(57)【要約】  本発明は、会合した遺伝子の発現を調節するエンハンサーの発見に関する。特に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）からの非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）は会合した核酸の発現および免疫原性を変調する、ということが見出された。
2007532091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）またはその機能的部分をコードする第１の核酸を準備し、
発現増大させるための第２の核酸を同定し、
前記第２の核酸を前記第１の核酸に細胞中で付随させ、それによりこのような付随が前記第１の核酸の非存在下の場合に比べて前記第２の核酸を多く発現させること、
を包含する、細胞中の核酸の発現を増大させる方法。
【請求項２】
前記第２の核酸がＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２の核酸がシスで連結される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２の核酸が並置される請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２の核酸が同一構築物上に存在する請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２の核酸が別個の構築物上に存在する請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
前記第１の核酸が配列番号２の１０〜２０連続アミノ酸から成る請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
前記第１の核酸が配列番号２の２０〜３０連続アミノ酸から成る請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸が配列番号２の３０〜４０連続アミノ酸から成る請求項１または２記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の核酸が配列番号２の５０〜５４連続アミノ酸から成る請求項１または２記載の方法。  
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）またはその機能的部分をコードする第１の核酸を準備し、
哺乳動物における免疫原性を増大させるための抗原をコードする第２の核酸を同定し、
前記第２の核酸を前記第１の核酸に付随させ、それによりこのような付随が、前記哺乳動物における前記第１の核酸の非存在下で前記第２の核酸により生成される前記抗原に対する免疫原性より大きい前記哺乳動物における前記抗原に対する免疫原性を生じさせること、
を包含する、哺乳動物における抗原に対する免疫原性を増大させる方法。
【請求項１２】
前記第２の核酸がＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２の核酸がシスで連結される請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２の核酸が並置される請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および第２の核酸が同一構築物上に存在する請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１６】
前記第１および第２の核酸が別個の構築物上に存在する請求項１１または１２記載の方
法。
【請求項１７】
前記第１の核酸が配列番号２の１０〜２０連続アミノ酸から成る請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の核酸が配列番号２の２０〜３０連続アミノ酸から成る請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の核酸が配列番号２の３０〜４０連続アミノ酸から成る請求項１１または１２記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の核酸が配列番号２の５０〜５４連続アミノ酸から成る請求項１１または１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、付随した遺伝子の発現を調節するエンハンサーの発見に関する。特に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）からの非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）は付随した核酸の発現および免疫原性を変調する、ということが見出された。
【０００２】
［発明の背景］
エンハンサーは、プロモーターに隣接する遺伝子の転写のレベルを増大させるシス作用エレメントである。しばしば転写の増強は、エンハンサーエレメントの位置および向きと比較的無関係である（Khoury and Gruss, Cell 33: 313 (1983)参照）。エンハンサーエレメントは、多数のウイルス、例えばポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびＢＫにおいて、ならびに多数の非ウイルス遺伝子で、例えばマウス免疫グロブリン遺伝子イントロン内で同定されている（例えば米国特許第ＲＥ３７，８０６号参照）。哺乳動物細胞中で作用するエンハンサーは、バイオテクオロジー、免疫学および医学において特に有用であり、より多くのエンハンサーの必要性が明らかである。
【０００３】
［発明の概要］
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）は、付随した核酸の転写および免疫原性を増強する、ということが発見された。最初の実験セットでは、ＨＣＶ−１  ＮＳ３／４Ａ遺伝子が哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる場合、真核生物発現ベクターに関して、ＮＳ３の発現レベルは、ＨＣＶ−１  ＮＳ３遺伝子および発現ベクターが単独（すなわちＮＳ４Ａなし）でトランスフェクトされる場合より高い、ということが観察された。さらにＮＳ３／４Ａ遺伝子で免疫されたマウスは、ＮＳ３遺伝子単独で免疫されたマウスと比較して、１０〜１００倍高いレベルのＮＳ３−特異的抗体を初回抗原刺激されている（primed）ことが見出された。ＮＳ３／４Ａ遺伝子により初回抗原刺激された体液応答は、ＮＳ３遺伝子（３．０）と比較して、より高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（＞２．０）を示したが、これは、Ｔヘルパー１−傾斜に偏った応答の証拠を提供する。
【０００４】
別の実験セットでは、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ発現ＳＰ２／０ミエローマ細胞を保持するマウスが低用量のＮＳ３／４Ａ遺伝子（１０μｇ）で筋注免疫された場合、ＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞の増殖は抑制されたが、一方、ＮＳ３遺伝子単独またはＮＳ３タンパク質を用いたマウスの低用量免疫はＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞の増殖の抑制をもたらさなかった。さらに、遺伝子銃が用いられる場合、２％〜４％の前駆体頻度で細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を効率的に初回抗原刺激するために、そしてＮＳ３／ＮＳ４Ａ発現ＳＰ２／０ミエローマ細胞を保有するマウスにおけるＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞の増殖を抑制するために必要とされるのは、３回の４μｇ用量のＮＳ３／４Ａ遺伝子だけである、ということが確定された。
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態は、ＮＳ４Ａに付随した核酸の転写のレベルを増強するためのアプローチを包含する。例えばいくつかの方法では、細胞中の核酸の発現は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）またはその機能的部分をコードする第１の核酸を準備し、発現増強に関する第２の核酸を同定し、そして上記細胞中の上記第２の核酸を上記第１の核酸に付随させ、それによりこのような付随が上記第２の核酸
の発現増強を生じることにより増大または増強される。いくつかの用途において、第２の核酸はＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）である。第１および第２の核酸は、同一構築物上で、別個の構築物上で、シス、並置、で連結され得るし、あるいはトランスで連結され得る。さらにいくつかの用途では、第１の核酸は、配列番号２の１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または５０〜５４連続アミノ酸から成る。
【０００６】
本発明のさらなる実施形態は、ＮＳ４Ａに付随した核酸の免疫原性を増強するためのアプローチに関する。例えばいくつかの方法では、核酸の免疫原性は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）またはその機能的部分をコードする第１の核酸を準備し、免疫原性増強に関する第２の核酸を同定し、そして上記細胞中の上記第２の核酸を上記第１の核酸に付随させ、それによりこのような付随が上記第２の核酸の免疫原性増強を生じることにより増大または増強される。いくつかの用途において、第２の核酸はＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）である。第１および第２の核酸は、同一構築物上で、別個の構築物上で、シス、並置、で連結され得るし、あるいはトランスで連結され得る。さらにいくつかの用途では、第１の核酸は、配列番号２の１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または５０〜５４連続アミノ酸から成る。
【０００７】
［発明の詳細な説明］
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ４Ａ遺伝子は、付随した遺伝子または核酸の転写および免疫原性を増大させるエンハンサーである、ということが発見された。本明細書中に提示されたデータは、ＨＣＶ−１  ＮＳ３／４Ａ遺伝子が哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる場合、真核生物発現ベクターに関して、ＮＳ３の発現レベルは、ＨＣＶ−１  ＮＳ３遺伝子および発現ベクターが単独（すなわちＮＳ４Ａなし）でトランスフェクトされた場合より高かった、ということを実証する。ＮＳ３／４Ａ遺伝子で免疫されたマウスは、ＮＳ３遺伝子単独で免疫されたマウスと比較して、１０〜１００倍高いレベルのＮＳ３−特異的抗体を初回抗原刺激されていたことが見出された。ＮＳ３特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、筋肉内にまたは経皮的に投与されたＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドにより有効に初回抗原刺激された。さらに、４μｇプラスミド／用量を用いた４回の遺伝子銃免疫は、強力な免疫応答を引き出したが、この場合、総脾臓ＣＤ８＋集団の約４％がＮＳ３／４Ａ特異的Ｔ細胞であった。これらの応答はｉｎ  ｖｉｖｏで活性であり、ＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞の増殖を抑制するのに十分であった。ヒト臨床試験に用いられる免疫原用量と同等の用量で経皮的に投与された場合、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１免疫原はＮＳ３特異的ＣＴＬを初回抗原刺激するのに非常に有効であることが判明した。
【０００８】
本明細書中に記載された実施形態は、付随した核酸（例えばＮＳ３をコードする遺伝子）の転写または免疫原性を増大させるためのＮＳ４Ａエンハンサーを含む遺伝子構築物の使用に関する。ＮＳ４Ａエンハンサーを含む発現構築物は、例えば、マーカー遺伝子（例えばグリーン蛍光タンパク質または「ＧＦＰ」またはｌａｃＺ）、免疫原（例えば肝炎またはＨＩＶ抗原）をコードする核酸、または治療用核酸（例えばアンチセンス構築物）の発現を増強するために用いられ得る。ＮＳ４Ａエンハンサーを含む発現構築物はまた、付随した遺伝子または遺伝子産物に対する免疫応答を生成するために用いられるワクチンおよび組成物中の活性成分であるよう処方され得る。好ましい実施形態は、遺伝子銃送達のために処方される組成物を用いるが、これは、約０．１〜２０μｇの間の任意量のＮＳ４Ａエンハンサーまたはその機能的部分を含む発現構築物および会合した遺伝子（例えば０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、３μｇ、５μｇ、７μｇ、１０μｇ、１３μｇ、１５μｇ、１７μｇまたは２０μｇ）を含む。
【０００９】
本明細書中に記載された方法は、ＮＳ４Ａエンハンサーに連結される対象遺伝子の発現を増大させるのに十分な量のＮＳ４Ａエンハンサーを含む組成物を、細胞、好ましくは哺乳動物（例えばヒト、ネコ、イヌ、ウマおよびヒツジ）または植物中に存在する細胞に導
入することにより実行され得る。以下の節で提示される例は、エンハンサー活性（例えば付随した遺伝子の転写の上方調節ならびに上記付随した遺伝子および／または遺伝子産物に対する免疫原性増大）が、細胞培養（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および哺乳動物中（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の両方において生じる、ということを実証する。
【００１０】
以下の節は、ＮＳ４ＡエンハンサーおよびＮＳ４Ａエンハンサーを含有する構築物を記載する。
【００１１】
ＮＳ４Ａエンハンサー
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、フラビウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスに属する（Virology, Fields ed., third edition, Lippencott-Raven publishers, pp 945-51 (1996)）。ＨＣＶゲノムは約９．６ｋｂ長であり、少なくとも１０のポリペプチドをコードする（Kato, Microb. Comp. Genomics, 5: 129-151 (2000)）。ゲノムＲＮＡはある単一ポリタンパク質に翻訳され、これはその後、ウイルスおよび細胞プロテアーゼにより切断されて、機能性ポリペプチドを産生する（同上）。ポリタンパク質は、３つの構造タンパク質（コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２）に、未知の機能を有するｐ７に、そして６つの非構造（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ／Ｂ、ＮＳ５Ａ／Ｂ）に切断される（同上）。ＮＳ３は、ウイルス成熟に必要とされるタンパク質分解事象のいくつかに関与するセリンプロテアーゼをコードし（Kwong et al., Antiviral Res., 41: 67-84 (1999)）、そしてＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼに関するコファクターとして作用する（同上）。ＮＳ３はさらにＮＴＰアーゼ活性を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡヘリカーゼ活性を保有する（Kwong et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 242: 171-96 (2000)）。
【００１２】
免疫原としてＮＳ３／４Ａを用いることの重要性が認識されている（例えば米国特許出願第０９／９２９，９５５号および米国特許出願第０９／９３０，５９１号参照）。さらに、完全ＮＳ３／４Ａプロテアーゼを含有する遺伝子免疫原に対する体液性応答は、かなり強力である（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)）。この理由はその時点で明らかでなかったが、しかしコファクターＮＳ４Ａの存在がＮＳ３の細胞内安定性を増大させるということを、いくつかは推測した（Wolk et al., J Virol, 74: 2293-2304 (2000)およびTanji et al., J Virol, 69: 1575-1581 (1995)）。安定性仮説の増大は、ＮＳ４Ａのアミノ末端が細胞内膜に対してＮＳ３／４Ａ複合体を標的にする、という事実により支持された（Tanji et al., J Virol, 69: 1575-1581 (1995)）。さらに、ＨＣＶ  ＮＳ３のプロテアーゼおよびヘリカーゼ活性はともに、ＮＳ４Ａの存在を必要とする（Bartenschlager et al., J Virol, 67: 3835-3844 (1993); Bartenschlager et al.,
J Virol, 69: 7519-7528 (1995); Failla et al., J Virol, 68: 3753-3760 (1994); Pang et al., Embo J, 21: 1168-1176 (2002)）。しかしながら本発明の開示まで、ＮＳ４Ａ遺伝子およびその部分が会合した遺伝子の発現および免疫原性を増強する、ということは分かっていなかった。
【００１３】
「ＮＳ４Ａエンハンサー」という用語は、会合した核酸の転写および／または前記付随した核酸の免疫原性を増強する任意のＨＣＶ単離物（好ましくはＨＣＶ−１ｂ）からの任意のＮＳ４Ａ遺伝子を指す。いくつかの情況では、「ＮＳ４Ａエンハンサー」という用語は、付随した遺伝子の転写および／または前記付随した遺伝子の免疫原性を増大させる能力を保持するＨＣＶ単離物（好ましくはＨＣＶ−１）のＮＳ４Ａ遺伝子の一部を指す。すなわち「ＮＳ４Ａエンハンサー」は、付随した遺伝子の転写および／または前記付随した遺伝子の免疫原性を増大させる能力を当該分子が保持する限り、ＮＳ４Ａの約３〜５４の任意量の連続アミノ酸（例えば寄託番号ＣＡＢ４６６７７により、そしてLohmann et al., Science 285: 110-113 (1999)により開示されるようなＳＴＷＶＬＶＧＧＶＬ  ＡＡＬＡＡＹＣＬＴＴ  ＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩ  ＬＳＧＫＰＡＩＩＰＤ  ＲＥＶＬＹＲＥＦＤＥ
ＭＥＥＣ（配列番号２））をコードする核酸から成るか、該核酸から本質的に成るか、
または該核酸を含み得る。すなわちＮＳ４Ａエンハンサーは、ＮＳ４Ａ（配列番号２）の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３または５４連続アミノ酸をコードする核酸から成るか、該核酸から本質的に成るか、または該核酸を含み得る。
【００１４】
さらに「ＮＳ４Ａエンハンサー」は、会合した遺伝子の転写および／または上記会合した遺伝子の免疫原性を増大させる能力を当該分子が保持する限り、ＮＳ４Ａ遺伝子の約９〜１６２の任意量の連続ヌクレオチド（例えば寄託番号ＡＪ２３８７９９により、そしてLohmann et al., Science 285: 110-113 (1999)により開示されるようなＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧ  ＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧ  ＣＧＧＡＧＴＣＣＴＡ  ＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧ  ＣＣＧＣＧＴＡＴＴＧ  ＣＣＴＧＡＣＡＡＣＡ  ＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧ  ＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧ
ＣＡＧＧＡＴＣＡＴＣ  ＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡ  ＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴ  ＣＡＴＴＣＣＣＧＡＣ  ＡＧＧＧＡＡＧＴＣＣ  ＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡ  ＧＴＴＣＧＡＴＧＡＧ  ＡＴＧＧＡＡＧＡＧＴ  ＧＣ（配列番号３））である核酸から成るか、該核酸から本質的に成るか、または該核酸を含み得る。すなわちＮＳ４Ａエンハンサーは、ＮＳ４Ａ遺伝子（例えば配列番号３）の少なくとも９、１５、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９または１６２連続ヌクレオチドである核酸から成るか、該核酸から本質的に成るか、または該核酸を含み得る。
【００１５】
本明細書中に記載されたＮＳ４Ａエンハンサーは、増強したい任意の所望の対象核酸（例えばＮＳ３）がＮＳ４Ａエンハンサーに付随され得るように設計される遺伝子構築物、例えば発現構築物中に組入れられ得る。このような会合は、「シス」状態にあり、これは同一プラスミド上に存在し、あるいは「トランス」状態で、これは別個のプラスミド上に存在する。好ましくはＮＳ４Ａおよび増強されるべき核酸は、並置される。望ましくはこのような構築物は、対象核酸をカセット様方式で容易に挿入させ、ＮＳ４Ａエンハンサーに連結させるＮＳ４Ａエンハンサーのまたはその付近の都合の良い制限部位（例えば多重クローニング部位）を有する。
【００１６】
以下の実施例は、ＮＳ４Ａエンハンサーを同定し、特徴付けるために用いられたいくつかの構築物の製造を記載する。
【実施例１】
【００１７】
ＮＳ３およびＮＳ３／４Ａ遺伝子を含有する構築物を、以下のように作製した。全長ＮＳ３およびＮＳ３／ＮＳ４Ａ遺伝子断片を、前に記載されたように（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)）、ＨＣＶ遺伝子型１ｂに感染した患者から増幅した。ＮＳ３およびＮＳ３／４Ａ遺伝子を真核生物発現ベクターｐＶＡＸ１（Invitrogen, San Diego, CA）に挿入した。ＮＳ３の増幅のために、順方向プライマー５’−ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＴＡＴ−３’（配列番号４）および逆方向プライマー５’−ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ−３’（配列番号５）を用いて、Ｅｃｏ  ＲＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限部位を導入した。工学処理された翻訳開始および停止コドンに下線を付す。ＮＳ３／ＮＳ４Ａの増幅のために、順方向プライマー５’−ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ
ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＴＡＴ−３’（配列番号４）および逆方向プライマー５’−ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ−３’（配列番号６）を用いて、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限部位を導入した。
これもまた、工学処理翻訳開始および停止コドンに下線を付す。発現構築物をシーケンスして、正しい配列およびリーディングフレームを保証し、そして構築物のサイズをＰＣＲおよび制限酵素切断により分析した。
【００１８】
突然変異ＮＳ３／４Ａ（ｍＮＳ３／４Ａ）遺伝子を含有する発現構築物も作製した。例えば一突然変異体構築物では、ＮＳ４Ａ上のアミノ末端セリン残基をプロリンに突然変異させた。この突然変異を、順方向プライマー（５’−ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＣＴ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＧＴＴ−３’（配列番号７））および逆方向プライマー（５’−ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＣＧＴ
ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ−３’（配列番号８））を用いて、部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（QuikChange, 部位特異的突然変異誘発キット、Stratagene; La
Jolla, CA）により、構築物中に導入した。その結果生じた構築物は、ｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１ベクターであった。突然変異体構築物をシーケンスして、所望の突然変異配列を制御し、正しいリーディングフレームを保証した。
【００１９】
ＮＳ３、ＮＳ４Ａエンハンサーおよび突然変異体ＮＳ３／４Ａを含有する構築物を、前に記載されたように（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)およびZhang
et al., Clin Diagn Lab Immunol, 7: 58-63 (2000)）、５０μｇカナマイシン／ｍｌを補足したルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地を含有するＬＡ／Ｋａｎａプレート上で培養した大腸菌から増殖させ、精製した。精製プラスミドＤＮＡを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解して、１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。
【００２０】
挿入遺伝子が無傷であり、そして翻訳され得る、ということを保証するために、原核生物Ｔ７結合網状赤血球溶解物系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写検定（ＴＮＴ；Promega, Madison, WI）を、前に記載されたように（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308
(2001)およびZhang et al., Clin Diagn Lab Immunol, 7: 58-63 (2000)）、３５Ｓ−メチオニンの存在下で実施した。プラスミドＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１およびｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１からの翻訳産物を生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この検定は、野生型におよび変異タンパク質がプラスミドから正確に翻訳されることができることを示した（図１参照）。
【００２１】
２つのバンド（約７０〜７８ｋＤ）はＮＳ３／４Ａプラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後に眼に見えるようになる、ということが前に観察されたが、このことは、ＮＳ３プロテアーゼにより媒介されるＮＳ３およびＮＳ４Ａ間の切断がｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳検定では完全でないかもしれない、ということを示す（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)およびZhang et al., Clin Diagn Lab Immunol, 7: 58-63 (2000)参照）。ＮＳ３／４Ａタンパク質分解部位のプロリンでＰ１’セリンを置換する標的化突然変異を導入することにより（Ingallinella et al., Biochemistry, 37: 8906-8914 (1998)およびSteinkuhler et al., J Virol, 70: 6694-6700 (1996)参照）、予測ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質を表すバンドのみが依然として可視的であった（図１）。Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒモチーフで連結Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒモチーフを置換することにより、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質のみが突然変異体プラスミドからの翻訳産物として検出され得るため、タンパク質分解部位が首尾よく破壊された。したがって、ＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１およびｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１構築物は予測全長遺伝子を発現し、そしてＮＳ３のプロテアーゼ活性は無傷のままであった、ということが確定された。
【００２２】
仔ハムスター腎（ＢＨＫ）−２１細胞を用いて、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）ベクターベースの発現系で、ＮＳ３、ＮＳ３／４ＡおよびｍＮＳ３／４Ａ遺伝子をさらにまた分析した。ＮＳ３、ＮＳ３／４ＡおよびｍＮＳ３／４Ａをコードする配列をＰＣＲによりＳｐｅ１−ＢＳｔＢ１断片として単離し、キャプシドの３４アミノ酸長翻訳エンハンサー
配列およびその後にＦＭＤＶ２ａ切断ペプチドを含有するｐＳＦＶ１０ＥｎｈのＳｐｅ１−ＢｓｔＢ１部位に挿入した（Smerdou et al., Curr Opin Mol Ther, 1: 244-251 (1999)およびSmerdou et al., J Virol, 73: 1092-1098 (1999)参照）。
【００２３】
２−ヘルパーＲＮＡ系を用いて、ｒＳＦＶ粒子中への組換えＲＮＡのパッケージングを成し遂げた（Smerdou et al., Curr Opin Mol Ther, 1: 244-251 (1999)およびSmerdou et al., J Virol, 73: 1092-1098 (1999)）。要するに、ＢＨＫ細胞（５％ＦＣＳ、１０％トリプトース・ホスフェイト・ブロス、２ｍＭのグルタミン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび抗生物質（ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌおよびペニシリン１００  ＩＵ／ｍｌ）を加えた完全ＢＨＫ培地で維持した）を、組換えＲＮＡおよび２つのヘルパーＲＮＡ(一方はＳＦＶキャプシドタンパク質をコードし、他方はエンベロープタンパク質をコードする)とともに同時トランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、組換えウィルスストックを含む培地を回収して精製した（Fleeton et al., J Gen Virol, 81: 749-758 (2000)参照）。
【００２４】
次に［３５Ｓ］メチオニンで代謝的標識することにより、ｒＳＦＶ感染細胞の発現レベルを分析した（Smerdou et al., Curr Opin Mol Ther, 1: 244-251 (1999)およびSmerdou
et al., J Virol, 73: 1092-1098 (1999)参照）。簡潔には、ＢＨＫ細胞を５のＭＯＩでｒＳＦＶ粒子に感染させて、１５時間後、増殖培地をメチオニンを含まないＭＥＭに取り換えて、３０分後に、７５μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを含有する新鮮な培地を付加した。１５分間標識後、非標識メチオニンを含有する培地中でさらに種々の時間細胞をインキュベートした。次に上清を収集し、１００ｍＭのヨードアセトアミドを含有するNonidetＰ−４０緩衝液で細胞を溶解した。細胞溶解物を、プロテインＡセファロースおよび抗ＮＳ３モノクローナル抗体（G. Inschauspe (Lyon, France)にご提供頂いた）とともに４℃で一晩免疫沈降させた。洗浄ペレットをＳＤＳ試料緩衝液中に再懸濁し、９５℃で５分間加熱後、１０％アクリルアミド還元ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。３つの遺伝子を発現するＳＦＶベクターによるＢＨＫ細胞の非増殖性感染は、インタクトのタンパク質分解部位を有するＮＳ３／４Ａ遺伝子は付随した遺伝子ＮＳ３の最高発現をもたらす、ということを明示した（図２参照）。データは、ＮＳ４Ａの存在が付随した遺伝子ＮＳ３の発現を増強する、ということを実証した。
【００２５】
次に、感染ＢＨＫ細胞の間接的免疫蛍光検査を実施した（Smerdou et al., Curr Opin Mol Ther, 1: 244-251 (1999)およびSmerdou et al., J Virol, 73: 1092-1098 (1999)）。すなわち、ＢＨＫ細胞を、５のＭＯＩでｒＳＦＶ−ＮＳ３、ＮＳ３／４ａまたはｍＮＳ３／４Ａに感染させた。１６、１８または２４時間増殖後、細胞をメタノール中に固定し、細胞を抗ＮＳ３モノクローナル抗体と、その後、抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ（Sigma）とともにインキュベートすることにより、タンパク質発現を検出した。ｒＳＦＶ−ＮＳ３およびｒＮＳ３／４Ａ感染ＢＨＫ細胞の免疫蛍光染色は、ＮＳ３の異なる細胞内分布を明示した（図２参照）。ｒＳＦＶ−ＮＳ３を用いた感染により発現されるＮＳ３タンパク質は、感染２４時間後のｒＮＳ３／４Ａと比較した場合に、より拡散した染色のパターンを表示したが、これは、ＮＳ４Ａにより付与された膜ターゲッティングの証拠を提示する。
【００２６】
次の節は、遺伝子構築物中のＮＳ４Ａエンハンサーに付随し得るいくつかの遺伝子を記載する。
【００２７】
ＮＳ４Ａエンハンサーに付随し得る核酸
ＮＳ４Ａエンハンサーは、多数の異なる付随した核酸の転写および免疫原性のレベルを改良し得る。ＮＳ４Ａエンハンサーは、例えばマーカー遺伝子の転写のレベルを改良し得る。ＧＦＰ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ｌａｃ  Ｚまたはクロラムフェニコールトランスフェラーゼをコードする遺伝子はとりわけ、市販の構築
物および／または分子生物学における慣用的技法を用いて、ＮＳ４Ａエンハンサーと容易に付随され得る。ＮＳ４Ａエンハンサーは、同様に免疫原をコードする核酸の転写および免疫原性のレベルを改良し得る。例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアおよびｅタンパク質またはＨＩＶ  ｇｐ１２０上に存在する配列に対応するペプチドからなるか、本質的に成るかまたは含むペプチドのような肝炎またはＨＩＶ抗原をコードする核酸は、ＮＳ４Ａエンハンサーと容易に会合され得る（例えば米国特許第６，４１７，３２４号；第５，５８９，１７５号；および第５，８４０，３１３号参照）。ＮＳ４Ａエンハンサーは、治療用遺伝子または核酸断片の転写のレベルも改良し得る。インターフェロンをコードする遺伝子または干渉する核酸（例えばアンチセンスまたはＲＮＡｉを起こす核酸）あるいは酵素をコードする遺伝子は、ＮＳ４Ａに連結され得る（例えば米国特許第４，８５５，２３８号；第５，５７４，１３７号；第５，５９５，８８８号；第５，６９０，９２５号；第６，３２６，１９３号；あるいは米国特許出願第２００２０１３７２１０号および第２００２００８６３５６号；あるいはＰＣＴ出願ＷＯ０２４４３２１；ＷＯ０１７５１６４；ＷＯ０１４２４４３；ＷＯ０１２９０５８；ＷＯ０２０７２７６２；およびＷＯ０１６８８３６参照）。
【００２８】
次の実施例は、ＮＳ４Ａ／ＧＦＰ構築物の構築を記載する。
【実施例２】
【００２９】
ＮＳ４Ａ／ＧＦＰ構築物を以下のように作製し、特徴付けることができる。ＧＦＰベクター（例えばｐＤＳ１−１、ｐＤＳ１−Ｎ１またはｐＤＳ１−Ｃ１）は、商業的供給元（Clonetech）から入手する。これらの発現ベクターは、エンハンサーおよび／またはプロモーターの効率を評価するよう設計され、そしてＮＳ４Ａおよびその他の要素の導入を促す都合の良い多数のクローニング部位を有する。例えば内因性プロモーターを有するベクターもあるし、プロモーターを挿入させるベクターもある。ベクター中のＧＦＰ配列に近位のクローニングを促すプライマーを用いて、上記のようにＰＣＲにより、ＮＳ４Ａ配列を生成し得る。任意に,ｐＶＡＸ−１中に存在するプロモーターをＧＦＰ／ＮＳ４Ａ構築物中にサブクローニングする。好ましくは、ＧＦＰの発現に及ぼすＮＳ４Ａの影響を直接評価するために、ＮＳ４Ａを欠く対照ベクターを作製する。シーケンスにより正確なクローンが立証されれば、適切な細胞株からの細胞をＮＳ４Ａ／ＧＦＰ構築物でトランスフェクトするか、あるいは対照構築物を用いてトランスフェクトする。次にＮＳ４Ａ／ＧＦＰ構築物含有細胞および対照構築物含有細胞中でのＧＦＰの発現を、メーカー推奨プロトコルに従って、慣用的な分析法（例えば顕微鏡またはＦＡＣＳ）を用いて比較する。ＮＳ４Ａ／ＧＦＰ含有細胞は、対照構築物を含有する細胞と比較した場合、ＧＦＰの発現増強を示す。
【００３０】
以下の節は、ＮＳ４Ａエンハンサーを用いて会合した遺伝子に対する免疫応答を促すかまたは改良したいくつかの方法を記載する。
【００３１】
ＮＳ４Ａは付随した核酸の免疫原性を改良する
会合した核酸の転写のレベルを増強するほかに、ＮＳ４Ａは付随した核酸の免疫原性を改良する、ということを発見した。したがって本明細書中に記載されたいくつかの実施形態は、ＮＳ４Ａおよび免疫原である付随した核酸を含有する構築物の製造および使用に関する。ワクチン製剤中の免疫原または活性成分としての核酸の使用は、十分に確立されている（例えば米国特許第５５８９４６６号および第６２１４８０４号参照）。好ましい実施形態は、ウイルス核酸ベースの免疫原、例えば肝炎免疫原（例えばＨＢＶコアおよびｅ免疫原およびＨＣＶ免疫原）ならびにＨＩＶ免疫原（例えばｇｐ１２０免疫原）と付随されるＮＳ４Ａ含有構築物の使用に関する。この目的のためにＮＳ４Ａに付随され得る核酸としては、例えば米国特許第６，４１７，３２４号；第５，５８９，１７５号；および第５，８４０，３１３号に記載されたペプチドをコードする核酸が挙げられる。次の実施例
は、会合ＮＳ３遺伝子も含有するＮＳ４Ａ含有構築物を用いて実行された実験を記載する。これらの実験の結果は、ＮＳ４Ａが付随した免疫原に対する免疫応答を促すかまたは改良するという証拠を提供した。
【実施例３】
【００３２】
異なるＮＳ３遺伝子の免疫原性を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを組換え（ｒ）ＮＳ３、ならびにＮＳ３、ＮＳ３／４ＡおよびｍＮＳ３／４Ａ遺伝子で免疫し、抗体力価を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いたのは、それらがＮＳ３に対して良好な反応を示すが、しかし遺伝子型１のＮＳ４Ａに対しては低／非反応であることが示されていたためであった（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001); Sallberg et al., J Gen Virol, 77: 2721-2728 (1996)およびZhang et al., J Gen Virol, 78: 2735-2746 (1997)）。したがって免疫応答における任意の差異は、新規のＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープの付加に起因するとは考えられなかった。近交系ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、商業的売主（Charles River, Uppsala, Sweden）から入手した。イソフルオラン麻酔マウスの眼窩後方採血により、一次免疫後２または４週目毎に、抗体検出およびアイソタイプ分類のための血清を収集した。前に記載されたように、酵素免疫検定を実施した（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)および Sallberg et al., J Gen Virol, 77: 2721-2728 (1996)）。
【００３３】
ＮＳ３およびＮＳ３／４Ａ遺伝子の免疫原性を直接比較するために、５匹のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスの２つの群を各々、１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫した。ＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡを、前脛骨（ＴＡ）筋に筋肉内(ｉ．ｍ．)投与した（Davis et al., Human Gene Therapy, 4: 733-740 (1993)）。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫したマウスは、より迅速な抗体応答を有し、ＮＳ３／４Ａプラスミドがより高い内在性免疫原性を有するという証拠を提供した（図３参照）。４回免疫後、ＮＳ３／４Ａで免疫されたマウスは、より高い抗体レベルを有した。
【００３４】
これらの予備的知見を立証するために、より大きい群のマウスを、ＮＳ３のみを発現するＮＳ３−ｐＶＡＸ１で、またはＮＳ３およびＮＳ４Ａの両方を発現するＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で、または突然変異体ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質を発現する突然変異体ＮＳ３／４Ａプラスミドで免疫した。ＮＳ３−ｐＶＡＸ１およびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミド間の免疫原性の差は、完全に反復された（図３参照）。さらにまた、ＮＳ３／４Ａ遺伝子は、応答マウスの平均抗体レベルおよび頻度に関して、ＮＳ３遺伝子単独よりも免疫原性が高かった。これらの結果は、ＮＳ４Ａが会合した遺伝子および／または遺伝子産物の免疫原性を増強する、ということを確証した。興味深いことに、初期免疫応答では、すなわち２および４週では、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドはまた、ｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドよりも高免疫原性であった（図３参照）。したがってある状況下では、会合した遺伝子およびＮＳ４Ａ間の機能的タンパク質分解部位が望ましい。
【００３５】
新規のＴｈエピトープがＮＳ３およびＮＳ４Ａタンパク質の接合部に生成されたか否か（これはＮＳ３／４Ａ遺伝子を用いて観察される免疫原性増大を部分的に説明し得る）を確定するために、Ｔ細胞増殖検定を実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｒＮＳ３またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫し、９日後に、脾臓細胞リコール培養を確立した（すなわちｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激細胞を、ｒＮＳ３で５日間リコールし、２０アミノ酸ペプチドをＮＳ３／４Ａ接合部にスパニングした）。組換えＮＳ３（ｒＮＳ３）タンパク質は、Darrell L. Peterson氏（Department of Biochemistry, Commonwealth University, VA）によりご提供頂いた。大腸菌中の組換えＮＳ３タンパク質（ＮＳ４Ａを含まない）の産生は、以前に詳細に記載されている（Jin et al., Arch. Biochem. Biophys., 323: 47-53 (1995)）。使用前に、ｒＮＳ３タンパク質をＰＢＳに対して一晩透析し、滅菌濾過した。完全フロイントアジュバントと混合した（１：１）１００μｇペプチドを用いて、尾
の基部に皮下（ｓ．ｃ．）注射して、ペプチド免疫を実施した。ＤＮＡ免疫原として用いられる完全ＮＳ３／４Ａ配列に対応する２０ｍｅｒペプチドを、前に記載されたように（Sallberg et al., Immunol Lett, 30: 59-68 (1991)）、自動ペプチド合成により合成した。
【００３６】
図３に示したように、ｒＮＳ３およびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１はともに、ｒＮＳ３によりｉｎ  ｖｉｔｒｏでリコールされたＴ細胞を初回抗原刺激した。ｒＮＳ３またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１初回抗原刺激化Ｔ細胞は、ＮＳ３／４Ａ接合性ペプチドによりリコールされない。同一結果は、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスにおいて反復された。これらの結果は、新規のＴヘルパー細胞部位はＮＳ３／４Ａ融合タンパク質により生成されなかった、ということを確証した。
【００３７】
ＮＳ３およびＮＳ３／４Ａの増殖性Ｔｈ細胞応答を比較するために、マウスの群を１００μｇのプラスミドで免疫し、１３日後、脾臓細胞を収穫し、ｒＮＳ３を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏリコール検定を確立した。ＮＳ３に対する増殖性応答の検出は、前に記載されたプロトコルに従った（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)および Sallberg et al., J Gen Virol, 77: 2721-2728 (1996)）。簡潔には、筋肉中の１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１でマウスの群を免疫した。１３日後、脾臓細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製し、細胞をｒＮＳ３の連続希釈液とともにインキュベートした。細胞を、ｒＮＳ３とともにまたは伴わずに４日間インキュベートし、最後の２４時間は３Ｈ−標識チミジン（ＴｄＲ）を付加した。液体シンチレーション計測により、放射性チミジンの取込みを測定した。
【００３８】
ＮＳ３特異的Ｔｈ細胞初回抗原刺激のレベルは、ＮＳ３免疫マウスの場合よりＮＳ３／４Ａ免疫マウスにおいてより効率的である、ということを確定した（図４）。Ｔ細胞増殖のレベルはより高く、そして検出可能応答をリコールするために必要とされるｒＮＳ３の量はより低かった。
【００３９】
ＮＳ３／４Ａ免疫により初回抗原刺激されるＴｈ細胞表現型は、以前に詳細に記載されている（Lazdina et al., J Gen Virol, 82: 1299-1308 (2001)）。ＮＳ３およびＮＳ３／４Ａ免疫により初回抗原刺激されたＴ細胞応答のＴヘルパー１（Ｔｈ１）およびＴｈ２−傾斜を直接比較するために、ＮＳ３特異的ＩｇＧ１（Ｔｈ２）およびＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１）抗体のレベルを分析した（図４参照）。ＰＢＳ中のｒＮＳ３またはアジュバントで免疫されたＨ−２ｄおよびＨ−２ｋマウスでは、ＩｇＧ１はドミナントなサブクラスであった。ｒＮＳ３で免疫したマウスにおけるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、Ｔｈ２支配応答をシグナル伝達するネズミハプロタイプにかかわらず、常に＜１であった（Schirmbeck et al., Intervirology, 44: 115-123 (2001)）。それに反して、ＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫したマウスは、＞１のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比により照明されるＴｈ１−傾斜Ｔｈ−細胞応答を有した。しかしながらＮＳ３−ｐＶＡＸ１免疫マウスにおけるサブクラス比は、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２応答の証拠を提供した（図４）。これに反して、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１免疫マウスはＩｇＧ１を示さなかったが、これは顕著なＴｈ１傾斜応答を示す。
【００４０】
本実施例における実験は、ＮＳ３ベースのＤＮＡ免疫原中のＮＳ４Ａの含入がより迅速なＮＳ３特異的体液性応答をもたらし、これはより高い力価に達する、ということを実証した。さらにＴｈ細胞の初回抗原刺激はより効果的であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡は、Ｔｈ１方向にシフトした。したがってＮＳ３タンパク質の内在性免疫原性は、ＮＳ４Ａの付加により改良されていた。次の実施例は、ＮＳ４Ａがｉｎ  ｖｉｖｏでの会合した核酸の免疫原性を増強する、という付加的証拠を示す。
【実施例４】
【００４１】
所望の抗原を発現するＳＰ２／０ミエローマ細胞を含有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍増殖の抑制をモニタリングすることにより、特定の抗原に対する免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に分析し得る（Encke et al., J Immunol, 161: 4917-4923 (1998)参照）。ＤＮＡ免疫後の腫瘍増殖の抑制は、特定のＣＴＬの効率的な初回抗原刺激に完全に依っている（Encke et al., J Immunol, 161: 4917-4923 (1998)）。このモデルは、望ましくないウイルスタンパク質（すなわちベクター由来タンパク質）が細胞により産生されないため、例えば組換えワクシニアウイルス系より信頼できる。
【００４２】
ＮＳ３／４Ａを安定的に発現するＳＰ２／０細胞株を作製し、ＮＳ３／４Ａ発現細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖動態が親細胞株と完全に一致することを見出した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Sigma Chemicals, St Louis, MO）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノールおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウム(GIBCO-BRL, Gaithersburgh, MD)を補足したＤＭＥＭ培地中に、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞株（Ｈ−２ｄ）を保持した。SuperFect（Qiagen GmbH, Hilden, FRG）トランスフェクション試薬を用いて、直線化ＮＳ３／４Ａ−ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドでＳＰ２／０細胞をトランスフェクトすることにより、ＮＳ３／４Ａの安定発現を示すＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞を生成した。メーカーのプロトコルに従って、トランスフェクション手法を実施した。限定希釈によりトランスフェクトされた細胞をクローン化し、８００μｇのジェネティシン（Ｇ４１８）／ｍｌ完全ＤＭＥＭ培地の付加により選定した。逆転写ＰＣＲにより、ならびにＮＳ３に対するモノクローナル抗体を用いた捕捉ＥＩＡにより、ＮＳ３／４Ａの発現を確認した（Zhang et al., Clin Diagn Lab Immunol, 7: 58-63 (2000)）。
【００４３】
ＮＳ３／４Ａ発現細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解したＣＴＬを初回抗原刺激するために必要とされるＤＮＡ注射の量を決定するよう、初期実験を計画した。心臓毒（ＤＮＡ免疫前に５日間、０．９％滅菌ＮａＣｌ生理食塩水中の０．０１ｍＭの心臓毒（Latoxan, Rosans, France）を５０μＬ／ＴＡで筋注し、４週間間隔で追加免疫した）でマウスを前処理し、次にＴＡ筋肉中に１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を１ヶ月に２回、３回または６回投与した。各注射の２週間後に５匹のマウスの群を屠殺し、分析した。ＤＮＡ免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞を、完全ＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。５Ｕ／ｍｌ組換えネズミＩＬ−２（ｍＩＬ−２；R&D Systems, Minneapolis, MN）を含入する最終容積１２ｍｌでの２５ｍｌフラスコ中で５日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を実行した。再刺激培養は、ＮＳ３／４Ａタンパク質を発現する総計４０×１０６免疫脾臓細胞および２×１０６照射（１０，０００  ｒａｄ）同系ＳＰ２／０細胞を含有した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の５日後、標準５１Ｃｒ放出検定を実施した。ＳＰ２／０細胞およびＮＳ３／４Ａタンパク質を発現するＳＰ２／０細胞を標的とし、２０μｌの５１Ｃｒ（５ｍＣｉ／ｍｌ）で１時間標識され、次にＰＢＳ中で３回洗浄された。エフェクター細胞の連続希釈液を５×１０３個の５１Ｃｒ標識化標的細胞／ウェルとともにインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で４時間のインキュベーション後、１００μｌの上清を回収し、γ−カウンターにより放射能を確定した。
【００４４】
同様に、ペプチド免疫マウス（免疫後１２日）またはナイーブマウスからの脾臓細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノールおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁した。２５×１０６脾臓細胞および２５×１０６照射（２，０００  ｒａｄ）同系脾臓細胞を含入する総容積１２ｍｌを２５ｍｌフラスコ中で５日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を実行した。０．０５μＭのＮＳ３／４Ａ−Ｈ−２Ｄｂ結合ペプ
チド（配列ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ、配列番号１）または非関連Ｈ−２Ｄｂペプチド（配列ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ、配列番号９）の存在下で、再刺激を実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日後、５１Ｃｒ放出検定を上記のように実施した。ＲＭＡ−Ｓ細胞および５１Ｃｒ標識前に＋３７℃で１．５時間、５０μＭのペプチドでパルス処理したＲＭＡ−Ｓ細胞は、標的とした。３〜６回筋注は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出可能ＣＴＬを初回抗原刺激するために必要とされる、ということを決定した（図５参照）。
【００４５】
活性ＣＴＬがｉｎ  ｖｉｖｏで初回抗原刺激されたことを保証するために、全マウスに５回の免疫を施した後、ＮＳ３／４Ａ発現細胞を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ曝露（challenge）した。Encke等（Encke et al., J Immunol, 161: 4917-4923 (1998)）により記載された方法に従って、ＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０ミエローマを用いた免疫マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ曝露を実施した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、記載されたように０、４、８、１２および１６週目に異なる免疫原で免疫した。最終免疫後２週間目に、２×１０６個のＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞を右わき腹に皮下注射した。腫瘍注射後７、１１および１３日目に皮膚を介して腫瘍のサイズを測定することにより、腫瘍増殖の動態を確定した。平均腫瘍サイズを算定し、動的腫瘍発達を、曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて比較した。ＡＵＣ値を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。頻度分析のためにフィッシャーの直接確率検定を用い、２つの群からの値を比較するためにはマン−ホイットニーＵ検定を用いた。ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアのマッキントッシュバージョン（バージョン５．０）を用いて、計算を実施した。ＰＢＳで、またはヒト免疫不全ウイルス１型のｐ１７タンパク質を発現する対照プラスミド（Iroegbu et al., Clin Diagn Lab Immunol, 7: 377-383 (2000)）で免疫したマウスの群間の腫瘍増殖に差は認められなかった（図６参照）。
【００４６】
１４日目に、全マウスを屠殺し、腫瘍を取り出して、パラフィン包埋し、切片にした。簡潔には、腫瘍組織をホルマリン中に入れて、パラフィン中に包埋し、そして４μｍの切片を調製した。パラフィン包埋切片をアビジン−ビオチンブロッキングキット（Vector, Vector Laboratories, Burlingame, CA）で前処理し、次に抗ＣＤ３抗体（Dako, Denmark）で免疫染色して、腫瘍中のＴ細胞浸潤の量を確定した。検出のために、ビオチニル化免疫グロブリンを、その後、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ（Vector）を用いた。ＣＤ３免疫染色のいくつかのために、マイクロ波前処理も用いた。標準手法に従って、４μｍ厚腫瘍切片をスライド上に載せて、いくつかをヘマトキシリン−エオシン染料で染色した。切片が属する群を知らされていない病理学者が、腫瘍の組織学的外観を分析した。
【００４７】
ＣＦＡ中のｒＮＳ３で免疫したマウスは腫瘍増殖の抑制を示さず、これは、特定のＢおよびＴｈ細胞単独の初回抗原刺激はこのモデルにおいては腫瘍防御を付与しないということを明らかにし、一方、１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫したマウスは全ての時点で腫瘍増殖の有意の低減を示した（図６参照）。興味深いことに、ｍＮＳ３／４Ａによる免疫は、７および１３日目には腫瘍増殖の有意の抑制を示したが、しかし１１日目には示さなかった。プラスミドの用量を１０分の１に低減することにより、応答抑制を初回抗原刺激する能力はＮＳ３−ｐＶＡＸ１プラスミドに関しては失われたが、しかしＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドに関しては失われなかった（図６参照）。これらの実験は、ＮＳ４がｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答を防御する腫瘍の初回抗原刺激においてＮＳ３の免疫原性を増強する、ということを明示した。ｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を用いた免疫によりわずかに低い防御が付与されたため、ＮＳ３／４Ａ接合部での機能的切断部位の存在は重要であり得る。
【００４８】
異なる実験群から回収された腫瘍の全ての組織学的知見は、偽免疫マウスにおいて発症した腫瘍のほとんどが壊死性で、中心細胞死および凝縮（pycnotic）核残遺物の存在により特徴付けられる、ということを明示した（図７参照）。ＣＤ３抗原に関して染色された
対応する切片では、陽性Ｔリンパ球のまばらな浸潤のみが認められた。同様の観察は、組換えＮＳ３タンパク質で免疫したマウスから単離された腫瘍でなされた。ＤＮＡ免疫動物（すなわちＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１およびｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１）では、時折壊死が観察されただけであった。これらの腫瘍では、大きな領域が浮腫性（oedematous）および血管新生化組織に置き換えられていた（図７参照）。これらの領域は、ＣＤ３陽性リンパ球により密に浸潤された。生存可能な腫瘍組織との境界では、リンパ球の蓄積、ならびに死滅するミエローマ細胞であろうアポトーシス細胞が認められた（図７参照）。さらにＣＤ３抗体による染色は、腫瘍退行の領域におけるＴ細胞の大きな侵入を明示した（図７参照）。
【００４９】
これらのデータはさらに、Ｔ細胞、おそらくはＣＴＬが、観察された腫瘍増殖抑制に関与しており、そしてＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞のＣＴＬ依存性抑制は、ＮＳ４Ａが存在した場合、１０分の１の用量の免疫原でｉｎ  ｖｉｖｏで得られる、ということを明らかにする。明らかに、ＮＳ４Ａは付随した遺伝子または遺伝子産物（例えばヘテロ二量体または融合タンパク質）の免疫原性を増強する。
【００５０】
次の実施例は、ＮＳ３／ＮＳ４ＡベースのＤＮＡ免疫原の使用を評価したより多くの実験を記載する。
【実施例５】
【００５１】
筋肉組織を再生するに際しての注射はマウスにおけるＤＮＡ免疫のために有効であるが、しかしこのような処置はヒトに用いるには望ましくない。したがって遺伝子銃を用いたＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１免疫原による経皮免疫の有効性を評価するための実験を実行した。遺伝子銃ベースの免疫のために、メーカー（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）により供給されたプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを金粒子と連結させた。免疫前に、注射領域を剃毛し、メーカーのプロトコルに従って免疫を実施した。各注射用量は、４μｇのプラスミドＤＮＡを含有した。１ヶ月間隔で、同一用量を用いてマウスを追加免疫した。
【００５２】
最初に、経皮プラスミド投与のＣＴＬ初回抗原刺激効率を評価するために、フローサイトメトリーによりＣＴＬ応答を定量するのに必要な試薬を開発した。まずＨ−２ｂ制限ＮＳ３特異的ＣＴＬエピトープに対応するペプチドを同定して、二価ＭＨＣ：Ｉｇ融合タンパク質を用いてＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬを定量した（Dal Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6671-6675 (1993)参照）。次にＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬエピトープを、一組の重複２０アミノ酸長合成ペプチド範囲のＮＳ３／４Ａ（１０アミノ酸重複を伴う総計６９の異なるペプチド）から同定した。抗原プロセシング（ＴＡＰ）２欠損ＲＭＡ−Ｓ細胞株と会合した輸送体上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の安定化に関して、２０アミノ酸長ペプチドを検定した（Ljunggren et al., Nature, 346: 476-480 (1990); Stuber et al., Eur J Immunol, 22: 2697-2703 (1992)）。
【００５３】
簡潔には、５％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中にＲＭＡ−Ｓ細胞を維持した。全細胞を、保湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で増殖させた。１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、１×１０６ＲＭＡ−ｓ細胞を、約０．３ｍＭの個々の２０−ｍｅｒペプチドとともに室温（〜２１℃）で１６〜２０時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、最適濃度（１μｇ／１０６）のＦＩＴＣ結合抗Ｈ−２Ｋｂまたは抗Ｈ−２Ｄｂ抗体を用いて氷上で３０分間染色した。０．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ：Sigma）を含有するＰＢＳ／１％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に細胞を再懸濁した。次に生細胞（ＰＩ陰性）上でのＨ−２ＫｂおよびＨ−２Ｄｂ発現を、ＦＡＣＳにより分析した。
この検定により、単一ペプチドを同定し、これは、高親和性でＨ−２Ｄｂ分子を結合した。
【００５４】
好ましいペプチド配列を同定するために、９アミノ酸長ペプチド（８つのアミノ酸重複）を合成し、Ｈ−２Ｄｂ結合に関して評価した。種々のペプチド濃度（０．０１〜１００μＭ）を用いて、ペプチド負荷ＲＭＡ−Ｓ細胞を３７℃で４５分間追跡した後、非特異的バックグラウンドを低減するために、抗Ｈ−２Ｄｂ抗体で染色した。
【００５５】
上記の実験は、Ｈ−２Ｄｂを有意に結合するＮＳ３／４Ａ接合部からの２１アミノ酸であるＮＳ３のＣ末端に位置する配列ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号１）から成るペプチドを明示した。次にこのペプチドを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（４〜８週齢）を免疫した。同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを、商業的売主（Charles River, Uppsala, Sweden）から入手した。免疫マウスからの脾臓細胞を収穫し、ＮＳ３ペプチドおよび無関連ペプチドを用いて再刺激培養を準備した。５日後、ペプチド負荷ＲＭＡ−Ｓ細胞の溶解に関して、効果細胞を試験した。
【００５６】
ＮＳ３／４Ａ−ペプチドで再刺激しておいたペプチド免疫マウスからの脾臓細胞では、ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬのみが検出された（図８参照）。ＮＳ３由来ＣＴＬペプチドが、遺伝子銃を用いたＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１免疫により初回抗原刺激されたＣＴＬにより認識され得るか否かを試験するために、ＤＮＡ免疫マウスからの脾臓をＮＳ３ペプチドで再刺激して、ペプチド負荷ＲＭＡ−Ｓ細胞の溶解に関して評価した。これらの実験は、遺伝子銃を用いてＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で経皮的に免疫されたマウスは、脾臓細胞がＮＳ３−ペプチドで再刺激されていた場合にのみＮＳ３特異的ＣＴＬを発生し、無関連ペプチドで再刺激された場合は生じないことを示した（図８参照）。
【００５７】
次に、特異的ＣＴＬをｅｘ−ｖｉｖｏで直接的に定量した。このアプローチの一利点は、それが、分析前にＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡張を回避する、という点であった。組換え可溶性二量体マウスＨ−２Ｄｂ：Ｉｇ融合タンパク質を用いたＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡ免疫マウスからの脾臓細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ染色により、ＮＳ３／４Ａ−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を分析した。１００μｌのＰＢＳ／１％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁させた約２×１０６個の脾臓細胞を、１μｇ／１０６細胞のＦｃ遮断抗体とともに氷上で１５分間インキュベートした。次に細胞を、１６０ｎＭの余分量のＮＳ３／４Ａ由来ペプチドで＋４℃で４８時間前負荷した２μｇ／１０６細胞のＨ−２Ｄｂ：Ｉｇ（配列ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ、配列番号１）、または２μｇ／１０６細胞の非負荷Ｈ−２Ｄｂ：Ｉｇ融合タンパク質とともに、氷上で１．５時間インキュベートした。次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、１０μｌ／１００μｌのＰＥ接合ラット−αマウスＩｇＧ１二次抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液１００μｌ中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、１μｇ／１０６細胞のＦＩＴＣ接合α−マウスＣＤ８抗体とともに３０分間インキュベートした。次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのＰＩを含有するＦＡＣＳ緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁した。各試料からの約２００，０００事象をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BDB）で得て、死細胞（ＰＩ陽性細胞）を分析では排除した。
【００５８】
ＮＳ３−ペプチド負荷二価Ｈ−２Ｄｂ：Ｉｇ融合タンパク質分子を用いたＮＳ３特異的ＣＴＬの直接ｅｘ−ｖｉｖｏ定量は、遺伝子銃を用いてＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で経皮的に免疫したマウスからの脾臓のＣＤ８＋集団の約２％〜４％がＮＳ３／４Ａに特異的である、ということを明示した（図９参照）。この結果は、溶解検定で記録されたペプチド負荷細胞の有効な溶解と完全に一致した。明らかに、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１は特異的ＣＴＬの大集団を有効に初回抗原刺激し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に検出可能であり、そして微細にマッピングされたＨ−２Ｄｂ結合ＮＳ３特異的ＣＴＬエピトープを認識
した。
【００５９】
経皮投与後にｉｎ  ｖｉｖｏでの初回抗原刺激ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬ応答の効率を試験するために、免疫マウスをＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０腫瘍細胞株で曝露した。従来の実験は、４回の経皮注射がＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬの高前駆体頻度を初回抗原刺激した、ということを示していた。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、未処置のままにしておくか、または４μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドを１ヶ月間隔で用いる４回の注射を投与した。総用量１６μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＴＬ応答を有効に初回抗原刺激し、腫瘍増殖を有意に抑制した（図１０参照）。したがってヒトワクチン試験にすでに用いたもの（Roy et al., Vaccine, 19: 764-778
(2000)）と一致する抗原用量で遺伝子銃免疫を用いることにより、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドは腫瘍抑制免疫応答を有効に初回抗原刺激する、ということが発見された。次の実施例は、ＮＳ４Ａがその発現を増大させることにより会合した核酸の免疫原性を増強する、という証拠を提供する。
【実施例６】
【００６０】
ＮＳ４Ａに付随された遺伝子の免疫原性増大に関する基礎を評価するために、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドまたは対照配列の存在下でのＢ細胞活性化および増殖を試験する実験を実施した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０倍地中のＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞（２×１０６／ｍｌ）を、５μｇ／ｍｌのｐＶＡＸ１ベクターまたは５μｇ／ｍｌのＮＳ３−ｐＶＡＸ１  ＤＮＡまたは５μｇ／ｍｌのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１  ＤＮＡを用いて、２４時間または４８時間刺激した。培地のみの中で増殖させた細胞は、陰性対照として用い、そして１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma Chemicals, St Louis, MO）および１．３μｇ／ｍｌのホスホロチオエート修飾オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ；Cybergene AB, Sweden）（ＣｐＧ−１８２６と呼ばれる）（Hartmann et al., J Immunol, 164:
1617-1624 (2000)）は、陽性対照として用いた。培養の最後の４時間に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；Sigma Chemicals）を付加して、最終濃度を１０μＭとした。培養終了時に、細胞を遠心分離して、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で２回洗浄した。最終洗浄後、細胞を２．４Ｇ２ｍＡｂ（ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中に１μｇ／１０６細胞）とともに＋４℃で２０分間インキュベートした。次に細胞を上記と同様に洗浄した。その後、細胞をＰＥ結合抗ＣＤ６９抗体およびＣｙＣｈｒｏｍｅ（商標）結合抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体を用いて、＋４℃で３０分間染色した。次に細胞を上記と同様に洗浄した。その後、ウェル当たり１００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）溶液（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｐｌｕｓキット（BDB Pharmingen）に含まれる）を付加することにより、細胞を固定し、透過化処理（permeabilized）して、＋４℃で20分間インキュベートした。その後、細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｐｌｕｓキットに含まれる）中で洗浄した。Boehringer Mannheim（Mannheim, Germany）から購入した２．５μｌ／ｍｌの２，０００Ｕ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）ＤＮアーゼＩを補足したＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液で希釈した１：１０のＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体で細胞を染色した。細胞を室温で暗所で１時間インキュベートし、次にＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液中で２回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中に再懸濁した。試料をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（商標）（BDB）で分析し、ＣＤ６９およびＢｒｄＵに対して陽性のＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ゲート）のパーセンテージを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）（BDB）プログラムを用いて算定した。対照ＤＮＡ配列（ＣＰＧ−１８２６）はＢ細胞を活性化するが、しかしフローサイトメトリーによるＮＳ３−ｐＶＡＸ１およびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１の付加により誘導されるＢ細胞活性化の比較は差を示さない、ということが観察された。このデータは、ＮＳ４Ａが付随した遺伝子の発現を増強することにより付随した遺伝子の免疫原性を増大させる、という証拠を提供した。
【００６１】
先の実施例では、全てのモノクローナル抗体およびＭＨＣ：Ｉｇ融合タンパク質（Dal 
Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6671-6675 (1993)）は、BDB Pharmingen（San Diego, CA）から購入した：例えば抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ−ブロック（商標）、クローン２．４Ｇ２）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、ＦＩＴＣ結合抗Ｈ−２Ｋｂ（クローンＡＦ６−８８．５）、ＦＩＴＣ結合抗Ｈ−２Ｄｂ（クローンＫＨ９５）、組換え可溶性二量体マウスＨ−２Ｄｂ：Ｉｇ、ＰＥ接合ラット−αマウスＩｇＧ１（クローンＸ５６）、ＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵ（クローンＢ４４）、ＰＥ結合抗ＣＤ６９（クローンＨ１．２Ｆ３）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（商標）結合抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６８２）。次の実施例は、ＮＳ４Ａがエンハンサーであるというよりさらなる証拠を提供する。
【実施例７】
【００６２】
異なるベクターにより初回抗原刺激されたＮＳ３特異的ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解活性を直接比較するために、１回または２回免疫後に標準５１Ｃｒ放出検定を実施した。ｗｔＮＳ３−ｐＶＡＸ１（野生型ＮＳ３）、ｗｔＮＳ３／４Ａ（野生型ＮＳ３／４Ａ）およびｃｏＮＳ３／４Ａ（ヒトコドン最適化ＮＳ３／４Ａ）プラスミドの遺伝子銃免疫、あるいはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ粒子（セムリキ森林ウイルス粒子を含有するＮＳ３／４Ａ）の皮下注射により、Ｈ−２ｂマウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出可能ＣＴＬの初回抗原刺激を実行した。コドン最適化ＮＳ３／４Ａ構築物を作製するために、ヒト細胞中の最も一般的に用いられるコドンに関するコドン用法に関して、野生型ＮＳ３／４Ａを分析した。総計４３３個のヌクレオチド（１５アミノ酸が異なった）を、ヒト細胞のためのコドン用法を最適化するために置き換えた。ｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子は、ＨＣＶ−１参照株のヌクレオチド位置３４１７〜５４７５の領域と７９％の配列相同性を有する。
【００６３】
５〜１０匹のＨ−２ｂマウスの群を、１回（ａ）または２回（ｂ）免疫した。ＮＳ３−ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ発現ＲＭＡ−Ｓ細胞、ならびにＮＳ３／４Ａを安定的に発現するＥＬ−４細胞の両方で、ｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激化ＣＴＬの溶解活性を検定した。特異的溶解％は、ＮＳ３−ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞（（ａ）および（ｂ）の上パネル）またはＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞（（ａ）および（ｂ）の下パネル）を用いて得られた溶解％から非負荷または非トランスフェクト化ＥＬ−４細胞を用いて得られた溶解％を引いた値に対応する。値は、６０：１、２０：１および７：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比に関して示されている。各線は、個々のマウスを示す。
【００６４】
１回投与後、ＮＳ３／４Ａコード構築物は、ＮＳ３−ペプチド被覆標的細胞を溶解するＣＴＬの初回抗原刺激に際して、ＮＳ３プラスミドより有意に効率的である、ということが明らかになった（図１１参照）。したがってＣＴＬ初回抗原刺激事象は、ＮＳ４Ａ遺伝子の存在により増強された。ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞を用いた場合、差はあまり明白でなかったが、これはおそらくは、この検定が低感受性のためである。２回免疫後、全てのＮＳ３／４Ａベクターが、同様の効率でＮＳ３特異的ＣＴＬを初回抗原刺激すると思われた。しかしながらＮＳ３／４Ａ含有ベクターのいずれかを用いた２回免疫は、ｗｔＮＳ３遺伝子のみを含有するプラスミドと比較した場合、ＮＳ３特異的ＣＴＬの初回抗原刺激において明らかにより効率的であった。したがってＮＳ４Ａ遺伝子は、ＮＳ３特異的ＣＴＬのより迅速な初回抗原刺激を促すエンハンサーである。次の実施例は、ＮＳ４Ａがエンハンサーであるというさらなる証拠を提供する。
【実施例８】
【００６５】
ＨＣＶウイルス抗原を発現するＳＰ２／０ミエローマ細胞を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、あるいはＨＣＶウイルス抗原を発現するＥＬ−４リンパ細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖の抑制の分析が、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＨＣＶ特異的免疫応答を表すことは、当該技術分野の当業者により認識されている（Encke J et al., J Immunol, 161: 4917-4923 (1998)参照）。ＮＳ３／４Ａを安定的に発現
するＳＰ２／０細胞株は、前に記載されており（Frelin L et al., Gene Ther 10: 686-699 (2003)参照）、そしてＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞株は下記のように特徴付けられた。
【００６６】
ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞株を用いた腫瘍増殖の抑制がＮＳ３／４Ａ特異的免疫応答に完全に依っている、ということを確証するために、対照実験を実施した。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、非免疫のままでおくか、またはｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドで２回免疫した。免疫の２週間後、１０６のナイーブＥＬ−４またはＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞（ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４）の皮下注射により、マウスを曝露した。ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４細胞株の増殖に対して免疫マウスのみが防御されたため、ＮＳ３／４Ａ特異的免疫応答は防御のために必要であった。したがってこのＨ−２ｂ制限モデルは、前に記載されたＨ−２ｂ制限モデル（同上）と非常に類似して振舞う。
【００６７】
組換えＮＳ３タンパク質による免疫は、ＮＳ３／４Ａ特異的Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方が腫瘍増殖に対する防御においてきわめて重要であるというわけではない、という証拠を提供した。ｃｏＮＳ３／４Ａプラスミド免疫Ｈ−２ｂマウスからの脾臓細胞のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの欠乏は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が５１Ｃｒ放出検定における主要効果細胞である、ということを示唆した。ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性抗腫瘍効果細胞集団を定義(define)するために、ｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドで免疫したマウスにおけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４主要細胞株を用いた攻撃誘発の１週間前および最中に選択的に欠乏させた。フローサイトメトリーによる分析は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の８５％がそれぞれ欠乏していた、ということを明示した。この実験は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ欠失は腫瘍免疫性に有意の作用を及ぼさない、ということを明示した。これに反して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞の欠失は、腫瘍免疫性を有意に低減した。したがって予測どおり、ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬは、腫瘍増殖の抑制に関するｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるエフェクター段階での主要防御細胞であると思われる。
【００６８】
次に上記の腫瘍曝露モデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍細胞の増殖に対する防御免疫を初回抗原刺激するに際しての異なる免疫原の効率を評価した。初回抗原刺激事象の有効性が試験されたことを保証するために、全てのマウスを１回だけ免疫した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＴＬデータと完全に一致して、ＮＳ３／４Ａを含有するベクターのみが防御的免疫応答を迅速に初回抗原刺激し得る、ということが観察された（図１２参照）（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。この初回抗原刺激事象は、ＮＳ４Ａエンハンサーに依っており、そしてコドン最適化とは無関係であった。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ防御的ＣＤ８＋ＣＴＬ応答の初回抗原刺激のための必要前提条件をさらに明らかにするために、さらなる実験を実施した。まず、ＮＳ３由来ＣＴＬペプチドで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍の増殖に対して防御されなかった（図１２）。第二に、アジュバント中の組換えＮＳ３による免疫は、腫瘍増殖に対して防御しなかった（図１２）。ＮＳ３由来ＣＴＬペプチドはＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＴＬを有効に初回抗原刺激し、アジュバント中のｒＮＳ３は高レベルのＮＳ３特異的Ｔヘルパー細胞を初回抗原刺激するため、ＮＳ３／４Ａの内因性産生はｉｎ  ｖｉｖｏ防御的ＣＴＬを初回抗原刺激するために必要であると思われる。初回抗原刺激事象をさらに特徴付けるために、Ｂ細胞の群（μＭＴ）またはＣＤ４欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を用いてｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子で１回免疫し、２週間後に曝露した（図１２）。両系列はともに腫瘍増殖に対して防御されたため、Ｂ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬの初回抗原刺激の必要がなかった（図１２）。したがってＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍防御性ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬの初回抗原刺激は、エンハンサーＮＳ４Ａ、ならびに免疫原の内因性発現を要
する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、初回抗原刺激は、遺伝子送達経路または補助細胞、例えばＢ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞にあまり依存しない。ｃｏＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡプラスミドによるｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＣＴＬの初回抗原刺激はＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に無関係であったという事実は、初回抗原刺激が起きた速度を説明するのに役立ち得る。
【００７０】
ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４細胞株を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける反復実験は、腫瘍増殖に対する防御は、コドン最適化とは無関係に、ＮＳ３／４Ａ遺伝子による最初の免疫後すでに得られる、ということを示している（図１２）。さらにまた２回注射後、ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍増殖に対する免疫性はさらに増強されたが、しかしＮＳ４Ａが存在した場合のみであった。したがってこのモデルは、異なる免疫原の内在性免疫原性における微妙な差を明示するのに十分に感受性であるというわけではない。ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡプラスミドの免疫原性をより良好に比較するために、Ｈ−２ｂマウスにおいてさらなる実験を実施したが、この場合、少なくとも２回の免疫が、腫瘍防御免疫のために必要であると思われた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＳ３／４Ａ遺伝子を用いた遺伝子銃免疫後に得られるＩｇＧサブクラス分布は混合Ｔｈ１／Ｔｈ２様応答を示した、ということを指摘することは重要である。したがって、Ｔｈ２傾向ＢＡＬＢ／ｃマウス株におけるＴｈ２様免疫経路（遺伝子銃）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効ＣＴＬ応答を初回抗原刺激する能力を減損し得る、という可能性があった。
【００７１】
本明細書中に記載した組成物は他の成分を含有し得る。その例としては、種々のペプチド、アジュバント、結合剤、賦形剤、例えば安定剤（長期貯蔵を促すため）、乳化剤、増粘剤、塩、防腐剤、溶媒、分散培地、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が挙げられるが、これらに限定されない（例えば米国特許出願第０９／９２９，９５５号および米国特許出願第０９／９３０，５９１号参照）。これらの組成物は、疾患または症状を回避するための予防手段として、あるいは疾患または症状にすでに悩まされている動物を治療するための療法として、動物、特に哺乳動物の治療に適している。
【００７２】
多数のその他の成分も存在し得る。例えばアジュバントおよび抗原は、慣用的賦形剤（例えばアジュバントおよび／または抗原と有害に反応しない非経口的、経腸的（例えば経口）、または局所的適用に適している薬学的に許容可能な有機または無機担体物質）と混合して用いられ得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。多数のさらに適切な担体が、Remmington’s Pharmaceutical Sciences, 15thEdition, Easton:Mack Publishing Company, pages 1405-1412 and 1461-1487 (1975)ならびにThe National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975)に記載されている。
【００７３】
本明細書中に記載した遺伝子構築物は、特に、同一遺伝子ワクチンがこのような作用物質の非存在下で投与される場合に起きる細胞による遺伝子構築物の取込みおよび／または発現と比較して、細胞による遺伝子構築物の取込みおよび／または発現を増大させる作用物質とともに処方されるかまたは投与され得る。このような作用物質ならびにそれらを遺伝子構築物と一緒に投与するためのプロトコルは、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９（１９９４年１月２６日出願）に記載されている。このような作用物質の例としては、以下のものが挙げられる：ＣａＰＯ４、ＤＥＡＥデキストラン、陰イオン性脂質；細胞外マトリックス活性酵素；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物およびステロイドホルモン；加水分解化低級アルキル；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；尿素および安息香酸エステルアニリド、アミジン、ウレタンおよびその塩酸塩、例えば局所麻酔
薬のファミリーのもの。さらに、遺伝子構築物は、脂質／ポリカチオン複合体内に封入され／それらとともに投与され得る。
【００７４】
ＮＳ４Ａをコードする核酸は、増強する遺伝子と「シス」状態で提供される（例えば並列または並置）か、または「トランス」で提供され得る（例えば増強されるべき遺伝子を含有する構築物と関係なく働く別個の構築物上に、または増強されるべき遺伝子を含有する構築物と融合する別個の構築物上に）。あるいはＮＳ４Ａペプチドは、上記の構築物のいずれかと一緒に投与され得る。
【００７５】
ワクチンは滅菌され、そして所望により、アジュバントあるいは投与される核酸またはペプチドと有害に反応しない助剤、例えば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味および／または芳香物質等と混合され得る。
【００７６】
特定のワクチン処方物の有効用量および投与方法は、個々の患者ならびに疾患の型および段階、ならびに当業者に既知のその他の因子に基づいて変わり得る。ワクチンの治療効力および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学手法により、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）により決定され得る。細胞培養検定および動物試験から得られるデータは、ヒト使用のための一連の投与量を処方するために用いられ得る。ワクチンの投与量は、好ましくは毒性を伴わないＥＤ５０を含む一連の循環濃度範囲内である。投与量は、アジュバント誘導体およびＨＣＶ抗原の型、用いられる剤形、患者の感受性ならびに投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
【００７７】
数年の間に多数のアジュバントが市場に出されているため、多数の剤形および投与経路が既知である。既知の剤形および投与経路は全て、本明細書中に記載した実施形態の情況内に提供され得る。好ましくは動物における抗原に対する免疫応答を増強するのに有効であるアジュバントの量は、動物において約０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌ、好ましくは約２．５μｇ／ｍｌの抗原の血中血清レベルを達成するのに十分な量であると考えられ得る。いくつかの実施形態では、アジュバントの量は、ワクチンを投与されるべき動物の体重によって確定される。したがってワクチン処方物中のアジュバントの量は、約０．１〜６．０ｍｇ／体重１ｋｇであり得る。すなわちいくつかの実施形態は、約０．１〜１．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇ、１．１〜２．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇ、２．１〜３．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇ、３．１〜４．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇ、４．１〜５．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇおよび５．１〜６．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇに対応するアジュバントの量を有する。ワクチンが約０．２５ｍｇ〜２，０００ｍｇのアジュバントを含有すると、さらに都合が良い。すなわち、いくつかの実施形態は、約２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇおよび２．０ｇのアジュバントを有する。
【００７８】
当業者が理解するように、ワクチン中の抗原の量は、抗原の型およびその免疫原性によって変わり得る。それに従って、ワクチン中の抗原の量が変化し得る。それにもかかわらず、一般的指針として、ワクチンは、例えば約１μｇ、５μｇ、１μｇ、２０μｇ、４０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、５〜１０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１００〜５００ｍｇおよび２，０００ｍｇまでの量の本明細書中に記載した抗原を有し得る。好ましくは抗原の量は、抗原が核酸である場合、０．１μｇ〜１ｍｇ、望ましくは０．１μｇ〜１００μｇ、好ましくは３μｇ〜５０μｇ、最も好ましくは７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ〜２０μｇである。
【００７９】
本明細書中に記載したいくつかのアプローチでは、アジュバントおよび／または抗原の的確な量は、治療される患者を考慮して、個々の医師により選定される。さらにアジュバントの量は、同一のまたは等価の量の抗原と組合せて、あるいはそれらとは別個に付加され得るし、そしてこれらの量は、患者特異的または抗原特異的考察の点から見て十分なレベルを提供するために、特定の予防接種プロトコル中に調整され得る。この趣旨で、考慮され得る患者特異的および抗原特異的因子としては、患者の疾患状態の重症度、患者の年齢および体重、食事、投与の時間および頻度、薬剤組合せ（単数または複数）、反応感受性、ならびに療法に対する耐容／応答が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
実施形態および実施例を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の精神を逸脱しない限り、種々の修正がなされ得る、と理解されるべきである。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】３５Ｓ−メチオニンの存在下でプラスミドＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１およびｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１から作製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分けられたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物。レーン１、分子量マーカー（ＣＦＡ  ７５６；Amersham Pharmacia Biotech）；レーン２、６１ｋＤａキット対照；レーン３、陰性対照；レーン４、ＮＳ３−ｐＶＡＸ１；レーン５、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１；およびレーン６、ｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１。
【図２】ｒＳＦＶ−ＮＳ３（ａ）、ｍＮＳ３／４ａ（ｂ）またはＮＳ３／４ａ（ｃ）感染ＢＨＫ−２１細胞により発現されるＮＳ３タンパク質の分析。３２Ｓメチオニンで標識後、細胞を非標識メチオニンで指示時間「チェイス」した。その結果生じた細胞溶解物を、免疫沈降および１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。ＮＳ３特異的モノクローナル抗体を用いて免疫蛍光染色により、ｒＳＦＶ−ＮＳ３（ｄ）およびｒＳＦＶ−ＮＳ３／４Ａ（ｅ）感染ＢＨＫ細胞中でも、ＮＳ３発現を分析した。細胞を感染後、２４時間染色し、ｒＳＦＶ−ＮＳ３感染細胞中（ｅ）でのＮＳ３タンパク質のより大きい分散を観察した。
【図３】５匹のＨ−２ｄマウスの群における１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を用いた免疫により初回抗原刺激された抗体応答（ａ）。矢印は、免疫時点を示す。マウスは全て、心臓毒で前処理した。値は、平均終点抗体±ＳＤとして示される。１０〜２０匹のＨ−２ｄマウスの群における１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１またはｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１により初回抗原刺激された体液応答の比較も示す。マウスを初回抗原刺激し、０および４週目に追加免疫した。値は、平均終点抗体力価±ＳＤとして示される。実線はｐ＜０．０１の有意差を、破線はｐ＜０．０５の差を、そして点線は有意差（マン−ホイットニーＵ検定）が観察されなかったことを示す。
【図４】Ｔ細胞は、免疫Ｈ−２ｄマウスからの脾臓中のＮＳ３に応答する。５匹のマウスの群を、１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫した。全マウスを心臓毒で前処理した。値は、抗原誘導性増殖−自発性増殖（Δｃｐｍ）として示される。値は、三重反復測定の平均ｃｐｍ値±ＳＤとして示される（ａ）。ＰＢＳ中のｒＮＳ３（２０μｇ）、ＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける６週目のＮＳ３特異的ＩｇＧサブクラス応答の比較（ｂ）。値は、ＮＳ３に対するＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体の平均終点力価±ＳＤとして示された。ＮＳ３に対するＩｇＧ２ａ抗体の平均終点力価をＮＳ３に対するＩｇＧ１抗体の平均終点力価で割ることにより、力価比を得た。高い比（＞３）はＴｈ１様応答を示し、低い比（＜０．３）はＴｈ２様応答を示すが、一方、１から３倍以内の差の値（０．３から３）は混合Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を示す。筋注で投与のＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドによる３回の１ヶ月ごとの注射後、ＣＦＡにおけるｒＮＳ３による１回の免疫後の脾臓中の増殖性応答も示される（これらのマウスを最終注射後６ヶ月に屠殺した）。値は、三重反復測定の平均ｃｐｍ値として示される（ｃ）。
【図５】Ｈ−２ｄマウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出可能ＣＴＬの初回抗原刺激の動態。５匹のＨ−２ｄマウスの群を、１ヶ月間隔で、１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で筋注により免疫した。全マウスを心臓毒で前処理した。細胞傷害性検定からの結果は、１００μｇＤＮＡの２回注射（ａ）、３回注射（ｂ）および６回注射（ｃ）から得た。特異的溶解％は、ＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞を用いて得られた溶解％から非トランスフェクト化ＳＰ２／０細胞を用いて得られた溶解％を引いた値に対応する。値は、４０：１、２０：１および１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比に関して得られた。１０より多い特異的溶解％を陽性とみなした。各線は、個々のマウスに対応する。
【図６】異なる方式の免疫を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖の抑制。５〜１０匹のＨ−２ｄマウスの群を、腹腔内投与されたＰＢＳまたはＣＦＡ中の２０μｇのｒＮＳ３もしくは１００μｇの対照プラスミド（ｐ１７−ｐｃＤＮＡ３）（ａ）で、あるいは１０μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１（ｂ）で、あるいは１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸ１またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１またはｍＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１（ｃ）で免疫した。マウスを初回抗原刺激し、そして４、８、１２および１６週目に追加免疫した。全マウスを心臓毒で前処理した。最終免疫後２週間目に、マウスに２×１０６個のＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞を皮下注射した。腫瘍注射後７、１１および１３日目に皮膚を介して、各腫瘍のサイズを測定した。各群における平均腫瘍増殖を全期間査定し、曲線下面積（ＡＵＣ）およびＡＮＯＶＡを用いて統計学的に群を比較した。（ｄ）では、実験群および対照群間の統計学的比較が示される。
【図７】非免疫マウス（ａおよびｂ）、１０μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫されたマウス（ｃおよびｄ）、ならびに１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で免疫されたマウス（ｅおよびｆ）から切り取られた固形腫瘍の組織学的外観。ヘマトキシリン−エオシンにより（ａ、ｃおよびｅ）、あるいは抗−ＣＤ３抗体により（ｂ、ｄおよびｆ）染色されたＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０黒色腫の切片。図（ａ）における挿入は、ＲＴ−ＰＣＲによりＮＳ３／４Ａ  ｍＲＮＡの発現に関してトランスフェクト化細胞株を試験した結果を示す。レーン１および２は分子量マーカーを、レーン３はＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞を、レーン４はＳＰ２／０細胞を、レーン５、７および８は陰性対照を、そしてレーン６は２，０６１塩基のバンドを示すＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドのＤＮＡ  ＰＣＲを示す。
【図８】ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を用いた遺伝子銃免疫は、Ｈ−２Ｄｂ制限ペプチドエピトープに特異的なＣＴＬを示す。５〜１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、ＣＦＡ中の１００μｇのＮＳ３特異的ペプチド（ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号１））で皮下に、あるいは１ヶ月間隔で遺伝子銃を用いて４μｇのＤＮＡ／用量で経皮的に免疫した。ナイーブ（ａ）またはＮＳ３／４Ａペプチド免疫マウス（ｂ）またはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１遺伝子銃免疫マウス（ｄ）からの脾臓細胞を、放射線照射ＮＳ３−ペプチド負荷ナイーブ脾臓細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで５日、再刺激した。関連のないＨ−２Ｄｂ結合ペプチドで再免疫刺激された遺伝子銃免疫マウスからの脾臓細胞を、陰性対照（ｃ）として用いた。パネル（ｄ）では、中白ボックスは３回の免疫後の特異的溶解％を示し、そして中黒ボックスは４回の免疫後の特異的溶解％を表す。括弧内は、再刺激培養に用いたペプチドを示す。各線は、個々のマウスからのデータを表す。
【図９】遺伝子銃免疫後のＮＳ３／４Ａ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の誘導。ナイーブマウス（ａ、ｃ、ｅおよびｇ）、ならびにＮＳ３ペプチド（ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号１））を負荷した二量体Ｈ−２Ｄｂ：Ｉｇ融合タンパク質を用いたＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１  ＤＮＡ免疫マウス（ｂ、ｄ、ｆおよびｈ）の脾臓細胞のフローサイトメトリー染色により、ＮＳ３／４Ａペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を決定した。非負荷Ｈ−２Ｄｂ：Ｉｇ融合タンパク質を用いて、非特異的染色をモニタリングした（ｇおよびｈ）。合計１５０，０００〜２００，０００細胞を収集し、Ｈ−２Ｄｂ：Ｉｇに関して染色されたＣＤ８＋細胞のパーセンテージを、各ドット−プロットの括弧内に示す。
【図１０】遺伝子銃免疫を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖の抑制。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、未処理のままにするか、あるいは４μｇのＤＮＡ／用量のＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で１ヶ月ごとに４回経皮免疫した。最終免疫後４週目に、マウスに１×１０６ＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞を皮下注射した。腫瘍注射後６、７、８、１０、１１、１２、１３および１４、１５日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。２つの曲線に関する曲線下面積は、統計学的に異なった（ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０１）。
【図１１】ｗｔＮＳ３−ｐＶＡＸ１（野生型ＮＳ３）、ｗｔＮＳ３／４Ａ（野生型ＮＳ３／４Ａ）およびｃｏＮＳ３／４Ａ（ヒトコドン最適化ＮＳ３／４Ａ）プラスミドの遺伝子銃免疫、あるいはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ粒子（ＮＳ３／ＮＳ４Ａ含有セムリキ森林ウイルス粒子）の皮下注射による、Ｈ−２ｂマウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出可能ＣＴＬの初回抗原刺激。５〜１０匹のＨ−２ｂマウスの群を、１回（ａ）または２回（ｂ）免疫した。特異的溶解％は、ＮＳ３−ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞（ａおよびｂの上パネル）またはＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞（ａおよびｂの下パネル）を用いて得られた溶解％から非負荷または非トランスフェクト化ＥＬ−４細胞を用いて得られた溶解％を引いた値に対応する。値は、６０：１、２０：１および７：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比に関して示されている。各線は、個々のマウスを示す。
【図１２】１回免疫後のＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａ特異的腫瘍抑制応答を初回抗原刺激する異なる免疫原の能力の評価。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、未処理のままにするか、あるいは図１１に記載したように、指示された免疫原を用いて１回免疫した（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）および（ｈ）では遺伝子銃を用いて４μｇのＤＮＡ；（ｄ）では１０７ＳＦＶ粒子を皮下投与；（ｅ）ではＣＦＡ中の１００μｇのペプチドを皮下投与；ならびに（ｆ）ではＣＦＡ中の２０μｇのｒＮＳ３を皮下投与）。最終免疫後２週間目に、マウスに１０６ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞を皮下注射した。腫瘍注射後６〜１９日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。値は、平均腫瘍サイズ±標準誤差として示されている。（ａ）〜（ｅ）では、陰性対照として、遺伝子銃により空ｐＶＡＸプラスミドを用いて免疫した群からの平均データを、各グラフにプロットした。（ｆ）〜（ｈ）では、陰性対照は非免疫マウスであった。曲線下面積およびＡＮＯＶＡを用いた対照と各曲線との統計学的比較から得られたｐ値も示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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