(57)【要約】  本発明は、新規な薬物送達ビヒクル、その生成法および使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、コレステロール（ＣＨ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）が、それぞれ、モル比で３０〜６０ｍｏｌ％および５〜２０ｍｏｌ％存在するリポソーム。
【請求項２】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＳＭがモル比で１０〜１８ｍｏｌ％存在し、特に１２〜１６ｍｏｌ％存在する、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＣＨがモル比で４０〜５６ｍｏｌ％存在し、特に４８〜５２ｍｏｌ％存在する、請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
リポソームの残りの脂質が、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホ脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および脂質を含む炭水化物からなる群から選択される、請求項１〜３の一項に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群から選択される、請求項４に記載のリポソーム。
【請求項６】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、前記ＰＥがモル比で５〜２５ｍｏｌ％存在する、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、前記ＰＣがモル比で１５〜４０ｍｏｌ％存在する、請求項５または６に記載のリポソーム。
【請求項８】
リポソームの直径が５０〜２００ｎｍであり、好ましくは８０〜１５０ｎｍである、請求項１〜７の一項に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記ＳＭが、乳由来ＳＭ、卵黄由来ＳＭ、脳由来ＳＭ、および合成ＳＭからなる群から選択される、請求項１〜８の一項に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記ＰＥが、卵由来ＰＥ、心臓由来ＰＥ、肝臓由来ＰＥ、植物由来ＰＥ、細菌由来ＰＥ、および合成ＰＥ、特に１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ、１‐アシル‐２‐アシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ、または１，２‐ジラウロイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ（ＤＬＰＥ）からなる群から選択される、請求項１〜９の一項に記載のリポソーム。
【請求項１１】
標的部分がリポソームに取り付けられる、請求項１〜１０の一項に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記標的部分が、ペプチドもしくはタンパク質、特に抗体もしくはその断片、一本鎖抗体もしくはその断片、受容体リガンドもしくはその断片、炭水化物、およびリガンドからなる群から選択される、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記標的部分が、天然もしくは合成の受容体結合ペプチド、特にＲＧＤ含有ペプチドなどのインテグリン結合ペプチド；増殖因子、特にＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＳＤＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン、ＢＭＦ、ボンベシン、Ｍ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、トロンボポエチン、エリスロポエチン、ＳＣＦ、ＳＤＧＦ、オンコスタチン、ＰＤＥＧＦ、エンドセリン；サイトカイン、特にＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、インターフェロンα、β、もしくはγ；ＴＮＦα、ＴＮＦβなどの腫瘍壊死因子；ケモカイン、特にランテス、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ‐１αもしくはβ、ＮＡＰ、β‐トロンボグロブリン；ペプチドホルモン例えばＳＲＨ、ＳＩＨ、ＳＴＨ、ＭＲＨ、ＭＳＨ、ＰＲＨ、ＰＩＨ、プロラクチン、ＬＨ‐ＲＨ、ＦＳＨ‐ＲＨ、ＬＨ／ＩＣＳＨ、ＦＳＨ、ＴＲＨ、ＴＳＨ、ＣＲＨ、ＡＣＴＨ、アジオテンシン、キニーネ、ヒスタミン；ステロイドホルモン、特にエストロゲン、ゲスターゲン、アンドロゲン、糖質コルチコイド；鉱質コルチコイド；またはそれらの相同物もしくは類似物；ビタミン、特に葉酸；接着分子、特にルイスＸ、Ｓ‐ルイスＸ、ＬＦＡ‐１、ＭＡＣ‐１、ＶＬＡ‐４、ＰＥＣＡＭ、ビトロネクチン、ＧＭＰ‐１４０、ＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、フィブロネクチン、ラミニン、Ｂ７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、およびセレクチン；ウイルスコートタンパク質；単糖類、特にグルコース、マンノース；ならびにオリゴ糖、特にＭａｎ２、Ｍａｎ３、Ｍａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、もしくはＭａｎ９、ルイスＹ、シアリルルイスＹ、レクチンからなる群から選択される、請求項１１の一項に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記標的部分がスペーサーに取り付けられる、請求項１１〜１３の一項に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記スペーサーの長さが１〜１０ｎｍであり、好ましくは２．５〜５ｎｍである、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記標的部分が脂質に取り付けられる、請求項１１〜１５の一項に記載のリポソーム。
【請求項１７】
前記脂質が、Ｎ‐カプロイルアミン‐ＰＥ、Ｎ‐ドデカニルアミン‐ＰＥ、ホスファチジルチオエタノール、Ｎ‐［４‐（ｐ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐カルボキシアミド‐ＰＥ（Ｎ‐ＭＣＣ‐ＰＥ）、Ｎ‐［４‐（ｐ‐マレイミドフェニル）ブチルアミド］‐ＰＥ（Ｎ‐ＭＰＢ‐ＰＥ）、Ｎ‐［３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート］‐ＰＥ、（Ｎ‐ＰＤＰ‐ＰＥ）、Ｎ‐スクシニル‐ＰＥ、Ｎ‐グルタリル‐ＰＥ、Ｎ‐ドデカニル‐ＰＥ、Ｎ‐ビオチニル‐ＰＥ、Ｎ‐ビオチニル‐Ｃａｐ‐ＰＥ、ホスファチジル‐（エチレングリコール）、ＰＥ‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）‐カルボン酸、ＰＥ‐ＰＥＧ‐マレイミド、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ＰＤＰ、ＰＥ‐ＰＥＧ‐アミン、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ビオチン、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ＨＮＳ、ジパルミトイル‐グリセロスクシニル‐リジン．α‐メトキシ‐ω‐（１，２‐ジオクタデセノイルオキシグリセリル）（ＤＯ）、およびα‐メトキシ‐ω‐（１，２‐ジテトラデセノイルオキシグリセリル）（ＤＴ）からなる群から選択される、請求項１６に記載のリポソーム。
【請求項１８】
リポソーム中に一種もしくは複数の薬物および／または診断薬が含まれる、請求項１〜１７の一項に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記薬物が、鎮痛薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、抗不整脈薬、抗生物質、抗感染薬、抗痴呆薬（向知性薬）、抗糖尿病薬、解毒薬、制吐薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、止血薬、抗高浸透圧薬、抗低浸透圧薬、抗凝血剤、抗真菌剤、鎮咳薬、抗ウイルス剤、β‐受容体およびカルシウムチャンネル拮抗薬、気管支溶解剤および喘息薬、ケモカイン、サイトカイン、分裂促進因子、細胞分裂停止薬物、細胞傷害性薬剤、およびそのプロドラッグ、皮膚薬、催眠薬および鎮静薬、免疫抑制剤、免疫賦活薬、ペプチドもしくはタンパク質薬物、特にホルモン、および生理学的もしくは薬理学的分裂促進因子阻害薬、ケモカイン、またはサイトカイン、あるいはそのそれぞれのプロドラッグからなる群から選択される、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２０】
前記細胞分裂停止薬物および細胞傷害性薬物が、アルキル化物質、抗代謝産物、抗生物質、エポシロン、核内受容体作用薬および拮抗薬、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン薬、インターフェロン、細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）阻害薬、シクロオキシゲナーゼおよび／またはリポキシゲナーゼ阻害薬、生体脂肪酸；プロスタノイド、ロイコトリエンを含む脂肪酸誘導体；タンパク質キナーゼ阻害薬、タンパク質ホスファターゼ阻害薬、脂質キナーゼ阻害薬、白金配位錯体、エチレンイメン、メチルメラミン、トラジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキルスルホネート、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ‐アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシウムホリネート、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シス‐プラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシンダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロプアミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、エストラムシンホスフェート、エストロゲン、エチニールエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、マフェナイドスルフェートオールアミド、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロンアセテート、酢酸メゲストロール、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド 、ニフララジン、ニフルティモックス、ニムスチン、ニノルアゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロイッシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロリド、セムスチンストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフィソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テルチポシド、テストラクトン、テストステロンプロピオネート、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクォン、トレオサルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ‐０１、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾルビシン、あるいはそのそれぞれの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される、請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２１】
前記診断薬が、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子、放射性分子、非放射性同位元素、および蛍光分子からなる群から選択される、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２２】
リポソーム中に安定剤、保護剤、金属イオンキレート剤、緩衝液、および／または添加剤が含まれる、請求項１〜２１の一項に記載のリポソーム。
【請求項２３】
乾燥、好ましくは凍結乾燥されている、請求項１〜２２の一項に記載のリポソーム。
【請求項２４】
ＳＭ、ＣＨ、および残りの脂質が混合される、請求項１〜２３の一項に記載のリポソームを生成する方法。
【請求項２５】
残りの脂質がＰＥおよびＰＣから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、安定剤、保護剤、金属イオンキレート剤、緩衝液、および／または添加剤が含まれる、請求項１〜２３の一項に記載のリポソーム、あるいは請求項２４に記載の方法に従って生成されたリポソームを含む医薬組成物。
【請求項２７】
さらに、安定剤、保護剤、金属イオンキレート剤、緩衝液、および／または添加剤が含まれる、請求項１〜２３の一項に記載のリポソーム、あるいは請求項２４に記載の方法に従って生成されたリポソームを含む診断組成物。
【請求項２８】
前記安定剤が、α‐トコフェロール、ビタミンＥ、あるいは炭水化物、特にグルコース、ソルビトール、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトトリオース、またはデキストランからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載のリポソーム、請求項２５に記載の医薬組成物、あるいは請求項２７に記載の診断組成物。
【請求項２９】
増殖性疾患、自己免疫疾患、伝染病、心血管疾患、リウマチ病、炎症性疾患、あるいは脈管構造への障害もしくはその透過性の上昇、または内皮細胞の活性化に関連付けられるあらゆる疾患もしくは状態の治療用薬物を生成するための、請求項１〜２３の一項に記載のリポソーム、あるいは請求項２６または２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
増殖性疾患が、胃腸路癌もしくは結腸直腸路癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、口腔粘膜異形成、浸潤性口腔癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、ホルモン依存性乳癌、非依存性乳癌、移行細胞癌および扁平上皮細胞癌、神経芽細胞腫を含む神経系悪性腫瘍、グリア細胞腫、星細胞腫、骨肉腫、柔組織肉腫、血管腫、内分泌腫瘍、白血病を含む血液異常増殖、リンパ腫、他の骨髄増殖性疾患およびリンパ球増殖性疾患、上皮内癌、過形成病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患、ならびにウイルス誘発増殖性疾患からなる群から選択される、請求項２９の使用。
【請求項３１】
増殖性疾患、自己免疫疾患、伝染病、心血管疾患、リウマチ病、および炎症性疾患の群から選択される疾患を診断するための請求項２７に記載の診断組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロールおよびスフィンゴミエリンを含む新規な薬物送達ビヒクル、それらを製造し使用する方法に関し、特に、増殖性疾患、免疫疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、および炎症性疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ほとんどの薬物は自由型で患者に投与されているが、この自由型とは溶液状であり、ビヒクルに結合せず、または組み込まれていないことを意味する。用語「自由型」は、さらに、所与の薬物の化学的誘導体および薬物によって形成され得る様々な付加塩を含む。しかし、その自由型での薬物投与と比較した場合、送達ビヒクルへの薬物の取付けまたは薬物の組込みによって利点がもたらされることが分かっていた。そのようなビヒクルへ組込み、または取付けを行うことによって、所与の薬物の全体的効力に作用する要因のいくつかに有利な作用を及ぼすことができる。こうした要因には、組織特異的分配、当該特定組織中または疾患部位への特に優先的な蓄積、特定の細胞型を薬物の標的にすること、血液成分の相互作用の低減、および循環時間の延長が含まれる。様々な薬物送達ビヒクルの適合性と比較した場合、上記要因は重要であるが、そのような送達ビヒクル間だけでなく、ビヒクルからの薬物の放出特性などの要因もその効力に重要なものになる。そのような薬物送達ビヒクルに結合させ、または組み込んだ場合、これらの要因の全ては所与の薬効の改善の可能性にある程度貢献するであろうが、新規な送達ビヒクルを求めての最終的な試験は、その「自由型」薬物や別のビヒクルと比較したときの疾患動物モデルまたは患者における効力である。
【０００３】
近年注目を浴びている薬物送達ビヒクルの一つの型は、リポソーム製剤である。一般に、用語「リポソーム」は、内部に水性物を封入し、形成された脂質膜数に応じて、単層または多層の脂質構造体という。典型的には、リポソームは薬物を搭載することができ、すなわち薬物をリポソーム内部にカプセル化し、かつ／または薬物をリポソームに取り付け、あるいは脂質二重層中に組み込むことができる。リポソーム製剤を含むそのような薬物は、自由型薬物と比較して効力が増大することが分かっている。例えば、ビンカアルカロイドビンクリスチンを含むリポソーム製剤は、自由型ビンクリスチンと比較した場合、白血病細胞に対する効力が上昇し、全体的な毒性が減少することが示されている（Mayer et al. (1993) Cancer Chemo. Pharmacol. 33: 17-24（非特許文献１））。リポソームは、ほぼどんな脂質からでも形成することができるので、多様な種々のリポソーム製剤が、当技術分野で知られている。しかし、所与の疾患への薬効に対する個々の脂質が有する作用だけでなく、２種以上の異なる脂質のどのモル比が脂質組成物に効力の改善をもたらすのかはほとんど分かっていない。
【０００４】
例えば、ＥＰ０５５５３３３Ｂ１（特許文献１）は、コレステロールの含有量が高いリポソームについて記載している。このリポソームは、コレステロールおよびリン脂質をコレステロール：リン脂質＝０．８：１．２の割合で含んでいる。こうした小胞は、抗原応答を引き出すための抗原の送達に適していることが教示され、すなわちワクチンとしての使用が開示されている。
【０００５】
ＵＳ５，５４３，１５２（特許文献２）、ＵＳ５，４７１，５１６（特許文献３）、およびＵＳ５，８１４，３３５（特許文献４）は、薬物を送達するためのスフィンゴミエリン（ＳＭ）およびコレステロール（ＣＨ）を含むリポソーム製剤、特に３０〜７５ｍｏｌ％のスフィンゴミエリンと２５〜５０ｍｏｌ％のコレステロールを含むリポソームの使用を教示し、このリポソームはスフィンゴソームと呼ばれている。これらのリポソームでは、ＳＭの代わりに、例えば、ジステアロイル‐ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含むリポソームと比べた場合、酸安定性が上昇することが教示されている。例えば、Mayer et al., Biochem. Biophys. Acta 1025: 143-151 (1990)（非特許文献２）に記載されているようなｐＨ勾配依存性カプセル化手順によって、それぞれの薬物がリポソーム中に搭載される場合、酸に対するこの安定性の上昇は利点である。この手順では、リポソーム内部をｐＨ４付近に酸性化する必要がある。さらに、ＤＳＰＣで製剤化したビンクリスチンと比較した場合、スフィンゴソーム（ＳＭ／ＣＨ５５／４５ｍｏｌ％）で製剤化したビンクリスチンの循環時間が延長され、マウス腫瘍モデルで効力が改善したことが開示されている。
【非特許文献１】Mayer et al. (1993) Cancer Chemo. Pharmacol. 33: 17-24
【非特許文献２】Mayer et al., Biochem. Biophys. Acta 1025:143-151 (1990)
【特許文献１】ＥＰ０５５５３３３Ｂ１
【特許文献２】ＵＳ５，５４３，１５２
【特許文献３】ＵＳ５，４７１，５１６
【特許文献４】ＵＳ５，８１４，３３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今回、驚くべきことに、従来技術で開示されている濃度よりも極めて低い濃度のＳＭおよび高濃度のＣＨを使用して、疾患治療、特に腫瘍治療で効力が増大したリポソームを生成できることが本発明者らによって見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＣＨおよびＳＭが、それぞれ、モル比で約３０〜約６０ｍｏｌ％および約５〜約２０ｍｏｌ％存在するリポソームを提供する。６０ｍｏｌ％を超える濃度では、規則的な脂質二重層構造の形成が制限されることが判明しており、従ってＣＨの含有量６０％が本発明のリポソームの上限である。他方で、コレステロール濃度を３０ｍｏｌ％未満に下げると、循環からのリポソームの排出速度が増加すると思われ、それによってリポソーム中に含まれている薬物の生物学的半減期が減少する。同時に、治療的施用での、特に腫瘍治療でのリポソームの効力が減少する。
【０００８】
同様に、動物腫瘍モデルにおいて、ＳＭを２０ｍｏｌ％超、例えば３０ｍｏｌ％に増加させると、ドキソルビシンの効力は減少し、一方ＳＭを５％未満に減らし、またはＳＭを完全に除去すると、カプセル化したドキソルビシンの循環時間は劇的に減少し、次いで効力も減少する。すなわち、本発明は一つには、リポソームの様々な構成の変化が薬効に及ぼす作用を徹底的に分析し、従来技術のリポソームと比較した場合、コレステロールの含有量が高いリポソームで、ＳＭ含有量をかなり減少させることによって、薬物送達および治療効力が改善し安定したリポソーム構造を示すリポソームが得られるという驚くべき発見を通してなされた。
【０００９】
好ましい実施形態では、リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＳＭがモル比で約８〜約１９ｍｏｌ％存在し、より好ましくは約１０〜約１８ｍｏｌ％、さらにいっそう好ましくは約１２〜約１６ｍｏｌ％、最も好ましくは約１３〜約１５ｍｏｌ％存在する。
【００１０】
さらに好ましい実施形態では、リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＣＨがモル比で約３５〜約５８ｍｏｌ％存在し、より好ましくは約４０〜５６ｍｏｌ％、さらにいっそう好ましくは約４５〜約５４ｍｏｌ％、最も好ましくは約４８〜約５２ｍｏｌ％存在する。
【００１１】
特定の好ましい実施形態では、全モル脂質組成物に対して、リポソームはＣＨおよびＳＭをモル比でそれぞれ、約３５〜約５８ｍｏｌ％および約５〜２０ｍｏｌ％含み、好ましくは約４０〜約５８ｍｏｌ％および約８〜約１９ｍｏｌ％、より好ましくは、それぞれ、約４５〜約５４ｍｏｌ％および約１０〜約１８ｍｏｌ％、最も好ましくは、それぞれ、約４８〜約５２ｍｏｌ％および約１２〜約１６ｍｏｌ％含む。
【００１２】
脂質残部、すなわちＳＭでもＣＨでもないが、添加して１００ｍｏｌ％にするのに必要な脂質の量は、どんな脂質から構成されていてもよい。ここでおよび本発明全体にわたって使用する用語「脂質」は、脂肪特性または脂肪様特性を有するどんな物質をもさす。一般に、脂質は、伸長した無極性残基（Ｘ）と、通常、水溶性極性親水性残基（Ｙ）を含み、この脂質は以下の基本式によって特徴付けることができる。
Ｘ‐Ｙｎ
【００１３】
式中、ｎは０以上である。ｎ＝０の脂質は「無極性脂質」と称し、ｎ≧１の脂質は「極性脂質」と称する。本発明のリポソームの脂質残部を構成できる脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホ脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および脂質を含む炭水化物からなる群から選択されることが好ましい。
【００１４】
これらの脂質の中で、脂質残部は一種または複数のリン脂質を含むのが好ましい。そのリン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群から選択されるのが好ましい。さらにより好ましい実施形態では、本発明のリポソームの脂質は、ＳＭ、ＣＨ、およびリン脂質のみからなる。この場合は、ＳＭおよび／またはＣＨは、上記のその好ましい濃度範囲で、および特に好ましい濃度範囲で存在してよい。
【００１５】
驚くべきことに本発明者らは、リポソームの血清滞留時間をさらに延長することによって、第３の脂質成分であるＰＥが本発明のリポソームの効力に対して正の作用を発揮することを示すこともできた。従って別の実施形態では、本発明のリポソームは、ＰＥを含み、好ましい実施形態では、リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＰＥはモル比で約５〜約２５ｍｏｌ％存在し、好ましくは約１０〜約２０ｍｏｌ％、より好ましくは約１２〜約１８ｍｏｌ％、最も好ましくは約１４〜約１６ｍｏｌ％存在する。同時に、ＳＭおよび／またはＣＨが、上記のその好ましい濃度範囲で、および特に好ましい濃度範囲でリポソーム中に含まれ、脂質残部が先に定義した任意の脂質から構成されている場合に、これらの割合のＰＥが存在するのが好ましい。しかし、特に好ましい実施形態では、脂質残部はリン脂質から選択される。
【００１６】
本発明のリポソーム中に含まれていてよい別の成分はＰＣである。好ましい実施形態では、リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＰＣは約１５〜約４０ｍｏｌ％を構成する。本発明のリポソームは、約２０〜約３５ｍｏｌ％のＰＣを含むのがより好ましい。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、リポソームはＳＭ、ＣＨ、ＰＥ、およびＰＣからなり、ＳＭ、ＣＨ、およびＰＥは上記のその好ましい濃度範囲で、および特に好ましい濃度範囲で存在し、１００ｍｏｌ％にするための脂質残部はＰＣから構成される。
【００１８】
本発明のリポソームの直径は、１０〜１０００ｎｍであってよい。しかし、好ましい実施形態では、リポソームの直径は５０〜２００ｎｍであり、８０〜１５０ｎｍがより好ましい。例えば、既知の孔径の篩またはメッシュを通しリポソーム組成物を押し出すことによって、リポソームの直径を達成することができる。径を制御するこの方法や別の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Mayhew et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-174またはOlson et al. (1979) Biochim. Biophys.Acta 557:9-23に記載されている。
【００１９】
ＳＭは、類似する親水性頭基を有する脂質の総称である。しかし、この頭基に多くの異なる無極性残基を取り付けることができる。すなわち、様々な天然源から単離したＳＭは、取り付けられた無極性残基の長さおよび化学構造が実質的に異なり、通常は異なるＳＭの混合物である。ある種のＳＭが、特定の優れた効力をもたらすことが本発明者らによって観察されており、従って本発明のリポソーム中に使用されているＳＭは、乳由来ＳＭ、卵黄由来ＳＭ、脳由来ＳＭ、および合成ＳＭからなる群から選択することが好ましい。好ましい実施形態では、そのＳＭを含む合成ＳＭはジステアロイル‐ＳＭである。
【００２０】
ＳＭと同様に、ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミン頭基を有する脂質の総称である。本発明のリポソーム中に組み込んだ場合、ある種のＰＥは他のものよりも優れた効力をもたらすこともまた本発明者らによって観察されており、従って好ましい実施形態では、ＰＥは、卵由来ＰＥ、心臓由来ＰＥ、肝臓由来ＰＥ、植物由来ＰＥ、細菌由来ＰＥ、および合成ＰＥ、特に１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ、１‐アシル‐２‐アシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥおよび／または１，２‐ジラウロイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ（ＤＬＰＥ）からなる群から選択される。
【００２１】
別の実施形態では、本発明のリポソーム膜を構成する成分のいずれかを別の化学部分に取り付けることができる。用語、化学部分は特に限定されない。しかし、好ましい実施形態では、化学部分は以下により詳細に記載するような標的部分、または安定化部分である。本発明の意味内での安定化部分は、ひとたび投与されたならばリポソームの循環時間を延長する。特定の好ましい安定化部分は、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、またはＰＥＧであり、特定の好ましいＰＥＧの分子量は、約１，０００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌであり、約５，０００ｇ／ｍｏｌがより好ましい。
【００２２】
好ましい実施形態では、化学部分、特に安定化部分は、リポソーム膜を構成する分子の少量にのみ取り付けられる。リポソーム膜の成分の約１〜約２０ｍｏｌ％が、取り付けられた化学部分を有することが好ましく、約３〜約１０ｍｏｌ％がより好ましく、約５ｍｏｌ％がさらにいっそう好ましい。
【００２３】
化学部分、特に安定化部分を取り付けるための好ましいリポソーム成分は、脂質成分である。様々な化学部分を様々な脂質成分に取り付けることができるが、化学部分は本発明のリポソーム内に含まれている一種または複数のリン脂質に取り付けることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、一種または複数の化学部分をＰＥに取り付ける。特に、例えばＰＥＧのような安定化薬剤を使用する場合、取付けにはＰＥを使用する。
【００２４】
安定化部分の取付けに加えて、本発明のリポソームの脂質二重層を安定させるために、界面活性剤、タンパク質およびペプチドをリポソームに組み込むことができる。二重層安定化成分として使用することができる界面活性剤には、これだけには限らないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ‐１００、デオキシコラート、オクチルグルコシド、リゾホスファチジルコリンが含まれる。二重層安定化成分として使用することができるタンパク質には、これだけには限らないが、グリコホリンやチトクロム酸化酵素が含まれる。好ましい実施形態では、リポソームは０．０５〜１５ｍｏｌ％の安定化薬剤を含むことができる。
【００２５】
本発明のリポソームは、ある種の腫瘍細胞に結合する特定の優先性は示さないと思われる。幾つかの施用例では、例えば、細胞傷害性薬物を腫瘍細胞に優先的に送達するのが望ましい腫瘍の治療では、主として体内の特異的部位をリポソームの標的にすることができる本発明のリポソーム標的化手段によって、リポソーム薬物製剤の全身毒性を低減することができ、あるいは別法として同程度の毒性でより多量の薬物を投与できるようになる。従って、本発明のリポソームの別の実施形態では、標的部分を前記リポソームに取り付ける。先に述べたように、化学部分に関して、原理上、標的部分はリポソームのどの成分にも取り付けることができる。標的部分は：ａ）リポソームの脂質成分の１つに取り付ける、ｂ）本発明のリポソーム膜に組み込むことができる膜タンパク質に取り付ける、あるいはｃ）それ自体をその脂質層に挿入し、または組込むことができる、ことが好ましい。
【００２６】
本説明全体にわたって使用されている用語「取り付ける」は、それぞれ、化学部分、特に標的部分とリポソームの別の成分との間の、直接的もしくは間接的な共有もしくは非共有結合および接続をさす。先に定義した取付けを可能にする多様な化学基は、例えば、ビオチン‐ストレプトアビジン、アミノ反応基（例えば、カルボジイミド、ヒドロキシルメチルホスフィン、イミドエステル、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、イソシアネート）、スルフヒドリル反応基（例えば、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、アジリジン）、カルボキシル反応分子（例えば、カルボジイミド、カルボジイミダゾール、ジアゾアルカン）、ヒドロキシル反応基（例えば、カルボニルジイミダゾール、アルキルハロゲン、イソシアネート）を含め、当技術分野で知られており、適宜当業者が容易に選択することができる。
【００２７】
好ましい実施形態では、標的部分は、ペプチドもしくはタンパク質、特に抗体もしくはその断片、一本鎖抗体もしくはその断片、受容体リガンドもしくはその断片、炭水化物、およびリガンドからなる群から選択される。
【００２８】
より詳細には、標的部分は、天然もしくは合成の受容体結合ペプチド、特にＲＧＤ含有ペプチドなどのインテグリン結合ペプチド；増殖因子、特にＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＳＤＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン、ＢＭＦ、ボンベシン、Ｍ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、トロンボポエチン、エリスロポエチン、ＳＣＦ、ＳＤＧＦ、オンコスタチン、ＰＤＥＧＦ、エンドセリン；サイトカイン、特にＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、インターフェロンα、β、もしくはγ；ＴＮＦα、ＴＮＦβなどの腫瘍壊死因子；ケモカイン、特にランテス、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ‐１αもしくはβ、ＮＡＰ、β‐トロンボグロブリン；ペプチドホルモン、例えば、ＳＲＨ、ＳＩＨＳＴＨ、ＭＲＨ、ＭＳＨ、ＰＲＨ、ＰＩＨ、プロラクチン、ＬＨ‐ＲＨ、ＦＳＨ‐ＲＨ、ＬＨ／ＩＣＳＨ、ＦＳＨ、ＴＲＨ、ＴＳＨ、ＣＲＨ、ＡＣＴＨ、アジオテンシン、キニーネ、ヒスタミン；ステロイドホルモン、特にエストロゲン、ゲスターゲン、アンドロゲン、糖質コルチコイド；鉱質コルチコイド；またはそれらの相同物もしくは類似物；ビタミン、特に葉酸；接着分子、特にルイスＸ、Ｓ‐ルイスＸ、ＬＦＡ‐１、ＭＡＣ‐１、ＶＬＡ‐４、ＰＥＣＡＭ、ビトロネクチン、ＧＭＰ‐１４０、ＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、フィブロネクチン、ラミニン、Ｂ７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、およびセレクチン；ウイルスコートタンパク質；単糖類、特にグルコース、マンノース；ならびにオリゴ糖、特にＭａｎ２、Ｍａｎ３、Ｍａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、もしくはＭａｎ９、ルイスＹ、シアリルルイスＹ、ならびにレクチンからなる群から選択することができる。
【００２９】
好ましい実施形態では、標的部分がスペーサーに取り付けられる。本説明全体にわたって使用される用語「スペーサー」は、それがリポソーム成分に取り付けられたときでさえ、標的部分のより優れた接近性（accessibility）を付与するのに役立つ化学部分をさす。リポソーム成分は、例えば、そうでない場合、標的部分の各標的構造への結合を立体的に妨害するであろう本発明の脂質である。この意味内でのスペーサーの直線的伸長は少なくとも０．５ｎｍであり、スペーサーの直線的伸長は１〜１０ｎｍが好ましく、２〜５ｎｍがさらにいっそう好ましい。スペーサーは、直鎖もしくは分枝の、飽和もしくは不飽和糖鎖であることが好ましい。糖鎖は、単量体構成単位の多量体反復を含むのが好ましい。それぞれの単量体構成単位の長さに応じて、単量体構成単位の２〜１０個の多量体反復が好ましい。好ましい実施形態では、スペーサーは親水性である。スペーサーは、一末端への標的部分の取付けを可能にする官能基、および他方の末端にリポソーム成分、例えば、本発明の脂質へのスペーサーの取付けを可能にする別の官能基を含むことができる。
【００３０】
好ましいスペーサーは、二機能性分子、特に、約１〜４０個の反復単位を好ましくは含む二機能性ポリエチレンもしくはポリプロピレングリコール誘導体であり、天然および／または合成アミノ酸を含むオリゴペプチドである。このオリゴペプチドは、好ましくは１〜４０個の、好ましくは２〜２０個の、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸含む。スペーサーの特定の好ましい構成単位は、８‐アミノ‐３，６‐ジオキサオクタン酸（8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid）（ｄｏｏ）であり、１〜１０個のｄｏｏ反復単位を含むスペーサーが好ましい。２〜５個のｄｏｏ単位を含むスペーサーがさらにより好ましく、３個のｄｏｏ単位を含むスペーサーが最も好ましい。リポソームと関連して、スペーサーには最適な長さがあり、それは２〜５ｎｍであることが本発明者らによって発見されている。一方で、長さが０．５ｎｍ未満のスペーサーでは、ほとんどの場合、リポソーム表面から標的部分が取り付けられている場所までの距離が十分ではなく、効率的な相互作用、すなわち、標的部分とそのそれぞれの標的、例えば、腫瘍細胞などとの結合が行われない。他方で、１０ｎｍを超える長さのスペーサーは、「緩み」が増大し、これも標的部分とその標的の間の相互作用に有害である。従って、好ましい実施形態では、スペーサーの長さは１〜１０ｎｍであり、２．５〜５ｎｍが好ましい。
【００３１】
本発明のリポソームの好ましい実施形態では、標的部分は、脂質、好ましくはリン脂質、例えば、ＰＥ、ＰＣ、ＰＳなどに取り付けられ、標的部分の取付けに使用される脂質は、Ｎ‐カプロイルアミン（caproylamine）‐ＰＥ、Ｎ‐ドデカニルアミン（dodecanylamine）‐ＰＥ、ホファチジルチオエタノール（phophatidylthioethanol）、Ｎ‐［４‐（ｐ‐マレイミドメチル（maleimidomethyl））シクロヘキサン（cyclohexane）‐カルボキシアミド（carboxamide）‐ＰＥ（Ｎ‐ＭＣＣ‐ＰＥ）、Ｎ‐［４‐（ｐ‐マレイミドフェニル（maleimidophenyl））ブチルアミド（butyramide）］‐ＰＥ（Ｎ‐ＭＰＢ）、Ｎ‐［３‐（２‐ピリジルジチオ（pyridyldithio））プロピオネート（propionate）］‐ＰＥ（Ｎ‐ＰＤＰ）、Ｎ‐スクシニル（succinyl）‐ＰＥ、Ｎ‐グルタリル（glutaryl）‐ＰＥ、Ｎ‐ドデカニル（dodecanyl）‐ＰＥ、Ｎ‐ビオチニル（biotinyl）‐ＰＥ、Ｎ‐ビオチニル（biotinyl）‐ｃａｐ‐ＰＥ、ホスファチジル（phosphatidyl）‐（エチレングリコール（ehtylene glycol））、ＰＥ‐ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）（ＰＥＧ）‐カルボン酸（carboxylic acid）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐マレイミド（maleimide）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ＰＤＰ、ＰＥ‐ＰＥＧ‐アミン（amine）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ビオチン（biotin）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ＨＮＳ、ジパルミトイル（dipalmitoyl）‐グリセロスクシニル（glycerosuccinyl）‐リジン（lysine）、α‐メトキシ（methoxy）‐ω‐（１，２‐ジオクタデセノイルオキシグリセリル（dioctadecenoyloxy glyceryl））（ＤＯ）、α‐メトキシ（methoxy）‐ω‐（１，２‐ジテトラデセノイルオキシグリセリル（ditetradecenoyloxy glyceryl））（ＤＴ）からなる群から選択されるのが好ましい。
【００３２】
上述の主成分および多くの実施形態での本発明のリポソーム膜を構成する唯一の成分は脂質である。しかし、本発明のある態様では、リポソーム膜は、脂質層中に挿入し／組み込むことができる成分をさらに含むことができる。そのような成分の例には、一個もしくは複数の膜貫通ドメイン、ＧＰＩ‐アンカー、リポペプチドや糖脂質などの他の両親媒性分子、あるいは一種もしくは複数の脂肪酸、脂質、または他の疎水性部分に接合しまたは融合された分子を含め、親水性部分を有するタンパク質がある。そのような分子は、例えば、リポソームに標的化能力を付与することができ、すなわち、そのような分子は標的部分であってよく、または酵素機能を有していてもよい。
【００３３】
先に述べたように、本発明のリポソームは、自由型薬物と比較した場合、循環中での薬物の存在を長びかせ、放出特性、すなわちリポソームから循環への薬物の放出に優れ、血液成分への結合性が低く、かつ、例えばリポソームの生成中に直面する高低のｐＨ条件に対して安定性が良好であると思われる優れた薬物用ビヒクルである。この点で、腫瘍の増殖阻害で判断したマウス腫瘍モデルにおいて、従来技術のリポソーム薬物製剤の循環中の安定性が、本発明のＡＶＥ９５‐ｄｏｘ製剤よりもはるかに効力が低いことは興味深く留意され、例えば、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（Ortho Biotech Products, L.P.の商標）は、５０％値、すなわち投与した当初薬物のわずか５０％が循環中で検出され得る時点、が６時間を超えるのに対して、本発明のＡＶＥ９５‐ｄｏｘ製剤の５０％値は約３０分にすぎない。本発明のリポソームは、優れた送達ビヒクルなので、好ましい態様では、本発明のリポソームは少なくとも一種の薬物および／または少なくとも一種の診断薬を含む。本発明の意味内での薬物は、投与によって治療効果を発揮するあらゆる化合物である。
【００３４】
薬物または診断薬は、リポソーム内部に含め、または親油性薬物の場合には脂質二重層内もしくは層間に含めることもまた、特に好ましい。リポソームに所与の薬物または診断薬を「搭載」するために、従来技術の様々な方法を利用することができる。その最も単純な形では、リポソーム形成中に薬物および／または診断薬を脂質成分と混合する。他の受動的な搭載方法には、脱水‐再含水法（Kirby & Gregoriadis (1984) Biotechnology 2:979）、逆相蒸発法（Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-）、または界面活性剤枯渇法（Milsmann et al. (1978) Biochim. Biophys. Acta 512:147-155）が含まれる。しかし、これらの技術は、搭載中しばしば、かなりの量の薬物の損失を招き、これは薬物が高価な場合には特に欠点である。
【００３５】
薬物および／または診断薬をカプセル化するための他の方法には、いわゆる「遠隔搭載」または「能動的搭載」が含まれ、その際、プリフォームしたリポソームの外部と内部間の勾配、例えば、ｐＨ勾配または塩勾配に基づいて、薬物および／または診断薬を勾配に従ってリポソーム中に輸送する（参照、例えば、Cheung et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1414:205-216；Cullis et al. (1991) Trends Biotechnol. 9:268-272；Mayer et al. (1986) Chem. Phys. Lipids 40:333-345）。
【００３６】
前記の受動的および能動的搭載技術ならびに当技術分野で周知の他の方法も全て、限定されることなく当業者は使用することができる。所与のどんな薬物または診断薬についても、最も効率的な搭載方法は、十分に確立された手順により常法の実験によって決定することができる。通常調整される変数は、ｐＨ、温度、塩の種類、塩濃度、緩衝液の種類などである。
【００３７】
好ましい実施形態では、薬物および／または診断薬は、遠隔搭載によってリポソーム中に搭載する。この方法により搭載しようとする物質の損失が非常に少なくなるからである。好ましい実施形態では、搭載にはｐＨ勾配を使用する。搭載しようとする物質に応じて、通常、リポソーム内部をその外部に対して酸性化する。内部をｐＨ１〜６にした後、薬物または診断薬を搭載するのが好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態では、薬物は、鎮痛薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、抗不整脈薬、抗生物質、血管新生阻害薬、抗感染薬、抗痴呆薬（向知性薬）、抗糖尿病薬、解毒薬、制吐薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、止血薬、抗高浸透圧薬、抗低浸透圧薬、抗凝血剤、抗真菌剤、鎮咳薬、抗ウイルス剤、β‐受容体およびカルシウムチャンネル拮抗薬、気管支溶解剤および喘息薬、ケモカイン、サイトカイン、分裂促進因子、細胞分裂停止薬物、細胞傷害性薬剤、およびそれらのプロドラッグ、皮膚薬、催眠薬および鎮静薬、免疫抑制剤、免疫賦活薬、ペプチドもしくはタンパク質薬物、特にホルモン、生理学的もしくは薬理学的分裂促進因子阻害薬、ケモカイン、サイトカイン、あるいはそのそれぞれのプロドラッグからなる群から選択される。もちろん本発明のリポソームは同時に一種を超える薬物を含むことも想定されている。
【００３９】
既に述べたように、その循環時間および放出特性のため、本発明のリポソームは細胞増殖を阻害する必要がある増殖性疾患の治療に特に適しており、従って、リポソームはいかなる細胞分裂停止薬物または細胞傷害性薬物を含んでもよいが、既知の細胞分裂停止薬物および細胞傷害性薬物からは、以下のものが特に好ましい：アルキル化物質、抗代謝産物、抗生物質、エポシロン、核内受容体作用薬および拮抗薬、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン薬、インターフェロン、細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）阻害薬、シクロオキシゲナーゼおよび／またはリポキシゲナーゼ阻害薬、生体脂肪酸；プロスタノイド、ロイコトリエンを含む脂肪酸誘導体；タンパク質キナーゼ阻害薬、タンパク質ホスファターゼ阻害薬、脂質キナーゼ阻害薬、白金配位錯体、エチレンイメン、メチルメラミン、トラジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキルスルホネート、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ‐アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシウムホリネート、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シス‐プラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシンダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロプアミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、エストラムシンホスフェート、エストロゲン、エチニールエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、マフェナイドスルフェートオールアミド、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロンアセテート、酢酸メゲストロール、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド 、ニフララジン、ニフルティモックス、ニムスチン、ニノルアゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロイッシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロリド、セムスチンストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルフアセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフィソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テルチポシド、テストラクトン、テストステロンプロピオネート、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクォン、トレオサルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ‐０１、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾルビシン、あるいはそのそれぞれの誘導体もしくは類似体。次に、癌を治療するために上記の薬物の数種を同時に投与し、従って、一種を超える細胞分裂停止薬物および／または細胞傷害性薬物を本発明のリポソーム中に含めることも想定されている。
【００４０】
別の態様では、本発明のリポソームは、抗血管原性薬物、例えば、フマギリン類似体、サリドマイド、２‐メソキシエストラジオール、タンパク質チロシンキナーゼ阻害薬などを含むことができる。そのような薬物は、内皮細胞の活性化および／または増殖が関与する疾病の治療に好ましい。しかし、内皮細胞の活性化および／または増殖が関与する疾病の治療には、細胞分裂停止薬物または細胞傷害性薬物、特に、好ましい細胞分裂停止薬物または細胞傷害性薬物として上に示した薬物を使用することも可能である。
【００４１】
用語「免疫抑制剤」は、免疫応答活性を低下させる物質および抗炎症作用を有する物質を含み、好ましい例はグルココルチコイド、特にベクロメタゾン、ベタメタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、フルドロキシコルチド、フルメタソン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルプレドニデンアセテート、ヒドロコルチゾン、パラメタソン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、プレグネノロン、トリアムシノロンもしくはトリアムシノロンアセトニド、シクロスポリン、特にシクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムス、ラパマイシン、ＦＫ５０６、シクロヘキシミド‐Ｎ‐（エタン酸エチル）、アザチオプリン、ガンシクロビル、抗リンパ球グロブリン、アスコマイシン，ミリオシン、ＭＡＰキナーゼの薬理学的阻害薬（特に、ＶＸ‐７４５などのｐ３８阻害薬）、カスパーゼ阻害薬、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬、および／またはメトトレキサートである。
【００４２】
用語「免疫賦活薬」は、免疫応答の媒介に直接的または間接的に関与する細胞の機能に作用し、その作用が免疫応答につながる物質全てを包含する。これらの細胞は、例えば、マクロファージ、ランゲルハンス細胞および他の樹状細胞、リンパ球、未定細胞だけでなく、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞など、それ自体免疫系に属さないが皮膚免疫疾患に関与する細胞を含むが、特にランゲルハンス細胞である。免疫応答強度は、例えば、生成された（インターフェロン‐γなどの）サイトカイン量、（ＭＨＣＩＩやＣＤ８６などの）樹状細胞の活性マーカーの検出、皮膚中の活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞数を通して決定することができる。本発明を目的とした免疫賦活薬は、特に、例えば、エキナセアパリダやエキナセアプルプレアから得られる植物免疫賦活薬；例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子などのサイトカイン；および後述物を模倣する細菌構成成分もしくは細菌分子である［細菌ＤＮＡ；ＣｐＧ配列を有する非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド；細菌細胞壁成分もしくは細胞外被成分、特に、モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルジペプチド（Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン）および／またはＰａｍＣｙｓ３などのリポ多糖やその由来分子、；破傷風トキソイド、ポリ‐Ｌ‐アルギニン、ＭＨＣＩＩペプチドなどの他の分子］。
【００４３】
用語「抗生物質」は、例えば、以下を包含する：ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド抗生物質、リンコサミド、ジャイレース阻害薬、スルホンアミド、トリメトプリム、ポリペプチド抗生物質、ニトロイミダゾール誘導体、アンフェニコール、特にアクチノマイシン、アラメチシン、アレキシジン、６‐アミノペニシラン酸、アモキシシリン、アンフォテリシン、アンピシリン、アニソマイシン、アンチアモエビン、アンチマイシン、アフィジコリン、アジダンフェニコール、アジドシリン、バシトラシン、ベクロメタゾン、ベンザチン、ベンジルペニシリン、ブレオマイシン、ブレオマイシン硫酸塩、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、カプレオマイシン、カルベニシリン、セフアセトリル、セファクロル、セファマンドールナフェート、セファゾリン、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファゾリン、セホペラゾン、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、セファログリシン、セファロチン、セファピリン、セルレニン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、クロラムフェニコールジアセテート、シクラシリン、クリンダマイシン、クロルマジノンアセテート、クロルフェニラミン、クロモマイシンＡ３、シンナリジン、シプロフロキサシン、クロトリマゾール、クロキサシリン、コリスチンメタンスルホネート、シクロセリン、デアセチルアニソマイシン、デメクロサイクリン、４，４’‐ジアミノジフェニルスルホン、ジアベリジン、ジクロキサシリン、ジヒドロストレプトマイシン、ジピリダモール、ドキソルビシン、ドキシサイクリン、エピシリン、エリスロマイシン、エリスロマイシンストラート、エチルコハク酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、エタンブトール、フルクロキサシリン、フルオシノロンアセトニド、５‐フルオロシトシン、フィリピン、ホルマイシン、フマルアミドマイシン、フラルタドン、フシジン酸、ジェネティシン、ゲンタマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、グリオトキシン、グラミシジン、グリセオフルビン、ヘルボル酸、ヘモリシン、ヘタシリン、カスガマイシン、カナマイシン（Ａ）、ラサロシド、リンコマイシン、マグネシジン、メルファラン、メタサイクリン、メチシリン、メビノリン、ミカマイシン、ミトラマイシン、ミトラマイシンＡ、ミスラマイシン複合体、マイトマイシン、ミノサイクリン、ミコフェノール酸、ミキソチアゾール、ナタマイシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネオマイシン硫酸塩、５‐ニトロ‐２‐フルアルデヒドセミカルバゾン、ノボビオシン、ニスタチン、オレアンドマイシン、オレアンドマイシンリン酸塩、オキサシヒン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペシロシン、フェネチシリン、フェノキシメチルペニシリン、フェニルアミノサリチラート、フレオマイシン、ピバンピシリン、ポリミキシンＢ、プロピシリン、ピューロマイシン、ピューロマイシンアミノヌクレオシド、ピューロマイシンアミノヌクレオシド５’‐モノホスフェート、ピリジノールカルバメート、ロリテトラサイクリン、リファンピシン、リファマイシンＢ、リファマイシンＳＶ、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、ストレプトマイシン硫酸塩、スルファベンズアミド、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、テトラサイクリン、チアンフェニコール、トブラマイシン、トロレアンドマイシン、ツニカルニシン、ツニカマイシンＡ１同族体、ツニカマイシンＡ２同族体、バリノマイシン、バンコマイシン、ビノマイシンＡ１、バージニアマイシンＭ１、バイオマイシン、および／またはキシロスタシン。
【００４４】
用語「抗感染薬」は、例えば、抗真菌剤、駆虫効果のある薬剤、ウイルス増殖阻止剤を包含し、特にアンフォテリシン、ビホナゾール、ブクロサミド、キノリン硫酸塩、クロルミダゾール、クロルフェネシン、クロルキナルドール、クロダントイン、クロキシキン、シクロピロックスオラミン、塩化デカリニウム、ジマゾール、フェンチクロル、フルシトシン、グリセオフルビン、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナタマイシン、スルベンチン、チオコナゾール、トイナフテート、抗レトロウイルス剤、および／またはヘルペス治療剤を包含する。
【００４５】
用語「抗アレルギー薬」は、例えば、グロブリン、コルチコイド、もしくは抗ヒスタミンのクラスに由来する物質を包含し、特にベクロメタゾンおよびその誘導体、ベタメタゾンコルチゾンおよびその誘導体、デキサメタゾンおよびその誘導体、バミピンアセテート、ブクリジン、クレマスチン、クレミゾール、クロモグリク酸、シプロヘプタジン、吉草酸ジフルコルトロン、ジメトチアジン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、エフェドリン、フルオシノロン、ヒスタピロジン、イソチペンジル、メトジラジン、オキソメマジン、パラメタソン、プレドニリデン、テオフィリン、および／またはトルプロパミントリトカリンを包含する。
【００４６】
用語「分裂促進因子」、「ケモカイン」、「サイトカイン」は、例えば、インターフェロン‐α、インターフェロン‐β、インターフェロン‐γ、インターロイキン‐１、インターロイキン‐２、インターロイキン‐７、インターロイキン‐１０、インターロイキン‐１２、インターロイキン‐１８、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＭＩＰ‐１‐α／β、ランテス、ＥＧＦ、塩基性または酸性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ‐βおよび／またはＴＮＦ‐αを包含する。
【００４７】
用語「皮膚薬」は、例えば、皮膚疾患を治療するためのシェールオイルスルホネート、タールおよびタール誘導体、収斂薬、制汗薬、ざ瘡治療剤、乾癬薬、脂漏治療剤および／または酵素調製物を包含する。
【００４８】
本発明のリポソームは、有利な放出パターンを示すので、特定の組織に診断薬を送達するためにこれらを使用することもできる。これは、標的部分に関連して特に好ましく、この標的部分はある組織または疾患部位に本発明のリポソームを優先的に局在化させる。好ましい実施形態では、診断薬は、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子、放射性分子、非放射性同位元素、および蛍光分子からなる群から選択される。
【００４９】
用語「マーカー」は、化学部分をさし、この化学部分は、蛍光測定、核磁気共鳴、コンピュータ断層撮影、またはシンチグラムを含む分析法によって直接的にまたは間接的に検出することができ、それだけには限らないが、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子；例えば、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５１Ｇｒ、５４Ｆｅ、６０Ｃｏ，６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１２ｍＡｇ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、１４８Ａｕ、３５Ｓ、３３Ｐ、３２Ｐ、１１Ｃなどの放射性分子；例えば、２Ｈや１３Ｃを含む非放射性同位元素；蛍光分子または蛍光や光などを発する分子、例えば、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、様々な蛍光色素を含み、それらの全ては、当業者によく知られている。
【００５０】
リポソームは、好ましくは、膜中に、あるいはリポソーム中に含まれた安定剤、保護剤、金属イオンキレート剤、緩衝液、および／または添加剤の内部に、様々な追加物質を含むことができる。
【００５１】
本発明のリポソームは安定構造であり、周囲の薬物または緩衝液を除去するために、生成後に、例えばろ過することができる。薬物および／または診断薬を含有した、あるいは含有しない、純粋なリポソームを使用できるが、その安定性のため、容易な貯蔵を促進するためにリポソームから全ての液体を除去することもできる。従って、本発明のリポソームは、乾燥形で、好ましくは凍結乾燥形で供給することができる。次いで、これらのリポソームは、使用時に水または緩衝液を添加後、容易に再含水させることができる。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明のリポソームを生成する方法であり、その場合、ＳＭ、ＣＨ、および残りの脂質または他の成分を混合する。残りの脂質は、ＰＥおよび／またはＰＣから選択することが好ましい。最初に薬物または診断薬を脂質に混合しない場合は、第２のステップで薬物および／または診断薬をリポソーム中に搭載する。「遠隔搭載」が、物質、好ましくは薬物および／または診断薬をリポソームに導入する好ましい方式であるので、好ましい実施形態では、本発明の方法は、好ましくはｐＨ勾配を使用する遠隔搭載ステップを含んでよい。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明のリポソームまたは本発明の方法に従って生成されたリポソームを含み、さらに、安定剤、保護剤、金属イオンキレート剤、緩衝液、および／または添加剤を含む医薬組成物である。
【００５４】
別の態様は、本発明のリポソームまたは本発明の方法に従って生成されたリポソームを含み、さらに安定剤、保護剤、金属イオンキレート剤、緩衝液、および／または添加剤を含む診断組成物である。
【００５５】
本発明のリポソーム、本発明の医薬組成物、または本発明の診断組成物は、安定剤を含むことが好ましく、この安定剤はα‐トコフェロール、ビタミンＥ、あるいは炭水化物、特にグルコース、ソルビトール、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトトリオース、またはデキストランからなる群から選択される。
【００５６】
本明細書に開示したリポソームおよびリポソーム組成物は、増殖性疾患、免疫疾患、特に自己免疫疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、特に骨関節炎もしくはリューマチ性関節炎、炎症性疾患、あるいはそれだけには限らないが、物理的損傷脳梗塞または出血を含む、脈管構造への障害もしくはその透過性の上昇に関連付けられるあらゆる疾患もしくは状態を治療する薬物を生成するための、本発明の特定の優れた送達ビヒクルあるいは医薬組成物である。本発明のリポソーム中に含まれる薬物および／または診断薬は、自由型薬物または診断薬を通常投与する量と同じくらいの量でまたは同一量で患者に投与することができる。適当な用量および投与スキームは、例えば、Berger et al. "Das RoteBuch" (1997) Publisher Ecomed Landsberg Lechを含む様々な情報源から知られている。例えば、ドキソルビシンは、典型的には、３〜４週間毎に１日当たり４５〜７５ｍｇ／ｍ２で、または毎週１０〜２０ｍｇ／ｍ２の範囲で投与する。しかし、観察される毒性の程度に基づいて、リポソーム中に含まれているそれぞれの薬物の用量または投与頻度を増大し、または低減することも主治医の能力内にある。
【００５７】
リポソームまたは医薬組成物は、筋肉内、静脈内、鼻腔内、腹腔内、皮内、または皮下を含む様々な方式によって投与することができる。化合物を疾患部位に直接注射することもできる。
【００５８】
本発明者らが実施したさらなる実験では、リポソームおよび医薬組成物は腫瘍の治療に優れた効力を有することが示され、従って好ましい実施形態では、増殖性疾患は胃腸路癌もしくは結腸直腸路癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、口腔粘膜異形成、浸潤性口腔癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、ホルモン依存性乳癌、非依存性乳癌、移行細胞癌および扁平上皮細胞癌、神経芽細胞腫を含む神経系悪性腫瘍、グリア細胞腫、星細胞腫、骨肉腫、柔組織肉腫、血管腫、内分泌腫瘍、白血病を含む血液異常増殖、リンパ腫、他の骨髄増殖性疾患およびリンパ球増殖性疾患、上皮内癌、過形成病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患、ならびにウイルス誘発増殖性疾患からなる群から選択される。
【００５９】
同様に、本発明の別の態様は、増殖性疾患、免疫疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、および炎症性疾患の群から選択される疾患を診断するための本発明の診断組成物の使用にも関与する。
【００６０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実施にあたって首尾よく機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従ってその実施に好ましい方式とみなし得ることを当業者には理解されたい。しかし、本開示に照らして、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の趣旨と範囲を逸脱せずに、開示した具体的実施形態では多くの変形を行うことができることを当業者は理解すべきものとする。引用した参照文献は全て、参照により本明細書に組み込む。
図面の説明
図１：ＡＶＥ９の低温電子顕微鏡写真。
図２：様々なＡＶＥ製剤とヒト血漿の相互作用。画分４＝リポソーム画分、画分１１＝主タンパク質画分。
図３：ローダミン標識リポソームを使用しフローサイトメトリーによって分析した、ＡＶＥ９およびＡＶＥ３の、様々な腫瘍細胞系への結合。
図４：Ｄｏｘｉｌと比較して、自由型ドキソルビシン、およびＡＶＥ９もしくはＡＶＥ９５中にカプセル化したドキソルビシンの薬物動態学。
図５：未カプセル化ドキソルビシンと比較した、ＡＶＥ９またはＡＶＥ９５中にカプセル化したドキソルビシンの抗腫瘍効果。Ｃ２６担腫瘍マウスに４ｍｇ／ｋｇ体重のドキソルビシンを３度（１、３、および６日目）注入した。
図６：ＡＶＥ９５‐ｄｏｘとＰＥＧ化リポソーム（Ｄｏｘｉｌ）の抗腫瘍効果の比較。Ｃ２６担腫瘍マウスに４ｍｇ／ｋｇ体重のドキソルビシンを３度（１、３、および６日目）注入した。
図７：ＡＶＥ９５‐ｄｏｘ、ならびにドキソルビシンを封入して含み、３０ｍｏｌ％のＳＭ、５０ｍｏｌ％のコレステロール、および２０ｍｏｌ％のＰＣ（３０／５０‐ｄｏｘ）から構成されたリポソームの抗腫瘍効果。Ｃ２６担腫瘍マウスに４ｍｇ／ｋｇ体重のドキソルビシンを３度（１、３、および６日目）注入した。
図８：自由型ミトキサントロン、およびＡＶＥ９５中にカプセル化したミトキサントロンの薬物動態学。
図９：用量４ｍｇ／ｋｇ体重のミトキサントロンを１、３、６日目に注射使用した、Ｃ２６大腸癌腫におけるＡＶＥ９５‐ミトキサントロンの抗腫瘍効果。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＡＶＥ９は長時間循環式リポソームである
本発明者らは、胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（Harlan、「ヌードマウス」）で様々なリポソーム製剤を薬物動態学的挙動について分析した：ＡＶＥ３（３３．３ｍｏｌ％のコレステロール、ＤＬＰＥ、ＤＯＰＳ）高負帯電リポソーム、ＡＶＥ５（３３．３ｍｏｌ％のコレステロール、ＤＬＰＥ、ＤＯＰＧ）高負帯電リポソーム、ＡＶＥ７（３５ｍｏｌ％のコレステロール、１５．４ｍｏｌ％の卵ＰＣ、１４．７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１６．７ｍｏｌ％のＤＯＰＳ、１８．２ｍｏｌ％の乳ＳＭ）、ＡＶＥ９（３５ｍｏｌ％のコレステロール、３２，１ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４，７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１８．２ｍｏｌ％の乳ＳＭ）、ＡＶＥ１１（３５ｍｏｌ％のコレステロール、２８，８ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４，７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、３，４ｍｏｌ％のＤＯＰＳ、１８．２ｍｏｌ％の乳ＳＭ）、ＡＶＥ１４（３３．３ｍｏｌ％のコレステロール、３３．３ｍｏｌ％の卵ＰＣ、３３．３ｍｏｌ％のＤＬＰＥ）。
【００６２】
脂質は全て、Avanti Polar Lipids（ＵＳＡ）から購入し、さらに精製することなく使用した。リポソームは、乾燥脂質フィルムから含水によって調製した。この目的のために、脂質をクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解し、示した割合で混合した。薬物動態を研究するために、トリチウム標識コレステリルオレオイルエーテル（１０μＣｉ／μｍｏｌ脂質）を加えた。ロータリーエバポレーターを使用して脂質を乾燥させ、残留溶媒を高真空除去した。次いで、脂質フィルムに１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．４を含水させて最終脂質濃度１０μｍｏｌ／ｍｌにした。５０ｎｍ膜に通してリポソームを２１回押し出した。調製したリポソームは全て、平均径が８０〜１１０ｎｍであった。平均ゼータ電位は、ＡＶＥ３が−６７ｍＶ、ＡＶＥ５が−４３ｍＶ、ＡＶＥ７が−４９ｍＶ、ＡＶＥ９が−８ｍＶ、およびＡＶＥ１４が−１２ｍＶであった。
【００６３】
リポソーム（ＰＢＳ中１μｍｏｌの脂質）をヌードマウスの尾静脈に静注した。様々な時点で血液試料を採取し、シンチレーションカウンティングによって放射能を分析した。腫瘍および臓器蓄積を分析するために、確立された皮下マウスＣ２６大腸癌を有するヌードマウスにリポソームを注射した。この研究によって、ＡＶＥ３、ＡＶＥ５、およびＡＶＥ７が循環から急速に排出されることが示された（５０％値、＜５分）。ＡＶＥ９（５０％値、約７０〜８０分）、ＡＶＥ１１（５０％値、約１０分）、およびＡＶＥ１４（５０％値、約３０分）では長い循環時間が観察された。すなわち、ＡＶＥ９脂質組成物に基づくリポソームは、血流中の循環が非常に長かった。これは、注射後６時間目に測定された臓器分布によっても反映された。ＡＶＥ３、ＡＶＥ５、およびＡＶＥ７では、高い肝臓での取込み（４０〜６０％）および低い腫瘍での蓄積（＜０．５％初期用量）が示されたが、特にＡＶＥ９では低い肝臓での取込み（約１０〜２０％）および高い腫瘍での蓄積（２〜４％）が示された。これらの結果は、コレステロール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルエタノールアミンから構成されるＡＶＥ９リポソームが、好都合な生体内反応速度（in vivo kinetics）を有することを示している。
【００６４】
実施例２：空のＡＶＥ９リポソームの低温電子顕微鏡検査
５μＬのリポソーム調製物を使用し、５００メッシュの銅グリッドをコートした。上清除去後、−１７０℃のエタン中で試料を凍結させた。液体窒素で冷却したグリッドホルダーにグリッドを移し、電子顕微鏡で検査した。
【００６５】
ＡＶＥ９リポソームは、径が５０〜２００ｎｍで、わずかに卵円であり主として単層構造をしていた（図１）。
【００６６】
実施例３：空のＡＶＥ９リポソームの安定性
実施例１に記載したようにＡＶＥ９リポソームの調製後、リポソームを４〜８℃で貯蔵し、１２０日間、毎週、光子相関分光法（ＰＣＳ）によって粒径を分析した。この期間にわたって粒径の増大は観察されず、ＡＶＥ９リポソームが貯蔵条件下で安定していることが示された。
【００６７】
実施例４：ＡＶＥ９リポソームは、血漿タンパク質に結合せず、結合してもほんのわずかである。
ＡＶＥ９リポソームの血漿タンパク質への相互作用は、リポソームをヒト血漿と共に３７℃で１時間インキュベートすることによって分析した。続いて、セファロース４Ｂカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって、リポソームを血漿タンパク質から分離した。トリチウム標識リポソームを使用する初期実験では、リポソームは画分４、５に溶出され、タンパク質は主ピークを画分９〜１２に溶出しながら画分６〜２０に溶出されることが実証された。これらの実験に、本発明者らは比較用にＡＶＥ３、ＡＶＥ５、ＡＶＥ１４（実施例１を参照）を含めた。サイズ排除クロマトグラフィーによって、血漿と共にインキュベートしたリポソームを分離した後、画分４（リポソーム画分）または画分１１（主タンパク質画分）に存在するタンパク質をトリクロル酢酸で沈殿させ、還元条件下で等量をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分離し、続いて銀染色によってタンパク質を可視化した。高負電荷ＡＶＥ３およびＡＶＥ５リポソームで多数の血漿タンパク質の結合が観察された。それに反して、ＡＶＥ９だけでなくＡＶ１４でも血漿タンパク質の結合は見られず、または週結合が見られただけであった（図２）。元の試料中の血漿タンパク質の存在は、画分１１に等量のタンパク質（主としてアルブミン）が存在することによって確認された。これらの結果は、ＡＶＥ９が、試験管内（in vitro）生理学的条件下では血漿タンパク質と相互に作用しない、または毎週しか作用しないことを実証している。
【００６８】
実施例５：ＡＶＥ９リポソームは、補体因子と相互に作用しない
ＡＶＥ９リポソームと補体因子の相互作用は、溶血性補体アッセイ（プレートに感作ヒツジ赤血球をアガロースで固定）を使用し分析した。ＡＶＥ３をこれらの実験に加えた。リポソームが強力な血漿タンパク質結合を示したからである。この目的のために、濃度が０，５〜１６ｎｍｏｌの脂質のリポソームをヒト血清と共にインキュベートした。濃度２〜１６ｎｍｏｌのＡＶＥ３は、補体媒介性溶解が阻害されたことによって示されるように、強力な補体因子結合を示した。それに反して、施用した脂質濃度ではＡＶＥ９は補体因子に結合せず、さらにＡＶＥ９は血漿タンパク質と相互に作用せず、または弱い作用しか示さないことが証明された。
【００６９】
実施例６：ＡＶＥ９リポソームの細胞結合特性
ＡＶＥ９リポソームと様々な腫瘍細胞系（ヒト黒色腫細胞系ＭｅＷｏ、Ｂ２５４、およびＭＳＭ、ヒト肺癌細胞系Ａ５４９、ラット膠芽腫細胞系Ｃ６）との結合特性は、脂質二重層中に０，３ｍｏｌ％のＲｈ‐ＤＰＰＥを含むローダミン標識リポソームによって分析した。リポソームを実施例１に記載した通りに調製した。ＡＶＥ９リポソームの結合と、高負電荷リポソームの結合を比較するために、ＡＶＥ３リポソームを含めた。腫瘍細胞をリポソーム（１００ｎｍｏｌの脂質）と共に４℃で３０分間インキュベートし、続いてフローサイトメトリーによって細胞結合活性を分析した。試験した全ての細胞系は、ＡＶＥ９とほんのわずかに結合（リポソームを用いないでインキュベートした細胞と比較して約２〜３倍の蛍光が増加）しただけであったが、ＡＶＥ３リポソームはほとんどの細胞系に強力に結合（＞１０倍の蛍光の増加）した（図３）。
【００７０】
実施例７：ＡＶＥ９リポソームの薬物動態へのコレステロールの影響
様々な濃度のコレステロールが薬物動態に及ぼす作用を１０〜５０ｍｏｌ％のコレステロールを含むリポソームについて分析した。この目的のために、ＡＶＥ９製剤に基づくが種々の濃度のコレステロールを含む以下のリポソームを調製した：ＡＶＥ９（３５ｍｏｌ％のコレステロール、３２，１ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４．７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１８．２ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ）、ＡＶＥ９１（１０ｍｏｌ％のコレステロール、４４，４ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、２０，４ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、２５，２ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ）、ＡＶＥ９２（２０ｍｏｌ％のコレステロール、３９，５ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１８，１ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、２２，２ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ）、ＡＶＥ９３（３０ｍｏｌ％のコレステロール、３４，６ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１５，８ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１９，６ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ）、ＡＶＥ９４（４０ｍｏｌ％のコレステロール、２９，６ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１３，６ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１６，８ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ）、およびＡＶＥ９５（５０ｍｏｌ％のコレステロール、２４，７ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１１，３ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１４，０ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ）。薬物動態を研究するために、トリチウム標識コレステリルオレオイルエーテル（１０μＣｉ／μｍｏｌ、脂質）を脂質二重層中に組み込んだ。実施例１に記載したように、リポソームは、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．４を含水させることによって乾燥脂質フィルムから調製した。リポソームは全て、−８〜−３ｍＶの範囲というほぼ同じゼータ電位であった。粒径は、ＡＶＥ９１が７０ｎｍ、ＡＶＥ９５が１０５ｎｍの範囲にあり、コレステロール濃度を上げると粒径もわずかに増大することが示唆された。
【００７１】
リポソーム（ＰＢＳ中１μｍｏｌの脂質）をヌードマウスの尾静脈に静注した。様々な時点で血液試料を採取し、シンチレーションによって放射能を分析した。薬物動態学的挙動の分析によって、循環時間が長い（５０％値、７０〜１００分）２０〜５０％のコレステロールを含む製剤よりも、１０ｍｏｌ％のコレステロールを含むリポソームが循環からの排出が極めて急速（５０％値、約２５分）であることが実証された。試験した全ての製剤の臓器分布について、有意差は見られなかった。
【００７２】
実施例８：ＡＶＥ９リポソームの薬物動態へのスピンゴミエリンおよびホスファチジルエタノールアミンの影響
ＡＶＥ９（実施例１を参照）と比較して、異なる濃度のスフィンゴミエリンを含むＡＶＥ９製剤またはホスファチジルエタノールアミンを含まないＡＶＥ９製剤の薬物動態学を分析した。以下の製剤を試験した：ＡＶＥ９‐０ＳＭ（３５ｍｏｌ％のコレステロール、５０，３ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４，７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ）、ＡＶＥ９‐５ＳＭ（３５ｍｏｌ％のコレステロール、４５，３ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４，７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、５ｍｏｌ％の乳ＳＭ）、ＡＶＥ９‐３０ＳＭ（３５ｍｏｌ％のコレステロール、２０，３ｍｏｌ％、ＰＯＰＣ、１４，７ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、３０ｍｏｌ％の乳ＳＭ）、ＡＶＥ９‐０ＰＥ（３５ｍｏｌ％のコレステロール、４６，８ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１８．２ｍｏｌ％の乳ＳＭ）。実施例１に記載したように、リポソームを調製し、薬物動態特性について分析した。
【００７３】
薬物動態学的挙動の分析によって、ＡＶＥ９、および５ｍｏｌ％のＳＭを含むＡＶＥ９（５０％値＝７０〜８０分）と比較して、３０ｍｏｌ％のＳＭを含むリポソームは、血清滞留時間（５０％値＝１９分）が減少することが実証された。ＳＭ（ＡＶＥ９‐０ＳＭ）を含まないリポソームも血清滞留時間が減少した（５０％値＝３２分）。ＰＥを含まないＡＶＥ９も血清滞留時間が減少した（５０％値＝６０分）。従って、これらの実験から薬物動態は、最適ＳＭ濃度が５〜２０ｍｏｌ％であるＳＭ濃度の影響を強く受けることが示唆された。
【００７４】
実施例９：ＡＶＥ９リポソームの薬物動態へのＰＥＧ化の影響
ＡＶＥ９および実施例３に記載した他の製剤と比較して、ＡＶＥ９の薬物動態に働くＰＥＧ化の影響をＡＶＥ９‐５％ＰＥＧ５０００（３３，２ｍｏｌ％のコレステロール、３０，５ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、１７，３ｍｏｌ％のウシ乳ＳＭ、５ｍｏｌ％のＤＰＰＥ‐ＰＥＧ５０００）およびＡＶＥ９‐０ＳＭ／５％ＰＥＧ５０００（３３，２ｍｏｌ％のコレステロール、４７，８ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、１４ｍｏｌ％のＤＬＰＥ、５ｍｏｌ％のＤＰＰＥ‐ＰＥＧ５０００）について分析した。実施例１に記載したように、リポソームを調製し、薬物動態特性について分析した。
【００７５】
薬物動態学的挙動の分析から、ＡＶＥ９リポソームのＰＥＧ化によって、循環時間はさらに延長（ＡＶＥ９の７５分と比較してＰＥＧ化したＡＶＥ９の５０％値は３２０分）することが実証された。スフィンゴミエリンを含まないＰＥＧ化ＡＶＥ９リポソーム（ＡＶＥ９‐０ＳＭ／５％ＰＥＧ５０００）の循環時間は減少（５０％値４３分）した。これらの知見から、スフィンゴミエリンは薬物動態に強く作用し、薬物動態特性に関してスフィンゴミエリンをＰＥＧ化に代わる物として考慮できることが示唆された。
【００７６】
実施例１０：ＡＶＥ９およびＡＶＥ９５中へのドキソルビシンのカプセル化
ドキソルビシンをＡＶＥ９またはＡＶＥ９５リポソーム中にカプセル化した（実施例１および７を参照）。この目的のために、脂質フィルムに３００ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．０を含水させた。押出し後、外部水溶液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。リポソームを６０℃に加熱し、ドキソルビシンを含むＰＢＳを加え、１５分間インキュベートした。これらの実験では、薬物：脂質＝１：５（ｗ／ｗ）の割合を常法に従って使用した。未カプセル化ドキソルビシンは、ビバスピンカラムを使用し限外濾過によって除去した。カプセル化効率は、逆相ＨＰＬＣ分析によって定量した。この手法によって、約７０〜９０％のドキソルビシンを常法に従ってカプセル化することができるであろう。ＡＶＥ９およびＡＶＥ９５（脂質組成物について実施例１および７を参照）については、脂質に対する薬物の示した割合ではカプセル化効率に差は観察されず、コレステロールの濃度はカプセル化効率に影響しないことが示された。ドキソルビシンを含むＡＶＥ９またはＡＶＥ９５の粒径は、空のリポソームと比較して約１０ｎｍ増大した。しかし、ＰＣＳによって測定すると平均径は１２０ｎｍ未満であった。低温電子顕微鏡によって、径が７０〜１５０ｎｍであり円構造または卵円構造の主として単層粒子が確認された。６ヵ月の期間に及ぶ４〜８℃での貯蔵で、ＡＶＥ９‐ｄｏｘおよびＡＶＥ９５‐ｄｏｘの粒径は、わずか１０ｎｍ増大した。これらの貯蔵条件下、７週間に及ぶ期間に、本発明者らはカプセル化薬物のほんの少しの放出（＜５％）を確認しただけであった。
【００７７】
実施例１１：ＡＶＥ９‐ドキソルビシンリポソームの薬物動態
ＡＶＥ９‐ｄｏｘおよびＡＶＥ９５‐ｄｏｘをヌードマウスの尾静脈に静注し、ドキソルビシンの血中濃度を様々な時点でＨＰＬＣによって測定した。この実験では、本発明者らは、未カプセル化ドキソルビシン、およびＰＥＧ化「ステルスリポソーム」中にカプセル化したドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））を含めた。ＡＶＥ９‐ｄｏｘと比較して、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘは、ドキソルビシンの血清滞留時間が長かった（ＡＶＥ９‐ｄｏｘでは５０％値が１１分であるのに対し、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘでは２３分）。未カプセル化ｄｏｘは、循環から急速に排出された（５０％値＝＜３分）。それに反して、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の注射後、５０％を超える初期ドキソルビシンが６時間後血中に存在した（図４）。自由型ドキソルビシンと比較して、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘは、肺、心臓、腎臓で薬物の蓄積が減少した。自由型ドキソルビシンと比較してＡＶＥ９５‐ｄｏｘを施用後、肝臓および脾臓のドキソルビシン濃度は３倍に増加した。さらに、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘおよび自由型ドキソルビシンをＣ２６担腫瘍マウス中に注射すると、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘでは腫瘍組織中のドキソルビシンの蓄積が増加した（６時間後に約２〜３倍）。これらのデータは、様々な臓器および腫瘍の低温断面の蛍光顕微鏡によって確認できるであろう。
【００７８】
実施例１２：ＡＶＥ９およびＡＶＥ９５‐ドキソルビシンリポソームの薬動力学
さらに研究するために、Ｃ２６マウス大腸癌モデルで薬力学的実験を実施した。この目的のために、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍の大きさが約５０〜１００ｍｍ３に達した後、１、３、６日目に４ｍｇ／ｋｇ体重の用量のドキソルビシンを注射し、担腫瘍マウスをドキソルビシン搭載リポソームで処理した。
【００７９】
第１の実験では、ＡＶＥ９‐ｄｏｘおよびＡＶＥ９５‐ｄｏｘ（実施例１０を参照）を未カプセル化ドキソルビシンと比較した。この実験では、ＡＶＥ９‐ｄｏｘまたは自由型ドキソルビシンにより処理した動物と比較して、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘで処理した動物において腫瘍増殖の減少および生存期間の延長が本発明者らによって認められた。未処理対照動物と比較して、全ての動物で腫瘍増殖が減少した（図５）。１２日目に自由型ドキソルビシンおよびＡＶＥ９５‐ｄｏｘの差は統計上有意（ｐ＝０．０５）になった。これは、平均生存時間によっても反映され、その時間はＡＶＥ９５‐ｄｏｘ処理動物で２０日、ＡＶＥ９‐ｄｏｘ処理動物で１６日、ドキソルビシン処理動物で１４日、および未処理動物で１２日であった。
【００８０】
第２の実験では、Ｃ２６担腫瘍マウスに４または８ｍｇ／ｋｇ体重で投与した場合について、自由型ドキソルビシンとＡＶＥ９５‐ｄｏｘとを比較した。この２種類の濃度では、自由型ドキソルビシンでは腫瘍増殖の差は観察されなかった。それに反して、４ｍｇ／ｍｌのＡＶＥ９５‐ｄｏｘと比較して、８ｍｇ／ｋｇのＡＶＥ９５‐ｄｏｘを使用すると腫瘍増殖はさらに減少した。
【００８１】
しかし、８ｍｇ／ｍｌでは、自由型ドキソルビシンおよびカプセル化したドキソルビシンの両方で死亡率の上昇が観察された。
【００８２】
第３の実験では、Ｃ２６腫瘍を治療するために、４ｍｇ／ｋｇの用量を施用し、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘとＤｏｘｉｌ（登録商標）を比較した。Ｄｏｘｉｌと比較して、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘの投与によって腫瘍増殖が統計学的に減少し（ｐ＜０．０５）、生存期間が延長された（図６）。
【００８３】
最終組の実験では、ＡＶＥ９５‐ｄｏｘリポソームを様々な濃度のスフィンゴミエリンを含むＡＶＥ９５ベース製剤と比較した。第一に、スフィンゴミエリンをホスファチジルコリンに代えた同じ製剤（ＡＶＥ９５‐０ＳＭ‐ｄｏｘ）とＡＶＥ９５‐ｄｏｘを比較した。スフィンゴミエリンを除去したことにより、自由型ドキソルビシンで見られた効力まで、効力は大幅に減少した。第二に、５０ｍｏｌ％のコレステロール、３０ｍｏｌ％のスフィンゴミエリン、および２０ｍｏｌ％のホスファチジルコリンからなるリポソームとＡＶＥ９５‐ｄｏｘを比較した。すなわち、この製剤は、同じコレステロール濃度ではあるが、スフィンゴミエリンの量がＡＶＥ９５リポソームの量の約２倍含まれていた。わずか１４ｍｏｌ％のスフィンゴミエリンを含むＡＶＥ９５と比較して、３０ｍｏｌ％のスフィンゴミエリンを含むリポソームで、抗腫瘍活性の減少が観察され、ＡＶＥ９５が高ＳＭ濃度のリポソームよりも優れていることが証明された（図７）。
【００８４】
実施例１３：ミトキサントロンをＡＶＥ９リポソームにカプセル化
遠隔搭載（Mayer et al. (1986) Chem. Phys. Lipids 40:333-345）によって、ミトキサントロン（ＭＸＲ）をＡＶＥ９またはＡＶＥ９５リポソーム中にカプセル化した（実施例１および７を参照）。この目的のために、脂質フィルムに３００ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．０を再含水させた。押出し後、外部水溶液のｐＨを２ＮのＮａＯＨによってｐＨ７．４に調整した。リポソームを５５℃に加熱し、ミトキサントロンを含むＰＢＳを加え、１５分間インキュベートした。これらの実験では、薬物：脂質＝１：１０（ｗ／ｗ）の割合を常法に従って使用した。未カプセル化ミトキサントロンは、ビバスピンカラムを使用し限外濾過によって除去した。カプセル化効率は、逆相ＨＰＬＣ分析によって測定した。この手法によって、約７５〜８５％のミトキサントロンを常法に従ってカプセル化することができるであろう。ＡＶＥ９およびＡＶＥ９５については、カプセル化効率の差は観察されなかった。ＡＶＥ９５‐ＭＸＲは、８℃での貯蔵に安定しており、４週間にわたってほんのわずかの薬物が漏出しただけであった。
【００８５】
実施例１４：薬物動態  ＡＶＥ９５‐カプセル化ミトキサントロン
ＡＶＥ９５‐ＭＸＲリポソームをヌードマウスの尾静脈に静注し、ミトキサントロンの血中濃度を様々な時点でＨＰＬＣによって測定した。この実験では、本発明者らは、未カプセル化ミトキサントロンを含めた。循環から急速に排出された未カプセル化ミトキサントロン（５０％値＝＜３分）と比較して、ＡＶＥ９５‐ＭＸＲは、ミトキサントロンの血清滞留時間を延長した（５０％値＝１１０分）（図８）。自由型ミトキサントロンと比較して、注射から６時間後、ＡＶＥ９５‐ＭＸＲによって肺、心臓、腎臓で薬物の蓄積が減少した。肝臓および脾臓のミトキサントロン濃度は、自由型ミトキサントロンと類似した。
【００８６】
実施例１５：薬理  ＡＶＥ９５‐カプセル化ミトキサントロン
ＡＶＥ９５‐ＭＲＸの効力をＣ２６マウス大腸癌モデルで分析した。この目的のために、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍の大きさが約５０〜１００ｍｍ３に達した後、０、２、５日目にミトキサントロン用量１．５ｍｇ／ｍｌまたは４ｍｇ／ｋｇ体重を注射し、ミトキサントロン搭載リポソームで担腫瘍マウスを処理した。未カプセル化ミトキサントロンをこれらの実験に加えた。用量４ｍｇ／ｋｇのミトキサントロンによって、自由型ミトキサントロンおよびカプセル化ミトキサントロンでは強力な腫瘍増殖阻害が観察された。しかし、自由型ミトキサントロンと比較して、ＡＶＥ９５‐カプセル化ミトキサントロンはこの用量で腫瘍増殖がさらに減少した（図９）。自由型ミトキサントロンと比較したこの効力の改善は、１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のミトキサントロンでも観察された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＡＶＥ９の低温電子顕微鏡写真を示す図である。
【図２】様々なＡＶＥ製剤とヒト血漿の相互作用を示す図である。
【図３】ローダミン標識リポソームを使用しフローサイトメトリーによって分析した、ＡＶＥ９およびＡＶＥ３の、様々な腫瘍細胞系への結合を示すグラフである。
【図４】Ｄｏｘｉｌと比較して、自由型ドキソルビシン、およびＡＶＥ９もしくはＡＶＥ９５中にカプセル化したドキソルビシンの薬物動態学を示すグラフである。
【図５】未カプセル化ドキソルビシンと比較した、ＡＶＥ９またはＡＶＥ９５中にカプセル化したドキソルビシンの抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図６】ＡＶＥ９５‐ｄｏｘとＰＥＧ化リポソーム（Ｄｏｘｉｌ）の抗腫瘍効果の比較を示すグラフである。
【図７】ＡＶＥ９５‐ｄｏｘ、ならびにドキソルビシンを封入して含み、３０ｍｏｌ％のＳＭ、５０ｍｏｌ％のコレステロール、および２０ｍｏｌ％のＰＣ（３０／５０‐ｄｏｘ）から構成されたリポソームの抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図８】自由型ミトキサントロン、およびＡＶＥ９５中にカプセル化したミトキサントロンの薬物動態学を示すグラフである。
【図９】用量４ｍｇ／ｋｇ体重のミトキサントロンを１、３、６日目に注射使用した、Ｃ２６大腸癌腫におけるＡＶＥ９５‐ミトキサントロンの抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図３】
2007513122.tif 000002
【図４】
2007513122.tif 000003
【図５】
2007513122.tif 000004
【図６】
2007513122.tif 000005
【図７】
2007513122.tif 000006
【図８】
2007513122.tif 000007
【図９】
2007513122.tif 000008
【図１】
2007513122.tif 000009
【図２】
2007513122.tif 000010
【国際調査報告】
2007513122.tif 000011
2007513122.tif 000012
2007513122.tif 000013