(57)【要約】ヒト４−１ＢＢに結合し、ヒト４−１ＢＢのヒト４−１ＢＢリガンドへの結合を可能にする完全ヒト抗体。一つの側面において、該抗体はＩｇＧ４抗体である。患者の疾患を処置する方法であって、治療学的有効量の該抗体を該患者に投与することを含む方法もまた提供される。
2007532095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、図４に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
該重鎖可変領域が、図３に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む
ことを特徴とするモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
該軽鎖が図４に示す可変領域を含み、
該重鎖が図３に示す可変領域を含む、
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号６のアミノ酸残基２１〜２３６を含み、該重鎖が配列番号３のアミノ酸残基２０〜４６７を含むモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分；および
薬理学的に許容しうる担体
を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載のモノクローナル抗体；および
薬理学的に許容しうる担体
を含む医薬組成物。
【請求項６】
患者の癌を処置する方法であって、治療学的有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を該患者に投与することを含む方法。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸残基２０〜４６７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号６のアミノ酸残基２１〜２３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全ヒト（fully human）抗体、さらに詳細にはヒト４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対する完全ヒト抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大な証拠が、癌に対してある程度の免疫がヒトおよび動物に存在することを疑いの余地なく示している。癌患者では、免疫系の細胞成分は、腫瘍細胞によって発現される抗原、たとえば分化または癌胎児性抗原、あるいは突然変異した遺伝子産物を認識することができる（S. Rosenberg, Nature, 411:380-4 (2001); P. van der Bruggenら、Immunological Rev., 188:51-64 (2002)）。多くの臨床研究は、腫瘍浸潤性のリンパ球が有利な予後的意義を有することを示している（E. Halapi, Med. Oncol., 15(4):203-11 (1998); Y. Naitoら、Cancer Res., 58(16):3491-4 (1998); L. Zhangら、N.E. J. Med., 348(3):203-13 (2003)）。さらに、イムノモデュレーター、たとえばサイトカインや細菌産物、癌ワクチン、または養子免疫療法を用いた臨床結果は、多くの患者で腫瘍の退縮に導いた（S. Rosenberg, Cancer J. Sci. Am. 6(S):2 (2000); P. Bassi, Surg. Oncol. 11(1-2):77-83 (2002); S. Antoniaら、Current Opinion in Immunol., 16:130-6 (2004)）。これら応答にもかかわらず、癌に対する免疫はしばしば腫瘍細胞を有効に排除することができない。この失敗の原因は３つの主要なカテゴリーに分けることができる：（i）腫瘍抗原の変化した発現かまたはクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の低減した発現のいずれかによる、免疫細胞による腫瘍認識の障害；（ii）腫瘍細胞による抑制性サイトカイン（たとえば、ＴＧＦ−β）の分泌の結果としての免疫抑制性の腫瘍微小環境（microenvironment）；および（iii）腫瘍細胞上でのコスティミュラトリー分子の発現の欠如による低い腫瘍免疫原性（腫瘍細胞がＴ細胞を有効に刺激することができないという結果となる）。腫瘍抗原認識および免疫エフェクター機能に対する要件についての本発明者らの理解の進歩は、抗腫瘍免疫応答を促進する可能な成功した戦略が補助分子によりコスティミュレーションを提供することであることを示している。腫瘍抗原特異的なＴ細胞は、エフェクター機能を開始および維持するにはコスティミュレーションが必要である。それゆえ、コスティミュラトリー分子を標的とする療法は、腫瘍に対する免疫応答をモデュレートおよび促進するのに応用することができる。
【０００３】
現在のＴ細胞活性化のモデルは、全活性化の誘発のためにはナイーブなＴ細胞が２つのシグナル：（i）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子によりＴ細胞レセプターに提示されたプロセシングされた抗原の結合により提供されるシグナル；および（ii）Ｔ細胞表面上のコスティミュラトリー分子と抗原提示細胞上のそのリガンドとの相互作用により提供されるさらなるシグナル、を必要とすることを仮定している。ナイーブなＴ細胞による抗原の認識は、それ自体ではＴ細胞活性化を引き起こすには不十分である。コスティミュラトリーシグナルなしでは、Ｔ細胞はその死またはアネルギーの誘発のいずれかにより排除されてしまう。ＣＤ２８コスティミュラトリー分子によるシグナル伝達は、Ｔ細胞応答の開始にとって重要であると思われる。しかしながら、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達は、抗原に対する免疫応答の維持および拡張にとって、並びに記憶Ｔ細胞の生成にとって、根本的であることが示されている。
【０００４】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）は腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）遺伝子ファミリー（細胞増殖、分化、およびプログラムされた細胞死の制御に関与するタンパク質を含む）の一員である。ＣＤ１３７は、５５ｋＤａのホモダイマーとして発現される３０ｋＤａのＩ型膜糖タンパク質である。このレセプターは最初にマウスで記載され（B. Kwonら、P.N.A.S. USA, 86:1963-7 (1989)）、その後、ヒトで同定された（M. Aldersonら、Eur. J. Immunol., 24: 2219-27 (1994); Z. Zhouら、Immunol. Lett., 45:67 (1995)）（公開されたPCT出願であるWO95/07984およびWO96/29348、および米国特許第6,569,997号をも参照；参照のため本明細書に引用する（配列番号２を参照））。ＣＤ１３７のヒト形態およびマウス形態はアミノ酸レベルで６０％同一である。保存配列が細胞質ドメイン並びに該分子の他の５つの領域に存在し、これら残基がＣＤ１３７分子の機能にとって重要であることを示している（Z. Zhouら、Immunol. Lett., 45:67 (1995)）。ＣＤ１３７の発現は、活性化されたＴ細胞、活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ２５制御Ｔ細胞などのリンパ系の細胞上で優先的に認められ、活性化された胸腺細胞、および上皮内リンパ球上でも認められることが示されている。さらに、ＣＤ１３７はまた、樹状細胞、単核細胞、好中球、および好酸球などの骨髄由来の細胞上でも発現されることが示されている。ＣＤ１３７発現は主として免疫／炎症細胞に限定されているが、炎症部位および腫瘍からの少数の組織と関連する内皮細胞上でのその発現を記載する報告がある。
【０００５】
Ｔ細胞上でのＣＤ１３７の機能的活性は充分に特徴付けられている。最適用量未満の抗ＣＤ３の存在下でのＣＤ１３７によるシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン合成（主としてＩＦＮ−γ）を誘発すること、および活性化細胞死を抑制することが示されている。これら作用は、マウスＴ細胞およびヒトＴ細胞の両者で観察されている（W. Shufordら、J. Exp. Med., 186(1):47-55 (1997); D. Vinayら、Semin. Immunol., 10(6):481-9 (1998); D. Laderachら、Int. Immunol., 14(10):1155-67 (2002)）。ヒトおよびマウスの両者において、コスティミュレーションは、抗原特異的およびエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増大させることにより、ＩＦＮ−γ産生や細胞障害性などのエフェクター機能を促進する。抗ＣＤ３シグナル伝達の不在下ではＣＤ１３７による刺激はＴ細胞機能を変えることはなく、ＣＤ１３７がコスティミュラトリー分子であることを示している。
【０００６】
Ｔ細胞上でのＣＤ１３７刺激の後に観察される生理事象は、別の生理機能を有するＮＦ−κＢおよびＰＩ３Ｋ／ＥＲＫ１／２シグナルによって媒体される。ＮＦ−κＢシグナルは抗アポトーシス分子であるＢｃｌ−ＸＬの発現を駆動し、かくして生存の上昇という結果となり、一方、ＰＩ３ＫおよびＥＲＫ１／２シグナルは、ＣＤ１３７によって媒体される細胞周期の進行を特に担っている（H. Leeら、J. Immunol., 169(9):4882-8 (2002)）。活性化誘発細胞死の抑制に対するＣＤ１３７活性化の作用は、Hurtadoら（J. Hurtadoら、J. Immunol., 158(6):2600-9 (1997)）によってインビトロで、およびインビボ系で示されており、インビボ系では抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体（ｍａｂ）がクローン除去を防ぐことによってスーパー抗原により活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の長期生存を生じることが示された（C. Takahashiら、J. Immunol., 162:5037 (1999)）。その後、２つの報告が、ＣＤ１３７シグナルがクローン拡張およびＣＤ８＋Ｔ細胞の生存の両者を制御することを異なる実験条件下で示した（D. Cooperら、Eur. J. Immunol., 32(2):521-9 (2002); M. Mausら、Nat. Biotechnol., 20:143 (2002)）。コスティミュレーションの後に観察される低減したアポトーシスはＣＤ８＋Ｔ細胞でのＢｃｌ−ＸＬレベルの増大と相関関係があったが、Ｂｃｌ−２発現は変わらなかった。４−１ＢＢによる抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−ＸＬおよびｂｆｌ−１のアップレギュレーションはＮＦ−κＢ活性化によって媒体されることが示された、なぜなら、ＮＦ−κＢ特異的なブロッカーであるＰＤＴＣがＢｃｌ−ＸＬの４−１ＢＢ媒体アップレギュレーションを抑制したからである（H. Leeら、J. Immunol., 169(9):4882-8 (2002)）。活性化されたＴ細胞のクローン拡張は、サイクリンＤ２、Ｄ３、およびＥの発現増大、およびｐ２７ｋｉｐ１タンパク質のダウンレギュレーションによって媒体されていると思われる。この作用はＩＬ−２依存的な仕方および非依存的な仕方の両者で起こる（H. Leeら、J. Immunol., 169(9):4882-8 (2002)）。
【０００７】
総合すると、ＣＤ１３７刺激は、新たに抗原刺激を受けた（primed）ＣＤ８＋Ｔ細胞に一部直接作用して、これら細胞の促進された拡張、生存、およびエフェクター機能という結果となる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両Ｔ細胞がＣＤ１３７刺激に応答することが示されているが、Ｔ細胞機能の促進はＣＤ８＋細胞における方が大きいようである（W. Shufordら、J. Exp. Med., 186(1):47-55 (1997); I. Gramagliaら、Eur. J. Immunol., 30(2):392-402 (2000); C. Takahashiら、J. Immunol., 162:5037 (1999)）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能および生存におけるＣＤ１３７刺激の重要な役割に基づき、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ系の操作は腫瘍およびウイルス病原体の治療のための妥当なアプローチを提供する。
【０００８】
最近、新たに単離した樹状細胞（ＤＣ）上でのＣＤ１３７の構成的発現が、マウス（(R. Wilcoxら、J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002); T. Futagawaら、Int. Immunol., 14(3):275-86 (2002)）およびヒト（S. Paulyら、J. Leukoc. Biol. 72(1):35-42 (2002)）で示された。これら報告は、ＤＣ上でのＣＤ１３７の刺激がＩＬ−６およびＩＬ−１２の分泌という結果となること、およびさらに重要なことには、それがアロ抗原に対するＴ細胞応答を刺激するＤＣの能力を高めることを示した。さらに、Panらは、ＤＣ上でのＣＤ１３７シグナル伝達がＭＨＣクラスＩおよびコスティミュラトリー分子のアップレギュレーションという結果となること、および腫瘍に浸潤するＤＣの増大した能力を生成することを示した（P. Panら、J. Immunol., 172(8):4779-89 (2004)）。それゆえ、ＤＣ上でのＣＤ１３７コスティミュレーションはＤＣの増殖、成熟、および移動のための新規な経路であると思われる。
【０００９】
活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、サイトカインによる刺激後にＣＤ１３７を発現する（I. Meleroら、Cell Immunol., 190(2):167-72 (1998); R. Wilcoxら、J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002)）。幾つかの報告は、アゴニストＣＤ１３７抗体によって誘発された抗腫瘍免疫応答のモデュレーション（modulation）にとってＮＫ細胞が重要であるように思われることを示した（I. Meleroら、Cell Immunol., 190(2):167-72 (1998); R. Millerら、J. Immunol., 169(4):1792-800 (2002); R. Wilcoxら、J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002)）。ＮＫ細胞の枯渇は、抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体の抗腫瘍活性を有意に低下させる。ＮＫ細胞へのＣＤ１３７のライゲーションは増殖およびＩＦＮ−γ分泌を誘発するが、ＮＫ細胞の細胞障害活性には影響を及ぼさない。とりわけ、インビトロでは、ＣＤ１３７刺激したＮＫ細胞はＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞に免疫調節または「ヘルパー」活性を与え、活性化されたＴ細胞の拡張という結果となる。それゆえ、ＮＫ細胞上でのＣＤ１３７シグナル伝達は腫瘍に対する先天性免疫をモデュレートする。
【００１０】
霊長類およびマウスモデルにおいてアゴニストＣＤ１３７抗体がＴ細胞抗原に対する体液性応答の抑制を誘発しうるという点で逆説的な作用が記載されている（H. Hongら、J. Immunother., 23(6):613-21 (2000); R. Mittlerら、J. Exp. Med., 190(10):1535-40 (1999)）。とりわけ、ＣＤ１３７アゴニスト抗体が、全身性エリテマトーデスや実験的自己免疫性脳脊髄炎などの抗体依存性の自己免疫疾患と関連する症状の有意の改善をもたらすことが示された（J. Foellら、N.Y. Acad. Sci., 987:230-5 (2003); Y. Sunら、Nat. Med., 8(12):1405-13 (2002)）。最近、Seoらは、慢性関節リウマチのマウスモデルにおいて、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体での処置が該疾患の発症を防いだこと、とりわけ疾患の進行を阻止したことを示した（S. K. Seoら、Nat. Med. 10;1099-94 (2004)）。この作用のメカニズムは充分にはわかっていないが、慢性関節リウマチのモデルにおいて、ＣＤ１３７アゴニスト抗体での処置がＩＦＮ−γ産生ＣＤ１１Ｃ−ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡張という結果となることが示された。ＩＦＮ−γが今度は樹状細胞を刺激してインドールアミン−２,３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を産生させ、このＩＤＯが免疫抑制活性を示す。また、抗原活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ１３７シグナル伝達がＩＦＮ−γ分泌の誘発という結果となり、この分泌がマクロファージを活性化することも提唱されている。活性化されたマクロファージが今度はＢ細胞の死のシグナルを産生することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ１３７による連続したシグナル伝達は、その後、これらＣＤ４＋活性化Ｔ細胞の活性化誘発細胞死（activation-induced cell death；ＡＩＣＤ）を誘発する。それゆえ、抗原活性化されたＴ細胞およびＢ細胞を排除することにより、低減した抗体応答が観察され、その結果としてＴｈ２媒体炎症疾患の劇的な低減が観察される（B. Kwonら、J. Immunol., 168(11):5483-90 (2002)）。これら研究は、炎症性または自己免疫性の疾患の治療にアゴニストＣＤ１３７抗体を免疫系の全身的な抑制を誘発することなく使用する役割を示唆している。
【００１１】
ＣＤ１３７の天然リガンド（ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）；ＴＮＦスーパーファミリーの３４ｋＤａ糖タンパク質メンバー）は、主として活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）、たとえば、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞上で検出され、マウスＢ細胞リンパ腫、活性化されたＴ細胞、および上皮起源のヒト癌腫細胞系列上でも検出されている（R. Goodwinら、Eur. J. Immunol., 23(10):2631-41 (1993); Z. Zhouら、Immunol. Lett., 45:67 (1995); H. Salihら、J. Immunol., 165(5):2903-10 (2000)）。ヒトのＣＤ１３７Ｌはマウスの対応物と３６％のホモロジーを有する（M. Aldersonら、Eur. J. Immunol., 24: 2219-27 (1994)）。
【００１２】
ＣＤ１３７発現細胞にシグナルを送達することに加えて、ＣＤ１３７ＬへのＣＤ１３７の結合は２方向でのシグナルを開始し、ＣＤ１３７Ｌ発現細胞に対する機能的な作用という結果となる。Langsteinらは、活性化された単核細胞上でのＣＤ１３７−Ｉｇ融合タンパク質のＣＤ１３７Ｌへの結合が、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αの産生を誘発し、ＩＣＡＭをアップレギュレーションし、ＩＬ−１０を抑制し、その結果、増大した接着となることを示した（J. Langsteinら、J. Immunol., 160(5):2488-94 (1998)）。さらに、単核細胞の増殖が高率のアポトーシスとともに示された（J. Langsteinら、J. Leukoc. Biol., 65(6):829-33 (1999)）。これら観察はJuらの研究（S. Juら、Hybrid Hybridomics, 22(5):333-8 (2003)）により確認された。同研究は、機能性の抗ＣＤ１３７Ｌ抗体が末梢血単核細胞の高率の増殖を誘発することを示した。リガンドをブロックするとＴ細胞活性化の抑制という結果となった。さらに、可溶性のＣＤ１３７Ｌが慢性関節リウマチおよび血液の悪性腫瘍を罹患する患者の血清で見出された（H. Salihら、J. Immunol., 167(7):4059-66 (2001)）。このように、ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの相互作用は、Ｔ細胞およびＡＰＣに影響を及ぼし、機能的な作用をもたらす。
【００１３】
Ｔ細胞機能の他の重要な側面において、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体が、老齢のマウスにおいてタンパク質抗原に対するＴ細胞応答を救出する（rescued）ことが示されている。抗原に対する免疫応答の年齢に関連した衰え、免疫老化（immunosenescence）として知られるプロセスが起こることについて豊富な文献が存在する（R. Miller, Science, 273:70-4 (1996); R. Miller, Vaccine, 18:1654-60 (2000); F. Hakimら、Curr. Opinion Immunol., 16:151-156 (2004)）。この現象は、細胞の拡張と細胞の生存または死との程度の平衡の変更によると思われる。Bansal-Pakalaらは、ＣＤ３もしくはＣＤ２８の低減した発現かまたはシグナルの低減した特性のいずれかのためにＴ細胞が充分な刺激を受けない状況下で、ＣＤ１３７による二次的なコスティミュレーションをＴ細胞応答の促進に用いることができるという仮説を試験した。彼らの研究は、年いったマウスが若いマウスに比べてインビトロでの再現（recall）応答が不足していることを示した（P. Bansal-Pakalaら、J. Immunol., 169(9):5005-9 (2002)）。しかしながら、年いったマウスを抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体で処理すると、Ｔ細胞の増殖応答およびサイトカイン応答は若いマウスで観察される応答と同じであった。この作用の特別のメカニズムは解明されていないが、Ｂｃｌ−ＸＬなどの抗アポトーシス分子の発現およびインビボでのＩＬ−２分泌の促進の両者を高めることは、欠陥のあるＴ細胞応答を救出するうえで何らかの役割を果たしているかもしれないと推測された。これら研究は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体が年いった免疫無防備状態の個体において弱いＴ細胞応答を救出する可能性を示しており、癌患者において抗ＣＤ１３７抗体を使用することの甚大な潜在的重要性を有している。
【００１４】
癌の治療におけるＣＤ１３７ターゲティング療法の役割は、アゴニスト抗マウスＣＤ１３７モノクローナル抗体を利用したマウスでのインビボ有効性研究により示唆された。Meleroらによる論文では、アゴニスト抗マウスＣＤ１３７抗体は、Ｐ８１５肥満細胞腫において、および低免疫原性腫瘍モデルＡｇ１０４において治癒をもたらした（I. Meleroら、Nat. Med., 3(6):682-5 (1997)）。抗腫瘍作用にはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両者が必要であった、なぜなら各亜集団の選択的なインビボ枯渇は抗腫瘍作用の低減ないし完全な喪失という結果となったからである。また、抗ＣＤ１３７療法が有効であるためには免疫応答の最小限の誘発が必要であることも示された。何人かの研究者は、癌療法に対するこのアプローチの実行可能性を示すべく抗ＣＤ１３７抗体を用いた（J. Kimら、Cancer Res., 61(5):2031-7 (2001); O. Martinetら、Gene Ther., 9(12):786-92 (2002); R. Millerら、J. Immunol., 169(4):1792-800 (2002); R. Wilcoxら、Cancer Res., 62(15):4413-8 (2002)）。
【００１５】
アゴニストＣＤ１３７抗体を用いた抗腫瘍効能データを支持するものとして、ＣＤ１３７Ｌにより提供されたシグナルがＣＴＬ活性および抗腫瘍応答を誘起することが示されている（M. DeBenedetteら、J. Immunol., 163(9):4833-41 (1999); B. Guinnら、J. Immunol., 162(8):5003-10 (1999)）。幾つかの報告は、マウス癌腫中へのＣＤ１３７リガンドの遺伝子導入が腫瘍の拒絶という結果となり、有効な免疫応答を生成するにはコスティミュレーションが必要であることを示した（S. Mogiら、Immunology, 101(4):541-7 (2000); I. Meleroら、Cell Immunol., 190(2):167-72 (1998); B. Guinnら、J. Immunol., 162(8):5003-10 (1999)）。Salihらは、ヒト癌腫およびヒト癌腫細胞株でのＣＤ１３７Ｌの発現を報告しており（H. Salihら、J. Immunol., 165(5):2903-10 (2000)）、該リガンドを発現する腫瘍細胞はコスティミュラトリーシグナルをＴ細胞に送達することができ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の放出という結果となること、およびこの作用が腫瘍上のＣＤ１３７Ｌのレベルと相関関係を有することを示した。ヒト腫瘍におけるＣＤ１３７Ｌの発現が、これら細胞をアゴニストＣＤ１３７抗体に対して一層感受性にするかはわかっていない。
【００１６】
ＣＤ１３７Ｌ−／−マウスは、ウイルスおよび腫瘍の両者に対するＴ細胞応答におけるＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ系の重要性を強調した（M. DeBenedetteら、J. Immunol., 163(9):4833-41 (1999); J. Tanら、J. Immunol., 164(5):2320-5 (2000); B. Kwonら、J. Immunol., 168(11):5483-90 (2002)）。ＣＤ１３７欠失マウスおよびＣＤ１３７Ｌ欠失マウスを用いた研究は、移植片対宿主病、および抗ウイルス性細胞障害性Ｔ細胞応答におけるＣＤ１３７コスティミュレーションの重要性を示した。ＣＤ１３７欠失マウスはＴ細胞の増殖が高められたが、サイトカインの産生および細胞障害性Ｔ細胞活性が低下した（B. Kwonら、J. Immunol., 168(11):5483-90 (2002); D. Vinayら、Immunol. Cell Biol., 81(3):176-84 (2003)）。さらに最近になって、ノックアウトマウス（ＣＤ１３７−／−）が対照マウスに比べて高い頻度（４倍）の腫瘍転移を有することが示された。これらデータは、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体の使用によるＣＤ１３７シグナル伝達の回復が、ウイルス病原体および癌に対する細胞性免疫応答を高めるための妥当なアプローチであることを示唆している。
【００１７】
抗腫瘍免疫応答にＣＤ１３７シグナル伝達が関与することを支持するマウスのインビボモデルにおけるデータに加えて、原発性のヒト腫瘍試料で行った研究が、エフェクターＴ細胞を生成するうえでのＣＤ１３７の役割を確認している。ユーイング肉腫を罹患した患者において、Zhangらは、腫瘍内エフェクターＴ細胞がＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ２８−／ＣＤ１３７＋の表現型を提示したことを示した。予期に反して、進行性の腫瘍の増殖と抗腫瘍免疫（エフェクターＴ細胞）との併存が観察された。患者の細胞を用いたイクスビボの刺激試験は、腫瘍により誘発されたＴ細胞の増殖および活性化にはＣＤ１３７Ｌでのコスティミュレーションが必要であることを示した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ではなく抗ＣＤ３／ＣＤ１３７ＬによるＰＢＬの刺激が、腫瘍溶解性エフェクターを誘発した。これら研究は、ＣＤ１３７媒体コスティミュレーションが腫瘍応答性ＣＴＬの拡張という結果となりうることのさらなる証拠を提供した（H. Zhangら、Cancer Biol. Ther., 2(5):579-86 (2003)）。さらに、ＣＤ１３７の発現が、肝細胞癌（ＨＣＣ）での腫瘍浸潤性リンパ球で示された（Y. Wanら、World J. Gastroenterol, 10(2):195-9 (2004)）。ＣＤ１３７発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより１９のＨＣＣ中１９で、および免疫蛍光染色により１３／１９で検出された。逆に、ＣＤ１３７は同じ患者の末梢血単核細胞では検出されなかった。健常なドナー肝臓組織で行った分析は、ＣＤ１３７の発現を示すことができなかった。これらの研究は臨床疾患をＣＤ１３７発現と相関付けようとするものではなかった。それゆえ、ユーイング肉腫および肝細胞癌で行った研究は、疾患の同時の進行とともにＣＤ１３７を発現するＴＩＬの存在を明らかにした。ユーイング肉腫では、ＣＤ１３７＋ＴＩＬが腫瘍細胞をイクスビボで殺すことができ、ＣＤ１３７経路がこれら患者で完全であること、およびおそらく腫瘍の微小環境中の抑制性因子が該経路の機能を抑制していることが示唆された。それゆえ、アゴニストＣＤ１３７抗体の全身投与が、これらエフェクターＴ細胞の拡張に必要なシグナルを提供すると提唱することができる。
【００１８】
癌に対する免疫の進展における役割に加えて、実験データは、自己免疫疾患およびウイルス疾患の治療へのＣＤ１３７アゴニスト抗体の使用を支持している（B. Kwonら、Exp. Mol. Med., 35(1):8-16 (2003); H. Salihら、J. Immunol., 167(7):4059-66 (2001); E. Kwonら、P.N.A.S. USA, 96:1507479 (1999); J. Foellら、N.Y. Acad. Sci., 987:230-5 (2003); Y. Sunら、Nat. Med., 8(12):1405-13 (2002) S. K. Seoら、Nat. Med. 10;1099-94 (2004)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、免疫応答をモデュレートするうえでの４−１ＢＢの役割に基づき、癌、感染性疾患、および自己免疫疾患などのヒトの疾患の処置または予防に用いることのできるアゴニスト活性を備えた抗ヒト４−１ＢＢ抗体を産生することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ヒト４−１ＢＢ（Ｈ４−１ＢＢ）に結合し、Ｈ４−１ＢＢのヒト４−１ＢＢリガンド（Ｈ４−１ＢＢＬ）への結合を可能にする完全ヒト抗体を提供する。それゆえ、本発明は、Ｈ４−１ＢＢに結合するがＨ４−１ＢＢのＨ４−１ＢＢＬへの結合を阻止せず、それによって本発明の抗体およびＨ４−１ＢＢＬの両者のＨ４−１ＢＢへの結合を可能とする抗体に関する。本発明はまた、Ｈ４−１ＢＢへの結合がＨ４−１ＢＢ媒体免疫応答の促進および刺激という結果となるという点でアゴニスト活性を備えた抗体をも提供する。これら抗体は、抗腫瘍または抗ウイルス免疫応答のイムノエンハンサー（immuno-enhancers）として、またはＴ細胞媒体自己免疫疾患のイムノモデュレーター（immunomodulators）として用いることができる。これら抗体はまた、癌、自己免疫その他の疾患を罹患する患者の血液または組織中のＨ４−１ＢＢの検出のための診断ツールとしても用いることができる。
【００２１】
一つの側面において、本発明は、Ｈ４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が、図４に示すＣＤＲ１（相補性決定領域１）、ＣＤＲ２（相補性決定領域２）およびＣＤＲ３（相補性決定領域３）を含み、該重鎖可変領域が、図３または図７に示すＣＤＲ１（相補性決定領域１）、ＣＤＲ２（相補性決定領域２）およびＣＤＲ３（相補性決定領域３）を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明のモノクローナル抗体（ｍａｂ）は、たとえば、ＩｇＧ４抗体またはＩｇＧ１抗体であってよい。
【００２２】
他の側面において、本発明は、軽鎖が図４に示す可変領域を含み、重鎖が図３または図７に示す可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２３】
他の側面において、本発明は、軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号６のアミノ酸残基２１〜２３６を含み、該重鎖が配列番号３のアミノ酸残基２０〜４６７を含むモノクローナル抗体を提供する。他の側面において、本発明は、軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号６のアミノ酸残基２１〜２３６を含み、該重鎖が配列番号９のアミノ酸残基２０〜４７０を含むモノクローナル抗体を提供する。
【００２４】
本発明の抗体は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患などの疾患のイムノモデュレーターとして広範な治療用途を有する。
【００２５】
本発明はさらに、患者において癌を処置する方法であって、該患者に治療学的有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。一つの側面において、この方法はワクチンを投与することをさらに含む。適当なワクチンとしては、たとえば、腫瘍細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ改変腫瘍細胞ワクチン、または抗原を負荷した（antigen-loaded）樹状細胞ワクチンが挙げられる。癌は、たとえば、前立腺癌、黒色腫、または上皮癌であってよい。
【００２６】
他の側面において、本発明は、免疫応答を促進する方法であって、本発明の抗体およびＳＩＶ ｇａｇワクチンを投与することを含む方法を提供する。他の側面において、本発明は、免疫応答を促進する方法であって、本発明の抗体およびＰＳＡワクチンを投与することを含む方法を提供する。他の側面において、本発明は、ＳＩＶ ｇａｇワクチンに対する免疫応答を促進する方法であって、本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。他の側面において、本発明は、ＰＳＡワクチンに対する免疫応答を促進する方法であって、本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の抗体、またはその抗原結合部分、および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物をも提供する。本発明の医薬組成物は、単独で、または治療剤、たとえば化学療法剤やワクチンまたは他のイムノモデュレーター（immunomodulatory agent）などの癌治療剤とともに投与することができる。
【００２８】
本発明はまた、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基２０〜４６７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基２１〜２３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；（ｅ）配列番号９のアミノ酸残基２０〜４７０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；（ｆ）配列番号９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のアミノ酸配列のフラグメント、たとえば、可変領域、定常領域、または１またはそれ以上のＣＤＲをコードするヌクレオチドよりなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチドをも提供する。本発明の単離したポリヌクレオチドはさらに、図３の少なくとも１のＣＤＲ、図４の少なくとも１のＣＤＲ、または図７の少なくとも１のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、配列番号１、配列番号４または配列番号７のヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
本発明はまた、配列番号３、配列番号６および配列番号９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドをも提供する。他の側面において、本発明は、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４６７のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチド、配列番号６のアミノ酸残基２１〜２３６のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチド、および配列番号９のアミノ酸残基２０〜４７０のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドを提供する。他の側面において、本発明は、図３、図４または図７の少なくとも１のＣＤＲ、または図３、図４または図７の少なくとも可変領域または定常領域のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドを提供する。
【００３０】
本発明はさらに、Ｈ４−１ＢＢに対する結合特異性を有する免疫グロブリンを包含し、該免疫グロブリンは抗原結合領域を含む。一つの側面において、免疫グロブリンは本発明の抗体のＦａｂまたはＦ(ａｂ')２である。
【００３１】
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合部分を産生する細胞株、本発明のヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、および抗体産生細胞株を培養することによる本発明の抗体の製造方法をも包含する。
【００３２】
本発明は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、または自己免疫などの疾患の治療に使用するための、抗体、およびその抗原結合フラグメント（本発明の抗体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質を包含する）の製造および特徴付けに関する。癌は、たとえば、前立腺癌、黒色腫、または上皮癌であってよい。
【００３３】
本発明の抗体はＨ４−１ＢＢに結合することができ、Ｈ４−１ＢＢに対して高い親和性を表し、Ｔ細胞応答を有効に促進することができる。一つの側面において、本発明の抗体はコスティミュラトリーアッセイにおいてＩＮＦ−γ産生を誘発するが、Ｈ４−１ＢＢのその対応リガンドであるＨ４−１ＢＢＬへの結合に影響を及ぼすことはなく、補体を結合しない。
【００３４】
本発明の抗体は、当該技術分野でよく知られた方法により製造することができる。一つの側面において、本発明の抗体は、不死化した真核細胞、たとえば、ミエローマ細胞またはハイブリドーマ細胞などのトランスフェクションした細胞での発現により製造することができる。
【００３５】
本発明の抗体は、単独で、または他の治療剤、たとえば放射線療法（放射線照射を含む）、ホルモン療法、細胞毒性剤、ワクチン、および他のイムノモデュレーター、たとえばサイトカインおよび生物学的応答の修飾因子とともに用いることができる。これら薬剤は、癌および免疫−増殖性疾患の治療に特に有用である。
【００３６】
一つの側面において、本発明は、モノクローナル抗体（ｍａｂ）２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４を提供する。図１および図２は、ｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａおよびｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのプラスミドマップをそれぞれ提供し、これらプラスミドを用いてモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４を製造することができる。図３（図３Ａ〜図３Ｈ）は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を提供し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。図４（図４Ａ〜図４Ｆ）は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【００３７】
他の側面において、本発明は、モノクローナル抗体（ｍａｂ）２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１を提供する。図５は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１重鎖配列構築物の模式図を示す。図６は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４および２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の両者についてモノクローナル抗体２０Ｈ４.９の軽鎖配列構築物の模式図を示す。図７は、図５の重鎖配列構築物のヌクレオチド配列（コード鎖（配列番号７）および相補鎖（配列番号８））、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号９のアミノ酸２０〜４７０である）を提供する。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の軽鎖は、２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の軽鎖と同じである。
【００３８】
本発明はまた、配列番号３、６および９に示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列にＨ４−１ＢＢ結合に実質的に影響を及ぼさない保存的なアミノ酸置換を有する抗体をも包含する。保存的な置換は、典型的に一つのアミノ酸の類似の特性を有する他のアミノ酸による置換、たとえば、以下の群内での置換を含む：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的に該ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結した発現調節配列（天然に関連したまたは異種のプロモーター領域を含む）をさらに含む。好ましくは発現調節配列は真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることのできるベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主のための調節配列をも用いることができる。ベクターが適当な宿主に導入されたら、この宿主を該ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下に維持し、所望なら軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体または完全抗体、結合フラグメントまたは他の免疫グロブリン形態の回収および精製を引き続き行う（S. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis、アカデミックプレス、ニューヨーク(1979)を参照）。一本鎖抗体あるいはミニ抗体（minibodies）（１またはそれ以上のＣＨドメインに融合した一本鎖抗体）もまた、本明細書に開示したＶＬ領域およびＶＨ領域をコードする核酸配列をポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡと連結することにより製造することができる。
【００４０】
大腸菌などの原核生物宿主および酵母などの他の微生物を用いて本発明の抗体を発現させることができる。微生物に加えて、哺乳動物組織の細胞培養を用いて本発明の抗体を発現および製造することもできる。真核生物細胞は、完全な免疫グロブリンを分泌することのできる適当な宿主細胞が多数開発されていることから好ましく、たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株、ＣＯＳ（アフリカミドリザル繊維芽細胞株）細胞株、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞株、およびハイブリドーマが含まれる。これら細胞の発現ベクターは、発現調節配列、たとえばプロモーターおよびエンハンサー、および必要なプロセシング情報部位、たとえばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写停止配列（すべて当該技術分野で知られている）を含んでいてよい。
【００４１】
目的とするＤＮＡセグメント（たとえば、重鎖および／または軽鎖のコード配列および発現調節配列）を含むベクターは、よく知られた方法（細胞宿主の種類により様々である）により宿主細胞に移すことができる。たとえば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞において一般的に用いられており、一方、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に用いることができる（たとえば、T. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス(1982)を参照）。
【００４２】
発現されたら、本発明の抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当該技術分野の標準法に従って精製することができる。少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。
【００４３】
本発明の抗体は、Ｔ細胞および抗体によって媒体された免疫応答をモデュレートするのに有用である。処置に適した典型的な疾患状態としては、癌、感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患、たとえば多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および重症筋無力症が挙げられる。
【００４４】
本発明はまた、少なくとも１の本発明の抗体および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物をも提供する。医薬組成物は、常法のよく知られた滅菌法により滅菌してよい。医薬組成物はまた、生理条件に近似するのに必要な薬理学的に許容しうる補助物質、たとえば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、マンニトールやtween 80などの安定性促進剤、毒性調節剤など、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、またはヒトアルブミンなどを含んでいてよい。
【００４５】
本発明の抗体および医薬組成物は、皮下、筋肉内および静脈内投与を含む非経口投与に特に有用である。非経口投与のための医薬組成物は、許容しうる担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体の溶液を含んでいてよい。様々な水性担体を用いることができ、これらはすべて当該技術分野で知られたものであって、たとえば、水、緩衝水、食塩水、グリシンなどを用いることができる。これら溶液は滅菌してあり、一般に粒状物質を含まない。投与を容易にし投与量を均一にするため、非経口組成物を単位投与剤型にて製剤化することが特に有利である。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、疾患のさらなる治療剤をさらに含んでいてよい。一つの側面において、本発明の医薬組成物は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療剤を含む。本発明の抗体はまた、疾患のさらなる治療剤とともにまたは別々に投与することができる。
【００４７】
本発明の抗体は、患者において癌性細胞に対する免疫応答を促進する他の薬剤とともに用いることができる。一つの側面において、本発明の抗体は、免疫原性の薬剤、たとえば、癌細胞、精製した腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、または免疫刺激サイトカインおよび細胞表面抗原をコードする遺伝子でトランスフェクションした細胞と組み合わせて用いる。他の側面において、本発明の抗体は、ワクチン、たとえば、腫瘍細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、遺伝子修飾した腫瘍細胞ワクチン、たとえば、ＧＭ−ＣＳＦ修飾した腫瘍細胞ワクチン、ペプチドワクチン、または抗原を負荷した樹状細胞ワクチンと組み合わせて用いる。
【００４８】
腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験戦略が考案されている。これら戦略の一つでは、自家または同種の腫瘍細胞を用いてワクチンを調製する。これら細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたときに最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種にとって抗原提示の強力なアクチベーターであることが示されている（Dranoffら、P.N.A.S., 90:3539-43 (1993); E. Jafeeら、J. Clin. Oncol., 19:145-56 (2001); R. Salgiaら、J. Clin. Oncol., 21:624-30 (2003)）。
【００４９】
種々の腫瘍細胞における遺伝子発現および大スケールの遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義に導いた（S. Rosenberg, Immunity 10:281-7 (1999)）。多くの場合、これら腫瘍特異的抗原は、腫瘍で発現されるまたは腫瘍が生じた細胞で発現される分化抗原、たとえば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原Ｔｒｐ−２である。これら抗原の多くは、宿主で見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示すことができる。本発明の抗体は、これら抗原に対する免疫応答を増幅しＴｈ１応答に向けるために、腫瘍で発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの回収物とともに用いることができる。これらタンパク質は、通常、免疫系によって自己抗原として認識され、それゆえこれらタンパク質に対して免疫寛容である。
【００５０】
本発明の一つの側面において、本発明の抗体を、ＳＩＶ ｇａｇ抗原（ＨＩＶ ＤＮＡワクチンのモデルとして）または前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を含むイムノモデュレーター、またはＳＩＶ ｇａｇ抗原または前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンと組み合わせる。ＰＳＡワクチンは、たとえば、M. Pavlenkoら、Br. J. Cancer, 91(4):688-94 (2004); J. Wolchokら、Semin. Oncol., 30(5):659-66 (2003); J. Kimら、Clin. Cancer Res., 7(3補遺):882s-889s (2001)に記載されている。ＳＩＶ ｇａｇワクチンは、たとえば、B. Makitaloら、J. Gen. Virol., 85(Pt 8):2407-19 (2004); N. Letvinら、J. Virol., 78(14):7490-7 (2004); S. Mossmanら、AIDS Res. Hum. Retroviruses., 20(4):425-34 (2004); F. Bertleyら、J. Immunol., 172(6):3745-57 (2004); L. Pattersonら、J. Virol., 78(5):2212-21 (2004); E. O'Neillら、AIDS Res. Hum. Retroviruses, 19(10):883-90 (2003); Z. Buら、Virology, 309(2):272-81 (2003)に記載されている。
【００５１】
腫瘍抗原としては、たとえば、タンパク質テロメラーゼが挙げられ、これは染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％以上で発現されるが体細胞組織では限られた数でしか発現されない（N. Kimら、Science, 266, 2011-2013 (1994)）。腫瘍抗原はまた、タンパク質の配列を変えまたは関連のない２つの配列間で融合タンパク質を生成する体細胞突然変異のゆえに、またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプゆえに癌細胞で発現される「新生抗原（neo-antigens）」であってもよい。他の腫瘍ワクチンは、ヒト癌への関与が疑われるウイルス、たとえば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）からのタンパク質を含んでいてよい。本発明の抗体とともに用いることのできる腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織自体から単離した精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これら熱ショックタンパク質は腫瘍細胞からのタンパク質の断片を含有し、これらＨＳＰは腫瘍免疫を誘起させるための抗原提示細胞への送達において高度に有効である（R. Suotら、Science 269: 1585-1588 (1995); Y. Tamuraら、Science 278: 117-120 (1997)）。
【００５２】
本発明の抗体はまた、ＨＩＶやＨＣＶなどのウイルス抗原に対するワクチンへの免疫応答を促進するのに用いることもできる。本発明の抗体はまた、他のイムノモデュレーターに対する免疫応答を促進し、記憶免疫応答を誘起するために用いることもできる。これらイムノモデュレーターの例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、Ｆｌ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（細菌ＤＮＡ）などのアジュバント、またはＯＸ−４０もしくはＣＴＬＡ−４に対する抗体である。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的な適用に際しては、すでに疾患に罹患している患者に該疾患を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに充分な量にて医薬組成物を投与する。このことを達成するのに適した量を「治療学的に有効な投与量」と定義する。この使用に有効な量は、疾患状態の重篤度および患者（たとえば、患者自身の免疫系の一般的状態を含む）に依存するであろうが、当業者により決定することができる。予防的な適用に際しては、本発明の医薬組成物を疾患状態に未だ至っていない患者に投与して該疾患状態に対する患者の抵抗性を促進させる。そのような量は「予防的に有効な投与量」と定義される。この使用でも正確な量は患者の健康状態（たとえば、患者自身の免疫系の一般的状態を含む）に依存し、当業者により決定することができる。一つの側面において、予防的使用は腫瘍の再発の予防のためのものである。
【００５４】
実施例
実施例１：抗体の生成
材料および方法
ヒトＣＤ１３７（４−１ＢＢ）レセプターに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、HuMAb-MouseR（Medarex, Inc.、プリンストン、ニュージャージー）で生成した。ＨｕＭＡｂマウスを、ＲＩＢＩアジュバント（Ribi Immunochemical）中のヒトＣＤ１３７の細胞外ドメイン２５μｇで腹腔内（i.p.）および皮下（s.c.）にて５回免疫した。融合前にマウスに同量の抗原を静脈内（i.v.）にてブースター投与した。ｈｕＣＤ１３７に対する抗体の適当な力価を有する免疫マウスからの脾臓細胞を、標準法に従ってマウスミエローマ細胞と融合させた。
【００５５】
抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（クローン：ＨＩＴ３ａ）、ヒトおよびサルＩＦＮ−γのためのＥＬＩＳＡキット、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）キット、およびフローサイトメトリーのためのすべてのコンジュゲート抗体をBD Pharmingen（サンジエゴ、カリフォルニア）から購入した。ヒトＩｇＧ１λおよびヒトＩｇＧ１κはSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ）から購入した。ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ２２６５）はＡＴＣＣから購入した。培地（ＲＰＭＩ）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はMediatech Inc.（ハーンドン、バージニア）から購入した。ヒツジ赤血球AlseversはColorado Serum Co.（デンバー、コロラド）から購入した。
【００５６】
ハイブリドーマスクリーニング：ｈｕＣＤ１３７への結合のＥＬＩＳＡによる検出：抗ヒトＣＤ１３７抗体を分泌するハイブリドーマを同定するため、ＥＬＩＳＡプレート（Nunc MaxiSorp）をＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ１３７−マウスＩｇＧ２ｂ融合タンパク質で４℃にて一夜コーティングした。ついで、プレートを０.０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳで３回洗浄し、ついでＰＢＳ−Ｔプラス１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温にて２０分間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔ中で１：３に希釈した５０μｌの上澄み液をプレートに加え、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。その後、プレートを上記のようにして洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson Laboratories、ウエストグローブ、ペンシルベニア）とともにインキュベートすることにより抗体の結合を検出した。プレートをｐＮＰＰで発色させ、４０５ｎｍで読み取った。
【００５７】
遮断アッセイ：ＥＬＩＳＡによりｈｕＣＤ１３７を認識する抗体を分泌する２６のハイブリドーマを、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用を可能にする能力について評価した。これら分析は、最初、ＥＬＩＳＡ形態で行った。プレートを０.２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウエルのヒトＣＤ１３７−ｍｕＩｇＧ２ｂでコーティングした。ＰＢＳ−Ｔおよび１％ウシ血清アルブミンに希釈したモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１または対照抗体の系列希釈をプレートに加えた。ＣＤ１３７Ｌ−ＣＤ８融合タンパク質を０.２μｇ／ｍｌの濃度でウエルに加えた。抗体の結合を、ビオチン化抗ＣＤ８抗体（０.２μｇ／ｍｌ、Ancell Corporation、ベイポート、ミネソタ）を用いて検出した。数回洗浄後、結合抗体の検出のためのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１：２０００）およびｐＮＰＰを加え、プレートを４０５ｎｍで読み取った。
【００５８】
選択した抗体がＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ結合を変化させないことを確認するため、精製抗体をBIAcore分析によりさらに特徴付けた。実験はすべてBIAcore 3000装置（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）で行った。ヒトＣＤ１３７を、BIAcoreセンサーチップ（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）のカルボキシメチル化デキストラン表面上に高密度で共有結合にて固定化した。注入を１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５.０中、２μｇ／ｍＬにて行った。占められていない活性エステルを、その後、過剰のエタノールアミンの注入によりブロッキングした。表面の再生を１０ｍＭグリシン、ｐＨ２.０を用いて行った。
【００５９】
抗ＣＤ１３７抗体の精製試料を、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび０.００５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）を添加したＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を用いて２００〜１０００ｎＭの濃度に希釈した。ヒトＣＤ１３７Ｌ−ＣＤ８融合タンパク質（ｈｕＣＤ１３７Ｌ）をＣＤ１３７リガンド源として用いた。ｈｕＣＤ１３７Ｌを抗ＣＤ１３７抗体の前に注入して、またはその逆にして、実験を行った。注入は５μＬ／分の流速で行った。結合したリガンドおよび抗体を１０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２.０を用いた再生により除去した。
【００６０】
ヒトＴ細胞の精製：Ｔ細胞またはＰＢＭＣを健常なヒトドナーから得た。血液をＥＤＴＡ中に回収し、洗浄（elutriation）緩衝液（２.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌポリミキシンＢを含有するＲＰＭＩ）に懸濁し、リンパ球分離培地（ＬＳＭ；Mediatech Inc.、ハーンドン、バージニア）を重層し、１８００ｒｐｍにて２５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを洗浄緩衝液および洗浄ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ、１：１０希釈）中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。ついで、細胞にＬＳＭを重層し、２５００ｒｐｍにて２５分間遠心分離した。界面を除去し、ＳＲＢＣをＳＲＢＣ溶解緩衝液で溶解した。単離したＴ細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに再懸濁した。
【００６１】
フローサイトメトリー分析：細胞上に発現されたＣＤ１３７への抗ヒトＣＤ１３７抗体の結合をフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＴ細胞白血病細胞株（ＣＥＭ）またはカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をこれら試験に用いた。これら細胞はＣＤ１３７を構成的に発現しないが、そのレセプターはミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で１８時間刺激することにより誘発することができる。ついで、細胞を洗浄し、染色緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ、プラス１％ＦＣＳ、および０.０１％アジ化ナトリウム）中の種々の濃度の抗体とともにインキュベートした。刺激したまたは刺激していない細胞への抗体の結合を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、ウエストグローブ、ペンシルベニア）により検出した。ＣＤ１３７の発現を確認するため、ＣＤ１３７リガンドの細胞外ドメインとマウスＣＤ８とからなる融合タンパク質（Ancell Corporation、ベイポート、ミネソタ）を用い、ついでＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ８（BD Pharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア）とともにインキュベートした。試料を１％ホルマリンに固定し、４℃に保持し、フローサイトメトリーにより読み取った。
【００６２】
機能的アッセイ：健常なドナーから得た一次ヒトＴ細胞またはサルＰＢＭＣを固定化抗ＣＤ３抗体で刺激してＴ細胞活性化の第一シグナルを得、ヒト抗ヒトＣＤ１３７抗体でコスティミュレートした。非特異的な対照として、ヒト化抗癌腫抗体（ＢＲ９６）を同じ抗体濃度で用いた。プレートを抗ＣＤ３抗体（０.５〜１μｇ／ｍｌ）で４℃にて一夜コーティングした。翌日、Ｔ細胞またはＰＢＭＣを１〜１.５×１０５／ウエルの濃度でプレーティングした。３７℃で７２時間培養後、ＩＦＮ−γの合成をサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）またはＥＬＩＳＡのいずれかにより測定した。
【００６３】
サイトカインアッセイ
ＥＬＩＳＡ：Ｔ細胞を種々の時間刺激した後、プレートを遠心分離し、培地を除去した。サイトカインレベルを製造業者の指示（BD Pharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア）に従ってＥＬＩＳＡにより検出した。簡単に説明すると、被験試料および標準を抗サイトカインコーティング９６ウエルプレートに添加した。周囲温度で２時間インキュベート後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ついで、まず作業（working）デテクター抗体とともにインキュベートし、ついで基質を添加した。４０５ｎｍにて吸光度を読み取り、濃度を標準曲線に基づいて計算した。
【００６４】
サイトメトリービーズアレイ：インビトロでのサイトカイン産生を決定するのに用いた他の方法は、BD Pharmingenによって開発されたサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーであった。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＮＦ−αのレベルを、製造業者の指示に従って培養上澄み中で測定した。結果をＣＢＡ分析ソフトウエアを用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【００６５】
ヒトＣＤ１３７への結合を示す抗体を分泌したハイブリドーマをさらに拡張し、サブクローニングした。分泌された抗体を精製し、ｈｕＣＤ１３７への結合能について試験し、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌの相互作用をさせた。評価した抗ヒトＣＤ１３７抗体のパネルのうち、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１を、その結合プロファイルおよび非遮断特性に基づいてさらに評価するために選択した。２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１抗体は、アルカリホスファターゼ抗ヒトＩｇＧ１、２、３、４、および抗カッパおよびラムダ試薬（Southern Biotech、バーミンガム、アラバマ）を用いたＥＬＩＳＡにより決定されるようにＩｇＧ１カッパである。図８（図８Ａ−ＥＬＩＳＡによるヒトＣＤ１３７への結合；図８Ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用に対するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の作用）は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の最初の特徴付けを提供する。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１、２６Ｇ６（遮断抗ＣＤ１３７抗体）、または破傷風毒素（ＴＴ、負の対照）の系列希釈を、ＣＤ１３７ＬへのＣＤ１３７の結合を変化させる能力について評価した。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１は１０μｇ／ｍｌまでの濃度でＣＤ１３７Ｌ結合を遮断しなかったが、モノクローナル抗体２６Ｇ６は＞０.３７μｇ／ｍｌの濃度で結合を抑制した。
【００６６】
モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１はまた、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激したヒトＴ細胞（ＣＥＭ）上およびカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で発現されたＣＤ１３７に対する反応性についても試験した。以前の研究では、ＣＤ１３７はＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化した後にＴ細胞上でアップレギュレーションされることが決定された。対照分子は、関係のないヒトＩｇＧ抗体（負の対照）またはＣＤ１３７Ｌ−ＣＤ８融合タンパク質（正の対照、BD Pharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア）からなっていた。これら研究からの結果は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１が、活性化されたヒトＣＥＭおよびカニクイザルからのＰＢＭＣに結合し、刺激されていない細胞に対しては最小の結合であることを示した。陽性細胞の同様のパーセントがモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１かまたはＣＤ１３７Ｌのいずれかで検出された。図９は得られた結果を提供しており、ＰＭＡ−イオノマイシン刺激したヒトまたはカニクイザル細胞へのモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の結合を示す。ヒトＣＥＭ（図９Ａ）またはサルＰＢＭＣ（図９Ｂ）を２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１またはヒトＣＤ１３７Ｌ融合タンパク質とともにインキュベートした。二次抗体を加え、試料をフローサイトメトリーにより読み取った。
【００６７】
つぎに、アゴニストＣＤ１３７抗体に望まれる重要な機能的作用として、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１が抗ＣＤ３刺激の存在下でのコスティミュラトリーアッセイにおいてＩＦＮ−γの促進を誘発できるか否かを決定した。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１をヒトおよびサルリンパ球での機能的研究においてそのコスティミュラトリー活性を評価した。初期データに基づき、２０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ１３７抗体（過剰抗体）をこれら研究に用いた。０.２〜１μｇ／ｍｌのレベルの抗ＣＤ３抗体を試験して、１０〜２０％のＣＤ１３７陽性リンパ球という結果となった。上澄み液中のＩＦＮ−γのレベルを培養７２時間後に測定した。図１０に示すように、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１は、対照よりも有意に高いレベルまでＩＦＮ−γ合成をヒトおよびサルの両コスティミュラトリーアッセイにおいて促進した。８人の健常なヒトドナーから単離したＴ細胞で行った試験の結果は、そのうち６人でモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１がＩＦＮ−γ合成を対照と比べて２.２〜４.３倍促進することを示した。他の２人のうちの一方は１.６倍の増大を示した。この促進のレベルは、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ０４／０１０９４７（参照のため本明細書に引用する）において提供されたヒト化抗ＣＤ１３７抗体であるｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４で観察されたものよりも優れており、同出願は８人のドナーのうち５人でＩＦＮ−γの増大を示し、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１よりも低いレベル（１.５〜２倍の増大）であった（図１０Ａ）。サルのコスティミュラトリー試験においても、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１は促進された機能的活性を示し、対照に比べてＩＦＮ−γの有意の増大という結果となった（図１０Ｂ）。ヒトでの試験においても、ＩＦＮ−γの促進は一貫してｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４よりも高かった。
【００６８】
対照レベルを超えるＴＮＦ−αの誘発もまた、ＩＦＮ−γよりも遙かに低いレベルではあるがヒト培養で観察された。抗ＣＤ３抗体単独（ベースライン）により誘発されるＴＮＦ−αレベルは、ＩＦＮ−γのベースラインレベルよりも約２０〜５０倍低かった。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１は８人のドナーのうち３人において〜２倍から４.７倍の増大を誘発した。ここでも、ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４（平行に試験した）は、同じドナーにおいて〜２倍の増大を誘発したが、低いレベルにおいてであった。試験した他のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−４）は、いずれの処理においても有意に変化しなかった。
【００６９】
総じてこれら研究は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１がＴｈ１タイプの応答を誘発することによりヒトおよびサルの両者において望まれる機能的活性を提示することを示した。重要なことには、インビボ抗腫瘍活性は抗ＣＤ１３７抗体がＩＦＮ−γ合成を誘発する能力と関係しているので、これら結果はアイソタイプスイッチについてモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の選択を支持するものである。
【００７０】
実施例２：モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１のインビトロ特徴付け
その結合動力学、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用を阻止できないこと、およびヒトＴ細胞に対する機能的作用に基づき、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１をＩｇＧ４形へのスイッチのために選択した。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１のＩｇＧ４形は２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４（図３および４に示す）である。
【００７１】
これら研究の第二段階は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４とモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１とのインビトロ特性の比較を含んでいた。このセクションでは両抗体の結合動力学およびヒトおよびサルリンパ球での機能的作用を記載する。
【００７２】
結合動力学
抗ヒトＣＤ１３７抗体の動力学的特性を、BIAcore 3000を用いた表面プラズモン共鳴により評価した。抗原としてヒトＣＤ１３７−マウスＩｇＧ２ａをＣＭ５センサーチップの表面に低密度にて共有固定化した。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１を２５〜２００ｎＭの濃度にて注入した。図１１は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の両者について１００ｎＭでの注入を示す。BIAevaluationソフトウエア（二価モデル、global curve fit分析）を用いて計算したデータは、両抗体について同様の動力学パラメーターという結果となった（表１参照）。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の解離定数ＫＤは、それぞれ１１.２および１６.６ｎＭと決定された。同様の実験条件下、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４はマウス４−１ＢＢに結合しなかった。
【００７３】
表１：モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の結合動力学の比較
【表１】
2007532095.tif 000003
【００７４】
フローサイトメトリー分析
０.３２ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度のビオチン化モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４を、ＣＥＭ細胞±ＰＭＡ−イオノマイシンへの結合について試験した。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４は、ＰＭＡ−イオノマイシン刺激したＣＥＭ細胞に濃度依存的な仕方で結合した。飽和は０.２μｇ／ｍｌで達成された。一方、親分子であるモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１で示されたように、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４はＰＭＡ−イオノマイシンで刺激しなかったＣＥＭ細胞には結合しなかった（図１２）。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の濃度依存的な結合は、ＰＭＡ−イオノマイシン刺激したＣＥＭ細胞で示された（図１２）。試料をフローサイトメトリーにより読み取った。
【００７５】
細胞／機能アッセイ
モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１のアイソタイプをスイッチするプロセスが該抗体の活性を変化させないことを確認するため、インビトロ研究を行ってモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の活性を親モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の活性とサルＰＢＭＣおよびヒトＴ細胞で比較した。ヒトおよびサルのＴ細胞またはＰＢＭＣに対するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の機能的作用を決定し、その親分子であるモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１と比較した。健常なドナーから一次ヒトＴ細胞またはサルＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体（０.５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）±抗ヒトＣＤ１３７抗体で刺激した。３７℃で培養７２時間後、ＩＦＮ−γの合成をヒト試料についてはサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）により、サル試料についてはＥＬＩＳＡにより測定した。最適濃度未満の抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）またはコンカナバリンＡ（１μｇ／ｍｌ）（ドナーＭ５１７０および８１のみ）の存在下、抗体をコスティミュラトリーアッセイで試験した。結果は、対照に対する増加倍数としてｐｇ／ｍｌで表してある。ドナー間で変わるバックグラウンド応答のため、データを対照処理（＝１）に対して正規化した。図１３ＡはヒトＴ細胞の結果を提供し、図１３ＢはサルＰＢＭＣの結果を提供する。図１３Ａ〜１３Ｂに示すように、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４は対照に比べてヒトおよびサル細胞において高レベルのＩＦＮ−γを産生するコスティミュラトリー特性を示した。ＩＦＮ−γ合成の促進のレベルは、ヒトおよびサルの試料において親分子に匹敵するものであった。
【００７６】
つぎに、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の機能的作用に対する抗体架橋の影響を評価した。抗体の架橋は抗体のシグナル伝達能の増強という結果となることが示されている。それゆえ、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４±抗ヒトＩｇＧ抗体の幾つかのバッチの機能的活性を決定する研究を行った。図１４Ａに示すように、ＩＦＮ−γ合成の有意の促進が架橋抗体の不在下で試験した全てのロットで観察され、プラトーは４００ｎｇ／ｍｌの濃度であった。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４によるＩＦＮ−γ合成の増大は、図１４Ｂに示すように抗ヒトＩｇＧ架橋抗体の添加によりさらに促進された。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の種々のバッチは匹敵する細胞活性を有していた。
【００７７】
それゆえ、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の架橋はＩＦＮ−γ合成を誘発する該抗体の能力の促進という結果となった。抗体の架橋はインビボでは免疫グロブリンのＦｃ部分の細胞レセプターによりまたは抗体二量体化により起こる。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４はＩｇＧ４のアイソタイプであり、これは他のＩｇＧアイソタイプに比べてＦｃレセプターに対する親和性が低い。しかしながら、ＩｇＧ４は、単核細胞および好中球上に発現されたＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に結合することができる。
【００７８】
モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４をさらに特徴付けるため、他の２つのアプローチ：（i）Ｔ細胞生存に対する作用；および（ii）サイクリンＤ２発現に対する作用を用いた。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４がヒトＴ細胞上のＣＤ１３７を介してシグナル伝達を誘発し、Ｔ細胞にコスティミュラトリーシグナルを提供して細胞の生存および拡張に導くことができるか否かを決定するため、ＩＦＮ−γ合成を誘発することが知られている濃度の抗ＣＤ３抗体±モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４で刺激したヒトＴ細胞を、アネキシンＶおよびプロピジウムヨーダイドで染色して生きた細胞の数を決定し（アネキシンＶ／プロピジウムヨーダイド陰性）、サイクリンＤ２で染色して細胞進行に対するその作用を決定した。図１５は、サイクリンＤ２発現およびＴ細胞の生存に対するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の４つの異なるロットの平均結果を示す。０.４〜１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の濃度は、生きた細胞の数の約１.８〜２倍の増加という結果となり、サイクリンＤ２発現Ｔ細胞の数の有意の増大をもたらした（２.５〜３倍）。
【００７９】
実施例３：カニクイザルでの薬動力学的モデルにおける４−１ＢＢ抗体のインビボ評価
この実施例は、ＤＮＡワクチンによって誘起された抗原特異的な免疫応答を促進するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４およびモノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４の能力を説明する。
【００８０】
材料および方法
実験動物群：
この研究のために雌および雄のカニクイザル（２.５〜５.０ｋｇ）をCharles River BRF（ヒューストン、テキサス）から購入し、つがいで収容した。各実験群は４匹の雄および２匹の雌からなり、体重により無作為化した。実験群は以下のとおりであった：
１群：ＳＩＶ ｇａｇおよびＰＳＡ ＤＮＡワクチン（各２ｍｇ）、第０日目、第２８日目、第５６日目に筋肉内、プラス食塩水対照を第１２日目、第１５日目および第１９日目に静脈内。
２群：ＳＩＶ ｇａｇおよびＰＳＡ ＤＮＡワクチン（各２ｍｇ）、第０日目、第２８日目、第５６日目に筋肉内、プラスモノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４を第１２日目、第１５日目および第１９日目に静脈内。
３群：ＳＩＶ ｇａｇおよびＰＳＡ ＤＮＡワクチン（各２ｍｇ）、第０日目、第２８日目、第５６日目に筋肉内、プラスモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４を第１２日目、第１５日目および第１９日目に静脈内。
４群：未処理対照群。
【００８１】
免疫および抗体処理：ＰＳＡおよびＳＩＶ ｇａｇ ＤＮＡワクチンは、David B. Weiner、Department of Pathology and Laboratory of Medicine、University of Pennsylvaniaから得た（Kimら、Oncogene 20, 4497-4506 (2001); Muthumaniら、Vaccine 21, 629-637 (2003)参照）。
【００８２】
サルをＰＳＡおよびＳＩＶ ｇａｇの両ＤＮＡ構築物（２ｍｇ／構築物／免疫）で筋肉内経路により同時に免疫し、ついで４週間隔で２回ブースター投与した（第０日目、第２８日目、および第５６日目）。最初の免疫から１２日後にモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４またはモノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４により処理を開始した。抗体を最初の免疫後の第１２日目、第１５日目、および第１９日目に５０ｍｇ／ｋｇにて静脈内投与した。モノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４に対する抗体応答を抑制することが示されたため、このスケジュールを選んだ。
【００８３】
臨床および臨床病理
この研究の全過程を通じて、教育病院に在籍する獣医により身体検査を全てのサルについて行った。血液学および血清化学分析のための血液試料を、ワクチン接種前、ついで免疫後の第１２日目、第４２日目、第７０日目、第９７日目、第１３４日目、および第１６８日目に回収した。
【００８４】
免疫アッセイ
これら治療レジメンにより誘発された免疫応答に対する作用を決定するため、抗原特異的な刺激されたリンパ球によるＩＦＮ−γ産生の検出に酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を用いた。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のための血液試料を、ワクチン接種前、ついで免疫後の第１２日目、第４２日目、第７０日目、第９７日目、第１３４日目、および第１６８日目に回収した。ＳＩＶ ｇａｇおよびＰＳＡ抗原の全配列に対応する合成ペプチドをＰＢＭＣのイクスビボ刺激に用いた。
【００８５】
結果
ＰＳＡまたはＳＩＶ ｇａｇペプチドに応答した抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴにより定量した。図１６（図１６Ａ〜図１６Ｄ）は、それぞれ１〜４群から得られた結果を示す。ＰＳＡに対する応答レベルは全群で極めて低く、ワクチン接種していない動物と比較したときに該ワクチンはそれ自体で測定可能で一貫した免疫応答を誘発するものではないことを示していた。一方、ＳＩＶ ｇａｇワクチン接種は単独で有意の数の抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞という結果となり、該数は時間とともに増加した（図１６Ａ）。未処理動物（ワクチン接種していない）は、この研究の全過程を通じて１００〜１,０００スポット／１０６ＰＢＭＣを示した（図１６Ｄ）。これら結果は、ワクチンに対する閾値応答を確立した；＜１,０００スポット／１０６ＰＢＭＣを提示した動物は非リスポンダーとした。ワクチンを投与した動物群において、６匹のサルのうち５匹が時間外で（overtime）増加した応答を示し、第三の免疫（第７０日目）後のスポットの平均数は１,７２７スポット／１０６ＰＢＭＣ（ＳＤ＝２４２、範囲＝１,４０３〜１,９６８スポット／１０６ＰＢＭＣ）であった。１匹のサルは非リスポンダーと考えられた（６２０スポット／１０６ＰＢＭＣ）。これら研究ではＭＨＣタイプ分けをしていないので、何匹かのサルによるワクチンに対するＴ細胞応答の欠如は、ＭＨＣミスマッチによると思われる。特に、第７０日目に、ＳＩＶ ｇａｇプラスモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４で処理した６匹の動物のうち４匹は、対照動物（図１６Ｄ）およびＤＮＡワクチン単独で免疫したマカークザル（図１６Ａ）と比較して有意に高い数のＩＦＮ−γスポット（図１６Ｃ）を提示した。モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４処理群の第三の免疫後のスポットの平均数は３,４６５スポット／１０６ＰＢＭＣ（ＳＤ＝１,２３６、範囲＝２,０７０〜４,７８０スポット／１０６ＰＢＭＣ）であった。この群の２匹のサルはワクチンに応答しなかった（＜８００スポット／１０６ＰＢＭＣ）。第三の免疫（第７０日目）後、モノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４プラスＤＮＡワクチンで処理すると６匹の動物のうち６匹がリスポンダーという結果となり、スポットの平均数は２,３４８スポット／１０６ＰＢＭＣ（ＳＤ＝５８８、範囲＝１,７３８〜３,２８３）であった（図１６Ｂ）。この群では、スポットの数の範囲は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４で処理したマカークザルと比較して低かった。
【００８６】
モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４およびモノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４の両者による処理は充分に寛容であり、対照サルと比較して臨床徴候、臨床化学、または血液学的パラメーターの有意の変化という結果とはならなかった。
【００８７】
これらデータは、ＤＮＡワクチンと組み合わせたモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４処理が、抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞により測定されるように、対照またはモノクローナル抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４処理と比較して被験抗原に対する特異的な細胞応答の強度のインビボ促進を誘起したことを示している。これらの予備的な研究では抗体のわずかに１の投与量レベルおよび１の投与レジメンを用いたので、最大の応答が誘発されたとは思われず、条件を最適化するためのさらなる研究が必要である。しかしながら、明らかに、この最適化されないプロトコールでさえ、被験抗原に対する細胞応答の促進がモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４で達成され、ＣＤ１３７機能のモデュレーションがＤＮＡワクチンの有効性を増大させるための魅力的なアプローチであることを示唆している。
【００８８】
以上、本発明を明瞭および理解を目的として説明および実施例により若干詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲内である種の変更および改変をなし得ることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのプラスミドマップを示す。
【００９０】
【図２】図２は、ｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのプラスミドマップを示す。
【００９１】
【図３Ａ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９２】
【図３Ｂ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９３】
【図３Ｃ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９４】
【図３Ｄ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９５】
【図３Ｅ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９６】
【図３Ｆ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９７】
【図３Ｇ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９８】
【図３Ｈ】図３は、プラスミドｐＤ１７−２０Ｈ４.９.ｈ４ａのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号１）、相補鎖（配列番号２）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号３のアミノ酸２０〜４６７である）を含む。
【００９９】
【図４Ａ】図４は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【０１００】
【図４Ｂ】図４は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【０１０１】
【図４Ｃ】図４は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【０１０２】
【図４Ｄ】図４は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【０１０３】
【図４Ｅ】図４は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【０１０４】
【図４Ｆ】図４は、プラスミドｐＤ１６ｇａｔｅ−２０Ｈ４.９.ＬＣのヌクレオチド配列を示し、コード鎖（配列番号４）、相補鎖（配列番号５）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜２０であり、軽鎖は配列番号６のアミノ酸２１〜２３６である）を含む。
【０１０５】
【図５】図５は、２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１重鎖配列構築物の模式図を示す。
【０１０６】
【図６】図６は、２０Ｈ４.９軽鎖配列構築物の模式図を示す。
【０１０７】
【図７Ａ】図７は、２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１重鎖配列構築物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、コード鎖（配列番号７）、相補鎖（配列番号８）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号９のアミノ酸２０〜４７０である）を含む。
【０１０８】
【図７Ｂ】図７は、２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１重鎖配列構築物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、コード鎖（配列番号７）、相補鎖（配列番号８）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号９のアミノ酸２０〜４７０である）を含む。
【０１０９】
【図７Ｃ】図７は、２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１重鎖配列構築物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、コード鎖（配列番号７）、相補鎖（配列番号８）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号９のアミノ酸２０〜４７０である）を含む。
【０１１０】
【図７Ｄ】図７は、２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１重鎖配列構築物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、コード鎖（配列番号７）、相補鎖（配列番号８）、および該コード鎖によりコードされるアミノ酸配列（リーダーペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基１〜１９であり、重鎖は配列番号９のアミノ酸２０〜４７０である）を含む。
【０１１１】
【図８Ａ】図８は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１のヒトＣＤ１３７への結合からＥＬＩＳＡにより得られた結果（図８Ａ）およびＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用に対するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の作用（図８Ｂ）を示す。
【０１１２】
【図８Ｂ】図８は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１のヒトＣＤ１３７への結合からＥＬＩＳＡにより得られた結果（図８Ａ）およびＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用に対するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の作用（図８Ｂ）を示す。
【０１１３】
【図９Ａ】図９は、ＰＭＡ−イオノマイシン刺激したヒトまたはカニクイザル細胞へのモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の結合から得られた結果を示す。ヒトＣＥＭ（図９Ａ）またはカニクイザルＰＢＭＣ（図９Ｂ）を２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１またはヒトＣＤ１３７Ｌ融合タンパク質とともにインキュベートした。
【０１１４】
【図９Ｂ】図９は、ＰＭＡ−イオノマイシン刺激したヒトまたはカニクイザル細胞へのモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の結合から得られた結果を示す。ヒトＣＥＭ（図９Ａ）またはカニクイザルＰＢＭＣ（図９Ｂ）を２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１またはヒトＣＤ１３７Ｌ融合タンパク質とともにインキュベートした。
【０１１５】
【図１０Ａ】図１０は、抗ＣＤ１３７抗体を用いたコスティミュラトリー試験においてＩＦＮ−γの誘発により得られた結果を示しており、対照に対する増加倍数（ｐｇ／ｍｌ）として表してある。ドナー間での様々なバックグラウンド応答のため、データを対照処置（＝１）に対して正規化した。抗ＣＤ３単独で刺激したヒトＴ細胞（図１０Ａ）またはサルＰＢＭＣ（図１０Ｂ）のＩＦＮ−γベースラインレベルの中央値は、それぞれ５９２ｐｇ／ｍｌおよび５０５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１６】
【図１０Ｂ】図１０は、抗ＣＤ１３７抗体を用いたコスティミュラトリー試験においてＩＦＮ−γの誘発により得られた結果を示しており、対照に対する増加倍数（ｐｇ／ｍｌ）として表してある。ドナー間での様々なバックグラウンド応答のため、データを対照処置（＝１）に対して正規化した。抗ＣＤ３単独で刺激したヒトＴ細胞（図１０Ａ）またはサルＰＢＭＣ（図１０Ｂ）のＩＦＮ−γベースラインレベルの中央値は、それぞれ５９２ｐｇ／ｍｌおよび５０５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１７】
【図１１】図１１は、ヒトＣＤ１３７へのモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ１の結合のプラズモン共鳴プロットを示す。
【０１１８】
【図１２】図１２は、ＰＭＡイオノマイシン刺激したヒトＣＥＭ細胞への２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の濃度依存的な結合、および刺激していないＣＥＭ細胞への無結合を示す。
【０１１９】
【図１３Ａ】図１３は、抗ＣＤ１３７抗体を用いたコスティミュラトリー試験におけるＩＦＮ−γの誘発を示す。結果は対照に対する増加倍数（ｐｇ／ｍｌ）として表してある。ドナー間での様々なバックグラウンド応答のため、データを対照処置（＝１）に対して正規化した。抗ＣＤ３単独で刺激したヒトＴ細胞（図１３Ａ）またはサルＰＢＭＣ（図１３Ｂ）のＩＦＮ−γベースラインレベルの中央値は、それぞれ５９２ｐｇ／ｍｌおよび５０５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１２０】
【図１３Ｂ】図１３は、抗ＣＤ１３７抗体を用いたコスティミュラトリー試験におけるＩＦＮ−γの誘発を示す。結果は対照に対する増加倍数（ｐｇ／ｍｌ）として表してある。ドナー間での様々なバックグラウンド応答のため、データを対照処置（＝１）に対して正規化した。抗ＣＤ３単独で刺激したヒトＴ細胞（図１３Ａ）またはサルＰＢＭＣ（図１３Ｂ）のＩＦＮ−γベースラインレベルの中央値は、それぞれ５９２ｐｇ／ｍｌおよび５０５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１２１】
【図１４Ａ】図１４は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４によるＩＦＮ−γ合成の用量依存的な促進で得られた結果（図１４Ａ）、および架橋抗ヒトＩｇＧ抗体（７μｇ／ｍｌ）の添加により架橋された抗体の作用（図１４Ｂ）を示す。
【０１２２】
【図１４Ｂ】図１４は、モノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４によるＩＦＮ−γ合成の用量依存的な促進で得られた結果（図１４Ａ）、および架橋抗ヒトＩｇＧ抗体（７μｇ／ｍｌ）の添加により架橋された抗体の作用（図１４Ｂ）を示す。
【０１２３】
【図１５】図１５は、Ｔ細胞生存および細胞周期進行に対するモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の作用を示す。ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）±列挙した濃度のモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４でコスティミュレーションした。アッセイの開始６日後に細胞を回収し、アネキシンＶおよびプロピジウムヨーダイドで染色して生きた細胞（アネキシンＶ／ＰＩ陰性）の数を決定するか、またはＰＥコンジュゲートサイクリンＤ２で染色して細胞周期を進行する（cycling）細胞を検出した。結果は、平行して試験した４ロットのモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４の平均（±ＳＤ）を表す。
【０１２４】
【図１６Ａ】図１６は、カニクイザルにおいてＤＮＡワクチン±抗ヒト４−１ＢＢ抗体で処理後にＥＬＩＳＰＯＴにより測定した抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示す。動物を、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目；図１６Ａ）、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｂ）、またはＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｃ）で処理した。一つの群の動物は処理せずにおいた（図１６Ｄ）。処理後の種々の時間で採血し、ＰＢＭＣを分離し、抗原の存在下でＩＦＮ−γを分泌する能力を評価した。
【０１２５】
【図１６Ｂ】図１６は、カニクイザルにおいてＤＮＡワクチン±抗ヒト４−１ＢＢ抗体で処理後にＥＬＩＳＰＯＴにより測定した抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示す。動物を、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目；図１６Ａ）、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｂ）、またはＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｃ）で処理した。一つの群の動物は処理せずにおいた（図１６Ｄ）。処理後の種々の時間で採血し、ＰＢＭＣを分離し、抗原の存在下でＩＦＮ−γを分泌する能力を評価した。
【０１２６】
【図１６Ｃ】図１６は、カニクイザルにおいてＤＮＡワクチン±抗ヒト４−１ＢＢ抗体で処理後にＥＬＩＳＰＯＴにより測定した抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示す。動物を、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目；図１６Ａ）、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｂ）、またはＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｃ）で処理した。一つの群の動物は処理せずにおいた（図１６Ｄ）。処理後の種々の時間で採血し、ＰＢＭＣを分離し、抗原の存在下でＩＦＮ−γを分泌する能力を評価した。
【０１２７】
【図１６Ｄ】図１６は、カニクイザルにおいてＤＮＡワクチン±抗ヒト４−１ＢＢ抗体で処理後にＥＬＩＳＰＯＴにより測定した抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示す。動物を、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目；図１６Ａ）、ＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびモノクローナル抗体２０Ｈ４.９−ＩｇＧ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｂ）、またはＳＩＶ ｇａｇワクチン（第０日目、第２８日目、第５６日目）およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４（第１２日目、第１５日目、および第１９日目；図１６Ｃ）で処理した。一つの群の動物は処理せずにおいた（図１６Ｄ）。処理後の種々の時間で採血し、ＰＢＭＣを分離し、抗原の存在下でＩＦＮ−γを分泌する能力を評価した。
【図１】
2007532095.tif 000004
【図２】
2007532095.tif 000005
【図３Ａ】
2007532095.tif 000006
【図３Ｂ】
2007532095.tif 000007
【図３Ｃ】
2007532095.tif 000008
【図３Ｄ】
2007532095.tif 000009
【図３Ｅ】
2007532095.tif 000010
【図３Ｆ】
2007532095.tif 000011
【図３Ｇ】
2007532095.tif 000012
【図３Ｈ】
2007532095.tif 000013
【図４Ａ】
2007532095.tif 000014
【図４Ｂ】
2007532095.tif 000015
【図４Ｃ】
2007532095.tif 000016
【図４Ｄ】
2007532095.tif 000017
【図４Ｅ】
2007532095.tif 000018
【図４Ｆ】
2007532095.tif 000019
【図５】
2007532095.tif 000020
【図６】
2007532095.tif 000021
【図７Ａ】
2007532095.tif 000022
【図７Ｂ】
2007532095.tif 000023
【図７Ｃ】
2007532095.tif 000024
【図７Ｄ】
2007532095.tif 000025
【図８Ａ】
2007532095.tif 000026
【図８Ｂ】
2007532095.tif 000027
【図９Ａ】
2007532095.tif 000028
【図９Ｂ】
2007532095.tif 000029
【図１０Ａ】
2007532095.tif 000030
【図１０Ｂ】
2007532095.tif 000031
【図１１】
2007532095.tif 000032
【図１２】
2007532095.tif 000033
【図１３Ａ】
2007532095.tif 000034
【図１３Ｂ】
2007532095.tif 000035
【図１４Ａ】
2007532095.tif 000036
【図１４Ｂ】
2007532095.tif 000037
【図１５】
2007532095.tif 000038
【図１６Ａ】
2007532095.tif 000039
【図１６Ｂ】
2007532095.tif 000040
【図１６Ｃ】
2007532095.tif 000041
【図１６Ｄ】
2007532095.tif 000042
【配列表】
2007532095000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月9日(2006.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007532095000001.app
【国際調査報告】
2007532095.tif 000067
2007532095.tif 000068
2007532095.tif 000069
2007532095.tif 000070