(57)【要約】  本発明は、RP-HPLCカラムにペプチドを添加するステップ、該カラムを製薬上許容しうる対イオン塩の水溶液で洗浄するステップ、および有機溶媒と製薬上許容しうる対イオンの酸との混合溶媒により該ペプチドを該カラムから溶出するステップを含む、該水溶液のpHが約6以上であることを特徴とするペプチド精製方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド精製方法において、
a) RP-HPLCカラムにペプチドを添加するステップ;
b) 該カラムを製薬上許容しうる対イオン塩の水溶液で洗浄するステップ; および
c) 有機溶媒と製薬上許容しうる対イオンの酸との混合溶媒により該ペプチドを該カラムから溶出するステップ；
を含んでなり、前記水溶液のpHが約6以上である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ペプチドが環状または非環状である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、バソプレシン、アトシバン、テルリプレシン、フェリプレシン、オルニプレシン、プラムリンチド、AOD-9604、バプレオチド、ソマトスタチン、ランレオチド、オクトレオチド、エプチフィバチド、デスモプレシン、サケカルシトニン、オキシトシンまたはネシリチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、オクトレオチド、デスモプレシン、サケカルシトニン、ネシリチドまたはエプチフィバチドである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記製薬上許容しうる対イオン塩が、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムまたはパモ酸アンモニウムである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液のpHが約8である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶液のpHが、少なくとも1つの塩基によって調整される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記塩基が、アンモニア、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、メチルエチルアミン、トリメチルアミンまたはトリエチルアミンである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記塩基が水酸化アンモニウムである、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合溶媒のpHが約6以下である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒がアセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはTHFのうちの少なくとも1つである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記製薬上許容しうる対イオンの酸が、酢酸、クエン酸またはパモ酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶出されるペプチドの残留対イオン含量が約0.25重量%以下である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶出されるペプチドの残留対イオン含量が約200ppm以下である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
残留対イオン含量が約0.25重量%以下であるクエン酸ネシリチド。
【請求項１７】
残留対イオンの含量が約0.25重量%以下である酢酸エプチフィバチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対イオン(counterion)交換法の使用によるペプチド精製を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ソマトスタチンは幅広い臨床応用の可能性を秘めたポリペプチドであるが、平均血中半減期がきわめて短いため、潜在適用例は限られる。そこで、安定性と効果を高めたソマトスタチン(somatostatin)類似体の開発研究が進められた。潜在的に有効と評価された一連の化合物は環状オクタペプチドである。環状オクタペプチドのオクトレオチド(octreotide)を評価すると、この化合物はin vitroとin vivoの両方で優れた生物活性を有することが判明した(Pless J., Metabolism 41, 5-6(1992))。オクトレオチドの基本式は次のとおりである:
【０００３】
【化１】
2007513192.tif 000002
【０００４】
(配列番号1) 式中2位と7位のCys残基の硫黄原子はジスルフィド架橋で結合されている。C末端アミノ酸トレオニン(Thr)のカルボキシル基はアルコールThr-ol(トレオニノール)残基へと還元されている。
N末端D-フェニルアラニン(D-Phe)とC末端アミノアルコールの存在は、D-トリプトファン(D-Trp)残基やジスルフィド架橋の存在と共に、この分子の代謝分解耐性をきわめて強くする。オクトレオチドは胃液などのような高反応性媒質中または胃粘膜中への24時間の定温放置を可能にする。
【０００５】
オクトレオチドは成長ホルモンを長時間阻害し、グルカゴンの分泌を抑制し、またインスリン分泌を一過的に限って阻害する。こうして、オクトレオチドは体内成長ホルモンレベルの調節作用が他のソマトスタチン類似体よりも選択的であり、従って目下そうしたホルモンの血中レベルの調節と低減を目的に末端肥大症に適用されている。また、オクトレオチドは胃腸膵管系内分泌由来の、およびある種の腫瘍の、細胞変異の治療にも有効である。
【０００６】
オクトレオチドとその誘導体の合成は2つの一般的な合成法によって説明されてきた。第1の方法は欧州特許出願第29,579 号(1981)明細書(Bauer et al.)や米国特許第4,395,403号明細書で開示するような、フラグメント縮合を基礎とする液相法である。この方法は一般に、保護ヘキサペプチド残基から保護基を除去するステップ、どちらか一方がヘキサペプチド残基を含む2つのペプチド単位をアミド結合で連結するステップ、生成したポリペプチドのN末端またはC末端の官能基を変換するステップ、および該ポリペプチドを酸化するステップを含む。この方法は時間のかかるマルチステップ合成法であり、またすべての合成ステップが液相で行われるため、反応混合物からのオクトレオチドの分離に際して新たな問題が生じる。
【０００７】
第2のオクトレオチド合成法はトレオニノール残基に始まる全ペプチド鎖の合成を固相法で行う。この方法ではトレオニノール残基を保護する必要がある。
【０００８】
第2の合成法ではアミノメチル樹脂を使用し、その上にトレオニノール残基を、アセタール型に保護した2つのアルコール基で結合する。Mergler et al. “Peptides: Chemistry and Biology,” Proceedings of 12th American Peptide Symposium, Poster 292 Presentation (Smith, JA and Rivier JE, Eds. ESCOM, Leiden) (1991). この合成法はFmoc/t-Bu保護スキームに従い、予め脱保護したシステイン残基上のチオール基の酸化によって樹脂上にジスルフィド架橋を形成させ、また20% TFA/DCM混合体でペプチドを解放し脱保護するものである。
【０００９】
Alsinaらは活性カーボネート樹脂へのトレオニノール残基の固定を開示している。その場合、アミノ基はBoc基で、また側鎖はBzl基で、それぞれ保護した。Alsina et al. Tetrahedron Letters, 38, 883-886 (1997). その後もBoc/Bzl戦略を用いて合成を続行した。ジスルフィド架橋の形成は樹脂上で直接、ヨウ素を使用して行い、またペプチドを樹脂から切り出し、その側鎖保護基をHF/アニソール(9/1)により同時に除去した。最終段階で、ピペリジン/DMF溶液によりホルミル基を除去した。Neugebauerらは収率わずか7%の線形合成法を開示している。Neugebauer et al. Peptides: Chemistry, Structure and Biology, p.1017 (Marshal GR and Rivier JE, Eds. ESCOM, Leiden, 1990).
【００１０】
Edwardsらが開示している固相近似法では、ペプチドD-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-HMP-樹脂(配列番号1)を樹脂上で段階的に合成した。Edwards et al. J. Med. Chem. 37, 3749-3757 (1994). その後、樹脂上でジスルフィド架橋を形成させ、得られた生成物をトレオニノールによるアミノ分解で樹脂から解放した。その通算収率は報告ではわずか14%であった。
【００１１】
AranoらはDTPA-オクトレオチドについて別の固相法を実行した。Arano et al. Bioconjugate Chem. 8, 442-446(1997). DTPA-ペプチドのヨウ素酸化により、DTPA-D-PheI-オクトレオチドが出発物Fmoc-Thr(tBu)-ol-樹脂を基準にして31.8%の通算収率で生成された。
【００１２】
Wuらは、オクトレオチド希釈溶液を使用し48時間の空気酸化によりジスルフィド結合を形成させることを特徴とするオクトレオチド合成法を開発した。Wu et al. Tetrahedron Letters, 39, 1783-1784 (1998).  Leeらは最近、オクトレオチド合成のための固相合成用樹脂にThr(ol)(またはThr-ol)を固定する新しい方法を実行した。米国特許第5,889,146号明細書を参照。Fmoc-Thr(ol)-テレフタル-アセタールを樹脂上に添加し、Fmoc化学の使用によるペプチド鎖の構築後、樹脂上で該ペプチドをヨウ素酸化により環化させた。ペプチド-樹脂をトリフルオロ酢酸で切り離してオクトレオチドを生成した。出発物Fmoc-Thr(ol)-テレフタル-アセタール樹脂からの通算収率は>70%であった。これらの手順はいずれもオクトレオチドの環化を、完全に脱保護したペプチド上かまたは樹脂上のいずれかで完了した。
【００１３】
さらなる環状、架橋環状または直鎖状ソマトスタチン類似体およびその合成方法は米国特許第4,310,518号および4,235,886号明細書、欧州特許明細書第EP-A-1295号; 70,021号; 113,209号; 215,171号; 203,031号; 214,872号および143,307号、ベルギー特許明細書第BE-A-900,089号で開示されている。
【００１４】
ペプチドの精製では、側鎖修飾、削除または付加配列、またはラセミ化生成物に起因する不純物を除去してもよい。ペプチド合成時に導入された対イオンもまた不純物源である。ペプチドはその配列中に少なくとも1個の塩基性官能基(LysまたはArg側鎖、またはN末端アミン基)を含むと、合成および精製時には遊離塩基としてではなく塩として現れる。ペプチド対イオンは一般にトリフルオロ酢酸(TFA)またはリン酸塩などを含む。酢酸塩は製薬上許容しうる対イオンであり、またしばしば活性医薬品成分(API)の合成または精製時に使用される対イオンを置換する代替物である。該対イオンはペプチド合成のいずれかの段階で置換しなければならない。
【００１５】
通常、ポリペプチド塩中の対イオンはイオン交換カラムで置換する。しかし、この方法はしばしば追加の精製ステップと追加の精製システムを必要とする。逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)は合成ペプチドの精製を著しく改善する。しかし、溶媒系の選定が難しいことに変わりはない。溶媒または混合溶媒が同じでもペプチド類の挙動は異なるからである。周知のようにRP-HPLCはイオン交換にも使用可能であるが、この方法には多量の溶媒を必要とするという難点がある。無用の残留対イオン量を十分に低いレベルへと引き下げるのが困難というのも難点である。
【００１６】
ペプチド精製の改善にもかかわらず、好ましくない量の許容し得ない対イオンをなお含む精製ペプチドもある。残留対イオンはしばしば、追加精製ステップなしには除去しにくい。本発明は代替方法としてRP-HPLC上でのイオン交換によりこの対イオン量を減らす方法を提供する。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の一実施態様は、RP-HPLCカラムにペプチドを添加するステップ、該カラムを製薬上許容しうる対イオン塩の水溶液で洗浄するステップ、および有機溶媒と製薬上許容しうる対イオンの酸との混合溶媒により該ペプチドを該カラムから溶出するステップを含む、該水溶液のpHが約6以上であることを特徴とするペプチド精製方法を包含する。該ペプチドはバソプレシン、アトシバン、テルリプレシン、フェリプレシン、オルニプレシン、プラムリンチド、AOD-9604、バプレオチド、ソマトスタチン、ランレオチド、オクトレオチド、エプチフィバチド、デスモプレシン、サケカルシトニン、オキシトシンまたはネシリチドでもよい。該ペプチドはオクトレオチド、デスモプレシン、サケカルシトニン、ネシリチドまたはエプチフィバチドであるのが好ましい。
【００１８】
一実施態様では、製薬上許容しうる対イオン塩は酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムまたはパモ酸アンモニウムである。該水溶液のpHが約8でもよい。該水溶液のpHは少なくとも1つの塩基で調整してもよいが、該塩基はアンモニア、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、メチルエチルアミン、トリメチルアミンまたはトリエチルアミンである。該塩基は水酸化アンモニウムであるのが好ましい。
【００１９】
さらに別の実施態様では、混合溶媒はpHが約6以下である。有機溶媒はアセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはTHFのうちの少なくとも1つでもよい。該有機溶媒はアセトニトリルであるのが好ましい。製薬上許容しうる対イオンの酸は酢酸、クエン酸またはパモ酸でもよい。
【００２０】
本発明の一実施態様は、残留対イオンの含量が約0.25重量%以下である溶出ペプチドを包含する。別の実施態様は残留対イオンの含量が約200ppm以下である溶出ペプチドを包含する。
本発明は残留対イオンの含量が約0.25重量%以下であるクエン酸ネシリチドを包含する。本発明はまた残留対イオンの含量が約0.25重量%以下である酢酸エプチフィバチドを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は対イオン交換カラムと逆相HPLC(RP-HPLC)を使用してペプチドを精製する方法を包含する。該方法はイオン交換によるペプチド精製ステップを含み、該ステップはペプチドの対イオンを製薬上許容しうる対イオンと交換することを特徴とする。イオン交換後のペプチドはカラムから溶出して回収する。一実施態様では、該方法はRP-HPLCカラムにペプチドを添加するステップ、該カラムを製薬上許容しうる対イオン塩の水溶液で洗浄するステップ、および有機溶媒と製薬上許容しうる対イオンの酸との混合溶媒により該ペプチドを該カラムから溶出するステップを含むが、該水溶液のpHは約6以上であることを特徴とする。
【００２２】
該方法はHPLCシステム用の好適な移動相の決定に部分的には基づく。というのは、各ペプチドの溶出は使用溶液に依存するからである。特に、該移動相は水性溶媒と有機溶媒の様々な比率による混合体である。溶出条件はグラジエント、定組成のいずれでもよい。
【００２３】
該方法に適したペプチドの例は環状または非環状ペプチドである。該ペプチドは遊離酸型でも対応する酸の塩でもよい。ペプチド塩に使用される好適な対イオンの非限定的な例はTFA、TEAP、フッ化水素、臭化水素または好適なリン酸塩などの対イオンである。特に、該ペプチドの非限定的な例はバソプレシン、アトシバン、テルリプレシン、フェリプレシン、オルニプレシン、プラムリンチド、AOD-9604、バプレオチド、ソマトスタチン、ランレオチド、オクトレオチド、エプチフィバチド、デスモプレシン、サケカルシトニン、オキシトシンまたはネシリチドである。該ペプチドの例はオクトレオチド、デスモプレシン、サケカルシトニン、ネシリチドまたはエプチフィバチドであるのが好ましい。
【００２４】
添加ステップでは、ペプチドを、溶媒を含む溶液として添加してもよい。該ペプチド溶液は一般に水で希釈したペプチドを含む。しかし、ペプチドは希釈せずに生で添加してもよい。
【００２５】
一般に、該方法に使用するHPLCカラムの例は、オリゴマー炭素鎖で誘導体化したシリカベースなどのような標準HPLCカラムである。HPLCカラムの非限定的な例はC4カラム、オクタデシル結合シリカ(C18)またはオクチル結合シリカ(C8)カラムである。中小サイズのペプチドすなわち残基数5〜50のペプチドはC18またはC8カラムで精製する。大サイズの、または疎水性の強いペプチドはC4カラムで精製する。使用カラムはC18 RP-HPLCカラムであるのが好ましい。
【００２６】
洗浄ステップで使用する水溶液はペプチド対イオンを製薬上許容しうる対イオンで置換しうるのがよい。この場合の「製薬上許容しうる対イオン」は、製薬上許容しうる塩型のペプチドを生成しうる対イオンをいう。製薬上許容しうる対イオンの非限定的な例は酢酸イオン、アスコルビン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、安息香酸イオン、炭酸水素イオン、硫酸水素イオン、酒石酸水素イオン、ホウ酸イオン、カムシル酸イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、二塩酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸イオン、シクロヘキシルスルファミン酸イオン、キニン酸イオン、エデト酸イオン、エジシラート(edisylate)、エストラート(estolate)、エシル酸イオン、フマキサート(fumaxate)、グルコン酸イオン、グルタミン酸イオン、グリセロリン酸イオン、臭化水素酸イオン、塩酸イオン、ヒドロキシナフトエ酸イオン、乳酸イオン、ラクトビオン酸イオン、ラウリン酸イオン、リンゴ酸イオン、マレイン酸イオン、マンデル酸イオン、メシル酸イオン、粘液酸イオン、ナプシル酸イオン、硝酸イオン、n-メチルグルカミン、オレイン酸イオン、シュウ酸イオン、パルモ酸イオン、パモ酸イオン(エンボニン酸イオン)、パルミチン酸イオン、パントテン酸イオン、過塩素酸イオン、リン酸イオン/二リン酸イオン、ポリガラクツロン酸イオン、サリチル酸イオン、ステアリン酸イオン、コハク酸イオン、硫酸イオン、スルファミン酸イオン、塩基性酢酸イオン、タンニン酸イオン、酒石酸イオン、トシル酸イオンまたは吉草酸イオンである。製薬上許容しうる対イオンは酢酸イオン、クエン酸イオンまたはパモ酸イオンであるのが好ましい。
【００２７】
洗浄ステップでは製薬上許容しうる対イオンの塩溶液を使用してもよい。製薬上許容しうる対イオン塩の好ましい非限定的な例は酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムまたはパモ酸アンモニウムである。バッファーグラジエントを使用するのが好ましい。加えて、有機または無機酸の任意の塩を使用して対イオンを置換してもよい。同様に、アンモニウム陽イオン以外の任意の陽イオンを使用してもよい。製薬上許容しうる塩の酸の非限定的な例は酢酸、クエン酸またはパモ酸である。
【００２８】
一般に洗浄ステップの水溶液は濃度が約0.1M〜約2Mでもよい。洗浄ステップの水溶液の濃度は約0.2M〜約1Mであるのが好ましく、また該濃度は約0.5Mであるのがさらに好ましい。
【００２９】
洗浄ステップでは、水溶液のpHは一般に約6以上である。pHがもっと低くなると、イオン交換効率が低くなり、所要時間が長くなり、移動相所要量も多くなる。洗浄ステップでの水溶液のpHは約8であるのが好ましい。シリカゲルを使用しないカラムまたは修飾シリカRPカラムの場合は、通常のシリカゲルカラムの場合の指定pHよりも高いpH範囲たとえばpH 10が好ましい。たとえばLuna吸着カラム(Phenomenex)はpH 10程度で安定である。RP-ポリマー系カラムたとえばPLRP-Sカラム(Polymer Laboratories)なら、個別ペプチドの安定性次第でpHを約10以上とすることができる。
【００３０】
洗浄ステップでの水溶液のpHは塩基を使用して調整してもよい。追加の精製ステップで不揮発性塩基を除去する手間を省くため、塩基によるpH調整には少なくとも1つの揮発性塩基を使用するのが好ましい。揮発性塩基の非限定的な例はアンモニア、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、メチルエチルアミン、トリメチルアミンまたはトリエチルアミンである。該塩基は水酸化アンモニウムであるのが好ましい。揮発性塩基の塩を単独で、または該揮発性塩基と共に、使用してもよい。揮発性塩基の塩の非限定的な例は酢酸アンモニウムである。あるいはナトリウム、カリウムなどのような無機塩基またはその塩でpHを調整してもよい。
【００３１】
溶出ステップはペプチドをカラムから除去しうるような溶媒系を使用して行う。当業者は実験をほとんどまたはまったく行うことなく、個別ペプチドと溶離目的に応じて溶媒混合比を容易に決定することができよう。溶出ステップに使用する溶離液は少なくとも1つの有機溶媒と製薬上許容しうる対イオンの酸とを含む。該溶離液はそうした有機溶媒と酸との様々な比率による混合体でもよい。たとえば有機溶媒がアセトニトリルであり、カラムからのペプチドの除去が目的であるとすれば、その濃度は約50%でもよい。あるいは、ペプチドのさらなる精製をも目的とするのであれば、アセトニトリルと酸水溶液のグラジエントを使用してもよい。溶離液のバッファーグラジエントを使用するのが好ましい。溶出ステップでの溶離液のpHは約6以下であるのが好ましい。
【００３２】
有機溶媒の非限定的な例はアセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはTHFのうちの少なくとも1つである。最も好ましい有機溶媒はアセトニトリルである。製薬上許容しうるイオンの酸は前記のうちの任意の製薬上許容しうる対イオンの酸である。酸の選定は使用される製薬上許容しうる対イオン次第である。
【００３３】
HPLCに使用する溶媒系の例はTFAを含む系(アセトニトリル/水0.1% TFA)およびリン酸トリエチルアンモニウム系を含むイオン対形成促進系(特定pHに緩衝されたアセトニトリル/TEAP)などである。
該精製方法は残留対イオン含量約0.25重量%以下のペプチドを生成する。あるいは該精製方法は残留対イオン含量約200ppm以下のペプチドを生成する。該対イオンはTFAであるのが好ましい。
【００３４】
残留対イオンレベルはDIONEX Application Note 115などのようなイオンクロマトグラフィー(IC)法で求めても、HPLCまたはGCなどのような他周知の方法で求めてもよい。この場合の「残留対イオン」は、ペプチド合成または精製時に使用され、添加ステップではなお存在していて、最終的に製薬上許容しうる対イオンによって置換される該ペプチドの対イオンをいう。
【００３５】
本発明の別の実施態様は残留対イオン含量約0.25重量%以下のクエン酸ネシリチドを包含する。本発明はまた残留対イオン含量約0.25重量%以下の酢酸エプチフィバチドを包含する。
本発明は特定の実施例や好ましい実施態様の点から説明しているが、本発明がそうした実施例や実施態様に限定されないことは言うまでもない。従って当業者には自明であろうが、請求の範囲では、明細書に記載された特定の実施例や好ましい実施態様に対する変更もまた本発明に含まれる。
【実施例】
【００３６】
実施例１．H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Arg-Gly-NH2 (配列番号2)(バソプレシン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂(50g)を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Arg(Pbf))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。
【００３７】
ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Tyr(tBu)、Arg(Pbf)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。AsnとGlnはアミド基を保護せずに使用する。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると110gの乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００３８】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して36gの生成物とする。残留TFA<0.25%。
【００３９】
実施例２．バソプレシンの調製
【化２】
2007513192.tif 000003
【００４０】
粗製ペプチドH-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Arg-Gly-NH2 (配列番号2) (36g、実施例1に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のトリフルオロ酢酸バソプレシンを含む画分を得る。該画分を処理してTFAイオンを酢酸塩で置換し、回収し、凍結乾燥して最終生成物の乾燥ペプチド11g(純度>99.0%)を得る。
【００４１】
実施例３．H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys(Acm)-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2 (配列番号7)(プラムリンチド前駆体)の調製
このペプチドの合成は実施例1に記載の要領で、通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法により、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Lys(Boc)、Thr(tBu)、His(Trt)、Ser(tBu)、Tyr(tBu)、Arg(Pbf)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。AsnとGlnはアミド基を保護せずに、またはTrt保護して、使用する。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００４２】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテル(MTBE)を加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥する。
【００４３】
実施例４．H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2 、環状(2-7)ジスルフィド、酢酸塩(配列番号7)の調製
実施例3に記載の要領で調製した粗生成物の半保護ペプチドを分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>97.5%のトリフルオロ酢酸プラムリンチドを含む画分を得る。該画分を処理してTFAイオンを酢酸塩で置換し、回収し、凍結乾燥して最終生成物の酢酸プラムリンチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００４４】
実施例５．H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Phe-OH(配列番号8)(AOD-9604前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、2-Cl-Trt樹脂を出発物として行う。予備ステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Phe)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、ピペリジン/DMF溶液で処理してFmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Gly)を導入して第1カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。
【００４５】
このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Tyr(tBu)、Arg(Pbf)、Ser(tBu)、Cys(Trt)およびCys(Acm)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００４６】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥する。
【００４７】
実施例６．AOD-9604の調製
【化３】
2007513192.tif 000004
【００４８】
実施例5に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Phe-OH(配列番号8)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のペプチドを含む画分を得る。該画分を回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００４９】
実施例７．H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Ser-Cys(Acm)-OH (配列番号10)(ソマトスタチン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、2-Cl-Trt樹脂を出発物として行う。予備ステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Cys(Acm))を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、ピペリジン/DMF溶液で処理してFmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Ser(tBu))を導入して第1カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。
【００５０】
このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Lys(Boc)、Thr(tBu)、Ser(tBu)、Cys(Trt)およびCys(Acm)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００５１】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥する。
【００５２】
実施例８．ソマトスタチンの調製
【化４】
2007513192.tif 000005
【００５３】
実施例7に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Ser-Cys(Acm)-OH (配列番号10)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のペプチドを含む画分を得る。対イオンを酢酸塩に置換する処理の後、該画分を回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００５４】
実施例９．H-D-Naph-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 (配列番号11)(ランレオチド前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Thr(tBu))を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Cys(Acm))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。
【００５５】
このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Tyr(tBu)、Lys(Boc)、Thr(tBu)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００５６】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とする。
【００５７】
実施例１０．ランレオチドの調製
【化５】
2007513192.tif 000006
【００５８】
実施例9に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-D-Naph-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 (配列番号11) を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のランレオチドを含む画分を得る。該画分を酢酸塩で処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００５９】
実施例１１．Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2 (配列番号3)(アトシバン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Orn(Boc))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。
【００６０】
このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Orn(Boc)、Thr(tBu)、Cys(Acm)およびMpa(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００６１】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とする。
【００６２】
実施例１２．アトシバンの調製
【化６】
2007513192.tif 000007
【００６３】
実施例11に記載の要領で調製した粗製ペプチドMpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2 (配列番号3) を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のアトシバンを含む画分を得る。該画分を処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００６４】
実施例１３．H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (配列番号4)(テルリプレシン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Lys(Boc))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。
【００６５】
このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Lys(Boc)、Tyr(tBu)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００６６】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とする。
【００６７】
実施例１４．テルリプレシンの調製
【化７】
2007513192.tif 000008
【００６８】
実施例13に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (配列番号4)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のテルリプレシンを含む画分を得る。該画分を処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００６９】
実施例１５．H-Cys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (配列番号5)(フェリプレシン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Lys(Boc))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。
【００７０】
樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Lys(Boc)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテル(MTBE)を加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とする。
【００７１】
実施例１６．フェリプレシンの調製
【化８】
2007513192.tif 000009
【００７２】
実施例15に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-Cys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (配列番号5)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のフェリプレシンを含む画分を得る。該画分を処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００７３】
実施例１７．H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly- NH2 (配列番号6)(オルニプレシン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Orn(Boc))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。
【００７４】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Orn(Boc)、Tyr(tBu)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００７５】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とする。
【００７６】
実施例１８．オルニプレシンの調製
【化９】
2007513192.tif 000010
【００７７】
実施例17に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2 (配列番号6)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のオルニプレシンを含む画分を得る。該画分を処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００７８】
実施例１９．H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys(Acm)-Trp-NH2 (配列番号9)(バプレオチド前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行う。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Trp)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加する。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Cys(Acm))を導入して第2カップリングステップを開始させる。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングする(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。
【００７９】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認する。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護してある。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Lys(Boc)、Tyr(tBu)、Cys(Acm)およびCys(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用する。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると乾燥ペプチド-樹脂が得られる。
【００８０】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去する。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とする。
【００８１】
実施例２０．バプレオチドの調製
【化１０】
2007513192.tif 000011
【００８２】
実施例19に記載の要領で調製した粗製ペプチドH-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys(Acm)-Trp-NH2 (配列番号9)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製する。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈する。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和する。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のバプレオチドを含む画分を得る。該画分を処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得る。残留TFA<0.25%。
【００８３】
実施例２１．H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (配列番号1)(オクトレオチド前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Thr(t-Bu)-ol-2-Cl-Trt樹脂(250g、0.7mmol/g-予備添加樹脂)を出発物として行った。樹脂洗浄後、第2のアミノ酸(Fmoc-Cys(Acm))を導入して第1カップリングステップを開始させた。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングした(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用した。
【００８４】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認した。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去した。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復した。使用アミノ酸は配列中の最後のアミノ酸Boc-D-Pheを除いてすべてFmoc-Nα保護した。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護した: Thr(t-Bu)、Cys(Trt)、Cys(Acm)およびLys(Boc)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用した。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると510gの乾燥ペプチド-樹脂が得られた。
【００８５】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出した。生成物は10容量部のエーテ(MTBE)を加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して201.7gの粉末とした。それはLC-MSによりH-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-olであると確認された。
【００８６】
実施例２２．オクトレオチドの調製
【化１１】
2007513192.tif 000012
【００８７】
粗製ペプチドH-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (配列番号1) (200g、実施例21に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製した。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈した。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和した。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のトリフルオロ酢酸オクトレオチドを含む画分を得た。トリフルオロ酢酸塩を置換する処理の後、該画分を回収し、凍結乾燥して最終生成物の乾燥ペプチド130gを得た。残留TFA<0.25%。
【００８８】
実施例２３．Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2 (配列番号12)(エプチフィバチド前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、2-Cl-Trp樹脂(50g)を出発物として行った。予備ステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Cys(Acm))を該樹脂上に約0.7mmol/g添加した。樹脂を洗浄した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Pro)を導入して第1カップリングステップを開始させた。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングした(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用した。
【００８９】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認した。樹脂を洗浄した後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去した。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復した。使用アミノ酸は配列中の最終ビルディングブロック(Trt-Mpa)を除いてすべてFmoc-Nα保護した。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護した: Asp(tBu)、Har(Pbf)およびCys(Acm)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用した。合成終了後ペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥し、80gの乾燥ペプチド-樹脂を得た。
【００９０】
以上の要領で調製したペプチドは1%TFA/DCM溶液で洗浄することにより、樹脂から切り出した。生成した溶液をDIPEAの添加で中和し、ペプチド含量10%程度に濃縮した。DCC/HOBtによるC末端の活性化とアンモニア/IPA溶液によるカップリングとでC末端をアミド化した。溶媒留去後、保護ペプチドをエーテル中に沈殿させ、乾燥した。95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液、2時間、室温条件で保護基を除去した。生成物を10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して30gの粗生成物とした。
【００９１】
実施例２４．エプチフィバチドの調製
【化１２】
2007513192.tif 000013
【００９２】
粗製ペプチドMpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2(配列番号12) (30g、実施例23に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製した。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈した。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和した。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のトリフルオロ酢酸エプチフィバチドを含む画分を得る。該画分を回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチド6.9g(純度>98.5%)を得た。残留TFA<0.25%。
【００９３】
実施例２５．Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (デスモプレシン前駆体)のSPPS法による調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂(200g)を出発物として行った。該樹脂からFmoc基を除去した後、通常のカップリング手順で第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に添加した。樹脂洗浄後、第2のアミノ酸(Fmoc-D-Arg(Pbf))を導入して配列伸長を続行した。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで該樹脂にカップリングした(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用した。
【００９４】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認した。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去した。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復した。使用アミノ酸は配列中の最後のビルディングブロックTrt-Mpaを除いてすべてFmoc-Nα保護した。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護した: Gln(Trt)、D-Arg(Pbf)、Tyr(tBu)およびCys(Acm)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用した。合成が終了したらペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥すると460gの乾燥ペプチド-樹脂が得られた。
【００９５】
以上の要領で調製したペプチドは89% TFA、5.0%フェノール、1.0% TIS、2.5% EDT、2.5%水の溶液で1.5時間、室温条件で処理して樹脂から切り出した。生成物は10容量部のエーテを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して115.0gの粉末とした。それはLC-MSによりMpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2であると確認された。
【００９６】
実施例２６．Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (配列番号13)(デスモプレシン前駆体)の液相法による調製
このペプチドの合成は通常の段階的「液相合成」法で行う。第2のアミノ酸(Fmoc-D-Arg-(Pbf)-OH)をDMFに溶解し、DIPEAの存在下にTBTU/HOBtを加えて予備活性化する。第1のアミノ酸(Gly-NH2)をDMFに溶解し、付加し、室温で約1時間反応させる。DMFを減圧留去し、残渣を酢酸エチルに溶解する。この有機溶液を塩酸(1N)、水、NaHCO3(5%)で数回洗う。溶液をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を留去してFmoc-D-Arg(Pbf)-Gly-NH2を得る。ピペリジン/DMF(20%)溶液に溶解してFmoc基を除去する。溶液を濃縮し、粗製ジペプチドを冷エーテル中に沈殿させる。
【００９７】
同様の手順で残りのアミノ酸も逐次付加し、保護基の付いた最終線状ペプチドを得る。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)を使用してin situで活性化し、ついで伸長途上のペプチド鎖にカップリングする。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用する。カップリングの完了はHPLCまたはTLCテストで確認する。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復する。使用アミノ酸は配列中の最後のビルディングブロックTrt-Mpaを除いてすべてFmoc-Nα保護する。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護する: Gln(Trt)、D-Arg(Pbf)、Tyr(tBu)およびCys(Acm)。
【００９８】
以上の要領で調製したペプチドは91.5% TFA、1.0% TIS、2.5% EDT、5.0%水の溶液を使用して、1.5時間、室温条件で酸不安定保護基を除去する。粗生成物Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2を10容量部のエーテを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して最終粉末とする。生成物はLC-MSにより確認する。
【００９９】
実施例２７．デスモプレシンの調製
【化１３】
2007513192.tif 000014
【０１００】
粗製ペプチドMpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (配列番号13) (115g、実施例25に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製した。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈した。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和した。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のトリフルオロ酢酸デスモプレシンを含む画分を得た。対イオンを酢酸塩へと交換した後、該画分を回収し、凍結乾燥して最終生成物の乾燥ペプチド37.2gを得た。該ペプチドは純度が>99.5%であった(HPLCによる)。残留TFA<0.25%。
【０１０１】
実施例２８．Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (配列番号14)(サケカルシトニン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂(200g)を出発物として行った。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Pro)を該樹脂上に添加した。樹脂を洗浄し、第2のアミノ酸(Fmoc-Thr(tBu))を導入して配列伸長を続行した。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBtを使用してin situで活性化し、次いで該樹脂にカップリングした(約60分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用した。
【０１０２】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認した。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去した。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復した。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護した。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護した: Cys(Trt)、Ser(tBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Thr(tBu)、Glu(tBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Arg(Pbf)、Tyr(tBu)およびCys(Acm)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用した。合成終了後、ペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥して670gの乾燥ペプチド-樹脂を得た。
【０１０３】
以上の要領で調製したペプチドは94% TFA、1.0% TIS、2.5% EDT、2.5%水の溶液により、1.5時間、室温条件で処理して樹脂から切り出した。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して345.0g粉末とした。それはLC-MSによりCys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2であると確認された。
【０１０４】
実施例２９． (サケ)カルシトニンの調製
粗製ペプチドCys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2(配列番号14) (345 g、実施例28に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製した。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈した。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和した。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のトリフルオロ酢酸カルシトニンを含む画分を得た。対イオンを酢酸塩に交換した後、該画分を回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチド64gを得た。該ペプチドは純度が>99.5%であった(HPLCによる)。残留TFA<0.25%。
【０１０５】
実施例３０．H-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 (配列番号15)(オキシトシン前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、Rinkアミド樹脂を出発物として行った。該樹脂からFmoc保護基を除去した後、通常のカップリングステップで第1のアミノ酸(Fmoc-Gly)を該樹脂上に約0.7mmol/g添加した。樹脂を洗浄し、Fmoc保護基を除去した後、第2のアミノ酸(Fmoc-Leu)を導入して第2カップリングステップを開始させた。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBtを使用してin situで活性化し、次いで該樹脂にカップリングした(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用した。
【０１０６】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認した。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去した。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復した。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護した。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護した: Tyr(tBu)、Cys(Acm) およびCys(Trt)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用した。合成終了後、ペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥して乾燥ペプチド-樹脂を得た。
【０１０７】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDTの溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去した。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥して粗生成物とした。
【０１０８】
実施例３１．オキシトシンの調製
【化１４】
2007513192.tif 000015
【０１０９】
粗製ペプチドH-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 (配列番号15) (実施例30に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製した。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈した。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和した。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のオキシトシンを含む画分を得た。該画分を処理して対イオンを置換した後、回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得た。残留TFA<0.25%。
【０１１０】
実施例３２．H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH (配列番号16) (ネシリチド前駆体)の調製
このペプチドの合成は通常の段階的Fmoc SPPS(固相ペプチド合成)法で、2-Cl-Trt樹脂を出発物として行った。予備ステップで第1のアミノ酸(Fmoc-His(Trt))を該樹脂上に約0.3mmol/g添加した。樹脂を洗浄した後、ピペリジン/DMF溶液でFmoc基を除去し、第2のアミノ酸(Fmoc-Arg(Pbf))を導入して第1カップリングステップを開始させた。Fmoc保護アミノ酸はTBTU/HOBtを使用してin situで活性化し、次いで該樹脂にカップリングした(50分)。このカップリングではジイソプロピルエチルアミンまたはコリジンを有機塩基として使用した。
【０１１１】
カップリングの完了はニンヒドリンテストで確認した。樹脂を洗浄後、20%ピペリジン/DMF条件(20分)でαアミン上のFmoc保護基を除去した。ペプチドの配列に従ってアミノ酸を追加するたびにこれらのステップを反復した。使用アミノ酸はすべてFmoc-Nα保護した。三官能性アミノ酸は次のように側鎖を保護した: Lys(Boc)、Arg(Pbf)、Ser(tBu)、Asp(tBu)、His(Trt)、Cys(Trt)およびCys(Acm)。カップリング反応には3当量の活性化アミノ酸を使用した。合成終了後、ペプチド-樹脂をDMFで、次いでDCMで、それぞれ洗浄し、減圧乾燥して乾燥ペプチド-樹脂を得た。
【０１１２】
以上の要領で調製したペプチドは95% TFA、2.5% TIS、2.5% EDT溶液により、2時間、室温条件で処理して樹脂から切り出すと同時に酸不安定保護基を除去した。生成物は10容量部のエーテルを加えて沈殿させ、ろ別し、減圧乾燥した。
【０１１３】
実施例３３．ネシリチドH-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH(10, 26環状)クエン酸塩の調製
粗製ペプチドH-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH (配列番号16) (実施例32に記載の要領で調製)を分取C18 RP-HPLCカラムで精製した。純度>95%の生成物を含む画分を合わせ、約1g/Lの濃度に希釈した。等モル量のヨウ素/酢酸を室温で激しく撹拌しながら加え、次いで過剰量のヨウ素を少量のアスコルビン酸で中和した。得られた溶液をC18 RP-HPLCカラムに添加し、精製して純度>98.5%のペプチドを含む画分を得た。対イオンをクエン酸塩に交換した後、該画分を回収し、凍結乾燥して最終乾燥ペプチドを得た。残留TFA<0.25%。
【国際調査報告】
2007513192.tif 000016
2007513192.tif 000017
2007513192.tif 000018
2007513192.tif 000019
2007513192.tif 000020