(57)【要約】  該発明は、結腸直腸細胞増殖障害を検出するため又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なうための方法、核酸及びキットを提供する。該発明は、前記の種類の障害の検出及びその間の弁別を改善し、かくして、患者の診断及び治療を改善できるようにするのに役立つメチル化パターンを有するゲノム配列を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、
ｉ）  血漿、血清、全血、単離された血液細胞、対象から得た血液から単離された細胞から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階であって、隣接ヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含んでいる段階、
ｉｉ）  ８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で提供される、結腸細胞増殖障害を検出するか又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なう段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
標的領域がそれぞれ配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、３６、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４、ＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡ、ＴＰＥＦ、Ｐ７３、ＡＰＣ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＣＡＶ１、Ｈ−カドヘリン及びＬＴＢＰ４から成る群から選択された遺伝子又は配列の少なくとも１６個の隣接するヌクレオチドを含むか又はこれらに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するか又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なうための方法において、前記対象から単離された生体試料中の配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群から選択された遺伝子又は配列の発現レベルを決定する段階を含んで成る方法。
【請求項４】
前記発現レベルが、前記遺伝子又は配列から転写されたｍＲＮＡの存在、不在又はレベルを検出することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現レベルが、前記遺伝子又は配列によりコードされるポリペプチドの存在、不在又はレベルを検出することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、免疫検定、ＥＬＩＳＡ免疫検定、放射免疫検定及び抗体から成る群から選択された単数又は複数の手段によって検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現が前記遺伝子又は配列内のＣｐＧメチル化の存在又は不在を検出することによって決定され、高メチル化が結腸細胞増殖障害の存在を表わしている、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、対象から、対象から得た生体試料から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含んで成り、ここで該標的領域は、それぞれ配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４及びＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡから成る群から選択された少なくとも１つの遺伝子又は配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドの１配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれに対してハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、かくして結腸細胞増殖障害の検出及び検出とそれらの間又は中での区別が少なくとも部分的に提供される、方法。
【請求項９】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、対象から、対象から得た生体試料から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含んで成り、ここで該標的領域は、それぞれ配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、３６、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４、ＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡ、ＴＰＥＦ、Ｐ７３、ＡＰＣ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＣＡＶ１、Ｈ−カドヘリン及びＬＴＢＰ４から成る群から選択された少なくとも１つの遺伝子又は配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドの１配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれに対してハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、かくして結腸細胞増殖障害の検出及び検出とそれらの間又は中での区別が少なくとも部分的に提供される、方法。
【請求項１０】
結腸直腸癌腫が、結腸腺腫、正常な結腸組織、非結腸組織及び非結腸組織増殖障害から成る群から選択された少なくとも１つの身体条件から区別される、請求項８及び９に記載の方法。
【請求項１１】
結腸腺腫が、結腸癌腫、正常な結腸組織、非結腸組織及び非結腸細胞増殖障害から成る群から選択された少なくとも１つの身体条件から区別される、請求項８及び９に記載の方法。
【請求項１２】
結腸直腸癌腫組織又は結腸腺腫のうちの少なくとも１つが、直径１ｃｍ未満の結腸ポリープ、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、標的領域が、配列番号１〜１２、１５〜２０、２２、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
結腸直腸癌腫が非結腸健常組織、末梢血リンパ球及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、該標的領域が、配列番号１〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれらに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１４】
結腸直腸癌腫が、炎症性結腸組織、正常な結腸組織、非結腸健常組織、末梢血リンパ球、結腸腺腫及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、該標的領域が配列番号１〜３、５〜１３、１５〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むかこれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１５】
結腸直腸癌腫が、結腸腺腫から区別され、標的領域が配列番号１１、２５、２７、３８、４０、４５、５３及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含む、又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１６】
結腸直腸癌腫組織又は大型腺腫のうちの少なくとも１つが、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１７】
結腸直腸癌腫組織が、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織のうちの少なくとも１つから区別され、標的領域が配列番号１〜３、５〜２３、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はそれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１８】
結腸直腸癌腫組織又は結腸腺腫のうちの少なくとも１つが、炎症性結腸組織、正常な結腸組織、非結腸健常組織、末梢血リンパ球及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、該標的領域が、配列番号１〜３６、３８〜４３、４５〜５８、及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
結腸に由来する組織が、非結腸由来の組織から区別される、請求項８及び９に記載の方法。
【請求項２０】
対象の体内の細胞増殖障害及び健常組織を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、対象から得た生体試料から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含んで成り、ここで該標的領域は、それぞれ配列番号：＆［ＩＤＧＥＮＳＥＱクラス９］から成る群から選択された少なくとも２つの配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドの１配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれに対してハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、該標的領域は、から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、方法。
【請求項２１】
ａ．対象から得られた生体試料からゲノムＤＮＡを抽出するか又はその他の形で単離する段階；
ｂ．その５位置でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換するべく、ａ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを単数又は複数の試薬で処理する段階；
ｃ．処理済みゲノムＤＮＡ又はその処理済みフラグメントを、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも２つのプライマ及び１つの増幅酵素と接触させる段階であって、ここで処理済みゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントが少なくとも１つの増幅物を産生するべく増幅されるか、または増幅されていない、段階；及び
ｄ．前記増幅物の存在又は不在又はその特性に基づいて、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された１配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態、又は配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された配列の複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化状態又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階であって、かくして結腸細胞増殖障害の検出又は検出とその間の区別のうちの少なくとも１つが少なくとも部分的に提供される段階、
を含んで成る請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ｂ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントの処理段階には、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩及びそれらの組合せから成る群から選択された試薬の使用が含まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｃ）の接触段階又は増幅段階には、増幅酵素としての耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用；５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼの使用；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用；検出可能な標識を担持する増幅物核酸分子の生成及びそれらの組合せから成る群から選択された少なくとも１つの方法が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能な増幅物標識が、蛍光標識；放射性核種又は放射性標識；質量分析計において検出可能である離脱可能な増幅物フラグメント質量標識；増幅物及び質量分析計において検出可能な単一正味正電荷又は単一正味負電荷を有する離脱可能な増幅フラグメント質量標識、及びそれらの組合せから成る群から選択選択されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象から得られた生体試料が、細胞系列、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、排泄物、結腸洗浄廃液、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
段階ｄ）に中にはさらに、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が含まれており、ここで前記核酸分子又はペプチド核酸分子は、それがハイブリッド形成される核酸の増幅を抑制する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸分子の配列が、
【化１】
2007528206.tif 000180
【化２】
2007528206.tif 000181
【化３】
2007528206.tif 000182
【化４】
2007528206.tif 000183
【化５】
2007528206.tif 000184
から成る群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸分子又はペプチド核酸分子が、各々の場合において、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素による分解を排除するべくその５’末端で修飾されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子又はペプチド核酸分子は各々の場合において３’ヒドロキシル基が欠如している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
増幅酵素は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ｄ）における決定段階には、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子のハイブリダイゼーションが含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸が
【化６】
2007528206.tif 000185
【化７】
2007528206.tif 000186
【化８】
2007528206.tif 000187
【化９】
2007528206.tif 000188
【化１０】
2007528206.tif 000189
から成る群から取られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのかかるハイブリッド形成する核酸分子又はペプチド核酸分子が固相に結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
複数のかかるハイブリッド形成する核酸分子又はペプチド核酸分子が、線形又は実質的に線形の、六角形又は実質的に六角形の、矩形又は実質的に矩形の、及びそれらの組合せのアレイ群から成る群から選択された核酸又はペプチド核酸アレイの形で固相に対し結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させる段階をさらに含んで成る請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ｅ）における決定段階には増幅物の配列決定段階が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
ｃ）における接触及び増幅段階には、メチル化特異的プライマの使用が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記メチル化特異的プライマの配列が
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
2007528206.tif 000192
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
2007528206.tif 000198
【化２０】
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【化２１】
2007528206.tif 000200
【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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から成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｄ）には、単数又は複数のＣｐＧ；ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むプライマオリゴマーヌクレオチドを使用する段階が含まれ；さらにｅ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子内でハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含みかつ固相に結合されている少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成し、少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させること；及び増幅物のｅ）における配列決定、から成る群から選択された少なくとも１つの方法の使用が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
ｄ）には、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が含まれ、ここで前記核酸分子又はペプチド核酸分子は、それがハイブリッド形成されている核酸の増幅を抑制し、さらに、ｅ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子内でハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含みかつ固相に結合されている少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成し、少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させること；及び増幅物のｅ）における配列決定、から成る群から選択された少なくとも１つの方法の使用が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
ｃ）には、単数又は複数のＣｐＧ；ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むプライマオリゴマーヌクレオチドによる増幅が含まれ、さらにｄ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの検出可能な形で標識された核酸分子をハイブリッド形成する段階が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
ｃ）には、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８及びその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が含まれ、ここで前記核酸分子又はペプチド核酸分子はそれがハイブリッド形成されている核酸の増幅を抑制し、さらにｄ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの検出可能な形で標識された核酸分子をハイブリッド形成する段階が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４３】
ｃ）のプライマオリゴマーヌクレオチドが
【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
2007528206.tif 000233
【化５５】
2007528206.tif 000234
【化５６】
2007528206.tif 000235
【化５７】
2007528206.tif 000236
から成る群から選択されている、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、
ａ．対象のゲノムＤＮＡを有する生体試料を対象から得る段階；
ｂ．ゲノムＤＮＡを抽出する、又はその他の形で単離する段階；
ｃ．配列番号１〜配列番号６４及びそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する配列から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むｂ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを、単数又は複数のメチル化感応性制限酵素と接触させる段階であって、ゲノムＤＮＡがその各々の分割認識モチーフとの関係において、それによって分割されて分割フラグメントを形成するか又はそれによって分割されない段階；及び
ｄ．少なくとも１つのかかる分割フラグメントの存在又は不在又はその特性に基づいて、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された１配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態、又は配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された配列の複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階であって、かくして結腸細胞増殖障害の検出又は検出とその間又はその中の弁別のうちの少なくとも１つが少なくとも部分的に提供される段階、
を含んで成る方法。
【請求項４５】
処理が、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの未メチル化シトシン塩基を、ウラシル又は、ハイブリダイゼーションに関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換させるのに適したものである、ゲノム配列番号１〜配列番号６４から誘導された処理済み核酸。
【請求項４６】
配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８及びそれに相補的な配列から成る群から選択された処理済みゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含む核酸において、該処理が、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの未メチル化シトシン塩基を、ウラシル又はハイブリダイゼーションに関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換させるのに適したものである、核酸。
【請求項４７】
隣接塩基配列が少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチド配列を含む、請求項４５及び４６に記載の核酸。
【請求項４８】
処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩及びそれらの組合せから成る群から選択された試薬の使用を含んで成る、請求項４５及び４６に記載の核酸。
【請求項４９】
配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された処理済みのゲノムＤＮＡ配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの１配列を含むオリゴマー。
【請求項５０】
少なくとも１つのＣｐＧ、ＣｐＡ又はＴｐＧジヌクレオチド配列を含んで成る、請求項４９に記載のオリゴマー。
【請求項５１】
結腸細胞増殖障害の検出及び／又はその間の区別を目的とした、請求項１〜４４に記載の方法、請求項４５〜４８に記載の核酸又は請求項４９〜５０に記載のオリゴマーヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、本書にその全体が参考として内含されている２００３年６月２３日付け米国特許出願第１０／６０３，１３８号の一部継続出願である２００３年１０月３日付けの米国特許出願第１０／６７９，６６２号；２００３年６月２３日付けの米国特許出願第１０／６０２，４９４号；２００４年５月６日付けの欧州特許出願ＥＰ０４０９０１７５，３号；及び２００４年２月２７日付けの欧州特許出願ＥＰ０４０９００７２．２号に基づく優先権の利益を請求するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、正常に比べて疾病状態では改変されたＣｐＧメチル化パターンを示すゲノムＤＮＡ配列に関する。特定の実施形態は、結腸直腸細胞増殖障害を検出するため又は検出しかつそれらの間又は中での弁別を行なうために有用である方法、核酸、核酸アレイ及びキットを提供している。
【０００３】
配列リスト
【０００４】
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．５２（ｅ）（５）に従った配列リストが、本書にその全体が参考として内含されている「４７６７５−７５．ｔｘｔ．用の配列リスト」という題の４．１７ＭＢテキストファイルとしてコンパクトディスク（１中１）上で提供されている。
【背景技術】
【０００５】
背景技術
病原性状態の病因論は、個々の遺伝子又はゲノムの修飾されたメチル化パターンが関与するものとして知られている。ＣｐＧジヌクレオチド配列の状況下で５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡ中で最も頻度の高い共有結合により修飾された塩基であり、転写調節、遺伝子インプリンティング及び腫瘍形成において１つの役割を果たしている。特定の標本内又は複数の標本の間又は中の５−メチルシトシン部位の同定及び定量化はかくして、研究においてのみならず、特にさまざまな疾病の分子診断にとって著しく有利なものである。
【０００６】
異常なＤＮＡメチル化と癌の相関関係。ＣｐＧ「アイランド」内の異常なＤＮＡメチル化は、広範囲の遺伝子スペクトルの解除又は過剰発現を導くＣｐＧジヌクレオチド配列の高メチル化又は低メチル化によって特徴づけされ、ヒトの急性腫瘍の中に見られそれと相関される最も早期で最も一般的な改変の１つである。さらに、或る種の腫瘍については遺伝子のイントロン及びコーディング部分内のＣｐＧ富有調節要素の中で、異常なメチル化が発生することが示されてきた。例えば、結腸癌内では、異常なＤＮＡメチル化が最も顕著な改変の１つを構成し、Ｐ１４ＡＲＦ、Ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＴＨＢＳ１、ＭＩＮＴ２及びＭＩＮＴ３１といったような数多くの腫瘍抑制遺伝子及びｈＭＬＨ１といったようなＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を不活性化する。
【０００７】
腫瘍抑制遺伝子の特異的高メチル化とは対照的に、ＤＮＡの全体的低メチル化が腫瘍細胞に観察できる。この包括的メチル化の減少は、明白な腫瘍形成の発生よりはるかに前の早期に検出することができる。数多くの腫瘍遺伝子について、低メチル化と遺伝子発現の増加の間に相関関係が見極められてきた。
【０００８】
米国では、結腸直腸癌の年間発生は、約１５０，０００例であり、毎年５６，６００人が結腸直腸癌で死亡している。人口全般における結腸直腸癌の生涯リスクは、約５〜６パーセントである。結腸癌のスクリーニング及び早期検出における近年の集中的な取り組みにもかかわらず、今日まで大部分の症例は、局所的又は遠位転移を伴う進行期に診断される。治療の選択肢としては外科手術及びアシュバント又は苦痛緩和的化学療法が含まれるものの、大部分の患者は、数カ月以内でその癌の進行によって死亡する。結腸癌の発生の根底にある分子変化を同定することは、これらの患者の全体的に不良な予後を改善できる新しい管理、スクリーニング、診断及び治療選択肢の開発の一助となるかもしれない。
【０００９】
米国癌協会による結腸直腸スクリーニングのための現行の指針は、５０歳以上の平均リスク個体におけるスクリーニングのための５つの異なる選択肢のうちの１つを利用している。これらの選択肢には、１）年一回の糞便潜血検査（ＦＯＢＴ）、２）５年に一回のファイバスコープＳ状結腸鏡検査、３）年一回のＦＰＢＴと５年に一回のファイバスコープＳ状結腸鏡検査、４）５年に１回の二重造影バリウム注腸（ＤＣＢＥ）又は５）１０年に１回の結腸鏡検査が含まれる。これらの処置は医学界で充分受け入れられているにせよ、結腸直腸癌のための広く行き渡ったスクリーニングの実施は、実現されていない。これらの処置に付随する不快又は不便さに起因して使用が限定されている主たる要因は患者のコンプライアンスにある。ＦＯＢＴ検査は、非侵襲的処置であるものの、検査の３〜５日前に規定食及びその他の制約が求められる。この検査の検出感度レベルも又、結腸直腸腺癌については非常に低く、試行によって広く変動する。腺腫の検出のための感度測定値は、大部分の腺腫が出血しないことから、さらに低くなる。これとは対照的に、Ｓ状結腸検査、結腸鏡検査といったようなより侵襲的処置についての感度は、結腸の内腔の直接的視覚化のためきわめて高い。無作為化試験のいずれもこれらの技術の有効性を評価しなかったが、ケースコントロールスタディからのデータ及び米国ポリープ研究（National Polyp Study）からのデータを用いて、腺腫ポリープを取除くと結果としてＣＲＣ発生が７６〜９０％低減されるということが示されてきた。Ｓ状結腸鏡検査法は、結腸の左側だけを視覚化して右側結腸内の病巣を未検出のままに残すという限界をもつ。内視鏡検査処置は両方共費用が高く、下剤による前処理を必要とし、罹病及び死亡リスクが高い。結腸直腸癌の一般的に広く行きわたったスクリーニングが日常的になるには、感度、特異性、使用し易さが高まり、コストが低くなった改良型の検査が明らかに必要である。
【００１０】
早期結腸直腸癌検出は一般に、無症候性の個体に対し年に一回実施される糞便潜血検査（ＦＯＢＴ）に基づいている。米国癌協会を含めた複数の健康管理機構によって適合化された現行の推奨事項は、５０才から始めて、患者にとってもはやスクリーニングが有効でなくなる時期まで年一回の割合でくり返し糞便潜血検査を行なうことを求めている。ＦＯＢＴが陽性となった場合に、腸の結腸鏡検査を行うことになるが、これは、高価で侵襲的な処置であり、５０００回に１回の割合で検査の重大な合併症が伴う。排泄物がヘム陽性である患者の１２％のみが、結腸鏡検査の時点で癌又は大きなポリープをもつと診断される。ＦＯＢＴスクリーニングが癌関連死亡率又は全体的生存率を改善することはないということは、数多くの研究が示している。潜血検査に対するコンプライアンスは低いものであった。オファーを受けるか又は推奨されている通りにＦＯＢＴを実施する国民は全体の２０パーセント未満である。ＦＯＢＴが適切に行なわれるならば、患者は、連続する３回の便通から糞便試料を収集する。試料は、患者が規定食指針を順守しかつ潜在的な胃腸出血を誘発するものとして知られている投薬を回避している間に得られる。現実には、医師は、患者に適切に指示を与えずにいることが多く又、患者はプロトコルを順守しないことが多く、又一部の患者は、糞便試料の収集という作業が困難又は不快なものであると考えており、かくして年一回の潜血検査についてのコンプライアンスは低い。検査の感度及び特異性を現行の方法よりも改善できれば、検査の頻度を削減することができ、連続した試料の収集が無くなり規定食及び投薬計画の修正も無くなり、患者のコンプライアンスも強まることになるだろう。コンプライアンスの問題との折合いをつけると、ＦＯＢＴの感度及び特異性は低くなる。低い検査特異性は不必要な結腸鏡検査を導き、結腸癌のスクリーニングに多大な出費を追加する。
【００１１】
ＦＯＢＴの特異性は、４３％（腺腫）及び５０％（結腸直腸癌）の感度で、最高で９６％であるものと計算されてきた。「In SureTM」という商品名の下で生産されているもののような免疫検定ＦＯＢＴを用いて、感度を改善することが可能であり、感度の改善は７７％（腺腫）及び８８．９％（結腸直腸癌腫）である。
【００１２】
分子疾病マーカーは、他のタイプのマーカーに比べいくつかの利点を提供し、１つの利点は、組織アーキテクチャが維持されていない試料及び／又は非常に小さい試料でもかなり効率良く分析可能であるという点にある。過去１０年間に、正常と結腸癌腫の間で数多くの遺伝子は異なる形で発現されることが示されてきた。しかしながら、どの単一のマーカーもマーカー組合せも、結腸癌腫の診断には充分であることは示されていない。高次元ｍＲＮＡベースのアプローチは最近、異なる腫瘍タイプ及び良性及び悪性病巣を区別する、より優れた手段を提供できることが示されてきた。しかしながら、臨床環境内での日常的診断ツールとしてのその応用は、ｍＲＮＡの極度の不安定さ、或る一定の誘因（例えば試料収集）の後の急速に発生する発現変化及び最も重要なことには、日常的生検から得ることができないことが多い、分析に必要とされる大量のｍＲＮＡ（Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21:20-24, 1999; Bowtall, D. D. L. Nature genetics suppl. 21:25-32, 1999）により妨げられている。
【００１３】
ＦＯＢＴの感度及び特異性をさらに改善するための生物学的マーカーの使用は、これまで提案されてきており、かかる検査の例としては、２０％（腺腫）及び５２％（結腸直腸癌腫）の感度及び両方のケースにおいて９５％の特異性をもつＥＸＡＣＴＳciencesから入手可能なPre Gen-PlusTM検便検定が含まれる。この検査は、結腸新生物の発生に付随する２３のＤＮＡ突然変異の存在について検定する。ＤＮＡメチル化を結腸癌マーカーとして使用することは、既知である。例えば、Sabbioni et al., （Molecular Diagnosis 7:201-207, 2003）は、結腸癌腫患者の９８％において末梢血中にＴＲＥＦ、ＨＩＣ１、ＤＡＰＫ及びＭＧＭＴから成る遺伝子パネルの高メチル化を検出した。しかしながら、かかる検査の特異性は、同様に充分高いものであると考えられることから、これはまさに商業的に市場性の高い検査のための適切な基礎を提供する。
【００１４】
結腸直腸の病因論の現行モデルは、異形成そして最終的に、侵襲性癌の兆候の発生を含む腺腫の段階的進行に有利に作用する。この腺腫−癌腫シーケンスの基礎を成す分子変化には、腫瘍抑制遺伝子（ＡＰＣ、ｐ５３、ＤＣＣ）の遺伝的及びエピジェネティック改変、腫瘍遺伝子の活性化（Ｋ−ｒａｓ）及びＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の不活性化が含まれる。最近、さらなる分子変化及び遺伝子欠陥が明らかにされてきた。かくして、Ｗｎｔシグナリング経路の活性化には、ＡＰＣ遺伝子の改変が含まれるばかりでなく、β−カテニン突然変異の結果としてももたらされ得る。さらに、そのシグナルトランスジューサＳＭＡＤ４及びＳＭＡＤ２と合わせてＴＧＦ−βシグナリング経路内の改変が、結腸癌の発生に結びつけられてきた。
【００１５】
結腸腺腫及び癌腫の病因論及びその遺伝的及び分子的変化の理解が近年進歩してきたにもかかわらず、転移の発生の基礎を成す遺伝的及びエピジェネティック変化はさほど理解されていない。しかしながら、細胞外マトリクスの侵入及びタンパク質分解プロセスならびに血管基底膜の浸透には、接着タンパク質例えば、インテグリン受容体ファミリの成員、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、ラミニン結合タンパク質及びＣＤ４４受容体が関与するということは一般に充分受入れられている。接着以外に、転移形成プロセスは同様に、血管形成の誘発及び調節（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、細胞増殖の誘発（ＢＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ）及びタンパク質分解酵素の活性化（ＭＭＰ、ＴＩＭＰ、ｕＰＡＲ）ならびにアポトーシスの阻害（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ）を内含する。より近年では、その他のグループが、転移病巣中の遺伝的及び分子的変化を原発性結腸直腸癌内に見られる変化と比較した。かくして、Kleeff et al.,は、原発性及び転移性の両方の結腸直腸癌における腫瘍抑制遺伝子候補であるＤＯＣ−２の損失について報告している。さらにZavber et al.は、彼らの４２の結腸直腸癌シリーズ内で原発性癌におけるＫｉ−ｒａｓ突然変異か４２の対合した原発性及び同期的転移性病巣の全てにおいて同一であることを報告した。同様にして、ＡＰＣ遺伝子座における異型接合性の喪失は、３９の対合した癌腫及び同期的転移について同一であった。著者らは、Ｋｉ−ｒａｓ及びＡＰＣ遺伝子について、転移内の遺伝的変化が原発性結腸直腸癌と同一であるという結論を下した。しかしながら、その他のグループは、原発性癌内に存在しない遺伝的及び分子的変化を転移性癌内に発見した。かくして、結腸直腸転移内の染色性３ＰのＬＯＨの発生が報告されてきた。さらに、比較用ゲノムハイブリダイゼーションを用いて、転移性病巣に独特のいくつかの改変が肝臓転移内に発見された（−９ｑ、−１１ｑ及び−１７ｑ）。
【００１６】
突然変異とは別に、ＣｐＧアイランドの異常なメチル化が、以前はさまざまな癌の病因論に結びつけられてきた或る種の遺伝子の転写サイレンシングを導くことが示されてきた。ＣｐＧアイランドというのは、ＣｐＧジヌクレオチド内に豊富であって通常全てのヒト遺伝子の約５０％の５’領域内に発見され得る短い配列である。これらのアイランド内でのシトシンのメチル化は遺伝子発現の喪失を導き、Ｘ染色体の不活性化及びゲノミックインプリンティングにおいて報告されてきた。
【００１７】
最近、複数のグループが同様に、結腸直腸癌におけるさまざまな遺伝子のメチル化を分析し、なかでもｐ１６ＩＮＫ４、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ＭＧＭＴ、ｈＭＬＨ１、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＣＤＨ１、ＴＩＭＰ−３及びＡＰＣについてのプロモータメチル化による転写サイレンシングを報告した。かくして或る種の遺伝子の突然変異不活性化とは別に、これらの遺伝子の高メチル化も又、この疾病の病因に著しく寄与している。
【００１８】
近年、ＭＳ−ＡＰＰＣＲにより、結腸癌においてメチル化されるいくつかの遺伝子が同定されてきた。この遺伝子群には、なかでも、結腸癌内で頻繁にメチル化されＭＳ−ＡＰＰＣＲ方法を用いて２つの異なるグループにより独立して同定されたＴＰＥＦ／ＨＰＰ１が含まれる（Young J, Biden KG, Simm LA, Huggard P, Karamatic R, Eyre HJ, Sutherland GR, Herath N, Barker M, Anderson GJ, Fitzpatrick DR, Ramm GA, Jass JR, Leggtt BA, HPP1:結腸直腸ポリープ及び癌において一般にメチル化される膜内外タンパク質コーディング遺伝子。Proc Natl Acad Sci USA 98:265-270, 2001）。
【００１９】
多因子アプローチ。癌の診断は、従来、単一の分子マーカーの検出に依存していた（例えば遺伝子突然変異、高いＰＳＡレベル）。残念なことに、癌は、単一のマーカーが標準的にその数多くの形態を検出又は弁別することができないでいる１つの疾病状態である。かくして、単一のマーカーのみを認識する検定は、予測的価値の低いものであることが示されてきた。本発明の基本的な１面は、メチル化に基づく癌診断及びかかる疾病のスクリーニング、診断及び治療用管理が、選抜された多数のマーカーを使用することにより、単一のマーカーの分析を用いる技術的現状に比べて著しい改善を提供することになるという点にある。癌は単純な病気ではないことから、多重化された分析アプローチは、癌の診断のために特に適しており、この多因子「パネル」アプローチは、細胞学的にも臨床的にも癌の不均一性と一貫性をもつ。
【００２０】
メチル化に基づく診断学的検査に対するパネルアプローチ実施の成功の鍵は、疾病状態を特徴づけし区別できる最適化されたマーカーパネルの設計及び開発にある。
【００２１】
医学的検査の開発。あらゆる医学的スクリーニング又は診断学的検査の２つの主要な評価尺度は、例外なく、かつ標的疾患をもたない個体を誤って内含することなく、罹患した個体全てを正確に検出するようにその検査がいかに優れた性能を示すかを測定する、その感度と特異性である（予測値）。歴史的には、数多くの診断学的検査が、感度及び特異性の低さのために批判を受けてきた。
【００２２】
真陽性（ＴＰ）は、検査が陽性であり病気が存在する場合である。偽陽性（ＦＰ）結果は、検査は陽性であるものの病気が存在しない場合である。真陰性（ＴＮ）は、検査は陰性であり、病気が存在しない場合である。偽陰性（ＦＮ）は、検査は陰性であるが病気が存在しない場合である。この状況下で、感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）；特異性＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）；そして予測値＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）である。
【００２３】
感度は、検査されている個体の体内の標的疾患を正しく検出する検査の能力の１つの尺度である。感度の低い検査は、高い率で偽陰性すなわちその疾病を有するもののその特定の疾病を有していないものとして誤って同定されている個体を生成する。偽陰性の潜在的危険性は、罹患した個体が一定の期間診断も治療もされずにとどまり、その間に該疾病が、治療方法があってもその効力が低くなっている可能性のあるより後期まで進行するかもしれないという点にある。感度が低い検査の一例は、ＨＩＶについてのタンパク質ベースの血液検査である。このタイプの検査は、その疾病が充分に確立されてウイルスが実質的な数で血流に侵入してしまうまでウイルスの存在を検出できないことから、低い感度を示す。これとは対照的に、高い感度をもつ検査の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたウイルス量検出である。高感度は、このタイプの検査が非常に少量のウイルスを検出できるという理由で達成される。高感度は、特に診断ミスの結果が重大である場合に重要である。
【００２４】
一方、特異性は、疾病状態をもたない患者を正確に同定する検査の能力の尺度である。特異性の低い検査は、高い率の偽陽性すなわち、疾病を有するものとして誤って同定される個体を生成する。偽陽性の不利益は、それにより患者は強制的に不要な医療処置を受けさせられ、それにはリスク、情緒的ストレスが付随し、患者の健康に対し不利な影響を与える可能性がある、ということにある。高い特異性をもつ診断的検査の開発を困難にしている疾病の特長は、特に癌における疾病のメカニズムに往々にして複数の遺伝子及びタンパク質が関与する、ということにある。さらに、疾病状態とは無関係の理由で或る種のタンパク質が高くなる可能性がある。高い特異性をもつ検査の一例は、ｐ５３突然変異を検出できる遺伝子ベースの検査である。さらなる診断的処置又はさらなる医療的介入に付随するコスト又はリスクが非常に高い場合、特異性が重要である。
【００２５】
当該技術分野における顕著なニーズ。結腸癌スクリーニング特異性を増大させることができるならば、不必要な結腸鏡検査に導く偽陽性の検査結果の問題は低減され、コストの節約及び安全性の改善が導かれることになるだろう。
【００２６】
結腸癌の発生率及び現行の結腸直腸細胞増殖障害スクリーニング方法に付随する欠点を考慮して、現在利用可能な検定に加えて又はその代替として使用されるように結腸細胞増殖障害特に結腸癌の早期検出のための改良型方法に対する実質的にニーズが、当該技術分野において存在している。
【発明の開示】
【００２７】
発明の要約
本発明のさまざまな態様が、効率の良い独特の遺伝子パネルを提供しており、これによると該パネルの成員の１つ又はそれらの組合せのメチル化分析が、特に高い感度、特異性及び／又は予測値で前立腺の細胞増殖障害の検出を可能にしている。本発明の結腸直腸癌細胞検査方法は、高いリスク集団のスクリーニングにとって特に有用である。本発明の方法は、感度、特異性及び確率の高い患者のコンプライアンスが改善されていることから、先行技術の方法（業界標準ＦＯＢＴを含む）に比べた利点を有する。
【００２８】
本発明は、結腸直腸細胞増殖障害の検出又はそれらの間の区別のための新規方法を提供する。前記方法は、最も好ましくは、結腸直腸癌腫、結腸腺腫、炎症性結腸組織、１ｃｍ未満の悪性度２の異形成結腸腺腫、１ｃｍより大きい悪性度３の異形成結腸腺腫、正常な結腸組織、非結腸正常組織、体液及び非結腸癌組織のうちの単数又は複数のものを検出するため又は検出してそれらの間で区別するために利用される。
【００２９】
該発明のさらなる−実施形態においては、該発明に従った方法は、気道消化器細胞増殖障害の検出のために使用される。
【００３０】
１実施形態においては、該発明は、対象の体内の結腸直腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法を提供する。前記方法は、ｉ）血漿、血清、全血、単離された血液細胞、対象から得た血液から単離された細胞から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階であって、前記標的領域のヌクレオチド配列が少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含んでいる段階、ｉｉ）８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で提供される、結腸直腸細胞増殖障害を検出するか又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なう段階、を含んで成る。
【００３１】
好ましくは、感度は、約７５％〜約９６％又は約８０％〜約９０％、又は約８０％〜約８５％である。好ましくは、特異性は約７５％〜約９６％又は約８０％〜約９０％又は約８０％〜約８５％である。
【００３２】
規制機関が認可した市販の検定において使用するのに充分なほど高い感度及び特異性をもつ、体液分析による結腸癌の検出を可能にする方法が現在全く存在しないことから、該方法は新規のものである。結腸直腸細胞増殖障害を検出し診断するのに使用される現行の方法には、結腸鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査法及び糞便潜血結腸癌が含まれる。これらの方法に比べると、開示されている発明は、結腸鏡検査よりも侵襲度が低く、Ｓ状結腸鏡検査法及びＦＯＢＴに比べより感度が高いとはいわないまでも同等の感度を示す。体液検定の開発は、単一の体液ベースの検査に対する患者のコンプライアンスが、現在ＦＯＢＴについて推奨されている排泄物の３重分析に比べて高くなることが予想されるという点で、当該技術分野において既知の現行の方法に比べて明白な技術的利点を表わす。
【００３３】
特定の実施形態においては、該発明は、結腸直腸細胞増殖障害の弁別、検出及び区別のためのマーカーとしての、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群から選択された単数又は複数の遺伝子又はゲノム配列の使用を含んで成る。
【００３４】
遺伝子の前記使用は、遺伝子の発現のあらゆる分析、ｍＲＮＡ発現分析又はタンパク質発現分析を用いて可能にすることができる。しかしながら、該発明の最も好ましい実施形態においては、結腸直腸細胞増殖障害の検出、弁別及び区別は、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４から成る群から選択された単数又は複数の遺伝子又はゲノム配列及びそれらのプロモータ又は調節要素の「メチル化状況」の分析を用いて可能となる。
【００３５】
該発明は、結腸直腸細胞増殖障害の発生に付随する特長について生体試料を分析するための方法において、配列番号１〜配列番号５３５から成る群からの少なくとも１つの核酸又はそのフラグメントを、ゲノム配列又は問題の配列内のメチル化された及びメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドの間の区別を行なう能力をもつ試薬又は一連の試薬と接触させることを特徴とする方法を提供している。
【００３６】
本発明は、ゲノムＤＮＡの遺伝的及び／又はエピジェネティックパラメータを確認する方法を提供する。該方法は、より特定的に言うと、結腸直腸細胞増殖障害のサブクラスの同定及びその間の弁別の改善を可能にすることによって、この障害の診断、治療及び管理を改善するのに有用である。該発明は、結腸直腸細胞増殖障害のきわめて特異的な分類を可能にしかくして患者の改善されたインフォームド治療を可能にするという点で、技術的現状に比べて改善を呈する。
【００３７】
好ましくは、検査試料の供給源は、細胞又は細胞系列、組織学的スライド、生検材料、パラフィン包埋組織、体液、射精精液、排泄物、尿、血液及びそれらの組合せから成る群から選択される。好ましくは、該供給源は、排泄物、血漿、血清、全血、単離血球、対象から得た血液から単離された細胞から成る群から選択される。
【００３８】
特定的には、本発明は、結腸直腸細胞増殖障害の検出方法において、ゲノム核酸（単複）を含む生体試料を得る段階；該核酸の標的配列内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の間の区別を行なうのに充分な１つの試薬又は複数の試薬と、該核酸（単複）又はそのフラグメントを接触させる段階であって、該標的配列が配列番号１〜６４の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含む配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれにハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含んでいる、段階；及び、少なくとも部分的に前記区別段階に基づいて、少なくとも１つの標的ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態又は、複数の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態、又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階を含んで成る方法を提供している。好ましくは、標的配列内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別する段階には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８及び標的配列に対応するその隣接領域から成る群から選択された配列内の対応する転換済み又は未転換ジヌクレオチド配列への、少なくとも１つのかかるＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態依存性転換又は非転換が含まれている。
【００３９】
付加的な実施形態は、結腸直腸細胞増殖障害の検出のための方法において、対象のゲノムＤＮＡを有する生体試料を得る段階；ゲノムＤＮＡを抽出する段階；その５位置でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換するべく、ａ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを単数又は複数の試薬で処理する段階；処理済みゲノムＤＮＡ又はその処理済みフラグメントを、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも２つのプライマ及び１つの増幅酵素と接触させる段階であって、ここで処理済みゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントが増幅物を産生するべく増幅されるか、または増幅されていない、段階；及び前記増幅物の存在又は不在又はその特性に基づいて、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された１配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態、又はその複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階を含んで成る方法を提供している。好ましくは、少なくとも１つのこのようなハイブリッド形成する核酸分子又はペプチド核酸分子は、固相に結合されている。好ましくは、決定段階には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む、固相に結合された少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成し、少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させること；及び増幅物の配列決定、から成る群から選択された少なくとも１つの方法の使用が含まれている。
【００４０】
さらなる実施形態は、結腸直腸細胞増殖障害を分析するための方法において、対象のゲノムＤＮＡを有する生体試料を得る段階；ゲノムＤＮＡを抽出する段階；配列番号１〜配列番号６４又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する配列から成る群から選択された単数又は複数の配列を含むゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを、単数又は複数のメチル化感応性制限酵素と接触させる段階であって、ゲノムＤＮＡが、それによって消化されて消化済みフラグメントを形成するか又はそれによって消化されない段階；及び少なくとも１つのかかる分割フラグメントの存在又は不在又はその特性に基づいて、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された単数又は複数の配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、又はその複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階を含んで成る方法を提供する。好ましくは、消化された又は未消化のゲノムＤＮＡは、前記決定段階の前に増幅される。
【００４１】
付加的な実施形態は、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された配列内のシトシンメチル化パターンの分析のための新規のゲノム及び化学修飾済みの核酸配列、ならびにオリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡオリゴマーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
定義
「観察／予想比」（「Ｏ／Ｅ比」）というのは、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を意味し、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各フラグメントについてのバンド長に対応する。
【００４３】
「ＣｐＧアイランド」という語は、（１）「観察／予想比」＞０．６に対応するＣｐＧジヌクレオチドの頻度を有する、及び（２）「ＧＣ含有量」＞０．５を有する、という基準を満たすゲノムＤＮＡの隣接領域を意味する。ＣｐＧアイランドは標準的には約０．２から約１ｋｂ又は約２ｋｂまでの間の長さを有するが、つねにそうであるとはかぎらない。
【００４４】
「メチル化状態」又は「メチル化状況」という用語は、ＤＮＡ配列内の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の存在又は不在を意味する。ＤＮＡ配列内の単数又は複数の特定のＣｐＧジヌクレオチド（各々２つのＣｐＧＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）におけるメチル化状態は、「未メチル化」「完全−メチル化」及び「半−メチル化」を含む。
【００４５】
「半メチル化」又は「半−メチル化」という用語は、パリンドロームＣｐＧメチル化部位の２つのＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つの中の単一のシトシンのみがメチル化されている（例えば５’ＣＣMＧＧ−３’（最上部ストランド）：３’−ＧＧＣＣ−５’（最下部ストランド）パリンドロームＣｐＧメチル化部位のメチル化状態を意味する。
【００４６】
本書で使用されている通りの「ＡＵＣ」という用語は、曲線下の面積の省略形である。特にそれは受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線より下の面積を意味する。ＲＯＣ曲線は、診断学的検査の考えられる異なるカットポイントについての偽陽性率に対する真正陽性率のプロットである。それは、選択されたカットポイントに応じた感度と特異性の間のトレードオフを示す（感度の増大にはことごとく、特異性の減少が伴うことになる）。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、診断学的検査の精度のための１つの尺度である（この面積が広くなればなるほど、精度はよくなり、最適は１であり、無作為検査は、０．５の面積をもつ対角線上に存在するＲＯＣ曲線を有することになる；参考としてJ.P.Egan.シグナル検出理論及びＲＯＣ分析、Academic Press, New York,1975）。
【００４７】
「高メチル化」という用語は、正常な対照ＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドで発見される５−ｍＣｙｔの量との関係における検査用ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの存在の増加に対応する平均メチル化状態を意味する。
【００４８】
「低メチル化」という用語は、正常な対照ＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドで発見される５−ｍＣｙｔの量との関係における検査用ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの存在の減少に対応する平均メチル化状態を意味する。
【００４９】
「マイクロアレイ」という用語は広義には、当該技術分野において認められている通りの「ＤＮＡマイクロアレイ」及び「ＤＮＡチップ（単複）」の両方を意味し、全ての当該技術分野で認められた固体支持体を包含し、それに対する核酸分子の添加又はその上への核酸の合成のための全ての方法を包含する。
【００５０】
「遺伝的パラメータ」というのは、その調節のためにさらに必要とされる遺伝子及び配列の突然変異及び多型性である。突然変異として指定されるべきものは、特に挿入、欠失、点突然変異、逆位及び多型であり、特に好ましいのはＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）である。
【００５１】
「エピジェネティックパラメータ」は、特にシトシンメチル化である。さらなるエピジェネティックパラメータとしては、例えばヒストンのアセチル化が含まれるが、これは、記述された方法を用いて直接分析され得ず、それ自体ＤＮＡメチル化と相関関係をもつ。
【００５２】
「重亜硫酸塩試薬」という用語は、本書で開示されているようにメチル化及び未メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに有用である重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素又はそれらの組合せを含む試薬を意味する。
【００５３】
「メチル化検定」という語は、ＤＮＡ配列内の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するためのあらゆる検定を意味する。
【００５４】
「ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ」（メチル化感応性任意プライマポリメラーゼ連鎖反応）という用語は、Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997によって記述されている、ＣｐＧジヌクレオチドを含有している確率が最も高い領域に焦点をあてるためＣＧ富有プライマを用いてゲノムを包括的に走査できるようにする当該技術分野において認められている技術を意味する。
【００５５】
「Methy LightTM」という用語は、Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999によって記述されている当該技術分野で認められた蛍光に基づく実時間ＰＣＲ技術を意味する。
【００５６】
本書で実施されているその実施形態において、「Heavy MethylTM」検定という用語は、増幅プライマの間のＣｐＧ位置をカバーする又は増幅プライマによりカバーされているメチル化特異的遮断用プローブ（本書ではブロッカとも呼ばれている）が核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする検定を意味する。
【００５７】
本書で実施されている実施形態において、「Heavy MethylTM Methy LightTM」検定という語は、Methy LightTM検定が、増幅プライマ間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的遮断プローブと組合せられるMethy LightTM検定の一変形形態であるHeavy MethylTM Methy LightTM検定を意味する。
【００５８】
「Ｍｓ−配列番号ｕＰＥ」（メチル化感応性単一ヌクレオチドプライマ拡張）という用語は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997によって記述されている当該技術分野により認められている検定を意味する。
【００５９】
「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）という用語は、Herman et al. Proc. Notl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996, 及び米国特許第５、７８６、１４６号により記述されている当該技術分野で認められたメチル化検定を意味する。
【００６０】
「ＣＯＢＲＡ」（組合せ型重亜硫酸塩制限分析）という用語は、Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997により記述されている当該技術分野で認められたメチル化検定を意味する。
【００６１】
「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）という用語は、Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999, 及び国際公開第００／２６４０１Ａ１号に記載のメチル化検定を意味する。
【００６２】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、２重鎖構造を形成する、サンプルＤＮＡ内のWatson-Crick塩基対合のラインに沿った相補的配列に対するオリゴマーヌクレオチドの結合として理解されなくてはならない。
【００６３】
本書で定義されている「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現には、５×ＳＳＣ／５×Denhardt溶液／１．０％のＳＤＳ中で６８℃でのハイブリッド形成及び室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄が関与するか又は、その当該技術分野により認められた等価物（例えばハイブリダイゼーションが２．５×ＳＳＣ緩衝液中で６０℃で実施されその後低い緩衝液濃度での３７℃の数回の洗浄段階が行なわれ、安定した状態にとどまっている条件）が関与している。本書で定義される穏やかにストリンジェントな条件には４２℃で３×ＳＳＣ中での洗浄の内含又は当該技術分野により認められているその等価物が関与している。塩濃度及び温度のパラメータは、プローブと標的核酸の間の最適な同一性レベルを達成するように変動させることができる。かかる条件に関する指針は、例えばSambrook et al., 1989, 分子クローニング、その実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Press, N.Y.;及びAusubel et al. (eds.), 1995, 分子生物学の最新プロトコル（John Wiley & Sons, N.Y.）ユニット２．１０によって、当該技術分野において入手可能である。
【００６４】
「アレイ配列番号」、「複合アレイ配列番号」又は「複合アレイ配列」という用語は、対象アレイの全ての個々の隣接配列の頭部から尾部への（５’→３’）線形複合物（例えばその順序での配列１−７１の頭部−尾部複合物）から成る仮説に基づく又はその他の形での配列を意味する。
【００６５】
「アレイ配列番号ノード」、「複合アレイ配列番号ノード」又は「複合アレイ配列ノード」という用語は、「アレイ配列番号」、「複合アレイ配列番号」又は「複合アレイ配列」の任意の２つの個々の隣接配列の間の接合部を意味する。
【００６６】
複合アレイ配列に関して、「隣接ヌクレオチド」という語句は、複合アレイの任意の個々の隣接配列の隣接配列領域を意味するが、以上で定義されているように「ノード」を内含する複合アレイ配列の１領域を内含しない。
【００６７】
概要：
本発明は、結腸直腸細胞増殖障害の発生と結びつけられるメチル化パターンの分析用として新規の有用性を有する分子遺伝学的マーカーを提供する。前記マーカーは、結腸直腸細胞増殖障害を検出しそれらの間の区別を行なうために用いることができ、かくして、前記障害の分類及び治療のための改善された手段を提供する。１変形実施形態においては、前記分子遺伝的マーカーは、気道消化器細胞増殖障害の検出のために使用可能である。
【００６８】
ＤＮＡの重亜硫酸塩修飾は、ＣｐＧメチル化状況を査定するのに使用される当該技術分野で認められた手段である。５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡ中で最も頻度の高い電子対共有塩基修飾である。それは、例えば、転写の調節、遺伝子インプリンティング及び腫瘍形成において１つの役割を果たす。従って、遺伝情報の一構成要素としての５−メチルシトシンの同定は、著しく有利なことである。しかしながら、５−メチルシトシン位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対合挙動を有することから、配列決定によって同定できない。その上、５−メチルシトシンが担持しているエピジェネティック情報は、例えばＰＣＲ増幅中に完全に失なわれる。
【００６９】
５−メチルシトシンの存在についてＤＮＡを分析するための最も頻繁に用いられる方法は、シトシンと重亜硫酸塩の特異的反応に基づいており、かくして、その後のアルカリ加水分解の時点で、シトシンは、その塩基対合挙動においてチミンに対応するウラシルへと転換される。しかしながら、有意なことに、５−メチルシトシンは、これらの条件下で未修飾状態にとどまる。その結果、もとのＤＮＡは、当初そのハイブリダイゼーション挙動によりシトシンと区別され得なかったメチルシトシンが今や例えば増幅及びハイブリッド形成によって又は配列決定によってといったように当該技術分野で認められた分子生物学技術を用いて唯一の残留シトシンとして検出され得るような形で、転換される。これらの技術は全て、今や充分に活用可能である示差的な塩基対合特性に基づいている。
【００７０】
先行技術は、感度に関しては、分析すべきＤＮＡをアガロースマトリクス内に閉じ込め、かくしてＤＮＡの拡散及び再生を妨げ（重亜硫酸塩は１本鎖ＤＮＡとのみ反応する）、全ての沈降及び精製段階を高速透析で置換することを含む方法によって定義される（Olek A, et al., 重亜硫酸塩ベースのシトシンメチル化分析のための修正され改善された方法、Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996）。かくして、メチル化状況について個々の細胞を分析して該方法の有用性及び感度を例示することが可能である。５−メチルシトシンを検出するための当該技術分野により認められた方法の概要は、Rein, T, et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998によって提供されている。
【００７１】
わずかな例外（例えばZeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997）を除いて、重亜硫酸塩技術は、現在研究のみに使用されている。全てのケースにおいて、既知の遺伝子の短かい特異的フラグメントが、重亜硫酸塩処理の後に増幅され、完全に配列決定され（Olek & Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997）、単数又は複数のプライマ拡張反応に付されて（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997; 国際公開第９５／００６６９号；及び米国特許第６，２５１，５９４号）個々のシトシン位置を分析するか、そうでなければ、酵素消化（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997）により処理される。ハイブリダイゼーションによる検出についても同様に、当該技術分野において記述されている（Olek et al., 国際公開第９９／２８４９８号）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化の検出のための重亜硫酸塩技術の使用が記述されてきた（Grigg & Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R. et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; 国際公開第９７４６７０５号及び国際公開第９５１５３７３号）。
【００７２】
本発明は、配列番号１〜配列番号６４から成る群からの配列内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況の決定のための、単数又は複数のメチル化検定と組合わせた形の重亜硫酸塩技術の使用を提供している。本発明に従うと、配列番号１〜配列番号６４から成る群からの配列内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況の決定は、診断及び予後診断上の有用性を有している。
【００７３】
メチル化検定手順。当該技術分野においてはさまざまなメチル化検定手順が知られており、本発明と併用することができる。これらの検定は、ＤＮＡ配列内の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えばＣｐＧアイランド）のメチル化状態の決定を可能にする。かかる検定には、その他の技術のなかでも、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡのＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ（配列特異的増幅用）、サザンブロット分析及びメチル化感応性制限酵素の使用が関与している。
【００７４】
例えば、重亜硫酸塩処理を用いることによるＤＮＡメチル化パターン及び５−メチルシトシン分布の分析のために、ゲノム配列決定が単純化されてきた（Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）。さらに、重亜硫酸塩転換されたＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化、例えばSadri & Hornsby （Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996）、又はCOBRA（組合せ型重亜硫酸塩制限分析）（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）によって記述された方法が使用される。
【００７５】
ＣＯＢＲＡ。ＣＯＢＲＡTM分析は、少量のゲノムＤＮＡ内で特定の遺伝子座におけるＤＮＡメチル化レベルを決定するために有用である定量的メチル化検定である（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）。簡単に言うと、重亜硫酸ナトリウムで処理されたＤＮＡのＰＣＲ産物のメチル化依存性配列差異を明らかにするために、制限酵素消化が用いられる。メチル化依存性配列差異はまず最初に、Frommer et al. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）により記述された手順に従った標準的重亜硫酸塩処理によって、ゲノムＤＮＡ内に導入される。重亜硫酸塩転換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅が次に、問題のＣｐＧアイランドに特異的なプライマを用いて実施され、その後制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動及び特異的な標識づけされたハイブリダイゼーションプローブを用いた検出が行なわれる。当初のＤＮＡ試料中のメチル化レベルは、ＤＮＡメチル化レベルの広いスペクトルを横断して線形定量的に、消化された及び未消化のＰＣＲ産物の相対的量によって表わされる。さらに、この技術は、顕微解剖されたパラフィン包埋組織試料から得たＤＮＡに対して、高い信頼性で応用することができる。
【００７６】
ＣＯＢＲＡTM分析のための標準的試薬（例えば、標準的なＣＯＢＲＡTMベースのキットの中に見られるようなもの）には、特異的遺伝子用のＰＣＲプライマ（又は重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）；制限酵素及び適切な緩衝液；遺伝子−ハイブリダイゼーションオリゴ；対照ハイブリダイゼーションオリゴ；オリゴプローブ用のキナーゼ標識キット及び標識されたヌクレオチドが含まれ得るがこれに制限されるわけではない。付加的には、重亜硫酸塩転換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルフォン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬及びキット（例えば、沈降、限外ろ過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；及びＤＮＡ回収成分、が含まれる可能性がある。
【００７７】
好ましくは、「Methy LightTM」（蛍光ベースの実時間ＰＣＲ技術）（Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999），Ms-SNuPETM（メチル化感応性単一ヌクレオチドプライマ拡張）反応（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）、メチル化特異的PCR（"MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 米国特許第５，７８６，１４６号）及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（"MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999）といったような検定が、単独で又はこれらの方法のうちのその他のものと組合せた形で使用される。
【００７８】
Methy LightTM。Methy LightTM検定は、ＰＣＲ段階の後にさらなる操作を全く必要としない蛍光ベースの実時間ＰＣＲ（Taq ManTM）技術を利用する高生産性の定量的メチル化検定である（Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999）。簡単に言うと、Methy LightTMプロセスは、標準的手順に従ってメチル化依存性配列差異をもつ混合プールへと重亜硫酸ナトリウム反応において転換されるゲノムＤＮＡの混合試料から始まる。次に蛍光ベースのＰＣＲが、（既知のＣｐＧメチル化部位と重複しないプライマでの「不偏」ＰＣＲ反応又は（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するＰＣＲプライマでの）「偏向」反応のいずれかで実施される。配列の識別は、増幅プロセスのレベル又は蛍光検出プロセスのレベルのいずれかで、又はその両方で行なわれ得る。
【００７９】
ゲノムＤＮＡ試料内のメチル化パターンについての定量的検査としてMethy LightTMを使用することができ、ここで配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで行なわれる。この定量的バージョンでは、ＰＣＲ反応は、特定の推定上のメチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下で不偏増幅を提供する。投入されたＤＮＡの量についての不偏対照が、プライマもプローブもどのＣｐＧジヌクレオチドにも重複していない反応によって提供される。代替的には、既知のメチル化部位を「カバー」しない対照オリゴマーヌクレオチド（「ＭＳＰ」技術の蛍光ベースのバージョン）又は潜在的メチル化部位をカバーするオリゴマーヌクレオチドのいずれかでの偏向ＰＣＲプールのプロービングによって、ゲノムメチル化についての定量的検査が達成される。
【００８０】
Methy LightTMプロセスを、増幅プロセス内で「Taq Man（登録商標）」プローブを用いて使用することができる。例えば２本鎖ゲノムＤＮＡが、重亜硫酸ナトリウムで処理され、例えば偏向プライマ及びTaq Man（登録商標）プローブか又は不偏プライマとTaq Man（登録商標）プローブのいずれかといったようにTaq Man（登録商標）プローブを用いた２組のＰＣＲ反応のうちの１つに付される。Taq Man（登録商標）プローブは、蛍光「リポータ」及び「消光剤」分子で２重標識され、順方向又は逆方向プライマよりもＰＣＲサイクルで約１０℃高い温度で融解してしまうような形で、比較的高いＧＣ含有量の領域に特異的なものとなるように設計される。こうして、Taq Man（登録商標）プローブはＰＣＲアニール／拡張段階の間充分ハイブリッド形成された状態にとどまることができる。TaqポリメラーゼはＰＣＲ中新しいストランドを酵素的に合成することから、それは最終的にアニールされたTaq Man（登録商標）プローブに到達することになる。Taqポリメラーゼ５’→３’エンドヌクレアーゼ活性はこのとき、実時間蛍光検出システムを用いて、その現在消光されていないシグナルを定量的に検出するため蛍光リポータ分子を放出するように消化することによってTaq Man（登録商標）プローブを変位させることになる。
【００８１】
Methy LightTM分析のための標準的試薬（例えば標準的Methy LightTMベースのキットの中に見られるようなもの）には、特異的遺伝子用のＰＣＲプライマ（又は重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）；Taq Man（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド；及びTaqポリメラーゼが含まれ得るが、これに制限されるわけではない。
【００８２】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥTM技術は、ＤＮＡの重亜硫酸塩処理とそれに続く単一ヌクレオチドプライマ拡張に基づく特異的ＣｐＧ部位におけるメチル化差異を査定するための定量的方法である（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）。簡単に言うと、５−メチルシトシンを変化しないままに残しながら未メチル化シトシンをウラシルに転換させるべくゲノムＤＮＡが重亜硫酸ナトリウムと反応させられる。次に、重亜硫酸塩で転換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマを用いて所望の標的配列の増幅が実施され、結果としての産物は単離され、問題のＣｐＧ部位（単複）におけるメチル化分析用の鋳型として使用される。少量のＤＮＡを分析することができ（例えば、顕微解剖された病理切片）、これにより、ＣｐＧ部分でのメチル化状況を決定するための制限酵素を利用する必要が無くなる。
【００８３】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥTM分析のための標準的試薬（例えば、標準的なＭｓ−ＳＮｕＰＥTMベースのキットの中に見られるようなもの）には、特異的遺伝子用のＰＣＲプライマ（又は重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の対照プライマ；特異的遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥTMプライマ；反応緩衝液（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応用）；及び標識されたヌクレオチドが含まれ得るがこれに制限されるわけではない。付加的には、重亜硫酸塩転換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルフォン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬及びキット（例えば、沈降、限外ろ過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；及びＤＮＡ回収成分、が含まれる可能性がある。
【００８４】
ＭＳＰ。ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、メチル化感応性制限酵素の使用とは無関係に、ＣｐＧアイランド内のほぼあらゆるＣｐＧ部位群のメチル化状況を査定できるようにする（Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 米国特許第５，７８６，１４６号）。簡単に言うと、ＤＮＡは、メチル化シトシンではなく全ての未メチル化シトシンをウラシルへと重亜硫酸ナトリウムで転換させることによって修飾され、その後、未メチル化ＤＮＡに比べメチル化ＤＮＡに特異的なプライマで増幅される。ＭＳＰは、少量のＤＮＡしか必要とせず、一定の与えられたＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化対立遺伝子に対し感応し、パラフィン包埋試料から抽出されたＤＮＡについて実施され得る。ＭＳＰ分析のための標準的試薬（例えば、標準的なＭＳＰベースのキットの中に見られるようなもの）には、特異的遺伝子用のＰＣＲプライマメチル化及び未メチル化（又は重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）、最適化されたＰＣＲ緩衝液及び特異的プローブが含まれ得るが、これに制限されるわけではない。
【００８５】
ＭＣＡ。ＭＣＡ技術は、ゲノムＤＮＡ内の改変されたメチル化パターンについてスクリーニングしこれらの変化に付随する特異的配列を単離するために使用できる方法である（Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999）。簡単に言うと、任意プライミングされたＰＣＲ増幅に先立って、原発性腫瘍、細胞系列及び正常な組織からのゲノムＤＮＡを消化するために、その認識部位内のシトシンメチル化に対し異なる感度を有する制限酵素が使用される。示差的メチル化を示すフラグメントが、高分解能のポリアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ産物の分解の後にクローニングされ配列決定される。クローニングされたフラグメントはその後、これらの領域の示差的メチル化を確認するためサザン分析のためのプローブとして用いられる。ＭＣＲ分析のための標準的試薬（例えば、標準的なＭＣＡベースのキットの中に見られるようなもの）には、ゲノムＤＮＡの任意プライミングのためのＰＣＲプライマ；ＰＣＲ緩衝液及びヌクレオチド、制限酵素及び適切な緩衝液；遺伝子−ハイブリダイゼーションオリゴ又はプローブ；対照ハイブリダイゼーションオリゴ又はプローブが含まれ得るがこれに制限されるわけではない。
【００８６】
配列番号１〜配列番号６４に従ったゲノム配列及び配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８に従ったその自然に発生しない処理済み変異体が、結腸直腸細胞増殖障害の検出、分類及び／又は治療のために新たな有用性をもつことが見極められた。
１実施形態において、本発明は、対象の体内で結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しそれらの間又は中での区別を行なうための方法を提供している。１実施形態においては、該発明は、ｉ）血漿、血清、全血、単離された血液細胞、対象から得た血液から単離された細胞から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階であって、前記隣接ヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含んでいる段階、ｉｉ）８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で提供される、結腸細胞増殖障害を検出するか又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なう段階、を含んで成る。
【００８７】
好ましくは、感度は、約７５％〜約９６％又は約８０％〜約９０％、又は約８０％〜約８５％である。好ましくは、特異性は約７５％〜約９６％又は約８０％〜約９０％又は約８０％〜約８５％である。
【００８８】
ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含め、当該技術分野において標準的なあらゆる手段により単離可能である。簡単に言うと、問題のＤＮＡは細胞膜によってカプセル封入されており、生体試料は酵素、化学又は機械的手段により分断され溶解されなくてはならない。このときＤＮＡ溶液から、例えばプロティナーゼＫでの消化により、タンパク質及びその他の汚染物質を一掃することができる。ゲノムＤＮＡはこのとき溶液から回収される。これは、塩析、有機抽出又は固相支持体に対するＤＮＡの結合を含めたさまざまな方法を用いて実施可能である。方法の選択は、時間、出費及びＤＮＡ所要量を含めた複数の要因により影響されることになる。体液が、好ましいＤＮＡ供給源であり、特に好ましいのは血漿、血清、全血、単離された血液細胞及び血液から単離された細胞である。
【００８９】
このとき、ゲノムＤＮＡ試料は、５’位置でメチル化されていないシトシン塩基がハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンと異なっているウラシル、チミン又はもう１つの塩基へと転換されるような形で処理される。これは、本書では「処理」として理解されることになる。
【００９０】
ゲノムＤＮＡの上述の処理は好ましくは、重亜硫酸塩（亜硫酸水素、二亜硫酸塩）及びその後のアルカリ加水分解を用いて実施され、この加水分解は、ウラシル又は塩基対合挙動に関してシトシンと異なっているもう１つの塩基への非メチル化シトシン核酸塩基の転換を結果としてもたらす。
【００９１】
処理済みＤＮＡは次に、結腸直腸癌腫の発生に結びつけられる単数又は複数の標的遺伝子配列のメチル化状態（処理以前の）を見極めるために分析される。標的領域が、表１に列挙されている通りの遺伝子及び配列から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又は配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はストリンジェント条件下でこれに対しハイブリッド形成することが特に好ましい。添付の配列表に記述されている通りの表３内の前記遺伝子の配列が分析されることがさらに好ましい。分析方法は、本書に列挙されているものを含めて、当該技術分野において既知のものから選択可能である。特に好ましいのは、本書で記述されるようなMethy-Light, ＭＳＰ及び遮断用オリゴマーヌクレオチドの使用である。かかる分析で使用されるあらゆるオリゴマーヌクレオチド（プライマ、遮断用オリゴマーヌクレオチド及び検出プローブ）が配列番号（ＩＤＢＩＳＥＱＦＩＲＳＴ）〜配列番号及び（ＩＤＢＩＳＥＱＬＡＳＴ）及びそれに相補的な配列のうちの単数又は複数のものの塩基配列の少なくとも１６塩基対の長さのセグメントに対し逆相補的であるか、同一であるか又はストリンジェント条件下又は極めてストリンジェントな条件下でこれに対しハイブリッド形成すべきであるとするのが好ましい。
【００９２】
より好ましくは、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群から取られた単数又は複数の遺伝子又はゲノム配列の異常なメチル化、より好ましくは高メチル化は、結腸直腸癌腫の存在と結びつけられる。
【００９３】
配列のうちの単数又は複数のものの分析は、８０％以上の感度及び８０％以上の特異性での結腸細胞増殖障害の検出及び検出とそれらの間又は中での区別の提供を初めて可能にする。感度は、｛検出された結腸新生組織形成／全ての結腸新生組織形成｝として計算され、特異性は（検出されない陰性／全陰性）として計算される。
【００９４】
好ましくは、感度は、約７５％〜約９６％又は約８０％〜約９０％、又は約８０％〜約８５％である。好ましくは、特異性は約７５％〜約９６％又は約８０％〜約９０％又は約８０％〜約８５％である。
【００９５】
結腸新生組織形成は、全ての結腸悪性腫瘍又は結腸悪性腫瘍と大きい（＞１ｃｍ）腺腫又はそれらのサブセットとして定義できる。陽性は、結腸悪性腫瘍及び腺腫以外のあらゆる疾病又は健康な個体として定義できる。
【００９６】
１実施形態においては、該方法は、結腸細胞増殖障害の弁別、検出及び区別のためのマーカーとしての、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群から選択された単数又は複数の遺伝子又はゲノム配列の使用を開示している。
【００９７】
ｍＲＮＡ発現分析又はタンパク質発現分析を用いた遺伝子の発現のあらゆる分析を用いて、遺伝子の前記使用を可能にすることができる。ただし、該発明の最も好ましい実施形態においては、結腸細胞増殖障害の検出、弁別及び区別は、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４及びそれらのプロモータ又は調節要素から成る群から選択された単数又は複数の遺伝子又はゲノム配列のメチル化状況の分析を用いて可能になる。遺伝子のメチル化分析の方法が、本書で記述されている。
【００９８】
表３に基づく配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４に従ったゲノム配列により調節された遺伝子、ゲノム配列又は遺伝子のｍＲＮＡ発現の異常なレベルが、結腸直腸癌に結びつけられる。
【００９９】
従って、前記遺伝子又は配列の発現レベルの増大又は低減は、結腸直腸癌腫及びその他の結腸直腸細胞増殖障害の発生と結びつけることができる。
【０１００】
結腸癌用の検出システムにおいて、遺伝子又はゲノム配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するためには、患者から試料を得る。この試料は、組織生検試料又は血液、血漿、血清などの試料であり得る。中に含有されている核酸を抽出するために試料を処理することが可能である。試料からの結果として得られた核酸は、ゲル電気泳動法又はその他の分離技術に付される。検出には、ハイブリッド２重鎖を形成するべくプローブとして役立つＤＮＡ配列と、核酸特に試料のｍＲＮＡを接触させる段階が関与されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間的長さ及びホルムアミド濃度を含めた、ハイブリダイゼーション中及び洗浄手順中の一定数の要因により決定される。これらの要因は、例えばSambrook et al（分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、１９８９）の中で概略的に記されている。結果として得られる２重鎖の検出は、通常、標識されたプローブを用いることによって達成される。代替的には、プローブは、標識されていなくてもよいが、直接的に又は間接的に、標識されているリガンドとの特異的結合によって検出可能であり得る。プローブ及びリガンドを標識するための適切な標識及び方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、既知の方法（例えばニックトランスレーション又はキナーゼ化）により取込まれ得る放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えばジオキセタン、特定的にトリガーされるジオキセタン）、酵素、抗体などを内含する。
【０１０１】
遺伝子又はゲノム配列から転写されたｍＲＮＡの試料中の検出の感度を増大させるために、ｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを増幅するべく、逆転写／重合連鎖反応の技術を使用することができる。逆転写／ＰＣＲの方法は、当該技術分野において周知である（例えば前出のWatson及びFlemingを参照のこと）。
【０１０２】
以下の通りに逆転写／ＰＣＲ方法を実施することができる。全細胞ＲＮＡが、例えば標準イソチオシアン酸グアニジウム方法によって単離され、全ＲＮＡが逆転写される。逆転写方法には、逆転写酵素及び３’末端プライマを用いたＲＮＡ鋳型上のＤＮＡの合成が関与する。標準的には、プライマはオリゴ（ｄＴ）配列を含有する。かくして産生されたｃＤＮＡは次に、ＰＣＲ方法及びＥＹＡ４特異的プライマを用いて増幅される（参考として内含されているBelyavaky et al., Nuel Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug及びBerger, 酵素学方法、Academic Press, N.Y.,第１５０巻、pp. 316-325, 1987中）。
【０１０３】
本発明は、一部の実施形態においては、生体試料の検査を通して結腸癌疾病状態を検出する上で使用するためのキットとして記述される可能性もある。代表的キットは、単数又は複数の核酸セグメントの各々について１つのコンテナとｍＲＮＡに対し選択的にハイブリッド形成する単数又は複数の核酸セグメントを含み得る。或る種の実施形態においては、単一の管内で複数の核酸セグメントを組合わせることができる。さらなる実施形態においては、核酸セグメントは、標的ｍＲＮＡを増幅するためのプライマ対をも内含し得る。かかるキットは、同様に、ハイブリダイゼーション、増幅又は検出反応のためのあらゆる緩衝液、溶液、溶剤、酵素、ヌクレオチド又はその他の構成要素も内含し得る。好ましいキット構成要素には、逆転写−ＰＣＲ、インサイチュハイブリッド形成、ノーザン分析及び／又はＲＰＡ用の試薬が含まれる。
【０１０４】
本発明はさらに、患者から得られた試料中の前記遺伝子又は遺伝子配列によりコードされるポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。
【０１０５】
表３に基づく配列番号：１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４に従った遺伝子、ゲノム配列又はゲノム配列により調節された遺伝子によりコードされたポリペプチドの異常なポリペプチド発現レベルが、結腸直腸癌腫と結びつけられる。
【０１０６】
従って、前記ポリペプチドの過剰又は過小発現を、結腸直腸癌腫及びその他の結腸直腸細胞増殖障害の発生と結びつけることが可能である。
【０１０７】
タンパク質を検出するための当該技術分野において既知のあらゆる方法を使用することができる。かかる方法には、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫化学方法、結合剤−リガンド検定、免疫組織化学技術、凝集及び補体検定が含まれるがこれに制限されるわけではない。例えば、参考として内含されている基礎及び臨床免疫学、Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. Pp 217-262, 1991を参照のこと）。好適なのは、抗体をエピトープ（単複）と反応させ、標識されたタンパク質又はその誘導体を競合的に変位させることを含む結合剤−リガンド免疫検定法である。
【０１０８】
本発明の或る種の実施形態は配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群の遺伝子又はゲノミック配列によりコードされたポリペプチドに特異的な抗体の使用を含んで成る。
【０１０９】
かかる抗体は、患者の結腸疾患マーカー発現レベルを正常な個体における同じマーカーの発現と比較することにより、疾病状態を検出する上で診断及び予後診断の利用分野のために有用であり得る。或る種の実施形態においては、コードされたポリペプチドを抗原として使用することによって、モノクローナル又はポリクローナル抗体の産生を誘発することができる。かかる抗体は、それ自体、ヒト疾病状態のためのマーカーとして、発現済みタンパク質を検出するために使用することができる。患者の末梢血又は組織試料中に存在するこのようなタンパク質のレベルは、従来の方法により定量化され得る。蛍光又は放射性リガンドでの標識といったような、当該技術分野において既知のさまざまな手段により、抗体−タンパク質結合を検出し定量化することができる。該発明はさらに、調査中のポリペプチドに特異的な抗体を収納する、上述の処置を実施するためのキットをも含んで成る。
【０１１０】
数多くの競合及び非競合的タンパク質結合免疫検定が、当該技術分野において周知である。このような検定において利用される抗体は、例えば凝集検査の中で使用されるように標識されていなくてもよいし、又は多種多様な検定方法を使用するために標識されていてもよい。使用可能な標識には、放射免疫測定（ＲＩＡ）、例えば酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）といった酵素免疫検定、蛍光免疫検定などで使用するための放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、酵素基質又は共同因子、酵素阻害物質、粒子、染料などが含まれる。当該技術分野において既知の数多くの方法のいずれかにより免疫検定において使用するため、ポリクローナル又はモノクローナル抗体又はそのエピトープを作ることができる。
【０１１１】
１つのタンパク質を調製するための１つのアプローチは、タンパク質の全て又は一部分のアミノ酸配列の選択及び調製であり、該配列を化学的に合成しそれを通常はウサギ又はマウスである適切な動物の体内に注入する（参考として内含されているMilstein及びKohler, Nature 256:495-497, 1975; Gulfre及びMilstein, 酵素学方法；免疫化学技術73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981）。ポリペプチド又はそのエピトープの調製方法には、化学合成、組換え型ＤＮＡ技術又は生体試料からの単離が含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１１２】
表３に基づいた、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群から選択された遺伝子又はゲノム配列のメチル化分析が行なわれる上述の実施形態に加えて、該発明は、結腸直腸癌の検出のための新しい有用性をもつ２つのさらなる遺伝子パネルを提示している。
【０１１３】
第１のさらなる実施形態において、本発明は、表３に基づいた、配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４及びＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡ及び／又はそれらの調節配列から成る群から取られた単数又は複数の遺伝子又はゲノム配列内のメチル化レベルの分析に基づいている。
【０１１４】
前記遺伝子又はゲノム配列が表３に基づくようなものであることがさらに好ましい。
【０１１５】
さらなる実施形態においては、本発明は、表３に従った全ての遺伝子及びゲノム配列及び／又はそれらの調節配列から成る群から取られた２つ以上の遺伝子又はゲノム配列内のメチル化レベルの分析に基づいている。前記遺伝子又はゲノム配列の配列は配列番号１〜配列番号６４に従ったようなものであることがさらに好ましい。
【０１１６】
本発明の特定の実施形態は、結腸直腸細胞増殖障害の精確な検出、特徴づけ及び／又は治療を可能にする前記配列内のメチル化レベル及び／又はパターンの分析の新規の応用を提供している。結腸直腸細胞増殖障害の早期検出は、疾病の予後診断と直接結びつけられ、開示された方法はかくして医師及び患者がより優れた及びよりインフォームドされた治療決定を行なえるようにする。配列番号２０、４１、３５、３、３９、３３＆２７から成る群の配列は、さらに、気道消化器細胞増殖障害の検出のためにさらに有用である。
【０１１７】
さらなる改良
本発明は、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択されたゲノム配列のための新規用途を提供している。付加的な実施形態は、配列番号１〜配列番号６４の修飾された変異体ならびに配列番号１〜配列番号６４内のシトシンメチル化パターンの分析のためのオリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーを提供する。
【０１１８】
該発明の目的には、配列番号１〜配列番号６４及びそれに対し相補的な配列から成る群から選択されたゲノム配列のうちの少なくとも１つの中の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の分析が含まれている。
【０１１９】
開示された発明は、配列番号１〜配列番号６４から誘導された処理済み核酸において、該処理がゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの未メチル化シトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーションに関してシトシンと検出可能な形で異なるもう１つの塩基に転換するのに適している核酸を提供している。問題のゲノム配列は単数又は複数の連続した又は無作為のメチル化ＣｐＧ位置を含み得る。前記処理は好ましくは、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、重亜硫酸塩及びそれらの組合せから成る群から選択された試薬の使用を含む。該発明の好ましい実施形態では、該目的には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された配列の長さが少なくとも１６隣接ヌクレオチド塩基である配列を含む非自然発生の修飾済み核酸の分析において、前記配列が少なくとも１つＣｐＧ、ＴｐＡ又はＣｐＡジヌクレオチド及びそれに相補的な配列を含む分析が含まれている。配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８の配列は、配列番号１〜配列番号６４に従った核酸の非自然発生の修飾済みバージョンを提供し、ここで、各々のゲノム配列の修飾は、以下の通りの前記ゲノム配列とは全く異なる独特の配列をもつ核酸の合成を結果としてもたらしている。各々のセンスストランドゲノムＤＮＡ、例えば配列番号１について、４つの転換済みバージョンが開示されている。第１のバージョンでは「Ｃ」→「Ｔ」であるが「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」にとどまっている（すなわち、ゲノム配列についてＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化され、かくして転換されていないケースに対応する）；第２のバージョンは、「Ｃ」→「Ｔ」であるが「ＣｐＧ」が「ＣｐＧ」にとどまっている（すなわちＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化され、かくして転換されていないケースに対応する）、開示されたゲノムＤＮＡ配列（すなわちアンチセンスストランド）の補体を開示している。配列番号１〜配列番号６４の「アップメチル化」された転換済み配列は、配列番号６５〜７６及び配列番号３０４〜配列番号４１９に対応する。「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列を含め全ての「Ｃ」残基について「Ｃ」→「Ｔ」である（すなわちゲノム配列について、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化されていないケースに対応する）各々のゲノム配列の第３の化学的に転換されたバージョンが提供されており、各配列の最終的な化学的に転換されたバージョンは、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含め、全ての「Ｃ」残基について「Ｃ」→「Ｔ」である（すなわち各ゲノム配列の補体（アンチセンスストランド）についてＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化されていないケースに対応する）、開示されたゲノムＤＮＡ配列の補体（すなわちアンチセンスストランド）を開示している。配列番号１〜配列番号６４の「ダウンメチル化された」転換済み配列は、配列番号７７〜８８及び配列番号４２０〜配列番号５３５に対応する。
【０１２０】
有意にも、これまで、配列番号１〜７、９〜１１、１４〜２３、２７、３１、３２、４０〜４２、４４〜４６、４８、５０〜５５及び５９〜６４に従った核酸配列及び分子は、結腸直腸細胞増殖障害又は気道・消化管細胞増殖障害の検出、分類又は処置に関与しておらず、又それと関連づけされることもなかった。
【０１２１】
代替的な好ましい実施形態においては、かかる分析には、配列番号１〜配列番号５３５に従ったゲノム又は処理済み（化学的に修飾された）ＤＮＡ内で、シトシンメチル化状態を検出するためのオリゴマーヌクレオチド又はオリゴマーの使用が含まれる。前記オリゴマーヌクレオチド又はオリゴマーは、穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件（以上で定義した通り）下で配列番号６５〜配列番号８８及び配列番号３０４〜配列番号５３５に従った処理済み核酸配列及び／又はそれに相補的な配列に対して又は、配列番号１〜配列番号６４に従ったゲノム配列及び／又はそれに相補的な配列に対してハイブリッド形成する少なくとも９個のヌクレオチドという長さをもつ核酸配列を含む。
【０１２２】
かくして、本発明は、穏やかにストリンジェントな及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜配列番号５３５の配列の全て又は一部分又はその補体に対してハイブリッド形成する核酸分子（例えばオリゴマーヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡ−オリゴマ）を内含する。ハイブリッド形成する核酸のハイブリッド形成部分は、標準的には長さが少なくとも９、１５、２０、２５、３０又は３５ヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子は発明力ある有用性を示し、かくして本発明の範囲内に入る。
【０１２３】
好ましくは、発明力あるハイブリッド形成核酸のハイブリッド形成部分は、配列番号１〜配列番号５３５の配列又はその一部分、又はその補体と少なくとも９５％又は少なくとも９８％又は１００％同一である。
【０１２４】
本書で記述されているタイプのハイブリッド形成核酸は例えば、プライマ（例えばＰＣＲプライマ）又は診断及び／又は予後診断プローブ又はプライマとして使用可能である。好ましくは、核酸試料に対するオリゴマーヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件下で実施され、プローブは標的配列に対する１００％の同一性をもつ。核酸２重鎖又はハイブリッド安定性は、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である融解温度又はＴｍとして表わされる。この融解温度は、必要とされるストリンジェンシー条件を定義するために用いられる。
【０１２５】
配列番号１〜配列番号６４の対応する配列（例えば対立遺伝子変異体及びＳＮＰに対し同一ではなくむしろ関係している及び実質的に同一である標的配列については、特定の濃度の塩（例えばＳＳＣ又はＳＳＰＥ）との相同なハイブリダイゼーションのみが発生する最低温度を最初に設定することが有用である。次に、１％のミスマッチがＴｍの１℃の低下を結果としてもたらすものと仮定すると、ハイブリダイゼーション反応における最終的洗浄液温度は、それに相応して低下する（例えば、プローブとの同一性が９５％を上回る配列が求められる場合、最終洗浄液温度は５℃低下させられる）。実際には、Ｔｍの変化は、ミスマッチ１％あたり０．５℃〜１．５℃の間であり得る。
【０１２６】
例えば配列番号１を基準とするポリヌクレオチド位置によって表わされるとおりの長さＸ（ヌクレオチド数で）の発明力あるオリゴマーヌクレオチドの例には、各々の連続的に重複するセット（一定の与えられたＸ値に対応する）内のオリゴマーヌクレオチドが、ｎ〜（ｎ＋（Ｘ−１））というヌクレオチド位置からのＺ個のオリゴマーヌクレオチドの有限セットとして定義されるものとして、長さＸの連続して重複するオリゴマーヌクレオチドのセット（センス及びアンチセンスセット）に対応するものが含まれる。なお式中、
ｎ＝１，２，３…（Ｙ−（Ｘ−１））であり；
Ｙは、配列番号１（２，２８０）の長さ（ヌクレオチド又は塩基対）に等しく；
Ｘは、該セット内の各オリゴマーヌクレオチドの共通の長さ（ヌクレオチド数での）に等しく（例えば、連続して重複する２０量体のセットについてはＸ＝２０）；かつ
長さＹの一定の与えられた配列番号についての長さＸの連続的に重複するオリゴマー−の数（Ｚ）はＹ−（Ｘ−１）に等しい。例えばＸ＝２０の場合、配列番号１のセンス又はアンチセンスのいずれかのセットについてＺ＝２，２８０−１９＝２，２６１である。
【０１２７】
好ましくは、該セットは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むオリゴマーに制限される。
【０１２８】
発明力ある２０量体オリゴマーヌクレオチドの例としては、配列番号１を基準にしてポリヌクレオチド位置により表わされた、２，２６１個のオリゴマーの以下のセット（及びそれに対し相補的なアンチセンスセット）が含まれる：
１−２０、２−２１、３−２２、４−２３、５−２４、…２２５９−２２７８、２２６０−２２７９及び２２６１−２２８０。
【０１２９】
好ましくは、該セットは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むようなオリゴマーに制限される。
【０１３０】
同様にして、発明力ある２５量体オリゴマーヌクレオチドには、配列番号１を基準にしたポリヌクレオチド位置で表わされた２，２５６オリゴマーの以下のセット（及びそれに相補的なアンチセンスセット）が含まれる：
１−２５、２−２６、３−２７、４−２８、５−２９、…２２５４−２２７８、２２５５−２２７９及び２２５６−２２８０。
【０１３１】
好ましくは、該セットは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むようなオリゴマーに制限される。
【０１３２】
本発明は、配列番号１〜配列番号５３５の各々について（センス及びアンチセンス）、例えばＸ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０又は３５ヌクレオチドである、長さＸのオリゴマーヌクレオチド又は修飾済みオリゴマーヌクレオチドの多数の連続的に重複するセットを包含する。
【０１３３】
本発明に従ったオリゴマーヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号１〜配列番号６４に対応するゲノム配列の遺伝的及びエピジェネティックパラメータを確認するのに有用な有効な手段を構成する。長さＸのこのようなオリゴマーヌクレオチド又は修飾済みオリゴマーヌクレオチドの好ましいセットは、配列番号１〜配列番号５３５（及びその補体）に対応するような連続的に重複するオリゴマーセットである。好ましくは、前記オリゴマーは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１３４】
本発明に従った特に好ましいオリゴマーヌクレオチド又はオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチド（又は対応する転換されたＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチド）配列のシトシンがオリゴマーヌクレオチドの中央第３番目以内にあるようなものである。すなわち、オリゴマーヌクレオチドが例えば長さが１３塩基である場合、ＣｐＧ、ＴｐＧ及びＣｐＡジヌクレオチドは、５’末端から５〜９番目のヌクレオチド以内に位置づけされている。
【０１３５】
該発明のオリゴマーヌクレオチドは、同様に、オリゴマーヌクレオチドの活性、安定性又は検出を増強させるべく、単数又は複数の部分又は接合体にオリゴマーヌクレオチドを化学的に連結させることによっても修飾され得る。かかる部分又は接合体には、例えば米国特許第５，５１４，７５８号、５，５６５，５５２号、５，５６７，８１０号、５，５７４，１４２号、５，５８５，４８１号、５，５８７，３７１号、５，５９７，６９６号及び５，９５８，７７３号の中に開示されているような発色団、フルオロフォア、脂質例えばコレステロール、コリン酸、チオエーテル、脂肪酸鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分その他が含まれる。プローブは同様に、特に好ましい対合特性をもつＰＮＡ（ペプチド核酸）の形でも存在し得る。かくしてオリゴマーヌクレオチドは、ペプチドといったようなその他の追加基を内含することができ、又ハイブリダイゼーショントリガー型分割剤（Krol et al., Bio Techniques 6:958-976, 1988）又は挿入剤（Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988）を内含し得る。この目的で、オリゴマーヌクレオチドは、例えば発色団、フルオロフォア、ペプチド、ハイブリダイゼーションでトリガー型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションでトリガーされた分割剤などのもう１つの分子に接合され得る。
【０１３６】
オリゴマーヌクレオチドは、少なくとも１つの当該技術分野で認められた修飾済みの糖及び／又は塩基部分をも含むことができ、或いは又修飾された主鎖又は非天然ヌクレオシド連結を含むことができる。
【０１３７】
本発明の特定の実施形態に従ったオリゴマーヌクレオチド又はオリゴマーは、標準的に、ゲノム配列配列番号１〜配列番号６４及びそれに相補的な配列、又は配列番号３０４〜配列番号５３５に従った処理済み核酸の配列及びそれに相補的な配列内の対応するＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドの各々の分析のための少なくとも１つのオリゴマーを含有する「セット」の形で使用される。しかしながら、経済的要因又はその他の要因のため、前記配列内のＣｐＧジヌクレオチドの制限されたセレクションを分析することが好ましい可能性があると予想され、オリゴマーヌクレオチドセットの中味はそれに従って、改変される。
【０１３８】
従って、特定の実施形態においては、本発明は、処理済みゲノムＤＮＡ（配列番号３０４〜配列番号５３５）内、又はゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号６４及びそれに相補的な配列）内のシトシンメチル化状態を検出するのに有用な少なくとも２つ（２）（オリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー）のセットを提供している。これらのプローブは、結腸直腸細胞増殖障害の遺伝子的及びエピジェネティックパラメータの診断、分類及び／又は療法を可能にする。処理済みゲノムＤＮＡ（配列番号３０４〜配列番号５３５）内又はゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号６４及びそれに相補的な配列）内の単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するためにも、該オリゴマーセットを使用することができる。
【０１３９】
好ましい実施形態では、オリゴマーヌクレオチドセットのうちの少なくとも１つ及びより好ましくは全ての成員が固相に結合される。
【０１４０】
さらなる実施形態においては、本発明は、配列番号１〜配列番号５３５及びそれに相補的な配列の１つ又はそのセグメントのＤＮＡ配列を増幅させるための「プライマ」オリゴマーヌクレオチドとして使用される少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドのセットを提供する。
【０１４１】
オリゴマーヌクレオチドは、「アレイ」又は「ＤＮＡチップ」（すなわち固相に結合された異なるオリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーの配置）の全て又は一部分を構成しうると予想されている。異なるオリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列のこのようなアレイは、例えば、矩形又は六角形格子の形で固相上に配置されていることを特徴とする。固相表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀又は金で構成され得る。ペレットの形で又は樹肢マトリクスとして存在し得るニトロセルロースならびにナイロンといったようなプラスチックも同じく使用可能である。オリゴマアレイ製造における先行技術の概要は、Nature Genetics （Nature Genetics追補、第２１巻、１９９９年１月）及びその中で引用されている文献から収集することができる。蛍光標識されたプローブを、固定化したＤＮＡアレイの走査のために使用することが多い。特異的プローブの５’−ＯＨに対するＣｙ３及びＣｙ５染料の単純な付着が、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実施可能である。Ｃｙ３及びＣｙ５染料は、その他の数多くのもの以外に、市販されている。
【０１４２】
オリゴマーヌクレオチド又はその特定の配列は、分析物の複合混合物を分析するため一意的標識されたプローブのさまざまな集団の一部として又はそれと組合せた形での「指定子」などとしてオリゴマーヌクレオチド又はその特定の配列が使用される「仮想アレイ」の全部又は一部を構成し得るということも予想されている。かかる方法は、例えば米国特許第２００３／００１３０９１号（２００３年１月１６日付けで公示された米国第０９／８９８，７４３号）の中で記述されている。かかる方法においては、複合混合物（すなわち各々の被分析物）内の各々の核酸が一意的標識によって一意的に結合されかくして検出され得るような形で、充分な標識が生成される（各標識は、直接計数され、その結果、混合物中の各々の分子種のデジタル読取りが結果としてもたらされる）。
【０１４３】
該発明に従ったオリゴマーは、結腸直腸細胞増殖障害の検出；そのサブクラスの検出及びその間又は中での弁別；その診断；その予後診断；その治療；その管理；そしてその治療と管理のために利用されることが特に好ましい。これは、結腸直腸癌腫、結腸腺腫、炎症性結腸組織、１ｃｍ未満の悪性度２の異形成結腸腺腫、１ｃｍより大きい悪性度３の異形成結腸腺腫、正常な結腸組織、非結腸健常組織及び非結腸癌組織といった組織クラスのうちの単数又は複数のものの検出又は検出と弁別のための前記セットの使用によって可能となる。
【０１４４】
特に好ましいのは、以下のオリゴマーヌクレオチドセットのうちの１つから選択された少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含むようなオリゴマーセットである。
【０１４５】
【表１】
2007528206.tif 000002
【表２】
2007528206.tif 000003
【表３】
2007528206.tif 000004
【表４】
2007528206.tif 000005
【表５】
2007528206.tif 000006
【０１４６】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫組織又は結腸腺腫のうちの少なくとも１つが、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される。これは、配列番号１〜１２、１５〜２０、２２、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチドそしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドから成るセットを使用することによってか又は、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドで構成されたセットを使用することによって達成される。
【０１４７】
【表６】
2007528206.tif 000007
【０１４８】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫が、非結腸健常組織、末梢血リンパ球及び非結腸癌から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される。１実施形態においては、これは、配列番号１〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドから成るセットを使用することによって達成される：
【０１４９】
【表７】
2007528206.tif 000008
【０１５０】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫が、炎症性結腸組織、正常な結腸組織、非結腸健常組織、末梢血リンパ球、結腸腺腫及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される。これは、配列番号１〜３、５〜１３、１５〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドから成るセットを使用することによってか又は、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含むオリゴマーセットを使用することによって達成される：
【０１５１】
【表８】
2007528206.tif 000009
【０１５２】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫は、結腸腺腫から区別される。これは、配列番号１１、２５、２７、３８、４０、４５、５３及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドから成るセットを使用することによって達成される。
【０１５３】
【表９】
2007528206.tif 000010
【０１５４】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫組織又は結腸腺腫のうちの少なくとも１つが、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される。これは、配列番号１〜６４及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含む少なくとも２つのオリゴマーから成るセットを用いることによって達成される：
【０１５５】
【表１０】
2007528206.tif 000011
【０１５６】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫組織が、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織のうちの少なくとも１つから区別される。これは、配列番号１〜３、５〜２３、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された、１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含む少なくとも２つのオリゴマーから成るセットを使用することによって達成される。
【０１５７】
【表１１】
2007528206.tif 000012
【０１５８】
該方法の１実施形態においては、結腸直腸癌腫組織又は結腸線種の少なくとも１つが、炎症性結腸組織、正常な結腸組織、非結腸健常組織、末梢血リンパ球及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される。これは、配列番号１〜３６、３８〜４３、４５〜５８、及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析により達成される。これは、好ましくは、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも１つのオリゴマーヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含む少なくとも２つのオリゴマーから成るセットを使用することによって達成される：
【０１５９】
【表１２】
2007528206.tif 000013
【０１６０】
該方法の１実施形態においては、結腸に由来する組織は、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含むオリゴマーセットを使用することによって、非結腸由来の組織から区別される。
【０１６１】
【表１３】
2007528206.tif 000014
【０１６２】
該方法の１実施形態においては、細胞増殖障害は、以下のものから成る群のうちの１つから選択された少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含むオリゴマーセットを使用することによって、健常組織から区別される：
【０１６３】
【表１４】
2007528206.tif 000015
【０１６４】
該方法のさらなる１実施形態においては、肺、肝臓、膵臓、胆管、胃及び結腸癌から成る群の気道・消化管細胞増殖障害が検出される。これは、配列番号２０、４１、３５、３、３９、３３及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列のメチル化状況の分析によって達成される。本発明はさらに、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することにより対象の体内で配列番号１〜配列番号６４に従ったゲノム配列の遺伝的及び／又はエピジェネティックパラメータを確認するための方法を提供している。前記方法は、前記対象から得た生体試料中の配列番号１〜配列番号６４のうちの単数又は複数のものを含む核酸を少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含み、ここで前記試薬又は一連の試薬が標的核酸内のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する。
【０１６５】
好ましくは、前記方法は、以下の段階を含んで成る。すなわち第１の段階では、分析すべき組織の試料が得られる。供給源は、細胞系列、組織学的スライド、生検材料、パラフィン包埋組織、体液、排泄物、結腸洗浄廃液、尿、血漿、血清、全血、単離血液細胞、血液から単離された細胞及び、考えられる全てのそれらの組合せといったような適切な任意の供給源であり得る。前記ＤＮＡ供給源が、結腸洗浄廃液、尿、血漿、血清、全血、単離血液細胞、血液から単離された細胞から成る群から選択された排泄物又は体液であることが好ましい。
【０１６６】
ゲノムＤＮＡは次に試料から単離される。ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含め、当該技術分野において標準的なあらゆる手段によっても単離され得る。簡単に言うと、問題のＤＮＡが細胞膜によりカプセル封入されている場合、生体試料は、酵素的、化学的又は機械的手段により分断され分解されなくてはならない。このとき、プロティナーゼＫでの消化などによりＤＮＡ溶液からタンパク質及びその他の汚染物を一掃することができる。その後ゲノムＤＮＡを該溶液から回収する。これは、塩析、有機抽出又は固相支持体へのＤＮＡの結合を含めたさまざまな方法を用いて実施可能である。方法の選択は、時間、支出及びＤＮＡ所要量を含めた複数の要因によって影響されることになる。
【０１６７】
ひとたび核酸が抽出されたならば、分析中でゲノム２本鎖ＤＮＡを使用する。
【０１６８】
該方法の第２段階においては、５’位置においてメチル化されていないシトシン塩基がウラシル、チミン又はハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンと異なっているもう１つの塩基へと転換されるような形で、ゲノムＤＮＡ試料を処理する。これは、本書では「前処理」又は「処理」として理解される。
【０１６９】
ゲノムＤＮＡの上述の処理は、好ましくは、重亜硫酸塩（亜硫酸水素、重亜硫酸）及び、ウラシル又は塩基対合挙動に関してシトシンと異なっているもう１つの塩基への非メチル化シトシン核酸塩基の転換を結果としてもたらすその後のアルカリ加水分解を用いて実施される。
【０１７０】
該方法の第３段階では、本発明に従ったプライマオリゴマーヌクレオチドセット及び増幅酵素を用いて、処理済みＤＮＡのフラグメントが増幅される。複数のＤＮＡセグメントの増幅を１つの同じ反応容器内で同時に実施できる。標準的には、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施される。プライマオリゴマーヌクレオチドのセットには、その配列が各々逆相補的、であるか、同一であるか又は配列番号３０４〜配列番号５３５及びそれに相補的な配列のうちの１つの塩基配列の少なくとも１６塩基対という長さのセグメントに対しストリンジェントな又はきわめてストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドが含まれる。
【０１７１】
該方法の代替的実施形態においては、配列番号１〜配列番号６４のうちの単数又は複数のものを含む核酸配列内の予め選択されたＣｐＧ位置のメチル化状況は、メチル化特異的プライマオリゴマーヌクレオチドを使用することによって検出可能である。この技術（ＭＳＰ）はHarmanに対する米国特許第６，２６５，１７１号の中で記述されてきた。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡの増幅のためにメチル化状況特異的プライマを使用することにより、メチル化核酸と非メチル化核酸の弁別を行なうことができる。ＭＳＰプライマ対は、重亜硫酸塩処理されたＣｐＧジヌクレオチドに対しハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマを含有する。従って前記プライマの配列は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマがＣｐＧ内のＣ位置の位置に「Ｔ」を含有している。従って、好ましくは、前記プライマの塩基配列は、配列番号３０４〜配列番号５３５及びそれに相補的な配列の１つに従った処理済み核酸配列に対しハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの長さをもつ配列を含むことが必要とされ、ここで前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。
【０１７２】
該方法のさらなる好ましい実施形態においては、ＭＳＰプライマは、以下のものから成る群から選択される：
【表１５】
2007528206.tif 000016
【表１６】
2007528206.tif 000017
【表１７】
2007528206.tif 000018
【表１８】
2007528206.tif 000019
【表１９】
2007528206.tif 000020
【表２０】
2007528206.tif 000021
【表２１】
2007528206.tif 000022
【表２２】
2007528206.tif 000023
【表２３】
2007528206.tif 000024
【表２４】
2007528206.tif 000025
【表２５】
2007528206.tif 000026
【表２６】
2007528206.tif 000027
【表２７】
2007528206.tif 000028
【表２８】
2007528206.tif 000029
【表２９】
2007528206.tif 000030
【表３０】
2007528206.tif 000031
【表３１】
2007528206.tif 000032
【表３２】
2007528206.tif 000033
【表３３】
2007528206.tif 000034
【表３４】
2007528206.tif 000035
【表３５】
2007528206.tif 000036
【表３６】
2007528206.tif 000037
【表３７】
2007528206.tif 000038
【０１７３】
該方法のさらなる好ましい実施形態は、ブロッカーオリゴマーヌクレオチドの使用を含む。かかるブロッカーオリゴマーヌクレオチドの使用については、Yu et al., Bio Techniques 23: 714-720, 1997によって記述されている。遮断用プローブオリゴマーヌクレオチドはＰＣＲプライマと同時に重亜硫酸塩処理された核酸に対してハイブリッド形成される。核酸のＰＣＲ増幅は、遮断用プローブの５’位置で終結され、かくして核酸の増幅は、該遮断用ブロックに相補的な配列が存在する場合に抑制されることになる。プローブは、メチル化状況に特異的な要領で重亜硫酸塩で処理された核酸に対しハイブリッド形成するように設計され得る。例えば、未メチル化核酸の集団内のメチル化核酸の検出のためには、メチル化核酸の増幅の抑制が望まれている場合の「ＣｐＧ」とは異なり、問題の位置で「ＣｐＡ」又は「ＴｐＡ」を含む遮断用プローブを使用することによって問題の位置でメチル化されていない核酸の増幅の抑制が実施されることになる。
【０１７４】
ブロッカーオリゴマーヌクレオチドを用いたＰＣＲ方法については、ポリメラーゼを媒介とした増幅の効率の良い分断には、ブロッカーオリゴマーヌクレオチドがポリメラーゼにより伸長されていないことが必要である。好ましくは、これは、「遊離」、ヒドロキシル基以外のもので３’位置で誘導体化されたオリゴマーヌクレオチド又は３’−デオキシオリゴマーヌクレオチドであるブロッカーの使用を通して達成される。例えば、３’−０−アセチルオリゴマーヌクレオチドが、好ましいクラスのブロッカー分子の代表である。
【０１７５】
付加的には、ブロッカーオリゴマーヌクレオチドのポリメラーゼが媒介分解を排除すべきである。好ましくは、このような排除には、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼの使用又は、例えばブロッカー分子にヌクレアーゼ耐性を付与するチオアート架橋をその５’末端に有する修飾されたブロッカーオリゴマーヌクレオチドの使用のいずれかが含まれる。特定の利用分野では、ブロッカーのかかる５’修飾が必要とされない可能性がある。例えば、ブロッカー及びプライマ結合部位が重複しかくしてプライマの結合が（例えば余剰のブロッカーで）排除される場合、ブロッカーオリゴマーヌクレオチドの分解が実質的に排除されることになる。これは、ポリメラーゼがプライマをブロッカーに向かって及びブロッカーを通して（５’−３’方向に）拡張しない（これは、通常ハイブリッド形成されたブロッカーオリゴマーヌクレオチドの分解を結果としてもたらすプロセスである）からである。
【０１７６】
本発明では、本書にて実施されているように、特に好ましいブロッカー／ＰＣＲ実施形態には、遮断用オリゴマーヌクレオチドとしてペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用が含まれる。このようなＰＮＡブロッカーオリゴマーは、ポリメラーゼによって分解されることも拡張されることもないことから、理想的に適している。
【０１７７】
従って好ましくは、前記遮断用オリゴマーヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３０４〜配列番号５３５及びそれに相補的な配列のうちの１つに従った処理済み核酸配列に対しハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの長さを有する１配列を含むことが必要とされ、ここで、前記オリゴマーヌクレオチドの塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１７８】
該方法のさらに好ましい実施形態では、該遮断用オリゴマーヌクレオチドは
【表３８】
2007528206.tif 000039
【表３９】
2007528206.tif 000040
から成る群から選択される。
【０１７９】
増幅を用いて得られたフラグメントは、直接的又は間接的に検出可能な標識を担持することができる。好ましいのは、質量分析計内で検出可能である標準的な質量をもつ離脱可能な分子フラグメント又は蛍光標識、放射性核種の形をした標識である。前記標識が質量標識である場合、標識された増幅物が単一の正又は負の正味電荷を有し、質量分析計内でのより優れた検出を可能にすることが好まれる。検出は、例えばマトリクスサポートレーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）を用いてか又は電子噴霧質量分析（ＥＳＩ）を用いて実施及び視覚化され得る。
【０１８０】
マトリクスサポートレーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の分析のための非常に効率の高い開発である（Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60: 2299-301, 1988）。吸光マトリクス内に、被分析物が包埋される。該マトリクスは短レーザーパルスにより蒸発され、かくして被分析物分子をフラグメント化されない形で蒸気相内に輸送する。被分析物は、マトリクス分子との衝突によってイオン化される。印加された電圧が、イオンを自由空間飛行管内に加速させる。その異なる質量のため、イオンは異なる速度で加速される。イオンは小さくなればなるほど、大きいものに比べ早く検出器に到達する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析は、ペプチド及びタンパク質の分析に極めて適している。核酸分析は、幾分かむずかしい（Gut & Beck、現行の改革及び将来の傾向、1: 147-57, 1995）。核酸分析に関する感度はペプチドの場合より約１００分の１低く、フラグメントサイズが大きくなるにつれて不均衡な形で減少する。その上、多重に負に帯電した主鎖をもつ核酸については、マトリクスを介したイオン化プロセスは著しく効率が悪い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析においては、マトリクスの選択が著しく重要な役割を果たす。ペプチドの脱離については、非常に細かい結晶化を生成するいくつかの非常に効率の良いマトリクスが発見されてきた。現在、ＤＮＡのためのいくつかの応答性マトリクスが存在するが、ペプチドと核酸の間の感度の差異は減少されていない。しかしながら、この感度差は、ペプチドにさらに類似するような形でＤＮＡを化学的に修飾することによって低減させることができる。例えば、主鎖の通常のリン酸塩がチオリン酸塩によって置換されているホスホチオアート核酸を単純なアルキル化学反応を用いて電荷中性ＤＮＡへと転換させることができる（Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995）。この修飾されたＤＮＡに対する電荷タグのカップリングは、ペプチドについて発見されるものと同レベルまでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ感度の増大を結果としてもたらす。電荷タグ付けのさらなる利点は、修飾されていない基質の検出をはるかに困難にする、不純物に対する分析の安定性の増大にある。
【０１８１】
該方法の第４段階では、該方法の第３段階中に得られた増幅物は、処理に先立ちＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況を確認する目的で分析される。
【０１８２】
増幅物がＭＳＰ増幅を用いて得られる実施形態においては、増幅物の有無はそれ自体プライマの塩基配列に従って、該プライマによりカバーされるＣｐＧ位置のメチル化状態を表わしている。
【０１８３】
標準ＰＣＲ及びメチル化特異的ＰＣＲの両方を用いて得られた増幅物は、アレイ技術及びプローブベースの技術といったように（ただしこれに制限されるわけではない）ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、ならびに配列決定及び鋳型誘導型拡張といったような技術を用いて、さらに分析可能である。
【０１８４】
該方法の１実施形態においては、段階３で合成された増幅物は、その後オリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡプローブのアレイ又はセットにハイブリッド形成される。この状況下で、ハイブリダイゼーションは、以下の要領で行なわれる。すなわちハイブリダイゼーション中に使用されるプローブセットは好ましくは少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーから成る。該プロセスにおいて、増幅物は、固相に予め結合されたオリゴマーヌクレオチドに対しハイブリッド形成するプローブとして役立つ。ハイブリッド形成されていないフラグメントはその後除去される。前記オリゴマーヌクレオチドは、該配列リスト内で特定された塩基配列のセグメントと逆相補的な又は同一の少なくとも９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含有する。そして、該セグメントは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１８５】
好ましい１実施形態においては、前記ジヌクレオチドは、オリゴマーの中央の３分の１に存在する。例えば、オリゴマーが１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む場合、前記ジヌクレオチドは好ましくは１３量体の５’末端から５番目乃至９番目のヌクレオチドである。１つのオリゴマーヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号６４に従った配列内の各々のＣｐＧジヌクレオチド及び配列番号３０４〜配列番号５３５内の同等の位置の分析のために存在している。前記オリゴマーヌクレオチドは同様に、ペプチド核酸の形でも存在し得る。このとき、ハイブリッド形成されていない増幅物は除去される。その後ハイブリッド形成された増幅物は検出される。このような状況下で、増幅物に付着された標識を、オリゴマーヌクレオチド配列が位置設定されている固相の各位置で固定できることが好ましい。
【０１８６】
該方法のさらなる実施形態においては、ＣｐＧ位置のゲノムメチル化状況は、ＰＣＲ増幅プライマと同時に重亜硫酸塩処理されたＤＮＡに対しハイブリッド形成するオリゴマーヌクレオチドプローブを用いて確認することができる（ここで前記プライマはメチル化特異的であっても標準のものであってもよい）。
【０１８７】
この方法の特に好ましい実施形態は、２重標識された蛍光オリゴマーヌクレオチドプローブを利用する（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム、Perkin Elmer Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティを用いたTaq ManTM PCR）、蛍光ベースの実時間定量的ＰＣＲ（Heid et al., Genome Res. 6: 986-994, 1996;米国特許第６，３３１，３９３号も参照のこと）の使用である。Taq ManTM PCR反応は、好ましい実施形態において順方向増幅プライマと逆方向増幅プライマの間にあるＧｐＣ−富有配列に対しハイブリッド形成するように設計されているTaq ManTM プローブと呼ばれる非拡張性の問合せオリゴマーヌクレオチドの使用という方法を利用する。Taq ManTM プローブはさらに、Taq ManTMオリゴマーヌクレオチドのヌクレオチドに付着されたリンカー部分（例えばホスホルアミダイト）に共有結合された蛍光「レポータ部分」及び「消光剤部分」を含む。重亜硫酸塩処理に続く核酸内のメチル化の分析のためには、プローブが、Methyl Light TM検定としても知られている米国特許第６，３３１，３９３号（本書にその全体が参考として内含されている）の中で記述されている通り、メチル化特異的であることが必要とされる。記述されている発明と共に使用するのに同じく適しているTaq ManTM 検出方法の変形形態としては、２重プローブ技術（LightcyclerTM）又は蛍光増幅プライマ（SunriseTM技術）の使用が含まれる。これらの技術は両方共、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡで使用するため、そしてさらにＣｐＧジヌクレオチド内でのメチル化分析のために適した要領で適合させることが可能である。
【０１８８】
重亜硫酸塩で処理された核酸の分析によるメチル化の査定のためのプローブオリゴマーヌクレオチドの使用のためのさらなる適切な方法。該方法のさらなる好ましい実施形態においては、該方法の第５段階は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997によって記述されているようなＭＳ−ＳＮｕＰＥといったような鋳型誘導型オリゴマーヌクレオチド拡張の使用を含んで成る。
【０１８９】
該方法のさらにもう１つの実施形態においては、該方法の第５段階は、該方法の第３段階において生成される増幅物の配列決定及びその後の配列分析を含んで成る（Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467, 1977）。
【０１９０】
最良の形態
該方法の最も好ましい実施形態においては、ゲノム核酸は以上で概略説明した方法の最初の３段階すなわち、
ａ）  対象のゲノムＤＮＡを有する生体試料を対象から得る段階；
ｂ）  ゲノムＤＮＡを抽出する、又はその他の形で単離する段階；
ｃ）  その５位置で非メチル化されているシトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換するべく、ｂ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを単数又は複数の試薬で処理する段階；
に従って単離され処理され、ここで
ｄ）  ｃ）にある処理の後の増幅が、メチル化特異的な要領で、すなわちメチル化特異的プライマ又は遮断用オリゴマーヌクレオチドを用いて実施されており、さらにここで
ｅ）  増幅物の検出は、上述の通り実時間検出プローブを用いて実施される。
【０１９１】
好ましくは、ｄ）のその後の増幅が上述のようにメチル化特異的プライマを用いて実施される場合、前記メチル化特異的プライマは、配列番号３０４〜配列番号５３５及びそれに相補的な配列のうちの１つに従って、処理済み核酸配列にハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの長さをもつ配列を含み、ここで前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。
【０１９２】
該方法のさらなる好ましい実施形態においては、ＭＳＰプライマは以下のものから成る群から選択される：
【表４０】
2007528206.tif 000041
【表４１】
2007528206.tif 000042
【表４２】
2007528206.tif 000043
【表４３】
2007528206.tif 000044
【表４４】
2007528206.tif 000045
【表４５】
2007528206.tif 000046
【表４６】
2007528206.tif 000047
【表４７】
2007528206.tif 000048
【表４８】
2007528206.tif 000049
【表４９】
2007528206.tif 000050
【表５０】
2007528206.tif 000051
【表５１】
2007528206.tif 000052
【表５２】
2007528206.tif 000053
【表５３】
2007528206.tif 000054
【表５４】
2007528206.tif 000055
【表５５】
2007528206.tif 000056
【表５６】
2007528206.tif 000057
【表５７】
2007528206.tif 000058
【表５８】
2007528206.tif 000059
【表５９】
2007528206.tif 000060
【表６０】
2007528206.tif 000061
【表６１】
2007528206.tif 000062
【表６２】
2007528206.tif 000063
【表６３】
2007528206.tif 000064
【０１９３】
該方法のＳｔｅｐ  ｅ）、すなわち配列番号１〜配列番号６４に従った単数又は複数のＣｐＧ位置のメチル化状況を表わす特異的増幅物の検出は、上述の通りの実時間検出方法を用いて実施され、ここで前記ハイブリダイゼーションプローブの配列は以下のものから成る群から選択される：
【表６４】
2007528206.tif 000065
【表６５】
2007528206.tif 000066
【表６６】
2007528206.tif 000067
【表６７】
2007528206.tif 000068
【表６８】
2007528206.tif 000069
【０１９４】
列挙された各々のゲノム配列について、配列リスト中に詳述されている通りの以下のオリゴマーヌクレオチドを、組合せ型ＭＳＰ−実時間分析のために使用することができる：
【０１９５】
Taqman実時間単一プローブ検出検定：
配列番号４１
【表６９】
2007528206.tif 000070
【表７０】
2007528206.tif 000071
【表７１】
2007528206.tif 000072
【表７２】
2007528206.tif 000073
【表７３】
2007528206.tif 000074
【表７４】
2007528206.tif 000075
【表７５】
2007528206.tif 000076
【表７６】
2007528206.tif 000077
【表７７】
2007528206.tif 000078
【表７８】
2007528206.tif 000079
【表７９】
2007528206.tif 000080
【表８０】
2007528206.tif 000081
【表８１】
2007528206.tif 000082
【表８２】
2007528206.tif 000083
【表８３】
2007528206.tif 000084
【表８４】
2007528206.tif 000085
【表８５】
2007528206.tif 000086
【表８６】
2007528206.tif 000087
【表８７】
2007528206.tif 000088
【表８８】
2007528206.tif 000089
【表８９】
2007528206.tif 000090
【表９０】
2007528206.tif 000091
【表９１】
2007528206.tif 000092
【表９２】
2007528206.tif 000093
【表９３】
2007528206.tif 000094
【表９４】
2007528206.tif 000095
【表９５】
2007528206.tif 000096
【表９６】
2007528206.tif 000097
【表９７】
2007528206.tif 000098
【表９８】
2007528206.tif 000099
【表９９】
2007528206.tif 000100
【表１００】
2007528206.tif 000101
【表１０１】
2007528206.tif 000102
【表１０２】
2007528206.tif 000103
【表１０３】
2007528206.tif 000104
【表１０４】
2007528206.tif 000105
【表１０５】
2007528206.tif 000106
【表１０６】
2007528206.tif 000107
【表１０７】
2007528206.tif 000108
【表１０８】
2007528206.tif 000109
【０１９６】
該方法の代替的な最も好ましい実施形態においては、ｄ）のその後の増幅は、上述のとおり、遮断用オリゴマーヌクレオチドの存在下で実施される。前記遮断用オリゴマーヌクレオチドは、配列番号３０４〜配列番号５３５及びそれに相補的な配列のうちの１つに従った処理済み核酸配列に対しハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの長さをもつ配列を含んで成り、ここで前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。該方法のＳＴｅ）すなわち、配列番号１〜配列番号４に従った単数又は複数のＣｐＧ位置のメチル化状況を表わす特異的増幅物の検出は、上述の通りの実時間検出を用いて実施される。
【０１９７】
該方法のさらなる好ましい実施形態においては、遮断用オリゴマーヌクレオチドの配列（単複）は以下のものから成る群から選択される：
【表１０９】
2007528206.tif 000110
【表１１０】
2007528206.tif 000111
【０１９８】
該方法の段階ｅ）、すなわち、配列番号１〜配列番号４に従った単数又は複数のＣｐＧ位置のメチル化状況を表わす特異的増幅物の検出は、上述の通りの実時間検出方法を用いて実施され、ここで前記ハイブリダイゼーションプローブの配列は以下のものから成る群から選択される：
【表１１１】
2007528206.tif 000112
【０１９９】
列挙されている各々のゲノム配列については、組合せ型遮断用オリゴマーヌクレオチド実時間分析のために、配列リスト中に詳述された通りの以下のオリゴマーヌクレオチドを使用することができる：
【表１１２】
2007528206.tif 000113
【表１１３】
2007528206.tif 000114
【表１１４】
2007528206.tif 000115
【表１１５】
2007528206.tif 000116
【表１１６】
2007528206.tif 000117
【表１１７】
2007528206.tif 000118
【表１１８】
2007528206.tif 000119
【表１１９】
2007528206.tif 000120
【表１２０】
2007528206.tif 000121
【表１２１】
2007528206.tif 000122
【０２００】
該発明の付加的な実施形態は、前処理の必要の無い該発明に従ったゲノムＤＮＡ（Ｓ１〜Ｓ６４及びその補体）のメチル化状況の分析のための方法を提供している。
【０２０１】
このような付加的な実施形態の第１段階においてゲノムＤＮＡ試料は、組織又は細胞供給源から単離される。好ましくは、かかる供給源には、細胞系列、組織学的スライド、体液又はパラフィンに包埋された組織が含まれる。第２段階において、ゲノムＤＮＡは抽出される。抽出は、洗浄剤溶解物の使用、音波処理及びガラスビーズを伴うボルテックスを含めた（ただしこれに制限されるわけではない）当業者にとって標準的である手段によるものであってよい。
【０２０２】
好ましい実施形態においては、ＤＮＡは、処理に先立って分割され得、これは、技術的現状において標準的なあらゆる手段によるもの、特にメチル化感応性制限エンドヌクレアーゼを用いたものであり得る。
【０２０３】
第３段階で、ＤＮＡは次に単数又は複数のメチル化感応性制限酵素で消化される。消化は、制限部位におけるＤＮＡの加水分解が特異的ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況の情報を提供することになるような形で実施される。
【０２０４】
任意のただし好ましい実施形態である第４段階で、制御フラグメントは増幅される。これは、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施され、前記増幅物は、上述のような適切な検出可能な標識、すなわちフルオロフォア標識、放射性核種及び質量標識を担持し得る。
【０２０５】
第５段階で、増幅物は検出される。該検出は、当該技術分野において標準的なあらゆる手段例えばゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、ＰＣＲ産物内の検出可能なタグの取込み、ＤＮＡアレイ分析、ＭＡＬＤＩ又はＥＳＩ分析（ただしこれに制限されるわけではない）によるものであってよい。
【０２０６】
ゲノム核酸のメチル化状態の決定の後、配列番号１〜配列番号６４の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態又は配列番号１〜Ｓ６４の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態又はこの平均メチル化状態を示す値に基づいて、結腸直腸細胞増殖障害の存在、不在又はサブクラスが演繹される。１変形実施形態においては、群から選択された気道消化器細胞増殖障害の存在又は不在は、配列番号２０、４１、３５、３、３９、３３のうちの少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態又は配列番号２０、４１、３５、３、３９、３３の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態又はそれを示す値に基づいて演繹される。
【０２０７】
結腸直腸細胞増殖障害のための診断学的検定
本発明は、配列番号１〜配列番号６４のうちの単数又は複数のものの中の重要な遺伝的及び／又はエピジェネティックパラメータをマーカーとして使用できる、患者又は個体にとって不利である事象の診断を可能にする。本発明を用いて得られる前記パラメータを、もう１つの遺伝的及び／又はエピジェネティックパラメータセットと比較することができ、その差異は、患者又は個体にとって不利である事象の診断及び／又は予後診断のためのベースとして役立つ。
【０２０８】
より特定的に言うと、本発明は、結腸直腸癌腫の早期検出のための高リスク集団のスクリーニングを可能にする。その上、本発明の特定の実施形態は、気道消化器癌の検出を可能にし、かくしてさらにこの目的に適している。該方法のさらなる実施形態は同様に、例えば結腸ポリープといったその他の結腸細胞増殖障害から結腸直腸癌腫を弁別するための細胞学的スクリーニングに対する代替案としても使用可能である。
【０２０９】
特定的には、本発明は、Ｓ１〜Ｓ６４の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列又はこのようなＣｐＧジヌクレオチド配列を含むそのサブ領域の示差的メチル化の測定に基づく診断学的癌検定を提供する。標準的には、かかる検定には、検査用組織から組織試料を得る段階、対照試料又は既知の標準との関係において、該組織試料から誘導されたＳ１〜Ｓ６４の単数又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の少なくとも１つのメチル化状況を測定するための検定を実施する段階、及びそれに基づいて診断又は予後診断を行なう段階が関与する。
【０２１０】
特定の好ましい実施形態においては、配列番号１〜配列番号５３５又はそのアレイに基づくものならびにそれに基づきかつ結腸直腸細胞増殖障害の診断及び／又は予後診断のために有用であるキット内のものといった発明力あるオリゴマーが、ＣｐＧジヌクレオチドメチル化状況を査定するために使用される。
【０２１１】
キット
その上、本発明の付加的な態様は、例えば重亜硫酸塩含有試薬；各ケースにおいてその配列が配列番号１〜配列番号５３５といった配列の長さ１６塩基のセグメントに対し相補的であるか又はストリンジェントな又は極めてストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも２つのオリゴマーヌクレオチドを含有する１組のプライマオリゴマーヌクレオチド；オリゴマーヌクレオチド及び／又はＰＮＡオリゴマー；ならびに上述の方法を実施し評価するための使用説明書を含むキットである。さらに好ましい実施形態においては、前記キットはさらに、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、MethyLightTM、HeavyMethylTM、ＣＯＢＲＡ及び核酸配列決定といった技術のうちの単数又は複数のものを含むＣｐＧ位置特定的メチル化分析を実施するための標準的試薬を含むことができる。
【０２１２】
本発明は、その好ましい実施形態のいくつかに従って特定的に記述されてきたものの、以下の実施例は、該発明を例示するためにのみ役立ち、本発明をその最も広い解釈及びその同等の構成の原理及び範囲内に制限することを意図したものではない。
【実施例】
【０２１３】
実施例
試料を、凍結した組織又は抽出されたゲノムＤＮＡのいずれかとして受取った。ゲノムＤＮＡの単離のためQiagen及びRoche磁気分離キットから溶解緩衝液を用いてＤＮＡ試料を抽出した。同じく、Qiagen Genomic Tip-100カラムならびにMagna Pure装置及びRoche試薬を用いても、ＤＮＡ試料を抽出した。全ての試料を、分光分析法又は蛍光分析法を用いかつ試料サブセットについてアガロースゲル上で定量化した。
【０２１４】
重亜硫酸塩処理及びｍＰＣＲ
全ての試料の全ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩で処理し、未メチル化シトシンをウラシルに転換した。メチル化シトシンは保存状態のままにしておいた。重亜硫酸塩処理を、Olek et al., （１９９６）に記述されたプロトコルに従ってわずかな修正を加えて実施した。同じ生物学的背景をもつ全ての試料を合わせて処理しその結果後日データ内に潜在的なプロセス−偏向をもたらすのを避けるために、試料を無作為に処理用バッチにグループ分けした。重亜硫酸塩処理のために、我々は、性別、診断及び組織について任意抽出した５０の試料のバッチを作成した。１個のＤＮＡ試料につき２つの独立した重亜硫酸塩反応を実施した。重亜硫酸塩化の後、各ＤＮＡ試料１０ｎｇを、６〜８個のプライマ対を含有するその後のｍＰＣＲ反応において使用した。
【０２１５】
各反応は、以下のものを含有していた：
各ｄＮＴＰＳ  ０．４ｍＭ
Taqポリメラーゼ  １ユニット
ＰＣＲ緩衝液  ２．５μｌ
ＭｇＣｌ2  ３．５ｍＭ
プライマセット８０ｎＭ（１２〜１６プライマ）
ＤＮＡ  １１．２５ｎｇ（重亜硫酸塩処理済み）。
プライマのさらなる詳細は、表１に示されている。
【０２１６】
以下の要領で４０サイクルを実施した：１５分間９５℃での変性とそれ続く４５秒５５℃でのアニーリング、２分間６５℃でのプライマ伸長。６５℃での最終伸長は、１０分間実施した。
【０２１７】
１．１．２，ハイブリダイゼーション
各々の個々の試料からの全てのＰＣＲ産物を次に、分析中の各ＣｐＧ位置について一対の固定化されたオリゴマーヌクレオチドを担持するガラススライドに対しハイブリッド形成させた。これらの検出オリゴマーヌクレオチドの各々は、当初未メチル化（ＴＧ）又はメチル化（ＣＧ）状態のいずれかであった１つのＣｐＧ部位のまわりで重亜硫酸塩転換済み配列にハイブリッド形成するように設計されていた。使用された全てのハイブリダイゼーションオリゴマーヌクレオチドのさらなる詳細（情報を提供するもの又はそうでないものの両方）については、表２を参照のこと。ＴＧ及びＣＧ変異体の間の単一ヌクレオチドの差異の検出を可能にするように、ハイブリダイゼーション条件を選択した。
【０２１８】
各々の多重ＰＣＲ産物５μｌ体積を１０×Ssarc緩衝液中で希釈させた（１０×Ssarc：ｄＨ2Ｏで１０００ｍｌまで希釈した２３０ｍｌの２０×ＳＳＣ、１８０ｍｌのラウロイルサルコシンナトリウム溶液２０％）。反応混合物を次に、以下の通り、検出オリゴマーヌクレオチドに対しハイブリッド形成した：９５℃での変性、１０℃までの冷却、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションとそれに続く４２℃で１０×SsarcとｄＨ2Ｏでの洗浄。
【０２１９】
ハイブリダイゼーションオリゴマーヌクレオチドのさらなる詳細が表２に示されている。
【０２２０】
各々のハイブリッド形成されたオリゴマーヌクレオチドからの蛍光シグナルを、genepixスキャナ及びソフトウェアを用いて検出した。（各ＣｐＧ位置を分析するのに使用されるＣＧオリゴマーヌクレオチド及びＴＧオリゴマーヌクレオチドからの）２つのシグナルについての比を、蛍光シグナルの強度の比較に基づいて計算した。
【０２２１】
性別、診断、組織及び重亜硫酸塩バッチについて任意抽出された８０個の試料のバッチ内で試料を処理した。各々の重亜硫酸塩処理済みＤＮＡ試料について、ハイブリダイゼーションを実施した。このことはすなわち、各試料について、合計４つのチップが処理されたことを意味している。
【０２２２】
データ分析方法
チップデータの分析：
未処理ハイブリダイゼーション強度からメチル化比まで；
各々のＣｐＧ位置でのログメチル化比（ｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ））は、以下の段階を含む標準化された予備処理パイプラインに従って決定される：
各スポットについて、前景画素強度中央値から背景画素強度中央値を減算する（こうして、背景補正されたハイブリダイゼーション強度の優れた推定値が得られる）：
各ＣｐＧ位置のＣＧ及びＴＧの両方の検出オリゴマーヌクレオチドについて、４つの冗長スポット強度の背景補正済み中央値を取る；
各チップ及び各々のＣｐＧ位置について、ｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）比を計算する；
各々の試料について、冗長チップ反復全体にわたるｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）強度の中央値を取る。
【０２２３】
この比は、ハイブリダイゼーションノイズが、考えられるメチル化率の全範囲にわたりおおよそ恒常な分散を有するという特性をもつ（Huber et al., 2002）。
【０２２４】
主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）は、測定ベクトル（例えばチップデータ、複数のＣｐＧｓ上のメチル化プロフィールなど）を新しい座標系上に投影する。新しい座標軸は、主成分と呼ばれる。第１の主成分は、データの最大の分散の方向に広がる。その後の成分は、分散を減少させることによって順序づけされ、互いに直交する。異なるＣｐＧ位置は、異なる重みで、異なる成分に沿ったデータクラウドの拡張に寄与する。ＰＣＡは、管理の無い技術である、すなわちそれはデータポイントの標識を考慮に入れない（さらなる詳細については、例えばRipley（1996）を参照のこと）。
【０２２５】
ＰＣＡは、標準的には、データから高い分散でフィーチャを視覚化又は抽出する目的でより低い次元のサブ空間上に高次元データ（我々の場合、メチル化アレイデータ）を投射するのに用いられる。本報告書では、我々は、データの統計的品質管理のために２次元投射を使用している。
【０２２６】
単一の異常値チップを検出し、これらをさらなる分析から排除するため、ＰＣＡのロバストバージョンが使用される（Model et al., 2002）。
【０２２７】
仮説検証
主たるタスクは、２つのクラス間の平均メチル化度の有意な差を示すマーカーを同定することにある。有意な差異は、２つのクラスの平均メチル化が同一であるというヌル仮説がＰ＜０．０５で拒絶され得る場合に検出される。我々はこの検査を潜在的マーカー全セットに応用することから、多重検査のためにＰ値を補正しなければならない。これは、誤発見率（ＦＤＲ）方法を適用することによって行なわれた（Dudoit et al., 2002）。
【０２２８】
２つのクラス内のメチル化レベルが同一であるというヌル仮説を検査するために、我々は、ロジスティック回帰モデルについての尤度比検定を使用した（Venable 及びRipley, 2002）。単一マーカーについてのロジスティック回帰モデルは、それぞれのゲノムの関心領域（ＲＯＩ）内の全てのＣｐＧ位置からのメチル化測定の線形組合せである。１つのマーカーの有意なＰ値は、このＲＯＩが、２つのクラスによって与えられるような関心のある問題に対して幾分かの系統的相関関係を有することを意味している。しかしながら、少なくとも正式には、それはそのマーカーの実際の予想力についていかなる供述も行なっていない。
【０２２９】
管理された学習によるクラス予測
選択されたマーカーのＣｐＧ集合が異なる組織クラス間でいかにうまく弁別を行えるかの信頼性の高い推定を提供するためには、分類によるその予測精度を決定することができる。その目的で、我々は、そのクラス標識を伴う或る一定の組織試料セットを使用してメチル化プロフィールベースの予測関数を計算する。この段階は、トレーニングと呼ばれ、データ標識により表わされる先行知識を活用する。この関数の予測精度は、このとき、クロス確認によって又は独立した試料セットについて検査される。選択方法として、我々は、サポートベクトルマシン（ＳＶＭアルゴリズム（Duda （2001），Christianmni （2000））を使用している。相反する供述のないかぎり、この報告書のためには、偽陽性又は偽陰性分類に付随するリスクは、それぞれのクラスサイズとの関係において等しくなるように設定される。そのため、学習アルゴリズムは、独立した検査試料セットについての精度を最適化するという目的でクラス予測関数を獲得することになる。従って、結果として得られる分類子の感度及び特異性はほぼ等しいものと予想できる。
【０２３０】
組織クラス予測の性能の推定：クロス確認
限られた試料サイズで、クロス確認は、識別子関数の予測精度についての有効かつ信頼性の高い推定値を提供し、従ってマーカーの有意性に加えて、我々はクロス確認精度、感度及び特異性の推定値を提供する。各々の分類タスクについて、試料をおよそ等しいサイズの５つのグループに区分化した。その後、学習アルゴリズムをこれら５つの試料グループのうちの４つについてトレーニングした。この方法によって得られた予測子を次に、独立した検査試料の残りのグループについて検査した。正しい陽性及び陰性分類の数を、先行する実行から得たいかなる知識も使用せずに独立した検査グループの考えられる全ての選択肢について該学習アルゴリズムについて５回の実行全体にわたり計数した。この手順を試料セットの最高１０の無作為順列についてくり返した。上述のクロス確認が、トレーニング及び独立した検査セットの考えられる事実上全ての組合せを用いて精度、感度及び特異性を評価するという点に留意されたい。従ってこれは、単に試料を１つのトレーニング試料セットと１つの独立した検査セットに分割するよりも優れた予測性能の推定値を提供する。
【０２３１】
結果
図１、５、９、１３、１６、２０、２４、２８及び３２は、１つのアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って、実施例１及び２に従って得られたデータのランク付けされたマトリクスを示している。図はグレースケールで示され、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、最上部に向かって有意性が低下する。黒色は、一定の与えられたＣｐＧ位置における完全なメチル化を表わし、白色は特定の位置においてメチル化が全くないことを表わし、メチル化度が、明灰色（メチル化の割合が低い）から暗灰色（メチル化の割合が高い）までの灰色で表わされている。各行は、遺伝子内の特定のＣｐＧ位置を表わし、各列は、１つの試料のための異なるＣｐＧｓについてのメチル化プロフィールを示す。右側には、個々のＣｐＧ位置についてのＰ値が示されている。Ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【０２３２】
図９６は、アルゴリズムを用いた２つのクラスの組織（左側の気道消化器癌及び右側の健常気道消化器組織）間のＣｐＧメチル化の差異に従った、実施例１及び２に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって低下する。赤色は一定の与えられたＣｐＧ位置での完全メチル化を示し、緑色は特定の位置において全くメチル化が無いことを表わす。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は、１つの試料についての異なるＣｐＧｓのメチル化プロフィールを示している。
【０２３３】
図２、６、１０、１７、２１、２５、２９及び３３は、各々の比較についての補正されていない多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々の個々のゲノム関心領域は、１つの点として表わされ、破線は、２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２３４】
図３、７、１１、１４、１８、２２、２６、３０及び３４は、最高の性能のマーカーについて、２つのクラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の実施例１及び２に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図はグレースケールで示され、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、最上部に向かって有意性が低下する。黒色は、一定の与えられたＣｐＧ位置における完全なメチル化を表わし、白色は特定の位置においてメチル化が全くないことを表わし、メチル化度が、明灰色（メチル化の割合が低い）から暗灰色（メチル化の割合が高い）までの灰色で表わされている。各行は、遺伝子内の特定のＣｐＧ位置を表わし、各列は、１つの試料のための異なるＣｐＧｓについてのメチル化プロフィールを示す。右側には、各々個々のゲノムの関心領域についての精度値が示されている。
【０２３５】
図４、８、１２、１５、１８、２３、２７、３１及び３５は、各分類の全てのゲノム領域のためのGenewise線形サポートベクトルマシンの精度を示す。各々のゲノム領域の精度は黒色正方形として表わされ、特異性は白抜き菱形として、又感度は白抜き正方形として表わされている。Ｘ軸上に測定される通りの精度は、正しく分類された試料の分数を示す。
【０２３６】
正常な結腸対結腸直腸癌
第１の比較１０２においては、結腸直腸癌腫試料が、結腸ポリープ及び結腸炎症性障害を含む正常な結腸からの７３の試料に比較された。
【０２３７】
図１は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２３８】
図２は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２３９】
図３は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２４０】
図４は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２４１】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜１２、１５〜２０、２２、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体。
【０２４２】
その他の組織対結腸直腸癌
この分類では、７３の結腸直腸癌腫試料が、非結腸直腸癌腫、末梢血リンパ球そして非結腸直腸由来のその他の正常な組織からの１４０の試料から成る「その他の組織」クラスと比較される。従ってこれらのマーカーは、例えば血清といったような体液内での結腸直腸癌腫細胞の検出を可能にする。
【０２４３】
図５は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２４４】
図６は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２４５】
図７は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２４６】
図８は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２４７】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体。
【０２４８】
正常な結腸及びその他の組織対結腸癌
この分類では、７３の結腸直腸癌腫試料が２４２の正常な結腸及び「その他の組織」試料に比較された。正常な結腸クラスは健常結腸、結腸ポリープ及び炎症性障害結腸組織試料から成り、「その他の組織」は、非結腸直腸癌腫、末梢血リンパ球及び非結腸直腸由来のその他の正常な組織から成っていた。
【０２４９】
図９は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２５０】
図１０は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２５１】
図１１は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２５２】
図１２は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２５３】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜３、５〜１３、１５〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体。
【０２５４】
ポリープ対結腸直腸癌
この分類では、７３の結腸直腸癌腫試料が５１の結腸ポリープ試料と比較された。
【０２５５】
図１３は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２５６】
図１４は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２５７】
図１５は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２５８】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１１、２５、２７、３８、４０、４５、５３及びその補体。
【０２５９】
正常な結腸対結腸直腸細胞増殖障害
この分類では、１２４の結腸直腸細胞増殖障害試料（結腸ポリープと結腸直腸癌腫から成る）を、健常な結腸試料及び炎症性障害の結腸組織の両方から成る５１の「正常な結腸」試料に比較した。
【０２６０】
図１６は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２６１】
図１７は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２６２】
図１８は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２６３】
図１９は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２６４】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜５８及びその補体。
【０２６５】
正常な結腸対結腸直腸癌
この分類では、７３の結腸直腸癌腫試料が、炎症性障害の健常な結腸試料と結腸組織の両方から成る５１の「正常な結腸」試料と比較された。
【０２６６】
図２０は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２６７】
図２１は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２６８】
図２２は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２６９】
図２３は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２７０】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜３、５〜２３、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体。
【０２７１】
正常な結腸及びその他の組織対結腸直腸細胞増殖障害
この分類においては、１２４の結腸直腸細胞増殖障害試料（結腸ポリープと結腸直腸癌腫から成る）が「正常な結腸」及び「その他の組織」試料から成るクラスと比較された。正常な結腸試料は、健常な結腸試料と炎症性障害の細胞組織の両方から成り、「その他の組織」は、非結腸直腸癌腫からの試料、末梢血リンパ球及び非結腸直腸由来のその他の正常な組織で構成されていた。
【０２７２】
図２４は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２７３】
図２５は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２７４】
図２６は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２７５】
図２７は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２７６】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜３６、３８〜４３、４５〜５８及びその補体。
【０２７７】
その他の組織対結腸組織
以下の比較は、特に体液中で腫瘍進行マーカーとして、遊離浮動結腸ＤＮＡの高いレベルを見分ける能力をもつマーカーを同定する目的で実施された。この分類では、「結腸組織」クラスは、結腸直腸癌腫、結腸ポリープ、炎症性障害の結腸組織及び健常結腸組織で構成されていた。「その他の組織」クラスは、非結腸直腸癌腫、末梢血リンパ球及びその他の非結腸直腸由来の正常な組織から成っていた。
【０２７８】
図２８は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２７９】
図２９は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２８０】
図３０は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２８１】
図３１は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２８２】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜５８及びその補体。
【０２８３】
正常な組織対細胞増殖障害組織
この分類においては、細胞増殖障害試料を結腸直腸癌腫、結腸ポリープ及び非結腸由来癌の両方からの細胞増殖障害試料を、「正常な組織」すなわち健常結腸試料、炎症性障害の結腸組織、末梢血リンパ球、非結腸直腸由来のその他の正常な組織から正確に識別するその能力について、遺伝子パネルを査定した。
【０２８４】
図３２は、保守的Bonferroni補正済みＬｏｇＲｅｇ検査を用いた１２の最も性能の高いマーカーの多変量検査結果を示す。
【０２８５】
図３３は、各比較についての未補正多変量ＬｏｇＲｅｇ検査結果を示す。各々のゲノム関心領域は、点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフ点を表わす。
【０２８６】
図３４は、１２の最高の性能のマーカーの精度を示す。
【０２８７】
図３５は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。
【０２８８】
以下のゲノムマーカーが有意であるものとして評価された：配列番号１〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体。
【０２８９】
気道消化器癌対健常気道消化器組織
この分類では、「気道消化器」という用語は、肺、肝臓、膵臓、胆管、胃、及び結腸から成る組織の試料セットを表わしている。図９６は、１つのアルゴリズムを用いて、２つのクラスの組織の間のＣｐＧメチル化差異に従った、実施例１及び２に従って得られたデータのランク付けされたマトリクスを示している（マトリクスの左側の癌組織がマトリクス右側の正常組織と比較された）。最も有意なＣｐＧ位置は、マトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。赤色は、一定の与えられたＣｐＧ位置で完全なメチル化を表わし、緑色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わしている。各々の行は、遺伝子内の１つの特定のＣｐＧ位置を表わし、各列は、１つの試料についての異なるＣｐＧｓのメチル化プロフィールを示す。以下のゲノムマーカーは、有意であるとみなされる；  配列番号２０、４１、３５、３、３９及び３３。
【０２９０】
以下の実施例は、健常な及び病気の結腸直腸細胞増殖障害試料内のゲノム配列、配列番号３５、配列３４、配列番号３９、配列番号２９のメチル化状況の分析について記述している。前記遺伝子と結腸直腸細胞増殖障害の間の初期結びつきは、最初、実施例１で記述されている通りのハイブリダイゼーション分析を用いて実施された。配列は、その後、前記実施例内で分析された遺伝子のより大きなセットから選択され、メチル化状況と結腸直腸細胞増殖障害の間の相関関係は、その他のメチル化分析技術、すなわちＭＳＰ−Methy LightTM及びHeavy MethylTMMethy LightTM検定を用いて、試料の分析により妥当性検査された。「Methy Light」という用語は、TaqmanTM（単一プローブ）及びLightcyclerTM（２重プローブ）の両方の技術のプローブを用いる重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの実時間ＰＣＲ分析を記述するために使用されるという点に留意されたい。
【０２９１】
実施例２
Qiagen抽出キットを用いて３３の結腸腺癌試料及び４３の正常結腸隣接組織から、ＭＳＰ−MethyLight検定（配列番号３５）ＤＮＡを使用した結腸癌内部のメチル化の分析を抽出した。各試料からのＤＮＡを、アガロースビーズ方法（Olek et al１９９６）に従って、重亜硫酸塩溶液（亜硫酸水素、二亜硫酸塩）を用いて処理した。該処理は、試料内部の全ての非メチル化シトシンがチミジンに転換される形のものである。換言すると、試料内の５メチル化シトシンが未修飾状態にとどまっている。
【０２９２】
メチル化状況は、ベータアクチン遺伝子からの対照フラグメント及び関心の対象であるＣｐＧアイランドのために設計されたＭＳＰ−MethyLight検定で決定された（Eads et al., ２００１）。ＣｐＧアイランド検定は、プライマ及びTaqman型式のプローブの両方においてＣｐＧ部位をカバーするが、対照遺伝子はカバーしない。対照遺伝子は、合計ＤＮＡ濃度の尺度として使用され、ＣｐＧアイランド検定（メチル化検定）は、その部位におけるメチル化レベルを決定する。
【０２９３】
方法：  以下のプライマ及びプローブを用いて、配列番号３５遺伝子ＣｐＧアイランド検定を実施した：
順方向プライマ
逆方向プライマ
順方向プライマ：ＣＧＧＡＧＧＧＴＡＣＧＧＡＧＡＴＴＡＣＧ（配列番号１４３８７）；
逆方向プライマ：ＣＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡ（配列番号１４３８８）；及び
プローブ：ＣＧＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＧ（配列番号１４３８９。対応する対照検定は、以下のプライマ及びプローブを用いて実施された：
プライマ：ＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＴ（配列番号１４３９０）；
プライマ：ＡＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＡ（配列番号１４３９１）；及び
プローブ：ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号１４３９２）。
反応は、各ＤＮＡ試料についてトリプリケートで、以下の検定条件で行なわれた：  反応溶液：（２０μｌの最終反応体積中、９００ｍＭのプライマ；３００ｎＭのプローブ；３．５ｍＭの塩化マグネシウム；１単位のtaqポリメラーゼ；２００μＭのｄＮＴＰｓ；７μｌのＤＮＡ）；サイクル条件；（１０分間９５℃；次に１５秒間９５℃、１分間６０℃のサイクル５０回）。
【０２９４】
文献（Eads et al ２００１）中で前述されたＰＭＲ計算を用いてデータを分析した。結果。正常な試料のための平均ＰＭＲは０．１５であり、標準偏差は０．１８であった。腫瘍試料のための平均ＰＭＲは１７．９８であり、標準偏差は１８．１８であった。腫瘍と正常な試料の間のメチル化レベルの全体的差異は、ｔ−検査において有意である（ｐ＝０．０００００３１２）。結果は図３６に示されている。検体の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）も同様に決定された。ＲＯＣは、診断的検査の異なる可能なカットポイントについての偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。これは、選択されたカットポイントに応じた感度と特異性の間のトレードオフを示す（感度の増加はすべて特異性の減少により達成されることになる）。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、診断学的検査の精度の尺度である（面積が大きくなればなるほど良くなり、最適は１であり、無作為検査は、０．５の面積で対角線上にあるＲＯＣ曲線を有することになる；参考；Ｊ．Ｐ．Egan．シグナル検出理論及びＲＯＣ分析、Academic Press, New York, １９７５）。ＭＳＰ−Methyl LightTM検定のためのＡＵＣは、０．９４（図３７）である。
【０２９５】
実施例３
結腸癌内部の配列番号３５のメチル化は、Heavy Methyl MethyLightTM検定を用いて分析された。Heavy MethylTM検定とも呼ばれるHeavy Methyl MethyLightTM（又はＨＭ  Methy LightTM）でＣｐＧアイランドのメチル化を分析するためにも同じＤＮＡ試料を使用した。メチル化状況を、関心の対象であるＣｐＧアイランド及び上述のものと同じ対照遺伝子検定のために設計されたＨＭ  MethyLightTM検定で決定した。ＣｐＧアイランド検定は、ブロッカー及びTaqmanTM型式のプローブの両方においてＣｐＧ部位をカバーするが、一方対照遺伝子はカバーしない。
【０２９６】
方法。ＣｐＧアイランド検定（メチル化検定）を以下のプライマ及びプローブを用いて実施した：
順方向プライマ：ＧＧＴＧＡＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＧ（配列番号１４３９３）
逆方向プライマ：ＣＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＣ（配列番号１４３９４）
順方向ブロッカ：ＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号１４３９５）
逆方向ブロッカ：ＡＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡ（配列番号１４３９６）
プローブ：ＡＡＡＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＡ（配列番号１４３９７）
【０２９７】
以下の検定条件で、各ＤＮＡ試料上でトリプリケートで反応を各々実施した：
反応溶液：  （２０μｌの最終反応体積中、４００ｎＭのプライマ；４００ｎＭのプローブ；１０μＭの両方のブロッカー；３．５ｍＭの塩化マグネシウム；１×ＡＢＩ  Taqman緩衝液；１単位のＡＢＩ  TaqGoldポリメラーゼ；２００μＭのｄＮＴＰ；及び７μｌのＤＮＡ）；
サイクル条件：（１０分間９５℃）：（１５秒間９５℃、１分間６４℃（２サイクル））；（１５秒間９５℃、１分間６２℃（２サイクル）；（１５秒間９５℃、１分間６０℃（２サイクル））；及び（１５秒間９５℃、１分間５８℃、４０秒間６０℃（４１サイクル））。
【０２９８】
結果。正常な試料のための平均ＰＭＲは、１．４５の標準偏差で１．１２であった。腫瘍試料についての平均ＰＭＲは、３３．２２の標準偏差で３８．２３であった。腫瘍と正常な試料の間のメチル化レベルの全体的差異は、ｔ−検査において有意である（ｐ＝０．００００００３２６）。結果は図３６に示されている。
【０２９９】
検定のＲＯＣ曲線も同様に決定された。ＭＳＰ−Methyl-Light検定のＡＵＣは０．９１（図３８）である。
【０３００】
付加的な結腸試料セット（２５の腺癌、３３の正常、及び１３の腺腫）について検定を検査した。結果は再び有意な差異を示した（図３９）。ＲＯＣは、図４０〜４２に示されている。
【０３０１】
Methyl Light検定のＭＳＰ及びHeavy Methyl変形形態は、配列番号３５におけるメチル化の分析と等価であることが見極められた。図４８は、２つの方法を用いた各試料中で検出されたメチル化百分率の回帰プロットを示している。
【０３０２】
実施例４
配列３５−Heavy Methyl-Methy Light検定は同様に、その他の組織のパネルに対しても検査された（図４３）。結腸癌試料以外に、２つの乳癌組織のうちの１つのみがメチル化された。しかしながら、２１の付加的な乳癌腫瘍（異なる病期）のパネル上では、１つしかメチル化されなかった（図４４）。従ってマーカーは結腸腫瘍試料に特異的である。全てのプライマ、プローブ、ブロッカー及び反応条件は、結腸癌試料の分析で使用されたものと同一であった（実施例３）。
【０３０３】
実施例５
実時間ＰＣＲにより分析された結腸組織のうち１２個も、外科手術の前に取った血清と対合した。我々は、Qiagen UltraSens  ＤＮＡ抽出キットを用いてその血清１mlからＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ試料を重亜硫酸塩処理し、これらの試料上で配列番号３５−Heavy MethyMethyLightTM検定を実行した。対照遺伝子は癌血清試料のうちの３つについて及び正常な血清試料の３つについて増幅しなかったことから、我々は、試料調製物がこれらのケースでは作用しなかったと結論づけすることができる。その他のケースでは、正常な試料よりも高い癌試料中のメチル化の証拠が存在した（図４５）。
【０３０４】
実施例６
配列番号３４−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いた結腸癌内でのメチル化の分析。実施例２内で記述された結腸癌試料を、Taqman（登録商標）型式のプローブを伴う配列番号３４−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いて分析した。試料の調製は上述の通りに（実施例１）実施した。以下のプライマ及びプローブを用いて検定を実施した。
順方向プライマ：ＴＧＧＧＡＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＴＴＡＧＴＴＴＣ（配列番号１４３９８）
逆方向プライマ：ＣＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＧＡＣＴＡＡＡ（配列番号１４３９９）
プローブ：ＴＣＧＡＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＡＣＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号１４４００）
対応する対照検定を上述の通りに実施した（実施例２）。
【０３０５】
以下の検定条件で各々のＤＮＡ試料上で反応をトリプリケートで実施した：
反応溶液：（２０μｌの最終反応溶液中９００ｎＭのプライマ；３００ｎＭのプローブ；３．５ｍＭの塩化マグネシウム；１単位のtaqポリメラーゼ；２００μＭのｄＮＴＰｓ、５μＭのブロッカー及び７μｌのＤＮＡ）；
サイクル条件；１０分間９５℃；（１５秒間９５℃、１分間６０℃）５０サイクル。
【０３０６】
文献中で以前に記述された（Eads et al ２００１）ＰＭＲ計算を用いてデータを分析した。
【０３０７】
結果。結果は図３６に示されている。正常な試料のための平均ＰＭＲは、３．５７の標準偏差で３．９３であった。腫瘍試料についての平均ＰＭＲは、２０．２３の標準偏差で２３．０６であった。腫瘍と正常な試料の間のメチル化レベルの全体的な差は、ｔ−検査において有意である（ｐ＝０．０００００３０６３）。検定のＲＯＣ曲線は、図４６で示されている。ＡＵＣは、０．８４である。
【０３０８】
これは、２重LightcyclerTMプローブを用いる配列番号３４−Heavy Methyl Methy LightTM検定を使用してさらに確認された。
【０３０９】
方法。以下のプライマ及びプローブを用いて、ＣｐＧアイランド検定（メチル化検定）を実施した：
順方向プライマ：ＴＧＧＡＴＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴ（配列番号１４４０１）
逆方向プライマ：ＣＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡ（配列番号１４４０２）；
ブロッカ：ＡＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＡＣＴＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＣ（配列番号１４４０３）；
プローブ：ＴＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＣＧＴＴＴＴ−フッ素（配列番号１４４０４）；
プローブ：ＬＣ６４０−ＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＴＣＧＡ−リン（配列番号１４４０５。
【０３１０】
反応は、各々トリプリケートで、以下の検定条件で各ＤＮＡ試料について実施された：
反応条件：  ５００ｍＭのプライマ：１０μＭのブロッカー；２５０ｎＭのプローブ；４ｍＭの塩化マグネシウム
サイクリングプロフィール：１０分間９５℃の変性；１０秒間９５℃、３０秒間５７℃、２０秒間７２℃のサイクル５０回。
【０３１１】
実施例７
配列番号２９−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いた結腸癌内でのメチル化の分析。実施例２内で記述された結腸癌試料を、Taqman（登録商標）型式のプローブを伴う配列番号２９−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いて分析した。試料の調製は上述の通りに（実施例１）実施した。以下のプライマ及びプローブを用いて検定を実施した。
順方向プライマ：ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号１４４０６）
逆方向プライマ：ＣＣＴＣＴＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＡＴ（配列番号１４４０７）
プローブ：ＡＡＴＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡ（配列番号１４４０８）
【０３１２】
以下の検定条件で各々のＤＮＡ試料上で反応をトリプリケートで実施した：
反応溶液：（２０μｌの最終反応溶液中９００ｎＭのプライマ；３００ｎＭのプローブ；３．５ｍＭの塩化マグネシウム；１単位のtaqポリメラーゼ；２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０μＭのブロッカー及び７μｌのＤＮＡ）；
サイクル条件；１０分間９５℃；（１５秒間９５℃、１分間６０℃）５０サイクル。
【０３１３】
対応する対照検定を上述の通りに実施した（実施例２）。
【０３１４】
文献中で以前に記述された（Eads et al ２００１）ＰＭＲ計算を用いてデータを分析した。
【０３１５】
結果。結果は図３６に示されている。正常な試料のための平均ＰＭＲは、４．２１の標準偏差で３．０４であった。腫瘍試料についての平均ＰＭＲは、２４．０８の標準偏差で２１．３８であった。腫瘍と正常な試料の間のメチル化レベルの全体的な差は、ｔ−検査において有意である（ｐ＝０．００００１０１９７３）。検定のＲＯＣ曲線は、図４７で示されている。ＡＵＣは、０．８０である。
【０３１６】
これは、２重標識されたLightcyclerTMプローブを用いる配列番号２９−Heavy Methyl Methy LightTM検定を使用してさらに確認された。
【０３１７】
方法。以下のプライマ及びプローブを用いて、ＣｐＧアイランド検定（メチル化検定）を実施した：
順方向プライマ：ＧＴＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＡＡＡＴ（配列番号１４４０９）
逆方向プライマ：ＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＡＣ（配列番号１４４１０）
ブロッカ：ＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＴＴ（配列番号１４４１１）
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＡＣＡＡＣＧ−Ｆｌｕｏｒ（配列番号１４４１２）
プローブ：ＬＣ６４０−ＧＴＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣ−Ｐｈｏｓ（配列番号１４４１３）
【０３１８】
反応は、各々トリプリケートで、以下の検定条件で各ＤＮＡ試料について実施された：
反応条件：  順方向プライマ：６００ｎＭ；逆方向プライマ；３０ｎＭ；ブロッカー；１０μＭ；プローブ；５００ｎＭ；Ｔａｇポリメラーゼ；０．１Ｕ／μｌ；ｄＮＴＰｓ；各々０．２ｍＭ；塩化マグネシウム；４ｍＭ；ＢＳＡ；０．２５ｍｇ／ｍｌ；ＭｇＣｌ2を含まないＲｏｃｈｅ緩衝液；１×。
サイクル条件：１０分間９５℃の変性；１０秒間９５℃、２５秒間５７℃、１０秒間７２℃のサイクル５０回。
【０３１９】
実施例８
配列番号２９−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いた結腸癌内でのメチル化の分析。配列番号２９についての付加的な検定を結腸試料について検査した。各々１２の結腸腺癌及び１２の正常な隣接組織試料を伴う２つの組織セットについて検定を検査した。
【０３２０】
試料の調製は上述の通りに（実施例２）実施した。以下のプライマ及びプローブを用いて検定を実施した。
順方向プライマ：ＧＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴＣＧＡＡＧＧＣＧ（配列番号１４４１４）
逆方向プライマ：ＧＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡ（配列番号１４４１５）
プローブ：ＡＣＣＣＧＡＡＡＴＣＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＡ（配列番号１４４１６）
【０３２１】
以下の検定条件で各々のＤＮＡ試料上で反応をトリプリケートで実施した：
反応溶液：（２０μｌの最終反応溶液中９００ｎＭのプライマ；３００ｎＭのプローブ；３．５ｍＭの塩化マグネシウム；１単位のtaqポリメラーゼ；２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０μＭのブロッカー及び７μｌのＤＮＡ）；
サイクル条件；１０分間９５℃；（１５秒間９５℃、１分間６０℃）５０サイクル。対応する対照検定を上述の通りに実施した（実施例２）。
【０３２２】
文献中で以前に記述された（Eads et al ２００１）ＰＭＲ計算を用いてデータを分析した。両方のケースにおいて、配列番号２９は、癌試料中で有意により多くメチル化されていた。検定のＲＯＣ曲線は、図４９及び５０内に示されている。ＡＵＣは、０．９３及び１である。
【０３２３】
実施例９
配列番号３９−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いた結腸癌内でのメチル化の分析。
【０３２４】
実施例２内で記述された結腸癌試料を、配列番号３９−ＭＳＰ−Methy LightTM検定を用いて分析した。試料の調製は上述の通りに（実施例２）実施した。以下のプライマ及びプローブを用いて検定を実施した。
順方向プライマ：ＧＡＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＧＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号１４４１７）
逆方向プライマ：ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＧＡ（配列番号１４４１８）
プローブ：ＧＣＴＣＣＴＣＧＣＧＡＡＡＴＡＣＴＣＡＣＣＣＣＧ（配列番号１４４１９）
【０３２５】
以下の検定条件で各々のＤＮＡ試料上で反応をトリプリケートで実施した：
反応溶液：（２０μｌの最終反応溶液中９００ｎＭのプライマ；３００ｎＭのプローブ；３．５ｍＭの塩化マグネシウム；１単位のtaqポリメラーゼ；２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０μＭのブロッカー及び７μｌのＤＮＡ）；
サイクル条件；１０分間９５℃；（１５秒間９５℃、１分間６０℃）５０サイクル。
【０３２６】
対応する対照検定を上述の通りに実施した（実施例２）。
【０３２７】
文献中で以前に記述された（Eads et al ２００１）ＰＭＲ計算を用いてデータを分析した。
【０３２８】
結果。結果は図３６に示されている。正常な試料のための平均ＰＭＲは、２．４２の標準偏差で２．２５であった。腫瘍試料についての平均ＰＭＲは、１７．５７の標準偏差で２５．６７であった。腫瘍と正常な試料の間のメチル化レベルの全体的な差は、ｔ−検査において有意である（ｐ＝０．００００００００１１８）。検定のＲＯＣ曲線は、図５２で示されている。ＡＵＣは、０．９４である。
【０３２９】
これは、Lightcycler形式の２重プローブ技術を使用した２重LightcyclerTMプローブを用いる配列番号３９−Heavy Methyl Methy LightTM検定を使用してさらに確認された。
【０３３０】
方法。以下のプライマ及びプローブを用いて、ＣｐＧアイランド検定（メチル化検定）を実施した：
＜成２６＞
順方向プライマ：ＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡＧ（配列番号１４４２０）
逆方向プライマ：ＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣ（配列番号１４４２１）
ブロッカ：ＣＣＴＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣ（配列番号１４４２２）
プローブ：ｒｅｄ６４０  ＴＴＴＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＧＧＧＴＧＡ−ホスファート（配列番号１４４２３）
プローブ：ＡＴＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＧＴ−フルオレシン（配列番号１４４２４）
【０３３１】
反応は、各々トリプリケートで、以下の検定条件で各ＤＮＡ試料について実施された：
反応条件：  順方向プライマ：６００ｎＭ；逆方向プライマ：３０ｎＭ；ブロッカー：１０μＭ；プローブ：５００ｎＭ；Ｔａｇポリメラーゼ：０．１Ｕ／μｌ；ｄＮＴＰｓ：各々０．２ｍＭ；塩化マグネシウム；４ｍＭ；ＢＳＡ；０．２５ｍｇ／ｍｌ；ＭｇＣｌ2を含まないＲｏｃｈｅ緩衝液：１×。
サイクル条件：１０分間９５℃の変性；１０秒間９５℃、２５秒間５７℃、１０秒間７２℃のサイクル５０回。
【０３３２】
実験１０：  メチル化マーカーの排泄物分析
排泄物試料に由来するＤＮＡからのメチル化マーカーの実施可能性（結腸細胞増殖障害の検出のため）を立証するために、以下の実験を行なった。従って、各々排泄物のみ（対照）又は結腸癌細胞系列ＳＷ６２０からの制御された量の細胞が付加された排泄物（２５、０００個の細胞当量−０．５μｇ）のいずれかを含む一連の試料を調製し、調製した試料を次に冷凍した。３つの異なる排泄物試料を使用した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）及び結腸癌細胞系列からの制御された量の細胞を含むさらなる試料を調製した。
【０３３３】
試料は以下の通りであった：
クラス１：排泄物試料Ｎｏ．１
クラス２：排泄物試料Ｎｏ．１＋０．１５ｕｇ
クラス３：排泄物試料Ｎｏ．２
クラス４：排泄物試料Ｎｏ．２＋０．１５ｕｇ
クラス５：排泄物試料Ｎｏ．３
クラス６：排泄物試料Ｎｏ．３＋０．１５ｕｇ
クラス７：ＰＢＳ＋２５，０００細胞当量（０．１５ｕｇ）
クラス８：Ｈ2Ｏ
【０３３４】
各クラスにおいて多数の試料を調製した。各試料中に３００ｎｇの排泄物ＤＮＡが存在した。次に各々の試料を、以下の通りの遺伝子ＥＰＨＢ６５のためのＭＳＰTaqMan検定を用いてメチル化について分析した。
プライマ順方向：ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号１４４５５）
プライマ逆方向：ＣＣＴＣＴＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＡＴ（配列番号１４４５６）
プローブ：ＡＡＴＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡ（配列番号１４４５７）
【０３３５】
サイクル条件は以下の通りであった：
Taq Manの反応条件：
初期変性              ９５ｏＣ    １０分
変性                  ９５ｏＣ    １５秒
アニーリング／拡張    ６０ｏＣ    ６０秒
【０３３６】
ＰＣＲ反応の増幅曲線は、図５２〜５８に従ったものであった。
クラス１：図５２
クラス２：図５３
クラス３：図５４
クラス４：図５５
クラス５：図５６
クラス６：該当せず（下記参照）
クラス７：図５７
クラス８：図５８
【０３３７】
Ｘ軸は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、この曲線が（Ａ）より上に達した場合メチル化が検出されたことになる。
【０３３８】
ここでわかるように、メチル化された直腸癌ＤＮＡは、クラス２及び５で検出可能であった。排泄物試料（クラス５）中にメチル化されたＤＮＡが検出されたことから、クラス６は分析されなかった。
【０３３９】
排泄物試料内のメチル化ＤＮＡ検出の絶対的感度を見極めるため、排泄物試料 No.２を、さまざまな量のＳＷ６２０ＤＮＡでスパイクした。上述のＭＳＰ検定を用いて５つのクラスの試料を分析した。
クラスＢ：  ２５０ｍｇの排泄物中の細胞当量２５，０００
クラスＣ：  ２５０ｍｇの排泄物中の細胞当量２，５００
クラスＤ：  ２５０ｍｇの排泄物中の細胞当量２５０
クラスＥ：  ２５０ｍｇの排泄物中の細胞当量２５
クラスＦ：  ２５０ｍｇの排泄物中の細胞当量０
【０３４０】
増幅曲線は図５９を見ればわかる。Ｘ軸は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は較正曲線（Ｂ−Ｆ）の閾値レベルを表わし、曲線が（Ａ）より上に達した場合にメチル化が検出されたことになる。曲線Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦは、それぞれクラスＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの増幅曲線である。従って、メチル化されたＤＮＡは、２５０ｍｇの排泄物あたり２５個の細胞レベルで排泄物試料内に検出され得ることがわかる。
【０３４１】
実施例１１：
メチル化感応性制限の実時間分析
１０個の結腸腫瘍試料及び１０個の正常な隣接組織試料からＤＮＡを調製した。ＤＮＡの単離は、専門家にとって既知の標準的方法を用いて実施された。
【０３４２】
以下の試薬を用いて３７℃でのインキュベーションにより、消化反応を実施した。
１μｇのゲノムＤＮ；
２５Ｕの酵素（１０Ｕ／μｌ）；
Ｙｔ／Tango緩衝液。
【０３４３】
全ての試料について並行して以下の段階を実施した。すなわち、１μｇのＤＮＡを、０．２mlのＰＣＲ管内で１９０μｌのＹ＋／Tango緩衝液（Fermentas）中に溶解させた。９５μｌの反応溶液（全体積の半分）を、対照として清潔なＰＣＲ管内にピペットで取った。最初の管の中の残りの試薬に対して１．２５μｌのＨｐａＩＩ及び１．２５μｌのHin６Ｉ制限エンドヌクレアーゼ（共にFermentasからのもの）を添加した。
【０３４４】
第２の管には、グリセロール及び水の混合物（ｖ：ｖ＝１：１）２．５μｌを添加した。５時間、エッペンドルフサーモサイクラ内で３７℃で４０本の管全てをインキュベートした後、次に制限酵素又は水−グリセロール混合物のもう１つのアリコートを各管に添加し、インキュベーションを１０時間延長した。この時間の後、１０分間６５℃で加熱することにより制限酵素を不活性化した。
【０３４５】
その後、各管から２０μｌずつ平板内に移送し８０μｌの水を添加することにより、９６ウェルの平板内で各管の希釈物を結集させた。
【０３４６】
最後に、定量的実時間ＰＣＲにより、各試料の対照及び制限産物の両方を分析した。この実施例では、表４に従ったプライマの１つを含有するＰＣＲマスターミックスを含むSybrGreen１２μｌを９６ウェルのTaqman平板内にピペットで取り込み、その後（各々デュプリケートで）制限済み試料とブランクの対応する希釈物８μｌを取込んだ。
【０３４７】
以下の温度プロフィールを応用してＡＢＩ７７００計器上で実時間ＰＣＲを実施した：９５℃で１５分；１５秒間９５℃、４５秒間６５℃、７５秒間７２℃；１５秒間９５℃とその後の１時間５０℃のサイクル５０回。
【０３４８】
上述のプライマ及び条件を用いて、メチル化感応性制限がＰＣＲより前に実施された場、この段階中に未メチル化コピーが消化されることから、（表４に従った）分析済み配列）のメチル化されたコピーについてのみ増幅が観察される。制限後のメチル化されたＤＮＡの量は、同じ試料のブランクの実時間定量化により得られる制限以前に存在するＤＮＡの合計量に対し正規化される。
【０３４９】
１．ΔＣｔ＝Ｃｔ blank−Ｃｔ restricted
という等式は、ＤＮＡ試料中に存在する未メチル化ＤＮＡの相対的量のための１つの尺度を表わす。ゼロという値は、ＤＮＡが完全にメチル化されていることを意味する。０．５という値は、最適化されたＰＣＲ反応の場合の約５０％のメチル化に対応し、一方さらに大きい値は、低いメチル化レベルに対応している。試料中に存在するメチル化された配列の相対量は、
（２）  Ｍ＝Ｅ-ΔCt
という式から得られ、ここでＥはＰＣＲ効率である。ＰＣＲ効率は、専門家にとって既知の方法により容易に得られる。
【０３５０】
【表１２２】
2007528206.tif 000123
【表１２３】
2007528206.tif 000124
【０３５１】
結果は図６０〜７１に示されている。各個別試料は、ｘ軸上で「正常」を表わす「ｎ」又は腫瘍を表わす「ｔ」として記されている。一部の検定においては、気管支組織試料が偶発的に分析されており、これらには矢印が付され、本発明には無関係である。Ｙ軸は、試料内のメチル化のレベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率｛メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４中のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。以上の公式（２）は、Ｅ＝２というＰＣＲ効率を仮定した計算のために用いられた。
【０３５２】
該データは、複数のフラグメントについて、腫瘍試料の大部分が対応する正常な隣接組織に比べて著しく高いメチル化率を示すということを実証している。
【０３５３】
実施例１２
ｍＲＮＡ発現分析
１．ＲＮＡ試料
正常な結腸（ｎ＝１）と結腸癌（腺癌；ｎ＝１）からの全ＲＮＡをAmbion（Huntingdon, 英国）から入手した。各々のＲＮＡ試料は単一のドナーに由来していた。ＴｏＴＡＬＬＹ  ＲＮＡキット（Ambion, Huntingdon, 英国）を用いて全細胞ＲＮＡを調製し、汚染を最小限におさえるためにDnase−処理を実施した。Agilent Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc, Palo Alto, ＣＡ）上で３７℃で１４時間のインキュベーションの前後に、ＲＮＡの無欠性を査定した。
【０３５４】
２．マイクロアレイ実験
メーカーのプロトコル（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA）に従って標的調製及び標識、マイクロアレイハイブリダイゼーション、洗浄及び走査を実施した。簡単に言うと、Ｔ７−結合したオリゴ−ｄＴプライマを用いて、１０μｇの全ＲＮＡを逆転写し、その後第２のストランド合成を行なった。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びビオチニル化されたリボヌクレオチド（ＵＴＰ、ＣＴＰ）を用いて、２本鎖ｃＤＮＡからビオチン標識されたｃＲＮＡ標的を調製した。９４℃で３５分間フラグメント化を実施した。１５μｇのフラグメント化されたビオチニル化ｃＲＮＡを、０．５mg／mlのアセチル化ウシ血清アルブミンを含有するＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）と混合させ、４５℃で１６時間Affymetrix Genechip ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイ（Santa clara, ＣＡ）に対しハイブリッド形成させた。ストレプトアビジンフィコエリスリン接合体を用いてマイクロアレイを染色した（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）。シグナル増幅のためには、ビオチニル化された抗−ストレプトアビジン抗体（Vector Laboratories, Burlingame, ＣＡ）を使用した。
【０３５５】
Affymetrix Gene Chipスキャナ上でアレイを走査した。各々のプローブセット（遺伝子を表わす）のための発現値を、Bioconductor Ｒパッケージ（http://www.bioconductor.org, 以下参照）を用いて生データから計算した。
【０３５６】
３．データ分析
Affymetrixスキャナーから得た生発現データ（いわゆるｃｅｌ−ファイル）を、BioconductorＲパッケージリリース１．４（Gautier L., Cope L, Bolstad ＢＭ，Irizarry ＲＡ：プローブレベルでのAffymetrix Gene Chipデータのaffy−分析、Bioinformatics, ２００４Feb １２；２０（３）：３０７−１５０）内で実装されているようなＲＭＡ正規化手順（Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP：高密度オリゴマーヌクレオチドアレイプローブレベルデータの探査、正規化及び要約Biostatistics, ２００３ Apr.４（２）：２４９−６４）のデフォルト設定を用いて背景補正し正規化した。生データ処理は、Affymetrix Gene Chip ＨＧ  Ｕ１３３Ａチップ上で利用可能な２２、２９３のプローブセットの各々について、シグナル強度値を結果としてもたらす。
【０３５７】
示差的に発現されたプローブセットを同定するために、結腸正常組織と結腸腫瘍組織の間の正規化されたシグナル強度の変化倍率を計算した。２を超える（又は０．５より小さい）変化倍率をもつ遺伝子を、示差的に発現されたものとして同定した。示差的に発現された遺伝子は表５に示されている。ここでわかるように、高メチル化は、全てのケースにおいて過小発現と相関関係をもたない。
【表１２４】
2007528206.tif 000125
【０３５８】
実施例１３
血清試料中のＴＲＥＦ（ＴＭＥＦＦ２）メチル化分析。
以下の実施例では、結腸直腸癌患者及び健常な結腸の個体からの血清の３つの異なる試料セットを、遺伝子ＴＭＥＦＦ２のＭＳＰ検定「４」及びＨＭ検定「６」を用いて分析した。健常な結腸は、結腸の悪性腫瘍又はポリープが全く存在しないものとして結腸鏡検査により確認されているものとして定義された。検定は、比較目的で２つの異なる計器バージョンすなわちバージョン「１，２」及び「２，０」を用いて、Light Cyclerプラットフォーム（Roche Diagnostics）上で実行された。以下ではこれらを、それぞれ「ＬＣ１．２」及び「ＬＣ２．０」と呼ぶ。
【０３５９】
試料セット
試料セット１：
３０の結腸直腸癌、結腸鏡検査で結腸悪性腫瘍又はポリープ無しとして確認された３０個、
試料セット２：
１５の結腸直腸癌、結腸鏡検査で結腸悪性腫瘍又はポリープ無しとして確認された１５個、
試料セット３：
３０の結腸直腸癌、結腸鏡検査で結腸悪性腫瘍又はポリープ無しとして確認された３０個、
各々のケースにおいて、約１．８mlsの血清当量をＰＣＲによって分析した。
【０３６０】
反応条件
検定「４」は、以下の通りに実施された。
順方向プライマ：ａｇｇｇｃｇｔｔｔｔｇｔｔｇｇｃｇ（配列番号１４４８２）
逆方向プライマ：ｃｔａｃａａｃｃｔａａａｃｇａｃｇｃｇｃＴ（配列番号１４４８３）
Ｔａｑｍａｎプローブ：ａｔｃｇｇｃｇｔｔｔｔａｇｃｇｔｇｃｇｇｇ（ＦＡＭ／ＢＨＱ１標識されたもの）（配列番号１４４８４）
【０３６１】
Lightcyclerプログラム：
活性化：          ９５°１０分
３サイクル          ９５°１５秒(２０°／秒)
６６° ４５秒(２０°／秒)検出 
３サイクル          ９５°１５ 秒 (２０°／秒)
６４°４５秒 (２０°／秒)検出 
５０サイクル        ９５°１５ 秒(２０°／秒)
６２°  ４５秒(２０°／秒)検出
【０３６２】
結果
検定「４」
試料セット１：
ＡＵＣ＝０．９５［０．８６、０．９９］（信頼区間９５％）ＬＣ２．０
試料セット２：
ＡＵＣ＝０．６５［０．４４、０．８０］ＬＣ２．０
ＡＵＣ＝０．５７［０．３７、０．７５］ＬＣ１．２
試料セット３：
ＡＵＣ＝０．８３［０．７１、０．９２］ＬＣ２．０
ＡＵＣ＝０．８３［０．７１、０．９２］ＬＣ１．２
検定「６」
順方向プライマ：ａａａａａａａａａａａａｃｔｃｃｔｃｔａｃａｔａＣ（配列番号１４４８５）
逆方向プライマ：ｇｇｔｔａｔｔｇｔｔｔｇｇｇｔｔａａｔａａａｔｇ  （配列番号１４４８６）
【０３６３】
【表１２５】
2007528206.tif 000126
【０３６４】
試料セット２：
ＡＵＣ＝０．７０〔０．５１、０．８５〕ＬＣ２．０
試料セット３  ：
ＡＵＣ＝０．６９〔０．５５、０．８０〕ＬＣ２．０
ＡＵＣ＝０．７１〔０．５３、０．８３〕ＬＣ１．２（一部の試料が失なわれ、約２０の癌血清試料、２０の健常な結腸血清試料が分析された）。
【０３６５】
実施例１４
表６（下記）に従った遺伝子のＭＳＰ分析
以下の分析においては、表３に従った遺伝子の選択のメチル化状況を、表６（下記）に従ったプライマを用いたメチル化特異的増幅を使用することによって分析した。
【０３６６】
研究は、結腸、乳房及び肝臓癌腫、正常な組織（末梢血リンパ球、健常な結腸及び結腸癌腫に隣接する健常組織）、結腸ポリープ及びその他の結腸疾患由来の約１４０の試料について行なわれた。陽性クラスは、結腸癌及び結腸ポリープから成っていた。陰性クラスは、ＰＢＬ（末梢血リンパ球）、結腸−正常、結腸−ＮＡＴ及び結腸−炎症性であった。カッコ内のＡＵＣ値については（下表７参照）、乳癌及び肝臓癌も同様に陰性クラス内に含まれていた。
【０３６７】
重亜硫酸塩転換後ＭＳＰ技術を用いてゲノムＤＮＡを分析した。全ての試料の合計ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩で処理し、未メチル化シトシンをウラシルに転換させた。メチル化シトシンは、保存状態のままにしておいた。重亜硫酸塩処理は、Olek et al.（１９９６）で記述されているプロトコルに従って、わずかに修正した上で実施された。
【０３６８】
問題の配列をこのときメチル化特異的プライマを用いて増幅させた。このとき、増幅物は、メチル化特異的Taqmanプローブを用いて検出される。
【０３６９】
【表１２６】
2007528206.tif 000127
【表１２７】
2007528206.tif 000128
【０３７０】
TaqmanＰＣＲプログラムのための反応条件：  １０分間９５℃での変性。
５０サイクル：  １５秒間９５℃での変性。
１分間６２℃でのアニーリング。ただし、６０℃のアニーリング温度を有する検定１５を除く。
各検定についての増幅曲線は、図７２〜８６（表６に従う）に示されている。
【０３７１】
一連の代替的検定の技術的性能は、鋳型として精子ＤＮＡを用いて以下の各々を検査することによって妥当性検査される。
遺伝子配列番号３４（ＭＳＰ検定）
プライマ：ｃｇｔａｃｇａａｃｇｃａａｃａａｃｃｇ（配列番号１４５３５）及びｇｔｔｃｇｇｃｇｔｔｇｔｔｔａｇｇｃ（配列番号１４５３６）
プローブ：ｇｃａｔｃｔｔｃｃａａｃａｃｃｇｔｃｃｃｇ（配列番号１４５３７）−Ｆｌｕｏ及びＬＣ６４０−ｃｔｃｃｇｃａｔｃｃｔｔｃｃｃｃｇａａ−ｐ（配列番号１４５３８）Lightcyclerプローブ）
Lightcyclerプログラム：  
９５°１０  分  
５５  サイクル      ９５°１５  秒  （２０°／秒）    
６２°４５秒  （２０°／秒）    検出
７２°１５  秒  （２０°／秒）  
遺伝子配列番号：２８（ＭＳＰ検定）
プライマ：ｃｃｇａａｃａａａｃｇｔａａｔａｃｇｃｇ（配列番号１４５３９）及びａｃｇｇｃｇｔｇａａｇｇａｇｃｇ（配列番号１４５４０）
プローブ：ｔａｃｇｃｇｃｇｇｔａｇｔｃｇｔｇｃｇｃ（配列番号１４５４１）（ＦＡＭ／ＢＨＱ１標識されたTaqmanプローブ）
Lightcyclerプログラム：
９５°１０分
５５サイクル    ９５°１５秒（２０°／秒）
６０°４５秒（２０°／秒）検出
遺伝子配列番号１０（ＭＳＰ  検定）
プライマ：ｃｇａｃａａａａｔｃｃｔｃａｔｃｇｃｇ（配列番号１４５４２）及びｇｔｃｇｔｔｔａｇｃｇｔｔｇｇｇａａｇＣ（配列番号１４５４３）
プローブ：ｔａｃｇｔａｃｇａｇｔｔｔｃｇｔａｃｇｃｇｔａｔｔａｔｔｔｃｇｔｃｇ（配列番号１４５４４）（ＦＡＭ／ＢＨＱ１標識されたTaqmanプローブ）
Lightcyclerプログラム：
９５°１０分
５５サイクル    ９５°１５秒（２０°／秒）
６２°４５秒（２０°／秒）検出
遺伝子配列番号９（ＭＳＰ検定）
プライマ：ａｃｔｔａａａａａｔｃｇｃｃｇａａｔｃｇ（配列番号１４５４５）及びａｇｔｔｔｔａｔａｇｔｔａａｔｔａｇｇｇｔａｇｔｔｇｔｃｇｔｃｇ（配列番号１４５４６）
プローブ：ｔｃｃｔａｔｃａｔｃｇｃｔｃａｃｇａａｃｇ（配列番号１４５４７）−フッ素及びＬＣ６４０−ｃｇａｃａａｃｇａｃｔａｔｃｃｔｔａｃｔａｔｔａｔａａ−ｐ（配列番号１４５４８）（Lightcyclerプローブ）
ＬＣプログラム：
９５°１０分
５５サイクル      ９５°１５秒（２０°／秒）
６０°３０秒（２０°／秒）検出
７２°１５秒（２０°／秒）
【０３７２】
【表１２８】
2007528206.tif 000129
【表１２９】
2007528206.tif 000130
【表１３０】
2007528206.tif 000131
【表１３１】
2007528206.tif 000132
【表１３２】
2007528206.tif 000133
【表１３３】
2007528206.tif 000134
【表１３４】
2007528206.tif 000135
【表１３５】
2007528206.tif 000136
【表１３６】
2007528206.tif 000137
【表１３７】
2007528206.tif 000138
【表１３８】
2007528206.tif 000139
【表１３９】
2007528206.tif 000140
【０３７３】
結果
感度及び特異性を、ＳＶＭ及び１０倍クロス確認で算出した。
【表１４０】
2007528206.tif 000141
【表１４１】
2007528206.tif 000142
【０３７４】
多重遺伝子（パネル）検定の感度と特異性
【表１４２】
2007528206.tif 000143
【表１４３】
2007528206.tif 000144
【０３７５】
管理された学習によるクラス予測
異なる組織クラス間で、選択されたマーカーセットのＣｐＧ集会をいかにうまく弁別できるかの信頼性の高い推定値を提供するために、我々は、分類によりその予測精度を決定した。その目的で、我々は、メチル化プロフィールベースの予測機能を計算した。この段階は、トレーニングと呼ばれ、データ標識で代表される先行する知識を活用する。その関数の予測精度はこのときクロス確認によってか又は一組の独立した試料について検査される。好ましい方法として、我々は、予測関数を学習するためにサポートベクトルマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Duda（２００１）、Christiannini（２００１））を使用した。相反する記述のないかぎり、本報告書では、偽陽性又は偽陰性分類に付随するリスクは、それぞれのクラスサイズとの関係において等しくセットされる。そのため、学習アルゴリズムは、独立した検査試料セットについて精度を最適化する目的でクラス予測関数を得ることになる。従って、結果としての分類子の感度及び特異性はほぼ等しくなると予想できる。図８７及び９５は、以下の検定を用いて全データセットについてトレーニングされた二次ＳＶＭを示す。
図８７：検定１２及び９
図８８：検定１２及び１１
図８９：検定１２及び１５
図９０：検定７及び６
図９１：検定１１及び５
図９２：検定７及び５
図９３：検定６及び４
図９４：検定１２及び７
図９５：検定１２及び６
【０３７６】
実施例１５
Heavy Methyl分析
以下では、遺伝子配列番号７、８及び１７に従った遺伝子／ゲノム配列のメチル化が、１５の結腸直腸癌試料（表７では「結腸（colon）」と呼ばれている）及び８個の末梢血リンパ球試料（表７では「ＰＢＬ」と呼ばれている）の中で分析された。
【０３７７】
全ての試料の全ゲノムＤＮＡは、重亜硫酸塩処理され、未メチル化シトシンをウラシルに転換した。メチル化シトシンは、保存状態のままにしておいた。重亜硫酸塩処理は、Olek et al.（１９９６）で記述されているプロトコルに従って、わずかに修正した上で実施された。
【０３７８】
問題の配列は次に、非メチル化ＤＮＡの増幅を抑制する目的で、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ及び遮断用オリゴマーヌクレオチドに特異的なプライマを用いて増幅された。遮断用オリゴマーヌクレオチドの３′ＯＨ末端は、ＰＣＲ反応中にポリメラーゼがプライマを拡張するのを防げるべくリン酸塩基により「キャッピング」された。増幅物はこのとき５’red６４０で標識され、キャッピングされた３’ＯＨ末端を有し、もう一方のプローブは３’フルオレセインで標識された。
【０３７９】
【表１４４】
2007528206.tif 000145
【０３８０】
反応は。Light Cycler装置（Roche Diagnostics）を用いて２０μｌの合計体積で実施された。実時間ＰＣＲ反応混合物は、１０μｌの鋳型ＤＮＡ、ハイブリダイゼーションプローブのための２μｌのFast Start Light Cycler反応混合物（Roche Diagnostics, Renzberg）、を含有していた。
【０３８１】
【表１４５】
2007528206.tif 000146
太字の数字は、増幅曲線が平坦であったことから、陽性として分類されたものを表わす。
【０３８２】
実施例１５
配列番号７、３０、２８及び８に従った遺伝子の血清分析
実施例１３（ＭＳＰ及び１４（Heavy Methyl）において以上で記述されたとおりの検定を次に、３２個の結腸直腸癌腫血清試料から成る１組の血清試料に適用し、５４個の正常な血清試料、良性結腸病巣からの１１の血清試料及び炎症性結腸疾患からの６つの血清試料から成るセットに比較した。１回の検定につき１３０μｌの血清を使用し、結果を陽性又は陰性として定量的に報告した。
【０３８３】
【表１４６】
2007528206.tif 000147
【表１４７】
2007528206.tif 000148
【表１４８】
2007528206.tif 000149
【表１４９】
2007528206.tif 000150
【表１５０】
2007528206.tif 000151
【表１５１】
2007528206.tif 000152
【表１５２】
2007528206.tif 000153
【表１５３】
2007528206.tif 000154
【表１５４】
2007528206.tif 000155
【表１５５】
2007528206.tif 000156
【表１５６】
2007528206.tif 000157
【表１５７】
2007528206.tif 000158
【表１５８】
2007528206.tif 000159
【表１５９】
2007528206.tif 000160
【表１６０】
2007528206.tif 000161
【表１６１】
2007528206.tif 000162
【表１６２】
2007528206.tif 000163
【表１６３】
2007528206.tif 000164
【表１６４】
2007528206.tif 000165
【表１６５】
2007528206.tif 000166
【表１６６】
2007528206.tif 000167
【表１６７】
2007528206.tif 000168
【表１６８】
2007528206.tif 000169
【表１６９】
2007528206.tif 000170
【表１７０】
2007528206.tif 000171
【表１７１】
2007528206.tif 000172
【表１７２】
2007528206.tif 000173
【表１７３】
2007528206.tif 000174
【表１７４】
2007528206.tif 000175
【表１７５】
2007528206.tif 000176
【表１７６】
2007528206.tif 000177
【表１７７】
2007528206.tif 000178
【表１７８】
2007528206.tif 000179
【図面の簡単な説明】
【０３８４】
【図１】図１は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図２】図２は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図３】図３は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図４】図４は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図５】図５は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図６】図６は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図７】図７は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図８】図８は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図９】図９は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図１０】図１０は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図１１】図１１は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図１２】図１２は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図１３】図１３は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図１４】図１４は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図１５】図１５は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図１６】図１６は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図１７】図１７は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図１８】図１８は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図１９】図１９は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図２０】図２０は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図２１】図２１は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図２２】図２２は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図２３】図２３は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図２４】図２４は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図２５】図２５は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図２６】図２６は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図２７】図２７は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図２８】図２８は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図２９】図２９は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図３０】図３０は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図３１】図３１は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【図３２】図３２は、実施例１及び２に従って及び適切なアルゴリズムを用いて２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置のためのｐ値は右側に示されている。ｐ値は、観察された分布がデータセット内で偶然発生した確率である。
【図３３】図３３は、各々の比較のための補正されていない多変量Log Reg検査結果を示す。問題の各々個々のゲノム領域は、１つの点として表わされ、破線は２５％の誤発見率についてのカットオフポイントを表わす。
【図３４】図３４は、最も性能の良いマーカーについての、２クラスの組織の間のGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度の、ランク付けされたデータマトリクスを示す。図は、グレースケールで示されており、ここで最も有意なＣｐＧ位置はマトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。黒色は一定の与えられたＣｐＧ位置における完全メチル化を表わし、白色は特定の位置にメチル化が全くないことを表わし、メチル化度は、明（低い割合のメチル化）から暗（高い割合のメチル化）の灰色で表わされている。各行は、１つの遺伝子内の１つの特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は１つの試料についての異なるＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。問題の各々個々のゲノム領域についての精度値が、右側に示されている。
【図３５】図３５は、各分類の全てのゲノム領域についてのGenewise線形サポートベクトルマシンクロス確認の精度を示す。各々のゲノム領域の精度は、黒色正方形で表わされ、特異性は白抜き菱形で、感度は白抜き正方形で表わされている。Ｘ軸上で測定された通りの精度は、適正に分類された試料の画分を示す。
【０３８５】
【図３６】図３６は、異なるＭＳＰMethy LightTM検定及びHeavy MethylTM Methy LightTM検定により決定されるメチル化レベルを示す。Ｙ軸は、メチル化度を示す。腫瘍試料は白色点により表わされ、正常な結腸組織試料は黒色点で表わされている。腫瘍試料中では、健常な組織試料に比べ著しく高いメチル化度が観察された。
【図３７】図３７は、実施例２に従った腺癌についての配列番号３５−ＭＳＰ−Methyl LightTM検定の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＭＳＰ−Methyl LightTM検定についてのＡＵＣは０．９４である。
【図３８】図３８は、実施例３に従った腺癌についての配列番号３５−ＭＳＰ−Methyl LightTM検定の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＭＳＰ−Methyl LightTM検定についてのＡＵＣは０．９１である。
【図３９】図３９は、さらなる１組の結腸試料（腺癌２５、正常３３、腺腫１３）をテストする、実施例３に従った配列番号３５−Heavy MethylTM Methy LightTM検定によって決定されたメチル化レベルを示す。Ｙ軸は、調査された配列番号３５遺伝子の領域内のメチル化度を示す。腺癌試料は、白色正方形で表わされ、正常な結腸組織試料は黒色菱形で表わされている。腫瘍試料内では、健常な組織試料に比べて著しく高いメチル化度が観察された。ｔ−検定を用いて測定される通りの有意性レベルは０．００４２４であった。
【図４０】図４０は、実施例３に従った腺癌及び腺腫についての配列番号３５−ＨＭ−Methyl LightTM−検定の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す（付加的な試料セット）。ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）より下の面積は、診断学的検査の精度のための１つの尺度である。ＨＭ−Methyl LightTM−検定についてのＡＵＣは０．８１である。
【図４１】図４１は、実施例２に従った腺癌のみについての配列番号３５−ＨＭ−Methyl LightTM−検定の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す（付加的な試料セット）。ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）より下の面積は、診断学的検査の精度のための１つの尺度である。ＨＭ−Methyl−Light−検定についてのＡＵＣは０．８４４である。
【図４２】図４２は、実施例２に従った腺腫についての配列番号３５−ＨＭ−Methyl LightTM−検定の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す（付加的な試料セット）。ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）より下の面積は、診断学的検査の精度のための１つの尺度である。ＨＭ−MethylLightTM検定についてのＡＵＣは０．７４８である。
【図４３】図４３は、実施例４に従った配列番号３５−Heavy MethylTM Methy LightTM検定によって決定された異なる腫瘍及び健康組織内のメチル化レベルを示す。Ｙ軸は、調査された配列番号３５遺伝子の領域内のメチル化度を示す。結腸癌試料以外に、２つの乳癌組織のうちの１つのみがメチル化された。
【図４４】図４４は、実施例４に従った配列番号３５−Heavy MethylTM Methy LightTM検定によって決定された異なる乳癌組織内のメチル化レベルを示す。１つのみがメチル化された。
【図４５】図４５は、実施例４に従った配列番号３５−Heavy MethylTM Methy LightTMにより決定された血清試料内のメチル化レベルを示す。Ｙ軸は、調査された配列番号３５遺伝子の領域内のメチル化度を示す。
【０３８６】
【図４６】図４６は、実施例９に従った配列番号３４−ＭＳＰ−Methyl LightTM−検定のＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８４である。
【図４７】図４７は、実施例１０に従った配列番号２９−ＭＳＰ−Methyl LightTM−検定のＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８０である。
【図４８】図４８は、Methyl LightTM検定のＭＳＰ及びHeavy MethylTM 変形型を用いた各試料内で計算された配列番号３５内のメチル化百分率の回帰プロットを示す。
【図４９】図４９は、実施例８に従った配列番号２９−、ＭＳＰ−MethyLight検定のＲＯＣ曲線を示す（第１の試料セット）。ＡＵＣは０．９３である。
【図５０】図５０は、実施例８に従った配列番号２９−、ＭＳＰ−MethyLight検定のＲＯＣ曲線を示す（第２の試料セット）。ＡＵＣは１である。
【図５１】図５１は、実施例９に従った配列番号３９−、ＭＳＰ−MethyLight検定のＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．９４である。
【図５２】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５３】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５４】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５５】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５６】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５７】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５８】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図５９】実施例１０に従った排泄物試料の増幅を示す。Ｘ軸はポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示し、Ｙ軸は背景全体にわたる蛍光強度であるデルタＲｎを示し、水平線（Ａ）は、較正曲線（Ｂ）の閾値レベルを表わし、該曲線が（Ａ）より上に達している場合メチル化が検出されたことになる。
【図６０】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６１】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６２】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６３】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６４】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６５】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６６】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６７】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６８】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図６９】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図７０】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【図７１】実施例１１に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。各々の個々の試料は、正常を示す「ｎ」又は腫瘍を示す「ｔ」としてＸ軸上で注釈が付されている。気管支組織試料が一部の検定中で偶発的に分析された。これらは矢印で注釈付けされ、本発明の中では無意味である。Ｙ軸は、試料中のメチル化レベル（「メチル化率」）を示す。メチル化率（メチル化／（メチル化＋未メチル化）は、表４内のプライマ対に対応するフラグメントについて示されている。
【０３８７】
【図７２】実施例１４の検定１〜１５に従った試料のＰＣＲ増幅を示す。Ｘ軸は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を示す。Ｙ軸は、背景全体にわたる蛍光強度を示す。図７２は、検定１の増幅曲線を示す。
【図７３】図７３は、検定２の増幅曲線を示す。
【図７４】図７４は、検定３の増幅曲線を示す。
【図７５】図７５は、検定４の増幅曲線を示す。
【図７６】図７６は、検定５の増幅曲線を示す。
【図７７】図７７は、検定６の増幅曲線を示す。
【図７８】図７８は、検定７の増幅曲線を示す。
【図７９】図７９は、検定８の増幅曲線を示す。
【図８０】図８０は、検定９の増幅曲線を示す。
【図８１】図８１は、検定１０の増幅曲線を示す。
【図８２】図８２は、検定１１の増幅曲線を示す。
【図８３】図８３は、検定１２の増幅曲線を示す。
【図８４】図８４は、検定１３の増幅曲線を示す。
【図８５】図８５は、検定１４の増幅曲線を示す。
【図８６】図８６は、検定１５の増幅曲線を示す。
【０３８８】
【図８７】実施例１４に従ったデータセットについてトレーニングされた二次ＳＶＭのクラス予測性能を示す。囲んだ点は、より明るい及びより暗い斜線付き部域間の境界線（白色）を画定するサポートベクトルである。図８７は、検定１２及び１９を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図８８】図８８は、検定１２及び１１を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図８９】図８９は、検定１２及び１５を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９０】図９０は、検定７及び６を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９１】図９１は、検定１１及び５を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９２】図９２は、検定７及び５を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９３】図９３は、検定６及び４を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９４】図９４は、検定１２及び７を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９５】図９５は、検定１２及び６を用いてトレーニングされたＳＶＭを示す。
【図９６】図９６は、１つのアルゴリズムを用いた２種類の組織（左側の気道消化器の癌及び右側の健常な気道消化器組織）の間のＣｐＧメチル化の差異に従った実施例１及び２に従って得られたランク付けされたデータマトリクスを示す。最も有意なＣｐＧ位置は、マトリクスの最下部にあり、有意性は最上部に向かって減少する。赤は、一定の与えられたＣｐＧ位置での全体的メチル化を表わし、緑は特定の位置でメチル化が全く無いことを表わす。各行は、遺伝子内部の特異的ＣｐＧ位置を表わし、各列は、１つの試料についての異なるＣｐＧｓのメチル化プロフィールを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【国際調査報告】
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