(57)【要約】  本発明は2成分型DNAポリメラーゼを提供し、また該ポリメラーゼを含むキット、該ポリメラーゼを核酸増幅および核酸配列決定のために使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製反応混合液中で核酸分子に複製反応を起こさせるステップを含む核酸分子の複製方法であって、該複製反応混合液は最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含み、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは少なくとも第1成分を含み、該第1成分はαサブユニットを含むが、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼはクランプ装着因子を欠き、また該核酸分子が該複製反応混合液中の該複製反応において該最小機能性Pol IIIにより複製されることを特徴とする方法。
【請求項２】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは非中温性細菌に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好極限性細菌に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好熱菌に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは熱安定性最小Pol IIIである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
αサブユニットはpolC αサブユニットである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
αサブユニットはdnaE αサブユニットである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
核酸はDNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
DNAは2本鎖DNAである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
第1成分はεサブユニットをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼであって、第2成分をさらに含み、該第2成分はクランプを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
方法は増幅方法であり、複製反応は増幅反応であり、また複製反応混合液は増幅反応混合液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
増幅方法はPCR法であり、増幅反応はPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)であり、また増幅反応混合液はPCR混合液である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
方法は配列決定法であり、複製反応は配列決定反応であり、また複製反応混合液は配列決定反応混合液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
複製反応混合液はCaCl2を欠く、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
複製反応混合液は弱有機酸と弱有機塩基とを含む両性イオン緩衝液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
複製反応混合液はpHが約7.5〜8.9である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
複製反応混合液中に存在するαサブユニットの濃度は6 ng/μL以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
核酸分子は複製反応混合液中の複製反応で最小Pol IIIレプリカーゼにより100塩基/秒以上の速度で複製される、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
核酸複製に有用な核酸複製キットであって、最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含み、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは少なくとも第1成分を含み、該第1成分はαサブユニットを含むが、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼはクランプ装着因子を欠くことを特徴とする核酸複製キット。
【請求項２２】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは非中温性細菌に由来する、請求項21に記載のキット。
【請求項２３】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好極限性細菌に由来する、請求項21に記載のキット。
【請求項２４】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好熱菌に由来する、請求項21に記載のキット。
【請求項２５】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは熱安定性最小Pol IIIである、請求項21に記載のキット。
【請求項２６】
αサブユニットはpolC αサブユニットである、請求項21に記載のキット。
【請求項２７】
αサブユニットはdnaE αサブユニットである、請求項21に記載のキット。
【請求項２８】
核酸はDNAである、請求項21に記載のキット。
【請求項２９】
DNAは2本鎖DNAである、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
第1成分はεサブユニットをさらに含む、請求項21に記載のキット。
【請求項３１】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである、請求項21に記載のキット。
【請求項３２】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼであって、第2成分をさらに含み、該第2成分はクランプを含む、請求項21に記載のキット。
【請求項３３】
方法は増幅方法であり、複製反応は増幅反応であり、また複製反応混合液は増幅反応混合液である、請求項21に記載のキット。
【請求項３４】
キットはDNA配列決定に有用な配列決定キットである、請求項21に記載のキット。
【請求項３５】
キットはDNA増幅に有用な増幅キットである、請求項21に記載のキット。
【請求項３６】
キットはPCRによる DNA増幅に有用なPCRキットである、請求項35に記載のキット。
【請求項３７】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む核酸複製反応混合液であって、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは少なくとも第1成分を含み、該第1成分はαサブユニットを含むが、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼはクランプ装着因子を欠くことを特徴とする核酸複製反応混合液。
【請求項３８】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは非中温性細菌に由来する、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項３９】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好極限性細菌に由来する、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４０】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好熱菌に由来する、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４１】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは熱安定性最小Pol IIIである、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４２】
αサブユニットはpolC αサブユニットである、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４３】
αサブユニットはdnaE αサブユニットである、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４４】
核酸はDNAである、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４５】
DNAは2本鎖DNAである、請求項44に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４６】
第1成分はεサブユニットをさらに含む、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４７】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４８】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼであって、第2成分をさらに含み、該第2成分はクランプを含む、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項４９】
複製反応混合液はDNA配列決定に有用なDNA配列決定反応混合液である、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項５０】
複製反応混合液はDNA増幅に有用なDNA増幅反応混合液である、請求項37に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項５１】
DNA増幅反応混合液はPCRによるDNA増幅に有用なPCR混合液である、請求項50に記載の核酸複製反応混合液。
【請求項５２】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む核酸複製反応チューブであって、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは少なくとも第1成分を含み、該第1成分はαサブユニットを含むが、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼはクランプ装着因子を欠くことを特徴とする核酸複製反応チューブ。
【請求項５３】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは非中温性細菌に由来する、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項５４】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好極限性細菌に由来する、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項５５】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好熱菌に由来する、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項５６】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは熱安定性最小Pol IIIである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項５７】
αサブユニットはpolC αサブユニットである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項５８】
αサブユニットはdnaE αサブユニットである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項５９】
核酸はDNAである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６０】
DNAは2本鎖DNAである、請求項59に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６１】
第1成分はεサブユニットをさらに含む、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６２】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６３】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼであって、第2成分をさらに含み、該第2成分はクランプを含む、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６４】
核酸複製反応チューブはDNA配列決定反応チューブである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６５】
核酸複製反応チューブはDNA増幅反応チューブである、請求項52に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６６】
DNA増幅反応チューブはPCRチューブである、請求項65に記載の核酸複製反応チューブ。
【請求項６７】
(i)鋳型DNA分子、(ii)随意に該鋳型DNA分子とハイブリダイズしうるプライマー、(iii)最小機能性Pol IIIレプリカーゼおよび(iv)該鋳型DNA分子の少なくとも1個の完全コピーを含む反応混合液であって、該鋳型DNA分子の完全コピーは該最小機能性Pol IIIレプリカーゼの使用による複製反応の生成物でありまた該溶液はクランプ装着因子を欠くことを特徴とする反応混合液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸分子の酵素的複製、修飾および消化に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAポリメラーゼは、分子生物学の分野で核酸配列決定、核酸定量(リアルタイムPCR、NASBA)、核酸増幅(PCR、RDA、SDA)などを含む種々の核酸複製法、さらにはRNAのcDNAへの逆転写法や核酸標識法などに使用される。
【０００３】
DNAポリメラーゼIIIホロ酵素(Pol III)を初精製し、E. coli染色体の主要レプリカーゼであると断定したのはKornbergである(Kornberg, A., 1982, Supplement to DNA Replication, Freeman Publications, San Francisco, pp 122-125. 参照により引用)。このホロ酵素は10個のサブユニットからなり、3つの機能性成分に分かれる(McHenry, et al., J. Biol. Chem., 252:6478-6484(1977); Maki, et al., J. Biol. Chem., 263:6551-6559(1988).  以上の文献は参照により引用)。
【０００４】
グラム陰性菌たとえばEscherichia coliなどのPol IIIレプリカーゼの3成分は(i)「コア」(=ポリメラーゼ)、(ii)β(=クランプ)、それに(iii)γ複合体(=クランプ装着因子)である。E. coliでは、2個のコアがτサブユニットにより1つにまとめられてPol III'サブアセンブリーとなり、それが1個のγ複合体と結合してPol III*を形成している。τサブユニットとγサブユニットはどちらもdnaXにコードされる。τサブユニットは完全長産物であるが、γサブユニットのほうはτサブユニットのうちのN末端側2/3程度を占め、翻訳フレームシフトによって形成される[Tsuchihashi et al., “Translational Frameshifting Generates the γ Subunit of DNA Polymerase III Holoenzyme,” (DNAポリメラーゼIII ホロ酵素γサブユニットを生成させる翻訳フレームシフト) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2516-2520(1990). 参照により引用]。他のグラム陰性菌たとえばAquifex aeolicusなどでは、dnaX遺伝子は単一タンパク質(τサブユニット)に翻訳されるだけであり、Pol IIIホロ酵素はγサブユニットを欠いたまま鎖伸長能をもつレプリカーゼを形成する[Bruck I. et al., “Analysis of a multicomponent thermostable DNA polymerase III replicase from an extreme thermophile,”(高度好熱菌に由来する多成分型熱安定性DNAポリメラーゼIII レプリカーゼの分析) J Biol Chem. 2002 May 10;277(19):17334-48. Epub 2002 Feb 21. 参照により引用]。
【０００５】
「コア」内には3つのサブユニットが存在する。αサブユニット(dnaEにコードされる)はDNAポリメラーゼ活性をもつ触媒サブユニットであり、εサブユニット(dnaQ、mutDにコードされる)は校正機能をもつ3'-5'エキソヌクレアーゼであり(Scheuermann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7747-7751(1984); および DiFrancesco, et al., J Biol Chem., 259:5567-5573(1984). 以上の文献は参照により引用)、またθサブユニット(holEにコードされる)はεサブユニットを刺激する[Studwell-Vaughan et al., “DNA Polymerase III Accessory Proteins V. theta encoded by holE*,”(holEがコードするDNAポリメラーゼIII 付属タンパク質V. θ) J. Biol. Chem., 268:11785-11791(1993). 参照により引用]。E. coliではαサブユニットはεサブユニットと緊密な1:1複合体を形成し(Maki et al., J. Biol. Chem., 260:12987-12992(1985). 参照により引用)、またθサブユニットはεサブユニットと1:1複合体を形成する(前記Studwell-Vaughan et al.)。
【０００６】
E. coli Pol IIIレプリカーゼは高効率であり、ユニークプライマー結合後のバクテリオファージ1本鎖DNA(ssDNA)を、ssDNA結合タンパク質(SSB)でコートされた状態で、30℃で毎秒500塩基以上のスピードで、5kbの環状DNAからただの一度も解離することなく、完全に複製する(Fay et al., J. Biol. Chem., 256:976-983(1981); O’Donnell et al., J. Biol. Chem., 260:12884-12889 (1985); Mok et al., J. Biol. Chem., 262:16644-16654 (1987). 以上の文献は参照により引用)。
【０００７】
それ以来、好熱菌を含めて数多くのグラム陰性菌およびグラム陽性菌に由来するDNAポリメラーゼIIIレプリカーゼが開示されてきた(たとえばBullard et al., J.Biol.Chem., 277:13401-13408(2002); Bruck et al., J.Biol.Chem., 277:17334-17348 (2002). 以上の文献は参照により引用)が、これらの細菌のPol IIIレプリカーゼの3成分構造はE. coliのものと類似するように見受けられる。たとえばStreptococcus pyogenesでは、Pol IIIレプリカーゼは(i)polC遺伝子にコードされるαサブユニット(εおよびθサブユニットを欠くが、両サブユニットはグラム陽性菌では欠落している)、(ii)βクランプ、および(iii)τ/δ/δ’複合体(=クランプ装着因子)からなる。in vitroで機能性Pol IIIレプリカーゼを形成するにはpolCに由来するαのβ、τ、δおよびδ’との集成で十分である[Bruck I, O’Donnell M., “The DNA replication machine of a gram-positive organism,”(グラム陽性菌のDNA複製機構) J Biol Chem. 2000 Sep 15;275(37): 28971-83. 参照により引用]。
【０００８】
グラム陽性菌はまたdnaE遺伝子にコードされた第2のDNAポリメラーゼを含むが、これはE.coliのαサブユニットと相同性をもつ。これらのdnaE由来αサブユニットはβと相互作用しうるように見えるものの(前掲Bruck and O’Donell)、Pol IIIレプリカーゼのPolC由来αサブユニットよりもずっと低速であり、校正活性を欠き、また損傷乗り越えDNA合成を促す作用がある。これは突然変異誘発とDNA修復での潜在的な役割を示唆する[Flett F. et al. “A ‘gram-negative type’ DNA polymerase III is essential for replication of the linear chromosome of Streptomyces coelicolor A3(2).” (「グラム陰性型」DNAポリメラーゼIII は放線菌A3(2)株の線状染色体の複製に不可欠) Mol Microbiol. 1999 Feb; 31(3):949-58], [Le Chatelier E. et al. “Involvement of DnaE, the second replicative DNA polymerase from Bacillus subtilis, in DNA mutagenesis.”(枯草菌由来の第2複製型DNAポリメラーゼであるDnaEの、DNA突然変異への関与) J Biol Chem. 2004 Jan 16;279(3):1757-67, Epub 2003 Oct 30], [Foster K. et al. “DNA polymerase III of Enterococcus faecalis: expression and characterization of recombinant enzymes encoded by the polC and dnaE genes.”(大便レンサ球菌DNAポリメラーゼIII : polCおよびdnaE遺伝子にコードされる組み換え酵素の発現と解析) Protein Expr Purif. 2003 Jan:27(1): 90-7], [Boshoff HI et al. “DnaE2 polymerase contributes to in vivo survival and the emergence of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.”(ヒト型結核菌の体内生存と薬剤耐性の出現をもたらすDnaE2ポリメラーゼ) Cell. 2003 Apr 18; 113(2):183-93], [Barnes MH et al. “DNA polymerases of low-GC gram-positive eubacteria: identification of the replication-specific enzyme encoded by dnaE.”(低GCグラム陽性菌のDNAポリメラーゼ: dnaEにコードされる複製酵素の同定) J Bacteriol. 2002 Jul;184(14):3834-8]。ともかく、dnaE由来αサブユニットはその低速と高フレームシフト頻度(損傷迂回活性に基づく)のために、様々な分子生物学的用途への使用には適さないものとなっている。
【０００９】
文献によるこれまでの一貫した教示によれば、DNAポリメラーゼIII ホロ酵素の3主成分すなわちコア(αサブユニットを含む)、クランプおよびクランプ装着因子が、ゲノム複製の特色である高伸長速度をもつ機能性DNAレプリカーゼの必要条件である。米国特許第6,555,349号、6,221,642号、5,668,004、5,583,026号、6,677,146号、6,238,905号の各明細書; およびO'Donnell, Bioessays, 14:105-111, 1992; O'Donnell et al., J. Biol. Chem., 260:12875-12883, 1985; McHenry, Mol. Microbiol., 49:1157-1165, 2003; McHenry, J. Biol. Chem., 266:19127-19130, 1991; Studwell et al., J.Biol.Chem., 265:1171-1178, 1990; Bullard et al., J.Biol.Chem., 277:13401-13408, 2002; およびBruck et al., J. Biol. Chem., 277:17334-17348, 2002などを参照。こうしたDNAポリメラーゼIII 関連文献が明らかに打ち立ててきたドグマによれば、グラム陰性菌のDNAポリメラーゼIII  αサブユニットとグラム陽性菌のpolC由来αサブユニットは単体では機能しえず、ポリメラーゼの安定性、忠実度および鎖伸長能には他のサブユニットが必要になる。
【００１０】
αサブユニット単体またはαサブユニット+コアのポリメラーゼ活性は活性化子牛胸腺DNAを使用した「ギャップフィリング」検定法では超高酵素濃度でしか測定できないこと、またその場合、コアとαサブユニット単体の鎖伸長速度はそれぞれ20 b/sec(塩基/秒)、7.7 b/secにすぎないことを最初に示したのはE. coli Pol IIIに関するKornbergらの原報である。その後、種々の細菌に由来するPol IIIについてのさらに多数の報告がKornbergらの原所見を支持し、またDNAポリメラーゼIII ホロ酵素のαサブユニットまたはコア複合体は高速鎖伸長能を示せないというドグマをさらに強固にした。たとえばBruckら(J. Biol. Chem., 275:28971-28983, 2000)はStreptococcus pyogenes由来のPol III αサブユニット(polC)が単体ではDNAポリメラーゼとして機能しないと報告しており、Bullardら(J. Biol. Chem., 277:13401-13408, 2002)とBruckら(J. Biol. Chem., 277:17334-17348, 2002)はそれぞれThermus thermophilusとAquifex aeolicusではPol IIIの3成分がレプリカーゼ活性に不可欠であると報告している。
【００１１】
先行技術で報告されている低伸長速度と高タンパク質濃度は細菌Pol III レプリカーゼαサブユニットの単独での、またはβクランプとの組み合わせによる、核酸の増幅および/または配列決定を含めた分子生物学研究および臨床診断への使用を阻んできた。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の概要
従前の所見に反して、細菌dnaEおよびpolCにコードされるαサブユニットが適正なin vitro条件下で独立に、単独でおよび/またはPol IIIのクランプ成分との組み合わせで、最小機能性Pol IIIレプリカーゼとして機能しうることを本明細書は明確にする。そうした1成分型または2成分型のPol IIIレプリカーゼはPol IIIクランプ装着因子を欠く。
【００１３】
特に、ここで開示されるのは、ある種のdnaEコード化αサブユニットすなわちグラム陰性菌特に非中温性細菌のdnaEコード化αサブユニットがクランプ装着因子の不存在下に、固有の亜鉛依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を、また機能性Pol IIIレプリカーゼ活性を有するという意外な発見である。ここで開示されるのはまた、ある種のpolCコード化αサブユニットすなわちグラム陰性菌特に非中温菌のpolCコード化αサブユニットがクランプ装着因子の不存在下に、機能性Pol IIIレプリカーゼ活性を有するという意外な発見である。そうしたαサブユニットは本発明の1成分型および2成分型Pol IIIレプリカーゼに使用される。本発明に用いるのが好ましいのは好極限性細菌に由来するαサブユニットである。本発明に用いるのが特に好ましいのは好熱菌に由来するαサブユニットである。
【００１４】
本発明に用いる1成分型および2成分型Pol IIIレプリカーゼはここでは個別に「1成分型Pol IIIレプリカーゼ」および「2成分型Pol IIIレプリカーゼ」といい、また一括して「最小機能性Pol IIIレプリカーゼ」という。意外にも、最小機能性Pol IIIレプリカーゼがin vitroで適正に機能するうえで、クランプ装着因子の存在と機能は不必要である。最小機能性Pol IIIレプリカーゼは、プライマー結合ssDNA鋳型分子を高速、高伸長能で、クランプ装着因子により形成される開始複合体の助けを借りずに、in vitro複製することができるという発見もまた意外である。本発明の最小機能性Pol IIIレプリカーゼは、クランプ装着因子を欠くにもかかわらず、また1成分型Pol IIIレプリカーゼの場合にはクランプをも欠くにもかかわらず、その伸長速度は本明細書で示すように、DNAの配列決定、増幅、定量、標識および逆転写に現在使用されているAタイプまたはBタイプのいずれの修復DNAポリメラーゼたとえばTaq DNAポリメラーゼI(Aタイプ)、E. coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント(Aタイプ)、T7 DNAポリメラーゼ(Aタイプ)、Bst DNAポリメラーゼI(Aタイプ)、phi29 DNAポリメラーゼ(Bタイプ)、Pfu DNAポリメラーゼ(Bタイプ)、Tli DNAポリメラーゼ(Bタイプ)またはKOD DNAポリメラーゼ(Bタイプ)と比較しても、少なくとも6〜8倍である。
【００１５】
さらにここで開示されるのは、好熱菌に由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼが適正条件下で2本鎖DNA 分子のin vitro増幅を導く温度サイクルモードでの反復DNA複製反応を支えるに足る熱安定性を示すという意外な発見である。
【００１６】
本発明は、核酸複製のための組成物および方法への、たとえばPCRなどのようなDNA増幅法およびDNA配列決定法への、最小機能性Pol IIIレプリカーゼの使用に関する。
【００１７】
従って、本発明は一態様で、核酸分子を複製する方法であって開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液中で該核酸分子に複製反応を起こさせるステップを含む方法を提供する。一実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである。別の実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼである。別の実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼの組み合わせが複製反応混合液に使用される。
【００１８】
好ましい実施形態では、複製される核酸分子はDNA分子である。さらなる好ましい実施形態では、DNA分子は2本鎖である。さらなる好ましい実施形態では、2本鎖DNA分子は線状DNA分子である。別の実施形態では、DNA分子は非線状たとえば環状またはスーパーコイル状DNAである。
【００１９】
好ましい実施形態では、核酸分子を複製する方法は核酸分子好ましくはDNAの配列決定に有用な配列決定法である。好ましい実施形態では、該方法は配列決定反応混合液中で該核酸分子に配列決定反応を起こさせるステップを含む。配列決定反応混合液は開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは1成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましくは、1成分型Pol IIIレプリカーゼは配列決定反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'末端ジデオキシヌクレオチドを除去しうる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００２０】
好ましい実施形態では、核酸分子を複製する方法は核酸分子好ましくはDNAの増幅に有用な増幅法である。好ましい実施形態では、該方法は増幅反応混合液中で該核酸分子に増幅反応を起こさせるステップを含む。増幅反応混合液は開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む。好ましい実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼは増幅反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００２１】
好ましい実施形態では、該増幅方法は核酸分子好ましくはDNA(2本鎖であるのが好ましい)の温度サイクルモードでの増幅に有用なサーモサイクリング増幅法である。好ましい実施形態では、該方法はサーモサイクリング増幅反応混合液中で該核酸分子にサーモサイクリング増幅反応を起こさせるステップを含む。サーモサイクリング増幅反応混合液は開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはサーモサイクリング増幅反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅反応混合液は開示の熱安定剤をさらに含む。さらなる好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅反応混合液は開示のDNA不安定化剤をもさらに含む。
【００２２】
好ましい実施形態では、該サーモサイクリング増幅方法は核酸分子好ましくはDNAのPCRによる増幅に有用なPCR法である。好ましい実施形態では、該方法はPCR反応混合液中で該核酸分子にPCRを起こさせるステップを含む。好ましい実施形態では、PCR反応混合液は開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはPCR反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましい実施形態では、PCR反応混合液は開示の熱安定剤をさらに含む。さらなる好ましい実施形態では、PCR反応混合液は開示のDNA不安定化剤をもさらに含む。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明は高速PCR法を提供する。好ましい実施形態では、該方法は高速PCR反応混合液中で該核酸分子に高速PCRを起こさせるステップを含む。好ましい実施形態では、高速PCR反応混合液は開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼは高速PCR反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましい実施形態では、高速PCR反応混合液は開示の熱安定剤をさらに含む。さらなる好ましい実施形態では、高速PCR反応混合液は開示のDNA不安定化剤をもさらに含む。該高速PCR法は変性のための第1温度とプライマーのアニーリング/伸長のための第2温度である2-温度サイクルの反復からなる2ステップPCR法であるのが好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明はロングレンジPCR法を提供する。好ましい実施形態では、該方法はロングレンジPCR反応混合液中で該核酸分子にロングレンジPCRを起こさせるステップを含む。好ましい実施形態では、ロングレンジPCR反応混合液は開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはロングレンジPCR反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましい実施形態では、ロングレンジPCR反応混合液は開示の熱安定剤をさらに含む。さらなる好ましい実施形態では、ロングレンジPCR反応混合液は開示のDNA不安定化剤をもさらに含む。
【００２５】
一態様では、本発明は開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む核酸増幅用の複製反応混合液を提供する。好ましい実施形態では、複製反応混合液はDNA複製に有用である。一実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである。別の実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼである。別の実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼの組み合わせが複製反応混合液に使用される。
【００２６】
一実施形態では、本発明は最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含むDNA増幅用またはDNA配列決定用の複製反応混合液を提供する。
【００２７】
好ましい実施形態では、複製反応混合液は核酸配列決定好ましくはDNA配列決定に有用な配列決定反応混合液である。該配列決定反応混合液は最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは1成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。該1成分型Pol IIIレプリカーゼは配列決定反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'末端ジデオキシヌクレオチドを除去しうる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、複製反応混合液は核酸増幅好ましくはDNA増幅に有用な増幅反応混合液である。該増幅反応混合液は開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む。好ましくは、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは増幅反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００２９】
好ましい実施形態では、該増幅反応混合液は核酸分子好ましくはDNA(2本鎖であるのが好ましい)の温度サイクルモードでの増幅に有用なサーモサイクリング増幅反応混合液である。好ましい実施形態では、該サーモサイクリング増幅反応混合液は開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましくは、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはサーモサイクリング増幅反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、サーモサイクリング増幅反応混合液は開示の熱安定剤をさらに含む。好ましくは、サーモサイクリング増幅反応混合液は開示のDNA不安定化剤をもさらに含む。
【００３０】
好ましい実施形態では、該増幅反応混合液は核酸分子好ましくはDNA(2本鎖であるのが好ましい)のPCR増幅に有用なポリメラーゼ連鎖反応混合液(PCR混合液)である。該PCR混合液は開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましくは、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはPCR混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、PCR混合液は開示の熱安定剤をさらに含む。好ましくは、PCR混合液は開示のDNA不安定化剤をもさらに含む。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明は高速PCR法に有用な高速PCR混合液であるPCR混合液を提供する。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明はロングレンジPCR法に有用なロングレンジPCR混合液であるPCR混合液を提供する。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液はある量の、すなわち鋳型DNAおよび該鋳型DNAとハイブリダイズしうるプライマーと混合させることができ、また 仕込み量の反応混合液とするために随意に適宜希釈することができる量の、最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含むが、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは、ハイブリダイズしたプライマーを>100塩基/秒の速度で、より好ましくは>150塩基/秒、より好ましくは>200塩基/秒、より好ましくは>250塩基/秒、より好ましくは>300塩基/秒、より好ましくは>350塩基/秒、より好ましくは>400塩基/秒、より好ましくは>450塩基/秒、より好ましくは>500塩基/秒、より好ましくは>550塩基/秒、より好ましくは>600塩基/秒、より好ましくは>650塩基/秒、より好ましくは>700塩基/秒の速度で伸長することにより該DNA鋳型を複製しうることを特徴とする。さらに、該仕込み量反応混合液はDNAポリメラーゼIII  αサブユニット濃度が好ましくは6ng/μL以上、より好ましくは7ng/μL以上、より好ましくは8ng/μL以上、より好ましくは9ng/μL以上、より好ましくは10ng/μL以上、より好ましくは20ng/μL以上、より好ましくは50ng/μL以上、より好ましくは100ng/μL以上、より好ましくは150ng/μL以上、より好ましくは200ng/μL以上である。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液は最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含むが、該反応混合液中のDNAポリメラーゼIII  αサブユニット濃度は6ng/μL以上、より好ましくは7ng/μL以上、より好ましくは8ng/μL以上、より好ましくは9ng/μL以上、より好ましくは10ng/μL以上、より好ましくは20ng/μL以上、より好ましくは50ng/μL以上、より好ましくは100ng/μL以上、より好ましくは150ng/μL以上、より好ましくは200ng/μL以上であることを特徴とする。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液は両性イオン緩衝液を含む。好ましい実施形態では、両性イオン緩衝液はpHが約7.5〜8.9である。好ましい実施形態では、両性イオン緩衝液は弱有機酸と弱有機塩基の組み合わせを含む。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明で提供されるサーモサイクリング増幅反応混合液は、最小機能性Pol IIIレプリカーゼの熱安定性を高める熱安定剤(本明細書では単に安定剤ともいう)を含む。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液はCaCl2を欠く。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液はγサブユニットおよび/またはτサブユニットを欠く。
【００３９】
一態様では、本発明は開示の核酸複製反応混合液を含む核酸複製反応チューブを提供する。複製反応混合液を含むチューブは反応混合液を入れたチューブである。該核酸複製反応チューブは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む。一実施形態では、核酸複製反応チューブは開示の1成分型Pol IIIレプリカーゼを含む。別の実施形態では、核酸複製反応チューブは開示の2成分型Pol IIIレプリカーゼを含む。別の実施形態では、核酸複製反応チューブは最小機能性Pol IIIレプリカーゼの組み合わせを含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、核酸複製反応チューブは開示の配列決定反応混合液を含む配列決定反応チューブである。該配列決定反応チューブは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは1成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましくは、1成分型Pol IIIレプリカーゼは配列決定反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'末端ジデオキシヌクレオチドを除去しうる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、核酸複製反応チューブは開示の増幅反応混合液を含む増幅反応チューブである。該増幅反応チューブは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む。
【００４２】
好ましい実施形態では、該増幅反応チューブは開示のサーモサイクリング増幅反応混合液を含むサーモサイクリング増幅反応チューブである。該サーモサイクリング増幅反応チューブは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００４３】
好ましい実施形態では、該サーモサイクリング増幅反応チューブは開示のPCR反応混合液を含むPCRチューブである。該PCRチューブは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明は開示の高速PCR反応混合液を含む高速PCRチューブであるPCRチューブを提供する。該高速PCRチューブは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明は開示のロングレンジPCR反応混合液を含むロングレンジPCRチューブであるPCRチューブを提供する。該ロングレンジPCRチューブは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【００４６】
一態様では、本発明は開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む、核酸の複製に有用な核酸複製キットを提供する。好ましい実施形態では、該複製キットは開示の複製反応混合液を含む。該キットの複製反応混合液は最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含まず、使用前に最小機能性Pol IIIレプリカーゼの添加を必要とするものでもよい。好ましい実施形態では、該複製キットはDNAの複製に有用である。一実施形態では、該キットの最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである。別の実施形態では、該キットの最小機能性Pol IIIレプリカーゼは2成分型Pol IIIレプリカーゼである。別の実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼの組み合わせが核酸複製キットに含まれる。
【００４７】
好ましい実施形態では、該核酸複製キットは核酸好ましくはDNAの配列決定に有用な配列決定キットである。該配列決定キットは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは1成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、該配列決定キットは開示の配列決定反応混合液を含む。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、該核酸複製キットは核酸好ましくはDNAの増幅に有用な増幅キットである。該増幅キットは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む。好ましくは、該増幅キットは開示の核酸増幅反応混合液を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、該増幅キットは核酸好ましくはDNA(2本鎖であるのが好ましい)の温度サイクルモードによる増幅に有用なサーモサイクリング増幅キットである。該サーモサイクリング増幅キットは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、該サーモサイクリング増幅キットは開示のサーモサイクリング増幅反応混合液を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、該サーモサイクリング増幅キットは核酸好ましくはDNA(2本鎖であるのが好ましい)のPCR増幅に有用なPCRキットである。該PCRキットは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、該PCRキットは開示のPCR反応混合液を含む。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明は高速PCRキットであるPCRキットを提供する。該高速PCRキットは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、該高速PCRキットは開示の高速PCR反応混合液を含む。
【００５２】
好ましい実施形態では、本発明はロングレンジPCRキットであるPCRキットを提供する。該ロングレンジPCRキットは開示の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼを、好ましくは熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを、含む。好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。好ましくは、該ロングレンジPCRキットは開示のロングレンジPCR反応混合液を含む。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明で提供される核酸複製キットは核酸複製反応混合液を含み、該複製反応混合液はある量の、すなわち鋳型DNAおよび該鋳型DNAとハイブリダイズしうるプライマーと混合させることができ、また 仕込み量の反応混合液を生成させるために随意に適宜希釈することができる量の、最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含むが、該最小機能性Pol IIIレプリカーゼは、ハイブリダイズしたプライマーを>100塩基/秒の速度で、より好ましくは>150塩基/秒、より好ましくは>200塩基/秒、より好ましくは>250塩基/秒、より好ましくは>300塩基/秒、より好ましくは>350塩基/秒、より好ましくは>400塩基/秒、より好ましくは>450塩基/秒、より好ましくは>500塩基/秒、より好ましくは>550塩基/秒、より好ましくは>600塩基/秒、より好ましくは>650塩基/秒、より好ましくは>700塩基/秒の速度で伸長することにより該DNA鋳型を複製しうることを特徴とする。さらに、該仕込み量反応混合液はDNAポリメラーゼIII  αサブユニット濃度が好ましくは6ng/μL以上、より好ましくは7ng/μL以上、より好ましくは8ng/μL以上、より好ましくは9ng/μL以上、より好ましくは10ng/μL以上、より好ましくは20ng/μL以上、より好ましくは50ng/μL以上、より好ましくは100ng/μL以上、より好ましくは150ng/μL以上、より好ましくは200ng/μL以上である。
【００５４】
一態様では、本発明は鋳型DNA分子、随意に該鋳型DNA分子とハイブリダイズしうるプライマー、最小機能性Pol IIIレプリカーゼ、および該鋳型DNA分子の少なくとも1個の完全コピーを含むin vitro反応混合液であって、該鋳型DNA分子の完全コピーは該最小機能性Pol IIIレプリカーゼの使用による複製反応の生成物であり、また該溶液はクランプ装着因子を欠くことを特徴とするin vitro反応溶液を提供する。
【００５５】
一実施形態では、該溶液はさらにクランプを欠く。
【００５６】
好ましい実施形態では、溶液中のDNAポリメラーゼIII  αサブユニット濃度は6ng/μL以上、より好ましくは7ng/μL以上、より好ましくは8ng/μL以上、より好ましくは9ng/μL以上、より好ましくは10ng/μL以上、より好ましくは20ng/μL以上、より好ましくは50ng/μL以上、より好ましくは100ng/μL以上、より好ましくは150ng/μL以上、より好ましくは200ng/μL以上である。
【００５７】
開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼは少なくとも第1成分を含み、該第1成分はPol III αサブユニットを含む。いくつかの好ましい実施形態では、該第1成分は実質的にPol III αサブユニットからなる。いくつかの好ましい実施形態では、該第1成分はPol IIIコアポリメラーゼ複合体の1つまたは複数の追加サブユニットを含む。開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼはクランプ装着因子を欠く。
【００５８】
本発明に使用される最小機能性Pol IIIレプリカーゼは開示のような機能性レプリカーゼである。
【００５９】
従って、本発明への使用に提供されるのは1成分型Pol IIIレプリカーゼと2成分型Pol IIIレプリカーゼとを含めた最小機能性Pol IIIレプリカーゼである。
【００６０】
本発明に使用される最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好ましくは非中温性細菌に由来し、より好ましくは好極限性細菌に由来し、もっとも好ましくは好熱菌に由来する。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明に使用される最小機能性Pol IIIレプリカーゼは1成分型Pol IIIレプリカーゼである。1成分型Pol IIIレプリカーゼは実質的に最小機能性Pol IIIレプリカーゼの第1成分からなる。本発明の1成分型Pol IIIレプリカーゼはクランプ装着因子を欠く。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、本発明に使用される最小機能性Pol IIIレプリカーゼはさらに第2成分を含むが、該第2成分はクランプを含む。従って、この2成分型Pol IIIレプリカーゼは実質的に第1成分と第2成分からなるが、第1成分は開示の1成分型Pol IIIレプリカーゼそのものであり、第2成分はクランプを含む。好ましい実施形態では、第2成分は実質的にクランプからなる。好ましい実施形態では、クランプはPol III βサブユニットを含む。いくつかの好ましい実施形態では、クランプは実質的にPol III βサブユニットからなる。2成分型Pol IIIレプリカーゼもまたクランプ装着因子を欠く。いくつかの実施形態では、2成分型Pol IIIレプリカーゼは複数の第1成分を含むが、それらの第1成分は同じでも異なってもよい。
【００６３】
本発明の熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好熱性細菌または好熱性藍色細菌に由来するのが好ましい。好ましい実施形態では好熱性細菌はThermus、Aquifex、Thermotoga、Thermocrinis、Deinococcus、Methanobacterium、Hydrogenobacter、Geobacillus、Thermosynchecoccus、Thermoanaerobacterの各属からなる群より選択される。特に好ましいのはAquifex aeolicus、Aquifex  pyogenes、Thermus thermophilus、Thermus aquaticus、Thermotoga neapolitanaおよびThermotoga maritimaに由来する1成分型および2成分型Pol IIIである。
【００６４】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼのαサブユニットは細菌polCまたはdnaE遺伝子にコードされるが、dnaEコード化αサブユニットは、開示のように、固有の亜鉛依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、細菌polCまたはdnaE遺伝子コード化αサブユニットはAquifex aeolicus、Thermus thermophilus、Deinococcus radiurans、Thermus aquaticus、Thermotoga maritima、Thermoanaerobacter、 Geobacillus stearothermophilus、Thermus flavus、Thermus ruber、Thermus brockianus、Thermotoga neapolitana、Thermotoga属の他種、Methanobacterium thermoautotrophicum、およびThermocrinis、Hydrogenobacter、Thermosynchecoccusの各属の種々の種、それに以上の種の突然変異種からなる群より選択される細菌または藍色細菌に由来する。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明に使用される2成分型Pol IIIレプリカーゼのαサブユニットはグラム陰性菌の細菌polC遺伝子にコードされる。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、本発明に使用される2成分型Pol IIIレプリカーゼのαサブユニットはグラム陽性菌の細菌polC遺伝子にコードされる。
【００６８】
一実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼは、または2成分型Pol IIIレプリカーゼの第1成分は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性をもつεサブユニットを追加的に含む。
【００６９】
一実施形態では、反応混合液中の最小機能性Pol IIIレプリカーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性はεサブユニットによって付与される。別の実施形態では、反応混合液中の最小機能性Pol IIIレプリカーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性はDNAポリメラーゼIII αサブユニットによって付与される。DNAポリメラーゼIII αサブユニットの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、開示のように、亜鉛によって調整することが可能であり、また反応混合液の違いによって異なる場合がある。
【００７０】
代替実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼは条件が同じなのにポリメラーゼ活性を有する一方で3'末端ジデオキシヌクレオチドを除去しうる有意の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示さない。好ましい実施形態では、有意の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く最小機能性Pol IIIレプリカーゼは、グラム陽性菌のdnaE遺伝子にコードされるαサブユニットを含む1成分型Pol IIIレプリカーゼである。
【００７１】
一実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼは、または2成分型Pol IIIレプリカーゼの第1成分は、Pol III DNAポリメラーゼコアの追加サブユニットたとえばθなどを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、熱安定性DNAポリメラーゼである1成分型Pol IIIレプリカーゼおよび2成分型Pol IIIレプリカーゼが使用される。これらの熱安定性DNAポリメラーゼは本願ではそれぞれ「熱安定性1成分型Pol IIIレプリカーゼ」、「熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼ」といい、また一括して「熱安定性最小機能性Pol IIIレプリカーゼ」という。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
本発明の詳細な説明
本発明で使用される最小機能性Pol IIIレプリカーゼにはDNAポリメラーゼIII ホロ酵素などを含めた既知のDNAポリメラーゼと比較していくつかの利点がある。たとえば1成分型および2成分型Pol IIIレプリカーゼの使用はDNAポリメラーゼIII ホロ酵素の使用と比較して明らかに費用効果が高いし、高速、高忠実度、随意的な熱安定性、および(今日の増幅および配列決定反応に使用されている通常の修復型DNAポリメラーゼや他の既知1成分型および2成分型DNAポリメラーゼたとえばグラム陽性菌dnaEポリメラーゼをしのぐ)比類ない鎖伸長活性をもたらす。特に、開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼは通常の修復型DNAポリメラーゼと比較して約6〜8倍も高速のプライマー伸長速度を、また最も正確な修復型DNAポリメラーゼと比較して3桁も低い(10-9)エラー率を、実現することができる。
【００７４】
加えて、DNAポリメラーゼIII ホロ酵素の単一サブユニット、単一成分または2成分で最小機能性Pol IIIレプリカーゼを再構成しうるというのは、該ホロ酵素中の追加サブユニット(たとえばクランプ装着因子のγまたはδサブユニット)が特定ソースからまだ同定、精製またはクローニングされていないときには、特に有利である。そのうえ、開示のように、最小機能性Pol IIIレプリカーゼとして有用なαサブユニットは、該ポリペプチドの活性についての予備知識や対応するホロ酵素の同定を前提とすることなく、配列分析だけで同定することができる。
【００７５】
本発明に有用な最小機能性Pol IIIレプリカーゼの成分は、対応するDNAポリメラーゼIII を生成する任意の生物から単離してもよい。
【００７６】
本発明に有用な最小機能性Pol IIIレプリカーゼの成分は、商業的に(たとえばAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md.から)入手可能な好熱菌を含む種々の細菌から単離してもよい。当業者には自明であろうが、熱安定性1成分型または2成分型Pol IIIレプリカーゼのソースとしては任意の好熱菌を使用してよい。細菌細胞の増殖は標準の微生物学的技術を用いて、技術上周知の特定好熱種の活性培養に適した培地および培養条件に従って行ってもよい[たとえばBrock, T.D. and Freeze, H., J. Bacteriol., 98(1):289-297 (1969); Oshima, T. and Imahori, K. Int. J. Syst. Bacteriol., 24(1):102-112 (1974)。両文献は参照により引用される]。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明のDNAポリメラーゼの成分は遺伝子組み換えによって生成させる。
【００７８】
「最小機能性Pol IIIレプリカーゼ」はDNAポリメラーゼIII サブユニットの機能性サブアセンブリーをいう。機能性は後述のように、プライマー伸長速度を特徴とするレプリカーゼ活性をいう。
【００７９】
特定細菌属または種「の」または「に由来する」遺伝子は本願では、特定細菌属または種「の」または「に由来する」遺伝子を直接的に意味するものではなく、該特定遺伝子の、該特定細菌属または種の内在性遺伝子との一致、対応を意味する。
【００８０】
核酸複製
本発明は一態様で、核酸分子を複製する方法であって最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液中で該核酸分子に複製反応を起こさせるステップを含む方法を提供する。
【００８１】
「核酸複製」は鋳型核酸分子の全部または一部の複製を意味する。従って、核酸複製反応の生成物は複製元の鋳型核酸分子に対して完全にまたは部分的に相補的である。核酸複製は鋳型核酸にハイブリダイズしたプライマーを5'-3'方向に伸長させることによって行うが、結果的に伸長産物の各位置には鋳型核酸の塩基に対して相補的なヌクレオチドが組み込まれる。プライマーはたとえば1本鎖DNA鋳型の一領域とハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドでもよい。また、プライマーはたとえば該1本鎖DNA鋳型の第2領域に対して相補的でありかつ自己プライミングしうるような1本鎖DNA鋳型の一領域でもよい。核酸複製反応の範囲内に包摂されるのは、等温複製反応、配列決定反応、増幅反応、サーモサイクリング増幅反応、PCR、高速PCR、ロングレンジPCRなどである。
【００８２】
核酸増幅反応で複製される核酸は好ましくはDNAであり、また複製は好ましくは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼのDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を必要とする。
【００８３】
核酸複製反応には1成分型および/または2成分型Pol IIIレプリカーゼを使用してもよい。核酸配列決定反応では、3'末端ジデオキシヌクレオチドを切除しうる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠いた1成分型Pol IIIレプリカーゼが一般に好ましい。核酸増幅反応では、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する2成分型Pol IIIレプリカーゼが一般に好ましい。核酸サーモサイクリング増幅反応では、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼが一般に好ましい。
【００８４】
好ましい実施形態では、複製反応混合液はpK約7.0〜8.5の弱有機酸(HEPES、DIPSO、TAPS、HEPBS、HEPPSO、TRICINE、POPSO、MOBS、TAPSO、TESなど)とpK約6.8〜8.5の弱有機塩基(Tris、Bis-Tris-プロパン、イミダゾール、TMNO、4-メチルイミダゾール、ジエタノールアミンなど)の組み合わせを含む両性イオン緩衝液を含むが、該緩衝液のpHは有機塩基による滴定で約7.5〜8.9に定めてあり、また有機酸濃度は約10〜40mMに、より好ましくは約20〜30mMである。
【００８５】
特に好ましい実施形態では、複製反応混合液と最小機能性Pol IIIレプリカーゼの組み合わせは次の組み合わせより選択される: (i)HEPES-Bis-Tris-プロパン(20mM, pH 7.5)+Thermus属特にThermus thermophilus種に由来するdnaEコード化αサブユニットを含む最小機能性Pol IIIレプリカーゼ; および(ii)TAPS-Tris(20mM, pH 8.7)+Aquifex属特にAquifex aeolicus種に由来するdnaEコード化αサブユニットを含む最小機能性Pol IIIレプリカーゼ。
【００８６】
好ましい実施形態では、核酸複製反応混合液はZn2+、Mg2+、K+およびNH42+からなる群より選択される1つまたは複数のイオンを含むが、該イオンは反応混合液中での最小機能性Pol IIIレプリカーゼ活性の至適化を目的に添加される。該イオンは予備検定で滴定して反応混合液中での最小機能性Pol IIIレプリカーゼ活性の至適化に対応する至適濃度を求めるのが好ましい。特に好ましい実施形態では、核酸複製反応混合液はCa2+イオンを欠く。
【００８７】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合液はカリウムイオンを含む。カリウムイオンは当初に滴定して、使用Pol III系に対応する至適濃度を求めるのが好ましい。一般に複製反応混合液中のK+濃度は好ましくは0〜約100mMであり、より好ましくは約5〜25mMである。カリウムイオンはKCl、K2SO4または酢酸カリウムの形で提供するのが好ましい。最小機能性Pol IIIレプリカーゼの活性にはK+と共に提供される特定の対陰イオンが影響を及ぼしうるので、特定の複製反応においてどの対陰イオンが特定の最小Pol III系に最もふさわしいかを明らかにする目的で予備検定を行うのが好ましい。一般に、Aquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼには対陰イオンとして硫酸イオンまたは塩化物イオンを使用するのが、しかも塩化物イオンよりも硫酸イオンのほうが、好ましい。また、カリウムイオンはThermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液には使用しないのが好ましい。
【００８８】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合液はアンモニウムイオンを含む。アンモニウムイオンは当初に滴定して、使用Pol III系に対応する至適濃度を求めるのが好ましい。一般に複製反応混合液中のNH42+濃度は好ましくは0〜約15mMである。アンモニウムイオンは硫酸アンモニウムの形で提供するのが好ましい。一般に、Aquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液にはアンモニウムイオンを使用するのが好ましい。また、Thermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液にはアンモニウムイオンは使用しないのが好ましい。
【００８９】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合液は亜鉛イオンを含む。亜鉛イオンは当初に滴定して、使用Pol III系に対応する至適濃度を求めるのが好ましい。一般に複製反応混合液中のZn2+濃度は好ましくは0〜約50μMであり、より好ましくは約5〜15μMである。亜鉛イオンはZnSO4、ZnCl2および酢酸亜鉛からなる群より選択される塩の形で提供するのが好ましい。最小機能性Pol IIIレプリカーゼの活性にはZn2+と共に提供される特定の対陰イオンが影響を及ぼしうるので、特定の複製反応においてどの対陰イオンが特定の最小Pol III系に最もふさわしいかを明らかにする目的で予備検定を行うのが好ましい。一般に、Thermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液には対陰イオンとして塩化物イオンまたは酢酸イオンを使用するのが好ましくは、またAquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼには硫酸イオンを使用するのが好ましい。
【００９０】
一般に、Zn2+は多数の(たとえばThermus thermophilus dnaE) αサブユニットの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を強めかねないので、配列決定反応混合液には使用しないのが好ましい。任意の特定最小機能性Pol IIIレプリカーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性に対するZn2+の影響および同じものを使用する配列決定反応に対するZn2+の影響は、技術上周知の標準エキソヌクレアーゼ活性検定法で評価してもよい。
【００９１】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合液はマグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンは当初に滴定して、使用Pol III系に対応する至適濃度を求めるのが好ましい。一般に複製反応混合液中のMg2+濃度は好ましくは0〜約15mMであり、より好ましくは約4〜10mMである。一般に、等温核酸複製反応は核酸配列決定反応を含めて、好ましい濃度範囲の上限寄りのMg2+濃度に対する適応力が強い。マグネシウムイオンはMgCl2、MgSO4および酢酸マグネシウムからなる群より選択される塩の形で提供するのが好ましい。最小機能性Pol IIIレプリカーゼの活性にはMg2+と共に提供される特定の対陰イオンが影響を及ぼしうるので、特定の複製反応においてどの対陰イオンが特定の最小Pol III系に最もふさわしいかを明らかにする目的で予備検定を行うのが好ましい。一般に、Thermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液には対陰イオンとして酢酸イオンまたは塩化物イオンを使用するのが、しかも塩化物イオンよりも酢酸イオンのほうが、好ましい。またAquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼには硫酸イオンを使用するのが好ましい。
【００９２】
特に好ましい実施形態では、Aquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼと併用する複製反応混合液はTAPS-Tris(20mM, pH 8.7)、25mM K2SO4、10mM NH4(OAc)2および10mM MgSO4を含む。
【００９３】
別の特に好ましい実施形態では、Thermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼと併用する複製反応混合液はHEPES-Bis-Tris(20mM, pH 8.7)と10mM Mg(OAc)2を含む。
【００９４】
一実施形態では、複製反応にヘリカーゼを使用して、複製用1本鎖核酸鋳型の提供に必要となる変性温度を引き下げるようにする。
【００９５】
一実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液はATPを欠く。
【００９６】
一実施形態では、本発明で提供される複製反応混合液はSSBを欠くが、SSBは複製反応混合液中に存在するとしたら、該複製反応混合液中に含まれる特定の最小機能性Pol IIIレプリカーゼのDNAポリメラーゼ活性を低下させることになろう。好ましい実施形態では、Streptococcus pyogenes polCにコードされるαサブユニットを含む最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む複製反応混合液は、SSBを欠く。
【００９７】
本願の核酸複製反応では、使用される1成分型または2成分型Pol IIIレプリカーゼは好熱菌に由来するが、反応混合液は好ましくはpHが約7.2〜8.9である。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合液はZn2+濃度が0〜約50μMであり、より好ましくは5〜15μMである。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合液はMg2+濃度が0〜約15mMであり、より好ましくは約4〜10mMである。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合液はK+濃度が0〜約100mMであり、より好ましくは約5〜25mMである。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合液はNH42+濃度が0〜約12mMであり、より好ましくは約5〜12mMである。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合液はこれらの陽イオンの、好ましい濃度範囲における、組み合わせを含む。
【００９８】
本願の核酸複製反応では、プライマー伸長を行う温度は好ましくは約60〜72℃、より好ましくは約62〜68℃である。
【００９９】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅反応でプライマーのアニーリングおよび伸長を行う温度は約60〜72℃、より好ましくは約62〜68℃、より好ましくは約62〜65℃であるが、至適温度はプライマーの鎖長、塩基含量、鋳型に対する相補性の度合い、および技術上周知の他の因子に左右されよう。
【０１００】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅反応で変性を行う温度は約86〜91℃、より好ましくは約87〜89℃であり、開示のDNA不安定化剤を含むサーモサイクリング増幅反応混合液の場合には該温度範囲の下限寄りの温度が好ましい。好ましいサーモサイクリング増幅法はPCR法であるが、そのサイクル数は約10〜100サイクル、より好ましくは約25〜50サイクルであり、ピーク温度は約86〜91℃、より好ましくは約87〜89℃であり、開示のDNA不安定化剤を含むPCR反応混合液の場合には該温度範囲の下限寄りの温度が好ましい。
【０１０１】
安定剤
サーモサイクリング増幅反応混合液には2以上好ましくは3以上の安定剤からなる複合安定剤を含めるのが好ましい。好ましい実施形態では、複合安定剤は少なくとも1つの共溶媒たとえばポリオール(グリセロール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなど)、少なくとも1つのクラウディング剤たとえばポリエチレングリコール(PEG)、フィコール、ポリビニルアルコールまたはポリプロピレングリコール、および糖、有機四級アミン(ベタインなど)とそのN-オキシドおよび界面活性剤からなる群より選択される第3成分を含む。特に好ましい実施形態では、複合安定剤は共溶媒、クラウディング剤、および四級アミンN-オキシドたとえばトリエチルアミン-N-オキシドまたはモルホリン-N-オキシドを含む。さらなる好ましい実施形態では、反応混合液はさらに第4の安定剤を、最も好ましくは第2のポリオールを含む。他の好ましい第4の複合安定剤は3種の共溶媒と四級アミンN-オキシドとを含む。
【０１０２】
高温変性ステップを採用する核酸複製反応は反応混合液に1つまたは複数の安定剤を含めるのが有効な場合もある。本発明の好ましい安定剤はポリオールなどの共溶媒とPEGなどのクラウディング剤とを、一般に1つまたは複数のオキシド、糖、界面活性剤、ベタインおよび/または塩と共に含む。**米国特許出願第60/541,999号および米国特許出願第11/ , 号の各明細書を参照。ホロ酵素活性一般、特に2成分型ポリメラーゼ活性には、前記成分の組み合わせが最も好ましい。
【０１０３】
「クラウディング高分子剤(crowding polymeric agent)」または「クラウディング剤(crowding agent)」は本明細書ではタンパク質凝集を少なくとも部分的に擬態するような高分子をいう。本発明に使用されるクラウディング剤の例はPEG、PVP、フィコール、プロピレングリコールなどである。
【０１０４】
「界面活性剤」は本明細書では水の表面張力を低下させる任意の物質をいい、その非限定的な例は陰イオン性、陽イオン性、非イオン性および両性イオン性の各界面活性剤である。本発明に使用される界面活性剤の例はTween 20、NP-40およびZwittergent 3-10などである。
【０１０５】
「ポリオール」は本明細書では多価アルコールを、すなわち3個以上のヒドロキシル基を含むアルコールをいう。3個のヒドロキシル基をもつ(3価)アルコールはグリセロールであり、ヒドロキシル基が4個以上のアルコールは糖アルコールといい、一般式CH2OH(CHOH)nCH2OHで表される(式中nは2〜5である)。
【０１０６】
【表１】
2007532116.tif 000002
【０１０７】
【表２】
2007532116.tif 000003
【０１０８】
【表３】
2007532116.tif 000004
【０１０９】
本発明の実施形態は一般に、温度サイクルモードの核酸増幅を容易にするためにＩ〜VII 群(Table 2)より選択される2種類以上好ましくは3種類以上の安定剤を合わせるステップを含む。本発明の好ましい実施形態はII群由来の少なくとも1成分特にグリセロールおよび/またはソルビトールをIII 群由来の成分と、増幅反応混合液中で合わせるステップを含む。特に好ましい複合はII群由来の2種類の成分と、III 群由来の1成分およびVII 群由来の1成分との複合である。
【０１１０】
核酸増幅
本発明は一態様で、核酸分子を増幅する方法であって、開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む増幅反応混合液中で該核酸分子に開示の増幅法に従って増幅反応を起こさせるステップを含む方法を提供する。好ましくは、増幅反応は開示の増幅反応チューブ内で行う。
【０１１１】
核酸分子は文献記載の任意の手動または自動化増幅法で増幅させてもよい。「増幅」は本明細書では、DNAまたはRNAポリメラーゼを使用して所期塩基配列のコピー数を増加させる任意のin vitro方法をいう。増幅対象の核酸はDNAであるのが好ましく、また増幅は好ましくは開示の最小機能性Pol IIIレプリカーゼのDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を必要とする。
【０１１２】
一実施形態では、核酸増幅ではDNA分子またはプライマー中に塩基が取り込まれ、以って核酸鋳型に対して相補的な新しいDNA分子が形成される結果となる。形成されるDNA分子とその鋳型は追加DNA分子を合成するための鋳型として使用することができる。1増幅反応は本明細書では多数回のDNA複製からなってもよい。DNA増幅反応の例はたとえばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法である。1 PCR反応は10〜100「サイクル」のDNA変性/合成からなってもよい。そうした方法の非限定的な例は(参照により引用される米国特許第4,683,195号および第4,683,202号の各明細書で開示の) PCR法、(参照により引用される米国特許第5,455,166号明細書で開示の)Strand Displacement Amplification (SDA)法、および(参照により引用される米国特許第5,409,818号明細書に開示の)Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)法などである。たとえば増幅は、低い加熱温度でDNA融解効率を高めるためにヘリカーゼを使用する場合もあるローリングサークル型複製システムで行ってもよい[Yuzhakou et al., “Replisome Assembly Reveals the Basis for Asymmetric Function in Leading and Lagging Strand Replication,”(リーディング鎖およびラギング鎖複製の非対称性機能の根拠を明らかにするレプリソーム集合過程) Cell 86:877-886 (1996)およびMok et al., “The Escherichia coli Preprimosome and DnaB Helicase Can Form Replication Forks That Move at the Same Rate,”(大腸菌のプレプライモソームとDnaBヘリカーゼは同一速度で移動する複製フォークの形成を可能にする) J. Biol. Chem. 262: 16558-16565 (1987)を参照。両文献は参照により引用される]。
【０１１３】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅反応で変性を行う温度は約86〜91℃、より好ましくは約87〜89℃であり、開示のDNA不安定化剤を含むサーモサイクリング増幅反応混合液の場合には該温度範囲の下限寄りの温度が好ましい。好ましいサーモサイクリング増幅法はPCR法であるが、そのサイクル数は約10〜100サイクル、より好ましくは約25〜50サイクルであり、ピーク温度は約86〜91℃、より好ましくは約87〜89℃であり、開示のDNA不安定化剤を含むPCR反応混合液の場合には該温度範囲の下限寄りの温度が好ましい。特に好ましい実施形態では、熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【０１１４】
好ましい実施形態では、1つまたは複数の高温変性ステップを伴う増幅反応に使用される増幅反応混合液は、本明細書でさらに詳しく開示しかつ例示するような、2成分型ポリメラーゼの熱安定性に寄与する安定剤をさらに含む。
【０１１５】
好ましい実施形態では、本発明で提供される増幅反応混合液はSSBを欠くが、SSBは複製反応混合液中に存在するならば、該複製反応混合液中に含まれる特定の最小機能性Pol IIIレプリカーゼのDNAポリメラーゼ活性を阻害することになろう。
【０１１６】
好ましい実施形態では、最小機能性Pol IIIレプリカーゼを適当な安定剤と共に使用してPCR反応を行って、少なくとも1つの標的核酸配列を、採用される反応ステップ数に比して指数関数的に増加させるが、ただし(a)標的配列の両末端が、それらにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの合成を可能にするほど十分詳しく判明していること、および(b)PCRを開始させるための少量の標的配列が得られることが条件となる。PCR反応の産物は個別の核酸二重鎖であり、使用する特定プライマーの両端に対応する末端を備える。
【０１１７】
精製、非精製の区別なく任意の核酸ソースを、それが所期の標的核酸配列を含むまたは含むと考えられる限り、出発核酸として使用することができる。従って、該増幅法にはたとえばDNAまたはRNAを、1本鎖、2本鎖いずれであれ、メッセンジャーRNAを含めて使用してもよい。さらに、DNA、RNAそれぞれの1本鎖からなるDNA-RNAハイブリッドを使用してもよい。これら任意の核酸の混合液を使用してもよいし、また以前の増幅反応で同じまたは異なるプライマーを使用して生成させた核酸を使用してもよい。増幅する核酸はDNAであるのが好ましい。増幅対象の標的核酸配列はより大きな分子の断片にすぎなくてもよいし、当初から個別分子として存在し標的配列が全核酸を構成してもよい。増幅対象の標的核酸配列が当初から純粋な形で存在する必要はなく、複雑な混合液の小部分(たとえば全ヒトDNAに含まれるβグロブリン遺伝子の一部分、または特定生物サンプルのごく小さな部分を構成するにすぎない微生物に起因する核酸配列の一部分)でもよい。出発核酸は複数の、同じまたは異なる、所期標的核酸配列を含んでもよい。従って、該増幅法は1標的核酸配列の大量生成に有用なだけでなく、同じまたは異なる核酸分子上に位置する複数の標的核酸配列の同時増幅にも有用である。
【０１１８】
核酸は任意のソースから獲得してよいし、また細菌、酵母、ウイルス、高等生物(植物または動物など)を含む任意のソースに由来するプラスミドやクローンDNAまたはRNA、さらにはDNAまたはRNAを含んでもよい。DNAまたはRNAはたとえば血液または他の体液、組織物質たとえば絨毛膜絨毛または羊膜細胞から、種々の技法たとえばManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory) pp. 280-281 (1982)に記載の技法により、抽出してもよい。
【０１１９】
任意の特定(すなわち標的)核酸配列を本発明の方法で生成させることができる。必要なのは、標的配列の両末端の十分な数の塩基について十分に詳しく知ることにより、所期配列の別々の鎖に、該配列上の相対位置で、ハイブリダイズするような2個のオリゴヌクレオチドプライマーを合成して、一方のプライマーから合成された伸長産物がその鋳型(相補体)から分離されときに他方のプライマーを所定鎖長の核酸へと伸長させるための鋳型として機能しうるようにすることだけである。標的塩基配列の両末端の塩基についての知見が増せば増すほど、標的配列に対するプライマーの特異性が増し、従って増幅法の効率もまた高まる。当然、用語「プライマー」は以下では、増幅対象の断片の末端配列に関する情報に若干の曖昧さがある場合には特に、複数のプライマーをいうこともある。たとえば核酸配列をタンパク質配列情報から推定している場合には、遺伝暗号の縮重に基づく可能な諸々のコドン変異に対応する配列を含む一群のプライマーを鎖ごとに使用することができる。このプライマー群に由来する1プライマーは増幅対象の所期配列の末端と相同であろう。
【０１２０】
いくつかの代替形態では、ランダムプライマー好ましくはヘキサマーを使用して鋳型核酸分子を増幅する。そうした実施形態では、増幅される正確な配列は予め決まっていない。
【０１２１】
加えて、当業者には自明であろうが、単一プライマーの使用によるone-sided増幅を行うこともできる。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドプライマーは、たとえばホスホトリエステル法やホスホジエステル法またはそれらの自動化形態など任意好適の方法で合成してよい。そうした自動化形態の1つでは、ジエチルホスホロアミダイトを出発物質として使用し、参照により引用されるBeaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859-1862 (1981)に記載の要領で合成してもよい。修飾固相担体でオリゴヌクレオチドを合成する一方法は、参照により引用される米国特許第4,458,006号明細書で開示されている。生物試料(たとえば制限酵素消化物)から単離したプライマーの使用も可能である。
【０１２３】
好ましいプライマーは鎖長が約20〜100塩基、より好ましくは約25〜50塩基、もっとも好ましくは30〜40塩基である。特に、本発明用の好ましいプライマーはPol Iポリメラーゼ用の好ましいプライマーよりも長い。
【０１２４】
標的核酸配列は該配列を含む核酸を鋳型として使用して増幅する。該核酸が2本鎖を含む場合には、プライマー伸長産物の合成とは別個のステップで、または該合成と同時に、核酸鎖を分離しなければ鋳型としては使用できない。この核酸鎖分離は物理的、化学的または酵素的手段を含めた任意好適の変性法で行うことができる。物理的な核酸鎖分離法の1つは核酸鎖を加熱して完全に(>99%)変性させるものである。一般的な熱変性は約80〜105℃、好ましくは約90〜98℃、より好ましくは93〜94℃の温度での約1〜10分間の処理である。核酸鎖分離は酵素(ヘリカーゼまたはヘリカーゼ活性を有しDNAを変性させることが判明しているRecA酵素)で誘導してもよい。ヘリカーゼによる核酸鎖分離に好適な反応条件はCold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLIII “DNA: Replication and Recombination” (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978)に記載されており、またRecA使用の技法はC. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16:405-37 (1982)で概説されている(以上の文献は参照により引用される)。本発明用の好ましいヘリカーゼはdnaBによりコードされる。
【０１２５】
増幅対象配列を含む元の核酸が1本鎖であれば、該1本鎖にオリゴヌクレオチドプライマーを付加してその相補体を合成する。適正な単一プライマーが付加されれば、該プライマー、2成分型ポリメラーゼ、および4つのヌクレオチド(後述)の存在下にプライマー伸長産物が合成される。該産物は元の1本鎖核酸に対して部分的に相補的であり、該核酸鎖とハイブリダイズして不等鎖長の二重鎖を形成しよう。その二重鎖を前述の要領で分離して1本鎖とすれば、互いに相補性の、分離した1本鎖が2本得られる。
【０１２６】
元の核酸が増幅対象配列である場合には、生成されるプライマー伸長産物は元の核酸鎖に対して完全に相補的であり、該核酸鎖とハイブリダイズして等鎖長の二重鎖を形成するであろうから、それを分離して1本鎖分子とする。
【０１２７】
核酸の相補鎖を分離すると、該核酸が元は1本鎖、2本鎖いずれであったかを問わず、該核酸鎖をそのまま、追加核酸鎖を合成するための鋳型として使用することができる。この合成には任意好適の方法が使用可能である。一般に、合成は緩衝水溶液中で行う。いくつかの実施形態では、緩衝液のpHは約8.5〜8.9であり、Pol I酵素の好ましいpH範囲とは明らかに異なる。分離鋳型鎖を含む緩衝液には、モル過剰の2オリゴヌクレオチドプライマーを添加するのが好ましい(クローン核酸の場合は通常、約1000:1プライマー:鋳型であり、またゲノム核酸の場合は通常、約106:1プライマー:鋳型である)。しかし当然、本発明の方法が診断用途に使用される場合には相補鎖の量は未知であろうから、相補鎖の量に対して相対的なプライマーの量を確定し得ない。しかし実際問題として、増幅対象配列が複雑な長い核酸鎖の混合液中に含まれる場合、プライマー添加量は一般に、相補鎖(鋳型)量に対してモル過剰である。増幅効率を高めるためには大過剰量が好ましい。
【０１２８】
合成混合液にはヌクレオシド三リン酸好ましくはdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPもまた適量が添加される。
【０１２９】
新たに合成された核酸鎖とその相補鎖は、増幅の後続ステップで使用される2本鎖分子を形成する。該2本鎖分子の核酸鎖は次のステップで、前記のうち任意の手順を用いて分離され、1本鎖分子となる。
【０１３０】
該1本鎖分子をもとに新核酸が合成される。前記の条件で反応を進めるうえで必要なら、追加のポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーを添加してもよい。この場合もまた、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの一端から始まり、1本鎖の鋳型に沿って進行して、追加の核酸が生成されることになろう。
【０１３１】
核酸鎖分離と伸長産物合成のステップを必要な回数だけ繰り返せば所期量の特定核酸配列を生成させることができる。特定核酸配列の生成量は指数関数的に増加しよう。
【０１３２】
最初の核酸または核酸混合液から複数種の特定核酸配列を生成させるのが望ましいときは、適正数の、異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。たとえば2種類の特定核酸配列を生成させる場合には、種類ごとに特異的なプライマーを2個ずつ、都合4個のプライマーを使用する。こうして本発明の方法により、2種類の特定核酸配列をそれぞれ指数関数的に生成させることができる。もちろん、異なる鋳型核酸の末端配列が同じである場合には、プライマー配列は互いに同一であり、また鋳型末端配列に対しては相補的である。
【０１３３】
また、代替実施形態では前述のように、ランダムプライマー好ましくはヘキサマーを使用して鋳型核酸分子を増幅する。
【０１３４】
また、単一プライマーを使用してone-sided増幅を行ってもよい。
【０１３５】
本発明はステップ式に実行して各ステップが終わるたびに新たな試薬を添加するようにしてもよいし、また同時に実行してすべての試薬を当初のステップで添加するようにしてよいし、また一部はステップ式に、一部は同時に実行して所定数のステップが終わった後で新たな試薬を添加するようにしてもよい。追加物質たとえば安定剤を必要に応じて添加してもよい。所定量の特定核酸配列を生成させるための相応の時間が経過したら、任意周知のやり方で酵素を失活させることにより、または反応成分を分離することにより、反応を停止させてもよい。
【０１３６】
従って、本発明に従って核酸分子を増幅するときは、好ましくは安定剤を添加した適正な増幅反応混合液中に熱安定性2成分型Pol IIIレプリカーゼを含んでなる組成物に該核酸分子を接触させる。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、本発明は一般に「ロングレンジPCR」と称する技法[Barnes, W.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2216-2220 (1994) (“Barnes”); Cheng, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5695-5699 (1994)。両文献は参照により引用される]で大核酸分子を増幅する方法を提供する。約5〜6キロベースを超える核酸分子の増幅に有効な一方法では、標的核酸分子を接触させる相手の組成物は最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含むだけでなく、約0.0002〜200 units/mL好ましくは約0.002〜100 units/mL なお好ましくは約0.002〜20 units/mLさらになお好ましくは約0.0002〜2.0 units/mL最も好ましくは約0.40 units/mLの濃度で3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す第2 DNAポリメラーゼ("exo+"ポリメラーゼ)(好ましくは熱安定性の修復型ポリメラーゼ、またはpolC αサブユニット)をも低濃度で含む。本発明方法用の好ましいexo+ポリメラーゼはThermotoga maritime PolC、pfu/DEEPVENTまたはTli/NENTTM(Barnes; 米国特許第5,436,149号明細書。両文献は参照により引用される); Thermotoga種に由来する熱安定性ポリメラーゼたとえばTma Pol I(参照により引用される米国特許第5,512,462号明細書); およびThermotoga neapolitanaから単離されるある種の熱安定性ポリメラーゼとその変種たとえばTne(3'exo+)である。Thermus thermophilusのPolC産物もまた好ましい。2成分型ポリメラーゼを第2ポリメラーゼと組み合わせて本発明に使用して、鎖長35〜100キロベース以上のDNA配列を高濃度に、忠実度を相当に高めながら、増幅するようにしてもよい。
【０１３８】
ロングレンジPCRについては、たとえばDavies et al., Methods Mol. Biol. 2002;187:51-5を参照(同文献は明示に参照により引用される)。
【０１３９】
好ましくは、本発明の増幅方法は安定剤の2成分型Pol IIIレプリカーゼとの併用を含む。好ましくは、該安定剤は増幅反応混合液中に含まれ、該反応混合液中の2成分型Pol IIIレプリカーゼの熱安定性を高める。
【０１４０】
本発明の増幅反応混合液は25%以下の共溶媒(反応混合液に添加される諸々の共溶媒の合計)、5%以下のクラウディング剤(反応混合液に添加される諸々のクラウディング剤の合計)、および2M以下のオキシド(反応混合液に添加される諸々のオキシドの合計)を含んでもよい。
【０１４１】
高速PCRについては、たとえば、を参照
特に好ましい実施形態では、Aquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼと併用する増幅反応混合液はTAPS-Tris(20mM, pH 8.7)、25mM K2SO4、10mM NH4(OAc)2、15μM ZnSO4、および4mM MgSO4を含む。
【０１４２】
別の特に好ましい実施形態ではThermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼと併用する増幅反応混合液はHEPES-Bis-Trisプロパン(20mM, pH 7.5)、0.5μM ZnCl2またはZn(OAc)2、および6mM Mg(OAc)2を含む。
【０１４３】
1つまたは複数の高温変性ステップを89℃未満で行う一実施形態では、サーモサイクリング増幅法はサーモサイクリング増幅反応混合液へのヘリカーゼの使用を、好ましくは細菌dnaB遺伝子にコードされるヘリカーゼを含む。サーモサイクリング増幅法が89℃以上での高温変性ステップを1つまたは複数含む場合にはヘリカーゼを使用しないのが好ましい。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の核酸複製法ではATPを欠く核酸複製反応混合液を使用する。
【０１４５】
一実施形態では、本発明の核酸複製法ではSSBを欠く複製反応混合液を使用するが、SSBは複製反応混合液中に存在するならば、該複製反応混合液中に含まれる特定の最小機能性Pol IIIレプリカーゼのDNAポリメラーゼ活性を低下させることになろう。
【０１４６】
核酸配列決定
本発明は一態様で、核酸分子好ましくはDNAの配列決定法であって、最小機能性Pol IIIレプリカーゼを含む配列決定反応混合液中で該核酸分子に配列決定反応を起こさせるステップを含む方法を提供する。
【０１４７】
配列決定反応用の好ましい最小機能性Pol IIIレプリカーゼは配列決定反応混合液中でDNAポリメラーゼ活性を有し、また3'末端ジデオキシヌクレオチドを除去しうる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０１４８】
従って、polCコード化αサブユニットを含む1成分型Pol IIIレプリカーゼは一般に、高レベルの亜鉛依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性のため配列決定反応用としては好ましくない。
【０１４９】
好ましい実施形態では、1成分型Pol IIIレプリカーゼはdnaE αサブユニットを、好ましくはThermusまたはAquifex属の、好ましくはThermus thermophilus、Thermus aquaticusまたはAquifex aeolicus種の、dnaE αサブユニットを含む。
【０１５０】
特に、本発明に使用されるdnaE αサブユニットの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は一般に3'末端ジデオキシヌクレオチドを除去しうるが、εサブユニットの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は一般にそうした末端ジデオキシヌクレオチド除去能を欠く。従って、εサブユニットによって付与された3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を配列決定反応混合液中で有する最小機能性Pol IIIレプリカーゼは一般に本発明の配列決定反応に有用である。また、好ましくないdnaE αサブユニット3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は化学的手段(すなわち緩衝液の条件、特にZn2+濃度とpH)により低下させるかまたは完全に阻害するのが好ましい。
【０１５１】
核酸分子は文献記載の任意の手動または自動化配列決定法で配列決定してもよい。そうした方法の非限定的な例はジデオキシ法(サンガー法) [Sanger, F., et al., J. Mol. Biol., 94:444-448 (1975); Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74:5463-5467 (1977); 米国特許第4,962,022号および第5,498,523号の各明細書。以上の文献は参照により引用される]、PCR法に基づく方法およびもっと複雑な、PCR法に基づく核酸フィンガープリンティング技術たとえばランダム増幅多型DNA(RAPD)法[参照により引用されるWilliams, J.G.K., et al., Nucl. Acids Res., 18(22):6531-6535 (1990)]、任意のプライマーを使用するPCR (AP-PCR)法[参照により引用されるWelsh, J., et al., Nucl. Acids Res., 18(24):7213-7218 (1990)]、DNA増幅フィンガープリンティング(DAF)法[参照により引用されるCaetano-Anolles et al., Bio/Technology, 9:553-557 (1991)]、マイクロサテライトPCR法またはマイクロサテライト領域DNA領域指定増幅(DAMD)法[参照により引用されるHeath, D.D., et al., Nucl. Acids Res., 21(24):5782-5785 (1993)]、および増幅断片長多型(AFLP)法[Vos, P., et al., Nucl. Acids Res., 23(21):4407-4414 (1995); Lin, J.J., et al.,, FOCUS, 17(2):66-70 (1995)。両文献は参照により引用される]などである。
【０１５２】
ひとたび配列決定対象の核酸分子が配列決定反応混合液中の最小機能性Pol IIIレプリカーゼと接触すると、開示の、または他の技術上周知のプロトコールに従って配列決定反応が進行する。
【０１５３】
特に好ましい実施形態では、Aquifex aeolicusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼと併用する配列決定反応混合液はTAPS-Tris(20mM, pH 8.7)、25mM K2SO4、10mM NH4(OAc)2および10mM MgSO4を含む。好ましくは、該反応混合液はαサブユニットの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を制限する意味で亜鉛を欠く。
【０１５４】
別の特に好ましい実施形態では、Thermus thermophilusに由来する最小機能性Pol IIIレプリカーゼと併用する配列決定反応混合液はHEPES-Bis-Trisプロパン(20mM, pH 7.5)と10mM Mg(OAc)2を含む。好ましくは、該反応混合液はαサブユニットの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を制限する意味で亜鉛を欠く。
【０１５５】
キット
本発明は一態様で、本発明の最小Pol IIIを使用する核酸複製キットを提供する。該キットは開示の1成分型Pol III、2成分型Pol III、または1成分型Pol IIIと2成分型Pol IIIの組み合わせを含む。
【０１５６】
好ましい実施形態では、核酸増幅キットは開示の緩衝液と安定剤を、または安定剤を添加した緩衝液を含む。安定剤は熱安定性最小Pol IIIを使用するサーモサイクリング反応用キットでは特に好ましい。
【０１５７】
本発明の核酸配列決定キットは最小Pol IIIとジデオキシヌクレオチド三リン酸とを含む。配列決定キットはさらに標準核酸配列決定プロトコールの実行に必要な追加の試薬と化合物たとえばピロホスファターゼ、アガロースまたはポリアクリルアミドなどの配列決定ゲル調製用媒体、および配列決定した核酸の検出に必要な他の成分を含んでもよい(DNA配列決定法に関する米国特許第4,962,020号および第5,498,523号の各明細書を参照)。
【０１５８】
本発明の核酸増幅キットは最小Pol IIIとdNTPとを含む。増幅キットはさらに標準核酸増幅プロトコールの実行に必要な追加の試薬と化合物を含んでもよい(PCRによるDNA増幅法に関する米国特許第4,683,195号および第4,683,202号の各明細書を参照。両文献は参照により引用される)。
【０１５９】
一実施形態では、キットはATPを欠き、またATPはキットによってもたらされる核酸複製反応に使用されない。
【０１６０】
追加の好ましい実施形態では、本発明の核酸複製キットは*校正を強化する目的で、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する第2 DNAポリメラーゼをさらに含んでもよい。好ましいのはpfu/DEEPVENT、Tli/NENTTM、Tma、Tne(3'exo+)、およびそれらの変種や誘導体である。 の*polC産物もまた好ましい。
【０１６１】
*含む?  本発明では、核酸分子の配列決定と増幅を同時に行うための、開示の成分を含むキットも提供される。
【０１６２】
*本発明のキットは説明書、 を含んでもよい。
【０１６３】
最小Pol III
本発明に使用する最小Pol IIIレプリカーゼは最小「機能性」レプリカーゼである。これらの最小機能性Pol IIIレプリカーゼはDNAポリメラーゼIII サブユニットの機能性サブアセンブリーをいう。機能性はプライマー伸長速度によって特徴付けられるレプリカーゼ活性をいう。機能性の最小Pol IIIレプリカーゼは75塩基/秒を超える伸長速度でのプライマー伸長能を特徴とする。本発明の特に好ましい最小Pol IIIは毎秒100塩基超、より好ましくは150塩基超、より好ましくは200塩基超、より好ましくは250塩基超、より好ましくは300塩基超、より好ましくは350塩基超、より好ましくは400塩基超、より好ましくは450塩基超、より好ましくは500塩基超、より好ましくは550塩基超、より好ましくは600塩基超、より好ましくは650塩基超、より好ましくは700塩基超のプライマー伸長速度で機能する。さらに、そうした好ましい最小機能性Pol IIIレプリカーゼは濃度2pM/μL以下で好ましいプライマー伸長速度を実現する。
【０１６４】
従って、E. coli DNAポリメラーゼIII αサブユニットを含む最小Pol IIIは、文献で明らかにされ本明細書でも確認されているように非機能性であるため、本発明の最小Pol IIIには包摂されない。
【０１６５】
「E. coli DNAポリメラーゼIII αサブユニット」は本明細書では野生型のE. coli DNAポリメラーゼIII αサブユニットを意味する。たとえば前掲Maki et al., 1985を参照。
【０１６６】
本発明に使用される最小機能性Pol IIIレプリカーゼはPol III αサブユニットを含む第1成分を少なくとも含む。いくつかの好ましい実施形態では、該第1成分は実質的にPol III αサブユニットからなる。いくつかの好ましい実施形態では、該第1成分はPol IIIのコアポリメラーゼ複合体の追加サブユニットを1つまたは複数含む。本発明の最小Pol IIIはクランプ装着因子を欠く。
【０１６７】
好ましい実施形態では、本発明は1成分型Pol IIIである最小Pol IIIを提供する。1成分型Pol IIIは実質的に最小Pol IIIの第1成分からなる。本発明の1成分型Pol IIIはクランプ装着因子を欠く。
【０１６８】
別の好ましい実施形態では、本発明はクランプを含む第2成分をさらに含む最小機能性Pol IIIレプリカーゼを提供する。従って、本発明の2成分型Pol IIIは実質的に第1成分と第2成分とからなるが、第1成分は開示の1成分型Pol IIIであり、また第2成分はクランプを含む。好ましい実施形態では、第2成分は実質的にクランプからなる。好ましい実施形態では、該クランプはPol III βサブユニットを含む。好ましい実施形態では、該クランプは実質的にPol III βサブユニットからなる。本発明の2成分型Pol IIIもまたクランプ装着因子を欠く。いくつかの実施形態では、2成分型Pol IIIは複数の第1成分を含むが、それらは同じでも異なってもよい。
【０１６９】
１成分型Ｐｏｌ  ＩＩＩ
開示の1成分型Pol IIIは単一のサブユニットからなっても、複数のサブユニットからなってもよい。該1成分型Pol IIIは実質的に最小Pol IIIの第1成分からなるが、該第1成分はαサブユニットを含み、またクランプ装着因子を欠く。該第1成分は実施形態によっては実質的にαサブユニットからなる場合もあれば、またPol IIIのコアポリメラーゼ複合体の追加サブユニットを1つまたは複数含む場合もある。従って、本発明の1成分型Pol IIIはαサブユニットを含み、またγサブユニットおよび/またはτサブユニットを欠く。本発明の1成分型Pol IIIには種々のαサブユニットを使用してもよい。
【０１７０】
本発明の熱安定性の最小機能性Pol IIIレプリカーゼは好熱性細菌または好熱性藍色細菌に由来するのが好ましい。好ましい実施形態では、好熱性細菌はThermus、Aquifex、Thermotoga、Thermocrinis、Deinococcus、Methanobacterium、Hydrogenobacter、Geobacillus、Thermosynchecoccus、Thermoanaerobacterの各属からなる群より選択される。特に好ましいのはAquifex aeolicus、Aquifex  pyogenes、Thermus thermophilus、Thermus aquaticus、Thermotoga neapolitanaおよびThermotoga maritimaに由来する1成分型および2成分型Pol IIIである。
【０１７１】
最小機能性Pol IIIレプリカーゼのαサブユニットは細菌polCまたはdnaE遺伝子にコードされるが、dnaEコード化αサブユニットは、開示のように、固有の亜鉛依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０１７２】
特に好ましい実施形態では、細菌dnaEまたはpolC遺伝子コード化αサブユニットはAquifex aeolicus、Thermus thermophilus、Deinococcus radiurans、Thermus aquaticus、Thermotoga maritima、Thermoanaerobacter、 Geobacillus stearothermophilus、Thermus flavus、Thermus ruber、Thermus brockianus、Thermotoga neapolitana、Thermotoga属の他種、Methanobacterium thermoautotrophicum、およびThermocrinis、Hydrogenobacter、Thermosynchecoccusの各属の種々の種、それに以上の種の突然変異種からなる群より選択される細菌または藍色細菌に由来する。一実施形態では、1成分型Pol IIIはθサブユニットおよび/またはεサブユニットを含むが、それらのサブユニットは1成分型Pol IIIのαサブユニットと同じ種に由来するのが好ましい。
【０１７３】
「熱安定性(の)」は本明細書では熱失活しにくいDNAポリメラーゼをいう。DNAポリメラーゼは開示の最小Pol IIIを含めて、1本鎖DNA鋳型に対して相補的なDNA分子を、5'→3'方向へとプライマーを伸長させることにより、合成する。熱安定性DNAポリメラーゼは本明細書では、熱不安定性DNAポリメラーゼよりも熱失活しくい。しかし、熱安定性DNAポリメラーゼは必ずしも熱失活をまったく受けないわけではなく、従って熱処理によりDNAポリメラーゼ活性をいくらかは失う。熱安定性DNAポリメラーゼはまた一般に、合成機能を発揮するための至適温度が熱不安定性DNAポリメラーゼより高い。熱安定性DNAポリメラーゼは一般に、好熱性生物たとえば好熱菌から単離する。
【０１７４】
「熱不安定性(の)」は本明細書では熱失活しにくい性質を欠くDNAポリメラーゼをいう。たとえば90℃の熱に30秒間接触させると完全に失活するT5 DNAポリメラーゼは熱不安定性DNAポリメラーゼであると考えられる。熱不安定性DNAポリメラーゼは本明細書では、熱安定性DNAポリメラーゼよりも熱失活しやすい。熱不安定性DNAポリメラーゼは一般に、至適温度が熱安定性DNAポリメラーゼより低いという可能性がある。熱不安定性DNAポリメラーゼは一般に、中温性生物たとえば中温性の細菌またはある種の動物を含む真核生物から単離する。
【０１７５】
αサブユニットの例は、たとえばそれぞれ参照により引用される以下の文献に求められる: 米国特許第6,238,905号(2001年5月29日発行); 米国特許出願第09/642,218号(2000年8月18日提出); 米国特許出願第09/716,964号(2000年11月21日提出); 米国特許出願第09/151,888号(1998年9月11日提出); 米国特許出願第09/818,780号(2001年3月28日提出)。
【０１７６】
本発明の1成分型Pol IIIに使用してもよいαサブユニットの例はポリペプチド中の後述のようなモチーフの存在を特徴とするものなどである。
【０１７７】
藍色細菌では最小Pol IIIホロ酵素の単離と解析はまだ行われていないが、グラム陰性菌に由来する対応サブユニットとの配列アラインメントから数種の藍色細菌(Nostoc punctiforme、Thermosynechococcus elongatus、Prochlorococcus marinus、Crocosphaera watsonii、Gloeobacter violaceus、Thrichodesmium erythraeum、Anabaena variabilis)のゲノム中の主要Pol IIIサブユニット遺伝子(holA、holB、dnaE、dnaX、dnaQ)が同定されている[Nakamura Y. et al. “Complete genome structure of Gloeobacter violaceus PCC 7421, a cyanobacterium that lacks thylakoids,”(チラコイドを欠く藍色細菌Gloeobacter violaceus PCC 7421菌株の完全なゲノム構造) DNA Res. 2003 Aug 31;10(4):137-45; Nakamura Y. et al. “Complete genome structure of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1,”’(好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatus BP-1菌株の完全なゲノム構造) DNA Res. 2002 Aug 31;9(4):123-30; Kaneko T, “Complete genome sequence of the filamentous nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120,”(窒素固定型糸状藍色細菌Anabaena sp. 菌株PCC 7120の完全なゲノム配列) DNA Res. 2001 Oct 31;8(5):205-13; 227-53; Rocap G., “Genome divergence in two Prochlorococcus ecotypes reflects oceanic niche differentiation,”(海洋ニッチの分化を反映するProchlorococcusの2生態型のゲノム分岐) Nature. 2003 Aug 28; 424(6592):1042-7. Epub 2003 Aug 13; 以上の文献は参照により引用される]。これらの所見から、藍色細菌の最小Pol IIIホロ酵素の構造はグラム陰性菌の場合とよく似ているまたは同じであるという結論が得られる。藍色細菌のPol III αサブユニットは2つの別個遺伝子からインテイン配列をもつタンパク質前駆体として発現する。分子間タンパク質スプライシングというユニークなプロセスにより、インテイン介在配列は除去され、αサブユニットのN末端およびC末端のエクステインがスプライシングで結合される[Wu H, Hu Z, Liu XQ., “Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split dnaE gene of Synechocystis sp. PCC 6803,”(Synechocystis sp. PCC 6803菌株の分断dnaE遺伝子にコードされた分断インテインによるタンパク質トランススプライシング) Proc Natl Acad Sci USA, 1998 Aug 4;95(16):9226-31。同文献は参照により引用される]。藍色細菌のインテインを含まないαサブユニットはグラム陰性菌のαサブユニットと同サイズであり、また30〜40%の配列相同性を有する。
【０１７８】
一実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットはアミノ酸コンセンサス配列モチーフA、BおよびCを含むが、モチーフA、BおよびCはそれぞれ[L/V/M]-[L/V/I]-K-X-D-[F/A/I]-L-G-[L/H]-X-X-[L/P]-[T/S]、[F/Y/W]-X-X-X-X-X-[F/R/K]-X-X-Y-[A/G/M/L]-F-[N/P]-[R/K]-X-Hおよび[P/S]-X-[P/I]-D-[L/I/V/F]-[D/N]-XP-D-[F/I]-D-X-D-[F/I/L/V]である(Xは任意のアミノ酸である)。モチーフはN末端からC末端へC-A-Bの順序で並ぶ。モチーフC、Aの間隔は約112〜約155アミノ酸である。モチーフA、Bの間隔は約167〜約201アミノ酸である。モチーフC、Bの間隔は約278〜約355アミノ酸である。
【０１７９】
一実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットはアミノ酸配列モチーフA、BおよびCを含むが、モチーフA、BおよびCはそれぞれG-[L/M]-[L/V/I]-K-X-D-F-L-G-L-X-X-L-T、[F/W]-X-X-X-X-X-F-X-X-Y-[A/G]-F-N-K-S-HおよびS-X-P-D-[F/I]-D-X-D-[F/I]である(Xは任意のアミノ酸である)。モチーフはN末端からC末端へC-A-Bの順序で並ぶ。モチーフC、Aの間隔は約153〜約155アミノ酸である。モチーフA、Bの間隔は約195〜約201アミノ酸である。モチーフC、Bの間隔は約348〜約355アミノ酸である。
【０１８０】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットはアミノ酸配列モチーフA、BおよびCを含むが、モチーフA、BおよびCはそれぞれG-[L/V]-[L/V]-K-X-D-[F/I]-L-G-L-[R/K]-X-L-[T/S]、[F/Y/W]-X-X-X-X-[R/K]-F-X-X-Y-[A/G]-F-N-[R/K]-X-HおよびP-D-I-D-[L/I/V]-D-[F/L/V]である(Xは任意のアミノ酸である)。モチーフはN末端からC末端へC-A-Bの順序で並ぶ。モチーフC、Aの間隔は約112〜約150アミノ酸である。モチーフA、Bの間隔は約167〜約190アミノ酸である。モチーフC、Bの間隔は約278〜約339アミノ酸である。
【０１８１】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットはアミノ酸配列モチーフA、BおよびCを含むが、モチーフA、BおよびCはそれぞれ[L/V]-[L/V]-K-X-D-[A/I]-L-G-H-D-X-P-T、[F/Y]-I-X-S-C-X-[R/K]-I-K-Y-[M/L]-F-P-K-A-HおよびP-D-I-D-L-D-F-Sである(Xは任意のアミノ酸である)。モチーフはN末端からC末端へC-A-Bの順序で並ぶ。モチーフC、Aの間隔は約124アミノ酸である。モチーフA、Bの間隔は約173〜約179アミノ酸である。モチーフC、Bの間隔は約296〜約302アミノ酸である。
【０１８２】
タンパク質モチーフの配列分析と同定に加えて、熱安定性DNAポリメラーゼ活性の標準検定法、および3'-5'エキソヌクレアーゼ活性の標準検定法を用いて、本発明の特定用途に特に好適なαサブユニットを特定してもよい。
【０１８３】
好ましい実施形態では、最小機能性Pol III レプリカーゼのαサブユニットはdnaEまたはpolC αサブユニット、好ましくは分類学的に系統樹の根元の真正細菌に当たる(たとえばAquifex、Hydrogenobacter、Thermus、Thermocrinis、DeinococcusおよびThermotogaの各属などの)好極限性細菌のdnaEまたはpolC αサブユニットである。
【０１８４】
好極限性細菌は、通常の生理的条件の範囲を超える極限環境条件たとえば高放射線、極低湿度、高温(>60℃)または低温(<10℃)、高浸透圧(0.5M超の塩濃度)などで成長増殖する細菌である。
【０１８５】
好極限性細菌のdnaEまたはpolC αサブユニットのなかでも、好熱菌に由来するdnaEまたはpolC αサブユニットが特に好ましい。
【０１８６】
好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットはThermus thermophilusに由来する。
【０１８７】
好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは*図Xに示すアミノ酸配列に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%のアミノ酸配列を含み、またさらにアミノ酸775〜805に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%のアミノ酸配列を含む。
【０１８８】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは  に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%のアミノ酸配列から実質的になり、またさらにアミノ酸775〜805に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは*図Xに示すアミノ酸配列、またはDNAポリメラーゼ活性を示すその断片を含むが、該断片はアミノ酸775〜805を含む。
【０１９０】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは実質的に、*図Xに示すアミノ酸配列、またはDNAポリメラーゼ活性を示すその断片からなるが、該断片はアミノ酸775〜805を含む。
【０１９１】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは*図Xに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１９２】
別の好ましい実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは実質的に、*図Xに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列からなる。
【０１９３】
一実施形態では、本発明の1成分型Pol IIIは細菌dnaQ遺伝子好ましくは好熱菌のdnaQ遺伝子によってコードされるεサブユニットを含む。好ましいεサブユニットの例はたとえば米国特許出願第09/642,218号(2000年8月18日提出); 米国特許出願第09/716,964号(2000年11月21日提出); 米国特許出願第09/151,888号(1998年9月11日提出); 米国特許出願第09/818,780号(2001年3月28日提出)の各明細書に求められる。
【０１９４】
一実施形態では、1成分型Pol III用のαサブユニットは実施例1で開示する生化学的単離法により得られる。
【０１９５】
T.th αサブユニットの精製
αサブユニットは遺伝子組み換えにより宿主細胞内で、たとえばE. coli細胞内で発現するようにしてもよい。まず形質転換細胞を培養し、収穫し、溶解させる。実施形態によっては、細胞の溶解にリゾチーム/スペルミジン溶液を使用するが、該溶液は約1〜4 mg/mLのリゾチームを含み、スペルミジン終濃度は約1.5〜3.0mMである。あるいは、Microfluidizerプロセッサー(Model M-110L)を使用して細胞を破砕してもよい。
【０１９６】
最初のステップとして、約30〜45%飽和硫酸アンモニウムで沈殿するタンパク質画分を細胞抽出液から分離する。この画分は発現した大半のαサブユニットを含む。要するに、細胞抽出液を30〜40%飽和硫酸アンモニウムで、好ましくは30%飽和硫酸アンモニウムで、沈殿させる。沈殿したタンパク質を一般に遠心分離法で取り出すが、他の常法を用いてもよい。ペレット化したタンパク質をpH 7.0〜8.0程度の、好ましくは7.5程度の再懸濁緩衝液に再懸濁させる。好ましい実施形態では、該再懸濁緩衝液は約10〜30%の、好ましくは約25%のグリセロールを含む。実施形態によっては、該再懸濁緩衝液はTris系であり、またEDTAなどのようなキレート剤を含む。緩衝液には約25〜30%の硫酸アンモニウムを加えて、ブチルセファロース上でのαサブユニットの疎水性を最大限に高める。他の分離材料の使用も可能である。
【０１９７】
再懸濁タンパク質をブチルセファロースカラムに通し、フロースルー液は捨てる。カラム溶離は30%→0%硫酸アンモニウムグラジエントを使用して行う。αサブユニットは他の疎水性タンパク質と共に高硫酸アンモニウム濃度で溶出する。画分中のαサブユニットの有無を、サイズに基づく検定法(電気泳動など)かまたは機能活性に基づく検定法(伸長検定)で調べる。検定法によっては、αサブユニットは50%硫酸アンモニウムで沈殿する。αサブユニットを含む沈殿を前述の要領で再懸濁させ、αサブユニットを含む画分をセファクリル300サイジングカラムに通す。好ましい実施形態では、セファクリル分離緩衝液に0.15M〜1MのKClを添加する。実施形態によっては、αサブユニット含有画分に対して透析または調整を行い、ブルーセファロースカラム用に緩衝液の導電性を至適化する。
【０１９８】
単離後のαサブユニットは、ブルーセファロースカラムまたは他カラム(アフィニティーカラムなど)でさらに精製するのが好ましい。カラム溶離にはKClまたはNaClグラジエントを使用する。αサブユニットは一般に約0.25〜0.6M KClで溶出するが、その同定にはサイズまたは機能に基づく検定法を用いる。
【０１９９】
精製後のαサブユニットは一般に、高グリセロール濃度の緩衝液たとえば5〜20mM Tris、0.5〜1.5mM DTT、0.3〜0.6mM EDTAおよび40〜50%グリセロールの緩衝液中に保存する。場合によっては、透析法などを用いて、αサブユニットがその中に溶出した高塩濃度の緩衝液を保存用緩衝液の代用とする。αサブユニットは必要に応じて濃度を加減し、マイナス20℃で保存する。
【０２００】
代替法では、再懸濁した30〜45%硫酸アンモニウム画分は70℃に30分ほど加熱してからブチルセファロースカラムに添加する。この加熱ステップをはさむことで、前記実施形態の場合よりもαサブユニット純度が高まる。この熱誘導タンパク質からの活性データは、2つのαサブユニット画分が単離され、第1の比較的低疎水性の画分は優れたギャップフィリング活性(DNAポリメラーゼ活性)を有し、また第2の比較的高疎水性の画分は非加熱精製αサブユニットと性質が類似した活性を有する。従って、熱処理は高活性αサブユニットの精製を容易にしよう。
【０２０１】
なお、τサブユニットの精製には35%硫酸アンモニウム沈殿、30分@65℃加熱およびSp-セファロースカラムによる分離の組み合わせを用いることができる。
【０２０２】
複数のサブユニットを含む1成分型Pol IIIでは、それらのサブユニットの共インキュベーションにより、溶液中で1成分型Pol IIIを形成させる。共インキュベーション溶液は反応混合液でもよいが、より好ましくは成分を会合させてから反応混合液に添加する。
【０２０３】
２成分型Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ
開示の2成分型Pol IIIレプリカーゼは実質的に第1成分と第2成分からなり、第1成分は開示の1成分型Pol IIIレプリカーゼであり、第2成分はクランプを含む。好ましい実施形態では、第2成分は実質的にクランプからなる。好ましい実施形態では、該クランプはPol III βサブユニットを含む。いくつかの好ましい実施形態では、該クランプは実質的にPol III βサブユニットからなる。本発明の2成分型Pol IIIレプリカーゼはまた、クランプ装着因子を欠く。実施形態によっては、2成分型Pol IIIは複数の第1成分を含むが、それらの第1成分は同じでも異なってもよい。
【０２０４】
本発明の2成分型Pol IIIレプリカーゼは、毎秒100塩基超、より好ましくは150塩基超、より好ましくは200塩基超、より好ましくは250塩基超、より好ましくは300塩基超、より好ましくは350塩基超、より好ましくは400塩基超、より好ましくは450塩基超、より好ましくは500塩基超、より好ましくは550塩基超、より好ましくは600塩基超、より好ましくは650塩基超、より好ましくは700塩基超の伸長速度でのプライマー伸長能(複製能)を特徴とする。
【０２０５】
さらに、2成分型Pol IIIレプリカーゼを反応混合液に使用するときは、DNAポリメラーゼPol III αサブユニットの濃度が好ましくは6ng/μL未満、より好ましくは7ng/μL未満、より好ましくは8ng/μL未満、より好ましくは9ng/μL未満、より好ましくは10ng/μL未満、より好ましくは20ng/μL未満、より好ましくは50ng/μL未満、より好ましくは100ng/μL未満、より好ましくは150ng/μL未満、より好ましくは200ng/μL未満となるようにする。
【０２０６】
好ましい実施形態では、2成分型Pol IIIレプリカーゼの第1成分のαサブユニットおよび該2成分型Pol IIIレプリカーゼのクランプは同じ種に由来する。
【０２０７】
本発明に有用なαサブユニットの同定に使用してもよい前記のモチーフＡ、B、Cに加えて、一般にPol III αサブユニットの中央寄りに位置しかつαサブユニットによるβサブユニットの結合に関与するモチーフを使用して、本発明の2成分型Pol IIIレプリカーゼへの使用が特に好ましいαサブユニットを同定するようにしてもよい。さらに、このPol III αサブユニット領域を修飾して、Pol III αを本発明の2成分型Pol IIIレプリカーゼへの使用に特に適したものにするモチーフをPol III α中に創出するようにしてもよい。好ましくは、該修飾は本発明の2成分型Pol IIIレプリカーゼの第1成分と第2成分の間の相互作用を強める。
【０２０８】
好ましい実施形態では、2成分型Pol IIIレプリカーゼは好熱菌に由来し、またαサブユニットおよび随意にεサブユニットを含む第1コア成分とβサブユニットを含む第2成分からなるが、該2成分型Pol IIIレプリカーゼはγサブユニットおよび/またはτサブユニットを欠く。
【０２０９】
βサブユニットの例はたとえば米国特許出願第09/642,218号(2000年8月18日提出); 米国特許出願第09/716,964号(2000年11月21日提出); 米国特許出願第09/151,888号(1998年9月11日提出); 米国特許出願第09/818,780号(2001年3月28日提出)の各明細書に求められるが、これらの各文献は参照により引用される。
【０２１０】
一実施形態では、2成分型Pol IIIレプリカーゼ用のαサブユニットは1成分型Pol IIIの項で述べた生化学的単離法により得られる。
【０２１１】
本発明の2成分型Pol IIIの第1および第2成分は共インキュベーションし、溶液中で2成分型Pol IIIを形成させてもよい。共インキュベーション溶液は反応混合液でもよいが、より好ましくは成分を会合させてから反応混合液に添加する。一実施形態では、複数の第1成分と第2成分との共インキュベーションにより2成分型Pol IIIを形成させるが、該Pol IIIは2種類の成分を含むだけであり、クランプ装着因子(すなわち第3因子)を欠く。
【０２１２】
新規αサブユニット、その断片、およびポリヌクレオチド
本発明は一態様で、新規のT.th由来DNAポリメラーゼIII  αサブユニットおよびその新規断片を提供する。本発明のαサブユニットは*図Xに示すアミノ酸配列に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%のポリペプチドを含み、またさらにアミノ酸775〜805に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%のアミノ酸配列を含む。本発明のαサブユニットの例には、*図Xに示すアミノ酸配列、またはDNAポリメラーゼ活性を示すその断片を含むポリペプチドも含まれるが、該断片はアミノ酸775〜805を含む。本発明のαサブユニットの例には、実質的に*図Xに示すアミノ酸配列、またはDNAポリメラーゼ活性を示すその断片からなるポリペプチドも含まれるが、該断片はアミノ酸775〜805を含む。本発明のαサブユニットの例には、*図Xに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、またはアミノ酸775〜805を含むその断片を含むポリペプチドも含まれるが、該核酸配列はDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。本発明のαサブユニットの例には、本発明のαをコードするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。
【０２１３】
本発明はまた、本発明のαサブユニットをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子の例は、図1に示す核酸配列を含む分子; 高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で図1の核酸配列にハイブリダイズし、かつヌクレオチド2430〜2519を含む分子; 図Xに示す核酸配列に対する配列同一性が約85%超、より好ましくは約90%、より好ましくは約95%、より好ましくは99%であって、かつヌクレオチド2430〜2519を含む分子; および本発明の新規Pol III αサブユニットのアミノ酸配列をコードする分子などである。
【０２１４】
一実施形態では、本発明は宿主中のT.thの存在の、該宿主に由来する核酸とのハイブリダイゼーションによる、検出に有用な新規核酸プローブであって、*図Xに示すヌクレオチド2430〜2519を含む、または実質的にヌクレオチド2430〜2519からなる、核酸プローブを提供する。ヌクレオチド2430〜2519はT.th αサブユニットの触媒領域の一部分をコードするため、機能性細菌Pol IIIの存在を検出しうる本発明のプローブが特に好ましいのは言うまでもない。
【０２１５】
本発明はαポリペプチドのある種の変異体および誘導体を、可溶型および融合タンパク質を含めて、包含する。たとえば本発明の融合タンパク質は異種タンパク質またはペプチドに融合した、所期機能を付与するポリペプチドを包含する。該異種タンパク質またはペプチドはαサブユニットの、たとえば精製、安定性、または分泌を促進しうる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、プラスミド、発現系、宿主細胞などを提供する。本発明のポリペプチドを産生させるための遺伝子工学的方法は、無細胞発現系内、細胞宿主内、および組織内でのポリヌクレオチド分子の発現を包含する。
【０２１６】
本明細書で示すように、30連続アミノ酸からなる新規断片が既報ポリペプチド配列内に、T.th由来分子のアミノ酸位置775〜805の間に、すでに定位されている(図 、 プログラムを参照)。
【０２１７】
本発明のαサブユニットポリヌクレオチド分子はcDNA、化学合成DNA、PCR法で増幅したDNA、RNA、またはそれらの組み合わせとすることができる。遺伝暗号の縮重のため、2つの異なるDNA配列が同じアミノ酸配列をコードする場合もある。
【０２１８】
さらに、本発明のポリペプチド配列は、*図Xに示す、アミノ酸残基775〜804の30連続アミノ酸残基を含むポリペプチド断片を包含する。
【０２１９】
配列同一性または相同性は、たとえば2つのポリペプチド配列を比較することにより、容易に決定しうる。これにはVector NCI, version 9.0プログラム(Invitrogen, Carlsbad, CA)などのような専用のコンピュータープログラムを使用する。
【０２２０】
αサブユニットの修飾には多数の既知手法のうち任意の手法を用いることができる。たとえばオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発法(oligonucleotide-directed mutagenesis)により特定位置に突然変異を導入してもよい(Walder et al., 1986, Gene, 42:133; Bauer et al., 1985, Gene, 37:73)。
【０２２１】
本発明のαサブユニットは単離体として提供するのが好ましく、また実質的に精製してあるのが好ましい。該ポリペプチドは組み換え細胞培養から、好ましくは開示の要領で、回収し精製する。
【０２２２】
前記の新規30アミノ酸断片すなわち残基775〜805(図1参照)は、たとえば特異的抗α抗体を生成させるために、使用することができる。
【０２２３】
ベクターと宿主細胞
本発明は本発明のポリヌクレオチド分子を入れたベクターを、またそうしたベクターを導入した宿主細胞を、提供する。ベクターには本発明のポリヌクレオチド分子のうち任意の分子を入れることができるが、該ベクターは一般に選択マーカーと複製開始点とを含む。該ベクターはさらに、好適な転写または翻訳調節配列たとえば細菌またはウイルス分子に由来する調節配列を含む。そうした調節配列の例は転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、および相応の配列などである。プロモーターヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列がαサブユニットの転写に関する場合には、DNA Pol III α DNA配列に作動可能に連結される。
【０２２４】
標的すなわち本発明のαポリペプチドをコードするαサブユニット分子のクローニングのための好適なベクターの選定は、該ベクターの導入先となる宿主細胞に、また該当する場合には該標的ポリペプチドが発現する場となる宿主細胞に、左右されよう。好適な宿主細胞は前述のとおりであるが、原核生物、酵母、および他の類似生物を含む。具体例はEscherichia、BacillusおよびSalmonella属の細菌、Pseudomonas、StreptomycesおよびStaphylococcus属の種、それにSaccharomyces、PichiaおよびKluyveromyces属の酵母などである。
【０２２５】
そうした宿主細胞内で発現することになる本発明のDNA Pol III αサブユニットポリペプチドはまた、異種タンパク質に由来する領域を含む融合タンパク質でもよい。終始述べているように、そうした領域を含める狙いはたとえば精製向上、分泌増大、安定性向上などでもよい。たとえばシグナルペプチド(分泌リーダー)をコードする核酸配列をαサブユニットにインフレームで融合し、αサブユニットが該シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。
【０２２６】
前述のように、本発明の新規ポリヌクレオチド分子はベクターに入れてもよいが、そうしたベクターは一般に選択マーカーと宿主内で増殖するための複製開始点とを含む。該ベクターはさらに、該DNA Pol III αポリヌクレオチドに作動可能に連結された好適な転写または翻訳調節配列たとえば哺乳動物、細菌、ウイルスまたは昆虫分子に由来する調節配列を含む。ヌクレオチド配列が作動可能に連結されているのは、調節配列が標的タンパク質をコードするDNAと機能的に関連する場合である。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列が    場合には、DNA配列に作動可能に連結されている。
【０２２７】
本発明のDNA Pol III αポリヌクレオチドの、特定ベクターへの挿入、特定発現系または宿主での使い勝手などを容易にし促進するための修飾(たとえば制限部位の修飾)は周知であり、また本発明での使用が見込まれる。ポリペプチドを産生させるための遺伝子工学的方法は、周知の方法による無細胞発現系内、細胞系内、細胞宿主内、組織内および動物モデル内でのポリヌクレオチド分子の発現を包含する。
【０２２８】
抗体
本発明の新規ポリペプチドはその全体または一部を、DNA Pol III αポリペプチド発現を検出するための診断検定法に有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製に使用しても、またαサブユニットの分子作用を解析するための試薬として使用してもよい。抗α抗体の作製にはαサブユニットの特異的エピトープ(前述の30アミノ酸配列; 図1参照)を含むペプチドを使用するのが好ましい。抗体の設計および作製方法は技術上周知である。たとえば次の文献を参照: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land(eds.), 1988 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Kennet et al.(eds), 1980 Plenum Press, New York.
【０２２９】
暫定出願第60/560,793号(表題:DNA Polymerase III α Subunit; 2004年4月7日提出)明細書はその全体が参照により引用される。暫定出願第60/641,183号(表題:Two-Component DNA Polymerases and Uses Thereof; 2005年1月3日提出)明細書はその全体が参照により引用される。
【０２３０】
引用文献はその全体が参照により引用される。
【実施例】
【０２３１】
実施例１：  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ  αおよびβサブユニットの精製
発酵、DNA Pol IIIユニットの発現と精製はDNAポリメラーゼ発現および精製の分野では技術上周知の標準手順に従って行った。
【０２３２】
本発明のDNA Pol IIIユニットはすべてpETシリーズの発現ベクタープラスミド(Novagen)中にクローニングにし、Novagenの種々の相補性E. coli宿主株(BL21、BL21pLysS、Rosetta、RosettaGami、Origami)で発現させた。T7 RNAポリメラーゼプロモーターからの発現はIPTGにより37℃で誘導した。A.ae DnaEの場合に限り、15℃で発現誘導した。
【０２３３】
2〜8時間にわたる発現誘導後、細胞を5000gでの遠心分離により回収した。Microfluidizerを用いて好適な溶解緩衝液中の細胞バイオマスから全タンパク質画分を抽出した。
【０２３４】
クロマトグラフィー精製ステップはすべて室温(22〜27℃)で行った。溶解と抽出、核酸沈殿および透析は4℃で、または氷上で行った。
【０２３５】
種々のPol IIIサブユニットの熱安定性に応じて、細胞粗抽出液を55〜80℃に20〜30分間加熱し、大部分の熱不安定性宿主タンパク質を沈殿させた。熱安定性の可溶性タンパク質画分から、沈殿した宿主タンパク質を20,000g(30分)、4℃での遠心により分離した。
【０２３６】
全核酸画分を種々の濃度(0.025〜0.1%)のポリエチレンイミン(PEI)で沈殿させて熱処理タンパク質画分から分けた。沈殿した全核酸画分をタンパク質画分から20,000g(30分)、4℃での遠心により分離した。
【０２３７】
熱処理およびPEI沈殿ステップの順序は後述のように場合に応じて切り替えた。
【０２３８】
PEI沈殿後上清中の硫酸アンモニウム濃度は、疎水性樹脂カラムに添加するために、対応サブユニットの沈殿点を下回る濃度へと調整した。
【０２３９】
αサブユニットはすべて疎水性カラム(ブチルセファロース)と2連続アフィニティーカラム(ブルーセファロースとヘパリンセファロース)を使用して精製した。必要に応じて追加のゲルろ過クロマトグラフィーステップを採用した(後述)。後続クロマトグラフィーステップの間にプールしたサブユニット画分を保存緩衝液に透析した。
【０２４０】
βサブユニットはすべて第1ステップで疎水性カラム(ブチルセファロース)を用いて精製し、次いで陰イオン交換カラム(Q-セファロース)で精製した。両カラム間に透析ステップを入れて、プールしたβサブユニット画分を保存緩衝液中に移した。
【０２４１】
Q-セファロース陰イオン交換クロマトグラフィーでは、1mM DTTと0.5mM EDTAとを添加した20mM Tri-HCl (pH 8.5)を用いてタンパク質をカラムに添加した。タンパク質の溶離には同じ塩基性緩衝液を用いたが、KCl濃度グラジエント0.025M(緩衝液A)→1M(緩衝液B)をつけた。βサブユニットは緩衝液Bの 40〜50%飽和で溶出した。
【０２４２】
Pol III βサブユニットの保存緩衝液としては、0.1mM EDTA 、1mM DTT、25〜50mM KClおよび50%グリセロールを添加した25mM Tri-HCl (pH 8.0)を用いた。
【０２４３】
ブチルセファロースHICクロマトグラフィーでは、50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に1mM EDTA 、1mM DTT(または0.1mM TCEP)、10〜25%グリセロールおよび種々の濃度の硫酸アンモニウムを加えたものを用いて、Pol IIIサブユニットを樹脂表面にしっかりと結合させるようにした。該タンパク質のカラムからの溶離には同じ緩衝液を、ただし硫酸アンモニウムを加えずに用いた。
【０２４４】
ブルー-またはヘパリン-セファロースによるアフィニティークロマトグラフィーでは、20mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に25mM KCl、1mM DTT、0.5mM EDTAを加えたもの(緩衝液A)を用いてタンパク質をアフィニティーカラムに添加した。カラムからのタンパク質の溶離にはKCl濃度勾配0.025M(緩衝液A)→1M(緩衝液B)を用いた。
【０２４５】
プールした最終サブユニット画分は、グリセロール無添加の水性保存緩衝液から50%グリセロール添加保存緩衝液への透析によって濃縮した。精製Pol IIIサブユニットはすべてマイナス20℃で保存した。
【０２４６】
Thermotoga maritimaのPolC (Tma PolC)
1.     細胞粗抽出液を60℃に20分間加熱した。
2.     全核酸画分を熱処理後上清から、終濃度0.025% のPEIで沈殿させた。
3.     ブチルセファロースカラムへの添加前に、PEI沈殿後上清の硫酸アンモニウム濃度を20%飽和に調整した。
4.     精製にはブチルセファロースとヘパリンセファロースという2つのクロマトグラフィーステップを採用した。
5.     ブチルセファロースから溶離した後の含α画分をプールし、ヘパリン緩衝液A (50mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM DTT、0.1mM EDTAおよび50mM KCl)に対して透析した。Tma PolCは78.7% 飽和の1M KCl添加緩衝液Bで溶出した。
6.     保存緩衝液: 10mM Tri-HCl (pH 8.0)、0.25mM EDTA 、0.5mM DTT、25mM KClおよび50%グリセロール。
【０２４７】
【表４】
2007532116.tif 000005
【０２４８】
Thermotoga maritimaのDnaN (Tma DnaN)
1.     粗抽出液中の核酸を濃度0.05%のPEIで沈殿させた。
2.     PEI沈殿後上清を60℃に20分間加熱した。
3.     緩衝液はすべて10%グリセロールを含んだ。
4.     ブチルセファロースカラムへの添加前に、宿主タンパク質熱処理後の上清の硫酸アンモニウム濃度を20%飽和に調整した。
5.     52%緩衝液Bでブチルセファロースからβサブユニットが溶出した。
6.     54%緩衝液BでQ-セファロースからβサブユニットが溶出した。
Tma DnaN用のβサブユニット保存緩衝液は25mM KClに調整した。
【０２４９】
【表５】
2007532116.tif 000006
【０２５０】
Thermus thermophilusのDnaE (Tth DnaE)
1.     細胞抽出液を55℃に20分間加熱し、PEIを加えて終濃度を0.075%とした。
2.     後続の精製ステップに移る前に、PEI沈殿後上清の30%→45%飽和硫酸アンモニウムカットを行い不純物を除去した。
3.     45%硫酸アンモニウムペレットをブチルセファロースカラム添加緩衝液に溶解し、硫酸アンモニウム濃度を30%に調整してから上清をカラムに添加した。
4.     ブチルセファロースから溶離した後の含α画分を硫酸アンモニウム50%飽和で沈殿させた。得られたペレットを、0.5mM EDTA 、0.1mM TCEPおよび0.15M KClを添加した20mM Tri-HCl緩衝液(pH 7.4)に溶解してSephacryl-300ゲルろ過カラムに添加した。
5.     ゲルろ過カラムの含α画分をプールし、次いで0.5mM EDTA 、0.1mM TCEPおよび10%グリセロールを添加した20mM Tri-HCl緩衝液(pH 7.4)に溶解し、ブルーセファロースカラムに添加した。55%飽和の1M KCl添加緩衝液BでTth DnaEが溶出した。
6.     保存緩衝液: 10mM Tri-HCl (pH 7.4)、0.25mM EDTA 、0.05mM TCEPおよび50%グリセロール。
【０２５１】
【表６】
2007532116.tif 000007
【０２５２】
Thermus thermophilusのDnaN (Tth DnaN)
1.     粗抽出液中の核酸を濃度0.2%のPEIで沈殿させた。
2.     PEI沈殿後上清を75℃に20分間加熱し、熱不安定性の宿主タンパク質を沈殿させた。
3.     ブチルセファロースカラムへの添加前に、宿主タンパク質熱処理後の上清の硫酸アンモニウム濃度を30%飽和に調整した。
4.     97.6%の緩衝液Bでブチルセファロースからβサブユニットが溶出した。
5.     28.5%の緩衝液BでQ-セファロースからβサブユニットが溶出した。
Tth DnaN用のβサブユニット保存緩衝液は50mM KClに調整した。
【０２５３】
【表７】
2007532116.tif 000008
【０２５４】
Aquifex aeolicus のDnaE (Aae DnaE)
1.     熱処理前に、終濃度0.075% のPEIにより粗抽出液から全核酸画分を除去した。
2.     PEI沈殿後上清を60℃に20分間加熱し、宿主E. coliタンパク質を除去した。
3.     熱処理した宿主タンパク質を沈殿させた後、上清の硫酸アンモニウム濃度を20%飽和に調整してから、1mM DTT、1mM EDTA 、10%グリセロールおよび10μM ZnSO4を添加した50mM Tri-HCl緩衝液(pH 7.5)に溶解してブチルセファロースカラムに添加した。同じ緩衝液を使用して、ただし硫酸アンモニウム無添加で、DnaEを溶離した。
4.     含α画分をプールし、カラム添加用緩衝液(0.5mM EDTA 、1mM DTTおよび50mM KClを添加した50mM Tri-HCl緩衝液(pH 7.4))に対して透析し、次いでブルーセファロースカラムに添加した。41.6%飽和の1M KCl添加緩衝液BでAae DnaEが溶出した。
5.     保存緩衝液: 25mM Tri-HCl (pH 7.5)、0.25mM EDTA 、0.5mM DTT、25mM KCl、10μM ZnSO4および50%グリセロール。
【０２５５】
【表８】
2007532116.tif 000009
【０２５６】
Aquifex aeolicus のDnaN (Aae DnaN)
1.     細胞粗抽出液を80℃に20分間加熱した。
2.     熱処理後の上清から全核酸画分を、濃度0.05%のPEIで沈殿させて、除去した。
3.     PEI沈殿後上清の硫酸アンモニウム濃度を25%に調整し、ブチルセファロースカラムに添加した。
4.     75%の緩衝液Bでブチルセファロースからβサブユニットが溶出した。
5.     64%の緩衝液BでQ-セファロースからβサブユニットが溶出した。
保存緩衝液は25mM KClを含む。
【０２５７】
【表９】
2007532116.tif 000010
【０２５８】
実施例Ｘ：  Ｐｏｌ  ＩＩＩ系サイクリング反応では安定剤の組み合わせが酵素の安定性を高める
安定剤の様々な組み合わせが核酸伸長用ホロ酵素の熱安定性に及ぼす効果を判定するためにサイクリング反応を行った。塩基性PCR緩衝液を1つまたは複数の安定剤と組み合わせ、ホロ酵素の熱安定性に対するその保護効果を試験した。伸長速度を60℃での陽性対照ホロ酵素条件と比較し、各試験温度(87℃〜95℃)に対して正規化した。各組み合わせについて活性率を示す(Table 3を参照)。各サイクル(合計5サイクル)の構成は85℃20秒、60℃2分、70℃2分である。5サイクル終了後、反応液に鋳型を加え、伸長検定を行った。新合成は3H標識チミジン取り込み能(cpm incorporation)で検出したが、それはポリメラーゼ活性および熱サイクリングのポリメラーゼに対する効果の指標でもある。
【０２５９】
Table 3のデータは複数の安定剤の組み合わせが、Pol III系の伸長反応に著しい安定効果を、この酵素を比較的高温に加熱したときに、及ぼすことを示す。ただし、試験した組み合わせのすべてがそうした高温で酵素安定性を支えたわけではなく、たとえばグリセロールとソルビトールの組み合わせは後続の伸長検定に明らかに役立ったが、グリセロールとピロリジノンの組み合わせはそうでなかった。
【０２６０】
【表１０】
2007532116.tif 000011
【０２６１】
【表１１】
2007532116.tif 000012
【０２６２】
【表１２】
2007532116.tif 000013
【０２６３】
【表１３】
2007532116.tif 000014
【０２６４】
実施例２：  Ａａｅ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ系ＰＣＲでは安定剤の組み合わせが酵素の安定性を高める
安定剤の様々な組み合わせがPol III系の核酸合成に及ぼす効果を判定するために温度依存性増幅反応を行った。いずれの場合にも、Pol IIIはAquifex aeolicus (A.ae)に由来した。反応検定には約0.2μgのβサブユニットと0.352μgのαサブユニットを使用した。意外にもA.ae使用のPCRは追加のサブユニットを必要とせず、α、β両サブユニットだけの存在下で進行した。pHは緩衝液で約8.8に保った。
【０２６５】
図22のデータは0.2mM dNTPs、0.3μMプラスミド(センスおよびアンチセンス)プライマー、1ng/μL鋳型プラスミド、40mM TAPS-Tris、0.04mg/mL BSA、50mM KCl、4mM Mg(OAc)2および9μM ZnSO4を含む反応混合液で得た。安定剤を各反応混合液に加え、93℃30サイクルでPCRを実行した。図22のデータが示すように、10%グリセロール、1.1M TMNOおよび10%ソルビトールの組み合わせは無添加条件で実行した反応と比較してPCR効率の大幅な向上につながった。10%グリセロール、1.1M TMNOおよび15%ソルビトールの組み合わせもまた有効であったが、10%ソルビトールのほうがより効果的であるように見えた。加えて、pH 8.7〜8.9のほうがpH 8.5よりも反応に有利であった。
【０２６６】
図22のデータは、3種類の安定剤を組み合わせて温度依存性増幅反応に使用すると、対照反応と比較して有意の効果があったことを示す。また、10mM (NH4)2SO4の添加もまたA.ae系のPCRを促進した。さらに、図22のデータはA.ae系の活性にはKClも必要であることを示している。
【０２６７】
図25は、15%グリセロールを0.5〜1.25M TMNO、1〜4% PEGおよび5〜15%ソルビトールと組み合わせて含む増幅反応混合液に関するデータである。最大の効果が得られたのは、15%グリセロール、2% PEG、10%ソルビトールおよび1.1M TMNOを組み合わせたときである。他の緩衝液条件は図に記載のとおりである。図25のデータは、4種類の安定剤を組み合わせると93℃30サイクルのPCRの促進になることを示す。図22の場合と同様に図25のデータもまた、優れたアンプリコン生産を可能にする条件下でA.ae系のPCRが行えることを示している。
【０２６８】
図23および24は、様々な組み合わせの1つまたは複数のポリオールの存在下にA.aeサブユニット(前記のとおり)を使用するPCR条件からのデータを示す。どの反応にも1.1M TMNOと2% PEG(20K)を使用した。10%グリセロールと10%ソルビトールを加えてPCRを行うと好結果が得られた。グリセロール添加量が15%に迫ると悪影響が見られたことも注目される。
【０２６９】
図21〜25のデータは、1つのまたは複数のポリオールと他安定剤の組み合わせが93℃でのA.ae Pol III 系PCRに資することを示す。加えて、それらのデータは組み合わせが異なればPCRを支える度合いも様々であり、また安定剤の濃度が異なればPol III系PCRへの効果も様々であることを示す。
【０２７０】
実施例３：  αサブユニットＤＮＡポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性
Thermus thermophilus (Tth)由来の最小DNAポリメラーゼIII ホロ酵素は6つの基本的なサブユニットを利用する。すでに見たように、Tth Pol III αサブユニットは該ホロ酵素内部での機能性とは別に、それ自体が強力なポリメラーゼであり、そこにE. coliや他のグラム陰性菌に由来するPol III αサブユニットとの違いがある。その固有伸長速度はプライマー結合後の7.2kb M13 ssDNA鋳型を30秒で複製するほど高速である。また、Tth αサブユニットは独自の3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。すでに示したように、αサブユニットは推定Pol III εサブユニットと60℃で相互作用する。この相互作用は3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を5倍に刺激し、また両サブユニットの熱安定性を高める。ICP-MSデータが示すように、Tth αサブユニットは甚句フィンガードメインを欠くにもかかわらず、α分子あたり1原子の亜鉛を含む。
【０２７１】
実施例４：  単離αの配列決定
(*図X)本例では、本発明の方法を用いて精製したαサブユニットのヌクレオチド配列の決定について説明する。配列決定用に一連のプライマーを6つ作製した:
【０２７２】
Ptac順方向配列決定用プライマー(24マー)
【０２７３】
5'-d(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)-3'
【０２７４】
601-621 pTAC-CCA-TE
【０２７５】
5'-ctcaacgagtacctctccat-3'
【０２７６】
1201-1221 pTAC-CCA-TE
【０２７７】
5'-atgaagagcctccccccctt-3'
【０２７８】
1801-1821 pTAC-CCA-TE
【０２７９】
5'-gagggcctgaaccgccacgc-3'
【０２８０】
2401-2421 pTAC-CCA-TE
【０２８１】
5'-aggcgggccatggggaagaa-3'
【０２８２】
3001-3021 pTAC-CCA-TE
【０２８３】
5'-gagactcgggagaaggcccg-3'
【０２８４】
3601-3621 pTAC-CCA-TE
【０２８５】
5'-gtccagggcgccttcggcga-3'
【０２８６】
配列決定反応をセットアップした。セットアップでは0.25反応系(2μL Big-Dye)を使用した。
【０２８７】
反応系は2μLのBig-Dye v3.1 (ABI)、1〜2μL(400〜600ng)のプラスミドDNA(Perfect Prep Plasmid Miniを使用して精製)、2μLの1pmol/μLプライマー、1μL 5×Sequencing Buffer(ABI)を含めて、最終容量を10μLとした。サイクリングと合成にはABI25CycとMJ Thermalcyclerを使用し、精製ではイソプロパノール(15μL)沈殿; 遠心1900g、30分; 10μL 1/10 TEへの再懸濁を行った。サイクルは25回繰り返した。サンプルの配列決定にはABI 3700を使用した。サンプルのPhredスコアを出し、Vector NTIデータベース中のクローン配列と比較した。96ウェルプレートを使用して各プラマーにつき12レプリケートを利用した。
【０２８８】
配列決定データはシーケンサー内臓のソフトウェア(ABIデータ収集)を使用して抽出し、得られたデータはCodonCode InterPhaceソフトウェアを使用してPhredスコアにより評価した。さらに、電気泳動図の評価にはABI Sequencing Analysis 3.6ソフトウェアを用いた。
【０２８９】
コンティグデータの生成にはInformax VectorNTI version 9 ContigExpressソフトウェアを使用した。データを評価し、またトリミングにより曖昧なデータポイントを除去した。得られた配列データを保存し、データベース内の既報配列データに照らして評価した。ヌクレオチドおよびアミノ酸残基の番号はNTIソフトウェアパラメーターに対応させて使用する。
【０２９０】
(*図X)は、米国特許第6,238,905号明細書で開示しているT.th α配列に由来する塩基配列(塩基2407〜2459)と本実施例で開示する方法を使用して得られた本発明のT.th α配列に由来する塩基配列の配列比較および対応する電気泳動図である。配列決定領域の電気泳動図は、番号2431の塩基Gの位置がT.th αサブユニットに関する公開または既報の配列データには存在しないことを示す。
【０２９１】
(*図X)は、米国特許第6,238,905号明細書で開示しているT.th α配列に由来する塩基配列(塩基2497〜2525)と本実施例で開示する方法を使用して得られたT.th α配列に由来する塩基配列の配列比較および対応する電気泳動図である。配列決定領域の電気泳動図は、T.th αサブユニットに関する公開配列データには番号2520の塩基Gが存在するものの、本発明の方法を用いて決定された配列には見られないことを示す。
【０２９２】
本発明の配列決定済みプラスミドから決定されたαの予想アミノ酸配列を(*図X)に示す。既報のαサブユニット配列と比較すると、アミノ酸残基776〜806の間に30アミノ酸の食い違いが存在する。一続きの30アミノ酸は米国特許第6,238,905号明細書では報告されていない塩基番号2431の挿入塩基Gと米国特許第6,238,905号明細書では塩基Gが存在している位置2521の欠失塩基またはブランクに対応する。本発明のαアミノ酸はアミノ酸番号775とアミノ酸番号805の間のEEMQK HRERF VQGAK ERGVP EEEAN RLFDMを含む。
【０２９３】
実施例５：  Ｔ．ｔｈ  αサブユニットおよびＴ．ｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩホロ酵素によるプライマー伸長
(*図X) Thermus thermophilus (T.th) αサブユニットを使用して経時プライマー伸長検定を行い、自立型ポリメラーゼとしてのその伸長速度を最小T.th DNA Pol IIIホロ酵素のそれとの比較を試みた。19.6μLの反応混合液中で、0.375pmolの30-merオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを結合させた350ng (0.15pmol)のssM13mp18 DNAを60℃で2分間、20mM TAPS-Tris (pH 7.5) [8mM Mg(OAc)2、14%グリセロール、40μg/mL BSAおよび40mMソルビトールを添加]に溶解した2μg(15pmol) T.th αサブユニットの存在下に、インキュベートした。プライマー伸長/複製は、10mM dATP、10mM dGTP、10mM dTTPおよび10mM dCTPを含み各終濃度を200μmolとした0.4μLのdNTP混合液を添加して開始させた。プライマー伸長検定の表示時点で、2μL 0.1M EDTAを添加し、反応系を氷上に移すことにより、個別反応を停止させた。複製産物を、0.7% TEAE緩衝アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色により分析した。矢印はフルサイズ(7.2kb)の2本鎖複製産物が検出可能となった最初の時点を示す。αサブユニットは単体でDNA結合7.2kb M13鋳型を最高伸長速度240 b/secで複製することができる。これは同等条件下でのTaq DNAポリメラーゼＩの伸長速度(30〜40 b/sec)の約6〜8倍である。最小ホロ酵素+クランプ+クランプ装着因子の複合体の伸長速度はα単体の複製速度の約3倍(725 b/sec)である。
【０２９４】
実施例６：  Ａ．ａｅ  αサブユニットによるプライマー伸長
(*図X) Aquifex aeolicus (A.ae) αサブユニット使用して経時プライマー伸長検定を行い、自立型ポリメラーゼとしてのその伸長速度の解明を試みた。19.6μLの反応混合液中で、0.375pmolの30-merオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを結合させた350ng (0.15pmol)のssM13mp18 DNAを60℃で2分間、20mM TAPS-Tris (pH 8.7) [25mM KCl、10mM (NH4)2SO4、8mM Mg(OAc)2、10uM ZnSO4、14%グリセロール、40mg/mL BSAおよび40mMソルビトールを添加]に溶解した350ng (2.5pmol) A.ae DNA Pol III αサブユニットの存在下に、インキュベートした。プライマー伸長/複製は、10mM dATP、10mM dGTP、10mM dTTPおよび10mM dCTPを含み各終濃度を200μmolとした0.4μLのdNTP混合液を添加して開始させた。プライマー伸長検定の表示時点で、2μL 0.1M EDTAを添加し、反応系を氷上に移すことにより、個別反応を停止させた。複製産物を、0.7% TEAE緩衝アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色により分析した。矢印はフルサイズ(7.2kb)の2本鎖複製産物が検出可能となった最初の時点を示す。A.ae αサブユニットは7.2kb M13鋳型を120 b/secの伸長速度で複製した。
【０２９５】
(*図X)別の19.6μLの反応系では、1μg(7.5pmol)のA.ae αサブユニットを、0.375pmolの30-merオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを結合させた350ng (0.15pmol)のssM13mp18 DNAと60℃で2分間、20mM TAPS-Tris (pH 8.7) [25mM KCl、10mM (NH4)2SO4、8mM Mg(OAc)2、10uM ZnSO4、14%グリセロール、40mg/mL BSAおよび40mMソルビトールを添加]の存在下に、インキュベートした。プライマー伸長/複製は、10mM dATP、10mM dGTP、10mM dTTPおよび10mM dCTPを含み各終濃度を200μmolとした0.4μLのdNTP混合液を添加して開始させた。プライマー伸長検定の表示時点で、2μL 0.1M EDTAを添加し、反応系を氷上に移すことにより、個別反応を停止させた。複製産物を、0.7% TEAE緩衝アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色により分析した。矢印はフルサイズ(7.2kb)の2本鎖複製産物が検出可能となった最初の時点を示す。A.ae Pol III αサブユニットは7.2kb M13鋳型を160 b/secの伸長速度で複製した。
【０２９６】
実施例７：  Ｔ．ｍａ  αサブユニット（ｐｏｌＣ）によるプライマー伸長
(*図X) Thermotoga maritime (T.ma) αサブユニット使用して経時プライマー伸長検定を行い、自立型ポリメラーゼとしてのその伸長速度の解明を試みた。19.6μLの反応混合液中で、0.375pmolの30-merオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを結合させた350ng (0.15pmol)のssM13mp18 DNAを60℃で2分間、20mM TAPS-Tris (pH 7.5) [25mM KCl、10mM (NH4)2SO4、8mM Mg(OAc)2、14%グリセロール、40mg/mL BSAおよび40mMソルビトールを添加]に溶解した100ng (0.64pmol) T.ma DNA Pol III αサブユニット(polC)の存在下に、インキュベートした。プライマー伸長/複製は、10mM dATP、10mM dGTP、10mM dTTPおよび10mM dCTPを含み各終濃度を200μmolとした0.4μLのdNTP混合液を添加して開始させた。プライマー伸長検定の表示時点で、2μL 0.1M EDTAを添加し、反応系を氷上に移すことにより、個別反応を停止させた。複製産物を、0.7% TEAE緩衝アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色により分析した。矢印はフルサイズ(7.2kb)の2本鎖複製産物が検出可能となった最初の時点を示す。T.ma αサブユニット(polC)は7.2kb M13鋳型を720 b/secの伸長速度で複製した。
【０２９７】
実施例８：  Ｔ．ａｑ  Ｐｏｌ  Ｉによるプライマー伸長
(*図X)19.6μLの反応混合液中で、0.375pmolの30-merオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを結合させた350ng (0.15pmol)のssM13mp18 DNAを60℃で2分間、20mM Bicine-Tris (pH 8.7)、50mM KCl、2.5mM Mg(OAc)2に溶解した100ng (1.1pmol)のTaq DNA Pol Iの存在下に、インキュベートした。プライマー伸長/複製は、10mM dATP、10mM dGTP、10mM dTTPおよび10mM dCTPを含み各終濃度を200μmolとした0.4μLのdNTP混合液を添加して開始させた。プライマー伸長検定の表示時点で、2μL 0.1M EDTAを添加し、反応系を氷上に移すことにより、個別反応を停止させた。複製産物を、0.7% TEAE緩衝アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色により分析した。矢印はフルサイズ(7.2kb)の2本鎖複製産物が検出可能となった最初の時点を示す。Taq DNA Pol Iは7.2kb M13鋳型を34 b/secの伸長速度で複製した。
【０２９８】
実施例９：  Ｔ．ｔｈ  対Ｅ．  ｃｏｌｉ  αサブユニットおよび最小ホロ酵素
(*図X) 30-merオリゴデオキシヌクレオチドプライマー(0.375pmol)を結合させたssM13mp18 DNA(0.146pmol)と2.5μg (15pmol)のαサブユニット単体または対応する最小DNA Pol IIIホロ酵素(15pmol)を使用してプライマー伸長検定を行った。T.th酵素用のプライマー伸長反応緩衝液は20mM HEPES-Tris (pH 7.5)、8mM Mg(OAc)2、14%グリセロール、40mg/mL BSAおよび40mMソルビトールを含んだ。E. coli酵素用のプライマー伸長反応緩衝液は50mM Tris-Cl (pH 7.5)、8mM Mg(OAc)2、14%グリセロール、40mg/mL BSA、40mMソルビトールおよび1mM DTTを含んだ。
【０２９９】
実施例１０：  Ｔ．ｔｈ  α／β  ２成分型Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼによる高速・感受性ＰＣＲ
(*図X)50ngのpBSKプラスミド鋳型と各10pmolの順方向および逆方向プライマーを含む50uL反応系でインバースPCR検定を行った。両プライマーは該プラスミドの複製起点で尾-尾アニールして、該プラスミドの全長線状アンプリコン(3kb)が増幅されるようにする。このPCRは2つの異なる濃度の2成分型Tth Pol IIIレプリカーゼを使用して行い、また種々のサイクル数で停止した。適用温度プロトコルにおける各PCRサイクルの時間間隔は3kb標的の場合は極端に短い(変性: 90℃30秒; プライマーのアニーリングと伸長: 62℃10秒)。PCR反応系は40mM HEPES-Bis-Tris-プロパン(pH 7.5)、1M TMAO(トリメチルアミンN-オキシド)、5%グリセロール、2% 20K PEG、6mM Mg(OAc)2、10%ソルビトールおよび各200umolのdNTPを含んだ。高酵素濃度では、3kb標的は20サイクル後にはもう検出可能となり、その総所要時間はわずか20分である。この高速増幅を支える2成分型レプリカーゼの平均伸長速度は300塩基/秒である。反応系の高酵素およびMg濃度(4mM Mg)が、等量のTaq DNAポリメラーゼを使用すれば可能となるようなPCRの特異性を犠牲にしないことは注目される。
【０３００】
実施例１１：  Ｔ．ｔｈ  α／β  ２成分型Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼによる高速・ロングレンジＰＣＲ
(*図X) 50ngの逓増サイズ(3kb、5.7kbおよび8.1kb)の様々なプラスミド鋳型と各10pmolの順方向および逆方向プライマーを含む50uL反応系でインバースPCR検定を行った。両プライマーは該プラスミドの複製起点で尾-尾アニールして、該プラスミドの全長線状アンプリコン(3〜8.1kb)が増幅されるようにする。2つの異なる濃度の2成分型Tth Pol IIIレプリカーゼを使用して30サイクルPCRを行った。適用温度プロトコルにおける各PCRサイクルの時間間隔は3kb、5.7kbおよび8.1kb標的の場合は極端に短い(変性: 90℃30秒; プライマーのアニーリングと伸長: 62℃60秒)。PCR反応系は40mM HEPES-Bis-Tris-プロパン(pH 7.5)、1M TMAO(トリメチルアミンN-オキシド)、5%グリセロール、2% 20K PEG、6mM Mg(OAc)2、10%ソルビトールおよび各200umolのdNTPを含んだ。どの標的も同じ短時間枠で増幅することができた。最高酵素濃度(0.5uM)は、最長8.1kb標的の場合にもっとも効率的であった。この高速増幅を支える2成分型レプリカーゼの平均伸長速度は300塩基/秒である。反応系の高酵素およびMg濃度(4mM Mg)が、等量のTaq DNAポリメラーゼを使用すれば可能となるようなPCRの特異性を犠牲にしないことは注目される。
【０３０１】
実施例１２：  Ｔ．ｔｈ  α／β  ２成分型Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ  対  Ｔ．ａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ  ＋  高速Ｔａｑ／ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｂ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （ＴＭ）による高速ＰＣＲ
(*図X)50ngのpBSKプラスミド鋳型(3kb)と各10pmolの順方向および逆方向プライマーを含む50uL反応系でインバースPCR検定を行った。両プライマーは該プラスミドの複製起点で尾-尾アニールして、該プラスミドの全長線状アンプリコン(3kb)が増幅されるようにする。30サイクルPCRを、2つの異なる濃度の2成分型Tth Pol IIIレプリカーゼを使用して行い、また比較のためにTaq DNAポリメラーゼ(2U)と2UのロングレンジPCR用高速Taq/DeepVent DNA Pol B Polymerase Mixture (TM - TripleMaster, Eppendorf)を使用して行った。適用温度プロトコルにおける各PCRサイクルの様々な時間間隔を図に示す(変性: 90℃30秒; プライマーのアニーリングと伸長: 62℃10〜40秒)。PCR反応系は40mM HEPES-Bis-Tris-プロパン(pH 7.5)、1M TMAO(トリメチルアミンN-オキシド)、5%グリセロール、2% 20K PEG、6mM Mg(OAc)2、10%ソルビトールおよび各200umolのdNTPを含んだ。Taq DNA Pol Iは30秒の伸長時間でドロップアウトし、40秒では少量の適正産物をかろうじて増幅するにすぎない。TripleMaster(TM)ロングレンジPCRポリメラーゼミックスは30秒でドロップアウトする。T.thの2成分型レプリカーゼはもっと低い濃度でも3kb標的を10秒伸長/サイクルで増幅するが、これは300 b/secのPCR伸長速度に相当する。
【０３０２】
実施例１３：  Ａ．ａｅ  α／β  ２成分型Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼによる高速ＰＣＲ
(*図X)50ngのpBSKプラスミド鋳型(3kb)と各10pmolの順方向および逆方向プライマーを含む50uL反応系でインバースPCR検定を行った。両プライマーは該プラスミドの複製起点で尾-尾アニールして、該プラスミドの全長線状アンプリコン(3kb)が増幅されるようにする。30サイクルPCRを、2つの異なる濃度の2成分型Aae Pol IIIレプリカーゼを使用して、安定剤グリシルベタインの存在下および不存在下に行った。次の温度サイクリングプロトコールを30サイクルを適用した:  変性: 90℃30秒; プライマーのアニーリングと伸長: 62℃10秒および40秒。PCR反応系は20mM TAPS-Tris緩衝液(pH 8.7)、50mM KCl、10mM硫酸アンモニウム、0.8mM CaCl2、15uM ZnSO4、2% 20K PEG、10%ソルビトール、4mM Mg(OAc)2、10%グリセロールおよび随意添加剤として1Mベタイン、さらに各200uMのdNTPを含んだ。Aquifex由来の2成分型DNA Pol IIIレプリカーゼは3kbを高速PCRモードで増幅することができるが、Taqにはそれができない。高タンパク質濃度の場合、効率的な増幅にはベタインの添加が必要である。さらに高い酵素濃度では安定剤としてグリシルベタインの代りにTMAOを使用することができる(データは示していない)。
【図面の簡単な説明】
【０３０３】
【図１】図1はT.th DNAポリメラーゼIII  αサブユニットとT.th DNAポリメラーゼIII ホロ酵素を使用したプライマー伸長検定を示す。
【図２】図2は350 ngのA.ae DNAポリメラーゼIII  αサブユニットを使用したプライマー伸長検定を示す。
【図３】図3は1μgのA.ae DNAポリメラーゼIII  αサブユニットを使用したプライマー伸長検定を示す。
【図４】図4はT.ma DNAポリメラーゼIII  αサブユニット(polC)を使用したプライマー伸長検定を示す。
【図５】図5はT.aq DNAポリメラーゼＩを使用したプライマー伸長検定を示す。
【図６】図6は、T.th DNAポリメラーゼIII  αサブユニット、T.th DNAポリメラーゼIII ホロ酵素、E.coli DNAポリメラーゼIII  αサブユニットおよびE.coli DNAポリメラーゼIII ホロ酵素を使用したプライマー伸長検定を示す。
【図７】図7は種々の量の    DNA ポリメラーゼIII  αサブユニットを使用したプライマー伸長検定を示す。
【図８】図8は種々の量の    DNA ポリメラーゼIII  αサブユニットを使用したプライマー伸長検定を示す。
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】図X〜Yは種々のポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、安定性および会合検定の結果と要約、それに温度、pH、安定剤および陽イオン濃度の影響を示す。
【０３０４】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】図Xは、本発明の実施形態を使用して形成されたアンプリコンを示す染色アガロースゲルである。PCRはPol III系ポリメラーゼを使用して行った(上限温度93℃、30サイクル)。安定剤を種々組み合わせてPCR効率への影響をみた。  図23および24は、本発明の実施形態を使用して形成されたアンプリコンを示す染色アガロースゲルである。PCRはPol III系ポリメラーゼを使用して行った(上限温度93℃、30サイクル)。安定剤を種々組み合わせてPCR効率への影響をみた。  図25は、本発明の実施形態を使用して形成されたアンプリコンを示す染色アガロースゲルである。PCRはPol III系ポリメラーゼを使用して行った(上限温度93℃、30サイクル)。安定剤を種々組み合わせてPCR効率への影響をみた。  図XはT.th由来DNA Pol III αサブユニットに対応する新規核酸配列および予測アミノ酸配列を示す。  図Xは、本発明で開示したDNA Pol III αサブユニットの予測アミノ酸配列と既報DNA Pol III αサブユニットとの相同性を示す。  図Xは細菌dnaEおよびpolC αサブユニットのモチーフA、BおよびCの配置と間隔の図式的な比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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