(57)【要約】本発明は、蛍光タンパク質および発色団タンパク質の自己組織化するフラグメントに基づくタンパク質標識および検出システムを提供する。本発明のシステムは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）由来の自己補完性フラグメントの種々の組み合わせで例示され、これらの組み合わせは、インビトロおよびインビボの両方で複数のアッセイフォーマットにおいてタンパク質可溶性を検出および定量するために使用される。
2007508841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＦＰ改変体のβ鎖１１に対応し、そして配列番号１２、１４および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ＧＦＰ改変体のβ鎖１１に対応し、そして配列番号１８および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ＧＦＰ改変体のβ鎖１〜１０に対応し、そして配列番号４および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１、２および３のいずか１項に記載の単離されたボリペプチドを備える、キット。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項２に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項３に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号３の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号５の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号１１の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１３の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１５の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１７の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１９の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項５〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
配列番号２１の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１９】
配列番号２２の配列を有する、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドベクター。
【請求項２０】
蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリペプチドが、前記ベクター中の唯一のＳｐｅＩ制限酵素部位とＫｐｎＩ制限酵素部位との間でインフレームに挿入され、ここで、さらに、停止コドンが、該ＫｐｎＩ制限酵素部位の前の該タグフラグメントの３’末端にインフレームで導入され、該タグの翻訳を終結する、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
蛍光タンパク質の１と１０との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリペプチドが、前記ベクター中の唯一のＳｐｅＩ制限酵素部位とＫｐｎＩ制限酵素部位との間でインフレームに挿入され、ここで、さらに、停止コドンが、該ＫｐｎＩ制限酵素部位の前の該タグフラグメントの３’末端にインフレームで導入され、該タグの翻訳を終結する、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
前記タグフラグメントが、配列番号１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
前記タグフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１１、１３、１５、１７および１９からなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ベクター中の唯一のＮｄｅＩ制限酵素部位とＢａｍＨＩ制限酵素部位との間にインフレームに挿入された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２５】
前記ベクター中の唯一のＮｄｅＩ制限酵素部位とＢａｍＨＩ制限酵素部位との間にインフレームに挿入された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクター中の唯一のＮｄｅＩ制限酵素部位とＢａｍＨＩ制限酵素部位との間にインフレームに挿入された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２７】
前記ベクター中の唯一のＮｄｅＩ制限酵素部位とＢａｍＨＩ制限酵素部位との間にインフレームに挿入された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項１９に記載のベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項２９】
請求項２０に記載のベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３０】
請求項２１に記載のベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３１】
請求項２２に記載のベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３２】
請求項２３に記載のベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３３】
請求項２８に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む、キット。
【請求項３４】
請求項２９に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む、キット。
【請求項３５】
請求項３０に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む、キット。
【請求項３６】
スプリット蛍光タンパク質システムであって、ＧＦＰ、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、およびそれらの改変体からなる群から選択される蛍光タンパク質の少なくとも２つのフラグメントを含み、該フラグメントが：
（ａ）該蛍光タンパク質中のβ鎖の完全補完体をともに含み、
（ｂ）それら自身蛍光を発せず、そして
（ｃ）自然に自己補完性であり、該蛍光タンパク質および蛍光表現型を再構築する、スプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項３７】
２つのポリペプチドフラグメントを含む、請求項３６に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項３８】
３つのポリペプチドフラグメントを含む、請求項３６に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項３９】
前記蛍光タンパク質のポリペプチドフラグメントの一方が異種ポリペプチドに融合され、該融合ポリペプチドが、該異種ポリペプチドが可溶性であるとき、該蛍光タンパク質の他方のポリペプチドと自然に自己補完する、請求項３７に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４０】
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドリンカーを介して融合される、請求項３９に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４１】
前記蛍光タンパク質が、円順列変異体またはその改変体である、請求項３６に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４２】
β鎖セットに対応する前記２つのポリペプチドフラグメントが、ｓ１−１０およびｓ１１；ｓ１−９およびｓ１０−１１；ｓ１−８およびｓ９−１１；ｓ１−７およびｓ８−１１；ｓ１−６およびｓ７−１１；ｓ１−５およびｓ６−１１；ｓ１−４およびｓ５−１１；ｓ１−３およびｓ４−１１；ｓ１−２およびｓ３−１１；ならびにｓ１およびｓ２−１１からなる群から選択される、請求項３７に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４３】
前記ポリペプチドフラグメントが、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＧＦＰ改変体に由来する、請求項４２に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４４】
スプリット蛍光タンパク質システムであって、発色団タンパク質およびその改変体の少なくとも２つのポリペプチドフラグメントを含み、該フラグメントが：
（ａ）該発色団タンパク質中のβ鎖の完全補完体をともに含み、
（ｂ）それら自身発色団ではなく、そして
（ｃ）自然に自己補完性であり、該発色団タンパク質および発色団表現型を再構築する、スプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４５】
２つのポリペプチドフラグメントを含む、請求項４４に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４６】
３つのポリペプチドフラグメントを含む、請求項４４に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４７】
前記発色団タンパク質のポリペプチドフラグメントの１つが異種ポリペプチドに融合され、該融合ポリペプチドが、該異種ポリペプチドが可溶性であるとき、該発色団タンパク質の前記他方のポリペプチドと自然に自己補完する、請求項４５に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４８】
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドリンカーを介して融合される、請求項４７に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項４９】
前記蛍光タンパク質が、円順列変異体またはその改変体である、請求項４４に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項５０】
β鎖セットに対応する前記２つのポリペプチドフラグメントが、ｓ１−１０およびｓ１１；ｓ１−９およびｓ１０−１１；ｓ１−８およびｓ９−１１；ｓ１−７およびｓ８−１１；ｓ１−６およびｓ７−１１；ｓ１−５およびｓ６−１１；ｓ１−４およびｓ５−１１；ｓ１−３およびｓ４−１１；ｓ１−２およびｓ３−１１；ならびにｓ１−およびｓ２−１１からなる群から選択される、請求項４５に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項５１】
蛍光タンパク質の可溶性自己補完性フラグメント対を単離する方法であって：
（ａ）変異体のライブラリーを生成するために、第１の試験フラグメントポリペプチドをコードする核酸を変異誘発に供する工程；
（ｂ）該第１の試験フラグメントポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程；
（ｃ）該細胞を溶解する工程；
（ｄ）該溶解物を第２の試験フラグメントポリペプチドと接触し、そして該第１の試験フラグメントポリペプチドが該第２の試験フラグメントと自己補完することを可能にする工程；
（ｅ）該溶解物中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第１の試験フラグメントポリペプチド最適物を選択する工程；
（ｆ）変異体のライブラリーを生成するために、該第２の試験フラグメントポリペプチドをコードする核酸を変異誘発に供する工程；
（ｇ）該変異体の試験フラグメントポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程；
（ｈ）該細胞を溶解する工程；
（ｉ）該溶解物を、（ｅ）に記載されたように選択された最適物と接触し、そして該変異体の第２の試験フラグメントポリペプチドが該変異体の第１の試験フラグメントポリペプチドの最適物と自己補完することを可能にする工程；
（ｊ）該溶解物中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第２の試験フラグメントポリペプチド最適物を選択する工程；を包含し、
ここで、該変異体の第１および第２の試験フラグメントポリペプチドの最適物が単離される、方法。
【請求項５２】
蛍光タンパク質の可溶性自己補完性フラグメント対を単離する方法であって：
（ａ）変異体のライブラリーを生成するために、第１の試験フラグメントポリペプチドをコードする核酸を変異誘発に供する工程；
（ｂ）該変異体のライブラリーを発現ベクター中にクローニングする工程；
（ｃ）該発現ベクター上のライブラリーを宿主細胞中に形質転換する工程；
（ｄ）該第１のライブラリーを該宿主細胞中で一時的に発現する工程；
（ｅ）第２の試験フラグメントポリペプチドを、該宿主細胞中に、適合する発現ベクターからのトランスフェクションまたは発現によって導入する工程であって、それによって、該変異体の第１の試験フラグメントポリペプチドを該第２の試験フラグメントと自己補完することを可能にする、工程；
（ｆ）該細胞中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第１の試験フラグメントポリペプチドの最適物を選択する工程；
（ｇ）変異体のライブラリーを生成するために、該第２の試験フラグメントポリペプチドを変異誘発に供する工程；
（ｈ）該変異体のライブラリーを発現ベクター中にクローニングする工程；
（ｉ）発現ビヒクル上の該ライブラリーを宿主細胞中に形質転換する工程；
（ｊ）該変異した第２のライブラリーを該宿主細胞内で一時的に発現する工程；
（ｋ）（ｆ）で記載されたように選択された最適物を、該宿主細胞中に、適合する発現ベクターからのトランスフェクションまたは発現によって導入する工程であって、それによって、該変異体の第２の試験フラグメントポリペプチドを、該変異体の第１の試験フラグメントポリペプチドの最適物と自己補完することを可能にする、工程；
（ｌ）該細胞中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第２の試験フラグメントポリペチドの最適物を選択する工程；を包含し、
ここで、該変異体の第１および第２の試験フラグメントポリペプチドの最適物が単離される、方法。
【請求項５３】
前記第１および第２の試験フラグメントポリペプチドが、ｓ１−１０およびｓ１１；ｓ１−９およびｓ１０−１１；ｓ１−８およびｓ９−１１；ｓ１−７およびｓ８−１１；ｓ１−６およびｓ７−１１；ｓ１−５およびｓ６−１１；ｓ１−４およびｓ５−１１；ｓ１−３およびｓ４−１１；ｓ１−２およびｓ３−１１；ならびにｓ１およびｓ２−１１からなる群から選択されるＧＦＰβ鎖セットに対応する、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試験フラグメントポリペプチドが、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＧＦＰ改変体に由来する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）第１の独立に誘導可能なプロモーターの制御下で、試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質のフラグメントの自己補完対の可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）第２の独立に誘導可能なプロモーターの制御下で、レポータータンパク質のフラグメントの自己補完対の可溶性の第２のアッセイフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の該構築物の両方を含む細胞を、その中の該独立に誘導可能なプロモーターの両方の抑制を可能にするベースライン条件下で培養する工程；
（ｄ）（ａ）の該構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間の間、次に、発現された融合タンパク質が不溶性であれば凝集することを可能にするに十分な時間誘導する工程；
（ｅ）次いで、（ｂ）の該構築物によってコードされる該第２のフラグメントの発現を、該第２のアッセイフラグメント、および可溶性の第１のタグフラグメント−試験タンパク質融合物とのその自己補完性の発現を可能にするに十分な時間誘導する工程；および
（ｆ）該細胞中の該レポータータンパク質の活性を検出する工程であって、それによって該可溶性の試験タンパク質を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項５６】
前記試験タンパク質が、レポータータンパク質の前記自己補完対のフラグメントのタグフラグメントのＮ末端に、リンカーポリペプチドを経由して融合される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記レポータータンパク質が、発色団タンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−１０に対応する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号４および６からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１０−１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−９に対応する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１のタグフラグメントが配列番号３４の配列を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第２のアッセイフラグメントが配列番号３６の配列を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）該試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む哺乳動物細胞を、該試験タンパク質−タグフラグメント融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで該発現された融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞を、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第２のアッセイフラグメントで化学的にトランスフェクトする工程、および
（ｄ）該細胞中で該レポータータンパク質の活性を検出し、それによって該可溶性の試験タンパク質を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項６６】
前記試験タンパク質が、リンカーポリペプチドを介して前記レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントのタグフラグメントのＮ末端に融合される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記レポータータンパク質が発色団タンパク質である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントβ鎖１−１０に対応する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号４および６からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１０−１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントβ鎖１−９に対応する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１のタグフラグメントが配列番号３４の配列を有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第２のタグフラグメントが配列番号３６の配列を有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む哺乳動物細胞を、試験タンパク質−タグフラグメント融合タンパク質の発現を可能にするに十分な条件および時間培養し、次に、発現された融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞を、該蛍光タンパク質の自己補完対の可溶性の第２のアッセイフラグメントで化学的にトランスフェクトする工程；および
（ｄ）該細胞中の蛍光を検出し、それによって該可溶性試験タンパク質を検出する工程、を包含するアッセイ。
【請求項７６】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、第１の独立に誘導可能なプロモーターの制御下に該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）第２の独立に誘導可能なプロモーターの制御下で、（ａ）の構築物中に提示されない蛍光タンパク質のβ鎖に対応する可溶性の第２のアッセイフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の構築物の両方を含む細胞を、その中の該独立に誘導可能なプロモーターの両方の抑制を可能にするベースライン条件下で培養する工程；
（ｄ）（ａ）の構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間誘導し、次に、該発現された該融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間誘導する工程；
（ｅ）次いで、（ｂ）の構築物によってコードされる第２のフラグメントの発現を、第２のアッセイフラグメント、および可溶性の第１のタグフラグメント−試験タンパク質融合物とのその自己補完性の発現を可能にするに十分な時間の間誘導する工程；ならびに
（ｆ）該細胞中の蛍光を検出し、それによって該可溶性試験タンパク質を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項７７】
蛍光が定量的に検出され、そして発現された可溶性試験タンパク質の量を測定するために用いられる、請求項５５に記載のアッセイ。
【請求項７８】
蛍光が定量的に検出され、そして発現された可溶性試験タンパク質の量を測定するために用いられる、請求項６５に記載のアッセイ。
【請求項７９】
蛍光が定量的に検出され、そして発現された可溶性試験タンパク質の量を測定するために用いられる、請求項７５に記載のアッセイ。
【請求項８０】
蛍光が定量的に検出され、そして発現された可溶性試験タンパク質の量を測定するために用いられる、請求項７６に記載のアッセイ。
【請求項８１】
総試験タンパク質をインビボで定量するためのアッセイであって：
（ａ）試験タンパク質のコード配列に融合された、蛍光タンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）該蛍光タンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第２のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物、および（ｂ）の構築物によってコードされる第２のフラグメントの発現を可能にする条件下で、該タグフラグメントおよびアッセイフラグメントの自己補完性を可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｄ）総タンパク質量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項８２】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−１０に対応する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号４および６からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１０−１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−９に対応する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号３４の配列を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号３６の配列を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
総試験タンパク質をインビボで定量するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）（ａ）の構築物中に提示されない蛍光タンパク質のβ鎖に対応する可溶性の第２のアッセイフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物、および（ｂ）の構築物によってコードされる第２のフラグメントの発現可能にする条件下で、該タグフラグメントおよびアッセイフラグメントの自己補完性を可能にするに十分な時間培養する工程；ならびに
（ｄ）総タンパク質量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項８９】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該細胞を溶解する工程；
（ｄ）該溶解物を、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの第２の補完性アッセイフラグメントと接触させる工程；ならびに
（ｅ）該レポータータンパク質の活性を検出する工程
を包含し、
ここで、検出可能なレポーター活性の存在が、該試験タンパク質が可溶性であることの指標を提供する、アッセイ。
【請求項９０】
前記試験タンパク質が、リンカーポリペプチドを介してレポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの前記タグフラグメントのＮ末端に融合されている、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記レポータータンパク質が発色団タンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１１に対応し、そして第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−１０に対応する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号４および６からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１０−１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−９に対応する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号３４の配列を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号３６の配列を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
不溶性試験タンパク質をインビトロで検出するためのアッセイであって：
（ａ）該試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該細胞を溶解し、そしてそれから不溶性フラクションを単離する工程；
（ｄ）該不溶性フラクションを化学的変性によって可溶化する工程；
（ｅ）可溶化された変性不溶性タンパク質フラクションを、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの第２の補完性アッセイフラグメントを含む適切な希釈剤中、自己補完を可能にするに十分な条件および時間の間再生する工程；および
（ｆ）該不溶性タンパク質の量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項１００】
前記試験タンパク質が、リンカーポリペプチドを介してレポータータンパク質の自己補完対のフラグメントのタグフラグメントのＮ末端に融合されている、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記レポータータンパク質が発色団タンパク質である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１１に対応し、そして第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−１０に対応する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号４および６からなる群ら選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１０−１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−９に対応する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号３４の配列を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号３６の配列を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
総試験タンパク質をインビトロで検出するためのアッセイであって：
（ａ）該試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該細胞を溶解する工程；
（ｄ）化学的変性によって該溶解物中の総タンパク質を可溶化する工程；
（ｅ）該溶解物中の可溶化されたタンパク質を、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの第２の補完性アッセイフラグメントを含む適切な希釈剤中、自己補完を可能にするに十分な条件および時間の間再生する工程；および
（ｆ）総タンパク質の量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項１１０】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｆ）該細胞を溶解する工程；
（ｇ）該溶解物を、（ａ）の構築物中で提示されない蛍光タンパク質のβ鎖に対応する第２の補完性アッセイフラグメントポリペプチドと接触する工程；および
（ｈ）該レポータータンパク質の活性を検出する工程
を包含し、
ここで、検出可能なレポーター活性の存在が、該試験タンパク質が可溶性である指標を提供する、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府によって支援された研究または開発の下でなされた発明に対する権利の陳述）
本発明は、米国エネルギー省によってＴｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに授与された、米国エネルギー省および契約番号第Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６からの認可番号ＤＥ−ＦＧ０２−９８ＥＲ６２６４７の下で政府援助によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有している。
【０００２】
（関連出願）
本特許出願は、米国仮特許出願番号第６０／５１４，３６３号の出願日の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
下流適用のために十分な量の可溶性の良好に折り畳まれた組換えタンパク質を得ることは、タンパク質発現技術を利用する多くの分野で顕著な隘路のままであり（Ｍａｋｒｉｄｅｓ  １９９６；Ｂａｎｅｙｘ  １９９９；Ｆａｈｎｅｒｔ、Ｌｉｌｉｅら、２００４）、これには、構造ゲノムプロジェクト（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ２００３；Ｇｏｈ、Ｌａｎら  ２００４；Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ２００４）が含まれる。可溶性タンパク質を最大にするための現在のアプローチは、多数のタンパク質改変体（変異体、フラグメント、融合タグ、折り畳みパートナー）のスクリーニング、および多くの発現および再折り畳み条件を試験すること（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、ｄｅ  Ｌｅｎｃａｓｔｒｅら、１９９９；Ｆａｈｎｅｒｔ、Ｌｉｌｌｉｅら  ２００４）を含む。可溶性発現のためにタンパク質をスクリーニングするためのいくつかの方法が最近開発され（Ｗａｌｄｏ  ２００３）、ドットブロットにおけるポリヒスチジンタグ化タンパク質の抗体検出（ＫｎａｕｓｔおよびＮｏｒｄｌｕｎｄ  ２００１）を含むが、これらのアプローチは、複数工程を必要とし、そしてインビボでは働かない。ｌａｃＺαフラグメントでタグ化されたタンパク質は、ｌａｃＺΩとの構造的補完の後検出され得る（Ｕｌｌｍａｎｎ、Ｊａｃｏｂら  １９６７；ＮｉｘｏｎおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ  ２０００；Ｗｉｇｌｅｙ、Ｓｔｉｄｈａｍら  ２００１；Ｗｅｈｒｍａｎ、Ｋｌｅａｖｅｌａｎｄら  ２００２）が、このｌａｃＺαフラグメントは相対的に大きく（５２アミノ酸）（Ｗｉｇｌｅｙ、Ｓｔｉｄｈａｍら  ２００１）、そしてその融合パートナー折り畳みおよび可溶性に対する影響に関する詳細な研究はない。１５アミノ酸のＳ−ペプチド（ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ  １９９３）でタグ化されたタンパク質は、Ｓ−プロテイン（ＲｉｃｈａｒｄｓおよびＶｉｔｈａｙａｔｈｉｌ  １９５９）との補完の後、高感度の蛍光発生基質を用いてインビロトで定量され得る（Ｋｅｌｅｍｅｎ、Ｋｌｉｎｋら  １９９９）（ＦｒｅｔＷｏｒｋｓ（登録商標）、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が、このアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のインビボの可溶性タンパク質発現を評価するために用いられることはできない。
【０００４】
ＧＦＰおよびその多くの関連する蛍光タンパク質は、今や、タンパク質タグ化物質として広く行き渡り使用されている（総説には、Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら  ２００３、Ａｎｔｈｏｚｏａ綱のＧＦＰ様蛍光タンパク質および色素タンパク質、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｅｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、第１８章、４０５〜４３９頁、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ、Ｋｅｒａｌａ、Ｉｎｄｉａ（非特許文献１）を参照のこと）。さらに、ＧＦＰは、末端に融合された試験タンパク質の可溶性レポーターとして用いられている（Ｗａｌｄｏら  １９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６９１〜６９５（非特許文献２）；「タンパク質／ペプチドの可溶性を決定および改変する方法」と題する米国特許番号第６，４４８，０８７号（特許文献１））。ＧＦＰ様タンパク質は、相同な、保存された１１のβ鎖「バレル」構造を共有する２５〜３０ｋＤａポリペプチドの広範なファミリーである。このＧＦＰ様タンパク質ファミリーは、現在、種々のＡｎｔｈｏｚｏａ種およびＨｙｄｒｏｚｏａ種からクローニングされ、そして赤色、黄色および緑色蛍光タンパク質ならびに種々の非蛍光発色色素タンパク質を含む（Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら、前述）、約１００のメンバーを含む。広範な種類の蛍光タンパク質標識アッセイおよびキットが市販され利用可能であり、広範なスペクトルのＧＦＰのスペクトル的改変体、およびＤｓＲｅｄおよびその他の赤色蛍光タンパク質（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むＧＦＰ様蛍光タンパク質を含む。
【０００５】
ＧＦＰおよび関連するタンパク質の可溶性を改善するための種々の戦略が文献に記載され、そして改良された折り畳み、可溶性および摂動耐性特徴を有する多くの変異体の生成を得ている。Ｓｔｅｍｍｅｒおよび共同研究者は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増加した蛍光および折り畳み収率を示したＧＦＰの変異体または改変体をスクリーニングするために指向された進化を適用した（例えば、Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４３：３１５〜３１９、１９９６（非特許文献３）を参照のこと）。彼らは、増加した折り畳み能力を示した変異体を同定した。ｃｙｃｌｅ−３またはＧＦＰ３と称されるＧＦＰのこのバージョンは、変異Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａを含む。ＧＦＰ３は、発現環境に相対的に非感受性であり、そしてＥ．ｃｏｌｉを含む広範な種類の宿主中で良好に折り畳まれる。ＧＦＰ３は、２７℃および３７℃で等しく良好に折り畳まれる。従って、これらのＧＦＰ３変異はまた、野生型ＧＦＰの折り畳みの間に生じる可能な温度感受性折り畳み中間体をなくすようである。
【０００６】
ＧＦＰ３は、別の折り畳みに乏しいポリペプチドとの融合タンパク質としての発現によって誤折り畳みされ得る。ＧＦＰ３が用いられて、Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現の間のＮ末端で融合されたタンパク質の「折り畳み粗暴」が報告されている（Ｗａｌｄｏら  １９９９、前述）。この方法では、レポーターの配列、例えば、ＧＦＰ３ドメインは、一定のままであり、そして折り畳みに乏しい上流ドメインは変異されている。ドメインＸのより良好に折り畳まれた改変体は、増加した蛍光によって同定される。
【０００７】
現存するタンパク質タグ化および検出プラットホームは強力であるが、欠点を有している。スプリットタンパク質タグは、タンパク質可溶性を混乱させ得る（Ｕｌｌｍａｎｎ、Ｊａｃｏｂら  １９６７；ＮｉｘｏｎおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ  ２０００；Ｆｏｘ、Ｋａｐｕｓｔら  ２００１；Ｗｉｇｌｅｙ、Ｓｔｉｄｈａｍら  ２００１；Ｗｅｈｒｍａｎ、Ｋｌｅａｖｅｌａｎｄら  ２００２）か、または生存細胞では働かないかも知れない（ＲｉｃｈａｒｄおよびＶｉｔｈａｙａｔｈｉｌ  １９５９；ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ  １９９３；Ｋｅｌｅｍｅｎ、Ｋｌｉｎｋら  １９９９）。緑色蛍光タンパク質融合物は誤折り畳みし得る（Ｗａｌｄｏ、Ｓｔａｎｄｉｓｈら  １９９９）か、または改変されたプロセッシングを示す（Ｂｅｒｔｅｎｓ、Ｈｅｉｊｎｅら  ２００３）。蛍光発生２砒素ＦＬａＳＨまたはＲｅＡＳＨ（Ａｄａｍｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌら  ２００２）基質は、これら制限の多くを克服するが、ポリシステインタグモチーフ、還元性環境、および細胞トランスフェクションまたは透過性化を必要とする（Ａｄａｍｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌら  ２００２）。
【０００８】
ＧＦＰフラグメント再構築システムがタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために主に説明されているが、いずれも、支援されない自己アセンブリを正確に折り畳まれた可溶性かつ再構築されたＧＦＰにすることができず、そして一般的なスプリットＧＦＰ折り畳みレポータシステムは、これらのアプローチから出現していない。例えば、Ｇｈｏｓｈら  ２０００は、ＧＦＰ構造のアミノ酸１〜１５７および１５８〜２３８に対応する２つのＧＦＰフラグメントが、個々のフラグメントが逆平行ロイシンジッパーを形成し得るコイルドコイル配列に融合されたとき、インビトロまたはＥ．ｃｏｌｉ中の同時発現により蛍光産物を生じ得たことを報告した（Ｇｈｏｓｈら  ２０００、逆平行ロイシンジッパー特異的タンパク質再アセンブリ：緑色蛍光タンパク質への適用。Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５６５８〜５６５９（非特許文献４））。同様に、米国特許第６，７８０，５９９号（特許文献２）は、逆平行ロイシンジッパーを形成し得、ＧＦＰ分子のスプリットフラグメントを接続し得るらせんコイルの使用を記載している。この特許の明細書は、再構築が、ＧＦＰフラグメントに付着された補完的らせんコイルの非存在下では生じないことを確立している。特に、この明細書は、ロイシンジッパー対なしのＧＦＰフラグメントが「任意の緑色コロニーを示さず、従って、インビボおよびインビトロにおけるＧＦＰアセンブリを仲介するためのＮＺジッパーおよびＣＺロイシンジッパーの両方の存在の必要性を強調する」コントロール実験を記載している。同様に、Ｈｕら、２００２は、相互作用タンパク質ｂＺＩＰおよびＲｅｌが、ＧＦＰの２つのフラグメントに融合されるとき、それらの相互作用によってＧＦＰ再構築を仲介し得ることを示した（Ｈｕら、２００２、生体分子蛍光補完性を用いる生存細胞中のｂＺＩＰファミリータンパク質およびＲｅｌファミリータンパク質間の相互作用の可視化。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：７８９〜７９８（非特許文献５））。Ｎａｇａｉら、２００１は、カルモジュリンおよびＭ１３に融合された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のフラグメントがカルシウムの存在下でＹＦＰの再構築を仲介し得たことを示した（Ｎａｇａｉら、２００１、Ｃａ２＋を感知するよう操作された環状に並び替えられた緑色蛍光タンパク質、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３１９７〜３２０２（非特許文献６））。このアプローチの改変例で、Ｏｚａｗａらは、カルモジュリンおよびＭ１３を、自己スプライシングインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）ポリペプチド配列を経由して２つのＧＦＰフラグメントに融合し、それによってカルシウムの存在下でＧＦＰフラグメントの共有結合再構築を仲介した（Ｏｚａｗａら、２００１、タンパク質スプライシングに基づくインビボでタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための蛍光インジケーター。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：５１５１〜５１５７（非特許文献７）；Ｏｚａｗａら、２００２、細菌におけるタンパク質−タンパク質相互作用をモニターするためのタンパク質スプライシングを基礎にしたスプリット緑色タンパク質の再構築：改善された感受性および減少したスクリーニング時間。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３���５８６６〜５８７４（非特許文献８））。これらの研究者の一人は、次いで、このスプライシングを基礎にしたＧＦＰ再構築システムの培養された哺乳動物細胞への適用を報告した（Ｕｍｅｚａｗａ、２００３、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｃ．３：２２〜２８（非特許文献９））。さらに最近、Ｚｈａｎｇら、２００４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで同時発現されるとき、Ｇｈｏｓｈら、２０００、前述のらせんコイルスプリットＧＦＰシステムを用いてＧＦＰ（ならびにＹＦＰおよびＣＦＰ）蛍光を再構築し得たことを示し、そしてインビボにおける同時発現を確認することで、このシステムの有用性を示した（Ｚｈａｎｇら、２００４、再構築された蛍光タンパク質を用いた細胞およびオルガネラのコンビナトリアルマーキング。Ｃｅｌｌ  １１９：１３７〜１４４（非特許文献１０））。
【０００９】
前述のＧＦＰ再構築システムは、２つのスペクトル的に別個のタンパク質タグの使用よりも利点を提供するが、それらは、フラグメントのサイズ、および対応して乏しい折り畳み特徴（Ｇｈｏｓｈら、Ｈｕら、前述）、再構築を推し進めるために化学的連結または融合された相互作用するパートナーポリペプチドの必要性（Ｇｈｏｓｈら、２０００、前述；Ｏｚａｗａら、２００１、２００２  前述；Ｚｈａｎｇら、２００４、前述）、および検出可能な、折り畳まれ、かつ蛍光性のＧＦＰ（Ｇｈｏｓｈら、２０００；Ｈｕら、２００１、前述）を生成するための同時発現または同時折り畳みによって制限されている。乏しい折り畳み特徴は、フラグメントが同時に発現されるか、または一緒に同時に再折り畳みされる適用にこれらのフラグメントの使用を制限する。このようなフラグメントは、補完の前に個々のフラグメントの長期間の安定性および可溶性を必要とするインビトロアッセイには有用ではない。このようなスプリットタンパク質フラグメントが有用ではないような適用の例は、スプリットタンパク質対の１つのメンバーでタグ化され、そして次いで補完性フラグメントの添加によって検出されるポリペプチドの定量であろう。
【特許文献１】米国特許第６，４４８，０８７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７８０，５９９号明細書
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｅｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ、Ｋｅｒａｌａ、Ｉｎｄｉａ、第１８章、ｐ．４０５〜４３９
【非特許文献２】Ｗａｌｄｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９９年、１７、ｐ．６９１〜６９５
【非特許文献３】Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９６年、１４３、ｐ．３１５〜３１９
【非特許文献４】Ｇｈｏｓｈら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、１２２、ｐ．５６５８〜５６５９
【非特許文献５】Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２年、９、ｐ．７８９〜７９８
【非特許文献６】Ｎａｇａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、９８、ｐ．３１９７〜３２０２
【非特許文献７】Ｏｚａｗａら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、７２、ｐ．５１５１〜５１５７
【非特許文献８】Ｏｚａｗａら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、７３、ｐ．５８６６〜５８７４
【非特許文献９】Ｕｍｅｚａｗａ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｃ．、２００３年、３、ｐ．２２〜２８
【非特許文献１０】Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ、２００４年、１１９、ｐ．１３７〜１４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
理想的なタンパク質タグは、遺伝子によりコードされ、インビボおよびインビトロの両方で働き、高感度の分析信号を提供し、そして外部の化学的試薬または基質を必要としないであろう。しかし、現在まで、蛍光レポーター活性の再構築を駆動するために融合された異質ポリペプチドドメインに依存しないスプリット蛍光タンパク質タグ化システムは記載されていない。フラグメントが、融合された相互作用タンパク質ドメインの必要性なくして自然に自己会合し得、会合前に可溶性のままであり、そして融合された標的タンパク質の可溶性を変えない、スプリット蛍光タンパク質タグ化システムが必要であり、そして本発明によって取り扱われる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、蛍光タンパク質および発色団タンパク質の自己補完性フラグメントに基づくタンパク質標識および検出システムを提供する。本発明のシステムは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）由来の自己補完性フラグメントの種々の組み合わせで例示され、これらは、インビトロおよびインビボの両方で複数のアッセイフォーマットでタンパク質可溶性を検出および定量するために用いられる。
【００１２】
１つの詳細な実施形態では、試験タンパク質がＧＦＰの１６のアミノ酸フラグメント（β鎖１１、アミノ酸２１５〜２３０）に融合され、融合タンパク質の可溶性を混乱しないように操作される。補完性ＧＦＰフラグメント（β鎖１〜１０、アミノ酸１〜２１４）が添加されるとき、これらＧＦＰフラグメントの自発的な会合は、構造的補完、折り畳み、および付随するＧＦＰ蛍光を生じる。
【００１３】
このスプリット−ＧＦＰシステムは非常に単純で、外部試薬を必要とせず、タグ化タンパク質の量に直接比例する高感度分析信号を提供し、代表的にはベンチで遭遇されるタンパク質の量を１５分以内に定量し、可溶性または不溶性タンパク質のいずれかを報告し得、そしてインビボおよびインビトロの両方で働く。これらの能力を組み合わせる他の現存するタンパク質タグ化および検出システムは存在しない。実施例、後述、に詳細に記載されるように、このスプリット−ＧＦＰシステムを用いて、マルチウェルプレートでタンパク質を定量し、そして生存Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中でタンパク質発現および可溶性をモニターする。本発明のこのスプリットＧＦＰシステムは、タンパク質を定量するため、タンパク質可溶性をアッセイするために、そして特定のポリペプチドまたはタンパク質の折り畳みおよび可溶性を改良することを狙う特異的進化戦略の成功をモニターするためのレポーターアッセイとして特に有用である。さらに、本発明のこれらシステムは、特に高スループット薬物開発フォーマットにおいて、タンパク質の不適正な折り畳みを阻害および／または促進する因子をアッセイするために用いられ得る。
【００１４】
レポータータンパク質の自己補完性フラグメントを生成する方法がまた、提供される。これらの方法は、ＧＦＰの操作されたフラグメントの生成によって例示され、そして他のＧＦＰ様蛍光タンパク質および非蛍光タンパク質の自己補完性フラグメントを生成するために用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（定義）
他であることが規定されなければ、本明細書で用いられる当該技術分野のすべての用語、表記およびその他の科学的用語法は、本発明が関係する当業者によって共通に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、共通して理解される意味をもつ用語は、本明細書中で明瞭さのため、および／または容易な参照のために定義され、そしてこのような定義を含めることは、当該技術分野で一般に理解されるものに対して実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中で説明され、または参照される技法および手順は、当業者によって従来の方法を用いて一般に良好に理解され、かつ共通に採用され、これには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．２００１）に記載された広く利用される分子クローニング方法などがある。認識されるように、市販され利用可能なキットおよび試薬の使用を含む手順は、他であることが注記されなければ、一般に、製造業者の規定したプロトコールおよび／またはパラメーターに従って実施される。
【００１６】
本明細書で用いられるとき、「蛍光タンパク質」は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの構造的改変体（すなわち、円順列変異体（ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）、モノマーバージョン）、ＧＦＰの折り畳み改変体（すなわち、より可溶性のバージョン、超折り畳みバージョン）、ＧＦＰのスペクトル的改変体（すなわち、ＹＦＰ、ＣＦＰ）、およびＧＦＰ−様蛍光タンパク質（すなわち、ＤｓＲｅｄ）である。用語「ＧＦＰ−様蛍光タンパク質」は、ＧＦＰの１１−β鎖「バレル」構造を共有するＡｎｔｈｏｚｏａ蛍光タンパク質のメンバー、ならびにその構造的、折り畳みおよび構造的改変体をいうために用いられる。用語「ＧＦＰ−様非蛍光タンパク質」および「ＧＦＰ−様発色団タンパク質」（または、単に、「発色団タンパク質」または「色素タンパク質」）は、ＧＦＰの１１−β鎖「バレル」構造を共有するＡｎｔｈｏｚｏａおよびＨｙｄｒｏｚｏａ発色団タンパク質、およびその構造的、折り畳みおよび構造的改変体をいうために用いられる。ＧＦＰ−様タンパク質はすべて、共通の構造的および機能的特徴を共有し、制限されずに、分子状酸素以外に、アクセサリーコファクター、外部酵素触媒または基質を必要とすることなく、内部発色団を形成する能力を含む。
【００１７】
蛍光タンパク質の「改変体」は、「親」蛍光タンパク質に由来し、そして上記１１β−鎖バレル構造および内因性蛍光を保持し、そしてこのタンパク質の新規または改変された性質（すなわち、より大きな安定性、改良された可溶性、改良された折り畳み、放射または励起スペクトルにおけるシフト、マルチマーを形成する減少したまたは無くした能力など）を与え得るアミノ酸置換、欠失または挿入をもつ構造、ならびに改変されたＮ末端およびＣ末端を有する構造（すなわち、円順列変異体）を含むことが意図される。
【００１８】
レポーターポリペプチドを参照して用いられるとき、用語「補完するフラグメント」、または「補完性フラグメント」は、個々には不活性であり（すなわち、レポーター表現型を発現しない）、ここで、補完性フラグメントの結合が、レポーター活性を回復するポリペプチドのフラグメントをいう。２つ以上の蛍光（または発色団）タンパク質フラグメントを記載するために用いられるとき、用語「自己補完性」、「自己組織化」、および「自然に会合する」は、これらフラグメントが、これら個々のフラグメントが可溶性であるとき、インタクトな、蛍光（または発色団）タンパク質に再構成し得ることを意味する。
【００１９】
本明細書で用いられるとき、「ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２構造」は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＭＤＢ）、ＰＤＢ  Ｉｄ：１ＥＭＡ  ＰＤＢ  Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｍ．Ｏｒｍｏ＆Ｓ．Ｊ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ＰＤＢ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：１−Ａｕｇ−９６  ＰＤＢ  Ｃｌａｓｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＤＢタイトル：Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質中、Ｏｒｍｏ＆Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎにより、ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２で開示されるＧＦＰ構造をいう。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）参照は、Ｉｄ  ＰＤＢ  Ｉｄ：１ＥＭＡ  ＰＤＢ著者：Ｍ．Ｏｒｍｏ＆Ｓ．Ｊ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ＰＤＢ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：１−Ａｕｇ−９６  ＰＤＢクラス：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＤＢタイトル：Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質である（例えば、Ｏｒｍｏら、「Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質の結晶構造」、Ｓｉｅｃｎｃｅ  １９９６  ９月６日；２７３（５２８０）：１３９２〜５；Ｙａｎｇら、「緑色蛍光タンパク質の分子構造」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６  １０月、１４（１０）：１２４６〜５１を参照のこと）。
【００２０】
「根２乗平均偏差（「ＲＭＳＤ」）」は、根２乗平均重ね合わせ残基をオングストロームでいう。この数は、２つの構造の最適重ね合わせ後、相当するα−原子間の２乗平均距離の平方根として算出される。
【００２１】
核酸の部分を参照して用いられるとき、用語「異質」は、核酸が本来互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、代表的には、新規な機能的核酸を作製するために整列される非関連遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からの蛍光タンパク質をコードする核酸、および別の供給源からのペプチド配列をコードする核酸を有して組換えにより発現される。同様に、異質タンパク質は、タンパク質が、元来、互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００２２】
用語「同一」または「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈においては、ＢＬＡＳＴ配列比較アルゴリズムもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターとともに使用して測定するかまたは手作業による並置および視認によって測定するように、比較ウィンドウすなわち指定領域の全体にわたって最大の一致について比較および並置した場合に、特定の領域全体にわたって同じである２つ以上の配列もしくは部分配列を指すか、あるいは特定の領域全体にわたって同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドに関して特定の割合（すなわち、約７０％同一性、好ましくは、７５％同一性、８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、または９５％同一性）を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。それゆえ、そのような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義はまた、試験配列の補完性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を指す。好ましくは、この同一性は、長さが少なくとも約２２アミノ酸もしくは少なくとも約２２ヌクレオチドである領域にわたって存在するか、またはより好ましくは、長さが３０アミノ酸、４０アミノ酸、もしくは５０アミノ酸〜１００アミノ酸または３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、もしくは５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００２３】
配列比較に関して、代表的には、１つの配列が、参照配列の役割を果たし、この参照配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列が、コンピューター中に入力され、部分配列座標が、必要な場合には指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが、指定される。デフォルトプログラムパラメーターが、使用され得るか、または代替的パラメーターが、指定され得る。その後、その配列比較アルゴリズムは、上記プログラムパラメーターに基づいて、上記参照配列に対する上記試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００２４】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０から選択される連続位置数のうちのいずれか１つである部分に対する言及を包含し、その部分において、配列は、同じ連続位置数の参照配列に対して、それら２つの配列が最適に並置された後に比較され得る。比較のための配列の並置方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適な並置は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）によって、または手作業による並置および視認（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）を参照のこと）によって、実施され得る。
【００２５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。これらのアルゴリズムは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、代表的には、本明細書中に記載されるデフォルトを用いて使用されて、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントが決定される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開された状態で利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、このＨＳＰは、データベース配列中の同じ長さのワードと並置された場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近接（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）ワードスコアの閾値Ｔと呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの初期近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致した一対の残基についての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびＮ（一致しない残基についてのペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスが、上記累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるそのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、達成した最大値から量Ｘ減少した場合；１つ以上の負のスコアの残基の整列の蓄積に起因して、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速さを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）  １１、期待値（Ｅ）  １０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）  ３、期待値（Ｅ）  １０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）、アライメント（Ｂ）  ５０、期待値（Ｅ）  １０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００２６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似すると考えられる。
【００２７】
参照配列番号に言及する文脈における用語「最大一致によって決定される場合」とは、配列が、デフォルトパラメーターに設定されたＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、参照配列の長さ全体にわたって参照配列番号と最大限に並置されることを意味する。
【００２８】
用語「連結（する）」とは、本明細書中で使用される場合、物理的結合ならびに生物学的粒子（例えば、ファージ、細菌、酵母、または他の真核生物細胞）と共存することによって生じる結合を指す。
【００２９】
「物理的結合」とは、２つの分子を機能的に接続する（これは、「物理的に結合された」と呼ばれる）ための当該分野で公知の任意の方法を指し、これには、介在ドメインを含む組換え融合または介在ドメインを含まない組換え融合、インテイン媒介性融合、非共有結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合および共有結合）、水素結合；静電結合；ならびに高次構造結合（例えば、抗体−抗原結合、およびビオチン−アビジン結合）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「融合した」とは、共有結合による結合を指す。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「リンカー」または「スペーサー」とは、２つの分子（蛍光結合リガンド、およびディスプレイタンパク質もしくはディスプレイ核酸）を接続してそれらの２つの分子を好ましい構成に配置する、分子または分子群を指す。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物である、アミノ酸ポリマー；ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー；および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３３】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにその天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに、後に改変されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのようなアナログは、改変型Ｒ基を有する（例えば、ノルロイシン）かまたは改変型ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能する、化合物を指す。
【００３４】
アミノ酸は、本明細書中では、その一般的に公知である３文字記号によってか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃａｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって、言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受け入れられている１文字記号によって言及され得る。
【００３５】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む核酸を包含する。そうではないと示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つ以上（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；およびＣａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８）。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換可能に使用される。
【００３６】
「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のアミノ酸配列もしくは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指し、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一である配列を指す。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、所定の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、コドンＧＣＣ、コドンＧＣＧ、およびコドンＧＣＵは、すべて、アミノ酸であるアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるどの位置でも、その子ドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載される対応するコドンのうちのいずれかに変更され得る。そのような核酸変化形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、「サイレント変化形」であり、これは、保存的に改変された改変形のうちの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、その核酸のあらゆる可能なサイレント変化形を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（本来メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧと、本来トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一である分子を生じるように改変され得ることを、認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化形が、記載される各々の配列において暗示される。
【００３７】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における１つのアミノ酸または少数のアミノ酸を変化、付加、もしくは欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個別の置換、欠失、もしくは付加は、その変化が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に改変された改変体」であることを、当業者は認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えて存在し、これらの本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子を排除しない。
【００３８】
以下の８つのグループの各々は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ），；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００３９】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、種々の組織化レベルに関して記載され得る。この組織化の一般的考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチドにおける局所的に秩序立った３次元構造を指す。これらの構造は、一般的にはドメインとして公知である。ドメインは、ポリペプチドの部分であり、この部分は、そのポリペプチドの小型単位（ｃｏｍｐａｃｔ  ｕｎｉｔ）を形成する。ドメインは、代表的には、２５アミノ酸長〜約５００アミノ酸長である。代表的なドメインは、組織化の程度が少ない部分（例えば、一連のβ−シートおよびα−へリックス）から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的会合によって形成される三次元構造を指す。異方性項（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｔｅｒｍｓ）はまた、エネルギー項（ｅｎｅｒｇｙ  ｔｅｒｍ）としても公知である。
【００４０】
用語「単離された」および「精製された」とは、その天然状態において見出されるような通常付随する成分を実質的にも本質的にも含まない物質を指す。しかし、用語「単離された」とは、電気泳動ゲルまたは他の分離媒体において存在する成分を指すことは、意図されない。単離された成分は、そのような分離媒体、および別の適用における使用準備ができているかまたは新たな適用／環境において既に使用中である形態を、含まない。
【００４１】
（スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系）
本発明の一局面は、蛍光タンパク質および発色団タンパク質の可溶性自己相補性フラグメントを提供する。別々には、それらのフラグメントは、上記蛍光「レポーター」表現型も色素原性「レポーター」表現型も提示しない。物理的に近接している場合、上記フラグメントは、自然に補完し、それによって、それらのフラグメントが由来するタンパク質を再構成して、レポーター表現型を回復する。そのようなフラグメントの相補性の組は、「スプリット」蛍光タンパク質系または「スプリット」発色団タンパク質系と呼ばれる。これらの系は、ＧＦＰ、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、ＧＦＰ様非蛍光タンパク質、およびその改変体から生成され得、そして生細胞において、細胞溶解物において、または他のインビトロアッセイ形態において、可溶性タンパク質もしくは不溶性タンパク質をタグ化して検出するために有用である。本発明のスプリット蛍光系およびスプリット発色団系の他の種々の用途が、企図される。
【００４２】
本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質は、使用するのが簡単であり、そのレポーター表現型を検出するために外因性試薬は必要としない。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、それらのフラグメントに融合された試験タンパク質の溶解度特徴を変化させない。他の実施形態において、フラグメントは、そのフラグメントに融合した試験タンパク質の溶解度を変化させ得、それにも関わらず、タンパク質溶解度スクリーニングとして有用であり得る。
【００４３】
本発明のこの局面を示すために、溶解度増強ＧＦＰ（米国特許出願第１０／４２３，６８８号：ＷＯ  ０３／０９５６１０）の自己補完性フラグメントのいくつかの組が、構築されて、下記の実施例６、実施例９、実施例１０においてさらに記載されるように、一連のタンパク質検出アッセイおよびタンパク質定量アッセイにおいて、そして精製方法において、使用された。これらの「スプリット−ＧＦＰ」タンパク質検出系は、インビボおよびインビトロ（すなわち、生細胞由来の可溶性発現タンパク質、粗溶解物における可溶性発現タンパク質、ならびに精製操作および下流操作の間の任意のサンプルにおける可溶性発現タンパク質）における、可溶性タンパク質含量、不溶性タンパク質含量、および／または全タンパク質含量の信頼性のある定量を示す。
【００４４】
上記ＧＦＰタンパク質、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、およびＧＦＰ様発色団タンパク質のうちのいずれかが、本発明の実施において使用され得る（下記の小見出し（蛍光タンパク質および発色団タンパク質）におけるこのファミリーのタンパク質の説明を参照のこと）。さらに、本発明の概念は、他のスプリットレポータータンパク質系の作製へと拡張され得る。その系は、検出可能な表現型を有する多数のタンパク質（例えば、酵素β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（Ｕｌｌｍａｎｎ，Ｊａｃｏｂら、１９６７；Ｗｅｌｐｌｙ，Ｆｏｗｌｅｒら、１９８１；ＷｏｒｒａｌｌおよびＧｏｓｓ  １９８９；Ｊａｐｐｅｌｌｉ，Ｌｕｚｚａｇｏら、１９９２；Ｒｏｓｓｉ，Ｂｌａｋｅｌｙら、２０００；Ｗｉｇｌｅｙ，Ｓｔｉｄｈａｍら、２００１；Ｌｏｐｅｓ  ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＡｌｉｘ  ２００２）、ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｇｅｇｇ，Ｂｏｗｅｒｓら、１９９７；ＩｗａｋｕｒａおよびＮａｋａｍｕｒａ  １９９８；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｖａｌｏｉｓら、１９９８；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ａｒｎｏｄｔら、１９９９；Ｉｗａｋｕｒａ，Ｎａｋａｍｕｒａら、２０００；ＳｍｉｔｈおよびＭａｔｔｈｅｗｓ  ２００１；Ａｒａｉ，Ｍａｋｉら、２００３）、クロラムフェニコール耐性タンパク質）を使用する。
【００４５】
スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系は、多数のタンパク質検出アッセイおよびタンパク質定量アッセイを可能にする。これらのアッセイは、時間がかかってロボット化が困難なタンパク質の検出および定量のための従来技術（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドットブロットなど）を上回る主要な利点を提供する。例えば、本発明のスプリット−ＧＦＰ系を使用するタンパク質の検出および定量は、高い程度の感度を提供し、これによって、生細胞または粗細胞溶解物におけるピコモル濃度のタンパク質検出が可能になる（下記の実施例９および実施例１０を参照のこと）。さらに、上記アッセイ系は、強固であり（すなわち、変性剤、ｐＨ条件、およびアジュバントを許容する。下記の実施例８を参照のこと）、折り畳みされていないペレットからのタンパク質の定量を可能にし、それによって、全タンパク質発現を定量するための手段、およびタンパク質リ折り畳み試薬をスクリーニングする差異の可溶性タンパク質回収を評価するための手段を提供する。
【００４６】
本発明のスプリット蛍光タンパク質系の設計は、下記の通りに簡単に示され得る。当業者によって認識されるように、スプリット発色団タンパク質検出系の設計は、同じ工程および同じ原理を含む。第一に、対象とする蛍光タンパク質が、個々のフラグメントを作製するための適切なスプライス点を決定するために、構造分析される。当業者によって理解されるように、これは、上記蛍光タンパク質の公知の結晶構造（ＧＦＰ結晶構造または別の蛍光タンパク質結晶構造に重ね合わせるかまたは重ね合わせないかのいずれかである）を参照することによって、ＧＦＰとの一次配列アライメントによって、（公知の蛍光タンパク質構造（すなわち、ＧＦＰ）に関する）推定構造モデリングなどによって、達成され得る。
【００４７】
適切なスプライス（または「スプリット」）点は、β−シート間、特に、ループモチーフとターンモチーフとの間の配列において見出される（図３Ａおよび図３Ｂを参照のこと）。単純な２フラグメント系の設計において、蛍光タンパク質は、連続的なβ鎖の間（すなわち、β鎖の間に存在するターンモチーフ内またはループモチーフ内）におけるその分子の任意の点で２つのフラグメントへと分割され得、第一組の連続β鎖に対応する第一フラグメントと、第二組の連続β鎖に対応する第二フラグメントとが作製され、β鎖の全補完体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）は、上記２つのフラグメントの組み合わせ中に含まれる。従って、例えば、上記蛍光タンパク質を、鎖１−９および鎖１０−１１に対応するフラグメント、または鎖１−１０および鎖１１に対応するフラグメントに分割し得る。上記蛍光（または発色団）タンパク質の１１個すべてのβ鎖は、フラグメントの組み合わせの状態で表わされる。蛍光タンパク質の円順列がまた、ネイティブＮ末端とネイティブＣ末端とを連結すること、および新たな開始コドンおよび終止コドンを導入することによって作製され得、そして連続するβ鎖に対応するフラグメント（例えば、予め入れ替えられた鎖９−１および２−８に対応するフラグメント）へと分割され得ることが、留意されるべきである。例示的な２フラグメントスプリットＧＦＰ系が、下記の実施例２、実施例１１、実施例１３に記載される。
【００４８】
同様に、３フラグメント系が作製されるべき場合には、上記蛍光タンパク質は、例えば、β鎖１−９、β鎖１０およびβ鎖１１に対応するフラグメントへと分割され得る。例示的な３フラグメントスプリットＧＦＰ系が、下記の実施例１２に記載される。
【００４９】
一旦、上記フラグメントの設計が実現されると、それらのフラグメントをコードする構築物は、当該分野で周知のクローニング方法を使用して調製され得る（例えば、下記の実施例１および実施例２を参照のこと）。
【００５０】
代替的なアプローチにおいて、同じ蛍光タンパク質または関連する蛍光タンパク質の種々のフラグメントの組が、補完資格について経験的に評価され得る。例えば、実施例２において記載されるように、ＧＦＰフラグメントのいくつかの対が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて適合性プラスミド上で共発現され得、そして補完および相対的蛍光について評価され得る。このアプローチは、蛍光タンパク質改変体の群（すなわち、超折り畳みＧＦＰおよびサイクル３  ＧＦＰ；実施例２を参照のこと）から有望なフラグメントの組を初期に迅速にスクリーニングすることを可能にし得る。その後、このスクリーニングから選択される個別のフラグメントが、溶解度を改善し、試験タンパク質の溶解度変動を弱めるように、進化され得る（下記の小見出し（スプリットタンパク質フラグメント操作）および下記の実施例３および実施例４を参照のこと）。
【００５１】
本発明のスプリット蛍光タンパク質系またはスプリット発色団系を使用するタンパク質検出は、すべての適用について原理について本質的に従う。簡単に述べると、上記蛍光（または発色団）タンパク質のフラグメントのうちの１つ（「タグ」フラグメント）が、試験タンパク質との融合物として発現される。その試験タンパク質が可溶性である場合、その融合物は可溶性であり、従って、そのレポータータンパク質のもう一方のフラグメント（「アッセイ」フラグメント）との補完のために利用可能である。これは、試験タンパク質−タグ融合タンパク質にとって、例えば、同じ細胞において試験タンパク質を発現させること、上記融合タンパク質を発現する細胞にその試験タンパク質を添加することなどによって、利用可能になる。対照的に、上記試験タンパク質が不溶性である場合、または上記試験タンパク質が、部分的にのみ可溶性である場合、上記試験タンパク質は、凝集し、それによって、融合したタグフラグメントを「埋没させ」、それによって、試験タンパク質−タグ融合物を、不溶性にし、そして上記アッセイフラグメントとの補完のために接近不能にする。補完が生じる場合、検出可能なレポーター表現型は、活性化される。例えば、蛍光タンパク質がレポーターとして使用される場合、個別に発現されたフラグメントの自己補完後の特徴的なβ−バレル構造の再構成によって、上記発色団の形成が可能になり、それによって、検出可能な蛍光が放出される。上記系がスプリットＧＦＰ系を使用してどのようにして作動するかについての模式図が、図２において示される。
【００５２】
スプリット蛍光タンパク質フラグメントは、それらのフラグメントが使用されるべき特定のアッセイの環境において折り畳まれ得かつ可溶性であり得る。好ましい実施形態において、個々のフラグメントの折り畳み／溶解度が、試験され、そして代表的には、可溶性「タグ」フラグメントと可溶性「アッセイ」フラグメントを分離するために進化される。好ましい溶解度アッセイ適用において、上記タグフラグメントは、１個と３個との間の個数のβ鎖であり、最も好ましい適用において、そのタグは、一本のβ鎖である。試験タンパク質が、このタグフラグメントに融合される。このタグフラグメントは、好ましくは、融合した試験タンパク質に対して実質的に変動性ではない。換言すると、その試験タンパク質単独の溶解度および折り畳みは、上記タグと融合した場合の試験タンパク質の溶解度および折り畳みと類似する。
【００５３】
スプリットＧＦＰ系を使用する実験結果（実施例２を参照のこと）に基づいて、溶解度アッセイにおける最適性能は、比較的大きなアッセイフラグメント（例えば、約８個〜約１０個連続するβ鎖）と、試験タンパク質が融合される比較的小さなタグフラグメント（例えば、約１個〜約３個連続するβ鎖）とを使用することによって、達成される。そのアッセイフラグメントは、可溶性であり、そしてタグフラグメント−試験タンパク質融合物にとって補完のために利用可能であり、そのタグフラグメントは、試験タンパク質の溶解度に対して非変動性である。理想的には、ほとんどの適用について、上記試験タンパク質単独の溶解度と、タグフラグメントと融合した状態の試験タンパク質の溶解度とは、ほぼ同じである。そのアッセイフラグメントは、理想的にはモノマーであり、そして自然に凝集することも誤折り畳みされることもない。
【００５４】
多くの適用において、非変動性タグフラグメントの使用が好ましいが、それにも関わらず、タグフラグメントは、蛍光と溶解度との間の実質的な比例性が存在する（しかし、必ずしも、正比例しない）限りには、試験タンパク質の溶解度に対して変動性であり得、そして溶解度スクリーニングアッセイにおいて有用なままである。いくつかの実施形態において、非変動性タグフラグメント（下記のサンドイッチ形式アッセイの説明を参照のこと）（例えば、目的は、高可溶性タンパク質をスクリーニングすることである）を使用することが、実際には、望ましくあり得る。この場合、非変動性タグフラグメントの使用は、すべてではないがほとんどの可溶性タンパク質またはタンパク質の変化形に対して有効に選択され得る。また、そのような適用におけるアッセイフラグメントは、可溶性であるべきである。なぜなら、不溶性変化形は、可溶性試験タンパク質−タグフラグメント融合物に対する補完のために利用可能ではないからである。
【００５５】
最適な性能のために蛍光タンパク質フラグメントを進化させるための方法もまた、下記の小節（スプリットタンパク質フラグメント操作において記載され、下記の実施例３および実施例４において示されるように、本明細書中にて提供される。これらの方法は、発色団タンパク質に対して同様に適用され得、そしてスプリット蛍光タンパク質系について記載される本明細書中の特徴を有するスプリットタンパク質系の作製のために、検出可能な表現型を有する任意のタンパク質に適用され得る。
【００５６】
種々のアッセイ形態が、本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質を使用してタンパク質を検出および定量するために使用され得る。タンパク質の検出および定量のためのいくつかの例示的アッセイが、さらに下記に記載される。さらに、これらのアッセイのうちのほとんどは、下記の実施例の節において記載されるように、実験的に実証されている。
【００５７】
本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系は、タンパク質溶解度スクリーニング、タンパク質の検出および定量、タンパク質精製、タンパク質の折り畳みおよび凝集、タンパク質の溶解度および収量を改善するための指向性進化ストラテジーなどにおいて、種々の適用を有する。これらの適用は、ここに簡単に記載される。これらの適用の例はまた、下記の実施例の節において見出される。
【００５８】
（タンパク質検出アッセイおよびタンパク質定量アッセイ）
本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質は、下記に記載されそして下記の実施例によって示されるように、タンパク質をインビトロまたはインビボで検出および定量するために使用され得る。本発明のこの局面は、可溶性タンパク質または不溶性タンパク質の検出用アッセイ、および可溶性タンパク質発現、不溶性タンパク質発現、または全タンパク質発現の定量用アッセイを提供する。検出アッセイおよび定量アッセイにおいて、上記スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット色素タンパク質系が、上記に一般的に記載されるように使用される。スプリット蛍光系を使用する、本発明のこの局面の種々の実施形態が、下記に概説される。しかし、類似する実施形態が、スプリット発色団タンパク質系について存在することが、理解されるべきである。
【００５９】
（インビトロ検出アッセイ）
一実施形態において、可溶性タンパク質を検出するための迅速なインビトロアッセイが、提供され、このアッセイは、第一蛍光タンパク質タグフラグメントと試験タンパク質Ｘとの融合物（例えば、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ）を発現する細菌（または他の）細胞を溶解する工程、その溶解物を、第二補完蛍光タンパク質アッセイフラグメントと接触させる工程、および検出可能な蛍光についてスクリーニングする工程を包含する。このアッセイにおける検出可能な蛍光の存在は、上記試験タンパク質が可溶性であるという指標を提供する。このアッセイ系は、改変体ライブラリーからのタンパク質の可溶性改変体のハイスループットスクリーニングに従い、このアッセイ系は、改善された溶解度特徴を示す改変体の迅速な同定を提供し、それによって、さらに進化され得る最適な迅速な識別を可能にする。このアッセイは、下記の実施例９において記載されるように、液体細胞培養物の粗溶解物から直接実施され得る。
【００６０】
２フラグメントスプリットＧＦＰ系を使用するインビトロ可溶性タンパク質検出アッセイの実施は、下記のように簡単に説明され得る。試験タンパク質が、ＧＦＰタグフラグメントのＮ末端に融合され（すなわち、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１）、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、その細胞が溶解される。過剰な量の補完性ＧＦＰアッセイフラグメント（すなわち、ＧＦＰ  １−１０）が、その溶解物または溶解物のサンプルと合わされる。検出可能な蛍光は、そのアッセイフラグメントと、試験タンパク質−タグフラグメント融合物との間の補完を示し、これによって、その試験タンパク質が可溶性であるという指標を提供する。さらに、使用されるタグフラグメントが、試験タンパク質溶解度を実質的に変動させない場合、得られる蛍光シグナルの強度は、可溶性試験タンパク質の量に正比例する。従って、この系において、蛍光の程度は、（較正されたタンパク質量曲線を参照することによって）その溶解物サンプル中に存在する可溶性試験タンパク質の量の正確な定量を提供する（下記および実施例６を参照のこと）。実際、そのタグフラグメントが試験タンパク質溶解度を変動させる場合でさえ、試験タンパク質の量と、蛍光の強度との間には、比例関係が存在する。検出可能な蛍光が完全に存在しないことまたは実質的に存在しないことは、そのタグフラグメント−試験タンパク質融合物が可溶性ではなかったこと、または実質的に不溶性であったこと、従って、その可溶性の大きなフラグメントで補完することが不可能であったことを示し、それによって、その試験タンパク質自体がＥ．ｃｏｌｉにおいて可溶性ではないという指標を提供する。
【００６１】
本明細書中に記載されるスプリットＧＦＰ系において、その試験タンパク質の溶解度は、その融合物のタグＧＦＰフラグメント成分がその補完体と会合するために利用可能であるか否かを決定する。その試験タンパク質が正確に折り畳まれておりかつ可溶性である場合、その融合物もまた、可溶性であり、従って、その可溶性アッセイフラグメントによる補完のために利用可能である。しかし、その試験タンパク質が不溶性である場合、その試験タンパク質は凝集し、そのタグドメインを隠すかまたは埋没させるかして、その融合物を不溶性にする。一般的には、試験タンパク質は、上記タグフラグメントのＮ末端に融合される（試験タンパク質−タグ）。Ｃ末端融合物（タグ−試験タンパク質）もまた、使用され得るが、そのような適用においては、そのタグフラグメントは、その試験タンパク質の折り畳みに有害な影響を与える可能性が高い。しかし、非常に溶解度の高いタンパク質のみをスクリーニングすることを望む適用においては、Ｃ末端融合物（タグ−試験タンパク質）の使用は、すべてでなはいがほとんどが溶解度の高いタンパク質に対して選択され得る。
【００６２】
種々の３フラグメント系もまた、企図される。一実施形態において、ＧＦＰは、代表的には、１つの大きなアッセイフラグメントと、それよりも小さい２つのタグフラグメントとして、３つのフラグメントへ分割される。その試験タンパク質は、この２つのタグフラグメントの間にインフレームで挿入され（すなわち、Ｓ１０−ｘ−Ｓ１１）、そのアッセイフラグメント（この場合は、ＧＦＰ  １−９）による補完は、その試験タンパク質が可溶性である場合にはＧＦＰ蛍光を再構成する。３フラグメント系（すなわち、Ｓ１−９  ＋  Ｓ１０−ｘ−Ｓ１１スプリットＧＦＰ系）は、下記の（（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）サンドイッチタグ形式の操作、およびアッセイフラグメントＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いた検出）と題する小節、実施例１２においてさらに記載される。。これらの「サンドイッチ」型可溶性タンパク質検出アッセイ形態は、いくつかの適用（例えば、変異型タンパク質のライブラリーが、増加した可溶性タンパク質収量についてスクリーニングされるべき場合）において、利点を提供する。このサンドイッチ形式は、全長でありかつインタクトな試験タンパク質のみが検出されることを確実にする。変異により試験タンパク質中に導入されるリーディングフレームシフトまたは内部リボソーム結合部位は、融合した完全Ｓ１０−ｘ−Ｓ１１を生じず、従って、補完は生じない。従って、この系の使用は、指向性進化ストラテジーにおいてこれらの異常なクローンを効果的に排除する。
【００６３】
（インビボタンパク質検出アッセイ）
関連するインビボ実験において、細胞が、両方（またはすべての）補完フラグメントを発現するように操作される。それらの補完フラグメントのうちの一つまたは２つは、試験タンパク質に融合される。それらのフラグメントは、同時または連続的に発現され得、これは、そのアッセイが、全タンパク質発現を検出（および定量）ことを目的とするか、または可溶性画分および／または不溶性画分のみを検出（および定量）することを目的とするかに依存する。その２つのフラグメントの連続発現が、一般的には好ましい。なぜなら、共発現は、共発現ではなければ不溶性である試験タンパク質を隠し得るからである（上記を参照のこと）。試験タンパク質−タグフラグメント融合物の連続発現（または付加）と、その後の補完アッセイフラグメントの発現は、不溶性試験タンパク質−タグ融合物が凝集して補完を妨げる時間を提供する。
【００６４】
より具体的には、例えば、試験タンパク質のコード配列は、レポータータンパク質の自己補完性フラグメント対の可溶性第一タグフラグメントにインフレーム（５’→３’）で融合され、第一独立誘導性プロモーターの制御下に配置される。その自己補完性フラグメント対の可溶性第二アッセイフラグメントのコード配列が、第二独立誘導性プロモーターの制御下に配置される。セラ得る２つの核酸構築物は、それらのプロモーターが別個に誘導可能であるという条件で同じベクターまたは別々のベクター（すなわち、１つのプラスミドまたは２つのプラスミド）中に組み込まれ得る。宿主細胞が、それらのベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。上記構築物を保有する細胞は、まず、基本条件下で培養され、上記の独立誘導性プロモーターの両方の抑制を可能にする。その後、細胞は、試験タンパク質−タグフラグメント融合物を、その融合タンパク質の発現を可能にするのに充分な時間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、代表的には約１／２時間〜３と１／２時間）の間発現するように誘導され、その後、「休止」時間（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて約１／時間〜１と１／２時間）が続くことによって、その細胞から誘導因子が拡散して出て行くことが可能になる（または、哺乳動物細胞においては、例えば、そのプロモーターを停止するためにアンチセンスポリヌクレオチドを使用する、そのプロモーターの能動的抑制による）。その後、細胞は、代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて約１／２時間〜４時間の間、上記アッセイフラグメントを発現するように誘導される。別の実施形態は、哺乳動物細胞に関して、「休止」期間の後、または第一誘導性プロモーターの能動的抑制の後に、アッセイフラグメントタンパク質を導入するためのタンパク質トランスフェクションを使用する（下記を参照のこと）。
【００６５】
２つの独立して制御可能なプロモーターの系は、記載されており、そして当該分野で周知である。例えば、ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ、１９９７、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｌａｃＲ／Ｏ，ｔｈｅ  ＴｅｔＲ／Ｏ  ａｎｄ  ＡｒａＣ／１−１２  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（６）：１２０３〜１２１０を参照のこと。
【００６６】
一例において、そのプロモーターがＬａｃＩｑタンパク質およびアラビノースインデューサー／リプレッサーの制御下にあるベクターが、そのアッセイフラグメントの発現のために使用され得る（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能であるｐＰＲＯＬＡＲベクター）。抑制は、ＩＰＴＧおよびアラビノースを増殖培地に供給することによって取り除かれ、クローン化されたアッセイフラグメントの発現を生じる。この系において、ａｒａｃリプレッサーが、宿主であるＥ．ｃｏｌｉ細胞の遺伝的バックグラウンドによって供給される。試験タンパク質−タグ融合物構築物の制御された発現のために、この構築物がテトラサイクリンリプレッサータンパク質の抑制下にあるベクターが、使用され得る（例えば、ｐＰＲＯＴＥＴベクター；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。この系において、抑制は、無水テトラサイクリンを増殖培地に供給することによって取り除かれ、試験タンパク質−タグ融合物構築物の発現をもたらす。ｔｅｔＲリプレッサータンパク質およびＬａｃＩｑリプレッサータンパク質が、第三のベクターにて供給され得るか、またはこのフラグメントを保有するベクター中に組み込まれ得る（下記の実施例１を参照のこと）。
【００６７】
試験タンパク質−タグ融合物とその後のアッセイフラグメントとの連続発現のために上記系を使用する際に、上記構築物で形質転換された細胞にアンヒドロテトラサイクリンを添加すると、ｔｅｔリプレッサーを置換し、試験タンパク質−タグ融合物の発現が、誘導される。その後、細胞は、新鮮な培地を含む新しいプレートに移され、そのアンヒドロテトラサイクリンは、約１時間かけてこの培地中に拡散させられ、その後、ｔｅｔリプレッサーが、再度上記プロモーターに結合して発現を停止する。その後、別個に誘導可能なＴ７プロモーターが、ＩＰＴＧの添加によって活性化され、上記アッセイフラグメントの発現を誘導する。そのアッセイフラグメントの発現は、可溶性第一フラグメント−タグタンパク質融合物による自己補完を可能にするために充分な時間の間、進行する。蛍光（またはスプリット発色団タンパク質系を使用する場合は、色）の検出は、可溶性試験タンパク質−タグ融合物を検出する。下記の実施例４を参照する。
【００６８】
上記インビボ溶解度アッセイは、ハイスループットスクリーニングしやすい。なぜなら、タグフラグメントに融合された試験タンパク質の改変体を発現する多数の細胞が、その細胞において発現されるかまたはその細胞に供給されるアッセイフラグメントによる補完から生じる蛍光によって示される、溶解度についてアッセイされ得る。細胞選別が、検出可能な蛍光を示す細胞を分離するために使用され得、従って、試験タンパク質の可溶性改変体を発現する細胞を、検出可能な蛍光も示さない細胞または低レベルの蛍光しか示さない細胞から分離するために使用され得る。
【００６９】
好ましいインビボ溶解度アッセイの実施形態は、個々のフラグメントが連続的に発現される（すなわち、試験タンパク質−タグフラグメント融合物の発現の後に、レポーターの自己補完性フラグメントの発現が生じる）、実施形態である。連続的発現によって、不溶性試験タンパク質が凝集するのが可能になり、それによって、その不溶性試験タンパク質が融合されるレポーターフラグメントが、そのレポーターの他のフラグメントによる補完には利用不能になる。従って、一般的には、本発明のインビボ溶解度アッセイ適用のためには、試験タンパク質−タグフラグメント融合物の発現は、不溶性融合物の凝集を可能にするために充分な時間の間、自己補完性フラグメントの発現に先行する。いくつかの（例えば、哺乳動物細胞を使用する）実施形態において、試験タンパク質−タグフラグメント融合物の発現は、その融合物が発現された後に停止され、その後、自己補完性フラグメントの発現が、活性化される。このようにして、最も正確なアッセイが、実施される。対照的に、レポーターフラグメント−タグタンパク質融合物および自己補完性フラグメントの両方の共発現は、溶解度アッセイの結果を損ない得る。なぜなら、この共発現によって、共発現しなければ不溶性である試験タンパク質が発現直後に一過性溶解するのを可能にし、それによって自己補完を可能にするからである。
【００７０】
（タンパク質定量アッセイ）
上記溶解度検出アッセイの両方が、試験タンパク質の定量にまで、より具体的には、可溶性画分発現、不溶性画分発現、および全タンパク質発現の定量にまで拡張され得る。可溶性タンパク質画分および不溶性タンパク質画分を定量するためのインビトロアッセイの一実施形態において、試験タンパク質−タグフラグメント融合物（例えば、ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１）を発現する細胞が、溶解され、そしてその不溶性画分が、ペレット化される。その可溶性画分を含む上清が、その後、補完性アッセイフラグメントと（すなわち、補完性フラグメントを含む一連のマイクロタイタープレートウェル中で）混合され、蛍光がモニターされる。あるいは、そのアッセイフラグメントは、溶解物に添加され得、連続して反応体積に添加され得る。蛍光の程度は、可溶性タンパク質の量に正比例し、可溶性タンパク質の量は、標準較正曲線（下記の実施例６に記載されるようにして作成される）を参照することによって、決定され得る。その不溶性タンパク質画分は、そのペレットタンパク質を変性させて再折り畳みさせること、そしてこの調製物を補完性アッセイフラグメントと合わせることによって、定量される。このアプローチの変化形において、全タンパク質発現が、測定され、そして可溶性タンパク質量と比較されて、不溶性タンパク質量が決定される。関連する実施形態において、全タンパク質量（可溶性タンパク質量＋不溶性タンパク質量）は、折り畳まれていない補完性フラグメントをともに再折り畳みすることによって、インビトロで定量され得る。
【００７１】
関連する実施形態において、全タンパク質量（可溶性タンパク質量＋不溶性タンパク質量）は、試験タンパク質‐タグフラグメント融合物と補完性フラグメントとの共発現によって、インビボでアッセイされ得る。蛍光の程度は、全タンパク質の量に比例する。下記の実施例９を参照のこと。
【００７２】
（サンドイッチ形式のスプリット蛍光タンパク質系）
レポーター蛍光タンパク質およびレポーター発色団タンパク質は、自己補完して再構成型レポータータンパク質を形成可能な３つ（またはそれ以上の）個々のフラグメントへと分割され得る。サンドイッチ形式タンパク質検出アッセイの一実施形態において、その蛍光タンパク質または発色団タンパク質の２つのタグフラグメントは、試験タンパク質に融合される。これらのフラグメントは、一緒になって、第三フラグメントによって補完されて蛍光表現型または発色団表現型を再構成することが可能である。例えば、試験タンパク質は、ＧＦＰの２つの連続するβ鎖の間に挿入され得る（すなわち、ＧＦＰ  Ｓ１０−ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１）。可溶性タンパク質の検出は、ＧＦＰ１−９による検出可能な補完によって達成される。この実施形態において、その３つのフラグメントの補完は、試験タンパク質を可溶性かつ全長であると同定し、これは、ｘに融合されたＧＦＰの２つのフラグメントが、ｘによって機能的に連結されることを示す。特に指向性進化ストラテジーの状況において、このアプローチは、試験タンパク質ｘが実際に全長でありかつインタクトであることを確実にし（一方、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１は、ＧＦＰ１−１０のみを補完し、ＧＦＰ１−９は補完しない）、試験タンパク質の短縮形または初期リボソーム結合部位を組み込んだ変化形またはタンパク質分解した変化形の出現を防ぐという利点を提供する。
【００７３】
より厳密な関連する溶解度アッセイ実施形態は、試験タンパク質に融合した２つのタグフラグメントを利用し、それらのフラグメントの各々は、独立した識別可能な第三補完アッセイフラグメントを用いて機能的に再構成することによって、独立して検出され得る。より具体的には、ＧＦＰ  Ｓ１０−ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１という融合物において、鎖１０は、円順列ＧＦＰ  １１−９Δ１０（円順列１１−１−２−３−４−５−６−７−８０９（１１と１とが連結されており、１０を欠いている。数字は、鎖を指す。図３を参照のこと））によって検出可能である。一方、鎖１１は、１−１０Δ１１（１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０（１１を欠いている））によって検出可能である。上記２つのタグを独立して同時に検出することは、１つの補完対または両方の補完対の色シフト改変体を利用することによって容易になり得る（すなわち、ＧＦＰ１１−９Δ１０が、シアン色改変体（Ｙ６６Ｗ）であり得、ＧＦＰ１−１０Δ１１が、黄色改変体（Ｔ２０３Ｙ）であり得る）。あるいは、それらのタグフラグメントは、別個のアミノ酸配列を有する複数の蛍光タンパク質から誘導され得、そして対応する適切なアッセイフラグメントを用いて検出され得る。例えば、ＧＦＰ由来の鎖１１は、試験タンパク質ＸのＮ末端をタグ化するために使用され得、ＧＦＰの鎖１−１０を用いて検出され得る。一方、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３）由来の鎖１１は、同じ試験タンパク質ＸのＣ末端への融合物として同時に使用され得、そしてＤｓＲｅｄの鎖１−１０を用いて検出され得る。
【００７４】
別の実施形態は、試験タンパク質によって連結された２つの再構成されたＧＦＰの間で示されるＦＲＥＴを利用する。例えば、ＣＦＰ１１−９Δ１０：：１０−Ｘ−１１：：ＹＦＰ１−１０が、使用され得る。そのような構築物は、ＣＦＰ−ｘ−ＹＦＰに対して機能的に等価である。ＣＦＰ−ｘ−ＹＦＰは、ｘがインタクトである限りはＣＦＰドナーからＹＦＰアクセプターへのＦＲＥＴを示し、ｘが切断された場合にはＦＲＥＴを失い、近接状態からＣＦＰおよびＹＦＰを遊離させ、ＦＲＥＴの効率は、（１／ｒ６）（ｒは、ドナーとアクセプターとの間の距離である）に依存することが、以前に示されている。
【００７５】
（原核生物細胞培養物における適用および真核生物細胞培養物における適用）
本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系が、事実上すべての細胞型（細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない）におけるアッセイに適用され得る。１つの限定事項は、ＧＦＰタンパク質およびＧＦＰ様タンパク質の発現は、高酸性環境（すなわち、ｐＨ＝４．０以下）では弱められることである。同様に、補完率は、一般的には、ｐＨ６．５以下の条件下では非効率的である（下記の実施例８を参照のこと）。
【００７６】
当業者によって認識されるように、タグフラグメントおよび／またはアッセイフラグメントを発現するために使用されるベクターは、そのベクターが存在する宿主細胞と適合性でなければならない。同様に、種々のプロモーター系が、利用可能であり、細胞型、株などとの適合性について選択されるべきである。コドン最適化技術が、周知であるような他の細胞において使用するために配列を適合するために使用され得る。
【００７７】
本発明の保管アッセイのために哺乳動物細胞を使用する場合、コドン最適化のための代替法は、化学的トランスフェクション試薬（例えば、最近記載された「チャリオット（ｃｈａｒｉｏｔ）」系（Ｍｏｒｒｉｓら、２００１、Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７３〜１１７６））の使用である。そのＣｈａｒｉｏｔＴＭ試薬は、哺乳動物細胞の細胞質中にタンパク質を直接トランスフェクトするために使用され得る。従って、このアプローチは、インビボタンパク質検出アッセイのために有用である。このアッセイにおいて、そのアッセイフラグメントは、細胞によって遺伝子によりコードされる試験タンパク質−タグフラグメント融合物が発現する前または後のいずれかに、細胞中に導入され得る。
【００７８】
（溶解度が増強されたタンパク質改変体を単離するための方法）
上記のタンパク質溶解度アッセイは、進化していない親タンパク質と比較して改善された溶解度特徴を有するタンパク質改変体を単離することを目的とする指向性進化ストラテジーと組み合わせて、使用され得る。
【００７９】
変異型タンパク質改変体のライブラリーを作製するための当該分野で公知の任意の方法が、タグフラグメントとの融合物として発現され得る候補試験タンパク質を生成するために使用され得る。その標的タンパク質または標的ポリペプチドは、通常は、その核酸を変異させることによって変異される。変異させるための技術は、当該分野で周知である。これらの技術としては、エラープローンＰＣＲ、化学的変異誘発、およびカセット変異誘発などの技術が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、宿主細胞のミューテーター株が、変異頻度を増加するために使用され得る（ＧｒｅｅｎｅｒおよびＣａｌｌａｈａｎ（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２）。例えば、エラープローンＰＣＲ（例えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌを参照のこと）は、長い配列全体にわたってランダムに低レベルの点変異を導入するために、低忠実度ポリマー化条件を使用する。他の変異誘発方法としては、例えば、組換え（ＷＯ９８／４２７２７）；オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３〜４６２（１９８５）；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３〜１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１〜７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ「Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５００（１９８３）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９〜３５０（１９８７）における概説を参照のこと）；ホスホチオエート媒介性ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９〜８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５〜８７８７（１９８５）；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：９６７９〜９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１〜８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３〜８１４（１９８８））；ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２（１９８５）およびＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２，１９８７）；ギャップ付き二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１〜９４５６（１９８４）；ＫｒａｍｅｒおよびＦｒｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０〜３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８））；ならびにＦｒｉｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７〜６９９９（１９８８））が挙げられる。さらなる方法としては、ポイントミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ  ３８：８７９〜８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用する変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２〜４０３（１９８７））、欠失変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｎおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６））、制限選択および制限増幅（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５〜４２３（１９８６））、完全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９〜１３０１（１９８４）；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１〜６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５）；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５〜３３１６（１９８５）が挙げられる。変異誘発のためのキットが、市販されている（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。より最近のアプローチとしては、コドンベースの変異誘発が挙げられ、このアプローチにおいては、Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：７６〜８１に記載されるＲＩＤ方法によって例証されるように、コドン全体が置換され、それによって生じた変異体の多様性が増加する。
【００８０】
細菌発現系において、改変体を発現するクローンは、上記のインビボアッセイまたはインビトロアッセイを使用して、溶解度について迅速にスクリーニングされ得る。従って、インビボでの実施形態において、クローンのライブラリーが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製され、その各々のクローンは、第一独立誘導性プロモーターの制御下にタグフラグメントに融合した個々の改変体タンパク質をコードする発現可能構築物を保有する。その細胞は、第二の別個に誘導可能なプロモーターの制御下に、補完アッセイフラグメントをコードする発現可能な構築物を同時に保有するか、またはアッセイフラグメントポリペプチド自体を同時に保有する（上記のＭｏｒｒｉｓら（２００１）に記載されるようなタンパク質トランスフェクション方法によって導入される）。
【００８１】
あるインビボ実施形態において、細胞は、タグフラグメント−タンパク質改変体融合物を発現するように、そしてその後にその細胞において補完フラグメントを発現するように、誘導される。最も好ましい実施形態において、その融合物の発現は、不溶性融合物の凝集を可能にするために充分な時間の間（すなわち、１時間；下記の実施例４および実施例１０を参照のこと）抑制または停止され、その後、補完フラグメントの発現を誘導される。このアプローチの変化形において、その細胞は、上記融合構築物のみを、好ましくは誘導性プロモーター／抑制性プロモーターの制御下に保有する。補完フラグメントは、タンパク質トランスフェクション方法論によって導入される。
【００８２】
種々のインビトロ実施形態が、可能である。一般的に、これらは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、改変体タンパク質−タグフラグメント融合物の発現と、その後の細胞溶解、および補完アッセイフラグメントポリペプチドとの反応を包含する。
【００８３】
（タンパク質精製）
本発明の別の局面は、上記の溶解度アッセイにおいて可溶性であると同定されたタンパク質を精製するための、スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質の使用である。簡単に述べると、そのタグフラグメントは、標準的な精製方法を使用して単離され得る基材に結合するようにそのタグを官能基化する、部分またはアミノ酸残基を含むように改変される。一実施形態において、そのタグポリペプチドは、周知の化学物質および市販されている化学物質（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．から市販）を使用して、ガラスビーズに結合するように官能基化される。あるいは、下記の実施例１３において記載されるように、そのタグフラグメントは、金属親和性樹脂ビーズに結合するようにそのタグを官能基化するために、ヒスチジン残基を組み込むように改変される。具体的な実施形態において、ＧＦＰ  Ｓ１１フラグメントは、β鎖中の外側を向いているすべての残基がヒスチジン残基で置換されるように、操作された。このＨＩＳタグフラグメントは、そのフラグメントと融合した試験タンパク質を変動させず、そしてＧＦＰ  １−１０アッセイフラグメントによる補完の際に可溶性タンパク質を検出可能である（実施例１３）。このＨＩＳタグフラグメントは、コバルトビーズカラム中でタンパク質を精製するために使用され得、そしてこのＨＩＳタグフラグメントは、可溶性タンパク質および不溶性タンパク質の定量、ならびに９５％純度までのタンパク質の精製および溶出を、いかなる別の精製タグシステムも必要とせずに可能にする。下記の実施例１３〜１７を参照のこと。
【００８４】
（事前補完）
ＧＦＰフラグメントの補完の間の蛍光形成速度は、その発色団が、適切な発色団アミノ酸を保有するフラグメントにおいて予め形成されたＧＦＰのフラグメントを使用することによって、発色団の環化が全く生じていないフラグメントと比較して、大幅に増加され得る。簡単に述べると、発色団アミノ酸を保有する非蛍光性の事前補完されたＧＦＰフラグメントは、（１）そのフラグメントを、発色団アミノ酸を含まない補完フラグメントと混合すること；（２）補完反応および蛍光形成を完了させること；（３）それらのフラグメントを、例えば、化学的手段によって折り畳みを解いて、折り畳みを解かれた非蛍光ＧＦＰフラグメントを生成させること；（４）発色団アミノ酸を含むフラグメントを回収し、それを他のフラグメントから分離すること；（５）発色団アミノ酸を保有するフラグメントを再生することによって、形成され得る。このフラグメントは、たとえ環化発色団を含むが、実質的に非蛍光性のままである。なぜなら、このフラグメントは、非蛍光性であるように化学的手段または他の手段によって実質的に折り畳みを解かれており、補完フラグメントの非存在下では折り畳みを解かれたままであるからである。蛍光の迅速な回復は、発色団に関連する共有結合改変を生じる必要なく、単に、補完性の非発色団含有ＧＦＰフラグメントを再添加することによって得られる。このアプローチによると、遅い発色団環化反応が完了するので、補完の間の蛍光の形成は、補完フラグメントの結合速度と、折り畳まれたネイティブのβバレル構造の形成とによってのみ、制限される。
【００８５】
（スプリットタンパク質フラグメントの操作）
（可溶性自己補完性フラグメントを単離するための指向性進化ストラテジー）
本発明の別の局面は、フラグメントの指向性進化および連続誘導によって、理想的なスプリットタンパク質相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）を作製するための方法に関する。連続的な誘導の組み込みは、スプリットフラグメントの同時誘導を特定する既存の公開されたアプローチとは対照的である。簡単に述べると、連続誘導アプローチにおいて、フラグメント１が、一定に保たれ、そしてフラグメント２が、進化させられる。フラグメント１が一定に保たれてフラグメント２が進化させられる場合、フラグメント２は、まず発現され、その後、発現が停止される。そのフラグメントは、凝集させられるか、または可溶性のままであるようにされる。次に、フラグメント１が、発現される。両方のフラグメントが同時発現される場合、これは、擬陽性をもたらし得る。なぜなら、凝集の前に補完が生じ得るからである。連続発現は、真の陽性（すなわち、改変体）の選択をもたらす。最適なフラグメント２改変体の選択の後、この改変体は、一定に保たれ、その後、フラグメント１が進化させられる。このプロセスは、望ましいフラグメント溶解度が達成されるまで、さらなる連続誘導を使用して継続され得る。このアプローチを使用して、生じるフラグメントは、補完の前にそれ自体が可溶性であるように操作され得る。
【００８６】
（検出可能なタンパク質の溶解度変動の減弱）
可溶性フラグメントは、融合したパッセンジャードメイン（試験タンパク質）の溶解度に対するその変動効果を減少するようにさらに操作され得る。簡単に述べると、上記フラグメントに融合された場合には単独で発現された場合よりも溶解度が小さい試験タンパク質が、そのフラグメントを、融合物の溶解度と非融合物の溶解度とが同様であることによってその試験タンパク質の溶解度に対するそのフラグメントの効果を減少するように操作することを目的とする指向性進化アプローチにおいて、「おとり（ｂａｉｔ）」ドメインとして使用される。このストラテジーは、小さなＧＦＰフラグメントを最適化する際に使用され、融合されたパッセンジャータンパク質に対する変動効果が減弱した改変体を生じた（下記の実施例４を参照のこと）。
【００８７】
（キット）
本発明の別の局面は、上記の種々のアッセイを実施する際に有用なスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系を提供する。本発明のキットは、本発明のスプリット蛍光系およびスプリット発色団系の使用を容易にし得る。本発明のアッセイを実施するための種々の材料および試薬が、提供され得る。キットは、試薬を含み得、この試薬としては、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、細胞形質転換試薬および細胞トランスフェクション試薬、ポリペプチドを精製するための試薬および材料、タンパク質変性試薬およびタンパク質再折り畳み試薬、ならびに本発明のアッセイおよび他の方法を実行する際に有用な他の溶液または緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。キットはまた、コントロールサンプル；本発明のアッセイを較正する際に有用な材料；ならびにアッセイ反応が実施され得る容器、チューブ、マイクロタイタープレートなどを含み得る。キットは、容器中に包装され得、その容器は、そのキットの内容物を収容するための区画、そのアッセイを実施するための指示書などを含み得る。
【００８８】
例えば、キットは、本発明の１つ以上のスプリット蛍光タンパク質フラグメント、１つ以上の蛍光タンパク質フラグメントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドベクター、そのベクターを増殖するために適切な細菌細胞株、１つ以上の蛍光タンパク質フラグメントをコードする構築物で事前形質転換または安定にトランスフェクトされた細胞、ならびに発現された融合タンパク質の精製のための試薬を提供し得る。
【００８９】
本発明のタンパク質検出アッセイの実施を容易にするキットの一実施形態において、そのキットは、タグ蛍光タンパク質フラグメントまたはタグ発色団タンパク質フラグメント（すなわち、ＧＦＰ  Ｓ１１）のコード配列を含むレシピエント核酸ベクターを含み、これは、そのタグフラグメントコード配列のＮ末端にインフレームで試験タンパク質を挿入するためのマルチクローニング部位を含む。必要に応じて、この挿入部位の後には、下流タグ配列のコード配列とインフレームであるリンカーポリペプチドのコード配列が存在し得る。具体的な実施形態は、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドである。このプラスミドの操作は、実施例１において記載されており、このプラスミドは、図１において示されている。ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの完全ヌクレオチド配列が、図１Ｂに示される。
【００９０】
このレシピエントまたは「タグベクター」は、適切な宿主細胞において試験タンパク質−タグ融合物を生成するために使用される。インビトロアッセイ実施形態において、このキットは、そのタグベクターによって発現される試験タンパク質−タグフラグメント融合物を検出するために使用される、予め精製されたアッセイフラグメント（すなわち、ＧＦＰ１−１０ポリペプチド）をさらに含む。インビボアッセイ実施形態において、このキットは、「アッセイベクター」をさらに含む。この「アッセイベクター」は、タグベクターと適合性であり、かつ独立して調節されるプロモーターの制御下にアッセイフラグメントをコードする。別のインビボアッセイ実施形態において、アッセイベクター（すなわち、誘導性プロモーターの制御下にＧＦＰ１−１０をコードするベクター）を含む細胞が、適合性タグベクターとともにこのキットにおいて提供され、この適合性タグベクター中に試験タンパク質がクローン化され得る。この適合性タグベクターにおいて、発現は、別個に誘導可能なプロモーターによって制御される。このアッセイベクターを含む細胞は、タグベクターで形質転換され得、細胞蛍光が、モニターされ得る。
【００９１】
本発明の溶解度アッセイを較正するための材料が、提供され得る。一実施形態において、このキットは、精製された亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１融合タンパク質試薬を含む。
【００９２】
（蛍光タンパク質および発色団タンパク質）
本発明は、スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系の設計のための方法および原理を提供し、これは、本明細書において、タンパク質の検出および定量における使用のための最適なスプリットＧＦＰ系の作製および分子進化によって例証される。しかし、他のＧＦＰ様タンパク質が、本発明の実施において使用され得る。
【００９３】
ある蛍光タンパク質群は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびに多数のＧＦＰ改変体（例えば、シアン色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など（Ｚｉｍｍｅｒ、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：７５９〜７８１；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：９０６〜９１８））を包含する。代表的には、これらの改変体は、配列番号２（または配列番号８）と約８０％以上の配列同一性を共有する。これらの色シフトＧＦＰ改変体は、青色〜黄緑色の放出色、増加した明るさ、および光安定性を有する（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６７：５０９〜５４４）。そのような１つのＧＦＰ改変体（増強型黄色蛍光タンパク質と呼ばれる）は、５２９ｎｍにおいて発光極大を提示する。最近記載された別の改変体（金色改変体）は、トリプトファンの非天然改変体をシアン改変体に組み込むことによって作製された。これは、充分に赤色にシフトした５７４ｎｍの発光極大によって特徴付けられる（Ｂａｅら、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：１０７１〜１０８１）。
【００９４】
改変型励起スペクトルおよび発光スペクトルを有するさらにＧＦＰベースの改変体（Ｔｓｉｅｎら、米国特許出願第２００２０１２３１１３Ａ１号）、蛍光強度および温度許容性が増大したさらなるＧＦＰベースの改変体（Ｔｈａｓｔｒｕｐら、米国特許出願第２００２０１０７３６Ａ１号；Ｂｊｏｒｎら、米国特許出願第２００２０１７７１８９Ａ１号）；および減少した酸素レベル下で発色団形成するさらなるＧＦＰベースの改変体（Ｆｉｓｈｅｒ、米国特許第６，４１４，１１９号）もまた、記載されている。花虫綱のＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ  ｋｏｌｌｉｋｅｒｉ由来のＧＦＰもまた、記載されている（Ｗａｒｄら、米国特許出願第２００３００１３８４９号）。
【００９５】
さらに、花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）由来の１００種を超えるＧＦＰ様蛍光タンパク質および非蛍光性色素タンパク質が、現在同定されている（概説について、Ｖｅｒｋｕｓｈａら、２００３、ＧＦＰ−ｌｉｋｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ．４０５〜４３９，Ｖ．Ｕｖｅｒｓｋｙ編，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｒｅａｌａ，Ｉｎｄｉａを参照のこと）。この群の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）タンパク質としては、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種のサンゴ由来の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３）、および種々のＤｓＲｅｄ（例えば、ＤｅＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２）が挙げられる。ＤｓＲｅｄおよび他の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）蛍光タンパク質は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰに対してたった約２６％〜約３０％のアミノ酸配列同一性しか有さないが、主要なすべてのモチーフが保存されており、このことは、ＧＦＰの１１本鎖βバレル構造の形成を示す。ＤｓＲｅｄの結晶構造もまた、解明されており、この結晶構造は、ＧＦＰ  ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造の保存を示す。
【００９６】
長い波長の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの多数の改変体もまた、記載されている。例えば、発光スペクトルがさらに赤色にシフトしている最近記載されたＤｓＲｅｄ改変体が、本発明の実施において使用され得る（Ｗｉｅｈｌｅｒら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８７：３８４〜３８９；Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５８５〜１５８８；Ｂａｉｒｄら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１９８４〜１１９８９）。最近、ＤｓＲｅｄのモノマー改変体が、記載された（Ｃａｍｐｅｌｌら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：７８７７〜７８８２）。この改変体（「ｍＲＦＰ１」と呼ばれる）は、（３０時間かけて成熟する野生型ＤｓＲｅｄと比較して）急速に成熟し、残留緑色蛍光を有さず、他のＤｅＲｅｄ改変体よりも約２５ｎｍ長い励起波長および発光波長を有する。
【００９７】
多数の海洋生物由来の増加する多数の他の蛍光タンパク質が、最近記載されており、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋは、現在、多数のＧＦＰおよびＧＦＰ改変体の結晶構造、ならびに種々のＧＦＰアナログの結晶構造を列挙する。サンゴ、シーペン、ホヤ、およびイソギンチャクに由来する、ＧＦＰと類似すると推測される構造を有する関連蛍光タンパク質が、記載されており、それは、本発明のスプリット蛍光タンパク質系の生成において使用され得る（概説について、Ｚｉｍｍｅｒ、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：７５９〜７８１；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：３：９０６〜９１８を参照のこと）。
【００９８】
さらに、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｍａｊａｎｏ由来の蛍光タンパク質、Ｚｏａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパク質、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質、およびＣｌａｖｕｌａｒｉａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質が、報告されている（Ｍａｔｚら、上記）。イシサンゴ種Ｔｒａｃｈｙｐｈｉｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉからクローニングされた蛍光タンパク質は、緑色光、黄色光、および青色光を発光すること、そしてＵＶ光に暴露されると緑色光発光を青色光発光へと変換することが、報告されている（Ａｎｄｏら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２６５１〜１２６５６）。イソギンチャク由来の最近記載された蛍光タンパク質としては、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａからクローニングされた緑色蛍光タンパク質および橙色蛍光タンパク質（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１４０９１〜１４０９６）、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａの触手からクローニングされた天然の増強型緑色蛍光タンパク質（Ｈｏｎｇｂｉｎら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０１：８７９〜８８５）、およびＡｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａからクローニングされた弱い赤色蛍光を示す概して非蛍光性の紫色色素タンパク質および近赤外シフト発光スペクトル（５９５ｎｍ）を示すその改変体（Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９〜２５８８２）が挙げられる。
【００９９】
イソギンチャクＥｎｔａｃｍａｅａ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒから単離された最近記載された赤色蛍光タンパク質ＥｑＦＰ６１１は、独特の共平面トランス発色団を有する近赤外の非常に蛍光性のタンパク質である（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１６４６〜１１６５１）。ＥｑＦＰ６１１の結晶構造は、解明されており、これは、ＧＦＰ  ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造の保存を示す（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｕｇｕｓｔ  ８，２００３；Ｍ３０７８９６２００）。
【０１００】
色素体特性を有するなおさらなる種類のＧＦＰ様タンパク質および蛍光特性を有するなおさらなる種類のＧＦＰ様タンパク質が、記載されている。そのような一群のサンゴ由来タンパク質（ポシロポリン）は、広範なスペクトル特徴および蛍光特徴を示す（ＤｏｖｅおよびＨｏｅｇｈ−Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，１９９９，ＰＣＴ出願ＷＯ００／４６２３３；Ｄｏｖｅら、２００１、Ｃｏｒａｌ  Ｒｅｅｆｓ  １９：１９７〜２０４）。最近、造礁サンゴＭｏｎｔｉｐｏｒａ  ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のポシロポリンＲｔｍｓ５の精製および結晶化が、記載されている（Ｂｅｄｄｏｅら、２００３、Ａｃａｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５９：５９７〜５９９）。Ｒｔｍｓ５は、色が深青色であるが、弱く蛍光する。しかし、Ｒｔｍｓ５ならびにＲｔｍｓ５に対して配列相同性を有する他の色素タンパク質は、単一アミノ酸置換を介して近赤外蛍光タンパク質へと相互変換され得ることが報告されている（Ｂｅｄｄｏｅら、２００３、上記；Ｂｕｌｉｎａら、２００２、ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：７；Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、上記）。
【０１０１】
ポシロポリンに密接に関連する他の種々のサンゴ由来色素タンパク質もまた、公知である（例えば、Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９〜８２；Ｇｕｒｓｋａｙａら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０７：１６〜２０を参照のこと）。これらの色素タンパク質が、ＧＦＰおよび他の蛍光タンパク質の保存された１１本鎖βバレル構造を含む程度まで、これらの色素タンパク質は、本明細書中に記載されるように自己補完性フラグメントへと分割され得、そしてアッセイ系において使用され得る。
【０１０２】
ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造から５オングストローム未満、しばしば３オングストローム未満または４オングストローム未満、好ましくは２オングストローム未満の根２乗平均偏差を有する構造を有する任意の蛍光タンパク質が、自己補完性フラグメントの開発において使用され得る。いくつかの場合において、蛍光タンパク質は、多量体形態で存在する。例えば、ＤｅＲｅｄは、テトラマーである（Ｃｏｔｌｅｔら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３９８０１４４０３）。当業者によって認識されるように、そのような多量体蛍光タンパク質とＧＦＰ（モノマー）との間の構造偏差（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、その蛍光タンパク質の構造のモノマー単位に基づいて評価される。
【０１０３】
当業者によって認識されるように、そのような蛍光タンパク質または色素タンパク質構造は、当該分野で周知の比較方法論を使用して同定され得る。そのタンパク質を同定する際に、ＭＭＤＢ  ＩＤ：５７４２構造に対する並置および比較における重要な特徴は、βバレル構造の保存（すなわち、代表的には、１１本のβ鎖を含むが、少なくとも１つの場合には、もっと少ないβ鎖を含む（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２０００（上記）を参照のこと）、ならびに二次構造エレメントの位相または結合順序（例えば、Ｏｒｍｏら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｃｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｙａｎｇら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：５２８０，１３９２〜５；Ｙａｎｇら、１９９６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１２４６〜５１）である。代表的には、蛍光タンパク質とＧＦＰ構造との間の偏差のほとんどは、重要なβ鎖間の結合鎖またはリンカーの長さにある（例えば、Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：４６２〜７中のｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＤｓＲｅｄ  ａｎｄ  ＧＦＰを参照のこと）。Ｙａｒｂｒｏｕｇｈらにおいて、ＧＦＰとＤｓＲｅｄとのアラインメントが、図示されている。立体図から、１１本鎖バレルが、この２つの構造の間で強く保存されていることが、明らかである。ｃ−α骨格が、１６９個のアミノ酸にわたって根２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）が１オングストローム以内に並置されるが、その配列同一性は、ＤｓＲｅｄとＧＦＰとを比較してたった２３％である。
【０１０４】
構造比較において、比較される２つの構造は、当業者に周知のアルゴリズムを使用して、例えば、ＣＣＰ４プログラムソフトウェアパッケージ（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ  ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＡＬ  ＰＲＯＪＥＣＴ，ＮＵＭＢＥＲ  ４．１９９４  「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）を用いて並置される。このようなプログラムを使用するにあたって、ユーザーは、並置されるべき２つの構造のＰＤＢ座標ファイルを入力し、このプログラムは、２つの構造中の原子の位置における全体的な差異を最小にするために剛体変換（回転および並進）を用いて、並置された構造の原子の出力座標ファイルを生成する。各構造についての出力された並置座標は、別個に可視化されてもよいし、容易に入手可能な分子グラフィックプログラム（例えば、ＲＡＳＭＯＬ，ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＴＩＢＳ），Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，  ｐ．３７４）またはＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ，Ｇｕｅｘ，ＮおよびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．，１９９６  Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ａｎｄ  ＰＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  Ｑｕａｔｅｒｌｙ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ７７，  ｐ．７７）による重ね合わせとして可視化されてもよい。
【０１０５】
ＲＭＳＤを考慮する場合、このＲＭＳＤ値は、構造アラインメントの程度に応じて定められ、このサイズは、全体的な構造類似性の記述子としてＲＭＳＤを用いる場合に、考慮に入れられる。ＲＭＳＤのスケーリングの問題は、代表的には、特定の閾値内で並置されるアミノ酸ブロックを含めることによって処理される。特定の基準を満たす並置された配列の乱れていない（ｕｎｂｒｏｋｅｎ）ブロックが長いほど、その構造は、よりよく並置される。ＤｓＲｅｄの例において、ｃ−α炭素の１６４は、ＧＦＰの１Å内にあるように並置され得る。代表的には、当業者は、例えば、Ｄａｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９３，２３３，１２３−１３８に記載されるように、剛体変換に基づいて、２つの試験構造を並置し得るプログラムを選択し得る。ＤＡＬＩアルゴリズムの出力は、剛体変換を使用して、２つの構造間で重ね合わせられ得る配列ブロックである。閾値Ｚ＝２以上のＺスコアを有する領域は、類似していると報告される。このようなブロックの各々について、全体的なＲＭＳＤが報告される。
【０１０６】
本発明において使用するための蛍光タンパク質または色素タンパク質のＲＭＳＤは、１１本のβ鎖内の配列の少なくとも８０％について５Å内である。好ましくは、ＲＭＳＤは、１１本のβ鎖（重ね合わせとして図示された２つの並置された構造の目視およびＤＡＬＩプログラム出力により報告された並置ブロックとの比較により決定されるβ鎖）内の配列の少なくとも９０％について２Å内である。当業者により認められるように、β鎖間のリンカーは、かなり変動し得、必ずしも構造間で重ね合わせできなくてもよい。
【０１０７】
好ましい実施形態において、蛍光タンパク質または色素タンパク質は、このタンパク質と比較して折り畳み特性または溶解度が改善されている、このタンパク質の変異バージョン、またはこのタンパク質の改変体である。しばしば、このようなタンパク質は、例えば、ＷＯ０１２３６０２に記載されている方法および増大された折り畳みについて選択するための他の方法を用いて同定され得る。
【０１０８】
例えば、増大した折り畳み特性を有する蛍光タンパク質を得るために、この蛍光タンパク質の折り畳み効率を減少させる、「ベイト」ペプチドまたは「ゲスト」ペプチドが、この蛍光タンパク質に連結され得る。このゲストペプチドは、挿入される場合に、この蛍光タンパク質の折り畳み効率を減少させる任意のペプチドであり得る。変異蛍光タンパク質のライブラリーが作製される。このベイトペプチドは、蛍光タンパク質に挿入され、このタンパク質の蛍光の程度が、アッセイされる。ベイトペプチドと親蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質と比較して増大した蛍光を示すクローンが、選択される（蛍光強度は、正確に折りたたまれた蛍光タンパク質の量を示す）。ゲストペプチドは、末端で蛍光タンパク質に連結されてもよいし、内部に挿入されてもよい。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明の実施において有用な、野生型蛍光タンパク質および変異蛍光タンパク質、ならびに野生型変異色素タンパク質および変異色素タンパク質は、極めて安定な「超折り畳み」改変体を生成するために、実験的に進化され得る。同時係属中の共有に係る米国特許出願第１０／４２３，６８８号（２００３年４月２４日出願、本明細書に参考として援用される）に記載される方法は、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、および任意の数の関連蛍光タンパク質ならびに色素タンパク質の指向性進化のために用いられ得る。このような超折り畳み改変体は、自己補完フラグメントに分割され得、このフラグメントをさらに進化させて、単独でまたは試験タンパク質に融合させた場合のこのフラグメントの溶解度特性を調節し得る。
【０１１０】
スプリット蛍光タンパク質フラグメントまたはスプリット色素タンパク質フラグメントの可溶性改変体および（試験タンパク質溶解度に対して）非変動性改変体は、小見出し「スプリットタンパク質フラグメント操作」（前出）にて提供される。
【実施例】
【０１１１】
本発明の種々の局面が、さらに記載され、以下のいくつかの実施例により例示されるが、これらのうちのいずれも、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【０１１２】
（実施例１：プラスミドｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲの構築）
市販のｔｅｔプロモーターＰＲＯ細菌発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、発現プラスミドとは別個の第２のプラスミド上に調節タンパク質ｔｅｔＲを有し、大規模なライブラリーの作製を非能率的にしている。この制限を克服するために、本発明者らは、標的タンパク質の発現を制御するｔｅｔプロモーターと、調節タンパク質ｔｅｔＲとを、テトラサイクリン誘導性プロモーターであるｔｅｔ、ｔｅｔプロモーター調節タンパク質ｔｅｔＲ、および選択可能な抗生物質マーカーであるＳｐｅｃＲを含む単一のプラスミド（抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を与える）上で組み合わせた。ＣｏｌＥ１複製起点は、このプラスミドが、ｐＴＥＴプラスミドを有する細胞内で、適合性の起点（例えば、ｐ１５起点）と共存することを可能にする。このことは、一方のタンパク質（例えば、ＧＦＰのフラグメントとタグ化されたタンパク質）がプラスミドから発現され、そして、もう一方のタンパク質（例えば、補完的なＧＦＰアッセイフラグメント）が、第２のプラスミド（たとえば、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から発現されることを可能にする。ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドは、図１Ａに図示され、このプラスミドの配列および遺伝的要素は、図１Ｂに示される。
【０１１３】
ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドを、市販のｐＰＲＯＴｅｔ．６×ＨＮベクター、ｐＰＲＯＬＡＲベクター、およびＢＬ２１−ＰＲＯ株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により保有される自己複製プラスミドからの要素を組み合わせる、オーバーラップＰＣＲにより操作した。クロラムフェニコール耐性遺伝子を、ＢＬ２１−ＰＲＯ株により保有される自己複製プラスミドからクローニングしたスペクチノマイシン耐性マーカーで置き換え、ｐＰＲＯＬＡＲベクターのカナマイシン耐性マーカーのプロモーターの制御下に置いた。本発明者らは、ＢＬ２１−ＰＲＯ株から単離したスペクチノマイシン耐性の自己複製プラスミドに由来するテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タンパク質を、Ｔ０転写終結配列の上流にクローニングした。翻訳されたｔｅｔＲの量は、ＳａｃＩの下流にある弱いＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列により調節する。このＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列は、小さな縮重ライブラリーからＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏの改変体を選択して、無水テトラサイクリンの添加後の漏出を最小にし、そして誘導を最大にすることによって操作される（下記を参照のこと）。市販のバージョンに存在するＳｐｅＩ制限部位を機能しないようにした（ｓｉｌｅｎｃｅ）。この新しいプラスミド「ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ」を、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩの制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化して、ＧＦＰ  Ｓ１１スプリットＧＦＰクローニングカセットを得た。この得られたクローニング部位の構造は、Ｎｃｏ−１：：６ＨＩＳ：：トロンビン切断部位：：Ｎｄｅ−１：：フレームシフトスタッファー（ｆｒａｍｅ  ｓｈｉｆｔ  ｓｔｕｆｆｅｒ）：：ＢａｍＨＩ：（ＧＧＧＳ）：ＳｐｅＩ：：ＧＦＰ  Ｓ１１（ＴＡＡ終止）：：ＫｐｎＩである。クローニングカセットのセンス鎖は、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩに隣接している：
【０１１４】
【化１】
2007508841.tif 000003
フレームシフトスタッファーは、再連結したベクターによるバックグラウンド発現を避けるために、好ましくは、ＮｄｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位の間に加える。
フレームシフトスタッファーの例１：ＦＳ０
【０１１５】
【化２】
2007508841.tif 000004
フレームシフトスタッファーの例２：ＦＳ１
【０１１６】
【化３】
2007508841.tif 000005
Ｃ末端スプリットタンパク質フラグメント（例えば、ＧＦＰ鎖１１またはＧＦＰ鎖１０〜１１）を、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、制限部位ＳｐｅＩとＫｐｎＩとの間にクローニングし、隣接制限部位および所望のフラグメントのコード配列を提供する。このフラグメントはまた、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ（当該分野で周知の方法）を使用して、鋳型ＤＮＡ供給源および組込んだ制限部位から増幅され得る。完成したＮｃｏＩ／ＫｐｎＩカセットが、目的のベクター内に、適切な制限部位を操作することによって、他の発現ベクターまたは発現システム（例えば、ｐＥＴベクター）に移され得ること、および、他の制限部位が採用され得ることは、当業者に明らかである。
【０１１７】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＯ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から単離したプラスミドを使用して、ｔｅｔＲ遺伝子を増幅した。遺伝子全体の増幅は、この遺伝子の配列の５’特異的プライマーおよび３’特異的プライマーを使用することにより認識した。センスプライマーは、ＳａｃＩ制限部位、およびその後に続く、ｔｅｔプロモーターの制御下に組換えタンパク質の最適な抑制／誘導のために最適化されたＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を含んだ（この実施例、下記を参照のこと）。下流のプライマーは、ＰＲＯＴｅｔプラスミドのＴ０転写終結配列に相同な領域を含んだ。得られたＰＣＲ産物を、Ｔ０終結アンプリコンと組み立てて、最終産物を、当該分野で周知の方法によるＰＣＲ媒介性部位指向変異誘発によって、共通の制限部位を機能しないようにすることによって予め修飾された、ＰＲＯＴｅｔＴＭ６×ＨＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＳａｃＩ／ＳｐｅＩ制限部位を介してクローニングした。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、以下の遺伝子特異的なプライマーを使用して、ＢＬ２１  ＤＥ３  ＰＲＯから単離したプラスミドから増幅した：
【０１１８】
【化４】
2007508841.tif 000006
Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマーは、ｐＰＲＯＬａｒベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのカナマイシンプロモーターの配列を含み、Ｐ３プライマーおよびＰ４プライマーは、カナマイシン部位の末端とＳａｃＩとの間に接合部を含んだ。完成したカセットを、ＡａｔＩＩ／ＳａｃＩ制限部位を介して、新規ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドに移動させた。
【０１１９】
【化５】
2007508841.tif 000007
を、重なるプライマーから操作し、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを介して、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドにクローニングして、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ  ｖ１プラスミドおよびｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ  ｖ２プラスミドを得た。ｔｅｔＲタンパク質の翻訳を制御するＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を、変異誘発および選択により最適化した。簡単に述べると、折り畳みレポーターＧＦＰ遺伝子を、ＤＨ１０Ｂ株に形質転換されたスタッファーｖ１  ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩにクローニングした。ｔｅｔＲ遺伝子を、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列の４つのヌクレオチドについての縮重プライマーを用いて増幅し、このカセットを、ＧＦＰ含有ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ受容ベクターのＳａｃＩ／ＳｐｅＩにクローニングした。得られたライブラリーを、ＢＬ２１  ＤＥ３株に形質転換した。最適な改変体を、誘導率（誘導後の細胞のＧＦＰ蛍光を、誘導前の細胞のＧＦＰ蛍光で割ったもの）を計算し、０．２５μｇ／ｍｌの無水テトラサイクリン（ＡｎＴＥＴ）を添加した際の最大誘導率を有する改変体を選択することによってスクリーニングした（表１）。最大の誘導率を示す最適なｔｅｔＲ配列のためのＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列は、ＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＴＧ［配列番号３２］である。
【０１２０】
【表１】
2007508841.tif 000008
（実施例２：スプリットＧＦＰの実現可能な対の発見）
図２に概説されたスプリットＧＦＰタンパク質のタグ化および検出のスキームを達成するために、本発明者らは、まず、折り畳みレポーターＧＦＰ（変異Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａを有するもの（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら、１９９６）、変異Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔを有するもの（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｋｎｏｂｅｌら、１９９７））、または、格別に安定な「超折り畳み」ＧＦＰ（折り畳みレポーターＧＦＰ変異、ならびにＳ３０Ｒ、Ｙ３９Ｎ、Ｎ１０５Ｔ、Ｙ１４５Ｆ、Ｉ１７１ＶおよびＡ２０６Ｖを含む）のいずれかに由来するフラグメントのいくつかの対を試験した。本発明者らは、アミノ酸１−１４５＋１４５−２３８、１−１５５＋１５６−２３８、１−１７１＋１７１−２３８、１−１９５＋１９６−２３８、１−２１４＋２１４−２３８を含む、数種類のＧＦＰフラグメントの対を、Ｅ．ｃｏｌｉ中の適合性プラスミド上に別々に、共発現させた。接合点は、β鎖間のループまたはターンに対応する（Ｔｓｉｅｎ  １９９８；Ｂａｉｒｄ，Ｚａｃｈａｒｉａｓら  １９９９）（図３を参照のこと）。超折り畳みレポーターＧＦＰからのフラグメント対は、一貫して、折り畳みレポーターＧＦＰからの同じ対よりもかなり明るいコロニーを生じた。例えば、１５６および１７２における超折り畳みＧＦＰフラグメントは、折り畳みレポーターＧＦＰに由来するフラグメントよりも明るかった（図４を参照のこと）。本発明者らの目的は、タンパク質タグとして使用するための１つのフラグメントのサイズを最小にすることであり、従って、本発明者らは、最小のフラグメント（１−２１４＋２１４−２３８）を有する実現可能な対に焦点を当てた。タグ化ドメインのサイズをさらに減らすために、本発明者らはまた、１−２１４（ＧＦＰ  １−１０）を２１４−２３０（ＧＦＰ  Ｓ１１）との補完性について試験し、小さなフラグメントから無秩序な残基２３１−２３８（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）を排除した。表２は、野生型および操作した変異体を含むＧＦＰ  Ｓ１１構築物の配列を示す。
【０１２１】
【表２】
2007508841.tif 000009
適合性の起点を有するｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からの超折り畳みＧＦＰフラグメント１−２１４（ＧＦＰ  １−１０）および２１４−２３０（ＧＦＰ  Ｓ１１野生型）の共発現は、蛍光のＥｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを生じた（図５、挿入部分）。対応する折り畳みレポーターＧＦＰフラグメントでは、検出可能な補完は起こらなかった（図５、挿入部分）。超折り畳みＧＦＰ  １−１０は、不溶性であったが、再び折り畳まれた封入体（実施例９、下記を参照のこと）を、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍに由来する可溶性亜硫酸レダクターゼ（Ｆｉｔｚ−Ｇｉｂｂｏｎ，Ｃｈｏｉら  １９９７）と共にインキュベートすると、Ｃ末端が野生型ＧＦＰであるＳ１１野生型とタグ化して、融合タンパク質亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型を生じ、時間依存的な蛍光の増加を生じた（図５、グラフ）。
【０１２２】
（実施例３：ＧＦＰアッセイフラグメントＧＦＰ  １−１０の操作）
本発明者らは、ＤＮＡシャッフリングにより超折り畳みＧＦＰ  １−１０を向上し（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）、その可溶性を向上させ、そして、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  １１によるその補完を増加させた。超折り畳みＧＦＰ  １−１０のＰＣＲアンプリコンを、出版されたプロトコール（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）を用いる、ＤＮＡ断片化およびシャッフリングに供した。ＧＦＰ  １−１０  ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドを、ｐＰＲＯＴＥＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上に亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型タグ化タンパク質を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＯ発現株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に形質転換した。この発現ライブラリーを、１．０ＯＤ６００ｎｍの凍結した２０％グリセロール／Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ストックの２つの段階４００倍希釈を使用して、ニトロセルロース膜の上にプレーティングした。３７℃にて一晩増殖させた後、膜を、培地１ｍｌあたり５０μｇカナマイシンおよび３５μｇクロラムフェニコール、および５０μｇスペクチノマイシンを含有するＬＢ／Ａｇａｒプレートに移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを足して３７℃にて３時間おき、次いで、上記の抗体＋６００ｎｇ／ｍｌ無水テトラサイクリン（ＡｎＴＥＴ）を含有する新しいプレートの上に移動させた。最も迅速な蛍光の発色を示すクローンをピックアップし、−８０℃にて２０％のグリセロール凍結ストックとして凍結した。これらのクローンを、増殖させ、１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして、可溶性の溶解物を、過剰量の精製した亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合タンパク質を用いるインビトロアッセイ（下記の実施例９を参照のこと）において、補完効率についてスクリーニングした。最良の候補をプールし、もう一ラウンドの進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に供した。変異を、蛍光色素によるターミネーターＤＮＡ配列決定により確認した。シャッフリングおよび最も明るいクローンの選択の３回のラウンドの後、最良の改変体（ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴと名付けた）の可溶性溶解物のインビトロ補完性は、同じ量の再び折り畳まれた超折り畳みＧＦＰ  １−１０と比べて８０倍向上した（図５、グラフ）。折り畳みレポーターＧＦＰ変異（上記を参照のこと）に加え、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴは、超折り畳みＧＦＰからのＳ３０Ｒ、Ｙ１４５Ｆ、Ｉ１７１Ｖ、Ａ２０６Ｖ、および、７つの新しい変異（Ｎ３９Ｉ、Ｔ１０５Ｋ、Ｅ１１１Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｋ１６６Ｔ、Ｉ１６７Ｖ、Ｓ２０５Ｔ）を含み、そして、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて３７℃で発現されると、約５０％が可溶性である。非蛍光ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの１０ｍｇ／ｍｌ溶液の紫外−可視スペクトルには、レッドシフトしたＧＦＰ（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）の４８０ｎｍ吸収帯がなく、ＧＦＰ  １１の付加が、環化されたクロモフォアを作製するために必要とされる折り畳み工程を誘発することを示唆する（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）。精製されたＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、超折り畳みＧＦＰ、および折り畳みレポーターＧＦＰを、各々、１０ｍｇ／ｍｌでロードされる分析用ゲル濾過により研究した。ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴは、６０％の二量体、３５％の単量体、および５％の高次凝集体として溶出したが、全長の折り畳みレポーターＧＦＰおよび超折り畳みＧＦＰは、ともに、９５％を超える単量体と、微量の二量体および高次凝集体として溶出した。
【０１２３】
（実施例４：ＧＦＰ  Ｓ１１の操作）
Ｃ末端野生型ＧＦＰ  Ｓ１１融合タグは、数個のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｆｉｔｚ−Ｇｉｂｂｏｎ，Ｃｈｏｉら  １９９７）試験タンパク質の溶解性を劇的に減少させた（表３）。３−ヘキスロース  ６−ホスファターゼシンターゼ（ＨＰＳ）は単独では、６０％が可溶性であったが、野生型のＧＦＰ  １１と融合させた場合、不溶性であった（図６、表３）。タンパク質の溶解性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および以前に記載されたゲルデンシトメトリー分析（Ｗａｌｄｏ，Ｓｔａｎｄｉｓｈら  １９９９；Ｗａｌｄｏ  ２００３）により決定した。簡単に述べると、ハイスループットのスクリーニングについて、１ｍｌの細胞培養物を遠心分離によりペレット化し、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０％ｖ：ｖグリセロールを含有する緩衝液（ＴＮＧ緩衝液）１１０μｌに再懸濁した。他の場合において、３ｍｌの細胞培養物を遠心分離によりペレット化し、３００  １０μｌのＴＮＧ緩衝液に再懸濁した。超音波処理した後、サンプルを遠心分離して、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを提供した。ペレットを、超音波処理した上清と等量のＴＮＧ中に再懸濁した。１５μｌの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、および２０％グリセロールを含有する２×ＳＤＳ変性緩衝液（１５μｌ）と混合し、１５分間１００℃にて加熱した。変性したサンプルを、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。タンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して染色し、ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した。校正走査装置（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ｓｃａｎｎｅｒ）は、タンパク質スポットの合成光学密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）Ｄを提供した。全ての発現されたタンパク質含量を、可溶性フラクションのタンパク質スポット光学密度（Ｄｓ）とペレットフラクションのタンパク質スポット光学密度（Ｄｐ）とを足すことによって見積もり、可溶性を、Ｓ＝Ｄｓ／（Ｄｓ＋Ｄｐ）として規定した。本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける指向性進化の図式において、ＨＰＳを「おとり（ｂａｉｔ）」として使用して、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１融合物の溶解性が、ＨＰＳ非融合物の溶解性と一致したＧＦＰ  Ｓ１１の変異体を発見した。
【０１２４】
【表３】
2007508841.tif 000010
ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１改変体およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのライブラリーを、それぞれ、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲベクター（実施例１、前出を参照のこと）およびｐＥＴ２８ベクターからの配列において発現させた。独立した誘導性の適合性プラスミドを用いるこの連続的な誘導プロトコールは、同時翻訳の折り畳みおよびＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１の不溶性改変体とＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴとの補完により生じる偽陽性を回避することに役立った。ヘキスロースリン酸シンターゼ−ＧＦＰ  １１（ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１）融合物を、ＰＣＲにより増幅し、刊行されたプロトコール（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）を用いてシャッフリングした。ＧＦＰ  Ｓ１１変異体ライブラリーを、ＡｎＴＥＴ誘導性ｔｅｔプロモーター（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ  １９９７）を有するｐＴＥＴプラスミドから、Ｎ末端６−ＨＩＳタグを有するおとりタンパク質であるＨＰＳとのＣ末端融合物として発現させ（図１および実施例１、前出を参照のこと）、そして、ｐ１５複製起点を含む修飾したｐＥＴベクターにおいてＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）株へと形質転換した。最適物を、以下のような連続誘導プロトコールを使用してスクリーニングした。３７℃において一晩増殖させた後、コロニーを有するニトロセルロース膜を、３００ｎｇ／ｍｌのＡｎＴｅｔを含有する、選択ＬＢ／寒天Ｂａｕｅｒプレート上に移し、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１ライブラリーを発現させ、これを、新しい「休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）」プレートに１時間移して、ＡｎＴｅｔをコロニーから拡散させ、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１の発現を遮断し、そして、最終的に、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するＬＢ／寒天プレートに２時間移して、ｐＥＴプラスミドから補完的なＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの発現を誘導した。ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型構築物は、完全に不溶性なので、連続発現プロトコールに従ってＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを発現するコロニーは、わずかに蛍光を発するのみであった。より可溶性のＨＰＳ−ＧＦＰ  １１最適物に関連する、より明るいコロニーを、９６ウェル組織培養プレートの選択液体培地にとり、−８０℃の２０％グリセロールストックとして保存した。これらのコロニーを、１ｍｌの液体培地中で増殖させ、３００ｎｇ／ｍｌ  ＡｎＴＥＴで誘導した。可溶性フラクションを、過剰の精製ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いるインビトロアッセイ（下記、実施例９を参照のこと）において、補完効果についてスクリーニングした。最速の補完速度を有するクローンを選択し、さらにもう一ラウンドの進化およびスクリーニングのためにプールした。２ラウンドの進化は、２つの別個のＧＦＰ  Ｓ１１変異体、Ｌ２２１ＨおよびＴ２２５Ｎを生じた。本発明者らは、まず、Ｌ２２１Ｈ改変体（ＧＦＰ  １１  Ｍ１と名付ける）に焦点を当てた。この変異は、インビボにおいて、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを効率的に補完し、そして、ＨＰＳ  ＧＦＰ  Ｓ１１野生型と比べて向上した溶解性を有したが、融合タンパク質の溶解度に対するＧＦＰ  Ｓ１１の有害な効果を完全には排除しなかった（図６および表３）。ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２を、Ｆ２２３Ｓ（異なるスプリットＧＦＰフラグメントの溶解性を実質的に増加した変異（実施例１１、下記を参照のこと））を、Ｔ２２５Ｎと合せることによって操作した（表３、前出を参照のこと）。ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ２の溶解性は、ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ１またはＨＰＳ−ＧＦＰ  １１野生型のいずれに対しても大きく向上した（図６、表３）。ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ２のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴでの補完率は、ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ１と比べて約５倍減少した。これは、可溶性融合タンパク質に匹敵する量である（図７）。本発明者らは、二重のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのＣ末端残基であるＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２からＫ２１４を除去し、そして、縮重プライマーセット（当該分野で周知の方法）を使用してホットスポット位置２２３において６４倍縮重ライブラリーをスクリーニングし、そして、得られたＧＦＰ  １１  Ｍ２の改変体をＨＰＳとのＣ末端融合物としてクローニングして、より保存的な変異について検索した。約２００クローンの可溶性フラクションを、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いるインビトロアッセイ（実施例９、下記を参照のこと）においてスクリーニングした。平衡化した最良のＧＦＰ  Ｓ１１構築物（Ｌ２２１Ｈ，Ｆ２２３Ｙ，Ｔ２２５Ｎ）（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３と称する：アミノ酸配列ＲＤＨＭＶＬＨＥＹＶＮＡＡＧＩＴ［配列番号１６］、表２（前出）を参照のこと）は、良好な補完性で（図７）、融合タンパク質の溶解度の揺れを減らした（図６、表２、前出）。本発明者らはまた、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２タグを補完標的として使用して、上記の実施例３において概説した方法に従う指向性進化により、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの補完を向上させることを試みた。これにより、ＧＦＰ  １−１０  Ａ４と呼ばれる改変体が生成され、この改変体は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに比べ、約５速いＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２の補完を示した。ＧＦＰ  １−１０  Ａ４は、超折り畳み変異、ならびにさらなる変異Ｒ８０Ｑ、Ｓ９９Ｙ、Ｔ１０５Ｎ、Ｅ１１１Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｋ１６６Ｔ、Ｅ１７２ＶおよびＳ２０５Ｔを含んだ。Ａ４改変体は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて主に封入体として発現され、そして、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに比べ、インビボアッセイにあまり有用ではない。しかし、改変体Ａ４は、インビトロアッセイにおいて有用である。なぜならば、改変体Ａ４は、単に新しいＴＮＧ緩衝液に尿素で可溶化したペレットを希釈することによって封入体から再び折り畳まれ得、そして、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴよりも４倍速くＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２またはＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を補完するからである。
【０１２５】
（実施例５：ＧＦＰ  １−１０の可溶性バージョンまたは不溶性バージョンを使用する、連続的な誘導または同時誘導の効果の比較）
同時誘導が、不溶性かつ凝集したＧＦＰ  １−１０の補完をもたらし得るという仮説を試験するために、本発明者らは、連続誘導プロトコールおよび同時誘導プロトコールを比較した。ＣｏｌＥ１起点を有するベクターｐＴＥＴ上の大きなＧＦＰ  １−１０フラグメント（折り畳みレポーターＧＦＰ  １−１０、超折り畳みＧＦＰ  １−１０またはＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ）、および、ｐ１５起点を有するｐＥＴプラスミド上の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型で同時形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、栄養寒天プレート上のニトロセルロース膜に二連でプレーティングし、直径約１ｍｍまで一晩増殖させた。１つの膜を、連続誘導プロトコール（実施例４、前出を参照のこと）を使用して処理した。簡単に述べると、ＧＦＰ  １−１０を、まず、ＡｎＴＥＴを用いて発現させ、その後、新しいプレート上に置いて、ＡｎＴＥＴを除き、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する新しいプレート上の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型を発現させた。二連のプレートを、別々に同時誘導させた（ＡｎＴＥＴおよびＩＰＴＧの療法を含有するプレート）。蛍光コロニーを、ＩｌｌｕｍａＴｏｏｌ（ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて４８８ｎｍの光で照射し、そして、Ｋｏｄａｋ  ＤＣ２９０デジタルカメラを使用して、５２０ｎｍロングパスフィルタを通して画像化した。超折り畳みＧＦＰ  １−１０を一過性に発現させ、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型の誘導前にインビボで凝集させると、細胞はぼんやりしている（図８）。対照的に、部分的に可溶性のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴおよび亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１構築物を発現する細胞は、予想通りに、同時発現であっても連続発現であっても、明るい（図８）。
【０１２６】
（実施例６：インビトロで行なったスプリットＧＦＰアッセイの感度）
本発明者らは、マイクロタイタープレートでの２００μｌの反応において、数個の異なる量の精製亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３の補完について、蛍光漸増曲線（ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｃｕｒｖｅ）を測定した（図９）。本発明者らは、高濃度かつ大モル過剰のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（８００ｐｍｏｌ）を使用して補完を開始させることにより、潜在的なより高次の動力学的効果を避けた。これらの感度実験について、９６ウェルマイクロプレートを最初に、ＴＮＧ緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ：ｖグリセロール）中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液で、１０分間ブロッキングした。Ｔａｌｏｎ樹脂で精製した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）６ＨＩＳ−亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質の２倍の段階希釈を、同じ緩衝液中で行なった。この希釈は、２０μｌのアリコートあたり、２００ｐｍｏｌ〜０．１ｐｍｏｌの範囲にわたり、このアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに添加し、次いで、１８０μｌのアリコートに添加された大過剰（８００ｐｍｏｌ）のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（約０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて実施した。その結果、大きなフラグメントの濃度は制限されなかった。粗製Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の、反応の感度に対する効果を、別個の実験で試験するために、サンプルをまた、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの添加前に、不適切な非タグ化タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解物（２０μｌ）を添加することによって、スパイクした。蛍光動力学（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ）を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｗｉｎｎｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いてモニタリングし、３分間隔で１５時間記録した。ブランクサンプル（２０μｌの不適切なタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ溶解物、１００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および１００μｌのＴＮＧ緩衝液中０．５％  ＢＳＡ）のバックグラウンド蛍光を、最終蛍光値から減算した。ブランクは、最も低い標的濃度（０．１ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３）から、３０％未満のシグナルであった。補完蛍光は、分析物濃度の線形関数であった（図９）。１０〜２００ｐｍｏｌ量の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの添加後１５分以内で正確に定量化され得（図９Ａ）、そして、０．１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌは、約１時間を要した（図９Ｂ）。広範な濃度範囲にわたる漸増曲線は、単純な線形スケーリングにより重ね合わされ得（図１０）、反応の動力学が、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの濃度により制限されなかったことを示す。図９に示される曲線にフィットする滑らかな線は、試験サンプルが、既知濃度のサンプルを測定する際に使用されるのと同じ条件下で測定される限りは、ＧＦＰタグ化ドメインでタグ化された試験サンプル中のタンパク質の量を決定するための校正曲線に歩み寄ることができる（例えば、この校正曲線は、同じアッセイ試薬濃度のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および同じ容量のサンプルを使用して、図９Ａの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を例示した）。従���て、図９Ａにおいて、蛍光（Ｙ）のｐｍｏｌへの線形フィットは、Ｙ＝２．４６×（ｐｍｏｌ）＋２２．８により与えられる。本発明者らが、校正曲線と同じ条件下でタグ化タンパク質の未知の濃度を測定すると仮定すると、２００単位の蛍光の測定が得られる。ｐｍｏｌについての解法（ｓｏｌｖｉｎｇ）は、（Ｙ−２２．８）／２．４６であり、Ｙを２００と置き換え、本発明者らは、ｐｍｏｌを、（２００−２２．８）／２．４６＝７２．０ｐｍｏｌを計算し得る。
【０１２７】
（実施例７：スプリットＧＦＰフラグメントの迅速な結合）
スプリットＧＦＰフラグメントの結合動力学と、クロモフォア形成の動力学との間を区別するために、本発明者らは、Ｔａｌｏｎ樹脂に結合させた６ＨＩＳ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの、Ｎ末端折り畳みレポーターＧＦＰにタグ化したＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３による補完を行なった。５０％ｖ／ｖスラリーのＴａｌｏｎ樹脂のアリコート（１００μｌ）を、Ｎ末端６ＨＩＳ親和性タグ（２ｍｇ／ｍｌタンパク質を２００μｌ）を有するＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴで飽和させた。ビーズ（５０μｌのベッド容量）を、３００μｌのＴＮＧ緩衝液で３回洗浄して、未結合のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを除去し、残った緩衝液を吸引して破棄し、そして、蛍光を９６ウェルマイクロタイタープレートにて測定した（図１１、工程１）。過剰の折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質（５ｍｇ／ｍｌタンパク質を２００μｌ）をビーズに添加し、１５秒間ピペッティングすることにより混合し、小さな０．２μスピン濾過カラムに迅速に移し、ＴＮＧの０．５ｍｌアリコートで３回洗浄して、未結合の折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タンパク質を除去した。この手順は、約５分を要した。ビーズをマイクロタイタープレートの新しいウェルに移し（図１１、工程２）、そして、蛍光を、３分間隔で１２時間測定した（図１１、工程３）。ビーズの蛍光は、折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タンパク質が、迅速に６ＨＩＳ−ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに結合したことを示した（図１１、工程２）。洗浄したビーズは、溶液中で観察されたものに匹敵する速度でさらなる蛍光を得（図１１、工程３）、蛍光形成の動力学が、ＧＦＰフラグメントの会合速度により制限されないことを示した。
【０１２８】
（実施例８：補完アッセイの頑健性、ならびにアジュバントおよびｐＨの影響）
本発明者らは、補完反応に対する一般的な化学アジュバントおよびｐＨの影響を試験した。９Ｍの尿素の連続的な２倍段階希釈を、ＴＮＧを用いて行なった。１０の溶液の１００μｌアリコート（９Ｍ尿素から０．０１９Ｍ尿素までの濃度範囲）を、１０μｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  １１  Ｍ３、１０μｌのアッセイフラグメントＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および８０μｌのＴＮＧ緩衝液と合せた。蛍光データを、ＦＬ−６００プレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、３分間隔で１２時間にわたって集めた。この反応を、２．０Ｍより上の尿素でクエンチした（図１２）。別の実験において、補完速度は、５ｍＭジチオスレイトールにより約３０％向上したが、０．１％ｗ／ｖ  ＳＤＳによりクエンチした。本発明者らは、次に、補完反応の効率に対する、異なるｐＨの溶液の影響を試験した。１０μｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質、またはＳ１１野生型ペプチドの等モル溶液を、適切な緩衝液ＭＥＳ（ｐＨ５〜６．５）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５〜８．５）、ＢＩＣＩＮＥ（ｐＨ８．５〜９．０）を含有する、１８０μｌの０．１Ｍ溶液（０．５ｐＨ単位の間隔で、５．０〜９．０のｐＨ範囲にわたる）に添加した。補完を、１０μｌのＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって開始し、そして、補完の動力学を、ＦＬ−６００プレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、３分間隔で一晩モニターした。補完は、ｐＨ６．５より下では非効率的であり、約ｐＨ７．３の見かけ上のｐＫａを有した（図１３）。補完後、蛍光ＧＦＰ部分は、５Ｍより大きな尿素において蛍光のゆっくりとした時間依存的な減少を示し（ｔ１／２＝２０時間）、約５．５のｐＫａは、「増強された」ＧＦＰと同様であった（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｋｎｏｂｅｌら  １９９７）。
【０１２９】
（実施例９：インビトロでのタンパク質の定量化）
スプリットＧＦＰシステムが、インビトロで正確に異なるタンパク質を定量化することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍタンパク質を、Ｃ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグを有するｐＥＴベクター構築物として液体培養物中で発現させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスプリットＧＦＰ補完システムを使用して、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを分析した（図１４）。１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍタンパク質の可溶性フラクションを、ｐＥＴ発現タンパク質定量化試験についてアッセイするため、そして、ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−１０改変体の指向性進化の間に、最適物に対してアッセイを行なうために、細胞溶解物の標的タンパク質の可溶性フラクション（２０μｌ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭプレート，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中で、１８０μｌの０．３５ｍｇ／ｍｌ再折り畳みＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（約６００ｐｍｏｌ）と混合した。不溶性のペレットをアッセイするために、５０μｌの再懸濁した不溶性フラクションの各々を遠心分離し、乾燥したペレットを、５０μｌの９Ｍ尿素の添加により溶解し、次いで、１０μｌの非折り畳みサンプルを、１９０μｌのＴＮＧ中０．３５ｍｇ／ｍｌ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの迅速な添加によりアッセイした。ペレットアッセイの蛍光値を、２つの因子によりスケール化して可溶性アッセイと比べて低い容量を補償し、可溶性フラクションアッセイとの直接的な比較を可能にした。アッセイ中の尿素の最終濃度は、約０．４Ｍであった（実施例８、前出、および図１２を参照のこと）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、可溶性フラクションおよびペレットフラクションのサンプルを定量化するために、１５μｌの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、１５μｌの２×ＳＤＳ変性緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、および２０％グリセロールを含有する）と混合し、１００℃にて１５分間加熱した。変性したサンプルを、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。ゲル上のタンパク質スポットを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、画像化して、ＧＳ−８００校正スキャニングデンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、タンパク質スポットの光学密度を定量化した。クーマシー色素は染色効率のタンパク質依存性のバリエーションを示すものの（Ｔａｉ，Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら  １９８５）、補完および折り畳みの完了後（約６時間後）、測定される蛍光値と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化したタンパク質の量との間には強い相関があった（図１４）。９Ｍ尿素中に溶解し（この実施例、前出を参照のこと）、過剰のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを含有する緩衝液で２０倍希釈した不溶性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化された不溶性タンパク質の量と良好に相関する蛍光を生じた（図１４）。対照的に、可溶化されたペレットを、濃縮したＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのアリコートを���加する前に、新しい緩衝液で希釈した場合、十分に発現された不溶性タンパク質のいくつか（すなわち、ポリスルフィドレダクターゼおよびヌクレオチド二リン酸キナーゼ、表３および図１４）は、検出可能な補完を与えなかった。おそらく、これらのタンパク質は、希釈の際に折り畳みを誤り、凝集し、引き続くＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ部分の前に、ＧＦＰ  １１  Ｍ３タグをアクセス不能にしている。
【０１３０】
（実施例１０：スプリットＧＦＰアッセイシステムを使用する、インビボでの可溶性タンパク質および総タンパク質の推定）
実用的なスプリットタンパク質タグ化システムは、可溶性タンパク質または不溶性タンパク質のいずれかを標識および検出するために、インビボで使用され得る。本発明者らは、可溶性タンパク質が、まず、タグ化タンパク質を限られた時間だけ発現させ、次いで、この発現を停止して、同じ細胞区画において補完性のＧＦＰフラグメントの引き続く発現の前に、タグ化タンパク質が、その固有の溶解表現型を現すことを可能にすることによって、生きているＥ．ｃｏｌｉ細胞においてアッセイされ得るという仮説を立てた。インビトロペレットアッセイ（実施例９、前出を参照のこと）における本発明者らの同時再折り畳みの結果から、本発明者らは、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグ化タンパク質およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを同時発現させることによって、インビボでの試験タンパク質の凝集前の構造的な補完およびＧＦＰ蛍光の発色に対する確約をもたらし、発現される総タンパク質の見積もりを可能にすることが期待された。Ｎ末端６ＨＩＳを有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質と、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミド（図１、前出を参照のこと）に由来するＣ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグと、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に由来するＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴとを同時に発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび７０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ中で飽和まで増殖させ、−８０℃のフリーザーストック用に、２０％グリセロール中に、ＯＤ６００ｎｍ＝１．０にて希釈した。細胞を、ＬＢ中２つの４００倍希釈で、段階希釈し、ニトロセルロース膜にプレートした。３２℃にて一晩増殖させた後、これらの細胞を、連続的（実施例４、ＧＦＰ  Ｓ１１の操作、前出を参照のこと）、または同時に誘導した。連続的な誘導について、一晩のコロニーを有する膜上の細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌのＡｎＴｅｔを含有するプレート上で１．５時間、静止プレートで１時間、そして、１ｍＭ  ＩＰＴＧプレート上で最後に１時間インキュベートした（ＧＦＰ  Ｓ１１の操作、実施例４に使用した時間と比べ、誘導時間が短いことに注意されたい）。同時誘導プロトコールについて、一晩のコロニーを有する膜を、６００ｎｇ／ｍｌのＡｎＴＥＴおよび１ｍＭのＩＰＴＧの両方を含有するプレートに移し、３７℃にて４時間インキュベートして、ＧＦＰ  Ｓ１１融合物、および大きなＧＦＰフラグメント１−１０の両方を同時に発現させた。プレート上で誘導されたコロニーを、４８８ｎｍ励起フィルタを備えるＩｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて照射し、ＤＣ２９０デジタルカメラ（Ｋｏｄａｋ）を用いて、有色ガラスフィルタ（５２０ｎｍロングパス，ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を通して写真撮影した。蛍光のコロニーを、同時発現の後、または連続的な発現の後に画像化し、同じ構築物の可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、液体培養物中での連続的な誘導の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１５）。本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析���前に、可溶性フラクションを過剰のＴａｌｏｎ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に結合することによって、有用な凝集していない６ＨＩＳタグ化タンパク質の量を評価した。簡単に述べると、インビボ全細胞プレート補完アッセイにおいて使用したものと同じクローンの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを分析するために、コロニーを、別個に、９６ウェル培養プレートの１ｍｌ中で、３７℃にて増殖させた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌ  ＡｎＴＥＴを含む対数期に１時間誘導し、新しいＬＢで３回洗浄し、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧで１．５時間誘導した。誘導後、培養ペレットを、１１０μｌのＴＮＧ緩衝液で再懸濁し、超音波処理によりばらばらにした。溶解物を、遠心分離によりフラクションして、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを得た。連続的に誘導した液体培養物の４０μｌの可溶性抽出物を、ＴＮＧ緩衝液中５０％ｖ／ｖの金属親和性樹脂ビーズ（Ｔａｌｓｏｎ樹脂，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の等容量のスラリーと混合し、簡単に遠心分離した。未結合のフラクションを、ピペッティングにより除去し、ビーズを、過剰のＴＮＧ緩衝液で連続的に２回洗浄した。最後の遠心分離工程の後、緩衝液を捨てた。４０μｌの２×ＳＤＳ変性緩衝液を添加し、１００℃にて１５分間加熱した。不溶性フラクションを、記載されたように変性した（実施例４、前出を参照のこと）。Ｔａｌｏｎ結合し、かつ変性したサンプルを、各々、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。タンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、ＧＳ−８００校正デンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した。同時誘導によるインビボコロニー蛍光は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致する総タンパク質を報告したが、その一方で、連続的な誘導によるコロニー蛍光は、Ｔａｌｏｎ結合した可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致した（図１５）。高度に可溶性のタンパク質を発現するコロニーは、ＧＦＰ  １−１０が同時に誘導されていようと、連続的に誘導されていようと（タンパク質２、４および５、図１５）、明るかった。不溶性タンパク質を発現するコロニーは、ＧＦＰ  １−１０が同時に誘導されたとき（タンパク質８、１１、１５、１６および１８、図１５）、かなり明るかった。タンパク質１、４、５、７、９、１２および１４は、各々、ｐＴＥＴプラスミド（図１５）のより弱いｔｅｔプロモーター（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ  １９９７）から発現された場合よりも、ｐＥＴシステム（表３および図１４、前出）の非常に強力なＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら  １９９０）から発現されたときに、溶けにくかった。タンパク質の発現レベルおよび溶解度に対するプロモーターの強度の影響は、以前に注目されている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ  １９９６；Ｂａｎｅｙｘ  １９９９；Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｅｄｗａｒｄｓら  ２００３；Ｙｏｋｏｙａｍａ  ２００３；Ｆａｈｎｅｒｔ，Ｌｉｌｉｅら  ２００４）。
【０１３１】
（実施例１１：ＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグフラグメントおよびＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントからなるスプリットＧＦＰ補完対の操作）
実施例２（前出）の方法に従って、本発明者らは、超折り畳みＧＦＰアミノ酸１９８−２３８から構成される実現可能なスプリットＧＦＰ対（ＧＦＰ  Ｓ１０−１１）、および超折り畳みＧＦＰアミノ酸１−１９８から構成される補完アッセイフラグメント（ＧＦＰ１−９）を同定した。これらは、２つのフラグメントがＥ．ｃｏｌｉにおいて同時に発現される場合に、蛍光細胞を産生した。ＧＦＰ  １−９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて単独で発現されると不溶性であった。単独で発現されたフラグメントはいずれも、蛍光ではなかった。実施例３（前出）の記述に従って、そして、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１０−１１融合タンパク質を補完標的として使用して、本発明者らは、指向性進化によるＧＦＰ  １−９の折り畳みおよび溶解度を向上させて、新規改変体ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを生じ、これは、超折り畳みＧＦＰの変異（実施例２、前出を参照のこと）、およびさらなる変異Ｓ２Ｒ、Ｔ４３Ｓ、Ａ８７Ｖ、Ｆ１１４ＳおよびＫ１６６Ｔを含んだ。このフラグメントは、ｐＥＴ  ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からＥ．ｃｏｌｉにおいて３７℃にて発現されると、約５０％可溶性であった。次に、本発明者らは、実施例４（前出）の記述に従って、進化したＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを補完標的として使用して、ＧＦＰ  Ｓ１０−１１の溶解度を向上させ、そして、融合タンパク質の折り畳みおよび溶解度の揺れを減少させた。超折り畳みＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグは、以下の配列：
【０１３２】
【化６】
2007508841.tif 000011
を有し、一方で、最適化されたＧＦＰ  Ｓ１０−１１は、以下の配列：
【０１３３】
【化７】
2007508841.tif 000012
（変異Ｎ１９８Ｄ、Ｓ２０５Ｔ、Ｖ２０６Ｉ、Ｋ２１４Ｅ、Ｆ２２３Ｓ）を有する。これらのフラグメントを使用する、インビトロスプリットＧＦＰアッセイの感度を、実施例６、前出に従って試験したが、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴの量は制限された（２．５μＭのＧＦＰ  １−９  ＯＰＴ）。これらの条件下で、蛍光は、予測どおり、２．５μＭ以上のタグ化フラグメント濃度において、プラトーに達した（図１６）。
【０１３４】
（実施例１２：（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）サンドイッチタグ形式の操作、およびアッセイフラグメントＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いた検出）
標的タンパク質の両端が結合しているときを厳密に試験するため、そして、標的タンパク質の一端のみがタグ化された状態で結合している潜在的なアーチファクト（例えば、タンパク質分解または内部リボソーム結合部位により生じた短いフラグメント）を減らすために、本発明者らは、試験タンパク質が、ＧＦＰの二つの小さなドメイン間の融合物として発現されるサンドイッチ形式を操作し、これを次いで、ＧＦＰの第３のドメインで補完させる。この実施形態において、試験タンパク質Ｘは、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）のようなＧＦＰ鎖１０とＧＦＰ鎖１１との間のサンドイッチとして発現される（図１７）。この種は、ＧＦＰの第３のドメインであるＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを補完して、インタクトなＧＦＰを生成する。本発明者らは、当該分野で周知の方法を使用して、超折り畳みＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグ中のＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との間に試験タンパク質を挿入することによって、構築物（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）を操作した。ここで、Ｌ１およびＬ２は、各々アミノ酸ＧＧＧＳから構成されるリンカーである（図１８Ａ）。本発明者らは、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを使用して、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−亜硫酸レダクターゼ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）を首尾よく検出したが、補完は、Ｃ末端がＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３＋ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ形式と同じくらいの効率である、わずか約１／３０であった。本発明者らはまた、他の部分的に可溶性のタンパク質が、このサンドイッチ形式で発現されると不溶性になることを発見した。まず、本発明者らは、溶解度とは無関係に補完効率を改善した。本発明者らは、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）から開始し、ここで、鎖ＧＦＰ  Ｓ１０および鎖ＧＦＰ  Ｓ１１は、超折り畳みＧＦＰに由来するものであり（図１８Ａ）、短いアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＳＧＧ［配列番号３７］が、２つのＧＦＰ鎖の間に柔軟なリンカーを提供する。これを、ＤＮＡシャッフリングにより変異させ、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの補完が向上した改変体のライブラリーを、ｐＴＥＴベクターからのライブラリーの連続的な誘導によりインビボでスクリーニングし、その後、（実施例４、前出に概説した方法に従って）プレート上のコロニーとして、Ｅ．ｃｏｌｉ内でｐＥＴベクターからＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを発現させた。６つの最も明るいコロニーを、３回の進化のラウンドの後に配列決定した（図１８Ａ）。本発明者らは、６つのセットのうちの５番目の変異体に焦点をあて、この構築物を、（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）（ＳＭ５＝サンドイッチ変異体番号５）と名付けた。この最適物は、以下の配列：
【０１３５】
【化８】
2007508841.tif 000013
を有し、ここで、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖には下線を付し、アスタリスクは終止コドンである。最初の斜体の配列は、ＮｄｅＩクローニング部位ＣＡＴＡＴＧに由来するものであり、アミノ酸ＨＭをコードする。第２の斜体の配列は、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣに由来するものであり、アミノ酸ＧＳをコードする。ＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ制限部位をインフレームで有する試験タンパク質を、当該分野で周知の方法を使用して、ＮｄｅＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素で前もって消化した構築物を含むベクターにクローニングする。代表的に、この構築物を含むクローニングカセット中のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のインフレームの領域は、フレームシフトスタッファーにより終止コドンで置き換えられ、消化されていないベクターまたは優先順位の低いベクターにより生じる偽陽性を防ぐ（代表的なフレームシフトスタッファー配列については、実施例１、前出を参照のこと）。このようなアプローチは、当該分野で周知である。このカセットを、ｐＴＥＴベクターへのクローニングするために、ＮｃｏＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位により隣接させる。開始鎖構築物と比べ、Ｎｄｅ−１／ＢａｍＨ−１部位にクローニングされた可溶性亜硫酸レダクターゼは、補完速度が約２０倍増加したが、（実施例４、前出のように）部分的に可溶性のＨＰＳタンパク質を用いて試験した場合、タンパク質の溶解度に対する有害な効果がまた増加した。続いて、向上した補完、および融合タンパク質の溶解度の摂動の減少について同時に選択するために、本発明者らは、ＧＦＰ  Ｓ１１の溶解度および補完を向上するために用いたものと同じおとりタンパク質であるリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）（実施例４、前出）を使用した。ＨＰＳは、ｐＴＥＴベクターから単独で発現されると、約６０％可溶性であった（図１５、タンパク質番号９）が、（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−ＨＰＳ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）融合タンパク質として発現されると、不溶性であった。本発明者らは、シャッフリングおよびプライマードーピング変異誘発（１４の合成オリゴヌクレオチドプライマーのプール）を用いて、上流の（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）ドメインに焦点をあてた（図１８Ｂ）。各プライマーを、ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５ドメインの１４のアミノ酸の１つに集中させた。中心の標的アミノ酸は、ＮＮＮがコードする縮重を含み、そして、クローニングベクターの前後関係において、ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５に対する相同物（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）と隣接する（図１８Ｂおよび図１９に示される標的配列）。縮重プライマーのプールを、組立て反応（実施例４、前出において実施した再組立て）の間に、断片化したＤＮＡに添加した。このようなプライマードーピング変異誘発技術は、当該分野で周知である。本発明者らは、上流でＮｃｏＩ、そして下流でＢａｍＨＩに隣接されたドメインＮｃｏ１：（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）をシャッフルして増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるフラグメントの再組立ての間に、縮重プライマーミックスを添加した。本発明者らは、ＰＣＲによって、再組立て��た変異型構築物に由来するドメインを再増幅し、次いで、変異型（ＧＦＰ  Ｓ１０）プールを含むＮｃｏ１／Ｎｄｅ−１フラグメントを消化して切り出し、標準的な技術を使用してゲル精製し、そして、Ｎｃｏ１／／Ｎｄｅ１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）を含む受容ベクターにクローニングした。（この実施例、前出、および、この実施例中の中間体フラグメントを使用する、インビトロ補完アッセイについて、実施例４、前出に概説された方法に従う）ｐＴＥＴプラスミドおよびｐＥＴプラスミドからの連続的な誘導形式を使用する、３回の選択ラウンドの後、最良の８クローンの各々の配列を、蛍光色素ターミネーター配列決定により決定した（図１９）。最良のパフォーマンスを示すクローン（（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）−Ｌ１−Ｎｄｅ１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と名付ける）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させると、約４５％が可溶性であり、これは、不溶性での開始構築物に対して顕著な改善である。そして、補完シグナルは、ここで、サンドイッチ構築物（前出）においてＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５タグのみを検出するためにＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを使用した場合の補完シグナルの、約１／５〜１／４であった。次に、本発明者らは、１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質（同一性および非融合物の溶解度については、表３、前出を参照のこと）を用いて、アッセイを試験した。可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、以前に記載したように（実施例９、前出）、本実施例の即時のフラグメントを用いてアッセイした。本発明者らは、参照物として（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）タグのみを特異的に検出するために、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いて、そしてまた、サンドイッチ形式でタグ化したタンパク質の（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）鎖および（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）鎖の両方の結合を必要とするＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを使用して、これらのサンドイッチ形式でタグ化したタンパク質をアッセイした。予想どおりに、補完は、一方の鎖のみが検出に必要とされる場合（ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの場合）に、より効率的であり、そして、尿素可溶化ペレットを用いたペレットフラクションの検出は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴでの検出の場合に最も効率的であった（図２０）。それにもかかわらず、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いて検出されるサンドイッチについての可溶性フラクションの蛍光は、ＧＦＰ  １−１０での検出を用いたときのシグナルと十分に相関し、可溶性タンパク質が予想どおりであったことを記録した。同様に、インビボでの連続的な誘導は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合物を用いた可溶性ｐＴＥＴの発現と相関した（図２０、また、実施例９（前出）および図１５も参照のこと）。好ましい最適物は、以下のアミノ酸配列：
【０１３６】
【化９】
2007508841.tif 000014
を有し、ここで、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖には下線を付し、アスタリスクは終止コドンである。最初の斜体の配列は、ＮｄｅＩクローニング部位ＣＡＴＡＴＧに由来するものであり、アミノ酸ＨＭをコードする。第２の斜体の配列は、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣに由来するものであり、アミノ酸ＧＳをコードする。ＮｄｅＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位をインフレームで有する試験タンパク質を、当該分野で周知の方法を使用して、ＮｄｅＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素で前もって消化した構築物を含むベクターにクローニングする。カセットは、ｐＴＥＴベクターにクローニングするために、ＮｃｏＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位に隣接される。代表的に、この構築物を含むクローニングカセット中のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のインフレームの領域は、フレームシフトスタッファーにより終止コドンで置き換えられ、消化されていないベクターにより生じる偽陽性を防ぐ（代表的なフレームシフトスタッファー配列については、実施例１、前出を参照のこと）。
【０１３７】
（実施例１３：検出および精製に使用するための、ＧＦＰ  Ｓ１１タグのヒスチジン富化変異体の操作）
本発明者らは、１つの単一のタグに、タンパク質の検出およびタンパク質の精製という２つの機能を合せるために、金属アフィニティタンパク質精製のための強力な親和性を有するようにＧＦＰ  Ｓ１１を操作した。本発明者らは、溶媒環境に露出され、その側鎖がＧＦＰ構造において埋もれていないＧＦＰ鎖１１（Ｏｒｍｏ，Ｃｕｂｉｔｔら  １９９６；Ｔｓｉｅｎ  １９９８）の残基は、ＧＦＰ  Ｓ１１タグの補完が大きなＧＦＰ  １−１０アッセイフラグメントで破壊されることなく、別のアミノ酸で荷電され得ると推測した。４つの外側に位置する残基を、以下の特定のプライマー：
【０１３８】
【化１０】
2007508841.tif 000015
を使用するＰＣＲにより、ヒスチジンに変異させた。得られたＧＦＰ  １１  Ｈ７フラグメントＫＨＤＨＭＨＬＨＥＨＶＨＡＨＧＧＴ［配列番号１８］を、Ｃ末端が可溶性のコントロールタンパク質である亜硫酸レダクターゼとなるようにクローニングした。ＧＦＰのＸ線結晶学構造の実験（Ｏｒｍｏ，Ｃｕｂｉｔｔら  １９９６；Ｔｓｉｅｎ  １９９８）（ＰＤＢ番号：１ＧＦＬ）（Ｙａｎｇ，Ｍｏｓｓら  １９９６）は、ＧＦＰ  １１  Ｈ７の末端にある２つのさらなる残基が、ＧＦＰ  １−１０の他のアミノ酸と特異的な接触を行なわなかったことを示した。これらのさらなる残基を、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７タグ内でヒスチジンへと変異させて、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９、ＨＤＨＭＨＬＨＥＨＶＨＡＨＨＨＴ［配列番号２０］を生成した。１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍコントロールタンパク質（表３、前出を参照のこと）を、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７またはＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９と融合させて、ｐＥＴベクター（実施例９、前出を参照のこと）から発現させ、これらのタグが、インビトロで融合タンパク質を正確に定量および精製するための新規の検出および精製のために使用され得るか否かを試験した。一晩の液体培養物を、新しいＬＢ中に希釈し、０．５ＯＤ  ６００ｎｍまで増殖させ、３７℃にて４時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、超音波処理および遠心分離により分画した。Ｃ末端にＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７融合タグまたはＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９融合タグを有する１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍコントロールタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる溶解度を、これより前に記載したように評価した（実施例９、前出）（表４を参照のこと）。非融合物の溶解度は、タンパク質について、以前に決定した（実施例９、前出）。ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７タグおよびＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９タグは、タンパク質の溶解度に最小限の効果を有する。
【０１３９】
【表４】
2007508841.tif 000016
（実施例１４：Ｓ１１  Ｈ７融合物とＧＦＰ  １−１０  Ａ４との間の補完反応の感度）
精製した亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７融合物の希釈を、これより前に記載したように（実施例６、前出）実施した。希釈は、１００μｌのアリコートあたり、６７０ｐｍｏｌ〜０．７ｐｍｏｌの範囲にわたり、次いで、１００μｌのアリコートに添加した大過剰（８００ｐｍｏｌ）のＧＦＰ  １−１０  Ａ４（約０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、補完を行なった。ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７の検出について、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴと比べて高い補完速度を有したので、ＧＦＰ  １−１０  Ａ４アッセイフラグメントを用いた。蛍光による補完動力学追跡（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、一晩モニターした。最終的な蛍光の値を、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７融合タンパク質の量に対してプロットした（図２１）。
【０１４０】
（実施例１５：Ｎ−６ＨＩＳタグまたはＣ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７タグのいずれかを用いる、ＧＦＰの精製の比較）
折り畳みレポーターＧＦＰを、Ｎ−６ＨＩＳ  ｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、またはＣ末端にＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７  タグを有するｐＥＴベクター（Ｎ−６ＨＩＳタグなし）にクローニングした。各融合物を発現するＢＬ２１（ＤＥ３）の２００ｍｌの培養物を、ＯＤ６００  約０．５まで増殖させ、３７℃にて１ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導した。この培養物のペレットを、２ｍｌのＴＮＧに再懸濁し、超音波処理した。可溶性フラクションを、Ｔａｌｏｎ樹脂精製ビーズ（ＴＡＬＯＮ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の上に充填した。過剰のＴＮＧ緩衝液で２回、そして、５ｍＭ  イミダゾールを補充したＴＮＧ中で１回洗浄した後、タンパク質を、ＴＮＧ緩衝液中１５０ｍＭイミダゾールで溶出した。粗製抽出物および精製したフラクション（１５０ｍＭイミダゾール溶出）を、ＳＤＳ変性緩衝液と混合し、１００℃にて１５分間加熱し、そして、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分離した。このタンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｃｏｄｅ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、ＧＳ−８００校正走査デンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した（図２２）。
【０１４１】
（実施例１６：Ｓ１１  Ｈ７、Ｓ１１  Ｈ９と融合したか、またはＴａｌｏｎ樹脂に結合したＮ−６ＨＩＳタグを有する、折り畳みレポーターＧＦＰのイミダゾール溶出プロフィール）
ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７タグおよびＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９タグのＴａｌｏｎ精製樹脂（Ｔａｌｏｎ  Ｒｅｓｉｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）への相対的な親和性を確認するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７またはＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９  非６ＨＩＳタグ化ｐＥＴベクター、およびＮ−６ＨＩＳ  ｐＥＴベクターとのＮ末端融合物にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ中の各融合物の３ｍｌの培養物を、ＯＤ６００  約０．５まで増殖させ、３７℃にて４時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。この培養物のペレットを、１５０μｌのＴＮＧに再懸濁し、超音波処理した。５０μｌの可溶性フラクションを、２００μｌのＴａｌｏｎ樹脂ビーズ（ＴＡＬＯＮ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の上に充填した。ＴＮＧ中３回の１ｍｌ洗浄の後、５０％ｖ：ｖのビーズのスラリー（２０μｌ）を、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭおよび１００ｍＭのイミダゾールを含有する５０μｌのＴＮＧ７つのＰＣＲチューブの各々に移し、ボルテックスして混合し、遠心分離してビーズをペレット化し、次いで、１０μｌの溶出したフラクションを、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭプレート、Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）にて１９０μｌのＴＮＧ緩衝液で希釈した。蛍光（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ）を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて測定した（図２３）。結果は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９タグは、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７タグと比べ、Ｔａｌｏｎ樹脂に対してより高い親和性を有し、タンパク質結合の後に、高いストリンジェンシーのイミダゾール洗浄を用いたタンパク質精製に適切であるはずであることを示す。
【０１４２】
（実施例１７：Ｓ１１  Ｈ９に融合したいくつかの試験タンパク質のコバルト精製）
７つの部分的に可溶性の（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質）−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９融合物を、Ｔａｌｏｎ樹脂に対するＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９変異体の親和性を使用して、Ｔａｌｏｎ樹脂ビーズ上での精製について選択した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）中の各融合物の３ｍｌの培養物を、ＯＤ６００  約０．５まで増殖させ、３７℃にて４時間１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。培養物のペレットを、１５０μｌのＴＮＧに再懸濁して、超音波処理した。５０μｌの可溶性フラクションを、３００μｌのエッペンドルフチューブにて、５０μｌのＴＮＧ洗浄Ｔａｌｏｎ樹脂ビーズ（Ｔａｌｏｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）と混合した。約２５℃の室温にて、１０分間誘導した後、この懸濁物を遠心分離して上清を除き、未結合のフラクションとして保存した。ビーズを、５ｍＭイミダゾールを含有する１ｍｌ  ＴＮＧで洗浄し、次いで、１０ｍＭイミダゾールを含有する１ｍｌ  ＴＮＧで洗浄して、偶発的に結合したタンパク質を除去した。過剰の上清を、０．２μフィルタカートリッジ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にてビーズをスピンダウンすることによって除去した。結合したタンパク質を、１５０ｍＭイミダゾールを含有する７５μｌのＴＮＧと共に１０分間インキュベートすることにより溶出し、この懸濁物を、０．２μフィルタカートリッジを通して遠心分離し、そして、濾過上清を、溶出したフラクションとして保存した。各タンパク質についての、結合した粗製抽出物（Ｓ）、未結合フラクション（Ｕ）、および溶出フラクション（Ｅ）を有するＴａｌｏｎ樹脂を、２×ＳＤＳ緩衝液で変性させ、そして、４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の上に充填した（図２４）。
【０１４３】
（引用した文献）
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
【表７】
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（配列表）
【０１４７】
【表８】
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【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
【表１０】
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【０１５０】
【表１１】
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【０１５１】
【表１２】
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【０１５２】
【表１３】
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【０１５３】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの概略図を示し、これは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能なｐＰＲＯＴｅｔ．６ｘＨＮベクターの改変バージョンである。クロラムフェニコール耐性遺伝子が、ｐＰＲＯｌａｒ耐性マーカーのカナマイシンプロモーターの制御下のスペクチノマイシン耐性マーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡからのｐＰＲＯｌａｒプラスミド）によって置換された。同一シストロン上に、Ｔ０転写終結配列の上流のテトラサイクリンリプレッサーがコードされている。翻訳されるリプレーサーの量は、ＳａｃＩの下流の弱いＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列によって調節される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、操作されたｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの異なる要素を示す。太字＝ＮｃｏＩ  ＣＣＡＴＧＧ、およびＫｐｎＩ  ＧＧＴＡＣＣによって隣接される、ｔｅｔプロモーター下の発現遺伝子のためのｖ１クローニングカセット。グレー＝ＳｐｅｃＲ−ｔｅｔＲシストロンのためのＴ０転写ターミネーター；緑＝ｔｅｒＲリプレッサー遺伝子；黄＝ｔｅｔＲ翻訳を制御するＲＢＳ；マジェンタ＝スペクチノマイシン（ｓｐｅｃＲ）遺伝子；シアン＝ＰＲＯＬＡＲベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からのカナマイシンプロモーター要素。
【図２】図２は、スプリットＧＦＰ補完の原理を示す。目的のタンパク質（Ｘ）が、柔軟なリンカー（Ｌ）を経由して小ＧＦＰフラグメント（β鎖１１、残基２１５〜２３０）に融合される。補完性ＧＦＰフラグメント（β鎖１〜１０、残基１〜２１４）は別個に発現される。単独で蛍光を発するフラグメントはない。混合されるとき、小ＧＦＰフラグメントおよび大ＧＦＰフラグメントは自然に会合し、ＧＦＰ折り畳みおよび蛍光発色団の形成を得る。誤折り畳みまたは凝集のような、小ＧＦＰタグを接近させないプロセスは、補完を防ぎ得る。
【図３】図３は、１１のβ鎖のＧＦＰファミリーメンバーのトポロジー的二次構造図を示す。（Ａ）アミノ酸の鎖および番号付け。丸で囲った番号は、鎖間の曲がりの指標（およびこのタンパク質を分離するために好ましい部位）に対応する。塗りつぶしの丸は、折り畳みレポーター変異であり、そして白丸は超折り畳みＧＦＰ変異である。（Ｂ）は、１１のβ鎖の番号付けの慣例を示す。（Ｃ）は、短い柔軟性のリンカーによってＮ末端およびＣ末端を連結することにより作製され、そしてアミノ酸１７３における新たな開始コドン、およびアミノ酸１７２の後の停止コドンを提供する、円順列変異体ＧＦＰを示す。
【図４】図４は、スプリット位置１５７または１７２における示されたＧＦＰフラグメント（すなわち、１〜１５６＋１５７〜２３８および１〜１７１＋１７２〜２３８）による、プレート上のＥ．ｃｏｌｉコロニー中の適合プラスミドから同時発現された、インビボ補完の蛍光イメージを示す。左のカラムは、折り畳みレポーターＧＦＰ由来のフラグメントを、右のカラムは、超折り畳みＧＦＰ由来の同じフラグメントを示す。予期されるように、この超折り畳みフラグメントは、確かに働き、そしてより明るいコロニーを与え、超折り畳みＧＦＰ  対  折り畳みレポーターＧＦＰの改良された折り畳みと一致する。
【図５】図５は、ＧＦＰ１〜１０改変体のインビトロ補完性効率を示す。野生型ＧＦＰ１１に融合された１ｍｇ／ｍｌの可溶性亜硫酸レダクターゼを含む１８０μｌの緩衝液の添加後の、１ｍｇ／ｍｌの再折り畳みされた超折り畳みＧＦＰ１〜１０の２０μｌ（下のトレース）、または等量の可溶性最適化ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴフラグメント（上のトレース）の補完についての蛍光進行曲線。挿入画は、ＧＦＰ１〜１０改変体のインビボ補完を示す。野生型ＧＦＰ  Ｓ１１と融合された亜硫酸レダクターゼとともに、超折り畳みＧＦＰ（上）、または折り畳みレポーターＧＦＰ（下）からの同時発現するＧＦＰ１〜１０ニトロセルロースメンブレン上のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コロニーの蛍光イメージ。
【図６】図６は、単独もしくはＧＦＰ  Ｓ１１野生型（ＷＴ）へのＮ末端融合としてタンパク質ヘクスロースホスフェートシンターゼ（ＨＰＳ）、または３つのＧＦＰ  Ｓ１１最適物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）に融合されたＨＰＳを発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の可溶性フラクション（Ｓ）およびペレットフラクション（Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合物は不溶性であり、その一方、ＨＰＳ単独は、約６０％可溶性であることに注目のこと。
【図７】図７は、組織培養プレート中、インビロで過剰のＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴ（８００ｐｍｏｌ）の添加後の、亜硫酸レダクターゼ（５０ｐｍｏｌ）に融合された３つのＧＦＰ  Ｓ１１変異体Ｍ１、Ｍ２およびＭ３の蛍光補完動力学的トレースを示す。各アッセイの最終容量は２００μｌであった。
【図８】図８は、３つの異なるＧＦＰ１〜１０構築物を用いる逐次的（左カラム）または同時誘導プロトコール（右カラム）の効果を示す。ＧＦＰ１〜１０構築物を発現するＥ．ｃｏｌｉクローンの３つの行の蛍光イメージは、漸次良好な性能および可溶性を有し：折り畳みレポーター（ＦＲ、第１の行）、超折り畳み（ＳＦ、第２の行）、または最適化ＧＦＰ１〜１０改変体（ＯＰＴ、第３の行）である。超折り畳みＧＦＰ１〜１０は、単独で発現されるとき不溶性である。第１のカラム：亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１融合物の発現が続くＧＦＰ１〜１０の一時的発現。第２のカラム：亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１野生型とのＧＦＰ１〜１０の同時発現。超折り畳みＧＦＰ１〜１０は不溶性であり、そして細胞は、一時的誘導プロトコール後、かすかに蛍光を発し、おそらく、超折り畳みＧＦＰ１〜１０が、亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合物の発現の前に凝集し得、補完効率を減少するからである。同時発現は、明るい細胞を与え、おそらく、超折り畳みＧＦＰ１〜１０と亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１との間の結合および補完が迅速に起こり、ＧＦＰ１〜１０を誤折り畳み、および凝集から救うためである。対照的に、部分的に可溶性のＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴを発現する細胞は、これら構築物が逐次的に発現されるか、または同時発現されるか否かにかかわらず明るい。
【図９】図９は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグフラグメントおよびＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。０．１〜２００ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、８００ｐｍｏｌのＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。（Ａ）ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴの添加１５分後、各溶液について測定された蛍光。（Ｂ）ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴの添加１時間後、各溶液について測定された蛍光。
【図１０】図１０は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３に融合された亜硫酸レダクターゼの５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、および１．５６ｐｍｏｌの補完の進行曲線を示す。これらデータは、小定数を引き、そしてＥＸＣＥＬデータ分析ツールＳｏｌｖｅｒ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｉｎｃ．）を用いて非線形最小自乗法によって算出された、スケーリング因子を適用することにより５０ｐｍｏｌの進行曲線に適合された。優れた重ね合わせは、この進行曲線の形状が、タグ化タンパク質の濃度、または非結合ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴフラグメントのプールの枯渇に依存しないことを示す。
【図１１】図１１は、Ｃ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３でタグ化されたレポーターＧＦＰを折り畳みすることによる、Ｔａｌｏｎ樹脂−結合６ＨＩＳ  ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴへの結合およびその補完を示す。（１）結合した６ＨＩＳ  ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴをもつＴａｌｏｎ樹脂、（２）融合したＣ−末端  ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を経由する折り畳みレポーターＧＦＰの結合によるビーズ−結合蛍光における迅速な増加、（３）補完に起因するゆっくりとした蛍光形成。
【図１２】図１２は、補完反応に対する尿素濃度の影響を示す。反応は、２Ｍ以上の尿素で停止される。
【図１３】図１３は、補完反応に対するｐＨの影響を示す。（Ａ）ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴの添加６時間後の亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３に対する最終蛍光のｐＨ依存性。（Ｂ）ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴの添加６時間後の合成ペプチドＧＦＰ  Ｓ１１の最終蛍光のｐＨ依存性。蛍光補完は、ｐＨ６．５未満で非効率的に見える。
【図１４】図１４の棒グラフは、スプリットＧＦＰシステムを用いる、Ｃ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグをもつ１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質のインビトロタンパク質定量を示す（前述、表３を参照のこと）。ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴを用いる可溶性（黒い棒）および非折り畳みペレットフラクション（灰色の棒）のＧＦＰフラグメント補完アッセイ蛍光。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、対応する可溶性（Ｓ）、およびペレットフラクション（Ｐ）を示す。タンパク質番号８、酒石酸デヒドロゲナーゼ−βサブユニットは、約１３ｋＤの第２のより低いバンドを示すことに注目のこと。
【図１５】図１５は、スプリットＧＦＰアッセイシステムを用いるインビボ可溶性および発現スクリーニングを示す。ｔｅｔ−プロモータープラスミドからのＮ−末端６ＨＩＳタグおよびＣ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグとともに発現された１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質（表３、前述を参照のこと）は、ＧＦＰ−１〜１０  ＯＰＴを発現するｐＥＴプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）株中にクローン化された。タグ化構築物およびＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴ（上）の同時誘導後、またはタグ化構築物、次いでＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴ（逐次的誘導、中央）の発現が続くタグ化構築物の一時的発現のプレート上のコロニーの蛍光イメージ。液体培養中で逐次的に誘導された細胞からのＴａｌｏｎ樹脂ビ−ズ−結合可溶性（Ｂ）およびペレットフラクション（Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下）。付随的に結合されたＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴ（見かけの分子量約２９ｋＤ）は矢印によって示される。ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（タンパク質番号７）は部分的に可溶性であることに注目のこと（Ｔａｌｏｎ樹脂−結合フラクション中のＧＦＰ１〜１０に対応するバンドの僅かに下のバンドを参照のこと）。ポリスルフィドレダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合物（表３、前述を参照のこと）は、４８８ｎｍの励起光を吸収し、そしてこのタンパク質の良好な発現にもかかわらず同時発現の間に総細胞蛍光を減少する強い赤色のコロニーを生成した。
【図１６】図１６は、ＧＦＰ  Ｓ１０〜１１  ＯＰＴタグフラグメントおよびＧＦＰ１〜９  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１０〜１１  ＯＰＴ融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、２５０μＭのＧＦＰ１〜９  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。蛍光は、ＧＦＰ１〜１０の添加６時間後、各溶液について測定された。ＧＦＰ１〜９  ＯＰＴの濃度は制限的であるので、蛍光は、約２５０μＭを超える亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１０〜１１でプラトーになる。
【図１７】図１７は、試験タンパク質Ｘが、ＧＦＰの２つのドメイン（鎖１０および鎖１１）の間の融合物として発現され、そしてＧＦＰの第３のドメインによって検出されるサンドイッチタグフォーマットの原理を示す。（ａ）補完は、これらタグ鎖がインタクトな標的タンパク質Ｘによって両者連結されるとき、効率的に起こる。（ｂ）補完は、これらタグ鎖が分離されると非効率的であり得る。
【図１８Ａ】（Ａ）は、開始配列（下の配列）が続く、補完標的としてＧＦＰ１〜９  ＯＰＴを用いる（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）の進化からの６つの最適物の配列を示す。ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、下線および青の強調表示で示される。開始配列に対する６つの最適物中の変異は黄色の強調表示で示される。第５の最適物が好ましく、そして（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と称され、ここで、Ｘは目的の標的タンパク質である。（Ｂ）は、ＧＦＰ  Ｓ１０の標的部位に変異を導入するために用いられた１４の変異誘発縮重プライマーを示す。
【図１８Ｂ】（Ａ）は、開始配列（下の配列）が続く、補完標的としてＧＦＰ１〜９  ＯＰＴを用いる（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）の進化からの６つの最適物の配列を示す。ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、下線および青の強調表示で示される。開始配列に対する６つの最適物中の変異は黄色の強調表示で示される。第５の最適物が好ましく、そして（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と称され、ここで、Ｘは目的の標的タンパク質である。（Ｂ）は、ＧＦＰ  Ｓ１０の標的部位に変異を導入するために用いられた１４の変異誘発縮重プライマーを示す。
【図１９】図１９は、参照配列（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）、図１８Ａからの最適配列（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）、および８つの最適物（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−Ｎｅｄ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）の配列を示す。開始配列（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｅｄ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）の可溶性を改良する標的鎖ＧＦＰ  Ｓ１０中の変異は、赤色の強調表示で示される。８つの最適物配列の各々は、ＨＰＳコード配列を通って続き、そしてＢａｍＨＩ部位で再開し、柔軟なリンカー配列およびＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５が続く（リスト中の第２の配列の端部を参照のこと）。
【図２０】図２０は、（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）−ＧＧＧＳ−ＮｅｄＩ−Ｘ−ＢａｍＨＩ−ＧＧＧＳ−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）をもつｐＴＥＴベクターのＮｅｄＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位中にクローン化され、そしてｐ１５オリジンをもつｐＥＴ２８ベクター上にＧＦＰ１〜９  ＯＰＴを含むＢＬ２１（ＤＥ３）株中に形質転換された１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍコントロールタンパク質Ｘのインビトロおよびインビボ補完アッセイを示す。インビトロアッセイには、液体培養がＡｎＴＥＴでのみ誘導された。（ａ）ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴでアッセイされた２０μｌの可溶性アリコート（ｂ）ＧＦＰ１〜１０  ＯＰＴでアッセイされた１０μｌの尿素可溶化ペレットのアリコート（ｃ）ＧＦＰ１〜９  ＯＰＴでアッセイされた１０μｌの尿素可溶化ペレットのアリコート。（ｅ）ＡｎＴＥＴ試薬を用いるｐＴＥＴからのサンドイッチタグ構築物の一時的誘導、次いでＩＰＴＧを用いるＧＦＰ１〜９の誘導後のＥ．ｃｏｌｉの蛍光イメージ。
【図２１】図２１は、ＧＦＰ１〜１０  Ａ４で補完された可溶性亜硫酸レダクターゼＳ１１  Ｈ７融合物の感受性プロフィールを示す。このアッセイは、ピコモルの感受性を示す。この実験では、９６ウェルのマイクロプレートは、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液でブロックされなかった。低濃度における較正曲線の非線形性（挿入画）は、ウェルの表面上への吸収によるタグ化タンパク質の損失に起因するようである。
【図２２】図２２は、折り畳みレポーターＧＦＰ−（ＧＦＰ−Ｓ１１  Ｈ７）融合物に対する、およびＮ６ＨＩＳ−折り畳みレポーターＧＦＰ融合物に対する粗抽出物および生成されたフラクションの染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。
【図２３】図２３は、Ｔａｌｏｎ樹脂ビーズに結合された、Ｎ６−ＨＩＳ−ＧＦＰ、折り畳みレポーターＧＦＰ−（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７）および折り畳みレポーターＧＦＰ−（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９）について、異なるイミダゾール濃度で溶出されたフラクションの蛍光を示す棒グラフである。（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ７）タグは、より堅く結合した（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９）に対し、より低い濃度のイミダゾールで溶出し始める。信号は、上清液に放出されたタンパク質の量に対応するので、信号が明るいほど、堅く結合された種は、示されたイミダゾール濃度でより少ない。
【図２４】図２４は、Ｔａｌｏｎ樹脂を用いるＣ−末端（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｈ９）タグをもつＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍからのいくつかの試験タンパク質の小スケールを示す。（Ｓ）可溶性溶解物、（Ｕ）非結合フラクション、（Ｅ）ＴＮＧ緩衝液中の１５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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