(57)【要約】本発明は、免疫応答を抑制または促進する物質を同定する方法、および同定法に使用するキットを提供する。本発明の方法は、CD26とカベオリン-1との間の相互作用を阻害または増強する物質を検出する段階を含む。別の方法は、カベオリン-1とTollipとの間の相互作用を阻害または増強する物質を検出する段階を含む。さらに別の方法は、カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用を阻害または増強する物質を検出する段階を含む。本発明はまた、カベオリン-1またはTollipに対するsiRNAなどの免疫応答を抑制する物質を含む免疫調節剤にも関する。本発明はさらに、免疫応答を促進する物質を含む免疫調節剤を提供する。これらの薬剤は炎症性疾患、自己免疫疾患、または他の免疫関連疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質がCD26シグナル伝達経路における因子間の相互作用を阻害するか否かを判定する段階を含む、動物における免疫応答を抑制する物質を同定する方法。
【請求項２】
物質が以下を阻害するか否かを判定する段階を含む、請求項1記載の方法：
（a）CD26とカベオリン-1との間の相互作用；
（b）カベオリン-1とTollipとの間の相互作用；または
（c）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用。
【請求項３】
相互作用がタンパク質：タンパク質結合である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
相互作用が、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、アフィニティクロマトグラフィー、蛍光顕微鏡検査、およびツーハイブリッドアッセイ法からなる群より選択される1つもしくは複数のアッセイ法によって判定される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
物質が、以下を阻害するか否かを判定する段階を含む、請求項1記載の方法：
（a）カベオリン-1のリン酸化；
（b）IRAK-1のリン酸化；
（c）NF-κBの活性化；または
（d）CD86発現の増強。
【請求項６】
細胞または細胞抽出物に物質を接触させる段階を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
細胞がT細胞または単球である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
細胞が、CD26シグナル伝達経路における因子を組換えにより発現する、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
細胞がレポーター遺伝子を含み、そのレポーター遺伝子の発現がCD26シグナル伝達経路における因子に反応する、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
物質が物質のライブラリーの一部である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
CD26シグナル伝達経路における少なくとも1種類の因子のレベルまたは機能を決定するために使用してもよい少なくとも1種類の薬剤を含む、動物における免疫応答を抑制する物質を同定するためのキット。
【請求項１２】
物質が以下を阻害するか否かを判定するための少なくとも1種類の薬剤を含む、請求項15記載のキット：
（a）CD26とカベオリン-1との間の相互作用；
（b）カベオリン-1とTollipとの間の相互作用；
（c）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用；
（d）カベオリン-1のリン酸化；
（e）IRAK-1のリン酸化；
（f）NF-κBの活性化；または
（g）CD86発現の増強。
【請求項１３】
動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防するための薬物の製造における、CD26シグナル伝達経路を阻害する免疫調節剤の使用。
【請求項１４】
免疫調節剤が以下を阻害する、請求項13記載の使用：
（a）CD26とカベオリン-1との間の相互作用；
（b）カベオリン-1とTollipとの間の相互作用；
（c）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用；
（d）カベオリン-1のリン酸化；または
（e）IRAK-1のリン酸化。
【請求項１５】
免疫調節剤が低分子干渉RNA（siRNA）である、請求項13記載の使用。
【請求項１６】
siRNAがカベオリン-1またはTollipを標的とする、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
siRNAが配列番号：6、配列番号：7、配列番号：9、または配列番号：10の配列を含む、請求項16記載の使用。
【請求項１８】
追加的な治療薬を投与する段階をさらに含む、請求項13〜17のいずれか一項記載の使用。
【請求項１９】
免疫抑制を必要とする疾患が自己免疫疾患、炎症性疾患、または移植拒絶である、請求項13〜18のいずれか一項記載の使用。
【請求項２０】
CD26シグナル伝達経路を阻害する免疫調節剤、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
免疫調節剤がsiRNAである、請求項20記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
siRNAがカベオリン-1またはTollipを標的とする、請求項21記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
siRNAが配列番号：6、配列番号：7、配列番号：9、または配列番号：10の配列を含む、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
カベオリン-1またはTollipを標的とするsiRNA。
【請求項２５】
siRNAが配列番号：6、配列番号：7、配列番号：9、または配列番号：10の配列を含む、請求項24記載のsiRNA。
【請求項２６】
CD26シグナル伝達経路における因子間の相互作用を阻害する物質を、処置を必要とする動物に投与する段階を含む、動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防する方法。
【請求項２７】
物質が、CD26シグナル伝達経路における因子間の相互作用を増強するか否かを判定する段階を含む、動物における免疫応答を促進する物質を同定する方法。
【請求項２８】
物質が以下を増強するか否かを判定する段階を含む、請求項27記載の方法：
（a）CD26とカベオリン-1との間の相互作用；
（b）カベオリン-1とTollipとの間の相互作用；または
（c）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用。
【請求項２９】
物質が以下を増強するか否かを判定する段階を含む、請求項27記載の方法：
（a）カベオリン-1のリン酸化；
（b）IRAK-1のリン酸化；
（c）NF-κBの活性化；または
（d）CD86発現の増強。
【請求項３０】
CD26シグナル伝達経路における少なくとも1種類の因子のレベルまたは機能の決定に使用可能な少なくとも1種類の薬剤を含む、動物における免疫応答を促進する物質を同定するためのキット。
【請求項３１】
物質が以下を増強するか否かを判定するための少なくとも1種類の薬剤を含む、請求項30記載のキット：
（a）CD26とカベオリン-1との間の相互作用；
（b）カベオリン-1とTollipとの間の相互作用；
（c）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用；
（d）カベオリン-1のリン酸化；
（e）IRAK-1のリン酸化；
（f）NF-κBの活性化；または
（g）CD86発現の増強。
【請求項３２】
動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防する薬物の製造における、CD26シグナル伝達経路を増強する薬剤の使用。
【請求項３３】
薬剤が以下を増強する、請求項32記載の使用：
（a）CD26とカベオリン-1との間の相互作用；
（b）カベオリン-1とTollipとの間の相互作用；
（c）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用；
（d）カベオリン-1のリン酸化；または
（e）IRAK-1のリン酸化。
【請求項３４】
CD26シグナル伝達経路を増強する薬剤、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項３５】
CD26シグナル伝達経路における因子間の相互作用を増強する物質を、処置を必要とする動物に投与する段階を含む、動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節剤を同定する方法に関する。本発明はまた、免疫調節剤およびこれらの使用にも関する。特に本発明は、免疫調節物質を含む薬学的組成物、および免疫応答に関連する疾患を治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の機能は、生命現象を理解する上で最も重要な生物学的機能系の1つである。元来、自己と非自己を識別する免疫系は、組織構造をとらず、複雑かつダイナミックなプロセスによって生体の維持を制御する1兆個を超える細胞が関与する生物学的防御機構である。しかしながら、複雑さ、精緻であるがゆえに、その機能の破綻は治療が困難な疾患を含む様々な疾患をもたらす。感染症における炎症反応、組織破壊を伴う自己免疫疾患における炎症反応、および臓器移植手術での拒絶における炎症反応を理解することは重要である。
【０００３】
炎症の第1段階における細胞内への抗原の侵入は非特異的に、または抗体や補体の受容体を介して生じる。細胞に取り込まれた抗原はプロセシングを受けてペプチド断片になり、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIの分子との複合体としてT細胞に提示される。これらの抗原提示細胞（APC）には、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、末梢血中の単球など（いわゆるプロフェッショナルAPC）がある。補助受容体分子CD80およびCD86の発現レベルの差、および産生されるサイトカインの種類の違いによって、その後のヘルパーT細胞（Th細胞）の分裂に偏りが生じる。IL-4の影響下で液性免疫に主に関与するTh2型は、インターロイキン-12（IL-12）の影響下で細胞性免疫に大きな役割を果たすTh1型に対し優性である。このように、一次エフェクター細胞が活性化されるか、または抗体産生が誘導されるかして感作が確立される。同時に、記憶T細胞および記憶B細胞が生じる。一次エフェクター細胞には、Th1細胞をはじめ、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、マスト細胞、単球、マクロファージ、好塩基球、好中球、NK細胞、血小板が含まれる。一次エフェクター細胞の活性化により生じたサイトカイン、ケモカイン、化学メディエーターなどの作用は、炎症領域の血管内皮細胞を活性化する。単球、マクロファージ、好中球、好酸球などの二次エフェクター細胞の活性化が誘導されて炎症が生じる。最終的に炎症反応は、起因物質の貪食、または炎症領域におけるFas/Fas-Lによるエフェクター細胞のアポトーシス、またCTLA-4やFcγRIIBなどによる免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif：ITIM）の抑制性シグナルの伝達によって抑制される。
【０００４】
自己免疫疾患の発症機構は依然不明であるが、上記のプロセスの原因が存在する可能性のあるのはどこかについて研究は進められている。臓器移植後の拒絶や移植片対宿主病（GVHD）において、炎症の誘導は異種抗原の侵入によって明瞭に引き起こされるという事実にもかかわらず、こうした疾患は未だ完全に制御できてはいない。
【０００５】
上述のTh細胞やCTL細胞のほかに、自己抗体産生や、補体、サイトカインなどの多様なエフェクター機能が、自己免疫疾患や拒絶反応、GVHDなどの免疫異常を引き起こす組織破壊を伴う炎症反応に寄与する。疾患の治療において、これらのエフェクター機能を制御するために、いくつかの免疫抑制療法が試みられている。標的となるT細胞の多く、したがって免疫異常症の制御の中心的存在は、エフェクターT細胞の制御となりつつある。したがって、炎症のエフェクター細胞としてのT細胞の研究は、免疫異常症の治療に極めて重要であると言える。
【０００６】
以上のことをふまえて、発明者らはCD26の研究に注目した。CD26陽性T細胞は、炎症領域に極めて容易に移動するサブセットであるTh1型の細胞である。これらは関節リウマチなどの自己免疫疾患、および拒絶やGVHDなどの免疫異常症に寄与し、また患部に蓄積することが知られている。したがって、CD26陽性T細胞に関する理解が進むことで、より病態特異的な治療法の確立が可能となる。
【０００７】
CD26は、広く分布する、766アミノ酸からなる110 kDaの細胞表面糖タンパク質であり、細胞外ドメインに既知のジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV、EC3.4.14.5）活性を有する（Morimoto, et al., 1998; von Bonin et al., 1998）。この酵素は、L-プロリンまたはL-アラニンのいずれかを有するアミノ末端のジペプチドを最後から2番目の位置で切断可能である。CD26の発現は、静止期のT細胞の活性化後に増強される。またCD4+CD26high T細胞は、破傷風トキソイドなどの記憶抗原に最も強く反応する（Morimoto, et al., 1989）。DPPIVの酵素活性が免疫応答に役割を果たすことを示す証拠は増えている（Oravecz et al., 1997; Iwata, et al., 1999）。CD26およびCD3と、固相の固定されたモノクローナル抗体（mAb）との架橋により、ヒトCD4+ T細胞またはCD26のcDNAをトランスフェクトしたジャーカットT細胞株のいずれかによるT細胞の共刺激とIL-2の産生を誘導できる（Tanaka, et al., 1992; Fleischer, et al., 1994）。また、T細胞を抗CD26抗体で処理すると、その内在化を介してCD26の表面発現の減少に至り、またこのような調節は、抗CD3刺激または抗CD2刺激に対する増殖応答の増強、ならびにCD3ζやp56-Lckなどのシグナル伝達分子のチロシンリン酸化の増強を招く（Hegen, et al., 1997）。またDPPIVの酵素活性は、CD26を介するT細胞の共刺激に必要である（Tanaka, et al., 1993）。最近の報告では、架橋後におけるCD26の内在化には、マンノース-6-リン酸/インスリン様成長因子II受容体（M6P/IGF-IIR）が部分的に関与すること、およびCD26とM6P/IGFIIRの相互作用がCD26によって誘導されるT細胞の共刺激に役割を果たすことが明らかにされている（Ikushima, et al., 2000）。
【０００８】
最大のT細胞活性化には、MHCペプチド複合体によってもたらされる抗原（Ag）特異的な刺激と共刺激シグナルの両方が必要である（Lenschow, et al., 1996）。T細胞表面のCD28が、抗原提示細胞（APC）上で発現されるB7-1（CD80）またはB7-2（CD86）と結合すると強力な共刺激シグナルが生じる（Yokochi, et al., 1982; Azuma, et al., 1993; Freeman, et al., 1993; Lenschow, et al., 1996; McAdam, et al., 1998）。CD28とB7の相互作用は、T細胞の増殖、分化、およびサイトカイン分泌につながる（McAdam, et al., 1998; Chambers, 2001）。これとは対照的に、活性化T細胞上のCTLA-4と、B7-1またはB7-2の結合はT細胞応答の阻害につながる（Croft, et al., 1992; Walunas, et al., 1994; Krummel, et al., 1995）。しかしながら、構成的に発現されるのはCD28だけであるため、CD28はT細胞免疫応答の発生に重要な役割を有する（Fraser, et al., 1992; Caux, et al., 1994; Hathcock, et al., 1994; Yi-qun, et al., 1996; Hakamada-Taguchi, et al., 1998; Manickasingham, et al., 1998）。
【０００９】
組換え型の可溶性CD26（rsCD26）は、可溶性抗原である破傷風トキソイド（TT）による刺激に対する末梢血リンパ球（PBL）の増殖応答を増強すると報告されている（Tanaka, et al., 1994）。さらに最近の報告では、rsCD26の標的細胞が末梢血中のCD14陽性単球であること、およびrsCD26がCD86の発現を増強する可能性があるが、単球上のCD80またはHLA-DR抗原のレベルを上昇させないことが実証されている（Ohnuma, et al., 2001）。M6P/IGF-IIRは、CD26とAPCの相互作用のためのプラットフォーム分子の1つであると考えられている。しかしながら、DPPIV陽性とDPPIV陰性のrsCD26のいずれもがM6P/IGF-IIRを介して単球に取り込まれた一方で、DPPIV陽性のrsCD26のみが、単球上におけるCD86の発現増強作用を示した。この結果は、別の因子がCD26と相互作用して、単球上におけるCD86の発現増強を直接誘導し得ることを示唆している。また、記憶抗原に対するCD4+CD26high T細胞の最大応答の分子機構は未だ明らかではない。
【００１０】
カベオリン-1は、カベオラの主要コートタンパク質であり、その骨格ドメインと様々な様々な細胞内の重要なシグナル伝達分子との結合を介してシグナル伝達に調節因子として関与する（Smart, et al., 1999; Peiro, et al., 2000; Carver, et al., 2003）。CD26は、線維芽細胞様滑膜細胞のカベオラに存在するが（Riemann, et al., 2001）、その直接的な結合またはシグナル伝達は免疫系細胞では示されていない。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の目的の1つは、CD26と相互作用して単球上におけるCD86の発現増強を直接誘導する分子を提供することである。
【００１２】
発明者らは、CD86の発現の増強に直接関与するCD26相互作用分子の同定を試み、APC上にCD26が結合したカベオリン-1が存在することを明らかにし、またCD26/DPPIVのポケット構造を形成するCD26中の残基201〜211位と残基630位のセリン触媒部位が（Rasmussen, et al., 2003）、カベオリン-1の骨格ドメインとの結合に寄与することを確認した。APC上におけるCD26とカベオリン-1の結合後に、カベオリン-1はリン酸化され、Toll相互作用タンパク質（Tollip）をカベオリン-1から細胞質ゾル内へと放出する。またカベオリン-1からのTollipの放出は、活性化NF-κBと結合するIRAK（インターロイキン-1受容体（IL-1R）結合セリン/トレオニンキナーゼ）のリン酸化と、これに続くCD86の発現増強と、後のT細胞上におけるCD28分子との結合を引き起こした。CD86の発現増強は、強力なT細胞-APC相互作用を招き、これは局所的な活性化記憶T細胞の発生と、免疫応答の活性化、および結果としての様々な炎症性疾患につながった。また発明者らは、カベオリン-1がAPC中でTollipおよびIRAK-1と同時に結合することを明らかにした。
【００１３】
発明者らは本明細書で、一連のCD26およびカベオリン-1の欠失変異体を用いてCD26がカベオリン-1に直接結合すること、またカベオリン-1がCD26との結合後にリン酸化されることを報告する。カベオリン-1は、細胞質側のN末端ドメインと細胞質側のC末端ドメインを有する膜内在型タンパク質であると報告されている（Smart, et al., 1999）。図2Aに示すように、カベオリン-1のN末端ドメインは、破傷風トキソイドを負荷した12〜24時間後に単球の細胞表面で発現された。破傷風トキソイドはカベオラ経由で細胞内に輸送されるので（Montesano, et al., 1982; Pelkmans, et al., 2002）、カベオリン-1は、APC中で生じるペプチド-MHC複合体とともに輸送される可能性があり、またT細胞との接触に関与する抗原プロセシング機構によって細胞表面で発現される可能性がある（Grakoui, et al., 1999; Turley, et al., 2000）。図2Cのデータから、活性化記憶T細胞上のCD26が、T細胞とAPCの相互作用の免疫学的シナプスであることが明らかになった接触領域において、TTを負荷した単球上のカベオリン-1に直面することがわかる。抗原負荷単球上におけるCD26とカベオリン-1の相互作用がCD86の発現増強を招き、これによりT細胞上におけるCD86とCD28の後の相互作用を高めて抗原特異的なT細胞の増殖および活性化を誘導すると考えられる。
【００１４】
CD26/DPPIVの結晶構造を調べることで、残基201〜207位の水平方向のらせんの位置が、630位のセリン残基のDPPIVの酵素活性部位の前面であると決定された。この小さな水平方向の空隙は、基質となるアミノ酸が、活性部位である630位のセリン残基に達すること、またCD26のDPPIV活性に関与することを可能とする（Rasmussen, et al., 2003）。この点に関しては、水平方向の空隙は、カベオリン-1との結合ならびにDPPIVの酵素活性に不可欠な役割を有する。特に、この空隙が破壊されたCD26変異体del 201-211およびS630Aは、カベオリン-1との結合能力を失い（図1G、1H、3A、および3B）、また単球上におけるCD86の発現増強に対して影響を及ぼさなかった（Ohnuma, et al., 2001）。またCD26とカベオリン-1の結合は、DPPIVの競合阻害剤であるバリン-ピロリジドによって阻害された（図1Hのm、n、o）。バリン-ピロリジド（Val-Pyr）は、DPPIVの酵素活性部位内の小さい方のポケットに結合し（Rasmussen, et al., 2003）、またCD26の水平方向のらせん内の2つのグルタミン酸（Glu205とGlu206）は、Val-Pyrの遊離のアミノ基との間に塩橋を形成する。したがってVal-Pyrは、酵素の空隙に対するアミノ酸の接近をブロックする。以上の知見は、DPPIVの酵素活性を欠くCD26が、TTが関与するT細胞増殖の増強、ならびにCD86の発現増強を誘導できない可能性があることを示す以前の研究を説明する。
【００１５】
本発明で示す興味深い特徴は、カベオリン-1が単球内でTollipと結合することである（図3B〜H）。TollipがIL-1R/Toll様受容体が介在するシグナル伝達に関与すること、またこれがIRAKをNF-κB、JNK、およびp38 MAPキナーゼに関連づけることが以前に報告されている（Cao, et al., 1996; Burns, et al., 2000）。TollipがToll様IL-1R/Toll様受容体およびIRAK複合体と結合すること、またこの複合体からTollipを除去することにより、活性化IRAKを解放して下流のTRAF6と結合させることによってシグナル伝達の継続が可能になることも報告されている（Zhang, et al., 2002）。IRAKは、カベオリン-1とTollipの複合体中には検出されないが、CD26とカベオリン-1は結合しており、またカベオリン-1は接触領域に集合し、カベオリン-1のリン酸化がこれに続いた。リン酸化されたカベオリン-1は次に、おそらく構造変化のためにTollipを放出し、また細胞質中に見出されたTollipは次にIRAKと結合してリン酸化される。発明者らは今回、カベオリン-1とTollipがIRAK-1と複合体を形成して3連構造体を形成することを明らかにした（図7A、C、およびD）。
【００１６】
発明者らは次に、CD26とカベオリン-1の相互作用後の、ヒトCD86遺伝子の発現調節における同遺伝子の5'側隣接領域の役割を探索した。CD86遺伝子の転写部位の上流の1.3キロ塩基対の断片のクローニングおよび機能解析から、CD26とカベオリン-1の相互作用後のCD86の発現増強には2か所のNF-κB結合部位が必要なことがわかった（図4C）。また、CD26で刺激した、TTを負荷した単球の転写因子アッセイ法では、NF-κB（p50およびp65）のレベルは、STAT-1またはAP-1（c-Fos、c-Jun）のレベルより有意に高いことがわかった（図4A）。この点に関しては、IFNγ、TNFα、またはCD40-CD154の連結などの他の複数の因子がCD86の発現増強に関与することも報告されている（Berberish, et al., 1994; Li, et al., 1999; Gordon, 2002）。
【００１７】
単球中のカベオラの喪失は、カベオリン-1ノックアウトマウスモデルでは報告されておらず（Drab, et al., 2001）、またヒトにおけるCD26の役割および分布はマウスとは異なる可能性があるので（Morimoto, et al., 1998）、発明者らはRNAi法により、精製ヒト単球中における天然のカベオリン-1の機能を直接解析した。過去数年間にRNAiは、哺乳類細胞で、配列特異的な短い（19〜22ヌクレオチド）2本鎖RNAとともに極めて有効に用いられることが明らかとなっている（Elbashir, et al., 2001）。この方法は、哺乳類遺伝子の機能の同定に役立つが、重要な限界の1つは、siRNAをベースとする方法では、標的タンパク質の「ノックアウト」ではなく「ノックダウン」しか提供されない点である。カベオリン-1は、単球のほかに内皮、線維芽細胞、および脂肪細胞などを含む他のヒト組織で構成的に発現されており、精製ヒト単球をsiRNAで処理すると、カベオリン-1はノックアウトされ、またCD26をコーティングしたビーズによる刺激後のCD86の発現増強は阻害された（図5A〜D）。単球中で、Tollipに対するsiRNAは、CD26によって誘導される、TTを負荷したT細胞の増殖を低下させた（図8BおよびC）。したがって、発明者らの得た知見は、カベオリン-1とTollipが単球におけるCD86の発現増強に直接関与することを強く示唆する。
【００１８】
発明者らの得た結果、そして過去に報告された知見を元に、発明者らは、CD26とカベオリン-1の相互作用によって引き起こされる、単球におけるシグナル伝達を説明するモデルを提案する（図6A）。このモデルでは、カベオリン-1は、破傷風トキソイドの単球中への輸送後に細胞表面に露出され、またCD26は、T細胞-APC接触領域で発現されるカベオリン-1の凝集およびリン酸化、Tollipの除去、ならびにこれに続くIRAKリン酸化を誘導する。一連の現象により、NF-κBの活性化とCD86遺伝子の転写が可能となる。最終的に、CD86の発現の誘導と、単球上のCD86とT細胞上のCD28の相互作用は、抗原特異的なT細胞の活性化および増殖をもたらす。別のモデル（図9）では、Tollipは、CD26による刺激後にIRAK-1をカベオリン-1に動員してIRAK-1を放出し、CD86の発現増強を引き起こす。T細胞とAPCの局所的な相互作用および免疫応答（図6B）に関して、カベオラを介した記憶抗原のAPC内への侵入は、MHCクラスIIの分子上における抗原ペプチドの提示、およびカベオリン-1の露出をもたらす。次にAPCは、TCRや共刺激分子（CD86/CD80-CD28など）を介して記憶T細胞の活性化を誘導し、成熟した免疫学的シナプスの形成をもたらす。APC上のカベオリン-1と記憶T細胞上のCD26との結合後、APC表面におけるCD86の発現は増強され、続いて記憶T細胞が、TCRの活性化の増強におけるCD26の共刺激作用によって活性化される（Hegen, et al., 1997）。CD26とカベオリン-1の相互作用によってTCR活性化が増強されることによって、免疫学的シナプスの寿命が延長する可能性がある（Huppa, et al., 2003）。
【００１９】
関節リウマチ、多発性硬化症、およびグレーブス病などの自己免疫疾患を患う患者は、炎症組織ならびに末梢血中のCD26high T細胞数が増加していることがわかっている（Hafler, et al., 1985; Eguchi, et al., 1989; Mizokami, et al., 1996）。また、これらの自己免疫疾患におけるCD26の発現の増強は、疾患の重症度と相関する可能性がある。こうした知見は、CD26high T細胞が、以上の疾患における炎症プロセスおよび続く組織損傷に役割を果たすことを意味する。内皮細胞でカベオリン-1の骨格ドメインを阻害すると、カベオリン-1と結合していたeNOS（endotherial nitric oxide synthase）を阻害することで炎症が緩和された（Bucci, et al., 2000）。本発明は、活性化された記憶T細胞とAPCの相互作用に直接干渉することによる、自己免疫疾患または他の免疫性疾患の新たな治療法を提供する。また、CD26のポケット構造とカベオリン-1の骨格ドメインの相互作用を標的とすることは、免疫応答を増強するための戦略として、免疫性疾患でだけでなく、癌の免疫療法やウイルス予防接種についても、抗原特異的な免疫応答を調節する作動物質または拮抗物質を利用する新規な治療法に繋がる可能性がある。
【００２０】
1つの局面では、本発明は、免疫応答を抑制または促進する物質を同定する方法、およびこの方法に使用するキットを提供する。本発明の方法は、CD26とカベオリン-1との間の相互作用、特にCD26のポケット構造とカベオリン-1の骨格ドメインとの間の相互作用を阻害する物質を検出する段階を含む。別の方法は、カベオリン-1とTollipとの間の相互作用、特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用を阻害または増強する物質を検出する段階を含む。さらに別の方法は、カベオリン-1、Tollip、およびIRAK間の相互作用、特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用、および/またはTollipのCUEドメインとIRAK-1のCTドメインとの間の相互作用を阻害もしくは増強する物質を検出する段階を含む。
【００２１】
本発明は、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤にも関する。本明細書で使用される「免疫調節剤」という用語は、阻害物質、強化物質、拮抗物質、および作動物質を含む。CD26シグナル伝達経路を阻害する免疫調節剤は、カベオリン-1に対するsiRNA、またはTollipに対するsiRNAを活性成分として含んでもよい。このような活性成分は、上述の同定法で得られる物質の場合もある。
【００２２】
また本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、または他の免疫性疾患を治療するための免疫調節剤の使用を提供する。
【００２３】
本明細書で用いる、「1つの」、および「その」という用語は、特に明記しない限り、「少なくとも1つ」を意味する。
【００２４】
本発明の1つの局面は、物質が、免疫系に対するCD26の刺激作用を調節することにより動物における免疫応答を調節するか否かを判定する方法を含む。この局面は、物質が、CD26の任意の作用、またはCD26のシグナル伝達経路の任意の下流因子を調節するか否かを判定する方法を含む。1つの態様では、物質がCD26シグナル伝達経路における因子間の相互作用を阻害するか否かを判定する段階を含む、動物における免疫応答を抑制する物質を同定する方法を提供する。1つの態様では、物質がCD26とカベオリン-1との間の相互作用、特にCD26のポケット構造とカベオリン-1の骨格ドメインとの間の相互作用を阻害するか否かを判定する方法を提供する。別の態様では、物質がカベオリン-1とTollipとの間の相互作用、特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用を阻害するか否かを判定する方法を提供する。他の態様では、物質がカベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用、特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用、および/またはTollipのCUEドメインとIRAK-1のCTドメインとの間の相互作用を阻害するか否かを判定する方法を提供する。1つの態様では、このような方法は、複数の物質を試験するスクリーニングアッセイである。別の態様では、物質のライブラリーを試験する。
【００２５】
タンパク質間の相互作用またはシグナル伝達の阻害剤を同定する、当技術分野で周知の任意の方法を本発明では使用することができる。タンパク質相互作用（例えば結合）の検出に有用な手法は当技術分野で周知であり、また免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、ツーハイブリッドシステム、蛍光顕微鏡検査、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない。これについては例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd Edition, (2000)を参照されたい。タンパク質相互作用アッセイは、細胞全体、細胞抽出物、または単離タンパク質を対象に実施することができる。対象タンパク質（例えば、CD26、カベオリン-1、Tollip、IRAK-1、NF-κB、CD86）を発現する任意の細胞を使用することができる。このような細胞は、上記の様なタンパク質を天然の状態で（例えばT細胞や単球などの免疫系細胞）、または組換え的に発現する可能性がある。細胞は、樹立細胞株（例えば、ジャーカットT細胞、THP-1単球）、新たに作製された細胞株、または被験者（例えばヒト）から単離された細胞の場合がある。単離されたタンパク質を必要とするアッセイに関しては、タンパク質は、天然のタンパク質、または組換えによって発現されたタンパク質でもよい。このようなタンパク質は、真核細胞または原核細胞で組換えによって発現させることができる。タンパク質は、当技術分野で常用されている精製法、例えば免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーで単離することができる。アッセイで使用されるタンパク質は、野生型のタンパク質の場合があるほか、1つもしくは複数の付加、欠失、または置換を含む変異体の場合がある。完全長のタンパク質、または相互作用ドメインを含む切断型タンパク質を使用することができる。例えば、カベオリン-1の骨格ドメイン（アミノ酸残基82〜101位）を使用することができる。同様に、カベオリン結合コンセンサスモチーフ（アミノ酸残基201〜211位）、およびアミノ酸残基630位を含むCD26のポケット構造を使用することができる。TollipのC2ドメイン（アミノ酸残基47〜178位）を使用することもできる。タンパク質は、精製や同定に有用なタグ、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ヘマグルチニン、Flag、または1個もしくは複数のヒスチジンを含むように修飾することができる。
【００２６】
阻害活性を調べる方法の試験対象となり得る物質には、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、オリゴヌクレオチド、天然物、有機分子、抽出物、およびこれらの物質のライブラリーが含まれるがこれらに限定されない。
【００２７】
物質がタンパク質：タンパク質結合に及ぼす作用は、当技術分野で周知の任意の方法で調べることができる。物質は、CD26シグナル伝達経路における任意の結合相互作用、例えばCD26とカベオリン-1の結合、特にCD26のポケット構造とカベオリン-1の骨格ドメインの結合、カベオリン-1からのTollipの放出、TollipとIRAK-1の結合、またはカベオリン-1とIRAK-1の結合、特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の結合、および/またはTollipのCUEドメインとIRAK-1のCTドメインとの間の結合をブロックする能力に関して試験し得る。
【００２８】
適切なアッセイの例は、例えば、対象タンパク質に特異的な抗体を使用して、対象タンパク質およびこれに結合する任意のタンパク質を細胞抽出物から沈殿させる免疫沈降法である。例えば、GST結合CD26またはカベオリン-1タンパク質を単球または単球抽出物に添加した後に、抗GST抗体を用いて沈殿させることができる。沈殿したタンパク質を次に電気泳動で分離し、GST結合タンパク質とともに沈殿した任意のタンパク質をウェスタンブロッティングで同定する。物質がタンパク質の免疫沈降をブロックすることが可能であれば、タンパク質と抗体結合タンパクの結合に対する阻害作用を有することがわかる。
【００２９】
タンパク質：タンパク質結合の解析に使用され得る別のアッセイはアフィニティクロマトグラフィーである。対象タンパク質は、適切な支持材料に結合させることができる。適切な支持材料（例えばセファロースビーズ）およびリンカーは当技術分野で周知である。対象タンパク質は、それ自体が支持材料に結合した結合相手と結合させてもよい（例えば、アデノシンデアミアーゼを結合させたセファロースビーズに結合するCD26）。抽出物中のタンパク質が結合タンパク質と結合可能となるように、結合させたタンパク質を次に細胞抽出物に接触させる。非結合タンパク質を洗浄して除いた後に、対象タンパク質と結合して残っている任意のタンパク質を溶出して、例えばウェスタンブロッティングまたはペプチドマスフィンガープリンティング法で同定することができる。物質が、タンパク質と、その結合タンパク質との結合をブロックできれば、タンパク質と対象タンパク質の結合の阻害作用を有することがわかる。
【００３０】
別の適切なアッセイはツーハイブリッドシステムである。この細胞ベースのアッセイでは、1つの対象タンパク質（例えばCD26）を、転写活性化ドメインを有する融合タンパク質として調製し、第1の対象タンパク質と結合する第2の対象タンパク質（例えばカベオリン-1）をDNA結合ドメインを有する融合タンパク質として調製する。2つの対象タンパク質が相互に結合すると、転写活性化ドメインとDNA結合領域が近接することになり、DNA結合ドメインによって認識される調節エレメントに連結されたレポーター遺伝子の発現を変化させる。物質が2つの対象タンパク質の結合をブロックすることができ、それによりレポーター遺伝子の発現を変化させれば、2つの対象タンパク質の結合に対する阻害作用を有することが明らかとなる。
【００３１】
タンパク質の結合に加えて、CD26のシグナル伝達経路に関する他の種類のアッセイが本発明に含まれる。そのようなアッセイは、カベオリン-1またはIRAK-1のリン酸化を検出する段階を含む。これらのタンパク質のリン酸化型および非リン酸化型に特異的な抗体は市販されている（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA; BD Transduction, Santa Cruz, CA）ほか、さらに当技術分野で周知の常用の手法で作製することができる。このような抗体を使用して、細胞全体、細胞抽出物、または精製タンパク質および他の成分を含む溶液中の各タンパク質のリン酸化型および非リン酸化型のレベルを検出することができる。物質が、CD26シグナル伝達経路の活性化に応答してカベオリン-1またはIRAK-1のリン酸化をブロック可能であれば、CD26シグナル伝達に対する阻害作用を有することがわかる。
【００３２】
CD26シグナル伝達経路におけるDNA結合および遺伝子活性化に関連するアッセイを使用することもできる。CD26経路の刺激は、NF-κBの活性化およびCD86（B7-2）の発現の増強の活性化につながる。NF-κBのDNA結合（例えばレポーター遺伝子コンストラクト中に1つもしくは複数のNF-κB応答エレメントを含むポリヌクレオチドに対するNF-κBの結合）活性の活性化を検出するアッセイを、CD26シグナル伝達の阻害剤の同定に使用することができる。例えばアッセイは、CD26で刺激した抗原提示細胞に由来する核抽出物と、1つもしくは複数のNF-κB応答エレメントを含むオリゴヌクレオチドをDNA結合アッセイに用いて実施することができる。全細胞アッセイを使用することもできる。例えば、CD86遺伝子の上流の調節領域は2つのNF-κB応答エレメントを含む。CD86の上流領域を含むレポーター遺伝子コンストラクトを使用し、レポーター遺伝子の発現の変化を検出することによって、CD26経路刺激後のNF-κBの活性化の阻害剤を同定することができる。当技術分野で既知の任意の適切なレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびβ-ガラクトシダーゼを使用することができる。物質が、レポーター遺伝子の発現の上昇を阻害できれば、CD26シグナル伝達に対する阻害作用を有することがわかる。
【００３３】
CD26シグナル伝達に応答した、NF-κBタンパク質またはその2つのサブユニット（p50とp65）のレベルの上昇を、CD26経路の阻害剤の同定に使用することもできる。物質が、p50およびp65のレベルの上昇を阻害できれば、CD26シグナル伝達に対する阻害作用を有することがわかる。
【００３４】
例えば、CD26経路が刺激された細胞全体におけるCD86の発現の測定を、CD26シグナル伝達経路の阻害剤の同定に使用することができる。このような細胞は、天然の状態でCD86を発現する可能性があるほか、CD86遺伝子を含む組換え型ベクターを含む場合がある。物質が、CD86の発現の上昇を阻害できれば、CD26シグナル伝達に対する阻害作用を有することがわかる。
【００３５】
相互作用タンパク質（例えばカベオリン-1やTollip）の共存は、生細胞で検出可能な配列を融合したタンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質）を細胞にトランスフェクトすることで、生細胞において調べることができる。物質が、CD26経路の相互作用タンパク質の共存をブロック可能であれば、CD26シグナル伝達に対する阻害作用を有することがわかる。
【００３６】
細胞間相互作用の検出を含むアッセイを使用することもできる。例えば、CD26を発現するT細胞とカベオリン-1を発現する抗原提示細胞（例えば単球）の相互作用は、CD26とカベオリン-1との間の相互作用の阻害剤を同定する方法として検出することができる。活性化T細胞と、抗原を負荷した単球を混合し、コンジュゲートを形成させ、蛍光標識抗体で染色し、CD26およびカベオリン-1の細胞の接触領域への動員を共焦点レーザー顕微鏡で検出することができる。活性化T細胞と抗原を負荷した抗原提示細胞との相互作用を模倣するために、可溶性のCD26またはCD26をコーティングしたビーズを細胞に接触させることで抗原提示細胞を刺激することができる。物質が、細胞の接触領域へのCD26およびカベオリン-1の動員をブロック可能であれば、CD26シグナル伝達に対する阻害作用を有することがわかる。
【００３７】
本発明の1つの局面では、CD26シグナル伝達経路の調節因子を同定するためのキットを提供する。ある態様では、CD26とカベオリン-1との間の相互作用（特にCD26のポケット構造とカベオリン-1の骨格ドメインとの間の相互作用）を阻害もしくは増強する物質、カベオリン-1とTollipとの間の相互作用（特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用）を阻害もしくは増強する物質、またはカベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用（特にカベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用、および/またはTollipのCUEドメインとIRAK-1のCTドメインの結合を阻害もしくは増強する物質の同定に使用可能なキットを提供する。本キットを、CD26シグナル伝達経路における少なくとも1種類の因子、例えばCD26、カベオリン-1、Tollip、IRAK-1、NF-κB、またはCD86のレベルもしくは機能を決定するために使用することができる。この態様では、キットを、CD26シグナル伝達経路における少なくとも1種類の因子のレベルまたは機能の決定に使用可能な少なくとも1種類の薬剤を含む1つもしくは複数の容器とともに提供する。薬剤には、CD26、カベオリン-1、Tollip、IRAK-1、NF-κB、もしくはCD86から選択される1種類もしくは複数のタンパク質、タンパク質断片、またはハイブリッドタンパク質；CD26、カベオリン-1、Tollip、IRAK-1、NF-κB、もしくはCD86から選択されるタンパク質、タンパク質断片、またはハイブリッドタンパク質をコードする1つもしくは複数の核酸；CD26、カベオリン-1、Tollip、IRAK-1、NF-κB、もしくはCD86から選択されるタンパク質、タンパク質断片、またはハイブリッドタンパク質に特異的に結合する1種類もしくは複数の抗体；レポーター遺伝子コンストラクト、または細胞などが含まれるがこれらに限定されない。他の様々な態様では、本キットは例えば、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質もしくは核酸の安定剤を含むこともできる。本キットは、薬剤の検出に必要な成分（例えば酵素や基質）を含むこともできる。本キットは、分析および被験試料と比較可能な対照試料または一連の対照試料を含むことができる。このキットの個々の成分は通常、個別の容器に包装されており、また様々な容器の全てが1つのパッケージに、同定アッセイを実施するための指示書と共に納められている。
【００３８】
本発明の1つの局面は、CD26シグナル伝達経路を阻害もしくは増強する治療的有効量の免疫調節剤を動物に投与する段階を含む、動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防する方法である。本発明の別の局面は、CD26シグナル伝達経路を阻害もしくは増強する治療的有効量の免疫調節剤、および1種類もしくは複数の治療薬を動物に投与する段階を含む、動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防する方法である。前記治療薬は、現在使用されているものか、過去に使用されたものか、または免疫応答に関連する疾患の治療、改善、もしくは予防に有用なことが分かっているものである。本発明の1つの態様は、動物における免疫応答に関連する疾患を治療する、改善する、または予防するための薬物の製造におけるCD26シグナル伝達経路を阻害する免疫調節剤の使用を含む。本発明の好ましい態様では、このような疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、急性もしくは慢性のGVHD（移植片対宿主病）、または移植拒絶である。
【００３９】
本明細書に記載された方法は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー-皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少症紫斑病、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、1型または免疫性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多内分泌腺症候群、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、進行性全身性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎、脈管炎などの血管炎、白斑、ならびにヴェーゲナー肉芽腫症を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患の治療または改善に有用である。
【００４０】
本明細書に記載された方法は、喘息、脳炎、炎症性腸疾患（例えばクローン病や潰瘍性大腸炎）、慢性閉塞性肺疾患、炎症性骨溶解、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症（例えば特発性肺線維症）、炎症性血管炎（例えば結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎、およびリンパ腫様肉芽腫）、外傷後の血管形成（例えば血管形成術後の再狭窄）、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、慢性肝炎、および慢性のウイルス感染もしくは細菌感染に起因する慢性炎症を含むがこれらに限定されない炎症性疾患の治療または改善に有用である。
【００４１】
本明細書に記載された方法は、肝移植拒絶、腎移植拒絶、骨移植拒絶、皮膚移植拒絶、心臓移植拒絶、輸血拒絶反応、および眼移植拒絶を含むがこれらに限定されない、急性もしくは慢性のGVHD（移植片対宿主病）、または移植拒絶の治療、改善、もしくは予防に有用である。
【００４２】
本明細書に記載される、「免疫応答に関連する疾患」という用語は、身体の免疫応答に起因する疾患（disorder）または疾患(disease)を意味する。特定の態様では、免疫応答に関連する疾患は、異常な、または制御不能のT細胞が媒介する応答に起因する疾患である。別の特定の態様では、このような疾患は、異常な、または制御不能のB細胞が媒介する応答に起因する。
【００４３】
本明細書で用いる、「CD26シグナル伝達経路を阻害する免疫調節剤」という用語は、免疫応答を弱めたり、除去したり、または妨げたりするように、CD26経路の因子群が関与する任意のシグナルまたは相互作用に干渉する任意の薬剤を意味する。
【００４４】
本明細書で用いる、「治療的有効量」という用語は、疾患の1つもしくは複数の症状の改善をもたらしたり、疾患の進行を防いだり、または疾患の退縮をもたらしたりするのに十分な治療薬の量を意味する。例えば、炎症性疾患または炎症を特徴とする自己免疫疾患の治療に関して、治療的有効量は好ましくは、関節、臓器、または組織の炎症を少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%緩和する治療薬の量を意味する。乾癬の治療に関しては、治療的有効量は好ましくは、ヒトの乾癬部重症度指標（PASI）スコアを少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%低下させる治療薬の量を意味する。あるいは乾癬の治療に関しては、治療的有効量は好ましくは、ヒトの総合評価スコア（global assessment score）を少なくとも25%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%改善する治療薬の量を意味する。関節リウマチの治療の場合は、治療的有効量は好ましくは、ヒトの疾病活動度スコア（DAS）を少なくとも20%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%低下させる治療薬の量を意味する。全身性エリテマトーデスの治療に関しては、治療的有効量は好ましくは、ヒトの全身性エリテマトーデス活動度尺度（Systemic Lupus Activity Measure：SLAM）スコアを少なくとも20%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%低下させる治療薬の量を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる、「移植拒絶」という用語は、レシピエントの免疫系による、遺伝的に非同一な組織、臓器、または移植の拒絶を意味する。
【００４６】
本明細書で用いる、「治療する」、「治療」、および「治療中の」という用語は、1種類もしくは複数の治療薬の投与に起因する免疫応答に関連する疾患に関連する1つもしくは複数の症状の改善を意味する。ある態様では、これらの用語は、1か所もしくは複数の関節の腫脹の緩和、またはこのような疾患を有する動物への1種類もしくは複数の治療薬の投与に起因する免疫性疾患に関連する疼痛の緩和を意味する。他の態様では、これらの用語は、ヒトのPASIスコア、DASスコア、またはSLAMスコアの低下を意味する。他の態様では、これらの用語は、ヒトの総合評価スコアの改善を意味する。
【００４７】
本明細書で用いる、「防ぐ」、「予防する」、および「予防」という用語は、動物における免疫応答に関連する疾患に由来する病態の発生率の低下を意味する。予防は例えば、動物における免疫応答に関連する疾患に起因する病態が全て消失するときに完了し得る。予防はまた、動物における免疫応答に関連する疾患に起因する病態の発生率が、本発明なしに生じる可能性のある場合に満たないといった、部分的な場合もある。
【００４８】
本明細書で用いる、「相乗的」という用語は、第1の薬剤と第2の薬剤を一緒に（例えば同じ時間に、または相次いで）投与したときに得られる作用が、第1の薬剤と第2の薬剤を個別に投与した時の相加作用よりも大きいことを意味する。相乗効果は、第1の薬剤および/または第2の薬剤の低用量の投与を可能とするか、または同じ用量でより大きな有効性もたらす。得られる相乗効果は、第1の薬剤および第2の薬剤を個別に投与した時の相加作用よりも少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも175%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、または少なくとも500%大きい場合がある。
【００４９】
本発明の1つの局面では、CD26シグナル伝達経路における因子を標的とする低分子干渉RNA（siRNA）分子である免疫調節剤を提供する。siRNAは、標的遺伝子の配列に相補的で、この遺伝子にコードされたタンパク質の発現を阻害する2本鎖RNA分子である。遺伝子発現を阻害するためのsiRNAの合成および使用は当技術分野で周知である。これについては例えば、米国特許第6,506,559号、およびElbashir, et al., 2001を参照されたい。1つの態様では、siRNAは、AA型（N19）（Nは任意のヌクレオチド）の標的遺伝子のオープンリーディングフレームに由来する配列を含む。配列は、対称な2本鎖を生じるように、2'-デオキシチミジン（dTdT）の2ヌクレオチドの3'オーバーハングをさらに含んでもよい。1つの態様では、カベオリン-1を標的とするsiRNAを提供する。特定の態様では、カベオリン-1を標的とするsiRNAは、配列番号：6または配列番号：7の配列からなる。1つの態様では、Tollipを標的とするsiRNAを提供する。特定の態様では、Tollipを標的とするsiRNAは、配列番号：9または配列番号：10の配列からなる。
【００５０】
CD26シグナル伝達経路における因子（例えばカベオリン-1やTollip）を標的とするsiRNAは、標的因子の発現を阻害することによるCD26経路の研究に使用することができる。siRNAはまた、上記の免疫性疾患の治療に使用することもできる。
【００５１】
本発明の免疫調節剤は、上述の同定法により得られる物質であってもよい。このような物質には、バリン-ピロリジドなどのDPPIV阻害剤、およびフィリピン（filipin）などのカベオラ輸送阻害剤が含まれる。
【００５２】
本発明の免疫調節剤は、化合物の細胞内への取り込みを増強するために担体分子に結合させてもよい。このような担体分子の例としては、Fulda et al., Nature Med. 8:808 (2002), Arnt et al., J. Biol. Chem. 277:44236 (2002)、およびYang et al., Cancer Res. 63:831 (2003)に記載されているような担体ペプチド、膜融合性ペプチド（例えば米国特許第5,965,404号を参照）、ならびにウイルス、および空のキャプシドやウイルスヘマグルチニンなどのウイルスの一部（例えば米国特許第5,547,932号を参照）が挙げられる。他の担体分子としては、アシアロ糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質受容体と結合する；米国特許第5,166,320号を参照）などの細胞表面受容体のリガンド、およびT細胞に特異的な抗体、例えば抗CD4抗体などの細胞表面受容体に対する抗体が挙げられる（米国特許第5,693,509号）。
【００５３】
本発明の範囲に含まれる組成物には、本発明の免疫調節剤を、意図した目的を達成するために有効な量で含むあらゆる組成物が含まれる。個々のニーズは様々なものの、各成分の有効量の最適範囲の決定は当技術分野の範囲内にある。実際の用量および治療計画は、当技術分野の医師であれば、投与経路、被験対象の年齢、体重、および健康状態、ならびに疾患の段階、そして言うまでもなく薬剤の任意の副作用、薬剤の効力を考慮し、かつ慣例的な医学上の手順および実践に準じて容易に決定できる。典型的には、哺乳類（例えばヒト）に対し、薬剤は、疾患の治療対象の動物の体重につき1日あたり0.0025〜50 mg/kgの用量で、または薬学的に許容されるその塩を同等量経口投与することができる。好ましくは、疾患を治療する、改善する、または予防するためには、約0.01〜約10 mg/kgを経口投与する。筋肉内注射の場合は、用量は一般に経口用量の約半分である。例えば、適切な筋肉内用量は、約0.0025〜約25 mg/kgであり、最も好ましくは約0.01〜約5 mg/kgであると考えられる。
【００５４】
単位経口用量は、約0.01〜約50 mg、好ましくは約0.1〜約10 mgの各薬剤を含み得る。単位用量は、それぞれが約0.1〜約10 mgの薬剤、また好都合には約0.25〜50 mgの薬剤を含む1個もしくは複数の錠剤またはカプセル剤として毎日1回もしくは複数回投与することができる。
【００５５】
免疫調節剤を、未修飾状態の化合物として投与することに加えて、本発明の薬剤は、化合物を薬学的に使用される調製物に加工しやすくする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に許容される担体を含めた薬学的調製物の一部として投与することができる。好ましくは、このような調製物、特に経口的または局所的に投与可能な調製物、ならびに錠剤、糖衣丸、除放性トローチ剤、およびカプセル剤、含漱剤および洗口液、ゲル、懸濁液、洗髪用リンス、ヘアージェル、シャンプーなどの好ましい型の投与に使用可能な調製物、ならびに坐剤などの直腸内に投与可能な調製物、ならびに注射による投与、局所投与、または経口投与に適した溶液は、約0.01〜99パーセント、好ましくは約0.25〜75パーセントの活性化合物を賦形剤とともに含む。
【００５６】
化合物およびこの薬学的組成物は、意図した目的を達成する任意の手段で投与することができる。例えば投与は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、舌下経路、髄腔内経路、頭蓋内経路、鼻腔内経路、または局所経路の場合がある。交互に、または同時に、投与は経口経路による場合がある。投与用量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、併用療法の種類（併用療法を実施する場合）、治療の頻度、および所望の作用の性質によって変動する場合がある。
【００５７】
本発明の薬学的調製物は、既知の手順で、例えば従来の混合、顆粒化、糖衣丸調製、溶解、または凍結乾燥過程によって製造される。したがって経口用の薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、また任意選択で、結果として得られる混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理し、錠剤または糖衣錠コアを得るために望ましいならば、または必要に応じて適切な補助剤を添加することで得られる。
【００５８】
適切な賦形剤は、特に糖類（例えば乳糖もしくはショ糖）、マンニトールもしくはソルビトール、セルロース調製物、および/またはリン酸カルシウム（例えばリン酸三カルシウムやリン酸水素カルシウム）などの充填剤、ならびにデンプンペースト（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンを使用）、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンなどの結合剤である。望ましいならば、上記のデンプン、またカルボキシメチルデンプンなどの崩壊剤に加えて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどの塩を添加することもできる。補助剤は特に、流動性調節剤および潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩（ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムなど）、および/またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、適切なコーティング（望ましいならば胃液に耐性を示すコーティング）を施して提供される。この目的では、任意選択でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよいある高濃度の糖溶液を使用することができる。胃液に耐性を示すコーティングを施すためには、フタル酸アセチルセルロースやフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース調製物の溶液を使用する。染料または色素は、例えば同定目的で、または活性化合物の用量の組み合わせの特徴を明らかにするために、錠剤もしくは糖衣錠コーティング剤に添加することができる。
【００５９】
経口的に使用可能な他の薬学的調製物には、ゼラチン製の押し込み型（push-fit）カプセル剤、ならびにゼラチンや可塑剤（グリセロールやソルビトールなど）から作られる軟性の密封カプセル剤などがある。押し込み型カプセル剤には、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、また任意選択で安定剤と混合可能な顆粒状の活性化合物を含めることができる。軟カプセル剤中では、活性化合物は好ましくは、脂肪油または液体パラフィンなどの適切な液体中に溶解しているか分散している。また安定剤を添加することができる。
【００６０】
直腸内に使用可能な薬学的調製物は例えば、1種類もしくは複数の活性化合物と坐剤基材の組み合わせからなる坐剤を含む。適切な坐剤基材は例えば、天然もしくは合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。また、活性化合物と基材の組み合わせからなるゼラチン製の経腸カプセル剤（rectal capsule）を使用することも可能である。可能な基材材料には例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素などが挙げられる。
【００６１】
非経口投与に適した製剤は、水溶性の形態、例えば水溶性の塩またはアルカリ性溶液中の活性化合物の水溶液を含む。また、油性注射用懸濁物に適切な活性化合物の懸濁液を投与することができる。適切な脂溶性の溶媒または媒質には、脂肪油（例えばゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはポリエチレングリコール-400が含まれる。水性の注射用懸濁物は例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁物の粘性を高める物質を含む場合がある。懸濁物は任意選択で安定剤も含む場合がある。
【００６２】
本発明の局所用組成物は好ましくは、適切な担体を選択することでオイル、クリーム、ローション、軟膏などとして製剤化される。適切な担体には、植物油や鉱油、白色石油（白色の軟パラフィン）、分岐鎖脂肪もしくはオイル、動物性脂肪、および高分子アルコール（C12を上回るもの）が含まれる。好ましい担体は、活性成分が可溶性である担体である。乳化剤、安定剤、保湿剤、および抗酸化剤、また望ましいならば色や香りをつける薬剤を含めることもできる。加えて、経皮浸透促進剤を、このような局所製剤に使用することができる。このような促進剤の例は、米国特許第3,989,816号および第4,444,762号に見られる。
【００６３】
クリームは好ましくは、鉱油、自己乳化性の蜜蝋、アーモンドオイルなどの少量のオイルに溶解した活性成分の混合物が混合された水の混合物から製剤化される。クリームの典型的な例は、水、蜜蝋、鉱油、およびアーモンドオイルを約40：20：40：1で含むクリームである。
【００６４】
軟膏は、アーモンドオイルなどの植物油中の活性成分の溶液を、温めた軟パラフィンと混合し、混合物を冷却することで製剤化可能である。軟膏の典型的な例は、重量で約30%のアーモンドオイルと70%の白色軟パラフィンを含む軟膏である。
【００６５】
本発明の併用療法は、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、およびCD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤とは作用機構が異なる少なくとも他の1種類の治療薬を含む。本発明の併用療法で使用可能なCD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤以外の治療薬の作用機構は、当技術分野で明らかにされている（例えば、Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics 10th Ed, Mc-Graw-Hill, New York, 2002；Physician's Desk Reference (PDR) 58th Ed., Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ (2004)(www.pdr.net)、およびemedicineのウェブサイトを参照）。本発明の併用療法はまた、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および相加効果または相乗効果を持たせるために、CD26シグナル伝達経路を阻害もしくは増強する免疫調節剤とともに機能することでCD26シグナル伝達経路を阻害もしくは増強する免疫調節剤の治療効果を改善する少なくとも1種類の他の治療薬も含む。CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤を、CD26シグナル伝達経路を阻害もしくは増強する免疫調節剤以外の1種類もしくは複数の治療薬の投与前（例えば0.5時間前、1時間前、2時間前、4時間前、6時間前、12時間前、24時間前、36時間前、48時間前、5日前、1週間前、2週間前、1か月前、またはこれより長期間前）に、投与後（例えば0.5時間後、1時間後、2時間後、4時間後、6時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後、5日後、1週間後、2週間後、1か月後、またはこれより長期間後）に、または同時に投与することができる。
【００６６】
本発明によれば、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤を、1種類もしくは複数の治療薬を組み合わせる際に有利に利用することができる。このような併用は、CD26シグナル伝達経路を阻害もしくは増強する免疫調節剤と他の治療薬の両方の投与に関連する有害な副作用を低減可能な場合がある。例えば、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤の投与により、免疫応答が関連する特定の疾患の治療または改善用の既知治療薬の1種類もしくは複数の用量の投与量について用量および/または頻度を少なくすることが可能である。
【００６７】
関節リウマチの治療または改善に使用される治療薬の例には、レミケード（Remicade）、コルチコステロイド、タクロリムス、ビスホスホネート、NSAID（例えばイブプロフェン、フェンプロフェン、インドメタシン、およびナプロキセン）、抗マラリア薬（例えばヒドロキシクロロキンおよびスルファサラジン）、アナキンラ（Anakinra）、アザチオプリン、エンブレル（Enbrel）、セレブレックス（Celebrex）、およびシクロホスファミドが含まれるがこれらに限定されない。クローン病の治療または改善に使用される治療薬の例には、スルファサラジン（アズルフィジン）、アミノサリチル酸、ステロイド（例えばプレドニゾン）、およびインフリキシマブが含まれるがこれらに限定されない。全身性エリテマトーデスの治療または改善に使用される治療薬の例には、NSAID、抗マラリア薬（例えばヒドロキシクロロキン）、コルチコステロイド、グルココルチコイド（例えばトリアムシノロン）、メトトレキセート、およびアザチオプリンが含まれるがこれらに限定されない。喘息の治療または改善に使用される治療薬の例には、コルチコステロイド（Azmacort、Vanceril、AeroBid、Flovent、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、およびヒドロコルチゾン）、ロイコトリエン阻害剤、アミノフィリン、ならびにテオフィリンが含まれるがこれらに限定されない。自己免疫性の肝炎の治療または改善に使用される治療薬の例には、コルチコステロイド（例えばプレドニゾン）、アザチオプリン、およびメルカプトプリンが含まれるがこれらに限定されない。移植拒絶の治療、改善、または予防に使用される治療薬の例には、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、Rapamune、コルチコステロイド、およびOKT2モノクローナル抗体が含まれるがこれらに限定されない。多発性硬化症の治療または改善に使用される治療薬の1例はIFN-β-1a（Avonex）である。
【００６８】
水疱性全身性エリテマトーデスの治療または改善に使用される治療薬の例には、ダプソン、コルチコステロイド（例えばプレドニゾンおよびトリアムシノロン）、およびメトトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。強皮症の治療または改善に使用される治療薬の例には、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート、シクロホスファミド、およびペニシラミンが含まれるがこれらに限定されない。壊疽性膿皮症の治療または改善に使用される治療薬の例には、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロランブシル、タクロリムス、免疫グロブリン、およびサリドマイドが含まれるがこれらに限定されない。円形脱毛症の治療または改善に使用される治療薬の例には、シクロスポリン、メトキサレン、アンスラリン、プロピオン酸クロベタゾール、プレドニゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、およびミノキシジルが含まれるがこれらに限定されない。白斑の治療または改善に使用される治療薬の例には、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メトキサレン、およびトリオキサレンが含まれるがこれらに限定されない。接触皮膚炎の治療または改善に使用される治療薬の例には、クロベタゾール、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ヒドロキシジン、ドキセピン、およびジスルフィラン（disulfiran）が含まれるがこれらに限定されない。乾癬の既知の治療の例には、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、シクロスポリン、アシトレチン、B紫外線光療法、光化学療法、局所コルチコステロイド（例えば、ジ酢酸ジフロラゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸ハロベタゾール、ジプロピオン酸ベタメタゾン、フルオシノニド、ハルシノニド、デソキシメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオシノロンアセトニド、フルランドレノリド、モメタゾンフロアート、ベタメタゾン、ジプロピオン酸アクロメタゾン、デソニド、およびヒドロコルチゾン）、ジスラノール（アンスラリン）、コールタール、サリチル酸、外用レチノイド（例えばタザロテン）、マクロライド系抗生物質（例えばタクロリムス）、抗CD3モノクローナル抗体、抗CD4モノクローナル抗体、抗CD11aモノクローナル抗体、抗IL-2Rαモノクローナル抗体、抗ICAM 1抗体、抗LFA1抗体、抗CD80モノクローナル抗体、CTLA4Ig、および皮膚軟化剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および本発明の併用療法の1種類もしくは複数の治療薬は、同時に、または連続して1剤ずつ動物に投与することができる。CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および本発明の併用療法の1種類もしくは複数の治療薬は周期的に投与することもできる。周期療法（cycling therapy）は、第1の治療薬の一定期間の投与と、これに続く第2の治療薬の一定期間の投与、およびこの一連の投与の繰り返し（すなわち、一方の薬剤の耐性の発現を減じ、一方の薬剤の副作用を避けたり減じたりし、および/または治療の有効性を改善するための周期）を含む。CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および本発明の併用療法の1種類もしくは複数の治療薬は、被験者に同時に投与することができる。「同時に」という用語は、正確に同時の治療薬の投与に限られず、むしろCD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および1種類もしくは複数の治療薬を、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤が他の薬剤とともに作用して、それ以外の投与様式では得られない利益の上昇をもたらすことが可能なように、連続的に、また時間間隔をおいて動物に投与することを意味する。CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および1種類もしくは複数の治療薬は個別に、任意の適切な形態で、また任意の適切な経路で投与することができる。好ましい態様では、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および1種類もしくは複数の治療薬を患者の同じ来院時に投与する。CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および併用療法用の1種類または複数の治療薬を同一の薬学的組成物として動物に投与することができる。あるいは、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および併用療法用の1種類もしくは複数の治療薬を動物に同時に、別個の薬学的組成物として投与することができる。CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および1種類もしくは複数の治療薬を同じ投与経路または異なる投与経路で動物に投与することができる。
【００７０】
CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤の投与は、1種類もしくは複数の治療薬の投与と同時に継続することができる。またCD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤の投与は、1種類もしくは複数の治療薬の投与以降も継続することができる。
【００７１】
本発明のある態様では、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤を投与する方法を、1種類もしくは複数の治療薬と組み合わせで少なくとも1回繰り返すことができる。この方法は、治療反応を達成または維持するために必要なだけ、例えば1回〜約10回もしくはこれ以上繰り返すことができる。この方法の各反復に関しては、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤、および1種類または複数の治療薬は、前回の反復で使用されたものと同じであっても、異なっていてもよい。加えて、CD26シグナル伝達経路を阻害または増強する免疫調節剤の投与の期間、および投与の様式は、反復毎に変わる場合がある。
【００７２】
ある態様では、本発明の治療用組成物または薬学的組成物を、疾患の症状の発現または診断の前もしくは後に投与する。例えば、本発明の薬学的組成物を臓器移植手術前に投与することができる。
【００７３】
本発明で治療可能な動物は、本発明の化合物の投与によって利益を得る可能性のある、あらゆる動物を含む。このような動物には、ヒト、イヌやネコなどのペット、およびウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物などが含まれる。
【００７４】
特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する用語と同じ意味をもつ。本明細書に記載された方法および材料に類似した、または同等の方法および材料を、本発明の実施もしくは検討に使用することができるが、適切な方法および材料について以下に述べる。本明細書に引用された任意の特許、特許出願、および出版物は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００７５】
実施のための最良の形態
以下の実施例が、本発明を説明するために、および当業者が本発明を作製および使用することを支持するために提示される。これらの実施例は、本発明の範囲をどんな形にせよ制限することは意図されていない。
【００７６】
（実施例1）一般的な方法
（1）ヒト単球の細胞株および単離
HEK293ヒト胚性腎臓、およびCOS-7サル線維芽細胞株を、10%ウシ胎仔血清（FCS）、100U/mlペニシリン（Life Technologies Inc., Grand Island, NY）、および100μg/mlストレプトマイシン（Life Technologies Inc.）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）中、5% CO2、37℃で成育させた。THP-1ヒト単球細胞株を、10% FCSおよびペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地（Sigma-Aldrich）中、5% CO2、37℃で成育させた。CD26を安定に発現するジャーカットT細胞株（J.CD26）を、500μg/mlのG418（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含む、10% FCSおよびペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地中、5% CO2、37℃で、以前に記載された（Tanaka, et al., 1992）様に培養した。
【００７７】
以前に記載された方法（Ohnuma, et al., 2001）に従って、採血前の1年以内にTTを免疫化された健康成人ボランティアから回収した末梢血単核細胞（PBMC）からヒト末梢単球を精製した。単球を、ペニシリン-ストレプトマイシンを追加したマクロファージ-SFM培地（Life Technologies Inc.）中、5% CO2、37℃にて培養した。混入による単球の非特異的な活性化による干渉を避けるために、硫酸ポリミキシンB（20 IU/ml, Sigma-Aldrich）を、APC/単球実験に使用した全ての培地および試薬に添加した。精製後の単球を標準的な培地中で24時間プレインキュベートして、ヒト血清中に存在するsCD26に由来する潜在的な干渉のリスクを最小限に抑えた（Tanaka, et al., 1993）。
【００７８】
（2）抗体および試薬
抗ヒトCD26マウスモノクローナル抗体（mAb）（1F7）は発明者らの研究室で作製した（Morimoto, et al., 1989）。抗カベオリン-1ウサギポリクローナル抗体（pAb）、抗IRAKウサギpAb、抗GST mAb、およびテキサスレッドを結合した抗免疫グロブリンG（Ig）（抗ウサギIgおよび抗ラットIg））はSanta Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）から購入した。抗ホスホカベオリン-1 mAbはBD Transduction（La Jolla, CA）から入手し、抗TollipラットpAbはALEXIS Biochemicals（San Diego, CA）から、ならびにFITC結合抗CD86 mAb、PE結合抗CD14 mAb、Cy Chrome結合抗CD45 mAb、およびアイソタイプ対照mAbはBD PharMingen（San Diego, CA）から入手した。破傷風トキソイドはCalbiochem（La Jolla, CA）から、およびポリ-L-リジンおよびADAはSigma-Aldrichから購入した。テキサスレッドによるタンパク質の標識は、FluoReporterテキサスレッドタンパク質ラベリングキット（Molecular Probes, Eugene, OG）を製造業者の指示書に従って使用して作製した。
【００７９】
（3）プラスミドの構築
GST-カベオリン-1、HA-カベオリン-1、およびカベオリン-1-EGFPは、カベオリン-1のcDNAを、それぞれpGEX6p1ベクター（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）、pCG-N-BLベクター、およびpEB6-CAG-EGFPベクター（Tanaka, et al., 1999）に挿入することで作製した。一連のカベオリン-1欠失変異体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって作製した変異型カベオリン-1のcDNA断片をそれぞれのベクターに挿入することによって作製した。
【００８０】
CD26-EGFPは、CD26のcDNAをpEB6-CAG-EGFPに挿入することで作製した。変異型のCD26-EGFPコンストラクト（del 201-211）は、ジーンテイラー変異誘発キット（Invitrogen）を使用した部位特異的変異誘発法により作製した。GST-CD26およびその欠失変異体は、CD26およびその変異体のcDNAを、哺乳類GST発現ベクターであるpEBGベクター（Sanchez, et al., 1994）に挿入することにより作製した。欠失変異体（GST-CD26 D1、D2、D3）の挿入断片はPCRで作製し、および他の変異体（GST-CD26-del 201-211）は、ジーンテイラー変異誘発キットを使用した部位特異的変異誘発法で構築した。
【００８１】
GST-Tollip、FLAG-Tollip、およびVSV-IRAK-1は、TollipのcDNAをそれぞれpGEX6p1、pFLAG-CMV-2（Sigma）、およびpCORON1000 VSV-G（Amersham Biosciences）に挿入することにより作製した。これらの欠失変異体は、PCRで得られたcDNA断片を挿入することにより構築した。
【００８２】
ヒトCD86遺伝子の5'側隣接領域のルシフェラーゼキメラは、プロモーター領域のPCR断片をpGL3-basicベクター（Promega, Madison, WI）のMluI-XhoI部位に挿入することにより作製した。ヒトCD86遺伝子の5'側隣接領域のPCR断片は、テンプレートとしてResGenのBAC RPC11 289N10クローン（Invitrogen）を使用し、またセンスオリゴヌクレオチドとして5'-GGACGCGTTTTAGCATTTTGGTCTAAACTAATTTATAATTATTTAGCCTTATTTCTCCA-3' （pGL3-Luc/1181用）（配列番号：1）、5'-GGACGCGTTTGGAATTTAAAATGTTCAAAATGATTTGTCTGGATG-3'（pGL3-Luc/783用）（配列番号：2）、5'-GGACGCGTTTGGTTGTGGAAATTGGCAGGGTTAGGTGG-3'（pGL3-Luc/409用）（配列番号：3）、5'-GGACGCGTATTCAGGCTCATCTTAACGTCATGTCTGG-3' （pGL3-Luc/213用）（配列番号：4）を、かつアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、5'-CGCTCGAGTGTGCTAGTCCCTGTTACAGCAGC-3' （配列番号：5）を用いて作製した。
【００８３】
全てのコンストラクトまたはcDNA断片は、DNA配列決定法により確認した。
【００８４】
（4）GST融合タンパク質の産生
GST-カベオリン-1、GST-Tollip、およびそれらの欠失変異体を作製するために、プラスミドコンストラクトでBL21（DE3）；pT-Trx大腸菌を形質転換した（Yasukawa, et al., 1995）。GST融合タンパク質を、0.1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（Amersham Pharmacia）を用いて25℃で10時間かけて誘導し、グルタチオンセファロース4B FF（GSH）ビーズ（Amersham Pharmacia）を使用して精製した。
【００８５】
GST-CD26およびその欠失変異体を、哺乳類細胞株COS-7により作製した。融合タンパク質を作製するために、20μgのpEBG-CD26ベクターまたは変異型ベクターを、1.0×107個のCOS-7にLipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を使用してトランスフェクトし、その後24時間増殖させ、氷上で溶解緩衝液（LB；1% Nonidet P-40、130 mM NaCl、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM NaF、2 mM オルトバナジウム酸ナトリウム（Na3VO4）、1%アプロチニン、10μg/mlロイペプチン、1 mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）、1 mM EDTA）を用いて溶解した後に、GSHビーズを用いて溶解物の清澄化およびインキュベーションを4℃で一晩行った。ビーズをLBで3回、0.5 M LiCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0で2回、および0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0で2回洗浄した。
【００８６】
組換えタンパク質は、ビーズから10 mMの還元グルタチオンで溶出した後に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で透析することにより得た。GSTを持たない完全長のカベオリン-1、哺乳類で発現されたCD26、およびその変異タンパク質の精製は、PreScissionプロテアーゼを用いて、GST融合タンパク質から作製し、その後PBSに対して4℃で透析を行った。全ての発現タンパク質の予想サイズはSDS-PAGEで検証した。
【００８７】
（5）CD26相互作用タンパク質の精製および分離
CD26を結合させたアデノシンデアミナーゼ-セファロースビーズ（ADAビーズ）を、以前に記載された方法（Tanaka, et al., 1993; Tanaka, et al., 1994）で作製した。THP-1単球細胞株の全細胞溶解物をCD26-ADAビーズカラムにアプライした。洗浄用緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH=8.0）、1 mM EDTA、0.1% NP-40、50 mM NaCl、1 mM DTT、1mM PMSF、10μg/mlアプロチニン）で十分に洗浄した後に、結合タンパク質を高塩緩衝液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1% NP-40、1000 mM NaCl、1 mM DTT、0.5 mM PMSF、10μg/mlアプロチニン）で溶出した。
【００８８】
CD26-ADAビーズでアフィニティ精製したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、銀染色を行った。MALDI-TOF MS（AXIMA-CFR plus; SHIMADZU BIOTECH, Kyoto, Japan）を使用して、対応するゲルバンドの典型的なゲル内消化物のペプチドマスフィンガープリントを記録することにより、ペプチドマスマッピングを実施し、続いてMASCOTデータベース（Matrix Sciences, London, U.K.）を検索した。
【００８９】
（6）GSTプルダウンアッセイ
GSHビーズ上のGSTによって前処理（preclear）した後に、J.CD26細胞溶解物を、GSHビーズ上のGST融合タンパク質と4℃で8時間インキュベートした。タンパク質-ビーズ複合体をビーズとともに緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1% NP-40、50 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM PMSF）で十分に洗浄し、還元条件下において適切な濃度のゲル上でのmini-Protean IIシステム（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を用いたSDS-PAGE解析に供した。次にタンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド膜（Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA）にトランスファーした。特異的抗原は、対応するmAbによって検出し、続いてHRP結合抗マウスIg（Amersham Pharmacia）によって検出した。ウエスタンブロットをエンハンスド・ケミルミネセンス法（PerkinElmer Life Science, Boston, MA）で可視化した。
【００９０】
（7）細胞の刺激
精製直後の単球を、マクロファージ-SFM培地中で24時間培養して血清の作用を抑え、0.5μg/mlの濃度のTTとさらに24時間プレインキュベートした。PBSで洗浄後に、1.0×106個のTTを負荷した単球を、所定の時間、rsCD26 wtまたはrsCD26 del 201-211（1.0μg/ml）をコーティングした0.5×106個のポリスチレンラテックスビーズ（Molecular Probes）で刺激した。刺激後の単球を、共焦点レーザー顕微鏡検査、免疫沈降アッセイ、ウェスタンブロッティング解析、またはフローサイトメトリー（FCM）に供した。
【００９１】
MACS Pan T細胞単離キット（Mitenyi Biotech, Auburn, CA）を使用して単離直後のT細胞を、PHA（10 ng/ml, Sigma-Aldrich）を添加した10% FCS-RPMI1640培地中で24時間培養した。その後、高レベルのCD26を発現する活性化T細胞（Morimoto, et al., 1989）を細胞コンジュゲーションアッセイに供した。
【００９２】
（8）免疫沈降法およびウェスタンブロット解析
RIPA溶解緩衝液（1% NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、5 mM EDTA、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.15 M NaCl、1 mM PMSF、0.5 mM NaF、10μg/mlアプロチニン、および0.02 mM Na3VO4）を用いて、組換え型の可溶性CD26（rsCD26）とインキュベートした1.0×107個のTHP-1細胞から、またはrsCD26をコーティングしたビーズで刺激した、TTを負荷した1.0×107個の単球から溶解物を作製した。次に溶解物を15,000×g、30分により清澄化した。溶解物を2μgの対照免疫グロブリン（Ig）およびタンパク質G-セファロースビーズ（Amersham Pharmacia）とともに4℃で1時間インキュベートすることで免疫沈降法（IP）を実施した。遠心分離後に上清を2μgの特異的Igと4℃で2時間インキュベートし、続けてタンパク質G-セファロースビーズを添加して一晩インキュベートした。RIPA溶解緩衝液で4回洗浄した後に、ビーズをSDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析へ供した。
【００９３】
内因性のカベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用を調べるために、THP細胞をRIPA溶解緩衝液（1% NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、5 mM EDTA、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.15 M NaCl、1 mM PMSF、0.5 mM NaF、10μg/mlアプロチニン、および0.02 mM Na3VO4）に溶解した。次いで溶解物を30分、15,000×gで遠心分離した。溶解物を2μgの対照免疫グロブリン（Ig）と4℃で1時間インキュベートして免疫沈降法（IP）を実施した。遠心分離後、上清を2μgの特異的Igと4℃で2時間インキュベートし、その後タンパク質G-セファロースビーズを添加して一晩インキュベートした。RIPA溶解緩衝液で4回洗浄後に、ビーズをSDS-PAGEとウェスタンブロット解析に供した。融合タンパク質との相互作用ドメインを調べるために、COS細胞（1 x 107個の細胞）に各5μgのHA-カベオリン-1、FLAG-Tollip、およびその欠失変異体、ならびにVSV-IRAK-1発現プラスミドをLipofectamine 2000を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を500μlのRIPA溶解緩衝液で溶解した。500μlの溶解物を20μlの抗Flag抗体M2アガロースビーズ（25%スラリー）とともに4℃で一晩攪拌し、ビーズをRIPA緩衝液で4回洗浄し、ビーズを100μlのFlagペプチド（150 ng/ml）で溶出することで精製を実施した。タンパク質ビーズをSDS-PAGEに供した。次にタンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド膜（Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA）にトランスファーした。特異的な抗原は、対応するmAbにより検出され、その後HRP結合抗マウスIg（Amersham Pharmacia）によって検出された。ウエスタンブロットはエンハンスド・ケミルミネセンス法（PerkinElmer Life Science, Boston, MA）で可視化した。
【００９４】
（9）共焦点レーザー顕微鏡検査
HEK293細胞を使用した蛍光顕微鏡実験では、細胞をLAB-TEK 4ウェルのチャンバースライドガラス（Nalgen Nunc International, Naperville, IL）で8時間プレインキュベートしてからトランスフェクションを行った。GFP融合コンストラクト（GFP-CD26 wt、GFP-CD26 del 201-211、GFP-カベオリン-1、またはGFP-カベオリン-1 del 82-101）をLipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を用いてトランスフェクトし、12時間後に、テキサスレッドを結合した組換えタンパク質（カベオリン-1 wt、カベオリン-1 del 82-101、rsCD26 wt、またはrsCD26 del 201-211）と1時間インキュベートした。氷冷PBSで3回洗浄した後、細胞をPBS中4%パラホルムアルデヒドで固定し、Antifade Prolongキット（Molecular Probes）でマウントした。競合DPPIV阻害剤（バリン-ピロリジド（Ki=2.9 nM、IC50=13 nM）、日本たばこ産業株式会社、TOKYO、JAPANの好意により提供）を使用したブロッキング実験では、1μMのバリン-ピロリジドを、GFP融合コンストラクト（GFP-CD26 wt、GFP-CD26 del 201-211、およびGFPベクター）をトランスフェクトしたHEK293細胞とともに15分間培養した。新鮮な10%FCS RPMI1640培地と交換後、細胞を、テキサスレッドを結合した組換えタンパク質（カベオリン-1 wtまたはADA）と1時間インキュベートした。
【００９５】
他で記載（Lee, et al., 2002）されたように、T細胞-APCコンジュゲーションアッセイでは、1.0×105個の活性化T細胞を、TTとともに（0.5μg/ml、所定の時間）、またはTT無しでパルス処理した1.0×105個の精製単球と混合し、さらに遠心分離した。30分後、細胞混合物を、ポリ-L-リジンをコーティングしたカバーガラス（Matsunami Glass Inc., Tokyo, Japan）に付着させ、PBS中4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間かけて固定した。細胞をマウスおよびウサギのIgアイソタイプ（1μg/ml）を用いて4℃で30分間かけてブロックした後に、抗CD26 mAbおよび抗カベオリン-1ウサギpAb（各10μg/ml）と4℃で60分間インキュベートし、その後氷冷PBSで2回洗浄し、FITC結合抗マウスIg抗体およびテキサスレッドを結合した抗ウサギIg抗体（1：200）と4℃で60分間インキュベートした。Antifade Prolongキットで細胞をカバーガラスにマウントした。コンジュゲートは、最初に微分干渉コントラスト顕微鏡で直接観察して同定した後に、T細胞における抗CD26 mAbの緑色蛍光、および単球における抗カベオリン-1 pAbの赤色蛍光を検出することで確認した。T細胞-APCコンジュゲーションの比率を、カバーガラス視野内の500個の異なる細胞を無作為に選択することで、5回の独立した実験から計算した。
【００９６】
カベオリン-1とTollipの共局在の検出に関しては、GFP-カベオリン-1で安定にトランスフェクトされたTHP-1細胞を、氷冷PBSで2回洗浄し、カバーガラスに付着させ、アセトン-メタノール（1：1）を用いて室温で2分間かけて固定した。次に細胞を、抗TollipラットpAb（10μg/ml）を用いて4℃で60分間かけて染色し、次いでテキサスレッドを結合した抗ラットIg抗体（1：200）を用いて4℃で60分間かけて染色した。
【００９７】
カベオリン-1、Tollip、およびIRAK間の相互作用の検出に関しては、HEK細胞をLAB-TEK 4ウェルチャンバースライドガラス（Nalgen Nunc International, Naperville, IL）中で8時間プレインキュベートした後にトランスフェクションを行った。GFP-カベオリン-1、FLAG-Tollip、およびVSV-IRAK-1のコンストラクトをLipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を使用してトランスフェクトした。12時間後に細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、氷冷50%アセトン-メタノールで固定し、抗HA抗体および抗VSV抗体と4℃で8時間インキュベートした。氷冷5% BSA-PBSで洗浄後、細胞を特異的な二次抗体とインキュベートし、Antifade Prolongキット（Molecular Probes）でマウントした。
【００９８】
共焦点顕微鏡検査は、60倍の対物レンズを備えるOlympus IX70共焦点顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）を用い、レーザー励起波長496 nmおよび568 nmで行った。特異性を最大にするようにオレゴングリーン発光チャネルおよびテキサスレッド発光チャネルの幅を設定した。
【００９９】
（10）フローサイトメトリーによる解析
細胞表面のカベオリン-1の露出の評価に関しては、精製した単球をTT（0.5μg/ml）で0時間、6時間、12時間、24時間、および48時間処理した後に、細胞を氷冷PBSを用いて3回洗浄し、抗カベオリン-1抗体（5μg/ml）を用いて4℃で60分間かけて染色し、FITC結合抗ウサギIg抗体（1：200）で4℃で60分間かけて染色した。カベオラを乱すために、精製済みの単球をフィリピン（1.0μg/ml, Sigma-Aldrich）で37℃で30分間処理した。次に細胞に上記の手順でTT負荷を与え、カベオリン-1の染色を行った。
【０１００】
TT（0.5μg/ml）有り、またはTT無しで24時間プレインキュベートした後に、rsCD26をコーティングしたビーズで24時間インキュベートした精製単球上のCD86の発現を評価する実験では、FITC結合CD86 mAb（10μg/ml）をPE結合抗CD14（10μg/ml）およびCy Chrome結合CD45（10μg/ml）と共に使用して、単球集団のみを対象にゲーティングを行った。単球中におけるカベオリン-1に対するsiRNAの作用を評価する実験では、精製単球に、後述のsiRNAをトランスフェクトし、rsCD26をコーティングしたビーズで24時間インキュベートし、上述の手順で染色した。
【０１０１】
10,000個の生細胞のフローサイトメトリー解析をBecton-DickinsonのFACScaliburで実施した。各実験を少なくとも3回繰り返し、結果を代表的な実験のヒストグラムの形で、または対照細胞または非処理細胞と比較した、平均蛍光強度（MFI）の平均パーセント±標準誤差（SE）の上昇として得た。
【０１０２】
（11）カベオリン-1に対する低分子干渉RNA（siRNA）
標的特異的なsiRNAの2本鎖を設計するために、発明者らは、ヒトカベオリン-1（アクセッション番号NM 001753）のオープンリーディングフレームに由来するAA型（N19）（Nは任意のヌクレオチド）の配列を選択した（Elbashir, et al., 2001）。さらに発明者らは、センスおよびアンチセンスの3'オーバーハングの配列組成に関して対称的な2本鎖を作製するために、2'-デオキシチミジン（dTdT）の2-ヌクレオチドの3'オーバーハングにこの配列を加えた。これらの対称的な3'オーバーハングは、siRNAが標的RNA切断性siRNAのセンスおよびアンチセンスをほぼ同等の比で形成することを保証する手だてとなることが報告されている（Elbashir, et al., 2001）。したがって発明者らは、カベオリン-1のmRNAの開始コドンの下流の81〜101位（ss1）および138〜153位（ss2）の2つの標的配列を選択した。（センス1のsiRNA（ss1-siRNA）：5’ AACAACAAGGCCAUGGCAGACdTdT （配列番号：6）、およびセンス2のsiRNA（ss2-siRNA）：5’ AAGGAGAUCGACCUGGUCAACdTdT （配列番号：7））さらにsiRNA 2本鎖の非特異的な作用を調べるために、4ヌクレオチドが異なるmis-siRNAを調製した。（mis-siRNA：5’ UACAAGAAGGGCAUGGCAGACdTdT（配列番号：8））トランスフェクション効率を可視化するために、発明者らは、テキサスレッドを結合したミスセンスsiRNA（mis-siRNA-TR）も調製した。これらの選択された配列も、ヒトゲノム上の唯一の遺伝子を標的とすることを保証するために、ヒトゲノム配列に対するBLAST検索を行った。siRNAは、QIAGEN（Valencia, CA）から購入した。60ピコモルのsiRNA 2本鎖を0.5×106個の細胞にHVJ-Eベクター（GenomeOne（商標）；IHSIHARA SANGYO KAISHA LTD., Osaka, Japanの好意により提供）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間または48時間後に試験のために細胞を調製した。
【０１０３】
（12）ヒトTollipに対する低分子干渉RNA（siRNA）
発明者らは、カベオリン-1のmRNAの開始コドンの下流の186〜206位（ss1）と774〜794位（ss2）由来の2つの標的配列を選択した。（センス1のsiRNA（ss1-siRNA）：5’AAGUUGGCCAAGAAUUACGGCdTdT（配列番号：9）、およびセンス2のsiRNA（ss2-siRNA）：5’AACAAGGAUCCGCCAUCAACdTdT（配列番号：10））。さらに、siRNA 2本鎖の非特異的な作用を調べるために、4ヌクレオチドが異なるmis-siRNAを調製した（mis-siRNA：5’UAGUUCGCCAAGUAUUACCGCdTdT（配列番号：11））。これらの選択された配列も、ヒトゲノム上の唯一の遺伝子を標的とすることを保証するために、ヒトゲノム配列に対するBLAST検索を行った。siRNAは、QIAGEN（Valencia, CA）から購入した。60ピコモルのsiRNA 2本鎖を0.5×106個の細胞にHVJ-Eベクター（GenomeOne（商標）；IHSIHARA SANGYO KAISHA LTD., Osaka, Japanの好意により提供）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に試験のために細胞を調製した。
【０１０４】
（13）ルシフェラーゼアッセイ
HEK 293細胞を、直径6 cmの培養ディッシュ（BD Bioscience, La Jolla, CA）上に30〜50%のコンフルエンシーとなるようプレーティングし、細胞培養用の培地をOpti-MEM培地（Invitrogen）と交換してトランスフェクションを行った。プラスミド混合物をLipofectamine 2000トランスフェクション試薬と混合し、培養物に添加した。総プラスミド量は、無関係のプラスミドを添加することで一定に維持した。6時間のインキュベーション後に、培地を、10% FCSを追加した新鮮なDMEMと交換し、細胞をさらに、様々な試薬の存在下または非存在下で37℃で24時間培養した。ルミノメーター（Promega）でルシフェラーゼ酵素活性を決定し、相対発光量を、タンパク質アッセイ用試薬で決定したタンパク質量に対して、製造業者の指示書（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に従って標準化した（Makino, et al., 1996）。
【０１０５】
（14）核タンパク質の抽出およびDNA結合タンパク質アッセイ
TTで処理し、rsCD26による刺激を行った精製単球から、TransFactor Extractionキット（Clontech, Palo Alto, CA）を用いて、核タンパク質抽出物（NE）を得た。Mercury TransFactorキット（Clontech）を使用したELISA法をベースにしたDNA結合タンパク質アッセイに、各6μgのNE（特定の競合オリゴヌクレオチド（500 ng）を含むものまたは含まないもの）を供した。DNA結合タンパク質の活性を、405 nmを基準として655nmにおける吸光度値を元にマイクロタイタープレートリーダー（Bio-Rad）で測定した。
【０１０６】
（15）2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）
単球由来の膜画分をReadyPrepタンパク質抽出キット（Bio-Rad）で、製造業者の指示書に従って抽出した。次に膜タンパク質を2D Clean-upキット（Bio-Rad）でペレット化することで清澄化し、再水和用溶解緩衝液（RHB；8 M尿素、2 M チオ尿素、4% CHAPS、50 mMジチオスレイトール、0.5% ZOOM担体両性電解質（pH 3〜10）（Invitrogen）、0.002%ブロモフェノールブルー）に最終濃度が1 mg/mlとなるように再懸濁した。広範囲の固定化pH勾配（IPG）ストリップ、pH 3〜10（Invitrogen）は、10μgのタンパク質を含む155μlのRHBに再水和し、等電点電気泳動はZOOM IPGRunner システム（Invitrogen）を用いて1367 Vhで行った。第2の次元のSDS-PAGEは、4〜12%のNuPAGE Bis-Trisゲル（Invitrogen）を用いて行った。解析用ゲルをSilverQuest銀染色キット（Invitrogen）で染色した。対応するゲルバンドの典型的なゲル内消化物のペプチドマスフィンガープリントを、MALDI-TOF MS（AXIMA-CFR plus; SHIMADZU BIOTECH, Kyoto, Japan）で記録することでペプチドマスマッピングを実施し、ついでMASCOTデータベース（Matrix Sciences, London, U.K.）を検索した。
【０１０７】
（16）T細胞増殖アッセイ
単離直後の単球（0.5×106個/ウェル）にsiRNAをトランスフェクトし、0.5μg/mlのTTで16時間プレインキュベートした後に、srCD26（0.5μg/ml）とともに24時間インキュベートした。PBSで洗浄後、次に1.0×104個/ウェルのプレインキュベートした単球は、同じドナーに由来する1×105個/ウェルの精製T細胞を用いたアッセイに供した。全ての実験において、細胞の増殖のモニタリングは、BrdUの取り込みを培養第7日目にELISA BrdUキット（Roche）で測定することで行った。増殖の程度を縦軸のcpmで示す。実験の結果は、5回の独立に実施した実験から計算した平均値±標準誤差を表す。
【０１０８】
（17）統計処理
スチューデントのt検定で、対照と試料の差が有意か否かを判定した（p < 0.05を有意であると見なした）。
【０１０９】
（実施例2）CD26結合タンパク質の同定
ADAがCD26結合タンパク質であることから（Kameoka, et al., 1993）単球中のCD26相互作用タンパク質を同定するために、発明者らは、ADA-セファロースを有するCD26結合アフィニティカラムを作製した。単球細胞株THP-1の細胞抽出物を、このCD26-ADAセファロースカラムにアプライした。十分に洗浄した後に、高濃度塩緩衝液を用いて結合状態のタンパク質を溶出した。次に、これらのタンパク質をSDS-PAGE解析に供した。非特異的な複数のバンドが、溶解物のレーン、ADA（擬似処理）カラム溶出のレーン、およびCD26-ADAカラム溶出後の洗浄溶液のレーンに認められた（図1Aのレーン1〜3）。一方、3本の主要なバンドがCD26-ADAカラムの溶出物中に認められた（図1Aのレーン4）。ADAカラム上のCD26に特異的に結合したタンパク質のバンドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）によるペプチドマスフィンガープリンティングに供した。MASCOTデータベースの検索に関しては、様々なポリペプチドについて得られた質量および見かけの分子量から、CD26-ADAセファロースカラムから溶出された画分が3本の主要なバンドを含むことが明らかとなり、かつこれらのバンドがCD26、ADA、およびカベオリン-1であることがわかった（図1A）。CD26-ADAビーズは、受動的な結合によって調製されたので、溶出画分中のCD26およびADAにはカラムビーズが混入している可能性がある。約20〜25 kDaのカベオリン-1は、溶出物画分（レーン4）において強く銀染色され、および擬似処理ADAビーズカラムを通過した画分（レーン2）においては特異的に検出されなかった。これらの所見は、カベオリン-1がCD26分子と結合することを示唆していた。
【０１１０】
生細胞におけるCD26とカベオリン-1との間の相互作用を確認するために免疫共沈降実験を行った。可溶性CD26（sCD26）とともに培養したTHP-1細胞を対象に、抗カベオリン-1抗体または抗CD26抗体のいずれかと免疫沈降法（IP）を行った。免疫複合体をSDS-PAGEで分離し、抗CD26抗体または抗カベオリン-1抗体による免疫ブロッティングを行った。膜をストリッピングし、所定の抗体で再プローブを行った。CD26は、カベオリン-1特異的抗体と免疫共沈殿を生じた溶解物中で、その特異的抗体によって検出された（図1Bの左のパネル）。内因性のカベオリン-1はTHP-1中に検出された（図1Bの左のパネルの下）。カベオリン-1は、CD26特異的抗体と免疫共沈殿を生じた溶解物のウエスタンブロットに特異的に検出された（図1Bの右のパネルの上）。内因性のCD26はTHP-1中には検出されなかった（図1Bの右のパネルの下）。したがって上記の結果から、カベオリン-1がTHP-1中でCD26に対する結合タンパク質であることが示された。
【０１１１】
カベオリン-1の対CD26結合ドメインを決定するために、発明者らは、カベオリン-1の一連のGST融合欠失変異体（図1C）、およびCD26をトランスフェクトしたジャーカットT細胞（J.CD26）を対象にGSTプルダウンアッセイを実施した。グルタチオンセファロース（GSH）ビーズ上のGST融合カベオリン-1およびその変異体を、GSHビーズ上のGSTで前処理した後にJ.CD26細胞溶解物と共にインキュベートした。結合タンパク質、および投入溶解物量の1%をSDS-PAGEで分離し、抗CD26抗体で免疫ブロットを行い、その後ストリッピングと抗GST抗体による再プローブを行った。図1Dに示すように、CD26はGST-Cav-1 wt、Cav-1（1-101）、およびCav-1（82-178）とは共沈殿を生じたが、GST-Cav-1（1-82）、Cav-1（102-178）、およびCav-1（del 82-101）とは生じなかった。これは、カベオリン-1の82-101残基が対CD26結合ドメインであることを示している。同ドメインは、カベオリン-1の骨格ドメイン（SCD）であることが知られている（Smart, et al., 1999）。これらの所見を生細胞で確認するために、発明者らは、GFPを融合した完全長のカベオリン-1、および骨格ドメインを欠くカベオリン-1（del 82-101）を構築した。GFPを融合したカベオリン-1およびその変異体を、CD26もカベオリン-1も発現していないHEK293細胞にトランスフェクトした後に、テキサスレッドを結合したCD26（sCD26-TR）を形質移入体に添加した。膜表面および核周辺領域に検出された完全長のカベオリン-1-GFP（図1E-a）は、sCD26-TRと明瞭に重なっていた（図1E-b、c）。一方、カベオリンの61〜101残基はオリゴマー形成に必要なことが証明されている（Smart, et al., 1999）ので、骨格ドメインを欠くカベオリン（del 82-101）-GFPは散在して存在しており（図1E-d）、sCD26-TRと相互作用することの証拠は得られなかった（図1E-e、f）。CD26-TRは、GFPのみをトランスフェクトしたHEK293細胞（図1E-g、h）でわずかに検出されたが、CD26-TRはGFPと結合していなかった（図1E-i）。
【０１１２】
カベオリン-1との結合に関与するCD26中の領域を決定するために、発明者らは、COS-7細胞で作製された一連のCD26のGST融合欠失変異体を用いてGST-プルダウンアッセイを実施した（図1F）。CD26の天然組成を維持するために、発明者らは、COS細胞で発現されるCD26の一連のGST融合欠失変異体を、哺乳類細胞において発現するGST融合タンパク質ベクターを使用して構築した（Sanchez, et al., 1994）。GSHビーズ上のGST融合CD26および欠失変異体をTHP-1細胞溶解物とともに、GSHビーズ上のGSTで前処理した後にインキュベートした。結合状態のタンパク質、および投入溶解物量の1%をSDS-PAGEで分離し、抗カベオリン-1抗体による免疫ブロットを行い、その後ストリッピングと抗GST抗体による再プローブを行った。図1Gに示すように、カベオリン-1はGST-CD26 wtおよびCD26 D3（31〜429残基）と共沈殿を生じたが、GST-CD26 D1（507〜766残基）、CD26 D2（267〜584残基）、およびCD26 del 201-211とは共沈殿を生じなかった。これらの結果から、CD26のアミノ酸201〜211が、CD26とカベオリン-1の結合に必要なことが示唆された。CD26中の同領域は、カベオリン結合コンセンサスモチーフ（CBD）（φXφXXXXφXXφ；φおよびXはそれぞれ芳香族残基と任意のアミノ酸を示す）（Smart, et al., 1999）、特にWVYEEEVFSAY（配列番号：12）を含む（Tanaka, et al., 1992）。発明者らの過去の報告では、CD26のDPPIV酵素活性が、TTを負荷した単球の活性化作用の発揮に必要なことが明らかにされた（Ohnuma, et al., 2001）。この点に関して、カベオリン-1は、DPPIV 酵素活性を欠くGST-CD26 S630Aとの複合体中には検出されなかった（図1G）。これらの所見を生細胞で確認するために、発明者らは、GFPを融合した完全長のCD26、CBDを欠く変異体（del 201-211）、およびDPPIV酵素活性を欠く変異体（S630A）を構築した。GFPを融合したCD26および変異体をHEK293細胞にトランスフェクトした後に、テキサスレッドを結合したカベオリン-1（cav-TR）を形質移入体に添加した。CD26 wt-GFP、CD26 del 201-211-GFP、およびCD26 S630A-GFPは細胞表面膜に局在していた（図1H-a、d、g）。cav-TRはCD26-wt-GFPをトランスフェクトしたHEK293細胞において共局在していた（図1H-b、c）。しかし、CD26 S630A-GFPをトランスフェクトした細胞と同様に、CD26（del 201-211）をトランスフェクトした細胞ではcav-TRは検出されなかった（図1H-e、f、h、i）。cav-TRは、GFPのみをトランスフェクトしたHEK293細胞では観察されなかった（図1H-j、k、l）。CD26とカベオリン-1の結合におけるDPPIV活性部位の役割を確認するために、発明者らはDPPIVの競合阻害剤、バリン-ピロリジド（Val-Pyr）を使用した。GFP-CD26 wtをトランスフェクトしたHEK293細胞をVal-Pyrで処理した後に（図1H-m）、cav-TRを細胞に添加した。GFP-CD26 wtをトランスフェクトしたHEK293細胞においては、Val-Pyrの処理後にcav-TRは観察されなかった（図1H-n、o）。DPPIV関連分子以外のCD26結合活性を確認するために、Val-Pyrとインキュベートした、GFP融合野生型CD26（wt）をトランスフェクトしたHEK293細胞に、テキサスレッドを結合させたADAを添加した（p〜r）。テキサスレッドを結合したADAとCD26の結合は、GFP-CD26 wtをトランスフェクトしたHEK293細胞において、Val-Pyrとの処理後に観察されたので（図1H-p、q、r）、Val-Pyrは、CD26の結合活性および形質移入体の性質を変化させなかったことになる。以上をまとめると、CD26はCBDを介して、およびCD26中の630位のセリン残基およびカベ���リン-1の骨格ドメインを介して、カベオリン-1と結合することが実証される。
【０１１３】
（実施例3）T細胞上のCD26は単球上のカベオリン-1と相互作用する
カベオリン-1は細胞質膜の内層の、細胞質ゾル側に局在することが実証されている（Smart, et al., 1999）。発明者らは過去に、記憶抗原の破傷風トキソイド（TT）による処理後にのみ、rsCD26が単球上のCD86発現を増強したことを明らかにした（Ohnuma, et al., 2001）。TTは、抗原提示細胞（APC）によって、カベオラを介して取り込まれることが報告されているので（Montesano, et al., 1982; Pelkmans, et al., 2002）、発明者らは、TT処理後における単球中のカベオリン-1のフリップフロップ現象について調べた。精製単球をTTの存在下または非存在下で、図2Bに記載される時間インキュベートした後に、細胞表面のカベオリン-1を、N末端領域を検出する抗カベオリン-1抗体で染色し、次いで抗ウサギIg FITC抗体による染色を行い、陽性細胞率（%）をフローサイトメトリーで解析した。カベオリン-1は、TT処理の12〜24時間後に単球の細胞表面で検出された（図2A）。一方、非処理単球上のカベオリン-1は、培養の0〜48時間後には検出されなかった。カベオラに対するTTの作用をさらに調べるために、細胞膜中のコレステロールを分散させることでカベオラ輸送を阻害するフィリピンを用いて単球を処理した（Peiro, et al., 2000）。精製後の単球をフィリピンと30分間プレインキュベートした後に、TTの存在下または非存在下で記載される時間インキュベートし、次いで細胞表面のカベオリン-1を上述の方法と同じ方法で検出した。図2Aに示すように、カベオリン-1は、フィリピンで処理した単球上には、TTを負荷した後でも検出されなかった。これらのデータから、TTを負荷した単球の特定の集団が、カベオリン-1を細胞表面に発現することが示された。
【０１１４】
CD26high T細胞は、TTなどの記憶抗原に強く反応し（Morimoto, et al., 1989）、活性化されたCD26high T細胞は炎症領域に蓄積するので（Morimoto, et al., 1998; von Bonin, et al., 1998）、発明者らは、活性化記憶T細胞と抗原を負荷した単球が、T細胞表面で発現されたCD26および単球上のカベオリン-1を介して直接相互作用すると仮定した。この点をさらに詳しく特徴づけるために、発明者らは、T細胞-単球の接触部位におけるCD26とカベオリン-1の共局在の可能性を調べた。この目的で、活性化された末梢T細胞を、TTを負荷した単球と混合し、この細胞混合物を遠心することでコンジュゲートの形成を開始させた。30分後、共焦点レーザー顕微鏡による観察用に、実施例1に記載されるように細胞を調製した。最初に、混合後に遠心を行わずに、活性化T細胞、およびTTを負荷した単球をカバーガラスに付着させ、透過処理を行うことなく固定し、抗CD26（FITC）抗体および抗カベオリン-1（テキサスレッド）抗体で染色した。これらの実験では、CD26は活性化T細胞上でのみ検出され（図2B a）、また細胞表面のカベオリン-1は、TTを負荷した単球上でのみ検出された（図2B b、c）。これらの結果は、T細胞がカベオリン-1発現しないこと（Galbiati, et al., 2001）、および静止期の単球がCD26を発現しないこと（Morimoto, et al., 1989）を示した過去の報告と矛盾しない。細胞間コンジュゲーションを形成させるために、活性化T細胞と、24時間TTを負荷した単球を混合して遠心した。30分間のインキュベーション後に、コンジュゲートをカバーガラスに付着させ、透過処理を行うことなく固定し、抗CD26（FITC）抗体および抗カベオリン-1（テキサスレッド）抗体で染色した。CD26およびカベオリン-1は、活性化T細胞と、TTを負荷した単球の接触領域に動員された（図2C-a〜i）。T細胞と単球間の細胞コンジュゲーションの定量を以下の手順で行った。精製単球をTTの存在下または非存在下で、図2Dに記載される時間インキュベートした後に、T細胞-単球コンジュゲーションを形成させ、実施例1に記載されるように染色を行った。カベオラ形成の阻害試験では、精製単球をフィリピンと30分間プレインキュベートした後に、TTの存在下または非存在下で記載される時間インキュベートし、次いで、上述の方法と同一の方法でT細胞-単球コンジュゲーションアッセイに供した。得られた結果を図2Dに示す。カベオリン-1発現試験（図2A）に示すように、活性化T細胞と、TTを負荷した単球のコンジュゲーションの形成は、TTを12〜24時間負荷した単球で増加した（図2Dの黒丸）。細胞のコンジュゲーションは、TT処理を行わなかった単球またはフィリピン処理単球では検出されなかった（図2Dの白丸、黒三角、および白三角）。これらのデータは、記憶CD26+ T細胞が、抗原を負荷した単球と、T細胞上のCD26と単球上で発現されたカベオリン-1との相互作用を介して相互作用することを示唆していた。
【０１１５】
（実施例4）カベオリン-1のリン酸化は単球におけるシグナル伝達につながる
発明者らは、カベオリン-1が介在するシグナル伝達事象に注目し、TTを負荷した単球の表面のカベオリン-1とCD26との結合後に、このような事象がCD86の発現を増強するか否かを判定した。TTを負荷した単球をCD26で刺激するために、発明者らは、末梢T細胞およびTTを負荷した単球の表面で発現されるCD26の生理学的相互作用を模倣するように、CD26をコーティングしたポリスチレンラテックスビーズを用いた。TTを負荷した単球を、野生型CD26（wt）、またはCBDを欠く欠失変異型のCD26（del 201-211）をコーティングしたポリスチレンラテックスビーズとインキュベートした。カバーガラスへの付着後に、透過処理を行うことなくコンジュゲートを固定し、抗カベオリン-1抗体で染色し、次いで抗ウサギIg FITC抗体で染色した。細胞とビーズを、共焦点レーザー顕微鏡により可視化した。図3A-aは、野生型CD26をコーティングしたビーズが、TTを負荷した単球の表面のカベオリン-1と結合するが、CBDを欠く変異型のCD26をコーティングしたビーズは、TTを負荷した単球の表面におけるカベオリン-1の発現を変化させなかったことを示す（図3A-b）。カベオリン-1を介するシグナル伝達事象には、カベオリン-1のリン酸化が関与することが報告されている（Smart, et al., 1999）。この目的のために、TTを負荷した単球をこれらのビーズで刺激した後の様々な時点で細胞溶解物を調製して解析を行った。細胞溶解物を対象に、抗カベオリン-1抗体による免疫沈降（IP）を行い、免疫複合体をSDS-PAGEで分離し、抗ホスホカベオリン-1抗体または抗Tollip抗体による免疫ブロットを行った後に、ストリッピングおよび抗カベオリン-1抗体による再プローブを行った。細胞溶解物全体もSDS-PAGEで分離し、抗IRAK抗体による免疫ブロットを行った。CD26 wtをコーティングしたビーズによる刺激の0.5〜10分後、カベオリン-1はリン酸化されており（図3B）、その強度の変化を棒グラフで図3Bの下のパネルに示した。CD86の発現増強に至るシグナル伝達カスケードには、MyD88、IRAK、およびTollipなどの多数のタンパク質が関与すると思われる（Medzhitov, 2001）。MyD88およびIRAKは、互いに相互作用する、またはIL-1受容体もしくはToll様受容体と相互作用するToll-IL-1受容体ドメインおよびデスドメインを含む（Medzhitov, 2001）。TollipはC2ドメイン（タンパク質キナーゼC保存領域2）を含む。同ドメインは膜脂質と結合していることが推定されているが依然明確に証明されてはいない（Burns, et al., 2000）。C2ドメインは、カルシウム依存的またはカルシウム非依存的な様式でリン脂質との結合に関与する、約130残基を含む領域である。C2ドメインは、シグナル伝達から小胞輸送までの機能を有する100種類を上回るタンパク質に見いだされている。シナプトタグミンのC2ドメインにカルシウムが結合しても、C2ドメインにはわずかな立体構造変化しか誘導されない。しかしカルシウムは、静電ポテンシャルの変化を引き起こしてリン脂質結合を増強することから、C2ドメインが静電スイッチとして機能することが示唆されている。静電的な相互作用に加えて、カルシウム結合ループ中の側鎖は、中性または負に帯電したリン脂質のいずれかに対する異なるC2ドメインの結合に影響を及ぼす。TollipのC2ドメインは、IL-1受容体またはToll様受容体のシグナル伝達においてカルシウム依存性の作用に関連することは報告されていな���った（Medzhitov, 2001）。したがって発明者らは、CD26-カベオリン-1の相互作用を介する、シグナル伝達カスケードにおけるこれらのタンパク質の関与の可能性について調べた。図3Bに示すように、TollipはIP複合体中でカベオリン-1 pAbと共に見出され、CD26-カベオリン-1相互作用の2〜5分後にカベオリン-1から放出された（2〜5分の間、Tollipはカベオリン-1 pAbとのIP複合体中に検出されていない）。これらの時点で、IRAKが高リン酸化されていることがウェスタンブロット解析から示された（図3B）。MyD88もIRAK-4も複合体中に観察されなかったことに留意されたい（データは提示していない）。一方、カベオリン-1は、変異型CD26（del 201-211）ビーズによる刺激後にリン酸化されず、Tollipの放出も認められず、またIRAKのシフトも認められなかった（図3C）。これらの結果は、Tollip-IRAKカスケードがCD26とカベオリン-1の相互作用によって開始されることを示唆していた。
【０１１６】
過去の報告により、TollipがIRAKとの複合体中に存在すること、および活性化されたIL-1受容体またはToll様受容体複合体へのTollip-IRAK複合体の動員がNF-κBの活性化につながることが実証されている（Cao, et al., 1996; Burns, et al., 2000）。以上の結果は、単球中のTollipがカベオリン-1との複合体中に存在することを示唆していた。発明者らは次に、カベオリン-1とTollipの結合について詳細に調べた。図3Bと図3Cに示した、単球におけるIP試験から、カベオリン-1がTollipと結合することが明らかとなった。生細胞においてTollipは、GFP融合カベオリン-1をトランスフェクトしたTHP-1細胞中、特に表面膜内で、カベオリン-1と部分的に共局在していた（図3D-a、b、およびc）。内因性のカベオリン-1は、Tollip特異的抗体と共免疫沈降を生じたTHP-1細胞の溶解物中において、その特異的抗体によって検出された（図3Eの左のパネル）。内因性のTollipもまた、カベオリン-1特異的抗体と免疫共沈降を生じたTHP-1細胞の溶解物において、抗Tollip抗体によって検出された（図3Eの右のパネル）。これらの結果から、単球上のカベオリン-1が、THP-1細胞中の内因性のTollipと結合することが示される。
【０１１７】
Tollip-カベオリン-1複合体の結合ドメインをさらに決定するために、発明者らは、一連のGST融合カベオリン-1変異体およびGST融合Tollip変異体を用いてGST-プルダウンアッセイを行った（図1Cおよび3F）。GSHビーズ表面のGST融合カベオリン-1および欠失変異体を、GSHビーズ上のGSTで前処理した後にTHP-1細胞溶解物とインキュベートした。結合タンパク質および投入溶解物量の1%をSDS-PAGEで分離し、抗Tollip抗体による免疫ブロットを行った後に、ストリッピングおよび抗GST抗体による再プローブを行った。同様に、GSHビーズ上のGST融合Tollipおよび欠失変異体を用いて、抗カベオリン-1抗体による免疫ブロッティングを行った。図3Fに示すように、TollipはGST-Cav-1 wt、Cav-1（1〜101位）、およびCav-1（82〜178位）と共沈殿を生じ、カベオリン-1の骨格ドメイン（82〜101位の残基）がTollipとの結合に必要なことが示唆された。図3Hに示すように、カベオリン-1はGST-Tollip wt、Tollip（47〜274位）、Tollip（1〜178位）、およびTollip（47〜178位）と共沈殿を生じた。これらの結果から、TollipのC2ドメイン（47〜178位の残基）がカベオリン-1との相互作用に関与することが明らかになった。以上をまとめると、CD26の結合による、TTを負荷した単球上のカベオリン-1の連結後に、カベオリン-1がリン酸化され、Tollipが放出され、これが単球におけるIRAKのリン酸化に結びつく。
【０１１８】
（実施例5）NF-κBの活性化はCD26とカベオリン-1の相互作用後のCD86の発現増強に必要である
上記のデータは、IRAKが、CD26とカベオリン-1の相互作用の下流事象として、単球におけるCD86の発現増強に役割を果たし得ることを示唆した。過去の研究において、IRAKのリン酸化がTRAF6と関連して、NF-κB、JNK（c-Jun N末端キナーゼ）、およびp38 MAPキナーゼの活性化を誘導することが報告されている（Cao, et al., 1996）。発明者らは次に、TTを負荷した単球の存在下でCD26によって活性化される転写因子を同定した。TTを負荷した単球を、CD26をコーティングしたビーズで2時間またはPMAで刺激し、回収して核タンパク質（NE）を抽出した。各6μgのNEを、特異的な競合オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で、ELISA法をベースにしたDNA結合タンパク質アッセイに供した。この実験で発明者らは、野生型CD26で刺激したTTを負荷した単球の核抽出物中に、有意なレベルのNF-κB成分の構成要素であるp50およびp65を検出した（図4Aの右のパネル）。p50およびp65のNF-κBレベルの上昇は、特異的な競合オリゴヌクレオチドによって阻害された（図4Aの左のパネル）。AP-1（c-Fosおよびc-Jun）、ならびにSTAT1のレベルは、野生型CD26で刺激した、TTを負荷した単球の核抽出物において検出されなかった（図4A）。これらの結果は、NF-κBが、Tollipがカベオリン-1から放出された後にIRAKのリン酸化を介して活性化されることを示唆していた。発明者らは次に、NF-κB結合部位が、活性化のためにヒトCD86のプロモーター領域において必要か否かを調べた。なぜならば、過去の報告において、GASエレメント（ガンマ-インターフェロン活性化部位）およびNF-κB結合部位が存在し、またCD86の転写の活性化に必要であることが明らかにされているからである（Li, et al., 1999）。この目的のために発明者らは、ヒトCD86の5'側隣接プロモーター領域の一連のルシフェラーゼキメラ変異体を構築した（図4B）。これらのルシフェラーゼ変異体を用いて発明者らは、CD26とカベオリン-1の相互作用後のCD86のプロモーター活性を調べた。HEK293細胞に、CD86-プロモータールシフェラーゼコンストラクトおよび野生型カベオリン-1発現ベクターを同時にトランスフェクトしてから12時間後に、野生型の可溶性CD26（rsCD26 wt）、または201〜211位の残基を欠く変異型のrsCD26 del 201-211を培地に添加し、さらに20時間インキュベートした。細胞を回収してルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定した。同一の様式で、pGL3-Luc/1181またはpGL3-Luc/basic、および野生型カベオリン-1発現ベクター、様々な濃度の野生型の可溶性CD26（rsCD26 wt）、または201〜211位の残基を欠く変異型のrsCD26 del 201-211を同時にトランスフェクトしたHEK293細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。GASエレメント（pGL3-Luc/1181およびpGL3-Luc/783）の存在下もしくは非存在下において、ルシフェラーゼ活性は、TTを負荷した単球のCD26による刺激後の影響を受けなかった（図4C）。一方、プロモーター領域内の2か所のNF-κB結合部位は、カベオリン-1を発現するHEK293細胞におけるCD26処理後のCD86の転写の活性化に必要であった（図4C）。これとは対照的に、NF-κBを一つしか持たないルシフェラーゼコンストラクト（pGL3-Luc/409）には有意な活性は検出されなかった（図4C）。rsCD26で処理した細胞、またはカベオリン-1のみで処理した細胞について、NF-κBルシフェラーゼに有意な活性が認められなかったことに留意されたい。さらに、ルシフェラーゼ活性の増強は、pGL3-Luc/1181およびカベオリン-1をトランスフェクトしたHEK293細胞において、rsCD26 wtの用量の増加に伴って観察された（図4D）。このような用量依存性のルシフェラーゼ活性は、CD26 del 201-211による刺激後には認められなかった。これらの所見により、カベオリン-1の下流におけるNF-κBの活性化が、CD26で刺激したTTを負荷した単球におけるCD86の発現増強をもたらすことが示された。
【０１１９】
（実施例6）単球におけるカベオリン-1に対するsiRNAはCD26処理によるCD86の発現増強を低減させる
CD26とカベオリン-1の相互作用、およびその機能的な因果関連をより直接的に調べるために、発明者らは、新たに単離した利用してsiRNA実験を行った。発明者らは最初に、siRNAが初代単球に良好にトランスフェクトするか否かを試験した。精製単球に、テキサスレッドを結合させたミスマッチsiRNA（siRNA-TR）を、HVJ-Eベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をカバーガラスに付着させ、固定し、抗CD14-FITC抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で可視化した。図5Aに示すように、95%を上回る単球が、HVJ-E（Hemagglutinating Virus of Japan Envelope）ベクターおよび遠心法を利用し、siRNA-TRを用いることによりトランスフェクトされた。発明者らは次にウェスタンブロット解析により、カベオリン-1に対するsiRNAが、トランスフェクトされた単球におけるカベオリン-1タンパク質レベルのノックダウンに有効か否かを調べた。発明者らは、カベオリン-1に対する2セットの特異的なsiRNA（ss1はカベオリン-1遺伝子の+81〜+101位を標的とし、ss2は+138〜+158位を標的とする）を、実施例1に記載される様に調製した。精製単球のトランスフェクションを、上記のセンスsiRNAまたはミスマッチsiRNAの存在下もしくは非存在下で、HVJ-Eベクターを用いて行った。トランスフェクションの48時間後に、細胞溶解物を調製し、SDS-PAGEで分離し、抗カベオリン-1抗体による免疫ブロットを行った後に、ストリッピングおよび抗β-アクチン抗体による再プローブを行った。図5Bに示すように、いずれのsiRNAも、単球におけるカベオリン-1の発現を効率的にノックダウンした。単球におけるカベオリン-1は、ミスマッチsiRNAまたはHVJ-Eベクターのみでは有意にノックダウンされなかったことから、siRNAによるこの阻害作用は特異的である。発明者らは次に、CD26が、その作用を、カベオリン-1の発現がsiRNAによってノックダウンされた単球において発揮するか否かを調べた。精製単球のトランスフェクションをsiRNAの存在、非存在下で、HVJ-Eベクターを用いて行った後に、TTによる処理を行った。CD26をコーティングしたビーズによる刺激後に、細胞を、表面におけるCD86発現のFCMによる解析に供した。単球は、CD45-Cy ChromeおよびCD14-PE陽性集団のゲーティングによって同定した。CD86発現は、CD26 wtをコーティングしたビーズで刺激した、TTを負荷した単球の有意な集団で増強されていた（図5Cの上部右側のパネル）。一方、センスsiRNA（ss1およびss2）は、TTを負荷した単球においてこのCD86の発現増強における作用を阻害した（図5Cの下部中央および右側のパネル）。ミスマッチsiRNAは、この阻害作用を示さなかった（図5Cの下部左側のパネル）。CD86発現の変化が図5Dで明瞭に認められたことから、カベオリン-1の発現のノックダウンが、CD26で刺激した、TTを負荷した単球におけるCD86の発現増強の阻害を招くことが実証された（図5Dの*および**）。これらの結果から、カベオリン-1が、TTを負荷した単球とCD26の結合後のシグナル伝達に重要な役割を果たし、単球におけるCD86の発現増強をもたらすことが示唆された。
【０１２０】
（実施例7）カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1間の相互作用
生細胞における内因性のカベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1の結合を確認するために、THP-1細胞の溶解物を対象に、IRAK-1特異的抗体およびTollip特異的抗体を用いて免疫沈降法（IP）を行った。SDS-PAGE後、ウェスタンブロッティングによってカベオリン-1が検出された（図7A）。Tollipもまた、その特異的抗体によってIRAK-1特異的抗体との免疫沈降中に検出され（図7A）、一方IRAK-1は、その特異的抗体によってTollip特異的抗体との免疫沈降中に検出された（図7A）。これらの結果から、カベオリン-1およびTollipがIRAK-1と複合体を形成して3連構造体を形成することが示される。
【０１２１】
TollipとIRAK-1が結合することは既に報告されている。TollipのCUEドメインがIRAK-1のCTドメインと結合し、およびTollipがIRAK-1のリン酸化を阻害する。言い換えるとTollipはIRAK-1の負の調節因子として機能すると言える。さらに上記実施例5に示すように、カベオリン-1の骨格ドメインはTollipのC2ドメインと結合する。したがって、カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1の複合体（図7B）の結合ドメインを決定するために、以下の実験を実施した。
【０１２２】
完全長のTollip（wt）および欠失変異体（47-274、1-178、delC2、47-178（C2））をFLAGで標識した。さらに、完全長のカベオリン-1および完全長のIRAK-1をそれぞれHA（cav wt-HA）およびVSV（IRAK-1 wt-VSV）で標識した。これらのタンパク質をCOS細胞で共発現させた。細胞溶解物を抗Flag抗体M2アガロースビーズと免疫沈降させ、SDS-PAGEに供し、抗Flag抗体（Tollip）、抗HA標識抗体（カベオリン-1）、または抗VSV標識抗体（IRAK-1）を用いてウェスタンブロッティングを行った。カベオリン-1はdelC2 Tollip変異体と共沈殿を生じなかった（図7C）。IRAK-1は、1-178または47-178（C2）のTollip変異体のいずれとも共沈殿を生じなかったが、delC2 Tollip変異体とは共沈殿を生じた。これらの結果は、TollipのC2ドメインとカベオリン-1との結合、およびTollipのCUEドメインとIRAK-1との結合によって3連構造体を形成するという可能性を示唆している。
【０１２３】
カベオリン-1とIRAK-1が直接結合する可能性もあるため、以下の実験を行った。HAで標識した完全長のカベオリン-1（HA-cav-wt）、および骨格ドメインを欠くHA-cav-d82を構築した。Flagで標識した完全長のTollip（FLAG-Tollip-wt）、およびC2ドメインを欠くFLAG-Tollip-dC2；ならびにVSVで標識した完全長のIRAK-1（VSV-IRAK-wt）、およびCTドメインを欠くVSV-IRAK-dCTもまた構築した。これらのタンパク質をCOS細胞で共発現させ、細胞溶解物を上述のように免疫沈降させた。得られた結果を図7Fに示す。TollipおよびIRAKはいずれも、完全長のものすべてを発現させた場合に共沈殿を生じた。Tollipは、IRAK-dCTを発現させた場合に共沈殿を生じたが、IRAKは共沈殿を生じなかった。TollipもIRAK-1もTollip-dC2を発現させた場合に共沈殿を生じなかった。したがって、カベオリン-1とIRAKが直接結合しないこと、またTollipのC2ドメインがカベオリン-1と結合し、またCUEドメインがIRAK-1と結合することが強く示された。
【０１２４】
（実施例8）単球におけるTollipに対するsiRNAは、CD26によって誘導されるTTを負荷したT細胞の増殖を低減させる
CD26とカベオリン-1の相互作用を介したシグナル伝達にTollipの役割を調べるために、図8Aに示す手順に従ってT細胞増殖アッセイを実施した。ウェスタンブロット解析の結果、いずれのsiRNAとも、内因性のTollipの発現を特異的にノックダウンすることが示された（図8B）。単球を破傷風トキソイド（TT）およびrsCD26で刺激すると、Tollipがノックダウンされた細胞のみがT細胞の増殖を阻害した（図8C）。これらの結果は、Tollipが、CD26とカベオリン-1の相互作用を介するシグナル伝達における正の調節因子として重要な役割を果たすことを示唆している。
【０１２５】
以上の結果から、TollipはCD26による刺激後、IRAK-1をカベオリン-1に動員し、IRAK-1を放出し、CD86の発現増強をもたらす可能性がある。Tollipが減少すると、カベオリン-1へのIRAK-1の動員が減少する可能性があり、したがってCD26によって誘導されるシグナル伝達が低下する可能性がある。
【０１２６】
産業上の利用可能性
本発明は、CD26とカベオリン-1の相互作用が、抗原を負荷した単球上のCD86の発現増強、およびこれに続くT細胞上におけるCD28との結合に重要な役割を果たし、抗原特異的なT細胞活性化をもたらすという発見を含む。CD86の発現増強は、強力なT細胞-APC相互作用をもたらし、これは活性化記憶T細胞の局所的な発生、および免疫応答の活性化、ならびに結果として様々な炎症性疾患の発症をもたらす。本発明は、活性化記憶T細胞とAPCの相互作用に直接干渉することによる、自己免疫疾患または他の免疫性疾患を治療する新規なアプローチを提供する。さらに、CD26のポケット構造とカベオリン-1の骨格ドメインの相互作用、カベオリン-1の骨格ドメインとTollipのC2ドメインとの間の相互作用、および/またはTollipのCUEドメインとIRAK-1のCTドメインの相互作用を標的とすることは、免疫性疾患だけでなく、免疫応答を増強する戦略としての癌の免疫療法およびウイルスのワクチン接種においても、抗原特異的な免疫応答を調節する作動薬または拮抗薬を利用した新規な治療法につながる可能性がある。
【０１２７】
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】CD26結合タンパク質の精製および同定を示す。図1Aは、SDS-PAGEと次の銀染色に供した指定の画分の写真である。THP-1細胞の全細胞溶解物（溶解物）、擬似精製由来の溶出画分（ADAビーズ）、THP-1細胞用のCD26-ADAセファロースカラムの溶出画分（溶出）由来のフロースルー画分（洗浄）。CD26-ADAセファロースカラムから溶出されたタンパク質をMS解析で同定し、右に記載した。図1Bは、可溶性CD26（sCD26）と共に共培養したTHP-1細胞の免疫ブロッティングの結果、および抗カベオリン-1（右のパネル）または抗CD26抗体（左のパネル）のいずれかによる免疫沈降法の結果（IP）を示す写真である。図1Cは、細菌によって産生されたGST融合カベオリン-1およびその変異体を模式図で示す。1〜81位の残基はN末端領域（右側の点を付した四角）を含み、82〜101位の残基は骨格ドメイン（SCD）（黒四角）を含み、102〜134位の残基は膜貫通領域（斜線の四角）を含み、また135〜178位の残基はC末端領域（左側の点を付した四角）を含む。図1Dは、J.CD26細胞の溶解物とインキュベートしたGST融合カベオリン-1およびその変異体の、抗CD26抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびその後のストリッピングと抗GST抗体による再プローブの結果を示す写真である。図1Eは、テキサスレッドを結合させたsCD26（rsVD26テキサスレッド）とインキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡検査により可視化した、トランスフェクトされたHEK293細胞を示す写真。細胞には、GFPを融合した野生型のカベオリン-1（wt）（a〜c）、SCDを欠く欠失変異体（del 82-101）（d〜f）、およびGFPベクターのみ（g〜i）をトランスフェクトした。バーは10μmのスケールを示す。図1Fは、COS-7細胞で産生され、GSHビーズで精製したGST融合CD26およびその欠失変異体を模式図で示す。膜貫通領域および細胞質ゾル領域が欠失している。201〜211位の残基は、カベオリン結合ドメイン（CBD）を含む。DPPIV酵素活性を欠失させるために、630位のセリン残基にアラニン残基の変異を導入した（S630A）。図1Gは、THP-1細胞溶解物とインキュベートしたGST融合CD26、およびその欠失変異体の、抗カベオリン-1抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびその後のストリッピングと抗GST抗体による再プローブの結果を示す写真である。図1Hは、テキサスレッドを結合したカベオリン-1とインキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡検査により可視化した、トランスフェクトされたHEK293細胞を示す写真である。細胞には、GFPを融合した野生型のCD26（wt）（a〜c）、CBDを欠く欠失変異体（del 201-211）（d〜f）、DPPIV活性欠損変異体（S630A）（g〜i）、およびGFPベクターのみ（j〜l）をトランスフェクトした。GFPを融合した野生型CD26（wt）をトランスフェクトしたHEK293細胞を、DPPIV阻害剤バリン-ピロリジド（Val-Pyr）とともにインキュベートした後に、テキサスレッドを結合したカベオリン-1（m〜o）を添加した。Val-Pyrと共にインキュベートしたGFP融合野生型CD26（wt）をトランスフェクトしたHEK293細胞に、テキサスレッドを結合したADAを添加した（p〜r）。バーは10μmのスケールを示す。
【図２】単球中のカベオリン-1が、破傷風トキソイド（TT）処理によって細胞表面に露出し、活性化T細胞上のCD26と相互作用したことを示す。図2Aは、単球の細胞表面のカベオリン-1の経時的な検出を示す。単球をTT存在下（黒丸）、またはTT非存在下（白丸）で、所定の時間インキュベートするか、またはフィリピンと30分間プレインキュベートした後に、TT存在下（黒三角）、またはTT非存在下（白三角）で、所定の時間インキュベートした。陽性細胞率（%）のデータを、5回の独立した実験の平均±標準誤差（SE）で示す。アスタリスクは、有意な上昇を示した点を示す。TTを負荷した単球中のカベオリン-1の平均蛍光強度（MFI）の代表的な数を示した。図2Bは、CD26とカベオリン-1が、活性化T細胞中およびTTを負荷した単球中で共局在することを示す写真である。バーは10μmのスケールを示す。図2Cは、活性化T細胞と、TTを負荷した単球のコンジュゲート中にCD26とカベオリン-1が共存することを示す写真である。3つの代表的なコンジュゲートを示した（conj#1〜#3）。バーは10μmのスケールを示す。図2Dは、T細胞と単球との細胞コンジュゲーションの定量を示す。単球をTT存在下（黒丸）、またはTT非存在下（白丸）で、所定の時間インキュベートするか、またはフィリピンと30分間プレインキュベートした後に、TT存在下（黒三角）、またはTT非存在下（白三角）で、所定の時間インキュベートした。データは、5回の独立した実験で解析されたカバーガラス視野内における500個の無作為に選択された細胞におけるT細胞-単球コンジュゲーション頻度の平均±SEを示す。アスタリスクは、有意な上昇を示した点を示す。
【図３】CD26によって、TTを負荷した単球におけるカベオリン-1のリン酸化を誘導した後に、Tollipを放出させてIRAKをリン酸化することを示す図である。図3Aは、野生型のCD26（wt）（a）、またはCBDを欠く欠失変異体のCD26（del 201-211）（b）をコーティングしたポリスチレンラテックスビーズとインキュベートした、TTを負荷した単球上のカベオリン-1を検出した写真である。細胞およびビーズは、共焦点レーザー顕微鏡検査により可視化した。パネルは、FITCビューと合成した位相差写真であった。バーは10μmのスケールを示す。図3Bは、CD26（wt）で刺激し、TTを負荷した単球におけるカベオリン-1の、抗ホスホカベオリン-1抗体または抗Tollip抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびこれに続くストリッピングと抗カベオリン-1抗体による再プローブの結果を示す写真、ならびに単球溶解物を対象とした抗IRAK抗体による免疫ブロッティングの結果を示す写真である（上部パネル）。IRAKのバンドの位置を白矢頭で示し、IRAKのスーパーシフトしたバンドを黒矢頭で示す。下のパネルは、抗カベオリン-1によって免疫沈降を生じたホスホカベオリン（白いバー）とTollip（黒いバー）の相対強度を示す棒グラフを示す。図3Cは、CD26（del 201-211）で刺激し、TTを負荷した単球におけるカベオリン-1の、抗ホスホカベオリン-1抗体または抗Tollip抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびこれに続くストリッピングと抗カベオリン-1抗体による再プローブの結果を示す写真、ならびに単球溶解物を対象とした抗IRAK抗体による免疫ブロッティングの結果を示す写真である（上のパネル）。IRAKのバンドの位置を白矢頭で示し、またIRAKのスーパーシフトしたバンドを黒矢頭で示す。下のパネルは、抗カベオリン-1によって免疫沈降を生じたホスホカベオリン（白いバー）およびTollip（黒いバー）の相対強度を示す棒グラフを示す。図3Dは、GFP-カベオリン-1をトランスフェクトし、抗Tollip抗体および抗ラットIgテキサスレッド抗体で染色して、共焦点レーザー顕微鏡検査により可視化したTHP-1細胞を示す写真である。バーは10μmのスケールを示す。図3Eは、内因性のカベオリン-1および内因性のTollipの、個々の抗体を用いた免疫ブロッティングの結果を示す写真である。図3Fは、THP-1細胞溶解物とインキュベートしたGST融合カベオリン-1と欠失変異体の、抗Tollip抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびこれに続くストリッピングと抗GST抗体による再プローブの結果を示す写真である。図3Gは、細菌に産生させたGST融合Tollipおよび欠失変異体を模式図で示す。47〜178位の残基（黒四角）はC2領域（タンパク質キナーゼC保存領域2）であり、178〜274位の残基（左側の灰色の四角）はCUEドメイン（ユビキチン結合酵素結合ドメイン）である。図3Hは、THP-1細胞溶解物とインキュベートしたGST融合Tollipと欠失変異体の、抗カベオリン-1抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびこれに続くストリッピングと抗GST抗体による再プローブの結果を示す写真である。
【図４】TTを負荷した単球のCD26による刺激がNF-κBを活性化してCD86発現を増強することを示す図である。図4Aは、ELISA法をベースにしたDNA結合タンパク質アッセイで検出した、TTを負荷した単球の存在下でCD26によって活性化される転写因子のレベルを示すグラフである。結合活性は655 nmのOD値で示した。データは3回の実験の平均±SEを示す。アスタリスクは、有意な上昇を示した点を示す。図4Bは、ヒトCD86遺伝子および欠失変異体の5'側隣接領域のルシフェラーゼキメラコンストラクトの模式図である。-1187位および-1127位の2つのGASエレメント（γ-インターフェロン活性化部位）を黒丸で示し、-612位および-238位の2つのNF-κB部位を黒三角で示す。転写開始部位（+1）に対する個々のコンストラクトの位置を示す。図4Cは、ルシフェラーゼアッセイによって検出した、CD26とカベオリン-1の相互作用後の、ヒトCD86の5'側隣接プロモーター領域のルシフェラーゼキメラ変異体のCD86プロモーター活性を示すグラフである。ルシフェラーゼ活性を、1μgの添加タンパク質に対する相対値として示す。データは3回の実験の平均±SEを示す。アスタリスクは、有意な上昇を示した点を示す。図4Dは、カベオリン-1と様々な用量のCD26の相互作用後の、CD86プロモーター活性を示すグラフである。ルシフェラーゼ活性を、1μgの添加タンパク質に対する相対値として示す。データは3回の実験の平均±SEを示す。
【図５】カベオリン-1に対するsiRNAが、TTを負荷した単球におけるCD86の発現増強に対するCD26の作用を阻害すること示す。図5Aは、テキサスレッドを結合したsiRNAを、HVJ-Eベクターを用いてトランスフェクトした精製単球を示す写真である。細胞は共焦点レーザー顕微鏡検査により可視化した。図5Bは、センスのsiRNAまたはミスマッチを含むsiRNAを使用して、または使用せずにトランスフェクトした単球の溶解物の、抗カベオリン-1抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、およびこれに続くストリッピングと抗βアクチン抗体による再プローブの結果を示す写真である。図5Cは、siRNAをトランスフェクトし、TTを負荷した後にCD26で刺激した単球におけるCD86の発現を示すヒストグラムである。5回の独立した実験の代表的なヒストグラムを示す。矢頭は、強い陽性領域を示す。図5Dは、図5Cで検討した細胞表面のCD86の平均蛍光強度（MFI）を示す棒グラフである。データは5回の独立した実験の平均±SEを示す。**は、センスsiRNA使用時の有意ではない変化を示した点を示す。一方、*は、有意な上昇を示した点を示す。
【図６】図6Aは、免疫増強に至るCD26とカベオリン-1の相互作用のモデルを示す。（1）単球（APC）中のカベオリン-1は、Tollipの有無にかかわらず内膜に存在する。（2）カベオラを介した破傷風トキソイドの単球への取り込み後、カベオリン-1集団の一部はフリップフロップして、TTを負荷した単球の細胞外表面に露呈される。（3）CD26陽性活性化T細胞の、抗原を負荷したAPC領域への移動により、TT抗原提示APCとの接触および、免疫学的シナプスの形成が生じ、これはCD26とカベオリン-1の結合をもたらす。カベオリン-1は接触領域において凝集してリン酸化を受ける。（4）リン酸化カベオリン-1（ホスホカベオリン-1）は、おそらくは構造が変化したために、複合体を形成したTollipを放出し、次に細胞質ゾル中のTollipがIRAKと相互作用する。（5）IRAKのリン酸化後に、NF-κBは活性化されて、CD86の発現増強をもたらす。図6Bは、T細胞とAPCの局所的な相互作用と免疫応答を示す。（1）カベオラを介した記憶抗原のAPCへの侵入は、MHCクラスII分子上の抗原ペプチドの提示およびカベオリン-1の露呈をもたらす。（2）成熟した免疫学的シナプスの形成を通じて、APCは記憶T細胞を、TCRおよびCD86/CD80-CD28などの共刺激分子を介して刺激する。同時にAPC上のカベオリン-1は記憶T細胞上のCD26と結合し、CD86発現はAPC中で増強され、また記憶T細胞はCD26の共刺激作用を介して活性化される。（3、4）CD86の発現増強によって、より大きなT細胞-APC相互作用が生じ、これは次に、記憶活性化T細胞の局所的な発生と、免疫応答の活性化をもたらし、自己免疫疾患などを引き起こす場合がある。
【図７】図7Aは、Tollip特異的抗体またはIRAK-1特異的抗体と免疫沈降を生じた内因性のカベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1を示す写真である。図7Bは、カベオリン-1、Tollip、およびIRAK-1のドメイン構造を模式図で示す。図7Cは、HA標識カベオリン-1およびVSV標識IRAK-1を共発現させたFlag標識野生型Tollipおよびその欠失変異体を対象とした、個々の標識特異的抗体による免疫ブロッティングの結果を示す写真である。図7Dは、HA標識カベオリン-1、Flag標識Tollip、VSV標識IRAK-1、およびそれらの欠失変異体を対象とした、個々の標識特異的抗体による免疫ブロッティングの結果を示す写真である。
【図８】図8Aは、実施例8記載の実験のタイムテーブルを示す。図8Bは、Tollipに対するsiRNAによってTollipをノックダウンした細胞の溶解物の、抗Tollip抗体、抗カベオリン-1抗体、および抗IRAK-1抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、これに続くストリッピングと抗βアクチン抗体による再プローブの結果を示す写真である。図8Cは、Tollipに対するsiRNAをトランスフェクトした単球とともにインキュベートした時の、T細胞におけるのBrdUの取り込みを示す棒グラフである。
【図９】CD26シグナル伝達経路のモデルを示す。（1）カベオリン-1はAPC中でTollipおよびIRAK-1と3連構造体を形成する。（2）抗原の取り込み後に、カベオリン-1は、抗原を負荷したAPCの細胞外表面に露呈される。（3）抗原を負荷したAPC上のカベオリン-1と結合する活性化T細胞上のCD26。カベオリン-1分子は接触領域に凝集し、リン酸化を受ける。（4）リン酸化されたカベオリン-1はTollipおよびIRAK-1を、おそらくは構造が変化したために放出する。（5）IRAKはリン酸化後に、TRAF6（TNF受容体結合因子6）と相互作用する可能性があり、TAK1を介したNF-κBの活性化にもたらす。その後NF-κBの活性化は、CD86の発現増強につながる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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