(57)【要約】本発明は、二本鎖DNAから、環状に閉じた最小発現構築体を生産する方法、前記方法により生産された発現構築体、及び、それらを使用する方法に関係する。本発明の発現構築体は、共有結合により修飾されており、遺伝子治療において、効果的にトランスフェクションをするために用いる。【選択図】図1
2007523593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖DNAから、円形の環状に閉じている発現構築体を生産する方法であって、
(a) 制限エンドヌクレアーゼを用いた第一消化により、生物学的手法により増殖可能であるプラスミドから二本鎖DNAを切断する工程と、
(b) 認識部位が、
i.   少なくとも1のプロモーター配列、
ii.  少なくとも1のコード配列
iii. 少なくとも1のポリアデニレーション配列
を含み、これらの配列の間及び両側にいかなる塩基も有していない発現カセットの配列を含んでいることを特徴とし、
(c) 共有結合により環状に閉じている二本鎖DNAを形成するために、生産された制限フラグメントの分子内部を結合する工程と、
(d) 発現構築体上には存在しないが、生物学手法により増殖可能であるプラスミドのレスト（rest）上には存在する認識部位を切断するために、制限消化混合物を、制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに消化する第二消化工程と、
(e) 3’-及び5’-のDNA末端に特異的に作用するエキソヌクレアーゼを用いて、生物学的手法により増殖可能であるプラスミドの閉じていないレスト（rest）を分解する工程（該工程は、前記工程と同時に、あるいは、前記工程の後に行う。）と、
(f) 二本鎖DNA由来の環状に閉じている発現カセットを精製する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
二本鎖DNAから、円形の環状に閉じられた発現構築体を生産する方法であって、
a) 制限エンドヌクレアーゼを用いた第一消化により、生物学的手法により増殖可能であるプラスミドから二本鎖DNAを切断する工程と、
b)  認識部位が、
i.   少なくとも1のプロモーター配列、
ii.  少なくとも1のコード配列
iii. 少なくとも1のポリアデニレーション配列
を含み、これらの配列の間及び両側にいかなる塩基も有していない発現カセットの配列を含んでいることを特徴とし、
c)  オリゴデオキシヌクレオチドを取り込むことで共有結合により（環状に）閉じる二本鎖DNAを形成するために、化学的手法により共有結合する少なくとも1のリガンドを有している少なくとも1のオリゴデオキシヌクレオチドの存在下で、生産された制限フラグメントの分子内部を結合する工程と、
d) 発現構築体上には存在しないが、生物学手法により増殖可能であるプラスミドのレスト（rest）上には存在する認識部位を切断するために、制限消化混合物を、制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに消化する第二消化工程と、
e)  3’-及び5’-のDNA末端に特異的に作用するエキソヌクレアーゼを用いて、生物学的手法により増殖可能であるプラスミドの閉じていないレスト（rest）を分解する工程（該工程は、前記工程と同時に、あるいは、前記工程の後に行う。）と、
f) 二本鎖DNA由来の環状に閉じている発現カセットを精製する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項2の方法であって、オリゴデオキシヌクレオチドが、1以上の炭酸、アミン、チオール又はアルデヒドの作用により化学的に修飾されていることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項1又は2に記載の方法であって、第一制限消化に、1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはEco31Iを用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項1又は2に記載の方法であって、第二制限消化に、好ましくはEco1417が用いられることを特徴とする方法。
【請求項６】
二本鎖DNAを含む、遺伝子情報を輸送するための発現構築体であって、
a) 該発現構築体は、円形の環状に閉じられており、バクテリア又はウイルス由来の配列を有しないことを特徴とし、
b) 該発現構築体は、生物学的手法により増殖することができないことを特徴とし、
c) 該発現構築体は、二本鎖DNAの発現カセットを含み、該発現カセットは、
i.   少なくとも1のプロモーター配列と、
ii.  少なくとも1のコード配列と、
iii. 少なくとも1のポリアデニレーション配列を含むことを特徴とし、
d) 該発現構築体の全長が、200から10000 bpであることを特徴とする発現構築体。
【請求項７】
請求項6の発現構築体であって、該発現構築体の全長が、1000から2500 bpであることを特徴とする発現構築体。
【請求項８】
請求項6又は7に記載の発現構築体であって、該発現構築体が、少なくとも1のオリゴデオキシヌクレオチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項8の発現構築体であって、オリゴデオキシヌクレオチドが、少なくとも1のアミノ修飾されたチミン塩基を有することを特徴とする発現構築体。
【請求項１０】
請求項8又は9に記載の発現構築体であって、オリゴデオキシヌクレオチドが、1以上の炭酸、アミン、チオール又はアルデヒドの作用により化学的に修飾されていることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項6又は10の発現構築体であって、少なくとも1のリガンドが、オリゴデオキシヌクレオチドに共有結合により結合していることを特徴とする発現構築体。
【請求項１２】
請求項11の発現構築体であって、このリガンドが、オリゴペプチドであることを特徴とする発現構築体。
【請求項１３】
請求項12の発現構築体であって、オリゴペプリドが、3から30アミノ酸により構成されており、このうちの少なくとも半分が塩基性アミノ酸のアルギニン又はリジンであることを特徴とする発現構築体。
【請求項１４】
請求項12の発現構築体であって、該オリゴペプチドが、核に局在するPKKKKRKVのアミノ酸配列を有することを特徴とする発現構築体。
【請求項１５】
ヒト又は動物における遺伝子治療用の製品において、遺伝子情報を輸送するために用いることを特徴とする、請求項1から14のいずれかに記載の発現構築体を使用する方法。
【請求項１６】
ワクチンとして請求項1から15のいずれかに発現構築体を使用する方法。
【請求項１７】
請求項1から16のいずれかに記載の発現構築体をキットの一部として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は、二本鎖DNAから、環状に閉じた発現構築体を発現する方法、及び、生産された発現構築体に関係する。その様な、発現構築体(ベクター)は、遺伝子治療の分野で利用される。遺伝子治療は、治療効果を有する1以上の遺伝子を、有機体の中へ導入することを言う。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、in vivoにおいてトランスフェクション方法を用いた、特定の有機体で遺伝子を効果的かつ安定に発現させるか、あるいは、特定のタンパク質の発現を初期に抑制する、無害の容易な方法であるとして発達してきた。
【０００３】
遺伝物質を細胞内に運ぶ間には、多数のバリア(細胞質膜、エンドソーム、及び細胞核)があることから、DNAトランスフェクションは確率が低く、再現性のない方法である。従って、十分なトランスフェクション効果を発揮させることが、これまで発達してきたベクターの主要な問題である。大きな細胞を有する組織にDNAを注入しても、該DNAが導入されにくいからである。さらに、DNAを導入した細胞は、導入されたDAN配列を別に発現する。
【０００４】
基本的にウイルスを用いたトランスフェクション法と、ウイルスを用いないトランスフェクション法とは、区別されている。ウイルスを用いたトランスフェクション方法は、輸送媒体として、遺伝的に修飾したウイルスを用いる。野生型ウイルス及びそれから誘導されたベクターは、高い導入効果と高い組織特異性を有することから、これらは、今日のトランスフェクション方法の大部分に使用されている。
【０００５】
しかし、それらの使用には、ウイルスを遺伝子治療に使用することに対して大きく躊躇させる予測不可能な危険性が伴う。従って、自然発生ウイルスを用いた、導入したウイルス粒子(部分)によるトランスフェクションは、内在的な危険性を有する。ウイルスが複製可能であるか複製不可能であるかは、組換えの結果によるものであり予測不可能であることから、新しい病原ウイルスが現れることがある。さらに、抗-ベクター免疫反応により引き起こる、免疫原性反応は、ウイルス使用に伴って生じる、深刻な不利益である。従って、アデノウイルスを高濃度で含む製品は、臨床試験において、患者を死に至らしめたことがある。明らかに、この理由は、免疫システムの過剰反応によるものである(Lehrman, 1999, Nature 401:517-518)。遺伝子治療を行った白血病治療の場合、このような問題は今日の技術では不可避であり、遺伝子治療を用いる上での重大な障害である(Buckley RH, 2002, Lancet 360:1185-6)。
【０００６】
これらの不利益は、通常、プラスミド由来の非ウイルストランスフェクションシステムを用いることにより回避することができる。このシステムは、剥き出しの(naked)DNAを用いた方法である。しかし、このような方法は、低い導入率と、それに伴い、導入された配列の発現率が低くなるだけでなく、細胞又は組織に対する特異性がないという不利益がある。
【０００７】
さらに知られている不利益は、非ウイルストランスフェクションステムは、プロトプラストの中に含まれているバクテリアDNAの配列の相対的に大きい部分だということである。それらは、標的組織において深刻な問題を引き起こす。従って、プラスミドに本来含まれている免疫刺激配列(「ISS」、例えば、非メチル化シトシン-グアニジンジヌクレオチド、「CpG」)は、免疫システムのエフェクター細胞を刺激し、このことにより、炎症性のサイトカイン及びインターロイキンを組織の中に撒き散らすことになる(Krieg, 2002、Annu  Rev Lmmunol 20:709-60)。免疫学的なTh1-表現形を誘発することが、望まれない、又は、好ましくない場合には、このようなことは避けるべきである。自己免疫成分を有するこのような病気は、従来から遺伝子治療を適用している病気の他に、紅斑性狼瘡又はクローン病がある。免疫システムの働きを伴わない疾患の例は、嚢胞性線維症又はアルファ-1アンチトリプシン欠乏性疾患である。
【０００８】
さらに既知のプラスミドは、それらの選択に必要となる抗生物質耐性遺伝子を含むことが知られている。至るところに存在する有機体バクテリアを用いた遺伝子組み換えは抗生物質耐性バクテリアを増やすという危険性を有する。この抗生物質耐性を有するバクテリアが増えることは、遺伝子治療の深刻な問題であり、遺伝子治療を正当化できない理由である。
【０００９】
Coutelle等は、ミニサイクルDNAといわれるプラスミド内で、バクテリアDNA配列を短縮させて、生産することに成功した。このプラスミドは従来のプラスミドと比較して、10倍以上の発現をin vivoで行うことができる(Coutelle et al., 2001, J of Biol.Chem. 25: 23018-23027)。プラスミドは、リコンビナーゼの2の認識部位を有するものが用いられた。リコンビナーゼ部位を有するバクテリア系統のために、これらのベクターは、プラスミドに共通する不利益を減らすために、バクテリアDNAのレスト(rests)をふくんでいるけれども、依然として不利益は存在する。導入仲介リガンドの特異的及び制御可能な結合が、ミニサークルの構造では不可能となることから、標的トランスフェクションは、これらのミニサークルを用いて行うことはできない。
【００１０】
U.S. Patent No.6,143,530は、バクテリア有機体を用いた、DNAの最小形態を有するプラスミドを開示した。しかし、この生産過程には、バクテリアのリコンビナーゼが必要とされた。従ってこのプラスミドは、バクテリアが誘発する炎症作用の原因となる、バクテリアDNA配列を有している。
【００１１】
U.S. Patent No.6,265,218において、選択マーカー遺伝子を用いずにベクターを生産する方法が開示されている。この開示された方法に従って生産されたベクターは、遺伝子治療又は遺伝子治療に用いられる医薬品を生産する目的で使用される。この文献で開示されている実行可能なベクターのみが、リコンビナーゼシステムを用いて生産される。従って、必然的に、ベクター配列を有する発現構築体を生産することになる。
【００１２】
他の種類の非ウイルスベクターは、最小の部分的に二本鎖を閉じた構造を有する環状発現構築体である。このような、直線状のものを共有結合により閉じた発現構築体の発現量は、EP0941318で示されている。このようなダンベル型の構築体は、標的遺伝子の発現に必要な配列情報のみを有し、バクテリア配列を有するプラスミドの不利益を避けることができる。このダンベル型発現構築体の不便な点は、環状閉鎖二本鎖プラスミドと比較した場合、治療効果のあるタンパク質の発現量が低いことである。
【００１３】
免疫反応を誘発するために、予防薬又はワクチン接種の間に、直線状ベクターが必要とされる。これらの直線状ベクターは、質的及び量的にも有意に好ましい免疫反応を引き起こすことから、明らかに従来のプラスミドよりも良い(Lutz et al., 2000, J Virol: 74(22):10447-57)。
【００１４】
トランスフェクション効果を増やすために、トランスフェクションについてアレンジされたリガンドが知られている。導入仲介リガンドは、細胞膜を通過して浸入し、後に、細胞核に侵入するために、ベクター、例えば、SV-40ウイルスからのシグナルが位置する核酸(NLL、アミノ酸配列PKKKRKV)、又は、HIV-1ウイルスのトランス活性タンパクに結合する。この機構を模倣することにより、細胞の中へ入るウイルスのメカニズムが実現でき、非ウイルスベクターが、有効な標的発見システムを備えることができる。
【００１５】
NLSペプチドをHBsAg(肝炎小表面抗原)をコードしている発現カセットに結合した後に、免疫実験行い、発現カセットを結合していないものと比較に、10から15倍の抗体力価を示すことはこれまでに可能であった(Schrimbeck et al.,  J. Mol Med.  2001. Jun；79(5-6)：343-50)。この方法の不利益は、発現率が従来のものにくらべて低いということであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
要約すれば、盛んな研究がされてきたにもかかわらず、高いトランスフェクション効率と、同時に、遺伝子治療における危険性又は人又は動物の免疫摂取を伴わずに使用できるDNAベクターは開発されていはいない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従来技術における上記の記載に基づいて、本発明は、高いトランスファー及び発現効率を有する非ウイルス発現構築体、さらに、対応する発現構築体及び、それらを用いた製品を提供することを目的とする。それゆえ、遺伝子治療に用いられる既知のウイルス発現システムによる不利益を避けることができる。
【００１８】
本発明は、請求項1及び請求項2に従って生産されるベクター、すなわち、環状のバクテリであってウイルスDNAを含まずに、細胞を効果的に及び直接的に形質導入することができる、環状(円形)のDNA発現構築体による方法を用いた技術により、この問題を解決する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において、環状発現構築体は、環状二本鎖DNAのみから成るDNAベクターを意味する。二本鎖DNAは、少なくとも1のプロモーター以外に、少なくとも1のコード配列、及び、必要な場合には、少なくとも1のポリアデンプンレーション配列を含む。適切には、このベクターは、エキソヌクレアーゼ分解に対する保護末端を含まない、しかし、環状に閉じている。
【００２０】
請求項2の態様において、該ベクターは、消化された発現カセットの結合性フラグメントの末端を共有結合的に閉じることができるオリゴデオキシヌクレオチドにより、共有結合により閉じられている。
【００２１】
このオリゴデオキシヌクレオチドは、1以上のリガンドを結合した、1以上の修飾塩基を有していてもよい。
【００２２】
用いるオリゴデオキシヌクレオチドの配列に応じて、離散構造モチーフを形成し、これを遊離させ、そして、リガンドへのアクセスをよりよくする。この「リガンド」とは、本明細書では、細胞のトランスフェクションを効果的に行わせるためのベクターに共有結合される、タンパク質及び/又は、糖又はステロイド分子等の他の有機分子を意味する。
【００２３】
トランスフェクションは、ある配列によりコードされるタンパク質、又は、触媒的に有効なRNA転写によりコードされるタンパク質を、わずかに又は一時的に生ずるように、核酸を導入しようとする細胞内へ、生物学的に、化学的に、あるいは物理学的手法を用いて、核酸配列を導入すること意味する。
【００２４】
相補的なメッセンジャーRNAとハイブリダイズすることによりタンパク質の発現を抑制する「アンチセンス」構築体といわれるものを導入することも可能である。
【００２５】
本発明の方法に従うことにより、環状に、そして、リガンド修飾された、環状遺伝子発現構築体は、連結している二本鎖DNAから生産することができる。本発明に従って、これらの発現構築体の発現カセットは、バクテリア由来でもウイルス由来でもなく、治療効果を有する遺伝子の発現のために必要な、限定された制御メカニズム対する正確に定義されたヌクレオチドのみが、ベクターの配列の中に存在する。該ベクターサイズは、約2キロベースに減少させられると同時に、このベクターの1周の90％を含むCpG-配列を減少させる。本発明の方法により生産された発現構築体は、増幅させられない、このことは、これらは真核細胞又は原核細胞の中で増幅することができないということを意味している。
【００２６】
本発明の環状発現構築体は、発現する遺伝子配列を含む適切なプラスミドから、IISタイプの制限酵素、好ましくはEco31Iを、用いて分裂することにより単離される。得られた結合力のある、発現カセットを含むフラグメントは、環状に結合されることにより閉じられる。一の態様において、1以上のリガンドが、開裂されている発現カセットの結合性末端を結合するための1以上のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)に結合される。ベクターを結合するこのペプチドの生産のために、1以上の導入仲介リガンドが、ODNを結合する前に、該ODNに共有結合で結合される。ODNは、1以上のアルカリ化炭酸、アミン、又はアルデヒドの作用により、化学修飾される。
【００２７】
制限エンドヌクレアーゼによる第二の消化工程において、発現カセットの中に認識部位を有さないプラスミドの骨格は、T7-ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能により酵素的に分解される。得られた本発明の環状二本鎖DNA発現構築体は、クロマトグラフィーにより精製される。さらに、この発現構築体は、イソプロパノール沈殿により精製することでもできる。本発明の方法により、バクテリア又はウイルス配列の中にあるような、プラスミド生産物に必要なすべての配列エレメントは排除される。
【００２８】
発現に必要な配列情報以外のものを減少させることにより、新規で微小な本発明のベクターを生産することができる。このようなベクターの生産物は、200-10000 bp、好ましくは、1000-2500 bpの幅で可能である。コード配列がない、従来のプラスミドの平均サイズは2000-3000 bpである。これ以下のサイズを有する従来タイプのプラスミドは、生産不可能である。
【００２９】
ODNに対するリガンドを共有結合することは、リンカー分子によりすることができ、所望の化学結合をさせることができる。リガンドは、DNAベクターの決められた位置に結合することが有利である。配列の機能反応領域内のリガンドに結合することにより、プロモーター又は機能遺伝子の機能は保持される。同様に、発現ベクターに対する定義された場所にお互いに独立したリガンドから、複数結合することが可能である。
【００３０】
本発明の方法は、本発明の発現構築体を生産するための市販製品のキットに適用される。そのようなキットは以下のものを含んでいる：
(a) プラスミド；特定の制限酵素に必要な認識配列を含み、発現構築体の複製に適しているもの
(b)  制限酵素及びリガーゼを含む第一酵素混合物、
(c)  制限酵素及びポリメラーゼを含む第二酵素混合物、
(d)  発現構築体の精製に対する既知の手段
(e)  緩衝液、ATP、DTT、水等の通常用いる反応基質、
(f)  キットのエレメントの機能コントロールに対する、コントロールベクター
このキットの必要条件は、プラスミド(a)の中に従来方法を用いてクローンした任意のコード配列を有することである。
【００３１】
本発明の更なる利点は、請求項、発明の詳細な説明、及び、図面により詳述される。本発明の環状に結合された二本鎖DNAベクターと、本発明の方法の驚くべき効果は、以下の図及び実施例で詳述される。
【００３２】
レポーター遺伝子ルシフェラーゼを用いた発現の確認は、2の細胞系統を用いてin vitroで行った。プラスミドのルシフェラーゼをコードしている発現強度を比較し、通常のベクターと、本発明のベクターを、ペプチド結合を有するものと有しないもので比較した。驚くべきことに、NLS(核酸位置配列、SV-40由来のアミノ酸配列PKKKRKV)ペプチド修飾した本発明の構築体を用いると、通常のプラスミドを用いた場合と比較すると、発現率が2倍以上高くなっていた(図3参照)。さらにペプチド修飾していない本発明の環状ベクターは、図4において、従来のベクターより明らかに有利に発現していることが示されている。
【００３３】
Lac-Z遺伝子をコードしている本発明のベクター又は従来のベクターのin vivoの試験において、これらのベクターをマウスに適用した。β-ガラクトシダーゼ発現の量に基づいて、β-ガラクトシダーゼ発現が誘発されているベクターの比較を行った。本発明のベクター(環状ベクター-NLSと表記)は、明らかに優れていた。図3で示すin vitro試験の結果のと同様に、in vivoでの発現率もまた、50％以上増加していた(図5参照のこと)。
【００３４】
更なるin vivo試験は、本発明の直線又は環状ベクターで、ワクチン接種した後の免疫反応の経過を調べるために行われた。この試験では、マウスに、HBsAgをコードしているベクターを接種し、得られたサイトカインプロファイルを、インターフェロン-γ分布に基づいて比較した。インターフェロン-γは、免疫反応及び抗ウイルス防御において重要な役割を担う。図6で示すように、本発明のベクターは、5マイクログラムのベクターを使用したときに、脾臓細胞のINF-γ分泌を誘発することができ、直線状ベクターは、INF-γ分泌を引き起こすことはできなかった。異なる病気のワクチン接種又は免疫治療において、Th-1型免疫反応を誘発することが、有利である、特に、HIV等のウイルスが引き起こす病気のほか、リーシュマニア（Leishmania）及びマラリア（Malaria）のような細胞内寄生タイプの病気にとって有効である。
【００３５】
遺伝子発現の優位な増加及び細胞が仲介する免疫反応の誘発の利点ほかに、新しいタイプのベクターは、ウイルス又はバクテリア由来の遺伝子マーカー又はコード配列を含んでいないが、治療に有効な遺伝子の発現に直接必要な配列のみを有していることから、患者に対して安全が保障される。一方、望まれない免疫学的又は感染の経過は、バクテリア又はウイルスDNAを含まないことから、避けることができる、一方で、関連してベクターサイズが少なくなっていることから、細胞核内でのトランスファー率が増加する。
【実施例１】
【００３６】
環状ベクターの生産
pMOK-Lucプラスミドを、制限酵素Eco31Iを用いて、37℃で2時間、インキュベートして完全に消化した。この制限消化により、2のDNAフラグメントが生じる。1のフラグメントは、プラスミドの増殖に必要な配列のほかに、カナマイシン耐性遺伝子を含む、他のフラグメントは、本発明のベクターを形成する配列を含む、つまり、CMVプロモーター、発現されるべき遺伝子配列、及びSV-40由来のポリアデニレーション配列である。T4-DNAリガーゼ(リガーゼ緩衝液中；400 mMのTris-HCL、100 mMのMgCL2、5 mMのATP)により、Eco31により生産された相補的な末端を4℃で一晩、インキュベートすることにより結合させた。得られた核酸の混合物を、Eco1471酵素で処理した。ベクター由来のレスティング(resting)DNAを分解するために、T7 DNAポリメラーゼ酵素を、混合物に添加する。得られた環状発現カセットは、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、イソプロパノール沈殿することにより得た。
【００３７】
図1は、本発明の環状ベクターの生産過程の概略図である。Eco31I(b)でプラスミド(a)を消化することにより、バクテリアのレスト(rest)DNAフラグメント(e)及び発現カセットが生産される。TaDNAリガーゼ酵素(f)及びEco31Iの存在により、リガンド修飾されたオリゴヌクレオチドリンカー(c)は(d)と結合される。このバクテリアのレスト(rest)DNA(g)及び生産物(i)は最終工程(h)で、T7DNAポリメラーゼで処理され、生産物(i)が生産される。
【実施例２】
【００３８】
実施例2a：リガンドの結合
ペプチド結合を有する環状発現カセットを以下のように構築した。NLSペプチドPKKKRKV(プロリン-リジン-リジン-リジン-アルギニン-リジン-バリン)は、1又は2のオリゴヌクレオチドと2段階で、結合される。第一段階は、修飾されたオリゴヌクレオチド(5,-PH-d(GGGAACCTTCAGTxAGCAATGG)及び、5,-PH-d(AGGGCCATTGCxACTGAAGG)、xTは、C2アミノリンカーでアミノ修飾されたチミン塩基を示す)(0.1mM)を、カップリング緩衝液中で、37℃で2時間、スルホ(sulfo)-KMUS(5 mM)を用いて活性化する。この反応を、50 mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(pH  7.5)により停止した。活性化されたODNは、エタノール沈殿(300 mMのNaOAc、  pH5.2、5.5 mMのMgCｌ2、100％エタノール)、遠心分離、及び70％エタノールで1回洗浄をした後に得られた。得られたODN(0.1 mM)を、カップリング緩衝液に溶解し(50 mMのNaPO4及び75 mMのNaCl2、0.5×  pH7.0)、及び、ペプチド(0.2 mM)と、1時間、37℃で反応させた。反応は、変性ポリアクリルアミドゲル(20％)及びエチジウムブロマイド染色により確認した。得られた、NLS結合されたペプチドを、HPLCで精製し、環状発現構築体の合成に使用した。
【００３９】
実施例2b：ペプチド結合を有する環状ベクターの構築
プラスミドpMOK-Lucを、Eco31I制限酵素で37℃で、2時間インキュベートすることにより完全に消化した。この制限消化により、2のDNAフラグメントを生じた。T4DNAリガーゼ制限酵素を用いて、90℃、3分でのハイブリダイズにより相補的な5-リン酸化オリゴヌクレオチド(TIBMolBio)(5’-PH-GGGAACCTTCAGTxAGCAATGG-3’及び5’-PH-AGGGCCATTGCTxACTGAAGG-3’)(xTは、選択によりシグナルペプチドNLSが共有されるC2リンカーでアミノ修飾されたチミン塩基を示す)を、ベクターフォーミングフラグメント(実施例1との比較)を形成するために、Eco31Iの存在下で、一晩4℃で結合した。得られた核酸の混合物を、T7DNAポリメラーゼで処理した。生産物を、陰イオン交換クロマトグラフィー及びイソプロパノール沈殿により精製する。
【実施例３】
【００４０】
細胞のトランスフェクション、発現の検出
細胞系統K562の細胞を、プラスミドpMOK-Luc、直線状ベクター、及び、結合されたリガンドを有する本発明のベクターを、エレクトロポレーションによりトランスフェクションした。この試験を3回の繰り返した。濃度の検出には、100 ngDNAを用いた。各サンプル溶液は、2.5×106細胞/250μｌの濃度で、300 V、1050μFでトランスフェクトした。37℃で24時間インキュベートした後、ルシフェラーゼの活性により発現検出が行われた。結果を図3に示す。
【実施例４】
【００４１】
リポフェクチンによるトランスフェクション
トランスフェクションの前日に、24穴プレートの中に、40000細胞のヒトHeLa細胞を巻いた(20000細胞/cm2)。この細胞を、プラスミドpMOK、直線状ベクター、及び、結合されたペプチドを有さない環状ベクターの各DNAをリポフェクチンを用いて、チランスフェクトした。これらは、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子をエンコードしている。濃度の検出には、800 ngのDNAを用いた。この実験では、4-8倍の発現を達成した。DNAを、20℃でDMEM(Dullbecco’s Modified Eagle Medium)中で(45’)(45分)リポフェクション試薬でトランスフェクトするためにインキュベートした。その後、DNA-リポフェクション混合物を添加することにより、細胞をトランスフェクトした。インキュベーションは、継続して4時間、37℃で行った。培地の交換の後、細胞を、21時間、37℃で培養し、発光計測器の中のルシフェラーゼ活性を指として発現を検出した。結果を、図4に示す。
【実施例５】
【００４２】
Lac-Zコーディングベクターの腫瘍内注入
各群6匹のマウスに、ジェット-注射方法を用いて、直線状ベクター、又は、Lac-Z遺伝子をコードしているペプチドを結合した環状ベクター、あるいは、これを有さない環状ベクターを、腫瘍内に注射した。実験に供したマウスに、5回注射を行った。DNA濃度は、1マイクロg/μlであった。注射ののち、48時間後にマウスを殺し、腫瘍を除去し、これを更なる臨床試験のために液体窒素中で保存した。腫瘍細胞の調製物を、800マイクロリットルの融解緩衝液(TE緩衝液、pH8、アプリロチニン  10 mg/lm及びPMSF10μg/mlを含む)の中でホモジネートした。遠心分離(14000 rpm、4℃、10分)の後、この溶解物は、クマシー染色により、タンパク質の検出を行った(Pierce、Rockford、USA)、595 nmにおける吸光度を測定した。結果を図5に示す。
【実施例６】
【００４３】
HBsAgで免疫性を与えた後のインターフェロン-y分泌
6から8週齢のBALB/cマウスは、HBsAgをコードしたベクター(50μｌの100mMのNa2PO4に溶解)を、内皮注射することにより、免疫性を与えた。4週後、各群の2匹のマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離した。この脾臓細胞は、コンカナバリンA(CoA)、の中でインキュベートされ、マイトマイシンC処理された抗原含有細胞(APC、陰性対照)及び、HBsAgペプチドに接触させたAPC(陽性対照)で、50％CO2、37℃、一晩インキュベートした。96穴プレートは、前もって、8μg/mlの抗マウスINF-y抗体(Pharmingen)でコートされている。インキュベーションの後、この細胞を、除去し、100μlのビオチン化抗-マウスINF-y抗体を、2μg/mlの濃度で、96穴プレートに添加した。4℃で一晩のインキュベーションの後このプレートを、洗浄し、100μlの1：800で希釈されたアビジンパーオキサイドを添加した後、室温で1時間インキュベートした。反応は、100μlのDAB基質(シグマ)を添加することにより開始する。20分後、この反応を停止させ、ステレオマイクロスコープを用いて、沈殿物を集計した。陰性対照の結果を陽性対照の結果から差し引く。このことにより、抗体特異的沈殿物の数が決定される。これらの値は、ConAインキュベート脾臓細胞の結果に関連する。結果は図6に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の環状DNAベクターの生産手順の概略図である；a) プラスミドb) Eco31Ic) リガンドを付加したオリゴヌクレオチドリンカーd) 発現カセットe) バクテリア残渣DNAf) Eco31Ig) バクテリア残渣DNA及び生産物(i)の混合物h) T7-DNA-ポリメラーゼi) 生産物
【図２】本発明のペプチド結合されたDNAベクターの集合的な機能を示す；a) 発現されるべき遺伝子の配列b) プロモーター領域c) リガンド修飾されたオリゴヌクレオチドリンカーd) ポリ(A)シグナル
【図３】本発明のベクターの発現のin vivoでの比較、従来のプラスミドと、ヘラ(HeLa)細胞のトランスフェクションの後に蛍光発光酵素を発現させた直線状ベクターを、相対発光単位(rlu)(relative right unit)で測定したもの。
【００４５】
プラスミド；発光酵素をコードしているプラスミドpMOK
直線状ベクター；発光酵素をコードしている直線状ベクター
環状ベクター；結合されたペプチドを有さない本発明の環状ベクター
【図４】本発明のベクターの発現のin vivoでの比較、従来のプラスミドと、ヘラ(HeLa)細胞のトランスフェクションの後に蛍光発光酵素を発現させた直線状ベクターを、相対発光単位(rlu)(relative right unit)で測定したもの。
【００４６】
プラスミド；発光酵素をコードしているプラスミドpMOK
直線状ベクター；発光酵素をコードしている直線状ベクター
環状ベクター；結合されたペプチドを有さない本発明の環状ベクター
【図５】Lac-Zをコードしている環状及び直線性DNA直線状ベクター；Lac-Zをコードしている直線状ベクター直線状ベクターNLS；Lac-Zをコードしている直線性NLSペプチド結合ベクター環状ベクター-NLS；Lac-Zをコードしている本発明の環状性NLSペプチド結合ベクター
【図６】マウスにおけるインターフェロン-γ分泌刺激脾臓細胞直線状ベクターNLS；HBsAgをコードしている、直線NLSペプチド結合ベクター環状ベクター-NLS；HBsAgをコードしている、本発明の環状NLSペプチド結合ベクター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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