(57)【要約】本発明は、ヌクレオチドを含む渦巻状組成物に向けられる。このヌクレオチドは概して、渦巻状物の成分に、または親油性尾部にリンカーを介して結合させることができる。あるいは、またはさらには、ヌクレオチドはトランスフェクション剤と会合させることができる。本発明は同様に、本明細書において提供される組成物を作製するおよび使用する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
渦巻状物; および
ヌクレオチド
を含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがリンカーを介して渦巻状成分に結合したヌクレオチド-渦巻状組成物。
【請求項２】
渦巻状物; および
渦巻状物と会合したヌクレオチド
を含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがリンカーを介して親油性尾部に結合した、ヌクレオチド-渦巻状組成物。
【請求項３】
リンカーが親油性または疎水性である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
リンカーがヌクレオチドを安定化する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項５】
リンカーがヌクレオチドと渦巻状成分との会合を促進する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項６】
渦巻状物が負に荷電している脂質成分および多価陽イオン成分を含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項７】
渦巻状物が大豆ホスファチジルセリンを含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項８】
リンカーが消化可能、還元可能、または別の方法で可逆的である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項９】
リンカーがN-スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１０】
リンカーがN-ヒドロキシスクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１１】
ヌクレオチドがsiRNAである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１２】
ヌクレオチドがモルホリノオリゴヌクレオチドである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１３】
モルホリノオリゴヌクレオチドがアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドである、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
ヌクレオチドが短い二本鎖DNAである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１５】
ヌクレオチドがリボザイムである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１６】
ヌクレオチドがアプタマーである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１７】
ヌクレオチドが転写因子デコイである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１８】
ヌクレオチドが少なくとも一つのミスマッチを含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１９】
ヌクレオチドが少なくとも一つの置換を含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２０】
ヌクレオチドが約18〜25ヌクレオチド長である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２１】
ヌクレオチドが約21〜23ヌクレオチド長である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２２】
ヌクレオチドが標的mRNAに対するRNA干渉を媒介する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２３】
標的mRNAが、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および正常な細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を発現する、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
ヌクレオチドが標的mRNAの翻訳の阻害を媒介する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２５】
標的mRNAが、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および正常な細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を発現する、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
第二の標的mRNAに向けられた第二のヌクレオチドをさらに含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２７】
リポソームと接触する前にヌクレオチドがトランスフェクション剤と複合体化される、請求項1または2記載の組成物。
【請求項２８】
トランスフェクション剤がポリカチオン性のトランスフェクション剤である、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
トランスフェクション剤がポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、またはこれらの誘導体である、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
リポソームおよびヌクレオチドを沈殿させてヌクレオチド-渦巻状物を形成させる段階を含むヌクレオチド-渦巻状組成物形成法であって、ヌクレオチドがリンカーを介して渦巻状成分または親油性尾部に結合したヌクレオチド-渦巻状組成物形成法。
【請求項３１】
渦巻状物および渦巻状物と会合したヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがリンカーを介して渦巻状成分または親油性尾部に結合したヌクレオチド-渦巻状組成物の生物学的有効量を宿主に投与する段階を含む、ヌクレオチドを宿主に投与する方法。
【請求項３２】
疾患または障害が治療されるように、渦巻状物および疾患または障害と関係がある標的mRNAに対するヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがリンカーを介して渦巻状成分または親油性尾部に結合したヌクレオチド-渦巻状組成物の治療有効量を被験者に投与する段階を含む、標的mRNAの発現と関係する疾患または障害を抱える被験者を治療する方法。
【請求項３３】
渦巻状物; および
渦巻状物と会合したヌクレオチド
を含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがトランスフェクション剤と複合体化されたヌクレオチド-渦巻状組成物。
【請求項３４】
トランスフェクション剤がポリカチオン性のトランスフェクション剤である、請求項33記載の組成物。
【請求項３５】
トランスフェクション剤がポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、またはこれらの誘導体である、請求項33記載の組成物。
【請求項３６】
トランスフェクション剤と複合体化されたヌクレオチドが、リンカーを介して渦巻状物または脂質尾部と会合される、請求項33記載の組成物。
【請求項３７】
ヌクレオチドがsiRNAである、請求項33記載の組成物。
【請求項３８】
ヌクレオチドがモルホリノオリゴヌクレオチドである、請求項33記載の組成物。
【請求項３９】
モルホリノオリゴヌクレオチドがアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドである、請求項38記載の組成物。
【請求項４０】
ヌクレオチドが短い二本鎖DNAである、請求項33記載の組成物。
【請求項４１】
ヌクレオチドがリボザイムである、請求項33記載の組成物。
【請求項４２】
ヌクレオチドがアプタマーである、請求項33記載の組成物。
【請求項４３】
ヌクレオチドが転写因子デコイである、請求項33記載の組成物。
【請求項４４】
ヌクレオチドが少なくとも一つのミスマッチを含む、請求項33記載の組成物。
【請求項４５】
ヌクレオチドが少なくとも一つの置換を含む、請求項33記載の組成物。
【請求項４６】
ヌクレオチドが約18〜25ヌクレオチド長である、請求項33記載の組成物。
【請求項４７】
ヌクレオチドが約21〜23ヌクレオチド長である、請求項33記載の組成物。
【請求項４８】
ヌクレオチドが標的mRNAに対するRNA干渉を媒介する、請求項33記載の組成物。
【請求項４９】
標的mRNAが、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および正常な細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を発現する、請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
ヌクレオチドが標的mRNAの翻訳の阻害を媒介する、請求項33記載の組成物。
【請求項５１】
標的mRNAが、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および正常な細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を発現する、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
第二の標的mRNAに向けられた第二のヌクレオチドをさらに含む、請求項33記載の組成物。
【請求項５３】
リポソームおよびヌクレオチドを沈殿させてヌクレオチド-渦巻状物を形成させる段階を含むヌクレオチド-渦巻状組成物形成法であって、ヌクレオチドがトランスフェクション剤に対して複合体化されるヌクレオチド-渦巻状組成物形成法。
【請求項５４】
渦巻状物および渦巻状物と会合したヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがトランスフェクション剤に対して複合体化されるヌクレオチド-渦巻状組成物の生物学的有効量を宿主に投与する段階を含む、ヌクレオチドを宿主に投与する方法。
【請求項５５】
疾患または障害が治療されるように、渦巻状物および疾患または障害と関係がある標的mRNAに対するヌクレオチドを含む、ヌクレオチドがトランスフェクション剤に対し複合体化された、ヌクレオチド-渦巻状組成物の治療有効量を被験者に投与する段階を含む、標的mRNAの発現と関係する疾患または障害を抱える被験者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は2004年4月9日付で出願した米国特許出願第10/822,235号; 2004年4月9日付で出願した国際出願番号PCT US2004/011020; 2004年10月27日付で出願した米国特許仮出願第60/623,097号; および2005年2月23日付で出願した米国特許仮出願第60/656,115号の恩典および優先権を主張するものである。上記の出願のそれぞれの内容は全て、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
渦巻状構造体はD. Papahadjopoulosにより、大型単層小胞体の調製での中間体として最初に調製された。米国特許第4,078,052号。さまざまなカーゴ成分を組み入れた渦巻状組成物が、そのような渦巻状物の作出および使用の方法を含め、例えば、米国特許第5,840,707号、同第5,994,318号および同第6,153,217号、ならびに国際出願番号WO 04/091578に、同じく開示されている。具体的には、米国特許第5,840,707号は、タンパク質渦巻状物およびポリヌクレオチド渦巻状物について開示している。これらの特許の内容は全て、この参照により組み入れられる。
【０００３】
さらに、ペプチドに結合した親油性尾部が、例えば、Bourgault, I., F. Chirat, A. Tartar, J.-P. Levy, J. G. GuilletおよびA. Venet, J. Immunol. 152:2530-2537 (1994)に開示されており、インビトロでおよびインビボでCD8+ MHCクラスIに拘束されるCTLを誘発することが示されている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は全体として、ヌクレオチド-渦巻状組成物ならびに製造および投与の方法に向けられる。この組成物は概して、ヌクレオチドがリンカーを介して渦巻状成分に結合した、渦巻状物およびヌクレオチドを含むことができる。あるいは、またはさらには、組成物は概して、ヌクレオチドがリンカーを介して親油性尾部に結合した、渦巻状物および渦巻状物と会合したヌクレオチドを含むことができる。
【０００５】
いくつかの態様では、リンカーは親油性または疎水性である。いくつかの態様では、リンカーはヌクレオチドを安定化する。他の態様では、リンカーは渦巻状成分とのヌクレオチドの会合を促進する。他の態様では、リンカーは消化可能、還元可能、または別の方法で可逆的である。リンカーはSMPBおよび/またはSPDPであることができるが、これに限定されることはない。
【０００６】
いくつかの態様では、渦巻状物は負に荷電している脂質成分および多価陽イオン成分を含む。他の態様では、渦巻状物は大豆ホスファチジルセリンを含む。
【０００７】
いくつかの態様では、ヌクレオチドはsiRNA、モルホリノオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド、短い二本鎖DNA、リボザイム、アプタマー、および/または転写因子デコイであることができるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様では、ヌクレオチドは少なくとも一つのミスマッチを含む。他の態様では、ヌクレオチドは少なくとも一つの置換を含む。特定の態様では、ヌクレオチドは約18〜25ヌクレオチド長である。他の態様では、ヌクレオチドは約21〜23ヌクレオチド長である。
【０００８】
いくつかの態様では、ヌクレオチドは標的mRNAに対するRNA干渉を媒介する。他の態様では、ヌクレオチドは標的mRNAの翻訳の阻害を媒介する。標的mRNAは、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および/または正常な細胞タンパク質を含みうるが、これらに限定されないタンパク質を発現する。いくつかの態様では、その組成物はさらに、第二の標的mRNAに向けられた第二のヌクレオチドを含む。
【０００９】
いくつかの態様では、ヌクレオチドはリポソームを接触させる前にトランスフェクション剤と複合体化される。特定の態様では、トランスフェクション剤はポリカチオン性のトランスフェクション剤である。トランスフェクション剤はポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、および/またはその誘導体であることができるが、これらに限定されることはない。
【００１０】
他の局面では、本発明は渦巻状物および渦巻状物と会合したヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがトランスフェクション剤と複合体化されたヌクレオチド-渦巻状組成物を提供する。特定の態様では、トランスフェクション剤はポリカチオン性のトランスフェクション剤である。トランスフェクション剤はポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、および/またはその誘導体であることができるが、これらに限定されることはない。
【００１１】
いくつかの態様では、トランスフェクション剤と複合体化されたヌクレオチドは、リンカーを介して渦巻状物または親油性尾部と会合される。いくつかの態様では、ヌクレオチドはsiRNA、モルホリノオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド、短い二本鎖DNA、リボザイム、アプタマー、および/または転写因子デコイであることができるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様では、ヌクレオチドは少なくとも一つのミスマッチを含む。他の態様では、ヌクレオチドは少なくとも一つの置換を含む。特定の態様では、ヌクレオチドは約18〜25ヌクレオチド長である。他の態様では、ヌクレオチドは約21〜23ヌクレオチド長である。
【００１２】
いくつかの態様では、ヌクレオチドは標的mRNAに対するRNA干渉を媒介する。他の態様では、ヌクレオチドは標的mRNAの翻訳の阻害を媒介する。標的mRNAは、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および/または正常な細胞タンパク質を含みうるが、これらに限定されないタンパク質を発現する。いくつかの態様では、その組成物はさらに、第二の標的mRNAに向けられた第二のヌクレオチドを含む。
【００１３】
いくつかの局面では、本発明はヌクレオチド-渦巻状組成物を形成させる方法に向けられる。この方法は概して、リポソームおよびヌクレオチドを沈殿させて、ヌクレオチドが本明細書に記述されるヌクレオチドのいずれかである、ヌクレオチド-渦巻状物を形成させる段階を含む。
【００１４】
他の局面では、本発明はヌクレオチドを宿主に投与する方法に向けられる。この方法は概して、渦巻状物、および渦巻状物と会合したヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドが本明細書に記述されるヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチド-渦巻状組成物の生物学的有効量を宿主に投与する段階を含む。
【００１５】
他の局面では、本発明は標的mRNAの発現と関係する疾患または障害を抱える被験者を治療する方法に向けられる。この方法は概して、疾患または障害が治療されるように、渦巻状物および疾患または障害と関係がある標的mRNAに対するヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドが本明細書に記述されるヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチド-渦巻状組成物の治療有効量を被験者に投与する段階を含む。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、渦巻状成分または親油性尾部と会合したヌクレオチドの利用が、渦巻状物との会合を増大させ、ヌクレオチドの生物学的利用能を促進しうるという発見に基づいている。
【００１７】
したがって、いくつかの局面では、本発明は、渦巻状成分およびヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物を提供する。本発明のある態様では、ヌクレオチドはリンカーを介して渦巻状成分に結合される。本発明の他の態様では、ヌクレオチドはリンカーを介して親油性尾部に結合される。
【００１８】
本発明をいっそう容易に理解できるように、ある種の用語を最初に定義する。
【００１９】
本明細書では「親油性尾部」という用語は、以下の特徴の一つまたは複数を実証する部分を指す: 水に溶けない傾向がある、非極性溶媒に溶ける傾向がある、オクタノール/水分配測定でオクタノールを好む傾向がある、または脂質二重層と適合する傾向があり二重層を形成し得る。したがって、親油性尾部は、完全に疎水性、大部分が疎水性でありうるか、または部分的に親水性でありうる部分を含む。
【００２０】
本明細書では「渦巻状物」、「脂質沈殿物」および「沈殿物」という用語は、水を含んだ内部空間がほとんどないかまたは全くない、通常は積み重なったおよび/または巻き上がった交互に重なる陽イオンシートと脂質二重層シートとを一般に含む脂質沈殿成分であって、その陽イオンシートが一種類または複数種類の多価陽イオンで構成されている成分を指すように互換的に使用される。さらに、「渦巻を形成した」という用語は、例えば、陽イオンシート中に取り込ませること、および/または脂質二重層中に含有させることにより、渦巻状構造体と会合していることを意味する。
【００２１】
本明細書では「多価陽イオン」という用語は、二価陽イオンもしくはさらに高い価数の陽イオンか、またはイオンを形成することができる、薬物およびその他の化合物のような、カルシウム、バリウム、亜鉛、鉄およびマグネシウムならびにその他の元素などの金属陽イオンを含む、少なくとも二個の正電荷を有する任意の化合物、あるいは負に荷電している脂質とキレートを形成して架橋を形成することができる複数の正電荷を有するその他の構造体を指す。さらにはまたはあるいは、多価陽イオンはその他の多価陽イオン化合物、例えば、陽イオン性のまたはプロトン化されているカーゴ成分を含むことができる。
【００２２】
「ヌクレオシド」という用語は、プリンまたはピリミジン塩基がリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合した分子を指す。典型的なヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、およびチミジンが挙げられる。「ヌクレオチド」という用語は、一つまたは複数のリン酸基が糖成分にエステル結合で連結したヌクレオシドを指す。典型的なヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、およびヌクレオシド三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は本明細書では同じ意味で使用されており、これらの用語は5'炭素原子と3'炭素原子との間のホスホジエステル結合により互いに連結されたヌクレオチドの重合体を指す。
【００２３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体の短い配列を指す。「RNA類似体」という用語は、対応する未改変または未修飾のRNAと比べて少なくとも一つの改変または修飾されたヌクレオチドを有するが、対応する未改変または未修飾のRNAと同一のまたは類似の性質または機能を保持しているポリヌクレオチド(例えば、化学的に合成されたポリヌクレオチド)を指す。本明細書に記載のように、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するRNA分子と比べてRNA類似体の加水分解の速度低下をもたらす結合によって連結させることができる。例えば、この類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホラミデート、および/またはホスホロチオエート結合を含むことができる。好ましいRNA類似体は、糖を修飾したおよび/または骨格を修飾したリボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドを含む。そのような改変または修飾は、非ヌクレオチド物質を、例えばRNAの末端にまたは内部に(RNAの一つまたは複数のヌクレオチドに)付加することをさらに含むことができる。RNA類似体は、これがRNA干渉を媒介する能力を有するという点で天然RNAに十分に類似してさえいればよい。
【００２４】
本明細書では「同一の」オリゴヌクレオチドとは、比較対象の参照ヌクレオチドの部分配列と同じ配列を有する。「厳密に相補的な」オリゴヌクレオチドとは、そのオリゴヌクレオチドの相補体が比較対象の参照ヌクレオチドの部分配列と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。「実質的に相補的な」および「実質的に同一の」オリゴヌクレオチドは、参照の遺伝子、DNA、cDNA、またはmRNA、およびその厳密な相補体に特異的にハイブリダイズする能力を有する。
【００２５】
「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドであって、標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする能力を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
「RNA」または「RNA分子」または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドの重合体を指す。「DNA」または「DNA分子」または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドの重合体を指す。DNAおよびRNAは人力によらないで(例えば、それぞれDNA複製またはDNAの転写により)合成することができる。RNAは転写後修飾することができる。DNAおよびRNAは化学的に合成することもできる。DNAおよびRNAは一本鎖(すなわち、それぞれssRNAおよびssDNA)または複数鎖(例えば二本鎖、すなわち、それぞれdsRNAおよびdsDNA)とすることができる。「mRNA」または「メッセンジャーRNA」は、一本または複数本のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖RNAである。リボソームがmRNAに結合すると、この情報がタンパク質合成の間に翻訳される。
【００２７】
本明細書では「RNA干渉」(「RNAi」)という用語は、標的遺伝子の発現を調節する、低減するまたは沈黙させるRNAの選択的な細胞内分解を指す。
【００２８】
本明細書では、「小さな干渉性RNA」(「siRNA」)(当技術分野では「短い干渉性RNA」とも呼ばれる)という用語は、約10〜50ヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)を含む二本鎖RNA(またはRNA類似体)であって、RNA干渉を誘導できるかまたは媒介できる二本鎖RNAを指す。
【００２９】
本明細書では「短い二本鎖DNA」という用語は、約50未満のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)を含む二本鎖DNA (またはDNA類似体)を指す。
【００３０】
「モルホリノオリゴヌクレオチド」および「モルホリノ」は互換的に使用されており、これらはモルホリノ骨格を有するオリゴヌクレオチドを指す。モルホリノはRNase Hに依存しない機序により機能しており、これは水溶液に可溶性であって、ほとんどがmM濃度で易溶である(通常、10 mg/ml〜100 mg/ml強)。モルホリノはRNAに高い親和性があり、mRNA内の極めて安定な二次構造にさえも効率的に侵入するので、これはmRNAの5'キャップからタンパク質コード領域のおよそ+25部位までの本質的にはどこであっても効果的かつ予測可能な標的化を可能とする。代替となるホスホロチオエートには十分な裏付けのある多くの非アンチセンス効果があって厄介なのに対し、モルホリノには顕著な非アンチセンス効果がない。モルホリノはヌクレアーゼが認識しないモルホリン骨格を含んでおり、したがって、生体系内で約数時間のうちに通常分解されるホスホロチオエートに比べて細胞内で安定である。その結果として、同様のアンチセンス効果を達成するのに、非常に少ないモルホリノが必要になるだけである(およそ100倍少ない)。モルホリノはまた、標的化がいっそう予測可能であり、細胞内での活性がいっそう確かで配列特異性に優れているので、ホスホロチオエートよりも優れている。Summerton, Biochimica et Biophysica Acta 1489: 141-158 (1999)。モルホリノは公知の方法にしたがって設計し調製することができる。例えば、Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7187-195 (1997)。
【００３１】
本明細書では「リボザイム」および「RNA酵素」という用語は、化学反応を触媒するRNA分子を指すように互換的に使用される。それ自体のおよび/またはその他のRNAの切断を触媒することに加えて、リボザイムは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することもある。リボザイムは細胞中では極めて稀有であるが、必要不可欠な機能、例えば、RNAのタンパク質へのリボソーム翻訳における役割を有することが多い。公知のリボザイムはRNase P、グループIおよびグループIIイントロン、リードザイム(leadzyme)、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザイム、ならびにテトラヒメナリボザイムを含むが、これらに限定されることはない。さらに、リボザイムは、例えば良好な酵素活性を維持しながら、合成により作製してもよい。合成リボザイムは天然に存在するリボザイムに似た構造を有してもよく、または新規な構造を有してもよい。
【００３２】
本明細書では「アプタマー」という用語は、一般的に、高い親和性および特異性で標的分子と結合する一本鎖DNAおよびRNA分子を指す。アプタマーは、結合ポケットを形成することによって特異的リガンドを認識するランダムな配列の集団からインビトロで選択されてもよい。アプタマーは化学的に合成することができ、一本鎖であっても、通常、複雑な三次元形状を有する。一般に、RNA酵素、またはリボザイム上のアプタマードメインは、リボザイムの活性を調節する。抗体と同様の様式で、アプタマーの形状が標的タンパク質の形状に合致する場合、強固に結び付いた複合体が形成されうる。これらのアプタマーは、薬物とアプタマーとの直接結合により、またはアプタマーでコーティングされている小胞体、例えば、リポソーム中への薬物のカプセル封入により、薬物の標的化送達における将来性を有し得る。したがって、一つの態様では、本発明の組成物に利用されるヌクレオチドはアプタマーである。アプタマーは渦巻状構造体内に少なくとも部分的に含まれてもよい。あるいは、アプタマーは渦巻状物上にコーティングされてもよい。アプタマー-渦巻状物は標的化送達のためのさらなるカーゴ成分を含んでもよい。
【００３３】
本明細書では「転写因子デコイ」という用語は一般に、例えば細胞培養において、特異的な転写因子を阻害するのに使われるオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を指す。転写因子タンパク質は、これらが発現を調節する標的遺伝子のプロモーター領域に見出される特異的配列に結合する。これらの結合配列は一般に長さが6〜10塩基対であり、時には標的遺伝子のプロモーター領域内に複数コピーで見出される。標的遺伝子中の配列と転写因子の結合について競合する転写因子デコイで、細胞をいっぱいにすることができる。このデコイは転写因子の結合および機能を変える可能性があり、したがって標的遺伝子の発現を調節する。より高濃度で、転写因子デコイは転写因子の機能を完全に遮断し得る。例示的な転写因子デコイは、例えば、Morishita, R., et al., Circ Res, 82, 1023-1028 (1998)およびMann, M. J. and Dzau, V.J., J. Clin. Invest., 106, 1071-1075 (2000)に記述されている。
【００３４】
「標的mRNAに対するRNAiを媒介する」ヌクレオチドとは、RNAi機序またはプロセスによって標的mRNAの破壊を引き起こすために、またはmRNAのタンパク質への翻訳を妨げるために、標的RNA(例えば、mRNAまたはスプライシングされて一つもしくは複数のmRNAを生成するRNA)に十分に相補的な配列を含んだヌクレオチドを指す。
【００３５】
「ヌクレオチド類似体」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、天然には存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、標準的ではないヌクレオチドを指す。好ましいヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学的性質を変化させるように、但し、ヌクレオチド類似体がその目的とする機能を果たす能力を保持するように任意の位置で修飾される。誘導体化できるヌクレオチドの位置の例としては、その5位、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、5-プロピンウリジン、5-プロペニルウリジンなど; その6位、例えば、6-(2-アミノ)プロピルウリジン; アデノシンおよび/またはグアノシンについてはその8位、例えば、8-ブロモグアノシン、8-クロログアノシン、8-フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチド類似体としては同様に、デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシン; およびN-修飾(例えば、アルキル化、例えば、N6メチルアデノシン、または当技術分野において他に知られているように修飾した)ヌクレオチド; ならびにHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記述されているものなどのその他の複素環修飾ヌクレオチド類似体が挙げられる。
【００３６】
ヌクレオチド類似体はヌクレオチドの糖部分に修飾を含むこともできる。例えば、その2'OH-基をH、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2、COOR、またはORより選択される基により置換することができ、その場合にRは置換または無置換C1〜C6アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。その他に可能な修飾としては、米国特許第5,858,988号、および米国特許第6,291,438号に記述されているものが挙げられる。
【００３７】
ヌクレオチドのリン酸基を例えば、リン酸基の酸素の一つもしくは複数を硫黄で置換すること(例えば、ホスホロチオエート)により、または例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5):317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11.2):77-85、および米国特許第5,684,143号に記述されているように、ヌクレオチドがその目的とする機能を果たすことを可能とするその他の置換を行うことにより修飾することもできる。上記のいくつかの修飾(例えば、リン酸基修飾)は、例えば、ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドのインビトロまたはインビボでの加水分解の速度を低下させることが好ましい。
【００３８】
障害に「関与する」または障害「と関係する」遺伝子またはmRNAは、その正常または異常な発現または機能が、疾患もしくは障害、またはその疾患もしくは障害の少なくとも一つの症状をもたらすかまたは引き起こす遺伝子またはmRNAを含む。
【００３９】
「標的mRNAの機能を調べる」という語句は、宿主細胞、組織または生物において、そのmRNAから起こる発現、活性、機能または表現型を試験することまたは研究することを指す。
【００４０】
本発明の渦巻状物は、リンカーを介して親油性尾部(例えば、本明細書に記述される脂質のいずれか、ポリエチレンイミン、またはビタミンE)または渦巻状成分に結合したまたは会合したヌクレオチドを含む。ヌクレオチドを渦巻状成分にまたは親油性尾部に結合させることまたは別の方法で会合させることは、例えば、渦巻状物へのヌクレオチドの取込みを促進するのに、投与後の膜を越えてのヌクレオチドの移送を促進するのに、またはその両方に好都合であり得る。いくつかの態様では、ヌクレオチドと親油性尾部とを連結する架橋剤は同様に、親油性または疎水性である。そのような架橋剤はさらに、渦巻状物へのヌクレオチドの取込みを促進することができる。いくつかの態様では、架橋剤はインビボでおよび/またはインビトロで安定である。いくつかの態様では、架橋剤はインビボでおよび/またはインビトロで不安定である。いくつかの態様では、親油性尾部および/または架橋剤はヌクレオチドを安定化する。いくつかの態様では、親油性尾部および/または架橋剤は、ヌクレオチド二重鎖またはその他の複合体(例えば、トランスフェクション剤との)を安定化する。いくつかの態様では、親油性尾部および/または架橋剤は、例えば、RNAi機序を安定化するかまたは妨害することにより、RNAiを調節するヌクレオチド、例えば、siRNAの能力を増大させるかまたは低下させる。いくつかの態様では、親油性尾部とともにヌクレオチドを含む渦巻状物は有意に、インビボでおよび/またはインビトロで毒性がないかまたは毒性が検出されない。一つの態様では、ヌクレオチドは消化可能な、還元可能な、または別の方法で可逆的なリンカーとともに脂質渦巻状成分または親油性尾部に結合される。ヌクレオチドは可逆的な形で(例えば、還元可能なまたは消化可能なリンカーとともに)または標的の条件(例えば、pH、温度、超音波エネルギーおよび同様のもの)の影響を受けやすいリンカーに結合されてもよい。これは特に有用である。通常は体内でまたは場合により標的の構造物内で、例えば、酵素により容易に消化されるようなリンカーを選択できるからである。すなわち、例えば、リンカーを血漿中の、間質液中の、細胞(例えば、マクロファージ)中のまたはエンドソーム中の酵素により分解されてヌクレオチドが遊離し、これらの構造体において非結合型として利用可能となるように選択することができる。別の態様では、可逆性のリンカーは静電結合、または例えば臓器、もしくは渦巻状物がpH勾配を受けるその他の構造物での、pHの変化により切断されるその他の結合とすることができる。別の態様では、リンカーは温度の変化によって、例えば、体温に曝されることによって逆戻りする。
【００４１】
一つの態様では、ヌクレオチドは、親油性尾部などの脂質成分との静電性、疎水性、共有結合性またはイオン性の相互作用により結合される。好ましい態様では、ヌクレオチドは、渦巻状物の二重層の成分、例えば、リン脂質またはその他の脂質に結合される。架橋結合により脂質にヌクレオチドを共有結合的に結合させることは、公知の方法によって達成することができる。例えば、架橋結合により脂質にヌクレオチドを共有結合的に結合させることは、安定な架橋剤N-スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、または還元可能な架橋剤N-ヒドロキシスクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)を用いた方法によって達成することができる。例えば、Martin, F. J., and Papahadjopoulos, D. J. Bio. Chem. 257:286-288 (1982)およびBarbet, J. et al. J Supra. Struct. Cell Biochem. 16:243-258 (1981)を参照されたい。
【００４２】
SMPBは立体障害を制限するよう引き伸ばされた鎖長を特徴とする。これは同様に、MBSの鎖伸長類似体であり、一般にSPDP複合体よりも血清中でいっそう安定であることが示されうる複合体を形成し、SMPBの反応基はNHSエステルおよびマレイミド基を含む。さらに、SMPBは概ね、アミノおよびスルフヒドリル基に対し反応性である。SMPBは、例えば、Iwai, K., et al., Anal. Biochem. 171, 277-282 (1988)で見つけられる。
2007532573.tif 000002
【００４３】
SPDPは典型的なヘテロ二官能性の切断可能な架橋剤である。これは免疫化学および薬物輸送系に使われる複合体で広く用いられており、抗体産生および酵素免疫測定はSPDPで成功裏に行われている。SPDPをタンパク質チオール化試薬として使用し、利用可能なSH基をもたらすことが可能であり、SPDPの反応基はNHSエステルおよびピリジルジチオ基を含む。さらに、SPDPは概ね、アミノおよびスルフヒドリル基に対し反応性である。SPDPは、例えば、Carlsson, J., et al., Biochem. J. 173, 723-737 (1978)で見つけられる。
2007532573.tif 000003
【００４４】
一つの態様では、共有結合はヌクレオチドを適当な条件の下で脂質成分または親油性尾部から脱離できるように可逆性である。例えば、ヌクレオチドが標的の組織、臓器またはその他の構造物に送達されるように、標的の組織、臓器、または構造物(例えば、血漿タンパク質、間質タンパク質、エンドソームまたは細胞内環境)に内在する酵素によって切断されうるリンカーを介して、ヌクレオチドをリン脂質に結合させることができる。別の態様では、ヌクレオチドをその他任意の手段により、例えば、静電相互作用および/または疎水性相互作用により結合させることができる。
【００４５】
ヌクレオチドは、本明細書に記述される方法のいずれかで脂質成分または親油性尾部と会合させることができる。例えば、一つの態様では、ヌクレオチドが標的の環境との接触によって脂質成分と解離するように、ヌクレオチドを脂質成分と会合させる。ヌクレオチドは、本明細書に記述されるリンカーのいずれか、例えば、標的の環境に内在する酵素、タンパク質または分子によって還元可能な、または別の方法で可逆的なもしくは消化可能なリンカーとともに渦巻状物の成分に結合させることができる。酵素は、被験者に内在する細胞外の、細胞内のまたはエンドソームの酵素とすることができる。別の態様では、ヌクレオチド成分は脂質成分と静電気的に会合しており、被験者の細胞または臓器中のpH勾配との接触により渦巻状物と解離する。
【００４６】
他の局面では、本発明は渦巻状成分およびヌクレオチドを含むヌクレオチド-渦巻状組成物であって、ヌクレオチドがトランスフェクション剤に対し複合体化されたヌクレオチド-渦巻状組成物を提供する。
【００４７】
ヌクレオチドとトランスフェクション剤との間で複合体を最初に形成させることにより、ヌクレオチドとリポソームおよび/または渦巻状物との結合の増強をもたらすことができる。トランスフェクション剤は、陽イオン性、もしくはポリ陽イオン性、例えば、プロタミン、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリビニルアミン、スペルミン、スペルミジン、ヒスタミン、陽イオン性脂質、または沈殿の前にリポソームとの結合性を高めるその他の成分とすることができる。または、ポリ陽イオンを最初にリポソームと混合してこれに結合させ、その後、ヌクレオチドを添加する。陽イオン性重合体のポリエチレンイミン(PEI)と複合体を形成したDNAの高いトランスフェクション能が報告されている。Boussif et al. Proc Natl Acad Sci USA 92: 7297-7301 (1995)。しかしながら、トランスフェクション率の増大は毒性の増大と連動するものであった。Bogden et al., AACS PharmSci 4(2) (2002)を参照のこと。PEIは商品名Lupasol G35で売られているものなど、例えば、BASFから得ることができる。さらに、硫酸プロタミンを使用してプラスミドDNAを濃縮し、このようにして脂質媒介性の遺伝子導入を増強させることが、例えば、Sorgi F.L., et al., Gene Ther. 4(9):961-8 (1997)に記述されている。さまざまな分子量を持つ陽イオン性重合体を利用してもよく、これは分岐していてもまたは分岐していなくてもよい。
【００４８】
ヌクレオチド渦巻状物へのトランスフェクション剤の付加は、例えば、ヌクレオチドの送達に有利とすることができる。例えば、渦巻を形成したsiRNA-PEI複合体は、文献で観測されている関連毒性なしに細胞中へのトランスフェクションを向上させることが発見されている。いくつかの態様では、陽イオンは陽イオン性重合体、例えば、PEIまたはPEI誘導体である。他の態様では、陽イオンはプロタミンである。そのような複合体を本明細書で論ぜられる方法のいずれかにより、リポソームと会合させることができる。
【００４９】
脂質のヌクレオチドとの比、およびPEIまたはプロタミンのヌクレオチドとの比などは変化し得る。好ましい態様では、N対P比(PEIまたはプロタミン中の窒素N 対 ヌクレオチド中のリン酸塩P)は、約0.5〜約20の間で変化し得る。特定の態様では、N対P比は約4〜約8である。
【００５０】
特定の局面では、本発明は渦巻を形成したヌクレオチド組成物を特徴とする。ヌクレオチド-渦巻状組成物は概して、渦巻状物、および渦巻状物と会合した本明細書に記載のヌクレオチド、例えば、リンカーを介して親油性尾部に結合したヌクレオチドを含む。本発明は同様に、ヌクレオチド-渦巻状物を使用する方法(例えば、研究および/または治療方法)を特徴とする。
【００５１】
いくつかの態様では、ヌクレオチドはsiRNAである。他の態様では、ヌクレオチドはモルホリノオリゴヌクレオチドである。本発明で用いるのに適したモルホリノオリゴヌクレオチドは、アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを含む。他の態様では、ヌクレオチドは短い二本鎖DNAである。他の態様では、ヌクレオチドはリボザイムである。他の態様では、ヌクレオチドはアプタマーである。他の態様では、ヌクレオチドは転写因子デコイである。本発明の特定の態様では、ヌクレオチドはDNAではない。
【００５２】
本発明のヌクレオチドは約7〜100ヌクレオチド長、10〜50、20〜35、および15〜30ヌクレオチド長とすることができる。本発明のヌクレオチドは長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30ヌクレオチドとすることができる。例えば、いくつかの態様では、モルホリノオリゴヌクレオチドは約18〜約25ヌクレオチド長である。他の態様では、siRNAは約21〜23ヌクレオチドの長さを有する。
【００５３】
本発明のヌクレオチド、例えば、siRNAまたはモルホリノは標的遺伝子に対しRNA干渉を媒介することができる。すなわち、いくつかの態様では、ヌクレオチドは標的遺伝子と関係がある標的RNA(例えば、mRNAまたはスプライスされて一つもしくは複数のmRNAを生成できるRNA)に十分に相補的な配列を有し、RNAi機序または過程によって標的mRNAの破壊を引き起こす。ヌクレオチドはすべての残基が標的分子中の残基に相補的であるように設計することができる。あるいは、一つまたは複数の置換を分子の内部で行って、その分子のプロセッシング活性を促進させることおよび/または安定性を増大させることができる。置換は、鎖の内部で行うことができ、または鎖の末端の残基に行うことができる。いくつかの態様では、ヌクレオチドは標的mRNAの翻訳の阻害を媒介するか、またはタンパク質の合成に向けられる。
【００５４】
本発明のヌクレオチドが誘導する標的mRNAの切断反応は配列特異的である。一般に、標的遺伝子の一部分に同一である配列を含んだヌクレオチドが阻害のためには好ましい可能性がある。しかしながら、本発明を実践するのに、ヌクレオチドと標的遺伝子との間の100%の配列同一性が必要とされることはない。配列変異は、遺伝子突然変異、系統間多型性、または進化的分岐によると予測できるものを含めて、許容することができる。例えば、標的配列に対して挿入、欠失、および単一点突然変異があるヌクレオチド配列は、阻害のために有効であることも見出されている。あるいは、ヌクレオチド類似体による置換または挿入を有するヌクレオチド配列は阻害のために有効とすることができる。したがって、一つの態様では、本発明のヌクレオチドは参照ヌクレオチドの部分配列と同一である。多の態様において、ヌクレオチドは参照ヌクレオチドの部分配列と厳密に相補的である。さらにもう一つの態様において、ヌクレオチドは参照ヌクレオチドの部分配列と実質的に相補的である。
【００５５】
さらに、ヌクレオチドの部位の全てが標的認識に等しく寄与しているわけではない。例えば、siRNAの中央部でのミスマッチは最も重大な意味を持っており、これは本質的に標的RNAの切断を無効にする。対照的に、siRNAの3'ヌクレオチドは標的認識の特異性に大して寄与していない。一般に、標的RNAに相補的であるsiRNA配列(例えば、そのガイド配列)の3'末端の残基は、標的RNAの切断にとって重要ではない。
【００５６】
配列同一性は配列比較および当技術分野において知られているアライメントアルゴリズムにより容易に決定することができる。二つの核酸配列の(または二つのアミノ酸配列の)同一性の割合を決定するため、最適な比較を目的にそれらの配列を整列させる(例えば、最適な整列のためにギャップを第一の配列または第二の配列に導入することができる)。次いで、対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)部位のヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を比較する。第一の配列中のある部位が第二の配列中のその対応部位と同じ残基によって占められているなら、それらの分子はその部位で同一である。二つの配列間の同一性の割合は、それらの配列が共有する同一部位の数の関数(すなわち、相同性% = 同一部位の数/部位の総数×100)であり、任意で導入ギャップ数および/または導入ギャップ長に対するスコアにペナルティーを与えてもよい。
【００５７】
二つの配列間の配列の比較および同一性の割合の決定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。一つの態様では、アライメントは十分な同一性を有するように整列された配列の特定部分に対して作成されるが、同一性の度合いが低い部分に対しては作成されない(すなわち、局所的アライメント)。配列の比較のために利用される局所的アライメントアルゴリズムの好ましい、限定するものではない例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5873にあるように修正された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl Acad Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはAltschul, et al.(1990) J Mol Biol. 215:403-10のBLASTプログラム(バージョン2.0)に取り入れられている。
【００５８】
他の態様では、アライメントを適当なギャップの導入により最適化し、同一性の割合を整列配列の長さに対して決定する(すなわち、ギャップ有りのアライメント)。比較を目的にギャップ有りのアライメントを得るため、Gapped BLASTをAltschul et al. , (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389に記述されているように利用することができる。他の態様では、アライメントを適切なギャップの導入により最適化し、同一性の割合を整列配列の全長に対して決定する(すなわち、大域的アライメント)。配列の大域的アライメントに利用される数学的アルゴリズムの好ましい、限定するものではない例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に取り入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウェイトの残基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを使用することができる。
【００５９】
ヌクレオチドと標的mRNAの一部分との間では、90%を超える配列同一性、例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または場合によっては100%の配列同一性が好ましい。あるいは、ヌクレオチドは標的のmRNA転写産物の一部分とハイブリダイズすること(例えば、400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTAにて、12〜16時間50℃または70℃でハイブリダイゼーション; その後洗浄)ができるヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)と機能的に定義することができる。さらなるハイブリダイゼーションの条件としては、1×SSC中で70℃、もしくは1×SSC、50%ホルムアミド中で50℃のハイブリダイゼーション、引き続く0.3×SSC中での70℃の洗浄、または4×SSC中で70℃、もしくは4×SSC、50%ホルムアミド中で50℃のハイブリダイゼーション、引き続く1×SSC中で67℃の洗浄が挙げられる。長さが50塩基対未満であると予想されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10℃低くするべきであり、その場合に、Tmは以下の方程式により決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドの場合、Tm(℃) = 2(A + Tの塩基数) + 4(G + Cの塩基数)。長さが18〜49塩基対のハイブリッドの場合、Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)、式中Nはハイブリッド中の塩基数であり、[Na+]はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度(1×SSCの[Na+] = 0.165 M)である。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件のさらなる例は、参照により本明細書に組み入れられるSambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 15 Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4に示されている。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、もしくは50塩基またはそれらとほぼ同等にすることができる。
【００６０】
一つの態様では、本発明のヌクレオチドを修飾して、血清中でのまたは細胞培養の場合には増殖培地中での安定性を改善させる。安定性を増大させるため、その3'残基を分解に対して安定化させてもよく、例えば、それらをプリンヌクレオチド、具体的にはアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択してもよい。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、2'-デオキシチミジンによるウリジンの置換は許容されるものであり、これはRNA干渉の効率に影響を及ぼすことはない。例えば、2'-ヒドロキシル基をなくすことにより組織培地中でのヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性を大幅に増大させることができる。
【００６１】
本発明の他の態様では、ヌクレオチドは少なくとも一つの修飾ヌクレオチド類似体を含むことができる。このヌクレオチド類似体は、標的特異活性、例えば、RNAiが媒介する活性が実質的に影響を受けないような部位に、例えば、RNA分子の5'末端および/または3'末端の領域中に位置付けることができる。具体的には、それらの末端を修飾ヌクレオチド類似体の組込みにより安定化させることができる。
【００６２】
ヌクレオチド類似体は、糖修飾および/または骨格修飾リボヌクレオチドを含む(すなわち、リン酸-糖骨格に対する修飾を含む)。例えば、天然RNAのホスホジエステル結合を修飾して、窒素または硫黄ヘテロ原子を少なくとも一つ含有させることができる。好ましい骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに連結しているホスホエステル基を例えば、ホスホチオエート基からなる修飾基により置換する。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、その2'-OH-基をH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはNO2より選択される基により置換し、その場合にRはC1〜C6アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはF、Cl、Br、またはIである。
【００６３】
ヌクレオチド類似体は同様に、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも一つの天然には存在しない核酸塩基を含んだリボヌクレオチドを含む。塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断することができる。典型的な修飾核酸塩基としては、以下に限定されることはないが、5-位で修飾されたウリジンおよび/またはシチジン、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン; 8-位で修飾されたアデノシンおよび/またはグアノシン、例えば、8-ブロモグアノシン; デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシン; O-アルキル化およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えば、N6-メチルアデノシンが挙げられ、これらが適当である。上記の修飾を組み合わせることができることに留意されたい。
【００６４】
ヌクレオチドを酵素的に、または部分的/全体的有機合成により生成することができ、任意の修飾リボヌクレオチドをインビトロでの酵素合成または有機合成により導入することができる。一つの態様では、本発明のヌクレオチドを化学的に調製する。RNA分子を合成する方法は当技術分野において知られており、具体的には、Verina and Eckstein (1998), Annul Rev. Biochem. 67:99に記載の化学合成法がある。他の態様では、本発明のヌクレオチドを酵素的に調製する。例えば、ヌクレオチドを所望の標的mRNAに十分な相補性を有する長い、二本鎖RNAの酵素的プロセッシングにより調製することができる。長いRNAのプロセッシングを、例えば、適切な細胞溶解物を用いてインビトロで行うことができ、その後にsiRNAまたはモルホリノをゲル電気泳動またはゲルろ過により精製することができる。次いで、ヌクレオチドを当技術分野において承認されている方法により変性させることができる。典型的な態様では、ヌクレオチドは溶媒もしくは樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはその組み合わせにより混合物から精製することができる。あるいは、ヌクレオチドを精製しないでまたは最低限の精製で使用して、サンプルのプロセッシングによる損失を回避することができる。
【００６５】
一つの態様では、本発明のヌクレオチドはインビボで、インサイチューで、またはインビトロで合成される。細胞の内在性RNAポリメラーゼは転写をインビボでもしくはインサイチューで媒介することができ、またはクローニングしたRNAポリメラーゼはインビボでのもしくはインビトロでの転写に使用することができる。インビボのトランス遺伝子または発現構築体からの転写の場合、調節領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナーおよびアクセプター、ポリアデニル化領域)を利用してモルホリノを転写させることができる。阻害するものは、臓器、組織、もしくは細胞型での特異的転写; 環境条件による刺激(例えば、感染、ストレス、温度、化学誘導物質); および/または発生段階もしくは年齢で転写を遺伝子工学的に変化させることによって標的化することができる。組換え構築体から本発明のヌクレオチドを発現するトランスジェニック生物は、その構築体を接合子、胚性幹細胞、または適切な生物に由来する他の多能性細胞に導入することにより作製することができる。
【００６６】
あるいは、ヌクレオチド、例えばsiRNAを合成による鋳型DNAから、または組換え細菌より単離したDNAプラスミドから酵素による転写によって調製することもできる。典型的には、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼなどのファージRNAポリメラーゼを使用する(Milligan and Uhlenbeck(1989) Methods Enzymol. 180:51-62)。このRNAを保存のために乾燥させることができ、またはこれを水溶液に溶解させることができる。この溶液はアニーリングを阻害するために、および/またはその二本鎖の安定性を増大させるために緩衝液または塩を含むことができる。
【００６７】
Ambion社(Austin, TX)およびMITのWhitehead Institute of Biomedical Research(Cambridge, MA)から入手可能なものなど、市販されている設計ツールおよびキットによりsiRNAの設計および生成が可能となる。一例として、所望のmRNA配列を、センスおよびアンチセンス標的鎖の配列を生成する配列プログラムに入力することができる。次いで、これらの配列を、センスおよびアンチセンスsiRNA鋳型オリゴヌクレオチドを決定するプログラムに入力することができる。これらのプログラムを利用して、例えば、ヘアピン挿入断片またはT1プロモータープライマー配列を付加することもできる。次いで、キットを使用して、siRNA発現カセットを構築することもできる。
【００６８】
いくつかの態様において、標的mRNAは、癌タンパク質、ウイルスタンパク質、HIVタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、異常な細胞タンパク質、および/または正常な細胞タンパク質であり得るがこれらに限定されないタンパク質を発現する。例えば、一つの態様では、本発明の標的mRNAは細胞タンパク質(例えば、核タンパク質、細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、または膜結合性タンパク質)などの少なくとも一種類のタンパク質のアミノ酸配列を特定している。他の態様では、本発明の標的mRNAは細胞外タンパク質(例えば、細胞外マトリックスタンパク質または分泌タンパク質)のアミノ酸配列を特定している。本明細書におけるタンパク質の「アミノ酸配列を特定している」という語句は、mRNA配列が遺伝暗号の規則にしたがってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下のクラスのタンパク質は、例示を目的として記載されているものである: 発生に関わるタンパク質(例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害因子、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、Winged helixファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンフォカインおよびその受容体、成長/分化因子およびその受容体、神経伝達物質およびその受容体); 癌遺伝子によりコードされるタンパク質(例えば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2。CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6。FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM 1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3、およびYES); 腫瘍抑制タンパク質(例えば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF 1、NF2、RB 1、TP53、およびWTI); ならびに酵素(例えば、ACC合成酵素および酸化酵素、ACP不飽和化酵素および水酸化酵素、ADPグルコースピロホスホリラーゼ、アセチル化酵素および脱アセチル化酵素、ATPase、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログリコシダーゼ、過酸化水素分解酵素、セルラーゼ、カルコン合成酵素、キチン分解酵素、シクロオキシゲナーゼ、脱炭酸酵素、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカン加水分解酵素、グルコース酸化酵素、顆粒結合性でんぷん合成酵素、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、転化酵素、異性化酵素、キナーゼ、ラクトース分解酵素、脂肪分解酵素、不飽和脂肪酸酸化酵素、リゾチーム、ノパリン合成酵素、オクトピン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、過酸化酵素、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、過リン酸分解酵素、フィターゼ、植物成長調整物質合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、タンパク質分解酵素およびペプチド加水分解酵素、プラナーゼ、組換え酵素、逆転写酵素、RUBISCO、トポイソメラーゼ、ならびにキシラン分解酵素)、細胞表面受容体およびリガンドならびに分泌タンパク質を含む、腫瘍増殖(血管新生を含む)に関与するまたは転位活性もしくは転移能に関与するタンパク質、細胞周期調節、遺伝子調節、およびアポトーシス調節タンパク質、免疫反応、炎症、補体、または凝固調節タンパク質。
【００６９】
本明細書において、「癌遺伝子」という用語は、細胞増殖を刺激する遺伝子であって、細胞でのその発現のレベルが低下すると、細胞増殖の速度が低下するかまたは細胞が静止状態になる遺伝子を指す。本発明との関連において、癌遺伝子は細胞内タンパク質、ならびに自己分泌または傍分泌機能を通じて細胞増殖を刺激できる細胞外増殖因子を含む。ヒト癌遺伝子であり、これに対してヌクレオチド構築体、例えばsiRNA、またはモルホリノ構築体を設計できる癌遺伝子の例をいくつか挙げると、c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I(I型プロテインキナーゼA)、Abl-1、Bcl2、Ras、c-Rafキナーゼ、CDC25ホスファターゼ、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(cdk)、テロメラーゼ、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、およびsrcが挙げられる。本発明との関連において、癌遺伝子はまた、染色体転座から生ずる融合遺伝子、例えば、Bcr/Abl融合癌遺伝子を含む。
【００７０】
さらなるタンパク質としては、サイクリン依存性キナーゼ、c-myb、c-myc、増殖細胞核抗原(PCNA)、形質転換増殖因子-β(TGF-β)、および転写因子、核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、BRCA、Bcl-2、VEGF、MDR、フェリチン、トランスフェリン受容体、IRE、C-fos、HSP27、C-rafならびにメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。
【００７１】
本発明で利用されるヌクレオチドは一種類または複数種類のタンパク質の合成に向けることができる。さらに、またはあるいは、あるタンパク質に向けられる複数のヌクレオチド、例えば、二つ組のヌクレオチドまたは同じ標的タンパク質に対して重複するもしくは重複しない標的配列に対応するヌクレオチドを存在させることができる。さらに、数種類のタンパク質に向けられる数種類のヌクレオチドを利用することができる。したがって、一つの態様では、同じ標的mRNAに対する二種類、三種類、四種類、またはいずれか複数種類のヌクレオチドを本発明の渦巻状組成物に含有させておくことができる。あるいは、ヌクレオチドはタンパク質をコードしていない構造RNA分子または調節RNA分子に向けることができる。
【００７２】
本発明の好ましい局面では、本発明の標的mRNA分子は、病的状態と関係があるタンパク質のアミノ酸配列を特定している。例えば、このタンパク質は、病原体関連タンパク質(例えば、宿主の免疫抑制もしくは免疫回避、病原体の複製、病原体の伝染、または感染の持続に関与するウイルスタンパク質)、あるいは宿主内への病原体の侵入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製もしくは組込み、宿主での感染の成立もしくは伝播、または次世代の病原体の構築を容易とする宿主タンパク質とすることができる。あるいは、このタンパク質は、腫瘍関連タンパク質または自己免疫疾患関連タンパク質とすることができる。
【００７３】
一つの態様では、本発明の標的mRNA分子は、内在性タンパク質(すなわち、細胞または生物のゲノムに存在しているタンパク質)のアミノ酸配列を特定している。他の態様では、本発明の標的mRNA分子は、組換え細胞または遺伝子組換え生物で発現される異種タンパク質のアミノ酸配列を特定している。他の態様では、本発明の標的mRNA分子は、トランス遺伝子(すなわち、細胞のゲノム内の異所に挿入された遺伝子構築体)がコードするタンパク質のアミノ酸配列を特定している。他の態様では、本発明の標的mRNA分子は、病原体のゲノムによりコードされるタンパク質であって、細胞またはその細胞が由来する生物に感染することができるタンパク質のアミノ酸配列を特定している。
【００７４】
このようなタンパク質の発現を阻害することにより、そのタンパク質の機能およびその阻害から得られる治療的有用性に関する貴重な情報を得ることができる。
【００７５】
したがって、一つの態様では、本発明のヌクレオチド-渦巻状組成物を哺乳類細胞の研究に利用して、特定の構造タンパク質および触媒タンパク質の役割を明らかにすることができる。他の態様では、それらを治療用途に使用して、真菌、細菌、およびウイルスを含む、病原生物を特異的に標的化することができる。
【００７６】
渦巻状物ならびに作製および使用の方法は例えば米国特許第5,999,318号および同第6,592,894号に開示されている。渦巻状送達媒体は、単純な、天然に存在する物質、例えば、ホスファチジルセリンおよびカルシウムから構成されることができる安定な脂質-陽イオン沈殿物である。天然に存在する分子(例えば、大豆脂質)および/または合成脂質もしくは修飾脂質の混合物を利用することができる。
【００７７】
その渦巻状構造体は、会合して「渦巻を形成した」成分を分解から保護することを可能にする。血清および粘膜分泌物中の二価陽イオンのインビボ濃度は、渦巻状構造が維持されるような濃度である。それ故、渦巻状物に会合した分子、例えば、カーゴ成分の大部分は、主として固体の、非水性の、安定な、不透過性構造体の内層に存在している。渦巻状構造体は連続する固体層を含んでいるので、たとえこの渦巻状物の外層が過酷な環境条件または酵素にさらされるとしても、渦巻状構造体の内部中の成分は実質的に損なわれていない。
【００７８】
この渦巻状物の内部には主として水がなく、酸素による透過に抵抗性である。酸素および水は分子の構成不能および分解に主に関与しており、この結果、有効期間が減少する可能性がある。したがって、渦巻形成はさらに、渦巻を形成したヌクレオチドに大幅な有効期間の安定性をもたらすはずである。
【００７９】
保存に関して、渦巻状物は陽イオンを含有する緩衝液中で保存することができ、またはこれを凍結乾燥するかもしくは別の方法で粉末に変え室温で保存することができる。必要に応じて、この渦巻状物を投与前に液体で再構成することもできる。渦巻状調製物は、陽イオンを含有する緩衝液中では4℃で2年以上の間安定であることが示されており、凍結乾燥粉末としては室温で少なくとも1年間安定であることが示されている。
【００８０】
一つの態様では、渦巻状物は負に荷電している脂質成分および多価陽イオン成分を含む。本発明で利用される脂質は、一種類または複数種類の負に荷電している脂質を含むことができる。本明細書では「負に荷電している脂質」という用語は、酸性、塩基性または生理的pHの水溶液中で負の形式電荷を持つ頭部基を有する脂質を含み、この用語は同様に、両性イオン性の頭部基を有する脂質を含む。
【００８１】
一つの態様では、この脂質は、少なくとも75%の負に荷電している脂質を含有する脂質の混合物である。他の態様では、この脂質は少なくとも85%の負に荷電している脂質を含む。他の態様では、この脂質は少なくとも90%、95%、または場合によっては99%の負に荷電している脂質を含む。60%〜100%の全ての範囲および値の負に荷電している脂質が本明細書において包含されていることが意図される。
【００８２】
この負に荷電している脂質は大豆ベースの脂質を含むことができる。この脂質は大豆リン脂質(大豆ベースのリン脂質)などの、リン脂質を含むことが好ましい。この負に荷電している脂質としては、ホスファチジルセリン(PS)、ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルイノシトール(PI)、および/もしくはホスファチジルグリセロール(PG)、ならびに/またはその他の脂質とのこれらの脂質の一つまたは複数の混合物を挙げることができる。さらに、またはあるいは、この脂質としては、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ジホスファチジルグリセロール(DPG)、ジオレオイルホスファチジン酸(DOPA)、ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)、ジミリストイルホスファチジルセリン(DMPS)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)および同様のものを挙げることができる。
【００８３】
この脂質は天然によるものまたは合成によるものとすることができる。例えば、この脂質としては、エステル化された脂肪酸アシル鎖、またはエーテル結合(米国特許第5,956,159号に記述されているような結合)、ジスルフィド結合、およびその類似体などの非エステル結合により連結された有機鎖を挙げることができる。
【００８４】
一つの態様では、この脂質鎖は炭素原子が約6個から約26個であり、この脂質鎖は飽和であってもまたは不飽和であってもよい。本発明で有用な脂肪アシル脂質鎖は、n-テトラデカン酸、n-ヘキサデカン酸、n-オクタデカン酸、n-エイコサン酸、n-ドコサン酸、n-テトラコサン酸、n-ヘキサコサン酸、cis-9-ヘキサデセン酸、cis-9-オクタデセン酸、cis,cis-9,12-オクタデセジエン酸、all-cis-9,12,15-オクタデセトリエン酸、all-cis-5,8,11,14-エイコサテトラエン酸、all-cis-4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸、2,4,6,8-テトラメチルデカン酸、およびラクトバシル酸、ならびに同様のものを含むが、これらに限定されることはない。
【００８５】
いくつかの態様では、ペグ化脂質も含まれる。ペグ化脂質はポリエチレングリコール(PEG)の重合体に共有結合的に連結された脂質を含む。PEGはその分子量によって通常分類されており、したがって、例えば、PEG 6,000 MWのものは約6000の分子量を持っている。ペグ化脂質を加えることで、一般的に、沈殿物に取り込める化合物(例えば、ペプチド、ヌクレオチド、および栄養素)の量が増加することになる。典型的なペグ化脂質は、PEG 5,000 MWを持つジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)である。いくつかの態様において、脂質の一部はペグ化されていない。他の態様において、渦巻状物を作製するために使用される脂質はいずれもペグ化されない。
【００８６】
本発明のヌクレオチド-渦巻状組成物は、付加的な成分を加えてまたは加えず種々の形態(例えば、粉末、液体、懸濁液)で提供することができる。適当な形態ならびに添加物、賦形剤、担体、および同様のものが当技術分野において公知である。
【００８７】
本発明の渦巻状物および渦巻状組成物は、任意で凝集阻害剤を含むことができる。凝集阻害剤は一つには、凝集が阻害されるように渦巻状物の表面特性を変化させることによって機能する。凝集は、例えば、立体的な大きさならびに/または渦巻状構造体の性質の変化、例えば、表面疎水性および/もしくは表面電荷の変化により阻害することができる。
【００８８】
カルシウムの添加時およびその後にリポソーム間の相互作用を阻止する物質をリポソーム懸濁液に含有させることによって、凝集を阻害することができる。あるいは、凝集阻害剤を渦巻状物の形成後に添加することができる。さらに、凝集阻害剤の量を変化させることができ、それにより渦巻状物のサイズの調節が可能になる。渦巻状組成物における凝集阻害剤の利用はWO 04/091578に見る事ができる。
【００８９】
本発明の渦巻状物および渦巻状組成物は、一種類または複数種類の付加的なカーゴ成分をさらに含むことができる。「付加的なカーゴ成分」とは、本発明のヌクレオチドに加えて渦巻を形成した成分であり、一般に渦巻状物を沈殿させるために利用される脂質およびイオンを指すものではない。カーゴ成分は生物学的興味を引く特質を有する任意の化合物、例えば、生物の生命現象に関与する化合物を含む。カーゴ成分は有機物でもまたは無機物でも、単量体でもまたは重合体でも、宿主生物にとって内在性でもまたはそうでなくても、天然に存在するものでもまたはインビトロで合成されるものなどでもよい。
【００９０】
付加的なカーゴ成分の例は、WO 04/091578に開示されており、この全体の内容は本参照により組み入れられる。カーゴ成分にはビタミン類、ミネラル類、栄養素、微量栄養素、アミノ酸、毒素、殺菌剤、静菌剤(microbistat)、補因子、酵素、ポリペプチド、ポリペプチド凝集体、ポリヌクレオチド、脂質、糖質、ヌクレオチド、でんぷん、色素、脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、香味料、精油、抽出物、ホルモン、サイトカイン、ウイルス、細胞小器官、ステロイドおよびその他の多環構造体、糖類、金属、代謝毒、造影剤、抗原、ポルフィリン類、テトラピロール色素、マーカー化合物、薬品、薬物、ならびに同様のものが含まれるがこれらに限定されない。
【００９１】
製造方法
他の局面では、本発明は全体として本明細書に記載されるヌクレオチド、例えばトランスフェクション剤と会合するヌクレオチドまたは渦巻状成分もしくは脂質尾部を含む渦巻状物の作製方法に向けられる。この方法は全体として、ヌクレオチド成分の存在下で、例えば、多価陽イオンを添加することによりリポソーム懸濁液を沈殿させる段階を含むことができる。この渦巻状物は付加的なカーゴ成分またはその他の構成要素、例えば、凝集阻害剤をさらに含むことができる。本明細書で記述される方法は全て、ヌクレオチド-渦巻状物を作製するために利用することができる。
【００９２】
リポソームは、リポソームを調製する周知のどの方法によっても調製することができる。すなわち、リポソームは、例えば、溶媒の注入、脂質の水和、逆蒸発、凍結と融解の繰返しによる凍結乾燥により調製することができる。リポソームは多重状または小型単層小胞体(SUV)を含めて、単層状とすることができる。リポソームは、例えば、透析、カラムクロマトグラフィー、バイオビーズSM-2を用いて界面活性剤を除去することにより、逆相蒸発(REV)により、または高圧押出しによる中間サイズの単層小胞体の形成により調製される大型単層小胞体(LUV)、安定型多重層小胞体(SPLV)またはオリゴラメラー(oligolamellar)小胞体(OLV)とすることができる。Methods in Biochemical Analysis, 33:337 (1988)を参照のこと。これらの方法および当技術分野において公知であるその他の方法の全てによって調製されるリポソームを本発明の実践時に使用することができる。
【００９３】
好ましい態様では、リポソームの少なくとも大部分は単層状である。この方法は、リポソームの大部分がULVとなるように、リポソーム懸濁液をろ過する段階および/またはMLVおよびULVリポソームの両方を含むこの懸濁液を小開口部から機械的に押し出す段階をさらに含むことができる。好ましい態様では、リポソームの少なくとも70%、80%、90%、または95%がULVである。
【００９４】
この方法は渦巻状物を形成する方法によって限定されることはない。周知のいずれかの方法を使用して、本発明のリポソーム(すなわち、ヌクレオチドと会合したリポソーム)から渦巻状物を形成させることができる。一つの態様では、米国特許第5,994,318号および米国特許第6,153,217号(その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記述されているものを含むがこれらに限定されない周知の方法を利用して、本発明の渦巻状物を形成させることができる。
【００９５】
一つの態様では、沈殿の前に、SUVを、例えば、ろ過により得て、このリポソームをヌクレオチドおよび/またはその他のカーゴ成分の存在下で沈殿させて、渦巻状物を形成させる。
【００９６】
他の態様では、MLVをヌクレオチドおよび/またはその他のカーゴ成分の存在下で一回または複数回押し出しし、次いで、このリポソームを沈殿させて、渦巻状物を形成させる。この態様では、MLVが押出し過程の間に開口し再封鎖し、それによって封入化またはMLVとのヌクレオチドおよび/もしくはその他のカーゴ成分の会合が別の方法で高められるものと考えられる。
【００９７】
さらに他の態様では、キレート剤(例えば、EDTA)を利用して、ヌクレオチドおよび/またはその他のカーゴ成分の存在下で渦巻状物をリポソームに変換し、次いで、陽イオンを添加して渦巻状物を形成させる。
【００９８】
さらに、またはあるいは、ヌクレオチドは、多量または少量のカルシウムとともに渦巻を形成することができる。したがって、一つの態様では、多量または「上昇した」量のカルシウムを使用し、例えば、その場合には、渦巻状物が形成されるときの溶液中のカルシウム濃度は約100〜約500 mMである。本明細書において、「上昇した量のカルシウム」という用語は、約100〜約500 mMのカルシウム濃度を意味する。他の態様では、比較的少(「低下した」)量の、例えば、約1〜約10 mMのカルシウムを使用する。本明細書において、「低下した量のカルシウム」という用語は、約1〜約10 mMのカルシウム濃度を意味する。いくつかの場合、多量のカルシウムとともに渦巻を形成したsiRNAは、少量のカルシウムとともに渦巻を形成したsiRNAよりも活性が高かった。したがって、より高いカルシウム濃度を用いて作製された本発明の渦巻状物の使用は一般的により活性の高いヌクレオチドをもたらすと考えられる。
【００９９】
一つの態様では、ヌクレオチドのpHを、分子内に電荷をもたらし、それによって渦巻状物、とりわけリン脂質とのその相互作用を増加させるために調整する。一つの態様では、この方法はリポソーム懸濁液のpHを調整する段階を含む。他の態様では、この方法はヌクレオチドの塩基対を荷電させる段階を含むことができる。例えば、pHはモルホリノの場合、約8.5または約6.0〜6.5または約3.0〜3.5に調整することができる。モルホリノの存在下でリポソーム懸濁液のpHを上昇させることにより、モルホリノをリポソームと会合させるかまたはそれと複合体化させる。ヌクレオチドのpHを上昇させるかまたは低下させること(3〜11)により、塩基または骨格上の電荷に影響を及ぼし、脂質との会合を促進させることができる。
【０１００】
pHを調整することおよび/または塩基対を荷電させることにより、渦巻状物とのヌクレオチドの会合を向上できることが見出された。したがって、この方法はリポソームとの接触または沈殿物の形成の前にまたはその間にヌクレオチドのpHを調整する段階をさらに含むことができる。pHを調整する周知のどの方法も利用することができる。例えば、ヌクレオチドを酸性緩衝水溶液で酸性化することができる。あるいは、pHを塩基性緩衝水溶液で上昇させることができる。酸性および塩基性緩衝液は当技術分野において知られており、さまざまな緩衝液を選別するのに、当業者は、日常の実験程度を必要とするだけであろう。あるいは、ヌクレオチドのpHは、酸、例えば、塩酸、または塩基、例えば、水酸化ナトリウムをゆっくり添加することによって調整することができる。
【０１０１】
さらに他の態様では、ヌクレオチドのpHを脂質沈殿物に組み入れる前に調整することができる。他の態様では、得られたモルホリノ渦巻状物の溶液のpHを、例えば、酸または塩基を用いて調整することができる。
【０１０２】
一つの態様では、渦巻状物は、脂質成分とヌクレオチドおよび/またはその他のカーゴ成分とを有機溶媒(例えば、THF)に溶解して溶液とし、ヌクレオチドのリポソームを形成し、このリポソームを沈殿させてヌクレオチド-渦巻状物を形成させることによって形成することができる。その溶媒を任意で、リポソームの形成前におよび/またはリポソームが形成された後に除去することができる。
【０１０３】
他の態様では、渦巻状物は、分子(例えば、ヌクレオチドおよび/または付加的なカーゴ成分)をリポソームに、その分子がそのリポソームと会合するような溶媒の存在下で導入し、このリポソームを沈殿させて渦巻状物を形成させることによって形成することができる。その分子は、溶媒と分子の溶液をリポソームに導入することにより、例えば、滴下により、連続流により、またはボーラスとして導入することができる。この分子を溶媒より前にまたは後にリポソームに導入することもできる。
【０１０４】
リポソームは、リポソームを調製する周知の任意の方法によっても調製することができる。さらに、この方法は渦巻状物を形成する方法によって限定されることはない。周知のいずれかの方法を使用して、本発明のリポソーム(すなわち、カーゴ成分と会合したリポソーム)から渦巻状物を形成させることができる。好ましい態様では、渦巻状物を沈殿により形成する。さらに、またはあるいは、凝集阻害剤をリポソーム段階の溶媒に、または沈殿後の渦巻状物に添加することができる。
【０１０５】
適当な任意の溶媒を本発明に関連して利用することができる。当業者は所定の用途に適した溶媒を容易に選別することができる。適当な溶媒としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メチルピロリドン、N-メチルピロリドン(NMP)、アセトニトリル、アルコール、例えば、ブタノールおよびエタノール(EtOH)、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、およびその組合せが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１０６】
さらに、各種の成分(例えば、ヌクレオチド、脂質、カルシウム(calium)、陽イオン錯化剤、溶媒)を添加する順序は容易に変化させることができる。各種の成分の濃度および比率を本明細書で例示されているように変えることもできる。最後に、必要に応じてイオン条件を調整することができる。塩濃度をおよそ等張(150 mM)に、高濃度(例えば、1〜2モル)に、低張に、ゼロ(水)にすることができる。
【０１０７】
本発明によりヌクレオチド-渦巻状物を形成する例示的な方法は一般に、以下の段階を含むことができる。リポソームおよびヌクレオチドを可溶化しボルテックスして、ヌクレオチドノ-リポソーム懸濁液を形成させることができる。典型的には、ボルテックスを約2分行うことで適当な懸濁液を形成させるには十分である。その懸濁液はさまざまに異なっており目視検査によって、例えば、顕微鏡を通じて確認することができる。
【０１０８】
次に、懸濁液のpHを約8.5に上昇させる(例えば、1 N NaOHで)かまたは約6.5に低下させる(例えば、1 N HClで)。いくつかのヌクレオチド、例えばモルホリノは荷電されないので、この段階は電荷を塩基対に置くために、リポソームとの相互作用を助けるために行われ得る。このイオン相互作用は、pHを8.5に増加させることにより、またはpHを6.5に低下させることにより達成することができる。この時点で、ヌクレオチドは脂質と相互作用する。この懸濁液を再びボルテックスして、ヌクレオチドとリポソームとの間の相互作用を引き起こす。典型的には、ボルテックスを約10分行うことが適当である。ヌクレオチドとリポソームとの間の相互作用は、位相差顕微鏡法および回折顕微鏡法により確認することができる。このヌクレオチドはリポソームの二重層と会合するかまたはその中に組み込まれる。次いで、このヌクレオチド-リポソームをろ過する(例えば、0.22マイクロメーターのシリンジフィルターを用いる)。
【０１０９】
カルシウム溶液をこの懸濁液にボルテックスしながら添加する。適当な添加方法は、500マイクロリットル用のチップを付けたエッペンドルフリピーターピペッター(eppendorf repeater pipetter)を使用することであり、渦巻状物が形成されるまで10秒毎に分注液10マイクロリットルをチューブに添加することである。渦巻状物の形成は、例えば、顕微鏡下でその調製物を観察することによりおよびpHの測定により確認することができる。その後、この渦巻状物は窒素雰囲気下で4℃にて安定的に保存することができる。
【０１１０】
使用方法
他の局面では、本発明は本明細書記載の組成物の任意のものを宿主(例えば、細胞または生物)に投与する方法を提供する。この方法は全体として、ヌクレオチド-渦巻状組成物の生物学的有効量を宿主に投与する段階を含む。この渦巻状組成物は、例えば、付加的なカーゴ成分およひ/または凝集阻害剤との組成物を含めて、本明細書で記述される組成物のいずれかを含むことができる。
【０１１１】
この宿主は細胞、細胞培養物、臓器、組織、および生物、動物等とすることができる。例えば、一つの態様では、ヌクレオチドを宿主内の細胞に(例えば、細胞の細胞質ゾル区画に)送達する。
【０１１２】
一つの態様では、ヌクレオチドは宿主内の標的mRNAに対しRNAiを媒介する。他の態様では、ヌクレオチドは宿主内の標的mRNAの翻訳を媒介する。どちらの態様にしても、異なる機構によって作用するものであるが、特異的な標的タンパク質の合成が宿主内で低下することが好ましい。好ましい態様では、特異的な標的タンパク質の合成が少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または場合によっては100%低下する。
【０１１３】
渦巻状物を利用する細胞および生物にヌクレオチドを導入する物理的方法は、細胞を渦巻状物と接触させる段階または渦巻状物を生物にいずれかの方法により、例えば、経口的に、筋肉内に、皮内に、経皮的に、鼻腔内に、直腸内に、皮下に、局所に、もしくは静脈内に投与する段階を含む。その全てが当技術分野において公知の複数の機序、方法、または経路を使用してヌクレオチド-渦巻状物を細胞または細胞内に導入してもよい。例えば、WO 04/091572を参照のこと。
【０１１４】
標的mRNAを有する細胞または組織は、任意の生物から得られるかまたは任意の生物に含まれる。この生物は、WO 04/091572に記載されるように、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス、または真菌とすることができる。
標的mRNAを有する細胞は、生殖系細胞もしくは体細胞、全能性細胞もしくは多能性細胞、分裂細胞もしくは非分裂細胞、柔細胞もしくは上皮細胞、不死化細胞もしくは形質転換細胞、または同様のもの由来とすることができる。この細胞は幹細胞または分化細胞とすることができる。分化する細胞種としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア細胞、血球、巨核球、リンパ球、貪食細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌腺または外分泌腺の細胞が挙げられる。
【０１１５】
特定の標的mRNAならびに送達されるヌクレオチド物質の用量に応じて、この過程は、宿主内で標的mRNAの機能の部分的なまたは完全な喪失をもたらすことができる。宿主または宿主内の標的化細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%またはそれ以上のmRNA発現の低下または消失が典型的である。mRNA発現の阻害とは、標的mRNAからのタンパク質および/またはmRNA産物のレベルの欠如(または観測可能な減少)を指す。特異性とは、細胞の他の遺伝子に対する明らかな影響なしに標的mRNAを阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞もしくは生物の外面的な特性を調べることにより、またはRNA溶液ハイブリダイゼーション法、ヌクレアーゼ保護法、ノーザンハイブリダイゼーション法、逆転写法、マイクロアレイによる遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着(ELISA)法、ウエスタンブロッティング法、放射免疫測定(RIA)法、その他の免疫測定法、および蛍光活性化細胞分析(FACS)法などの生化学的方法により確認することができる。本発明の組成物の送達および活性を評価するためのアッセイ、ならびにmRNA発現のアッセイが、例えばWO 04/091572に記載されている。
【０１１６】
そのヌクレオチドは細胞につき少なくとも1コピーの送達を可能とする量で導入することができる。高用量(例えば、細胞につき少なくとも5、10、100、500または1000コピー)の物質はいっそう効果的な阻害をもたらすことができる; より低い用量も特定の用途に有用とすることができる。
【０１１７】
その渦巻状物はさらなる薬剤と同時に投与することができる。この第二の薬剤は同じ渦巻状調製物として、本発明の渦巻状調製物と混合された別個の渦巻状調製物として、別々に他の形態(例えば、カプセル剤または丸剤)として、または渦巻状調製物を有する担体として送達することができる。この渦巻状物は、その他の薬物、ペプチド、ヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)、抗原、栄養素、風味料および/またはタンパク質などの一種類または複数種類の付加的なカーゴ成分をさらに含むことができる。このような分子は米国特許第6,153,217号(Jin et al.)および米国特許第5,994,318号(Gould-Fogerite et al.)、ならびに国際特許公開番号WO 00/42989(Zarif et al.)およびWO 01/52817(Zarif et al.)に記述されている。これらの特許は参照により特に組み入れられる。
【０１１８】
本発明の渦巻状物はインビトロ診断アッセイで用いるレポーター分子を含むこともでき、その分子はフルオロフォア、放射性標識または造影剤とすることができる。この渦巻状物は特定の細胞標的との渦巻状物の直接的な結合を導く分子、または特定の細胞種への選択的な侵入を促進する分子を含むことができる。
【０１１９】
本発明の他の利点は、渦巻状物のサイズを調節する能力である。渦巻状物のサイズを調節することで、ヌクレオチドおよび/または付加的なカーゴ成分が細胞に取り込まれる様式を変化させることができる。例えば、一般に、小さな渦巻状物は細胞に素早くかつ効率的に取り込まれるのに対し、もっと大きな渦巻状物はもっとゆっくり取り込まれるが、いっそう長い時間にわたって効力を保持する傾向がある。同様に、場合によっては、小さな渦巻状物が特定の細胞では大きな渦巻状物よりも効果的となる一方で、その他の細胞では大きな渦巻状物が小さな渦巻状物よりも効果的となる。
【０１２０】
治療方法
他の局面では、本発明は、ある障害の危険性がある(またはその障害の影響を受けやすい)被験者または異常なもしくは望ましくない標的遺伝子の発現もしくは活性と関係するある疾患を抱える被験者を治療する予防的方法と治療的方法の双方を提供する。この方法は全体として、疾患または障害が治療されるように、本発明のヌクレオチド-渦巻状物の治療有効量を被験者に投与する段階を含む。
【０１２１】
本発明は、本発明の組成物の投与により恩恵を享受できる被験者を治療する方法を提供する。本発明の渦巻状組成物により恩恵を享受できるいずれかの治療指標を本発明の方法により治療することができる。この方法は、疾患または障害が治療されるように、本発明の組成物を被験者に投与する段階を含む。
【０１２２】
治療的有効量を含む治療方法(予防的および治療的)が、例えはWO 04/091572に記載される。
【０１２３】
本発明の渦巻状物の利点の一つは、その組成物の安全性および安定性である。渦巻状物は経口的にまたは懸念なく点滴注入により、ならびに経口経路、鼻腔内経路、眼球内経路、直腸内経路、腟内経路、肺内経路、局所経路、皮下経路、皮内経路、筋肉内経路、静脈内経路、皮下経路、経皮経路、全身経路、くも膜下腔内経路(CSFの中に)、および同様のものなどのいっそう従来的な経路により投与することができる。粘膜表面への直接塗布は、渦巻状物で可能とされる魅力的な送達手段である。
【０１２４】
本発明により治療される疾患または障害は、本発明のヌクレオチドの投与の成功により治療できるいずれかの疾患または障害とすることができる。典型的な疾患および障害としては、統合失調症、強迫性障害(OCD)、うつ病および双極性障害などの異常なまたは望ましくない遺伝子発現と関係する神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、リンパ腫、免疫介在炎症性疾患、過形成、癌(cancers)、細胞増殖性疾患、血液凝固障害、異常フィブリノーゲン血症および血友病(AおよびB)、皮膚障害、高脂質血症、高血糖症、高コレステロール血症、肥満症、急性および慢性の白血病およびリンパ腫、肉腫、腺腫、真菌感染症、細菌感染症、ウイルス感染症、リソソーム蓄積症、ファブリー病、ゴーシェ病、I型ゴーシェ病、ファーバー病、ニーマン・ピック病(A型およびB型)、球様細胞白質委縮症(クラッベ病)、異染性白質委縮症、多発性スルファターゼ欠損症、スルファチダーゼアクチベーター(sap-B)欠損症、sap-C欠損症、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、テイ・サックス病B1異型、テイ・サックス病AB異型、酸性マルターゼ欠損症、ムコ多糖症、サンドホフ病、癌(a cancer)、自己免疫疾患、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、グレーブス病、同種移植拒絶反応、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、強皮症、癌腫、上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、肝細胞癌、腎細胞癌、胆道癌、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮癌、黒色腫、子宮頸癌、睾丸癌、食道癌、胃癌、中皮腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、下垂体腺腫、炎症性疾患、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、ブドウ膜炎、湿疹、慢性鼻副鼻腔炎、喘息、遺伝病、嚢胞性線維症、ならびに筋ジストロフィーが挙げられる。
【０１２５】
この方法を同様に遺伝子発現の調節のために使用して、健康状態または生活の質をいっそう向上させることができる、例えば、コレステロール摂取を制限することができ、または脂質代謝、体重増加、空腹、老化、もしくは成長を調節することができる。しわとりなどの化粧品の効果、育毛、色素沈着、または皮膚障害を取り扱うこともできる。
【０１２６】
本発明の組成物を使用して、抗ウイルス防御、トランスポゾンの抑制、遺伝子の調節、セントロメアの静止、およびゲノムの再構成を促進させることができる。本発明の組成物を使用して、その他の種類のRNA、例えば、リボソームRNA、転移RNA、および核内低分子RNAの発現を阻害することもできる。
【０１２７】
本発明のヌクレオチド渦巻状組成物は、さまざまな遺伝子治療で利用することができる。そのような治療の一つは、とりわけ免疫不全患者でアスペルギルスフミガタス(Aspergillus fumigatus)のような日和見真菌感染症を管理するためのものである。既存の抗真菌剤による現在の治療プロトコルは、依然としてHIV患者でまたは癌に関連した化学療法を受けている患者で80%の死亡率をもたらす可能性がある。しかしながら、真菌細胞の生理機能に欠かせない重要な原形質膜酵素P型 H+-ATPaseの標的破壊は、A.フミガタスなどの真菌を破壊する代替的なおよびいっそう効果的な方法とすることができる。この特定のATPaseはクローニングされており、この重要なタンパク質の発現をノックダウンし、その結果、真菌の死を引き起こすことができる選択性の小さな干渉性RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドが得られている。
【０１２８】
胞子発芽および増殖細胞の増殖におけるH+-ATPaseの重要な役割によって、ナノ渦巻状物がA.フミガタスのH+-ATPaseを標的とするsiRNAを効率的に送達する能力を模索する機会が得られる。A.フミガタスの医学的な重要性および利用可能な抗真菌化合物が不足していることを考慮すると、本発明の組成物、例えばsiRNA渦巻状組成物は有効な治療的代替手段になる可能性がある。
【０１２９】
併用療法
上記の方法はその他の治療がなくても、またはその他の治療と組み合わせて利用することができる。そのような治療は、本発明の組成物の投与前に、その投与時に、またはその投与後に開始することができる。したがって、本発明の方法は、疾患もしくは障害に対する第二の治療またはその他の治療の副作用を和らげるための第二の治療のような、第二の治療を施す段階をさらに含むことができる。このような第二の治療には、例えば、免疫反応の抑制に対して行われるいずれかの治療を含むことができる。さらに、またはあるいは、さらなる治療には、疾患をさらに治療するための薬物の投与または疾患もしくはその他の治療の副作用を治療するための薬物(例えば、吐き気止め)の投与を含むことができる。
【０１３０】
一つの局面では、本発明は被験者において、本発明の組成物の投与により治療できる疾患または障害を予防する方法を提供する。本明細書に記載の薬剤により治療できる疾患または症状に対する危険性がある被験者は、例えば、当業者に公知の診断試験または予後試験のいずれかまたはその組合せにより同定することができる。予防薬の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいは、その進行が遅くなるように、疾患または障害に特徴的な徴候が現れる前に行うことができる。
【０１３１】
薬学的組成物
本発明は以下に記述されるように予防上のおよび治療上の処置のための本発明の渦巻状物の使用に関する。したがって、本発明の渦巻状物を投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。このような組成物は典型的には、本発明の渦巻状物および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合した、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むよう意図される。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。
【０１３２】
本発明の渦巻状物は、安全で、単純な、十分に定義された、天然に存在している物質、例えば、ホスファチジルセリン(PS)およびカルシウムから容易に調製することができる。ホスファチジルセリンは全ての生体膜の天然成分であり、これは脳内に最も集中している。使用されるこのリン脂質は合成的に生成することができ、またはこれは天然源から調製することができる。大豆PSは安価で、大量に利用可能であって、ヒトに用いるのに適している。さらに、臨床試験から、PSは安全であり、老齢脳において精神機能の補助に関与する可能性があることが示唆されている。多くのカチオン性脂質とは異なり、渦巻状物(これは陰イオン性脂質からなる)は非炎症性であり生体分解性である。静脈内経路、腹腔内経路、鼻腔内経路および経口経路を含めて、さまざまな経路による渦巻状物の複数回投与に対するマウスのインビボ寛容性が評価されている。同じ動物に高用量の渦巻状組成物を複数回投与することでは毒性は示されず、渦巻状マトリックスに対する免疫反応の発現、または渦巻型媒体に関連する何らかの副作用が引き起こされることはない。
【０１３３】
本発明の渦巻状物は、ヒトおよびヒト以外の動物の両方を含む、動物に投与することができる。これは、例えば、動物の飼料または水に入れて動物に投与することができる。本発明の組成物で使われるさらなる薬剤(例えば、湿潤剤、乳化剤および滑沢剤)を含む、本発明の組成物を含む薬学的組成物を調製する方法は、投与の方法に依存しうる。そのような方法は当技術分野において、例えば、WO 04/091572で公知である。
【０１３４】
いくつかの態様では、免疫賦活剤または免疫調節物質を本発明の組成物に添加して、免疫反応を刺激することができる。免疫調節物質はヒトもしくは動物ウイルスに由来する外膜タンパク質、オリゴヌクレオチド、例えば、CpGオリゴヌクレオチドを含むことができ、または天然の化学物質とすることができる。具体的な化学的免疫調節物質には、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマおよびインターロイキン12を含むが、これらに限定されないサイトカイン、ケモカインおよびリンホカインが含まれるが、これらに限定されることはない。外膜タンパク質の供給源として適した動物ウイルスの例は、次の科由来のウイルスを含むが、これらに限定されることはない: アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、コロナウイルス科、デルタウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、ポックスウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、およびトガウイルス科。インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびワクシニアウイルス、およびセンダイウイルス由来の外膜タンパク質も本発明に包含される。
【０１３５】
その薬学的組成物は投与のための使用説明書とともに、容器、パック、または分注器に含まれてもよい。薬学的組成物は一種類または複数種類のさらなる化合物または組成物および使用説明書とともに容器に含まれてもよい。例えば、本発明は同様に、二種類の薬剤であって、このそれぞれがそれを必要性としている被験者に投与された場合に治療効果を及ぼすその薬剤を含む包装した医薬品を提供する。薬学的組成物には第三の薬剤、またはさらに多くの薬剤までもが含まれてもよく、この場合、第三(および第四など)の薬剤は、癌治療などの、疾患に対する別の薬剤(例えば、抗癌薬および/または化学療法)またはHIVカクテルとすることができる。場合によっては、個々の薬剤は、販売のためにまたは消費者に引き渡すのに別個の容器に詰められてもよい。本発明の薬剤は、適当な溶媒を用いて溶液でまたは溶媒なしの形態(例えば、凍結乾燥状態)で供給されてもよい。さらなる構成品には酸、塩基、緩衝剤、無機塩類、溶媒、抗酸化剤、保存剤、または金属キレート剤が含まれてもよい。このさらなるキット構成品は、純粋な構成品として、あるいは一種類または複数種類のさらなるキット構成品を加えた水溶液または有機溶液として存在するものである。キット構成品のいずれかまたは全てが任意で緩衝液をさらに含むものである。
【０１３６】
本発明は同様に、第二の薬剤と組み合わせた(例えば、混同した)第一の薬剤を含有する包装した医薬品を含む。本発明は同様に、第二の薬剤の存在下で第一の薬剤を用いるための使用説明書または本発明の方法で第一の薬剤を用いるための使用説明書とともに包装されている第一の薬剤を含んだ医薬品を含む。本発明は同様に、第一の薬剤の存在下で第二のまたはさらなる薬剤を用いるための使用説明書あるいは本発明の方法で第二のまたはさらなる薬剤を用いるための使用説明書とともに包装されている第二のまたはさらなる薬剤を含んだ医薬品を含む。あるいは、その包装した医薬品はそれらの薬剤を少なくとも一つ含んでもよく、その医薬品は第二の薬剤とともに用いるように奨励されてもよい。
【０１３７】
本発明は、2004年4月9日に提出されたUSSN 10/822230に記載される方法および組成物、ならびにこれらと本明細書に記載の方法および組成物の任意の組み合わせをさらに含む。
【０１３８】
実施例
実施例1: siRNA-PEI複合体で調製した渦巻状物
siRNAおよびポリエチレンイミン(PEI)を会合させて正に荷電している複合体を形成し、次いでこれを負に荷電しているリポソームに結合し渦巻を形成した。これらの渦巻を形成した複合体の効果を調べた。
【０１３９】
siRNA(20 μM) 22.5 μlをEppendorf微量遠心管に添加した。0.05%の濃度のPEI(2000 MW, Lupasol G35, BASF) 16.2 μlを添加し十分に混合した。次いで、予め調製しておいた1.5 mg/mlのDOPSリポソーム(TES中、pH 7.0) 116 μlをこの混合液に添加し十分に混合した。最後に、0.1 M塩化カルシウム115 μlを添加し十分に混合して、渦巻状物を形成させた。渦巻状物の形態を顕微鏡によって確認した。siRNA-渦巻状組成物から遊離(渦巻を形成していない)siRNAを除去するために、siRNA-渦巻状物を遠心により沈殿し、その上清を除去した。沈殿物は再懸濁した。
【０１４０】
同じ方法によって、渦巻状物を同様に非特異的siRNA(erbB2に対する特異性がなく周知の細胞内標的がない)で形成した。未処理のSKOV3細胞と並行して、抗Erb siRNA-渦巻状物および非特異的siRNA-渦巻状物(どちらもPEIで形成した)をSKOV3細胞に0.25 μg(全用量)および0.125 μg(50%用量)で投与し、これらを72時間インキュベートした。
【０１４１】
図1に要約したように、siRNA/PEI-渦巻状組成物(Erb_siRNA/PEI/Cch.Plt(1))で処理したSKOV3細胞は、未処理細胞(細胞のみ(1))に比べてErb B染色の著しい低下を示した。非特異的siRNAを有する類似の組成物は統計学的にさらに弱い阻害を示した(CtrlErb_siRNA/PEI/Cch.Plt(1))。siRNA/PEI-渦巻状物の濃度を半分にして使用した場合、抗ErbB siRNA/PEI-渦巻状物(ErbB Plt(2))は引き続きErb B染色の顕著な低下をもたらしたが、対照の渦巻状物(Ctl.Plt(2))は、未処理細胞(細胞のみ(2))に匹敵して阻害を示さなかった。このことは、渦巻状物で送達されたsiRNAの抗ErbB2特異的な効果を示唆するのもである。
【０１４２】
siRNA/PEI-渦巻状物を(1)渦巻を形成していないsiRNA/PEI複合体、(2)渦巻を形成したウシ胎児血清(FBS)およびPEI、(3)渦巻を形成していないFBSおよびPEIで処理したSKOV3細胞、ならびに未処理細胞と比較した。これらの対照はsiRNA渦巻状物と同じ方法によりならびに同じ量および濃度で処方した。
【０１４３】
図2に要約したように、siRNA/PEI-渦巻状物(Erb_siRNA/PEI/Cch.Plt(1))の投与により、渦巻を形成していないsiRNA/PEI (Erb_siRNA/PEI/Cplz.Plt(1))と比べてErbBのいっそう強い阻害が認められたことは、渦巻状物によるsiRNAの送達に対するプラスの役割を示唆するものである。FBS/PEI-渦巻状物(FBS/PEI/Cch.Plt(1))、および渦巻を形成していないFBS/PEI(FBS/PEI/CplxPlt(1))は、複合体を形成していないPEIの細胞毒性によって、染色の低下を示した。
【０１４４】
実施例2: インビボでのGFP渦巻状物の発現
緑色蛍光タンパク質(GFP)渦巻状物をインビボでのその発現を調べるため静脈内に投与した。
【０１４５】
渦巻状物の局所注射
GFP渦巻状物(500 nm〜5 μm) 150 μgをC57BL/6系マウスの脚筋に局所注射した。GFPの発現をその後7日間調べた。3日後、脚筋はGFPの発現を示す(図3を参照のこと)。GFPトランス遺伝子の発現は同様に、さらに4日間認められる。
【０１４６】
GFP渦巻状物の腫瘍内注射
GFP渦巻状物(150 μg)、GFPナノ渦巻状物(300 nm〜1 μm、150 μg)、空の渦巻状物、および渦巻を形成していない「裸の」DNA (15 μg)を2種の腫瘍モデル、つまりLewis肺癌側腹部腫瘍および4T1乳腺腺癌脂肪体(MFP)腫瘍に注射し、7日間にわたって観察した。GFPの発現を目的に、腫瘍および局所リンパ節の凍結切片を免疫組織化学的に染色した。GFP渦巻状物、GFPナノ渦巻状物、および「裸の」DNAは全て、図4および5に示されるように、両腫瘍モデルでGFPの発現について陽性染色を示した。
【０１４７】
GFP渦巻状物の静脈内送達
GFP発現プラスミドを乳腺脂肪体腫瘍に送達するため、DNA渦巻状物をカゼイン、つまり凝集阻害剤有りおよび無しで、静脈内に注射した(150 μg PS/15 μg DNA)。注射の4日後に、凍結腫瘍切片でのGFPに対する免疫組織化学を利用し、遺伝子導入および発現をアッセイした。
【０１４８】
予備データから、図6に示されるように、GFP DNA渦巻状物の静脈内投与は乳腺腫瘍において遺伝子発現を媒介することが示唆される。予備データから、図7に示されるように、カゼインナノ渦巻状物の静脈内送達は乳腺腫瘍で多くの量の遺伝子発現をもたらすが、肺ではそうでないことが示唆される。
【０１４９】
実施例3: インビトロでのDNA配合物の細胞毒性
SKOV3細胞にDNA配合物(C: ポリエチレンイミン25K直鎖(PEI)と配合したDNA渦巻状物、P: DNA PEI複合体、L: リポフェクトアミン2000を用いたDNA、Ctrl: 対照、未処理細胞)を1ウェル当たりDNA 1.0〜0.25 μgトランスフェクトした(図9)。トランスフェクションから72時間後、細胞の生存を試験した(WST1アッセイ)。この結果(図9)から、渦巻状物/PEI DNA配合物がPEIまたはリポフェクトアミン群のものよりもずっと低い細胞毒性を有することが実証される。トランスフェクションから72時間後の時点で、細胞を溶解し、蛍光強度を調べた。リポフェクトアミンおよびPEI/DNA配合物とは対照的に、渦巻状配合物は、WST1アッセイで毒性が認められなかった0.5および0.25 μg/ウェルの濃度で同等のトランスフェクションをもたらした(図8)。
【０１５０】
実施例4: 架橋ペプチドを含む脂質-小胞体の調製(免疫原性複合体の調製用に開発)
ペプチド-脂質複合体の初期調製
架橋結合試薬をホスファチジルエタノールアミンに結合することは、次のとおりMartinおよびPapahadjopoulos (J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982))の方法にしたがって達成した。
【０１５１】
スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、無水メタノール、およびトリエチルアミンをN2下、室温で2時間反応させた(例えば、メタノール2 ml、トリエチルアミン5 μl、SMPB 17 mgを乾燥PE 25 mgに添加した)。メタノールをN2気流によって反応生成物から除去した。CHCl3 2 mlをN2下で添加し、この混合物を同様にN2下、1500 RPMで5分間遠心することにより1% NaClのH2O溶液2 mlで2回抽出した。その後、シリカゲルカラムでのクロマトグラフィーを次のように行った。
【０１５２】
カラムをCHCl3 50 mlで洗浄した。CHCl3 5 ml中にてサンプルをカラムに負荷し、引き続いて分画液5 mlを回収しながらCHCl3:MeOH 40:1、30:1、25:1、20:1、15:1を各10 ml、その後10:1を40 ml負荷した。次に、シリカゲルカラム分画液の薄層クロマトグラフィー(溶媒- CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4)を行った。CHCl3:MeOH 10:1の初期分画液に溶出した架橋剤とリン脂質との結合体(MPB-PE)では、PE標準物質と共移動する単一のスポットが示された。この誘導体化PEのスポットは、ニンヒドリン陰性、ヨウ素陽性であった。PE標準物質のスポットはニンヒドリン陽性であった。MPB-PEを含有するシリカゲルカラム分画液をプールし、-20℃でN2下にて保存した。リン脂質をBartlett (J. Biol. Chem. 234:466 (1959))の方法により定量化した。平均収率は50%であった。
【０１５３】
末端システインを含むペプチドの還元
固相手順(Yarney and Marrifield, 「The Peptide: Analysis, Synthesis, Biology.」中 Academic Press, N.Y. Vol. 2、1-284)により調製したペプチドを1 M酢酸(HAc)に溶解した(例えば、HAc 1 mlにペプチド2 mg)。ジチオスレイトール(DTT)を濃度100 mMまで添加した。サンプルを脱気し、窒素で飽和し、その後37℃で3時間スクリューキャップ付き試験管の中でインキュベートした。Bondeluteカラム(Analytichem Internationalから入手した3 ccカラム C18、部品番号607203)でのアフィニティークロマトグラフィーを次のように行った。
【０１５４】
カラムを2容量の100% MeOH、その後10容量の1 M HAcで洗浄した。ペプチドをBondeluteカラムにアプライした。カラムを5容量の1 M HAc、その後5容量の0.02%トリフルオロ酢酸(TFA)で洗浄した。サンプルを5容量の60%アセトニトリル、0.02% TFAで溶出した。溶出されたサンプルを一晩凍結乾燥し、-20℃で保存した。本質的に完全な回収率が得られた。
【０１５５】
脂質およびステロール(コレステロール)の混合物と会合したペプチド-脂質複合体を含む免疫原性複合物の調製
脂質、つまりMPB-PE、スフィンゴミエリン(SP)、ホスファチジルコリン(PC)およびホスファチジルセリン(PS)、ならびにステロール、つまりコレステロール(Ch)をMPB-PE:SP:PC:PS:Chのモル比2:1:1:1:5でエーテル(10 mg/ml)に溶解した。このサンプルを窒素気流下で乾燥させた。乾燥サンプルを1 ml当たり脂質およびコレステロール4 mgで緩衝液(20 mMクエン酸、35 mMリン酸二ナトリウム、108 mM NaCl、1 mM EDTA, pH 4.5)に再懸濁した。サンプルを超音波処理して粒子懸濁液を形成させた。オクチル-β-D-グルコシド(脂質およびステロール1 mg当たり10 mg)を超音波処理サンプルに添加した。サンプルを再び超音波処理して脂質を全て溶解させた。このサンプルを暗所中にN2下で保存した。
【０１５６】
誘導体化されたホスファチジル-エタノールアミンを含む脂質混合物(MPB-PE)へのペプチドの結合
上記ステップII由来の事前に作出された還元ペプチドをpH 4.5のMPB-PEを含有する上記ステップIII由来の脂質/ステロール混合物に添加した(MPB-PEモル濃度はペプチドのモル濃度の2倍であった)。pHを1N NaOHで6.5に調整した。混合物中のMPB-PEおよびペプチドをN2下、室温で一晩反応させた。数回4℃、pH 7.2のリン酸緩衝生理食塩水を替えて混合物を透析した。脂質およびコレステロールの混合物と会合したタンパク質-脂質複合体を含む免疫原性複合物を透析袋から回収し、冷蔵保存した(4℃)。
【０１５７】
等価物
当業者は、本明細書に記述されている本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するであろう、または日常の実験を利用して、本発明の特定の態様に対する多くの等価物を確認することができると考えられる。そのような等価物は添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
（図１）PEIと配合し、遊離siRNAを除去するために洗浄した抗erb B2 siRNA-渦巻状物のSKOV3細胞に対する部分的ノックダウン効果を示すグラフである。
（図２）SKOV3細胞における渦巻を形成していないsiRNAと比べて渦巻を形成したsiRNAでのRNAi効果の表示の増大を示すグラフである。
（図３〜７）2種のマウス腫瘍モデルでのGFPの発現を示す画像である。
（図８〜９）SKOV3細胞での異なるプラスミドDNA配合物の相対蛍光強度および細胞生存データのグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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