(57)【要約】【課題】眼における血管漏出等について動物を予防的又は治療的に処置する方法の提供。【解決手段】本発明は、眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法に関する。本方法は、動物の眼における血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物に、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む。本発明はまた、眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。本方法は、動物の血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物にＰＥＤＦを眼周囲に投与することを含む。本発明はまた、眼における非糖尿病性血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。本方法は、眼における非糖尿病性血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物にＰＥＤＦを投与することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法であって、該方法は、動物の眼における血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを、それを必要とする動物に投与することを含む、方法。
【請求項２】
該方法が、眼における血管漏出に罹患している動物を治療的に処置することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
発現ベクターが眼に直接投与される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
発現ベクターがアデノ随伴ベクターである、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
発現ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の全ての必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む、請求項６又は請求項７記載の方法。
【請求項９】
アデノウイルスベクターが、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む、請求項６〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む、請求項６〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の全ての必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む、請求項６〜８又は１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターが、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ１領域及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
血管漏出が眼血管新生を伴うものである、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
眼血管新生が脈絡膜の血管新生である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
眼血管新生が網膜の血管新生である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
発現ベクターが、血管漏出の領域に直接投与される、請求項１〜１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
発現ベクターが、神経起源の細胞、毛様体上皮細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、内皮細胞、小柱網の細胞、虹彩上皮細胞、角膜細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、又は星状細胞と接触する、請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
発現ベクターが、局所、結膜下、硝子体内、眼球後、眼周囲、網膜下、脈絡膜上、又は眼内に投与される、請求項１〜１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
アデノウイルスベクターが、約１×１０６〜約１×１０９．５粒子の用量で硝子体内に投与される、請求項５〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
アデノウイルスベクターが、約１×１０５〜約１×１０８．５の用量で網膜下に投与される、請求項５〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
アデノウイルスベクターが、約１×１０７〜約１×１０１２の用量で眼周囲に投与される、請求項５〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
アデノウイルスベクターが、脈管形成阻害剤をコードする核酸配列をさらに含む、請求項５〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
該方法が、脈管形成阻害剤をコードする核酸配列を含む異なるアデノウイルスベクターを、眼に投与することをさらに含む、請求項５〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
脈管形成阻害剤が、抗脈管形成因子、脈管形成因子に特異的なアンチセンス分子、リボザイム、及び脈管形成因子に対するレセプターからなる群より選ばれる、請求項２２又は請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
脈管形成阻害剤が可溶性ｆｌｔである、請求項２２〜２４のいずれか記載の方法。
【請求項２６】
該方法が、動物の同じ眼に２以上の適用においてＰＥＤＦを投与することを含む、請求項１〜２５のいずれか記載の方法。
【請求項２７】
眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法であって、該方法は、動物の眼における血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を、それを必要とする動物に眼周囲投与することを含む、方法。
【請求項２８】
眼における非糖尿病性血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法であって、該方法は、動物の眼における非糖尿病性血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を、それを必要とする動物に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
ＰＥＤＦが動物の眼に直接投与される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＰＥＤＦが、局所、結膜下、硝子体内、眼球後、眼周囲、網膜下、脈絡膜上、又は眼内に投与される、請求項２８又は請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＰＥＤＦが眼に眼周囲投与される、請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
該方法が、眼における血管漏出に罹患している動物を治療的に処置することを含む、請求項２７〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
該方法が、脈管形成阻害剤を動物に投与することをさらに含む、請求項２７〜３２のいずれか記載の方法。
【請求項３４】
脈管形成阻害剤がｓｆｌｔである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
脈管形成阻害剤が動物において産生されるように、脈管形成阻害剤をコードする核酸が動物に投与される、請求項３３又は請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、眼における血管漏出（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ）について動物を予防的又は治療的に処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
世界の人口の圧倒的多数は、一生の間に幾らかの程度の視力低下を経験する。視力低下は、年齢、人種、経済的もしくは社会的地位、又は地理上の位置にかかわらず、実質的に全ての人々に影響する。眼関連障害は、しばしば生命を脅かすものではないが、罹患した個人の自立を台無しにするライフスタイルの変化を必要とする。視力不全は、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、網膜剥離、毒素性網膜症、網膜血管疾患、網膜変性、血管異常、加齢性黄斑変性症及び他の後天性障害、感染性疾患、炎症性疾患、眼虚血、妊娠関連障害、網膜腫瘍、脈絡膜腫瘍、脈絡膜障害、硝子体障害、外傷、白内障合併症、ドライアイ、及び炎症性眼神経障害を含む殆ど全ての眼障害から生じ得る。
【０００３】
重篤な視力低下及び失明の主要な原因は、眼の血管構造が損傷するか、又は不十分に調節される眼関連障害である。血管新生の局面を含む眼関連疾患は多数あり、例えば、滲出性加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生、脈絡膜血管新生、新生血管緑内障、毛葉体炎、ヒッペル−リンダウ病、未熟児網膜症、翼状片、ヒストプラスマ症、虹彩血管新生、黄斑浮腫、緑内障に伴う血管新生などが挙げられる。重篤な視力低下は、血管新生から直接的に生じるのではなく、網膜上での血管新生の効果から生じると考えられる。網膜は、その上で画像を受容する繊細な眼の膜である。網膜の中心付近には、黄斑（視覚が最も鋭い網膜組織の楕円形の領域）がある。網膜は、中心窩（即ち、黄斑の中心に存在する中心の窪み）で最も繊細である。網膜の損傷、即ち、網膜剥離、網膜裂傷、又は網膜変性は、視力低下と直接連関する。
【０００４】
眼の層内及び硝子体腔内の液体の蓄積は、網膜剥離、眼の感覚細胞の変性、眼内圧の上昇、及び炎症（これらの全ては、視力及び眼の全般的な健常性に不利に影響する）を引き起こし得る。例えば、非増殖性糖尿病性網膜症に伴う視力低下は、血管漏出から生じる網膜浮腫、特に糖尿病性黄斑浮腫に依拠する。限局性及び散在性の血管漏出は、微小血管異常、網膜内微細動脈瘤、毛細血管閉鎖及び網膜出血の結果として起こる。血管漏出の長期化は、最終的に、基底膜の肥厚並びに軟性及び硬性滲出物の形成に至る。非増殖性糖尿病性網膜症はまた、網膜周細胞の損失によっても特徴付けられる。糖尿病性網膜症の増殖性段階は、網膜又は円板（ｄｉｓｃ）の内表面にわたる網膜又は視神経からの、又は硝子体腔内への血管新生及び線維血管（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）増殖（即ち、グリア及び線維要素を含む瘢痕化）によって特徴付けられる。網膜又は脈絡膜の血管新生に伴い新たに形成された血管はしばしば透過性であり、それにより血管液の周囲組織内への漏出、並びに線維性組織の形成及び瘢痕化を許容する。血管構造から眼の組織内への物質の漏出及び瘢痕化は、視力低下につながり得る。
【０００５】
網膜、脈絡膜、及び黄斑浮腫を含む多くの眼関連障害について、現在のところ、効果的な治療選択肢は何ら利用可能ではない。血管新生を低減させるため、レーザー光凝固が、眼の種々の領域にレーザー焼灼を投与するために用いられている。血管新生の低減は、周囲組織に蓄積する血管液の低減につながり得る。レーザー処置はまた、液体の蓄積を止めるために、漏出している血管構造を密閉し得る。例えば、限局的な黄斑光凝固が、黄斑の外側の血管漏出の領域を治療するために使用されている（非特許文献１）。同様に、血管新生、特に進行性の増殖性網膜症は、散乱又は汎網膜光凝固によって通常処置される。しかし、レーザー処置は、処置した領域に対応する永久的な盲目スポットを引き起こし得る。レーザー処置はまた、持続性又は反復性の出血を引き起こし得るか、網膜剥離のリスクを増強させ得るか、又は血管新生もしくは線維化を誘導し得る。さらに、多くの患者は、レーザー処置に応じ得ない。殆どの場合において、眼血管新生及び制御不能な血管透過性についての全ての利用可能な処置選択肢は、限定された治療効果を有し、繰り返される高価な手法を必要とし、そして／又は、危険な副作用を伴う。
【非特許文献１】Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｍｅｒ．Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，５１（４），７８５−７９６（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
眼関連障害の罹患率を考慮すれば、依然として眼関連障害、特に、血管漏出を伴う障害の効果的な予防的及び治療的処置の必要性がある。従って、本発明は、眼における血管漏出について動物を予防的及び治療的に処置するための物質及び方法を提供する。本発明のこの及び他の利点は、本明細書中に提供される詳細な説明から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、眼関連障害の予防的又は治療的処置のための方法を提供する。特に、本発明は、眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。本方法は、動物の眼における血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物に、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む。好ましくは、発現ベクターはアデノウイルスベクターであり、動物は、眼における血管漏出に罹患している。
【０００８】
さらに、本発明は、眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供し、本方法は、動物の眼における血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物にＰＥＤＦを眼周囲に投与することを含む。本発明はさらに、眼における非糖尿病性血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供し、本方法は、動物の眼における非糖尿病性血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物にＰＥＤＦを投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、眼の層内の血管漏出について、動物、好ましくはヒトを予防的又は治療的に処置する方法に関する。血管漏出について動物を処置すること自体により、本発明の方法は、血管漏出又は眼障害（血管漏出が障害の合併症である）により引き起こされる眼障害の治療又は予防における利用性を有する。特に、本発明は、眼内の血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。本方法は、眼における血管漏出が治療的又は予防的に処置されるように、それを必要とする動物に、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む。好ましくは、発現ベクターは、眼に直接投与され、それにより発現ベクターが眼細胞に接触し、この細胞が発現ベクターにより形質導入される。ＰＥＤＦをコードする核酸配列は、異常な血管を含む、又は異常な血管構造を発達させるリスクがある眼の領域にＰＥＤＦを送達するために発現される。さらに、本発明は、眼における血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供し、本方法は、動物の眼における血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、それを必要とする動物にＰＥＤＦを投与することを含む。一実施形態では、ＰＥＤＦは、眼周囲に投与される。あるいは又はさらに、血管漏出は、非糖尿病性である（即ち、糖尿病に関連付けられていない）。本発明はまた、眼関連障害を処置するための物質を提供する。
【００１０】
（血管漏出）
眼の血管構造からの液及び代謝物の漏出は、種々の眼関連障害又は損害により引き起こされ得る。眼の血管構造は、毛細管閉塞、網膜末梢血管拡張、血管間接合の破損、毛細血管瘤、傷害、炎症、新しい脆弱な血管の発達、感染、及び眼組織内の巨大分子の不均衡に起因して不自然に透過性になり得る。多くの認識される眼関連障害は、血管漏出成分を含む。例えば、血管漏出は、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、未熟児網膜症、網膜性血管疾患、血管異常、脈絡膜障害、脈絡膜血管新生、血管新生緑内障、緑内障、黄斑浮腫（例、糖尿病性黄斑浮腫）、網膜浮腫（例、糖尿病性網膜浮腫）、中心性（ｃｅｎｔｒａｌ）漿液性網脈絡膜症、及び眼の層内の血管液の蓄積により引き起こされる網膜剥離を伴う。これらの眼障害に罹患している患者はしばしば、眼の網膜又は脈絡膜層における血管液の制御不能な漏出を実証する。血管漏出はしばしば血管新生（及び眼の血管新生に伴う障害）を伴うが、眼内の液の蓄積、及び特に黄斑浮腫は、異常な血管新生を必ずしも含まないことが理解されるであろう。眼の浮腫は、例えば、手術的手法（例、白内障手術から生じる類嚢胞黄斑浮腫）、感染、異常な免疫応答、及び炎症（例、ブドウ膜炎）に関連付けられている。本発明の方法がＰＥＤＦポリペプチドを動物に投与することを含む場合、血管漏出は好ましくは、糖尿病に関連しない、又はそれにより引き起こされず、例えば、血管漏出は、糖尿病性網膜症又は糖尿病性黄斑浮腫に関連付けられない。この点において、本発明は、眼における非糖尿病性血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。本方法は、非糖尿病性血管漏出が予防的又は治療的に処置されるように、ＰＥＤＦを動物に投与することを含む。
【００１１】
血管漏出は、眼の密な結合層内の液を沈着させ、それにより眼の天然構築体を破壊するのみならず、例えば脂質滲出物、鉱物、糖等の血液の他の成分もまた沈着させる。眼内の血管液の漏出及び貯留の最も一般的な合併症は、網膜剥離、炎症、及び視力インピーダンスである。実際、非常に多くの網膜損傷は、浮腫、下にある膜の肥厚、及び代謝副産物の堆積の結果として起こる。
【００１２】
本明細書中に記載されている治療用物質での処置に適切な他の眼障害としては、加齢性黄斑変性症及び他の後天性障害、眼内炎、感染性疾患、炎症性疾患、ＡＩＤＳ関連障害、眼虚血性症候群、妊娠関連障害、末梢網膜変性症、網膜変性症、毒素性網膜症、白内障、網膜腫瘍、角膜血管新生、脈絡膜腫瘍、硝子体障害、及び増殖性硝子体網膜症、毛様体炎、非貫通性外傷、貫通性外傷、白内障後合併症、ヒッペル−リンダウ病、ドライアイ、炎症性眼神経障害、翼状片、虹彩血管新生、ブドウ膜炎、病的近視、手術誘導性障害などが挙げられるが、それらに限定されず、これらの障害のうちの多くが、眼の血管構造からの血液又は血液副産物の漏出につながり得る。
【００１３】
血管漏出はしばしば、脈絡膜の血管新生等の制御不能な眼血管新生を伴う。脈絡膜は、網膜下に位置する薄い血管膜である。脈絡膜の異常な血管新生は、例えば、光凝固、前部虚血性視神経障害、ベスト病、脈絡膜血管腫、金属性眼内異物、脈絡膜非灌流、脈絡膜骨腫、脈絡膜裂傷、細菌性心内膜炎、コロイデレミア、慢性網膜剥離、ドルーゼ、代謝廃棄物沈着、内因性カンジダ眼内炎、鋸状縁での血管新生、手術用顕微鏡による火傷、点状内部脈絡膜症（ｐｕｎｃｔａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ）、放射線網膜症、網膜低温傷害、網膜色素変性症、網膜脈絡膜欠損、風疹、網膜下排液、傾斜椎間板症候群（ｔｉｌｔｅｄ  ｄｉｓｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、トキソプラズマ脈絡網膜炎、結核などから生じる。
【００１４】
あるいは、血管漏出は、網膜の血管新生に伴い得る。網膜血管新生は、多くの眼の疾患及び障害（それらの多くは上で述べられる）に伴う症候である。網膜血管新生の一般的な原因としては、虚血、ウイルス感染、及び網膜損傷が挙げられる。網膜の血管新生は、黄斑浮腫、網膜下変色、瘢痕化、出血などにつながり得る。網膜血管新生に伴う合併症は、新しく形成された血管の増殖、破断及び漏出に依拠する。血液が硝子体腔を満たし、効率的に除去されないと視力は損なわれる。光の通過が妨げられるのみならず、過剰の血液及び代謝物に対する炎症応答が、眼組織に対するさらなる損傷を引き起こし得る。さらに、新しい血管は、線維性瘢痕組織を形成し、この組織は、経時的に、網膜を乱し、網膜の裂傷及び剥離を引き起こすであろう。血管漏出はまた、加齢性黄斑変性症の湿形態、即ち、滲出性黄斑変性症から生じ得る。
【００１５】
本発明は、眼の血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。「予防的」とは、血管漏出に対する全体的又は部分的な保護を意味する。「治療的」とは、血管漏出の緩解自体（例、血管構造の透過性の減少又は新たな漏出性血管の破壊）、及び眼血管構造のさらなる異常な漏出に対する全体的又は部分的な緩解を意味する。当業者は、眼における血管漏出からの任意の程度の保護又は緩解が患者に有益であることを理解するであろう。好ましくは、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はＰＥＤＦタンパク質自体が、少なくとも一方の眼が血管漏出に罹患している動物に投与される。本発明は、治療剤が、現在用いられている治療の有害な副作用無しに患部に直接的に適用され得るという点で特に利点がある。
【００１６】
本発明の方法は、眼血管構造の制御不能な漏出に関連する、急性及び持続性の両方の進行性眼関連障害の処置に有用である。急性の病気については、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はＰＥＤＦタンパク質自体が、短期間内に、単回又は複数回の適用を用いて投与され得る。持続性の血管漏出（例、糖尿病性網膜症又は糖尿病性黄斑変性症に伴うもの）については、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドの多数回の適用が、治療効果を実現するのに必要であり得る。
【００１７】
眼における血管漏出は、種々の技術により検出され得る。臨床医はしばしば、眼における血管漏出の領域を検出するためにフルオレセイン血管造影図を頼りにする。患者は、蛍光色素を投与され、血管構造を通るその移動が、眼の後方の写真を複数の時点で撮影することにより評価される。眼血管構造からの色素の漏出に起因する過剰蛍光が検出され、主観的に定量され得る。総体の漏出が、隣接組織内への血管液の拡散を示唆する、血管造影図上の染色として検出可能である。フルオレセイン色素「プール」は、血液／網膜バリアの破損から生じ得る、組織剥離の領域において観察される。眼の後部が色素投与の不在下で撮影される眼底写真では、血管漏出は、写真のぼやけた区分として出現する。血管漏出の軽減は、より明瞭な写真を生じる。あるいは、網膜の厚さが、眼血管構造の漏出の尺度として用いられ得る（例、網膜の厚さの増加は、網膜又は脈絡膜内の血管漏出を示す）。光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）は、網膜の高解像度の画像化を可能にする非侵襲性技術である。光散乱技術を用いて、網膜の層が同定され得、そして網膜の厚さが測定され得る。本発明の状況では、当業者は、本明細書中に記載されているそれらの技術及び当該技術分野において公知の他のものを含む任意の適切な技術（例えば、Ｇｅｈｌｂａｃｈら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１４，１２９−１４１（２００３））を用いて血管漏出における増加又は減少を決定し得る。
【００１８】
（発現ベクター）
当業者は、任意の多くの発現ベクターが、本発明の方法における使用に適切であることを理解するであろう。適切な発現ベクターの例としては、例えば、プラスミド、プラスミド−リポソーム複合体、及びウイルスベクター、例えば、パルボウイルスベースのベクター（即ち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター）、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイルスベースのベクターが挙げられる。これらの発現ベクターはいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。
【００１９】
遺伝子操作された環状の二本鎖ＤＮＡ分子であるプラスミドは、動物に対して、好ましくは、プラスミドが眼細胞をトランスフェクトするように動物の眼に対して直接的に、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を送達するために、発現カセットを含むように設計され得る。プラスミドは、治療用核酸の投与の目的で記載されている第１のベクターであるが、トランスフェクション効率のレベルは、他の技術と比較して乏しい。プラスミドをリポソームと複合体化することによって、遺伝子移入の効率は一般的に改善される。プラスミド媒介遺伝子移入ストラテジーのために使用されるリポソームは、種々の組成を有するが、それらは、代表的には、合成カチオン性脂質である。プラスミド−リポソーム複合体の利点としては、治療用核酸をコードする大きなＤＮＡを移入するそれらの能力、及びそれらの比較的低い免疫原性が挙げられる。
【００２０】
プラスミドは、しばしば、短期間発現のために使用される。しかし、プラスミド構築物は、長期の発現を得るように改変され得る。パルボウイルス、特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、ＡＡＶにしばしば関連する、高レベルの持続的な核酸発現を担うことが最近発見された（例えば、米国特許第６，１６５，７５４号参照）。従って、発現ベクターは、ＰＥＤＦをコードする導入遺伝子等の導入遺伝子の長期及び実質的な発現を得るために、ネイティブのパルボウイルスＩＴＲを含むプラスミドであり得る。プラスミドは、本発明の状況における使用に適切であるが、好ましくは、発現ベクターはウイルスベクターである。
【００２１】
ＡＡＶベクターは、遺伝子治療プロトコルにおける使用のために特に興味深いウイルスベクターである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こすことが知られていないＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（即ち、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）との共感染、あるいはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与のために使用されるＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製及びパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復（ＩＴＲ）のみが残存するように、親ゲノムのおよそ９６％を欠失している。これは、ウイルス遺伝子の発現に起因する免疫原性又は毒性の副作用を排除する。さらに、所望される場合、ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質の送達は、ゲノムの特定の領域への、ＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターの組み込みを可能とする。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞の増殖又は形態において如何なる変化も示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号参照）。効率的ではあるが、ヘルパーウイルス又はヘルパー遺伝子の必要性は、このベクターの広範な使用にとっての障害であり得る。
【００２２】
レトロウイルスは、広範な種々の宿主細胞に感染し得るＲＮＡウイルスである。感染の際、レトロウイルスゲノムは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞ＤＮＡと共に複製され、それによって、ウイルスＲＮＡ及びレトロウイルスゲノムに組み込まれた任意の核酸配列を不変的に産生する。病原性レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）を用いる場合は、毒性を除去するためにウイルスゲノムを改変する際に注意を払わなければならない。レトロウイルスベクターはさらに、ウイルスを複製不能にするように操作され得る。それ故、レトロウイルスベクターは、インビボでの安定な遺伝子移入のために特に有用であると考えられている。ＨＩＶベースのベクター等のレンチウイルスベクターは、遺伝子送達のために使用されるレトロウイルスベクターの例である。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶベースのベクターは、非分裂細胞にそれらのパッセンジャー遺伝子を組み込むことが知られており、従って、眼関連疾患の萎縮形態を処置するのに有用であり得る。
【００２３】
ＨＳＶベースのウイルスベクターは、核酸を眼細胞に導入する発現ベクターとして使用するのに適切である。成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直線状の二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する被覆性の正二十面体カプシドからなる。大部分の複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を妨げるために１以上の前初期遺伝子を除く欠失を含む。ヘルペスベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現を生じ得る潜伏期に入るその能力、及び２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡを収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムにある。もちろん、この能力はまた、短期間の処置レジメンの観点では不利である。本発明の方法における使用に適切なＨＳＶベースのベクターの説明については、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号；同第５，８４６，７８２号；同第５，８４９，５７２号；及び同第５，８０４，４１３号、並びに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、及びＷＯ９９／０６５８３を参照のこと。
【００２４】
アデノウイルス（Ａｄ）は、眼に関連する細胞型を含む、種々の異なる標的細胞型にインビボでＤＮＡを効率的に移入する３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスである。本発明の方法における使用について、このウイルスは、好ましくは、ウイルス複製のために必要な選択された遺伝子を欠失させることによって、複製欠損にされる。消耗性のＥ３領域もまた、しばしば、より大きなＤＮＡ挿入物のためのさらなる余地を可能にするために欠失される。ベクターは、高力価で産生され得、複製性及び非複製性細胞に効率的にＤＮＡを移入し得る。新たに移された遺伝子情報は、染色体上に残留し、それ故、標的細胞の遺伝子型のランダムな挿入変異誘発及び永久的な変更のリスクを排除する。しかし、所望される場合、ＡＡＶの組み込み特性は、ＡＡＶ−Ａｄキメラベクターを構築することによって、アデノウイルスに付与され得る。例えば、アデノウイルスベクターに取り込まれたＡＡＶ  ＩＴＲ及びＲｅｐタンパク質をコードする核酸は、アデノウイルスベクターが哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれるのを可能とする。従って、ＡＡＶ−Ａｄキメラベクターは、本発明における使用についての興味深い選択肢である。
【００２５】
好ましくは、本発明の方法の発現ベクターは、ウイルスベクターである；より好ましくは、発現ベクターはアデノウイルスベクター（例、ヒトアデノウイルスベクター）である。任意の起源、任意の亜型、亜型の混合物、又は任意のキメラアデノウイルスからのアデノウイルスが、本発明のアデノウイルスベクターについてのウイルスゲノムの供給源として用いられ得る。ヒトアデノウイルスは好ましくは、アデノウイルスベクターについてのウイルスゲノムの供給源として用いられる。アデノウイルスは、任意のサブグループ又は血清型（例、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から現在入手可能であるアデノウイルス血清型１〜５１）であり得る。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例、血清型１２、１８及び３１）、サブグループＢ（例、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５及び５０）、サブグループＣ（例、血清型１、２、５、及び６）、サブグループＤ（例、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、及び４２〜４８）、サブグループＥ（例、血清型４）、サブグループＦ（例、血清型４０及び４１）、未分類の血清型群（例、血清型４９及び５１）、あるいは任意の他のアデノウイルス血清型群であり得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、サブグループＣ、特に血清型２又はさらにより望ましくは血清型５である。
【００２６】
しかしながら、非グループＣアデノウイルスは、及び非ヒトアデノウイルスでさえも、眼細胞へのＤＮＡの送達のためのアデノウイルス遺伝子移入ベクターを調製するために使用され得る。非グループＣアデノウイルス遺伝子移入ベクターの構築に用いられる好ましいアデノウイルスとしては、Ａｄ１２（グループＡ）、Ａｄ７及びＡｄ３５（グループＢ）、Ａｄ９、Ａｄ３０及びＡｄ３６（グループＤ）、Ａｄ４（グループＥ）、並びにＡｄ４１（グループＦ）が挙げられる。非グループＣアデノウイルスベクター、非グループＣアデノウイルスベクターの製造方法、及び非グループＣアデノウイルスベクターの使用方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、第５，８３７，５１１号、及び第５，８４９，５６１号、並びに国際特許出願ＷＯ９７／１２９８６及びＷＯ９８／５３０８７に開示されている。好ましいヒトアデノウイルスとしては、サル（例、ＳＡＶ２５）、ウシ、イヌ、ブタのアデノウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２７】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされる少なくとも１つの遺伝子機能を欠損し、それにより、「複製欠損」アデノウイルスベクターを生じる。「複製欠損」とは、アデノウイルスベクターが、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠くアデノウイルスゲノムを含む（即ち、それにより、アデノウイルスベクターが、代表的な宿主細胞において、特に、本発明の治療の過程でアデノウイルスベクターによって感染され得るヒト患者中の宿主細胞において複製しない）ことを意味する。本明細書中で用いられる場合、遺伝子、遺伝子機能、あるいは遺伝子又はゲノム領域における欠損は、核酸配列が全体的又は部分的に欠失した遺伝子の機能を損なうか、又は消失させる、ウイルスゲノムの十分な遺伝物質の欠失として定義される。遺伝子領域全体の欠失は、しばしば、複製必須遺伝子機能の破壊に必要ではない。しかしながら、１以上の導入遺伝子についてアデノウイルスゲノムに十分な空間を提供する目的のために、遺伝子領域の大部分の除去が望ましいものであり得る。遺伝物質の欠失が好ましいが、付加又は置換による遺伝物質の変異もまた、遺伝子機能の破壊に適切である。複製必須遺伝子機能は、複製（例、増殖）に必要であり、例えば、アデノウイルス初期領域（例、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ４領域）、後期領域（例、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例、ＩＶａ２遺伝子）、及びウイルス付随ＲＮＡ（例、ＶＡ−ＲＮＡ−１及び／又はＶＡ−ＲＮＡ−２）によりコードされる遺伝子機能である。より好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１以上の領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む。この点では、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ４領域又はＥ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能を欠損する。Ｅ１領域における欠損に加え、組換えアデノウイルスはまた、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）中に変異を有し得る。ＭＬＰにおける変異は、国際特許出願ＷＯ００／００６２８において議論されるように、それがプロモーターの応答性を変更するような任意のＭＬＰ制御エレメント中にあり得る。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能及びＥ３領域の少なくとも一部を欠損する（例、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）。Ｅ１領域に関して、アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部及びＥ１ｂ領域の少なくとも一部を欠損（例、欠失）し得る。例えば、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域全体及びＥ３領域の一部（即ち、ヌクレオチド３５５〜３，５１１及び２８，５９３〜３０，４７０）の欠失を含み得る。単一欠損アデノウイルスベクターは、およそヌクレオチド３５６〜３，３２９及び２８，５９４〜３０，４６９（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）を欠失し得る。あるいは、アデノウイルスベクターゲノムは、およそヌクレオチド３５６〜３，５１０及び２８，５９３〜３０，４７０（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）を欠失し得、それによりアデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域における欠失を有するアデノウイルスベクターを生じる。欠失されたヌクレオチド部分を規定する端点は、正確に決定するのが困難であり得、代表的にはアデノウイルスベクターの性質に有意に影響を与えない。即ち、上記ヌクレオチド数の各々は、±１、±２、±３、±４、±５、あるいは±１０又は±２０ヌクレオチドでさえあり得る。
【００２８】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、「多重欠損」である。これは、アデノウイルスベクターが、２以上の領域の各々でウイルス複製に必要とされる１以上の必須遺伝子機能を欠損していることを意味する。例えば、上記Ｅ１欠損、又はＥ１、Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子をさらに欠損し得る。Ｅ４欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、例えば、必要に応じてＥ１領域での欠失（例、Ｅ１領域のヌクレオチド３５６〜３，３２９、ヌクレオチド３５６〜３，５１０、又はヌクレオチド４５７〜３３３２）、並びに／あるいはＥ３領域での欠失（例、ヌクレオチド２８，５９４〜３０，４６９又はヌクレオチド２８，５９３〜３０，４７０）に加えて、ヌクレオチド３２，８２６〜３５，５６１（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）の欠失を含み得る。必要に応じて、ＶＡ−ＲＮＡ１をコードする領域のヌクレオチド１０５９４〜１０５９５が欠失され得る。上で列挙した特定のヌクレオチド指定は、アデノウイルス血清型５ゲノムに対応するものであるが、非血清型５アデノウイルスゲノムについて対応するヌクレオチドは、当業者により容易に決定され得る。
【００２９】
あるいは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全て又は一部及びＥ２領域の全て又は一部（例、Ｅ２Ａ領域）を欠く。しかしながら、Ｅ１領域の全て又は一部、Ｅ２領域の全て又は一部、及びＥ３領域の全て又は一部を欠くアデノウイルスベクターもまた、本明細書中で意図される。一実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全て又は一部、Ｅ２領域の全て又は一部、Ｅ３領域の全て又は一部、及びＥ４領域の全て又は一部を欠く。多重欠損ウイルスベクターは、このようなベクターが外因性ＤＮＡの大きな挿入物を受容し得るという点で特に有用である。実際、ウイルスゲノムのパッケージング及び複製に必要とされるゲノム配列のみを含む多重欠損アデノウイルスベクターの例であるアデノウイルスアンプリコンは、およそ３６ｋｂの挿入物を受容し得る。
【００３０】
従って、好ましい実施形態では、本発明の方法の発現ベクターは、Ｅ１領域の全て又は一部、Ｅ３領域の全て又は一部、及びＥ４領域の全て又は一部を欠く多重欠損アデノウイルスベクターである。この点では、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターは、インビボで限られた時間の間、高レベルで導入遺伝子を発現すること、並びに少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターでの導入遺伝子の発現の持続は、とりわけ、ＨＳＶ  ＩＣＰ０、ＡｄｐＴＰ、ＣＭＶ−ＩＥ２、ＣＭＶ−ＩＥ８６、ＨＩＶｔａｔ、ＨＴＬＶ−ｔａｘ、ＨＢＶ−Ｘ、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８などのトランス作用性因子、ＨＳＶ  ＩＣＰ０のように機能するＵ２０５骨肉腫細胞株からの細胞因子、又は神経成長因子によって誘導されるＰＣ１２細胞における細胞因子の作用により調節され得ることが観察されている。上記を考慮すると、多重欠損アデノウイルスベクター（例、少なくともＥ４欠損ベクター）は、好ましくは、ＰＥＤＦをコードする核酸配列の発現の持続性を調節するトランス作用性因子をコードする核酸配列をさらに含む。あるいは、ＰＥＤＦをコードする核酸配列の発現の持続性を調節するトランス作用性因子をコードする核酸配列を含む第２の発現ベクターが動物に投与される。導入遺伝子発現の持続性を調節するシス及びトランス作用性因子の使用は、例えば、米国特許第６，２２５，１１３号、同第６，６６０，５２１号、及び同第６，６４９，３７３号、並びに国際特許出願ＷＯ００／３４４９６にさらに記載されている。
【００３１】
アデノウイルスベクターは、特にＥ１及びＥ４領域の複製必須遺伝子機能において、多重複製欠損がある場合、好ましくは、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特にＥ１領域における欠損を含むアデノウイルスベクターによって達成されるウイルス増殖と同様の相補細胞株におけるウイルス増殖を提供するスペーサーエレメントを含む。Ｌ５ファイバー領域が保持される本発明の好ましいＥ４−アデノウイルスベクターでは、スペーサーは、望ましくは、Ｌ５ファイバー領域と右側のＩＴＲとの間に位置する。より好ましくは、このようなアデノウイルスベクターでは、Ｅ４ポリアデニル化配列は、単独で、又は、最も好ましくは、別の配列との組合せにおいて、Ｌ５ファイバー領域と右側のＩＴＲとの間に存在することによって、保持されたＬ５ファイバー領域を右側のＩＴＲから十分に分離し、それによりこのようなベクターのウイルス産生は、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に単一複製欠損Ｅ１欠損アデノウイルスベクターのウイルス産生に近づく。
【００３２】
スペーサーエレメントは、所望の長さ、例えば、長さにおいて、少なくとも約１５塩基対（例、約１５塩基対と約１２，０００塩基対との間）、好ましくは約１００塩基対〜約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対〜約８，０００塩基対、さらにより好ましくは約１，５００塩基対〜約６，０００塩基対、及び最も好ましくは約２，０００〜約３，０００塩基対である任意の配列（単数）又は配列（複数）を含み得る。スペーサーエレメント配列は、アデノウイルスゲノムに関して、コーディング配列であっても非コーディング配列であってもよく、そしてネイティブであっても非ネイティブであってもよいが、欠損領域に対する複製必須機能を回復させない。スペーサーはまた、プロモーター可変発現カセットを含み得る。より好ましくは、スペーサーは、さらなるポリアデニル化配列及び／又はパッセンジャー遺伝子を含む。好ましくは、スペーサーがＥ４を欠損する領域に挿入された場合、Ｅ４ポリアデニル化配列及びアデノウイルスゲノムのＥ４プロモーターもしくは任意の他の（細胞又はウイルス）プロモーターの両方がベクター中に残存する。スペーサーは、Ｅ４ポリアデニル化部位とＥ４プロモーターとの間に位置するか、又はＥ４プロモーターがベクターに存在しない場合、スペーサーは、右側のＩＴＲに近接する。スペーサーは、任意の適切なポリアデニル化配列を含み得る。適切なポリアデニル化配列の例としては、合成最適化配列、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、並びにヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスが挙げられる。好ましくは、特にＥ４欠損領域において、スペーサーはＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウイルスベクターのより高いウイルス産生レベルを可能とする。スペーサーの非存在下では、多重複製欠損アデノウイルスベクターのファイバータンパク質の産生及び／又はウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのものと比較して減少する。しかし、欠損アデノウイルス領域の少なくとも１つ、好ましくはＥ４領域におけるスペーサーの含有は、ファイバータンパク質産生及びウイルス増殖におけるこの減少に対して反作用し得る。
【００３３】
パッセンジャー遺伝子は、代表的には、アデノウイルスゲノムのＥ１欠損領域に挿入されるが、パッセンジャー遺伝子はまた、アデノウイルスゲノムのＥ４欠損領域でのスペーサーとして機能し得る。パッセンジャー遺伝子は、ベクターが収容し得るフラグメントのサイズによってのみ限定され、そして任意の適切な遺伝子であり得る。適切なパッセンジャー遺伝子の例としては、ｐＧＵＳ、分泌性アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、及びヒト抗トリプシンなどのマーカー遺伝子配列；可溶性ｆｌｔなどの所定の治療遺伝子；並びにＢ３−１９Ｋ、Ｅ３−１４．７、ＩＣＰ４７、ｆａｓリガンド遺伝子、及びＣＴＬＡ４遺伝子などの潜在性免疫修飾因子が挙げられる。理想的には、スペーサーは、グルクロニダーゼ遺伝子から構成される。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、例えば、米国特許５，８５１，８０６及び国際特許出願ＷＯ９７／２１８２６に記載されている。
【００３４】
望ましくは、アデノウイルスベクターは、複製（即ち、増殖）のために、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、及び／又はＥ４領域の複製必須遺伝子機能の相補性を必要とする。換言すれば、アデノウイルスゲノムは、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、及び／又はＥ４領域の複製必須遺伝子機能を欠損する。しかしながら、アデノウイルスベクターが欠損したままであり、例えば、破壊された複製必須遺伝子機能をコードする相補細胞及び／又は外因性ＤＮＡ（例、ヘルパーアデノウイルス）を用いて増殖され得る限り、アデノウイルスゲノムは、実施者により所望されるように、１以上の複製必須遺伝子機能を破壊するように改変され得る。この点では、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみの、アデノウイルスゲノムの後期領域のみの、及びアデノウイルスゲノムの初期及び後期領域の両方の複製必須遺伝子機能を欠損し得る。アデノウイルスベクターはまた、本質的に、アデノウイルスゲノム全体が除去されたものであり得、この場合、少なくともウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）及びパッケージングシグナルがインタクトなままであること（即ち、アデノウイルスアンプリコン）が好ましい。ＩＴＲ及びパッケージング配列を含むアデノウイルスゲノムの５’又は３’領域は、ウイルスゲノムの残りと同じアデノウイルス血清型を起源とする必要はない。例えば、アデノウイルス血清型５ゲノムの５’領域（即ち、アデノウイルスＥ１領域に対してゲノムの５’の領域）は、アデノウイルス血清型２ゲノムの対応領域と交換され得る（例、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に対してＡｄ５ゲノム領域の５’が、Ａｄ２ゲノムのヌクレオチド１−４５６と交換される）。しかしながら、本発明の方法のアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムの欠損は、好ましくは、アデノウイルスゲノムの初期領域によりコードされる複製必須遺伝子機能に限定される。多重複製欠損アデノウイルスベクターを含む適切な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許第５，８３７，５１１号、第５，８５１，８０６号、第５，９９４，１０６号、及び第６，５７９，５２２号、米国公開特許出願２００１／００４３９２２Ａ１、２００２／０００４０４０Ａ１、２００２／００３１８３１Ａ１、及び２００２／０１１０５４５Ａ１、並びに国際特許出願ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９７／１２９８６、及びＷＯ９７／２１８２６に開示されている。理想的には、医薬組成物は、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）共雑物を実質的に含まない（例、医薬組成物は、約１％未満のＲＣＡ共雑物のみ含む）。最も望ましくは、医薬組成物は、ＲＣＡを含有しない。ＲＣＡを含有しないアデノウイルスベクター組成物及びストックは、米国特許第５，９４４，１０６号及び第６，４８２，６１６号、米国公開特許出願２００２／０１１０５４５Ａ１、並びに国際特許出願ＷＯ９５／３４６７１に記載されている。理想的には、国際特許出願ＷＯ０３／０４０３１４にさらに記載されているように、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの別の領域の他の複製必須遺伝子機能における欠損と組合せてＥ１欠損である場合、医薬組成物は、Ｅ１復帰突然変異体も含有しない。
【００３５】
複製必須遺伝子機能をコードするアデノウイルス配列の改変（例、欠失、変異、又は交換）に加えて、アデノウイルスゲノムは、良性又は非致死性の改変、即ち、このような改変が、複製必須遺伝子機能を他に含むアデノウイルスゲノムの領域にある場合でさえも、アデノウイルスを複製欠損にしない改変、又は、望ましくは、ウイルスの機能性及び／又はウイルスタンパク質の産生に有害な影響を与えない改変を含み得る。このような改変は、通常、ＤＮＡ操作から生じるか、又は発現ベクター構築を容易にするのに役立つ。例えば、アデノウイルスゲノムにおいて制限酵素部位を除去又は導入することは利点があり得る。このような良性変異は、しばしば、ウイルスの機能性に対する検出可能な有害な効果を何ら有していない。例えば、アデノウイルスベクターは、ＶＡ−ＲＮＡ−１転写に関連するヌクレオチド１０，５９４及び１０，５９５（アデノウイルス血清型５のゲノムに基く）の欠失を含み得るが、その欠失は、ＶＡ−ＲＮＡ−１の産生を禁じない。
【００３６】
複製欠損アデノウイルスベクターは、代表的には、複製欠損アデノウイルスベクター中に存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を提供する相補細胞株において、高力価のウイルスベクターストックを作製するために適切なレベルにて産生される。好ましい細胞株は、複製欠損アデノウイルスに存在しない少なくとも１つ、及び好ましくは全ての複製必須遺伝子機能について相補する。相補細胞株は、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス付随ＲＮＡ領域、又はそれらの組合せ（全てのアデノウイルス機能を含む）によりコードされる少なくとも１つの複製必須遺伝子機能における欠損について相補し得る（例、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にするため）。最も好ましくは、相補細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（例、２以上の複製必須遺伝子機能）における欠損、特にＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の各々の複製必須遺伝子機能における欠損について相補する。さらに、相補細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び末端タンパク質に関して）及び／又はＥ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能における欠損について相補し得る。望ましくは、Ｅ４領域における欠損について相補する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を産生する。このような細胞は、望ましくは、少なくともＯＲＦ６を含み、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の他の如何なるＯＲＦも含まない。細胞株は、好ましくは、ベクターゲノムが細胞性ＤＮＡと組換える可能性を最小にし、かつ現実的には排除する、アデノウイルスベクターと非重複様式で相補する遺伝子を含むことによってさらに特徴付けられる。従って、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の存在は、ベクターストックにおいて回避されない場合には、最小にされ、従って、所定の治療目的、特に遺伝子治療目的のために適切である。ベクターストックにおけるＲＣＡの欠落は、非相補細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を回避する。このような相補細胞株の構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されているような、標準的な分子生物学及び細胞培養技術を含む。
【００３７】
アデノウイルスベクターを産生するための相補細胞株としては、２９３細胞（例、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６，５９−７２（１９７７）に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例、国際特許出願ＷＯ９７／００３２６、並びに米国特許第５，９９４，１２８号及び同第６，０３３，９０８号に記載されている）、並びに２９３−ＯＲＦ６細胞（例、国際特許出願ＷＯ９５／３４６７１及びＢｒｏｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，９２０６−９２１３（１９９７）に記載されている）が挙げられるが、それに限定されない。幾つかの状況では、相補細胞は、全ての必要とされるアデノウイルス遺伝子機能について相補しない。ヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターの複製を可能とするために細胞又はアデノウイルスゲノムによりコードされない遺伝子機能をトランスで提供するために用いられ得る。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号、同第５，９９４，１２８号、同第６，０３３，９０８号、同第６，１６８，９４１号、同第６，３２９，２００号、同第６，３８３，７９５号、同第６，４４０，７２８号、同第６，４４７，９９５号、及び同第６，４７５，７５７号、米国特許出願公開２００２／００３４７３５Ａ１、並びに、国際特許出願ＷＯ９８／５３０８７、ＷＯ９８／５６９３７、ＷＯ９９／１５６８６、ＷＯ９９／５４４４１、ＷＯ００／１２７６５、ＷＯ０１／７７３０４、及びＷＯ０２／２９３８８、並びに本明細書中に明示される他の参考文献に記載されている物質及び方法を用いて、構築、増殖及び／又は精製され得る。アデノウイルス血清型３５ベクターを含む、非グループＣアデノウイルスベクターは、例えば、米国特許５，８３７，５１１号及び同第５，８４９，５６１号、並びに国際特許出願ＷＯ９７／１２９８６及びＷＯ９８／５３０８７に示される方法を用いて産生され得る。さらに、多くのアデノウイルスベクターが市販されている。アデノ随伴ウイルスベクターは、例えば、米国特許第４，７９７，３６８号及びＬａｕｇｈｌｉｎら，Ｇｅｎｅ，２３，６５−７３（１９８３）に示される方法を用いて、構築及び／又は精製され得る。
【００３８】
アデノウイルスベクターのコートタンパク質は、アデノウイルスベクターが野生型コートタンパク質に対する中和抗体により認識される能力又はされない能力を減少するように改変され得る。このような改変は、複数回の投与に有用である。同様に、アデノウイルスベクターのコートタンパク質は、潜在的宿主細胞上のウイルスレセプターに対するアデノウイルスベクターの結合特異性又は認識を変更するために操作され得る。このような操作としては、ファイバー、ペントン、ヘキソン、ｐＩＩＩａ、ｐＶＩ、及び／又はｐＩＸの領域の欠失又は置換、種々のネイティブ又は非ネイティブリガンドのコートタンパク質の一部への挿入などを挙げることができる。コートタンパク質の操作は、アデノウイルスベクターにより感染する細胞の範囲を拡張し得るか、又はアデノウイルスベクターの特定の細胞型へのターゲティングを可能にする。アデノウイルスベクターが潜在的宿主細胞を認識する能力は、コートタンパク質の遺伝的操作無しに、即ち、二重特異性分子の使用を通じて、調節され得る。例えば、ペントンベース又はファイバー結合ドメイン及び特定の細胞表面結合部位を選択的に結合するドメインを含む二重特異性分子でのアデノウイルスの複合体化は、アデノウイルスベクターの特定の細胞型へのターゲティングを可能にする。
【００３９】
好ましくは、アデノウイルスカプシドは、非ネイティブアミノ酸配列を表示するように改変され得る。非ネイティブアミノ酸配列は、内部コートタンパク質配列（例、アデノウイルスファイバータンパク質の露出ループ内）に挿入され得るか、又はそれと置き換えられ得るか、あるいはアデノウイルスコートタンパク質の末端に融合され得る（例、必要に応じてリンカー又はスペーサー配列を用いて、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に融合される）。非ネイティブアミノ酸配列が、キメラコートタンパク質を形成するために任意のアデノウイルスコートタンパク質に結合体化され得る。従って、例えば、非ネイティブアミノ酸配列は、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、ＩＸ、ＶＩ又はＩＩＩａタンパク質などに結合体化され得るか、それらに挿入され得るか、又はそれらに付着され得る。このようなタンパク質の配列、及びそれらを組換えタンパク質において用いるための方法は、当該技術分野で周知である（例、米国特許第５，５４３，３２８号；同第５，５５９，０９９号；同第５，７１２，１３６号；同第５，７３１，１９０号；同第５，７５６，０８６号；同第５，７７０，４４２号；同第５，８４６，７８２号；同第５，９６２，３１１号；同第５，９６５，５４１号；同第５，８４６，７８２号；同第６，０５７，１５５号；同第６，１２７，５２５号；同第６，１５３，４３５号；同第６，３２９，１９０号；同第６，４５５，３１４号；同第６，４６５，２５３号；及び同第６，５７６，４５６号；並びに米国特許出願公開２００１／００４７０８１及び２００３／００９９６１９；並びに国際特許出願ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／４０５０９、ＷＯ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０、及びＷＯ０１／９２５４９参照）。キメラコートタンパク質のコートタンパク質部分は、リガンドドメインが付属又は短縮（例、内部的に、あるいはＣ及び／又はＮ末端にて）される全長アデノウイルスコートタンパク質であり得る。コートタンパク質部分は、それ自体、アデノウイルスベクターに対してネイティブである必要はない。
【００４０】
非ネイティブアミノ酸（例、リガンド）がファイバータンパク質に付着される場合、好ましくは、それは、ウイルスタンパク質間又はファイバーモノマー間の相互作用を妨害しない。従って、非ネイティブアミノ酸配列は好ましくは、それ自体、アデノウイルスファイバーの三量体化ドメインと有害に相互作用し得るような、オリゴマー化ドメインではない。好ましくは、リガンドは、ビリオンタンパク質に付加され、そして基質に対して非ネイティブアミノ酸配列を最大に存在させるために、基質に容易に露出されるような様式（例、基質に面する残基に付着する、基質と接触するペプチドスペーサー上に配置するなど、タンパク質のＮ又はＣ末端にて）において取り込まれる。理想的には、非ネイティブアミノ酸配列は、キメラコートタンパク質を創出するために、ファイバータンパク質のＣ末端にてアデノウイルスファイバータンパク質に取り込まれるか（及びスペーサーを介して付着するか）、あるいはファイバーの露出ループ（例、ＨＩループ）に取り込まれる。非ネイティブアミノ酸配列がペントンベースの一部に付着されるか又はそれを交換する場合、好ましくは、それは、それが基質と接触することを保障するように可変領域内にある。非ネイティブアミノ酸配列がヘキソンに付着される場合、好ましくは、それは可変領域内にある（Ｍｉｋｓｚａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（３），１８３６−４４（１９９６））。アデノウイルス粒子の表面から離れて非ネイティブアミノ酸配列を伸長させるためのスペーサー配列の使用は、非ネイティブアミノ酸配列がレセプターに対する結合についてより利用可能であり得ること、並びに非ネイティブアミノ酸配列とアデノウイルスファイバー単量体との間の任意の立体相互作用が低減されるという点で有利であり得る。
【００４１】
非ネイティブリガンドを含むキメラウイルスコートタンパク質は、望ましくは、キメラウイルスコートタンパク質ではなく野生型ウイルスコートタンパク質を含むことを除いては同一であるベクターの細胞への進入よりも効率的である、コートタンパク質を含むウイルス（即ち、アデノウイルス）ベクターの細胞への進入を指向し得る。好ましくは、キメラウイルスコートタンパク質は、野生型コートタンパク質を含むベクターにより認識されないか、又は僅かに認識される細胞表面上に存在する新規内因性結合部位を結合する。
【００４２】
さらに、アデノウイルスカプシドタンパク質は、ネイティブアデノウイルスレセプター（即ち、野生型アデノウイルスにより結合されるレセプター）に対する結合を低減させるか、又は奪うように変更され得る。特に、コクサッキー及びアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）と相互作用するアデノウイルスファイバータンパク質の部分が、アデノウイルスファイバータンパク質がＣＡＲを結合しないように、欠失、置換、ファイバータンパク質内の再配置などにより改変され得る。同様に、インテグリンと相互作用するアデノウイルスペントンタンパク質の部分が、ネイティブなインテグリン結合を奪うように変更され得る。アデノウイルスベクター（例、複製欠損又は条件付き複製アデノウイルスベクター）のネイティブな結合及び形質導入を低減するために、細胞進入を媒介するアデノウイルスコートタンパク質（例、ファイバー及び／又はペントンベース）上に位置するネイティブ結合部位が欠落されるか、又は破壊される。２以上のアデノウイルスコートタンパク質が、細胞表面への付着を媒介すると考えられている（例、ファイバー及びペントンベース）。宿主細胞（例、中皮細胞又は肝細胞）に対するネイティブな結合を変更するための任意の適切な技術が用いられ得る。例えば、細胞に対するネイティブな結合を奪うための異なるファイバー長の利用が、ペントンベース又はファイバーノブに対する結合配列の付加を介して為し遂げられ得る。この付加は、二重特異性又は多重特異性結合配列を介して直接的又は間接的のいずれかでなされ得る。あるいは、アデノウイルスファイバータンパク質は、ファイバーシャフト中のアミノ酸数を低減し、それにより「短シャフト」ファイバーを創出するように改変され得る（例えば、米国特許第５，９６２，３１１号に記載されているように）。幾つかのアデノウイルス血清型のファイバータンパク質は、天然では、他のものよりも短く、これらのファイバータンパク質は、アデノウイルスのそのネイティブレセプターへのネイティブな結合を低減させるために、ネイティブファイバータンパク質の代わりに用いられ得る。例えば、血清型５アデノウイルスに由来するアデノウイルスベクターのネイティブファイバータンパク質は、ファイバータンパク質でアデノウイルス血清型４０又は４１から切り替えられ得る。
【００４３】
この点では、アデノウイルスベクターは、異なる血清型のアデノウイルスからのアデノウイルスコートタンパク質（例、ファイバー、ペントン、又はヘキソンタンパク質）を含むように改変され得る。例えば、アデノウイルス血清型５アデノウイルスは、アデノウイルス血清型３５ファイバーを表示し、次いで、必要に応じて１以上の非ネイティブアミノ酸リガンドを含むように改変され得る。特定の細胞型にベクターをターゲティングするために、眼に関連する細胞型に天然に感染しないアデノウイルスベクターを利用することが可能である。あるいは、眼細胞に天然に形質導入するアデノウイルスベクターは、標的細胞に対して如何なる天然の向性も有しないアデノウイルス由来のアデノウイルスファイバータンパク質及び／又はアデノウイルスペントンベースを表示するように改変され得る（このアデノウイルスベクターは、標的細胞の形質導入を可能とする非ネイティブアミノ酸配列を表示し得る）。
【００４４】
別の実施形態では、ネイティブな基質結合に関連する核酸残基は、変異核酸残基を取り込むアデノウイルスベクターがそのネイティブ基質に対してより結合しないように、変異され得る（例、国際特許出願ＷＯ００／１５８２３；Ｅｉｎｆｅｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２３），１１２８４−１１２９１（２００１）；及びｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（６），２７５３−２７６２（２００２）参照）。例えば、アデノウイルス血清型２及び５は、コクサッキーウイルス及びアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）に対するアデノウイルスファイバータンパク質の結合、及び細胞表面上に位置するインテグリンに対するペントンタンパク質の結合を介して、細胞に形質導入する。従って、本発明の方法のアデノウイルスベクターは、ＣＡＲに対するネイティブな結合を欠き得、及び／又はインテグリンに対するネイティブな結合の低減を示し得る。宿主細胞に対するアデノウイルスベクターのネイティブな結合を低減するために、ネイティブＣＡＲ及び／又はインテグリン結合部位（例、アデノウイルスペントンベースに位置するＲＧＤ配列）が除去又は破壊される。
【００４５】
アデノウイルスコートタンパク質に対する改変は、生じるアデノウイルスベクターが宿主免疫系を免れる能力を増強し得る。一実施形態では、アデノウイルスベクターは、ＣＡＲ及び／又はインテグリンに対するアデノウイルスベクターのネイティブな結合の除去、並びにアデノウイルスカプシドへの１以上の非ネイティブリガンドの取り込みによって眼細胞に選択的にターゲティングされる。特異的なレセプターを介する形質導入を媒介する適切なリガンドは、慣用的なライブラリーディスプレイ技術（例、ファージディスプレイ）を用いて決定され得る。非ネイティブアミノ酸配列及びそれらの基質の例としては、インテグリンにより認識されるひと続きの短い線状のアミノ酸（例、６以下のアミノ酸）、並びに例えばポリリジン、ポリアルギニン等のポリアミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。キメラアデノウイルスコートタンパク質を作出するための非ネイティブアミノ酸配列は、米国特許第６，４５５，３１４号及び国際特許出願ＷＯ０１／９２５４９にさらに記載されている。
【００４６】
アデノウイルスベクターに対する適切な改変は、米国特許第５，５４３，３２８号、同第５，５５９，０９９号、同第５，７１２，１３６号、同第５，７３１，１９０号、同第５，７５６，０８６号、同第５，７７０，４４２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８７１，７２７号、同第５，８８５，８０８号、同第５，９２２，３１５号、同第５，９６２，３１１号、同第５，９６５，５４１号、同第６，０５７，１５５号、同第６，１２７，５２５号、同第６，１５３，４３５号、同第６，３２９，１９０号、同第６，４５５，３１４号、及び同第６，４６５，２５３号、米国公開出願２００１／００４７０８１Ａ１、２００２／００９９０２４Ａ１、及び２００２／０１５１０２７Ａ１、並びに国際特許出願ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／４０５０９、ＷＯ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０、及びＷＯ０１／９２５４９にさらに記載されている。アデノウイルスベクターの構築は、当該技術分野で十分に理解されている。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号、同第６，１６８，９４１号、同第６，３２９，２００号、同第６，３８３，７９５号、同第６，４４０，７２８号、同第６，４４７，９９５号、及び同第６，４７５，７５７号、並びに国際特許出願ＷＯ９８／５３０８７、ＷＯ９８／５６９３７、ＷＯ９９／１５６８６、ＷＯ９９／５４４４１、ＷＯ００／１２７６５、ＷＯ０１／７７３０４、及びＷＯ０２／２９３８８、並びに本明細書中で明示される他の参考文献に示される方法を用いて、構築及び／又は精製され得る。
【００４７】
本発明の方法における使用のための発現ベクターの選択は、例えば、宿主、ベクターの免疫原生、タンパク質産生の所望の持続時間などの種々の要因に依存するであろう。各型の発現ベクターは、異なる特性を有するので、研究者は、本発明の方法を任意の特定の状況にあつらう自由度を有する。さらに、１を超える型の発現ベクターが、動物、望ましくは、血管漏出に罹患している動物の眼細胞に核酸配列を送達するために用いられ得る。従って、本発明の方法は、動物に異なる発現ベクター（各々が、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む）を投与することを含み得る。ＰＥＤＦをコードする核酸配列が発現され、それにより眼の血管漏出について動物を予防的又は治療的に処置するためのＰＥＤＦ産生が生じる。好ましくは、少なくとも２つの異なる型の発現ベクター（即ち、プラスミド及びウイルスベクター又は２つの異なるウイルスベクター）が動物の眼に直接送達され得る。一実施形態では、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ベクターのカクテルが、動物に投与され、好ましくは、動物の眼に直接投与される。当業者は、眼の血管漏出を含む眼関連障害を処置又は研究するために多重送達系の有利な特性を利用する能力を理解する。
【００４８】
（色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ））
本発明の方法は、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクターを動物に投与すること、あるいはＰＥＤＦポリペプチド自体を投与することを含む。初期集団倍加因子−１（ｅａｒｌｙ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＥＰＣ−１）とも呼ばれるＰＥＤＦは、セルピンと名付けられたセリンプロテアーゼインヒビターのファミリーに対して相同性を有する分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは、網膜色素上皮細胞により優位に作られ、身体の大部分の組織及び細胞型において検出可能である。ＰＥＤＦは、網膜芽細胞腫細胞における分化を誘導すること、並びに神経集団の生存を増強することが観察されている（Ｃｈａｄｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．，２０，２０９−２１６（１９８７））。有害な条件下で神経生存を増強する因子（例、ＰＥＤＦ）は、本明細書中で記載されている場合、「神経栄養性」と呼ばれる。ＰＥＤＦはさらに、グリア抑制（ｇｌｉａｓｔａｔｉｃ）活性を有する、即ち、グリア細胞増殖を阻害する能力を有する。先に考察したように、ＰＥＤＦはまた、抗脈管形成活性を有する。ＰＥＤＦの抗脈管形成誘導体としては、ＷＯ９９／０４８０６で考察されるＳＬＥＤタンパク質が挙げられる。また、ＰＥＤＦは細胞老化に関与すると仮定されている（Ｐｉｇｎｏｌｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（１２），８９４９−８９５７（１９９８））。ＰＥＤＦは、米国特許第５，８４０，６８６号、並びに国際特許出願ＷＯ９３／２４５２９及びＷＯ９９／０４８０６においてさらに特徴付けられている。
【００４９】
ＰＥＤＦをコードする核酸配列は、任意の供給源から得ることができ、例えば、天然から単離され、合成的に作出され、遺伝子操作された生物から単離されるなどしたものである。同様に、ＰＥＤＦポリペプチドが投与される場合、ＰＥＤＦポリペプチドは、任意の供給源から得ることができる。任意の事象では、本発明のＰＥＤＦタンパク質は、望ましくは、米国特許第５，８４０，６８６号又は配列番号２に示されるＰＥＤＦのアミノ酸配列に少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ血管抗透過活性を有するタンパク質又はペプチドである。理想的には、ＰＥＤＦポリペプチド（例、本発明の発現ベクターの核酸配列によりコードされるＰＥＤＦポリペプチド）は、配列番号２のＰＥＤＦアミノ酸配列と比較して、少なくとも約６０％の配列同一性（例、少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％の配列同一性）、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性（例、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％の配列同一性）、及び最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性（例、少なくとも約９５％の配列同一性）を含む。好ましくは、ＰＥＤＦポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドである。また好ましくは、ＰＥＤＦをコードする核酸配列は、ＰＥＤＦ遺伝子のコーディング配列（即ち、遺伝子に関連する調節配列を欠落するＰＥＤＦタンパク質をコードするＰＥＤＦ遺伝子の部分）、又はＰＥＤＦタンパク質をコードするｃＤＮＡである。理想的には、核酸配列は、配列番号２のポリペプチドをコードする。ＰＥＤＦをコードする核酸配列は、本明細書中において配列番号３として提供される。望ましくは、アデノウイルスベクターは、配列番号１に示される核酸配列を含む。
【００５０】
ＰＥＤＦをコードする核酸配列は、好ましくは、米国特許第５，８４０，６８６号、同第６，３１９，６８７号及び同第６，４５１，７６３号、並びに国際特許出願ＷＯ９３／２４５２９及びＷＯ９５／３３４８０に記載されているものであるものの、核酸配列の多くの改変及びバリエーション（例、変異）が本発明の状況において可能であり、かつ適切である。例えば、遺伝コードの縮重が、コードされるポリペプチドの変更を伴うことなく、コーディング配列にわたる、及び翻訳停止シグナルにおけるヌクレオチドの置換を可能にする。このような置換可能な配列が、既知のＰＥＤＦのアミノ酸配列又はＰＥＤＦをコードする核酸配列から推定され得、従来の合成又は部位特異的変異誘発手法により構築され得る。合成ＤＮＡ方法は、Ｉｔａｋｕｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，１０５６−１０６３（１９７７）、及びＣｒｅａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，５７６５−５７６９（１９７８）の手法に実質的に従って行われ得る。部位特異的変異誘発手法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（第２版、１９８９）に記載されている。あるいは核酸配列は、生じるＰＥＤＦポリペプチドが活性（即ち、抗透過活性）を保持する限り、タンパク質のＮ又はＣ末端のいずれかでの伸長を有するＰＥＤＦをコードし得る。
【００５１】
本発明はまた、ＰＥＤＦポリペプチドの全て又は一部を含むキメラ又は融合ペプチドをコードする核酸配列の使用を意図する。組換えＤＮＡ技術を通じて、当業者は、所望の活性を有するキメラペプチドを作出するために２以上の因子の活性ドメインを融合し得る。キメラペプチドは、２以上のペプチドのアミノ酸配列全体を含み得るか、あるいは２以上のペプチド（例、１０、２０、５０、７５、１００、４００、５００以上のアミノ酸残基）の一部を含むように構築され得る。例えば、ＰＥＤＦ又はその治療用フラグメント及びペプチドコンフォメーションを安定化する部分を含む融合タンパク質は、血管漏出を処置又は予防するために本発明の状況において用いられ得る。当業者は、改変されたＰＥＤＦタンパク質又はそのフラグメントが、例えば、眼底写真、フルオレセイン血管造影法、又はＯＣＴを用いて治療活性を有するか否かを決定する能力を有する。
【００５２】
アミノ酸同一性の程度は、当該技術分野で公知の任意の方法（例、ＢＬＡＳＴ配列比較）を用いて決定され得る。さらに、本発明の状況で用いられ得るＰＥＤＦタンパク質のホモログは、少なくとも中程度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、好ましくは、高い（ｈｉｇｈ）ストリンジェンシー条件下でＰＥＤＦタンパク質にハイブリダイズし、かつ活性を保持する任意のペプチド、ポリペプチド又はそれらの部分であり得る。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における３７℃での一晩のインキュベーション、続いて１×ＳＳＣ中における約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄、あるいは実質的に同様の条件（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）に記載されている中程度のストリンジェント条件）が挙げられる。高ストリンジェンシー条件は、例えば、（１）洗浄についての低イオン強度及び高温（例、５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、（２）ハイブリダイゼーションの間の変性剤（例、ホルムアミド）の採用（例えば、４２℃での０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）／７５０ｍＭ塩化ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸緩衝液、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと一緒の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）、あるいは（３）４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストラン、並びに（ｉ）０．２×ＳＳＣ中における４２℃、（ｉｉ）５０％ホルムアミド中における５５℃、及び（ｉｉｉ）０．１％ＳＳＣ（好ましくはＥＤＴＡとの組合せ）中における５５℃での洗浄を伴う条件である。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（同上）に提供されている。
【００５３】
代替的な実施形態では、ＰＥＤＦレセプターに作用する因子が、血管漏出を予防的又は治療的に処置するために動物に投与される。例えば、発現ベクターは、ＰＥＤＦの生物学的活性を担う一連の細胞内事象を伝達するＰＥＤＦレセプターに結合し、かつ活性化する抗体又はペプチドアゴニストをコードする核酸配列を含み得る。同様に、発現ベクターは、生物学的効果を達成するためにＰＥＤＦレセプターと相互作用するペプチドをコードする核酸配列を含み得る。例えば、ＰＥＤＦレセプターを介する細胞シグナリングを構成的に活性化するドミナントポジティブタンパク質が構築され得る。ＰＥＤＦレセプターの考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｄｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（４４），３１６０５（１９９９）を参照のこと。
【００５４】
本発明の方法において用いられる核酸配列は、望ましくは、発現カセットの一部、即ち、核酸配列のサブクローニング及び回収を容易にする機能を保有する特定のヌクレオチド配列（例、１以上の制限酵素）又は核酸配列の発現を容易にする機能を保有する特定のヌクレオチド配列（例、ポリアデニル化またはスプライス部位）として存在する。核酸配列は、好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に位置する（例、全体又は部分的にＥ１領域を交換する）。例えば、Ｅ１領域は、核酸配列を含むプロモーター可変発現カセットにより交換され得る。発現カセットは、好ましくは、３’−５’配向にて挿入される（例、発現カセットの転写の方向が周囲の隣接アデノウイルスゲノムのものと反対であるように配向される）。しかしながら、発現カセットは、発現カセットが挿入されるアデノウイルスゲノムの領域に関して５’−３’の位置に配向され得る。核酸配列を含む発現カセットに加えて、発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）は、他の産物をコードする核酸配列を含む他の発現カセット（このカセットは、アデノウイルスゲノムの任意の欠失領域を交換し得る）を含み得る。アデノウイルスゲノム（例、ゲノムのＥ１領域）への発現カセットの挿入は、既知の方法により（例えば、アデノウイルスゲノムの所定の位置での独特な制限部位の導入により）容易にされ得る。先に示したように、好ましくは、アデノウイルスベクターの全て又は一部のＥ３領域もまた欠失される。
【００５５】
ＰＥＤＦをコードする核酸配列は、発現に必要な調節配列（即ち、プロモーター）に機能可能に連結される。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し、それによりＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。核酸配列は、プロモーターが核酸配列の転写を指向し得る場合に、プロモーターに「機能可能に連結」される。任意のプロモーター（即ち、天然から単離されるか、あるいは組換えＤＮＡ又は合成技術により産生されるかのいずれか）は、核酸配列の転写を提供するように本発明に連関して用いられ得る。プロモーターは、それが機能可能に連結される核酸配列に対してネイティブ又は非ネイティブであり得る。プロモーターは、好ましくは、真核生物（望ましくは哺乳動物）細胞における転写を指向し得る。プロモーターの機能は、ベクターに存在する１以上のエンハンサー及び／又はサイレンサーの存在により変更され得る。「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害するＤＮＡのシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーもまた、「サイレンサー」と呼ばれる。エンハンサーは、エンハンサーがいずれかの配向において、及び転写される領域の下流の位置からであっても、数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたって機能し得るという点で、プロモーターのみに見出される配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に対するＤＮＡ結合部位（これはまた「プロモーターエレメント」と呼ばれる）とは異なる。
【００５６】
プロモーター領域は、長さ及び配列において変動し得、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に対する１以上のＤＮＡ結合部位、並びに／あるいはエンハンサー又はサイレンサーをさらに包含し得る。エンハンサー及び／又はサイレンサーは、プロモーター自体の外側の核酸配列上に同様に存在し得る。望ましくは、細胞又はウイルスエンハンサー（例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー）が、プロモーター活性を増強するために、プロモーターの近位に配置される。さらに、スプライスアクセプター及びドナー部位が、転写を増強するために核酸配列上に存在し得る。
【００５７】
核酸配列は、好ましくは、ウイルスプロモーターに機能可能に連結される。適切なウイルスプロモーターは、当該技術分野において公知であり、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例、ＣＭＶ前初期プロモーター）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例、ＨＩＶ長末端反復プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例、ＲＳＶ長末端反復）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（例、Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，１４４−１４５（１９８１））、ＳＶ４０又はエプスタイン・バー・ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例、ｐ５プロモーター）などが挙げられる。好ましくは、ウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター（例、Ａｄ２又はＡｄ５主要後期プロモーター及び三つ組み（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー）、ＣＭＶプロモーター、又はＲＳＶプロモーターである。
【００５８】
あるいは、本発明は、細胞プロモーター、即ち、細胞タンパク質の発現を駆動するプロモーターを用いる。本発明における使用のために好ましい細胞プロモーターは、治療剤を産生するための所望の発現プロフィールに依存するであろう。１つの局面では、細胞プロモーターは、好ましくは、種々の細胞型（例、眼に関連する細胞）において働く構成的プロモーターである。適切な構成的プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、又は真核生物細胞に共通の構造遺伝子の発現を駆動し得る。例えば、Ｙｉｎｇ  Ｙａｎｇ  １（ＹＹ１）転写因子（ＮＭＰ−１、ＮＦ−Ｅ１、及びＵＣＲＢＰとも呼ばれる）は、核マトリクスの固有成分である遍在性の核転写因子である（Ｇｕｏら，ＰＮＡＳ，９２，１０５２６−１０５３０（１９９５））。ＹＹ１は、細胞環境の変化に応答する調節タンパク質である。従って、ウイルス感染プロセスは、ウイルス構築物からの増強した転写、引き続いて増強したタンパク質産生を提供するためにＹＹ１プロモーターの活性をアップレギュレートし得る。本明細書中に記載されているプロモーターは、構成的プロモーターとして考慮されるものの、構成的プロモーターがアップレギュレートされ得ることが当該技術分野において理解される。プロモーター解析は、基底転写に重要なエレメントが、プロモーターからの転写開始部位に比し、ＹＹ１遺伝子の−２７７から＋４７５にあること、並びにＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴボックスを含むことを示す。ＪＥＭ−１（ＨＧＭＷ及びＢＬＺＦ−１しても既知である）もまた、正常及び腫瘍性組織において同定された遍在性の核転写因子である（Ｔｏｎｇら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２（１１），１７３３−１７４０（１９９８）、及びＴｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６９（３），３８０−３９０（２０００））。ＪＥＭ−１は、細胞増殖制御及び成熟に関与し、レチノイン酸によりアップレギュレートされ得る。ＪＥＭ−１プロモーターの最大活性を担う配列は、プロモーターの転写開始部位に比し、ＪＥＭ−１遺伝子の−４３２から＋１０１に位置している。ＹＹ１プロモーターとは異なり、ＪＨＥＭ−１プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含まない。ユビキチンプロモーター（詳細には、ＵｂＣ）は、幾つかの種において機能的である強力な構成的な活性プロモーターである。ＵｂＣプロモーターは、Ｍａｒｉｎｏｖｉｃら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９），１６６７３−１６６８１（２００２）においてさらに特徴付けられている。
【００５９】
多くの上記プロモーターは、構成的プロモーターである。構成的プロモーターである代わりに、プロモーターは、誘導性プロモーター、即ち、適切なシグナルに応答してアップ−及び／又はダウン−レギュレートされるプロモーターであり得る。例えば、調節配列は、眼血管新生が低酸素に伴う場合に活性である低酸素駆動プロモーターを含み得る。適切な誘導性プロモーター系の他の例としては、ＩＬ−８プロモーター、メタロチオネイン誘導性プロモーター系、細菌ｌａｃＺＹＡ発現系、テトラサイクリン発現系、及びＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例、グロビン遺伝子は、胎児及び成人でグロビン関連プロモーターから差示的に転写される）が用いられ得る。核酸配列の発現を調節するプロモーター配列は、外因性薬剤による調節に応答する少なくとも１つの異種の調節配列を含み得る。調節配列は、好ましくは、薬物、ホルモン又は他の遺伝子産物（理想的には、眼で産生される遺伝子産物）など（これらに限定されない）の外因性薬剤に応答する。例えば、調節配列（例、プロモーター）は、好ましくは、グルココルチコイドレセプター−ホルモン複合体に応答性であり、次いで、治療用ペプチド又はその治療用フラグメントの転写のレベルを増強させる。
【００６０】
好ましくは、調節配列は、組織特異的プロモーター、即ち、所定の組織で優先的に活性化され、活性化された組織での遺伝子産物の発現を生じさせるプロモーターを含む。代表的に使用される組織特異的プロモーターは、筋細胞特異的プロモーターである。筋細胞特異的プロモーターの例示的なプロモーターは、ミオシン軽鎖１Ａプロモーターである。発現ベクターにおける使用のための組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞型に基づき、当業者によって選択され得る。本発明の方法における使用のために好ましい組織特異的プロモーターは、眼組織に特異的である（例、ロドプシンプロモーター）。ロドプシンプロモーターの例としては、ＧＮＡＴ錐体形質導入αサブユニット遺伝子プロモーター、又はインターフォトレセプター（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）レチノイド結合タンパク質プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
当業者は、各プロモーターが、転写、それ故、時間及び産生されるタンパク質の量に関して異なるように、タンパク質発現を駆動することを理解するであろう。例えば、ＣＭＶプロモーターは、形質導入の直後（即ち、形質導入の約２４時間後）にピーク活性を有し、次いで素早く漸減することにより特徴付けられる。本明細書中に記載されている細胞プロモーターは、治療因子の産生を最適化するために利用され得る異なる発現プロフィールを示す。ＵｂＣプロモーターとＹＹ１プロモーターは、ベクターの投与１日後で観察される転写レベルと比較して転写の急速な消失を伴うＣＭＶプロモーターと比較して、長時間にわたり導入遺伝子の安定発現を駆動する。１つの局面では、本発明のプロモーターは、好ましくは、約２×１０８粒子の用量でマウスに眼内（例えば、硝子体内）に投与される場合、投与約１ヶ月（２８日）後（好ましくは、投与の３５日、４２日、又は４８日後）に活性を実質的に損失させることなく、治療因子又はそのフラグメントをコードする核酸配列の転写を駆動する。好ましくは、核酸配列の転写のレベル（理想的には、タンパク質産生を生じる）は、投与１日後での核酸配列の転写のレベルと比較して、投与２８日後で、１０倍（例、７倍）を超えて減少しない。より好ましくは、転写のレベルは、発現（例えば、アデノウイルス）ベクター投与１日後での転写のレベルと比較して、２８日目で、５倍（例、３倍）を超えて減少しない。最も好ましくは、２８日目でプロモーター活性の損失は存在しない。理想的には、同じレベルの転写がヒトの眼で達成される。幾つかの細胞プロモーターは、投与１日後でのレベルと比較して、経時的な発現の増強を示す。１日目のレベルは、活性の低い初期レベルを有し得る（即ち、初期発現レベルは最小限の上記バックグラウンドである）。例えば、ＪＥＭ−１プロモーターからの初期発現は、バックグラウンドレベル近傍である。しかし、転写レベルは、転写の初期レベルと比較して、形質導入後１４日で１０倍まで増加し、ベクターの投与２８日後でも上昇したままである。従って、プロモーターは、活性のその特定のパターンを、ＰＥＤＦの発現の所望のパターン及びレベルと合わせることによって、本発明の方法における使用のために選択され得る。
【００６２】
あるいは、複数のプロモーターの所望の局面を組合せたハイブリッドプロモーターが構築され得る。例えば、ＣＭＶプロモーターの高い活性をＵｂＣプロモーターの高い活性の維持レベルと組合せたＣＭＶ−ＵｂＣハイブリッドプロモーターが、本発明の方法の多くの実施形態における使用のために特に好ましいであろう。調査者により操作され得る発現プロフィールを有するプロモーターを選択することもまた可能である。
【００６３】
また好ましくは、発現ベクターは、シス作用性因子（ここでシス作用性因子は核酸配列の発現を調節する）をコードする核酸を含む。好ましくは、シス作用性因子は、とりわけ、マトリクス付着領域（ＭＡＲ）配列（例、イムノグロブリン重鎖（Ｊｅｎｕｎｗｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３８５（１６），２６９（１９９７））、アポリポタンパク質Ｂ、又は遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）配列を含む。ＭＡＲ配列は、ヌクレアーゼ消化及び抽出の組合せ後に核マトリックスに付随するＤＮＡ配列として特徴付けられている（Ｂｏｄｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１），１９５−１９７（１９９２））。ＭＡＲ配列は、しばしば、エンハンサー型調節領域を伴い、ゲノムＤＮＡに組み込まれた場合、ＭＡＲ配列は、隣接ヌクレオチド配列の転写活性を増強させる。ＭＡＲ配列は、クロマチン構造の形態学的状態の制御において役割を果たし、それにより、転写的に活性な複合体の形成を容易にすると仮定されている。同様に、ＬＣＲ配列は、転写に許容的なドメインを確立及び／又は維持するように機能すると考えられている。多くのＬＣＲ配列は、付随する核酸配列の組織特異的発現を付与する。ＭＡＲ又はＬＣＲ配列の発現ベクターへの付加は、ＰＥＤＦ発現をさらに増強させ得る。
【００６４】
発現に必要な調節配列に機能可能に連結された外因性核酸の構築は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）参照）。本発明の核酸配列の発現に関して、当業者は、例えば、転写、ｍＲＮＡ翻訳、及び転写後プロセシング等の異なる遺伝子シグナル及びプロセシング事象が細胞中の核酸及びタンパク質／ペプチドのレベルを制御することを把握する。ＤＮＡのＲＮＡへの転写は、本明細書中に記載されているように、機能性プロモーターを必要とする。
【００６５】
これらの方針に沿って、タンパク質産生を最適化するために、好ましくは、核酸配列は、核酸配列のコード領域の後にポリアデニル化部位をさらに含む。また好ましくは、全ての適切な転写シグナル（及び適切な場合、翻訳シグナル）は、核酸配列が導入される細胞中で適切に発現されるように、正確に並べられる。所望される場合、核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を容易にするように、スプライス部位（即ち、スプライスアクセプター及びスプライスドナー部位）を取り込み得る。さらに、核酸配列が、プロセスタンパク質又は分泌タンパク質であるか、あるいは細胞内で作用するタンパク質又はペプチドをコードする場合、好ましくは、核酸配列は、プロセシング、分泌、細胞内局在などのための適切な配列をさらに含む。
【００６６】
特定の実施形態において、ＰＥＤＦ産生を調節することは利点であり得る。核酸配列の発現を調節する特に好ましい方法は、発現ベクター上に部位特異的組換え部位の付加を含む。部位特異的組換え部位を含む発現ベクターのリコンビナーゼとの接触は、組換え事象を通して、コーディング配列の転写をアップ−又はダウン−レギュレートのいずれかにするか、又は同時に、１つのコーディング配列の転写をアップ−レギュレートし、かつ別の転写のダウン−レギュレートする。核酸配列の転写を調節するための部位特異的組換えの使用は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号及び同第６，０６３，６２７号並びに国際特許出願ＷＯ９７／０９４３９に記載されている。
【００６７】
ＰＥＤＦをコードする核酸配列、及び本明細書中に記載されている任意の他の核酸配列は、それらの治療効果を向上させるためにそれらのネイティブ形態から変更され得る。例えば、治療用核酸の細胞質形態が、コードされる遺伝子産物にシグナルペプチドを取り込ませることによって分泌形態に変換され得る。治療用因子は、ＶＰ２２とのペプチドの融合により近隣の細胞により取り込まれるように設計され得る。これは、治療用核酸を含む眼細胞が、哺乳動物内の多くの眼細胞に対する治療効果を有することを可能にする。
【００６８】
（共治療）
本発明の方法は、さらなるペプチド又は導入遺伝子（例、１以上の治療用因子をコードする核酸配列）を、ＰＥＤＦ又はＰＥＤＦをコードする核酸配列との組合せにおいて送達することを含み得る。例えば、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクターもまた、異なる治療用因子をコードする核酸配列を含み得る。あるいは、異なる発現ベクター（ここで異なる発現ベクターは治療用因子をコードする核酸配列を含む）が、ＰＥＤＦをコードする発現ベクターとの組合せにおいて投与され得る。望ましくは、導入遺伝子の発現は、眼細胞又は眼に対して有益（例、予防的又は治療的に有益）である。導入遺伝子が細胞に予防的又は治療的有益性を付与する場合、導入遺伝子は、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルでその効果を奏し得る。導入遺伝子は、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、スプライシング又は３’プロセシング（例、ポリアデニル化）に影響するタンパク質、あるいはｍＲＮＡ蓄積又は輸送の変更した速度の媒介あるいは翻訳後調節における変更などにより、細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響するタンパク質（即ち、遺伝子発現が、転写の開始からプロセスタンパク質の産生を通じて全ての工程を含むように広範に考慮される場合）をコードし得る。導入遺伝子は、眼関連障害の組合せ処置のためのキメラペプチドをコードし得る。導入遺伝子は、ＰＥＤＦよりも異なる標的分子に作用する因子をコードし得る。実際、導入遺伝子産物は、異なるシグナル伝達経路に作用し得るか、あるいはＰＥＤＦの同じシグナル伝達経路の異なる点にて作用し得る。
【００６９】
ＰＥＤＦをコードする核酸配列に加えて、本発明の方法は、「脈管形成阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」をコードする核酸を動物に投与することを含み得る。「脈管形成阻害剤」とは、血管新生を予防又は緩解する任意の因子を意味する。当業者は、血管新生の完全な予防又は緩解が、治療効果を実現するために必要とされないことを理解する。従って、脈管形成の部分的及び完全の両方の予防及び緩解が、本発明の状況において意図される。脈管形成阻害剤としては、例えば、抗脈管形成因子、脈管形成因子に特異的なアンチセンス分子、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ干渉分子）、脈管形成因子に対するレセプター、及び脈管形成因子に対するレセプターに結合する抗体が挙げられる。
【００７０】
本発明における使用が意図される抗脈管形成因子としては、アンジオスタチン、コンブレテスタチン、バスキュロスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、ヘパリナーゼ、インターフェロン（例、ＩＮＦα）、及びメタロプロテイナーゼ３の組織インヒビター（ＴＩＭＰ３）が挙げられるが、これらに限定されない。このような因子は、新規血管の増殖を予防し、血管成熟を促進し、血管透過性を阻害し、内皮細胞の遊走を阻害することなどをする。種々の抗脈管形成因子が、国際特許出願ＷＯ０２／２２１７６に記載されている。当業者は、任意の抗脈管形成因子が、改変又は短縮化され得、抗脈管形成活性を保持し得ることを理解するであろう。従って、抗脈管形成因子の活性フラグメント（即ち、脈管形成を阻害するのに十分な生物学的活性を有するそれらのフラグメント）もまた、本発明の方法における使用に適切である。
【００７１】
脈管形成因子に特異的なアンチセンス分子は、一般的には、阻害されるべき脈管形成因子をコードする核酸の少なくとも一部、好ましくは少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドに実質的に同一であるべきであるが、同一である必要はない。アンチセンス核酸分子は、阻害効果が核酸に相同性又は実質的な相同性を示す遺伝子のファミリー内の他のタンパク質に適用されるように、設計され得る。導入されるアンチセンス核酸分子はまた、１次転写産物又は完全にプロセスされたｍＲＮＡのいずれかに対し全長である必要はない。一般的に、より高い相同性は、より短い配列の使用を補うために使用され得る。さらに、アンチセンス分子は、同じイントロン又はエクソンパターンを有する必要がなく、非コーディングセグメントの相同性は等しく有効であろう。アンチセンス・ホスホロチオタック（ｐｈｏｓｐｈｒｏｔｈｉｏｔａｃ）・オリゴデオキシヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤＮ）は、脈管形成因子に特異的なアンチセンス分子の例示である。また、ｓｉＲＮＡ等の他のＲＮＡ干渉剤が適切である（例、Ｃｈｕｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１０（３），５４９−６１（２００２）参照）。
【００７２】
実質的に任意の標的ＲＮＡと特異的に対合し、特定の位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活化するリボザイムが、設計され得る。この切断を行う際に、リボザイム自体は変更されず、それ故、再使用し得、そして他の分子を切断し得る。このことは、リボザイムを真の酵素とする。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を含ませることは、それらにＲＮＡ切断活性を付与し、それによって構築物の活性を向上させる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計及び使用は、Ｈａｓｅｌｏｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１（１９８８）に記載されている。好ましくは、リボザイムは、リボザイムの活性部位の各々の側に標的配列に相補的である少なくとも約２０個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００７３】
脈管形成因子に特異的なレセプターは、細胞応答を促進し得る機能的レセプターから増殖因子を隔離することによって、血管新生を阻害する。例えば、Ｆｌｔ及びＦｌｋレセプター（例、可溶性ｆｌｔ）、並びにＶＥＧＦ−レセプターキメラタンパク質は、血管内皮細胞上のＶＥＧＦレセプターと競合し、内皮細胞増殖を阻害する（Ａｉｅｌｌｏ，ＰＮＡＳ，９２，１０４５７（１９９５））。また、脈管形成因子を中和するか、又は脈管形成因子のレセプターと結合する増殖因子特異的抗体及びそのフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）も意図される。
【００７４】
あるいは又は加えて、少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸配列が動物に投与され得る。神経栄養因子は、発達するニューロンの成熟及び成体ニューロンの維持を担うと考えられている。従って、１以上の神経栄養因子の投与は、血管漏出に伴う神経細胞の変性及び死を阻害又は逆転し得る。神経栄養因子は３つのサブクラスに分類される：神経新生サイトカイン（ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）；ニューロトロフィン；及び線維芽細胞増殖因子。毛葉体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、神経新生サイトカインの例示である。ＣＮＴＦは、毛葉体神経節ニューロンの生存を促進し、ＮＧＦ−応答性である特定のニューロンを支持する。ニューロトロフィンとしては、例えば、脳由来神経栄養因子及び神経成長因子（恐らく、最も特徴付けられた神経栄養因子）が挙げられる。ＰＥＤＦとの組合せにおける投与に適切な他の神経栄養因子としては、例えば、トランスフォーミング増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、及びインターロイキン１−βが挙げられる。ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の脈管形成に関連する神経栄養因子は、あまり好ましくない。神経栄養因子はまた、ニューロン栄養因子（ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（例、ニューロンの生存を増強させる因子）であり得る。神経栄養因子は実際に、ニューロンの分解を逆転させ得ると仮定されてきた。このような因子は多分、視力低下を伴うニューロンの変性の処置に有用である。神経栄養因子は、パラクライン及びオートクラインの両方の様式で機能し、それらを理想的な治療剤とする。
【００７５】
あるいは、細胞分化に関連する因子をコードする１以上のさらなる核酸配列（例、導入遺伝子）が、動物に投与され得る。好ましくは、導入遺伝子は、Ｍａｔｈ１又はＨａｔｈ１等のａｔｏｎａｌ関連ペプチド、あるいは上記のいずれかの生物学的活性フラグメントをコードする。Ｍａｔｈ１は、転写因子のマウス塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーのメンバーであり、ショウジョウバエ遺伝子ａｔｏｎａｌと相同である。Ｈａｔｈ１は、Ｍａｔｈ１のヒト対応物である。Ｍａｔｈ１は、毛の発生に必須であることが示されており、耳において毛再生を刺激し得る。ＰＥＤＦの抗脈管形成及び抗透過活性とａｔｏｎａｌ関連ペプチドの毛細胞分化特性との組合せは、例えば感覚障害の処置及び研究の強力なツールを提供する。Ｍａｔｈ１はさらに、例えば、Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１８３７−１８４１（１９９９）並びにＺｈｅｎｇ及びＧａｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３（２），５８０−５８６（２０００）において特徴付けられている。
【００７６】
血管成熟因子をコードする核酸配列が、ＰＥＤＦをコードする核酸配列に加えて、動物に投与され得る。血管成熟因子は血管漏出量を低減させ、従って、本発明の状況において有用である。血管成熟因子としては、アンジオポイエチン（Ａｎｇ、例、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、ミドカイン（ＭＫ）、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、肝増殖因子（ＨＧＦ）、及びヘパリン結合神経栄養因子（ＨＢＮＦ、ヘパリン結合増殖因子としても知られる）が挙げられるが、それらに限定されない。免疫抑制因子をコードするヌクレオチド配列もまた、眼関連障害又は発現ベクターの投与の結果としての眼内の任意の不適切な免疫応答を低減させるために、発現ベクターに取り込まれ得る。
【００７７】
本明細書中で考察されるように、本発明の方法の発現ベクターは、ＰＥＤＦをコードする核酸配列、及び必要に応じて他の治療用因子を含む。好ましい実施形態では、ＰＥＤＦをコードする核酸配列及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）又は可溶性ｆｌｔ（ｓｆｌｔ）をコードする核酸配列が、動物に投与され得る。複数の核酸配列が、異なるプロモーターに機能可能に連結され得る。本明細書中で考察されるように、異なるプロモーターは、活性の同様でないレベル及びパターンを有する。当業者は、複数のプロモーターの使用を通じて異なるコーディング配列の発現を指示する自由度を理解するであろう。あるいは、複数のコーディング配列は、ポリシストロニックエレメントを形成するために同じプロモーターに機能可能に連結され得る。ポリシストロニックエレメントは、細胞（例、眼細胞）に形質導入される場合、単一のｍＲＮＡ分子に転写される。ｍＲＮＡ分子の翻訳は、各コーディング配列にて開始され、それにより複数の別々のペプチドが同時に産生される。
【００７８】
本発明の方法は、他の非遺伝的な治療形態を含む処置レジメンの一部であり得る。従って、それは、薬物療法、光力学療法、光凝固レーザー療法、汎網膜療法、温熱療法、放射線療法、又は手術（例、黄斑移動術（ｍａｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、網膜下の血液の除去、又は網膜下脈絡膜血管新生膜の除去）等の多くの眼療法のいずれかを用いて血管漏出が処置されたことがあるか、処置されているか、あるいは処置されるであろう場合に、適切である。
【００７９】
（組成物及び投与の経路）
本発明の方法の発現ベクターは望ましくは、医薬として許容できる（即ち、生理学的に許容できる）担体及び発現ベクターを含む医薬組成物で投与される。ＰＥＤＦポリペプチドが動物に投与される場合、ＰＥＤＦポリペプチドは、医薬組成物で投与される。任意の適切な医薬として許容できる担体が、本発明の状況内で使用され得、このような担体は当該技術分野で周知である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与されるべき特定の部位、及び組成物を投与するために用いられる特定の方法により決定されるであろう。
【００８０】
適切な製剤としては、水溶性及び非水溶性溶液、等張滅菌溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図されるレシピエントの血液又は眼内液で製剤を等張にする溶質を含み得る）、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含み得る水溶性及び非水溶性滅菌懸濁液が挙げられる。この製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数用量を密封した容器で提示され得、使用直前に滅菌液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の溶液及び懸濁液は、上記の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。好ましくは、医薬として許容できる担体は、緩衝化生理食塩水溶液である。より好ましくは、本発明の方法における使用のための発現ベクターは、投与の前に損傷から発現ベクターを保護及び／又は安定化するように製剤化された医薬組成物で投与される。例えば、医薬組成物は、発現ベクターを調製、保存、又は投与するために用いられるデバイス（例、ガラス器具、シリンジ、ペレット、徐放性デバイス、ポンプ、又は針）上での発現ベクターの損失を低減するように製剤化され得る。医薬組成物は、発現ベクターの光感受性及び／又は温度感受性を減少するように製剤化され得る。この目的のために、医薬組成物は、好ましくは、医薬として許容できる液体担体（例えば、上記のもの等）、並びにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる安定化剤を含む。一実施形態では、製剤は、Ｔｒｉｓ塩基（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（７５ｍＭ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ（１ｍＭ）、ポリソルベート８０（０．００２５％）及び無水トレハロース（５％）を含む。このような医薬組成物の使用は、ベクターの貯蔵寿命を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を増加させる。この点では、医薬組成物はまた、形質導入効率を増強させるように製剤化され得る。適切な組成物はさらに、米国特許第６，２２５，２８９号及び同第６，５１４，９４３号に記載されている。
【００８１】
さらに、当業者は、本発明の方法の発現ベクター（例、ウイルスベクター）、又は本発明の方法のＰＥＤＦポリペプチドが、他の治療又は生物学的活性剤と共に組成物に存在し得ることを理解するであろう。例えば、特定の適用症の処置に有用な治療用因子が存在し得る。例えば、視力低下を処置する場合、ヒアルロニダーゼが、例えば、眼の硝子体中の血液及び血液タンパク質の破損に影響を及ぼすために、組成物に添加され得る。ヒアルロン酸もまた、医薬組成物に含め得る。イブプロフェン又はステロイド等の炎症を制御する因子は、ウイルスベクターのインビボ投与に伴う膨潤及び炎症、並びに眼の苦痛を低減するために組成物の一部であり得る。炎症はまた、炎症過程に関与するサイトカイン（例、ＴＮＦα）の効果をダウンレギュレートすることによって制御され得る。あるいは、炎症を制御するケモカイン（例、ＴＧＦβ）に対するアゴニストが、炎症の有害な影響を低減するために含まれ得る。免疫系の抑制剤が、ベクター自体に対する任意の免疫応答、又は眼障害に伴う任意の免疫応答を低減するために、本発明の方法との組合せにおいて投与され得る。脈管形成阻害剤（例えば、可溶性増殖因子レセプター（ｓｆｌｔ）、増殖因子アンタゴニスト（例、アンジオテンシン）、抗増殖因子抗体（例、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、スクアラミン（アミノステロール）など）はまた、神経栄養因子、血管成熟因子、及び分化因子（例、本明細書中に記載されているもの）と同様に、組成物の一部であり得る。同様に、ビタミン及びミネラル、抗酸化剤、並びに微量栄養素が、医薬組成物の一部として又は別々に共投与され得る。抗生物質、即ち、殺微生物剤及び殺真菌剤は、遺伝子移入方法及び他の障害に伴う感染のリスクを低減するために存在し得る。甲状腺ホルモン、レチノイド、特定のプロスタグランジン、エストロゲンホルモン、グルココルチコイド又はそれらのアナログなどの核レセプターに対するリガンドは、組成物の一部であり得る。ＰＥＤＦレセプターに対する低分子アゴニストもまた製剤に含まれ得る。このような低分子アゴニストは、本発明の方法の治療効果を増幅し得る。製剤に含有される適切な薬物として、プロスタグランジンアナログ、ベータ−ブロッカー（緑内障の処置に一般的には使用される）、ヒアルロニダーゼ（例、Ａｌｌｅｒｇａｎから入手可能なＶｉｔｒａｓｅ（登録商標））、ペグアプタニブ・ナトリウム（例、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））、テトラヒドロゾリン塩酸塩（例、Ｖｉｓｉｎｅ（登録商標））、ドルゾラミド塩酸塩（Ｃｏｓｏｐｔ（登録商標）及びＴｒｕｓｐｏｔ（登録商標））、並びにアルファ−２−アドレナリンアゴニスト（例、Ａｌｐｈａｇａｎ（登録商標））が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、これらの化合物は、動物に別々に投与され得る。
【００８２】
好ましくは、哺乳動物（詳細にはヒト）等の動物が血管漏出、又は血管漏出の任意の根本的な原因（例、眼血管新生）のリスクがあると、あるいは眼血管新生又は血管漏出を発生し始めていると決定された後は、可能な限り迅速に、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチド自体が、投与される（治療用処置）。処置は、部分的には、投与経路、任意の共療法、並びにもしあれば、認識される血管漏出の原因及び程度に依存する。理想的には、本発明の方法の発現ベクターは、眼細胞が発現ベクターと接触し、かつ形質導入されるように、眼に直接的に送達される。眼細胞としては、神経起源の細胞、網膜の全ての層の細胞、詳細には、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、周皮細胞、内皮細胞、虹彩上皮細胞、角膜細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、星状細胞、眼の周囲にあり、かつ付着している筋細胞（例、外側直筋の細胞）、線維芽細胞（例、上強膜に関連する線維芽細胞）、眼窩脂肪細胞、強膜及び上強膜の細胞、結合組織細胞、血管内皮細胞、及び小柱網の細胞が挙げられるが、それらに限定されない。小柱網は、眼の外への液体排出についての通路に関連する。好ましくは、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドは、血管漏出により影響されるか、又は血管漏出により影響されるリスクがある眼の領域（例、血管新生により悩まされる眼の領域）に投与される。
【００８３】
当業者は、治療剤（例、ＰＥＤＦをコードする発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチド自体）を眼に直接的に投与する適切な方法（即ち、侵襲的方法及び非侵襲的方法）が利用可能であることを理解するであろう。１を超える経路が治療剤を投与するために用いられ得るが、特定の経路は、別の経路よりも、より迅速かつより効果的な反応を提供し得る。本発明の方法は、所望の効果を達成するために、動物（好ましくは、ヒト）に発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドを投与する様式に依存せず、投与の記載された経路は単なる例示であり、そして如何なる様式にも限定されない。従って、ＰＥＤＦが発現ベクターから産生され、かつ眼細胞と接触する限り、いずれの投与経路も適切である。従って、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドは、注射、眼ローション、軟膏、インプラント等の形態で適切に製剤化され、投与され得る。発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドは、例えば、全身的、局所的、眼房内、結膜下、眼内、眼球後、眼周囲（例、テノン下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）送達）、網膜下、又は脈絡膜上に適用され得る。特定の場合では、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドに眼細胞を十分に曝すことを保障するために、複数の適用を投与し、複数の経路（例、網膜下及び硝子体内）を採用することが適切であり得る。発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドの複数の適用もまた、所望の効果を達成するために必要とされ得る。
【００８４】
特定の場合に依存して、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドを患者に非侵襲的に投与することが望ましいものであり得る。例えば、複数の手術が行われ、患者が麻酔薬に低い耐性しか示さない場合、又は他の眼関連障害が存在する場合、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドの局所投与が最も適切であり得る。局所用製剤は、当業者に周知である。このような製剤は、皮膚又は目の表面への適用のために、本発明の状況において適切である。パッチ、角膜シールド（例、米国特許第５，１８５，１５２号参照）、及び眼用溶液（例、米国特許第５，７１０，１８２号参照）及び軟膏（例、点眼剤）の使用は、当該技術分野における技能の範囲内である。発現ベクターはまた、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．から入手可能なＢｉｏｊｅｃｔｏｒ  ２０００  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）等の無針注射デバイスを用いて、非侵襲的に投与され得る。
【００８５】
発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドはまた、眼用スポンジ、網、メカニカルリザーバー、又はメカニカルインプラントなどの、発現ベクターの放出の制御又は持続を可能とするデバイス中に又は上に存在する。インプラント（例、米国特許第５，４４３，５０５号、同第４，８５３，２２４号、及び同第４，９９７，６５２号参照）、移植可能デバイス（例、メカニカルリザーバー、眼内デバイス又は眼内導管を備える眼外デバイス）などのデバイス（例、米国特許第５，５５４，１８７号、同第４，８６３，４５７号、同第５，０９８，４４３号及び同第５，７２５，４９３号参照）、あるいはポリマー組成物を含むインプラント又はデバイスは、発現ベクターの眼投与に特に有用である。発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドはまた、例えばゼラチン、コンドロイチン硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）等のポリホスホエステル、又はポリ乳酸−グリコール酸を含む、徐放性製剤（例、米国特許第５，３７８，４７５号参照）の形態で投与され得る。
【００８６】
好ましくは、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドは、眼の特定の領域への送達のための眼科用装置を介して投与される。特殊な眼科用装置の使用は、隣接する眼組織への損傷を最小限にしつつ正確な投与を保障する。眼の特定の領域への発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドの送達はまた、影響を受けていない細胞がＰＥＤＦに曝されることを制限する。好ましい眼科用装置は、鉗子及び網膜下針又は鋭い屈曲カニューレの組合せである。
【００８７】
あるいは、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドは、例えば、硝子体内注射又は網膜下注射（必要に応じて硝子体切除が先行する）、又は眼周囲（例、テノン下）送達などの侵襲的手法を用いて投与され得る。本発明の医薬組成物は、眼の異なる区画（例、硝子体内腔又は前房）に注入され得る。眼内注射が好ましいが、注射用組成物はまた、筋肉内、静脈内、動脈内及び腹腔内に投与され得る。注射用組成物のための医薬として許容できる担体は、当業者に周知である（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ（編），ｐ．２３８−２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ（第４版），ｐ．６２２−６３０（１９８６）参照）。あまり好ましくはないが、発現ベクターはまた、微粒子銃（即ち、遺伝子銃）によりインビボで投与され得る。
【００８８】
特に好ましくはないが、発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドは、非経口的に投与され得る。好ましくは、眼血管漏出の予防的又は治療的処置のために患者に非経口的に投与される任意の発現ベクターは、眼細胞を特異的に標的とする。本明細書中で考察されるように、発現ベクターは、潜在的な宿主細胞上のレセプターに対する発現ベクターの結合特異性又は認識性を変更するように、改変され得る。アデノウイルスに関して、このような操作としては、ファイバー、ペントン又はヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質の一部への種々のネイティブもしくは非ネイティブのリガンドの挿入などを挙げることができる。当業者は、非経口投与が、適切な宿主細胞に発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドを効率的に送達するために、多くの用量又は複数の投与を必要とし得ることを理解するであろう。
【００８９】
当業者はまた、投薬及び投与経路が宿主の免疫系に起因する発現ベクターの損失を最小限にするように選択され得ることを理解するであろう。例えば、インビボで眼細胞を発現ベクターと接触させるために、本発明の方法の実施前に、空の発現ベクター（即ち、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含まない発現ベクター）を宿主に投与することは、利点があり得る。空の発現ベクターの前投与は、発現ベクターに対する宿主の免疫（例、寛容）を創出するのに役立ち得、それによって免疫系により排除されるベクターの量を減少する。
【００９０】
本発明に従って動物（特にヒト）に投与される発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチドの用量は、合理的な期間にわたって動物に所望の応答を与えるのに十分であるべきである。当業者は、投薬が、年齢、種、問題の症状、及び条件又は疾患状態を含む種々の要因に依存することを認識するであろう。投薬はまた、発現されるべき治療用因子及び治療用因子の組合せ、並びに眼関連障害により影響を受けようとしているか、又は実際に影響を受けた眼組織の量に依存する。用量のサイズはまた、投与の経路、タイミング及び頻度、並びに例えば特定の発現ベクターの投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度、及び所望の生理的効果によって決定されるであろう。種々の条件又は疾患状態、特に慢性の条件又疾患状態が複数の投与を含む長期の処置を必要とし得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【００９１】
適切な用量及び投薬レジメンは、当業者に公知の通常の範囲決定技術によって決定され得る。好ましくは、約１０６ウイルス粒子〜約１０１２ウイルス粒子が、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を送達するために、患者に送達される。換言すれば、約１０６粒子／ｍｌ〜約１０１２粒子／ｍｌ（約１０６粒子／ｍｌ〜約１０１２粒子／ｍｌの範囲内の全ての整数を含む）、好ましくは、約１０１０粒子／ｍｌ〜約１０１２粒子／ｍｌのアデノウイルスベクター濃度を含む医薬組成物が投与され得、そして代表的には、眼あたりこのような医薬組成物の約０．１μｌ〜約５００μｌ（例、約１０μｌ、約５０μｌ、約１００μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、又は約４００μｌ）の眼内投与を含む。幾つかの場合では、注射は、約０．５ｍＬ〜約１ｍＬの医薬組成物を含み得る。理想的には、眼あたり約１×１０６、約１×１０６．５、約１×１０７、約１×１０７．５、約１×１０８、約１×１０８．５、約１×１０９、又は約１×１０９．５粒子のアデノウイルスベクターの用量が、硝子体内注射を介して患者に投与される。あるいは、本発明の方法のアデノウイルスベクターは、眼あたり約１×１０５、約１×１０５．５、約１×１０６、約１×１０６．５、約１×１０７、約１×１０７．５、約１×１０８、又は約１×１０８．５粒子の用量において網膜下に投与される。眼周囲に投与される場合、投与されるアデノウイルスベクターの用量は、好ましくは、眼あたり約１×１０７、約１×１０７．５、約１×１０８、約１×１０８．５、約１×１０９、約１×１０９．５、約１×１０１０、約１×１０１０．５、約１×１０１１、約１×１０１１．５、又は約１×１０１２粒子である。発現ベクターがプラスミドである場合、好ましくは、約０．５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡが投与される。より好ましくは、約０．１μｇ〜約５００μｇが投与され、さらにより好ましくは、約１μｇ〜約１００μｇのＤＮＡが投与される。最も好ましくは、約５０μｇのＤＮＡが眼あたり投与される。ＰＥＤＦポリペプチドを眼に直接的に送達する場合には、理想的には約２μｇ〜約１００μｇのＰＥＤＦ（例、約１５μｇ〜約８０μｇのＰＥＤＦ、好ましくは、約３０μｇ〜約５０μｇのＰＥＤＦ）が、ヒトの眼に投与される。理想的には、約９μｇ〜約２３μｇのＰＥＤＦタンパク質が、眼に投与される。全身的に投与される場合、約３ｍｇ〜約２０ｍｇのＰＥＤＦポリペプチド、好ましくは約５ｍｇ〜約１５ｍｇのＰＥＤＦポリペプチド、及び最も好ましくは約８ｍｇのＰＥＤＦが、ヒト患者に投与される。もちろん、他の投与経路は、治療効果を達成するために、より低い、又はより高い用量を必要とし得る。投薬及び投与経路における任意の必要なバリエーションは、当該技術分野で公知の慣用的な技術を用いて当業者により決定され得る。
【００９２】
幾つかの実施形態では、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はＰＥＤＦポリペプチド自体の２回以上（即ち、複数）の用量を投与することは利点がある。特に、本発明の方法は、血管漏出を予防的又は治療的に処置するために、発現ベクターの複数の適用を提供する。例えば、外因性核酸（例、ＰＥＤＦをコードする核酸配列）を含む発現ベクターの少なくとも２回の適用が、同じ眼に投与され得る。あるいは、ＰＥＤＦポリペプチドの少なくとも２回の適用が、患者に提供され得る。好ましくは、複数の用量は、バックグラウンドレベルを超える遺伝子発現を保持しつつ投与される。また好ましくは、発現ベクターの２回以上の適用が、約３０日以内又はそれを超える間に、眼に投与される。より好ましくは、２回以上の適用が、約９０日以内又はそれを超える間に、同じ眼の眼細胞に投与される。しかしながら、遺伝子発現が起こり、かつ血管漏出が阻害又は緩解される限り、３回、４回、５回、６回又はそれを超える用量が、任意の期間において投与され得る（例、用量の間で、２日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、７０日、７７日、８５日又はそれを超える日）。好ましい実施形態では、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターは、３ヶ月に２回、又は６週に４回、同じ眼に投与される。
【００９３】
ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクターが、所定の動物、特にヒトから予め取り出された細胞、好ましくは眼細胞にエキソビボで導入され得ることが当業者により理解されるであろう。動物又はヒトに再導入された、このような形質導入された自己又は相同の宿主細胞は、ＰＥＤＦをインビボで直接的に発現するであろう。１つのエキソビボ治療の選択肢は、眼又は身体の任意の他の部分に移植され得る生体適合性カプセルへの感染した眼細胞のカプシド形成を含む。当業者は、このような細胞が患者から単離される必要がないが、その代わりに、別の個体から単離され、患者に移植され得ることを理解するであろう。
【００９４】
（他の考慮）
治療用遺伝子の発現の調節は、動物における生物学的応答（例、治療的応答）の影響の際に重要である。治療用因子の長期産生又は繰り返し投与は、単回ボーラス投与よりも、眼の進行性又は慢性障害（あるいは身体の位置にかかわらず任意の障害又は疾患の状態）をより効率的に処置し得る。しかし、アデノウイルスの状況では、ＣＭＶプロモーターの指示下の多くの遺伝子の発現は、本来は一過性であり、眼の硝子体及び身体における他の位置への投与の後、およそ２〜４週続くと報告されている。同様の効果が、アデノウイルスベクター骨格で他のプロモーターを用いて観察されている。治療用遺伝子のさらなる又は引き続く発現は、以前には、標的組織（例、眼又は周囲の組織）に発現ベクターを反復して投与することによってのみ達成できた。しかしながら、驚くべきことに、導入遺伝子発現は、インビボでのアデノウイルスベクターの投与後に増強又はアップレギュレートされ得、そして発現レベルが衰えた後に再活性化され得ることが決定された。本発明は、発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）を反復して投与することなく、長期の導入遺伝子発現（好ましくは、治療用導入遺伝子）を達成する方法を提供する。長期の発現及び好ましくはタンパク質産生は、発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与後の任意の時点で導入遺伝子の転写をアップレギュレートし、それによりタンパク質産生を再活性化することによって達成される。
【００９５】
長期の遺伝子発現を達成するために、プロモーターに機能可能に連結され、かつＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、発現ベクターが宿主細胞（例、１以上の眼細胞）に形質導入し、そして核酸配列が遺伝子産物を産生するために転写されるように、眼に投与される。ＰＥＤＦをコードする核酸配列の転写は、発現ベクターの投与後にアップレギュレートされる。発現の活性化は、ウイルスプロモーター（例、ＣＭＶ前初期プロモーター）を有するベクターに限定されず、例えば、ＥＦ１−α（伸長因子１−α）（これは、少なくとも部分的にｊｕｎ及びｆｏｓから構成される）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、並びにＹｉｎｇ  Ｙａｎｇ  １（ＹＹ１）プロモーター等の細胞プロモーターの使用にもまた拡張される。転写のアップレギュレーションは、ＲＮＡ転写物レベルの増加、タンパク質産生の増加、及び／又は検出可能な遺伝子産物活性の増強（それらの全ては、慣用的な実験室技術を用いて検出され得る）を生じ得る。転写は、例えば、外因性物質を眼に投与することにより、及び／又は眼におけるストレス応答を誘導することにより、発現ベクターを含む宿主細胞の環境を変更することによって、当該細胞において調節される。外因性物質は、眼に直接的に投与され得るか（それは、幾つかの場合では、眼におけるストレス応答を誘導する）、又は眼以外の部位に投与され得る。投与の例示的経路は本明細書中に記載され、例えば、局所、結膜下、眼球後、眼周囲、テノン下、網膜下、脈絡膜上、又は眼内投与が挙げられる。例えば、眼周囲注射は、網膜に対するタンパク質及び／又は核酸の送達を可能とする。従って、徐放性デバイスは、眼の種々の領域に物質を投与するために眼周囲の空間に移植され得る。外因性物質を、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、鼻内、経皮、全身、又は気管内に投与することもまた、適切である。外因性物質は、投与の任意の適切な経路のために製剤化され得る。例えば、外因性物質は、例えばレチノイン酸（例、全トランス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、ＮＰＢ、又はＬＧ１０００６４）の、点眼剤、眼への局所送達用の軟膏、経口送達用の組成物、又は全身送達用の非経口溶液に製剤化され得る。
【００９６】
眼における核酸配列の転写のアップレギュレーションのために動物に投与するために適切な外因性物質としては、生理食塩水、二糖類（例、トレハロース）、タンパク質、核酸、及び薬物（例、ホルボールエステルなど）などの本明細書中に記載されている任意の物質が挙げられるが、それらに限定されない。タンパク質を投与する場合、タンパク質は、好ましくは、サイトカイン、脈管形成阻害剤（例、可溶性ｆｌｔ（ｓ−ｆｌｔ））、神経栄養剤、ステロイド、酵素（例、ヒアルロニダーゼ）、又は抗体（例、抗ＶＥＧＦ抗体）である。核酸を投与する場合、好ましくは、核酸は、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、又は二重鎖ＲＮＡである。転写のアップレギュレーションに適切な薬剤としては、免疫抑制剤（例、シクロスポリン、グルココルチコイド、又はＳＫ５０６）、ステロイド誘導体、ジクロフェナックナトリウム及びミソプロストール（ｍｉｓｏｐｒｏｓｔｏｌ）、ジクスルウレナック（ｄｉｘｌｕｒｅｎａｃ）、コンブレタスタチン、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（例、ＬＹ３３３５３１（Ｄａｎｉｓら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３９（１），１７１−９（１９９８））参照）、チロシンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤（Ｓｅｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５４（６），１７４３−５３（１９９９））、Ｃｏｘ−Ｉ阻害剤、Ｃｏｘ−ＩＩ阻害剤（例、ネパフェナック）、抗炎症剤、アスピリン、又はヒアルロン酸が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９７】
あるいは又はさらには、第２の発現ベクター（例、第２のアデノウイルスベクター）が、動物に投与され得る。理想的には、第２のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ４領域によりコードされる全ての複製必須遺伝子機能を欠損する。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の全ての遺伝子機能を欠損する。理想的には、第２のアデノウイルスベクターは、ＰＥＤＦコーディング配列を含まない。第２の発現ベクターが、治療用タンパク質をコードする必要はない。
【００９８】
転写をアップレギュレートするために投与するのに好ましい化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（これは、抗脈管形成及び抗癌活性を有し得る）、並びにレチノイン酸である。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＨＤＡＣ１及びＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ１１、ＨＤＡＣ４及びＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、又はサーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）を含むが、それらに限定されない任意の哺乳動物クラスＩ、クラスＩＩ、又はクラスＩＩＩのヒストンデアセチラーゼ酵素を阻害し得る。例示的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤としては、例えば、短鎖脂肪酸、ブチレート及びフェニルブチレート、バルプロエート、ヒドロキサム酸、トリコスタチン、ＳＡＨＡ及びその誘導体、オキサムフラチン、ＡＢＨＡ、スクリプタイド（ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）、ピロキサミド、プロペンアミド、エポキシケトン含有環状テトラペプチド、トラポキシン、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、ジヘテロペプチン、ＷＦ−３１６１、Ｃｙｌ−１及びＣｙｌ−２、非エポキシケトン含有環状テトラペプチド、ＦＲ９０１２２８、アピシジン、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド（ＣＨＡＰ）、ベンズアミド及びそのアナログ、ＭＳ−２７５（ＭＳ−２７−２７５）、ＣＩ−９９４、デプデシン、並びに有機硫黄化合物が挙げられる。同様に、全トランス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、ＮＰＢ、及びＬＧ１０００６４等のレチノイン酸の種々の機能的アナログが当該技術分野で公知である。レチノイン酸は、レチノイン酸レセプターの２つのファミリー（ＲＡＲ及びＲＸＲ）の少なくとも１つと結合する。レチノイン酸レセプターへのレチノイン酸の結合の際、レチノイン酸レセプターは二量体化し得、それによりレチノイン酸応答エレメントと相互作用する活性なレセプター複合体を形成する。
【００９９】
好ましい実施形態では、動物に投与される外因性物質は、リポ多糖（これは、多くの組織で炎症を引き起こし得る）等のパイロジェンではない。従って、本発明の方法は、望ましくは、転写の非パイロジェン活性化剤（例、本明細書中に記載されている外因性物質）を投与することを含む。同様に、幾つかの実施形態では、転写をアップレギュレートするために、アデノウイルスベクター（又は他の発現ベクター）を投与しないことが好ましい。アデノウイルスベクターの繰り返し投与は、特に眼で炎症を引き起こし得る。アデノウイルス由来の外因性物質はまた、炎症を引き起こし得、そして幾つかの場合では、転写をアップレギュレートするために適切ではあり得ない。放射線もまた、組織損傷を引き起こし得、そして幾つかの場合では、好ましいものではあり得ない。炎症、免疫応答を引き起こすか、又は形質導入した細胞を損傷する外因性物質は、多くの場合に（特に、細胞保護が所望される状況下では）適切ではないことが理解されるであろう。さらに、発現ベクターが存在している限り、転写の再活性化が任意の時点で達成され得る。形質導入した細胞の除去は、この点で所望されない。
【０１００】
転写はまた、眼においてストレス応答を誘導することによって、アップレギュレートされ得る。ストレス応答は、眼の穿刺、例えば光力学療法においてレーザーを用いる熱への暴露、低温への暴露、光への暴露、放射線（例、Ｘ線）への暴露、マイクロ波への暴露、超音波への暴露、又は物理的外傷（それらの全ては、眼の細胞環境を変更して、転写を増強させ得る）によって誘導され得る。眼細胞の環境を変更する代替方法は、緑内障検査の間に通常施されるように、一吹きの空気を眼に施すことによる。あるいは、ストレス応答は、核酸、脂質、薬物、及び本明細書中に記載されている他のもの、又はストレス応答を誘導するか、又はそれ自体が細胞ストレス応答における活性な関与物である上記のものの任意の組合せなどの外因性物質を投与することによって誘導され得る。
【０１０１】
転写は、実施者により所望される発現プロフィールによって決定されるように、アップレギュレートされ得る。理想的には、本方法は、第１の発現ベクターの投与後に転写をアップレギュレートすることを含む。ウイルスゲノムが眼において安定であり（１日目のレベルの〜２０％が、投与後少なくとも１ヶ月間検出される）、そして１年以上維持されるという点で、アデノウイルスベクターは、繰り返し投与することなく、延長された期間にわたってタンパク質を送達する手段を提供する。実施者は、初期の発現レベルを増強及びアップレギュレートするために、発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与と同時に細胞環境を変更し得るが、好ましくは、転写は、発現ベクター投与に引き続いてアップレギュレートされる。転写は、同じアデノウイルス骨格から複数（即ち、２以上）倍にアップレギュレートされ得る。大部分のプロモーターは、ある期間後（例、２週間）活性を喪失する。１つの局面では、転写は、導入遺伝子産物の発現を再活性化するために、プロモーター活性の喪失に応答してアップレギュレートされる。転写は、好ましくは、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも１日以内に１度、より好ましくは、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも７日以内に１度（例、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも１４日以内に１度）、アップレギュレートされる。理想的には、転写は、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも２１日以内に１度、好ましくは、少なくとも２８日で１度、アップレギュレートされる。あるいは、転写は、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも３５日以内、４２日以内、又は４８日以内に１度、アップレギュレートされる。より好ましくは、転写は、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも３月（例、４月又は５月）以内に１度アップレギュレートされ、さらにより好ましくは少なくとも６月（例、７月、８月、又は９月以上）以内に１度、アップレギュレートされる。最も好ましくは、転写は、アデノウイルスベクターの投与の少なくとも１２月（即ち、１年）以内に１度、アップレギュレートされる。動物の寿命に依存して、発現は、所望される場合、長月（即ち、１０年又は２０年）の後、再活性化され得る。実際、転写は、発現ベクターが宿主細胞中に存在する（そして形質導入した宿主細胞が機能的である）限り、アップレギュレート又は再活性化され得る。従って、転写は、形質導入した宿主細胞の寿命に依存して、発現ベクターの投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０年以上の後にわたり、必要により、再活性化又はアップレギュレートされ得る。
【０１０２】
発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与とＰＥＤＦコーディング配列の転写のアップレギュレーションとの間の時間は、ケースバイケースを基礎として、実施者により決定され得る。望ましくは、発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与と転写のアップレギュレーションとの間の時間は、少なくとも１日（例、少なくとも４日、少なくとも７日、又は少なくとも１４日）である。あるいは、第１の発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与と転写のアップレギュレーションとの間の時間は、少なくとも２８日（例、少なくとも４８日、少なくとも６０日、又は少なくとも３月）である。さらに、第１の発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与と転写のアップレギュレーションとの間の時間は、少なくとも６月（例、少なくとも９月又は１年）であり得る。１つの実施形態では、転写は、初期転写レベルが２、５、又は１０倍減少した後にアップレギュレートされる。
【０１０３】
さらに、転写は、発現ベクターの投与後、多くの回数アップレギュレート又は再活性化され得る。転写は、例えば、１回〜約５０回（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、又は５０回）アップレギュレート又は再活性化され得る。
【０１０４】
核酸配列（例、ＰＥＤＦをコードする核酸配列）の転写のアップレギュレーション（再活性化）は、試験した時点（即ち、発現プロフィール上の同じ時点）にて、アップレギュレーション転写を欠落する核酸配列の転写レベルに比し、転写における増強を生じる。好ましくは、転写のアップレギュレーション後の転写レベルは、発現プロフィールのどの時点で転写のピークレベルが生じたとしても、転写のアップレギュレーションを欠落する核酸配列の転写レベルよりも大きい。驚くべきことに、アデノウイルスベクター構築物の発現能は、少なくとも２８日間保持され、そして本発明の方法を用いて約１０〜約１００倍にアップレギュレートされ得る。従って、核酸配列の転写レベルは、好ましくは、転写のアップレギュレーションを欠落する核酸配列の転写レベルと比較して、少なくとも約２倍増強される。より好ましくは、核酸配列の転写レベルは、転写のアップレギュレーションを欠落する核酸配列の転写レベルよりも、少なくとも約５倍（例、少なくとも約１０倍、約２０倍、約２５倍、約３５倍、約４０倍、又は約４５倍）大きい。さらにより好ましくは、核酸配列の転写レベルは、転写のアップレギュレーションを欠落する核酸配列の転写レベルよりも、少なくとも約５０倍（例、少なくとも約５５倍、約６０倍、約６５倍、又は約７０倍）大きい。最も好ましくは、核酸配列の転写レベルは、転写のアップレギュレーションを欠落する核酸配列の転写レベルよりも、少なくとも約７５倍（例、少なくとも約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、又は約１００倍）大きい。
【０１０５】
一方、アップレギュレーション後に達成される転写レベルは、第１の発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与１日後での転写レベルと比較され得る。幾つかの場合では、発現ベクターの投与１日後での発現レベルは、転写のピークレベルである。好ましくは、転写アップレギュレーションの１日後での転写レベルは、第１の発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与１日後での核酸配列の転写レベルの、少なくとも約２０％（例、少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約４５％）である。より好ましくは、転写アップレギュレーションの１日後での転写レベルは、第１の発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与１日後での核酸配列の転写レベルの、少なくとも約５０％（例、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％）である。最も好ましくは、転写アップレギュレーションの１日後での転写レベルは、第１の発現ベクター（例、アデノウイルスベクター）の投与１日後での核酸配列の転写レベルの、少なくとも約１００％である（例、１００％よりも高い）。
【０１０６】
本発明の方法の発現ベクターは、治療用因子をコードしない導入遺伝子を含み得る。例えば、導入遺伝子は、緑蛍光タンパク質又はルシフェラーゼ等のマーカータンパク質をコードし得る。このようなマーカータンパク質は、ベクター構築及びベクター移動の決定に有用である。マーカータンパク質はまた、所望される場合、処置の広範な領域を提供するために、発現ベクターの注入の間隔を効率的に空けるように、注入の点又は処置される眼組織を決定するのに用いられ得る。あるいは、導入遺伝子は、ベクター構築プロトコルでもまた有用である選択因子をコードし得る。
【０１０７】
本発明の方法はまた、他の医薬として活性な化合物の共投与を含み得る。「共投与」とは、上記のような発現ベクターの投与前、それと同時（例、同じ製剤中又は別々の製剤中の発現ベクターとの組合せ）、又はその後の投与を意味する。本明細書中に記載されている外因性物質、薬物、タンパク質などの任意のものが、アジュバント療法として発現ベクターと共投与され得る。例えば、炎症を制御する因子（例、イブプロフェン又はステロイド）が、発現ベクターの眼内投与に伴う膨潤及び炎症を低減するために共投与され得る。免疫抑制剤は、眼障害又は本発明の方法の実施に関連する不適切な免疫応答を低減するために共投与され得る。可溶性増殖因子レセプター、増殖因子アンタゴニスト（即ち、アンジオテンシン）等の抗脈管形成因子もまた、神経栄養因子と同様に共投与され得る。さらに、本発明の方法の発現ベクターは、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、又は脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ等）を隔離又は不活化する抗体などの抗増殖剤と共に投与され得る。同様に、ビタミン及びミネラル、抗酸化剤、並びに微量栄養素が共投与され得る。抗生物質（即ち、殺微生物剤及び殺真菌剤）は、眼手法及び幾つかの眼関連障害に伴う感染のリスクを低減するために共投与され得る。眼障害のための他の治療薬は、本発明の方法と連関して投与され得る。例えば、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｒｅｔａａｎｅ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ（Ｇｅｎａｅｒａ）、Ｃｏｓｏｐｔ、及びＡｌｐｈａｇａｎは、第１の発現ベクターと共に処方され得るか、又は動物への第１の発現ベクターの投与の前、間、又は後に別々に投与され得る。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、当然のことながら、その範囲を如何なる様式にも制限するものとして解釈されるべきではない。
【０１０９】
実施例１
本実施例は、インビボ網膜において、アデノウイルスベクターから、抗脈管形成及び神経栄養活性の両方を含む因子の発現を得る好ましい方法を説明する。
【０１１０】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損し、かつＰＥＤＦ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＰＥＤＦ）を、好ましくは、ＷＯ９９／１５６８６（ＭｃＶｅｙら）に示されるように構築する。しかしながら、本発明の方法は、用いられたベクター構築の方法に依存せず、ベクター構築の以前に記載された方法もまた適切である。
【０１１１】
眼血管新生の幾つかのインビボモデルが利用可能である。網膜の血管新生を、例えば、新生仔動物、即ち、新生仔マウスにおいて、出生後まもなくのマウスを低酸素条件に曝すことにより得る。数日後、新生仔マウスを標準的な大気条件に曝して、網膜の虚血誘導性血管新生を引き起こす。
【０１１２】
Ａｄ．ＰＥＤＦを、例えば、硝子体内注射を介して、ケタミン又はケタミン及びキシラジンの組合せで麻酔された少なくとも１２日齢のマウスの右眼に投与する。注射を、眼の後方部分に導入部位を形成し、Ａｄ．ＰＥＤＦを含むおよそ０．１〜５．０μｌの組成物を投与することにより行う。多くの場合には、発現ベクターの注射剤を片方の眼にのみ投与し、一方で、残りのｍＲＮＡはコントロールとする。マウスを投与後の種々の時点で屠殺し、網膜におけるＰＥＤＦ発現の程度及び持続時間を決定する。各動物の右及び左の眼を摘出し、いずれかを組織学的解析のために固定化するか、又はＰＥＤＦ発現解析のために調製する。ＰＥＤＦ  ＤＮＡ、ＰＥＤＦ  ＲＮＡ、又はＰＥＤＦタンパク質の検出は、当該技術分野で周知の方法、例えば、ＰＣＲ及びブロッティング技術（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）参照）を用いて達成し得る。
【０１１３】
例えばヒトにおけるインビボでの血管新生に対するＰＥＤＦの効果を決定するため、網膜の間接的眼底検査が理想的である。立体写真は広範な血管新生の検出に有用であるが、細部の病変の検出には適切ではない。
【０１１４】
実施例２
本実施例は、インビボ脈絡膜において、アデノウイルスベクターから、抗脈管形成及び神経栄養活性の両方を含む因子の発現を得る好ましい方法を実証する。以下の実施例はさらに、血管新生に対するＰＥＤＦの効果を決定するための方法を提供する。
【０１１５】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損し、かつＰＥＤＦ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＰＥＤＦ）を、ＷＯ９９／１５６８６（ＭｃＶｅｙら）に示されているように構築する。
【０１１６】
脈絡膜血管新生のインビボモデルは、例えばマウス又はウサギの眼の網膜を剥離させ、色素性上皮を切除することにより得ることができる。脈絡毛細管再生を、処置した及び未処置の眼の両方でモニターする。Ａｄ．ＰＥＤＦを網膜色素上皮（ＲＰＥ）の撹乱前に投与し、脈絡膜血管新生の予防における本発明の方法の効果を決定する。当然のことながら、Ａｄ．ＰＥＤＦを、血管新生に対する本手法の治療効果を決定するために、網膜及びＲＰＥの撹乱後に投与する。
【０１１７】
脈絡膜血管新生は、当該技術分野で一般的に用いられるように、眼底写真、フルオレセイン血管造影法及び／又はインドシアニン−グリーン血管造影法を用いてインビボでモニターし得る。これらの方法を用いることで、当業者は、血管新生にしばしば関連する新たな血管の増殖及び血管漏出を検出し得る。研究目的のために、血管新生もまた、眼を摘出し、血管鋳型（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃａｓｔ）を調製することによってか、又は走査電子顕微鏡を介して眼組織を調べることによって決定し得る。
【０１１８】
実施例３
本実施例は、複数用量の外因性核酸を眼に送達するアデノウイルスベクターの利用性を実証する。
【０１１９】
ルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．Ｌ）又は如何なる導入遺伝子も含まないコントロールアデノウイルスベクター（Ａｄ．ｎｕｌｌ）を、Ｃ５７ＢＬ６マウスの眼の硝子体内空間に注射した（０日目）。アデノウイルスベクターの注射１日後（１日目）、Ａｄ．Ｌに感染した眼を摘出し、凍結した（１回目の投与）。Ａｄ．ｎｕｌｌに感染した眼を３つの群に分割した。群Ｉでは、Ａｄ．Ｌベクターを、１４日目（初回用量のＡｄ．ｎｕｌｌの１４日後）に、眼の硝子体内空間に注射した。群Ｉの眼を摘出し、アデノウイルスベクターの２回目の投与の翌日（１５日目、２回目の投与）に凍結した。群ＩＩの眼にＡｄ．ｎｕｌｌを１４日目に硝子体内に注射し、Ａｄ．ｎｕｌｌによる初回注射の４週後に、Ａｄ．Ｌベクターを硝子体内に注射した（２８日目、３回目の投与）。次いで、眼を摘出し、アデノウイルスベクターの３回目の投与後の日に凍結した。群ＩＩＩの眼にＡｄ．ｎｕｌｌを１４日目及び２８日目に硝子体内に注射し、Ａｄ．ｎｕｌｌによる初回注射の６週後にＡｄ．Ｌベクターを注射した（４２日目、４回目の投与）。次いで、眼を摘出し、アデノウイルスベクターの４回目の投与後の日に凍結した。ルシフェラーゼアッセイを眼のサンプルに対して行って、ベクターの複数用量に関連する感染効率及び遺伝子発現を決定した。
【０１２０】
アデノウイルスベクターの１回目及び２回目の投与後の眼細胞におけるルシフェラーゼ発現は実質的に同等であった。換言すれば、遺伝子移入ベクターの２回の投与後、遺伝子発現の如何なる損失も検出されなかった。アデノウイルスベクターの３回目の投与からの遺伝子発現は、１回目の投与及び２回目の投与からの遺伝子発現と比較して、１０倍と１００倍との間に低減したが、依然としてバックグランドレベル（例、Ａｄ．ｎｕｌｌで形質導入された細胞で検出されるもの）よりも上であった。アデノウイルスベクターの４回目の投与からの遺伝子発現は、３回目の投与後に観察された遺伝子発現と比較して、およそ３倍から１０倍に低減した。しかしながら、４回目の投与後の遺伝子発現のレベルは、バックグランドレベルよりも上であった。
【０１２１】
本実施例は、眼細胞における外因性核酸の発現を得るために、アデノウイルスベクターの眼への複数適用を行う容易性を実証する。
【０１２２】
実施例４
本実施例は、抗脈管形成及び神経栄養特性の両方を含む因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターが脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する能力を実証する。
【０１２３】
ＣＭＶ前初期プロモーターに機能可能に連結されたＰＥＤＦについてのコーディング配列を含む複製欠損（Ｅ１−／Ｅ３−欠損）アデノウイルスベクター（ＡｄＰＥＤＦ．１０）を、標準的な技術を用いて構築した。ＰＥＤＦコーディング配列を含まない、ｎｕｌｌバージョンのベクター（ＡｄＮｕｌｌ．１０）もまた構築した。
【０１２４】
Ｈａｒｖａｒｄポンプマイクロインジェクション装置及びプルドガラス（ｐｕｌｌｅｄ  ｇｌａｓｓ）マイクロピペットを用いて、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡｄＮｕｌｌ．１０又はＡｄＰＥＤＦ．１０を硝子体内に注射した。各眼に、１０９粒子のウイルスを含む１μｌのビヒクルを硝子体内に注射した。あるいは、各眼に、１μｌのヒビクル中に懸濁された１０８粒子のウイルスを網膜下に注射した。注射５日後、マウスをケタミン塩酸塩（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。ダイオードレーザー光凝固によるブルッフ膜の破裂前に、トピカミド（１％）を利用して瞳孔を散大させた。ブルッフ膜の破裂は、脈絡膜の血管新生を誘導することが知られている。
【０１２５】
ブルッフ膜のレーザー誘導破裂の１４日後、脈絡膜フラットマウント（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｆｌａｔ  ｍｏｕｎｔ）（Ｅｄｅｌｍａｎら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４１，Ｓ８３４（２０００）に記載されている）を調製して、脈絡膜の血管新生の程度を観察した。簡潔には、眼を被験体から取り出し、リン酸緩衝化ホルマリン中で固定した。角膜、水晶体、及び網膜を眼杯から取り出し、眼杯をフラットマウントした。次いで、フラットマウントを蛍光顕微鏡により調べ、コンピューター画像解析のために、３色ＣＣＤビデオカメラ（ＩＫ−ＴＵ４０Ａ，東芝，東京，日本）を用いて、画像をデジタル化した。
【０１２６】
血管新生の広い領域を、注射していない眼及びＡｄＮｕｌｌ．１０を受けている眼において観察した。ＡｄＰＥＤＦ．１０を網膜下又は硝子体内に注射された眼は、コンピューター画像解析を用いると、コントロールと比較して血管新生のより小さな領域を示した。
【０１２７】
上記の結果は、本発明の方法が、臨床的な動物関連モデルにおいて、眼血管新生、即ち、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する能力を説明する。
【０１２８】
実施例５
本実施例は、抗脈管形成及び神経栄養性特性の両方を含む因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターが虚血誘導性網膜血管新生を阻害する能力を実証する。
【０１２９】
ＣＭＶ前初期プロモーターに機能可能に連結されたＰＥＤＦについてのコーディング配列を含む複製欠損アデノウイルスベクターを、標準的な技術を用いて構築した。ＰＥＤＦをコードするＥ１−／Ｅ３−／Ｅ４−欠損ベクター（ＡｄＰＥＤＦ．１１）及びＰＥＤＦコーディング配列を含まない、ｎｕｌｌバージョンのベクター（ＡｄＮｕｌｌ．１１）を構築した。
【０１３０】
虚血網膜症を、以前に記載（例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３５，１０１（１９９４）参照）されているように成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに生じさせた。簡潔には、７日齢のマウス（Ｐ７）を７５＋／−３％酸素の大気に５日間曝した。Ｐ１０に、マウスに１０９粒子のＡｄＰＥＤＦ．１１又はＡｄＮｕｌｌ．１１を硝子体内に注射し、酸素に二日間戻し、次いで室大気に戻した。Ｐ１７に、マウスを屠殺し、眼を素早く取り出し、至適切断温度包埋化合物（ＯＣＴ；Ｍｉｌｅｓ  Ｄｉｓｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中で凍結した。
【０１３１】
血管新生を検出するために、眼を切片にし、ビオチン化されたグリフォニア・シンプリシフォリア・レクチンＢ４（ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４）（ＧＳＡ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）により組織化学的に染色した。次いで、スライドをメタノール／Ｈ２Ｏ２中で４℃にて１０分間インキュベートし、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．６（ＴＢＳ））で洗浄し、１０％正常ブタ血清中で３０分間インキュベートした。次いで、スライドをビオチン化ＧＳＡと共に２時間インキュベートし、ＴＢＳでリンスし、アビジン結合化アルカリホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４５分間インキュベートした。ＴＢＳによる１０分間の洗浄後、スライドをＨｉｓｔｏｍａｒｋ  Ｒｅｄと共にインキュベートした。ＧＳＡ染色した１０μｍの一連の切片を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を用いて調べた。画像を、コンピューター画像解析のために、３色ＣＣＤビデオカメラ（ＩＫ−ＴＵ４０Ａ，東芝，東京，日本）を用いてデジタル化した。
【０１３２】
広範な網膜血管新生を、如何なるウイルスも注射していない眼において検出した。ＡｄＮｕｌｌ．１１を注射した眼は、注射していない眼よりも、より低い血管新生を示したが、ＡｄＰＥＤＦ．１１を注射した眼よりも、網膜のより有意な血管新生を示した。ＡｄＰＥＤＦ．１１を注射した眼は、最小量の血管新生を含んだ。
【０１３３】
本実施例は、本発明の方法が、臨床的に関連する動物モデルにおいて、眼関連障害、即ち、虚血誘導性網膜血管新生を阻害する能力を明らかに実証する。
【０１３４】
実施例６
本実施例は、アデノウイルスベクターゲノムが眼に少なくとも２８日間残存することを実証する。
【０１３５】
アデノウイルスベクターにおけるＣＭＶプロモーターの指示下の多くの遺伝子の発現は、天然では一過性であり、眼の硝子体内への投与後およそ２週間持続することが報告されている。発現の損失は、眼からのベクターゲノムのクリアランス又はベクターゲノムからの発現の停止に起因し得るものであった。これらの潜在的メカニズムに取り組むため、眼におけるベクターゲノムの存在を、アデノウイルスベクターの硝子体内送達後に測定した。Ｅ１、Ｅ４、及びＥ３（部分的）アデノウイルス初期遺伝子領域を欠失した複製欠損アデノウイルスを、実施例５に記載されているように硝子体内注射を介してマウスの眼内に送達した。ベクターゲノムの量を、高感度かつ特異的な定量的ＰＣＲアッセイを用いて定量した。インビトロ及びインビボにおけるゲノムに対する用量応答性は、ｑＰＣＲアッセイの高感度性及び信頼性を示した。眼におけるアデノウイルスベクターゲノムの量を、用量及び投与後の時間の関数として定量した。投与１日後での眼におけるベクターゲノムのレベルは、投与したベクター粒子の量と直接的に相関した。これらのデータは、発現が急速に落ちるが、ベクターゲノムの量が投与２８日後では顕著に一定のままであることを示した。
【０１３６】
本実施例は、アデノウイルスベクターからの発現の一過的性質が発現の停止に起因し、眼組織からのアデノウイルスベクターゲノムの損失には起因しないことを示唆する。アデノウイルスベクターゲノムの量は、硝子体内注射後の少なくとも２８日間は一定のままであった。
【０１３７】
実施例７
本実施例は、宿主細胞におけるストレス応答の誘導により細胞環境を変更することによる、アデノウイルスベクターからの導入遺伝子発現の調節を実証する。
【０１３８】
アデノウイルス血清型５ベクターの一部として、眼の硝子体内腔に送達される、マーカー遺伝子、即ち、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の経時変化を決定した。アデノウイルスベクターゲノムは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損し、かつルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた（ＡｄＬ．１１Ｄ）。ＣＭＶ前初期プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域を交換したものであり、一方Ｅ４領域は、転写されないスペーサー配列と交換されていた。
【０１３９】
合計１×１０７粒子単位（ｐｕ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに硝子体内注射した。眼を投与後の種々の日数で回収し、ルシフェラーゼ活性の相対レベルを決定した。ルシフェラーゼ活性の測定は、転写の研究で受け入れられている方法である。発現の最初の突発（ｂｕｒｓｔ）が、図１に示されるように、投与１日後に観察され、２週間までに７〜１０倍減少した。このより低いレベルの発現は、バックグランドシグナルよりも上のままであった。
【０１４０】
ＡｄＬ．１１Ｄにおけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化するために、２×１０８ｐｕのＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄ（如何なる導入遺伝子も発現しない同質遺伝子的ベクター）を、硝子体内注射を介して眼に投与した。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄベクターを、１×１０７ｐｕのＡｄＬ．１１Ｄと共投与したか、あるいはその投与の７、１４、又は２８日後に投与したかのいずれかであった。このような実験の結果を図２に示す。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄによる誘導を欠くＡｄＬ．１１Ｄベクターからの発現は、実験の最初の２週にわたって低下した。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄの添加は、２８日の実験の期間について試験した全ての時点で発現を増強させた。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄの投与により誘導される発現レベルは、ＡｄＬ．１１Ｄ単独で１日目に得られるピーク発現レベルよりも、少なくとも１０倍高かった。約１００倍の最大誘導が、投与後の１４日目及び２８日目（ＡｄＬ．１１Ｄからの発現レベルがその最低のレベルであったとき）に観察された。
【０１４１】
ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄが発現を活性化する能力は、ＣＭＶプロモーターを含むアデノウイルスベクターに制限されなかった。野生型Ｅ４配列を有するＡｄＬ．１１Ｄに対する同質遺伝子的ベクターを構築し、ここでＣＭＶプロモーターをＥＦ１α細胞性プロモーターと交換して、ＡｄＥＦ．Ｌを作製した。用量１×１０７ｐｕのＡｄＬ．１１Ｄ又はＡｄＥＦ．Ｌのいずれかを、硝子体内注射を介して眼に投与した。用量２×１０８ｐｕのＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄを共投与した。眼を投与１日後に回収し、ルシフェラーゼ活性のレベルを決定した。ＡｄＬ．１１Ｄからのルシフェラーゼ遺伝子の発現は、ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄの不在下での発現と比較して、ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄの共投与によりおよそ１０倍刺激された。転写の同じ１０倍の誘導もまた、ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄを共投与した場合に、ＡｄＥＦ．Ｌについて観察された。
【０１４２】
眼におけるストレスの誘導は、発現活性化のメカニズムにおける一つの要素であることが見出されている。合計１×１０７ｐｕのＡｄＬ．１１Ｄを、硝子体内注射を介して眼に送達し、続いてＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄ、ベクター希釈緩衝液、あるいは生理食塩水のいずれかを３日後に注射した。あるいは、３日目に、如何なる物質も送達させることなく、眼を単に穿刺した。眼を４日目に回収し、ルシフェラーゼ発現のレベルを決定した（図３）。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄでの誘導の陽性コントロールは、空のベクターの投与の不在下におけるＡｄＬ．１１Ｄの発現レベルと比較して約１００倍のオーダーで発現を誘導した。他の処置の３つ全て（緩衝液又は生理食塩水の投与、あるいは眼の穿刺）もまた、発現を誘導した。眼の単なる穿刺により、発現の２０倍の増強が生じた。
【０１４３】
本実施例により提供されるデータは、宿主細胞におけるストレス応答の誘導による、導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの宿主細胞の形質導入後の任意の時点での発現の超活性化を実証する。導入遺伝子の発現は、ベクター投与と同時にストレス応答を誘導することにより増強され、発現は、試験した全てのその後の時点で再活性化された。発現レベルは、非活性化コントロールにおいて得られた最高（ピーク）レベルの発現よりも１０倍高いレベルに増強された。発現レベルは、同じ時点にて非活性化コントロールよりも１００倍高いレベルに再活性化された。さらに、空ベクターの投与は、導入遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターにかかわらず、アデノウイルスベクターからの発現を活性化した。このことは、残余ゲノムが、完全に発現能力を維持することを実証する。ウイルス粒子の追加はストレスシグナルをさらに増強する可能性が最も高い。
【０１４４】
実施例８
本実施例は、眼への硝子体内投与後における、アデノウイルスベクターにおけるＵｂＣ、ＪＥＭ−１、及びＹＹ１プロモーターの発現プロフィールを詳説する。
【０１４５】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損し、かつルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（ＡｄＬ．１１Ｄ）は、実施例６及び７に記載されている。ＡｄＬ．１１ＤのＣＭＶプロモーターを、ＵｂＣプロモーターと交換したアデノウイルス構築物（ＡｄＵｂ．Ｌ．１１Ｄ）、ＪＥＭ−１プロモーターと交換したアデノウイルス構築物（ＡｄＪＥＭ１．Ｌ．１１Ｄ）、又はＹＹ１プロモーターと交換したアデノウイルス構築物（ＡｄＹＹ１．Ｌ．１１Ｄ）を調製した。用量２×１０８ｐｕの各アデノウイルスベクターを、ＣＤ−１ヌードマウスの眼内に硝子体内に注射した。眼細胞をアデノウイルスベクター投与後の種々の時点で単離し、ルシフェラーゼ活性をアッセイし、それにより経時的に発現レベルを比較する平均値を提供した。ＵｂＣ、ＪＥＭ−１、及びＹＹ１プロモーターの発現プロフィールを図４で説明する。全てのプロモーターにより媒介される発現は、少なくとも２８日間にわたって定常的であった。投与２８日後でのＵｂＣ及びＹＹ１プロモーターにより媒介される発現は、ピーク発現レベルと比較して約１０倍以下に減少した。ＪＥＭ−１プロモーターにより媒介される発現は、２８日間にわたって定常的に増加した。
【０１４６】
実施例９
本実施例は、薬物による眼における導入遺伝子発現のアップレギュレーションを実証する。
【０１４７】
アデノウイルスベクターを、本明細書中に記載されているように構築した。アデノウイルスベクターゲノムは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損し、かつ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列を含んでいた（ＡｄＧＦＰ．１１Ｄ）。ＣＭＶ前初期プロモーターの制御下のＧＦＰ遺伝子を、アデノウイルスゲノムのＥ１領域と交換し、一方、Ｅ４領域を、転写されないスペーサー配列と交換した。
【０１４８】
合計２×１０８粒子ユニット（ｐｕ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに硝子体内注射した。アデノウイルスベクターの用量の投与後の５５日目に、レチノイン酸を、腿部の筋肉内に注射した。アデノウイルスベクターの投与１日後に、発現の最初の突発が観察された。導入遺伝子発現は、５５日までに検出不能なレベルまで下がった。アデノウイルスベクターの投与後の５６日目に（即ち、レチノイン酸の投与の１日後）、ＧＦＰ活性を検出し、それにより導入遺伝子発現の再活性化が示された。
【０１４９】
別の実験では、ルシフェラーゼ遺伝子を含むＥ１、Ｅ３、Ｅ４−欠損アデノウイルスベクター（ＡｄＬ．１１Ｄ）の１×１０７粒子ユニット（ｐｕ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに硝子体内注射した。アデノウイルスベクターの投与後７日目に、レチノイン酸（１００μｌ、５０ｍＭ）をマウスに全身投与した。導入遺伝子発現を検出するために、１日目、７日目、８日目に眼を回収した。最初の導入遺伝子発現は、１日目から７日目までにおよそ１０倍低下した。レチノイン酸の投与により、遺伝子産物活性で測定すると、ピークレベルまでの発現の回復が起こった。換言すれば、レチノイン酸は、アデノウイルスベクターの投与後の１日目に検出されたレベルと同様のレベルまで導入遺伝子発現の回復を促進し、転写の１０倍の活性化を生じた。
【０１５０】
本実施例は、導入遺伝子の転写が、導入遺伝子をコードするアデノウイルスベクターの投与後少なくとも５５日での薬物の全身的投与によりアップレギュレートされ得ることを実証した。さらに、転写は、ピークレベルまで再活性化され得る。
【０１５１】
実施例１０
本実施例は、ヒト患者における血管漏出を寛解する方法を実証する。
【０１５２】
新生血管の加齢性黄斑変性症の成人患者に、１×１０６、１×１０６．５、１×１０７、１×１０７．５、１×１０８、１×１０８．５、１×１０９、又は１×１０９．５粒子のＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄを含む医薬組成物を単回硝子体内注射を介して投与した。本明細書中に記載されているように、ＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄは、アデノウイルスベクターを多重欠損性にする、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域における欠失、アデノウイルスゲノムのＥ４領域に位置するスペーサー配列、並びにアデノウイルスゲノムのＥ１領域に位置する発現カセットを含み、かつＣＭＶ前初期プロモーターに機能可能に連結されたＰＥＤＦコーディング配列を含むアデノウイルスベクターである。局所麻酔を、標準的な局所麻酔薬及び抗菌薬を用いて、処置された眼に適用した。低容量のシリンジに取り付けられた３０ゲージの針を、水平な経線を回避し、かつ球（ｇｌｏｂｅ）の中心の方に向かって、縁に対して３．５〜４ｍｍ後方の領域を通じて、検眼鏡検査のガイダンス下で導入した。ＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄを含むおよそ１００μｌの医薬組成物を硝子体内腔中にゆっくりと注射した。眼液の損失を低減させる目的で、針を引き抜きながら、綿棒を、注射部位で転がした。
【０１５３】
２５％の処置患者は、視力における改善を実証し、視力は、５０％の処置被験者で安定化していた。フルオレセイン血管造影法、眼底写真、及びＯＣＴを行い、網膜血管漏出及び円板漏出の存在及び程度を評価した。血管漏出は、各用量にてＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄを投与された全ての患者において低減した。例えば、１名の患者の網膜の厚さは、１×１０７粒子のＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄを受ける前では、窩（ｆｏｖｅａ）下で３９８μｍであると測定された。処置の３ヶ月後、ＯＣＴは、網膜の厚さが２９３μｍに低減することを示し、それにより窩下の血管漏出の量における低減が示された。血管漏出の有意な低減もまた、フルオレセイン血管造影法により、処置の３ヶ月後に観察された。別の患者では、眼底写真は、１×１０６粒子のＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄの投与の３ヶ月後に、眼内における液の回復及び出血の減少を示した。治療効果は、ＡｄＰＥＤＦ．１１Ｄ投与のおよそ６ヵ月後まで観察された。
【０１５４】
本実施例は、ＰＥＤＦをコードする核酸配列を含む発現ベクターの投与による、ヒト患者における血管漏出の寛解を実証する。
【０１５５】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が本明細書中に示されるのと同じ程度に、本明細書により参考として援用される。
【０１５６】
本発明を記載する状況において（特に、添付の特許請求の範囲の状況において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書中で他に示されない限り、又は状況に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注記されない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の列記は、本明細書中で他に示されない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載されている全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、又は他に状況に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言語（例、「例、等、など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に主張されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして、主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１５７】
本発明の実施について本発明者らが把握する最良の形態を含む、本発明の「好ましい実施形態」が、本明細書中に記載されている。それらの好ましい実施形態のバリエーションは、先の記載を読むことで、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合せが、本明細書中で他に示されない限り、又は他に状況に明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、ＡｄＬ．１１Ｄの投与後の日数に対してルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／μｇタンパク質）を相関付けるグラフである。
【図２】図２は、ＡｄＬ．１１Ｄの投与後の日数に対してルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／μｇタンパク質）を相関付けるグラフである。
【図３】図３は、ＡｄＬ．１１Ｄにおけるルシフェラーゼ遺伝子の転写及び眼細胞におけるストレス応答を活性化する方法から産生されるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／μｇタンパク質）を相関付けるグラフである。
【図４】図４は、ＡｄＵｂ．Ｌ．１１Ｄ、ＡｄＹＹ１．Ｌ．１１Ｄ、及びＡｄＪＥＭ１．Ｌ．１１Ｄの投与後の日数に対してルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／μｇタンパク質）を相関付けるグラフである。
【配列表】
2007528903000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月13日(2006.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
合計１×１０７粒子単位（ｐｕ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに硝子体内注射した。眼を投与後の種々の日数で回収し、ルシフェラーゼ活性の相対レベルを決定した。ルシフェラーゼ活性の測定は、転写の研究で受け入れられている方法である。発現の最初の突発（ｂｕｒｓｔ）が、投与１日後に観察され、２週間までに７〜１０倍減少した。このより低いレベルの発現は、バックグランドシグナルよりも上のままであった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
ＡｄＬ．１１Ｄにおけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化するために、２×１０８ｐｕのＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄ（如何なる導入遺伝子も発現しない同質遺伝子的ベクター）を、硝子体内注射を介して眼に投与した。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄベクターを、１×１０７ｐｕのＡｄＬ．１１Ｄと共投与したか、あるいはその投与の７、１４、又は２８日後に投与したかのいずれかであった。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄによる誘導を欠くＡｄＬ．１１Ｄベクターからの発現は、実験の最初の２週にわたって低下した。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄの添加は、２８日の実験の期間について試験した全ての時点で発現を増強させた。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄの投与により誘導される発現レベルは、ＡｄＬ．１１Ｄ単独で１日目に得られるピーク発現レベルよりも、少なくとも１０倍高かった。約１００倍の最大誘導が、投与後の１４日目及び２８日目（ＡｄＬ．１１Ｄからの発現レベルがその最低のレベルであったとき）に観察された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
眼におけるストレスの誘導は、発現活性化のメカニズムにおける一つの要素であることが見出されている。合計１×１０７ｐｕのＡｄＬ．１１Ｄを、硝子体内注射を介して眼に送達し、続いてＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄ、ベクター希釈緩衝液、あるいは生理食塩水のいずれかを３日後に注射した。あるいは、３日目に、如何なる物質も送達させることなく、眼を単に穿刺した。眼を４日目に回収し、ルシフェラーゼ発現のレベルを決定した。ＡｄＮｕｌｌ．１１Ｄでの誘導の陽性コントロールは、空のベクターの投与の不在下におけるＡｄＬ．１１Ｄの発現レベルと比較して約１００倍のオーダーで発現を誘導した。他の処置の３つ全て（緩衝液又は生理食塩水の投与、あるいは眼の穿刺）もまた、発現を誘導した。眼の単なる穿刺により、発現の２０倍の増強が生じた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、及びＥ４領域の１以上の必須遺伝子機能を欠損し、かつルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（ＡｄＬ．１１Ｄ）は、実施例６及び７に記載されている。ＡｄＬ．１１ＤのＣＭＶプロモーターを、ＵｂＣプロモーターと交換したアデノウイルス構築物（ＡｄＵｂ．Ｌ．１１Ｄ）、ＪＥＭ−１プロモーターと交換したアデノウイルス構築物（ＡｄＪＥＭ１．Ｌ．１１Ｄ）、又はＹＹ１プロモーターと交換したアデノウイルス構築物（ＡｄＹＹ１．Ｌ．１１Ｄ）を調製した。用量２×１０８ｐｕの各アデノウイルスベクターを、ＣＤ−１ヌードマウスの眼内に硝子体内に注射した。眼細胞をアデノウイルスベクター投与後の種々の時点で単離し、ルシフェラーゼ活性をアッセイし、それにより経時的に発現レベルを比較する平均値を提供した。全てのプロモーターにより媒介される発現は、少なくとも２８日間にわたって定常的であった。投与２８日後でのＵｂＣ及びＹＹ１プロモーターにより媒介される発現は、ピーク発現レベルと比較して約１０倍以下に減少した。ＪＥＭ−１プロモーターにより媒介される発現は、２８日間にわたって定常的に増加した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2007528903.tif 000002
2007528903.tif 000003
2007528903.tif 000004
2007528903.tif 000005
2007528903.tif 000006
2007528903.tif 000007