(57)【要約】【課題】サンゴ精製方法、及び、これにより得たサンゴの提供。【解決手段】本発明は、サンゴ中の有機物の抽出方法であって、超臨界状態の流体又は流体混合物により、上記サンゴの結晶構造を変えずに、２７０℃未満の温度で、上記流体又は流体混合物の臨界圧より大幅に高い圧力、例えば上記臨界圧の少なくとも約３倍、好ましくは約５倍の圧力でサンゴを処理する方法を提供する。また本発明は、上記方法により得たサンゴ、及び、上記サンゴから作成した骨代替物も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンゴ中の有機物の抽出方法であって、
超臨界状態の流体又は流体混合物により、前記サンゴの結晶構造を変えずに、２７０℃未満、好ましくは２６０℃以下、より好ましくは２５０℃以下の温度で、前記流体又は流体混合物の臨界圧より大幅に高い圧力、例えば前記臨界圧の少なくとも約３倍、好ましくは約５倍の圧力でサンゴを処理する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記流体はエタノール及びアセトンから選択され、流体混合物はエタノールと二酸化炭素との混合物及びアセトンと二酸化炭素との混合物から選択され、その臨界温度は２７０℃未満、好ましくは２６０℃以下、より好ましくは２５０℃以下である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体はエタノールである
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
サンゴの処理圧力は３００ＭＰａ〜４５０ＭＰａ、好ましくは３５０ＭＰａ〜４５０ＭＰａである
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サンゴの処理温度は２４０℃〜２６０℃、好ましくは約２５０℃であり、サンゴの処理時間は１５分〜２４０分、好ましくは約１時間である
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
流体混合物がエタノールと二酸化炭素の混合物である場合、サンゴの処理圧力は３０ＭＰａ〜５０ＭＰａ、好ましくは約４０ＭＰａである
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
サンゴの処理温度は約８０℃〜１００℃である
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により得たサンゴ。
【請求項９】
請求項８に記載のサンゴから作成した骨代替物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンゴ精製方法及びこの方法で得たサンゴに関する。
【０００２】
本発明は医学分野において特に応用される。
【背景技術】
【０００３】
サンゴは多孔性構造を有し、本質的に（約９７％は）無機物（主として炭酸カルシウム）からなり、残り（約３％）はマグネシウム及び鉄の酸化物、並びに、その色の原因である有機物から構成される。その硬度はモーズ硬度計で２．５〜３．５である。
【０００４】
サンゴの構成成分である炭酸カルシウムは準安定アラゴナイト型の結晶構造を有し、特に温度約２６０℃で、容易に方解石に変化可能である。
【０００５】
サンゴ中の有機物はタンパク性物質を含み、脂性物質は本質的に含まない。
【０００６】
現在、サンゴに基く骨代替物があり、Ａｇｅｎｃｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  Ｓａｎｉｔａｉｒｅ  ｄｅｓ  Ｐｒｏｄｕｉｔｓ  ｄｅ  Ｓａｎｔｅ（ＡＦＳＳＡＰＳ）［フランス医薬品庁］の承認済みである。これらのうち、商品名ＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）でＩＮＯＴＥＢ社から市販のものは、サンゴの孔表面を処理して上記有機物の一部を除去することにより得る。
【０００７】
しかし、サンゴのより詳細な形態分析（熱走査電子顕微鏡及び質量分光法）は、上記有機物がサンゴの孔の中だけでなく炭酸カルシウム粒子の粒子界面にも存在することを示す。ＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）について実施された処理によっては、粒子界面の有機物（総有機物の約９０％に相当）の抽出は不可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明が解決しようとする課題の一つは、有機物、特にタンパク質を本質的に含まず、既存の合成インプラントと同等の質を有する骨代替物の作成に使用可能なサンゴの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書中で使用する用語「有機物を本質的に含まないサンゴ」は、有機物含量が未処理サンゴの半分以下であるサンゴを意味する。
【００１０】
本発明が解決しようとする別の課題は、結晶構造を変えずにサンゴ中の有機物を除去可能な方法の提供である。
【００１１】
本発明は、最適範囲の温度および圧力で超臨界状態の流体でサンゴを処理することにより、従来の方法では未解決の上記課題を解決可能であることを発見し、このことは本発明の基礎である。
【００１２】
従って第一の態様において、本発明は、サンゴ中の有機物の抽出方法であって、超臨界状態の流体又は流体混合物により、上記サンゴの結晶構造を変えずに、２７０℃未満、好ましくは２６０℃以下、より好ましくは２５０℃以下の温度で、上記流体又は流体混合物の臨界圧より大幅に高い圧力、例えば上記臨界圧の少なくとも約３倍、好ましくは約５倍の圧力でサンゴを処理する方法を提供する。
【００１３】
超臨界状態の流体の有機物抽出における使用はヨーロッパ特許ＥＰ−Ａ−０６０３９２０中に記載される。しかし、上記特許は骨組織の処理にのみ関し、二酸化炭素を使用して脂質（すなわちサンゴに含まれない物質）を抽出する。上記特許においては、タンパク質の抽出において、界面活性剤又は酸化剤等の（サンゴの構造を変える可能性のある）化合物を更に使用する、補足的な化学処理又は酵素処理を用いる。更に、上記特許においては、二酸化炭素の臨界圧に近い圧力で処理を実施する。
【００１４】
本発明の方法では、「超臨界」と呼ばれる条件で流体を使用する、すなわち流体はガスの侵入特性を有すると同時に液体として作用する。この理由から、流体はサンゴの多孔性構造中に湿潤性の問題なく拡散可能であり、これによりサンゴ中の有機物、特にタンパク質（以下で「有機マトリックス」とも呼ぶ）の抽出を最適化可能である。
【００１５】
本発明の方法における使用に好適な流体又は流体混合物は２７０℃未満、好ましくは２６０℃以下、より好ましくは２５０℃以下の臨界温度を有する必要があり、有機物を溶解させるであろう。
【００１６】
例としては、エタノール、アセトン、又は、これら二種の流体の一種と二酸化炭素との混合物であって、臨界温度が２７０℃未満のものが挙げられる。エタノールは入手が容易で安価であり毒性がないため、有利に使用される。エタノールは臨界温度が２４０℃、臨界圧が６．１２ＭＰａ［メガパスカル］である。
【００１７】
流体がエタノール又はアセトンである場合、サンゴの処理温度は２４０℃〜２６０℃が有利である。
【００１８】
エタノールと二酸化炭素の混合物等の流体混合物を使用する場合、サンゴの処理温度は８０℃〜１００℃が有利である。
【００１９】
本発明の方法は、サンゴの結晶構造を変形させないように、使用する流体又は流体混合物の臨界圧より大幅に高い十分な圧力で実施する。この点において、上述の流体の臨界圧は容易に達成される。
【００２０】
エタノール又はアセトンを使用する場合、サンゴの処理圧力は３００ＭＰａ〜４５０ＭＰａ、好ましくは３５０ＭＰａ〜４５０ＭＰａが有利である。
【００２１】
エタノールと二酸化炭素の混合物等の流体混合物を使用する場合、サンゴの処理圧力は３０ＭＰａ〜５０ＭＰａ、好ましくは約４０ＭＰａが有利である。
【００２２】
処理時間自体は重要ではなく、使用する流体に応じて一般的に数分〜数時間の間である。エタノール又はアセトンを使用する場合、この時間は１５ｍｉｎ［分］〜２４０ｍｉｎ、好ましくは約１ｈ［時間］が有利である。
【００２３】
サンゴの化学組成が無機的な組成であることを前提とすれば、本発明の流体又は流体混合物は、サンゴの構造を変える可能性のある界面活性剤又は酸化剤等の化合物を更に使用することなく、有利に使用される。
【００２４】
第二の態様において、本発明は、上記方法で得た、有機物を本質的に含まないサンゴに関する。
【００２５】
第三の態様において、本発明は、有機物を本質的に含まないサンゴから作成した骨代替物を提供する。上記骨代替物は当業者に公知の方法で取得可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明を以下の例示により説明する。
【実施例１】
【００２７】
＜サンゴの超臨界処理＞
一定容積のチャンバー内において高水圧発生装置中で未処理サンゴを処理した。このチャンバーは高力合金製で、深さ２２９ｍｍ［ミリメートル］、内径５５ｍｍであった。このチャンバーは金属シールを支えるキノコ形の閉鎖部により閉じていて、これが変形して密閉される。開始時（オートクレーブは非加圧状態）には、上部でネジ８本で閉鎖部を持ち上げることにより密閉状態を作成した。ポンプでチャンバーを加圧することにより、又は、シールを温度加圧することにより、系を密閉する。
【００２８】
リアクター上部に取り付けた熱電対によりチャンバー内部の温度を測定した。熱電対は加圧流体と直接接触させた。
【００２９】
約３００℃の温度に耐熱性があり、圧力により変形可能な可撓性の２０ｍＬ［ミリリットル］テフロン（登録商標）ＰＦＡボトル（品番：Ｍ７７４００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｂｌｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中にサンゴを入れた。ボトルの内壁及び外壁に同じ圧力をかけた。ボトル内には空気がほとんど又は全くないため、ボトル内の液体及び送られる液体（水）の圧力は等しく、従って水の圧縮による壁の変形はほとんどなかった。２４０℃〜２６０℃、好ましくは約２５０℃の温度、かつ、３００ＭＰａ〜４００ＭＰａ、好ましくは約３５０ＭＰａの圧力の「超臨界」流体のエタノールの存在下、１５分間〜２４０分間、好ましくは約１時間処理を実施した。
【実施例２】
【００３０】
＜処理したサンゴ中に残った有機物の定量＞
実施例１で得たサンプルを乳鉢で粉砕して重量を量った（ＵＭ質量−未処理物−約３ｇ［グラム］）。得た粉末３ｇを０．１Ｎ  ＨＣｌ  １３５ｍＬ中に撹拌しながら１時間かけて溶解させた。これにより得た溶液を分子量１２０００〜１６０００の膜（品番：ＭＣＷＯ）で透析し、−８０℃で冷凍して凍結乾燥させた。その後、凍結乾燥物の重量を量った（ＯＭ質量−有機物−約３ｇ）。
【００３１】
比較するため、未処理のサンゴサンプル（アラゴナイト）及びＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）のサンプルについて同じ実験を実施した。
【００３２】
図１は、３つのサンプル各々のＯＭ／ＵＭの比率を示す。本発明の「超臨界」処理により、有機物含量がＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）の約半分であるサンゴを作成可能であることが分かるであろう。
【実施例３】
【００３３】
＜処理したサンゴ中に残ったタンパク質の定量＞
１／試験溶液及びサンプルの調製：
・溶液Ａと溶液Ｂを５０：１の容量比で混合した。試験溶液は最初わずかに曇っているが、ボルテックスでゆっくり撹拌すると急速に透明になった。乳緑色であった；
・サンプルを乳鉢で粉砕し、得た粉末の重量を量った；
・粉末１ｇを０．６Ｎ  ＨＣｌ  ４５ｍＬ中に撹拌しながら１時間かけて溶解した。
２／測定方法：
水溶性画分を水中で分析した：有機物１．２ｍｇ［ミリグラム］を水７５μＬ［マイクロリットル］中に溶解した；
・遠心分離した残渣を０．３Ｎ  ＮａＯＨ  ７５μＬ中に溶解した；
・これらと、（アッセイサンプルと同様に調製した）各サンプルの各標準（０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び２５０μｇ／ｍＬ［マイクログラム／ミリリットル］）を２５μＬずつ、９６ウェルプレートのウェル中に分配した；
・プレートを覆い、３７℃で３０分間インキュベートした；
・プレートが室温まで冷えたら光学濃度を５６２ｎｍ［ナノメートル］で読み取った。
【００３４】
比較するため、未処理のサンゴサンプル（アラゴナイト）及びＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）のサンプルについて同じ実験を実施した。
【００３５】
図２は、３つのサンプル各々のタンパク質／ＵＭの比率を示す。本発明の「超臨界」処理により、ＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）の約二倍のタンパク質が抽出されたサンゴを作成可能であることが分かるであろう。
【実施例４】
【００３６】
＜処理したサンゴ上における骨細胞の細胞増殖の立証＞
シリンダ（直径＝１２ｍｍ）を石切り用丸鋸で厚さ１ｍｍの円盤状に切り、１００℃で１時間３０（３サイクル）乾熱滅菌した。円盤を培養皿（ＮＵＮＣ；２４ウェル、２ｃｍ２［平方センチメートル］）に入れた０．１％アガロース台上に置いた。細胞懸濁液を、完全培地（ＩＭＤＭ：Ｉｓｃｏｗｅ社ダルベッコ改変培地、１０％ＦＣＳ−ウシ胎仔血清）１００μＬ中に、ＭＧ６３細胞２００００個／ｃｍ２（１．１３ｃｍ２×２、多孔質であるため−細胞２２６００個、すなわち一サンプル当たり細胞約５００００個）の割合で各円盤上に置いた。３０分間かけて細胞を付着させた後、培地１ｍＬを添加した。２日毎に培地を交換した。
【００３７】
完全培地を除去して培地のみで洗浄した。細胞を１７時間飢餓状態にした（培地のみ＋１０％ＦＣＳ、トリチウム化チミジン、１０μＣｉ／ｍＬ［マイクロキュリー／ミリリットル］（品番：ＴＲＫ７５８、アマシャム社）（すなわち、３ＨＴ１０μＬ／完全培地１容量）。上清を除去し（後の除去のため残す）、その後、物質をアガロースから取り出してプラスチックウェルに移した。これをＰＢＳ  １×（又はＨａｎｋ’ｓ溶液  １×）で二回洗浄後、冷却した１００％メタノールで細胞を４℃において１０分間かけて固定した。これをＰＢＳ  １×（又はＨａｎｋ’ｓ溶液  １×）で二回洗浄後、冷却した５％ＴＣＡで４℃において２０分間かけて沈殿させた。上清を除去し、ＰＢＳ  １×（又はＨａｎｋ’ｓ溶液  １×）で四回洗浄した。
【００３８】
これを３００μＬ〜５００μＬを超えない量の０．３Ｎ  ＮａＯＨ中で室温において２  時間インキュベート（細胞層を溶解）した。この溶液を回収し、液状閃光体（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）５ｍＬを入れたシンチレーション管中に入れて、溶液及び物質の放射能をβ線カウンター（放射能はごく微量）で測定した。
【００３９】
比較するため、未処理のサンゴサンプル（アラゴナイト）及びＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）のサンプルについて同じ実験を実施した。
【００４０】
結果を図３中に示す。本発明により処理したサンゴ上におけるＭＧ６３細胞の細胞増殖はＢＩＯＣＯＲＡＬ（登録商標）を用いた場合と同じであることが分かるであろう。
【００４１】
これらの結果は、本発明により処理したサンゴを使用して骨代替物を作成可能であることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】３つのサンプル各々のＯＭ／ＵＭの比率を示す。
【図２】３つのサンプル各々のタンパク質／ＵＭの比率を示す。
【図３】処理したサンゴ上における骨細胞の細胞増殖。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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