(57)【要約】本発明は、造血前駆細胞の標的組織への接着および/または遊走を変化させるための、ならびに造血前駆細胞の二次細胞型への分化を変化させるための方法を提供することにより、当技術分野における必要性を満たす。本発明はまた、試験化合物を、造血前駆細胞の標的組織への接着および/または遊走のレベルを変化させることについて、ならびに造血前駆細胞の二次細胞型への分化を変化させることについて、スクリーニングするための方法を提供する。本発明はさらに、造血前駆細胞を単離するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、造血前駆細胞の標的組織への接着のレベルを変化させるための方法：
a)以下のものを供給する段階：
i)インテグリンα4β1を発現する造血前駆細胞を含む細胞の集団、
ii)骨髄内皮組織ではない標的組織、および
iii)インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドへの特異的結合を変化させる1つまたは複数の作用物質、ならびに
b)該細胞集団の1つまたは複数および該標的組織を該作用物質で、該インテグリンα4β1の該インテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下で処理し、それにより、該造血前駆細胞の該標的組織への接着のレベルを変化させる段階。
【請求項２】
処理段階が、造血前駆細胞の経内皮遊走のレベルを変化させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
処理段階が、造血前駆細胞の二次細胞型への分化のレベルを変化させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
二次細胞型が骨髄内皮細胞ではない、請求項3記載の方法。
【請求項５】
二次細胞型が、間葉細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、免疫細胞、メラニン細胞、筋上皮細胞および胚細胞の1つまたは複数を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
標的組織が、血管内皮、筋肉、ニューロン、腫瘍、炎症性、末梢血、臍帯血、心臓、眼、皮膚、滑液、腫瘍、肺、乳房、前立腺、頸部、膵臓、結腸、卵巣、胃、食道、口腔、舌、歯肉、皮膚、肝臓、気管支、軟骨、睾丸、腎臓、子宮内膜、子宮、膀胱、脾臓、胸腺、甲状腺、脳、ニューロン、胆嚢、眼および関節の組織の1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
組織が損傷している、請求項1記載の方法。
【請求項８】
組織が虚血性である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
標的組織がフィブロネクチンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
標的組織が血管組織を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
処理段階がインビトロである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
処理段階がインビボで哺乳動物対象におけるものである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物対象が、疾患をもっている、疾患をもちやすい、疾患をもつのではないかと疑われる、および疾患をもちやすいのではないかと疑われる対象の1つまたは複数から選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物対象がヒトである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
疾患が血管新生性である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
疾患が血管新生性ではない、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
作用物質が抗体を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
抗体が抗インテグリンα4β1抗体を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
抗体が抗血管細胞接着分子抗体を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
抗体が抗フィブロネクチン抗体を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
リガンドが血管細胞接着分子(VCAM)を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
リガンドがフィブロネクチンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、骨髄内皮組織ではない標的組織への造血前駆細胞の接着のレベルを変化させることについて試験化合物をスクリーニングするための方法：
a)以下のものを供給する段階：
i)インテグリンα4β1を含む第一組成物、
ii)1つまたは複数のインテグリンα4β1リガンドを含む第二組成物、および
iii)試験化合物、
b)該試験化合物を、該第一組成物および該第二組成物の1つまたは複数と、該インテグリンα4β1の該インテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下で接触させる段階、ならびに
c)該試験化合物の非存在下においてと比較して、該試験化合物の存在下における該インテグリンα4β1の該インテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のレベルの変化を検出し、それにより、該試験化合物を、造血前駆細胞の該標的組織への接着のレベルを変化させると同定する段階。
【請求項２４】
試験化合物を、造血前駆細胞の経内皮遊走のレベルを変化させると同定する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
試験化合物を、造血前駆細胞の二次細胞型への分化のレベルを変化させると同定する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
二次細胞型が骨髄内皮細胞ではない、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
二次細胞型が、間葉細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、免疫細胞、メラニン細胞、筋上皮細胞および胚細胞の1つまたは複数を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
標的組織が、血管内皮、筋肉、ニューロン、腫瘍、炎症性、末梢血、臍帯血、心臓、眼、皮膚、滑液、腫瘍、肺、乳房、前立腺、頸部、膵臓、結腸、卵巣、胃、食道、口腔、舌、歯肉、皮膚、肝臓、気管支、軟骨、睾丸、腎臓、子宮内膜、子宮、膀胱、脾臓、胸腺、甲状腺、脳、ニューロン、胆嚢、眼および関節の組織の1つまたは複数を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
接触段階がインビトロである、請求項23記載の方法。
【請求項３０】
接触段階がインビボで非ヒト哺乳動物におけるものである、請求項23記載の方法。
【請求項３１】
以下の段階を含む、造血前駆細胞を組織から単離するための方法：
a)以下のものを供給する段階：
i)造血前駆細胞を含む組織、および
ii)インテグリンα4β1へ特異的に結合する抗体、
b)該組織を該抗体で、該抗体が該インテグリンα4β1へ特異的に結合するような条件下で処理する段階、ならびに
c)該抗体に結合するインテグリンα4β1を単離し、それにより、該造血前駆細胞を単離する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、造血前駆細胞(造血幹細胞および内皮前駆細胞のような)の標的組織への接着および/または遊走を変化させるための、ならびに造血前駆細胞の二次細胞への分化を変化させるための方法に関する。本発明はまた、造血前駆細胞の標的組織への接着および/または遊走のレベルを変化させることについて、ならびに造血前駆細胞の二次細胞への分化を変化させることについて、試験化合物をスクリーニングするための方法に関する。本発明はさらに、造血前駆細胞を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、2003年9月29日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第60/507,202号の優先権を主張し、その内容は、全体として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本発明は、National Cancer Institute of the National Institutes of Healthにより与えられた助成金番号CA71619およびCA83133における政府支援によって部分的になされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
発明の背景
造血前駆細胞(骨髄由来CD34+幹細胞のような)は、病変および損傷組織の修復を促進し、遺伝性および後天性ヒト疾患の処置の見込みを与える(Asahara et al. (1997) Science 275, 964-967; Rafii et al. (2003) Nat. Med. 9, 702-12; Takahashi et al., (1999) Nat. Med. 5, 434-438; Kawamoto et al. (2001) Circulation 103, 634-637; Hattori et al. (2001) J. Exp. Med. 193, 1005-1014; Otani et al. (2002) Nat. Med. 8, 1004-1010 (2002); Priller et al. (2001) J. Cell Biol. 155, 733-738; LaBarge et al. (2002) Cell. 111, 589-601;およびTorrente et al. (2003) J. Cell Biol. 162, 511-520)。例えば、骨髄由来CD34+幹細胞は、内皮細胞へ分化することにより新血管形成を促進する(Asahara et al. (1997)前記; Rafii et al. (2003) Nat. Med. 9, 702-12; Takahashi et al. (1999) Nat. Med. 5, 434-438; Kawamoto et al. (2001) Circulation 103, 634-637; Hattori et al. (2001) J. Exp. Med. 193, 1005-1014; Otani et al. (2002) Nat. Med. 8, 1004-1010 (2002); Priller et al. (2001) J. Cell Biol. 155, 733-738; LaBarge et al. (2002) Cell. 111, 589-601; Torrente et al. (2003) J. Cell Biol. 162, 511-520; Lyden et al. (2001) Nat. Med. 7, 1194-201; Ruzinova et al. (2003) Cancer Cell. 4:277-289; Jain et al. (2003) Cancer Cell 3, 515-516; Religa et al. (2002) Transplantation 74, 1310-1315;およびBoehm et al. (2004) J. Clin. Invest. 114, 419-426)。新血管形成は、損傷組織の治癒を刺激し(Asahara et al. (1997) 前記; Rafii et al. (2003) Nat. Med. 9, 702-12; Takahashi et al. (1999) Nat. Med. 5, 434-438; Kawamoto et al. (2001) Circulation 103, 634-637; Hattori et al. (2001) J. Exp. Med. 193, 1005-1014; Otani et al. (2002) Nat. Med. 8, 1004-1010 (2002);およびCarmeliet (2003) Nat. Med. 9, 653-660)、とはいえ、それはまた、腫瘍増殖および炎症性疾患のような望ましくない結果を促進する(Lyden et al. (2001) Nat. Med. 7, 1194-201; Ruzinova et al. (2003) Cancer Cell. 4:277-289; Jain et al. (2003) Cancer Cell 3, 515-516; Carmeliet (2003) Nat. Med. 9, 653-660;およびHanahan et al. (1996) Cell 86, 353-364)。
【０００５】
その技術は、造血前駆細胞を用いることの利点の一部を認識しているが、どのようにして、造血前駆細胞の接着、分化および遊走が調節されうるかは、はっきりしないままである。従って、造血前駆細胞の標的組織への接着および/または遊走を変化させるための、ならびに造血前駆細胞の二次細胞への分化を変化させるための方法の必要性が残されている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、造血前駆細胞(HPC)の標的組織への接着および/または遊走を変化させるための、ならびに造血前駆細胞の二次細胞への分化を変化させるための方法を提供することにより当技術分野における必要性を満たす。本発明はまた、造血前駆細胞の標的組織への接着および/または遊走のレベルを変化させることについて、ならびに造血前駆細胞の二次細胞への分化を変化させることについて、試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。本発明はさらに、造血前駆細胞を単離するための方法を提供する。
【０００７】
特に好ましい態様において、本発明は、以下の段階を含む、造血前駆細胞の標的組織への接着のレベルを変化させるための方法を提供する：a)i)インテグリンα4β1を発現する造血前駆細胞を含む細胞集団、ii)骨髄内皮組織ではない標的組織、およびiii)インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドへの特異的結合を変化させる1つまたは複数の作用物質、を供給する段階、ならびにb)1つまたは複数の細胞集団および標的組織を、インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下において作用物質で処理する段階。一つの態様において、処理段階はさらに、造血前駆細胞の経内皮遊走のレベルを変化させることを含む。もう一つの態様において、処理段階はさらに、隣接した正常組織および/または他の正常器官と比較した場合のような、造血前駆細胞の二次細胞への分化のレベルを変化させることを含む(例えば、実施例22〜23、および図36a〜b)。もう一つの態様において、処理段階は、標的組織において血管形成のレベルを変化させることを含まない。
【０００８】
HPCの型または源を限定することを意図しないが、一つの態様において、HPCは、遺伝子組換えまたは野生型でありうる。もう一つの態様において、HPCは、CD34+非内皮細胞および/または内皮へ分化することができるCD34+CD133+細胞を含む(図34a)。さらなる態様において、HPCは、任意の組織(肺組織、乳房組織、前立腺組織、頸部組織、膵臓組織、結腸組織、卵巣組織、胃組織、食道組織、口腔組織、舌組織、歯肉組織、皮膚組織、筋肉組織、心臓組織、肝臓組織、気管支組織、軟骨組織、骨組織、睾丸組織、腎臓組織、子宮内膜組織、子宮組織、膀胱組織、骨髄組織、リンパ腫組織、脾臓組織、胸腺組織、甲状腺組織、脳組織、ニューロン組織、胆嚢組織、眼組織(例えば、角膜、ブドウ膜、脈絡膜、黄斑、硝子体液など)、および関節組織(例えば、滑膜組織など))に含まれる造血幹細胞、内皮前駆細胞、リンパ内皮前駆細胞、間葉前駆細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、顆粒球前駆細胞、マクロファージ前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、プロB細胞およびプロT細胞、骨髄前駆細胞、末梢血前駆細胞、臍帯前駆細胞、CD34+前駆細胞の1つまたは複数を含む。一つの態様において、骨髄前駆細胞は、CD31+細胞(実施例24、図36e〜f)、cKit+細胞、VEGFR1+細胞、VEGFR2+細胞およびCD34+細胞の1つまたは複数を含む。
【０００９】
本発明は、標的組織の型または源に限定されることを意図しない。とはいえ、一つの態様において、標的組織は、血管内皮、筋肉、ニューロン、腫瘍、炎症性、末梢血、臍帯血、心臓、眼、皮膚、滑液、腫瘍、肺、乳房、前立腺、頸部、膵臓、結腸、卵巣、胃、食道、口腔、舌、歯肉、皮膚、肝臓、気管支、軟骨、睾丸、腎臓、子宮内膜、子宮、膀胱、脾臓、胸腺、甲状腺、脳、ニューロン、胆嚢、眼および関節の組織の1つまたは複数を含む。好ましい態様において、組織は、損傷性、虚血性および/または悪性(転移性悪性腫瘍組織のような)である。もう一つの態様において、標的組織は、フィブロネクチンおよび血管組織の1つまたは複数を含む。好ましい態様において、血管組織は、内皮細胞、周皮細胞、血管平滑筋、血管新生性組織、および血管新生性ではない組織のような1つまたは複数の細胞型を含む。
【００１０】
本発明は、HPCが分化する二次細胞の源または型に限定されることを意図しない。一つの態様において、二次細胞型は、非限定的に、線維芽細胞、筋線維芽細胞、ストローマ細胞、周皮細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞の1つまたは複数のような、間葉細胞前駆体および/または間葉細胞を含む。もう一つの態様において、二次細胞型は、表皮細胞、分泌細胞、有毛細胞、角膜細胞、肝細胞、肺胞細胞、肺細胞、皮膚細胞、腸細胞、および腎臓細胞の1つまたは複数のような上皮細胞を含む。好ましい態様において、分泌細胞は、乳房上皮細胞、腸細胞および脂腺上皮細胞の1つまたは複数から選択され、有毛細胞は、耳有毛細胞および皮膚有毛細胞の1つまたは複数から選択される。さらなる態様において、二次細胞型は、非限定的に、骨格筋の筋細胞、心臓の筋細胞、血管平滑筋細胞、心内膜細胞、および心筋細胞の1つまたは複数のような筋肉細胞前駆体および/または筋肉細胞を含む。さらにもう一つの態様において、二次細胞型は、非限定的に、星状細胞、シュワン細胞、プルキンエ細胞、樹状細胞およびグリア細胞の1つまたは複数のような神経細胞前駆体および/または神経細胞を含む。もう一つの態様において、二次細胞型は、Bリンパ球細胞、Tリンパ球細胞、単球/マクロファージ細胞、顆粒球細胞、好酸球細胞、好中球細胞、ナチュラルキラー細胞、および巨核球細胞の1つまたは複数のような免疫細胞前駆体および/または免疫細胞を含み、単球細胞は、限定されるわけではないが、マクロファージ細胞、破骨細胞および骨芽細胞の1つまたは複数として例示される。さらにもう一つの態様において、二次細胞型は、腺組織に見出されるもののような、胚細胞前駆体、胚細胞、メラニン細胞前駆体、メラニン細胞、筋上皮細胞前駆体および/または筋上皮細胞を含む。
【００１１】
本発明は、HPCおよび標的組織の作用物質での処理の位置に限定されない。一つの態様において、処理段階は、インビトロ(実施例19、20)、エクスビボ、および哺乳動物対象におけるインビボ(実施例21)でありうる。好ましい態様において、哺乳動物対象は、疾患をもっている、疾患をもちやすい、疾患をもつのではないかと疑われる、および疾患をもちやすいのではないかと疑われる対象の1つまたは複数から選択される。より具体的には、処理段階は、疾患の1つまたは複数の症状の顕現の前、中、および後の1つまたは複数から選択される。一つの好ましい態様において、哺乳動物対象はヒトである。
【００１２】
一つの態様において、疾患は、非限定的に、新生物、糖尿病性網膜症、新血管形成に関連した黄斑変性症、乾癬血管腫、歯肉炎、関節リウマチ、変形性関節症、炎症、および炎症性腸疾患の1つまたは複数のような血管新生性である。対象において標的組織を限定することを意図しないが、一つの態様において、組織は、眼組織、皮膚組織、骨組織、および滑膜組織の1つまたは複数を含み、眼組織は、網膜、黄斑、角膜、脈絡膜および硝子体液により例示される。もう一つの態様において、組織は悪性腫瘍、およびより好ましくは転移性悪性腫瘍のような腫瘍を含む。
【００１３】
もう一つの態様において、疾患は血管新生性ではない。いくつかの態様において、限定されるわけではないが、線維症(造血前駆細胞は、肺、肝臓、心臓、皮膚および/または角膜細胞の例示的な組織において、線維芽細胞または他の細胞へ分化する)、アテローム性動脈硬化症(造血前駆細胞は、例示的なマクロファージ/単球、血管平滑筋細胞、および/または血管壁における内皮細胞へ分化する)、再狭窄(造血前駆細胞は、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージ、好酸球、顆粒球のような免疫細胞および/または血管壁における他の免疫細胞へ分化する)、関節リウマチのような慢性炎症性疾患(造血前駆細胞は、内皮細胞、周皮細胞および/または軟骨を消化する滑膜細胞、血管新生性および炎症性因子を分泌する単球/マクロファージへ分化する)、喘息(造血前駆細胞は、好酸球およびそれらの免疫細胞、内皮細胞、周皮細胞、ならびに/または線維芽細胞へ分化する)、転移性かどうかにかかわらない癌(造血前駆細胞は、悪性細胞、および/または線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞のようなストローマ細胞、および/または単球などへ分化する)、心筋梗塞(造血前駆細胞は、造血幹細胞から生じる炎症性細胞および/または造血幹細胞から生じる線維芽細胞へ分化する)、および出血性卒中(脳)、急性呼吸器疾患、心筋梗塞、末梢動脈障害(造血幹細胞から生じる炎症性細胞を抑制する)のような虚血性疾患により例示される疾患におけるような非血管新生性疾患における標的組織へのHPCの接着を低減させることが望ましい可能性がある。
【００１４】
もう一つの態様において、骨髄移植を受けた対象および骨髄移植を受けるだろう対象におけるような非血管新生性疾患においてHPCの標的組織への接着を増加させることが望ましくあり得、処理段階は、骨髄移植の前、中および後の1つまたは複数から選択される。もう一つの態様において、哺乳動物対象は、造血前駆細胞移植を受けた対象および造血前駆細胞移植を受けるだろう対象から選択され、処理段階は、造血前駆細胞移植の前、中、および後の1つまたは複数から選択される。なおさらなる態様において、哺乳動物対象は、組織に創傷を有するおよび/または発生しやすい(限定されるわけではないが、やけど、皮膚創傷、美容整形外科および内部外科を含む任意の組織および器官への外科創傷、傷跡置換、心筋梗塞(本発明は、血管の増大、再生による上皮組織修復および心筋細胞発生を刺激することにより組織を修復するために有用である)、切断された神経(例えば、神経細胞および任意の型の内皮細胞を含む)、損傷した脳(例えば、神経細胞および内皮細胞を含む)、損傷した筋肉(例えば、筋細胞および内皮細胞を含む)、筋ジストロフィー-デュシェンヌ型および骨格筋細胞を含む他の疾患、末梢動脈虚血性障害(PAD)(本発明は、造血前駆細胞によるホーミング、接着、ならびに、筋肉細胞、神経細胞、内皮細胞、周皮細胞および/または血管平滑筋への造血前駆細胞の分化を刺激するために有用である)、卒中(本発明は、造血前駆細胞によるホーミング、接着、ならびに、神経細胞および/または血管細胞への造血前駆細胞の分化を刺激するために有用である)、パーキンソン病(本発明は、造血前駆細胞によるホーミング、接着、およびセロトニンを産生する細胞への造血前駆細胞の分化を刺激するために有用である)においてのような先天的に損傷した筋肉を含むすべての型の創傷治癒)。もう一つの態様において、哺乳動物対象は、糖尿病をもっている、および/または糖尿病を発症しやすい(本発明は、造血前駆細胞によるホーミング、接着、およびインスリンの供給源である膵島細胞への造血前駆細胞の分化を刺激するために有用である)。さらなる態様において、哺乳動物対象は、AIDSをもっている、および/または発症しやすい(本発明は、造血前駆細胞によるホーミング、接着、および組織のT細胞再増殖を刺激しうる造血前駆細胞のT細胞への分化を刺激するために有用である)。もう一つの態様において、哺乳動物対象は、癌をもっている、および/または発症しやすい(本発明は、造血前駆細胞によるホーミング、接着、およびT細胞およびナチュラルキラー細胞のような抗癌の免疫細胞への造血前駆細胞の分化を刺激するために有用である)。
【００１５】
本発明は、HPCの標的組織への接着および/または遊走を変化させる、ならびにHPCの二次細胞型への分化を変化させる、作用物質の特定の型または源に限定されることを意図しない。一つの態様において、作用物質は、限定されるわけではないが、抗インテグリンα4β1抗体(例えば、実施例19〜21、図34b、d〜e、および35b〜d)を含む抗体により例示される抗体のような、ペプチドを含む。一つの態様において、抗インテグリンα4β1抗体の結合の特異性は、抗β2インテグリン抗体(実施例24)、cIgG抗体(実施例24)、抗αvβ5(P1F6)、およびα5β1(P1F6)(図17〜20および34)および抗αvβ3(LM609)(図20)のような対照抗体と比較されうる。もう一つの態様において、作用物質は、抗血管細胞接着分子抗体および抗フィブロネクチン抗体の1つまたは複数を含む。もう一つの態様において、作用物質は非限定的に、インテグリンα4β1アンチセンス配列、血管細胞接着分子アンチセンス配列、およびフィブロネクチンアンチセンス配列の1つまたは複数を含むアンチセンス配列のようなアンチセンス配列を含む。さらにもう一つの態様において、作用物質は非限定的に、インテグリンα4β1リボザイム、血管細胞接着分子リボザイム、およびフィブロネクチンリボザイムを含むリボザイムのようなリボザイムを含む。本発明は、作用物質の作用機構に限定されないが、一つの態様において、作用物質は、a)HPC上でのα4β1の発現を誘導すること、b)インテグリンα4β1の、そのリガンドの1つもしくは複数への特異的結合のレベルを増加させることによるようなHPC上のα4β1を活性化すること、およびc)1つもしくは複数のα4β1リガンドの発現を1つもしくは複数の細胞型により誘導すること、の1つまたは複数により機能しうる。
【００１６】
本発明は、インテグリンα4β1リガンドの何か特定の型または源に限定されることもまた、意図されない。一つの好ましい態様において、リガンドは、血管細胞接着分子(VCAM)およびフィブロネクチンの1つまたは複数を含む。
【００１７】
本発明は、以下の段階を含む、造血前駆細胞の標的組織への経内皮遊走のレベルを変化させるための方法を提供する：a)i)インテグリンα4β1を発現する造血前駆細胞を含む細胞集団、ii)骨髄内皮組織ではない標的組織、およびiii)インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドへの特異的結合を変化させる1つまたは複数の作用物質、を供給する段階、ならびにb)細胞集団および標的組織の1つまたは複数を、インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下において作用物質で処理し、それにより、造血前駆細胞の標的組織への経内皮遊走のレベルを変化させる段階。一つの態様において、処理段階は、造血前駆細胞が遊走する組織において血管新生のレベルを変化させることを含まない。
【００１８】
さらに、以下の段階を含む、骨髄内皮細胞ではない二次細胞型への造血前駆細胞の分化のレベルを変化させるための方法が本明細書に提供される：a)i)インテグリンα4β1を発現する造血前駆細胞を含む細胞集団、およびii)インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドへの特異的結合を変化させる1つまたは複数の作用物質、を供給する段階、ならびにb)細胞集団を、インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下において作用物質で処理し、それにより、造血前駆細胞の二次細胞型への分化のレベルを変化させる段階。一つの態様において、処理段階は、造血前駆細胞が分化する組織において血管新生のレベルを変化させることを含まない。
【００１９】
本発明はまた、以下の段階を含む、骨髄内皮組織ではない標的組織への造血前駆細胞の接着のレベルを変化させることについて試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する：a)i)インテグリンα4β1を含む第一組成物、ii)1つまたは複数のインテグリンα4β1リガンドを含む第二組成物、およびiii)試験化合物、を供給する段階、b)試験化合物を第一組成物および第二組成物の1つまたは複数と、インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下において接触させる段階、ならびにc)試験化合物の非存在下においてと比較して、試験化合物の存在下におけるインテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のレベルの変化を検出し、それにより、造血前駆細胞の標的組織への接着のレベルを変化させると試験化合物を同定する段階。一つの態様において、方法はさらに、造血前駆細胞の遊走の、および造血前駆細胞の二次細胞型への分化の1つまたは複数のレベルを変化させると試験化合物を同定する段階を含む。遊走および分化のレベルにおける変化は、対照隣接正常組織と、または他の正常器官と比較されうる(例えば、実施例22、実施例23、図36a〜bに例示されているようなHPC分化の阻害など)。接触段階は、何か特定の位置に限定されないが、インビトロ(実施例19、20)、エクスビボ、および非ヒト哺乳動物におけるインビボ(実施例21)でありうる。
【００２０】
本発明はさらに、以下の段階を含む、骨髄内皮組織ではない標的組織への造血前駆細胞の経内皮遊走のレベルを変化させることについて試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する：a)i)インテグリンα4β1を含む第一組成物、ii)1つまたは複数のインテグリンα4β1リガンドを含む第二組成物、およびiii)試験化合物、を供給する段階、b)試験化合物を第一組成物および第二組成物の1つまたは複数と、インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下において接触させる段階、ならびにc)試験化合物の非存在下においてと比較して、試験化合物の存在下におけるインテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のレベルの変化を検出し、それにより、造血前駆細胞の組織への経内皮遊走のレベルを変化させると試験化合物を同定する段階。
【００２１】
また、本発明により、以下の段階を含む、骨髄内皮組織ではない二次細胞型への造血前駆細胞の分化のレベルを変化させることについて試験化合物をスクリーニングするための方法が提供される：a)i)インテグリンα4β1を含む第一組成物、ii)1つまたは複数のインテグリンα4β1リガンドを含む第二組成物、およびiii)試験化合物、を供給する段階、b)試験化合物を第一組成物および第二組成物の1つまたは複数と、インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下において接触させる段階、ならびにc)試験化合物の非存在下においてと比較して、試験化合物の存在下におけるインテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のレベルの変化を検出し、それにより、造血前駆細胞の二次細胞型への分化のレベルを変化させると試験化合物を同定する段階。
【００２２】
本発明はさらに、以下の段階を含む、組織から造血前駆細胞を単離するための方法を提供する：a)i)造血前駆細胞を含む組織、ii)インテグリンα4β1ポリペプチドに特異的に結合する抗体、を供給する段階、b)抗体が造血前駆細胞に結合するような条件下において組織を作用物質で処理する段階、および抗体に結合する造血前駆細胞を単離する段階。
【００２３】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００２４】
本明細書および添付された特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、内容が明らかに別なふうに指図しない限り、単数および複数の言及の両方を含む。
【００２５】
本明細書に用いられる場合、語句「AまたはB」において用いられ、AおよびBが組成物、疾患、生成物などを指す時の用語「または」は、一方、または他方、または両方を意味する。
【００２６】
第一の物の第二の物に対する位置に関する場合の用語「の上に(on)」は、例えば、第一の物が、最初に第二の物の上に置かれた後、第二の物へ浸透する場合を含む、第一の物が、第二の物の上に、および/または、の中にあることを意味する。
【００２７】
本明細書に用いられる場合、方法における段階の列挙の前に置かれる場合の用語「を含む」は、方法が、明確に列挙されたものの追加である1つまたは複数の段階を含むこと、および追加の1つまたは複数の段階が、列挙された段階の前、間、および/または後に行われうることを意味する。例えば、段階a、bおよびcを含む方法は、段階a、b、xおよびcの方法、ならびに段階a、b、cおよびxの方法、加えて、段階x、a、bおよびcの方法を含む。さらになお、方法における段階の列挙の前に置かれる場合の用語「を含む」は、内容が明らかに別なふうに指図しない限り、列挙された段階の逐次的実施を必要としない(必要とする場合もあるが)。例えば、段階a、bおよびcを含む方法は、例えば、段階a、cおよびbの順、段階c、bおよびaの順、ならびに段階c、aおよびbの順などで段階を実施する方法を含む。
【００２８】
他に規定がない限り、本明細書および特許請求の範囲に用いられる場合、成分の量、分子量のような性質、反応条件などを表すすべての数は、すべての例において用語「約」により修飾されるとして理解されるべきである。従って、それとは反対に規定されない限り、本明細書および特許請求の範囲における数値パラメーターは、本発明により得られるように求められる所望の性質に依存して変動しうる近似値である。最低限でも、かつ特許請求の範囲の範囲への等価の原則の適用を制限することなく、各数値パラメーターは、報告された有効数字の、および通常の丸め技法を適用することによる数を考慮して、少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例における数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は、本質的に、数値の試験測定に見出される誤差に必然的に起因する標準偏差を含む。
【００２９】
何か特に指定された分子(タンパク質、ヌクレオチド配列などのような)または現象(細胞接着、細胞遊走、細胞分化、血管新生、生物活性、生化学活性などのような)の前に置かれ、かつそれに関して述べられる場合の用語「ではない(not)」は、特に指定された分子または現象のみが除外されることを意味する。
【００３０】
任意の分子(タンパク質、ヌクレオチド配列などのような)または現象(細胞接着、細胞遊走、細胞分化、血管新生、生物活性、生化学活性などのような)のレベルに関して本明細書に用いられる場合、用語「変化させること」および文法的相当語句は、量が客観的におよび/または主観的に測定されるかどうかにかかわらず、物質および/もしくは現象の量における増加ならびに/または減少を指す。
【００３１】
第二試料に対する第一試料における、分子(タンパク質、ヌクレオチド配列などのような)または現象(細胞接着、細胞遊走、細胞分化、血管新生、生物活性、生化学活性などのような)のレベルに関する場合の用語「増加させる」、「上昇させる」、「上げる」および文法的相当語句は、第一試料における物質および/または現象の量が、第二試料においてより、スチューデントt検定のような任意の技術分野容認の統計学的解析方法を用いて統計学的に有意である任意の量だけ高いことを意味する。一つの態様において、増加は、例えば、患者が、痛み、視覚の明瞭さなどのような疾患症状の彼らの主観的認知に言及する場合、主観的に測定されうる。もう一つの態様において、第一試料における物質および/または現象の量は、第二試料における同じ物質および/または現象の量より、少なくとも10%多い、好ましくは少なくとも25%多い、より好ましくは少なくとも50%多い、さらにより好ましくは少なくとも75%多い、および最も好ましくは少なくとも90%多い。
【００３２】
第二試料に対して第一試料における分子(タンパク質、ヌクレオチド配列などのような)または現象(細胞接着、細胞遊走、細胞分化、血管新生、生物活性、生化学活性などのような)のレベルに関する場合の用語「低下させる」、「阻害する」、「減らす」、「抑制する」、「減少させる」および文法的相当語句は、第一試料における物質および/または現象の量が、第二試料においてより、任意の技術分野容認の統計学的解析方法を用いて統計学的に有意である任意の量だけ低いことを意味する。一つの態様において、低下は、例えば、患者が、痛み、視覚の明瞭さなどのような疾患症状の彼らの主観的認知に言及する場合、主観的に測定されうる。もう一つの態様において、第一試料における物質および/または現象の量は、第二試料における同じ物質および/または現象の量より、少なくとも10%少ない、好ましくは少なくとも25%少ない、より好ましくは少なくとも50%少ない、さらにより好ましくは少なくとも75%少ない、および最も好ましくは少なくとも90%少ない。分子および/または現象のレベルの低下は、分子および/または現象の絶対的欠如を意味する場合もあるが、その必要性はない。
【００３３】
何か具体的に指定されたタンパク質(「インテグリンα4β1」、「血管細胞接着分子」、フィブロネクチンなどのような)への本明細書での言及は、具体的に指定されたタンパク質の生物活性(本明細書に開示されたおよび/または当技術分野において公知のもののような)の少なくとも1つを有するポリペプチドを指し、生物活性は任意の方法により検出できる。好ましい態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、具体的に指定されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも95%相同性(すなわち、同一性)をもつ。何か具体的に指定されたタンパク質(「インテグリンα4β1」、「血管細胞接着分子」、フィブロネクチンなどのような)への本明細書での言及はまた、具体的に指定されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも95%相同性を有する、具体的に指定されたタンパク質の断片、融合タンパク質、および変異体をその範囲内に含む。
【００３４】
タンパク質に関する場合の用語「断片」は、サイズが4個の連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス1個のアミノ酸残基までの範囲でありうるそのタンパク質の部分を指す。従って、「アミノ酸配列の少なくとも一部」を含むポリペプチド配列は、アミノ酸配列の4個の連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列までを含む。
【００３５】
本明細書に用いられる場合、タンパク質の用語「変異体」とは、そのタンパク質と、1個もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、および/または保存的置換により異なるアミノ酸配列と定義される。アミノ酸の用語「保存的置換」は、そのアミノ酸の、類似した疎水性、極性および/または構造をもつもう一つのアミノ酸との置換を指す。例えば、中性側鎖を有する以下の脂肪族アミノ酸は、一つを他のものの代わりに保存的に用いられうる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニン。一つを他のものの代わりに保存的に用いられうる、中性側鎖を有する芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む。システインおよびメチオニンは、一つを他のものの代わりに保存的に用いられうるイオウ含有アミノ酸である。また、アスパラギンは、グルタミンの代わりに保存的に用いられ得、逆もまた同じであるが、両方のアミノ酸は、ジカルボン酸のアミノ酸のアミドであるからである。さらに、アスパラギン酸は、グルタミン酸の代わりに保存的に用いられうるが、両方とも酸性の荷電(親水性)アミノ酸であるからである。また、リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、一つを他のものの代わりに保存的に用いられうるが、それぞれは、塩基性の荷電(親水性)アミノ酸であるからである。どのアミノ酸残基が、およびいくつのアミノ酸残基が、生物学的および/または免疫学的活性を消失させることなく、置換、挿入または欠失されうるかを決定するにおける手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えばDNAStar(商標)ソフトウェアを用いて見出されうる。一つの態様において、変異体の配列は、問題のタンパク質の配列と、少なくとも95%同一性、好ましくは少なくとも90%同一性、より好ましくは少なくとも85%同一性、さらにより好ましくは少なくとも75%同一性、よりいっそう好ましくは少なくとも70%同一性、およびまたより好ましくは少なくとも65%同一性を有する。
【００３６】
何か具体的に指定されたヌクレオチド配列(インテグリンα4β1をコードする配列などのような)への本明細書での言及は、具体的に指定されたヌクレオチド配列の断片、相同体、ならびに具体的に指定されたヌクレオチド配列に高いおよび/または中位のストリンジェント性の条件下でハイブリダイズし、かつ具体的に指定されたヌクレオチド配列の生物活性(本明細書に開示された、および/または当技術分野において公知のもののような)の少なくとも1つをもつ配列をその範囲内に含み、生物活性は任意の方法により検出できる。
【００３７】
ヌクレオチド「断片」は、サイズが例示的に10個、20個、50個、100個の連続したヌクレオチド残基から全核酸配列マイナス1個の核酸残基までの範囲でありうる。従って、ヌクレオチド配列の「少なくとも一部」を含む核酸配列は、ヌクレオチド配列の10個の連続したヌクレオチド残基から全ヌクレオチド配列までを含む。
【００３８】
具体的に指定されたヌクレオチド配列の用語「相同体」は、問題のヌクレオチド配列の配列と、少なくとも95%同一性、より好ましくは少なくとも90%同一性、さらにより好ましくは少なくとも85%同一性、さらにより好ましくは少なくとも80%同一性、またより好ましくは少なくとも75%同一性、さらにより好ましくは少なくとも70%同一性、および最も好ましくは少なくとも65%同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を指す。
【００３９】
具体的に指定されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列に関して、高ストリンジェント性条件は、約100〜約1000ヌクレオチド長のプローブが用いられる場合、5X SSPE、1%SDS、5X デンハルト試薬および100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中の68℃での特異的結合またはハイブリダイゼーション、続いて、0.1X SSPEおよび0.1% SDSを含む溶液中の68℃での洗浄と等価である条件を含む。核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「中位のストリンジェント性条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブが用いられる場合、5X SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4-H2Oおよび1.85 g/l EDTA、NaOHで7.4に調整されたpH)、0.5%SDS、5X デンハルト試薬および100μg/ml変性サケ精子DNAの溶液中の42℃での結合またはハイブリダイゼーション、続いて、1.0X SSPE、1.0% SDSを含む溶液中の42℃での洗浄と等価である条件を含む。
【００４０】
それが対象となるハイブリダイゼーション条件に関連する場合のハイブリダイゼーション条件に関して述べられる時の用語「等価の」とは、ハイブリダイゼーション条件および対象となるハイブリダイゼーション条件が、結果として、同じ範囲のパーセント(%)相同性をもつ核酸配列のハイブリダイゼーションを生じることを意味する。例えば、対象となるハイブリダイゼーション条件が結果として、第一核酸配列の、第一核酸配列と85%から95%までの相同性をもつ他の核酸配列とのハイブリダイゼーションを生じる場合には、もう一つのハイブリダイゼーション条件は、この他方のハイブリダイゼーション条件もまた、第一核酸配列の、第一核酸配列と85%から95%までの相同性をもつ他の核酸配列とのハイブリダイゼーションを生じるならば、対象となるハイブリダイゼーション条件と等価であると言われる。
【００４１】
当業者に理解されるように、天然に存在しないコドンを有する、対象タンパク質をコードするヌクレオチド配列を作成することが有利なことがある。それゆえに、いくつかの好ましい態様において、特定の原核生物または真核生物の宿主により好まれるコドン(Murray et al., Nucl. Acids Res., 17(1989))が、例えば、天然に存在する配列から産生される転写産物より、発現率を増加させるように、またはより長い半減期のような望ましい性質を有する組換えRNA転写産物を産生するように、選択される。
【００４２】
物体(細胞などのような)および/または化学物質(アミノ酸、アミノ酸配列、核酸、核酸配列、コドンなどのような)に適用される時、本明細書に用いられる場合の用語「天然に存在する」とは、物体および/または化合物が天然に見出されうることを意味する。例えば、天然に存在するポリペプチド配列は、天然における源から単離されうる生物体(ウイルスを含む)に存在するポリペプチド配列を指し、このポリペプチド配列は、実験室において人間により故意に改変されていない。
【００４３】
「特定の核酸配列を含む」ヌクレオチド配列および「特定のアミノ酸配列を含む」タンパク質という用語ならびにこれらの用語の相当語句は、それぞれ、特に指定された核酸配列および特に指定されたアミノ酸配列を含む、対象となる任意のヌクレオチド配列、および対象となる任意のタンパク質を指す。本発明は、対象となるヌクレオチド配列および/もしくは対象となるタンパク質の、源(例えば、細胞型、組織、動物など)、性質(例えば、合成、組換え、細胞抽出物から精製されたなど)、ならびに/または配列へ制限しない。一つの態様において、対象となるヌクレオチド配列および対象となるタンパク質は、構造遺伝子(例えば、プローブ遺伝子、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、発癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、成長因子など)のコード配列を含む。
【００４４】
用語「A、BおよびCから選択された」とは、A、BおよびCの1つまたは複数を選択することを意味する。
【００４５】
本明細書に用いられる場合、「特定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」は、読み上げられたポリヌクレオチド配列を含む任意の組成物を広く指す。組成物は、例えば、塩(例えば、NaCl)、界面活性剤(例えば、SDS)、および他の成分(例えば、デンハルト液、ドライミルク、サケ精子DNAなど)を含む水溶液を含みうる。
【００４６】
用語「造血前駆細胞」および「HPC」は、コミットメントされていない(すなわち、未分化の)および/または部分的にコミットメントされた(すなわち、部分的に分化した)細胞を指す。造血前駆細胞はオリゴ分化性（oligopotent）である、すなわち、それらは、非限定的に、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、および単球(例えば、単球、マクロファージ)を含む1つより多い細胞型へ分化する能力をもつ。
【００４７】
造血前駆細胞は、必ずではないが、通常は骨髄に存在する。それらはまた血液循環にも見出され、他の組織内にも存在する。造血前駆細胞は、表面マーカーにより同定される。例えば、ヒト前駆細胞は、表面マーカーCD34(CD34+細胞)により同定される。例えば、血液における循環細胞の0.1%はCD34+であり、骨髄細胞の2.1%はCD34+である。組織に存在する造血幹細胞もまた、CD34+であることが見出された。骨髄由来(すなわち、骨髄から、または循環から単離された)および組織由来CD34+細胞は、筋肉、神経組織、上皮組織、血管細胞、免疫細胞などへ分化することができ、標的組織を再増殖するために用いられうる。造血前駆細胞は、インビボで、損傷したおよび疾患組織を再増殖し、組織修復過程および病理に自発的に参加するように治療的に用いられた(Belicci et al., (2004) J. Neurosci Res. 77, 475-86; Otani et al., 2002, Nature Med. 8, 1004-1010; Otani et al., (2004) J. Clin. Invest. 114, 765-774; Tamaki et al., (2002) J. Cell Biol. 157, 571-577; Torrente et al., (2004) J. Clin. Invest. 114, 182-195; Hashimoto et al., (2004) J. Clin. Invest. 113, 243-252)。
【００４８】
用語「造血前駆細胞」は、明確には、造血幹細胞、内皮前駆細胞、リンパ内皮前駆細胞、間葉前駆細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、顆粒球前駆細胞、マクロファージ前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、プロB細胞およびプロT細胞を含む(Terskikh (2003) Blood 102, 94-101)。
【００４９】
造血前駆細胞は、血液製剤からのような、本明細書に開示された方法および当技術分野において公知の方法を用いて単離かつ培養されうる(例えば、参照により組み入れられる、米国特許第5,061,620号および第6,645,489号)。本発明に用いられる場合の「血液製剤」とは、造血系の細胞を含む身体または身体の器官から得られる製剤を定義する。そのような源は、未分画骨髄、臍帯、末梢血、肝臓、胸腺、リンパ液および脾臓を含む。前記の未精製または未分画の血液製剤のすべてが、多数の方法で「造血前駆細胞」特性をもつ細胞について濃縮されうることは、当業者にとって明らかであると思われる。例えば、血液製剤は、より分化した子孫から取り出されうる。より成熟、分化した細胞は、それらが発現する細胞表面分子により、反対に選択されうる。さらに、血液製剤は、CD34.sup.+細胞について選択するように分画されうる。そのような選択は、本明細書に開示された方法、および市販されている磁気抗CD34ビーズ(Dynal, Lake Success, N.Y.)を用いて達成されうる。未分画血液製剤は、ドナーから直接的に得られうる、または凍結保存性貯蔵から回収されうる。
【００５０】
用語「造血幹細胞」および「HSC」は、非限定的に、内皮前駆細胞、リンパ内皮前駆細胞、間葉前駆細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、顆粒球前駆細胞、マクロファージ前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、プロB細胞およびプロT細胞のようなより分化した前駆細胞を生じるオリゴ分化性細胞型を指す(Terskikh (2003)前記)。HSCは、しばしば骨に付着して、骨髄に存在するが、循環にも見出され、他の組織内にも存在する。造血幹細胞は、自己再生の能力をもつが、よりコミットメントされた前駆体はもたない(Terskikh (2003)前記)。HSCおよびHPCは共通の細胞表面マーカーを有し、特に、ヒト細胞については、マーカーCD34による。系統陰性(B細胞上のB220、T細胞上のCD3、骨髄性細胞上のCD11bなどのような、いずれの分化した細胞についての特異的なマーカーも欠く)、CD34+、c-kit+である(Belicci et al. (2004) 前記)。マウスにおいて、これらの細胞は、c-kit+、Thy1.1lo、Sca-1+およびLin-である(Rafii et al. 2003、前記)。さらに、内皮前駆体を含むいくつかの前駆体はCD133を発現する。
【００５１】
用語「内皮前駆細胞」、「EPC」、「内皮細胞前駆体」および「リンパ内皮前駆細胞」は、HSCから生じ、かつそれぞれ、分化した内皮細胞およびリンパ内皮細胞を生じる細胞を指す。EPCは、CD34+、CD133+、c-kit+、およびLin-である(Rafii et al. 2003、前記)。さらに、VEGFR2+および/またはVEGFR3+である可能性がある(Rafii et al. 2003、前記)。ヒト内皮前駆細胞は、表面分子CD34、flk-1、および/またはtie-2を発現する(Isner et al., 米国特許第5,980,887号、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる)。マウス内皮細胞前駆体は、TM遺伝子、tie-2遺伝子および/もしくはfgf3遺伝子を発現する、ならびに/またはGSL I B4レクチンで染色する(Hatzopoulos et al. (1998) Development 125:1457-1468)。
【００５２】
用語「間葉前駆細胞」は、HSCから生じ、かつ線維芽細胞、ならびに骨、脂肪組織および軟骨のような他のストローマ細胞を生じる細胞を指す(Gronthos et al., 2003, J. Cell Sci. 116, 1827-1835)。
【００５３】
用語「骨髄系前駆細胞」は、HSCから生じ、かつ顆粒球、マクロファージ、赤血球、巨核球(およびそれに伴って、血小板)、および場合により、内皮細胞、筋肉細胞、および他の組織を生じる前駆体である細胞を指す(Terskikh et al. (2003)前記)。
【００５４】
用語「リンパ系前駆細胞」は、HSCから生じ、かつT細胞およびB細胞を生じる細胞を指す(Otani et al. (2002) 前記)。
【００５５】
本明細書に用いられる場合、用語「血管新生を示す組織」とは、新しい血管が、前から存在する血管から発生している組織を指す。
【００５６】
本明細書に用いられる場合、用語「血管新生を阻害すること」、「血管新生を減少させること」、「血管新生を低下させること」およびそれらの文法的相当語句は、対照組織における量より、好ましくは10%少ない、より好ましくは50%少ない、さらにより好ましくは75%少ない、よりいっそう好ましくは90%少ない、および最も好ましくは対照組織に観察される同じレベルである量で、組織における血管新生のレベルを低下させることを指す。血管新生のレベルの低下は、血管新生の絶対的欠如を意味する場合もあるが、そうである必要性はない。本発明は、完全に血管新生を排除する方法を必要とせず、かつそれに限定されない。
【００５７】
血管新生のレベルは、非限定的に、本明細書に考察されているように、血管の数および/または血管分岐点の数を数えることを含む、当技術分野において周知の方法を用いて測定されうる。代替アッセイ法は、化合物が、α4β1発現細胞(例えば、M21メラノーマ細胞)のVCAMまたはフィブロネクチンに接着する能力を阻害するかどうかを示すインビトロ細胞接着アッセイ法を含む。企図されるもう一つのインビトロアッセイ法は、細胞レベルにおいて新しい血管の増殖を示すチューブ状帯形成アッセイ法を含む(D.S. Grant et al., Cell, 58:933-943 (1989))。技術分野容認のインビボアッセイ法もまた知られており、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギなどのような様々な試験動物の使用を含む。これらのインビボアッセイ法は、正常および新生物組織の両方において抗血管新生活性を示すのに適している、ニワトリ絨毛尿膜(CAM)アッセイ法を含む(D.H. Ausprunk, Amer. J. Path., 79, No. 3:597-610 (1975)およびL. Ossonowski and E. Reich, Cancer Res., 30:2300-2309 (1980))。他のインビボアッセイ法は、特定のマウスにおいて移植された腫瘍の増殖率を低下させる、または癌にかかりやすいもしくは化学的に誘導された癌を発現するマウスにおいて腫瘍もしくは前癌細胞の形成を抑制する、化合物の能力を示すマウス転移アッセイ法を含む(M.J. Humphries et al., Science, 233:467-470 (1986)およびM.J. Humphries et al., J. Clin. Invest., 81:782-790 (1988))。
【００５８】
用語「インテグリンα4β1」は、インテグリンのファミリーのメンバーを指すために、用語「CD49d/CD29」、「最晩期抗原4」、および「VLA4」と交換可能に用いられる。「インテグリン」は、幅広い種類の細胞において発現している細胞外受容体であり、細胞外マトリックスにおいて特定のリガンドに結合する。インテグリンにより結合される特定のリガンドは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸のトリペプチド(Arg-Gly-Asp; RGD)、またはロイシン-アスパラギン酸-バリン(Leu-Asp-Val)のトリペプチドを含み得、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシン、およびフォンビルブラント因子を含む。インテグリンα4β1は、細胞外マトリックス(ECM)中および細胞表面上に存在するリガンドに結合するα4およびβ1サブユニットから構成されるヘテロ二量体細胞表面接着受容体である。例示的なα4ポリペプチド配列は、図1に示され、例示的なβ1ポリペプチド配列は、図2に示されている。
【００５９】
用語「インテグリンα4β1」は、α4β1の部分を含むことも企図される。用語「部分」は、タンパク質に関して用いられる場合(「α4β1の部分」においてのような)、そのタンパク質の断片を指す。断片は、サイズが3個の連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス1個のアミノ酸残基までの範囲でありうる。従って、「アミノ酸配列の少なくとも一部」を含むポリペプチド配列は、アミノ酸配列の3個の連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列までを含む。
【００６０】
一つの好ましい態様において、インテグリンα4β1の部分は、α4ポリペプチド配列の一部を含む。より好ましい態様において、図1に示されたα4ポリペプチド配列の部分は、配列
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(アミノ酸141位からアミノ酸301位まで)を含む。より好ましい態様において、インテグリンα4β1の部分は、配列
2007509042.tif 000003
(アミノ酸145位からアミノ酸164位まで)、配列
2007509042.tif 000004
(アミノ酸184位からアミノ酸197位まで)、配列
2007509042.tif 000005
(アミノ酸219位からアミノ酸224位まで)、配列
2007509042.tif 000006
(アミノ酸270位からアミノ酸280位まで)、および配列
2007509042.tif 000007
(アミノ酸34位からアミノ酸85位まで)を含む。代替の態様において、本発明は、明確には、前記の部分を含むα4ポリペプチド配列(図1の配列により例示されている)の部分を含む。そのような配列は、例えば、
2007509042.tif 000008
を含む。
【００６１】
試料における分子(例えば、タンパク質、DNA、RNAなど)または物(例えば、造血前駆細胞)に関して用いられる場合の用語「単離された」、「精製された」およびそれらの文法的相当語句は、試料由来の少なくとも1つの夾雑物分子および/または物の量における減少(少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、よりいっそう好ましくは少なくとも75%、および最も好ましくは少なくとも90%)を指す。従って、精製は、結果として、試料において、1つもしくは複数の他の分子および/または物に対して所望の分子および/または物の量において「濃縮」、すなわち増加を生じる。
【００６２】
「非内皮細胞」とは、非限定的に、幹細胞、リンパ球、間葉細胞、骨髄性細胞、リンパ球様細胞、顆粒球細胞、マクロファージ細胞、巨核球細胞、赤血球系細胞、B細胞、T細胞、骨髄細胞、筋肉細胞、神経細胞などのような内皮細胞以外の任意の細胞型である(すなわち、内皮細胞ではない)。
【００６３】
用語「疾患」および「病的状態」は、正常な機能の実行を中断または改変し、環境因子(栄養失調、工業災害、または気候のような)、特定の感染性原因物質(寄生虫、細菌またはウイルスのような)、生物体の先天的な欠陥(様々な遺伝的異常のような)、またはこれらを始めとする因子の組み合わせに対する応答である可能性がある、生きている動物、またはその器官もしくは組織のいずれかの正常な状態の任意の損傷、中断、停止、または障害に関連している状態、徴候および/または症状を指すために交換可能に用いられる。用語「疾患」は、損傷に対する応答、特に、そのような応答が過度である、個体の正常な活性に過度に干渉する症状を生じる、および/または組織が正常に治癒しない場合の応答を含む(過度とは、干渉の程度、または干渉の長さとして特徴付けられる)。
【００６４】
発明の説明
本発明は、造血前駆細胞の標的組織への接着および/または遊走を変化させるための、ならびに造血前駆細胞の二次細胞型への分化を変化させるための方法を提供することにより、当技術分野における必要性を満たす。本発明はまた、造血性細胞の標的組織への接着および/または遊走のレベルを変化させることについて、ならびに造血前駆細胞の二次細胞型への分化を変化させることについて試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。本発明はさらに、造血前駆細胞を単離するための方法を提供する。本発明の方法は、例えば、HPC接着、遊走および分化に関連している疾患および状態の診断、予防および症状の低減に有用である。本発明の方法はまた、HPC細胞を単離するにおいて、ならびに発生および創傷治癒の根底にある機構を決定するにおいて、有用である。本発明の方法は、インテグリンα4β1がHPC接着、遊走および分化において役割を果たしているという本発明者らの思いがけない発見に部分的に基づく。
【００６５】
造血幹細胞は、内皮細胞(EC)へ分化することにより腫瘍において新しい血管の15%までを供給するが(Ruzinova et al. Cancer Cell 4:277-289 (2003))、いくつかの造血幹細胞はまた、血管新生因子を分泌する単球のような細胞へ分化することにより血管新生を促進しうる(Cursiefen et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:1040-1050)。たいていのCD34+細胞はインテグリンα4β1を発現し、α4β1アンタゴニストが造血幹細胞のホーミングをほとんど完全にブロックしたため、本明細書におけるデータ(実施例17〜24)は、α4β1が、新血管形成における造血幹細胞についての両方の役割を制御することを示している。造血幹細胞、部分的にコミットメントされた前駆細胞、またはその2つの組み合わせが、血管新生に関与しているかどうかもまた、明らかではない。本発明者らのデータは、内皮前駆細胞もまた、α4β1依存性様式で腫瘍へホーミングすることを示している。本明細書におけるデータは、従って、α4β1の阻害が、例示的な造血幹細胞の新血管構造へのホーミングおよびその後の内皮細胞への成長をブロックすることを示している。
【００６６】
例示的な循環造血幹細胞が、新血管形成の部位へホーミングし(Asahara et al. (1997) 前記; Rafii et al. (2003) Nat. Med. 9, 702-12; Takahashi et al. (1999) Nat. Med. 5, 434-438; Kawamoto et al. (2001) Circulation 103, 634-637; Hattori et al. (2001) J. Exp. Med. 193, 1005-1014; Lyden et al. (2001) Nat. Med. 7, 1194-201; Ruzinova et al. (2003) Cancer Cell. 4:277-289; Jain et al. (2003) Cancer Cell 3, 515-516; Religa et al. (2002) Transplantation 74, 1310-1315;およびBoehm et al. (2004) J. Clin. Invest. 114, 419-426))、それらは血管構造の約15%を生じる(Ruzinova et al. (2003) Cancer Cell. 4:277-289)ことが、本発明者らの考慮である。それらはまた、筋肉、脳および他の組織へホーミングし、筋肉、神経および他の細胞型へ分化することにより組織再生または病因に関与する(Priller et al. (2001) J. Cell Biol. 155, 733-738; LaBarge et al. (2002) Cell. 111, 589-601; Torrente et al. (2003) J. Cell Biol. 162, 511-520; 13. Religa et al. (2002) Transplantation 74, 1310-1315;およびBoehm et al. (2004) J. Clin. Invest. 114, 419-426)。
【００６７】
インテグリンα4β1-VCAM相互作用は、インビボでの多くの過程中のヘテロタイプな細胞接着を促進する。α4β1-VCAM相互作用は、どちらの分子の胚損失でも絨毛膜の尿膜との融合(Yang et al. (1995) Development 121, 549-560;およびKwee et al. (1995) Development 121, 489-503)および心内膜の心筋との融合(Yang et al. (1995) Development 121, 549-560;およびKwee et al. (1995) Development 121, 489-503)を阻害するため、正常な胚発生に関与している。フィブロネクチンおよび/またはVCAMとのインテグリンα4β1の相互作用はまた、免疫細胞前駆体の骨髄ECへの接着について、およびこれらの細胞の骨髄へ戻るホーミングについて(Simmons et al. (1992) Blood 80, 388-395; Papayannopoulou et al. (2001) Blood 98, 2403-2411; Craddock et al. (1997) Blood 90, 4779-4788;およびMiyake et al. (1991) J. Cell Biol. 114, 557-565)、炎症(Guan et al. (1990) Cell 60, 53-61;およびElices et al. (1990) Cell 60, 577-584)および癌(Melder et al. (1996) Nat Med. 2:992-997)における免疫細胞輸送に関与している。一つの態様において、本発明者らのデータは、例示的なリガンドVCAMおよびフィブロネクチンとのα4β1の相互作用の新規の機能、すなわち、新血管形成および組織リモデリング中の例示的な造血幹細胞の内皮細胞との会合を促進すること、を実証している。
【００６８】
本明細書におけるデータ(例えば、実施例17〜24、図21〜36)は、インテグリンα4β1が、例示的な造血幹細胞の腫瘍、炎症性組織および損傷組織へのホーミングにおいて中心的役割を果たしていること、ならびにインテグリンα4β1およびそのリガンドの発現および/または機能の操作が、造血幹細胞のような造血前駆細胞を含む病理学的過程を調節するための手段を提供することを示している。
【００６９】
本発明は、以下の標題の下、下記でさらに考察されている：A)インテグリンα4β1リガンド、B)インテグリンα4β1のそのリガンドへの結合を変化させる作用物質、C)インテグリンα4β1は、新血管形成中に、内皮幹細胞により例示されるように、内皮前駆細胞の輸送を媒介する、D)造血前駆細胞の接着、遊走および分化を変化させること、E)造血前駆細胞の接着、遊走および分化を変化させること、F)インテグリンα4β1を発現する造血前駆細胞の検出、G)化合物のスクリーニング、ならびにH)造血前駆細胞の単離。
【００７０】
A. インテグリンα4β1リガンド
本発明の方法は、インテグリンα4β1の、そのリガンドの1つまたは複数との特異的結合を阻害する作用物質を用いる。インテグリンα4β1受容体のリガンドに関して本明細書に用いられる場合の用語「リガンド」とは、α4β1が特異的に結合する分子および/またはその部分を指す。一つの態様において、リガンドの結合は、細胞において、特定の生物学的応答(例えば、造血前駆細胞の接着、遊走および/または分化)および/またはシグナルの伝達を惹起する。インテグリンα4β1リガンドは、細胞表面上に存在しうる、または細胞外マトリックス(ECM)中に存在しうる。
【００７１】
一つの好ましい態様において、細胞表面上に存在するインテグリンα4β1リガンドは、血管細胞接着分子(VCAM)により例示される。VCAMのポリペプチド配列の例は、図3に示されている。もう一つの好ましい態様において、インテグリンα4β1リガンドは、VCAMの部分である。VCAM(図3A、GenBankアクセッション番号P19320)の好ましい部分は、アミノ酸配列RTQIDSPLNG(SEQ ID NO:15)(アミノ酸60位からアミノ酸69位まで)；アミノ酸配列RTQIDSPLSG(SEQ ID NO:16)(アミノ酸348位からアミノ酸357位まで)；およびアミノ酸配列KLEK(SEQ ID NO:17)(アミノ酸103位からアミノ酸106位まで、およびアミノ酸391位からアミノ酸394位まで)を含む。VCAMの他の部分もまた企図され、好ましくは、RTQIDSPLNG(SEQ ID NO:15)、RTQIDSPLSG(SEQ ID NO:16)、KLEK(SEQ ID NO:17)配列の1つまたは複数を含む。これらは、限定されるわけではないが、
2007509042.tif 000009
により例示される。
【００７２】
もう一つの好ましい態様において、ECMに存在するインテグリンα4β1リガンドは、フィブロネクチンにより例示される。フィブロネクチンの例示的なポリペプチド配列は、図4に示されている。もう一つの好ましい態様において、インテグリンα4β1リガンドは、フィブロネクチンの部分である。図4に例示されているフィブロネクチンの好ましい部分は、2つのα4β1結合部位をコードする、アミノ酸1982位からアミノ酸2111位までのIIICS配列
2007509042.tif 000010
を含む。一つのより好ましい態様において、部分は、アミノ酸配列LDV(SEQ ID NO:19)(アミノ酸2011位からアミノ酸2013位まで)を含むCS-1配列を含む。代替の態様において、部分は、アミノ酸配列REDV(SEQ ID NO:20)(アミノ酸2091位からアミノ酸2094位まで)を含むCS-5配列を含む。さらにもう一つの好ましい態様において、部分は、アミノ酸配列IDAPS(SEQ ID NO:21)(アミノ酸1903位からアミノ酸1907位まで)を含む。本発明はさらに、限定されるわけではないが、配列
2007509042.tif 000011
により例示されているように、前記の配列を含むフィブロネクチンの部分を含む。
【００７３】
VCAM、フィブロネクチン、およびそれらの部分以外のインテグリンα4β1リガンドもまた、本発明の範囲内であることが企図される。これらのリガンドは、当業者に利用可能な日常的方法を用いて決定されうる。例えば、VCAM、フィブロネクチンおよびインテグリンα4β1に対する抗体の存在は、他のインテグリンα4β1およびインテグリンα4β1リガンドを単離するための可能な方法を作成する。一つの方法は、イディオタイプ法として公知の抗体特性を利用する。各抗体は、抗原に特異的である固有の領域を含む。この領域はイディオタイプと呼ばれる。抗体それ自身、抗原決定基を含む；抗体のイディオタイプは、その分子に固有の抗原決定基である。生物体を抗体で免疫することにより、イディオタイプを認識する抗体を含む、抗体を認識する「抗-抗体」を産生させることができる。もう一つの抗体のイディオタイプを認識する抗体は、抗イディオタイプ抗体と呼ばれる。いくつかの抗イディオタイプ抗体は、抗体が認識する本来の抗原の形を模倣し、抗原の「内部イメージ」を有すると言われる(Kennedy (1986) Sci. Am. 255:48-56)。例えば、抗イディオタイプ抗体は、抗ELAM1抗体に対して産生されることに成功し、(インテグリンα4β1と同様に)内皮細胞の表面上に発現される分子である、ELAM1リガンドを認識することが見出された(参照により全体として組み入れられる、米国特許第6,252,043号)。
【００７４】
抗原がリガンドである場合、特定の抗イディオタイプは、そのリガンドの受容体に結合することができる。これらのうちのいくつかが同定され、インスリン、アンジオテンシンII、アデノシンI、アドレナリンの受容体、ならびにラット脳ニコチンおよびアヘン剤受容体に結合する抗イディオタイプを含む(Carlsson and Glad (1989) Bio/Technology 7:567-73)。
【００７５】
B. インテグリンα4β1のそのリガンドへの結合を変化させる作用物質
本発明のいくつかの好ましい方法は、α4β1の、そのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を変化させる(すなわち、増加させるまたは減少させる)作用物質を利用する段階を含む。インテグリンα4β1かまたはインテグリンα4β1リガンドのいずれかへの作用物質の結合に関して本明細書に用いられる場合の用語「特異的結合」とは、相互作用が、それぞれ、インテグリンα4β1またはそのリガンド上の特定の構造の存在に依存していることを意味する。例えば、作用物質がエピトープ「A」に特異的である場合には、標識された「A」および作用物質を含む反応におけるエピトープA(すなわち、遊離の標識されていないA)を含むタンパク質の存在は、作用物質に結合した標識されたAの量を低下させる。
【００７６】
インテグリンα4β1のインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合への作用物質の効果に関して用いられる場合の用語「特異的結合を阻害する」および「特異的結合を低下させる」とは、作用物質が、インテグリンα4β1のそのリガンドとの特異的結合のレベルを、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)により検出される場合、対照試料における特異的結合の量より、好ましくは10%少ない、より好ましくは50%少ない、さらにより好ましくは75%少ない、よりいっそう好ましくは90%少ない、および最も好ましくは対照試料において観察される同じレベルである、量で低下させることを意味する。特異的結合のレベルの低下は、特異的結合の絶対的欠如を意味する場合もあるが、その必要性はない。本発明は、インテグリンα4β1のそのリガンドとの特異的結合を完全に除去する方法を必要としないし、かつそれに限定されない。
【００７７】
用語「アンタゴニスト」は、受容体およびそのリガンドの特異的結合を阻害することができる分子(例えば、抗体)を意味するように本明細書において用いられる。抗α4β1インテグリン抗体は、α4β1のフィブロネクチンとの特異的結合を阻害する、α4β1アンタゴニストの例である。アンタゴニストは、α4β1のそのリガンドへの結合の競合的阻害剤または非競合的阻害剤として作用することができる。
【００７８】
用語「作用物質」、「試験作用物質」、「試験化合物」、「化合物」、「分子」および「試験分子」は、任意の源(例えば、植物、動物および環境的源など)から得られる、または任意の方法(例えば、天然に存在する分子の精製、化学合成、遺伝子工学的方法など)により調製される、任意の型の分子(例えば、ペプチド、核酸、糖、脂質、有機および無機分子など)を指す。作用物質は、既知および可能性のある化合物の両方を含む。下でさらに記載されているように、作用物質は、限定されるわけではないが、抗体、アンチセンスのような核酸配列およびリボザイム配列、ならびに化学的ライブラリー、ファージライブラリーにより作製される化合物などにより例示される。
【００７９】
本発明を何かの機構に限定することを意図せず、かつ機構の理解が必要とされないことを認識しているが、作用物質は、インテグリンα4β1受容体のそのリガンドとの特異的結合を、例えば、リガンド上に位置している結合部位に結合し、それによりインテグリンα4β1受容体のリガンド上のその結合部位への結合を阻害することによる、またはリガンド上の結合部位以外の部位に結合し、インテグリンα4β1受容体のリガンド上の結合部位への結合を立体的に妨げることによるを含む、様々な機構により阻害することができることが考えられる。または、作用物質は、インテグリンα4β1へ(インテグリンα4β1リガンドへよりむしろ)結合し、それにより、インテグリンα4β1のリガンドへの結合を阻害する、受容体における高次構造的なまたは他の変化を引き起こしうる。
【００８０】
1. 抗体
一つの態様において、α4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害する作用物質は、抗体である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、免疫原により動物において誘起される、および免疫原に対して、またはより具体的には、免疫原に含まれる1つもしくは複数のエピトープに対して特異性を示す、糖タンパク質またはその部分を指す。用語「抗体」は、明確には、その範囲内に、例えば、抗体のFab、F(ab')2、Fd、またはFv断片を含む、そのような抗体の抗原結合断片を含む。本発明の抗体はまた、キメラおよびヒト化抗体を含む。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。用語「ポリクローナル抗体」は、プラズマ細胞の単一より多いクローンから産生される免疫グロブリンを指す；対照的に、「モノクローナル抗体」は、プラズマ細胞の単一クローンから産生される免疫グロブリンを指す。
【００８１】
本発明の範囲内にあることが企図される抗体は、天然に存在する抗体、および、例えば、一本鎖抗体、キメラ、二機能性、およびヒト化抗体、加えて、それらの抗原結合断片を含む天然に存在しない抗体を含む。天然に存在する抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヒトおよびサルの種を含む任意の種において産生されうる。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築されうる、組換えで産生されうる、または、例えば、以前に記載されているように(Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989))、可変性重鎖および可変性軽鎖からなる組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより得られうる。例えば、キメラ、ヒト化、CDR-グラフト化、一本鎖、および二機能性抗体を作製するこれらを始めとする方法は、当業者に周知である(Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992);およびBorrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995)。
【００８２】
本明細書に用いられる場合、抗インテグリン抗体、特に、抗インテグリンα4β1抗体に関して用いられる時の用語「抗体」は、α4β1ポリペプチドもしくはそのペプチド部分上の1つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、かつRGD結合ドメインの一部または全部を含む場合もあるし、含まない場合もある、抗体を指す。一つの態様において、抗インテグリンα4β1抗体、またはその抗原結合断片は、少なくとも約1x105M-1、より好ましくは少なくとも約1x106M-1、およびさらにより好ましくは少なくとも約1x107M-1のインテグリンα4β1に対する特異的結合活性を有することを特徴とする。
【００８３】
当業者は、所望のポリペプチドに特異的であるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製する方法を知っている。例えば、モノクローナル抗体は、動物を所望の抗原で免疫することにより作製され得、免疫された動物由来の脾臓細胞は、一般には骨髄腫細胞との融合により不死化される。
【００８４】
抗原での免疫化は、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント)の存在下または非存在下において達成されうる。典型的には、マウスについて、50〜200μlアジュバントまたは水溶液における10μg抗原が、皮下、腹腔内または筋肉内経路によりマウスごとに投与される。ブースター免疫化は、間隔(例えば、2〜8週間)を置いて与えられうる。最終ブーストは、融合の約2〜4日前に与えられ、一般的には、アジュバントにおいてよりむしろ水溶液において与えられる。
【００８５】
免疫された動物由来の脾臓細胞は、室温において、脾臓を滅菌ふるいを通して培地へとひき裂くことにより、または2つの滅菌ガラス顕微鏡スライドの艶消し末端の間の圧力により脾臓細胞を培地へ優しく遊離させることにより、調製されうる。細胞は、遠心分離(5 min、400xg)により収集され、洗浄され、カウントされる。
【００８６】
脾臓細胞は、骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞系を生じる。ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(HAT)に対する感受性について選択されたいくつかのマウス骨髄腫細胞系は、市販されており、例えば、10〜15% ウシ胎児血清を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)(Gibco BRL)において増殖されうる。骨髄腫細胞および脾臓細胞の融合は、ポリエチレングリコール(PEG)を用いて、または当技術分野において日常的であるプロトコールを用いる電気融合により、達成されうる。融合細胞は、96ウェルプレートへ分配され、続いて、10〜15% ウシ胎児血清およびHATを含む0.1 ml DMEMにおける1〜2週間の培養により融合細胞を選択する。上清は、当技術分野において周知の方法を用いて抗体産生についてスクリーニングされる。抗体を産生する細胞を含むウェルからのハイブリドーマクローンが得られる(例えば、限界希釈により)。クローン化ハイブリドーマ細胞(4-5x106個)は、レシピエントマウス、好ましくはBALB/c遺伝的バックグラウンドの、において腹腔内に移植される。血清および腹水は、典型的には、10〜14日間後、マウスから収集される。
【００８７】
本発明はまた、インテグリンα4β1および/またはそのリガンドの少なくとも一部に特異的であるヒト化抗体を企図する。ヒト化抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて作製され得、その方法は、米国特許第5,545,806号；第5,569,825号および第5,625,126号に記載されたものを含み、その全内容は、参照により組み入れられる。そのような方法は、例えば、ヒト免疫グロブリン鎖遺伝子を含み、かつヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる様々なイソタイプの抗体のレパートリーを産生するようにこれらの遺伝子を発現することができるトランスジェニック非ヒト動物の作製を含む。
【００８８】
好ましい態様において、抗体は、インテグリンα4β1および/またはその部分に特異的である(すなわち、特異的に結合する)。本発明は、フィブロネクチンのC末端に対する、およびインテグリンα4β1に対する抗体を用いて、ならびにインテグリンα4β1に対する例示的なペプチドアンタゴニストを用いて、例証されているが、本発明は、これらの特定の作用物質の使用に限定されない。むしろ、本発明は、明確には、インテグリンα4β1の1つまたは複数のインテグリンα4β1リガンドへの特異的結合を阻害する任意の作用物質を含む。一つの好ましい態様において、抗インテグリンα4β1抗体は、インテグリンα4β1を、それが別のインテグリン、例えば、Vβ3および/またはVβ5、を結合するより、少なくとも2倍大きい、好ましくは少なくとも5倍大きい、より好ましくは少なくとも10倍大きい、およびさらにより好ましくは少なくとも100倍大きい親和性で結合する。抗インテグリンα4β1抗体は、非限定的に、HP2/1、HP1/3、HP1/1、HP1/7、HP2/4(Sanchez-Madrid et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16, 1342-1349)、ALC1/4.1、ALC1/5.1(Munoz et al. (1997) Biochem J., 327, 27-733)、44H6(Quackenbush et al. (1985) J. Immunol. 134:1276-1285)、P1H4、P4C2、P4G9(Wayner et al. (1998) J. Cell Biol. 109:1321)、9C10(Kinashi et al. (1994) Blood Cells 20:25-44)、9F10(Hemler et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:11478)、B5G10(Hemler et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 3300-3309)、15/7(Yednock et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:28740-28750)、SG/73(Miyake et al. (1992) J. Cell Biol., 119, 653-662)のようなマウス抗ヒトインテグリンα4β1抗体を含む。また、本発明の範囲内に、「ANTEGREN(商標)」(ナタリツマブとしても知られている)のようなヒト化抗ヒトインテグリンα4β1抗体(Tubridy et al. (1999) Neurology 53(3):466-72, Sheremata et al. (1999) Neurology 52: No. 5, March 23 1999およびLin et al. (1998) Current Opinion in Chemical Biology 2:453-457)、ならびに内容が参照により組み入れられる、Newman et al., 米国特許第5,750,105号により開示されたキメラ抗体；PS/2のようなラット抗マウスインテグリンα4β1抗体(Chisholm et al. (1993) European J. Immunol 23:682-688)；TA-2のようなマウス抗ラットα4β1抗体(Issekutz (1991) J. Immunol 147:4178-4184)；およびR1-2のようなラット抗マウスα4β1抗体(Holzmann et al. (1989) Cell 56:37-46)も含まれる。
【００８９】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、VCAMおよび/またはその部分に特異的である。より好ましい態様において、抗VCAM抗体は、VCAMのα4β1インテグリンへのであって、他のインテグリンへのではない、結合を阻害する。例示的抗体は、例えば、4B2および1E10、P1B8、およびP3C4(Needham et al. (1994) Cell Adhes. Commun. 2:87-99; Dittel et al. (1993) Blood 81:2272-2282)、ならびに内容が参照により組み入れられる、Newman et al., 米国特許第5,750,105号により開示されたキメラ抗体を含む。
【００９０】
さらにもう一つの好ましい態様において、抗体は、フィブロネクチンおよび/またはその部分に特異的である。より好ましい態様において、抗VCAM抗体は、VCAMのα4β1インテグリンへのであって、他のインテグリンへのではない、結合を阻害する。そのような抗体は、非限定的に、フィブロネクチンのC末端領域における主要および非主要インテグリンα4β1結合部位に対する抗体、ならびにインテグリンα4β1のフィブロネクチンへの結合に干渉する隣接ヘパリン結合部位に対する抗体を含む。例示的な抗体は、P1F11およびP3D4(Garcia-Pardo et al. (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications 186(1):135-42)；ならびに抗体20E10、21E5、9E9、16E6、19B7、26G10、30B6、36C9、および39B6(Mostafavi-Pour et al. (2001) Matrix Biology 20(1):63-73)を含む。
【００９１】
2. ペプチド
代替の態様において、インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害する作用物質は、インテグリンα4β1のそのリガンドへの結合を阻害する例示的なペプチドEILDVPST(SEQ ID NO:22)のようなペプチドである(VarnerのWO 03/019136 A3)。本明細書に用いられる場合の用語「ペプチド」は、ペプチド結合および/またはペプチド結合の類似体により共有結合性に連結されている少なくとも2つのアミノ酸ならびにアミノ酸類似体を指す。ペプチドという用語は、アミノ酸および/またはアミノ酸類似体のオリゴマーおよびポリマーを含む。ペプチドという用語はまた、一般的には約2個のアミノ酸から約20個のアミノ酸までを含む、一般にペプチドと呼ばれる分子を含む。ペプチドという用語はまた、一般的には約20個から約50個までのアミノ酸を含む、一般にポリペプチドと呼ばれる分子を含む。ペプチドという用語はまた、一般的には約50個から約3000個までのアミノ酸を含む、一般にタンパク質と呼ばれる分子を含む。ペプチドアンタゴニストのアミノ酸は、L-アミノ酸および/またはD-アミノ酸でありうる。
【００９２】
ペプチドに関する場合の用語「誘導体」または「修飾された」とは、ペプチドが少なくとも1つの誘導体アミノ酸を含むことを意味する。アミノ酸の「誘導体」および「修飾された」アミノ酸は、化学修飾されたアミノ酸である。誘導体アミノ酸は、「生物学的な」または「非生物学的な」アミノ酸でありうる。1つまたは複数のアミノ酸メンバーの化学的誘導体は、機能性側鎖との反応により達成されうる。例証となる誘導体化分子は、例えば、遊離アミノ基が、塩酸アミン、p-トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基および/またはホルミル基を形成するように誘導体化されている分子を含む。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステルおよび/またはエステルの他の型、ならびにヒドラジドを形成するように誘導体化されうる。遊離ヒドロキシル基は、O-アシルおよび/またはO-アルキル誘導体を形成するように誘導体化されうる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、N-イム-ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化されうる。また、20個の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも化学的誘導体として含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換されうる；5-ヒドロキシリジンは、リジンと置換されうる；3-メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換されうる；ホモセリンは、セリンと置換されうる；およびオルニチンはリジンと置換されうる。他の含まれる修飾は、アミノ末端アシル化(例えば、アシル化またはチオグリコール酸アミド化)、末端カルボキシルアミド化(例えば、アンモニアまたはメチルアミンでの)、および類似した末端修飾である。末端修飾は、周知のとおり、プロテイナーゼ消化による感受性を低下させるために、およびそれゆえに、溶液中、特にプロテアーゼが存在しうる生体液中においてペプチドの半減期を長くするために、有用である。例示的な修飾アミノ酸は、非限定的に、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、サルコシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含む。誘導体はまた、必要な活性が維持される限り、1つもしくは複数の付加または欠失を含むペプチドを含む。
【００９３】
ペプチドのアミノ酸は、生物学的アミノ酸および非生物学的アミノ酸を含むことが企図される。用語「生物学的アミノ酸」は、細胞が、mRNAから翻訳されるポリペプチドへ導入することができる既知の20個のコードされたアミノ酸のいずれか1個を指す。用語「非生物学的アミノ酸」は、生物学的アミノ酸ではないアミノ酸を指す。非生物学的アミノ酸は、例えば、それらの立体化学またはそれらの化学的性質のために、有用である。非生物学的アミノ酸、例えば、ノルロイシンは、メチオニンのと形が類似した側鎖を有する。しかしながら、側鎖イオウ原子を欠くため、ノルロイシンは、メチオニンより酸化に対して感受性が低い。非生物学的アミノ酸の他の例は、生物学的アミノ酸と比較して異なる立体的性質をもつ疎水性側鎖を含む、アミノ酪酸、ノルバリンおよびアロ-イソロイシンを含む。
【００９４】
本発明において有用であるペプチドは、化学合成および組換えDNA技術を含むいくつかの方法により合成されうる。固相メリフィールド合成のような合成化学技術は、純度、望ましくない副産物が存在しないこと、作製の容易さなどの理由で好ましい。利用可能な技術の概要は、固相ペプチド合成について、Steward et al., Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman, Co., San Francisco (1969); Bodanszky, et al., Peptide Synthesis, John Wiley and Sons, 第2版 (1976); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, 2:46, Academic Press (1983); Merrifield, Adv. Enzymol. 32:221-96 (1969); Fields et al., Intl. Peptide Protein Res., 35:161-214 (1990)および米国特許第4,244,946号；ならびに、古典的な溶液合成について、Schroder et al., The Peptides, Vol 1, Academic Press (New York) (1965)を含むいくつかの参考文献に見出される。合成に使用できる保護基は、Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York (1973)に同様に記載されている。固相合成方法は、1つまたは複数のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の伸長するペプチド鎖への逐次的付加からなる。第一アミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかは、適切な選択的に除去可能な保護基により保護される。異なる、選択的に除去可能な保護基は、リジンのような反応性側鎖を含むアミノ酸のために利用される。
【００９５】
結果として生じた線状ペプチドは、その後、それらの対応する環状ペプチドを形成するように反応されうる。ペプチドを環化するための方法は、Zimmer et al., Peptides, 393-394 (1992), ESCOM Science Publishers, B.V., 1993に記載されている。ジスルフィド結合の形成を通して2個またはそれ以上のシステインを含むペプチドを環化するために、Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 113:6657-6662 (1991); Plaue, Int. J. Peptide Protein Res., 35:510-517 (1990); Atherton, J. Chem. Soc. Trans. 1:2065 (1985);およびB. Kamber et al., Helv. Chim. Acta 63:899 (1980)により記載された方法が有用である。ポリペプチド環化は、環化により形成される安定した構造を理由として、かつ環状ペプチドについて観察される生物活性を考慮すれば、修飾ペプチド(例えば、ペプチド模倣体)を作製するための有用な修飾である。
【００９６】
または、本発明の選択された化合物は、ペプチドが知られたならば、周知の方法に従って調製される組換えDNA構築物の発現により産生される。そのような産生は、そのような化合物の大量または代替的態様を提供するのに望ましいであろう。組換え手段による産生は、少なくとも8個のアミノ酸残基のペプチドについて、標準的固相ペプチド合成より望ましい場合がある。所望のペプチド配列をコードするDNAは、好ましくは、市販されている核酸合成方法を用いて調製される。これらの核酸合成方法後、ペプチドをコードするDNAが、精製された形で単離される。組換え宿主におけるペプチドの産生のための発現系を構築するための方法もまた、当技術分野において一般的に知られている。適合性宿主へ形質転換される場合の好ましい組換え発現系は、ペプチドをコードするDNAを発現することができる。ペプチドを産生するために用いられる他の好ましい方法は、本発明のペプチドを産生するようにコードDNAの発現を引き起こすのに、および最終的に、培養物からペプチドを回収するのに効果的である条件下において、組換え宿主を培養することを含む。
【００９７】
発現は、原核生物および真核生物宿主において実施されうる。原核生物は、最も頻繁には、大腸菌(E. coli)の様々な菌株により代表される。しかしながら、桿菌、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)、シュードモナス属(Pseudomonas)の様々な種、または他の菌種のような、他の微生物菌株も用いられうる。そのような原核生物系において、宿主と適合性のある種由来の複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、大腸菌のための主力商品ベクターは、pBR322およびその派生体である。リボソーム結合部位配列と共に、任意でオペレーターを含む、転写開始のためのプロモーターを含む一般に用いられる原核生物の制御配列は、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびλ-由来PLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位のような一般に用いられるプロモーターを含む。しかしながら、原核生物発現と適合性のある任意の利用可能なプロモーター系が、使用に適している。
【００９８】
真核生物宿主において有用な発現系は、適切な真核生物遺伝子由来のプロモーターを含む。例えば、酵母において有用なプロモーターのクラスは、糖分解酵素の合成のためのプロモーター(例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼについてのもの)を含む。他の酵母プロモーターは、YEp13から得られるエノラーゼ遺伝子またはLeu2遺伝子由来のものを含む。適切な哺乳動物プロモーターは、SV40由来の初期および後期プロモーター、またはポリオーマ、アデノウイルスII、ウシパピローマウイルス、またはトリ肉腫ウイルス由来のもののような他のウイルスプロモーターを含む。適切なウイルスおよび哺乳動物のエンハンサーもまた、用いられうる。植物細胞が発現系として用いられる場合には、例えばノパリン合成プロモーターが適切である。
【００９９】
いったん、発現系が周知の制限およびライゲーション技術を用いて構築されたならば、適切な宿主細胞の形質転換は、そのような細胞に適した標準技術を用いてなされる。発現系を含む細胞は、ペプチドの産生に適切な条件下で培養され、ペプチドは、その後、回収および精製される。
【０１００】
好ましい態様において、インテグリンα4β1を特異的に結合する作用物質は、ペプチドがインテグリンα4β1に、αVβ3のような別のインテグリンに対するより、少なくとも約2倍大きい、より好ましくは少なくとも約5倍大きい、よりいっそう好ましくは少なくとも約10倍大きい、および最も好ましくは少なくとも約100倍大きい、インテグリンα4β1に対する特異性をもって結合する場合、本発明の方法において有用である。このように、インテグリンαVβ3に対するまたはαVβ5(PCT/US94/13542)に対するそれらの相対的に高い結合親和性に基づいて同定された様々なRGDおよびRLD含有ペプチドは、本明細書に定義されているように、インテグリンα4β1のそのリガンドへの結合のペプチドアンタゴニストとみなされない。
【０１０１】
インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害する例示的ペプチドは、非限定的に、
2007509042.tif 000012
(Xは任意のアミノ酸または修飾アミノ酸である)、(X)C＊(X)PC＊(SEQ ID NO:31)(Xは任意のアミノ酸である)、RC＊DPC＊(SEQ ID NO:32)、C＊WLDVC＊(SEQ ID NO:33)、YC＊APC＊(SEQ ID NO:34)およびYC＊DPC＊(SEQ ID NO:35)、およびフェニルアシル-C＊DfC＊(SEQ ID NO:36)(「f」はD-Pheである)(Jackson et al., J. Med. Chem. (1997) 40(21):3359-68)；RC＊D(ThioP)C＊(SEQ ID NO:37)(Nowlin et al., J. Biol. Chem. (1993) Sep 25, 268(27):20352-9)；9-フルオレンカルボキシルRC＊D(ThioP)C＊(SEQ ID NO:38)(Cardarelli et al., J. Biol. Chem. (1994) 269(28):18668-73)；EGYYGNYGVYA(SEQ ID NO:39)およびC＊YYGNC＊(SEQ ID NO:97)(＊は環化点を示す)；ならびにそれらの修飾体(Thorsett et al., Inhibitors of leukocyte adhesion (1996) WO9602644)；1-アダマンタンアセチル-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(SEQ ID NO:41)(Cardarelli et al., J. Biol. Chem. (1994) 269(28):18668-73)を含む。他の例示的なペプチドは、限定されるわけではないが、カーペットバイパー(Echis carinatus)由来のEC3、EC3のサブユニットであり、かつ配列
2007509042.tif 000013
を有するEC3B、EC3のペプチド断片；およびそれらの修飾体(Brando et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 267(1):413-417, およびMarcinkiewicz et al., J. Biol. Chem. (1999) 274(18):1 2468-73)；可溶性VCAM(Rose et al. (2000) Blood 95:602-609)；可溶性VCAM断片(Dudgeon et al., Eur. J. Biochem. (1994) 226(2):517-23)；VCAMペプチド配列RTQIDSPLN(SEQ ID NO:44)、TQIDSP(SEQ ID NO:45)、QIDS(SEQ ID NO:46)、IDSP(SEQ ID NO:47)およびKLEK(SEQ ID NO:48)(Clements et al., J. Cell Sci. (1994) 107(Pt 8):2127-35)により例示されるヘビのディスインテグリンを含む。
【０１０２】
インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害するさらなる例示的な修飾ペプチドは、ペプチド模倣体(すなわち、ペプチドの構造を模倣する有機分子)；またはビニル性ペプトイドのようなペプトイドを含む。本発明の範囲内である環状ペプチドおよびペプチド模倣体の例は、非限定的に、TBC722(Kogan et al., WO9600581)と名付けられた化合物のようなペプチド構造GPEYLDVP(SEQ ID NO:49)に基づいている、フェニルアセチルLDFp(Arrhenius et al., WO9515973; Arrhenius et al., WO9606108)を含むペプチド構造LDVP(SEQ ID NO:50)に基づいている、ペプチド構造ILDV(SEQ ID NO:51)(Dutta, WO9702289)、BIO1211(4-(2-メチルフェニルルリエド)フェニルアセチルLDVP)BIO1272(Lin et al., WO9200995; Lin et al., WO9622966)、CY9652 a CS-1ペプチド模倣体、TBC3342、ZD-7349(Curley et al., (1999) Cell. Mol. Life Sci., 56:427-441)；および他のもの(EP-842943-A2, WO9842656-A1, WO9620216-A1, WO9600581-A1, Souers et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2297-2302)に基づいているものを含む。例示的なペプチドおよび修飾ペプチドは、図5(Lin et al. (1999) J. Med. Chem., 42:920-934参照)、図6(Lin et al. (1998) Curr. Opin. Chem. Biol., 2:453-457参照)および図7(Souers et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2297-2302参照)に示されている。模倣体のライブラリーを作製するための方法、および受容体のそれらのリガンドへの結合を阻害することについて模倣体のライブラリーを評価するための方法は、当技術分野において公知である。(Souers et al. (1998)前記)。
【０１０３】
血管新生を低下させるα4β1アンタゴニストとして有用な他のペプチドは、商業的供給元から購入されうる、および化学合成の周知の方法を用いて調製されうるペプチドのライブラリーをスクリーニングすることにより同定されうる(Koivunen et al. J. Cell Biol., 124:373-380 (1994))。例えば、本明細書に具体的に開示されたもの以外のインテグリンα4β1のペプチドアゴニストは、全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Palladino et al.の米国特許第5,780,426号に記載されているようにファージディスプレイペプチドライブラリーをパニングすることによるような、当技術分野において公知の方法を用いて同定されうる。例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、小さな直径(1μm)のポリスチレンラテックスビーズのような固体支持体に付着したインテグリンα4β1受容体でパニングされる。この方法により選択されたファージは、その後、ELISAまたは他の免疫学的に基づいたアッセイ法により、インテグリンα4β1への特異的結合について試験されうる。個々のペプチド配列は、その後、ファージDNAのシーケンシングにより決定される。結合に必要とされる最小限のペプチド配列のさらなる分析は、欠失および部位特異的突然変異誘発、続いて、ELISAによりインテグリンα4β1への結合についてのファージの試験により、評価されうる。同定されるペプチド候補は、主要ファージコートタンパク質に融合されるため、可溶性ペプチドは、その後、化学合成され、これらの遊離ペプチドの活性は、インテグリンα4β1受容体のアンタゴニストとして作用する能力について様々なインビトロおよびインビボのアッセイ法で試験される。
【０１０４】
3. 核酸配列
代替の態様において、α4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害する作用物質は、核酸配列である。本明細書に用いられる場合の用語「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、お互いに共有結合性に連結されている2個以上のヌクレオチドを指す。この定義内に含まれるのは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびにそれらの断片および/または部分、一本鎖または二本鎖であり得、かつセンス鎖またはアンチセンス鎖を示すゲノム起源および/もしくは合成起源のDNAならびに/またはRNAである。本発明において特に有用である核酸配列は、非限定的に、アンチセンス配列およびリボザイムを含む。核酸配列は、インテグリンα4β1またはそのリガンドの1つもしくは複数をコードするゲノムDNA配列またはRNA配列に結合し、それにより、インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数との結合を阻害することが企図される。アンチセンスおよびリボザイム配列は、アンチセンス核酸またはmRNA分子としてのリボザイムを発現するベクターで細胞をトランスフェクションすることにより細胞へ送達されうる。または、送達は、リポソームにリボザイムおよびアンチセンス配列を捕捉することにより達成されうる。
【０１０５】
a. アンチセンス配列
アンチセンス配列は、インテグリンα4β1リガンドの1つであるVCAM1をコードする遺伝子(参照により全体として組み入れられる、米国特許第6,252,043号)を含む、いくつかの遺伝子(Markus-Sekura (1988) Anal. Biochem. 172:289-295; Hambor et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1237-1245; および特許EP 140 308)の発現を抑制するために用いることに成功した。本明細書で交換可能に用いられる場合の用語「アンチセンスDNA配列」および「アンチセンス配列」とは、デオキシリボヌクレオチド残基の配列が、DNA二重鎖のセンス鎖におけるデオキシリボヌクレオチド残基の配列に関して逆の5'から3'への配向にあるデオキシリボヌクレオチド配列を指す。DNA二重鎖の「センス鎖」は、自然状態における細胞により「センスmRNA」へ転写されるDNA二重鎖における鎖を指す。センスmRNAは、一般的には、最後に、ポリペプチドへ翻訳される。従って、「アンチセンスDNA配列」は、DNA二重鎖における非コード鎖と同じ配列を有し、かつ「アンチセンスRNA」(すなわち、配列が「センスmRNA」配列に相補的であるリボヌクレオチド配列)をコードする配列である。記号表示(-)(すなわち、「マイナス」)は、時々、アンチセンス鎖に関して用いられ、記号表示(+)は、時々、センス(すなわち、「プラス」)鎖に関して用いられる。アンチセンスRNAは、アンチセンスDNA配列を、アンチセンスRNAの合成を可能にするプロモーターへつなぎ合わせることによる合成を含む、任意の方法により作製されうる。転写されたアンチセンスRNA鎖は、細胞により産生された天然のmRNAと結合し、二重鎖を形成する。これらの二重鎖は、その後、mRNAのさらなる転写かもしくはその翻訳のいずれかをブロックする、またはその分解を促進する。
【０１０６】
任意のアンチセンス配列は、それが、(a)アンチセンスインテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンド配列で処理されていない、(b)センスインテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンド配列で処理されている、または(c)ナンセンス配列で処理されている対照組織におけるインテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンド発現の量より少ない量まで、インテグリンα4β1および/またはそのリガンド（例えばVCAMおよびフィブロネクチン）の1つもしくは複数のレベルを低下させることができる場合には、本発明の範囲内であることが考えられる。
【０１０７】
用語「インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンドの発現のレベルを低下させる」、「インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンド発現を減少させる」およびそれらの文法的相当語句は、インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンド発現のレベルを、好ましくは対照組織における量より20%少ない、より好ましくは対照組織における量より50%少ない、さらにより好ましくは対照組織における量より90%少ない、および最も好ましくは、インテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンドのウェスタンブロット分析、インテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンドの検出のための免疫蛍光、インテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンドmRNAの検出のための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、またはインテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンドmRNAの検出のためのインサイチューハイブリダイゼーションの、バックグラウンドレベルである、またはそれによっては検出できない量まで低下させることを指す。インテグリンα4β1もしくはインテグリンα4β1リガンドのペプチドまたはmRNAのバックグラウンドレベルまたは検出不能レベルが測定される場合、これは、インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンドが発現されていないことを示している可能性がある。インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンドのレベルの低下は、インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンドの発現の絶対的非存在を意味する場合もあるが、必要とはしない。本発明は、インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンドの発現を除去するアンチセンスインテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンド配列を必要とせず、かつ、これらに限定されない。
【０１０８】
インテグリンα4β1発現のレベルを低下させることができるアンチセンスインテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンド配列は、例えば、高ストリンジェント性または中位のストリンジェント性条件下で、インテグリンα4β1 cDNAまたはインテグリンα4β1リガンドcDNAの少なくとも一部とハイブリダイズすることができる配列を含む。本発明の範囲内のアンチセンスインテグリンα4β1配列およびアンチセンスインテグリンα4β1リガンド配列は、当技術分野において公知のアプローチを用いて設計されうる。好ましい態様において、アンチセンスインテグリンα4β1配列およびアンチセンスインテグリンα4β1リガンド配列は、それぞれ、インテグリンα4β1遺伝子およびインテグリンα4β1リガンド遺伝子のコード領域によりコードされるインテグリンα4β1 mRNAまたはインテグリンα4β1リガンドmRNAにハイブリダイズするように設計される。または、アンチセンスインテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンド配列は、上流非翻訳配列にハイブリダイズし、それによりプロモーターの転写因子への結合を阻止することにより転写を低減させるように設計されうる。
【０１０９】
好ましい態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、サイズが約8ヌクレオチド残基から約100ヌクレオチド残基までの範囲である。さらにより好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、サイズが約8ヌクレオチド残基から約30ヌクレオチド残基までの範囲である。最も好ましい態様において、アンチセンス配列は20ヌクレオチド残基を有する。
【０１１０】
しかしながら、本発明は、本明細書に開示されたオリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオチド残基の数に限定されることを意図されない。インテグリンα4β1のまたはインテグリンα4β1リガンドの発現を低下させることができる任意のオリゴヌクレオチド配列は、本発明の範囲内にあることを企図される。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、サイズが約3ヌクレオチド残基から全インテグリンα4β1またはインテグリンα4β1リガンドcDNA配列までの範囲でありうる。当業者は、配列独自性の程度が、長さの減少につれて減少し、それによりオリゴヌクレオチドのインテグリンα4β1 mRNAまたはインテグリンα4β1リガンドmRNAに対する特異性を低下させることを認識している。
【０１１１】
本発明の方法において有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド残基およびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド類似体は、例えば、変化した糖部分、変化した糖間結合(例えば、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の、イオウ含有結合、ホスホロチオネート結合、アルキルホスホロチオネート結合、N-アルキルホスホラミデート、ホスホロジチオネート、アルキルホスホネートおよび短鎖アルキルまたはシクロアルキル構造との置換)、または変化した塩基ユニットを含むヌクレオチド残基を含みうる。オリゴヌクレオチド類似体は、例えば、天然のホスホジエステル結合はヌクレアーゼ加水分解に抵抗性ではないため、生物学的条件下においてアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物の安定性を増加させることが望ましい。オリゴヌクレオチド類似体はまた、治療効果に必要とされるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を低減させ、それによりまた、処置の費用および可能性のある副作用を低減させるために、オリゴヌクレオチドのリポソームへの取り込み効率を向上させること、活性が調節されることになっている核酸配列が位置している細胞へ浸透する組成物の能力を増強させることが望ましくありうる。
【０１１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、当技術分野において公知の多数の方法のいずれかを用いて、および市販されているサービス(例えば、Genta, Inc.)を用いて、合成されうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、固体支持体および市販されているDNA合成機を用いて、行われうる。または、アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、標準ホスホラミデート化学技術を用いて合成されうる。例えば、ホスホジエステル結合の作製について、酸化はヨウ素を通して仲介されるが、ホスホロチオネートの合成については、酸化は、亜リン酸エステル結合の段階的チオ化としてアセトニトリルにおける3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン,1-ジオキシドで仲介される。チオ化段階の後に、キャッピング段階、固体支持体からの切断、およびHPLCにおける、例えば、PRP-1カラムおよび酢酸トリエチルアンモニウム、pH 7.0におけるアセトニトリルの勾配における、精製が続く。
【０１１３】
一つの態様において、アンチセンスDNA配列は、「インテグリンα4β1アンチセンスDNA配列」(すなわち、インテグリンα4β1ゲノム配列の少なくとも一部と、またはインテグリンα4β1 mRNAと結合するように設計されるアンチセンスDNA配列)である。インテグリンα4β1アンチセンスDNA配列の設計は、インテグリンα4サブユニットcDNA(図8および9)およびインテグリンβ1 cDNA(図10)の配列を利用できることにより容易にされる。特に好ましいアンチセンス配列は、リガンドの1つもしくは複数との特異的結合に関与するインテグリンα4β1の部分をコードするゲノムDNAと、またはRNAとハイブリダイズするものである。そのようなインテグリンα4β1部分は、限定されるわけではないが、配列
2007509042.tif 000014
を含む配列(図1参照)により例示される。
【０１１４】
もう一つの態様において、アンチセンスDNA配列は、「血管細胞接着分子アンチセンスDNA配列」、すなわち、VCAMゲノム配列の少なくとも一部と、またはVCAM mRNAと結合するように設計されているアンチセンスDNA配列である。これらのアンチセンス配列の選択および設計は、VCAM cDNA配列(図11)を利用できることにより可能となる。例示的な好ましいアンチセンス配列は、VCAMのインテグリンα4β1との特異的結合に関与しているVCAM(図3A、GenBankアクセッション番号P19320)の部分をコードするゲノムDNAと、またはRNAとハイブリダイズするものである。VCAMの少なくとも一部の例は、アミノ酸配列RTQIDSPLNG(SEQ ID NO:15)(アミノ酸60位からアミノ酸69位まで)；RTQIDSPLSG(SEQ ID NO:16)(アミノ酸348位からアミノ酸357位まで)、KLEK(SEQ ID NO:17)(アミノ酸103位からアミノ酸106位まで、およびアミノ酸391位からアミノ酸394位まで)、
2007509042.tif 000015
を含む。
【０１１５】
さらにもう一つの態様において、アンチセンスDNA配列は、「フィブロネクチンα4β1アンチセンスDNA配列」(すなわち、フィブロネクチンゲノム配列の少なくとも一部と、またはフィブロネクチンα4β1 mRNAと結合するように設計されているアンチセンスDNA配列)である。これらのアンチセンス配列の選択および設計は、フィブロネクチンcDNA(図12)についての配列を利用できることにより可能となる。標的にされうる例示的な核酸配列は、図4に示された以下の配列、アミノ酸1982位からアミノ酸2111位までのIIICS配列
2007509042.tif 000016
、アミノ酸配列LDV(SEQ ID NO:19)(アミノ酸2011位からアミノ酸2013位まで)を含むCS-1配列、アミノ酸配列
2007509042.tif 000017
を含むCS-5配列をコードするものである。
【０１１６】
b. リボザイム
いくつかの代替の態様において、インテグリンα4β1のそのリガンドへの特異的結合を阻害する作用物質はリボザイムである。リボザイム配列は、インテグリンα4β1リガンドの1つであるVCAM1をコードする遺伝子を含むいくつかの遺伝子の発現を阻害するために用いることに成功した(参照により全体として組み入れられる、米国特許第6,252,043号)。
【０１１７】
用語「リボザイム」は、基質RNAにおける相補配列にハイブリダイズし、基質切断部位で配列特異的様式で基質RNAを切断するRNA配列を指す。典型的には、リボザイムは、2つの「結合領域」に隣接した「触媒領域」を含む。リボザイム結合領域は、基質RNAにハイブリダイズし、一方、触媒領域は、「基質切断部位」で基質RNAを切断し、「切断RNA産物」を生じる。リボザイム結合領域のヌクレオチド配列は、リボザイム結合領域がハイブリダイズする基質RNA配列に完全に相補的、または部分的に相補的でありうる。完全相補性は、特異性および回転率(すなわち、切断RNA産物からのリボザイムの遊離の率)を増加させるためには好ましい。部分的相補性は、あまり好ましくはないが、約10個より多いヌクレオチドを含むリボザイム結合領域を設計するために用いられうる。主張された本発明の範囲内であることを企図されているが、部分的相補性は、一般的に、基質RNAに対して部分的相補性を有する結合領域は、基質RNAに対して完全な相補性を有する結合領域を含むリボザイムの特異性および回転率と比較した場合、リボザイムの特異性および回転率の低下を示すため、完全相補性より好ましくない。リボザイムは、部分的または完全な相補的DNA配列にハイブリダイズしうるが、リボザイム切断は、DNA配列上で利用できない標的分子上の2'-OHを必要とするため、ハイブリダイズしたDNA配列を切断することができない。
【０１１８】
リボザイムの基質切断部位で切断する能力は、当技術分野において公知の方法を用いて容易に測定されうる。これらの方法は、限定されるわけではないが、対照(例えば、リボザイムの非存在下において、またはリボザイムを基質RNAを切断することができないようにする一方もしくは両方の不対のヌクレオチド配列における突然変異を含むリボザイム配列の存在下において)におけるRNAのレベルと比較して、リボザイムが特異的であるリボザイム基質切断部位を含むRNAのインビトロまたはインビボのレベルの低下の検出(例えば、本明細書に記載されているようなノーザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、インサイチューハイブリダイゼーションなど)を含む。
【０１１９】
本発明の範囲内であることを企図されるリボザイムは、限定されるわけではないが、ハンマーヘッドリボザイム(例えば、Reddy et al., 米国特許第5,246,921号；Taira et al., 米国特許第5,500,357号、Goldberg et al., 米国特許第5,225,347号、それぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられる)、グループIイントロンリボザイム(Kruger et al. (1982) Cell 31:147-157)、リボヌクレアーゼP(Guerrier-Takada et al. (1983) Cell 35:849-857)、ヘアピンリボザイム(参照により組み入れられる、Hampel et al., 米国特許第5,527,895号)、およびデルタ肝炎ウイルスリボザイム(Wu et al. (1989) Science 243:652-655)を含む。
【０１２０】
リボザイムは、基質RNAが1つまたは複数の基質切断配列を含み、かつ基質切断部位に隣接する配列が知られている限り、任意の基質RNAにおいて基質切断部位で切断するように設計されうる。事実上、そのようなリボザイムのインビボでの発現、および結果として生じる、対象となる遺伝子のRNA転写産物の切断は、対応する遺伝子の発現を低下させる、または除去する。
【０１２１】
例えば、リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである場合、ハンマーヘッドリボザイム設計の基本的原理は、基質切断配列を含む基質RNAにおける領域の選択、基質切断配列に隣接する配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの2つの配列(すなわち、結合領域)の作製、および2つの結合領域間にハンマーヘッド触媒領域を形成する配列を置くことを含む。
【０１２２】
候補基質切断部位を含む基質RNAにおいて領域を選択するために、基質RNAの配列は、決定される必要がある。対象となるゲノム配列によりコードされるRNAの配列は、当技術分野において公知の方法を用いて容易に決定されうる。例えば、RNA転写産物の配列は、手作業でか、または入手可能なコンピュータプログラム(例えば、IntelliGenetic Inc.からのGENEWORKS、またはole@mango.mef.ki.seでのインターネットから入手できるRNADRAW)を用いるかのいずれかで、RNA転写産物をコードするDNA配列におけるTをUへ変えることにより、達成されうる。
【０１２３】
標的RNAにおける基質切断配列は、入手可能なコンピュータプログラムを用いてRNA配列を検索することにより位置を突きとめられうる。例えば、リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである場合、ハンマーヘッドリボザイムの触媒領域は、NUH(Nが任意のヌクレオチドであり、Uがウリジンであり、Hがシトシン(C)、ウリジン(U)またはアデニン(A)であるが、グアニン(G)ではない)を含む基質切断部位においてのみ切断することは、当技術分野において公知である。NUH切断部位におけるU-H二重項は、Gがリボザイムにおける隣接Cと対形成し、リボザイム切断を阻止するため、U-G二重項を含まない。典型的には、NはGであり、HはCである。結果として、GUCが、ハンマーヘッドリボザイムについて最も効率的な基質切断部位であることが見出されたが、CUCにおけるリボザイム切断もまた効率がいい。
【０１２４】
好ましい態様において、基質切断配列は、基質RNAのループ構造に、または不対領域に位置している。RNA二次構造形成の予測のためのコンピュータプログラムは、当技術分野において公知であり、例えば、「RNADRAW」、「RNAFOLD」(Hofacker et al. (1994) Monatshefte F. Chemie 125:167-188; McCaskill (1990) Biopolymers 29:1105-1119)、「DNASIS」(Hitachi)および「THE VIENNA PACKAGE」を含む。
【０１２５】
基質RNAのループ構造または不対領域に位置している基質切断配列を選択することの望ましさに加えて、基質切断配列が、翻訳された切り詰め型ポリペプチドが生物学的に機能的でなくなるように、翻訳開始コドン(AUGまたはGUG)の下流に(すなわち、3'末端に)位置していることも、必要ではないが、望ましい。
【０１２６】
好ましい態様において、リボザイムは、「インテグリンα4β1リボザイム」(すなわち、基質切断配列が、インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数との特異的結合に関与するインテグリンα4β1の部分とハイブリダイズするように設計されているリボザイム)である。そのようなインテグリンα4β1部分は、限定されるわけではないが、配列
2007509042.tif 000018
を含む配列(図1参照)により例示される。
【０１２７】
代替の態様において、基質切断配列は、インテグリンα4β1リガンドの部分とハイブリダイズするように設計され、その部分は、リガンドのインテグリンα4β1との特異的結合に関与している。
【０１２８】
より好ましい態様において、リボザイムは、「血管細胞接着分子リボザイム」(すなわち、基質切断配列が、VCAMのインテグリンα4β1との特異的結合に関与するVCAMの部分とハイブリダイズするように設計されているリボザイム)である。リガンドVCAM(図3A、GenBankアクセッション番号P19320)の例示的な部分は、アミノ酸配列RTQIDSPLNG(SEQ ID NO:15)(アミノ酸60位からアミノ酸69位まで)；RTQIDSPLSG(SEQ ID NO:16)(アミノ酸348位からアミノ酸357位まで)、KLEK(SEQ ID NO:17)(アミノ酸103位からアミノ酸106位まで、およびアミノ酸391位からアミノ酸394位まで)、
2007509042.tif 000019
を含む。
【０１２９】
代替の好ましい態様において、リボザイムは、「フィブロネクチンリボザイム」(すなわち、基質切断配列が、フィブロネクチンのインテグリンα4β1との特異的結合に関与するフィブロネクチンの部分とハイブリダイズするように設計されているリボザイム)である。例示的なリガンドフィブロネクチンの部分は、図4に示された以下の配列、アミノ酸1982位からアミノ酸2111位までのIIICS配列
2007509042.tif 000020
、アミノ酸配列LDV(SEQ ID NO:19)(アミノ酸2011位からアミノ酸2013位まで)を含むCS-1配列、アミノ酸配列REDV(SEQ ID NO:20)(アミノ酸2091位からアミノ酸2093位まで)を含むCS-5配列、IDAPS(SEQ ID NO:21)(アミノ酸1903位からアミノ酸1907位まで)、
2007509042.tif 000021
を含む。
【０１３０】
基質RNA分子に対するリボザイム切断の特異性は、基質切断部位に隣接し、かつリボザイム結合領域とハイブリダイズするヌクレオチドの配列により決定されることは当技術分野において公知である。従って、リボザイムは、結合領域が基質RNA上の任意の既知の配列とハイブリダイズするようにリボザイムのリボザイム触媒領域を囲む結合領域の配列を変えることにより、基質RNA分子内の異なる位置で切断するように設計されうる。
【０１３１】
結合領域の配列を、RNA基質における異なる位置への結合をもたらすように変えることに加えて、リボザイム結合領域のそれぞれにおけるヌクレオチドの数もまた、RNA基質における所定の位置に対するリボザイムの特異性を変化させるために変えられうる。結合領域におけるヌクレオチドの数は、好ましくは約5ヌクレオチドと約25ヌクレオチドの間、より好ましくは約11ヌクレオチドと約15ヌクレオチドの間、さらにより好ましくは約7ヌクレオチドと約10ヌクレオチドの間である。
【０１３２】
当業者は、リボザイム触媒領域に隣接する2つの結合領域は等しい長さであることは必要ではないことを認識している。ヌクレオチドの任意の数を含む結合領域は、RNA基質に対するリボザイムの所望の特異性およびRNA基質の所望の切断率が達成される限り、本発明の範囲内にあることを企図される。当業者は、より長いヌクレオチド配列の結合領域が、特定の基質RNA配列に対する特異性を増加させるが、切断後、基質RNAから解離して、もう一つの基質RNA分子と結合するリボザイムの能力を低下させ、それに従って、切断率を低下させうる。他方では、より短いヌクレオチド配列をもつ結合領域は、解離および切断のより高い率をもちうるが、基質切断部位に対する特異性は、損なわれる。
【０１３３】
所望の特異性および切断率が達成されるようにリボザイムの結合領域についての最適な長さを決定することは、十分、当技術分野の技術内である。基質RNAに対するリボザイムの特異性およびリボザイムによる基質RNAの切断率の両方は、例えば、ノーザンブロット分析またはヌクレアーゼプロテクションアッセイと組み合わせた動態学的研究により測定されうる。
【０１３４】
好ましい態様において、リボザイム結合領域と基質RNAの間の相補性は完全である。しかしながら、本発明は、結合領域が基質RNAとの完全な相補性を示すリボザイム配列に限定されない。基質切断部位に対するリボザイムの所望の特異性および基質RNAの切断率が達成される限り、相補性は部分的でもよい。従って、基質切断配列に隣接する領域における基質RNAとの実質的な塩基対形成が維持され、かつ基質切断配列との塩基対形成が最小である限り、塩基変化は、リボザイム結合領域の一方または両方においてなされうる。用語「実質的な塩基対形成」とは、ハイブリダイズした配列の塩基の約65%より多く、より好ましくは約75%より多く、およびさらにより好ましくは約90%より多くが塩基対形成であることを意味する。
【０１３５】
発現ベクターにより発現されるリボザイムの細胞内安定性を増加させることが望ましい場合がある。これは、リボザイム分子内に二次構造(例えば、ステム-ループ構造)を含むように発現されるリボザイムを設計することにより達成される。リボザイムを安定化させるのに適している二次構造は、限定されるわけではないが、ストランド内塩基対により形成されるステム-ループ構造を含む。リボヌクレアーゼ分解に対してリボザイムを保護するためのステム-ループ構造の使用に代わるものは、リボザイム配列の各末端におけるステムループの挿入による(Sioud and Drlica (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7303-7307)。リボザイムのリボヌクレアーゼ分解に対する感受性を低下させるのに有用である他の二次構造は、ヘアピン、バルジループ、内部ループ、多分枝ループ、および"Molecular and Cellular Biology," Stephen L. Wolfe (Ed.), Wadsworth Publishing Company (1993) p. 575に記載されているような偽結節構造を含む。さらに、エキソヌクレアーゼ分解がRNAの5'末端かまたは3'末端のいずれかで開始されるため、リボザイム分子の環化は、リボヌクレアーゼ分解から保護する。環化RNAを発現させる方法は、当技術分野において公知である(例えば、Puttaraju et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:4253-4258参照)。
【０１３６】
いったん、所望の結合領域、触媒領域およびヌクレアーゼ安定性をもつリボザイムが設計されたならば、リボザイムは、化学合成を含む任意の公知の手段により作製されうる。化学合成されたリボザイムは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどにより細胞へ導入されうる。好ましい態様において、リボザイムは、所望のリボザイム配列をコードする遺伝子を含む発現ベクターからの発現により産生される。
【０１３７】
4. 他の作用物質
本発明は、インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害する抗体、ペプチドおよび核酸配列を用いて、本明細書に例証されているが、本発明は、明確には、作用物質がインテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害することができる限り、他の作用物質(例えば、有機分子、無機分子など)をその範囲内に企図される。そのような作用物質は、競合的結合アッセイまたは細胞接着アッセイを用いて試験化合物のライブラリー(下記のように作成された)をスクリーニングすることにより同定されうる。競合的結合アッセイにおいて、例えば、インテグリンα4β1は、プラスチックマイクロタイタープレート上にコーティングされ、標識された公知のインテグリンα4β1リガンド(例えば、CS-1フィブロネクチンまたはVCAM)と接触させられる。試験化合物は、標識リガンドのインテグリンα4β1への結合を阻害するそれらの能力について試験される。そのような結合を阻害する化合物が、インテグリンα4β1のリガンドへの特異的結合を阻害することができる作用物質として同定される。
【０１３８】
または、細胞接着アッセイにおいて、標識された公知のインテグリンα4β1リガンド(例えば、CS-1フィブロネクチンまたはVCAM)は、培養プレート上にコーティングされ、インテグリンα4β1を発現する細胞を、試験化合物のライブラリーの存在下において20〜30分間、リガンドに接着するようにさせておく。インテグリンα4β1発現細胞のインテグリンα4β1リガンドのコーティングへの結合を阻害する化合物は、インテグリンα4β1のリガンドへの特異的結合を阻害する作用物質として同定される。
【０１３９】
C. インテグリンα4β1は、新血管形成中に、内皮幹細胞により例示されるような内皮前駆細胞の輸送を媒介する
血管内皮、平滑筋、ニューロンおよび筋肉を含む骨髄由来幹細胞は、修復を起こす組織の再増殖に寄与する(Asahara et al., Science 1997 Feb 14;275(5302):964-7; Jain et al., Cancer Cell 2003 Jun;3(6):515-6; Religa et al., Transplantation 2002 Nov 15;74(9):1310-5; Priller et al., J Cell Biol. 2001 Nov 26;155(5):733-8; LaBarge et al., Cell 2002 Nov 15;111(4):589-601)。造血幹細胞が進行中の組織修復の部位へホーミングする機構は明らかにされていないままである。ここで、本発明者らは、インテグリンα4β1(VLA-4)が、循環から血管新生の部位への内皮前駆細胞(EPC)の遊出を促進することを示している。血管新生中、インテグリンα4β1は、EPCの、活性化内皮におけるVCAMへの、およびこの内皮の下にあることが見出される、選択的にスプライシングされた組織(CS-1)フィブロネクチンへの接着を促進する。α4β1のアンタゴニストは、血管新生中、循環からのEPCの流出をブロックし、それにより、インビボで、成長因子および腫瘍誘導血管新生を抑制する。従って、α4β1は、造血幹細胞の新血管床への補充を制御することにより血管新生に寄与する。
【０１４０】
新血管形成は、創傷治癒に寄与する組織修復過程の重要な構成要素であるが、慢性的に刺激される場合、それはまた、腫瘍増殖および炎症性疾患のような病態において役割を果たす(Carmeliet et al., Nat Med. 2003 Jun;9(6):653-60; Carmeliet et al., Nature 2000 Sep 14;407(6801):249-57)。新血管形成は、2つの機構により生じることが考えられる。組織血管内の静止状態の内皮細胞の血管新生成長因子による活性化は、出芽による新しい血管の発生を促進する(Carmeliet et al., Nat. Med. 2003 Jun;9(6):653-60; Carmeliet et al., Nature 2000 Sep 14;407(6801):249-57)。第二機構は、骨髄由来内皮幹細胞の、虚血性肢または腫瘍のような新血管形成の部位へのホーミングを含む(Asahara et al., Science 1997 Feb前記; Jain et al., Cancer Cell 2003 Jun;3(6):515-6; Lyden et al., Nat. Med. 2001 Nov;7(11):1194-201; Takahashi et al., Nat. Med. 1999 Apr;5(4):434-8; Kawamoto et al., Circulation 2001 Feb 6;103(5)634-7; Hattori et al., J Exp Med 2001 May 7;193(9):1005-14; Kalka et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000 Mar 28;97(7):3422-7)。これらの骨髄由来幹細胞は、筋肉、脳、およびそれらが組織再生に関与する修復を起こしている他の組織へホーミングすることができる(Asahara et al., Science 1997 Feb前記; Jain et al., Cancer Cell 2003 Jun;3(6)515-6; Religa et al., Transplantation 2002 Nov 15;74(9):1310-5; Priller et al., J Cell Biol 2001 Nov 26;155(5):733-8; LaBarge et al., Cell 2002 Nov 15;111(4):589-601; Lyden et al., Nat Med 2001 Nov;7(11):1194-201; Takahashi et al., Nat Med 1999 Apr;5(4):434-8; Kawamoto et al., Circulation 2001 Feb 6;103(5):634-7; Hattori et al., J Exp Med 2001 May 7;193(9):1005-14; Kalka et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000 Mar 28;97(7):3422-7; Torrente et al., J Cell Biol 2003 Aug 4;162(3):511-20)。しかしながら、EPCのような骨髄由来幹細胞が循環から出て、組織修復過程に関与するために組織へ入る機構は、明らかにされていないままである。
【０１４１】
インテグリンα4β1のアンタゴニスト(抗体、ペプチドなど)は、骨髄由来幹細胞または前駆細胞が組織へ入るのを、血管内皮とのそれらの会合をブロックすることにより、および内皮より下の組織において細胞外マトリックスでのそれらの遊走をブロックすることにより、阻害する。これらのアンタゴニストは、造血幹細胞が、血管新生、アテローム性動脈硬化、再狭窄、炎症、癌、および造血幹細胞が役割を果たしている他の疾患に関与するのをブロックするために用いられうる。さらに、高親和性抗体、組換え可溶性VCAMまたはCS-1フィブロネクチンのようなα4β1に選択的に結合する試薬は、造血幹細胞を、それらが、増殖されて、損傷した心臓組織の修復、虚血性組織における血管新生の刺激、および先天性筋肉欠損の修復のような治療的適用のためにさらに用いられうるように、組織、骨髄、末梢血、臍帯血などから精製するのに用いられうる。最後に、血管内皮におけるVCAMを上方制御するサイトカインは、造血幹細胞が血管内皮に接着するための部位を供給することにより、造血幹細胞の組織への流入を促進するために用いられうる。
【０１４２】
現在、骨髄由来造血幹細胞は、筋肉、心臓、虚血性組織、神経の修復、および無数の他の創造できるかぎりの適用に用いるために研究中である。研究者は、精製または天然の骨髄由来造血幹細胞が正常組織へ入ることを示すことができるが、一般的に、それを組織へたどりつく細胞の数は少ない。さらに、骨髄由来造血幹細胞は、腫瘍増殖および血管新生、アテローム性動脈硬化および再狭窄のような病理学的過程に関与する。本明細書のデータ(実施例4〜15のような)は、これらの細胞が内皮を認識し、それに接着し、組織へ入る分子経路の同定を示している。さらになお、本発明者らは、造血幹細胞のホーミングを阻害または促進するためのいくつかの方法を決定した。
【０１４３】
インテグリンα4β1はまた、インビボでの免疫細胞輸送のエフェクターであるため、本明細書のデータ(実施例4〜15)は、α4β1が、「ヘマンジオブラスト」、HSCおよびEPC系統に共通の推定前駆体、により発現されうることを示唆している。本明細書のデータは、インテグリンα4β1が、組織修復過程において、内皮前駆細胞のより確立した内皮との相互作用を媒介することにより、重要かつ独特の役割を果たしていることを示す。インテグリンα4β1はまた、確立した血管からの内皮出芽を制御するにおいて重要な役割を果たしうる；新血管上でのその一過性発現は、血管新生過程の初期に機能的役割を示しうる。CD34陽性骨髄由来幹細胞は、インテグリンα4β1陽性であるため、このインテグリンが、組織修復中、他のCD34陽性幹細胞の組織への輸送を制御することは可能である。これらのデータは、インテグリンα4β1のアンタゴニストが、病的血管新生および腫瘍増殖、加えて造血幹細胞が重要な役割を果たしている他の病的状態を抑制するために用いられうることを示す。これらのデータはまた、造血幹細胞の修復を必要とする組織へのホーミングは、内皮をVCAMを発現するように刺激することにより、および造血幹細胞α4β1活性を刺激することにより、増強されうることを示唆する。
【０１４４】
造血幹細胞が循環から出て、組織へ入る機構についてほとんど知られていない。さらになお、この過程をブロックまたは増強するための方法は知られていない。従って、本発明は、造血幹細胞の組織へのホーミングをブロックまたは促進するための唯一知られている方法を提供する。本発明は、血管内皮についての造血幹細胞受容体であるインテグリンα4β1の阻害剤を用いることによりホーミングをブロックすることにおいて有用である。本発明はまた、内皮上の対受容体（counter-receptor）であるVCAMを発現させることにより(成長因子または炎症性サイトカインを領域の血管構造に投与することにより)ホーミングを刺激することにおいて有用である。
【０１４５】
インテグリンα4β1の抗体、ペプチドまたは有機分子の阻害剤は、インビボで、造血幹細胞が、組織に入って、癌、関節炎および新生血管性眼疾患、アテローム性動脈硬化、再狭窄などにおける病的血管新生のような異常型組織修復過程に関与するのを阻害するために用いられうる。修復を必要とする組織の内皮におけるVCAM発現の刺激は、造血幹細胞の組織へのホーミングを促進するために用いられうる。最後に、高親和性でα4β1を結合する試薬は、治療的適用に用いるための造血幹細胞を精製または単離するために用いられうる。
【０１４６】
本明細書のデータ(例えば、実施例4〜15)は、α4β1を阻害することが、血管新生(成長因子および腫瘍誘導性)をブロックする、インビトロで内皮幹細胞増殖をブロックする、インビトロで内皮幹細胞の内皮への接着をブロックする、およびインビボで内皮幹細胞の内皮への補充をブロックすることを示している。本明細書のデータ(例えば、実施例4〜15)はまた、すべての骨髄由来幹細胞(CD34陽性マーカーの発現により同定されうる)がα4β1を発現させ、α4β1をブロックすることが、追加の幹細胞が内皮に接着して組織に入るのをブロックすることを現在、示しつつある。これらの研究は、幹細胞の追加のマーカーと組み合わせてα4β1発現を用いることの、幹細胞を単離する可能性を示している。
【０１４７】
本発明は、インテグリンα4β1の阻害を利用することにより有用である：造血幹細胞の疾患への寄与をブロックすることによる、腫瘍増殖の抑制、関節炎、眼疾患および乾癬のような他の新血管性疾患の抑制、アテローム性動脈硬化および再狭窄の抑制。
【０１４８】
本発明はまた、α4β1についての対受容体である内皮上のVCAMの発現を誘導することにより造血幹細胞の組織への流入の増強を利用することにより有用である：虚血性疾患(心臓発作、糖尿病)における血管新生の増強、神経筋疾患における筋肉修復および神経修復の増強、他の型の組織修復を増強すること。本発明はまた、インテグリンα4β1選択を用いて造血幹細胞を単離するのに有用である。
【０１４９】
D. 造血前駆細胞の接着、遊走および分化を変化させること
本発明はさらに、インテグリンα4β1のそのリガンドへの特異的結合を変化させる作用物質を用いることにより、HPCの標的組織への接着および/または遊走を変化させるための、ならびにHPCの二次細胞型への分化を変化させるための方法を提供する。本発明は、インテグリンα4β1(VLA-4)が、新血管構造上に発現されている、α4β1リガンド、血管細胞接着分子(VCAM)および細胞性フィブロネクチン、への例示的な循環造血幹細胞のホーミングを促進するという驚くべき発見を少なくとも一部分、前提としている(実施例17〜24)。インテグリンα4β1を発現するCD34+幹細胞は、活発な新血管形成の部位へホーミングしたが、正常組織へはしなかった。インテグリンα4β1のアンタゴニストは、例示的な造血幹細胞のインビトロおよびインビボでの内皮への接着、ならびに新血管へのそれらの成長をブロックした(実施例17〜24)。
【０１５０】
本明細書に用いられる場合の用語「細胞接着」は、細胞外マトリックス(例えば、フィブロネクチン、コラーゲンI-XVIII、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、オステオポンチン、Del 1、テネイシン、フォンビルブラント因子など)の1もしくは複数の構成要素への、細胞表面上に発現されているリガンド(例えば、VCAM、ICAM、LI-CAM、VE-カドヘリン、インテグリンα2、インテグリンα3など)への、および/または、同じ型の(例えば、HPCのもう一つのHPCへの接着)もしくは異なる型の(例えば、HPCの、内皮細胞、内皮幹細胞、CD34を発現する幹細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、腫瘍細胞など)もう一つの細胞への、細胞の物理的接触を指す。
【０１５１】
用語「細胞接着を低下させること」とは、接着のレベルを、対照細胞における量より、好ましくは10%少ない、より好ましくは50%少ない、さらにより好ましくは75%少ない、よりいっそう好ましくは90%少ない、および最も好ましくは、対照細胞において観察される同じレベルである量で低下させることを指す。細胞接着のレベルの低下は、細胞接着の絶対的欠如を意味する場合もあるが、その必要性はない。本発明は、完全に細胞接着を排除する方法を必要とせず、かつそれに限定されない。細胞接着のレベルは、本明細書に開示された方法および当技術分野において公知の他のもの(例えば、VarnerのWO 03/019136 A3)を用いて測定されうる。
【０１５２】
本明細書に用いられる場合の用語「細胞遊走」とは、細胞外マトリックスの1つもしくは複数の構成要素(例えば、フィブロネクチン、コラーゲンI-XVIII、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、オステオポンチン、Del 1、テネイシン、フォンビルブラント因子など)を横切って、ならびに/または同じ型のもう一つの細胞の(例えば、もう一つのHPCに沿ってのHPCの遊走)、および/もしくは異なる細胞の(例えば、内皮細胞、内皮幹細胞、CD34を発現する幹細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、腫瘍細胞などに沿ってのHPCの遊走)、表面に沿っての細胞の転位置を指す。従って、細胞の「経内皮遊走」とは、細胞外マトリックスの1つもしくは複数の構成要素および/または内皮組織の細胞を横切っての細胞の転位置を指す。
【０１５３】
用語「細胞遊走を低下させること」とは、細胞の遊走のレベルを、対照細胞における量より、好ましくは10%少ない、より好ましくは50%少ない、さらにより好ましくは75%少ない、およびよりいっそう好ましくは90%少ない、ならびに最も好ましくは、対照細胞において観察される同じレベルである量で低下させることを指す。細胞遊走のレベルの低下は、細胞遊走の絶対的欠如を意味する場合もあるが、その必要性はない。本発明は、完全に細胞遊走を排除する方法を必要とせず、かつそれに限定されない。細胞遊走のレベルは、本明細書に開示された、および経時的ビデオ顕微鏡検査法、掻爬型創傷アッセイなどのような当技術分野において公知の(例えば、VarnerのWO 03/019136 A3)方法を用いて測定されうる。
【０１５４】
試料における対象となる細胞に関する場合の「分化のレベル」とは、分化した細胞(例えば、それぞれ、B220マーカーを発現するB細胞、CD3マーカーを発現するT細胞、およびCD11bを発現する骨髄性細胞)により発現される同じマーカーの細胞あたりの量と比較した、発現された分化マーカー(例えば、B220、CD3、CD11bなど)の対象となる細胞(例えば、造血前駆細胞)あたりの量を指す。
【０１５５】
用語「細胞分化を低下させること」とは、細胞の分化のレベルを、対照細胞における量より、好ましくは10%少ない、より好ましくは50%少ない、さらにより好ましくは75%少ない、およびよりいっそう好ましくは90%少ない、ならびに最も好ましくは、対照細胞において観察される同じレベルである量で低下させることを指す。細胞分化のレベルの低下は、細胞分化の絶対的欠如を意味する場合もあるが、その必要性はない。本発明は、完全に細胞分化を排除する方法を必要とせず、かつそれに限定されない。細胞分化のレベルは、本明細書に開示された、および当技術分野において公知の方法を用いて測定されうる。
【０１５６】
E. 造血前駆細胞の接着、遊走および分化を変化させること
本発明は、対象における組織において、α4β1のそのリガンド(例えば、フィブロネクチンおよびVCAM)の1つまたは複数への結合を変化させることにより、対象においてHPC接着、遊走および/または分化を変化させるための方法を提供する。一つの態様において、対象は、血管新生性疾患においてのような、望ましくないHPC接着、遊走および/または分化に関連している状態をもつ。用語「血管新生性疾患」は、少なくとも一部分、新血管形成により特徴付けられる任意の状態を意味するように本明細書で広く用いられる。対照的に、「非血管新生性疾患」は、新血管形成と関連していない状態である。血管新生は、正常な血管新生過程(例えば、創傷治癒中の瘢痕形成または受胎中)、ならびに、限定されるわけではないが、新生物、新血管形成と関連した糖尿病性網膜症および黄斑変性症のような眼疾患、乾癬および血管腫のような皮膚疾患、歯肉炎、関節リウマチおよび変形性関節症、および炎症性腸疾患により例示される病的状態を含む、眼組織(例えば、網膜、黄斑または角膜)において、乾癬で生じるような皮膚において、滑膜組織において、骨において、腸組織において、または腫瘍において生じるもののような病的状態に関連している血管新生を含む。
【０１５７】
もう一つの態様において、対象は新生物をもつ。用語「新生物」および「腫瘍」は、一部分、血管新生により特徴付けられる組織増殖を指す。新生物は、良性である場合があり、限定されるわけではないが、血管腫、神経膠腫、奇形種などに例示される。新生物は、または悪性である場合があり、例えば、癌腫、肉腫、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などである。
【０１５８】
用語「悪性新生物」および「悪性腫瘍」は、少なくとも1つの癌細胞を含む新生物を指す。「癌細胞」は、以前に記載されているように(H.C. Pitot (1978) "Fundamentals of Oncology," Marcel Dekker (Ed.), New York pp15-28)、多段階新生物進行の初期、中間期、または進行期を起こしている細胞を指す。新生物進行の初期、中間期および進行期の特徴は、顕微鏡法を用いて記載されている。新生物進行の3つの期のそれぞれにおける癌細胞は、一般的に、転座、逆位、欠失、同腕染色体、一染色体、および染色体外を含む、異常な核型を有する。悪性進行の初期における細胞は、「過形成性細胞」と呼ばれ、無制御におよび/または同じ組織における同じ細胞型の正常細胞より速い速度で分裂することにより特徴付けられる。増殖は、遅い場合も速い場合もあるが、衰えずに続く。新生物進行の中間期は、「異形成細胞」と呼ばれる。異形成細胞は未熟上皮細胞に似ており、一般的に組織内で空間的に組織崩壊され、その特定化された構造および機能を喪失している。新生物進行の中間期中、上皮の増加するパーセンテージは、異形成細胞から構成されるようになる。「過形成」および「異形成」細胞は、「前癌(pre-neoplastic)」細胞と呼ばれる。新生物進行の進行期において、異形成細胞は「腫瘍(neoplastic)」細胞になる。腫瘍細胞は、典型的には、それらが1つまたは複数の二次癌を惹起する身体における他の位置への浸潤性である(すなわち、それらは、隣接組織に侵入するか、または原発部位から脱落し、血液およびリンパの中を循環するかのいずれかである)(すなわち、「転移」)。従って、用語「癌」は、転移性である場合もあるし転移性でない場合もあるが、悪性新生物を指すように本明細書で用いられる。本発明の方法を用いて診断されうる悪性新生物は、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頚癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌(例えば、黒色腫、基底細胞癌、カポジ肉腫など)、筋肉癌、心臓癌、肝臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、睾丸癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髄癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳癌、ニューロン癌、中皮腫、胆嚢癌、眼癌(例えば、角膜の癌、ブドウ膜の癌、脈絡膜の癌、黄斑の癌、硝子体液癌など)、関節癌(例えば、滑膜癌)、神経膠芽細胞腫、リンパ腫、および白血病を含む。悪性新生物はさらに、肉腫(骨肉腫およびカポジ肉腫のような)により例示される。本発明は、明確には、新生物が、少なくとも一部分、新しく生じている血管によるα4β1発現と関連した血管新生により特徴付けられる限り、任意の悪性新生物をその範囲内に企図する。
【０１５９】
用語「病的状態の重症度を低下させること」、「病的状態の重症度を減少させること」および「病的状態に付随した症状を低減させること」は、病的状態に付随した有害な臨床的徴候または症状が、特定の組成物または方法での処置の非存在下における病的状態のレベルと比較して、低下する、遅延するまたは除去されることを意味する。病的状態の重症度を減少させることの効果は、限定されるわけではないが、血管造影法、超音波評価、蛍光透視像化、光ファイバー内視鏡検査、生検および組織像、相対的な酵素レベルまたは循環している抗原もしくは抗体を測定するために用いられうる血液検査、新生物の増殖速度またはサイズにおける減少を検出するために用いられうる画像化検査、または糖尿病患者の網膜における血管の数の低下を同定するために用いられうる眼科手順を含む、当業者にとって日常的な方法により測定されうる。そのような臨床検査は、処置されることになっている特定の病的状態に基づいて選択される。例えば、本発明の方法は、結果として、対照腫瘍組織(例えば、本発明の方法の前の同じ腫瘍、または対照の被験者における異なる腫瘍)と比較して、「腫瘍組織の低減」(例えば、腫瘍組織のサイズ、重さおよび/または容積における減少)を生じる。病的状態の重症度における低下はまた、処置されることになっている患者により作成されたコメント、例えば、関節炎に罹っている患者が、痛みを感じるのがより少ない、もしくは関節可動性がより大きいこと、または新血管形成による糖尿病性網膜症もしくは黄斑変性症をもつ患者がより明瞭に見ることができることなど、に基づいて検出されうる。
【０１６０】
本発明の方法での予防および/または処置を受け入れられる病的状態は、組織における発生または進行がHPC接着、遊走および/または分化を含んでいる任意の病的状態を含む。例示的な病的状態は、例えば、固形腫瘍癌、固形腫瘍転移、血管線維腫、皮膚癌、水晶体後線維増殖症、カポジ肉腫、小児血管腫、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、乾癬、歯肉炎、関節リウマチ、変形性関節症、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、およびアテローム斑を含む。
【０１６１】
他の病的状態は、組織への損傷を伴うものを含む。組織に関しての用語「損傷した」とは、組織の細胞構成が、正常組織における細胞構成と比較して変化している組織を指す。そのような損傷は、結果として、例えば、偶発的な切り傷、またはやけど、手術に関連した切り傷などのような皮膚組織の破壊(例えば、切り傷、深傷、裂傷)に起因しうる。損傷した組織は、肺、乳房、前立腺、頸部、膵臓、結腸、卵巣、胃、食道の癌、口腔癌、舌癌、歯肉、筋肉などを含む。特に、望ましくない瘢痕組織の形成に関連している皮膚損傷は、特に、本発明の治療的アプローチを受け入れられる。
【０１６２】
インテグリンα4β1のα4β1リガンドへの結合を変化させるにおいて有用である作用物質は、例えば、経口で、鼻腔内に、または、静脈内に、筋肉内に、皮下に、眼窩内に、嚢内に、滑液嚢内に、腹腔内に、槽内にを含む非経口で、または、例えば、皮膚パッチもしくはイオンフォレーゼを用いる、皮膚を通しての受動的もしくは促進された吸収により、を含む様々な経路により投与されうる。さらになお、作用物質は、注射、挿管法により、坐剤を通して、経口でまたは局所的に、投与され得、後者は、例えば、作用物質を含む軟膏もしくは粉末の直接的適用により受動的に、または、例えば、鼻腔用スプレーもしくは吸入器を用いて能動的でありうる。作用物質はまた、必要に応じて、局所的スプレーとして投与され得、その場合、組成物の1つの成分は適切な高圧ガスである。薬学的組成物はまた必要に応じて、リポソーム、ミクロスフェアまたは他の重合体マトリックスへ取り込まれうる(Gregoriadis, "Liposome Technology," Vol. 1, CRC Press, Boca Raton, FL 1984)。例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製および投与するのに比較的簡単な、非毒性で、生理学的に受け入れられ、かつ代謝可能な担体である。リポソームは、他の脂質担体粒子と同様に化学作用物質を取り込むことができる、脂質二重層を有する脂質含有ベシクルである。リポソームは、1つまたは複数のリン脂質で作製されうるが、任意でステロールのような他の物質を含む。適切なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、および当技術分野において周知である多くの他のものを含む。リポソームは、単ラメラ、多重ラメラでありうる、または定義されていないラメラ構造をもちうる。例えば、転移性癌腫を患っている個体において、薬学的組成物における作用物質は、静脈内に、経口で、または作用物質を全身性に分配する別の方法により、投与されうる。
【０１６３】
インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害する作用物質は、他の治療と併用して投与されうる。例えば、癌治療の場合、作用物質は、固形腫瘍に対して、および転移の確立の制御のために向けられる通常の薬物療法ならびに/または化学療法と併用して投与されうる。一つの態様において、作用物質は、化学療法中または後に投与されうる。より好ましい態様において、作用物質は、化学療法後、腫瘍組織が毒性攻撃に応答しようとしている時に、投与される。腫瘍は、血液供給および栄養分の腫瘍組織への供給により回復するように血管新生を誘導しようと試みる。そのような回復は、インテグリンα4β1のそのリガンドの1つまたは複数への特異的結合を阻害することにより血管新生を阻害する作用物質の投与により阻まれる。代替の態様において、作用物質は、固形腫瘍が、将来的転移に対する予防として除去された手術後に投与されうる。
【０１６４】
一つの態様において、作用物質は、「治療量」で(すなわち、所望の結果に達するのに十分である量で)投与される。特に、治療量は、対象の組織においてα4β1インテグリンのその特異的リガンドへの特異的結合を阻害する、および結果として、対象において望ましくない病理学的効果の低減、遅延または除去を生じる、量である。当業者は、「治療的有効」量が、用いられる治療剤、対象の年齢、状態、および性別に、ならびに対象における疾患の程度に依存して変わることを認識している。一般的に、用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などのような有害な副作用を引き起こすほど多くあるべきではない。用量はまた、所望の治療的目標に達するように個々の医師または獣医により調整されうる。
【０１６５】
治療量は、当技術分野において公知のインビトロおよびインビボのアッセイを用いて測定され得、一般的には、約0.0001〜100 mg/kg体重である。
【０１６６】
作用物質が投与される「対象」は、限定されるわけではないが、ヒト、およびサル、齧歯類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、ネコ、鳥類などのような非ヒトの動物を含む、組織において血管新生を発生する能力がある任意の動物を含む。好ましい非ヒトの動物は、齧歯目のメンバー(例えば、マウスおよびラット)である。従って、本発明の化合物は、ヒトの健康についての専門家および獣医により投与されうる。
【０１６７】
F. インテグリンα4β1を発現する造血前駆細胞の検出
本発明は、さらに、インテグリンα4β1ポリペプチドおよび/またはインテグリンα4β1 mRNAへ特異的に結合する作用物質を用いることにより、インテグリンα4β1を発現するHPCを検出するための方法を提供する。これらの方法は、接着、遊走および分化が本発明の方法を用いる調節を受け入れられるHPCの存在を、そのようなHPCが正常組織に位置しているかまたは病的状態に関与する組織に位置しているかにかかわらず、同定するために有用である。それとして、本発明は、インテグリンα4β1を発現するHPCの関与により特徴付けられる病的状態を診断する方法をさらに提供する。
【０１６８】
インテグリンα4β1ポリペプチドは、ウェスタンブロット分析または免疫蛍光を用いて検出されうる。または、インテグリンα4β1 mRNAの存在は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)またはインサイチューハイブリダイゼーションを用いて検出されうる。
【０１６９】
一つの態様において、インテグリンα4β1ポリペプチドおよび/またはmRNAの存在を検出する際に用いられる作用物質は、例えば、作用物質の特異的結合がインビボで検出されることになっているかどうか、または作用物質が結合するのではないかと疑われる組織が取り出されて(例えば、生検により)エクスビボで検査されることになっているかどうかに基づいて選択される部分へ作用物質を連結することにより検出可能に標識されうる。
【０１７０】
作用物質アンタゴニストを標識するのに有用な部分は、放射線核種、常磁性体、X線減衰物質、蛍光の、化学ルミネセンスのもしくはルミネセンスの分子、ビオチンのような分子、または特定の試薬との反応で可視化されうる分子、例えば、酵素についての基質、もしくは抗体についてのエピトープでありうる。部分は、一部分、作用物質および部分の化学的性質に基づいて選択される、周知の方法を用いて作用物質に連結されうる。例えば、部分がヘキサヒスチジン(His6)配列のようなアミノ酸配列であり、かつ作用物質がペプチドである場合、His6配列は、そのペプチドの一部として合成され得、His6標識作用物質は、His6部分へのニッケルイオン試薬の結合により同定されうる。
【０１７１】
部分を作用物質へ化学的に連結するための方法もまた利用されうる。例えば、多糖をペプチドに結合するための方法は、結合試薬としてスクアリン酸ジエステル(1,2-ジエトキシシクロブテン-3,4-ジオン)を用いてNaIO4活性化オリゴ糖へα-またはε-アミノ基を介して結合すること、多糖が還元末端を有し、かつカルボキシル基を含まない場合、ペプチドリンカーを介して結合すること(米国特許第5,342,770号)、ヒト熱ショックタンパク質hsp65由来の合成ペプチド担体と結合すること(米国特許第5,736,146号)、および米国特許第4,639,512号の方法を用いることにより例示されるが、限定されるわけではない。タンパク質をタンパク質に結合するための方法は、ヒト熱ショックタンパク質hsp65由来の合成ペプチド担体と結合すること(米国特許第5,736,146号)、ペプチドを抗体に結合するために用いられる方法(米国特許第5,194,254号；第4,950,480号)、ペプチドをインスリン断片に結合するために用いられる方法(米国特許第5,442,043号)、米国特許第4,639,512号の方法、およびEDAC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)仲介アミド形成を用いて環状デカペプチドポリミキシンB抗生物質をIgG担体に結合する方法(Drabick et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:583-588)を含む。それぞれが参照により全体として組み入れられる米国特許第5,574,142号；第6,117,631号；第6,110,687号に記載されているもののような、核酸をタンパク質に結合するためのアプローチも当技術分野において公知である。脂質をペプチドに結合するための方法は、限定されるわけではないが、還元アミノ化および第2級または第3級アミンを含むエーテル結合の使用(米国特許第6,071,532号)、米国特許第4,639,512号の方法、ペプチドを単ラメラリポソームへ共有結合性に結合するために用いられる方法(Friede et al. (1994) Vaccine 12:791-797)、ヘテロ二官能性試薬N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)を用いてヒト血清アルブビンをリポソームへ結合する方法(Kamps et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1278:183-190)、リン脂質-ポリ(エチレングリコール)-マレイミドアンカーを用いて抗体Fab'断片をリポソームへ結合する方法(Shahinian et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239:157-167)、およびシステイン-セリンスペーサーアミノ酸を介してマラリア原虫(Plasmodium)CTLエピトープをパルミチン酸へ結合する方法(Verheul et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:219-226)を含め、当技術分野において記載されている。
【０１７２】
特異的に結合した作用物質は、放射性核種イメージング法、ポジトロン放出断層撮影法、コンピュータ体軸断層撮影法、X線もしくは磁気共鳴イメージング法のようなインビボのイメージング方法を用いて個体において検出されうる、または、投与後、組織の試料が個体から得られ、試料における作用物質の特異的結合が検出される(例えば、免疫組織化学的分析により；VarnerのWO 03/019136 A3参照)、エクスビボの方法を用いて検出されうる。
【０１７３】
試料においてα4β1インテグリンに特異的に結合している作用物質は、作用物質を検出することにより直接的に、または放射性核種部分により放射される放射能を検出することによるような部分の存在を検出することにより間接的に、検出されうる。特異的に結合した作用物質はまた、作用物質と、または作用物質に連結した部分と特異的に相互作用する試薬にそれをさらに接触させ、試薬の作用物質または標識との相互作用を検出することにより間接的に検出されうる。例えば、部分は、特に、部分が作用物質に連結されている場合、部分を特異的に結合する抗体にそれを接触させることにより検出されうる。部分はまた、例えば、その存在が検出されうるように、部分と相互作用して部分を変化させる酵素により接触される基質でありうる。そのような間接的検出系は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼなどのような酵素の使用を含むが、当技術分野において周知であり、市販されており、特定の部分を作用物質の特定の型に組み入れるまたは連結するための方法も同様である。
【０１７４】
G. 化合物のスクリーニング
本発明はまた、以下の段階を含む、造血細胞の標的組織への接着および/または遊走のレベルを変化させるための、ならびに造血前駆細胞の二次細胞型への分化を変化させるための試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する：i)インテグリンα4β1を含む第一組成物、ii)1つまたは複数のインテグリンα4β1リガンドを含む第二組成物、iii)試験化合物と供給する段階、b)その試験化合物をその第一組成物およびその第二組成物の1つまたは複数と、そのインテグリンα4β1のそのインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のための条件下で、接触させる段階、ならびにc)その試験化合物の非存在下においてと比較して、その試験化合物の存在下におけるそのインテグリンα4β1のそのインテグリンα4β1リガンドとの特異的結合のレベルの変化を検出し、それにより、その試験化合物を、造血細胞の標的組織への接着および/または遊走のレベルを変化させるとして、および造血前駆細胞の二次細胞型への分化を変化させるとして、同定される段階。
【０１７５】
組織は、インビボまたはエクスビボで作用物質と接触させられうる(例えば、参照により組み入れられる、米国特許第5,622,699号を参照)。本発明のスクリーニング方法がインビトロ形式を用いて行われる場合、それは自動化手順に適応させられ得、それに従って、HPC接着、遊走および/または分化を変化させることができる可能性のあるα4β1アンタゴニストを同定するために分子のライブラリーを調べるための高処理量スクリーニングアッセイを可能にする。
【０１７６】
または、スクリーニングアッセイは、単離されたHPCを試験化合物と接触させ、HPC接着、遊走および/または分化のレベルの変化を検出し、それにより、化合物を、HPC接着、遊走および/または分化のレベルを変化させるとして同定することにより、行われる。
【０１７７】
試験化合物は、分子のライブラリーを調製するための技術分野公知の方法により作成され得、オリゴヌクレオチドライブラリー(参照により組み入れられる、Gold et al., 米国特許第5,270,163号)；ペプチドライブラリー(Koivunen et al., 前記, 1993, 1994)；ペプチド模倣体ライブラリー(Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92 (1995))；オリゴ糖ライブラリー(York et al., Carb. Res. 285:99-128 (1996); Liang et al., Science 274:1520-1522 (1996);およびDing et al., Adv. Expt. Med. Biol. 376:261-269 (1995))；リポタンパク質ライブラリー(de Kruif et al., FEBS Lett., 399:232-236 (1996))；糖タンパク質もしくは糖脂質ライブラリー(Karaoglu et al., J. Cell Biol. 130:567-577 (1995))；または、例えば、薬物もしくは他の医薬品を含む化学物質ライブラリー(参照により組み入れられる、Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994); Ecker and Crook, Bio/Technology 13:351-360 (1995), 米国特許第5,760,029号)を調製するための方法により例示される。多様な分子のライブラリーもまた商業的供給源から得られうる。
【０１７８】
H. 造血前駆細胞の単離
本発明はさらに、HPCを含む組織を、インテグリンα4β1への特異的結合の能力がある作用物質(例えば、抗体)で処理し、作用物質が結合するHPCを単離することにより組織からHPCを単離するための方法を提供する。これらの方法は、HPCがインテグリンα4β1を発現するという本発明者らの発見に部分的に基づいている。
【０１７９】
一つの態様において、HPCは、内皮前駆細胞(EPC)を含む。EPCは血管新生を制御するにおいて有用である(参照により組み入れられる、Isner et al., 米国特許第5,980,887号)。異種の、同種のおよび自家の内皮細胞前駆体移植片は、インビボで、活発な血管新生または血管損傷の部位へと合体する(すなわち、それらは、そのような位置へ選択的に遊走する)(Isner et al., 米国特許第5,980,887号)。内皮細胞前駆体は、例えば、末梢血、骨髄および臍帯血を含む多数の組織に存在している。内皮細胞前駆体は、内皮細胞前駆体を含む組織(例えば、末梢血、骨髄、臍帯血など)を、インテグリンα4β1ポリペプチドの少なくとも一部への特異的結合の能力がある抗体で処理し、続いて、抗体に結合する細胞を単離することによる本発明の方法に従って単離されうる。単離された細胞の内皮細胞前駆体性質は、単離された細胞の表面上における内皮細胞前駆体特異的抗原(例えば、CD34、flk-1、および/またはtie-2)の存在を、これらの抗原に対する市販されている抗体を用いて測定することにより確認されうる。内皮細胞前駆体を含む組織を処理する前に、インビボで内皮細胞前駆体を、補充成長因子(例えば、GM-CSFおよびIL-3)の患者への投与により増殖させることが、必要ではないが、望ましくありうる。
【０１８０】
従って、一つの態様において、単離された内皮細胞前駆体は、血管新生を促進するために、または血管新生モジュレーター(例えば、それぞれに、抗血管新生作用物質または血管新生促進作用物質)を病的もしくは効用的血管新生の部位へ送達するために用いられうる。さらに、もう一つの態様において、内皮細胞前駆体は、損傷した血管の再内皮化を誘導し、それに従って、平滑筋細胞増殖を間接的に阻害することにより再狭窄を低減させるために用いられうる(Isner et al., 米国特許第5,980,887号)。
【０１８１】
一つの好ましい態様において、内皮細胞前駆体は、血管新生について患者を増強するように単独で用いられうる。いくつかの患者集団、典型的には高齢の患者は、限られた数の内皮細胞または限られた数の機能しうる内皮細胞のいずれかをもちうる。従って、血管新生を促進すること、例えばVEGFのような強力な血管新生を用いることにより血管形成を刺激することを望む場合には、そのような血管形成は内皮細胞の欠乏により制限されうる。しかしながら、内皮細胞前駆体を投与することにより、それらの患者において血管形成を増強することができる。
【０１８２】
内皮細胞前駆体は血管新生の病巣へホーミングするため、これらの細胞はまた、虚血または血管損傷の遺伝子治療および診断のための自家ベクターとして有用である。例えば、これらの細胞は、血管新生を阻害する、および増大させるために利用されうる。例えば、抗腫瘍療法について、内皮細胞前駆体は、細胞毒性薬、免疫反応を刺激しうるサイトカインもしくは共刺激分子、他の抗腫瘍薬、または血管新生阻害剤と共にトランスフェクションされうる、または、それに結合されうる。局所虚血の処置について、血管新生は、血管新生サイトカインおよび/または選択されたマトリックスタンパク質の恒常的発現を達成するための内皮細胞前駆体の事前トランスフェクションにより増幅されうる。さらに、内皮細胞前駆体は、標識され(例えば、放射性標識され)、患者へ投与され、虚血性組織または血管損傷の検出に用いられうる。
【０１８３】
自家内皮細胞前駆体移植片を用いることに成功し、内皮細胞前駆体は容易にエクスビボで操作および増殖されることが示された(米国特許第5,980,887号；第5,199,942号；および第5,541,103号、それらの開示は参照により組み入れられる)。
【０１８４】
いったん単離されたならば、HPC(内皮前駆細胞のような)は、任意で、多数の状態を処置するために対象に投与する前に低温状態で保存されうる。対象への投与は、例えば、静脈内注射、静脈内ボーラス、およびカテーテルによる部位特異的送達を含む任意の適切な手段によりうる。好ましくは、対象から得られたHPCが再投与される。一般的に、約106個から約1018個までのHPCが移植として対象へ投与される。
【０１８５】
一つの態様において、HPC(内皮前駆細胞のような)は、遺伝子組換えまたは野生型でありうる。「遺伝子組換え」細胞は、「導入遺伝子」、すなわち、実験操作により細胞へ導入される任意の核酸配列、を含む細胞を指す。導入遺伝子は、「内因性DNA配列」または「異種性DNA配列」(すなわち、「外来DNA」)でありうる。遺伝子組換え細胞は、導入遺伝子を含まない「野生型細胞」と対比される。HPCは、様々なホルモン、成長因子、酵素、サイトカイン、受容体、MHC分子などをコードする遺伝子により例示されるような、抗癌剤を含む様々なタンパク質をコードする遺伝子についての遺伝子組換えでありうる。用語「遺伝子」は、ウイルスベクター、例えば、ヒトTNF遺伝子を含むブタのポックスのようなポックスウイルス、が導入されうる細胞に対して外因性および内因性の両方の核酸配列を含む。さらに、遺伝子によりコードされたタンパク質により全身的な効果を与えるためにHPCからの分泌としてポリペプチドをコードする遺伝子を用いることは興味深い。対象となる特定の遺伝子は、TNF、TGF-α、TGF-β、ヘモグロビン、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-9、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12など、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、ヒト成長因子、共刺激因子B7、インスリン、第VIII因子、第IX因子、PDGF、EGF、NGF、EPO、β-グロビン、細胞マイトジェンなど、加えてこれらのタンパク質の生物活性のある改変型をコードするものを含む。遺伝子はさらに、別の遺伝子産物の発現を制御する、または生物学的経路において1つもしくは複数の段階をブロックする、産物をコードしうる。さらに、遺伝子は、ポリペプチド(例えば、受容体リガンド)に融合した毒素、または腫瘍細胞のような標的へ毒素を向ける抗体をコードしうる。同様に、遺伝子は、患部組織または器官に治療効果を送達するために、ターゲティングポリペプチドに融合した治療用タンパク質をコードしうる。
【０１８６】
もう一つの態様において、HPC(内皮前駆細胞のような)はまた、特定の疾患または腫瘍と戦う免疫系の能力を増強しうる遺伝子を送達するために用いられうる。例えば、細胞は、免疫系をブーストしうる1つもしくは複数のサイトカイン(例えば、IL-2)および/または1つもしくは複数の抗原を送達するために用いられうる。
【０１８７】
さらにもう一つの態様において、HPC(内皮前駆細胞のような)はまた、O-クロロアセチルカルバモイルフマギロール(TNP-470)のような抗血管新生化合物のような薬物を選択的に投与するために用いられうる。好ましくは、薬物は、リポソーム、持続放出性カプセルなどのような媒体において細胞へ取り込まれる。HPC(内皮前駆細胞のような)は、その後、化合物が放出される、急速に増殖している腫瘍のような活発な血管新生の部位を選択的に標的とする。この方法により、他の位置における望ましくない副作用を低減させることができる。
【０１８８】
さらなる態様において、HPC(内皮前駆細胞のような)は、虚血性組織(すなわち、虚血性疾患の結果として血液の欠乏をもつ組織)において血管形成を増強するために用いられうる。そのような組織は、例えば、筋肉、脳、腎臓および肺を含みうる。虚血性疾患は、例えば、脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、肢虚血、虚血性心筋症、心筋虚血を含む。虚血性組織における新しい血管の形成を誘導するための方法は、参照により本明細書に組み入れられる、Isner et al., 米国特許第5,980,887号に開示されている。
【０１８９】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を例証する役割を果たし、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１９０】
実施例1
マウスおよびラットの動物モデルにおけるインビボの内皮前駆細胞遊走の阻害
インテグリンα4β1阻害剤は、内皮細胞前駆体が血流から出て、新血管形成の部位へ入ることを防ぐために用いられうる。血管新生アッセイは、マウスTie2-LacZ骨髄を移植されたマウスまたはヌードラットにおいて、血管新生成長因子を含むマトリゲル、体温で凝固する粘稠性細胞外マトリックス、を注入することにより行われる。マウスは、抗マウスα4β1および対照抗体またはα4β1の他の阻害剤での静脈注射により処理される。α4β1阻害剤は、LacZ染色細胞が血管へ合体するのをブロックすることが予想され、α4β1は、内皮前駆細胞の循環から出ていくことを制御することを示す。マトリゲルの凍結切片は、血管新生指標の表示を得るために、CD31および第VIII因子関連抗原に向けられる抗体で染色される。
【０１９１】
実施例2
内皮前駆細胞(EPC)はインテグリンα4β1を発現する
精製されたヒト臍静脈内皮細胞(「HUVECS」)(Clonetics, San Diego, CA)、および循環CD34+幹細胞(Asahara et al., Science, 275:964-967, (1997)参照)由来のフィブロネクチン上で培養された内皮前駆細胞(「EPC」)を、マウス抗ヒトインテグリンα4β1抗体と60分間、氷上でインキュベートし、PBSで2回洗浄し、その後、ローダミン標識ヤギ抗マウスIgGにおいて30分間、氷上でインキュベートした。細胞を冷PBSで2回、洗浄し、その後、インテグリンα4β1の発現についてFACSCANアナライザーで分析した。このインテグリンを発現する細胞パーセントを測定し、細胞型によってプロットした(図13)。
【０１９２】
内皮前駆細胞の33パーセントが、インテグリンα4β1発現について陽性であったが、HUVECSの12%のみが陽性であった。これらの結果は、血管新生におけるα4β1アンタゴニストの阻害効果が、血管新生における内皮前駆細胞の関与の阻害に起因することを示した。
【０１９３】
実施例3
α4β1アンタゴニストは内皮幹細胞の血管新生への寄与をブロックする
マウス血管新生は、400 ng/ml bFGFまたはVEGFを含む成長因子を枯渇させたマトリゲルの400μlの、FVB/N系の近交系マウスの後部背側脇腹へ、または照射され、Tie2LacZマウス由来の骨髄を移植されたFVB/Nマウスへの皮下注射により誘導された。動物を、0日目および3日目での100μlにおける内毒素を含まないラット抗マウスα4β1抗体(PS-2)の200μg、または1日目および4日目での対照のイソタイプ一致ラット抗マウスインテグリンβ2抗体の静脈注射により処理した(n=10)。5日間後、マトリゲルプラグを切除し、OCTに包埋し、凍結させ、切片を作製した。薄切片(5μm)をラット抗マウスCD31、続いてアレクサ(Alexa)565結合型ヤギ抗ラット免疫グロブリンで免疫染色した。200X顕微鏡視野あたりCD31陽性血管密度を、マトリゲルプラグあたり5視野において測定した。視野あたり平均血管密度+/-SEMを処理条件に対してグラフにした。β-ガラクトシダーゼ発現について染色された、対照のIgGおよび抗α4β1処理されたbFGFまたはVEGF含有プラグの代表的視野の写真を撮ったが、赤色はCD31陽性血管を示し、青色はすべての細胞の核を表す(図14B)。Tie2/LacZ移植されたマウスからの切片を、Life Technologiesからのキットを用いてβ-ガラクトシダーゼの発現について切片を染色することにより骨髄由来内皮細胞の存在について分析した。bFGF刺激血管新生に関して、移植された骨髄から生じたプラグにおける青色細胞を数えた(図14A)。
【０１９４】
インテグリンα4β1のアンタゴニストは、血管新生における内皮前駆細胞の関与を妨げる。これらのマウスは、内皮特異的プロモーター、Tie2プロモーター、の下でLacZを発現するマウス由来骨髄の移植の前に、それら自身の骨髄を殺すために照射されたため、β-ガラクトシダーゼを発現する内皮細胞は、骨髄由来である。従って、骨髄から生じる内皮細胞は、β-ガラクトシダーゼの基質中でインキュベートされた組織において、青色に変わる。これらのデータは、対照抗体で処理されたマウスにおいてより、抗α4β1で処理されたマウスにおいて、成長因子により誘導された青色の内皮細胞は少ないことを示した。それゆえに、抗α4β1は、骨髄由来の内皮前駆体の血管新生における関与を阻害した。
【０１９５】
実施例4
例示的な材料および方法
以下は、本発明において、特に実施例5〜13および図15〜20において、有用でありうるいくつかの例示的な材料および方法である。
【０１９６】
A. ニワトリ絨毛尿膜血管新生アッセイ
日齢10日のニワトリ胎児のニワトリ絨毛尿膜を、1μg/ml bFGF、ならびにフィブロネクチンのRGD含有細胞結合ドメイン(CBP)およびEILDV含有C末端CS-1ドメインに対して方向づけられた機能阻止抗体(25μg/ml)で刺激し、加えてイソタイプ一致対照抗体(抗MHC)も適用した。3日後、血管分岐点を30X倍率を用いて数えた。血管新生は、1μg/ml bFGF、VEGF、TNFα、またはIL-8でCAMにおいて刺激された。生理食塩水またはインテグリンα4β1に対して方向づけられた抗体(マウス抗ヒトα4β1抗体HP1/2、P4G9、P1H4およびラット抗マウスα4β1 PS2はすべて試験され、類似した結果であった)および対照イソタイプ一致抗体をCAMに適用し、血管分岐点を3日後に数えた。bFGF刺激された、生理食塩水または抗体で処理のCAMからの凍結切片を、フォンビルブラント因子の血管発現を検出するために免疫染色した。VWF+構造は、5つの200X顕微鏡視野において定量化された。各実験は、3〜4回繰り返され、代表的な実験からの結果が示されている。
【０１９７】
B. マウス血管新生アッセイ
血管新生は、FVB/Nマウスにおいて、bFGFまたはVEGFの400 ng/mlを補充された、成長因子低減マトリゲルの400μlの皮下注射により惹起された。マウスを、0日目および3日目において、200μg機能ブロッキングラット抗インテグリンα4β1(PS/2)またはイソタイプ一致対照抗体(ラット抗インテグリンβ2、BD Pharmingen)の静脈注射により処理した。マトリゲルプラグを5日後、切除し、凍結保存した。凍結切片を、CD31発現を検出し、DAPIと対比染色するために免疫染色した。微小血管密度を、各処理群(n=8)における各プラグについて10個の無作為に選択された200X顕微鏡視野において定量化した。または、血管新生は、FVB/Nマウスにおいて、400 ng/mlのVEGFを含む重合ペレットの角膜移植により惹起された。動物(n=5)を、0日目および3日目において抗α4β1(PS/2)または対照IgGで処理した。5日目における屠殺の15分前に、マウスに内皮特異的レクチン、Bandeira simplifolia-FITCを静脈内に注射し、組織を凍結保存した。VEGFに対する血管新生応答は、100X倍率で見える緑色蛍光面積パーセントとして定量された。または、5百万個のHT29ヒトα4β1陰性結腸癌細胞をヌードマウスにおいて皮下に移植した。腫瘍が触知できる(約30 mm3)場合、マウスを、週に2回、生理食塩水、ラット抗マウスα4β1、またはイソタイプ一致対照抗体、抗CD11bインテグリン(M1/70、BD Pharmingen)の静脈注射により処理した。腫瘍面積は隔日に測定され、腫瘍質量は、処理の4週間後、測定された。平均腫瘍質量+/-SEMが示されている。腫瘍の凍結切片を、CD31を検出するために免疫染色し(BD Pharmingen)、微小血管密度を5個の無作為に選択された顕微鏡視野について定量化した。さらに、腫瘍をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した(n=10)。3つの実験を行い、選択された代表的なデータが示されている。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。
【０１９８】
C. FACs分析
ヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞および内皮前駆細胞の表面抗原の発現プロファイルを、ヒトα4β1(HP1/2)、αvβ3(LM609)、αvβ5(P1F6)、α5β1(JBS5)、ベータ1(P4C10)、ベータ7(FIB504、Beckton Dickinson Pharmingen)、CD34(8G12、Becton Dickinson)、AC133(AC133、Miltenyi Biotec)、Flk-1(A-3、Santa Cruz Biotechnology)、CD45(2D1、Beckton Dickinson)、CD31(HEC7、Endogen)、VE-カドヘリン(BV6、Chemicon International)およびVCAM(P8B1、Chemicon International)およびウサギ抗VWF(Dako)に対して方向づけられたマウス抗体を用いるFACs分析により分析した。
【０１９９】
D. 内皮前駆細胞の単離
ヒト末梢血由来の単核細胞を公知の方法を用いて単離した。いくつかの実験において、CD34陽性細胞を、MACS磁気ビーズ系を用いて単核集団から精製した。細胞を内皮増殖培地(2%ウシ胎児血清、bFGF、VEGFを含むEGM-2)において9日間まで培養した。7日後、細胞の80%は、紡錘状であり、血管細胞マーカーおよび幹細胞マーカーを発現させている。
【０２００】
E. 接着および遊走アッセイ
接着は、本質的に記載されているように行われた。接着分析について、7日目のEPCを、5μg/ml CS-1フィブロネクチン(組換えH120断片、Martin J. Humphriesからの親切な贈り物)、組換え可溶性VCAM、血漿フィブロネクチン、ビトロネクチン(記載されているように精製された)、またはコラーゲンでコーティングされた48ウェルのプレートの3連（triplicate）のウェルに接着するように30分間、させておいた。プレートを5回、洗浄し、接着した細胞を200X倍率で定量化した。または、細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、洗浄し、空気乾燥させ、酢酸で抽出した。600 nmにおける吸光度をその後、測定した。いくつかの実験において、インテグリンα4β1(HP1/2)、α5β1(JBS5)、β1(P4C10)、αvβ5(P1F6)、またはαvβ3(LM609)に対する25μg/ml機能阻止抗体を接着アッセイに加えた。遊走アッセイは、記載されているように行われた。EPCを5μg/ml CS-1フィブロネクチン(Martin J. Humphriesからの組換えH120断片)、コラーゲン、フィブロネクチンまたはビトロネクチンでコーティングされた3連の8μm 細孔サイズトランスウェルインサートに加えた。4時間後、細胞を3.7%パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、トランスウェルの下側にある細胞を定量した。
【０２０１】
F. 骨髄移植
Tie2LacZトランスジェニックマウス(n=8)由来の骨髄を、照射されたFVB/Nマウスへ移植した。回復の1ヶ月後、血管新生は、bFGFまたはVEGFの400 ng/mlを補充された成長因子低減マトリゲルの注射により惹起された。マウスを、0日目および3日目において、200μgラット抗マウスα4β1抗体(PS/2)またはイソタイプ一致対照(抗b2インテグリン)の静脈注射により処理した。プラグを5〜7日後、切除し、凍結保存した。凍結切片を、マトリゲルプラグ内のβ-ガラクトシダーゼの発現を検出するように処理した。顕微鏡写真を200Xおよび600X倍率で撮った。200X視野あたりのLacZ陽性細胞は、10個の顕微鏡視野において定量化された。凍結切片をまた、ウサギ抗β-ガラクトシダーゼおよびラット抗マウスCD31で免疫染色した。顕微鏡写真を200Xで撮った。LacZ、CD31陽性血管は、10個の顕微鏡視野において定量化された。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。
【０２０２】
実施例5
血管新生におけるフィブロネクチンおよびその受容体の役割を分析する研究において、本発明者らは、フィブロネクチンのRGD細胞結合ドメインおよびその受容体α5β1のアンタゴニストが、血管新生を強くブロックすることを見出した(Kim et al., Am J Pathol 2000 Apr;156(4):1345-62)。驚いたことには、組織フィブロネクチンの選択的にスプライシングされたドメイン、CS-1フィブロネクチン、におけるEILDV部位を認識する抗体がニワトリ絨毛尿膜(CAM)モデルにおいて血管新生を強くブロックした(図15A、P<0.05)。これらのアンタゴニストは、CS-1フィブロネクチンのその原則的な受容体、インテグリンα4β1、への結合に干渉する(Guan et al., Cell 1990 Jan 12;60(1):53-61)。重要なことには、これらの抗体は、CS-1フィブロネクチン上で培養されたヒト内皮細胞の接着および遊走を阻害する。これらの結果は、CS-1フィブロネクチンおよびその受容体α4β1が血管新生において役割を果たしている可能性があることを示唆している。これらの発見は、フィブロネクチン発現が血管新生中に有意に上方制御されるという本発明者らの以前の観察(Kim et al. 2000、前記)、ならびにCS-1フィブロネクチン発現が、皮膚、心臓および他の組織における創傷修復中、加えて関節リウマチのような慢性炎症性疾患中の血管に関連して上方制御されることを示す第三者による報告(Elices et al., J Clin Invest 1994 93(1):405-16; Morales-Ducret et al., J Immunol 1992 149(4):1424-31)と一致している。これらの結果に基づいて、本発明者らは、α4β1が血管新生に関与しているかどうかを考慮した。血管新生におけるα4β1の役割を評価するために、α4β1機能阻止抗体を、bFGF、VEGF、TNFαまたはIL-8で刺激されたCAMに適用した。抗α4β1は、これらの成長因子のそれぞれにより誘導された血管新生をブロックした(図15B、P<0.05)。これらの研究は、インテグリンα4β1が、ニワトリCAMモデルにおける新血管形成において役割を果たしていることを示している。
【０２０３】
実施例6
哺乳動物の血管新生におけるα4β1の役割を評価するために、新血管形成の数匹のマウスモデルにおいてインテグリンα4β1のアンタゴニストの効果を試験した。bFGFまたはVEGFのいずれかの飽和マトリゲルの皮下注射により血管新生を起こすように刺激されたマウスへ抗インテグリンα4β1抗体(PS/2)を静脈内に注射した(図15C)。本発明者らは、α4β1の阻害が、微小血管密度により評価されようが、総血管容積により評価されようが、血管新生を有意にブロックすることを見出した(P<0.05)。さらに、α4β1のペプチドアンタゴニスト（EILDV、CS-1フィブロネクチン由来）もまた、このモデルにおいて新血管形成をブロックし、この過程におけるα4β1の役割についてさらなる支持を提供した。抗α4β1抗体はまた、角膜血管新生をブロックした(P<0.05)。重要なことには、インテグリンα4β1のアンタゴニストは、腫瘍血管新生および腫瘍増殖を有意に阻害した(図15D〜E)。従って、CS-1フィブロネクチンおよびその受容体インテグリンα4β1は、新血管形成の制御において重要な役割を果たしている。
【０２０４】
実施例7
本発明者らは次に、α4β1が血管新生を制御するならば、このインテグリンは、腫瘍の血管構造および他の新血管組織上に発現されるべきであると推論した。ヒト腫瘍の新血管床上のインテグリンα4β1の発現パターンを評価するために、本発明者らは、インテグリンα4β1およびフォンビルブラント因子、血管内皮のマーカー、の発現を検出するように免疫組織化学を行った(Kim et al. 2000、前記)。様々なモノクローナル抗α4抗体を用いて、驚いたことには、本発明者らは、腫瘍内皮上のα4の発現を示すことがほとんどできなかったが、リンパ節のような対照組織およびヒト黒色腫においてインテグリンα4β1発現を検出した(参照；図16A)。たまに、本発明者らは、浸潤性乳管癌のような腫瘍内の血管のサブセット上にα4β1発現を検出した(図16A)。α4の細胞質尾部と反応する抗体を用いて、本発明者らは、成長因子で刺激されたCAM、成長因子で刺激されたマウス組織、マウス腫瘍およびヒト腫瘍において血管内皮細胞上に高レベルのα4発現を検出することができた(図16B)。しかしながら、新血管のインテグリンα5β1およびαvβ3(Brooks et al., Science 1994 264:569-71)とは違って、インテグリンα4β1は、インビトロで増殖性のヒト微小血管または静脈内皮細胞上に弱く発現されるのみである(図16C)。
【０２０５】
実施例8
α4β1は増殖性の精製された内皮細胞上で弱く発現されるのみであるため、本発明者らは、このインテグリンは、インビボで内皮細胞により一過性に発現される、または新血管形成中に内皮前駆体により発現される可能性があると推論した。新しい血管は、出芽によるだけでなく、組織における骨髄由来幹細胞の接種によっても生じることができ、本発明者らは、EPCがα4β1を発現するかどうかを考慮した。EPCを単離するために、末梢血白血球の単核画分またはCD34陽性幹細胞(末梢血白血球の単核画分から単離された)を血管新生性サイトカインbFGFおよびVEGFの存在下でフィブロネクチン培養プレート上で培養した。結果として生じたEPCは、高レベルのα4β1を発現するだけでなく、CD34、CD133、Flk-1(Asahara et al., 1997 Feb 前記; Brooks et al., Science 1994 前記)、CD45およびCD18のような幹細胞マーカー、加えてVE-カドヘリン、VCAM、CD31およびVWFのような内皮マーカーも共発現する(図16D〜E)。培養の時間が増加するにつれて、これらの細胞は、内皮細胞の追加の特徴を獲得し、CD34、VE-カドヘリン、VCAMおよびVWFの増加する量を発現させる(図16D〜E)。これらの細胞は、より大きく、伸長した、粘着性形態を示し、チューブ様構造を自発的に形成する(図16F)。重要なことには、EPCは、インテグリンα4β1について強く陽性であるが、密接に関連した白血球インテグリンα4β7を発現させることができない(図16D)。EPCはまた、インテグリンα5β1、RGD結合フィブロネクチン受容体を含む他の接着受容体についても陽性である(Kim et al. 2000、前記)。際立ったことには、EPCは、インビトロの発生の初期に、インテグリンαvβ5をほとんど、αvβ3を全く発現させないが、後期では、これらのインテグリンの高レベルが観察され(図16E)、これらのインテグリンは、EPCがだんだんとより多い内皮の特徴を獲得するにつれて、上方制御されることを示唆している。EPCはまた、UEAレクチン染色、内皮系の細胞の特徴、について陽性であり、DiIアセチル化LDLを結合する。従って、成熟内皮細胞と対照的に、EPCは、インテグリンα4β1発現について強く陽性である。
【０２０６】
実施例9
循環しているリンパ球上のインテグリンは、しばしば、不活性または低親和性状態に維持されているため(Peichev et al., Blood 2000 Feb 1;95(3):952-8)、本発明者らは、次に、EPCにより発現されたインテグリンα4β1は機能しうるかどうかを決定した。実際、EPCは、CS-1フィブロネクチン、加えてコラーゲン、血漿フィブロネクチンおよびビトロネクチンに接着し、かつ、の上を遊走する。重要なことには、CS-1フィブロネクチンへの接着は、インテグリンα4β1により媒介されるが、機能阻止抗α4β1およびβ1抗体が、EPCのこのマトリックスタンパク質への接着を妨げるからである(図17A)。α4β1はまた、活性化内皮により発現される免疫グロブリンスーパーファミリー分子VCAMについての受容体であるため、本発明者らはまた、組換え可溶性VCAM(rsVCAM)でコーティングされたプレートに接着するEPCの能力を調べた。α4β1のアンタゴニストは、EPCのVCAMへの接着をブロックし、インテグリンα4β1が、内皮幹細胞上のCS-1フィブロネクチンおよびVCAMの両方についての機能的活性のある受容体であることを示した(図17B)。
【０２０７】
実施例10
EPCが、血管新生性成長因子により刺激された増殖性血管内皮に接着することができるかどうかを決定するために、DiIアセチル化LDLで標識されたEPCを増殖性内皮単層上へ置いた。EPCはα4β1依存性様式で内皮に強く結合し(図17C)、しかも、rsVCAMはEPCの内皮単層への接着をブロックした(図17D)。同様の結果は、α4β1抗体またはrsVCAMがEPCと事前インキュベートされた場合に得られたが、それらが内皮単層と事前インキュベートされた場合には得られなかった。従って、α4β1は、EPCの血管内皮上のVCAMへの接着を媒介する。VCAMは、炎症性サイトカインおよび成長因子に応答して血管新生を起こしている内皮において上方制御され、VCAMの組換え可溶性型は、血管新生を阻害することができるため(Nakao et al., J. Immunol. 2003 Un 1;170(11):5704-11)、これらの結果は、α4-VCAM相互作用が、血管新生および組織修復中における骨髄由来幹細胞または前駆細胞の組織への移動を促進する可能性があることを示唆している。実際、インテグリンα4β1-VCAM相互作用は、インビボで、胎児発生中に(絨毛膜-尿膜、心内膜-心筋、一次筋芽細胞の融合)、免疫細胞輸送において(炎症におけるリンパ球、単球および好酸球の血管外遊走)、および骨髄における免疫細胞前駆体の保持において、ヘテロタイプな細胞接着を促進するにおいて不可避的な役割を果たしている(Rosen et al., Cell 1992 Jun 26;69(7):1107-19)。従って、α4-VCAM相互作用は、幹細胞の組織修復の部位への流入を制御しうる。
【０２０８】
実施例11
α4β1がEPCによる新血管の形成を制御するかどうかを決定するために、VEGFを含むマトリゲルにおけるDiI標識ヒトEPCおよび抗ヒトα4β1または対照抗体をヌードマウスに皮下に移植した。5日後、新血管を、Bandeira simplifoliaの注射で可視化した。本発明者らは、多くのEPCが血管を形成したこと（図18A）、および対照抗体ではなかったが、抗α4β1抗体は血管形成をブロックしたことを観察した。これらの研究は、EPCが新血管を形成する能力があること、およびα4β1機能がこの過程に必要とされることを示している。
【０２０９】
実施例12
α4β1はインビボでEPCの血管新生性内皮への接着を媒介するかどうかを決定するために、皮下に移植されたインテグリンα4β1陰性結腸癌腫瘍を有するヌードマウスへヒトEPCを養子性に移した。マウスを、抗ヒトα4β1抗体、対照抗体または生理食塩水で全身性に処理した。本発明者らは、EPCが新血管へ合体したこと、およびヒトα4β1のアンタゴニストのみがこの事象をブロックしたことを見出した(図18B)。これらの発見は、インテグリンα4β1が内皮幹細胞の循環から血管新生組織への血管外遊走を媒介することを実証している。すべてのCD34陽性幹細胞は、組織へ入るために内皮を通過しなければならないから、これらの研究は、α4β1がインビボで、幹細胞輸送を媒介することを示唆している。
【０２１０】
実施例13
α4β1の、インビボでの、骨髄由来内皮幹細胞輸送の制御における役割を調べるために、Tie2LacZマウス由来の骨髄を移植されたマウスにおいて血管新生を誘導し、その動物を抗マウスα4β1抗体(PS/2)および対照抗体(抗マウスβ2インテグリン)で全身性に処理した。抗β2抗体ではなく抗α4β1抗体が、血管新生がbFGFにより誘導されようがVEGFにより誘導されようが、マトリゲルにおいてLacZ陽性細胞および血管の合体を有意にブロックしたことが測定された(図18C〜D)。LacZ陽性細胞が血管へ合体し、内皮マーカーを発現するかどうかをさらに測定するために、凍結切片を抗β-ガラクトシダーゼ(緑色)および抗マウスCD31(赤色)で免疫染色した。CD31陽性血管内にLacZ陽性骨髄由来細胞の有意な数(>90%)を同定し、α4β1のアンタゴニストが、これらの細胞の新血管への合体をブロックしたことを観察した(図18E〜F)。これらの研究は、α4β1が、新血管構造の形成に関与しいてる組織への骨髄由来内皮幹細胞の流入を促進することを示している。
【０２１１】
実施例14
本明細書の追加データは図19に示されている。図19Aは、培地、抗CS-1フィブロネクチンまたは対照抗体(W6/32、抗MHC)の存在下における、5μg/ml CS-1フィブロネクチンでコーティングされた8μm細孔トランスウェル上での内皮細胞の遊走を示している。図19B、Cは、培地、抗α4β1(HP1/2)または対照抗体(P1F6)の存在下における、5μg/ml CS-1フィブロネクチンでコーティングされたプラスチックプレートへの内皮細胞の接着を示している。図19Dは、bFGFで刺激された、生理食塩水または抗体処理のCAMからの凍結切片が、フォンビルブラント因子の血管発現を検出するために免疫染色されたことを示している。VWF+構造は、5つの200X顕微鏡視野において定量化された。図19Eは、血管新生が、FVB/Nマウスにおいて、400 ng/mlのVEGFを含む重合ペレットの角膜移植により惹起されたことを示している。動物(n=5)を、0日目および3日目において抗α4β1(PS/2)または対照IgG(cIgG)で処理した。5日目における屠殺の15分前に、マウスに内皮特異的レクチン、Bandeira simplifolia-FITCを静脈内に注射し、組織を凍結保存した。VEGFに対する血管新生応答は、高倍率(100X)下で見える緑色蛍光面積パーセントとして定量された。図19F〜Gは、血管新生が、ヌードマウスにおいて、(F)200μg機能阻止ラット抗インテグリンα4β1(PS/2)またはイソタイプ一致対照抗体(ラット抗インテグリンβ2)を含む、400 ng/mlのbFGFを補充された400μl成長因子低減マトリゲルの皮下注射により惹起されたことを示しており、図19Gは、50μM EILDVまたはEILEVペプチドを用いることを示している。5日目における屠殺の15分前に、マウスに内皮特異的レクチン、Bandeira simplifolia-FITCを静脈内に注射した。マトリゲルプラグをRIPA緩衝液にホモジナイズし、蛍光強度を測定した。
【０２１２】
実施例15
本明細書の追加データは、図20に示されている。図20Aは、UEA-1レクチン結合およびDiI-アセチル化LDLの取り込みについてのEC、EPCおよび線維芽細胞の細胞蛍光分析を示している。図20Bは、5μg/mlフィブロネクチン、CS-1フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンでコーティングされたプラスチックプレートへの精製EPCの接着を示している。図20Cは、5μg/mlフィブロネクチン、CS-1フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンでコーティングされた8μm細孔トランスウェル上での精製EPCの遊走を示しており、図20Dは、培地、抗α4β1(HP1/2)、抗αvβ3(LM609)、抗αvβ5(P1F6)、または抗α5β1(P1F6)の存在下における、5μg/mlビトロネクチンでコーティングされたプラスチックプレート上の精製EPCの接着を示している。
【０２１３】
実施例16
以下は、本発明において、特に実施例17〜24および図33〜36において、有用でありうるいくつかの例示的な材料および方法である。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。
【０２１４】
A. 幹細胞単離：
3.7X109個の単核細胞を、San Diego Blood Bankからの6ユニットのヒトバフィーコートからHistopaque勾配遠心分離により精製した。CD34細胞単離を、Miltenyi Biotech(Auburn, CA)からのキットを用いて2つの抗CD34カラムを通してのポジティブ選択により行った。CD34+細胞の収量は、FACs分析で評価して89%の純度で3X106個であった。
【０２１５】
B. 生体内顕微鏡法
幹細胞を、5-および-6-4-クロロメチルベンゾイルアミノ-テトラメチル-ローダミン(CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA)で、培地において氷上で15分間、標識し、洗浄した。1X106個の標識幹細胞を、透明背側皮下脂肪房の下の移植された乳房脂肪体上で増殖したN202同系のGFP発現腫瘍球状体をもつマウスへ静脈注射した。動物を鎮静させ(15〜20分間)、同時に、インビボ蛍光顕微鏡法を、エピ-イルミネーターおよびキセノンアークからのビデオ-トリガーのストロボスコープ照明(MV-7600, EG&G, Salem, MA)を備えたMikron Instrument Microscope(Mikron Instrument, San Diego, CA)を用いて行った。シリコン増倍型ターゲットカメラ(SIT68, Dage-MTI, Michigan City, IN)が顕微鏡に取り付けられている。ファームウェアバージョン2.50(Hamamatsu Photonic System, USA)を含むHamamatsu画像プロセッサー(Argus 20)は、画像処理のために、および画像をコンピュータへ取り込むために用いられる。Zeiss Achroplan 20X/0.5 W 対物レンズ10/0.22が画像を取り込むために用いられた。
【０２１６】
C. FACs分析
FACs分析は、UCSD Cancer Center Core施設で行われた。幹細胞上のインテグリンα4β1、CD34、およびCD133の発現は、PE結合型マウス抗ヒトα4β1(HP2/1, Chemicon International, Temecula, CA)、FITCおよびPE結合型マウス抗ヒトCD34(AC136, Miltenyi Biotech, Auburn, CA)、ならびにPE結合型CD133(AC133/1, Miltenyi Biotech, Auburn, CA)、CD31(HEC7, Pierce)を用いる2色の蛍光により分析された。EC上のVCAMの発現は、P8B1(Chemicon International, Temecula, CA)で測定された。
【０２１７】
D. 免疫組織化学
凍結切片を、冷アセトン中に2分間、固定し、空気乾燥させ、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で5分間、再水和した。スライドを、PBSにおける0.05〜0.1% トリトンX-100中で2分間、洗浄し、PBSにおける5%ウシ血清アルブミン中で一晩、4℃で、および一次抗体(5〜10μg/ml)中で2時間、RTでインキュベートし、PBS中で3回洗浄し、1μg/mlでの二次抗体中で1時間、RTでインキュベートした。スライドをPBS中で3回、洗浄し、DAPIで染色し、カバースリップを載せた。一次抗体は以下である：フィブロネクチン(TV-1, Chemicon)、抗マウスVCAM(ChemiconからのM/K-2)、抗汎種（anti-pan species）VCAM(Santa CruzからのH-276、sc-8304)、および抗マウスCD31(PharmingenからのMEC 13.3)。
【０２１８】
E. 接着アッセイ
接着アッセイは、記載されているように(Kim et al. (2000) Am. J. Pathol. 156, 1345-1362)、組換えH120 CS-1フィブロネクチン(Martin J. Humphries, University of Birmingham, UKから)の5μg/mlでコーティングされたプラスチックの48ウェルのプレート上で行われた。幹細胞を、25μg/ml抗α4β1_(HP2/1)または抗αvβ5(P1F6、David Cheresh博士, the Scripps Research Instituteから)の存在下において、コーティングされたプレート上で30分間、インキュベートした。CMTMR標識幹細胞を、HEPES緩衝無血清培地において、25μg/ml HP2/1またはP1F6の存在下で、HUVEC単層上で60分間、37℃でインキュベートした。結合していない細胞をPBSで優しく洗浄することにより除去した。細胞を3.7%パラホルムアルデヒド中に固定した。代表的な視野を200Xで写真に撮り、視野あたりに接着している細胞の数を、処理条件ごとに5つの代表的視野において定量化した。
【０２１９】
F. 養子移入腫瘍研究
3X106個のCMTMR標識幹細胞を、生理食塩水、50μg/mlの対照抗体(LM609、抗ヒトαvβ3)または抗ヒトα4β1(HP2/1、Roy Lobb, Biogenからの贈り物、または9F10、Becton-Dickinson, San Diego, CA)中でインキュベートした。細胞を、N202またはルイス(Lewis)肺癌腫瘍を有するヌードマウスへ注射する前に、抗体と氷上で30分間、インキュベートした。1時間後、動物を屠殺した。周囲結合組織を加えての腫瘍を切除し、凍結保存した(n=6)。
【０２２０】
または、系統陰性(Lin-)細胞を、以前に記載されているように(Otani et al. (2002) Nat. Med. 8, 1004-1010)、ネガティブ免疫選択によりEGFPマウスの骨髄から単離した。細胞を、0.5 cm ルイス肺癌腫瘍を有するヌードマウスへ注射した。動物を、次の5日間、生理食塩水、対照抗体(抗CD11b)または抗マウスα4β1抗体(PS/2)で処理した。5日後、動物を屠殺した。周囲結合組織を加えての腫瘍を切除し、凍結保存した(n=6)。
【０２２１】
G. 骨髄移植
FVB/N-Tie2LacZマウス由来の骨髄を、照射されたFVB/Nマウスへ移植した。12週間後、マウスに、400 ng/mlのbFGFまたはVEGFを補充された400μl成長因子低減マトリゲルを注射し、1日目および3日目において、200μg/マウスのラット抗マウスα4β1抗体(低内毒素PS/2、Biogenからの親切な贈り物)またはラット抗マウスβ2インテグリン(低内毒素M1/70、Becton-Dickinson, San Diego, CA)の静脈注射により処理した。プラグを5日後に切除した(n=8)。研究は2回行った。凍結切片を、X-gal中でインキュベートした、またはウサギ抗β-ガラクトシダーゼおよびラット抗マウスCD31(MEC13.3, Becton-Dickinson, San Diego, CA)で免疫染色した。陽性血管は、10個の無作為に選択された顕微鏡視野において200Xで定量化された。
【０２２２】
実施例17
幹細胞は新血管構造へ選択的にホーミングする
どのようにして幹細胞が新血管構造へホーミングするかを理解するために、乳癌をもつマウスへ移植された幹細胞の移動を研究しうるリアルタイム生体内顕微鏡法を用いた。ヒトCD34+幹細胞を、赤色蛍光細胞追跡用色素で標識し、背部皮下脂肪房の下の乳房脂肪体上にマウス乳癌球状体を移植されたヌードマウスの循環へ注射した(図33a)。生体内顕微鏡法をその後すぐに行い、幹細胞の腫瘍へのホーミングを追跡した。腫瘍および付随した非蛍光血管が見え(図33b)、血管構造内の細胞接着を評価することを可能にした。循環している蛍光細胞は、中心および末梢の腫瘍血管構造の両方において明らかであったが、それらは、腫瘍周辺における血管においてのみ停止した(図33c〜d)。対照的に、幹細胞は、腫瘍中心において(図33c〜d)、または他の器官において、めったに停止しなかった。蛍光顕微鏡法による腫瘍の死後分析は、幹細胞(赤色、矢頭)が、抗CD31免疫染色(緑色、矢印)により同定される、腫瘍末梢血管構造においてのみ停止した、または隣接組織へ血管外遊走したことを確認した(図33e)。これらの研究は、幹細胞が、増大する末梢腫瘍血管構造へ選択的にホーミングすることを示し、特定の細胞接着機構がこのホーミング応答において役割を果たしている可能性があることを示唆している。
【０２２３】
実施例18
幹細胞はインテグリンα4β1を発現する
どのようにして幹細胞が末梢血管構造に停止するかを決定するために、幹細胞ホーミングにおける細胞接着分子の役割を調べた。リンパ球のような循環細胞は、内皮上に停止するために、および循環から血管外遊走するためにインテグリンα4β1を利用するが(Guan et al. (1990) Cell 60, 53-61; およびElices et al. (1990) Cell 60, 577-584)、造血前駆細胞は、骨髄内皮に接着するためにα4β1を用いる(Simmons et al. (1992) Blood 80, 388-395; Papayannopoulou et al. (2001) Blood 98, 2403-2411; Craddock et al. (1997) Blood 90, 4779-4788; Miyake et al. (1991) J. Cell Biol. 114, 557-565)。幹細胞ホーミングにおけるα4β1についての役割を評価するために、FACs分析により循環している幹細胞上のα4β1の発現を調べた。CD34+細胞の大多数がα4β1を発現させていること、および内皮へ分化することができる(Peichev et al. (2000) Blood 95, 952-958)、CD34+CD133+サブセットの実質的にすべてが、インテグリンα4β1を発現させていることを見出した(図34a)。
【０２２４】
実施例19
インテグリンα4β1は幹細胞における機能的活性のある受容体である
循環細胞におけるインテグリンは、しばしば、不活性または低親和性状態に維持されるため(Bartolome et al. (2003) Mol. Biol. Cell 14, 54-66)、次に、幹細胞上のα4β1は機能的活性があるかどうかを測定した。インテグリンα4β1は、細胞性フィブロネクチン(CS-1フィブロネクチン)についての(Elices et al. (1994) J. Clin. Invest. 93, 405-416)、およびVCAM、炎症性組織における内皮上に発現される免疫グロブリンスーパーファミリー分子、についての(Elices et al. (1990) Cell 60, 577-584)、受容体である。幹細胞は、CS-1フィブロネクチンでコーティングされたプレートへ容易に接着した；この接着は、抗α4β1抗体によりブロックされたが、対照(抗αvβ5)抗体ではされなかった(図34b)。これらの結果は、インテグリンα4β1が多くの幹細胞上の機能的活性のある受容体であることを示している。
【０２２５】
実施例20
インテグリンα4β1のVCAMおよび/またはフィブロネクチンとの相互作用が、インビトロでの幹細胞の内皮細胞への接着を媒介する
幹細胞がα4β1依存性様式で内皮細胞(EC)に接着することができるかどうかを決定するために、α4β1のリガンドVCAMを発現させている(図34c)、集密的EC単層上に、蛍光標識された幹細胞を置いた。幹細胞は、ECへ強く結合した(図34d〜e)。この接着は、α4β1の抗体アンタゴニストによりブロックされたが、対照抗体(抗αvβ5)によってはされなかった(図34d〜e)。接着はまた、組換え可溶性VCAM、インテグリンα4β1機能の競合的阻害剤、によりブロックされた。これらの研究は、α4β1が、インビトロでの幹細胞のECへの接着を媒介することができることを実証し、α4-VCAMまたはα4-フィブロネクチン相互作用が、幹細胞の血管構造への接着を促進することができることを示唆している。
【０２２６】
実施例21
新血管構造細胞は、インビトロで、インテグリンα4β1リガンドVCAMおよびフィブロネクチンを発現する
次に、新血管形成を起こしている組織がα4β1リガンドVCAMおよび細胞性フィブロネクチンを発現するかどうかを、これらの分子についてマウス乳癌または正常組織を検査することにより調べた。両方の分子(緑色)は、腫瘍末梢において、その中心においてよりずっと高いレベルで、腫瘍内皮(赤色、図35a)に発現されている(図35a)。これらのリガンドは正常内皮によりめったに発現されないが、フィブロネクチンが、たまに、大血管の周りに観察された(図35a)。これらの結果は、α4β1リガンドVCAMおよびフィブロネクチンが、α4β1+幹細胞の接着を促進するように正確に正しい位置にあることを実証している。
【０２２７】
実施例22
インテグリンα4β1抗体は、インビボで、幹細胞の新血管構造への遊走を阻害する
α4β1が、インビボで、幹細胞の増殖している血管への接着を媒介するかどうかを決定するために、蛍光標識された幹細胞を、確立したマウス乳癌(N202)またはルイス肺癌(LLC)腫瘍をもつヌードマウスへ尾静脈注射により導入した。細胞注入の1時間以内に分析のために組織を取り出した。幹細胞(赤色)は、両方の腫瘍型の血管(緑色)、に停止した、または、の近くに血管外遊走した(図35b)。際立ったことには、幹細胞が機能阻止抗ヒトα4β1抗体と共注入された場合、それらは、どちらの腫瘍型の血管構造においても停止することができなかった(図35b〜d)。対照的に、生理食塩水または対照抗体は、幹細胞の停止および接着に最小の影響しか及ぼさなかった(図35b〜d)。幹細胞は腫瘍血管構造へホーミングしたが、それらは、隣接する正常組織へ、または肺のような他の器官へホーミングしなかった。これらの研究は、α4β1が、幹細胞の腫瘍新血管構造へのホーミングを制御することを示している。幹細胞は中心の腫瘍血管に留まらず、特定の受容体のアンタゴニストは、血管におけるそれらの接着をブロックするため、これらの結果は、漏れやすい腫瘍血管への細胞の非特異的ホーミングを割り引いている。
【０２２８】
実施例23
インテグリンα4β1抗体は、インビボで、幹細胞の血管内皮への分化を阻害する
α4β1が、インビボで、幹細胞のホーミングおよびその後の血管形成における関与を促進するかどうかを決定するために、EGFP(増強緑色蛍光タンパク質)マウス6からの系統陰性(Lin-)骨髄由来細胞を、α4β1アンタゴニストおよび対照抗体の存在または非存在下において、LLC腫瘍をもつ動物へ注射した。5日後、インビボで、対照処理された動物におけるEGFP+細胞が、有意な数で腫瘍へホーミングし(矢頭)、EGFP+血管を形成した(矢印、図36a〜b)ことを見出した。対照的に、抗α4β1処理されたマウスの腫瘍において、少しのEGFP+細胞しか観察されず、EGFP+血管は観察されなかった(図36a〜b)。これらの研究は、幹細胞の腫瘍血管構造へのホーミングの妨害が、それらの血管内皮への分化を阻害することを示している。
【０２２９】
実施例24
インテグリンα4β1抗体は、インビボで、骨髄幹細胞の新血管構造への遊走を阻害する
上記データは、インテグリンα4β1が、骨髄から直接的に生じる幹細胞の腫瘍へのホーミングを媒介することを示唆した。これを評価するために、マウスに、Tie2LacZマウス由来の骨髄を移植した。これらのマウスにおいて、内皮へ分化する骨髄由来細胞は、インビボで、内皮タンパク質Tie2のプロモーターの制御下でβ-ガラクトシダーゼを発現する。血管新生は、これらのマウスにおいて、VEGFまたはbFGFで飽和された成長因子低減マトリゲルの移植により刺激された。これらの成長因子は、血管新生応答およびβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞のホーミングを誘導した(図36c〜d)。マウスの抗α4β1抗体での処理は、β-ガラクトシダーゼ陽性細胞のマトリゲルへの合体を完全にブロックしたが、抗β2インテグリン抗体ではなかった(図36c〜d)。対照処理された動物において、抗CD31(赤色)および抗β-ガラクトシダーゼ(緑色)免疫染色により測定される場合、β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の大部分が、新血管構造(矢印)へ合体した(図36e〜f)。重要なことには、α4β1のアンタゴニストは、この合体を完全にブロックした(図36e〜f)。総合すれば、これらの研究は、β2インテグリンはしないが、α4β1は、幹細胞輸送を、リモデリング組織における新血管構造へのそれらの接着を促進することにより、増強することを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】ヒトα4サブユニットのポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)、GenBankアクセッション番号XP_039012.1、を示す。
【図２】ヒトβ1サブユニットのポリペプチド配列(SEQ ID NO:2)、GenBankアクセッション番号P05556、を示す。
【図３】ヒト血管細胞接着分子(VCAM)のポリペプチド配列、GenBankアクセッション番号P19320(SEQ ID NO:3)(A)およびXP_035774(SEQ ID NO:96)(B)、を示す。
【図４】ヒトフィブロネクチンのポリペプチド配列(SEQ ID NO:4)、GenBankアクセッション番号P02751、を示す。
【図５】インテグリンα4β1のVCAMへの結合を阻害する例示的な作用物質を示す。
【図６】インテグリンα4β1のそのリガンドへの結合を阻害する例示的な作用物質を示し、IC50値は、直接的な結合アッセイに基づいている。この図において、略語は以下のとおりである：FCA、9-フルオレンカルボキシル；IC、阻害濃度；PA、フェニルアセチル。
【図７】インテグリンα4β1のフィブロネクチンへの結合を阻害する例示的なβ-ターン模倣体を示す。
【図８】ヒトインテグリンα4サブユニットcDNAのcDNA配列(SEQ ID NO:5)、GenBankアクセッション番号XM_039012、を示す。
【図９】ヒトインテグリンα4サブユニットcDNAのcDNA配列(SEQ ID NO:6)、GenBankアクセッション番号XM_039012、を示す。
【図１０】ヒトインテグリンβ1サブユニットcDNAのcDNA配列(SEQ ID NO:7)、GenBankアクセッション番号X07979、を示す。
【図１１】ヒトVCAM cDNA配列(SEQ ID NO:8)、GenBankアクセッション番号X53051、を示す。
【図１２】ヒトフィブロネクチンcDNAの配列(SEQ ID NO:9)、GenBankアクセッション番号X02761、を示す。
【図１３】ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および内皮前駆細胞(EPC)に対するインテグリンα4β1を発現する細胞パーセントのグラフを示す。
【図１４】抗体処理に対する100X視野あたりのβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞の数のグラフ(パネルA)、および切除されたマトリゲルプラグの免疫染色された凍結切片の写真(パネルB)を示す。
【図１５】インテグリンα4β1およびCS-1フィブロネクチンが血管新生を制御することを示す。(A)1μg/ml bFGFで刺激され、かつ抗フィブロネクチンCBPもしくはCS-1機能阻止抗体または対照抗体で処理されたCAMにおける30X倍率での血管分岐点。(B)生理食塩水、抗インテグリンα4β1(HP1/2)または対照イソタイプ一致抗体で処理された、bFGF、VEGF、TNFαまたはIL-8刺激されたCAMにおける血管分岐点。(C)血管新生は、FVB/Nマウスにおいて、bFGFまたはVEGFを補充された成長因子低減マトリゲルの皮下注射により惹起され、マウス(n=8)は、ラット抗インテグリンα4β1(PS/2)(白色バー)またはイソタイプ一致対照抗体(ラット抗インテグリンβ2)(黒色バー)の静脈注射により処理された。微小血管密度は、CD31免疫組織化学により200Xで定量化された(右)。(D〜E)HT29ヒトα4β1陰性結腸癌細胞は、ヌードマウス(n=10)において皮下に移植され、触知できる腫瘍(約30 mm3)をもつマウスは、生理食塩水、ラット抗マウスα4β1、またはイソタイプ一致対照抗体、抗CD11bインテグリン、の静脈注射により処理された。(D)平均腫瘍質量+/-SEM。(E)CD31陽性微小血管は、免疫組織化学により検出され、200X視野あたりで定量化された。
【図１６】内皮細胞および内皮前駆細胞上のα4β1の発現を示す。(A)ヒトリンパ節、黒色腫、および浸潤性乳管癌の厚さ5ミクロンの凍結切片は、抗vWF(緑色)抗体、およびP1H4、抗ヒトα4β1(赤色)抗体で免疫染色された。(B)ヒト乳癌、マウスMTAG自然発症乳癌、マウスVEGFマトリゲル、正常マウス肝臓、bFGF刺激されたCAM、および正常CAMの厚さ5ミクロンの凍結切片は、抗vWF(赤色)抗体およびヤギ抗α4細胞質尾部(緑色)抗体で免疫染色された。発現の一致は黄色で表されている。C)CD31およびα4β1発現についてのHMVECのFACs分析。(D)CD34、AC133、およびFlk-1の、4日目および7日目でのEPCにおける発現レベルのFACs分析。(E)CD31、VE-カドヘリン、VCAMおよびVWFの、4日目および7日目でのEPCにおける発現レベルのFACs分析。(F)β1、β7、β2、α4β1、αvβ3、αvβ5およびα5β1の、4日目および7日目でのEPCにおける発現レベルのFACs分析。(G)培養中の4日目、7日目または9日目でのEPCの透過光線下での顕微鏡写真。
【図１７】EPCに発現されたα4β1の機能的役割を示す。(A〜B)培地、抗α4β1(HP1/2)または対照抗体(P1F6)の存在下における、(A)5μg/ml CS-1フィブロネクチンまたは(B)組換え可溶性VCAMでコーティングされたプラスチックプレート上への精製EPCの接着。(C)培地、抗α4β1(HP1/2)または対照抗体(P1F6)の存在下における、DiI標識された精製EPCのHUVEC単層VCAMへの接着。細胞は、200X顕微鏡視野あたりの接着した赤色蛍光細胞を数えることにより定量化された。(D)培地、rsVCAMまたは対照タンパク質の存在下における、DiI標識された精製EPCのHUVEC単層への接着。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。
【図１８】インテグリンα4β1がインビボで、内皮前駆細胞輸送を制御することを示す。(A)DiIアセチル化-LDL(赤色)標識された内皮前駆細胞は、成長因子を枯渇させたマトリゲルにおいて、400 ng/ml VEGF、抗体なし、対照抗体(P1F6)または抗ヒトα4β1抗体(HP1/2)と混合された。5日後、マウスは、Bandeira simplicifoliaレクチン-FITC(緑色)を注入され、屠殺された。凍結切片は、蛍光顕微鏡法により分析された。(B)DiIアセチル化-LDL標識された内皮前駆細胞は、200 mm3 HT29結腸癌腫瘍を有する動物へ、抗体なし、対照抗体(P1F6)、または抗ヒトα4β1抗体(HP1/2)と共に静脈注射された。5日後、マウスは、Bandeira simplicifoliaレクチン-FITCを注入され、屠殺された。凍結切片は、蛍光顕微鏡法により分析された。(C〜D)Tie2LacZ陽性骨髄は、照射されたFVB/Nマウスへ移植された。1ヶ月の回復期間後、血管新生は、bFGF(B)またはVEGF(C)で惹起され、マウスは、ラット抗マウスα4β1(PS/2)またはイソタイプ一致対照(抗b2インテグリン)抗体の静脈注射により処理された(n=8)。凍結切片は、マトリゲルプラグ(200X)；挿入写真、600X、内のβ-ガラクトシダーゼの発現を検出するために処理された。200X視野あたりのLacZ陽性細胞の平均+/-S.E.M.が測定された。(E)LacZ陽性細胞は、200Xにおいて、β-ガラクトシダーゼ(緑色)についておよびCD31(赤色)発現について免疫染色することにより血管内で検出された。両方について陽性の血管は黄色(矢印)である。(F)平均+/-S.E.M. LacZ+CD31+血管(n=8)。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。
【図１９】(A)培地、抗CS-1フィブロネクチン、または対照抗体(W6/32、抗MHC)の存在下における、5μg/ml CS-1フィブロネクチンでコーティングされた8μm細孔トランスウェル上での内皮細胞の遊走を示す。(B、C)培地、抗α4β1(HP1/2)、または対照抗体(P1F6)の存在下における、5μg/ml CS-1フィブロネクチンでコーティングされたプラスチックプレートへの内皮細胞の接着。(D)bFGF刺激された、生理食塩水または抗体処理のCAMは、フォンビルブラント因子の血管発現を検出するために免疫染色された。(E)血管新生は、FVB/Nマウスにおいて、400 ng/mlのVEGFを含む重合ペレットの角膜移植により惹起された。動物(n=5)を、0日目および3日目において抗α4β1(PS/2)または対照IgG(cIgG)で処理した。5日目における屠殺の15分前に、マウスに内皮特異的レクチン、Bandeira simplifolia-FITCを静脈内に注射し、組織を凍結保存した。VEGFに対する血管新生応答は、高倍率(100X)下で見える緑色蛍光面積パーセントとして定量化された。(F〜G)血管新生は、ヌードマウスにおいて、(F)200μg機能阻止ラット抗インテグリンα4β1(PS/2)またはイソタイプ一致対照抗体(ラット抗インテグリンβ2)、および(G)50μM EILDVまたはEILEVペプチドを含む、400 ng/mlのbFGFを補充された400μl成長因子低減マトリゲルの皮下注射により惹起された。5日目における屠殺の15分前に、マウスに内皮特異的レクチン、Bandeira simplifolia-FITCを静脈内に注射した。マトリゲルプラグをRIPA緩衝液にホモジナイズし、蛍光強度を測定した。
【図２０】(A)EC、EPCおよび線維芽細胞の、UEA-1レクチン結合およびDiI-アセチル化LDLの取り込みについての細胞蛍光分析を示す。(B)5μg/mlフィブロネクチン、CS-1フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンでコーティングされたプラスチックプレートへの精製EPCの接着。(C)5μg/mlフィブロネクチン、CS-1フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンでコーティングされた8μm細孔トランスウェル上での精製EPCの遊走。(D、E)培地、抗α4β1(HP1/2)、抗αvβ3(LM609)、抗αvβ5(P1F6)、または抗α5β1(P1F6)の存在下における、5μg/mlビトロネクチンでコーティングされたプラスチックプレート上の精製EPCの接着。
【図２１】骨髄由来細胞は内皮細胞(EC)へ分化することができることを示す。
【図２２】インテグリンα4β1は内皮前駆細胞(EPC)の初期マーカーであることを示す。
【図２３】内皮前駆細胞は、インテグリンα4β1陽性のままであり、αvインテグリン発現を獲得することを示す。
【図２４】4日目、7日目および9日目における内皮前駆細胞成熟を示す。
【図２５】インテグリンα4β1は内皮前駆細胞のフィブロネクチンへの接着を媒介することを示す。
【図２６】インテグリンα4β1は内皮前駆細胞のrsVCAMへの接着を媒介することを示す。
【図２７】内皮前駆細胞はインテグリンα4β1を介して内皮単層へ接着することを示す。
【図２８】内皮前駆細胞はVCAM依存性様式で、内皮単層へ接着することを示す。
【図２９】新血管形成における造血幹細胞役割の例示的なTie2BMTモデルを示す。
【図３０】インテグリンα4β1のアンタゴニストは内皮前駆細胞の新血管床への流入をブロックすることを示す。
【図３１】インテグリンα4β1はインビボで、内皮前駆細胞の血管新生への寄与を促進することを示す。
【図３２】インテグリンα4β1は内皮前駆細胞の血管外遊走および血管形成における関与を促進することを示す。
【図３３】ヒトCD34+幹細胞は末梢腫瘍血管構造へホーミングすることを示す。(a)CMTMR標識幹細胞は、背側皮下脂肪透明房（dorsal skinfold transparent chamber）の下に乳癌をもつヌードマウスへ注射された。(b)上部、透明房における腫瘍および血管構造。下部、末梢および中心の腫瘍血管ははっきり見える。(c)末梢および中心の腫瘍血管床の蛍光ビデオ顕微鏡法。矢頭は、造血幹細胞を指す(200X倍率)。(d)(c)からの200X顕微鏡視野あたりの造血幹細胞の平均数+/-SEM。(e)200Xおよび400X倍率における、抗マウスCD31(緑色)で免疫染色された腫瘍の凍結切片。造血幹細胞(矢頭)は、血管(矢印)の中または近くにある。アスタリスクはP<0.05を示す。バー=50μm。
【図３４】ヒトCD34+幹細胞上のインテグリンα4β1を示す。(a)幹細胞上のCD34、CD133およびインテグリンα4β1についてのFACsプロファイル。(b)培地、抗α4β1(HP2/1)または対照抗体(P1F6)の存在下における、幹細胞のCS-1フィブロネクチンへの接着+/-SEM。(c)EC上のVCAM(黒色)および非特異的IgG対照(灰色)についてのFACSプロファイル。(d)培地、抗α4β1(HP2/1)または対照抗体(P1F6)の存在下における、幹細胞のHUVECへの接着+/-SEM。(e)左、EC上の幹細胞の明視野/赤色蛍光画像。右、抗α4β1(HP2/1)または対照抗体(cIgG、P1F6)の存在下における、EC上の幹細胞の赤色蛍光画像。アスタリスクはP<0.05を示す。
【図３５】造血幹細胞ホーミングにおけるインテグリンα4β1およびリガンドを示す。(a)CD31(赤色)およびVCAMまたはフィブロネクチン(緑色)について免疫染色された、マウス乳癌または正常組織(結腸、左；心臓、右)の凍結切片。矢頭は血管を指す。黄色は、VCAM/フィブロネクチンのEC発現を表す。(b)抗マウスCD31(緑色、矢印)で免疫染色された、抗ヒトα4β1抗体または陰性抗体(Cntrl)の存在下における造血幹細胞(赤色、矢頭)を注射されたマウスからの乳癌(N202)またはルイス肺癌(LLC)の凍結切片。(c〜d)(c)N202および(d)LLC腫瘍についての200X顕微鏡視野あたりの造血幹細胞の平均数+/-SEM。アスタリスクはP<0.05を示す。バー=50μm。
【図３６】インテグリンα4β1は造血幹細胞の骨髄からのホーミングを促進することを示す。(a)抗CD31(赤色、矢印)で免疫染色された、EGFP+Lin-細胞(緑色、矢頭)および対照抗体(cIgG)または抗α4β1を注射されたマウスからのLLC腫瘍の凍結切片。EGFP+血管は黄色である。(b)200X顕微鏡視野あたりのEGFP細胞の平均数+/-SEM。(c)β-ガラクトシダーゼを検出する(200X)ように染色された、Tie2LacZ骨髄を移植され、かつ抗α4β1または対照抗体(cIgG)で処理されたマウスからのbFGFまたはVEGF飽和マトリゲルの凍結切片。(d)(c)からの200X視野あたりのLacZ+細胞の平均数+/-SEM：VEGF(黒色バー)、FGF(白色バー)。(e)β-ガラクトシダーゼ(緑色)およびCD31(赤色)について免疫染色された(d)からの凍結切片。LacZ+/CD31+血管は黄色である(矢印)。(f)200X視野あたりのLacZ+/CD31+血管の平均数+/-SEM。アスタリスクはP<0.05を示す。バー=50μm。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月30日(2006.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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