(57)【要約】  本発明は、サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子から由来した植物貯蔵根で遺伝子を高効率で発現させるプロモータと、これを含む植物貯蔵根で遺伝子を高効率で発現させるベクターと、前記発現ベクターを用いて、植物貯蔵根で外来遺伝子を一時的に発現させる一時的発現方法に関するものである。本発明によるプロモータは、植物貯蔵根で特異的に高効率で発現を誘導することができる。したがって、本発明は、植物貯蔵根で有用物質を大量で生産するための形質転換植物体の開発に非常に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対し、ｂｐ−１ないし−２，８０１部位の塩基配列を含む、植物貯蔵根用発現プロモータ。
【請求項２】
配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対し、ｂｐ＋１ないし＋２０９部位の塩基配列を含む、植物貯蔵根で遺伝子の発現に有用なサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の５’−非翻訳部位。
【請求項３】
請求項１の植物貯蔵根用発現プロモータと請求項２の５’−非翻訳部位を含む、植物貯蔵根用一時的発現ベクター（ｐＳＰｍａｄｓ−３．０）。
【請求項４】
前記プロモータは、配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対し、ｂｐ−１ないし−１，２２８部位の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の植物貯蔵根用一時的発現ベクター（ｐＳＰｍａｄｓ−１．５）。
【請求項５】
請求項３の一時的発現ベクターを含む大腸菌。
【請求項６】
請求項４の一時的発現ベクターを含む大腸菌。
【請求項７】
請求項３の植物貯蔵根用一時的発現ベクターを用いて、外来遺伝子を貯蔵根で発現させる一時的発現方法。
【請求項８】
請求項４の植物貯蔵根用一時的発現ベクターを用いて、外来遺伝子を貯蔵根で発現させる一時的発現方法。
【請求項９】
外来遺伝子を含む前記発現ベクターは、粒子銃法により貯蔵根組織に導入されることを特徴とする、請求項７に記載の一時的発現方法。
【請求項１０】
請求項１の植物貯蔵根用発現プロモータと請求項２の５’−非翻訳部位を含む、植物体形質転換用バイナリベクター。
【請求項１１】
前記プロモータは、配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対し、ｂｐ−１ないし−１，２２８部位の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の植物体形質転換用バイナリベクター。
【請求項１２】
請求項１０の植物体形質転換用バイナリベクターを含む大腸菌。
【請求項１３】
請求項１１の植物体形質転換用バイナリベクターを含む大腸菌。
【請求項１４】
請求項１０の植物体形質転換用バイナリベクターを用いて形質転換された形質転換植物体。
【請求項１５】
請求項１１の植物体形質転換用バイナリベクターを用いて形質転換された形質転換植物体。
【請求項１６】
サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子プロモータをクローニングするための、配列番号２および配列番号４で表示されるＰＣＲ用プライマー。
【請求項１７】
配列番号１で表示される配列を含むプロモータＤＮＡ断片を増幅させるための、配列番号６および配列番号７で表示されるＰＣＲ用プライマー。
【請求項１８】
配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対し、ｂｐ−１ないし−１，２２８部位の塩基配列、および配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対し、ｂｐ＋１ないし＋２０９部位の塩基配列を含むプロモータＤＮＡ断片を増幅させるための、配列番号８および配列番号９で表示されるＰＣＲ用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は植物の貯蔵根で高効率で発現させるＭＡＤＳ−ｂｏｘプロモータ、およびこれを含む発現ベクターと、前記発現ベクターを用いる一時的発現（transient assay）方法に関するものである。より詳しくは、サツマイモ由来ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子プロモータ塩基配列のうち、植物の貯蔵根で発現を誘導する塩基配列、前記塩基配列を含むプラスミドベクター、および前記ベクターを用いて貯蔵根で一時的発現を誘導する方法に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
作物の分子育種は、全ての種の遺伝子を材料として使用することができ、既存のゲノム単位のみで可能であった育種技術を遺伝子単位で無限大の育種効果を微細に調節することができるという側面で次世代農業を引いていく核心的な技術である。
【０００３】
このような作物分子育種は、技術の効果を極大化させるためには、
１）種々の植物の遺伝子を代表し得る多くの遺伝子データの蓄積が先行されていなければならなく、
２）多様な作物の形質転換システムが構築されていなければならなく、
３）外部から挿入された遺伝子の発現を調節し得る多様なプロモータの開発が先行されていなければならない。
【０００４】
国外では、１９８０年代初から植物遺伝子の発現を調節するプロモータに対する研究が進行されてきた。カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus）のプロモータが植物の全組織で強い発現を誘導する可能性が提示された（Hohn et al., 1982, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 193-236）。
【０００５】
その後、前記プロモータの塩基配列が確認され（Odell et al., 1985, Nature 313:810-812）、植物体内で強い発現が証明された（Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 1543-58）。その後、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ（Patent NO.: JP1993192172-A1）は植物で最も多く使用される普遍的なプロモータとなった。
【０００６】
一方、ＣａＭＶ ３５Ｓの確認の後、植物の組織特異的に発現するプロモータに対する研究も活発に進んでいる。植物組織別に特異的に発現するプロモータに関連した研究についてより具体的に述べると次のようである。
【０００７】
＜種子特異的に発現するプロモータに関する研究＞
種子特異的プロモータは作物分子育種での活用度が非常に高いと期待して、組織特異的プロモータに関する研究のうち、最も活発に研究が進んでいる分野である。サヤインゲン（French bean）の種子貯蔵蛋白質であるベータ−ファセオリン（beta-phaseolin）遺伝子のプロモータがクローニングされ（Bustos et al., 1989, Plant Cell 1: 839-853）、ＵＡＳ１（−２９５〜−１０９）部分が種子特異的な発現に必要なシス−要素（cis-element）であることが確認された（Bustos et al., 1991, EMBO J. 10: 1469-1479）。その後、ＵＡＳ１のうち、６８ｂｐ（−６４〜＋６）が種子特異的エンハンサー（enhancer）として作用することが報告された（van der Geest and Hall, 1996, Plant Mol. Biol. 32: 579-588）。
【０００８】
そのほかにも、ナピン（napin）遺伝子のプロモータｎａｐＡの種子特異的発現にはＢ−ｂｏｘ ＡＢＡ-ｃｏｍｐｌｅｘとＲＹ／Ｇ ｃｏｍｐｌｅｘが必要であることが確認された（Ezcurra et al., 1999, Plant Mol. Biol. 40: 699-709）。稲の貯蔵蛋白質グルテリン（glutelin）遺伝子、ＧｌｕＢ−１のプロモータ（Washida et al., 1999, Plant Mol. Biol.40: 1-12）、豌豆のトリプシン／キモトリプシン阻害（trypsin/chymotrypsin inhibitor）遺伝子（ＴＩ）のプロモータ（Welham and Domoney, 2000, Plant Sci. 159: 289-299）などが種子特異的プロモータとして開発された。
【０００９】
＜花組織特異的に発現するプロモータに関する研究＞
ペチュニアのｃｈｓＡ（chalcone synthase）遺伝子のプロモータが花組織特異的な発現をするためにはプロモータ部位の６７ｂｐが必要であることが確認され（van der Meer et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15: 95-109）、トマトのＬＡＰ（leucine aminopeptidase）遺伝子のプロモータも花組織特異的なプロモータであって、−３１７ないし−３部位が花組織特異的な発現に決定的な因子であることが確認された（Ruiz-Rivero and Prat, 1998, Plant Mol. Biol.36: 639-648）。
【００１０】
＜根組織特異的に発現するプロモータに関する研究＞
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のペロキシダーゼプロモータ（prxEa）は根組織特異的なプロモータであって、−１７２ないし−１の間で組織特異的な発現のための調節因子が存在する（Wanapu and Shinmyo, 1996, Ann N. Y. Acad. Sci. 782: 107-114）。最近、シロイヌナズナのほかの根組織特異的なプロモータ（Pyk10）が報告され、その調節因子も糾明された（Nitz et al., 2001, Plant Sci. 161: 337-346）。
【００１１】
＜ジャガイモの塊茎特異的に発現するプロモータに関する研究＞
パタチン（patatin）遺伝子はジャガイモの塊茎で多く発現される糖蛋白質であって、リピドアシルハイドロラーゼ（lipid acyl hydrolase）の活性を有する。このパタチン遺伝子のプロモータはジャガイモの塊茎特異的な発現を表し（特許番号：EP0375092,B1；Jefferson et al., 1990, Plant Mol. Biol. 14: 995-1006）。このプロモータの塊茎特異的な糖誘導的発現には−１８３ないし−１４３に位置する調節因子が決定的な役割をする（Liu et al., 1990, Mol. Genl Genet. 223: 401-406）。一方、パタチンプロモータの塊茎特異的発現を調節するトランス作用因子（trans-acting factor）である核蛋白質も報告された（Kim et al., 1994, Plant Mol. Biol.26: 603-615）。
【００１２】
一方、サツマイモのスポラミン（sporamin）が貯蔵根である塊根の全体可溶性蛋白質の６０〜８０％を占めるため、この遺伝子のプロモータをサツマイモ塊根用プロモータとして用いようとする研究が行われてきた。
【００１３】
しかし、未だ貯蔵根での発現誘導程度を確認することができなく、同一プロモータによる形質転換タバコ植物の葉柄、葉および篩管組織で高い発現を確認した（Hattori et al., Plant Mol. Biol 14: 595-604. 1990, Ohta et al., Mol. Gen. Genet. 1991, 225:369-378）。
【００１４】
したがって、このようなプロモータに関する広範囲な研究にかかわらず、いまだ貯蔵根特異的に使用可能なプロモータに関する研究は報告されたことがない。
【００１５】
〔発明の開示〕
〔技術的問題点〕
前記従来技術の問題点および要求を解決するため、本発明の目的は、植物の貯蔵根用プロモータ塩基配列を提供することにある。
【００１６】
本発明のほかの目的は、前記植物の貯蔵根用プロモータを含む植物貯蔵根用発現ベクターを提供することにある。
【００１７】
本発明のさらにほかの目的は、前記発現ベクターを用いて、外来遺伝子を貯蔵根で一時的に発現させる方法を提供することにある。
【００１８】
〔技術的解決方法〕
前記目的を達成するため、本発明者らは、サツマイモから根および貯蔵根特異的に発現するサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータ部位をクローニングして、同一遺伝子の５’−非翻訳部位を含ませて貯蔵根で強力な発現を誘導するプロモータを製作し、同一プロモータの強い発現をニンジンと大根の貯蔵根で一時的に発現させてその活性を確認することにより、本発明を完成した。
【００１９】
したがって、本発明は、配列番号１の塩基配列を含む、分離された植物貯蔵根用プロモータ部位およびサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の５’−非翻訳部位のＤＮＡ塩基配列を提供する。
【００２０】
前記プロモータのＤＮＡ塩基配列は、配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対する−１ないし−２８０１から由来することを特徴とする（図５参照）。本発明による前記プロモータは、植物の貯蔵根で目的遺伝子の強い発現を誘導することができる。
【００２１】
また、前記非翻訳部位は、配列番号１のサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の転写開始部位に対する＋１ないし＋２０９部位のＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の非翻訳部位を含み（図５参照）、前記非翻訳部位は、報告された植物のほかの遺伝子の５’−非翻訳部位のように、植物体に導入された遺伝子の翻訳効率を高めることにより、目的遺伝子の発現を著しく増加させることができる。
【００２２】
本発明の目的を達成するため、本発明は、植物貯蔵根の発現プロモータおよびＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の５’−非翻訳部位を含む植物の貯蔵根での発現のための高効率発現ベクターを提供する。
【００２３】
前記貯蔵根用高効率発現ベクターは、外来遺伝子を導入された植物体内で一時的に発現させ得る一時的発現ベクターであり得るが、好ましくは外来遺伝子を導入された植物体内で永久的に発現させ得るバイナリベクターであることがよい。本発明においては、その例として、一時的発現ベクターを用いる形質転換を実施した。
【００２４】
バイナリベクターはAgrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドとともに存在するとき、植物体を形質転換させ得るＴ−ＤＮＡのＲＢとＬＢを含有するどんなバイナリベクターともなり得るが、好ましくは当業界で多く使用されるｐＢＩ１０１（cat#: 6018-1, Clonetech, 米国)、ｐＢＩＮ（Genbank 受託番号 U09365）、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩＮ２０、ＢＩＢＡＣベクターなどを使用することがよい。
【００２５】
前記貯蔵根用高効率発現ベクターがバイナリベクターである場合は、たとえばAgrobacterium tumefaciens 法（An, G. 1987, Plant Physiology）、粒子銃法（particle bombardment, Lacorte et al., 1997, Plant Cell Reports）などにより形質転換させることができる。
【００２６】
本発明で使用した植物貯蔵根用高効率発現ベクターは、外来遺伝子を導入された植物体内で一時的に発現させ得る一時的発現用ベクターである。
【００２７】
本発明の植物体貯蔵根用発現ベクターにおいて、本発明によるプロモータおよびＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の５’−非翻訳部位はｐＢＩ２２１ベクターに含まれた外来遺伝子の前に位置する。本発明においては、ＧＵＳレポーター遺伝子が含まれたベクター（ｐＢＩ２２１）に本発明のプロモータおよび５’−非翻訳部位を挿入したｐＳＰｍａｄｓ−３．０およびｐＳＰｍａｄｓ−１．５（図６参照）を製造したが、前記ＧＵＳレポーター遺伝子は外来遺伝子の一例であって、ほかの有用な目的の外来遺伝子で置換できる。
【００２８】
また、本発明は、前記本発明による植物の貯蔵根用高効率発現ベクターを用いて一時的に形質転換された貯蔵根を提供する。
【００２９】
前記植物体高効率発現ベクターを用い、粒子銃法（Lacorte et al., 1997, Plant Cell Reports）により、植物体貯蔵根を一時的に形質転換させることができる。本発明による植物貯蔵根用発現ベクターは、貯蔵根作物の種類にかかわらず、形質転換させることができ、作物の例としてはニンジン、大根などが挙げられる。
【００３０】
本発明のほかの目的を達成するため、本発明は、前記本発明の植物貯蔵根用高効率発現ベクターを用いて、外来遺伝子を一時的に植物貯蔵根で高効率で発現させる方法を提供する。
【００３１】
前記外来遺伝子は植物貯蔵根で大量で発現可能などんな遺伝子でもあり得、本発明の植物貯蔵根用高効率発現ベクターの前記プロモータおよびサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子の５’−非翻訳部位の後に位置し、必要によってはレポーター遺伝子と融合して発現されることもできる。
【００３２】
本発明は、サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子プロモータをクローニングするための配列番号２および配列番号４で表示されるＰＣＲ用プライマーを提供する。
【００３３】
本発明は、配列番号１の塩基配列を含むプロモータのＤＮＡ断片を増幅するための配列番号６〜配列番号９で表示されるＰＣＲ用プライマーを提供する。
【００３４】
〔有利な効果〕
本発明はサツマイモ（Ipomoea batatas）由来ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータおよびその遺伝子の５’−非翻訳部位に関するもので、これは植物の根および貯蔵根特異的発現を誘導し、特に貯蔵根では高程度の発現を誘導する。したがって、本発明は、植物の貯蔵根で有用物質を大量で生産するための形質転換植物体の開発に効果的に用いられる。
【００３５】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記およびほかの目的、特徴および利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明から明らかに理解可能である。
【００３６】
図１は、本発明において、遺伝子の発現様相の分析のために使用されたサツマイモ組織を示す写真である。
【００３７】
図２は図１に示す組織のノーザンブロット分析結果を示す図である。
【００３８】
図３は本発明によるプロモータクローニングのためのＰＣＲ過程を示す図である。
【００３９】
図４はクローニングされた本発明によるプロモータを制限酵素処理により確認することを示す図である。
【００４０】
図５は本発明によるサツマイモ由来ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータおよび前記遺伝子の５’−非翻訳部位の塩基配列を示す図である。
【００４１】
図６は本発明によるサツマイモ由来ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータおよび前記遺伝子の５’−非翻訳部位を含む一時的発現ベクター（以下、“ｐＳＰｍａｄｓ−１．５またはｐＳＰｍａｄｓ−３．０”という）を示す図である。
【００４２】
図７は本発明によるｐＳＰｍａｄｓ−１．５またはｐＳＰｍａｄｓ−３．０により一時的発現を分析した結果を示す図である。
【００４３】
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。下記実施例はただ本発明を例示するためのもので、本発明の権利範囲が下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１：根および貯蔵根で特異的に発現する遺伝子の確認〕
根および貯蔵根で特異的に発現する遺伝子を確保するため、本発明者らは多様なサツマイモ組織でノーザンブロット分析を行った。より詳しく、ジンホンミサツマイモ（Ipomoea batatas cv. Jinghongmi）塊根の発達初期の発現ＥＳＴを分析した（You et al., 2003, FEBS Letters, 536; 101-105）。
【００４５】
サツマイモの塊根が発達する前の個体から、葉（Leaf-FRN）、茎（stem-FRN）、葉柄（Petiole-FRN）および根（FRN）、塊根の発達初期の個体から、葉（Leaf-SR）、茎（stem-SR）、葉柄（Petiole-SR）、根（FREN）および幼い貯蔵根（SR）、そして塊根が全く成長した後の根組織（FRLS）（図１参照）から総ＲＮＡを抽出した。
【００４６】
サツマイモＥＳＴを探針として、前記抽出されたＲＮＡをノーザンブロット分析した結果、サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子が塊根の発達前後の根組織で発現していて、塊根が発達した後、塊根組織での発現が著しく高くなることを確認した（図２参照）。しかし、そのほかのサツマイモ組織では発現しないことから、このＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子が根および貯蔵根組織特異的に発現することを確認した。
【００４７】
〔実施例２：サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータクローニング〕
サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータをクローニングするため、サツマイモ（Ipomoea batatas cv. White Star）ゲノムウォーカー（GenomeWalker）ライブラリをＰＣＲ法でクローニングした。
【００４８】
第１ＰＣＲのため、ジンホンミサツマイモ（Ipomoea batatas cv. Jinghongmi）ＥＳＴの塩基配列に基づくＭａｄｓ（１２４）Ｒプライマー（表１の配列番号２）とアダプタプライマー１（表１の配列番号３）を使用した。
【００４９】
そして、第２ＰＣＲのため、ジンホンミサツマイモ（Ipomoea batatas cv. Jinghongmi）ＥＳＴの塩基配列に基づくＭａｄｓ（９４）Ｒプライマー（表１の配列番号４）とネスティドアダプタ（nested adapter）プライマー２（表１の配列番号５）を使用し、ユニバーサルゲノムウォーカーキット（Universial Genome Walker kit, Clonetech）指針書にしたがって行った。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
その結果を図３および図４に示すが、各図は第１ＰＣＲおよび第２ＰＣＲの産物をアガロースゲルで電気泳動した写真である。第２ＰＣＲ産物のうち、２番産物（３−６ｋｂ）をアガロースゲルから抽出し、ＴＯＰＯ ＸＬ ＰＣＲクローニングキット（Invitrogen）によりｐＣＲ−ＸＲ−ＴＯＰＯベクターに挿入した後、２０個の大腸菌（E.coli）コロニーからプラスミドを抽出して制限酵素で確認し（図４）、塩基配列を決定した後、このうち、ジンホンミサツマイモ（Ipomoea batatas cv. Jinghongmi）ＥＳＴの５’塩基配列と一致する一つのプラスミドを確認し（図４の１０番）、クローニングされた部位全体（およそ３ｋｂ）の塩基配列をＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録した（Accession no. AY655162）。
【００５２】
図５は本発明によるサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘのプロモータと５’−非翻訳部位の塩基配列を示す。蛋白質合成の開始コドン‘ＡＴＧ’は下線表示し、転写開始部位の塩基‘Ａ’は＋１で表示した。５’−非翻訳部位には推定のイントロン（イタリック体で表示）が存在するが、このイントロン部位の塩基がジンホンミサツマイモ（Ipomoea batatas cv. Jinghongmi）のｃＤＮＡ上の塩基配列と相違する。
【００５３】
〔実施例３：植物貯蔵根用プロモータの一時的発現用ベクター構築〕
実施例２でクローニングされたサツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子プロモータと５’−非翻訳部位をｐＢＩ２２１ベクター（Clonetech）に挿入した。この際、プロモータ部位は二つの大きさ、つまり３，０１０ｂｐ（−１ないし−２８０１）プロモータと１，４３７ｂｐ（−１ないし−１２２８）プロモータを使用したが、両プロモータ共に５’−非翻訳部位の２０９ｂｐを含んだ。
【００５４】
前記３，０１０ｂｐプロモータと１，４３７ｂｐプロモータはＰＣＲで増幅させ、ＳｐｈＩとＢａｍＨＩで切断した後、ｐＢＩ２２１のＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩ位置に挿入してｐＳＰｍａｄｓ−３．０、ｐＳＰｍａｄｓ−１．５と命名した（図６参照）。前記ＰＣＲに使用されたプライマーは表２に具体的に示した。
【００５５】
この際、ＰＣＲは、まず９４℃で４分間処理した後、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２分３０秒のサイクルを５回行った後、９４℃で１分、６３℃で１分、７２℃で２分３０秒のサイクルを５回行った後、９４℃で１分、６６℃で１分、７２℃で２分３０秒のサイクルを２０回行った後、７２℃で５分間処理した。
【００５６】
【表２】
2007528199.tif 000004
【００５７】
〔実施例４：一時的発現分析による貯蔵根用プロモータの活性確認〕
ｐＳＰｍａｄｓ−３．０とｐＳＰｍａｄｓ−１．５ベクターの活性を植物の貯蔵根組織で確認するため、一時的発現分析を実施した。このため、肥大成長中の直径２ｃｍ以下のニンジンと大根（Raphanus Sativus L.）の貯蔵根を採取し洗浄した後、貯蔵根を横方向におよそ５ｍｍの厚さに切断し、十分な湿度を維持する状態でペトリ皿に入れ、４℃で４〜５時間放置した。
【００５８】
Ｓａｎｆｏｒｄなどの方法（1993, Meth Enzymol 217:485-509）にしたがい、直径１．０μｍのゴールド粒子にＤＮＡを混合してコートし、ＤＮＡ濃度１．０μｇ、ヘリウムガス圧力１，３５０ｐｓｉ、ニンジンまたは大根（Raphanus Sativus L.）との距離６ｃｍの条件でボンバーディング（bombarding）を行った。
【００５９】
ボンバーディングの後、２５℃の暗所で２４時間放置した後、ＧＵＳ活性を組織化学的染色方法で確認した。ニンジンと大根（Raphanus Sativus L.）の切断された貯蔵根組織を染色するため、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）に溶解した１ｍＭのＸ−ｇｌｕ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide）、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（sodium phosphate、pH 7.0）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのフェリシアン化カリウム（potassium ferricyanide）、０．５ｍＭのフェロシアン化カリウム（potassium ferrocyanide）、および０．１％のトリトンＸ−１００を含有する溶液に漬けて３７℃で２４時間反応させた。
【００６０】
溶液を除去した後、切断された貯蔵根組織を７０％のエタノールで２４時間リンスし、毎日交替する１００％のエタノールに数日間入れることで、組織に存在する色素を除去した。
【００６１】
その結果、図７に示すように、ｐＳｍａｄｓ−３．０は、ニンジン貯蔵根から二次水管を除いた全組織で活性を表し、ｐＳｍａｄｓ−１．５は、ニンジン貯蔵根の全組織で強活性を表した。また、両プロモータは共にニンジンの形成層で強活性を表した。
【００６２】
一方、ｐＳＰｍａｄｓ−３．０とｐＳＰｍａｄｓ−１．５共に大根（Raphanus Sativus L.）の貯蔵根の全組織で強活性を表した。反面、同一プロモータでニンジンと大根（Raphanus Sativus L.）の葉を形質転換させた結果、前記プロモータは活性を表さなかった（図７）。
【００６３】
以上の結果とノーザンブロット分析を総合した結果、本発明によるプロモータの活性は貯蔵根および根特異的であると言える。
【００６４】
〔産業上の利用可能性〕
前述したように、本発明においては、サツマイモＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータと同一遺伝子の５’−非翻訳部位を含む貯蔵根用プロモータをｐＢＩ２２１に挿入させて、一時的発現による分析用ベクターを製造し、一時的発現分析により同一プロモータがニンジンと大根（Raphanus Sativus L.）の貯蔵根で強活性を表すことを確認した。この活性は根および貯蔵根特異的活性であると言える。
【００６５】
本発明によるプロモータは、形質転換貯蔵根組織で有用な蛋白質を大量で生産しようとするとき、あるいは形質転換体による貯蔵根組織の代謝調節および機能性物質生産などに効果的に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明において、遺伝子の発現様相の分析のために使用されたサツマイモ組織を示す写真である。
【図２】図１に示す組織のノーザンブロット分析結果を示す図である。
【図３】本発明によるプロモータクローニングのためのＰＣＲ過程を示す図である。
【図４】クローニングされた本発明によるプロモータを制限酵素処理により確認することを示す図である。
【図５】本発明によるサツマイモ由来ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータおよび前記遺伝子の５’−非翻訳部位の塩基配列を示す図である。
【図６】本発明によるサツマイモ由来ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子のプロモータおよび前記遺伝子の５’−非翻訳部位を含む一時的発現ベクター（以下、“ｐＳＰｍａｄｓ−１．５またはｐＳＰｍａｄｓ−３．０”という）を示す図である。
【図７】本発明によるｐＳＰｍａｄｓ−１．５またはｐＳＰｍａｄｓ−３．０により一時的発現を分析した結果を示す図である。
【国際調査報告】
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