(57)【要約】  ２個以上の分子を連結、例えば、ペプチドをペプチドに、またはペプチドを標識に連結する方法が提供される。この方法は、ａ）ヒドラジン部分、ヒドラジド部分、またはアミノオキシ部分である反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、ｂ）活性化エステル部分を有する第２のオリゴペプチドを提供するステップと、ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップとを含んでよい。第２のオリゴペプチドは、好ましくは、チオール試薬により誘導されるインテイン融合タンパク質切断によって生成させることができる。本発明はさらに、ヒドラジド部分とアルデヒド官能基またはケトン官能基との反応によってタンパク質ヒドラジドが連結される、標識法およびライゲーション法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）活性化エステル部分を有する第２のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【化１】
2007534626.tif 000007
【請求項２】
前記末端の活性化エステル部分がチオエステルであり、前記ペプチドがチオエステルのアシル置換基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のポリペプチドが、Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含む前駆体分子のチオール試薬依存性切断により生成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供し、
（ｉｉ）前駆体分子にチオール試薬依存性切断を起こさせて、Ｃ末端にチオエステル部分を有する第２のオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチド分子と反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【請求項５】
前記反応性部分が、ヒドラジン部分、ヒドラジド部分、またはアミノオキシ部分である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記反応性部分がアミノオキシ部分であり、前記活性化エステル部分がチオエステルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のオリゴペプチドが、ヒドラジンと、チオエステル部分を介してＮ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチド前駆体を含む前駆体分子との反応によって作製される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ａ）ヒドラジン部分、ヒドラジド部分、またはアミノオキシ部分である反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
（ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、オリゴペプチド前駆体分子と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【請求項９】
前記第１のオリゴペプチドまたは前記第２のオリゴペプチドが組換えオリゴペプチドであり、前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドの他方が合成ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが組換えオリゴペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが合成オリゴペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むタンパク質分
（ｂ）インテインドメインがオリゴペプチドから切断されてタンパク質ヒドラジドを生成するように、前記タンパク質分子をヒドラジンと反応させるステップと
を含む、タンパク質ヒドラジドを生成させる方法。
【請求項１３】
前記方法のステップ（ｃ）が、ｐＨ６．５〜７．５の範囲のｐＨで実施される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）前記オリゴペプチド前駆体分子をヒドラジンと反応させて、末端にヒドラジド部分を有するオリゴペプチド中間体を含むオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｄ）第１のオリゴペプチドのアルデヒドまたはケトン部分を、オリゴペプチド中間体分子のヒドラジド部分と反応させて、ヒドラゾン連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【請求項１５】
前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって作製されるオリゴペプチド生成物。
【請求項１６】
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）活性化エステル部分を有するオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている、標識されたオリゴペプチドを形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）において、前記標識分子および前記オリゴペプチドが式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルが末端の活性化エステル部分である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）アシル置換基である、活性化エステル部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）反応性部分を有するオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）標識分子の活性化エステル部分を、オリゴペプチドの反応性部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチドを形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法であって、
ステップ（ｃ）において前記標識分子およびオリゴペプチドが、式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルが末端の活性化エステル部分である方法。
【請求項１９】
前記オリゴペプチドが、ヒドラジンと、チオエステル部分を介してＮ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチド前駆体を含む前駆体分子との反応によって作製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）反応性部分を有する標識を提供するステップと、
（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供し、
（ｉｉ）前駆体分子にチオール試薬依存性切断を起こさせて、Ｃ末端にチオエステル部分を有するオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｃ）標識の反応性部分を、オリゴペプチド分子と反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して標識とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチドを形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項２１】
前記反応性部分がアミノオキシ部分であり、前記活性化エステル部分がチオエステルである、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応性部分がアミノオキシ部分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチド前駆体分子と反応させて、上記に定義した式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項２４】
前記方法のステップ（ｃ）が、ｐＨ６．５〜７．５の範囲のｐＨで実施される、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第１のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）前記オリゴペプチド前駆体分子をヒドラジンと反応させて、末端にヒドラジド部分を有するオリゴペプチド中間体を含むオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｄ）標識分子のアルデヒドまたはケトン部分を、オリゴペプチド中間体分子のヒドラジド部分と反応させて、ヒドラゾン連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている、標識されたオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項２６】
前記アルデヒドまたはケトン部分がα−ジケトンまたはα−ケト−アルデヒド基である、請求項１４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法によって作製された、標識されたオリゴペプチド
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本出願は、２個以上の分子、例えば、有機低分子、標識、ペプチドなどを連結する方法に関する。特に、本出願は、合成ペプチドの組換えペプチドへのライゲーションなどペプチドを連結する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
タンパク質工学の方法は、基礎研究への応用、診断、薬物の発見のための、また、タンパク質治療としてのタンパク質に基づく手段を作り出すために大変貴重であることが分かっている。制御された方式でタンパク質の一次構造を操作する能力は、生物科学および医学において多くの新しい可能性を開く。ゆえに、タンパク質を部位特異的に修飾し、次にそれを応用するための方法の開発に対して一致協力した努力がなされている。
【０００３】
タンパク質生成の２つの主要な方法は、組換法または化学合成によるものである。これまでのところ、これら２つの方法は、補完的であることがわかっている。すなわち、組換法は、どんなサイズのタンパク質でも生成させることが可能であるが、通常、それらは、タンパク質由来のアミノ酸の組立に限定されている。したがって、一般に、組換えタンパク質への標識およびプローブの導入は、翻訳後に実施しなければならず、タンパク質主鎖への修飾はできない。
【０００４】
組換えタンパク質を標識するための最も一般的な方法は、タンパク質内部のリジン側鎖／Ｎαアミノ基またはシステイン側鎖とそれぞれ共有結合的に反応する、アミノまたはチオール反応性の型の標識を使用する。このような標識法が部位特異的になるためには、修飾しようとする位置に特有の反応性官能基を含む、適切なタンパク質誘導体を設計しなければならない。これには、一次配列中の他のすべての天然の反応性官能基が、アミノ酸変異誘発によって除去されることが必要となる。タンパク質アミノ官能基の場合、タンパク質内部に多量のリジン残基があり、配列のＮ末端にはアミノ官能基が存在するため、これはほぼ不可能である。同様に、システインの場合、このプロセスは労力を要し、タンパク質の機能に有害となることがしばしばある。
【０００５】
部位特異的な修飾および／または標識を有するタンパク質の作製は、化学合成法を用いるとより容易に達成できる。タンパク質の化学合成により、部位特異的に、タンパク質の側鎖部分および主鎖部分の双方に複数の修飾を組み込むことが可能となるが、通常、合成し、単離することができる配列の最大の大きさは約５０〜１００アミノ酸である。
【０００６】
タンパク質ライゲーション
タンパク質生成の別の方法は、タンパク質／ペプチドライゲーションである。この方法では、相互に反応性の化学官能基（天然アミノ酸の化学的性質と相互作用しない（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）、すなわち、天然アミノ酸の反応性部分の反応と比べて、相互に排他的な化学的性質によって反応する）を、保護されていないポリペプチド断片のＮ末端およびＣ末端に組み込み、その結果、それらが混合されると化学選択的に反応して、２つの配列を相互に結合するようにする（Ｃｏｔｔｏｎ  ＧＪおよびＭｕｉｒ  ＴＷ．  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９９年、６、Ｒ２４７〜Ｒ２５４頁）。化学ライゲーションの原理を、図１に概略的に示す。
【０００７】
２種の合成ペプチドのライゲーションを行うために、いくつかの化学的性質が利用されており、固相ペプチド合成により多様な範囲の様々な化学官能基をポリペプチド末端に組み込むことができる。これらには、チオエステルを形成させるための、チオ酸とブロモアルキルとの反応（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ＭおよびＫｅｎｔ  ＳＢＨ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年、２５６、２２１〜２２５頁）、それぞれチアゾリジンまたはオキサゾリジンを形成させるための、アルデヒドとＮ末端システインまたはトレオニンとの反応（Ｌｉｕ  Ｃ−ＦおよびＴａｍ  Ｊ  Ｐ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４年、９１、６５８４〜６５８８頁）、ヒドラゾンを形成させるための、ヒドラジドとアルデヒドとの反応（Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ＨＦ他、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３、２６２〜２６８頁）、オキシムを形成させるための、アミノキシ基とアルデヒドとの反応（Ｒｏｓｅ  Ｋ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４年、１１６、３０〜３３頁）、アミド結合を形成させるための、アジドとアリールホスフィンとの反応（シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション）（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＢＬ、Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ  ＬＬ、およびＲａｉｎｅｓ  ＲＴ．  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、３、９〜１２頁、Ｋｉｉｃｋ他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２年、９９、１９〜２４頁）、および、天然のアミド結合を形成させるための、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドとＮ末端にシステインを有するペプチドとの反応（Ｄａｗｓｏｎ他  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、２６６、７７６頁）（ネイティブ化学ライゲーション法、米国特許第６１８４３４４号、ＥＰ０８３２０９６Ｂ１）が含まれる。このネイティブ化学ライゲーション法は、水性緩衝液中でのＶａｌＳＰｈおよびＣｙｓＯＨの反応が、ジペプチドＶａｌＣｙｓＯＨを生じることを示したＷｉｅｌａｎｄおよび共同研究者による研究（Ｗｉｅｌａｎｄ  Ｔ他、Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、１９５３年、５８３、１２９〜１４９頁）を拡張したものである。
【０００８】
ネイティブ化学ライゲーション法がよく使われるようになっているが、これは、反応用にＮ末端にシステインを含むペプチドを必要とし、したがって、システインがタンパク質中の適切な位置に存在していない場合は、システインをライゲーション部位に導入する必要がある。しかし、タンパク質配列中に余分なチオール基を導入することは、特に、システインは、折り畳み経路を阻害し、または折り畳みタンパク質の機能を損なうことがあるジスルフィド結合を形成する傾向を有するため、その構造／機能に有害となることがある。
【０００９】
既知のライゲーション技術には関連する困難および問題があるため、２個の合成断片のライゲーションでは、通常、約１００〜１５０個のアミノ酸からなるタンパク質を化学的に合成することしかできない。２個以上の断片を相互に連結することによって、より大型のタンパク質が合成されているが、これは技術的に難しいことが分かっている（Ｃａｍａｒｅｒｏ他  Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．、１９９８年、５４、３０３〜３１６頁、Ｃａｎｎｅ  ＬＥ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９年、１２１、８７２０〜８７２７頁）。
【００１０】
タンパク質の半合成
合成のタンパク質断片でも組換えにより誘導したタンパク質断片でも相互に結合させることができるタンパク質ライゲーション技術が説明されている。これは、合成断片と組換え断片の組合せ物から大型のタンパク質を構築することを可能にし、天然物および非天然物の双方によって、部位特異的にタンパク質を修飾することを可能にする。このような、いわゆるタンパク質半合成を利用することによって、標的タンパク質内部の複数の異なる部位に部位特異的に、多くの様々な合成部分を組み込むことができる。
【００１１】
ライゲーション戦略で組換えタンパク質を利用するためには、組換え断片が、ライゲーションを促進するための適切な反応性官能基を含んでいなければならない。組換えタンパク質中に特有の反応性官能基を導入するための１つの方法は、Ｎ末端のセリン含有配列を過ヨウ素酸酸化することによる。こうした処理はＮ末端セリンを、Ｎ末端アルデヒドを含むグリオキシル部分に変換する。次に、ヒドラジドを含む合成ペプチドが、Ｎ末端にグリオキシル基を有するタンパク質とのヒドラゾン結合形成を通じ、化学選択的に、これらのタンパク質のＮ末端に連結された（Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ＨＦ他、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３、２６２〜２６８頁、Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ＨＦ他  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、２６９、７２２４〜７２３０頁）。Ｎ末端システイン残基を有する組換えタンパク質を生成させるために、別の取り組みがなされた。その後、Ｃ末端にチオエステルを含む合成ペプチドが、「ネイティブ化学ライゲーション法」に類似した方式で、アミド結合形成を通じて、これらのタンパク質のＮ末端に部位特異的に結合された（Ｃｏｔｔｏｎ  ＧＪおよびＭｕｉｒ  ＴＷ．  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、７、２５３〜２６１頁）。しかし、ネイティブ化学ライゲーション法による合成ペプチドのライゲーションと同様に、この技術では、一次配列が適切な位置にシステインを含んでいない場合は、ライゲーション部位にシステインを導入する必要がある。
【００１２】
タンパク質スプライシング技術
最近、Ｃ末端チオエステル基を含む組換えタンパク質の生成を可能にする技術が開発された。Ｃ末端のチオエステル官能基は、タンパク質ライゲーションのために利用することができる、タンパク質内部の特有の反応性化学基を供給する。組換えＣ末端チオエステルタンパク質は、タンパク質スプライシングとして知られている天然の生物学的現象を操作することによって作製される（Ｐａｕｌｕｓ  Ｈ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００、６９、４４７〜４９６頁）。タンパク質スプライシングとは、翻訳後プロセスであって、タンパク質前駆体が一連の分子内再配列を受けて、インテインと呼ばれる内部領域の正確な除去およびエクステインと呼ばれる２つのフランキング配列のライゲーションをもたらすプロセスである（図２）。一般に、エクステインのどちらにも配列要求性は無いが、インテインはいくつかの保存配列モチーフを特徴とし、このタンパク質ドメインファミリーの１００を優に超えるメンバーが現時点で同定されている。
【００１３】
タンパク質スプライシングの第１のステップは、Ｎ末端側エクステイン単位が、インテインの隣接したＮ末端に常に位置している保存残基Ｃｙｓ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒの側鎖のＳＨ基またはＯＨ基に移される、Ｎ→Ｓ（またはＮ→Ｏ）アシル転位を伴う。この機序の洞察から、タンパク質スプライシングの第１ステップのみを促進することができるいくつかの変異インテインが設計された（Ｃｈｏｎｇ他  Ｇｅｎｅ．１９９７年、１９２、２７１〜２８１頁、（Ｎｏｒｅｎ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２０００年、３９、４５０〜４６６頁）。これら人工的に設計されたインテインのうちの１つへのインフレームなＮ末端融合として発現されるタンパク質を、分子間トランスチオエステル化反応を介してチオールによって切断して、Ｃ末端チオエステル組換えタンパク質誘導体を生成させることができる（図３）（Ｃｈｏｎｇ他  Ｇｅｎｅ．１９９７年、１９２、２７１〜２８１頁、（Ｎｏｒｅｎ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２０００年、３９、４５０〜４６６頁）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  国際公開第００／１８８８１号、国際公開第００４７７５１号）。次に、発現タンパク質ライゲーション（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＥＰＬ）またはインテインを媒介とするタンパク質ライゲーション（ｉｎｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＩＰＬ）と呼ばれる手順で、このような組換えＣ末端チオエステルタンパク質のＣ末端に、Ｎ末端システイン残基を含むペプチド配列を特異的に連結することができる（Ｍｕｉｒ他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８年、９５、６７０５〜６７１０頁、Ｅｖａｎｓ  Ｊｒ他  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．、１９９８年、７、２２５６〜２２６４頁）。
【００１４】
合成であろうと組換えであろうと、Ｃ末端チオエステルを含むペプチドへのＮ末端システイン含有ペプチドの化学選択的ライゲーションは、一般に、わずかに塩基性のｐＨで、チオール補助因子の存在下で実施される。この戦略も、システインが一次配列中に適切に位置していない場合は、システインをライゲーション部位に導入することを必要とする。このライゲーション法のこれらの条件は、タンパク質ライゲーション生成物と最初の反応物の双方の構造および／または機能を改変する可能性を有する。
【００１５】
例えば、ケモカインＲＡＮＴＥＳは、Ｎ末端システインを含む分子へのＣ末端チオエステル分子のライゲーション（発現タンパク質ライゲーションおよびネイティブ化学ライゲーション）を行うために通常使用される緩衝液である、１００ｍＭの２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）を含む、１００ｍＭ  ＮａＣｌと１００ｍＭリン酸ナトリウムからなるｐＨ７．４の緩衝液中では不安定である。ＲＡＮＴＥＳは、タンパク質の構造および機能を維持するために重要なジスルフィド結合を２つ有している。前述の標準的なライゲーション緩衝液中では、折り畳みタンパク質が、４８時間以内に、還元タンパク質およびＭＥＳＮＡタンパク質付加体の混合物に変換されることが判明した。タンパク質混合物の大半は、おそらくは、これらの種の折り畳まれていない性質を反映して、その後に沈殿を形成した（Ｃｏｔｔｏｎ、未発表）。
【００１６】
したがって、本発明者らは、チオール含有緩衝液を必要とするライゲーション反応は、一般に、抗体、抗体断片、および抗体ドメイン、サイトカイン、成長因子などジスルフィド結合を有するタンパク質の完全性を維持するのには適さないと考える。したがって、通常はチオールの不在下で実施されるライゲーション法が必要とされている。例えば、数日間にわたり観察すると、ＲＡＮＴＥＳは、１００ｍＭ  ＮａＣｌと１００ｍＭリン酸ナトリウムからなるｐＨ７．４の緩衝液、およびｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中では安定であることが判明した（本発明者の未発表の結果）。したがって、このような条件下で実施することができるライゲーション反応は、ジスルフィドを有するタンパク質にもジスルフィドを有さないタンパク質にも適用可能であるはずである。
【００１７】
タンパク質標識化
歴史的には、タンパク質ライゲーションとは、２つのペプチド／タンパク質断片を相互に結合することを意味するが、これは、標識がペプチドまたは誘導体化ペプチドであるタンパク質標識化と同義である。同様に、非ペプチド性合成低分子がタンパク質ライゲーションのために必要な反応性化学官能基を含んでいる場合は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに直接この合成分子をライゲーションすることにより、タンパク質が部位特異的に標識化される。したがって、タンパク質断片のライゲーションのために開発された技術を、ペプチドまたはタンパク質の配列とは無関係な部位特異的な方式で、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかを直接標識化するのに使用することもできる。
【００１８】
（対応するＮ末端セリンタンパク質を過ヨウ素酸酸化することにより生成させた）Ｎ末端グリオキシル官能基を含む組換えタンパク質が、標識のヒドラジドまたはアミノキシ誘導体との反応によって、部位特異的にＮ末端を標識された（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＫＦおよびＳｔｒｏｈ  ＪＧ．  Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３、１３８〜１４６頁、Ａｌｏｕｎｉ  Ｓ他  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、２２７、３２８〜３３４頁）。また、Ｎ末端システイン残基を含む組換えタンパク質は、それぞれアミドおよびチアゾリジンを形成させるための、チオエステル官能基を含む標識、チオエステルのアシル置換基である標識（Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＢおよびＰａｎｎｅｌｌ  ＬＫ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、１３、１０３９〜４３頁）、およびアルデヒド官能基（Ｚｈａｏ他  Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、１０、４２４〜４３０頁）との反応を通じて、Ｎ末端を標識されている。
【００１９】
タンパク質をライゲーションするためのいくつかの方法があるが、各方法には潜在的な欠点がある。したがって、新規なライゲーション法が必要とされており、特に、合成断片にも組換え断片にも適合性があり、ジスルフィド結合を有さないタンパク質と同様にジスルフィド結合を有するタンパク質のライゲーションで使用することができる方法であり、既存の技術を補完し、タンパク質分野の技術者に別の手段を与えるライゲーション法が必要とされている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明者らは、従来技術に関連するいくつかの問題を克服し、従来技術のいくつかの問題を克服する、ペプチド分子を連結するための新しい方法を開発した。
【００２１】
したがって、本発明の第１の態様では、
ａ）反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）活性化エステル部分を有する第２のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法が提供される。
【００２２】
【化１】
2007534626.tif 000002
【００２３】
好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）で前記オリゴペプチドが式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、また、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルは、末端の活性化エステル部分である。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記連結部分は、式Ｉまたは式ＩＩＩで表される連結部分を介して連結される。
【００２５】
文脈上別の意味で解釈する必要がない限り、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質という用語は、互換的に使用される。
【００２６】
第１のオリゴペプチドの活性化エステル部分は、チオエステル部分、フェノールエステル部分、ヒドロキシスクシンイミド部分、またはＯ−アシルイソ尿素部分など任意の適切な活性化エステル部分でよい。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、活性化エステル部分は、チオエステル部分である。ペプチドがチオエステルのアシル置換基である任意の適切なチオエステルペプチドを本発明で使用してよい（図４）。
【００２８】
このようなチオエステルペプチドは、合成的に作製しても組換えによって作製してもよい。当業者なら、合成ペプチドチオエステルを生成させるための当技術分野で既知の方法をよく知っている。例えば、ＨＦを切断すると同時にＣ末端チオエステルを生じる、樹脂上での合成によって、合成ペプチドチオエステルを作製することができる（Ｈｏｊｏ他、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９９３年、６６、２７００〜２７０６頁）。さらに、組み立てられたペプチドをチオール導入樹脂から切断することにより、Ｃ末端チオエステルを生成するために、「セーフティーキャッチ」リンカーの使用が普及している（Ｓｈｉｎ  Ｙ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９年、１２１、１１６８４〜１１６８９頁）。
【００２９】
さらに、最近では、組換えＣ末端チオエステルタンパク質の生成を可能にする技術が開発されている。組換えＣ末端チオエステルタンパク質は、タンパク質スプライシングとして知られている天然の生物学的現象を操作することによって作製することができる。前述したように、タンパク質スプライシングとは、翻訳後プロセスであって、タンパク質前駆体が一連の分子内再配列を受けて、インテインと呼ばれる内部領域の正確な除去およびエクステインと呼ばれる２つのフランキング配列のライゲーションをもたらすプロセスである。
【００３０】
前述したように、タンパク質スプライシングの第１ステップのみを促進することができるいくつかの変異インテインが設計されている（Ｃｈｏｎｇ他  Ｇｅｎｅ．１９９７年、１９２、２７１〜２８１頁、Ｎｏｒｅｎ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２０００年、３９、４５０〜４６６頁）。これら人工的に設計されたインテインのうちの１つへのインフレームなＮ末端融合として発現されるタンパク質を、分子間トランスチオエステル化反応を介してチオールによって切断して、Ｃ末端チオエステル組換えタンパク質誘導体を生成させることができる（Ｃｈｏｎｇ他  Ｇｅｎｅ．１９９７年、１９２、２７１〜２８１頁、Ｎｏｒｅｎ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２０００年、３９、４５０〜４６６頁）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  国際公開第００／１８８８１号、国際公開第００４７７５１号）。このようなタンパク質チオエステルを本発明の方法で使用してよい（図３を参照のこと）。
【００３１】
したがって、本発明の好ましい態様では、ステップ（ｂ）で、チオール試薬に誘導されるインテイン融合タンパク質切断により、第２のオリゴペプチドが生成される。
【００３２】
したがって、本発明の第２の態様では、
ａ）反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチド前駆体を含むオリゴペプチド前駆体分子を提供し、
（ｉｉ）前駆体分子にチオール試薬依存性の切断を起こさせて、Ｃ末端にチオエステル部分を有する第２のオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチド分子と反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法が提供される。
【００３３】
第１のオリゴペプチドの反応性部分は、任意の適切な反応性部分でよい。本発明の好ましい実施形態では、この反応性部分は、それぞれ一般式ＩＶ、Ｖ、またはＶＩで表されるヒドラジン部分、アミノオキシ部分、またはヒドラジド部分である。
【化２】
2007534626.tif 000003
【００３４】
例えば、特定の好ましい実施形態では、反応性部分は式ＩＶで表され、本発明の方法によって作製されたオリゴペプチド生成物において、第１のオリゴペプチドおよび第２のオリゴペプチドは、式Ｉで表される連結部分を介して連結されている。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、反応性部分は式Ｖで表され、本発明の方法によって作製されたオリゴペプチド生成物において、第１のオリゴペプチドおよび第２のオリゴペプチドは、式ＩＩで表される連結部分を介して連結されている。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、反応性部分は式ＶＩで表され、本発明の方法によって作製されたオリゴペプチド生成物において、第１のオリゴペプチドおよび第２のオリゴペプチドは、式ＩＩＩで表される連結部分を介して連結されている。
【００３７】
前述したように、第１のオリゴペプチドは反応性部分を含み、これは、好ましい実施形態では、ヒドラジン部分（例えば式ＩＶ）、アミノオキシ部分（例えば式Ｖ）、またはヒドラジド部分（例えば式ＶＩ）でよい。
【００３８】
本発明のライゲーション法の特有の利点は、チオールの不在下で実施できることである。これにより、ジスルフィド結合を含むタンパク質／ペプチド、ならびにこのような結合をもたないタンパク質の効率的なライゲーションが可能となる。
【００３９】
したがって、本発明の第１および第２の態様の実施形態では、第１のオリゴペプチドおよび第２のオリゴペプチドのうちの少なくとも１種が１つまたは複数のジスルフィド結合を有する。
【００４０】
ヒドラジン、ヒドラジド、またはアミノオキシを含む合成オリゴペプチドの誘導体は、既知の方法、例えば、固相合成法を用いて、容易に作製することができる。
【００４１】
さらに、本発明者らは、ヒドラジン処理により選択的に、Ｎ末端でインテインドメインに融合されているタンパク質をインテインから切断して、対応するそのヒドラジド誘導体として所望のタンパク質を遊離させることができることも発見した（例えば、図５を参照のこと）。
【００４２】
したがって、本発明のさらに好ましい実施形態では、第１のオリゴペプチドは、ヒドラジンと、Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第１のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド分子との反応によって生成される。
【００４３】
実際に、このような反応形態によってこのようなタンパク質ヒドラジドを作製できるという発見は、本発明の独立した態様になっている。
【００４４】
したがって、本発明の第３の態様は、
ａ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むタンパク質分子を提供するステップと、
ｂ）インテインドメインがオリゴペプチドから切断されてタンパク質ヒドラジドを生成するように、前記タンパク質分子をヒドラジンと反応させるステップとを含む、
タンパク質ヒドラジドを生成させる方法を提供する。
【００４５】
さらに、Ｃ末端にヒドラジド部分を有する第１のオリゴペプチドを生成させるためにこのような反応を用いることに加えて、上述したように第１のオリゴペプチドは活性化エステル部分を有する第２のオリゴペプチドとの反応に利用できるため、本発明は、さらに、２個のペプチドを連結してオリゴペプチド生成物を生成させるための「ワンステップ」の方法にも及ぶ。
【００４６】
これは、Ｎ末端がインテインに直接結合されている適切なタンパク質を、ヒドラジン、ヒドラジド、またはアミノオキシ部分を有するポリペプチドと反応させることによって、実現することができる。
【００４７】
したがって、第４の態様では、本発明は、
ａ）ヒドラジン部分、ヒドラジド部分、またはアミノオキシ部分である反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、オリゴペプチド前駆体分子と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップとを含む、
オリゴペプチド生成物を作製する方法を提供する。
【００４８】
したがって、本発明のライゲーション技術は、合成のタンパク質およびペプチドも組換えのタンパク質およびペプチドも利用することができる。したがって、これにより、２個以上の合成ペプチドのライゲーション、２個以上の組換えペプチドのライゲーション、または少なくとも１個の合成ペプチドと少なくとも１個の組換えペプチドとのライゲーションが可能となる。
【００４９】
さらに、ペプチドを連結する新規な方法を提供することに加えて、本発明は、合成または組換えペプチドを標識するのにも使用できる。
【００５０】
したがって、本発明の第５の態様では、
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）活性化エステル部分を有するオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、上記に定義した式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている、標識されたオリゴペプチドを形成させるステップとを含む、
オリゴペプチドを標識する方法が提供される。
【００５１】
好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）において、前記標識分子および前記オリゴペプチドが式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルが末端の活性化エステル部分である。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、ステップ（ｂ）において、チオールで誘導されるインテイン融合タンパク質切断により、オリゴペプチドが生成される。
【００５３】
したがって、本発明の第６の態様では、
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｃ）（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチド前駆体を含むオリゴペプチド前駆体分子を提供し、
（ｉｉ）前駆体分子にチオール試薬依存性の切断を起こさせて、Ｃ末端にチオエステル部分を有するオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチドと反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチドを形成させるステップとを含む、
オリゴペプチドを標識する方法が提供される。
【００５４】
別法として、末端に活性化エステル部分を有する標識分子を用いて、反応性部分を有するオリゴペプチドを標識することもできる。したがって、本発明の第７の態様では、
ａ）アシル置換基である、活性化エステル部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）反応性部分を有するオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）標識分子の活性化エステル部分を、オリゴペプチドの反応性部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチドを形成させるステップとを含む、
オリゴペプチドを標識する方法であって、
ステップ（ｃ）において前記標識分子およびオリゴペプチドが式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルが末端の活性化エステル部分である方法が提供される。
【００５５】
ライゲーション技術と同様に、インテイン分子に連結された前駆体分子として存在しているオリゴペプチドを直接標識することもできる。したがって、本発明の第８の態様は、
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチド前駆体分子と反応させて、上記に定義した式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチド生成物を形成させるステップとを含む、
オリゴペプチドを標識する方法を提供する。
【００５６】
本発明の方法では、当業者に既知の任意の適切な標識分子を使用してよい。標識の選択は、標識ペプチドが使われる予定の用途に応じて変わる。例えば、本発明の方法で使用できる標識としては、フルオロフォア、架橋試薬、スピン標識、アフィニティープローブ、イメージング試薬、例えば放射性同位体、ＤＯＴＡなどのキレート剤、ＰＥＧなどのポリマー、脂質、糖、細胞毒性薬、ならびに固体表面およびビーズを挙げることができる。
【００５７】
本発明の第５、第６、および第７の態様の特定の実施形態では、標識およびオリゴペプチドのうちの少なくとも１種が、１つまたは複数のジスルフィド結合を有する。
【００５８】
本発明の方法は、ペプチドのライゲーション、特に、従来のライゲーション技術を用いると、様々な保護基を必要とするはずであるペプチドのライゲーションにおいて特に有用である。本発明者らは、反応性部分のみが反応するｐＨ条件下で本発明の方法を実施できることを示した。
【００５９】
本発明の第１および第２の態様の好ましい実施形態、ならびに本発明の第４から第８の態様の好ましい実施形態では、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．５の範囲、好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ８．０、例えば、ｐＨ４．０〜７．５、より好ましくは、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０の範囲、より好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ７．５の範囲、最も好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の範囲のｐＨで本方法のステップ（ｃ）を実施する。
【００６０】
例えば、本発明者らは、合成ペプチドのＣ末端のチオエステルが、ｐＨ６．０、水性条件下でヒドラジンと特異的に反応して、対応するペプチドヒドラジドを形成することを実証した。これにより、潜在的に有害なチオール補助因子（断片または最終構築体がチオールの影響を受けやすい場合は有用である）を必要とせずに、本明細書で記述するライゲーション法をｐＨ６．０で実施することが可能となり、潜在的に反応性の側鎖基（チオールなど）のタンパク質中への導入が起こらない。同様に、本発明者らは、合成ペプチドのＣ末端のチオエステルが、ｐＨ６．０およびｐＨ６．８、水性条件下でヒドロキシルアミンと特異的に反応して、対応するペプチドヒドロキサム酸を形成することも実証した。さらに、後述するように、本発明者らは、合成ペプチドＣ末端のチオエステルも組換えタンパク質のＣ末端チオエステルも、ｐＨ７．５、水性条件下でＯ−メチルヒドロキシルアミンと特異的に反応して、対応するＣ末端Ｎ−メトキシアミド誘導体を形成することも実証した。これにより、潜在的に有害なチオール補助因子を必要とせずに、本明細書で記述するライゲーション法をｐＨ７．５で実施することが可能となる。
【００６１】
チオエステル基を含むペプチドおよびタンパク質（この場合、ペプチドはチオエステルのアシル置換基である）を、標識またはペプチドのヒドラジン、ヒドラジド、またはアミノオキシ誘導体と反応させて、それぞれ部位特異的標識および化学選択的ライゲーションを行うことができる（例えば、図４および図５を参照のこと）。
【００６２】
類似した方法で、ヒドラジン、ヒドラジド、またはアミノオキシ基を含むペプチドを、標識またはペプチドのチオエステル誘導体と反応させて、それぞれ部位特異的標識および化学選択的ライゲーションを行うことができる（例えば、図４および図５を参照のこと）。
【００６３】
さらに、本発明者らは、タンパク質−インテイン融合物をヒドラジンで切断することによって組換えタンパク質ヒドラジドを生成させられることを実証して、ヒドラジド部分を活性化エステル部分以外の反応性の基、例えば、アルデヒド官能基またはケトン官能基と反応させることによって、このようなタンパク質ヒドラジドを連結できることも示した。例えば、後述するように、本発明者らは、記載した方法を用いて、合成ペプチドのピルボイル誘導体を組換えタンパク質ヒドラジドのＣ末端に化学選択的に連結できることを示し、また、類似した方法で、記載した方法により、フルオレセインのピルボイル誘導体を用いて組換えタンパク質ヒドラジドのＣ末端を部位特異的に標識した。
【００６４】
本発明のこの態様は、組換えペプチドを第２のペプチドに、または実際には標識に連結する、さらなる新規な方法を提供する。
【００６５】
したがって、本発明の第９の態様は、
ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）前記オリゴペプチド前駆体分子をヒドラジンと反応させて、Ｃ末端にヒドラジド部分を有するオリゴペプチド中間体を含むオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｄ）第１のオリゴペプチドのアルデヒドまたはケトン部分を、オリゴペプチド中間体分子のヒドラジド部分と反応させて、ヒドラゾン連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップとを含む、
オリゴペプチド生成物を作製する方法を提供する。
【００６６】
本態様の例を図６に示す。
【００６７】
本発明の第１０の態様は、
ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第１のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）前記オリゴペプチド前駆体分子をヒドラジンと反応させて、末端にヒドラジド部分を有するオリゴペプチド中間体を含むオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｄ）標識分子のアルデヒドまたはケトン部分を、オリゴペプチド中間体分子のヒドラジド部分と反応させて、ヒドラゾン連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている、標識されたオリゴペプチド生成物を形成させるステップとを含む、
オリゴペプチドを標識する方法を提供する。
【００６８】
本発明の第９および第１０の態様の好ましい実施形態では、ヒドラゾン部分は式ＶＩＩで表される。
【化３】
2007534626.tif 000004
（式中、ＲはＨ、または任意の置換もしくは非置換、好ましくは非置換のアルキル基である。）
【００６９】
本発明の第９および第１０の態様の好ましい態様では、ｐＨ１．０〜ｐＨ７．０の範囲、好ましくはｐＨ１．０〜ｐＨ６．０、より好ましくは、ｐＨ２．０〜ｐＨ５．５の範囲、最も好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ４．５の範囲のｐＨで、本方法を実施する。
【００７０】
本発明の第９および第１０の態様の特定の実施形態では、オリゴペプチドまたは標識のアルデヒドまたはケトン含有部分は、α−ジケトン基またはα−ケトアルデヒド基である。
【００７１】
本発明の第１１の態様では、本発明の方法を用いて作製されたオリゴペプチド生成物が提供される。
【００７２】
第１２の態様では、本発明の方法により標識されたオリゴペプチドを含む標識オリゴペプチドが提供される。
【００７３】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のそれぞれに関しては必要に応じて変更を加える。
【００７４】
以下に、添付図を参照して、以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００７５】
実施例１−ペプチド／タンパク質のチオエステルとヒドラジン／ヒドラジドまたはアミノキシ官能基を含む化合物との反応を用いたタンパク質ライゲーション／部位特異的タンパク質標識
Ａ）ｐＨ６．０における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１００ｍＭヒドラジンとの反応
１００ｍＭヒドラジン一水和物（２００μＬ）を含有するｐＨ６．０の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、ＡＳ６２６ｐ１Ａと名づけたモデル合成Ｃ末端チオエステルペプチド（２００μｇ）に加えて、最終ペプチド濃度を３１７μＭとした。ＡＳ６２６ｐ１Ａは、配列ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ（Ｍｅ）３  ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱ  ＬＡＴＫＡＡＲＫ−ＣＯＳ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＣ２Ｈ５（配列番号１）を有しており、この配列中では、ただ１つのアラニン残基（配列番号１のアラニン残基のうちのどの１つでもよい）がアルギニン残基によって置換されている。反応を室温でインキュベートし、分析用逆相ＨＰＬＣを用いて経時的に観察した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（５μＭ、０．４６×２５ｃｍ）。アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、流速１ｍＬ／分でペプチドを溶出させた。エレクトロスプレー質量分析法により、カラムから溶出する個々のペプチドの特性を決定した。
【００７６】
Ｂ）ｐＨ６．０における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１００ｍＭヒドロキシルアミンとの反応
１００ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン（２００μＬ）を含有するｐＨ６．０の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をＡＳ６２６ｐ１Ａ（２００μｇ）に加えて、最終ペプチド濃度を３１７μＭとした。反応を室温でインキュベートし、分析用逆相ＨＰＬＣを用いて経時的に観察した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（５μＭ、０．４６×２５ｃｍ）。アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、流速１ｍＬ／分でペプチドを溶出させた。エレクトロスプレー質量分析法により、カラムから溶出する個々のペプチドの特性を決定した。
【００７７】
Ｃ）ｐＨ６．８における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１００ｍＭヒドロキシルアミンとの反応
１００ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン（２００μＬ）を含有するｐＨ６．８の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をＡＳ６２６ｐ１Ａ（２００μｇ）に加えて、最終ペプチド濃度を３１７μＭとした。反応を室温でインキュベートし、分析用逆相ＨＰＬＣを用いて経時的に観察した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（５μＭ、０．４６×２５ｃｍ）。アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、流速１ｍＬ／分でペプチドを溶出させた。エレクトロスプレー質量分析法により、カラムから溶出する個々のペプチドの特性を決定した。
【００７８】
Ｄ）ｐＨ６．８における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１０ｍＭヒドロキシルアミンとの反応
１００ｍＭヒドロキシルアミンを１０ｍＭヒドロキシルアミンに置き換えて、Ｃ）で記述した手順を繰り返した。
【００７９】
Ｅ）ｐＨ７．５における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１０ｍＭヒドロキシルアミンとの反応
ｐＨ７．５で、Ｄ）で記述した手順を繰り返した。
【００８０】
Ｆ）ｐＨ７．５における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと２ｍＭヒドロキシルアミンとの反応
１０ｍＭヒドロキシルアミンを２ｍＭヒドロキシルアミンに置き換えて、Ｅ）で記述した手順を繰り返した。
【００８１】
Ｇ）ｐＨ７．５における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１００ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミン（ＮＨ２−Ｏ−ＣＨ３）との反応
１００ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミン（２００μＬ）を含有するｐＨ７．５の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、Ｃ末端がチオエステルである合成ペプチドＡＳ６２６ｐ１Ａ（２００μｇ）に加えて、最終ペプチド濃度を３１７μＭとした。反応を室温でインキュベートし、分析用逆相ＨＰＬＣを用いて経時的に観察した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（５μＭ、０．４６×２５ｃｍ）。アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、流速１ｍＬ／分でペプチドを溶出させた。エレクトロスプレー質量分析法により、カラムから溶出する個々のペプチドの特性を決定した。
【００８２】
Ｈ）ｐＨ７．５における、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドと１０ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミンとの反応
１００ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミンを１０ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミンで置き換えて、Ｇ）で記述した手順を繰り返した。
【００８３】
Ｉ）ｐＨ７．５における、Ｃ末端にチオエステルを有する組換えタンパク質と１００ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミンとの反応
以下の実施例２で記述するように、融合タンパク質Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡインテイン−ＣＢＤの切断により、組換えＧｒｂ２−ＳＨ２のＣ末端メルカプトエタンスルホン酸チオエステル誘導体を生成させた。この組換えＣ末端チオエステルタンパク質（１００μｇ）を、ｐＨ７．５の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶かした１００ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミン（２００μＬ）と反応させた。反応を室温でインキュベートし、分析用逆相ＨＰＬＣを用いて経時的に観察した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ５カラム（５μＭ、０．４６×２５ｃｍ）。アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、流速１ｍＬ／分でペプチドを溶出させた。エレクトロスプレー質量分析法により、カラムから溶出する個々のペプチドの特性を決定した。
【００８４】
結果
これらの実施例は、ペプチド／タンパク質Ｃ末端のチオエステルとヒドラジン／ヒドラジドまたはアミノキシ官能基を含む化合物との反応を用いて、本発明の合成タンパク質配列および組換えタンパク質配列の双方のタンパク質ライゲーション／部位特異的なタンパク質標識を行うための新規な戦略を示している。
【００８５】
前述したように、精製した合成２７アミノ酸Ｃ末端チオエステルペプチド（エチル３−メルカプトプロピオナートチオエステル誘導体）を、様々な条件下でヒドラジンおよびヒドロキシルアミンで処理した（表１）。
【００８６】
ｐＨ６．０、１００ｍＭヒドラジンで処理すると、ＨＰＬＣによる分析において出発時のチオエステルペプチドより早く溶出するペプチド種が形成された。この物質は、ＥＳＭＳにより、期待されたペプチドヒドラジドとして同定された：観測質量＝３０５４Ｄａ、期待質量（アイソトープ化合物の平均）は３０５３Ｄａ。ペプチドヒドラジドを形成するための、Ｃ末端がチオエステルであるペプチドとヒドラジンとの反応を、逆相ＨＰＬＣを用いて経時的に観察した。３日後でさえも、副生成物を形成することなく、所望の物質のみが形成された。これらの反応条件下でペプチドヒドラジドが安定であることは、この反応がＣ末端チオエステル部分で起こり、化学選択的な性質を有することを示唆している。このことから、タンパク質ライゲーションおよび標識のためにこの反応を適用できることも強調される（２時間で７０％の変換、４時間で９５％を超える変換）。
【００８７】
タンパク質ライゲーションおよび部位特異的標識を行うために、アミノオキシ含有化合物が化学選択的にペプチド／タンパク質のＣ末端チオエステルと反応するかを確認するために、合成Ｃ末端チオエステルペプチドを様々な条件下で、ヒドロキシルアミンで処理した（表１）。
【００８８】
精製した合成２７アミノ酸Ｃ末端チオエステルペプチド（エチル３−メルカプトプロピオナートチオエステル、観測質量３１５５Ｄａ）を、様々なｐＨの水性緩衝液に溶かした様々な濃度のヒドロキシルアミンとともに室温でインキュベートした。すべての場合において、逆相ＨＰＬＣにより分析したところ、Ｃ末端がチオエステルであるペプチドが反応して、出発時のチオエステルペプチドより早く溶出する単一の生成物を形成した。ＥＳＭＳにより測定されたように、この物質は、期待されたペプチドヒドロキサム酸に対応している：観測質量＝３０５２Ｄａ、期待質量（アイソトープ化合物の平均）は３０５４Ｄａ。逆相ＨＰＬＣを用いて、反応動態を観察した。Ｃ末端がチオエステルであるペプチドは、副生成物の形成を伴わず清浄な様式で、対応するペプチドヒドロキサム酸に変換された。反応緩衝液のｐＨを高くすると、反応速度が速まった。例えば、濃度１００ｍＭのＮＨ２ＯＨを用いて、ｐＨ６．０からｐＨ６．８に移動させた結果、１時間後の生成物形成率は２５％から９１％に上昇した。ｐＨ６．０で１００ｍＭのＮＨ２ＯＨを用いた場合の反応速度は、ｐＨ６．８における１０ｍＭのＮＨ２ＯＨと同等であった。
【００８９】
対応するヒドロキサム酸を形成させるための、Ｃ末端がチオエステルであるペプチドとヒドロキシルアミンとの反応速度は、ｐＨの上昇に伴って速くなり、ＮＨ２ＯＨ濃度の低下に伴って遅くなる。ペプチド／タンパク質標識およびライゲーションに適切なｐＨおよび反応物濃度の条件を特定するために、ｐＨを上昇させ、また、ＮＨ２ＯＨ濃度を低下させて、標識化を実施した。
【００９０】
１０ｍＭ  ＮＨ２ＯＨとの反応は、ｐＨ６．８では４時間後に８３％完了したのに対し、ｐＨ７．５では２時間後に８３％完了した。さらにＮＨ２ＯＨ濃度を２ｍＭまで低下させた結果、ｐＨ７．５での反応速度は著しく低下し、８時間後に、出発時のα−チオエステルペプチドの７０％が、対応するヒドロキサム酸に変換された。質量がペプチド酸に対応する、少量の副生成物が反応進行中に形成されることが注目された。これは、ｐＨ７．５での競合的な加水分解副反応によって形成されたと考えられる。この副反応は、ｐＨ７．５で１０ｍＭ  ＮＨ２ＯＨを用いた際は、このより高い反応物濃度では反応がより速く起こるため、観察されなかった。
【００９１】
【表１】
2007534626.tif 000005
【００９２】
タンパク質ライゲーションおよび部位特異的標識を行うために、アミノオキシ含有化合物とペプチド／タンパク質Ｃ末端チオエステルとの化学選択的反応をさらに調査するために、合成Ｃ末端チオエステルペプチドＡＳ６２６ｐ１をＯ−メチルヒドロキシルアミンで処理した。
【００９３】
精製した合成２７アミノ酸Ｃ末端チオエステルペプチド（エチル３−メルカプトプロピオナートチオエステル、観測質量３１５５Ｄａ）を、ｐＨ７．５の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶かした１００ｍＭのＯ−メチルヒドロキシルアミンとともに室温でインキュベートした。逆相ＨＰＬＣにより分析したところ、ペプチドＣ末端チオエステルが反応して、出発時のチオエステルペプチドより早く溶出する単一の生成物を形成した。ＥＳＭＳにより測定されたように、この物質は、期待されたＮ−メトキシペプチドアミドに対応していた：観測質量＝３０７０Ｄａ、期待質量は３０６８Ｄａ。逆相ＨＰＬＣを用いて、反応動態を観察した（表ＩＩ）。ペプチドＣ末端チオエステルは、副生成物の形成を伴わず清浄な様式で、対応するＮ−メトキシペプチドアミド誘導体に変換され、２４時間後に反応の７５％が完了した。これらの条件下では、チオエステルの加水分解は観察されなかった。
【００９４】
【表２】
2007534626.tif 000006
【００９５】
１０ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミンで１００ｍＭ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミンを置き換えた以外は同じ条件下で反応を繰り返すと、反応速度は遅くなった。しかし、７２時間後には、出発時のＣ末端チオエステルペプチドの８８％が反応していた。これらの条件下では、所望の反応生成物の形成に加えて、副生成物の形成が観察された。それでも、７２時間後には、反応混合物のＨＰＬＣ分析により、反応生成物の３０〜４０％が所望のライゲーション反応生成物（Ｎ−メトキシペプチドアミド）であると推定された。
【００９６】
Ｏ−メチルヒドロキシルアミンと組換えＣ末端チオエステルタンパク質との反応も調査した。実施例２で記述したように、融合タンパク質Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡインテイン−ＣＢＤのチオールを媒介とした切断により、Ｃ末端メルカプトエタンスルホン酸チオエステル誘導体として、組換えＧｒｂ２−ＳＨ２が生成された。ｐＨ７．５で、この組換えＣ末端チオエステルタンパク質を１００ｍＭのＯ−メチルヒドロキシルアミンと反応させた。１８時間後の反応混合物をＨＰＬＣおよびＥＳＭＳによって分析したところ、Ｃ末端チオエステルタンパク質のすべてが完全に２種類のタンパク質種に変換されていることが示された。これら２種のタンパク質誘導体は、所望のライゲーション反応生成物、すなわちＣ末端がＮ−メトキシアミドであるＧｒｂ２−ＳＨ２（期待質量１２０６７Ｄａ、観測質量１２０６７Ｄａ）と、所望の反応生成物の酸化型（観測質量１２０８４Ｄａ）とに対応していた。Ｃ末端のタンパク質チオエステルの加水分解に対応する副生成物は観察されなかった。したがって、組換えＣ末端チオエステルタンパク質のすべてが、タンパク質のＣ末端で特異的にアミド結合を形成する反応を介して、化学選択的にＯ−メチルヒドロキシルアミンと連結していた。すなわち、この反応は、組換えタンパク質の部位特異的Ｃ末端標識をもたらした。
【００９７】
実施例２−Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２  ＳＨ２組換えタンパク質（組換えＣ末端ヒドラジドＧｒｂ２  ＳＨ２タンパク質）の生成
（ｉ）ヒドラジンによるタンパク質−インテイン融合物の選択的切断による、組換えＣ末端ヒドラジドタンパク質の生成能力、および（ｉｉ）ライゲーション／標識化反応におけるそれらのその後の用途を調査するために、アダプタータンパク質Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインをモデル系として選択した。
ヒトＧｒｂ２  ＳＨ２  ドメインの配列
ＨＰＷ  ＦＦＧＫＩＰＲＡＫＡ  ＥＥＭＬＳＫＱＲＨＤ  ＧＡＦＬＩＲＥＳＥＳ  ＡＰＧＤＦＳＬＳＶＫ  ＦＧＮＤＶＱＨＦＫＶ  ＬＲＤＧＡＧＫＹＦＬ  ＷＶＶＫＦＮＳＬＮＥ  ＬＶＤＹＨＲＳＴＳＶ  ＳＲＮＱＱＩＦＬＲＤ  ＩＥＱＶＰＱＱＰＴ
【００９８】
Ｇｒｂ２−ＳＨ２ドメイン−ＧｙｒＡインテイン融合物の発現
余分なグリシン残基がＣ末端に付いているヒトＧｒｂ２のＳＨ２ドメインをコードしているＤＮＡ配列を、ｐＴＸＢ１発現プラスミド（ＮＥＢ）中にクローニングした。このベクターｐＴＸＢ１Ｇｒｂ２−ＳＨ２（Ｇｌｙ）は、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインがグリシン残基を介してＧｙｒＡインテインのＮ末端に結合されている、すなわち、キチン結合ドメイン領域（ＣＢＤ）のＮ末端に融合されている、融合タンパク質をコードしている。このプラスミドで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、ＬＢ培地中で中期対数期まで増殖させ、また、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、３７℃で４時間、タンパク質発現を誘導した。遠心分離後、細胞を溶解緩衝液（０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。溶解緩衝液中で予め平衡化したキチンカラム上に可溶性画分を載せた。次に、洗浄緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）でカラムを洗浄して、キチンビーズ上に固定化された精製Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤを得た（図７）。
【００９９】
チオールの誘導によるＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡインテイン融合物の切断による、Ｃ末端がチオエステルであるＧｒｂ２−ＳＨ２の生成
タンパク質内部のインテインドメインが機能的であることを確認するために、融合タンパク質をチオールに曝露させて、トランスチオエステル化による切断の程度を評価した。固定化されたＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤを含むキチンビーズをｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液中に入れて平衡化した。次に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）をｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液中のビーズに加えて、それぞれチオールの最終濃度が１００ｍＭまたは１２０ｍＭである５０％のスラリーを得た。次に、この混合物を室温で振とうし、一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。４８時間後に、反応物から上清を分離し、続いて、ＨＰＬＣおよびＥＳＭＳによって分析した。
【０１００】
Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡインテイン−ＣＢＤ融合物をＤＴＴで処理してもＭＥＳＮＡで処理しても、融合タンパク質は２種のタンパク質種に切断された（図７）。２種の断片の分子サイズは、Ｇｒｂ２−ＳＨ２およびＧｙｒＡ−インテイン融合物の分子サイズに対応しており、ＳＨ２−インテイン連結部で切断が起こったことを示している。融合タンパク質前駆体の切断により、ＳＨ２ドメインが上清中に遊離されたのに対し、ＧｙｒＡインテイン−ＣＢＤ部分は、キチンビーズ上に固定されたままであった。ＤＴＴまたはＭＥＳＮＡの双方により切断した後、上清のＥＳＭＳ分析から、Ｇｒｂ２−ＳＨ２が、それぞれ期待されたＤＴＴまたはＭＥＳＮＡのＣ末端がチオエステルである誘導体として生成されていることが確認された。
【０１０１】
ＤＴＴ−Ｃ末端チオエステルを有するＧｒｂ２−ＳＨ２の期待質量は１２１７３．９Ｄａであり、観測質量は１２１７３．５Ｄａであった。ＭＥＳＮＡ−Ｃ末端チオエステルを有するＧｒｂ２−ＳＨ２の期待質量は１２１６２．０Ｄａであり、観測質量は１２１６３．０Ｄａであった。
【０１０２】
ヒドラジンの誘導によるＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡインテイン融合物の切断による、Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２の生成
本発明者らは、融合タンパク質前駆体中のＧｒｂ２−ＳＨ２およびＧｙｒＡインテイン間のチオエステル結合が、ヒドラジンによって切断されるという仮説を立てた。Ｇｒｂ２  ＳＨ２をインテインに連結しているチオエステル部分でヒドラジンの化学選択的反応が起これば、Ｇｒｂ２−ＳＨ２ドメインが、対応するそのＣ末端ヒドラジド誘導体として上清中へ遊離されるはずである。したがって、固定化されたＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤを含むキチンビーズをｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液中に入れて平衡化し、同じ緩衝液中にヒドラジン一水和物を加えて、ヒドラジンの最終濃度が２００ｍＭである５０％のスラリーを得た。次に、この混合物を室温で振とうし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図８）。２０時間後に、上清を取り出し、ＨＰＬＣおよびＥＳＭＳによって分析した。
【０１０３】
Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡインテイン−ＣＢＤ融合物をヒドラジンで処理すると、融合タンパク質は切断されて２種になった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した２種の断片の分子サイズは、Ｇｒｂ２−ＳＨ２およびＧｙｒＡ−インテイン融合物に対応しており、ＳＨ２およびインテインドメイン間の特有のチオエステル結合で切断が起こったことを示していた。融合タンパク質前駆体の切断により、ＳＨ２ドメインが上清中に遊離されたのに対し、ＧｙｒＡインテイン−ＣＢＤ部分は、キチンビーズ上に固定されたままであった。切断後の上清のＨＰＬＣおよびＥＳＭＳ分析から、Ｇｒｂ２−ＳＨ２のＣ末端ヒドラジド誘導体に対応する、単一のタンパク質種が生成されていることが確認された。Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドの期待質量は１２０５１．７Ｄａであり、観測質量は１２０５３．０Ｄａであった（図９）。
【０１０４】
反応の２０時間後に、（ｉ）ＲＰＨＰＬＣとその後に続く凍結乾燥によって、または（ｉｉ）ゲルろ過によって、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドを上清から単離した。この後者の方法では、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドの反応溶液をスーパーデックスペプチドカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上に載せ、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムからなるランニング緩衝液で溶出させた。これにより、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中に溶けた、精製Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドの溶液が得られた。セントリコンフィルター（３０００  ＭＷＣＯ）を用いてこの溶液を濃縮し、次に、急速凍結し、使用するまで−２０℃で保管した。
【０１０５】
精製および凍結乾燥したＧｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドのサンプル（１００μｇ）を、ｐＨ８．２の１００ｍＭアンモニウム重炭酸緩衝液（１００μＬ）に溶かしたプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（５μｇ）で処理した。３０℃で一晩インキュベーションした後、反応物を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって分析した。Ｃ末端のタンパク質分解断片（ＦＮＳＬＮＥＬＶＤＹＨＲＳＴＳＶＳＲＮＱＱＩＦＬＲＤＩＥＱＶＰＱＱＰＴＧ）の観測質量は、所望のＣ末端ヒドラジド誘導体に対応している（Ｃ末端がヒドラジドであるタンパク質分解断片の期待質量は４２２９Ｄａ、観測質量は４２３１Ｄａ）。
【０１０６】
実施例３−Ｃ末端がヒドラジドである組換えマルトース結合タンパク質の生成
タンパク質−インテイン融合物をヒドラジンで選択的に切断することにより組換えＣ末端ヒドラジドタンパク質を生成するための説明した方法のさらなる実証として、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＣ末端ヒドラジド誘導体の生成を調査した。
使用したヒトＭＢＰの配列
ＭＫＩＥＥＧＫＬＶＩＷＩＮＧＤＫＧＹＮＧＬＡＥＶＧＫＫＦＥＫＤＴＧＩＫＶＴＶＥＨＰＤＫＬＥＥＫＦＰＱＶＡＡＴＧＤＧＰＤＩＩＦＷＡＨＤＲＦＧＧＹＡＱＳＧＬＬＡＥＩＴＰＤＫＡＦＱＤＫＬＹＰＦＴＷＤＡＶＲＹＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳＬＩＹＮＫＤＬＬＰＮＰＰＫＴＷＥＥＩＰＡＬＤＫＥＬＫＡＫＧＫＳＡＬＭＦＮＬＱＥＰＹＦＴＷＰＬＩＡＡＤＧＧＹＡＦＫＹＥＮＧＫＹＤＩＫＤＶＧＶＤＮＡＧＡＫＡＧＬＴＦＬＶＤＬＩＫＮＫＨＭＮＡＤＴＤＹＳＩＡＥＡＡＦＮＫＧＥＴＡＭＴＩＮＧＰＷＡＷＳＮＩＤＴＳＫＶＮＹＧＶＴＶＬＰＴＦＫＧＱＰＳＫＰＦＶＧＶＬＳＡＧＩＮＡＡＳＰＮＫＥＬＡＫＥＦＬＥＮＹＬＬＴＤＥＧＬＥＡＶＮＫＤＫＰＬＧＡＶＡＬＫＳＹＥＥＥＬＡＫＤＰＲＩＡＡＴＭＥＮＡＱＫＧＥＩＭＰＮＩＰＱＭＳＡＦＷＹＡＶＲＴＡＶＩＮＡＡＳＧＲＱＴＶＤＥＡＬＫＤＡＱＴＮＳＳＳＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＬＧＩＥＧＲＧＴＬＥＧ
【０１０７】
ＭＢＰ−Ｓｃｅ  ＶＭＡインテイン融合物の発現
発現ベクターｐＭＹＢ５（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）は、Ｎ末端がＳｃｅ  ＶＭＡインテインに融合されている、すなわち、精製を容易にするためにキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）のＮ末端に融合されている、マルトース結合タンパク質（上記の配列）を含む融合タンパク質をコードしている。
【０１０８】
このプラスミドで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、ＬＢ培地中で中期対数期まで増殖させ、また、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、３７℃で４時間、タンパク質発現を誘導した。遠心分離後、細胞を溶解緩衝液（０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。溶解緩衝液中で予め平衡化したキチンカラム上に可溶性画分を載せた。次に、洗浄緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）でカラムを洗浄して、キチンビーズ上に固定化された精製融合タンパク質（ＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤ）を得た。
【０１０９】
チオールの誘導によるＭＢＰ−ＶＭＡインテイン融合タンパク質の切断による、Ｃ末端がチオエステルであるＭＢＰの生成
ＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤ内部のインテインドメインが機能的であることを確認するために、融合タンパク質を２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）に曝露させて、トランスチオエステル化による切断の程度を評価した。固定化されたＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤを含むキチンビーズをｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液中に入れて平衡化した。次に、ＭＥＳＮＡをｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭリン酸  緩衝液中のビーズに加えて、チオールの最終濃度が１２０ｍＭである５０％のスラリーを得た。次に、この混合物を室温で振とうし、一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。４８時間後に、反応物から上清を分離し、続いて、ＨＰＬＣおよびＥＳＭＳによって分析した。
【０１１０】
ＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤ融合物をＭＥＳＮＡで処理すると、融合タンパク質は２種のタンパク質種に切断された。２種の断片の分子サイズは、ＭＢＰおよびＶＭＡ−ＣＢＤ部分の分子サイズに対応しており、ＭＢＰ−ＶＭＡインテイン連結部で切断が起こったことを示している。融合タンパク質前駆体の切断により、ＭＢＰが上清中に遊離されたのに対し、ＶＭＡ−ＣＢＤ部分は、キチンビーズ上に固定されたままであった。これは、１種のタンパク質種を含む切断後の上清をＥＳＭＳ分析することにより、確認された。Ｃ末端がＭＥＳＮＡチオエステルであるＭＢＰの期待質量は４３０６４Ｄａであり、観測質量は４３０９８Ｄａであった。
【０１１１】
ヒドラジンの誘導によるＭＢＰ−ＶＭＡインテイン融合タンパク質の切断による、Ｃ末端がヒドラジドであるＭＢＰの生成
固定化されたＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤを含むキチンビーズをｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液中に入れて平衡化し、同じ緩衝液中にヒドラジン一水和物を加えて、ヒドラジンの最終濃度が２００ｍＭである５０％のスラリーを得た。次に、この混合物を室温で振とうし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＨＰＬＣおよびＥＳＭＳによって分析した。
【０１１２】
反応の２０時間後に、（ｉ）ＲＰＨＰＬＣとその後に続く凍結乾燥によって、または（ｉｉ）ゲルろ過によって、Ｃ末端ヒドラジドＭＢＰを上清から単離した。この後者の方法では、Ｃ末端ヒドラジドＭＢＰの反応溶液をスーパーデックスペプチドカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上に載せ、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液からなるランニング緩衝液で溶出させた。これにより、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に溶けた精製されたＣ末端ヒドラジドＭＢＰの溶液が得られた。セントリコンフィルター（３０００  ＭＷＣＯ）を用いてこのタンパク質溶液を濃縮し、次に、急速凍結し、使用するまで−２０℃で保管した。
【０１１３】
ＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤ融合物をヒドラジンで処理すると、融合タンパク質は切断されて２種になった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した２種の断片の分子サイズは、ＭＢＰおよびＶＭＡ−ＣＢＤ部分に対応しており、ＭＢＰ−ＶＭＡインテインドメイン間の特有のチオエステル結合で切断が起こったことを示している。融合タンパク質前駆体の切断により、ＭＢＰが上清中に遊離されたのに対し、ＶＭＡ−ＣＢＤ部分は、キチンビーズ上に固定されたままである。切断後の上清のＨＰＬＣおよびＥＳＭＳ分析から、観測質量が４２９８８Ｄａである、単一のタンパク質種が生成されていることが確認されている。タンパク質のＣ末端ＭＥＳＮＡチオエステル誘導体とそれに対応するＣ末端ヒドラジドとの期待質量の差は、１１１Ｄａである。ＭＢＰのＣ末端ＭＥＳＮＡチオエステルの観測質量は４３０９８Ｄａであることが判明した。したがって、ＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤのヒドラジン切断による生成物は、１１０Ｄａ少なく、所望のＭＢＰのＣ末端ヒドラジド誘導体が形成されていたことを示している。
【０１１４】
実施例４−Ｃ末端にヒドラジドを含む組換えタンパク質への、アルデヒドおよびケトンを含むペプチドおよび標識のライゲーション：組換えＧｒｂ２  ＳＨ２ドメインへの合成ペプチドｃ−ｍｙｃのライゲーション
本発明者らは、対応するインテイン融合前駆体のヒドラジン処理によって生成させた組換えタンパク質Ｃ末端ヒドラジドを、アルデヒドおよびケトンを含有するペプチドおよび標識を用いた化学選択的ライゲーションによって部位特異的に修飾できると仮説を立てた。このような方法を実証するために、ケトンを含む合成ペプチドが上記のように生成されたＧｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドと連結する能力を調査した。ｃ−ｍｙｃエピトープ配列に対応する合成ペプチドＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−ＮＨ２を合成した。この際、組立の最終工程として、ピルビン酸がペプチドのアミノ末端に結合された。このペプチド（ＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃと呼ぶ）をＲＰＨＰＬＣによって純度が９５％を超えるまで精製し、凍結乾燥した（ＥＳＭＳの期待モノアイソトピック質量は１３２８．６Ｄａ；観測質量は１３２８．６Ｄａ）。
【０１１５】
ＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃペプチドのサンプルをｐＨ４．５の１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解させ、ペプチド濃度を４ｍＭとした。次に、凍結乾燥したＧｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドタンパク質の一定量（約２５０μｇ）にこのペプチド溶液（１００μＬ）を加え、この反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した（図１０）。また、対照として、チトクロムＣ、すなわちＧｒｂ２−ＳＨ２と類似したサイズであるがヒドラジド官能基を有さないタンパク質とともにＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃをインキュベートした。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドがより分子量の大きいタンパク質種（約１０００〜２０００Ｄａ大きい）へと変換されたことから示されるように、ＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃペプチドが、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドと実際に連結したことを示している。２４時間後に、反応は実質的に完了し、反応生成物は安定なようである。一方、チトクロムＣの経時的な変化は観察されず、すなわちライゲーションが起こらず、これは、ライゲーション反応がＧｒｂ２−ＳＨ２のＣ末端ヒドラジド官能基で起こっていることを証明している。
【０１１７】
反応の９６時間後に、Ｇｒｂ２−ＳＨ２ライゲーション反応の生成物をＨＰＬＣによって単離し、ＥＳＭＳによって特性を決定した。ヒドラゾン結合形成を介した、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドへのＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃの化学選択的ライゲーションが起これば、期待質量が１３３６３．７Ｄａである生成物が得られるはずである。生成物の観測質量は１３３６４．１Ｄａであり、所望のライゲーション生成物が形成されていることを示した。
【０１１８】
実施例５−Ｃ末端にヒドラジドを含む組換えタンパク質（組換えＣ末端ヒドラジドタンパク質）への、アルデヒドおよびケトンを含むペプチドおよび標識のライゲーション：Ｇｒｂ２−ＳＨ２のフルオレセイン標識
本実施例では、インテイン融合タンパク質前駆体のヒドラジン切断により生成させた、Ｇｒｂ２−ＳＨ２の組換えＣ末端ヒドラジド誘導体を、ケトンを含むフルオレセイン誘導体と反応させて、タンパク質の部位特異的蛍光標識を行った。
【０１１９】
記述する方法による、Ｃ末端がヒドラジドである組換えタンパク質の蛍光標識を容易にするためには、フルオロフォアが、ライゲーションのための適切な反応基、すなわちアルデヒドまたはケトン官能基を含んでいる必要がある。このために、ピルボイル部分を含むフルオレセイン誘導体を合成した。最初に、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨをリンクアミド樹脂に結合させ、標準手順により（ジクロロメタン中１％ＴＦＡ、４％トリイソプロピルシラン）Ｍｔｔ基を取り除いた。次に、５（６）−カルボキシフルオレセインをリジンのε−アミノ基に結合させた。次に、Ｆｍｏｃ基を取り除き、リジンの遊離α−アミノ基にピルビン酸を結合させた。樹脂から切断した後、所望のフルオレセイン誘導体（ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）と呼ぶ。図１１を参照のこと）をＲＰＨＰＬＣによって純度が９５％を超えるまで精製し、凍結乾燥した（ＥＳＭＳの期待モノアイソトピック質量は５７６．２Ｄａ；観測モノアイソトピック質量は５７６．０Ｄａ）。
【０１２０】
ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）とＣ末端ヒドラジドペプチドおよびタンパク質との反応性を確かめるために、ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）と小型の合成Ｃ末端ヒドラジドペプチドＳＬＡＹＧ−ＮＨＮＨ２との反応を調査した。ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）のサンプルおよびＳＬＡＹＧ−ＮＨＮＨ２ペプチドをｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に共に溶解させて、それぞれ最終濃度を０．３ｍＭおよび２ｍＭとした。室温で２０時間インキュベーションした後、ＲＰＨＰＬＣ分析により測定して、反応が完了したとみなした。出発時のＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）のすべてが反応して大部分が単一の生成物を生じていた。その質量は、所望のライゲーション生成物、すなわち、ヒドラゾン結合形成を介した２種の反応物の結合物に対応している（ＥＳＭＳの期待モノアイソトピック質量は１０７９Ｄａ；観測質量は１０８０Ｄａ）。
【０１２１】
ヒドラジド含有ペプチドとのＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）の特異的反応が確かめられたため、（Ｇｒｂ２  ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤのヒドラジン切断によって生成させた）組換えＣ末端ヒドラジドＧｒｂ２  ＳＨ２を部位特異的に標識するのに、このフルオレセイン誘導体を用いた。
【０１２２】
融合タンパク質切断反応物からＧｒｂ２  ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドを精製するために、２つの補完的方法を使用した（実施例２）。凍結乾燥した固体として、またはｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の溶液の状態で、精製タンパク質を単離した。ｐＨがヒドラゾン結合形成反応に適しているため、後者の緩衝液系を選択した。ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムに溶かしたＧｒｂ２  ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドの一定量（２５０μｇ、２００μＬ）をＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）のサンプルに直接加えて、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）の最終濃度を約０．３ｍＭとした。反応物を室温でインキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した。また、対照として、チトクロムＣ、すなわちＧｒｂ２−ＳＨ２と類似したサイズであるがヒドラジド官能基を有さないタンパク質とともに、同じ条件下でＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）をインキュベートした。
【０１２３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドが、分子量が明らかに増えた単一のタンパク質種（約１０００〜２０００Ｄａ大きい）へと変換されたことから示されるように、ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）が、Ｇｒｂ２−ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドと実際に連結したことを示している（図１２）。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した後、ゲルの蛍光画像化により、新しく形成された反応生成物がフルオレセイン標識を含有していること、およびその反応物が清浄であり、単一の蛍光タンパク質生成物のみが形成されていることが確認された（図１４）。２４時間後に、反応は実質的に完了し、反応生成物はこれらの条件下で安定なようである。
【０１２４】
一方、実験の時間経過の中で、チトクロムＣの変化は観察されず、すなわちライゲーションが起こらず（図１３）、いかなる蛍光タンパク質生成物の形成も全くなかった（図１４）。したがって、これは、ライゲーション反応がＧｒｂ２  ＳＨ２のＣ末端ヒドラジド官能基で起こっており、組換えタンパク質の部位特異的なＣ−末端蛍光標識をもたらすことを証明している。反応の４８時間後に、Ｇｒｂ２  ＳＨ２とのライゲーション反応から得られた生成物をＨＰＬＣによって単離した。ＥＳＭＳにより測定したこの生成物の質量から、タンパク質に１つのフルオレセイン基が付加されていることが確認された。
【０１２５】
別の実施例では、凍結乾燥したＧｒｂ２  ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドを直接ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解させ、ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）に加えた。いくらかタンパク質の沈殿が観察されたが、タンパク質の可溶性画分は、前述の予想された方式でＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）と反応した。
【０１２６】
代替の戦略では、Ｇｒｂ２  ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドの凍結乾燥サンプル（２５０μｇ）を４０％水性アセトニトリル含有０．１％ＴＦＡ（２００μＬ）中に溶解させた。次に、この溶液をＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）のサンプルに加えて、フルオロフォアの最終濃度を約０．３ｍＭとした。溶液を室温でインキュベーションし、反応物を定期的に分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、標識化反応がこれらの条件下で清浄に、かつ迅速に起こっていることが示された（図１５）。Ｇｒｂ２  ＳＨ２Ｃ末端ヒドラジドは、所望の生成物の分子量であると予想される明らかに増えた分子量を有する単一のタンパク質種に変換されており、この新しく形成されたタンパク質は、ＵＶランプ下で可視化すると緑蛍光色を呈した。この反応生成物のＥＳＭＳから、タンパク質にフルオレセイン分子１つが付加されていることが確認された。反応は４時間後に実質的に完了し、長時間のインキュベーションはライゲーション生成物の形成に有害なようである。
【０１２７】
実施例６−Ｃ末端にヒドラジドを含む組換えタンパク質への、アルデヒドおよびケトンを含むペプチドおよび標識のライゲーション：ＭＢＰのフルオレセイン標識
さらなる例証として、記述した方法を用いて、フルオレセインによりＭＢＰを部位特異的にＣ末端標識した。凍結乾燥した組換えＣ末端ヒドラジドＭＢＰのサンプル（２５０μｇ）（ＭＢＰ−ＶＭＡ−ＣＢＤ融合タンパク質前駆体のヒドラジン切断により生成させた）を０．１％ＴＦＡ含有４０％水性アセトニトリル（２００μＬ）中に溶解させた。次に、この溶液をＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）のサンプルに加えて、フルオロフォアの最終濃度を約０．３ｍＭとした。次に反応物を室温でインキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定期的に分析した。
【０１２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約４２ＫＤａの分子量を有する単一の緑蛍光の種の形成によって示されるように、これらの条件下でフルオレセイン標識化反応が起こっていることが示された。４８時間後の反応混合物のＭＡＬＤＩ分析の結果は、ＭＢＰへのフルオレセイン分子１つの付加と一致していた。
【０１２９】
要約すると、本発明は、タンパク質ライゲーションおよびタンパク質標識の新規な方法を提供する。これらは、合成および組換えの双方により誘導したタンパク質断片を位置選択的な方式で、効率的に相互を結合させることを可能にする。したがって、これは、合成および組換えの断片の組合せ物から大型のタンパク質を構築することを可能にし、また、前例のない方式でどんなサイズのタンパク質でも部位特異的に修飾することを可能にする。３０、０００個のヒト遺伝子が、翻訳後修飾を通して数十万の様々なタンパク質種を生じることを考慮すると、これは、生物科学および生物医学ならびに薬物発見にとって非常に重要である。翻訳後に修飾されたこのようなタンパク質は、現在の組換え技術によっては評価することができない。
【０１３０】
このようなタンパク質ライゲーション技術の応用は、タンパク質に基づく手法およびタンパク質治療のために、また、デノボ設計（新規設計）において使用することができ、これまで不可能であった生物科学および生物医学の多くの新しい道を切り開くことができる。
【０１３１】
本明細書中で参照したすべての文献は、本明細書に参照により組み込まれている。本発明の範囲および趣旨から逸脱しない、記述した本発明の実施形態の様々な改変法および変形法が、当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明はこれら特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、当業者には明らかである、説明した本発明を実施する形態の様々な改変法は、本発明に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】化学ライゲーションの一般的原理を概略的に示す図である。
【図２】タンパク質スプライシングの機序を概略的に示す図である。
【図３】Ｃ末端がチオエステルである組換えタンパク質の生成を示す図である。
【図４】タンパク質およびペプチドのチオエステルと、標識、ペプチド、およびタンパク質などのヒドラジンおよびアミノオキシ含有単位とのライゲーションを示す図である。
【図５】チオエステル含有分子とライゲーションさせるための合成および組換えペプチドヒドラジドの生成を示す図である。ペプチドまたは標識がチオエステルのアシル置換基であることに留意されたい。
【図６】アルデヒドおよびケトンを含有する分子とライゲーションさせるための組換えペプチドヒドラジドの生成を示す図である。
【図７】ＤＴＴおよびＭＥＳＮＡで処理したＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤ（キチンビーズ上に固定化）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。分子量マーカー（レーン１）；キチンビーズ上に固定化した精製Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤ（レーン４）。１００ｍＭ  ＤＴＴ（レーン５および７）または１２０ｍＭ  ＭＥＳＮＡ（レーン８および１０）で処理したＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤ。反応スラリー全体（レーン５および８）と反応上清（レーン７および１０）の双方を分析した。
【図８】ヒドラジンで処理したＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤ（キチンビーズ上に固定化）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。分子量マーカー（レーン１）；リン酸緩衝液のみで２０時間処理した後の、キチンビーズ上に固定化した精製Ｇｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤ（レーン２）。リン酸緩衝液に溶かした２００ｍＭヒドラジンで２０時間処理したＧｒｂ２−ＳＨ２−ＧｙｒＡ−ＣＢＤ。反応スラリー全体を分析した。
【図９】Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２誘導体のＥＳＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図１０】合成のケトン含有ＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃペプチドと、Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２およびチトクロムＣとの反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す写真である。分子量マーカー（レーン１）；Ｃ末端がＤＴＴチオエステルであるＧｒｂ２−ＳＨ２（レーン２）。時間ｔ＝０（時間）（レーン３）、ｔ＝２４（時間）（レーン４）、ｔ＝４８（時間）（レーン５）、ｔ＝７２（時間）（レーン６）における、Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２とＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃとの反応。時間ｔ＝０（時間）（レーン７）、ｔ＝２４（時間）（レーン８）、ｔ＝４８（時間）（レーン９）、ｔ＝７２（時間）（レーン１０）における、チトクロムＣとＣＨ３ＣＯＣＯ−ｍｙｃとの反応。
【図１１】ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）の構造を示す図である。５−カルボキシフルオレセインの位置異性体を示す。
【図１２】ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中でのＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）とＣ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２との反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す写真である。分子量マーカー（レーン１）；Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２（レーン２）。時間ｔ＝４（時間）（レーン３）、ｔ＝２４（時間）（レーン４）、ｔ＝４８（時間）（レーン５）における、Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２とＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）との反応。
【図１３】ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中でのＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）とチトクロムＣとの反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す写真である。分子量マーカー（レーン１）；チトクロムＣ（レーン２）。時間ｔ＝４（時間）（レーン３）、ｔ＝２４（時間）（レーン４）、ｔ＝４８（時間）（レーン５）における、チトクロムＣとＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）との反応。
【図１４】ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中での、ＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）と、Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２との反応およびチトクロムＣとの反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す写真である。（Ａ）ゲルの全タンパク質の染色。このクーマシー染色（Ａ）をする前に、緑蛍光に対してゲルを画像化した（Ｂ）。分子量マーカー（レーン１）；Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２  ＳＨ２（レーン２）；時間ｔ＝４（時間）（レーン３）、ｔ＝２４（時間）（レーン４）、ｔ＝４８（時間）（レーン５）における、Ｃ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２  ＳＨ２とＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）との反応。チトクロムＣ（レーン６）；時間ｔ＝４（時間）（レーン７）、ｔ＝２４（時間）（レーン８）、ｔ＝４８（時間）（レーン９）における、チトクロムＣとＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）との反応。
【図１５】０．１％ＴＦＡ含有４０％水性アセトニトリル中でのＣＨ３ＣＯＣＯ−Ｌｙｓ（Ｆｌ）とＣ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２  ＳＨ２との反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す写真である。反応４時間後（レーン１）、２４時間後（レーン２）、４８時間後（レーン３）、およびＣ末端がヒドラジドであるＧｒｂ２−ＳＨ２（レーン４）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月9日(2005.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）活性化エステル部分を有する第２のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【化１】
2007534626.tif 000023
【請求項２】
前記末端の活性化エステル部分がチオエステルであり、前記ペプチドがチオエステルのアシル置換基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のポリペプチドが、Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含む前駆体分子のチオール試薬依存性切断により生成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供し、
（ｉｉ）前駆体分子にチオール試薬依存性切断を起こさせて、Ｃ末端にチオエステル部分を有する第２のオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、第２のオリゴペプチド分子と反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【請求項５】
前記反応性部分が、ヒドラジン部分、ヒドラジド部分、またはアミノオキシ部分である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記反応性部分がアミノオキシ部分であり、前記活性化エステル部分がチオエステルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のオリゴペプチドが、ヒドラジンと、チオエステル部分を介してＮ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチド前駆体を含む前駆体分子との反応によって作製される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ａ）ヒドラジン部分、ヒドラジド部分、またはアミノオキシ部分である反応性部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
（ｃ）第１のオリゴペプチドの反応性部分を、オリゴペプチド前駆体分子と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【請求項９】
前記第１のオリゴペプチドまたは前記第２のオリゴペプチドが組換えオリゴペプチドであり、前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドの他方が合成ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが組換えオリゴペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが合成オリゴペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むタンパク質分
（ｂ）インテインドメインがオリゴペプチドから切断されてタンパク質ヒドラジドを生成するように、前記タンパク質分子をヒドラジンと反応させるステップと
を含む、タンパク質ヒドラジドを生成させる方法。
【請求項１３】
前記方法のステップ（ｃ）が、ｐＨ６．５〜７．５の範囲のｐＨで実施される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有する第１のオリゴペプチドを提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第２のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）前記オリゴペプチド前駆体分子をヒドラジンと反応させて、末端にヒドラジド部分を有するオリゴペプチド中間体を含むオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｄ）第１のオリゴペプチドのアルデヒドまたはケトン部分を、オリゴペプチド中間体分子のヒドラジド部分と反応させて、ヒドラゾン連結部分を介して第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチド生成物を作製する方法。
【請求項１５】
前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって作製されるオリゴペプチド生成物であって、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して前記第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されているオリゴペプチド生成物。
【請求項１６】
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）活性化エステル部分を有するオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチドの活性化エステル部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている、標識されたオリゴペプチドを形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）において、前記標識分子および前記オリゴペプチドが式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルが末端の活性化エステル部分である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）アシル置換基である、活性化エステル部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）反応性部分を有するオリゴペプチドを提供するステップと、
ｃ）標識分子の活性化エステル部分を、オリゴペプチドの反応性部分と反応させて、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチドを形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法であって、
ステップ（ｃ）において前記標識分子およびオリゴペプチドが、式ＩＩで表される連結部分を介して連結され、ステップ（ｂ）の前記活性化エステル部分がチオエステルではなく、前記活性化エステルが末端の活性化エステル部分である方法。
【請求項１９】
前記オリゴペプチドが、ヒドラジンと、チオエステル部分を介してＮ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチド前駆体を含む前駆体分子との反応によって作製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）反応性部分を有する標識を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供し、
（ｉｉ）前駆体分子にチオール試薬依存性切断を起こさせて、Ｃ末端にチオエステル部分を有するオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｃ）標識の反応性部分を、オリゴペプチド分子と反応させて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩで表される連結部分を介して標識とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチドを形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項２１】
前記反応性部分がアミノオキシ部分であり、前記活性化エステル部分がチオエステルである、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応性部分がアミノオキシ部分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）反応性部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されているオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）標識分子の反応性部分を、オリゴペプチド前駆体分子と反応させて、上記に定義した式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項２４】
前記方法のステップ（ｃ）が、ｐＨ６．５〜７．５の範囲のｐＨで実施される、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有する標識分子を提供するステップと、
ｂ）Ｎ末端でインテインドメインに融合されている第１のオリゴペプチドを含むオリゴペプチド前駆体分子を提供するステップと、
ｃ）前記オリゴペプチド前駆体分子をヒドラジンと反応させて、末端にヒドラジド部分を有するオリゴペプチド中間体を含むオリゴペプチド分子を生成させるステップと、
ｄ）標識分子のアルデヒドまたはケトン部分を、オリゴペプチド中間体分子のヒドラジド部分と反応させて、ヒドラゾン連結部分を介して標識分子とオリゴペプチドとが連結されている、標識されたオリゴペプチド生成物を形成させるステップと
を含む、オリゴペプチドを標識する方法。
【請求項２６】
前記アルデヒドまたはケトン部分がα−ジケトンまたはα−ケト−アルデヒド基である、請求項１４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法によって作製された、標識されたオリゴペプチドであって、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表される連結部分を介して前記第１のオリゴペプチドと第２のオリゴペプチドとが連結されている標識されたオリゴペプチド。
【国際調査報告】
2007534626.tif 000024
2007534626.tif 000025
2007534626.tif 000026
2007534626.tif 000027