(57)【要約】  哺乳動物細胞における心臓のイオンチャネルなどの内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える薬剤を特定するハイスループットアッセイシステムおよび方法を開示する。かかる方法を用いて特定された薬剤を用いる治療方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞における内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える薬剤を特定する方法であって、前記方法は、
ａ）前記膜タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップと、
ｂ）哺乳動物細胞を含む前記第１の培地に有効量の候補薬剤を添加するステップと、
ｃ）前記候補薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｄ）哺乳動物細胞を含む前記第１の培地に、前記膜タンパク質の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｅ）前記候補薬剤と共にインキュベートした後に前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップであって、対照と比べた前記結合レベルの変化が、前記候補薬剤が前記膜タンパク質の表面発現レベルを変えることを示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ｆ）前記膜タンパク質の第２の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第２の培地を調製するステップであって、前記第２の突然変異体は、前記第１の突然変異体と異なっており、前記哺乳動物細胞の表面で前記膜タンパク質の野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、
ｇ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に有効量の前記候補薬剤を添加するステップと、
ｈ）前記候補薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｉ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に、前記膜タンパク質の前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｊ）前記候補薬剤と共にインキュベートした後に前記膜タンパク質の前記第２の突然変異体の前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップと
をさらに含み、
対照と比べた前記結合レベルの変化が、前記候補薬剤が前記膜タンパク質の前記第２の突然変異体の表面発現レベルを変えることを示すことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップを含み、前記一次抗体は前記膜タンパク質の前記第１の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合し、前記二次抗体は前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合レベルは、蛍光、冷光、放射能、吸光度またはその２種以上の組合せによって測定されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記内在性膜タンパク質は膜イオンチャネルであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記膜イオンチャネルはナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネルまたは塩素イオンチャネルであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の細胞外エピトープは野生型エピトープを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種の細胞外エピトープはタグを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外タグは前記内在性膜タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部を置換することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外タグは前記膜タンパク質の細胞外ドメインに挿入されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞外タグは赤血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記一次抗体および／または前記二次抗体は酵素に結合していることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素はペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の突然変異体は、前記膜タンパク質の野生型のアミノ酸配列から少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の突然変異体は、前記膜タンパク質の野生型のアミノ酸配列から少なくとも１種のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記膜タンパク質はカリウムイオンチャネルであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記カリウムイオンチャネルはｈＥＲＧであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＧ６０１Ｓであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＮ４７０Ｄであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＧ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＮ４７０Ｄ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
有効量の活性薬剤をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、心不整脈を予防または治療する方法であって、
ａ）ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップであって、前記第１の突然変異体が前記哺乳動物細胞の表面でｈＥＲＧの野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、
ｂ）前記第１の培地に有効量の前記活性薬剤を添加するステップと、
ｃ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｄ）哺乳動物細胞を含む前記第１の培地に、ｈＥＲＧの前記突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｅ）前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップと、
ｆ）ｈＥＲＧの第２の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第２の培地を調製するステップであって、前記第２の突然変異体は、前記第１の突然変異体と異なっており、前記哺乳動物細胞の表面でｈＥＲＧの野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、
ｇ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に有効量の前記活性薬剤を添加するステップと、
ｈ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｉ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に、ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｊ）ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体の前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップと
を含む方法によって決定して、前記活性薬剤は哺乳動物細胞におけるｈＥＲＧの第１の突然変異体の表面発現レベルを増加させ、哺乳動物細胞におけるｈＥＲＧの第２の突然変異体の表面レベルを増加させないことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記活性薬剤はバノキセリンまたは薬学的に許容されるその塩であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｄ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップを含み、前記一次抗体はｈＥＲＧの前記第１の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合し、前記二次抗体は前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合レベルは、蛍光、冷光、放射能、吸光度またはその２種以上の組合せによって測定されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の細胞外エピトープはタグを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞外タグはｈＥＲＧの細胞外ドメインの少なくとも一部を置換することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞外タグはｈＥＲＧの細胞外ドメインに挿入されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞外タグは赤血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記一次抗体および／または前記二次抗体は酵素に結合していることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素はペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＧ６０１Ｓであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＮ４７０Ｄであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＧ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＮ４７０Ｄ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｉ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップを含み、前記一次抗体はｈＥＲＧの前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合し、前記二次抗体は前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記膜タンパク質は、前記細胞の表面で前記タンパク質の野生型よりも少ないレベルで発現される突然変異体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞における心臓のイオンチャネルなどの内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える薬剤を特定するハイスループットアッセイシステムおよび方法に関する。本発明は、かかる方法を用いて特定された薬剤を用いる治療方法にも関する。
本願は、２００３年７月１５日に出願された出願番号１０／６１９，１８４号明細書の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
Ａ．アッセイ
ヒトＥｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ）（ｈＥＲＧ）は、心臓の再分極電流ＩＫｒを生じ６回膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）と細胞質アミノ末端およびカルボキシル末端とからなるポア形成カリウムチャネルサブユニットである。ｈＥＲＧは、先天性と薬物性の両方のＱＴ延長症候群、心臓の重篤な症状と潜在的な致命的症状に関連付けられてきた。
【０００３】
ｈＥＲＧの変異によって、機能に障害を生じているチャネルおよび／または輸送に欠陥のあるチャネルが生じ、どちらもＩＫｒ電流を減少させる。この分子の大部分に及ぶ変異は、様々なｌｏｎｇＱＴ家族において認められている。これは、ｈＥＲＧが心臓生理学に極めて重要な役割を果たしていることを示唆している。
【０００４】
ＱＴ延長症候群（薬物誘導型）に関連する薬物の大部分はｈＥＲＧ遮断薬である。例えば、（例えば、非特許文献１参照）を参照されたい。１９９６年に非鎮静性抗ヒスタミン薬テルフェナジン（Ｓｅｌｄａｎｅ）の心毒性がｈＥＲＧ遮断と関連付けられて（例えば、非特許文献２参照）以来、抗不整脈薬、抗生物質、抗精神病薬並びに抗ヒスタミン薬を含めて多様な構造を有する多種多様な薬物が強力なｈＥＲＧ遮断薬であることが示されている。
【０００５】
したがって、ｈＥＲＧは、新しい治療薬の心臓安全性試験の重要な標的となっている。米国食品医薬品局は、現在、新規治療化合物の承認を求める医薬品会社に、ｈＥＲＧ遮断の可能性について化合物を検査するよう勧告している。
【０００６】
現在、ｈＥＲＧ心臓安全性試験は、電気生理学を含み、ｈＥＲＧを安定に過剰発現するＨＥＫ  ２９３細胞におけるｈＥＲＧ電流のパッチクランプ記録法からなる。しかし、このアッセイは高価であり、時間がかかり、かなりの専門的技術を要する。その結果、このアッセイは、通常、薬剤開発プロセスの比較的終わりの方で実施される。残念ながら、その時に新規治療化合物が強力なｈＥＲＧ遮断薬であることが発見されると、その化合物が承認され治療に使用される見込みは場合によっては壊滅的打撃を受ける。その結果、安価で迅速であり、薬剤開発プロセスの極めて初期に使用することができるｈＥＲＧ遮断薬アッセイに対してかなりの関心が医薬産業にある。
【０００７】
パッチクランプアッセイに限界があることから、薬物を潜在的ｈＥＲＧ相互作用について前臨床スクリーニングする代替方法が生み出された。いくつかの方法が記述されているが、それらは、例えば、感度、処理能力および／または偽陽性率に限界がある（例えば、非特許文献３参照）。
【０００８】
例えば、１つのタイプのアッセイは、ＤｉＢＡＣ４またはＦＭＰのような膜電位感受性蛍光色素を使用する。これらのアッセイは、膜電位の変化を測定し、ｈＥＲＧ活性を測定しないので、偽陽性（すなわち、膜電位を変化させるがｈＥＲＧを遮断しない薬物）のリスクが大きい。かかるアッセイの最近の評価（非特許文献４）では、偽陽性の問題がかなりあり、それほどではないが偽陰性の問題が指摘されている。加えて、感度は約１／１００に低下する。さらに、ｈＥＲＧ遮断薬能力の順位はパッチクランプ測定に比べて膜電位アッセイで異なるため、かかる蛍光アッセイの使用は、その効力に関する有用な情報を提供せずに潜在的なｈＥＲＧチャネル遮断薬を同定することに限定されている。最後に、色素／薬物相互作用もこのアッセイにおいて問題を生じている。
【０００９】
ｈＥＲＧ相互作用についての可能なハイスループット前臨床スクリーニングとして示唆される第２のアッセイは、ｈＥＲＧ形質移入細胞の膜への［３Ｈ］ドフェリチド（ｄｏｆｅｌｉｔｉｄｅ）結合である。（非特許文献５参照）。この結合アッセイは機能的でなく、ｈＥＲＧチャネルへの結合に対して［３Ｈ］ドフェリチドと競合する薬物の能力に依拠している。しかし、予備的実験において、パッチクランプ法によって同定されたｈＥＲＧ遮断薬の順位は、［３Ｈ］ドフェリチド結合アッセイで再現されなかった。また、結合基質として精製細胞膜が必要であり、放射能標識ドフェリチドが必要であることから、このアッセイの有用性は限られている。
【００１０】
示唆された第３のアッセイは、ｈＥＲＧを発現する細胞を通るルビジウム（Ｒｂ）流束を測定することを含む（非特許文献６参照）。これらの細胞にＲｂチャネルを導入し、高カリウムレベルで活性化し、培地中に放出されるＲｂを測定する。しかし、この方法によって得られる効力の順位は、パッチクランプデータと相関がない（非特許文献４参照）。また、処理量は限られており、感度は１／１０に低下する。
【００１１】
したがって、ｈＥＲＧなどの心臓のイオンチャネルを含めて、内在性膜タンパク質の遮断薬を特定するアッセイシステムが依然として求められている。
Ｂ．心不整脈
心房粗動および／または心房細動（ＡＦ）は、臨床実務において最も一般的に経験する心不整脈であり、人口の高齢化とともに有病率が増加する可能性がある。現在、ＡＦは、年間１００万人を超える米国人が発症し、循環器病の全入院患者の５％を超え、米国において毎年８０，０００件を超える発作を起こしている。ＡＦが致命的な不整脈であることは稀であるが、ＡＦはかなりの罹患率の原因となり、うっ血性心不全または血栓塞栓症の発生のような合併症をもたらし得る。現在利用可能なクラスＩおよびクラスＩＩＩ抗不整脈薬はＡＦの再発率を低下させるが、心室性催不整脈作用を含めた様々な潜在的有害作用のために使用が限られている。現在の治療は不適当であり副作用を伴うので、新たな治療手法を開発する必要性は明らかである。
【００１２】
心室細動（ＶＦ）は、急性心筋梗塞、虚血性冠状動脈疾患およびうっ血性心不全に関連した最も一般的な原因である。ＡＦ同様、現在の治療は不適当であり、新たな治療手法の開発が求められている。
【００１３】
現在、様々な抗不整脈薬が市場で入手可能であるが、良好な効力と高い安全性の両方を有する抗不整脈薬は得られていない。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ−Ｗｉｌｌｉａｍｓの分類体系（非特許文献７）によれば、活動電位の上昇行程の最大速度（Ｖｍａｘ）の選択的阻害を引き起こすクラスＩの抗不整脈薬は、心臓の活動電位の波長を短縮し、それによってリエントリーを助けるので、心室細動を防止するのには不適当である。加えて、クラスＩの抗不整脈薬は安全性の点で問題がある。すなわち、クラスＩの抗不整脈薬は心筋の収縮を抑制し、インパルス伝導を阻害するため不整脈を誘発する傾向がある。ＣＡＳＴ（冠状動脈抑制試験（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｉａｌ））は、クラスＩ拮抗物質がプラセボ対照よりも死亡率が高いので、進行中に終了された。それぞれクラスＩＩおよびクラスＩＶに属するβ−アドレナリン受容体遮断薬およびカルシウムチャネル（ＩＣａ）拮抗物質は、それらの効果があるタイプの不整脈に限定され、またはある循環器病患者においては心臓抑制特性のために禁忌である欠点を有する。しかし、それらの安全性は、クラスＩの抗不整脈薬の安全性よりも高い。
【００１４】
クラスＩＩＩの抗不整脈薬は、最大上昇速度（Ｖｍａｘ）を大きく低下させることなく活動電位持続時間（ＡＰＤ）を選択的に延長する薬物である。したがって、クラスＩＩＩ抗不整脈薬は、心臓活動電位が増加する不応期（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｅｓ）のセーブ期間（ｓａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ）を延長し、それによってリエントリーに拮抗する。このクラスの利用可能な薬物は数が限られている。ソタロール、アミオダロンなどの例は、興味深いクラスＩＩＩ特性を有することが判明したが（非特許文献８および９）、これらは選択的クラスＩＩＩ薬剤ではない。
【００１５】
ソタロールは、心臓抑制を引き起こし得るクラスＩＩ（β−アドレナリン遮断）効果も有し、ある種の感受性の高い患者には禁忌である。
【００１６】
アミオダロンも、複数の電気生理学的作用を有するので選択的クラスＩＩＩ抗不整脈薬ではなく、副作用によって厳格に制限されている。（非特許文献１０）。このクラスの薬物は、心室細動を予防するのに有効であると予想されている。選択的クラスＩＩＩ薬剤は、定義によれば、心筋抑制を起こさず、クラスＩ抗不整脈薬に見られる活動電位の伝導阻害による不整脈も誘発しないと考えられる。
【００１７】
クラスＩＩＩ薬剤は、心臓の活動電位持続時間（ＡＰＤ）を延長することによって心筋の不応性を高める。心臓の活動電位の延長は、理論的に、内向き電流（すなわちＮａ＋またはＣａ２＋電流；以後、それぞれＩＮａおよびＩＣａ）の増加または外向き再分極カリウムＫ＋電流の減少によって実現することができる。遅延整流性（ＩＫ）Ｋ＋電流は、活動電位プラトー中の全再分極過程に関与する主要な外向き電流であるのに対し、一過性外向き電流（Ｉｔｏ）および内向き整流性（ＩＫＩ）Ｋ＋電流はそれぞれ早い初期再分極および末期再分極の原因である。
【００１８】
細胞の電気生理学的研究により、ＩＫは、薬理学的および動力学的に異なる２つのＫ＋電流サブタイプＩＫｒ（高速の活性化および不活性化）とＩＫｓ（低速の活性化および不活性化）からなる。（非特許文献１１）。ＩＫｒは、ヒトＥｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の産物でもある。細胞系におけるｈＥＲＧ  ｃＤＮＡの発現は、ＩＫｒとほぼ同一であるｈＥＲＧ電流の生成を導く（非特許文献１２）。
【００１９】
現在開発中のクラスＩＩＩ抗不整脈薬は、これらだけではないが、主としてｄ−ソタロール、ドフェチリド（ＵＫ−６８，７９８）、アルモカラント（Ｈ２３４／０９）、Ｅ−４０３１およびメタンスルホンアミド−Ｎ−［１’−６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６イル］、（＋）−，モノクロライド（ＭＫ−４９９）を含めて、ＩＫｒを遮断する。アミオダロンはＩＫｓの遮断薬であるが（非特許文献１３）、ＩＮａおよびＩＣａも遮断し、甲状腺機能をもたらし、非特異的アドレナリン遮断薬であり、酵素ホスホリパーゼ阻害剤として作用し、肺線維症を起こす（非特許文献１０）。
【００２０】
リエントリー性興奮（リエントリー）は、ヒトにおける上室性不整脈を生じる重要な機序であることが判明している。リエントリー性興奮には、同時に共存しＡＦを持続させる複数のリエントリー回路の惹起および維持を可能にする遅い伝導速度と十分に短い不応期の間の極めて重要なバランスが必要である。ＡＰＤの延長によって心筋の不応性が増大すると、リエントリー不整脈が防止されおよび／または停止する。これらだけでないが、主としてｄ−ソタロール、ドフェチリドのような現在開発中のより選択的なクラスＩＩＩ抗不整脈薬は、ヒトの心房と心室の両方に見られるＩＫの高速活性化成分であるＩＫｒを遮断する。
【００２１】
これらのＩＫｒ遮断薬は、伝導自体には影響を及ぼさずに心房と心室の両方におけるＡＰＤおよび不応性を増加させるので、理論的にＡＦおよびＶＦのような不整脈の治療に有用な潜在的薬剤の代表である。これらの薬剤は、遅い心拍数における催不整脈作用のリスクを高めるという点で不利である。例えば、心電図のＱＴ間隔の過剰な延長に一般に関連し、したがって「後天性ＱＴ延長症候群」と命名される多形性心室頻拍の特異的なタイプであるトルサード  ド  ポアンツは、これらの化合物が利用されたときに認められる（非特許文献１４）。遅い心拍数における過大な効果は「逆頻度依存性」と称し、頻度非依存性または頻度依存性作用と対比される。（非特許文献１５）。催不整脈傾向のためにＳＷＯＲＤトライアルは中止された。このとき、ｄ−ソタロールはプラセボ対照よりも死亡率が高かった。
【００２２】
遅延整流性（ＩＫｓ）の遅い活性化成分は、心室性不整脈に関連するＩＫｒ遮断薬の限界のいくつかを場合によっては克服する。しかし、その活性化速度が遅いため、心房性再分極におけるＩＫｓの役割は、心房のＡＰＤが比較的短いために限定されることがある。その結果、ＩＫｓ遮断薬は、心室性不整脈の場合に明確な利点を提供することができるが、上室性頻脈性不整脈（ＳＶＴ）に対する効果は極めて小さいと考えられる。
【００２３】
現在利用可能なほとんどのクラスＩＩＩ抗不整脈薬の別の主要な欠点または限界は、それらの効果が徐脈または遅い心拍数においてあるいはその期間に増加しまたはより明らかになり、これが潜在的催不整脈作用能に寄与することである。一方、頻脈中あるいはこれらの薬剤または薬物が意図され最も必要とされる症状の間に、これらのクラスＩＩＩ抗不整脈薬はその効果の大部分を失う。速い心拍数における効果の喪失または減少は、「逆使用依存性」（非特許文献１６、１７）または「逆速度依存性」（非特許文献１８、１９））と称される。したがって、現在のほとんどのクラスＩＩＩ抗不整脈薬が有するのと逆の使用依存性または速度依存性プロファイルを有する薬剤は、安全性が改善されるだけでなく効力も増強されるはずである。
【００２４】
現在のクラスＩＩＩ抗不整脈薬に関連する問題に鑑みて、哺乳動物における心不整脈に有効な治療が依然として求められている。
【００２５】
【特許文献１】米国特許第４，２０２，８９６号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４７６，１２９号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８７４，７６５号明細書
【特許文献４】欧州特許ＥＰ２４３，９０３号明細書
【特許文献５】国際公開第９１／０１７３２号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，１８７，８０２号明細書
【特許文献７】ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１８３６８号明細書
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、本発明の一目的は、心臓のイオンチャネルなどの内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える薬剤を特定するアッセイおよび方法を提供することである。また、本発明の一目的は、心不整脈を予防または治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
これらの目的および他の目的に従って、本発明の第１の実施の形態は、哺乳動物細胞における内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える薬剤を特定する方法を対象とする。この方法は、ａ）目的とする膜タンパク質の第１の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップであって、この第１の突然変異体が前記細胞の表面で野生型よりも少ないレベルで発現されるステップと、ｂ）有効量の候補薬剤を添加するステップと、ｃ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、ｄ）前記突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｅ）結合レベルを決定するステップとを含み、前記結合レベルの変化によって、前記候補薬剤が表面発現レベルを変えることが示される。
【００２８】
本発明の第２の実施形態は、ａ）前記細胞の表面でｈＥＲＧの野生型よりも低いレベルで発現されるｈＥＲＧの第１の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップと、ｂ）有効量の前記活性薬剤を添加するステップと、ｃ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、ｄ）このｈＥＲＧ突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｅ）前記抗体の結合レベルを決定するステップと、ｆ）前記第１の突然変異体とは異なる突然変異体であって、前記哺乳動物細胞の表面でｈＥＲＧの野生型よりも低いレベルで発現されるｈＥＲＧの第２の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第２の培地を調製するステップと、ｇ）前記第２の培地に有効量の前記活性薬剤を添加するステップと、ｈ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、ｉ）この第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｊ）前記抗体の結合レベルを決定するステップとを含む方法によって決定して、哺乳動物細胞におけるｈＥＲＧの第１の突然変異体の表面発現レベルを増加させ哺乳動物細胞におけるｈＥＲＧの第２の突然変異体の表面レベルを増加させない有効量の活性薬剤をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、心不整脈を予防または治療する方法を対象とする。
【００２９】
本発明のさらなる利点、目的および特徴は、以下の説明に部分的に記載されており、以下を検討することによって当業者にはある程度明らかなはずであり、または本発明を実施することによって知ることができる。本発明の目的および利点は、添付された特許請求の範囲に特に指摘されたとおり理解し、達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
Ｉ．アッセイおよび使用方法
本発明の好ましい実施形態は、膜イオンチャネルのような内在性膜タンパク質に結合する薬剤を特定し、それによって哺乳動物細胞におけるその表面発現を増加または減少させるアッセイシステムおよび方法を含む。ある特に好ましい実施形態においては、このアッセイおよびシステムは、内在性膜タンパク質の突然変異体上の特定の部位へ結合し、それによってその表面発現を変える薬剤の能力を決定する。表面発現のかかる変化は、野生型膜タンパク質上の活性部位に対応する突然変異体上の部位を遮断する薬剤によって、および／または細胞内輸送を遮断することによって、および／または突然変異体膜タンパク質のプロセシングによって生じ得る。あるいは、表面発現の変化は、突然変異体膜タンパク質の細胞内輸送を改善する薬剤によって生じ得る。
【００３１】
適切な結合アッセイには当業者に公知で利用可能な多種多様な形式がある。本発明のある実施形態によれば、目的とする膜タンパク質を発現する１種または複数の細胞は、適切な液体培地中で提供され、１種または複数の候補化合物に暴露することができ、他の実施形態においてはこの細胞は表面に固定することができる。同様に、本発明のさらに別の実施形態によれば、１種または複数の候補化合物は、表面に固定して目的とする膜タンパク質を発現する１種または複数の細胞を含む液体培地に暴露することができ、あるいは目的とする膜タンパク質を発現する１種または複数の細胞が添加される適切な液体培地中に含めることができる。
【００３２】
結合は、候補化合物および目的とする膜タンパク質の少なくとも１種が（例えば、蛍光、放射能、酵素、抗体など、それらの組合せを含めて、当業者に公知のとおり）標識されたシステムにおいてより容易に検出されることが多い。候補化合物を膜タンパク質を発現する細胞に暴露し、非結合性試薬を洗い流し、または他の方法で除去し、標識成分（すなわち、試験システムの非標識成分に結合された）の存在を測定する。
【００３３】
様々な結合アッセイを実施する方法は、これに限定されないが、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１８３６８号明細書（特許文献７）に記載のものなどのアッセイシステムを含めて、当分野で公知である。様々な参考文献が、競合的結合アッセイおよび直接結合アッセイを含めて、タンパク質結合アッセイの様々な形式について全般的に記載している。（例えば、非特許文献２０〜２２を参照されたい）。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態は、膜タンパク質の活性を遮断することによって、および／またはその細胞内輸送および／またはプロセシングを遮断することによって目的とする膜タンパク質の表面発現を増加または減少させる化合物を特定するアッセイシステムおよび方法を含む。
【００３５】
したがって、ある特に好ましい実施形態によれば、目的とする膜タンパク質を発現する１種または複数の細胞が適切な固体担体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル、マイクロカードまたは当業者に公知の任意の他の類似の形式）に一般に結合されており、候補薬剤と混合され、目的とする膜タンパク質の表面発現レベルの変化を観察する免疫測定法が提供される。したがって、これらの好ましい実施形態においては、１種または複数のアッセイ成分は固体表面に付着している。
【００３６】
一部の実施形態においては、アッセイシステムを（当分野で公知のとおり）使用して、候補薬剤の結合による膜タンパク質の表面発現の変化を検出することができる。例えば、目的とする膜タンパク質が膜イオンチャネルである場合には、パッチクランプアッセイを使用して膜を通るイオン流束の変化を検出し、それによってイオンチャネルの表面発現レベルの増加を証明することができる。
【００３７】
別の実施形態においては、膜タンパク質の細胞外エピトープに対する１種または複数の抗体を添加することによって細胞表面の膜タンパク質を検出する当分野で公知の間接的免疫測定システムを使用する。
【００３８】
本発明の方法において固体担体を使用するときには、表面材料がアッセイ試薬に適合し、アッセイ成分の反応性を過度に変えることなくその表面に成分を付着させることが可能な限り、実質的にあらゆる固体表面が適切である。一部の成分は固相アッセイにおいて活性が低下するが、その活性が検出および／または定量に十分である限り一般に許容されることを当業者は認識している。
【００３９】
適切な固体担体には、ガラスビーズ、平面ガラス、制御された多孔質ガラス（ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、プラスチック多孔質プラスチック金属（ｐｌａｓｔｉｃ  ｐｏｒｏｕｓ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｍｅｔａｌ）、あるいは材料または細胞が接着することができる樹脂などのようなあらゆる固体表面が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、一部の実施形態においては、本発明の方法に使用される固体担体は、官能基（例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、エステルおよびスルフヒドリル）を用いて誘導体化して、リンカーの付着あるいは候補薬剤または他のアッセイ成分の直接付着のための反応部位を提供できることを認識している。
【００４０】
固体担体へのアッセイ成分の接着は、直接的（すなわち、成分が固体表面に直接接触する）または間接的（すなわち、薬剤および／または成分（例えば抗体）が担体に結合し、別のアッセイ成分が固体担体ではなくこの薬剤または成分に結合する）とすることができる。一部の実施形態においては、薬剤または成分は共有結合的に固定され（例えば、タンパク質成分を固着させるためにシステインの単一反応性チオール基を利用して（例えば、非特許文献２３参照）、あるいは非共有結合的であるが特異的に（例えば、固定化抗体または他の特異的結合タンパク質によって（例えば、非特許文献２４、２５参照））、ビオチン／ストレプトアビジンシステム（例えば、非特許文献２６参照）、または金属キレート化ラングミュアー−ブロジェット膜（例えば、非特許文献２７〜３０参照）、および金属キレート化自己組織化単層膜（例えば、非特許文献３１参照）に固定され、ポリヒスチジン融合タンパク質を結合する。
【００４１】
特に好ましい一部の実施形態においては、一般に当分野で公知の標準の直接的または間接的ＥＬＩＳＡ法、ＩＦＡ法またはＲＩＡ法を使用して、目的とする膜タンパク質への候補薬剤の結合を検出する。一部の実施形態においては、試料における膜タンパク質の表面発現レベルの増加が検出されるが、他の実施形態においては表面発現レベルの減少が検出される。したがって、本発明の方法は複数の要素の検出、同定および特徴付けに適用できることが明白である。
【００４２】
したがって、本発明の方法の特に好ましい一部の実施形態においては、捕捉用モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（「捕捉抗体」）および結合した抗体−抗原複合体（例えば、抗ｈＥＲＧ抗体に結合したｈＥＲＧまたは対応する抗体に結合したｈＥＲＧ突然変異体）の検出用の二次抗体（「レポーター抗体」）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を使用することができる。
【００４３】
一部の好ましいＥＬＩＳＡ実施形態においてはアルカリホスファターゼ複合体が使用され、さらに別の好ましい実施形態においては西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体が使用される。また、特に信号を増大する必要があるアッセイシステムの場合には、アビジン／ビオチンシステムも使用することができる。好ましい実施形態に使用される適切な酵素には、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびこれらの２種以上の混合物などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
したがって、説明のための本発明の一方法においては、ブロッキング緩衝剤に適切に希釈された（例えば、ｈＥＲＧまたはその突然変異体に対する）ビオチン化抗体１００μｌをアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（例えば、Ｐｉｅｒｃｅから市販されているｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎプレート）の各ウェルに添加する。２時間後、プレートを洗浄緩衝剤（例えば、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％、遮断薬を含むまたは含まない）で洗浄する。さらなる非特異的結合は、ブロッキング緩衝剤を添加することによって（例えば、製造者の推奨に従ってＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）３００μｌを２回添加することによって）阻害することができる。ウェル表面にビオチン化抗体が結合できるようにインキュベートした後に、プレートを当分野で公知の方法に従って（例えば、３回）洗浄して、ウェル中に存在する非結合抗体を除去する。
【００４５】
目的とする膜タンパク質を発現する細胞の試料ならびに標準および対照を適切な緩衝剤で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加することができる。希釈標準、対照および試料をＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加することができる（例えば、１００μｌ／ウェル）。標準、対照および試料は一般に２回で試験される。プレートを例えば終夜または別の適切な時間、加湿装置などの中の一般にロッキングテーブル上で５ＲＰＭで、または他の適切な撹拌手段でインキュベートする。プレートを当分野で公知の洗浄緩衝剤を用いて洗浄する（例えば、３回など）。次いで、適切に希釈された（好ましくは、プレートのウェルを被覆するために使用された抗体で前もって吸収された）モノクローナルまたはポリクローナルレポーター抗体１００μＬを添加することができ、室温で、好ましくは終夜（例えば、約１８〜２０時間）または他の適切なこのようなインキュベーション期間インキュベートすることができる。
【００４６】
次いで、好ましくは上述したようにプレートを再度洗浄することができ、適切なブロッキング緩衝剤（例えば、ＴＢＳ中のＢＳＡ遮断薬）に適切に希釈された（Ｐｉｅｒｃｅから市販されている）アルカリホスファターゼ複合抗ウサギＩｇなどの酵素標識抗体１００μｌを添加することができ、上述したようにロッキングまたは類似の撹拌をしながら十分な期間（例えば２時間）インキュベートすることができる。
【００４７】
次いで、プレートを上述したように好ましくは再度洗浄することができる。酵素基質をウェルに添加することができ、適切な時間反応させ、その最後に反応を当分野で公知の任意の適切な方法を用いて停止し、ウェル内の溶液の光学濃度を当分野で公知のとおり測定することができる。
【００４８】
バックグラウンド信号は増幅アッセイにおいて制約要因となることが多いので、本発明の一部の実施形態においては、これらのアッセイにおけるバックグラウンド信号を低下させるように測定することができる。
【００４９】
固体担体が利用されるアッセイシステムに加えて、本発明は、アッセイ成分が溶液に懸濁されたままである方法を提供する。
【００５０】
本発明の特に好ましい第１の実施形態によれば、哺乳動物細胞においてｈＥＲＧのような内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える、ペプチド、タンパク質、抗体、化学薬品のような薬剤を特定する方法が提供される。この方法は、ａ）目的とする膜タンパク質の第１の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップであって、この第１の突然変異体が前記細胞の表面で前記タンパク質の野生型よりも少ないレベルで発現されるステップと、ｂ）有効量の候補薬剤を添加するステップと、ｃ）前記候補薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、ｄ）前記突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｅ）前記細胞を前記候補薬剤とインキュベートした後に前記タンパク質の細胞外エピトープに対する前記抗体の結合レベルを決定するステップとを含む。
【００５１】
候補薬剤の存在下での結合レベルにおける対照と比べた増加、減少などの変化によって、候補薬剤が膜タンパク質の第１の突然変異体の表面発現レベルを変えることが示される。
【００５２】
本発明の特に好ましい第２の実施形態によれば、上記方法は、ｆ）目的とする膜タンパク質の第２の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第２の培地を調製するステップであって、この第２の突然変異体が前記第１の突然変異体とは異なり、やはり前記哺乳動物細胞の表面で前記膜タンパク質の野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、ｇ）有効量の前記候補薬剤を添加するステップと、ｈ）前記候補薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、ｉ）前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｊ）前記細胞外エピトープに対する前記抗体の結合レベルを決定するステップとをさらに含む。候補薬剤とのインキュベーション後の結合レベルの変化によって、候補薬剤が、目的とする膜タンパク質の第２の突然変異体の表面発現レベルを変えることが示される。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記ステップ（ｄ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を含む。かかる実施形態によれば、一次抗体は、好ましくは、目的とする膜タンパク質の第１の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する。さらにより好ましくは、かかる実施形態によれば、二次抗体は第１の抗体に結合する。
【００５４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、上記ステップ（ｉ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップも含む。かかる実施形態によれば、一次抗体は、好ましくは、目的とする膜タンパク質の第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する。さらにより好ましくは、かかる実施形態によれば、二次抗体は第１の抗体に結合する。
【００５５】
二次抗体は、結合レベルの検出および測定を容易にする酵素に結合することが好ましい。本発明の方法に使用される適切な酵素は当業者に公知であり、入手可能である。説明のための適切な酵素の例には、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびこれらの２種以上の混合物などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
目的とする内在性膜タンパク質の表面発現レベルの決定は、当業者に公知で利用可能な方法および技術のいずれかを用いて実施することができる。結合レベルは、蛍光、ルミネッセンス、放射能、吸光度またはこれら２つ以上の組合せによって決定されることが好ましい。
【００５７】
本発明のある特に好ましい実施形態によれば、内在性膜タンパク質は膜イオンチャネルである。説明のための適切な膜イオンチャネルの例には、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネルまたは塩素イオンチャネルが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、膜タンパク質の第１の突然変異体上の抗体が結合する細胞外エピトープは、野生型エピトープ、すなわち目的とする膜タンパク質の天然体上の細胞外エピトープと好ましくは同じである。操作性などの理論に拘泥するものではないが、かかる取合わせは、例えばタンパク質の機能的諸特性の１つまたは複数における変化によって、タンパク質構造の違いから生じる誤りを減少させることができる。
【００５９】
本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、抗体が膜タンパク質の第２の突然変異体上で結合する細胞外エピトープは、野生型エピトープと好ましくは同じである。
【００６０】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、膜タンパク質の第１および／または第２の突然変異体上の細胞外エピトープはタグを含む。適切なタグが当業者に公知で利用可能である。本発明の方法に使用される特に好ましいタグは赤血球凝集素（ＨＡ）タグである。タグは、膜タンパク質の第１および／または第２の突然変異体の細胞外ドメインに挿入することができ、あるいはその細胞外ドメインの一部を置換することができる。
【００６１】
本発明の方法によれば、膜タンパク質の第１および第２の突然変異体は、好ましくは、膜タンパク質の野生型のアミノ酸配列とは少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。さらに、第１および第２の突然変異体は、好ましくは、互いのアミノ酸配列からも少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。
【００６２】
ある好ましい実施形態によれば、膜タンパク質の第１の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体とすることができ、したがって、哺乳動物細胞表面で対応する野生型よりも低いレベルで発現される。さらに別の好ましい実施形態によれば、第２の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体とすることができ、さらに別の好ましい実施形態によれば、第１および第２の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体とすることができる。
【００６３】
本発明のある特に好ましい実施形態によれば、目的とする膜タンパク質は心臓のイオンチャネルであり、最も好ましくはカリウムイオンチャネルである。かかるイオンチャネルは当業者に公知である。例示としてのカリウムイオンチャネルの例はｈＥＲＧである。
【００６４】
本発明の方法に使用されるｈＥＲＧの適切な第１の突然変異体は当業者に公知である。本発明の好ましい実施形態によれば、かかる突然変異体は細胞表面で発現されたときに機能すべきであるが、最も好ましくは輸送欠陥のために、表面で野生型よりも低レベルで発現されるべきである。適切な突然変異体の実例には、（ＱＴ延長症候群家族において特定された）Ｇ６０１ＳおよびＮ４７０Ｄが含まれるが、これらに限定されない。Ｇ６０１Ｓは動力学的に不変であるが極小の電流を生成する輸送欠陥低次形態チャネルであり（例えば、非特許文献３２参照）、Ｎ４７０Ｄは低次形態ミスセンス変異である。Ｇ６０１Ｓ、Ｎ４７０Ｄなどの突然変異体の表面発現を増加させる薬剤はｈＥＲＧイオン伝導経路中の高親和性部位に結合し、したがって強力なｈＥＲＧ遮断薬である。
【００６５】
例示のためであって限定するためではないが、本発明の好ましい実施形態においては、ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓなどのイオンチャネルの突然変異体は、膜貫通領域Ｓ１とＳ２のリンカーにおいてＨＡタグのような細胞外タグを発現するように操作される（かかるタグは、好ましくは、チャネルの機能的諸特性を変えるべきではない）。このタグ付き突然変異体、例えばｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ−ＨＡを安定に発現するＨＥＫ  ２９３細胞のような細胞は、９６ウェルマイクロタイタープレートなどの適切な容器にプレート化し、１種または複数の候補薬剤と一緒に終夜など十分な時間インキュベートされる。次いで、細胞は、例えばホルムアルデヒドを用いて好ましくは固定されるが、好ましくは透過化処理されず、ＨＡタグを認識する抗体が添加される。西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素と好ましくは複合化された二次抗体は、固定された細胞の表面に結合された抗ＨＡ抗体に結合させるために使用される。次いで、細胞表面信号は化学発光反応混合などの任意の適切な方法によって発生させることができ、そのレベルは、例えばマイクロタイタープレート照度計において測定される。対照細胞は、通常、水および／または候補薬剤と組み合わせて使用されるＤＭＳＯのような液体ビヒクルと一緒にインキュベートされる。第１の突然変異体の表面発現を増加させる薬剤は、ｈＥＲＧ（または類似のかかるイオンチャネル）の遮断薬候補である。
【００６６】
本発明の方法に使用されるｈＥＲＧの適切な第２の突然変異体も当業者に公知である。本発明の好ましい実施形態によれば、かかる突然変異体は、最も好ましくは輸送欠陥のために、やはり表面で野生型よりも低レベルで発現されるべきであるが、細胞表面で発現されたときに機能すべきではない。説明のための適切なｈＥＲＧ突然変異体の例には、Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６ＣおよびＮ４７０Ｄ／Ｆ６５６Ｃが含まれるが、これらに限定されない。Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃ、Ｎ４７０Ｄ／Ｆ６５６Ｃのような突然変異体の表面発現を増加させない薬剤は、強力なｈＥＲＧ遮断薬である。
【００６７】
やはり説明のためであって限定するためではないが、本発明の好ましい実施形態においては、ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃなどのイオンチャネルの第２の突然変異体は、膜貫通領域Ｓ１とＳ２のリンカーにおいてＨＡタグなどの細胞外タグを発現するように操作される（やはり、かかるタグは、好ましくは、チャネルの機能的諸特性を変えるべきではない）。このタグ付き突然変異体、例えばｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃ−ＨＡを安定に発現するＨＥＫ  ２９３細胞などの細胞は、９６ウェルマイクロタイタープレートなどの適切な容器にプレート化され、候補薬剤、好ましくは第１の突然変異体の表面発現を増加させる候補薬剤と一緒に十分な時間インキュベートされる。次いで、細胞は好ましくは固定され、透過化処理されず、ＨＡタグを認識する一次抗体が添加される。次いで、酵素と好ましくは複合化された二次抗体は、固定された細胞の表面に結合された抗ＨＡ抗体に結合させるために使用される。次いで、細胞表面信号は化学発光反応混合などの任意の適切な方法によって発生させることができ、そのレベルが、例えばマイクロタイタープレート照度計において測定される。対照細胞は、通常、水および／または候補薬剤と組み合わせて使用されるＤＭＳＯなどの液体ビヒクルと一緒にインキュベートされる。第２の突然変異体の表面発現レベルを増加させないこれらの薬剤は、強力なｈＥＲＧ遮断薬である可能性がある。第１の突然変異体の表面発現レベルを増加させ、第２の突然変異体の表面発現レベルを増加させない薬剤は、強力なｈＥＲＧ遮断薬である可能性が高い。
【００６８】
上記方法の特により好ましい実施形態によれば、ｈＥＲＧ表面発現は、インキュベーターからマイクロタイタープレートを取り出し、細胞を浸す培地を除去することによって分析される。ウェルをＰＢＳ（１００μＬ）で３回リンスし、次いで、細胞をパラホルムアルデヒド（例えば、４％ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２、１００μｌ）で固定し、次いでＰＢＳでリンスする。細胞表面の非特異的結合部位は、例えば前記細胞を１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液（「ブロッキング緩衝剤」）と一緒にインキュベートすることによって好ましくはブロックされる。ブロッキング緩衝剤を除去した後に、ラット抗ＨＡのブロッキング緩衝剤溶液などの一次抗体と一緒に細胞をインキュベートする。次いで、一次抗体を除去し、細胞を（例えばブロッキング緩衝剤で３回）洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗ラットヤギ抗体のブロッキング緩衝剤溶液のような二次抗体を添加する。次いで、二次抗体を除去し、細胞を好ましくは洗浄する。
【００６９】
かかる実施形態によれば、化学発光信号は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）のような任意の適切な技術を用いて発生させることができる。マイクロタイタープレートの各ウェルに対して適切な量の試薬、例えば５０μｌを添加し、ＧｌｏＲｕｎｎｅｒ照度計（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いてデータを得る。
【００７０】
蛍光反応を、ウェル１個当たりの細胞数をモニターするために、任意選択的に追加してもよい。
ＩＩ．治療用組成物および方法
本発明の好ましい実施形態は、上記アッセイによって特定される有効量の薬剤をそれを必要とするヒトなどのそれを必要とする哺乳動物に投与することによって心不整脈を予防または治療する方法である。好ましくは、本発明は、Ｇ６０１Ｓ、Ｎ４７０ＤなどのｈＥＲＧの第１の突然変異体の表面発現レベルを増加させる有効量の薬剤を、それを必要とするヒトなどのそれを必要とする哺乳動物に投与することによって、心不整脈を予防または治療する方法である。さらにより好ましくは、かかる薬剤は、Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃ、Ｎ４７０Ｄ／Ｆ６５６ＣのようなｈＥＲＧの第２の突然変異体の発現レベルを増加させない。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態は、薬学的に許容される担体と組み合わせた有効量のかかる薬剤を含む、ヒトのような哺乳動物において心不整脈を予防または治療する組成物も含む。
【００７２】
本発明の治療方法および組成物に使用するのに適切な特に好ましい薬剤の説明のための例は（ＧＢＲ−１２９０９としても知られる）バノキセリンである。バノキセリン、その製造および／またはそのある種の医薬品用途は、特許文献１、特許文献２および特許文献３ならびに特許文献４および特許文献５に記載されている。
【００７３】
バノキセリンの薬学的に許容される塩も、本発明の方法に使用することができる。本発明の方法に使用することができるバノキセリンの薬学的に許容される塩には、無毒の無機酸または有機酸から形成されるバノキセリンの塩が含まれるが、これらに限定されない。例えば、薬学的に許容される塩には、以下のもの：塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸から誘導される塩；酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸（ｐａｍｏｉｃ）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸などのような有機酸から誘導される塩；およびグルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸から誘導される塩が含まれるが、これらに限定されない。例えば、特許文献５および６を参照されたい。
【００７４】
本発明の方法に有用なバノキセリンの薬学的に許容される塩は、バノキセリンから従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、これらの塩は、イオン交換クロマトグラフィーによって、あるいは遊離塩基を化学量論量または過剰の所望の塩形成性無機酸または有機酸と適切な溶媒または溶媒の様々な組合せの中で反応させることによって、調製される。
【００７５】
薬学的に許容されるバノキセリン代謝産物は、ヒトのような哺乳動物に投与されたときに必要な薬理学的応答を誘発し、その他の点では本発明の方法における使用に適切であり、例えば、許容される毒物学プロファイルを示し、使用条件下で比較的安定であるなどの前提で、本発明の方法に使用することができる。本発明の方法に使用することができる説明のための適切な代謝産物の例には、１−［２−（ジフェニルメトキシ）エチル］−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジン（ＧＢＲ  １２９３５としても知られ、ヒトにおけるバノキセリンの主要な代謝産物である）ならびに薬学的に許容されるその塩、類似体および誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
薬学的に許容されるバノキセリン誘導体も、ヒトのような哺乳動物に投与されたときに必要な薬理学的応答を誘発し、その他の点では本発明の方法における使用に適切であり、例えば、許容される毒物学プロファイルを示し、使用条件下で比較的安定であるなどの前提で、本発明の方法に使用することができる。本発明の方法に使用することができる説明のための適切な誘導体の例には、３−フェニルプロピル部分が３−フェニルプロペン−２−イル部分で置換されている以外は、それぞれバノキセリンおよびＧＢＲ  １２９３５に構造的に類似したＧＢＲ  １３０６９およびＧＢＲ  １２７８３が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
他の適切な誘導体には、バノキセリンのフェノール誘導体、すなわちバノキセリンの非置換フェニル基が１個または複数のヒドロキシ基で置換されたバノキセリンの誘導体、ならびにそのメトキシ同族体などが含まれる。（例えば、非特許文献３３および３４参照）。
【００７８】
本発明の方法に使用することができる適切な誘導体の追加の例には、４−［２−ビス（ハロフェニル）メトキシ］−エチル］−α−（置換フェニル）−１−ピペラジンアルカノール誘導体が含まれる。例えば、特許文献２を参照されたい。
【００７９】
本方法に使用されるときには、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物は、頬、舌下、経鼻、経口、局所、直腸および非経口投与（ただしこれらに限定されない）を含めた、所望の作用部位に薬学的に活性な薬剤を導入することができる任意の技術によって投与することができる。化合物の送達は、皮下移植片または経皮パッチの制御放出剤形を使用することもできる。
【００８０】
経口投与の場合、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を含む適切な組成物は、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤および水性または油性懸濁液剤として調製することができる。これらの組成物の調製に使用される不活性成分は当分野で公知である。例えば、錠剤は、ジャガイモデンプン、微結晶セルロースなどの崩壊剤およびステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤の存在下で、活性化合物をラクトース、リン酸カルシウムなどの不活性希釈剤と混合し、次いでその混合物を公知の方法によって錠剤にすることによって調製することができる。
【００８１】
錠剤は、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を徐放するように、当分野で公知の方法によって処方することもできる。かかる錠剤は、公知の方法によって、例えば酢酸フタル酸セルロースを使用することによって、必要に応じて腸溶コーティングすることができる。適切な結合剤または造粒剤には、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、糊精などが含まれるが、これらに限定されない。タルク、コロイド状ケイ酸、ステアリンならびにステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウムなどを抗接着剤および滑剤（ｇｌｉｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として使用することができる。
【００８２】
錠剤は、湿式造粒とそれに続く圧縮によって調製することもできる。バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物と少なくとも１種の希釈剤とを含み、場合によっては崩壊剤の一部を含んでもよい混合物を、結合剤の水溶液、エタノール溶液または水性エタノール溶液と一緒に適切な装置中で顆粒化し、次いでその顆粒を乾燥する。その後、他の防腐添加剤、表面活性添加剤、分散添加剤、崩壊添加剤、滑剤および抗接着添加剤を乾燥顆粒と混合することができ、その混合物を圧縮して錠剤またはカプセル剤にすることができる。
【００８３】
錠剤は、活性成分と必要な添加剤とを含む混合物を直接圧縮することによって調製することもできる。必要に応じて、錠剤は、糖、セルロース誘導体（メチルまたはエチルセルロースあるいはナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、食用色素、芳香剤、酸化鉄顔料などのような製薬業界において一般に使用される保護剤、香味料および染色剤を用いて、糖衣錠剤に変換することができる。
【００８４】
カプセル剤またはカプレットの調製の場合には、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物と所望の添加剤との混合物を硬質または軟質ゼラチンカプセル剤のようなカプセル剤に充填することができる。カプセル剤および／またはカプレットの内容物は、活性化合物を徐放するように公知の方法によって処方することもできる。
【００８５】
バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物の液体経口剤形は、化合物が無毒の懸濁剤と混合されたエリキシル剤、懸濁液剤および／またはシロップ剤とすることができる。液体経口剤形は、１種または複数の甘味剤、香味料、防腐剤および／またはその混合物を含むこともできる。
【００８６】
直腸投与の場合、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を含む適切な組成物は、坐剤として調製することができる。坐剤は、活性成分に加えて、カカオ脂、グリセリンゼラチン、または高分子量ポリエチレングリコールのような薬学的業務において一般に使用される坐剤練剤（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｍａｓｓ）を含むことができる。
【００８７】
非経口投与の場合、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物の適切な組成物は、注入可能な溶液または懸濁液の形態で調製することができる。注入可能な溶液または懸濁液を調製する場合には、活性成分は、場合によってはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、モノオレエート、モノステアレートのような可溶化剤の存在下で、グリコールエーテルのような水系または非水系等張性無菌注射溶液あるいは懸濁液中に溶解することができる。これらの溶液または懸濁液は、経口投与用の処方で使用するための上述された１種または複数の担体あるいは希釈剤を有する無菌粉末あるいは顆粒から調製することができる。非経口投与は、静脈内、皮内、筋肉内または皮下注射によることができる。
【００８８】
バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を含む組成物は、鼻から吸って、例えば噴霧剤、エアゾール剤、霧状にされる溶液および／または粉末によって投与することもできる。当業者に公知の定量用量システムも使用することができる。
【００８９】
バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物の薬剤組成物は、ゆっくり溶解する錠剤、チューインガム、トローチ剤、舐剤、香錠、ゲル剤、ペースト剤、洗口剤、リンス剤および／または散剤のようなかかる投与のための公知の剤形で頬側口腔（例えば、舌下）に投与することができる。
【００９０】
バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を含む局所投与用組成物は、化合物を経皮投与するために皮膚に接触したままになるように薬理学的活性物質が分散されたマトリックスを含むことができる。適切な経皮組成物は、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を、鉱物油、ワセリンおよび／またはワックス、例えばパラフィン蝋または蜜蝋などの局所用ビヒクルと、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコールのような潜在的経皮促進剤と一緒に混合することによって調製することができる。あるいは、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物は、薬学的に許容されるクリームまたは軟膏基剤に分散させることができる。局所用製剤に含まれるバノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物の量は、治療有効量が、局所用製剤を皮膚上に置こうとする時間送達されるようにすべきである。
【００９１】
バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物は、外部源から例えば静脈内注入によって、または体内に置かれた化合物源から、連続注入によって投与することもできる。内部源には、注入されるバノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を含む移植貯蔵器であって、これらが、例えば浸透によって連続的に放出されるもの、並びに、（ａ）例えばドデカノエート塩のような水に非常に溶解し難い誘導体の形での注入される化合物の、薬学的に許容されるオイル懸濁液もしくは溶液のような液体、または（ｂ）例えば合成樹脂または蝋状材料の移植支持体の形の固体であり得る移植片が含まれる。担体は、すべての化合物を含む単一体でも、送達される化合物の一部を各々が含む一連のいくつかの本体でもよい。内部源中に存在するバノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物の量は、治療有効量が長時間にわたって送達されるようにすべきである。
【００９２】
また、バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物の注射液は、ベンジルアルコール、メチルまたはプロピル４−ヒドロキシベンゾエート、塩化ベンザルコニウム、ホウ酸フェニル水銀などのような防腐剤；アスコルビン酸、トコフェロール、ピロ硫酸ナトリウムのような酸化防止剤などの様々な添加剤を含むことができ、微量金属を結合させるエチレンジアミン四酢酸塩のような錯体形成剤を任意選択的に含んでいてもよく、ｐＨ値を調節する緩衝剤を含むことができ、局所麻酔薬、例えばリドカインを任意選択的に含んでいてもよい。バノキセリンあるいは薬学的に許容されるその塩、誘導体または代謝産物を含有する注射液は、ろ過してからアンプルに充填され、充填後に滅菌される。
【００９３】
本発明のかかる治療方法に使用することができる他の薬剤としては、アステルミゾール（ａｓｔｅｒｍｉｚｏｌｅ）、テルフェナジン、Ｅ−４０３１、シサプリド、クロロキンのような公知のｈＥＲＧ遮断薬のいずれかが含まれる。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
アステミゾールによるｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ表面発現の救済
ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ−ＨＡを安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、底部が透明なＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ−リジンセルウェア（ｃｅｌｌｗａｒｅ）９６ウェル黒色プレート（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ）にプレート化した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２と１０％ＦＢＳ＋ペニシリン−ストレプトマイシンおよびジェネティシン（Ｇ４１８；０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む完全培地に細胞をプレート化し（８×１０４細胞／ウェル）、薬物を添加する前に３７℃／５％ＣＯ２で８時間インキュベートした。薬物（アステミゾール、ノルアステミゾール、フェキソフェナジン）のストック溶液（２００μＭ、１ｍＭおよび５ｍＭ）を調製した。添加直前に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で作業用希釈液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（２００ｎＭ、１μＭおよび５μＭ）を調製した。ビヒクルは、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中の０．１％ＤＭＳＯからなる。細胞を浸している培地を除去し、薬物を含む培地またはビヒクル対照培地（１００μｌ／ウェル）で置換した。各薬物に対して、各濃度に対する３個の試験ウェルと３個の対照ウェルがあった。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で終夜（約１６時間）インキュベートしてから表面発現アッセイを開始した。
【００９５】
表面発現アッセイは実験台（ｂｅｎｃｈ  ｔｏｐ）上で室温で実施された。細胞をＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、続いて新たに調製された氷冷４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２、１００μｌ、２０分間）で固定した。固定液を除去し、細胞をＰＢＳ１００μＬでリンスした。１％ヤギ血清のｐＢＳ溶液（ブロッキング緩衝剤、１００μｌ  ３０分間）と一緒にインキュベートして細胞上の非特異的結合部位をブロックした。ブロッキング緩衝剤を除去し、ブロッキング緩衝剤で希釈されたラット抗ＨＡ（１：５００希釈、１００μｌ、Ｒｏｃｈｅ）と一緒に細胞を３時間インキュベートした。一次抗体を除去した後、細胞を１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液（１００μｌおよび１０分間／洗浄）で３回洗浄した。ＨＲＰ複合ヤギ抗ラット抗体（１：２０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）をブロッキング緩衝剤で希釈し、細胞と一緒に１時間（１００μｌ／ウェル）インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液１００μｌで（１０分間）洗浄し、次いでＰＢＳ１００μｌで３回（１０分間／洗浄）洗浄した。
【００９６】
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて化学発光信号を発生させた。ＰＢＳをウェルから除去し、ウェル当たり１００μｌの検出試薬で置換した。信号はＧｌｏＲｕｎｎｅｒ照度計（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いて直ちに捕捉された。
【００９７】
得られたデータは、ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ−ＨＡの表面発現を救済する薬物の能力と薬物がｈＥＲＧを遮断する効力との間で直接の相関を示した。すなわち、アステミゾールは、はるかに弱い遮断薬であるノルアステミゾールよりも表面発現をはるかに増大させた。同様に、ｈＥＲＧを全く遮断しないフェキソフェナジンはｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ−ＨＡの表面発現を増加させなかった。
【００９８】
（実施例２）
ｈＥＲＧの薬物結合部位を除去するとアステミゾールによる救済が消滅する
３５ｍｍ皿中のＨＥＫ−２９３細胞に、ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ−ＨＡまたはｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃ−ＨＡをコードするｃＤＮＡを一時的に形質移入した。形質移入から２４時間後に、アステミゾール（１μＭ）を幾つかのプレートに添加し、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）を他のプレートに添加し、これらのプレートを終夜インキュベートした。
【００９９】
インキュベーション後、（試薬体積を比例して大きくした以外は）上述したように、パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、ＨＡタグの表面発現用に加工した。ＴＤ２０／２０照度計（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて化学発光信号を発生させた。
【０１００】
得られたデータは、アステミゾールが二重突然変異体ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃの発現を救済しなかったが、ｈＥＲＧ−Ｇ６０１Ｓの発現を救済し、ｈＥＲＧ−Ｇ６０１ＳがｈＥＲＧの強力な遮断薬であることを示した。
【０１０１】
本発明を十分に説明したが、本発明の方法は、本発明の範囲またはその実施形態から逸脱することなく、広範で等価な範囲の条件、処方および他のパラメータを用いて実施することができることを当業者は理解されたい。
【０１０２】
本明細書に引用されるすべての特許および刊行物を参照によりそれら全体を完全に援用する。任意の刊行物の引用は、その開示が出願日前であるためであるが、かかる刊行物が従来技術であることを認めるものと解釈すべきではなく、本発明が、先行発明の効力によって、かかる刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月12日(2007.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞における内在性膜タンパク質の表面発現レベルを変える薬剤を特定する方法であって、前記方法は、
ａ）前記膜タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップと、
ｂ）哺乳動物細胞を含む前記第１の培地に有効量の候補薬剤を添加するステップと、
ｃ）前記候補薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｄ）哺乳動物細胞を含む前記第１の培地に、前記膜タンパク質の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｅ）前記候補薬剤と共にインキュベートした後に前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップであって、対照と比べた前記結合レベルの変化が、前記候補薬剤が前記膜タンパク質の表面発現レベルを変えることを示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記膜タンパク質は、前記細胞の表面で前記タンパク質の野生型よりも少ないレベルで発現される突然変異体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｆ）前記膜タンパク質の第２の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第２の培地を調製するステップであって、前記第２の突然変異体は、前記第１の突然変異体と異なっており、前記哺乳動物細胞の表面で前記膜タンパク質の野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、
ｇ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に有効量の前記候補薬剤を添加するステップと、
ｈ）前記候補薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｉ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に、前記膜タンパク質の前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｊ）前記候補薬剤と共にインキュベートした後に前記膜タンパク質の前記第２の突然変異体の前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップと
をさらに含み、
対照と比べた前記結合レベルの変化が、前記候補薬剤が前記膜タンパク質の前記第２の突然変異体の表面発現レベルを変えることを示すことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップを含み、前記一次抗体は前記膜タンパク質の前記第１の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合し、前記二次抗体は前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合レベルは、蛍光、冷光、放射能、吸光度またはその２種以上の組合せによって測定されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記内在性膜タンパク質は膜イオンチャネルであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記膜イオンチャネルはナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネルまたは塩素イオンチャネルであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種の細胞外エピトープは野生型エピトープを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種の細胞外エピトープはタグを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外タグは前記内在性膜タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部を置換することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞外タグは前記膜タンパク質の細胞外ドメインに挿入されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞外タグは赤血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記一次抗体および／または前記二次抗体は酵素に結合していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素はペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の突然変異体は、前記膜タンパク質の野生型のアミノ酸配列から少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の突然変異体は、前記膜タンパク質の野生型のアミノ酸配列から少なくとも１種のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜タンパク質はカリウムイオンチャネルであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記カリウムイオンチャネルはｈＥＲＧであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＧ６０１Ｓであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＮ４７０Ｄであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＧ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＮ４７０Ｄ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
有効量の活性薬剤をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、心不整脈を予防または治療する方法であって、
ａ）ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第１の培地を調製するステップであって、前記第１の突然変異体が前記哺乳動物細胞の表面でｈＥＲＧの野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、
ｂ）前記第１の培地に有効量の前記活性薬剤を添加するステップと、
ｃ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｄ）哺乳動物細胞を含む前記第１の培地に、ｈＥＲＧの前記突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｅ）前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップと、
ｆ）ｈＥＲＧの第２の突然変異体を発現する哺乳動物細胞を含む第２の培地を調製するステップであって、前記第２の突然変異体は、前記第１の突然変異体と異なっており、前記哺乳動物細胞の表面でｈＥＲＧの野生型よりも低いレベルで発現されるステップと、
ｇ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に有効量の前記活性薬剤を添加するステップと、
ｈ）前記活性薬剤の存在下で前記細胞を十分な時間インキュベートするステップと、
ｉ）哺乳動物細胞を含む前記第２の培地に、ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合する有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、
ｊ）ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体の前記細胞外エピトープに対する前記少なくとも１種の抗体の結合レベルを決定するステップと
を含む方法によって決定して、前記活性薬剤は哺乳動物細胞におけるｈＥＲＧの第１の突然変異体の表面発現レベルを増加させ、哺乳動物細胞におけるｈＥＲＧの第２の突然変異体の表面レベルを増加させないことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記活性薬剤はバノキセリンまたは薬学的に許容されるその塩であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｄ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップを含み、前記一次抗体はｈＥＲＧの前記第１の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合し、前記二次抗体は前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記結合レベルは、蛍光、冷光、放射能、吸光度またはその２種以上の組合せによって測定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の細胞外エピトープはタグを含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞外タグはｈＥＲＧの細胞外ドメインの少なくとも一部を置換することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞外タグはｈＥＲＧの細胞外ドメインに挿入されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞外タグは赤血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記一次抗体および／または前記二次抗体は酵素に結合していることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記酵素はペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の突然変異体は輸送に欠陥がある突然変異体であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＧ６０１Ｓであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
ｈＥＲＧの前記第１の突然変異体はＮ４７０Ｄであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＧ６０１Ｓ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
ｈＥＲＧの前記第２の突然変異体はＮ４７０Ｄ／Ｆ６５６Ｃであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｉ）は、有効量の少なくとも１種の一次抗体および有効量の少なくとも１種の二次抗体を添加するステップを含み、前記一次抗体はｈＥＲＧの前記第２の突然変異体の少なくとも１種の細胞外エピトープに結合し、前記二次抗体は前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【国際調査報告】
2007534300.tif 000002
2007534300.tif 000003