(57)【要約】  本発明は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、本明細書に定義されているとおりである構造を有する式（Ｉ）、またはその医薬上許容される塩のエストロゲン受容体調節剤を提供する。2007502277.tif 000011
2007502277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2007502277.tif 000010
［式中：
Ｒ１は水素、置換されていてもよいアルキル、ハロゲン、ＣＮ、または置換されていてもよいアルコキシであり；
Ｒ２は水素、置換されていてもよいアルキル、または置換されていてもよいフェニルであるか；または
Ｒ１とＲ２が一緒になって、５〜７員環を形成していてもよく、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいアルキルまたは置換されていてもよいアルコキシである］
で表される化合物；あるいはその医薬上許容される塩またはプロドラッグ。
【請求項２】
Ｒ１が置換されていてもよいアルキルである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が水素または置換されていてもよいアルキルである請求項１または請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって６員環を形成する請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が水素、ハロゲンまたはＣＮである請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ４が水素である請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４がＦである請求項６記載の化合物。
【請求項８】
（ａ）１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム；
（ｂ）５−フルオロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム；
（ｃ）５−クロロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム；
（ｄ）５−ブロモ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム；
（ｅ）（４Ｅ）−９−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オンオキシム；または
（ｆ）１−（４−ヒドロキシフェニル）−Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシムあるいは
（ｇ）１−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
である請求項１記載の化合物。
【請求項９】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載されている化合物および
ｂ）医薬用担体、を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物における骨粗しょう症を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載されている化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１１】
哺乳動物における骨関節炎、低カルシウム血症、高カルシウム血症、ページェット病、骨軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫または骨組織に対して有害作用を有する他の形態癌を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に請求されている化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１２】
哺乳動物における良性または悪性異常組織の増殖を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載されている化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１３】
異常組織増殖が、前立腺肥大症、子宮平滑筋腫、乳癌、子宮内膜症、子宮体癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、良性乳房疾患、腺筋症、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、またはＣＮＳ癌である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物におけるコレステロール濃度、トリグリセリド濃度、Ｌｐ（ａ）濃度、またはＬＤＬ濃度を低下させるか；あるいは高コレステロール血症；高脂血症；循環器病；アテローム硬化症；末梢血管疾患；再狭窄；または血管攣縮を阻害するか；あるいは免疫媒介損傷に至る細胞事象由来の血管壁損傷を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１５】
哺乳動物におけるフリーラジカル起因性病態を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１６】
哺乳動物における認知力改善または神経保護を提供するか；あるいは老人性認知症、アルツハイマー病、認知力低下、または神経変性疾患を治療するかまたは阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１７】
哺乳動物における炎症性腸疾患、潰瘍性直腸炎、クローン病、大腸炎、のぼせ、膣または外陰部萎縮、萎縮性膣炎、膣乾燥、かゆみ、性交困難、排尿困難、頻尿、尿失禁、尿路感染、血管運動症状；男性型禿頭症；皮膚萎縮症；座瘡；ＩＩ型糖尿病；機能不全子宮出血；または不妊症を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１８】
哺乳動物における白血病、子宮内膜剥離、慢性腎疾患または肝疾患または凝血疾患または凝血障害を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする前記哺乳動物に提供することを含んでなる方法。
【請求項１９】
薬物として使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
薬物調製時における請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の使用であって、
それを必要とする哺乳動物における骨粗しょう症を阻害するか、
それを必要とする哺乳動物における骨関節炎、低カルシウム血症、高カルシウム血症、ページェット病、骨軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫または骨組織に対して有害作用を有する他の形態癌を阻害するか、
それを必要とする哺乳動物における良性または悪性異常組織の増殖を阻害するか、
それを必要とする哺乳動物におけるコレステロール濃度、トリグリセリド濃度、Ｌ（ｐ）濃度、またはＬＤＬ濃度を低下させるか；あるいは高コレステロール血症；高脂血症；循環器病；アテローム硬化症；末梢血管疾患；再狭窄；または血管攣縮を阻害するか；あるいは細胞事象から免疫媒介血管損傷を引き起こす血管壁損傷を阻害するか、
それを必要とする哺乳動物におけるフリーラジカル起因性病態を阻害するか、
それを必要とする哺乳動物における認知力改善または神経保護を提供するか；あるいは老人性認知症、アルツハイマー病、認知力低下、または神経変性疾患を治療または阻害するか、
それを必要とする哺乳動物における炎症性腸疾患、潰瘍性直腸炎、クローン病、大腸炎、のぼせ、膣または外陰部萎縮、萎縮性膣炎、膣乾燥、かゆみ、性交困難、排尿困難、頻尿、尿失禁、尿路感染、血管運動症状；男性型禿頭症；皮膚萎縮症；座瘡；ＩＩ型糖尿病；機能不全子宮出血；または不妊症を阻害するか、あるいは
それを必要とする哺乳動物における白血病、子宮内膜剥離、慢性腎疾患または肝疾患または凝血疾患または凝血障害を阻害するための使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、（ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム誘導体、エストロゲン様薬剤としてのそれらの使用、およびそれらの調製法に関する。
【０００２】
（従来技術）
哺乳動物組織におけるエストロゲンの多面発現効果は十分に実証されており、エストロゲンは、多くの器官系に影響を及ぼすことが現在認識されている［非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９］。エストロゲンは、幾つかの方法で組織に作用を及ぼし得る。恐らく、最もよく特性化された作用機構は、遺伝子転写において変更をもたらすエストロゲン受容体との相互作用であろう。エストロゲン受容体は、リガンド活性化転写因子であり、核ホルモン受容体のスーパーファミリーに属する。このファミリーの他のメンバーとしては、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体および無機質コルチコイド受容体が挙げられる。リガンド結合の際に、これらの受容体は、二量化し、ＤＮＡ上の特定配列（応答要素として知られている）に直接結合することにより、あるいは他の転写因子（ＡＰ１など）と相互作用することにより遺伝子転写を活性化でき、次いで特定のＤＮＡ配列に直接結合する（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。「共調節性」蛋白質のクラスは、リガンド結合受容体とも相互作用でき、さらに、その転写活性を調節できる［非特許文献１３］。また、エストロゲン受容体は、リガンド依存様式および独立様式の双方においてＮＦΚＢ−媒介転写を抑制できることも示されている［非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６］。
【０００３】
エストロゲン受容体はまた、リン酸化によって活性化できる。このリン酸化は、ＥＧＦなどの成長因子によって媒介され、リガンド不在下で遺伝子転写を変化させる［非特許文献１０、非特許文献１１］。
【０００４】
エストロゲンが、細胞に影響を及ぼすことができる特性化の不十分な手段は、いわゆる膜受容体を介するものである。このような受容体の存在については議論の余地があるが、エストロゲンが、細胞からの極めて迅速な非ゲノム応答を誘発し得ることが十分に文書化されている。これらの作用を伝達する原因となる分子実体は、明確に単離されてはいないが、エストロゲン受容体の核形態に少なくとも関連していることを示唆する証拠がある［非特許文献１７、非特許文献１８］。
【０００５】
今日まで２種のエストロゲン受容体が発見されている。第１のエストロゲン受容体は、約１５年前にクローン化され、現在、ＥＲαと称される［非特許文献１９］。第２のエストロゲン受容体では、比較的最近見つかり、ＥＲβと呼ばれる［非特許文献２０］。ＥＲβに関する初期の研究は、種々のリガンドに対するその親和性を明らかにすることに焦点が当てられ、実際、ＥＲαとの幾つかの相違点が見られた。ＥＲβの組織分布は、げっ歯類において十分にマップ化されているが、それはＥＲαと一致しない。マウスおよびラットの子宮などの組織は、主としてＥＲαを発現するが、一方、マウスおよびラットの肺では、ＥＲβを主として発現する［非特許文献２１、非特許文献２２］。同じ器官内であっても、ＥＲαおよびＥＲβの分布を区画化し得る。例えば、マウスの卵巣において、ＥＲβは、顆粒膜細胞内での発現が高く、ＥＲαは、包膜細胞および間質細胞に限定される［非特許文献２３、非特許文献２４］。しかしながら、該受容体は共発現される例があり、インビトロ研究において、ＥＲαとＥＲβとは、ヘテロ二量体を形成できるという証拠がある［非特許文献２５］。
【０００６】
最も効力のある内因性エストロゲンは、１７β−エストラジオールである。１７β−エストラジオールの活性を模擬するか、または遮断する多数の化合物が記載されている。１７β−エストラジオールとほぼ同じ生物学的作用を持つ化合物は、「エストロゲン受容体アゴニスト」と称される。それと組み合わされて投与された場合、１７β−エストラジオールの作用を遮断するものは、「エストロゲン受容体アンタゴニスト」と称される。現実には、エストロゲン受容体アゴニスト活性とエストロゲン受容体アンタゴニスト活性との間に連続領域があり、幾つかの化合物は、幾つかの組織においてはエストロゲン受容体アゴニストとして、しかし他の組織においてはエストロゲン受容体アンタゴニストとして作用する。混合活性を有するこれらの化合物は、選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭＳ）と呼ばれ、治療的に有用な薬剤（例えば、ＥＶＩＳＴＡ）である［非特許文献２６、非特許文献２７］。同じ化合物が、なぜ細胞特異的作用を有し得るかという正確な理由は明らかにされていないが、受容体高次構造および／または共調節性蛋白質の環境における相違が示唆されている。
【０００７】
エストロゲン受容体は、リガンドと結合する際に種々の高次構造を採ることが、以前から知られている。しかしながら、これらの変化の影響および微細な点は、ごく最近明らかになった。ＥＲαとＥＲβの三次元構造は、種々のリガンドとの共結晶化により解明されており、受容体共調節性蛋白質の相互作用に必要とされる蛋白質配列を立体的に障害するエストロゲン受容体アンタゴニストの存在下、ヘリックス１２の還納を明確に示している［非特許文献２８、非特許文献２９］。さらに、ファージディスプレー技法が、種々のリガンド存在下、エストロゲン受容体と相互作用するペプチド類を同定するために用いられてきた［非特許文献３０］。例えば、完全エストロゲン受容体アゴニスト１７β−エストラジオールに結合されているＥＲαと、ジエチルスチルベステロールとの間で識別するペプチドを同定した。種々のペプチドが、ＥＲαに結合しているクロミフェンとＥＲβとの間を識別することが示された。これらのデータは、各リガンドが、互いに異なる生物活性を有する可能性が高いユニークかつ意外な高次構造で受容体を配置することを示している。
【０００８】
上記のとおり、エストロゲンは、生物学的過程全般に影響を及ぼす。さらに、性別による相違が記載されているが（例えば、疾患頻度、誘発応答など）、その説明は、男性と女性との間でのエストロゲン濃度の相違に関係している可能性がある。
【特許文献１】米国特許第４，４１８，０６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９９８，４０２号明細書
【非特許文献１】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｋａｒａｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４０：１８０１−１８１１頁（１９９９）
【非特許文献２】Ｅｐｐｅｒｓｏｎら、Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ６１：６７６−６９７頁（１９９９）
【非特許文献３】Ｃｒａｎｄａｌｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｗｏｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｇｅｎｄｅｒ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ８：１１５５−１１６６頁（１９９９）
【非特許文献４】Ｍｏｎｋ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄａｔｙ、Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ＆  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｃｏｎｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １１：１−１０頁（２０００）
【非特許文献５】Ｈｕｒｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｒａｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ２０：６３１−６５２頁（２０００）
【非特許文献６】Ｃａｖｉｎ、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ３４：１９５−２１０頁（２０００）
【非特許文献７】Ｆｉｎｋｉｎｇら、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ８９：４４２−４５３頁（２０００）
【非特許文献８】Ｂｒｉｎｃａｔ、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ３５：１０７−１１７頁（２０００）
【非特許文献９】Ａｌ−Ａｚｚａｗｉ、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ７７：２９２−３０４頁（２００１）
【非特許文献１０】Ｍｏｇｇｓ  ａｎｄ  Ｏｒｐｈａｎｉｄｅｓ、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ２：７７５−７８１頁（２００１）
【非特許文献１１】Ｈａｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７６：３６８６９−３６８７２頁（２００１）
【非特許文献１２】ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．３５１−３６１頁（２０００）
【非特許文献１３】ＭｃＫｅｎｎａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ２０：３２１−３４４頁（１９９９）
【非特許文献１４】Ｑｕａｅｄａｃｋｅｒｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４２：１１５６−１１６６頁（２００１）
【非特許文献１５】Ｂｈａｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６７：２３３−２４０頁（１９９８）
【非特許文献１６】Ｐｅｌｚｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８６：１１５３−７頁（２００１）
【非特許文献１７】Ｌｅｖｉｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ９１：１８６０−１８６７頁（２００１）
【非特許文献１８】Ｌｅｖｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ１０：３７４−３７７頁（１９９９）
【非特許文献１９】Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ３２０：１３４−９頁（１９８６）
【非特許文献２０】Ｋｕｉｐｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ９３：５９２５−５９３０頁（１９９６）
【非特許文献２１】Ｃｏｕｓｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：４６１３−４６２１頁（１９９７）
【非特許文献２２】Ｋｕｉｐｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：８６３−８７０頁（１９９７）
【非特許文献２３】Ｓａｒ  ａｎｄ  Ｗｅｌｓｃｈ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４０：９６３−９７１頁（１９９９）
【非特許文献２４】Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４０：２５８１−２５９１頁（１９９９）
【非特許文献２５】Ｃｏｗｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７２：１９８５８−１９８６２頁（１９９７）
【非特許文献２６】ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ７：Ｓ１０−Ｓ１５頁（２０００）
【非特許文献２７】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ６：２１２−２２４頁（２０００）
【非特許文献２８】Ｐｉｋｅら、Ｅｍｂｏ１８：４６０８−４６１８頁（１９９９）
【非特許文献２９】Ｓｈｉａｕら、Ｃｅｌｌ９５：９２７−９３７頁（１９９８）
【非特許文献３０】Ｐａｉｇｅら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ９６：３９９９−４００４頁（１９９９）
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、（ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム誘導体に関する。ある態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2007502277.tif 000003
（式中：
Ｒ１は、水素、置換されていてもよいアルキル、ハロゲン、ＣＮ、または置換されていてもよいアルコキシであり；
Ｒ２は、水素、置換されていてもよいアルキル、または置換されていてもよいフェニルであるか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって、５〜７員環を形成していてもよく、
Ｒ３とＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいアルキルまたは置換されていてもよいアルコキシである）で表される化合物であるか；あるいはその医薬上許容される塩またはプロドラッグである。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、化合物１および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患などの疾患の治療または予防におけるこのような化合物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、炎症性腸疾患（クローン病および大腸炎など）などの疾患の治療および／または予防に有用である式Ｉ
【化２】
2007502277.tif 000004
のエストロゲン様化合物を提供するものであって、
式中、Ｒ１は、水素、置換されていてもよいアルキル、ハロゲン、ＣＮ、または置換されていてもよいアルコキシでり；Ｒ２は、水素、置換されていてもよいアルキル、または置換されていてもよいフェニルであるか；またはＲ１とＲ２は一緒になって、５〜７員環を形成していてもよく、Ｒ３とＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいアルキルまたは置換されていてもよいアルコキシである化合物であるか；あるいはその医薬上許容される塩またはプロドラッグである。
【００１３】
化合物１のある実施形態において、Ｒ１は、アルキル、好ましくは低級アルキル、例えばメチルである。他の実施形態において、Ｒ２は、水素、またはアルキル、好ましくは低級アルキル、例えばメチルである。さらなる実施形態は、Ｒ１とＲ２が一緒になって、６員環を形成する組成物を包含する。幾つかの実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣＮである。幾つかの実施形態において、Ｒ４は、フルオロである。幾つかの実施形態において、Ｒ４は、オルトフルオロである。
【００１４】
医薬上許容される塩類は、本発明の化合物が塩基性部分を含有する場合、有機酸類および無機酸類、例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、および同様に公知の許容できる酸から形成できる。塩類はまた、本発明の化合物が酸性部分を含有する場合、アルカリ金属塩類（例えば、ナトリウム、リチウム、またはカリウム）、アルカリ土類金属塩類、アンモニウム塩類、各アルキル基において１〜６個の炭素原子を含有するアルキルアンモニウム塩類または１〜６個の炭素原子を含有するジアルキルアンモニウム塩類、および各アルキル基において１〜６個の炭素原子を含有するトリアルキルアンモニウム塩類などの有機塩類および無機塩基類から形成できる。
【００１５】
本明細書に用いられる用語の「アルキル」とは、単独で用いられようとまたは他の基の一部として用いられようとも、置換または非置換脂肪族炭化水素鎖を称し、限定はしないが、他に明白に特定しない限り、１個から１２個の炭素原子、好ましくは１個から６個の炭素原子を含有する直鎖および分枝鎖が含まれる。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉ−ブチルおよびｔ−ブチルが、用語の「アルキル」に包含される。特に、「アルキル」の定義内に含まれるものは、置換されていてもよい脂肪族炭化水素鎖である。用語の「低級アルキル」とは、１個から６個の炭素原子、幾つかの実施形態においては１個から３個の炭素原子を有するアルキル基を称す。本明細書に用いられる用語の「アルコキシ」とは、Ｒが、好ましくは１個から６個の炭素原子のアルキル基であるＲ−Ｏ−基を称す。
【００１６】
本明細書の定義に用いられる炭素数は、炭素主鎖および炭素分枝鎖を言うが、アルコキシ置換基などの置換基の炭素原子を含まない。
【００１７】
本明細書に用いられる用語の「フェニル」とは、単独で用いられようとまたは他の基の一部として用いられようとも、置換または非置換フェニル基を称す。
【００１８】
置換されていてもよいアルキル、アルケニル、およびフェニルは、１つ以上の置換基により置換されていてもよい。好適な任意の置換基は、ニトロ、シアノ、−Ｎ（Ｒ１１）（Ｒ１２）、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルアルコキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオ、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１１）（Ｒ１２）、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１１）（Ｒ１２）、（Ｒ１１）（Ｒ１２）Ｎ−アルキル、（Ｒ１１）（Ｒ１２）Ｎ−アルコキシアルキル、（Ｒ１１）（Ｒ１２）Ｎ−アルキルアリールオキシアルキル、−Ｓ（Ｏ）ｓ−アリール（ｓ＝０〜２）、または−Ｓ（Ｏ）ｓ−ヘテロアリール（ｓ＝０〜２）から独立して選択できる。本発明のある実施形態において、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはフェニルにとって好ましい置換基としては、ニトロ、シアノ、−Ｎ（Ｒ１１）（Ｒ１２）、ハロ、ヒドロキシル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アルコキシアルキル、およびアルコキシカルボニルが挙げられる。本発明のある実施形態において、アリールおよびヘテロアリールにとって好ましい置換基としては、−Ｎ（Ｒ１１）（Ｒ１２）、アルキル、ハロ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、アリールアルキル、およびアルキルアリールが挙げられる。Ｒ１１およびＲ１２は、各々水素およびアルキルから独立して選択される。
【００１９】
本明細書に用いられる用語の「アルケニル」とは、単独で用いられようとまたは他の基の一部として用いられようとも、置換または非置換脂肪族炭化水素鎖を称し、限定はしないが、２個から８個の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を含有する直鎖および分枝鎖が含まれる。アルケニル部分は、１つまたは２つの二重結合を有することが好ましい。このようなアルケニル部分は、ＥまたはＺ構造で存在でき、本発明の化合物は、双方の構造を含む。特に、「アルケニル」の定義の範囲内に含まれるものは、置換されていてもよい脂肪族炭化水素鎖である。アルケニルに結合されるＯ、ＳまたはＮ−Ｒなどのヘテロ原子は、二重結合に結合している炭素原子に結合していてはならない。
【００２０】
本明細書に用いられる場合の用語のアルキニルは、１つから３つの三重結合を含有し得る２個から７個の炭素原子を有する脂肪族の線状または分枝状炭化水素鎖を称す。本明細書に用いられる場合の用語のシクロアルキルは、３個から８個の炭素原子を有するモノ炭素環式環、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを称す。本明細書に単独または基の一部として用いられる場合の用語のアリールとは、フェニルまたはナフチルなどの芳香族５員環から１３員環のモノまたはジ炭素環式環を称す。アリール部分を含有する基は、環内に５個から７個の炭素原子を有する単環式であることが好ましい。本明細書に単独または基の一部として用いられる場合の用語のヘテロアリールとは、独立して窒素、酸素または硫黄であり得る１個から５個のヘテロ原子を有する単環式または二環式環を含有する芳香族５員から１３員炭素を称す。ヘテロアリール部分を含有する基は、環員の１つまたは２つが、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される環において５員から７員を有する単環式であることが好ましい。好適なアリール基としては、フラニル、チエニル、ピリジニル、インドリルおよびキノリルが挙げられる。
【００２１】
ハロゲン置換アルキル類およびアルケニル類に関する例としては、１−ブロモビニル、１−フルオロビニル、１，２−ジフルオロビニル、２，２−ジフルオロビニル、１，２，２−トリフルオロビニル、１，２−ジブロモエタン、１，２−ジフルオロエタン、１−フルオロ−２−ブロモエタン、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３などが挙げられる。
【００２２】
用語のハロゲンとしては、臭素、塩素、フッ素、およびヨウ素、好ましくは臭素、塩素またはフッ素が挙げられる。
【００２３】
本発明により包含される化合物または物質を提供することに関して、本発明により用いられる用語の「提供すること」とは、このような化合物または物質を直接投与すること、あるいは体内で化合物または物質の有効量を形成するプロドラッグ、誘導体、または類縁体を投与することを意味する。
【００２４】
本発明の化合物の調製に用いられる試薬は、商業的に入手可能か、または文献に記載された標準的方法により調製できる。
【００２５】
本発明の幾つかの代表例の調製は、以下のスキーム１〜３に記載されている。
【化３】
2007502277.tif 000005
【化４】
2007502277.tif 000006
【化５】
2007502277.tif 000007
【００２６】
本発明の化合物は、エストロゲン欠乏または過剰により少なくとも部分的に媒介される病態、障害、または病態の治療または阻害に有用な、またはエストロゲン様薬剤の使用により治療または阻害し得るエストロゲン受容体調節剤である。本発明の化合物は、産生される内因性エストロゲン濃度が大きく減少している閉経期前後、閉経期、または閉経期後の患者に特に有用である。閉経は、一般に最終自然月経期として定義され、卵巣機能の停止を特徴とし、血流中のエストロゲン循環の相当な減少をもたらす。本明細書に用いられる閉経にはまた、外科的、化学的、または卵巣機能の早期減少または停止をもたらす病態により引き起こされ得るエストロゲン産生の減少状態が含まれる。
【００２７】
したがって、本発明の化合物は、骨粗しょう症の治療または阻害、および個体の新たな骨組織の形成とより古い組織の再吸収における不均衡から生じ得、骨の正味損失をもたらす骨鉱物質消失の阻害に有用である。このような骨欠乏は、個体の範囲で、特に閉経後の女性、両側卵巣切除術を受けた女性、拡張コルチコステロイド療法を受けているか、または受けたことのある女性、生殖器発育不全を経験している女性、クッシング症候群を患っている女性に生じる。歯および口骨などの骨に関する特別の必要性で、骨折、欠陥骨構造を有する個体、骨関連手術および／または補てつ材料の移植を受けた個体において、これらの化合物を用いた交換もまた扱うことができる。上記のこれらの問題に加えて、これらの化合物は、骨関節炎、低カルシウム血症、高カルシウム血症、ページェット病、骨軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫または骨組織に対して有害作用を有する他の形態癌の治療または阻害に用いることができる。
【００２８】
また、本発明の化合物は、前立腺肥大症、子宮平滑筋腫、乳癌、子宮内膜症、子宮体癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、良性乳房疾患、腺筋症、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、ＣＮＳ癌、膠腫またはアスチオブラストミア（ａｓｔｉｏｂｌａｓｔｏｍｉａ）など、良性または悪性異常組織増殖の治療または阻害に有用である。
【００２９】
本発明の化合物は、心保護性があり、コレステロール濃度、トリグリセリド濃度、Ｌｐ（ａ）濃度、またはＬＤＬ濃度を低下させ；高コレステロール血症；高脂血症；循環器病；アテローム硬化症；末梢血管疾患；再狭窄、および血管攣縮を阻害または治療し；免疫媒介血管損傷を引き起こす細胞事象からの血管壁損傷を阻害するのに有用である。これらの心血管保護特性は、骨粗しょう症を阻害するために閉経後の患者をエストロゲンにより治療する際、およびエストロゲン療法が適用される際の男性において極めて重要である。
【００３０】
また、本発明の化合物は、抗酸化剤であり、したがってフリーラジカル起因性病態の治療または阻害に有用である。抗酸化療法が保証されることが示される特定の状態は、癌、中枢神経系障害、アルツハイマー病、骨疾患、老化、炎症性障害、末梢血管疾患、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患、呼吸困難、肺気腫、再灌流傷害の防止、ウィルス肝炎、慢性活動性肝炎、結核、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、成人呼吸困難症候群、中枢神経系外傷および心臓発作である。
【００３１】
また、本発明の化合物は、認知力改善の提供、および老人性認知症、アルツハイマー病、認知力低下、神経変性障害の治療または阻害に有用であり、神経保護または認知力改善を提供する。
【００３２】
また、本発明の化合物は、炎症性腸疾患、潰瘍性直腸炎、クローン病、および大腸炎；のぼせを含む血管運動症状などの閉経期関連病態、膣または外陰部萎縮、萎縮性膣炎、膣乾燥、かゆみ、性交困難、排尿困難、頻尿、尿失禁、尿路感染、のぼせを含む血管運動症状、筋肉痛、関節痛、不眠症、過敏性など；男性型禿頭症；皮膚萎縮症；座瘡；ＩＩ型糖尿病；機能不全子宮出血；および不妊症の治療または阻害に有用である。
【００３３】
本発明の化合物は、白血病、子宮内膜剥離、慢性腎疾患または肝疾患または凝血疾患または凝血障害など、無月経が有利である病態に有用である。
【００３４】
本発明の化合物は、特にプロゲスチンと組み合わせた場合、避妊薬として使用できる。
【００３５】
特定の病態、または障害の治療または阻害のために投与される場合、有効投与量は、利用される具体的な化合物、投与様式、病態、および治療を受ける病態の重症度、ならびに治療を受ける個体に関連する種々の身体的要因に依って変わり得ることが解される。本発明の化合物の有効な投与は、約０．１ｍｇ／日から約１，０００ｍｇ／日の経口投与で与えることができる。投与は、単回用量または２回以上の分割用量で、好ましくは、約１０ｍｇ／日から約６００ｍｇ／日、より好ましくは、約５０ｍｇ／日から約６００ｍｇ／日である。毎日の投与計画は、投与経路により変わることが予想される。
【００３６】
このような用量は、経口、インプラント経由、非経口（静脈内、腹腔内および皮下注射）、直腸、鼻腔内、膣内、および経皮など、本明細書の活性化合物を受容個体の血流に向けるのに有用ないずれの様式で投与してもよい。
【００３７】
本発明の活性化合物を含有する経口製剤は、錠剤、カプセル剤、舌下錠形態、トローチ剤、口内錠および経口液剤、懸濁剤または液剤など、従来から使用される経口形態を含んでなり得る。カプセル剤は、活性化合物（１種または複数種）と、医薬上許容される澱粉（例えば、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉またはタピオカ澱粉）、糖類、人工甘味剤、結晶および微結晶セルロースなどの粉末セルロース、小麦粉、ゼラチン、ゴムなどの不活性充填剤および／または希釈剤との混合物を含有し得る。有用な錠剤製剤は、従来の圧縮法、湿式顆粒化法または乾式顆粒化法により作製でき、また限定はしないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギン酸、アラビアゴム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、ケイ酸複合体、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、ショ糖、ソルビトール、リン酸ジカルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、タルク、乾燥澱粉および粉末糖など、医薬上許容される希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、表面修飾剤（界面活性剤を含む）、懸濁化剤または安定化剤を利用できる。好ましい表面修飾剤としては、非イオン性およびアニオン性表面修飾剤が挙げられる。表面修飾剤の代表例としては、限定はしないが、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル類、二酸化コロイドールシリコン、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、およびトリエタノールアミンが挙げられる。本明細書の経口用製剤は、標準的遅延製剤または時間放出製剤を利用して活性化合物（１種または複数種）の吸収を変化させることができる。また、該経口用製剤は、必要な場合には適切な溶解剤または乳化剤を含有して、水中またはフルーツジュース中の有効成分を投与することから構成できる。
【００３８】
幾つかの場合において、エアロゾルの形態で気道に直接化合物を投与することが望ましい場合もある。
【００３９】
また、本発明の化合物は、非経口的にまたは腹腔内に投与できる。遊離塩基または医薬上許容される塩としてのこれら活性化合物の液剤または懸濁剤は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製できる。また、分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール類およびそれらの油中混液中で調製できる。通常の保存および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。
【００４０】
注射使用に好適な製薬形態としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射液または分散液の即時調製用の滅菌粉剤が挙げられる。全ての場合、該形態は、無菌でなければならず、簡便な注入性が存在する範囲で液体でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混液、および植物油を含有する溶媒または分散液媒体であり得る。
【００４１】
本開示の目的のため、経皮投与は、体表面ならびに上皮および粘液組織などの身体通過の内層を越える全ての投与を含むことと解される。このような投与は、ローション、クリーム、泡状状物、パッチ、懸濁液、溶液、および座剤（直腸および膣）中、本化合物または医薬上許容されるそれらの塩類を用いて実施できる。
【００４２】
経皮投与は、活性化合物、および活性化合物に対して不活性であり、皮膚に対して非毒性であり、全身吸収のため皮膚を介して血流中に薬剤の送達を可能にする担体を含有する経皮パッチの使用により達成できる。該担体は、クリームおよび軟膏、ペースト、ゲル、および閉鎖型装置などの任意の数の形態をとり得る。クリームおよび軟膏は、水中油タイプまたは油中水タイプの粘稠液または半固体乳剤であり得る。有効成分を含有する鉱油または親水性鉱油中に分散させた吸収性粉末からなるペーストもまた好適であり得る。担体を有して、または担体無しで有効成分を含有する貯蔵器を覆う半透膜、または有効成分を含有するマトリクスなどの血流中に有効成分を放出するための種々の閉鎖型装置が使用できる。他の閉鎖型装置は、文献に公知である。
【００４３】
座薬製剤は、座薬の融点を変えるためのワックス類添加の有無でのカカオ脂、、およびグリセリンなど、従来の材料から作製できる。種々の分子量のポリエチレングリコール類などの水溶性座薬用基剤もまた使用できる。
【００４４】
実施例１ａ
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール
２−メチルインドール（３．２８ｇ、２５ミリモル）、４−ベンジルオキシヨードベンゼン（７．７６ｇ、２５ミリモル）、炭酸カリウム（２．６５ｇ、２５ミリモル）、およびＮ−メチルピロリジノン（２５０ｍＬ）の混合物に、臭化銅（Ｉ）（０．５ｇ、３．５ミリモル）を加えた。この撹拌溶液を１８０℃に加熱し、１８時間維持した。反応混合物を冷却し、氷に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を水とブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を留去すると暗色液体を得た。シリカゲルクロマトグラフィ（２％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製して、標題化合物を白色固体（３０％）として得た：ｍｐ９５〜９６℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２４（３Ｈ，ｓ）、５．１９（２Ｈ，ｓ）、６．３８（１Ｈ，ｓ）、６．９３〜７．０４（３Ｈ，ｍ）、７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）、７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ）、７．３２〜７．５３（８Ｈ，ｍ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３１４：
Ｃ２２Ｈ１９ＮＯ  ０．１Ｈ２Ｏの元素分析：
理論値：Ｃ，８３．８３；Ｈ，６．１４；Ｎ，４．４４。
実測値：Ｃ，８３．８４；Ｈ，６．１８；Ｎ，４．２９。
【００４５】
実施例１ｂ
５−フルオロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール
５−フルオロ−２−メチルインドール（５．０ｇ、３３．５ミリモル）および４−ベンジルオキシヨードベンゼン（１０．４０ｇ、３３．５ミリモル）を、上記実施例１ａに用いられた手法に従って反応させると白色固体（２３％）が得られた：ｍｐ９４〜９５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２３（３Ｈ，ｓ）、５．１９（２Ｈ，ｓ）、６．３９（１Ｈ，ｓ）Ｈ，、６．８４〜６．９４（２Ｈ，ｍ）、７．１９〜７．２９（３Ｈ，ｍ）、７．３４〜７．４４（５Ｈ，ｍ）、７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３３２。
Ｃ２２Ｈ１８ＮＯＦの元素分析：
理論値：Ｃ，７９．７４；Ｈ，５．４７；Ｎ，４．２３。
実測値：Ｃ，７９．５４；Ｈ，５．５４；Ｎ，４．２１。
【００４６】
実施例１ｃ
５−クロロ−１−（４−メトキシメチルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール
５−クロロ−２−メチルインドール（４．１４ｇ、２５ミリモル）および４−メトキシメチルオキシヨードベンゼン（６．２０ｇ、２５ミリモル）を、上記実施例１ａに用いられた手法に従って反応させると無色液体（１９％）が得られた：１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２５（３Ｈ，ｓ）、３．４４（２Ｈ，ｓ）、５．２８（２Ｈ，ｓ）、６．４０（１Ｈ，ｓ）、６．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３０２／３０４（１Ｃｌ）。
Ｃ１７Ｈ１６ＣｌＮＯ２の元素分析：
理論値：Ｃ，６７．６６；Ｈ，５．３４；Ｎ，４．６４。
実測値：Ｃ，６７．４９；Ｈ，５．１７；Ｎ，４．５１。
【００４７】
実施例１ｄ
５−ブロモ−１−（４−メトキシメチルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール
５−ブロモ−２−メチルインドール（５．５９ｇ、２３．８ミリモル）および４−メトキシメチルオキシヨードベンゼン（７．４７ｇ、２３．８ミリモル）を、上記実施例１ａに用いられた手法に従って反応させると無色液体（８．４％）が得られた：１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２３（３Ｈ，ｓ）、３．４３（２Ｈ，ｓ）、５．２６（２Ｈ，ｓ）、６．３９（１Ｈ，ｓ）、６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３４６／３４８（１Ｂｒ）。
Ｃ１７Ｈ１６ＢｒＮＯ２の元素分析：
理論値：Ｃ，５８．９８；Ｈ，４．６６；Ｎ，４．０５。
実測値：Ｃ，５８．７２；Ｈ，４．５３；Ｎ，４．１７。
【００４８】
実施例１ｅ
（４Ｅ）−９−（４−ベンジルオキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール
カルバゾール（８．７０ｇ、３９．７ミリモル）および４−ベンジルオキシヨードベンゼン（１２．３３ｇ、３９．７ミリモル）を、上記実施例１ａに用いられた手法に従って反応させると黄褐色固体（２０％）が得られた：ｍｐ１２８〜１２９℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．８６（４Ｈ，ｂｒ  ｓ）、２．５５（２Ｈ，ｂｒｓ）、２．７２（２Ｈ，ｂｒ  ｓ）、５．１６（２Ｈ，ｓ）、７．００〜７．０３（２Ｈ，ｓ）、７．０５〜７．０８（１Ｈ，ｍ）、７．１３〜７．１６（２Ｈ，ｍ）、７．２７〜７．３０（１Ｈ，ｍ）、７．３３〜７．３６（１Ｈ，ｍ）、７．４０〜７．４３（２Ｈ，ｍ）、７．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３５４。
Ｃ２５Ｈ２３ＮＯの元素分析：
理論値：Ｃ，８４．９５；Ｈ，６．５６；Ｎ，３．９６。
実測値：Ｃ，８４．７４；Ｈ，６．７６；Ｎ，３．９１。
【００４９】
実施例１ｆ
１−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール
２−メチルインドール（６．２３ｇ、４７．５ミリモル）、４−ベンジルオキシ−３−フルオロブロモベンゼン（１４．０６６ｇ、５０ミリモル）、炭酸カリウム（５．８３ｇ、５５ミリモル）、およびＮ−メチルピロリジノン（５００ｍＬ）の混合物に、臭化銅（Ｉ）（１．０ｇ、７ミリモル）を加えた。この撹拌溶液を１８０℃に加熱し、１８時間維持した。反応混合物を冷却し、氷に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を水とブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を留去すると、暗色液体が得られ、これをシリカゲルクロマトグラフィ（２％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、標題化合物アレーが白色固体（３．４５ｇ、２２％収率）として得られた：ｍｐ７０〜７１℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２６（３Ｈ，ｓ）、５．２８（２Ｈ，ｓ）、６．３９（１Ｈ，ｓ）、６．９９〜７．０５（３Ｈ，ｍ）、７．２１〜７．２４（２Ｈ，ｍ）、７．３６〜７．５４（７Ｈ，ｍ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３３２：
Ｃ２２Ｈ１８ＮＯＦ  ０．１Ｈ２Ｏの元素分析：
理論値：Ｃ，７９．３１；Ｈ，５．５１；Ｎ，４．２０。
実測値：Ｃ，７９．２９；Ｈ，５．３９；Ｎ，４．１６。
【００５０】
実施例２ａ
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド
オキシ塩化リン（３ｍＬ）を無水ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）に加え、この混合物を室温で１５分間撹拌した。ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中、１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール（０．９４ｇ、３ミリモル）の混合物を加え、この混合物を８０℃に１８時間加熱した。反応混合物を氷に注ぎ、２Ｎ  ＮａＯＨの添加によりｐＨを７に調整した。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を水とブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。蒸発により生成物を暗色固体として得た。シリカゲルクロマトグラフィ（１０％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、白色固体（６３％）が得られた：ｍｐ１５０〜１５２℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．５４（３Ｈ，ｓ）、５．２２（２Ｈ，ｓ）、６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）、７．１７〜７．４２（４Ｈ，ｍ）、７．４５〜７．５４（７Ｈ，ｍ）、８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１０．１９（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３４２。
Ｃ２３Ｈ１９ＮＯ２の元素分析：
理論値：Ｃ，８０．９２；Ｈ，５．６１；Ｎ，４．１０。
実測値：Ｃ，８０．７６；Ｈ，５．７０；Ｎ，３．９３。
【００５１】
実施例２ｂ
５−フルオロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド
オキシ塩化リン（５ｍＬ）を無水ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に加え、この混合物を室温で１５分間撹拌してから、５−フルオロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール（１．６３ｇ、４．９ミリモル）のジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を加え、実施例２ａに用いられた手法に従って反応させると黄褐色固体（８５％）が得られた：ｍｐ２１９〜２２０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．５３（３Ｈ，ｓ）、５．２２（２Ｈ，ｓ）、６．９９〜７．０６（２Ｈ，ｍ）、７．２７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．３７〜７．５３（７Ｈ，ｍ）、７．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３６０。
Ｃ２３Ｈ１８ＦＮＯ２・０．５Ｈ２Ｏ元素分析：
理論値：Ｃ，７４．９９；Ｈ，５．２０；Ｎ，３．８０。
実測値：Ｃ，７４．９１；Ｈ，４．９６；Ｎ，３．５９。
【００５２】
実施例２ｃ
５−クロロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド
オキシ塩化リン（５ｍＬ）を無水ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に加え、室温で１５分間撹拌したら、５−クロロ−１−（４−メトキシメチルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール（１．２２ｇ、３．５ミリモル）のジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を実施例２ａに用いられた手法に従って反応させると、黄褐色固体（８５％）が得られた：ｍｐ＞２４０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．５２（３Ｈ，ｓ）、６．９７〜７．０２（３Ｈ，ｍ）、７．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ）、１０．０２（１Ｈ，ｓ）、１０．１６（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２８６／２８８（１Ｃｌ）。
Ｃ１６Ｈ１２ＣｌＮＯ２・０．３Ｈ２Ｏ元素分析：
理論値：Ｃ，６６．０１；Ｈ，４．３６；Ｎ，４．８１。
実測値：Ｃ，６５．８５；Ｈ，４．１０；Ｎ，４．７４。
【００５３】
実施例２ｄ
５−ブロモ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド
オキシ塩化リン（２．５ｍＬ）を無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に加え、室温で１５分間撹拌したら、５−ブロモ−１−（４−メトキシメチルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール（０．６５ｇ、１．９ミリモル）のジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を実施例２ａに用いられた手法に従って反応させると、黄褐色固体（５１％）が得られた：ｍｐ＞２５０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．５０（３Ｈ，ｓ）、６．９５〜７．０２（３Ｈ，ｍ）、７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ）、９．９８（１Ｈ，ｓ）、１０．１４（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３１８／３２０（１Ｂｒ）。
Ｃ１６Ｈ１２ＢｒＮＯ２・０．２Ｈ２Ｏ元素分析：
理論値：Ｃ，５５．９９；Ｈ，３．８８；Ｎ，４．３５。
実測値：Ｃ，５５．６９；Ｈ，３．９５；Ｎ，４．１５。
【００５４】
実施例２ｅ
（４Ｅ）−９−（４−ベンジルオキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オン
（４Ｅ）−９−（４−ベンジルオキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール（１．５５ｇ、４．４ミリモル）のテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）の撹拌溶液に、ＤＤＱ（１ｇ、４．４ミリモル）を加えた。撹拌を３０分間続けてから、粗製物をろ過し、水で洗浄した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（２５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製すると、白色固体（５７％）が得られた：ｍｐ２１９〜２２０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ２．１８〜２．２５（２Ｈ，ｍ）、２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）、２．７９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、５．１６（２Ｈ，ｓ）、７．１１〜７．５１（１２Ｈ，ｍ）、８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３６８。
Ｃ２５Ｈ２１ＮＯ２・０．５Ｈ２Ｏの元素分析：
理論値：Ｃ，７９．７６；Ｈ，５．８６；Ｎ，３．７２。
実測値：Ｃ，７９．８６；Ｈ，５．７５；Ｎ，３．５３。
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド
【００５５】
実施例２ｆ
１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド（３．６３ｇ、２５ミリモル）および４−ベンジルオキシヨードベンゼン（７．７６ｇ、２５ミリモル）を、上記実施例１ａに用いられた手法に従って反応させると黄色固体（１２％）が得られた：ｍｐ６２〜６４℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ５．２２（２Ｈ，ｓ）、７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３２〜７．５２（７Ｈ，ｍ）Ｈ，、７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、８．１９〜８．２２（１Ｈ，ｍ）、８．５４（１Ｈ，ｓ）、１０．０２（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３２８。
Ｃ２２Ｈ１７ＮＯ２・０．１Ｈ２Ｏの元素分析：
理論値：Ｃ，８０．２７；Ｈ，５．２７；Ｎ，４．２５。
実測値：Ｃ，８０．１５；Ｈ，５．０５；Ｎ，３．９７。
【００５６】
実施例２ｇ
１−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド
オキシ塩化リン（３ｍＬ）を無水ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）に加え、この混合物を室温で１５分間撹拌した。ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中、１−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール（１．０３ｇ、３．１ミリモル）の混合物を加え、この混合物を８０℃に加熱し、１８時間維持した。反応混合物を氷に注ぎ、２Ｎ  ＮａＯＨの添加によりｐＨを７に調整した。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を水とブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発により生成物を暗色固体として得た。シリカゲルクロマトグラフィ（２５％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、白色固体（０．８４ｇ、７６％）が得られた：ｍｐ１６６〜１６８〜１５２℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．５５（３Ｈ，ｓ）、５．３０（２Ｈ，ｓ）、７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）、７．１９〜７．２８（２Ｈ，ｍ）、７．２３〜７．５２（７Ｈ，ｍ）、７．４４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．４Ｈｚ）、７．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，Ｊ＝２．５）、８．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、１０．２０（１Ｈ，ｓ）Ｈｚ；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３６０。
Ｃ２３Ｈ１８ＦＮＯ２の元素分析（０．１Ｈ２Ｏ）：
理論値：Ｃ，７６．４８；Ｈ，５．０８；Ｎ，３．８８。
実測値：Ｃ，７６．３９；Ｈ，４．８１；Ｎ，３．６９。
【００５７】
実施例３ａ
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド（０．６４ｇ、１．９ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．２５ｇ、３．６ミリモル）、メタノール（２５ｍＬ）およびピリジン（１ｍＬ）の溶液を、３０分間加熱還流した。混合物を冷却し、メタノールを蒸発により留去した。生成物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）に抽出し、有機層を水とブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ、生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（２５％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、白色固体（５３％）が得られた：ｍｐ１７１〜１７３℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．３１（３Ｈ，ｓ）、５．２０（２Ｈ，ｓ）、６．９４〜７．０１（１Ｈ，ｍ）、７．１０〜７．１４（２Ｈ，ｍ）、７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．３７〜７．４７（５Ｈ，ｍ）、７．５２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、８．０１〜８．０３（１Ｈ，ｍ）、８．４１（１Ｈ，ｓ）、１０．６６（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３５７。
Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ２・０．５Ｈ２Ｏの元素分析：
理論値：Ｃ，７５．６０；Ｈ，５．７９；Ｎ，７．６７。
実測値：Ｃ，７５．１２；Ｈ，５．５３；Ｎ，７．３４。
【００５８】
実施例３ｂ
５−フルオロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
５−フルオロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド（０．９７ｇ、２．７ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．２５ｇ、３．６ミリモル）、メタノール（２５ｍＬ）およびピリジン（１ｍＬ）の混合物を、実施例３ａの手法に従って反応させると、白色固体（８８％）が得られた：ｍｐ１８３〜１８５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．３０（３Ｈ，ｓ）、５．２０（２Ｈ，ｓ）ｄ，６．９４〜６．９７（２Ｈ，ｍ）、７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．３７〜７．４６（５Ｈ，ｍ）、７．５２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ）、８．４１（１Ｈ，ｓ）、１０．７２（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３７５。
Ｃ２３Ｈ１９ＦＮ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７３．７８；Ｈ，５．１１；Ｎ，７．４８。
実測値：Ｃ，７３．５５；Ｈ，５．０３；Ｎ，７．３５。
【００５９】
実施例３ｅ
（４Ｅ）−９−（４−ベンジルオキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オンオキシム
（４Ｅ）−９−（４−ベンジルオキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オン（１．００ｇ、２．７ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．５６ｇ、８．１ミリモル）、メタノール（２５ｍＬ）およびピリジン（１ｍＬ）の混合物を、実施例３ａの手法に従って反応させると、白色固体（５１％）が得られた：ｍｐ２４１〜２４３℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．８３〜１．９２（２Ｈ，ｍ）、２．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）、２．７２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．２０（２Ｈ，ｓ）、７．０９〜７．１４（３Ｈ，ｍ）、７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３６〜７．４６（５Ｈ，ｍ）、７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）、８．００〜８．０２（１Ｈ，ｍ）、１０．４６（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−  ３７９。
Ｃ２５Ｈ２４Ｎ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７８．５１；Ｈ，５．８０；Ｎ，７．３２。
実測値：Ｃ，７８．２４；Ｈ，５．５２；Ｎ，７．２６。
【００６０】
実施例３ｆ
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド（０．５０ｇ、１．５ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．２５ｇ、３．６ミリモル）、メタノール（２５ｍＬ）およびピリジン（１ｍＬ）の混合物を、実施例３ａの手法に従って反応させると、黄色固体（６１％）が得られた：ｍｐ１５２〜１５４℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ５．２０（２Ｈ，ｓ）、７．１９〜７．５３（１２Ｈ，ｍ）、７．８６（１Ｈ，ｓ）、８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１０．７５（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３８３。
Ｃ２２Ｈ１８Ｎ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７７．１７；Ｈ，５．３０；Ｎ，８．１８。
実測値：Ｃ，７７．４９；Ｈ，５．４４；Ｎ，７．８５。
【００６１】
実施例３ｇ
１−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
１−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド（０．８１ｇ、２．３ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．２５ｇ、３．６ミリモル）およびメタノール（２５ｍＬ）の撹拌溶液に、ピリジン（１ｍＬ）を加えた。反応液を加熱還流し、３０分間保持した。混合物を冷却し、メタノールを蒸発により留去し、残渣を酢酸エチル／水に溶かした。生成物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出し、酢酸エチル層を水とブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ、粗製物をシリカゲルクロマトグラフィ（２５％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、白色固体（０．７ｇ、８３％）が得られた：ｍｐ１６７〜１６８℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．３２（３Ｈ，ｓ）、５．２９（２Ｈ，ｓ）、６．９９〜７．０１（１Ｈ，ｍ）、７．１０〜７．１７（２Ｈ，ｍ）、７．２５〜７．２８（１Ｈ，ｍ）、７．３７〜７．４２（１Ｈ，ｍ）、７．４３〜７．４９（１Ｈ，ｍ）、７．４９〜７．５４（２Ｈ，ｍ）、８．０１〜８．０４（１Ｈ，ｍ）、８．４１（１Ｈ，ｓ）、１０．６７（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３７５。
Ｃ２３Ｈ１９ＦＮ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７３．７８；Ｈ，５．１１；Ｎ，７．４８。
実測値：Ｃ，７３．５３；Ｈ，５．０６；Ｎ，７．３２。
【００６２】
実施例４
１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
ジクロロメタン（２０ｍＬ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（５０ｍｇ、０．２ミリモル）およびトリエチルシラン（２ｍＬ）の撹拌溶液に、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、この混合物を室温で１５分間撹拌した。該混合物に、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム（０．３６ｇ、１ミリモル）を加えて９０分間撹拌した。酢酸エチル（２５ｍＬ）と塩化アンモニウム（２５ｍＬの１０％溶液）とを加え、生成物を酢酸エチル（２×２５ｍＬ）に抽出した。有機層を合せて、水（３×２５ｍＬ）とブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去後、液体が得られた。これを無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解した。この混合物に、フッ化テトラブチルアンモニウム（３ｍＬ）を加えた。３０分間撹拌後、混合物を酢酸エチルと水とで抽出した。有機層を水とブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒の蒸発後、得られた粗製固体をシリカゲルクロマトグラフィ（２５％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、淡黄色固体（８３％）が得られた：ｍｐ１７１〜１７３℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２９（３Ｈ，ｓ）、６．９５（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．０９〜７．１３（２Ｈ，ｍ）、７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．９８〜８．０１（１Ｈ，ｍ）、８．４０（１Ｈ，ｓ）、９．８９（１Ｈ，ｓ）、１０．６３（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２６７。
Ｃ１６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７２．１７；Ｈ，５．３０；Ｎ，１０．５２。
実測値：Ｃ，７１．７８；Ｈ，５．２３；Ｎ，１０．３７。
【００６３】
実施例５
５−フルオロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
５−フルオロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム（０．４９ｇ、１．３ミリモル）を、実施例４に用いられた手法に従って反応させると、白色固体（６７％）が得られた：ｍｐ１６２〜１６３℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２９（３Ｈ，ｓ）、６．９４〜６．９７（４Ｈ，ｍ）ｄ，７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．７０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ）、８．３９（１Ｈ，ｓ）、９．９２（１Ｈ，ｓ）、１０．７０（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２８５。
Ｃ１６Ｈ１３ＦＮ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，６７．６０；Ｈ，４．６１；Ｎ，９．８５。
実測値：Ｃ，６７．４４；Ｈ，４．６７；Ｎ，９．７９。
【００６４】
実施例６
５−クロロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
５−クロロ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム（０．６３ｇ、２．２ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．３０ｇ、４．３ミリモル）、メタノール（２５ｍＬ）およびピリジン（１ｍＬ）の混合物を、実施例４に用いられた手法に従って反応させると、白色固体（６８％）が得られた：ｍｐ２１２〜２１３℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２９（３Ｈ，ｓ）、６．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．２４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ）、８．４０（１Ｈ，ｓ）、９．９３（１Ｈ，ｓ）、１０．７５（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３０１／３０３（１Ｃｌ）。
Ｃ１６Ｈ１３ＣｌＮ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，６３．９０；Ｈ，４．３６；Ｎ，９．３１。
実測値：Ｃ，６３．６３；Ｈ，４．１２；Ｎ，９．１７。
【００６５】
実施例７
５−ブロモ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
５−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム（０．１６ｇ、０．５ミリモル）、塩酸ヒドロキシルアミン（０．１０ｇ、１．４ミリモル）、メタノール（１０ｍＬ）およびピリジン（０．２ｍＬ）の混合物を、実施例４に用いられた手法に従って反応させると、白色固体（６６％）が得られた：ｍｐ２０９〜２１１℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．２９（３Ｈ，ｓ）、６．９２〜６．９７（３Ｈ，ｍ）、７．２０〜７．２５（３Ｈ，ｍ）、８．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）、８．３９（１Ｈ，ｓ）、９．９４（１Ｈ，ｂｒｓ）、１０．７６（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ３４５／３４７（１Ｂｒ）。
Ｃ１６Ｈ１３ＢｒＮ２Ｏ２・０．５Ｈ２Ｏの元素分析：  
理論値：Ｃ，５４．２６；Ｈ，３．９８；Ｎ，７．９１。
実測値：Ｃ，５４．２６；Ｈ，３．６８；Ｎ，７．６５。
【００６６】
実施例８
（４Ｅ）−９−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オンオキシム
（４Ｅ）−９−（４−ベンジルオキシフェニル）−１，２，３，９−テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オンオキシム（０．２３ｇ、０．６ミリモル）を、実施例４に用いられた手法に従って反応させると、黄褐色固体（４０％）が得られた：ｍｐ２２７〜２２９℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．８７〜１．９１（２Ｈ，ｍ）、２．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）、２．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、６．９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０９〜７．１３（３Ｈ，ｍ）、７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．９８〜８．００（１Ｈ，ｍ）、９．８５（１Ｈ，ｓ）、１０．４３（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２９３。
Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７３．９５；Ｈ，５．５２；Ｎ，９．５８。
実測値：Ｃ，７３．６１；Ｈ，５．３９；Ｎ，９．４２。
【００６７】
実施例９
１−（４−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
１−（４−ベンジルオキシフェニル）−Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム（０．３１ｇ、０．９ミリモル）を、実施例４に用いられた手法に従って反応させると、黄色固体（１８％）が得られた：ｍｐ９５〜９７℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ６．９４〜６．９８（２Ｈ，ｍ）、７．１９〜７．２９（２Ｈ，ｍ）、７．３６〜７．４５（４Ｈ，ｍ）、８．３１（１Ｈ，ｓ）、９．８０〜９．８３（１Ｈ，ｍ）、１０．７２（１Ｈ，ｓ）、１１．４４（１ｓ、ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２５３。
Ｃ１５Ｈ１２Ｎ２Ｏ２の元素分析：
理論値：Ｃ，７１．４２；Ｈ，４．７９；Ｎ，１１．１０。
実測値：Ｃ，７１．８５；Ｈ，５．３６；Ｎ，９．７０。
【００６８】
実施例１０
１−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム
ジクロロメタン（１０ｍＬ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（５０ｍｇ、０．２ミリモル）およびトリエチルシラン（３ｍＬ）の撹拌溶液に、トリエチルアミン（１．５ｍＬ）を加え、この混合物を周囲温度で１５分間撹拌した。該混合物に、ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の１−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドオキシム（０．５２ｇ、１．４ミリモル）を加え、撹拌を４時間続けた。酢酸エチル（２５ｍＬ）と塩化アンモニウム（２５ｍＬの１０％溶液）とを加え、生成物を酢酸エチル（２×２５ｍＬ）に抽出した。有機層を合せて、水（３×２５ｍＬ）とブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去後、液体が得られ、これを無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解した。この撹拌混合物に、フッ化テトラブチルアンモニウム（３ｍＬ）を加えた。３０分間撹拌後、混合物を酢酸エチル／水に溶かして振り、層を分離した。有機部分を水とブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒の蒸発後、粗製固体をシリカゲルクロマトグラフィ（２５％酢酸エチル−ヘキサン類）により精製すると、淡黄色固体（０．２２ｇ、５６％）が得られた：ｍｐ１８２〜１８４℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．３１（３Ｈ，ｓ）、６．９８〜７．０１（１Ｈ，ｍ）、７．０７〜７．１７（４Ｈ，ｍ）、７．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、７．９９〜８．０３（１Ｈ，ｍ）、８．４０（１Ｈ，ｓ）、１０．３５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、１０．６４（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２８５。
Ｃ１６Ｈ１３ＦＮ２Ｏ２（０．３Ｈ２Ｏ）の元素分析：
理論値：Ｃ，６６．３４；Ｈ，４．５７；Ｎ，９．３０。
実測値：Ｃ，６６．３８；Ｈ，４．６１；Ｎ，９．８５。
【００６９】
実施例１１
ＥＲα受容体またはＥＲβ受容体に対する選択性
本発明の代表例を、ＥＲαまたはＥＲβの双方に関して、１７β−エストラジオールと競合するそれらの能力について評価した。この試験法によって、特定の化合物が、エストロゲン受容体に結合するかどうか（したがって「エストロゲン様」である）、またＥＲαまたはＥＲβに対して選択性があるかどうかを決定する方法論が提供される。これらの値は、下表に示され、ＩＣ５０として報告されている。１７β−エストラジオールは、比較のための標準対照として含まれる。用いられる手法を手短に下記に示す。ヒトＥＲαまたはＥＲβのエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（Ｄ、Ｅ、およびＦ）を発現する大腸菌の粗製ライセートを調製した。受容体および化合物の双方を、１ｍＭ  ＥＤＴＡで補足された１×ダルベッコーのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中で希釈した。高結合マスクマイクロタイタプレートを用いて、１００μＬの受容体（１μＧ／ウェル）を、２ｎＭ［３Ｈ］−１７β−エストラジオールおよび種々の濃度の化合物と組み合わせた。室温で５時間から１５時間後、該プレートをＤＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、結合放射活性を、液体シンチレーションカウントにより測定した。ＩＣ５０は、全１７β−エストラジオール結合を５０％減少させる化合物濃度として定義される。得られた結果は、下表に示している。
【００７０】
【表１】
2007502277.tif 000008
【００７１】
標準的な薬理試験法で得られた結果は、本発明の化合物がエストロゲン様化合物であり、その幾つかがＥＲβ受容体に強力な選択的親和力を有していることを証明している。本発明の化合物は、ＥＲαよりもＥＲβに高選択的親和力を有するものから両受容体にほぼ等しい親和力を有するものまでの範囲にある。したがって、本発明の化合物は、少なくとも部分的に、それらの受容体親和力の選択性プロフィルに基づく活性範囲に亘っている。さらに、各新規な受容体リガンド複合体がユニークであり、したがって種々の共調節蛋白質とのその相互作用がユニークであることから、本発明の化合物は、それらが存在している細胞の場所に依って異なる調節作用を示す。例えば、幾つかの細胞型において、ある化合物が、エストロゲンアゴニストとして、一方、他の組織においてアンタゴニストとして作用することが可能である。このような活性を有する化合物は、時にはＳＥＲＭ類（選択的エストロゲン受容体調節剤類）と称されている。しかしながら、多くのエストロゲンとは異なって、ＳＥＲＭ類の多くは、子宮の湿重量増加を起こさない。これらの化合物は、子宮内で抗エストロゲン様であり、子宮組織においてエストロゲンアゴニストの栄養効果に完全に拮抗できる。しかしながら、これらの化合物は、骨系、心血管系、および中枢神経系においてはエストロゲンアゴニストとして働く。これらの化合物の組織選択性により、エストロゲン欠乏（骨または心血管などの一定の組織において）またはエストロゲン過剰（子宮または乳腺において）により生じるか、またはそれに関連する哺乳動物の病態または症候群の治療または予防に、これらの化合物は有用である。
【００７２】
さらにこのような細胞特異的調節以外に、本発明の化合物はまた、１つの受容体タイプにはアゴニストとして作用し、他の受容体にはアンタゴニストとして作用する可能性を有する。例えば、該化合物が、ＥＲβに対してはアンタゴニストであり、ＥＲαに対してはアゴニストであり得ることが証明されている（Ｍｅｙｅｒｓ，Ｍａｒｖｉｎ  Ｊ．；Ｓｕｎ，Ｊｕｎ；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｅ．；Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂｅｎｉｔａ  Ｓ．；Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｊｏｈｎ  Ａ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）、４２（１３）、２４５６−２４６８頁）。このようなＥＲＳＡＡ（エストロゲン受容体選択的アゴニストアンタゴニスト）活性により、本シリーズの化合物内で薬理学的に異なるエストロゲン様活性が提供される。
【００７３】
所与の試験化合物の活性プロフィルを決定するために、標準的薬理試験法を容易に利用できる。以下に、幾つかの代表的試験法を手短に要約する。ＳＥＲＭ類に関する標準的試験法は、米国特許第４，４１８，０６８号明細書、および米国特許第５，９９８，４０２号明細書にも提供されている。
【００７４】
実施例１２
ラットの子宮栄養性／抗子宮栄養性試験法
該化合物のエストロゲン様および抗エストロゲン様性質を、Ｌ．Ｊ．Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｇｏｏｄｅ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２６、１４５３頁（１９８０）により以前に記載されているように、未成熟ラットの子宮栄養性アッセイ（４日）において決定できる。未成熟ＳＤラット（メス、１８日齢）を、６匹群で試験した。抗エステロゲン性をチェックするために、注射媒体として５０％ＤＭＳＯ／５０％生理食塩水を用いて、１０ｕＧ化合物、１００ｕＧ化合物、（１００ｕＧ化合物＋１ｕＧ  １７β−エストラジオール）、および１ｕＧ  １７β−エストラジオールの毎日、ｉｐ注射により動物を処置する。４日目に動物をＣＯ２窒息により殺処理し、子宮を摘出し、過剰の脂質を取り除き、流体を除き、湿重量を測定する。補体成分の３種の遺伝子発現を評価するために１つのホーン小切片を組織学に供し、残りは全ＲＮＡを単離するために用いる。
【００７５】
実施例１３
６週の卵巣摘出ラット試験法−骨および心保護
メスＳＤ  ＣＤラット、ｏｖｘまたはシャム（ｓｈａｍ）ｏｖｘを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍから手術１日後に得る（２４０〜２７５ｇの体重範囲）。３匹または４匹のラット／ケージを、１２／１２（明／暗）スケジュールの室内で飼い、飼料（Ｐｕｒｉｎａ  ５Ｋ９６Ｃラット用固形飼料）と水を自由に供給する。全試験に関する処置は、動物到着１日後から開始し、１週当たり７日６週間指定されたとおり投与した。いずれの処置を受けない齢合致のシャム術ラット群を、各試験に関する無処置エストロゲン充満対照群として供給する。
【００７６】
全ての処置は、処置容量が、０．１ｍＬ／１００ｇ体重であるように規定された濃度で標準的生理食塩水中１％ツウィーン８０において調製される。１７β−エストラジオールは、トウモロコシ油（２０μｇ／ｍＬ）に溶解し、０．１ｍＬ／ラットを皮下送達する。全ての投与量は、群の平均体重測定値に従って３週間隔で調整する。
【００７７】
処置開始から５週後、試験終了１週前に、各ラットを、骨塩量（ＢＭＤ）について評価する。ＸＣＴ−９６０Ｍ（ｐＱＣＴ；Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ、Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ、ドイツ国）を用いて麻酔ラットで脛骨近位の全密度および小柱密度を評価する。測定は以下のとおり実施される：走査１５分前に、４５ｍｇ／ｋｇケタミン、８．５ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１．５ｍｇ／ｋｇアセプロマジンの腹腔内注射により各ラットに麻酔をかける。
【００７８】
右後足を、直径２５ｍｍのポリカーボネートチューブに通し、足首関節を９０°角で、また膝関節を１８０°でアクリルフレームにテープで貼る。該ポリカーボネートチューブを、ｐＱＣＴの開口部に対して垂直に維持するスライディングプラットフォームに固定する。大腿骨の遠位端と脛骨の近位端とが、走査領域内にあるように、該プラットフォームを調整する。二次元スカウト図を、長さ１０ｍｍ、線解像度０．２ｍｍで操作する。スカウト図が、モニター上でディスプレーされたら、脛骨の近位端を位置決めする。この点から３．４ｍｍの遠位でｐＱＣＴ走査を開始する。ｐＱＣＴ走査は、厚さが１ｍｍであり、０．１４０ｍｍのボクセル（三次元ピクセル）サイズを有し、スライスを通した１４５の投影からなる。
【００７９】
ｐＱＣＴ走査が完了したら、画像をモニター上にディスプレーする。脛骨は含むが、腓骨を除外する対象領域の輪郭を描く。軟組織は、反復アルゴリズムを用いて自動的に除去される。残りの骨密度（全密度）はｍｇ／ｃｍ３で報告される。骨の外部５５％は、同心螺旋で剥がされる。残りの骨密度（柵状織密度）はｍｇ／ｃｍ３で報告される。ＢＭＤ評価１週後に、ラットを二酸化炭素窒息により安楽死させ、コレステロール測定のために採血する。子宮を摘出し、重量を量る。全コレステロールは、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＨＰキットを用い、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１１臨床用アナライザーを用いて決定される。統計は、ダネット検定によるワンウェイ分散分析を用いて比較した。
【００８０】
実施例１４
ＭＣＦ−７／ＥＲＥ抗増殖試験法
試験化合物の保存液（通常０．１Ｍ）をＤＭＳＯ中で調製してから、ＤＭＳＯで１０倍から１００倍に希釈して１ｍＭまたは１０ｍＭの作業溶液を作製する。ＤＭＳＯ保存液は、４℃（０．１Ｍ）または−２０℃（＜０．１Ｍ）で保存する。ＭＣＦ−７細胞を、週２回、増殖培地［１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭグルタマックス−１を含有するＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地］で継代培養する。この細胞を、５％ＣＯ２／９５％加湿空気インキュベーター内で３７℃で通気フラスコ中に維持する。処置１日前、細胞を、９６ウェルプレートに２５，０００／ウェルで増殖培地と共に塗布し、３７℃で一晩温置する。
【００８１】
細胞を、実験培地［１０％（ｖ／ｖ）熱不活化チャコールストリップトウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭグルタマックス−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッド無しのＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地］中、５０μｌ／ウェルの１：１０希釈アデノウィルス５−ＥＲＥ−ｔｋ−ルシフェラーゼと共に３７℃で２時間感染させる。次いでこのウェルを、１５０μλの実験媒体で１回洗浄する。最後に細胞を、１５０μλ／ウェルの媒体（≦０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯ）または実験媒体に≧１０００倍の希釈されている化合物により、８ウェル／処理を反復して３７℃で２４時間処理する。
【００８２】
試験化合物の最初のスクリーニングは、単独試験（アゴニスト様式）である１μＭの単回投与か、または０．１ｎＭ  １７β−エストラジオール（ＥＣ８０；アンタゴニスト様式）と併用して行われる。また、各９６ウェルプレートには、媒体対照群（０．１％  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）およびアゴニスト対照群（０．１ｎＭまたは１ｎＭ  １７β−エストラジオール）を含む。用量応答実験は、１０−１４Ｍから１０−５Ｍまでの対数増加における活性化合物に対するアゴニスト様式および／またはアンタゴニスト様式で実施する。これらの用量応答曲線から、それぞれＥＣ５０値およびＩＣ５０値が出る。各処理群における最終ウェルには、ＥＲアンタゴニスト対照として５μｌの３×１０−５Ｍ  ＩＣＩ−１８２，７８０（１０−６Ｍの最終濃度）を含有する。
【００８３】
処理後、該細胞を、２５μｌ／ウェルの１×細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によりシェーカ上で１５分間溶解する。細胞溶解液（２０μｌ）を、９６ウェルのルミノメータプレートに移し、ルシフェラーゼ活性を、１００μｌ／ウェルのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐルミノメータ（ＥＧ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定する。基質の注入前に、各ウェルに対して１秒のバックグランド測定を行う。基質の注入後、ルシフェラーゼ活性を、１秒遅延後、１０秒間測定する。このデータをルミノメータからＭａｃｉｎｔｏｓｈのパーソナルコンピュータに移し、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて解析する；このプログラムは、各ウェルに関するルシフェラーゼ測定値からバックグラウンドの読み取りを差し引いてから、各処理の平均値と標準偏差を決定する。
【００８４】
ルシフェラーゼデータを、対数により変換し、Ｈｕｂｅｒ  Ｍ−ｅｓｔｉｍａｔｏｒを用いて、外れ変換値の加重を低下させる。ＪＭＰソフトウェアを用いて、ワンウェイＡＮＯＶＡ（ダネット検定）に関して変換しかつ加重したデータを解析する。化合物処理を、アゴニスト様式における媒体対照結果、またはアンタゴニスト様式における陽性アゴニスト対照結果（０．１ｎＭ  １７β−エストラジオール）と比較する。最初の単回投与実験に関して、化合物の処理結果が適切な対照と有意に異なる場合（ｐ＜０．０５）、その結果を、１７β−エストラジオールに対する相対パーセント［すなわち、（（化合物−媒体対照）／（１７β−エストラジオール）−媒体対照）］×１００］として報告する。また、ＪＭＰソフトウェアを用いて、非線形用量応答曲線からＥＣ５０値および／またはＩＣ５０値を決定する。
【００８５】
実施例１５
ＬＤＬ酸化阻害−抗酸化活性
ブタの大動脈を、と殺場から入手し、洗浄し、冷ＰＢＳ中に移し、大動脈内皮細胞を採取する。該細胞を採取するために、大動脈の肋間血管の両端を結び、大動脈の一端をクランプする。新鮮な滅菌ろ過された０．２％コラゲナーゼ（ＳｉｇｍａタイプＩ）を血管中に入れてから、血管の他端をクランプして閉鎖系を形成する。大動脈を３７℃で１５〜２０分間温置し、その後、コラゲナーゼ溶液を採取し、２０００×ｇで５分間遠心分離する。各ペレットを、チャコールストリップトＦＢＳ（５％）、ＮｕＳｅｒｕｍ（５％）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０００Ｕ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）およびゲンチミシン（７５μｇ／ｍｌ）で補足したフェノールレッド無しのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地から成る７ｍＬの内皮細胞培養培地に懸濁させ、１００ｍｍのペトリ皿に接種し、５％ＣＯ２中、３７℃で温置する。２０分後、細胞をＰＢＳでリンスし、新鮮な培地を加え、これを２４時間目に再度繰り返した。細胞は、凡そ１週間後に集密化した。内皮細胞を週に２回ルーチンに与え、集密化したら、トリプシン化し、１：７比で接種する。１２．５μｇ／ＬＤＬの細胞媒介酸化を、３７℃で４時間、評価すべき化合物（５μＭ）の存在下で進行させる。結果は、遊離アルデヒド分析のためのＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）法（Ｙａｇｉ  Ｋ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  １５：２１２−２１６頁（１９７６））によって測定される酸化プロセスの阻害パーセントとして表される。
【００８６】
実施例１６
Ｄ１２視床下部細胞試験法
Ｄ１２ラット視床下部細胞を、ＲＣＦ１７親細胞系からサブクローン化し、凍結保存する。それらを、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）、グルタマックス−１（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、プラス１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中でルーチンに増殖させる。該細胞を、サブ集密密度（１〜４×１０  ６細胞／１５０ｍｍ皿）で２〜１０％チャコールストリップトＦＢＳを含有するフェノールレッド無しの培地（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、グルタマックス、ペニシリン−ストレプトマイシン）中で平板培養する。該細胞を、２％ストリップト血清を含有する培地と共に２４時間後に再度加える。アゴニスト活性を試験するために、細胞を、１０ｎＭ  １７ｂ―エストラジオールまたは種々の用量の試験化合物（１ｍＭまたは１ｐＭから１ｍＭの範囲）で処理する。アンタゴニスト活性を試験するために、細胞を、変動用量（１００ｐＭから１ｍＭ）の試験化合物の不在下または存在下、０．１ｎＭ  １７β―エストラジオールで処理する。また、陰性対照として対照皿も、ＤＭＳＯで処理する。ホルモン添加４８時間後、細胞を溶解し、結合試験法を実施する。
【００８７】
各結合試験法について、１００〜１５０ｍｇ蛋白質を、１５０ｍｌ用量で１０ｎＭ  ３Ｈ−Ｒ５０２０＋１００倍過剰のＲ５０２０と共に温置する。三通りの反応液（Ｒ５０２０有りで三通り、Ｒ５０２０無しで三通り）を９６ウェルプレート中で調製する。先ず蛋白質抽出液を加え、次いで３Ｈ−Ｒ５０２０または３Ｈ−Ｒ５０２０＋１００×非標識Ｒ５０２０を加える。この反応は、室温で１〜２時間実施する。ｐＨ７．４のＴＥ中、１００ｍｌ冷５％チャコール（Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ−４）、０．５％デキストラン６９Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の添加により該反応を中止させる。室温で５分後、結合および未結合リガンドを遠心分離（５分、１０００ＲＣＦ、４℃）により分離する。上澄液（約１５０ｍｌ）を除去し、シンチレーションバイアルに移す。シンチレーション液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ＋）の添加後、サンプルを、シンチレーションカウンタで１分間カウントする。
【００８８】
実施例１７
ＣＮＳ視索前野におけるプロゲステロン受容体
６０日齢メスＳＤラットを卵巣切除する。該ラットは、１２時間の明期、１２時間の暗期で動物管理施設で飼い、水道水とげっ歯類用固形飼料を自由に取らせた。
【００８９】
卵巣切除ラットは、媒体（５０％ＤＭＳＯ、４０％ＰＢＳ、１０％エタノール媒体）、１７β―エストラジオール（２００ｎｇ／ｋｇ）または被試験化合物で注射された群に無作為に分けた。この化合物のアンタゴニスト性を評価するために、追加のラットに対し、１７β―エストラジオールの注射１時間前に試験化合物を注射する。ｓ．ｃ．注射６時間後、ラットを致死量のＣＯ２により安楽死させ、それらの脳を採取し、凍結した。
【００９０】
動物から採取した組織をクリオスタット上−１６℃で切断し、シラン被覆顕微鏡スライド上に採取する。次に切片を載せたスライドを、４２℃に維持されたスライドウォーマー上で乾燥し、−８０℃で乾燥スライドボックス中に保存する。スライド上での凝縮形成を避け、したがって組織およびＲＮＡ分解を最少にするため、処理前に乾燥スライドボックスを室温まで徐々に温める（−２０℃で１２〜１６時間；４℃で２時間；室温で１時間）。乾燥スライドを金属ラックに装填し、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ９．０）中に５分間固定後、前述のとおり処理する。
【００９１】
ラットＰＲ  ｃＤＮＡ９の８１５ｂｐ断片を含有するプラスミド（リガンド結合ドメイン）を線形化し、ラットＰＲ  ｍＲＮＡの一部に相補的であるＳ  ３５−ＵＴＰ標識プローブを生成するために用いる。処理切片を載せたスライドを、リボプローブ（４〜６×１０  ６ＤＰＭ／スライド）と５０％ホルムアミドとを含有する２０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物によりハイブリダイズし、５５℃の加湿チャンバ内に一晩温置する。翌朝、該スライドを２×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）／１０ｍＭ  ＤＴＴ中に浸漬されている金属ラックに入れる。このラックの全てを大型容器に移し、２×ＳＳＣ／１０ｍＭ  ＤＴＴ中、室温で１５分間静かに撹拌しながら洗浄する。次にスライドを、ＲＮアーゼ緩衝液中、３７℃で３０分間洗浄し、ＲＮアーゼＡ（２ｍｇ／ｍｌ）により３７℃で３０分間処理し、室温で１５分間１×ＳＳＣで洗浄する。引き続き、スライドを０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄して（２×３０分）非特異的標識を除き、室温で１５分間０．１×ＳＳＣでリンスし、一連の段階的アルコール：酢酸アンモニウム（７０％、９５％および１００％）で脱水する。風乾したスライドを、Ｘ線フィルムに３日間対向させてから原版処理する。条件によるアッセイ間の変動差異を排除するために全てのラットのスライドを一緒にハイブリダイズし、洗浄し、暴露し、原版処理する。
【００９２】
実施例１８
ラットの顔面潮紅−ＣＮＳ作用
卵巣切除メスの６０日齢ＳＤラットを以下の手術により得る。手術は、第１の処理の最低８日前に行う。該ラットを個々に１２時間の明／暗サイクル下で飼い、標準的なラット用固形飼料と水を自由に与える。
【００９３】
２つの対照群を各試験に含む。用量は、ゴマ油中の１０％ＤＭＳＯ（ｓｃ試験）または生理食塩水中の１．０％ツウィーン８０（ｐｏ試験）におけるｍｇ／ｋｇの群平均体重に基づいて調製される。ラットに、０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの群平均体重の範囲の用量で試験化合物を投与する。媒体およびエチニルエストラジオール（ＥＥ）対照（０．１ｍｇ／ｋｇ、ｓｃまたは０．３ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）の対照群を、各試験に含む。化合物を、それらのアンタゴニスト活性について試験する場合、ｓｃまたはｐｏ試験に、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇでＥＥを共投与する。試験化合物は、尾の皮膚温度を測定する日まで投与する。
【００９４】
４日間の順化後、ラットを１日１回、対象化合物（１種または複数種）により処置する。１処置群当たり１０匹のラットである。化合物の投与は、頸の項部に０．１ｍｌのｓｃ注射か、または０．５ｍｌ容量のｐｏ注射による。処置３日目に、モルフィンペレット（７５ｍｇの硫酸モルフィン）を皮下に埋め込む。処置５日目に、１個または２個の追加のモルフィンペレットを埋め込む。８日目に、凡そ半数のラットにケタミンを注射し（８０ｍｇ／ｋｇ，筋肉内）、ＭａｃＬａｂ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ミルフォード、マサチューセッツ州）に接続した熱電対を、尾の付け根から凡そ１インチの尾上にテープで留める。このシステムにより、尾皮膚温度の連続測定が可能になった。ベースライン温度を１５分間測定してから、ナロキソン（１．０ｍｇ／ｋｇ）をｓｃ投与（０．２ｍｌ）してモルフィン作用を遮断し、それから１時間後に尾皮膚温度を測定する。９日目に、残りのラットを準備し、同様に分析する。
【００９５】
実施例１９
単離ラット大動脈環における血管運動機能
ＳＤラット（２４０〜２６０グラム）を４群に分ける：
１．正常な非卵巣摘出（無処置）
２．媒体で処置した卵巣摘出（卵巣切除術）
３．１７β−エストラジオールで処置（１ｍｇ／ｋｇ／日）した卵巣摘出
４．試験化合物で処置（すなわち、１ｍｇ／ｋｇ／日）した卵巣摘出
【００９６】
ラットは、処置凡そ３週前に卵巣摘出する。各ラットに、蒸留脱イオン水中、１％ツウィーン８０と共に懸濁した１ｍｇ／ｋｇ／日の硫酸１７β−エストラジオールまたは試験化合物を胃管により投与する。媒体処置動物には、薬物処置群に用いられた媒体の適量を投与する。
【００９７】
ラットを、ＣＯ２吸入により安楽死させ放血させる。それらの胸部大動脈を素早く取り出し、以下の組成物（ｍＭ）：最終ｐＨが７．４にＣＯ２−Ｏ２、９５％／５％で気体処理したＮａＣｌ（５４．７）、ＫＣｌ（５．０）、ＮａＨＣＯ３（２５．０）、ＭｇＣｌ２２Ｈ２Ｏ（２．５）、Ｄ−グルコース（１１．８）およびＣａＣｌ２（０．２）と共に３７℃の生理溶液に入れる。アドバンチチア（ａｄｖａｎｔｉｔｉａ）を外表面から除き、血管を２〜３ｍｍ幅の環に切断する。１０ｍＬの組織浴に環の一端を浴槽の底に取り付け、他端をフォーストランスデューサに取り付ける。１グラムの静止張力を環上に与える。環を１時間平衡化し、シグナルを得て分析する。
【００９８】
平衡後、該環を濃度増加のフェニレフリン（１０−８Ｍから１０−４Ｍ）に暴露し、張力を記録する。次に浴槽を新鮮な緩衝液で３回リンスする。洗い流した後、２００ｍＭ  Ｌ−ＮＡＭＥを組織浴に加え、３０分間平衡化させる。次いでフェニレフリン濃度応答曲線を反復する。
【００９９】
実施例２０
８−アームラジアルアーム迷路−認知力改善
到着時に２００〜２５０ｇ重量のオスＳＤ、ＣＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、キングストン、ニューヨーク州）を用いる。１週間、１ケージ当たり６匹のラットを入れ標準的実験室用固形飼料と水を自由に利用させる。２２℃で維持されたコロニー室に入れ、午前６時に点灯する１２時間の明／暗サイクルを実施した。施設に対する馴化後、ラットを個々にケースに入れ、自由給餌重量の８５％を維持する。安定な重量に達したら、ラットを８−アーム放射状迷路に馴化させる。
【０１００】
迷路構造は、ＰｅｅｌｅおよびＢａｒｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ、２９：１４３−１５０頁、１９８０年）の迷路構造を改造したものである。該迷路は、７５．５ｃｍの高さに上げ、互いに等距離の中心から放射状に出ている８−アームにより囲まれる円形領域から構成される。各アームは、長さ５８ｃｍ×高さ１３ｃｍである。各セッションの開始前、迷路の中心部分にラットを封入するために、透明な叢状ガラスの円筒を下げる。迷路の各アームには、データ捕捉ユニットに接続され、次いでコンピュータに接続している３セットのフォトセルが具備されている。該フォトセルは、迷路中のラットの動きを追跡するために用いられる。ペレット給餌器が、各アームの末端の飼料カップ上に配置されており、アームの外側フォトセルが、所与のセッションの初回に作動させる際に、４５ｍｇのチョコレート２個が分配される。視覚による手がかりとして役立つように、迷路は、各壁に黒白の幾何学ポスターが貼られた試験室内に配置される。全てのトレーニングおよび試験手順中、白色ノイズが聞き取れる（約７０ｄｂ）。
【０１０１】
トレーニング法は、各々、毎日のセッションが５分から１０分続く５つのフェーズからなる。ラットが迷路の中心に位置する時間と、セッションを開始するために円筒を上げる時間との間で１０秒の遅れが課される。フェーズＩの時は、迷路の８つのアームを通してばらまかれた４５ｍｇのチョコレート飼料ペレットと共に迷路に飼料制限のラットのペアを１０分間置く。フェーズＩＩの時は、フォトセルの中央から各アームの飼料カップまでペレットをばらまいて、各ラットを１０分間個々に迷路上に置く。フェーズＩＩＩの時は、各アーム内の飼料カップの内および周囲のみに飼料ペレットを配置して、各ラットを１０分間迷路上に置く。フェーズＩＶでは、各ラットに１０分間各アームから２個のペレットを採取させる。アームへのリエントリーは、エラーと考える。ラットが、３日連続のトレーニングにおいて全部で２回以内のエラーで基準行動を達成するまで、この様式で毎日トレーニングする。馴化およびトレーニング時間は全部で凡そ３週間である。
【０１０２】
試験化合物を、リン酸緩衝生理食塩水中で調製し、１ｍｇ／ｋｇ量で投与する。スコポラミンＨＢｒ（０．３ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）は、エラー率（記憶損失）の増加を生じさせる障害剤として働いた。試験化合物は、所与の任意の試験日に最初の迷路暴露３０分前に、スコポラミンと同時に腹腔内投与する。
【０１０３】
試験化合物を評価するため、最少量の動物による高実験効率を達成するため、反復測定用に８×８バランスドラテン方格がデザインされる。８つの実験セッションを１週当たり２つで各セッション内で無作為化した８つの処置（媒体、スコポラミン、スコポラミンと併用する３種の用量の試験化合物）により実施する。各々の処置は１つおきに、同じ回数続けた。したがって、個々の処置の残留効果が推定でき、直接的処置効果から除くことができた。ＡＮＯＶＡ後、調整手段に対するダネットの両側検定を用いて複数比較を実施する。
【０１０４】
最初の暴露時、５分以内に正しい選択を４回しなかった動物、または第２の暴露の終りまでに全部で８つの選択をしなかった動物は、そのセッションに関して「時間切れ」と考える。試験化合物の１回超投与後に「時間切れ」したラットは、いずれも解析から除外する。
【０１０５】
実施例２１
神経保護
一次皮質神経細胞培養における時間依存細胞死の阻害
一次皮質神経細胞は、Ｍｏｎｙｅｒら、１９８９年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８３：３４７−３５４頁
により記載された方法の変法を用いて０〜１日齢であるラット脳から生成した。分散した脳組織を、ＤＭＥＭ／１０％ＰＤＨＳ（妊娠ドナーのウマ血清）中、３日間増殖させてから、シトシンアラビノシド（ＡＲＣ）により２日間処理して汚染膠腫細胞を除いた。５日目に、ＡＲＣ培地を除き、ＤＭＥＭ／１０％ＰＤＨＳと交換した。使用前に神経細胞をさらに４〜７日間培養した。
【０１０６】
対照の一次神経細胞培養物は、培養１２日目と１８日目との間に細胞死の進行を示す。１２の培養物を、９日目にＤＭＥＭと１０％ＰＤＨＳ中に維持された６つの培養物に試験化合物を加え、対照として残りの培養物を維持した後、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）の濃度に関して１２日目と１６日目に評価した。ＬＤは、Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉら、１９５５年、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９０：２１０−２１３頁
により記載された方法の変法を用いてアッセイした。ＬＤは、組織生存度を決定するために臨床および基礎研究の双方で共通に用いられるサイトゾル酵素である。培地中ＬＤの増加は、直接細胞死に関連する。
【０１０７】
低血糖により誘導された細胞毒性に対する神経保護
ＡＴＣＣから入手したＣ６膠腫細胞を、ＦＡＬＣＯＮ２５ｃｍ２組織培養フラスコ内で１×１０＜６＞細胞／ｍｌの濃度でＦＢＳと共にＲＰＭＩ培地中で平板培養した。低血糖発症４時間前に、維持培地を廃棄し、単層を適切な媒体中、２回洗浄してから、血清なしまたは血清なしプラス試験化合物中３７℃で４時間温置した。適切なグルコース添加処理前に、該単層を２回洗浄するためにクレブス・リンゲル燐酸緩衝液を使用した。ＲＰＭＩ培地は２ｍｇグルコース／ｍｌを含有し；フラスコは、各々、１００％グルコース（２ｍｇ／ｍｌ），８０％グルコース（１．６ｍｇ／ｍｌ），６０％グルコース（１．２ｍｇ／ｍｌ）または０％グルコース（緩衝液）を受け、または試験化合物で補足される６つの投与群に分けた。全てのフラスコを、２０時間温置してから、全細胞数、生細胞数および死細胞数を、トリパンブルーを利用して評価した。
【０１０８】
興奮毒性アミノ酸に対する神経保護
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞を含有する５つの培養皿を試験化合物で処理し、５つの培養皿をＰＰＭＩ媒体で処理した。４時間後、全ての細胞をＮＭＤＡ（５００ｍｕＭ）で５分間処理した。次いで、全ての生存細胞と死滅細胞を測定した。
【０１０９】
酸素−グルコース欠乏に対する神経保護
アポトーシス測定のための核濃縮症核の分析：  Ｅ１８ラット胎仔から皮質神経細胞を調製し、ポリ−Ｄ−リジン（１０ｎｇ／ｍｌ）と血清で予めコーティングした８ウェルチャンバースライドに、１００，０００細胞／ウェルの密度で塗布する。細胞を、１０％ＦＣＳを含有する高グルコースＤＭＥＭ中で平板培養し、１０％ＣＯ２／９０％空気の３７℃において、インキュベーターに維持する。翌日、Ｂ２７サプリメントを含有する高グルコースＤＭＥＭにより培地を交換することによって血清を除去し、実験日まで、さらなる培地交換をせずに、細胞をインキュベーターに維持する。６日目、スライドを２つの群；対照群とＯＧＤ群に分ける。対照群の細胞は、グルコースを有するＤＭＥＭおよび通例のＢ２７（抗酸化剤なし）を与えられる。ＯＧＤ群の細胞は、真空下で１５分脱気した非グルコースＤＭＥＭを通例のＢ２７と共に与えられる。細胞に、９０％Ｎ２／１０％ＣＯ２を１０分間、気密チャンバー内でフラッシュし、３７℃で６時間温置する。６時間後、対照細胞とＯＧＤ細胞の双方を、通例のＢ２７を有するグルコース含有ＤＭＥＭ中、媒体（ＤＭＳＯ）または試験化合物のいずれかを含有する培地の交換に供する。細胞を、３７℃の酸素正常インキュベーターに戻す。２４時間後、細胞を、４℃で１０分間、４％ＰＦＡ中に固定し、Ｔｏｐｒｏ（蛍光核結合色素）により染色する。Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて、核濃縮症核を測定することにより、アポトーシスを評価する。
【０１１０】
細胞死の指標としてのＬＤＨ放出の測定：  Ｅ１８ラットの皮質神経細胞を調製し、ポリ−Ｄ−リジン（１０ｎｇ／ｍｌ）と血清で予めコーティングした４８ウェル培養プレートに、１５０，０００細胞／ウェルの密度で塗布する。細胞を、１０％ＦＣＳを含有する高グルコースＤＭＥＭ中で平板培養し、１０％ＣＯ２／９０％空気の３７℃において、インキュベーターに温置する。翌日、Ｂ２７サプリメントを含有する高グルコースＤＭＥＭにより培地を交換することによって血清を除去する。６日目、細胞を２つの群、対照群とＯＧＤ群に分ける。対照群の細胞は、グルコースを有するＤＭＥＭおよび通例のＢ２７（抗酸化剤なし）を与えられる。ＯＧＤ群の細胞は、真空下で１５分脱気した非グルコースＤＭＥＭを通例のＢ２７と共に与えられる。細胞に、９０％Ｎ２／１０％ＣＯ２を１０分間、気密チャンバー内でフラッシュし、３７℃で６時間温置する。６時間後、対照細胞とＯＧＤ細胞の双方を、通例のＢ２７を有するグルコース含有ＤＭＥＭ中、媒体（ＤＭＳＯ）または試験化合物のいずれかを含有する培地の交換に供する。細胞を、３７℃の酸素正常インキュベーターに戻す。２４時間後、培地への細胞放出ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を測定することにより、細胞死を評価する。ＬＤＨアッセイのために、５０μｌアリコートの培地を９６ウェルプレートに移す。１４０μｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）および１００μｌの０．２ｍｇ／ｍｌＮＡＤＨの添加後、該プレートを、２０分間、室温で暗所に置く。１０μｌのピルビン酸ナトリウムの添加により、反応が開始する。該プレートを直ちに、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において、３４０ｎＭで読み取る。ＮＡＤＨ濃度の指標である吸光度を、６秒ごとに５分間記録し、ＮＡＤＨ消失の割合を示す勾配を用いて、ＬＤＨ活性を算出する。
【数１】
2007502277.tif 000009
【０１１１】
実施例２２
ＨＬＡラット試験法−クローン病および炎症性腸疾患
オスＨＬＡ−Ｂ２７ラットをＴａｃｏｎｉｃから入手し、食餌（ＰＭＩ  Ｌａｂ食５００１）と水を無制限に与える。試験開始時、ラットは２２〜２６週齢である。
【０１１２】
ラットに、下記の製剤のうちの１つを、１日１回７日間、皮下投与する。各群５匹のラットで、最終投与は、安楽死２時間前に行う。
・  媒体（５０％ＤＭＳＯ／５０％ダルベッコＰＢＳ）
・  １７α−エチニル−１７β−エストラジオール（１０μｇ／ｋｇ）
・  試験化合物
【０１１３】
糞便の質を毎日観察し、以下の尺度により、等級分けする：下痢＝３；軟便＝２；正常便＝１。試験操作の最後に、血清を採取し、−７０℃で保存する。組織学的分析のために、大腸切片を調製し、脊髄過酸化酵素活性に関して追加のセグメントを分析する。
【０１１４】
脊髄過酸化酵素活性を測定するために、以下の方法を用いる。大腸組織を採取し、液体窒素中、瞬間凍結させる。サンプル間の一貫性を保証するため、大腸全体の代表的サンプルを用いる。該組織を使用するまで−８０℃で保存する。次に、該組織の重さを計り（およそ５００ｍｇ）、１：１５ｗ／ｖの５ｍＭ  Ｈ２ＫＰＯ４（ｐＨ６）洗浄緩衝液中で均一化する。該組織を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ５Ｂ遠心分離機において、２〜８℃で４５分間、２０，０００×ｇで回転させる。次いで、上澄み液を捨てる。細胞内ＭＰＯの溶解を助けるために、２．５ｍｌ（１：５ｗ／ｖ）の５０ｍＭ  Ｈ２Ｋｐｏ４中、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％Ｈｅｘ臭化アンモニウムと共に、組織を再懸濁し、均一化する。組織を液体窒素中で凍結し、３７℃の水浴中で解凍し、１５秒間音波処理して、膜溶解を確実にする。この操作を３回繰り返す。次いで、サンプルを氷上に２０分間保持し、２℃〜８℃において１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離する。上澄み液を、以下のステップにより分析する。
【０１１５】
２．９ｍｌの５０ｍＭ  Ｈ２ＫＰＯ４を、０．０００５％のＨ２Ｏ２を有する０．１６７Ｏ−ジアニシジンと共に反応菅に加えることにより、試験混合物を調製する。過酸化水素が分解すると、Ｏ−ジアニシジンは酸化され、濃度依存様式において、４６０ｎｍで吸収する。該混合物を２５℃に加熱する。１００μＬの組織上澄み液を該反応菅に加え、２５℃で１分間温置してから、１ｍｌを使い捨てプラスチックキュベットに移す。４６０ｎｍでのＯＤを、２分間の反応時間ごとに、２．９ｍｌの反応混合物および１００μｌの０．５％臭化アンモニウム溶液を含有するブランクに対して測定する。
【０１１６】
精製ヒトＭＰＯ３１．１単位／バイアルによって作成した標準曲線に対し、４６０における吸光度を比較することにより、酵素活性単位を定量化する。ＭＰＯを再構成し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％Ｈｅｘ臭化アンモニウムと共に、５０ｍＭ  Ｈ２ＫＰＯ４を用いて、４種の既知濃度へ連続希釈する。サンプルの吸光度をこの曲線と比較して、活性を決定する。
【０１１７】
組織学的分析を、以下の通り実施する。大腸組織を、１０％中性緩衝化ホルマリン中に浸漬する。大腸の各検体を、評価のため、４つのサンプルに分離する。ホルマリン固定組織をパラフィン包埋のため、真空浸透プロセサー内で処理する。サンプルを５μｍに切断してから、Ｂｏｕｇｈｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈにより修正された尺度を用いる盲検化組織学的評価のために、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。スコアを記入した後、サンプルの盲検化を解き、データの作表を行い、複数の平均比較によるＡＮＯＶＡ線形モデル化によって解析する。
【０１１８】
本明細書に引用した全ての特許、刊行物、および他の文書は、参照として、それらの全体が本明細書に組み込まれている。
【国際調査報告】
2007502277.tif 000012
2007502277.tif 000013
2007502277.tif 000014
2007502277.tif 000015