(57)【要約】転移の予後予測の方法を提供する。当該方法は染色体12q24上のSMRT遺伝子座における脆弱部FRA12Eの存在または非存在を同定することを含む。個体におけるFRA12Eの存在は、 蛍光インサイツハイブリッド形成技法のようなハイブリダイゼーション技術を用いて、個体から採取した細胞サンプルで測定することができる。この遺伝子座におけるこの脆弱部の存在は、脆弱部が存在しない場合と比べて転移の可能性が高いことを示唆する。また、転移の可能性を測定するためのキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）個体のゲノムDNAを含む生体サンプルを準備するステップ、
ｂ）SMRT遺伝子座においてヒト染色体12q24のゲノム配列領域に対する、一以上のプローブを使用するステップ、及び
ｃ）SMRT遺伝子座においてヒト染色体12q24の配列内の破損を検出するステップ、
とを含む、個体について癌が転移する可能性を測定する方法。
【請求項２】
前記一以上のプローブの使用が、インサイツハイブリッド形成法に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイゼーションが、蛍光インサイツハイブリッド形成法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記個体が、癌と診断された個体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、直腸結腸癌、肺癌及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが、BAC RP11-339B19、BAC RP11-665C13、BAC RP11-677L6、BAC RP11-408I18及びBAC RP11-30G17、並びにその一部からなる群から選択される、一以上のBACクローンに対応する配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが、BAC RP11-339B19あるいはその一部、BAC RP11-665C13あるいはその一部、及びBAC RP11-677L6あるいはその一部に対応する配列を含むポリヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ネガティブコントロール・プローブをさらに含み、当該ネガティブコントロール・プローブが、12q24領域外の染色体12に対応する配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ネガティブコントロール・プローブが、BAC RP11-469A24に対応する配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一以上のプローブの使用が、サザン・ハイブリダイゼーションに基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）SMRT遺伝子座においてヒト染色体12q24のゲノム配列領域に対するテスト・プローブパネルであって、前記パネルの配列の組み合わせが全SMRT遺伝子座をカバーするものであるパネル、及び
ｂ）少なくとも一のネガティブコントロール・プローブであって、当該ネガティブコントロール・プローブが、SMRT遺伝子座の外側の染色体12q24に対応する配列を含むものである、ネガティブコントロール・プローブ、
とを含み、前記テスト・プローブは全て蛍光標識を有し、前記コントロール・プローブは、前記テスト・プローブの標識と異なる蛍光標識を有することを特徴とする、
個体について癌転移の可能性を測定するためのキット。
【請求項１５】
前記プローブが、BAC RP11-339B19、BAC RP11-665C13、BAC RP11-677L6、BAC RP11-408I18及びBAC RP11-30G17、あるいはその一部に対応する配列を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ネガティブコントロール・プローブが、BAC RP11-469A24に対応する配列を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
アフィディコリンをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
ポジティブコントロール細胞株とネガティブコントロール細胞株をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１９】
SMRT遺伝子座においてヒト染色体12q24のゲノム配列領域内のFRA12Eの存在を同定することを含む、個体について癌転移の可能性を測定するための方法。
【請求項２０】
前記個体が、癌と診断された個体である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主に癌の分野、より詳しくは転移性疾患の予後診断のツール及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移は原発部位からの癌の伝播及び遠隔臓器での新しい腫瘍の形成である。癌が、伝播する前の初期段階で発見された場合であれば、しばしば外科手術あるいは局部照射によって有効に治療することができる。しかしながら、癌が転移後に発見される場合、治療は非常に成功しにくい。さらに、初期診断の時点では転移の証拠がない多くの患者において、転移は後に、明らかに成功したと思われる一次治療の数十年後でさえ、発生しうる。
【０００３】
転移は、明らかに成功したと思われる一次治療の数年後あるいは数十年後でさえ発生し得る伝播に関して臓器特異的パターンを示す可能性がある。乳ガン(BC)は、先進工業国の女性人口において最も頻度の高い癌であり、しばしば骨組織に転移する。骨組織への転移は、進行性疾患に罹患した患者の70%以上に発生する。化学療法レジメンの進歩にもかかわらず、乳癌誘発性転移及び骨溶解を治療することは実質的に不可能である。いくつかの他の癌の転移もまた臓器特異的であると考えられる。例えば、前立腺癌は骨に伝播することが知られている。
【０００４】
人口統計及び疾病の特性が類似している同じタイプの癌を有する個体のグループの中で、患者が局在性疾患から転移性疾患へ現実に進行する可能性、及び初期治療の後無病のままでいる可能性を予測するために、全てのタイプの癌に渡る持続的なクリニカル・チャレンジがなされてきた。転移の臨床的重要性にもかかわらず、予測及び素因マーカーだけでなく、転移プロセスのバイオロジーについても学ぶべきことがたくさん残っている。ひとつには、転移が「隠れて」進行すること及び診断が一般に転移が起こった後でなされるという理由により、知識が限定されている。多くの分子的因子が、検出可能な転移形成の原因となり得るとして同定されてきた。しかしながら、転移のエンドポイントと関連している分子及び遺伝子の同定は、それ自体、これらの分子が転移プロセスにどのように寄与するか及びそのプロセスがどのように誘導されるかについての情報を提供するものではない。この知識は、転移に寄与する分子についての急速に増加しつつある情報を当てはめるための生物学的背景を提供するために重要となるだろう。
【０００５】
転移病巣を進行させるには、腫瘍細胞は宿主免疫監視(非特許文献１)を回避する一方、多段階プロセスにおける各ステップを達成できなければならない。一連の細胞的事象は全転移プロセスに関連して現れる。これらには、癌細胞と周囲の間質細胞との相互作用；すなわち、マトリクス認識、細胞-吸着、生理活性マトリクス結合因子の放出及び腫瘍増殖のためのマトリクス破壊を導く細胞外マトリクスとの相互作用；腫瘍の脈管構造あるいは血管新生の形成；及び免疫保護の回避と細胞死の回避(非特許文献２)が含まれる。
【０００６】
似たパターンの事象が、非ホジキンリンパ腫(NHLs)の形質転換において起こる。非ホジキンリンパ腫では、完全悪性表現型の発生が、相乗的優性発癌遺伝子の同時活性化及び腫瘍抑制遺伝子機能の損失を含む、複数の遺伝的事象の獲得にほぼ依存している(非特許文献３及び４)。 
【０００７】
悪性腫瘍または転移のメカニズムは完全には理解されていないが、腫瘍抑制遺伝子活性の機能低下が発生しうる一つのメカニズムとして、遺伝子の破損がある。遺伝子の破損が誘導される可能性のある染色体位置は、脆弱部として知られている。脆弱部は複数の悪性腫瘍において存在することが示されている。悪性腫瘍における脆弱部は、肺癌中のFHIT遺伝子(染色体3p)のような既知の遺伝子内に存在し、染色体3上に小さな欠失が常に観察されている（非特許文献１７及び１８）。これらの脆弱部は、優性のメンデルの法則で遺伝する。それらはまた200倍以上繰り返された特異的な塩基配列を含むことも知られている。２つの脆弱部が染色体12の長腕上に存在することがすでに証明されている。FRA12Bは12q24.13に位置し（非特許文献１９）、FRA12Eは12q24.2-3に位置している（非特許文献２０）。人口の約５％は、これら２つの脆弱部のうち一つが陽性であると推定されている。
【０００８】
【非特許文献１】Yoneda T. , Williams P., Hiraga T. , Niewolna M. , Nishimura R. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in vitro. J. Bone Miner. Res.,16 : 1486-1495, 2001.
【非特許文献２】Fidler I. Modulation of the organ microenvironment for treatment of cancer metastasis. J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda),87 : 1588-1592, 1995.
【非特許文献３】Korsmeyer SJ (1992). BCL-2 initiates a new category of oncogenes : regulators of cell death. Blood, 80:879-886.
【非特許文献４】Hahn WC, Counter CM, Lundberg AS, Beijersbergen RL, Brooks MW, Weinberg RA Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature 1999 Jul 29; 400 (6743): 464-8
【非特許文献５】Chen JD, Evans RM A transcriptional co-repressor that interacts with nuclear hormone receptors. Nature 1995 Oct 5; 377 (6548): 454-7
【非特許文献６】Heinzel T, Lavinsky RM, Mullen TM, Soderstrom M, Laherty CD, Torchia J, Yang WM, Brard G, Ngo SD, DavieJR, Seto E, Eisenman RN, Rose DW, Glass CK, Rosenfeld MG A complex containing N-CoR, mSin3 and histone deacetylase mediates transcriptional repression. Nature 1997 May 1; 387 (6628): 43-8
【非特許文献７】Nagy L, Kao HY, Chakravarti D, Lin RJ, Hassig CA, Ayer DE, Schreiber SL, Evans RM Nuclear receptor repression mediated by a complex containing SMRT, mSin3A, and histone deacetylase. Cell 1997 May 2; 89 (3): 373-80
【非特許文献８】Alland L, Muhle R, Hou H Jr, Potes J, Chin L, Schreiber-Agus N, DePinho RA Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature 1997 May 1;387(6628) : 49-55
【非特許文献９】Laherty CD, Yang WM, Sun JM, Davie JR, Seto E, Eisenman RN Histone deacetylases associated with the mSin3 corepressor mediate mad transcriptional repression. Cell 1997 May 2; 89 (3): 349-56
【非特許文献１０】Zhang Y, Iratni R, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Reinberg D Histone deacetylases and SAP18, a novel polypeptide, are components of a human Sin3 complex. Cell 1997 May 2; 89 (3):357-64
【非特許文献１１】Taunton J, Hassig CA, Schreiber SL A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p. Science 1996 Apr 19; 272 (5260): 408-11
【非特許文献１２】Yang WM, Inouye C, Zeng Y, Bearss D, Seto E Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3. Proc Natl Acad Sci USA 1996 Nov 12; 93 (23):12845-50
【非特許文献１３】Ayer DE, Lawrence QA, Eisenman RN Mad-Max transcriptional repression is mediated by ternary complex formation with mammalian homologs of yeast repressor Sin3. Cell 1995 Mar 10; 80 (5): 767-76
【非特許文献１４】Schreiber-Agus N, Chin L, Chen K, Torres R, Rao G, Guida P, Skoultchi AI, DePinho RA An amino-terminal domain of Mxil mediates anti-Myc oncogenic activity and interacts with a homolog of the yeast transcriptional repressor SIN3. Cell 1995 Mar 10; 80 (5): 777-86
【非特許文献１５】Grunstein M Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 1997 Sep 25; 389 (6649): 349-52
【非特許文献１６】Wolffe AP Transcriptional control. Sinful repression. Nature 1997 May 1; 387 (6628): 16-7
【非特許文献１７】Mimori K, Druck T, Inoue H, Alder H, Berk L, Mori M, Huebner K, Croce CM Cancer-specific chromosome alterations in the constitutive fragile region FRA3B. Proc Natl Acad Sci USA 1999 Jun 22; 96 (13): 7456-61
【非特許文献１８】Menin C, Santacatterina M, Zambon A, Montagna M, Parenti A, Ruol A, D'Andrea EAnomalous transcripts and allelic deletions of the FHIT gene in human esophageal cancer. Cancer Genet Cytogenet 2000 May; 119 (1) : 56-61
【非特許文献１９】Voiculescu I, Back E, Schempp W.Homozygous condition for a BrdU-requiring fragile site on chromosome 12. Hum Genet 1991 Feb; 86 (4): 416-7.
【非特許文献２０】Sutherland GR Heritable fragile sites on human chromosomes: Factor affecting expression in lymphocyte culture. Am J Hum Genet 31:136-148.
【非特許文献２１】Q Jiang, SGaliegue-Zouitina, C Roumier, MP Hildebrand, S Thomas, LJ Coignet. Genomic organization and refined mapping of the human silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptor (smrt) on chromosome 12q24.3. Cytogenet Cell Genet, 97: 217-220.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、脆弱部と転移との関係は明確でなく、従って転移に対する新規なマーカーを同定し発展させる必要性が今なお存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、転移の予後予測の方法を提供する。当該方法は染色体12q24上のSMRT遺伝子座における脆弱部FRA12Eの存在または非存在を同定することを含む。この遺伝子座におけるこの脆弱部の存在は、脆弱部が存在しない場合より転移の可能性が高いことを示す。この脆弱部の存在は、12q24座とハイブリッド形成可能な核酸配列をプローブとして用いることによって検出され得る。プローブとして使用できる核酸配列の例として、BACクローン(SMRT-特異的RPC11 BACクローン等)を挙げることができる。
【００１１】
ある実施形態において、染色体12上の12q24座におけるFRA12Eサイトの存在を検出する方法は、個体のゲノムDNAサンプルと、SMRT遺伝子座の12q14領域に対応する配列を含む一以上の標識BACクローンとを接触させるステップ、及び該プローブの特異的結合を測定するステップを含む。好ましい実施形態では、前記プローブの特異的結合は蛍光インサイツハイブリッド形成法(FISH)によって測定する。
【００１２】
本発明の別の面では、脆弱部FRA12EはSMRT遺伝子内あるいはその近傍に位置しているので、転移の予後評価予測は、ELISA、ウエスタンブロット法、蛍光標識などのような免疫検出によってSMRT蛋白の発現を測定することによって実行することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は転移の予後診断の方法を提供する。本発明の方法は、脆弱部FRA12Eがヒト染色体12q24上のSMRT遺伝子座に位置しているという発見に基づいている。さらに、乳癌及び前立腺癌における我々の成果及び複数の他の癌におけるSMRTの発現低下の関与は、SMRT遺伝子座内に局在化しているこの特定の脆弱部が、SMRTの完全性へダメージを与える大きなリスクに直接関与し、最終的には腫瘍形質転換／転移に至る可能性があることを示している。
【００１４】
SMRTは、溶液中及びDNA応答エレメントへの結合の両方で核内レセプターと関連し、リガンドによって不安定化される蛋白として1995年に最初に開示された（非特許文献５）。いくつかのグループによる研究が（非特許文献６〜１０）、SMRT及び関連コリプレッサーN-CoR (核内レセプターコリプレッサー)が、sin3A/Bプロテイン及びヒストン脱アセチル化酵素(HDAC1/2)を含む（非特許文献１１〜１４）、核内レセプターへの転写阻害複合体を補強することを実証した。ヒストンを脱アセチル化する「サイレンシング・コンプレックス」の能力は、転写を阻害する凝縮クロマチン状態を生じさせる（非特許文献１５及び１６）。SMRT遺伝子の配列は配列番号１で表される。
【００１５】
本発明にかかる方法は、上記知見を利用して転移を予後判定するための方法を提供する。本明細書中で使用されるFRA12Eという語は、SMRT遺伝子座での12q24領域のゲノム配列における破損を意味する。したがって、当該方法は、SMRT遺伝子座のゲノム配列における破損を測定するステップを含む。
【００１６】
本発明は一面では、12q24座における染色体12上のFRA12Eサイトの存在を検出する方法であって、個体から採取したゲノムDNAサンプルを一以上のプローブと接触させるステップを含む方法を提供する。当該プローブは、ポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドであり、SMRT遺伝子座において12q24領域に相補的な配列を含む；そして前記プローブの特異的結合を測定する。
【００１７】
ハイブリダイゼーションまたはPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの配列は当該技術分野で既知のいくつかのファクターによって決まるであろう。第一に、当該オリゴヌクレオチドの配列は、FRA12Eサイトに結合する能力によって決まるであろう。この決定は、当業者の範囲内で周知である。
【００１８】
FRA12Eサイトと特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチド（「プローブ」と呼ぶ）は、単独で、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体(YACs)、バクテリア人工染色体(BACs)、または限定されない何らかの他の好適なベクター中で提供することができる。核酸ハイブリダイゼーションに基づく相補配列の検出のためのプローブの大きさは２０塩基でもよいことが当技術分野で周知である。従って、例えばプローブとしてBACクローンを使用する場合、全長BACクローンを使用してもよく、また脆弱部の検出を達成可能なその一部（２０塩基以上）を使用してもよい。BACクローンの一部で構成されるプローブの、FISH分析に使いやすい長さは、例えば約１キロベースである。
【００１９】
ある実施形態では、FRA12Eサイトの存在を検出するために、前記プローブが、サザン・ハイブリダイゼーション・アッセイで使用される。当該ハイブリダイゼーションは、テストサンプル上で実行でき、コントロールサンプルに行った標準方法によるサザン・ハイブリダイゼーションと比較できる。このような反応は、12q24領域にまたがるシングルプローブあるいは重複プローブのパネルを使用して実行できる。12q24領域外の染色体12領域とハイブリッド形成できるコントロール・プローブを使用してもよい。
【００２０】
別の実施形態として、インサイツハイブリッド形成法を使用してもよい。脆弱部は遺伝的形質であり、全ての細胞に存在するので、全ての組織を使用することができる。インサイツハイブリッド形成法のためには、一般に、標準技術を用いて細胞が生体サンプルから収集される。例えば細胞は、血液等の生体サンプルを遠心分離し、ペレット状の細胞を再懸濁することによって収集可能である。典型的には、細胞はリン酸緩衝食塩水(PBS)中で再懸濁される。あるいは、血液から得られた細胞を、リンパ球の増殖を刺激するために、フィトヘマグルチニン(PHA)とともに、数日間(例えば３日)、培養液中にセットすることもできる。収集に先立ち、細胞を、DNAポリメラーゼ阻害剤(例えば、アフィディコリン)を用いて処理し（例えば２４時間）、脆弱部の可視化を促進することができる。
【００２１】
収集後は、例えば、酸アルコール溶液、酸アセトン溶液、あるいはホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒド等のアルデヒド中で、細胞を固定できる。染色体標本を得るため、細胞は１〜３日間培養する。遮断剤（例えばコルセミド）を培養液に添加して、染色体が高度に凝縮される分裂中期において細胞をブロックし、可視化することができる。染色体標本をその後固定し（例えば、メタノール／酢酸[3:1vol/vol]の溶液で）、それからスライド上に広げる。バックグラウンドを潜在的に低くするため及び核へのプローブの浸透を促進するために、前処置（例えばRNA分解酵素及びペプシン）を標本に適用してもよい
【００２２】
好ましくは細胞が単層として存在するように細胞権濁液をスライドに塗布する。細胞密度は光学あるいは位相差顕微鏡で測定することができる。インサイツハイブリッド形成法に先立ち、染色体プローブ及び染色体DNAを変性させる。変性は、典型的には、高pH、高温（例えば、約70℃〜約95℃の温度）、ホルムアミド及びテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物等の有機溶媒、あるいはそれらの組合わせの存在下でインキュベートすることによって行われる。例えば、染色体DNAは、温度約70℃（例えば、約73℃）及び、70%ホルムアミド及び2XSSC（0.3M塩化ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウム）を含む変性緩衝液の組み合わせによって変性させることができる。変性コンディションは典型的には細胞形態が保存されるように構築される。染色体プローブは熱によって変性しうる。例えば、プローブを約73℃で約5分間加熱すればよい。
【００２３】
変性後、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションのコンディションは、塩濃度、温度及びインキュべーションの長さのみならず、濃度、塩基組成、複雑性及びプローブの長さによって変わる。プローブの濃度が高いほど、ハイブリッド形成の確率も高くなる。例えば、インサイツハイブリッド形成法は、通常、1-2XSSC、50%ホルムアミド及び 非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するためのブロッキングDNAを含むハイブリダイゼーションバッファー中で行われる。一般に、ハイブリダイゼーション・コンディションには、上述のように、約25℃〜約55℃の温度及び約0.5〜約96時間の長さのインキュべーションが含まれる。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、約32℃〜約40℃で約2〜約16時間行われる。
【００２４】
FRA12E領域外のDNAに対する染色体プローブの非特異的結合は、一連の洗浄によって減じることができる。各洗浄液における温度と塩の濃度は所望する厳密性によって決まる。例えば、厳密性の高いコンディションでは、洗浄は約65℃〜約80℃、0.2X〜約2XSSCを用いて、及び約0.1％〜約1%のノニデットP-40(NP40)等の非イオン性界面活性剤で実行することができる。厳密性は、洗浄液の温度の低下あるいは洗浄液中の塩濃度の増加によって低下しうる。
【００２５】
染色体プローブは、通常、感受性及び特異性が最大のものを選ぶ。プローブの長さは一般的に、約50〜約1×105ヌクレオチドの範囲である。染色体プローブは典型的には、低波長／高エネルギーの光を吸収した後に蛍光を発する有機分子であるフルオロフォアで直接標識される。フルオロフォアは第２の検出分子なしでプルーブを可視化することが可能である。ヌクレオチドにフルオロフォアを共有結合的に付着した後、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、PCR標識などの標準技術を用いて、当該ヌクレオチドを前記プローブの中に直接組み込むことができる。または、リンカーを用いて、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドをアミノ基転移することができる。フルオロフォアをその後、アミノ基転移したデオキシシチジンヌクレオチドに共有結合的に付着する。そのセットにおける各染色体プローブがはっきり可視化されるように、異なる色のフルオロフォアを選択する。好ましいフルオロフォアには、以下の物質が含まれる；7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸 (AMCA)，テキサス・レッド(登録商標) (Molecular Probes社、オレゴン州、ユージーン)，5-(及び-6)-カルボキシ-X-ローダミン, リサミン・ローダミン B，5-(及び-6)-カルボキシフルオレセイン，フルオレセイン-5-イソチオシアネート(FITC), 7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸，テトラメチルローダミン-5-(及び-6)-イソチオシアネート，5- (及び-6)-カルボキシテトラメチルローダミン，7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸，6-[フルオレセイン5-(及び-6)-カルボキサミド]ヘキサン酸，N-(4, 4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a, 4a ジアザ-3-インダセンプロピオン酸，エオシン-5-イソチオシアネート，エリトロシン-5-イソチオシアネート，及びカスケード(登録商標)，ブルー・アセチラジド(Molecular Probes社、オレゴン州、ユージーン)。プローブは、各フルオロフォアごとに、蛍光顕微鏡及び適切なフィルターを用いて見ることができる。または、フロー・サイトメトリー等の技術が、染色体プローブのハイブリダイゼーション・パターンを調べるために用いられる。
【００２６】
プローブを可視化するためには第二の検出分子あるいはさらなる処理がその後必要になるが、プローブをビオチンあるいはジオキシゲニンで間接的に標識することもでき、あるいは32P及び3H等の放射性同位元素で標識することもできる。例えばビオチンで間接的に標識されたプローブは、検出可能なマーカーと結合したアビジンによって検出することができる。例えば、アビジンを、アルカリホスファターゼや西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素マーカーと結合させることができる。酵素マーカーは、酵素に対する基質及び／または触媒を使用して標準的な比色反応で検出することができる。アルカリホスファターゼの触媒として、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸塩及びニトロブルーテトラゾリウムが挙げられる。ジアミノ安息香酸エステルは西洋わさびペルオキシダーゼの触媒として使用できる。
【００２７】
FRA12Eの存在を検出するために有用なテストプローブの例として、SMRT遺伝子座の一部あるいは全部を挙げることができる。これらの配列はBACクローン(例えばRPCI BAC ライブラリー由来のクローンなど)の一部として存在しうる。これらのクローンの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のジェンバンクを通じて容易に利用できる。例として、ゲノムBACコンストラクトであるBAC-RP11-339B19、BAC-RP11-665C13、BAC-RP11-677L6、BAC-RP11-408I18及びBAC-RP11-30G17(RPCI BAC ライブラリー)に対応する配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのプローブ(またはプローブの一部あるいは全プローブに対応する配列)のいずれか一つを使用することもできるが、SMRT遺伝子座の全配列をカバーするようなプローブを二以上使用することが好ましい。例えば、BAC-RP11-339B19、BAC-RP11-665C13及びBAC-RP11-677L6などのプローブパネル（一群のプローブ）を使用することによって、全SMRT遺伝子座の配列中の破損を評価することができる。それゆえ、これらの核酸配列は、転移性疾患／形質転換への癌の進行のマーカとして、及び転移性疾患に発展する癌患者の前兆因子として、FRA12E脆弱部の存在を検出するために使用することができる。BAC RP11-469A24(RPCI BAC ライブラリー)等の、12q24領域の外側の染色体12領域に対応する核酸配列を含むネガティブコントロール・プローブは、結果の正確性を補強するために使用できる。
【００２８】
この予後検査は、悪性腫瘍と診断された個体について、転移の可能性を予測するための選別手段として使用することができる。この検査はまた、母集団中で、この脆弱部のキャリアである個体の識別子として使用することもできる。このFISH検査自体は、簡単な検査であり、診察に利用される従来の細胞遺伝学研究所で行うことができる。
【００２９】
また別の面では、本発明による予後検査を行うためのキットが提供される。当該キットは、テスト・プローブ及び任意でネガティブコントロール・プローブを含む。例えば、キットは、SMRT遺伝子座において染色体12の12q24領域にハイブリッド形成するBACクローンに対応する配列を有するプローブを含む。ある実施形態において、テスト・プローブは、BAC-RP11-339Bl9、BAC-RP11-665C13、及びBAC-RP11-677L6の配列に対応するポリヌクレオチドである。テスト・プローブは蛍光標識を有する(例えば、フルオレセインあるいはローダミンなど)。ネガティブコントロール・プローブの蛍光標識は、テスト・プローブの標識とは異なる。キットは任意で、脆弱部の可視化を促進するDNAポリメラーゼ阻害剤（アフィディコリン等）を、溶液の形態においてあるいは粉末として含んでいてもよい。さらにまた、脆弱部がポジティブかネガティブかをテストされ同定された細胞株が、キットに含まれていてもよい。
【００３０】
本発明は、下記の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は説明のために記載され、如何なる方法においても限定を意図しない。
【実施例１】
【００３１】
本実施例は、SMRT遺伝子が転移性細胞において減少していることを実証する。このことを説明するために、SMRT遺伝子の発現をいくつかの転移性細胞株において測定した。総タンパクを種々の細胞株から抽出し、ポリクロナール抗-SMRT抗体を用いたウエスタンブロット法に適用した。図１に示すように、一連の転移性細胞株のウエスタンブロット分析は、試験した細胞株の殆どにおいて、SMRTの著しい発現低下を示した。
【実施例２】
【００３２】
本実施例において、SMRT遺伝子の発現低下を、乳癌(BC)においてテストした。いくつかの乳癌細胞株におけるSMRT遺伝子の発現は、実施例１の記載と同じ方法で測定した。その結果、転移性疾患を有するBC患者由来のサンプルのみならず、BC細胞株もSMRT発現を変化させることが実証された（図１Ｂ）。さらに、９組の乳癌サンプル（同一患者に由来する原発性及び転移性腫瘍）のうち７つが、原発腫瘍で陽性染色を、転移性サンプルで陰性を示した。一例を図２に示す。同様の結果は前立腺腫瘍でも得られ、８つの腫瘍のうち６つが、転移性サンプルにおいて陰性染色を示した。
【実施例３】
【００３３】
本実施例では、胸癌、前立腺癌、直腸結腸癌、肺癌および卵巣癌サンプルの組織マイクロアレイから、SMRTに対する免疫染色データを得た。各アレイは、150〜200サンプルで構成した。結果を表１に示す。記載された数字は、SMRT発現が欠失している腫瘍のパーセンテージである。
【００３４】
【表１】
2007523645.tif 000002
【００３５】
これらのデータは、原発腫瘍ではSMRT陰性の発生率がより小さいという、SMRT発現の欠失と疾患の段階との関係を示す。
【実施例４】
【００３６】
FRA12E領域は、SMRTのサイトに対応している(12q24.2)。我々は、転移性／形質転換腫瘍におけるSMRTの不活性化は、この脆弱部の存在に起因する12q24での染色体破損が原因であるという仮説をテストした。さらに、この脆弱部の存在が、SMRT内の12q24における切断点の再発を説明するなら、それらの存在は、NHLの形質転換あるいは固形腫瘍の転移に関する個体の素因状態を表すかもしれない。
【００３７】
FRA12E脆弱部がSMRT遺伝子内に局在化するかどうか評価するために、研究を行った。正常リンパ球をアフィディコリン（脆弱部の誘発物質）の存在下で培養し、その後に分裂中期の染色体を以下に示すように調製した。その後、これらの標本に、SMRT-特異的RPCI BAC クローンのセットを用いた蛍光インサイツハイブリッド形成法を適用した（図３Ａ）。
【００３８】
SMRT遺伝子座を含んでいる３つのRPCIll BACクローンを実験で使用した。それらは図３Ａにおいて緑色のバーとして表される。これらのクローンは、ヒトゲノムプロジェクトを通じて配列決定した。これらの配列に対するジェンバンク・リファレンスは以下の通りである：cen: AC068837(BAC-RP11-339B19)，AC027706(BAC-RP11-665C13)，AC025685(BAC-RP11-677L6) tel.(NCBI website-http://www.ncbi/nlm.nih.gov/)。他のBACクローンはこれらの配列に対応し得る、例えば、AC073916(BAC-RP11-408I18)及びAC069261(BAC-RP11-30G17)である。SMRT遺伝子座の一部あるいは全てをカバーするポリヌクレオチド配列または一セットのポリヌクレオチドあるいはクローンが使用できる。ある実施形態では、全SMRT遺伝子座をカバーする配列が使用される。この遺伝子座の配列はJiang等により記述されている（非特許文献２１）。この群のBACに対し、例えばBACクローンテロメア等の、当該配列が欠けているクローンは、コントロール・プローブとして使用することができる。コントロール・プローブの例として、ジェンバンク・リファレンスAC048340(BAC-RP11-469A24)がある。 
【００３９】
BAC DNA 標識化は以下のようにして行われる。BAC DNAsをDNA抽出キット(Qiagen)を使用して抽出した。DNAをその後、市販のキット(Vysis, Downers Grove, IL)を利用して、蛍光色素-結合ヌクレオチドを用いたニックトランスレーション標識化に適用した。SMRT-特異的クローンは緑色で標識化し、コントロールは赤色で標識化した。 
【００４０】
染色体標本に対し、以下の手順を使用した。試験管一本分の抹消血を癌患者及びコントロールから採取した。血液は、135μg/mlのPHAと共に、10%のウシ胎児血清及び抗生物質を追加したRPMI培地10ml中で３日間培養のためにセットした。染色体を収集する24時間前に、脆弱部を誘導するために、アフィディコリン(0.2μg/ml)を培養液に添加した。その後、染色体収集を、染色体標本のための古典的な細胞遺伝学的技術に従って実行した。次に、標識BACクローンによるハイブリダイゼーションのために、顕微鏡用スライドを準備した。
【００４１】
蛍光インサイツハイブリッド形成法は以下のようにして行った。確立した手順に従って、ハイブリダイゼーションを実行した(非特許文献２１)。各標識BAC DNAを100ng含む混合物を、変性後の染色体標本に塗布した。ハイブリダイゼーションを一晩実行し、翌朝スライドを洗浄した。シグナルを評価するために、適切なフィルターを備えたUV顕微鏡下で観察する前に、スライドをアンチフェード溶液で標本化した。
【００４２】
図３Ｂに示すように、 その領域におけるあらゆる破損を検出するためには、全SMRT遺伝子座を包含する重複クローンを使用することが必要である。実際に、特定の染色体12それぞれにおける潜在的破損は、全遺伝子座に渡って点在し得、それゆえ、脆弱部の正確な検出には、全遺伝子座をカバーするプローブのセットが必要とされる。この方法を用いることにより、我々はFRA12E脆弱部がSMRT遺伝子内に局在化していることを実証することができた（図４）。この図は２つのシグナルを示している。右上角のシグナル（短い矢印で識別する）は、コントロール・プローブの赤色のシグナルとSMRT-特有の緑色のシグナルが混ざった黄色の大きなシグナルによって特徴付けられる。さらに、分裂した緑色のシグナルが、この第一の黄色のシグナルのすぐ右側に観察される。分裂した緑色のシグナルは脆弱部の存在を表す。左下角のFISHシグナルの存在は、ほぼ黄色のシグナルを示し、これはコントロール・プローブ由来の赤色のシグナルとSMRT-特異的プローブの緑色のシグナルの重複／近位に起因するものである。脆弱部の非存在を示すこの症例では、分裂した緑色のシグナルは観察されない。
【実施例５】
【００４３】
形質転換/転移で観察されるSMRT変化が、その配列における当該脆弱部(FRA12E)の存在の結果であり得るかどうか調べるために、我々は乳癌患者で研究を行い、BCと転移性疾患を有する患者、BCを有し転移性疾患を有しない患者、及び正常人の血液細胞における脆弱部の発生率を比較した。我々は、乳癌有／転移性疾患有、乳癌有／転移性疾患無、及び乳癌無、の３群の患者を採用した。末梢血を採取し、上述したように、染色体標本とした。この研究で得られた結果（図５）は、「早期」転移性疾患を呈するBC患者の100%が脆弱部のキャリアであることを示す。図に示すように、転移性患者２人は非-キャリアである。それらは、最初の診断から９年後に発現した転移性疾患を有する１人の患者、及び未治療癌の一症例に対応し、ノーマル・コントロール中の７％に匹敵する。BC有／転移性疾患無の患者においては、２つの群が示され、50%が非キャリアであり、50%がキャリアである。非-転移性群の患者は、最初の診断の１〜２年内であった。これらの症例は、FRA12Eのキャリアがさらに転移性腫瘍に発展するかどうかをみるために臨床的に追跡できる。
【００４４】
統計分析は、コントロール群と転移性群の平均値間の差異が有意であることを示した(p=0.000441×10-3)。同様に、非転移性群におけるキャリア対非キャリアの平均値間の差異も有意である(p=0.00168×10-6)。一方、この分析は、非転移性群由来のキャリア群と、転移性群の平均との差異のみならず、非転移性群由来の非キャリアとコントロール群の平均との差異が有意でないことを示す(それぞれp=0.06及び0.748)。 
【００４５】
図５に示すように、我々はさらに、転移性前立腺癌（２例）及び転移性黒色腫（２例）から、４例をテストした。我々の分析は、これらの患者もまたFRA12E脆弱部のキャリアであることを示した。これらのデータは、本発明が転移性疾患の予後診断の予測のために使用できることを実証する。
【００４６】
この実施形態の別の実例において、我々は図６に示すように、前立腺癌患者とコントロールとで同様の研究を行った。各群は14人の患者からなる。我々は同様に、転移性疾患に発展した患者の全てが脆弱部のキャリアである(P<0.0001)のに対して、14人のうち１人のコントロールが脆弱部のキャリアであり、転移性腫瘍に発展していない前立腺癌患者の１人もキャリアではないことを見出した。
【００４７】
本発明を上記実施例を用いて説明したが、この発明に対する通常の変更は当業者に明らかであり、本発明の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、抗-SMRT抗体を用いた異なる悪性細胞株のウエスタンブロット分析を示す。１Ａ：CTV1=AML細胞株(control)、他の系統は全て形質転換NHLsである。１Ｂ：MCF7は転移性乳癌細胞株、MCF10Aはその非悪性対応物、Col2は転移性直腸結腸癌LnCAPは非-転移性前立腺、PC3は転移性前立腺、Heclaは転移性子宮体癌、A549は転移性非小細胞肺癌、PIG1は不死化ケラチン生成細胞、F002は表皮内黒色腫、M1123、M14及びG24は転移性黒色腫細胞株。
【図２】同じ患者から採取した乳癌の一組のサンプル２Ａ）原発腫瘍及び２Ｂ）転移腫瘍における抗-SMRT抗体を用いた免疫染色。９組のサンプルを研究に用いた。この図に示すように、９のうち７つで、発現のディファレンシャル・パターンが同じであった。すなわち、原発腫瘍で陽性であり、転移腫瘍でネガティブであった。残りの２つのケースは、原発及び転移腫瘍の両方で陽性の染色を示した。２つの群の患者（転移腫瘍でのSMRTが＋または−）間の差は、原発の診断から転移性疾患の診断までの平均期間が、２年（＋/−ケース）から９年（＋/＋ケース）に至ることである。図２Ｃ及び２Ｄは、陽性染色を示す良性の前立腺腫瘍（２Ｃ）及び染色を示さない転移性腫瘍（２Ｄ）に対する抗-SMRT抗体を用いた免疫染色を示す。
【図３】３Ａ及び３Ｂは、SMRT遺伝子内のFRA12E脆弱部を検出及びマップするために使用されたRPCI11 BACクローンのマッピングの略図である。３Ａ：BACクローン 339，665 及び667はSMRT遺伝子座を含んでいる；BAC 469はコントロール・プローブとして使用されている。３Ｂ：SMRT遺伝子座の破損が拡散している可能性を示す略図であって、可能性のある破損全てを検出するために一セットのプローブを使用する必要があることを図示する。
【図４】SMRT遺伝子内のFRA12E脆弱部のマッピング。染色体はアフィディコリンで脆弱部を誘発した後で収集され、SMRT-特異的RPCIll BACクローン(図３)(緑色）及びコントロールBACクローン(赤色)とハイブリッド形成させた。一つの染色体12は、主要シグナルが黄色である正常なハイブリダイゼーションパターンを示す（緑色と赤色のシグナルの重複／並列に起因する）。他のシグナル(短い矢印で示す)は、メインの黄色のシグナルに隣接する分裂した緑色のシグナルを示し、BACクローンが、脆弱部の活性化に起因するDNA二本鎖切断にまたがることを示す。破損の両サイト上でハイブリッド形成したSMRT特異的プローブは、分裂したFISHシグナルを生じている。ドットの色は図中に示す。
【図５】ノーマル・コントロール及び、転移性疾患を有するあるいは有さない乳癌患者から採取した末梢血サンプル中のFRA12E脆弱部の検出の略図である。このグラフは、ある患者において、分裂したFISHシグナル（FRA12E破損を示す）を伴う分裂中期の染色体のパーセンテージを表す。各ドットは患者サンプルを、点線は、異なる群を最も適切に区別でき、サンプルの状態(キャリアあるいは非キャリア)を決定するカットオフ値を示す。２つの最後のカテゴリーは、転移性前立腺癌及び黒色腫を有することが検査された、更なる患者サンプルを示す。
【図６】ノーマル・コントロール及び、転移性疾患を伴うあるいは伴わない前立腺癌に罹患した患者から採取した末梢血サンプル中のFRA12E脆弱部の検出の略図である。このグラフは、ある患者において、分裂したFISHシグナル(FRA12E破損を示唆する)を伴う分裂中期の染色体のパーセンテージを表す。各ドットは患者サンプルを、点線は、異なる群を最も適切に区別でき、サンプルの状態(キャリアあるいは非キャリア)を決定するカットオフ値を示す。
【図１Ａ】
2007523645.tif 000003
【図１Ｂ】
2007523645.tif 000004
【図２】
2007523645.tif 000005
【図３Ａ】
2007523645.tif 000006
【図３Ｂ】
2007523645.tif 000007
【図４】
2007523645.tif 000008
【図５】
2007523645.tif 000009
【図６】
2007523645.tif 000010
【配列表】
2007523645000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月14日(2006.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007523645000001.app
【国際調査報告】
2007523645.tif 000014
2007523645.tif 000015