(57)【要約】【課題】アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解する活性を有するタンパク質、該タンパク質をエンコードする遺伝子、該タンパク質を発現する細胞、及びそれらの製造方法の提供。【解決手段】アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解する活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素、該酵素をエンコードする遺伝子、及び該遺伝子を発現する形質転換細胞を開示する。また、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを分解することができる酵素の製造方法であって、細胞を培養すること、該細胞において前記酵素を発現させること、及び、酵素を精製することを含む方法も開示する。該酵素を含む組成物は、糖製造中におけるデキストラン又は多糖類汚染物質の除去を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解する活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、その誘導体又はそのフラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質、誘導体又はフラグメントをエンコードする配列番号２の遺伝子、その誘導体又はそのフラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子、誘導体又はフラグメントを発現する形質転換細胞。
【請求項４】
前記細胞が原核細胞又は真核細胞である請求項２に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
前記細胞が、ＫＣＴＣ１０５７３ＨＰの受託番号で寄託された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株である請求項３又は４に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解する活性を有する酵素の製造方法であって、
請求項３に記載の細胞を培養すること；
培養した細胞において前記酵素を発現させること；及び、
発現した酵素を精製すること
を含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって製造された酵素。
【請求項８】
請求項７に記載の酵素を含む組成物。
【請求項９】
糖製造中、デキストランを除去するために使用される請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
歯垢除去のために、又はマウスウォッシュとして使用される請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明分野
本発明は、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを分解するタンパク質、その遺伝子、その発現細胞、及びその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、歯垢の形成を抑制し、かつこれまでに形成された歯垢を分解する能力のため抗歯垢組成物又はマウスウォッシュにおいて有用であるだけではなく、デキストランを加水分解する優れた能力のため、糖製造中におけるデキストランの除去にもまた有用な酵素、該酵素をコードする遺伝子、該酵素を発現する細胞、及び該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
歯垢は、歯に蓄積されたバイオフィルムであり、歯の表面に細菌が定着することにより生じる。歯垢の塊は、グルカン（不溶性グルカン）として既知の、またムタンとも呼ばれる細菌由来の細胞外多糖類からなり、そしてそれは定着を強化する。歯垢の乾燥重量の約２０％に達する該多糖類は、虫歯を引き起こす重要な要因として作用する。ストレプトコッカス  ミュータンスによって製造されるグルカンの構造研究により、不溶性グルカンのグルコース部分は、主に、α−１，３−、α−１，４−及びα−１，６−Ｄ−グルコシド結合によって互いに結合していることが明らかになっている。それ故、効果的な歯垢の除去には、ムタン分解活性、澱粉分解活性及びデキストラン分解活性が必要となる。
【０００３】
従来、歯垢及び虫歯の形成の予防は、主に口内のストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の成長の抑制に依存してきた。これに関連して、防腐剤又はフッ素等のＳ．ｍｕｔａｎｓの成長に対して活性を有する化合物が、歯磨き粉又はマウスウォッシュ等の口腔用製品中に含まれる。一般的な抗虫歯化合物であるフッ素は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの成長を抑制するが、歯のフッ素症（斑状歯［エナメル］の形成）並びに強い毒性及び大気汚染等の副作用を引き起こす。他の試みとしては、デキストラナーゼ等の酵素を用いた虫歯の予防が行われている。しかしながら、その効果はまだ立証されていない。
【０００４】
米国特許第５，７４１，７７３号明細書は、抗歯垢活性及び抗虫歯活性を有するグリコマクロペプチドを含む歯磨剤組成物を提供している。この慣用技術は、虫歯を引き起こす細菌の成長を抑制することに関する。しかしながら、歯垢形成の防止又はこれまでに形成された歯垢の加水分解については、提案されていない。
【０００５】
本発明者らによる米国特許第６，４８５，９５３号明細書（韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書に対応）は、歯垢形成の抑制及びこれまでに形成された歯垢の分解において、様々な構造の多糖類を加水分解することができるＤＸＡＭａｓｅの使用を提案している。様々な多糖類を分解することができる酵素に加えて、該酵素を産生する微生物（リポマイセス  スターケイ  ＫＦＣＣ−１１０７７）及び該酵素を含む組成物もまた開示されている。
【０００６】
しかしながら、まだ、歯垢形成の抑制並びにこれまでに形成された歯垢の加水分解においてより良好な活性を有する酵素が必要とされている。
【０００７】
韓国特許出願第１０−２００１−４８４４２号明細書において、本発明者らはまた、韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書の微生物（リポマイセス  スターケイ  ＫＦＣＣ
−１１０７７）によって製造される酵素、ＤＸＡＭａｓｅが高いデキストラン分解活性のためにデキストランの除去において有用であり得ることも示唆している。
【０００８】
それ故、デキストラン除去のために十分なデキストラン分解活性を有する新規酵素を開発することが当該技術において明らかに必要とされている。
【特許文献１】米国特許第５，７４１，７７３号明細書。
【特許文献２】米国特許第６，４８５，９５３号明細書（韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書に対応）。
【特許文献３】韓国特許出願第１０−２００１−４８４４２号明細書。
【特許文献４】韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
従って、本発明は、従来技術において起こる上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを含む様々な多糖類を加水分解することができる新規酵素、及び該酵素をエンコードする遺伝子を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、該遺伝子を有する株を提供することにある。
【００１１】
本発明の更なる目的は、該酵素及び該遺伝子の製造方法を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の更なる目的は、該酵素を含む産業的に有用な組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの観点に従って、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解する活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、その誘導体又は該活性を有するその酵素フラグメント、及び該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
【００１４】
本発明の他の観点に従って、前記遺伝子を発現する形質転換細胞が提供される。
【００１５】
本発明の更なる観点に従って、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解する酵素の製造方法であって、
前記細胞を培養すること；
培養した細胞において前記酵素を発現させること；及び、
発現した酵素を精製すること
を含む方法が提供される。
【００１６】
図面の簡単な説明
本発明の上記及び他の目的、特徴及び利点は、添付した図面と併せて、以下の詳細な説明からより明確に理解され得る。
図１（図１ａ及び図１ｂ）は、本発明に従ったリポマイセス  スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）（ＬＳＡ）から得られたカルボヒドラーゼのアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をエンコードする１９４６ｂｐのヌクレオチド配列を示す（ここで、通常の下線部は、熟成タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列決定を通じて分析されたベクターに熟成タンパク質をクローニングするためのＰＣＲプライマー部分を表わし、矢印で示され部分はシグナルペプチドのためのスプライシング部位を表わし、太い下線部分は、α
−アミラーゼの保存領域を表わす。）。
図２は、煮沸された酵素（レーン１）及び煮沸していない酵素がゲル上で電気泳動されるところのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果及び抗カルボヒドラーゼ抗体が煮沸された酵素と複合されるところ（レーン３）のウエスタンブロットの結果を示す写真である。
図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの結果を示す写真であり、ここで、矢印で示される本発明のＬＳＡは、ゲル上で分子量マーカー（Ｍ）とともに電気泳動され、クーマシーブルー染色（レーン１）によって及び活性染色（レーン２）によって視覚化を行われ、そして、母細胞の抗ＬＳＡ抗体と反応させられる（レーン３）。
図４は、本発明のＬＳＡの活性及び安定性が温度に対してプロットされるところのグラフである。
図５は、本発明のＬＳＡの活性及び安定性がｐＨ値に対してプロットされるところのグラフである。
図６は、本発明のＬＳＡの活性に対するアセトンの影響を示すグラフである。
図７は、本発明のＬＳＡの活性に対するエタノールの影響を示すグラフである。
図８は、本発明のＬＳＡの酵素活性を示すＴＬＣの結果の写真であり、ここで、酵素によって加水分解される前及び後に、マルトデキストリン（Ｍｎ）とともに、澱粉試料（１％ｗ／ｖ）が分析され（それぞれ、パネルＡのレーン１及びレーン２）、精製ＬＳＡをＧ１（グルコース）ないしＧ７（マルトヘプタオース）を含む一連のマルトオリゴ糖と反応させた後、マルトオリゴ糖試料（１％ｗ／ｖ）が分析された（それぞれ、パネルＢのレーン１ないしレーン７。）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
好ましい態様の説明
本発明のカルボヒドラーゼ（ＬＳＡ）をコードする遺伝子の獲得は、澱粉を含む培地中でリポマイセス  スターケイを培養することによって開始される。次ぎに、リポマイセス
スターケイから精製された炭水化物加水分解酵素のＮ−末端アミノ酸配列に基づき、予期された保存領域を含むプライマーが構成され、その後、該プライマーを用いて、ＰＣＲが行われる。約２ｋｂの長さのＰＣＲ生成物が、完全なカルボヒドラーゼ遺伝子（ＬＳＡ）とするために、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥにおいて使用される。ＰＣＲによって増幅させた後、株該遺伝子はｐＲＳＥＴＢベクター（米国、インビトロゲン社製）においてクローン化され、その後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）ｐＬｙｓＳによって形質転換される。
【００１８】
リポマイセス  スターケイは、デキストランを分解するエンドデキストラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１１）及び澱粉を分解するα−アミラーゼを製造することが知られている。この微生物は、食品に適用されており、抗生物質又は他の有毒な代謝産物を産生することは今まで報告されていない。
【００１９】
細菌から得られるいくつかを除いて、微生物によって産生されるデキストラナーゼの大半は、誘導性酵素として知られる。リポマイセス  スターケイ  ＡＴＣＣ７４０５４は、米国特許第５，２２９，２７７号明細書で最初に報告され、その特徴もまた開示されているところのデキストラナーゼ及びアミラーゼの両方を製造する。該明細書はまた、その菌株がスクロース及び澱粉から低分子量デキストランを産生することも報告している。該知見に基づいて、本発明者らは、デキストラン及び澱粉の両方を加水分解することができるＤＸＡＭａｓｅ酵素、該酵素を産生する微生物（リポマイセス  スターケイ  ＫＦＣＣ−１１０７７と同定。）、及び該酵素を含む組成物に関する韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書（２００２年１０月１１日）（米国特許第６，４８５，９５３号明細書（２００２年１１月２６日）に対応。）を得た。
【００２０】
本発明の遺伝子（ＬＳＡ）から発現される酵素は、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロースを加水分解することができるカルボヒドラーゼである。また、本発明に
従った酵素は、デキストラン、α−シクロデキストリン及びプルランを分解することが発見された。該酵素は非常に安定である。
最大９０％の酵素活性が比較的に広いｐＨ範囲（ｐＨ５−８）にわたるだけでなく、ＥＧＴＡ含有溶液等の変性溶液によってさえも抑制されない。Ｃａ2+又はＭｇ2+は、酵素のための共因子として機能する。
【００２１】
また、本発明は、カルボヒドラーゼをコードする遺伝子を有する新規微生物に関する。本発明に従った大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株は、２００３年１２月２４日に、ＫＣＴＣ１０５７３ＢＰの受託番号で、韓国、デジョン市、ユサン  グに所在の韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＫＣＴＣ）に寄託された。
【００２２】
また、本発明はカルボヒドラーゼの製造方法に関する。まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株が培養される。該大腸菌を培養により得た後、その細胞を、ガラスビーズを使用して崩壊させ、そこからカルボヒドラーゼを単離した。
【００２３】
本発明の酵素を含む組成物は、様々な口腔ケア用製品において使用され得る。デキストラン及びアミロース等の多糖類を分解する能力によって、本発明の酵素はまた、糖製造中にデキストランを除去するために効果的に使用される。更に、本発明に従った酵素を含む組成物は、ガム、飲料、牛乳等の食品に適用され得、そしてそれらの成分は当業者によって容易に決定され得る。
【００２４】
本発明のより良い理解は、説明のために示されたものであり、本発明を制限するように解釈されるべきでない以下の実施例を通して得られ得る。
【実施例】
【００２５】
実施例１：リポマイセス  スターケイにおけるＬＳＡ遺伝子のクローニング
１）株及びプラスミド
デキストラナーゼ及びアミラーゼ活性を有するＤＸＡＭａｓｅを製造するリポマイセス
スターケイ  ＫＦＣＣ  １１０７７をｃＤＮＡ単離及びアミラーゼ遺伝子選択のためのＤＮＡドナーとして使用した。一般的なＤＮＡ操作及びＤＮＡ配列決定は、大腸菌ＤＨ５α及びｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（米国、プロメガ社製）を用いて行った。ｃＤＮＡライブラリーの構築のために、大腸菌ＸＬ１−ブルー及びＳＯＬＲ（米国、ストラタジーン社製）を、ラムダフェーズ（ｌａｍｂｄａ  ｐｈａｓｅ）を有する宿主細胞として使用し、ベクターとしてＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲを使用した。
【００２６】
２）培養条件
リポマイセス  スターケイを、澱粉１％（ｗ／ｖ）を補ったＬＷ培地中で培養した。酵母エキス  ０．３％（ｗ／ｖ）及びＫＨ2ＰＯ4  ０．３％（ｗ／ｖ）を含むＬＷ培地を、ＨＣｌを用いてｐＨ４．５に調整した。細菌培養のため、ＬＢ（トリプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、ＮａＣｌ  １％、ｐＨ７．３）及びＬＢＡ（アンピシリン５０ｇ／ｍＬを含むＬＢ）を使用した。
【００２７】
３）カルボヒドラーゼの精製
前培養物を得るために、リポマイセス  スターケイを、澱粉１％（ｗ／ｖ）を補ったＬＷ培地中で攪拌しながら成長させた。その後、前培養物を、炭素源として澱粉１％（ｗ／ｇ）を補ったＬＷ培地８．３Ｌを含む１０Ｌ発酵槽（韓国、ハニル  Ｒ＆Ｄ社製）中で培養し、興味深いカルボヒドラーゼを製造した。培養上清を、１００Ｋのカットオフ中空糸（韓国、サエハン社製）を通して濾過し、その後、３０Ｋのカットオフ中空糸（米国、ミリポア社製）を通して８３０ｍＬまで濃縮した。濃縮物の７０％までの量の硫酸アンモニ
ウム（米国、シグマ  ケミカル社製）を添加することによって、タンパク質を沈殿させた。遠心分離した後、沈殿物を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ  ６．４）６０ｍＬ中で懸濁させた。タンパク質の濃度及び滴定量は、精製工程毎に測定した。タンパク質濃縮物（３０ｍｇ／１．５ｍＬ）を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液で平衡にされたＤＥＡＥ−セファロース  カラム中に置き、ＮａＣｌ濃度０ないし１．０Ｍの濃度勾配で溶出させた。活性溶出画分を収集し、濃縮し、ＧＰＣカラム（バイオ−ラド社製、Ａ−０．５ｍ、７０ｃｍ×２．６ｃｍ）中に置き、興味深いタンパク質を単離した。該カラムを５０ｍＭのリン酸クエン酸塩緩衝溶液（ｐＨ５．５）を用いて平衡にした。該濃縮物は４ｍｇ／ｍＬの量でタンパク質を含む。
【００２８】
４）ポリＡ＋ＲＮＡの単離
リポマイセス  スターケイを、澱粉１％（ｗ／ｖ）を補ったＬＷ培地に接種した。２８℃で３６時間（中指数的成長相（ｍｉｄ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）まで）培養した後、培養物を６，５００ｘｇで遠心分離し、細胞ペレットを回収した。全ＲＮＡをガラスビーズ及び酸性の熱フェノールを使用して単離した。細胞をグアニジンチオシアネート、０．５％ラウリルサルコシネートナトリウム、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール、及び２５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．０）と混合し、その後、等量の酸洗いしたガラスビーズ及びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物と併せて、最高速で５分間攪拌した。遠心分離後、混合溶液を３倍容量のイソプロパノール及び０．３倍容量の３Ｍ  酢酸ナトリウムと混合し、ＲＮＡペレットを製造し、その後、それを、次ぎの使用まで貯蔵するために、ＲＮＡ分解酵素が存在しない蒸留水中に溶解させた。
【００２９】
５）ＮＨ2−末端アミノ酸配列決定及びオリゴヌクレオチド合成
精製したアミラーゼタンパク質のＮＨ2−末端アミノ酸配列を、エドマン分解法に基づき、自動タンパク質シーケンサー（米国、アプライド  バイオシステムス社製、モデル  ４７１Ａ）を使用して分析した。
精製後、リポマイセス  スターケイから得られたカルボヒドラーゼ（ＬＳＡ、デキストラナーゼ活性及びアミラーゼ活性を有する）のＮ末端アミノ酸配列をＤＸＳＴＶＴＶＬＳＳＰＥＴＶＴ（式中、Ｘは明らかにされないままである。）と分析した。該アミノ酸配列ＴＶＴＶＬＳＳＰＥに基づき、オリゴヌクレオチド、即ちセンスプライマー１（５’−ＴＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡ−３’）（配列番号３）を設計した。アンチセンスプライマー２（５’−ＣＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡ−３’）（配列番号４）を構築した。電気泳動法によって測定したところ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて得られたＰＣＴ生成物は約２ｋｂのサイズであることが判った。
【００３０】
６）リポマイセス  スターケイｃＤＮＡライブラリーの構築
澱粉を添加した培地中で３６時間培養することによって得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ５ｇから、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットを使用して、ｃＤＮＡを製造した。５００ｋｂ以上のサイズの、製造したｃＤＮＡを、スピンカラム画分法によって分離し、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化されたＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターとライゲートさせた。ライゲートしたファージｃＤＮＡの試験管内パッケージングをギガパック  ゴールド  キット（米国、ストラタジーン社製）を使用して行った。
【００３１】
７）ＬＳＡのクローニング
ＬＳＡ遺伝子のオープンリーディングフレームを有するＤＮＡフラグメントを、一対のプライマー（デキストラナーゼ及びアミラーゼ特性を示すタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列及びＣ−末端アミノ酸配列にそれぞれ対応するセンスプライマー  ５’−ＴＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡ−３’とアンチセンスプライマー  ５’
−ＣＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡ−３’）を使用したＰＣＲによって得た。アガロースゲル上で分離した後、ＰＣＲ生成物をアククプレップ（登録商標：ＡｃｃＰｒｅｐ）ゲル抽出キット（韓国、バイオネール社製）を用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（米国、プロメガ社製）とライゲートさせた。塩基配列決定を、ジーンＡＭＰ  ９６００  サーマル  サイクラー  ＤＮＡ  シークエンシング  システム（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（米国、アプライド  バイオシステムス社製、モデル  ３７３−１８）中でＡＢＩ  プリズム  サイクル  シークエンシング  キット（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）（米国、パーキンエルマー社製）を使用して行った。
【００３２】
８）大腸菌におけるＬＳＡタンパク質の異種発現及び精製
ＬＳＡ遺伝子をｐＲＳＥＴＢベクター（米国、インビトロゲン社製）のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に挿入し、組換えベクター、ｐＲＳＥＴ−ＬＳＡを製造した。ｐＲＳＥＴ−ＬＳＡで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地中で３７℃において中央定常期まで培養した。該培養物にＩＰＴＧを添加して、１ｍＭの最終濃度とした後、２８℃において６時間、インキュベーションを行った。細胞を遠心分離（５０００ｇ×１０分）によって収集し、０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）で洗浄し、超音波処理を行った。発現タンパク質の精製をＮｉ2+−ニトリロトリ酢酸−アガロース（ＮＴＡ）（独国、クイアジーン社製）を使用して行った。細胞溶解物をＮｉ2+−ＮＴＡと合わせ、４℃で１時間放置し、該混合物をカラムに入れ、その後、洗浄緩衝液で４度洗浄した。それぞれ０．５ｍＬのタンパク質画分を緩衝液で乳化させた。
【００３３】
９）電気泳動及び活性染色
ナトリウム  ドデシル  スルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために、タンパク質試料を、トリスグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）中１０％ポリアクリルアミドゲル上に置いた。ポリアクリルアミドゲルは、タンパク質試料が澱粉多糖類を分解し得たかどうかを検出するために、澱粉１％を含む。電気泳動が完了した後、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）及び２０％  ２−プロパノール溶液を用いて、１時間、ゲルを洗浄することにより、ＳＤＳを除去した。３７℃において２日間、ゲルを反応緩衝液（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５）中に浸し、その後、１０分間、ヨウ素溶液（ヨウ素０．３％、ヨウ化カリウム３％）中に浸し、蒸留水で洗浄した。澱粉加水分解活性を、褐色のバックグラウンドに対する透明なゾーンの出現によって確認した。
興味深いタンパク質の分子量を決定するために、ミオシン（２００ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤａ）、血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１ｋＤａ）及びアプロチニン（６．５ｋＤａ）を含むマーカーもまた、ゲル上で電気泳動させた。
【００３４】
１０）ウェスタンブロット
電気泳動後、ゲル中のタンパク質を電場の存在下でＰＶＤＦ膜へ移した。カルボヒドラーゼ（デキストラナーゼ活性及びアミラーゼ活性の両方を有する）に対して特異的なラビットポリクローナル抗体を使用して、ＬＳＡを検出した。抗カルボヒドラーゼ抗体を含む血清を、使用するために、１：２００の割合に希釈した。該抗体で処理した膜を、ツィーン２０（Ｔ）を０．１％含むトリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）で３度洗浄した。抗原抗体複合体を、二次抗体とＥＣＬウェスタンブロット分析システム（米国、アメルシャム  ファーマシア社製）を使用して調べた。二次抗体として機能するペルオキシダーゼ−複合  抗−ラビット−ＩｇＧ（米国、アメルシャム  ファーマシア社製）を１：１５００の割合に希釈した。バイオマックスフ
ィルム（米国、コダック社製）を、スクリーン露出のために１分間使用した。
【００３５】
実施例２：カルボヒドラーゼ活性の分析
カルボヒドラーゼの還元値を、銅−ビシンコニネート（ｃｏｐｐｅｒ−ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎａｔｅ）法と組み合わせたＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）法によって決定した。即ち、銅−ビシンコニネート１００μＬを酵素溶液１００μＬに添加し、８０℃において３５分間反応させ、その後、約１５分間冷却した。吸光度を５６０ｎｍにおいて測定した。
【００３６】
実施例３：酵素の最適ｐＨ及び温度及び安定性の分析
ＬＳＡ酵素の最適ｐＨを、ｐＨ１．０の間隔でｐＨ３−９の範囲内において反応速度を測定することによって分析した。このために、２０ｍＭのリン酸クエン酸塩緩衝溶液（ｐＨ４．０）、クエン酸塩／リン酸塩緩衝液（ｐＨ５−６）及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７−９）を使用した。３７℃において４８時間反応させた後、酵素のカルボヒドラーゼ活性を、ＤＮＳ法によって決定した。また、酵素を各緩衝液に添加し、２２℃において３時間放置した後、酵素のｐＨ安定性を測定した。
酵素の最適温度は、様々な温度（２０−８０℃、１０℃間隔）において３０分間放置した酵素の反応速度を測定することによって決定した。温度安定性の決定のために、様々な温度（２０−９０℃、１０℃間隔）において３０分間放置した後、酵素の残留活性を測定した。澱粉１％（ｗ／ｖ）を、酵素の活性及び安定性の決定において基質として使用した。
【００３７】
実施例４：酵素活性に対する金属イオン、キレート溶液及び変性溶液の影響
酵素活性に対するＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及び金属イオンの影響を測定した。ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡは、それぞれ１ｍＭの最終濃度で使用した。金属イオンは、ＺｎＣｌ2、ＣｕＳＯ4、ＣａＣｌ2及びＭｇＣｌ2を含み、５ｍＭの最終濃度で使用した。酵素活性はまた、ドデシルスルフェート（ＳＤＳ、０．１％、０．５％、１％、２％）、ウレア（２Ｍ）、アセトン（０−８０％）及びエタノール（０−７０％）の存在下において測定した。測定のために、酵素を基質としての澱粉２％と３７℃において３０分間反応させた。
【００３８】
結果
リポマイセス  スターケイ由来のＬＳＡ遺伝子のクローニング
精製後、リポマイセス  スターケイから得たカルボヒドラーゼ（ＬＳＡ）（デキストラナーゼ活性及びアミラーゼ活性の両方を有する）が、ＤＸＳＴＶＴＶＬＳＳＰＥＴＶＴ（Ｘ：まだ明らかにされないアミノ酸残基）のＮ−末端アミノ酸配列を有することを分析した。該アミノ酸配列ＴＶＴＶＬＳＳＰＥに基づき、センスプライマー１（５’−ＴＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡ−３’）を設計し、合成した。それとは別に、アンチセンスプライマー２（５’−ＣＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡ−３’）を構築した。電気泳動により、ＰＣＴ生成物は２ｋｂのバンドを示した。アミノ酸配列決定及び塩基配列決定の結果を図１（図１ａ及び図１ｂ）及び配列番号１及び配列番号２に示す。
【００３９】
ＬＳＡ遺伝子の特性
デキストラナーゼ及びアミラーゼを産生するリポマイセス  スターケイ  ＫＦＣＣ  １１０７７から、ＬＳＡをコードする遺伝子が、１９４６ｂｐのｃＤＮＡフラグメントとしてクローン化された。ｃＤＮＡフラグメントにおいて、オープンリーディングフレームは１９４４ｂｐ（６４７個のアミノ酸）からなり、７１，８８９Ｄａの分子量を有し、そしてそれは非変性のＬＳＡ前駆体に相当した。その熟成タンパク質が６１９個のアミノ酸（１，８５７ｂｐ）を有し、６８，７０９Ｄａの分子量を有することが判った。熟成タンパク質をつくるために、前駆体タンパク質が、Ａｒｇ28とＡｓｐ29の間の位置にプロセシン
グされることが推論される（図１（図１ａ及び図１ｂ））。
ＬＳＡ  ＯＲＦ（ＬＳＡ  オープンリーディングフレーム）は、ヌクレオチド位置１番目において開始コドンＡＴＧを用いて開始され、ヌクレオチド位置１９４４番目において停止コドンＴＡＧを用いて停止される。推定上のＬＳＡアミノ酸配列は、様々な酵母及び植物由来のα−アミラーゼ、細菌由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、プルラナーゼ及びα−グリコシダーゼ、及びＢ．ポリミキシン由来のβ−アミラーゼと相同性を持つ。ＬＳＡは、Ｌ．コノネンコアーエ（ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、Ｓｗ．オシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（ＡＭＹ１）及びＳｈ．フィブリゲラ（ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）（ＡＬＰ１）のアミラーゼと５２−７８％の相同性を示すことが判った（パーク，Ｊ．Ｃ．，バイ，Ｓ．，タイ，Ｃ．Ｙ．及びチュン，Ｓ．Ｂ．（１９２２），Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２６０７７。ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．９３，１７−２４；ステイン，Ａ．Ｊ．Ｃ．，マルマー，Ｊ．及びプレトリウス，Ｉ．Ｓ．（１９５５）  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ  α−ａｍｙｌａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ。ＧＥＮＥ．１６６，６５−７：イトウ，Ｔ．，ヤマシタ，Ｉ．及びフクイ，Ｓ．（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ（ＡＬＰ１）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１９，３３９−３４２。）。比較のために、本発明に従って得られたＬＳＡ遺伝子を含む、様々なアミラーゼの４つの保存領域を以下の表１に示す。６ボックスのアミノ酸残基は保存領域で同一である。
表１
【表１】
2007534315.tif 000002
酵素略語：ＬＳＡ＝リポマイセス  スターケイ  α−アミラーゼ；ＡＭＹＡ＝アスペルギルス  ニズランス  α−アミラーゼ；ＡＬＰ１＝サッカロマイコプシス  フィブリゲラ  α−アミラーゼ；ＳＷＡ２＝デバロマイセス（ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）  オシデンタリス  α−アミラーゼ；ＡＭＹ２＝スキゾサッカーロマイセス  ポブメ  α−アミラーゼ（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｂｍｅ  α−ａｍｙｌａｓｅ）；ＬＫＡ１＝Ｌ．コノネンコアーエ  α−アミラーゼ；ＮＰＬ＝バシラス  ステアロサーモフィラス  ネオプルラナーゼ；ＩＡＭ＝シュードモナス  アミロデラモサ  イソアミラーゼ；Ｐ
ＵＬ１＝クレブシェラ  アエロゲネス  プルラナーゼ；ＰＵＬ２＝Ｂ．ステアロサーモフィラス  プルラナーゼ；ＣＧＴ１＝Ｋ．ニューモニエ  シクロデキストリン  グルカノトランスフェラーゼ；ＣＧＴ２＝ペニバシラス  マセランス  シクロデキストリン  グルカノトランスフェラーゼ；ＣＧＴ３＝好アルカリ性のバシラス属シクロデキストリン  グルカノトランスフェラーゼ；ＣＧＴ４＝Ｂ．ステアロサーモフィラス  シクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ；ＢＥ１＝大腸菌分枝酵素；ＢＥ２＝シネコッカス属分枝酵素；ＢＥ３＝トウモロコシ分枝酵素（ｍａｉｚｅ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）；ＭＡＬ＝サッカロマイセス  カールスバーゲンシス  マルターゼ；１，６Ｇ＝Ｂ．セレウス  オリゴ−１，６−グルコシダーゼ。
【００４０】
ｃＤＮＡの９６６番目の塩基と９６７番目の塩基の間に見られる、６０個の塩基からなる１つのイントロン（５’−ＧＴＧＧＴＡＴＧＴＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＴＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣ−３’）がＬＳＡのゲノムＤＮＡ中に存在する。本発明に従って製造された組換えＬＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された母細胞（リポマイセス  スターケイ）のＬＳＡ（約１００ｋＤａ）と分子量が異なることが判った。この差は、母細胞の酵素が酵母中で製造された糖タンパク質で糖化されたためであると思われる。母細胞のカルボヒドラーゼにおいて、抗カルボヒドラーゼ抗体は約１００ｋＤａで検出された（図２）。それは他のものと凝集する傾向にあるため、煮沸されない場合、活性ＬＳＡ酵素は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定すると、２００ｋＤａであることが判った。
【００４１】
ＬＳＡ遺伝子の発現
大腸菌中にＩＰＴＧ誘導を行い、細胞を回収し、超音波処理によって破壊した。タンパク質を、ヒスチジン標識アフィニティーカラムを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって分析した（図３、レーン１）。主に、発現タンパク質のためのバンドは、７３ｋＤａに相当する（ＬＳＡ＋ヒスチジン標識）。澱粉等の多糖類を分解する精製タンパク質の能力を試験するために、澱粉含有ＰＡＧＥゲルを使用して、電気泳動を行った。電気泳動が完了した後、ゲルを３７℃において３０分間放置し、ヨウ素溶液で染色した。ＬＳＡ活性バンドの透明ゾーンが褐色のバックグラウンドに対して示された（図３、レーン２）。ウエスタンブロット分析に示されるように、抗カルボヒドラーゼ抗体が約７３ｋＤａ（ＬＳＡ＋ヒスチジン標識）においてタンパク質を検出した（図３、レーン３）。
【００４２】
ＬＳＡの生化学的特性
ＬＳＡ酵素が、４０℃において最適な活性を示すこと及び２０−５０℃の温度範囲において安定性を維持することが判った。６０℃において３時間、インキュベーションした後、ＬＳＡ酵素は、安定な温度におけるの活性の７０％の活性であった（図４）。ＬＳＡ酵素のアミラーゼ活性は、５−８のｐＨ範囲において、最適にはｐＨ６において、安定に維持された（図５）。
酵素の澱粉分解活性は、５ｍＭのＣｕ2+によって抑制されたが、５ｍＭのＣａ2+及び５ｍＭのＭｇ2+の存在下において、それぞれ約３１５％及び２２０％に増加した（表２）。該酵素の活性は、１ｍＭのＥＤＴＡによって抑制されたが、１ｍＭのＥＧＴＡは影響しなかった。ＳＤＳは酵素の澱粉分解活性を完全に抑制し、ウレア又はアセトンは該活性を増加させた。１０ないし４０％のアセトン溶液及び１０ないし２０％のエタノール溶液が使用される場合、ＬＳＡ酵素の活性は、それぞれ１．０３ないし１．２２倍及び１．２５ないし１．３３倍増加する。６０％のアセトン又はエタノールの存在下において、ＬＳＡ酵素は、最適活性の５０％より低い活性を示した（図６及び図７）。本発明のＬＳＡ酵素の高い安定性は、既知の澱粉加水分解酵素の安定性とは全く異なる。
表２
ＬＳＡ酵素活性に対する金属イオン、キレート剤及び変性剤の影響
【表２】
2007534315.tif 000003
【００４３】
ＬＳＡと澱粉２％の反応の早期段階において、マルトペンタオースより大きいオリゴ糖が製造された。その後、マルトオリゴ糖がマルトペンタオース及びより小さなオリゴ糖に分解された。最終的に、マルトトリオース及びマルトテトラオースが他のオリゴ糖より優勢であった（図８）。マルトオリゴ糖系（マルトースないしマルトヘプタオース）の混合物と反応する場合、ＬＳＡはＧ２及びＧ３は加水分解しないが、Ｇ４をＧ２に、Ｇ５をＧ２＋Ｇ３に、Ｇ６をＧ２＋Ｇ４又はＧ３＋Ｇ３に、Ｇ７をＧ３＋Ｇ４に分解する（図８Ｂ）。また、ＬＳＡが、アミロペクチン、澱粉（溶性）及びグリコーゲンを強く分解し、アミロース、アミロデキストリン、デキストラン、α−シクロデキストリン及びプルランをあまり分解しないことが判った（表３）。
表３
ＬＳＡ酵素の相対的基質特異性
【表３】
2007534315.tif 000004
【００４４】
上記したように、本発明によって提供される酵素は、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン及びアミロース等の様々な多糖類を効果的に加水分解することができる。このような分解活性を有するため、本発明の酵素は、抗歯垢組成物又はマウスウォッシュを含む、デンタルケア産業における様々な用途において有用なだけではなく、糖製造中におけるデキストラン又は多糖類汚染物質の除去においても有用である。
【００４５】
本発明の好ましい態様は、説明目的のために開示されたものであるとはいえ、当業者ならば、添付した請求の範囲に開示される本発明の範囲及び精神から外れることなく、様々な変形、付加及び代替が可能であることを予期し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ】本発明に従ったリポマイセス  スターケイ（ＬＳＡ）から得られたカルボヒドラーゼのアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をエンコードする１９４６ｂｐのヌクレオチド配列を示す（ここで、通常の下線部は、熟成タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列決定を通じて分析されたベクターに熟成タンパク質をクローニングするためのＰＣＲプライマー部分を表わし、矢印で示され部分はシグナルペプチドのためのスプライシング部位を表わし、太い下線部分は、α−アミラーゼの保存領域を表わす。）。
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列の続きである。
【図２】煮沸された酵素（レーン１）及び煮沸していない酵素がゲル上で電気泳動されるところのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果及び抗カルボヒドラーゼ抗体が煮沸された酵素と複合されるところ（レーン３）のウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの結果を示す写真であり、ここで、矢印で示される本発明のＬＳＡは、ゲル上で分子量マーカー（Ｍ）とともに電気泳動され、クーマシーブルー染色（レーン１）によって及び活性染色（レーン２）によって視覚化を行われ、そして、母細胞の抗ＬＳＡ抗体と反応させられる（レーン３）。
【図４】本発明のＬＳＡの活性及び安定性が温度に対してプロットされるところのグラフである。
【図５】本発明のＬＳＡの活性及び安定性がｐＨ値に対してプロットされるところのグラフである。
【図６】本発明のＬＳＡの活性に対するアセトンの影響を示すグラフである。
【図７】本発明のＬＳＡの活性に対するエタノールの影響を示すグラフである。
【図８】本発明のＬＳＡの酵素活性を示すＴＬＣの結果の写真であり、ここで、酵素によって加水分解される前及び後に、マルトデキストリン（Ｍｎ）とともに、澱粉試料（１％ｗ／ｖ）が分析され（それぞれ、パネルＡのレーン１及びレーン２）、精製ＬＳＡをＧ１（グルコース）ないしＧ７（マルトヘプタオース）を含む一連のマルトオリゴ糖と反応させた後、マルトオリゴ糖試料（１％ｗ／ｖ）が分析された（それぞれ、パネルＢのレーン１ないしレーン７。）。
【図１ａ】
2007534315.tif 000005
【図１ｂ】
2007534315.tif 000006
【図２】
2007534315.tif 000007
【図３】
2007534315.tif 000008
【図４】
2007534315.tif 000009
【図５】
2007534315.tif 000010
【図６】
2007534315.tif 000011
【図７】
2007534315.tif 000012
【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月7日(2006.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記細胞が、ＫＣＴＣ１０５７３ＢＰの受託番号で寄託された大腸菌ＤＨ５＠／ｐＲＬＳＡ株である請求項３又は４に記載の形質転換細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
好ましい態様の説明
本発明のカルボヒドラーゼ（ＬＳＡ）をコードする遺伝子の獲得は、澱粉を含む培地中でリポマイセス  スターケイを培養することによって開始される。次ぎに、リポマイセス
スターケイから精製された炭水化物加水分解酵素のＮ−末端アミノ酸配列に基づき、予期された保存領域を含むプライマーが構成され、その後、該プライマーを用いて、ＰＣＲが行われる。約２ｋｂの長さのＰＣＲ生成物が、完全なカルボヒドラーゼ遺伝子（ＬＳＡ）とするために、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥにおいて使用される。ＰＣＲによって増幅させた後、株該遺伝子はｐＲＳＥＴＢベクター（米国、インビトロゲン社製）においてクローン化され、その後、大腸菌ＤＨ５＠／ｐＲＬＳＡによって形質転換される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、本発明は、カルボヒドラーゼをコードする遺伝子を有する新規微生物に関する。本発明に従った大腸菌ＤＨ５＠／ｐＲＬＳＡ株は、２００３年１２月２４日に、ＫＣＴＣ１０５７３ＢＰの受託番号で、韓国、デジョン市、ユサン  グに所在の韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＫＣＴＣ）に寄託された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
また、本発明はカルボヒドラーゼの製造方法に関する。まず、大腸菌ＤＨ５＠／ｐＲＬＳＡ株が培養される。該大腸菌を培養により得た後、その細胞を、ガラスビーズを使用して崩壊させ、そこからカルボヒドラーゼを単離した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
８）大腸菌におけるＬＳＡタンパク質の異種発現及び精製
ＬＳＡ遺伝子をｐＲＳＥＴＢベクター（米国、インビトロゲン社製）のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に挿入し、組換えベクター、ｐＲＳＥＴ−ＬＳＡを製造した。ｐＲＳＥＴ−ＬＳＡで形質転換した大腸菌ＤＨ５＠／ｐＲＬＳＡを、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地中で３７℃において中央定常期まで培養した。該培養物にＩＰＴＧを添加して、１ｍＭの最終濃度とした後、２８℃において６時間、インキュベーションを行った。細胞を遠心分離（５０００ｇ×１０分）によって収集し、０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）で洗浄し、超音波処理を行った。発現タンパク質の精製をＮｉ2+−ニトリロトリ酢酸−アガロース（ＮＴＡ）（独国、クイアジーン社製）を使用して行った。細胞溶解物をＮｉ2+−ＮＴＡと合わせ、４℃で１時間放置し、該混合物をカラムに入れ、その後、洗浄緩衝液で４度洗浄した。それぞれ０．５ｍＬのタンパク質画分を緩衝液で乳化させた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007534315000001.app
【国際調査報告】
2007534315.tif 000014
2007534315.tif 000015
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