(57)【要約】本発明は、微生物病原体の毒性を減弱させる方法、または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる方法における環状ジヌクレオチドであるｃ−ジ−ＧＭＰおよびその環状ジヌクレオチドアナログの使用に関する。本発明の方法はさらに、微生物のバイオフィルム形成を阻害し、細菌感染症を処置することができる。阻害または低減される微生物のコロニー形成またはバイオフィルム形成は、皮膚、または鼻または粘膜表面上であってもよい。阻害される微生物のコロニー形成またはバイオフィルム形成はまた、医療器具、特に、患者と密接に接触しているものの表面、および微生物のコロニー形成およびバイオフィルム形成が関心事である産業および建設資材の表面上のものであり得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする患者において微生物病原体の毒性を減弱させる方法または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる方法であって、必要とする患者に有効量のｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを投与し、微生物病原体の毒性を減弱させるか、または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる、方法。
【請求項２】
微生物病原体の毒性の減弱が細菌感染症を処置することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細菌感染症がスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）感染症である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
細菌感染症が乳腺のスタフィロコッカス・アウレウス感染症である乳房炎である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
微生物のバイオフィルム形成を阻害することにより、または既に形成された微生物のバイオフィルムを低減させることにより細菌感染症が処置される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログが、ｃ−ジ−ＧＭＰアゴニストとして作用するｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
微生物のバイオフィルムがスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルムである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログが、ｃ−ジ−ＧＭＰアンタゴニストとして作用するｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログを含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
微生物のバイオフィルムがビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）のバイオフィルムまたはサルモネラ・エンテリティデス（Salmonella enteritidis）のバイオフィルムである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
微生物のバイオフィルムが皮膚、または鼻または粘膜表面上にある、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
細菌感染症を処置する際に有効な抗生物質を投与することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログが環状ジヌクレオチド化合物（Ｉ）〜（ＸＩＸ）からなる群から選択されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
微生物病原体のコロニー形成の阻害または低減が、微生物病原体によりコロニー形成されるリスクのある患者または微生物病原体により既にコロニー形成された患者を処置することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
阻害または低減される微生物病原体のコロニー形成が、皮膚、または鼻または粘膜表面上にある、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
微生物病原体がスタフィロコッカス・アウレウスである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
患者がスタフィロコッカス・アウレウスのキャリアである、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
固体表面上での微生物のコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害する方法またはコロニー形成および既に形成された微生物のバイオフィルムを低減させる方法であって、固体表面を有効量のｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログに曝露し、固体表面上での微生物のコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害するか、または微生物のコロニー形成および既に形成されたバイオフィルムを低減させる、方法。
【請求項１８】
固体表面が医療器具の固体表面である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
医療器具が患者に移植可能なものであるか、あるいは患者と接触可能なものである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
医療器具が患者に移植されているか、そうでなければ患者と接触しているものである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
微生物のコロニー形成およびバイオフィルムがスタフィロコッカス・アウレウスのコロニー形成およびバイオフィルムであり、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログがｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアゴニストである、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
有効成分としてのｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログが環状ジヌクレオチド化合物（Ｉ）〜（ＸＩＸ）からなる群から選択されるものである、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ｃ−ジ−ＧＭＰアゴニストとして作用する環状ジヌクレオチドアナログを含む、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ｃ−ジ−ＧＭＰアンタゴニストとして作用する環状ジヌクレオチドアナログを含む、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２６】
細菌感染症を処置するための医薬の製造におけるｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログの使用。
【請求項２７】
コロニー形成および微生物のバイオフィルム形成を阻害するため、あるいはコロニー形成および既に形成された微生物のバイオフィルムを低減させるための医薬の製造におけるｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、微生物病原体の毒性を減弱させるため、およびバイオフィルム形成を阻害するための環状ジヌクレオチドの使用に関し、これにより、微生物のコロニー形成または多種多様な微生物種により引き起こされる感染症が制御される。
【０００２】
関連技術の記載
コレラは、深刻な罹患率および死亡率となるヒトの重大な下痢性疾患である（Pollitzer, 1959；およびKaper et al., 1995）。コレラは７５ヶ国より多くの国、そして全ての大陸を襲う（Communicable Disease Surveillance and Response, World Health Organization, who. org）。小腸にコロニーを形成し、大量の分泌性下痢、そして処置しないと死を導くコレラ毒素（ＣＴ）を放出し得る病原性ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）を含有する糞便で汚染された食物または水を飲むことにより、コレラに罹患（acquired）する（Kaper et al., 1995）。症例に対するその高い死亡率、飲料水中での存続、および爆発的流行型で生じるその能力のため、コレラは公衆衛生上の関心事である。さらに、食物および飲料水に対する兵器化されたビブリオ・コレラ（V. cholerae）の脅威の可能性があるため、それは生物テロ防衛の研究において優先される生物である。ビブリオ・コレラは国際的に輸送される可能性を有し、新たな地域に船舶のバラスト水を介して侵入することが分かると、経済、環境、および人類の健康への脅威も高まりつつある（McCarthy et al., 1994）。ビブリオ・コレラは環境で存続することが知られているが、ビブリオ・コレラの環境での存続を促進する因子についてはあまり分かっていない。
【０００３】
ビブリオ・コレラは、その表現型を変化させ、ＥＰＳｏｆｆ（滑らかなコロニー形態）からＥＰＳｏｎ（しわ状コロニー形態）（細胞は、細胞外多糖またはしわ状エキソ多糖類（ｒＥＰＳ）に包埋され、しわの寄った「しわ状」コロニー形態（図１Ａおよび１Ｂ）および関連するバイオフィルムを呈する）へ可逆的に切りかわることができる（White, 1940およびRice et al., 1993）。ＥＰＳｏｎおよびしわ状表現型への切りかわりにより、バイオフィルム形成が促進される（Rice et al., 1993；Morris et al., 1996；およびWatnick et al., 1999）。重要なことに、ＥＰＳはビブリオ・コレラのバイオフィルム形成に必須である。しわ状変異体は、高度に塩素耐性であり、かつ酸、紫外線、および補体介在性血清殺菌活性（complement-mediated serum bactericidal activity）による殺傷に対して増大した抵抗性を示す（Rice et al., 1993；Morris et al., 1996；およびYildiz et al., 1999）。それゆえ、ＥＰＳｏｎおよびしわ状表現型への切りかわりは、ニッチの特殊化および特定環境での生存および適応の促進に重要であり得る。しわ状株は毒性であり、ウサギの回腸ループにおいて体液貯留を引き起こし、ヒトボランティアにおいて下痢を生じ、そして補体介在性血清殺菌活性に対して高度に耐性である（Rice et al., 1993；Morris et al., 1996；およびYildiz et al., 1999）。凝集した細胞からなるしわ状またはしわの寄ったコロニー表現型は、サルモネラ・エンテリカ・エンテリティデス（S. enterica Enteritidis）（Petter, 1993）、サルモネラ・エンテリカ・チフィムリウム（S. enterica Typhimunium）（Anriany et al., 2001）、ビブリオ・パラハエモリチクス（V. parahaemolyticus）（Gauvener et al., 2003）、シュードモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）（Parsek, 2003）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）（Farmer et al., 1980）で報告されている。本発明者と他の者からなる研究室による研究により、ビブリオ・コレラのＥＰＳ産生は、重要な毒性因子の分泌にも関与するＩＩ型通常細胞外タンパク質分泌経路と結びつくことも示された（Ali et al., 2000；Davis et al., 2000）。
【０００４】
ビブリオ・コレラのｖｐｓ（ビブリオ多糖）遺伝子クラスターは、ｒＥＰＳの生合成に関する構造遺伝子を有する（Yildiz et al., 1999）。ｖｐｓ遺伝子クラスターは、２つの、近接して位置するが離れたオペロン（ｖｐｓＡおよびｖｐｓＬは、それぞれのオペロンの第１遺伝子を表す）を含むと考えられている（Yildiz et al., 1999および2001）。ｖｐｓＡおよびｖｐｓＬの転写は、あまりよく分かっていない機序でＶｐｓＲ（σ５４転写活性化因子の相同体）により調節される（Yildiz et al., 2001）。ＶｐｓＲは、関連するセンサーキナーゼタンパク質によるそのレシーバードメインのリン酸化の後に転写を活性化するＮｔｒＣ、ＡｌｇＢ、およびＨｙｄＧ細菌エンハンサー結合タンパク質に対する高い相同性を有する（Kern et al., 1999）。従前の研究により、あるビブリオ・コレラ株のＨａｐＲがある未知の機序によりしわ状表現型と結びつくこと（Jobling et al., 1997）、およびＣｙｔＲがｖｐｓ遺伝子の転写および関連するバイオフィルム形成を抑制し得ること（Haugo et al., 2002）が見出された。本発明者はまた、ビブリオ・コレラのしわ状表現型への切りかわりはＴｏｘＴ、ＬｕｘＳ、およびＲｐｏＳに依存しないことを見出した（Ali et al., 2002）。しかしながら、ビブリオ・コレラの滑らかな表現型からしわ状表現型への切りかわりの基礎をなす分子基盤は、依然としてあまりよく分かっていない。
【０００５】
ビブリオ・コレラのしわ状表現型についての初期の研究は、試験した条件下でのＥＰＳｏｎおよびしわ状表現型への切りかわりが非常に低い頻度であることによって妨げられた（Morris et al., 1996；Yildiz et al., 1999；およびWai et al., 1998）。本発明者の研究室は、最近、高頻度しわ状産出（production）（ＨＦＲＰ）と呼ばれる過程においてしわ状表現型への急激なシフトを促進する（〜８０％）条件を同定した（Ali et al., 2002）。流行株間での表現型の発現および安定性に違いがあること、および高頻度で切りかわる能力が非病原性株におけるものより流行ビブリオ・コレラ株において共通することが見出された（Ali et al., 2002）。これは、しわ状表現型へ切りかわる能力がビブリオ・コレラにおいて重要であり、特定条件下で適応できるという強みをもたらし得ることを示唆している。
【０００６】
バイオフィルムは、多くの細菌種の存在の主な様式であり、それらの生存、存続、そしてしばしば毒性の中枢である（Costerton et al., 1995；Davey et al., 2000；Donlan, 2002およびWatnick et al., 2000）。バイオフィルムは、バイオフィルムなしで生存している細胞より上手く環境ストレスおよび不利な条件に抵抗し、増大した栄養素利用性を有し、そして免疫応答をうまく回避することができる（Anwar et al., 1992）。バイオフィルムに共通する特徴は、微生物がＥＰＳを多く含む細胞外基質に包埋されることである（Costerton et al., 1981およびWingender et al., 1999）。ＥＰＳは、バイオフィルムの構造上および機能上の完全性に重要であり、その物理化学的および生物学的特性を決定し、接着、防御において役割を担い、そしてコミュニティの相互作用を促進する（Wimpenny, 2000）。ＥＰＳは、ＵＶ照射、ｐＨシフト、浸透圧ショック、および乾燥のような様々な環境ストレスからの防御をもたらす。
【０００７】
ある種の病原体の環境での存続および伝播におけるバイオフィルムの役割もよく認識されている。ビブリオ・コレラ（Ali et al., 2002；Morris et al., 1996およびYildiz et al., 1999）同様、サルモネラ・エンテリカ・チフィムリウム（Salmonella enterica Typhimurium）は、増大したバイオフィルム形成能を有し、かつ環境での増長した存続において役割を担うと提案されるしわ状ＥＰＳ産生表現型を形成する能力を有する（Anriany et al., 2001）。洗浄液耐性のサルモネラ・エンテリティデス（Salmonella enteritidis）のバイオフィルムは、サルモネラ症の発症後少なくとも４週間、家庭用トイレで存続することが示された（Barker et al., 2000）。エスケリキア・コリ（E. coli）およびサルモネラのバイオフィルムが発芽の際観察され得るという知見は抗菌化合物でのそれらの根絶を困難なものとし、それゆえ、それらの存続が増長し、摂取および感染に結びつく（Fett, 2000）。ＤＮＡ交換が、バイオフィルムなしで浮遊している浮遊細胞間よりむしろ、表面に接着している細菌およびバイオフィルム内にいる細菌において増大され得ることを示唆する結果が存在することから、バイオフィルムの重要性はまた水平方向の遺伝子移動の過程において際立つ（Ehlers, 2000）。これは、抗生物質抵抗性または毒性、および総体的な存続のような機能をコードする遺伝子の移動に関与する。
【０００８】
臨床上、バイオフィルム形成は、感染症の処置におけるいくつかの困難性の確立および存続における鍵となる因子であることが知られている。嚢胞性線維症は、多量のＥＰＳを発現し、肺でバイオフィルムを形成するある種のシュードモナス・アエルギノーサ株により引き起こされる（Davies et al., 1995；Geesey et al., 1993およびGovan et al., 1996）。これらのシュードモナス・アエルギノーサ株のＥＰＳにより、それらは抗菌処置に不応となる。興味深いことに、ビブリオ・コレラのＥＰＳ（Ali et al., 2002およびMorris et al., 1996）同様、シュードモナス・アエルギノーサによるアルギン酸ＥＰＳ産生は、これらの株を塩素から守り、そして塩素処理された水道でのこれらの株の生存に寄与し得る（Grobe et al., 2001）。バイオフィルムにより介在される感染症の別の例は、慢性耳感染症（中耳炎）である（Dingman et al., 1998）。歯周病もバイオフィルムにより介在される疾患の別の例であり、これは歯茎を支える組織の慢性炎症に起因し、歯の喪失を導き得る。この疾患を引き起こす主な微生物はポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）である（Lamont et al., 1998）。
【０００９】
バイオフィルムのＥＰＳ基質は、イオン交換体として作用し、それにより、化合物の外部環境からバイオフィルムへの分散を制限することにより、ある種の抗菌剤のバイオフィルムへのアクセスを物理的に妨げる可能性を有する（Goodell et al., 1985；Nichols et al., 1988およびNickel et al., 1985）。ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）は、宿主の防御因子および抗生物質に対する抵抗性を増強させる際、およびインビボ低ｐＨ条件下での成長を促進する際に重要であると思われるバイオフィルムを産生する（Stark et al., 1999）。バイオフィルム細菌は、浮遊状態で成長した同じ生物より、抗生物質処置に〜１，０００倍耐性であり得る（Gilbert et al., 1997）。臨床的なバイオフィルムによる感染症は、典型的には、抗生物質での度重なる処置の後でさえ再発する症状により特徴付けられる。さらに、バイオフィルムによる感染症は、まれに、宿主の免疫系により解決される（Costerton et al., 1999）。人工弁上の細菌のバイオフィルムは、心臓弁置換術を受けた患者で心内膜炎を生じる原因である。これらの感染症を発症する患者において、死亡率は７０％もの高さである（Hyde et al., 1998）。何百万ものカテーテル（例えば、中心カテーテル、静脈カテーテル、および尿カテーテル）が毎年患者に挿入され、これらの挿入物がバイオフィルムのための可能性ある表面として働く。全体として、全院内感染症の６０％より多くがバイオフィルムによるものであると考えられる。これらのバイオフィルムによる感染症は、２〜３日間入院を長引かせ、１年当たり１０億ドルより高い追加コストとなり得る（Archibald et al., 1997）。
【００１０】
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は、重要なヒトおよび動物の病原体として長く認識されてきた別のバイオフィルム形成細菌である（Archer, 1998；Hermans et al., 2003；Kluytmans et al., 1997およびSutra et al., 1994）。スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）は、ヒトの皮膚および粘膜表面、特に、鼻孔前部で見出され得る。時間がたつと、ヒト集団の〜２０％は持続キャリア；〜６０％は断続キャリアとなる一方で集団の〜２０％はコロニー形成されない（Peacock et al., 2001）。スタフィロコッカス・アウレウスは、コミュニティで罹患する感染症および病院で罹患する感染症の両方に共通する原因である。カナダの最近の集団ベースの積極的（active）サーベイランスにおいて、侵襲性スタフィロコッカス・アウレウス感染症の１年当たりの発生率は１００，０００人の集団当たり２８．４であった（Laupland et al., 2003）。血管カテーテルの様な留置医療器具を装着した患者、血液透析を受けている患者、経静脈薬を使用している患者、皮膚病および糖尿病を有する患者を含むある種の集団は、一般的な集団より高いコロニー形成率を有する（Kirmani et al., 1978；Tuazon et al., 1975および1974）。キャリアはコロニー形成株に感染するリスクがあるので、スタフィロコッカス・アウレウスキャリアの状態は臨床上重要である。透析を受けている患者、ＨＩＶ感染症の患者、および血流感染症の患者における研究は、株を分子タイピングにより調べると、感染症の原因となるスタフィロコッカス・アウレウスの単離物は元々内在性であるという仮説を支持するものとなる（Ena et al., 1994；Luzar et al., 1990；Nguyen et al., 1999；von Eiff et al., 2001およびYu et al., 1986）。ゆえに、スタフィロコッカス・アウレウスの保因およびコロニー形成を阻害または低減させる方法が必要である。
【００１１】
Disease Control and Prevention's National Nosocomial Infection Surveillance systemによると、スタフィロコッカス・アウレウスは、院内感染症の特に共通する原因であり、手術部位感染症の最も共通する原因であり、そして院内菌血症の２番目に共通する原因である（National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) Report, 1998）。集中治療室でのスタフィロコッカス・アウレウス感染症総数は、１９８７年から１９９７年に増大し、このうち大部分の増大がメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス単離物によるものであった（Lowry, 1998）。スタフィロコッカス・アウレウスは、しばしば複数の抗生物質に耐性である。メチシリンおよび複数の抗生物質に耐性のスタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）により引き起こされる感染症は処置するのが特に難しく、ＭＲＳＡ感染症はしばしば高い死亡率と関連し、メチシリン感受性株より医療費を増大させる（Cosgrove et al., 2003）。
【００１２】
スタフィロコッカス・アウレウスはまた授乳中のメスの乳腺内感染（ＩＭＩ）に共通する原因であり、しばしば慢性乳腺炎を生じ、これはアメリカ合衆国中での乳牛の潜在性乳房炎と関連する乳業における毎年の損失（推定約１０億ドル）を伴う（Ott, 1999）。メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）に起因する感染症に選択される薬物はバンコマイシンであるが、この抗生物質は処置の最後の要である。
【００１３】
他の細菌種同様、バイオフィルム形成は、スタフィロコッカス感染症の確立および存続において鍵となる因子であることが知られている。バイオフィルム中の細菌細胞は、浮遊状態で成長した同じ細胞より抗生物質処置に対して最大１，０００倍耐性であり得る。この知見と一致して、組織または医療器具上でのバイオフィルム形成は、ヒトおよび動物のスタフィロコッカス・アウレウス感染症の発病の重要な第１工程である（Bradley et al., 1991；Cole et al., 2001；Cucarella et al., 2001, 2002および2004；Goetz, 2002；Huang et al., 2003；Kluytmans et al., 1997；Mest et al., 1994；Muder et al., 1991；Peacock et al., 2001；Pujol et al., 1996；およびRoghmann et al., 2001）。全体として、全院内感染症の６０％より多くがバイオフィルムに関与する。これらのバイオフィルムベースの感染症は、２〜３日間入院を長引かせ、１年当たり１０億ドルより高い追加コストとなり得る。感染のリスクは、スタフィロコッカス・アウレウスによるコロニー形成のあるヒトで高いが、コロニー形成およびバイオフィルム形成を予防する別の切実な理由がある。それは、スタフィロコッカス・アウレウスの他への伝播を予防することである（Muto et al., 2003）。ＭＲＳＡは、既存のメチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウスから自然発生的には出現しない。ＭＲＳＡのコロニー形成を有する人々の大部分が、ＭＲＳＡで一過性にコロニー形成された（ＭＲＳＡ感染患者またはコロニー形成患者との先に接触したことに由来する）医療従事者の手に曝されることにより、ＭＲＳＡに罹患する（Muto et al., 2003）。隔離および手指洗浄のような感染症の制御手段はこの伝播を低減するが、消去せず、従ってこれらの方針の順守はしばしば低いものとなる（Richet et al., 2003）。ＭＲＳＡの根絶は一般的に一時的なものでしかないので、他への伝播を制御するためのアプローチとしての除菌法は一般的には不成功であった。それゆえ、コロニー形成およびバイオフィルム形成を予防または阻害する新規介入ステージの開発が必要とされている。
【００１４】
ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの様な環状ヌクレオチドは、真核生物の重要な小分子シグナル伝達分子としてよく認識されている。細菌において、ｃＡＭＰはグルコース異化代謝産物抑制の緩和において役割を担う（Jackson et al., 2002；Notley- McRobb et al., 1997）が、一方ｃＧＭＰがシグナル伝達分子として作用することは示されていない。しかしながら、別のグアノシンヌクレオチドである環状ジヌクレオチドｃ−ジ−ＧＭＰ（３’，５’−環状ジグアニル酸、環状ジグアニル酸塩、環状ジグアノシンモノリン酸塩、環状ビス（３’→５’）ジグアニル酸、環状ジグアニル酸、ｃＧｐＧｐ、およびｃ−ＧｐＧｐとしても知られている）
【化１】
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（上記構造式中のＧはグアニンである）は、細胞内の細菌シグナル伝達分子であると数種において報告されており、その構造は既知であり、頭部と尾部が結合した２個のｃＧＭＰ分子からなる（Jenal, 2004およびRoss et al., 1991）。ｃ−ジ−ＧＭＰは、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）（グルコンアセトバクター・キシリナム（Gluconacetobacter xylinum）に改名）において最初に同定され、この種でセルロースの産生を調節することが示された（Amikam et al., 1989；Mayer et al., 1991；Ross et al., 1990および1991）。正確な分子機序は不明なままであるが、グルコンアセトバクター・キシリナム（G. xylinum）における調節は、ｃ−ジ−ＧＭＰが遺伝子発現を活性化する膜タンパク質と結合することを含むようである。セルロースの産生は、ＧＧＤＥＦドメインを有する２つのタンパク質、ジグアニル酸シクラーゼ（Ｄｇｃ）およびｃ−ジ−ＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰｄｅＡ）（それぞれ、細胞のｃ−ジ−ＧＭＰレベルを制御する）の効果を妨害することにより、調節されるようである。従って、ｃ−ジ−ＧＭＰはシグナル伝達分子であると考えられる。
【００１５】
本発明者の研究室および他の研究室による研究に基づき、現時点で、ビブリオ・コレラ、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、サルモネラ・エンテリティデス・チフィムリウムおよびシュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）を含む多くの病原体でのバイオフィルムの形成が、ＧＧＤＥＦタンパク質と関連することが数多く報告されつつある（Bomchil et al., 2003；D'Argenio et al., 2002；Jones et al., 1999およびRoumling et al., 2000）。
【００１６】
細菌病原体における抗生物質耐性の出現の増大、および感染過程におけるコロニー形成およびバイオフィルムの重要性は、代替する抗菌ストラテジーの開発を必要とする。本発明までに、バイオフィルムおよび可能性のある感染症の制御における抗菌アプローチとして使用するｃ−ジ−ＧＭＰのような環状ジヌクレオチドの適用は述べられていない。
【００１７】
本明細書における任意の文書の引用は、かかる文書が直接関係のある先行技術であるか、または本願の任意の請求項の特許性を阻止する資料であることを認めることを意図するものではない。任意の文書の内容または日付についてのいずれの記述も、出願時に出願人が利用可能であった情報に基づき、かかる記述の正確さについての承認を構成するものではない。
【００１８】
発明の要約
本発明は、微生物病原体の毒性を低減させる方法、または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる方法を提供し、該方法は、微生物病原体がバイオフィルム形成細菌であるか否かに関わらず、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログをそれらを必要とする患者に投与することによるものである。この方法は、細菌感染症を処置することができる。
【００１９】
バイオフィルム形成細菌に関して、本発明の方法はまた、バイオフィルム形成を阻害するか、あるいはその存在、すなわち、既に形成されたバイオフィルムの量を低減させる。従って、本発明は、バイオフィルム形成を阻害し、あるいは既に形成されたバイオフィルムの量を低減し、さらなるバイオフィルム発生を阻害し、それにより、バイオフィルム形成細菌病原体により引き起こされる感染症を処置する方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、固体表面、特に、患者と密接に接触しているか、あるいは接触状態になる医療器具の固体表面上での、微生物のコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害する方法およびコロニー形成を低減させ、バイオフィルムの分解を促進する（既に存在するコロニー形成および既に形成されたかあるいは蓄積したバイオフィルムを低減させる）方法に関し、該方法は、該固体表面をｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログと接触させることによるものである。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物に関するものである。
【００２２】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１の滑らかな変異体（図１Ａ）およびしわ状変異体（図１Ｂ）のコロニー形態を示す。示したコロニーは、ＬＢ寒天プレート上４８時間後のものである。
【００２３】
図２は、ビブリオ・コレラの滑らかなコロニー変異体およびしわ状コロニー変異体によるバイオフィルム形成を示すグラフである。
【００２４】
図３は、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１（野生型）、ＡｍｉＢ変異体（ＤＫ６３０）、およびＲｏｃＳ変異体（ＤＳ５６７）の運動性を示す遊走プレートアッセイ（Swarm plate assay）である。プレートは、０．３％  寒天を添加したＬＢ培地を含有し、３７℃で４時間インキュベーションした。
【００２５】
図４Ａおよび４Ｂは、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１（野生型の細胞を図４Ａに示し、ＡｍｉＢ変異細胞を図４Ｂに示す）の細胞形態に対するＡｍｉＢ変異の効果を示す。ＡｍｉＢ細胞は形態に差があり、全部の細胞の大きさが増大し、多数の連鎖した細胞が存在することを示すことに注意されたい。倍率は×１０００である。
【００２６】
図５Ａおよび図５Ｂはｃ−ジ−ＧＭＰのＨＰＬＣ特性を示す。生成物の純度を、ｃ−ジ−ＧＭＰの合成直後の分析により示す（図５Ａ）。０．９％  ＮａＣｌ中、４℃で３ヶ月間保存後のｃ−ジ−ＧＭＰの純度を、分析により示す（図５Ｂ）。
【００２７】
図６Ａ〜６Ｆは、スタフィロコッカス・アウレウス細胞と細胞の凝集に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示す。２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰで処理したＤＫ８２５の２４時間培養物（図６Ａ）および無処理対照（図６Ｂ）。ｃ−ジ−ＧＭＰで処理した細胞（図６Ｃ）および無処理の細胞（図６Ｄ）のグラム染色。ｂａｐ変異体Ｍ５５６のｃ−ジ−ＧＭＰで処理した培養物（図６Ｅ）および無処理対照（図６Ｆ）。図６Ｃおよび図６Ｄの倍率は×６３０である。
【００２８】
図７Ａ〜７Ｃは、スタフィロコッカス・アウレウスのヒト臨床単離物のポリスチレン表面（マイクロタイタープレートを用いた）上でのバイオフィルム形成能に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示す。マイクロタイタープレートのウェルでのバイオフィルム形成の阻害は、ＴＳＢおよび０．２５％  グルコース中のスタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５を種々の濃度のｃ−ジ−ＧＭＰで２４時間処理し、クリスタルバイオレットで染色して示す。ウェルの外観およびＯ．Ｄ．５７０値を示す（図７Ａ）。ｃ−ジ−ＧＭＰで処理したスタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５でのバイオフィルム形成の阻害の用量応答性についての定量的分析（図７Ｂ）。ｃ−ジ−ＧＭＰで処理した高バイオフィルムスタフィロコッカス・アウレウス株１５９８１でのバイオフィルム形成の阻害についての定量分析（図７Ｃ）。
【００２９】
図８Ａ〜８Ｄは、スタフィロコッカス・アウレウスウシ乳房炎単離物Ｖ３２９（図８Ａ）、Ｍ５５６（図８Ｂ）、Ｖ２９９（図８Ｃ）およびＶ３１５（図８Ｄ）のポリスチレン表面上でのバイオフィルム形成能に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果についての定量的分析を示すグラフである。
【００３０】
図９Ａおよび９Ｂは、ポリスチレン表面上でのスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成の阻害に対するグアノシンヌクレオチドアナログの効果を示す。マイクロタイタープレートのウェルでのバイオフィルム形成の阻害は、ＴＳＢおよび０．２５％  グルコース中のスタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５をヌクレオチドｃ−ジ−ＧＭＰ、ｃＧＭＰ、および５’−ＧＭＰで処理したことによるものである。ウェルの外観およびＯ．Ｄ．５７０値を図９Ａに示す。バイオフィルムの形成に対する５’−ＧＭＰ、ｃＧＭＰ、およびｃ−ジ−ＧＭＰの処理の効果についての定量的バイオフィルム分析を図９Ｂに示す。
【００３１】
図１０は、２４時間既にバイオフィルムを形成したスタフィロコッカス・アウレウスに対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果についての定量的バイオフィルム分析を示すグラフである。
【００３２】
図１１Ａおよび１１Ｂは、ＨｅＬａ上皮細胞と接着したスタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５に対するｃ−ジ−ＧＭＰ処置の効果を示す。図１１Ａは無処理対照培養物；図１１Ｂはｃ−ジ−ＧＭＰ処理培養物である。
【００３３】
図１２は、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１およびＲｏｃＳ変異体におけるバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示すグラフである。結果は、少なくとも３つの独立したコロニーに基づく平均である。
【００３４】
図１３は、バイオフィルム成長の反応システムの略図であり、これは３７℃のインキュベーター内に完全に入れられたワンスルーシステムである。１０７ＣＦＵを反応チューブに注入し、３０分間接着させ、各時点でフローをシステムに戻すことが可能である。フローセルを除去し、シリコンチューブを開き、腔の内側を擦過することで、バイオフィルムを回収できる。
【００３５】
図１４は、図１３に示したバイオフィルム成長反応システムに挿入したインラインであり、ＰＢＢＡおよびステンレススティールを含む種々の表面に接触したバイオフィルム試料を得るために用いられる、シールドフローセル（Protofab, Inc., Bozeman, MT）を示す。バイオフィルムの回収のため、挿入物は容易に取り出すことができる。
【００３６】
図１５は、マウス乳房炎モデルにおけるスタフィロコッカス・アウレウスＮｅｗｂｏｕｌｄ３０５株のＣＦＵ数に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示すグラフである。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明者は、環状ジヌクレオチドであるｃ−ジ−ＧＭＰ（３’，５’−環状ジグアニル酸、ｃ−ＧｐＧｐ）が、微生物のバイオフィルム形成に影響し、病原性細菌のコロニー形成、運動性および毒性において顕著な役割を担う、天然に存在するシグナル（エフェクター）分子であることを見出した。純粋に化学合成されたｃ−ジ−ＧＭＰは、溶解性かつ安定であり、ｃ−ジ−ＧＭＰでのスタフィロコッカス・アウレウスの処理は、劇的に低減したバイオフィルム形成およびスタフィロコッカス・アウレウスの細胞と表面との相互作用、およびスタフィロコッカス・アウレウス細胞に対する印象的な抗凝集効果（細胞と細胞の細菌相互作用を阻害する）を示す。本発明者が得た結果により、ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスのヒト上皮細胞への接着を高度に阻害し、いくつかの細胞株において有意な毒性を示さず、かつ生物学的に適切な用量でマウスにおいて致命的ではなかったことがさらに示される。従って、ｃ−ジ−ＧＭＰは、スタフィロコッカス・アウレウスでのバイオフィルム形成を阻害し、その毒性およびコロニー形成能を低減または減弱させる。
【００３８】
さらなる実験により、ｃ−ジ−ＧＭＰはスタフィロコッカス・アウレウスにおける多数の遺伝子の発現に影響することが見出された。例えば、クオラムセンシング（quorum sensing）遺伝子はアップレギュレーションされ、毒素産生、毒性、接着、およびコロニー形成と関連する遺伝子はダウンレギュレーションされた。これらの結果は、毒性、毒素、コロニー形成における既知の役割を有する調節因子としてのクオラムセンシング遺伝子およびバイオフィルム関連遺伝子の役割と一致し、ｃ−ジ−ＧＭＰがバイオフィルム形成、コロニー形成、細胞凝集、毒素活性、および毒性を減弱させるという知見をさらに支持するものとなる。
【００３９】
細菌細胞は、クオラムセンシングと呼ばれる過程の成長フェーズと関連する低分子量のシグナル伝達分子を分泌することにより、特定の遺伝子の発現を制御する能力を有する。クオラムセンシングにより制御される生理的過程は多様な種の細菌で生じ、生物発光、抗生物質合成、病原性または毒性、タンパク質分泌、莢膜エキソ多糖類合成、バイオフィルム形成、および運動性を含む（Miller et al., 2001；Schander et al., 2001；Whitehead et al., 2001）。ビブリオ・コレラにおいて、毒性に重要なバイオフィルム形成およびいくつかの他の表現型は、クオラムセンシングにおける小シグナル伝達分子により調節されることが知られている（Hammer et al., 2003；Miller et al., 2002；Zhu et al., 2002）。しかしながら、ｃ−ジ−ＧＭＰは、かかるクオラムセンシングのシグナル伝達分子として同定されていなかった。細胞密度および毒性の制御はクオラムセンシングの顕著な特性の１つであり、クオラムセンシングに欠失を生じる化合物は抗菌活性を有するだろう。従って、本発明の１つの態様は、病原性細菌におけるクオラムセンシングのコミニケーション調節システムを破壊または阻害するためにｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを用いる方法を提供するものである。
【００４０】
スタフィロコッカス・アウレウスを用いた結果から、ｃ−ジ−ＧＭＰは細菌（細菌がバイオフィルム形成細菌であるか否かに関わらない）における普遍的なシグナル伝達分子であり、それゆえまた、病原性細菌におけるバイオフィルム形成、毒素産生、コロニー形成、および毒性のような生理的過程に関与する。本発明は、微生物病原体の毒性を減弱させる方法、または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる方法を提供し、該方法は、それを必要とする患者、すなわち、微生物病原体に曝露された患者、コロニー形成された患者、または感染した患者に有効量のｃ−ジ−ＧＭＰまたはｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログを投与することを含む。従って、本発明の方法は、微生物病原体の毒性を減弱させることにより、細菌感染症を処置することができ、それは、ｃ−ジ−ＧＭＰ（またはその環状ジヌクレオチド）を単独で、あるいは別の抗生物質／抗菌剤と組合せて相乗的に用いることによる。例えば、バイオフィルム形成の阻害は、確実に病原性細菌を病原体特異的な感染症を処置するために通常用いられるような別の抗生物質／抗菌剤の作用に非常に影響を受けやすいものとするだろう。用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、活性または確立した細菌感染症を指示するだけでなく、感染症を導く発症の初期ステージの阻害を指示することも意図されている。
【００４１】
好ましい実施態様として、本発明の方法は、バイオフィルムの形成がその病原性、すなわち、その毒性およびそのコロニー形成能に必須である微生物病原体におけるバイオフィルム形成を阻害する。スタフィロコッカス・アウレウスに関して、ｃ−ジ−ＧＭＰがそれを必要とする患者に投与され、スタフィロコッカス・アウレウスのコロニー形成およびバイオフィルム形成が阻害され（またはコロニー形成および既に形成されたバイオフィルムが低減される）、スタフィロコッカス・アウレウス感染症が処置される。スタフィロコッカス・アウレウスは、多種多様なヒトおよび動物の感染症を生じることが知られており、これは、膿痂疹、乳腺炎、食中毒、敗血症、骨髄炎、関節炎、心内膜炎、および肺炎を含むが、これらに限らない。感染症（乳房炎）の動物モデルの予備データは、ｃ−ジ−ＧＭＰが乳腺のスタフィロコッカス・アウレウス感染症である乳房炎を阻害することを示している。乳牛の乳房炎（ウシ乳房炎）は、酪農業において特に関心事であり、経済上重要である。
【００４２】
スタフィロコッカス・アウレウスを例として用いると、病院環境下でのスタフィロコッカス・アウレウスの存在は、入院患者および職員でのコロニー形成および感染のリスクを有する。従って、ｃ−ジ−ＧＭＰは、入院患者および職員、ならびに新たに来院した患者に投与され得る（すなわち、皮膚、鼻腔および粘膜表面にスプレーすることで、患者でのスタフィロコッカス・アウレウスのコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害し、スタフィロコッカス・アウレウスのキャリアである個体のコロニー形成およびバイオフィルム形成を低減させる）。
【００４３】
ｃ−ジ−ＧＭＰの他に、ｃ−ジ−ＧＭＰアゴニストとして作用する（すなわち、ｃ−ジ−ＧＭＰと同じ効果を有する）その環状ジヌクレオチドアナログを用いて、スタフィロコッカス・アウレウスのコロニー形成およびバイオフィルム形成が阻害され（または、既に存在するコロニー形成および既に形成されたバイオフィルムが低減され）、スタフィロコッカス・アウレウス感染症が処置され得る。
【００４４】
意外なことに、本発明者はさらに、細菌に依存して、ｃ−ジ−ＧＭＰがバイオフィルム形成を阻害する効果を有し得るか、あるいはバイオフィルム形成を誘導するか、または増強する反対の効果を有し得ることを見出した。例えば、ビブリオ・コレラおよびサルモネラ・エンテリティデス（共にグラム陰性である）において、ｃ−ジ−ＧＭＰはバイオフィルム形成を誘導するか、または増強し、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウスにおいては反対の効果であることを見出した。従って、ｃ−ジ−ＧＭＰの効果は、細菌特異的である。ｃ−ジ−ＧＭＰがバイオフィルム形成を阻害するか、あるいは増強するかに関わらず、ｃ−ジ−ＧＭＰはやはり、細菌におけるバイオフィルム形成を調節するシグナル伝達エフェクター分子として機能する。
【００４５】
異なる細菌におけるｃ−ジ−ＧＭＰの反対効果の現象は、細菌がグラム陽性であるか、グラム陰性であるかに起因し得る可能性がある一方、これは単なる思索であり、容易に試験され得る。本明細書において以下で開示されるマイクロタイタープレートまたは試験管およびフラスコでのバイオフィルム形成／阻害アッセイは、特定の細菌に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を決定する迅速かつ容易なアッセイである。さらに、これらのアッセイは、ｃ−ジ−ＧＭＰの効果についての多くの異なる種類の細菌（すなわち多くの異なる株、種、および／または属）の試験をハイスループットで同時にできる。従って、いずれかのバイオフィルム形成細菌に関して、そのバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果について容易かつ迅速に試験され得る。ｃ−ジ−ＧＭＰがバイオフィルム形成を阻害することが見出されると、次に、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはｃ−ジ−ＧＭＰ活性を有する環状ジヌクレオチドアナログ（ｃ−ジ−ＧＭＰアゴニストとして作用する）を用いて、バイオフィルム形成が阻害されるか、あるいは既に形成されたバイオフィルムが低減され得る（並びに、毒性が減弱され、コロニー形成が阻害および低減される）。同様に、ｃ−ジ−ＧＭＰが代わりにバイオフィルム形成を増強するか、あるいは誘発すると、次に、ｃ−ジ−ＧＭＰアンタゴニスト活性を有するｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログ（ｃ−ジ−ＧＭＰの効果と反対に作用する）を用いて、バイオフィルム形成が阻害されるか、あるいは既に形成されたバイオフィルムが低減される（並びに、毒性が減弱され、コロニー形成が阻害および低減される）。ビブリオ・コレラおよびサルモネラ・エンテリティデス（S. enteritidis）は、ｃ−ジ−ＧＭＰアンタゴニストとして作用する添加されたｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログがバイオフィルム形成を阻害する、細菌の非限定的な例である。
【００４６】
迅速かつ容易なバイオフィルム形成／阻害アッセイを用いて、試験した細菌に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を迅速に決定できるだけでなく、該アッセイを用いて、ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログがｃ−ジ−ＧＭＰのアゴニストであるか、あるいはアンタゴニストであるかを単に日常的な実験で決定できることを当業者は理解するだろう。ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログの非限定的な例は、化合物（Ｉ）〜（ＸＩＸ）として以下に示される。
【化２】
2007500697.tif 000004
【化３】
2007500697.tif 000005
【化４】
2007500697.tif 000006
上記の環状ジヌクレオチドは、ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログの好ましい実施態様のみであって、制限することを意図されいていない。例えば、グアニン塩基は、他の基で置換されてもよい。
【００４７】
本発明はまた、固体表面上での微生物のコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害する方法を提供し、該方法は、固体表面を有効量のｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログに曝露し、医療器具、より好ましくは患者に移植可能であるか、移植される医療器具（すなわち、人工関節、ステントなど）、またはそうでなければ患者に接着しているか、密接に接触している医療器具（すなわち、カテーテル、留置器具、静脈管系、インスリンポンプなど）の表面上での微生物のコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害するか、またはその存在を低減させることによるものである。固体表面は、バイオフィルム形成細菌の存在が改善を必要とする問題を生じ得る産業パイプライン、および建築または建設資材のような非医薬向けの器具上であり得ることも意図されるであろう。医療器具の固体表面上でスタフィロコッカス・アウレウスにより形成された微生物バイオフィルムが特に関心事であるので、本発明のこの態様の好ましい実施態様は、表面を有効量のｃ−ジ−ＧＭＰアゴニストに曝露することによる、医療器具の固体表面上でのスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成を阻害するか、あるいはその存在を低減させることである。上述の微生物病原体の毒性を減弱させる方法およびコロニー形成およびバイオフィルム形成を阻害する方法と同様、この方法において、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログ（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか）が、特定の表面についての関心事であるバイオフィルム形成細菌の種類に基づき選択され得る。例えば、スタフィロコッカス・アウレウスまたはバイオフィルム形成がｃ−ジ−ＧＭＰにより阻害される細菌が主な関心事である場合、ｃ−ジ−ＧＭＰが用いられ得る。他の例では、関心事である細菌のバイオフィルム形成がｃ−ジ−ＧＭＰにより増強／誘発されるが、ｃ−ジ−ＧＭＰのアンタゴニストにより阻害される場合、ｃ−ジ−ＧＭＰアンタゴニストとして作用するｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログが用いられ得る。
【００４８】
当業者は、当業者に既知のあらゆる方法で固体表面がｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログに曝露され得ることを理解するだろう。ある方法としては、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを固体表面に接着または固定することであるか、または表面にｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを取り込むことである。別の方法としては、固体表面をｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを含有する溶液で流すことである。
【００４９】
本発明の方法に適当な病原性および非病原性の両方の種々の細菌種の非限定的な例は、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）、シュードモナス・フルオレッセン（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens）、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、フソバクテリウム ナクレタム（Fusobacterium nucleatum）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、シトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii）、ポルフィロモナス・ジンジバーリス、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、バーコホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、エロモナス・ハイドロフイラ（Aeromonas hydrophilia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・パラチフス（Salmonella paratyphi）、サルモネラ・エンテリティデス、シゲラ・ディゼンテリエ（Shigella dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・エーロジェネス（Enterobacter aerogenes）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、エルシニア・ペスチス、エルシニア・シュ−ドツベルクロ−シス（Yersinia pseudotuberculosis）、エルシニア・インテン−ネジア（Yersinia inten-nedia）、ボルデテラ・ペルツーシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラペルツーシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、エスケリキア・コリ、サルモネラ・チフィムリウム、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・ヘモリチクス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・パラヘモリチクス（Haemophilus parahaemolyticus）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）、ガードネレラ・バジナリス（Gardnerella vaginalis）、バクテロイデス種（Bacteroides spp）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラー（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・レプラ（Mycrobacterium leprae）、コリネバクテリア・ジプリテリア（Corynebacterium diplitheriae）、コリネバクテリア・ウルセランス（Corynebacterium ulcerans）、レジオネラ・ニューロノフィラ（Legionella pneurnophila）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ヘリコバクター・ピロリ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、ボレリア・ブルグフドルフェリ（Borrelia burgfdorferi）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ナイセリア・ゴノレーエー（Neisseria gonorrhoeae）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、カンピロバクター���フェトゥス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、デスルフビブリオ種（Desulfvibrio spp.）、アクチノミセス種（Actinomyces spp.）、エルビニア種（Erwinia spp.）、キサントモナス種（Xanthomonas spp.）、キシレラ種（Xylella spp.）、クラビバクテル種（Clavibacter spp.）、デスルホモナス種（Desulfomonas spp.）、デスルフォヴィブリオ種（Desulfovibrio spp.）、デスルホコッカス種（Desulfococcus spp.）、デスルフォバクター種（Desulfobacter spp.）、デスルホブルブス種（Desulfobulbus spp.）、デスルホサルシナ種（Desulfosarcina spp.）、デスルフロモナス種（Desulfuromonas spp.）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ハエモリチクス（Acinetobacter haemolyticus）、エンテロコックス・ファエカルス（Enterococcus faecalls）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトーコッカス・パイオジェネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティー（Streptococcus agalactiae）、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガルス（Proteus vulgarls）、ストレプトマイセス種（Streptomyces spp.）、クロストリジウム種（Clostridium spp.）、ロドコッカス種（Rhodococcus spp.）、テルマトガ種（Thermatoga spp.）、スフィンゴモナス種（Sphingomonas spp.）、ザイモモナス種（Zymomonas spp.）、ミクロコッカス種（Micrococcus spp.）、アゾトバクター種（Azotobacter spp.）、ノルカルジア種（Norcardia spp.）、ブレビバクテリウム種（Brevibacterium spp.）、アルカリゲネス種（Alcaligenes spp.）、ミクロビスポラ種（Microbispora spp.）、ミクロモノスポラ種（Micromonospora spp.）、メチロバクテリウム・オルガノフィルム（Methylobacterium organophilum）、シュードモナス・レプチリボラ（Pseudomonas reptilivora）、シュードモナス・カラギエノボラ（Pseudomonas carragienovora）、シュードモナス・デンチフィカンス（Pseudomonas dentificans）、コリネバクテリウム種（Corynebacterium spp.）、プロピオニバクテリウラン種（Propionibacteriurn spp.）、キサノトモナス種（Xanothomonas spp.）、メチロバクテリウム種（Methylobacterium spp.）、クロモバクテリウラン種（Chromobacteriurn spp.）、サッカロポリスポラ種（Saccharopolyspora spp.）、アクチノバチルス種（Actinobacillus spp.）、アルテロモナス種（Alteromonas spp.）、アエロモナス種（Aeronomonas spp.）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデンニジス（Staphylococcus epidennidis）、スタフィロコッカス・オミニス（Staphylococcus hominis）、スタ��ィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）、スタフィロコッカス・ワルネイ（Staphylococcus warneri）、スタフィロコッカス・コーニイ（Staphylococcus cohnii）、スタフィロコッカス・サプロフィティックス（Staphylococcus saprophyticus）、スタフィロコッカス・カピチス（Staphylococcus capitis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス・インテムジウス（Staphylococcus intemedius）、スタフィロコッカス・ハイカス（Staphylococcus hyicus）、スタフィロコッカス・サッカロリチクス（Staphylococcus saccharolyticus）、およびリゾビウム種（Rhizobium spp.）、およびそれらの変異体を含む。
【００５０】
本発明の微生物病原体の毒性を減弱させる方法または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる方法、好ましくは哺乳類において、最も好ましくはヒトにおいて用いられることが意図されている（トリのような他の動物においても用いられ得る）。
【００５１】
本発明の微生物病原体の毒性を減弱させる方法または微生物病原体によるコロニー形成を阻害または低減させる方法をふまえて使用するｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログを含有する医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いた通常の方法で製剤され得る。担体は、組成物の他の成分と影響し合わないという意味で「許容され」なければならず、かつその受け手に有害であってはならない。
【００５２】
担体、投与経路、投薬形態の以下の例は既知の可能性を有するので挙げられ、それらの中から担体、投与経路、投薬形態などが本発明で用いられるために選択され得る。しかしながら、当業者は、任意の指定の剤形および選択された投与経路が最初に試され、それが所望の結果を達成するか否かが決定されるべきであることを理解するだろう。ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドが有効成分として単独で、あるいは細菌感染症を処置するために通常用いられるような別の抗性物質または抗菌剤と組み合わせて用いられてもよいことも理解するだろう。
【００５３】
用語「担体」は、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドが一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビークルを意味する。医薬組成物における担体は、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、スターチ、ラクトースまたはラクトース一水和物（monochydrate）のような結合剤；アルギン酸、メイズスターチなどのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウムのような滑沢剤または界面活性剤；コロイド状二酸化ケイ素のような潤滑剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味料；および／または
ペパーミント、メチルサリチル酸塩、またはオレンジ香味料のような香味料を含んでいてもよい。
【００５４】
投与方法は、非経腸、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経粘膜（例えば、経口、経鼻、口腔、膣、直腸、眼内）、くも膜下、局所および皮内経路を含むが、これらに限らない。投与は全身または局所のいずれでもあってもよい。
【００５５】
経口投与用の医薬製剤は液体形態（例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤）であってもよいし、あるいは使用前に水または他の適当なビークルでの再調製用薬剤製品として提供されてもよい。かかる液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビークル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、または植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩、またはソルビン酸）のような医薬的に許容される添加剤を用いた通常の方法で製剤されてもよい。医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、あらかじめゼラチン化したメイズスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモでんぷんまたはナトリウムスターチグリコール酸塩）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような医薬的に許容される賦形剤を用いた通常の方法で例えば錠剤またはカプセル剤の形態で製剤されてもよい。錠剤は、当該技術分野でよく知られた方法でコーティング（すなわち、腸溶性コーティング）されていてもよい。
【００５６】
経口投与用製剤は、活性化合物の制御した放出を生じるように適当に製剤されてもよい。
【００５７】
局所投与のため、ｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログは、膏薬または軟膏のような局所に適応したビークルに取り込まれる。
【００５８】
口腔内投与のため、組成物は通常の方法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【００５９】
組成物は、注射（例えば、ボーラス注射または持続注射）により非経腸投与用に製剤されてもよい。注射用製剤は、単位投薬形（例えば、アンプル剤）または保存剤を添加した多用量容器にて提供されてもよい。組成物は油性または水性ビークル中の懸濁剤、液剤、または乳剤のような形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化用の剤を含有していてもよい。あるいは、有効成分は、使用前に適当なビークル（例えば、清潔なパイロジェンフリー水）で調製する粉剤形態であってもよい。
【００６０】
組成物はまた、座剤または停留浣腸剤（例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような通常の座剤基剤を含有する）のような直腸用組成物の形で製剤されてもよい。
【００６１】
吸入による投与のため、本発明により用いられる組成物は、適当な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適当なガス）を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの形で通常もたらされる。吸入スプレーとして加圧パックまたは噴霧器を必要としない鼻用スプレーが、鼻腔内投与のために代わりに用いられてもよい。加圧エアゾールの場合、定量を運ぶバルブを用意することで投薬単位が決定されてもよい。吸入器または吸入器（insufflator）において用いるために例えばゼラチンからなるカプセル剤およびカートリッジが製剤されてもよく、これは化合物の粉剤混合物およびラクトースまたはスターチのような適当な粉剤基剤を含有する。
【００６２】
典型的な処置計画は、数日間ないし１週間から約６ヶ月間を含む期間までにわたる有効量の投与を含む。
【００６３】
コロニー形成、バイオフィルム形成、または感染部位での有効用量は、約１μＭから９９０μＭ、好ましくは約２０μＭから５００μＭ、より好ましくは約１００μＭから３００μＭの間のようなμＭの範囲内にあるようである。当業者は、何用量のｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログが、投与経路に依存してかかる有効量をバイオフィルム形成または感染部位に運ぶのに必要であるかを日常の実験で決定する。
【００６４】
インビボで投与されるｃ−ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドアナログの投薬量は、受け手の年齢、性別、健康状態、および体重、併存処置の種類、必要に応じて処置の頻度、および所望の医薬効果の性質に依存し得ることは理解される。本明細書に記載の有効用量範囲は、限定的なものではなく、好ましい用量範囲を表すものである。しかしながら、最も好ましい投薬量は個々の対象に合わせられ、このことを当業者は理解し、決定できる。例えば、Berkow et al., eds., The Merck Manual,16th edition, Merck and co., Rahway, N. J., 1992；Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y. (1990)；Katzung, Basic and Clinical Pharamacology, Appleton and Lange, Norwalk, Conn., (1992)；Avery's Drug Treatment: Principles and Practic of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Col, Boston, (1985)（引例は、引用により本明細書に完全に取り込まれる）を参照されたい。
【００６５】
これまで本発明を一般的に説明したが、それらが以下の実施例（説明の目的で提供されるものであって、本発明を制限することを意図するものではない）を通じてより簡単に理解されるだろう。
【００６６】
実施例１
ビブリオ・コレラ（および他種）のしわ状表現型を研究している研究者は、インビトロでの滑らかな細胞（ＥＰＳｏｆｆ）としわ状細胞（ＥＰＳｏｎ）との切りかわりの頻度が非常に低い（＜１％）ことにより邪魔されてきた（Morris et al., 1996；Wai et al., 1998；White, 1940および1938；Yildiz et al., 1999）。本発明者の研究室は、滑らかな細胞（ＥＰＳｏｆｆ）からしわ状表現型（ＥＰＳｏｎ）への高頻度のシフトを生じる培地および条件であるＡＰＷ＃３（１％  プロテオースペプトン＃３、１％  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．５）を同定した。この過程は高頻度しわ状産出（ＨＦＲＰ）と呼ばれる（表１）（Ali et al., 2002）。
【００６７】
表１  ビブリオ・コレラ株によるしわ状ＥＰＳ産出（ＨＦＲＰ）への切りかわり頻度
【表１】
2007500697.tif 000007
ａＨＦＲＰまたは自然発生したしわ状コロニーを示す株のみを挙げる
ｂＣ、臨床；Ｅ、環境；括弧内は単離した年である
【００６８】
高頻度でのしわ状表現型への切りかわりは、非病原性株においてより流行株において共通するものであることを見出した。時間上および地理上無関連の６／１９の毒素産生単離物（３２％）および無関連の１／１６のみの非毒素産生株（６％）が、しわ状表現型（ＥＰＳｏｎ）へシフトでき、ＨＦＲＰを示すことを見出した（Ｔ検定；ｐ＜０．０５）（表１）。試験した全ての株のうち、Ｅｌ  Ｔｏｒ株Ｎ１６９６１が最も高い切りかわり率（８０％まで）であった。より低い頻度であるがしわ状表現型から滑らかな表現型への逆のものも見出され、これは表現型の切りかわりが条件付きで一過性であることを示している。これらの特徴は、切りかわり過程がフェーズバリエーション（phase variation）様機序と関連し得ることを示唆している。流行株が全て高頻度で切りかわることができるわけではないが、高頻度での切りかわりが毒素産生株とより相関することを示す結果は、それがビブリオ・コレラにおいて重要であることを示唆し、そしてまたこの過程と毒性との間の結びつきを示唆している。従前の研究（Morris et al., 1996）と一致して、しわ状表現型への低頻度（＜０．５％）のシフトをいくつかの株で見出した。非病原性株は、ＥＰＳｏｎしわ状表現型への切りかわりを刺激するための異なる条件下で成長させられなければならない可能性がある一方、このことは、それにも関わらず臨床上の株と非病原性株との間に差があることを依然として示すものである。本発明者の研究室は、６番目の世界的流行（古典的バイオタイプ）株ＮＣＴＣ  ６５８５が高頻度（４８％まで）でしわ状表現型に切りかわったことを見出した。ＨＦＲＰは、滑らかな表現型からしわ状表現型へのシフトが＞３％であると定義した（Ali et al., 2002）。ＮＣＴＣ  ６５８５のしわ状変異体がｒＥＰＳを発現することを確かめるために、ルテニウムレッド染色した薄片について透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を行った。ＴＥＭのため、ＬＢ培地上２日目の滑らかなコロニーおよびしわ状コロニーを０．５−ｃｍ２のブロックとして取り出し、次に、固定し、０．１Ｍ  カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の２％  グルタルアルデヒド、０．０７５％  ルテニウムレッド、５０ｍＭ  リジン塩酸塩溶液中で１時間、室温、次に、１８時間、４℃にて染色した。試料を０．１Ｍ  カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で２回洗浄し、２％  溶解Ｎｏｂｌｅ寒天にて包埋し、０．１Ｍ  カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の１％  四酸化オスミウムで一晩、４℃にて後固定した。次に、試料を３０％、５０％、７０％、および９０％  ＥｔＯＨにてそれぞれ１０分間、１００％  ＥｔＯＨにてそれぞれ１０分間を２回、脱水した。次に、それぞれプロピレンオキシドで１５分間２回処理の後、プロピレンオキシドとエポンの１：１溶液を用いて２時間室温にて、次に３：１  エポン／プロピレンオキシドにて一晩浸透させた。次に、試料を純粋なエポン中に１時間置き、エポンで包埋し、６０℃のオーブンに２日間入れ、次に薄切した（厚さ  ５０〜８０ｎｍ）。切片を酢酸ウラニルで２０分間染色し、くえん酸塩を２０分間導入した。試料を、ＪＥＯＬ  １２００  ＥＸ  ＩＩ透過顕微鏡下８０ｋＶで調べた。しわ状ＮＣＴＣ  ６５８５のＴＥＭは、細胞間の細胞外多糖の存在��および滑らかな細胞にはこの物質が存在しないことを示した。ビブリオ・コレラの全ての主要な流行コロニー（古典、Ｅｌ  Ｔｏｒおよび０１３９）はしわ状表現型にシフトできると思われる。
【００６９】
ｒＥＰＳの産生は、塩素、ＵＶ照射、過酸化水素のような種々の環境ストレスおよび補体介在性細菌活性に対するＥｌ  Ｔｏｒ株の耐性を促進することが知られている（Morris et al., 1996；Rice et al., 1993；Watnick et al., 1999およびYildiz et al., 1999）。６番目に世界的流行の古典的バイオタイプ株ＮＣＴＣ  ６５８５のしわ状細胞が環境ストレスに対する耐性を促進するか否かを決定するために、滑らかな変異体およびしわ状変異体を塩素に曝露した。塩素耐性を新鮮なＬＢ（Miller）培地３ｍｌ中でのＮＣＴＣ  ６５８５一晩培養物の１：５０希釈物を用いてアッセイした（４回の独立実験）。次に、培養物を３７℃にて３時間、〜２×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで静的にインキュベーションし、細胞を遠心により回収し、３ｍｇ／Ｌ  遊離塩素（次亜塩素酸ナトリウム，Sigma）含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）に再懸濁した。３ｍｇ／Ｌ  塩素に５分間曝露した後、培養物を連続希釈し、ＬＢ寒天上に播種した生存細胞数を決定した。Ｅｌ  Ｔｏｒ株９２Ａ１５５２と一致して（Yildiz etal., 1999）、しわ状ＮＣＴＣ  ６５８５細胞は滑らかな細胞より１０，０００倍塩素（５分間、３ｍｇ／Ｌに曝露）耐性であった。これらの知見は、古典的なバイオタイプ株によりしわ状表現型を報告する最初のものであり、ｒＥＰＳはまた古典的なバイオタイプ株の生存を促進することを示している。
【００７０】
ＥＰＳｏｎおよびしわ状表現型への切りかわりはバイオフィルム形成を促進する
しわ状表現型はＥｌ  Ｔｏｒおよび０１３９株におけるバイオフィルム形成を促進できるので、Ｎ１６９６１（Ｅｌ  Ｔｏｒ）、ＮＣＴＣ  ６５８５（古典的）、およびＡｌｄｏｖａ（非０１／非０１３９）株の滑らかな変異体およびしわ状変異体のバイオフィルム形成能を、上記方法を用いて試験した（Watnick et al., 2001）。ＬＢ培地５００μｌを含有するガラス試験管に、各変異体の一晩培養物の１：１００希釈物を植え付けた。
【００７１】
次に、これらの培養物を室温にて２４時間静的にインキュベーションした。次に、培養上清を破棄し、蒸留水で激しく洗浄して未接着の細胞を除去し、０．１％  クリスタルバイオレット（Sigma）６００μｌで満たし、３０分間室温でインキュベーションし、次に水で再び洗浄した。定量的バイオフィルム形成を、細胞関連ダイをＤＭＳＯ（Sigma）６００μｌで抽出して生成した溶液の５７０ｎｍでの吸高度を測定することによりアッセイした。他の研究（Yildiz et al., 1999）と一致して、結果は、試験した全ての株のしわ状変異体が、滑らかな細胞より有意に高い（〜７倍）バイオフィルム形成能を有すること（図２）、およびＥＰＳがビブリオ・コレラのバイオフィルム形成に必須であることを示している。
【００７２】
ビブリオ・コレラは環境下でしわ状表現型（ＥＰＳｏｎ）へ切りかわることができる
ＥＰＳｏｎおよびしわ状表現型への切りかわりが環境下でのビブリオ・コレラの生存を促進するという仮説は、ＥＰＳｏｎへの切りかわりが環境下で起こるという前提に基づくものである。しかしながら、しわ状ビブリオ・コレラを環境（または臨床上）供給源から検出したという報告はない。不運なことに、しわ状株を環境から単離する現行の濃縮方法はない。ＴＣＢＳはビブリオ・コレラの選択および鑑別培地であるが、本発明者の研究室は、ＴＣＢＳがしわ状表現型を阻害（遮断）することを見出した（Ali et al., 2002）。
【００７３】
滑らかな細胞が天然環境の水試料中でしわ状表現型に切りかわるか否かを試験するために、Columbia, Howard County, Marylandの市の端に位置するKittamaqundi湖の天然の湖水を用いた。Kittamaqundi湖は、およそ長さ１マイル、幅１／８マイル、最深７フィートの２７エーカーの人造湖である。およそ数マイルのみ離れたチェサピーク湾は、ビブリオ・コレラの天然の保有所であると知られている。新鮮な水試料を２００２年の３月から９月の暖かい間に湖から集めた。集める際、湖水は、ｐＨ７．６、そしてＮａ＋濃度およびＣｌ−濃度はそれぞれ６ｍＭおよび２ｍＭであった。湖水を使用に先立ち１時間オーロクレーブにかけた。この研究において、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１をＬＢ培地中で一晩、３７℃にて成長させ、遠心して、０．８５％  ＮａＣｌで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、適当に希釈し、湖水１００ｍｌに植え付け、最終濃度１０４〜１０５ｃｆｕ／ｍｌをプレートカウントで確かめた。微生物を室温、暗所にて静的にインキュベーションし、適当な時間間隔で一定分量をＬＢ寒天上に播種し、プレートカウントおよびコロニー形態を決定した。約６ヶ月間試料採取した後の予備的な結果は、ビブリオ・コレラＮ１６９６１がこれらの条件下で存続でき、生存力は１  ｌｏｇのみ低減してことを示唆している。重大なことに、Ｎ１６９６１は、これらの条件下で５０日まで高頻度（１６％まで）で滑らかな（ＥＰＳｏｆｆ）表現型からしわ状（ＥＰＳｏｎ）表現型へ切りかわることができた。これらの研究の利点は、それが本来の環境シナリオおよびＮ１６９６１の野生型株の切りかわりをしっかりと模倣しているということである。これらの研究を拡大することができる一方、これらの結果は、ビブリオ・コレラが天然環境下でしわ状表現型にシフトできることを示唆している。
【００７４】
ビブリオ・コレラでのｒＥＰＳの組成分析
本発明者の研究室の上記知見は、ビブリオ・コレラの古典的（６番目の世界的流行）バイオタイプ株でのしわ状表現型を報告する最初のものであった。古典的なバイオタイプ株ＮＣＴＣ  ６５８５のしわ状変異体の構造組成を決定し、それを他の種の多糖と比較するために、古典的なバイオタイプ株ＮＣＴＣ  ６５８５のしわ状コロニーをＡＰＷ＃３に植え付け、ＥＰＳ産生およびバイオフィルム形成を促進する静的条件下３７℃にて３日間インキュベーションした。ＥＰＳを回収するために、培養物を大きな（１０μｍ）孔サイズフィルター（ＶＷＲ）を用いて濾過した。バイオフィルムを１回ＰＢＳで軽く洗浄し、浮遊細胞を除去し、新しいチューブに移し、３ｍｍのガラスビーズを加え、バイオフィルムを崩壊した。次に、試料を２０，０００ｒｐｍ（５０，０００×ｇ）で１６時間４℃にて遠心し、細胞片および他の混合物を除去した。上清をDetoxi-Gel Affinitypakカラム（アガロースカラムにポリミキシンＢを固定したもの）（Pierce）に通し、試料由来のＬＰＳの痕跡を全て除去し、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ（最終濃度  １００μｇ／ｍｌ）を添加し、次に、３７℃で４時間インキュベーションした。プロテイナーゼＫ（最終濃度  １００μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で一晩、次に、６０℃にて１５分間インキュベーションした。９５％  エタノール  ３容量を添加後、混合物を一晩４℃で沈殿させ、次に、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。遠心したＥＰＳを２回洗浄し、まず８０％  エタノールで、次に９５％のエタノールで洗浄した。ＥＰＳ沈殿物を、ＭＱ  ０．５ｍｌに再懸濁し、−８０℃で２時間インキュベーションし、４時間凍結乾燥させ、次に、複合ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）（Atlanta, GeorgiaにあるComplex Carbohydrate Research Centerにより行った）により分析した。
【００７５】
以下の表２の分析は、６番目の世界的流行株ＮＣＴＣ  ６５８５のしわ状ＥＰＳ（ｒＥＰＳ）が、主要な糖としてグルコースを有する７番目の世界的流行株９２Ａ１５５２（Yildiz et al., 1999）および主要な糖としてマンノースを有する株ＴＳＩ−４（Wai et al., 1998）のＥＰＳと顕著に異なることを示している。組成分析結果はまた、本明細書に記載の細胞外炭水化物が、典型的には多量のペロサミン（perosamine）およびクイノボサミン（quinovosamine）を含有する０１  ＬＰＳと非常に異なることを示唆している（Raziuddin, 1980）。Ｅｌ  Ｔｏｒ株９２Ａ１５５２の結果（４結合ガラクトースおよび４結合グルコースが主要な結合である）（Yildiz et al., 1999）とは対照的に、古典的バイオタイプ株について行ったガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を用いたグリコシル結合分析は、主要な結合が４結合ガラクトシル残基であり、糖骨格を表し得ることを示している。
【００７６】
表２  株ＮＣＴＣ  ６５８５由来のｒＥＰＳのグリコシル組成および結合分析
【表２】
2007500697.tif 000008
ａ全ての残基はピラノース（ｐ）型である。
【００７７】
実施例２
ビブリオ・コレラは、エキソ多糖類（ＥＰＳ）基質、しわの寄ったコロニー形態、増加したバイオフィルム形成および特定の条件下での増大した生存により特徴付けられる「しわ状」表現型に切りかわることができる。しわ状ＥＰＳ（ｒＥＰＳ）の生合成に関与するｖｐｓ遺伝子クラスターは、ＶｐｓＲにより正に制御される。ＥＰＳ産生およびしわ状表現型を促進する培地（ＡＰＷ＃３）を同定し、流行株が非病原性株より高頻度で切りかわることを見出し、このことは、この切りかわりおよび細胞外多糖がコレラの疫学に重要であることを示唆している。この実施例の実験において、滑らかなビブリオ・コレラ株上のトランスポゾン変異誘発を用いて、切りかわりの分子基盤をより理解するために誘導条件下でしわ状表現型にシフトできない変異体を同定した。本発明者は、しわ状表現型とすでに関連するとされているｖｐｓＲ、ｇａｌＥ、およびｖｐｓを同定し、ＬＰＳ合成において役割を担うｒｆｂＤおよびｒｆｂＥ、および芳香族アミノ酸合成において役割を担うａｒｏＢおよびａｒｏＫを含む、これまでに関連するとはされていない遺伝子も同定した。さらに、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼをコードするａｍｉＢにおける変異は、切りかわり、運動性、および細胞形態における欠失を引き起こした。ＧＧＤＥＦおよびＥＡＬドメインを含有するＲｏｃＳと呼ばれる新規調節タンパク質（細胞シグナル伝達の調節）をコードし、ｃ−ジ−ＧＭＰと関連する遺伝子が、しわ状表現型、ＥＰＳ、バイオフィルム形成、および運動性に重要であることも見出した。
【００７８】
材料および方法
しわ状表現型への切りかわりにおいて役割を担う遺伝子の変異誘発およびスクリーニング
本発明者の研究室は高頻度でしわ状表現型への切りかわりを促進する培養条件（ＨＦＲＰ）を既に同定し（Ali et al., 2002）、これを滑らかな表現型からしわ状表現型への分子切りかわりに関与する遺伝子を同定するアッセイの開発において利用した。従前の研究において、本発明者の研究室は、ＡＰＷ＃３と呼ばれる培地中での細胞のインキュベーションが、ビブリオ・コレラの滑らかなＮ１６９６１細胞のしわ状表現型への高頻度（８０％まで）の切りかわりを生じることを報告した（All et al., 2002）。Ｎ１６９６１は、バングラデシュで単離された野生型で７番目に流行型（Ｅｌ  Ｔｏｒ株）である（Levine et al., 1981）。滑らかな（ＥＰＳｏｆｆ）表現型からしわ状（ＥＰＳｏｎ）表現型への分子切りかわりに関与する遺伝子を同定するために、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５ｋｍ２変異誘発を用いた（de Lorenzo et al., 1990およびHerrero et al., 1990）。Ｔｎ５は、自殺ベクターｐＧ７０４に由来するＲ６ＫベースのプラスミドｐＵＴ／ｍｉｎｉ−Ｔｎ５Ｋａｎ（またはｐＵＴＫｍ）上に含有され（Miller et al., 1988）、Ｒ６Ｋおよびそれに由来するプラスミドに必須の複製タンパク質であるＲ６Ｋ特異的λｐｉｒタンパク質を産生する宿主株（例えば、エスケリキア・コリのλｐｉｒ溶原）においてただ維持され得る。それはまた、有効な接合伝達を可能とするプラスミドＲＰ４の伝達供給源であるｏｒｉＴを有する。宿主プラスミドｐＵＴＫｍのレシピエント細胞への送達は、トランスポゾンの外側の部位にあるプラスミド上にコードされる同族トランスポサーゼにより仲介される。この変異誘発システムの利点は、同族トランスポサーゼが転位中のトランスポゾンに付随しないので、Ｔｎ５挿入が安定なことである。従って、それぞれの変異体はスクリーニングするために１つのＴｎ５のみを有する。
【００７９】
エスケリキア・コリＳ１７  λｐｉｒ（ｐＵＴ／ｍｉｎｉ−Ｔｎ５  Ｋｍ）を、滑らかなＮ１６９６１（ＥＰＳｏｆｆ）細胞とかけ合わせ、３０種の独立した同族体から１４，５００種のｍｉｎｉ−Ｔｎ５変異体を得、続いてマイクロタイタープレートのウェル中で保存した。トランスポゾン変異体をマイクロタイタープレートのウェル中ＡＰＷ＃３培地  ２００μｌに植え付け、４８時間インキュベーションし、ＬＢ寒天に植えかえ、２４〜４８時間インキュベーションすると、コロニー形態を視覚的に観察できる、ハイスループットスクリーニングをＨＦＲＰ変異体について行った。このアプローチを用いて、しわ状コロニーを全く産出しないＨＦＲＰ陰性と操作上定義された４３種の変異体を同定した。これらの変異体は、ガラス試験管中ＡＰＷ＃３  ３ｍｌにコロニーを植え付け、４８時間３７℃で静的にインキュベーションすることによる、ＨＦＲＰ誘発条件下でのしわ状表現型への切りかわりにおいて安定かつ欠失であることをさらに確かめた。次に、清潔なガラスビーズ（直径  ４ｍｍ）を加え、培養物をしわ状細胞の凝集を破壊しないようボルテックスした。それぞれの培養物の適当な希釈物をＬＢ寒天に播種し、コロニーを標準的プレートカウントによりカウントし、しわ状細胞のトータルのＣＦＵ／ｍｌおよび頻度を決定した。これらのスクリーニング方法により同定し、試験した４３種の変異体は、しわ状誘発（ＨＦＲＰ）条件下で検出可能なしわ状コロニーを産出せず、これらをさらに研究した。
【００８０】
トランスポゾン挿入部位の配列決定、および破壊された遺伝子の同定
これらの変異体におけるトランスポゾン挿入部位を同定するために、困難ではない任意の１次ＰＣＲ法、次に、既に記載のもの（Bahrani-Mougeot et al., 2002）に類似したＤＮＡ配列決定を用いた。簡単にいうと、任意のＰＣＲを２工程で行った。第１の反応において、変異体の染色体ＤＮＡを、トランスポゾンの両サイドを読み取るプライマー、および２つの任意のプライマーを用いたＰＣＲの鋳型として用いた。これらの１次反応により、トランスポゾン挿入体の接合部に由来するいくつかを含む多数の単位複製配列が生じた。１回目のＰＣＲ産物をＧｅｎｅｃｌｅａｎで精製し、第１ペアの外側にある外方向トランスポゾンプライマーの第２ペア、およびオリジナルの任意のプライマーの一定領域に対応する任意のプライマーを用いて増幅した。この第２のＰＣＲ反応は、トランスポゾン接合部を含む第１のＰＣＲ産物を増幅するために特異的に作用する。増幅したフラグメントは１００〜８００ｂｐの範囲であった。最も強力な結合を生じる産物をアガロースゲルから回収し、第２のＰＣＲで用いたのと同じトランスポゾンプライマーおよび任意のプライマーを用いて配列決定した。配列決定を自動ＤＮＡシークエンサー（３７３Ａモデル，Applied Biosystems）にてPrism ready reaction dye deoxy terminationキット（Applied Biosystems）を用いて製造元の指示に従い行った。
【００８１】
ｖｐｓＲのクローニング
ＰＣＲプライマーＫＡＲ４８６（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＴＡＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＴＣＧＣ−３’；配列番号：３）およびＫＡＲ４８７（５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＧＴ−３’；配列番号：４）を用いて、２．６１ｋｂのＰＣＲフラグメント上にＮ１６９６１のｖｐｓＲ遺伝子を得た。ＰＣＲフラグメントをＢａｍＨ  ＩおよびＳａｃ  ＩＩでそれぞれ切断し、低コピーベクターｐＷＳＫ２９に適当にクローニン化し（Wang et al., 1999）、プラスミドｐＤＫ１０４を得た。
【００８２】
運動性アッセイ
等量のビブリオ・コレラ細胞（ＬＢブロスで成長させたもの）を０．３％  寒天含有ＬＢ培地に突き刺し、３７℃で４時間インキュベーションした後のそれぞれの区域の群直径を測定することで、群プレートアッセイにて運動性を決定した。
【００８３】
ａｍｉＢ変異体株の顕微鏡分析
野生型Ｎ１６９６１およびａｍｉＢ変異体株ＤＫ６３０由来のＬＢプレート上シングル１８時間コロニーを、ＰＢＳ  １ｍｌに再懸濁し、アリコート  ５０μｌをガラススライド上に塗抹し、熱固定し、次に、０．１％  クリスタルバイオレットで３０秒間染色した。次に、スライドをｄＨ２Ｏで洗浄し、乾燥させ、Zeiss Axioskopエピ蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Inc. NY）を用いて細胞形態を観察した。画像をAxioCam Mrmカメラ（Carl Zeiss, Inc. NY）を用いて取り込んだ。
【００８４】
結果および考察
本発明者の研究室は、滑らかな表現型からしわ状表現型へ切りかわることができない４３種のビブリオ・コレラ変異体のトランスポゾン挿入部位の配列決定および同定に成功した。破壊された遺伝子を同定するための公開ビブリオ・コレラＮ１６９６１ゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索（Heidelberg et al., 2000）の概略を表３に示す。
【００８５】
表３  ビブリオ・コレラＮ１６９６１の代表的なＨＦＲＰ変異体
【表３】
2007500697.tif 000009
ａ括弧内の数は同じ遺伝子座に挿入物を有するｍｉｎｉ−Ｔｎ５変異体の数を示す
ｂ遺伝子座および推定タンパク質はビブリオ・コレラＮ１６９６１  ＴＩＧＲ配列決定プロジェクトからもたらされたものである
【００８６】
従前のトランスポゾン変異誘発研究により、安定なしわ状から滑らかな変異体を生じる遺伝子変異が同定されている（Watnick et al., 1999；Yildiz et al., 1999；およびAli et al., 2000）。対照的に、本発明者の研究室が開発したしわ状表現型への切りかわりを促進する条件を利用して、Ｎ１６９６１の滑らかな株上でのトランスポゾン変異誘発を行い、しわ状誘発条件下でのしわ状表現型へ切りかわることができない安定な変異体をスクリーニングした。該知見により、いくつかの生合成のようなしわ状表現型において役割を担うと既に同定されている遺伝子（ｖｐｓオペロン）、および調節遺伝子（ｖｐｓＲ）およびＬＰＳ遺伝子（ｇａｌＥ）における欠損を有する変異体が明らかとなる一方、このスクリーニングにより、まだ同定されていない遺伝子の挿入物を支持する変異体も同定した。これらの新たに同定した変異体を、ＬＰＳをコードするいくつかの機能群（ｒｆｂＤおよびｒｆｂＥ）（ある種の糖結合の付加の触媒において役割を担い、それによりＬＰＳ構造物における置換がまたしわ状（ＥＰＳｏｎ）表現型の活動停止と結びつく遺伝子；芳香族アミノ酸生合成に関与し、それにより芳香族アミノ酸生合成遺伝子がしわ状表現型と直接的または間接的に関連し得る遺伝子（ａｒｏＢおよびａｒｏＫ）；細胞壁加水分解に関与する遺伝子（ａｍｉＢ）、およびＮ１６９６１ゲノムデータベースにおいて「ｐｄｅＡ様」と指定した新規遺伝子座ＶＣ０６５３（本発明者は、ここで、ＧＧＤＥＦおよびＥＡＬドメインを含有する仮想タンパク質（配列番号：２）をコードするＲｏｃＳ（細胞シグナル伝達の調節用；配列番号：１）と呼ぶ））にクラスター形成させることができた。ＧＧＤＥＦおよびＥＡＬドメインの正確な機能はあまりよく分かっていないが、シグナル伝達においていくつかの役割を担うと考えられ、これらのドメインを含有するタンパク質が原核生物種に広く行きわたり、多くの種の調節および生物学において鍵となる機能を担うと思われる。
【００８７】
ＶｐｓＲはしわ状表現型への切りかわりにおいて重要な役割を担う
ビブリオ・コレラにおいてｖｐｓ生合成遺伝子を調節する際の重要性から、本発明者はＤＫ５６２およびＤＫ５８１と呼ばれるいくつかのｖｐｓＲトランスポゾン変異体をさらに研究した。遺伝子座ＶＣ０６６５によりコードされるＶｐｓＲは、ＮｔｒＣ、ＡｌｇＢ、およびＨｙｄＧのようなδ５４応答制御因子ファミリーに高度に類似する仮想の４４４個のアミノ酸タンパク質である（Yildiz et al., 2001およびAli et al., 2000）。本発明者の研究室は、プラスミドｐＤＫ１０４上でのｖｐｓＲ供給が、これらのｖｐｓＲ変異体両方においてしわ状表現型への切りかわりを保持できることを見出した。これらの知見により、これらの変異体におけるしわ状表現型への切りかわりの欠失はｖｐｓＲの変異が原因であることが確かめられた。ＶｐｓＲは転写活性化因子であると予測されるので、本発明者は、それがビブリオ・コレラの運動性を制御するか否かを思索した。ＶｐｓＲ変異体（ＤＫ５６２およびＤＫ５８１）について行った運動性試験は、変異体が親Ｎ１６９６１と比較してその運動性を常に〜５０％低減していることを示した（データは示していない）。ビブリオ・コレラ細胞は典型的には運動性であり、運動性は毒性に重要である（Yancey et al., 1978およびRichardson, 1991）ので、ＶｐｓＲがまたビブリオ・コレラの毒性において役割を担い得るかを思索することを試みた。ＶｐｓＲはＥＰＳ（ｖｐｓ）生合成遺伝子および可能性のある他の表現型を調節する際に重要であるが、ＶｐｓＲ発現を促進する条件およびｖｐｓ遺伝子を調節するその機序はあまりよく分かっていない。
【００８８】
ＡｍｉＢアミダーゼはしわ状表現型への切りかわりにおいて役割を担う
ＡｍｉＢ（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）タンパク質は、ａｍｉＢ遺伝子（ＶＣ０３４４）によりコードされる。ビブリオ・コレラのしわ状株は運動性が影響されていることが既に見出されている（Ali et al., 2002）ので、ａｍｉＢ変異体を試験し、その運動性が影響されているかを確かめた。運動性アッセイは、ＡｍｉＢ変異体（株ＤＫ６３０）がその親Ｎ１６９６１（領域２６ｍｍ）と比較してその運動性を常に〜５０％低減されている（領域１０ｍｍ）ことを示した（図３）。これらの結果は、ＡｍｉＢがビブリオ・コレラの運動性およびしわ状表現型に影響することを示唆している。
【００８９】
細菌細胞壁は、典型的には、ムレインまたはペプチドグリカンとして知られているヘテロポリマーからなる。多くのグラム陰性細菌は、１世代当たりそのムレインの５０％までを退化させ、それを繰り返して新たなムレインを形成する（Goodell, 1985；Park, 1993）。Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼは、しばしば、自己溶解または微生物の細胞壁加水分解と関連する。意外なことに、ＡｍｉＢのような中隔を開裂するグラム陰性細菌の酵素は、最近でも数種で研究されているのみであり、エスケリキア・コリにおいて、ＡｍｉＢ変異体は分離していない細胞からなる長い鎖として成長することが見出された（Heidrich et al., 2001およびHoltje et al., 2001）。アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）において、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼは、アゾトバクター・ビネランジーのその細胞壁を再利用する能力によりアルギン酸産生と結びつく（Nunez et al., 2000）。
【００９０】
ＢＬＡＳＴ検索により、ビブリオ・コレラのＡｍｉＢ配列が、シュードモナス・アエルギノーサ（７ｅ−７８）、サルモネラ・エンテリカ・チフィムリウム（Salmonella enterica Typhi）（７ｅ−６９）、エスケリキア・コリＯ１５７：Ｈ７（６ｅ−５７）、およびエルシニア・ペスチス（６ｅ−５０）を含む多種多様な種において見出されるＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼに高度に類似することが示された。ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１のＡｍｉＢは、セリン（９．５％）、プロリン（６％）、およびスレオニン（６％）が異常に濃縮した５９ｋＤａのタンパク質であると推定される。かかる組成は、グラム陽性細菌の細胞壁と関連するタンパク質ドメインに共通し（Fischetti et al., 1991）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の推定ペプチドグリカン加水分解酵素（ａｃｍＢ）に類似する（Huard et al., 2003）。エスケリキア・コリおよびエルシニア・ペスチスにおいてと同様ビブリオ・コレラにおいて、ａｍｉＢは、ＤＮＡミスマッチ修復において役割を担うｍｕｔＬの直ぐ上流に位置する（Tsui et al., 2003およびParkhill et al., 2001）。ＰＳＯＲＴを用いたコンピューター分析により、ビブリオ・コレラのＡｍｉＢは切断可能なＮ末端シグナル配列を有すると予測され、ＴＭｐｒｅｄを用いた分析により、ＡｍｉＢが２つの膜貫通型ドメイン（スコア２３６３）（一方はＮ末端（アミノ酸１０〜２９）に位置し、これはＮ末端シグナルアンカー配列も表し得、もう一方の膜貫通型ドメインはＣ末端（アミノ酸４４６〜４６５）に位置する）を有することが強く予想される。ｓｅｃ依存性シグナル配列がまた予測されると、ＴｍｐｒｅｄはＮ末端にある膜貫通型領域を推測すると予測される。ビブリオ・コレラのＡｍｉＢはまた、そのＣ末端にあるＬｙｓＭ（リジンモチーフ）ドメインを含有すると予測され、そしてこれは細胞壁分解に関与する酵素において見出されたものである（Bateman et al., 2000）。興味深いことに、ビブリオ・コレラのＡｍｉＢは、種々の哺乳類接着タンパク質の表面結合ドメインとしばしば関連するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを含有する。
【００９１】
ＡｍｉＢは、エスケリキア・コリのような他種において中隔と関連する（Heidrich et al., 2001および2002）ので、ビブリオ・コレラのＡｍｉＢ変異体は、その細胞形態ならびにしわ状表現型が影響されているかどうかを決定した。細胞を調べると、細胞の形態および配列においてＡｍｉＢ変異体（図４Ｂ）と野生型株（図４Ａ）との間に明らかな違いが示された。ＡｍｉＢ変異体の多くの細胞は形が変化し、いくつかは細胞の大きさ（長さおよび幅）が劇的に増大していた。ＡｍｉＢ変異体は、鎖状の細胞の割合が高いようであった。この知見により、細胞分裂または中隔が影響され得ることが示唆される。野生型とＡｍｉＢ変異体ＤＫ６３０との間で成長速度の差は観察されず（データは示していない）、このことは細胞構造の差が成長速度の差に関与しないことを示唆している。ＬＢプレート上で成長させた細胞の知見は継代培養において形質を維持するものである一方、ＬＢブロスで成長させた株の間で明らかに劇的な差は観察されなかった（データは示していない）。例えば、電子顕微鏡を用いてＡｍｉＢ変異体の細胞構造および形態をより詳細に分析するためにさらなる研究が必要であるが、この実施例に示す研究結果は、ビブリオ・コレラの細胞分裂、構造または中隔としわ状表現型との間に結び付きがあることを示唆している。これらの知見は、原核生物のアミダーゼの新たな機能、すなわちしわ状表現型への切りかわりおよびバイオフィルム形成に重要であることの証拠をもたらすものである。
【００９２】
ビブリオ・コレラのＲｏｃＳ：ＧＧＤＥＦおよびＥＡＬドメインを有する保存された調節タンパク質はしわ状表現型を調節する
本発明者の研究室が特に興味を持った別の種類の変異体は、ＲｏｃＳ（前述のデータベースにおける「ＰｄｅＡ様」タンパク質）と呼ばれ、ＧＧＤＥＦおよびＥＡＬドメイン含有推定タンパク質をコードする遺伝子座ＶＣ０６５３における欠失を有するものであった。３種の独立した接合体からｒｏｃＳにおいて変異を含有する３種の独立した変異体が単離されたことに注意することが重要である。この結果は、ビブリオ・コレラのＲｏｃＳが、ｒＥＰＳ産生、しわ状表現型、バイオフィルム形成、およびおそらく他の表現型において重要な役割を担うことを示唆している。この変異体におけるしわ状表現型の欠失は、野生型Ｎ１６９６１とＲｏｃＳ（ＤＫ５６７）細胞間の成長速度の差によっては説明されない（データは示していない）。ビブリオ・コレラのＲｏｃＳ変異体はしわ状表現型への切りかわりが欠失しているようであるという知見は、上記の運動性の試験を促すものであった。運動性アッセイにより、ＲｏｃＳ変異体（ＤＫ５６７）が、その親であるＮ１６９６１（領域２６ｍｍ）と比較して常にその運動性が＞５０％低減していることが示され、このことは、この遺伝子座がまたビブリオ・コレラの運動性に影響することを示唆している（図３）。これらの結果に基づき、本発明者は、ビブリオ・コレラのＲｏｃＳ（およびｃ−ジ−ＧＭＰ）が、種の毒性、バイオフィルムおよび存続において役割を有するものを含むいくつかの表現型を調節すると考える。
【００９３】
興味深いことに、ＧＧＤＥＦドメインは、セルロース（β−１，４−グルカン）合成の調節に関与することが知られているタンパク質において示された（Ausmees et al., 2001）。アセトバクター・キシリナム、リゾビウム・レグミノサルム生物型トリーフォリー（Rhizobium leguminosarum bv. trifolii）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスにおけるセルロース産生は、２つの酵素、ジグアニル酸シクラーゼ（Ｄｇｃ）およびｃ−ジ−ＧＭＰジエステラーゼ（ＰｄｅＡ）（それぞれ、細胞において新規シグナル伝達分子であるｃ−ジ−ＧＭＰのレベルを調節する）の逆効果により調節される（Amikam et al., 1989およびRoss et al., 1990および1991）。ジグアニル酸シクラーゼは、セルロース産生を特異的に活性化するｃ−ジ−ＧＭＰの形成を触媒することにより正の調節因子として作用し、一方ホスホジエステラーゼはｃ−ジ−ＧＭＰを消化し、セルロースを負に調節する。ｃ−ジ−ＧＭＰ分子は、セルロース生合成の可逆アロステリック活性化因子（エフェクター）であると予測される（Ross et al.,1991）。さらに、共通する唯一のエレメントとしてＧＧＤＥＦドメインを有するタンパク質をコードする異なる種由来の遺伝子を用いた遺伝的相補性研究により、ＧＧＤＥＦドメインがジグアニル酸シクラーゼ活性において役割を担い、ｃ−ジ−ＧＭＰレベルの調節において重要であることが示唆される（Ausmees et al., 2001）。本発明者の研究室は、ビブリオ・コレラのＲｏｃＳタンパク質が、ＥＰＳ様物質の産生および増大したバイオフィルム形成と関連するしわ状表現型への切りかわりにおいて鍵となる役割を担うことを見出した。
【００９４】
ビブリオ・コレラのＲｏｃＳのＢＬＡＳＴ検索により、それが高度に保存され、シュードモナス・アエルギノーサ（ＰＡ０５７５；４２％  ｉｄ；５ｅ−９２）、バチルス・アントラシス（ＢＡ５５９３；３７％  ｉｄ；６ｅ−９０）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）（ＲＳｃ０５８８；３６％  ｉｄ；４ｅ−８８）、およびアセトバクター・キシリナム（A. xylinum）（ｃ−ジ−ＧＭＰジグアニル酸シクラーゼ  Ｄｇｃ；４０％，９ｅ−８２）を含む多種多様な他の種において見出された推定タンパク質と有意な相同性を有することが示された。ｄｇｃおよびｐｄｅＡ遺伝子はいくらかの相同性を有し、類似のドメイン構築物を有するが、ｒｏｃＳ変異体はＥＰＳ様物質を産生できないという本明細書での知見は、セルロースを産生できないジグアニル酸シクラーゼ（ｄｇｃ）変異体と一致する。ビブリオ・コレラのＲｏｃＳは、ＰｄｅＡよりアセトバクター・キシリナムのＤｇｃと有意に高度な類似性を有する（データは示していない）。最近の報告によると、「ＲｏｃＳ」相同体をシュードモナス・アエルギノーサ（これはバイオフィルム形成に必須なようである）（Connolly etal., 2003）およびビブリオ・パラハエモリチクスにおいて（これは莢膜多糖産生を調節する）（Gauvener et al., 2003）同定された。加えて、疫病細菌であるエルシニア・ペスチス（Y. pestis）の自己凝集表現型（しわ状表現型の典型である）は、ＧＧＤＥＦ含有タンパク質ＨｍｓＴを必要とする（Jones et al., 1999）。相同な調節（ＧＧＤＥＦ含有）タンパク質がいくつかの種で見出され、しわの寄ったコロニー、ＥＰＳ産生、およびバイオフィルム形成と関連付けられたが、この過程を調節する際のそれらの役割はあまり研究されていない（一部は、利用可能な試薬がないことに起因する）。ＧＧＤＥＦ含有タンパク質はヌクレオチドシクラーゼ活性を有し（Ausmees et al., 2001；Ross et al., 1987；Pei et al., 2001およびTal etal., 1998）、細菌において広がっている（Croft et al., 2000およびGalperin et al., 2001）ことを示唆する証拠は増えている。原核生物におけるこのタンパク質の相同体およびｃ−ジ−ＧＭＰの可能性のある広範囲の出現は、共通する調節系、およびそれらが、ビブリオ・コレラにおけるＥＰＳ産生、しわ状表現型、およびバイオフィルム形成を含む表現型および多種の表現型を調節する際に重要な機能を有し得ることを示唆している。
【００９５】
しわ状様表現型は、サルモネラ・エンテリカ・エンテリティデス（Petter, 1993）、サルモネラ・エンテリカ（Anriany et al., 2001）、ビブリオ・パラハエモリチクス（Gauvener et al., 2003）、シュードモナス・アエルギノーサ（D'Argenio et al., 2002）およびエンテロバクター・サカザキ（Farmer et al., 1980）を含むいくつかの種で報告されている。現在、しわ状表現型はビブリオ・コレラおよびいくつかの他の種で重要な役割を有し得ることが次第に認められつつある。このことは、これらの「変異体」が「氷山の一角」を表し得ることを示唆している。しわ状変異体がバイオフィルム形成、特にニッチまたは特に環境下で特異的な役割を満たすことを示唆するデータが増えている。ビブリオ・コレラの場合、ｒＥＰＳ産生、しわ状表現型、およびＨＦＲＰは、特に環境下での細胞亜種に対するいくつかの進化的または適応した利点をもたらし得る。
【００９６】
この実施例において示す研究において、本発明者の研究室は、ビブリオ・コレラの滑らかな表現型からしわ状表現型への高頻度での切りかわりを促進する条件を同定し、これを利用して、滑らかな表現型としわ状表現型との間の分子切りかわりに関与する遺伝子を同定し、研究した。ビブリオ・コレラ株のいくつかは、特定の条件下でのＥＰＳ産生、増大したバイオフィルム形成、および増大した細胞生存と関連するしわ状表現型への高頻度シフトの有効な機序を引き出したようである。増大したバイオフィルム形成を導くことができる切りかわる能力は、特に、株が同じ生態学的ニッチについて競い合い、耐性、増大したコロニー形成、または細胞凝集を促進する表現型の若干のバリエーションが適応および生存に重要である環境下で適応する利点をもたらし得る。
【００９７】
実施例３
スタフィロコッカス・アウレウスはヒトおよび動物の重要な病原体であり、その抗生物質耐性は公衆衛生の関心事である。バイオフィルム形成は発病に必須であり、バイオフィルムを形成し、伝統的な抗生物質処置に抵抗する能力により、しばしば処置は困難なものとなり、感染が持続する。従って、新規抗菌アプローチは科学、医療、および農業コミュニティーにとって非常に興味を引くものである。本発明者は、実施例１において環状ジヌクレオチドシグナル伝達分子であるｃ−ジ−ＧＭＰ（３’５’−環状ジグアニル酸）のレベルを調節することが原核生物の表現型を調節する際に適用できると提案した。この実施例の以下に記載する実験において、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰは、メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）株を含むスタフィロコッカス・アウレウスのヒト臨床およびウシ乳房炎に対する活性を示す。本実施例により、化学的に合成したｃ−ジ−ＧＭＰは生理食塩水に溶解性かつ安定であり、沸騰、および酸およびアルカリに曝露した後も安定であることが示される。細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰでのスタフィロコッカス・アウレウスの処置は、無処置対照と比較して、液体培地における細胞と細胞（細胞間）の接着相互作用を阻害し、ヒトおよびウシ単離物における細胞と表面の相互作用およびバイオフィルム形成を低減（＞５０％）した。ｃ−ジ−ＧＭＰは、スタフィロコッカス・アウレウスのヒト上皮ＨｅＬａ細胞との接着を阻害し、そしてｃ−ジ−ＧＭＰはＨｅＬａ細胞への明らかな毒性を示さず、マウスにおいて致命的ではなかった。グアノシンヌクレオチドアナログＧＭＰは、バイオフィルムに対する効果は劣っており、一方５’−ＧＭＰは効果を有していなかった。本明細書におけるデータは、スタフィロコッカス・アウレウスが細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰシグナルに感受性であり、応答し得ることを示唆している。単独、あるいは他の抗菌剤と組み合わせて用いられる場合、ｃ−ジ−ＧＭＰのような環状ジヌクレオチドは、バイオフィルムの阻害および制御、ならびに感染症の制御および処置における新規かつ魅力的なアプローチとなる。
【００９８】
材料および方法
用いたｃ−ジ−ＧＭＰ、ｃＧＭＰおよび５’−ＧＭＰヌクレオチド  ｃ−ジ−ＧＭＰジアンモニウム塩を純粋かつ高収率で製造する最近記載された新規合成方法を用いて、本実施例の研究において用いるｃ−ジ−ＧＭＰを純粋な形で生化学的に合成した（図５Ａ）（Hayakawa et al., 2003）。使用前に、まず分子を０．９％  ＮａＣｌ中に再懸濁し、２ｍＭ  溶液を調製して、凍結乾燥させたｃ−ジ−ＧＭＰの純度および安定性を決定し、次にＨＰＬＣ分析およびＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分光計により確認した。ｃＧＭＰ（グアノシン３’，５’−環状モノリン酸塩，Sigma #G7504）および５’−ＧＭＰ（グアノシン５’−モノリン酸塩，ＴＣＩ，Tokyo Kasei Kogyo Co.）ヌクレオチドも用いた。別段述べてない限り、それぞれのヌクレオチドの０．９％  ＮａＣｌ中の４ｍＭ  ストック溶液を調製し、必要になるまで４℃で保存した。
【００９９】
用いた細菌株および成長培地  スタフィロコッカス・アウレウスのヒト臨床単離物を本研究において用い、−７０℃、５０％  グリセロール中で保存した。スタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５は、Veterans Affairs Medical Center（Baltimore, MD、緊急処置ベット数およそ２００床）の患者の血液培養物から２００３年に単離されたものである。ＤＫ８２５はＶＡＭＣの診断的微生物学研究室により単離され、標準的なプレーティング技術、コアグラーゼ検出用BactiStaph Latex 150試験キット（Remel）を用いたラテックス凝集、および抗生物質感受性試験により、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）であると確認された（Sensititre plates, Microbiology Systems）。スタフィロコッカス・アウレウス株１５９８１は、Universitaria de Navarra, Spain（Inigo Lasa、パーソナルコミュニケーション）の臨床研究室によって耳炎患者から１９９９年に単離された高接着性高バイオフィルムヒト臨床株である（Valle et al., 2003）。スタフィロコッカス・アウレウス１５９８１は、天然のａｇｒ変異体であり、ＭＥＴ、ＡＭＸ、ＣＬＩ、ＥＲＹ、ＤＯＸ、ＦＯＦ、ＶＡＮ、ＣＩＰに感受性であり、ＧＥＮに耐性である。本研究で用いた野生型ウシ潜在性乳房炎株は、Ｖ３２９（高バイオフィルム株）（Cucarella et al., 2001）、Ｖ２９９（ｂａｐ陰性ｉｃａＡＤＢＣ陽性）（Cucarella et al., 2004）およびＶ３１５（ｂａｐ陰性およびｉｃａＡＤＢＣ陰性）（Cucarella et al., 2004）であった。スタフィロコッカス・アウレウス株Ｍ５５６（Ｖ３２９のアイソジェニックなトランスポゾン挿入ｂａｐ変異体）（Cucarella et al., 2001）も用いた。別段示していない限り、スタフィロコッカス・アウレウス株は、３７℃、ヒツジ血液寒天プレート上、または０．２５％  グルコース添加トリプティックソイブロス（ＴＳＢ，Difco）中で成長させた。
【０１００】
ｃ−ジ−ＧＭＰ安定性試験  用語ｃ−ジ−ＧＭＰを本明細書で用いるが、ｃ−ジ−ＧＭＰジアンモニウム塩（遊離二リン酸ではない）をこれらの安定性試験のために用いた。（ｉ）沸騰水中：２ｍＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ水中溶液を、ｃ−ジ−ＧＭＰ  ２．４２ｍｇ（３．３μｍｏｌ）をイオン交換／イオンを含まない水（蒸留水をイオン交換樹脂を通して調製した）１．６５ｍＬに溶解して調製した。この溶液を１００℃で１０分間加熱し、次に減圧下で濃縮した。生じた残渣を、以下に示す条件下でＨＰＬＣ分析の対象とした。（ｉｉ）ｐＨ３の溶液中：上記の２ｍＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ水溶液  ５００μｌ（１μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰを含有）を１ｍＭ  ＨＣｌ  ２０ｍＬ中に溶解し、ｐＨ３（ｐＨメーターで確かめた）を得た。得られた溶液を室温にて１時間攪拌し、次に、０．１ｍＭ  ＮａＯＨ  ２００ｍＬを添加して中和した。水を減圧下で蒸発させ、得られた残渣をＨＰＬＣ分析の対象とした。（ｉｉｉ）ｐＨ１０の溶液中：上記２ｍＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ水溶液  ５００μｌ（１μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰを含有）を、０．１ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液  ２００ｍＬ中に溶解し、ｐＨ１０（ｐＨメーターで確かめた）の溶液を得た。得られた溶液を室温にて１時間攪拌した。反応物を１ｍＭ  ＨＣｌ  ２０ｍＬを添加してクエンチした。得られた中和溶液を減圧下で濃縮し、残渣物質をＨＰＬＣ分析の対象とした。ＨＰＬＣ分析を、Waters 2996 Photodiode Array Detectorを備えたWaters 2695 Separation Module上で次の条件下で行った。カラム：Nacalai Tesque COSMOSIL 5C18-AR-IIカラム（４．６ｍｍ（直径）×２５０ｍｍ（長さ））；検出：２５４ｎｍの紫外線；温度：４０℃；溶出：Ａ＝０．９％  ＮａＣｌ（水溶液）、Ｂ＝水：アセトニトリル  ２０：８０混合物；流速；１ｍＬ／分；０〜１０分：Ａ  １００％；１０〜６０分：Ａ  １００％／Ｂ  ０％からＡ  ４０％からＢ  ６０％への直線的勾配。
【０１０１】
抗生物質感受性試験  感受性試験を、Sensititreマイクロタイタープレートにて製造元（Microbiology Systems）の指示に従い行った。
【０１０２】
スタフィロコッカス・アウレウスの成長速度に対する効果  スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５を、グリセロールストックから血液寒天プレート上に継代培養し、３７℃で１８時間インキュベーションした。次に、シングルコロニーをＴＳＢブロス（０．２５％  グルコース添加）５ｍｌに植え付け、３７℃で４時間２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。一晩培養物の１０−３希釈物１００μｌアリコートを、ＴＳＢブロス  ５ｍｌ含有試験管に開始細胞カウント  １０５ｃｆｕ／ｍｌ（プレーティングにより確かめた）で植え付けた。「処置」試料のため、ｃ−ジ−ＧＭＰの適当なアリコートを添加し、２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ（最終濃度）とした。負の「無処置」対照として、ＴＳＢ含有試験管および等量の０．９％  ＮａＣｌを研究に含めた。時間０で、それぞれの試料５０μｌを血液寒天プレートに播種し、開始ｃｆｕ／ｍｌを測定した。次に、試験管を３７℃で８時間、振盪条件下でインキュベーションし、全試験管由来のアリコートを３０分毎に播種した。
【０１０３】
試験管凝集アッセイおよび光学顕微鏡
１８時間後の血液寒天プレート由来コロニーをＰＢＳ  １ｍｌに植え付け、〜５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ（プレートカウントで確かめた）含有０．５  McFarland標準とした。次に、０．５  McFarland標準由来のアリコート  ５μｌを、ＴＳＢ  １ｍｌ含有５ｍｌ  ポリスチレンチューブに植え付け、〜１０５ｃｆｕ／ｍｌ（プレートカウントで確かめた）とした。これらのチューブを、ｃ−ジ−ＧＭＰ  ５０μｌと共に植え付けて、最終濃度２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰを得るか（「処置」試料を表す）、または対照として０．９％  ＮａＣｌ  ５０μｌと共に植え付けた（「無処理」対照を表す）。培養物を３７℃で２４時間静的にインキュベーションした。インキュベーション後、これらの培養物を肉眼的および顕微鏡（Zeiss Axioskop）で調べ、視覚可能な細胞と細胞の凝集の存在または不存在を調べた。
【０１０４】
スタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰの作用  スタフィロコッカス・アウレウス株を、グリセロールストックから血液寒天プレートに継代培養し、３７℃で１８時間インキュベーションした。シングルコロニーを、ＴＳＢブロス  ５ｍｌに清潔なループで植え付け、３７℃で１８時間２５０ｒｐｍで攪拌しながら、分光光度計（SpectraMAX 250, Molecular Devices）を用いて分光学的に測定してＯ．Ｄ．６６０値が３．０に達するまでインキュベーションした。インキュベーション後、培養物を新しいＴＳＢで１：２５０希釈し、希釈した培養物  ２００μｌを平底ポリスチレンマイクロタイタープレート（Evergreen Scientific）のウェルに移した。バイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰ処置の効果を試験するために、ｃ−ジ−ＧＭＰの１０倍希釈物を含有する「処置」試料の連続希釈物をＴＳＢ中にセットアップした。これは次の最終濃度（０、２、２０、および２００μＭ）のｃ−ジ−ＧＭＰを含有するものであった。これらのバイオフィルム実験において、０．９％  ＮａＣｌを等量、異なるウェルセットに加え、これは「無処置」対照試料を表すものとした。次に、マイクロタイタープレートを３７℃で２４時間または４８時間静的にインキュベーションした。インキュベーション後、上清を注意して捨て、ウェルをＰＢＳ  ２６０μｌで２回洗浄した。次に、プレートを、ペーパータオル上で３０分間乾燥させ、その後０．１％  クリスタルバイオレット  ２６０μｌを各ウェルに添加し、プレートを室温にて３０分間インキュベーションした。クリスタルバイオレットを捨て、プレートを水で簡単に洗浄し、ウェルを３０分間乾燥せ、次に、ＤＭＳＯ  ２６０μｌを各ウェルに添加し、１時間軽く振盪し、Ｏ．Ｄ．５７０値を分光光度計（SpectraMAX 250, Molecular Devices）を用いて測定した。これらのバイオフィルムアッセイの結果は、デュプリケートで試験した少なくとも３種の独立したコロニーから得られたデータに基づくものであった。
【０１０５】
スタフィロコッカス・アウレウスの既に形成されたバイオフィルムに対するｃ−ジ−ＧＭＰの作用  スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５を、グリセロールストックから血液寒天プレートに継代培養し、３７℃で静的にインキュベーションした。シングルコロニーをＴＳＢブロス（０．２５％  グリコース含有）５ｍｌに植え付け、３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで振盪しながら、培養物がＯ．Ｄ．６６０値〜３．０に達するまでインキュベーションした。インキュベーション後、培養物を、新たなＴＳＢブロスで１：２５０希釈し、希釈した培養物  ２００μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに移し、スタフィロコッカス・アウレウス培養物を有するウェルを含有するプレートを３７℃で２４時間静的にインキュベーションした。２４時間後、ｃ−ジ−ＧＭＰを適当量添加し、最終濃度２００μＭとし、これを「処置」試料を表すものとした。「無処置」の対照として、０．９％  ＮａＣｌ同量を独立したウェルに加えた。次に、プレートを３７℃でさらに２４時間静的にインキュベーションした。インキュベーション後、培養物を捨て、マイクロタイタープレートを１×ＰＢＳで２回洗浄した。等量（２６０μｌ）の１×ＰＢＳを洗浄のため各ウエルに加えた。次に、プレートをペーパータオル上で〜３０分間乾燥させた。０．１％  クリスタルバイオレット  ２６０μｌを各ウェルに添加し、バイオフィルム中の細胞を染色し、プレートを室温にて３０分間インキュベーションした。クリスタルバイオレットを捨て、プレートをｔａｐ水で軽く洗浄し、ペーパータオル上で３０分間乾燥させた。ＤＭＳＯ  ２６０μｌを各ウェルに添加し、１時間軽く振盪した。バイオフィルムの量を定量的にアッセイするため、Ｏ．Ｄ．５７０を分光光度計（SpectraMAX 250, Molecular Devices）により測定した。結果は、デュプリケートで試験した少なくとも３種の独立したコロニーに基づくものであった。
【０１０６】
上皮細胞アッセイ  ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）を完全培地（グルタミン（Invitrogen）および５０ｐｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを含む１０％  ＦＢＳ（Sigma）ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中コンフレントになるまで成長させ、０．１％  トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理した。ＨｅＬａ細胞約１×１０５をチャンバースライドの各ウェルに播種し、次に、ＨｅＬａ細胞を３７℃、５％  ＣＯ２中で少なくとも１８時間、８５％  コンフレントとなるまでインキュベーションした。感染に先立ち、ＨｅＬａ細胞を温ＰＢＳで２回洗浄し、次に、温ＦＭＥＭ／Ｆ１２  ５００μｌを各ウェルに添加した。細菌接着アッセイのため、スタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５の一晩培養物をＬＢブロス中、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩成長させた。インキュベーション後、一晩培養物  １ｍｌをペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ  １ｍｌに再懸濁した。ウェル中のＨｅＬａ細胞をＨＢＳＳ  ５００μｌで２回洗浄し、所望の濃度（０、２、２０、および２００μＭ）のｃ−ジ−ＧＭＰを含むＤＭＥＭ  アリコートを調製した。各濃度のｃ−ジ−ＧＭＰを含有するＤＭＥＭ（５００μｌ）をＨｅＬａ細胞含有ウェルに植え付け、次にスタフィロコッカス・アウレウス  １０μｌ（〜１０７）（ＭＯＩ  ＨｅＬａ：細菌〜１：１００）を添加した。上皮細胞アッセイをＣＯ２中で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ  ５００μｌで２回洗浄し、２％  ホルマリンで２０分間固定した。細胞を再びＰＢＳで２回洗浄し、１０秒間ギムザ染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、次に細胞を水中の９０％  グリセロール  ４０μｌで覆い、カバースライドを置いた。スライドを光学顕微鏡（Zeiss Axioskop）下、６３０×ｍａｇで観察した。１００個の個々のＨｅＬａ細胞との細菌の接着レベルを、それぞれデュプリケートの処理について計測し、平均を決定した。
【０１０７】
安全性および毒性アッセイ  ＨｅＬａ細胞の毒性研究のため、種々の濃度（０、２５、５０、１００、２００、および４００μＭ）のｃ−ジ−ＧＭＰを、完全培地（細菌を含まない）中上記のように調製したＨｅＬａ細胞含有チャンバースライドの別々のウェルにて試験した。ＨｅＬａ細胞形態を１２、２４、および４８時間インキュベーションした後、顕微鏡で調べた。マウスに投与したｃ−ジ−ＧＭＰの可能性のある致死性も調べた。これらの研究において、成体メスＣＤ−１マウスおよび生後５日間のマウスに、２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ  ５０μＬを経口で植え付け、ｃ−ジ−ＧＭＰ処置の２４時間後に調べた。
【０１０８】
結果および考察
医療器具のような種々の表面上または組織上でバイオフィルムを形成するスタフィロコッカス・アウレウスの能力は、疾患の発病において重要かつ必須の第１工程である。コミュニティーおよび病院内のスタフィロコッカス・アウレウスの総合的普及率、バイオフィルムを形成するその能力、およびスタフィロコッカス・アウレウスが複数の抗生物質にしばしば耐性であるという事実により、スタフィロコッカス・アウレウスは主要な公衆衛生の課題となる。従って、ヒトおよび動物におけるバイオフィルム形成を低減させる新規介入および抗菌方法は、対応する抗生物質感受性の増大、およびより有効な予防および処置ストラテジーとなり得る。この研究は、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスのヒトおよび動物単離物における細胞と細胞との相互作用およびバイオフィルム形成を阻害することを示している。
【０１０９】
スタフィロコッカス・アウレウスにおけるＧＧＤＥＦドメインの同定はｃ−ジ−ＧＭＰとの結びつきを示唆する  ｃ−ジ−ＧＭＰはＧＧＤＥＦアミノ酸ドメインを含有するタンパク質と関連する。ＧＧＤＥＦドメインは、アデニル酸シクラーゼ様折りたたみを有し、環状ジグアニル酸合成酵素として作用する〜１８０個のアミノ酸タンパク質フラグメントである。これらのドメインは、保存されたＧＧ（Ｄ／Ｅ）ＥＦモチーフ（配列番号：５）を有するが、また多くの他の保存された残基も有する（Galperin, 2001および2004）。ＧＧＤＥＦタンパク質は、細菌のエキソ多糖類、バイオフィルム形成、コロニー形成、および接着の調節において重要であるという知見が増大している（Bomchil et al., 2003；D'Argenio et al., 2002；Jones et al., 1999およびRoumping et al., 2000）。これらの種類のタンパク質は細菌に広く行きわたっており、これは、広範囲の種が標的としての可能性を有し、ｃ−ジ−ＧＭＰレベルを調節することで調節される表現型および多くの種がＧＧＤＥＦドメインを含む多数のタンパク質を有することを示唆している（Galperin, 2001および2004）。興味深いことに、ＣＯＧデータベースの検索により、スタフィロコッカス・アウレウスが、Ｃ末端にＧＧＤＥＦドメインを含むただ１つのタンパク質（ＳＡ０７０１、ＣＯＧ２１９９）、および修飾ＧＧＤＥＦドメインを含む別のタンパク質（ＳＡ００１３、ＣＯＧ３８８７）を有することが示される（Tatusov et al., 2001）。Ｐｆａｍ分析（pfam. wustl. edu）によると、ＳＡ０７０１のＮ末フラグメントは、５ＴＭ−５ＴＭＲ＿ＬＹＴタイプ（５個の推定膜貫通型セグメント、Ｐｆａｍエントリー  ＰＦ０７６９４）の不可欠な膜感覚ドメインであると予測され、それゆえ、ジグアニル酸シクラーゼアウトプットドメインを含む膜受容体であると予測される。不運なことに、スタフィロコッカス・アウレウス中のこれらの推定シグナル伝達タンパク質の役割、およびそれらがｃ−ジ−ＧＭＰと結びつく可能性があるか否か、ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスにより作られるか否か、およびｃ−ジ−ＧＭＰの調節効果が全ての種で類似するか否かはまだ分かっていない。
【０１１０】
ｃ−ジ−ＧＭＰの安定性  種々の物理的条件下および処置下でのｃ−ジ−ＧＭＰの安定性はあまりわかっていない。しかしながら、ｃ−ジ−ＧＭＰが抗菌ストラテジーの一部または抗菌剤として用いられるべきものであると、その安定性はより研究されることを必要とする。本発明者の研究室は、数種の保存条件下での保存後、次に熱、酸（ｐＨ３）およびアルカリ（ｐＨ１０）処理を含む種々の曝露後にｃ−ジ−ＧＭＰの安定性を決定した。
【０１１１】
イオンを含まない蒸留水（蒸留水をイオン交換樹脂カラムを通して調製される）にＨＰＬＣ分析の直前に再懸濁され、２ｍＭ  ストックとなる、ｃ−ジ−ＧＭＰのきちんとした（凍結乾燥粉末由来物）形のＨＰＬＣ分析は、数日間−７８℃でのｃ−ジ−ＧＭＰのきちんとした形の保存は凝集分子（構造は現時点ではわかっていないが、決定されつつある（データは示していない））を形成することを示した。さらに、希釈剤として水を含む２ｍＭ  ストック溶液の任意の温度（１０〜２０℃）での幾日間かの保存は、凝集産物の形成を生じる。しかしながら、興味深いことに、溶液を０．９％  ＮａＣｌ濃度に調節すると、凝集分子はモノマー型に戻ることを見出した（ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分光分析により決定）（データは示していない）。ｃ−ジ−ＧＭＰは、１００ｍＭ  リン酸バッファー中で少なくとも１ヶ月間−７８℃、４℃、および２５℃で安定であり、構造も変化しなかった（データは示していない）。０．９％  ＮａＣｌ溶液中で、ＨＰＬＣ分析により、モノマー構造のｃ−ジ−ＧＭＰは、−７８℃、４℃、および２５℃で少なくとも３ヶ月間保存後非常に安定であった（図５Ｂ）。ｃ−ジ−ＧＭＰはまた、１００ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー中、少なくとも１ヶ月間、−７８℃、４℃、および２５℃で安定であり、構造も変化を受けないことを見出した。これらの結果は、ｃ−ジ−ＧＭＰのストック溶液が、ｃ−ジ−ＧＭＰが安定であり、少なくとも数ヶ月間モノマー型で残るように、０．９％  ＮａＣｌ中に調製されるべきであることを示唆している。
【０１１２】
セルロース産生を活性化する際のｃ−ジ−ＧＭＰの役割を調べたグルコンアセトバクター・キシリナムにおけるRoss等の（Ross et al., 1991）従前の研究と一致して、この研究のＨＰＬＣ分析は、化学的に合成されたｃ−ジ−ＧＭＰは１００℃に１０分間曝露した後安定であることを示した。Rossは、「活性化因子」（セルロース活性化活性により測定）が比較的強いアルカリ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、ｐＨ〜１３．５、３７℃で２４時間）での処置の後も不安定であることを見出したが、本研究で行ったＨＰＬＣ分析は、ｃ−ジ−ＧＭＰが中程度のアルカリ（０．０００１Ｎ  ＮａＯＨ、ｐＨ１０、２０〜２５℃で１時間）での処置後安定であることを示唆するものであった。Ross等（Ross et al., 1991）による従前の研究における知見と一致して、本発明者の研究室のデータは、化学的に合成されたｃ−ジ−ＧＭＰが酸処理（０．００１Ｎ  ＨＣｌ、ｐＨ３、２０〜２５℃で１時間）後安定であることを示した。これらの研究に基づき、ｃ−ジ−ＧＭＰは安定であり、溶解性の低分子量の分子である。
【０１１３】
スタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５の抗生物質感受性
スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５をさらに特徴付けるために、抗生物質感受性試験を通常用いられる抗生物質に対して行った。ＤＫ８２５についての抗生物質感受性試験を次のＭＩＣプロフィル（μｇ／ｍｌ）で行った：ペニシリン，ＰＥＮ  ＞８；アンピシリン，ＡＭＰ  ４；オキサシリン，ＯＸＡ  ＞２；テトラサイクリン，ＴＥＴ  ＞３２；リファンピン，ＲＩＦ  ＞２；クラリスロマイシン，ＣＬＲ  ＞４；レポフロキサシン，ＬＶＸ  ２；シプロフロキサシン，ＣＩＰ  ＞２；モキシフロキサシン，ＭＸＦ  ２；クリンダマイシン  ＣＬＩ  ＞２；エリスロマイシン，ＥＲＹ  ＞４；バンコマイシン，ＶＡＮ＜  ０．５。これらの知見はさらに、スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５が通常用いられる多数の抗生物質に耐性であるが、バンコマイシン感受性であることを示した。
【０１１４】
ｃ−ジ−ＧＭＰ処置は、スタフィロコッカス・アウレウス細胞と細胞の相互作用を予防する。スタフィロコッカス・アウレウスに対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果についての１次実験により、ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスの成長速度に対する効果を有するか否かを調べた。８時間までの成長速度を１時間毎に調べ、２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰが成長速度に対して明らかな効果を有さないことを示した。次に、本発明者の研究室は、ｃ−ジ−ＧＭＰ処置が、液体培地中での２４時間静的インキュベーション後にスタフィロコッカス・アウレウス細胞の肉眼的成長および出現に影響を及ぼすか否かを試験した。インキュベーション後、処理した培養物および無処理培養物を、視認できる細胞と細胞の凝集（clumping）および凝集について視覚的に調べた。スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５での結果は、２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰで処理した培養物は、明らかに視認可能な細胞凝集または管底部でのペレットを現さなかった（図６Ａ）が、無処理培養物は明らかな細胞凝集およびペレットを示した（図６Ｂ）。ｃ−ジ−ＧＭＰで処理した培養物および無処理培養物を播種すると、培養物間での最終細胞カウント（６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）に差はなかった。このことは、細胞と細胞の相互作用の阻害が成長速度または最終細胞数の主要な差に寄与しないことをさらに示唆している。ｃ−ジ−ＧＭＰに応答した管底部での細胞凝集に対する同様の効果を、いくつかの独立した野生型スタフィロコッカス・アウレウスウシ乳房炎株（Ｖ３２９、Ｖ２９９、Ｖ３１５）で観察した（データは示していない）。Cucarella等（Cucarella et al., 2001）による最近の研究により、管底部での細胞凝集の蓄積を、野生型Ｖ３２９について肉眼でのみ観察し、アイソジェニックなｂａｐ変異体Ｍ５５６では観察しなかった。株Ｍ５５６でのそれほど多くない視認可能な凝集を観察する一方で、本明細書での結果はｃ−ジ−ＧＭＰ処理は、無処理培養物と比較して管底部でのＭ５５６細胞の細胞凝集を阻害することを明らかに示唆していた（図６Ｅおよび６Ｆ）。ｂａｐ変異体であるＭ５５６株がｉｃａ陽性であることに気づくことも重要である（Cucarella et al., 2001）。これらの２つの研究における知見を説明し得る２点の可能性は、Cucarella等の結果が振盪培養物に基づくものであること、または異なる供給源から得られたＴＳＢが細胞成長および細胞相互作用に影響し得ることである。細胞凝集の阻害は一貫し、同様のｃ−ジ−ＧＭＰ処理（用いたｃ−ジ−ＧＭＰは独立して合成されたものである）後観察された。この肉眼的分析結果は、スタフィロコッカス・アウレウスが細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰに応答すること、およびｃ−ジ−ＧＭＰ処理がヒトおよび動物単離物においてスタフィロコッカス・アウレウス細胞凝集を阻害することを示している。
【０１１５】
上記の処理培養物および無処理培養物間で観察される肉眼的な違いに横たわる基盤をさらに研究するために、これらの培養物における細胞をボルテックス処理し、グラム染色し、光学顕微鏡により視覚化した。スタフィロコッカスという名前は、「ブドウの房」を意味するギリシア語に由来する。しかしながら、ＤＫ８２５  ｃ−ジ−ＧＭＰ処理培養物のグラム染色試験は、典型的なブドウ様クラスターを示す無処理細胞（図６Ｄ）より液体培地中での細胞と細胞の相互作用および凝集（図６Ｃ）を劇的に減少したことを示した。図６における知見と同様に、そして肉眼的分析と一致して、少ない細胞間相互作用および凝集を野生型ウシ乳房炎株（Ｖ３２９、Ｖ２９９、Ｖ３１５）のグラム染色および光学顕微鏡像により観察した（データは示していない）。野生型株Ｖ３２９はｂａｐ陽性ｉｃａＡＤＢＣ陽性であり、一方野生型株Ｖ２９９およびＶ３１５は、それぞれｂａｐ陰性ｉｃａＡＤＢＣ陽性、ｂａｐ陰性ｉｃａＡＤＢＣ陰性であることに気づくことが重要である（Cucarella et al., 2004）。ｂａｐ遺伝子はウシ乳房炎単離物において少ない率でのみ存在すると思われるので、大抵のウシ乳房炎単離物はｂａｐ陰性であると思われ、ｂａｐはヒト単離物にも存在しないようである（Cucarella et al.,2001）。この実施例の実験において、アイソジェニックなｂａｐ変異体株Ｍ５５６における細胞凝集はその親Ｖ３２９よりずっと少ないが、データは、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理がＭ５５６における細胞凝集を阻害することを示唆している（図６Ｅおよび６Ｆ）。野生型および変異体株の分析のこのデータは、細胞相互作用の阻害がｂａｐおよびｉｃａＡＤＢＣ遺伝子クラスター独立であることを含意しているようである。重要なことに、肉眼的分析結果は顕微鏡観察と相関し、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理が、ヒトおよびウシ単離物においてスタフィロコッカス・アウレウス細胞と細胞（細胞間）接着性相互作用を阻害できることをさらに示唆する。
【０１１６】
ｃ−ジ−ＧＭＰは、ヒトおよびウシスタフィロコッカス・アウレウスにおけるバイオフィルム形成を阻害する。ｃ−ジ−ＧＭＰ処理がスタフィロコッカス・アウレウス細胞と細胞の相互作用を阻害すると考え、本発明者はｃ−ジ−ＧＭＰがバイオフィルム形成を阻害すると予測する。定量的バイオフィルムの結果は、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理が、無生物ポリスチレン表面上でのスタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５バイオフィルム形成を用量に依存して阻害することを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰの阻害効果を、２０μＭ（〜５０％低減）、２００μＭ（〜６５％低減）、および４００μＭ（〜８５％低減）で観察した。処理培養物と無処理培養間のバイオフィルム形成の同様の違いを、４８時間の測定後観察した。これは、処理耐性の選択が生じなかったことを示唆している（データは示していない）。結果は、試験した濃度で高度に接着性の高バイオフィルムスタフィロコッカス・アウレウス株１５９８１において２４時間の時点で同様のバイオフィルム形成のｃ−ジ−ＧＭＰによる阻害も示した（図７Ｃ）。コアグラーゼは、宿主組織に対するスタフィロコッカス・アウレウスのコロニー形成に重要であると示されてきたが、ＤＫ８２５における処理細胞と無処理細胞間のコアグラーゼ産生の違いは見出されなかった（データは示していない）。定量的バイオフィルムの結果は、肉眼的データおよび肉眼的な細胞と細胞の凝集データと相関し、このことは、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰがヒト単離物において細胞相互作用およびバイオフィルム形成を阻害することを示唆している。
【０１１７】
定量的バイオフィルム分析はまた、ｃ−ジ−ＧＭＰがウシ潜在性乳房炎株のバイオフィルム形成を阻害することも示した（図８Ａ〜８Ｄ）。野生型ウシＶ３２９株は、ポリスチレン表面での強力なバイオフィルム産生体であることが既に示されているが、アイソジェニックなｂａｐ変異体Ｍ５５６はこのバイオフィルム能が減弱していた（Cucarella et al., 2001）。本明細書における分析は、この知見を支持するが、重要なことに、ヒト単離物と同様ｃ−ジ−ＧＭＰは、これらの野生型および変異体ウシ株、ならびに野生型ｂａｐ陰性株Ｖ２９９および野生型ｂａｐ陰性ｉｃａＡＤＢＣ陰性株Ｖ３１５（非常に低レベルでバイオフィルムを形成する）においてバイオフィルム形成を劇的に阻害することを示している（図８Ｃおよび８Ｄ）。同様に、これらの結果は、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理がバイオフィルム形成に関与するスタフィロコッカス・アウレウスの細胞と細胞の相互作用および細胞と表面の相互作用を阻害することを示すためのさらなる説得力のある証拠を提供する。これらの知見は、ｃ−ジ−ＧＭＰのような環状ジヌクレオチドが、医療器具のような臨床上関連する表面上でのバイオフィルムを防止するのに有用であり、ヒトおよび動物の感染症の制御において可能性を有することも示唆している。
【０１１８】
スタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成に関与する調節機序は、完全には分かっていない。しかしながら、スタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成は、ｉｃａＡＤＢＣ遺伝子により合成され、細胞凝集においても役割を担う細胞外多糖細胞間接着（ＰＩＡ／ＰＮＡＧ／ＰＳＡ）の産生により仲介されることが知られている（Cramton et al., 1999；Maira-Litran et al., 2002およびMcKenney et al., 1999）。ＳａｒＡ調節因子は、Ｂａｐタンパク質を有している（Cucarella et al., 2001および2002）ので、バイオフィルム形成に重要であると示された（Beenken et al., 2003；Blevins et al., 2002およびValle et al., 2003）。作用の正確な機序が依然として決定されるべきであるが、株１５９８１の結果は機序がａｇｒ独立であり得ることを示唆し、ウシ単離物での初期研究は機序がｂａｐおよびｉｃａＡＤＢＣ独立であり得ることを示唆している。
【０１１９】
バイオフィルム形成に対するｃＧＭＰおよび５’−ＧＭＰの効果
ｃ−ジ−ＧＭＰで観察された効果に基づき、本発明者の研究室は、次に同じ濃度（２００μＭ）のｃＧＭＰ（グアノシン３’，５’−環状モノリン酸塩）および５’−ＧＭＰ（グアノシン５’−モノリン酸塩）のような細胞外グアノシンヌクレオチドアナログで処理した培養物が、スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５のバイオフィルム形成も阻害できるか否かを試験した。これらの実験を行い、この実施例の研究において観察されたバイオフィルムに対する効果が、一般的な細胞外グアノシンヌクレオチドまたは環状グアノシン（モノヌクレオチド）アナログの存在に単に起因する可能性を除外した。ｃ−ジ−ＧＭＰの構造が頭部と尾部（３’−５’）で結合している２つのｃＧＭＰに幾分類似し、５’−ＧＭＰはｃ−ジ−ＧＭＰの既知の崩壊産物であるので、これらの２つの特定のヌクレオチドも選択された（Ross et al., 1991）。ｃＧＭＰの成長培地への添加により、バイオフィルム形成は阻害（〜４０％）されたが、ｃ−ジ−ＧＭＰよりずっと狭く、一方５’−ＧＭＰはｃ−ジ−ＧＭＰと比較してバイオフィルム形成に対する効果を有していなかった（図９Ａおよび９Ｂ）。これらの知見は、ｃＧＭＰと比較してｃ−ジ−ＧＭＰで観察された阻害効果は、事実ただ単にグアノシン塩基を有するか、またはただ単に環状である分子に寄与するものではないが、その環状ジヌクレオチド構造がどういうわけか独特であることを示している。ｃ−ジ−ＧＭＰと比較してスタフィロコッカス・アウレウスでのバイオフィルム形成を阻害するその能力におけるｃＧＭＰおよび５’−ＧＭＰの可能性の総合的な欠如は、細胞に対する作用および効果のその機序におけるｃ−ジ−ＧＭＰの重要性、新規かつおそらく特異性および親和性をさらに高める。分子の一般的でない形および構造を考慮すると、それは特定の細胞（または細胞壁）標的または受容体に対するある種特異性を伴って結合することが可能である。
【０１２０】
スタフィロコッカス・アウレウスの事前に形成されたバイオフィルムに対するｃ−ジ−ＧＭＰ処理の効果  本実施例で示すデータは、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理がスタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５および１５９８１におけるバイオフィルム形成を阻害するので、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰが事前に形成され、確立したバイオフィルムに対する効果を有するという仮説を試験した。得られた結果は、２４時間前に形成されたバイオフィルムのｃ−ジ−ＧＭＰ処理（２００μＭ）が無処理対照と比較してさらなるバイオフィルム展開をブロック（〜７５％低減）することを示した（図１０）。これらのデータに基づくと、ｃ−ジ−ＧＭＰがバイオフィルムの初期形成および既に形成されたバイオフィルムのさらなる展開の両方を阻害するようである。
【０１２１】
ｃ−ジ−ＧＭＰ処置はスタフィロコッカス・アウレウスのヒト上皮細胞への接着を阻害する。スタフィロコッカス・アウレウスの上皮細胞単層への接着および接着を阻害する可能性のある治療剤の効果を調べる研究を行った（Balaban et al., 2003；Cucarella et al., 2002；Matsuura et al., 1996；Miyake et al., 1989および1991；Roche et al., 2003；およびWyatt et al., 1990）。本明細書の研究のデータは、２および２０μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰでの処理が接着に対する明らかな効果を全く示さなかったことを示している。しかしながら、無処理対照（図１１Ａ）と比較して、２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰでの処理は、ＨｅＬａ細胞に接着しているスタフィロコッカス・アウレウスの細胞数を低減させた（図１１Ｂ）。データは、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理が接着を平均１２細菌／細胞から４細菌／細胞低減させた（〜６６％低減）ことを示した。完全培地（細菌不存下）にて上記のように調製したＨｅＬａ細胞に対する種々の濃度（０、２５、５０、１００、２００、および４００μＭ）のｃ−ジ−ＧＭＰの効果は、１２、２４および４８時間インキュベーション時点で顕微鏡で調べたＨｅＬａ細胞の形態に対して明らかな目に見える効果を示さなかった。ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスと上皮細胞との接着を阻害する分子機序はまだ分かっていないが、これらのインビトロのデータは、ポリスチレン（抗菌）表面を用いた従前のバイオフィルム結果と非常に一致し、ｃ−ジ−ＧＭＰを用いて、上皮細胞（細菌）表面のバイオフィルム形成が阻害され得ることを示唆している。
【０１２２】
安全性および毒性試験  ＨｅＬａ細胞の分析により、４００μＭまでの濃度でのｃ−ジ−ＧＭＰ処理が２４時間曝露後、細胞形態に明らかな変化を全く引き起こさなかったことが示された。しかしながら、４００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰで処理されたＨｅＬａ細胞は、４８時間曝露後形態学的変化を受けたようであった。これらの知見は、濃度＜４００μＭでｃ−ジ−ＧＭＰが試験した条件下でこれらの上皮細胞に対して比較的毒性が低いようであることを示唆している。
【０１２３】
ｃ−ジ−ＧＭＰの安全性および可能性のある致死率を、ＣＤ−１マウスにてさらに調べた。これらの研究において、ｃ−ジ−ＧＭＰ処置（２００μＭ、５０μＬ、経口）の２４時間後にマウスを調べたところ、全てのマウスが生存しており、致命的な効果は観察されなかった。屠殺後、種々の組織、組織液を後の組織学的分析および生化学的分析のために回収した。ｃ−ジ−ＧＭＰ処置後の組織分布レベルおよび可能性のある組織毒性はまだ分かっていないが、現在研究中であり、インビボの研究により、この濃度でのｃ−ジ−ＧＭＰの処置がマウスにおいて致命的でなく、ｃ−ジ−ＧＭＰが比較的安全であり毒性が低いことを示す本発明者の研究室のデータを支持することが示されている。
【０１２４】
スタフィロコッカス・アウレウスに対するｃ−ジ−ＧＭＰの作用の可能性のある機序  グラム陰性細菌種であるアセトバクター・キシリナムでの研究は、ｃ−ジ−ＧＭＰが細胞内シグナル伝達分子であり、これらの細菌細胞に侵入できないようであることを示した。グラム陽性種であるスタフィロコッカス・アウレウスにおける本明細書記載の知見に基づき、スタフィロコッカス・アウレウスは細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰに感受性であり、応答できると考えられる。これらの知見は、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰ処置および生じた細胞と細胞の相互作用およびバイオフィルム形成の阻害が、ｃ−ジ−ＧＭＰの受容体（おそらく、細胞表面に提示されている）への結合に関与し、これがシグナル伝達現象調節遺伝子およびタンパク質発現の引き金を引くことを示唆している。ｃ−ジ−ＧＭＰは真核細胞に侵入できると報告されてきたので（Steinberger et al., 1999）、別の可能性は、ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスに侵入し、タンパク質発現の変化の引き金を引くことができることである。関与する分子機序にもかかわらず、この実施例での知見は、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理が、スタフィロコッカス・アウレウスにおける細胞と細胞の相互作用およびバイオフィルム形成を阻害することを明らかに示している。細菌標的部位の抗生物質に対する感受性を増大させるので、この能力は抗菌処置に対する有用な補助特性である。
【０１２５】
実施例４
細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰはビブリオ・コレラのバイオフィルム形成を阻害する。異なるバッファーおよび温度下での分子の安定性を調べる試験により、それは生理食塩水中、４℃にて少なくとも数ヶ月間安定であり、１０分間沸騰させた後も安定であり、そして酸（ｐＨ３）およびアルカリ（ｐＨ１０）中で１時間処理した後も安定であることが示された。種々の濃度のｃ−ジ−ＧＭＰを添加したＬＢブロス含有ガラス試験管にて２４時間静的にインキュベーションした後、標準的なクリスタルバイオレットを用いて定量的バイオフィルムアッセイを行い、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰが無処理対照と比較してビブリオ・コレラＮ１６９６１においてバイオフィルム形成を用量に依存して増大させることを見出した（図１２）。これらの知見は、増大したｃ−ジ−ＧＭＰレベルがセルロース産生を増大させるグルコンアセトバクター・キシリナムにおける知見と一致する。得られた結果は、処理培養物と無処理培養物との間の成長の差に関与しないようであった。興味深いことに、ＲｏｃＳ変異体は、野生型株と比較して低いバイオフィルム形成能を示し、ｃ−ジ−ＧＭＰに応答して増大したバイオフィルム形成活性を示した。ＲｏｃＳはｃ−ジ−ＧＭＰと結びつくと、細胞外ｃ−ジ−ＧＭＰは変異体において野生型バイオフィルムレベルを保持することができず、これはＲｏｃＳ変異体がｃ−ジ−ＧＭＰ調節ばかりでなく、バイオフィルム形成と関連する他の特性における欠失であることを意味する。
【０１２６】
実施例５
カテーテルの表面のような生理的環境下で、スタフィロコッカス・アウレウスは、コロニー形成し、バイオフィルム形成すると予測され、これにより細胞のフロー条件下での存続を可能にする。インビトロでこれらの条件を模倣し、新規抗バイオフィルム剤としてのｃ−ジ−ＧＭＰの可能性のある使用をさらに探るために、連続培養フローセルバイオフィルムモデルを用いて、シリコン表面およびステンレス・スティール表面上でのスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰ処置を研究する。ｃ−ジ−ＧＭＰ単独、および通常用いられる抗生物質オキサシリンと組み合わせたｃ−ジ−ＧＭＰでの処置の感受性を増大させ、シリコンおよびステンレス・スティール上でのバイオフィルム形成を低減させる効果も試験する。
【０１２７】
スタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を試験するためのフローセルバイオフィルムモデル
ｉ．成長条件
バイオフィルム形成のため、ダイナミックフロー下のシリコン表面上で培養物を成長させ、シリコンチューブのセクション  １ｍの内部表面（サイズ１６、容量７ｍｌを生じる、Masterflex）を接触表面として用いる（反応器の図については図１３を参照）。バイオフィルムがフローセル内で成長させられるべきである実験において、Protofab Sealed Flowcellを用いた（図１４）。このフローセルは反応系のシリコンチューブのセクション  １ｍの中程に取り込まれることができ、接着性のバイオフィルムのため取り外し可能かつ回収可能なインサート（ＰＭＭＡまたはステンレス・スティールのいずれか）を有する。ｃ−ジ−ＧＭＰ処置は、ａ）シリコンおよびスティール上でのバイオフィルム形成を阻害し、ｂ）シリコンおよびスティール上の事前に形成されたバイオフィルムを低減するという仮説を試験する。
【０１２８】
ｉｉ．バイオフィルム形成に対する効果
スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５培養物を一晩３７℃ＴＳＢ中で振盪しながら成長させる。次に、一晩培養物を新鮮なＴＳＢで１：１０００希釈し、対数成長フェーズに達するまで試料を振盪しながら３７℃で成長させる。この対数フェーズ培養物（〜１０７ＣＦＵ）（２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ（処理）含有）のアリコート、および０．９％  ＮａＣｌの同じアリコートで植え付けた試料（無処理）をチューブに注入し、ＴＳＢフロー（ｃ−ジ−ＧＭＰありおよびｃ−ジ−ＧＭＰなし）（０．７ｍｌ／分）を開始する３０分前に接着させる。残り時間７．５分（バッチ成長条件下での細菌の倍加時間は３０〜４０分未満）以降は、接着した生物のみが表面に保持される。全てのバイオフィルム実験を３７℃のインキュベーター内で行い、かつ全ての試料をトリプリケートで行う。シリコンおよびスティール表面を擦過し、それによりバイオフィルムを剥離させてバイオフィルム試料を植え付けた２４時間後に回収する。それぞれの試料をＰＢＳ  ２ｍｌに懸濁し、ボルテックスして任意の凝集細胞を解離させる。処理試料および無処理試料のｃｆｕ／ｍｌを数えるためにボルテックスした試料の連続希釈物を血液寒天プレートに播種し、それによりシリコンおよびスティールのモデルバイオフィルムシステムにおけるスタフィロコッカス・アウレウスの生存力に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を試験する。
【０１２９】
ｉｉｉ．事前に形成されたバイオフィルムに対する効果
スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５を一晩３７℃でＴＳＢ中にて振盪しながら成長させる。次に、一晩培養物を新鮮なＴＳＢで１：１０００希釈し、対数成長フェーズに達するまで３７℃で振盪しながら成長させる。ｃ−ジ−ＧＭＰを含まないこの対数フェーズの培養物（〜１０７ＣＦＵ）のアリコートをチューブに注入し、ｃ−ジ−ＧＭＰ（処理）を含むＴＳＢまたは０．９％  ＮａＣＬ（無処理）同じアリコートを含有するＴＳＢフロー（０．７ｍｌ／分）を開始する３０分前に接着させる。残り時間７．５分（バッチ成長条件下での細菌倍加時間は３０〜４０分未満）以降、接着した生物のみが表面に保持される。全てのバイオフィルム実験を３７℃のインキュベーター内で行い、かつ全ての試料をトリプリケートで行う。次に、シリコンおよびスティール表面を擦過し、それによりバイオフィルムを剥離させて、バイオフィルム試料を植え付けた２４時間後に回収する。それぞれの試料をＰＢＳ  ２ｍｌに懸濁し、ボルテックスして任意の凝集細胞を解離させる。処理試料および無処理試料のｃｆｕ／ｍｌを数えるためにボルテックスした試料の連続希釈物を血液寒天プレートに播種し、それによりシリコンおよびスティールのモデルバイオフィルムシステムにおけるスタフィロコッカス・アウレウスの生存に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を試験する。実施例３の結果は、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理が、細胞と細胞の相互作用、細胞と表面の相互作用（プラスチックと上皮細胞との接着）を低減し、スタフィロコッカス・アウレウス細胞の生存力を低減させることを示唆しているので、本発明者は、ｃ−ジ−ＧＭＰがシリコンおよびスティール表面上でのバイオフィルム形成を阻害し、既に形成されたバイオフィルムのレベルも低減することを見出すと予測する。
【０１３０】
感受性およびバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰおよび抗生物質の効果を試験するためのフローセルバイオフィルムモデル
本発明者の研究室の予備データに基づき、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理がスタフィロコッカス・アウレウスの抗生物質感受性を増大させると予測される。それゆえ、「抗バイオフィルム」剤としてｃ−ジ−ＧＭＰを用いる可能性があるかをさらに調べるために、ｃ−ジ−ＧＭＰ処理が抗生物質感受性を増大させるという仮説を試験する。まず、ｃ−ジ−ＧＭＰ単独、および通常用いられる抗生物質であるオキサシリンと組み合わせたｃ−ジ−ＧＭＰのバイオフィルム関連スタフィロコッカス・アウレウスの感受性を増大させる効果を試験する。これらの研究は、上記の連続培養フローセルバイオフィルムモデルを用い、単独または組み合わせたｃ−ジ−ＧＭＰの存在下でのスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成を分析する。
【０１３１】
スタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルムに対するｃ−ジ−ＧＭＰおよびオキサシリンからなる任意の組合せ抗菌活性（相乗作用）の可能性を研究するため、上記のフローセルバイオフィルムモデルの変形版を用いる。まず、National Committee for Clinical Laboratory Standard（ＮＣＣＬＳ）を用いて濃度１−１，０２４μｇ／ｍｌを試験することにより、標準的チューブアッセイを用いてオキサシリンのＭＩＣを決定する。２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰ存在下でのオキサシリンのＭＩＣを定量し、感受性および相乗作用における低減がないかどうかを決定する。
【０１３２】
バイオフィルムモデルにおける研究のため、スタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５を一晩３７℃、ＴＳＢ中にて振盪しながら成長させる。次に、一晩培養物を新鮮なＴＳＢで１：１０００希釈し、対数成長フェーズに達するまで、試料を３７℃で振盪しながら成長させる。この対数フェーズの培養物（〜１０７ＣＦＵ）アリコート（５ｍｌ）（ｉ）２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰのみ、ｉｉ）ｃ−ジ−ＧＭＰ＋オキサシリン（上で決定した濃度）、ｉｉｉ）オキサシリンのみ、およびｉｖ）０．９％  ＮａＣｌのみを含有）をチューブに注入し、ＴＳＢフロー（上記と同様の条件）（０．７ｍｌ／分）を開始する前３０分間接着させる。残り時間７．５分（バッチ成長条件下での細菌の倍加時間は３０〜４０分未満）以降、接着している生物のみが表面に保持される。全てのバイオフィルム実験を３７℃のインキュベーター内で行い、かつ全ての試料をトリプリケートで行う。シリコン表面を擦過し、それによりバイオフィルムを剥離させ、バイオフィルム試料を植え付けた２４時間後に回収する。それぞれの試料をＰＢＳ２ｍｌ中に懸濁し、ボルテックスして任意の凝集細胞を解離させる。処理試料および無処理試料のｃｆｕ／ｍｌを数えるために、ボルテックスした試料の連続希釈物を血液寒天プレートに播種し、それにより、抗生物質感受性およびスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成の阻害に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を試験する。Domaracki等（Domaracki et al., 2000）の方法に類似の時間−殺菌曲線も行い、上記のバイオフィルムモデルにおける１２時間のインキュベーションを通じてＭＲＳＡ株ＤＫ８２５の成長に対するｃ−ジ−ＧＭＰおよびオキサシリンの組合せの効果を研究する。ＴＳＢ＋２％  ＮａＣｌ中、半ＭＩＣ濃度のオキサシリン単独（用いらるべき濃度は上で決定）またはｃ−ジ−ＧＭＰ（２００μＭ）との組合せにより株を試験する。これらの研究において、フローセルシステム由来の試料を血液寒天に播種して、生存力のカウントを０、３、６および１２時間に行う。
【０１３３】
この実施例に使用したバイオフィルムモデルシステムは臨床上のセッティング（例えば、医療器具）を模倣しており、一定濃度の「薬物」がフローシステムにより投与されると、その後のインターバルでの薬物再投与を回避する。上の実施例３のデータは、ｃ−ジ−ＧＭＰが細胞の生存力をおよそ１−ｌｏｇ阻害し、既に試験した条件下で細胞と細胞の相互作用およびバイオフィルムを阻害することを示唆するので、このモデルバイオフィルムシステムにおけるｃ−ジ−ＧＭＰ処理で低減されると予測される。一方、オキサシリン感受性に対する拮抗作用はないと予測可能である。また、疑わしいことに、細胞と細胞の相互作用を阻害すると、抗菌標的へのアクセスがより良好になり、ｃ−ジ−ＧＭＰが相乗的にならず、ＤＫ８２５の抗菌感受性を増大させない。しかしながら、本発明者は、組合せｃ−ジ−ＧＭＰ処置は相乗効果を生じ、オキサシリンまたはｃ−ジ−ＧＭＰ処置単独と比較してスタフィロコッカス・アウレウスにおける抗菌感受性の測定可能な増大を引き起こすことを見出すと予測する。かかる相乗効果は、抗菌活性を増大させるためにｃ−ジ−ＧＭＰを他の薬物と組合せて用いられることを示す。感受性の差をこのシステムにおいて見出した場合、これらの知見はｃ−ジ−ＧＭＰが有用な抗菌活性を有することを支持し、異なる抗生物質を用いてさらなる感受性研究を行う。時間−殺菌曲線は、ｃ−ジ−ＧＭＰとオキサシリンの組合せの存在下での殺菌の増強を示すと予測される。例えば、２−ｌｏｇの殺菌をスタフィロコッカス・アウレウスの摂取開始と比較して観察した場合、これは相乗作用を示す。本研究は半ＭＩＣのオキサシリンがｃ−ジ−ＧＭＰと一体となって、殺菌において有効であるか、またはＭＲＳＡの感受性を少なくとも増大させる際に有効であることを示し得る。相乗作用を観察した場合、動物モデルを用いたさらなる調査を行い、ｃ−ジ−ＧＭＰ・オキサシリンの組合せがインビボにおいて相乗的であるかどうかを観察する。さらなる試験も行い、異なる種のスタフィロコッカスおよび臨床上のスタフィロコッカス集団において相乗効果の普及を決定することができる。
【０１３４】
実施例６
ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１の配列決定（Heidelberg et al., 2000）は、この病原体を研究する新たなアプローチを可能にする。３８８４のオリゴ（１オリゴ／ゲノム遺伝子）により表されるＮ１６９６１ゲノムのマイクロアレイを、ポリスチレンコートガラスマイクロアレイスライド（Corning）上にマイクロアレイマーカーＰＳ５２００（Cartesian Technologies）を用いてプリントした。オリゴヌクレオチドプローブを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ６．５、５０％  ＤＭＳＯ（プリントバッファー）に懸濁し、次に、９６ウェルプレートにアレイし、適当な条件の温度および湿度の下スポットした。プリント後、スライドを乾燥させ、次に、スポットしたＤＮＡをStratalinker（Stratagene）を用いて６０ｍＪにてＵＶ架橋結合によりスライドに結合させ、８０℃で２時間焼いた。標的核酸をＣｙ３またはＣｙ５蛍光ダイのいずれかで標識する。
【０１３５】
ＧＧＤＥＦドメインを有するタンパク質は調節する役割を有し、ｃ−ジ−ＧＭＰと関連すると考えられる。ビブリオ・コレラは、約４１種のＧＧＤＥＦタンパク質を含有する（Galperin et al., 2001）ので、本発明者はｃ−ジ−ＧＭＰが毒性を含む多くの遺伝子およびビブリオ・コレラ（および他の病原体）の重要な過程を調節すると予測する。この仮説を、転写プロファイルアプローチを用いて試験し、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１のトランスクリプトームを研究する。
【０１３６】
これらの最初の研究において、ｃ−ジ−ＧＭＰの存在下および不存下で成長させた野生型細胞を比較して、発現がｃ−ジ−ＧＭＰにより影響される遺伝子を同定する。ＬＢブロス中、３７℃にて振盪させて成長させた対数フェーズの細胞由来のＲＮＡを、ＯＤ６００  ０．３〜０．４に調節した後RNA Easy kit（Qiagen）を用いて抽出し、標識前にDNase I（Qiagen）で処理する。標識反応のため、ｍＲＮＡをＣｙ３またはＣｙ５ダイのいずれかで標識する。両方の標識反応を全ての試料で行い、標識反応およびダイの特徴に基づくシステム上の変動を評価する。アミノアシル標識ヌクレオチドでの逆転写酵素を含む標準的方法を用いて蛍光標識を取り込む。未取り込みのｄＮＴＰおよびオリゴｄＴプライマーをエタノール沈殿により除去する。第２の工程にて標識を取り込む。アミノアシル標識は対照試料において試料から試料への一様な産物をもたらすことが分かる。シグナルを最大にし、バックグランドを最小とするために、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０％  ホルムアミド、１０％  硫酸デキストラン、１％  ＳＤＳ、および１％  ウシ血清アルブミン中、１時間４２℃にてマイクロアレイをプレハイブリダイゼーションする。標識標的核酸を９５℃で５分間変性し、４℃に冷却し、次に、スライドを含有するハイブリダイゼーションチャンバーに加えた。ハイブリダイゼーション反応を４２℃で一晩インキュベーションして行う。スライドをチャンバーから取り出し、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％  ＳＤＳで５分間室温にて洗浄する。次に、スライドを空気乾燥させる。ハイブリダイゼーションさせたマイクロアレイをScan Array 3000（GSI Lumonics）スキャナーにてスキャンする。スキャナーでは、Ｃｙ３およびＣｙ５をそれぞれ位置決定するために６３３ｎｍおよび５４３ｎｍでレーザー操作する。光分解に対する感受性が高いので、Ｃｙ５を最初にスキャンする。それぞれの蛍光チャンネルのデータをＴＩＦＦファイルとして別々に保存する。Imagene（Biodiscovery）ソフトウエアを用いて、それぞれのスポットの位置を同定し、スポット識別子をつけ、各スポットの周りのバックグランド密度を測定し、蛍光強度を単純なフラットファイルに記録する。複製スポットおよび同じ値（taxa）を示すスポットのデータを比較し、異常値を除去し、その他をソフトウエアGeneSight（Biodiscovery）を用いて平均する。
【０１３７】
マイクロアレイデータ分析の実験設計  ｃ−ジ−ＧＭＰあり、およびなしで成長させた細胞の発現特性を比較するために、ラテン方格法を用いる。それぞれのペアの試料（ｃ−ジ−ＧＭＰあり、およびなし）の２つのアリコート（すなわち、ｃ−ジ−ＧＭＰなしの試料由来の２つ（Ａ１およびＡ２）およびｃ−ジ−ＧＭＰありの試料由来の２つ（Ｂ１およびＢ２））を調製する。第１のアレイは、レッドで標識し、グリーンで標識した第２の処理試料（Ｂ１）でハイブリダイゼーションさせた第１の未処理試料（Ａ１）からなる。第のアレイは、レッドで標識し、グリーンで標識した未処理の試料（Ａ２）でハイブリダイゼーションさせた第２の処理試料（Ｂ２）からなる。ラテン方格法のレイアウトを以下の表４に示す。
【０１３８】
表４
【表４】
2007500697.tif 000010
【０１３９】
この設計は、ｃ−ジ−ＧＭＰあり、およびなしそれぞれの比較のためダイバイアスを除去する際に非常に効果的である。ラテン方格法はそれぞれトリプリケートのペアの試料に適用するので、６個のチップを用いた。
【０１４０】
データ処理  典型的には、マイクロアレイイメージのバックグランドはアレイ全体にわたり一様ではない。局所性バックグラウンド強度の抽出方法を使用する。それぞれのアレイからの２つのチャンネル由来の（バックグランドを引いた）強度を互いにプロットし、データ（すなわち、転写レベルが本質的に変化していない全ての遺伝子のデータ）のクオリティーをチェックする（直線となるべきである）。値の範囲は、全てのチャンネルについてほぼ同じとなるべきであり、いずれのチャンネルも満たされなければならない。Ｌｏｇ転換により、データがそれぞれの遺伝子においておよそ正常な分布であることを確かめ、そしてそれは分散分析の統計的実施を改良する。方法は正常から逸脱したものに対して公平なものである。転換後のそれぞれの単位が２倍差に対応するので、底２のｌｏｇスケールを分析において用いる。
【０１４１】
校正  個々の遺伝子のデータにバイアス影響を生じる実験幅系統的効果を説明するため、そのままの蛍光強度値をダイおよびアレイの機能と合わせるＡＮＯＶＡを用いて校正を行う（Wolfinger et al., 2001）。遺伝子ｇ、幅ｉ（ｉ＝１、２）、ダイｊ（ｊ＝１、２）およびアレイｋ（ｋ＝１、＊、６）由来のバックグラウンドで補正した強度値の底２の対数をｙｇｉｊｋとする。校正モデルは：
【数１】
2007500697.tif 000011
（式中、μは全体の平均、Ｄはダイの主な効果、Ａはアレイの主な効果、ＤＡはアレイとダイの相互作用効果、εはランダムなエラーである）である。モデル（１）において、主な相互作用効果をランダム効果として処理してもよい。効果について適合した値をｙｇｉｊｋ値から引いて計算したこのモデルの残りを、試料平均に対するそれぞれの遺伝子の相対的蛍光強度と見なすことができる。校正モデルの基本的考え方は、ダイ間およびアレイ間の全体的な差を除去することである。
【０１４２】
遺伝子特異的な有意モデル  処理細胞と無処理細胞との間で異なって発現した遺伝子を同定するために、遺伝子特異的ＡＮＯＶＡ（Wolfinger et al., 2001）を行う。ｒｇｉｊｋはモデル（１）の残り（すなわち、遺伝子ｇの相対的蛍光光度）を示すものとする。遺伝子モデルは：
【数２】
2007500697.tif 000012
である。
【０１４３】
全ての効果をｇにより指標化し、モデル（１）でのものと同じ役割をなすと思われるが、遺伝子レベルにおいて、Ｖはバリエーションの主要な効果である。Ｖ以外の他の効果は、ランダムな効果として扱われ得る。第１の対象の概算は、Ｖｇｉ効果のものであり、それはそれぞれの遺伝子についての様々な効果を測定したものである。これらの効果の差を、遺伝子内ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤのようなＳＡＳ手順を用いて試験する。この統計的アプローチに基づき、カットオフ値を確立する。最終的に、異なって発現した遺伝子のリストをそれぞれの比較のために選択する。
【０１４４】
代替分析  マイクロアレイの有意な分析（ＳＡＭ）（Tusher et al., 2001）は、ＡＮＯＶＡアプローチの代わりとなる。Rob Tibshirani, Stanford Universityにより開発されたＳＡＭはマイクロアレイに特に適合した統計的方法である。ＳＡＭは、それぞれの遺伝子を、遺伝子について示された測定値の標準偏差に対する遺伝子発現の変化に基づくスコアで指定する。閾値より高いスコアを有する遺伝子は、有意である可能性があると考える。この手順により、過誤発見率（false discovery rate）（ＦＤＲ）が提供され、かかる遺伝子の割合は偶然同定された。正確なＦＤＲ（０．０５のような）を制御することで、異って発現した遺伝子のセットをそれぞれの比較について同定する。ＡＮＯＶＡの結果との比較において、両方の方法で同定された遺伝子に注意が向けられる。
【０１４５】
予測結果と解釈  これらの転写プロファイル研究により、ｃ−ジ−ＧＭＰにより調節される遺伝子が同定される。ｃ−ジ−ＧＭＰにより有意に活性化され、抑制される興味ある特定の遺伝子（例えば、調節および毒性）を、ＲＴ−ＰＣＲにより確認し、さらなる研究に用いる。たとえｃ−ジ−ＧＭＰが既知の毒性遺伝子を調節するとしても、これは毒性を制御する新規シグナル伝達カスケードを表すだろう。同様のアプローチを用いて、他の病原体の低減でのｃ−ジ−ＧＭＰおよびアナログの効果を研究することができる。
【０１４６】
実施例７
スタフィロコッカス・アウレウス単位複製配列に基づくマイクロアレイをＴＩＧＲ（The Institute for Genomic Research, Rockville, MD）により構築し、これは、スタフィロコッカス・アウレウス株ＣＯＬ（参考株）、スタフィロコッカス・アウレウス株ＭＵ５０、スタフィロコッカス・アウレウス株ＭＷ２、およびスタフィロコッカス・アウレウス株Ｎ３１５由来の２４８０個のＯＲＦのセグメントを表す単位複製配列を含有する。マイクロアレイも対照転写スポットでプリントする。
【０１４７】
以下の表５は、スタフィロコッカス・アウレウス株ＤＫ８２５でのｃ−ジ−ＧＭＰ（２００μＭ）の効果について得られたマイクロアレイのデータのサブセットを示す。発現（転写レベル）がｃ−ジ−ＧＭＰに応答して異なって調節される（アップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされる）既知の調節、毒性、およびバイオフィルム関連遺伝子のいくつかのみをこの表に示す。スタフィロコッカス・アウレウスの無処理対照から単離されたＲＮＡに対するハイブリダイゼーション強度と比較して、２００μＭ  ｃ−ジ−ＧＭＰで処理したスタフィロコッカス・アウレウスから単離されたＲＮＡに対するマイクロアレイ上での単位複製配列スポットのハイブリダイゼーション強度により決定される、それぞれの遺伝子の発現の倍増または減少を提示する。
【０１４８】
表５
【表５】
2007500697.tif 000013
【０１４９】
データは、ｃ−ジ−ＧＭＰがスタフィロコッカス・アウレウスの多数の遺伝子の発現に影響することを示す。特に、ｃ−ジ−ＧＭＰ分子はクオラムセンシング（ａｇｒ）遺伝子、毒性における既知の役割を担う調節因子、毒素遺伝子およびコロニー形成およびバイオフィルム関連遺伝子の発現に影響する。データは、バイオフィルム形成、コロニー形成、細胞凝集、毒素活性、および全体的（調節）毒性について減弱されているスタフィロコッカス・アウレウスのものと一致する。ｒｓｂＷ遺伝子は、完全な毒性に重要であるシグマＢの発現を表す抗シグマＢ因子をコードする。それゆえ、ｒｓｂＷの増大した発現は減少した毒性と一致する。
【０１５０】
実施例８
スタフィロコッカス・アウレウスＮｅｗｂｏｕｌｄ３０５株を用いたスタフィロコッカス・アウレウス感染症のマウス乳房炎モデル（Brouillette et al., 2003、2004aおよび2004b）を用いて、ｃ−ジ−ＧＭＰでの処置の有効性を示した。１群当たり３匹のマウスおよび１マウス当たり２つの乳腺を用い、１処置当たりトータル６試料とした。スタフィロコッカス・アウレウスＮｅｗｂｏｕｌｄ３０５株１００ＣＦＵ（コロニー形成単位）をそれぞれの乳腺に植え付けた。ｃ−ジ−ＧＭＰ  ５または５０ｎｍｏｌを、時間０（容量１００μｌ、すなわち、５０または５００μＭ濃度のスタフィロコッカス・アウレウス接種材料とあらかじめ混合したもの）および感染の４時間後（５０μｌ中、すなわち、１００または１０００μＭ）でそれぞれ２回乳腺に注射して投与した。ミルクを含んだ乳腺の容量は約２５０μｌであると考えられるため、各注射時の乳腺中のｃ−ジ−ＧＭＰの最終濃度は２０μＭまたは２００μＭであると推定された。ｃ−ジ−ＧＭＰでの処置は、スタフィロコッカス・アウレウスの乳腺における増殖またはコロニー形成する能力に対するｃ−ジ−ＧＭＰの有意な用量依存性抑制効果（ＣＦＵカウントの低減）をはっきりと示している（図１５）。結果は、乳腺に注射されたｃ−ジ−ＧＭＰ  ５０ｎｍｏｌがインビボにおいて乳腺のスタフィロコッカス・アウレウス感染症を少なくとも１０倍（Ｔ検定：ｐ＝０．００４；マンホイットニーＵ検定：ｐ＝０．００９）有意に阻害することを示す。
【０１５１】
十分に本発明を説明したが、それは本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつ適切な実験なしで、均等なパラメーター、濃度、および条件の広い範囲内で行われ得ることを当業者は理解するだろう。
【０１５２】
本発明は特定の実施態様と関連して記載されているが、さらなる修飾が可能であることは理解されるだろう。本願は、一般的な本発明の原理に従い、かつ当該技術分野内で既知または慣習的な実施内に入る本発明の開示から本発明が関連するものへの逸脱および添付の請求の範囲内となる上述の必須の特徴に適合し得る逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または適用をカバーすることが意図されている。
【０１５３】
文献、抄録、公開または対応する米国または外国の特許出願、公開米国または外国特許、または任意の他の引用文献を含む本明細書において引用される全ての引用文献は、本明細書において引用により完全に取り込まれ、これは、引用文献において提示された全てのデータ、表、図、およびテキストを含む。さらに、本明細書において引用される引用文献において引用された引用文献の全ての内容も引用により完全に取り込まれる。
【０１５４】
既知の方法工程、通常の方法工程、既知の方法、または通常の方法への言及は、本発明の任意の態様、記載または実施態様が従来技術において開示され、教示され、あるいは示唆されていることを決して許可するものではない。
【０１５５】
特定の実施態様の上述の記載は、第三者が、当業者の知識（本明細書において引用される引用文献の内容を含む）を適用して、適切な実験を行うことなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、かかる本発明の実施態様を容易に修飾し、および／または種々の応用を適合させ得ることができる、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするであろう。それゆえ、かかる適合および修飾は、本明細書において提示された教示および指針に基づき、開示の実際態様と均等な意味および範囲内にあることが意図される。本明細書における用語または専門用語は、説明の目的のためのものであって、制限するためのものではなく、本明細書の専門用語または用語は、本明細書に提示の教示および指標に照らして、当業者の知識と組み合わせて、当業者によって解釈されるべきでることは理解されるべきである。
【０１５６】
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１の滑らかな変異体（図１Ａ）およびしわ状変異体（図１Ｂ）のコロニー形態を示す。
【図２】図２は、ビブリオ・コレラの滑らかなコロニー変異体およびしわ状コロニー変異体によるバイオフィルム形成を示すグラフである。
【図３】図３は、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１（野生型）、ＡｍｉＢ変異体（ＤＫ６３０）、およびＲｏｃＳ変異体（ＤＳ５６７）の運動性を示す遊走プレートアッセイ（Swarm plate assay）である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１（野生型の細胞を図４Ａに示し、ＡｍｉＢ変異細胞を図４Ｂに示す）の細胞形態に対するＡｍｉＢ変異の効果を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂはｃ−ジ−ＧＭＰのＨＰＬＣ特性を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、スタフィロコッカス・アウレウス細胞と細胞の凝集に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、スタフィロコッカス・アウレウスのヒト臨床単離物のポリスチレン表面（マイクロタイタープレートを用いた）上でのバイオフィルム形成能に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、スタフィロコッカス・アウレウスウシ乳房炎単離物Ｖ３２９（図８Ａ）、Ｍ５５６（図８Ｂ）、Ｖ２９９（図８Ｃ）およびＶ３１５（図８Ｄ）のポリスチレン表面上でのバイオフィルム形成能に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果についての定量的分析を示すグラフである。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ポリスチレン表面上でのスタフィロコッカス・アウレウスのバイオフィルム形成の阻害に対するグアノシンヌクレオチドアナログの効果を示す。
【図１０】図１０は、２４時間既にバイオフィルムを形成したスタフィロコッカス・アウレウスに対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果についての定量的バイオフィルム分析を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＨｅＬａ上皮細胞と接着したスタフィロコッカス・アウレウスＤＫ８２５に対するｃ−ジ−ＧＭＰ処置の効果を示す。
【図１２】図１２は、ビブリオ・コレラ株Ｎ１６９６１およびＲｏｃＳ変異体におけるバイオフィルム形成に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、バイオフィルム成長の反応システムの略図であり、これは３７℃のインキュベーター内に完全に入れられたワンスルーシステムである。
【図１４】図１４は、図１３に示したバイオフィルム成長反応システムに挿入したインラインであり、ＰＢＢＡおよびステンレススティールを含む種々の表面に接触したバイオフィルム試料を得るために用いられる、シールドフローセル（Protofab, Inc., Bozeman, MT）を示す。
【図１５】図１５は、マウス乳房炎モデルにおけるスタフィロコッカス・アウレウスＮｅｗｂｏｕｌｄ３０５株のＣＦＵ数に対するｃ−ジ−ＧＭＰの効果を示すグラフである。
【図１】
2007500697.tif 000014
【図２】
2007500697.tif 000015
【図３】
2007500697.tif 000016
【図４】
2007500697.tif 000017
【図５】
2007500697.tif 000018
【図６】
2007500697.tif 000019
【図７】
2007500697.tif 000020
【図８】
2007500697.tif 000021
【図９】
2007500697.tif 000022
【図１０】
2007500697.tif 000023
【図１１】
2007500697.tif 000024
【図１２】
2007500697.tif 000025
【図１３】
2007500697.tif 000026
【図１４】
2007500697.tif 000027
【図１５】
2007500697.tif 000028
【配列表】
2007500697000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月30日(2006.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007500697000001.app
【国際調査報告】
2007500697.tif 000036
2007500697.tif 000037
2007500697.tif 000038
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