(57)【要約】  本発明は、ポリペプチドの可逆的凝集および/または解離の代替法を提供する。本発明のタンパク質またはポリペプチドは固有の凝集能力を有し、その凝集は、このポリペプチドの自在に不規則になるドメイン中に局在するペプチド反復配列の存在および構造に基づく、ポリペプチドのオリゴマー化である。ペプチド反復配列を含む自在に不規則になるドメインは、タンパク質アミノ酸配列のN末端と非常に近接して位置することが好ましい。それぞれのペプチド反復配列は、アミノ酸配列:PHGGGWGQを有する1〜4個の同一のオクタペプチドを含む配列を有することが好ましい。好ましいタンパク質は、細胞プリオンタンパク質(PrPC)、およびそれぞれ固有の可逆的凝集能力および解離能力を有する改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む群から選択される。凝集の新たな機構のために、タンパク質のオリゴマー化反応は流体環境中において、この流体環境のpHに応じて可逆的である。オリゴマー化は6.2〜7.8のpHで起こり、モノマーへの解離は4.5〜5.5のpH範囲であると報告されている。
2007523831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを可逆的に凝集および/または解離させる方法であって、固有の凝集能力を有するポリペプチドを提供することを含み、流体環境中での前記ポリペプチドのオリゴマー化が、前記流体環境のpHに依存して自在に不規則になる前記ポリペプチドのドメイン中に局在するペプチド反復配列の存在および構造に基づく方法。
【請求項２】
前記ペプチド反復配列を含む前記自在に不規則になるドメインが、前記ポリペプチドのアミノ酸配列のN末端と非常に近接して位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドの可逆的オリゴマー化反応を、流体環境のpHを変えることによって前記流体環境中で行う、前記請求項の1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴマー化を6.2〜7.8のpH範囲で行い、かつ/あるいはモノマーへの解離を4.5〜5.5のpH範囲で行う、請求項1から3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド反復配列のそれぞれが、オクタペプチド、または擬似オクタペプチド、あるいはヘキサペプチドまたは擬似ヘキサペプチドを含む配列を有する、請求項1から4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記オクタペプチドが以下のアミノ酸配列：PHGGGWGQを有し、擬似オクタペプチドが前記配列に由来する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘキサペプチドが以下のアミノ酸配列:PHNPGYを有し、擬似ヘキサペプチドが前記配列に由来する、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド反復配列のそれぞれが、C末端βターン構造と結合したN末端ループ構造を含む、請求項1から5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド反復配列が4個の同一のオクタペプチドを含む、請求項1から5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固有の可逆的凝集能力および解離能力を有する改変ポリペプチドまたは融合タンパク質であって、流体環境中での前記ポリペプチドのオリゴマー化が、前記流体環境のpHに依存して自在に不規則になる前記ポリペプチドのドメイン中に含まれているペプチド反復配列の存在および構造に基づく、改変ポリペプチドまたは融合タンパク質。
【請求項１１】
前記可逆的凝集能力および解離能力が流体環境中のpHの変化に基づく、請求項10に記載の改変ポリペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチド反復配列のそれぞれが、オクタペプチド、および/または擬似オクタペプチド、および/またはヘキサペプチド、および/または擬似ヘキサペプチドを含む配列を有する、請求項10または11に記載の改変ポリペプチド。
【請求項１３】
前記オクタペプチドがアミノ酸配列:PHGGGWGQを有し、前記ヘキサペプチドがアミノ酸配列:PHNPGYを有し、前記擬似オクタペプチドまたは擬似ヘキサペプチドが前記配列に由来する、請求項12に記載の改変ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチド反復配列のそれぞれが、C末端βターン構造と結合したN末端ループ構造を含む、請求項10または11に記載の改変ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項10から14のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドの使用であって、ヒトまたは動物性プリオンタンパク質を検出するための診断試験を提供および/または施用するために、前記改変ポリペプチドを使用する使用。
【請求項１６】
請求項10から14のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドの使用であって、前記改変ポリペプチドが固相に固定されている使用。
【請求項１７】
請求項16に記載の改変ポリペプチドの使用であって、ペプチド反復配列を含む融合タンパク質および/または天然タンパク質の親和性精製および/または富化および/または検出を提供および/または施用するために前記改変ポリペプチドを使用する使用。
【請求項１８】
請求項10から14のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドの使用であって、vCJDなどのTSEに対する予防、医薬または療法および/またはそれらの施用を提供するために前記改変ポリペプチドをプリオンタンパク質の特異的認識用に使用する使用。
【請求項１９】
請求項10から14のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチド凝集体の三次元構造と選択的に結合するリガンドを生成するためのOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドを提供するために前記改変ポリペプチドを使用する使用。
【請求項２０】
請求項19に記載の改変ポリペプチドの使用であって、ポリクローナル、モノクローナル、および/または改変抗体を生成するためのOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドを提供するために前記改変ポリペプチドを使用する使用。
【請求項２１】
請求項10から14のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチド凝集体の三次元構造とリガンドの結合を検出するセンサーを提供するために前記改変ポリペプチドを使用する使用。
【請求項２２】
請求項10から14のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドの使用であって、化学的および/または物理的センサーチップを含めたセンサー技術用のOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドを提供するために前記改変ポリペプチドを使用する使用。
【請求項２３】
請求項1から9のいずれか１項に記載の方法の使用であって、ヒトまたは動物性プリオンタンパク質を検出するための診断試験を提供および/または施用するためにポリペプチドの可逆的凝集および/または解離を使用する使用。
【請求項２４】
請求項1から9のいずれか１項に記載の方法の使用であって、ペプチド反復配列を含む融合タンパク質および/または天然タンパク質の、親和性精製および/または富化および/または検出を提供および/または施用するためにポリペプチドの可逆的凝集および/または解離を使用する使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、その開示があらゆる目的で参照により明確に含まれている、2003年3月25日に出願された正規の国内出願である米国特許出願第10/397,059号の優先権を主張するものである。
【０００２】
プリオンタンパク質(PrP)は、伝達性海綿状脳症(TSE)の感染物質を同定するための試みにおいて検出されており、その結果我々は、スクレピー形であるPrPScの病理学的活性について多くを知っているが、一方で細胞形であるPrPCの生理的機能は依然として謎である(Prusiner、S.B.(1998) Prions.Proc Natl Acad Sci USA 95、13363〜13383)。PrPCは健常な成体の脳内に不均一に分布するシナプスの糖タンパク質であり、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー、および脂質ラフトと呼ばれている膜ドメインとの仕切りを介して細胞表面と結合している。細胞表面上にPrPCが局在することは、PrPCが細胞接着、リガンドの取り込みまたは経膜シグナルにおいて機能することができることを示唆する。
【０００３】
ニワトリPrPCの生化学的分析に基づいて、PrPCはシナプス終末のコリン作動性受容体の発現の制御と関係がある可能性があると仮定された。実際、PrPC過剰発現トランスゲニックマウスの免疫組織化学によって、PrPCが主としてシナプス原形質膜に、ある程度はシナプス小胞に局在する、シナプスの発現パターンが明らかになった。電子顕微鏡によって、このタンパク質がシナプス前部とシナプス後部の両方に存在することが示された。PrPCは伸長する軸索に沿っても局在しており、PrPCがおそらく接着性タンパク質として、軸索の成長において役割を果たしている可能性があることが一層明らかとなっている。
【０００４】
配列PHGGGWGQの反復配列からなるオクタペプチド反復配列領域は、哺乳動物中のPrPの最も保存されたセグメントである(Schatzl、H.M.、Da Costa、M.、Taylor、L.、Cohen、F.E.およびPrusiner、S.B. (1995) Prion protein gene variation among primates. J Mol Biol 245、362〜374; Wopfner、F.、Weidenhofer、G.、Schneider、R.、von Brunn、A.、Gilch、S.、Schwarz、T.F.、Werner、T.およびSchatzl、H.M. (1999) Analysis of 27 mammalian and 9 avian PrPs reveals high conservation of flexible regions of the prion protein. J Mol Biol 289、1163〜1178)。ヒトPrP中の残基60〜91は4個のHis含有オクタペプチド反復配列(OPR)からなり、残基51〜59は相同配列PQGGGGWGQからなる(図1)。
【０００５】
図1は、ヒトプリオンタンパク質(hPrP)の一次構造を示す。成熟ヒトプリオンタンパク質は、残基23〜230からなる。残基51〜91のOPR領域の詳細なアミノ酸配列(グレーのボックス)は底部に示し、核磁気共鳴(NMR)スペクトルにおいて明確に帰属された残基には下線を引いてある。セグメント54〜89に関しては、一組の共鳴シグナルが、それぞれの反復アミノ酸に関して検出された。正常な二次構造要素は黒色で表す。Cys179とCys214の間のジスルフィド結合(S-S)は、グレーの線として描く。上部の矢印は、この試験で使用したhPrP構築物のN末端切断部位を示す。
【０００６】
哺乳動物および鳥類のプリオンタンパク質のOPRと銅の結合は、Hornshawおよび同僚によって最初に実証されており(Hornshaw、M.P.、McDermott、J.R.、Candy、J.M.およびLakey、J.H. (1995) Copper binding to the N-terminal tandem repeat region of mammalian and avian prion protein : structural studies using synthetic peptides.Biochem Biophys Res Commun 214、993〜999 ; Hornshaw、M.P.、McDermott、J.R.、Candy、J.M.およびLakey、J.H. (1995) Copper-Binding to the N-Terminal Tandem Repeat Region of Mammalian and Avian Prion Protein-Structural Studies Using Synthetic Peptides.Biochemical and Biophysical Research Communications 214、993〜999)、銅の結合はPrPCの生理的機能と関係があることが示唆されてきている(Brown、D.R.他、(1997) The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature 390、684〜687)。近年、Cu2+の存在下で結合が増大する、PrPCのOPR内のヘパリン結合部位が同定されてきている。ラミニン受容体タンパク質がヘパラン硫酸の存在下でPrPCの受容体として作用するという発見によって、プリオンタンパク質、銅、ヘパリン/ヘパラン硫酸と、プリオンタンパク質の細胞機能と関係がある受容体タンパク質との間の複雑な相互作用が示唆される。PrPCがシナプス小胞から放出されて、シナプス間隙におけるタンパク質の非特異的な銅結合を妨げ、それがエンドサイトーシスによるシナプス前部への銅の再摂取を助長することも示唆されてきている。
【０００７】
従来技術で見られた問題点
伝達性海綿状脳症(TSE)またはプリオン病は、プリオンタンパク質(PrPSc)から構成される従来とは異なる感染物質(プリオン)によって引き起こされる中枢神経系の致死的障害である(Prusiner、S.B.(1998) Prions.Proc Natl Acad Sci U S A 95、13363〜13383)。TSEにおける重要な事象は、プリオン遺伝子PRNPによってコードされる、宿主タンパク質、細胞プリオンタンパク質(PrPC)の、アミロイド線維に凝集し、神経およびリンパ性網皮細胞中に蓄積する神経病理的イソ型PrPScへの立体配座の変化である(Doi、S.、Ito、M.、Shinagawa、M.、Sato、G.、Isomura、H.およびGoto、H.(1988) Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69 (Pt4)、955〜960 ; Wadsworth、J.D.F.、Joiner、S.、Hill、A.F.、Campbell、T.A.、Desbruslais、M.、Luthert、P.J.およびCollinge、J.(2001) Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet 358、171〜180)。したがって、PCRなどの他の感染物質を検出するために使用される診断戦略は無益である。しかしながら、in vivoスクリーニング試験または感染個体の同定法として、臨床症状の初期段階または症状発現前の相での正確な診断法が必要とされている。過去数年多大な努力がなされてきているが、これらの試験はまだ依然として利用可能ではない。
【０００８】
PrPScの形成はTSEにおいてのみ起こり、したがって、これらの障害に関する特異的マーカーである。PrPScが広く分布し、TSE感染宿主の身体中での感染性があるにもかかわらず、組織化学的および生化学的病変は中枢神経系(CNS)のみに限られ、海綿状脳症と呼ばれる。散発性および遺伝性TSEでは、PrPScが由来する組織は明らかではないが、PrPScはCNSで始まり、したがって容易に接触可能な組織または体液中のPrPScの検出に基づく初期診断法の開発を無益なものにする可能性がある。プリオンによる感染中に、PrPScはリンパ性網皮組織中で容易に検出可能であり(Doi、S.他、(1988) Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69 (Pt4)、955〜960)、ヒツジおよびvCJDにおけるスクレピー(Hill、A.F.、Zeidler、M.、Ironside、J.およびCollinge、J.(1997) Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy.Lancet 349、99〜100)、BSE感染蓄牛からヒトに伝染している新しい変異型のクロイツフェルトヤコブ病の診断用の、バイオプシーで採取した扁桃組織中のPrPScの測定の提案につながる。
【０００９】
近年、TSEの症状発現前のin vivo診断用の、末梢および接触可能な組織(扁桃など)または体液(脳脊髄液(CSF)または血液など)中のPrPSc検出の考えられる用途に、多大な注意が払われている。実験データは何らかの形のヒトTSEに冒された患者の血液中で感染性を検出できなかったが、主にリンパ性網皮組織中の高レベルのPrPScおよび感染性のために、血液中の感染性に関する懸念が増大しているvCJD患者は例外であると思われる。
【００１０】
症状発現前診断の見通しから、診断法の感度およびPrPScを濃縮するための手順が重要になる。なぜなら、CNS外のPrPScの量は非常に少ない可能性があるからである。ELISAなどの現在利用可能なPrPSc検出法の検出限界は、約2pMである(Ingrosso、L.、Vetrugno、V.、Cardone、F.およびPocchiari、M.(2002) Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies.Trends in Molecular Medicine 8、273〜280)。PrPScと高い親和性で結合する、リンタングステン酸ナトリウム(Wadsworth、J.D.F.他、(2001) Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet 358、171〜180)、および新たに発見された分子、プラスミノゲン(Fischer、M.B.、Roeckl、C.、Parizek、P.、Schwarz、H.P.およびAguzzi、A.(2000) Binding of disease-associated prion protein to plasminogen.Nature 408、479〜483)およびプロトカドヘリン-2(Brown、P.、Cervenakova、L.およびDiringer、H.(2001) Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease.J Lab Clin Med 137、5〜13)などを用いる、PrPSc用の改善された抽出法は、TSEの症状発現前診断に関する、新たな希望を増大させる可能性がある。PrPScの最小の検出可能レベルを高めるための本来の手法は、Saborioおよび同僚に由来するものであり(Saborio、G.P.、Permanne、B.およびSoto、C.(2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.Nature 411、810〜813)、彼らはPrPScを10〜100倍増幅させるための有効なプロトコルを開発した。
【特許文献１】米国特許出願第10/397,059号
【非特許文献１】Prusiner、S.B.(1998) Prions.Proc Natl Acad Sci USA 95、13363〜13383
【非特許文献２】Schatzl、H.M.、Da Costa、M.、Taylor、L.、Cohen、F.E.およびPrusiner、S.B. (1995) Prion protein gene variation among primates. J Mol Biol 245、362〜374
【非特許文献３】Wopfner、F.、Weidenhofer、G.、Schneider、R.、von Brunn、A.、Gilch、S.、Schwarz、T.F.、Werner、T.およびSchatzl、H.M. (1999) Analysis of 27 mammalian and 9 avian PrPs reveals high conservation of flexible regions of the prion protein. J Mol Biol 289、1163〜1178
【非特許文献４】Hornshaw、M.P.、McDermott、J.R.、Candy、J.M.およびLakey、J.H. (1995) Copper binding to the N-terminal tandem repeat region of mammalian and avian prion protein : structural studies using synthetic peptides.Biochem Biophys Res Commun 214、993〜999
【非特許文献５】Hornshaw、M.P.、McDermott、J.R.、Candy、J.M.およびLakey、J.H. (1995) Copper-Binding to the N-Terminal Tandem Repeat Region of Mammalian and Avian Prion Protein-Structural Studies Using Synthetic Peptides.Biochemical and Biophysical Research Communications 214、993〜999
【非特許文献６】Brown、D.R.他、(1997) The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature 390、684〜687
【非特許文献７】Prusiner、S.B.(1998) Prions.Proc Natl Acad Sci U S A 95、13363〜13383
【非特許文献８】Doi、S.、Ito、M.、Shinagawa、M.、Sato、G.、Isomura、H.およびGoto、H.(1988) Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69 (Pt4)、955〜960
【非特許文献９】Wadsworth、J.D.F.、Joiner、S.、Hill、A.F.、Campbell、T.A.、Desbruslais、M.、Luthert、P.J.およびCollinge、J.(2001) Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet 358、171〜180
【非特許文献１０】Doi、S.他、(1988) Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69 (Pt4)、955〜960
【非特許文献１１】Hill、A.F.、Zeidler、M.、Ironside、J.およびCollinge、J.(1997) Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy.Lancet 349、99〜100
【非特許文献１２】Ingrosso、L.、Vetrugno、V.、Cardone、F.およびPocchiari、M.(2002) Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies.Trends in Molecular Medicine 8、273〜280
【非特許文献１３】Wadsworth、J.D.F.他、(2001) Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet 358、171〜180
【非特許文献１４】Fischer、M.B.、Roeckl、C.、Parizek、P.、Schwarz、H.P.およびAguzzi、A.(2000) Binding of disease-associated prion protein to plasminogen.Nature 408、479〜483
【非特許文献１５】Brown、P.、Cervenakova、L.およびDiringer、H.(2001) Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease.J Lab Clin Med 137、5〜13
【非特許文献１６】Saborio、G.P.、Permanne、B.およびSoto、C.(2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.Nature 411、810〜813
【非特許文献１７】Schultz、S.(1987) Sensitivityおよびdynamics of bioreceptor-based biosensors.Ann.ニューヨーク、Acad.Sci.506、406〜414
【非特許文献１８】Rigler、P.、Ulrich、W.P.、Hoffmann、P.、Mayer、M.およびVogel、H.(2003) Reversible immobilization of peptides: surface modification and in situ detection by attenuated total reflection FTIR spectroscopy.Chemphyschem.4、268〜275
【非特許文献１９】Zahn、R.他、(2000) NMR solution structure of the human prion protein.Proc Natl Acad Sci U S A 97、145〜150
【非特許文献２０】Burns、C.S.他(2002) Molecular features of the copper binding sites in the octarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41、3991〜4001
【非特許文献２１】Hundt、C.他、(2001) Identification of interaction domains of the prion protein with its 37-kDa/67-kDa laminin receptor.Embo Journal 20、5876〜5886
【非特許文献２２】Dyson、H.J.およびWright、P.E.(2001) Nuclear magnetic resonance methods for elucidation of structure and dynamics in disordered states.Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules、Pt B 339、258〜270
【非特許文献２３】Liu、A.Z.、Riek、R.、Wider、G.、von Schroetter、C.、Zahn、R.およびWuthrich、K.(2000) NMR experiments for resonance assignments of C-13、N-15 doubly-labeled flexible polypeptides: Application to the human prion protein hPrP(23〜230).Journal of Biomolecular Nmr 16、127〜138
【非特許文献２４】Holm、L.およびSander、C.(1993) Protein-Structure Comparison by Alignment of Distance Matrices.Journal of Molecular Biology 233、123〜138
【非特許文献２５】Smith、C.J.、Drake、A.F.、Banfield、B.A.、Bloom-berg、G.B.、Palmer、M.S.、Clarke、A.R.およびCollinge、J.(1997) Conformational properties of the prion octa-repeat and hydrophobic sequences.Febs Letters 405、378〜384
【非特許文献２６】Yoshida、H.、Matsushima、N.、Kumaki、Y.、Nakata、M.およびHikichi、K.(2000) NMR studies of model peptides of PHGGGWGQ repeats within the N-terminus of prion proteins: A loop conformation with histidine and tryptophan in close proximity.Journal of Biochemistry 128、271〜281
【非特許文献２７】Pauly、P.C.およびHarris、D.A.(1998) Copper stimulates endocytosis of the prion protein.J Biol Chem 273、33107〜33110
【非特許文献２８】Aronoff-Spencer、E.他、(2000) Identification of the Cu2+ binding sites in the N-terminal domain of the prion protein by EPR and CD spectroscopy.Biochemistry 39、13760〜13771
【非特許文献２９】Viles、J.H.、Cohen、F.E.、Prusiner、S.B.、Goodin、D.B.、Wright、P.E.およびDyson、H.J.(1999) Copper binding to the prion protein: structural implications of four identical cooperative binding sites.Proc Natl Acad Sci U S A 96、2042〜2047
【非特許文献３０】Mange、A.、Milhavet、O.、Umlauf、D.、Harris、D.およびLehmann、S.(2002) PrP-dependent cell adhesion in N2a neuroblastoma cells.Febs Letters 514、159〜162
【非特許文献３１】Lehmann、S.およびHarris、D.A.(1995) A mutant prion protein displays an aberrant membrane association when expressed in cultured cells.J Biol Chem 270、24589〜24597
【非特許文献３２】Agnati、L.F.、Zoli、M.、Stromberg、I.およびFuxe、K.(1995) Intercellular Communication in the Brain-Wiring Versus Volume Transmission.Neuroscience 69、711〜726
【非特許文献３３】Pokutta、S.およびWeis、W.I.(2002) The cytoplasmic face of cell contact sites.Current Opinion in Structural Biology 12、255〜262
【非特許文献３４】Zahn、R.、von Schroetter、C.およびWuthrich、K.(1997) Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding.FEBS Lett 417、400〜404
【非特許文献３５】Guntert、P.、Dotsch、V.、Wider、G.およびWuthrich、K.(1992) Processing of Multidimensional Nmr Data with the New Software Prosa.Journal of Biomolecular Nmr 2、619〜629
【非特許文献３６】Farrow、N.A.、Zhang、O.W.、Formankay、3.D.およびKay、L.E.(1994) A Heteronuclear Correlation Experiment for Simultaneous Determination of N-15 Longitudinal Decay and Chemical-Exchange Rates of Systems in Slow Equilibrium.Journal of Biomolecular Nmr 4、727〜734
【非特許文献３７】Herrmann、T.、Guntert、P.およびWuthrich、K.(2002) Protein NMR structure determination with automated NOE assignment using the new software CANDID and the torsion angle dynamics algorithm DYANA.Journal of Molecular Biology 319、209〜227
【非特許文献３８】Guntert、P.、Mumenthaler、C.およびWuthrich、K.(1997) Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA.Journal of Molecular Biology 273、283〜298
【非特許文献３９】Bartels、C.、Xia、T.H.、Billeter、M.、Guntert、P.およびWuthrich、K.(1995) The Program Xeasy for Computer-Supported Nmr Spectral-Analysis of Biological Macromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 6、1〜10
【非特許文献４０】Luginbuhl、P.、Guntert、P.、Billeter、M.およびWuthrlch、K.(1996) The new program OPAL for molecular dynamics simulations and energy refinements of biological macromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 8、136〜146
【非特許文献４１】Koradi、R.、Billeter、M.およびWuthrich、K.(1996) MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.Journal of Molecular Graphics 14、51〜55
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって本発明の目的は、ポリペプチドの可逆的凝集および/または解離の代替的可能性を提供することである。このようなポリペプチド凝集体の三次元構造と選択的に結合するリガンドを提供することも、本発明の目的である。このようなポリペプチド凝集体の三次元構造とリガンドの結合を検出するセンサーを提供することも、本発明の他の目的である。
【００１２】
これらの目的および他の目的は、請求項1に記載の方法によって、請求項10に記載のタンパク質によって達成される。他の特徴および好ましい特徴は、従属項に由来する。
【００１３】
4.5と5.5の間のpH値での哺乳動物プリオンタンパク質の構造研究によって、N末端の100残基のドメインは自在に不規則になる、すなわち、ランダムコイル情報を有することが確立された。本発明は、6.5と7.8の間のpH値、すなわち細胞膜でのpHにおいて、充分に保存された配列PHGGGWGQを含む組換えヒトプリオンタンパク質hPrP(23〜230)中のオクタペプチド反復配列が構造化されることを記載する。pH6.2でのOPRの核磁気共鳴(NMR)溶液構造によって、マクロ分子状凝集体への可逆的なpH依存性のPrPオリゴマー化を引き起こす新たな構造モチーフが明らかになる。HGGGW-Cu2+の結晶構造と比較すると、銅イオンの結合が、PrP凝集をおそらく調節する立体配座の変化を誘導することが示される。これらの結果によって、シナプス間隙中のリンパ性網皮細胞接着における、細胞プリオンタンパク質の機能的役割が示唆される。
【００１４】
バイオレセプターは、特異的で感度の良いバイオセンサーの基を与えることができる(Schultz、S.(1987) Sensitivityおよびdynamics of bioreceptor-based biosensors.Ann.ニューヨーク、Acad.Sci.506、406〜414)。バイオテクノロジーおよび生物医学における当該の生化学物質用の性質の、バイオレセプターの多くの源が存在する。これらのバイオレセプター(抗体、酵素、膜タンパク質、結合タンパク質)は改変され、現代のバイオテクノロジー技法を使用して多量に生成することができる(Rigler、P.、Ulrich、W.P.、Hoffmann、P.、Mayer、M.およびVogel、H.(2003) Reversible immobilization of peptides: surface modification and in situ detection by attenuated total reflection FTIR spectroscopy.Chemphyschem.4、268〜275)。バイオセンサーの特徴は、類似体-検体の構造を改変することによって微調整することもでき、これによって所与のバイオレセプターとの数桁範囲の大きさ感度ももたらされる。バイオセンサーの最終的な感度は、検体とバイオレセプターの間の反応の解離反応速度によって制限される可能性がある。なぜなら、検体濃度の変化に対する感度とセンサーの応答速度の間には、交換条件があるからである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の利点は以下のことを含む:
・固有の凝集能力を有するポリペプチドまたはタンパク質は、pHに依存して自在に不規則になるこのポリペプチドのドメイン中に局在するペプチド反復配列の存在および構造によって、オリゴマー化させることができる。
・可逆的なポリペプチドの凝集および/または解離に必要とされるペプチド反復配列は（単独、あるいは自在に不規則になったタンパク質ドメイン部分と共に）元のアミノ酸配列の一部であるか、あるいはポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾によって導入することができる。
・オリゴマー化のみが、ポリペプチドまたはタンパク質の流体環境のpHに依存する。
【００１６】
以下の図は、従来技術および本発明を述べることを目的とする。本発明の方法の好ましい実施形態をこれらの図によっても説明し、これは本発明の範囲を制限することを目的としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
NMR溶液構造は、組換え形の完全ヒト(Zahn、R.他、(2000) NMR solution structure of the human prion protein.Proc Natl Acad Sci U S A 97、145〜150)、ウシ、およびネズミPrP、pH4.5、およびシリアンハムスターPrP、pH5.5に関して記載されている。酸性条件下では、すべてのプリオンタンパク質が、二本鎖アンチパラレルβシートおよび3αヘリックスを含む、ほぼ残基121〜230から広がるC末端球状ドメイン、および自在に不規則になった残基23〜120を含むN末端ドメインを含む(図1)。脳の平均的な間質環境であるpH7.3では、利用可能な詳細な構造情報は、酸性条件での構造と大部分が類似している(Zahn他、2000)、pH7で決定されたヒトプリオンタンパク質、hPrP(121〜230)の球状ドメインに対応するC末端断片のNMR構造以外は存在しない(Luigi CalzolaiおよびR.Z.、未発表の結果)。pH8の溶液中で成長する結晶から近年決定された二量体hPrP(90〜231)の結晶構造では、2つの球状ドメインは、鎖間ジスルフィド結合を介して連結している。
【００１８】
PrPCの構造に対するpHの考えられる影響を調べるための試みにおいて、我々は、NMR分光法および動的光散乱法を使用して、溶液中の組換えヒトプリオンタンパク質(hPrP)を研究してきている。これらの研究用に我々は、成熟PrPCおよび2つのN末端切断型PrP構築物に対応する組換えhPrP(23〜230)を生成した(図1)。我々は、4つのOPRヒスチジンのプロトン付加によって、PrPの凝集がもたらされることを見出している。15N標識hPrP(23〜230)の距離的制約の計算から、我々は、pH6.2溶液中のOPRのNMR構造を計算している。この構造を、近年決定された銅結合オクタペプチド反復配列セグメントHGGGW-Cu2+の結晶構造と比較する(Burns、C.S.他(2002) Molecular features of the copper binding sites in the octarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41、3991〜4001)。これらの結果は、銅の存在下および不在下でのPrPC中のOPRの考えられる機能的役割に関して評価する。
【００１９】
さらに本発明は、以下の適用を含む:
・新しい種類のスクリーニング試験、ならびにTSE(伝達性海綿状脳症)、特にvCJD(新しい変異型のクロイツフェルトヤコブ病)の臨床症状の初期段階、あるいは症状発現前の期間中の正確な診断法の提供および施用。
・OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドを、樹脂、ガラスビーズなどの固相に固定することによって、新しい種類のOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの親和性精製、富化または検出を提供および/または施用することができる。
・OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供、およびIT技術用の新しい種類のpH依存性分子変換用、または分子レベルで働く分子センサーまたは機器用のそれらの施用。
・TSEに対する治療剤としてプリオンタンパク質を特異的に認識する、OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供、ならびにvCJDの治療用の遺伝子療法ベクターの提供。
・ポリクローナル、モノクローナル、および/または改変抗体を生成するための、OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供。
・このようなポリペプチド凝集体の三次元構造と選択的に結合するリガンドの提供。このようなリガンドは、プリオンタンパク質(PrPCおよびPrPSC)、抗体、化学分子、およびオクタペプチド含有融合タンパク質を含む。
・化学的(例えば生化学的)および/または物理的(例えば光学的)センサーチップを含めたセンサー技術用のOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供。
【００２０】
実験結果
1.ヒトプリオンタンパク質の生成および分光学的特徴付け:
本試験用に、以下のポリペプチドを調製した(図1):成熟形のヒトプリオンタンパク質、hPrP(23〜230);1つのオクタペプチドを含むhPrP(81〜230);OPRを完全に欠き、プリオン伝播に必要とされる最小配列に概ね対応するhPrP(90〜230);および充分に構造が知られている球状PrPドメインに対応するhPrP(121〜230)(Zahn他、2002)。この構築物のアレイによって、ヒトプリオンタンパク質の溶液特性に対する、全鎖長の考えられる影響を調べることができた。
【００２１】
2.ヒトプリオンタンパク質の流体力学半径に対するpHの影響:
hPrPポリペプチドの流体力学半径(RH)は、図2に要約した動的光散乱の測定から決定した。
【００２２】
図2は、hPrPポリペプチドのみかけの分子量を示す。動的光散乱の測定は、4mg/mlのタンパク質溶液を用いて20℃において行い、10mMの酢酸ナトリウムでpH4.5に緩衝した溶液(明るいグレーの線)、10mMのリン酸ナトリウムでpH7.0に緩衝した溶液(暗いグレーの線)、または10mMの酢酸ナトリウムでpH4.5に緩衝し、さらに100mMの塩化ナトリウムを含む溶液(黒線)のそれぞれについて行われた。30のデータ点それぞれで、4つの独立した測定値に関して標準誤差を得る。矢印は、pH7.0でのhPrP(23〜230)のみかけの分子量が、4MDaより大きいことを示す。
【００２３】
pH4.5では、hPrP(121〜230)のRHは、モノマータンパク質の分子サイズと非常に一致する。C末端ドメインの丸い球状形を想定すると、その推定されるhPrP(121〜230)のみかけの分子量は、アミノ酸配列から計算した13.1kDaと比較して15.1kDaである。残基23〜120のN末端ドメインは、pH4.5溶液においてhPrP分子の分散率をごくわずかに低下させたが、100mMの塩化ナトリウムの存在下では、RHの増大、およびN末端の長さの増大があった。みかけの分子量に対する塩の影響は、どちらかといえば非特異的である。なぜなら、それは特定の配列モチーフに依存しないからである。
【００２４】
しかしながらpH7.0では、pH4.5からpH7へのタンパク質溶液の調整によるhPrP(23〜230)の早急な沈殿が、動的光散乱法を使用するRHの評価を妨げ(図2)、hPrP凝集体の粒子の大きさが4Mdaより大きかったことが示された。サイズ排除クロマトグラフィーによる実験では、PrP凝集体の分子の大きさをより正確に確認することはできなかった。なぜなら、おそらくは多糖に関するOPRの親和性のために、タンパク質がアガロース-デキストランゲルと相互作用したからである(Hundt、C.他、(2001) Identification of interaction domains of the prion protein with its 37-kDa/67-kDa laminin receptor.Embo Journal 20、5876〜5886)。対照的に、C末端断片hPrP(81〜230)、hPrP(90〜230)およびhPrP(121〜230)は、低イオン強度でのpH4.5溶液中の測定と比較すると、RHのわずかな増大のみを示し、hPrP(23〜230)のマクロ分子状タンパク質粒子への非常に特異的な凝集は、OPRを含む残基23〜89のN末端セグメントに原因がある可能性があることが示された(図1)。
【００２５】
3.ヒトプリオンタンパク質の1HNMR線幅に対するpDの影響:
hPrP(23〜230)のpH依存性の凝集をさらに特徴付けるために、我々は、さまざまな溶液条件で1HNMR実験を行った。1HNMR実験での1H線幅は、全体的な回転相関時間(τc)にほぼ正比例し、したがって分子質量および分子の形状に依存する。
【００２６】
タンパク質の分子質量に基づき予想より有意に大きい線幅は、凝集によるτcの増大、または化学的交換または立体配座の交換の影響は線幅に有意に貢献することを意味する。
【００２７】
図3は、hPrPの1HNMRスペクトルのpD依存性を示す。20℃におけるhPrPをD2Oに溶かした0.6mM溶液の、750MHz 1HNMRスペクトル中の6〜9ppmのスペクトル領域を示す。(A)hPrP(23〜230)。(B)hPrP(81〜230)。(C)hPrP(90〜230)。これらの実験の前に、サンプルをD2Oに溶かすことによって、不安定なプロトンを重陽子と交換した。その後、少量のNaODを加えることによって、DCIを少量加えることによってpD4.5にそれが再度低下する前に、サンプルのpDを段階式に増大させた(底部から上部の矢印を参照のこと)。選択した芳香族の共鳴シグナルに関する共鳴の帰属は、それぞれのスペクトルの上部に示す。
【００２８】
図3Aは、D2O中で記録したhPrP(23〜230)の1HNMRスペクトル中の6〜9ppmのスペクトル領域を示す。pD4.5では、折り畳まれたC末端ドメイン内に位置するHis、PheおよびTyr残基の芳香環プロトンは、約23kDaの球状タンパク質に典型的な線幅を示す。ヒスチジン61、69、77および85のHε1の重複共鳴などの、自在に不規則になった尾部のあまり分散していない共鳴線は有意に狭い。なぜなら、それらの有効なτcは、尾部における高い移動度のために少ないからである。pDが段階的に4.5から8に増大したので、図3A中に芳香環プロトンに関して示すのと同様に、HisのHε1の共鳴は電界の強い方向に移り、1H線幅は概ね増大する。これらの変化は、上部スペクトルにより示したように可逆的であった。hPrP(81〜230)に関して同じ実験を繰り返すことによって、共鳴シグナルのわずかな線の拡大がもたらされたが(図3B)、一方hPrP(90〜230)に関しては、線幅はpDとは無関係であった(図3C)。
【００２９】
交換不能なプロトンのみが検出されるD2O中でこれらの測定を行ったので、NMRスペクトルにおける観察された均一な線の拡大の、考えられる原因としての化学的交換を、我々は除外することができる。さらに、線幅に対する立体配座の交換の独占的影響は、図3Aで観察された影響より相当小さいと思われ、記録したNMRスペクトルは、共鳴があまり分散していない溶解した球状タンパク質のスペクトルとは似ていない(Dyson、H.J.およびWright、P.E.(2001) Nuclear magnetic resonance methods for elucidation of structure and dynamics in disordered states.Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules、Pt B 339、258〜270)。さらにおそらくは、動的光散乱の実験と一致して(図2)、6.0と8.0の間のpD値におけるNMRスペクトルの累進的拡大は、ペプチドセグメント23〜89内のHis側鎖、すなわち4つのOPR-ヒスチジンの脱プロトン化によるタンパク質凝集によって引き起こされ(図1)、観察されたHε1共鳴の電界の強い方向への移動をもたらす(図3A)。pH7.0でのH2O溶液中の非標識hPrP(23〜230)と15N-標識hPrP(121〜230)の等モル混合物に関して記録した、[15N,1H]-関連分光(COSY)スペクトルにおける線の拡大は存在せず(データ示さず)、OPRの結合エピトープは、N末端セグメント23〜120内に位置することが示された。
【００３０】
4.pH6.2におけるN末端ドメインの共鳴の帰属:
pH6.2におけるN末端セグメント23〜120の骨格アミドプロトンおよび窒素の、配列特異的な帰属を、pH4.5で記録したスペクトルとの化学的シフトの比較に基づく、15N標識hPrP(23〜230)を用いた[15N,1H]-COSY pH-滴定実験から得た(Liu、A.Z.、Riek、R.、Wider、G.、von Schroetter、C.、Zahn、R.およびWuthrich、K.(2000) NMR experiments for resonance assignments of C-13、N-15 doubly-labeled flexible polypeptides: Application to the human prion protein hPrP(23〜230).Journal of Biomolecular Nmr 16、127〜138)。約40%の非混乱状態のヒスチジンが脱プロトン化されるpH6.2では、[15N,1H]-COSYスペクトル中の共鳴線がごくわずかに拡大し、大部分のPrP分子はこれらの条件下においてモノマーであることが示される。骨格の帰属は、三次元の15N-解像[1H,1H]-核Overhauser増大分光(NOESY)スペクトルを使用して確認し、このスペクトルは側鎖プロトンの帰属用に後に使用した。すべてのポリペプチド骨格の共鳴を帰属、OPR領域中のGly残基のそれらと重複する、Gly35、Gly93およびG1y94のアミド窒素およびアミドプロトンは除外した(Liu他、2000)。個々のOPRセグメントの対応する共鳴線は、2つの側面ジペプチドGln52-Gly53およびGly90-Gln91(図1)、すなわち全5個の反復配列に関して同じ頻度で存在するオクタペプチド中の所与の残基由来の所与の原子の共鳴以外、完全に重複する。不安定な側鎖プロトンの中では、全4Asnおよび8Gln残基のアミド基は、Gln59という唯一の例外以外は、残基間NOEを使用して帰属させることができると思われる。3Arg残基のε-プロトン共鳴は、溶媒の交換が速いためにpH6.2では検出することができないと思われる。
【００３１】
5.pH6.2におけるN末端ドメインの立体配座の制約および構造の計算のまとめ:
NOESYの交差ピークを帰属させるために、我々は、構造計算プログラムDYANAと組み合わせて、自動式NOE帰属ソフトウェアCANDIDを使用した。hPrP(23〜230)中のペプチドセグメント23〜120の構造計算の最初に、合計689のNOESY交差ピークを帰属、pH6.2で記録した15N-解像[1H,1H]-NOESYスペクトルに組み込み、これによって322のNOEの上限の距離的制約を得た。顕著なことに、合計219のNOESYの交差ピークを、pH6.2でのOPR領域のアミド窒素およびプロトンに由来するものとして確認することができたが、一方でわずか98のこのようなピークがpH4.5で観察される(Liu他、2002)。これによって、pH4.5では安定していない、pH6.2でのOPR中の他の構造領域の存在が示された。対照的に、OPR外の残基に関しては、他のNOESYの交差ピークを確認することはできず、pH依存性構造の形成はこの領域に限られることが示される。
【００３２】
15N-解像[1H,1H]-NOESY内のそれぞれの交差ピークは、アミドプロトンと同じオクタペプチドの第二のプロトン、または他のオクタペプチドのプロトンの相互作用の結果であると思われる。NOESYの交差ピークと、オクタペプチド間および内の帰属の適合性を調べるために、我々は、プログラムCANDIDおよびDYANAを使用して、2つのOPRに対応する16残基のペプチド(PHGGGWGQ)2の構造計算を行い、この場合同じ化学的シフトは、2つのOPR内の所与の残基の対応する原子に原因があった。生成した80のNOEの上限の距離的制約のうち、11の制約を、第一のオクタペプチドのC末端Glnと関係がある、オクタペプチド内のものとして帰属させた:Proに関する7つの連続した(i,i+1)NOE、Hisに関する2つの中範囲(i,i+2)NOE、およびTrpに関する2つの長範囲(i,i+5)NOE。
【００３３】
OPRの構造計算をさらに改善するために我々は、NOESYの交差ピークと、1つのオクタペプチド内のさまざまな考えられる帰属の適合性を調べた。我々は、入力値として同じピークのリストを使用して、一連のCANDID/DYANA構造計算を行った。ただし、化学的シフトのリスト内のアミノ酸配列は、標準OPR配列PHGGGWGQに対して変えた(図1)。表1の結果は、8つすべての構造計算値が、1近くの残基のDYANA標的関数値に収束したことを示す。
【００３４】
【表１】
2007523831.tif 000003
【００３５】
しかしながら、2、3または4個の連続的OPRを含むペプチド以外同じ距離的制約を使用して、DYANA計算を繰り返したとき、生成した構造は異なる標的関数値に収束した。常に小さな残基の制約の違反は、繰り返し配列要素HGGGWGQPを有するペプチドに関してのみ得られ(表1)、これらの構造は大部分が実験の制約と一致し、したがって他の7つのオクタペプチド配列の構造より立体的に好ましいことが示される。
【００３６】
8残基ペプチドHGGGWGQP、およびhPrP(23〜230)の残基61〜84(図1)に対応する24残基ペプチド(HGGGWGQP)3のNMR構造を表すために使用した、20個の最良のDYANAコンホマーを、プログラムOPALpを用いてさらにエネルギー精製した。表2は、構造計算の結果の概観を与える。
【００３７】
【表２】
2007523831.tif 000004
【００３８】
表2は、一連のHGGGWGQPの20個のコンホマー中の全体的なRMSD値によって、高品質の構造が決定されることを表し(図4A)、一方(HGGGWGQP)3のNMR構造は、OPRと結合した長範囲のNOEの帰属がないために、あまり正確に定義されていないことを示す。
【００３９】
図4は、オクタペプチド反復配列構造の立体図を示す。(A)HGGGWGQPのN、C0およびC'原子を最適に重ね合わせた、20個のエネルギー精製DYANAコンホマーの全重原子を表す。骨格はグレーであり、側鎖は異なる色で示す:Trp(黄色)、His(シアンブルー)、Gln(ピンク)およびPro(オレンジ)。(B)(HGGGWGQP)3の空間充填モデル。番号は、ヒトプリオンタンパク質配列(図1)中の残基61〜84に対応する。(A)と同じカラーコードを使用した。(C)HGGGWGQPのNMR構造とHGGGW-Cu2+のX線構造の比較(Burns他、2002)。ペンタペプチドセグメントHGGGW(RMSD 1.3Å)の骨格重原子の最適な重ね合わせから生じた2分子の相対的配向。NMR構造の骨格および側鎖の重原子は緑色である。このX線構造中では、酸素、窒素、炭素および水素原子は、それぞれ赤色、青色、グレーおよび白色で示す。ペンタペプチドと規則的に配列した水分子の間の水素結合は、白い断続線として示す。銅イオンの位置は、シアンブルーの球によって示す(例示目的で、銅の半径は測らずに、真の原子半径を反映させる)。赤線および青線は、それぞれ銅とペプチド酸素、および銅と窒素原子の間の銅の配位位置を示す。
【００４０】
6.オクタペプチド反復配列(HGGGWGQP)および(HGGGWGQP)3のNMR構造:
HGGGWGQPのNMR構造は、(HGGGWGQP)3中の対応するOPRと同様の全体的な折り畳み構造、およびHGGGWGQPおよびhPrP(23〜230)の残基61〜68に対応する(HGGGWGQP)3のN末端オクタペプチドの、平均的構造中の骨格重原子間で0.32ÅのRMSD値を有する。セグメントHGGGWおよびGWGQは、それぞれループ構造およびβターン構造をとり、この場合βターンは、連続的な型のdNNおよびdONNOE結合、ならびにTrpとGlnの間のdON(i,i+2)NOE結合によって確認される。(HGGGWGQP)3では、オクタペプチドが配列して、三角球体ドメインを形成する(図4B)。この分子構造は反復する水素結合の組によって安定化し:3つのOPRのそれぞれが、3つのオクタペプチド間水素結合His(i)HN-O'Gln(i+6)、Gly(i+2)HN-Nε2His(i)およびTrp(i+3)Hε-O'Gly(i)を含む。3つのOPR間の接触は、型Gly(i+2)HN-O'Pro(i)の2つの水素結合によって安定化する。Gln(i)-Pro(i+1)のペプチド結合はトランス立体配座中に存在する。すべての側鎖原子は、Trpの疎水性残基鎖を含めて大部分が溶媒に露出している(図4B)。OPRの三次元構造から、したがって、溶媒に露出した疎水性残基の対称的な分布は、PrP凝集に重要である可能性がある。
【００４１】
7.pH6.2でのhPrP(23〜230)の骨格の動態:
OPR内のpH6.2での三次構造相互作用の形成は、ヘテロ核15N{1H}-NOEの測定によって検出することができる分子間の過渡過程と相関関係がある。pH4.5溶液中での以前の試験では(Zahn他、2002)、hPrP(23〜230)の残基23〜120を含むN末端ドメインは負のNOEのみを示し、球状構造ドメインに典型的な値を示したC末端ドメインとは対照的であった。したがって、有効な回転相関時間τcは、C末端ドメインの骨格15N-1H部分に関しては、少なくとも数ナノ秒であると推定することができると思われ、一方N末端ドメイン中の15N-1H部分は、柔軟なランダムコイル様のポリペプチド鎖に関して予想されたのと同様に、1未満のτcを有するはずである。対照的にpH6.2では、OPRおよびOPR側面の幾つかの残基(図5)を含めた、N末端ドメインの15N-1H部分の幾つかは、約0.2の陽性15N{1H}-NOEを示し、このポリペプチド領域がある程度の移動度で球状構造中に折り畳まれていることが示され、おそらくそれは、さらに折り畳まれていない立体配座で平衡状態にあるからである。
【００４２】
図5は、hPrP(23〜230)の骨格の移動度を示す。アミド基の定常状態15N{1H}-NOEを、pH6.2および20℃において90%H20/10%D20のhPrP(23〜230)の0.5mM溶液中で測定した。位置51〜91由来のボックス中では、丸印は、変性した化学的シフトのために、5つすべての反復配列に関して型が同一であることを示す(本文参照)。矢印は、Lys23およびLys24に関して15N{1H}-NOEが-1未満であることを示す。スペクトル重複のため、幾つかの15N{1H}-NOEは定量化することができなかった。
【００４３】
骨格のアミド基に加えて、OPRのTrpインドールの15N-1H部分を0に近いNOE値によって特徴付けし、構造計算からの結果と一致して、この側鎖は一時的な三次構造の相互作用と関係がある可能性があることを示した。6.2より高いpH値でのhPrP(23〜230)の凝集によって、これらの条件下での詳細なNMRの特徴が除外されたが、ヒスチジンの高度の脱プロトン化のために、OPRの球状構造は、pH7でさらに安定化する可能性がある。
【００４４】
結果の考察
1.オクタペプチド反復配列構造は、新しい構造モチーフを表す:
プログラムDALI(Holm、L.およびSander、C.(1993) Protein-Structure Comparison by Alignment of Distance Matrices.Journal of Molecular Biology 233、123〜138)によって、ここに記載したHGGGWGQPおよび(HGGGWGQP)3の構造と、タンパク質データバンクの任意の以前の寄託物の間に有意な類似性がないことが明らかになり、このOPR構造が新しい構造モチーフを表すことが示された。我々の構造計算の結果は、合成OPRペプチドの以前の構造研究からは逸脱する。pH7.4での円偏光二色性の実験から、このOPRは、ポリ-L-プロリンII型ヘリックスと類似した性質を有する、伸長した立体配座をとることが示唆され(Smith、C.J.、Drake、A.F.、Banfield、B.A.、Bloom-berg、G.B.、Palmer、M.S.、Clarke、A.R.およびCollinge、J.(1997) Conformational properties of the prion octa-repeat and hydrophobic sequences.Febs Letters 405、378〜384)、一方で、pH6.2と6.6の間で行われた近年のNMR試験は、セグメントHGGGWおよびGWGQは、それぞれループ構造およびβターン構造をとることを示唆する(Yoshida、H.、Matsushima、N.、Kumaki、Y.、Nakata、M.およびHikichi、K.(2000) NMR studies of model peptides of PHGGGWGQ repeats within the N-terminus of prion proteins: A loop conformation with histidine and tryptophan in close proximity.Journal of Biochemistry 128、271〜281)。我々はセグメントGWGQに関するターン様の立体配座も観察しているが(図4A)、我々の構造体中のループ状立体配座は異なるものである。なぜなら、Trpの芳香環と非常に近い位置のHisのイミダゾール側鎖は、我々の構造計算からは裏づけされていないからである。1つまたは2つのオクタペプチドを含む環状OPRに関するNMRデータも、HisおよびTrp側鎖の非常に近い位置は裏づけしないので(Yoshida他、2000)、この相互作用は一時的にのみ形成される可能性がある。
【００４５】
哺乳動物のオクタペプチドの変異体は、PHGGSWGQ(マウス)およびPHGGGWSQ(ラット)などの配列、または擬似オクタペプチド、例えばこれらのオクタペプチドに由来し、8個より多いか又は8個より少ないアミノ酸を有する、PHGGGGWSQ(さまざまな種)、またはPHGGGSNWGQ(有袋動物)などを含む。非哺乳動物のヘキサペプチドは、PHNPGY(ニワトリ)またはPHNPSY、PHNPGY(カメ)などの配列、あるいは例えばこれらのヘキサペプチドに由来し、6個より多いか又は6個より少ないのアミノ酸を有する擬似ヘキサペプチドを含む。ここで論じる配列は、本発明の要旨を制限しない例として理解されよう。
【００４６】
2.pH依存性のPrP凝集の調節における銅の考えられる役割:
意外なことに、HGGGWGQPのNMR構造中のHGGGWループは、pH7.4で増大した結晶から近年決定された銅結合オクタペプチド反復配列セグメントHGGGW-Cu2+の結晶構造中の、対応する残基と同様の骨格の折り畳みを有する(Burns、C.S.他、(2002) Molecular features of the copper binding sites in the octarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41、3991〜4001)。HGGGW-Cu2+の構造(図4C)では、Cu2+は、Hisイミダゾールのδ1-窒素と、その第二のGlyがそのアミドカルボニル酸素にも貢献する、隣の2つのGly残基由来のアミド窒素からの赤道結合とペンタ位置にある。His骨格窒素およびC0以外は、Hisから第三のGlyの窒素までのすべての原子が赤道面にほぼ位置し、銅はこの面の真上に位置し、ペンタ配位錯体と一致する。Trpインドールも水素結合から軸位置の水分子まで関与し、一方グルタミンは、銅結合と関係がない官能基を有する唯一の側鎖である。そのデータからBurnsおよび同僚は、膜結合PrPの2つの「金属サンドウィッチ」オクタペプチド反復配列内の露出したグルタミン側鎖が、PrP分子の間の分子間認識の相互作用部位として働き、これによって銅誘導型エンドサイトーシスを刺激し(Pauly、P.C.およびHarris、D.A.(1998) Copper stimulates endocytosis of the prion protein.J Biol Chem 273、33107〜33110)、あるいはPrPSCの形成を容易にする可能性があるモデルを提案した。
【００４７】
銅を含まないHGGGWループのNMR構造は、HGGGW-Cu2+中の対応する残基と同様の骨格の立体配座、および2つのペンタペプチドの骨格の重原子の間で1.3ÅのRMSD値を有するが(図4C)、HGGGW-Cu2+構造中の銅の配位と関係がある芳香環側鎖に関して、明らかな立体配座の違いが存在する。銅を含まないHGGGWでは、Hisイミダゾールは下部に移動し、HGGGW-Cu2+構造中の銅ペンタ配位錯体の赤道面に対して傾き、1.9Å〜3.5ÅのHisのδ1-窒素とCu2+結合部位の間の距離の増大をもたらす。さらに、HGGGW中のTrpインドールは、配位する窒素およびCu2+を通過する軸と平行な仮想軸の周りで約180°(方向を変え、これによってHGGGW-Cu2+構造中で観察されるTrpのεNHと軸方向水分子の酸素原子の間の水素結合の形成が妨げられる。
【００４８】
本明細書および以前の刊行物(Aronoff-Spencer、E.他、(2000) Identification of the Cu2+ binding sites in the N-terminal domain of the prion protein by EPR and CD spectroscopy.Biochemistry 39、13760〜13771; Viles、J.H.、Cohen、F.E.、Prusiner、S.B.、Goodin、D.B.、Wright、P.E.およびDyson、H.J.(1999) Copper binding to the prion protein: structural implications of four identical cooperative binding sites.Proc Natl Acad Sci U S A 96、2042〜2047)中で報告された、構造データと生化学データの組合せから、OPR内のHGGGW-ループの立体配座は、pHと銅結合の両方に依存するようである:
【００４９】
【化１】
2007523831.tif 000005
【００５０】
スキーム(1)によれば、4.7と5.8の間のpH値、すなわちエンドソーム様区画のpHでは、OPR-ヒスチジンは主にプロトン付加状態であり、したがって、OPRは自在に不規則になり、低い親和性および協同性で銅のみと結合する。6.5と7.8の間のpH値、すなわち細胞膜におけるpHでは、OPR-ヒスチジンは主に脱プロトン化状態であり、これによって凝集を促進するHGGGW-ループ構造が安定状態になり、存在する場合はCu2+が銅結合部位に取り込まれる。HGGGWによる銅の配位によって、おそらくPrP凝集体の構造変化につながる、わずかではあるが有意な立体配座の変化がもたらされる。したがって銅の機能は、pH依存性のPrP凝集の調節物質の機能であると思われるが、Cu2+の結合が、OPRの二量体またはオリゴマータンパク質凝集体への逆方向の凝集と適合性があるかどうかは、依然として示されていない。
【００５１】
PrPCが大きなタンパク質凝集体を形成することは、従来技術では知られていなかった。さらに、PrPCの凝集が流体環境のpHに依存するという発見は、新たなものである。さらに、OPRがPrPCのpH依存性の凝集を担い、立体配座の変化はこのOPRの凝集のpH依存性と関係があることは、知られていなかった。現在のデータベースは、図4で報告する構造と同様の三次元構造を欠いている。オリゴマー化反応は流体環境のpHに依存し、オリゴマー化は一価または二価カチオン、例えばHg2+、Ni2+、Sn2+またはCu2+イオンなどの不在下でも起こる。
【００５２】
3.PrPCの生理的機能に対するpH依存性凝集の関与:
天然のPrPCが組換えhPrPと比較してin vivoで同様に働くと仮定すると、その凝集状態も大部分は環境のpHに依存する可能性がある。したがってHis含有OPRは、シナプス前部の膜表面の脂質ラフト内に多数のPrPC分子を集める、pH依存性凝集部位として作用すると思われる。直径44nmの脂質ラフトは、5nmの直径を有する約80のPrPC分子に充分な表面を与えると思われる。したがって、銅の生理的役割は脂質ラフト内のPrPC分子の数を調節し、それによってシナプス前部の小胞へのPrPCのエンドサイトーシスを刺激することであると思われ、この場合プリオンタンパク質は、局部的に酸性であるpHのためにモノマーに解離すると思われる。このモデルは、銅がPrPC凝集の誘導物質ではなく調節物質として作用すること以外は、Burnsおよび同僚の提案(Burns他、2002)と一致すると思われる。
【００５３】
あるいは、哺乳動物PrPC中のOPRは、ニューロン軸と樹状突起の間の細胞間接触用の、細胞内接触部位として働くことができる。細胞接着におけるPrPCの考えられる関与は、Lehmannおよび同僚によって近年実証されてきている(Mange、A.、Milhavet、O.、Umlauf、D.、Harris、D.およびLehmann、S.(2002) PrP-dependent cell adhesion in N2a neuroblastoma cells.Febs Letters 514、159〜162)。彼らは、PrPCを過剰発現する細胞芽腫細胞は、非トランスフェクト細胞と比較すると高い凝集性を示すことを示した。細胞凝集アッセイ中に銅キレート剤またはカチオンキレート剤を添加することには、有意な影響がなく、PrPC介在の接着がカチオン非依存的に起こることが示された。ネズミPrPの残基45〜66を含む合成ペプチドに対して産生したポリクローナル抗体P45〜66を用いて、細胞芽腫細胞を処理することによって(Lehmann、S.およびHarris、D.A.(1995) A mutant prion protein displays an aberrant membrane association when expressed in cultured cells.J Biol Chem 270、24589〜24597)、細胞凝集を有意に阻害した。これらの結果から、PrPCは神経細胞中で接着分子として機能すると思われ、PrPCとN-CAMまたはラミニン受容体前駆体などの異種タンパク質の特異的な経細胞結合によって、細胞凝集が仲介されると結論付けた。しかしながら、OPRがpH依存性の凝集部位を構成するという我々の発見に基づくと、PrPCが同性細胞間の認識と関係がある可能性もある。これは、そのエピトープがpH依存性のPrP凝集を担うHis含有OPR(図1)を含む、抗体P45〜66の活性を抑制する凝集と一致する。他の場合は大部分が構造化されていないN末端ドメイン内のOPR中の凝集部位を介して相互作用する、隣接細胞中の2つのGPIアンカー型PrPC分子の直線的組合せは、シナプス間隙部分の20〜30nmの距離で容易に広がると思われる(Agnati、L.F.、Zoli、M.、Stromberg、I.およびFuxe、K.(1995) Intercellular Communication in the Brain-Wiring Versus Volume Transmission.Neuroscience 69、711〜726)。したがって、プリオンタンパク質は、カドヘリンなどの他の同性細胞接着分子と類似しており(Pokutta、S.およびWeis、W.I.(2002) The cytoplasmic face of cell contact sites.Current Opinion in Structural Biology 12、255〜262)、プリオンタンパク質は、初期の分化中の脳構造および結合を確立させるために非常に重要であると考えられる。さらにPrPCは、シナプス構造の再構築およびシナプスシグナルの強度の改変に関与しており、したがってシナプスの構造、機能、および弾性において活発な役割を果たすと思われる。PrPCの細胞凝集活性は銅に依存しないので、銅の役割は、独立の細胞機能を有する2つのオリゴマーの立体配座の間に、すなわち銅とは無関係な細胞間接着から銅依存性のエンドサイトーシス、およびこの逆にPrPCを移すことができる、シャペロンの役割である可能性がある。
【００５４】
物質および方法
1.サンプル調製:
非標識形または均一な15N標識を有するhPrPポリペプチドのクローニング、発現および精製を、以前に記載されたのと同様に行った(Zahn、R.、von Schroetter、C.およびWuthrich、K.(1997) Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding.FEBS Lett 417、400〜404)。タンパク質溶液は、Ultrafree-15遠心分離濾過装置(Millipore)を使用して濃縮した。
【００５５】
2.NMR測定および構造計算:
4つの無線周波数チャンネル、および遮蔽z-勾配コイルを有する三重共鳴プローブヘッド、および1mMのタンパク質溶液の非標識または15N標識サンプル、20℃において90%H20/10%D20または99.9%D20を備えるBruker DRX500、DRX750およびDRX800分光計で、NMR測定を行った。立体配座の制約をまとめるために、H20中の三次元の15N-解像[1H,1H]-NOESYスペクトルを、T=20℃で混合時間τm=100ms、207(t1)×39(t2)×1024(t3)複合地点、t1,max(1H)=23.0ms、t2,max(15N)=21.4ms、t3,max(1H)=114msで、800MHzにおいて記録し、このデータ組は512×128×2048ポイントにゼロ充填した。スペクトルの処理は、プログラムPROSAを用いて行った(Guntert、P.、Dotsch、V.、Wider、G.およびWuthrich、K.(1992) Processing of Multidimensional Nmr Data with the New Software Prosa.Journal of Biomolecular Nmr 2、619〜629)。1Hおよび15Nの化学的シフトを、2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸ナトリウム塩に対して計算した。
【００５６】
定常状態15N{1H}-NOEを、Farrow他(Farrow、N.A.、Zhang、O.W.、Formankay、3.D.およびKay、L.E.(1994) A Heteronuclear Correlation Experiment for Simultaneous Determination of N-15 Longitudinal Decay and Chemical-Exchange Rates of Systems in Slow Equilibrium.Journal of Biomolecular Nmr 4、727〜734)に従い、一連の120度のパルスを5ミリ秒間隔で施すことにより3秒のプロトン飽和時間を使用して、500MHzにおいて測定した;t1,max(15N)=117.4ms、t2,max(1H)=146.3ms、時間ドメインデータサイズ250(t1)×1024(t2)複合地点。
【００５７】
NOE帰属をCANDIDソフトウェア(Herrmann、T.、Guntert、P.およびWuthrich、K.(2002) Protein NMR structure determination with automated NOE assignment using the new software CANDID and the torsion angle dynamics algorithm DYANA.Journal of Molecular Biology 319、209〜227)を、構造計算プログラムDYANA(Guntert、P.、Mumenthaler、C.およびWuthrich、K.(1997) Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA.Journal of Molecular Biology 273、283〜298)と組み合わせて使用して得た。CANDIDおよびDYANAは、自動的なNOEの帰属、およびNOE強度の距離的計算、共有結合距離の制約の除去、ねじれ角の動態を用いた構造計算、および自動的なNOEの上限の距離的制約の変動分析を行う。CANDID用の入力値として、前述のNOESYスペクトルのピークのリストを、プログラムXEASY(Bartels、C.、Xia、T.H.、Billeter、M.、Guntert、P.およびWuthrich、K.(1995) The Program Xeasy for Computer-Supported Nmr Spectral-Analysis of Biological Macromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 6、1〜10)、およびプログラムSPSCAN(Ralf Glaser、パーソナルコミュニケーション)を用いたピーク体積の自動的統合を用いた相互作用ピークの採取によって作製した。CANDIDおよびDYANAを用いる計算用の入力値は、配列特異的な共鳴の帰属からのNOESYのピークのリストおよび化学的シフトのリストを含んでいた。この計算は、7サイクルの反復的なNOEの帰属および構造計算(Herrmann他、2002)の標準的なプロトコルに従った。最初の6CANDIDサイクル中は、あいまいな距離的制約を使用した。最終的な構造計算用に、第六の計算サイクル後に明確な帰属値を有したNOEの交差ピークに対応した、NOEの距離的制約のみを保った。立体特異的な帰属は、上限の距離的限界と第六のCANDIDサイクルから生じた構造を比較することによって確認した。最小の最終的なDYANA標的関数値を有する20個のコンホマーを、プログラムOPALp(Luginbuhl、P.、Guntert、P.、Billeter、M.およびWuthrlch、K.(1996) The new program OPAL for molecular dynamics simulations and energy refinements of biological macromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 8、136〜146)を用いて、AMBER力場を使用して、水殻中においてエネルギー最小化した。プログラムMOLMOL(Koradi、R.、Billeter、M.およびWuthrich、K.(1996) MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.Journal of Molecular Graphics 14、51〜55)を使用して、生成した20個のエネルギー最小化コンホマーを分析し(表1および2)、構造の図面を作製した。
【００５８】
3.動的光散乱の実験:
動的光散乱の測定を、タンパク質溶液Ltd.モデル801動的光散乱用装置(Hertford、英国)を使用して20℃において行った。この装置は、散乱光の強度データの自己相関関数から、サンプルセル中の分子の翻訳時の拡散係数DTを計算する。散乱粒子の流体力学半径RHは、KBがボルツマン定数であり、Tがケルビンの絶対温度であり、ηが溶媒の粘度である、ストークス-アインシュタインの関係式:DT=KBT/6πηRHを使用してDTから誘導される。タンパク質濃度は、pH4.5で10mMの酢酸ナトリウム、またはpH7.0で10mMのリン酸ナトリウムを含むバッファー溶液中で4mg/mlであった。タンパク質溶液は、100nm孔サイズのフィルター(Whatman、英国)によって濾過した。気泡または埃による干渉を減らすために、モレキュラーリサーチDYNAMICSからのDynaPro動的光散乱用装置調節ソフトウェア(バージョン4.0)を使用して、実験当たりで30のデータ地点を分析した。流体力学半径RHは、球体モデルを使用して調整ヒストグラム法から計算して、そこからみかけの分子量を、知られている球状タンパク質に関して計算した標準曲線に従い推定した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ヒトプリオンタンパク質の一次構造の図である。
【図２】hPrPポリペプチドのみかけの分子量の図である。
【図３Ａ】hPrPの1HNMRスペクトルのpD依存性の図である。hPrP(23〜230)の図である。
【図３Ｂ】hPrPの1HNMRスペクトルのpD依存性の図である。hPrP(81〜230)の図である。
【図３Ｃ】hPrPの1HNMRスペクトルのpD依存性の図である。hPrP(90〜230)の図である。
【図４Ａ】オクタペプチド反復配列構造の立体図である。HGGGWGQPである20のエネルギー精製型DYANAコンホマーの立体図である。
【図４Ｂ】オクタペプチド反復配列構造の立体図である。(HGGGWGQP)3の空間充填モデルの立体図である。
【図４Ｃ】オクタペプチド反復配列構造の立体図である。HGGGWGQとHGGGW-Cu2+のX線構造の比較の図である。
【図５】hPrP(23〜230)の骨格の移動度の図である。
【図１】
2007523831.tif 000006
【図２】
2007523831.tif 000007
2007523831.tif 000008
2007523831.tif 000009
【図５】
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2007523831.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月25日(2005.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを可逆的に凝集および/または解離させるための方法であって、流体環境中において6.2〜7.8のpHでポリペプチドをオリゴマー化するステップおよび/または4.5〜5.5のpHでポリペプチド凝集体を解離させるステップを含み、前記ポリペプチドが、
(i)プリオンタンパク質由来の1つまたは複数のペプチド反復配列構造を含むことを特徴とし、
(ii)前記タンパク質が6.2〜7.8のpHで流体中においてオリゴマー化し、4.5〜5.5のpHでモノマーに解離することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ペプチド反復配列が、オクタペプチド、擬似オクタペプチド、ヘキサペプチドまたは擬似ヘキサペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記オクタペプチドが、PHGGGWGQ(ヒト)、PHGGSWGQ(マウス)およびPHGGGWSQ(ラット)からなる群から選択される配列を有するか、あるいは好ましくはPHGGGGWSQ(さまざまな種)、およびPHGGGSNWGQ(有袋動物)からなる群から選択される前記配列に由来する擬似オクタペプチドである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘキサペプチドが、PHNPGY(ニワトリ)、PHNPSY、PHNPGY(カメ)からなる群から選択される配列を有するか、あるいは前記配列に由来する擬似ヘキサペプチドである、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド反復配列のそれぞれが、C末端βターン構造と結合したN末端ループ構造を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが4個の同一のオクタペプチドを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒトまたは動物性プリオンタンパク質を検出するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項８】
前記ポリペプチドを親和性精製および/または富化するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項９】
前記ポリペプチドを固相に固定する、請求項7または8に記載の方法の使用。
【請求項１０】
化学的および/または物理的センサー技術用の、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
2007523831.tif 000012
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