(57)【要約】  本発明は、リパーゼを用いて、非極性溶媒中で未保護アミノ酸及び単糖からの単糖のアミノアシルエステルの合成であって、リパーゼ仲介性の合成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖のアミノアシルエステル製造のための酵素的方法であって、酵素及び非極性溶媒の存在下で誘導体化されていないアミノ酸を糖と反応させて単糖のアミノアシルエステルを生成し、そして当該生成物を回収することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記アミノ酸が、Ｎ保護及びカルボキシ活性化がなされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸が、グリシン、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-リジン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-アルギニン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン及びこれらの対応するＤ、Ｌ混合物より成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導体化されていない糖が、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-マンノース、Ｄ-アラビノース、リボース及びデオキシリボースより成る群から選ばれる単糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、ブタ膵臓、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)、カンジダ・クリンドラシア(Candida cylindracea)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)及び小麦胚芽から得られるリパーゼより成る群から選ばれるリパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒が４０℃〜８０℃の範囲の沸点を有する低沸点溶媒であり、且つジクロロメタン、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ヘキサン、ペンタン、石油エーテル(６０℃〜８０℃画分)、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン及びこれらの任意の混合物より成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記反応を２〜５日間の範囲の間行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記反応を４０℃〜８０℃の範囲の温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生成物を濾過によって分離する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単糖類のアミノアシルエステルを製造するための改善された酵素的方法を提供するものである。特に本発明は、単糖類のアミノアシルエステルのリパーゼ仲介合成に関するものである。本発明はさらに、非極性溶媒中の非保護アミノ酸及び単糖からリパーゼを用いて単糖類のアミノアシルエステルを製造することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖類のアミノアシルエステルは、洗浄剤、甘味料として、医薬品製造におけるマイクロカプセルとして、生物活性物質のデリバリーにおいて、抗ウイルスヌクレオシドアミノ酸エステルとして、エマルジョンとして、そして抗生物質として使用される。炭水化物の位置選択的アシル化は取り組み甲斐のある目標であり、これらの分子に幾つかのヒドロキシ基があるために達成がかなり困難である(Haines, A. H., Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1976, 33, 11)。化学的試薬を用いたこれらの化合物の選択的合成は、使用した糖分子の特定位置での反応から生成する生成物をもたらさない。酵素を用いた炭水化物の位置選択的変換は近年殆ど実施されていない(Wong, C. H. and Whitesides, G. M., Enzymes in organic synthesis, Elsevier Science, Oxford, 1994)。このような酵素的合成のなかでも、糖のアミノアシルエステルの酵素的合成は極めて少ない。
【０００３】
Suzuki, Y., Shimizu, T., Takeda, H. and Kanda, K., Jpn Kokai Tokkyo Koho JP. 03216194 A2(1991年9月24日)について言及するが、この中では、アミノ酸の糖エステルをニューロスポラ・シトフィラ(Neurospora sitophila)及びロドトルラ・ラクトサ(Rhodotorula lactosa)由来の酵素を用いて合成している。
【０００４】
Riva, S., Chopineau, J., Kieboom, A. P. G. and Klibanov, A. M., J. Amer. Chem. Soc., 110, 584-589, 1988について言及するが、この中では、サブチリシン(subtilisin)０.６ｇを含有する無水ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解した単糖１５ｍｍｏｌとＮ-アセチル-Ｌ-フェニルアラニンクロロエチルエステル６ｍｍｏｌを４５℃及び２５０ｒｐｍで１６時間振盪した。
【０００５】
Oh-Jin Park, Gyo-Jong Jeon and Ji-Won Yang, Enzyme and Microbial Technology, 25, 455-462, 1999について言及するが、この中では、５ｇの酵素Ｏｐｔｉｍａｓｅ  Ｍ-４４０を入れた２５０ｍｌ丸底フラスコ中のピリジン５０ｍｌに溶解したスクロース１.０３ｇと４.１６ｇのｔ-Ｂｏｃ-Ｌ-ＰｈｅＯＴＦＥを４５℃２５０ｒｐｍで８日間振盪した。
【０００６】
Oh-Jin Park, Gyo-Jong Jeon and Ji-Won Yang, Biotech Letters, 18, 473-478, 1996について言及するが、この中では、Ｏｐｔｉｍａｓｅ  Ｍ-４４０を入れたガラスバイアル中に封入した糖とｔ-Ｂｏｃ-Ｌ-Ｐｈｅ-ＴＦＥの混合物を４５℃２５０ｒｐｍで振盪した。
【０００７】
Yu Mitin, V., Kashparov, I. A., Kuhl, P. and Scheller, D., Bioorg. Khim., 25(4), 243-246, 1999について言及するが、この中では、パパインを用いてソルビトールをＮ-ベンジルオキシバルボニルアラニンでエステル化した。
【０００８】
上に述べた酵素法の主な欠点は以下の通りである：
１.  これらの反応は、少量の基質と高濃度の酵素を用いて振盪フラスコレベルで実施された。
２.  Ｏｐｔｉｍａｓｅ  Ｍ-４４０、サブチリシンならびにニューロスポラ・シトフィラ(Neurospora sitophila)及びロドトルラ・ラクトサ(Rhodotorula lactosa)由来といったような、商業的に容易に入手できない幾つかの酵素が使用された。
３.  最大８日間という長時間のインキュベーションが行われた。
４.  使用したアミノ酸は全てアミノ位を保護するよう誘導体化された。導入された保護基はＮ-ｔ-ＢＯＣ及びＮ-ベンジルオキシカルボニル基であった。
５.  幾つかの事例では、容易に反応を受けさせるため、アミノ基もまた、カルボキシ位で誘導体化することにより活性化した。大抵はアミノ酸のトリフルオロエチルエステルを製造し、その後これを単糖とのエステル転移反応に付した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の目的
本発明の主たる目的は、上に詳述した欠点を回避した、糖のアミノアシルエステルを製造するための改善された酵素的方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、アミノ基の保護又はカルボキシ基の活性化を伴わなずに誘導体化されていないアミノ酸を使用することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、誘導体化されていない単糖類を糖分子として使用することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、高い変換率で糖のアミノアシルエステルを製造する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、水を連続的に除去して糖のアミノアシルエステルを製造し、それにより酵素が触媒するエステル化反応に必須である水分活性を極めて低く維持する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、ブタ膵臓リパーゼ及びリゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼといった容易に入手できる市販リパーゼを使用することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、より良好な変換を達成するため、上記方法に記載の量よりも少量の酵素を使用することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、４０℃〜８０℃の温度範囲で低沸点溶媒を使用することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、単糖類のアミノアシルエステルを取得することであって、その際、酵素反応によって３種のモノエステル、６-Ｏ-アミノアシル、３-Ｏ-アミノアシル、及び２-Ｏ-アミノアシルエステルの混合物が生成する。
【００１８】
発明の要約
本発明の新規性は、アミノ基が保護されておらずカルボキシ基が活性化されていない、誘導体化されていないアミノ酸を使用する点である。高濃度の基質と少量の酵素の使用を容易にする実験設定を使用した。市販の容易に入手できるリパーゼを使用できる。考案されたこの方法は、大スケールでも任意のアミノアシル糖エステルの製造に使用できる。
【００１９】
したがって本発明は、単糖類のアミノアシルエステルを製造するための改善された酵素的方法を提供するものであって、その方法は、酵素及び非極性溶媒の存在下で、誘導体化されていないアミノ酸を糖と反応させて単糖のアミノアシルエステルを製造し、その生成物を回収することを含む。
本発明の或る態様では、アミノ酸はＮ保護及びカルボキシ活性化がなされていない。
【００２０】
本発明の別の態様では、アミノ酸は、グリシン、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-リジン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-アルギニン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン及びこれらの対応するＤ、Ｌ混合物より成る群から選ばれる。
【００２１】
本発明の別の態様では、誘導体化されていない糖は、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-マンノース、Ｄ-アラビノース、リボース及びデオキシリボースより成る群から選ばれる単糖類である。
【００２２】
本発明の別の態様では、酵素は、ブタ膵臓、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)、カンジダ・クリンドラシア(Candida cylindracea)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)及び小麦胚芽から得られるリパーゼより成る群から選ばれるリパーゼである。
【００２３】
本発明の別の態様では、溶媒は４０℃〜８０℃の範囲の沸点を有する低沸点溶媒であり、且つジクロロメタン、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ヘキサン、ペンタン、石油エーテル(６０℃〜８０℃画分)、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン及びこれらの混合物より成る群から選ばれる。
【００２４】
本発明の別の態様では、この反応は２〜５日間の範囲で実施する。
本発明のさらに別の態様では、この反応は４０℃〜８０℃の温度範囲で実施する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、単糖類のアミノアシルエステルを製造するための改善された酵素的方法を提供する。この方法は、誘導体化されていないアミノ酸を酵素及び非極性溶媒の存在下に、好ましくは２〜５日間、且つ４０℃〜８０℃の温度範囲で糖と反応させることを含む。次いで、得られた単糖のアミノアシルエステルを当分野で既知の常法によって回収する。
【００２６】
使用するアミノ酸は、Ｎ-保護及びカルボキシ活性化がなされていない、誘導体化されていない遊離アミノ酸である。このようなアミノ酸の例には、グリシン、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-リジン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-アルギニン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン及びこれらの対応するＤ、Ｌ混合物がある。
【００２７】
エステル化に使用する誘導体化されていない糖は、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-マンノース、Ｄ-アラビノース、リボース及びデオキシリボースを包含する単糖類である。使用する酵素は、ブタ膵臓、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)、カンジダ・クリンドラシア(Candida cylindracea)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)及び小麦胚芽由来の市販リパーゼであってよい。
【００２８】
使用する溶媒は、沸点範囲４０℃〜８０℃の低沸点溶媒、例えばジクロロメタン、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ヘキサン、ペンタン、石油エーテル(６０℃〜８０℃画分)、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン及びこれらの混合物である。
【００２９】
ブタ膵臓リパーゼ、II型(ステアプシン)はM/S  Sigma Chemical. Co. (Mo, USA)から購入した。弱陰イオン交換樹脂上に固定化したＬｉｐｏｚｙｍｅ-ＩＭ２０、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor meihei)リパーゼはＮｏｖｏ(デンマーク)から取得した。ブタ膵臓リパーゼ及びＬｉｐｏｚｙｍｅ  -ＩＭ２０のエステル化活性は、エステル化法(Kiran, K. R., Hari Krishna, S., Suresh Babu, C. V., Karanth, N. G. and Divakar, S. 未発表データ、1999)により測定した。活性検定は、当該酵素を、ｎ-ヘプタン中のブタノール(０.３２Ｍ)及び酪酸(０.１６Ｍ)の混合物と一定時間インキュベートした後に反応した酪酸を測定するものである。タンパク質はＬｏｗｒｙ法(Lowry, O. H., Roseborough, N. J., Farr, N. L. and Randall, R. J., J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951)によって見積もった。ブタ膵臓リパーゼ及びＬｉｐｏｚｙｍｅ-ＩＭ２０のエステル化活性は各々０.０６及び０.４６μモル／分／ｍｇ(酵素)であった。
【００３０】
誘導体化されていないアミノ酸(０.００１-０.０１ｍｏｌ)を、ブタ膵臓リパーゼ０.１-２.０ｇの存在下に溶媒又は溶媒混合物５０-５００ｍｌと共に平底二頸フラスコに入れ、４０℃〜８０℃の温度範囲で２〜５日間還流した。次に反応混合物を水２０-１００ｍＬに添加し、攪拌し濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて未反応の単糖、未反応のアミノ酸及び単糖のアミノアシルエステルの混合物を得た。
【００３１】
既知重量の試料を既知過剰量の０.０５Ｎ・ＫＯＨで処理し、過剰の未反応ＫＯＨを０.１Ｎシュウ酸に対して滴定する逆滴定法によってエステル化の割合を決定した。遊離酸に対応する滴定値から遊離酸の量を決定した。使用したアミノ酸の既知重量から、生成したエステルの量を決定した。この、単糖のアミノアシルエステルを、２０℃で稼働させるＢｒｕｋｅｒ・ＤＲＸ-４００及び５００・ＮＭＲ機器で一次元１Ｈ及び１３Ｃ・ＮＭＲならびに二次元ＮＭＲスペクトルを記録することにより特性決定した。試料はＤＭＳＯ-ｄ６及びＤ２Ｏに溶解し、シグナルはＤＳＳをレファランスとした。
【００３２】
分析に付した反応混合物は、３種のモノエステル及び約５％のペプチドの形成を示した。
Ｌ-フェニルアラニン・グルコース・エステルについてのＮＭＲデーターは以下のとおりである。
【化１】
2007528694.tif 000002
【００３３】
Ｌ-ロイシン・モノサッカライド・エステルについてのＮＭＲデーターは以下のとおりである。
【化２】
2007528694.tif 000003
【００３４】
以下の実施例は例示のために供するものであり、故に本発明の範囲を限定すると解するべきではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
分子篩を満たしたソクスレー装置(Soxhelet apparatus)を備えた二頸丸底フラスコ中のジメチルホルムアミド：ジクロロメタン混合物(１：９)１００ｍＬにＤ-グルコース０.０２５ｍｏｌ及び遊離Ｌ-フェニルアラニン０.０２５ｍｏｌを溶解した。反応混合物を、弱陰イオン交換樹脂上に固定化したＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＩＭ-２０、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ０.０９ｇで処理し、４０℃で７２時間還流した。溶媒の蒸気を分子篩中に凝縮させ、それらをフラスコ中に排水することにより、水の連続除去を達成した。反応の後、反応混合物を水５０ｍＬに添加し、攪拌及び濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて未反応の単糖、未反応のアミノ酸及びＬ-フェニルアラニルグルコースエステルの混合物を得た。逆滴定法による反応では変換収率２７.０％となり、ＨＰＬＣでは３６.５％であった。
【００３６】
実施例２
分子篩を満たしたソクスレー装置を備えた二頸丸底フラスコ中のジメチルホルムアミド：ジクロロメタン混合物(１：９)１００ｍＬにグルコース０.００１ｍｏｌ及び遊離Ｌ-フェニルアラニン０.００１ｍｏｌを溶解した。反応混合物を、ブタ膵臓リパーゼ０.０３６ｇで処理し、４０℃で７２時間還流した。溶媒の蒸気を分子篩中に凝縮させ、それらをフラスコ中に排水することにより、水の連続除去を達成した。反応の後、反応混合物を水５０ｍＬに添加し、攪拌及び濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて、未反応の単糖、未反応のアミノ酸及びＬ-フェニルアラニルグルコースエステルの混合物を得た。逆滴定法により反応では変換収率３６.５％となり、ＨＰＬＣでは５６.５％であった。
【００３７】
実施例３
分子篩を満たしたソクスレー装置を備えた二頸丸底フラスコ中のジメチルホルムアミド：ジクロロメタン混合物(１：９)１００ｍＬにグルコース０.００１ｍｏｌ及び遊離Ｌ-フェニルアラニン０.００３ｍｏｌを溶解した。反応混合物を、ブタ膵臓リパーゼ０.０３６ｇで処理し、４０℃で７２時間還流した。溶媒の蒸気を分子篩中に凝縮させ、それらをフラスコ中に排水することにより、水の連続除去を達成した。反応の後、反応混合物を水５０ｍＬに添加し、攪拌及び濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて、未反応の単糖、未反応のアミノ酸及びＬ-フェニルアラニルグルコースエステルの混合物を得た。逆滴定法による反応では変換収率５７.０％となり、ＨＰＬＣでは５２.０％であった。
【００３８】
実施例４
分子篩を満たしたソクスレー装置を備えた二頸丸底フラスコ中のジメチルホルムアミド：ジクロロメタン混合物(１：９)１００ｍＬにグルコース０.００１ｍｏｌ及び遊離Ｌ-ロイシン０.００１ｍｏｌを溶解した。反応混合物を、弱陰イオン交換樹脂上に固定化したＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＩＭ-２０、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ０.０５５ｇで処理し、４０℃で７２時間還流した。溶媒の蒸気を分子篩中に凝縮させ、それらをフラスコ中に排水することにより、水の連続除去を達成した。反応の後、反応混合物を水５０ｍＬに添加し、攪拌及び濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて、未反応の単糖、未反応のアミノ酸及びＬ-ロイシルグルコースエステルの混合物を得た。逆滴定法による反応では変換収率７５.３％となり、ＨＰＬＣでは５４.７％であった。
【００３９】
実施例５
分子篩を満たしたソクスレー装置を備えた二頸丸底フラスコ中のジメチルホルムアミド：ジクロロメタン混合物(１：９)１００ｍＬにグルコース０.００１ｍｏｌ及び遊離Ｌ-ロイシン０.００１ｍｏｌを溶解した。反応混合物を、ブタ膵臓０.０７２ｇで処理し、４０℃で７２時間還流した。溶媒の蒸気を分子篩中に凝縮させ、それらをフラスコ中に排水することにより、水の連続除去を達成した。反応の後、反応混合物を水５０ｍＬに添加し、攪拌及び濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて、未反応の単糖、未反応のアミノ酸及びＬ-ロイシルグルコースエステルの混合物を得た。逆滴定法による反応では変換収率４３.８％となり、ＨＰＬＣでは６８.０％であった。
【００４０】
実施例６
分子篩を満たしたソクスレー装置を備えた二頸丸底フラスコ中のジメチルホルムアミド：ジクロロメタン混合物(１：９)１００ｍＬにグルコース０.００１ｍｏｌ及び遊離Ｌ-ロイシン０.００５ｍｏｌを溶解した。反応混合物を、弱陰イオン交換樹脂上に固定化したＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＩＭ-２０、リゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ０.０５４ｇで処理し、４０℃で７２時間還流した。溶媒の蒸気を分子篩中に凝縮させ、それらをフラスコ中に排水することにより、水の連続除去を達成した。反応の後、反応混合物を水５０ｍＬに添加し、攪拌及び濾過してリパーゼを除去した。濾液を水浴上で蒸発させて、未反応の単糖、未反応のアミノ酸及びＬ-ロイシルグルコースエステルの混合物を得た。逆滴定法による反応では変換収率８４.４％であった。
【００４１】
本発明の主たる利点は以下の通りである：
１.  誘導体化されていないアミノ酸の使用。誘導体化されたアミノ酸も使用できる。
２.  特別に設計した実験条件で反応を実施することにより、高い変換率が達成された。
３.  考案された実験条件は反応中の水の連続除去を可能にしたが、これがなされない場合には、加水分解のためエステル化の程度が低下する結果となる。
４.  ブタ膵臓リパーゼリゾムコームミヘイ(Rhizomicor miehei)リパーゼのような容易に入手できる市販リパーゼの使用。
５.  より良好な変換を達成するための、より少量の酵素の使用。
６.  この方法は単糖の誘導体化を含まない。
７.  ４０℃〜８０℃の温度範囲における低沸点溶媒の使用。
８.  この方法は大スケールでの変換の実現にも利用できる。
【国際調査報告】
2007528694.tif 000004
2007528694.tif 000005
2007528694.tif 000006