(57)【要約】本発明は、タンパク質(Snow1)、その突然変異体、および前記タンパク質をコード化している核酸に関し、これはIce1と相互作用し、これはCBF3プロモーター活性を活性化し、このようにして植物における凍結耐性を制御する。【選択図】    なし
2007507227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項1記載の単離されたポリヌクレオチドであって、前記タンパク質がSnow1転写アクチベーター活性を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号1のポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項3記載のポリヌクレオチドと相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項3記載のポリヌクレオチドと少なくとも70%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項3記載のポリヌクレオチドと少なくとも80%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項3記載のポリヌクレオチドと少なくとも90%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項3記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって；前記ストリンジェントな条件が5X  SSCにおいて50〜68℃の温度で洗浄することを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項3記載の単離されたポリヌクレオチドであって、Snow1転写アクチベーター活性を有するタンパク質をコード化する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項1記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項3記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項1記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項3記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項1記載の単離されたポリヌクレオチドを含む植物細胞。
【請求項１５】
請求項3記載の単離されたポリヌクレオチドを含む植物細胞。
【請求項１６】
請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物。
【請求項１７】
請求項3記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物。
【請求項１８】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項16記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項17記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
前記植物がコムギ、トウモロコシ、ピーナッツ綿、カラスムギ、およびダイズ植物からなる群から選択される、請求項16記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
前記単離されたポリヌクレオチドが誘導可能なプロモータに動作可能に連結される、請求項16記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
前記単離されたポリヌクレオチドが誘導可能なプロモータに動作可能に連結される、請求項17記載のトランスジェニック植物。
【請求項２３】
Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドをスクリーニングするための方法であって、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチドを選抜されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることと；前記ポリヌクレオチドを発現して、タンパク質を産生することと；および前記タンパク質におけるSnow1転写アクチベーター活性の存在または非存在を検出することとを含む方法。
【請求項２４】
Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドをスクリーニングするための方法であって、請求項3記載の単離されたポリヌクレオチドを選抜されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることと；前記ポリヌクレオチドを発現して、タンパク質を産生することと；および前記タンパク質におけるSnow1転写アクチベーター活性の存在または非存在を検出することとを含む方法。
【請求項２５】
Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドをスクリーニングするための方法であって、請求項8記載の単離されたポリヌクレオチドを選抜されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることと；前記ポリヌクレオチドを発現して、タンパク質を産生することと；および前記タンパク質におけるSnow1転写アクチベーター活性の存在または非存在を検出することとを含む方法。
【請求項２６】
請求項1記載のヌクレオチドに対して少なくとも70%相同性を有する核酸を検出するための方法であって、核酸サンプルを、請求項1記載のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを又はその相補物の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーと接触させることを含む方法。
【請求項２７】
請求項1記載のヌクレオチドに対して少なくとも70%相同性を有する核酸を生産するための方法であって、核酸サンプルを、請求項1記載のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを又はその相補物の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含むプライマーと接触させることを含む方法。
【請求項２８】
請求項3記載のポリヌクレオチドのための方法であって、核酸サンプルを、請求項3記載のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを又はその相補物の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーと接触させることを含む方法。
【請求項２９】
請求項3記載のポリヌクレオチドを生産するための方法であって、核酸サンプルを、請求項3記載のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを又はその相補物の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含むプライマーと接触させることを含む方法。
【請求項３０】
Snow1タンパク質を作出するための方法であって、請求項12記載の宿主細胞を、特定時間およびSnow1の発現に適切な条件下で培養することと、および前記Snow1タンパク質を収集することとを含む方法。
【請求項３１】
Snow1を作出するための方法であって、請求項13記載の宿主細胞を、特定時間およびSnow1の発現に適切な条件下で培養することと、および前記Snow1タンパク質を収集することとを含む方法。
【請求項３２】
トランスジェニック植物を作出する方法であって、請求項1記載のポリヌクレオチドを前記植物へと導入することを含む方法。
【請求項３３】
トランスジェニック植物を作出する方法であって、請求項1記載のポリヌクレオチドを前記植物へと導入することを含む方法。
【請求項３４】
冷温順化をそれを必要とする植物において増加させる方法であって、請求項1記載のポリヌクレオチドを前記植物へと導入することを含む方法。
【請求項３５】
冷温順化をそれを必要とする植物において増加させる方法であって、請求項3記載のポリヌクレオチドを前記植物へと導入することを含む方法。
【請求項３６】
冷温順化をそれを必要とする植物において増加させる方法であって、前記植物におけるsnow1遺伝子の発現を増強することを含む方法。
【請求項３７】
配列番号2のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
請求項37記載の単離されたポリペプチドであって、Snow1転写アクチベーター活性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
請求項37記載の単離されたポリペプチドに対して少なくとも70%同一であり且つSnow1転写アクチベーター活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
請求項37記載の単離されたポリペプチドに対して少なくとも80%同一であり且つSnow1転写アクチベーター活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
請求項37記載の単離されたポリペプチドに対して少なくとも90%同一であり且つSnow1転写アクチベーター活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
請求項37記載の単離されたポリペプチドに対して少なくとも95%同一であり且つSnow1転写アクチベーター活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
植物の冷温順化を増加する方法であって、Snow1転写アクチベーターを前記植物において過剰発現させることを含む方法。
【請求項４４】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが配列番号2のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項４５】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが配列番号1の配列を有している核酸によりコード化される方法。
【請求項４６】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、snow1に対して少なくとも70%同一である配列を有する核酸によりコード化される方法。
【請求項４７】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、snow1に対して少なくとも90%同一である配列を有する核酸によりコード化される方法。
【請求項４８】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、snow1の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化され、前記ストリンジェントな条件が5X  SSCにおいて50〜68゜Cの温度で洗浄することを含む方法。
【請求項４９】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターのアミノ酸配列が、Snow1に対して少なくとも80%の相同性を有する方法。
【請求項５０】
請求項43に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターのアミノ酸配列が、Snow1に対して少なくとも90%の相同性を有する方法。
【請求項５１】
請求項43記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナである方法。
【請求項５２】
前記植物がコムギ、トウモロコシ、ピーナッツ綿、カラスムギ、およびダイズからなる群から選択される、請求項43記載の方法。
【請求項５３】
請求項43記載の方法であって、前記植物が、CBF転写制御因子およびDREB1転写制御因子からなる群から選択される１以上の付加的な転写制御因子の発現の増加を有する方法。
【請求項５４】
請求項43記載の方法であって、前記植物が、1以上の冷温応答性遺伝子の発現の増加を有する方法。
【請求項５５】
請求項54記載の方法であって、前記冷温応答性遺伝子が、炭水化物の呼吸に関与する酵素、炭水化物の代謝に関与する酵素、脂質の呼吸に関与する酵素、脂質の代謝に関与する酵素、フェニルプロパノイドの呼吸に関与する酵素、フェニルプロパノイドの代謝に関与する酵素、抗酸化物の呼吸に関与する酵素、抗酸化物の代謝に関与する酵素、分子シャペロン、不凍化タンパク質、および凍結により生じる脱水の耐性に関与するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコード化する方法。
【請求項５６】
請求項43記載の方法であって、前記植物が、Snow1転写アクチベーターをコード化しているベクターで形質転換される方法。
【請求項５７】
請求項56記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが配列番号2のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項５８】
請求項56記載の方法であって、Snow1転写アクチベーターが配列番号1の配列を有している核酸によりコード化される方法。
【請求項５９】
請求項56記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、配列番号1と少なくとも70%同一である配列を有する核酸によりコード化される方法。
【請求項６０】
請求項56記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、配列番号1と少なくとも90%同一である配列を有する核酸によりコード化される方法。
【請求項６１】
請求項56記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、配列番号1の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化され、前記ストリンジェントな条件が5X  SSCにおいて50〜68゜Cの温度で洗浄することを含む方法。
【請求項６２】
請求項56記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターのアミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも80%の相同性を有する方法。
【請求項６３】
請求項56記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターのアミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有する方法。
【請求項６４】
請求項56記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナである方法。
【請求項６５】
前記植物がコムギ、トウモロコシ、ピーナッツ綿、カラスムギ、およびダイズからなる群から選択される、請求項56記載の方法。
【請求項６６】
請求項56記載の方法であって、前記植物が、CBF転写制御因子およびDREB1転写制御因子からなる群から選択される１以上の付加的な転写制御因子の発現の増加を有する方法。
【請求項６７】
請求項56記載の方法であって、前記植物が、1以上の冷温応答性遺伝子の発現の増加を有する方法。
【請求項６８】
請求項67記載の方法であって、前記冷温応答性遺伝子が、炭水化物の呼吸に関与する酵素、炭水化物の代謝に関与する酵素、脂質の呼吸に関与する酵素、脂質の代謝に関与する酵素、フェニルプロパノイドの呼吸に関与する酵素、フェニルプロパノイドの代謝に関与する酵素、抗酸化物の呼吸に関与する酵素、抗酸化物の代謝に関与する酵素、分子シャペロン、不凍化タンパク質、および凍結により生じる脱水の耐性に関与するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコード化する方法。
【請求項６９】
植物細胞における1以上の冷温応答性遺伝子の発現を増強する方法であって、前記植物を、Snow1転写アクチベーターをコード化するベクターで形質転換することを含む方法。
【請求項７０】
請求項69記載の方法であって、前記植物が冷温順化の増加を有する方法。
【請求項７１】
請求項69に記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが配列番号1のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項７２】
請求項69記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが配列番号2の配列を有している核酸によりコード化される方法。
【請求項７３】
請求項69記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、配列番号1と少なくとも70%同一である配列を有する核酸によりコード化される方法。
【請求項７４】
請求項69記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、配列番号1と少なくとも90%同一である配列を有する核酸によりコード化される方法。
【請求項７５】
請求項69記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターが、配列番号1の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化され、前記ストリンジェントな条件が5X  SSCにおいて50〜68゜Cの温度で洗浄することを含む方法。
【請求項７６】
請求項69記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターのアミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも80%の相同性を有する方法。
【請求項７７】
請求項69記載の方法であって、前記Snow1転写アクチベーターのアミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有する方法。
【請求項７８】
請求項69記載の方法であって、前記植物細胞がシロイヌナズナである方法。
【請求項７９】
前記植物細胞がコムギ、トウモロコシ、ピーナッツ綿、カラスムギ、およびダイズからなる群から選択される、請求項69記載の方法。
【請求項８０】
植物細胞において機能的な、配列番号1のSnow1タンパク質をコード化している単離された核酸に動作可能に連結されるプロモータを具備する発現カセットであって、植物細胞における前記タンパク質の発現の増強が、冷温順化の増加を前記植物細胞へと付与する発現カセット。
【請求項８１】
請求項80記載の発現カセットであって、前記プロモーターは、ウイルス性コートタンパク質プロモーター、組織特異的なプロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ストレス誘導性のプロモーター、CaMV  35Sプロモーター、CaMV  19Sプロモーター、アクチンプロモーター、cabプロモーター、ショ糖合成酵素プロモーター、チューブリンプロモーター、napin R遺伝子複合体プロモーター、トマトE8プロモーター、パタチンプロモーター、mannopineシンターゼプロモーター、ダイズ種子タンパク質グリシニンプロモーター、ダイズ栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージSP6プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、バクテリオファージT7プロモーター、Ptacプロモーター、根細胞プロモーター、ABA誘導性プロモーター、および膨圧誘導性プロモーターからなる群から選択される発現カセット。
【請求項８２】
(a)配列番号1に対して少なくとも70%相同性を有し、Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチド並びに(b)配列番号3に対して70%相同性を有し、Ice1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを共発現させるベクターを含む宿主細胞。
【請求項８３】
請求項82記載の宿主細胞であって、(a)が配列番号1に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドである宿主細胞。
【請求項８４】
請求項82記載の宿主細胞であって、(a)が配列番号1のポリヌクレオチドである宿主細胞。
【請求項８５】
請求項82記載の宿主細胞であって、(b)が配列番号3に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドである宿主細胞。
【請求項８６】
請求項82記載の宿主細胞であって、(b)が配列番号3のポリヌクレオチドである宿主細胞。
【請求項８７】
請求項82記載の宿主細胞であって、前記ベクターが、誘導可能なプロモータと動作可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項８８】
請求項87記載の宿主細胞であって、前記プロモーターは、ウイルス性コートタンパク質プロモーター、組織特異的なプロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ストレス誘導性のプロモーター、CaMV  35Sプロモーター、CaMV  19Sプロモーター、アクチンプロモーター、cabプロモーター、ショ糖合成酵素プロモーター、チューブリンプロモーター、napin R遺伝子複合体プロモーター、トマトE8プロモーター、パタチンプロモーター、mannopineシンターゼプロモーター、ダイズ種子タンパク質グリシニンプロモーター、ダイズ栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージSP6プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、バクテリオファージT7プロモーター、Ptacプロモーター、根細胞プロモーター、ABA誘導性プロモーター、および膨圧誘導性プロモーターからなる群から選択される宿主細胞。
【請求項８９】
請求項87記載の宿主細胞であって、(a)および(b)が選択的に誘導可能なプロモータと動作可能に連結される宿主細胞。
【請求項９０】
(a)配列番号1に対して少なくとも70%相同性を有し、Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチド並びに(b)配列番号3に対して70%相同性を有し、Ice1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを共発現させるベクターを含む植物細胞。
【請求項９１】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項90記載の植物細胞。
【請求項９２】
請求項90記載の植物細胞であって、(a)が配列番号1に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドである植物細胞。
【請求項９３】
請求項90記載の植物細胞であって、(a)が配列番号1のポリヌクレオチドである植物細胞。
【請求項９４】
請求項90記載の植物細胞であって、(b)が配列番号3に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドである植物細胞。
【請求項９５】
請求項90記載の植物細胞であって、(b)が配列番号3のポリヌクレオチドである植物細胞。
【請求項９６】
請求項90記載の植物細胞であって、前記ベクターが、誘導可能なプロモータと動作可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含む植物細胞。
【請求項９７】
請求項96記載の植物細胞であって、前記プロモーターは、ウイルス性コートタンパク質プロモーター、組織特異的なプロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ストレス誘導性のプロモーター、CaMV  35Sプロモーター、CaMV  19Sプロモーター、アクチンプロモーター、cabプロモーター、ショ糖合成酵素プロモーター、チューブリンプロモーター、napin R遺伝子複合体プロモーター、トマトE8プロモーター、パタチンプロモーター、mannopineシンターゼプロモーター、ダイズ種子タンパク質グリシニンプロモーター、ダイズ栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージSP6プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、バクテリオファージT7プロモーター、Ptacプロモーター、根細胞プロモーター、ABA誘導性プロモーター、および膨圧誘導性プロモーターからなる群から選択される植物細胞。
【請求項９８】
請求項96記載の植物細胞であって、(a)および(b)が選択的に誘導可能なプロモータと動作可能に連結される植物細胞。
【請求項９９】
(a)snow1に対して少なくとも70%相同性を有し、Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチド並びに(b)配列番号3に対して70%相同性を有し、Ice1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを共発現させるベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１００】
前記植物がコムギ、トウモロコシ、ピーナッツ綿、カラスムギ、およびダイズ植物からなる群から選択される、請求項99記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０１】
請求項99記載のトランスジェニック植物であって、(a)が配列番号1に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１０２】
請求項99記載のトランスジェニック植物であって、(a)が配列番号1のポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１０３】
請求項99記載のトランスジェニック植物であって、(b)が配列番号3に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１０４】
請求項99記載のトランスジェニック植物であって、(b)が配列番号3のポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１０５】
請求項99記載のトランスジェニック植物であって、前記ベクターが、誘導可能なプロモータと動作可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物。
【請求項１０６】
請求項105記載のトランスジェニック植物であって、前記プロモーターは、ウイルス性コートタンパク質プロモーター、組織特異的なプロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ストレス誘導性のプロモーター、CaMV  35Sプロモーター、CaMV  19Sプロモーター、アクチンプロモーター、cabプロモーター、ショ糖合成酵素プロモーター、チューブリンプロモーター、napin R遺伝子複合体プロモーター、トマトE8プロモーター、パタチンプロモーター、mannopineシンターゼプロモーター、ダイズ種子タンパク質グリシニンプロモーター、ダイズ栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージSP6プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、バクテリオファージT7プロモーター、Ptacプロモーター、根細胞プロモーター、ABA誘導性プロモーター、および膨圧誘導性プロモーターからなる群から選択されるトランスジェニック植物。
【請求項１０７】
請求項105記載のトランスジェニック植物であって、(a)および(b)が選択的に誘導可能なプロモータと動作可能に連結されるトランスジェニック植物。
【請求項１０８】
冷温順化をそれを必要とする植物において増加させる方法であって、(a)配列番号1に対して少なくとも70%相同性を有し、Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチド並びに(b)配列番号3に対して70%相同性を有し、Ice1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを共発現する能力を有する少なくとも１つのベクターを、前記植物へと導入することを含み、両方のポリヌクレオチドが前記植物中に存在する方法。
【請求項１０９】
請求項108記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナである方法。
【請求項１１０】
請求項108記載のトランスジェニック植物であって、(a)が配列番号1に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１１１】
請求項108記載のトランスジェニック植物であって、(a)が配列番号1のポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１１２】
請求項108記載のトランスジェニック植物であって、(b)が配列番号3に対して少なくとも90%相同性を有しているポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１１３】
請求項108記載のトランスジェニック植物であって、(b)が配列番号3のポリヌクレオチドであるトランスジェニック植物。
【請求項１１４】
請求項108記載の方法であって、前記ベクターが、誘導可能なプロモータと動作可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含む方法。
【請求項１１５】
請求項114記載の方法であって、前記プロモーターは、ウイルス性コートタンパク質プロモーター、組織特異的なプロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ストレス誘導性のプロモーター、CaMV  35Sプロモーター、CaMV  19Sプロモーター、アクチンプロモーター、cabプロモーター、ショ糖合成酵素プロモーター、チューブリンプロモーター、napin R遺伝子複合体プロモーター、トマトE8プロモーター、パタチンプロモーター、mannopineシンターゼプロモーター、ダイズ種子タンパク質グリシニンプロモーター、ダイズ栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージSP6プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、バクテリオファージT7プロモーター、Ptacプロモーター、根細胞プロモーター、ABA誘導性プロモーター、および膨圧誘導性プロモーターからなる群から選択される方法。
【請求項１１６】
請求項114記載の方法であって、(a)および(b)が選択的に誘導可能なプロモータと動作可能に連結される方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、2003年10月8日に出願された米国60/508,316の優先権を主張する出願であり、本明細書中に参照によって、その全体が援用される。
【連邦政府により援助された研究に関する記載】
【０００２】
本件は、国立科学財団  助成金番号MCB0241450により援助された。合衆国政府は、本出願に一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
［発明の分野］  
本発明は、タンパク質、その突然変異体、および前記タンパク質をコード化している核酸に関し、前記タンパク質はIce1と相互作用し、これはCBF3プロモータ活性を活性化し、このようにして植物における凍結耐性（freezing tolerance）を制御する。
【０００４】
［背景の考察］  
有害な（Adverse）低温は、ほとんど全ての生きている生命体の生存度および分布に影響する。固着性（sessile）である植物は、低温ストレスを知覚し、対応するよう進化してきている。有害な低温に対する彼らの反応性が、生理的、分子的、および生化学的なレベルで明らかにされている。多くの温帯植物（temperate plants）は、不凍性温度への事前の暴露後に、これら植物の凍結耐性を増加させる潜在力を有している（冷温順化として知られるプロセス）(Guy 1990; Hughes and Dunn 1996; Browse and Xin 2001)。
【０００５】
分子レベルで、特定のセットのタンパク質が、低温に応答して誘導され、これにより植物を有害な低温条件に耐えさせる。そのうえ、遺伝子発現が冷温（cold）に応答して変化することが観察されており、このことは低温耐性(Gong et al. 2002; Hsieh et al. 2002)および冷温順化(Thomashow 1999; Knight et al. 1999; Tahtiharju and Palva 2001)に重要な事項である。冷温順化（cold acclimation）の間に誘導されるタンパク質には、炭水化物、脂質、フェニルプロパノイド、および抗酸化物の呼吸および代謝に関与する酵素；分子シャペロン、不凍化タンパク質（antifreeze proteins）;および凍結により生じる脱水への耐性において推定された機能を有する、多くの他のものが含まれる(Thomashow 1999; Guy 1990; Mohapatra et al 1989)。これらの遺伝子および遺伝子産物は、CAPs(cold acclimation proteins；冷温順化タンパク質)/CORs(cold responsive；冷温応答性）/LTIs(low temperature inducible；低温誘導性)と称されている。
【０００６】
これらの遺伝子の多くのプロモータは、DRE/CRT(脱水応答配列/C-リピート)を有しており、これは冷温ストレス下の遺伝子転写に必要かつ十分なシスエレメントである(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 1994; Stockinger et al 1997)。相同的な転写制御因子(CBF/DREB)の小グループは、この配列と結合し、冷温制御性の遺伝子発現を誘導する(Stockinger et al 1997; Liu et al 1998)。最近、本発明者らは特定の上流因子を同定した。この因子はCBF3プロモータのMyc様配列に結合し、アラビドプシス（Arabidopsis）におけるCBF3発現および凍結耐性の重要な決定要素である(Chinnusamy et al 2003)。CBF3プロモータにおいてMyc様配列から離れて、多くの推定上のMyb様配列が存在する(Shinwari et al 1998)。MYC関連bHLH転写制御因子は、標的遺伝子の転写活性化に、MYB共転写制御因子および／またはWD-リピート含有因子を必要とする(Spelt et al. 2000; Walker et al. 1999)。
【０００７】
Chinnusamy等(2003)は、おそらくMyb様転写制御因子がIce1と相互作用し、CBF遺伝子の冷温誘導性発現を生じることを提案した。重要なことに、マイクロアレイ分析は、多くのレベル（more levels）のSnow1(本出願が優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に援用される米国60/508,316中で、以前にAtMyb15と称された)転写物を、ice1変異体において示している（冷温ストレスの条件下で野生型植物と比較した場合）(Chinnusamy et al 2003)。このことは次の事項を指摘している。その事項とは、Ice1機能の非存在において、多くのレベルのSnow1が産生されてIce1の機能の欠損を補償し得ることである。
【０００８】
環境要因（例えば、冷温）により、多くの植物種の地理的分布および成長する季節が限定され、そして度々、作物の質および生産性に影響するので、植物（特に、農作物として有用な植物）における冷温耐性および／または冷温順化を増加させることに関して、現在もなお重要な必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の課題は、植物の冷温耐性および／または冷温順化(以下では単純に冷温順化と称する)を増加させる方法および組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の課題は、増加した順化を有する、トランスジェニック植物および植物細胞を提供することである。
【００１１】
本発明等の課題は、植物の冷温順化を増加する方法により達成し得る；該方法は、Snow1を前記植物において過剰発現させることを含む。
【００１２】
また、本発明の課題は、植物細胞の冷温順化を増加する方法により達成し得る；該方法は、Snow1を前記植物細胞において過剰発現させることを含む。
【００１３】
また、本発明の課題は、Snow1をコード化する核酸で形質転換された植物または植物細胞により達成し得る。
【００１４】
従って、本発明は、係る植物または植物細胞を産生する方法をも提供し、該方法は、植物または植物細胞を、Snow1をコード化する核酸で形質転換することにより実施される。
【００１５】
また、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を有している、単離された及び精製されたSnow1を提供する。
【００１６】
また、本発明は、上記のSnow1を産生する方法を提供する。該方法は、Snow1をコード化している核酸で形質転換された宿主細胞を、Snow1が発現される条件下で培養することと、およびSnow1を単離することとを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、Snow1転写アクチベーター活性（Snow1 transcriptional activator activity）を有している単離された及び精製された酵素を提供する（ここで、前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号2に対して、70%から100%未満の相同性を有している）。
【００１８】
また、本発明は、上記の酵素を産生する方法を提供する。該方法は、前記酵素をコード化している核酸で形質転換された宿主細胞を、前記酵素が発現される条件下で培養することと、および前記酵素を単離することとを含む。
【００１９】
また、本発明は、植物の冷温順化を増加する方法を提供する。該方法は、Snow1転写アクチベーターを前記植物において過剰発現させることを含む。
【００２０】
また、本発明は、植物の冷温順化を増加させる方法を提供する。該増加は、CBF転写制御因子およびDREB1転写制御因子からなる群から選択される、１以上の付加的な転写制御因子の発現を増加することによる、および／または1以上の冷温応答性遺伝子の発現を増加させることによるものである。
【００２１】
更に本発明は、上述の細胞および方法を提供する（ここで、Ice1はSnow1と共発現されて、冷温順化において得られる増加を補う）。
【００２２】
本発明者等は、Snow1のCBF3発現を変更させる能力を評価した。マイクロアレイおよびノーザン分析の双方により、ice1表現型細胞においてSnow1転写物のレベルが増大したことを確認した。Snow1は、構成的（constitutive）で、遍在性（ubiquitous）で、核局在性である。Snow1はIce1と物理的に相互作用し得る、これは酵母2-ハイブリッドおよびタンパク質プルダウンアッセイにより決定された。Snow1タンパク質は、CBF3プロモータ中のMyb様認識配列に結合し、その一過性発現によって、CBF3駆動性のルシフェラーゼ遺伝子のルシフェラーゼ活性が増加する、このようなことから冷温順化および冷温耐性でのその役割が指摘されている。Snow1を過剰発現しているトランスジェニック植物(CBF3-luc)は、冷温ストレス条件下でルミネッセンスの増加を示す。これらの結果は、Snow1がCBF3発現の活性化因子であることを示唆している。
【００２３】
上記の課題は、本発明の特定の側面を強調している。本発明の付加的な課題、側面、および態様は、以下の発明の詳細な記述に記載される。
【００２４】
本発明のより完全なる認識（appreciation）及びその多くの付随する利点は、以下の図面を以下の詳細な記述と関連させて参照することでより良く理解される事項と同様な事項として、容易に得られるだろう。
【発明の詳細な記述】
【００２５】
特に既定しないかぎり、本明細書中に使用される技術的および科学的な全ての用語は、酵素学、生化学、細胞生物学、分子生物学、植物生物学、および医科学の当業者により通常理解される用語と同様の意味を有する。
【００２６】
本明細書中に記載されるものと類似する又は均等な、全ての方法および材料を、本発明の実施に又は試験において、本明細書に記載されている適切な方法および材料（materials）と共に使用することができる。本明細書中に記載される、全ての文献、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照によって援用される。抵触（conflict）する場合、本明細書（定義を含む）によって調整されるだろう。特に他で特定しないかぎり、更なる材料、方法、および例は、単なる例示であり、これらは限定されることを意図していない。
【００２７】
冷温ストレスは、一連の転写制御因子の冷温誘導性発現により順番に制御される、多くの遺伝子を誘導する。CBFクラスの転写制御因子には、作物植物における冷温応答（cold response）の主な決定因子の幾つかが含まれる。最近、本発明者等は、CBF遺伝子の発現がice1（別の上流転写制御因子）により制御されることを報告した。Ice1は、CBF3プロモータ中のMYC様認識配列と結合する。MYC様認識配列とは別に、CBF3プロモータはMyb様配列をも有する。Chinnusammyら(2003)は、別の転写制御因子の存在を提案した；その転写制御因子はMyb様認識配列と結合し、CBF3発現を制御するものである。本発明者は、マイクロアレイデータをスキャンし(Chinnusammy et al 2003)、そして１つのMYB転写制御因子を発見した；それはice1変異体中で冷温ストレス下で高い転写レベルを示すものである。1つの遺伝子の機能喪失が別の遺伝子の発現の増加により補償され得ることを考慮し、本発明者等はCBF3発現を制御することにおけるSnow1の役割を調査した。
【００２８】
ノーザン分析は次の事項を明らかとしている；その事項とは、Snow1が冷温ストレスにより若干誘導されることである；このことはSnow1が、冷温ストレスに対応することにおいて、潜在的に同様の役割を有することを指摘している。マイクロアレイデータと一致して、ノーザン分析は、低温ストレス条件下のice1変異体中でSnow1転写物のレベルが増加したことを示している。Snow1の発現の増加は、Ice1の機能喪失を補償し得る。Snow1は、全ての組織中で構成的に発現され、そして核局在型である。EMSAは次の事項を示している；その事項とは、Snow1が、CBF3プロモータと結合すること、CBF3プロモータのMyb様認識配列をとりわけ（specifically）必要とすることである。Snow1がCBF3プロモータと結合することは、それがCBF3プロモータの発現を制御することを指摘している。
【００２９】
Snow1はice1と物理的に相互作用する。酵母２ハイブリッド分析は、Snow1はIce1のＣ末端部分(a.a. 266-499)と相互作用することを示している。その上、Snow1とIce1との特異的な相互作用は、Ice1の358-494a.a.に制限（narrowed down）されている。さらに、Ice1およびSnow1の双方は、相互作用することが可能である（タンパク質プルダウンアッセイにより決定される）。前記相互作用は特異的なものであった〔というのも遠縁のMYB転写制御因子(Myb79)がIce1と相互作用することができなかったので〕。転写制御因子間の組み合わせの相互作用（Combinatorial interactions）が、下流遺伝子の制御に重要であることが示されている(Walker et al 1999, Spelt et al 2000, Grotewold et al 2000)。一過性アッセイの結果は、Snow1の過剰発現がCBF3プロモータ駆動によるルシフェラーゼの発現を増加させることを示している。Ice1をSnow1と共衝突（co-bombarded）させた際に、ルシフェラーゼ活性における最低限（marginal）の増加が存在していた。このことは次の事項を指摘している；その事項とは、ice1およびSnow1の双方が、独立的に作用して、インビボでのCBF3発現を活性化すること、および彼らの相互作用がCBF3発現を過増強（super enhance）しないことである。これらの２つの転写制御因子によるCBF3発現の誘導を、冷温ストレス持続時間の発端（inception）に分布（distributed）させることが可能である。トランスジェニック植物(CBF3-lucバックグラウンド)であって、Snow1をCaMV35Sプロモータのコントロール下で構成的に発現しているトランスジェニック植物は、増強したルミネッセンスを冷温ストレス下で示す（野生型植物と比較した際に）。全てのこれらの結果は、Snow1がCBF3発現の転写活性化因子であることを示している。
【００３０】
このように、本発明は、本明細書中に提供される記載によって具現化され、そして以下で更に説明および例示される。
【００３１】
「植物（plant）」の用語は、植物全体（whole plants）、植物の器官(例えば、葉、茎、根、など)、種子、および植物細胞、および同じ子孫（progeny of same）を含む。本発明の方法に使用可能な、植物のクラス（class）は、一般的に、形質転換技術を受け入れられる高等植物のクラスと同等に広いものであり、単子葉および双子葉の植物の双方を含んでいる。好適な植物には、イネ、トウモロコシ、コムギ、綿、ピーナッツ、およびダイズが含まれる。
【００３２】
「植物（plant）」の用語は、植物全体（whole plants）、植物の器官(例えば、葉、茎、根、など)、種子、および植物細胞、および同じ子孫（progeny of same）を含む。本発明の方法に使用可能な、植物のクラス（class）は、一般的に、形質転換技術を受け入れられる高等植物のクラスと同等に広いものであり、単子葉および双子葉の植物の双方を含んでいる。好適な植物には、イネ、トウモロコシ、コムギ、綿、ピーナッツ、およびダイズが含まれる。
【００３３】
以上のように、本発明の一態様において、冷温順化を、前記植物において利用可能なタンパク質の量を増加させることにより、好ましくは前記植物におけるsnow1遺伝子の増強により、増強させる又は増加（increased）させることができる。
【００３４】
以上のように、本発明の一態様は、本発明のポリヌクレオチドを保持している植物細胞であり、好ましくは本発明の単離されたポリヌクレオチドを保持しているトランスジェニック植物である。
【００３５】
本明細書中に使用される、「増強（enhancement）」の用語は、植物細胞および／または植物において、対応するDNA（corresponding DNA）によりコード化される、１以上の酵素の細胞内活性の増加を意味する。増強は、細菌細胞の様々な操作の援助により達成できる。増強（特に、過剰発現）を達成するために、対応する遺伝子のコピー数を増加させ得る強いプロモータを使用し得る、またはプロモータおよび制御領域またはリボソーム結合部位（構造遺伝子の上流に配置される）を変異させ得る。発現カセット（これは構造遺伝子の上流に導入される）は、同じ様式で作用し得る。加えて、誘導性プロモータを用いることにより発現を増加させることが可能である。また、高い活性を有する対応する酵素をコード化する、遺伝子を使用することができる。また、発現を、mRNAの寿命を延長させるための処置（measures）により改善できる。さらにまた、前記酵素の分解を阻止することにより、酵素活性を全体として増加させることができる。さらに、これらの処置を、任意の所望の様式に、自由選択的に組み合わせることができる。特定の植物において遺伝子の活性を変更させるための、これらの及び他の方法は既知であり、例えば文献〔Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al, Eds.,  Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995)〕に記載されている。
【００３６】
本明細書中に使用される「発現カセット（expression cassette）」にはプロモータが含まれ、これは特定の植物細胞において機能的であり、配列番号２のSnow1タンパク質をコード化している核酸(例えば、配列番号１の配列を有しているポリヌクレオチド)に動作可能に連結される（ここで、特定の植物細胞における前記タンパク質の発現の増強は、冷温順化の増加を前記植物細胞へと付与する）。本発明の好適な態様において、前記プロモータは、ウイルス性コートタンパク質プロモータ、組織特異的なプロモータ、単子葉植物プロモータ、ユビキチンプロモータ、ストレス誘導可能なプロモータ、CaMV  35Sプロモータ、CaMV  19Sプロモータ、アクチンプロモータ、cabプロモータ、ショ糖合成酵素プロモータ、チューブリンプロモータ、napin R遺伝子複合体プロモータ、トマトE8プロモータ、パタチンプロモータ、mannopineシンターゼプロモータ、ダイズ種子タンパク質グリシニンプロモータ、ダイズ栄養貯蔵タンパク質プロモータ（soybean vegetative storage protein promoter）、バクテリオファージSP6プロモータ、バクテリオファージT3プロモータ、バクテリオファージT7プロモータ、Ptacプロモータ、根細胞プロモータ（root-cell promoter）、ABA誘導性プロモータ、および膨圧誘導性プロモータからなる群から選択される。Snow1に関しては上記に記載したとおりであるが、本発明の発現カセットの別の例は、配列番号4のIce1タンパク質をコード化している核酸(例えば、配列番号3の配列を有しているポリヌクレオチド)を含有する（ここで、特定の植物細胞における前記タンパク質の発現の増強は、冷温順化の増加を前記植物細胞へと付与する）。なお別の態様において、前記発現カセットは、Snow1およびIce1をコード化している両方のポリヌクレオチド(これらのポリヌクレオチド及びその変異体は、以下に記載される)を含有してもよい；これらは同じ(または異なる)プラスミドまたはベクター上の、同じプロモータまたは選択的に誘導可能なプロモータのコントロール下に配置される。本明細書中で使用される「選択的に誘導可能なプロモータ（selectively inducible promoter
）」の用語は次の事項を意味する；その事項とは、２以上のプロモータが同じプラスミドまたはベクター上に存在する場合、或いは、これらのプロモータが異なるプラスミドまたはベクター上に存在するが、しかし、前記プラスミドまたはベクターが同じ宿主細胞、植物細胞、またはトランスジェニック植物に含有される場合、これらのプロモータが、宿主と適合性(宿主細胞、植物細胞、またはトランスジェニック植物により安定的に維持される)であり、個別的に、活性化されるか又は転写増強される(例えば、一方のプロモータのケースにおいてIPTGの添加により、および他方のケースでは温度を上昇させることにより）ことである。
【００３７】
また、高い活性を有する、対応する又は変異体の酵素をコード化する、遺伝子を使用することができる（例えば、Snow1および／またはIce1）。好ましくは、前記対応する酵素は、前記酵素の天然形態（native form）よりも大きな活性を有しており、より好ましくは少なくとも5、10、25%、または50%の範囲でより活性であり、最も好ましくは天然酵素の活性の２倍以上である。
【００３８】
本出願の前後関係において（In the context of the present application）、次の場合、ポリヌクレオチド配列は、本発明による配列と「相同（homologous）」である；その場合とは、該ポリヌクレオチド配列の塩基組成および塩基配列の、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が、本発明による配列と一致（corresponds）する場合である。本発明によると、「相同タンパク質（homologous protein）」は次のタンパク質を含むと理解される；そのタンパク質とは、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列が、本発明によるアミノ酸配列と一致する或いは上述のポリヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸配列を含有するものである〔ここで、一致は、対応するアミノ酸が同一（identical）であるか又は相互に相同的（mutually homologous）なアミノ酸であることを意味すると理解される〕。本明細書中で定義されたとおり、本発明の配列は、配列番号1(ポリヌクレオチド配列:snow1)、配列番号2(アミノ酸配列:Snow1)、配列番号3(ポリヌクレオチド配列:ice1)、および配列番号4(アミノ酸配列:Ice1)に対応する。「相同的なアミノ酸（homologous amino acids）」の表現は、特に荷電、疎水性の特性、立体的な特性などに関する対応する特性を有するものを意味する。以上のように、前記タンパク質は、配列番号2または配列番号4に対して、70%〜100%相同未満であり得る。
【００３９】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性（Homology）、配列類似度（sequence similarity）、または配列同一性（sequence identity）は、既知のソフトウェアまたはコンピュータプログラム〔例えば、BestFitまたはGapペアワイズ比較プログラム(GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711)〕を用いることにより、通常決定し得る。BestFitは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム〔Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)〕を使用して、２つの配列間の同一性または類似度の最適セグメントを発見する。Gapは、グローバルアラインメント（global alignments）を実施する、即ち：NeedlemanおよびWunsch〔J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)〕の方法を用いて、全ての１配列を全ての別の類似配列で調べる。配列アライメントプログラム（例えば、BestFit）を用いて、配列の相同性、類似度、または同一性の程度を決定する場合、初期設定を使用し得る、又は適切なスコアリングマトリックスを選択して同一性、類似度、または相同性のスコアを至適化し得る。同様に、プログラム（例えば、BestFit）を用いて、２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似度、または相同性を決定する場合、初期設定を使用し得る、又は適切なスコアリングマトリックス（例えば、blosum45またはblosum80）を選択して同一性、類似度、または相同性のスコアを至適化し得る。
【００４０】
また、本発明は、次のポリヌクレオチドに関する；それは、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子、又はその断片を含有するポリヌクレオチドであり、これは対応する遺伝子バンクとプローブ（該プローブは、配列番号1に対応する該ポリヌクレオチド、又はその断片の配列を含有する）とをハイブリダイゼーションさせる手段によりスクリーニングすること、および該DNA配列の単離により取得できる。
【００４１】
本発明によるポリヌクレオチド配列は、snow1遺伝子の配列（特に、配列番号１のsnow1遺伝子）に対して高程度の類似性を提示するcDNAsまたは遺伝子を単離するための、RNA、cDNA、およびDNAに対するハイブリダイゼーションプローブとして適切である。
【００４２】
また、本発明によるポリヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)のプライマーとして適切であり、これによりSnow転写アクチベーター活性を有している酵素をコード化するDNAが生産される。
【００４３】
オリゴヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマーとして作用するもの）は、30以上、好ましくは30まで、より好ましくは20まで、最も好ましくは少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含有し得る。また、少なくとも40または50ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドが適切である。
【００４４】
「単離された（isolated）」の用語は、その天然の環境から分離されたことを意味する。次の事項を理解すべきである；その事項とは、本発明の「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、更に実質的に純粋または純粋であってもよい(即ち、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、精製されている)ということである。本明細書中で使用される「実質的に純粋（substantially pure）」の用語は、次の事項を意味する；その事項とは、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、その天然の環境から単離され、その単離の程度が微量な不純物が残存する程度である(例えば、結果として生じるポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%純粋である）ことである。本明細書中に使用される、「純粋（pure）」の用語は、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに夾雑物がないことを意味する(即ち、100%純粋である)。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」の用語は、通常はポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを意味する；また、無修飾型RNA（unmodified RNA）もしくはDNAまたは修飾型RNAもしくはDNAを意味し得る。
【００４６】
「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合を介して結合する２以上のアミノ酸を含有する、ペプチドまたはタンパク質を意味すると理解すべきである。
【００４７】
本発明によるポリペプチドは、配列番号2に対応するポリペプチド、特にSnow1転写アクチベーターの生物学的活性を有するものを含む、また次のポリペプチドを含む；そのポリペプチドとは、そのポリペプチドの少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が、配列番号2に対応するポリペプチドと相同であり且つ例証した活性（the cited activity）を有するポリペプチドである。従って、前記ポリペプチドは、配列番号2に対して70%〜100%までの相同性を有し得る。
【００４８】
また、本発明は、コーディングＤＮＡ配列に関し、これは配列番号1から遺伝暗号の縮退により生じる。更に、同じ様式において、本発明は、配列番号1と又は配列番号1の部分とハイブリダイズするDNA配列に関する。加えて、当業者は、保存されたアミノ酸置換をも認識する；そのアミノ酸置換は、例えば、タンパク質中のグリシンをアラニンで又はアスパラギン酸をグルタミン酸で「センス変異（sense mutation）」として置換することであり、これは前記タンパク質の活性において如何なる基本的（fundamental）な変化をも生じさせない（即ち、この変異は機能的に中立である）。次の事項もまた既知である；その事項とは、タンパク質のN-および／またはC-終端での変化は、その機能を実質的に損傷させず、それどころか該機能を安定化し得ることである。
【００４９】
また、同じ様式において、本発明は、配列番号1と又は配列番号1の部分とハイブリダイズするDNA配列に関する。また、本発明は、配列番号1から生じるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生産されたDNA配列に関する。このタイプのオリゴヌクレオチドは、典型的には、上記で定義したような少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する。
【００５０】
「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の用語は、特定のポリヌクレオチドがその標的配列と、他の配列よりも検出可能に大きな程度(例えば、少なくともバックグランドに対して2倍)にハイブリダイズする条件へのリファレンス（reference）を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況において異なるであろう。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件の厳密性をコントロールすることにより、前記プローブに対し100%相補的である、標的配列を同定することができる(相同的な探索)。代わりに、厳密性条件を、配列において幾つかのミスマッチングを許容させて、より低い程度の類似度が検出されるように調整することができる(非相同的な探索)。
【００５１】
典型的には、ストリンジェントな条件は、次の条件である；つまり塩濃度が約1.5M  Naイオン未満、典型的には約0.01〜1.0M  Naイオン濃度(または他の塩)、pH7.0〜8.3、および温度は、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)に対して少なくとも約30℃および長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド以上)に対して少なくとも約60℃である。また、ストリンジェントな条件は、不安定化因子（例えば、ホルムアミド）の添加で達成し得る。例示的な低い厳密性条件には、30〜35%ホルムアミド、1M塩化ナトリウム、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝液で37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X  SSC(20X  SSC=3.0M  NaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム)で50〜55℃での洗浄が含まれる。例示的な中等度の厳密性条件には、40〜45%ホルムアミド、1M  NaCl、1%SDSで37℃でのハイブリダイゼーション、および0.5X〜1X  SSCで55〜60℃での洗浄が含まれる。例示的な中等度の厳密性条件には、50%ホルムアミド、1M  NaCl、1%SDSで37℃でのハイブリダイゼーション、および0.1X  SSCで60〜60℃での洗浄が含まれる。
【００５２】
特異性は、典型的にはポスト-ハイブリダイゼーション洗浄の役割（function）である（最終的な洗浄溶液のイオン強度および温度として重要な要素）。DNA―DNAハイブリッドに関して、TmはMeinkothおよびWahl〔Anal. Biochem., 138:267-284 (1984)〕の式、即ち：Tm=81.5oC.+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/Lで近似することができ；ここでMは一価の陽イオンのモル濃度、%GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、%formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、およびLは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Tmは、特定の温度(既定のイオン強度およびpHのもとでの)であり、その温度で相補的な標的配列の50%が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする。Tmは、ミスマッチング1%ごとに約1℃減少する；以上のように、Tm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列へとハイブリダイズさせることができる。例えば、約90%同一性の配列を探す場合、Tmを10℃減少させ得る。一般に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびpHで、特異的な配列及びその補完物（complement）に関する温度のメルティングポイント(Tm)よりも約5℃低いように選択される。しかしながら、重度にストリンジェントな条件は、温度のメルティングポイント(Tm)よりも1、2、3、または4℃低い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる；中等度にストリンジェントな条件は、温度のメルティングポイント(Tm)よりも6、7、8、9、または10℃低い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる；低度にストリンジェントな条件は、温度のメルティングポイント(Tm)よりも11、12、13、14、15、または20℃低い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。前記の式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の組成物、および所望のTmを用いる場合、当業者は次の事項を理解するだろう；その事項とは、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液の厳密性におけるバリエーションが生得的（inherently）に記載
されていることである。所望の程度のミスマッチングが45℃(水溶液)または32℃(ホルムアミド溶液)未満のTmを生じる場合、より高い温度を使用できるようにSSC濃度を増加することが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、文献〔 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2000)〕中に記載されている。
【００５３】
以上のように、上述の情報に基づいて、当業者は、本ポリヌクレオチドに実質的に類似するポリヌクレオチドを同定および単離することができる。係るポリヌクレオチドをそのように単離することにおいて、前記ポリヌクレオチドを、例えば、植物の冷温順化を増加させることにおける本ポリヌクレオチドとして使用することができる。
【００５４】
本発明の一態様は、ポリヌクレオチドをスクリーニングする方法である；該ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド、好ましくはSnow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化しているポリヌクレオチドと実質的な相同性を有する。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド配列を、1以上の適切なプラスミドまたはベクター上に、植物などに関する技術分野において既知の様式で保持させることができる。上述したとおり、ポリヌクレオチド配列(配列番号1および配列番号3)を同じ又は異なるプラスミドまたはベクターに具備させることも、本発明の範囲内である。 本発明の一態様において、これらのポリヌクレオチドを、単一のプロモータ、同タイプの異なるプロモータ、または選択的に誘導可能なプロモータへと、同じ(または異なる)プラスミドまたはベクター上で動作可能に連結し得る。
【００５６】
一態様において、前記ポリヌクレオチドを増殖させることに関して、それを細菌又は真菌株中に、適切なベクター（前記細胞タイプに適切な）と共に保持させることは有利であろう。ポリヌクレオチドを増殖させる及びこれらの細胞タイプ中でタンパク質を生産する通常の方法は、当該技術分野において既知であり、例えば文献〔Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982) and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)〕中に記載されている。
【００５７】
別の好適な態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号1に対して相補的（complimentary）であるポリヌクレオチド、配列番号1に対して少なくとも70%、80%、90%、または95%同一であるポリヌクレオチド；或いは配列番号1に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記ストリンジェントな条件は5X SSC中での50〜68℃の温度での洗浄を含む。従って、前記ポリヌクレオチドは、配列番号1に対して70%〜100%同一未満であり得る。
【００５８】
本発明の態様において、本発明のポリヌクレオチド(即ち、上記のような、配列番号1、そのバリアント、配列番号2をコード化しているポリヌクレオチド、又はそのバリアント)は、プラスミドまたはベクター中に、Ice1に関連するポリヌクレオチド(即ち、上記のような、配列番号3、そのバリアント、配列番号4をコード化しているポリヌクレオチド、又はそのバリアント)の非存在下または存在下で含有される。
【００５９】
本発明の別の態様において、本発明のプラスミド(s)またはベクター(s)は、宿主細胞、植物細胞、またはトランスジェニック植物に含有される。好ましくは、前記植物は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliania）であるか又はコムギ、トウモロコシ、ピーナッツ綿（peanut cotton）、カラスムギ、およびダイズ植物からなる群から選択される。好適な態様において、前記ポリヌクレオチド(上記のような、Snow1および／またはIce1をコード化している)は、プロモータ、好ましくは誘導可能なプロモータと動作可能に連結される。これまでの記載のように、これらのポリヌクレオチドを、単一のプロモータ、同タイプの異なるプロモータ、または選択的に誘導可能なプロモータへと、同じ(または異なる)プラスミドまたはベクター上で動作可能に連結し得る。
【００６０】
別の好適な態様において、本発明は、Snow1転写アクチベーター活性を有しているタンパク質をコード化するポリヌクレオチドをスクリーニングするための方法を提供する。該方法は、本発明のポリヌクレオチドを選抜されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることと；前記ポリヌクレオチドを発現させて、タンパク質を産生することと；および前記タンパク質におけるSnow1転写アクチベーター活性の存在または非存在を検出することとを含む。
【００６１】
別の好適な態様において、本発明は、ヌクレオチド配列番号1、配列番号1に相補的な配列および／または配列番号2におけるアミノ酸配列を有しているタンパク質をコード化する配列に対して少なくとも70%相同性を有する核酸を検出するための方法を提供する。該方法は、核酸サンプルを、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを又はその相補物（complement thereof）の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーと連続的に接触させることを含む。
【００６２】
別の好適な態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに対して少なくとも70%相同性を有する核酸を産生するための方法を提供する。該方法は、核酸サンプルを、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを又はその相補物の少なくとも15の連続的なヌクレオチドを含むプライマーと接触させることを含む。
【００６３】
別の好適な態様において、本発明は、Snow1タンパク質を作出するための方法を提供する；該方法は、本発明のポリヌクレオチドを保持している宿主細胞を、特定時間およびSnow1の発現に適切な条件下で培養することと、および前記Snow1を収集すること（collecting）とを含む。
【００６４】
別の好適な態様において、本発明は、トランスジェニック植物を作出する方法を提供する；該方法は、本発明のポリヌクレオチドを前記植物へと導入することを含む。
【００６５】
別の好適な態様において、本発明は、冷温順化をそれを必要とする植物において増加させる方法を提供する；該方法は、本発明のポリヌクレオチド(snow1に関して本明細書中で既定したポリヌクレオチド単独またはice1に関して本明細書中で既定したポリヌクレオチドの存在下を含めた包括的なもの)を前記植物へと導入することを含む。
【００６６】
本発明に基づく植物および植物細胞を形質転換するための、方法、ベクター、および組成物は、当業者に周知であり、特に限定されない。詳細に記載された例に関しては文献〔Karimi et al., TRENDS in Plant Science, Vol. 7, NO: 5, May 2002, pp. 193-195、本明細書中に参照によって援用される〕を参照されたい。
【００６７】
別の好適な態様において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供する；該ポリペプチドは、配列番号2における又は配列番号2に対して少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%、および最も好ましくは95%相同性であるタンパク質におけるアミノ酸配列を含む（ここで、前記ポリペプチドはICE1転写アクチベーター活性を有する）。従って、前記酵素は、配列番号2に対して70%〜100%未満までの相同性を有する。
【００６８】
また、別の態様において、本発明は、植物の冷温順化を増加する方法を提供する；該方法は、Snow1転写アクチベーターを前記植物において過剰発現させることを含む。この態様において、Snow1は、さらにIce1と共発現され得る。
【００６９】
また、本発明は、別の態様において、植物の冷温順化を増加させる方法を提供する；該方法は、CBF転写制御因子およびDREB1転写制御因子からなる群から選択される、１以上の付加的な転写制御因子の発現を増加することによる、および／または1以上の冷温応答性遺伝子の発現を増加させることによる方法である。
【００７０】
本発明の前後関係において、「冷温応答性遺伝子（cold responsive genes）」の用語は、特定のタンパク質をコード化する遺伝子を含み；該タンパク質は、炭水化物の呼吸に関与する酵素、炭水化物の代謝に関与する酵素、脂質の呼吸に関与する酵素、脂質の代謝に関与する酵素、フェニルプロパノイド（phenylpropanoids）の呼吸に関与する酵素、フェニルプロパノイドの代謝に関与する酵素、抗酸化物（antioxidants）の呼吸に関与する酵素、抗酸化物の代謝に関与する酵素、分子シャペロン、不凍化タンパク質、および凍結により生じる脱水の耐性に関与するタンパク質からなる群から選択される。
【００７１】
本発明の上記記載により、当該技術分野における任意の当業者が同じものを作出および使用できるように、それを作出および使用する様式（manner）および方法が提供される、この実施可能性は特に添付される特許請求の範囲の主題に対して提供され、この特許請求の範囲は元の記載の一部を構成する。
【００７２】
上記で使用される、「からなる群から選択される」、「から選択される」などの用語は、特定された材料の混合（mixtures）を含む。
【００７３】
本明細書中に記載される数的な既定または範囲には、終点（endpoints）が含まれる。また、数的な既定または範囲の範囲内の、全ての値および部分範囲（subranges）は、あたかも明示的に記載されたかのように明らかに含まれる。
【００７４】
上記記載は、当業者が本発明を作出および使用できるように記載されている、そして特定の適用及びその必要性の関連において提供される。好適な態様に対する様々な修飾は、当業者が容易に理解できる。また、本明細書中で既定される一般的な原則は、本発明の精神（spirit）および範囲から逸脱することなく、他の態様および適用に適用し得る。従って、本発明は、記載された態様に限定されず、本明細書中に開示される原則（principles）および特徴（features）に一致する最大範囲に合致する。
【００７５】
本発明は一般的に記載されているので、特定の具体的な例を参照することで更なる理解を得ることができる、これらの例は説明の目的でのみ本明細書中に提供される、また、他で既定されないかぎり限定されない。
【実施例】
【００７６】
材料および方法  
遺伝子発現分析: 
RNA分析に関して、同じＭＳプレートの分離した半分（separate halves）上で成長させた、野生型およびice1(表現型)植物の10日齢の実生（seedlings）を使用した。コントロールおよびストレスを与えた植物（stressed plants）から抽出したトータルRNAを、文献〔Liu and Zhu (1997)〕に記載のように、RNAブロッティングで分析した。Snow1を過剰発現しているトランスジェニック植物からのRNAを、記載のように抽出した。前記RNAをナイロン膜に転写し、そして前記膜完全長snow1相補ＤＮＡまたはCBF3でプローブした。βチューブリン遺伝子を、記載(Chinnusamy et al 2003)のようにPCRで増幅し、ローディングコントロールとして使用した。様々な組織における発現分析に関して、RNAを根、葉、基部、花、および長角果（silique）から抽出し、引き続いてRNAブロッティングを完全長snow1相補ＤＮＡをプローブとして用いて実施することにより分析した。ICE1のオープンリーディングフレーム(配列番号:3)を、RT-PCRにより取得されたcDNAsを配列決定することにより決定した(米国特許シリアル番号10/425,913を参照されたい、この出願の全内容が参照により援用される）。
【００７７】
酵母２ハイブリッド相互作用試験： 
完全長Snow1を、プライマー5’ GATGGGAAGAGCTCCATGCTG 3’ (配列番号:5)および5’ CCGCTCGAGCTAGCCAATACATCGAACCAG 3’ (配列番号:6)を用いて増幅し、そしてpACT2 ベクターのSmaIおよびXhoIサイトにクローン化した(preyベクター)。Ice1のＣ末端領域(266-494アミノ酸に対応する)を、pMal-Ice1  DNA(MBP融合ベクターにクローン化したIce1)を鋳型として、5’ TGAGACTGGGATTGAGGTTTCTG 3’ (配列番号:7)および5’ CAAGCTTGCCTGCAGGTCGAC 3’(配列番号:8)プライマーを用いて増幅し、そしてpAS2ベクターのSmaIおよびSalIサイトにクローン化した(baitベクター)。相互作用ドメインのマッピングのために、Ice1のＣ末端部分の欠失体を、遺伝子特異的なプライマーを用いてPCR増幅し、そしてpAS2ベクターのNcoIおよびBamHIサイトにクローン化した。Preyおよびbaitプラスミドを、Y190株の酵母に共形質転換し、コロニーをSC-Trp、Leu培地で選択した。結果として生じたコロニーをβ-Gal活性に関してアッセイした。
【００７８】
E.Coliにおける融合タンパク質の発現および精製： 
完全長snow1相補ＤＮＡ(pGEMT-easyにクローン化された)を、遺伝子特異的なプライマー  CGGGATCCATGGGAAGAGCTCCATGCTGTG(配列番号:9)およびSP6プライマーを用いて増幅した。アンプリコンを、pMALベクター(NEB)またはpGEX4T-1ベクター(ファルマシア、USA)のBamH IおよびSal Iサイトにクローン化した。完全長AtMyb79相補ＤＮＡを、CGGGATCCGAATGGTGGAAGAAGTTTGGAGAAA(配列番号:10)およびCCGCTCGAGTTAACAAAATGGAATCACCAAGTT(配列番号:11)を用いて増幅し、pGex 4T-1ベクター(ファルマシア)のBamH IおよびXho Iサイトにクローン化した。MBP-Snow1融合タンパク質を、製造者により提供された説明書のとおり精製した。GST-融合Snow1、GST-融合Atmyb79(遠縁のMYB転写制御因子)構築物を、大腸菌BL21(コドン  プラス)細胞(ストラタジーン)に形質転換した。単一コロニーを、一晩37℃で成長させ、新鮮な20x容量のLuria-Bertani培地に移し、そして更に1時間培養した。組換えタンパク質発現を、1mMのイソプロピル  ベータ-D-チオガラクトピラノシドで4h、37℃で誘導した。細胞を、遠心分離(5,000xg、10min、4℃)で回収し、ペレットを予備冷却した溶解緩衝剤(10mM  Tris  pH8.0、150mM  NaCl、1mM  EDTA、および100μg/mlリゾチーム)に懸濁し、氷上で15minインキュベーションした。ジチオスレイトール(50mM)、フェニルメタンスルホニルフルオリド(1mM)、およびN-ラウロイル  サルコシン(1%)を、1min-超音波処理の前に添加した。超音波処理物を、遠心分離（30,000xgで15min、4゜C）で清澄化した。Triton X-100(1.5%)を、上清に添加し、ボルテックスした。調製されたグルタチオン-アガロースビーズ(シグマ)。前記ビーズを、予備冷却したPBSで６回洗浄した。ＧＳＴ融合タンパク質を、100mMグルタチオン(シグマ)、50mM  Tris、pH8.8で溶出した。His-タグICE1を、予備冷却したPBS（1Mイミダゾールを含有している）で溶出した。
【００７９】
DNA結合: 
CBFプロモータとの結合に関して、異なる断片を、CBFプロモータ(使用した領域の詳細に関しては、図3を参照されたい)から、KODポリメラーゼ(Novagen)を用いてPCR増幅した。増幅された断片を、Qiaquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて、アガロースゲルから溶出した。溶出した断片を、γ-P32 ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、末端標識した。500pgの標識プローブを、500ngの精製MBP-SNOW1融合タンパク質と、RTで30minインキュベーションした。競合に関して、精製タンパク質を、100ngの非標識断片と、30min、RTでインキュベーションした（それらと標識プローブとのインキュベーションの前に）。DNA-タンパク質複合体を、5%ポリアクリルアミドゲル（0.5X  TBE中）で分離し、オートラジオグラフィーで視覚化した。
【００８０】
一過性発現アッセイ： 
完全長のsnow1およびAtMyb79  相補ＤＮＡを、植物発現ベクター2X35S-MCS-NosのSma IおよびSal Iサイトにクローン化した。結果として生じたエフェクタープラスミドのプラスミドDNAおよびCBF3プロモータlucレポーターを、粒子衝突（particle bombardment）を用いてアラビドプシスの葉に送達した(Ohta et al 2001)。
【００８１】
インビトロのプルダウンアッセイ: 
インビトロプルダウンアッセイを実施して、Snow1およびIce1の物理的な相互作用を確認した。完全長のsnow1（pGEM-Teasyにクローン化した）およびAtMyb79(pBCSKストラタジーンのEcoR IおよびXho Iサイトにクローン化した)を使用した。完全長のIce1およびABI2を、pCITE4aのEcoRI/SalIおよびNcoI/EcoRIサイトにクローン化した。各2μgの直線化したプラスミドを、MegascriptT7ＲＮＡポリメラーゼキット(Ambion)を用いて、インビトロ転写した。10μgの精製した転写物（snow1およびAtMyb79）を、35Sメチオニンの存在下でFlexi Rabbit Reticulocyte system(Promega)を用いて、インビトロ翻訳した。S-tag-Ice1およびS-tag-ABI2転写物を35S-メチオニンの非存在下で翻訳し、それらのタンパク質をS-tag精製キット(Novagen)を用いて精製した（製造者の説明書どおり）。S-Tag Ice1およびS-tag ABI2（S-Tagスラリーに結合した）を使用して、35S-標識タンパク質をプルダウンした。別の実験において、35S-標識S-tag Iceを産生し、そしてGST-Snow1またはGST-Myb79タンパク質を用いたプルダウンに使用した。プルダウンアッセイを、文献(Haftler et al 2000)に記載のとおり実施した。
【００８２】
Snow1の発現および局在化: 
Snow1プロモータ―GUS融合の構築物に関して、snow1相補ＤＮＡの開始コドンに対して上流2.0kb断片を、CCCAAGCTTATACCATATCAAATCTGAGAAAG(配列番号:18)およびCGCGGATCCATTTGTGATTGCTGATAAAAGAAG(配列番号:19)プライマーを用いて、Col WTゲノムDNAからPCR増幅し、そしてpCAMBIA1391ZのHindIIIおよびBamHIサイトにクローン化した。結果として生じたプラスミドを、GV3101系統のアグロバクテリウムに導入し、Col-Oのアラビドプシス植物に花減圧浸潤（floral vacuum infiltration）により形質転換した(Bechtold and Pelletier、1998)。前記トランスジェニック植物を、MS（30mg/Lのハイグロマイシンを含有している）上で選択した。トランスジェニック実生を、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニドで21日齢に文献〔Jefferson et al (1987)〕の記載にしたがって組織化学的に染色し、そしてオリンパスFZX12解剖顕微鏡を用いて視覚化した。GFP融合完全長Snow1相補ＤＮＡを、CCGGAATTCATGGGAAGAGCTCCATGCTGTGAG(配列番号:20)およびCGCGGATCCCTAGCCAATACATCGAACCAGAAG(配列番号:21)プライマーを用いてPCR増幅し、pEGADベクター（bialophosアセチルトランスフェラーゼ選択マーカー遺伝子を含有している）のEcoRIおよびBamHIサイトにクローン化した(Cutler et al.、2000)。結果として生じたプラスミドを、アグロバクテリウム  系統GV3101に導入し、続いてアラビドプシス植物（Col-0生態型）に花減圧浸潤により形質転換した(Bechtold and Pelletier、1998)。共焦点顕微鏡観察に関し、Snow1:GFPトランスジェニック実生（50mg/Lフォスフィノスリシンを添加したMS寒天培地で選択した）を、スライドガラス上に封入し、イメージをツァイス510  Meta共焦点顕微鏡（488-nm励起レーザーおよび522/DF35エミッションフィルターを備える）を用いて視覚化した。
【００８３】
トランスジェニック植物の構築： 
完全長Snow1を、GCTCTAGAATGGGAAGAGCTCCATGCTGTGA(配列番号:22)およびGGGGTACCCTAGCCAATACATCGAACCAGA(配列番号:23)を用いて増幅し、そしてpRT105ベクターのXbaI/KpnIサイトにクローン化した。35Sプロモータ―Snow1―nosターミネーターを含有しているカセットを、結果として生じたプラスミドから摘出し、そしてpCAMBIA3300ベクターのPstIサイトにクローン化した。最終的な構築物を、アグロバクテリウム系統GV3101に導入した。アラビドプシス植物(CBF3-luc  バックグランド)の形質転換を、アグロバクテリウム媒介性の植物内浸潤（Agrobacterium-mediated in planta infiltration）で実施した。Agrobacterim  GV3101（Snow1過剰発現ベクターを有する）を使用して、Snow1過剰発現株（CBF3-LUC  バックグランド）を取得した。T1トランスジェニック植物を、発芽後2週間で、30mg/Lのbastaを3回、3日インターバルでスプレーすることにより選択した。各T1植物(T2)からの種子を、個々に収集し、更なる分析に使用した。
【００８４】
結果
snow1発現はice1変異体植物において高い  
RNAブロット分析を実施して、snow1転写物のレベルにおけるice1変異の効果を分析した。マイクロアレイデータと一致して、野生型植物(CBF3:luc)よりも多くのsnow1転写物が、冷温ストレスの条件下でice1植物中に観察された。増加したsnow1転写物は、冷温処理の1時間、3時間、および6時間で観察された。しかしながら、冷温ストレスの12時間で、ice1中のsnow1発現は、野生型植物よりも低かった。また、RNAブロット分析は、snow1発現が冷温処理に応答してアップレギュレートされることを指摘している。野生型植物は、Snow1転写物の冷温ストレス誘導を冷温ストレスの１時間後に示し、その発現は6時間で最高点に達した。また、Snow1転写物は、非ストレス条件下（unstressed conditions）で検出可能であった。
【００８５】
Snow1は植物の全ての部分で構成的に発現される  
snow1の分布を分析するために、RNAゲルブロット分析を根、茎、花、および長角果から抽出したRNAを用いて実施した。Snow1は、アラビドプシス植物の全ての器官で発現されることが見出された。トランスジェニック植物は、Snow1プロモータのコントロール下でGus遺伝子を発現するよう作出された。トランスジェニック  アラビドプシス植物のT1株を、Gus発現に関して分析した。Gus発現を、根、葉、茎、および花の部分で検出した、このことからSnow1が構成的に及びユビキタスに発現されることが更に確認された。
【００８６】
酵母２ハイブリッド相互作用：
Snow1がIce1と相互作用するかどうかを決定するために、酵母2ハイブリッドシステムを実施した。Ice1タンパク質の異なる部分をbaitとして使用して、完全長Snow1をpreyとして使用して、それらの相互作用を試験した。Snow1は、Ice1のC-末端部分と優先的に相互作用した。Snow1およびIce1の相互作用は特異的であった、というのもpreyプラスミドのみ又はAtMyb79  preyプラスミドがIce1と相互作用できなかったからである。Ice1のC-末端部分を欠失（deletion）させることにより更に狭めて、そしてbaitとして使用して、Snow1との相互作用ドメインを精密にマップした。Ice1の358-494アミノ酸に対応する領域がSnow1と特異的に相互作用することが観察された。2ハイブリッド相互作用とは別に、本発明者等はタンパク質プルダウンアッセイを使用して、Ice1およびSnow1間の相互作用を確認した。GST-Snow1は、35S-標識Ice1をプルダウンできた。同様に、S-tagged Ice1は、35S-標識Snow1をプルダウンできた。それらの相互作用は特異的であった（というのもGST-Myb79もS-tagged ABI2も、それぞれIce1またはSnow1タンパク質の何れかをプルダウンできなかったからである）。これらの結果は、Snow1がIce1と相互作用することを示唆する。
【００８７】
Snow1はCBF3プロモータにおけるMYB認識サイトに結合する
EMSAを実施して、Snow1とCBFプロモータとの結合を決定した。CBFプロモータの異なる部分を、PCR増幅し、EMSAに使用した。CBF1プロモータのプロモータ領域において、推定上のMyb認識配列の分布は、次の通りである、0（領域  -1000/-750において）、各１（領域  -750/-500、-500/-300、および-150/+1において）および2（-300/-150において）。同様に、CBF2プロモータ配列において、推定上のMyb認識なし（領域  -1000/-750において）、および各1（領域  -500/-270および-270/-20において）。また、CBF3プロモータの4つの異なる領域を、MBP-Snow1融合タンパク質と共にEMSAに使用した。全ての前記断片は、２つのMYB認識配列を有していた（係る配列が非存在である、第3の断片を除いて）。
【００８８】
1つの主要な複合体は、CBF1プロモータの領域-750/-500および-500/-300に対応する断片中に観察された、他方でCBF1プロモータの他の領域はSnow1と結合しなかった。CBF2プロモータ断片が使用された場合、結合は領域  -1000/-750および-500/-270に対応する断片で観察された、他方で結合はCBF2の-270/-20領域で観察されなかった。Snow1は、CBF3プロモータの４つの断片全てに結合することが可能であった。これらの複合体は、同じ配列を有するコールド  コンペティター（cold competitors）の量を増加させて添加することにより消失した。これらの結果は次の事項を指摘している。その事項とは、Snow1がCBFプロモータと結合し、その結合がおそらくMyb配列により媒介されることである。
【００８９】
Snow1はCBF3発現を制御する
一過性発現アッセイを実施して、Snow1がCBF3発現を活性化できるかどうかを決定した。エフェクター  プラスミド（effector plasmid）を、完全長Snow1相補ＤＮＡ（CaMV35Sプロモータのコントロール下）をクローニングすることにより構築した。CaMV35-Snow1およびCBF3-応答性レポーター遺伝子（CBF3-LUC）を、アラビドプシスの葉に粒子衝突により送達した；ルシフェラーゼ活性は、コントロール（CBF3-lucのみを含有しているレポータープラスミドの存在または非存在）に対しほぼ６倍増加した(図4A)。活性の増加は、CaMV35-Ice1がエフェクターとして使用された際よりも大きかった。CaMV35-Snow1およびCaMV35-Ice1を共衝突（co-bombarded）した場合、CBF3駆動性のルシフェラーゼ活性において若干の変化があった（CaMV35-Snow1単独のみをエフェクターとして使用した場合と比較して）。これらの結果は、Snow1がCBF3発現をポジティブに増強することを示唆している。
【００９０】
Snow1の細胞内局在
Snow1タンパク質の細胞内局在を試験するため、完全長Snow1相補ＤＮＡを、緑色蛍光タンパク質(GFP)コード配列のＣ末端に、インフレームで融合した。CaMV35Sプロモータにより駆動されるGFP-Snow1融合を使用して、トランスジェニック植物を作出した。T1トランスジェニック植物中でのGFP蛍光の共焦点イメージングにより、次の事項が示された。その事項とは、GFP-Snow1融合タンパク質が核に存在することであり(図4B)、これによってSnow1が非ストレス条件下で核局在型であることが確認された。
【００９１】
トランスジェニック分析
Snow1過剰発現構築物を、アグロバクテリウムGV3101に導入した。Snow1過剰発現ベクターを保持しているアグロバクテリウムを、野生型(CBF3-LUC)植物の花浸漬形質転換（flower-dipping transformation）に使用した。Snow1過剰発現系統(T1)を、次にbastaに対して抵抗する能力により選択した。T2種子で、Snow1過剰発現系統におけるCBF3-LUCルミネッセンス強度を、T2実生において分析した。野生型におけると同様に、検出可能なルミネッセンスは、冷温処理無しのSnow1過剰発現系統において観察されなかった。しかしながら、冷温処理後、Snow1過剰発現系統は、野生型よりも高いCBF3-LUC発現を示した。次の事項に留意すべきである。その事項とは、本発明者等はSnow1過剰発現T2系統(segregating population；分離集団)を使用したので、Snow1過剰発現T2系統において高いルミネッセンスを有する実生のルミネッセンス強度が、野生型強度との比較に使用されたことである。冷温処理の間、ルミネッセンス強度は、Snow1過剰発現系統において高いまま維持された（野生型と比べて）。興味深いことに、１つのSnow1過剰発現系統は、より低いルミネッセンス強度を、試験された全ての時間で示した。このことはSnow1の共抑制（co-suppression）を示唆している。
【００９２】
本発明において多くの修飾および変形（variations）が、上記の教示に照らして可能である。従って、本願に添付される特許請求の範囲の請求項の範囲内で、本明細書中に具体的に記載された以外でも本発明を実施し得る。
【参考文献】
【００９３】
Guy, C.L. 1990. Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187−223.
Hughes, M. and Dunn, M. 1996. The molecular biology of plant acclimation to low temperature. J. Exp. Bot. 47: 291−305.
Browse, J. and Xin, Z. 2001. Temperature sensing and cold acclimation. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 241−246.
Hsieh, T.H., Lee, J.T., Yang, P.T., Chiu, L.H., Charng, Y.Y., Wang, Y.C., and Chan, M.T. 2002. Heterology expression of the Arabidopsis C-repeat/dehydration response element binding factor 1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato. Plant Physiol. 129: 1086−1094.
Gong, Z., Lee, H., Xiong, L., Jagendorf, A., Stevenson, B., and Zhu, J.-K. 2002. RNA helicase-like protein as an early regulator of transcription factors for plant chilling and freezing tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 11507−11512.
Thomashow, M.F. 1999. Plant cold acclimation, freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 571−599.
Tahtiharju, S. and Palva, T. 2001. Antisense inhibition of protein phosphatase 2Caccelerates cold acclimation in Arabidopsis thaliana. Plant J. 26: 461−470.
Knight, H., Veale, E.L., Warren, G.J., and Knight, M.R. 1999. The sfr6 mutation in Arabidopsis suppresses low-temperature induction of genes dependent on the CRT/DRE sequence motif. Plant Cell 11: 875−886.
Mohapatra, S.S., Wolfraim, L., Poole, R.J., and Dhindsa, R.S. 1989. Molecular cloning and relationship to freezing tolerance of cold-acclimation-specific genes of alfalfa. Plant Physiol. 89: 375−380.
Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. 1994. A novel cisacting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress. Plant Cell 6: 251−264.
Stockinger, E.J. Gilmour, S.J., and Thomashow, M.F. 1997. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcription activator that binds to the C-repeat/DRE, a cisacting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl. Acad. Sci. 94: 1035−1040.
Liu, Q., Sakuma, Y., Abe, H., Kasuga, M.,Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10: 1391−1406.
Chinnusamy, V., Ohta, M., Kanrar, S., Lee, B.-h., Hong, X., Agarwal, M., and Zhu, J.-K. 2003. ICE1, a master regulator of cold induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis. Genes & Dev. 17:1043−1054.
Shinwari, Z.K., Nakashima, K., Miura, S., Kasuga, M., Seki, M., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. 1998. An Arabidopsis gene family encoding DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene expression.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 161−170.
Spelt, C., Quattrocchio, F., Mol, J.N.M., and Koes, R. 2000. Anthocyanin1 of petunia encodes a basic-helix−loop−helix protein that directly activates transcription of structural anthocyanin genes. Plant Cell 12: 1619−1631.
Walker, A.R., Davison, P.A., Bolognesi-Winfield, A.C., James, C.M., Srinivasan, N., Blundell, T.L., Esch, J.J., Marks, M.D., and Gray, J.C. 1999. The TRANSPARENT TESTA GLABRA1 locus, which regulates trichome differentiation and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis, encodes a WD40-repeat protein. Plant Cell 11: 1337−1349.
Ohta, M., Matsui, K., Hiratsu, K., Shinshi, H., and Ohme-Takagi, M. 2001. Repression domains of class II ERF transcriptional repressors share an essential motif for active repression. Plant Cell 13: 1959−1968.
Grotewold E, Sainz MB, Tagliani L, Hernandez JM, Bowen B, Chandler VL. 2000. Identification of the residues in the Myb domain of maize C1 that specify the interaction with the bHLH cofactor R. Proc Natl Acad Sci U S A. 97(25):13579-84.
Liu, J. and Zhu, J.-K. 1997. Proline accumulation and salt-stressinduced gene expression in a salt-hypersensitive mutant of Arabidopsis. Plant Physiol. 114: 591−596.
Halfter, U., Ishitani, M. and Zhu, J.-K. 2000. The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 3735-3740.
Bechtold N, Pelletier G. 1998. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods Mol Biol. 82:259-66.
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. 1987. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6(13): 3901-3907.
Cutler SR, Ehrhardt DW, Griffitts JS, Somerville CR. 2000. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.  Proc Natl Acad Sci U S A. 97(7): 3718-23.
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】Snow1は、植物において構成的およびユビキタスに発現される。(A)通常および冷温ストレス条件下でのWT(CBF3-luc)およびice1植物におけるSnow1転写。チューブリン遺伝子を、ローディングコントロールとして使用した。(B)アラビドプシス植物の異なる器官におけるSnow1転写物。2μgのトータルRNAを逆転写し、次にSnow1およびチューブリン（コントロールとして）に対する、遺伝子特異的なプライマーを用いたPCRを実施した。(C)アラビドプシス実生の異なる器官における、Gusタンパク質の組織化学的局在。
【図２−１】Snow1はIce1と特異的に相互作用する。(A)2ハイブリッド相互作用に使用した、異なるpreyおよびbaitの組み合わせを示す。(B)Ice1の異なる領域をbaitとして使用して、そのSnow1との相互作用ドメインを詳細にマップした。これらの領域をAからFに示している。線図中の箱で囲んだ領域（boxed region）は、Ice1タンパク質のbHLH領域を表す。(C)Ice1の指摘した領域とSnow1  baitとの相互作用。(D)GST-taggedタンパク質を用いた、インビトロ  プルダウン。使用した組み合わせを最上部に示す。分子量マーカーをパネルの左側に示す。GST-tagged精製タンパク質のクマシー染色ゲルを、左のパネルに示す。また、オートラジオグラムを、右のパネルに示す。(E)S-taggedタンパク質を用いた、インビトロ  プルダウン。使用した組み合わせを最上部に示す。分子量マーカーをパネルの左側に示す。(F)Ice1とSnow1とのインビボ相互作用。アラビドプシスのプロトプラストを、Myc-Ice1およびHA-Snow1で形質転換した。Myc tagged Ice1を、抗c-Myc抗体で免疫沈降した。前記タンパク質を、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。そして前記膜を抗HA抗体でプローブした。タンパク質分子量マーカーを、パネルの右に示す。
【図２−２】Snow1はIce1と特異的に相互作用する。(A)2ハイブリッド相互作用に使用した、異なるpreyおよびbaitの組み合わせを示す。(B)Ice1の異なる領域をbaitとして使用して、そのSnow1との相互作用ドメインを詳細にマップした。これらの領域をAからFに示している。線図中の箱で囲んだ領域（boxed region）は、Ice1タンパク質のbHLH領域を表す。(C)Ice1の指摘した領域とSnow1  baitとの相互作用。(D)GST-taggedタンパク質を用いた、インビトロ  プルダウン。使用した組み合わせを最上部に示す。分子量マーカーをパネルの左側に示す。GST-tagged精製タンパク質のクマシー染色ゲルを、左のパネルに示す。また、オートラジオグラムを、右のパネルに示す。(E)S-taggedタンパク質を用いた、インビトロ  プルダウン。使用した組み合わせを最上部に示す。分子量マーカーをパネルの左側に示す。(F)Ice1とSnow1とのインビボ相互作用。アラビドプシスのプロトプラストを、Myc-Ice1およびHA-Snow1で形質転換した。Myc tagged Ice1を、抗c-Myc抗体で免疫沈降した。前記タンパク質を、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。そして前記膜を抗HA抗体でプローブした。タンパク質分子量マーカーを、パネルの右に示す。
【図３】Snow1タンパク質は、CBFプロモータの異なる部分に結合する。(A)Snow1タンパク質とCBF1プロモータの部分との間の相互作用。(A)Snow1タンパク質とCBF2プロモータの部分との間の相互作用。(A)Snow1タンパク質とCBF3プロモータの部分との間の相互作用。使用した異なる断片を、各パネルの最上部に示す。
【図４−１】Snow1は核局在型の転写活性化因子であり、その過剰発現はCBF3発現を増加させる。(A)核におけるGFP-Snow1タンパク質の局在。パネルは、GFP-Snow1トランスジェニック植物の根細胞における共焦点イメージを示す。(B)CBF3-LUCおよび35S-Snow1および／または35S-Ice1でのトランスフェクション後の、相対ルシフェラーゼ活性。各トランスフェクション後に得られた値を標準化するため、Renillaのルシフェラーゼに関する遺伝子を内部コントロールとして使用した。ルシフェラーゼ活性は、Renillaルシフェラーゼ(Ohta et al.  2001に記載のように)の活性に対する、任意ユニット（arbitrary units）で表される。
【図４−２】Snow1は核局在型の転写活性化因子であり、その過剰発現はCBF3発現を増加させる。(A)核におけるGFP-Snow1タンパク質の局在。パネルは、GFP-Snow1トランスジェニック植物の根細胞における共焦点イメージを示す。(B)CBF3-LUCおよび35S-Snow1および／または35S-Ice1でのトランスフェクション後の、相対ルシフェラーゼ活性。各トランスフェクション後に得られた値を標準化するため、Renillaのルシフェラーゼに関する遺伝子を内部コントロールとして使用した。ルシフェラーゼ活性は、Renillaルシフェラーゼ(Ohta et al.  2001に記載のように)の活性に対する、任意ユニット（arbitrary units）で表される。
【図５】A.  実生のイメージおよび野生型およびSnow1過剰発現株(#7)のルミネッセンス。イメージは、冷温12h処理後であった。B.  冷温ストレスの間の野生型およびSnow1過剰発現株(#4、7&15)からのルミネッセンス強度の定量化。
【図６】Snow1過剰発現系統#7および#10における、Snow1およびCBF3転写物の定常状態レベル。使用された系統を右に示す。冷温ストレス処理（00 C）を、最上部に示す。アクチンを、内在性コントロール（endogenous control）として使用した。
【図７】Snow1  T-DNA系統の分析。(A)Snow1遺伝子におけるT-DNA統合の図。(B)遺伝子ノックアウトを、ホモ接合性の(#28)及びヘテロ接合性の(#30)T-DNA系統のRT-PCRにより確認した。WT-野生型、チューブリンを、内部コントロールとして使用した。(C)コントロールおよび冷温ストレスの条件下での、野生型(WT)およびホモ接合性のT-DNA系統(#28)におけるCBF遺伝子のレベル。
【図８】Snow1のホモ接合性過剰発現およびT-DNA系統のイオン漏出（Ion-leakage）。順化、同様に、非順化の植物の葉を冷温ストレス処理した後、伝導率（Conductivity）を測定した。(A)Snow1過剰発現株の伝導率。(B)Snow1  T-DNA株の伝導率。
【図１】
2007507227.tif 000003
【図２−１】
2007507227.tif 000004
【図２−２】
2007507227.tif 000005
【図３】
2007507227.tif 000006
【図４−１】
2007507227.tif 000007
【図４−２】
2007507227.tif 000008
【図５】
2007507227.tif 000009
【図６】
2007507227.tif 000010
【図７】
2007507227.tif 000011
【図８】
2007507227.tif 000012
【配列表】
2007507227000001.app
【国際調査報告】
2007507227.tif 000013
2007507227.tif 000014
2007507227.tif 000015
2007507227.tif 000016