(57)【要約】【課題】本発明は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の組み換えＣｌｐＰ蛋白質を含むワクチンに関する。本発明では、前記ＣｌｐＰが熱ショック後に細胞壁内へ位置移動したことを立証した。病原性Ｄ３９を追加投与する前に肺炎球菌ＣｌｐＰを用いたマウスの免疫化は、広く知られた肺炎球菌蛋白質ワクチンであるＰｓｐＡ及びＰｌｙを使用する場合に得られる水準に匹敵すべき水準で全身性疾患に対しての保護性免疫を誘導した。従って、本発明の肺炎球菌ＣｌｐＰはワクチンのための抗原として使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え肺炎球菌ＣｌｐＰ蛋白質を抗原として含むワクチン。
【請求項２】
アジュバントをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
アジュバントが明礬である、請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項のワクチンをヒトまたは動物に免疫学的有効量投与してヒトまたは動物を肺炎球菌感染症に対して免疫化させる方法。
【請求項５】
肺炎球菌感染症が細菌性肺炎、中耳炎、菌血症または髄膜炎である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ｉ）肺炎球菌ＣｌｐＰをコードするＤＮＡ塩基配列が作動的に結合した発現ベクターを提供する段階と、
ｉｉ）前記ｉ）の発現ベクターを宿主細胞に導入する段階と、そして
ｉｉｉ）宿主細胞から組み換え肺炎球菌ＣｌｐＰを分離精製する段階
を含む組み換え肺炎球菌ＣｌｐＰを製造する方法。
【請求項７】
発現ベクターがｐＥＴ３０（ａ）−ｃｌｐＰである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞が大腸菌である、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
請求項６または７の方法によって製造された組み換え肺炎球菌ＣｌｐＰを抗原として含むワクチン。
【請求項１０】
請求項８の方法によって製造された肺炎球菌ＣｌｐＰを抗原として含むワクチン。
【請求項１１】
弱毒化された肺炎球菌ｃｌｐＰ−突然変異体を含むワクチン。
【請求項１２】
肺炎球菌ｃｌｐＰ−突然変異体が、９５個の塩基配列（２０６番目〜３００番目）が欠失された突然変異体である、請求項１０記載のワクチン。
【請求項１３】
ｃｌｐＰ−突然変異体がＨＹＫ２またはＨＹＫ３０２である、請求項１１記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の組み換えＣｌｐＰ（Caseinolytic protease P）蛋白質を抗原として含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)は、形質転換可能なグラム陽性細菌であって、ヒト及び動物で様々な感染症、例えば細菌性肺炎、中耳炎、菌血症及び髄膜炎を引き起こす[Willett, H. P. 1992. Streptococcus pneumoniae. In Zinsser Microbiology. Joklik, W.K., Willet, H.P., Amos, D.B. and Wilfert, C.M., (eds). Prentice-Hall International, London, pp. 432-442]。肺炎球菌による感染は、多剤耐性菌の登場で抗生剤による治療が難しい実情である。肺炎球菌感染症を予防するために現在市販されている２３価多糖類ワクチン［Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ２３(Merck社)及びＰｎｕ−Ｉｍｕｎｅ２３ (Wyeth-Lederle社)］は、莢膜多糖類（ＡＰＳ）を有効抗原としているが、嬰幼児では抗体生成率が低くて効果がなく、記憶反応(memory response)がないという欠点がある。
【０００３】
このような２３価ワクチンの欠点を解決するために開発された７価コンジュゲートワクチン［Ｐｒｅｖｎａｒ(Wyeth-Lederle社)］は、７種のＣＰＳを担体蛋白質にコンジュゲートして製造したものであるが、高価であり、９５個以上の肺炎球菌の中でもただ７タイプの肺炎球菌のみに対して防御効果があるので、肺炎球菌感染症の予防ワクチンとしての使用が非常に制限的である。したがって、肺炎球菌感染症を予防するために、高抗原性の蛋白質を用いたワクチンを開発しようとする試みが行われている。肺炎球菌の毒性因子として、宿主細胞のコレステロールと結合して穿孔するニューモリシン(pneumolysin：Ｐｌｙ)トキソイドが知られており、弱毒化されたニューモリシン（ＰｄＢ）をワクチンとして開発しようとする試みがあった。
【０００４】
ところが、ニューモリシンは、生体内及び試験管内で毒性が非常に強く、ＰｄＢ単独では効果がないため、他の毒性因子である肺炎球菌の表面蛋白質Ａ（ＰｓｐＡ）、コリン結合蛋白質（ＣｂｐＡ）、肺炎球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）、ＬｙｔＡなどと共に投与する場合にのみ、肺炎球菌感染症に対する生存率が増加した(Ogunniyi, A. D. et al., 2000, Immunization of mice with combinations of pneumococcal virulence proteins elicits enhanced protection against challenge with Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 68:3028-3033)。このように、既存の肺炎球菌感染症予防ワクチンの候補抗原蛋白質が、低い免疫原性を有し、或いは全ての血清型に対して防御効能を有しないため、免疫原性が高くて全ての肺炎球菌で保存的に存在する抗原蛋白質候補物質または弱毒化されたワクチンの開発が要求される。
【０００５】
肺炎球菌は健康な個体の鼻咽頭に存在し、これは肺炎球菌感染症に対する主な貯蔵所である。肺炎球菌は生体内で様々な環境的ストレスを受ける。肺炎球菌が鼻咽頭から血流へ浸透するように、宿主における環境的な適所(niche)の変化は、遺伝子発現の変化のみならず、急激な形態的変化を誘発するおそれがある。例えば、鼻咽頭の肺炎球菌は、主に透明なコロニー表現型であり、少量の莢膜及び多量のコリン結合蛋白質Ａ（ＣｂｐＡ）を発現させる傾向があるものと立証された。一方、血流中の肺炎球菌は、主に不透明なコロニー形態であり、多量の莢膜及び少量のＣｂｐＡを生成させる傾向がある(Kim, J. O. et al., 1998, Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177:368-377)。
【０００６】
さらに、肺炎球菌は、発病過程中に鼻粘膜（３０〜３４℃）(Lindemann, J. et. al., 2002, Nasal mucosal temperature during respiration. Clin. Otolaryngol. 27:135-139)で血液及び／または脳膜（３７℃）に浸透した後、熱ストレスを受ける。このような温度変化は、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）と呼ばれる高度の保存性蛋白質セットの合成が迅速且つ一時的に増加することに対する重要な原因として作用する可能性がある(Neidhardt, F.C. et. al., , and R. A. VanBogelen. 1987. Heat shock response, p. 1334-11345. In F. C. Neidhardt, J. L. Ingraham, K.B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), E. coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C.)。上昇した温度、またはエタノール、酸化ストレスまたは重金属の露出によるＨＳＰの誘導は、このような有害効果から細菌を保護する機能を行うことにより、細菌の生存率を増加させる。したがって、熱ショック反応を完全理解すると、肺炎球菌が直面する敵対的環境に対する肺炎球菌の適応に関する有用な情報を得ることができる。
【０００７】
ＨＳＰは、分子量によってＨｓｐ１００、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０及び小型Ｈｓｐファミリーに分類され、原核生物及び真核生物の何処にも存在する。ＨＳＰの一種であるｈｓｐ１００／Ｃｌｐ（カゼイン溶解性プロテアーゼ：caseinolytic protease)ファミリーは、真核生物では１０４ｋＤａ蛋白質として存在するが、原核生物では８０〜９５ｋＤａ蛋白質として存在する。これは、シャペロン機能を行い、且つ蛋白質分解に関与して損傷及び変性した蛋白質を除去する。Ｃｌｐによる蛋白質分解にはセリン型ペプチダーゼＣｌｐＰサブユニット及び調節性ＡＴＰａｓｅサブユニットが必要である(Schirmer, E. C. et. al., 1996, HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sci. 21:289-296)。
【０００８】
調節性Ｃｌｐサブユニット蛋白質は、一般に、２種のクラス、すなわちｃｌｐＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含み且つ２つのＡＴＰ結合領域を含有するクラスＩ、及びｃｌｐＭ、Ｎ、Ｘ及びＹを含み且つ只１つのＡＴＰ結合領域のみを含有するクラスＩＩに指定できる。Ｃｌｐは中央スペーサセグメントの大きさ、全体配列の整列におけるギャップの必要性、及びよく保存された領域とＮ末端及びＣ末端セグメントで配列類似性によって分類され、可変リーダ領域は各サブファミリーでそれぞれ非常に異なる配列を有する(前記Schirmer, E. C. et al., 1996)。
【０００９】
大腸菌のようなグラム陰性細菌においてＣｌｐファミリーの作用メカニズムの理解について相当な進歩が行われたが、グラム陽性細菌のＣｌｐについては知られている事項が殆どない。ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＣオペロンは、直接反復された作動遺伝子配列(A/GGT CAA ANA NA/GG TCA AA)を認識するＣｔｓＲによって陰性的に調節されるが、ｃｌｐＸはこのような配列を持っておらず、これらの特異的作用メカニズムは詳細に決定されたことがなかった(Derre, I. Et. al., 2000, The CtsR regulator of stress response is active as a dimer and specifically degraded in vivo at 37C. Mol. Microbiol. 38:335-347)。
【００１０】
温度及び栄養分利用性を含む様々な環境的シグナルが毒性因子の発現を調節することができるので、以前の研究において、本発明者は、細胞を様々なストレスに露出させた後、肺炎球菌で熱ショック反応の蛋白質プロフィールを調査した。熱ショックによって誘導された主な蛋白質は大きさが６２、７２及び８４ｋＤａであり、これらは後でそれぞれＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ及びＣｌｐＬと確認された。ところが、[35Ｓ]−メチオニンで蛋白質をパルス標識した結果、大腸菌(E. coli)及びバシラス・サブティラス(Bacillus subtilis)でストレス反応を誘導するものと知られている特定の条件が、高分子量ＨＳＰ、例えばＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫ相同物を誘導することはできないものと確認された。
【００１１】
ところが、鼻粘膜から肺に移動した後、肺炎球菌が接する温度変化と類似に、試験管内で３０℃から３７℃に温度を変化させると、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬが誘導された(Choi, I. H. et al., 1999, Limited stress response in Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Immunol. 43: 807-812)。いろいろのグラム陽性生物体のＣｌｐＬのヌクレオチド配列は公知になっているが(L. lactis [X62333]; S. aureus [AP003365, AP003137]; S. pyogenes [AE006538, AE004092]; Lactobacillus rhamnosus [AF323526])、ＣｌｐＬに対する機能的な研究は限定された。肺炎球菌のｃｌｐＰ−突然変異体は、最近、高温、Ｈ２Ｏ２及びピューロマイシン(puromycin)に敏感であると明らかになっており、マウスで毒性が著しく弱化された(Robertson, G. T. et al., 2002, Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and virulence. J. Bacteriol. 184:3508-3520)。ｃｌｐＣ、ｃｌｐＥ及びｃｌｐＸのような他の熱ショック遺伝子の特異的役割は十分明らかになっていない (Charpentier, E. et. al., 2000, Regulation of growth inhibition at high temperature, autolysis, transformation and adherence in Streptococcus pneumoniae by clpC. Mol Microbiol 37:717-726; Chastanet, A. et al., 2001, Regulation of Streptococcus pneumoniae clp genes and their role in competence development and stress survival. J. Bacteriol. 183:7295-7307)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明者は、全ての肺炎球菌で普遍的に存在する抗原蛋白質及びこれを用いたワクチンを開発するために、まずＣｌｐＬ及びＣｌｐＰの合成に対する熱ショックの影響を研究し、重要な肺炎球菌毒性遺伝子の試験管内の発現に対するｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響を評価した。また、肺炎球菌の毒性に対するｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響をマウスの腹腔内試験感染モデルで評価した。ここで、本発明者は、熱ショック過程が野生型肺炎球菌でニューモリシン（Ｐｌｙ）の発現を誘導し、他の毒性因子の発現を調節することを立証した。また、本発明者は、ｃｌｐＰの突然変異が上昇した温度でｍＲＮＡの発現を増加させるが、ｐｌｙの活性を増加させなかったことを究明した。次に、本発明者は、ＣｌｐＰが毒性を弱化させる根本的なメカニズムを調査し、ＣｌｐＰによる免疫化が毒性肺炎球菌による試験感染(challenge)からマウスを保護することができるか否かを評価することにより、本発明を完成した。
【００１３】
本発明の目的は、肺炎球菌由来の組み換えＣｌｐＰ蛋白質を抗原として含むワクチンを提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、ワクチンとして使用するための組み換え肺炎球菌ＣｌｐＰ蛋白質を製造する方法を提供することにある。
【００１５】
また、本発明のさらに他の目的は、肺炎球菌ＣｌｐＰ蛋白質を含むワクチンをヒトまたは動物に免疫学的有効量投与してヒトまたは動物を肺炎球菌感染症に対して免疫化させる方法を提供することにある。
【００１６】
また、本発明のさらに他の目的は、弱毒化された生ワクチンとして肺炎球菌突然変異体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明者は、一具体例において、ＣｌｐＬ及びＣｌｐＰの合成に対する熱ショックの影響を研究し、重要な肺炎球菌毒性遺伝子の試験管内発現に対するｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響を調査した。他の一具体例において、肺炎球菌の毒性に対するｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響をマウスの腹腔内試験感染モデルで検討し、野生型肺炎球菌で熱ショックがニューモリシン（Ｐｌｙ）の発現を誘導しかつ他の毒性因子の発現を調節することを確認した。また、他の一具体例において、本発明者は、ｃｌｐＰ−突然変異が、上昇した温度でｍＲＮＡ発現を増加させるが、ｐｌｙの活性を増加させないことを明らかにした。また、他の一具体例において、本発明者は、ＣｌｐＰが毒性を弱化させる根本的なメカニズムを調査し、ＣｌｐＰによる免疫化が毒性肺炎球菌による試験感染（challenge）からマウスを保護することができることを確認した。
【００１８】
本発明者の研究によれば、ＣｌｐＰ―突然変異体では、ニューモリシンｍＲＮＡの発現が増加したが、熱ショック後にニューモリシンの水準及び溶血性は増加しなかった。ＣｌｐＰ―突然変異体をマウスに試験感染させると、マウスの生存時間及び生存率が野生型に比べて有意的に増加し、ＣｌｐＰ−突然変異体の毒性が弱化されたが、これはＣｌｐＰ−突然変異体が弱毒化ワクチンとして潜在的に使用できることを提示する。また、肺炎球菌の生化学的分画結果は、ＣｌｐＰが熱ショックによって細胞質から細胞壁部位へ移動することを提示し、これは、肺炎球菌が宿主に感染を引き起こす時のストレスにより宿主細胞にＣｌｐＰを露出させることができることを示唆する。また、肺炎球菌に対するＣｌｐＰの免疫保護能に対する実験は、ＣｌｐＰ蛋白質１０μｇをＢａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回腹腔内に注射した後、毒性のある１×１０５ＣＦＵの肺炎球菌Ｄ３９菌株（タイプ２）を試験感染させ、生存時間を測定して行った。その結果、弱毒化されたニューモリシン（ＰｄＢ）を投与した実験群と対等な生存時間を示した。これは、ＣｌｐＰが宿主細胞で経験するストレスによって菌体の外部に露出されて抗原として作用するうえ、弱毒化されたニューモリシンと対等な肺炎球菌の感染に対する防御効果があることを示す。したがって、本発明によれば、ＣｌｐＰ蛋白質は、肺炎球菌感染症に対する効果的なワクチンとして使用できる。
【００１９】
本発明の肺炎球菌ＣｌｐＰ蛋白質は、熱ショック蛋白質であって、２１ｋＤａの分子量を有するセリンプロテアーゼである（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＥ００８４４３）。本発明において、組み換えＣｌｐＰ蛋白質は、当該分野で通常の遺伝工学的方法によって大量発現させた後、分離して製造することができる。これを簡略に説明すると、ＣｌｐＰ蛋白質は、ＣｌｐＰ遺伝子のＯＲＦ(open reading frame)（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＥ００８４４３で塩基配列５４１６番目〜６００６番目）を発現ベクター、例えばｐＥＴ３０（ａ）(Novagen)内にクローニングさせ、プラスミドｐＥＴ３０（ａ）−ＣｌｐＰ（図１）を作り、これを宿主細胞、例えば動物細胞、植物細胞または大腸菌に挿入して発現させた後、精製させて製造することができる。発現ベクター、宿主、培養条件、遺伝子挿入方法などは、当業者の通常の知識範囲内で適切に選択できる。本発明の一具体例は、大腸菌を用いた組み換えＣｌｐＰ蛋白質の製造を記述する。ＣｌｐＰ蛋白質は、肺炎球菌毒性因子であるニューモリシン、ＰｓａＡ、ＣｂｐＡ、ＰｓｐＡなどのｍＲＮＡ及び蛋白質水準の発現調節に関与する。
【００２０】
本発明に係るワクチンは、非経口、皮内、経皮（徐放性重合体の使用によって）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口及び鼻腔内投与経路を含み、様々な経路で投与できる。ワクチンは免疫学的有効量投与される。「免疫学的有効量」とは、免疫反応の誘導に適した用量である。用量は、ワクチン接種のための動物またはヒト被検者の年齢、体重及び身体状態などの要因及び抗体を合成する動物の免疫系の能力及び目的の保護程度に依存する。効果的な用量は、用量反応曲線を設定する日常的な試みを介して、当業者が容易に設定できる。免疫化は、ワクチンの単一用量によって提供できるか、或いは数回追加抗原投与量の投与を要求することができる。ＣｌｐＰの用量は、典型的に約１μｇ〜約５０μｇの範囲であり、或いは適切な場合にそれより高いか低い。
【００２１】
本発明に係るワクチンは、ＣｌｐＰ蛋白質を通常の方式で免疫学的に受け入れられる希釈剤または担体に添加して製造できる。希釈剤または担体は、水、塩水、デキストロスまたはグリセロールを挙げることができるが、これに制限されるものではない。また、ｐＨ安定化剤、等張化剤、湿潤剤または乳化剤が添加できる。また、ワクチンは、水酸化アルミニウム、明礬、ＱＳ−２１、モノホスホリル脂質Ａ及び３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）など、薬学的に受け入れられる他のアジュバントをさらに含むことができる。ワクチンは、典型的に水溶液または懸濁液の形で注射できるように製造されるか、或いは使用前に溶解または懸濁される固体の形に剤形化できる。その他、当該分野における通常の方法で鼻腔内製剤、経口用製剤などに剤形化できる。
【００２２】
鼻腔内製剤は、鼻粘膜に対する刺激を引き起こさない、或いは繊毛機能を激しく妨害しない賦形剤を含むこともでき、水や塩水などの希釈剤を含むことができる。鼻腔内製剤は、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含有することもできる。鼻粘膜による蛋白質抗原の吸収を向上させるために、界面活性剤を含有することもできる。経口用液状製剤は、例えば水性或いは油性懸濁液、溶液、エーマルジョン、シロップまたはエリキシルの形であり、或いは使用前に水またはその他適切な賦形剤との再構成のための錠剤タイプまたは製品であって、乾燥状態で存在することもできる。液剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤（食用油を含むこともできる）または保存剤など通常の添加剤を含有することもできる。ワクチンを製造するために、精製されたＣｌｐＰ蛋白質を凍結乾燥及び安定化することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る肺炎球菌の組み換えＣｌｐＰ蛋白質を含むワクチンは、免疫原性が高く、全ての肺炎球菌で保存的に存在する抗原蛋白質なので、免疫原性が低い、或いは全ての血清型に対して防御効能を有しない既存の肺炎球菌感染症予防ワクチンの欠点を示さずに、効果的に肺炎球菌感染症に対する免疫保護効果を示すことができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。また、本発明に記載の参考文献は、本発明に参考として統合される。
【００２５】
実施例１：肺炎球菌の毒性遺伝子の発現に及ぼす熱ショックとＣｌｐＬ及びＣｌｐＰ突然変異の効果
実施例１では、ＣｌｐＬ及びＣｌｐＰの合成に対する熱ショックの影響を研究し、重要な肺炎球菌毒性遺伝子の試験管内発現に対するｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響を評価した。また、肺炎球菌の毒性に対するｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響をマウス腹腔内試験感染モデルで評価した。
【００２６】
１．材料及び方法
ｉ）細菌菌株、成長条件及び形質転換
本研究に用いられた細菌菌株は表１の通りである。Ｒｘ−１の誘導体（莢膜のない非病原性肺炎球菌）である肺炎球菌ＣＰ１２００(前記Choi, I. H. et al., 1999)を本研究に使用し、これを３７℃でカシトン−トリプトン(Casitone-Tryptone:：ＣＡＴ)基本培地で指数成長期の中間段階まで培養した：ＣＡＴ基本培地１Ｌは、１０ｇの酵素カゼイン加水分解物(enzymatic casein hydrolysate)(Difco Laboratories, USA)、５ｇのトリプトファン (Difco Laboratories)、１ｇの酵母抽出物(yeast extract)(Difco Laboratories)、５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのコリン(choline)(Sigma, USA)、０.２％のグルコース(glucose)(Sigma, USA)、１６.６ｍＭのリン酸２カリウム(dipotassium phosphate)(Sigma, USA)を含有した。ＣＡＴブロスにリットル当り１４７ｍｇのＣａＣｌ２及び２ｇの牛胎児血清（分画Ｖ；Sigma)を添加して完全な形質転換培地を製造した。コンピテンス(Competence)をコンピテンス特異的ペプチドの添加によって調節し、従来の文献(Havarstein, L. S. et al., 1995, An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11140-11144)に記載されているように、培養培地で細胞をＤＮＡに露出させた後、収得したノボビオシン抵抗性形質転換体として定量化した。
【００２７】
莢膜菌株Ｄ３９（タイプ２）を脳心臓注入ブロス(Difco Laboratories, USA)またはＴＨ(Todd Hewitt)ブロス(Difco Laboratories, USA)で成長させ、従来の文献(Bricker, A. L. et al., Transformation of a type 4 encapsulated strain of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol. Lett. 172:131-135)に記載されているように形質転換させた。肺炎球菌形質転換体を選別するために、エリスロマイシンまたはノボビオシンを成長培地にそれぞれ２.５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。大腸菌菌株（表１のＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５ａ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）をＬＢ(Luria-Bertani)ブロスまたはＬＢ寒天で成長させた。プラスミドを文献(Hanahan, D. et al., 1983, Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580)に記載されているように、形質転換によって大腸菌内に導入させた。大腸菌形質転換体を選別するために、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を成長培地に添加した。本研究で新しく生成された形質転換体と共にプラスミドベクターを表１に記載した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
ｉｉ）抗血清の製造
肺炎球菌Ｄｎａｋ及びＧｒｏＥＬに対するＨＳＰ抗体の生成は、従来の文献(前記Choi et al., 1999)に記載されている。ＣｌｐＬ及びＣｌｐＰに対する抗体を製造するために、肺炎球菌ＣＰ１２００の指数成長期の培養物を４２℃で３０分間培養させ、細胞を超音波処理させ、蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、クマシーブリリアントブルー(Commasie Brilliant Blue)で明るく染色させた。８４ｋＤａ及び２１ｋＤａの蛋白質バンドを切り出し、電気溶離させた。食塩水１ｍｌ当り蛋白質１００μｇをフロイント不完全アジュバント１ｍｌと混合した。その後、この混合物をウサギに筋肉内及び皮下注射した。２つの追加抗原投与量を２週間隔で投与し、抗血清を６週後に採取した。ＣｂｐＡ、肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）及びＰｌｙに対する血清の製造は、従来の文献(前記Ogunniyi, A. D. et al., 2000)に記載の方法と本質的に同一であった。
【００３０】
ｉｉｉ）蛋白質の標識及びゲル電気泳動
蛋白質標識実験のために、細胞をＣＡＴ培地でＡ５５０（５５０ｎｍにおける吸光度）＝０.２となるまで成長させた後、２ｍｌの分取液に分けた。その後、細胞を収集し、予め加温した新しい低含量メチオニン標識培地に再懸濁させ、３０℃で１０分間平衡化させた。１０μＣｉの[35Ｓ]-メチオニン(１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ, Amersham)を添加し、培養物の温度を熱ショックのために４２℃にした。細胞を集め、２０μｌの溶解緩衝液を（５ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ８.０］、３０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸［ＥＤＴＡ］、０.１％のトリトンＸ−１００、０.０２５％［Ｗ／ｖ］のフェニルメタンスルホニルフルオリド［ＰＭＳＦ］、１ｍＭのジチオスレイトール）に再懸濁させた後、従来の文献(前記Choi et al., 1999)に記載されているように、超音波（氷上で）によって完全溶解させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０または１５％のポリアクリルアミドゲル）を文献(Laemmli et al., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685)に記載されているように行い、蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色によって可視化した。ポリアクリルアミドゲルを放射線敏感性映像化プレートに数日間露出させて映像を得た。放射線写真映像データを映像化分析システム(Fujix Bio-imaging Analyzer BAS2500, Fuji Photo Film Co.)を用いて定量化した。
【００３１】
ｉｖ）免疫ブロット
１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された蛋白質をポリビニルリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上にエレクトロブロットした後、１次抗体として肺炎球菌の熱ショック蛋白質に対して生成されたウサギ抗血清の１：１００の希釈液、または肺炎球菌の毒性蛋白質（ＣｂｐＡ、ＰｓａＡ及びＰｌｙ）に対して生成されたマウス抗血清の１：５,０００の希釈液と反応させた。２次抗体は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(Sigma)またはアルカリ性ホスファターゼ(Bio-Rad)にコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギまたはヤギ抗−マウスＩｇＧの１：２,０００の希釈液であった。
【００３２】
ｖ）逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ
従来の文献(Ogunniyi, A. D. et al., 2002, The genes encoding virulence-associated proteins and the capsule of Streptococcus pneumoniae are upregulated and differentially expressed in vivo. Microbiol. 148:2045-2053)に記載されているように、高温酸フェノール法を用いて全体ＲＮＡを抽出した。ｐｌｙ、ｐｓａＡ、ｃｂｐＡ及びｃｐｓ２Ａに対するｍＲＮＡの水準を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ-ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ(Promega Biotech, Cat.# A1250)を用いる１段階の実時間逆転写法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量化した。様々なＲＴ−ＰＣＲ検定に用いられる特異的プライマーは、文献(前記Ogunniyi et al., 2002)に記載されており、反応当り５０ｎＭの最終濃度で使用された。内部対照として、１６Ｓ ｒＲＮＡに対して特異的なプライマー(正方向、5'-GGT GAG TAA CGC GTA GGT AA-3': SEQ ID NO. 1;逆方向、5'-ACG ATC CGA AAA CCT TCT TC: SEQ ID NO. 2, Bioneer Co.)を使用した。別個のＲＴ−ＰＣＲ反応（構成プライマーのみが異なる）を、Ｓｙｂｒ&reg;Ｇｒｅｅｎ(Molecular Probes)が最終濃度１：５０,０００で添加されたマスター混合物から設定した（氷上で）。混合物を氷上で各上流及び下流プライマーを含有するチューブに分取し、徐々に攪拌して完全混合させた。
【００３３】
各混合物を最終的に０.１ｍｌの反応チューブ内に分取し、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ２０００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｃｙｃｌｅｒ(Corbett Research, Australia)に入れた。ＲＴ−ＰＣＲサイクリング条件を、４８℃で３９分間１サイクル（第１本のｃＤＮＡ合成のために）、９４℃で２分間１サイクル（ＡＭＶ逆転写酵素不活性化及びＲＮＡ／ｃＤＮＡ／プライマー変性のために）後に変性（９４℃で３０秒）、プライマーアニーリング（６０℃で３０秒）、及び延長（７２℃で３９秒）からなるＰＣＲ増幅４０サイクルにした。増幅データを延長段階で得て比較臨界閾値(ΔΔＣＴ)を用いるＣｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ４.４で分析した。抽出物間に、標的転写体の水準を内部１６Ｓ ｒＲＮＡ対照に対して得た転写体の水準を参照して正規化した。全ての実験は４重に行った。
【００３４】
ｖｉ）ｃｌｐＬ及びｃｌｐＰ欠失突然変異体の製作
肺炎球菌のｃｌｐＬの欠失−挿入突然変異（ΔｃｌｐＬ：：ｅｒｍＢ）を作るために、８６０−ｂｐ ｅｒｍＢカセット（フランスのトルーズＣＮＲＳのClaverys博士から入手、Vasseghi, H., and J. P. Claverys. 1983. Amplification of a chimeric plasmid carrying an erythromycin-resistance determinant introduced into the genome of Streptococcus pneumoniae. Gene 21:285-292)をエリスロマイシン抵抗性大腸菌染色体ＤＮＡからのｐｒｓ３(5'-CCG GGC CCA AAA TTT GTT TGA T-3' : SEQ ID No. 3)及びｐｒｓ４(5'-AGT CGG CAG CGA CTC ATA GAA T-3': SEQ ID No. 4)を用いて増幅させ、ｃｌｐＬを分解(disruption)させることに使用した。ｃｌｐＬ及びｅｒｍＢの５′末端の一部を含有する４１０ｂｐ断片(clpL-up)をＣＰ１２００ ＤＮＡからのｈｌｐ３(5'-CGG TAC CAT GAA CAA TAA TTT TAA C-3': SEQ ID No. 5)及びｈｌｐ１ (5'-ATC AAA CAA ATT TTG GGC CCG GTC AGA TGT TTC TTG AAT TTC C-3': SEQ ID No. 6)を用いて増幅させた。下流ｃｌｐＬ配列及びｅｒｍＢの３′末端の一部を含有する３００ｂｐ断片(clpL-down)をＣＰ１２００ ＤＮＡからのｈｌｐ２(5'-ATT CTA TGA GTC GCT GCC GAC TGT TCT AGA TGA TGG TCG TTT G-3': SEQ ID No. 7) 及びｈｌｐ４(5'-GGC CGA GCT CTT AGA CTT TCT CAC GAA TAA C-3': SEQ ID No. 8)を用いて増幅させた。３つのＰＣＲ生成物を、ｈｌｐ３及びｈｌｐ４を用いるＰＣＲに対する混合テンプレートとして用い、ｅｒｍＢ遺伝子によって置換されたｃｌｐＬの１,３０１ｂｐ欠失部分(Genebank AE008411塩基配列６３７４番目〜７６７４番目)を有する１.６ｋｂ断片を生産した。
【００３５】
その後、３部分の１.６ｋｂ断片を肺炎球菌ＣＰ１２００またはＤ３９菌株に形質転換によって導入し、組み換え断片が相同組み換えによって染色体内に挿入された受容者細菌をエリスロマイシン耐性によって選別した。ＰＣＲ及び免疫ブロット分析（図示せず）によって正しい欠失部分に対して形質転換体をスクリーニングした。ＣＰ１２００及びＤ３９のｃｌｐＬ―突然変異体であるＨＹＫ１及びＨＹＫ３０４それぞれは、ｃｌｐＬ内に正しい欠失部分を含有し、追加研究に使用した。ｃｌｐＰ ｕｐ（２３４−ｂｐ）の場合、ｈｐｐ３(5'-CGA ATT CAT GAT TCC TGT AGT TAT-3': SEQ ID No. 9)及びｈｐｐ１１(5'-ATT CTA TGA GTC GCT GCC GAC TCA GAA CCA CCT GGT GTA TTG A-3': SEQ ID No. 10)プライマーを使用し、ｃｌｐＰ−ｄｏｗｎ（３１９−ｂｐ）の場合、ｈｐｐ１０(5'-ATC AAA CAA ATT TTG GGC CCG GAT CGC ATC AAG TGG AGC AAA A-3': SEQ ID No. 11)及びｈｐｐ６(5'- CGA GCT CTT AGT TCA ATG AAT TGT TG-3': SEQ ID No. 12)プライマーを使用したことを除いては、同一の方法を用いてＣＰ１２００またはＤ３９で９５ｂｐの欠失部分(Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＥ００８４４３で塩基配列５６２１番目〜５７１５番目)を有するｃｌｐＰ−突然変異体ＨＹＫ２及びＨＹＫ３０２を作った。
【００３６】
ｖｉｉ）大腸菌におけるＣｌｐＬの過発現
大腸菌でＨｉｓ６−タグＣｌｐＬを過発現させるために、ｃｌｐＬ ＯＲＦをＣＰ１２００ＤＮＡのｈｌｐ３及びｈｌｐ４を用いて増幅させた。断片をＫｐｈＩ及びＳａｃＩで分解させ、ｐＥＴ３０（ａ）(Novagen)ＫｐｎＩ及びＳａｃＩの部位にクローニングさせてプラスミドｐＫＨＹ００４（図２）を生成させた。Ｈｉｓ６−タグ蛋白質を大腸菌内で発現させ、ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ ｆｌｏｗＴＭクロマトグラフィ(Amersham Pharmacia)によって０.１〜０.４ＭのＮａＣｌ勾配で溶離させた。ＣｌｐＬを含有する分画をプーリングし、製造者(Novagen)の指示をやや変形させた方法によってニッケル−ニトリロ酢酸カラム上で精製した。結合したＨｉｓ６−タグ蛋白質を４０ｍＭのイミダゾール緩衝液で洗浄し、０.４Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７.９）で溶離させ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、５ｍＭのＭｇＣｌ２に対して透析させた。蛋白質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで判定して＞９５％であり、前記蛋白質をクマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した（データは表示せず）。
【００３７】
ｖｉｉｉ）シャペロン活性の決定
従来の文献(Kudlicki, W. et al., 1997, Renaturation of rhodanese by translational elongation factor (EF) Tu. Protein refolding by EF-Tu flexing. J. Biol. Chem. 272:32206-32210)に記載の方法を次のように変形させた方法によってＣｌｐＬのシャペロン活性を決定した。Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ(Sigma, USA)（９μＭ）を１ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び８Ｍのウレアを含有する２００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.６）で１時間２５℃で変性させた。８Ｍのウレア中の変性された酵素２.５μｌを希釈させ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、２００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５ｍＭのチオ硫酸ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌを含有する最終容積２５０μｌの溶液にして自発的なＣｌｐＬ補助リフォールディングを開始した。リフォールディング反応において、Ｒｈｏｄａｎｅｓｅの最終濃度は９０ｎＭであった。リフォールディング反応は２５℃で３０分間行った。Ｒｈｏｄａｎｅｓｅの天然形態へのリフォールディングによってＣｌｐＬのシャペロン活性を測定した。Ｒｈｏｄａｎｅｓｅの酵素活性は、文献(Sorbo, B. H. et al., 1953, Crystalline rhodanese. I. Purification and physicochemical examination. Acta Chem. Scand. 7:1129-1136)に記載の方式で決定した。
【００３８】
ｉｘ）毒性の研究
毒性が非常に強い莢膜タイプ２菌株（Ｄ３９）及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ―及びｃｌｐＬ−突然変異体（それぞれＨＹＫ３０２及びＨＹＫ３０４）で腹腔内（ｉ.ｐ.）試験感染を行い、肺炎球菌の毒性に及ぼすｃｌｐＬまたはｃｌｐＰの突然変異の影響を評価した。細菌を、１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］の馬血清を加えた脳心臓注入寒天(Difco Laboratories, USA)またはＴＨ(Todd Hewitt)寒天(Difco Laboratories, USA)（必要に応じてエリスロマイシン補充）上で一晩中３７℃で培養した後、血清ブロス（１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］の馬血清を加えた脳心臓注入ブロス(Difco Laboratories, USA)またはＴＨ (Todd Hewitt)ブロス(Difco Laboratories, USA)）で３時間３７℃で成長させて約１０８ＣＦＵ／ｍｌの細菌培養物を収得した(前記Ogunniyi, A. D. et al., 2000)。次に、各細菌培養物を血清ブロスで希釈させて約１０６ＣＦＵ／ｍｌとし、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群を体積０.１ｍｌのＤ３９、ＨＹＫ３０２またはＨＹＫ３０４で腹腔内感染させた。試験感染したマウスの生存を、最初５日間は１日４回、次の５日間は１日２回、試験感染後の２１日目までは毎日モニタリングした。
【００３９】
ｘ）ニューモリシン検定
従来の文献(前記Hanahan, D., 1983)に記載の方法をやや変形させた方法によって溶血活性を決定した。ＴＨＹブロスで指数成長期の初期−中期段階（Ａ６００＝０.０５〜０.１）まで成長させた肺炎球菌（Ｄ３９、ＨＹＫ３０２、ＨＹＫ３０４）を、４℃で１０分間３９００×ｇの遠心分離によって収集し、リン酸塩緩衝食塩水に再懸濁させた。デオキシコール酸ナトリウムを最終濃度０.１％で添加した後、３７℃で１０分間培養した。サンプルを遠心分離した後、上澄液を回収し、連続的に希釈させた。９６ウェルマイクロタイタープレートに１.５％の洗浄されたヒト赤血球の等量と共に培養して溶血活性を決定した。溶血力価は５４０ｎｍで赤血球５０％が溶解される推定希釈度の逆数で決定した。
【００４０】
ｘｉ）統計処理
対応標本または独立標本スチューデントｔ検定(paired or unpaired Student's t test)を用いて統計的分析を行った。提示されたデータは２つ〜４つの独立実験に対する平均±標準偏差である。群間の平均生存時間の差はマン・ホイットニーのＵ検定（両側）(2-tailed)によって分析し、群間の全体的な生存率の差はフィッシャーの正確検定 (Fisher Exact test)によって分析した。
【００４１】
２．結果
ｉ）ＣｌｐＬの特性究明
従来、８４ｋＤａ ＨＳＰはＮ−末端アミノ酸配列化によってＣｌｐＬと確認された(前記Choi et al., 1999)。Ｃｌｐファミリーの一員は、２つの高度に保存されたＡＴＰ−結合領域（ＡＴＰ−１及びＡＴＰ-２）を含有し、前記各領域はアデニンヌクレオチド結合に対するコンセンサス配列を含有する(Gottesman, S. et al., 1990, Conservation of the regulatory subunit for the Clp ATP-dependent protease in prokaryotes and eukaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-3517)。推定肺炎球菌ＣｌｐＬが実際Ｃｌｐファミリーの一員であることを確認するために、Ｎ−末端アミノ酸配列(5'-GAT GAA YAA YAA YTT YAA YAA YTT YAA-3': SEQ ID NO. 13)からのオリゴーヌクレオチドとＣｌｐファミリーの最もよく保存されたアミノ酸配列(PTGVGKT)であるＣｌｐの一員に対する第２ＡＴＰ結合部位(5'-GTY TTN CCN CAN CCN GYN GG-3'、ここでY=TまたはC, N=A, C, Gまたは T: SEQ ID NO. 14)をＣＰ１２００染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。
【００４２】
ＰＣＲの結果、ラクトコッカス・ラクチス(L. lactis)ＣｌｐＬが大きさから予想される１.３７ｋｂ ＤＮＡ断片を得た。これをｐＧＥＭ−Ｔ(promega)にクローニングしてプラスミドｐＧ８４１３を生成させた。クローニングされた断片を配列分析した結果、ラクトコッカス・ラクチス(L. lactis)ｃｌｐＬ及び牛ｃｌｐ遺伝子に対する相同性を示した（データは表示せず）。次に、ＢＬＡＳＴ分析を用いてＴＩＧＲ肺炎球菌タイプ４ゲノムで完全なｃｌｐＬ遺伝子を確認した。また、肺炎球菌Ｒ６において、ｃｌｐＬ相同物はタイプ４ｃｌｐＬ相同物と９８％の同一性を示し、ＣＰ１２００ｃｌｐＬはＲ６ｃｌｐＬと高度の配列相同性を示した（データは表示せず）。ゲノムの前記領域の構成は図３に示されている。
【００４３】
ｃｌｐＬの配列を詳細に分析した結果、分子量が７７，６９９ダルトンであり、ｐＩ（等電点）が４.９９である７０１個のアミノ酸を有する推定ポリペプチドをコード化する２１０３ｂｐのＯＲＦであることが分かった。ヌクレオチド配列を分析した結果、肺炎球菌ｃｌｐＬは、ＡＴＧコドンの２４０ｂｐ上流にシグマＡタイププロモータ (TTGACC-17-bp-TATATT)を有することが分かった。ｃｌｐＬの上流にはＣｔｓＲリプレッサー結合配列ＧＴＣ ＡＡＡ ＮＡＮ ＲＧＴ ＣＡＡ Ａ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１５）があり、これは幾つかの有機体でｃｌｐ遺伝子に隣接しているものと確認された。したがって、ｃｌｐＬはＣｔｓＲによって調節できる。ｃｌｐＬから６１９ｂｐ上流の遺伝子は推定ウンデカプレニル−ｐ−ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡＣ−ペンタペプチドトランスペラーゼをコードして同一の配向で存在する。ＬｕｘＳをコードするｃｌｐＬの下流の遺伝子は反対配向で存在し（図３）、これはｃｌｐＬがモノシストロン転写ユニットとして構成されることを示唆する。
【００４４】
ＢＬＡＳＴ分析結果、肺炎球菌ＣｌｐＬは、アミノ酸１２１〜１２８(GDAGVGKT)及び３９１〜３９８(GSTGVGKT)における２つの保存されたＡＴＰ結合領域（ｐループ）でＣｌｐファミリーの全ての構成員に対して高度の相同性を有することが分かった。親水性Ｎ−末端領域において位置１１から１８までの８つのアミノ酸(MDDLFNQL)は、牛のＣｌｐ類似蛋白質及びラクトコッカス・ラクチス(L. lactis)ＣｌｐＬにおいて絶対的に保存された。肺炎球菌ＣｌｐＬ ＡＴＰａｓｅは牛のＣｌｐ類似蛋白質（７６％の同一性及び８８％の類似性）及びラクトコッカス・ラクチス(L. lactis)ＣｌｐＬ（５９％の同一性及び７６％の類似性）と最も強い相同性を示す。また、これは他の種と高い相同性を示す（データは表示せず）。
【００４５】
ｉｉ）熱ショック後のＣｌｐＬの一時的な誘導及び高い安定性
それぞれ分子量８４ｋＤａ、７３ｋＤａ及び６５ｋＤａの主なＨＳＰであるＣｌｐＬ、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬは、熱ショック後に相応する肺炎球菌蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列化によって確認された。ＨＳＰ発現の協同的または独立的な調節に対しては決定されたことがなかったため、本発明者は、[35Ｓ]−メチオニンでパルス標識化してＨＳＰ合成の動力学を調査した。熱ショック蛋白質の誘導動力学を決定するために、３０℃の指数成長期のＣＰ１２００細胞（Ａ５５０＝０.２）に温度を４２℃に変化させて熱ショックを加えた後、[35Ｓ]−メチオニンで１０分間パルス標識した。培養物２ｍｌを取って細胞を溶解緩衝液中で超音波によって溶解させた後、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、蛋白質バンドを自動放射線写真法によって可視化させた。その結果、ＨＳＰの誘導は、温度上昇変化１０分後に最高に達した後、基本水準に急激に減少した（図４ａ）。細胞を４２℃で１０分間培養した後、ＣｌｐＬ、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬの合成は、対照に比べてそれぞれ１１.３±０.８、５.０±０.３及び２.７±０.２倍に増加した。ＧｒｏＥＬバンドは、近い蛋白質バンドと非常に類似であったが、自動放射線写真を高倍率で拡大した結果、ＧｒｏＥＬが誘導されたことが明確であった（図４ｂ）。
【００４６】
また、熱ショック蛋白質の安定性を決定するために、３０℃の指数成長期中盤のＣＰ１２００細胞（Ａ５５０＝０.２）に４２℃で１０分間熱ショックを加えた後、 [35Ｓ]−メチオニンでパルス標識化した後、細胞培養物を３０℃に復帰させ、その後表示された時間中に過量の非放射性メチオニンを追跡した。培養物２ｍｌを収集し、細胞を超音波によって溶解させた後、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、蛋白質バンドを自動放射線写真法によって可視化させた（図４ｂ）。４２℃で最初１０分間露出させた後、主なＨＳＰ合成の水準は迅速に減少し、熱ショック処理を行っていない対照に比べてそれぞれ２.０±０.２、２.２±０.３及び１.２±０.１倍になった。これはＨＳＰの合成が新しい定常状態に到達したことを示唆する。
【００４７】
図２ａに提示された結果と同様に、０分から１５分まで[35Ｓ]−メチオニンで２.５分間パルス標識した結果、ＧｒｏＥＬ、Ｄｎａｋ及びＣｌｐＬは初期に生成され、ＨＳＰの誘導は温度上昇変化約５分後に最高に到達したが、７.５分後には定常状態に落ち、対照に比べて１.５〜２倍の純増加を示した（データは表示せず）。この結果はこれらのＨＳＰが異なるクラスに属するとしても、同一の誘導動力学を有することを示す。また、熱ショック時の合成率の増加は、肺炎球菌の固定成長期でｃｌｐＬ及びｇｒｏＥＬのｍＲＮＡ水準の増加とそれぞれ類似である(Saizieu, A. et al., 1998, Bacterial transcript imaging by hybridization of total RNA to olignucleotide arrays. Nature Biotechnol. 16:45-48)。
【００４８】
Ｃｌｐ構成員のＡＴＰａｓｅサブユニットがＣｌｐＰセリンプロテアーゼと複合体を形成することができるため、３０℃の指数成長期中盤のＣＰ１２００細胞（Ａ５５０＝０.２）に４２℃で１０分間熱ショックを加えた後、[35Ｓ]−メチオニンでパルス標識化し、その後細胞培養物を３０℃に復帰させた後、表示された時間中に過量の非放射性メチオニンを追跡した。培養物２ｍｌを収集し、細胞を超音波によって溶解させた。収得した蛋白質を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、蛋白質バンドを自動放射線写真法によって可視化させた（図４ｃ）。その結果、熱ショック後に２１ｋＤａ ＨＳＰが誘導され、Ｎ−末端アミノ酸配列化によって前記２１ｋＤａ ＨＳＰがＣｌｐＰであることが確認された。図４ｃにおいて、レーンＣは、熱ショックを与えないことを示す。図４ａ〜図４ｃにおいて、上部の数字は非ストレス条件に復帰した後の経過時間（分）、濃い矢印は主要ＨＳＰをそれぞれ示し、分子サイズは左側にｋＤａで表示された。
【００４９】
ＨＳＰは、一部病原体において免疫原性であり(Kaufmann, S. H. E. et al., 1994, Heat shock proteins as antigens in immunity against infection and self, p. 495532. In R. I. Morimoto, A. Tissieres, and C. Georgopoulos (ed.), Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press)、その存続は宿主において病原体の生存に助けを与えることができる。したがって、ＨＳＰの安定性を調査した。４２℃で１０分間細菌に熱ショックを与え、パルス標識化し、３０℃に復帰させた後、非放射性メチオニンで様々な長さの時間だけ追跡した。１〜６０分後、ＨＳＰに対して調査したとき、放射性ＣｌｐＬ、ＤｎａＫまたはＧｒｏＥＬ量の検出可能な減少はなかった。すなわち、熱ショック中に生成されたＨＳＰは、６０分間温度下向き変化中に存続した（図５ｂ）。面白いことは、肺炎球菌ＨＳＰを用いた免疫ブロット分析結果、熱ショックが持続される間、ＣｌｐＬの絶対量が著しく且つ引き続き増加したことが確認された（６０分まで１４倍以下）。
【００５０】
図５ａ及び図５ｂは熱ショック後にＣｌｐＬが引き続き増加することを示す。４２℃に露出された指数成長期の肺炎球菌の全体細胞溶解物を免疫ブロット分析した。３０℃でＡ５５０＝０.３まで成長した肺炎球菌細胞に表示された時間だけ４２℃で熱ショックを加えた後、培養物を収集し、溶解緩衝液に再懸濁させた。細胞を超音波によって溶解させた後、蛋白質１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＣｌｐＬ、Ｄｎａｋ及びＧｒｏＥＬに対する抗血清と反応させた。ＣｌｐＰの場合、３０μｇの蛋白質を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に免疫ブロット分析を行った（図５ａ）。図５ａに示すような熱ショック後にＣｌｐＬ、ＣｌｐＰ、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬの相対水準を密度測定によって分析した。数字は独立した３回の実験の標準偏差を示す（図５ｂ）。測定された６０分間、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬの量はそれぞれ２.４倍及び３.４倍に増加した（図５ａ及び図５ｂ）が、以後には全てのＨＳＰの量が減少した（データは表示せず）。このような結果はＣｌｐＬが肺炎球菌で相当安定していることを意味する。
【００５１】
ｉｉｉ）ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体の表現型
ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体を構成するために、ΔｃｌｐＬ：：ｅｒｍＢまたはΔｃｌｐＰ：：ｅｒｍＢ挿入部分を含有するＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させ、材料及び方法編で記載されているように、形質転換によって染色体内に挿入させた。挿入突然変異をＰＣＲ及び免疫ブロット分析によって確認し、ＣｌｐＬまたはＣｌｐＰの不在をそれぞれ確認した。Ｄ３９及びその同種遺伝子型ｃｌｐＬ−（ＨＹＫ３０４）及びｃｌｐＰ―（ＨＹＫ３０２）突然変異体を５５０ｎｍにおける吸光度０.１まで培養した。次に、温度を３７℃から４３℃に変化させ、培養物を表示時間で培養し、その結果を図６に示した。ΔｃｌｐＬ：：ｅｒｍＢを保有するＤ３９誘導体ＨＹＫ３０４の成長率は、３０℃で母菌株の成長率と類似であったが、３７℃では倍増時間が母菌株で約４０分であったことに比べて５５分であって、さらに遅く成長した（図６ａ〜図６ｃ）。したがって、ＣｌｐＬは３０℃及び３７℃で肺炎球菌の成長に必須的でないものと判断される。
【００５２】
対照的に、ΔｃｌｐＰ：：ｅｒｍＢ突然変異を保有するＨＹＫ３０２は、３０℃（倍増時間＝２７０分）及び３７℃（倍増時間＝１００分）における成長が母菌株（それぞれ１００分及び４０分）に比べて激しく減少したことが分かる。４３℃におけるＤ３９の成長は、最初２時間は増加したが、その以後には減少した。母菌株の生存力は４２℃で４５分間維持されたが、４５分経過後には生存力が減少し始めた（データは表示せず）。４３℃において、ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体（それぞれＨＹＫ３０４及びＨＹＫ３０２）の成長が減少した。また、同種遺伝子型ＣＰ１２００誘導体ＨＹＫ１及びＨＹＫ２は、ＨＹＫ３０４及びＨＹＫ３０２それぞれの成長パターンと類似の成長パターンを示した（データは表示せず）。
【００５３】
ｉｖ）ｃｌｐＰ−突然変異におけるＣｌｐＬの誘導
ＣｌｐＬ及びＣｌｐＰが同一のＣｔｓＲによって調節されるものと判断され、ＣｌｐＰはＣｔｓＲの分解と関連があるという従来の研究結果より、ＣｌｐＬはＣｌｐＰによって調節できるものと予測された。このような可能性を調査するために、本発明者は、ＣＰ１２００またはそのｃｌｐＬまたはｃｌｐＰ陰性突然変異体を用いてＣｌｐＬ及びＣｌｐＰの量を決定した。指数成長期の肺炎球菌ＣＰ１２００（Ａ５５０＝０.３）及びその同種遺伝子型ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−誘導体に４２℃で３０分間熱ショックを加えた。培養物３ｍｌから得た蛋白質に対して抗ＣｌｐＬまたはＣｌｐＰポリクロナール血清を用いて免疫ブロット分析を行った。野生型（ＣＰ１２００)及びｃｌｐＬ−突然変異体（ＨＹＫ１）において、ＣｌｐＰは３０℃で検出されたが、細胞に３０分間熱ショックを加えた後、ＣｌｐＰの量は図７ａ及び図７ｂに示すように限界的に増加した。ＣｌｐＬが誘導されたが、誘導されていない培養物中のＣｌｐＬの量は野生型よりｃｌｐＰ―突然変異体（ＨＹＫ２）で一層多く、これはＣｌｐＰがＣｌｐＬの発現を抑制することを示唆する（図７ａ及び図７ｂ）。
【００５４】
ｖ）ＣｌｐＬのシャペロン機能
ＨＳＰが分泌を促進し且つ蛋白質の適当なフォールディング及び位置移動を助けるため(Craig, E. A. et al., 1993, Heat shock proteins: Molecular chaperones of protein biogenesis. Microbiol. Rev. 57:402-414)、肺炎球菌におけるＣｌｐＬのシャペロン活性を調査した。シャペロン活性を定量的に測定するために、変性された蛋白質を天然の形態にリフォールディングさせる方法を使用した(Mendoza, J. A. et al., 1991, Unassisted refolding of urea unfolded rhodanese. J. Biol. Chem. 266:13587-13591)。Ｒｈｏｄａｎｅｓｅの触媒されていないＲｈｏｄａｎｅｓｅリフォールディングは相対的に遅く起こり(前記Mendoza et al., 1991)、Ｒｈｏｄａｎｅｓｅの活性は簡単且つ敏感な検定によって決定できるため、変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅのリフォールディングは蛋白質フォールディングの研究に幅広く用いられてきた。ヒスチジンタグＣｌｐＬ（ｐＫＨＹ００４）（図２）を大腸菌で過発現させ、精製させ、リフォールディング活性の決定に使用した。試験条件の下で、変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅは、従来の文献(前記Craig et al., 1993)に開示されているように、天然Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性の只２.８〜７.７％のみを示した。これは、変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅの自発的リフォールディングが８Ｍのウレア溶液から１００倍希釈された場合に非効率的に起こることを意味する。
【００５５】
このような活性は同一の方法によって行われた天然Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性の百分率で発現される。変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅに対して約３モル過量でリフォールディング反応混合物にＣｌｐＬを含ませると、活性が増加して天然Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性の略１０％に天然状態への回帰が行われた。ところが、１２倍過量のＣｌｐＬを変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅに添加した場合、活性が天然水準の３０％に増加した。前記濃度以上にＣｌｐＬの量を増加させると、ＡＴＰの存在下にさらに若干の天然状態回帰が起こった（表２）。このような結果は、ＣｌｐＬがシャペロンに独立に作用して大腸菌でＣｌｐＡに対して、従来から知られているように、変性された蛋白質をリフォールディングさせることを立証した。
【００５６】
【表２】
2007528839.tif 000003
【００５７】
変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅ（最終濃度９０ｎＭ）を３７℃で１時間２ｍＭ ＡＴＰの存在下に単独で或いはＣｌｐＬと共に培養した。リフォールディングされた酵素の活性を２５℃で６０分間培養した後測定し、同一の条件下に２５℃で培養した同一量の天然酵素の活性の百分率で表わす。５つの独立実験の平均値と標準偏差が提示されている。
＊：対照（ＣｌｐＬがない場合）との有意差Ｐ＜０.０５
＊＊：対照との有意差Ｐ＜０.００１
ｖｉ）熱ショックによる毒性関連因子の発現調節
熱ショック及び飢餓を含む環境ストレスは、毒性因子の発現に影響を及ぼす可能性がある(Mekalanos, J. J. 1992. Environmental signals controlling expression of virulence genes determinants in bacteria. J. Bacteriol. 174:1-7)。したがって、莢膜菌株Ｄ３９及びそのｃｌｐＰ−突然変異体（ＨＹＫ３０２）及びｃｌｐＬ−突然変異体（ＨＹＫ３０４）の毒性関連因子の発現に対する熱ショックの効果を、コリン結合蛋白質（ＣｂｐＡ）、ＰｓａＡ、肺炎球菌表面蛋白質Ａ（ＰｓｐＡ）、Ｐｌｙ及びオートリシン（ＬｙｔＡ）に対する抗体を使用する免疫ブロット分析によって決定した。指数成長期の莢膜肺炎球菌Ｄ３９（Ａ６００＝０.１）及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ―（ＨＹＫ３０２）及びｃｌｐＬ−（ＨＹＫ３０４）誘導体に４２℃で２０分間熱ショックを加えた。培養物０.６ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁させた後、３分間沸かした。
【００５８】
その後、ＣｂｐＡ、Ｐｌｙ及びＰｓａＡに対して生成されたポリクロナール抗血清の混合物を用いて細胞溶解物に対して免疫ブロット分析を行った。図８にＣｂｐＡ、Ｐｌｙ及びＰｓａＡの相対位置を示した。予想外に、Ｐｌｙは熱ショック後に野生型Ｄ３９及びｃｌｐＬ−突然変異体から誘導された。ＰｓａＡも熱ショック後にＤ３９から若干誘導されたが、ｃｌｐＬ−突然変異体では誘導されなかった。対照的に、ＣｌｐＰ−突然変異体において、ＣｂｐＡが誘導されたが、Ｐｌｙ及びＰｓａＡの発現は減少した（図８）。ＰｓｐＡ及びＬｙｔＡ水準は、遺伝子の背景に関係なく熱ショック後に変化しなかった（結果は表示せず）。熱ショック後にＰｌｙ発現の増加を確認するために、細胞溶解物中のＰｌｙの溶血活性を決定した。Ｐｌｙ活性はＤ３９で熱ショック後に１.８倍増加したが、ｃｌｐＰ−突然変異体では増加しなかった（表３）
【００５９】
【表３】
2007528839.tif 000004
【００６０】
培養物の溶血活性はＡ６００＝１と同一である。細胞溶解物の５０μｌをリン酸塩緩衝食塩液５０μｌに連続的に希釈（１：１）した。次に、ヒト赤血球の１.５％懸濁液５０μｌを各ウェルに添加した後、プレートを３７℃で３０分間培養した。溶血単位は５０％溶血が起こったウェルから計算した。このような結果は、熱ショックが野生型及びｃｌｐＬ−突然変異体でストレス負荷時に毒性の増加に寄与することが可能なＰｌｙの発現を増加させたことを立証しているが、これはｃｌｐＰ−突然変異体では起こらなかった。
【００６１】
エルシニアエンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)において、ＣｌｐＰプロテアーゼはａｉｌ転写体水準及び細胞表面発現Ａｉｌ蛋白質の両方ともの発現を抑制するものと知られている(Pederson, K. J., S. Carlson, and D. E. Pierson. 1997. The ClpP protein, a subunit of the Clp protease, modulates ail gene expression in Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol. 26:99-107)。このため、本発明者は、肺炎球菌(S. pneumoniae)においてｍＲＮＡ水準で毒性遺伝子発現の調節を調査した。ＲＮＡを培養物から製造し、ｐｌｙ、ｃｂｐＡ、ｐｓａＡ及び莢膜合成遺伝子ｃｐｓ２ＡのｍＲＮＡ水準をＲＴ−ＰＣＲによって測定してその結果を図９に示した。
【００６２】
図９において、ＲＮＡ抽出物間に個別的なｍＲＮＡ種の水準を内部１６Ｓ ｒＲＮＡ対照に対して得た水準を参照して補正した。データポイントは、各ＲＮＡ抽出物の４重サンプルの平均±標準偏差を示す。３０℃で、ｃｌｐＬ−突然変異体におけるｃｂｐＡの発現はＤ３９の場合に比べて減少したが（Ｐ＝０.００１）、ｃｌｐＰ―突然変異体では増加した（Ｐ＝０.０１）。野生型及びｃｌｐＬ−突然変異体でｐｌｙ及びｐｓａＡ発現の著しい変化は検出されなかったが、ｃｌｐＰ−突然変異体ではｐｌｙの発現が２.５倍増加した反面（Ｐ＜０.０１）、ｐｓａＡの発現は半分に減少した（Ｐ＜０.０１）。熱ショック後に、ｃｂｐＡ ｍＲＮＡ水準は３０℃でＤ３９、ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ―突然変異体の場合と比較してそれぞれ７.４８倍、２.３９倍及び３.４８倍に増加した（それぞれＰ＜０.００１、Ｐ＜０.００１、Ｐ＝０.００１）。
【００６３】
同様に、ｐｌｙのｍＲＮＡ水準は３０℃でＤ３９、ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体の場合と比較してそれぞれ５.２７倍、６.０倍及び３.４８倍に増加した（全ての場合、Ｐ＜０.００１）。熱ショック後に、ｃｐｓ２Ａの発現は、３０℃でＤ３９及びｃｌｐＬ−突然変異体の場合と比較して著しく減少した（２つの場合ともＰ＝０.００１）。ｃｌｐＰ−突然変異体においてｃｐｓ２Ａの発現は熱ショック後に増加したが、その増加は統計的に有意性がなかった。対照的に、熱ショックはＤ３９及びｃｌｐＰ−突然変異体でｐｓａＡのｍＲＮＡ水準を１.６倍及び５.０４倍にそれぞれ増加させたが（それぞれＰ＜０.０１、Ｐ＝０.００１）、ｃｌｐＬ―突然変異体ではその水準が減少した（Ｐ＜０.０１、図９）。このような結果はｃｌｐＬ−突然変異がｐｓａＡの発現に否定的な影響を及ぼす虞がある反面、ｃｌｐＰ−突然変異はある未知の方式でｃｐｓ２Ａの発現に肯定的な影響を及ぼす可能性があることを示唆する。このような発見は、熱ショックのみならず、ｃｌｐＬ及びｃｌｐＰが新しい環境的チャレンジに対処するために様々な毒性関連遺伝子を調節するという証拠を提示する。
【００６４】
ｖｉｉ）毒性に及ぼすｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響
Ｄ３９の毒性に及ぼすｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異の影響をさらに調査するために、肺炎球菌約１０５ＣＦＵを腹腔内注射した後、マウスの生存時間を測定した。約１０５ＣＦＵのＤ３９またはそのｃｌｐＰ−（ＨＹＫ３０２）またはｃｌｐＬ−（ＨＹＫ３０４）誘導体で１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群を感染させた。図１０にその結果を示した。図１０において、各データポイントはマウス１匹を示し、水平線は各群に対する中間生存時間を示す。母菌株（Ｄ３９）及びｃｌｐＬ−突然変異体で感染させた群のマウスに対する中間生存時間はそれぞれ５５時間及び６０時間であり、このような差異は統計的に有意性がなかった。
【００６５】
ところが、ｃｌｐＰ−突然変異体で感染させたマウス群は、感染２〜３日後に痛んだが、感染４〜５日後には大部分が段々回復された。ｃｌｐＰ−突然変異体で試験感染させたマウスのうち２匹のみが６７時間及び１１９時間後に死亡した（図１０）。ｃｌｐＰ−突然変異体で感染させたマウス群と、Ｄ３９またはｃｌｐＬ−突然変異体で感染させた群間の中間生存時間及び全体的な生存率は、高度の有意差を示した（全ての場合にＰ＜＜０.００１）。このような結果はＣｌｐＰ機能が肺炎球菌の毒性因子の発現に対して重要であることを示す。
【００６６】
３．検討
本研究において、本発明者は、肺炎球菌においてＡＴＰ−依存性ＣｌｐプロテアーゼＡＡＫ７４５１３がｃｌｐＬ相同物であることを確認した。ＣｌｐＬ相同物はいろいろのグラム陽性有機体で確認されたが(L. lactis X62333; S. aureus AP003365, AP003137; S. pyogenes AE006538, AE004092; Lactobacillus rhamnosus AF323526)、グラム陰性有機体では確認されなかったので(Derre, I. Et al., 1999, ClpE, a novel type of HSP100 ATPase, is part of the CtsR heat shock regulon of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 32:581-593)、ＣｌｐＬはＣｌｐＥと同様にグラム陽性有機体に特異的なようである。
【００６７】
免疫ブロット分析の走査密度測定法(scanning densitometry)を用いて、本発明者は、肺炎球菌がＣｌｐＬを除いては３０℃でＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ及びＣｌｐＰを高い基本水準で発現させたことを明らかにした。このような水準は、有機体を熱ショックに４０分間露出させた場合、２倍に増加した。ところが、蛋白質を[35Ｓ]−メチオニンで１０分間パルス標識化した結果、全てのＨＳＰの迅速且つ一時的な誘導が立証された。これはＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ及びＣｌｐＰが３０℃で構成的に大量発現されたことを意味する。また、ＣｌｐＬ、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬが３０℃への復帰時に存続するということは、正常的な培養条件への復帰時にはＨＳＰが活発に分解されないことを示す。
【００６８】
ＨＳＰはシャペロンとして機能し、フォールディングされていない蛋白質の天然状態復帰を促進し、様々な細菌性病原体で感染中に誘導されるので、生体内生存率は敵対的環境で細菌の巨大分子複合体に及ぼすＨＳＰの安定化効果によって増加できる。したがって、正常的な条件への復帰時にＨＳＰの存続及び熱ショックによるＰｓａＡ及びＰｌｙのような毒性蛋白質の誘導は、肺炎球菌の毒性に寄与し或いはこれを増加させることができる。主なＨＳＰであるＤｎａＫは、肺炎球菌において非常に免疫原性であり(Hamel, J., D. Martin, and B. B. Brodeur. 1997. Heat shock response of Streptococcus pneumoniae: identification of immunoreactive stress proteins. Microb. Pathog. 23:11-21)、ＨＳＰが様々な病原体による感染で免疫優性抗原であるという相当な証拠は文献上に現われている(前記Kaufmann, S. H. E. et al., 1994)。肺炎球菌の発病生活様式が高い水準のＤｎａＫ及びＣｌｐＬを必要とするか、そしてＣｌｐＬが特異的気質と結合し、蛋白分解のためのＣｌｐＰとの複合体を形成するかは、組み換え蛋白質を使用する研究の主題である。
【００６９】
ＨＳＰ遺伝子の突然変異は、多くの病原体で付着性及び毒性に影響を及ぼすものと知られている。ストレスにより誘導されたＣｌｐＰセリンプロテアーゼは、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)の毒性に寄与し(Webb, C., et al., 1999, Effects of DksA and ClpP protease on sigma S production and virulence in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 34:112-123)、エルシニアエンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)で付着浸透性遺伝子座(ail)の遺伝子発現を調節する (Pederson, K. J. et al., 1997, The ClpP protein, a subunit of the Clp protease, modulates ail gene expression in Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol. 26:99-107)。リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)において、ＣｌｐＰは細胞内寄生生活及び毒性に必須的である(Gaillot, O. et al., 2000, The ClpP serine protease is essential for the intracellular parasitism and virulence of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 35:1286-1294)。本結果は、ＣｌｐＰも肺炎球菌の毒性に必須的な役割を果たし、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等(前記Robertson, G. T. et al., 2002, Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and virulence. J. Bacteriol. 184:3508-3520)の最近調査結果を裏付ける。
【００７０】
本研究において、本発明者は、ｃｂｐＡ、ｐｌｙ及びｐｓａＡなどの毒性関連遺伝子に対するｍＲＮＡが熱ショックによって上向きに調節されたことを立証した。３０℃で野生型とｃｌｐ突然変異体における遺伝子発現を比較した場合、ｃｌｐＬ−突然変異体はｃｂｐＡ、ｐｌｙ、ｐｓａＡ及びｃｐｓ２Ａに対する野生型の場合とほぼ同一の発現パターンを示す反面、ｃｌｐＰ−突然変異体ではｃｂｐＡの発現は増加するが、ｐｌｙ及びｐｓａＡの発現は減少する。したがって、ｃｌｐＰは、ｃｂｐＡの発現に対しては陰性調節物質として作用するが、ｐｌｙの発現に対しては陽性調節物質として作用するようである。本発明者の研究結果とは対照的に、Ｃｈａｓｔａｎｅｔなどの文献では、Ｐｌｙ生成がｃｌｐＰ−突然変異によって影響を受けないと報告されている(Chastanet, A. et al., 2001, Regulation of Streptococcus pneumoniae clp genes and their role in competence development and stress survival. J. Bacteriol. 183:7295-7307)。Ｃｈａｓｔａｎｅｔ等は血液寒天プレート上の溶血ヘイロウを観察して定量的に評価した反面、本発明者は定量的な溶血検定を使用したので、このような差はＰｌｙ活性に対する測定方法の差のための可能性がある。Ｐｌｙは肺炎球菌の菌血症で立証された毒性因子なので、熱ショック後の発現増加は発病において寄与因子である可能性がある。これは呼吸性病原体肺炎球菌において熱ショックによる毒性遺伝子の調節に関する最初の報告である。
【００７１】
熱ショック後に、実時間ＲＴ−ＰＣＲデータはｃｌｐＰ−突然変異体でｐｌｙ発現の増加を示したが、免疫ブロット分析及びＰｌｙ活性測定結果、増加したものと確認されなかった。このような不一致は高温でｃｌｐＰ−突然変異体のｐｌｙ ｍＲＮＡの不安定性に起因する可能性がある。ＣｌｐＰは、発生期のＰｌｙを直接活性化する作用を行うことができるものとも考えられる。本発明者の免疫ブロットデータは、ｃｌｐＰ−突然変異結果、熱ショックに関係なく高い水準にＣｌｐＬが発現されたことを立証しており、これはＣｌｐＰがＣｌｐＬを陰性的に調節することができることを示唆する。このような結果は、３７℃でｃｌｐＰ−突然変異体でｃｌｐＬが高い水準に誘導されたことを示す最近のマイクロアレイ研究を確証している(前記Robertson, G. T. et al., 2002, Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and virulence. J. Bacteriol. 184:3508-3520)。さらに、熱ショック後に、莢膜生合成遺伝子座の一番目の遺伝子であるｃｐｓ２Ａの発現水準は、野生型及びｃｌｐＬ−突然変異体において減少し、これは宿主免疫系に対する耐性がさらに低い可能性があることを暗示する。対照的に、ｃｌｐＰ−突然変異体におけるｃｐｓ２Ａの発現水準は減少しなかった。このような結果は、ｃｌｐＰ−突然変異体が全体的な毒性は減少したが、ストレス負荷時に宿主マクロファージに対する耐性を野生型の水準で示さなければならないことを示唆する。これは慢性菌血症の発病をもたらす可能性があり、この場合、細菌は宿主の免疫系に浸透して宿主内に生存できるが、Ｄ３９のニューモリシン陰性突然変異体に対して、従来立証された現象である電撃性の疾患を誘発することはできない。
【００７２】
要するに、毒性遺伝子の調節は、熱ショックのみならず、ＣｌｐＬ及びＣｌｐＰプロテアーゼによって調節できる。ｃｌｐＬ−突然変異体の熱敏感性及び組み換えＣｌｐＬによる変性されたＲｈｏｄａｎｅｓｅのリフォールディング活性はＣｌｐＬのシャペロン機能に対する証拠を提供する。また、ｃｌｐＰはｐｌｙ及びｃｂｐＡ発現の調節に必須的な役割を果たすものと立証された。
【００７３】
実施例２：肺炎球菌におけるＣｌｐＰプロテアーゼの毒性因子発現調節及び肺炎球菌試験感染に対する免疫性
本実施例では、ＣｌｐＰが毒性を弱化させる根本的なメカニズムを調査し、ＣｌｐＰによる免疫化が毒性肺炎球菌による試験感染からマウスを保護することができるか否かを評価した。
【００７４】
１．材料及び方法
ｉ）細菌菌株、成長条件及び形質転換
細菌菌株及びプラスミドベクターは、本研究で新しく生成された組合体と共に表４に提示されている。Ｒｘ−１の誘導体である肺炎球菌ＣＰ１２００をカシトン−トリプトン(Casitone-Tryptone:ＣＡＴ)基本培地で成長させた(前記Choi et al., 1999)。肺炎球菌菌株Ｄ３９（タイプ２）をＴＨＹ(Todd Hewitt Yeast)ブロスで培養した。肺炎球菌形質転換体の選別のために、エリスロマイシンを０.２μｇ／ｍｌの濃度で成長培地に添加した。大腸菌菌株（表４のＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５ａ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）をＬＢ(Luria-Bertani)ブロスまたはＬＢ寒天で成長させた。プラスミドを、文献(前記Hanahan, D., 1983)によって記述されているように、形質転換によって大腸菌に導入した。大腸菌形質転換体の選別のために、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を成長培地に添加した。
【００７５】
【表４】
2007528839.tif 000005
【００７６】
ｉｉ）細胞培養
ヒト肺上皮癌種Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）及びマウスマクロファージＲＡＷ２６４.７細胞株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）をアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)から購入し、これらを３７℃で５％のＣＯ２下に培養させた。Ａ５４９細胞をグルコース４.５μｇ／Ｌ、１０％の牛胎児血清(ＦＢＳ; Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)及びペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Gibco BRL, Gaithersburg, Md)で培養させた。ＲＡＷ２６４.７細胞の培養のために、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及び０.２％のＮａＨＣＯ３が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地(Gibco BRL, Gaithersburg, Md)を基本培地として用い、ＦＢＳ(Gibco BRL, Gaithersburg, Md)を１０％濃度で添加した。
【００７７】
ｉｉｉ）肺炎球菌の莢膜多糖類（ＣＰＳ）標本
血液寒天プレート上で一晩中成長させた肺炎球菌（Ａ６００＝０.５）を１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）、１ｍＭのＭｇＳＯ４で再懸濁させてＤ３９及びその同種遺伝子型(isogenic)ｃｌｐＰ―突然変異誘導体のＣＰＳ標本を製作した。これはｍｌ当りの肺炎球菌数５×１０９と等量である。その１ｍｌの分取液を１０,０００×ｇでペレット化した。０.１％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸ナトリウム(Sigma, St. Louis, MD)を添加し、１５分間３７℃で培養して前記細菌を溶菌させた。次のサンプルを１００Ｕムタノリシン(Sigma)、５０μｇのＤＮａｓｅＩ(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)及び５０μｇのＲＮａｓｅＡ(Roche Applied Science)とともに３７℃で１８時間培養した。次に、サンプルを５０μｇのプロテイナーゼＫ(Sigma)とともに５６℃で４時間培養した後、−２０℃で貯蔵した。次に、ポリクロナールタイプ２多糖類特異的抗血清を使用する免疫ブロットによって細胞性物質を分析した。
【００７８】
ｉｖ）抗血清、ゲル電気泳動及び免疫ブロット
ＰｓｐＡ及びＰｄＢ（Ｐｌｙのトキソイド誘導体）に対する血清は、本質的に従来の文献(前記Ogunniyi, A. D. et al., 2000)の記載と同一に製作した。免疫ブロットのために細菌をＴＨＹでＡ６００＝０.３になるまで培養し、従来の文献(Kwon, H. Y. et al., 2003, Effect of Heat Shock and Mutations in ClpL and ClpP on Virulence Gene Expression in Streptococcus pneumoniae. Submitted to Infect. Immun)の記載と同一に製作した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１０％または１５％ポリアクリルアミドゲル)を文献(Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685)の記載と同一に行った。蛋白質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロット(electroblotting)した後、ＰｓｐＡ及びＰｄＢに対するポリクロナールマウス血清の１：５,０００希釈液と反応させた。莢膜ブロットのために、サンプルをナイロン膜上にエレクトロブロットした後、抗血清タイプ２のポリクロナールマウス血清の１：５０００希釈液と反応させた。２次抗体はアルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートされたヤギ抗−マウスＩｇＧ(Bio-Rad)の１：２０００希釈液であった。
【００７９】
ｖ）ニューモリシン検定
従来の文献(Lock, R. A. et al., 1996, Sequence variation in the Streptococcus pneumoniae pneumolysin gene affecting haemolytic activity and electrophoretic mobility of the toxin. Microb. Pathog. 21:71-83)に記載の方法を若干修正した方法によって溶血活性を決定した。簡単には、ＴＨＹブロスで指数成長期の初期−中期段階(early-mid log phase)（Ａ６００＝０.０５〜０.１）まで成長させた肺炎球菌を３９００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離させて収集し、リン酸塩緩衝食塩に再懸濁させた。デオキシコール酸ナトリウムを０.１％の最終濃度で添加した後、３７℃で１０分間培養させた。サンプルを遠心分離させた後、上澄液を回収して連続的に希釈させた。９６ウェルマイクロタイタープレートで同一体積の１.５％洗浄されたヒト赤血球（０.００１％の２−メルカプトエタノール(Merck)含有）とともに３７℃で３０分間培養して溶血活性を決定した。溶血力価はＡ５４０で５０％の赤血球が溶解される推定希釈度の逆数で決定した。
【００８０】
ｖｉ）ＲＮＡ技法
全体ＲＮＡ抽出のために培養懸濁液の１.５ｍｌ分取液を周期的に採取した。ｍＲＮＡ半減期を測定するために、リファンピシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。全体ＲＮＡを、従来の文献(前記Ogunniyi, A. D. et al., 2002)に記載されているように、高温酸フェノール法によって抽出した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ(Promega Biotech, Cat.# A1250)を用いて１段階の実時間逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙに対するｍＲＮＡ水準を定量した。これらの反応に対して特異的な内部対照（１６Ｓ ｒＲＮＡ）プライマーは、従来の文献(前記Ogunniyi et. al., 2002)に記載されている。ＲＴ−ＰＣＲ反応の準備、サイクリング条件及びデータの分析は、本質的に従来の文献(前記Kwon et. al., 2003)の記載と同一であった。全ての反応をＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ２０００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｃｙｃｌｅｒ(Corbett Research, Australia)で行った。ｍＲＮＡ半減期の分析をＳｉｇｍａＰｌｏｔ曲線当てはめプログラム（指数値の総合に対して非線形最小二乗法(non-linear least squares fitting)）によって行った。２つのモデル、すなわち１相分解または２相分解モデルが提案された。各場合に、最小偏差を有するデータを当てはめさせたモデルがより有効なものとして保有された。
【００８１】
ｖｉｉ）大腸菌におけるＣｌｐＰのクローニング、発現及び精製
ｃｌｐＰ ＯＲＦ(Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＡＥ００８４４３で塩基配列５４１６番目〜６００６番目)をＣＰ１２００ ＤＮＡから前方向及び逆方向プライマー(5'-CGA ATT CAT GAT TCC TGT AGT TAT-3': SEQ ID NO. 9、及び5'-CGA GCT CTT AGT TCA ATG AAT TGT TG-3' : SEQ ID NO. 12、プライマーはＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ部位にそれぞれ挿入される)を用いてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ断片を同一の酵素で分解させ、ｐＥＴ３０（ａ）(Novagen)の該当制限部位内にクローニングさせてプラスミドｐＥＴ３０(ａ)−ｃｌｐＰを作った（図１）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株内で０.１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を用いて３時間発現を誘導した。細胞を６,０００×ｇで１０分間遠心分離させて収集した後、プロテアーゼ抑制剤のフェニルメチル−スルホニルフルオリドが最終濃度１ｍＭで添加された溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８.０、２ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁させた。
【００８２】
その後、細胞をフレンチ圧力セル(SLM Aminco, Inc.)内で１２,０００１ｂ／ｉｎ２で溶解させ、溶解物を１００,０００×ｇで１時間遠心分離させた。Ｈｉｓ６−タグ蛋白質を含有する上澄液をニッケル−ニトリロ酢酸カラム(Probond, Invitrogen)にロードさせた後、１０カラム体積の１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾール、及び１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６.０）で洗浄した。ニッケルが結合したＨｉｓ６−タグ蛋白質を１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）緩衝液中の０〜５００ｍＭ勾配のイミダゾール３０ｍｌで溶離させ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）に対して透析させた。蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色して判断するとき、純度が＞９５％であった（データは表示せず）。
【００８３】
ｖｉｉｉ）芽細胞分画の分離及び位置測定
指数成長期の細胞を遠心分離によって収集し、スクロースによって誘導された原形質体の形成を、従来の文献(Vijayakumar, M. N. et al., 1986, Localization of competence induced proteins in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 165:689-695)に記載の方法によって行った。細胞を１Ｍのスクロース緩衝液（１Ｍのスクロース、１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７.６、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＰＭＳＦ）とともに３０℃で１時間培養させて原形質体に転換させた。１３,０００×ｇで２０分間遠心分離させて細胞壁分画（上澄液）を原形質体（ペレット）から分離させた。原形質体を１９体積の低張性(hypotonic)緩衝液(100 mM Tris HCl pH 7.6, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA)で希釈させて浸透的に溶解させた。溶解物をまず５,０００×ｇで５分間遠心分離させて未溶解細胞を除去した後、５０,０００×ｇで３０分間遠心分離させて細胞質分画（上澄液）及び細胞膜分画（ペレット）を収得した。
【００８４】
ｉｘ）リンゴ酸脱水素酵素活性の決定
リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）の酵素活性を、０.５ｍＭのオキサル酢酸塩を含有する０.１５Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７.６）の中で０.２ｍＭのＮＡＤＨの３４０ｎｍ及び２５℃での吸光度（Ａ３４０＝６.２２／ｍＭ／ｃｍ）の減少率をモニタリングして決定した。サンプルを添加した後、反応混合物を２５℃で１分４０秒間培養し、３４０ｎｍで吸光度を測定した。反応を開始するために基質を添加した。最初１分４０秒間の反応からＮＡＤＨの酸化率の初期傾斜度を用いてＭＤＨの活性を計算した。
【００８５】
ｘ）付着性及び浸透性の検定
ヒト肺Ａ５４９細胞への肺炎球菌の浸透性検定は、従来の文献(前記Vijayakumar, M. N. et al., 1986)に記載の抗生剤保護検定を変形させて行った。Ａ５４９細胞を２４ウェル組織培養プレートでコンフルアンス(confluence)的に成長させ、リン酸塩緩衝食塩（ＰＢＳ、ｐＨ７.２）で３回洗浄した後、ウェル当り培養培地（抗生剤非含有）１ｍｌを添加した。ＲタイプＣＰ１２００及びその異種遺伝子型ｃｌｐＰ−突然変異体菌株の指数期培養物（Ａ５５０＝０.３、１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁させた。単層を１０７個の細菌で感染させ（細菌：細胞比、１０：１）、細胞単層と細菌の初期接触を、８００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した後、３７℃で２時間培養して促進させた。１０μｇ／ｍｌのペニシリン及び２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する新規培地を各ウェルに添加し、このような処理が全ての細胞外細菌を死滅させるに十分であるかを確認した。その上、１時間さらに培養した後、単層をＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの０.２５％トリプシン−０.０２％のＥＤＴＡで処理してプレートから細胞を取り外した後、４００μｌのトリトンＸ−１００（０.０２５％の水溶液）を添加して溶解させた。適切な希釈液を血液寒天にプレーティングさせて生存細菌数を決定した。付着性細胞内細菌の総数を決定するために、感染した単層を前述のように洗浄した後、トリプシンで処理し、溶解させ、抗生剤処理なしで定量的にプレーティングさせた。全てのサンプルを三重(triplicate)に検定し、各検定を３回以上繰り返し行った。
【００８６】
ｘｉ）ＲＡＷ２６４.７細胞の生存
細胞単層を抗生剤非含有ＲＰＭＩ１６４０培養培地(Sigma)で１０７ＣＦＵ肺炎球菌（細胞：細胞比、１０：１）にて感染させた。細菌感染のために、培養物を３７℃で２時間培養させた。前記培養後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１０μｇ／ｍｌのペニシリン及び２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する新規培地を添加して細胞外細菌を死滅させた（検定の０時間）。感染後、様々な時期における細胞内肺炎球菌を定量化するために、上澄液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、前述のようにトリトンＸ−１００で溶解させた。各ウェルの溶解物の一連の希釈液を血液寒天上にプレーティングさせた。３７℃で２４時間培養した後、ＣＦＵの数を決定した。各細菌菌株に対して３つの独立的な検定を行った（三重検定）。対応標本または独立標本ステューダントｔ検定(paired or unpaired Student's t test)を用いて統計的分析を行った。
【００８７】
ｘｉｉ）コロニー形成研究
本研究は、最近の文献(前記Ogunniyi et al., 2003, MS in preparation)に記載の方法と本質的に同一に行った。試験感染の実施前に、細菌を１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］の馬血清を加えたＴＨ(Todd Hewitt)寒天(Difco Laboratories, USA)（必要な場合、エリスロマイシンを補充する）上で一晩中３７℃で培養させた後、ＴＨＹブロスで約４時間３７℃で成長させて約４×１０７ＣＦＵ／ｍｌ（Ａ６００＝０.１）の細菌を得た。その後、各細菌培養物をＴＨＹブロスで約１０９ＣＦＵ／ｍｌに調節し、細胞１０μｌ（約１０７ＣＦＵ）を５週齢のＣＤ１マウスの外鼻腔に接種させた。感染後１、２及び４日目に、各群のマウス４匹をランダムに犠牲させて各菌株の保菌程度を評価した。鼻咽頭、血液及び肺のサンプルを適切に滅菌ＰＢＤで連続的に希釈させ、適した抗生剤を含有する血液寒天上に二重に(duplicate)プレーティングした。プレートを９５％の空気／５％のＣＯ２の雰囲気下に３７℃で約１６時間培養した後、コロニーを計数し、複製本間の平均を求めた。
【００８８】
ｘｉｉｉ）マウスの免疫化及び血清の分析
マウスを従来の文献(前記Ogunniyi, A. D. et al, 2000)に記載されている通りに腹腔内免疫させた。５〜６週齢のＣＢＡ／Ｎマウスの雌からなる４個群（群当り１２匹）をＡｌＰＯ４単独、遺伝子変形されたＰｌｙトキソイド（ＰｄＢ）＋ＡｌＰＯ４、ＰｓｐＡ＋ＡｌＰＯ４、またはＣｌｐＰ＋ＡｌＰＯ４で腹腔内免疫させた。各マウスに１２〜１４日間隔で各蛋白質抗原１０μｇを３回投与し、３回免疫後１週目に眼窩後方の採血によってマウスから血清を採取した。血清を群別にプーリングし、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によってＰｌｙ、ＰｓｐＡまたはＣｌｐＰ特異的抗体に対して分析した。また、肺炎球菌Ｄ３９の全体細胞溶解物、または精製されたＰｌｙ、ＰｓｐＡまたはＣｌｐＰを抗原として用いるウェスタン免疫ブロットで前記血清を分析した。
【００８９】
ｘｉｖ）試験感染
最終免疫後２週目に、免疫されたマウスを猛毒性の莢膜性タイプ２菌株（Ｄ３９）で腹腔内試験感染させた。試験感染の実施前に、免疫細菌を血液寒天上で一晩中３７℃で成長させた後、肉類抽出ブロス(脳心臓注入ブロス、Difco Laboratories, USA)またはＴＨ (Todd Hewitt)ブロス(Difco Laboratories, USA)に１０％（ｖ／ｖ）の馬血清を添加した血清ブロスに接種させた。次に、細菌を３７℃で３時間静的に成長させて約１０８ＣＦＵ／ｍｌの細菌を得、接種物を試験感染容量当たり７.５×１０５ＣＦＵに調整した。血清タイプ特異的莢膜の生成は、Statens Seruminstitut(Copenhagen, Denmark)から購入した抗血清を用いて膨脹反応(quellung reaction)によって確認した。試験感染の実施後に、マウスを最初７日間４時間毎にモニタリングした後、２１日までは毎日モニタリングし、各マウスの生存時間を記録した。各群間の中間生存時間上の差異をマン・ホイットニーのＵ検定（片側）(Mann-Whitney U test, one-tailed)によって分析した。
【００９０】
２．結果
ｉ）ｃｌｐＰ−突然変異体は、マウスで持続的な感染をもたらさない
本発明者は、ｃｌｐＰ−突然変異体が著しく弱毒された毒性を示したことを立証したことがある。ｃｐｓ２Ａ、すなわち莢膜生合成遺伝子座の第１遺伝子の発現水準は、この菌株で熱ショック後に減少しなかったが、母菌株におけるｃｐｓ２Ａの発現は熱ショック後に著しく減少した。これは、全体的な毒性が減少したとしても、ｃｌｐＰ−突然変異体がストレス負荷時に宿主マクロファージに対して野生型水準の耐性を示さなければならないことを示唆する。これは慢性菌血症を引き起こすおそれがあり、この場合、細菌が宿主免疫系に浸透して宿主内で生存することができるが、Ｄ３９のニューモリシン陰性突然変異体に対して従来立証されている現象である電撃性の疾患は誘発しない。
【００９１】
このような仮説を確認するために、１０匹のマウスに１０５ｃｆｕのｃｌｐＰ−突然変異体を腹腔内注射し、感染後に眼窩後方から採血した。その結果、肺炎球菌は、感染後７日、１４日及び２１日目にいずれのマウスからも検出されておらず、これはｃｌｐＰ−突然変異が持続的な感染を引き起こさないことを示す（データは表示せず）。
【００９２】
ｉｉ）ｍＲＮＡ半減期の決定
本発明者は、ｃｌｐＰ−突然変異体において、熱ショック後にｐｌｙ ｍＲＮＡ発現は増加したが、同時にＰｌｙ蛋白質及びＰｌｙ溶血活性は増加しなかったことを最近立証した。ところが、野生型では、熱ショック後にｐｌｙ ｍＲＮＡ水準だけでなく、Ｐｌｙ蛋白質及び溶血活性が全て著しく増加した(前記Kwon, H. Y. et al., 2003)。
【００９３】
このような不一致は、ｃｌｐＰ−突然変異体では高温でｐｌｙ ｍＲＮＡが不安定であるためかも知れない。したがって、熱ショック(Heat Shock, ＨＳ)後に、ｐｌｙ ｍＲＮＡ分解動力学を調査した。３０℃でｍＲＮＡの安定性を比較するために、リファンピシンを添加してｍＲＮＡのｄｅ ｎｏｖｏ合成を遮断し、その分解をｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙ特異的プライマーを使用する実時間ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした（図１１ａ）。３０℃でｍＲＮＡ半減期を決定するために、肺炎球菌菌株をまず３０℃で成長させた後、リファンピシンを添加した。リファンピシンを添加する前（３０℃）とリファンピシンを添加した後１０分（Ｒ１０ｍ）及び２０分（Ｒ２０ｍ）目に、ＲＮＡ抽出物に対する分取液を除去した（図１１ａ）。熱ショック後にｍＲＮＡ半減期を決定するために、肺炎球菌菌株を３０℃で成長させた後（３０℃）、４２℃で熱ショックを加えた。４２℃で１０分後に、リファンピシンを添加した（ＨＳ）。熱ショック前後と４２℃でリファンピシンを添加した後、１０分（Ｒ−１０ｍ）及び２０分（Ｒ−２０ｍ）目に、ＲＮＡ抽出物に対する分取液を除去した（図１１ｂ）。ｍＲＮＡ半減期に及ぼす熱ショックの影響を決定するために、肺炎球菌菌株を３０℃で成長させ（３０℃）リファンピシンで１０分間処理した後、４２℃で熱ショックを加えた。ＲＮＡ抽出物に対する分取液を、３０℃でリファンピシンを添加する前及び後１０分に引き抜いた後（Ｒ−１０ｍ）、熱ショック後１０分（Ｒ＋ＨＳ１０ｍ）及び２０分（Ｒ＋ＨＳ１０ｍ）に除去した（図１１ｃ）。ＲＮＡ抽出物間に個別的なｍＲＮＡ種の水準を内部１６Ｓ ｒＲＮＡ対照に対して得た水準を参照して補正した。データポイントは、各ＲＮＡ抽出物の４重サンプルの平均±標準偏差を示す。分解動力学を比較した結果、野生型及びｃｌｐＰ−突然変異体のｐｌｙ ｍＲＮＡの半減期は、それぞれ２.７５分及び５.８分であった。これは、３０℃で突然変異体のｐｌｙの半減期が野生型の半減期に比べて２.１倍さらに長いことを意味する（表５）。ところが、３０℃で、ｃｌｐＰ−突然変異体におけるｃｐｓ２Ａ ｍＲＮＡの分解は母菌株の分解と比較して只１.３１倍に過ぎなかった（図１１ａ及び表５）。このような結果は、ＣｌｐＰプロテアーゼが知られていない方式によって３０℃でｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙ ｍＲＮＡを分解させることができることを示唆する。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
ｍＲＮＡ半減期の測定のために、リファンピシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加し、培養懸濁液１.５ｍｌを１０分間隔で取って高温フェノール法を用い、これから全体ＲＮＡを抽出した。その後、実時間ＲＴ-ＰＣＲによってｍＲＮＡ水準を決定した。指数値の総合に非線形最小二乗させてｍＲＮＡ半減期を分析した。全ての実験は４重に行った。熱ショック後に転写体の安定性を比較するために、肺炎球菌細胞をまず３０℃で成長させた後、温度を４２℃に変化させた。全体ＲＮＡは、４２℃でリファンピシンを添加して１０分及び２０分を経過した後だけでなく、４２℃でリファンピシン添加直前に作られた。熱ショック後に、ｃｌｐＰ−突然変異体のｐｌｙ ｍＲＮＡ水準は７.５倍増加したが（図１１ｂ）、Ｐｌｙ蛋白質の水準は増加しておらず（データは表示せず）、これは本発明者の以前の結果を確証した。分解動力学のデータによれば、母菌株及びｃｌｐＰ−突然変異体でｐｌｙ転写体の半減期がそれぞれ１.７５分及び３.７５分であり、これは、熱ショック後にｃｌｐＰ−突然変異体でｐｌｙ ｍＲＮＡが母菌株に比べて２.１倍さらに遅く分解されることを意味する。さらに、母菌株及びｃｌｐＰ−突然変異体においてｃｐｓ２Ａ転写体の半減期はそれぞれ２.０分及び４.１分であり、これは熱ショック後にｃｌｐＰ−突然変異体でｃｐｓ２Ａ ｍＲＮＡが母菌株に比べて２.０５倍さらに遅く分解されることを意味する（図１１ｂ）。
【００９６】
熱ショック後に、ｐｌｙ及びｃｐｓ２Ａ ｍＲＮＡ転写体の半減期が３０℃で母菌株及びｃｌｐＰ−突然変異体の場合に比べて短くなったことを考慮すると、ｍＲＮＡ種が１６Ｓ ｒＲＮＡに比べて４２℃でさらに迅速に分解され易いか、或いはＣｌｐＰ以外のＨＳＰによってさらに迅速に分解されることが可能である。したがって、本発明者は、熱ショックそれ自体がｐｌｙ ｍＲＮＡの半減期に影響を及ぼすことができるか否かを調査した。ｐｌｙ ｍＲＮＡ半減期に対する熱ショックの影響を究明するために、３０℃で培養した細胞をリファンピシンで処理した後、熱ショックを加え、ｍＲＮＡの分解動力学をＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定した。このような条件の下で、ｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙ転写体は、両方とも母菌株及びｃｌｐＰ−突然変異体で２０分以上安定であった（図１１ｃ）。これは３０℃で観察されたシナリオと相反した（図１１ａ）。このような結果は転写体が４２℃で熱ショックによって実際安定化されることを立証した（図１１ｃ）。
【００９７】
ｉｉｉ）Ｐｌｙの溶血活性はＣｌｐＰによって活性化されない
ＣｌｐＰの脱安定化作用は、ｐｌｙプロセス産物及びｐｌｙ１次転写体の低い安定性をもたらすことが可能である。ｐｌｙ ｍＲＮＡが熱ショックによって安定化されたとしても、Ｐｌｙ蛋白質の量またはその溶血活性の水準で相応する増加はなかった。このような不一致は、Ｐｌｙが直接ＣｌｐＰプロテアーゼによって活性化され、溶血活性が母菌株では増加することができるが、ｃｌｐＰ−突然変異体では増加することができないためである。
【００９８】
このような仮説を立証するために、肺炎球菌細胞を３０℃で培養した後、４２℃で２０分間熱ショックを加えた。前記細胞を０.１％のデオキシコール酸ナトリウムと共に３７℃で１０分間培養して溶解させた。次に、細胞溶解物をさらに３７℃で２０分、４０分及び６０分間培養し、Ｐｌｙの溶血活性を決定した。野生型及びｃｌｐＰ−突然変異体の両方ともにおいて、溶血活性は前記期間中に減少し、３７℃でｃｌｐＰ−突然変異体における溶血力価は母菌株における溶血力価と有意差はなかった。これはＣｌｐＰプロテアーゼがＰｌｙの溶血活性の活性化に必要でないことを示唆する（データは表示せず）。
【００９９】
ｉｖ）熱ショック後のＣｌｐＰの移動
抗−ｈｓｐ１００抗体を使用する免疫金標識法(immunogold labeling)によってｈｓｐ１００の位置を測定した結果、ｈｓｐ１００は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)で熱ショック前後に細胞質及び核に位置するものと明らかになった(Fujita, K. et al., 1998, Hsp104 responds to heat and oxidative stress with different intracellular localization in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 248: 542-547)。バシラス・サブティラス(B. subtilis)では、抗体を用いた免疫金標識結果、ＣｌｐＣ及びＣｌｐＸ ＡＴＰａｓｅが細胞外皮(envelope)及び細胞内部から検出され(Kruger, E. et al., 2000, The clp proteases of Bacillus subtilis are directly involved in degradation of misfolded proteins. J. Bacteriol. 182: 3259-3265)、これはｈｓｐ１００、ＣｌｐＣ及びＣｌｐＸ蛋白質が熱ショック処理中に蛋白質凝集体と密接に関連があることを示唆する。
【０１００】
本発明者は、肺炎球菌におけるＣｌｐＰの位置を調べるために、莢膜菌株を用いてまず芽細胞蛋白質の分画化(fractionation)を試みた。ところが、１Ｍのスクロース緩衝液中で細胞を培養した後遠心分離した結果、厚い莢膜の存在によって細胞壁が原形質体から分離されなかった（データは表示せず）。したがって、莢膜のない菌株を位置測定実験に使用した。分画法は、熱ショック中または熱ショック後に細胞質内容物の部分的な溶解または漏洩を生じさせる可能性があるため、ＭＤＨを内部細胞質マーカーとして使用した。細胞壁におけるＭＤＨ活性は３０℃で全体ＭＤＨ活性の１０％未満であった（データは表示せず）。さらに、細胞壁におけるＭＤＨの活性は、熱ショック以後にも増加しなかった（データは表示せず）。これは熱ショックが細胞膜の溶解または漏洩を生じさせないことを示唆する。
【０１０１】
指数成長期の肺炎球菌ＣＰ１２００細胞を４２℃に２０分間露出させて熱ショックを加えた後、細胞蛋白質を、スクロースで原形質形成を誘導した後、低張性緩衝液（材料及び方法編を参照）で溶解させて細胞壁、細胞膜及び細胞質に分画化した。次に、ＣｌｐＰを可視化するために、ポリクロナール抗−ＣｌｐＰ抗体（ウサギにＣｌｐＰ蛋白質をａｌｕｍと混ぜて２週間隔で３回皮下注入した後、血清を採取して得る）を使用する免疫ブロットで芽細胞分画を分析した。ＣｌｐＰは、３０℃では細胞質分画から主に検出されたが、細胞壁分画からはさらに少量検出された。ところが、熱ショック後には、細胞質及び細胞壁の両方ともにおいてＣｌｐＰの量が増加し（図１４）、これはＣｌｐＰが正常温度で誘導されるが、熱ショック後にはさらに誘導されることを意味する。図１４において、Ｗ：細胞壁、Ｍ：細胞膜及びＣ：細胞質を意味する。このような結果は、熱ショック後に相当量のＣｌｐＰが細胞壁として用いることができるため、ＣｌｐＰが細胞壁にある重要な役割を行うことができ、或いは蛋白質の分解に関与することができることを示唆する。
【０１０２】
ｖ）ｃｌｐＰ−突然変異体のコロニー形成及び肺浸透性に対する結果
従来では、ｃｌｐＰ−突然変異体はマウス敗血症モデルで毒性が非常に弱化された(前記Kwon, H. Y. et al., 2003)。しかも、ｃｌｐＰ−突然変異体は、器官内試験感染後にマウスの肺に著しい水準でコロニーを形成せず、４８時間の感染中に、死亡は記録されなかった(前記Robertson, G. T. et al., 2002)。ところが、肺炎球菌の侵入及び伝播は、その自然適所である鼻咽頭を介して行われるようである。
【０１０３】
したがって、鼻腔内試験感染後に肺炎球菌のコロニー形成に対するＣｌｐＰの影響を評価した。非常に毒性の強い莢膜タイプ２菌株（Ｄ３９）及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ−突然変異体（ＨＹＫ３０２）で鼻腔内感染させた結果、ｃｌｐＰ−突然変異体は、４８時間鼻粘膜及び肺に全くコロニーを形成していないと示された（図１２ａ〜図１２ｃ）。これは付着性の欠陥を示唆する。
【０１０４】
また、肺炎球菌のＣｌｐＣは付着性と関連があるものと明らかになった(Charpentier, E., R. Novak, and E. Tuomanen. 2000. Regulation of growth inhibition at high temperature, autolysis, transformation and adherence in Streptococcus pneumoniae by clpC. Mol Microbiol 37:717-726)。リステリア(Listeria)及びエルシニア(Yersinia)において、ｃｌｐＣ (Rouquette, C., C. de Chastellier, S. Nair, and P. Berche. 1998. The ClpC ATPase of Listeria monocytogenes is a general stress protein required for virulence and promoting early bacterial escape from the phagosome of macrophages. Mol. Microbiol. 27: 1235-1245)、ｃｌｐＥ (Nair, S., C. Frehel, L. Nguyen, V. Escuyer, and P. Berche. 1999. ClpE, a novel member of the HSP100 family, is involved in cell division and virulence of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 31: 185-196)及びｃｌｐＰ (前記Pederson, K. J. et al., 1997)の突然変異体は、宿主上皮細胞に対する付着性が減少したものと示された。
【０１０５】
したがって、宿主上皮細胞に対する付着性においてＣｌｐＰの関連性を調査した。多糖類莢膜の存在が宿主細胞の表面に対する肺炎球菌の付着性を著しく弱化させるために、本発明者は、Ｒタイプ菌株を用いて付着及び浸透性に対するｃｌｐＰ―突然変異の影響を決定した。ＲタイプｃｌｐＰ欠失突然変異体ＨＹＫ２は、その同種遺伝子型母菌株と比較してＡ５４９ヒト肺細胞に対する付着及び浸透性に有意差を示さなかった（データは表示せず）。したがって、このような結果は、コロニーが形成できなかったことが付着性または浸透性の欠陥に起因するものではないことを示唆する。
【０１０６】
ｖｉ）マウスマクロファージＲＡＷ２６４.７細胞株におけるｃｌｐＰ突然変異体の生存減少
肺胞マクロファージは、肺炎球菌の侵入に対する宿主防御における１次的な要素である。(Knapp, S. et al., 2003, Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167:171-179)。本研究において、ｃｌｐＰ−突然変異体は、その母菌株に比べて鼻粘膜のコロニー形成において欠陥があるものと観察されたため、これは、突然変異体がさらに遅く成長するうえ、肺炎球菌が迅速に除去(clearance)されるためであると推論された。
【０１０７】
したがって、マウスマクロファージＲＡＷ２６４.７細胞におけるｃｌｐＰ−突然変異体の生存率を決定した（図１３）。ＲＡＷ２６４.７細胞の単層をＲＰＭＩ１６４０培地中の約１０７ＣＦＵの肺炎球菌（細菌：細胞比＝１０：１）で感染させた後、相違した時点で取ってゲンタマイシンを処理した後、細胞内肺炎球菌を定量化した。各細菌菌株に対して３つの独立検定を３重に行った。Ｄ３９母菌株は、検定過程中（８時間）にマクロファージ内で生存することができ、１６０ＣＦＵの水準に維持された反面、回復可能なｃｌｐＰ−突然変異体の数は８時間の感染後に引き続き減少して０になった（図１３）。マクロファージ細胞内においてｃｌｐＰ−突然変異体の生存率が母菌株より感染５（Ｐ＜０.０１）、６（Ｐ＜０.０５）、８（Ｐ＜０.０１）時間後有意的に減少した（図１３）。抗生剤を添加して２時間が経過した時、生存細胞の数は、抗生剤が添加された時点で存在する数の約半分になるであろう。ところが、実際ＣＦＵの数は予測より一層少なく、このような事実はｃｌｐＰ−突然変異体の成長欠陥であるよりは、ｃｌｐＰ−突然変異体のマクロファージに対するストレス敏感性形質または感受性のためであることを示す。これはＣｌｐＰがＲＡＷ２６４.７細胞で細胞内の生存に必要であることを示唆する。
【０１０８】
ｖｉｉ）ｃｌｐＰ突然変異体のｃｐｓ水準は野生型菌株と類似である
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescence)のｃｌｐＰ−突然変異体において、菌膜水準は著しく減少した(Lemos, J. A., and R. A. Burne. 2002. Regulation and physiological significance of ClpC and ClpP in Streptococcus mutans. J. Bacteriol. 184:6357-6366)。したがって、これらの突然変異体において、ｃｐｓの量は母菌株タイプの場合に比べてさらに低いものと考慮された。
【０１０９】
これが肺炎球菌にも該当するか否かを調査するために、Ｄ３９及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ−突然変異体を使用し、ポリクロナールタイプ２多糖類特異的抗血清を使用する免疫ブロット分析によってｃｐｓの量を決定した。２つの培養物を同一の光学密度に調整して菌株の成長能力の偏差による差異が観察される可能性を排除させた。母菌株（Ｄ３９）及びｃｌｐＰ−突然変異体（ＨＹＫ３０２）の両方ともにおいて、同量のｃｐｓが検出された（データは表示せず）。これは、ｃｌｐＰ−突然変異体の毒性弱化はｃｐｓ水準がより低いためではなかったことを示す。
【０１１０】
ｖｉｉｉ）マウスにおいてＣｌｐＰによる肺炎球菌試験感染から保護
ＨＳＰは一部病原体で抗原として機能し、これら蛋白質は感染性疾患に対する防御機能をするものと知られた。また、ＣｌｐＰが熱ショック後に細胞壁へ移動するので、肺炎球菌試験感染に対する前記蛋白質の防御誘導能を評価した。
【０１１１】
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ニトロセルロース上にエレクトロブロットした。次に、これらを前記蛋白質で免疫させたマウス群から収得した血清と反応させた。図１５ａ及び図１５ｂは、その結果を示す。図１５ａ及び図１５ｂにおいて、レーン１〜４のニトロセルロース膜のストリップは、それぞれＡｌＰＯ４アジュバント（レーン１）、ＰｄＢ＋ＡｌＰＯ４（レーン２）、ＰｓｐＡ＋ＡｌＰＯ４（レーン３）、及びＣｌｐＰ＋ＡｌＰＯ４（レーン４）で免疫させたマウスから得た血清と反応させた結果である。ＣｌｐＰで免疫させたマウスは、抗原に対して強い特異的な抗体反応を誘導し、精製されたＣｌｐＰで免疫させたマウスのプーリングされた血清のＥＬＩＳＡ力価は８,４００±２２５０であり、これを精製されたＰｄＢで免疫させたマウスから得た力価（８,０００±６００）及び精製されたＰｓｐＡで免疫させたマウスから得た力価（８,３００±２,４００）と比較した。明礬（ＡｌＰＯ４）アジュバント単独で免疫させたマウスは、検出限界１００の力価を示した。Ｄ３９の全体細胞溶解物に対する血清のウェスタン免疫ブロット結果も各抗原に対する抗体反応の特異性を立証した（図１５ａ）。血清は精製されたそれぞれの蛋白質と特異的に反応した（図１５ｂ）。ところが、精製されたＣｌｐＰの場合、若干の蛋白質分解産物が観察された。
【０１１２】
能動免疫／試験感染実験において、マウスを約７×１０５ＣＦＵのＤ３９で試験感染させた。２匹のＣＢＡ／Ｎマウス群を、表示された抗原で免疫化させ、３回免疫後２週目に約７.５×１０５ＣＦＵの莢膜タイプ２菌株Ｄ３９で試験感染させた。その結果を図１６に示した。図１６において、各データポイントはマウス１匹を示し、水平線は各群に対する中間生存時間を意味する。ＣｌｐＰの投与を受けたマウスに対する中間生存時間は約２日であった（図１６）。これは明礬アジュバントを単独で投与されたマウスに比べて有意的に長かった（Ｐ＜０.０１）。同様に、ＰｓｐＡの投与を受けたマウスに対する中間生存時間（２日）は、明礬アジュバントを単独で投与されたマウスに比べて有意性のある程度に長かった（Ｐ＜０.００１）。ＰｄＢ（ニューモリシントキソイド）の投与を受けたマウスの場合、中間生存時間は約２.５日であった。また、これは明礬アジュバントを単独で投与されたマウスに比べて有意的に長かった（Ｐ＜０.００１）。ところが、ＣｌｐＰを投与されたマウスに対する中間生存時間を、ＰｄＢまたはＰｓｐＡを用いて得られた結果と比較したとき、有意すべき差はなかった。
【０１１３】
３．検討
本研究の目的は、肺炎球菌性疾患の発病において熱ショック蛋白質ＣｌｐＰの役割を評価しようとすることにある。本発明者は、熱ショック後にｃｌｐＰ−突然変異体においてｐｌｙ ｍＲＮＡ発現は増加するが、Ｐｌｙの量または溶血活性が同時に増加しなかったことを立証した。このような矛盾は、ｃｌｐＰ−突然変異体においてｐｌｙ及びｃｐｓ２Ａ ｍＲＮＡが３０℃及び４２℃の両方ともで安定しているので、ＣｌｐＰが転写体の分解に対する寄与因子であることにあると思われる。しかも、熱ショック後にｃｌｐＰ−突然変異体においてｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙ ｍＲＮＡの両方ともの半減期が野生型の場合に比べて２倍以上さらに長かった。これは、熱ショック後にｍＲＮＡ種の半減期は、ＣｌｐＰの不在下に増加することを明確に示す。Ｐｌｙの溶血活性は、３７℃で細胞溶解物の培養によってさらに増加されなかった。これはＣｌｐＰがＰｌｙの溶血活性の活性化に対する直接的な原因ではないことを示す。本発明者は、このような発見からｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙ ｍＲＮＡが転写後水準でＣｌｐＰによって分解されるが、これに対する特定のメカニズムはまだ不明であると結論付けた。
【０１１４】
肺炎球菌において、ｃｐｓは重要な毒性因子であり、食細胞作用に対する抵抗性を提供する(Austrian, R. 1981. Some observations on the pneumococcus and on the current status of pneumococcal disease and its prevention. Rev. Infect. Dis. 3(Suppl.):S1S17)。ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans)でｃｌｐＰ−突然変異を形成させた結果、菌膜形成が８０％減少したが(Lemos, J. A., and R. A. Burne. 2002. Regulation and physiological significance of ClpC and ClpP in Streptococcus mutans. J. Bacteriol. 184:6357-6366)、肺炎球菌のｃｌｐＰ−突然変異体においてｃｐｓの量は野生型と同一である。したがって、マクロファージ内でｃｌｐＰ−突然変異体の生存率が減少し、鼻粘膜にコロニーが形成されなかったことは、ｃｐｓ水準に起因するものではなく、３０℃及び３７℃の両方ともで成長が減少したためであると思われる(前記Kwon, H. Y. et al., 2003)。また、これは、正常的にＣｌｐＰプロテアーゼに対する標的になる変性蛋白質の蓄積によるストレス敏感性形質に起因するものであるかも知れない。一部病原体において、ＨＳＰは細胞の表面上に存在し、宿主細胞への付着を媒介することができる(Marcellaro et., 1998; 59, 60)。
【０１１５】
肺炎球菌(前記Charpentier, E. et al., 2000)及びリステリア・モノサイトゲネス(L. monocytogenes) (Nair, S., E. Milohanic, and P. Berche. 2000. ClpC ATPase is required for cell adhesion and invasion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 68: 7061-7068)において、ＣｌｐＣは細胞付着性及び毒性因子の発現に必要なものと明らかになり、肺炎球菌ＣｌｐＣ突然変異体はヒトタイプＩＩ肺胞細胞に対する付着性欠陥を示し、ニューモリシンまたはコリン結合蛋白質ＣｂｐＡ、ＣｂｐＥ、ＣｂｐＦまたはＣｂｐＪを発現させなかった。これはＣｌｐＣが付着性に対して多面発現効果(pleiotropic effect)を示すことを示唆する(前記Charpentier et. al. 等)。本研究において、本発明者は、肺炎球菌のｃｌｐＰ−突然変異体の宿主細胞に対する付着及び浸透性は影響を受けなかったことを立証した（データは表示せず）。これは、ＣｂｐＡ及びＰｓａＡのような蛋白質の発現において反作用に起因するかも知れない。熱ショック後に、付着性の純減少を示していないｃｌｐＰ−突然変異体において、ＣｂｐＡの発現は増加した反面、ＰｓａＡの発現はｍＲＮＡ及び蛋白質水準の両方ともで著しく減少した(前記Kwon et al. 等)。
【０１１６】
ｈｓｐ７０及びｈｓｐ１００ファミリーの分子シャペロンは、位置移動複合体と結合するものと明らかになり、これは位置移動前駆体と相互作用する(Berry, A.M. et al., 1989, Reduced virulence of a defined pneumolysin negative mutant of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 57:2037-2042; 前記Vijayakumar, M. N. et al., 1986)。最近、バシラス・サブティラス(B. subtilis)ＣｌｐＣ及びＣｌｐＸ ＡＴＰａｓｅが細胞外皮及び細胞質から検出された(前記Kruger, E. et al., 2000)。このような研究において、熱ショック後にまたは他のストレスによってＣｌｐ蛋白質それ自体の移動は立証されなかった。ところが、本研究では、肺炎球菌の生化学的分画化結果、熱ショック後に細胞壁分画でＣｌｐＰ量が相当増加するものと現われた。したがって、ＣｌｐＰは熱ショック後に細胞壁分画へ移動するものと明らかになった最初のＣｌｐ蛋白質であり、この蛋白質は宿主細胞と相互作用し、或いは輸送／移動される予定の肺炎球菌蛋白質を分解させることにより相互作用する。
【０１１７】
細菌ＨＳＰは、感染中に誘導され、細胞内蛋白質の適したフォールディングに作用する以外にも付着及び浸透性を媒介する(前記Charpentier等, 2000; 前記Nair等, 2000; Parsons, L. M., et al., 1997, Alterations in levels of DnaK and GroEL result in diminished survival and adherence of stressed Haemophilus ducreyi. Infect. Immun. 65:2413-2419)。本研究において、本発明者は、毒性Ｄ３９で試験感染させる前に精製された肺炎球菌ＣｌｐＰでマウスを免疫させると、特性が良く究明された肺炎球菌蛋白質ワクチン候補物のＰｓｐＡ及びＰｌｙから得られる水準と対等な水準で全身性疾患に対する防御的免疫性が誘導されることを立証した。試験感染前に免疫されたマウスで強い抗原特異的抗体反応が生成されたという事実は、前記防御が少なくとも部分的に抗体によって媒介できることを示唆する。結論的に、ｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙの発現は、転写後の水準でＣｌｐＰによって媒介できる。ＣｌｐＰは、熱ショック後に細胞壁へ移動し、毒性肺炎球菌試験感染前に精製された蛋白質でマウスを免疫させた結果、全身性疾患に対する防御的免疫性が提供された。
【０１１８】
実施例３：肺炎球菌ＣｌｐＰとヒトＣｌｐＰの反応性検討
ｉ）菌株及び培養
多糖類カプセルのない非病原性肺炎球菌（Ｒタイプ）ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)ＣＰ１２００(前記Choi等、1999)菌株をＣＡＴ培地(Casitone 1%、Tryptone 0.5%、NaCl 0.5%、Yeast Extract 0.1%、0.175 M K2HPO4、及び glucose 0.2%)で培養し、多糖類カプセルを含有する病原性肺炎球菌Ｄ３９(type 2; Avery Avery, O.T. et al., 1944. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79:137-158)と臨床で分離したＳｐｎ１０４９菌株（韓国の三星医療院で患者から分離された肺炎球菌であって、Optochinと胆汁酸に敏感であり、血液寒天培地で不完全溶血反応を示す）は、０.５％の酵母抽出物(yeast extract)を添加したＴＨ(Todd-Hewitt)ブロス培地で培養した。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)（ＡＴＣＣ ２８７）は、グルコースが２％含まれたＹＮＢ培地(Difco Laboratories, USA)で、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus) (ＫＣＴＣ ３７７８)は、ＭＲＳ培地(Difco Laboratories, USA)で、バシラス・サブティラス(Bacillus subtilis)Ｍａｒｂｕｒｇ菌株(Boylan SA, Chun KT, Edson BA, Price CW. Early-blocked sporulation mutations alter expression of enzymes under carbon control in Bacillus subtilis. Mol Gen Genet. 212(2):271-280 (1988))、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) (ＡＴＣＣ １５５２２)、チフス菌 (Salmonella typhi) (ＡＴＣＣ ２７８７０)、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ(Bethesda Research Laboratory)はＮｕｔｒｉｅｎｔ培地(Difco Laboratories, USA) で、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９(ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５)は１０％のＦＢＳと２％のペニシリンストレプトマイシン(penicillin streptomysin)含有のＤＭＥＭ培地(Gibco BRL)でそれぞれ培養した。 
【０１１９】
ｉｉ）免疫ブロット分析
肺炎球菌のＣｌｐＰと他の生物体蛋白質との類似性を確認するために、抗ＣｌｐＰ抗体と免疫ブロットを行った。肺炎球菌といろいろの生物体の溶解液を１０％のポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転移させた後、抗ＣｌｐＰ抗体と免疫ブロットした後、酵素で標識された２次抗体(secondary antibody)を用いて検索した。すなわち、ニトロセルロースを、２％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝塩水(Tris-buffered saline) (ＴＢＳ; 50 mM Tris, 150 mM NaCl [pH 7.2]) 溶液で処理して非特異的な抗原−抗体反応をブロッキングさせた後、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ溶液でウサギ抗−ＣｌｐＰ抗血清と室温で１時間徐々に揺すりながら 反応させた。ＨＲＰ(Horse radish peroxidase)−コンジュゲーションヤギ抗−ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を２次抗体(secondary antibody)として用いて、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ溶液で１：１０００にて希釈して反応させ、過酸化水素と９５％のエタノールで溶解されたＮ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−４メチルベンジジンをそれぞれ基質と発色剤で反応させた。
【０１２０】
ｉｉｉ）ＣｌｐＰ蛋白質のアミノ酸配列比較
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ(NCBI, U.S.A.)から提供するＢＬＡＳＴ検索を用いて肺炎球菌ｃｌｐＰと隣接した遺伝子を確認し、かつ他の生物体のＣｌｐＰ蛋白質との類似性を確認した。ＢＬＡＳＴ検索を行ったとき、肺炎球菌ｃｌｐＰの塩基配列から類推されたアミノ酸配列は、他の生物体のＣｌｐＰと高い類似性を示した。特に、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)とストレプトコッカス・アガラクチェ(Streptococcus agalactiae)のＣｌｐＰ蛋白質とはそれぞれ８８％及び８７％一致し(identity) 、９１％及び９２％の類似性(similarity)を示した。また、ラクトコッカス・ラクチス(L. lactis)ＣｌｐＰと８９％、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)ＣｌｐＰと８１％、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ＣｌｐＰと７９％、バシラス・サブティラス(B. subtilis)ＣｌｐＰと７５％の類似性をそれぞれ示す。特に、ホモサピエンス(Homo sapiens) とは７０％の類似性を示した。ＣｌｐＰ蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果、全体的に高い水準の類似性を示し、特にセリンプロテアーゼの活性部位として推定されるセリン−９６、ヒスチジン−１２１、アスパテート−１７２残基部分が非常に高い水準の保存性を示した。
【０１２１】
ｉｖ）肺炎球菌ＣｌｐＰと他のＣｌｐＰメンバーとの類似性
現在、肺炎球菌ＤｎａＫは、抗原性が高く(Hamel J, Martin D, Brodeur BB. Heat shock response of Streptococcus pneumoniae: identification of immunoreactive stress proteins. Microb Pathog. 23(1):11-21 (1997))、肺炎球菌ＤｎａＫ抗体がヒト蛋白質と反応せず(Kim SW, Choi IH, Kim SN, Kim YH, Pyo SN, Rhee DK. Molecular cloning, expression, and characterization of dnaK in Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 161(2):217-224 (1998))、ワクチン候補物質として評価されているので、ＣｌｐＰに対してもこのような可能性を調査した。まず、ＣｌｐＰ蛋白質が他の生物体のＣｌｐＰファミリーと類似であるか否かを確認するために、他の細菌または高等生物体の細胞溶解液と免疫ブロットを行った。予想とは異なり、グラム陽性菌であるストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus, Sth)と肺炎球菌Ｄ３９（Ｄ３９）及び臨床で分離された肺炎球菌（Ｓｐｎ１０４９）とは反応したが、Ｅ.ｃｏｌｉ（Ｅｃｏ）、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae, Ｓｃｅ)、バシラス・サブティラス(B. subtilis, Ｂｓｕ)、シュードモナス・アエルギノーサ(Psuedomonas aeruginosa, Ｐａｅ)、チフス菌(Salmonella typhi, Ｓｔｙ)及びヒト肺癌細胞株Ａ５４９の細胞蛋白質とは全く反応しなかった。その結果を図１７ａ及び図１７ｂに示した。このような結果は、肺炎球菌のＣｌｐＰ蛋白質がＤｎａＫのようにワクチン候補物質として使用できることを提示する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】ｐＥＴ３０（ａ）−ＣｌｐＰ発現ベクターの構造を示す図である。
【図２】ｐＫＨＹ００４発現ベクターの構造を示す図である。
【図３】肺炎球菌ｃｌｐＬ遺伝子座の相対的位置を示す図である。
【図４ａ】肺炎球菌における熱ショック後の熱ショック蛋白質の一時的誘導及び安定性に関する実験結果を示す図である。
【図４ｂ】肺炎球菌における熱ショック後の熱ショック蛋白質の一時的誘導及び安定性に関する実験結果を示す図である。
【図４ｃ】肺炎球菌における熱ショック後の熱ショック蛋白質の一時的誘導及び安定性に関する実験結果を示す図である。
【図５ａ】熱ショック後にＣｌｐＬが引き続き増加することを示す図である。
【図５ｂ】熱ショック後にＣｌｐＬが引き続き増加することを示す図である。
【図６ａ】肺炎球菌Ｄ３９及びそのｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体の成長を示す図である。
【図６ｂ】肺炎球菌Ｄ３９及びそのｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体の成長を示す図である。
【図６ｃ】肺炎球菌Ｄ３９及びそのｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体の成長を示す図である。
【図７ａ】肺炎球菌１２００のｃｌｐＰ−突然変異体におけるＣｌｐＬの誘導結果を示す図である。
【図７ｂ】肺炎球菌１２００のｃｌｐＰ−突然変異体におけるＣｌｐＬの誘導結果を示す図である。
【図８】熱ショックによる毒性関連遺伝子の誘導を示す図である。
【図９】肺炎球菌Ｄ３９、ｃｌｐＬ−及びｃｌｐＰ−突然変異体で熱ショック前後に実時間ＲＴ−ＰＣＲによって測定したｃｂｐＡ、ｃｐｓ２Ａ、ｐｌｙ及びｐｓａＡの相対ｍＲＮＡ濃度を示す図である。
【図１０】腹腔内試験感染後のマウスの生存時間を示す図である。
【図１１ａ】ｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙの相対ｍＲＮＡの安定性を実時間ＲＴ−ＰＣＲによって検出した結果を示す図である。
【図１１ｂ】ｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙの相対ｍＲＮＡの安定性を実時間ＲＴ−ＰＣＲによって検出した結果を示す図である。
【図１１ｃ】ｃｐｓ２Ａ及びｐｌｙの相対ｍＲＮＡの安定性を実時間ＲＴ−ＰＣＲによって検出した結果を示す図である。
【図１２ａ】肺炎球菌Ｄ３９及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ−誘導体で鼻腔内試験感染させた後、４日間のＣＤ１マウスの鼻咽頭からの細菌回復について評価した結果を示す図である。数値は平均±各時点に対する平均（ｎ＝５）の標準誤差である。
【図１２ｂ】肺炎球菌Ｄ３９及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ−誘導体で鼻腔内試験感染させた後、４日間のＣＤ１マウスの鼻咽頭からの細菌回復について評価した結果を示す図である。数値は平均±各時点に対する平均（ｎ＝５）の標準誤差である。
【図１２ｃ】肺炎球菌Ｄ３９及びその同種遺伝子型ｃｌｐＰ−誘導体で鼻腔内試験感染させた後、４日間のＣＤ１マウスの鼻咽頭からの細菌回復について評価した結果を示す図である。数値は平均±各時点に対する平均（ｎ＝５）の標準誤差である。
【図１３】マクロファージ細胞における肺炎球菌ｃｌｐＰ−突然変異体の生存率を示す図である。
【図１４】熱ショック後のＣｌｐＰの転移を示す図である。
【図１５ａ】蛋白質抗原に対する抗体反応の特異性を示す、肺炎球菌Ｄ３９の全体細胞溶解物（図１５ａ）及びＰｄＢ（５３ｋＤａ）、ＰｓｐＡ断片（４３ｋＤａ）及びＣｌｐＰ（２１ｋＤａ）の精製された製造物（図１５ｂ）のウェスタン免疫ブロット分析を示す図である。
【図１５ｂ】蛋白質抗原に対する抗体反応の特異性を示す、肺炎球菌Ｄ３９の全体細胞溶解物（図１５ａ）及びＰｄＢ（５３ｋＤａ）、ＰｓｐＡ断片（４３ｋＤａ）及びＣｌｐＰ（２１ｋＤａ）の精製された製造物（図１５ｂ）のウェスタン免疫ブロット分析を示す図である。
【図１６】肺炎球菌ＣｌｐＰ及び既存の知られた抗原蛋白質で３回免疫させた後、毒性のあるＤ３９菌株を腹腔内試験感染させたときのマウスの生存時間を示す図である。
【図１７ａ】肺炎球菌ＣｌｐＰ抗体と他の生物体由来蛋白質との反応性を示す免疫ブロット実験結果を示す（図面左側の数字は蛋白質の分子量を示し、Ｄ３９、Ｓｐｎ１０４９はそれぞれ肺炎球菌Ｄ３９と臨床菌株１０４９菌株を示す。Ｓｔｈはストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、Ａ５４９はヒト肺癌Ａ５４９細胞株、Ｓｃｅはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、Ｂｓｕはバシラス・サブティラス(Bacillus subtilis)、Ｐａｅはシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ＥｃｏはＥ.ｃｏｌｉ、Ｓｔｙはチフス菌(Salmonella typhi)などを示す）図である。
【図１７ｂ】肺炎球菌ＣｌｐＰ抗体と他の生物体由来蛋白質との反応性を示す免疫ブロット実験結果を示す（図面左側の数字は蛋白質の分子量を示し、Ｄ３９、Ｓｐｎ１０４９はそれぞれ肺炎球菌Ｄ３９と臨床菌株１０４９菌株を示す。Ｓｔｈはストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、Ａ５４９はヒト肺癌Ａ５４９細胞株、Ｓｃｅはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、Ｂｓｕはバシラス・サブティラス(Bacillus subtilis)、Ｐａｅはシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ＥｃｏはＥ.ｃｏｌｉ、Ｓｔｙはチフス菌(Salmonella typhi)などを示す）図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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