(57)【要約】  本発明は、新規ペニシリウム・クリソゲヌムタンパク質をコードする単離核酸分子、かかる核酸分子を含むベクター、かかる核酸分子又はベクターで形質転換された宿主細胞及びかかる形質転換宿主細胞を用いてペニシリンを製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列のみを有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子である、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号２の塩基配列又は遺伝コードの縮重のために配列番号２の前記配列と異なるに過ぎない塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３の塩基配列又は遺伝コードの縮重のために配列番号３の前記配列と異なるに過ぎない塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号４の塩基配列又は遺伝コードの縮重のために配列番号４の前記配列と異なるに過ぎない塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項７】
塩基配列の配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から、又は遺伝コードの縮重のために前記配列の１つと異なるに過ぎない塩基配列から選択される塩基配列のみを有する、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
宿主細胞を形質転換するのに適切である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記宿主細胞が微生物である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記微生物が糸状菌である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記糸状菌が、ペニシリウム・クリソゲヌム、ペニシリウム・ノタツム、ペニシリウム・ブレビコンパクツム、ペニシリウム・シトリヌム、アクレモニウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・テレウス及びトリポクラジウム・インフラタムからなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記糸状菌がペニシリウム・クリソゲヌムである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子で、又は請求項８から１３のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
微生物である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記微生物が糸状菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記糸状菌が、ペニシリウム・クリソゲヌム、ペニシリウム・ノタツム、ペニシリウム・ブレビコンパクツム、ペニシリウム・シトリヌム、アクレモニウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・テレウス及びトリポクラジウム・インフラタムからなる群から選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記糸状菌がペニシリウム・クリソゲヌムである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞によりペニシリンを形成させるのに適切な条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、ペニシリンを製造する方法。
【請求項２０】
前記ペニシリンがペニシリンＧ又はペニシリンＶである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
形成されたペニシリンの単離をさらに含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１のアミノ酸配列を含む単離タンパク質。
【請求項２３】
配列番号１のアミノ酸配列のみを有する、請求項２２に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペニシリウム・クリソゲヌムタンパク質をコードする単離核酸分子、かかる核酸分子を含むベクター、かかる核酸分子又はベクターで形質転換された宿主細胞及びかかる形質転換細胞を用いてペニシリンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリンは、糸状菌ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（以下、Ｐ．クリソゲヌムと称する）を発酵させることによって工業規模で得られる天然の代謝産物である。これに加えて、ペニシリンＧ及びペニシリンＶは、いくつかの半合成ペニシリン抗生物質の重要な前駆体を形成する。ペニシリン物質クラスは治療上きわめて重要である。プロセス技術の改善とは別に、工業的ペニシリン発酵の収率増加を達成することは菌株を遺伝的に連続して改善することに本質的に基づく。製造増加能力を示す特定の遺伝子を用いた製造菌株の形質転換は、この菌株改善を達成する現代の方法において常に卓越したものになってきている。ペニシリン生合成における生化学的相互関係の理解によれば、公知のペニシリン生合成遺伝子の小グループは菌株改善能力を有する。実験においては、これらの公知遺伝子の増幅、すなわちコピー数の増加は、製造生物の生産性のかなりの改善を実際にもたらすことがある。しかし、科学的可能性の考察に基づいて、菌株改善能力を有すると予測することができる公知遺伝子群はきわめて少ない。しかし、これらの公知の生合成遺伝子に加えて、増幅によって製造増加能力が同様に得られる未知数の他の遺伝子があると考えることができる。これらの遺伝子の機能は、ペニシリン生合成に影響を有する細胞プロセス全体が現在まだ十分に理解されていないので不明なことが多い。したがって、製造増加能力を有するさらに別の遺伝子を特定する戦略はきわめて重要である。
【０００３】
重要なペニシリン生合成遺伝子、すなわちＡＣＶシンセターゼ（ＡＣＶＳ）、イソペニシリン−Ｎ（ＩＰＮ）シンターゼ及びアシルＣｏＡ：ＩＰＮアシルトランスフェラーゼは比較的長期間知られている。中心的な酵素はＡＣＶＳ、すなわちトリペプチドＡＣＶの形成を触媒する非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）である。一部の微生物において、ＮＲＰＳは活性型にするためにホスホパンテテインを「加え（ｌｏａｄｅｄ）」なければならないことが知られるようになったのはほんの最近である。
【０００４】
４’−ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）は、補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）からＰｐａｎｔ依存性担体タンパク質中にある保存セリン残基の側鎖のヒドロキシル官能基への４’−ホスホパンテテイン（Ｐｐａｎｔ）基の転移を触媒する。これに関連して、ＸＣＰと一般に略される担体タンパク質は、触媒作用的に不活性なアポ型から触媒作用的に活性なホロ型に転化される。この反応はＭｇ２＋依存性であり、３’−５’−ＡＤＰを副生物として形成する。さまざまなＰｐａｎｔ依存性生合成経路がある。アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）が中間体に結合する脂肪酸生合成はあらゆる細胞において見られる。シクロスポリン、β−ラクタムなどの多数の抗生物質及び天然物は、ペプチジル担体タンパク質（ＰＣＰ）又は、それぞれ、ＡＣＰを含む非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）又はポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって産生される。最後に、特別なペプチドシンセターゼは、リジンをもたらす生合成経路において真菌及び一部の植物に見ることができる。これらの全生合成経路は、関与する担体タンパク質がＰＰＴａｓｅによってホスホパンテテイン化され、それによって活性型に転化されるという特徴を共有している。ＰＰＴａｓｅはこれらのプロセスに必須の因子であるが、それをコードする遺伝子は多くの場合においてまだ知られていない。この性質のＰＰＴａｓｅも対応する遺伝子もこれまでＰ．クリソゲヌムにおいては記述されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
その結果、Ｐ．クリソゲヌムにおけるかかる未知のＰＰＴａｓｅコード遺伝子を発見することは、本発明の中心的目的を形成する。したがって、本発明の一目的は、新規Ｐ．クリソゲヌムタンパク質をコードし、Ｐ．クリソゲヌム宿主細胞をこの宿主細胞が良好な収率でペニシリンを供給することができるように形質転換するのに使用することができる核酸及びベクターを提供することである。本発明の別の目的は、かかる形質転換宿主細胞を提供することである。最後に、本発明の別の目的は、前記形質転換宿主細胞を使用してペニシリンを調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｐ．クリソゲヌムにおいて未知のタンパク質をコードする新規Ｐ．クリソゲヌム遺伝子が本発明において記載される。このタンパク質は新規ＰＰＴａｓｅであり、この遺伝子を用いた同時形質転換実験によって、工業的判定基準によって測定して高いペニシリン力価を有する菌株をもたらすことができることが示される。
【０００７】
新規遺伝子は、Ｐ．クリソゲヌム菌株Ｐ２＝ＡＴＣＣ  ４８２７１（この番号でＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＰＯ  Ｂｏｘ  Ｎｏ．  １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１０８、ＵＳＡから入手することができる。）から単離することができる。しかし、この新規遺伝子は他のＰ．クリソゲヌム菌株においても見出すことができる。別法として、本明細書の核酸及びアミノ酸配列又は分子は合成により調製することができる。
【０００８】
この遺伝子は、４１１アミノ酸長であるタンパク質をコードする。アミノ酸配列を図１に示す。図２及び４に見ることができるように、遺伝子中、コード領域は１個のイントロンによって分断される。
【０００９】
本発明によるＰ．クリソゲヌム遺伝子は、機能試験に基づいて（実施例２参照）、未知のＰＰＴａｓｅに対する遺伝子であると断定され、ｐｐｔＡ遺伝子と命名される。
【００１０】
その結果、本発明の主題の一部は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離核酸分子である。
【００１１】
その結果、かかる核酸分子は、例えば、上記アミノ酸配列（配列番号１）に加えてさらなるアミノ酸も含むタンパク質をコードし、例えば融合タンパク質をコードする。かかる融合タンパク質は、例えば、単離型の新規タンパク質を調製することが望ましいときにある役割を果たすことができる。融合部分は、例えば、安定性を高め、又は精製を容易にすることができる。
【００１２】
本発明では、配列番号１のアミノ酸配列のみをコードする本発明による核酸分子が好ましい。かかる核酸分子は、以下に示すように、ペニシリン、特にペニシリンＶ又はＧを製造する目的に有利に使用することができる。その結果、本発明の主題の別の部分は、配列番号１のアミノ酸配列のみを有するタンパク質をコードする本発明による核酸分子である。
【００１３】
本発明による核酸分子は好ましくはＤＮＡ分子である。或いは、核酸分子はＲＮＡ分子、特にｍＲＮＡ分子とすることができる。
【００１４】
本発明によるＤＮＡ分子は、例えば、前記Ｐ．クリソゲヌム菌株ＡＴＣＣ４８２７１のゲノムからゲノムＤＮＡライブラリを作製することによって調製することができる。ゲノムクローンは、図４に示される遺伝子の記載された核酸配列からその構造を推定することができる相同プローブを用いてスクリーニングすることによって特定される。
【００１５】
適切な技術は文献から公知である（すなわち、例えば、Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ）。求められているＤＮＡ分子は、古典的な技術を用いて単離又は調製することができるかかるクローンのサイズ約３．２ｋｂのＳａｌｌ断片上に位置する。かかる断片を図４に示す。その結果、本発明の好ましい実施態様は、配列番号４の塩基配列又は遺伝コードの縮重のために配列番号４の前記配列と異なるに過ぎない塩基配列を含む、本発明による核酸分子に関する。すなわち、本発明によれば、本発明は、記載されたコドンの１個以上が、コードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）が変わらないように１個又はいくつかの異なるコドンで置換された点で、具体的に示された配列とは異なる核酸分子にも関する。これは、１個（又はそれ以上）の代替終止コドンの使用も含む。これは、以下に記載される他の核酸分子にも当てはまる。配列番号４の核酸分子は（プロモーター、終止コドンなどの）制御配列を含み、Ｐ．クリソゲヌムを形質転換し、したがってペニシリン、特にペニシリンＧ又はペニシリンＶを製造するために、特にベクター中で有利に使用することができる。
【００１６】
サイズ約３．２ｋｂの前記Ｓａｌｌ断片は、特に、新規遺伝子のコード部分を含む。この部分は図２に示され、１個のイントロンを含む。その結果、本発明は、上で説明したように、配列番号２の塩基配列又は遺伝コードの縮重のために配列番号２の前記配列と異なるに過ぎない塩基配列を含む、本発明による核酸分子にも関する。その結果、かかる核酸分子は、新規遺伝子のコード部分のゲノムＤＮＡ配列に対応する。本発明の別の好ましい実施態様は、その１個のイントロンの欠如によって配列番号２のそれと異なる核酸分子である。
【００１７】
その結果、上で説明したように、配列番号３の塩基配列又は遺伝コードの縮重のために配列番号３の前記配列と異なるに過ぎない塩基配列を含む、本発明による核酸分子も好ましい。かかる核酸分子はもはやイントロンを含まず、したがって対応するｃＤＮＡ配列と同等とみなすことができる。
【００１８】
また、（前記ｃＤＮＡ分子を含む）本発明による核酸分子は、例えば、完全に又は部分的に合成によって調製することができる。標準技術を使用して本発明によるＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子を微生物Ｐ．クリソゲヌムから単離することができ、又はそれらを合成によって調製することができる。標準技術を使用して、対応するｃＤＮＡ分子を対応するｍＲＮＡから調製することができる。
【００１９】
前記核酸分子は、（例えば、融合タンパク質をコードするために）追加の塩基配列を申し分なく十分に含むことができるが、好ましい実施態様は、上で説明したように、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の塩基配列からなる群から選択される塩基配列又は遺伝コードの縮重のために前記配列の１つと異なるに過ぎない塩基配列のみを有する、本発明による核酸分子に関する。
【００２０】
別の実施態様においては、本発明による核酸分子は、さらに、コード領域末端直後のそのＣ末端に１個以上の終止コドンも含む。ＴＡＡであると特定された天然の終止コドンが好ましい。しかし、他の公知終止コドンも代わりに使用することができる。いくつかの終止コドンを使用することもできる。
【００２１】
本発明は、本発明による上記核酸分子の１個を含むベクターにも関する。このベクターは、宿主細胞を形質転換するのに適切であることが好ましい。この宿主細胞は、特に、微生物である。この微生物は好ましくは糸状菌である。糸状菌は、ペニシリウム・クリソゲヌム、ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）及びトリポクラジウム・インフラタム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ）からなる群から選択されることが有利である。本発明の特に好ましい実施態様においては、微生物又は糸状菌はペニシリウム・クリソゲヌムである。
【００２２】
かかるベクターは、例えば、プラスミドの形で存在することができる。かかるベクターは、必要に応じ、本発明による核酸分子に加えて、形質転換が起きた後に本発明による核酸分子が発現することができるように他の配列、例えば複製開始点及び追加の調節性要素（プロモーター、翻訳開始シグナル又は終結シグナルなど）を含む。形質転換が起きた後に、本発明による核酸分子及び追加のベクター要素を宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、これは、新規遺伝子のコード部分の増幅に相当する。本発明によるベクターは、配列番号４の塩基配列を含む核酸分子を含むことが有利である。かかる塩基配列は前記Ｓａｌｌ断片に相当し、対応するプロモーターなどの制御配列をすでに含む。
【００２３】
標準技術を使用して本発明による核酸分子を適切な標準ベクターにクローニングすることによって、これらのベクターを作成することができる。
【００２４】
本発明は、さらに、本発明による核酸分子又は本発明によるベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。この宿主細胞は、特に、微生物である。この微生物は好ましくは糸状菌である。糸状菌は、ペニシリウム・クリソゲヌム、ペニシリウム・ノタツム、ペニシリウム・ブレビコンパクツム、ペニシリウム・シトリヌム、アクレモニウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・テレウス及びトリポクラジウム・インフラタムからなる群から選択されることが有利である。本発明の特に好ましい実施態様においては、宿主細胞（又は微生物若しくは糸状菌）はペニシリウム・クリソゲヌムである。
【００２５】
かかる宿主細胞、特にＰ．クリソゲヌムを本発明によるベクターで形質転換するために標準方法が使用される。かかる方法の例は、オーストリア特許明細書ＡＴ  ３９１  ４８１、実施例６、８、１０及び１２に記載されている。
【００２６】
これの代替として、同時形質転換と称されるものを実施することもできる。この場合、選択マーカーを含むベクターと本発明による遺伝子を含むベクターとは、形質転換において別個の分子として使用される。
【００２７】
これの代替として、本発明による核酸分子を形質転換に使用することもできる。
【００２８】
特に、その結果、導入される遺伝子（本発明による遺伝子と少なくとも１個の標識遺伝子）は、例えば線状核酸分子として別個に使用することができる。次いで、選択されるベクター又は対応する選択遺伝子を宿す形質転換宿主細胞のある割合は、かかる同時形質転換に使用される第２の遺伝子も含む。この割合は、個々の実験及び実際に選択される実験パラメータに依存する。
【００２９】
本発明による形質転換Ｐ．クリソゲヌム宿主細胞は、ペニシリンを製造するために有利に使用することができる。その結果、本発明は、ペニシリンを製造する方法にも関する。この方法は、宿主細胞によってペニシリンを形成するのに適切な条件下で本発明によるＰ．クリソゲヌム宿主細胞を培養することを含む。ペニシリンＧ及びペニシリンＶからなる群から選択されるペニシリンを選択することが特に好ましい。
【００３０】
適切な培養／発酵技術は、抗生物質分野の当業者に知られており、ペニシリンの製造に長年使用されてきた。
【００３１】
好ましい実施態様においては、本発明による方法は、形成されたペニシリンを単離することも含む。本発明による形質転換Ｐ．クリソゲヌム宿主細胞によって形成されたペニシリンは、発酵性菌糸体マッシュから公知技術によって、例えば酢酸ブチルによる抽出とその後のクロマトグラフィー技術によって精製及び／又は単離することができる。
【００３２】
本発明によって製造されたペニシリン、特にペニシリンＧ又はペニシリンＶは、抗生物質特性を有する他の誘導体に有利に転化することができる。
【００３３】
本発明の別の適用は、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離タンパク質に関する。前述したように、かかるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する成熟タンパク質を切断によって所望のとおりにそこから製造することができる対応する融合タンパク質も包含する。配列番号１のアミノ酸配列のみを有する本発明によるタンパク質が好ましい。
【００３４】
本発明によるタンパク質は、該タンパク質をコードする核酸分子を含む本発明による適切な発現ベクターを宿す適切な原核生物又は真核生物宿主細胞を該タンパク質を発現させる条件下で培養することによって調製することができる。このタンパク質は、通例の技術によって精製及び単離することができる。本発明によるｃＤＮＡが使用される適切な原核生物宿主細胞の例は、特に、細菌細胞、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）であり、適切な真核生物宿主細胞の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞又はＣＨＯ、ＢＨＫ細胞などの哺乳動物細胞である。
【００３５】
本発明によるタンパク質は、例えば、４’−ホスホパンテテイン基、ＮＲＰＳ、ＰＫＳなどの適切な酵素又はその個々のモジュール若しくはドメイン単位によって、アポ型から酵素的に活性なホロ型にインビトロで転換するために使用することができる（上記参照）。したがって、本発明によるタンパク質は、（ＮＲＰＳ、ＰＫＳなどの）前記酵素群の代表例及び他の４’−ホスホパンテテイン含有酵素又はその個々の部分から新しい分子を生成する活性なインビトロシステム、例えばコンビナトリアル生合成用システムを調製する貴重なツールを構成する。
【００３６】
本明細書に述べられる科学的文献の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００３７】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明されるが、これらの実施例に限定されない。実施例は、特に、本発明の好ましい実施態様に関係する。
実施例
本明細書に述べられる材料及び試薬は、当業者になじみのあるものであり、商業的に入手可能であり、又は容易に利用可能であり、製造者の指示に従って使用することができる。
【実施例１】
【００３８】
ペニシリウム  クリソゲヌムからの新規遺伝子ｐｐｔａの単離
本発明による遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応法によって調製される。このため、ＤＮＡはペニシリウム  クリソゲヌム菌株ＡＴＣＣ４８２７１から単離される。これを実施するために、真菌細胞は、乳鉢中で研和することによって液体窒素中で機械的に粉砕され、続いて例えばＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡに記載の標準技術によって、又は例えばＱｉａｇｅｎ社によって供給されている市販キットを用いて単離される。
【００３９】
サイズ約３．２ｋｂの増幅物は、標準状態下でプライマーＰＣＲ１ｆ及びＰＣＲ１ｒ及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてゲノムＤＮＡから調製される。
【００４０】
プライマーＰＣＲ１ｆ  ５’−ＣＣＣＣ  ＧＴＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＴＴＴＣＧＧＴＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＡＴ（配列番号５）
プライマーＰＣＲ１ｒ  ５’−ＣＣＣＣ  ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＣ（配列番号６）
【００４１】
本発明による配列番号４の核酸分子に対応する増幅領域をクローニングするために、断片は制限エンドヌクレアーゼＳａｌｌを用いて切断され、使用されるＥ．コリプラスミドにＳａｌｌ部位を介して標準方法で連結される。かかる標準プラスミドの例は（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋である。
【００４２】
連結生成物はＥ．コリ（例えば、菌株ＤＨ５アルファ）に形質転換され、Ｅ．コリ中で後続段階に十分な量で産生され、次いで精製される。構築方法に応じて、逆向きの核酸分子を含むプラスミドを得ることも可能である。しかし、原則的には、これらの構造体は同等に十分機能する。
【００４３】
その後の配列決定及び分析によって、図２（配列番号２）及び４（配列番号４）に示される核酸配列が得られる。次いで、図１（配列番号１）に示されるコードタンパク質のアミノ酸配列を推定することができるように、図３（配列番号３）に示されるｃＤＮＡ配列を核酸配列から推定することができる。原則的には、クローニング生成物は、その配列を決定し、その配列を図２及び／又は４に示されるＤＮＡ配列と比較することによって確証することができる。Ｓａｌｌ断片を有するプラスミドはプラスミド１と命名され、次いで使用される。
【実施例２】
【００４４】
新規ペニシリウム・クリソゲヌム遺伝子ｐｐｔＡの機能的キャラクタリゼーション
新規遺伝子を機能的に特徴づけるために、新規ペニシリウム・クリソゲヌムｐｐｔＡ遺伝子のｃＤＮＡをＰ．クリソゲヌム全ｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅する。全ｃＤＮＡは、（例えば、Ｑｉａｇｅｎ製）市販キット及び標準実験室方法によってＰ．クリソゲヌムｍＲＮＡから調製される。
【００４５】
プライマーＰＣＲ２ｆ及びＰＣＲ２ｒを使用してこのｃＤＮＡからサイズ約１．２５ｋｂの増幅物を調製する。次いで、この増幅物を酵母ベクターｐＹＥＳ２．１−Ｓｆｉに組み込む。
【００４６】
プライマーＰＣＲ２ｆ  ５’−ＧＧＧＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡＧ（配列番号７）
プライマーＰＣＲ２ｒ  ５’−ＧＧＧＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＡＡＡＣＧ（配列番号８）
【００４７】
ベクター及び後続の機能試験の実施は、Ｈ．Ｄ．  Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｒａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｇａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｌｙｓ５”，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２１３（２００２），  ｐｐ．５１−５７に詳細に記載されている。本実施例における機能試験に使用される酵母発現ベクターは、ｐＹＥＳ２−ｎｐｇＡと同様に調製される（Ｈ．Ｄ．  Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、同上、第２．２章、５３ページ）。
【００４８】
試験は、酵母菌株における特定の欠陥の機能補完性に基づく。Ｌｙｓ５遺伝子は、酵母細胞中でアミノ酸リジンを産生するのに必須であるＰＰＴａｓｅをコードし、したがってリジンのない最少培地上で酵母細胞を増殖させることができる。Ｌｙｓ５遺伝子が破壊された特別に構築された酵母菌株は、もはやリジンを産生することができない。上記酵母発現ベクターに組み込まれた本発明による遺伝子は、この酵母菌株に形質転換される。試験は、上記Ｈ．Ｄ．  Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．による前記刊行物の第３章、５４−５５ページに詳細に記載されている。
【００４９】
発現されたＰ．クリソゲヌムｐｐｔＡ遺伝子を含む対応する酵母形質転換体は、選択培地（リジンを含まない最少培地）上で再度増殖することができる。すなわち、ｌｙｓ５欠陥は補完される（Ｈ．Ｄ．  Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．による前記刊行物中の第３．４章、５５ページも参照されたい）。そのために、これは、Ｐ．クリソゲヌムｐｐｔＡ遺伝子が機能的４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを示している。
【実施例３】
【００５０】
ペニシリウム・クリソゲヌムの同時形質転換
実施例１に記載された本発明による核酸分子は、（実施される形質転換アッセイの数に応じて）プラスミド１の適切な量から調製され、プラスミドをＳａｌｌで制限し、次いでその３．２ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製することによって、形質転換が容易になる。
【００５１】
Ｐ．クリソゲヌムｎｉａＤ遺伝子は、オーストリア特許明細書ＡＴ  ３９１  ４８１に記載されているプラスミドＪ−１２の構成断片の形で選択マーカーとして使用される。このため、プラスミドＪ−１２はＥｃｏＲＩで切断され、ｎｉａＤ断片を有するサイズ約６．５ｋｂの断片がＥｃｏＲＩ−線形プラスミドｐＵＣＢＭ２０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に連結される。これによって、どちらの場合もサイズ約９．１ｋｂであり、組み込まれたＥｃｏＲＩ断片の配向が異なる２個の可能なプラスミドが生成する。サブクローンからの対応するプラスミドは、酵素ＸｍａＩ及びＡｇｅＩを用いてそれらを一緒に消化することによって分析される。サイズ約２ｋｂの断片とサイズ約７．１ｋｂの断片が形成される配向を有するクローンが選択されｐ１６４９Ａと命名される。プラスミドｐ１６４９ＡはＸｍａＩ及びＡｇｅＩで切断され、ＸｍａＩ及びＡｇｅＩは適合性の末端を有するのでサイズ約７．１ｋｂの断片は再連結される。対応するＥ．コリクローンからのプラスミドは、それをＥｃｏＲＩで制限することによって検査され、ｐ１６４９Ｃと命名される。
【００５２】
プラスミドｐ１６４９Ｃの線状構成断片、すなわちサイズ約４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片は、対応する菌株のＰ．クリソゲヌムプロトプラストを形質転換するために使用される。この線状構成断片は、プラスミドを酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで制限し、次いでその断片を単離することによって調製される。この断片はｎｉａＤ遺伝子を有する。完全なプラスミドｐ１６４９Ｃ、ｐ１６４９Ａ又はＪ−１２を対応する方法で形質転換に使用することも当然可能である。
【００５３】
原則的には、適切な選択系が形質転換用レシピエント菌株として利用可能である任意のＰ．クリソゲヌム菌株を使用することができる。プロトプラスト形質転換用標準手順を使用して、新規遺伝子及びそれぞれｎｉａＤマーカーをそれに応じて含む調製された２個の断片を、ｎｉａＤ突然変異体とみなされるＰ．クリソゲヌム菌株（ＰＣ−１８００６０）に形質転換する。或いは、（Ｐ．クリソゲヌム菌株Ｐ２と命名された）ＡＴＣＣ４８２７１などの市販Ｐ．クリソゲヌム菌株が形質転換に使用される。
【００５４】
使用されるプロトプラスト形質転換方法は、例えば、オーストリア特許明細書ＡＴ  ３９１  ４８１（特に、その刊行物中の実施例６、８、１０及び１２を参照されたい）に記載されており、硝酸レダクターゼ突然変異体を生成することと、この突然変異体を形質転換することと、続いてニトラート含有栄養寒天上で形質転換体を選択することを含む。この選択に使用されるｎｉａＤ遺伝子の諸性質は引用文献に同様に記載されている。
【００５５】
プロトプラスト密度はＫＣＭ緩衝剤（０．７Ｍ  ＫＣｌ／５０ｍＭ  ＣａＣｌ２／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ｐＨ５．８）で１０８／ｍｌに調節される。形質転換に使用されるＤＮＡ断片溶液の一定分量はこの懸濁液１００μｌに添加体積１０μｌで添加される。２個の断片の比は約１−１．５から１のモル比になるように選択され、これらの断片を別の比で添加することも当然可能である。（ｎｉａＤ遺伝子を含む）約４．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片約１．５から３．５μｇ及び（本発明による遺伝子を含む）実施例１の約３．２ｋｂ  Ｓａｌｌ断片約０．８から１．８μｇが形質転換アッセイ試料に添加される。次いで、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液（５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２０％ＰＥＧ）５０μＬが添加され、全体が混合され、氷上で２０分間インキュベートされる。次いで、ＰＥＧ溶液（上記参照）０．５ｍＬがさらに添加され、管を回転させることによって全体が慎重に混合され、次いで室温で５分間静置される。その後、ＫＣＭ緩衝剤１．５ｍｌが添加され、全体が再度慎重に混合される。最後に、各場合において、形質転換アッセイ試料の約半分がＲ１軟寒天７ｍＬと混合され、Ｒ１選択寒天上に注がれる（オーストリア特許明細書ＡＴ  ３９１  ４８１も参照されたい）。寒天板を２５℃で約２週間インキュベートした後に、形質転換体コロニーは十分増殖し、さらなる使用に利用可能となった。
【００５６】
サザンブロット法は、例えば、さらに組み込まれた本発明による遺伝子のコピー又は使用された必須プラスミド部分の有無についてかかる実験からの形質転換体を試験するために使用される。
【実施例４】
【００５７】
ペニシリンの製造
実施例３で生成された形質転換体は、ペニシリン製造についてフラスコ発酵実験において試験される。便宜上、約５００から１０００個の同時形質転換体及び形質転換体からなるほぼ同じサイズの集団が各場合において並行して比較される。これを実施するために、これらのフラスコ発酵からの上清がＨＰＬＣ分析によって評価される。
【００５８】
酢酸フェニル又はフェノキシアセタートのどちらが前駆体として添加されたかによって、ペニシリンＧ又はペニシリンＶに適切な方法は、例えば、Ｃ．Ｓ．  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎ−Ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ”，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３６（１９９０），  ｐｐ．１１１０−１１１８に記載されている。
【００５９】
フラスコ発酵におけるペニシリン力価は、例えばＬ．Ｈ．  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｄｉｕｍ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ”，  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２９６（１９９４），  ｐｐ．５１−６２に詳述されたＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００６０】
統計的に適切なデータ量を得るために、これらの分析は数回（例えば、６回）繰り返される。各場合においていくつか（例えば、４回）の並行した各菌株のフラスコ発酵が実施され、各繰返しにおいて個々に試験される。本発明によるｐｐｔＡ遺伝子を用いた同時形質転換に由来し、出発菌株よりも著しく高いペニシリン生産性を示す３個の菌株（ＰＣ−２０４９４、ＰＣ−２０４９５及びＰＣ−２０４９６）は、Ｐ．クリソゲヌム菌株ＰＣ−１８００６０から出発したときにこのようにして特定される。これらの菌株は、ペニシリン、特にペニシリンＧ又はペニシリンＶを製造するのに工業規模で使用することができる。ペニシリンを製造するのに適切な発酵プロセスは公知である。例えば、Ａ．Ｈ．  Ｒｏｓｅ（Ｅｄ．），  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９７８中のＳ．Ｑｕｅｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  ”Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ：  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”の章／”Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”の節、５０−７４ページを参照されたい。
【００６１】
公表された標準方法を使用して、形質転換菌株によって発酵マッシュから産生されたペニシリンを抽出し、それを精製する（例えば、Ａ．Ｈ．  Ｒｏｓｅ（Ｅｄ．），  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９７８中のＳ．Ｑｕｅｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  ”Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ：  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”の章／”Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ”の節、７５−８６ページを参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明による核酸分子からその配列（図２又は４に従う核酸配列）が推論される新規Ｐ．クリソゲヌムタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）である。配列はＮ末端からＣ末端方向に示されている。
【図２】１個のイントロンを含めて、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から翻訳終止コドン（ＴＡＡ）までのＰ．クリソゲヌムｐｐｔＡ遺伝子のコード領域のゲノムＤＮＡ配列（配列番号２）である。イントロンには下線が引かれ、配列は５’から３’方向の一本鎖として示される。
【図３】翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から翻訳終止コドン（ＴＡＡ）までの新規遺伝子のコード領域のｃＤＮ配列である（配列番号３）。配列は５’から３’方向の一本鎖として示される。
【図４ａ】新規遺伝子のゲノムクローンのＳａｌｌ断片のゲノムＤＮＡ配列（配列番号４）である（配列は５’から３’方向の一本鎖として示される）。コード領域の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び翻訳終止コドン（ＴＡＡ）には下線が引かれ、太字で印刷され、イントロンには下線が引かれている。
【図４ｂ】新規遺伝子のゲノムクローンのＳａｌｌ断片のゲノムＤＮＡ配列（配列番号４）である（配列は５’から３’方向の一本鎖として示される）。コード領域の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び翻訳終止コドン（ＴＡＡ）には下線が引かれ、太字で印刷され、イントロンには下線が引かれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【国際調査報告】
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