗体は、対象中のタンパク質の凝集を起こし、それ故、タンパク質の活性を阻害または減少し得る。このような抗体はまたＣＲＥＡＰ活性を、例えば、活性部位と直接相互作用するかまたは基質の活性部位への接近を遮断することにより、阻害または減少し得る。ＣＲＥＡＰ抗体はまた、ＣＲＥＡＰタンパク質の制御に関連し、かつタンパク質活性に必須であり得るタンパク質−タンパク質相互作用の阻止により、ＣＲＥＡＰ活性を阻害または減少し得る。本明細書に記載のような阻害活性を有する抗体は、製造でき、当業者に既知の標準アッセイにしたがい、同定できる。
【０１０７】
ＣＲＥＡＰ抗体はまた診断的に使用し得る。例えば、これらの抗体を、対象中のＣＲＥＡＰタンパク質のレベルを定量するための慣用法にしたがい、使用してよい；上昇したレベルは、例えば、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の過剰な活性化(例えばそのプロモーター領域にＣＲＥを有する遺伝子の活性化)の指標である可能性があり、おそらく、過剰な活性化の程度を示し、関連する病理学的状態の重症度に対応する。故に、異なるＣＲＥＡＰレベルは、異常なＣＲＥ−依存性遺伝子発現または臨床またはケモカインの異常な活性化に関連する病理学的状態の種々の臨床形または重症度の指標であり得る。このような情報は、ＣＲＥＡＰモジュレーターでの処置に応答するかもしれないまたは応答しないかもしれない病理学的状態を有する患者の下位集団を同定するのにも有用であろう。
【０１０８】
ここでは、ＣＲＥＡＰレベルまたは活性のモニタリングおよび／またはＣＲＥＡＰ発現(ｍＲＮＡレベル)の検出が、臨床試験法の一部として、例えば、ある処置レジメンの効果を決定するために使用し得ることも考えられる。例えば、薬剤を投与している患者を評価し、医師は、どの患者のＣＲＥＡＰレベル、活性および／または発現レベルが望ましいものより高いかを同定することが可能である(すなわち、関連する疾患状態を経験していないコントロール患者における、または、臨床的介入により疾患状態が十分に軽減した患者におけるレベルより高いかまたは低い)。これらのデータに基づき、医師は、その後、投与量、投与レジメンまたは処方薬の種類を調節できるであろう。
【０１０９】
患者に対する治療を最適化するために考察する因子は、処置する特定の状態、処置する特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定の種類、投与の方法、投与のスケジュール、および、医療従事者に既知の他の因子を含む。投与すべき活性化合物の治療的有効量は、このような考察により決定され、所定の病理学的状態の処置に必要な最小量である。
【０１１０】
ＣＲＥＡＰ遺伝子ファミリーが、高い保存性の重要な領域を含むため、ＣＲＥＡＰタンパク質のペプチド模倣物は、ＣＲＥＡＰモジュレーターとして作用することも予測される。故に、本発明の一つの態様は、ＣＲＥＡＰファミリータンパク質に由来するまたはそれから設計した、ＣＲＥＡＰ機能を遮断するペプチドである。これらの模倣物は、非常に関連するＣＲＥＡＰタンパク質のすべての機能を遮断できることが予測される。ＣＲＥＡＰタンパク質に対する適当なペプチド模倣物は、ＣＲＥＡＰタンパク質活性に必要なポリペプチドの領域の理解に基づき、慣用法にしたがい製造できる。簡単に言うと、短いアミノ酸配列を、野生型タンパク質の欠失または変異分析のような慣用の構造機能試験により、タンパク質中で同定する。重要な領域を同定したら、それらが同タンパク質の非常に保存的な部分に対応しているとき、この領域が重要な機能(例えばタンパク質−タンパク質相互作用)を担うであろうことが予測される。該重要な領域に類似して設計された小合成模倣物は、完全なタンパク質と競合し、したがって、その機能を妨害すると予測される。該合成アミノ酸配列は、完全にまたは一部、この領域とマッチするアミノ酸から構成される。このようなアミノ酸は、元のアミノ酸と似ているが、高い阻害活性、安定性、半減期または生体利用能のような薬理学的に良好な特性を与える化学構造で置換し得る。
【０１１１】
ＣＲＥＡＰタンパク質または関連する調節タンパク質に対する適当な抗体は、商業的供給源から得ることができるか、慣用法にしたがい製造できる。例えば、本明細書に記載されているのは、１個またはそれ以上の発現が異なる遺伝子エピトープを特異的に認識できる抗体の製造法である。このような抗体は、上記のすべてのポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生したフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Ｉｄ)抗体、およびエピトープ−結合性フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
本明細書に記載のＣＲＥＡＰポリペプチドに対する抗体を産生するために、種々の宿主動物を、ポリペプチド、またはその一部の注射により免疫し得る。このような宿主動物は、ウサギ、マウス、およびラットを含むが、これらに限定されない。種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を増強し得、宿主のタイプに依存して、フロインド(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用な可能性のあるヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメット・ゲラン菌)およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)を含むがこれらに限定されない。
【０１１３】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物のような抗原、または、その抗原機能性誘導体で免疫した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の製造のために、上記のような宿主動物を、コードされたタンパク質、またはその一部を、同様にまた上記のアジュバントを補って注射することにより免疫できる。
【０１１４】
特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)は、培養における連続細胞系による抗体分子の賛成のために提供された方法のいずれかにより得ることができる。これらは、Kohler and Milstein, Nature, Vol. 256, pp. 495-497(1975)；および米国特許４,３７６,１１０のハイブリドーマ法、Kosbor et al., Immunol. Today, Vol. 4, p. 72(1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 2026-2030(1983)のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985)を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む免疫グロブリンのいずれかおよびそれらのいずれかのサブクラスであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養し得る。製造法で現在好ましいのは、インビボでの最高力価のｍＡｂの産生である。
【０１１５】
加えて、適当な抗原特異性の分子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子を、マウス抗体由来の遺伝子とスプライシングすることにより、“キメラ抗体”を産生するために開発された方法(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, pp. 6851-6855(1984); Neuberger et al., Nature, Vol. 312, pp. 604-608(1984); およびTakeda et al., Nature, Vol. 314, pp. 452-454(1985)参照)を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物に由来する分子、例えば、マウスｍＡｂ由来の可変または超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである。
【０１１６】
あるいは、一本鎖抗体の製造について記載された方法(米国特許４,９４６,７７８；Bird, Science, Vol. 242, pp. 423-426(1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, pp. 5879-5883(1988); およびWard et al., Nature, Vol. 334, pp. 544-546(1989))を、異なって発現される遺伝子一本鎖抗体の産生に適合できる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重−および軽−鎖フラグメントを、アミノ酸架橋を介して形成し、一本鎖ポリペプチドを得る。
【０１１７】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の製造に有用な方法を、タンパク質、フラグメントまたはその誘導体に対する抗体の製造に適合できる。このような方法は米国特許５,９３２,４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５，９１０，７７１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５，５４５，５８０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に記載されており、これらすべての記載を引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０１１８】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法により産生できる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により製造できるＦ(ａｂ')２フラグメント、および、Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド結合の還元により製造できるＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性のモノクローナルＦａｂフラグメントの急速で容易な同定を可能にするために、構築できる(Huse et al., Science, Vol. 246, pp. 1275-1281(1989))。
【０１１９】
本明細書に記載の抗体の検出は、標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、およびインビトロまたはインビボで使用される標準造影技術を使用して、達成し得る。検出は、抗体を検出可能な物質に結合(すなわち、物理的架橋)することにより容易にできる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、配合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、(３−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な配合団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシル・クロライドまたはフィコエリスリンを含み；蛍光物質の例はルミノールを含み；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリンを含み、適当な放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【０１２０】
検出の容易さのために特に好ましいのは、サンドイッチアッセイであり、それには多くの変法が存在し、そのすべてを本発明に包含することを意図する。例えば、典型的前向きアッセイにおいて、非標識抗体を固体支持体上に固定し、試験する物質を該結合分子と接触させる。抗原−抗体バイナリー複合体の形成を可能にするのに十分な時間である適当な期間、インキュベーションした後、検出可能なシグナルを誘導できるレポーター分子で標識した二次抗体を添加し、抗体−抗原−標識抗体の３重複合体の形成を十分に可能にする。すべての未反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により決定するか、または、既知の量の抗原を含むコントロールサンプルと比較することにより定量してよい。前向きアッセイの変法は、サンプルと抗体の両方を結合抗体に同時に添加する同時アッセイ、または、標識抗体と試験するサンプルを最初に合わせ、インキュベートし、非標識表面結合抗体を添加する、リバースアッセイを含む。これらの方法は当分野で既知であり、微細な変化の可能性は容易に明らかである。本明細書で使用する“サンドイッチアッセイ”は、基本的な２部位法のすべての変法を包含することを意図する。本発明のイムノアッセイに関して、唯一の制限因子は、標識抗体がＣＲＥＡＰポリペプチドまたは関連調節タンパク質、またはそのフラグメントに特異的な抗体でなければならないことである。
【０１２１】
このタイプのアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分は、酵素、フルオロフォア−または放射性核種−含有分子のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合、酵素を、通常、グルタールアルデヒドまたは過ヨウ素酸の手段により二次抗体に結合する。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に既知の広範囲の異なるライゲーション法が存在する。一般的に使用される酵素は、とりわけホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。特異的酵素と共に使用すべき基質は、一般に、対応する酵素での加水分解による、検出可能な色の変化の産生のために選択する。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリホスファターゼコンジュゲートとの使用に適しており；ペルオキシダーゼコンジュゲートに関して、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンを一般に使用する。上記のような発色性基質よりむしろ蛍光産物を産生する、蛍光発生基質を用いることも可能である。適当な基質を含む溶液を次いで３重複合体に添加する。基質は二次抗体に結合した酵素と反応し、定質的可視シグナルを発生し、それをさらに、通常、分光光度法により定量し、血清サンプル中に存在する目的のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量を評価できる。
【０１２２】
あるいは、蛍光化合物、例えば、フルオレッセインおよびローダミンを、その結合能を変えることなく、抗体と化学的に結合させ得る。特定波長の光の照射により活性化したとき、蛍光色素−標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の興奮状態を誘導し、続いて、特徴的な長い波長の光を放出する。放出は光学顕微鏡で可視的に検出可能な特徴的な色として発現する。免疫蛍光法およびＥＩＡ法の両方とも当分野で十分に確立されており、本方法のために特に好ましい。しかしながら、他のレポーター分子、例えば放射性同位体、化学発光または生物発光分子も用いてよい。当業者には、要求される使用に適合させるためにどのように方法を変更すべきか明白であろう。
【０１２３】
別の態様において、ＣＲＥＡＰタンパク質またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を、治療目的で、遺伝子治療の方法で投与する。遺伝子治療は、対象への核酸の投与により行われる治療を意味する。本発明のこの態様において、核酸は、正常なＣＲＥ−依存性遺伝子発現またはケモカインの正常な活性化を促進することにより、治療的効果を媒介する、それがコードするタンパク質を産生する。
【０１２４】
当分野で利用可能なすべての遺伝子治療を本発明にしたがい使用できる。方法の例を以下に記載する。
【０１２５】
好ましい局面において、該治療は、適当な宿主においてＣＲＥＡＰタンパク質またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部である、ＣＲＥＡＰ核酸を含む。特に、このような核酸は、ＣＲＥＡＰコード領域に操作可能に結合したプロモーターを有し、該プロモーターは誘導性または構造的であり、所望により、組織特異的である。他の特定の態様において、ＣＲＥＡＰコード配列および任意の他の望む配列がゲノム中の所望の部位での相同的組み換えを促進する領域の横に位置し、故に、ＣＲＥＡＰ核酸の染色体内発現を提供するものである、核酸分子を使用する(KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
【０１２６】
核酸の患者への送達は、患者が直接拡散または核酸運搬ベクターに暴露されるものである直接的、または、細胞を最初に核酸でインビトロで形質転換し、次いで、患者に移植するものである間接的であり得る。これらの２つの方法は、各々、インビボまたはエキソビボ遺伝子治療として既知である。
【０１２７】
特定の態様において、核酸を直接インビボに投与し、その場所でそのコードした産物を産生するために発現される。これは、当分野で既知の多くの方法のいずれか、例えば、それを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを細胞内となるように、例えば、欠損または弱毒レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用した感染により細胞内とさせることにより(例えば、米国特許４,９８０,２８６および上記のその他の文献参照)、または裸のＤＮＡの直接注入により、または微粒子衝突の使用により(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)、または脂質または細胞表面レセプターまたはレセプターまたはトランスフェクション試薬(transfecting agent)でのコーティング、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルへの封入により、またはそれを核に配列ことが既知のペプチドとの結合に付すことにより、それをレセプター介在エンドサイトーシスに付されるリガンドとの結合に付すことにより(例えば、米国特許５,１６６,３２０；５,７２８,３９９；５,８７４,２９７；および６,０３０,９５４、これらすべてを引用によりその全体を本明細書に包含させる)(レセプターを特異的に発現する標的細胞型に対して使用できる)などにより達成できる。別の態様において、核酸−リガンド複合体を形成し、その中で、リガンドは融合性ウイルスペプチドを含み、エンドソームを破壊し、核酸がリソソーム分解を避けることを可能にする。さらに別の態様において、特定のレセプターを標的とすることにより、核酸を、細胞特異的取り込みおよび発現に対するインビボの標的とできる(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８；およびＷＯ９３／２０２２１参照)。あるいは、核酸を細胞内に挿入し、相同的組み換えにより宿主細胞ＤＮＡ中に組み込む(例えば、米国特許５,４１３,９２３；５,４１６,２６０；および５,５７４,２０５；およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438参照)。
【０１２８】
特定の態様において、ＣＲＥＡＰ核酸を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる(例えば、米国特許５,２１９,７４０；５,６０４,０９０；および５,８３４,１８２参照)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要ではないレトロウイルス配列を欠失するように修飾されている。遺伝子治療に使用すべきＣＲＥＡＰ核酸を、遺伝子の患者への送達を容易にするベクター内にクローン化する。
【０１２９】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用できる別のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達するために特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは本質的に呼吸器上皮に感染し、そこで緩和な疾患の原因となる。アデノウイルス−ベースの送達系の他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分割細胞に感染できる利点を有する。アデノウイルス−ベースの遺伝子治療を行う方法は、例えば、米国特許５,８２４,５４４；５,８６８,０４０；５,８７１,７２２；５,８８０,１０２；５,８８２,８７７；５,８８５,８０８；５,９３２,２１０；５,９８１,２２５；５,９９４,１０６；５,９９４,１３２；５,９９４,１３４；６,００１,５５７；および６,０３３,８８４３に記載され、そのすべてを引用によりその全体を本明細書に包含する。
【０１３０】
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)はまた、遺伝子治療への使用が提案されている。ＡＡＶを産生および利用する方法は、例えば、米国特許５,１７３,４１４；５,２５２,４７９；５,５５２,３１１；５,６５８,７８５；５,７６３,４１６；５,７７３,２８９；５,８４３,７４２；５,８６９,０４０；５,９４２,４９６；および５,９４８,６７５に記載され、そのすべてを引用によりその全体を本明細書に包含する。
【０１３１】
遺伝子治療への他の試みは、遺伝子を、組織培養中の細胞に、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により移入することを含む。通常、移入の方法は、細胞への選択可能マーカーの伝達を含む。次いで、細胞を細胞選択し、移入された遺伝子を取り込み、発現する細胞を単離する。これらの細胞を次いで患者に送達する。
【０１３２】
この態様において、核酸を投与前に細胞内に挿入し、その後、得られた組み換え細胞を投与する。このような挿入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列含有ウイルスまたはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体−介在遺伝子移入、微小核体−介在遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含むが、これらに限定されない、当分野で既知の任意の方法により行うことができる。外来遺伝子を細胞内に挿入するための多くの方法が当分野で既知であり、レシピエント細胞の必要な発育および生理学的機能が妨害されない限り、本発明において使用できる。該技術は、核酸の細胞内への安定な移入を提供し、核酸が細胞により発現され、好ましくは、その細胞子孫に遺伝性でかつ発現可能である。
【０１３３】
得られた組み換え細胞を、患者に当分野で既知の種々の方法により送達できる。好ましい態様において、上皮細胞を、例えば、皮下的に注射する。別の態様において、組み換え皮膚細胞を、皮膚移植片として患者に適用する。組み換え血液細胞(例えば、造血幹または前駆細胞)を、好ましくは静脈内投与する。使用が意図される細胞量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者が決定できる。
【０１３４】
核酸を遺伝子治療の目的で挿入できる細胞は、すべての所望の、利用可能な細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；種々の幹または前駆細胞特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血液、胎児肝臓などから得られる造血幹または前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
好ましい態様において、遺伝子治療に使用する細胞は、患者に対して自己である。
【０１３６】
組み換え細胞を遺伝子治療に使用する態様において、ＣＲＥＡＰ核酸を、それが細胞またはその始祖により発現されるように細胞に挿入し、組み換え細胞を次いでインビボで治療効果のために投与する。特定の態様において、幹または前駆細胞を使用する。インビトロで単離および維持できるすべての幹−および／または前駆細胞を、本発明のこの態様において使用できる可能性がある。このような幹細胞は、造血幹細胞(ＨＳＣ)、皮膚および腸の内膜のような上皮組織の幹細胞、胎児心臓筋肉細胞、肝臓幹細胞(例えば、ＷＯ９４／０８５９８)、および神経系幹細胞(Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985)を含むが、これらに限定されない。
【０１３７】
上皮幹細胞(ＥＳＣ)またはケラチン生成細胞を、皮膚および腸の内膜のような組織から、既知の方法により得ることができる(Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229)。皮膚のような層状の上皮組織において、基底膜に最も近い層である胚層内の幹細胞の有糸分裂により再生が起こる。腸の内膜内の幹細胞は、この組織の速い再生速度のために提供される。患者またはドナーの皮膚または腸の内膜から得たＥＳＣまたはケラチン生成細胞を、組織培養により増殖できる(Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771)。ＥＳＣがドナーにより提供されたとき、宿主対移植片の再活性を抑制するための方法(例えば、適度な免疫抑制を促進するための照射、薬剤または抗体投与)も使用できる。
【０１３８】
造血幹細胞(ＨＳＣ)に関して、ＨＳＣのインビトロでの単離、繁殖、および維持を提供するすべての方法を、本発明のこの態様において使用できる。これが達成できる方法は、(ａ)将来の宿主、またはドナーからの骨髄細胞単離からの単離およびＨＳＣ培養の確立、または(ｂ)同種または異種であってよい、予め確立した長期ＨＳＣ培養の使用を含む。非自己ＨＳＣを、好ましくは将来の宿主／患者の移植免疫応答を抑制する方法と組み合わせて使用する。本発明の特定の態様において、ヒト骨髄細胞を、針吸引により、後部腸骨稜から得ることができる(例えば、Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384参照)。本発明の好ましい態様において、ＨＳＣを非常に豊富にするか、または、実質的に純粋な形にできる。この富化は、長期培養の前、途中、または後に達成でき、当分野で既知の任意の技術により行うことができる。骨髄細胞の長期培養は、例えば、改変Dexter細胞培養法(Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335)またはWitlock-Witte培養法(Witlock and Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612)を使用して確立および維持できる。
【０１３９】
特定の態様において、遺伝子治療の目的で挿入すべき核酸は、核酸の発現が転写の適当なインデューサーの存在または非存在の制御により制御可能なように、コード領域に操作可能に結合した誘導性プロモーターを含む。
【０１４０】
本発明はまた診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。特に、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化が関連する病理学的状態を診断する方法であり：
ヒトの適当な組織または細胞において異常な、例えば、ヒトにおける適当な組織または細胞において配列番号２、１６、２５に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする正常の内因性ヒト遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの上昇した転写を検出し、ここで該異常な転写が、上記の状態を有するヒトの診断に用いられることを含む。特に、該正常な内因性ヒト遺伝子は、配列番号１、１５、２４に記載のヌクレオチド配列を含む方法に関する。好ましい態様においてこのような方法は、配列番号２、１６、２５に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも約２０ヌクレオチド長の単離ヌクレオチド配列を、該適当な組織または細胞のサンプルと接触させるか、または、その組織または細胞由来の単離ＲＮＡまたはＤＮＡ分子と接触させる。上昇した転写は、同対象が１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰモジュレーターでの処置の候補である指標である。
【０１４１】
機能不全と関連するＣＲＥＡＰタンパク質の変異形の検出は、ＣＲＥＡＰ遺伝子の低い発現、過剰発現または空間的もしくは時間的に変えられた発現に由来する疾患、または疾患の感受性の診断に加えることができる、または、それを規定する診断ツールを提供する。遺伝子に変異を有する個体を、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出し得る。
【０１４２】
診断のための核酸、特にｍＲＮＡは、対象の細胞から、例えば血液、尿、唾液、組織生検材料または剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してよく、またはＰＣＲまたは他の増幅法を使用して、分析前に酵素的に増幅してよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様の形式で使用できる。欠失および挿入を、正常遺伝子型との比較に置いて、増幅産物のサイズの変化により検出できる。増幅したＤＮＡの、本発明のＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする標識ヌクレオチド配列へのハイブリダイズは、点変異を動的できる。完全にマッチした配列を、ＲＮａｓｅ消化により、または融点の差異によりミスマッチの二本鎖と区別できる。ＤＮＡ配列差異はまた、変性剤を用いたまたは用いないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定により検出できる(例えば、Myers et al., Science (1985)230:1242)。特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学開裂法によりまた確認できる(Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985)85:4397-4401参照)。別の態様において、本発明のＣＲＥＡＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはこのようなヌクレオチド配列のフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築し、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行うことができる。アレイ法は既知であり、一般的な適用を有し、遺伝子発現、遺伝子の連鎖、および遺伝子可変性を含む、分子遺伝学における種々の問題の処理に使用できる(例えば：M. Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)参照)。
【０１４３】
診断アッセイは、記載の方法によるＣＲＥＡＰ遺伝子中の変異の検出を介して、疾患に対する感受性を診断または決定する方法を提供する。加えて、このような疾患は対象由来のサンプルから、異常に減少したまたは増加したポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルを決定することを含む方法により診断し得る。減少したまたは増加した発現は、ＲＮＡレベルで、例えば、核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン・ブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法のような、ポリヌクレオチドの定量に関して当業者に既知の方法のいずれかを使用して測定できる。宿主由来のサンプル中のタンパク質、例えば本発明のポリペプチドのレベルを決定するために使用できるアッセイ法は、当業者に既知である。このようなアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的−結合アッセイ、ウェスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【０１４４】
故に、他の局面において、本発明は：
(ａ)本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１、１５または２４のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント；
(ｂ)(ａ)に相補的なヌクレオチド配列；
(ｃ)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２、１６、２５のポリペプチドまたはそのフラグメント；
(ｄ)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２、１６、２５のポリペプチドに対する抗体；または
(ｅ)ＣＲＥＡＰタンパク質、好ましくは配列番号２、１６または２５のものに対するペプチド模倣物
を含む、診断キットに関する。
【０１４５】
このようなキットのすべてに置いて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)または(ｅ)は実質的構成要素を構成し得ることは認められよう。このようなキットは疾患または疾患に対する感受性、特にＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連する疾患もしくは病理学的状態の診断に使用する。該キットが、本明細書に記載のようなＣＲＥＡＰ関連調節タンパク質またはＣＲＥＡＰにより修飾されたタンパク質のレベルを検出するために設計された(ａ)−(ｅ)を含むことも考えられる。
【０１４６】
本発明のヌクレオチド配列は、染色体局在性のためにも価値がある。本配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的標的とし、ハイブリダイズできる。本発明にしたがった染色体に対する関連配列の地図作成は、これらの配列と遺伝子関連疾患を相関させる重要な最初の段階である。配列が厳密な染色体上の位置に配置できたら、染色体上の同配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関できる。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能)に見られる。同じ染色体領域上に位置されている遺伝子と疾患の相関関係を、連鎖解析を通して同定する(物理的に隣接した遺伝子の共同相続)。
【０１４７】
ｃＤＮＡまたはゲノム配列における、罹患したおよび罹患してない個体との間の差異も決定できる。変異が罹患した個体の幾分かまたはすべてで観察されるが、すべての正常個体では観察されないとき、その変異はこの疾患の原因因子でありそうである。
【０１４８】
本発明の医薬組成物はまたＣＲＥＡＰタンパク質の発現を核酸レベルで阻害する物質も含み得る。このような分子は、ＣＲＥＡＰ核酸の適当なヌクレオチド配列を指向する、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、および二本鎖または一本鎖ＲＮＡである。これらの阻害性分子は、過度の負担または実験なしに当業者が通常の技術を使用して創成できる。例えば、遺伝子発現の修飾(例えば阻害)は、本明細書に記載のＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、すなわちプロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより得ることができる。例えば、転写開始部位、例えば、出発部位から−１０から＋１０の間の位置に由来するオリゴヌクレオチドを使用し得る。それにもかかわらず、遺伝子の全領域を、ｍＲＮＡに対する最強のハイブリダイゼーションをするものを創成するために、アンチセンス分子の設計に使用してよく、このような適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、製造し、当業者に既知の標準アッセイ法により同定できる。
【０１４９】
同様に、遺伝子発現の発現の阻害は“三重らせん”塩基対形成法を使用して達成し得る。三重らせん対形成は、それがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に開けるために二重らせんの能力の阻害をもたらすために、有用である。三重らせんＤＮＡを使用した近年の治療的利点は文献に記載されている(Gee, J.E. et al. (1994)In:Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.)。これらの分子はまたリボソームに転写物が結合することを防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計し得る。
【０１５０】
酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムをまた使用して、ＲＮＡの特定の開裂を触媒することにより、遺伝子発現を阻害し得る。リボザイムの作用の機構は、リボザイム分子の粗補的標的ＲＮＡへの配列−特異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレアーゼ的(endonucleolytic)開裂が関与する。使用できるものの例は、遺伝子配列、例えば、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３の遺伝子のエンドヌクレアーゼ的(endonucleolytic)開裂を特異的にかつ効率よく職場得するために設計できる、操作した“ハンマーヘッド”または“ヘアピン”モチーフリボザイム分子である。
【０１５１】
任意の可能性のあるＲＮＡ標的内の特定のリボザイム開裂部位を、最初にリボザイム開裂部位に対する標的分子を走査することにより同定し、それは下記配列を含む：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ。同定したら、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５から２０リボヌクレオチドの間の短ＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの走査不能性に関与し得る二次構造特性について評価し得る。候補標的の適性はまたリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接近可能性の試験により評価し得る。
【０１５２】
リボザイム法は、細胞をリボザイムに暴露するか、このような小ＲＮＡリボザイム分子の細胞中の発現の誘導を含む(Grassi and Marini, 1996, Annals of Medicine 28:499-510;Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15:287-299)。本明細書に記載の遺伝子の少なくとも１個に対応するｍＲＮＡを標的としたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現は、該遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害に利用できる。
【０１５３】
リボザイムは、細胞にリボザイム配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドの形で直接送達するか、または細胞に望むリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして挿入することができる。リボザイムは、ｍＲＮＡを開裂するのに触媒的に有効な十分な量でインビボで慣用的に発現でき、それにより細胞中のｍＲＮＡの富化を修飾する(Cotten et al., 1989 EMBO J. 8:3861-3866)。特に、慣用の、既知の規則にしたがい設計され、例えば、標準ホスホラミダイト化学により合成された、リボザイムをコードするＤＮＡ配列を、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドン幹およびループにおける制限酵素部位にライゲートでき、それを次いで当分野で慣用の方法により目的の細胞内に形質転換し、発現できる。好ましくは、誘導性プロモーター(例えば、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン反応エレメント)もこの構築物に挿入し、リボザイム発現を選択的に制御できるようにする。飽和使用のために、高度にかつ構造的に活性のプロモーターを使用できる。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子)が、その小さいサイズ、高い割合の転写および異なる種類の組織中の遍在的発現のために、この適用で有用である。
【０１５４】
したがって、リボザイムを、実質的にすべてのｍＲＮＡ配列を開裂するために慣用的に設計でき、細胞を、制御可能かつ触媒的に有効量のリボザイムが発現されるように、このようなリボザイムをコードするＤＮＡで慣用的に形質転換できる。したがって、細胞中の事実上すべてのＲＮＡ種の富化を修飾または混乱させ得る。
【０１５５】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドに関して記載したのと実質的に同じ方法で修飾でき、例えば、リボザイム配列は、修飾塩基部分を含み得る。
【０１５６】
ＲＮＡアプタマーも細胞中に挿入でき、または発現でき、ＲＮＡ富化または活性を修飾する。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質、例えばＴａｔおよびＲｅｖ  ＲＮＡ(Good et al., 1997, Gene Therapy 4: 45-54)に対する、その翻訳を特異的に阻害できる、特異的ＲＮＡリガンドである。
【０１５７】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた慣用の二本鎖ＲＮＡ技術を使用して達成し得る。このような技術の記載は、引用によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ９９／３２６１９に見ることができる。加えて、ｓｉＲＮＡ技術が、遺伝子発現を阻害するための手段として有用であることが証明されている(Cullen, BR Nat. Immunol. 2002 Jul; 3(7): 597-9)。
【０１５８】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分野で既知の任意の方法により製造し得る。これらは、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術を含む。あるいは、ＲＮＡ分子を、本明細書に記載のポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により産生し得る。このようなＤＮＡ配列は、広範囲の種々のベクターに、適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６と共に挿入してよい。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構造的にまたは誘導性に合成するｃＤＮＡ構築物を細胞系、細胞、または組織に挿入できる。
【０１５９】
ＣＲＥＡＰ発現の阻害に関する上記の方法に加えて、ここで、本明細書に記載のポリペプチドのインビボでの転写を阻害するための、小分子または他の天然産物の同定および使用が可能であることが考えられる。例えば、慣用法を使用した、細胞系の培養培地由来のサンプルに容易に適用できるＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３のためのアッセイを、当業者は確立できる。このアッセイを使用して、細胞系をスクリーニングして、目的のＣＲＥＡＰタンパク質を発現するものを発見する。これらの細胞系を、例えば、９６ウェルプレートで培養できる。遺伝子発現のある既知の修飾剤のいくつか、例えばデキサメタゾン、ホルボールエステル、一次組織培養上の熱ショックおよび細胞系の効果の比較は、使用するための適当な細胞系の選択を可能にする。次いで、スクリーニングは、単に各ウェルに添加した異なる化合物の設定された時間の培養および続くＣＲＥＡＰ活性／ｍＲＮＡレベルのアッセイのみを含む。
【０１６０】
上記のアッセイにおけるＣＲＥＡＰの検出を容易にするために、ルシフェラーゼまたは他の市販の蛍光タンパク質を、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３のプロモーターに対する適当なマーカータンパク質として遺伝的に融合する。例えばＣＲＥＡＰ１のプロモーターの、ＡＴＧの上流の配列を、ゲノム配列データから、ＮＣＢＩゲノム配列に対するＢＬＡＳＴのためのGenBank受託番号ＮＭ＿０２５０２１を使用して、同定できる。(現在、ＣＲＥＡＰ１のゲノム隣接配列に関するGenBank受託番号はＮＴ＿０１１２９５である。)これは、既知の塩基対のいずれも含まないＣＲＥＡＰ１のＡＴＧの少なくとも５kb上流を与える。ヒトゲノムＤＮＡからの２kbまたはそれより長いフラグメントを増幅するためのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマーの２つの対を容易に設計および試験できる。プロモーターフラグメントを、容易に、ヒト細胞で発現するように設計したプロモーター−レスのレポーター遺伝子ベクター(例えばClontechプロモーター−レスの増強された蛍光タンパク質ベクターｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−１、またはｐＥＹＦＰ、Clontech, Palo Alto, CA)に容易に挿入できる。次に、スクリーニングは、各ウェルに添加した異なる化合物で適当な長さの時間細胞を培養し、次いで、レポーター遺伝子活性をアッセイすることを含む。次いで、有望な化合物をインビボで、ＣＲＥＡＰ１活性および／またはｍＲＮＡレベル対する効果に関して、先に記載の病理学的状態インビボモデルを使用して、評価できる。培養時間、培養条件、レポーターアッセイおよびインビボでＣＲＥＡＰタンパク質の転写を阻害するのに有用な適当な小分子または他の天然産物の同定に使用できる他の方法のようなさらなる詳細は、当業者に既知である。
【０１６１】
加えて、ＣＲＥＡＰタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび／またはＣＲＥＡＰタンパク質それ自体、ＣＲＥＡＰタンパク質により段階的に修飾されるかまたは間接的に活性化される、他のタンパク質、例えばキナーゼ、プロテアーゼまたは転写因子の同定に使用できる。このように同定したタンパク質を、例えば、本明細書に記載の病理学的状態を処置するための薬剤スクリーニングに使用し得る。ＣＲＥＡＰタンパク質の下流であるこれらの遺伝子を同定するために、例えば、疾患状態モデルの動物を特定のＣＲＥＡＰインヒビターで処置し、動物を殺し、関連する組織を摘出し、これらの細胞から全ＲＮＡを単離し、標準マイクロアレイアッセイ法を使用し、コントロール動物(薬剤を投与していない動物)と比較して変化したメッセージレベルを同定する、慣用法を使用することが考えられる。
【０１６２】
加えて、慣用のインビトロまたはインビボアッセイを使用して、ＣＲＥＡＰタンパク質の過剰発現をもたらす可能性のある遺伝子を同定し得る。このように同定された遺伝子によりコードされるこれらの関連する調節タンパク質を使用して、本明細書に記載の病理学的状態の処置の強力な治療剤であるはずである薬剤をスクリーニングできる。例えば、ＣＲＥＡＰタンパク質のプロモーター領域がレポーター遺伝子の上流に配置され、その構築物が適当な細胞(例えばATCC, Manassas, VAからのもの)にトランスフェクトされ、そして慣用法を使用して、該細胞をレポーター遺伝子の発現の検出によりＣＲＥＡＰプロモーターの活性化をもたらす上流遺伝子に関してアッセイするものである、慣用のレポーター遺伝子アッセイを使用できる。
【０１６３】
本明細書では、関連する調節タンパク質またはＣＲＥＡＰタンパク質により修飾されるタンパク質の機能および／または遺伝子の発現を、本明細書に記載の病理学的状態を処置する方法で、例えば、これらのタンパク質に対する抗体またはペプチド模倣物の設計および／またはこのようなタンパク質の遺伝子を標的とする阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、二本鎖または一本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーの慣用法に従った設計により、阻害できることも考える。該病理学的状態の処置のためのこのような阻害性物質を含む医薬組成物も意図する。
【０１６４】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の病理学的状態のいずれかを処置するための、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせた、医薬組成物の投与に関する。このような医薬組成物は、ＣＲＥＡＰタンパク質、またはそのフラグメント、ＣＲＥＡＰポリペプチドまたはペプチドフラグメントに対する抗体、模倣物、および／またはＣＲＥＡＰモジュレーター(例えばＣＲＥＡＰ発現および／または機能のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビター)を含み得る。本組成物は単独で、または少なくとも１個の他の薬剤、例えば安定化化合物と組み合わせて投与してよく、これは塩水、緩衝化塩水、デキストロース、および水を含むがこれらに限定されない任意の滅菌、生体適合性薬理学的担体の中で投与してよい。本組成物は患者に単独で、または他の薬物、薬剤またはホルモンと組み合わせて投与してよい。
【０１６５】
ＣＲＥＡＰタンパク質またはそのフラグメントを含む医薬組成物は、当業者により医学的利点が考慮されるとき、例えばＣＲＥＡＰ機能のアゴニストが治療的効果を有する、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性疾患のとき、投与してよい。本発明によって使用するためのこのような医薬組成物は、１個またはそれ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して慣用法で製剤し得る。
【０１６６】
異常なＣＲＥ−依存性遺伝子発現またはケモカインの異常な活性化に関連する病理学的状態の予防、処置または改善に有用な本明細書に記載の医薬組成物は、患者に治療的有効量で投与する。治療的有効量は、該状態の予防、処置または改善をもたらすのに十分な同化合物の量を意味する。
【０１６７】
化合物およびそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入(inhalation)または吹き入れ(insufflation)(口または鼻のいずれかを通して)または局所、経口、バッカル、非経腸または直腸投与により投与するために製剤し得る。
【０１６８】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、ゲル状(pregelatinized)メイズデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)；滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコラート)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に許容される賦形剤と慣用の手段で製造した錠剤またはカプセルの形を取り得る。本錠剤は、当分野で既知の方法によりコーティングしてよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形を取り得、またはそれらは水または他の適当な溶媒で使用前に再構成するための乾燥産物として存在してよい。このような液体製剤は、慣用法で、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画した植物油)；および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)のような薬学的に許容される添加剤と製造し得る。該製剤はまた適当であれば緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含んでよい。
【０１６９】
経口投与用製剤は、活性化合物の制御された放出を提供するために適当に製剤し得る。
【０１７０】
バッカル投与のために、本組成物は、慣用法で製剤された錠剤またはロゼンジの形を取り得る。
【０１７１】
吸入での投与のために、本発明にしたがい使用する化合物は、簡便には、加圧パックまたはネブライザーから、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスの使用により出される、エアロゾルスプレーの形で送達する。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、決定された量を放出するためのバルブを提供することにより決定し得る。吸入器または吹き入れ器で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物と、ラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含んで、製剤し得る。
【０１７２】
本化合物は注射、例えば、ボーラス注射または連続輸液による非経腸投与用に製剤し得る。注射用製剤は、単位投与形として、例えば、アンプル中または複数回容器中に、添加された防腐剤を伴い、存在し得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形を取り得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤助剤(formulatory agent)を含み得る。あるいは、活性成分は、適当な媒体、例えば、滅菌無発熱原水で使用前に再構成するための粉末形であってよい。
【０１７３】
本化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような慣用の坐薬基剤を含む、坐薬または留置エネマ(retention enemas)のような直腸製剤に製剤し得る。
【０１７４】
先に記載の製剤に加えて、本化合物はまたデポ製剤にも製剤し得る。このような長期に作用する製剤は、インプラント(例えば皮下または筋肉内)により、または、筋肉内注射により投与し得る。このように、例えば、化合物は、適当な重合性または疎水性物質(例えば許容される油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂と、または、やや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として製剤し得る。
【０１７５】
組成物は、望ましいとき、活性成分を含む１回またはそれ以上の投与形を含み得る、パックまたはディスペンサー装置中に存在し得る。パックは、例えば、ブリスターパックのような、金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与指示書を伴い得る。
【０１７６】
本発明における使用に適した医薬組成物は、活性成分が、意図する目的を達成するための十分量で包含させる、組成物を含む。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１７７】
すべての化合物に関して、治療的有効量を、最初に、例えば、新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、または、動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいて概算できる。動物モデルはまた適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用し得る。投与量は、動物モデルで、ＩＣ５０(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように製剤し得る。このような情報を、次いで、ヒトにおける有用な投与量および投与経路を決定するために使用できる。
【０１７８】
治療的有効量は、目的の病理学的状態の予防、処置または改善に有用な活性成分の量を意味する。治療効果および毒性は、細胞培養または他の実験動物における標準的な薬学的方法により決定してよく、例えば、ＥＤ５０(集団の５０％に治療的有効な量)およびＬＤ５０(集団の５０％に致死的な量)である。毒性と治療効果の間の量の比率が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として示すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトでの使用のための投与量の範囲の計算に使用する。このような組成物中に含まれる投与量は、好ましくは、わずかの毒性または無毒性でＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、この範囲内で、用いる投与形、患者の感受性および投与経路に依存して変化する。
【０１７９】
正確な投与量は、実施者により、処置を必要とする対象に関連する因子を鑑みて決定される。投与量および投与は、活性成分の十分なレベルを提供するか、所望の効果を維持するために調節する。考慮すべき因子は、疾患状態の重症度、対象の全般的健康、対象の年齢、体重、性別、食事、投与時間と頻度薬剤組み合わせ、反応感受性、および、治療に対する耐容性／反応を含む。長期作用医薬組成物は、３から４日毎、毎週、または２週間に１回、特定の製剤の半減期および排出速度に依存して投与し得る。
【０１８０】
通常の投与量は、投与経路に依存して、０.１から１００,０００mgの間で変化し、約１ｇまでの合計投与量である。特定の投与量および送達法は、文献に提供され、当業者の実施者に一般に入手可能である。当業者は、タンパク質またはそのインヒビターよりむしろ、ヌクレオチドに関して異なる製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、局所などに特異的である。タンパク質の経口投与に適した医薬組成物は、例えば、米国特許５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１に記載されている。
【０１８１】
下記実施例は本発明をさらに説明し、本発明を制限することを意図しない。
【０１８２】
下記実施例１−５を実施するために、下記の材料および方法を行った：
ヒト完全長ｃＤＮＡクローンのコレクションの集合
我々は、３３個のヒト組織型のｍＲＮＡから製造した、複数高品質完全長ｃＤＮＡライブラリー由来の約１７０,０００クローンを、保管し、５'末端で配列決定している。私有の生物情報経路を使用して、我々は、実験的に定義したかまたは概念的に予測された、ＯＲＦのための最初のＡＴＧコドンを有するｃＤＮＡクローンをすべて同定しており、したがって、おそらく完全長転写産物を示す。ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)内の合計２０,７０２クローンを、アーカイブに保管したクローンのセットから、Ｑ−ｂｏｔ(Genetix Limited, Hampshire, United Kingdom)を使用して、６０μl  Luriaブロス(ＬＢ)を含む３８４ウェルＧｅｎｅｔｉｘプレートに再配置した。これらの２０,７０２クローンの５'配列の生物情報学的分析に基づき、それらは、その構造および存在に関して強いサポートを有するが、そのほとんどが機能を有さない約１１,０００遺伝子由来であり、そして、６,０００の可能性のある新規配列はまだ公的ｃＤＮＡデータベースに存在しない。
【０１８３】
配置したクローンを、アーカイブにするための複数コピーを産生するために複製する。一つのコピーを使用して、ミニプレップＤＮＡを、QIAGEN BioRobot 8000(Qiagen, Valencia, CA)を使用して産生する。同ＤＮＡサンプルを９６−ウェルＵＶ−プレート(Corning, Acton, MA)中に溶出し、その濃度および収量をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  １９０(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で行うＯＤ２６０の測定により決定する。得られた２０,７０２  ＤＮＡサンプルを次いで小分けし、アーカイブ(ＴＥ緩衝液中８０pg／ウェル)および３８４−ウェルプレートでの細胞−ベースのアッセイ(ＯＰＴＩ−ＭＥＭ細胞培養培地(Invitrogen)中５０ng／ウェル)のための複数コピーを産生する。プレートを密封し、−２０℃で貯蔵する。
【０１８４】
サイクリックＡＭＰ応答エレメントのアクティベーターのためのゲノム−幅スクリーニング
２２５ml組織培養フラスコ中増殖させたＨｅｌａ細胞(ATCC, Manassas, VA)をトリプシン処理し、１０５細胞／mlにＤＭＥＭ培地(Invitrogen)中希釈する。本細胞を懸濁し、次いで３８４−ウェル組織培養プレートに、Multi-drop 384(Thermo Labsystems, Beverly, MA)で、３０μl／ウェルで分配する。一晩インキュベーション後、０.２５μl  Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche Applied Biosciences)、５０ngのｐＣＲＥ−Ｌｕｃプラスミド構築物(Stratagene)および５０ngのクローンコレクション由来の個々のｃＤＮＡプラスミドを含む６μlのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を、３８４−ウェルプレートの各ウェルに、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体処理ロボット(Beckman Coulter)を使用して添加する。トランスフェクション４０時間後、各ウェルのルシフェラーゼ活性を、BrightGlo Luciferase Assay System(Promega, Madison, WI)を、LUMINOSKAN Ascent照度計(Thermo Labsystems)上で、製造者のプロトコールにしたがい使用して、測定する。生のルシフェラーゼデータを、ハイスループット遺伝子機能分化プロジェクトを運営するために特別に設計された社内データ処理および分析システムにより処理する。すべてのアッセイを２回行い、４１,４０４のデータ点を作成し、これは各々一つのウェル中のｃＤＮＡクローンでの小型化トランスフェクション実験に対応する。
【０１８５】
ＨＴＳヒット確認および検証
デュプリケートの２０,７０２データ点の各々に関して、Ｚスコア(活性化の倍率を、集団の標準偏差で割ったものとして計算)および集団中央値に対する活性化倍率を計算し、アノテーションした検索可能データベースに挿入する。可能性のあるアクティベーターを、２つの基準：(１)Ｚスコアがいずれかのアッセイで３.０より大きいおよび(２)ルシフェラーゼ／中央値の増加倍率が両方のアッセイで８.０より大きいことに基づき、選択する。合計８５クローン(全クローンの０.４％)を、上記基準に基づき、同定した。これらのヒットのＤＮＡサンプルを、クローンアーカイブから回収し、細菌株XL-10 Gold(Stratagene)に再形質転換する。各サンプルの個々のコロニーを採取し、ＤＮＡミニプレップを行う。ミニプレップＤＮＡサンプルの一部を、クローン検証のために、５'末端から配列決定する。残ったサンプルを、それらをｐＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター構築物ならびにウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼをＳＶ４０初期プロモーターの制御下にコードするｐＲＬ−ＳＶ４０プラスミド(Promega)と共にＨｅｌａ細胞に手動でトランスフェクトし、続いて、製造者の指示にしたがい、デュアル−ルシフェラーゼアッセイ(Promega)を行うものである、ヒット検証に使用する。
【０１８６】
ノーザン・ブロット分析およびインビトロ転写および翻訳分析
ＣＲＥＡＰ１  ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６プラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、挿入物をQiagen  ＤＮＡゲル抽出キットを使用して、ゲル精製し、販売者の指示にしたがってＥｎｚｏランダム・プライムＤＮＡ標識システム(Bio-11-dCTP deoxynucleotide pack, Cat.# 42723, Enzo Biochem, Farmingdale, NY)で標識する。簡単に言うと、２００ng  ＣＲＥＡＰ１フラグメント、または１００ngのβアクチンｃＤＮＡ(Clontech)を、１００℃で１０分変性し、氷上で３−５分冷却し、次いで５μl  １０×ヘキサマーランダム・プライマー、５μl  ｄＣＴＰ−１１−Ｂｉｏ  ｍｉｘおよび１μl  クレノウ・フラグメントと混合し、３７℃で４時間インキュベートする。プローブを、指示されるプロトコールにしたがい、多組織ｍＲＮＡノーザン・ブロット膜(Clontech)とハイブリダイズする。シグナル検出を、ビオチン検出キット(Ambion, Austin, TX)を使用して達成する。膜をＸ線フィルムに１０から３０秒暴露する。最初の暴露後、膜を剥がし(stripped)、ベータアクチンプローブ(Clontech)と再プローブして、発現レベルを標準化する。
【０１８７】
ＣＲＥＡＰ１タンパク質のインビトロ転写および翻訳を、ＴＮＴ  ＳＰ６急速結合転写および翻訳系(Promega)で、販売者のマニュアルにしたがい、行う。翻訳産物を、Ｎｕｐａｇｅプレキャスト・ゲル(４−２０％)(Invitrogen)中で分離し、ニトロセルロース膜に移し、Transcend非放射活性検出系(Promega)により、製造者の指示にしたがい、検出する。
【０１８８】
ＣＲＥＡＰ１−ＣＲＥＢシグナル伝達経路分析
インビボキナーゼアッセイのために、酵母ＧＡＬ４ＤＮＡ結合性ドメイン(１−１４７アミノ酸)構築物と融合した、ＣＲＥＢの活性化ドメインまたはＡＴＦ２転写因子を使用する(Stratagene, PathDetect In Vivo Signal Transduction Pathway trans-reporting Systems)。５×ＧＡＬ４ＤＮＡ結合性エレメントおよびＴＡＴＡボックス駆動ルシフェラーゼレポーターを含むＨＬＲ細胞系を、製造者のプロトコール通りに使用する(Stratagene)。１０４  ＨＬＲ細胞を９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに分ける。１６時間後、細胞を１００ngのＣｒｅｂ−ＧＡＬ４またはＡＴＦ２−ＧＡＬ４融合構築物、３０ngのウミシイタケ・ルシフェラーゼ制御プラスミドを、１００ngのｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ−ＣＲＥＡＰ１、ｐＦＣ−ＰＫＡまたはｐＦＣ−ＭＥＫＫ(Stratagene)アクティベータープラスミドの各々とトランスフェクトする。トランスフェクションをＦｕｇｅｎｅ６試薬(Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland)で、製造者のマニュアルにしたがい、行う。トランスフェクション４０時間後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を、製造者のプロトコールを使用して行う。
【０１８９】
優性ネガティブＣＲＥＢアッセイのために、ＣＲＥＢ優性ネガティブ構築物(リン酸化不可能なＳ１３３Ａ変異またはＤＮＡ結合性ドメインＫ２８７Ｌ変異Ｋ−Ｃｒｅｂ)を使用する(Clontech, Cat.# K6014-1)。上記トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ法は、製造者のものにしたがい、少し改変する。Ｈｅｌａ細胞、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、ｐＣＭＶ−ＣＲＥＡＰ１、ｐＳ１３３Ａ−ＣｒｅｂまたはｐＫ−Ｃｒｅｂ構築物をトランスフェクションに使用する。
【０１９０】
ＣＲＥＡＰ１タンパク質欠失の機能分析
ＣＲＥＡＰ１タンパク質アミノ酸１−１７０、１−３５６、１−４９４、１−５８０および１７０−６５０をｐＦｌａｇ−ＣＭＶ４発現ベクター(Sigma, St. Louis, MO)に、当業者に公知のＰＣＲ法を使用して挿入する。
【０１９１】
１０４  Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに分ける。細胞を、１６時間後に１００ngのｐＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター構築物、３０ngのウミシイタケ・ルシフェラーゼ制御プラスミドで、１００ngのｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ−ＣＲＥＡＰ１および異なるＦｌａｇ−ＣＲＥＡＰ１欠失融合構築物と各々トランスフェクトする。トランスフェクションは、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬(Roche Applied Biosciences)で、製造者の指示にしたがい行う。デュアル−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を、トランスフェクション４０時間後に行う。ホタル・ルシフェラーゼカウントを、ウミシイタケ・ルシフェラーゼに対して標準化し、プロットする。
【０１９２】
実施例１
サイクリックＡＭＰ応答エレメントアクティベーター遺伝子のためのゲノム−幅スクリーニング
ＣＲＥ活性化を導くタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定するために、我々は、最小化ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター系における１１,０００−１６,０００の個々の遺伝子に関する完全長転写産物を示すと予測される２０,７０２ヒトｃＤＮＡクローンのコレクションをアノテーションし、インデックスを付けた。実験を、各々一過性タンパク質過剰発現アッセイ由来のルシフェラーゼ活性に対応する、合計４１,４０４データ点でデュプリケートで行い、ここで、約３,０００のＨｅｌａ細胞は、目的のｃＤＮＡクローンおよびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドで一過性にトランスフェクトされている。２個のデータセットの統計学的分析により、デュプリケートの一次スクリーニング実験の２個の集団中央値と比較してルシフェラーゼ活性が少なくとも８倍増加した８５クローンのリストを作っている。続く二次検証実験において、これらのクローンのための個々のコロニーを回収し、類似であるが、データ標準化のためにＳＶ４０プロモーターの制御下にあるウミシイタケ・ルシフェラーゼででのアッセイに付し、１４クローンを確認した(データは示していない)。得られたヒットは、現在まで機能が未知のタンパク質であり、Kazusa DNA Research InstituteによりＫＩＡＡ０６１６と名付けられたものを含んだ(Accession number:NM_025021)。我々のこのタンパク質の機能分析に基づき、我々はこのタンパク質を、本明細書に記載の一過性過剰発現ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ＣＲＥを活性化できるその能力に基づいて、ＣＲＥ活性化タンパク質１または“ＣＲＥＡＰ１”と改名した。
【０１９３】
ＣＲＥＡＰ１に特異的な経路またはプロモーターをさらに定義するために、Ｈｅｌａ細胞におけるアッセイ系に準じて、種々のプロモーター−ルシフェラーゼ構築物のグループに対して試験した。これらの構築物は、ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥＢ、ＮＦＡＴおよびＮＦｋＢ転写因子結合性エレメントならびにＩＬ−８、ＶＣＡＭ、ＩＬ−２４およびＮＰＹの真正プロモーターを活性化する能力を試験した。加えて、３個のルシフェラーゼベクターを試験のバックグラウンドのために、かつ、特異性コントロールとして包含させた。結果は、ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥ特異的アクティベーターであることを示す(データは示していない)。
【０１９４】
実施例２
ＣＲＥＡＰ１遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
活性ＣＲＥＡＰ１クローン中の２.４kb  ｃＤＮＡ挿入物を、慣用法にしたがい、両方の鎖から配列決定した。結果は、この遺伝子のコード領域は、１９５０ヌクレオチドであることを示し、かつアミノ酸配列は６５０アミノ酸であると予測される。生物情報分析は、ＣＲＥＡＰ１が、分子の中程のアミノ酸３７９から４４８のプロリン・リッチ・ドメイン以外、保存されたタンパク質機能的ドメイン(例えばキナーゼＡＴＰ結合性ドメインまたは転写因子ＤＮＡ結合性ドメイン)を含まないことを示す。本ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を下記に示す。
【０１９５】
ＣＲＥＡＰ１の確認されたＤＮＡ配列の完全長：
【表４】
2007523608.tif 000005
【表５】
2007523608.tif 000006
【０１９６】
ＣＲＥＡＰ１の予測されるアミノ酸配列(６５０アミノ酸)：
【表６】
2007523608.tif 000007
【０１９７】
実施例３
ＣＲＥＡＰ１タンパク質のノーザン・ブロットおよびインビトロ翻訳
異なるヒト組織におけるＣＲＥＡＰ１遺伝子発現を調べるために、我々は、無作為に標識したＣＲＥＡＰ１プローブを使用したノーザン・ブロット分析を行った。ノーザン・ブロット分析によって２.４Kbおよび７Kbの２個のｍＲＮＡが観察された。２.４Kbバンドは、コード領域サイズと一致する。７.０Kbバンドは、ｍＲＮＡの別々のスプライシング形を反映し得る。ヒト組織の大部分で発現されているが、ＣＲＥＡＰ１  ｍＲＮＡは脳、心臓、骨格筋および腎臓に多い(データは示していない)。
【０１９８】
ＣＲＥＡＰ１の予測されるアミノ酸配列の正確さを試験するために、我々は鋳型としてｐＣＭＶＳＰＯＲＴ−ＣＲＥＡＰ１を使用し、インビトロ転写および翻訳反応を行った。インビトロ翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、１個のＣＲＥＡＰ１タンパク質バンドが８０Kd付近に観察され、それが６５０アミノ酸を含むという考えと一致した(データは示していない)。
【０１９９】
実施例４
ＣＲＥＡＰ１はＣＲＥＢを介して働く
ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥプロモーター転写を協力に活性化するため、我々は、次に、ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥＢ経路を介して働くか否かを調べた。この課題に近づくため、インビボキナーゼアッセイを、ＣＲＥＢまたはＡＴＦ２転写因子の転写促進ドメインと、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合性ドメイン(アミノ酸１−１４７)から成る融合構築物およびPathDetect Trans-Reporter Plasmid(Stratagene)を安定に統合されたＨＬＲ細胞系を使用して行った。この系において、ＣＲＥＢまたはＡＴＦ２の転写促進ドメインを活性化する上流レギュレーター(おそらくキナーゼ)のみが、ルシフェラーゼレポーター発現を誘導できた。結果は、ＣＲＥＡＰ１が、ＧＡＬ４プロモーター上のＣＲＥＢ−ＧＡＬ４融合分子およびその活性を、ＣＲＥＢをリン酸化する規範的キナーゼであるＰＫＡ触媒サブユニットよりも幾分強く刺激することを示した。興味深いことに、ＣＲＥＡＰ１は、ＡＴＦ２−ＧＡＬ４融合分子を活性化できないが、一方ＭＥＫＫ(ＡＴＦ２経路の上流キナーゼ、Stratageneキットマニュアル)は、ＡＴＦ２融合を１００倍以上刺激できた。この結果は、ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥＢ経路−特異的上流アクティベーターであることを証明する。
【０２００】
この観察をさらに確認するために、２個のＣＲＥＢ優性ネガティブ構築物(リン酸化不可能なＳ１３３Ａ変異またはＤＮＡ結合性ドメイン変異Ｋ２８７Ｌ、(Clontech))を、コトランスフェクションアッセイに使用した。実験データは、ＣＲＥＢ  Ｓ１３３Ａ変異またはＫ２８７Ｌ変異のいずれかが、ＣＲＥプロモーター上のＣＲＥＡＰ１の活性化を完全に無くし、ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥＢシグナル伝達経路の上流で働き、かつＣＲＥＢのリン酸化およびＤＮＡ結合性活性の両方がＣＲＥＡＰ１シグナル伝達に必要であることを示唆する。
【０２０１】
実施例５
ＣＲＥＡＰ１タンパク質分子内ドメインの機能的分析
ＣＲＥＡＰ１分子内の機能的ドメインを詳細に試験するために、アミノ酸１−１７０、１−３５６、１−４９４、１−５８０および１７０−６５０のＣＲＥＡＰ１タンパク質フラグメントをｐＦｌａｇ−ＣＭＶ４ベクターにＰＣＲベースの方法を使用してサブクローン化し、デュアル−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイにおいて上記の通りに機能を試験した。結果は、ＣＲＥＡＰ１のアミノ酸１−１７０を含むアミノ末端フラグメントが、このアミノ末端を各Ｋ５(ａａ  １７０−６５０)がほとんどすべての刺激活性を欠くため、その機能に重要であることを示した。しかしながら、該１−１７０フラグメント単独(Ｋ１)ではその機能は十分ではない。他方、ＣＲＥＡＰ１  Ｃ末端は、Ｋ４欠失(アミノ酸５８１−６５０を欠く)が野生型活性のほとんどすべてを維持するため、その機能に必要ではない。Ｋ２とＫ４の活性の比較は、アミノ酸３５６−５８０(プロリン・リッチ・ドメインを有する)が、Ｋ４からのこの部分の除去(Ｋ２をもたらす)が、ＣＲＥＡＰ１の機能的活性を１０倍まで減少させるため(下記表１参照)、この部分がＣＲＥＡＰ１機能に非常に重要であることを示唆する。
【０２０２】
【表７】
2007523608.tif 000008
【０２０３】
下記の材料および方法を、下記実施例６−９を行うために使用する：
ＤＮＡ構築物
ＩＬ−８プロモーターを含む１.５kb配列により駆動されるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＧＬ−２−ＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃを、慣用法を使用して研究室内で構築した(Roebuck, J. InterferonおよびCytokine Res. 19:429-438 (1999))。ｐＧＬ３Ｂ−ＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃを、ｐＧＬ−２−ＩＬ−８Ｐ−ＬｕｃのＨｉｎｄ  III／ＸｈｏＩ消化により摘出した１.５kbヒトＩＬ−８プロモーターＤＮＡのライゲーションおよびＨｉｎｄ  III／Ｘｈｏ  Ｉ消化ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ(Promega)への挿入により構築する。
【０２０４】
ｐＩＬ−８Ｌｕｃレポーターを、ヒトＩＬ−８遺伝子の−１４９１から＋４３領域のｐＧＬ３Ｂａｓｉｃベクター(Promega, Inc)への挿入により構築した。ＰＣＲを使用して、野生型最小ＩＬ−８プロモーターならびに点変異を産生するために使用した。ＡＰ−１、Ｃ／ＥＢＰ、ＮＦ−κＢの変異は、Wu et al. ( Wu et al. J.Biol.Chem., 272:2396-2403 (1997))に記載されている。推定ＣＲＥ−様部位のＴＧＡＣＡＴＡＡ配列をＴＣＧＡＴＣＡＡに変異した。ＣＲＥ−様応答エレメント(ｐＣＲＥＬ−Ｌｕｃ)の６個のコンカテマー化コピーまたはヒトＰＥＰＣＫで見られるＣＲＥ−様エレメントＴＧＡＣＡＣＡＡの５個のコピーおよびＣＡＰＬプロモーター(ｐＣＲＥＬ２−Ｌｕｃ)を担持するプロモーター構築物を、ＰＣＲ増幅した配列をｐＴＡＬ−Ｌｕｃ(BD Biosciences)にライゲートすることにより製造した。すべての技術は、慣用法を使用して行った。
【０２０５】
ＩＬ−８プロモーター欠失および点変異した変異体の構築
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して、ＩＬ−８プロモーター変異体を産生する。ＰＣＲ増幅サイクルは：２分、９４℃、５×[１５秒、９４℃、３０秒、５５℃および１５秒、７２℃]および２０×[１５秒、９４℃、３０秒、６５℃および１５秒、７２℃]から成る。Advantage 2 ＤＮＡポリメラーゼ(BD Biosciences)を全増幅段階に使用する。すべての変異体を、ヒトＩＬ−８遺伝子の配列＋１３から＋４３に対応するヌクレオチド配列(５'−ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧ−３')(配列番号３)の共通アンチセンスプライマーＰ２.１で増幅する(Roebuck, J. Interferon and Cytokine Res. 19:429-438 (1999)。ＢａｍＨＩ制限部位(下線)はすべてのセンスプライマーに含まれる。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット(Invitrogen)を使用してライゲートする。配列を確認したクローンを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  II−ＴＯＰＯからＨｉｎｄ  III／ＢａｍＨ  Ｉにより摘出し、Ｈｉｎｄ  III／ＢａｍＨ  Ｉ消化ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃにライゲートする。
【０２０６】
ＡＰ−１部位を欠く切断型(truncated)最小ＩＬ−８プロモーターを担持するｐＩＬ−８ｐ[デルタＡＰ−１]−Ｌｕｃを、Ｐ２.１および、Ｓ３(５'−ＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧ−３')(配列番号４)、ヒトＩＬ−８遺伝子の配列−１１４から＋４３に対応する１５７ｎｔ産物を産生するためのプライマーでの増幅により産生する。
【０２０７】
野生型または変異ＡＰ−１部位のいずれかを担持する最小ＩＬ−８プロモーターを、各々センスプライマーであるｗｔＡＰ−１(５'−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧ−３')(配列番号５)およびｍＡＰ−１(５'−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧ−３')(配列番号６)と、Ｐ２.１プライマーで増幅する。ＡＰ−１部位中のヌクレオチド変異に下線を引く。１８７ｎｔ産物の両方ともヒトＩＬ−８遺伝子の配列−１４４から＋４３に対応する。野生型およびＡＰ−１変異を、各々ｐＩＬ−８ｐ[ｗｔＡＰ−１]−ＬｕｃおよびｐＩＬ−８ｐ[ｍｕｔＡＰ−１]−Ｌｕｃと名付ける。
【０２０８】
変異Ｏｃｔ−１／Ｃ／ＥＢＰおよびＮＦ−κＢ部位を担持するＩＬ−８最小プロモーター変異体を、２回のＰＣＲ工程で製造する。センスプライマーおよびＰ２.１アンチセンスプライマーであるＳＰ３＿ＮＦ−κ  Ｂｍｕｔ(５'−ＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡＡＴ−３')(配列番号７)、またはＳＰ３＿Ｏｃｔ−１ｍｕｔ(５'−ＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴ−３')(配列番号８)での最初のＰＣＲ中に、各々変異ＮＦ−κ  ＢおよびＯｃｔ−１／Ｃ／ＥＢＰ結合部位を担持する、１５７ｎｔ産物が増幅する。ＮＦ−κ  ＢおよびＯｃｔ−１部位中のヌクレオチド変異に下線を引く。２回目のＰＣＲ中、ＡＰ−１＿Ｂａｍセンスプライマー(５'−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣ−３')(配列番号９)、およびＰ２.１アンチセンスプライマーを使用して、最初のＰＣＲ反応の両方の産物を再増幅し(１００fmol／反応)、ヒトＩＬ−８遺伝子の配列−１４４から＋４３に対応する１８７ｎｔ  ｃＤＮＡを産生する。ＮＦ−κ  ＢおよびＯｃｔ−１／Ｃ／ＥＢＰ結合部位変異は、各々ｐＩＬ−８ｐ[ｍｕｔＮＦ−κ  Ｂ]−ＬｕｃおよびｐＩＬ−８ｐ[ｍｕｔＯｃｔ−１]−Ｌｕｃと名付ける。
【０２０９】
変異ＣＲＥ−様応答エレメントを担持するＩＬ−８最小プロモーター変異体を３回のＰＣＲ工程で産生する。最初のＰＣＲ中、ＣＲＥｍｕｔセンスプライマー(５'−ＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧ−３')(配列番号１０)、およびＰ２.１アンチセンスプライマーを使用して、１３７ｎｔ産物を産生する。ＣＲＥ−様部位内のヌクレオチド変異に下線を引く。ＳＰ３＿Ｏｃｔ−１ｗｔセンスプライマー(５'−ＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＴ−３')(配列番号１１)、およびＰ２.１アンチセンスプライマーを使用した２回目のＰＣＲ中、最初のＰＣＲ反応の両方の産物を再増幅し(１００fmol／反応)、ヒトＩＬ−８遺伝子の配列−１１４から＋４３に対応する１５７ｎｔ産物を産生する。最後に、ＡＰ−１＿ＢａｍセンスプライマーおよびＰ２.１アンチセンスプライマーおよび２回目のＰＣＲ反応の産物を鋳型として使用し(１００fmol／反応)た３回目のＰＣＲ中、ＩＬ−８最小プロモーター変異体の５'末端をヒトＩＬ−８遺伝子の−１４４ヌクレオチド位置まで伸長する。本試験で使用した得られた構築物をｐＩＬ−８ｐ[ｍｕｔＣＲＥ＿ｌｉｋｅ]−Ｌｕｃと名付ける。
【０２１０】
ＩＬ−８プロモーターのコンカテマー化ＣＲＥ−様応答エレメントを担持するプロモーター構築物を、センスであるＣＲＥｌｉｋｅ＿Ｓ(５'−ＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧ−３')(配列番号１２)およびアンチセンスプライマーであるＣＲＥｌｉｋｅ＿ＡＳ(５'−ＡＣＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧ−３')(配列番号１３)と、鋳型オリゴヌクレオチド(５'−ＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＧＣＧＴＧＣＴＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＧＴ−３'(配列番号１４)(１００fmol／反応)を増幅のために使用したＰＣＲにより製造する。ＣＲＥ−様応答エレメント(ＴＧＡＣＡＴＡＡ)の６個のコンカテマー化コピーに下線を引く。ＰＣＲ増幅パラメーターは上記の通りである。９９ヌクレオチドＰＣＲ産物をＫｐｎ  ＩおよびＢｇｌ  IIにより開裂し、ゲル精製し、Ｋｐｎ  Ｉ／Ｂｇｌ  II消化ｐＴＡＬベクター(BD Biosciences)にライゲートし、ｐＴＡＬ−６Ｘ[ＣＲＥ＿ｌｉｋｅ]レポーターを得る。
【０２１１】
ハイスループット・スクリーニングのためのＤＮＡ調製物
上記の配置したクローンを、アーカイブにするための複数コピーを産生するために複製する。１つのコピーを使用して、ミニプレップＤＮＡを、QIAGEN BioRobot 8000  (Qiagen, Valencia, CA)を使用して産生する。簡単に言うと、各３８４−ウェルプレートに、２μlのグリセロールストックを使用して、１００μl  Luriaブロス(Gibco BRL)−８％グリセロール含有Greiner  ３８４−ディープ・ウェルプレートに摂取する。Greinerプレートを、air poreシート(Qiagen)で覆い、サランラップで包み、３７℃で振盪せずに〜２２時間インキュベーションする。続いて、５μlの培養物を１個の３８４−ウェルGreinerプレートから、各ウェルに１ml  Terrificブロス(KD Medical)(＋１００μg／mlアンピシリン)を含む４個のQiagen９６−ウェル・ディープ・プレートに移す。４個のQiagenプレートをair poreシートで覆い、２５０rpmで３７℃インキュベーター中、〜２２時間振盪する。細菌細胞を、４０００rpmで１５分の遠心によりペレット化し、上清をデカントし、プレートをQIAGEN BioRobot 8000を使用して、ＤＮＡ調製のために処理する。使用したプロトコールは、製造者のプロトコール“QIAprep Turbo96 PB (1 to 4 plates)”に基づき９６−ウェルＵＶ−透過性(Corning)を溶出プレートに変えたのみである。ＤＮＡサンプルの濃度および収率を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  １９０(Molecular Devices)上のＯＤ２６０値の測定により決定する。得られた２０,７０２ＤＮＡサンプルを次いで小分けし、アーカイブ(ＴＥ緩衝液中８０pg／ウェル)のための複数コピーを産生する。アッセイのために、ＤＮＡの２,３６８  ｃＤＮＡクローンコレクションのアリコートを、９６−ウェルＰＣＲプレート(ABGene, Rochester, NY)中、６μl／ウェルで２０ng  ＤＮＡ／μlで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ細胞培養培地(Gibco BRL, Carlsbad, CA)中産生する。２０,７０２  ｃＤＮＡコレクションでのスクリーニングのためのＤＮＡアリコートを、３８４−ウェルＰＣＲプレート中、４μl／ウェルで７.５ngプラスミド／μlで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に産生する。プレートをアルミホイルで密封し、−２０℃で貯蔵する。
【０２１２】
細胞培養
トリプシン処理したＨｅＬａ細胞(ATCC, Manassas, VA)を、ダルベッコ改変イーグル培地(Ｄ−ＭＥＭ)(GIBCO BRL Carlsbad, CA Cat.# 10317-022)中に１０％ウシ胎児血清(GIBCO BRL Carlsbad, CA Cat# 10082-147)および１×抗生物質−抗菌物質(GIBCO BRL Carlsbad, CA Cat# 15240-062)を含む完全増殖培地(ＤＭＥＭ、Invitrogen)に、１０５細胞／mlで再懸濁し、２,３６８  ｃＤＮＡクローンコレクションスクリーニングのために２４個の白色９６−ウェルプレート(Corning, Acton, MA)に７５μl／ウェルでまたは２０,７０２  ｃＤＮＡクローンコレクションスクリーニングのために５１白色３８４−ウェルプレート(Costar)に３０μl／ウェルで、Multi drop 384(Thermo Labsystems)を使用して分配する。細胞を、一晩、組織培養インキュベーター中、３７℃および５％ＣＯ２で静置する。
【０２１３】
ハイスループットトランスフェクション法。
２,３６８  ｃＤＮＡクローンコレクションスクリーニングのために、３３０μgのｐＧＬ３Ｂ−ＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃレポータープラスミドを、５０ml円錐形試験管中の３３mlのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ低血清培地に、レポーターの最終濃度が１００ng／トランスフェクションとなる量で再懸濁する。試験管を振盪し、４×８mlのアリコートに分ける。トランスフェクションの前に、０.８mlのＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche Applied Bioscience)を８mlアリコートあたり(４μlのＦｕｇｅｎｅ６／トランスフェクトしたＤＮＡのμg)添加する。内容物を、数回ピペット中を上下させることにより混合し、９６−ウェルのクリーンなＰＣＲプレート(ABGene)に７５μl／ウェルで添加する。１０μlの[ＯｐｔｉＭＥＭ−レポーター−Ｆｕｇｅｎｅ６]混合物を、６μlの予め希釈したｃＤＮＡを含む各娘プレートにＢｉｏｍｅｋＦＸピペッティング・ステーション(Beckman Coulter, Fullerton, CA)を使用して各ウェルに添加する。プレート＃２４の最後の行を、ネガティブコントロールとしてのｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６空ベクターまたはポジティブコントロールとしてのヒトＭＥＫＫ１(Stratagene)のＡＡ３６０−６７２に対応する配列をコートする構築物を発現するｐＦＣ−ＭＥＫＫのために使用する。両方のプラスミドを２０ng／μlに予め希釈し、６μl／ウェルに小分けする。１５分、室温でインキュベーション後、１３μlの最終混合物を９６−ウェル  ＨｅＬａ培養プレートに移す。細胞を４８時間、３７℃で、５％ＣＯ２の大気中でインキュベートする。
【０２１４】
２０,７０２  ｃＤＮＡクローンコレクションスクリーニングのために、１.６５mgのｐＧＬ３Ｂ−ＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃレポータープラスミドを、２５０mlエレンマイヤーフラスコ(Corning)中の１００mlのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉに、レポーターの最終濃度が５０ng／トランスフェクションとなる量で再懸濁する。フラスコを浸透し、８mlアリコートに分ける。トランスフェクションの前に、０.６５mlのＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬を、８mlアリコートあたり(３μlのＦｕｇｅｎｅ／トランスフェクトしたＤＮＡのμg)添加する。内容物を、数回ピペット中を上下させることにより混合し、９６−ウェルのクリーンなＰＣＲプレート(ABGene)に７５μl／ウェルで添加する。３μlの[ＯｐｔｉＭＥＭ−レポーター−Ｆｕｇｅｎｅ６]混合物を、４μlの予め希釈したｃＤＮＡを含む３８４−ウェル娘プレートにＢｉｏｍｅｋＦＸ(Beckman)を使用して各ウェルに添加する。１５分、室温でインキュベーション後、各ウェルからの７μlの混合物を３８４−ウェル組織培養プレートに移す。細胞を、４８時間、３７℃で、５％ＣＯ２の大気中でインキュベートする。
【０２１５】
ルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクション４８時間後、ホタル・ルシフェラーゼ活性をBrightGloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega, Madison, WI)で、製造者が提供したプロトコールにしたがい測定する。簡単に言うと９０μlまたは４０μlの新たに再構成したルシフェラーゼ試薬を、９６−ウェルまたは３８４−ウェル組織培養プレートの各々のウェルにMulti drop 384(Thermo Labystems, Beverly, MA)を使用して添加する。２分インキュベーション後、発光を、LUMINOSKAN Ascent照度計(Thermo Labsystems)で、４００msec積分時間で、製造者の指示にしたがい読む。
【０２１６】
ヒット確認のためのクローン回収
各一次アッセイのために、Ｚスコアおよび集団中央値に対する活性化倍率を、慣用法にしたがい計算し、アノテーションした検索可能データベースに挿入した。可能性のあるヒットは２つの基準：(１)Ｚスコアが３.０より大きいおよび(２)活性化倍率が２,３６８および２０,７０２  ｃＤＮＡクローンコレクションスクリーニングの各々で１０および５より大きいことに基づき、選択する。２,３６８クローンサブ−アレイの一次アッセイにおいてヒットとしてスコアリングされたクローンを、グリセロールストック(再配置プレートのコピー１)から回収する。全２０,７０２クローンコレクションの一次アッセイからのヒットを、アーカイブからのＤＮＡアリコートの再形質転換により回収する。形質転換をXL-10 Gold細菌(Stratagene)中で行う。各クローンをLuriaブロス寒天プレート＋抗生物質(１００μg／mlアンピシリン)(KD Medical, Columbia, MD)に縞状に培養し３７℃で一晩増殖させ、各プレートから３個のコロニーを採取し、各ウェルに９９５μl  Terrificブロス(KD Medical)＋１００μg／mlアンピシリンを含むディープ・ウェル９６ウェル−プレートで増殖させる。これらのディープ・ウェルプレートをair poreテープで覆い、一晩３７℃で、３００RPMで振盪してインキュベートする。ＤＮＡ  ミニプレップを上記のように調製する。すべてのＤＮＡ調製物を次いで１２５ng／μl(１２５ng／μlより大きい濃度のウェル中)に希釈し、８μlをＤＮＡ配列確認のために取る。残りのＤＮＡを２５ng／μlに希釈し、６μlのＤＮＡを娘９６−ウェルＰＣＲプレート(ABGene)に移し、上記のトランスフェクション法を使用した検証に使用する。トランスフェクション効率を標準化するために、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＲＬ−ＳＶ４０(Promega)を、２０ng／トランスフェクション包含させる。ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を、デュアル−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系(Promega)で製造者が提供するプロトコールにしたがい、測定する。簡単に言うと、９０μlの新たに再構成したルシフェラーゼ試薬を、９６−ウェル組織培養プレートの各ウェルにMulti drop 384を使用して添加し、１５分インキュベーション後、発光を、LUMINOSKAN Ascent照度計で４００msec積分時間で読む。続いて９０μlのＳｔｏｐ−ａｎｄ−Ｇｌｏ試薬を９６−ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加し、１５分インキュベーション後、発光を、LUMINOSKAN Ascent照度計で、２００msec積分時間で読む。選択したクローンの特異性を、異なるルシフェラーゼベースのプロモーター構築物：ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ、ｐＭＣＳ−Ｌｕｃ(Stratagene)、ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ(BD Biosciences)、ｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ(BD Biosciences)、ｐＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃ、ｐＲｈｏＢＰ−Ｌｕｃ(研究室内で慣用法にしたがい製造／BD Biosciences)およびｐＶＣＡＭＰ−Ｌｕｃ(Iademarcom, M.F., J. J. McQuillan, G. D. Rosen, およびD. C. Dean. 1992. J Biol Chem 267:16323-9の記載にしたがい製造)で試験する。
【０２１７】
ＨｅＬａ細胞のＩＬ−８  Ｅｌｉｓａアッセイ
ＨｅＬａ細胞を、検証し、確認したヒットの配列から選択されたＤＮＡサンプルで、１００ng／ウェルで、９６ウェルプレート(Costar)中、上記の方法にしたがいトランスフェクトする。コ−アクティベーターとして示されるＤＮＡサンプルを、２５ng／ウェルでコ−トランスフェクトする。空ベクターｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６をネガティブコントロールとして使用する。トランスフェクション７２時間後、ＩＬ−８含量を、１から５μlの条件付けされた増殖培地に対応する予め希釈されたアリコートの細胞増殖培地中、ＩＬ−８  Ｅｌｉｓａキット(Sigma)を使用して、提供されたプロトコールにしたがい測定する。ポジティブコントロールとして、増殖培地を、空ベクターでトランスフェクトした細胞から回収し、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα(R&D System)で、各々５ng／mlおよび５０ng／mlで１６時間処理し、その後増殖培地をＩＬ−８アッセイのために回収する。
【０２１８】
Affymetrix  ＤＮＡマイクロアレイチップでの遺伝子発現プロファイリング
ＨｅＬａ細胞を本明細書に記載のようにＣＲＥＡＰ１で、またはｒｅｌＡ(Ruben SM et al., Science 1991 Mar 22;251(5000):1490-3)、ＭＡＰ３Ｋ１１(Hartkamp, J. et al., (1999). Cancer Res. 59, 2195-2202)またはＡＮＫＲＤ３(Muto, A., et al., (2002)J. Biol. Chem. 277, 31871-31876)を含む発現構築物で、Targefect F1トランスフェクション試薬(Targeting Systems, Santee, CA)を使用して、産物に添付のプロトコールにしたがいトランスフェクトする。簡単に言うと、ＨｅＬａ細胞を、Ｔ７５組織培養フラスコ(Falcon)中、７０−８０％のコンフルエンシーでのトランスフェクションに使用する。トランスフェクション混合物は下記の通り調製する：５０ml円錐形試験管(Falcon)に、８mlのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ、２０μgの選択したプラスミドＤＮＡを添加し、軽打することにより攪拌する。２個のトランスフェクションを、ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６空ベクターで製造する。Targefect F-1ストック溶液を、最高速度で２０秒、ボルテックス処理し、４０μlを各試験管に添加し、再び試験管を軽打することにより混合し、室温で３０分インキュベーションして、トランスフェクション複合体を形成させる。ＨｅＬａ細胞を２０mlのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で２回洗浄し、１２mlの各トランスフェクション複合体を１個のＴ７５フラスコ当たりに添加する。４時間、３７℃でインキュベーション後、８mlの血清含有増殖培地を各フラスコに添加する。培地を翌日置換する。トランスフェクション５６時間後、培地を再び置換し、ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６プラスミドＴＮＦα(R&D System)でトランスフェクトしたフラスコの一方に、５０ng／mlで添加し、インキュベーションを３７℃でさらに１６時間続ける。トランスフェクション７２時間後、細胞を１０mlのＴＲＩｚｏｌ試薬(Gibco BRL)中に回収し、−８０℃で凍結する。全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付のプロトコールにしたがい単離する。二本鎖ｃＤＮＡプローブの合成標識、Affymetrix Gene-Chipハイブリダイゼーションおよびデータ分析を慣用法にしたがい行う(Eberwine, J., et al., J. Neurosci. 21, 8310-8314およびHakak, Y., et al., (2001)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 4746-4751も参照)。
【０２１９】
実施例６
ＩＬ８Ｐルシフェラーゼベクターの特徴付け
ヒトＩＬ−８プロモーターのフラグメントを含む１.５kB  ＩＬ−８プロモーターで制御されているルシフェラーゼレポーターを、サイトカイン−介在遺伝子発現の既知のレギュレーターによる誘導性に関して試験した。ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ(BD Biosciences)およびｐＧＬ２−ＩＬ−８Ｐ−ＬｕｃレポーターをＨＥＫ  ２９３細胞に、私有クローンコレクションを使用して、慣用法にしたがい製造した既知のＮＦ−κＢ経路のアクティベーター、切断型(truncated)ＭＥＫＫ(ＡＡ  ３６０−６７２)(Stratagene)および完全長ＴＲＡＦ６  ｃＤＮＡを含む発現構築物とコ−トランスフェクトした。空ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ベクターとコ−トランスフェクトした細胞は非処置のままであるか、ＴＮＦα(５０ng／ml、１６時間)で処置した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション４８時間後に測定した。ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃレポーターをポジティブコントロールとして使用した。
【０２２０】
データは、ＭＥＫＫ、ＴＲＡＦ６およびＴＮＦαがＩＬ−８プロモーター−レポーターを著しく活性化し、レポーター遺伝子の活性を各々１６倍、４.９倍および４.７倍増加させることを示す。我々の私有のｃＤＮＡクローンコレクションのハイスループット機能的スクリーニングのために、ＩＬ−８プロモーター配列を、特異性および効率が改善された元々ｐＧＬ２ベクターに由来する誘導体であるｐＧＬ３Ｂａｓｉｃベクター(Promega)にサブクローン化した。
【０２２１】
実施例７
２０,０００  ｃＤＮＡコレクションのＩＬ−８プロモーターベースの機能的スクリーニングおよびヒット活性の検証
ｐＧＬ３Ｂ−ＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃを、３８４−ウェルプレートに２０,７０２の個々の完全長ｃＤＮＡクローンと、ＨｅＬａ細胞にコ−トランスフェクトし、レポーターアッセイを上記のようにトランスフェクション４８時間後に行った。ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６を、ネガティブコントロールとしてレポーターとコ−トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、BrightGloレポーターアッセイ系(Promega)を使用して測定した。ＩＬ−８プロモーターレポーター活性の絶対量を決定し、ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６プラスミドコントロールの５倍を超えるスコアリングのクローンを同定した(データは示していない)。ヒットの同一性および活性を検証するために、クローンを上記のように回収し、および３個の独立コロニーを単離した。ＤＮＡミニプレップを配列検証およびＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃレポーターとの二次アッセイに使用した(データは示していない)。
【０２２２】
二次アッセイにおいてＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃレポーターの著しい活性を産生するクローンを、７個のプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物：ｐＴＡＬ、ＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ、ＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃ、ＲｈｏＢＰ−Ｌｕｃ、ＶＣＡＭＰ−Ｌｕｃ(BD Biosciences)(ｐＴＡＬと同一であり、４個のＣＲＥ応答エレメントが付加されている)を活性化するその能力に関して試験した。
【０２２３】
ｃＤＮＡクローンを、ｃＤＮＡ１２,９０５クローンにマッチするＲｅｆＳｅｑ遺伝子の１個の５'末端由来の予測されたまたは特徴的な遺伝子に関する開始コドンの存在に基づいて選択し、その内５,４６３に機能的アノテーションを指定した。２０,７０４  ｃＤＮＡを、ＩＬ−８プロモーター(ｐＩＬ−８−Ｌｕｃ)で制御されたホタル・ルシフェラーゼレポーター遺伝子とコ−トランスフェクトした。６４個のｃＤＮＡが、レポーターを５倍以上多く誘導した。検証された活性ｃＤＮＡは、２８の独特な遺伝子の１−３コピーを含んだ。２２個の非冗長ｃＤＮＡをさらなる試験のために選択した。全コレクションをまたサイクリックＡＭＰ応答エレメント(ＣＲＥ)または血清応答エレメント(ＳＲＥ)駆動レポーターの活性化に関するアッセイにおいてスクリーニングした。一次スクリーニングにおいて２２  ｃＤＮＡで得られた結果を階層的構造形成(Eisen)を使用してグループ分けし、いずれかの遺伝子が、３つのアッセイで交差反応性を有するかを決定する。多くの遺伝子は、相対的にＩＬ−８レポーターに特異的であった。これらは既知のＮＦ−κＢのインデューサーを含み、最近同定されたＮＦ−κＢアクティベーターＡＣＴ１およびキナーゼＰＫＫである、ＮＦ−κＢ転写因子のサブユニットであるｒｅｌＡ(ｐ６５)、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー１Ａ、ＴＮＦ関連分子ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＲＩＰＫ２およびＴＲＡＦ６の各々を含む。第２のグループはＡＰ−１転写因子部位のアクティベーターを示し、ＪｕｎＤおよびＪＮＫ−誘導ＭＡＰキナーゼＭＡＰ３Ｋ１２およびＭＡＰ３Ｋ１１の複数のクローンを含む。ＩＬ−８プロモーターＮＦ−ＩＬ６部位に直接結合することが既知であるＣ／ＥＢＰβも同定された。故に、一次スクリーニングは、多くの異なる経路を介してＩＬ−８遺伝子を活性化することが予測される多くのインデューサーを同定した。
【０２２４】
ＣＲＥＡＰ１は得られたヒットの中にある。故に、データは、ＣＲＥＡＰ１が、ＣＲＥ−ＬｕｃおよびＩＬ−８Ｐ−Ｌｕｃ構築物の両方の強力なアクティベーターであることを示す。実際、これまで未知の機能であったこのタンパク質は、ＣＲＥのアクティベーター(２個の、ＣＲＥ−ＢＰａおよびＣＲＥＢ１ＣＲＥ結合性転写活性剤より強くさえあり(データは示していない)、上記の実施例に記載の結果を確認する)、これらの二次アッセイで見られたＩＬ−８遺伝子の最強のアクティベーターでもあった。
【０２２５】
実施例８
ＣＲＥＡＰ１は、ＩＬ−８プロモーター−特定のＣＲＥ−様エレメントのタンデムを担持するレポーターを強く活性化する
強いアクティベーターがまた内因性ＩＬ−８遺伝子を誘導するか否かを決定するために、ＨｅＬａ細胞から分泌されたＩＬ−８タンパク質を、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１アクティベーターの例に準じて、ｒｅｌＡおよびＭＡＰ３Ｋ１１構築物でトランスフェクションした後に測定した。ＭＡＰ３Ｋ１１およびｒｅｌＡは少ない増加を誘導するが、両方の組み合わせは、既知のＩＬ−８の最も強力なインデューサーの一つであるＩＬ−１βと同等なレベルにＩＬ−８を誘導した。このデータは、内因性ＩＬ−８遺伝子の制御が、複数のシグナル伝達経路の相互作用を必要とすることを示唆する。
【０２２６】
作用の機構が未知であった数個のｃＤＮＡを同定した。これらは２個のＲｈｏ−依存性ＧＴＰ−ＧＤＰ促進因子(Ｒｈｏ−ＧＥＦ)、ｐ１１４およびＡＲＨＧＥＦ１、Ｃ１６ｏｒｆ１５、およびＴＳＨ産生細胞胚因子１(ＴＥＦ１)、フィブロネクチン(ＦＮ１)および核レセプターファミリーメンバーＮＲ２Ｆ２を含む。Ｃ１６ｏｒｆ１５は、脳で非常に発現される未知の機能のプロリン・リッチ・タンパク質をコードする。ＴＥＦ１は、ＴＥＦ応答エレメントを介して直接作用する塩基性ロイシンジッパー転写因子のメンバーである。ＦＮ１は、傷害組織で非常に発現されるマトリックス糖タンパク質であり、またＡＰ−１−依存性機構を介してＩＬ−１βを発現できる。ＮＲ２Ｆ２は、全アッセイで強力なアクティベーターであり、したがって、その活性は非特性であるようであった。
【０２２７】
最強のＩＬ−８アクティベーターのいくつかは、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現と関連した。Ｃ／ＥＢＰβ、ＪｕｎＤ、ｃ−ｊｕｎ、ＣＲＥ結合性タンパク質ＣＲＥＢ１、ＣＲＥ−ＢＰａおよびＸＢＰ１は、ＣＲＥ−駆動レポーターの強力なインデューサーとして発見された。ＫＩＡＡ０６１６およびＭＥＣＴ１に関して寄託された配列と重複するｃＤＮＡもまた上記のＣＲＥＡＰ１遺伝子として同定された。興味深いことに、ＭＥＣＴ１の最初の４４アミノ酸をコードする配列が、粘膜表皮癌のMastermind−様遺伝子ＭＡＭＬ２上に転座している以外、このタンパク質に関して何も知られていない(Tonon et al., Nat.Genet., 33:208-213 (2003))。
【０２２８】
最強のＩＬ−８アクティベーターの多くがまたＣＲＥアクティベーターまたは結合性タンパク質であるとの観察は、ＩＬ−８プロモーターが認知されていないＣＲＥを含むはずであることが示唆される。これは、最初に、アデニリルサイクラーゼの非特異的アクティベーターである植物ジテルペンホルスコリン(Sigma)を使用して、ＩＬ−８プロモーターに対する上昇したｃＡＭＰレベルの効果を試験することにより試験された。簡単に言うと、ＨＥＫ２９３細胞を、上記のように、ｐＣＲＥ−ＬｕｃまたはｐＩＬ−８−Ｌｕｃのいずれかと、空ベクターまたはＣＲＥ−ＢＰａの発現構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche)を使用してコ−トランスフェクトした。トランスフェクション１６時間後、ＩＢＭＸを５００μＭで含む当量の増殖培地をウェルに添加した。８時間後、ホルスコリンを、増殖培地で調製した５０μＭストック溶液から、ＩＢＭＸで前処理した細胞に、５μMの最終濃度に達するように添加した。細胞を、ホルスコリンと共に１６時間、３７℃で静置した。ルシフェラーゼ活性を、デュアル−Ｇｌｏアッセイキット(Promega)を使用して決定し、上記のように標準化した。データを、空ベクターでトランスフェクトした非処置細胞と比較した誘導倍率として示した。結果は、ホルスコリンがＩＬ−８レポーターを弱く誘導することを示した。ＣＲＥ結合性タンパク質のコ−トランスフェクションは、スクリーニングにおいて、、ＣＲＥ−ＢＰａがＩＬ−８プロモーターを、ホルスコリン処置に際して相乗的に活性化することが判明した。
【０２２９】
標準技術を使用して、ＩＬ−８プロモーター配列を、次いで、可能性のあるＣＲＥ配列の存在に関して試験した。配列５'−ＴＧＡＣＡＴＡＡ−３'を有する、可能性のある非対称変異体ＣＲＥは、ＩＬ−８プロモーターの−６９から−６２の間に見られ、それは先にＡＰ−１結合配列であることが記されていたが、機能はまだ報告されていなかった(Roebuck, J. Interferon and Cytokine Res. 19:429-438 (1999))。我々は、この部位を“ＣＲＥ−様応答エレメント”と名付けた。同一のＤＮＡ配列を担持するオリゴヌクレオチドは、ＣＲＥＢ２によく結合し、ＣＲＥＢ１に非常にわずかしか結合しないことが示された(Benbrook and Jones, Nucleic Acids Res., 22:1463-1469 (1994))。興味深いことに、ＣＲＥＢ２は、転写アクティベーター／リプレッサーとして二重の役割を演ずることが提案された。“ＣＲＥ−様応答エレメント”に結合したＣＲＥＢ２は、ＣＲＥＢのようなアクティベータータンパク質の結合を妨害し、したがってＣＲＥ−依存性転写を抑制すると考えられた(Karpinski, et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:4820-4824 (1992))。他方、ＣＲＥＢ２は、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＦ−１のような他の転写因子またはウイルスタンパク質Ｔａｘと一緒に働いている場合の数個の遺伝子の転写を活性化できた(Schoch, et al. NeuRochem. Int. 38:601-608 (2001))。
【０２３０】
ＩＬ−８プロモーターのＭＡＰ３Ｋ１１およびＣＲＥＡＰ１による誘導の機構を追求した。プロモーター・エレメントが、これらの遺伝子による活性化を必要とするか否かを決定するために、ＩＬ−８  ＣＲＥ−様および他の調節部位に変異を有するプロモーター変異体を創成し、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＣＲＥＡＰ１、またはｒｅｌＡによる誘導について試験した。結果は、Ｃ／ＥＢＰ結合部位の変異が、いずれかのタンパク質による活性化に影響しないことが示唆された。ＮＦ−κＢ部位変異は、ＭＡＰ３Ｋ１１またはＣＲＥＡＰ１にほとんど影響しないが、ｒｅｌＡによる誘導を無くした。ＡＰ−１部位の変異は、ｒｅｌＡの効果を著しく変えなかったが、ＭＡＰ３Ｋ１１による誘発を非常に減少した。これは、ＭＡＰ３Ｋ１１がＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路およびＡＰ−１を活性化できる能力と一致する。驚くべきことに、この変異はまたＣＲＥＡＰ１による活性化を著しく減少した。ＣＲＥ−様部位の変異は、ＣＲＥＡＰ１およびＭＡＰ３Ｋ１１の両方による誘導を劇的に減少し、または無くした(データは示していない)。
【０２３１】
“ＣＲＥ−様エレメント”がＣＲＥＡＰ１またはＭＡＰ３Ｋ１１に直接応答性であるか否かを決定するために、両方の遺伝子の、コンカテマー化ＣＲＥ−様部位(ｐＣＲＥＬ−Ｌｕｃ)を担持する最小プロモーターを活性化する能力を試験した。加えて、我々は、ＡＰ−１の既知のインデューサーであるＰＭＡの効果を試験した。ＣＲＥレポーター(ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ)と同様に、ｐＣＲＥＬ−ＬｕｃはＣＲＥＡＰ１により強く活性化されたが、ＭＡＰ３Ｋ１１またはＰＭＡ処置のいずれの処置でも活性化されなかった(データは示していない)。このデータは、ＣＲＥＡＰ１およびＭＡＰ３Ｋ１１の両方が、その活性のために完全なＣＲＥ−様およびＡＰ−１部位を必要としているが、それらはＩＬ−８プロモーターを、ＣＲＥ−様またはＡＰ−１部位の各々をそれらの一次応答エレメントとして使用する異なる機構を介して誘導することを示唆する。
【０２３２】
我々は、さらにＣＲＥＡＰ１−誘導ｐＩＬ−８−Ｌｕｃレポーター活性が、ＣＲＥＢに依存性であるか否かをアッセイした。ＣＲＥＡＰ１およびＫＣＲＥＢ(ＣＲＥＢの優性ネガティブ形)(BD Biosciences)の共発現が、ＣＲＥＡＰ１−誘導ＩＬ−８プロモーター活性の著しい減少をもたらした(データは示していない)。対照的に、ＣＲＥＡＰ１活性は、Ｉ−КＢα(ＮＦ−КＢ経路の強力なインヒビター)の構造的に活性な形とのコ−トランスフェクションに影響を受けなかった。
【０２３３】
ＣＲＥＡＰ１とＣＲＥおよびＡＰ−１結合部位の相互作用が、同一または異なるドメインと関連しているかを決定するために、我々は、Ｎ−およびＣ−末端からの欠失を担持するＣＲＥＡＰ１の数個の変異体を、慣用法を使用して構築し、これらの変異体がｐＩＬ−８−Ｌｕｃレポーターの活性化に、ＣＲＥＡＰ１またはＭＡＰ３Ｋ１により影響を与える能力を試験した。５９Ｎ−末端アミノ酸欠失(デルタ５９)を含む変異体は、野生型ＣＲＥＡＰ１を減少し、ＭＡＰ３Ｋ１１のＩＬ−８レポーターを発現する能力を非常に阻害した(データは示していない)。阻害は、デルタ５９がｒｅｌＡによる活性化に対して影響を与えなかったため、特異的であった。反復ＡＰ−１部位を含む、ＡＰ−１特異的レポーター、ｐＡＰ１(ＰＭＡ)−Ｌｕｃの、ＰＭＡまたはＭＡＰ３Ｋ１１のいずれかによる活性化もデルタ５９により遮断された(データは示していない)。同時に、デルタ５９は、ホルスコリン−刺激ｐＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターを遮断できなかった(データは示していない)。このデータはＣＲＥＡＰ１がＣＲＥを介した発現をＣＲＥＢ−依存性形態で活性化するが、このタンパク質は、ＡＰ−１活性化に必須の成分と直接的または間接的に相互作用しているようであることを示唆する。
【０２３４】
実施例９
ＣＲＥＡＰ１で一過性にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の遺伝子発現プロファイリング
ＣＲＥＡＰ１が、真正のＣＲＥＢ標的の発現を制御するか否かを決定するために、細胞の遺伝子発現を、ＣＲＥＡＰ１の過剰発現後にＤＮＡマイクロアレイを使用して測定した。簡単に言うと、ＨｅＬａ細胞をｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６、ＣＲＥＡＰ１で、Targefect F１試薬(Targeting Systems)を使用して一過性にトランスフェクトした。ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６でトランスフェクトした細胞の半分を未処置のまま残し、ネガティブコントロールとして使用した。全ＲＮＡ単離、標識プローブ調製およびＤＮＡマイクロチップハイブリダイゼーションプロトコールは、上記のように行った。
【０２３５】
結果は、興味深いことに、ＣＲＥＡＰ１のトランスフェクションをしたＨｅＬａ細胞の遺伝子発現のパターンが、他のアクティベーターと明らかに異なり、ｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ経路に依存性であることが既知の遺伝子の特定の富化を伴うことを示す。特異的に、ＣＲＥＡＰ１トランスフェクションは、７個の遺伝子を１０倍以上誘導した(表２参照)。他の遺伝子は、ＣＲＥＢおよびｃＡＭＰの既知の標的を含み、ＴＳＨアルファ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ(ＰＥＰＣＫ)、結晶性アルファ−Ｂ、およびＥＧＦ−様分子アンフィレギュリンを含む。ＣＲＥＭ(ｃＡＭＰレベルの上昇により誘導されることが既知の別の遺伝子)もまたＣＲＥＡＰ１で少ない程度で活性化された。この遺伝子のセットは、ｃ−ＪｕｎおよびＡＰ−１の既知の標的であるＰＡＩ−２を誘導するＭＡＰ３Ｋ１１の影響を受けなかった(Arts, et al., 1996 Eur. J. Biochem 241:393-402)。故に、ＣＲＥＡＰ１は、真正のＣＲＥＢ標的遺伝子のインデューサーである。
【０２３６】
内因性ＩＬ−８遺伝子もまたスクリーニングで同定された各アクティベーターにより、相対的に少ない程度(２から５倍)活性化された。人工レポーター構築物で観察された強い活性化と比較して内因性ＩＬ−８遺伝子の弱い活性化は、おそらく上記のような複数経路を介した活性化が必要であるためである。我々は、ＣＲＥＡＰ１により異なって制御される遺伝子のセット、または、ＨＥＫ２９３細胞中で過剰発現するタンパク質キナーゼＡ(ＰＫＡ)の触媒サブユニットを、階層的構造形成アルゴリズムを使用して分析している。我々は、両方のタンパク質がＣＲＥＢを介して作用するが、上方制御および下方制御される遺伝子のプールは、完全には重複しないことを発見している。このデータはＣＲＥＡＰ１が、転写を活性化するための既知のリン酸化−依存性機構の代替を提供し得ることを示唆する。
【０２３７】
【表８】
2007523608.tif 000009
【０２３８】
ＣＲＥＡＰ１により最も強く誘導される２つの遺伝子は、ｃＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(ＰＥＰＣＫまたはＰＣＫ１)(Roesler, W.J. Mol. Cell Endocrinol. 162:1-7 (2000))および甲状腺−刺激ホルモンアルファ(ＴＳＨα)((Kim, D.S. et al. Mol Endocrinol. 8:528-36 (1994))の既知の標的である。３番目に高く制御される遺伝子であるアンフィレギュリンは、ある癌系における発現がＰＫＡ依存性であることが報告されており(Bianco, C.G. et al. Clin. Cancer res. 3:439-48 (1997))、我々はマウスおよびヒト遺伝子で完全に保存的である近位アンフィレギュリンプロモーターにおけるコンセンサスＣＲＥ部位を同定している(データは示していない)。
【０２３９】
ＣＲＥＡＰ１により最も高く誘導される内因性遺伝子の２つは、ｃＡＭＰまたはＣＲＥＢタンパク質の標的であることが知られていない。最初のものはＣＡＰＬであり；第二はケモカインＥｘｏｄｕｓ−１(ＣＣＬ２７、ＭＩＰ−３αまたはＬＡＲＣとしても既知)である。興味深いことに、Ｅｘｏｄｕｓ−１遺伝子はまたケモカインであり、近位プロモーターがＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−１およびＮＦ−ＩＬ６／Ｃ／ＥＢＰ部位を含むことが報告されている点で、ＩＬ−８遺伝子と非常に類似の方法で制御される。Ｅｘｏｄｕｓ−１遺伝子は、ＣＲＥＡＰ１により、内因性ＩＬ−８遺伝子よりも高い程度で誘導された。ＣＲＥＡＰ１が、ＴＮＦ−αまたはＮＦ−κＢよりも強いＥｘｏｄｕｓ−１のインデューサーであることも注意すべきである(データは示していない)。Ｅｘｏｄｕｓ−１プロモーターが認識されていないＣＲＥを含むか否か、またはＣＲＥＡＰ１が記載のように変異ＡＰ−１部位を介して作用するか否か、知られていない。しかしながら、ＣＲＥＡＰ１によるＥｘｏｄｕｓ−１発現の活性化は、Ｅｘｏｄｕｓ−１遺伝子がｃＡＭＰによりまたは他のＣＲＥＢ−誘導経路により制御されることを示唆する。
【０２４０】
ＣＡＰＬ、ＫＩＡＡ０４６７およびＤＫＦＺｐ５６６Ｋ１９２遺伝子のプロモーターはまだ記載されていない。我々は、可能性のあるＣＲＥＡＰ１−応答エレメントとして、ＣＡＰＬのプロモーター(それに対する明白なＣＲＥは報告されていない)を試験した。配列５'−ＴＧＡＣＡＣＡＡ−３'を有する、ＣＲＥ−様２と名付けた一つの配列が、ＰＥＰＣＫプロモーター(ヌクレオチド−２４９および−２５６)および位置したＣＡＰＬプロモーター(ヌクレオチド−３８５および−３９２)の両方で発見された。ＣＲＥ−様２エレメントは最小プロモーターの上流に位置し、ＣＲＥＡＰ１による誘導に関して試験した。このエレメントは、ＣＲＥＡＰ１による誘導を介在するのに十分であった。ＩＬ−８  ＣＲＥ−様およびＣＲＥ−様２配列の両方とも、ＩＬ−８プロモーターと同様に、増加したｃＡＭＰにより中程度に活性化され、ｃＡＭＰとＣＲＥ−ＢＰａにより相乗的に活性化された。故に、ＣＲＥＡＰ１応答性エレメントはｃＡＭＰ経路を介して活性化できるが、ＣＲＥＢ１を介してはできず、なぜなら、ＩＬ−８プロモーターに見られるＣＲＥ−様エレメントならびにＣＡＰＬおよびＰＥＰＣＫプロモーターに見られるＣＲＥ−様２エレメントが、ＣＲＥＢ１により認識されていないようであるためである。
【０２４１】
ＣＲＥＡＰは、薬剤開発の魅力的な標的である。これは、ＣＲＥＡＰの機能が、ＣＲＥＢと他の転写因子の相互作用により、ＣＲＥＢ−制御遺伝子の特異的サブセットを制御するためであるとき、特に当てはまる。ＣＲＥＢに直接影響するアンタゴニストまたはアゴニストのすべてが、ＣＲＥＢ−応答性遺伝子の数の多さのために、多くの作用を持ちすぎているようである。他方、ＣＲＥＡＰ機能のモジュレーターは、自己免疫および炎症性疾患の処置のためのケモカイン、例えば、ＩＬ−８およびＥｘｏｄｕｓ−１、増殖性疾患の処置に使用が示唆されるアンフィレギュリン、ならびに糖尿病の処置のためのＰＥＰＣＫのような特定の遺伝子のサブセットを遮断する能力を、これらの遺伝子のすべてがＣＲＥＡＰ１により非常に誘導されるため、有するかもしれない。
【０２４２】
実施例１０
ＣＲＥＡＰ２の同定
ＣＲＥＡＰ１の完全アミノ酸配列を、公的ＮＣＢＩデータベースのためのＢＬＡＳＴＰ検索に使用した。最初に、ＣＲＥＡＰ１コード領域と著しい相同性を有する２つの公的ドメインｃＤＮＡ(ＸＭ＿１１７２０１およびＦＬＪ００３６４)を同定した。ＸＭ＿１１７２０１のヌクレオチド配列を私有ｃＤＮＡライブラリーＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴＮ検索(Altschul S. F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))に使用し、ＸＭ＿１１７２０１公的配列を表す４個のクローンを同定した。全４個のクローンを、ＣＲＥＡＰにより誘導されることが最初に判明したＣＲＥ−ＬｕｃおよびＩＬ−８ｐ−Ｌｕｃレポーターとのコ−トランスフェクションにより、上記に準じた方法を使用して、機能的試験を行った。簡単に言うと、トリプシン処理したＨｅＬａ細胞を、完全増殖培地に６×１０４細胞／mlで再懸濁し、白色９６−ウェルプレート(Costar)に１００μl／ウェルの容量で分配する。細胞を、一晩、３７℃で５％ＣＯ２の組織培養インキュベーター中に静置する。ｐＧＬ３Ｂ−ＩＬ−８Ｐ−ＬｕｃレポータープラスミドまたはＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター(BD Biosciences)ならびに試験したｃＤＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ低血清培地(GIBCO BRL)に２５ng／mlの濃度で再懸濁する。レポータープラスミドおよびｃＤＮＡを、次いで、９６−ウェルのクリーンなＰＣＲプレート(ABGene)に、各々４μl／ウェルおよび３μl／ウェルで分配する。Ｆｕｇｅｎｅ６試薬(Roche Applied Bioscience)を１.５μl／トランスフェクションでおよびｐＲＬ−ＳＶ４０(Promega)プラスミドを２０ng／トランスフェクションで含む混合物を、予め希釈したｃＤＮＡを含む９６−ウェルＰＣＲプレートのウェルあたり１０μlの容量で添加する。各ウェルの内容物をピペッティングにより混合し、１０分、室温に静置する。各ウェルからの１５μlのトランスフェクション混合物を９６−ウェル組織培養プレートに移す。細胞を４８時間インキュベートする。
【０２４３】
ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を、デュアル−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系(Promega)を使用して、製造者の提供したプロトコールにしたがい測定する。簡単に言うと、１１５μlの新たに再構成したルシフェラーゼ試薬を、９６−ウェル組織培養プレートの各ウェルにMulti drop 384で添加し、１５分インキュベーション後、発光を、LUMINOSKAN Ascent照度計(Thermo Labsystems)で、４００msec積分時間で読む。続いて、１１５μlのＳｔｏｐ−ａｎｄ−Ｇｌｏ試薬を９６−ウェル組織培養の各ウェルに添加し、１５分インキュベーション後、発光をLUMINOSKAN Ascent照度計で、２００msec積分時間で読む。試験した各ｃＤＮＡの活性をホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の対応する比率として測定する。
【０２４４】
４個のクローンのうち１個のクローンが活性であるように見えた。このクローンの挿入物を一方向で十分配列決定し、ＸＭ＿１１７２０１  ｃＤＮＡから予測される公的ドメインタンパク質ＸＰ＿１１７２０１と完全に重複する、５８６アミノ酸のＯＲＦをコードするように見えた。このクローンをＣＲＥＡＰ２としてアノテーションし、ヌクレオチド１７７の開始コドンと２２５６に停止コドンをコードするＴＧＡを有する、６９３アミノ酸の予測されるタンパク質をコードする。文献の検索は、ＣＲＥＡＰ２の一部をコードするｃＤＮＡが存在するが、すべてヒトＣＲＥＡＰ２の完全配列も、提供されるタンパク質の機能も含んでいないことを示唆する。
【０２４５】
ヒトＣＲＥＡＰ２のヌクレオチド配列を下記に示す。開始コドンはヌクレオチド１７７に位置し、２２５６の停止コドンをコードするＴＧＡを斜体で示す：
【表９】
2007523608.tif 000010
【０２４６】
ヒトＣＲＥＡＰ２の予測されるアミノ酸配列を下記に示す：
【表１０】
2007523608.tif 000011
【０２４７】
実施例１１
ＣＲＥＡＰ３の同定
上記と同様の方法を使用して、我々の私有ｃＤＮＡライブラリーＥＳＴデータベースから、公的ドメインクローン、ｃＤＮＡＦＬＪ００３６４の配列との比較によりクローンが見つかった。ＦＬＪ００３６４によりコードされる予測されるタンパク質は、イニシエーターＡＴＧを下記、ＣＲＥＡＰ１と相同性を有しないＮ−末端配列を有した。公的ドメインクローン配列と、我々のデータベースの類似のクローン比較により、私有クローン配列が、配列ＣＣＧＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧＣ(配列番号１７)(ここで、余分のＣを下線を引いて示す)に余分のＣを含むことが確認された。この余分のＣは、ゲノム配列の比較により確認された。この変化は、ＦＬＪ００３６４  ｃＤＮＡにより予測される最初の６３アミノ酸の除去をもたらし、ＣＲＥＡＰ１の予測されるタンパク質配列、Ｅ２３ＥＴＡＡＦＥ(配列番号１９)で非常に保存的な、アミノ酸配列ＥＥＴＲＡＦＥ(配列番号１８)で開始するフレーム内の別の８１アミノ酸に置換する。
【０２４８】
一連の連続的ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を、私有クローンの完全ＯＲＦに対して行った。ＰＣＲ増幅サイクルは：２分、９４℃、２３×[１５秒、９４℃、３０秒、６８℃および１５秒、７２℃]および２分、７２℃から成る。Advantage 2  ＤＮＡポリメラーゼ(BD Biosciences)を全増幅工程に使用した。全３個のＰＣＲ産物を、ＯＲＦの開始に対するヌクレオチド配列(５'−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＧＧＧ−３')(配列番号２０)の一般的なセンスプライマーＫＩＡＡｈＳ３＿Ｒ１で増幅した。ＥｃｏＲＩ制限部位を、慣用法を使用して、プライマーの５プライム末端配列に包含させた。最初のＰＣＲに関して、ヒトゲノムＤＮＡ(BD Biosciences)を鋳型として(２mg／反応)、およびアンチセンスプライマーＫＩＡＡｈＡＳ２(５'−ＣＣＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＣＧＣＧ−３')(配列番号２１)を使用した。１４２nt  ＰＣＲ産物をフェノール−クロロホルム混合物で抽出し、イソプロパノールで沈殿させた。沈殿を氷冷７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液で再懸濁した。５ngの産物を、ＫＩＡＡｈＳ３＿Ｒ１センスおよびＫＩＡＡｈＡＳ３(５'−ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＴＣＡＴＧ−３')(配列番号２２)アンチセンスプライマーとの２回目のＰＣＲの鋳型として使用した。１６１nt  ＰＣＲ産物を元のＰＣＲ産物と同様に加工し、５ngの再懸濁したＤＮＡを、ＫＩＡＡｈＳ３＿Ｒ１センスおよびＫＩＡＡｈＡＳ４(５'−ＴＧＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＣＣＧ−３')(配列番号２３)アンチセンスプライマーとの最終ＰＣＲの鋳型として使用した。全てのプライマーは、SIGMA-Aldrich Corp.(Saint Louis, MO, USA)から得たか、または慣用法で製造した。
【０２４９】
２０２nt産物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、私有クローンのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化プラスミドに挿入した。再構築した完全長ＦＬＪ００３６４  ｃＤＮＡの１６個の個々のクローンを配列検証し、上記のようにＣＲＥ−ＬｕｃおよびＩＬ−８ｐ−Ｌｕｃレポーターで機能的試験を行った。ＰＣＲ−挿入ミスマッチがなく、両方のレポーターを強力に活性するクローン＃５を、ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントに使用し、ＣＲＥＡＰ３としてアノテーションした。
【０２５０】
ＣＲＥＡＰ３のヌクレオチド配列を下記に示す。ヌクレオチド４６の開始コドンおよび１９０５のＴＧＡ停止コドンを、斜体で示す。太字かつ下線を引いて示す残基２８８のＣは、ゲノム配列と私有クローン配列の比較のために付加していることに注意。下線ＣＧＡＧＧ配列は、私有クローンの５'−末端を示す。この配列の上流のヌクレオチド配列を、ＰＣＲで、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、上記の私有クローンに挿入して戻した。
【０２５１】
ＣＲＥＡＰ３のヌクレオチド配列：
【表１１】
2007523608.tif 000012
【表１２】
2007523608.tif 000013
【０２５２】
ＣＲＥＡＰ３  ｃＤＮＡは、ヌクレオチド４６の開始コドンと、１９０５の停止コドンをコードするＴＧＡを有する、６１９アミノ酸の予測されたタンパク質をコードする。公的クローンＦＬＪ００３６４により予測される配列と異なる、ＣＲＥＡＰ３によりコードされるアミノ酸の別の正しい配列を、下線を引く。アミノ酸位置５５１および６１６のグルタミン酸およびアラニンを太字で示す。
【表１３】
2007523608.tif 000014
【０２５３】
上記の２８８の位置の余分なＣのために、最初の８１アミノ酸は、ＦＬＪ００３６４から予測されるポリペプチドと正しい私有クローンの間で異なる。
【０２５４】
我々は、示したＣＲＥＡＰ３によりコードされるアミノ酸配列が、それがＣＲＥＡＰ１およびＣＲＥＡＰ２とかなりの相同性を示すため、正しいと考える。簡単に言うと、ＣＲＥＡＰ遺伝子ファミリー配列を、ClustalWを使用して比較した。アミノ酸同一性を、Align, version 2.0(Myers E.W. and Miller W., Bull. Math Biol 51:5-37 (1989))およびBlosum 50スコアリング・マトリックス(ＣＩＴＥ)で決定した。ゲノム配列とのアラインメントを、ＢｌａｓｔＮおよびＣｅｌｅｒａ  ＣＨＤデータベース(Celera Genomics, Rockville, MD)を使用して行い、マスクされたコンセンサスヒト配列を検索した。(ファイル：CHGD_masked_assembly_500k-i)。
【０２５５】
私有クローンおよびＦＬＪ００３６４  ｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列は、２つの他の領域で異なる。私有クローンは付加的なＧＡＡトリプレットを含み、上記の通り、アミノ酸位置５５１にグルタミン酸を付加する。最後に、ＣＲＥＡＰ３  ｃＤＮＡの１個のヌクレオチドＡ／Ｇ変化が、上記の通り、アミノ酸位置６１６のスレオニン／アラニンの変化をもたらす。
【０２５６】
実施例１２
他の種由来のＣＲＥＡＰ遺伝子の同定
キイロショウジョウバエＣＲＥＡＰ遺伝子、ｄＣＲＥＡＰの同定：
ＣＲＥＡＰ１およびＣＲＥＡＰ３コード領域の両方で、慣用法にしたがい行った、Genebankタンパク質のおよびＤＮＡ配列データベースのＢＬＡＳＴＰ検索は、一つの予測されるキイロショウジョウバエ遺伝子、ＣＧ６０６４を同定した。この遺伝子はｄＣＲＥＡＰと名付け、そのアミノ酸配列を下記に示す。この配列は、ドロソフィラ・メラノガスター(D. melanogaster)の配列決定から、未知の機能の予測される遺伝子として見つかった、GenBankエントリー|7293954|gb|AAF49313.1|CG6064-PA[ドロソフィラ・メラノガスター](Adams et al., Science 287(5461):2185-2195 (2000))。ｄＣＲＥＡＰ遺伝子ＣＧ６０６４は挿入物を含まず、ヒトＣＲＥＡＰより幾分大きい７９７アミノ酸のタンパク質を予測する。
【０２５７】
ｄＣＲＥＡＰＤＮＡ配列
【表１４】
2007523608.tif 000015
【０２５８】
ｄＣＲＥＡＰの予測されるアミノ酸配列を下記に示す：
【表１５】
2007523608.tif 000016
【０２５９】
ｄＣＲＥＡＰの活性を下記の方法にしたがい分析する：
ｄＣＲＥＡＰオープン・リーディング・フレームをコードする２.３kb  ｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、センス(配列番号３７)およびアンチセンス(配列番号３８)プライマーを使用して増幅する。
ｄＣＲＥＡＰＯＲＦ  ｃＤＮＡの増幅に使用したセンスプライマーは：(キイロショウジョウバエＫｏｚａｋ配列ＣＡＡＣに下線を引く)
ＣＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＧＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＡＧ  (配列番号３７)
ｄＣＲＥＡＰＯＲＦ  ｃＤＮＡの増幅に使用したアンチセンスプライマーは：
ＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＴＣ  (配列番号３８)
【０２６０】
増幅した産物を、キイロショウジョウバエＰ−エレメント形質転換ベクター、ｐＵＡＳＴに挿入した(Brand and Perrimon, Development 118:401-415 (1993))。最終構築物ｐＵＡＳ−ｄＣＲＥＡＰを、ドロソフィラ・メラノガスターＳｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞(Ｓ２)におけるトランスフェクション実験に使用した。ホタル・ルシフェラーゼレポーターを創成し、それはキイロショウジョウバエＣＲＥエンハンサーエレメント(配列番号３９)(Eresh, S. et. Al. EMBO J. 16:2014-2022 (1997))の４コピー、その後にｈｓｐ７０最小プロモーターを含んだ。
オリゴヌクレオチド配列は、キイロショウジョウバエＣＲＥの４コピーを含む。ＣＲＥエレメントの配列に下線を引く：
ＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧ  ＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧ  ＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧ  ＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧ  (配列番号３９)
【０２６１】
Ｓ２細胞を、６ウェルプレート(Costar)中、ＣａＰＯ４法によりトランスフェクトした(Bunch, T. and Goldstein, L. Nucleic Acids Res. 17:9761-9782 (1989))。合計２５μgのＤＮＡを、４mlの細胞(〜１×１０６細胞／ml)を含む６−ウェル皿にトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を１８時間後に取り出し、ルシフェラーゼアッセイを４８時間後に行った。ＵＡＳ−トランス遺伝子は、Dr. Norbert Perrimonにより提供されたアクチンプロモーター−Ｇａｌ４プラスミドとのコ−トランスフェクションにより活性化された。トランスフェクション効率を、最小熱ショックプロモーター(慣用法にしたがい製造)により駆動されるｈｓｐｍｉｎウミシイタケ・ルシフェラーゼとのコ−トランスフェクションにより標準化した。ルシフェラーゼ活性を、デュアル−ルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を使用して測定した。ネガティブコントロールとして、Ｓ２細胞をＣＲＥ−ｈｓｐ−Ｌｕｃレポーターおよび空ｐＵＡＳＴベクターとコ−トランスフェクトした。データを、ネガティブコントロールとして示されるレポーター遺伝子の活性と比較した、誘導倍率として計算した。
【０２６２】
結果(表３参照)は、ヒトＣＲＥＡＰＳと同様、ｄＣＲＥＡＰがまたキイロショウジョウバエ中のＣＲＥを、ＣＲＥエレメントが存在するとき、それがＣＲＥ−ｈｓｐ−Ｌｕｃレポーターの活性を誘導するため、制御できることを示す。
【表１６】
2007523608.tif 000017
【０２６３】
マウスＣＲＥＡＰ１(ｍＣＲＥＡＰ１)遺伝子の同定：
マウスＣＲＥＡＰ１タンパク質も慣用法を使用して同定した。簡単に言うと、ｍＣＲＥＡＰ１  ｃＤＮＡを下記の順番で集合させた：
ヌクレオチド１−４８３は、マウスＥＳＴ  ＢＹ７５２０８０(ここおよび下記はGenBank受託番号である)から取った；
ヌクレオチド４８４−８９１は、マウスＥＳＴ  ＢＭ９５０９５５から取った；
ヌクレオチド８９２−９０９はマウスゲノムＤＮＡ配列Ｃｅｌｅｒａクローンから取った：
ヌクレオチド９１０−９８１はマウスＥＳＴ  ＣＡ３２６８９１から取った；
ヌクレオチド９８２−１６１０はマウスＥＳＴ  ＢＭ９３５８２０から取った；
ヌクレオチド１６１１−２４１６はマウスＥＳＴ  ＢＩ４５３５１０から取った。
【０２６４】
ｍＣＲＥＡＰ１の得られたヌクレオチド配列：
【表１７】
2007523608.tif 000018
【０２６５】
ｍＣＲＥＡＰ１のタンパク質配列のオープン・リーディング・フレームは、ヌクレオチド２５−１９１４によりコードされる。
ｍＣＲＥＡＰ１のタンパク質配列：
【表１８】
2007523608.tif 000019
【０２６６】
フグＣＲＥＡＰ１の同定：
ＣＲＥＡＰ１を、トラフグ(Fugu rubripres)で同定した。配列を、フグゲノム(バージョン３)に対するヒトＣＲＥＡＰ１タンパク質配列を、ＴＢＬＡＳＴＮを使用して同定した。非常に相同性の領域を、アライメントから回収した。回収された配列をさらに手で編集した(hand-edited)。
【０２６７】
フグＣＲＥＡＰ１アミノ酸配列：
【表１９】
2007523608.tif 000020
【０２６８】
フグＣＲＥＡＰ１  ＤＮＡ＿配列：
【表２０】
2007523608.tif 000021
【０２６９】
実施例１３
ヒトＣＲＥＡＰコード領域と、他の種由来の別のＣＲＥＡＰタンパク質との比較
全３個のＣＲＥＡＰ配列を、図１に示すようにそれらのコード領域のグローバル・アラインメントにより比較した。各タンパク質は同等のサイズであり、ＣＲＥＡＰ２が幾分大きい(６９３アミノ酸を、ＣＲＥＡＰ１および３各々の６５０および６１９アミノ酸と比較して)。タンパク質を大まかに保存に基づき３ドメインに分割できる。第一は、保存的アミノ末端第三であり、ＣＲＥＡＰ１のアミノ酸２６７を通して高い程度の同一性である(すなわち、アミノ酸１−２６７)。この領域は、３個のＣＲＥＡＰでほぼ３３％同一である。第２のドメインは、プロリン、グリシンおよびセリン残基の総数が非常に多い、ＣＲＥＡＰ１のアミノ酸２８９−５３８を通して伸びる中心領域である。これは、ＣＲＥＡＰ１  ＣＲＥＡＰ２、およびＣＲＥＡＰ３の各々のアミノ酸２８９−５２９、３７６−６０６、２３５−５３３に対応する。この領域はアミノ酸同一性は低いが、アミノ酸組成は類似している。最後に、カルボキシ末端から３分の１のタンパク質(大まかに、ＣＲＥＡＰ１の最後の７８アミノ酸(ＣＲＥＡＰ１のアミノ酸５７５−６５０)に対応する)は、全３個のタンパク質で、ほぼ３８％アミノ酸同一性でまた非常に保存されている。
【０２７０】
興味深いことに、タンパク質の最も保存的な部分はアミノ末端である。２４アミノ酸にわたる８０％同一性の領域が、全３個のタンパク質に存在する。この領域はまたキイロショウジョウバエで保存的であり、ＣＲＥＡＰ機能に必須であり、ＣＲＥＡＰ機能の制御の重要な領域を示すようである。ＣＲＥＡＰのアミノ末端の保存は、この領域がその機能に重要であることを示唆する。この考えは、アミノ−末端２５０アミノ酸の欠失が、ＣＲＥＡＰ１活性を消失させることを示すデータにより支持される(上記表１参照)。
【０２７１】
ほとんどのアミノ末端残基が必須であるか否かをさらに同定するために、ＣＲＥＡＰ１のＮ−末端５９アミノ酸のほとんどの欠失を産生した。ＣＲＥＡＰ１  ｃＤＮＡを元のｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６プラスミドから、ＳｃａＩ／ＸｈｏＩ制限酵素(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)により摘出した。ＣＲＥＡＰ１  ＯＲＦの１７７ヌクレオチドを欠損する２３８２ntのＳｃａＩ消化したＣＲＥＡＰ１  ｃＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ＥｃｏＲＶ／ＳａｌＩ消化したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６Ｂベクター(BD Biosciences)にフレーム内にサブクローン化した。正しいクローンを慣用法にしたがい単離し、配列検証した。このタンパク質(デルタ５９)をプロモーター−レポーターアッセイで試験した。その保存と一致して、これらの残基の欠失は、ＣＲＥＡＰ活性の８０−９０％損失に至った(データは示していない)。
【０２７２】
ヒトＣＲＥＡＰ１および他の種由来の同族体の類似性を図１に示す。全体的に、ヒトＣＲＥＡＰに関して記載した３個のドメインはまた他のＣＲＥＡＰ配列に包含されている。アミノ末端末端は非常に保存的である。注目に値するのは、ヒトＣＲＥＡＰのアミノ−末端の最も端の保存的アミノ酸がまたこれらのタンパク質で非常に保存的であることである。
【０２７３】
本試験で同定されたヒトＣＲＥＡＰ１  ｃＤＮＡは、予測される６５０アミノ酸タンパク質をコードする。ｃＤＮＡは、ＫＩＡＡ０６１６としてアノテーションされた多くのｃＤＮＡと部分的に重複するが、コードされるタンパク質の予測されるＣ−末端が異なる。我々は、Ｎ−末端ｃｏｉｌ−ｃｏｉｌドメイン(アミノ酸８−５４)、セリン／グルタミン−リッチドメイン(アミノ酸２８９−５５９)および強い負に荷電したＣ−末端ドメイン(アミノ酸６０２−６４３)を同定できた(データは示していない)。ヒトＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３と同様に、ＣＲＥＡＰ１に非常に類似性のタンパク質をコードする遺伝子が、示すようにマウスおよびフグゲノムで見られた。全体的に、ヒトおよびマウスＣＲＥＡＰ１遺伝子は９０％同一である。予測されるフグタンパク質は、５６６アミノ酸長であり、ヒトＣＲＥＡＰ１と６６％同一である。
【０２７４】
我々はまたキイロショウジョウバエゲノムおいて予測される、ＣＲＥＡＰ１様遺伝子を同定している。哺乳類および魚ＣＲＥＡＰ１遺伝子は、キイロショウジョウバエ配列と約２０％しか同一ではないが、キイロショウジョウバエ配列は他のＣＲＥＡＰ１タンパク質と類似の構成を共有する。各タンパク質は非常に保存的なアミノおよびカルボキシル末端領域と、プロリン、グルタミンおよびセリン残基に富む中心領域を含む。我々は、キイロショウジョウバエの予測される遺伝子をｄＣＲＥＡＰと呼ぶ。ｄＣＲＥＡＰの２８アミノ酸の最初の２２個はヒトＣＲＥＡＰ１と同一である。アミノ−末端は、完全に保存的なコンセンサスＰＫＡまたはＣＲＥＢタンパク質のリン酸化部位と類似のＰＫＣコンセンサスリン酸化部位(ＲＫＦＳ)である。ＣＲＥＢ中のこのセリン(ＣＲＥＢ１のセリン１３３)のリン酸化は、ｃＡＭＰによるＣＲＥＢ依存性遺伝子発現の誘導に必須である。
【０２７５】
ｄＣＲＥＡＰの最初の３２アミノ酸は、ヒトＣＲＥＡＰ１に６９％同一かつ８４％類似であり、また、ＣＲＥＡＰのアミノ末端がその機能に重要であるとの考えを支持する。ｄＣＲＥＡＰの中心ドメインも、また、相同性の低い低い複雑さの領域である。予測されるｄＣＲＥＡＰコード領域はあるグリシンおよびプロリン・リッチ領域を有するが、グルタミン残基が非常にリッチであるという点で独特である。再び、ヒトＣＲＥＡＰと同様に、タンパク質のカルボキシ末端の最も端は、ヒトＣＲＥＡＰ１と保存的である(最後の３０アミノ酸にわたり３０％)。
【０２７６】
ＣＲＥＡＰ遺伝子の関連性を表４に示す。全体として、ヒトＣＲＥＡＰ遺伝子は、ｄＣＲＥＡＰよりもお互いにより関連する。ＣＲＥＡＰ２はＣＲＥＡＰ１およびＣＲＥＡＰ３に、ＣＲＥＡＰ１およびＣＲＥＡＰ３が互いに類似するよりもわずかに類似しているが、すべて、３４−３９％の間の同一性である。全ヒトＣＲＥＡＰは、予測されるｄＣＲＥＡＰ遺伝子と約２０％同一であることが判明したが、上記の類似性はタンパク質の非常に保存的なアミノおよびカルボキシ末端に大きく依存する。すべての３個のＣＲＥＡＰ遺伝子がマウスおよびヒトゲノムで非常に保存的であることは注意すべきである(データは示していない)。これは、個々のイソ型が、独特で重要な機能を有することを示唆する。ＣＲＥＡＰの進化の過程での保存は、ＣＲＥＡＰがＣＲＥ活性の重要なレギュレーターであるとの概念を支持する。
【０２７７】
【表２１】
2007523608.tif 000022
【０２７８】
実施例１４
ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３の活性
ヒトＣＲＥＡＰ遺伝子の間の相同性は、それらが機能的に関連することを示唆する。これを調べるために、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３が、ＩＬ−８プロモーターおよびＣＲＥ−依存性プロモーターにより駆動される遺伝子発現を活性化する能力を、上記のコ−トランスフェクションアッセイで試験した。簡単に言うと、ＩＬ−８プロモーターまたはＣＲＥの４個のコピーと結合した最小プロモーターのいずれかにより駆動されるルシフェラーゼレポーターの発現のレベルを、空ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６発現ベクターまたは、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２もしくはＣＲＥＡＰ３のｃＤＮＡを担持する同じベクターとコトランスフェクションした後に決定した。結果は、ＣＲＥＡＰ１とＩＬ−８プロモーター−依存性またはＣＲＥ−依存性駆動ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子のいずれかとのコトランスフェクションが、ルシフェラーゼ活性の劇的増加をもたらすことを示す(表５参照)。ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３のいずれかのトランスフェクションも両方のレポーターの類似の活性を産生する。他の実験は、この活性がＣＲＥの完全性またはＩＬ−８プロモーターに存在するＣＲＥ−様部位に依存することを示す(データは示していない)。興味深いことに、ＣＲＥＡＰ３は、ＣＲＥＡＰ１およびＣＲＥＡＰ２と比較して、遺伝子発現の誘導レベルが２−４倍高いことが示された。故に、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３は、ＣＲＥ駆動遺伝子発現の強力なアクティベーターであり、ＣＲＥＡＰファミリーは配列および活性の両方が保存されたファミリーを示す。加えて、全３個のＣＲＥＡＰファミリーメンバーが、ゲノム−統合されたＵＡＳ−Ｌｕｃレポーターを担持するＨＬＲ−ＣＲＥＢ細胞系(Stratagene)で過剰発現されたとき、ＣＲＥＢ−ＧＡＬ４融合タンパク質を活性化する能力を示し、ＣＲＥＡＰタンパク質がプロモーターに結合したＣＲＥＢタンパク質との相互作用を介して遺伝子発現を誘導するはずであるとの証拠を支持する(データは示していない)。
【０２７９】
【表２２】
2007523608.tif 000023
【０２８０】
実施例１５
ＣＲＥＡＰ１タンパク質は転写アクティベーターである
いくつかの観察が、ＣＲＥＡＰ１が転写コ−アクティベーターであることを示唆する。第一に、我々は、ＣＲＥＡＰ１中のすべてのＤＮＡ結合活性を同定できていないが、各ＣＲＥＡＰタンパク質は予測されるＮ−末端ｃｏｉｌ−ｃｏｉｌドメイン(ｈＣＲＥＡＰ１残基８−５４)、セリン／グルタミン−リッチ・ドメイン(ｈＣＲＥＡＰ１残基２８９−５５９)および負に荷電したカルボキシル−末端を含む。
【０２８１】
ＣＲＥＡＰタンパク質が転写アクティベーターとして働くかを決定するために、全３個のＣＲＥＡＰ同族体の種々の領域(ＣＲＥＡＰ１のアミノ酸３００−６５０、ＣＲＥＡＰ２のアミノ酸２９６−６９４およびＣＲＥＡＰ３のアミノ酸３３５−６３５)を、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質として発現させ、ＧＡＬ４タンパク質結合配列と結合したレポーター遺伝子(ＵＡＳ−Ｌｕｃ(ｐＦＲ−Ｌｕｃレポーター))の発現を活性化する能力に関して試験した。簡単に言うと、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３の示す領域をＰＣＲにより増幅し、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをコードするｐＣＭＶ−ＢＤベクター(Stratagene)にフレーム内にサブクローンした。選択したプラスミドおよび空ベクター(ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６)を、ＨＥＫ２９３細胞に、７５ng／ウェルで、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche)を使用して上記のようにトランスフェクトした。５個のコンカテマー化ＧＡＬ４結合部位(ＵＡＳ)と結合した最小プロモーターにより駆動されるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＦＲ−Ｌｕｃレポーター(Stratagene)を、１００ng／ウェルでコ−トランスフェクトした。ポジティブコントロールとして、レポーターもまたＧＡＬ４−ＣＲＥＢ融合タンパク質(Stratagene)のみをコードするプラスミドと、またはＣＲＥＢキナーゼ誘導性活性化ドメインを活性化するためのタンパク質キナーゼＡ(Stratagene)の触媒的サブユニットをコードする発現構築物であるｐＦＣ−ＰＫＡの存在下、コ−トランスフェクトした。誘導倍率を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合性ドメインのみを担持する発現ベクターであるｐＣＭＶ−ＢＤでトランスフェクトした細胞で測定されるレポーターの活性と比較した。レポーターの活性は、３個の完全長ＣＲＥＡＰタンパク質により著しく影響を受けないが、ＣＲＥＡＰ１−３のカルボキシ−末端の半分を含む融合物は、ＵＡＳ−Ｌｕｃの発現を強力に誘導した(表６参照)。
【０２８２】
【表２３】
2007523608.tif 000024
【０２８３】
完全長ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３ならびにＧａｌ４  ＤＮＡ結合性ドメイン単独またはＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３のＣ−末端部分との結合体をコードする発現構築物を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位に結合した最小プロモーター(ｐＦＲＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ)により制御されるルシフェラーゼ遺伝子を誘導する能力に関して試験した。示すデータは、ｐＦＲ−Ｌｕｃレポーターとコ−トランスフェクトしたｐＣＭＶ−ＢＤベクターで見られる値に対して標準化している。
【０２８４】
ＣＲＥＡＰタンパク質がＣＲＥＢ１タンパク質を直接活性化できるか否かを決定するために、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２およびＣＲＥＡＰ３の発現構築物を個々に、またはＧＡＬ４−ＣＲＥＢプラスミド(Stratagene)と共に、ｐＦＲ−ＬｕｃレポーターのゲノムＤＮＡに統合されたコピーを担持するＨＬＲ細胞系(Stratagene)にトランスフェクトした。簡単に言うと、ＨＬＲ細胞を製造者の指示にしたがい維持した。選択したプラスミドおよび空ベクター(ｐＣＭＶ−ＢＤ)またはＧＡＬ４−ＣＲＥＢプラスミドのいずれかを、７５ng／ウェルで、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche)を使用して上記のようにトランスフェクトした。ポジティブコントロールとして、タンパク質キナーゼＡ(Stratagene)の触媒的サブユニットをコードする発現構築物であるｐＦＣ−ＰＫＡも、ＧＡＬ４−ＣＲＥＢとコ−トランスフェクトした。活性化の倍率は、空ベクターでトランスフェクトした細胞で測定したレポーターの活性と比較した。レポーターの活性は、３個の完全長ＣＲＥＡＰタンパク質により著しい影響を受けないが、ＧＡ４Ｌ−ＣＲＥＢ融合タンパク質の活性は、３個の完全長ＣＲＥＡＰとコ−トランスフェクトしたときに上方制御され、ＣＲＥＢおよびＣＲＥＡＰタンパク質が相互作用して活性転写複合体を形成することが示唆される。下記表７参照。
【０２８５】
【表２４】
2007523608.tif 000025
【０２８６】
ＣＲＥＡＰ１がＣＲＥＢと直接相互作用できるか否かを決定するために、ＣＲＥＡＰ１のＫ１およびＫ５変異体(表１参照)を、１００mm皿(Falcon)中で増殖させたＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬(Roche Applied Science)を使用して、製造者により提供されたプロトコールにしたがい、トランスフェクトした。トランスフェクション４０時間後、細胞をプレートからＰＢＳにかき集め、１０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７.６、２５０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＤＴＴ、０.１％ＮＰ−４０および新たに溶解したプロテアーゼインヒビターを含む８００μlの低ストリンジェンシー緩衝液に融解した。Ｍ２−アガロースビーズ(Sigma)を使用して、免疫沈降を行った。沈殿したタンパク質を４−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Invitrogen)上で分離し、ニトロセルロース膜(Invitrogen)に移した。ウェスタン・ブロットを、ＣＲＥＢに対する抗体(Cell Signaling Technology)を使用して行った。ネガティブコントロールとして、ＦＬＡＧ−標識ヒトヒストンデアセチラーゼ１(ＨＤＡＣ１)をコードする発現構築物を使用した。我々は、非常に保存的なｃｏｉｌ−ｃｏｉｌドメインを含む、ＣＲＥＡＰ１のＮ−末端１７０アミノ酸フラグメントが、内因性ＣＲＥＢ１とインビボで結合することを発見した。表１に示すデータは、この領域がＣＲＥのＣＲＥＡＰ−介在活性化に必須であることを証明する。
【０２８７】
ＣＲＥＡＰファミリーは、最近同定されたＬＩＭ−ｏｎｌｙタンパク質ファミリーに加えて、ＣＲＥＢコアクティベーターの進化の過程で保存された保存された派生物であり得る(Fimia, G. et al. 2000, Mol Cell Biol 20, 8613-8622)。興味深いことに、ＬＩＭ−ｏｎｌｙタンパク質は、既知のＣＲＥリプレッサーであるＣＲＥＭと結合し、リン酸化およびＣＢＰに非依存性の活性化機能を提供するが、我々のデータは、ＣＲＥＡＰが、ＣＲＥＢ１により認識されない、規範的ＣＲＥ部位に結合したＣＲＥＢ１およびＣＲＥ−様エレメントに結合したＣＲＥＢ２と相互作用し、それにより遺伝子標的の異なるプールの発現を活性化するはずであることを示唆する。さらに、ＣＲＥＡＰ１は、ＣＲＥに見かけ上結合しているタンパク質と、ＡＰ−１結合部位の間の相乗効果を可能にするようである。ＣＲＥＡＰ１作用の解明は、ＣＲＥＢのアクティベーターに対する組織選択的応答を制御する機構の解明に役立つはずである。
【０２８８】
本明細書に記載の実験は、疾患中のＩＬ−８発現の制御におけるＣＲＥ−様部位の著しい問題を提示した。ＣＲＥまたはＣＲＥ−様部位は、先に、ＩＬ−８プロモーターに帰することが証明されていないが、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させるために働くβ２−アドレナリン作動性アゴニスト(β２−ＡＲ)は、気道平滑筋細胞のＩＬ−８分泌を促進する(Kavelaars A. et al. J. Neuroimmunol. 1997 Aug;77(2):211-6)。これは、β２−ＡＲアゴニストの気管支拡張剤としての使用が、喘息を引き起こすかもしれず、抗炎症性ステロイドと組み合わせて使用すべきであるため、特に重要である(Cockcroft, D. et al., 1993;Lancet 342:833-837;Knox, A.J 2002;Curr. Pharm Des.1863-1869;Vathenen et al., 1988 Lancet 1:554-558)。示したデータは、この効果がＣＲＥ−様部位およびおそらくＣＲＥＡＰ１を介したＩＬ−８転写の活性化に直接依存するものであり得ることを示唆する。
【配列表】
2007523608000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月15日(2005.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007523608000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月8日(2007.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善するための方法であり、必要とする対象に、有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを投与することを含む、方法。
【請求項２】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターがＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該モジュレーターが、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターがＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善する方法であり、必要とする対象に、有効量のＣＲＥＡＰモジュレーターを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターがＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害する、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の予防、処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であり、候補モジュレーターのＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する能力をアッセイすることを含む、方法。
【請求項２２】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該方法が、さらに、同定したＣＲＥＡＰ阻害性モジュレーターが、該病理学的状態のインビトロ、エキソビボまたはインビボモデルおよび／または該病理学的状態の対象での臨床試験で観察される病理学的影響を回復させる能力をアッセイすることを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態の予防、処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であり、候補モジュレーターがＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害する能力をアッセイすることを含む、方法。
【請求項２９】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該方法が、さらに、同定したＣＲＥＡＰ阻害性モジュレーターが、該病理学的状態のインビトロ、エキソビボまたはインビボモデルおよび／または該病理学的状態の対象での臨床試験で観察される病理学的影響を回復させる能力をアッセイすることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰモジュレーターを、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を、必要とする対象において予防、処置または改善するのに有効な量で含む、医薬組成物。
【請求項３６】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３８】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３９】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項４０】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害する、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項４１】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰタンパク質に対する１個またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４２】
該モジュレーターが、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物を含み、ここで、該ペプチド模倣物が該ＣＲＥＡＰタンパク質の活性を阻害できるものである、請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４３】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される任意の１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害できるものである、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項４４】
該ＣＲＥＡＰモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１個またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質がＣＲＥＡＰタンパク質の発現を阻害するように設計されているものである、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４５】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、ＣＲＥＡＰモジュレーターでの処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して上昇したｍＲＮＡレベルを有する対象を、ＣＲＥＡＰモジュレーター処置に適した候補者であるとする、方法。
【請求項４６】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、ＣＲＥＡＰモジュレーターでの処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して上昇したレベルを有する対象を、ＣＲＥＡＰモジュレーター処置に適した候補者であるとする、方法。
【請求項４８】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を予防、処置または改善する方法であり：
(ａ)対象におけるＣＲＥＡＰ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルをアッセイし；そして、
(ｂ)コントロールと比較してＣＲＥＡＰ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルが上昇した対象に、該病理学的状態を予防、処置または改善するのに十分な量のＣＲＥＡＰモジュレーターを投与する
ことを含む、方法。
【請求項５０】
該病理学的状態が神経変性疾患である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
該病理学的状態が炎症性疾患である、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
生物学的サンプル中のＣＲＥＡＰタンパク質のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを検出するための診断用キットであり：
(ａ)ＣＲＥＡＰのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；
(ｂ)(ａ)に相補的なヌクレオチド配列；
(ｃ)ＣＲＥＡＰポリペプチド、またはそのフラグメント；
(ｄ)ＣＲＥＡＰポリペプチドに対する抗体；または
(ｅ)ＣＲＥＡＰタンパク質に対するペプチド模倣物
を含み、ここで、成分(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)または(ｅ)が、実質的構成要素を構成し得る、キット。
【請求項５５】
該ＣＲＥＡＰタンパク質が、ＣＲＥＡＰ１、ＣＲＥＡＰ２またはＣＲＥＡＰ３からなる群から選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるＣＲＥＡＰアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５７】
請求項５６記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸配列。
【請求項５８】
配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるＣＲＥＡＰアミノ酸配列から成る、単離ポリペプチド。
【請求項５９】
請求項５８記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸配列。
【請求項６０】
生物のＣＲＥＡＰ遺伝子によりコードされる、単離ＣＲＥＡＰポリペプチド。
【請求項６１】
請求項６０記載のＣＲＥＡＰポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離ＤＮＡ。
【請求項６２】
請求項５７記載の単離核酸のフラグメントを含む、ベクター分子。
【請求項６３】
１個またはそれ以上の転写制御配列を含む、請求項６２記載のベクター分子。
【請求項６４】
請求項６３記載のベクター分子を含む、宿主細胞。
【請求項６５】
請求項５６記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項６６】
ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメントである、請求項６５記載の抗体フラグメント。
【請求項６７】
ポリクローナル抗体である、請求項６５記載の抗体。
【請求項６８】
モノクローナル抗体である、請求項６５記載の抗体。
【請求項６９】
請求項５６記載のポリペプチドを産生する方法であり、配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるアミノ酸を含むポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらすことを含む、方法。
【請求項７０】
該方法がさらに該細胞により産生されたポリペプチドを回収することを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
該外来ポリヌクレオチドが、配列番号１、１５および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
請求項５６記載のポリペプチドを産生する方法であり、配列番号２、１６および２５からなる群から選択されるアミノ酸から成るポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらすことを含む、方法。
【請求項７３】
該方法がさらに該細胞により産生されたポリペプチドを回収することを含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
該外来ポリヌクレオチドが、配列番号１、１５および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
ヒトＣＲＥＡＰタンパク質のアミノ酸領域１−２６７、２８９−５３８、３５６−５８０および５７５−６５０のフラグメントをコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、ベクター分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
他の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、ＣＲＥＡＰモジュレーターまたは外来ＣＲＥＡＰタンパク質での処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して異常なレベルを有する対象を、処置に適した候補者であるとする、方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
さらに別の局面において、本発明は、ＣＲＥ−依存性遺伝子発現の異常な活性化またはケモカインの異常な活性化に関連した病理学的状態を有し、１個またはそれ以上のＣＲＥＡＰモジュレーターまたは外来ＣＲＥＡＰタンパク質での処置に適した候補者である可能性がある対象を診断する方法であり、該対象由来の生物学的サンプルにおけるＣＲＥＡＰタンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイし、ここで、コントロールと比較して異常なｍＲＮＡレベルを有する対象を、処置に適した候補者であるとする、方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の他の局面は、前記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体および誘導体、変異体および誘導体のフラグメント、および前記のアナログを産生する方法を提供する。本発明のこの局面の好ましい態様において、前記ＣＲＥＡＰタンパク質の産生方法であり、このようなポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをその中に組み込まれて有する宿主細胞を、該宿主細胞中のポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現されたポリペプチドの産生をもたらし、所望により発現したポリペプチドを回収することを含む、方法を提供する。
【国際調査報告】
2007523608.tif 000047
2007523608.tif 000048
2007523608.tif 000049
2007523608.tif 000050
2007523608.tif 000051