(57)【要約】  本発明は、リポソーム中に封入された親水性物質の製剤、親水性物質をリポソーム中に封入する方法、及びヒト又は動物の疾病及び／又は疾患の予防及び／又は処置における当該製剤の使用に関する。
2007530639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの中性飽和リン脂質及び少なくとも１つの荷電飽和脂質の混合物により形成される、少なくとも１つの脂質二重層から構成されるリポソーム中に封入された、少なくとも１つの活性親水性物質を含んで成るリポソーム製剤。
【請求項２】
中性飽和リン脂質が、ホスファチジルコリンの誘導体及びそれらの組み合わせの中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
ホスファチジルコリンの誘導体が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ及びＤＭＰＣの中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
負に荷電した飽和脂質が、ホスファチジルグリセロールの誘導体、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びそれらの組み合わせから構成される群の中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
負に荷電した飽和脂質が、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ及びＰＳの中から選択されることを特徴とする、請求項４に記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
正に荷電した飽和脂質がＳＡであることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
ステロール及び誘導体、ガングリオシド及びスフィンゴミエリンの中から選択される少なくとも１つの他の脂質も含むことができる、請求項１〜６に記載のリポソーム製剤。
【請求項８】
ステロールがコレステロールであることを特徴とする、請求項７に記載のリポソーム製剤。
【請求項９】
活性親水性物質が薬剤であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
薬剤が低い分子量を有することを特徴とする、請求項９に記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
低分子量の薬剤が、５−フルオロウラシル、アシクロビル、ヨードデオキシウリジン、メトトレキサート及びシプロフロキサシンの中から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧから構成されるリポソーム中に封入された５−ＦＵを含んで成る、請求項１〜１２に記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
ＤＳＰＣ：ＰＳから構成されるリポソーム中に封入された５−ＦＵを含んで成る、請求項１〜１１に記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＰＰＧから構成されるリポソーム中に封入されたＡＣＶを含んで成る、請求項１〜１１に記載のリポソーム製剤。
【請求項１５】
ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧから構成されるリポソーム中に封入されたＡＣＶを含んで成る、請求項１〜１１に記載のリポソーム製剤。
【請求項１６】
脂質二重層が、５０／５０〜９５／５のモル比の中性飽和ＰＬ／荷電飽和脂質を有することを特徴とする、請求項１〜１５に記載のリポソーム製剤。
【請求項１７】
中性飽和ＰＬ／荷電飽和脂質のモル比が８０／２０〜９５／５であることを特徴とする、請求項１６に記載のリポソーム製剤。
【請求項１８】
活性親水性物質／脂質のモル比が０．０１／１〜４０／１であることを特徴とする、請求項１〜１７に記載のリポソーム製剤。
【請求項１９】
活性親水性物質／脂質のモル比が０．１／１〜２／１であることを特徴とする、請求項１８に記載のリポソーム製剤。
【請求項２０】
５−ＦＵ／脂質のモル比が０．２〜１．５であることを特徴とする、請求項１２、１３、１８及び１９に記載のリポソーム製剤。
【請求項２１】
５−ＦＵ／脂質のモル比が０．５〜１．０であることを特徴とする、請求項２０に記載のリポソーム製剤。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のリポソーム製剤及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬製剤。
【請求項２３】
医薬活性成分の局所投与のための、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
ヒト又は動物の疾病又は疾患の予防及び／又は処置のための薬剤の調製における、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項２５】
疾病又は疾患が皮膚及び／又は粘膜（ｍｕｃｏｓａｓ）に影響を及ぼす、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
皮膚及び／又は粘膜における過剰増殖疾病又は疾患の予防及び／又は処置のための局所薬剤の調製における、請求項１２、１３、１６、１７、２０又は２１に記載の５−ＦＵのリポソーム製剤の請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
皮膚及び／又は粘膜におけるヘルペスウイルスにより引き起こされる感染症の予防及び／又は処置のための局所薬剤の調製における、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のＡＣＶのリポソーム製剤の請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
−  有機溶媒の混合物中に脂質を溶解すること；
−  脂質フィルムが容器の壁面に形成されるまで溶媒を除去すること；
−  それを活性成分の水溶液と共に撹拌することにより、フィルムを水和すること；
−  必要であれば、形成したリポソーム懸濁液をフィルターを通して抽出し、小胞の大きさを選択すること；
−  得られた懸濁液を、バッファー溶液を用いた透析濾過にかけること；
−  必要であれば、リポソーム懸濁液をバッファー溶液で希釈すること
を含む、請求項１〜２１に記載のリポソーム製剤の調製手順。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム中に封入された親水性物質の製剤に関し、またリポソーム中に親水性物質を封入する方法並びにヒト又は動物の疾病及び疾患の予防及び／又は処置における当該製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、同心二重層により形成される脂質膜により囲まれた中心の水性空洞を有する微小の小胞である。リポソームは、単層（すなわち、それらはたった１つの脂質二重層を有する）、オリゴ層又は多重層（すなわち、それらは多種の二重層を有する）であることができる。多重層小胞（ＭＬＶ）は、０．２μｍ〜１０μｍの大きさを有し、一方単層小胞は、大きい（ＬＵＶ）か又は小さく（ＳＵＶ）、０．０２μｍ〜０．２μｍの大きさを有することができる。それらの構造は、それらが親水性物質（水性内部中）又は疎水性物質（脂質膜中）のどちらかを組み込むことを可能にする。
【０００３】
リポソームの最も重要な構造的要素は、リン脂質である（ＰＬ）。中性、正電荷又は負電荷を有するリン脂質の使用、及び／又は脂肪酸鎖の長さ及び飽和レベルを変えることにより、特定の特性を有するリポソームを生成することができる。
【０００４】
同様に、例えばその膜にコレステロール（ＣＨＯＬ）又は他の脂質を加えることにより、或いは脂質二重層の数を変えることにより又は天然の分子（例えば、タンパク質、多糖類、糖脂質、抗体又は酵素）若しくは合成の分子（例えば、ポリエチレングリコール）をそれらの表面に共有結合することにより、リポソームの特性を変えることができる。
【０００５】
要約すると、リポソームを設計する場合、考慮すべきいくつかの可変要素があり、その結果は必ずしも予測可能とは限らない。
【０００６】
薬剤の投与のための小胞としては、リポソームは理論上多くの利点を有する。非毒性成分から構成され、一般的に非免疫原性であり、無刺激であり、そして生分解性であるだけでなく、それらは封入、保持、輸送及び様々な治療剤を標的器官に放出することができ、それにより副作用を軽減することができるべきである。
【０００７】
しかし、ほとんどの場合においては、技術的及び治療上の観点からの最適なリポソーム製剤の開発の目標は達成されていない。
【０００８】
特に、最適なリポソーム小胞は：
−  封入効率（封入した薬剤及び脂質の量の間の比率）が、用量及び製剤コストの観点から適切であるように、活性成分をその内部に高いパーセンテージで封入すべきであり；
−  安定であるべきであって、それは製剤の有効寿命の間封入した活性成分を保持し、一旦患者に投与されれば、作用部位に到達し；
−  治療目的に適した放出プロファイルで、全身毒性を減少させながら、作用部位で薬剤を放出するべきである。
【０００９】
更に、局所適用の具体的場合において、リポソーム小胞を形成する脂質は、脂質二重層に対して一定の特性を与え、得られたリポソームが角膜層を越える活性成分の迅速な侵入及び所望の作用部位（通常、表皮の基層の近く）の局在化を促進しなければならない。
【００１０】
以前の試験は親水性物質（低分子量で極性の）をリポソーム中に封入することができたが、活性成分のリポソーム内の保持は、以下の試験において実証するように、解決すべき技術的問題を残していた。
【００１１】
Ｓｉｍｍｏｎｓ ＳＰ，Ｋｒａｍｅｒ ＰＡ．［Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：９８４−９８６（１９７７）］は、スフィンゴミエリン、コレステロール及びジセチル−リン酸塩から生成した多重層リポソームを用いて、２５℃で４０時間後に、最初に封入した５−ＦＵのほんの２０％がリポソーム内に存在することを見出す。
【００１２】
Ｔｓｕｋａｄａ Ｋ，Ｕｅｄａ Ｓ，Ｏｋａｄａ Ｒ．［Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ ３２：１９１２−１９３５（１９８４）］は、ＤＳＰＣから生成したリポソームを用いて、調製後６時間で、３７℃及び２５℃それぞれにおいて、５０％及び１０％の５−ＦＵが放出されることを見出す。
【００１３】
Ｏｚｅｒ ＡＹ［Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．Ｄｅｌｉｖ．１：１５−１６０（１９９２）］は、２つの組成物中のＯＬＢタイプのリポソームの挙動について試験する：ａ）ダイズレシチン：コレステロールヘミスクシネート：コレステロール（１０：１：４）及びｂ）ＤＰＰＣ：コレステロールヘミスクシネート：コレステロール（１０：１：４）。問題の薬剤の保持容量は減少するが、それは試験した製剤に依存する。タイプＡのリポソームにおいては、室温で２８日後には、ほんの１０％の５−ＦＵが内部に残る。タイプＢのリポソームにおいては、室温で４２日後には、４０％の５−ＦＵが放出される。
【００１４】
Ｆｒｅｓｔａ  Ｍ，Ｖｉｌｌａｒｉ  Ａ，Ｐｕｂｌｉｓｉ Ｇ，Ｃａｖａｌｌａｒｏ  Ｇ［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．９９：１４５−１５６  （１９９３）］は、３７℃で７時間、異なる大きさ及び異なる組成のリポソームの保持容量を試験する。そのタイプ及び組成により、この時間枠内では、最初に保持した５−ＦＵの１５％〜３５％が漏出することを彼らは見出す。
【００１５】
同様に、Ｅｌｏｒｚａ  Ｂ，Ｅｌｏｒｚａ  ＭＡ，Ｆｒｕｔｏｓ  Ｇ，Ｃｈａｎｔｒｅｓ  ＪＲ．［ＢＢＡ  １１５３：１３５−１４２  （１９９３）．］は、ＤＳＰＣ及びスフィンゴミエリンそれぞれから生成される２つの異なる組成物を用いたＬＵＶリポソームを使用して、６０分にわたるリポソームの内側からの５−ＦＵの放出を試験する。この時間枠においては、７５％超がＤＳＰＣリポソームから漏出し、ＳＭタイプからは１２％〜２５％が漏出する。
【００１６】
ＥＬ  Ｍａｇｈｒａｂｙ  ＧＭＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＣ，Ｂａｒｒｙ  ＢＷ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐａｒｍａｃｏｌ  ５３：１０６９−１０７７（２００１）は、３つの異なる組成物：ＳＰＣ；ＳＰＣ：コレステロール（１：１）及びＳＰＣ：コール酸塩（８４：１６）を用いたＬＵＶリポソームを使用して、５−ＦＵの急速な漏出（５０分後に５０％超）を見出す（それが５−ＦＵの飽和溶液中に懸濁されたという事実に関わらず）。同様に、ＳＰＣ：コール酸塩リポソームを５−ＦＵを含まない溶液に懸濁する場合、それは５分後に最初に封入した５−ＦＵの８０％を放出する。
【００１７】
最後に、Ｍａｙｅｒ  ＬＤ，Ｂａｌｌｙ  ＭＢ，Ｃｕｌｌｉｓ  ＰＲ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＲＳ，Ｍｉｔｉｌｅｎｅｓ  ＧＮ，米国特許第６．０８３．５３０号（２０００）は、２つの既知の問題を解決することを提案する：封入を増大させ、抗腫瘍薬をリポソーム内に確実に保持する。それらは、コレステロールを有する及び有しない異なる組成物を用いる。小胞はＬＵＶタイプであり、薬剤はｐＨ勾配により活発に荷電している。この方法は高い封入パーセンテージを達成し、それらはリポソーム内に活性成分を保持することができる。しかし、ｐＨ勾配をなくすと、薬剤の放出は急速である。５−ＦＵ製剤は、この挙動を示す例の１つである。
【００１８】
Ｎｏｒｌｅｙ  Ｓ．Ｇ．他，［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：６８１−６８５（１９８６）］は、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）法を用いて調製した、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール１５：１から生成した中性リポソームを用いて、４℃で１４日後にアシクロビルの４４％の保持を得、そして３７℃で２４時間後に４８％の保持を得る。
【００１９】
Ｌａｗ  Ｓ．Ｌ．他，［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１６１：２５３−２５９（１９９８）］は、正電荷の場合３７℃で１０時間後に７５％〜２５％未満（電荷量に依存）、負電荷の場合９０％〜３５％（電荷量に依存）、そして中性の場合８０％〜６０％のアシクロビルの保持を達成する。これは、卵ＰＣ及びコレステロール１．６：１からのＭＬＶリポソームを用いることにより達成された（これは、中性であるか又は０．１５〜１．６のモル比のジセチルリン酸塩又はステアリルアミンの添加により荷電している）。
【００２０】
Ｆｒｅｓｔａ  Ｍ．他，［Ｊ．Ｐａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：５６５−５７６（１９９９）］は、ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ  ７：４（厳密に中性）、ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ  ７：４：１（厳密に負に荷電）及びＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＤＡＢ  ７：４：１（厳密に正に荷電）から生成したリポソームを用いることにより、ＯＬＶについては３７℃で８時間後に５０％〜３０％のアシクロビルの保持（中性及び陰性に対する最小の保持で）、ＭＬＶについては３７℃で８時間後に６５％〜４５％のアシクロビル保持（中性及び陰性に対する最小の保持で）を得る。
【００２１】
Ｓａｒｂｏｌｏｕｋｉ  ＭＮ，Ｔｏｌｉａｔ  Ｔ．ＰＤＡ，［Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３−２７（１９９８）］は、ＭＬＶ及びＲＥＶの大きさのＥＰＣから生成したリポソーム（柔軟に中性）を用いて、３０日後に４℃で７０％；２５℃で４０％、そして３７℃で＜１０％のメトトレキサート保持を達成する。
【００２２】
Ｋｈｏｐａｄｅ  ＡＪ，他［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３２：１５７−１６２（２００２）］は、ＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ（中性、厳密に）及びＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＣＰ（陰性、厳密に）のＭＬＶリポソームを用いて、３７℃で８時間後に３５％のメトトレキサート保持を得る。
【００２３】
Ｎｏｒｌｅｙ  ＳＧ，他，［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３６：６８１−６８５（１９８６）］は、ＤＲＶ法を用いて調製した、卵ＰＣ（ポリ不飽和、柔軟に）及びコレステロール  １５：１（中性）から生成したリポソームを用いて、４℃で２４時間後に５０％のヨードデオキシウリジンの保持、３７℃で１時間後に２０％の保持を獲得する。
【００２４】
Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＳＰ，Ｋｒａｍｅｒ  ＰＡ．，［Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６：９８４−９８６（１９７７）］は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）：ＣＨＯＬ：ＤＣＰ  ４．８：２．８：１（陰性）から生成したＭＬＶリポソームを用いて、２５℃で４０時間後に７０％のフロクスウリジンの保持を得る。
【００２５】
Ｍａｕｒｅｒ  Ｎ．他，［ＢＢＡ  １３７４：９−２０（１９９８）］は、ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ  ５５：４５（中性、厳密に）から生成したＬＵＶリポソームを用いて、２５℃で３０分後に２０％のシプロフロキサシン保持を獲得する。
【００２６】
要約すると、親水性活性成分の封入は達成されたが、それらの安定性に対する比率、すなわちそれらの内部における活性成分の保持においては、問題は残されている。
【発明の開示】
【００２７】
本発明の概要
従って、高い封入効率を有し、安定で治療目的に適した放出プロファイルを有し、そして患者に対して非毒性である、リポソーム中に封入された親水性活性成分の医薬製剤に対する必要性が存在する。
【００２８】
本発明の著者は、リポソームの調製における中性の飽和リン脂質及び荷電飽和脂質の混合物の使用が、これらの目的の達成を可能にすることを見出した。
【００２９】
このようにして、彼らは親水性薬剤の安定な製剤を獲得した。その中では、活性成分は、患者に投与されるまでの対応する医薬製剤の調製、貯蔵及び流通のための必要な時間の間、リポソーム内で効果的に封入されている。
【００３０】
同様に、局所適用の具体的な場合に関して、彼らは、当該製剤が皮膚において優れた拡散を有し、表皮に到達し、そして皮膚上で繰り返し適用した後に毒性の徴候（皮膚の刺激）を示さずに持続（ｄｅｐｏｔ）作用を有することを達成した。これが粘膜（ｍｕｃｏｓａｓ）中でも優れた拡散を示すことが望まれている。
【００３１】
その結果として、中性の飽和ＰＬ及び荷電飽和脂質の組み合わせの使用が、高度に安定で、処置上効果的（薬剤の優れた皮膚拡散に基づいて）で且つ安全（低い体内吸収により）なリポソーム中に封入された低分子量の親水性薬剤の局所的組成物を産生することを可能にする。
【００３２】
更に、中性の飽和ＰＬ及び荷電飽和脂質の混合物の使用が、薬剤だけでなく、他の親水性物質、例えば診断用物質、化粧品、食料物質などのリポソームにおける安定で効果的な封入を可能にするだろう。
【００３３】
上記によると、本発明の第一の側面は、少なくとも１つの中性飽和リン脂質及び少なくとも１つの荷電飽和脂質の混合物から生成した、１つの又は多種の脂質二重層から構成されるリポソーム中に封入された、少なくとも１つの親水性活性成分を含んで成るリポソーム製剤に関する。
【００３４】
本発明の第二の側面は、リポソーム中の親水性活性成分のための封入手順、すなわち上記のリポソーム製剤の調製方法に関する。
【００３５】
本発明の第三の側面は、ヒト又は動物における疾患又は病気の予防又は処置のための医薬の調製における、当該リポソーム製剤の使用に関する。
【００３６】
本発明の第四の側面は、上記のリポソーム製剤及び少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤を含む、薬剤又は獣医用製剤に関する。
【００３７】
具体的な調製物の説明の前に、限定することを意図するのではなく、明らかにすることのみを目的として、本発明の主な側面に関するいくつかの具体的な用語を定義するのが適切である。
【００３８】
「リポソーム製剤」は、活性成分の一部又は全てがリポソーム内に封入されているものと理解される。
【００３９】
リポソームは、１又はいくつかの脂質二重層から構成され、異なる大きさを有することができる。この二重層は、極性表面（内側及び外側）及び非極性核を有する。
【００４０】
「リン脂質」は、そのヒドロキシル基の１つがリン酸でエステル化され、他の２つのヒドロキシルが長鎖脂肪酸（それらは互いに同等か又は異なり得る）でエステル化される、グリセロールの両親媒性誘導体を意味すると理解される。
【００４１】
飽和リン脂質は、脂肪酸が単一（多重ではない）の炭素−炭素結合のみを有するものである。
【００４２】
中性リン脂質は、一般的に、もう一つのリン酸ヒドロキシルが極性基（通常、ヒドロキシル又はアミノ）により置換されたアルコールによりエステル化され、正味荷電がゼロであるものである。
【００４３】
荷電リン脂質は、一般的に、もう一つのリン酸ヒドロキシルが極性基により置換されたアルコールによりエステル化され、正味荷電が正又は負であるものである。
【００４４】
「荷電飽和脂質」（荷電飽和リン脂質も含む）という表現の意味は、正味電荷がゼロとは異なる他の両親媒性化合物も含み、例えば極性基（例えばアミン）及び脂肪酸の誘導体により置換された長鎖炭化水素酸塩（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）誘導体である。
【００４５】
本発明との関連では、親水性薬剤は、ゼロ未満のｌｏｇＰｏｗ（オクタノール水分配係数の常用対数）を示すものであると考えられる。
【００４６】
同様に、低分子量薬剤は、１０００Ｄａ未満の分子量を有するものであると考えられる。
【００４７】
発明の詳細な説明
原則として、任意の陰性飽和ＰＬ及び任意の荷電飽和脂質（天然又は合成）は、本発明のリポソーム製剤中で使用することができる。
【００４８】
好ましい実施態様において、中性飽和ＰＬは、ホスファチジルコリンの誘導体及びそれらの組み合わせ、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びそれらの組み合わせから構成される群から選択される。
【００４９】
別の好ましい実施態様において、荷電飽和ＰＬは負の電荷を有し、ホスファチジルグリセロールの誘導体、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びそれらの組み合わせ、例えばジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）及び異なる飽和脂肪酸（ＰＳ）（例えば、ウシ脳（ＰＳ））を有するホスファチジルセリンエステルの混合物から構成される群から選択される。
【００５０】
別の好ましい実施態様において、荷電飽和脂質は正電荷を有し、ステアリルアミン（ＳＡ）である。
【００５１】
原則として、中性ＰＬ及び荷電脂質の間の任意の比率を、本発明の製剤中で使用することができる。
【００５２】
好ましい実施態様において、中性ＰＬ／荷電脂質のモル比は、５０／５０〜９５／５、好ましくは８０／２０〜９５／５であるだろう。
【００５３】
本発明により提供するリポソーム製剤は、他の脂質成分、例えばステロール及び誘導体（例えば、コレステロール）又はスフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン及びグリコスフィンゴ脂質、特にガングリオシド）も含むことができる。
【００５４】
任意の親水性物質は、本発明のリポソーム製剤中に封入することができる。好ましくは、当該物質は薬剤である。
【００５５】
原則として、任意の親水性物質は、本発明のリポソーム製剤中に封入することができる。局所適用リポソーム製剤の場合、親水性薬剤は低分子量のものである。
【００５６】
好ましい実施態様において、薬理活性物質は、アシクロビル（ＡＣＶ）、ヨードデオキシウリジン（ＩＤＵＲ）、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びシプロフロキサシンの中から選択される。
【００５７】
好ましい実施態様の典型においては、親水性薬剤／脂質のモル比は、０．０１／１〜４０／１であり、より好ましくは０．１／１〜２／１であろう。
【００５８】
下限値は、リポソームに意図した使用を与えるのに実用的な薬剤の低い量により決定され、当業者により容易に決定することができる。上限値は、薬剤の結晶化濃度により調節することができる。
【００５９】
リポソーム５−ＦＵの特に好ましい製剤は、リポソームがＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ及びＤＳＰＣ：ＰＳリン脂質の混合物（中性ＰＬ／荷電ＰＬの比は８５／１５〜９５／５）から構成されるものである。これらの製剤中において、５−ＦＵ／脂質のモル比は、０．２〜１．５、好ましくは０．５〜１．０であることができる。
【００６０】
リポソームＡＣＶの特に好ましい製剤は、リポソームがＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ及びＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＰＰＧから形成されるものである。
【００６１】
薬剤、ＰＬ及び本発明における製剤の他の成分は、当業者により知られており、商業的供給源から得ることができる。例えば、ＤＳＰＧ及びＤＳＰＣはＣｈｅｍｉ  Ｓ．ｐ．Ａ．から得られ、ウシ脳ＰＳ及び５−ＦＵはＳｉｇｍａから得られた。
【００６２】
本発明のリポソーム製剤は、当業者に知られた任意の方法を用いて調製することができる。
【００６３】
得られたリポソームの大きさは、使用する調製方法に依存する。理想の生成物のおいては、リポソームは実施例１，４，６及び１１に記載された方法により調製する。
【００６４】
得られたリポソームは、後の製剤及び／又は貯蔵及び流通のために脱水（凍結乾燥）することができる。
【００６５】
同様に、リポソームは、薬剤を含む又は含まないことのできる水溶液中で、懸濁状態に保つことができる。第一の場合において、得られた懸濁液は、封入された一部の薬剤をリポソームの内部に含み、そして一部をリポソームの外側に含むだろう。
【００６６】
局所投与のリポソーム５−ＦＵ製剤の場合、活性成分の一部を外相中に有するもの、例えば実施例４及び５に記載したものを用いることが好ましい。これらの製剤中において、リポソームの内部に封入した５−ＦＵの５−ＦＵの総量に関する重量パーセンテージは、２０％〜１００％、好ましくは３５％〜５５％であるだろう。
【００６７】
本発明により提供されるリポソーム製剤は、ヒト又は動物における疾病又は疾患の予防及び／又は処置のための、薬剤又は獣医用組成物の調製において特に有用であるだろう。
【００６８】
本リポソーム製剤は、皮膚及び／又は粘膜の疾病又は疾患の予防及び／又は処置において、特に有用且つ有利であることを示した。
【００６９】
特に、本発明のリポソーム５−ＦＵ製剤は、細胞過剰増殖、例えばヒト及び動物における様々なタイプの癌、前癌症状又は他の疾患に関する、疾病又は疾患の予防及び／又は処置のための、薬剤又は獣医用組成物の調製において有用であるだろう。
【００７０】
様々なタイプの癌としては、乳、腸、胃、膵臓、膀胱、前立腺、頭部及び首、前立腺、頸部、子宮内膜、肝臓、肺、表在性基底（ｂａｓｅ）細胞癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
前癌障害としては、例えば光線角化症、子宮頸部形成異常などが挙げられる。
【００７２】
細胞過剰増殖に関連する他の疾患はとしては、例として乾癬、ヒト乳頭腫ウイルスなどが挙げられる。
【００７３】
本発明中で与えるリポソーム５−ＦＵの製剤は、皮膚及び／又は粘膜の過剰増殖性疾病又は疾患、例えば光線角化症及び乾癬の局所処置において、特に有用且つ有利であることを示した。
【００７４】
同様に、本発明のリポソームＡＣＶ製剤は、皮膚及び／又は粘膜中のヘルペスウイルスにより引き起こされる感染症の局所処置、特に皮膚ヘルペスの処置において有用である。
【００７５】
好ましくは、本発明のリポソーム製剤は、少なくとも１つの賦形剤から構成される、許容される賦形薬において投与する。当該賦形剤は、用いる投与方法により、当業者により知られる任意のものから選択することができる。当該賦形剤は、所望の治療目的によって決まる。
【００７６】
非経口投与の場合、賦形剤は通常、生理条件と適合させるのに必要な補助物質、例えばｐＨ調整剤、等張化剤と水から構成される。得られた水溶液は、慣用の方法により滅菌し、使用のために瓶に詰め、又は濾過し、凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、抗凍結剤の使用が必要とされ得る。凍結乾燥物質は、投与前に滅菌水溶液と混合する。
【００７７】
局所投与の場合、賦形剤は、各場合において問題の薬剤形態（好ましくは液体又は半固体）により選択される賦形剤から構成される。液体製剤はとしては、水溶液、含水アルコール溶液、ローションなどが挙げられる。半固体製剤は、軟膏、クリーム又はゲルであることができる。任意のこれらの製剤は、保存剤、抗酸化剤、キレート剤、乳化剤、ｐＨ調整系、等張化調整物質、保存剤、生体接着ポリマー、ゲル化物質などの使用が必要とされ得る。
【００７８】
保存剤は、例えば安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、パラベン、ブロノポール、メチルイソチアゾリノン及びそれらの組み合わせから選択することができる。抗酸化剤は、例として、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ヒドロキシアニソール及びトコフェロール及びそれらの誘導体から選択することができる。キレート剤は、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）及びクエン酸又はそれらの塩により形成される群選択することができる。ｐＨ調製系は、例として、リン酸バッファー溶液及びクエン酸バッファー溶液から選択することができる。ゲル化剤は、例えばＣａｒｂｏｐｏｌｓ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）及びそれらの組み合わせから選択することができる。
【００７９】
特に好ましい実施態様において、本発明の獣医用又は薬剤組成物は、局所適用（皮膚上又は粘膜）のために製剤する。
【００８０】
患者に投与される薬理活性成分の用量は、処方の治療指標、処置及び併用治療に対する患者の応答に依存する。
【実施例】
【００８１】
臨床試験
本発明の製剤の予想外で有利な特性を、以下の非制限的な「インビトロ」及び「インビボ」での試験により示す。
【００８２】
Ａ−調製手順及び安定性試験
実施例１：外相中に５−ＦＵを有しない、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ組成物のリポソーム中の５−ＦＵの封入。
３８４ｍｇのＤＳＰＣ、４３ｍｇのＤＳＰＧ、４．５ｇのガラスビーズ、及び９ｍｌの２：１ ｖ／ｖの比率のクロロホルム：メタノール混合物を、ロータリーエバポレーターフラスコに加える。一旦脂質が溶媒混合物中に溶解すれば、フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、浴槽の温度を４０℃に調節し、そして脂質フィルムがフラスコの壁面上に形成されるまで溶媒を減圧下（８００ｍバール）で蒸発させる。次に、圧力を１００ｍバール減少させ、それを１時間保つ。最後に、フラスコをロータリーエバポレーターから外し、それを一晩凍結乾燥して、存在し得る微量の有機溶媒を除去する。形成した脂質フィルムを、９ｍｌの５−ＦＵの水溶液（５０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ  ８．８）と共に、６５℃で１時間撹拌することにより水和させる。その後、混合物を更に１時間、３０℃で撹拌する。
【００８３】
形成したリポソーム懸濁液を、２μｍのポリカーボネートフィルター孔を通して抽出し、形成した小胞の大きさを均一にする。最後に、１００ＫＤカットオフのＶｉｖａｆｌｏｗ５０メンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、得られた懸濁液を６倍量の塩類（ｓａｌｉｎｅ）リン酸バッファー（ｐＨ  ６；６００ｍオスモル／Ｋｇ）で透析濾過し、封入されなかった５−ＦＵを除去する。得られたリポソームを同一のバッファーで希釈し、ポリプロピレンバイアルに分け、それらを分析まで２５℃で保存する。
【００８４】
リポソーム懸濁液中に存在する５−ＦＵの総量を決定するために、この懸濁液を前もってメタノール中に希釈し、リポソーム膜の脂質を溶解して内容物を放出させる。５−ＦＵの濃度を、その後２６６ｎｍで分光法により決定し、較正曲線と比較する。
【００８５】
封入されたフルオロウラシルを決定するために、リポソームを２５分間２６，０００ｇで遠心することにより前もって沈殿させ、上清を回収する。その後、上記の手順を用いて上清中の５−ＦＵ含有量を分析する。
【００８６】
全５−ＦＵと上清中に存在するものとの間の差は、封入された画分を表す。記載した実施例において、全５−ＦＵの濃度は０．８００ｍｇ／ｍｌとなり、これは試験の初めにリポソーム内に封入したものの９５．５％であった。５−ＦＵ／脂質のモル比は０．８２であった。
【００８７】
図１は、２５℃での６ヶ月にわたる封入された５−ＦＵのパーセンテージ（初期のパーセンテージにおいて表す）における発展を示す。封入された５−ＦＵの初期の減少が示され、それはその後６７％で安定する（Ｃ．Ｉ．  ９５％＝６１−７３）。これにより、中性飽和及び荷電飽和ＰＬの組み合わせを用いて、安定なリポソーム５−ＦＵ製剤が得られることを実証する。
【００８８】
実施例２：外相中に５−ＦＵを有しない、ＤＳＰＣ：ＰＳリポソーム中の５−ＦＵの封入。
これは、負に荷電したリン脂質としてＤＳＰＧをＰＳで置換することによる以外は、その実施例と同様の方法で実施する。この場合、全５−ＦＵの濃度は０．６００ｍｇ／ｍｌとなる（初期に封入された９６．５％を有し、０．７の５−ＦＵ／脂質のモル比を有する）。
【００８９】
図２は、２５℃での６ヶ月にわたる封入のパーセンテージ（初期のパーセンテージにおいて表す）における発展を示す。その動態は、前の実施例において観察されたものと類似しており、それは封入された５−ＦＵの７１％で安定する（Ｃ．Ｉ．  ９５％＝６６−７５）。
【００９０】
実施例３：外相中の５−ＦＵの一部除去を伴う、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧリポソーム中の５−ＦＵの封入。
これは、ほんの３倍量のバッファーを用いて透析濾過を実施すること以外は、実施例１と同様の方法で実施するので、非封入の５−ＦＵの全ては除去されない。全５−ＦＵの濃度が３．４１ｍｇ／ｍｌに達するまで、リポソームの懸濁液を希釈する（そのうちの７１％はリポソーム内に封入され、１．５の５−ＦＵ／脂質のモル比を有する）。
【００９１】
安定性の追跡を、２５℃で２ヶ月にわたり実施する。結果を図３に示す。これらの条件において、試験した時間枠内では、封入されたパーセンテージは顕著に減少しない。
【００９２】
実施例４：外相中の５−ＦＵの一部除去を伴わない、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧリポソーム中の５−ＦＵの封入。
１４．０ｇのＤＳＰＣ、１．５５ｍｇのＤＳＰＧ、３０ｇのガラスビーズ、及び６０ｍｌの２：１ ｖ／ｖの比率のクロロホルム：メタノール混合物を、ロータリーエバポレーターフラスコに加える。一旦脂質が溶媒混合物中に溶解すれば、フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、浴槽の温度を４０℃に調節し、そして脂質フィルムがフラスコの壁面上に形成されるまで溶媒を減圧下（８００ｍバール）で蒸発させる。その後、圧力を１００ｍバール減少させ、それを１時間保つ。最後に、フラスコをロータリーエバポレーターから外し、それを一晩凍結乾燥して、存在し得る微量の有機溶媒を除去する。形成した脂質フィルムを、１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６  ６５℃まで予熱）中の６０ｍｌの３０ｍｇ／ｍｌの５−ＦＵの溶液と共に、１時間撹拌することにより水和させる。その後、温度を６５℃に保ちながら、得られた懸濁液をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  Ｔ−２５（ＩＫＡ）を用いて均一にする（６５００ｒｐｍで１５分間）。その後、５−ＦＵの濃度が１２ｍｇ／ｍｌに近づくまでリポソーム懸濁液を塩類クエン酸バッファー（３００ｍオスモル／Ｋｇ）で希釈し、それを室温で更に１時間撹拌する。得られた懸濁液を等分し、分析まで２５℃で保存する。
【００９３】
５−ＦＵの定量化を、前の実施例と同様の方法で実施する。封入のパーセンテージの測定は、第一にＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラム（ＰＤ−１０、アマシャム）における排除クロマトグラフィーにより、封入されていない５−ＦＵを除去し、リポソーム画分中の５−ＦＵの量（カラムの排除量に対応）を測定することにより実施する。この場合、リポソーム調製物は、１１．６ｍｇ／ｍｌの全５−ＦＵ濃度を有する（初期に封入された３６％を有し、０．７の５−ＦＵ／脂質のモル比を有する）。
【００９４】
図４は、２５℃での７０日間の封入の追跡の結果を示す。ここで、顕著な減少は観察されなかった。
【００９５】
実施例５：外相中の５−ＦＵの一部除去を伴わない、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧリポソーム中の５−ＦＵの封入。
クエン酸バッファーを１０ｍＭの塩類リン酸バッファー（ｐＨ６．２）に置換して、実施例４と同様の方法でこれを実施する。生成した懸濁液は、１２．５ｍｇ／ｍｌの全５−ＦＵを有する（その４１％はリポソーム中に封入され、０．６８の５−ＦＵ／脂質のモル比を有する）。
【００９６】
図５は、２５℃での４ヶ月にわたる封入の追跡の結果を示し、顕著な減少は観察されなかった。
【００９７】
実施例６：ＭＬＶ  ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧリポソーム中のＡＣＶの封入。
９：１のモル比のＤＳＰＣ及びＤＳＰＧ並びに２：１ ｖ／ｖの比率のクロロホルム：メタノール混合物を、ロータリーエバポレーターフラスコに加える。一旦脂質が溶媒混合物中に溶解すれば、フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、浴槽の温度を４０℃に調節し、そして脂質フィルムがフラスコの壁面上に形成されるまで溶媒を減圧下（８００ｍバール）で蒸発させる。その後、圧力を１００ｍバール減少させ、それを１時間保つ。最後に、フラスコをロータリーエバポレーターから外し、それを一晩凍結乾燥して、存在し得る微量の有機溶媒を除去する。形成した脂質フィルムを、９ｍｌのＡＣＶナトリウム水溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）と共に、６５℃で１時間ロータリーエバポレーター中で撹拌することにより水和させる。
【００９８】
形成した多重層リポソームを、２．０μｍのポリカーボネートフィルター孔を用いて押し出しにより処理する。次に、１００ＫＤカットオフのＶｉｖａｆｌｏｗ５０メンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、第一に３倍量の１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ１１．５）、そして次に５〜６倍量の１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）を用いて、非封入のＡＣＶを透析濾過により除去する。得られたリポソームを、同一のバッファーで希釈し、その溶液を分析まで２５℃でポリプロピレンバイアル中に保存するアリコートに分画する。
【００９９】
リポソーム懸濁液中に存在するＡＣＶの総量を決定するために、この懸濁液を第一にメタノール中に希釈し、リポソーム膜の脂質を溶解して内容物を放出させる。次に、ＡＣＶの濃度を、その後２５４ｎｍで分光法により決定し、較正曲線と比較する。
【０１００】
封入されたＡＣＶを決定するために、リポソームを２５分間２６，０００ｇで遠心することにより前もって沈殿させ、上清を回収する。その後、上記の手順を用いて上清中のＡＣＶ含有量を分析する。
【０１０１】
全ＡＣＶと上清中に存在するものとの間の差は、封入された画分を表す。全ＡＣＶの濃度は０．５５５ｍｇ／ｍｌとなり、これは試験の初めにリポソーム内に封入したものの９６．３％であった。ＡＣＶ／脂質のモル比は０．８３であった。
【０１０２】
図６は、２５℃での４ヶ月間の封入されたＡＣＶのパーセンテージ（初期のパーセンテージにおいて表す）における発展を示し、顕著な減少は検出されなかった。これにより、中性飽和及び荷電飽和ＰＬの組み合わせを用いて、安定したリポソームＡＣＶ製剤が得られることを実証する。
【０１０３】
実施例７：ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＰＰＧ  ＬＵＶリポソーム中のＡＣＶの封入。
６０：１０：４０のモル比のＤＰＰＣ、ＤＰＰＧ及びＣＨＯＬ並びに２：１ ｖ／ｖの比率のクロロホルム：メタノール混合物を、ロータリーエバポレーターフラスコに加え、実施例６で用いた手順を繰り返す。形成した脂質フィルムを、９ｍｌのＡＣＶナトリウム水溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）と共に、５５℃で１時間ロータリーエバポレーター中で撹拌することにより水和させる。
【０１０４】
生成したリポソームは、押し出しが０．２μｍの孔のメンブレンによることを除いて、実施例６におけるもとの同様の方法で処理する。
【０１０５】
全ての封入されたＡＣＶの決定を、実施例６におけるものと同一の手順を用いて実施する。得られたリポソームは、０．５２のＡＣＶ／脂質のモル比を示す（リポソーム内に封入されたＡＣＶの９８．４％を有する）。２５℃での６週間にわたる、封入されたＡＣＶのパーセンテージにおける変動は検出されなかった。
【０１０６】
実施例８：パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）から生成したＬＵＶリポソーム中のＡＣＶの封入。
脂質をＰＯＰＣに置換して、リポソームを実施例７と同じように調製する。
【０１０７】
封入されたＡＣＶの決定を、実施例７に記載した方法に従って実施し、不飽和中性ＰＬを用いることにより、初期のＡＣＶのほんの２７．３％が、２４時間後にリポソーム内に保持されることを確認する。すなわち、リポソーム製剤は安定ではない。
【０１０８】
実施例９：ＬＵＶ  ＰＯＰＣ：ＤＰＰＧリポソーム中のＡＣＶの封入。
脂質を９：１のモル比のＰＯＰＣ及びＤＰＰＧに置換して、リポソームを実施例７と同じように調製する。
【０１０９】
封入されたＡＣＶの決定を、実施例７に記載した方法に従って実施し、不飽和中性ＰＬを用いることにより、初期のＡＣＶのほんの３８．１％が、２４時間後にリポソーム内に保持されることを確認する。
【０１１０】
実施例１０：ＬＵＶ  ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬリポソーム中のＡＣＶの不安定な封入。
脂質を６：４のモル比のＤＰＰＣ及びコレステロールに置換して、リポソームを実施例７と同じように調製する。封入されたＡＣＶの決定を、実施例７に記載した方法に従って実施し、荷電飽和ＰＬを有しない脂質の混合物を用いることにより、初期のＡＣＶのほんの２５．４％が、２４時間後にリポソーム内に保持されることを確認する。
【０１１１】
実施例１１：ＭＬＶ  ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧリポソーム中のＩＤＵＲの封入。
９：１のモル比のＤＳＰＣ及びＤＳＰＧ並びに２：１ ｖ／ｖの比率のクロロホルム：メタノール混合物を、ロータリーエバポレーターフラスコに加える。一旦脂質が溶媒混合物中に溶解すれば、フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、浴槽の温度を４０℃に調節し、そして脂質フィルムがフラスコの壁面上に形成されるまで溶媒を減圧下（８００ｍバール）で蒸発させる。その後、圧力を１００ｍバール減少させ、それを１時間保つ。最後に、フラスコをロータリーエバポレーターから外し、それを一晩凍結乾燥して、存在し得る微量の有機溶媒を除去する。形成した脂質フィルムを、５０ｍｌのヨードデオキシウリジン水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）と共に、６５℃で１時間ロータリーエバポレーター中で撹拌することにより水和させる。
【０１１２】
形成したリポソーム懸濁液を、２μｍのポリカーボネートフィルター孔を用いて抽出し、形成した小胞の大きさを均一にする。次に、１００ＫＤカットオフのＶｉｖａｆｌｏｗ５０メンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、６倍量の塩類リン酸バッファー（ｐＨ  ６；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、非封入薬剤を透析濾過により除去する。得られたリポソームを同一のバッファーで希釈し、ポリプロピレンバイアルに分け、それらを分析まで２５℃で保存する。
【０１１３】
リポソーム懸濁液中に存在するＩＤＵＲの総量を決定するために、この懸濁液を第一にメタノール中に希釈し、リポソーム膜の脂質を溶解して内容物を放出させる。次に、ＩＤＵＲの濃度を、その後２８４ｎｍで分光法により決定し、較正曲線と比較する。
【０１１４】
封入されたＩＤＵＲを決定するために、リポソームを２５分間２６，０００ｇで遠心することにより前もって沈殿させ、上清を回収する。その後、上記の手順を用いて上清中のＩＤＵＲ含有量を分析する。
【０１１５】
全ＩＤＵＲと上清中に存在するものとの間の差は、封入された画分を表す。記載した実施例において、全ＩＤＵＲの濃度は０．５５５ｍｇ／ｍｌとなり、これは試験の初めにリポソーム内に封入したものの９７．８％であった。ＩＤＵＲ／脂質のモル比は０．０４であった。
【０１１６】
図７は、２５℃での２ヶ月にわたる封入されたＩＤＵＲのパーセンテージ（初期のパーセンテージにおいて表す）における発展を示し、顕著な減少は検出されなかった。これにより、中性飽和及び荷電飽和ＰＬの組み合わせを用いて、安定なＩＤＵＲリポソーム製剤が得られることを実証する。
【０１１７】
Ｂ−皮膚中の拡散
実施例１２：リポソーム５−ＦＵに対する皮膚浸透及び用量比。
実施例５に従って、リポソームを調製する。それを用いて、５−ＦＵの全含有量がそれぞれ１．２％、０．９％及び０．４％に達するまで、塩類リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を用いて、３つの異なる希釈物を得る。封入される５−ＦＵのパーセンテージは４１％である。
【０１１８】
３つの濃度のそれぞれ１つを用いて、拡散実験を下記の通りに２４時間実施する。各リポソーム試料を、８つの異なる実験において分析する。
【０１１９】
０．６３６ｃｍ2の全拡散表面を有する、静置型フランツ拡散セル（Ｈａｎｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上に載せた、１ｍｍに皮膚採取した（ｄｅｒｍａｔｏｍｉｚｅｄ）ブタの耳からの皮膚を用いて、拡散試験を実施する。それぞれの拡散のレセプターを４．５ｍｌのリン酸バッファーで満たし、３００ｒｐｍで回転させながら３７℃に保つ。１０μｌのリポソーム懸濁液を、皮膚の表面に加える。拡散のために設定した時間の後に、細胞を取り外し、皮膚の表面を広範囲に掃除して、過剰なリポソーム懸濁液を取り除く。洗浄後に、皮膚を乾燥させ、凍結してＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｂａｙｅｒ）中に組み込み、低温保持装置（ｃｒｉｏｓｔａｔ）（ＣＭ−１９００、Ｌｅｉｃａ）中に置く。皮膚の表面上で、平行で４０μｍの連続的なカットを得る。皮膚のカット中に存在する５−ＦＵを、５０℃で３００μｌの水を用いて１５分間抽出する。その後、試料を遠心し（１０分間  ８０００ｒｐｍ；Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８０４Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ＨＰＬＣ分析用に濾過する（０．４５μｍ）。
【０１２０】
レセプター区画及び皮膚中のカットの試料における５−ＦＵの含有量の分析を、以下のクロマトグラフィー条件を用いて、ＨＰＬＣを用いて実施する（可視−ＵＶ検出器ＨＰ１１００を有するクロマトグラフＨＰ１１００；Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）。：
−Ｋｒｏｍａｓｉｌカラム  Ｃ18（２４０×４）５μｍ
−ＯＤＳプレカラム
−プレカラムフィルター
−移動相：Ｋ2ＨＰＯ4  ０．０１Ｍ（ｐＨ＝３）：メタノール（９８：２）
−流量＝１ｍｌ／分
−温度＝３５℃
−検出＝２６６ｎｍ
−注入体積＝１００μｌ
【０１２１】
図８は、皮膚の異なる層における５−ＦＵの濃度を示す。
【０１２２】
最初の８０μｍは角膜層に対応し、表皮は８０〜２００に見られ、それ以下は真皮である（Ｊｅｎｎｉｎｇ，Ｖ．，Ｇｙｓｌｅｒ，Ａ．，Ｓｃｈａｆｅｒ Ｋｏｒｔｉｎｇ，Ｍ．，Ｇｏｈｌａ，Ｓ．Ｈ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，４９．２１１−２１８（２０００））。
【０１２３】
明らかな用量−応答効果と共に、分析した全ての層の皮膚において５−ＦＵの明らかな浸透が存在する。
【０１２４】
実施例１３：リポソームＡＣＶの皮膚浸透、及び溶液中のＡＣＶとの比較。
実施例７に従ってリポソームを調製し、ＡＣＶ濃度が１ｍｇ／ｍｌに達するまで、得られた懸濁液を調節する。同時に、１ｍｇ／ｍｌのＡＣＶの標準液を、同一のバッファー中でリポソームとして調製する。リポソーム懸濁液及びＡＣＶ標準懸濁液の双方を、下記の拡散実験において試験した。
【０１２５】
毛のないマウス（ＳＫＨ−１）の背面皮膚を用いて、０．６９ｃｍ2の表面を有するＰｅｒｍｅＧｅａｒ ＩＬＣ−０７細胞を備えた、連続フロー装置において、拡散実験を実施する。データを標準化するために、１ｍｇ／ｍｌの固定した濃度のＡＣＶを用い、実施例２に従って調製したリポソーム懸濁液の希釈物を用いる。同一のバッファー中のＡＣＶの溶液を、基準として用いる。２００μｌのリポソーム溶液又は懸濁液を供与細胞中に置いて、全ての実験を実施する。
【０１２６】
皮下油を取り除いた後に、マウスの皮膚の試料を、拡散細胞上に置く。１０ｍＭのリン酸バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６）を、レセプター液体（真皮と接触した）として用いる。３７℃に保ったこのバッファーを、拡散チャンバー中において、０．５ｍｌ／時の一定流量で循環する。拡散を開始する前に、少なくとも１時間、全ての試料を水和する。拡散は、全部で１８時間行う。この時間の後、細胞膜を等張リン酸バッファー（ｐＨ６）で３回洗い、綿棒で慎重に乾燥させる。皮膚全体及び表皮に存在するＡＣＶを分析する。後者の場合、一旦拡散が起これば、記載したように皮膚の膜を洗いそして乾燥させ、皮膚の表面上に粘着テープを連続的に１０回適用して取り除くことにより、角膜層を除去する。
【０１２７】
一旦洗浄及びカットをしたら、皮膚又は表皮を液体窒素中で繰り返し凍結及び解凍し、１ｍｌの０．５ＮのＮａＯＨを添加する。得られた懸濁液を、可溶化のために５０℃で１６時間インキュベートする。最後に、試料を遠心し、表面の脂質層を避けながら溶液を除去し、そして０．２μｍのナイロンフィルターによりそれらを濾過する。この時点で、分析前の処理まで試料を凍結する。
【０１２８】
試料を０．５ＮのＮａＯＨ中に希釈し、５ＮのＨＣｌＯ4でタンパク質を沈殿させることにより、その処理を実施する。その後、それらを遠心し、上清を０．２μｍのナイロンフィルターで濾過することにより、直接ＨＰＬＣ注入バイアルに回収する。２５０×４．６ｍｍのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｍｉｄｅ  Ｃ１６カラム及び５μｍの粒子（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて、以下のクロマトグラフィー条件で、ＨＰＬＣにより試料の分析を実施する：
・溶出：水
・流量：１．５ｍｌ／分
・検出：２５４ｎｍ
・温度：２７℃
・注入体積：５０μｌ
【０１２９】
結果を表１に示す。ここで、本発明のリポソームは、皮膚におけるＡＣＶの拡散において重要な促進作用を有し、封入されたＡＣＶは、溶液中でその薬剤を用いて生成したものより３〜４倍の量で、角膜層より更に深い生存皮膚の層に達することが分かる。
【０１３０】
【表１】
2007530639.tif 000003
【０１３１】
実施例１４：５−ＦＵの持続放出の市販製剤との比較。
実施例５に従ってリポソームを得、５−ＦＵの全含有量が０．４％である希釈物を調製する。
【０１３２】
この調製物及びＣａｒａｃ（登録商標）ブランドの市販製品（０．５％の５−ＦＵを含み、その２／３の部分はマイクロスポンジ中に含まれる）を用いて、実施例１２に記載した方法により、拡散実験を実施する。この製剤は５−ＦＵの持続放出を有することが述べられている。この実験は、２、６、２４及び７２時間にわたり実施する。全ての場合において、適用した生成物の量は１０ｍｇであった。
【０１３３】
皮膚中で測定した平均レベルは、リポソーム製剤で常に高く、２４時間では、表皮及び真皮において統計的に有意である。リポソームで明らかな持続作用が観察され、表皮中の５−ＦＵの濃度は２〜２４時間で一定を保たれる。
【０１３４】
角膜層、表皮及び真皮のそれぞれに関して、図９、１０及び１１において結果を示す。
【０１３５】
実施例１５：リポソーム５−ＦＵの皮膚刺激、及び５−ＦＵの市販製剤との比較。
実施例６に記載した通りに、１．２％の５−ＦＵリポソーム懸濁液を用いる。この組成物及びＥｄｕｄｉｘ（登録商標）ブランドの商業的に入手可能な製剤（５％の５−ＦＵ含有量の）を用いて、皮膚刺激実験を実施した。
【０１３６】
ＯＣＤＥのガイド４０４に基づいた処理に従って、皮膚刺激実験を実施する。１．８〜２ｋｇの体重の、３匹の雄性アルビノ（ニュージーランド）ウサギを用いる（ＫＢＬ  ＩＯＰＳ／ＳＰＦ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｓ．Ａ．）。
【０１３７】
動物は、個々のケージの中で、標準的な食事及び水を自由に接種させる。動物は、温度（２０±２℃）、光周期（１２／１２時間  明／暗）、及び相対湿度（４０〜６０％）に関する条件が管理されている。
【０１３８】
０．５ｍｌの量の、実施例６に記載した１．２％の５−ＦＵのリポソーム懸濁液を、前もって毛をそった皮膚（その後ガーゼで覆う）のおよそ６ｃｍ2の領域に局所的に適用する。適用の４時間後に、パッチを取り除き、適用領域を洗う。１時間〜２４時間の後に、その領域を観察し、引き起こされた刺激を観察し、そして紅斑及び浮腫それぞれの悪性度を０〜４のスケールで書き留める。この適用を、無傷の皮膚の同じ領域において、毎日（週に５日）、合計で３週間繰り返す。同じ手順を、５％の５−ＦＵの市販製剤を用いて実施する。
【０１３９】
それぞれの適用後に、刺激の各徴候に対する平均的なマーキングを、１時間後及び２４時間後に実施する観察において得る。引き起こされる紅斑及び浮腫を、０〜４に別々に書き留め、ＥＵ皮膚病分類に従って刺激の悪性度を分類する。その中で、紅斑又は浮腫において２＞のマーキングを引き起こす物質は、刺激物質と見なされる。
【０１４０】
これらの条件において、Ｅｆｕｄｉｘ（登録商標）は、高い刺激性を示し、引き起こされた刺激の重症度により、２週間後に処理を中断した。逆に、リポソーム懸濁液は、処理の全持続時間に対して非刺激性を示した。
【０１４１】
生薬（ｇａｌｅｎｉｃ）製剤
本発明のリポソームを様々な医薬組成物に移送することができ、それらのいくつかを以下に記載する（それは網羅的なリストでなはいが）。
【０１４２】
【表２】
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【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
Ｃａｒｂｏｐｏｌの代わりに、製剤の重量において、１５〜２０％の量のＰｏｌｏｘａｍｅｒ４０７、１〜１０％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、１〜５％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、１〜１５％のヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、１〜５％のメチルセルロース（ＭＣ）及びそれらの組み合わせの中から、別のゲル化剤を選択することができる。
【０１４５】
【表４】
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【０１４６】
製剤の重量において、プロピレングリコール（ＰＧ）は１〜２０％、エタノールは１％〜５％、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）は１％〜５％、ブロノポールは０．０１〜０．１％の量であることができる。
【０１４７】
リン酸バッファー（Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ／ＮａＨ2ＰＯ4）の代わりに、他の医薬として許容されるｐＨ調整系（当業者に知られている）を、通常の濃度で用いることができる。必要であれば、製剤を等張にするために、当業者に知られた方法において、バッファー及びＮａＣｌの量を変えることができる。
【０１４８】
図１２に示すように、本発明のリポソームの構造は、このタイプのゲルの中で保持される。図１２では、フリーズフラクチャー電子顕微鏡により得られた、２％のヒドロキシエチルセルロースゲル中のＤＳＰＣ：ＤＳＰＧリポソームの写真を示す。
【０１４９】
Ｃ−非経口溶液
リポソーム懸濁液
塩類リン酸バッファー
塩化ナトリウム等張溶液
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
（原文記載なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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