(57)【要約】【課題】ペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分とを含有するペプチド系化合物の提供。【解決手段】本発明は、ポリ（エチレングリコール）部分（好ましくは直鎖状）が、20Kダルトンより大きい（好ましくは20〜60Kダルトンの）分子量を有する、ペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分を含有するペプチド系化合物に関する。ペプチド部分はモノマーであっても、ダイマーであっても、あるいはオリゴマーであってもよい。そのようなペプチド系化合物は適宜リンカー部分および/またはスペーサー部分を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（エチレングリコール）部分が直鎖状で、分子量が20Kダルトン以上の、ペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分とを含有するペプチド系化合物。
【請求項２】
ポリ（エチレングリコール）部分が20〜40Kダルトンの分子量を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ポリ（エチレングリコール）部分が1.20以下の多分散値（Mw/Mn）を有する、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
ペプチド部分が単一ペプチドを含有するペプチドモノマーである、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
ペプチド部分がリンカー部分を介して結合している二つのペプチドを含有するペプチドダイマーである、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
それぞれのペプチドが50アミノ酸以下のモノマーを含有する、請求項４または５記載の化合物。
【請求項７】
それぞれのペプチドが約10〜25アミノ酸モノマーを含有する、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
それぞれのペプチドが約12〜18アミノ酸モノマーを含有する、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
ペプチド部分がエリスロポエチン受容体に結合するペプチドを含有する、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
ペプチド部分がトロンボポエチン受容体に結合するペプチドを含有する、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
さらにペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分との間にスペーサー部分を含有する、請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
スペーサー部分が構造：
-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-
を有し、ここでα、β、γ、δおよびεはそれぞれ整数で、その数値は独立に選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
αが、1＜α＜6である整数；
βが、1＜β＜6である整数；
εが、1＜ε＜6である整数；
δが、0または1；
γが、0＜γ＜10である整数；および
YがNHまたはCOのいずれかである、
請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
γ＞1およびβ＝2である、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
(a) ペプチド系化合物がペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分を含有し、該ポリ（エチレングリコール）部分が直鎖状で、分子量が20Kダルトン以上の、ペプチド系化合物；ならびに
(b) 一つまたはそれ以上の薬学的に許容されうる希釈剤、保存料、安定化剤、乳化剤、補助剤および/またはキャリア；
を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
ポリ（エチレングリコール）部分が20〜40Kダルトンの分子量を有する、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ポリ（エチレングリコール）部分が1.20以下の多分散値（Mw/Mn）を有する、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
ペプチド部分が単一ペプチドを含有するペプチドモノマーである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
ペプチド部分がリンカー部分を介して結合している二つのペプチドを含有するペプチドダイマーである、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
それぞれのペプチドが50アミノ酸以下のモノマーを含有する、請求項１８または１９記載の組成物。
【請求項２１】
それぞれのペプチドが約10〜25アミノ酸モノマーを含有する、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
それぞれのペプチドが約12〜18アミノ酸モノマーを含有する、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
ペプチド部分がエリスロポエチン受容体に結合するペプチドを含有する、請求項１５記載の組成物。
【請求項２４】
ペプチド部分がトロンボポエチン受容体に結合するペプチドを含有する、請求項１５記載の組成物。
【請求項２５】
さらにペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分との間にスペーサー部分を含有する、請求項１５記載の組成物。
【請求項２６】
スペーサー部分が構造：
-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-
を有し、ここでα、β、γ、δおよびεはそれぞれ整数で、その数値は独立に選択される、請求項１５記載の組成物。
【請求項２７】
αが、1＜α＜6である整数；
βが、1＜β＜6である整数；
εが、1＜ε＜6である整数；
δが、0または1；
γが、0＜γ＜10である整数；および
YがNHまたはCOのいずれかである、
請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
γ＞1およびβ＝2である、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
ポリ（エチレングリコール）部分が20〜60Kダルトンの分子量を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項３０】
ポリ（エチレングリコール）部分が20Kダルトンの分子量を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項３１】
ポリ（エチレングリコール）部分が少なくとも一つの直鎖状のポリ（エチレングリコール）鎖である、請求項１記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第119条(e)項に基づき、同時係属の2003年5月12日出願の米国仮出願第60/470,246号に対し、優先権を主張する。この優先権出願の内容は参照してその全体が本開示に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）あるいは「PEG」を有する多数のペプチド系化合物の修飾に関する。特に、本発明はPEG、好ましくは20〜60Kダルトンの直鎖状のPEG部分で修飾されたペプチドモノマー、ペプチドダイマーおよびペプチドオリゴマーに関する。さらに、本発明はそのようなPEG修飾化合物を用いた新規治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、タンパク質の研究が進むにつれ、様々な活性を有する多数のペプチドが見出されてきている。遺伝子組換え技術及びペプチドの有機合成法の進展に伴い、これらの生理活性ペプチドおよびそれらの構造類似化合物が大量に得られるようになった。特別な活性を有するこれらのペプチドの多くは医薬品にとって極めて有用である。
【０００４】
そのようなペプチドの例としては、エリスロポエチン（EPO）受容体（EPO-R）に結合するペプチドがあげられる。EPOは165アミノ酸を有し、24番目、38番目、83番目および126番目の4個所のアミノ酸にグリコシル化部位を有する、分子量約34,000の糖タンパク質ホルモンである。EPOは赤血球前駆細胞の体細胞分裂と分化を刺激し、赤血球の産生を確実にする。EPOは赤血球細胞形成過程で必須であり、このホルモンは、赤血球の低産生または産生の欠損により特徴付けられる血液の疾患の診断および治療の両方に潜在的に有用な用途を有する。EPO-Rに相互作用する多くのペプチドが発見されている（Wrightonらの米国特許第5,773,569号；およびWrightonらの米国特許第5,830,851号；Smith-SwintoskyらのWO01/91780参照）。
【０００５】
しかし、特に循環系に投与された場合のペプチドのクリアランスは一般的に非常に速い。それゆえ、そのようなペプチドの持続性を改良することが望ましい。加えて、ペプチドが異なる種の動物から得られ、ペプチドタンパク質工学によりデザインされ、および/または目的のものとは異なる構造を有する場合、抗体産生により重篤な症状を引き起こす危険性がある。したがって、そのようなペプチドの抗原性を改良することも望ましい。これらのペプチドを医薬品として使用するために、改良された抗原性と持続性の両者を有することが必要である。
【０００６】
ポリ（エチレングリコール）のような巨大分子化合物を用いたペプチドの化学修飾が各種ペプチドの抗原性と持続性を改良するのに効果的であることが示されている。それゆえ、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）誘導体はペプチド修飾巨大分子試薬として広く用いられてきた。
【０００７】
最も一般的な形状として、ポリ（エチレングリコール）は次の構造を有する：
【化１】
2007530440.tif 000002
【０００８】
上記のポリマー、アルファ-、オメガ-ヒドロキシル  ポリ（エチレングリコール）は、HO-PEG-OHという簡略な形態で表され、-PEG-という記号は次の構造単位を表す：
【化２】
2007530440.tif 000003
【０００９】
特定の理論または作用機序に限定されることなく、長鎖様PEG分子または部分は大量に水和しており、水媒体に入れると速い運動状態になると考えられている。この速い運動は、PEGの大量排除を引き起こすと考えられており、他の分子の接近と干渉を防止する。結果として、（ペプチドのような）他の化学物質が結合すると、PEGポリマー鎖はそのような化学物質を免疫応答および他のクリアランス機構から保護することができる。その結果、PEG化は薬物動態を最適化し、バイオアベイラビリティ（bioavailability）を増加し、免疫原性と投与回数を減少することにより、改良薬剤に効力と安全性をもたらす。
【００１０】
例えば、PEGのいくつかの活性誘導体は、タンパク質および酵素に結合し、有益な結果をもたらす。PEGは有機溶媒に可溶である。酵素に結合したPEGは、有機溶媒に可溶で活性のあるPEG-酵素抱合体となる。PEGのタンパク質への結合は、未修飾タンパク質と比較して、免疫原性と腎臓でのPEG-タンパク質抱合体のクリアランス速度を減少し、抱合体の血液循環寿命を劇的に増加する。
【００１１】
例えば、治療用タンパク質、例えばインターロイキン類（Knauf, M. J.ら、J. Biol. Chem. 1988、263、15,064；Tsutsumi, Y.ら、J. Controlled Release 1995、33、447）、インターフェロン類（Kita, Y.ら、Drag Des. Delivery 1990、6、157）、カタラーゼ（Abuchowski, A.ら、J. Biol. Chem. 1977、252、3,582）、スーパーオキシド  ディスムターゼ（Beauchamp, C. O.ら、Anal. Biochem. 1983、131、25）、およびアデノシンデアミナーゼ（Chen, R.ら、Biochim. Biophy. Acta 1981、660、293）へのPEGの共有結合は生体内での半減期を延長し、および/またはその免疫原性および抗原性を減少させることが報告されている。
【００１２】
加えて、表面に結合するPEGは、表面へのタンパク質および細胞の吸着を減少させ、表面の電気的性質を変化させることができる。同様に、リポソームに結合するPEGはこれらの粒子の血液循環寿命を大いに増加し、それにより場合によっては薬物送達の有用性を増加することができる（J. M. Harris編、「ポリエチレングリコール化合物の生物医学的・バイオ技術的応用（Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry）」、プレナム（Plenum）社、ニューヨーク、1992）。
【００１３】
Johnsonらの米国特許第5,767,078号は、EPO-Rに結合できるペプチドモノマーのダイマー化を開示している。ダイマー化はモノマーの共有結合に基づく。PEGはダイマー形成に好ましいリンカーである。ここで具体的に用いられるPEGは3400または5000ほどの分子量を有する。
【００１４】
Smith-SwintoskyらのWO 01/91780は、成長因子型の受容体の結合とシグナルの開始を示すペプチドのダイマーおよびマルチマーを開示している。開示されるリンカーはポリエチレングリコールである。開示されるリンカーはポリエチレングリコールである。しかし、該文献にはPEGの適切な大きさやクラス（例えば、直鎖）を選択するための指針は提供されていない。
【００１５】
Weiらの米国特許第6,077,939号は、ポリペプチド、およびヒドラゾン結合もしくは還元ヒドラゾン結合またはオキシム結合もしくは還元オキシム結合を介してN-末端のα-炭素原子に共有結合する水溶性ポリマーから実質的になる組成物を開示している。水溶性ポリマーの分子量の範囲は200〜200Kダルトンの範囲である。PEGは水溶性ポリマーの例として開示されている。PEGの分子量はほんの700から20Kダルトンであり、わずか5KダルトンのPEG部分が好ましいといわれている。
【００１６】
BaluらのWO 01/38342は、二つのペプチド鎖を結合するC1-12結合部分により形成されるダイマーを開示している。これはダイマーのN-末端をPEG化し得ることを示している。しかし、該公報は用いたPEGの分子量を特定もしていなければ、直鎖状か、分枝状かも示していない。
【００１７】
Saiferら（Adv. Exp. Med. Biol. (1994), 366: 377-87）は、1〜9本の高分子量（35K〜120Kダルトン）のPEGを結合させたウシおよび組換え型ヒトのCu, Znスーパーオキシド  ディスムターゼ（SOD）のPEG付加体を記載している。Somackら（Free Rad. Res. Comms. (1991), 12-13: 553-562）は、1〜4本の高分子量（41K〜72Kダルトン）のPEGを含むSOD付加体を記載している。これら二つの参考文献はどちらもPEGを用いてペプチドを修飾することを教示していない。その上、これらの化合物に用いられたPEG部分は、直鎖状PEGとは反対に、分枝していると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
PEG修飾ペプチド系化合物部位でなされた進歩にもかかわらず、改良された抗原性と持続性を有する新規PEG修飾化合物の必要性が残されている。
【００１９】
この項における、および本明細書全体における参考文献の引用および/または議論は、そのような文献が本発明の先行技術であることを承認していると解すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の要約
本発明は、ペプチド部分と、ポリ（エチレングリコール）部分が直鎖状で、20Kダルトン以上の分子量を有するようなポリ（エチレングリコール）部分とを含有するペプチド系化合物に関する。
【００２１】
好ましくは、ポリ（エチレングリコール）部分は約20〜60Kダルトンの分子量を有している。より好ましくは、ポリ（エチレングリコール）部分は約20〜40Kダルトンの分子量を有している。最も好ましくは、PEGは約20Kダルトンの分子量を有している。
【００２２】
好ましくは、該ポリ（エチレングリコール）部分は1.20以下、より好ましくは1.1以下、最も好ましくは1.05以下の多分散値（Mw/Mn）を有する。
【００２３】
好ましくは、ペプチド部分はダイマーであり、リンカー部分で結合した二つのモノマーペプチドを含有する。その上、そのようなダイマーおよび他のマルチマーはヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーであってよい。
【００２４】
一態様において、ペプチド部分はエリスロポエチン受容体に結合するペプチド類から選択される。そのようなEPO-R結合ペプチド類の限定されない例としては、公開された国際出願PCT/US00/32224（公開番号WO 01/38342 A2）、PCT/US96/09810（公開番号WO 96/40749）およびPCT/US01/16654（公開番号WO 01/91780 A1）；米国特許第5,767,078号、第5,773,569号、第5,830,851号、第5,986,047号に開示されたものをあげることができる。さらに、本発明のペプチド部分として用いることができる他の例示的なEPO-R結合ペプチド類は、2003年5月12日出願の米国仮出願番号第60/479,245号に記載されている。本発明のペプチド部分として用いることができるさらに他のEPO-R結合ペプチド類の例は、2003年5月12日出願の米国仮出願番号第60/469,993号に記載されている。またさらなる本発明のペプチド部分として用いることができるEPO-R結合ペプチド類は2003年5月12日出願の米国仮出願第60/470,244号に記載されている。
【００２５】
別の態様では、ペプチド部分はトロンボポエチン受容体（「TPO-R」）に結合するペプチド類から選択される。そのようなTPO-R結合ペプチド類の限定されない例は、米国特許第6,552,008号、第6,506,362号、第6,498,155号、第6,465,430号、第6,333,031号、第6,251,864号、第6,121,238号、第6,083,913号、第5,932,546号、第5,869,451号、第5,683,983号、第5,677,280号、第5,668,110号、および第5,654,276号;ならびに公開された米国特許出願第2003/0083361号、第2003/0009018号、第2002/0177166号および第2002/0160013号に記載されている。
【００２６】
好ましくは、そのようなペプチド系化合物はさらに、ペプチド部分とポリ（エチレングリコール）部分との間にスペーサー部分を含有する。より好ましくは、スペーサー部分は次の構造を有し：
-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-
ここで、α、β、γ、δおよびεはそれぞれ整数であり、その数値は独立に選択される。そのようなスペーサー部分は、より詳細に、「ポリ（エチレングリコール）修飾ペプチド系化合物の新規スペーサー部分」という名称で、2003年5月12日出願の米国特許仮出願第60/469,996号に記載されている。
【００２７】
好ましい態様では、
αは、1＜α＜6である整数；
βは、1＜β＜6である整数；
εは、1＜ε＜6である整数；
δは、0または1；
γは、0＜γ＜10である整数；および
YがNHまたはCOのいずれかである。
【００２８】
特定の好ましい態様では、γ＞1のとき、β＝2である。
【００２９】
特に好ましい一態様では、
α＝β＝ε＝2；
γ＝δ＝1；および
YがNHである。
【００３０】
他の態様では、
γ＝δ＝0；
2＜α＋ε＜5；および
YはCOである。
【００３１】
特定の別の態様では、
γ＝δ＝0；
α＋ε＝5；および
YはCOである。
【００３２】
本発明はさらに、上記の一つまたはそれ以上のペプチド系化合物を含有する医薬組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
詳細な説明
定義
ペプチド類のアミノ酸残基は以下のように略記する：フェニルアラニンはPheまたはF；ロイシンはLeuまたはL；イソロイシンはIleまたはI；メチオニンはMetまたはM；バリンはValまたはV；セリンはSerまたはS；プロリンはProまたはP；スレオニンはThrまたはT；アラニンはAlaまたはA；チロシンはTyrまたはY；ヒスチジンはHisまたはH；グルタミンはGlnまたはQ；アスパラギンはAsnまたはN；リジンはLysまたはK；アスパラギン酸はAspまたはD；グルタミン酸はGluまたはE；システインはCysまたはC；トリプトファンはTrpまたはW；アルギニンはArgまたはR；およびグリシンはGlyまたはG。ペプチド類の非通常アミノ酸は以下のように略記する：1-ナフチルアラニンは1-nal；2-ナフチルアラニンは2-nal；N-メチルグリシン（サルコシンとしても知られる）はMeGまたはSc；およびアセチル化グリシン（N-アセチルグリシン）はAcG; ホモセリンメチルエーテルはHsm。
【００３４】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、モノマーがアミド結合によりαアミノ酸が連結しているポリマーをいう。ペプチドは2個またはしばしばそれより長いアミノ酸モノマーである。一般に、当分野および本発明の文中で用いる場合、用語「ペプチド」は長さにしてわずか数個のアミノ酸残基のポリペプチドをいう。特に、本発明のペプチド類は好ましくは長さ約50アミノ酸残基以下、より好ましくは長さ約5〜40アミノ酸残基、さらにより好ましくは長さ約17〜40アミノ酸残基である。それに対して、ポリペプチドは任意の数のアミノ酸残基を含有する。それゆえ、ポリペプチドはペプチド類、ならびにより長いアミノ酸の配列、例えば長さ数百のアミノ酸残基のタンパク質類を含む。
【００３５】
本発明で用いられるペプチドはより長いポリペプチド配列、例えばタンパク質の配列の部分である、またはそれに「由来する」ものであってよい。
【００３６】
ここで用いられるように、語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与した際に「一般に安全とされている」、例えば、生理学的に許容され、アレルギー反応または類似の有害反応、例えば胃の異常、めまい等を生じない分子全体および組成物をいう。好ましくは、ここで用いられているように、用語「薬学的に許容される」は、動物、特にヒトへの使用のために連邦政府または州政府の監督官庁により認可され、あるいは米国薬局方または他の一般的に認識される薬局方に掲載されることを意味する。用語「キャリア」は化合物と共に投与される希釈剤、助剤、賦形剤またはビヒクルをさす。そのような製剤キャリアは、水、およびピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物または合成由来の油を含む油類などの滅菌した液体である。水または水溶液、食塩溶液およびブドウ糖溶液およびグリセロール溶液がキャリアとして好ましく、特に注射溶液として用いられる。適当な製剤キャリアは、E.W. Martinの「レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に記載されている。
【００３７】
ここで用いられているように、用語「アゴニスト」は、その相補的な生物学的活性のある受容体に結合し、その受容体を活性化し、生物学的応答を引き起こす、または受容体の元からある生物学的活性を促進するような生物学的活性リガンドをいう。
【００３８】
PEG部分
本発明で用いられるPEG部分は直鎖状で、20Kダルトンまたはそれ以上の分子量を有する。好ましくは、PEGは約20〜60Kダルトンの分子量を有する。より好ましくは、PEGは約20〜40Kダルトンの分子量を有する。最も好ましくは、PEGは20Kダルトンの分子量を有する。
【００３９】
PEG部分は本発明の化合物に共有結合で、直接的にペプチド部分、リンカー部分、またはスペーサー部分に結合する。一実施態様において、PEG部分はペプチドモノマーまたはダイマーの少なくとも一つの末端（N-末端またはC-末端）に結合する：例えば、ペプチドダイマーのそれぞれのN-末端は結合したPEG部分（合計二つのPEG部分）を有する。一態様において、PEGは二つのペプチドモノマーをダイマー化するリンカーとして機能する：例えば、単一のPEG部分は同時にペプチドダイマーの両方のN-末端に結合することができる。別の態様では、PEGはペプチドモノマーまたはダイマーのスペーサー部分に結合する。好ましい態様では、PEGはペプチドダイマーのリンカー部分に結合する。高度に好ましい態様において、PEGはスペーサー部分に結合し、前記スペーサー部分はペプチドダイマーのリンカーLk部分に結合する。最も好ましくは、PEGはスペーサー部分に結合し、前記スペーサー部分はリジンリンカーのカルボニル炭素またはリジンアミドのリンカーのアミド窒素を介してペプチドダイマーに結合する。
【００４０】
本発明のペプチド系化合物は複数のPEG部分（例えば、2、3、4、あるいはそれ以上）を含有できる。特定の態様において、PEG部分は二つの直鎖状モノマーPEG鎖を含有する。好ましくは、二つの直鎖状モノマーPEG鎖は、リジン残基またはリジンのアミド（カルボキシル基がアミド -CONH2に置換されているリジン残基）を介して結合している。より好ましくは、二つのPEG鎖はリジンのαおよびεアミノ基と結合し、一方カルボキシル基はスペーサー部分への結合のために、ヒドロキシスクシンイミジルエステルとして活性化される。例えば、リジンのアミドが二つのモノマーPEG鎖を結合すると、ダイマーは構造的には式I（Formula I）のように図示され、式IIの（Formula II）ように要約される：
【化３】
2007530440.tif 000004
【００４１】
式Iにおいて、N2はリジンのε-アミノ基の窒素原子を表し、N1はリジンのα-アミノ基の窒素原子を表す。好ましい態様では、二つのペプチドモノマーのC-末端リジンはL-リジンである。別の態様では、一つまたはそれ以上のリジン残基がD-リジンであってよい。
【００４２】
化合物が一つ以上のPEG部分を含有する場合、複数のPEG部分は同一または異なる化学部分であってよい（例えば、異なる分子量のPEG）。いくつかの場合では、PEG化の程度（ペプチドに結合したPEG部分の数、および/またはPEGが結合したペプチドの総数）は、PEG化反応におけるPEG分子対ペプチド分子の比率、ならびに反応混合物中にそれぞれがあるならば合計濃度に影響を受ける。一般に、（過剰でない未反応のペプチドおよび/またはPEGに提供される反応効率という点からの）最適PEG対ペプチド比は、望ましいPEG化の程度（例えば、モノ-、ジ-、トリ-等）、選択したポリマーの分子量、ポリマーが分枝しているか否か、特定の結合方法の実験条件のような因子により決定される。
【００４３】
当業者に入手可能な多くのPEG結合方法がある[例えば、Goodsonら（1990）Bio/Technology 8: 343（部位特異的突然変異誘発後のグリコシル化部位におけるインターロイキン-2のPEG化）；EP 0 401 384（PEGとG-CSFとのカプリング）；Malikら、（1992）Exp. Hematol. 20: 1028-1035（トレシルクロリドを用いたGM-CSFのPEG化）；PCT公開番号WO 90/12874（システイン特異的mPEG誘導体を用いて組換え導入したシステイン残基を含むエリスロポエチンのPEG化)；米国特許第5,757,078号（EPOペプチドのPEG化）；米国特許第5,612,460号（ポリペプチド修飾のためのポリアルキレン酸化物の活性炭酸塩）,米国特許第5,672,662号（バイオ技術応用のためのポリ（エチレングリコール）およびプロピオン酸またはブタン酸とモノ置換した関連ポリマー、およびその官能基誘導体）；米国特許第6,077,939号（ペプチドのN-末端α-炭素のPEG化）；Veroneseら、（1985）Appl. Biochem. Bioechnol 11: 141-142（PEG-ニトロフェニルカーボネート (「PEG-NPC」)またはPEG-トリクロロフェニルカーボネートを用いたペプチドのN-末端α-炭素のPEG化）；およびVeronese (2001) Biomaterials 22: 405-417 (ペプチドおよびタンパク質のPEG化についての総説)を参照）。
【００４４】
例えば、PEGは反応基を介してアミノ酸残基に共有結合させることができる。反応基は活性化PEG分子が結合し得る基である（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）。例えば、N-末端アミノ酸残基とリジン（K）残基は遊離のアミノ基を有し；およびC-末端アミノ酸残基は遊離のカルボキシル基を有する。スルフィドリル基（例えば、システイン残基上に見出されるもの等）もまた、PEG結合のための反応基として用いることができる。加えて、ポリペプチドのC-末端に特異的に活性基（例えば、ヒドラジド基、アルデヒド基および芳香族アミノ基）を導入するための酵素介助法が記載されている[Schwarzら（1990）Methods Enzymol.184: 160；Roseら（1991）Bioconjugate Chem. 2: 154；Gaertnerら（1994）J. Biol. Chem. 269: 7224]。
【００４５】
例えば、PEG分子は、異なる反応部分を有するメトキシ化PEG（「mPEG」）を用いてアミノ基に結合させることができる。そのような反応部分の限定されない例としては、スクシンイミジルスクシネート（SS）、スクシンイミジルカーボネート（SC）、mPEG-イミデート、パラ-ニトロフェニルカーボネート（NPC）、スクシンイミジルプロピオネート（SPA）および塩化シアヌルがあげられる。反応部分を有するようなmPEG類の限定されない例としては、mPEG-スクシンイミジルスクシネート（mPEG-SS）、mPEG-スクシンイミジルカーボネート（mPEG-SC）、mPEG-イミデート、mPEG-パラ-ニトロフェニルカーボネート（mPEG-NPC）、mPEG-スクシンイミジルプロピオネート（mPEG-SPA）およびmPEG-塩化シアヌルがあげられる。
【００４６】
PEGの結合が非特異的であり、特異的なPEG結合を含むペプチドが望まれる場合、目的のPEG化化合物はPEG化化合物の混合物から精製することができる。例えば、N-末端PEG化ペプチドが所望されるならば、N-末端PEG化型はランダムにPEG化されたペプチドの集団から精製（すなわち、この部分を他のモノPEG化部分から分離）することができる。
【００４７】
好ましい態様において、PEGは部位特異的にペプチドに結合する。成長ホルモン放出因子の強いアナログのN-末端、側鎖およびC-末端の部位特異的PEG化は、固相合成により実施される[Felixら、（1995）Int. J. Peptide Protein Res. 46: 253]。別の部位特異的な方法には、N-末端スレオニンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化により生ずるN-末端の反応アルデヒド基を介した部位特異的方法でのリポソーム表面移植PEG鎖の先端にペプチドを結合する方法をあげることができる [Zalipskyら（1995）Bioconj. Chem. 6: 705]。しかし、この方法はN-末端にセリン残基またはスレオニン残基を有するポリペプチドに限定される。
【００４８】
一方法において、選択的N-末端PEG化は、特定のタンパク質の誘導体化で利用可能な異なる型の主要なアミノ基（リジン対N-末端）の差がある反応性を利用する還元アルキル化によって達成される。適切な反応条件下で、PEGを含むカルボニル基はペプチドのN-末端に選択的に結合する。例えば、リジン残基のε-アミノ基とペプチドのN-末端のα-アミノ基のpKaの違いを生かすpHで反応を行うことにより、タンパク質のN-末端を選択的にPEG化することができる。そのような選択的結合により、他の反応基（例えば、リジン側鎖のアミノ基）の顕著な修飾なしに、PEG化が主としてタンパク質のN-末端で起きる。還元アルキル化を用いて、PEGはタンパク質をカプリングするために単一の反応性アルデヒドを有するべきである（例えば、PEGプロピオンアルデヒドを用いることができる）。
【００４９】
部位特異的突然変異誘発は、部位特異的ポリマー結合をペプチドにさせるために用いられるさらなるアプローチである。この方法により、ペプチドのアミノ酸配列は適当な反応基をペプチド内の目的の位置へ取り込むようにデザインされる。例えば、WO 90/12874は、システイン残基の挿入または他の残基のシステイン残基への置換により修飾されたタンパク質の部位特異的PEG化を記載している。この公報はまた、EPOに組換え的に導入されたシステイン残基を用いてシステイン特異的mPEG誘導体を反応することによるmPEG-エリスロポエチン（「mPEG-EPO」）の調製を記載している。
【００５０】
PEG部分がスペーサー部分またはリンカー部分に結合する場合、類似した結合反応を用いることができる。この場合、リンカーまたはスペーサーは反応基を含み、適切な相補的反応基を含む活性化PEG分子が共有結合を生じるために用いられる。好ましい態様では、リンカーまたはスペーサーの反応基は末端反応基である（すなわち、リンカーまたはスペーサーの末端に位置する）。
本発明のペプチド、ペプチドダイマーおよび他のペプチド系分子は、水溶性ポリマーを該分子の受容体結合部（例えば、ペプチド＋スペーサー）につなげる各種化学物質のいずれかを用いて、水溶性ポリマー（例えばPEG）に結合することができる。典型的な態様は、水溶性ポリマーが受容体結合部に共有結合するために、単一の結合接合部を用いるが、別の態様では、異なる種の水溶性ポリマーが、別の結合接合部（スペーサーとの、および/またはスペーサーまたは両方のペプチド鎖との共有結合接合部を含む）で、受容体結合部に結合するような、さらなる変種を含む複数の結合接合部を用いることができる。いくつかの態様では、ダイマーまたは高次マルチマーは異なる種のペプチド鎖（すなわち、ヘテロダイマーまたは他のヘテロマルチマー）を含有する。一例であって、これに限られないが、ダイマーはPEG結合接合部を有する第一のペプチド鎖と、PEG結合接合部を欠くか、第一のペプチド鎖とは異なる結合化学物質を用いる第二のペプチド鎖とを含有し、いくつかの変法では、スペーサーはPEG結合接合部を含むか、またはこれを欠き、前記スペーサーは、PEG化されていれば、第一および/または第二のペプチド鎖のものとは異なる結合化学物質を利用する。さらなる態様は受容体結合部のスペーサー部分に結合するPEG、および分子のペプチド部分のアミノ酸の一つの側鎖に結合する異なる水溶性ポリマー（例えば、炭水化物）を利用する。
【００５１】
多種のポリエチレングリコール（PEG）類は、受容体結合部（ペプチド＋スペーサー）のPEG化に用いることができる。実質的に、適切な反応性PEG試薬を用いることができる。好ましい態様では、反応性PEG試薬は、受容体結合部への接合部にカルバメート結合またはアミド結合を形成する。適当な反応性PEG類には、NOF社（〒150-6019  東京都渋谷区恵比寿4丁目20-3  恵比寿ガーデンプレイスタワー）の薬物送達システムカタログ（2003）およびネクター・セラピューティクス（35806  アラバマ州ハンツビル  ディスカバリードライブ490）の分子工学技術カタログ（2003）で市販されているものが含まれるが、これらに限定されない。例えば、限定されないが、次のPEG試薬が各種態様で、しばしば好ましく用いられる：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、マルチアームPEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-チオエステル、mPEG-ダブルエステル、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、ヘテロ官能基PEG類（NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL）、PEGアクリレート類（ACRL-PEG-NHS）、PEG-リン脂質（例えば、mPEG-DSPE）、当業者により選択された化学物質により活性化されるグリセリン系PEGのGLシリーズを含むサンブライト（SUNBRITE）シリーズのマルチアームPEG、限定はされないが、カルボキシル-PEG、p-NP-PEG、トレシル-PEG、アルデヒドPEG、アセタール-PEG、アミノ-PEG、チオール-PEG、マレイミド-PEG、ヒドロキシル-PEG-アミン、アミノ-PEG-COOH、ヒドロキシル-PEG-アルデヒド、カルボン酸無水物型PEG、機能化PEG-リン脂質および他の類似および/または特定の応用と使用について当業者により選択された適切な反応性PEG-リン脂質。
【００５２】
ペプチド部分
ヒトを含む動物、微生物または植物由来の任意のペプチド、および遺伝子工学により、および合成により産生されたペプチドをペプチド部分として用いることができる。例としては、EPO−Rに結合するペプチドおよびTPO-Rに結合するペプチドが含まれる。
【００５３】
好ましくは、ペプチド部分は、一つまたはそれ以上のペプチドを含有し、各ペプチドの長さは50アミノ酸以下、より好ましくは約10〜25アミノ酸、最も好ましくは約12-18アミノ酸である。
【００５４】
好ましい一態様において、ペプチド部分は、米国特許第5,773,569号；第5,830,851号；およびWrightonらの第5,986,047号；WrightonらのPCT公開番号WO 96/40749；JohnsonとZivinの米国特許第5,767,078号およびPCT公開番号 96/40772；BaluのPCT公開番号WO 01/38342；Smith-SwintoskyらのWo 01/91780；2003年5月12日出願の米国仮出願第60/470,245号；2003年5月12日出願の米国仮出願第60/469,993号；および2003年5月12日出願の米国仮出願第60/470,244号に開示されるようなEPO-Rに結合するペプチド類から選択される。
【００５５】
好ましい別の態様では、ペプチド部分はトロンボポエチン受容体（「TPO-R」）に結合するペプチド類から選択される。そのようなTPO-R結合ペプチドの限定されない例としては、米国特許第6,552,008号、第6,506,362号、第6,498,155号、第6,465,430号、第6,333,031号、第6,251,864号、第6,121,238号、第6,083,913号、第5,932,546号、第5,869,451号、第5,683,983号、第5,677,280号、第5,668,110号、および第5,654,276号；および公開米国特許出願第2003/0083361号、第2003/0009018号、第2002/0177166号および第2002/0160013号に開示されるものがあげられる。
【００５６】
一態様において、ペプチド部分は、長さ10〜40、またはそれ以上のアミノ酸残基で、配列X3X4X5GPX6TWX7X8を有するモノマーペプチドである。ここでそれぞれのアミノ酸は標準的な一文字略記で示される；X3はC；X4はR、H、LまたはW；X5はM、FまたはI；X6は20個の遺伝コードされるL-アミノ酸のいずれか一つから独立に選択される；X7はD、E、I、LまたはV；X8はCで、該ペプチドはエリスロポエチン受容体（EPO-R）に結合し、活性化し、あるいは同様にEPOアゴニストとして作用する。
【００５７】
別の態様では、ペプチド部分は、コアのアミノ酸配列  LYACHMGPITX1VCQPLR  を含有する、長さ17〜約40アミノ酸のモノマーペプチドであり、ここでそれぞれのアミノ酸は標準的な一文字略記で示され；X1はトリプトファン（W）、1-ナフチルアラニン（1-nal）または2-ナフチルアラニン（2-nal）である。
【００５８】
また別の態様では、ペプチド部分は、Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Nal(1)-Leu-Ala-Ala-Arg-SarまたはAc-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Sar等の配列を有する一つまたはそれ以上のTPO-R結合ペプチドを含有する。
【００５９】
本発明のいくつかの態様によれば、20個の遺伝的にコードされたL-アミノ酸または立体異性のD-アミノ酸のいずれかから独立に選択される、二つまたはそれ以上の、好ましくは2〜6アミノ酸残基が上記のコア配列の一方または両方の末端にカップリングする。例えば、配列GGはしばしばペプチドの合成の際に容易にコア配列の一方または両方の端に付加される。本発明はまた、これらのペプチドの結合体およびその誘導体、ならびにEPO-R結合性を保持したペプチドのペプチド擬似体を提供する。
【００６０】
20個の通常アミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、a,a-二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非通常アミノ酸もまた、本発明の化合物に適した成分である。非通常アミノ酸の例としては、限定されるものではないが、β-アラニン、3-ピリジルアラニン、4-ヒドロキシプロリン、O-ホスホセリン、N-メチルグリシン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、ノルロイシン、ならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸が含まれる。
【００６１】
好ましい態様において、本発明のペプチド部分はコア配列の二つのシステイン残基の間に分子内ジスルフィド結合を含んでいる。例えば：
【化４】
2007530440.tif 000005
【００６２】
ダイマーおよびオリゴマーペプチド
好ましい態様において、本発明のモノマーペプチド部分はダイマー化またはオリゴマー化されてダイマーまたはオリゴマーを形成する。
【００６３】
一態様において、本発明のペプチドモノマーをビオチン/ストレプトアビジン系を用いてオリゴマー化することができる。ペプチドモノマーのビオチン化類似体は標準的技術で合成できる。例えば、ペプチドモノマーをC-末端ビオチン化できる。これらのビオチン化モノマーはその後、ストレプトアビジンとインキュベートすることにより[例えば、4：1のモル比で、室温、リン酸緩衝液化食塩水（PBS）またはHEPES緩衝液化RPMI培地（Invitrogen）中、1時間]、オリゴマー化される。この態様の変法において、ビオチン化ペプチドモノマーは、多くの市販されている抗ビオチン抗体のいずれか一つ[例えば、Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.（ワシントンDC）のヤギ抗ビオチンIgG]とインキュベートすることによりオリゴマー化される。
【００６４】
リンカー
好ましい態様では、本発明のペプチドモノマーは少なくとも一つのリンカー部分に共有結合することによりダイマー化する。リンカー（Lk）部分は好ましくは、必要ではないが、任意に一つまたは二つの-NH-結合部を末端に有し、任意に一つまたはそれ以上の得られる炭素原子が低級アルキル置換基に置換されているC1-12結合部分である。好ましくは、リンカーLkは-NH-R-NH-を含有し、ここでRは他の分子部分に結合できるような（例えば、固体支持体の表面に存在するような）カルボキシル基またはアミノ基のような官能基に置換された低級（C1-6）直鎖状炭化水素である。最も好ましくは、リンカーはリジン残基またはリジンのアミド（カルボキシル基がアミド部分-CONH2に置換されているリジン残基）である。好ましい態様において、リンカーはそれぞれのモノマーのC-末端アミノ酸に同時に結合して、二つのペプチドモノマーのC-末端を架橋する。
【００６５】
例えば、C-末端リンカーLkがリジンアミドである場合、ダイマーは構造的に式I（Formula I）で示されるように表され、式II（Formula II）で示されるように要約される：
【化５】
2007530440.tif 000006
【００６６】
式Iにおいて、N2はリジンのε-アミノ基の窒素原子を表し、N1はリジンのα-アミノ基の窒素原子を表す。ダイマー構造は、リジンを含有するリンカー部分のαおよびεアミノ基の両方に結合するペプチドを示すために[ペプチド]2-Lkと、リジンを含有するリンカー部分のαおよびεアミノ基の両方に結合するN-末端をアセチル化したペプチドを示すために[Ac-ペプチド]2-Lkと、分子内ジスルフィドループを含むそれぞれのペプチドを有する、リジンを含有するリンカー部分のαおよびεアミノ基の両方に結合するN-末端をアセチル化したペプチドを示すために[Ac-ペプチド、ジスルフィド]2-Lkと、分子内ジスルフィドループと、リンカー部分のC-末端とPEG部分の間に共有結合を形成するスペーサー分子を含むそれぞれのペプチドを有する、リジンを含有するリンカー部分のαおよびεアミノ基の両方に結合するN-末端をアセチル化したペプチドを示すために[Ac-ペプチド、ジスルフィド]2-Lk-スペーサー-PEGと記載される。
【００６７】
一般的に、必要ではないが、分子間ジスルフィド結合の形成とは別の技術によりダイマー化したペプチドダイマーもまた、ペプチドモノマーのシステイン残基の間に一つまたはそれ以上のジスルフィド結合を含む。例えば、二つのモノマーは一つまたはそれ以上の分子間ジスルフィド結合により架橋される。好ましくは、二つのモノマーは少なくとも一つの分子内ジスルフィド結合を含む。最も好ましくは、ペプチドダイマーのモノマー両方は分子内ジスルフィド結合を含み、その結果、それぞれのモノマーは環状基を含む。
【００６８】
ペプチド修飾
また、本発明の他の化合物を産生するために、本発明のペプチド化合物のアミノ末端および/またはカルボキシ末端を修飾できる。アミノ末端修飾には、メチル化（すなわち、-NHCH3または-N(CH3)2）、アセチル化（例えば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体、例えばα-クロロ酢酸、α-ブロモ酢酸、またはα-ヨード酢酸との）、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）基の付加、またはRCOO-で定義されるカルボキシレート官能基またはR-SO2-で定義されるスルホニル官能基（ここでRはアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール等および類似の基からなる群から選択される）を含む任意のブロッキング基を用いたアミノ末端のブロッキングが含まれる。また、プロテアーゼ感受性を減少し、あるいはペプチド化合物の構造を限定するために、N-末端にdesアミノ酸を取り込むことができる（その結果、N-末端アミノ基はなくなる）。好ましい態様では、N-末端はアセチル化されている。最も好ましい態様では、N-末端グリシンはアセチル化され、N-アセチルグリシン（AcG）となっている。
【００６９】
カルボキシ末端の修飾としては、遊離酸をカルボキシアミド基に置換する、または構造的制約を導入するためにカルボキシ末端にラクタム環を形成することがあげられる。また、本発明のペプチドを環状化し、またはペプチドの末端にdesアミノまたはdesカルボキシ残基を取り込むことができ、その結果末端のアミノ基またはカルボキシル基がなくなり、プロテアーゼ感受性を減少し、あるいはペプチド化合物の構造を限定することができる。本発明の化合物のC-末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシおよびカルボキシ、およびそれらの低級エステル誘導体、ならびにその薬学的に許容される塩をあげることができる。
【００７０】
天然に存在する20個の遺伝的にコードされるアミノ酸（または立体異性Dアミノ酸）の側鎖を他の側鎖、例えば、アルキル、低級アルキル、環状4-、5-、6-または7-員アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびそれらの低級エステル誘導体等の基、および4-、5-、6-または7-員複素環と置換できる。特に、プロリン残基の環サイズが5員から4、6または7員に変えられるプロリン類似体を用いることができる。環状基は飽和であっても、不飽和であってもよく、不飽和の場合、芳香環または非芳香環である。複素環基には好ましくは、一つまたはそれ以上の窒素、酸素および/または硫黄ヘテロ原子が含まれる。そのような基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソクサゾリル、モルホリニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、1-ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、1-ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、1-ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）、およびトリアゾリルをあげることができる。これらの複素環基は置換されていても、非置換であってもよい。基が置換されている場合、置換基はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換もしくは非置換フェニルである。
【００７１】
また、容易にリン酸化および他の方法[例えば、Hrubyら、（1990）Biochem J. 268: 249-262に記載されている方法]により、ペプチド部分を修飾できる。
【００７２】
本発明のペプチド部分はまた、類似の生物活性を有する非ペプチド化合物の構造モデルとして機能する。当業者は、リードペプチド化合物と同様または類似の所望の生物活性を有するが、溶解性、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解に対しての感受性について、リードよりも良い活性を有する化合物を構築するための各種技術が得られることを認識する[MorganとGainor（1989）Ann. Rep. Med. Chem.  24：243-252参照]。これらの技術には、ペプチドのバックボーンをホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、2級アミンおよびN-メチルアミノ酸からなるバックボーンに置換することが含まれる。
【００７３】
モノマーペプチド部分、ダイマーペプチド部分またはオリゴマーペプチド部分は直接PEG部分に結合するか、または一つまたはそれ以上のスペーサー部分を介して結合する。
【００７４】
スペーサー部分
モノマー、ダイマーまたはオリゴマーペプチド部分がスペーサー部分を介してPEG部分に結合している態様において、スペーサー部分は任意に、末端に-NH-結合部または-C(O)O-基を有する部分である。例えば、スペーサーは、他の分子部分に結合することができる、カルボキシル基またはアミノ基等の官能基、または一つもしくはそれ以上のグリシン（G）残基、または6-アミノヘキサン酸等のアミノヘキサン酸（Ahx）；またはリジン（K）残基、またはリジンアミド（K-NH2、カルボキシル基がアミド部分-CONH2に置換されているリジン残基）と任意に置換される低級（C1-12）直鎖状炭化水素である。
【００７５】
好ましい態様では、スペーサー部分は次の構造を有する：
【化６】
2007530440.tif 000007
ここで、α、β、γ、δおよびεはそれぞれ整数であり、その数値は独立に選択される。
【００７６】
好ましい態様において、
αは、1＜α＜6である整数；
βは、1＜β＜6である整数；
εは、1＜ε＜6である整数；
δは、0または1；
γは、0＜γ＜10である整数；および
YがNHまたはCOのいずれかである。
【００７７】
特定の好ましい態様では、γ＞1のとき、β＝2である。
【００７８】
特に好ましい一態様では、
α＝β＝ε＝2；
γ＝δ＝1；および
YがNHである。
【００７９】
他の態様では、
γ＝δ＝0；
2＜α＋ε＜5；および
YはCOである。
【００８０】
一態様では、
γ＝δ＝0；
α＋ε＝5；および
YはCOである。
【００８１】
本発明によれば、水溶性部分（好ましくはPEG）は、スペーサーのNH末端に結合する。水溶性部分は直接スペーサーに結合してもよいし、間接的に、例えばアミドまたはカルバメート結合を用いて結合してもよい。ペプチド部分はスペーサーのY末端に結合する。スペーサーはペプチドのC-末端またはN-末端のいずれに結合してもよい。それゆえ、スペーサーがペプチドのC-末端に結合する態様において、YはNHである。スペーサーがペプチドのN-末端に結合する態様において、YはCOである。好ましい態様では、本発明のスペーサーは下記のリジンリンカーによりペプチドダイマーに結合する。そのような態様において、スペーサーは好ましくはリンカー部分のC-末端に結合し、YはNHである。別の好ましい態様では、本発明のスペーサーは三官能基リンカー（下記）の部分としてペプチドに結合する。その態様において、YはCOであり、三官能基リンカーのN原子とアミド結合を形成する。
【００８２】
スペーサー部分はペプチド合成の間にペプチドに取り込まれ得る。例えば、スペーサーが遊離アミノ基と、別の分子部分へ結合させる第二の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを含む場合、スペーサーは固体支持体に結合され得る。その後、ペプチドは直接、スペーサーの遊離アミノ基に、標準的な固相法により合成される。
【００８３】
好ましい態様において、二つの官能基を含むスペーサーは最初に第一の官能基を介して固体支持体に結合される。ダイマーペプチドを合成する場合、任意に、ペプチド合成の開始部位として機能できる二つまたはそれ以上の官能基、および他の分子部分を結合できるさらなる官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）を持っているリンカーLk部分は、スペーサーの第二の官能基とリンカーの第三の官能基を介してスペーサーに結合する。その後、二つのペプチドモノマーが、リンカーLk部分の二つの反応性窒素基上に直接、固相合成技術の変法で合成される。例えば、遊離のアミン基を持つ固体支持体を結合したスペーサーは、リンカーの遊離のカルボキシル基を介してリジンリンカーと反応することができる。
【００８４】
ペプチド部分がスペーサー部分に結合する別の態様では、当該スペーサー部分はペプチド合成後にペプチドに結合され得る。そのような結合を当分野で十分確立した方法により達成することができる。一実施態様において、リンカーは、少なくとも一つの、合成されたペプチドの標的官能基に結合させるのに適している官能基を含む。例えば、遊離アミン基を有するスペーサーはペプチドのC-末端カルボキシル基と反応できる。別の例では、遊離のカルボキシル基を有するスペーサーはペプチドN-末端またはリジン残基の遊離のアミン基と反応できる。また別の例では、遊離のスルフィドリル基を含むスペーサーは酸化によりペプチドのシステイン残基に結合し、ジスルフィド結合を形成する。
【００８５】
医薬組成物
本発明の別の局面では、上記PEG修飾ペプチド系化合物の医薬組成物が提供される。そのような組成物の投与により軽減される、または調節される症状には上記のようなものがあげられる。そのような医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（IV）または皮下注射）、経皮（受身的に、またはイオントフォレーゼもしくはエレクトロポレーションを用いた）、経粘膜（経鼻、経膣、経直腸または舌下）投与経路による、または生物侵食挿入を用いた投与のためのもので、それぞれの投与経路に適した剤形に製剤される。一般に、薬学的に許容されうる希釈剤、防腐剤、溶解剤、乳化剤、助剤および/またはキャリアとともに、有効量の治療ペプチド（例えば、EPO-Rに結合するペプチド）を含有する医薬組成物が本発明に包含される。そのような組成物には、各種緩衝液内容物（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pH、およびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および溶解剤（例えば、Tween 80、Poysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合化合物の微粒子調剤、またはリポソームへの物質の取り込みが含まれる。ヒアルロン酸もまた用いることができる。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボの放出速度およびインビボのクリアランスに影響する。例えば、ここに参照して取り込まれる、レミントンの薬剤科学、第18版（1990、マック・パブリッシング・カンパニー、18042、ペンシルベニア州イーストン）、1435-1712ページを参照とする）。組成物は液体の形状で、あるいは乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）の形状で調製される。
【００８６】
経口送達
ここでの使用を意図しているのは経口固体剤形であり、これは、ここに参照して取り込まれる、レミントンの薬剤科学、第18版（1990、マック・パブリッシング・カンパニー、18042、ペンシルベニア州イーストン）、第89章に記載されている。固体剤形には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチまたはトローチ剤、カプセル、小球、粉末または顆粒が含まれる。リポソームによるカプセル封入またはタンパク質様体によるカプセル封入が本組成物を製剤するために用いられる（例えば、米国特許第4,925,673号に報告されたタンパク質様ミクロスフェア）。リポソーム・カプセル封入体が用いられ、リポソームは各種ポリマーから誘導される（例えば、米国特許第5,013,556号）。治療のために可能な固体剤形の記載は、ここに参照して取り込まれる、現代薬剤学（Modern Pharmaceutics）、G.S.BankerとC.T.Rhodes編、第10章（1979）のMarshall, K.によりなされている。一般に、製剤にはEPO-Rアゴニストペプチド（またはその化学修飾体）および、胃の環境から保護し、腸において生物活性物質を放出するために不活性成分を含有する。
【００８７】
ここで使用を意図しているのはまた、経口投与のための液体剤形で、薬学的に許容される乳化剤、溶液、懸濁剤およびシロップを含み、不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤および懸濁剤等の助剤；ならびに甘味剤、着香料および香料を含む他の成分を含む。
【００８８】
ペプチドは化学的に修飾され、その結果として、誘導体の経口送達が効果的となる。一般に、意図される化学修飾は、少なくとも一つの部分の成分分子自身への結合であり、前記部分は、(a) タンパク質分解の阻害；および(b) 胃または腸からの血流への取り込みを可能にする。成分または成分類の全体的な安定性の増加および体内の循環時間の増加も望まれる。上で議論したように、PEG化は薬剤用途のための好ましい化学修飾である。用いられる他の部分には、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレン、ポリ-1,3-ジオキソランおよびポリ-1,3,6-チオキソカンが含まれる[例えば、「薬剤としての酵素」HocenbergとRoberts編（ウィリー-インターサイエンス：ニューヨーク州ニューヨーク）367-383ページのAbuchowskiとDavis（1981）「溶解性ポリマー-酵素アダクト(Soluble Polymer-Enzyme Adducts)」；およびNewmarkら、（1982）J. Appl. Biochem.  4：185-189を参照する]。
【００８９】
経口製剤については、放出場所は胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸である。当業者は、胃で溶けず、十二指腸または腸のどこかで物質を放出するような入手可能な製剤を有している。好ましくは、放出は、ペプチド（または誘導体）の保護、またはペプチド（または誘導体）の放出のいずれかにより、胃環境以外に、例えば腸において、胃環境の有害効果を避けるであろう。
【００９０】
胃における十分な耐性を確実にするために、少なくともpH 5.0まで不浸透性のコーティングが必須である。腸溶性コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例としては、セルロースアセテート・トリメリテート（CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・フタレート（HPMCP）、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニルアセテート・フタレート（PVAP）、Eudragit L30D、アクアテリック、セルロースアセテート・フタレート（CAP）、Eudragit L、Eudragit Sおよびシェラックがある。これらのコーティングは混合フィルムとして用いることができる。
【００９１】
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、錠剤に用いることができるが、胃に対して保護されない。これには糖衣または、錠剤を飲み込みやすくするコーティングが含まれる。カプセルは、乾いた治療剤（すなわち粉末）の送達のために、（ゼラチンのような）ハードシェルからなり、液体剤形には、ソフトゼラチンシェルが用いられる。カプセルのシェル材は厚いデンプンまたは他の食用紙である。丸薬、トローチ剤、成型錠剤または錠剤粉薬には、モイスト・マッシング法（moist massing technique）を用いることができる。
【００９２】
ペプチド（または誘導体）を、粒子径約1 mmの顆粒または小球形状の細かい多微粒子として製剤に含むことができる。カプセル投与のための材料の製剤はまた、粉末状の、軽く圧縮したプラグ（plugs）として、または錠剤としてさえありうる。これらの治療剤は圧縮により調製される。
【００９３】
着色剤および/または着香料もまた含まれる。例えば、ペプチド（または誘導体）は（例えば、リポソームまたはミクロスフェアのカプセル化により）製剤化され、その後さらに、食用の産物内、例えば着色剤と着香料を含む冷飲料に含有される。
【００９４】
不活性物質を用いて、ペプチド（または誘導体）の容量を希釈または増加することができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α-乳糖、無水乳糖、セルロース、ショ糖、修飾デキストランおよびデンプンが含まれる。カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む特定の無機塩類もまた充填剤として用いることができる。市販の希釈剤のいくつかは、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellである。
【００９５】
錠剤分解物質は、固体剤形中に治療剤の製剤として含まれ得る。錠剤分解物質として用いられる物質は、これに限定されないが、デンプンに基づく市販の錠剤分解物質であるExplotabを含むデンプンである。デンプングリコレート・ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、カイメンおよびベントナイトは全て用いることができる。錠剤分解物質はまた、不溶性の陽イオン交換樹脂であってもよい。粉末増粘剤が錠剤分解物質および結合剤として用いられ、寒天、カラヤ（Karaya）またはトラガカント等の増粘剤が含まれ得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた錠剤分解物質として有用である。
【００９６】
結合剤は、ペプチド（または誘導体）剤を保持するとともに硬い錠剤を形成するために用いることができ、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチン等の天然産物由来の物質が含まれる。他のものとしては、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）およびカルボキシメチルセルロース（CMC）がある。ポリビニルピロリドン（PVP）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）を共にペプチド（または誘導体）を粒状化するためにアルコール溶液中で用いることができる。
【００９７】
減摩剤をペプチド（または誘導体）の製剤に含めて、製剤工程の間の張り付きを防ぐことができる。潤滑剤はペプチド（または誘導体）とダイ壁との間の層として用いられ、これらには、限定はされないが、そのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、流動パラフィン、植物油およびロウが含まれ得る。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Carbowax）4000および6000等の可溶性潤滑剤もまた用いることができる。
【００９８】
製剤中の薬剤の流動性を改善する流動促進剤は、圧縮の間の再配列を助けるために添加することができる。流動促進剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカおよび水和ケイアルミン酸塩が含まれ得る。
【００９９】
ペプチド（または誘導体）の水性環境への溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加し得る。界面活性剤には、陰イオン界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムが含まれ得る。陽イオン界面活性剤を用いてもよく、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムが含まれる。界面活性剤として製剤中に含まれ得る潜在的な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴル400、ポリオキシル40ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50および60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート 40、60、65および80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、または異なる比の混合物として、タンパク質または誘導体の製剤中に存在している。
【０１００】
ペプチド（または誘導体）の取り込みを潜在的に促進する添加剤は例えば、脂肪酸である、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【０１０１】
制御放出の経口製剤が望ましい。ペプチド（または誘導体）は、拡散または浸出機構のいずれかにより放出させる不活性マトリックス、例えば増粘剤に組み込むことができる。ゆっくり変化するマトリックスもまた製剤中に取り込んでもよい。いくつかの腸溶性もまた、遅延放出効果を有する。制御放出の別の形態はオロス・セラピューティック・システム（Oros Therapeutic System）(Alza社)に基づく方法によるものである、すなわち薬剤は、浸透圧効果のために単一の小孔を通って、水が入り、薬剤が押し出される半透膜中に封入される。
【０１０２】
他のコーティングは製剤に用いられる。これらにはコーティングパンに応用される各種の糖が含まれる。ペプチド（または誘導体）もまた、フィルムコートした錠剤に加えられ、この例で用いられる物質は二つの群に分けられる。第一は非腸溶性物質で、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ-エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、カルボキシ-メチルセルロース・ナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが含まれる。第二の群は通常フタル酸のエステルである腸溶性物質からなる。
【０１０３】
物質の混合は、最適フィルムコーティングを提供するのに使用し得る。フィルムコーティングはパンコーターまたは流動床で、あるいは圧縮コーティングにより行ってもよい。
【０１０４】
非経口送達
本発明による非経口投与のための製剤には、滅菌した水性または非水性の溶液類、懸濁剤または乳化剤が含まれる。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油およびコーン油、ゼラチン、およびエチルオレアート等の注射可能な有機エステルである。そのような剤形はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤等の助剤を含み得る。それらは例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、組成物に滅菌した剤を取り込むことにより、組成物を放射線照射することにより、あるいは組成物を加熱することにより滅菌できる。それらはまた、使用直前に滅菌水または他の滅菌した注射溶剤を用いて製造することができる。
【０１０５】
直腸または膣送達
直腸または膣投与のための組成物は好ましくは、有効成分に加え、カカオバターまたは坐剤ロウ等の賦形剤を含む坐剤である。経鼻または舌下投与のための組成物もまた、当業者に周知の標準的な賦形剤を用いて調製される。
【０１０６】
肺送達
EPO-Rアゴニストペプチド（またはその誘導体）の肺送達も本発明において意図される。ペプチド（または誘導体）は吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層から血流へ行き来する[例えば、Adjeiら（1990）Pharmaceutical Research 7: 565-569 ; Adjeiら（1990）Int. J. Pharmaceutics 63: 135-144（酢酸ロイプロリド）；Braquetら（1989）J. Cardiovascular Pharmacology 13(sup5): 143-146（エンドセリン-1）； Hubbardら（1989）Annals of Internal Medicine, Vol.III, pp. 206-212（α1-アンチトリプシン）；Smithら（1989）J. Clin. Invest. 84: 1145-1146（α-l-プロテイナーゼ）； Osweinら（1990）「タンパク質のエアゾール化（"Aerosolization of Proteins"）」、肺薬剤送達に関するシンポジウムIIの紀要（Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II）コロラド州キーストーン（組換えヒト成長ホルモン）；Debsら（1988）J. Immunol.140: 3482-3488（インターフェロン-γおよび腫瘍壊死因子α）；およびPlatzらの米国特許第5,284,656号（顆粒球コロニー刺激因子）を参照]。全身的効果のための肺への薬剤送達の方法および組成物については、Wongらの米国特許第5,451,569号に記載されている。
【０１０７】
治療薬の肺への送達のためにデザインされた様々な機械装置はこの発明の実施における使用のために意図され、限定はされないが、噴霧器、定量吸入器、および粉吸入器を含み、そのすべては当業者に熟知されている。本発明の実施に適している市販の装置のいくつかの特定の例としては、ウルトラベント噴霧器（Ultravent nebulizer）（Mallinckrodt Inc.、ミズーリ州セントルイス）；Acorn II噴霧器（Marquest Medical Products、コロラド州エングルウッド）；ベントリン（Ventolin）定量吸入器（Glaxo Inc.、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）；およびスピンへーラー粉吸入器（Spinhaler）(Fisons Corp.、マサチューセッツ州べドフォード)がある。
【０１０８】
そのような全ての装置は、ペプチド（または誘導体）の投与に適した製剤の使用が必要である。典型的には、それぞれの製剤は用いられる装置の型に特異的で、治療に有用な通常の希釈剤、助剤および/またはキャリアに加え、適当な推進剤物質の使用を含めることができる。また、リポソーム、ミクロカプセルまたはミクロスフェア、包接錯体または他の型のキャリアの使用も意図される。化学修飾ペプチドも、化学修飾の型または用いる装置の型に依存して、異なる製剤に調製することができる。
【０１０９】
ジェットまたは超音波、いずれの噴霧器の使用にも適している製剤は、典型的には、溶液mLあたり約0.1〜25 mgの生物学的活性のあるタンパク質の濃度で水に溶解したペプチド（または誘導体）を含有する。製剤はまた、緩衝液および単糖を（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧調節のため）含めてもよい。噴霧器製剤はまた、エアゾール形成時に溶液が噴霧化することにより引き起こされるペプチド（または誘導体）の表面に誘導される凝集を減少する、または防止するために、界面活性剤を含むことができる。
【０１１０】
定量吸入装置の使用のための製剤は一般に、界面活性剤と共に推進剤に懸濁したペプチド（または誘導体）を含む微粉末を含有する。推進剤は、この目的に用いられる従来からの物質で、例えば、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび1,1,1,2-テトラフルオロエタンを含む、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボン、またはそれらの組み合わせである。適した界面活性剤には、ソルビタン・トリオレアートおよびダイズレシチンが含まれる。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である。
【０１１１】
粉吸入装置から投薬される製剤には、ペプチド（または誘導体）を含む微細乾燥粉末を含有し、装置からの粉末の投薬が容易になる量、例えば製剤重量の50〜90％で、乳糖、ソルビトール、ショ糖またはマンニトール等の充填剤を含めることができる。ペプチド（または誘導体）は、最も好都合には、末梢肺に最も効率よく送達するために、平均粒子径10 mm（ミクロン）以下、最も好ましくは0.5〜5 mmの微粒子で調製される。
【０１１２】
経鼻送達
EPO-Rアゴニストペプチド（または誘導体）の経鼻送達もまた意図される。経鼻送達は、鼻への治療薬の投与後、肺への薬剤の堆積の必要なしに、ペプチドを直接血流に入れるものである。経鼻送達用製剤にはデキストランまたはシクロデキストランを用いた製剤が含まれる。
【０１１３】
用量
全てのペプチド化合物について、さらに研究するために、各種患者の各種症状の治療のための適切な用量レベルに関する情報が明らかとなり、当業者は、レシピエントの治療の状況、年齢、および一般的な健康を考慮し、適正な投与を確定できる。選択された用量は所望の治療効果、投与経路および所望の治療期間に依存する。一般的には、1日体重1 kg当り0.001〜10 mgの用量レベルが哺乳動物に投与される。一般的には、静脈内注射または輸液のため、用量を減らしてもよい。投薬の計画は循環半減期および用いられる製剤に依存して変化し得る。
【０１１４】
本発明のペプチド（またはその誘導体）を、一つまたはそれ以上のさらなる活性成分または医薬組成物とともに投与することができる。
【０１１５】
実施例
以下の実施例は発明の例示であり、限定されない。
【実施例１】
【０１１６】
H-TAP-Boc分子の合成
ステップA：Cbz-TAPの合成
【化７】
2007530440.tif 000008
TAP（10 g、67.47 mmol、アルドリッチケミカル社から入手）の無水ジクロロメタン（DCM）（100 ml）溶液を0℃に冷却した。ベンジルクロロホルメート（Cbz-Cl、Cbz=カルボキシベンジルオキシ）（4.82 ml、33.7 mmol）の無水DCM（50 ml）溶液をゆっくり6-7時間かけて、TAP溶液に滴下ロートを用いて添加し、反応混合物の温度をその間0℃に維持した。得られた混合物を室温（〜25℃）に暖めた。さらに16時間後、DCMを真空下で除去し、残渣を3N HClとエーテルで分配した。水層を回収し、NaOHの50％水溶液でpH8-9に中和し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥し、真空下で濃縮して、粗モノ-Cbz-TAP（5 g、収率約50％）を得た。この化合物をさらに精製せずにステップBの反応に用いた。
【０１１７】
ステップB：Cbz-TAP-Bocの合成
【化８】
2007530440.tif 000009
Boc2O（3.86 g、17.7 mmol、Boc=tert-ブトキシカルボニル）を激しく撹拌したCbz-TAP（5 g、17.7 mmol）のヘキサン懸濁液（25 ml）に添加した。撹拌を室温で一晩続けた。反応液をDCM（25 ml）で希釈し、10％クエン酸水溶液（2回）、水（2回）およびブライン（brine）で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮した。粗産物（収量 5 g）を直接ステップCの反応に用いた。
【０１１８】
ステップC：Boc-TAPの合成
【化９】
2007530440.tif 000010
ステップBの粗Cbz-TAP-Bocをメタノール（25 ml）に溶解し、5％ Pd存在下、炭素（5％ w/w）で、膨張圧の元で、16時間水素化した。混合液を濾過し、メタノールで洗浄し、その濾液を真空下で濃縮し、粗H-TAP-Boc産物（収量 3.7 g）を得た。
ステップA-C後の全体収量は約44％（用いたCbz-Clの量に基づく計算）である。
【実施例２】
【０１１９】
C-末端をもつペプチドへのスペーサーの結合
下記反応スキームは、スペーサーのC-末端をもつペプチドへの結合の方法を説明している。
【化１０】
2007530440.tif 000011
H-TAP-Bocを実施例１に従って調製した。DCCはN.N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドである。
【実施例３】
【０１２０】
遊離の側鎖の酸をもつペプチドへのスペーサーの結合
下記反応スキームは、スペーサーの遊離の側鎖の酸をもつペプチドへの結合の方法を説明している。
【化１１】
2007530440.tif 000012
TFAはトリフルオロ酢酸である。
【実施例４】
【０１２１】
mPEG-NPCを用いたペプチドのPEG化
【化１２】
2007530440.tif 000013
ここでmPEG-NPCは次の構造を有する：
【化１３】
2007530440.tif 000014
【実施例５】
【０１２２】
mPEG-SPAを用いたペプチドのPEG化
【化１４】
2007530440.tif 000015
ここでmPEG-SPAは次の構造を有する：
【化１５】
2007530440.tif 000016
【実施例６】
【０１２３】
スペーサーの結合とペプチドの合成
下記反応スキームは、スペーサーの固体支持体への結合と該固体支持体上でのペプチドの合成の方法を説明している。
【化１６】
2007530440.tif 000017
【実施例７】
【０１２４】
樹脂に結合したスペーサーをもつペプチドダイマーの合成
ステップA：TentaGelリンカーの合成
【化１７】
2007530440.tif 000018
TentaGelブロミド（2.5 g、0.48 mmol/g、ラップ・ポリマー（Rapp Polymere）社、ドイツから入手）、フェノール系リンカー（5等量）およびK2CO3（5等量）を20 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中で70℃まで14時間加熱した。室温まで冷却後、樹脂を洗浄し（0.1 N HCl、水、アセトニトリル（ACN）DMF、MeOH）、あめ色の樹脂になるまで乾燥させた。
【０１２５】
ステップB：TentaGelリンカー-TAP(Boc)の合成
【化１８】
2007530440.tif 000019
上記ステップAの樹脂2.5 gとH-TAP-Boc（1.5 g、5等量）および氷酢酸（34  μｌ、5等量）をメタノール（MeOH）/テトラヒドロフラン（THF）の1：1の混合液中で合わせ、一晩振盪した。シアノホウ化水素ナトリウム 1 M（5等量）のTHF水溶液を混合液に添加し、さらに7時間振盪した。樹脂を濾過、洗浄（DMF、THF、0.1 N 塩酸、水、MeOH）し、乾燥させた。少量の樹脂をDCM中の塩化ベンジルとジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を用いて洗浄し、70％トリフルオロ酢酸（TFA）-DCMを用いて切断し、LCMSおよびHPLCでチェックした。
【０１２６】
ステップC：TentaGelリンカー-TAP-Lysの合成
【化１９】
2007530440.tif 000020
上記ステップBの樹脂を、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH（Fmoc=9-フルオレニルメトキシカルボニル、5等量のアミノ酸と、0.5 M でDMFに溶解し、続いて10等量のDIEAを添加した、5等量のHATU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)ウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）から調製）の活性化溶液で処理し、緩やかに14時間振盪した。樹脂をその後洗浄（DMF、THF、DCM、MeOH）し、保護樹脂が得られるまで乾燥させた。残留アミン基は、樹脂を10％無水酢酸、DCM中20％ピリジンの溶液で20分間処理し、上述のように洗浄することによりキャップされた。Fmoc基は、樹脂をDMF中30％ピペリジンで20分間緩やかに振盪し、続いて洗浄（DMF、THF、DCM、MeOH）、および乾燥することにより除去した。
【０１２７】
ステップD：TentaGelリンカー-TAP-Lys（ペプチド）2の合成
【化２０】
2007530440.tif 000021
上記ステップCの樹脂をHBTU/HOBｔ活性化を用いたFmoc-アミノ酸カプリングとピペリジンを用いたFmoc除去の繰り返しサイクルにかけ、両方のペプチド鎖を同時に構築した。この反応は、アプライドバイオシステム社から市販されているABI433自動ペプチド合成機で都合よく実施した。最後のFmoc除去後、末端のアミン基をDMF中の無水酢酸（10等量）とDIEA（20等量）を用いて、20分間アシル化し、続いて上記のように洗浄した。
【０１２８】
ステップE：樹脂の切断
【化２１】
2007530440.tif 000022
上記ステップDの樹脂をTFA（82.5％）、フェノール（5％）、エタンジチオール（2.5％）、水（5％）およびチオアニソール（5％）の溶液に3時間室温で懸濁した。あるいは、TFA（95％）、水（2.5％）およびトリイソプロピルシラン（2.5％）等の切断カクテルもまた用いることができる。TFA溶液は5℃まで冷却し、Et2Oを注いでペプチドを沈殿させた。減圧下での濾過と乾燥により、スペーサーを有する所望のペプチドを得た。C18カラムを用いた分取HPLCをかけた精製から、スペーサーを有する純粋ペプチドダイマーを得た。
【０１２９】
ステップF：酸化
還元システイン残基を有する（スペーサーに結合する）ダイマーのペプチドを酸化し、ジスルフィド結合を有するダイマーペプチドを得た。
【化２２】
2007530440.tif 000023
ダイマーペプチドを20％ DMSO/水（1 mgの乾燥重量のペプチド/mL）に溶解し、室温で36時間放置した。反応混合物をC18 HPLCカラム（ウォーターズ デルタ-パック  C18、粒子径15ミクロン、ポアサイズ300オングストローム、40 mm×200 mmの長さ）にロードし、40分にわたるACN/水/0.01％  TFA中の5〜95％ ACNの直線濃度勾配により、ペプチドを精製した。所望のペプチドを含む画分の凍結乾燥により、ふわふわした白色の固体酸物を得た。
【実施例８】
【０１３０】
スペーサー、mPEG-NPCを有するペプチドダイマーのPEG化
【化２３】
2007530440.tif 000024
例えば
【化２４】
2007530440.tif 000025
スペーサーに結合したダイマーペプチドを、等量（モル基準）の活性化PEG類（NOFコーポレーション（日本）製、ネクター・セラピューティクス（Nektar Therapeutics）（米国）（旧シェアウォーター・コーポレーション（Shearewater Corp.））販売のmPEG-NPC）と乾燥DMF中で混合し、透明な溶液を得た。5分後、4等量のDIEAを上記溶液に加えた。混合液を周囲温度で14時間撹拌し、C18逆相HPLCで精製した。PEG化ペプチドの構造をMALDI質量分析法により確認する。
mPEG-NPCは次の構造を有する：
【化２５】
2007530440.tif 000026
【実施例９】
【０１３１】
スペーサー、mPEG-SPAを有するペプチドダイマーのPEG化
【化２６】
2007530440.tif 000027
スペーサーを有するペプチドダイマーのPEG化はまた、mPEG-SPAを用いて実施できる。mPEG-SPAは次の構造を有する。
【化２７】
2007530440.tif 000028
【実施例１０】
【０１３２】
イオン交換による精製
【化２８】
2007530440.tif 000029
実施例８で得られた上記化学式の試料を用いて、ペプチド-スペーサー-PEG結合体の精製に適したイオン交換支持体を同定した。
一般的な手順は次のとおりであった：
イオン交換樹脂（2-3 g）を1 cmカラムに充填し、ナトリウム型への置換（溶出液がpH 14になるまでカラムに0.2 N NaOHを流した）、水素型への置換（溶出液が充填したときのpHになるまで0.1 N HClまたは0.1 M HOAcで溶出した）およびpH 6になるまで25％ ACN/水による洗浄を行った。結合前のペプチドまたはペプチド-PEG結合体のいずれかを25％ ACN/水（10 mg/mL）に溶解し、そのpHをTFAで3より低く調整し、独立の実験としてカラムに充填した。2-3カラム容の25％ ACN/水で洗浄し、5 mL画分に集めた後、ペプチドを25% ACN/水中0.1 M NH4OAcで溶出することによりカラムから遊離させ、再度5 mLフラクションに集めた。HPLC分析により、画分が目的のペプチドを含むことが明らかとなった。蒸発光散乱検出器（ESLD）を用いた解析により、ペプチドがカラムについている場合およびNH4Oac溶液で溶出された場合（通常4〜10画分）、非結合PEGは夾雑物として検出されないことが示された。最初の洗浄緩衝液（通常最初の2画分）中にペプチドが溶出される場合、目的のPEG結合体および過剰のPEGの分離は観察されなかった。
【０１３３】
イオン交換支持体は、ペプチド-PEG結合体と未反応（または加水分解した）PEGとのその分離能ならびに開始ダイマーペプチドの保持能に基づいて選択した。モノS HR 5/5強陽イオン交換プレロードカラム（アマシャム・バイオサイエンシズ）、SE53セルロース微粒子強陽イオン支持体（ワットマン（Whatman））およびSPセファロース  ファーストフロー強陽イオン交換支持体（アマシャム・バイオサイエンシズ）が適切なイオン交換支持体として同定された。
【実施例１１】
【０１３４】
α-アミノ酸に基づく三官能基分子の合成
構造
【化２９】
2007530440.tif 000030
m=1-5、n=1-14、mおよびnは整数であり、
ここでXが
【化３０】
2007530440.tif 000031
である構造を有する分枝三官能基分子を次の反応スキームに従って合成した：
【化３１】
2007530440.tif 000032
m=1-5、n=1-14、mおよびnは整数である。
そのような三官能基分子は同時にリンカーおよびスペーサーとして作用し得る。
【実施例１２】
【０１３５】
3級アミドに基づく三官能基分子の合成
構造
【化３２】
2007530440.tif 000033
m=1-5、n=1-14、mおよびnは整数であり、
ここでXが
【化３３】
2007530440.tif 000034
である構造を有する分枝三官能基分子を次の反応スキームに従って合成した：
【化３４】
2007530440.tif 000035
m=1-5、n=1-14、mおよびnは整数である。
そのような三官能基分子は同時にリンカーおよびスペーサーとして作用できる。
【実施例１３】
【０１３６】
ホモ三官能基分子の合成
構造
【化３５】
2007530440.tif 000036
m=1-2、n=1-6、mおよびnは整数であり、
ここでXが
【化３６】
2007530440.tif 000037
である構造を有する分枝三官能基分子を次の反応スキームに従って合成した：
【化３７】
2007530440.tif 000038
m=1-2、n=1-6、mおよびnは整数である。
そのようなホモ三官能基分子は同時にリンカーおよびスペーサーとして作用できる。
【実施例１４】
【０１３７】
三官能基分子を用いたC-末端ダイマー化およびPEG化
構造
【化３８】
2007530440.tif 000039
を有する三官能基分子を実施例１２に従って作製した。
この三官能基分子を次の反応スキームに従ったC-末端ダイマー化およびPEG化に用いた：
【化３９】
2007530440.tif 000040
【実施例１５】
【０１３８】
三官能基分子を用いたN-末端ダイマー化およびPEG化
以下に従って三官能基分子を作製した：
【化４０】
2007530440.tif 000041
【０１３９】
0℃のDCM 200 mL中、Boc-βAla-OH（10.0 g、52.8 mmol）（Boc=tert-ブトキシカルボニル）とジエチルイミノジアセテート（10.0 g、52.8 mmol）の溶液に、DCC（10.5 g、50.9 mmol）を5分以上かけて加えた。白色沈殿が2分以内に形成された。反応混合物を室温まで温め、24時間撹拌した。尿素を焼結フィルター（中程度の多孔度）で濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物を500 mLのEtOAc（EtOAc=酢酸エチル）に含ませ、上述のように濾過し、分別ロートに移した。有機相を洗浄し（飽和NaHCO3、ブライン、1 N HCl、ブライン）、乾燥（MgSO4）、濾過し、乾燥することにより無色の油を得た。この油を10分以内に固化し、白色の結晶固体を得た。
【０１４０】
【化４１】
2007530440.tif 000042
【０１４１】
粗ジエステルを75 mLのTHF（THF=テトラヒドロフラン）に含ませ、75 mLのMeOH（MeOH=メタノール）および50 mLの水を加えた。この溶液に水25 mL中KOH（KOH=水酸化カリウム）（8.6 g、153 mmol）の溶液を添加した。反応混合物は淡黄色に変化した。12時間の撹拌後（pHは〜12のまま）、有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、得られたスラリーをEt2O（Et2O＝ジエチルエーテル）と飽和NaHCO3に分配した。合わせた水相をpH 1に酸性化し、NaClで飽和し、EtOAcで抽出した。EtOAc相を洗浄し（ブライン）、乾燥し（MgSO4）、濃縮することにより、白色固体の13.97 gの産物を得た（2ステップで90.2％）。
【０１４２】
注：DCC反応をACN中で実施すると収率が73％に低下した。DICを用いると、副産物である尿素は、目的の産物からクロマトグラフィなしでは除去できなかった；DCC尿素はクロマトグラフィなしで定量的に除去できる。反応はまた、水溶性カルボジイミドを用いても十分うまくいく。
【０１４３】
【化４２】
2007530440.tif 000043
【０１４４】
50 mLのACN中の2価酸（1.00 g、3.29 mmol）とヒドロキシスクシンイミド（0.945 g、8.21 mmol）の溶液に、DCC（1.36 g、6.59 mmol）を5分以上かけて添加した。白色沈殿が直ちに形成された。反応混合物を22時間撹拌し、濾過してDCC尿素を除去した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をEtOAc（250 mL）に含ませ、分別ロートに移した。有機相を洗浄し（飽和NaHCO3、ブライン、1 N HCl、ブライン）、乾燥し（MgSO4）、濃縮し、白色固体を得た。この個体を75mLのACNに含ませ、濾過し、濃縮し、1.28gの産物を白色固体として得た（収率78.2％）。
【０１４５】
注：収率はTHFで31％、DMF（DCCに代わりDICを用いた）で68％、DCM/DMFで57％に低下した。開始の2価酸はACNに可溶であり、DCC添加前に溶解しない物質があるならば、濾過し、除去しておくのがよい。
【０１４６】
この三官能基分子を次の反応スキームに従って、N-末端ダイマー化およびPEG化に用いた：
【化４３】
2007530440.tif 000044
【実施例１６】
【０１４７】
mPEG2-リジノール-NPCの合成
市販のリジノールを過剰のmPEG2で処理し、mPEG2-リジノールを形成させる。その後、mPEG2-リジノールを過剰のNPCで処理し、mPEG2-リジノール-NPCを形成させる。
【実施例１７】
【０１４８】
三官能基分子（PEG部分は二つの直鎖状PEG鎖を含有する）を用いたPEG化
構造
【化４４】
2007530440.tif 000045
を有する三官能基分子を実施例１５に従って作製した。
【０１４９】
ステップ1-三官能基リンカーのペプチドモノマーへのカプリング：
リンカーとのカプリングのために、2等量のペプチドを1等量の三官能基リンカーと乾燥DMF中で混合し、透明な溶液を得、2分後に5等量のDIEAを添加する。この混合液を周囲温度で14時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、粗産物をDCM中80％ TFAに溶解してBoc基を除去し、C18逆相HPLCを用いて精製する。ダイマーの構造をエレクトロスプレー質量分析により確認する。このカプリング反応は、それぞれのモノマーのリジン残基のε-アミノ基の窒素原子にリンカーを結合する。
【０１５０】
【化４５】
2007530440.tif 000046
【０１５１】
ステップ4-ペプチドダイマーのPEG化：
カルバメート結合を介したPEG化：
ペプチドダイマーとPEG類（mPEG2-リジノール-NPC）を1：2のモル比で乾燥DMF中で混合し、透明な溶液を得る。5分後、4等量のDIEAを上記溶液に加える。混合液を周囲温度で14時間撹拌し、C18逆相HPLCを用いて精製する。PEG化ペプチドの構造をMALDI質量で確認する。精製ペプチドはまた、以下に概略するように陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にかけれた。
【０１５２】
【化４６】
2007530440.tif 000047
【０１５３】
アミド結合を介したPEG化
ペプチドダイマーとPEG類（mPEG2-Lys-NHS）を1：2のモル比で乾燥DMF中で混合し、透明な溶液を得る。mPEG2-Lys-NHSは例えば、ネクター・セラピューティクス（35806、アラバマ州ハンツビル  ディスカバリードライブ  490）のモレキュラー・エンジニアリング・カタログ（2003）の商品番号2Z3X0T01として市販されている。5分後、10等量のDIEAを上記溶液に加える。混合液を周囲温度で2時間撹拌し、C18逆相HPLCを用いて精製する。PEG化ペプチドの構造をMALDI質量で確認した。精製ペプチドはまた、以下に概略するように陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にかけた。
【０１５４】
【化４７】
2007530440.tif 000048
【０１５５】
本発明は、明細書に記載された特定の実施態様による範囲に限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、発明の各種の改変が前述の記載および後述の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は追加クレームの範囲内にあることを意図している。
【０１５６】
特許、特許出願、プロトコールおよび各種刊行物を含む多くの参考文献が本発明の記載に引用され、議論されている。そのような参考文献の引用および/または議論は、本発明の記載を単に明確にするだけのものであり、そのような参考文献のいずれかが本明細書に記載される発明の「先行文献」であることを承認しているわけではない。本明細書において引用され、議論された全ての参考文献はその全体を参照して、およびそれぞれの参考文献が個々に参照して取り込まれるかのような程度まで、取り込まれる。
【国際調査報告】
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