(57)【要約】  驚くべき事に、下記の式（Ｉ）で示されるトリオキソピリミジン誘導体および水溶性シクロデキストリン（以下ＣＤと略記する）で形成されるトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体が、高い水溶性、優れた安定性、および低い局所刺激性を示し、治療物質として有用であることが判明した。したがって本発明は、トリオキソピリミジン誘導体またはその塩およびシクロデキストリン、好ましくはα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンまたは水溶性シクロデキストリン誘導体（水溶性とは、２５℃において少なくとも０．５gr／１００ml（水）の溶解度と定義する）［ここで、トリオキソピリミジン誘導体は式（Ｉ）で示される］で形成されたトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体を提供する。さらに、このようなシクロデキストリンとのトリオキソピリミジン複合体およびＬ−リジンまたはＬ−アルギニンのようなアジュバントは、改善された水溶性およびバイオアベイラビリティー、優れた安定性、ならびに低い局所刺激性を示し、治療製剤として有用であることが判明した。
2007530628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリオキソピリミジン誘導体またはその塩および水溶性シクロデキストリンで形成されるトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体であって、トリオキソピリミジン誘導体が、式（Ｉ）：
【化１】
2007530628.tif 000019
［式中、
Ｒ１は、場合により−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−により１回または数回で中断されていてもよいＣ３−Ｃ２０アルキルであるか；または、
基Ｗ−Ｖ［式中、
Ｗは、化学結合またはフェニルであり；そして、
Ｖは、フェニル、フェニルオキシ、フェニルチオ、フェニルスルフィニル、フェニルスルホニルまたはフェニルアミノ［これらのフェニル部分は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、シアノ、ニトロもしくはＣ１−Ｃ６−アルキルスルホニルにより１回または数回置換されていてよい］である］であり；そして、
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル［このアルキル基は、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはアミノにより１回または２回置換されており、そして、場合により−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−により１回または数回で中断されていてもよい］；
ベンゾイル基［これは非置換であるか、または、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルホニル、アミドスルホニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、ビス−Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニルにより１回または数回置換されていてよい］；
へテロ芳香族アシル基；または、
フェニルもしくはヘテロアリール基［これらは非置換であるか、または、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−ジアルキルアミノ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、Ｃ１−Ｃ６−アシル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、アミドスルホニル、ビス−Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシカルボニル、カルボキシにより１回または数回置換されている］である］
で示される、トリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項２】
アジュバントとしてＬ−リジンまたはＬ−アルギニンを添加した、請求項１に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項３】
トリオキソピリミジン誘導体が、
５−ビフェニル−４−イル−５−［４−（４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−イル］ピリミジン−２，４，６−トリオン；
５−（４−フェノキシ−フェニル）−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン；
５−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−フェニル］−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン；
５−［４−（３，４−ジクロロ−フェノキシ）−フェニル］−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン；
５−［４−（４−ブロモ−フェノキシ）−フェニル］−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン、
またはこれらの塩である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項４】
水溶性シクロデキストリンがβ−シクロデキストリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項５】
水溶性シクロデキストリンがヒドロキシプロピル化シクロデキストリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項６】
水溶性シクロデキストリンがランダムメチル化シクロデキストリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項７】
水溶性シクロデキストリンがスルホブチル−β−シクロデキストリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項８】
水溶性シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体を含有する薬学的製剤。
【請求項１０】
薬学的に許容される添加物を含有する請求項９に記載の薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピリミジン−２，４，６−トリオン（トリオキソピリミジン）の薬学的組成物、それらの製造方法および使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基底膜を分解できる、亜鉛およびカルシウム依存プロテアーゼのファミリーである（Egeblad, M., and Werb, Z., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 161-174；Overall, C.M., and Lopez-Otin, C., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 657-672）。これらは、胚の発生および成長（Holmbeck, K.ら、Cell 99 (1999) 81-92；Vu, T.H.ら、Cell 93 (1998) 411-422）ならびに組織のリモデリングおよび修復（Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol. 10 (1998) 602-608；Lund, L.R.ら、EMBO J. 18 (1999) 4645-4656）において中心的役割を有すると考えられる。故にＭＭＰの過剰または不適当な発現は、腫瘍の進行（Egeblad, M., and Werb, Z., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 161-174；Overall, C.M., and Lopez-Otin, C., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 657-672）および動脈瘤の形成（Carmeliet, P.ら、Nat. Genet. 17 (1997) 439-444）を包含する多くの組織リモデリングプロセスの病因に寄与し得る。ＭＭＰの作用はＥＣＭ分解に限定されるものでは決してない（Chang, C. and Werb, D., Trends Cell Biol. 11 (2001) S37-43）。ＥＣＭタンパクによって捕捉されたペプチド成長因子は、ＭＭＰ−９により分解されると利用可能となる（Manes, S.ら、J. Biol. Chem. 274 (1999) 6935-6945）。ＭＭＰはＶＥＧＦのバイオアベイラビリティーを増大させ得る（Bergers, G.ら、Nat. Cell Biol. 2 (2000) 737-744）のみならず、プラスミノーゲンの開裂によってアンギオスタチンのような血管新生インヒビターを作り出す（Dong, Z.ら、 Cell 88 (1997) 801-810）。ＭＭＰは骨髄幹細胞の動員に関与していると考えられる（Janowska-Wieczorek, A.ら、Blood 93 (1999) 3379-3390）。Ｇ−ＣＳＦが誘導するＨＰＣの動員中に、高濃度のＭＭＰ９が観察された（Carstanjen, D.ら、Transfusion 42 (2002) 588-596）。
【０００３】
トリオキソピリミジン類は、周知の構造クラス由来の化合物である。このような化合物は、例えば、米国特許第６２４２４５５および６１１０９２４号；国際公開公報第９７／２３４６５号；国際公開公報第９８／５８９１５号；国際公開公報第０１／２５２１７号（これらは参照として本明細書に組み入れられる）；ならびにGrams, F.ら、Biol. Chem. 382 (2001) 1277-1285に記載されており、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１４に対して有効且つ極めて選択的である。
【０００４】
シクロデキストリン類は、デンプンに由来する環状炭水化物である。これらは、グルコピラノース単位の数によって構造が相互に異なっている。親となるシクロデキストリンは、６、７および８個のグルコピラノース単位を含み、各々α、βおよびγ−シクロデキストリンと称する。酵素によるデンプンの変換により調製されるα−、β−およびγ−シクロデキストリンは、疎水性空洞の直径が異なっており、一般に数多くの親油性物質の包接に好適である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
極めて強力なＭＭＰインヒビターであるトリオキソピリミジンは、水および水性溶媒に難溶性である。故に本発明の目的は、このようなトリオキソピリミジンを溶解でき、そのようなトリオキソピリミジンの水性組成物を薬学的組成物として使用できるような水性組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
驚くべき事に、下記の式（Ｉ）で示されるトリオキソピリミジン誘導体、および水溶性シクロデキストリン（以下ＣＤと略記する）で形成されるトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体が、高い水溶性、優れた安定性、および低い局所刺激性を示し、治療製剤として有用であることが判明した。
【０００７】
さらに、このようなシクロデキストリンとのトリオキソピリミジン複合体、およびＬ−リジンまたはＬ−アルギニンのようなアジュバントは、改善された水溶性およびバイオアベイラビリティー、優れた安定性、ならびに低い局所刺激性を示し、治療製剤として有用であることが判明した。したがって本発明は、トリオキソピリミジン誘導体またはその塩およびシクロデキストリン、好ましくはα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンまたは水溶性シクロデキストリン誘導体（水溶性とは、２５℃において少なくとも０．５gr／１００ml（水）の溶解度と定義する）［ここで、トリオキソピリミジン誘導体は式（Ｉ）で示される］で形成されたトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体を提供する。
【０００８】
さらに本発明は、Ｌ−リジンまたはＬ−アルギニン、好ましくはＬ−リジンのようなアジュバントの存在下に、式（Ｉ）で示されるトリオキソピリミジン誘導体またはその塩およびシクロデキストリン、好ましくはα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンまたは水溶性シクロデキストリン誘導体（水溶性とは、２５℃において少なくとも０．５gr／１００ml（水）の溶解度と定義する）で形成されたトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体を提供する。
【０００９】
本発明のこのような複合体はトリオキソピリミジン−シクロデキストリンの包接複合体であり、液体または固体形態で提供される。
【００１０】
本発明の複合体において、好ましくは、トリオキソピリミジン１molが、シクロデキストリン、好ましくはβ−もしくはγ−シクロデキストリンまたはこれらの誘導体約１molないし２molにより複合体形成および包接される。
【００１１】
本発明はさらに、薬学的有効量の活性成分として、本発明によるトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体を含有する、それを必要とする患者の処置、好ましくは気管支炎症疾患の処置のための薬学的製剤を提供する。
【００１２】
本発明の薬学的製剤は、極めて重要または不適切なＭＭＰ発現が引き起こす病理に、治療的、予防的または防御的に適用可能である。好ましくは、このような処置は、関節リウマチ、腫瘍、転移性浸潤、骨粗鬆症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、角膜潰瘍、アテローム性動脈硬化症、気管支炎症疾患、気管支炎症疾患、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患または気腫の、治療的、予防的または防御的処置である。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体の薬学的有効量を含有する注射製剤を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、本発明の複合体の液体水性製剤であって、薬学的に許容される担体が水であり、投与する組成物が水溶液であるような製剤である。この場合本発明の活性物質は、水溶液中のシクロデキストリンに包接されることにより複合体の状態にある。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−リジン（１０mMおよび１０００mMの間、好ましくは１０mMおよび５００mMの間、そしてより好ましくは１０mMおよび１００mMの間のＬ−リジン濃度）存在下の本発明の複合体の液体水性製剤であって、薬学的に許容される担体が水であり、投与される組成物が水溶液である製剤である。この場合本発明の活性物質は、Ｌ−リジン存在下で水溶液中のシクロデキストリンに包接されることにより複合体の状態にある。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、固体状態である本発明の複合体であって、その複合体が水に可溶の粉末であり、投与前に溶解するか、またはそのまま投与する、複合体である。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、錠剤、カプセル剤、多粒子系、経口溶液、経口懸濁液、非経口投与用溶液、懸濁液、およびインプラント、吸入用溶液または粉末、親水型もしくは親油型クリームおよび軟膏、局所、経皮または膣用の水性もしくは水−アルコール性ゲルおよびローション、子宮内器具、眼用の溶液、懸濁液およびインプラント、直腸用の坐剤、懸濁液、スプレー、溶液、ならびに泡沫剤であってよい、所望の投与形態に従う、異なるガレヌス製剤の形態に含まれる複合体である。
【００１８】
本発明はさらに、そのような疾患、好ましくは気管支炎症疾患に罹患している患者において、該疾患の処置のために薬学的有効量の該薬学的製剤を使用することを提供する。本発明の複合体は、好ましくは局所、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経口または非経口レベルで投与する。
【００１９】
本発明はさらに、好ましくはこのような疾患、好ましくは気管支炎症疾患の処置のための、薬学的製剤の製造方法であって、好ましくは補助物質、緩衝剤、保存剤、溶媒および／または粘度調節剤をさらに含有する、水または緩衝化水溶液中でトリオキソピリミジンを薬学的有効量のシクロデキストリンと複合体形成させることを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
好ましいシクロデキストリンは、
− α−シクロデキストリンおよびその合成誘導体、例えばＨＰαＣＤ、メチル化αＣＤ、ヒドロキシブチルαＣＤ、マルトシルαＣＤ、グルコシルαＣＤ、
− β−シクロデキストリンおよびその合成誘導体、例えばＨＰβＣＤ、ＳＢＥβＣＤ、ＲＭβＣＤ、ＤＩＭＥβＣＤ、ＴＲＩＭＥβＣＤ、ヒドロキシブチルβＣＤ、グルコシルβＣＤ、マルトシルαＣＤ、
− γ−シクロデキストリンおよびその合成誘導体、例えばＨＰγＣＤ、ＲＭγＣＤおよびＤＩＭＥγＣＤ、ヒドロキシブチルγＣＤ、グルコシルγＣＤ、マルトシルγＣＤ、
である。
【００２１】
本発明はさらに、上記疾病の治療的、予防的または防御的処置のための医薬を製造するための、治療有効量のピリミジン−２，４，６−トリオンおよび少なくとも１種類のシクロデキストリン、ならびに場合により薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物の使用に関するものである。
【００２２】
本発明はさらに、上記疾病の治療的、予防的または防御的処置のための医薬を製造するための、治療有効量のａ）ピリミジン−２，４，６−トリオン、ｂ）少なくとも１種類のシクロデキストリン、ｃ）Ｌ−リジンまたはＬ−アルギニン、好ましくはＬ−リジン、およびｄ）場合により薬学的に許容される担体、を含有する薬学的組成物の使用に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明に係るピリミジン−２，４，６−トリオン（トリオキソピリミジン）は、式（Ｉ）：
【００２４】
【化２】
2007530628.tif 000003
【００２５】
［式中、
Ｒ１は、場合により−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−により１回または数回で中断されていてもよいＣ３−Ｃ２０アルキルであるか；または、
基Ｗ−Ｖ［式中、
Ｗは、化学結合またはフェニルであり；そして、
Ｖは、フェニル、フェニルオキシ、フェニルチオ、フェニルスルフィニル、フェニルスルホニルまたはフェニルアミノ［これらのフェニル部分は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、シアノ、ニトロもしくはＣ１−Ｃ６−アルキルスルホニルにより１回または数回置換されていてよい］である］であり；そして、
【００２６】
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル［このアルキル基は、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはアミノにより１回または２回置換されており、そして、場合により−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−により１回または数回で中断されていてもよい］；
ベンゾイル基［これは非置換であるか、または、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルホニル、アミドスルホニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、ビス−Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニルにより１回または数回置換されていてよい］：
へテロ芳香族アシル基；または、
フェニルもしくはヘテロアリール基［これらは非置換であるか、または、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−ジアルキルアミノ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、Ｃ１−Ｃ６−アシル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、アミドスルホニル、ビス−Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシカルボニル、カルボキシにより１回または数回置換されている］である］
で示される。
【００２７】
本発明の目的は、新規な薬学的調製物の製造における、式（Ｉ）の化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、エナンチオマー形態、ジアステレオマーおよびラセミ化合物の使用である。
【００２８】
本明細書中Ｒ１に対して使用する「Ｃ３−Ｃ２０アルキル」という語は、３ないし２０、好ましくは４ないし１２、より好ましくは８ないし１２個の炭素原子を含む直鎖または分岐飽和炭化水素を表す。例としては、ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、２−エチルヘキシル、２−エチルオクチルである。好ましいＣ３−Ｃ２０アルキル残基は、ｎ−オクチルおよびｎ−デシルである。このＣ３−Ｃ２０アルキル基は、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−、好ましくは−Ｏ−により１回または数回で中断されていてよい。このようなＣ３−Ｃ２０アルキル基の例は、５−エトキシ−ｎ−ペンチル、９−メトキシ−ｎ−オクチルである。
【００２９】
「Ｖ」のフェニル部分の置換基は、好ましくはｐおよび／またはメタ位に位置する。
【００３０】
好ましくは、基「Ｗ−Ｖ」は、ｐ−ブトキシフェニル、ビフェニル、フェノキシフェニル、ｐ−クロロ−フェノキシフェニル、ｐ−ブロモ−フェノキシフェニル、３，４−ジクロロ−フェノキシフェニルである。
【００３１】
Ｒ２において使用する「Ｃ１−Ｃ１０−アルキル」という語は、１ないし１０、好ましくは１ないし６、より好ましくは１ないし４個の炭素原子を含む直鎖または分岐飽和炭化水素を表す。このＣ１−Ｃ１０−アルキルは、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−、好ましくは−Ｏ−により１回または数回で中断されていてよく、より好ましくはエチレンオキシフラグメントで構成される基を生ずるように中断されていてよい。Ｃ１−Ｃ１０−アルキル基の好ましい例は、ヒドロキシエチル；ヒドロキシプロピル；エトキシエチル；１，２−ビスエトキシエチル；１，２−ビス−ヒドロキシ−エチルである。
【００３２】
Ｒ２中の「ヘテロ芳香族アシル基」において使用するヘテロ芳香族という語は、五または六員芳香環［ここで、１、２または３個の環原子は酸素、窒素または硫黄であり、残りの環原子は炭素原子である］を指す。このヘテロ芳香族基は、他のフェニル環と融合していてもよい。このようなヘテロ芳香族アシル基の例は、フランカルボキシル、チオフェンカルボキシル、４−イミダゾリルカルボキシル、３−ベンズチオフェンカルボキシル、ピリジルカルボキシルである。好ましい例は、フランカルボキシルおよびチオフェンカルボキシルである。
【００３３】
本明細書中使用する「ヘテロアリール」という語は、上記で定義のヘテロ芳香族を意味する。好ましいヘテロアリール基は、電子不足残基、例えばピリジン、ピリミジン、ピラジンまたは１，３，５−トリアジンといった窒素を含む六員環である。ヘテロアリール基ピリミジニルまたはピラジニルが特に好ましい。
【００３４】
Ｒ２のフェニルまたはヘテロアリール基上に存在し得る置換基は、原則として各々の置換反応にとって好適な任意の位置にある。好ましくは１または２個の置換基がパラおよび／またはメタ位に存在する。
【００３５】
単独またはＣ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−ジアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−アシル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニル、ビス−Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミドスルホニルもしくはＣ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルと組み合わせて本明細書中で使用する「Ｃ１−Ｃ６−アルキル」という語は、１ないし６，好ましくは１ないし４個の炭素原子を有する直鎖または分岐飽和炭化水素を指す。好ましい例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはｔｅｒｔ−ブチルである。
【００３６】
本明細書中使用する「Ｃ２−Ｃ６−アルケニル」という語は、２ないし６，好ましくは２ないし５個の炭素原子および１または２個の二重結合を含む直鎖または分岐不飽和炭化水素を指す。２個の二重結合が存在する場合、これらは孤立していても共役二重結合であってもよく、好ましくは共役二重結合である。好ましい例は、アリルまたはペンタジエニルである。
【００３７】
本明細書中使用する「Ｃ２−Ｃ６−アルキニル」という語は、２ないし６，好ましくは２ないし４個の炭素原子を含む直鎖または分岐炭化水素を指す。好ましい例はプロパルギルである。
【００３８】
「ハロゲン」という語は、フッ素、塩素、臭素、沃素、好ましくは塩素または臭素を意味する。
【００３９】
本明細書中使用する「数回」という語は、１、２、３または４回、好ましくは１または２回を意味する。
【００４０】
本明細書中前記で使用する「薬学的に許容される塩」という語は、式（Ｉ）の化合物の生物学的有効性および性質を保持し、適切な非毒性有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される通常の酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硫酸、スルファミド酸、リン酸および硝酸といった無機酸から誘導される塩、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、蓚酸、琥珀酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などといった有機酸から誘導される塩を包含する。塩基付加塩の例は、水酸化アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および四級アンモニウム、例えば水酸化テトラメチルアンモニウムから誘導される塩を包含する。薬学的化合物（即ち薬物）から塩への化学的修飾は、化合物の改善された物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性ならびに溶解性を得るための、製薬化学者にとって周知の技術である（例えば、Ansel, H.ら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., (1995) p.196およびp.1456-1457を参照されたい）。
【００４１】
本発明の化合物は欧州特許第０８６９９４７号および国際公開公報第０１／２５２１７号の記載に従って調製できる。
【００４２】
本発明によれば、以下の化合物が特に好ましい：
【００４３】
５−ビフェニル−４−イル−５−［４−（４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−イル］ピリミジン−２，４，６−トリオン（化合物I）
５−（４−フェノキシ−フェニル）−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン（化合物II）
５−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−フェニル］−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン（化合物III）
５−［４−（３，４−ジクロロ−フェノキシ）−フェニル］−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン（化合物IV）
５−［４−（４−ブロモ−フェノキシ）−フェニル］−５−（４−ピリミジン−２−イル−ピペラジン−１−イル）−ピリミジン−２，４，６−トリオン（化合物V）
【００４４】
このトリオキソピリミジン誘導体（Ｉ）がカルボキシル基またはスルホニル基のような酸性部分を含む場合、この誘導体はその酸性部分によって塩基との塩を形成できるという事もまた明らかである。
【００４５】
上に述べた付加物型の塩に加えて、トリオキソピリミジンは水和物型または溶媒和物型をとり得る。これらは、式（Ｉ）の遊離化合物と式（Ｉ）の化合物の塩の水和物および溶媒和物の両者を包含する。これらはさらに式（Ｉ）の化合物の互変異性体をも包含する。
【００４６】
本発明に係るシクロデキストリン（ＣＤ）は、デンプンの酵素分解により生成される環状オリゴ糖であって、可変数、ほとんどが６、７または８個のグルコピラノース単位より成り、これらのシクロデキストリンはそれぞれα、β、およびγシクロデキストリン（αＣＤ、βＣＤおよびγＣＤ）と称される。本発明のシクロデキストリンは、シクロデキストリン自身、またはシクロデキストリン誘導体であり、これらは２５℃で少なくとも０．５gr／１００mlの量が水に溶解する。
【００４７】
本発明において好ましく使用される水溶性シクロデキストリンとは、少なくともβ−シクロデキストリンの水溶解度を有するシクロデキストリンを指す。このような水溶性シクロデキストリンの例は、スルホブチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、およびこれらの塩である。特にスルホブチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、およびこれらの塩である。
【００４８】
本発明による好ましいシクロデキストリンはさらに、メチルシクロデキストリン（シクロデキストリンのメチル化産物）、ジメチルシクロデキストリン（ＤＩＭＥＢ）（好ましくは２および６位で置換されている）、トリメチルシクロデキストリン（好ましくは２、３および６位で置換されている）、「ランダムメチル化」シクロデキストリン（好ましくは２、３および６位でランダムに置換されている。但し、ユニットグルコピラノースにより幾つかの１，７ないし１，９メチルを伴う。ＲＭβＣＤ）、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰＣＤ、好ましくは主に２および３位（ＨＰ−βＣＤ、ＨＰ−γＣＤ）でランダムに置換されているヒドロキシプロピル化シクロデキストリン）、スルホブチルエーテルシクロデキストリン（ＳＢＥＣＤ）、ヒドロキシエチル−シクロデキストリン、カルボキシメチルエチルシクロデキストリン、エチルシクロデキストリン、ヒドロキシ基に炭化水素化した鎖をグラフト化により得られ、ナノ粒子を形成できる、両親媒性シクロデキストリン、モノアミノ化されたシクロデキストリンを（スペーサーアームで）グラフト化することにより得られるトリグリセリド−シクロデキストリンおよびコレステロールシクロデキストリンである。
【００４９】
本発明に係るアジュバントは、Ｌ−リジンまたはＬ−アルギニン、好ましくはＬ−リジンである。このようなアジュバントは、三重複合体の形成によって酸性成分の溶解度を増大させるのに使用できる。本発明のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体は、トリオキソピリミジンまたはその塩および水溶性シクロデキストリンを含有する水溶液を製造することにより得られる。水溶性シクロデキストリンは、好ましくはトリオキソピリミジンまたはその塩１mol／molに基づき１molまたはそれ以上、より好ましくは１〜１０mol、特に好ましくはトリオキソピリミジン１molあたりシクロデキストリン１〜２molの量で使用する。
【００５０】
水溶性シクロデキストリンの濃度が高いほどトリオキソピリミジンの溶解度が増す。この水溶液の製造方法には特に制限は課せられず、例えば水または緩衝液を使用し、およそ−５ないし３５℃の温度範囲で製造する。
【００５１】
シクロデキストリン水溶液を式（Ｉ）で示される過剰のトリオキソピリミジンと共に攪拌すると、これら２分子の間に複合体が形成される。しかしながら、平衡に到達するには少なくとも数日ほどかかるので、数時間後、または１日後では、本発明に係るトリオキソピリミジンの溶解性の改善は見いだされない。この溶液を濾過すると、溶液中の複合体が濾液に回収でき、この複合体は水に可溶性である。この複合体はまた、水溶液中に可溶化した既知量の式（Ｉ）のトリオキソピリミジンを、適切な比率を算出することにより、可溶化した既知量のＣＤと混合することによっても取得できる。
【００５２】
複合体を取得するもう一つの方法は、溶媒（例えばアルコール、アセトンなど）中の式（Ｉ）のトリオキソピリミジン溶液をシクロデキストリン水溶液に添加することである。充分な攪拌の後に、溶媒の蒸発後であっても、または溶媒の存在下であっても、この複合体が形成し得る。
【００５３】
トリオキソピリミジン−ＣＤ複合体を取得する、これらすべての方法において、Ｌ−リジンまたはＬ−アルギニンの溶液（１０mMおよび１０００mMの間、好ましくは１０mMおよび５００mMの間、そしてより好ましくは１０mMおよび１００mMの間のアミノ酸濃度）をアジュバントとして使用できる。Ｌ−リジンの溶液がアジュバントとして好ましい。
【００５４】
本発明の複合体溶液の凍結乾燥または噴霧化により、この複合体を固体形態で取得できる。このようにして複合体をアモルファス粉末の形態で取得できる。ＣＤおよび式（Ｉ）のトリオキソピリミジンを適当な有機溶媒に溶解し、溶媒を蒸発させた後に、この複合体を固体状態で取得することも可能である。
【００５５】
固体複合体を調製するために他の方法も使用できる。その方法とは、式ＩのトリオキソピリミジンおよびＣＤをごく少量の水に入れた懸濁液を激しく攪拌し、次いで、乾燥後に複合体を集める、または、超臨界状態のＣＯ２存在下に式ＩのトリオキソピリミジンおよびＣＤを混合するために、超臨界状態のＣＯ２を使用することである。
【００５６】
本発明に係る複合体は、例えばそれ自体既知の方法で、溶液から、またはペースト法を用いて調製でき、この場合、シクロデキストリン対トリオキソピリミジンの重量比は、分子量約１３００のシクロデキストリンについて２（２：１）ないし５４０（５４０：１）の間、好ましくは２ないし２５の間、特に好ましくは２．６ないし３．５（シクロデキストリンとの１：１複合体）または５．２ないし６．２（シクロデキストリンとの１：２複合体）とすべきである。
【００５７】
この複合体は、濃縮水性シクロデキストリン調製物から調製するのが好ましい。この調製物のシクロデキストリン濃度は、好ましくは５０および４００mMの間である。１００ないし２５０mMのシクロデキストリン濃度が好ましい。稠度に応じてこの混合物を激しく攪拌するかもしくは練る。シクロデキストリンの重量パーセントは水性シクロデキストリン調製物の総重量を基準にする。
【００５８】
この複合体を、Ｌ−リジン溶液の存在下で濃縮水性シクロデキストリン調製物から調製することは、さらに好ましい（１０mMおよび１０００mMの間、好ましくは１０mMおよび５００mMの間、そしてより好ましくは１０mMおよび１００mMの間のＬ−リジン濃度）。この調製物のシクロデキストリン濃度は、好ましくは５０および４００mMの間である。１００ないし２５０mMのシクロデキストリン濃度が好ましい。稠度に応じてこの混合物を激しく攪拌するかもしくは練る。シクロデキストリンの重量パーセントは水性シクロデキストリン調製物の総重量を基準にする。
【００５９】
反応温度は通常２０℃および８０℃の間、好ましくは２０℃および６０℃の間、特に好ましくは２５℃および４５℃の間である。反応時間は温度によるが、少なくとも数日である。複合体形成の平衡状態に到達させるための反応時間は少なくとも７日間が好ましい。その後、非溶解物質が尚存在する場合は反応混合物を濾過し、完全に溶解している場合は直接使用する。所望により、この複合体を、例えばクロマトグラフィー手段によって単離できる。好ましくは、トリオキソピリミジンおよびシクロデキストリンの濃度および比は、複合体の形成が完全に起こり（平衡状態に到達）、溶解していないまたは複合体形成していないトリオキソピリミジンが検出されないような濃度および比である。
【００６０】
本発明に従って、式（Ｉ）のトリオキソピリミジンとシクロデキストリンの複合体が、トリオキソピリミジンの水溶性を驚くほど増大させる事が立証された。この複合体の形成がトリオキソピリミジンの薬理学的性質を妨げないこともまた見いだされた。
【００６１】
本発明に従って、式（Ｉ）のトリオキソピリミジン、シクロデキストリンおよびＬ−リジンまたはＬ−アルギニンのようなアジュバントの複合体が、トリオキソピリミジンの水溶性を驚くほど増大させる事が立証された。この複合体の形成がトリオキソピリミジンの薬理学的性質を妨げないこともまた見いだされた。
【００６２】
これらすべての性質は、注射用または噴霧用溶液としての液体製剤の調製を可能にし、バイオアベイラビリティーを、特に経口において改善できる。本発明のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体は、そのまま、または、共存する水を除去して得られる粉末形態で使用できる。水分除去方法の例は、凍結乾燥および減圧乾燥を包含する。凍結乾燥で得られる粉末製品が特に好ましい。
【００６３】
本発明のトリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体は、経口投与または非経口投与のいずれによってもその効果を現し、非経口投与用製剤、特に注射用製剤または局所用製剤、特にエアロゾル製剤に製剤化するのが好ましい。
【００６４】
本発明の複合体の用量は、年齢、体重、および患者の症状の重篤度に従って適切に改変することができ、また、この複合体は一回でまたは分割して投与できる。剤型の例は、錠剤、カプセル剤、散剤、および顆粒剤を包含する。これらは、賦形剤、潤滑剤、および結合剤のような典型的な添加物を使用して、既知の技術で製造できる。
【００６５】
本発明は、気管支炎症疾患、例えば特に喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置を必要とする宿主哺乳動物において、本発明に係る複合体の薬学的有効量を患者に適用することにより該疾患を処置するために使用する方法に関するものである。喘息は、アレルゲン暴露に関連する、または関連しない、気管支樹の炎症性疾患である。この炎症は、気管支平滑筋を刺激して収縮させ、粘液分泌を亢進させ、そしてこの疾患の経過に関して悪化因子となると考えられている気管支の形態学的変化を誘発することによって患者に症状を引き起こす。気道過敏性がこの疾患の特徴であり、殆どの症状の原因である。気管支樹は多くの細胞型（上皮細胞、平滑筋細胞、炎症細胞、神経、粘液産生細胞、線維芽細胞など）を伴う非常に複雑な組織であり、多くの局面を含む気管支リモデリング事象は、主として気管支壁への細胞外マトリックス成分の沈着および粘液産生細胞の過形成より成る。本発明の複合体の使用は、気管支肺胞洗浄の区画および気管支周辺組織への炎症細胞の流入を阻害し、そして、メタコリンのような刺激物質に対する異常反応として定義される過敏性を阻害する。この疾患および現行の処置は、例えばGINA Workshop Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention (NIH Publication No. 02-3659) に概説されている。
【００６６】
したがって本発明はさらに、処置を必要とする宿主哺乳動物において、本発明に係る複合体を使用して慢性閉塞性肺疾患を処置または防止するための方法に関するものである。この疾患では、気管支が炎症を起こし、粘液腺が過形成となり大量の粘液を産生する。気管支壁は異常であり、異常な細胞外マトリックス成分の沈着が気流の抵抗を高める。この疾患および現行の処置が、例えばFabbri, L.M., and Hurd, S.S., Eur. Respir. J. 22 (2003) 1-2に記載されている。
【００６７】
したがって本発明はさらに、処置を必要とする宿主哺乳動物において、本発明に係る複合体を使用して気腫を処置または防止するための方法に関するものである。この疾患では、肺胞壁が蛋白分解プロセスによって破壊され、この破壊が血液への酸素の移送を妨げる。呼吸筋機能不全の惹起による換気異常を引き起こす過膨脹が誘導されるため、そして進行期には心不全を導く肺動脈高血圧症のため、生理的問題もまた起こる。
【００６８】
本発明によれば、トリオキソピリミジン−シクロデキストリン複合体は、好ましくは治療を必要とする患者に数ヶ月または数年にわたって投与される。この複合体は、好ましくは１kg・１日あたりマイクロモル〜ナノモル濃度の範囲の非毒性用量を、液体または粉末製剤のエアロゾル化によって投与される。
【００６９】
本発明に係る複合体の正確な用量は様々であるが、容易に決定できる。一般に、この複合体の１日用量は１μmol/kg・日ないし１００nmol/kg・日（複合体中のトリオキソピリミジンの濃度）の範囲となる。
【００７０】
この薬学的組成物は、好ましくは生理的適合性を持つ水性組成物である。さらにこの組成物は、好ましくは緩衝剤、保存剤および／または補助物質のような薬学的に許容される添加物を含有する。適切な緩衝系は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたは硼酸ナトリウムに基づいている。使用中のこの薬学的組成物の微生物汚染を防ぐため、保存剤が必要である。好適な保存剤は、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、ソルビン酸である。このような保存剤を典型的には０．０１ないし１％重量／容量の量で使用する。
【００７１】
好適な補助物質および薬学的製剤が、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co. (Osloら編)に記載されている。典型的には、その製剤を等張とするため、製剤に適切量の薬学的に許容される塩を使用する。薬学的に許容される物質の例は、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を包含する。溶液のｐＨは好ましくは約５ないし約８，より好ましくは約７ないし約７．５である。
【００７２】
複合体形成のためのアジュバントとしてＬ−リジンまたはＬ−アルギニンを使用する場合、溶液のｐＨは好ましくは約６ないし約８．５、より好ましくは約７．５ないし約８．５である。
【００７３】
本発明の好ましい製剤は、注射用または噴霧用製剤であり、好ましくはモル比１ないし５００のＣＤおよびトリオキソピリミジンから調製する。
【００７４】
この複合体は、ＣＤを水に溶解し、式Ｉのトリオキソピリミジンを加え、水浴中でトリオキソピリミジンが完全に溶解するまで加熱することにより調製する。好ましくはこの溶液を濾過滅菌する。好ましくはこの溶液は、２００〜４００、好ましくは約３００mOs/kgの浸透圧を有する。ｐＨは約７．２である。トリオキソピリミジンおよび／またはＣＤの濃度は必要に応じて改変できる。ＮａＣｌを添加して張性を調節することが好ましい。
【００７５】
噴霧用の好ましい製剤は、トリオキソピリミジン、ＣＤ、ＮａＣｌおよび水を含有する。トリオキソピリミジン０．０５〜０．２g、好ましくは０．１g；ＣＤ １０〜５０g、好ましくは２０g（好ましくはＨＰβＣＤ）；塩化ナトリウム１．２〜１．５g、好ましくは１．４２g（等張性）および水、好ましくは発熱性物質を含まない滅菌精製水（加えて２００mlとする）の組み合わせ（溶液２００mlに対して）が特に好ましい。
【００７６】
ＣＤを精製水１００mlに溶解し、トリオキソピリミジンおよびＮａＣｌを攪拌しながら加えてこれらを溶解し、水を加えて２００mlの溶液を得ることによって、この溶液を調製する。好ましくはこの溶液をポリプロピレンメンブレン０．２２μmで濾過、または蒸気滅菌プロセスにより滅菌する。
【００７７】
その他の好ましい製剤は、眼科用製剤、口腔用製剤、子宮内器具である。例えばナノ粒子もしくはマイクロ粒子またはリポソームのような他の系との組み合わせも考えられる。
【００７８】
本発明の理解を助けるために以下の実施例、参考文献および図を供するが、本発明の真の範囲は付記する請求項に開示する。本発明の精神を逸脱することなく、開示する方法に修飾を施し得ることが理解できるであろう。
【００７９】
略語
ＣＤ                  シクロデキストリン
βＣＤ                β−シクロデキストリン
γＣＤ                γ−シクロデキストリン
ＤＩＭＥβＣＤ        ジメチルβ−シクロデキストリン
ＨＰβＣＤ            ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン
ＲＭβＣＤ            ランダムメチル化β−シクロデキストリン
Ｉ．Ｖ．              静脈内
【実施例】
【００８０】
実施例１
化合物Ｉおよびシクロデキストリン（ＣＤ）の可溶性複合体の調製
１．１  ２０mgの化合物Ｉを秤量する。ＨＰβＣＤ ２００mMの溶液２mlを加える。３７℃で２４時間攪拌する。ミリポアフィルターMillex HV０．４５μmで濾過する。濾過後に得られる溶液は、溶液中に化合物Ｉ−ＣＤ複合体を含有する。
【００８１】
１．２  ２．５mgの化合物Ｉを秤量する。２００mMＨＰβＣＤ溶液２mlを加える。３７℃で２４時間、または化合物Ｉが完全に溶解するまで攪拌する。このようにして得た溶液は、化合物Ｉ−ＣＤ複合体を含有する。
【００８２】
実施例２
相溶解度の研究
複合体の形成時に、事実上水不溶性（＜０．６μg/ml、ＭＷ：４８５）の化合物Ｉが劇的に可溶化する。このように、化合物Ｉの溶解度の増大は化合物ＩおよびＣＤ間での複合体形成の証拠である。複合体の形成および平衡の達成は、１日後で２０％、４日後で４０％、そして７日後で１００％に見いだされる。過剰の化合物Ｉを漸増濃度のＣＤ溶液に加えることにより、溶解度の図（図１）を作製する。サーモスタットで３７℃に調節した浴中で７日間攪拌した後、これらの溶液を濾過し、可溶化した化合物Ｉの量をＨＰＬＣで測定する。βＣＤおよびγＣＤならびにそれらの合成誘導体に、化合物Ｉとの複合体を形成させた。βＣＤおよびＨＰβＣＤはROQUETTE（France）から入手し、ＲＭβＣＤおよびγＣＤはWacker（Germany）により供給された。
【００８３】
ＣＤ水溶液の調製
−  βＣＤ：２、４、８、１０、１２、１６mMを含有する溶液。
−  ＨＰβＣＤ：１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００mMを含有する溶液。
−  ＲＭβＣＤ：１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００mMを含有する溶液。
−  γＣＤ：１０、２５、５０、１００、７５、１５０mMを含有する溶液。
【００８４】
複合体の形成
化合物Ｉおよびシクロデキストリンを入れたフラスコを、サーモスタットで３７℃に調節した浴に攪拌しながら７日間入れると、複合体形成の平衡に到達する。この後、懸濁液をＰＶＤＦのミリポアフィルター０．２２μmを利用して濾過し、濾液を移動相のＤＭＳＯに溶解して、検量線上に自身の位置を定める濃度試料を得る。次いでこれらを、下記の有効なＨＰＬＣ法によって定量する。
【００８５】
化合物Ｉの定量：ＨＰＬＣ法
装置：
ポンプ  Merck-HitachiモデルL-7100、サンプラー  Merck-Hitachi L-7200、加熱炉  Merck-Hitachi L-7350、検出器  Merck-Hitachi ダイオードアレイ検出器L-7455、インターフェース  D-7000、これらの装置を、Merck-Hitachiの供給するデータ取得ソフトウェア「Chromatography Data Station Software」によって操作する。
【００８６】
固定相：
固定相オクチルシランC8 LiChorspher(登録商標) 60RP-Select B（５μm）Merckを充填したLichrocart Column（１２５ｘ４mm ｄ．ｉ．）。
【００８７】
クロマトグラフィー条件：
移動相：０．０５Mリン酸緩衝液（ｐＨ＝３とする）およびメタノールの混合物（３０／７０、ｖ／ｖ）。１５分間超音波を通過させることにより気体を抜く。アウトプット：１ml/分、UV検出のλ：２６５nm、稼働温度：３０℃、注入容量：２０μl。
【００８８】
化合物ＩのＨＰＬＣ定量の結果を各シクロデキストリンについて下表（表１ないし４）に再現する。シクロデキストリン無しで得られた溶解度は０．５６μg/mlである。
【００８９】
【表１】
2007530628.tif 000004
【００９０】
【表２】
2007530628.tif 000005
【００９１】
【表３】
2007530628.tif 000006
【００９２】
【表４】
2007530628.tif 000007
【００９３】
溶解度の増大が観察されていることから、化合物Ｉは検討された全てのシクロデキストリンと複合体を形成する。化合物ＩおよびRamebの間で形成された複合体が化合物Ｉの水溶性をかなり、そして全く予想外に増大させることもまた直接観察できる。この観察結果はＨＰ−βＣＤについても当てはまる。表５は、各シクロデキストリンの最大被検濃度で得られた溶解度の結果をまとめたものである。溶解度の増大は、化合物Ｉの水溶解度（シクロデキストリン不在下）と比較して算出し、その水溶解度は０．５６μg/mlと測定されている。
【００９４】
これらの結果に基づき、Higuchi, T., and Connors, K.A., Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation 4 (1965) 117-212に従って相溶解度図を作製した。
【００９５】
【表５】
2007530628.tif 000008
【００９６】
【表６】
2007530628.tif 000009
【００９７】
高いＫ１：１値は、精製水中では、βＣＤ誘導体の空洞が、この包接物に含まれる化合物Ｉの分子部分に非常に良く適合することを示唆している。０ないし４mMのβＣＤ濃度では、化合物Ｉの溶解度は増大し、最大８mMのβＣＤで平坦部に達する。８mMより高いβＣＤ濃度では、より低い溶解度（１．５μg/ml）を持つ１：２化学量論（Ｃｐｄ．Ｉ：βＣＤ）のさらなる複合体が形成される。故に、得られる相図はＡＬ図である。γＣＤ、ＨＰ−βＣＤおよびＲＭβＣＤについてはＡｐ型の図が得られる。算出された安定定数３４６Ｍ−１は、ＣＤの空洞が大きすぎて充分な相互作用が得られないことを示している。
【００９８】
化合物Ｉは、複合体型とそうでない型とでは異なる溶解度を有する。例えば、化合物Ｉはアセトニトリル中で良好な溶解性を示す（±７００μg/ml）が、ＨＰ−βＣＤおよび化合物Ｉ−ＣＤ複合体はこの溶媒に不溶である。これらの条件においては、含まれる薬物は捕捉されたままであり、この溶媒に不溶となる。遊離型と複合体型の化合物Ｉの溶解度差についてのこの技術を、複合体形成パーセンテージの評価に応用することができる。
【００９９】
実施例３
ＨＰβＣＤ存在下での種々のトリオキソピリミジンの溶解度
実施例１および２に従い溶解度を調べる。結果を表７に示す。
【０１００】
【表７】
2007530628.tif 000010
【０１０１】
実施例４
アジュバントとしてＬ−リジン溶液を用いる相溶解度の研究
Higuchi, T., and Connors, K.A., Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation 4 (1965) 117-212に記載のように溶解度の研究を実施した。過剰量の化合物Ｉを、精製水またはＬ−リジン溶液（５０mMまたは５００mM）いずれかの溶解媒質５ml中の漸増濃度のＨＰ−β−ＣＤ（０〜２００mM）に加えた。ガラス容器を密封し、この懸濁液を、複合体形成が平衡に達するまで（７日間）２５℃の水浴中で振盪した。アリコートを０．４５μm ＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、実証された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法によって化合物Ｉの含有量について検定した。
【０１０２】
図７は、精製水、５０mM Ｌ−リジン溶液および５００mM Ｌ−リジン溶液に入れたＨＰ−β−ＣＤの存在下で２５℃において得られた化合物Ｉの相溶解度図を示す。これら３つの場合において、化合物Ｉの水溶解度はＣＤ濃度の関数として増大する。Ｌ−リジン不在下で得られた溶解度図は、先に述べた結果を裏付ける：２００mM ＨＰ−β−ＣＤ溶液中の化合物Ｉの溶解度は約５．５mg/ml（１１mM）であり、これは化合物Ｉの水溶解度のおよそ１００００倍の増大に相当する。
【０１０３】
Ｌ−リジン存在下では、ＨＰ−β−ＣＤ溶液中の化合物Ｉの溶解度はさらに高い。２００mM ＨＰ−β−ＣＤ溶液中での溶解度は、５０mMおよび５００mMのＬ−リジン存在下では各々約２および７倍増大する。表８は、異なる媒質中での化合物Ｉの溶解度のデータを示す。結果は、Ｌ−リジンおよびＨＰ−β−ＣＤの間の相乗効果を示している。５００mM Ｌ−リジンおよび２００mM ＨＰ−βＣＤ（３８．１４mg/ml）両者の存在下での溶解度は、ＨＰ−βＣＤおよびＬ−リジン（５．５３mg/mlおよび０．０９mg/ml）の効果を別々に加えることで予想される溶解度より高い。Ｌ−リジンおよびＨＰ−β−ＣＤ間のこの相乗効果は、化合物Ｉの水溶解度の重要な増大を可能にする（５００mM Ｌ−リジンおよび２００mM ＨＰ−βＣＤにより７００００倍）。
【０１０４】
【表８】
2007530628.tif 000011
【０１０５】
実施例５
ＮＭＲ研究
Ｄ２Ｏ中１０mM濃度のＤＩＭＥ−βＣＤ溶液を調製した。化合物Ｉの水溶解度があまりに低いため、化合物Ｉ単独のスペクトルはＤ２Ｏ中で実施できなかった。プロトンの帰属のため、化合物ＩのＮＭＲスペクトルをＤＭＳＯ中で実施した。すべてのＮＭＲ実験を、プロトンについて５００MHzで操作するBruker DRX500分光計で実施した。温度は２９８Kに設定した。ＨＤＯの二次レファランスとして溶媒の残留共鳴を用いて較正を行った。Ｔ−ＲＯＥＳＹ実験のため、３００msecの混合時間を用いた。すべてのプロセシングをBrukerのためのWINNMRプログラムを用いるSilicon Graphics INDYデータステーション上で実施した。単独および過剰のＤＩＭＥβＣＤ存在下での化合物ＩのNMRスペクトルを比較すると、Ｈ−３およびＨ−５プロトンに対応するシグナルが上方にシフトすることに注目できる。このシフトは、包接の証明を成す。Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトル分析は、ＣＤ空洞に化合物Ｉが包接されていることを立証する。この分子の異なる２つの部分がＣＤ空洞中にぴったり収まることができる。
【０１０６】
実施例６
分子模型作成研究
Cambridge Data BaseのβＣＤのPOBRON結晶構造を用いて分子模型作成計算をGaussian 94 で実施した。化合物Ｉの２つの極端な空間コンホメーションを計算した。得られた結果は、この包接がエネルギー的に実現可能であり極めて安定であることを示す。この安定性は、酸素と、バルビツール核の窒素およびＣＤの外側にあるアルコールのプロトンとの間の水素結合の形成によって説明できる。化合物Ｉおよびシクロデキストリン（好ましくはβＣＤ、γＣＤおよびこれらの合成誘導体）を、複合体の形態で、または共に含む、すべての薬学的組成物は、それらの形態および治療適用の如何に拘わらず、本発明の枠組み内にあると確信する。事実、化合物ＩおよびＣＤが製剤中で複合体の形態でなくとも、これはその場で形成される余地がある。
【０１０７】
実施例７
薬学的組成物
異なる組成物の製剤を、すべてではないが例として記載する。
【０１０８】
注射用製剤の好ましい例：
−  ＨＰ−βＣＤ ２００mM；化合物Ｉ １mg/ml；注射用滅菌水適量。
【０１０９】
２５mlの溶液のために：
ａ）溶液の調製
ＨＰβＣＤ（４．２％のＨ２Ｏ）６．７７gを秤量し、これを注射により水２５mlに溶解する。化合物Ｉ ２５mgを加え、これが完全に溶解するまで水浴中で加熱する。この溶液を濾過滅菌する。
【０１１０】
ｂ）溶液の特性
この溶液の浸透圧は３０８mOs/kgである。ｐＨは７．２である。
【０１１１】
化合物Ｉおよび／またはＣＤの濃度は必要に応じて改変できる。ＮａＣｌを添加して張性を調節するのが好ましい。
【０１１２】
好ましい噴霧用製剤：
２００mlの溶液のために：
−  化合物Ｉ                                  ０．１g（ＭＷ：４８５）
−  発熱性物質を除去したＨＰβＣＤ            ２０．１５g（ＭＷ：１３００）
−  塩化ナトリウム                            １．４２g（等張性）
−  発熱性物質を含まない滅菌精製水            ２００mlになる量
【０１１３】
ａ）発熱性物質を除去したＨＰβＣＤ（３．２％Ｈ２Ｏ、ROQUETTE）２０．１５gを秤量し、精製水１００mlに溶解する。
ｂ）化合物Ｉ ０．１gおよび塩化ナトリウム１．４２gを秤量し、これらを強く攪拌することにより溶液（ａ）に加えて溶解させる。
ｃ）水を加えて２００mlの溶液を得る。
ｄ）０．２２μmポリプロピレンメンブレンで濾過滅菌する。
【０１１４】
実施例８
バイオアベイラビリティーに関する薬物動態学的研究
生体適合性のpH値で高い化合物Ｉの濃度を実現する、ＨＰ−βＣＤおよびＬ−リジンの組み合わせを有する、薬物動態学研究のための溶液を開発した。
【０１１５】
投薬形態の調製
ＨＰ−βＣＤ（２００mM）、Ｌ−リジン（２０mM）および注射用水を含む溶液に化合物Ｉ（１０mg/ml）を溶解することにより、化合物Ｉ／ＨＰ−βＣＤ静脈用溶液を得た。この溶液の浸透圧（約３２５mOsmol/kg）およびｐＨ（約８．２）値は、静脈注射に適合する。この溶液を無菌条件下で０．２０μm滅菌酢酸セルロースフィルターを通過させることにより滅菌した。
【０１１６】
ＨＰ−βＣＤ（２００mM）、Ｌ−リジン（５０mM）および水を含む溶液に化合物Ｉ（１５mg/ml）を溶解することにより、化合物Ｉ／ＨＰ−βＣＤ経口溶液を調製した。
【０１１７】
化合物Ｉの懸濁液は、化合物Ｉ（１５mg/ml）、湿潤剤としてのポリソルベート８０（０．１mg/ml）、シマルドラート（VEEGUM HV(登録商標)、１％ ｍ／ｖ）および増粘剤としてのメチルセルロース（METHOCEL A400(登録商標)、０．４％ ｍ／ｖ）で構成されていた。
【０１１８】
動物実験プロトコルおよび薬物投与
体重４５ないし８２kgの範囲の６頭の健康なヒツジ（雄２頭、雌４頭）を実験動物に使用した。試験中、動物には餌と水を自由に摂らせた。
【０１１９】
表９の計画に従って実施した実験研究は、経口投与とその後の静脈内投与による無作為化二元クロスオーバー法を含んでいた。各投与の間に３週間のウォッシュアウト期間を設けた。
【０１２０】
【表９】
2007530628.tif 000012
【０１２１】
経口投薬形態については、各動物に１５mg/kg(体重)と同等の用量の化合物Ｉを、両方の製剤から投与した。投薬形態量を適合させるため、薬物投与の日にヒツジの体重を測定した。経口投与の前、および０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、６、８、１０、１２、２４、２８、３２、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に、頸静脈から血液試料を採取した。
【０１２２】
静脈内投薬形態については、６頭のヒツジすべてに５mg/kg(体重)の化合物Ｉを投与した。この溶液を左頸静脈から投与し、静脈内投与開始の前、および５、１０、１５、２０、３０、４５分、１、１．５、２、３、４、５、６、８、１０、１２、２４、２８、３２、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に、右頸静脈から血液試料を採取した。
【０１２３】
すべての血液試料を遠心し、検定するまで血清を−８０℃で保存した。
【０１２４】
生物分析法
血清中のこの化合物のＬＣ測定のために完全自動化法を開発した。限定アクセス材料（ＲＡＭ）、即ちLiChrospher RP-8 ADS（アルキルジオールシリカ）を充填したプレカラムを、カラムスイッチ法によって分析カラムにオンライン結合させることにより、試料のクリーンアップを実施した。ＡＤＳ吸着剤は内表面逆相支持体の群に属し、ＬＣ分析前の生体試料のクリーンアップにうまく適用されている（Yu, Z., and Westerlund, D., Chromatographia 44 (1997) 589-594；Hubert, Ph.ら、S. T. P. Pharma Pratiques 9 (1999) 160-180；Souverain, S.ら、Journal of Chromatography B 801 (2004) 141-156）。稼働条件は過去の文献に記載されている（Chiap, P.ら、Journal of Chromatography B 817 (2005), 109-117）。この方法を、全測定誤差を考慮した、正確性プロファイルに基づく新規なアプローチに従って完全にバリデーションした（Hubert, P.ら、Analytica Chimica Acta 391 (1999) 135-148；Hubert, Ph.ら、S. T. P. Pharma Pratiques 13 (2003) 27-64；Hubert, Ph.ら、J. Pharm. Biomed. Anal. 36 (2004) 579-586）。
【０１２５】
生物分析学的研究については、高濃度を測定するため、この方法の用量範囲を５０μg/mlまで増加させねばならなかった。部分的な再バリデーションを行い、応答関数、真実性、精密性、正確性および直線性に関して良好な結果を得た。
【０１２６】
薬物動態学および統計学的解析
静脈内投与の研究のため、一次分布および排出を伴う線型２−コンパートメントモデルを用いて、各動物について薬物動態パラメータを決定した（Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications. McGrow-Hill Companies, USA, 2002）。線型台形公式により、サンプリング期間中の曲線下面積値（ＡＵＣ０−１６８）を算出した。コンパートメント分析に随伴する従来の等式を用いて、無限大まで外挿したＡＵＣ（ＡＵＣ０−∞）、全身クリアランス値（Ｃｌｔ）、生物学的半減期（Ｔ１／２β）および総分布容積（Ｖｄｔ）を算出した（Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications,  McGrow-Hill Companies, USA, 2002）。
【０１２７】
経口投与の研究のため、一次インプットおよび一次アウトプットを伴う線型１−コンパートメントモデルを用いて、各動物について、そして懸濁液および溶液の両者について、薬物動態パラメータを決定した（Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications. McGrow-Hill Companies, USA, 2002）。台形加算により上記の通りＡＵＣ０−１６８を算出した。ＡＵＣ０−∞は以下の等式（等式１）によって推定した：
【０１２８】
【数１】
2007530628.tif 000013
【０１２９】
［式中、Ｋおよびｋａは各々総排出速度定数および吸収速度定数であり、Ｃ０は外挿された初期濃度である］。
【０１３０】
薬物の最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）および対応時刻（Ｔｍａｘ）を各動物について２つの異なる手段で決定した：濃度−時間のグラフから直接（Ｃｍａｘ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌおよびＴｍａｘ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）および以下の等式（等式２および３）を用いて算出（Ｃｍａｘ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄおよびＴｍａｘ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：
【０１３１】
【数２】
2007530628.tif 000014
【０１３２】
絶対バイオアベイラビリティー（Ｆａｂｓｏｌ）を以下の関係（等式４）を用いて評価した：
【０１３３】
【数３】
2007530628.tif 000015
【０１３４】
［式中、ＤｏｒａｌおよびＤＩ．Ｖ．は、各々経口およびＩ．Ｖ．投与された薬物の量である］。
【０１３５】
すべての薬物動態パラメータを、平均ＡＵＣ０−∞から算出した絶対アベイラビリティーを除いて平均値±標準偏差として示す。
【０１３６】
個々のＡＵＣ値が平均値±２標準偏差より高いまたは低い時にはそのデータを異常とみなした。これに基づき、経口溶液投与後の薬物動態パラメータの決定および統計学的解析から、１頭のヒツジを除外した。
【０１３７】
２つの経口投薬形態について、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡ）を用いて薬物動態パラメータの比較を実施した。分布を正規化するための対数変換の後、算出された各パラメータの平均値を比較した。結果は５％臨界レベルで有意と考えられた（ｐ＜０．０５）。
【０１３８】
静脈内投与後の化合物Ｉの薬物動態
ヒツジへの静脈用溶液（５mg/kg）１回投与後に得られた化合物Ｉの平均血清中濃度対時間曲線を、図９ａに示す。図９ｂ（化合物Ｉの平均血清中濃度の対数対時間曲線）は、化合物Ｉの薬物動態が２−コンパートメントモデルに従うことを示している。この静脈内投与後に算出された異なる薬物動態パラメータを表１０に列挙する。
【０１３９】
【表１０】
2007530628.tif 000016
【０１４０】
分布相は短く（約３０分間）、化合物Ｉが生体に急速に分布することを示している。総分布容量は少なく（約８リットル）、この事は、化合物Ｉの分布が細胞外液に限定され、組織内への化合物Ｉの拡散がそれほど重要でないことを示している。これに対して、化合物Ｉの生物学的半減期は長く（約１５．５時間）、したがって薬物排出は非常に緩徐である。分布容量が少ないことを考えると、生体への蓄積は、例えば脂肪への貯蔵による訳ではなく、おそらくは蛋白またはその他の血漿成分との強い結合によって起こるのであろう。全身クリアランス値もまた算出したが、これは３５８．５ml/h前後であった。
【０１４１】
懸濁液および溶液の経口投与後の化合物Ｉの薬物動態
化合物１の溶液および懸濁液の単一用量（１５mg/kg）を経口投与した後に得られた化合物Ｉの平均血清中濃度対時間のプロファイルを図１０ａに示す。平均血清中濃度の対数変換の後、経口投与後の薬物動態は１−コンパートメントモデルに従うようである（図１０ｂ）。薬物動態パラメータを表１１にまとめる。
【０１４２】
【表１１】
2007530628.tif 000017
【０１４３】
溶液の経口投与後の化合物Ｉの血清中濃度は、同用量を懸濁液で投与して得られた血清中濃度よりも明らかに高い。溶液で観察された吸収相（約４時間）は、懸濁液投与後に達成されたもの（約１０時間）より短い。溶液および懸濁液の薬物動態パラメータが有意に異なっている（Ｐ＜０．０５）こともまた観察できる（表１１）。化合物Ｉの平均血清中ピーク濃度は、溶液および懸濁液の投与後で各々約５４および５μg/mlである。溶液のＣｍａｘは懸濁液のＣｍａｘより約１０倍高い。懸濁液（約１１時間）に比較して溶液（約３．８時間）では３倍早いＴｍａｘが得られる。ＡＵＣ値はＣｍａｘ値と同じ傾向に従い、溶液投与後のＡＵＣは懸濁液投与後のＡＵＣ値より約１０倍高い。したがって、Ｉ．Ｖ．溶液と比較した絶対バイオアベイラビリティーは、懸濁液（８％）より溶液（８０％）の方が遙かに高い。
【０１４４】
実施例９
インビボ実験（血管新生の阻害）
化合物Ｉ−シクロデキストリン複合体の潜在的効果を調べるため、血管新生のモデルを使用した。大動脈環を切除し、培地に入れる。この培地は以下の成分を含有する：
【０１４５】
−  活性成分無し
−  化合物Ｉ−シクロデキストリン複合体（最終濃度１０−６M、１０−７M）
−  ＤＭＳＯを利用してＤＭＳＯに溶解した化合物Ｉ（最終濃度１０−６、１０−７M）。
【０１４６】
マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター化合物Ｉの不在下で、新血管の形成（血管新生）が観察される。ＤＭＳＯに溶解した、またはシクロデキストリン中の包接複合体の形態での化合物Ｉのみの存在下では、血管新生が著しく阻害される。
【０１４７】
実施例１０
喘息モデルマウスにおけるアレルゲン誘発気道炎症および気管支過敏症治療のための、化合物ＩおよびＨＰβＣＤを含有する製剤の使用
【０１４８】
材料
ＨＰ−βＣＤ（置換度＝０．６４）はRoquette（France）に由来する。非発熱性リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）はBio-Wittaker（Verviers, Belgium）から、そしてメタコリンはSigma-Aldrich（Germany）から購入した。他の材料はすべて分析等級のものであった。この実験全体を通じて注射用滅菌水を使用した。滅菌、非発熱性および等張性のＣＤ溶液を２０、５０および７５mMで調製した。市販の吸入用フルチカゾン溶液（Flixotide(登録商標) １mg/ml）はGlaxo-Smithkline(Genval, Belgium)から購入した。
【０１４９】
感作、アレルゲン暴露および治療プロトコル
化合物Ｉの腹腔内注射による気道炎症の調節を調べるため、アルミン吸着させたオボアルブミン（aluminject, perbio, Erembodegem, Belgium）１０μgを腹腔内注射してマウスを０日目および７日目に感作し、その後２１日目から２４日目までオボアルブミン（ＯＶＡ）１％またはＰＢＳエアロゾルに３０分間暴露した。腹腔内注射をＯＶＡ吸入の３０分前に実施した。注射された異なる製剤は、クレモフォル１０％−ＤＭＳＯ １０％−ＰＢＳ ８０％−化合物Ｉ ３０mg/kg（懸濁液）；クレモフォル１０％−ＤＭＳＯ １０％−ＰＢＳ ８０％−化合物Ｉ ３．７５mg/kg（溶液）；ＨＰβＣＤ ２００mM  化合物Ｉ ７．５mg/kg（溶液）；ＨＰβＣＤ ２００ｍＭであった。すべての結果を、ＯＶＡで感作しＰＢＳに暴露したマウス、およびＯＶＡで処理しＰＢＳを腹腔内注射したマウスと比較した。吸入した化合物Ｉによる気道炎症の調節を調べるため、マウスを前記のように感作した。短期間暴露チャレンジおよび長期間暴露チャレンジと称する二つのプロトコルを使用した。短期間暴露チャレンジでは、プレクシガラスの暴露試験箱（３０ ｘ ２０ ｘ １５cm）中で、２１日目から２７日目まで、マウスを水溶液中の活性化合物濃度０．０３および０．３mg/mlの化合物Ｉ複合体のエアロゾルに３０分間暴露させた。２３日目から２７日目まで、マウスを化合物Ｉ吸入の３０分後にＯＶＡエアロゾルに暴露させた。いわゆる長期間吸入チャレンジでは、マウスを、水溶液中のＨＰβＣＤと複合体形成させた濃度０．０３および０．３mg/mlの化合物Ｉのエアロゾルに、３０分間ずつ奇数週に５日間、そしてＯＶＡエアロゾルに奇数週に３日間、１１週間の間、暴露させた。偶数週には吸入を行わなかった。
【０１５０】
エアロゾルは、振動数２．４MHz、振動強度および換気レベルが可変性の超音波ネブライザーSYSTAM（Systeme Assistance Medical, Le Ledat, France）を用いて製造した。振動強度を６の位置に固定し、換気レベルは２５（ν１／２）l/分とした。
【０１５１】
気道反応性測定
最後のアレルゲン暴露の２４時間後に、Hamelmann, E.ら、Am. J Respir. Crit. Care Med. 156 (1997) 766-775により提唱されたように、気圧プレチスモグラフを用いてＰｅｎｈを測定することにより気管支過敏性を測定した。Ｐｅｎｈを、ベースライン、および漸増用量（２５、５０、７５および１００mM）のメタコリン（Ｍｃｈ）吸入の５分後に測定した。
【０１５２】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）および組織像
気道反応性の評価直後にマウスを殺処理し、イオン化カルシウムおよびマグネシウムを含まず０．０５mMＥＤＴＡナトリウムを添加したＰＢＳ １mlを気管カニューレから４回滴注し、穏やかに手動吸引することにより回収した。回収した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を遠心した（４℃、１８００rpmで１０分間）。この細胞ペレットを２回洗浄し、最後にＰＢＳ １mlに再懸濁した。総細胞数の計数をThoma chamber中で実施し、少なくとも４００個の細胞について、Diff-Quick（Dade, Germany）で染色後に、標準的形態学基準を用いて細胞遠心調製物に対する個別細胞計数を行った（Cytospin 2; Cytospin, Shandon td., Runcorn, Cheshire, U.K.）。ＢＡＬの後、胸郭を切開し、左主気管支をクランプで止めた。左肺を切除し、蛋白化学およびｍＲＮＡ抽出のために液体Ｎ２中で直ちに凍結し、右肺は組織像用に処理した。上述したように（Cataldo, D.D.ら、Am. J. Pathol. 161 (2002) 491-498）、右肺に４％パラホルムアルデヒドを注入し、パラフィン包埋した。すべての裂片から取った厚さ５μmの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。気管支周囲の浸潤程度を炎症スコアによって評価した。スライドを暗号化し、気管支周囲の炎症を、他所（Cataldo, D.D.ら、Am. J. Pathol. 161 (2002) 491-498）に記載された再現性ある採点系を用いてブラインド方式で等級付けた。採点した各組織切片について、１基準あたり０ないし３の値で判定した。炎症が検出できない場合に値０、時折見られる炎症細胞を伴うカフィングに値１、殆どの気管支が炎症細胞の薄層（１ないし５個の細胞）に取り囲まれている場合に値２、そして殆どの気管支が炎症細胞の厚層（＞５個の細胞）に取り囲まれている場合に値３と判定した。マウス１匹につき５−７枚の無作為に選択した組織切片を採点するので、炎症スコアを１動物あたりの平均値で表し、群間で比較することができた。気管支壁に浸潤している好酸球の量を具体的に反映する、組織好酸球浸潤スコアと称するもう一つのスコアを以下のように測定した：コンゴーレッド染色の後、マウス１匹につき７個の気管支を調べた。気道壁の範囲内で気管支周辺の好酸球を計数し、上皮基底膜の周長を測定して結果を好酸球数／mm（基底膜）として表した。左肺を液体窒素で迅速凍結し、Mikro-Dismembrator S（Braun Biotech International, Melsungen, Germany）を用いて圧搾し、抽出物を研究前に−８０℃で保存した。腎臓を切除してパラフィン包埋し、５μm切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。心臓穿刺により血液をサンプリングし、分析を実施するまで血清を−８０℃で保存した。
【０１５３】
すべてのインビボ操作は地域のVeterinarian Ethics Committeeにより認可された。
【０１５４】
化合物Ｉの腹腔内注射
化合物Ｉ（溶液または沈殿物）の腹腔内注射は、プラセボと比較した場合、３．７５ないし３０mg/kgの用量でＢＡＬのアレルゲン誘発気道好酸球性炎症を低下させた（図４ａ）。同用量において、気管支周辺の炎症スコアもまた、化合物Ｉによって著明に低下し、これはすべての被検製剤について同等の有効性であった（図４ｂ）。組織好酸球浸潤スコアは、７．５および２５mg/kg用量の化合物Ｉの腹腔内注射により著明に低下した。
【０１５５】
化合物Ｉおよび化合物Ｉ−ＨＰβＣＤ複合体への吸入暴露
短期間暴露に４０mg/mlの化合物Ｉの純ＤＭＳＯ溶液を用いることにより、まず、局所活性抗炎症薬としての化合物Ｉの固有活性を評価した。ＤＭＳＯのみの吸入と比較した場合、この製剤の吸入は、ＢＡＬ好酸球（ｐ＜０．００５）、気管支周辺炎症スコア（ｐ＜０．０１）、および気管支過敏性（ｐ＜０．０５）の著明な低下を導いた。
【０１５６】
短期間暴露プロトコルにおいて、本発明者等は、ＨＰ−βＣＤ化合物Ｉ複合体含有製剤の、気道炎症および過敏性に及ぼす効果を評価した。化合物Ｉ−ＨＰβＣＤ複合体含有製剤の吸入効果を、プラセボ（ＰＢＳ）または対照治療に用いたフルチカゾン（１mg/ml）と比較した。化合物Ｉの０．０３および０．３mg/ml用量を含有する製剤の吸入は、プラセボと比較した時にフルチカゾンの効果に匹敵する程度で、ＢＡＬにおける好酸球性炎症の著明な減少を誘導した（ｐ＜０．０００１）（図５ａ）。気管支周辺の炎症スコアもまたプラセボと比較して低下し（ｐ＜０．０００１）（図５ｂ）、組織好酸球浸潤スコアもまた同様であった（ｐ＜０．０１）（図５ｃ）。
【０１５７】
アレルゲンの長期間暴露の後、化合物Ｉ−ＨＰβＣＤ含有製剤の吸入処置後のＢＡＬ好酸球増加は、フルチカゾンの効果と同程度に著しく減少した（ｐ＜０．００１）（図６ａ）。気管支周辺の炎症スコアもまた、化合物Ｉ−ＨＰβＣＤ含有製剤の吸入によってフルチカゾンと同様に著しく減少した（ｐ＜０．０００１）（図６ｂ）。組織好酸球浸潤スコアもまた、化合物Ｉの吸入処置後に、フルチカゾン処置マウスに匹敵する程度に減少した（ｐ＜０．０１）（図６ｃ）。
【０１５８】
【表１２】
2007530628.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】ＲＭβＣＤおよびＨＰ−β−ＣＤ両者について得られた化合物Ｉの溶解度を示す図である。相溶解度の図はいずれもＡｐ型であり、これはＣＤが化学量論１：１および１：２の複合体を形成することを意味する。次いで安定性定数を算出したが、それらの値を表６に示す。
【図２】化合物ＩおよびＤＩＭＥβＣＤの複合体（上部）ならびにＤＩＭＥβＣＤ単独（下部）のＮＭＲスペクトルである。
【図３】化合物Ｉ（上部）、ＤＩＭＥβＣＤ（右側）およびＴ−ＲＯＥＳＹ（中央）のＮＭＲスペクトルである。
【図４ａ】ＢＡＬ好酸球数に及ぼす化合物Ｉ懸濁液の腹腔内注射の効果である。対照は、アレルゲンには暴露させずＰＢＳにのみ暴露させたマウス（ＰＢＳ）、および、吸入によりｏｖａに、そして腹腔内注射によりプラセボに暴露させたマウス（ＯＶＡ）である。
【図４ｂ】気管支周辺の炎症スコアに及ぼす化合物Ｉ懸濁液の腹腔内注射の効果である。対照は、アレルゲンには暴露させずＰＢＳにのみ暴露させたマウス（ＰＢＳ）、および、吸入によりｏｖａに、そして腹腔内注射によりプラセボに暴露させたマウス（ＯＶＡ）である。
【図５ａ】短期（５日間）アレルゲン暴露モデルにおける、ＢＡＬ好酸球増加に及ぼす、エアロゾルで投与した化合物Ｉ−ＨＰ−β−ＣＤ複合体、フルチカゾンおよびプラセボ（ＰＬＡＣ）の治療効果である。
【図５ｂ】短期（５日間）アレルゲン暴露モデルにおける、気管支周辺の炎症スコアに及ぼす、エアロゾルで投与した化合物Ｉ−ＨＰ−β−ＣＤ複合体、フルチカゾンおよびプラセボ（ＰＬＡＣ）の治療効果である。
【図５ｃ】短期（５日間）アレルゲン暴露モデルにおける、組織好酸球浸潤スコアに及ぼす、エアロゾルで投与した化合物Ｉ−ＨＰ−β−ＣＤ複合体、フルチカゾンおよびプラセボ（ＰＬＡＣ）の治療効果である。
【図６ａ】長期（１１週間）アレルゲン暴露モデルにおける、ＢＡＬ好酸球増加に及ぼす、エアロゾルで投与した化合物Ｉ−ＨＰ−β−ＣＤ複合体、フルチカゾンおよびプラセボ（ＰＢＳ）の治療効果である。感作させたがアレルゲンに暴露させていないマウス（ＰＢＳ）および感作させＯＶＡに暴露させたマウス（ＰＬＡＣ）をＰＢＳ吸入により処置した。
【図６ｂ】長期（１１週間）アレルゲン暴露モデルにおける、気管支周辺の炎症スコアに及ぼす、エアロゾルで投与した化合物Ｉ−ＨＰ−β−ＣＤ複合体、フルチカゾンおよびプラセボ（ＰＢＳ）の治療効果である。感作させたがアレルゲンに暴露させていないマウス（ＰＢＳ）および感作させＯＶＡに暴露させたマウス（ＰＬＡＣ）をＰＢＳ吸入により処置した。
【図６ｃ】長期（１１週間）アレルゲン暴露モデルにおける、組織好酸球浸潤スコアに及ぼす、エアロゾルで投与した化合物Ｉ−ＨＰ−β−ＣＤ複合体、フルチカゾンおよびプラセボ（ＰＢＳ）の治療効果である。感作させたがアレルゲンに暴露させていないマウス（ＰＢＳ）および感作させＯＶＡに暴露させたマウス（ＰＬＡＣ）をＰＢＳ吸入により処置した。
【図７】精製水（●）、Ｌ−リジン５０mM（ｘ）またはＬ−リジン５００mM（▲）中の、ＨＰ−β−ＣＤを伴う化合物Ｉの相溶解度図である。
【図８ａ】ヒツジ（ｎ＝６）に静脈内投与（５mg/kg）した後の、化合物Ｉの平均（±Ｓ．Ｄ．）血清中濃度対時間の曲線である。
【図８ｂ】ヒツジ（ｎ＝６）に静脈内投与（５mg/kg）した後の、化合物Ｉの平均血清中濃度の対数対時間の曲線である。
【図９ａ】ヒツジ（溶液ではｎ＝５、懸濁液ではｎ＝６）に溶液（▲）および懸濁液（●）を経口投与（１５mg/kg）した後の、化合物Ｉの平均（±Ｓ．Ｄ．）血清中濃度対時間の曲線である。
【図９ｂ】ヒツジ（溶液ではｎ＝５、懸濁液ではｎ＝６）に溶液（▲）および懸濁液（●）を経口投与（１５mg/kg）した後の、化合物Ｉの平均血清中濃度の対数対時間の曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【国際調査報告】
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