(57)【要約】  本発明は、プロバイオティック微生物、とりわけ乳酸菌およびビフィズス菌が豊富な食用オリーブ、それを含有する食品、およびその調製方法に関する。本発明のオリーブおよび食品は、胃腸管に対して有益な作用を発揮するのに充分な量の微生物を提供し、動物由来のプロバイオティック食品、とりわけミルク誘導体の投与が不可能な場合にとりわけ有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌（lactobacilli）および/またはビフィズス菌（bifidobacteria）を果皮上に付着して含有することを特徴とする食用オリーブ。
【請求項２】
前記乳酸菌が、Lactobacillus rhamnosusおよびL. paracaseiから選択され、前記ビフィズス菌が、Bifidobacterium bifidumおよびB. longumから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のオリーブ。
【請求項３】
前記乳酸菌が、Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103；L. rhamnosus IMPC 11；L. rhamnosus IMPC 19；Lactobacillus paracasei LMG P-22043；Lactobacillus paracasei IMPC 4.1から選択され、前記ビフィズス菌が、Bifidobacterium bifidum ATCC15696およびBifidobacterium longum ATCC15708から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のオリーブ。
【請求項４】
前記乳酸菌が、ベルギー・コーディネイティッド・コレクションズ・オブ・ミクロオーガニズムズ（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）に受託番号LMG P-22043で寄託されたLactobacillus paracasei株に属することを特徴とする、請求項３に記載の食用オリーブ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の食用オリーブを含むプロバイオティック食品。
【請求項６】
食用オリーブの果皮を被覆するための乳酸菌およびビフィズス菌の使用。
【請求項７】
ベルギー・コーディネイティッド・コレクションズ・オブ・ミクロオーガニズムズ（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）に受託番号LMG P-22043で寄託されたLactobacillus paracasei。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティック食品、すなわち、健康に対して、とりわけ胃腸管に対して有益な効果を有する微生物を含有する食品に関する。
【発明の背景】
【０００２】
プロバイオティック食品は、一般的に、腸に到達し腸内ミクロフローラに対して平衡作用を発揮するのに十分多量の生きた活性な微生物を含有する発酵食品である。
【０００３】
プロバイオティクスの摂取は、有益な微生物の増殖を刺激し、病原体の量を低減し、体の自然防御を強化する。プロバイオティック細菌、とりわけ乳酸菌およびビフィズス菌は、腸内フローラの平衡を維持するのを助け（Salminen S., et al. Int. Dairy J. 8: 563-572, 1998; Saarela M., L. et al., Int. J. Food Microbiol. 2002, 78: 99-117）、病原体を防御し（Drago L., M. R. et al., FEMS Microbiol. Letters, 1997, 153: 455-463およびCross M. L. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002, 34: 245-253）、これにより胃腸疾患のリスクを低減する。実際、腸内ミクロフローラが変化したとき、プロバイオティック細菌の投与は、その正常な平衡を再度確立するだけでなく、微生物バランスおよび内生フローラの特性を改良する。食物アレルギーおよび不耐性の予防におけるプロバイオティクスの役割は、なお研究中である（Isolauri E., et al., Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73 (suppl.): 444s-450s; Jahreis G., et al. Food Res. Int. 2002, 35: 133-138）。
【０００４】
プロバイオティック細菌は、ヒトの栄養摂取のための食品、とりわけ発酵乳、たとえばヨーグルトに導入される。プロバイオティック食品の製造に関する問題の一つは、菌株の特性、とりわけ細胞の生存能力、完全性および集団安定性に関する製造技術の影響である（Mattila-Sandholm T., et al. Int. Dairy, 2002 J. 12: 173-182）。液体および冷凍培養物が過去において主に使用されたが、それらの製造、輸送および保存コストは高い。凍結乾燥培養物が現在広まっているが、細胞はしばしば損傷を受け、長期間保存することはできない。実際、凍結乾燥細胞は、嫌気条件で生存し、再水和により生存能力は元の状態に戻る。この処理は、細胞全ての生存を保証しないだけでなく、生存した細胞が代謝的に変化し、胃液酸度に耐えられないこともある。濃縮された単回投与（monodose）細胞培養物も広まっている。この場合、最大の困難性は、高い細胞濃度、すなわち約1010(UFC)/gに達することである。従って、現在入手可能なプロバイオティクスのほとんどは、動物由来のものであり、とりわけ乳製品、たとえばヨーグルト、チーズ、デザート、アイスクリームである。しかし、乳製品の消費量は、ミルクおよびその誘導物に対するアレルギーまたは不耐性により制限され得る。また、ミルク発酵細菌に対する菌株関連の感受性、ｐＨ、温度および酸素濃度による、発酵乳製品に（プロバイオティクスで主に使用される）ビフィズス菌を導入する困難性も知られている（Gobbetti M. et al. J. Dairy Sci. 1998, 81: 37-47）。
【０００５】
プロバイオティック脱水フルーツは、プロバイオティック微生物に浸漬したフルーツを真空乾燥することにより実験的スケールで得られるが（Betoret N., et al. J. Food Engin. 2003, 56: 273-277）、プロバイオティック細菌を含有するオート麦ベースの製品およびフルーツジュースの幾つかが、既に市場で入手可能である（Johansson et al. Int. J. Food Microbiol., 1998, 42: 29-38）。
【０００６】
また、上述の製品のすべてが、開封後すぐに消費されなければならないことに注意すべきである。
【０００７】
したがって、アレルギーも不耐性も引き起こすことなくプロバイオティック細菌を投与可能であり、かつ開封後に長期間保存できる食品を提供することが有利であるはずである。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本発明は、プロバイオティック細菌を含有する食用オリーブに基づくプロバイオティック食品に関する。
【０００９】
第一の態様において、食品は、その果皮がラクトバチルス属（Lactobacillus）およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の微生物、とりわけプロバイオティック乳酸菌（lactobacilli）およびビフィズス菌（bifidobacteria）で被覆された食用オリーブから成る。好ましくは、乳酸菌は、Lactobacillus rhamnosusおよびLactobacillus paracaseiから選択され、ビフィズス菌は、Bifidobacterium bifidumおよびBifidobacterium longumから選択される。更に好ましくは、微生物は、以下のものから選択される：Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103；L. rhamnosus IMPC 11；L. rhamnosus IMPC 19；Lactobacillus paracasei IMPC 2.1（ベルギー・コーディネイティッド・コレクションズ・オブ・ミクロオーガニズムズ（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）、BCCM/LMG-コレクション、ヘント、ベルギーに受託番号LMG P-22043で寄託されている）；Lactobacillus paracasei IMPC 4.1；Bifidobacterium bifidum ATCC15696およびBifidobacterium longum ATCC15708。
【００１０】
本発明のオリーブは、食用オリーブを所望の微生物の懸濁液中に室温（約25℃）で保持することにより調製することができ、これにより、5×105〜5×108 UFC/グラムの範囲の量で微生物が果皮上に付着しているオリーブを得ることができる（3ヶ月保存後の評価、表１および２参照）。
【００１１】
本発明の食用オリーブは、そのまま消費されることもできるし、あるいは本発明の更なる態様であるプロバイオティック食品の調製のために使用することもできる。
【００１２】
本発明のオリーブおよびプロバイオティック食品は、腸の障害を治療または予防するため、または抗生物質治療後に腸内フローラを回復するための有効な手段である。
【００１３】
L. paracasei IMPC 2.1が豊富なオリーブは、この微生物の顕著なプロバイオティック特性、好気条件および嫌気条件の両方で増殖し果皮に付着する能力だけでなく、胃液および胆汁酸塩に対する抵抗性のために、特に有益である。L. paracasei IMPC 2.1は、新規微生物であり、本発明の更なる態様である。
【００１４】
ビフィズス菌は、発酵乳製品中でほとんど増殖、生存しないことが知られているため、ビフィズス菌を組み込むことができる可能性も特に重要である。
【００１５】
本発明のオリーブおよびそれを含有する食品は、食品夾雑物により引き起こされる疾患を予防または治療するため、胃腸疾患に罹患した旅行者において、抗生物質治療の作用促進剤として、より一般的には身体の免疫防御を増大させることが必要な状況において、特に有効である。
【００１６】
オリーブは、便利な投与、非冷蔵条件での保存（室温で90日後に細菌総数は１×105〜7.6×107 UFC/グラムの範囲である）、並びに官能的特性のおかげで、プロバイオティック細菌の迅速な投与が必要なときにいつでも、ラクトース不耐性のヒトによっても消費することができる。更なる利点は、パッケージ内容物（すなわち塩水（brine）でなくオリーブ）の一部のみの消費が、ヨーグルトまたは濃縮培養物により提供されるものに相当する用量のプロバイオティック細菌を提供することである。
【００１７】
最後に、微生物が液体媒質に再懸濁されている動物または植物由来のプロバイオティック食品に対して、細菌細胞が固定されているオリーブの場合、胃腸管への有効で安全な輸送が保証されることに注意しなければならない。更に、大量の脂肪を含有する製品に結合させることにより、微生物は胃液に対して抵抗することができる。
【実験のセクション】
【００１８】
例１−オリーブ果皮上でのプロバイオティック細菌の生存能力
以下の菌株の食用オリーブ果皮のコロニー形成および生存を評価した：Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103、L. rhamnosus IMPC 11およびIMPC 19、Lactobacillus paracasei IMPC 2.1およびIMPC 4.1、Bifidobacterium bifidum ATCC15696およびBifidobacterium longum ATCC15708。
【００１９】
Lactobacillus paracasei IMPC 2.1は、ベルギー・コーディネイティッド・コレクションズ・オブ・ミクロオーガニズムズ（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）、BCCM/LMG-コレクション、ヘント、ベルギーに受託番号LMG P-22043で寄託された。
【００２０】
試験は、前もって苦味を除去し食用に処理された、種なしブラックオリーブおよび完全なブラックオリーブで行った。同じ試験を、フレッシュまたは半完成のグリーンおよびブラックオリーブ、および苦味を除去し処理されたグリーンオリーブ（完成品）で行った。
【００２１】
菌株の生存能力は、280 mlのオリーブ独自の塩水またはNaCl 4%±フルクトース0.2÷1%、pH 6.5に浸漬した80オリーブを含有する瓶を用いて評価した。
【００２２】
手法。オリーブ独自の塩水に浸漬したブラックオリーブ（完成品）に、4×109〜9×1011(UFC)の各菌株を含有する細菌懸濁液を添加した。接種後、オリーブを、ネジ蓋で閉じられた無菌の瓶の中に置いた。コントロールとして、非接種のオリーブを瓶の中に置いて使用した。サンプルを室温（約25℃）で3ヶ月間保存し、その後ｔ＝1、15、30および90で、各サンプルから4つのオリーブを採取し、細菌のカウントに用いた。塩水を完全に除去し、オリーブに20 ml 0.85% NaClおよび0.025% Tween 80を添加し、2時間激しく攪拌して、果皮から細菌を引き離した。得られた懸濁液を、乳酸菌のカウントのために寒天基質に播いた。その結果を以下の表に報告する。
【表１】
2007512823.tif 000002
【表２】
2007512823.tif 000003
【００２３】
実験はすべて2回繰り返し、関連のばらつきは観察されなかった。
【００２４】
激しい再懸濁の手法により実証されるとおり、果皮は、細菌をしっかりと固着し、摂取後のゆっくりとした放出を保証する。とりわけ、細菌の添加から30日後に分析したサンプルから、Tweenを添加した生理溶液中で2時間激しく攪拌することにより、約106× UFC/gが回収され；その後3回洗浄した後も（同じ条件でそれぞれ1時間）、約105、104および103 UFC/9 gがなお果皮に付着していた。
【００２５】
同様の粘着性が、細菌の添加から7日後または90日後に採取したサンプルで観察された。
【００２６】
例２−Lactobacillus paracasei IMPC 2.1（基準菌株）の選択
Lactobacillus paracasei IMPC 2.1は、健康な成人の被検体から、糞便中107 UFC/gの細菌集団で単離された。
【００２７】
菌株の遺伝的同定
Y2/PARAプライマーを用いた種特異的PCR（図１）を第一の同定ステップとして行った。Y2は、ユーバクテリア（eubacteria）のユニバーサルプライマーであり、PARAはL. paracaseiの特異的プライマーである。IMPC 2.1は、L. paracasei種に典型的な290 bpの増幅バンドを示した。
【００２８】
確認分析として、Sau 3AIを制限酵素として用いたARDRAを行い；このケースでもL. paracaseiの予測される制限プロファイルが得られた（図２）。
【００２９】
L. paracasei IMPC 2.1は、以下の実験により実証されるとおり、ブタの腸粘液、非生物的表面および果皮にしっかりと付着することができ、胆汁酸に対して高い抵抗性を有する。
【００３０】
ブタの腸粘液への付着
ブタの腸粘液への付着に関するインビトロ試験を、インビボでの付着を評価するために、Schou, et al. (APMIS 1999, 107: 493-504) の方法に従って、以下のとおり部分的に改変して行った。
【００３１】
ブタの粘液（Tipe II, Sigma）でコーティングした96ウェルプレートに、滴定量の（titred）細菌懸濁液（100μl, PBSバッファー）を播いた。37℃で2時間、揺り動かしてインキュベーションした後、プレートをPBSで3回洗浄し、粘液をウェルから機械的に除去し、その後、その洗浄液および粘液をプレートに播いた。図３は、3回洗浄後の粘液に付着するL. paracasei IMPC 2.1のSEM画像を報告する。
【００３２】
試験に使用したL. paracasei菌株を、カウントの結果（滴定量の細菌懸濁液中のUFCに対する最終工程の粘液上のUFCのパーセンテージ比）とともに以下に記載する。
【００３３】
１）IMPC 2.1＝40%
２）IMPC CV1＝37%
３）IMPC 4.1＝10%
４）IMPC 1.3＝40%
５）IMPC 1.5＝33%
６）IMPC 1.4＝35%
７）Chr.Hansen Lc1＝39%
８）IMPC CLV1＝38%
９）ATCC 10863＝18%
IMPC 2.1は、より多く付着する菌株の一つである。
【００３４】
胆汁酸に対する抵抗性
L. paracasei菌株の抵抗性を、Oxgallウシ胆汁酸を種々の濃度で含有するMRS培地（De Man et al., J. Appl. Bacteriol., 1960, 23: 130-135）を用いて評価した。最初の試験は、0.2、0.3、0.4％ Oxgallを用いて行った：これら条件において、菌株は、濃度が増大すると、僅かに増殖の減少を示した。600 nmで光学密度（OD）を測定することにより増殖を評価した。
【表Ａ】
2007512823.tif 000004
以下の工程において、（胆汁酸）濃度は0.7%まで増大させた。
【表Ｂ】
2007512823.tif 000005
IMPC 2.1は、胆汁酸に対して優れた抵抗性を示す菌株の一つであることが分かった。
【００３５】
塩分濃度抵抗性
種々のNaCl濃度に対する菌株の抵抗性を評価するためにMRS培地を使用した。このケースでも、600 nmで光学密度（OD）を測定することにより増殖を評価した。
【表Ｃ】
2007512823.tif 000006
高い増殖速度が2% NaClを用いても観察されたため、更に高い濃度で試験を行った。
【表Ｄ】
2007512823.tif 000007
IMPC 2.1は、優れた塩分濃度抵抗性を示す菌株の一つであることが分かった。
【００３６】
擬似胃液に対する抵抗性（UFC/ml）
擬似胃液に対する菌株の抵抗性を、MRS培地で培養した種々の菌株を用いて評価した。培養物を無菌食塩水で洗浄し、同体積の擬似胃液（NaCl, 125 mM-1；KCl, 7 mM-1；NaHCO3, 45 mM-1およびペプシン, 3 gr l-1）に添加し、HClを用いてpHを2に調整した。その後、蠕動をまねるために、懸濁液を室温で攪拌しながら（200 rev min-1）インキュベートした。時間0、90分後、150分後に一部を採取し、MRS寒天上でカウントした。
【表Ｅ】
2007512823.tif 000008
IMPC 2.1は、擬似胃液に対して優れた抵抗性を示す菌株の一つであることが分かった。
【００３７】
非生物的表面への付着
菌株が腸粘膜にコロニーを形成するのに必要な付着能力を、非生物的表面に対する付着試験（Tuomola et al., Int. J. Food Microbiol., 2000, 41: 45-51）により評価した。菌株をMRS培地で、37℃で48時間、嫌気条件下で培養した。その後、培養物をMRSで1:40に希釈し、200μlの一部を96ウェルのポリスチレンプレートに播いた。24時間37℃でインキュベートした後、ウェルをダルベッコのリン酸バッファー（DPBS, pH 7.3）で静かに洗浄し、乾燥させ、クリスタルバイオレット溶液を添加して細胞を染色した。余分な色素をエタノール−アセトン（80：20 v/v）で洗い流し、その後光学密度（DO）を自動読取り装置で測定した。DO値に基づいて、細胞を4つの付着クラスに分けた：付着なし（AC1, OD≦0.5）、弱い付着（AC2, 0.5＜OD≦1.2）、中程度の付着（AC3, 1.2＜OD≦2.0）、および強い付着（AC4, OD＞2.0）（表３）。
【００３８】
菌株の付着能力に対する酵素処理、物理的処理および化学的処理の効果を評価するため、定常期の初期（6時間増殖）の細菌培養物に、種々の温度および時間の処理を行い、その後、付着の変化を評価した。付着特性を以下の表に報告する。その結果より、菌株の付着特性は、物理的処理、化学的処理および酵素処理によって一般に大きくは変化しないことがわかる。
【表３】
2007512823.tif 000009
【００３９】
果皮への付着
図４は、果皮上へのL. paracasei IMPC 2.1の固着および分布を示す（表１および２も参照）。
【００４０】
例３−胃腸管におけるL. paracasei IMPC 2.1の存続
実験１
二人の健康な成人被検体に、全体で3×1010および6×1010 UFCのL. paracasei IMPC 2.1をそれぞれ含有する、完全に水分を除去した5オリーブ（被検体1）および10オリーブ（被検体2）を一部ずつ7日間与えた。被検体の腸内フローラの組成を、投与開始時（タイム0）、投与から7日後（t=7）、投与終わりから3日後にモニターした。それぞれのサンプリング時に、各被検体からの1 gの糞便を、9 mlのAmies媒質に添加し、ホモジナイズし、10進法希釈し、これを12μg/ml Rogosa±バンコマイシン基質上に播き、37℃で48時間、嫌気条件下で培養した。
【表４】
2007512823.tif 000010
【００４１】
二人の被検体の腸内乳酸菌集団において対数の約2サイクルの増加が観察され；投与の停止後に、被検体１では約2.5サイクルの予測される減少が観察され、被検体２では約1サイクルの予測される減少が観察された。
【００４２】
実験２
二人の健康な成人被検体（ＡおよびＢ）に、約109 CFUのL. paracasei IMPC 2.1を含有する10オリーブを一部ずつ与えた。腸内ミクロフローラを、実験１に記載の手法に従って、実験開始時（タイム0）、当該プロダクトの毎日の消費から10日後（t=10）、投与終わりから7日後にモニターした。結果を以下の表に報告する。
【００４３】
両実験で単離されたコロニーに、分子同定を行い（例２参照）、これにより、L. paracasei IMPC 2.1が二人の被検体に存在し、被検体の腸にコロニーを形成することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Y2/PARAプライマーを用いてL. paracasei IMPC 2.1に対して種特異的PCRを行った結果を示す図。
【図２】ARDRAによるL. paracasei IMPC 2.1同定の結果を示す図。
【図３】ブタの腸粘液へのL. paracasei IMPC 2.1の付着を示す写真図。
【図４】果皮上へのL. paracasei IMPC 2.1の付着を示す写真図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2007512823.tif 000015
2007512823.tif 000016
2007512823.tif 000017