(57)【要約】  本発明は、標識スフィンゴシンの使用による、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を測定する方法(アッセイ)に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための、標識スフィンゴシンの使用。
【請求項２】
ａ. 適当な培養培地に含まれる生存細胞を、酵素産物が形成できるように予定された時間標識スフィンゴシンと接触させ、
ｂ. 工程ａ.で形成された酵素産物を分離し、そして
ｃ. 形成された酵素産物の量を測定する
工程を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための方法。
【請求項３】
Ａ. 標識非リン酸化スフィンゴシンと
−所望によりスフィンゴシンキナーゼを含むサンプル、および
−ホスフェート源を、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ.の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒を添加し、
Ｃ. 工程Ｂ.で得られた相を分離し、
Ｄ. 工程Ｃ.で得られた水性相中の酵素産物の量を測定する
工程を含む、スフィンゴシンキナーゼの活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための方法。
【請求項４】
ａ. 標識非リン酸化スフィンゴシンと
−ホスフェート源、および
−スフィンゴシンキナーゼを、
ａ１. 候補化合物の非存在下、および
ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ｂ. 工程ａ１および工程ａ２の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒の混合物を添加し、
ｃ. 工程ａ１.およびａ２.で形成された酵素産物を、非反応標識スフィンゴシンから、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、
ｄ． 工程ａ１.および工程ａ２で得られた酵素産物の量を検出し、そして工程ａ１.および工程ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
ｅ. 工程ｄで決定した通りにスフィンゴシンキナーゼの活性を調節する薬剤を選択する
工程を含む、スフィンゴシンキナーゼの活性を調節する薬剤を同定する方法。
【請求項５】
Ａ. 標識リン酸化スフィンゴシンと、適当な培地に含まれる生存細胞を、
Ａ１. 候補化合物の非存在下、および
Ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ１.およびＡ２.で形成された酵素産物を、非反応標識リン酸化スフィンゴシンから分離し、
Ｃ. 工程Ａ１.および工程Ａ２で得られた酵素産物の量を検出し、そして工程Ａ１.および工程Ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
Ｄ. 工程Ｃで決定した通りにスフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する
工程を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する方法。
【請求項６】
α.
α１. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、所望によりスフィンゴシンキナーゼ−１−活性もしくはスフィンゴシンキナーゼ−２−活性または両方を含むか、またはスフィンゴシンキナーゼ活性を含まないサンプル、およびホスフェート源、
α２. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、定義された量のスフィンゴシンキナーゼ−１−活性を含むサンプル、およびホスフェート源、
α３. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、定義された量のスフィンゴシンキナーゼ−２−活性を含むサンプル、およびホスフェート源、
を酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
β. 工程α１.、α２.およびα３.で形成された酵素産物を、標識スフィンゴシンの非反応化合物から、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、そして
γ. 工程α１.、α２.およびα３におけるホスフェート変換速度を、測定し、かつ比較する
工程を含む、サンプル中にスフィンゴシンキナーゼ−１−活性またはスフィンゴシンキナーゼ−２−活性または両方があるか、またはスフィンゴシンキナーゼ活性が存在しないかを測定する方法。
【請求項７】
ｉ. 式Ｉの非リン酸化化合物とホスフェート源および
ｉ１. スフィンゴシンキナーゼ−１、
ｉ２. スフィンゴシンキナーゼ−２を、
−試験化合物の非存在下、および
−試験化合物の存在下
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ii. 非反応の式Ｉの非リン酸化化合物を、工程ｉ１.およびｉ２.で形成された酵素産物から、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、そして
iii. 工程ｉ１.およびｉ２.におけるホスフェート変換速度を測定し、かつ比較する
工程を含む、試験化合物がスフィンゴシンキナーゼ−１および／またはスフィンゴシンキナーゼ−２の活性を介在できるか否かを区別する方法。
【請求項８】
主成分としての標識スフィンゴシンおよび該キットを使用するための指示書を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性の測定のためのキット。
【請求項９】
スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を介在する薬剤の同定に使用するための、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
標識スフィンゴシンが、式
【化１】
2007507205.tif 000059
〔式中、
Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はＨ、ＯＨまたはオキソであり、
ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍは、互いに独立してＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨ２−フェニル、フェニル−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＮＨ−ＣＨ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−フェニル、ＣＨ２−フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、ＳＯ２−ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２の基であるか、またはＡ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの中の一つの基が存在せず、
ｍは、０〜１２から選択される数字であり、
ｎは、０〜１２から選択される数字であり、
そしてｍ＋ｎは、０〜１４から選択される数字であり、
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物において物理的手段により選択的に検出可能な基である。
ただし、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方は、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択される。〕
の化合物である、請求項１から７のいずれかに記載の使用、方法または請求項８もしくは９に記載のキット。
【請求項１１】
式
【化２】
2007507205.tif 000060
〔式中、
Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はＨ、ＯＨまたはオキソ、例えばＨまたはＯＨであり、
ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍは、互いに独立してＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨ２−フェニル、フェニル−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＮＨ−ＣＨ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−フェニル、ＣＨ２−フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、ＳＯ２−ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２の基であるか、またはＡ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの中の一つの基が存在せず、
ｍは、０〜１２から選択される数字であり、
ｎは、０〜１２から選択される数字であり、
ｍ＋ｎは、０〜１４から選択される数字であり、そして
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物において物理的手段により選択的に検出可能な基である。
ただし
−Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方はＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択され、そして
−式
【化３】
2007507205.tif 000061
(式中、Ｘは上記で定義の通りである)
の化合物を除く。〕
の化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の式Ｉの蛍光標識スフィンゴシンの、例えばスフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を調節する薬剤を同定するための、ハイスループットアッセイにおける使用。
【請求項１３】
スフィンゴ脂質経路に包含されるスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素を介在できる薬剤であって、請求項４または５のいずれかに記載の方法により同定される、薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばスフィンゴ脂質経路に包含されるスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼのような酵素の活性を測定するための方法(アッセイ)に使用するための、標識スフィンゴシン、例えば蛍光標識スフィンゴシンに関する。
【０００２】
スフィンゴシン−１−ホスフェート(ＳＰＰ)は、細胞内および細胞外作用の両方を有する重要なシグナル伝達分子である(例えばBaumruker T. et al., Semin. Immunol. 2002, 14, 57-63参照)。ＳＰＰは、スフィンゴシン(ＳＰ)から、スフィンゴシンキナーゼ(ＳＰＨＫ)により、ホスフェート源、例えばアデノシン三リン酸(ＡＴＰ)、グアノシン三リン酸(ＧＴＰ)の存在下、形成される。ＳＰおよびＳＰＰの両方の機能および細胞下局在の試験のために、例えば、ＳＰ／ＳＰＰ比の決定による、ＳＰＨＫの生物活性の決定が必須である。２位のアミノ基でアシル化されているスフィンゴシンは、セラミドキナーゼにより認識され、そしてホスフェート源、例えばアデノシン三リン酸(ＡＴＰ)またはグアノシン三リン酸(ＧＴＰ)の存在下、これらのスフィンゴシンはリン酸化される。
【０００３】
我々は、容易に行うことができ、かつ効率的であり得る、サンプル中の、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼまたは脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を測定する方法を驚くべきことに発見した。
【０００４】
一つの局面において、本発明は、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための、標識スフィンゴシンまたは標識スフィンゴシンホスフェートの使用を提供する。
【０００５】
他の局面において、本発明は、
ａ. 適当な培養培地に含まれる生存細胞を、酵素産物が形成できるように予定された時間標識スフィンゴシンと接触させ、
ｂ. 工程ａ.で形成された酵素産物を分離し、そして
ｃ. 形成された酵素産物の量を測定する
工程を含む、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための方法を提供する。
【０００６】
工程ｂ.で形成された酵素産物の分離は、適当に、例えば工程ａ.で得られた混合物に、水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒を添加し、例えば抽出後、このようにして得た相を分離することにより、行うことができる。
【０００７】
スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼから成る群から選択される酵素を取り込む能力を有する全ての細胞系を本発明の方法で使用できる。好ましくはヒト細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)のような、例えばヒト内皮細胞である。
【０００８】
細胞を、適当な培地、例えばヒト細胞、例えばＨＵＶＥＣを含むヒト内皮細胞の培養に適した培地中の生存細胞として使用する。
記載の細胞ベースのアッセイで使用する標識スフィンゴシンは、本明細書に記載の通りの式Ｉの化合物である。
【０００９】
スフィンゴシンキナーゼ活性の測定のために、使用する標識スフィンゴシンはＳＰ、すなわち非リン酸化スフィンゴシンであり、一方、スフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび／または脂質ホスフェートホスファターゼ活性の測定のために、使用する標識スフィンゴシンはＳＰＰ、すなわち１−ホスフェート−スフィンゴシンである。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、
Ａ. 標識非リン酸化スフィンゴシンと
−ホスフェート源、および
−所望によりスフィンゴシンキナーゼを含むサンプルを、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ.の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒を添加し、
Ｃ. 工程Ｂ.で得られた相を分離し、
Ｄ. 工程Ｃ.で得られた水性相中の酵素産物の量を測定する
工程を含む、スフィンゴシンキナーゼの活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための方法を提供する。
【００１１】
本明細書で使用するスフィンゴシンは、天然に存在するスフィンゴシンおよびスフィンゴシンホスフェート、ならびに化学的に修飾され、かつ天然スフィンゴシンまたはスフィンゴシンホスフェートと化学的に異なるが、まだスフィンゴシンキナーゼ、または、各々スフィンゴシンホスフェートホスファターゼまたは脂質ホスフェートホスファターゼから成る群から選択される酵素により基質として認識される、スフィンゴシンおよびスフィンゴシンホスフェートを含む。
【００１２】
化学的に修飾されたスフィンゴシンおよびスフィンゴシンホスフェートは、例えば酵素反応速度または溶解度のような様々なパラメータに関して最適化でき、そしてＳＰ、ＳＰＰおよびＳＰＨＫの研究における価値のあるツールであり得、そして、慣用のまたは本明細書に記載の方法に従い、例えば、準じて製造できる。
【００１３】
本発明の方法で有用な標識スフィンゴシンは、例えば式
【化１】
2007507205.tif 000002
〔式中、
Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はＨ、ＯＨまたはオキソ、例えばＨまたはＯＨであり、
ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍは、互いに独立してＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、
例えば、式
【化２】
2007507205.tif 000003
の基を含むＣＨ２−フェニル、フェニル−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−フェニル；
ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＮＨ−ＣＨ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、
例えば、式
【化３】
2007507205.tif 000004
の基を含むフェニル−Ｏ、Ｏ−フェニル、ＣＨ２−フェニル−Ｏ；
Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、ＳＯ２−ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２の基であるか、またはＡ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの中の一つの基が存在せず、
ｍは、０〜１２から選択される数字であり、
ｎは、０〜１２から選択される数字であり、
ｍ＋ｎは、０〜１４から選択される数字であり、
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物において物理的手段により選択的に検出可能な基である。
ただし、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方は、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択される。〕
の化合物を含む。
【００１４】
他の局面において、本発明は、式
【化４】
2007507205.tif 000005
〔式中、
Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はＨ、ＯＨまたはオキソ、例えばＨまたはＯＨであり、
ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍは、互いに独立して
ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、
例えば、式
【化５】
2007507205.tif 000006
の基を含むＣＨ２−フェニル、フェニル−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−フェニル；
ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＮＨ−ＣＨ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、
例えば、式
【化６】
2007507205.tif 000007
の基を含むフェニル−Ｏ、Ｏ−フェニル、ＣＨ２−フェニル−Ｏ；
Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、ＳＯ２−ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２の基であるか、またはＡ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの中の一つの基が存在せず、
ｍは、０〜１２から選択される数字であり、
ｎは、０〜１２から選択される数字であり、
そしてｍ＋ｎは、０〜１４から選択される数字であり、
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物において物理的手段により選択的に検出可能な基である。
ただし、
−Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方はＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択され、そして
−式
【化７】
2007507205.tif 000008
(式中、Ｘは上記で定義の通りである)
の化合物を除く。〕
の化合物を提供する。
【００１５】
本発明の方法において、好ましくは
−スフィンゴシンキナーゼ活性の測定のために、使用する標識スフィンゴシンは、ＸがＨである式Ｉの化合物であり、
−スフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび／または脂質ホスフェートホスファターゼ活性の測定のために、使用する標識スフィンゴシンは、Ｘが(ＨＯ)２ＰＯである式Ｉの化合物である。
【００１６】
本明細書で他に定義しない限り、
−アシルはアルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニルを含み、
−アルキルは(Ｃ１−４)アルキルを含み、
−シクロアルキルは(Ｃ３−８)シクロアルキルを含み、
−アリールは(Ｃ６−１８)アリール、例えばフェニル、ナフチルを含み、
−ヘテロシクリルは、５または６環員と、Ｎ、Ｓ、Ｏから成る群から選択される１個から４個のヘテロ原子を有するヘテロ環式環(系)を含む。
【００１７】
本発明の方法で使用する標識スフィンゴシンは、物理的手段により選択的に検出可能な基、例えば蛍光基、例えば蛍光色素に由来する基で標識された基のような、蛍光手段により選択的に検出可能な基で標識されたスフィンゴシンを含む。例えば基ＤＹＥは、例えばピレニル、ダンシル、ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾリル(＝ＮＢＤ)、Ｃｙ５基、bodipy基、例えばピレニル、ダンシル、ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾリル(＝ＮＢＤ)を含む、慣用の通りの蛍光基のような蛍光基を含む。基ＤＹＥは、好ましくは
−ピレニル、
−ダンシル、
−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾリル(＝ＮＢＤ−イル)である。
【００１８】
他の局面において、本発明は、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ａ−Ｄ、ｍ、Ｅ−Ｇ、ｎ、Ｌ−Ｍが上記で定義の通りであり、そして基ＤＹＥがピレニルまたはダンシルである、
式Ｉの化合物を提供する。
【００１９】
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物中で化学的に結合しており、その化学構造を物理的手段で選択的に検出し得る基を有する分子に由来する。該選択的検出性は、式Ｉの化合物において残る。例えば、蛍光基を含む分子が、式Ｉの化合物に化学的に結合し、その化学構造において蛍光基を有する分子に揺らし、その蛍光基はその蛍光特性を式Ｉの化合物において保持する。
【００２０】
ピレンは、式
【化８】
2007507205.tif 000009
の化合物であり、ピレン−２−イルは式
【化９】
2007507205.tif 000010
の基である。
【００２１】
ダンシルは式
【化１０】
2007507205.tif 000011
の基である。
【００２２】
ＮＢＤは、式
【化１１】
2007507205.tif 000012
の基であり；ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルは式
【化１２】
2007507205.tif 000013
の基である。
【００２３】
bodipyフルオロフォアの基本化学構造は、式
【化１３】
2007507205.tif 000014
のものである。
【００２４】
Ｃｙ５は、式
【化１４】
2007507205.tif 000015
のシアニン−５.１８分子を含む。
【００２５】
ピレニル、ダンシル、ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾリル(＝ＮＢＤ)、Ｃｙ５基およびbodipy基は、上記の通りの対応する基本化学構造を有する蛍光基を含み、また、該構造の化学的修飾を有する蛍光基も含む。
【００２６】
他の局面において、本発明は
−式
【化１５】
2007507205.tif 000016
の化合物
−式
【化１６】
2007507205.tif 000017
の化合物
−式
【化１７】
2007507205.tif 000018
の化合物
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ａ−Ｄ、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｍ、ｎおよび基ＤＹＥは上記で定義の通りである。ただし、
−Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方はＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択され、そして
−式
【化１８】
2007507205.tif 000019
(式中、Ｘは上記で定義の通りである)
の化合物を除く。〕
を提供する。
【００２７】
他の局面において、本発明は、
−式
【化１９】
2007507205.tif 000020
の化合物
−式
【化２０】
2007507205.tif 000021
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｎ、ｍおよび基ＤＹＥは上記で定義の通りである。
ただし、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方はＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択される。〕
を提供する。
【００２８】
式Ｉの化合物は、式ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤおよびＩＥの化合物を含む。
本発明のスフィンゴシンは、式Ｉの化合物(例えばおよび式ＩＰ１およびＩＰ２の化合物)を含む。
【００２９】
式Ｉの化合物の好ましい局面において
−Ｒ１はＨまたはメチルであり、
−Ｒ２はＨまたはＯＨであり、
−ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
−Ａ−Ｄは存在し、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＮＨ、Ｏ−ＣＨ２または式
【化２１】
2007507205.tif 000022
の基であるか；またはＡ−Ｄは存在せず、
−Ｅ−ＧはＯ−ＣＯ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＮＨ−ＣＯ、または式
【化２２】
2007507205.tif 000023
の基であり；
−Ｌ−ＭはＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＮＨ、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２であり、
−ｍは、０〜１２、例えば０〜１０から選択される数字であり、
−ｎは、０〜１２、例えば０〜８から選択される数字であり、
−ｍ＋ｎは、０〜１４、例えば０〜１１から選択される数字であり、
基ＤＹＥは、ピレニル、ダンシルおよびニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−イルから成る群から選択される基である。
【００３０】
ただし、
−Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方は、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択され、そして
−式
【化２３】
2007507205.tif 000024
(式中、Ｘは上記で定義の通りである)
の化合物を除く。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、
Ｒ１がＨであり、
Ｒ２がＨまたはＯＨであり、
ＸがＨまたは(ＨＯ)２ＰＯ、例えばＨであり、
Ａ−Ｄが存在し、かつＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＮＨまたはＯ−ＣＨ２であるか、またはＡ−Ｄが存在せず、
Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯまたは式
【化２４】
2007507205.tif 000025
の基であり、
Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯ、Ｏ−ＣＨ２またはＮＨ−ＳＯ２であり、
ｍが０〜１０から選択される数字であり、
ｎが０〜７から選択される数字であり、
ｍ＋ｎが０〜１０から選択される数字であり、そして
基ＤＹＥがピレニルである；
ただし、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２であるとき、Ｅ−ＧはＯ−ＣＯまたはＮＨ−ＣＯである、
式Ｉの化合物を提供する。
【００３２】
さらなる局面において本発明は、
Ｒ１がＨまたはメチルであり、
Ｒ２がＨまたはＯＨであり、
ＸがＨまたは(ＨＯ)２ＰＯ、例えばＨであり、
Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨまたはＯ−ＣＨ２であり、
Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、
Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、
ｍが０〜７から選択される数字であり、
ｎが０であり、
ｍ＋ｎが５〜１０から選択される数字、例えば７であり、そして
基ＤＹＥがダンシルである、
式Ｉの化合物を提供する。
【００３３】
さらなる局面において本発明は、
Ｒ１がＨまたはメチルであり、
Ｒ２がＨまたはＯＨであり、
ＸがＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＮＨ、Ｏ−ＣＨ２または式
【化２５】
2007507205.tif 000026
の基であり、
Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、
Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、
ｍが３、４、５、７または８の数字であり、
ｎが０または１から選択される数字であり、
ｍ＋ｎが３〜８から選択される数字であり、そして
基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−イルである、
式Ｉの化合物を提供する。
【００３４】
他の局面において、本発明は、特記されない限りＸがＨであり、そして
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、ｍが３であり、Ｅ−ＧがＯ−ＣＯであり、ｎが１であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、ｍが３であり、Ｅ−ＧがＯ−ＣＯであり、ｎが３であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、ｍが３であり、Ｅ−ＧがＯ−ＣＯであり、ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＯ−ＣＯであり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＮＨ−ＣＯであり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＮＨ−ＳＯ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
【００３５】
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがダンシルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＣＯ−ＮＨであり、ｍが６であり、Ｅ−ＧがＯ−ＣＯであり、ｎが１であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＣＯ−ＮＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＮＨ−ＣＯであり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＣＯ−ＮＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＮＨ−ＳＯ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＣＯ−ＮＨであり、ｍが１０であり、Ｅ−ＧがＮＨ−ＣＯであり、ｎが１であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＣＨ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＣＯ−ＮＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−Ｄが存在せず、Ｅ−Ｇが式
【化２６】
2007507205.tif 000027
の基であり、ｍおよびｎが０であり、Ｌ−ＭがＯ−ＣＨ２であり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
【００３６】
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＯ−ＣＨ２であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−ＤがＯ−ＣＨ２であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−ＤがＯ−ＣＨ２であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがダンシルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−ＤがＯ−ＣＨ２であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＮＨ−ＣＯであり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ａ−ＤがＯ−ＣＨ２であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＮＨ−ＣＯであり、そして基ＤＹＥがピレン−２−イルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−Ｄが式
【化２７】
2007507205.tif 000028
の基であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが５であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
【００３７】
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−Ｄが式
【化２８】
2007507205.tif 000029
の基であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ａ−Ｄが式
【化２９】
2007507205.tif 000030
の基であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが３であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｘが(ＯＨ)２ＰＯであり、Ａ−Ｄが式
【化３０】
2007507205.tif 000031
の基であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが８であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１およびＲ２がＨであり、Ｘが(ＯＨ)２ＰＯであり、Ａ−ＤがＯ−ＣＨ２であり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルであるか、
−Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｘが(ＯＨ)２ＰＯ、Ａ−ＤがＣＨ＝ＣＨであり、Ｅ−ＧがＣＨ２−ＣＨ２であり、ｍ＋ｎが７であり、Ｌ−ＭがＣＨ２−ＮＨであり、そして基ＤＹＥがニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾル−７−イルである
式Ｉの化合物を提供する。
【００３８】
本発明により提供される化合物は、以後“本発明の(に従う)化合物(群)”と呼ぶ。式Ｉの化合物は、式ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤおよびＩＥの化合物を含む。標識スフィンゴシン、例えば本発明の化合物は、全ての形の、例えば遊離形、塩の形の、溶媒和物のおよび、所望により存在するとき溶媒和物の形である塩の形の化合物を含む。
【００３９】
他の局面において、本発明は、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ａ−Ｄ、ｍ、Ｅ−Ｇ、ｎ、Ｌ−Ｍおよび基ＤＹＥが上記で定義の通りであり、両方のただし書きを伴う、塩の形の式Ｉの化合物を提供する。
【００４０】
標識スフィンゴシン、例えば本発明の化合物の塩は、金属塩および酸付加塩を含む。金属塩は、例えばアルカリまたはアルカリ土類塩；例えばカリウム、ナトリウム；式Ｉの化合物と酸、例えばフマル酸水素、フマル酸、ナフタリン−１,５−スルホン酸、塩酸、二塩塩素酸(deuterochloric acid)との塩を含む、酸付加塩；好ましくは塩酸を含む。
【００４１】
遊離形の本発明の化合物は、対応する塩の化形の化合物に変換でき；そして逆も可能である。遊離形または塩の形のおよび溶媒和物形の本発明の化合物は、遊離形または非溶媒和形の塩の形の対応する化合物に変換でき；そして逆も可能である。
【００４２】
本発明の化合物は、異性体およびそれらの混合物；例えば光学異性体、ジアステレオ異性体、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ配座異性体の形で存在し得る。本発明の化合物は、例えば不斉炭素原子を含み得、故にエナンチオマーまたはジアステレオ異性体およびそれらの混合物、例えばラセミ体の形で存在し得る。全ての不斉炭素原子は(Ｒ)−、(Ｓ)−または(Ｒ,Ｓ)−立体配置、好ましくは(Ｒ)−または(Ｓ)−立体配置で存在し得る。例えば、本発明の化合物において、Ｒ１が結合している炭素原子およびＲ２が結合している炭素原子(Ｒ２が水素以外であるとき)は、両方とも不斉炭素原子である；不斉炭素原子に結合している基は、(Ｒ)−、(Ｓ)−または(Ｒ,Ｓ)−立体配置であり得る。例えば本発明の化合物は二重結合を含み得、このような二重結合の水素原子または基は、故にｃｉｓ−またはｔｒａｎｓ−コンホメーションであり得る。
【００４３】
異性体混合物は、純粋異性体を得るのに適当な、慣用法に、例えば従って、例えば準じて分離し得る。本発明は、全ての異性体形および全ての異性体混合物の本発明の化合物を含む。
【００４４】
本発明はまた、互変体が存在できるとき、式Ｉの化合物の互変体も含む。
【００４５】
式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤおよびＩＥの化合物において、各々の単独で定義の置換基が、例えば、定義の他の置換基と無関係に、好ましい置換基であり得る。
【００４６】
本発明により提供される方法におけるホスフェート源は、自然環境に存在するホスフェート源、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ、好ましくはＡＴＰを含む。
【００４７】
本発明により提供される工程ａ.からｃ.、または、ＡからＤを各々含む方法におけるサンプルは、スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンホスフェートホスファターゼの活性を測定したいと望む全てのサンプルを含み、例えばインビボおよびインビトロ研究由来のサンプル、例えば、例えば細胞融解物、組織を含む細胞を含むサンプル、または酵母、哺乳類、動物、鳥類、魚類および植物由来の漿液；インビトロサンプル、例えば比較理由のためにキナーゼ活性を含まない、適当な純度の試験サンプルを含む。スフィンゴシンホスフェートホスファターゼの測定のために、インビボサンプルを使用する。このようなサンプルの準備は慣用の方法に、例えば、従って、例えば準じて行い得る。
【００４８】
酵素活性がサンプルに存在しないとき、本発明の方法を使用したとき、活性は検出されないであろう。キナーゼ／ホスファターゼ活性がサンプルに包含されるとき、活性の程度を、本発明の方法に使用により測定できる。
【００４９】
本発明の方法におけるスフィンゴシンキナーゼ活性は、全てのスフィンゴシンキナーゼ、例えばスフィンゴシンキナーゼ−１およびスフィンゴシンキナーゼ−２の活性を含む。本発明の方法におけるスフィンゴシンホスフェートホスファターゼ活性は、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に包含される全てのスフィンゴシンホスファターゼを含む。
【００５０】
本発明により提供される方法において酵素産物の形成に必要な時間は研究において望まれる結果に依存する。このような時間は各個々のサンプルについての試験サンプルで予め決定し得る。
【００５１】
本発明により提供される方法における形成される酵素産物は、スフィンゴシン(shingosine)キナーゼの場合、リン酸化蛍光標識スフィンゴシン、例えば式Ｉの化合物(式中、残基は上記で定義の通りであり、対応するスフィンゴシンの１位のヒドロキシ基はリン酸化されており、すなわち１位のヒドロキシ基は(ＨＯ)２ＰＯ−Ｏ−基で置換されている)のような、酵素的、標識産物を含むホスフェートであるか；またはスフィンゴシンホスフェートホスファターゼ(uehosphatase)の場合、酵素的標識非リン酸化産物、例えば式Ｉの化合物(式中、残基は上記で定義の通りであり、対応するスフィンゴシンの１位のヒドロキシ基は遊離であり、非リン酸化である)である。
【００５２】
本発明により提供される方法において水との組み合わせで２相を形成できる有機溶媒は
−水との組み合わせで２相を形成でき、そして
−該有機溶媒および水の混合物中の非反応標識スフィンゴシンを溶解できる。
【００５３】
このような有機溶媒は、例えばハロゲン化炭化水素、例えばＣＨＣｌ２、ＣＨＣｌ３、エーテル、例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル；炭化水素、例えばｎ−ブタン、ｎ−ペンタン；酢酸アルキル、例えば酢酸(Ｃ２−５)アルキル、例えば酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルを含み、例えば、本明細書に具体的に記載したような個々の有機溶媒の、例えば混合物を含む。
【００５４】
本発明により提供される方法における水性緩衝液は、形成した酵素産物が、上記の有機溶媒と水性緩衝液の混合物の水性相に溶解できるｐＨ、例えば約８.５のような例えば７.０〜１０のｐＨを有する緩衝液であり、例えばＫ２ＨＰＯ４含有緩衝液を含む。このような水性緩衝液は既知であるか、または慣用の通り得ることができる。
【００５５】
本発明により提供される方法において形成された２相の分離は、適当な慣用の方法に、例えば、従って、例えば準じて、例えば工程ｂ、または工程Ｂ.で各々得られた水性相の、有機溶媒での抽出および各々工程ｃまたは工程Ｃ.で得れた相の分離により行うことができる。
【００５６】
本発明により提供される方法において形成される酵素産物の量は適当に、慣用の方法に、例えば、従って、例えば準じて、例えば適当な波長の蛍光手段により、例えば相分離互に得た水性相で測定できる。
【００５７】
本発明の方法は、スフィンゴ脂質経路に包含されるスフィンゴシンキナーゼまたはホスファターゼの活性を調節する薬剤の同定に有用であり得る。
【００５８】
他の局面において、本発明は、
ａ. 標識非リン酸化スフィンゴシンと
−ホスフェート源、および
−スフィンゴシンキナーゼを、
ａ１. 候補化合物の非存在下、および
ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ｂ. 工程ａ１および工程ａ２の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒を添加し、
ｃ. 工程ａ１.およびａ２.で形成された酵素産物を、非反応標識スフィンゴシンから、例えば本発明の方法において定義された通りの工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、
ｄ. 工程ａ１.および工程ａ２で得られた酵素産物の量を、例えば蛍光手段により検出し、そして工程ａ１.および工程ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
ｅ. 工程ｄで決定した通りにスフィンゴシンキナーゼの活性を調節する薬剤を選択する
工程を含む、スフィンゴシンキナーゼの活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。
【００５９】
他の局面において、本発明は、
Ａ. 標識リン酸化スフィンゴシンと、適当な培地に含まれる生存細胞を、
Ａ１. 候補化合物の非存在下、および
Ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ１.およびＡ２.で形成された酵素産物を、非反応標識リン酸化スフィンゴシンから分離し、
Ｃ. 工程Ａ１.および工程Ａ２で得られた酵素産物の量を検出し、そして工程Ａ１.および工程Ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
Ｄ. 工程Ｃて決定した通りにスフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する
工程を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する方法を提供する。
【００６０】
本発明で提供される方法により同定される薬剤をまた“本発明の薬剤”と呼ぶ。
【００６１】
標識された、例えば蛍光標識された、スフィンゴシンを使用する本発明により提供される方法は、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性の測定のための、およびスフィンゴシンキナーゼの活性を介在する(影響を与える)薬学的に活性な化合物のスクリーニングにおいて有用なツールであり得る。例えばスフィンゴ脂質ホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのようなスフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴ脂質キナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素活性のアッセイのための適当な試験系は、実施例に記載する。本発明により提供される方法をハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)で行い得ることは利点である。
【００６２】
候補化合物は、例えばスフィンゴ脂質ホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴ脂質キナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素における効果が未知の化合物化合物(ライブラリー)を含む。化合物(ライブラリー)は、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、模倣物、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ)を含む。
【００６３】
本発明の薬剤は、例えばスフィンゴ脂質ホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴ脂質キナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性に対する効果が、本発明により提供される方法において測定される候補化合物である。このような薬剤は、キナーゼ／ホスファターゼの活性を減少または増加し得る。本発明の薬剤は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、模倣物、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ)を含む。
【００６４】
他の局面において、本発明は、主成分としての標識スフィンゴシン、例えば蛍光標識スフィンゴシン、例えば式Ｉの(例えばまたは式ＩＰ１またはＩＰ２の)化合物のような、本発明の化合物、および指示、例えば、本発明の方法の一つで定義の通りの工程ａ.からｃ.および／または工程Ａ.からＤ.を行うための詳細を含む、該キットを使用するための指示書を含む、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を測定するためのキットを提供する。
【００６５】
このようなキットは、さらに試験すべきサンプルの適当な環境を含む、実質的成分を含む。
このようなキットは、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を介在する薬剤の同定に有用であり得る。
【００６６】
本発明のキットにおいて、キナーゼの活性の測定のために、標識非リン酸化スフィンゴシンを使用し、スフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性の測定のために、標識１−リン酸化スフィンゴシンを使用する。
【００６７】
他の局面において、本発明は、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスフェートホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を介在する薬剤の同定に使用するための上記のキットを提供し、例えば該キットは、さらに、実質的成分として、例えば、試験すべきサンプル中の候補化合物の抗頬を決定するための適当な手段および指示を含み得る。
【００６８】
さらに、我々は、驚くべきことに、本発明により提供される方法におけるスフィンゴシンキナーゼ−１−またはスフィンゴシンキナーゼ−２のホスフェート変換速度が、おそらく本発明のスフィンゴシン使用により、異なり得ることを発見した。本発明により提供される方法において、故に、サンプル中にスフィンゴシンキナーゼ−１−またはスフィンゴシンキナーゼ−２のいずれが存在するか(またはスフィンゴシンキナーゼ活性がないか)区別することが可能であり得る。
【００６９】
他の局面において、本発明は、
α.
α１. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、所望によりスフィンゴシンキナーゼ−１−活性もしくはスフィンゴシンキナーゼ−２−活性または両方を含むか、またはスフィンゴシンキナーゼ活性を含まないサンプル、およびホスフェート源、
α２. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、定義された量のスフィンゴシンキナーゼ−１−活性を含むサンプル、およびホスフェート源、
α３. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、定義された量のスフィンゴシンキナーゼ−２−活性を含むサンプル、およびホスフェート源、
を酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
β. 工程α１.、α２.およびα３.で形成された酵素産物を、標識スフィンゴシンの非反応化合物から、例えば本発明により提供される方法において定義の通りの工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、そして
γ. 工程α１.、α２.およびα３におけるホスフェート変換速度を、測定し、かつ比較する
工程を含む、サンプル中にスフィンゴシンキナーゼ−１−活性またはスフィンゴシンキナーゼ−２−活性または両方があるか、またはスフィンゴシンキナーゼ活性が存在しないかを測定する方法を提供する。
【００７０】
さらなる局面において本発明は、
ｉ. 式Ｉの非リン酸化化合物とホスフェート源および
ｉ１. スフィンゴシンキナーゼ−１、
ｉ２. スフィンゴシンキナーゼ−２を、
−試験化合物の非存在下、および
−試験化合物の存在下
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ii. 非反応の式Ｉの非リン酸化化合物を、工程ｉ１.およびｉ２.で形成された酵素産物から、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、そして
iii. 工程ｉ１.およびｉ２.におけるホスフェート変換速度を測定し、かつ比較する
工程を含む、試験化合物がスフィンゴシンキナーゼ−１および／またはスフィンゴシンキナーゼ−２の活性を介在できるか否かを区別する方法を提供する。
【００７１】
ホスフェート変換速度の測定および比較により、試験化合物が、例えばスフィンゴシンキナーゼ−１またはスフィンゴシンキナーゼ−２、または両方の活性のいずれを、かつどの程度介在できるか同定することが可能となり得る。
【００７２】
試験化合物は、本明細書で記載の候補化合物、キナーゼ活性を介在できることが既知であであることが既知の化合物および本発明の薬剤を含む。
【００７３】
本発明により提供される方法において、比較試験サンプルを、同じ条件下(例えばスフィンゴシンキナーゼ活性を含まない)、並行して行う。
【００７４】
他の局面において、本発明は、
ａ１. 式
【化３１】
2007507205.tif 000032
(式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ａ−Ｄ、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｎおよびｍは上記で定義の通りであり、そしてＹは、式
ＤＹＥ−Ｚ          III
の脱離基Ｚを置換するのに好適な基である)
の化合物と、式III(式中、基ＤＹＥは上記で定義の通りであり、例えばＤＹＥ−Ｚは、式IIの化合物の基Ｙの置換に好適な脱離基であり、官能基は所望により保護されている)の化合物を反応させるか、または
ａ２. 式
【化３２】
2007507205.tif 000033
(式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ａ−Ｄ、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｎおよびｍは上記で定義の通りであり、そしてＷは脱離基であり、かつ官能基は所望により保護されている)
の化合物と、式
ＤＹＥ−Ｕ          Ｖ
(式中、ＤＹＥは上記で定義の通りであり、Ｕは脱離基Ｗの置換に好適な基であり、例えばＤＹＥ−Ｕは、脱離基Ｗの置換に好適な基であり、かつ官能基は所望により保護されている)
の化合物を反応させ、官能基が所望により保護されている式Ｉの化合物を得るか、または
ｂ. 式
【化３３】
2007507205.tif 000034
(式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ａ−Ｄおよびｍが上記で定義の通りであり、Ｅ−Ｇ'は上記で定義のＥ−Ｇの意味を有するが、ただし、Ｅ−ＧのＧがＧ'で置換されており、Ｇ'はアミノ、(Ｃ１−４)アルキルアミノヒドロキシ、カルボキシル、反応性カルボキシル誘導体、例えばカルボン酸ハロゲニド、アミドであるか；またはＳＯ３Ｈであり、そして、官能基は所望により保護されている)
の化合物と、式
【化３４】
2007507205.tif 000035
(式中、Ｌ、ＭおよびＤＹＥは上記で定義の通りであり、そしてＧ''は、式Ｉの化合物におけるＥ−Ｇを得るためにＧ'と反応させるのに好適な基であり、ここで、Ｅ−Ｇは上記で定義の通りである)
の化合物と反応させ、
ｃ. 所望により、得られた保護されている式Ｉの化合物を脱保護し、そして
ｄ. 反応混合物から式Ｉの化合物を単離する
工程を含む、式Ｉの(例えばまたは式ＩＰ１またはＩＰ２の)化合物の製造法を提供する。
【００７５】
このようにして得た式Ｉの化合物を、例えば別の式Ｉの化合物に変換してよく、または遊離形で得た式Ｉの化合物を式Ｉの化合物の塩に変換してよく、この逆も可能である。
【００７６】
工程ａ１.、ａ２.およびｂ.における反応は求核性置換反応であり、適当に慣用の方法に、例えば、従って、例えば準じて、または本明細書に記載の通りに行い得る。
【００７７】
式II、III、IV、Ｖ、VIおよびVIIの化合物は、式Ｉの化合物の製造における中間体(出発物質)である。本明細書に記載の全ての化合物、例えば本発明の化合物および式II、III、IV、Ｖ、VIおよびVIIの中間体は、適当な慣用の方法に、例えば、従って、例えば準じて、例えばまたは本明細書に特記のように製造できる。
【００７８】
式IVの化合物のような中間体の典型的な製造法は、例えば、下記反応スキーム１に従って、例えば準じて行い得る：
【化３５】
2007507205.tif 000036
【００７９】
中間体の製造のための、例えば式VIの製造のための他の典型的な方法は、下記反応スキーム２に従って、例えば準じて行い得る。反応スキーム２において、式Ｉの化合物の製造もまた示す：
【化３６】
2007507205.tif 000037
【００８０】
中間体の他の典型的な製造法は、下記反応スキーム３Ａまたは３Ｂに従って、例えば準じて行い得る。
【化３７】
2007507205.tif 000038
【化３８】
2007507205.tif 000039
【００８１】
スキーム１、スキーム２およびスキーム３Ａおよび３Ｂにおいて、また適当な保護基技術を例示する；例えばＤＹＥにおける官能基をさらに保護し得る。
【００８２】
他の局面において、本発明は、本発明の、例えば蛍光標識された、標識スフィンゴシンのハイスループットアッセイにおける使用を提供する。
【００８３】
他の局面において、本発明は、例えば、ハイスループットアッセイにおいて、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される、酵素の活性を介在する薬剤の同定のための、本発明の蛍光標識スフィンゴシンの使用を提供する。
【００８４】
他の局面において、本発明は、薬剤がスフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ−１、またはスフィンゴシンキナーゼ−２、または両方を介在できるかを測定するための、本発明の化合物の使用を提供する。
【００８５】
本発明の方法により提供される薬剤は、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を介在でき、故に、薬理学的活性を示し得て、医薬として有用であり得る。本発明の方法により提供される薬剤は、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素により介在される障害に対する治療効果を示し得る。
【００８６】
他の局面において、本発明は、例えば、医薬として使用するための、例えばスフィンゴシンホスフェートホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を調節、例えば、阻害または増強できる薬剤(該薬剤は本発明の方法により同定される)を提供する。
【００８７】
このような障害は、スフィンゴ脂質経路に関与するＳＰ、ＳＰＰ、ＳＰＨＫまたはホスファターゼの生物学的機能が役割を有する疾患を含む。このような障害は、例えば自己免疫性障害および炎症性障害、アレルギー性障害および癌を含む。アレルギー性障害は、例えばアレルギー性喘息、接触性アレルギー、薬物アレルギー、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性鼻炎のような季節的アレルギーを含む。
【００８８】
自己免疫が関連するおよび炎症性である障害は、例えばＩ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症または全身性エリテマトーデスを含む。
【００８９】
処置のためのために、本発明の薬剤は、１種またはそれ以上の、好ましくは１種の本発明の薬剤、例えば、２種またはそれ以上の本発明の薬剤の組み合わせを含む。
【００９０】
さらなる局面において、本発明は、活性成分としての本発明の薬剤を、少なくとも１種の薬学的賦形剤と共に含む、医薬組成物に関する。
【００９１】
他の局面において、本発明は、アレルギー性喘息、接触性アレルギー、薬物アレルギー、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎または季節性アレルギー、例えばアレルギー性鼻炎；Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス、癌のような、自己免疫性障害および炎症性障害、アレルギー性障害および癌を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するＳＰ、ＳＰＰ、ＳＰＨＫまたはホスファターゼの生物学的機能が役割を有する障害の処置用医薬、例えば医薬組成物の製造のための、本発明の薬剤の使用を提供する。
【００９２】
処置は処置および予防を含む。
このような処置のために、適当な適当な投与量は、例えば、用いる本発明の薬剤の化学的性質および薬物動態データ、個々の宿主、投与の形態および処置する状態の性質および重症度に依存して、変化するであろう。しかしながら、一般に、大型哺乳類、例えばヒトにおいて十分な結果を得るために、指示される一日量は、約０.０１ｇから約２.０ｇの本発明の薬剤；例えば０.５ｇ〜１.０ｇであり、簡便には、例えば、１日４回までの分割投与量で投与する。
【００９３】
本発明の薬剤は、全ての慣用の経路により、例えば経鼻、バッカル、直腸、経口投与を含む、例えば経腸的に；例えば静脈内、筋肉内、皮下投与を含む、非経腸的に；または例えば経皮、鼻腔内、気管支内投与を含む、局所的に；例えばコーティングまたは非コーティング錠剤、カプセル、注射可能溶液または懸濁液の形で、例えばアンプル、バイアルの形で、クリーム、ゲル、ペースト、吸入用粉末、泡状物、チンキ、リップスティック、ドロップ、スプレーの形で、または坐薬の形で投与できる。
【００９４】
本発明の薬剤は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または金属塩の形で；または遊離形の形で；所望により溶媒和物の形で投与できる。塩形および所望により溶媒和物形の本発明の薬剤は、遊離形(所望により溶媒和物である)の本発明の薬剤と同程度の活性を示す。
【００９５】
本発明の薬剤は、本発明に従う医薬的処置に、単独で、または１種もしくはそれ以上の薬学的活性剤と組み合わせで使用できる。
【００９６】
組み合わせは、２種またはそれ以上の薬学活性剤が同じ製剤中にある固定された組み合わせ；別々の製剤の２種またはそれ以上の薬学活性剤が同じ包装物で、例えば、併用のための指示書と共に販売されているキット；および薬学活性剤が別々に包装されているが、同時のまたは連続投与のための指示が与えられる自由な組み合わせを含む。
【００９７】
他の局面において、本発明は、本発明の薬剤を、少なくとも１種の薬学的賦形剤、例えば増量剤、結合剤、崩壊剤、流動調節剤、滑剤、糖および甘味剤、芳香剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤を含む、例えば適当な担体および／または希釈剤と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００９８】
他の局面において、本発明は、さらに別の薬学的活性剤を含む、本発明の医薬組成物を提供する。
【００９９】
このような医薬組成物は慣用の方法に従って、例えば準じて、例えば混合、造粒、コーティング、溶解または凍結乾燥法により製造できる。単位投与形は、例えば、約０.５mgから約２０００mg、例えば１mgから約５００mg、例えば０.００６２５mg／kgから約１２.５mg／kgを含み得る。
【０１００】
他の局面において、本発明は、
ａ. 標識スフィンゴシンと
−ホスフェート源、および
−スフィンゴシンキナーゼを含み得るサンプルを、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ｂ. 工程ａ.の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒を添加し、
ｃ.工程ｂ.で得られた相を、例えば抽出後に分離し、そして
ｄ. 工程ｃ.で得られた水性相中の酵素産物の量を測定する；
工程を含み、
例えばここで、標識スフィンゴシンが、式
【化３９】
2007507205.tif 000040
〔式中、
Ｒ１Ｐ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキル、例えばメチルであり、Ｒ２Ｐ１はＨ、ＯＨまたはオキソであり、
Ａ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｇ１、Ｌ１およびＭ１は互いに独立してＣＨ２であり、そしてさらに
Ａ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｇ１、Ｌ１およびＭ１は互いに独立してＯ、ＣＯ、ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、例えばＮ(ＣＨ３)、ＳＯ２またはＣＨ２である。ただし、基Ａ１−Ｄ１、Ｅ１−Ｇ１および／またはＬ１−Ｍ１において構成要素Ａ１およびＤ１、Ｅ１およびＧ１および／またはＬ１およびＭ１が同一であるものを化合物を除く。または
Ａ１およびＤ１、Ｅ１およびＧ１および／またはＬ１およびＭ１は、一体となって基ＣＨ＝ＣＨであり、そしてＬ１およびＭ１は、一体となって、さらに基ＨＣ≡ＣＨであり、
ｘは、０〜１２から選択される数字であり、
ｙは、０〜１２から選択される数字である。
ただし、ｘ＋ｙは３〜１４から選択される数字である。そして
基ＤＹＥ１は物理的手段により式ＩＰ１の化合物において選択的に検出できる基である。〕
である、サンプル中のスフィンゴシンキナーゼの活性を測定する方法を提供する。
【０１０１】
セラミドの機能および細胞下局在を調査するために、およびスフィンゴ脂質経路にまた関与するセラミドキナーゼの阻害剤を同定するために、セラミドキナーゼの生物活性の測定は必須であり得る。このような評価のために、本発明の標識スフィンゴシン(ここで、標識スフィンゴシンは非リン酸化である)由来である、標識セラミドのような標識セラミドを使用し得る。
【０１０２】
他の局面において、本発明は；
例えば
ａ. 適当な培養培地に含まれる生存細胞を、酵素産物が形成できるように予定された時間、式Ｉ(式中、残基は上記で定義の通りであり、そしてＸがＨであり、上記で定義の両方のただし書きを伴う式Ｉのスフィンゴシンである)の標識スフィンゴシン由来である標識セラミドと接触させ、
ｂ. 工程ａ.で形成された酵素産物を分離し、そして
ｃ. 形成された酵素産物の量を測定する
ことによる、スフィンゴ脂質経路に関与するセラミドキナーゼの活性が、サンプルに存在するか否か測定するための、または該活性の程度を測定するための、標識セラミド〔ここで、該セラミドは、残基は上記で定義の通りであり、そしてＸがＨであり、上記で定義の両方のただし書きを伴う式Ｉのスフィンゴシンであり、例えば該標識セラミドは、式Ｉ(式中、残基は上記で定義の通りであり、そしてＸがＨであり、上記で定義の両方のただし書きを伴う式Ｉのスフィンゴシンである)の標識スフィンゴシンをこのようなスフィンゴ脂質経路の出発物質として使用するとき、スフィンゴ脂質経路の間に形成され得る〕の使用を提供する。
【０１０３】
このような方法はまた、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼまたはホスファターゼを介在する薬剤の同定について本明細書に記載した通りの工程を含むが、スフィンゴシンキナーゼまたはホスファターゼの代わりにセラミドキナーゼを使用し、本発明の標識スフィンゴシンの代わりに、式Ｉ(式中、残基は上記で定義の通りであり、そしてＸがＨである)の標識スフィンゴシン由来の標識セラミド〔例えば、該標識セラミドは、式Ｉ(式中、残基は上記で定義の通りであり、そしてＸがＨであり、上記で定義の両方のただし書きを伴う式Ｉのスフィンゴシンである)の標識スフィンゴシンをこのようなスフィンゴ脂質経路の出発物質として使用するとき、スフィンゴ脂質経路の間に形成され得る〕を使用する、スフィンゴ脂質経路に関与するセラミドキナーゼを介在する薬剤を同定するための方法において有用である。
【０１０４】
本発明に従う生存細胞における酵素活性の測定方法は、サンプルにおいて生存細胞を使用し、例えば、そのサンプル中にスフィンゴ脂質経路が発生するとき、また、単独のサンプル中の、スフィンゴシンキナーゼ活性およびホスファターゼ活性、例えば、およびセラミドキナーゼ活性の測定にも使用し得る。
【０１０５】
図面の記載：
図１は、ＨＵＶＥＣを
ａ)標識スフィンゴシン(ＮＢＤ−Ｓｐｈ)とインキュベートし、キナーゼ活性の分散パターンを測定する
ｂ)標識スフィンゴシン−１ホスフェートとインキュベートし、ホスファターゼの分散パターンを測定する
ときの、スフィンゴイド塩基中間体の濃度測定の結果として分散パターンを示す。
代謝産物は、スフィンゴシン(Ｓｐｈ)、スフィンゴシン−１−ホスフェート(Ｓ１Ｐ)、セラミド(Ｃｅｒ)およびスフィンゴミエリン(ＳＭ)である。
【０１０６】
図２は、ＳＰＨＫ−１阻害剤存在下の実施例２４の標識スフィンゴシンの、細胞内変換を示す。
【０１０７】
図３は、実施例２４の標識スフィンゴシンが、適当な細胞と接触させたとき、ＳＰＨＫ−１よりもＳＰＨＫ−２でより効率的にリン酸化されることを示す。
レーン１：細胞をコントロールベクターのみでトランスフェクトした場合のパターン、
レーン２：細胞がＳＰＨＫ−１を過剰発現する場合のパターン
レーン３：細胞がＳＰＨＫ−２を過剰発現する場合のパターン。
【０１０８】
下記の実施例において全ての温度は摂氏(℃)であり、未補正である。
【０１０９】
下記略語を使用する：
【表１】
2007507205.tif 000041
【０１１０】
実施例Ａ
ピレン−１−カルボン酸(Ｅ)−(１３Ｒ,１４Ｓ)−１４−アミノ−１３,１５−ジヒドロキシ−ペンタデク−１１−エニル)エステル
５０８mgの(Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−ヒドロキシ−１３−(ピレン−１−カルボニルオキシ)−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの１５mlのＣＨ２Ｃｌ２溶液を１mlのＴＦＡで処理し、ＲＴで一晩撹拌する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、蒸発残渣を分取ＲＰ−クロマトグラフィーに付し、ピレン−１−カルボン酸(Ｅ)−(１３Ｒ,１４Ｓ)−１４−アミノ−１３,１５−ジヒドロキシ−ペンタデク−１１−エニルエステルを得る。
【０１１１】
出発物質の製造
Ａ１. (Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−ヒドロキシ−１３−(ピレン−１−カルボニルオキシ)−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５８０mgの(Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−(２−クロロ−アセトキシ)−１３−(ピレン−１−カルボニルオキシ)−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの１５mlのＭｅＯＨおよび２mlのＣＨ２Ｃｌ２中の溶液を、５mlの水性ＮＨ４ＯＨ(２８％ｗ／ｗ)で処理し、ＲＴで５時間撹拌する。得られた反応混合物から溶媒を蒸発させ、得られた蒸発残渣を１Ｎ  水性ＨＣｌとＥｔＡｃに分配する。得られた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させる。(Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−ヒドロキシ−１３−(ピレン−１−カルボニルオキシ)−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。
【０１１２】
Ａ２. (Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−(２−クロロ−アセトキシ)−１３−(ピレン−１−カルボニルオキシ)−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５４０mgの(Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−(２−クロロ−アセトキシ)−１３−ヒドロキシ−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル(Kozikowski et al., Tetrahedron Lett. 1996, 37, 3279-3282の記載に準じて製造)の１０mlの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液を２７１mgのピレン−１−カルボン酸、４２２.４mgの１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチル−カルボジイミドＨＣｌおよび２６９.３mgのＤＭＡＰで処理し、４時間、ＲＴで撹拌する。得られた反応混合物をＥｔＡｃと１Ｎ  水性ＨＣｌに分配する。得られた有機層を飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液および塩水で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させる。(Ｓ)−４−[(Ｅ)−(Ｒ)−１−(２−クロロ−アセトキシ)−１３−(ピレン−１−カルボニルオキシ)−トリデク−２−エニル]−２,２−ジメチル−オキサゾリジン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。
【０１１３】
実施例Ｂ
４−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−[１０−(ピレン−１−スルホニルアミノ)−デシル]ブチルアミド
４−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−[１０−(−１−スルホニルアミノ)−デシル]ブチルアミドを、Ｏ,Ｎ−保護(Ｒ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸および１,１０−ジアミノデカンの縮合により製造する。得られた２５mgの縮合産物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、２１μlのＥｔ３Ｎ、触媒量のＤＭＡＰおよび１５mgの１−ピレンスルホニルクロライドで処理する。得られた混合物を、一晩、ＲＴで遮光しながら撹拌する。得られた混合物をＨ２Ｏで洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させる。得られた蒸発残渣を遮光しながら濾過紙、得られた濾過残渣をＭｅＯＨ／ＨＣｌ溶液に溶解し、３０分、ＲＴに静置する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、４−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−[１０−(ピレン−１−スルホニルアミノ)−デシル]ブチルアミドを塩酸塩の形で得る。
【０１１４】
実施例ＡまたはＢに記載の方法に準じるが、適当な出発物質を使用して、下記表１および２に記載の通りの実施例１〜１３の化合物を得る。１Ｈ−ＮＭＲデータ(ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ、他に記載がない限り)(またはエレクトロスプレーＭＳデータ)も表１および２に示す。
【０１１５】
実施例１から７
式
【化４０】
2007507205.tif 000042
〔式中、ｍ、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｎ、ｍおよびＤＹＥは表１に定義の通りである。〕
の化合物：
【０１１６】
【表２】
2007507205.tif 000043
【表３】
2007507205.tif 000044
【０１１７】
実施例８から１２
式
【化４１】
2007507205.tif 000045
〔式中、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｍ、ｎおよびＤＹＥは表２に定義の通りである。〕
の化合物：
【０１１８】
【表４】
2007507205.tif 000046
【表５】
2007507205.tif 000047
【０１１９】
実施例１３
式
【化４２】
2007507205.tif 000048
〔式中、ＤＹＥはＰＤである。〕
の化合物。
1H-NMR(CDCl3/d6-DMSO)：選択した特徴的シグナル、δ 8.31(d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.05 -8.25(m, 7H), 8.03(t, J = 8.6 Hz, 1H), 7.16(d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.02(d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.73(s, 2H), 3.67(dd, J = 12.2 + 18.1 Hz, 2H), 2.65(dd, J = 6.7 + 10.6 Hz, 2H), 1.94 -2.0(m, 2H), 1.36(s, 3H).
【０１２０】
実施例１４
(Ｓ)−２−アミノ−３−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−プロパン−１−オール
式
【化４３】
2007507205.tif 000049
〔式中、ＤＹＥはＮＤである。〕
の化合物。
１３９mgの｛(Ｓ)−１−ヒドロキシメチル−２−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液を、ＲＴで２.５時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られた蒸発残渣を精製する。(Ｓ)−２−アミノ−３−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−プロパン−１−オールをトリフルオロ酢酸塩の形で得る。
1H-NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ： 9.55(bs;1H), 8.50(d;1H), 7.80(bs;3H), 6.40(d;1H), 5.20(bs;1H), 3.60-3.30(m;8H), 3.22(m;1H), 1.65(m;2H), 1.49(m;2H), 1.40 -1.15(m;14H).
【０１２１】
実施例Ｃ
出発物質の製造
Ｃ１.：｛(Ｓ)−１−ヒドロキシメチル−２−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
１１４mgの[(Ｓ)−２−(１１−アミノ−ウンデシルオキシ)−１−ヒドロキシメチル−エチル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの６mlのＴＨＦの溶液を、７６mgの７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾフラザンで処理し、１６時間、ＲＴで撹拌する。得られた反応混合物をＥｔＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏ、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３および塩水で抽出する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、得られた蒸発残渣を精製する。｛(Ｓ)−１−ヒドロキシメチル−２−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。エレクトロスプレーＭＳ：５６４.３４(ＭＮａ＋)。
【０１２２】
Ｃ２.：[(Ｓ)−２−(１１−アミノ−ウンデシルオキシ)−１−ヒドロキシメチル−エチル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
アルゴン雰囲気下、４４５mgの[(Ｓ)−２−(１１−ジベンジルアミノ−ウンデシルオキシ)−１−ヒドロキシメチル−エチル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの１８mlのＭｅＯＨ溶液を２３３mgのギ酸アンモニウムおよび１０％Ｐｄ炭(５７mg)で処理し、７０°(還流)で２時間撹拌する。得られた混合物をＲＴに冷却し、触媒を濾過により除去し、得られた濾液を濃縮する。得られた濃縮残渣をＥｔＡｃに再溶解し、飽和水性ＮａＨＣＯ３および塩水で抽出する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、[(Ｓ)−２−(１１−アミノ−ウンデシルオキシ)−１−ヒドロキシメチル−エチル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。エレクトロスプレーＭＳ：５６１.３(ＭＨ＋)。
【０１２３】
Ｃ３.：[(Ｓ)−２−(１１−ジベンジルアミノ−ウンデシルオキシ)−１−ヒドロキシメチル−エチル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
１.４２ｇのジベンジル−｛１１−[(Ｒ)−２−(トリチル−アミノ)−３−トリチルオキシ−プロポキシ]−ウンデシル｝−アミンのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液を、１.６２mlのトリイソプロピルシランで処理し、１６時間、ＲＴで撹拌する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、ＭｅＯＨを添加し、得られた沈殿を濾過により除去し、得られた濾過残渣を濃縮する。得られた濃縮残渣をジエチルエーテルに再溶解し、得られた混合物を１Ｎ  ＮａＯＨで抽出し、得られた有機相から溶媒を蒸発させ、得られた蒸発残渣を精製する。３９７mgの保護されていないアミノアルコールを２８９mgのジ−ｔｅｒｔ.ブチルジカーボネートの５mlのＣＨ２Ｃｌ２溶液と反応させる。[(Ｓ)−２−(１１−ジベンジルアミノ−ウンデシルオキシ)−１−ヒドロキシメチル−エチル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。エレクトロスプレーＭＳ：５４１.３５(ＭＨ＋)、５６３.４(ｍＮａ＋)。
【０１２４】
Ｃ４.：ジベンジル−｛１１−[(Ｒ)−２−(トリチル−アミノ)−３−トリチルオキシ−プロポキシ]−ウンデシル｝−アミン
アルゴン雰囲気下、１２１０mgのＫＨ(パラフィン中２０％懸濁液)の１４mlのトルエン中の懸濁液を４°に冷却し、１３９４mgの(Ｒ)−２−(トリチル−アミノ)−３−トリチルオキシ−プロパノール＊を滴下して処理する。得られた混合物を３０分、ＲＴでおよび５分、４５°で処理し、４°に冷却する。得られた混合物を１３５４mgのメタンスルホン酸１１−ジベンジルアミノ−ウンデシルエステルの６mlのトルエンで処理し、得られた混合物を１６時間、５０°で撹拌する。得られた混合物をＲＴに冷却し、ＥｔＡｃを添加する。得られた有機相を水性飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で抽出し、乾燥させ、濃縮する。ジベンジル−｛１１−[(Ｒ)−２−(トリチル−アミノ)−３−トリチルオキシ−プロポキシ]−ウンデシル｝−アミンを得る。エレクトロスプレーＭＳ：９２５.５４(ＭＨ＋)
＊例えばBartel, M.;Rattay, B.;Nuhn, P. “Synthesis of enantiomerically pure, sn-1 modified sn-2-deoxy-2-amido-glycero-3-phospholipids” Chemistry and Physics of Lipids(2000), 107(1), 121-129参照。
【０１２５】
Ｃ５.：メタンスルホン酸１１−ジベンジルアミノ−ウンデシルエステル
５００mgの１１−アミノ−ウンデカノール、７３８mgのＫ２ＣＯ３および６９８μlのベンジルブロマイドの５mlのＤＭＦ中の懸濁液を、１６時間、ＲＴで激しく撹拌する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、得られた蒸発残渣をＣＨ２Ｃｌ２とＨ２Ｏに分配し、得られた有機層を乾燥させ、濃縮して１１−ジベンジルアミノ−ウンデカノールを得る。６５５mgの１１−ジベンジルアミノ−ウンデカノールを２５２μlのメタンスルホニルクロライドのＣＨ２Ｃｌ２溶液で、４５２μlのＥｔ３Ｎ存在下、ＲＴで処理する。メタンスルホン酸１１−ジベンジルアミノ−ウンデシルエステルを得る。エレクトロスプレーＭＳ：４４６.３(ＭＨ＋)。
【０１２６】
実施例１４に準じるが、適切に保護された出発物質を使用して、下記表３および表４に記載の通りの実施例１５〜２１の化合物を得る。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲデータも表３および表４に示す。
【０１２７】
実施例１５から１８
式
【化４４】
2007507205.tif 000050
〔式中、Ｅ−Ｇ、Ｌ−Ｍ、ｍ、ｎおよびＤＹＥＥＸ１５は表３に定義の通りであり、Ｒ１は実施例１８ではＨであり、実施例１５〜１７ではＲ１はＣＨ３である。〕
の化合物：
【０１２８】
【表６】
2007507205.tif 000051
【０１２９】
実施例１９から２１
式
【化４５】
2007507205.tif 000052
〔式中、ｍ＋ｎは表４に定義の通りであり、ＤＹＥはＮＤである。〕
の化合物。
【０１３０】
【表７】
2007507205.tif 000053
【０１３１】
実施例２２
リン酸モノ−((Ｒ)−２−アミノ−２−メチル−４−｛４−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−フェニル｝−ブチル)エステル
式
【化４６】
2007507205.tif 000054
〔式中、ＤＹＥはＮＤである。〕
の化合物。
１７５mgの[(Ｒ)−１−(ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシ−ホスホリルオキシメチル)−３−(４−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−フェニル)−１−メチル−プロピル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの、１０％Ｈ２Ｏ含有ＴＦＡ溶液を、ＲＴで２時間撹拌する。得られた混合物から溶媒を蒸発させ、得られた蒸発残渣にＭｅＯＨを添加し、得られた沈殿を回収する。リン酸モノ−((Ｒ)−２−アミノ−２−メチル−４−｛４−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−フェニル｝−ブチル)エステルを得る。
1H-NMR(CD3OD + 1滴DCL, 500 MHz): δ= 8.51(d;1H), 7.13(d;2H), 6.81(d;2H), 6.34(d;1H), 4.09/ 4.01(ABX system, 2H), 3.91(t;2H), 3.54(bs;2H), 2.63(m;2H), 2.04-1.87(m;2H), 1.81-1.69(m;2H), 1.50 -1.29(m;14H), 1.41(s;3H).
【０１３２】
実施例Ｄ
出発物質
[(Ｒ)−１−(ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシ−ホスホリルオキシメチル)−３−(４−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−フェニル)−１−メチル−プロピル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２００mgの[(Ｒ)−３−(４−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−フェニル)−１−ヒドロキシメチル−１−メチル−プロピル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル(実施例２０参照)および６９mgの１Ｈ−テトラゾールの乾燥ＴＨＦ溶液を１８９μlのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジエチルホスホロアミデイトで処理する。得られた混合物を１０５分、ＲＴで撹拌し、０.３３mlのＨ２Ｏ中のＨ２Ｏ２の水性３０％溶液を滴下し、撹拌を１時間続ける。得られた混合物を水性飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３とＥｔＡｃに分配する。得られた有機層を１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮する。[(Ｒ)−１−(ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシ−ホスホリルオキシメチル)−３−(４−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−フェニル)−１−メチル−プロピル]−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。エレクトロスプレーＭＳ：８４２.４９(ＭＮａ＋)。
【０１３３】
実施例２３
リン酸モノ−｛(Ｒ)−２−アミノ−３−[１１−(７−ニトロ−ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾル−４−イルアミノ)−ウンデシルオキシ]−プロピル｝エステル)を実施例２２の記載に準じるが、実施例１４の化合物を出発物質と使用する。
1H-NMR(CD3OD + 1滴DCL, 400 MHz): δ= 8.57(d;1H), 8.35(bs;1H), 6.44(d;1H), 4.22(m;2H), 3.75-3.50(m;7H), 1.77(m;2H), 1.57(m;2H), 1.50-1.23(m;14H).
【０１３４】
上記の方法に準じるが、適当な出発物質を使用して、下記実施例２４および２５の化合物を得る；
【０１３５】
実施例２４
式
【化４７】
2007507205.tif 000055
の化合物
1H-NMR(CD3OD, 400 MHz): 8.43(d, J = 9 Hz;1H), 6.25(d, J = 9 Hz;1H), 5.74(dt, J = 15, 7 Hz;1H), 5.36(dd, J = 15, 7 Hz;1H), 4.18(dd, J = 6, 7 Hz;1H);3.69(dd, 4, 12 Hz;1H);3.56(dd, 8, 12 Hz;1H);3.44(bs;2H), 3.12-3.03(m;1H), 2.00-1.95(m;2H), 1.72-1.64(m;2H);1.40-1.25(m;14H)。エレクトロスプレーＭＳ：４３６.２(Ｍ＋Ｈ)＋、Ｃ２１Ｈ３３Ｎ５Ｏ５、計算値４３５.２)。
【０１３６】
実施例２５
式
【化４８】
2007507205.tif 000056
の化合物
1H-NMR(CD3OD, 400 MHz): 8.53(d, 1H), 6.34(d, 1H), 5.85(dt;1H), 5.46(dd;1H), 4.31-4.26(m;1H), 4.16-3.98(m, 2H), 3.57-3.46(m;2H), 3.40-3.35(m;1H), 2.12-2.05(m;2H), 1.81-1.74(m;2H);1.50-1.27(m;14H).
【０１３７】
試験実施例１
スフィンゴシンキナーゼ活性の蛍光アッセイ
アッセイ原理：
我々は、下記反応スキーム４に従い、スフィンゴシンキナーゼが、ＡＴＰの存在下、蛍光標識スフィンゴシンである化合物ＣＯＭＰＡ(実施例２３の化合物)リン酸化し、対応するリン酸化化合物ＣＯＭＰＡ−Ｐ(実施例２４の化合物)を得ることを確認。
【０１３８】
【化４９】
2007507205.tif 000057
ここで、残基は上記で定義の通りであり、そしてＲ３が、ＡＴＰの存在下、実施例２４の化合物がスフィンゴシンキナーゼにより実施例２５の化合物にリン酸化されるように、Ｈである。ＣＯＭＰＡおよびＣＯＭＰＢは、液−液抽出により分離する。水性相中での式ＣＯＭＰＡ−Ｐの化合物の酵素活性の指標としての蛍光は定量的である。詳しくは：
【０１３９】
スフィンゴシンキナーゼを、総容量１００μlで、式ＣＯＭＰＡの化合物(２０μM、ＤＭＳＯ中の貯蔵溶液から添加)およびＡＴＰ(１mM)と、１５mM  ＭｇＣｌ２、０.００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０mM  ＫＣｌを含む５０mM  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７.４中、３０分、３０°でインキュベートし、得られた混合物に１００μl  １Ｍ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８.５、続いて２５０μl  ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ  ２：１を添加する。得られた混合物を短く撹拌し、相を遠心により分離する(２分、１５,０００×ｇ)。上水性層(典型的に１００μl)のアリコートを取り、白色９６ウェルポリスチレンマイクロプレート(Packard, Meriden, CT)に入れ、続いて等量のＤＭＦを添加する。蛍光強度を、４８５nmの励起および５３８nmの放出でプレートリーダーで測定する。スフィンゴシンキナーゼを含まない反応混合物はブランクとして働く。蛍光強度から、式ＣＯＭＰＡ−Ｐの化合物の濃度を同じ溶媒系中の適当な秤量曲線を使用して計算する。これらの濃度はまた酵素の反応速度(ホスフェート変換速度)の計算にも使用する。本アッセイは、精製タンパク質のスフィンゴシンキナーゼ活性の測定にまたは細胞の融解物もしくは組織のホモジネートにおける活性の測定に適している。
【０１４０】
試験実施例２
試験系
蛍光標識スフィンゴシンとスフィンゴシンキナーゼの反応
ａ)リン酸化反応の実施
リン酸化反応を、本質的に下記の通り行う。ヒトＰＨＫ−１または−２を過剰発現する組み換えＨＥＫ−２９３細胞の細胞質フラクションを、総容量１００μlでＳＰ誘導体(２０μM；ＤＭＳＯ中の貯蔵溶液から添加)、１mMのＡＴＰ、および２μCi  [γ−３２Ｐ]ＡＴＰと、１５mM  ＭｇＣｌ２、０.００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０mM  ＫＣｌ、１０mM  ＮａＦおよび１.５mM  セミカルバジド含有５０mM  Ｈｅｐｅｓ緩衝液(ｐＨ７.４)中で３０°でインキュベートする。２時間までの様々な異なるインキュベーション時間の後、脂質を抽出し、ＴＬＣ−プレート(Merck)で分離する。ＴＬＣをシリカプレートで、ＢｕＯＨ／酢酸／Ｈ２Ｏ  ３：１：１またはＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ(２８ｗ／ｗ％)２００：１５０：２９：１のいずれかを移動相として使用して行う。これらの系において、スフィンゴシンおよび実施例４の化合物は同時に移動する。ピレン−標識ＳＰＰおよびスフィンゴミエリン(ＳＭ)と代謝物の同一性は、標準としての市販のトリチウム標識ＳＰＰおよびＳＭと同時の移動により確率される。
【０１４１】
放射標識ＳＰＰ誘導体を、Molecular Dynamics Storm PhosphorImager(Sunnyvale, CA)を使用して可視化および定量する。リン酸化の速度を計算し、蛍光標識スフィンゴシンについて、スフィンゴシンの速度(その速度は、ＳＰＨＫ−１および−２について各々４１および２５nmol／分／mgである)に対する値として報告する。
【０１４２】
ｂ)スフィンゴシンキナーゼ−１(ＳＰＨＫ−１)とスフィンゴシンキナーゼ−２(ＳＰＨＫ−２)のリン酸化速度の差異
蛍光標識した実施例１−７のスフィンゴシンを、ヒト組み換えＳＰＨＫ−１およびＳＰＨＫ−２の基質として使用し、それら全て、[γ−３２Ｐ]ＡＴＰおよび該キナーゼとのインキュベーションによる、放射標識ホスフェートの取り込みにより可視化されるように、リン酸化誘導体に変換される。リン酸化の速度(ホスフェート変換速度)を測定し、天然基質スフィンゴシン(＝ＳＰ)(これは１の値と見なす)に対して表Ａに要約する。
【０１４３】
【表８】
2007507205.tif 000058
【０１４４】
ＳＰＨＫ−１、最短の主鎖を有する実施例１のピレン−標識誘導体を使用すると、ＳＰよりも効率が約２０倍低く、対応するホスフェートに変換される。鎖長を２個のＣＨ２基(実施例２)により伸ばすと、リン酸化速度が２倍に増加し、一方、４個のＣＨ２基の添加によるさらなる主鎖伸張(実施例３)は、ＳＰＨＫ−１による基質ターンオーバーの低下をもたらした(ＳＰと比較して約４０倍少ない)。実施例４の化合物について、天然ＳＰと比較してほぼ同等なＳＰＨＫ−１によるリン酸化が観察される。ＳＰＨＫ−２を使用すると、実施例１〜４の化合物の相対的リン酸化速度はＳＰＨＫ−１の使用より速いが、基質有効性の順位は両方の酵素で同じである。
【０１４５】
実施例４の化合物中のエステル官能性は、代謝に不安定であるはずであり(短時間インビトロリン酸化実験では分解は観察されていないが)、そして、従って、アミドで置換し得る(実施例５)。これは、ＳＰＨＫ−１および−２の各々について、２倍および３倍しかリン酸化効果を減少しない。エステルのスルホンアミドリンカー(実施例６)への鉛管は、ＳＰＨＫ−２よりもＳＰＨＫ−１で耐性が低く(実施例４の化合物よりも、ホスフェート変換速度が約２０倍低い)、この実施例６のリン酸化化合物はＳＰとほぼ同程度の有効性である。これらの結果は、ＳＰＨＫ−１対ＳＰＨＫ−２の基質特異性のはっきりした差異を示す。
【０１４６】
試験実施例３
ヒト内皮細胞における蛍光標識スフィンゴシンの取り込み、細胞下分布および代謝の測定
ヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)における取り込み、細胞下分布および代謝(ホスフェートへの変換)を測定するために、実施例４のピレン標識スフィンゴシンを使用する。蛍光標識化合物は、添加５分以内に細胞に急速に取り込まれ、小胞体およびゴルジ体への優勢な分布を１５−３０分のインキュベーション後に示す。さらに、化合物は細胞内で薄層クロマトグラフィーにより示されるように、４種の産物に変換される。主代謝物はスフィンゴシン−１−ホスフェート(ＳＰＰ)と、少ない産物はスフィンゴミエリン(ＳＭ)およびセラミド(Ｃｅｒ)と同時に移動する。ＨＵＶＥＣにおける化合物の代謝的変換のパターンは、[３Ｈ]−スフィンゴシンと同様である。
【０１４７】
試験実施例４
スフィンゴシン−１−ホスフェート(ＳＰＰ)およびスフィンゴシン−１−ホスフェート(ＳＰＰ)ホスファターゼ活性の測定のための細胞ベースのアッセイ
ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を、３７°および５％ＣＯ２で、ＥＧＭＴＭ−２培地(Clonetics；内皮細胞培地)中で培養する。細胞を５回までの継代で実験に使用し、６ウェルプレートに８０−９０％コンフルエンシーで播種し、一晩増殖させる。細胞を、各々、５μMの標識したＸが(ＨＯ)２ＰＯである式Ｉの化合物、または、標識したＸがＨである式Ｉの化合物と０,５時間、１時間および３時間インキュベートする。適当なインキュベーション時間の後に得たインキュベーション残渣を抽出し、得られた液体抽出残渣を溶媒系としてＢｕＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏを使用するＴＬＣに付す。図１に示す通りのスフィンゴイド塩基代謝物が観察される。
【０１４８】
試験実施例５
スフィンゴシンキナーゼ１阻害剤存在下の生存細胞における標識スフィンゴシン変換
試験実施例４に記載の通りのＨＵＶＥＣを、１０μＭおよび３０μＭのスフィンゴシンキナーゼ１阻害剤と１時間インキュベートする。標識した、ＸがＨである式Ｉの化合物を添加し、インキュベーションを３０分行う。得られたインキュベーション残渣から脂質を抽出し、ＢｕＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ  ３：１：１を溶媒系として使用するＴＬＣで分離する。得られたＴＬＣプレートをＣＣＤカメラを使用してスキャンし、脂質産物の密度をソフトウェアAlphaImage 2200を使用して測定する。
阻害曲線は図２に示す。
【０１４９】
試験実施例６
スフィンゴシンキナーゼタイプ１および２(ＳＰＨＫ−１およびＳＰＨＫ−２)で一過性にトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ細胞中の標識スフィンゴシンのスフィンゴ脂質ターンオーバー
試験実施例４に記載の通りのＨＵＶＥＣを６ウェルプレートに５０％コンフルエンシーで播種し、一晩増殖させる。得られた増殖細胞を、エンプティーベクター(ClontechのＧＦＰベクター)単独ならびにＳＰＨＫ−１およびＳＰＨＫ−２をコードするＧＦＰ標識発現構築物を含むLipofectamine Plus試薬使用してトランスフェクトする。トランスフェクションを２０時間行う。得られたトランスフェクトした細胞に、標識されたＸが(ＨＯ)２ＰＯである式Ｉの化合物を２μMで添加し、各々０.５時間、１時間および３時間インキュベートする。脂質を抽出し、得られた抽出残渣を、溶媒系としてＢｕＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ  ３：１：１を使用するＴＬＣに付す。得られたＴＬＣプレートをＣＣＤカメラを使用してスキャンし、得られた脂質産物をAlphaImage 2200を使用して測定する(図３参照)。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ＨＵＶＥＣをａ)標識スフィンゴシン(ＮＢＤ−Ｓｐｈ)とインキュベートし、キナーゼ活性の分散パターンを測定するｂ)標識スフィンゴシン−１ホスフェートとインキュベートし、ホスファターゼの分散パターンを測定するときの、スフィンゴイド塩基中間体の濃度測定の結果として分散パターンを示す。  代謝産物は、スフィンゴシン(Ｓｐｈ)、スフィンゴシン−１−ホスフェート(Ｓ１Ｐ)、セラミド(Ｃｅｒ)およびスフィンゴミエリン(ＳＭ)である。
【図２】ＳＰＨＫ−１阻害剤存在下の実施例２４の標識スフィンゴシンの、細胞内変換を示す。
【図３】実施例２４の標識スフィンゴシンが、適当な細胞と接触させたとき、ＳＰＨＫ−１よりもＳＰＨＫ−２でより効率的にリン酸化されることを示す。  レーン１：細胞をコントロールベクターのみでトランスフェクトした場合のパターン、  レーン２：細胞がＳＰＨＫ−１を過剰発現する場合のパターン  レーン３：細胞がＳＰＨＫ−２を過剰発現する場合のパターン。
【図１】
2007507205.tif 000062
【図２】
2007507205.tif 000063
【図３】
2007507205.tif 000064
【国際調査報告】
2007507205.tif 000065
2007507205.tif 000066
2007507205.tif 000067
2007507205.tif 000068