(57)【要約】本発明は、生物学的因子の欠損から生じる疾患の治療において、哺乳動物被験者中に免疫特権部位を生成し、それによってこうした生物学的因子を産生する細胞の移植を容易にするための、セルトリ細胞および筋様細胞の使用に関する。セルトリ細胞および筋様細胞を含有する薬剤組成物とともに、これらの細胞の使用に関する療法を本発明が提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルトリ細胞、筋様細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含む薬剤組成物。
【請求項２】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約０．５：９９．５である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項３】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約５：９５である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項４】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約２５：７５である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項５】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項６】
前記セルトリ細胞が細胞株から得られる、請求項１の薬剤組成物。
【請求項７】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が哺乳動物の精巣から得られる、請求項１の薬剤組成物。
【請求項８】
前記哺乳動物がブタである、請求項７の薬剤組成物。
【請求項９】
前記ブタが６０日齢以下である、請求項８の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記ブタが５日齢以下である、請求項８の薬剤組成物。
【請求項１１】
生物学的因子を産生する細胞をさらに含む、請求項１〜１０の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記生物学的因子がホルモンである、請求項１１の薬剤組成物。
【請求項１３】
生物学的因子を産生する前記細胞が膵島細胞である、請求項１１の薬剤組成物。
【請求項１４】
８００膵島あたり、２ｘ１０６以下のセルトリ細胞が用いられる、請求項１３の薬剤組成物。
【請求項１５】
セルトリ細胞および筋様細胞を被包する装置中に提供され、前記装置が哺乳動物被験者に埋め込むのに適している、請求項１の薬剤組成物。
【請求項１６】
哺乳動物被験者において、免疫特権部位を生成する方法であって、該被験者にセルトリ細胞および筋様細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約０．５：９９．５である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約５：９５である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約２５：７５である、請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である、請求項１６の方法。
【請求項２１】
前記セルトリ細胞が細胞株から得られる、請求項１６の方法。
【請求項２２】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が哺乳動物の精巣から得られる、請求項１６の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物がブタである、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記ブタが６０日齢以下である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記ブタが５日齢以下である、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、被験者中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与される、請求項１６の方法。
【請求項２７】
前記部位が、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、１０５〜１０８細胞の範囲の総量で投与される、請求項１６の方法。
【請求項２９】
前記総量が約１０７〜１０８細胞である、請求項１６の方法。
【請求項３０】
哺乳動物被験者がヒトである、請求項１６の方法。
【請求項３１】
投与が細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植による、請求項１６の方法。
【請求項３２】
前記移植が同種移植または異種移植である、請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、投与前に、セルトリ−筋様細胞凝集体が形成される条件下で共培養される、請求項３１の方法。
【請求項３４】
哺乳動物被験者において、生物学的因子の欠損から生じる疾患を治療する方法であって、セルトリ細胞、筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する療法的に有効な量の細胞を前記被験者に投与することを含み、前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、免疫特権部位を生成するのに有効な量で投与される、前記方法。
【請求項３５】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約０．５：９９．５である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約５：９５である、請求項３４の方法。
【請求項３７】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約２５：７５である、請求項３４の方法。
【請求項３８】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である、請求項３４の方法。
【請求項３９】
前記セルトリ細胞が細胞株から得られる、請求項３４の方法。
【請求項４０】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が哺乳動物の精巣から得られる、請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物がブタである、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記ブタが６０日齢以下である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記ブタが５日齢以下である、請求項４１の方法。
【請求項４４】
前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する前記細胞が、哺乳動物中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与される、請求項３４の方法。
【請求項４５】
前記部位が、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する前記細胞が、１０５〜１０８細胞の範囲の総量で投与される、請求項３４の方法。
【請求項４７】
前記総量が約１０７〜１０８細胞である、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物被験者がヒトである、請求項３４の方法。
【請求項４９】
投与が細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植による、請求項３４の方法。
【請求項５０】
前記移植が同種移植または異種移植である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記生物学的因子がホルモンである、請求項３４の方法。
【請求項５２】
前記生物学的因子がインスリンであり、そして前記疾患が糖尿病である、請求項３４の方法。
【請求項５３】
前記生物学的因子を産生する前記細胞が、膵島細胞である、請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記膵島細胞が、投与前に、セルトリ−筋様−膵島細胞凝集体が形成されるように共培養される、請求項５３の方法。
【請求項５５】
８００膵島あたり、２ｘ１０６以下のセルトリ細胞が用いられる、請求項５３の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的因子の欠損から生じる疾患の治療において、哺乳動物被験者中に免疫特権部位を生成し、それによってこうした生物学的因子を産生する細胞の移植を容易にするための、セルトリ細胞および筋様細胞の使用に関する。セルトリ細胞および筋様細胞を含有する薬剤組成物とともに、これらの細胞の使用に関する療法を本発明が提供する。
【０００２】
発明の背景
精巣、脳、および前眼房は、免疫特権部位と見なされ、そしてこれらが細胞性移植片を保護する能力に関して研究されてきている［１〜３］。精巣内に移植された同種組織および調和性（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）異種組織は、長期間生存する［４〜１０］。
【０００３】
さらに、副甲状腺切除ラットにおいて、精巣中に副甲状腺を同種移植すると、正常カルシウム値に回復し［８］、そして糖尿病げっ歯類において、腹腔内に置かれた精巣に膵島を移植すると、高血糖が是正される［９、１０］。精巣の他の主要構成要素であるライディッヒ細胞および生殖細胞を選択的に破壊した後も、移植片がなお保護されるため、精巣における免疫寛容は、少なくとも部分的にセルトリ細胞による［１１、１２］。さらに、げっ歯類セルトリ細胞は、同種移植片として生存可能であり［１３、１４］、そして同種膵島または異種副腎クロム親和性細胞は、セルトリ細胞と同時移植されると、免疫が仲介する拒絶から保護される［１４〜１６］。セルトリ細胞は、哺乳動物精巣の主要構成要素を構成し、そして秩序だった発生および精子の保護に必要な多くの因子を提供するため、「養育（ｎｕｒｓｅ）」細胞とみなされる［１７］。生殖細胞は、成熟するにつれて、免疫系が異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）と認識する表面抗原を発展させるため、精巣が発生中の胚細胞を保護する機構を発展させることが必要になる［１８、１９］。セルトリ細胞は、血液−精巣関門を生成することによって［２０、２１］、そして局所免疫寛容につながりうる因子を分泌することによって［１３、２２〜２６］、生殖細胞を保護すると考えられている。セルトリ細胞は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）［１３］、トランスフォーミング増殖因子ｂ（ＴＧＦβ）［２７］、およびクラステリン［２８］を産生することが知られており、これらはそれぞれ、免疫保護特性［１３、２９］、抗炎症特性［３０、３１］、および寛容原性特性［２８、３２］を有すると考えられている。これらのタンパク質がセルトリ細胞の免疫保護能の原因となりうると仮定される。セルトリ細胞移植の確立されたモデルにおいて、これらの因子をさらに研究すると、局所免疫寛容誘発環境を生成するのに必要な因子の手がかりが提供されうる。
【０００４】
最近、セルトリ細胞をあらかじめ移植することによって、免疫特権部位を生成可能であり、こうした部位は、続いて、同種膵島を拒絶から保護しうることが示されてきている［５６］。非免疫抑制ビーグル犬において、再配置した腹腔内精巣中に入れたブタ膵島が長期間生存することが報告された［５７］。大網嚢に移植した同系ラット膵島移植片が生存することもまた報告された［５８］。膵島発生および異種移植を研究するモデルが記載されてきている［５９］。最近の報告から、免疫特権部位であるラット脳において、１２週齢のＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタ由来のセルトリ細胞の生存が示されている［３３］。しかし、非免疫特権部位における、不調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）異種ブタ・セルトリ細胞の生存は立証されてきていない。
【０００５】
発明の概要
本発明の発明者らは、非免疫抑制Ｌｅｗｉｓラットにおいて、非免疫特権部位である腎被膜下に移植した際に、ブタ新生仔セルトリ細胞（ＮＰＳＣ）が長期間生存することを立証した。驚くべきことに、本発明の発明者らは、セルトリ細胞の長期間の生存が、筋様細胞の存在に依存することを見出した。
【０００６】
したがって、本発明の１つの態様は、セルトリ細胞、筋様細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含有する薬剤組成物を提供する。
好ましい態様において、薬剤組成物中の筋様細胞対セルトリ細胞の比率は、少なくとも約０．５：９９．５である。好ましくは、比率は０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である。
【０００７】
セルトリ細胞および筋様細胞を、各々、哺乳動物、好ましくはブタ、そしてより好ましくは６０日齢以下のブタ新生仔、そしてさらにより好ましくは５日齢以下のブタ新生仔の精巣から単離することも可能である。あるいは、セルトリ細胞を、細胞株から得ることも可能であり、細胞株は、ＴＭ４などの樹立細胞株、またはヒト組織に由来することも可能な幹細胞株いずれであることも可能である。
【０００８】
本発明の薬剤組成物はまた、生物学的因子を産生する細胞も含むことも可能である。好ましい態様において、生物学的因子を産生する細胞は膵島細胞である。薬剤組成物中の膵島細胞に対するセルトリ細胞の相対量に関しては、８００膵島あたり、２ｘ１０６より多くないセルトリ細胞、すなわち２ｘ１０６以下のセルトリ細胞が用いられることが好ましい。
【０００９】
別の好ましい態様において、薬剤組成物は、哺乳動物被験者に埋め込むのに適した装置中に提供される。
別の態様において、本発明は、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者において、免疫特権部位を生成する方法であって、該被験者にセルトリ細胞および筋様細胞を投与することによる、前記方法を提供する。
【００１０】
好ましい態様において、被験者に投与される筋様細胞対セルトリ細胞の比率は、少なくとも約０．５：９９．５である。好ましくは、比率は０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である。
【００１１】
セルトリ細胞および筋様細胞を、各々、哺乳動物、好ましくはブタ、そしてより好ましくは６０日齢以下のブタ新生仔、そしてさらにより好ましくは５日齢以下のブタ新生仔の精巣から単離することも可能である。あるいは、セルトリ細胞を、ＴＭ４などの樹立細胞株、またはヒト組織に由来することも可能な幹細胞株いずれかの、セルトリ細胞株から得ることも可能である。細胞株から調製されたこうしたセルトリ細胞を、被験者に投与するため、筋様細胞と混合することも可能である。
【００１２】
好ましくは、セルトリ細胞および筋様細胞は、投与前に、セルトリ−筋様細胞凝集体が形成される条件下で、例えば約２４〜４８時間、共培養される。
セルトリ細胞および筋様細胞は、被験者中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与されることも可能である。好ましくは、部位は、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される。
【００１３】
本発明にしたがって、投与されるセルトリ細胞および筋様細胞の総量は、１０５〜１０８細胞の範囲内である。一般的に言って、ヒト被験者において、免疫特権部位を生成するのに必要な細胞量は、例えば、マウスで必要な量より多い。ヒト被験者に投与するには、投与される細胞の総量は、好ましくは約１０７〜１０８細胞である。
【００１４】
投与は、細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植によって達成可能である。移植は同種移植または異種移植いずれであることも可能である。
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物被験者、好ましくはヒトにおいて、生物学的因子の欠損から生じる疾患を治療する方法であって、セルトリ細胞、筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する療法的に有効な量の細胞を該被験者に投与することによる、前記方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、被験者に投与される筋様細胞対セルトリ細胞の比率は、少なくとも約０．５：９９．５であり、そして０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である。
被験者に投与されるセルトリ細胞および筋様細胞は、好ましくは、哺乳動物、好ましくはブタ、そしてより好ましくは６０日齢以下のブタ新生仔、そしてさらにより好ましくは５日齢以下のブタ新生仔の精巣から単離される。あるいは、セルトリ細胞を、ＴＭ４などの樹立細胞株、またはヒト組織に由来することも可能な幹細胞株いずれかの、セルトリ細胞株から得ることも可能である。細胞株から調製されたこうしたセルトリ細胞を、筋様細胞、および望ましい生物学的因子を産生する細胞と混合することも可能である。
【００１６】
好ましい態様において、生物学的因子はホルモンである。
別の好ましい態様において、疾患は糖尿病であり、そして生物学的因子を産生する細胞は、膵島細胞である。セルトリ細胞対膵島細胞の比率が、８００膵島あたり、２ｘ１０６以下のセルトリ細胞が用いられるようなものであることが好ましい。細胞を被験者に投与する前に、セルトリ細胞、筋様細胞、および膵島細胞が、投与用のセルトリ−筋様−膵島細胞凝集体が形成される条件下で、例えば約２４〜４８時間、共培養されることもまた、好ましい。
【００１７】
細胞は、被験者中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与されることも可能である。好ましくは、部位は、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される。
【００１８】
被験者に投与されるセルトリ細胞、筋様細胞、および生物学的因子を産生する細胞の総量は、１０５〜１０８細胞の範囲内である。一般的に言って、ヒト被験者を治療するのに必要な細胞量は、例えば、マウスを治療するのに必要な量より多い。ヒト被験者に投与するには、投与される細胞の総量は、好ましくは約１０７〜１０８細胞である。
【００１９】
投与は、細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植によって達成可能である。移植は同種移植または異種移植いずれであることも可能である。
【００２０】
発明の詳細な説明
（実施例１）
材料および方法
動物
オスのＬａｎｄｒａｃｅ−Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅブタ新生仔（１〜３日齢）をセルトリ細胞ドナーとして用いた。８〜１０週齢のオスＬｅｗｉｓラット（ＲＴ１ｌ／ｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ、カナダ・ケベック州セントコンスタント）をレシピエントとして用いた。
【００２１】
セルトリ細胞単離
ラット・セルトリ細胞に関して以前記載されたもの［１４］と類似の技術を用いて、ＮＰＳＣを単離した。簡潔には、１〜３日齢のオスのＬａｎｄｒａｃｅ−Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅブタ新生仔をハロタンで麻酔し、精巣を外科的に取り除き、そして０．２５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）を補った冷（４℃）ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を含有する５０ｍｌコニカル試験管に入れた。精巣をはさみで１ｍｍ断片に切り、コラゲナーゼ（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  タイプＶ、米国ミズーリ州セントルイス）で、３７℃で１０分間消化し、そして次いでＨＢＳＳで３回洗浄した。１ｍＭ  ＥＧＴＡを補ったカルシウム不含培地中に組織を再懸濁し、そしてトリプシン（２５μｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カナダ・ラバル）およびＤＮアーゼ（４μｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で、３７℃で１０分間、さらに消化した。消化物を５００μｍのナイロンメッシュに通過させ、ＨＢＳＳで洗浄し、そして６０〜８０ｘ１０６細胞、並びに１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース、２ｍｍｏｌ／ｌ  ｌ−グルタミン、５０μｍｏｌ／ｌイソブチルメチルキサンチン、０．５％ウシ血清アルブミン、１０ｍｍｏｌ／ｌニコチンアミド、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％熱不活性化ブタ新生仔血清を補ったＨａｍのＦ１０培地３５ｍｌを含有する未処理ペトリ皿（１５ｃｍ直径）中で培養した。細胞を３７℃で４８時間インキュベーションして、細胞凝集体（１００〜３００μｍ直径）の形成を可能にした。
【００２２】
セルトリ細胞移植片の性質決定および移植
培養した後、そして移植直前に、ＮＰＳＣの純度、生存度および量を、それぞれ、ビメンチン陽性セルトリ細胞と平滑筋アルファアクチン陽性管周囲筋様細胞の比率、トリパンブルー色素排除およびＤＮＡ含量に基づいて決定した。三次元構造中で細胞を正確に計数するのは困難であるため、膵島解離に関して以前記載された技術［３４］を用いて、凝集体を単細胞に解離させた後、それぞれのアリコット中のビメンチン陽性セルトリ細胞および平滑筋アルファアクチン陽性管周囲筋様細胞の数を評価した。分散した細胞懸濁物をＨｉｓｔｏｂｏｎｄ接着性顕微鏡スライド（Ｆ．Ｇ．Ｒ．  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  Ｉｎｃ．、カナダ・ブリティッシュコロンビア州サリー）に付着させ、ブアン溶液で３０分間固定し、７０％エタノールで洗浄し、そしてセルトリ細胞マーカーであるビメンチン［１４］または筋様細胞マーカーである平滑筋アルファアクチン［３５］を用いて免疫染色した。各調製物において、最小５００の単細胞を計数した。
【００２３】
移植時点で、トリパンブルー色素排除アッセイを用いて、細胞生存度を測定した。このアッセイは、生存細胞がトリパンブルー色素を取り込まず、一方、非生存細胞は該色素を取り込むという原理に基づく。細胞凝集体を以前記載された［３４］ように解離させ、そして０．１％トリパンブルー色素（Ｓｉｇｍａ）とともに５分間インキュベーションした。染色された細胞および染色されない細胞を計数し、そして生存細胞の割合を計算した。
【００２４】
培養後の細胞回収率を評価し、そして各実験で移植されるＮＰＳＣの量を標準化するため、Ｈｏｅｆｅｒ  ＤｙＮａ  Ｑｕａｎｔ  ２００蛍光分析アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）を用いて、総細胞ＤＮＡ含量に関して、細胞凝集体の３つの代表的なアリコットを測定した。アリコットをクエン酸緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、３ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４］で洗浄し、ＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に懸濁し、そして勧誘した（ｓｏｌｉｃｉｔｅｄ）。２ｍｌのアッセイ溶液（１ｘＴＮＥ中の０．１μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）で１０μｌのアリコットを希釈し、そして蛍光（３６５ｎｍ励起／４６０ｎｍ発光）を測定することによって、アリコットを３つ組でアッセイした。試料を平行に実験し、そしてウシ胸腺ＤＮＡを用いて生成した、６点（０〜５００ｎｇ／ｍｌ）のＤＮＡ標準曲線に比例して希釈した。各調製において、ブタ・セルトリ細胞のＤＮＡ含量（６．６ｐｇ  ＤＮＡ／細胞）を用いて、平均ＤＮＡ回収率を考慮する際、続いて、細胞総数を計算した。移植のため、１１ｘ１０６細胞からなるアリコットをポリプロピレン微量遠心管中に入れ、ポリエチレン管（ＰＥ−５０）中に吸引し、遠心分離によってペレットにし、そしてハロタンで麻酔したＬｅｗｉｓラットの左腎被膜下に穏やかに入れた［１４］。
【００２５】
移植後のＮＰＳＣ生存の評価
組織学
移植４日後（ｎ＝３）、２０日後（ｎ＝５）、３０日後（ｎ＝８）、４０日後（ｎ＝５）、６０日後（ｎ＝１０）および９０日後（ｎ＝３）に、形態学的解析のため、腎摘出を行った。移植片を所持する腎臓をＺ固定液に浸し、そしてパラフィンに包埋した。脱パラフィンおよび再水和後、最大出力の電子レンジにおいて、０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間加熱することによる抗原回復を用いて、組織切片を免疫染色した［１４、３６、３７］。連続切片を１０％過酸化水素とインキュベーションして、内因性ペルオキシダーゼの反応を停止し、非特異的血清でブロッキングし、そしてマウス・モノクローナル抗ビメンチン（ＰＣＮＡ；１：１００；Ｄａｋｏ、米国カリフォルニア州カーピンテリア）またはマウス・モノクローナル抗増殖細胞核抗原（１：５０；Ｄａｋｏ）いずれかと３０分間インキュベーションした。次いで、切片をビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）と２０分間インキュベーションし、その後、ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン、基質色素原（アミノエチルカルバゾール）とインキュベーションし、そして次いで、ヘマトキシリン（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）で染色した。陽性対照には、ブタ新生仔精巣の切片が含まれ、一方、陰性対照には、一次抗体の省略が含まれた。陽性対照はセルトリ細胞内で、ビメンチンおよびＰＣＮＡ免疫反応を示し、そして陰性対照は染色を示さなかった。
【００２６】
ＤＮＡ抽出、ＰＣＲおよび配列解析
交差汚染を防止するため、無菌条件下で、移植４日後、２０日後、３０日後、４０日後、６０日後、および９０日後に、ＤＮＡ抽出のためにも腎摘出を行った（各時点でｎ≧３）。移植片を所持する腎臓および移植片を所持しない腎臓由来の組織を、直ちに凍結し、そして後でＤＮＡを単離するため、−８０℃で保存した。氷上で融解した後、３５０μｌの溶解緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］中で試料を再懸濁し、そして０．２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を用いて５５℃で一晩処理した。プロテイナーゼＫを不活性化し、クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した後、ＤＮＡペレットを７０％エタノール中で洗浄し、風乾し、そして１００μｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水（Ｓｉｇｍａ）に溶解した。増幅前に分光光度解析によって、ＤＮＡ濃度および品質を決定した。
【００２７】
ブタＤＮＡの存在を確認するため、ＣＯＩＩ［３８］をコードするブタ・ミトコンドリア遺伝子に特異的なプライマーおよびハウスキーピング遺伝子であるマウス・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーを用いた。ＣＯＩＩ  ＰＣＲは二段階（入れ子（ｎｅｓｔｅｄ））であり、一方、ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲは一段階であった。入れ子ＰＣＲの第一の増幅および一段階ＰＣＲにおいて、出発テンプレートは、１ｘＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各３００ｎＭのプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰおよび１．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を含有する５０μｌ体積中、０．５〜１μｇのＤＮＡであった。入れ子ＰＣＲでは、最初の反応の２〜３％が第二の周期の増幅のテンプレートとして働いた。Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ系９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、以下の周期条件で、すべての増幅を行った：９４℃３分間の変性、その後、２５周期（最初のＰＣＲ）または３０周期（第二のＰＣＲ）いずれかの９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、７２℃３０秒間、および７２℃１０分間の最終伸長。エチジウムブロミド染色アガロースゲル（１．５％）を通じてＰＣＲ産物を電気泳動し、そして写真撮影した。予期されるサイズのＣＯＩＩ  ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（配列決定のためのＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、そして配列決定した。ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を用いて、未知の配列を解析し、そして既知のＧｅｎＢａｎｋ配列と比較した。配列決定したバンドは、ブタＣＯＩＩ  ＤＮＡの７１１２〜７４２６ｂｐの領域（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＦ３０４２０２）に同一であり、ＰＣＲ産物が特異的であることが実証された。ＣＯＩＩのプライマーは、最初のＰＣＲでは、順方向−ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣおよび逆方向−ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧであり、第二のＰＣＲでは順方向−ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＣＣおよび逆方向−ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＡＴであった。ＧＡＰＤＨのプライマーは：順方向−ＡＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡおよび逆方向−ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＧであった。
【００２８】
結果
ＮＰＳＣ凝集体性質決定
新生仔精巣からブタ・セルトリ細胞を単離し、そして２日間培養して、細胞性凝集体の形成を可能にした。移植前、免疫反応性ビメンチン陽性セルトリ細胞および平滑筋アルファアクチン陽性筋様細胞の比率を評価することによって、これらの細胞性凝集体の組成を決定した［１４、３５］。総数４の独立の調製物から、これらの凝集体が、９２．２±５．１％のセルトリ細胞および２．２±０．７％の筋様細胞を含有することが示された。残った細胞集団（すなわち＜６％）は、生殖細胞、ライディッヒ細胞および線維芽細胞で構成されるようである。
【００２９】
各ＮＰＳＣ調製物の総ＤＮＡ含量、および単一のＮＰＳＣが６．６ｐｇ  ＤＮＡ／細胞を含有するという観察（データ未提示）に基づいて、精巣あたり５２．５±１３．３ｘ１０６細胞が得られ、そして各移植片が１１ｘ１０６細胞を含有すると計算された。したがって、ビメンチン陽性セルトリ細胞の割合を考慮すると、各移植片内のセルトリ細胞の数は、およそ１０．１ｘ１０６であるはずである。さらに、トリパンブルー色素排除によって細胞生存度を測定し、そして移植時点での細胞性調製物は、９８．６±１．７％生存細胞からなることが示された。
【００３０】
ブタ・セルトリ細胞の生存
免疫適合Ｌｅｗｉｓラットの腎被膜下にＮＰＳＣを移植して、ＮＰＳＣが不調和異種移植片として生存可能であるかどうかを確かめた。移植４日後、２０日後、３０日後、４０日後、６０日後、および９０日後、巨視的には、セルトリ細胞移植片は、大規模な新血管形成を伴って、容易に同定可能であった（図１）。組織切片を組織学的に調べると、すべての時点で移植片中にＮＢＰＳＣが同定され、移植片の６６〜１００％がセルトリ細胞を含有していた（表１）。ビメンチン陽性セルトリ細胞は、主に、細胞クラスターまたは細管様構造いずれかとして配置されていた（図２Ａ〜Ｄ）。セルトリ細胞がクラスターに編成される場合、大きな渦巻く円形の塊として凝集し、索形成中の胚性精巣に存在する輸精索（ｓｅｍｉｎｉｆｅｒｏｕｓ  ｃｏｒｄｓ）のものに似ていた（図２Ｅ〜Ｇ）［３９］。細管様構造に配置される場合、大部分のセルトリ細胞は、細管の基底端に沿って核が整列するのではなく、上皮層全体に局在した（図２Ｎ）。しかし、時折、セルトリ細胞核が天然精巣におけるように配置されている細管が観察された（図２Ｍ）。
【００３１】
異種移植片におけるセルトリ細胞の生存をさらに確認するため、ブタ特異的遺伝子に関するＰＣＲを行った。移植４日後、２０日後、３０日後、４０日後、６０日後、および９０日後、移植片を取り除き、そしてブタ・ミトコンドリアＣＯＩＩ  ＰＣＲのため、ＤＮＡを抽出した。ＣＯＩＩは、ブタ組織のマーカーであり［３８］、そして本研究においては、レシピエントにおけるＮＰＳＣの存在を確認するために用いた。各移植片に関して、非移植腎臓由来のラット組織からなる陰性対照実験を行って、ブタＤＮＡのプライマーの特異性を実証した。非移植腎臓では、陽性シグナルは検出されなかった（図３、レーン２）が、解析したすべての時点で、ＣＯＩＩは、移植片中、３２０ｂｐの予期されるサイズで検出された（図３、レーン４〜７）。さらに、３２０ｂｐバンドを配列決定し、そしてこれがブタＣＯＩＩ  ＤＮＡの７１１２〜７４２６ｂｐの領域（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＦ３０４２０２）に同一であることを見出し、ＰＣＲ産物が特異的であることを実証した。ＰＣＲによって、移植片の５６〜１００％がブタ組織に関して陽性であり（表１）、したがって、ＮＰＳＣが、Ｌｅｗｉｓラットにおいて、少なくとも移植後９０日間、生存可能であることが立証された。
【００３２】
表１
ビメンチン免疫組織化学およびＣＯＩＩ  ＰＣＲによって測定されるような、Ｌｅｗｉｓラットに移植されたＮＰＳＣ異種移植片の生存パーセント
【００３３】
【表１】
2007530416.tif 000002
【００３４】
ａ移植片を免疫染色およびＰＣＲ両方に用いた。
巨視的には、移植２０日後、セルトリ細胞移植片の大規模な増殖が観察された。移植片が増殖したように見えるとともに、移植した細胞が制御されずに増殖した可能性もあるため、組織切片をＰＣＮＡに関して免疫染色して、分裂中の細胞を同定した。ＰＣＮＡはＤＮＡ複製に関与し、そして増殖中の細胞に局在する［４０〜４２］。連続切片をビメンチン（図２Ｅ〜Ｈ）およびＰＣＮＡ（図２Ｉ〜Ｌ）に関して免疫染色すると、移植２０日後および３０日後に採取した移植片では、ある程度のＰＣＮＡ陽性細胞が検出された（図２Ｉ、データ未提示）；が、第４０日には、大部分のセルトリ細胞はもはや分裂していなかった（図２Ｊ）。増殖中のセルトリ細胞数は、移植後の時間が経過するのにつれて減少し、移植６０日後および９０日後には、増殖中のセルトリ細胞は、非常にわずかしかなかった（図２Ｋ、Ｌ）。このことから、セルトリ細胞は、移植６０日後には分裂を止め、そしてしたがって腫瘍を形成する見込みが減少していることが示唆される。
【００３５】
考察
我々の結果から、ＮＰＳＣが、非免疫抑制Ｌｅｗｉｓラットにおいて、異種移植後、長期間生存することが示される。ビメンチン免疫染色によって組織学的に生存を確定し、そしてＣＯＩＩ  ＰＣＲによってさらに実証した。他の研究は、げっ歯類において、移植された不調和［ブタ対ラット；３３］および調和［ラット対マウス；４３］セルトリ細胞が生存することを報告しているが、これらの移植片は、免疫特権部位［３］と見なされる脳に移植された［３３］か、または免疫保護アルギン酸微小カプセル中に入れられた［４３］。我々の知る限り、免疫抑制または免疫を調節する何らかの他の介入を伴わない不調和異種移植片の生存を報告したのは、本研究が初めてである。ＮＰＳＣが異種レシピエントにおいて生存可能であることは、これらが拒絶を防止する免疫調節因子（単数または複数）を合成し、そして分泌する可能性もあることを示す。これらの因子をさらに研究すると、免疫寛容を調べるモデルが提供されうる。例えば、セルトリ細胞は、ＦａｓＬ［１３］、ＴＧＦβ［２７］およびクラステリン［２８］を産生することが知られ、これらはすべて、移植片保護において役割を果たすことが示唆されている。セルトリ細胞はまた、ＩＬ−２産生［２４］およびＴ細胞増殖［２４〜２６］を減少させる、未同定の因子もまた分泌する。先のデータから、セルトリ細胞に分泌されるＦａｓＬは、同種レシピエントの腎被膜下に移植されたマウス精巣組織断片の生存において、役割を果たしうることが示されている［１３］。特に、ｇｌｄマウス（機能するＦａｓＬを欠く）から単離された精巣組織を同種移植片として移植すると、該移植片は７日後にはもはや存在しないが、野生型マウス（機能するＦａｓＬを産生する）由来の移植片は２８日間生存した［１３］。しかし、より最近の論文は、糖尿病の非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて、ＮＯＤマウス膵島と同時移植した際、セルトリ細胞が示す免疫保護効果は、ＦａｓＬとは関連せず［２２、２３］、ＦａｓＬはむしろ、有害であり、そして好中球補充およびそれに続く移植片破壊と相関することを示唆している［２２］。一方、ＮＯＤマウス・セルトリ細胞／膵島同時移植モデルを用いた我々の以前の研究から、ＴＧＦβが膵島破壊を防止する際に保護する役割を果たすことが示されている［２３］。
【００３６】
ＮＰＳＣに産生される単一のタンパク質ではなく、免疫調節因子の組み合わせが、異種レシピエントにおけるＮＰＳＣの生存を可能にするようである。１つの例がＣｈｅｎら［４４］に報告されており、彼らは、ＦａｓＬを発現するようにトランスフェクションされ、そして皮下注射された結腸癌細胞株が、好中球補充および活性化によって、迅速に拒絶されることを立証している［４４］。しかし、ＦａｓＬおよびＴＧＦβ両方を発現するようにこれらの細胞を操作すると、移植片は生存した［４４］。著者らは、組み合わせ保護は、ＴＧＦβが、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）に依存するＦａｓＬ誘導性好中球細胞傷害性を防止することによって、ｐ３８  ＭＡＰＫ機能が阻害されるためである可能性が最も高いと示唆する［４４］。したがって、ＴＧＦβおよびＦａｓＬは、炎症を減少させ、そしてリンパ球のクローン除去を増加させることによって、相乗的に作用して、ＮＰＳＣ生存を促進しうる。クラステリンは、両親媒性糖タンパク質であり、そしてセルトリ細胞に分泌される最も豊富なタンパク質の１つであるが、多くの免疫調節機能を有することもまた知られる。特に、クラステリンは：抗炎症特性を示し［２８］、細胞傷害または細胞死の後で、上方制御され、そして損傷を受けていない細胞に局所保護効果を提供し［２８］、ラット肝臓同種移植片の寛容誘導に役割を果たし［４５］、そして補体カスケードの活性化を阻害する［２８、３２］ことが示されてきている。不調和異種移植片の超急性拒絶には、補体系の活性化が必要であり［４６］、この破壊プロセスを防止するのは、明らかに、拒絶を防止する重要な機構であろう。したがって、ＴＧＦβおよびクラステリン、そして場合によってはＦａｓＬが、ＮＰＳＣに分泌され、ＮＰＳＣが異種移植された際に生存可能にする因子のいくつかである可能性がある。ブタ・セルトリ細胞の異種生存の機構をさらに研究すると、寛容の誘導および補体活性化の阻害に関して情報が提供されうる。
【００３７】
異種ブタ・セルトリ細胞の生存はまた、遺伝子操作のための細胞性移植片の同時移植に、潜在的な臨床適用も有する。免疫抑制療法を用いた臨床的膵島移植が最近成功しており［４７］、このことから、ヒトにおけるさらなる膵島移植の基礎が提供される。このアプローチが若い若年性１型糖尿病患者で実現するためには、免疫抑制措置を、代替戦略で置き換えなければならないであろう。セルトリ細胞が、げっ歯類において、同種マウス［１４、１５］およびＮＯＤマウス［２２、２３］膵島移植片を免疫保護する能力を有するため、セルトリ細胞を用いて、免疫特権部位を生成することが解決策となりうる。しかし、入手可能なヒトドナー組織がなく、そして最近の論文のデータから、ヒト精巣細胞をマウスに移植すると生存不能であることが示されている［４８］ため、ヒトは、セルトリ細胞の現実的な供給源ではない。ブタは比較的豊富であり、そして我々は、ＮＰＳＣが容易に単離され、そしてげっ歯類において、異種移植片として生存することを示した。このことから、ブタは、膵島の免疫特権部位を生成するセルトリ細胞の理想的な供給源であることが暗示される。膵島移植片に加えて、ＮＰＳＣを用いた免疫特権異所（ｅｃｔｏｐｉｃ）部位の生成は、神経細胞などの細胞性移植片にも有用でありうる［１６、３３］。あるいは、セルトリ細胞を操作して、ドーパミンまたは因子ＶＩＩＩなどの療法タンパク質を産生し、パーキンソン症または血友病などの疾患を潜在的に治療することも可能である。
【００３８】
臨床状況においてブタ・セルトリ細胞を使用する前に、腫瘍形成の可能性に取り組まなければならない。したがって、我々は、ＰＣＮＡに関して免疫染色することによって、Ｌｅｗｉｓラットに移植した後のＮＰＳＣの増殖を調べ、そして長期移植片において、あるとしてもわずかしか増殖がないことを見出した。第２０日、多くのＰＣＮＡ陽性細胞が検出されたが、この数は第４０日には減少し、そして第６０日および第９０日には、陽性細胞はほぼ存在しなかった。天然精巣中のセルトリ細胞は、新生仔期後の精巣発生中、性成熟期（ｐｕｂｅｒｔｙ）まで増殖し、その時点で分裂を止めることが示されている［４９〜５１］。この増殖は、濾胞刺激ホルモン、上皮増殖因子、神経増殖因子、ニューロトロピン−３、およびトランスフォーミング増殖因子−α［５２〜５５］を含む、多くの因子によって制御される。セルトリ細胞は、移植から第２０日までの時点では、比較的未成熟であり、そしてしたがって増殖する可能性が最も高い。移植後の時間が経過するにつれ、セルトリ細胞は成熟し、そしてしたがって、分裂する細胞の数が減少する可能性もある。このことから、移植されたセルトリ細胞の細胞分裂が調節され、したがって腫瘍を形成する見込みが減少しうることが示唆される。
【００３９】
結論として、我々は、免疫抑制を伴わず、げっ歯類において、異種ＮＰＳＣが長期間生存することを立証した。免疫組織化学およびＰＣＲによって生存が実証され、このことから、セルトリ細胞が同種移植片として生存可能であるだけでなく、不調和異種移植片としても生存可能であることが示唆される。このモデルをさらに研究すると、異種移植片生存および免疫寛容の機構に対する手がかりが提供される可能性もある。
【００４０】
（実施例２）
セルトリ細胞が濃縮された移植片によって与えられる局所免疫保護における、筋様細胞の潜在的な関与
セルトリ細胞は精巣の正常構成要素であり、セルトリ細胞は精巣において、発生中の生殖細胞を養育し、そして免疫学的に保護する。単離セルトリ細胞は、免疫特権部位を異所性に生成することも可能であり、強力な免疫抑制分子および生存増進分子を分泌することによって、同時移植された同種細胞または異種細胞の生存を可能にする。セルトリ細胞の天然機能を利用することによって、細胞移植に関連する主要な制限：適切なドナー組織の不足および一生続く免疫抑制の必要性を克服することも可能である。前臨床動物モデルにおいて、単離セルトリ細胞は（１）同種環境および異種環境に移植された際、生着し、そして自己保護し、（２）同時移植された同種細胞および異種細胞を免疫破壊から保護し、そして（３）膵島同時移植片の長期生存を可能にし、そして膵切除によるかまたは自己免疫疾患による糖尿病の動物（非肥満性糖尿病モデル）において、高血糖を逆転させることが可能である。
【００４１】
移植前に、セルトリ細胞が濃縮された移植片の細胞組成をより完全に性質決定しようとする最近の努力によって、セルトリ細胞移植が成功する調製物内には、ある割合の筋様細胞もまた含有されることが明らかになった。ＳＴＩによって行われる移植片研究で見られる局所免疫保護を移植片が与える能力を最適にする際に、筋様細胞が含まれることが重要な役割を果たしうることを示唆するため、この観察は重要である。筋様細胞およびセルトリ細胞が、いくつかの重要な方式で実際に相互作用することを示唆するいくつかの一連の証拠がある。まず、天然精巣において、筋様細胞がセルトリ細胞に非常に近接して見出され、こうした箇所では、これらは精細管の基底部の一部を形成し、そして管内液の移動および放出された精子の推進に主要な役割を提供する。第二に、筋様細胞は、セルトリ細胞の細胞分化および機能を調節する因子（ＰｍｏｄＳなど）を産生することによって、セルトリ細胞の機能および活性を制御するのに役割を果たす。最後に、筋様細胞は、それ自体、免疫保護性であると考えられるＴＧＦなどの増殖因子およびサイトカインを産生し、そしてセルトリ細胞に産生される、増殖因子およびサイトカインのすでに強力なカクテルを増強することも可能である。
【００４２】
セルトリ細胞が濃縮された移植片が生成する免疫保護への筋様細胞の貢献を、以下に列挙する実験によって試験することも可能である：
（１）免疫抑制を使用せずに、ラットに異種ブタ新生仔セルトリ細胞を移植して生存するかどうかを決定する実験を設計した。セルトリ細胞を単離し、培養し、そして次いで、非免疫抑制Ｌｅｗｉｓラットの腎被膜下に移植した。免疫細胞化学技術を用いて、培養した細胞調製物は、９２＋／−５．１％のセルトリ細胞（ビメンチン染色）および２．２＋／−０．７％の筋様細胞（平滑筋アルファアクチン染色）を含有することが見出された。生存を評価するため、移植４日後、２０日後、３０日後、４０日後、６０日後、および９０日後に移植片を取り除き、そしてセルトリ細胞マーカーであるビメンチンに関して免疫染色した。ブタ組織のマーカーであるブタ・ミトコンドリア・チトクロムオキシダーゼＩＩサブユニット遺伝子（ＣＯＩＩ）に関するＰＣＲによって、生存を確認した。どちらの方法によっても、少なくとも９０日間、移植片中にセルトリ細胞が検出された。組織学的に、セルトリ細胞は、小さい凝集体にクラスターを形成するか、または細管様構造に編成された。隣接切片を染色すると、セルトリ細胞移植片部位内に、生存筋様細胞が存在することもまた明らかになった（図４）。これらのデータから、少ない割合の筋様細胞を含有するブタ・セルトリ細胞調製物が、ラットにおいて、異種移植後、長期間生存することが立証される。
【００４３】
（２）組織学的研究から、生存同時移植セルトリ細胞および膵島移植片が、豊富な生存筋様細胞もまた含有することが確認される。１１００万のＬｅｗｉｓセルトリ細胞および２０００個のＬｅｗｉｓ膵島を糖尿病Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットの腎被膜下に移植した。１ヵ月後に移植片を取り除き、そしてＧＡＴＡ−４を用いてセルトリ細胞を、そして平滑筋アルファアクチンを用いて筋様細胞を、免疫細胞化学的に染色した。生存セルトリ細胞は、移植部位全体で見出され、そしてしばしば細管様構造に再編成されていた。隣接組織切片を用いると、天然精巣を連想させる様式で、再形成された細管構造が、豊富な生存筋様細胞に裏打ちされていることが見出された（図５）。上記研究と併せて、これらのデータは、移植前調製物に元来含有されるのと同じ筋様細胞が生存し、そして該細胞が、移植後の細管構造の構造的再形成に役割を果たすことを示唆する。
【００４４】
（３）上述の局所免疫保護に対する筋様細胞の相対的貢献を決定するさらなる方法の１つは、筋様細胞をまったく含まずに純粋なセルトリ細胞を移植することである。セルトリ細胞株は、当然、筋様細胞を含有しない。こうした細胞株を膵島細胞とともに移植することによって、我々の先の研究における筋様細胞を含む他の細胞の貢献的役割に関して、さらなる洞察を得ることが可能である。この目的に向けて、５００個のＢａｌｂ／ｃ膵島を、多様な数の細胞株ＭＳＣ−１（マウス由来セルトリ細胞株）とともに、糖尿病Ｃ３Ｈマウスの腎被膜下に移植した。Ｔ抗原染色を用いた組織学的解析によって、ＭＳＣ−１細胞が腫瘍原性細胞株であるにもかかわらず、該細胞の生存が劣っており、そして移植１ヵ月後、小さいクラスターで分布することが明らかになった。同一切片または隣接切片をインスリンに関して染色すると、ＭＳＣ−１細胞が同時移植した膵島を保護しないことが明らかになった（図６）。同様に、ＭＳＣ−１細胞（２００〜４００万）とともに膵島（５００個）を含んでも、長期間続く高血糖の逆転は生じなかった。同系膵島移植片を得た対照動物は、６０日間（研究期間中）正常血糖のままであった。しかし、同種膵島および同種ＭＳＣ−１細胞を同時移植すると、迅速に正常血糖が生じたが、この効果は４００万のＭＳＣ−１細胞を得た動物においても、短期間（すべての場合で＜３０日間）であった。
【００４５】
上記実験から、セルトリ細胞が豊富な移植片が免疫調節に成功する際には、筋様細胞が存在することが立証される。０．５％〜６５％の間の筋様細胞の割合が、移植成功の際に見られるようである。この先数ヶ月で、我々は、セルトリ細胞が豊富な移植片中の筋様細胞を除去する方法、およびセルトリ細胞が豊富な移植片中の筋様細胞の割合を選択的に変化させる方法の同定を試みて、異質のレシピエントにおける移植片の生存と関連する用量効果があるかどうかを決定するであろう。セルトリ細胞株のデータから、ＭＳＣ−１移植片が未成熟に失敗した１つの理由は、筋様細胞の支持集団が存在しなかったことであることが示唆される。移植片の未成熟破壊は、不死化または増殖プロセスによって、細胞の免疫調節能の減少が引き起こされたためではないことを確定するため、この先数ヶ月で、我々は多様なレベルのネズミ筋様細胞を含むＭＳＣ−１移植片を移植し、そして現在のベースラインデータを超える生存があるかどうかを判断することを試みるであろう。
【００４６】
参考文献
【００４７】
【化１】
2007530416.tif 000003
【００４８】
【化２】
2007530416.tif 000004
【００４９】
【化３】
2007530416.tif 000005
【００５０】
【化４】
2007530416.tif 000006
【００５１】
【化５】
2007530416.tif 000007
【００５２】
【化６】
2007530416.tif 000008
【００５３】
【化７】
2007530416.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ。Ｌｅｗｉｓラットの左腎被膜下ＮＢＰＳＣ移植片の顕微鏡写真。移植した組織の巨視的検証のため、移植３０日後（Ａ）、４０日後（Ｂ）、および６０日後（Ｃ）に移植片を取り除き、そして写真撮影した。
【図２】図２Ａ〜２Ｎ。Ｌｅｗｉｓラットに移植したＮＰＳＣ移植片における生存細管形成およびセルトリ細胞増殖。移植片を移植２０日後（Ａ、Ｅ、Ｉ）、４０日後（Ｂ、Ｆ、Ｊ、Ｎ）、６０日後（Ｃ、Ｇ、Ｋ）および９０日後（Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｍ）に取り除き、そしてビメンチン（Ａ〜Ｈ、Ｍ、Ｎ）またはＰＣＮＡ（Ｉ〜Ｌ）で免疫染色した。Ｔ、細管；Ｃ、セルトリ細胞クラスター；Ｌ、リンパ球；矢印、セルトリ細胞核。顕微鏡写真Ｅ〜Ｈは、それぞれ、Ｉ〜Ｌの連続切片由来である。Ｎは、Ｂに示す細管をより高倍率で示し、ＭはＨに示す細管をより高倍率で示す。Ｄ中のバーは、Ａ〜Ｄの２００μｍを示す。Ｌ中のバーは、Ｅ〜Ｌの５０μｍを示す。Ｎ中のバーは、ＭおよびＮの５０μｍを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂ。ブタ組織の異種生存を立証する、Ｌｅｗｉｓラット由来のＮＰＳＣ移植片におけるＣＯＩＩ  ＤＮＡの検出。ブタＣＯＩＩに関して入れ子ＰＣＲを行い（Ａ）、一方、マウスＧＡＰＤＨに関して一段階ＰＣＲを行った（Ｂ）。移植片を、移植２０日後（レーン４）、３０日後（レーン５）、６０日後（レーン６）および９０日後（レーン７）に取り除いた。陰性対照は、非移植Ｌｅｗｉｓラット腎臓から単離したＤＮＡを含み（レーン２）、一方、陽性対照は、移植前の細胞性凝集体由来のＤＮＡを含んだ（レーン９）。
【図４】Ｌｅｗｉｓラット腎被膜下に１１００万のブタ新生仔セルトリ細胞を移植した後の、腎被膜切片の顕微鏡写真。移植部位を移植２０日後に取り除き、そしてビメンチン（セルトリ細胞のマーカー）および平滑筋アルファアクチン（筋様細胞のマーカー）に関して染色した。左のパネルに示すように、ビメンチン染色によって、生存ブタ・セルトリ細胞の存在が明らかになった。右のパネルは、これらの移植部位が、移植部位全体に分布する生存ブタ筋様細胞もまた含有することを示す。
【図５】糖尿病Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットに２０００個のＬｅｗｉｓ膵島とともに１１００万のＬｅｗｉｓセルトリ細胞を同時移植した後の、腎被膜切片の顕微鏡写真。移植部位を移植３３日後に取り除き、そしてＧＡＴＡ−４（セルトリ細胞のマーカー）および平滑筋アルファアクチン（筋様細胞のマーカー）で染色した。左のパネルに示すように、ＧＡＴＡ−４染色によって、細管様構造に再編成された生存セルトリ細胞の存在が明らかになった。右のパネルは、これらの移植部位が、移植部位全体に分布する生存筋様細胞もまた含有することを示す。重要なことに、生存移植片を含む動物はまた、血糖が正常になった。
【図６】糖尿病Ｃ３Ｈマウスに５００個のＢａｌｂ／ｃ膵島とともに４００万のＭＳＣ−１細胞を同時移植した後の、腎被膜切片の顕微鏡写真。移植部位を移植２７日後に取り除き、そしてＭＳＣ−１細胞を同定するためＴ抗原に関して、そして膵島を同定するためインスリンに関して、染色した。生存ＭＳＣ−１の中程度の大きさのポケットが見出されたが、このセルトリ細胞は、同時移植した膵島には、いかなる免疫保護も提供しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルトリ細胞、筋様細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含む薬剤組成物。
【請求項２】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約０．５：９９．５である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項３】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約５：９５である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項４】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約２５：７５である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項５】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である、請求項１の薬剤組成物。
【請求項６】
前記セルトリ細胞が細胞株から得られる、請求項１の薬剤組成物。
【請求項７】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が哺乳動物の精巣から得られる、請求項１の薬剤組成物。
【請求項８】
前記哺乳動物がブタである、請求項７の薬剤組成物。
【請求項９】
前記ブタが６０日齢以下である、請求項８の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記ブタが５日齢以下である、請求項８の薬剤組成物。
【請求項１１】
生物学的因子を産生する細胞をさらに含む、請求項１〜１０の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記生物学的因子がホルモンである、請求項１１の薬剤組成物。
【請求項１３】
生物学的因子を産生する前記細胞が膵島細胞である、請求項１１の薬剤組成物。
【請求項１４】
８００膵島あたり、２ｘ１０６以下のセルトリ細胞が用いられる、請求項１３の薬剤組成物。
【請求項１５】
セルトリ細胞および筋様細胞を被包する装置中に提供され、前記装置が哺乳動物被験者に埋め込むのに適している、請求項１の薬剤組成物。
【請求項１６】
哺乳動物被験者において、免疫特権部位を生成するための薬剤組成物であって、前記組成物がセルトリ細胞、筋様細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記薬剤組成物。
【請求項１７】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約０．５：９９．５である、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項１８】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約５：９５である、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約２５：７５である、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項２０】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項２１】
前記セルトリ細胞が細胞株から得られる、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項２２】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が哺乳動物の精巣から得られる、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項２３】
前記哺乳動物がブタである、請求項２２の薬剤組成物。
【請求項２４】
前記ブタが６０日齢以下である、請求項２３の薬剤組成物。
【請求項２５】
前記ブタが５日齢以下である、請求項２３の薬剤組成物。
【請求項２６】
被験者中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与される、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項２７】
前記部位が、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される、請求項２６の薬剤組成物。
【請求項２８】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、１０５〜１０８細胞の範囲の総量を含む、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項２９】
前記総量が約１０７〜１０８細胞である、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項３０】
哺乳動物被験者がヒトである、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項３１】
細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植により投与される、請求項１６の薬剤組成物。
【請求項３２】
前記移植が同種移植または異種移植である、請求項３１の薬剤組成物。
【請求項３３】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、投与前に、セルトリ−筋様細胞凝集体が形成される条件下で共培養される、請求項３１の薬剤組成物。
【請求項３４】
哺乳動物被験者において、生物学的因子の欠損から生じる疾患を治療する薬剤組成物であって、セルトリ細胞、筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する療法的に有効な量の細胞を含み、前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、免疫特権部位を生成するのに有効な量含む、前記薬剤組成物。
【請求項３５】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約０．５：９９．５である、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項３６】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約５：９５である、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項３７】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも約２５：７５である、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項３８】
前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が０．５：９９．５〜６５：３５の範囲内である、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項３９】
前記セルトリ細胞が細胞株から得られる、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４０】
前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が哺乳動物の精巣から得られる、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４１】
前記哺乳動物がブタである、請求項４０の薬剤組成物。
【請求項４２】
前記ブタが６０日齢以下である、請求項４１の薬剤組成物。
【請求項４３】
前記ブタが５日齢以下である、請求項４１の薬剤組成物。
【請求項４４】
哺乳動物中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与される、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４５】
前記部位が、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される、請求項４４の薬剤組成物。
【請求項４６】
前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する前記細胞が、１０５〜１０８細胞の範囲の総量で含まれる、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４７】
前記総量が約１０７〜１０８細胞である、請求項４６の薬剤組成物。
【請求項４８】
前記哺乳動物被験者がヒトである、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４９】
細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植により投与される、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項５０】
前記移植が同種移植または異種移植である、請求項４９の薬剤組成物。
【請求項５１】
前記生物学的因子がホルモンである、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項５２】
前記生物学的因子がインスリンであり、そして前記疾患が糖尿病である、請求項３４の薬剤組成物。
【請求項５３】
前記生物学的因子を産生する前記細胞が、膵島細胞である、請求項５２の薬剤組成物。
【請求項５４】
前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記膵島細胞が、投与前に、セルトリ−筋様−膵島細胞凝集体が形成されるように共培養される、請求項５３の薬剤組成物。
【請求項５５】
８００膵島あたり、２ｘ１０６以下のセルトリ細胞が用いられる、請求項５３の薬剤組成物。