(57)【要約】本発明は、表面に骨組織形成増進ペプチドが固定されている骨移植材及び組織工学用支持体に係り、より具体的には、細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドが表面に固定されている骨移植材及び組織工学用支持体に関する。本発明の骨移植材及び組織工学用支持体は、表面に付着している骨組織形成増進ペプチドによって、再生に関連した細胞の移行、増殖及び分化を促進して最終的に組織再生力を極大化させることができる。また、表面に固定されているペプチドは、分子量が少なくて体内への適用の際に免疫反応の危険が少なく、体内で安定な形で存在することができて薬効の持続化が可能であり、歯周組織再生手術、歯槽骨再生手術及びその他の骨組織再生手術の際に容易であって手術便宜性に優れるうえ、高い治療効果を期待することができる。【選択図】図５
2007530099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドが表面に固定されている骨移植材。
【請求項２】
前記細胞付着誘導ペプチドはＲＧＤのアミノ酸配列を持つペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の骨移植材。
【請求項３】
前記細胞付着誘導ペプチドは配列番号１（ＣＧＧＲＧＤＳ）または配列番号２（ＣＧＧＶＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）のアミノ酸配列を持つペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の骨移植材。
【請求項４】
前記組織生長因子由来のペプチドは、（ａ）骨形成蛋白質(bone morphogenetic protein、ＢＭＰ)−２，４及び６のアミノ酸配列のうち、それぞれ２〜１８位置のアミノ酸配列［ＢＭＰ−２の場合（配列番号３）、ＢＭＰ−４の場合（配列番号４）及びＢＭＰ−６の場合（配列番号５）］；ＢＭＰ−２の１６〜３４位置のアミノ酸配列（配列番号６）、４７〜７１位置のアミノ酸配列（配列番号７）、７３〜９２位置のアミノ酸配列（配列番号８）、８８〜１０５位置のアミノ酸配列（配列番号９）、２８３〜３０２位置のアミノ酸配列（配列番号１０）、３３５〜３５３位置のアミノ酸配列（配列番号１１）及び３７０〜３９０位置のアミノ酸配列（配列番号１２）；ＢＭＰ−４の７４〜９３位置のアミノ酸配列（配列番号１３）、２９３〜３１３位置のアミノ酸配列（配列番号１４）、３６０〜３７９位置のアミノ酸配列（配列番号１５）及び３８２〜４０２位置のアミノ酸配列（配列番号１６）；ＢＭＰ−６の９１〜１１０位置のアミノ酸配列（配列番号１７）、３９７〜４１８位置のアミノ酸配列（配列番号１８）、４７２〜４９０位置のアミノ酸配列（配列番号１９）及び４８７〜５１０位置のアミノ酸配列（配列番号２０）；及びＢＭＰ−７の９８〜１１７位置のアミノ酸配列（配列番号２１）、３２０〜３４０位置のアミノ酸配列（配列番号２２）、３９０〜４０９位置のアミノ酸配列（配列番号２３）及び４０５〜４２３位置のアミノ酸配列（配列番号２４）；
（ｂ）骨シアロ蛋白(bone sialoprotein)の６２〜６９位置のアミノ酸配列（配列番号２５）、１３９〜１４８位置のアミノ酸配列（配列番号２６）、２５９〜２７７位置のアミノ酸配列（配列番号２７）、１９９〜２０４位置のアミノ酸配列（配列番号２８）、１５１〜１５８位置のアミノ酸配列（配列番号２９）、２７５〜２９１位置のアミノ酸配列（配列番号３０）、２０〜２８位置のアミノ酸配列（配列番号３１）、６５〜９０位置のアミノ酸配列（配列番号３２）、１５０〜１７０位置のアミノ酸配列（配列番号３３）及び２８０〜２９０位置のアミノ酸配列（配列番号３４）；
（ｃ）形質転換成長因子(transforming growth factor)の２４２〜２５０位置のアミノ酸配列（配列番号３５）、２７９〜２９９位置のアミノ酸配列（配列番号３６）及び３４３〜３６１位置のアミノ酸配列（配列番号３７）；
（ｄ）血素板由来成長因子の１００〜１２０位置のアミノ酸配列（配列番号３８）及び１２１〜１４０位置のアミノ酸配列（配列番号３９）；
（ｅ）酸性線維芽細胞成長因子(acidic fibroblast growth factor)の２３〜３１位置のアミノ酸配列（配列番号４０）及び９７〜１０５位置のアミノ酸配列（配列番号４１）；
（ｆ）塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor)の１６〜２７位置のアミノ酸配列（配列番号４２）、３７〜４２位置のアミノ酸配列（配列番号４３）、７８〜８４位置のアミノ酸配列（配列番号４４）及び１０７〜１１２位置のアミノ酸配列（配列番号４５）；
（ｇ）ＤＳＰ(dentin  sialoprotein)の２５５〜２７５位置のアミノ酸配列（配列番号４６）、４７５〜４９４位置のアミノ酸配列（配列番号４７）及び５５１〜５７３位置のアミノ酸配列（配列番号４８）；
（ｈ）ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子(heparin binding EGF-like growth factor)の６３〜８３位置のアミノ酸配列（配列番号４９）、８４〜１０３位置のアミノ酸配列（配列番号５０）、１０４〜１１６位置のアミノ酸配列（配列番号５１）及び１２１〜１４０位置のアミノ酸配列（配列番号５２）；
（ｉ） ＣＥＬＳＲ３（cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3）の３２６〜３５０位置のアミノ酸配列（配列番号５３）、３５１〜３７１位置のアミノ酸配列（配列番号５４）、３７２〜４００位置のアミノ酸配列（配列番号５５）、４０１〜４２３位置のアミノ酸配列（配列番号５６）、４３４−５４５位置のアミノ酸配列（配列番号５７）、５４６〜６５１位置のアミノ酸配列（配列番号５８）、１３７５〜１４３３位置のアミノ酸配列（配列番号５９）、１４３５〜１４７１位置のアミノ酸配列（配列番号６０）、１４７５〜１５１４位置のアミノ酸配列（配列番号６１）、１５１５〜１７１９位置のアミノ酸配列（配列番号６２）、１７６４〜１９４４位置のアミノ酸配列（配列番号６３）及び２０９６〜２５２９位置のアミノ酸配列（配列番号６４）；及び
（ｊ）骨芽細胞特異カドヘリン（OB-cadherin)の５４〜１５９位置のアミノ酸配列（配列番号６５）、１６０〜２６８位置のアミノ酸配列（配列番号６６）、２６９〜３８３位置のアミノ酸配列（配列番号６７）、３８４〜４８６位置のアミノ酸配列（配列番号６８）及び４８７〜６１２位置のアミノ酸配列（配列番号６９）よりなる群から選択された少なくとも一つのペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の骨移植材。
【請求項５】
前記組織成長因子由来のペプチドは、Ｎ末端に、システインが付加されていることを特徴とする請求項４に記載の骨移植材。
【請求項６】
前記システインはＣＧＧスペーサ形態で付加されていることを特徴とする請求項５に記載の骨移植材。
【請求項７】
前記骨移植材が自家骨、牛骨及び豚骨から起因した生物由来骨ミネラル粉末及び多孔性ブロック、合成水酸化アパタイト粉末及び多孔性ブロック、リン酸三カルシウム粉末及び多孔性ブロック、リン酸一カルシウム粉末及び多孔性ブロック、二酸化珪素（シリカ）からなる骨移植材、シリカと高分子との混合体よりなる骨充填移植材、キトサン、ポリ乳酸を含む生体適合性高分子からなる微粒子及び多孔性支持体、チタニウム及び３次元的多孔性支持体よりなる群から選択された一つであることを特徴とする請求項１乃至請求項６の中何れか一項に記載の骨移植材。
【請求項８】
前記骨移植材の表面は架橋剤が結合されていることを特徴とする請求項１に記載の骨移植材。
【請求項９】
前記架橋剤は、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭ［ＰＥＯ］４）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロアート］（ＳＭＣＣ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＰ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、スクシニミジル［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）よりなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする 請求項８に記載の骨移植材。
【請求項１０】
細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドが表面に固定されている 組織工学用支持体。
【請求項１１】
前記細胞付着誘導ペプチドはＲＧＤのアミノ酸配列を持つペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の組織工学用支持体。
【請求項１２】
前記細胞付着誘導ペプチドは配列番号１（ＣＧＧＲＧＤＳ）または配列番号２（ＣＧＧＶＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）のアミノ酸配列を持つペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の組織工学用支持体。
【請求項１３】
前記組織生長因子由来のペプチドは、（ａ）骨形成蛋白質(bone morphogenetic protein、ＢＭＰ)−２，４及び６のアミノ酸配列のうち、それぞれ２〜１８位置のアミノ酸配列［ＢＭＰ−２の場合（配列番号３）、ＢＭＰ−４の場合（配列番号４）及びＢＭＰ−６の場合（配列番号５）］；ＢＭＰ−２の１６〜３４位置のアミノ酸配列（配列番号６）、４７〜７１位置のアミノ酸配列（配列番号７）、７３〜９２位置のアミノ酸配列（配列番号８）、８８〜１０５位置のアミノ酸配列（配列番号９）、２８３〜３０２位置のアミノ酸配列（配列番号１０）、３３５〜３５３位置のアミノ酸配列（配列番号１１）及び３７０〜３９０位置のアミノ酸配列（配列番号１２）；ＢＭＰ−４の７４〜９３位置のアミノ酸配列（配列番号１３）、２９３〜３１３位置のアミノ酸配列（配列番号１４）、３６０〜３７９位置のアミノ酸配列（配列番号１５）及び３８２〜４０２位置のアミノ酸配列（配列番号１６）；ＢＭＰ−６の９１〜１１０位置のアミノ酸配列（配列番号１７）、３９７〜４１８位置のアミノ酸配列（配列番号１８）、４７２〜４９０位置のアミノ酸配列（配列番号１９）及び４８７〜５１０位置のアミノ酸配列（配列番号２０）；及びＢＭＰ−７の９８〜１１７位置のアミノ酸配列（配列番号２１）、３２０〜３４０位置のアミノ酸配列（配列番号２２）、３９０〜４０９位置のアミノ酸配列（配列番号２３）及び４０５〜４２３位置のアミノ酸配列（配列番号２４）；
（ｂ）骨シアロ蛋白(bone sialoprotein)の６２〜６９位置のアミノ酸配列（配列番号２５）、１３９〜１４８位置のアミノ酸配列（配列番号２６）、２５９〜２７７位置のアミノ酸配列（配列番号２７）、１９９〜２０４位置のアミノ酸配列（配列番号２８）、１５１〜１５８位置のアミノ酸配列（配列番号２９）、２７５〜２９１位置のアミノ酸配列（配列番号３０）、２０〜２８位置のアミノ酸配列（配列番号３１）、６５〜９０位置のアミノ酸配列（配列番号３２）、１５０〜１７０位置のアミノ酸配列（配列番号３３）及び２８０〜２９０位置のアミノ酸配列（配列番号３４）；
（ｃ）形質転換成長因子(transforming growth factor)の２４２〜２５０位置のアミノ酸配列（配列番号３５）、２７９〜２９９位置のアミノ酸配列（配列番号３６）及び３４３〜３６１位置のアミノ酸配列（配列番号３７）；
（ｄ）血素板由来成長因子の１００〜１２０位置のアミノ酸配列（配列番号３８）及び１２１〜１４０位置のアミノ酸配列（配列番号３９）；
（ｅ）酸性線維芽細胞成長因子(acidic fibroblast growth factor)の２３〜３１位置のアミノ酸配列（配列番号４０）及び９７〜１０５位置のアミノ酸配列（配列番号４１）；
（ｆ）塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor)の１６〜２７位置のアミノ酸配列（配列番号４２）、３７〜４２位置のアミノ酸配列（配列番号４３）、７８〜８４位置のアミノ酸配列（配列番号４４）及び１０７〜１１２位置のアミノ酸配列（配列番号４５）；
（ｇ）ＤＳＰ(dentin  sialoprotein)の２５５〜２７５位置のアミノ酸配列（配列番号４６）、４７５〜４９４位置のアミノ酸配列（配列番号４７）及び５５１〜５７３位置のアミノ酸配列（配列番号４８）；
（ｈ）ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子(heparin binding EGF-like growth factor)の６３〜８３位置のアミノ酸配列（配列番号４９）、８４〜１０３位置のアミノ酸配列（配列番号５０）、１０４〜１１６位置のアミノ酸配列（配列番号５１）及び１２１〜１４０位置のアミノ酸配列（配列番号５２）；
（ｉ）ＣＥＬＳＲ３（cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3）の３２６〜３５０位置のアミノ酸配列（配列番号５３）、３５１〜３７１位置のアミノ酸配列（配列番号５４）、３７２〜４００位置のアミノ酸配列（配列番号５５）、４０１〜４２３位置のアミノ酸配列（配列番号５６）、４３４−５４５位置のアミノ酸配列（配列番号５７）、５４６〜６５１位置のアミノ酸配列（配列番号５８）、１３７５〜１４３３位置のアミノ酸配列（配列番号５９）、１４３５〜１４７１位置のアミノ酸配列（配列番号６０）、１４７５〜１５１４位置のアミノ酸配列（配列番号６１）、１５１５〜１７１９位置のアミノ酸配列（配列番号６２）、１７６４〜１９４４位置のアミノ酸配列（配列番号６３）及び２０９６〜２５２９位置のアミノ酸配列（配列番号６４）；及び
（ｊ）骨芽細胞特異カドヘリン（OB-cadherin)の５４〜１５９位置のアミノ酸配列（配列番号６５）、１６０〜２６８位置のアミノ酸配列（配列番号６６）、２６９〜３８３位置のアミノ酸配列（配列番号６７）、３８４〜４８６位置のアミノ酸配列（配列番号６８）及び４８７〜６１２位置のアミノ酸配列（配列番号６９）よりなる群から選択された少なくとも一つのペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の組織工学用支持体。
【請求項１４】
前記組織成長因子由来のペプチドはＮ末端に、システインが付加されていることを特徴とする請求項１３に記載の組織工学用支持体。
【請求項１５】
前記システインはＣＧＧスペーサ形態で付加されていることを特徴とする請求項１４に記載の組織工学用支持体。
【請求項１６】
前記骨移植材が自家骨、牛骨及び豚骨から起因した生物由来骨ミネラル粉末及び多孔性ブロック、合成水酸化アパタイト粉末及び多孔性ブロック、リン酸三カルシウム粉末及び多孔性ブロック、リン酸一カルシウム粉末及び多孔性ブロック、二酸化珪素（シリカ）からなる骨移植材、シリカと高分子との混合体よりなる骨充填移植材、キトサン、ポリ乳酸を含む生体適合性高分子からなる微粒子及び多孔性支持体、チタニウム及び３次元的多孔性支持体よりなる群から選択された一つであることを特徴とする請求項１０乃至請求項１５の中何れか一項に記載の組織工学用支持体。
【請求項１７】
前記組織工学用支持体は遮蔽膜或いはインプラントであることを特徴とする請求項１０に記載の組織工学用支持体。
【請求項１８】
前記遮蔽膜は多孔性ポリ乳酸遮蔽膜、キチン或いはキトサンのナノ繊維から製造された再生膜、またはキチン或いはキトサンのフィルム状の遮蔽膜であることを特徴とする請求項１７に記載の組織工学用支持体。
【請求項１９】
前記インプラントは、チタニウムインプラントであることを特徴とする請求項１７に記載の組織工学用支持体。
【請求項２０】
前記インプラントの表面は、活性ペプチドの付着が容易となるように酸化及び窒素化されていることを特徴とする請求項１７に記載の組織工学用支持体。
【請求項２１】
前記組織工学用支持体の表面は架橋剤が結合されていることを特徴とする請求項１０に記載の 組織工学用支持体。
【請求項２２】
前記架橋剤は、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭ［ＰＥＯ］４）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロアート］（ＳＭＣＣ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＰ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、スクシニミジル［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）よりなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする 請求項２１に記載の組織工学用支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面に骨組織形成促進ペプチドが固定されている骨移植材及び組織工学用支持体に係り、より具体的には、細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドが表面に固定されている骨移植材及び組織工学用支持体（以下、支持体）に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯を支える歯周組織は、大きく歯槽骨、歯槽骨と歯間の歯根膜を構成する歯周靱帯組織、上皮組織、及び結締組織からなる。歯周炎の進行による歯槽骨の消失は歯周靱帯組織の喪失を伴うが、歯周炎治療後の消失組織部位では、結締組織の過多生長により歯槽骨と歯周靱帯組織の正常的な回復が不可能になる。また、新しい骨が生成されても、歯周靱帯組織が正常的に分化しないため、歯の機能喪失を誘発するおそれがある。
【０００３】
したがって、かかる問題を解決するために、歯槽骨再生術により自己骨移植術(autografting)と共に人為的な遮蔽膜を用いて完全な組織の再生または新形成を誘導しようとする試みが盛んに行われている。また、骨組織の再生のために、骨移植材として組織工学的培養支持体も活用されている。最近、１０余年間に骨移植材及び支持体の導入によって効果的に歯周組織及び骨組織の再生を誘導した事例(Camelo, M. et. al, International J. Periodont. Restorative Dent. 21:109, 2001)が報告されて以来、牛骨からなる骨粉末粒子を含んで多様な素材が骨移植材及び組織再生目的の組織工学用支持体として活用されてきた。
【０００４】
一方、このような骨移植材及び支持体の再生効率を向上させるために、骨移植材及び支持体に、組織の再生を向上させることが可能な物質を付着させる研究が行われている。特に、細胞外基質(extracellular matrix)または特定の組織成長因子は、生体内で組織の損傷を修復し再生させる能力が卓越したものと報告されており、実際臨床においてもこれらの優れた組織再生力が多数の結果から確認されたことがある。
【０００５】
ところが、これら大部分の細胞外基質及び成長因子は、相対的に高価であり、分子量が数十ｋＤａに至る高分子量の生体内では不安定であって活性が低下するという欠点が指摘されてきた。特に、体内で数分以内に消失してしまうので、所望の治療効果を得るためには大容量を投与しなければならない点と共に、これによる副作用の誘発が欠点として指摘されてきた。
【０００６】
最近、骨再生術式に活用される骨移植材及び組織工学技術(tissue engineering)に活用される高分子支持体(scaffold)に前記組織成長因子を含有させて徐放することにより、単純適用による欠点を軽減しようとする試みが行われてきて、ある程度その効果も立証された。しかし、これらの骨移植材または支持体自体によっては、組織成長因子が物理的に混合されている状態として初期適用の際に速放(burst release)が起こって治療期間中に有効濃度の維持が難しいという欠点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、かかる従来の技術の問題点を解決するために鋭意努力した結果、組織再生効果を得ることが可能な組織成長因子及び細胞外基質蛋白質の活性部位ペプチドが表面に付着している骨移植材及び支持体が、低濃度のペプチドを付着させても安定的且つ持続的な薬理効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の目的は、低濃度の細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドの用量でも、所望の組織再生効果を得ることが可能な骨移植材及び組織工学用支持体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドが表面に固定されている骨移植材及び組織工学用支持体を提供する。
【００１０】
すなわち、本発明は、薬理活性を持つ細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドを骨組織再生用骨移植材及び組織工学用支持体の表面に固定させることにより、薬理活性を持たせて骨組織及びその他の組織再生効率を増加させることが可能な骨移植材及び支持体を提供する。
【００１１】
前記細胞付着誘導ペプチドまたは組織成長因子由来ペプチドは、生理活性サイトカイン(cytokine)から活性部位のアミノ酸配列を分離抽出したもので、抽出後に化学的な修飾を経て活性構造を維持するようにした。
【００１２】
具体的に、前記細胞付着誘導ペプチドは、一般に使用されるＲＧＤのアミノ酸配列を持つペプチドを使用することが好ましく、さらに好ましくはＣＧＧＲＧＤＳ（配列番号１）または前記ＲＧＤのアミノ酸配列を構造的に安定に維持するために考案されたＣＧＧＶＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号２）のペプチドを使用する。
【００１３】
また、前記組織成長因子由来ペプチドは、組織成長因子の活性領域から由来したものを同定して化学的に合成したものを使用するが、具体的に、（ａ）骨形成蛋白質(bone morphogenetic protein、ＢＭＰ)−２，４及び６のアミノ酸配列のうち、それぞれ２〜１８位置のアミノ酸配列［ＢＭＰ−２の場合（配列番号３）、ＢＭＰ−４の場合（配列番号４）及びＢＭＰ−６の場合（配列番号５）］；ＢＭＰ−２の１６〜３４位置のアミノ酸配列（配列番号６）、４７〜７１位置のアミノ酸配列（配列番号７）、７３〜９２位置のアミノ酸配列（配列番号８）、８８〜１０５位置のアミノ酸配列（配列番号９）、２８３〜３０２位置のアミノ酸配列（配列番号１０）、３３５〜３５３位置のアミノ酸配列（配列番号１１）及び３７０〜３９０位置のアミノ酸配列（配列番号１２）；ＢＭＰ−４の７４〜９３位置のアミノ酸配列（配列番号１３）、２９３〜３１３位置のアミノ酸配列（配列番号１４）、３６０〜３７９位置のアミノ酸配列（配列番号１５）及び３８２〜４０２位置のアミノ酸配列（配列番号１６）；ＢＭＰ−６の９１〜１１０位置のアミノ酸配列（配列番号１７）、３９７〜４１８位置のアミノ酸配列（配列番号１８）、４７２〜４９０位置のアミノ酸配列（配列番号１９）及び４８７〜５１０位置のアミノ酸配列（配列番号２０）；並びにＢＭＰ−７の９８〜１１７位置のアミノ酸配列（配列番号２１）、３２０〜３４０位置のアミノ酸配列（配列番号２２）、３９０〜４０９位置のアミノ酸配列（配列番号２３）及び４０５〜４２３位置のアミノ酸配列（配列番号２４）；
【００１４】
（ｂ）骨シアロ蛋白(bone sialoprotein)の６２〜６９位置のアミノ酸配列（配列番号２５）、１３９〜１４８位置のアミノ酸配列（配列番号２６）、２５９〜２７７位置のアミノ酸配列（配列番号２７）、１９９〜２０４位置のアミノ酸配列（配列番号２８）、１５１〜１５８位置のアミノ酸配列（配列番号２９）、２７５〜２９１位置のアミノ酸配列（配列番号３０）、２０〜２８位置のアミノ酸配列（配列番号３１）、６５〜９０位置のアミノ酸配列（配列番号３２）、１５０〜１７０位置のアミノ酸配列（配列番号３３）及び２８０〜２９０位置のアミノ酸配列（配列番号３４）；
【００１５】
（ｃ）形質転換成長因子(transforming growth factor)の２４２〜２５０位置のアミノ酸配列（配列番号３５）、２７９〜２９９位置のアミノ酸配列（配列番号３６）及び３４３〜３６１位置のアミノ酸配列（配列番号３７）；
【００１６】
（ｄ）血素板由来成長因子の１００〜１２０位置のアミノ酸配列（配列番号３８）及び１２１〜１４０位置のアミノ酸配列（配列番号３９）；
【００１７】
（ｅ）酸性線維芽細胞成長因子(acidic fibroblast growth factor)の２３〜３１位置のアミノ酸配列（配列番号４０）及び９７〜１０５位置のアミノ酸配列（配列番号４１）；
【００１８】
（ｆ）塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor)の１６〜２７位置のアミノ酸配列（配列番号４２）、３７〜４２位置のアミノ酸配列（配列番号４３）、７８〜８４位置のアミノ酸配列（配列番号４４）及び１０７〜１１２位置のアミノ酸配列（配列番号４５）；
【００１９】
（ｇ）ＤＳＰ(dentin  sialoprotein)の２５５〜２７５位置のアミノ酸配列（配列番号４６）、４７５〜４９４位置のアミノ酸配列（配列番号４７）及び５５１〜５７３位置のアミノ酸配列（配列番号４８）；
【００２０】
（ｈ）ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子(heparin binding EGF-like growth factor)の６３〜８３位置のアミノ酸配列（配列番号４９）、８４〜１０３位置のアミノ酸配列（配列番号５０）、１０４〜１１６位置のアミノ酸配列（配列番号５１）及び１２１〜１４０位置のアミノ酸配列（配列番号５２）；
【００２１】
（ｉ）ＣＥＬＳＲ３（cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3）の３２６〜３５０位置のアミノ酸配列（配列番号５３）、３５１〜３７１位置のアミノ酸配列（配列番号５４）、３７２〜４００位置のアミノ酸配列（配列番号５５）、４０１〜４２３位置のアミノ酸配列（配列番号５６）、４３４−５４５位置のアミノ酸配列（配列番号５７）、５４６〜６５１位置のアミノ酸配列（配列番号５８）、１３７５〜１４３３位置のアミノ酸配列（配列番号５９）、１４３５〜１４７１位置のアミノ酸配列（配列番号６０）、１４７５〜１５１４位置のアミノ酸配列（配列番号６１）、１５１５〜１７１９位置のアミノ酸配列（配列番号６２）、１７６４〜１９４４位置のアミノ酸配列（配列番号６３）及び２０９６〜２５２９位置のアミノ酸配列（配列番号６４）；並びに
【００２２】
（ｊ）骨芽細胞特異カドヘリン（OB-cadherin)の５４〜１５９位置のアミノ酸配列（配列番号６５）、１６０〜２６８位置のアミノ酸配列（配列番号６６）、２６９〜３８３位置のアミノ酸配列（配列番号６７）、３８４〜４８６位置のアミノ酸配列（配列番号６８）及び４８７〜６１２位置のアミノ酸配列（配列番号６９）よりなる群から選択された少なくとも一つを使用することが好ましい。前記ペプチドは、Ｎ末端に、システイン及び２分子のグリシンからなるスペーサ（ＣＧＧ−）を付加し、化学的に骨移植材及び支持体への固定を容易にすることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明に係る活性ペプチドは、活性ペプチドは、全体組織成長因子のアミノ酸配列のうち１０〜２０個単位のアミノ酸配列をそれぞれ合成し、これらを用いて細胞接着力実験を行って最高の活性のアミノ酸配列を選択し、これらアミノ酸配列の末端にさらに化学的な修飾を加えた後、骨移植材及び支持体への固定が容易となるように考案したものである。これにより、骨移植材は、表面に最小単位のアミノ酸配列のみで活性を維持すると同時に、組織成長因子の物理的な含入及び塗布に伴う薬の損失及び副作用を減らすことができるため、治療効果に付加的な利点を提供することができる。
【００２４】
本発明で使用可能な骨移植材及び支持体には、当該分野で使用する全ての種類及び形態の骨移植材及び高分子支持体を使用することができ、好ましくは自家骨、牛骨及び豚骨から起因した生物由来骨ミネラル粉末及び多孔性ブロック、合成水酸化アパタイト粉末及び多孔性ブロック、リン酸三カルシウム粉末及び多孔性ブロック、リン酸一カルシウム粉末及び多孔性ブロック、二酸化珪素（シリカ）からなる骨移植材、シリカと高分子との混合体よりなる骨充填移植材、キトサン、ポリ乳酸を含む生体適合性高分子からなる微粒子及び多孔性支持体、チタニウム及び３次元的多孔性支持体などがある。この際、前記骨移植材及び支持体の表面は、活性ペプチドの付着が容易となるように改質することが好ましい。本発明に係る組織工学用支持体は、歯槽骨の再生に用いられる遮蔽膜や、歯のインプラントなどを含む。
【００２５】
前記遮蔽膜は、多孔性ポリ乳酸遮蔽膜、キチン或いはキトサンのナノ繊維から製造された再生膜、またはキチン或いはキトサンのフィルム状の遮蔽膜を使用することが好ましいが、これに局限されるものではない。また、インプラントは、チタニウムインプラントを使用することが好ましいが、これに局限されるものではない。この際、インプラントの表面は、活性ペプチドの付着が容易となるように酸化及び窒素化によって改質することがさらに好ましい。
【００２６】
本発明に係るペプチドは、組織成長因子自体より体内酵素反応に敏感にならず、体内免疫原性も低いので、ペプチドを組織再生用骨移植材、支持体、遮蔽膜またはインプラントの表面に固定して術式に利用する場合、所望する濃度の活性ペプチドが局所に存在しながら活性を示して治療効果を増加させることができるため、骨組織及び歯周組織の再生治療に適した特徴を持つ。
【００２７】
本発明に係るＮ末端に自由アミノ基またはシステインを持っているペプチドは、架橋剤による骨移植材及び支持体の表面への固定が容易である。本発明に適した架橋剤としては、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭ［ＰＥＯ］４）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロアート］（ＳＭＣＣ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＰ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、スクシニミジル［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）及びそのスルホン化塩（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）などがあるが、これらに局限されるものではない。
【００２８】
また、前記ペプチドを骨移植材及び支持体の表面に化学的に結合させ、表面にｃｍ２当り０．１〜１０ｍｇが固定されるようにすることが好ましく、さらに好ましくはこれらのペプチドを骨移植材及び支持体の表面単位ｃｍ２当り１〜５ｍｇを固定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されてはならないことは当業界における通常の知識を有する者には自明なことであろう。
【００３０】
実施例１：牛骨由来骨ミネラル粒子への細胞付着性ＲＧＤペプチドの固定
牛骨由来骨ミネラル粒子をエタノールで減圧洗浄した後、１００℃、真空オーブンで２０時間静置して表面の不純物を除去した。骨ミネラル粒子の表面を、ヘキサンに溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシラン(3-aminopropyl ethoxysilane、ＡＰＴＥＳ)で処理した後、洗浄した。これにより表面にアミン残基が形成され、ここに架橋剤ＢＭＢを添加して結合させた。さらに、架橋剤が結合した骨ミネラル粒子を、ＲＧＤを持つ配列番号１と配列番号２のペプチドと１２時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されている骨ミネラル粒子を得た。
【００３１】
実施例２：合成水酸化アパタイト及びリン酸三カルシウムへの細胞付着性ＲＧＤペプチドの固定
合成水酸化アパタイト及びリン酸三カルシウム骨移植材の粉末をエタノールで減圧洗浄した後、１００℃、真空オーブンで２０時間静置して表面の不純物を除去した。粒子表面をヘキサンに溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyl ethoxysilane、ＡＰＴＥＳ）で処理した後、洗浄した。これにより表面にアミン残基が形成され、ここに架橋剤ＢＭＢを添加して結合させた。架橋剤が結合した骨移植材粒子を配列番号１と配列番号２のペプチドと１２時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されている骨ミネラル粒子を得た。
【００３２】
実施例３：キトサン骨移植材への細胞付着性ＲＧＤペプチドの固定
粉末状或いは多孔性支持体の形で製造されたキトサン骨移植材を２ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に加えて表面を水和させた後、ここに架橋剤としてＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを５ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、２時間攪拌してキトサン骨移植材の表面に反応基(functional group)を導入した。２時間の常温反応後、キトサン骨移植材を洗浄し、ここに、配列番号１のペプチド１０ｍｇを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されているキトサン骨移植材を製造した。
【００３３】
実施例４：ポリ乳酸骨移植材への細胞付着性ＲＧＤペプチドの固定
ポリ乳酸移植用粉末または多孔性支持体をリン酸緩衝液（ｐＨ４．７）に加えて表面を水和させた後、２０ｍｇ／ｍＬの塩酸シスタミン溶液と反応させた。ここに架橋剤としてＥＤＣを滴加して骨移植材の表面のカルボン酸を活性化させた。２４時間反応させ、洗浄した後、３０ｍｇ／ｍＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液１ｍＬを加えてさらに２４時間反応し、ポリ乳酸の表面にスルフヒドリル基が導入されるようにした。前記改質されたポリ乳酸骨移植材を細胞付着性ＲＧＤペプチド（配列番号１）と混合すると、骨移植材のスルフヒドリル基とペプチドとの間にＳ−Ｓ結合を誘導してペプチドを固定した。
【００３４】
実施例５：骨ミネラル粒子への組織成長因子由来ペプチドの固定
本実施例で使用した組織成長因子由来ペプチドは、骨形成蛋白質（ＢＭＰ−２）の細胞付着及び活性ドメインを含有するペプチドである配列番号３及び配列番号６〜９のアミノ酸配列のＮ末端部位にシステインを持つようにＣＧＧ−スペーサを付加して化学的に合成されたペプチドを使用した。
【００３５】
牛骨由来骨ミネラル粒子をエタノールで減圧洗浄した後、１００℃、真空オーブンで２０時間静置して表面の不純物を除去した。骨ミネラル粒子の表面を、ヘキサンに溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で処理した後、洗浄した。これにより粒子の表面にアミン残基が形成され、ここに架橋剤としてＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを５ｍｇ／ｍＬの濃度で加えて２時間攪拌し、骨移植材の表面に反応基を導入した。２時間の常温反応後、骨移植材を洗浄し、ここに、前記ペプチド１０ｍｇを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されている骨ミネラル粒子を得た。
【００３６】
実施例６：合成骨移植材粒子への組織成長因子由来ペプチドの固定
本実施例では、組織成長因子由来のペプチドとして、実施例５で使用したペプチドと同一のペプチドを使用した。
【００３７】
合成骨移植材としては、合成水酸化アパタイト及びリン酸三カルシウムミネラルを使用し、骨移植材粒子をエタノールで減圧洗浄した後、１００℃、真空オーブンで２０時間保管して表面の不純物を除去した。粒子の表面を、ヘキサンに溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理した後、洗浄した。これにより表面にアミン残基が形成され、ここに架橋剤として５ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを加えて２時間攪拌し、骨移植材の表面に反応基(functional group)を導入した。２時間の常温反応後、骨移植材を洗浄し、ここに、前記ペプチド１０ｍｇを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、組織成長因子由来ペプチドが固定されている骨移植材粒子を得た。
【００３８】
実施例７：キトサン骨移植材及び支持体への組織成長因子由来ペプチドの固定
キトサンからなる骨移植材及び組織再生用支持体を２ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に加えて表面を水和させた後、ここに架橋剤としてＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを５ｍｇ／ｍＬの濃度で加えて２時間攪拌し、キトサン骨移植材の表面に反応基を導入した。２時間の常温反応後、キトサン骨移植材を洗浄し、ここに、実施例５で使用した組織成長因子由来ペプチドと同一のペプチド１０ｍｇを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されているキトサン骨移植材及び支持体を製造した。
【００３９】
実施例８：ポリ乳酸骨移植材及び支持体への組織成長因子由来ペプチドの固定
ポリ乳酸移植用粉末または多孔性支持体をリン酸緩衝液（ｐＨ４．７）に加えて表面を水和させた後、２０ｍｇ／ｍＬの塩酸シスタミン溶液と反応させた。ここに、架橋剤としてＥＤＣを滴加してポリ乳酸骨移植材の表面のカルボン酸を活性化させた。２４時間反応してから洗浄した後、１ｍＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を加えてさらに２４時間反応し、ポリ乳酸の表面にスルフヒドリル基が導入されるようにした。前記骨移植材は、前記組織成長因子由来ペプチドである配列番号８のアミノ酸配列にＣＧＧスペーサが結合しているペプチドと混合し、骨移植材とペプチド間のＳ−Ｓの結合を自発的に誘導させてペプチドを固定した。
【００４０】
実施例９：骨ミネラル粒子への骨シアロ蛋白由来ペプチドの固定
本実施例で使用した骨シアロ蛋白由来ペプチドは、石灰化誘導活性ドメイン構造を含むペプチドである配列番号１５のペプチド、及び細胞付着機能部位を含むペプチドである配列番号２７のペプチドを化学的に合成したものを使用した。
【００４１】
牛骨由来骨ミネラル粒子をエタノールで減圧洗浄した後、１００℃、真空オーブンで２０時間静置して表面の不純物を除去した。骨ミネラル粒子の表面を、ヘキサンに溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理した後、洗浄した。これにより表面にアミン残基が形成され、ここに架橋剤として５ｍｇ／ｍＬ濃度のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを加えて２時間攪拌し、骨移植材の表面に反応基を導入した。反応済みの骨移植材を洗浄し、ここに、前記骨シアロ蛋白(bone sialoprotein)由来ペプチド１０ｍｇを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されている骨ミネラル粒子を得た。
【００４２】
実施例１０：合成骨移植材粒子への骨シアロ蛋白由来ペプチドの固定
本実施例では、実施例９で使用したペプチドと同一のペプチドを使用した。
【００４３】
水酸化アパタイト及リン酸三カルシウムミネラル粒子をエタノールで減圧洗浄した後、１００℃、真空オーブンで２０時間静置して表面の不純物を除去した。粒子の表面を、ヘキサンに溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理した後、洗浄した。これにより表面にアミン残基が形成され、ここに架橋剤として５ｍｇ／ｍＬ濃度のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを加えて２時間攪拌し、骨移植材の表面に反応基を導入した。反応済みの骨移植材を洗浄し、ここに、実施例９で使用したペプチド１０ｍｇを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されている骨移植材粒子を得た。
【００４４】
実施例１１：キトサン骨移植材への骨シアロ蛋白の付着及び活性部位を含有するペプチドの固定
本実施例では、実施例９で使用したペプチドと同一のペプチドを使用した。
【００４５】
キトサン骨移植材及び支持体を２ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に加えて表面を水和させた後、ここに架橋剤として５ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを加えて２時間攪拌し、キトサン骨移植材の表面に反応基を導入した。反応済みのキトサン骨移植材を洗浄し、ここに、１０ｍｇの前記ペプチドを１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液を加え、２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されているキトサン骨移植材及び支持体を製造した。
【００４６】
実施例１２：ポリ乳酸骨移植材及び支持体への骨シアロ蛋白の付着及び活性部位を含有するペプチドの固定
本実施例では、実施例９で使用したペプチドと同一のペプチドを使用した。
【００４７】
ポリ乳酸骨移植材及び支持体をリン酸緩衝液（ｐＨ４．７）に加えて表面を水和させた後、２０ｍｇ／ｍＬの塩酸シスタミンの溶液と反応させた。ここに架橋剤としてＥＤＡＣを滴加してポリ乳酸の表面のカルボン酸を活性化させた。２４時間反応させてから洗浄した後、３０ｍｇ／ｍＬ濃度のＤＴＴ溶液１ｍＬを添加し、さらに２４時間反応して骨移植材と支持体の表面にスルフヒドリル基が導入されるようにした。前記骨移植材及び支持体は、前記ペプチドと混合して骨移植材とペプチド間のＳ−Ｓ結合を自発的に誘導させてペプチドを固定した。
【００４８】
実施例１３：キトサン遮蔽膜への骨組織形成促進ペプチドの固定
キトサン遮蔽膜を２ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に加えて遮蔽膜の表面を水和させた後、ここに架橋剤として５ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを加え、２時間攪拌して遮蔽膜の表面に反応基を導入した。反応後、遮蔽膜を洗浄し、ここに配列番号１の細胞付着ペプチド、実施例５で使用したＢＭＰ−２由来ペプチド、及び実施例９で使用した骨シアロ蛋白由来ペプチドを５ｍｇずつ１００μＬのリン酸緩衝液に溶かしたそれぞれの溶液を遮蔽膜の表面に加えて２４時間反応させ、洗浄した後、ペプチドが固定されている遮蔽膜を製造した。
【００４９】
実施例１４：ポリ乳酸遮蔽蔽への骨組織形成促進ペプチドの固定
ポリ乳酸遮蔽膜をリン酸緩衝液（ｐＨ４．７）に加えて表面を水和させた後、２０ｍｇ／ｍＬの塩酸シスタミン溶液と反応させた。ここに架橋剤としてＥＤＣを滴加してポリ乳酸の表面のカルボン酸を活性化させた。２４時間反応してから洗浄した後、３０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ溶液１ｍＬを加えてさらに２４時間反応し、遮蔽膜の表面にスルフヒドリル基が導入されるようにした。前記遮蔽膜は、配列番号１の細胞付着ペプチド、実施例５で使用したＢＭＰ−２由来ペプチド、及び実施例９で使用した骨シアロ蛋白由来ペプチドとそれぞれ混合し、遮蔽膜とペプチド間のＳ−Ｓの結合を自発的に誘導させてペプチドを固定した。
【００５０】
実施例１５：チタニウムインプラントへの骨組織形成促進ペプチドの固定
チタニウムからなるインプラントの表面を窒素化プラズマ処理してアミン基を表面に露出させた後、ここに架橋剤としてＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを５ｍｇ／ｍＬの濃度で加えて２時間攪拌し、表面に反応基を導入した。反応完了の後、インプラントを洗浄し、ここに配列番号１の細胞付着ペプチド、実施例５で使用したＢＭＰ−２由来ペプチド、及び実施例９で使用した骨シアロ蛋白(bone sialoprotein)由来ペプチドをそれぞれ５ｍｇずつ１００μＬのリン酸緩衝液に溶かした溶液をそれぞれのインプラントの表面に加えて２４時間反応させた後、洗浄し、ペプチドが固定されているインプラントを製作した。
【００５１】
実験例１：本発明に係る骨移植材の表面分析
実施例１〜１２で製造されたそれぞれのペプチドが固定されている骨移植材の表面を分析するために、骨移植材を２％グルタルアルデヒド溶液で固定した。固定された骨移植材を１％の四酸化オスミウム(osmium tetroxide)溶液で処理した後、洗浄し、脱水及び乾燥させた。
【００５２】
製造された骨移植材の表面をＸＰＳ方法によって分析した。前記方法は、物質の表面に固定された元素を同定して結合の有無を確認する方法であって、本発明によって固定されたペプチドと骨移植材との間には、ジスルフィド結合(disulfide bond)が存在するので、硫黄の存在有無によって結合を確認した。
【００５３】
図１は本発明によってキトサン骨移植材に固定されているペプチドの分析結果を示すもので、（Ａ）はペプチドで修飾されていないキトサンによって製作された骨移植材の表面を示し、（Ｂ）は硫黄を含有したペプチドが固定されている骨移植材を示す。図１に示すように、ペプチドが固定されている骨移植材の表面から硫黄の存在が確認され、ペプチドが固定されていることが分かる。また、ペプチドが固定されている骨移植材の硫黄含量を測定することにより、全体移植材の表面積当りのペプチドの固定率を確認した。その結果、表１に示すように、ペプチドで修飾されていないキトサンでは硫黄が検出されなかったが、これに対し、ペプチドが固定されているキトサンでは８．６６％の硫黄が検出された。
【００５４】
【表１】
2007530099.tif 000003
【００５５】
実験例２：本発明に係る骨移植材の細胞付着力実験
実施例３、７及び１１によって製造されたペプチド付着骨移植材に骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３細胞株）を接種した後、それぞれ４時間及び１日に亘って培養した。骨芽細胞が培養された骨移植材を２％グルタルアルデヒド溶液で固定した。固定されている骨移植材を１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した、蛍光標識ファロイジン溶液を添加し、付着している細胞質を染色した。染色の後、洗浄して試片を固定し、その後、骨移植材に付着している細胞を共焦点レーザ走査顕微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope)で観察した（図２）。
【００５６】
図２において、（Ａ）はペプチドで修飾されていない骨移植材への細胞付着を示すもので、（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれＢＭＰ及び骨シアロ蛋白由来ペプチドがそれぞれ固定されている骨移植材への細胞付着を示すものである。細胞付着結果、ペプチドが固定されていない骨移植材の場合は、球状に不安定に付着していることが観察されたが、これに対し、ＢＭＰ及び骨シアロ蛋白由来ペプチドが固定されている骨移植材の表面は、細胞培養４時間後に既に大部分の細胞から細胞質の伸長が観察されるなど、安定的な細胞付着が観察された。
【００５７】
また、図３は、細胞付着度を定量的に分析した結果を示すもので、ペプチドで修飾されていないキトサン骨移植材より、ペプチドが修飾されているキトサン骨移植材において細胞の付着程度が著しく増加し、このような増加度は修飾されているペプチドの量にある程度比例した。
【００５８】
実験例３：本発明に係るペプチド固定骨移植材の表面に培養された骨芽細胞における分化マーカー蛋白質の発現
本発明によってペプチドが固定されている骨移植材の表面で培養された骨芽細胞の分化マーカー蛋白質の発現を確認するために、分化マーカー蛋白質であるｓｍａｄ １、５及び８の発現程度をウェスタンブロットで確認した。
【００５９】
骨芽細胞を、骨移植材、及びペプチドが固定されている骨移植材の表面に接種した後、２週間培養した。培養後、細胞内の総蛋白質を抽出し、その量を２８０ｎｍで吸光度を測定して定量した。この中で１ｍｇ／ｍＬの蛋白質溶液２μＬを取ってアクリルアミドゲルに電気永動させた後、分化マーカー蛋白質であるｓｍａｄ １、５及び８の抗体と反応させた。その後、抗体と結合する２次抗体を標識者で標識して反応させ、前記ゲルを現像して示す蛋白質バンドを観察し、その密度を測定した（図４）。
【００６０】
その結果、図４に示すように、ペプチドが固定されていない骨移植材に培養された細胞の場合と比較し、ペプチドが固定されている骨移植材の表面に培養された骨芽細胞におけるｓｍａｄの発現が著しく増加し、これにより組織成長因子由来ペプチドが固定されている骨移植材の表面で成長した細胞は、骨組織への分化が促進されることが分かった。
【００６１】
実験例４：ペプチド固定骨移植材によるウサギ頭蓋骨の再生効果
実施例１〜５で製造されたペプチドが固定されている骨移植材をウサギの頭蓋骨の円形欠損部に移植して骨再生力を確認した。麻酔させたウサギの頭蓋骨部位に直径８ｍｍの円形骨欠損部を形成させ、前記骨欠損部に、骨移植材及びペプチドが修飾されている骨移植材を欠損部当り５０ｍｇずつ移植し、骨膜と皮膚とを二重縫合した。移植２週後に動物を犠牲にし、採取した標本はホルマリン溶液に入れて固定させた後、組織を包埋して厚さ２０μｍの試片に製作した。製作された試片は、塩基性フクシンとトルイジンブルーで染色して非脱灰標本を製作した。製作された標本は、光学顕微鏡で観察して写真撮影を行った。
【００６２】
図５はペプチドが固定されている骨移植材による骨再生効果を示すもので、ペプチドが付着していない骨移植材に比べて（A）、本発明に係る骨組織形成促進ペプチドが表面に付着している骨移植材をウサギの頭蓋部の欠損に適用した場合、２週以内にも著しい骨再生力を示すことを確認することができた（Ｂ）。
【００６３】
以上、本発明の特定の内容部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者において、このような具体的な記述は好適な実施様態に過ぎないもので、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項及びその等価物によって定義されるべきである。本発明の単純な変形、変更ないし追加は当分野における通常の知識を有する者によって容易に利用でき、それらの変形または変更も本発明の領域に含まれるものと理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、低濃度の用量でも所望の組織再生効果を得ることが可能な細胞付着誘導ペプチド及び／または組織成長因子由来ペプチドが表面に固定されている骨移植材及び組織工学用支持体を提供するという効果がある。
【００６５】
本発明に係る骨組織形成促進ペプチドが固定されている骨移植材及び組織再生用支持体は、細胞接着及び骨組織への分化を促進し、既存の方法による組織成長因子の活用の単純含入による速い分解及び体内漏出に伴う副作用を防ぐことができ、局所濃度を高めるために多量を適用することによる莫大な費用を節減することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明に係る骨移植材に固定されているペプチドの電子表面分析結果を示すもので、（Ａ）はペプチドが固定されていない骨移植材の表面分析結果を示し、（Ｂ）は硫黄を含有したペプチドが固定されている骨移植材の表面分析結果を示す。
【図２】本発明の骨移植材の細胞付着様相を示す共焦点レーザ走査顕微鏡写真であって、（Ａ）はペプチドが固定されていない骨移植材の表面への細胞付着様相を示し、（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれＢＭＰ及び骨シアロ蛋白(Bone sialoprotein)から由来したペプチドが固定されている骨移植材の表面への細胞付着様相を示す。
【図３】本発明のペプチドが固定されている骨移植材の表面の細胞付着度を定量的に分析したグラフである。
【図４】本発明の骨移植材に細胞を分注して一定の期間培養し、培養された細胞を収去して細胞内の骨組織分化マーカーであるｓｍａｄ １、５、８蛋白質の量をウェスタンブロットによって測定した結果を示す写真である（Ｃｏｎ：ペプチドが固定されていない骨移植材；ＢＭＰ：ＢＭＰ由来ペプチドが固定されている骨移植材；ＢＳＰ：骨シアロ蛋白(bone sialoprotein)由来のペプチドが固定されている骨移植材）。
【図５】本発明に係る骨移植材を用いてウサギの頭蓋骨欠損部における骨再生力を観察した写真であって、（Ａ）はペプチドが固定されていない骨移植材（ＨＡ）の頭蓋骨欠損部における骨再生力を示し、（Ｂ）は本発明のペプチドが固定されている骨移植材（ＨＡ）の頭蓋骨欠損部における骨再生力を示し、ニューボーン(New Bone)は骨移植材の表面に固定されているペプチドによって生成された新生骨を示す。
【図１】
2007530099.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007530099.tif 000008
【配列表】
2007530099000001.xml
【国際調査報告】
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2007530099.tif 000044
2007530099.tif 000045