(57)【要約】  アテローム性動脈硬化症は傷害に対する反応と見なし得る；その反応はそれ自体重症のアテローム性動脈硬化症ではないが、代わりにアテローム性動脈硬化プラークの破壊に繋がる因子である。本発明において、我々はかかる因子を同定した。アネキシンＶと内皮との結合低下が、アテローム血栓症の病歴を有する患者に認められた。活性成分としての未変性のアネキシンＶもしくはＮ−末端フラグメントまたは免疫グロブリンのサブフラグメントを医薬組成物の製造に使用することを、当該結合を改善するために提案する。頚動脈プラークに対するアネキシンＶの結合を増加させるために、アネキシンＶ、Ｎ−末端フラグメントまたは免疫グロブリンを使用することが、アテローム血栓症を予防するための新規メカニズムとなる。
2007532617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントの、塩の形状とした使用。
【請求項２】
医薬組成物が有効量のアネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントを、担体および添加物と組合わせて含有してなる請求項１記載の使用。
【請求項３】
医薬組成物中のアネキシンＶの有効量がアネキシンＶ−内皮結合の診断的状況分析により決定されるものである請求項１または請求項２記載の使用。
【請求項４】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、有効量のアネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントまたはその対応する塩を含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項５】
危険状態にある被験対象が全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者である請求項４記載の方法。
【請求項６】
アネキシンＶに結合する抗体を阻害する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクション。
【請求項７】
アネキシンＶの内皮に対する結合を促進する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクション。
【請求項８】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬の製造における、請求項６または７記載の精製サブフラクションの使用または市販入手可能なプール免疫グロブリン製剤の使用。
【請求項９】
医薬に使用する請求項６または７に記載の精製サブフラクション。
【請求項１０】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、プール免疫グロブリンまたはプール免疫グロブリンの精製サブフラクションを有効量含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項１１】
危険状態にある被験対象が全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者である請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアテローム性動脈硬化症およびアテローム血栓症の分野に関係する。本発明は取分けアテローム血栓症およびプラーク破壊を予防または阻害するための新規メカニズムに関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症とアテローム血栓症との間には相互関係がある。アテローム性動脈硬化症は炎症性疾患の多くの特徴を有する；例えば、病巣における、多量の炎症性細胞および前炎症性サイトカインの産生などである１，２。
【０００３】
心臓血管系疾患による死に至る危険の増大、取分け全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の患者における死亡リスクは重要な臨床上の課題である。ＳＬＥ患者の心臓血管系疾患は異常脂肪血症などの伝統的なリスクファクター、および低密度リポタンパク質の酸化（oxＬＤＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）システムにおける上昇した活性（異常脂肪血症と密接に関連）、ＣＲＰにより判定される全身性炎症、ホモシステインおよび抗リン脂質抗体（aＰＬ）などの非伝統的リスクファクターの両方と関連する３−７。抗リン脂質は、ＳＬＥ患者に共通して、再発性妊娠喪失および再発性血栓症を特徴とする抗リン脂質抗体症候群（ＡＳＰ）の原因となり得る８，９。抗リン脂質の異なる形状は、一般住民における心臓血管系疾患にも関係がある１０，１１。
【０００４】
アネキシンはカルシウムと負に荷電したリン脂質に結合する性質を有し、その両方の性質が血液凝固に必要である。最近、アネキシンＶが抗リン脂質抗体症候群に関係するとされた；その理由は、ある種の抗リン脂質抗体が胎盤のアネキシンＶ抗血栓遮蔽を崩壊させ、胎盤ミクロ血栓症と再発性流産にかかりやすくするからである１２−１４。
【０００５】
アネキシンＶが活性化した血小板と傷害を受けた細胞に結合することが、多分、血栓中での選択的タンパク質保持を説明している。このことは静脈性および動脈性血栓症の実験動物モデルにおいて示されており１５、標識アネキシンは、ノイズの少ない安全性の高いヒトの血管血栓を医療用に画像化するためのものとして提案されている１６。
【０００６】
血液凝固系障害におけるアネキシンＶの治療使用と関連する重要な問題は、動物実験で５〜１５分と見積もられている、循環系でのその短い半減期である１５，１７；アネキシンＶはヒトの循環系において半減期が短い。
【０００７】
「修飾アネキシンタンパク質および血栓症の予防方法」とするＥＰ１３７９２６６には、出血を増大させることなく血栓症を予防するために使用するポリエチレングリコール−修飾アネキシンタンパク質が請求されている。アネキシンＶの半減期は、血栓形成に必要なプロトロンビナーゼ複合体の結合を防止する方法において、ＰＥＧ複合体を使用することにより改善されている。
【０００８】
本発明において、我々は、アネキシンＶがアテローム性動脈硬化症のプラークを安定化し得ることを示した。アネキシンＶまたはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントを本発明に従って（好ましくは、注射により）投与すると、それは最初の経路上の内皮プラークに結合する。循環系におけるアネキシンＶの短い半減期は、従って、ＥＰ１３７９２６６の場合と同様に、問題ではない。アネキシンＶまたはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントを添加剤と共に、または添加剤なしに含有してなる注射用組成物は、従って、瞬間的な結合を経て頚動脈プラークを安定化することにより、アテローム血栓症を予防する。
【０００９】
免疫グロブリンＧまたはＩｇＧは、成人において９００ｍｇ／ｄｌないし２４００ｍｇ／ｄｌの範囲の正常濃度で形成されるタンパク質である。これは血清または血漿に見出される総タンパク質の約２０％である。ＩｇＧの半減期は２３日である。このものはバクテリア、ウイルス、寄生虫、ある種のカビに対する免疫として寄与し、組織において抗体活性を提供する。ＩｇＧは炎症反応の引き金を引く補体を活性化することができ、それ自体が対象である。ＩｇＧは動物の種々のウイルスなどに対し、接種またはナチュラル・バーンヤードとの接触を介して予防を提供する。接触が起こると、メモリーが展開し、身体は特異的な感染と闘うために必要な抗体を産生することが可能となる。ヒトの場合、ＩｇＧは胎盤を通して新生児に移行する。もしＩｇＧが存在しないかまたは低レベルであるなら、哺乳動物は動物が接触することとなる感染因子に対して予防力の乏しいものとなる。
【００１０】
静脈内用免疫グロブリン製剤（例えば、ＩＧＩＶ（バクスター（Baxter）その他）は、市販品として入手可能なＩｇＧの高度精製製剤であり、抗体生産がまったくないか、または非常に低いレベルである患者の処置に使用する。免疫グロブリン製剤は以下のメーカーから入手可能である：バクスター（米国）例、ガンマガード（Gammagard；登録商標）、イシベン（Isiven）（アンチモ・ナポリ、イタリア）、オムリックス（Omrix）（テル−ハショマー（Tel-Hashomer）、イスラエル）、マイルス（生物製品部門、ウエスト・ヘブン、コネチカット）、スクラボ（Sclavo）（ルッカ（Lucca）、イタリア）、サンド（ノバルティス、バーゼル、スイス、例、サンドグロブリン（Sandoglobulin；登録商標）、バイオテスト・ディアグノスティック・コーポレイション（デビル、ニュージャージー）。免疫グロブリン製剤の例は、ガンマガードＳ／Ｄ（登録商標、ガンマーＩＶ（登録商標）、ガンマー−ＰＩＶ（登録商標）、ガムイミューンＮ（Gammimune N；登録商標）、イベエガム（Iveegam；登録商標）、パングロブリン（Panglobulin；登録商標）、ポリガムＳ／Ｄ（Polygam S/D；登録商標）、サンドグロブリン（Sandoglobulin；登録商標）、ベノグロブリン（Venoglobulin；登録商標）。免疫グロブリン製剤は一般にある種のＩｇＭならびにＩｇＧを含有する。微量のＩｇＭがガンマガード（Gammagard；登録商標）中に存在する。ペンタグロビン（Pentaglobin）（バイオテスト）はＩｇＭに富む製剤であり、ＳＡＲＳの処置に使用されている。
【００１１】
かかるＩvＩg製剤は多くのドナーに由来するプール血漿からのもので、しばしば自己免疫症状にも使用されるが、その場合の認められている作用様式は抗イディオタイプ抗体の存在、例えば、病原である他の抗体と反応し、それを中和する抗体の存在である。
【００１２】
ＵＳ６６１３３２８には、ホン・ウイルブランド（von Willebrand）因子特異的抗体による血栓症疾患の処置法が記載されている。ヒト化抗体は特異的に製造される。しかし、ＩＧＩＶなどの容易に入手し得る免疫グロブリンまたはこれら免疫グロブリンのサブフラクションがアテローム血栓症またはプラーク破壊の予防に使用し得るという情報はない。さらに、本発明にて提供されるアネキシンＶと内皮との結合の低下の動機となりえるＩｇＧが、抗体と本来のアネキシンＶとの結合を阻害し得るという文献情報もない。
【発明の開示】
【００１３】
本発明はアテローム血栓症およびプラーク破壊を予防し、アテローム性動脈硬化合併症を処置する新規な方法であって、アネキシンＶがプラークに結合するのを阻害するＩｇを阻害することにより前記結合を回復する化合物を投与する方法を提供する。この処置は、一定用量のアネキシンＶまたはＮ−末端フラグメントを、好ましくはＩＶ注射により投与するか、またはアネキシンＶが抗体に結合するのを阻害することによりアネキシンＶがプラークに結合するのを促進するように作用する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのサブフラクションをＩＶ投与することにより実施する。免疫グロブリン（ＩＧＩＶ；バクスター）または他の市販入手可能な製剤（その例示は上記）ならびにアフィニティ精製したサブフラクション（感染症および重篤な自己免疫症状の処置または予防用として技術上既知である）を使用することができる。免疫グロブリンのアフィニティ精製サブフラクションが好ましい。
【００１４】
本発明方法において、活性成分（アネキシンＶ、アネキシンＶのＮ−末端フラグメントまたは免疫グロブリンサブフラクション）は、有効量の活性成分を含む医薬組成物としてアテローム血栓症の危険状態にある被験対象に投与する。該医薬組成物は静脈内投与するか、またはリスクグループに属する患者の処置として別ルートで投与する。適するリスクグループとは、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者である。別のリスクグループは、抗リン脂質関連抗体のレベルを上昇させ得る上部呼吸気道の、または他の感染症（肺炎球菌感染を包含する）を有するか、または有していた（または、その危険状態にある）患者である。この処置は適切な時間間隔で繰り返すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
アテローム血栓症とプラーク破壊のリスクは、抗体がアネキシンＶ−プラーク結合を阻害する結果として、内皮に結合するアネキシンＶが低下するときに、著しく上昇する。プラーク−アネキシン結合を低下させる他の抗体（例えば、アネキシンＶ−結合抗体）を阻害するアネキシンＶ（またはフラグメント）の投与、または免疫グロブリン、好ましくは免疫グロブリンのサブフラクション（すなわち、上記のプール免疫グロブリン製剤のサブフラクション）を投与することによるアネキシンＶ結合の回復は、アテローム血栓症と特に心臓血管系疾患の主要原因であるプラーク破壊に対する新提案治療法を提供する。
【００１６】
本発明の第１の局面では、アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントの塩の形状としての使用が提供される。
【００１７】
アネキシンＶという用語は当業者周知であり、例えば、上記に引用した文献、例えば、ＥＰ１３７９２６６で使用されている。当業者には明らかなように、アネキシンＶのＮ−末端フラグメントはアネキシンＶのフラグメントとして当業者が認識し得るために十分な大きさである（例えば、他のアネキシンのフラグメントよりもむしろ大きい。
【００１８】
該医薬組成物は有効量のアネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントを、担体および添加物と組合わせて含有していてもよい。適切な担体および添加物は当業者に周知のものであり、ＥＰ１３７９２６６に例示されたものが使用し得る。その塩は医薬的に許容し得る酸付加塩でよく、その場合の対イオンは、例えば、塩素、酢酸塩などである。
【００１９】
該医薬組成物中のアネキシンＶの有効量は、アネキシンＶ−内皮結合の診断的状況分析により決定される。従って、用量は患者のアネキシンＶ−内皮結合の状態を評価することにより決定し得る。従って、アネキシンＶ−内皮結合は、アネキシンＶと内皮との結合に対する患者血清の影響を、例えば、アネキシンＶと培養した内皮細胞との結合に対する患者血漿の影響を評価する、実施例にて使用された技法と同様の技法（「内皮細胞結合の培養；アネキシンＶの結合」および「結果」の部参照）を用いて評価することにより評価し得る。患者からの剖検プラーク材料の免疫組織化学的染色（実施例の「ヒトアテローム性動脈硬化症プラークの免疫組織化学的染色」の部に記載）を使用することができる。
【００２０】
標識アネキシンを用いる画像化技法（文献１６（ＷＯ９５／３４３１５）の考察参照）も使用し得る。当業者が理解するように、患者のアネキシンＶ結合が非常に低いと判明したなら、患者のアネキシンＶ結合が正常人で見出されるものに近いことが分かっている場合よりも、より高用量のアネキシンＶ（またはそのフラグメント）が必要とされ得る。
【００２１】
本発明のさらなる局面では、アテローム血栓症および／またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、有効量のアネキシンＶまたはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントの塩の形状で含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法が提供される。
【００２２】
該危険状態にある被験対象とは全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者である。ＳＬＥ患者はさらに上記に考察したリスクファクターを有している；例えば、異常脂肪血症、低密度リポタンパク質の酸化（oxＬＤＬ）上昇、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）システムにおける上昇した活性（異常脂肪血症と密接に関連）、ＣＲＰにより判定される全身性炎症、ホモシステインおよび抗リン脂質抗体（aＰＬ）などである。ＳＬＥ患者はさらに再発性血栓症または度々繰り返されるアテローム血栓症を示すか、または心臓血管系疾患の１回以上の徴候；例えば、血栓塞栓症の非出血性または脈管炎性の発作、心筋梗塞、狭心症または間欠性跛行などを切り抜けて生き残っている。危険状態にある被験対象は、肺炎球菌感染症に罹患しているか、罹患していたか、またはそのリスクのある患者であり得る；または不安定狭心症、他の形状の重篤な狭心症、または一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）などの切迫性心臓血管系疾患の徴候ありとする症候または臨床評価に基づき同定される、攻撃され易いプラークを有する患者であり得る。アネキシンＶ−内皮結合の評価は、上記考察のように、リスクを評価する際に使用し得る。
【００２３】
本発明のさらなる局面では、アネキシンＶに結合する抗体を阻害する能力を有する免疫グロブリンの精製サブフラクション（すなわち、上記で考察したプール免疫グロブリン製剤の精製サブフラクション）が提供される。かかるサブフラクションは上記の技法、例えば、アフィニティ精製を用いて調製することができる。該精製サブフラクションは、抗ＩｇＧ抗体サブフラクション、例えば、ＩｇＧに結合する親和性により、特にＩｇＧ定常ドメインに選択されるサブフラクションであり得る。
【００２４】
本発明のさらなる局面では、アネキシンＶの内皮（または内皮細胞、例えば、培養中）に対する結合を促進する能力を有する免疫グロブリンの精製サブフラクション（すなわち、上記で考察したプール免疫グロブリン製剤の精製サブフラクション）が提供される。かかるサブフラクションは、上に示した技法、例えば、アフィニティ精製により調製し得る。該サブフラクションは抗Ｉｇ抗体サブフラクション、例えば、ＩｇＧ、取分けＩｇＧ定常ドメインにアフィニティ結合させることにより選択されるサブフラクションである。かかるサブフラクションは抗−aＰＡＦ、抗−aＬＰＣ、抗−aＰＳまたは抗−a−肺炎球菌ワクチンを含み得るものであり、これらはaＰＡＦ、aＬＰＣ、aＰＳまたは肺炎球菌ワクチンに対する抗体のレベルを低下させることが可能であり、その欠乏はアネキシンＶ結合を増加させることが判明した（実施例参照）。アネキシンＶが内皮に結合するのを促進するサブフラクションの能力は、上記のように、また実施例に示したように、アネキシンＶ−内皮結合分析評価法を用いて評価することができる。例えば、適切なサブフラクションは、アネキシンＶと内皮細胞との結合に対して、ＳＬＥ症例からの血漿（高抗リン脂質抗体（aＰＬ）タイター血清）の阻害作用を低下させるものであり得る。該サブフラクションは、ホスホリルコリン複合体、例えば、実施例にて考察したＰＣ−ＢＳＡまたはＰＣ−ＫＬＨなどに対する結合に基づくアフィニティ精製により調製し得る。かかるサブフラクションは出発原料の免疫グロブリン標品に比べて、抗ホスホリルコリン（aＰＣ）抗体、例えば、aＰＣ ＩｇＧおよび／またはaＰＣ ＩｇＭなどのレベルを上昇させ得る。実施例に記すように、我々はaＰＣ−ＢＳＡとaＰＣ−ＫＬＨとアネキシンＶ結合のレベル間に統計的な相関関係を見出した。aＰＣ ＩｇＧおよび／またはＩｇＭがある種のＩｇＧに結合することが可能で（例えば、Halpern et al
(1991) J Clin Invest 88(2), 476-482 参照）、またＩｇＧを産生するＢ２細胞をも中和し得るＢ細胞サブタイプのＢ１細胞により産生される可能性がもっとも高いことが考えられる。
【００２５】
本発明のさらなる局面においては、例えば、アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬として使用する本発明の精製サブフラクションが提供される。
【００２６】
本発明のさらなる局面においては、アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬の製造における本発明の前記局面による精製サブフラクションの使用または市販入手可能な免疫グロブリン製剤（すなわち、上記に考察したプール免疫グロブリン製剤）の使用が提供される。
【００２７】
本発明のさらなる局面においては、アテローム血栓症および／またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、有効量の免疫グロブリン（すなわち、上記に考察したプール免疫グロブリン製剤）または免疫グロブリンの精製サブフラクション（上記の例）を含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法が提供される。
【００２８】
処置すべき被験対象（または処置用医薬）の選択は、上記に考察した。被験対象は、例えば、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者であるか、または肺炎球菌感染症に罹患しているか、罹患していたか、またはその危険のある患者であるか、または攻撃され易いプラークおよび／または不安定狭心症を有する患者であり得る。
【００２９】
本発明につき、以下の非制限的図面および実施例を参照することにより、ここでより詳細に説明する。
【００３０】
本明細書に引用した文献は、参照により本明細書の一部とする。
【実施例】
【００３１】
検討グループ
検討したグループは、心臓血管系疾患を１回以上発症し、生き延びてきたＳＬＥの女性２６名からなり、血栓塞栓症の非出血性または脈管炎発作（ｎ＝１５）（コンピューター断層または磁気共鳴画像化により確認）；心筋梗塞（ｎ＝７）（心電図検査およびクレアチン・キナーゼ上昇により確認）；狭心症（ｎ＝９）（運動ストレス検査により確認）または間欠性跛行（ｎ＝４）（血管造影図により確認される末梢アテローム性動脈硬化症）と定義されたグループ；ＳＬＥであるが、心臓血管系疾患の臨床的徴候のない年齢の釣り合う女性２６名；および健常集団に基づく年齢の釣り合う女性２６名からなる。
【００３２】
すべての患者は１９８２年に改正されたＳＬＥ１６に対するアメリカリウマチ学会の基準を満足するものであった。この研究はカロリンスカ病院の倫理委員会により承認された。参加者はすべて研究に参加する前にインフォームドコンセントを承諾した。
【００３３】
頚動脈超音波
左右の頚動脈について、二重機能スキャナー(アクソン・セコイア（Acuson Sequoia）、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、米国)により試験し、アテローム性動脈硬化症の程度は内部媒質厚（ＩＭＴ）により判定した。
【００３４】
アネキシンＶ結合内皮細胞の培養物
凍結保存プールヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の２継代のものをカスケード・バイオロジックス・インク（Cascade Biologics, Inc.）（ポートランド、オレゴン、米国）から購入し、培養物は２％ウシ胎児血清およびサプリメントを含有するＥＧＭ（商標）フェノール・レッド不含培地（クロネチックス（Clonetics）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に維持した。細胞は７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ、ＡＧ，トラサジンゲン（Transadingen）、スイス）中に、湿潤５％ＣＯ２下、３７℃の条件でインキュベートした。実験はすべて３〜４継代で実施した。ＨＵＶＥＣはフローサイトメトリー分析用１２穴プレート（ヌンク・インク（NUNC, Inc.）、ネイパービル、イリノイ、米国）に、２×１０４細胞／ｍｌの密度で；ＭＴＴ分析評価用９６穴プレート（ＴＰＰ）に、１×１０４細胞／ウエル／１００μｌの密度で；ＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡ用２４穴プレート（ヌンク）に、８×１０３細胞／ｍｌの密度で；播種した。細胞は、１２〜２４時間付着させて、無血清培地（ＳＦＭ）で注意深く洗浄した後、処理に先立ち、少なくとも１２時間ＳＦＭに静止状態とした。検討グループから採取したヘパリン保存血漿をＳＦＭ中１０％の濃度で単層に加えた。
【００３５】
細胞は細胞解離溶液（ＣＤＳ；シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国）により非酵素的に収穫した。ＨＵＶＢＣは注意深く上清と共にプールして、剥がれて浮遊するＥＣの選択的損失を排除し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離した。１００μｌのアネキシンＶ−結合バッファー（モレキュラー・プローブ・インク、ユージン、オレゴン、米国）サンプルの再懸濁液を５ｍｇ／ｍｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（モレキュラー・プローブ）で染色し、氷上、１５分間インキュベートした。取得直前に、１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｒ＆Ｄシステムズ・ヨーロッパ（株）、アビンドン、英国）を加えた。分析はセルクエスト（CellQuestTM）ソフトウエアを備えたＦＡＣＳスキャン・フロー・サイトメーター（ＢＤバイオサイエンス、サン・ホセ、カリフォルニア、米国）で実施した。取得に際し、直線ＦＣＳおよびＳＳＣスケール上、２３０未満の事象を除くためにゲートを設置した。各サンプルにつき、１００００事象を集めた。
【００３６】
ヒトアテローム性動脈硬化プラークの免疫組織化学的染色
以前に特性化したヒトプラークについて、免疫染色を実施した。プラークは一過性虚血発作後の頚動脈血管内膜切除術を受けた患者１２名から集めた。標品はすべて進行性アテローム性動脈硬化病巣を含んでいた。対照として、肉眼的に健康な腸間膜動脈を無関係の腸管切除後に得た。凍結切片を２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（シグマ・ケミカルス）中で、４℃で２０分間固定し、−７０℃で保存した。内在するペルオキシダーゼを遮断した後、切片をマウス・タイプＩｇＧ２ａのモノクローナル抗アネキシンＶ抗体（アレキシス（Alexis）バイオケミカル・コープ、ソーセン、スイス）、抗ＣＤ６８（ダコ・サイトメーション（Dako Cytomation）、グロストラップ、デンマーク）または抗ＣＤ３１（モノサン（Monosan）、ウーデン、オランダ）と一夜インキュベートした。無関係のマウスＩｇＧ２ａ（セロテック（株）、オックスフォード、英国）は負の対照として使用した。抗体はすべて１％ＢＳＡ−０.０２％ＮａＮ３／ＰＢＳで希釈した。洗浄後、１％正常ウマ血清／ＰＢＳを使用した。二次抗体−ビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリン（ベクター・ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア、米国）を加えた。ＡＢＣペルオキシダーゼ・エリート（商標）キットを使用した（ベクター・ラボラトリーズ）。染色はジアミノベンジジン（ベクター・ラボラトリーズ）で発色し、対比染色はヘマトキシリンで実施した。断片はすべてライカＤＭＲＸＡ顕微鏡（ライカ、ウエッツラー、ドイツ）で分析した。
【００３７】
aＰＣの調製
全ＩｇＭまたはＩｇＧフラクションはハイトラップＩｇＭまたはＩｇＧカラム（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて、市販入手可能なプールヒト免疫グロブリン（ガンマガード（登録商標））から５０ｍｇ／ｍｌで分離した。ホスホリルコリン（ＰＣ）に対する抗体はキーホールリンペット（limpet）ヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質（１または５ｍｇ／ｍｌ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１ｍｇ／ｍｌ）に接合したＰＣにカップル結合したＮＨＳ−セファロースカラム上、ＩｇＭまたはＩｇＧフラクションを負荷した後に溶出し、次いで、ＢＳＡのみのカラムに付した。ＰＣ−ＢＳＡ（ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン）およびＰＣ−ＫＬＨはバイオサーチ・テクノロジーズ・インク（カリフォルニア、米国）より購入した。溶出フラクションはＰＤ−１０カラムでバッファー交換し、ミリポア・セントリコーン（登録商標）装置にて濃縮した。操作は製造業者による説明書に従って実施した。調製したＩｇＭａＰＣの濃度は、一般に５０μｇ／ｍｌであり、ＩｇＧａＰＣの濃度は一般に３０μｇ／ｍｌであった。
【００３８】
内皮細胞に対するアネキシンＶの結合
アネキシンＶの結合を阻害する高い能力を有するヘパリン保存血漿を、ＳＦＭ中、１０％の濃度でＨＵＶＥＣ単層に加えた。２４時間後に、細胞を細胞解離溶液（ＣＤＳ；シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国）により収穫し、注意深く上清をプールし、剥がれて浮遊する細胞の選択的損失を排除し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離した。１００μｌのアネキシンＶ−結合バッファー（モレキュラー・プローブ・インク、ユージン、オレゴン、米国）サンプル中の再懸濁液を５ｍｇ／ｍｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（モレキュラー・プローブ）２μｌで染色し、氷上、１５分間インキュベートした。取得直前に、１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；生体色素；Ｒ＆Ｄシステムズ・ヨーロッパ（株）、アビンドン、英国）を加えた。分析は前記同様に実施した。
【００３９】
結果
アネキシンＶの結合に対する免疫グロブリンＩｇＧ欠乏の影響
免疫グロブリンＩｇＧサブクラスの欠乏は、アネキシンＶ結合の蛍光強度増大を２.７〜２.６倍にまで至らしめた（完全血清平均ＦＩ：２６７.９５± vs ７０９.９１±；中間値ＦＩ：２２２.６７± vs
５６７.４２±）。ＩｇＧフラクションを再構築して欠乏血清とすると、蛍光強度が低下し、一方、ＩｇＧ溶出液で培養すると、アネキシンＶ結合の蛍光強度が完全血清の蛍光強度に匹敵するものとなった。
【００４０】
アネキシンＶの結合はＳＬＥ症例からの血漿を使用して、２４時間後に対照と比較した場合、有意に低下していた（ＳＬＥ症例 vs 集団対照：ｐ＝０.００２；ＳＬＥ症例 vs ＳＬＥ対照：ｐ＝０．０２）。アネキシンＶの結合を阻害する高い能力をもつ血清から全ＩｇＧを枯渇させると、この結合が完全に回復する。ＳＬＥ症例の中には、アネキシンＶ結合とアテローム性動脈硬化症の程度の間に、顕著な正の関連性が存在した（Ｒ＝０.７３；ｐ＜０.００１）。免疫染色は試験した１１／１２のプラークにアネキシンＶの存在することを明らかにした。
【００４１】
プロテインＧアフィニティ・カラムクロマトグラフィー
ＥＣに結合するアネキシンＶを阻害する高い能力を有するプール血清は、０.４５μｍで濾過し、等容量の内皮基礎培地で希釈した。ハイトラップ・プロテインＧ ＨＰ、アマシャム・バイオサイエンス（ウプサラ、スウェーデン）から得た２５ｍｇヒトＩｇＧ／ｍｌ結合能力をもつゲルの１ｍｌカラムを、製造業者の説明書に従い使用した。ＩｇＧフラクションは０.１Ｍ−グリシンＨＣｌ（ｐＨ２.７）でカラムを溶出することにより得た。中和のために、１Ｍ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９.０）を使用した。完全血清、流出液および溶出液を使用し、分離した日に、ＳＦＭ中、１：１０の希釈でＨＵＶＥＣとインキュベーションした。
【００４２】
内皮細胞に結合するアネキシンＶの測定
アネキシンＶ結合に陽性のＨＵＶＥＣの頻度は、ニ変量ドットプロット上のアネキシンＶ＋／ＰＩ細胞のパーセントとして、またはヒストグラムに基づくアネキシンＶ＋細胞のパーセントとして決定した。結合を低下させることが分かっており、ＩＶＩＧでプレインキュベートした血清の存在下において、ＨＵＶＥＣに対するアネキシンＶ結合を決定した。ＩＶＩＧとのプレインキュベーションはアネキシンの結合を回復させ得るが、このことはＩＶＩＧに存在する抗体が結合を中和し得ることを物語っている（図１）。
【００４３】
aＰＣ−ＢＳＡおよびaＰＣ−ＫＬＨは共に、ＣＶＤの病歴をもつＳＬＥ患者において、ＥＣに結合するアネキシンＶと有意に関連していた（それぞれ、ｒ＝０.４５；ｐ＝０.０２およびｒ＝０.０３）。aＰＣ−ＢＳＡおよびaＰＣ−ＫＬＨレベルは、標準的技法、例えば、以下の試薬を用いて評価した。ポリソープ（Polysorp）Ｆ９６マイクロタイター免疫プレートはヌンク（ロスキライド、デンマーク）から購入した；ＰＣ−ＢＳＡ（ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン）はバイオサーチ・テクノロジー・インク（米国）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｒ−鎖特異的）、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ｕ−鎖特異的）、ＰＮＰＰ（アルカリ性ホスファターゼ基質）はシグマ（セントルイス、ミズーリ、米国）から得た。例えば、ＰＣ−ＢＳＡに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。１７名の抗リン脂質症候群患者からのプール血清は内部基準として使用し、各プレート上で試験した。抗体結合は１０μｇ／ｍｌの抗原濃度で頭打ちとなった。そこで、Ｆ９６マイクロタイター・ポリソープ・プレートはＰＢＳ中で、ＰＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウエルで被覆した。被覆プレートは４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した後、プレートは室温で２時間、２％ＢＳＡ−ＰＢＳにより遮断し、上記同様に洗浄した。血清サンプルは０.２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に希釈し（１：３０）、５０μｌ／ウエルで加えた。
【００４４】
結合低下を誘発する高い能力を有する血清の肺炎球菌ワクチン（国立血清研究所、デンマーク）、ＰＡＦ、ホスファチジルセリンまたはリソホスファチジルコリンによるプレインキュベーションは、抗原に対する血清の結合を低下させる作用を有していた；また、アネキシンＶの結合も保存された（図：２、３、５）。対照的に、ＰＣは有意な作用を有しなかった。このことは、肺炎球菌ワクチン、ＰＡＦ、ホスファチジルセリン、リソホスファチジルコリンに結合する抗体が、内皮細胞に対するアネキシンＶの結合低下に関与している可能性のあることを示唆している。
【００４５】
結論として、アネキシンＶはアテローム性動脈硬化病巣の多くの部位、取分け、プラーク破壊の傾向のある部位に存在する。アネキシンＶ結合が最適ではなく、代わりにアネキシン−プラーク結合に干渉する抗体の影響により結果として低下する場合、アテローム血栓症とプラーク破壊のリスクが大きく上昇する。従って、アネキシンＶ結合を回復させることは、アテローム血栓症および取分け心臓血管系疾患の主原因であるプラーク破壊に対する可能性のある斬新な治療法である。本発明は２つの方法を提供する。１つはアネキシンＶまたは該タンパク質の塩の最適用量の使用に基づくものであり、該タンパク質は好ましくは静脈内注射により投与すべきである；他方は容易に入手可能な免疫グロブリン、または免疫グロブリンのアフィニティ精製サブフラクションの使用に基づくものであり、これらもまた注射により投与し得る。
【００４６】
投与に際してのアネキシンＶ（または免疫グロブリン）の有効量は、現状のアネキシンＶ−プラーク結合に対しての診断状態分析から決定し得る。結合は上記の分析方法により決定した。活性成分を含有してなる医薬組成物での処置は、好ましくは危険状態にある被験対象に投与することである。危険状態にある被験対象は頻繁にアテローム血栓症を繰り返すＳＬＥ患者である。危険状態にある別の被験対象は、肺炎球菌感染症に罹患しているか、または罹患していたか、またはその危険状態にある患者である。
【００４７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
（図１）ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に結合するアネキシンＶに対し、ヒト・プール免疫グロブリン・ガンマガード（登録商標）により高抗リン脂質抗体（aＰＬ）タイター血清をプレインキュベーションしたことの影響；２４時間培養後のフローサイトメトリー分析。
2007532617.tif 000004
（図２）ＨＵＶＥＣに結合するアネキシンＶに対し、肺炎球菌莢膜多糖により高抗リン脂質抗体（aＰＬ）タイター血清をプレインキュベーションしたことの影響；２４時間培養後のフローサイトメトリー分析。
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（図３）ＨＵＶＥＣに結合するアネキシンＶに対し、LysoＰＣとＰＡＦにより高抗リン脂質抗体（aＰＬ）タイター血清をプレインキュベーションしたことの影響；２４時間培養後のフローサイトメトリー分析。
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（図４）ＨＵＶＥＣに結合するアネキシンＶに対し、無関係な抗体（破傷風毒素）により高抗リン脂質抗体（aＰＬ）タイター血清をプレインキュベーションしたことの影響；２４時間培養後のフローサイトメトリー分析。
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（図５）ＨＵＶＥＣに結合するアネキシンＶに対し、LysoＰＣにより高抗リン脂質抗体（aＰＬ）タイター血清をプレインキュベーションしたことの影響；２４時間培養後のフローサイトメトリー分析。
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【図１】
2007532617.tif 000009
【図２】
2007532617.tif 000010
【図３】
2007532617.tif 000011
【図４】
2007532617.tif 000012
【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月16日(2006.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントの塩の形状とした使用。
【請求項２】
該医薬組成物が有効量のアネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントを、担体および添加物と組合わせて含有してなる請求項１記載の使用。
【請求項３】
該医薬組成物中のアネキシンＶの有効量がアネキシンＶ−内皮結合の診断的状況分析により決定されるものである請求項１または請求項２記載の使用。
【請求項４】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、有効量のアネキシンＶタンパク質またはアネキシンＶのＮ−末端フラグメントまたはその対応する塩を含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項５】
該危険状態にある被験対象が全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者である請求項４記載の方法。
【請求項６】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンＶに結合する抗体を阻害する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションまたは、アネキシンＶの内皮に対する結合を促進する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションの使用。
【請求項７】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための医薬の製造における、市販入手可能なプール免疫グロブリン製剤の使用。
【請求項８】
アテローム血栓症および／またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、プール免疫グロブリンまたはプール免疫グロブリンの精製サブフラクションを有効量含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項９】
危険状態にある被験対象が全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者である請求項６または請求項７の使用または請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ヒトにおけるアテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための、先のクレームのいずれか一つの使用または方法。
【請求項１１】
傷つきやすいプラークを有する患者のアテローム血栓症および／またはプラーク破壊を予防するための、先のクレームのいずれか一つの使用または方法。
【国際調査報告】
2007532617.tif 000014
2007532617.tif 000015
2007532617.tif 000016
2007532617.tif 000017