(57)【要約】本発明は、一般的に、自己ワクチンの免疫学および開発の分野に関する。より具体的には、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のフラグメントで活性化された自己ＣＤ８＋細胞を用いて患者を免疫する手段により、自己免疫疾患の多発性硬化症（ＭＳ）を処置する方法に関する。本発明は、ＨＬＡ−Ａ２レセプターおよびＨＬＡ−Ａ２４レセプターに対して高親和性を有する、４つの免疫原性ＭＢＰフラグメントを同定し、そして抗ＭＳワクチンを調製することにおいて、これらフラグメントを使用する方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンを作製する方法であって、以下：
（ａ）該ワクチンで処置されるべき患者に由来するＴ細胞を含む末梢血単核細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を減らす工程；
（ｃ）ＭＳ関連抗原および必要に応じて抗原提示細胞を添加する工程；
（ｄ）工程（ｃ）を１回以上反復する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＭＳ関連抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＳ関連抗原が、配列番号１〜４のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＳ関連抗原が、ＭＢＰのアミノ酸８３−９９またはアミノ酸１５１−１７０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）がさらにＩＬ−２を添加する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）がさらにマイトジェンを添加する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マイトジェンが、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマイトジェン、およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法により作製された、自己Ｔ細胞ワクチン。
【請求項９】
請求項８に記載の自己Ｔ細胞ワクチンを多発性硬化症の処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、多発性硬化症を処置する方法。
【請求項１０】
ＭＳ関連抗原に反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の富化集団を含む、自己Ｔ細胞ワクチン。
【請求項１１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が減らされる、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ＭＳ関連抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質およびミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質からなる群より選択される、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ＭＳ関連抗原が、配列番号１〜４のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ＭＳ関連抗原が、ＭＢＰのアミノ酸８３−９９またはアミノ酸１５１−１７０を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府により援助される研究または開発についての陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより与えられた助成金第ＲＯ１  ＮＳ４１２８９号で部分的に米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、一般に、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））の処置の分野に関する。より特定すると、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫原性フラグメントを使用することにより調製される、ＣＤ８＋Ｔ細胞ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連分野の説明
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性かつ慢性炎症性の疾患である。この疾患の組織病理学的特徴としては、白質内で他の炎症性細胞を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の限局性浸潤、ならびにいくつかの軸索損傷を示す脱髄が挙げられる（非特許文献１；非特許文献２）。特定のミエリンタンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ））に対するＴ細胞応答がＭＳの病因において重要な役割を担うと長い間推察されている。実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＭＳについての古典的動物モデル）において、ＭＢＰを認識するＣＤ４＋Ｔ細胞は、大規模な炎症および穏和な脱髄によって特徴付けられるＣＮＳ病理を誘発することが、見出されている（非特許文献３）。最近まで、ＭＢＰの短いペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞が、明確なＣＮＳ病理を伴ってＥＡＥを誘発し得ることは公知でなかった。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、標的細胞に対して細胞傷害性であり、内因的にプロセッシングされたＭＢＰを認識し、そして養子移入の際に重篤なＥＡＥを誘発した（非特許文献４；非特許文献５）。ＥＡＥにおいて、ＭＢＰを認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞により誘発されたＣＮＳ損傷は、大規模な脱髄により特徴付けられ、これはヒトにおけるＭＳ病理学に非常に似ており（非特許文献４、前出）、このことが、ＭＢＰを認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ分子およびＭＢＰの両方を発現する稀突起神経膠細胞の傷害を引き起こし得ることを示唆することに注目することが、重要である。これらの知見は、ＣＤ８＋細胞傷害性ＭＢＰ反応性Ｔ細胞がＭＳにおいて同様の役割を担うかどうかについて、新たな疑問を想起している。
【０００４】
ＭＳにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＭＢＰに応答し、そして他の候補ミエリン抗原がこの疾患の進行に重要な役割を担い得ることを示す、いくつかの証拠が存在する（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。これまでに蓄積された結果は、ＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、健常なコントロールと比較して、ＭＳ患者においてインビボ活性化およびクローン性増殖を受け（非特許文献１７，非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）、そして急性の増悪の間に前駆体頻度の増大が起こること（非特許文献１６）を示す。ＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞相当物と比較して、ＭＳの病理学におけるＣＤ８＋細胞傷害性ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の潜在的な関与は、未知である。Ｔｓｕｃｈｉｄａおよび共同研究者は、ＭＳ患者の血中のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ならびに健常な個体における血中のＣＤ８＋細胞傷害性ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の同定を報告した（非特許文献２２）。これらＣＤ８＋Ｔ細胞株のいくつかは、内因的にプロセッシングされたミエリンペプチドを認識するようであり、これは、ＭＨＣクラスＩ分子およびミエリン抗原を恒常的に発現する（しかしＭＨＣクラスＩＩ分子は発現しない）稀突起神経膠細胞の傷害における、これらＣＤ８＋Ｔ細胞株の潜在的な役割を示唆する。その後の研究は、ＭＢＰの１１０−１１８ペプチドを認識する、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞株が、ヒト稀突起神経膠細胞の溶解を媒介し得ることを確認した（非特許文献２３）。しかし、ＭＢＰを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞がインビボで感作されて、健常なコントロールと比較した場合、ＭＳ患者において活性化および増殖が起こるかどうか、そして他のＭＨＣクラスＩ分子と結合するさらなるエピトープが存在するかどうかは、依然として未知のままである。
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１０：５３
【非特許文献２】Ｋｅｅｇａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２００２；５３：２８５
【非特許文献３】Ｚａｍｖｉｌら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１７：３５５
【非特許文献４】Ｈｕｓｅｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９４：６６９
【非特許文献５】Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１；１９４：２７
【非特許文献６】Ｏｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４６：１８３
【非特許文献７】Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１７３：１９
【非特許文献８】Ｚｈａｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９２；３２：３３０
【非特許文献９】Ｔｒｏｔｔｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；８４：１７２
【非特許文献１０】Ｍａｒｋｏｖｉｃ−Ｐｌｅｓｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１５５：９８２
【非特許文献１１】Ｋｅｒｌｅｒｏ  ｄｅ  Ｒｏｓｂｏら，１９９７；２７：３０５９
【非特許文献１２】Ｂｉｅｇａｎｏｗｓｋａら，Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８５：１５８５
【非特許文献１３】Ｗａｌｌｓｔｒｏｍら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；２８：３３２９
【非特許文献１４】Ｌｉｎｄｅｒｔら，Ｂｒａｉｎ  １９９９；１２２：２０８９
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：９７３
【非特許文献１６】Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１２：１６４１
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：９７３
【非特許文献１８】Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０；２４７：７１８
【非特許文献１９】Ｃｈｏｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１９８９；２３：２０７
【非特許文献２０】Ｖａｎｄｅｒｖｙｖｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；２５：９５８
【非特許文献２１】Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５２：５５８１
【非特許文献２２】Ｔｓｕｃｈｉｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４；９１：１０８５９
【非特許文献２３】Ｊｕｒｅｗｉｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：３０５６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、多発性硬化症関連抗原（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のような抗原および／またはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない）を認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の単離に関する。ＭＢＰフラグメントは、配列番号１〜４に記載の任意の配列の８以上のアミノ酸を含むペプチドであり得る。このＭＳ関連抗原はまた、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）またはミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）であり得る。
【０００６】
１つの実施形態において、本発明はＭＢＰフラグメントに関し、このフラグメントは高い親和性でＨＬＡ−Ａ２レセプターおよびＨＬＡ−Ａ２４レセプターに結合する。本発明により包含されるＭＢＰフラグメントのうち、配列番号１〜４に記載されるものが存在する。これらのフラグメントはまた、フラグメントの１つ以上の位置に保存的アミノ酸を有するが、依然としてＨＣＡ−Ａ２レセプターおよびＨＣＡ−Ａ４レセプターに結合するホモログであってもよい。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、ＭＳの処置または予防に有用なワクチンを調製するための方法を記載し、これは、処置される患者由来のＴ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を得る工程；好ましくは集団中のＣＤ４＋細胞の数を低減または枯渇させることにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を富化する工程；およびこのＣＤ８＋Ｔ細胞富化集団を、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４に結合可能なＭＢＰフラグメントに対応する１つ以上のペプチドとインキュベートして、このＭＢＰポリペプチドに特異的な集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの数を増大させる工程を、包含する。ＭＢＰに特異的応答性のＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、例えば、対応するＭＢＰペプチドおよびマイトジェンを用いてこれら細胞を交互に刺激することによって、さらに増殖され得る。
【０００８】
本発明のなお別の実施形態は、ＭＢＰフラグメント（配列番号１、２、３または４に対応するアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）で初回刺激された自己細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞ワクチンの細胞傷害性について、ＣＤ８＋Ｔ細胞ワクチンを試験する方法を開示する。
【０００９】
なお別の実施形態において、本発明は、ＭＢＰフラグメント応答性で、そして好ましくはＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４に結合可能な自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた処置を必要とする患者に投与することによって、ＭＳを処置する方法に関する。
【００１０】
なお別の局面において、本発明は、患者のＭＰＢ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する細胞傷害活性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を単離または調製することにより、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞ワクチンを生成する方法を提供する。これらの方法の下で、自己Ｔ細胞記憶クローンは、患者のＭＢＰ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する反応性について選択される。
【００１１】
本発明はまた、同時係属の米国特許出願第０９／９５２，５３２号；ＰＣＴ／ＵＳ０２／２８８７４；６０／４０２，５２１；ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４５４８（これらのすべては、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるＴ細胞ワクチンに関し、このＴ細胞ワクチンは、本発明の方法に従って生成されたＭＳ関連抗原ペプチドに反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の添加により、さらに改変される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明の化合物、生成物および組成物、ならびに方法が開示されそして記載される前に、明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈中にそれ以外の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことが理解されるべきである。
【００１３】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を認識するＣＤ４部分集団の自己反応性Ｔ細胞およびＣＤ８部分集団の自己反応性Ｔ細胞は、多発性硬化症（ＭＳ）の病理学に寄与する。ＥＡＥにおいて大規模なＣＮＳ炎症および穏和な脱髄を誘発するＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞とは異なり、ＭＢＰ由来のペプチドを認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、おそらく稀突起神経膠細胞の傷害の誘発を介して、ＥＡＥにおける重篤なＣＮＳ脱髄に直接寄与する（Ｈｕｓｅｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１，１９４：６６９）。これらＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の明確な役割はＭＳと特に関連し、このＭＳにおいて、脱髄は神経性欠損と関係する最も重要なＣＮＳ病理を示す。ＭＳにおけるミエリン抗原候補に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答について、およびＣＤ４＋ミエリン反応性Ｔ細胞を抑制または排除するための準備中の治療的試みについて、文献に証拠が存在する（Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６１：１４５１；Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６；１０：１１０９）。対照的に、ＭＳにおいてミエリン抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的特徴および潜在的役割は、現実には未知である。この分野における進展の欠如の理由の一部は、ミエリン抗原に反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の検出および産生における技術的困難と関連する。ＭＳ関連抗原（好ましくは、ＭＢＰおよび／またはそのフラグメント）に反応性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を同定すること、およびＣＤ８＋Ｔ細胞株（これらは、ＭＳの処置、この疾患の進行をモニタリングすること、およびこの疾患の処置に対する治療的応答をモニタリングすることにおいて有用である）の有効な調製に対するアプローチを、本発明は開示する。本発明の方法はまた、ＭＳの進行の診断およびモニタリングに有用である。
【００１４】
このアプローチは、処置を必要とするＭＳ患者からＰＢＭＣを得る工程；ＣＤ４＋Ｔ細胞のＰＢＭＣ集団を予め除去して、ＭＳ関連抗原を用いてＣＤ８＋細胞に富化されたＰＢＭＣ集団を生じ、この集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増大させ、そして必要に応じて抗原提示細胞の存在下および非存在下で刺激サイクルを反復する工程、を包含する。刺激サイクルを交互に行うことを使用したＴ細胞株の産生は、米国特許出願第０９／９５２，５３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２８８７号（ＷＯ０３／０２４３９３として公開された）および同第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４５４８号（ＷＯ０４／１５０７０として公開された）（これらの内容は本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００１５】
特定の抗原（ＭＢＰの免疫原性フラグメントを含む）に対する反応性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞株を選択する方法もまた、含まれる。この文脈中、免疫原性とは、Ｔ細胞応答（増殖性応答が挙げられるが、これに限定されない）を誘導または持続する能力、または例えば、Ｔ細胞による共毒素（ｃｏｔｏｘｉｎ）の産生を刺激する能力を、意味する。ＭＢＰ免疫原性フラグメントを同定する方法もまた開示され、そしてＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４に高い結合親和性を有する４つのＭＢＰ免疫原性フラグメントについてのアミノ酸配列が提供される。
【００１６】
本明細書中に記載されるデータは、ＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞がＭＳの病理学に関与する重要な証拠を提示し、従ってＭＳ患者においてこれらＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の数を減らす処置の開発の必要性を示す。
【００１７】
ＭＢＰの同定されたＭＨＣクラスＩペプチドを認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の推定された頻度は、ＭＳ患者由来のＰＢＭＣにおいて３．４〜５．４×１０−７の範囲、およびコントロール群において１．１〜２．０×１０−７の範囲にある。この知見に関連していくつかの問題が存在する。第一に、同じ実験条件下で、ＰＢＭＣ中のＭＢＰの同定された領域を認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の観察された頻度は、ＭＳ患者におけるＭＢＰの免疫優性ペプチドを認識するＣＤ４＋Ｔ細胞の観察された頻度（ＰＢＭＣ中１〜２×１０−６）より相対的に低い（Ｏｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４６：１８３；Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：９７３；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｉｎｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１２：１６４１）。ＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞と同様に、これらＣＤ８＋細胞傷害性ＭＢＰ反応性Ｔ細胞はまた、健常な個体において検出され得る（Ｏｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４６：１８３；Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１９；Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：９７３；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｉｎｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；．１２：１６４１）。しかしながら、推定されたＴ細胞頻度はコントロール中よりもＭＳ患者中で有意に高い。この差異は、ＭＳ患者およびコントロールにおいて見られるＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞についての差異よりも有意であるようである。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの両方を発現する未処理のＴ細胞であるＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞（Ｍｕｒａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：５４７４）とは異なり、本発明で同定されたこれらＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ表現型を発現するがＣＤ４５ＲＡ表現型を発現しない、抗原を体験した（ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ）記憶Ｔ細胞の部分集合に属することもまた、注目されるべきである。第二に、この知見は、ＭＢＰ由来ペプチドを認識するこれらＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が、ＭＳ患者においてインビボで活性化され得ることを、示唆する。
【００１８】
このことに関して、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が分子模倣として公知のメカニズムを介して種々の微生物抗原により活性化され得ることを示す証拠が、増えつつある（Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９；１４５：１２７；Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９８；１２：１２５５；Ｈａｆｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９；１０４：５２７；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００３；５３：１８９）。最近、本発明者らは、ＨＨＶ−６（ＭＳに対して疑われる病因学的因子）とＭＢＰとの間の配列相同性を同定し、そして両方の抗原と交差反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞が、健常な個体とは対照的に、ＭＳ患者において感作されることを実証した（Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００３；５３：１８９）。本明細書で同定されたＭＢＰの領域は、ミエリンタンパク質と完全な配列ホモロジーを共有しないが、ＴＣＲの縮重がＭＢＰ反応性Ｔ細胞において生じることが立証された。このことは、Ｔ細胞の認識に必要とされるＴＣＲ接触残基が保存される限り、配列の不完全一致の微生物抗原ペプチドを認識可能なＭＢＰ反応性Ｔ細胞を、提供する（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら，Ｃｅｌｌ  １９９５；８０：６９５；Ｈｅｍｍｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８５：１６５１；Ｋｏｚｏｖｓｋａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；２８：１８９４）。最後に、細胞培養ベースのスプリットウェル方法が一貫して使用される場合、個体サンプル間のＴ細胞頻度を比較するのに有用であると示されている（Ｏｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４６：１８３；Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：９７３；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１２：１６４１；Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６１：１４５１；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：６１４７）が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の実際の前駆体頻度がこの方法を使用して過小評価され得ることは、議論の余地がある。ＣＤ４＋特異的Ｔ細胞の前駆体頻度の分析についての多くの研究は、いくつかの指標を証明している。ＭＳにおけるＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度が、抗原刺激に応答したサイトカインのエキソビボ分泌に基づくＥＬＩＳＰＯＴにより、４×１０−５の範囲にあることが報告されている。この範囲は、本発明で使用されるスプリットウェル方法により１〜２×１０−６と測定された範囲より高い。しかしながら、この研究において、ＥＬＩＳＰＯＴは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量性検出に適用可能でない。なぜなら、γ−ＩＦＮのエキソビボ分泌の供給源は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間で、たとえこれら細胞が照射を受けても異なり得るからである。この研究において、さらなる特徴付けは、これらＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞が本質的に細胞傷害性であることを確認した。これらＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子およびＭＢＰ遺伝子で二重にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞を含む一連の実験において証明されたように、ＭＢＰペプチ��でパルスされた自己標的細胞と、ＭＨＣクラスＩ分子の前後関係において内因的にプロセッシングされたＭＢＰとの両方を認識し、そしてこの両者に対して細胞傷害性である。この知見は、クラスＩ分子およびＭＢＰの両方を発現する稀突起神経膠細胞の傷害におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の潜在的役割の観点から、特に重要である。これらの知見は、Ａ２＋ヒト稀突起神経膠細胞に対する、ＣＤ８＋ＭＢＰ１１０−１１８反応性Ｔ細胞の特異的細胞傷害性を報告したＪｕｒｅｗｉｃｚおよび共同研究者らによる以前の研究（Ｊｕｒｅｗｉｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：３０５６）と一致する。本明細書に記載されるＭＢＰ由来ペプチド反応性のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、ＥＡＥにおいて同様の機能特性のＣＤ８＋Ｔ細胞（この細胞は、稀突起神経膠細胞に対する特異的認識および細胞傷害性活性を介して大規模なＣＮＳ脱髄を強力に誘導し得る（Ｈｕｓｅｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９４：６６９）を連想させる。
【００１９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために包含される。これら以下の実施例に開示される技術は本発明の実施に際してうまく機能させるために本発明者により開示される技術を表し、そしてこれによって本発明の実施のための好ましい様式を構築するとみなされ得ることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示された特定の実施形態において多くの変更がなされ得ること、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同じ結果または同様の結果が依然として得られ得ることを、理解すべきである。
【００２０】
本発明は多くの局面を有し、これらは以下の非限定的な実施例により例示される。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
ＨＬＡ−Ａ２レセプターおよびＨＬＡ−Ａ２４レセプターに対する高親和性を有するＭＢＰフラグメントの同定
ＴＥＰＩＴＯＰＥ（（Ｖａｃｃｉｎｏｍｅのウェブサイト）ＨＬＡクラスＩリガンド結合性エピトープの同定を可能にするアプリケーション（Ｓｃｈｒｏｅｒｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；６２：２６００；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；  １２：１８１；Ｍａｎｉｃｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１８９：８７１））を使用して、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４に結合し得るフラグメントについてヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のアミノ酸配列をスクリーニングした。予想されたＨＬＡ−Ａ２結合配列（閾値１％）を有する２つのフラグメントおよび予想されたＨＬＡ−Ａ２４結合配列（閾値１％）を有する２つのフラグメントを同定した。これらフラグメントのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【００２２】
【数１】
2007509063.tif 000003
次いで、配列番号１〜４を有するペプチドを、Ｍａｙｆｉｅｌｄの方法を使用して合成し、ＨＰＬＣ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して精製した。ペプチドの純度は９０％より高かった。
【００２３】
（実施例２）
ＭＳ患者および健常なコントロールにおけるＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の前駆体頻度分析
再発軽減性のＭＳまたは続発進行性のＭＳ（Ｐｏｓｅｒら，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．，１３（３）：２２７−３１，１９８３）を患う１５人の患者を、本研究に含めた。研究に入る前の少なくとも３ヶ月は、患者を免疫抑制剤でも免疫調節剤（例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド、βインターフェロンまたはガラティラメルアセテート）でも処置しなかった。プロトコルは、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認された。年齢および性別についてＭＳ群と一致する１５人の健常被験体群を、コントロールとして含めた。臨床学的特徴／個体群統計学的データならびにＭＳ患者およびコントロール被験体のＨＬＡ−Ａ２表現型およびＨＬＡ−Ａ２４表現型を、表１に示す。
【００２４】
配列番号１〜４を有する選択されたＭＢＰペプチドを認識するＴ細胞の前駆体頻度を、スプリットウェル方法（Ｏｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４６：１８３；Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：９７３）を使用して、ＭＳ患者およびコントロールにおいて測定した。未分画の末梢血単核細胞における、ＭＢＰペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を検出するための最初の試みは、ＣＤ４＋表現型およびＣＤ８＋表現型の混ざった、低頻度の特異的Ｔ細胞単離物を得た。引き続き、ＭＢＰ由来ペプチドに反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためのアプローチを、予めＣＤ４＋Ｔ細胞を除去することにより進めた。この除去は、以下に記載の方法を使用して達成された。
【００２５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＭＳ患者および健常な個体の末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ分離により単離した。抗ＣＤ４抗体を結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  ＡＳＡ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を予め除去した。簡潔に述べると、ビーズ  対  細胞比を１０で３０分間穏やかに揺らしながら、抗体でコーティングされた磁気ビーズと共にＰＢＭＣをインキュベートした。未結合のＰＢＭＣ画分を磁石の分離により収集した。ＣＤ４＋Ｔ細胞についての除去割合は、全ての場合において９８％より高かった。得られたＣＤ４除去画分は、フローサイトメトリー分析により決定すると、代表的に７２±８％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含んだ。代表的な実験を図１に示す。
【００２６】
次いで、１０５個の自己未分画ＰＢＭＣ（これらは照射されてＣＤ４＋Ｔ細胞の「ヘルパー」機能を提供するが、これら自体は抗原に応答して増殖し得ない）と一緒に、得られたＰＢＭＣを、５０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルＵ字底マイクロタイタープレートに播種した。配列番号１〜４を有するペプチドを、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で培養物に添加した。総計３２ウェルを各々のペプチドについて設定した。破傷風トキソイドの免疫優性ペプチド（８３０〜８３８残基）に対応する合成ペプチドを、ネガティブコントロールとして前駆体頻度分析において含めた。細胞を５％  ＣＯ２雰囲気下で３７℃で培養した。７日後、全ての培養物をトリチウム化チミジン取り込みにより、対応するペプチドに対する特異的増殖について試験した。簡潔に述べると、各々のウェルを４つのアリコート（アリコート当たり約１０４細胞）に分割し、そして２０μｇ／ｍｌの対応するＭＢＰ由来ペプチドの存在下および非存在下で、１０５個の自己ＰＢＭＣと共に二連で培養した。培養物を３日間そのままにし、そして続いて１６時間の培養の間、１ウェルあたり１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いてパルスした。次いで、培養物を自動処理の細胞ハーベスターを使用して収集し、そして［３Ｈ］チミジン取り込みをβプレートカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で計数した。
【００２７】
ＣＰＭが１，５００より大きくかつ参照のＣＰＭ（ペプチドの非存在下）を少なくとも３倍上回る場合、ウェル／培養物、をペプチドに対して特異的であると定義した。次いで、ポジティブなウェルの数を、最初の培養物中に播種したＣＤ４除去ＰＢＭＣの総数で除算することにより、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定した。
【００２８】
図２に示すように、これらの結果は、ＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の平均前駆体頻度が、ＭＳを患う患者から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞除去ＰＢＭＣにおいて３．４〜５．４×１０−７の範囲で推定されたことを明らかにした。この範囲は、コントロール被験体（特にＭＢＰ１１１−１１９およびＭＢＰ８７−９５について（Ｐ＜０．０５））における範囲（１．１〜２．１×１０−７）より、明らかに高かった。対照的に、破傷風トキソイドの免疫優性エピトープ（８３０〜８３８残基）（不良（ｒｅｃａｌｌ）抗原）を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、ＭＳ患者と健常コントロールとの間で有意には異ならなかった（図２）。
【００２９】
（実施例３）
調製されたＣＤ８＋Ｔ細胞株の表現型分析
実施例２において調製された３９個のＣＤ８＋Ｔ細胞株のパネルを、表現型発現、サイトカインプロフィールおよび自己標的細胞に対する特異的細胞傷害活性について、特徴付けた。このパネルは、ＭＳ患者由来の２５個のＴ細胞株および健常コントロール由来の１４個のＴ細胞株を含み、そして４つ全てのＭＢＰ由来ペプチドに対する反応性について表した（表２）。
【００３０】
表現型発現を分析するため、各々の細胞株の１０５細胞を１％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＦＢＳ−ＰＢＳ）で洗浄し、そして１：１００希釈の蛍光色素標識化抗体（Ｓｉｍｕｌｔｅｓｔ  ＣＤ４／ＣＤ８，ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯ，ＴＣＲα／β／ＴＣＲγ／δ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）または適切なＩｇアイソタイプコントロール（γ２α−ＦＩＴＣ／γｌ−ＰＥ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む１００μｌのＦＢＳ−ＰＢＳに再懸濁した。氷上で３０分のインキュベーション後、これらの細胞をＦＢＳ−ＰＢＳで３回洗浄し、そしてフローサイトメトリー分析のため１％ホルムアルデヒドで固定した。
【００３１】
選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞株は、種々のＭＢＰ由来ペプチドに対するそれらの反応性に関係なく、ＴＣＲαβ／ＣＤ８を発現するが（平均で、＞９５％）ＣＤ４は発現せず（＜５％）、そしてＣＤ４５ＲＯを発現するがＣＤ４５ＲＡを発現しなかったこと、を見出した。これらの知見は、選択されたＴ細胞株がＣＤ８＋メモリーＴ細胞部分集合に属することを示す。
【００３２】
（実施例４）
ＣＤ８＋Ｔ細胞株のサイトカイン産生
得られたＣＤ８＋Ｔ細胞株がＴｈ１部分集合またはＴｈ２部分集合に属するかどうかを決定するため、得られたＣＤ８＋Ｔ細胞株のサイトカインプロフィールを分析した。選択されたＴ細胞株（ｎ＝３９）を最初に、対応するＭＢＰペプチドでパルスした自己ＡＰＣを用いてチャレンジした。サイトカインプロフィールは、ＥＬＩＳＡキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて定量的に決定した。マイクロタイタープレート（９６ウェル、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、ヒトサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、γ−ＩＦＮ）に対する精製マウス捕捉モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、ウェル当たり１μｇで、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、そして非特異的結合部位を１０％（Ｗ／Ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を用いて１時間飽和させ、続いて洗浄した。上清およびサイトカイン標準をＰＢＳで希釈し、そして二連のウェルに添加した。このプレートを３７℃で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔで洗浄した。適合するビオチン体化検出抗体を各々のウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。洗浄後、アビジン結合体化西洋わさびペルオキシダーゼを添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ）を発色基質として使用した。光学的濃度を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して４５０ｎｍで測定し、そして、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により、二連の８点標準曲線を使用して、サイトカイン濃度を定量した。
【００３３】
図５に見られるように、ＭＢＰ由来ペプチドを認識する選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞株は、優勢的にＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを産生したが、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生しなかった。このことにより、この細胞株はＴｈ１表現型に属する。ＭＳ由来Ｔ細胞株とコントロール被験体由来Ｔ細胞株との間に有意な定量的差異は認められ得なかった。
【００３４】
（実施例５）
代表的なＴ細胞株からのクローンの構築
４つの代表的なＴ細胞株（Ｅ１１、Ｄ１０、Ｂ９およびＦ１２）を、４つのＭＢＰペプチドの認識について選択し、そしてさらに限界希釈によりクローン化した。簡潔に述べると、照射したＰＢＭＣ（１００，０００細胞）および２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンタンパク質（ＰＨＡ−Ｐ）の存在下で、限界希釈の条件の下、９６ウェルＵ字底プレートにおいて、１ウェル当たり１細胞でプレートアウトした。細胞を、ＩＬ−２を含む培地中で３〜４日毎に培地を交換しながら、１０〜１２日間培養した。ＣＤ８の表現型発現について、そして対応するペプチドに対する反応性について、増殖のポジティブなウェルを確認した。得られたＴ細胞クローンを、自己ＡＰＣの存在下で、対応するＭＢＰペプチドおよびＰＨＡ−Ｐを用いた交互の刺激により、さらに増殖させた。
【００３５】
ＨＬＡ−Ａ２の状況において、２つのこのようなクローン化ＣＤ８＋Ｔ細胞株は、それぞれ、ＭＢＰ１１１−１１９ペプチド（Ｅ１１）（配列番号２）およびＭＢＰ８７−９５ペプチド（Ｄ１０）（配列番号１）を認識し、一方、２つの他のＣＤ８＋Ｔ細胞株はＡ２４拘束性であり、そしてＭＢＰ１３４−１４２ペプチド（Ｂ９）（配列番号３）およびＭＢＰ１４−２２ペプチド（Ｆ１２）（配列番号４）と反応した。図３は、上記の４つのクローン化Ｔ細胞株の代表的な表現型発現を例示する。
【００３６】
次いで、選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞株に対するＨＬＡ−Ａ２テトラマーの特異的に結合を、試験した。ＨＬＡ−Ａ２−ＭＢＰ１１１−１１９テトラマーを、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手した。図４に示されるように、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＢＰ１１１−１１９テトラマーは、ペプチドＭＢＰ１１１−１１９を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞株（Ｅ１１）に対して９０％より大きい特異的な結合を示したが、ペプチドＭＢＰ８７−９５を認識するＡ２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞株（Ｄ１０）に対する特異的な結合を示さなかった。
【００３７】
（実施例６）
自己細胞に対するペプチドＭＢＰ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞株の細胞傷害性
３９個の選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞を全て、自己の標的細胞に対する細胞傷害性について分析した。この目的のため、自己Ｂ細胞株のパネルを、以前に記載された手順（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９；２３：２４９；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２；１０７：４０３）に従い、ＥＢＶのトランスフォーメーションを使用して、患者およびコントロールから調製した。この調製された細胞株を、ＢＭＰの対応するペプチドでパルスし、そして自己標的細胞として使用した。ＭＢＰ由来ペプチドまたはコントロールＴ細胞レセプターペプチド（４０μｇ／ｍｌ）とそれぞれ共に細胞を２時間インキュベートし、続いて遊離ペプチドを除去するために洗浄することにより、Ｂ細胞のパルス化を実施した。
【００３８】
細胞傷害性試験を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した。ＬＤＨ放出を、製造業者の指示書に従う酵素アッセイにおいて測定した。簡潔に述べると、ＣＤ８＋Ｔ細胞（５０，０００個のエフェクター細胞／ウェル）を、にエフェクター  対  標的比１０で自己細胞と共にインキュベートし、そして２５０×ｇで１回遠心分離した。未パルスの自己Ｂ細胞および非トランスフェクタントをコントロールとして使用した。バックグラウンドの吸収を避けるため、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０をこのアッセイを通して使用した。３７℃および５％  ＣＯ２で４時間のインキュベーション後、これらのプレートを再び遠心分離した。５０μｌの上清を別のプレートに移し、試験キットに提供されるＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｍｉｘと混合した。この反応を３０分後に停止させ、そして４９０ｎｍの吸光度を読み取った。特異的細胞傷害性を、以下のとおりに計算した：％細胞傷害性＝（実験による放出−自発的放出）／（最大の放出−自発的放出）×１００。
【００３９】
これらの結果は、２１／２５（８４％）のＭＳ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞および１１／１５（７３％）のコントロール由来ＣＤ８＋Ｔ細胞が、３０％より大きい特異的細胞溶解により定義される場合、対応するペプチドでパルスされたが自己標的細胞に対して特異的な細胞傷害性効果を示したが、未パルスの同じ自己標的細胞にも無関係なぺプチドでパルスした同じ自己標的細胞にも示さなかった。しかしながら、ＭＳ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞株とコントロールＣＤ８＋Ｔ細胞との間の特異的細胞溶解の百分率についての有意な差異は、認めることができなかった。３人のＭＳ患者由来の４つの選択されたＴ細胞株を用いた代表的な実験を、図６に示す。
【００４０】
さらに、ＭＨＣクラスＩ分子に対するモノクローナル抗体（Ｗ６／３２）の添加により阻害され得たように、観察された細胞傷害性効果はＭＨＣクラスＩ分子に拘束された。一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体（ＨＢ５５）は効果を有さなかった（図７）。これらのＭＨＣ拘束実験のため、ＭＨＣクラスＩに対する精製モノクローナル抗体（Ｗ６／３２）またはＭＨＣクラスＩＩに対する精製モノクローナル抗体（ＨＢ５５）を、上記の細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞と標的細胞とのインキュベーションの間に、２０μｇ／ｍｌで添加した。
【００４１】
（実施例７）
プロセッシングされたＭＢＰを発現する細胞に対するＭＢＰ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの、ＭＨＣクラスＩ分子の併用時の細胞傷害性
選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子および内因的にプロセッシングされたＭＢＰの両方を発現する稀突起神経膠細胞に対して細胞傷害効果を有するかどうかを同定することが、重要であった。この問題に対処するため、以下の試験を開発した。この試験下で、ＣＯＳ細胞をＨＬＡ−Ａ２＊０１遺伝子およびヒトＭＢＰ遺伝子でトランスフェクトした。具体的には、ヒトＭＢＰおよびヒトＨＬＡ−Ａ２をコードするｃＤＮＡを、２つのプロモーター（ＰＣＭＶプロモーターおよびＰＥＦ−α１）を有するｐＢｕｄ  ＣＥ４．１ベクター中に構築した。この組み換えＤＮＡを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを、４００μｇ／ｍｌでＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む選択培地を用いて選択した。ＭＢＰおよびＨＬＡ−Ａ２の安定な発現を、ＭＢＰに対する結合体化モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）またはＨＬＡ−Ａ２に対する結合体化モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートし、続いてフローサイトメトリーにより分析することによって、評価した。
【００４２】
ペプチドでパルスされた自己標的細胞に対して細胞傷害性である、選択されたＭＳ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞株を、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞を使用した細胞傷害性実験において分析した。２つのＨＬＡ−Ａ２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞株（Ｅ１１およびＤ１０）は、Ａ２−ＭＢＰでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に対して特異的な細胞傷害性を示したが、非トランスフェクタントに対しては示さず、一方、他のＡ２４拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞株（Ｂ９およびＦ１２）は、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞に対する細胞傷害効果を有さなかった。４つの代表的なＣＤ８＋Ｔ細胞株についての結果を、図８に示す。このことは、ヒトＭＢＰおよびＨＬＡ−Ａ２の両方を発現する標的細胞に対する特異的な認識および細胞傷害性を示す。
【００４３】
【表１−１】
2007509063.tif 000004
【００４４】
【表１−２】
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【００４５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｔ細胞除去前およびＴ細胞除去後の、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を図示する。ＭＳ患者（ＭＳ−４）由来のＰＢＭＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の磁気ビーズによる除去前（左側パネル）および除去後（右側パネル）の、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率について分析された。ＣＤ４＋Ｔ細胞の除去割合は、３０回の実験全てにおいて常に９８％より大きかった。ＣＤ４＋Ｔ細胞が除去されたＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、７２±８％であった。
【図２】図２は、ＭＳを患う患者および正常な被験体（ＮＳ）における、ＭＢＰ由来ペプチドに反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の測定された前駆体頻度を示す。このＣＤ８＋Ｔ細胞頻度分析は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について予め除去された応答性ＰＢＭＣ画分が、それぞれ示されるＭＢＰ由来ペプチドの存在下で分画されなかった自己ＰＢＭＣとそれぞれ培養されるスプリットウェル法により、実施された。破傷風トキソイドの免疫優性エピトープ（残基８３０−８３８）に対応する合成ペプチドを、コントロールとして使用した。各々の白丸は、各々の個体におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を表す。このデータは、ＰＢＭＣのＣＤ４除去画分における、ＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の測定頻度として表される。
【図３】図３は、ＭＢＰ由来ペプチドに反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の形質発現を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞株（Ｅ１１、Ｄ１０、Ｂ９およびＦ１２）は、ＴＣＲαβ／ＴＣＲγδ、ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯに対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、形質発現について分析された。
【図４】図４は、フローサイトメトリーによる、ＭＨＣクラスＩテトラマーがクローン化ＣＤ８＋Ｔ細胞株に結合することの分析を示す。ＭＢＰ１１１−１１９ペプチド（Ｅ１１）およびＭＢＰ８７−９５ペプチド（Ｄ１０）を認識する、２つのＡ２拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞株が、ＨＬＡ−Ａ２−ＭＢＰ１１１−１１９テトラマーを使用したフローサイトメトリーにより分析された。白抜きのプロフィールは、ＰＥで架橋されたコントロール抗体を用いたＴ細胞の染色を表す。黒塗のプロフィールは、同じ提示実験においてテトラマーを用いたＴ細胞の染色を示す。
【図５】図５は、ＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカインプロフィールを図示する。ＭＳを患う患者（ＭＳ、ｎ＝２５）および正常な被験体（ＮＳ、ｎ＝１４）に由来する、得られたＣＤ８＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞株のサイトカイン産生が、ＥＬＩＳＡにより測定された。これらのＴ細胞株は、それぞれ対応するペプチドでチャレンジされ、そして４８時間後、示されたサイトカインの濃度について上清が試験された。バーは、平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）±ＳＥＭを示す。全てのサイトカインについてのこのアッセイの検出限界は、２５ｐｇ／ｍｌ未満であった。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、自己標的細胞に対する、ＭＢＰ由来ペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。ＭＢＰ由来ペプチド反応性の４つの代表的なＣＤ８＋Ｔ細胞株（ＭＢＰ１１１−１１９に対するＥ１１、ＭＢＰ８７−９５に対するＤ１０、ＭＢＰ１３４−１４２に対するＢ９、およびＭＢＰ１４−２２に対するＦ１２）を、ＬＤＨ放出アッセイにおいて、細胞傷害性について試験された。パネルＡ。ＣＤ８＋Ｔ細胞株は、示されるエフェクター（ＣＤ８＋Ｔ細胞）対  標的（ＥＢＶで形質転換された自己Ｂ細胞）比で、対応するペプチドを用いてパルスされた自己標的細胞に対する細胞傷害性について、試験された。無関係のＴＣＲ  ＣＤＲ３配列に対応する９マーの合成ペプチド（ＳＴＲＱＧＰＱＥＴ）（配列番号５）が、コントロールとして使用された。パネルＢ。同じＣＤ８＋Ｔ細胞株を、ＭＢＰの異なるペプチドを用いてパルスされたコントロールの自己標的細胞に対する細胞傷害性について分析された。コントロールぺプチドとして役立つ無関係のＴＣＲペプチドを用いて、同じ自己標的細胞がパルスされた。エフェクター  対  標的比は１０であった。
【図７】図７は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞株のＭＨＣ拘束を図示する。ＭＢＰ由来ペプチドを認識する、選択されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞株は、２０μｇ／ｍｌの濃度での、ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）およびＭＨＣクラスＩＩ（ＨＢ５５）に対する２つのモノクローナル抗体の存在下および非存在下で、自己標的細胞に対する特異的な細胞傷害性について試験された。エフェクター  対  標的比は、すべての実験について１０であった。データは、％特異的細胞傷害性として表される。使用された手順は、図５の説明に記載される手順と同様である。
【図８】図８は、ヒトＭＢＰ遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２遺伝子でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞に対する、ＭＢＰ由来ペプチドに反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞株の細胞傷害活性を示す。  選択されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞株は、ヒトＭＢＰ遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２遺伝子でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞を用いた、細胞傷害性について、ＬＤＨ放出アッセイにおいて試験された。エフェクター  対  標的比は１０であった。コントロールとして、トランスフェクションされていないＣＯＳ細胞が使用された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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