(57)【要約】  癌の処置に有用な製薬学的組成物およびキットは、とりわけ例えばシスチンジメチルエステルおよびジ−アルキルペプチジルシスタミンエステルを包含する、シスチンのある種のアルキルエステル類およびある種のアルキル−置換されたシスタミン誘導エステル類を含む。これらの化合物は、癌を処置する方法またはアポプトシスに対するある種の癌細胞の感受性を測定する方法において、単独でまたは他の化学療法剤、放射線剤もしくはアポプトシス剤と組み合わせて、使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）
【化１】
2007508384.tif 000011
［式（ａ）および（ｂ）のいずれかに関して、Ｒ１は炭素数１〜１０の置換されたまたは未置換の低級アルキルであり、Ｘは天然に存在するかまたは天然には存在しないアミノ酸であり、そしてｍは０〜２０の整数であり、そして式（ｂ）に関して、ｎは１または２の整数であり、そしてｑは０または１の整数である］
よりなる式から選択される化合物またはその製薬学的に許容可能な塩を製薬学的に許容可能な担体中に含んでなる
癌の処置に有用な製薬学的組成物。
【請求項２】
式（ａ）のＸｍが
【化２】
2007508384.tif 000012
［式中、ｎは１または２の整数であり、そしてｑは０または１の整数であり、そしてｓは０〜１９の整数である］
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式（ａ）のＸｍが
【化３】
2007508384.tif 000013
［式中、ｎは１または２の整数であり、そしてｑは０または１の整数であり、そしてｓは０〜１９の整数である］
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該式（ａ）に関してｍが０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該式（ａ）に関して該Ｒ１がメチル基であり、そして該化合物がシスチンジメチルエステルである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＸがＤ−Ａｓｐ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｄ−ＧｌｕおよびＬ−Ｇｌｕよりなる群から選択されそしてｍが１である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項７】
該（ｂ）に関してｑが１でありそしてｍが０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
該（ｂ）に関して該Ｒ１がメチル基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ｍが１〜１０の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ｍが１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種の式（ａ）の化合物および少なくとも１種の式（ｂ）の化合物を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
追加の細胞毒性化合物をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
該細胞毒性化合物がアポプトシス化合物（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該アポプトシス化合物が化学療法化合物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
式（ａ）または（ｂ）の該化合物が感受性細胞に対する露呈時に細胞のリソソーム内シスチン水準を０．５ナノモル（ｎｍｏｌ）／ｍｇ細胞蛋白質より上に増加させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
該癌がエストロゲン陰性乳癌、エストロゲン陽性乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、脳癌、頭部および頸部癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞性肺癌および非−小細胞性肺癌、骨髄腫、神経芽細胞腫／多形性神経膠芽腫、膵臓癌、膵島癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、結腸癌、頸部癌、および白血病、網膜芽細胞腫、並びに他の上皮−誘発性癌よりなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
哺乳動物患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）の癌細胞を請求項１の組成物で処置することを含んでなる患者における癌の進行を処置または予防する方法。
【請求項１８】
該処置が該組成物をインビボで投与することを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該処置が該組成物をエクスビボで投与することを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該投与が経口、局所、全身的、腸内、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、門脈内、前立腺内、動脈内、皮膚内、鞘内、病変内、腫瘍内、膀胱内、膣内、眼内、直腸内、肺内、脊椎内、経皮、皮膚下、腫瘍部位における局所灌流、鼻吸入、肺吸入、皮膚内への圧入およびエレクトロコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）よりなる群から選択される投与経路を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１の組成物を用いる処置の前、請求項１の組成物を用いる処置の後および請求項
１の組成物を用いる処置と同時よりなる群から選択される時点で、該患者を第二の細胞毒性剤で処置するかまたは該患者を該剤に露呈することをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該細胞毒性剤が化学療法剤、アポプトトーゲン（ａｐｏｐｔｏｔｏｇｅｎ）および放射線よりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該処置が該組成物を該患者に１．０μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重の薬用量で投与することを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
該癌がエストロゲン陰性乳癌、エストロゲン陽性乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、脳癌、頭部および頸部癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞性肺癌および非−小細胞性肺癌、骨髄腫、神経芽細胞腫／多形性神経膠芽腫、膵臓癌、膵島癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、結腸癌、頸部癌、および白血病、網膜芽細胞腫、膵島癌、並びに他の上皮−誘発性癌よりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
式（ａ）の該化合物がシスチンジメチルエステルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
式（ｂ）の該化合物がアスパルチル−シスタミンジメチルエステルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
培養中の該癌細胞を製薬学的に有効な量の請求項１の組成物と接触させそして該培養中のアポプトシス速度を測定することを含んでなる、アポプトシスに対する癌の感受性を測定する方法。
【請求項２８】
少なくとも１種の請求項１の組成物を薬用量単位で含んでなる癌の処置用の製薬学的キット。
【請求項２９】
少なくとも１種の式（ａ）の化合物および少なくとも１種の式（ｂ）の化合物をさらに含んでなる、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
式（ａ）の該化合物がシスチンジメチルエステルである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
式（ｂ）の該化合物がアスパルチル−シスタミンジメチルエステルである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
追加の細胞毒性化合物をさらに含んでなる、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
アポプトシス、すなわちプログラムされた細胞死滅、は抑制されない細胞増殖を防止するための進化中に強く保護されてきた自然発生工程である。細胞自殺のこの形態は、余分のまたは望まれない細胞を排除することにより多細胞有機体の発育および保存を確保する際に重要な役割を演ずる。成長因子、細胞外マトリックス変化、ＣＤ４０配位子、ウイルス遺伝子生成物、中性アミノ酸類、亜鉛、エストロゲン、およびアンドロゲン類により誘発される不充分なアポプトシスは癌の進行に寄与しうる（非特許文献１）。
【０００２】
癌の最近の処置は化学療法剤および放射線療法に集中している。これらの２つの養生法（ｒｅｇｉｍｅｎｓ）の目標は細胞の複製に関係する工程を妨害することにより急速に分割する細胞を死滅させることであると一般に考えられている。これらの処置はある種の剤に対する分裂しつつある細胞の感受性を利用する。これらの方法のあるものは、例えばコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）およびパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の如く有糸分裂中の微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ）集合を損傷するように設計された処置を包含する（非特許文献２）。例えばドキソルビシン（Ｄｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびエピルブシン（ｅｐｉｒｕｂｕｃｉｎ）の如き他の化学療法薬はＤＮＡの複製を妨害する（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ａｆｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｒａｎｄｈａｗａ，Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０００，５３，５５−６３
【非特許文献２】Ｋａｕｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４２−４９
【非特許文献３】Ｂｕｓｃｈｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，２００３，ｖｏｌ．１８，ｎｏ．１，ｐｐ．２５−３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの最近の療法は癌細胞を標的にしているが、それらは細胞分割工程に含まれるその他の点では健康な細胞にも同様な影響を与える。種々の癌の処置、予防および診断に有用な化合物および製薬学的組成物並びに方法に関する要望が当該技術に依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
一面で、本発明は以下の式（ａ）により定義されているシスチンをベースとしたジ−アルキルエステルである化合物もしくは以下の式（ｂ）のジ−アルキルペプチジルシスタミンエステルである化合物またはその製薬学的に許容可能な塩を製薬学的に許容可能な担体中に含む癌の処置に有用な製薬学的組成物を提供する。１つの態様では、式（ａ）の化合物はシスチンジメチルエステルである。１つの態様では、式（ｂ）の化合物はアスパルチル−シスタミンジメチルエステルである。さらに別の態様では、組成物は式（ａ）の化合物および式（ｂ）の化合物を含有する。別の態様では、組成物は化学療法化合物またはアポプトゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）である追加化合物をさらに含有する。この組成物は化合物の細胞内への浸透性を増強するためおよび／またはその生物学的利用能を広げそしてインビボでの酵素性分解に対するその耐性を増加するための他の製薬学的に許容可能な成分を含有しうる。当該式の化合物の種々の別の態様、並びに式（ａ）および（ｂ）内の可変基に関する定義は詳細な記述に開示されている。そのような組成物は種々の癌の処置、予防および診断において有用である。これらの化合物は単独でまたは他のアポプトゲン性
化合物と一緒になってアポプトシスに対する標的細胞の感受性を特異的に増加させ、そして種々の癌に対するさらに有効な療法のための組成物および方法を提供する。
【０００５】
他の面で、本発明は哺乳動物患者の癌細胞をここに記載された組成物で処置することにより患者における癌の進行を処置または予防する方法を提供する。処置段階はインビボまたはエクスビボでありうる。
【０００６】
さらに別の面で、本発明は本発明の組成物を用いる処置の他に、哺乳動物患者を第二の化学療法剤またはアポプトゲン剤で処置するかまたは該患者を該剤に露呈することにより、患者における癌の進行を処置または予防する方法を提供する。１つの態様では、第二の剤を用いる処置は本発明の組成物を用いる処置の前に行われる。別の態様では、第二の剤を用いる処置は本発明の組成物を用いる処置の後に行われる。さらに別の態様では、第二の剤を用いる処置は本発明の組成物を用いる処置と共に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）または同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）行われる。
【０００７】
別の面で、本発明の方法は上皮−誘発性癌細胞を本発明の組成物で処置することによる細胞内でアポプトシスを誘発させることを包含する。さらに別の面で、本発明の方法は乳癌細胞を本発明の組成物で処置することによる細胞内でアポプトシスを誘発させることを包含する。以下の記述は他の癌、特にここに記載された組成物を用いる他のアポプトゲンに耐性である癌、を処置する方法をさらに記述する。
【０００８】
さらに別の面で、本発明は培養中の癌細胞を適量のここに記述される組成物と接触させそして該培養中のアポプトシスの速度を測定することによりアポプトシスに対する癌細胞の感受性を測定する方法を提供する。
【０００９】
別の面で、本発明は以上で定義された少なくとも１種の組成物を薬用量単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）で含んでなる癌の処置用の製薬学的キットを提供する。一面で、キットはシスチンジメチルエステル、並びに場合により存在する成分、例えば適当な製薬学的にまたは診断的に許容可能な担体、浸透促進剤またはバイオアベイラビリティーを広げそしてインビボでの酵素性分解に対するその耐性を増加させるための成分、融合化合物、検出可能な試薬、物理的移送（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）手段および他の同様な品目、を含有する。
【００１０】
別の面で、本発明は哺乳動物患者における癌の処置または予防のための薬品の製造における上記化合物または組成物の使用を提供する。
【００１１】
本発明の他の面および利点は以下のその好ましい態様の詳細な記述にさらに記載される。
【００１２】
図面の簡単な記述
図１は半−融合性の腎障害シスチン症または正常な線維芽細胞におけるアポプトシスに対するＭＥＡまたはシスチンジメチルエステル（ＣＤＭＥ）の影響を示す棒グラフである。
【００１３】
図２は腎臓線維芽細胞のアポプトシスに対する種々の二硫化物化合物およびそれらのエステル類の影響を示す表並びにその中の構造の図面である。シスチンジメチルエステル以外の構造のいずれも人間の近位腎臓細管上皮細胞においてアポプトシスの有意な増加を引き起こさなかった。
【００１４】
図３は腎臓近位細管上皮（ＲＰＴＥ）細胞におけるアポプトシスに対するＣＤＭＥの影響を示すグラフである。半−融合性のＲＰＴＥ細胞を０．２５ｍＭのＣＤＭＥまたはＴＮＦ−αで処置し、０．５、１、３、および６時間において回収し、チュネル（ＴＵＮＥＬ）で染色し、そして蛍光顕微鏡により計数した。それぞれの実験は三重に行われた。対照（時間０）シスチン含有量は０．６ｎモル／ｍｇの蛋白質であった。１時間のインキュベーション後に、シスチン含有量は２．２ｎモル／ｍｇの蛋白質であった。
【００１５】
図４は対照、ＣＤＭＥおよび既知のアポプトシス剤であるタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）を用いる乳癌細胞系ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−４８９、ＭＣＦ−７およびＴ７４Ｄの処置後のアポプトシス細胞の百分率を示す棒グラフである。
発明の詳細な記述
癌の処置用の追加のアポプトシスまたはアポプトゲン組成物に関する当該技術の要望に応えて、本発明は以下の式（ａ）により定義されるシスチンをベースとしたジ−アルキルエステルである化合物または以下の式（ｂ）のジ−アルキルペプチジルシスタミンエステルである化合物を含む癌の処置に有用な組成物を提供する。
Ａ．本発明の化合物
本発明によると、本発明の好ましい化合物は下記の式（以下ではまとめて「本発明の式」と称する「式（ａ）」および「式（ｂ）」）により定義される。
【００１６】
【化１】
2007508384.tif 000002
【００１７】
式（ａ）および式（ｂ）の両者の化合物に関して、Ｒ１は炭素数１〜１０の置換されたまたは未置換の低級アルキルである。「アルキル」はここでは炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状の両方の飽和脂肪族炭化水素基をさす。用語「置換されたアルキル」は、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アリール、複素環、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニル、アルキル、カルボキシおよびアリールチオを包含するが、これらに限定されない１個もしくはそれ以上の置換基を有するアルキルをさし、これらの基はそれとは別に置換されうる。これらの置換基は、結合が安定な化学部分を構成する限り、アルキル基のいずれの炭素原子にも結合されうる。ある種の好ましい態様では、Ｒ１は炭素数が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の直鎖状アルキルである。別の態様では、Ｒ１はメチル基である。別の態様では、Ｒ１はブチル基である。さらに他のＲ１は当業者により容易に選択されうる。
【００１８】
式（ａ）および式（ｂ）の両者の化合物に関して、Ｘは天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸であり、そしてｍは０〜２０の整数である。「天然に存在するアミノ酸」はここでは、アラニン、システイン、アスパルテート、グルタメート、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパルギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンを包含する自然界にＬ形態で生ずる２０種のアミノ酸類、または自然界に生ずる生物学的工程もしくは経路を通して製造されるそれらのいずれかの誘導体をさすために使用される。
【００１９】
「天然に存在しないアミノ酸」はここでは、合成されうるまたは「人造」でありうる、以上で定義された天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸類をさすために使用され、そして合成的にまたは生物学的工程もしくは経路を通して製造されるそれらの誘導体を包含する。天然に存在しないアミノ酸はＤアミノ酸類、非天然的に置換された側鎖を含有するアミノ酸類、例えば、メチル−Ａｒｇ、環式アミノ酸類、ジアミノ酸類、β−アミノ酸類、ホモアミノ酸類を包含するが、限定されない。天然に存在しないまたは非天然アミノ酸類は新規な骨格および側鎖構造により同定することができそして商業用試薬供給業者、例えばシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）、ｗｗｗ．Ｎｅｔｃｈｅｍ．ｃｏｍおよび他のサイト、から広く入手可能である。例えば、Ｈａｎ  Ｓ  ａｎｄ  Ｖｉｏｌａ  ＲＥ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｌｅｔｔ．２００４  １１（２）：１０４−１４；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２００４  ７６（１）：６９−８２；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００４  ２７（２）：２４４−７；Ｐａｓｃａｌ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００３  ３６９：１８２−９４；Ｙｏｄｅｒ  ＮＣ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ  Ｋ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００２  ３１（６）：３３５−４１；およびＡｇｅｒ  ＤＪ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．２００２  ５（６）：８９２−９０５をとりわけ包含するが限定されないそのような構造に関する広範な文献を参照すべきであり、それらは引用することにより本発明の内容となる。この用語は、以上で定義された「天然に存在するアミノ酸」の定義内に入る誘導体は包括しない。
【００２０】
そのような１種もしくは複数の非−天然−産出アミノ酸は、上記化合物中で使用される時には、化合物を血清、唾液、胃および腸内での哺乳動物酵素による分解に対してより耐性にすることに関係し、そしてそれ故１種もしくはそれ以上のそのようなアミノ酸より構成される化合物は化合物に対してインビボでの増加した安定性および生物学的利用能を与えうる。天然に存在しないアミノ酸を製造するための種々の方法は既知でありそして当業者により選択されうる。
【００２１】
例えば、天然に存在しないアミノ酸の１種は立体化学性に影響するＬアミノ酸類である。それ故、本発明の化合物の１つの態様では、ペプチド中のアミノ酸類の１つもしくはそれ以上はＬ形態でありうるが、他のものはＤ形態でありうる。別の天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸構造中のアルファ−炭素上に置換基を含有するように変更されているアミノ酸である。例えば、アルファ−炭素は適当な炭化水素部分、例えばアミノイソブチレート、により置換されうる。天然に存在しないアミノ酸類のさらに別の種類は、それらの炭素鎖長を延長するように変更または突然変異されているアミノ酸類である。例えば、１個のアルファ−炭素鎖を有するアミノ酸は少なくとも１個の追加炭素、すなわち、ベータ−炭素、などで延長されうる。アミノ酸に対する追加の変更はアミノ基の窒素上での置換基の挿入である。このタイプの変更の例はＮ−メチルアミノ酸である。アミノ酸分子のアルファ炭素もしくは追加炭素上または窒素上の置換基の追加は上記式のアミノ酸のいずれにおいても起きうる。
【００２２】
天然に存在しないアミノ酸類を作成するために有用な置換基の中には、直鎖状、分枝鎖状、環式または複素環式Ｃ１−１２アルキル基、および直鎖状、分枝鎖状、環式または複素環式Ｃ１−１２アルカノイル基がある。アミノ酸は修飾用の糖、イミド基などの挿入によっても変更されうる。他のアミノ酸類はオルトまたはメタ位置で例えばＨ、ＯＨ、ＣＨ３、ハロゲン、ＯＣＨ３、ＮＨ２、ＣＨまたはＮＯ２の如き置換基により置換される。
【００２３】
上記式に合致する化合物中への包含のための修飾されたまたは非−天然−産出アミノ酸類の非限定リストは、Ｎ−末端アセチル化、Ｃ−末端アミド化、Ｎ−末端メチオニンのホルミル化、化合物中のＡｓｐ、Ａｓｎ、ＰｒｏまたはＬｙｓ基のガンマ−カルボキシグル
タミン酸ヒドロキシル化、ＬｙｓまたはＡｒｇのメチル化、好ましくは化合物中のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＨｉｓのホスホリル化、内部環式ラクタムを生成したＮ−末端グルタメートであるピロリドンカルボン酸の使用、Ｔｙｒの硫酸化により修飾されたアミノ酸類を一般的に包含する。天然に存在しないアミノ酸類のさらに別の修飾は下記の部分の使用または置換を包含する：２−アミノアジピン酸基、３−アミノアジピン酸基、ベータ−Ａｌａまたはベータ−アミノプロピオン酸基、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアモノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、６−Ｎ−メチルリシン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチン。
【００２４】
それ故、本発明の化合物のある種の態様では、Ｘｍにより表される１種もしくは複数の天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸は存在しないことができる。他の態様では、Ｘｍは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸基でありうる。さらに別の態様では、Ｘｍは１〜１５の範囲である。さらに別の態様では、Ｘｍは１〜１０個のアミノ酸の範囲である。この式（ａ）のさらに別の態様は１〜５個のアミノ酸基をＸｍ位置に含有する。さらに別の好ましい化合物は、Ｘｍが１個のアミノ酸である時に製造される。Ｘｍにより表されるそのようなアミノ酸類はＤまたはＬ回転形態でありうる。
【００２５】
別の態様では、式（ａ）のＸｍが下記の２種の構造：
【００２６】
【化２】
2007508384.tif 000003
【００２７】
の１種を有する本発明の化合物が提供される。式（ａ）に関するＸｍのこれらの態様においてそして式（ｂ）の全ての態様に関して、ｎは１または２の整数であり、そしてｑは０または１の整数である。Ｘは以上で定義されている通りであるが、ｓは０〜１９の整数である。
【００２８】
それ故、ｎが１である式（ａ）または（ｂ）の化合物のある種の態様では、化合物の左側端部上のエステル基はＡｓｐにより形成される。ｎが２である態様では、エステル基はＧｌｕ基により形成される。関係ある構造によって、ＡｓｐまたはＧｌｕはＤ−Ａｓｐ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｄ−ＧｌｕまたはＬ−Ｇｌｕでありうる。
【００２９】
Ｘｓが存在しない式（ａ）の１つのそのような態様では、形成される化合物はシスチン
のジ−アルキルアスパルチルまたはジアルキルグルタミルエステル誘導体である。ｎが１または２の整数であり、そしてｑが０または１の整数であり、Ｒ１およびＸｍが以上で定義された通りである式（ｂ）の特別な態様では、シスタミンの種々のジアルキルＡｓｐまたはジアルキルＧｌｕエステル類が提供される。
【００３０】
本発明の特別な態様では、式（ａ）の化合物はｍが０でありそしてＲ１がメチル基であることにより特徴づけられ、結果として化合物シスチンジメチルエステル（ＣＤＭＥ）となる。ｑが１でありそしてｍが０であり、且つＲ１がメチル基である式（ｂ）の態様では、シスタミンのジメチルアスパラチルまたはジメチルグルタミルエステル誘導体が提供される。別の態様では、本発明は可変要素が言及された範囲内のいずれかで定義されている化合物を提供する。
【００３１】
Ｂ．製造方法
本発明の化合物は通常既知の化学合成技術により製造することができる。本発明の化合物は商業的販売業者、例えばシグマ−アルドリッチ・カンパニー、から購入することもできる。当業者に既知であるそのような好ましい技術の中には、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３  ８５：２１４９−２１５４により記載されている合成方法、並びに例えばＧ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ｔ．Ｅｌｍｏｒｅ，“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｏｃｔ．１９９８、および“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ｅｄｓ．Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ，Ｈ−Ｄ  Ｊａｋｕｂｋｅ，Ａｕｇ．２００２の如き文献、並びに合成化合物の構成に関する他の従来の教本が包含される。
【００３２】
Ｃ．製薬学的組成物および調合物
本発明の製薬学的組成物は、１つの態様では、式（ａ）の化合物を、製薬学的に許容可能な担体中に、他の、場合により使用する適当な製薬学的に非反応性または不活性成分と共に含有する。別の態様では、製薬学的組成物は式（ｂ）の化合物を同様な調合物中に含有する。別の態様では、本発明の製薬学的組成物は１種もしくはそれ以上の上記式の化合物を、１種もしくはそれ以上の別の治療的に有用な試薬と共に含有する。１つの態様では、式（ａ）の化合物および式（ｂ）の化合物が単一組成物中に存在する。別の態様では、式（ａ）の化合物および／または式（ｂ）の化合物は１種もしくはそれ以上の化学療法アポプトシス剤および／または生物学的アポプトシス剤、放射線アポプトシス剤、および／または以下で記載されているような他の療法剤と組み合わされる。
【００３３】
１．塩類
本発明の化合物は、製薬学的組成物中で調合される時には、描かれた構造の生物活性により特徴づけられるここで提供される構造の互変異性体を包括する。さらに、本発明の化合物は製薬学的にまたは生理的に許容可能な酸類、塩基類、アルカリ金属類およびアルカリ土類金属類から誘導される製薬学的に許容可能な塩類の形態で使用することができる。
【００３４】
生理的に許容可能な塩類は無機および有機酸類から誘導されるものを包含する。多くの無機酸類が当該技術で既知でありそしてとりわけ塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、および燐酸を包含する。同様に、種々の有機酸類も当該技術で既知でありそしてとりわけ乳酸、蟻酸、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、シュウ酸、琥珀酸、グルコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フロ酸（ｆｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、サリチル酸、酒石酸、マロン酸、リンゴ酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニック・アシド（ｅｍｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、パンテノイック・アシド（ｐａｎｔｈｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ステアリン酸、スルファニル酸、アルギン酸、およびガラクツロン酸を包含するが、限定されない。
【００３５】
生理的に許容可能な塩基類は無機および有機塩基類から誘導されるものを包含する。多くの無機塩基類が当該技術で既知でありそしてとりわけ硫酸アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛の硫酸塩または燐酸塩化合物を包含する。多くの有機塩基類が当該技術で既知でありそしてとりわけＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、およびプロカインを包含するが、限定されない。
【００３６】
生理的に許容可能なアルカリ塩類およびアルカリ土類金属塩類はエステル類の形態のナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩類、並びにカルバメート類を包含するが、限定されない。他の従来の「プロ−ドラッグ」形態も利用することができ、それらはそのような形態で分配される時にインビボで活性部分に転化される。
【００３７】
これらの塩類、並びに本発明の他の化合物は、好ましくは「プロ−ドラッグ」形態としての使用のためにはエステル類の形態であり、それらはそのような形態で分配される時にインビボで活性部分に転化される。別の態様では、プロドラッグはカルバメート類である。例えば、Ｂ．Ｔｅｓｔａ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：Ｔｈｅ“Ａｄ  Ｈｏｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｓ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６（３）：２２３−２４１，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９６）を参照のこと。
【００３８】
ここで論じられる化合物は、本発明の化合物を細胞または患者により処理することにより製造される生成物である「代謝物質」も包括する。好ましくは、代謝物質はインビボで製造される。
【００３９】
２．担体
本発明の製薬学的組成物は未希釈のまたは１種もしくはそれ以上の投与用の製薬学的担体と共に調合された本発明の化合物を包含し、その割合は化合物の溶解度および化学的性質、選択される投与方式並びに標準的な薬理学的実施法により決められる。１種もしくは複数の製薬学的担体は固体または液体でありうる。調合物には固体および液体担体の両方を混入しうる。
【００４０】
固体担体は、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、グライダント（ｇｌｉｄａｎｔｓ）、圧縮助剤、結合剤または錠剤−崩壊剤として作用しうる１種もしくはそれ以上の物質を包含し、それはカプセル化材料であってもよい。粉剤では、担体は微細分割された活性成分と混合された微細分割された固体である。錠剤では、活性成分は適当な割合において必要な圧縮性質を有しそして所望される形状および寸法で圧縮される担体と混合される。適する固体担体は、例えば、燐酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、澱粉、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス類およびイオン交換樹脂、結晶性セルロース、結合剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、コーティング剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびそのテレフタレート、滑沢剤、例えばステアリン酸亜鉛およびステアリン酸アルミニウム、を包含する。
【００４１】
液体担体は、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｅｒｓ）および加圧された組成物を製造する際に使用される。活性成分を製薬学的に許容可能な液体担体、例えば水、有機溶媒、両者の混合物または製薬学的に許容可能な油類もしくは脂肪類、の中に溶解または懸濁させることができる。担体はグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどを包含する。液体担体は他の適する製薬学的添加剤、例えば可溶化剤、乳化剤、等張剤、糖類、塩化ナトリウム、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｓ）、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、濃稠化剤、界面活性剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤または浸透−調節剤、張力−活性剤、を含有しうる。経口的および非経口的投与のための液体担体の適する例は水（一部は上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液、を含有する）、アルコール類（１価アルコール類および多価アルコール類、例えばグリコール類、を包含する）およびそれらの誘導体、レチシン類、並びに油類（例えば分別されたヤシ油および落花生油）を包含する。非経口的投与のためには、担体は油状エステル、例えばオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピル、でもありうる。減菌液体担体は非経口的投与用の減菌液体形態組成物において有用である。加圧された組成物のための液体担体はハロゲン化された炭化水素または他の製薬学的に許容可能な噴射剤、可溶化剤および分散化剤、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、安定剤、ｐＨ調節剤、および等張性−付与剤、防腐剤、抗−細菌剤および抗−カビ剤、リポソーム、マンノース、グルコースおよび均衡された塩溶液、燐酸塩緩衝食塩水、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、ハロタン、またはトリフルオロトリクロロエタンでありうる。
【００４２】
３．複数の化合物を含有する製薬学的組成物
さらに、本発明の化合物は本発明の組成物中で単独で調合することもでき、または本発明の他の化合物および癌処置技術で既知である他の化合物と組み合わせることもできる。本発明の化合物は他の治療剤と組み合わせて使用することもできる。
【００４３】
ある種の態様では、そのような他の剤は化学療法アポプトシス剤、例えば抗−代謝物質、ＤＮＡ損傷、微小管不安定化、微小管安定化、アクチン脱重合、成長抑制、トポイソメラーゼ阻害、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害、プリン抑制、ピリミジン抑制、メタロプロテイナーゼ阻害、ＣＤＫ阻害、カスパーゼ阻害、プロテアソーム阻害、脈管形成抑制、異化誘発および免疫療法薬品、並びにＴＧＦ−β応答および／またはアポプトシスの促進用組成物を包含するが、限定されない。これらの剤はアントラシクリン抗生物質、例えばドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、アクチノマイシン−Ｄ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ−Ｄ）、ミトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、バラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）など（ステロイド薬品を添加しまたは添加しない）；抗−アンドロゲン類（例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、アドレノコルチコトロピン性ホルモン分泌抑制剤、ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、エストロゲン類、抗−エストロゲン類およびＬＨＲＨ生成抑制剤）、免疫調節剤（サイトキン類、ケミキン類、インターフェロン類、インターロイキン類を包含する）、レチノイド類（レチン酸、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド−Ｏ−グルクロニド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド、レチノイド類のＯ−グルクロニド共役体、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミドおよびそのグルクロニド誘導体、レチニル−β−グルクロニド、レチノイン酸およびレチノールのグルコニド共役体、トレチノイン、エトレチネート、アロチノイド、イソトレチノン（ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｎ）、酢酸レチニル、アシトレチン、アダパレン、およびタザロテン）、レチノイド−関連化合物を含有するアダマンチルまたはアダマンチル基誘導体（例えば、６−［３−（１−アダマンチル）−４−メトキシフェニル］−２−ナフトエ酸、２−［３−（１−アダマンチル）−４−メトキシフェニル］−５−ベンズイミダゾールカルボン酸、および６−［３−（１−アダマンチル）−４，５−メチレンジオキシフェニル］−２−ナフトエ酸、２−メトキシエストラジオール）、プロゲスチン、１−Ｏ−アセチルブリタニラクトン、１，６−Ｏ，Ｏ−ジアセチルブリタニラクトン、２−ニトロイミダゾール誘導体（例えば１−（２，３−ジヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−プロポキシメチル）−ニ���ロイミダゾール、１−（４−ヒドロキシ−２−ブテニルオキシメチル）−２−ニトロイミダゾールおよび１−（２，３−ジヒドロキシプロポキシメチル）−２−ニトロイミダゾール）、ベンズアミドリボシド、合成グリコアミン類、ＴＮＦ−α、抗−Ｆａｓ抗体、タプシガルギン、ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２またはＴＧＦ−β−３）、非−プロゲスチン／非−エストロゲンＴＧＦ−β誘発剤、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、食物フラバノイド類、抗−炎症薬、モノテルペン類、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、セレン、並びにビタミンＤ化合物よりなる群から選択される非−プロゲスチン／非−エストロゲンアポプトシス促進剤を包含するが、限定されない。
【００４４】
他のアポプトシス剤は生物学的アポプトシス剤、例えばｐ５３蛋白質または遺伝子、ミコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）（Ｍ．Ｐｈｌｅｉ）ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）およびＭ．Ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）と複合したＤＮＡ、メロスリア・インジカ・ロウ（Ｍｅｌｏｔｈｒｉａ  ｉｎｄｉｃａ  Ｌｏｕ）の抽出物、フェツイン（ｆｅｔｕｉｎ）、アポゲン（Ａｐｏｇｅｎ）Ｐ−１ａ、アポゲンＰ−１ｂ、アポゲンＰ−１ｃ、アポゲンＰ−２、およびアポゲンＬ、を包含する。別のアポプトシス剤は放射線アポプトシス剤、例えば放射性同位体およびＤＮＡ損傷放射線、例えばＸ線、紫外線、ガンマ線およびマイクロ波、を包含する。
【００４５】
以上で挙げられていないが本発明の組み合わせ療法に有益である他の治療剤も本発明内であると考えられる。
【００４６】
１つの態様では、本発明の化合物および／または他の剤は単一組成物中で投与することができる。しかしながら、本発明はそのように限定されない。他の態様では、本発明の化合物を、本発明の他の化合物、化学療法アポプトシス剤、生物学的アポプトシス剤、放射線アポプトシス剤または所望に応じた他の剤とは別個の１つもしくはそれ以上の調合物中で投与することができる。
【００４７】
本発明の化合物および組成物は殺菌性水性溶液もしくは分散液、水性懸濁液、油乳化液、水中／油乳化液、部位−特異的乳化剤、長期滞留乳化液、粘着性乳化液、マイクロ乳化液、ナノ乳化液、リポソーム、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、マイクロ球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ナノ球（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ミニポンプによる、および持続放出を可能にする種々の天然または合成重合体を用いる投与のために調合することができる。本発明の化合物はエアロゾル剤、錠剤、丸剤、減菌粉剤、坐剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、持続−分配装置、または薬品分配で使用される他の調合物に調合することもできる。
【００４８】
使用される１種もしくは複数の調合物は所望される１種もしくは複数の投与方式に応じて変動するであろう。例えば、注射可能調合物は組成物を液体と組み合わせることにより製造することができる。液体は、水、グリセロール、エタノール、グリコール類、例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、油類、並びにそれらの混合物の中から選択することができ、そしてより好ましくは液体担体は水である。１つの態様では、油は植物油である。場合により、液体担体は懸濁化剤を含有する。別の態様では、液体担体は等張性媒体でありそして約０．０５％〜約５％の懸濁化剤を含有する。
【００４９】
１つの態様では、製薬学的組成物は単位薬用量形態、例えば錠剤またはカプセル剤、である。そのような形態では、組成物は適量の活性成分を含有する単位服用量に細分され、単位薬用量形態は包装された組成物、例えば、包装された粉剤、瓶、アンプル、予備−充填された注射器または液体を含有する小袋（ｓａｃｈｅｔｓ）でありうる。単位薬用量形態は、例えば、カプセル剤もしくは錠剤自体であることができ、またはそれは包装形態の適当な数のそのような組成物でありうる。
【００５０】
Ｄ．製薬学的キット
本発明は、ここに記載される化合物または組成物を含む製薬学的調合物のキットまたはパッケージを提供する。キットは好ましくは各々の所望される時点に服用される単一の経口調合物または経口調合物の組み合わせを指示するように構成されており、好ましくは指定された時点に各々服用される経口錠剤を包含し、そしてより好ましくは１個の経口錠剤は指示された組み合わせ周期的薬用量の各々を含有するであろう。
【００５１】
キットは１種もしくはそれ以上の化学療法アポプトシス剤、生物学的アポプトシス剤、または他の治療剤、例えば上記のものの中から選択される１種もしくはそれ以上の剤、も包含しうる。当業者は本発明のキット中での使用のための適量の上記剤を容易に調合することができるであろう。本発明の組成物と組み合わされた放射線剤を含有するキットも考えられる。
【００５２】
ここに記載される化合物または組成物を連続的に分配しようとする時には、パッケージまたはキットは化合物を各薬用量単位（例えば溶液剤、ローション剤、錠剤、丸剤、または上記のもしくは薬品分配で利用される他の単位）の中に包含しうる。化合物を周期的に停止して分配しようとする時には、パッケージまたはキットは化合物が移送されない期間中にプラシーボ（ｐｌａｃｅｂｏｓ）を包含しうる。組成物の濃度、組成物の成分、または組成物内の化合物もしくは剤の相対比を時間経過につれて変動させる時には、パッケージまたはキットは薬用量単位の順序をそのように変動させて含有しうる。
【００５３】
経口使用のための薬剤を分配する際の使用のための多くのパッケージまたはキットが当該技術で既知である。好ましくは、パッケージは各期間に関する指示書を有しており、そしてより好ましくはラベルが貼られた発泡ブリスター（ｂｌｉｓｔｅｒ）パッケージ、ダイアルディスペンサー（ｄｉａｌ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）パッケージ、または瓶である。
【００５４】
キットの包装手段、例えば吸入器、注射器、ピペット、点眼器、またはそのような同様な装置、はそれ自体で投与のために調合物を身体の感染領域、例えば肺、に適用できるように伝達装置で作動させる（ｇｅａｒｅｄ）ことができ、またはキットの他の成分に適用しそして混合することさえできる。
【００５５】
これらのキットの組成物は乾燥されたまたは凍結乾燥された形態でも提供されうる。試薬または成分が乾燥された形態で提供される時には、再構成は一般的に適当な溶媒の添加による。溶媒も他の包装手段の中に供給することが推奨される。
【００５６】
本発明のキットは典型的には市販用の密閉瓶を含有するための手段、例えば所望する瓶が保持される注射器または吹き込み成型（ｂｌｏｗ−ｍｏｌｄｅｄ）されたプラスチック容器、も包含するであろう。パッケージの数またはタイプとは無関係に、本発明のキットは注射／投与または動物の体内への最終的な複合組成物の配置を助けるための別の器具も包含することもでき、またはそれと共に包装することもできる。そのような器具は吸入器、注射器、ピペット、鉗子、測定スプーン、点眼器またはいずれかのそのような医学的に認可される分配手段でありうる。他の器具はインビトロでの反応を読み取るかまたは監視することを可能にする装置を包含する。
【００５７】
１つの態様では、本発明の製薬学的キットは本発明の式に従う化合物を含有する少なくとも１種の組成物を薬用量単位で含む。別の態様では、本発明の製薬学的キットは式（ａ）の少なくとも１種の化合物および式（ｂ）の少なくとも１種の化合物を薬用量単位で含有する。別の態様では、本発明の製薬学的キットはシステインジメチルエステル（ＣＤＭＥ）を単位薬用量形態で含有する。別の態様では、本発明の製薬学的キットはアスパルチル−シスタミンジメチルエステルを単位薬用量形態で含有する。
【００５８】
さらに別の態様では、本発明の製薬学的キットは化学療法アポプトシス剤、生物学的アポプトシス剤、および／または他の上記の治療剤も含有する。さらに別の態様では、本発明の製薬学的キットは上記の組成物を放射線剤および処置と共に使用する。
【００５９】
Ｅ．処置の方法
本発明の組成物は癌の処置において有用である。本発明の組成物で処置しようとする具体的な癌はエストロゲン陰性乳癌、エストロゲン陽性乳癌、前立腺癌（アンドロゲン−非依存性前立腺癌）、卵巣癌、膀胱癌、脳癌、頭部および頸部癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞性肺癌および非−小細胞性肺癌、骨髄腫、神経芽細胞腫／多形性神経膠芽腫、膵臓癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、結腸癌、頸部癌、および白血病、網膜芽細胞腫、膵島癌、または他の上皮−誘発性癌を包含する。
【００６０】
１つの態様では、哺乳動物患者の癌細胞を本発明の組成物で、インビボまたはエクスビボのいずれかで、処置することを含んでなる患者における癌の進行を処置または予防する方法が意図される。本発明の製薬学的組成物は患者に１種もしくはそれ以上の方式により投与して所望に応じて癌細胞と接触させることができる。例えば、組成物は経口、局所、全身的、腸内、経腸、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内（例えば点滴による）による注射用に調合される）、皮下、門脈内、前立腺内、筋肉内、静脈内、動脈内、皮膚内、鞘内、病変内、腫瘍内、膀胱内、膣内、眼内、直腸内、肺内、脊椎内、経皮、および皮膚下方式により投与することができる。さらに、組成物は体腔内への配置、腫瘍部位又は他の所望の部位における局所灌流、鼻吸入、肺吸入、皮膚内への圧入およびエレクトロコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により分配することもできる。１種もしくは複数の投与方式は、処置しようとする１種もしくは複数の細胞、１種もしくは複数の組織、１種もしくは複数の器官、または１種もしくは複数のシステムに応じて変動するであろう。
【００６１】
別の態様では、化合物は経皮的に、または組成物および化合物に対して非反応性であり、皮膚に対して無毒であり、そして血液流内への全身的吸収のために化合物の移送を可能にする、場合により存在する担体を含有する経皮パッチ剤の使用による持続放出により分配される。そのような担体は、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ゲル剤、または密封装置（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｄｅｖｉｃｅ）でありうる。クリーム剤および軟膏剤は粘着性液体または半固体乳剤でありうる。ペースト剤は石油または親水性石油の中に分散された吸収性粉剤を包含する。さらに、種々の密封装置を利用して活性試薬を血液流内に放出することができ、そして活性試薬を含有する受器または活性試薬を含有するマトリックスを覆う半透膜を包含する。
【００６２】
患者が薬品を毎日基準で服用する必要性を回避するためには持続分配装置の使用が望まれうる。用語「持続分配」はここでは、分配環境中への配置後まで活性成分、すなわち、本発明の化合物、の放出を遅延させ、剤の持続放出がその後の時間に引き続くことをさす。多くの持続分配装置が当該技術で既知でありそしてヒドロゲル類（米国特許第５，２６６，３２５号明細書、第４，９５９，２１７号明細書、第５，２９２，５１５号明細書）、浸透ポンプ類（とりわけ、米国特許第４，２９５，９８７号明細書および第５，２７３，７５２号明細書並びに欧州特許第３１４，２０６号明細書）、疎水性膜材料、例えばメタクリル酸エチレン（ＥＭＡ）およびビニル酢酸エチレン（ＥＶＡ）、生再吸収（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）重合体システム（国際特許公開番号第９８／４４９６４号パンフレット並びに米国特許第５，７５６，１２７号明細書および第５，８５４，３８８号明細書）、並びに例えばポリエステル、ポリ無水物、または乳酸／グリコール酸共重合体より構成される他の生再吸収移植装置（米国特許第５，８１７，３４３号明細書）を包含する。そのような持続分配装置中での使用のためには、本発明の化合物はここに記載されているように調合することができる。米国特許第３，８４５，７７０号明細書、第３，９１６，８９９号明細書、第３，５３６，８０９号明細書、第３，５９８，１２３号明細書、および第４，００８，７１９号明細書を参照のこと。
【００６３】
本発明の方法は、そのような組成物を有効量で投与して患者の非癌細胞に対する悪影響を最少にしながら癌細胞内のアポプトシスを誘発させることを包含する。本発明の化合物および組成物の薬用量は、使用される特定の組成物、投与方式、存在する兆候の重篤度、処置される特定の患者、そして患者の他の薬品および処置、並びに患者の病歴で変動する。経口、非経口、鼻内、または気管支内投与のための正確な薬用量は、投与する医師により、処置する個別の患者に関する経験を基にして決めることができる。有効な治療薬用量は癌細胞のアポプトシスを誘発させるのに充分な薬用量を含有するであろう。１つの態様では、本発明の組成物の薬用量は投与が細胞のリソソーム内シスチンを０．５ナノモル（ｎｍｏｌ）／ｍｇより高く増加させるようなものである。
【００６４】
各々の有効な服用量の中に存在する本発明の化合物の量は、化合物の半減期、癌の同定および／または段階、患者の年令、体重、性別、全般的身体状態などの考察に関連して選択される。有意な悪性副作用なしに癌細胞に対して有効なアポプトシス効果を誘発するために必要な活性成分または化合物の量は、使用される製薬学的組成物および場合により存在する他の成分の存在によって変動する。ここに記載される癌を処置するために使用される組成物の適する薬用量は１種もしくは複数の化合物１．０μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲内でありうる。１つの態様では、薬用量は少なくとも１０μｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも１００μｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも５００μｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも１０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも１００ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも２５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも４００ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、薬用量は少なくとも５００ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、各々の服用量は約５μペプチド／ｋｇ患者体重〜約１０ｍｇ／ｋｇの間で含有するであろう。一般的に、有用な治療薬用量は１〜５ｍｇペプチド／ｋｇ患者体重である。有用な薬用量の別の態様は約５００μｇ／ｋｇペプチドでありうる。他の薬用量範囲も当業者には考えられうる。例えば、本発明のペプチド類の薬用量は他の癌療法に関して論じられた薬用量と同様でありうる。
【００６５】
本発明の組成物の初期服用量に引き続き、場合により担当医師により選択される期間にわたり投与が繰り返される。薬用量頻度も上記の要素に依存しており、そして約３日間ないし最大約１週間以内の期間にわたる１日当たり１〜６服用量の範囲内でありうる。本発明の組成物は約３−５日間にわたる連続的注入剤として投与することもでき、注入剤の具体的な薬用量は化合物の半減期に依存する。本発明の化合物は、投与の反復サイクルを包含する化学療法処方に組み入れることもできる。適切な投与方法の選択は担当医師によりなされるであろう。
【００６６】
本発明の別の態様では、哺乳動物患者における癌の進行を処置または予防する方法は患者を１種または複数（例えば、２、３、４種、もしくはそれ以上）の化学療法アポプトシ
ス剤、生物学的アポプトシス剤、放射線アポプトシス剤、またはここに記載される他の治療剤に露呈することを包含する。そのような組み合わせ処置は、上記の複数の活性成分を投与することにより、行うことができる。しかしながら、本発明は上記の式（ａ）または（ｂ）の化合物を含有する組成物と一緒の抗癌剤または療法の投与方法も包括する。そのような方法の１つの態様では、活性成分は患者に対して１種もしくはそれ以上の選択された投与方式により連続的に投与される。そのような方法の１つの態様では、化学療法剤は本発明の組成物を用いる処置の前に投与される。別の態様では、化学療法剤は本発明の組成物を用いる処置の後に投与される。さらに別の態様では、化学療法剤は本発明の組成物を用いる処置中に投与される。１つの態様では、化学療法剤は本発明の組成物を用いる処置の前に投与される。別の態様では、化学療法剤は本発明の組成物を用いる処置の後に投与される。さらに別の態様では、化学療法または生物学的アポプトシス剤は本発明の組成物を用いる処置の前、最中または後に投与される。
【００６７】
さらに別の態様では、患者は本発明の組成物を用いる処置の前、最中または後に放射線処置に露呈される。１種もしくはそれ以上の本発明の化合物または組成物と組み合わされて放射線剤が所望される場合には、薬用量は投与する医師により標準的処方に従い組み合わせ適用される他の処置を包含する他の要素を考慮に入れて決めることができる。例えば、Ｘ線に関する照射線量範囲の適切な処方は長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンから２０００〜６０００レントゲンの単一線量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）までの範囲にわたる。放射性同位体に関する線量範囲（ｄｏｓａｇｅ  ｒａｎｇｅ）は広く変動し、そして同位体の半減期、発生する放射線の強度およびタイプ、並びに細胞による吸収に依存する。
【００６８】
本発明の具体的な態様では、哺乳動物患者における癌の進行を処置または予防する方法はシスチンジメチルエステル（ＣＤＭＥ）を当該組成物として用いて患者の癌細胞を処置することを包含する。以下の実施例で論じられるように、ＣＤＭＥは式（ａ）の原型化合物として使用されそして癌のリソソーム内でシスチンの集合を誘発して、アポプトシスをもたらす。ＣＤＭＥは他のアポプトゲンのアポプトシス機能を増加させることも見出された。
【００６９】
別の態様では、哺乳動物患者における癌の進行を処置または予防する方法は該患者をアスパルチル−シスタミンジメチルエステルまたはここに記載される他の化合物を用いてＣＤＭＥで例示された方法で処置することを包含する。
Ｆ．癌細胞を感受性に関してスクリーニングする際の本発明の化合物の使用
本発明の別の態様は、アポプトシスに対する癌細胞の感受性を測定する方法、そして具体的には本発明の組成物を用いる処置または処置養生法に対する癌患者の感受性を測定する方法である。この方法によると、培養中の患者の癌細胞の試料を適量の本発明の組成物と接触させそして培養中のアポプトシスの割合を測定する。記載されるスクリーニングは、当該技術で既知でありそして使用されている技術を用いて行うことができる。そのような検定法の例はここでは実施例に記載される。
【００７０】
例えば、腫瘍細胞試料は患者から得ることができ、そして適当な培地、例えばＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳの中に保存することができる。細胞懸濁液（例えば、５×１０５個の細胞／ｍｌ）の適当な（例えば、１００μｌ）アリコートを次に平底９６ウエル板の中で種々の濃度の式（ａ）および（ｂ）の化合物の存在下で培養する。室温またはそれより高い温度（例えば、２３−３７℃）における５％ＣＯ２を含有する加湿空気中での適当なインキュベーション時間（例えば、１−７２時間）後に、生存細胞数を適当な検定法、例えばＭＴＴ検定法、により測定することができる。ＭＭＴ検定法は以下の通りにして行われる：１０μｌの３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（５ｍｇ／ｍｌ濃度）（シグマ）を各ウエルに加え
そしてさらに６時間にわたりインキュベートする。インキュベーション中に生成するホルマザン結晶を１００μｌの酸性化されたイソプロパノールの中に溶解させた。５５０ｎｍにおける光学濃度（生存細胞数と線状に関連する）を板分光計を用いて測定した。癌細胞の成長特性は細胞に関してトリパン・ブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）排除により測定される。
【００７１】
陰性対照および場合により陽性対照と比較する濃度−依存方式での低下した細胞生存率は、本発明の選択された化合物が癌細胞内でアポプトシスを誘発したことを立証した。他の検定法、例えば以下の実施例１に記載されたアポプトシス検定法、を使用して本発明の化合物に対する特定の癌細胞の感受性を測定することもできる。当業者はこの測定に適する検定法を容易に選択できる。
【実施例】
【００７２】
下記の実施例は本発明の種々の面を説明する。これらの実施例は、添付された特許請求の範囲により規定される発明の範囲を限定するものではない。当業者は、具体的な試薬および条件は下記の実施例に略述されているが発明の精神および範囲により包括されると考えられる改変を実施しうることを認識するであろう。
【００７３】
実施例１：方法および物質
Ａ  細胞培養
正常およびシスチン症線維芽細胞をコリエル・ミュータント・セル・レポシトリー（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から購入し、そして１０％胎牛血清（ＦＣＳ）が補充されたハム（Ｈａｍ）Ｆ１２培地のクーン（Ｃｏｏｎ）変種の中で培養した。腎臓近位細管上皮（ＲＰＴＥ；バイオウィタッカー・コープ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｏｒｐ．））を５００ｍｌ当たり１個のシングルクオーツ（Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ）ＴＭキット（バイオウィタッカー）が補充された腎臓上皮基本培地の中で培養して腎臓上皮成長培地（ＲＥＧＭ、バイオウィタッカー）を製造した。線維芽細胞およびＲＰＴＥを５％の二酸化炭素、９５％の空気の加湿インキュベーターの中に３７℃において保存した（Ｔｈｏｅｎｅ  Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，１９７６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，５８：１８０−１８９）。
【００７４】
試験した細胞系、それらの遺伝子型、および公称シスチン含有量が以下の表１に挙げられている。シスチン含有量は下記のシスチン結合蛋白質検定法により測定された。細胞系統ＧＭ００００８、ＧＭ００７６０、およびＧＭ０００４６中の突然変異が１０才までにＥＳＲＤを有する重篤な腎障害シスチン症を典型的に引き起こす。表１に挙げられたシスチン症系統に示されたシスチン含有量は０．８〜１５．７ナノモル／ｍｇ蛋白質の間で変動し、後者は典型的には培養されたシスチン症線維芽細胞で見られる。
【００７５】
【表１】
2007508384.tif 000004
【００７６】
Ｂ．アポプトシスの誘発
アポプトシスの誘発およびその検出用検定は市販の試薬を用いて行われた。正常およびシスチン症線維芽細胞を継代数（±３）および細胞密度に関して適合させ、そして次にアポプトシス誘発剤に露呈した。使用した１種のアポプトシス誘発剤は１６時間にわたるアクチノマイシンＤ（２．５μｇ／ｍｌ）を含むＴＮＦ−α（３０ｎｇ／ｍｌ）であった。別の誘発剤は１６時間にわたるアクチノマイシンＤ（２．５μｇ／ｍｌ）を含む抗−Ｆａｓ抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）であった。細胞内でアポプトシスを誘発する第三の誘発剤は紫外線Ｂ（６０ｍＪ）であった。例えばＡｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ，１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｅｒ．，５６：６１−７８；Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９９５  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７８：１７３−１８１；Ｉｔｏｈ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ，１９９１  Ｃｅｌｌ，６６：２３３−２４３；Ｉｔｏｈ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１０９３２−１０９３７のこれまでに記載された処方を参照のこと。血清除去もアポプトシス刺激剤として使用され（Ｌｉｅｂｅｒｔｈａｌ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ，１９９８  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｆ６９１−Ｆ７０２；Ｖｅｒｚｏｌａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，２００１  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，９：３６６−３７１；Ｉｇｌｅｓｉａｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，１９９９  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｆ７１１−Ｆ７１２；Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ＧＶ，ｅｔ  ａｌ，１９９４  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０７：１１６９−１１７９）、その場合に細胞は血清を含まないＦ１２培地の中で２４時間にわたりインキュベートされそして次にアポプトシスに関して分析された。
【００７７】
露呈後に、細胞はハムＦ１２培地のクーン変種の中で分析前１６時間にわたり保存された。
【００７８】
Ｃ．アポプトシス検定法
細胞を次に３種の市販のアポプトシス検定法を使用してアポプトシスに関して検定した。
【００７９】
１．カスプエース（ＣａｓｐＡＣＥ）検定法
カスプエース（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））は、１つもしくは複数の活性化されたカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ（ｓ））と結合するパン−カスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ−ＦｍｋのＦＩＴＣ−共役結合された細胞−透過性形態である。細胞をＦＩＴＣ−ＶＡＤ−
Ｆｍｋ−含有培地の中でインキュベートし（１０μＭ、３０分間、３７℃）、洗浄し、そして次に分析前に１０％緩衝ホルマリンの中で固定した（３０分間、室温）。細胞を蛍光顕微鏡により視覚的に計数し、蛍光に関して５つのフィールド（２５０〜３００個の細胞）の最小値を三重に記録し、引き続き同一フィールド中の全ての細胞を条件当たりに記録された７５０個の細胞の最小値と共に光顕微鏡により計数した。アポプトシス割合はフィールド中の合計細胞により割り算された蛍光を発する細胞の合計数である。
【００８０】
２．チュネル検定法
チュネル検定法は、アポプトシス細胞内で生ずる二本鎖ＤＮＡ切断部の末端をＦＩＴＣ−共役結合されたｄＵＴＰで標識付けするために、末端デオキシウクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用する。細胞を４％緩衝ホルマリンの中で固定し、洗浄し、浸透化溶液（０．１％クエン酸Ｎａ中０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）の中で２分間にわたり氷上でインキュベートし、そして次に２５μｌのＴｄＴ／４５μｌの標識付けされたｄＮＴＰ混合物を用いて４０分間にわたり３７℃において染色した。細胞を蛍光顕微鏡により視覚的に計数し、蛍光に関して５つのフィールド（２５０〜３００個の細胞）の最小値を三重に記録し、引き続き同一フィールド中の全ての細胞を条件当たりに記録された７５０個の細胞の最小値と共に光顕微鏡により計数した。アポプトシス割合はフィールド中の合計細胞により割り算された蛍光を発する細胞の合計数である。
【００８１】
３．アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ検定法
アネキシンＶ−ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色は、ＴＮＦ−α刺激後に１回、製造業者（アネキシン・Ｖ・フルオス（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ｆｌｕｏｓ））キット指示、ロシェ・ラボラトリーズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））の記載の通りにして行われた。
【００８２】
Ｄ．シスチン結合蛋白質検定法
細胞内リソソームを含まないシスチンをシスチン結合蛋白質（ＣＢＰ）検定法（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，１９７４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９：６０３３−６０３９）を用いて測定した。ＣＢＰはリバーサイド・サイエンティフィック（Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。この検定法は０．１μＭの感度を有する。合計細胞蛋白質をロウリー（Ｌｏｗｒｙ）法の変法により測定した（Ｌｏｗｒｙ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ  １９５１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９３：２６５−２７５）。統計学的分析を、ウィンドウズ用のＳＳＰＳを用いる手段のための対になったｔ試験を用いて、行った。結果は平均＋／−１．０ＳＤである（図３）。
【００８３】
Ｅ．正常およびシスチン症線維芽細胞の免疫組織化学
細胞をリソトラッカー・レッド（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））により５分間にわたり室温において染色し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして次に４％ホルマリン中で１時間にわたり固定した。スライドを阻止緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％カーネーション・ドライミルク、０．１％トリトンＸ−１００）の中に２０分間にわたり室温において浸し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして次に１：１００に希釈された一次抗体（抗−カテプシンＢ、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と共に２時間にわたり室温においてインキュベートし、引き続き二次抗体（ＦＩＴＣ−共役結合されたウサギ抗−ヤギ、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジーズ）と共に４℃において一晩にわたりインキュベートした。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、そして次にカバースリップで密封しそしてライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＲＸデコンボリューティング（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ）顕微鏡を用いて観察した。
【００８４】
実施例２：培養されたヒト線維芽細胞および腎臓管上皮細胞内でリソソームシスチン貯蔵はアポプトシスを増加させる
【００８５】
Ａ．未処置細胞内で誘発されるアポプトシス
アポプトシスは３種の腎障害シスチン症、２種の正常、１種の中間シスチン症、および１種の眼のシスチン症の線維芽細胞系内で３種の別個の誘発剤により誘発された。１つの態様では、細胞を以上で示されたようにアポプトシス誘発剤で処置した。これらの系におけるアポプトシスはカスプエース検定法により評価されそして蛍光顕微鏡により分析された。条件当り２５０個の細胞の最小値を三重に記録した。それ故、少なくとも７５０個の細胞が記録された予備条件であった。Ｔ−統計：平均腎障害対平均正常に関してＰ＜０．００１。眼対腎障害に関してＰ＜０．０５。眼対正常、中間対腎障害、および中間対正常に関してＰ＞０．０５。
【００８６】
この実験の結果は表２に示される。シスチン症細胞は正常な細胞系と比べて３種のアポプトシス誘発剤に関して平均して約２〜３倍のアポプトシス割合を示した。シスチン症変種系はこれらの条件下で増加したアポプトシスを示さなかった。これらの差異はシスチン症および正常系に関する平均の間でそして腎障害および眼のシスチン症系の間でＰ＝０．０５において統計学的に有意であった。中間および腎障害系、眼の細胞および正常細胞、または中間対正常細胞の間にはアポプトシスの割合における有意な差異はなかった。
【００８７】
【表２】
2007508384.tif 000005
【００８８】
別の実験では、細胞を指示された通りにアポプトシス誘発剤で処置し、チュネル試薬で染色し、そして蛍光顕微鏡により分析した。条件当り２５０個の細胞の最小値を三重に記録した。腎障害シスチン症細胞および中間細胞系統の全ての対、およびいずれかの正常系統から有意に異ならなかった以下の表３に星印により指示されたもの以外の２種の正常系統の間に関してＰ＞０．０５。眼対正常および中間に関してＰ＞０．０５。眼対腎障害に関してＰ＝０．０１。表３に報告されているように、系統ＧＭ００００８は抗−Ｆａｓま
たは紫外線露呈後に正常系統の応答と有意に異ならず、ＴＮＦ−α露呈後の系統ＧＭ０００４６と有意に異ならなかった。ここでも、変種系統は正常線維芽細胞系統と比べて増加したアポプトシスを示さなかった。
【００８９】
【表３】
2007508384.tif 000006
【００９０】
Ｂ．リソソーム充填細胞内で誘発されたアポプトシス
正常線維芽細胞リソソームに、通常の培養培地に対する処置前の１時間にわたる０．５ｍＭシスチンジメチルエステル（ＣＤＭＥ、シグマ）の添加により、シスチンを充填した（Ｐｉｓｏｎｉ，ＲＬ，ｅｔ  ａｌ，１９９２  Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：１−６）。細胞をアポプトシス誘発剤で処置して、ＣＤＭＥを培地中に残してリソソームシスチン損失を防止し、そして次にアポプトシスに関して分析した。
【００９１】
ＲＰＴＥ細胞のリソソームシスチン充填は、アポプトシス誘発剤を用いるまたは用いない処置の前に、１時間にわたる正常なＲＥＧＭ中の０．１ｍＭまたは０．２５ＣＤＭＥへの露呈により、行われた。
【００９２】
アポプトシス応答の調整は、正常または腎障害シスチン症線維芽細胞のリソソームシスチン含有量を変えることにより、得られた。腎障害シスチン症線維芽細胞（継代７−１３）を、細胞を１０％ＦＣＳを含むシスチンを欠くハムＦ１２培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の中で１ｍＭのシステアミン−ＨＣｌ（ＭＥＡ；シグマ）でアポプトシス誘発剤への露呈前１時間にわたり処置し（Ｔｈｏｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９７６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：１８０−１８９）、それらを正常なリソソームシスチン含有量（１ｍｇの蛋白質当たり０．０１〜０．１３ｎモルのシスチン）まで枯渇させた。シスチンを含まない培地中でのこの予備処置がシスチン再集合を阻止した。
【００９３】
正常線維芽細胞のリソソームシスチン含有量も以下の通りに変えられた。正常線維芽細胞も継代７−１３において０．５ｍＭのＣＤＭＥで１時間にわたり予備処理し、それらのリソソームのシスチン含有量をシスチン症範囲（１ｍｇの蛋白質当たり０．４７〜１．９５ナノモルのシスチン）に増加させた。
【００９４】
２種の正常細胞（２種の細胞系）および腎障害細胞（２種の細胞系）を次にアポプトシス刺激、すなわち、紫外線照射（ＵＶ）、ＴＮＦ−アルファまたは対照、で処置し、そしてシスチンを含まないまたはＣＤＭＥ−含有培地の中に保ちながら１６時間にわたりインキュベートした。アポプトシスは上記の通りにしてカプスエース検定法により評価された。
【００９５】
結果は図１に報告され、それはＭＥＡを用いる腎障害線維芽細胞のシスチン含有量の正常水準への補正の前および後の、並びにＣＤＭＥを用いる予備インキュベーションの前および後の、ＴＮＦ−αまたは紫外線照射への露呈により誘発されたアポプトシス割合を示す。シスチン枯渇前のシスチン症細胞のアポプトシスの平均割合は１５．６＋／−２．７％であり、ＭＥＡへの露呈によるシスチン枯渇後に、それは６．１＋／−２．８％に下がった。この差異はＰ＜０．００１において有意である。正常線維芽細胞系に関する平均調節アポプトシス割合は７．２＋／−１．３％であり、それはＣＤＭＥへの露呈後に１８．７＋／−５．４％に上昇した（Ｐ＜．００１）。この影響は誘発がＴＮＦ−αまたは紫外線によるかどうかを支持している。
【００９６】
蛍光顕微鏡（示されていない）も、処置されていないおよびＣＤＭＥ−予備処置された正常および腎障害シスチン症線維芽細胞の紫外線（６０ｍＪ）に対する露呈後の正常および腎障害シスチン症線維芽細胞内のリソソームシスチンのこの影響を示した。４．０ナノモル／ｍｇ蛋白質の初期シスチン含有量を有するシスチン症線維芽細胞内のアポプトシスの高い割合はシステアミンを用いる処置後に下がり、それはシスチン含有量を＜０．１ナノモル／ｍｇ蛋白質に低下させた。正常線維芽細胞内のアポプトシスの正常な割合（シスチン含有量＜０．１ナノモル／ｍｇ蛋白質）はＣＤＭＥに対する細胞の予備露呈後にシスチン症線維芽細胞内で見られたものと同様な割合に増加し、それはシスチン含有量を１．９５ナノモル／ｍｇ蛋白質に増加させた。
【００９７】
ＴＮＦ−アルファ露呈だけの後の正常線維芽細胞、ＣＤＭＥ中の正常線維芽細胞内の、およびＮＦ−アルファ露呈だけの後の腎障害線維芽細胞内の相顕微鏡写真（示されていない）も得られた。典型的なアポプトシス形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）が観察され、すなわち血漿膜内の典型的な水泡が正常およびシスチン症細胞系の両者内でＴＮＦ−αを用いる処置後に見られそしてＭＥＡおよびＣＤＭＥの調整影響が見られた。正常細胞よりシスチン症細胞内の方により多いアポプトシス細胞が見られた。ＣＤＭＥが加えられた正常細胞内で増加したアポプトシスが見られる。ＭＥＡ処置後に腎障害シスチン症細胞内でより多い正常形態が見られる。
【００９８】
別の実験では、シスチン含有量はシスチン症細胞内で、シスチンを含まないおよび血清を含まないハムＦ１２培地中でのインキュベーション前のＭＥＡを用いる予備処理により、シスチン２．３〜０．５ナノモル／１０６細胞に減少した。正常細胞内のシスチン含有量は、血清を含まないクーンＦ１２中でのインキュベーション前のＣＤＭＥを用いる予備処理により、シスチン０．４〜１．３ナノモル／１０６細胞増加した。細胞をカスプエースで染色しそして分析した。表４に示されているように、培養された線維芽細胞内の血清除去は使用された他の刺激より少ない基準線上のアポプトシスを引き起こしたが、自然に完全なＣＴＮＳ機能によるかまたは人工的にＣＤＭＥ充填による、リソソームシスチンの増加も増加したアポプトシス割合を生じた。００８血清除去対０５３９９血清除去に関するＰ＝０．０６８；００８血清除去対００８血清除去およびＭＥＡに関するＰ＝０．１７２；および０５３９９血清除去対０５３９９血清除去およびＣＤＭＥに関するＰ＝０．００６。
【００９９】
【表４】
2007508384.tif 000007
【０１００】
リソソームがＴＮＦ−αによりこれらの条件下で浸透化されること（Ｇｕｉｃｃｉａｒｄｉ  Ｍ，２０００  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６：１１２７−１１３７）を立証するために、カテプシンＢ（リソソームシスチンプロテアーゼ）をアポプトシスの誘発の前および後に正常および腎障害シスチン症細胞内で免疫組織化学により局在化させた。線維芽細胞は通常の培養条件下で保存され、ＴＮＦ−αに露呈され、リソトラッカー・レッド（Ｒｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄ）が充填され、固定され、そしてカテプシンＢに関して抗−カテプシンＢ抗体を使用して染色された。デコンボルーティング（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ）顕微鏡により写真を作成した。
【０１０１】
リソソームをリソトラッカー・レッド染料を用いて同定した。ＴＮＦ−α露呈後の正常および腎障害シスチン症線維芽細胞内のカテプシンＢの共局在化の損失が観察された。ＴＮＦ−α処置前の正常およびシスチン症線維芽細胞内では、カテプシンＢはレッドリソソーム染料と密に関連する斑点のあるパターンを示した。ＴＮＦ−αによるアポプトシスの誘発は、リソソーム位置から拡散シスチン症位置へのカテプシンＢの移動を色の共局在化の損失と共に引き起こした。粒度の損失および減じられた共局在化が、正常線維芽細胞対ＴＮＦ−αで処置された正常線維芽細胞と、そしてシスチン症対照細胞対ＴＮＦ−αで処置されたシスチン症細胞と、比べて観察された。
【０１０２】
実施例３：アポプトシスの割合に対する種々の化合物の影響
培養されたヒト腎臓近位細管上皮細胞を種々のアポプトシス化合物と共に０．５ｍＭの濃度において１６時間にわたりインキュベートした。処置化合物の構造は図２に示される。インキュベーション後に、細胞をカスプエーセで染色した。蛍光−活性化された細胞選別法（ベックマン・クルター・エピックス・エリート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ））を使用して各処置群からのアポプトシスを受ける細胞の割合を測定した。
【０１０３】
ＲＰＴＥ細胞はＣＤＭＥ露呈後にのみ顕著なアポプトシスを示す（３９．７％）。線維芽細胞内で使用された濃度（０．５ｍＭ）はこれらの細胞に対して有毒でありそしてＲＰＴＥ実験に関しては０．１または０．２５ｍＭに減じられた。０．２５ｍＭのＣＤＭＥのみによって生じたアポプトシスの割合はＴＮＦ−αのみに対する露呈により誘発されるものと等しかった。時間工程は促進され、これらの細胞は（線維芽細胞内での１７時間とは異なり）６時間以内にアポプトシスの最大割合を達成し、引き続き溶解しそして培養皿から放出された（図３参照）。０．２５ｍＭのＣＤＭＥに対する１時間にわたる露呈後のＲＰＴＥシスチン含有量は１．９９ナノモル／ｍｇ蛋白質であった。各時点における蛍光顕微鏡（示されていない）は０．５、１、３、および６時間におけるＲＰＴＥ細胞内のアポ
プトシスに対するＣＤＭＥの影響を示した。
【０１０４】
０．１ｍＭのＣＤＭＥに対する露呈によるシスチン充填後のＴＮＦ−αに対するＲＰＴＥ細胞の露呈並びにアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色による分析が、露呈後１時間における４．３％のアネキシンＶ陽性細胞および０のＰＩ陽性細胞、３時間における９．５％および１．７％、並びに６時間における２５．３％および９．１％を生じた。壊疽性ＰＲＴＥ細胞の割合はＣＤＭＥに対する露呈期間で増加したが、アポプトシス性であるものの数より実質的に少ないままであった。
【０１０５】
実施例４：ヒト乳癌細胞系統におけるアポプトシスに対するＣＤＭＥの影響
カスプエースＴＭ検定システム（プロメガ）および従来のフローサイトメトリー技術を使用して、ＣＤＭＥのアポプトシス影響をタモキシフェンのものと比較した。
【０１０６】
全ての細胞系は断らない限り２０１０８、バージニア州、マナッサス、私書箱１５４９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られた。試験された細胞系は、エストロゲン受容体−陰性乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＴＢ−２６）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＴＢ−１３２）並びにエストロゲン受容体−陽性乳癌細胞系であるＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＴＢ−２２）およびＴ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＴＢ−１３３）であった。
【０１０７】
全ての細胞系を、それらが約５０％の集密度に達するまで、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＲＰＭＩ−１６４０中で１２−ウエルフラスコの底で成長させた。その後、培地を１０％木炭で処置されたＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ（シグマ、Ｄ−５０３０）と交換した。
【０１０８】
４日後に（約７５％の集密度において）、細胞を１６時間にわたり３７℃においてＣＤＭＥ（５００μＭ）もしくはタモキシフェン（１００μＭ）のいずれかへの露呈により、またはいずれも用いずに、処置した。処置されたおよび対照細胞のカスプエースＴＭ検定分析は実施例２に記載されている通りにして行われそしてフローサイトメトリーにより測定された。タモキシフェンの薬用量が化学療法用に通常投与されるものより高い最大陽性対照服用量であることに注意すること。
【０１０９】
上記の実験工程は、以下の表５に示され、図４にグラフで表示されている結果を与えた。これらの結果は、２種のエストロゲン受容体−陰性乳癌細胞系内で種々の度合いで有意なアポプトシスを誘発する際のＣＤＭＥの有効性を示す。ＥＲ＋乳癌細胞に対する影響は陰性対照より良くなかった。
【０１１０】
【表５】
2007508384.tif 000008
【０１１１】
実施例５：マウスにおけるＣＤＭＥの毒性試験
ＣＤＭＥをマウスにおいて種々の服用量に対する応答におけるシスチン発生に関して以下の通りにして評価した：１．８ｇＣＤＭＥ／５００μＬＰＢＳの濃度を有するＣＤＭＥのＰＢＳ中貯蔵溶液を製造した。貯蔵溶液を希釈して投与用溶液を製造した。５００μＬの希釈された溶液を黒色マウス（体重〜０．０３ｋｇ）に腹腔内注射した。全ての注射は二重に行われた。製造されたＣＤＭＥ溶液および５００μＬの注射に関する１ｋｇのマウス体重当たりの有効薬用量は表６に示されている。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
表６の溶液の投与後に、２つの器官（腎臓および肝臓）内の内因性シスチン濃度を６匹のマウス、すなわち、ＣＤＭＥ−注射されたマウス並びに黒色、異種細胞性、および野生型対照マウス、に関して試験した。分析は実施例１のシスチン結合蛋白質ＣＢＰ検定法およびビシンコニニック・アシド（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ）ＢＣＡ検定法（ピアース・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して合計蛋白質濃度に関して行われた。
【０１１４】
５，０００ｍｇＣＤＭＥ／ｋｇ体重またはそれ以上が与えられたマウスは死亡した。以下の表７に示されている生じたデータは、注射された溶液中のＣＤＭＥの濃度増加に応答して上昇したシスチン水準を示した。ＣＤＭＥが注射されたマウスはリソソーム内シスチンにおいて約１００倍の増加を含有した。これらの結果は、ＣＤＭＥがマウスにおける通常のシスチン症水準よりたくさん誘発することを示す。
【０１１５】
【表７】
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【０１１６】
実施例６：ヌードマウスにおける本発明の式の化合物の抗癌効果
ヒト乳癌細胞をヌードマウスに移植しそして腫瘍成長を２〜３週間にわたり誘発させる。次に、本発明の化合物を腫瘍組織に４−３日間方法、すなわち４日間の注射および３日間の停止、により注射する。本発明の化合物（２０μｇ）を含むかまたは含まないＰＢＳ溶液（５０μｌ）を処置（Ｔ）または対照（Ｃ）マウスの腫瘍にそれぞれ注射する。腫瘍容量を処置および対照マウスにおいて長径および短径の両方を測定することにより推定しそして腫瘍の抑制および／または減少を測定するために比較した。
【０１１７】
本明細書に引用された全ての文献および公表データベースは引用することにより本発明の内容となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は半−融合性の腎障害シスチン症または正常な線維芽細胞におけるアポプトシスに対するＭＥＡまたはシスチンジメチルエステル（ＣＤＭＥ）の影響を示す棒グラフである。
【図２】図２は腎臓線維芽細胞のアポプトシスに対する種々の二硫化物化合物およびそれらのエステル類の影響を示す表並びにその中の構造の図面である。
【図３】図３は腎臓近位管上皮（ＲＰＴＥ）細胞におけるアポプトシスに対するＣＤＭＥの影響を示すグラフである。
【図４】図４は対照、ＣＤＭＥおよび既知のアポプトシス剤であるタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）を用いる乳癌細胞系統ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−４８９、ＭＣＦ−７およびＴ７４Ｄの処置後のアポプトシス細胞の百分率を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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