(57)【要約】  チモサポニンＢＩＩの調製法であって、この方法は漢方薬の知母または、新鮮な知母（Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  Ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｇｅ．）の根茎またはひげ根を原料として用い、溶媒抽出、樹脂吸着、ポリアミドクロマトグラフィ、逆相カラムクロマトグラフィ、セファデックスＬＨ−２０上のカラムクロマトグラフィなどの工程の１種以上を従来の乾燥法である真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などと組み合わせてチモサポニンＢＩＩを単離することからなる。本発明の方法によって得られるチモサポニンＢＩＩは純度９０％以上であり、この方法は簡単で、工業生産に使用するのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チモサポニンＢＩＩの改良された調製方法であって：
ａ）知母中薬飲片あるいは新鮮な知母（Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｕｎｇｅ）の根茎または髭根を原料とし、水、アセトン、エタノール、プロパノール、およびその２種以上の混合物からなる群から選択される溶媒で抽出すること；
ｂ）ａ）で得られた抽出液を、樹脂吸着、ポリアミドクロマトグラフィ、逆相カラムクロマトグラフィ、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィから選択される１種以上の方法により分離し、さらに水、アセトン、アセトニトリル、エタノール、プロパノールまたはこれらの少なくとも２種からなる混合物からなる溶離液で溶離すること；
ｃ）ｂ）の溶離液を合体し、乾燥し、チモサポニンＢＩＩを得ること
を包含する方法。
【請求項２】
工程ａ）における抽出が、室温抽出または加熱抽出、あるいは超音波振動器による超音波振動抽出であり、抽出を一回以上行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）における溶剤抽出が、原料を水中で煮出した後、
１０〜９５％のエタノール水溶液で還流、滲出ろ過（滲漉）あるいは超音波抽出を行うこと；あるいは
１０〜８０％のアセトン水溶液で還流、滲出ろ過あるいは超音波抽出を行うこと
のうちいずれかにより抽出することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｂ）に記載の樹脂吸着法に用いる樹脂がポリスチレン型多孔性樹脂であり、溶離液が水、アセトン、エタノールおよびプロパノールから選択され、溶離が定濃度溶離または勾配溶離である請求項１の方法。
【請求項５】
ｂ）に記載の樹脂がＤ−ｌ０ｌ型吸着樹脂、ＡＢ−８型吸着樹脂、ＸＡＤ−２型吸着樹脂、ＨＰ２０型吸着樹脂、ＳＰ８２５型吸着樹脂、ＳＰ７００型吸着樹脂、ＣＨＰ−２０Ｐ型吸着樹脂またはＳＰ７０型吸着樹脂である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
樹脂吸着法が、溶剤抽出液の遠心上清またはろ液を多孔性樹脂に通して吸着させ、水またはアセトン、エタノールもしくはプロパノールの５〜２０％水溶液をカラム体積の２〜７倍量流して不純物を除き、次いでカラム体積の２〜７倍の、アセトン、エタノールまたはプロパノールの２０〜７０％水溶液で溶脱することを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｂ）におけるポリアミドクロマトグラフィがカラムクロマトグラフィまたは静置吸着ろ過法であり、溶離液が水、アセトン、アセトニトリル、エタノールおよびプロパノールからなる群より選択される溶剤であり、溶離が定濃度溶離または勾配溶離である請求項１に記載のチモサポニンＢＩＩ調製方法。
【請求項８】
ｂ）におけるポリアミドクロマトグラフィが、チモサポニンＢＩＩ水溶液をポリアミドカラムに通し、水、またはアセトン、エタノールもしくはプロパノールの０〜１５％水溶液をカラム体積の２〜７倍用いて溶離することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
逆相カラムクロマトグラフィが常圧または加圧逆相カラムクロマトグラフィであり、カラム充填剤がシリカゲルＲＰ−１８（ＯＤＳ）またはＲＰ−８であり、溶離液がアセトニトリル−水、アセトン−水、エタノール−水、およびプロパノール−水からなる群より選択され、溶離が定組成溶離または勾配溶離である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィが常圧または加圧カラムクロマトグラフィであり、溶離液がアセトニトリル−水、アセトン−水、エタノール−水、およびプロパノール−水からなる群より選択され、溶離が定濃度溶離または勾配溶離である請求項１に記載のチモサポニンＢＩＩ調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチモサポニンＢＩＩの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方薬である知母は百合科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ科）知母（Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ）属の多年生植物Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｇｅ．の根茎である。主産地は中国河北、内蒙古、山西、東北部などである。伝統的中国医学では、これは苦寒清熱薬（苦い生薬で体内の熱をとる薬）として用いられ清熱瀉火（炎症を抑え熱を冷ます）、慈陰潤燥（体液を補い乾燥を潤す）の効果がある。主な治療対象は外感熱病（感染による熱）、高熱頻渇、肺熱乾咳、骨蒸潮熱（体の深部から出る熱）、内熱消渇（糖尿病）、腸燥便秘（腸の水分不足による便秘）である。知母の主成分はステロイド性サポニンで、フラボン、少糖類、多糖類、脂肪酸なども含まれる。薬理研究から知母は抗菌、抗ウイルス、解熱、血糖降下、鎮静、血小板凝集阻害、抗がんおよび放射線防御等の効果を有することがわかっている。
【０００３】
チモサポニンＢＩＩ（プロトチモサポニンＡＩＩＩとも呼ばれる）は知母の根の主要成分である。その構造は（２５Ｓ）−２６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２２−ヒドロキシ−５β−フロスタン−３β，２６−ジオール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで、以下の構造式を有する。
【化１】
2007534706.tif 000002
【０００４】
チモサポニンＢＩＩは川崎敏男等により１９６３年に初めて単離されたが、構造は示されなかった。１９９１年に、南雲清二等がチモサポニンＢＩＩの構造を初めて明らかにした（Ｓｅｉｊｉ  ＮＡＧＵＭＯ  ｅｔ  ａｌ、薬学雑誌（日）、１９９１；１１１（１）：３０６−３１０）。その後、Ｎｏｂｏｒｕ  Ｎａｋａｓｈｉｍａ（Ｎｏｂｏｒｕ  ＮＡＫＡＳＨＩＭＡ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１９９３；５６（３）：３４５−３５０）、馬百平等（馬百平等、薬学学報（中）１９９６；３１（４）：２７１−２７７）、Ｍａｓａｙａｓｕ  Ｋｉｍｕｌａ（Ｍａｓａｙａｓｕ  ＫＩＭＵＲＡ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ、１９９６；１９（７）：９２６−９３１）およびＪｉａｎ−ｙｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ（Ｊｉａｎ−ｙｉｎｇ  ＺＨＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９９；２８９：７９−８８）等がチモサポニンＢＩＩの単離と活性を報告した。研究によりチモサポニンＢＩＩが血糖を下げ、血小板の凝集を阻害し、フリーラジカルの捕捉および抗認知症活性を有することが明らかになった。先行技術文献のほとんどすべてにおいて、チモサポニンＢＩＩはｎ−ブタノール抽出、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィ、マクロ多孔性樹脂カラムクロマトグラフィ、およびＨＰＬＣで調製されている。しかしチモサポニンはｎ−ブタノール抽出で乳化しやすく、シリカゲルクロマトグラフィにおける試料の量は限られ、シリカゲルを再生するのは困難であり、クロロホルム−メタノール−水の溶離液を回収して利用するのは難しい。したがって、報告されている方法は、工程が難しく、低収量、低純度で工業的生産には向かない。マクロ多孔性樹脂と逆相液体クロマトグラフィとを用いても、メタノール−水による溶離液ではチモサポニンＢＩＩのＣ−２２水酸基のメトキシ化が起こり、かなりの割合でチモサポニンＢＩが生じる（Ｓｅｉｊｉ  ＮＡＧＵＭＯ  ｅｔ  ａｌ、薬学雑誌（日）、１９９１；１１１（１）：３０６−３１０）。したがってこれらの方法では試料が無駄になったり、チモサポニンＢＩＩとチモサポニンＢＩの混合物のみが得られたりする可能性があり、純粋なチモサポニンＢＩＩを得るのは非常に難しい。
【化２】
2007534706.tif 000003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがってチモサポニンＢＩＩの調製方法を改良することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的の一つはチモサポニンＢＩＩの改良された調製方法を提供することである。この方法は、ｎ−ブタノールとシリカゲルクロマトグラフィとを抽出、精製に使用せず、また溶出液にメタノールを使用しないので、チモサポニンＢＩＩを高い純度と収量で得ることができる。
【０００７】
よって、本発明はチモサポニンＢＩＩの改良された調製方法であって、ａ）原料として知母の中薬飲片（生薬を刻んだもの）あるいは新鮮な知母の根を用意し、これを水、アセトン、エタノール、プロパノール、およびこれらのうち少なくとも２種の混合物からなる群より選択される溶剤で抽出する工程；ｂ）ａ）での抽出物を、樹脂吸着、ポリアミドクロマトグラフィ、逆相カラムクロマトグラフィおよびセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィからなる群より選択される１種以上の方法で分離し、水、アセトン、アセトニトリル、エタノール、プロパノールおよび少なくともこれらのうち２つの混合物からなる群から選択される溶離液で溶出する工程；ｃ）工程ｂ）での溶離液を合体し、乾燥してチモサポニンＢＩＩを得ることを特徴とする。
【０００８】
本発明によれば、工程ａ）において使用する溶剤は、水、アセトン、エタノール、プロパノール、これらの２種以上を任意の割合で混合したもの、のいずれでもよい。抽出は室温での浸漬抽出または超音波抽出機中での超音波抽出でもよく、加熱下での浸漬抽出や還流抽出でもよい。抽出は一回以上行うことができる。工程ａ）で好ましい抽出方法は以下のようである。水と煮出す；１０〜９０％のエタノール水溶液中で還流、滲出ろ過（滲漉）または超音波抽出する；１０〜８０％のアセトン水溶液中で還流、滲出ろ過または超音波抽出する。
【０００９】
本発明によれば、工程ｂ）での樹脂吸着法に関し、樹脂としてはＤ−１０１型吸着樹脂、ＡＢ−８型吸着樹脂、ＸＡＤ−２型吸着樹脂、ＨＰ２０型吸着樹脂、ＳＰ８２５型吸着樹脂、ＳＰ７００型吸着樹脂、ＣＨＰ−２０Ｐ型吸着樹脂、ＳＰ７０型吸着樹脂、あるいはその他の型のポリスチレン（ＰＳ）マクロ多孔性吸着樹脂を使用することができる。溶離液としては水、アセトン、エタノール、およびプロパノールを単独でまたは組み合わせて使用することができる。溶出方法としては定組成溶離または濃度勾配溶離が使用できる。
【００１０】
さらに詳しく述べると、抽出液の遠心上清またはろ過液をマクロ多孔性樹脂に吸着させ、水または低濃度アセトンまたは低級アルコール（たとえばエタノールやプロパノール）の水溶液で洗って不純物を除く（濃度は５〜３０％、量はカラム容積の２〜７倍（２〜７ＢＶ））。
【００１１】
ついで濃度の高いアセトンまたは低級アルコール（たとえばエタノールやプロパノール）水溶液を用いてカラムから溶離する（濃度は２０〜７０％で量はカラム容積（ベッド体積）の２〜７倍）。検出結果により、溶離液の全部または一部を集め、溶媒を回収し、残渣を濃縮して粗チモサポニンＢＩＩを得る。
【００１２】
本発明によれば、工程ｂ）で用いることのできる別法として、ポリアミドクロマトグラフィとしてカラムクロマトグラフィあるいは静置吸着ろ過法を用いることができる。
溶離液としては水、アセトン、アセトニトリル、エタノールおよびプロパノールのうちの１種以上を使用することができる。溶離方法としては定組成溶離または濃度勾配溶離を用いることができる。
【００１３】
より具体的には、チモサポニンＢＩＩの水溶液をポリアミドカラムの上にのせ、水または低濃度のアセトンまたは低級アルコールの水溶液（たとえば、エタノールやプロパノールの水溶液）で溶離する。ここで濃度は０〜１５％で、量はカラム体積（ベッド体積）の２〜５倍でよい。検出結果により、溶離液の全部または一部を集め、溶媒を回収して残渣を濃縮して粗チモサポニンＢＩＩを得る。あるいはチモサポニンＢＩＩを含む水溶液にポリアミドを加え、十分攪拌して静置し、ブフナーロートでろ過し、水または低濃度のアセトンあるいは低級アルコールの水溶液で溶離する。検出結果により、溶離液の全部または一部を集め、溶媒を回収して残渣を濃縮してチモサポニンＢＩＩを得る。ポリアミドは高濃度のアセトン、エタノール、またはプロパノールの水溶液で、もしくは酸またはアルカリで再生してもよい。
【００１４】
本発明の調製方法の工程ｂ）で用いられる逆相カラムクロマトグラフィとしては、常圧または加圧逆相クロマトグラフィが使用できる。カラムにはシリカゲル逆相１８（シリカゲルＲＰ−１８）またはシリカゲル逆相８（シリカゲルＲＰ−８）を充填する。溶離液には、アセトニトリル−水、アセトン−水、エタノール−水、プロパノール−水の１種以上を用いることができる。溶出法としては定組成溶離あるいは濃度勾配溶離を用いることができる。
【００１５】
具体例としては、チモサポニンＢＩＩを含む試料を溶離液に溶解し、その溶液を逆相カラム上でカラムクロマトグラフィにかけ、アセトニトリル−水、アセトン−水、エタノール−水、プロパノール−水の１種以上を用いて溶出する。ここでの有機溶媒の濃度は１５―６０％で、溶離液は分画して集める。検出結果により、溶離液の全部または一部を取り、溶媒を回収し、残渣を濃縮して粗チモサポニンＢＩＩを得る。
【００１６】
本発明の工程ｂ）では、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィを常圧または加圧下で使用することもできる。溶離液には、アセトニトリル−水、アセトン−水、エタノール−水、プロパノール−水の１種以上を用いることができる。溶出法としては定組成溶離あるいは濃度勾配溶離を用いることができる。
【００１７】
一実施態様においては、チモサポニンＢＩＩを含むサンプルを溶離液に溶かし、セファデックス  ＬＨ−２０カラムに導入し、アセトニトリル−水、アセトン−水、Ｃ２−Ｃ５のアルコール（たとえば、エタノールやプロパノール）−水のうちの１種以上を用いて溶離する。ここで、有機溶剤の濃度は５−６０％で、溶離液は分画して集める。
【００１８】
検出結果に基づき、溶離液の一部を合体し、溶媒を回収し、残りを濃縮してチモサポニンＢＩＩを得る。
本発明によれば、工程ｃ）では本技術分野で知られている乾燥法を用いることができる。たとえば、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥法である。
【００１９】
本発明によれば、従来の方法の複雑さが解消される。特にｎ−ブタノール、メタノールおよびシリカゲルカラムクロマトグラフィの使用に起因する生成チモサポニンＢＩＩの純度の低さと低収量の問題が解決された。本発明の方法によれば、調製されたチモサポニンＢＩＩの純度は９０％を超え、この方法は簡便であり、実用的で工業化に適している。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例は本発明をさらに詳しく説明するものであって本発明を何ら制限するものではない。
【００２１】
実施例１
チモサポニンＢＩＩの調製
知母中薬飲片８ｋｇを粉砕し、それに４８Ｌの５０％エタノールを加えた。薬を１時間浸漬した後、１時間還流抽出し、ろ過した。残渣については同様な還流抽出をさらに２回行った。エタノール抽出物を合体し、エタノールを回収し、残りを減圧下で４０Ｌまで濃縮した。前処理したマクロ多孔性吸着樹脂ＳＰ８２５（三菱、日本）をカラム（１８Ｌ）に充填し、水で平衡化した。濃縮した抽出物はろ過し、ろ液をカラムに載せ、水で洗って不純物を除いた。その後、カラムをカラム容積の３倍量の（３ＢＶ）３５％エタノール、３ＢＶの５０％エタノールおよび３ＢＶの９５％エタノールで順次溶離した。検出結果から、チモサポニンＢＩＩは主として５０％エタノール画分に回収されたことが判った。この画分からエタノールを除き少量にまで濃縮し、エタノールを最終濃度３５％になるよう加え保存した。再生マクロ多孔性樹脂ＳＰ８２５カラム（１８Ｌ）を３５％エタノールで平衡化した。上記の試料をこのカラム上でクロマトグラフィを行い、６ＢＶの４５％エタノールで溶出した。溶離液は２，０００ｍＬずつに分けて集め、各画分の純度をＨＰＬＣで測定した。画分１８−３０を合体しエタノールを除いて少量にまで濃縮した。得られた試料液を前処理したポリアミドカラム（６Ｌ、３０−６０メッシュ、臨江試剤工廠）上に導入し、５ＢＶの水で溶出した。着色帯は捨てて、溶離液を６００ｍＬずつの画分に分けて集め、ＨＰＬＣで検出を行った。フラクション６−２３を合体し、濃縮し、噴霧乾燥してチモサポニンＢＩＩ（５６．５ｇ）を得た。製品収量は原材料の０．７１％で、ＨＰＬＣで測定した純度は９０．８％であった。
【００２２】
実施例２
チモサポニンＢＩＩの調製
知母中薬飲片５ｋｇを粉砕し、それに３０Ｌの３０％アセトンを加えた。薬を２時間浸漬した後、０．５時間超音波振動器で抽出し、ろ過した。残渣については同様な超音波抽出をさらに２回行った。アセトン抽出物を合体し、アセトンを回収し、減圧下で３０Ｌまで濃縮した。前処理したマクロ多孔性吸着樹脂ＡＢ−８（天津南開化工廠）をカラム（１８Ｌ）に詰め、水で平衡化した。濃縮した抽出物をろ過し、ろ液をカラムに載せ、水で洗って不純物を除いた。その後、カラムをカラム体積の３倍量（３ＢＶ）の２０％エタノール、３ＢＶの５０％エタノールおよび３ＢＶの９５％エタノールで順次溶離した。検出結果から、チモサポニンＢＩＩは主として５０％エタノール画分に回収されたことが判った。この画分からエタノールを除き少量にまで濃縮し、真空乾燥して粗チモサポニンＢＩＩを２８６ｇ得た。粗試料８０ｇを１０００ｍＬの２５％アセトンに溶解し、２５％アセトンで平衡化したシリカゲルＲＰ−１８カラム（６．５Ｌ）に導入した。このカラムを２８％アセトン（２００００ｍＬ）、３０％アセトン（２００００ｍＬ）の順で洗って、８０％アセトン（１３０００ｍＬ）でカラムを再生した。２８％アセトン溶離液と３０％アセトン溶離液は６００ｍＬずつ分画して集めた。各画分の純度はＨＰＬＣで測定した。フラクション６〜２１を合体し、アセトンを除き、少量にまで濃縮しついで凍結乾燥した。チモサポニンＢＩＩ１２．９ｇが得られた。製品収量は原材料の０．９２％で、純度は、ＨＰＬＣによると９４．３％であった。
【００２３】
実施例３
チモサポニンＢＩＩの調製
知母中薬飲片５ｋｇを粉砕し、それに３０Ｌの３０％アセトンを加えた。薬を２時間浸漬した後、０．５時間超音波振動器で抽出し、ろ過した。残渣については同様な超音波抽出をさらに２回行った。アセトン抽出物を合体し、アセトンを回収し、減圧下で３０Ｌまで濃縮した。前処理したマクロ多孔性吸着樹脂ＡＢ−８（天津南開化工廠）をカラム（１８Ｌ）に詰め、水で平衡化した。濃縮した抽出物はろ過し、ろ液をカラムに載せ、水で洗って不純物を除いた。その後、カラムをカラム体積の３倍量（３ＢＶ）の２０％エタノール、３ＢＶの５０％エタノールおよび３ＢＶの９５％エタノールで順次溶離した。検出結果から、チモサポニンＢＩＩは主として５０％エタノール画分に回収されたことが判った。この画分からエタノールを除き少量にまで濃縮し、真空乾燥して粗チモサポニンＢＩＩ２９０ｇを得た。この粗試料８０ｇを１０００ｍＬの２５％アセトンに溶解し、３４％メタノールで平衡化したシリカゲルＲＰ１８カラム（６．５Ｌ）上でクロマトグラフィを行った。カラムは３２％メタノール（２００００ｍＬ）、３４％メタノール（２００００ｍＬ）の順で溶離し、９０％メタノール（１５０００ｍＬ）で再生した。３２％メタノールと３４％メタノールでの溶離液は６００ｍＬずつに分けて集めた。各画分の純度はＨＰＬＣで測定した。フラクション８−１９を合し、メタノールを除き、少量にまで濃縮し、次いで凍結乾燥した。チモサポニンＢＩＩが９．７ｇ得られた。純度はＨＰＬＣによると７３．１％であった。この試料を３０％アセトンに溶解し、９５℃で５時間還流した。アセトンを除き、少量にまで濃縮したのち凍結乾燥してチモサポニンＢＩＩ９．７ｇを得た。製品収量は原材料の０．７０％で、純度はＨＰＬＣによる測定で９３．９％であった。
【００２４】
実施例４
チモサポニンＢＩＩの調製
新鮮な知母の根茎４ｋｇをスライスし、１０Ｌの水を加えて１時間に出した後、ろ過した。残渣に８Ｌの水を加えて１時間煮出した後ろ過した。ろ液を合体し、減圧下で濃縮して１０Ｌとした。これにエタノールを終濃度２５％になるよう加え、抽出液として用いた。前処理したマクロ多孔性樹脂Ｄ１０１（天津農薬工廠）をカラム（６Ｌ）に充填し、２５％エタノールで平衡化した。抽出液はろ過し、ろ液をカラムに載せた。ついでカラムを３ＢＶの２５％エタノール、３ＢＶの３５％エタノール、３ＢＶの９０％エタノールの順で溶出した。検出結果からチモサポニンＢＩＩは主として３５％エタノール画分に回収されたことが判った。この画分を濃縮してエタノールを除き少量にした。濃縮溶離液を前処理したポリアミドカラム（６Ｌ、３０−６０メッシュ、臨江試剤工廠）上に導入し、５ＢＶの水で溶離した。着色帯は捨てて、溶離液を６００ｍＬずつの画分に分けて集め、ＨＰＬＣで検出を行った。フラクション８−２４を合体し、濃縮し、噴霧乾燥を行いチモサポニンＢＩＩの脱色粗標品５１ｇを得た。粗標品約４０ｇを２００ｍＬの３５％エタノールに溶解し、３５％エタノールで平衡化したセファデックスＬＨ−２０カラム（８．５Ｌ）に導入し、カラムは３５％エタノール５０，０００ｍＬで溶離した。ついで９５％エタノール２０，０００ｍＬでカラムを再生した。３５％エタノールでの溶離液を８００ｍＬずつの画分にわけて回収し、各画分の純度はＨＰＬＣで測定した。フラクション１６〜３５を合体し、エタノールを除去して少量にまで濃縮した後、凍結乾燥して、チモサポニンＢＩＩを１１．２ｇ得た。製品収量は新鮮根茎の０．３６％で、これは乾燥薬材では１．０７％に相当する。ＨＰＬＣ測定による純度は９２．３％であった。
【００２５】
実施例５
チモサポニンＢＩＩ
知母の髭根２ｋｇを切り刻み１６Ｌの水で１時間煮出した後ろ過した。１２Ｌの水を残渣に加え、１時間煮出した後ろ過した。ろ液を合し、減圧下で１２Ｌまで濃縮した。これにアセトンを終濃度１５％となるように加えて保存した。前処理した多孔性樹脂ＳＰ７００（三菱会社、日本）を６Ｌのカラムに充填し、１５％アセトンで平衡化した。抽出液はろ過し、ろ液をカラム上に載せた。ついでカラムを３ＢＶの２５％アセトン、３ＢＶの３５％アセトン、３ＢＶの８０％アセトンの順で溶離した。検出結果からチモサポニンＢＩＩは主として３５％アセトン画分に回収されたことが判った。この画分を濃縮してアセトンを除き、噴霧乾燥して粗チモサポニンＢＩＩ標品４５．０ｇを得た。粗標品約４０ｇを２００ｍＬの１０％アセトンに溶かし、前もって１０％アセトンで平衡化したセファデックスＬＨ−２０カラム（８．５Ｌ）に載せた。カラムは１０％アセトン（４０，０００ｍＬ）で溶出した後、８０％アセトン（２０，０００ｍＬ）で再生した。１０％アセトンでの溶離液を８００ｍＬずつ分画し、各画分の純度はＨＰＬＣで決定した。画分２０−３６を合体し、アセトンを除去し、少量になるまで濃縮した。凍結乾燥してチモサポニンＢＩＩを９．２ｇ得た。原料の根に対する製品の収量は０．５２％であった。ＨＰＬＣで求めた純度は９１．７％であった。
【００２６】
実施例６
チモサポニンＢＩＩの調製
知母の新鮮な根茎４ｋｇをスライスし、これに８Ｌの５０％エタノールを加えた。２時間浸漬後、超音波振動器で０．５時間抽出してろ過した。残渣は同様に超音波抽出を２回行った。エタノール抽出液を合し減圧下でエタノールを除去し１０Ｌまで濃縮した。前処理した多孔性樹脂ＡＢ−８（天津南開化工廠）をカラム（６Ｌ）に充填し、水で平衡化した。濃縮抽出液はろ過し、ろ液をカラムに載せ、水で溶出して不純物を除いた。カラムには３ＢＶの２０％エタノール、３ＢＶの５０％エタノールおよび３ＢＶの９５％エタノールを順次流した。検出結果からチモサポニンＢＩＩは主として５０％エタノール画分に存在することが判った。この画分からエタノールを除去して少量にまで濃縮し、真空乾燥してチモサポニンＢＩＩの粗標品５９．３ｇを得た。この粗標品５０ｇを２００ｍＬの２５％アセトンに溶解し、２５％アセトンで予め平衡化しておいたシリカゲルＲＰ１８カラム（６．５Ｌ）に導入した。カラムは２８％アセトン（２００００ｍＬ）、３０％アセトン（２００００ｍＬ）、の順で溶出してから８０％アセトン（１５０００ｍＬ）で再生した。２８％アセトンと３０％アセトン部分を６００ｍＬずつ分画して集めた。各画分の純度はＨＰＬＣで決定した。画分６−２５を合体し、アセトンを除去して少量になるまで濃縮し、凍結乾燥してチモサポニンＢＩＩを１５．６ｇ得た。この標品１４．１ｇを７０ｍＬの２５％アセトン溶液に溶解し、２５％アセトンで前もって平衡化したシリカゲルＲＰ１８カラム（６．５Ｌ）に導入した。２８％アセトン（４０，０００ｍＬ）で溶離し、カラムは８０％アセトン（１，２００ｍＬ）で再生した。溶離液は６００ｍＬずつに分画し、各画分の純度はＨＰＬＣで求めた。画分８〜１９を合体し、アセトンを除去して少量になるまで濃縮し、ついで凍結乾燥した。チモサポニンＢＩＩ（４．５ｇ）が得られた。標品の収量は知母の新鮮根茎の０．１５％（乾燥薬材の０．４４％に相当）、ＨＰＬＣで求めた純度は９８．６％であった。
【００２７】
この標品は白色不定形粉末で、ｍｐ＞２４３℃（ｄｅｃ）、Ｌｉｅｂｅｎｎａｎｎ‐Ｂｕｒｃｈａｒｄ反応とＭｏｌｉｓｈ反応はどちらも陽性であった。エールリッヒ試薬にも陽性を呈した。
【００２８】
得られたチモサポニンＢＩＩの構造は、ＩＲ、ＭＳおよびＮＭＲにより以下のように同定された。
ＩＲ  （拡散反射）  ｃｍ−１：３３４８（ＯＨ）、２９３０、２８５０、１０７５、１０４４（グリコシド結合Ｃ−Ｏ）。
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：９４３（Ｍ＋Ｎａ）＋、９０３（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ）＋、７４１（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ−Ｇｌｃ）＋、５７９（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ−Ｇｌｃ×２）＋、４１７（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ−Ｇｌｃ×２−Ｇａｌ）＋、３９９（アグリコン＋Ｈ−Ｈ２Ｏ×２）＋、２５５、１８５、１４５。
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：７４０（Ｍ−Ｈ２Ｏ−Ｇｌｃ）＋、５７８（Ｍ−Ｈ２Ｏ−Ｇｌｃ）＋、４１６（アグリコン−  Ｈ２Ｏ）＋、４１５（アグリコン−Ｈ−  Ｈ２Ｏ）＋、３５７、２７３、２１７、１８１、１３９。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ５Ｄ５Ｎ）δ：０．８５（３Ｈ、Ｓ、１８−ＣＨ３）、０．９６（３Ｈ、Ｓ、１９−ＣＨ３）、１．００（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２７−ＣＨ３）、１．３０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２１−ＣＨ３）、４．７９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｇｌｃ  １−Ｈ）、４．９０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｇａｌ  １−Ｈ）、５．２７（ＩＨ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｇｌｃ  １−Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲのデータを表１にしめす。この化合物は（２５Ｓ）−２６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２２−ヒドロキシ−５β−フロスタン−３β，２６−ジオール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであった。
【００２９】
表１  チモサポニンＢＩＩの１３Ｃ‐ＮＭＲ化学シフト（ピリジン‐ｄ５中のδ）
位置（アグリコン）      δｃ      位置（グリコシル）      δｃ              
１                    ３０．９      ｇａｌ−１          １０２．５
２                    ２７．０      ２                    ８１．８
３                    ７５．０      ３                    ７６．９
４                    ３０．９      ４                    ６９．８
５                    ３６．９      ５                    ７６．５
６                    ２６．７      ６                    ６２．１
７                    ２６．７      ｇｌｃ−１          １０６．１
８                    ３５．４      ２                    ７５．５
９                    ４０．２      ３                    ７８．０
１０                  ３５．２      ４                    ７１．４
１１                  ２１．１      ５                    ７８．４
１２                  ４０．４      ６                      ６２．７
１３                  ４１．２      ２６ｇ１ｃ−１        １０５．１
１４                  ５６．４      ２                      ７５．２
１５                  ３２．４      ３                      ７８．５
１６                  ８１．２      ４                      ７１．６
１７                  ６４．０      ５                      ７８．４
１８                  １６．７      ６                      ６２．７
１９                  ２４．０
２０                  ４０．６
２１                  １６．４
２２                １１０．６
２３                  ３７．１
２４                  ２８．３
２５                  ３４．４
２６                  ７５．３
２７                  １７．４                                                
【００３０】
比較例１
チモサポニンＢＩＩの調製
知母中薬飲片１ｋｇを粉砕し、６Ｌの６０％エタノールを加えた。１時間浸漬した後、加熱して１時間還流抽出を行い、次いでろ過した。残渣について同様にしてさらに２回還流抽出を行った。エタノール抽出液を合し、４Ｌになるまで減圧濃縮してエタノールを除去した。４Ｌの水飽和ｎ−ブタノールを濃縮液に加えた。得られた溶液を振とうして混和した後静置して層分離させた。ついで上層のｎ−ブタノール層を回収し、下層の水層は同様に水飽和ｎ−ブタノールを加えてさらに４回抽出した。この５回のｎ−ブタノール抽出液を合体し、濃縮乾固してサポニン３３．１ｇを得た。サポニンをメタノールに溶解し、シリカゲル６０ｇと混ぜ、加熱して溶媒を揮発させた。この試料を乾式充填したシリカゲルカラム（３Ｌ）に載せ、クロロホルム−メタノール−水の勾配溶出を行った。チモサポニンＢＩＩを含むクロロホルム−メタノール−水（６０：４０：１０、下相）の溶離液を回収し濃縮乾固して粗製標品２．３ｇを得た。この粗標品をさらにシリカゲルカラム（５００ｍＬ）にかけ、クロロホルム−メタノール−水で溶離した。クロロホルム−メタノール−水（６５：３５：１０、下相）での溶離液を５０ｍＬずつに分けて採取した。画分１５−２３を濃縮乾固し標品を得た（０．６７ｇ）。標品を３２％メタノールに溶解し、シリカゲルＲＰ１８カラム（６００ｍＬ）上でカラムクロマトグラフィを行った。カラムを３２％メタノール（１，８００ｍＬ）と３４％メタノール（１，８００ｍＬ）の順で溶離し、ついで９０％メタノール（１，２００ｍＬ）で再生した。３２％メタノール溶離液と３４％メタノール溶離液は５０ｍＬずつ分画し、各画分の純度をＨＰＬＣで決定した。画分１３〜２１を合体し、少量になるまで濃縮してメタノールを除去した。凍結乾燥してチモサポニンＢＩＩを０．３４ｇ得た。ＨＰＬＣによる純度は７５．５％であった。この標品を３０％アセトンに溶解し、９５℃の湯浴中で６時間還流した。ついで濃縮してアセトンを除いてから凍結乾燥した。チモサポニンＢＩＩが０．３３ｇ得られた。製品の収量は原料の薬材の０．０３３％で、純度は９３．４％であった。
【国際調査報告】
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