(57)【要約】  本発明は、抗原送達およびワクチン免疫処置ストラテジーに使用され得る微粒子に関する。本発明は、特に、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染の予防および処置に有用な微粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  水不溶性のポリマーまたはコポリマーを含有するコア、および
(b)  親水性のポリマーまたはコポリマーおよびイオン性またはイオン化性である官能基を含有するシェル;
を含む微粒子であって、外表面に吸着された疾患関連抗原を有する微粒子。
【請求項２】
疾患関連抗原が微生物抗原または癌関連抗原である、請求項１記載の微粒子。
【請求項３】
水不溶性ポリマーがポリ(スチレン)である、請求項１または２記載の微粒子。
【請求項４】
水不溶性ポリマーがポリ(メタクリル酸メチル)である、請求項１または２記載の微粒子。
【請求項５】
親水性ポリマーがヘミスクシナート化ポリビニルアルコールである、前記請求項いずれか記載の微粒子。
【請求項６】
親水性コポリマーがEudragit（登録商標）L100-55 (メタクリル酸とアクリル酸エチルとのコポリマー)である、請求項１〜４いずれか記載の微粒子。
【請求項７】
該粒子が0.1〜10μmの最大径を有する、前記請求項いずれか記載の微粒子。
【請求項８】
抗原がヒト免疫不全ウイルス-1 (HIV-1)抗原である、前記請求項いずれか記載の微粒子。 
【請求項９】
抗原がHIV-1 Tat タンパク質(配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 もしくは32)またはその免疫原性断片である、請求項８記載の微粒子。
【請求項１０】
(a)  １種類以上の水不溶性モノマーを、１種類以上の親水性ポリマーの存在下で分散重合により重合して微粒子を形成する工程；および
(b)  前記微粒子の外表面に疾患関連抗原を吸着させる工程
を含む、前記請求項いずれか記載の微粒子の作製方法。
【請求項１１】
請求項１〜９いずれか記載の微粒子および薬学的に許容され得る賦形剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９いずれか記載の微粒子または請求項１１記載の医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、個体において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１３】
請求項８または９記載の微粒子を治療有効量で投与することを含む、HIV感染またはAIDSの予防または処置方法。
【請求項１４】
治療または診断によるヒトまたは動物の身体の処置方法における使用のための請求項１〜９いずれか記載の微粒子または請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
個体において免疫応答を生じさせるための医薬の製造のための請求項１〜９いずれか記載の微粒子の使用。
【請求項１６】
HIV感染またはAIDSの予防または処置用の医薬の製造のための請求項８または９記載の微粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗原送達およびワクチンの分野に関する。より詳しくは、本発明は、ある種の微粒子、ならびにかかる微粒子を用いた抗原送達およびワクチン免疫処置ストラテジーに関する。本発明は、特に、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染の予防および処置に有用な微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
治療用または予防用ペプチド、特にワクチンを、著しい分解なく、その作用部位に効率的に送達することは、重要である。ペプチド抗原が封入されたポリマー系微粒子は、抗原をプロフェッショナル抗原提示細胞に効率的に標的化し、これを長期間にわたって制御された様式で放出するその能力について潜在的な送達系として詳細に研究されている。(O’Hagan DT., Recent advances in vaccine adjuvants for systemic and mucosal administration, J. Pharm. Pharmacol., 1998；59:1-10；Nugent J, Wan Po L, Scott E., Design and delivery of non- parental vaccines, Review. J. Clin. Pharm. Therap., 1998；23:257-85；および Alpar HO, Ward KR, Williamson ED., New strategies in vaccine delivery., S.T.P. Pharma. Sci., 2000；10:269-78). 
【０００３】
微粒子状マトリックス内に封入されたペプチドは、非経口または粘膜投与後に遭遇する望ましくない状態から保護され得るが(Nedrud JG, Lamm ME., Adjuvants and the mucosal immune system, In：Spriggs DR, Koff WC, editors, Topics in vaccine adjuvant research, Boca Raton：CRC, 1991. p.51-67)、これらは、多くの場合、不安定となるか、または分解される。これは、封入プロセス中(例えば、有機系溶媒, 高せん断および凍結乾燥への曝露など）および／またはポリマーの分解によって引き起こされる低pH微環境に抗原が曝露されたときの体内のいずれかで起こり得る(O’Hagan DT, Singh M, Gupta RK., Poly(lactide-co-glycolide)microparticles for the development of single-dose controlled-release vaccines, Adv. Drug. Deliv. Rev. 1998；32:225-46；および O’Hagan DT., 前出)。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明者らは、抗原をポリマー系微粒子の外表面に固定または吸着させ得ることを見出した。さらに、発明者らは、これらの微粒子が、抗原を標的細胞に効率的に送達するために用いられることを示した。
【０００５】
したがって、本発明は、
(a)水不溶性のポリマーまたはコポリマーを含有するコア、および
(b)親水性のポリマーまたはコポリマーおよびイオン性またはイオン化性である官能基を含有するシェル;
を含む微粒子であって、外表面に吸着された疾患関連抗原を有する微粒子を提供する。
【０００６】
本発明は、さらに、
−  本発明の微粒子の作製方法;
−  本発明の微粒子を含有する医薬組成物;
−  本発明の微粒子を治療有効量で投与することを含む、個体において免疫応答を生じさせる方法;
−  本発明の微粒子を治療有効量で投与することを含む、HIV感染またはAIDSの予防または処置方法
−  治療または診断によるヒトまたは動物の身体の処置方法における使用のための本発明の微粒子;
−  個体において免疫応答を生じさせるための医薬の製造のための本発明の微粒子の使用；および
−  HIV感染またはAIDSの予防または処置用の医薬の製造のための本発明の微粒子の使用
を提供する。
【０００７】
（配列表の簡単な説明）
配列番号：1は、完全長をコードするヌクレオチド配列を示す。HTLV-III、BH10 CLONE、CLADE B由来のHIV-1 Tatタンパク質。これは、TCペプチド(配列番号：33〜48)の親配列である。
【０００８】
配列番号：2は、HILV、BH10 CLONE CLADE B由来の完全長 HIV-1 Tatタンパク質の102アミノ酸配列を示す。
【０００９】
配列番号：3〜32は、HTLV-III、BH10 CLONE、CLADE Bから単離した完全長 HIV-1 Tatタンパク質のバリアントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。Tatの長さおよび配列は、ウイルス単離物に応じて異なる。
【００１０】
配列番号：3は、HIV-1 Tatタンパク質(BH10)の短鎖形をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１１】
配列番号：4は、HIV-1 Tatタンパク質(BH10)の86アミノ酸短鎖形を示す。この配列は、配列番号：1の残基1〜86に相当する。
【００１２】
配列番号：5は、BH10(配列番号：4)のシステイン22変異型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
配列番号：6は、BH10(配列番号：4)の86アミノ酸システイン22変異型を示す。
【００１４】
配列番号：7は、BH10(配列番号：4)のリシン 41変異型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
配列番号：8は、BH10(配列番号：4)の86アミノ酸リシン 41変異型を示す。
【００１６】
配列番号：9は、BH10(配列番号：4)のRGDΔ変異型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
配列番号：10は、BH10(配列番号：4)の83アミノ酸 RGDΔ変異型を示す。
【００１８】
配列番号：11は、BH10(配列番号：4)のリシン 41 RGDΔ変異型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
配列番号：12は、BH10(配列番号：4)の83アミノ酸リシン 41 RGDΔ変異型を示す。
【００２０】
配列番号：13は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_A-A1-A2バリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
配列番号：14は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_A-A1-A2バリアントを示す。
【００２２】
配列番号：15は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_Bバリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
配列番号：16は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_Bバリアントを示す。
【００２４】
配列番号：17は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_Cバリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２５】
配列番号：18は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_Cバリアントを示す。
【００２６】
配列番号：19は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_DバリアントDをコードするヌクレオチド配列を示す。 
【００２７】
配列番号：20は、HIV-1 Tatタンパク質の86アミノ酸コンセンサス_Dバリアントを示す。
【００２８】
配列番号：21は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_F1-F2バリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２９】
配列番号：22は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_F1-F2バリアントを示す。
【００３０】
配列番号：23は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_Gバリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００３１】
配列番号：24は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_Gバリアントを示す。
【００３２】
配列番号：25は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_Hバリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００３３】
配列番号：26は、HIV-1 Tatタンパク質の86アミノ酸コンセンサス_Hバリアントを示す。
【００３４】
配列番号：27は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_CRF01バリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００３５】
配列番号：28は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_CRF01バリアントを示す。
【００３６】
配列番号：29は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_CRF02バリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００３７】
配列番号：30は、HIV-1 Tatタンパク質の101アミノ酸コンセンサス_CRF02を示す。
【００３８】
配列番号：31は、HIV-1 Tatタンパク質のコンセンサス_Oバリアントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００３９】
配列番号：32は、HIV-1 Tatタンパク質の115アミノ酸コンセンサス_Oバリアントを示す。
【００４０】
配列番号：33は、表8のTC27ペプチドの配列を示す。
【００４１】
配列番号：34は、表8のTC28ペプチドの配列を示す。
【００４２】
配列番号：35は、表8のTC29ペプチドの配列を示す。
【００４３】
配列番号：36は、表8のTC30ペプチドの配列を示す。
【００４４】
配列番号：37は、表8のTC31ペプチドの配列を示す。
【００４５】
配列番号：38は、表8のTC32ペプチドの配列を示す。
【００４６】
配列番号：39は、表8のTC33ペプチドの配列を示す。
【００４７】
配列番号：40は、表8のTC34ペプチドの配列を示す。
【００４８】
配列番号：41は、表8のTC35ペプチドの配列を示す。
【００４９】
配列番号：42は、表8のTC36ペプチドの配列を示す。
【００５０】
配列番号：43は、表8のTC37ペプチドの配列を示す。
【００５１】
配列番号：44は、表8のTC38ペプチドの配列を示す。
【００５２】
配列番号：45は、表8のTC39ペプチドの配列を示す。
【００５３】
配列番号：46は、表8のTC40ペプチドの配列を示す。
【００５４】
配列番号：47は、表8のTC41ペプチドの配列を示す。
【００５５】
配列番号：48は、表8のTC42ペプチドの配列を示す。
【００５６】
配列番号：49は、HE1D微粒子上に吸着させたオボアルブミンの配列を示す。
【００５７】
配列番号：50は、表11のCFDペプチドの配列を示す。
【００５８】
配列番号：51は、表11のKVVペプチドの配列を示す。
【００５９】
配列番号：52は、表11のSIIペプチドの配列を示す。
【００６０】
配列番号：53は、表11のOVA1ペプチドの配列を示す。
【００６１】
配列番号：54は、表11のOVA2ペプチドの配列を示す。
【００６２】
配列番号：55は、表11のOVA3ペプチドの配列を示す。
【００６３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、特定の抗原に限定されないことを理解されたい。また、開示した方法の異なる適用は、当該技術分野の特定のニーズに対して調整され得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、本発明の特定の態様を記載する目的のためにすぎず、限定することを意図しないことを理解されたい。
【００６４】
また、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明白に他の意味を示す場合を除き、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「単数形の抗原(an antigen)」に対する言及は、２つ以上のかかる薬剤の混合物を含み、「単数形微粒子(a microparticle)」に対する言及は、２つ以上の微粒子の混合物に対する言及を含み、「単数形の「標的」細胞」に対する言及は、２つ以上のかかる細胞を含む、などである。
【００６５】
本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、前出または後述のいずれも、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００６６】
本発明は、抗原を標的細胞に送達するための微粒子を提供する。微粒子は、その外表面に吸着されたまたは固定された抗原を有する。用語「本発明の微粒子」は、本明細書において、外表面に吸着された抗原を有する微粒子であると定義する。
【００６７】
微粒子は、水不溶性のポリマーまたはコポリマーを含有するコア、および親水性のポリマーまたはコポリマーおよびイオン性またはイオン化性である官能基を含有するシェルを含む。微粒子は、典型的には、親水性のポリマーまたはコポリマーの存在下での水不溶性モノマーの分散重合により得られ得る。水不溶性モノマーを重合してコアを形成し、親水性のポリマーまたはコポリマーは、シェルを構成する。外側シェルは、典型的には、内部コアに共有結合している。微粒子外部表面は、典型的には、イオン性またはイオン化性化学基を含有する親水性シェルである。微粒子表面は、全体として正または負の電荷を有する。微粒子は、カチオン性またはアニオン性である。微粒子は、好ましくは、その外表面全体にわたって正味の正または負の電荷を有する。表面電荷密度は、典型的には、微粒子の表面のいたる所で異なる。
【００６８】
微粒子のシェルおよびコアは、好ましくは、生体適合性ポリマー系材料から構成される。用語「生体適合性ポリマー系材料」は、動物に対して有毒でなく、発癌性でないポリマー系材料と定義される。また、マトリックス材料は、ポリマー系材料が身体でのインビボプロセスによって身体により容易に処分され得る生成物によって分解されるべきであり、身体内に蓄積すべきでないという意味において、生分解性であるのがよい。他方において、微粒子が、生体から自然に剥がれる組織内に挿入される場合(例えば、皮膚の脱落)、マトリックス材料は生分解性である必要はない。
【００６９】
微粒子のコアにおける使用に好適な水不溶性ポリマー形成材料としては、限定されないが、ポリ(ジエン)、例えば、ポリ(ブタジエン)など；ポリ(アルケン)、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど；ポリ(アクリル樹脂)、例えば、ポリ(アクリル酸)など；ポリ(メタクリル樹脂)、例えば、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)など；ポリ(ビニルエーテル)；ポリ(ビニルアルコール)；ポリ(ビニルケトン)；ポリ(ハロゲン化ビニル)、例えば、ポリ(塩化ビニル)など；ポリ(ビニルニトリル)、ポリ(ビニルエステル)、例えば、ポリ(酢酸ビニル)など；ポリ(ビニルピリジン)、例えば、ポリ(2-ビニルピリジン)、ポリ(5-メチル-2-ビニルピリジン)など；ポリ(スチレン)；ポリ(カーボネート)；ポリ(エステル)；ポリ(オルトエステル)；ポリ(エステルアミド)；ポリ(無水物)；ポリ(ウレタン)；ポリ(アミド)；セルロースエーテル、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；セルロースエステル、例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートブチレートなど；ポリ(サッカリド)、タンパク質、ゼラチン、デンプン、ゴム、樹脂などが挙げられる。ポリマー系材料は、架橋されたものであり得る。
【００７０】
好ましい材料としては、限定されないが、ポリアクリレート、ポリメタクリレートおよびポリスチレンが挙げられる。用語「ポリ(メタ)アクリレート」は、本明細書で使用する場合、ポリアクリレートおよびポリメタクリレートの両方を包含する。同様に、用語「(メタ)アクリレート」は、アクリレートおよびメタクリレートの両方を包含する。
【００７１】
コア材料として使用され得る好ましいポリ(メタ)アクリレートとしては、ポリ(アルキル(メタ)アクリレート)、特に、ポリ(C1〜10アルキル(メタ)アクリレート)、好ましくはポリ(C1〜6アルキル(メタ)アクリレート)、例えば、ポリ(アクリル酸メチル)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸エチル)およびポリ(メタクリル酸エチル)が挙げられる。ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)がコア材料として特に好ましい。
【００７２】
微粒子の親水性シェルにおける使用に好適な親水性ポリマー形成材料としては、限定されないが、ヘミスクシナート化(hemisuccinated)ポリビニルアルコールおよびEudragit（登録商標）コポリマーが挙げられる。
【００７３】
親水性シェルに好ましい材料は、式I:
【００７４】
【化１】
2007509903.tif 000002
【００７５】
（式中、R1は水素, メチルまたはエチルである）
の繰返し単位を含有するポリマーまたはコポリマーである。
【００７６】
親水性は、このポリマーを二塩基酸、例えば、マレイン酸またはコハク酸などと反応させることによって増大され得る。特に好ましい親水性ポリマーはヘミスクシナート化ポリビニルアルコールである。
【００７７】
微粒子の親水性シェルに使用され得る別の好ましい種類の親水性ポリマーは、式(II)および(III):
【００７８】
【化２】
2007509903.tif 000003
【００７９】
（式中、R2 および R4は、各々、独立して、水素またはメチルを表し、R3は、水素、-A-NR9R10または-A-N+R9R10R11X-（式中、AはC1〜10アルキレンを表し、R9、R10およびR11は、各々、独立して、水素またはC1〜10アルキルを表し、Xは、ハロゲンを表す）を表し、R5はC1〜10アルキルを表す）
の繰返し単位を含有するコポリマーである。
【００８０】
特定の態様では、式(II)の繰返し単位におけるR2は水素またはメチルである。
【００８１】
特定の態様では、式(II)のモノマーにおけるR3は水素または-A-NR9R10を表す。
【００８２】
式(II)のモノマーにおけるAは、C1〜10アルキレンであり、好ましくはC1〜6アルキレン基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンもしくはヘキシレン基またはその異性体である。エチレンが好ましい。
【００８３】
式(II)のモノマーにおけるR9は、水素またはC1〜10アルキルであり、好ましくはC1〜10アルキル基、より好ましくはC1〜6アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、i-プロピル、i-ブチル、sec-ブチルもしくはtert-ブチル基、またはペンチルもしくはヘキシル基またはその異性体である。メチルおよびエチルが、特にメチルが好ましい。
【００８４】
式(II)のモノマーにおけるR10は、水素またはC1〜10アルキルであり、好ましくはC1〜10アルキル基、より好ましくはC1〜6アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、i-プロピル、n-ブチル、sec-ブチルもしくはtert-ブチル基、またはペンチルもしくはヘキシル基またはその異性体である。メチルおよびエチルが、特にメチルが好ましい。
【００８５】
式(III)の繰返し単位におけるR4は水素またはメチルである。
【００８６】
式(III)の繰返し単位におけるR5は、C1〜10アルキルであり、好ましくはC1〜6アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、i-プロピル、n-ブチル、sec-ブチルもしくはtert-ブチル基、またはペンチルもしくはヘキシル基またはその異性体である。メチル、エチルおよびブチルが好ましい。
【００８７】
本発明において使用され得る式(II)および(III)の繰返し単位を含有するコポリマーの一例は、メタクリル酸とアクリル酸エチルのコポリマー、例えば、遊離カルボキシル基のエステル基に対する比がおよそ1:1である統計コポリマーである。好適なコポリマーは、Roehm Pharmaから商標名Eudragit（登録商標）L 100-55で市販されている。
【００８８】
本発明において使用され得る式(II)および(III)の繰返し単位を含有するコポリマーのさらなる例は、2-(ジメチルアミノ)メタクリル酸エチルとC1〜6アルキルメタクリレートのコポリマー、例えば、2-(ジメチルアミノ)メタクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよびメタクリル酸ブチルのコポリマーである。好適なコポリマーは、Roehm Pharmaから商標名Eudragit（登録商標）E 100で市販されている。
【００８９】
親水性ポリマー形成材料は、イオン性またはイオン化性である化学基を含む。好ましくは、これらの基は、生理学的pHにおいてイオン性またはイオン化性である。用語「生理学的pH」は、個体の血中、および細胞外液中におけるpHをいう。生理学的pHは、典型的には、7.2〜7.6、好ましくは7.4である。
【００９０】
これらの水不溶性および親水性ポリマー系材料および親水性は、単独で、物理的混合物（ブレンド）として、またはコポリマー(ブロックコポリマーであり得る)として使用され得る。この場合も、これらのポリマーは、架橋されたものであってもよい。コポリマーは、ブロック、ランダムまたは規則的なコポリマーであり得る。
【００９１】
通常、満足のいく数平均分子量は、5,000〜500,000ドルトンの範囲、より好ましくは10,000〜500,000ドルトンの範囲である。前記ポリマーは、一般的に、30,000〜50,000ドルトン、約120,000ドルトンまで、例えば、80,000〜100,000ドルトンなどの数平均分子量を有する。当業者なら、特定のポリマーの適切な数平均分子量範囲が理解されよう。
【００９２】
微粒子の構築の従来法を用いて本発明の微粒子を構築してもよい。微粒子は、モノマー分散重合によって得られ得る。この方法は、Sparnacciら Macromolecular Chemistry and Physics, 2002：203(10-11)：1364-1369に記載されている。ポリマーは１種類のモノマーの重合により形成される。コポリマーは、１種類より多いモノマーの重合により形成される。したがって、１種類以上の水不溶性コアモノマーが重合反応に含まれ得る。したがって、１種類以上の親水性シェルポリマーが重合反応に含まれ得る。
【００９３】
典型的には、コアモノマー、シェルポリマーおよびラジカル開始剤を適当な溶媒に、窒素雰囲気下で溶解する。好適な溶媒としては、有機系溶媒、例えば、アセトンなど、ハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルム、塩化メチレンなど、芳香族炭化水素化合物、ハロゲン化芳香族炭化水素化合物、環状エーテル,アルコール、酢酸エチルなどが挙げられる。好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、エタノールと2-メトキシエタノールの1:1比混合物およびメタノールと水の混合物(7:3 〜9:1の比)である。材料と溶媒の混合物は、使用するポリマー系材料に応じて凍結解凍サイクルに供してもよい。分散液の形成時の温度は、特に重要でないが、微粒子の大きさおよび質に影響し得る。さらにまた、用いる溶媒に応じて、温度は低すぎるべきでなく、溶媒および加工媒体は固化するべきでなく、または特定の実用目的のために加工媒体は粘性が高くなりすぎるべきでなく、または加工媒体が蒸発するほど高くてはならず、または液体加工媒体が維持されないほど高くてはならない。したがって、分散方法は、安定な操作条件を維持する任意の温度でなされ得、その好ましい温度は、選択した材料に応じて約30℃〜80℃である。
【００９４】
分散された微粒子は溶媒から、任意の従来の分離手段によって単離し得る。したがって、例えば、反応混合物を、遠心分離と溶媒での再分散の数回のサイクル後、遠心分離と水中での再分散の数回のサイクルに供し得る。
【００９５】
分散溶媒からの微粒子の単離後、微粒子を、大気への曝露によって、または他の従来の乾燥手法、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、デシケータでの乾燥などによって乾燥し得る。吸収させる前に、微粒子を、適当な液体中に再分散させ、一次的に保存してもよい。当業者には、どのような条件下で本発明の微粒子を保存するのがよいかが認識されよう。典型的には、微粒子を、低温、例えば4℃で保存する。
【００９６】
微粒子は、通常、球形形状を有するが、不規則な形状の微粒子も可能である。したがって、顕微鏡下で見たとき、粒子は、典型的には、回転楕円面状であるが、楕円形、不規則な形状またはドーナツ型であってもよい。微粒子は、0.1μm〜10μm、典型的には、0.5μmもしくは0.75μm〜4μm、または、典型的には、1μm、1.5μmもしくは2.5μm〜6μmの範囲で大きさが異なる。最大径は、球形微粒子の直径である。
【００９７】
微粒子の大きさは、従来の手法、例えば、顕微鏡使用による手法(この場合、粒子は、統計的に集団とするのではなく、直接かつ個別に分級される)、ガスの吸収、または透過手法などを用いて測定し得る。所望により、自動粒径計測器を使用し(例えば、Coulter Counter, HIAC Counter、またはGelman Automatic Particle Counter)、平均粒径を確認することができる。
【００９８】
実際の微粒子密度は、公知の定量手法、例えば、ヘリウムピクノメトリーなどを用いて容易に確認することができる。あるいはまた、エンベロープ(「タップ」)密度測定値を用いて粒子状組成物の密度を評価することができる。エンベロープ密度情報は、不規則な大きさおよび形状の物体の密度の特性付けに特に有用である。エンベロープ密度または「嵩密度」は、物体の質量をその容積で割ったものある。この場合、容積は孔および小空隙を含む。他に、個々の粒子の密度を相関させる間接的な方法も利用可能である。エンベロープ密度を測定するいくつかの方法（ワックス浸漬、水銀移動(displacement)、吸水および見かけ比重手法など）が当該技術分野において公知である。いくつかの好適なデバイスもまたエンベロープ密度の測定に利用可能である。例えば、GeoPycTM Model 1360（Micromeritics Instrument Corp.から市販）。試料医薬組成物絶対密度とエンベロープ密度の差により、試料の全多孔度割合および比孔容積に関する情報が提供される。
【００９９】
微粒子の形態、特に粒子の形状は、標準的な光学または電子顕微鏡法を用いて、容易に評価し得る。粒子は十分に球状の、または少なくとも実質的に球の形状を有することが好ましい。粒子は2以下すなわち2:1から1:1の軸比を有し、棒または針形状の粒子が存在しないようにすることがまた好ましい。かかる同様の顕微鏡技術はまた、粒子表面の特性、例えば表面空隙の量および程度または多孔度を評価するために用いられ得る。
【０１００】
特に好ましい態様では、微粒子はポリ（スチレン）のコアおよびヘミスクシナート化（hemisuccinated）ポリ（ビニルアルコール）の親水性シェルを含み、0.9μmから4μmの平均サイズを有する。別の特に好ましい態様では、微粒子はポリ（メタクリル酸メチル）のコアおよびEudragit（登録商標）E100の親水性シェルを含み、1.5 μmから8.5 μmの平均サイズを有する。さらなる特に好ましい態様では、微粒子はポリ（メタクリル酸メチル）のコアおよびEudragit（登録商標）L100/55の親水性シェルを含み、1.5 μmから2.0 μmの平均サイズを有する。
【０１０１】
用語「吸着」または「固定」は、微生物抗原が微粒子のシェルの外表面に付着することを意味する。吸収または固定は、好ましくは静電気引力により起こる。静電気引力は、逆帯電した2つ以上のイオンまたはイオン性化学基の間に生じる引力または結合である。吸収または固定は典型的には可逆的である。
【０１０２】
抗原は、好ましくは微粒子のイオン親水性シェルにそれを引きつける実効電荷を有する。抗原は典型的には一つ以上の帯電した化学またはイオン基を有する。ペプチドである抗原の場合、抗原は典型的には一つ以上の荷電したアミノ酸残基を有する。抗原は典型的には正または負の実効電荷を有する。抗原は好ましくは微粒子の親水性シェルの電荷と反対の実効電荷を有する。結果的に、塩基性抗原は酸性微粒子に吸着され得、酸性抗原は塩基性微粒子に吸着され得る。
【０１０３】
抗原は、抗原の溶液を微粒子の液体懸濁液と混合することにより、微粒子に吸着され得る。抗原および微粒子は、典型的には適当な液体、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）などの生理的緩衝液の中で混合される。混合物は、抗原の保存、および抗原と微粒子との間の結合の形成に適した条件下で、しばらく（sometime）の間放置し得る。かかる条件は当業者に理解される。吸着は好ましくは0°〜37℃で、好ましくは4〜25℃かつ暗所で行われる。吸着は典型的には30分間から、および180分間行われる。吸着の後、本発明の微粒子は、当該分野で公知の方法、例えば遠心分離により吸着液体から分離され得る。微粒子抗原複合体は、次に個体への投与に適した液体中に再度懸濁され得る。
【０１０４】
用語「疾患関連抗原」は、最も広義には、疾患と関連する任意の抗原のことを言うのに用いられる。抗原は、宿主の免疫系を刺激して、細胞性抗原特異性免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせる一つ以上のエピトープを含有する分子である。したがって、疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激し、疾患に対する細胞性抗原特異性免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含有する分子である。そのため疾患関連抗原は、予防または治療の目的で用いられ得る。
【０１０５】
疾患関連抗原は、好ましくは、微生物、典型的には微生物抗原による感染と関連するか、または癌、典型的には腫瘍と関連する。したがって、本発明において用いられ得る抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、免疫原性タンパク質断片、オリゴ糖、多糖などが挙げられる。用語「免疫原性断片」は、それ自体が宿主の免疫系を刺激して、細胞性抗原特異性免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせ得る、本明細書中に記載される任意の抗原の断片を意味する。
【０１０６】
疾患関連抗原は、微生物感染と関連し得、したがって、微生物感染に対して、宿主の免疫系を刺激して、細胞性抗原特異性免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含有し得る。抗原は典型的には、個体が微生物感染を有している場合、個体の体内に見出される。抗原は好ましくは、微生物に由来する、すなわち微生物である。したがって、抗原は、任意の公知の微生物、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、原生動物などの原生生物、または真菌に由来し得、生物体の全体またはその免疫原性部分、例えば細胞壁成分であり得る。
【０１０７】
本発明において用いる抗原としては、限定されないが、数ある中でピコルナウイルス科（例えばポリオウイルスなど）；カリシウイルス科；トガウイルス科（例えば風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば狂犬病ウイルス、麻疹（measels）ウイルス、呼吸合胞体ウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルスA、BおよびC型など）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（Retroviradae）（例えばHTLV-I; HTLV-II; HIV-1; およびHIV-2）；サル免疫不全ウイルス（SIV）の科を構成するものを含む、またはそれに由来するものが挙げられる。さらに、ウイルス性抗原は、乳頭腫ウイルス（例えばHPV）；ヘルペスウイルス、すなわち単純ヘルペス1型および2型；肝炎ウイルス、例えばA型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、デルタ（D）型肝炎ウイルス（HDV）、E型肝炎ウイルス（HEV）およびG型肝炎ウイルス（HGV）、ならびにダニ媒介脳炎ウイルス；天然痘、パラインフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（cytomeglavirus）、エプスタイン‐バー、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、ムンプス、風疹、コクサッキーウイルス、ウマ脳脊髄炎、日本脳炎、黄熱、リフトバレー熱、リンパ球性脈絡髄膜炎などに由来し得る。これらおよび他のウイルスの記載については、例えばVirology, 第3版(W.K. Joklik編 1988); Fundamental Virology, 第2版(B.N. FieldsおよびD.M. Knipe, 編 1991)を参照。
【０１０８】
細菌性抗原としては、限定されないが、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎、ならびに髄膜炎菌A、B、およびC、ヘモフィルスインフルエンザ（Hemophilus influenza）菌B型（HIB）、およびヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）、ジフテリア菌、リステリア菌、炭疽菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、髄膜炎菌、淋菌、ミュータンス菌、緑膿菌、チフス菌、パラインフルエンザ菌、百日咳菌、野兎病菌、ペスト菌、コレラ菌、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）菌、ヒト型結核菌、らい菌、梅毒トレポネーマ、レプトスピラ・インテロガンス（Leptspirosis interrogans）、ライム病菌、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）などを含む他の病態を引き起こす生物を含む、またはそれに由来するものが挙げられる。
【０１０９】
抗寄生虫性抗原の例としては、限定されないが、マラリアおよびライム病を引き起こす生物に由来するものが挙げられる。クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）、カンジダトロピカリス（Candida tropicalis）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、リケッチア・リケッチ（Rickettsia ricketsii）、発疹熱リケッチア（Rickettsia typhi）、肺炎マイコプラスマ（Mycoplasma pneumoniae）、オウム病クラミジア（Chlamydial psittaci）、トラコーマクラミジア（Chlamydial trachomatis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）などの、かかる真菌、原生動物、および寄生生物体の抗原がある。
【０１１０】
特に好ましい態様では、微粒子に吸着された抗原は、HIV Tatタンパク質（配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、もしくは32）、またはその免疫原性断片である。
【０１１１】
疾患関連抗原は、癌に関連するものであり得る。癌関連抗原は、宿主の免疫系を刺激し、癌に対する細胞性抗原特異性免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含有する分子である。癌関連抗原は、個体が癌を有するとき、典型的には個体の体内に見出される。癌関連抗原は、好ましくは腫瘍に由来する。癌関連抗原としては、限定されないが、癌関連抗原（CAA）、例えば乳CAA、卵巣CAAおよび膵臓CAA；メラノサイト分化抗原、例えばMelan A/MART-1、チロシナーゼおよびgp100；癌生殖細胞（CG）抗原、例えばMAGEおよびNY-ESO-1；変異抗原、例えばMUM-1、p53およびCDK-4；過剰発現自己抗原、例えばp53およびHER2/NEU、ならびに非一次オープンリーディングフレームmRNA配列に由来する腫瘍タンパク質、例えばLAGE1が挙げられる。
【０１１２】
合成抗原、例えば、ハプテン、ポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換え体もしくは組換え体、または合成由来の抗原もまた、抗原の定義に含まれる(Bergmannら (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmannら (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. およびCell Biol. 75:402-408; Gardnerら (1998) 第12回世界AIDS会議, Geneva, Switzerland (1998年6月28日〜7月3日)。合成疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激し、疾患に対する細胞性抗原特異性免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含有する合成分子である。
【０１１３】
本明細書中で言及される抗原または抗原の免疫原性断片は、典型的には一以上のT細胞エピトープを含有する。「T細胞エピトープ」は、一般にT細胞応答を誘導し得るペプチド構造を特徴とするものである。この点については、T細胞エピトープがMHC分子のペプチド結合間隙内で拡張立体配座をとる線状ペプチド決定基を含有することが当該分野において認められている(Unanueら (1987) Science 236: 551-557)。本明細書中で用いられる場合、T細胞エピトープは一般に約8〜15、好ましくは5〜10以上のアミノ酸残基を有するペプチドである。
【０１１４】
本発明の微粒子は、「ワクチン組成物」とみなされ得、したがって、抗原を含有し、被験体における疾患または状態を予防または処置するために用いられ得る任意の医薬組成物を含む。該用語は、サブユニットワクチン、すなわち抗原が自然において係わっている生体全体から分離され、ばらばらになった抗原を含有するワクチン組成物、ならびに完全に死なせた、弱毒化した、または不活性化した細菌、ウイルス、寄生体または他の微生物を含む組成物の双方を包含する。ワクチンはまた、ワクチンの効果をさらに向上させ得るサイトカインを含有し得る。
【０１１５】
本発明の微粒子は、約1〜約99重量%の抗原から、例えば約0.01〜約10重量%の抗原からなり得る。そのため微粒子は、2〜8重量%の抗原、または5〜6重量%の抗原などの0.05〜10重量%の抗原からなり得る。実際の量は、抗原の性質、所望の用量、および当業者に容易に理解される他の変動する要因を含むいくつかの要因による。
【０１１６】
発明者は本発明の微粒子の投与が個体において免疫応答を生じることを示した。したがって発明者は、微粒子の外表面への抗原の吸着は、抗原の生物学的活性を維持することを示した。したがって発明者はまた、抗原の微粒子への吸着は、抗原の免疫原性に影響を及ぼさないことを示した。発明者はまた、微粒子への抗原の吸着は、免疫応答を生じるのに要する抗原の量を減少させ、必要とされる追加抗原注射の数をなくすか、または減少させ、抗原の取り扱いまたは貯蔵期間を向上させることを示した。
【０１１７】
したがって本発明はまた、本発明の微粒子を利用した予防または治療の方法に関する。かかる予防または治療の方法は、本発明の微粒子を用いて、個体において免疫応答を生じさせることを含む。したがって、本発明の微粒子は、個体に投与され、その個体において免疫応答を生じさせ得る。あるいは、微粒子は個体において免疫応答を生じさせる医薬の製造に用いられ得る。
【０１１８】
用語「投与する」または「送達する」は、微粒子と標的細胞または組織とを接触させる任意の送達方法をいうものとする。用語「組織」は、本明細書中に定義されるような動物、患者、被験体などの軟組織のことをいい、この用語は、限定されないが、皮膚、粘膜組織（例えば口腔の、結膜の、歯肉）、膣のものなどを含む。しかし、骨、例えば骨折も本発明の粒子によって処置され得る。
【０１１９】
投与が処置のためである場合、投与は予防または治療目的のいずれかであり得る。予防的に与えられる場合、抗原は任意の症状に先立って与えられる。抗原の予防的投与は、任意の後に起こる症状を防ぐかまたは弱めるのに役立つ。治療的に与えられる場合、抗原は症状の開始時に（またはすぐ後に）与えられる。抗原の治療のための投与は任意の実際の症状を弱めるのに役立つ。投与、およびしたがって本発明の方法はインビボまたはインビトロで行われ得る。
【０１２０】
用語「動物」、「個体」、「患者」、および「被験体」は、限定されないが、チンパンジーならびに他の類人猿およびサルの種などの非ヒト霊長類動物を含むヒトおよび他の霊長類の動物；ウシ科の動物、例えばウシなどの家畜；ヒツジ科の動物、例えばヒツジ；ブタ科の、例えばブタ；ウサギ、ヤギおよびウマ；イヌおよびネコなどの飼いならされた哺乳動物；野生動物；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなどの飼い慣らされた鳥、野生の鳥、および猟鳥を含む鳥などを含む、脊索動物（cordata）亜門を構成する任意のものを含む生物体のサブセットをいうのに、本明細書中で同義に用いられる。該用語は、特定の年齢を示さない。したがって成熟したおよび新生の個体の双方を包含するものとする。一つの態様では、個体は典型的にはHIVに感染していることがあり得る。
【０１２１】
本発明は、本明細書中に記載された微粒子を、かかる処置が必要な被験体に投与することにより、動物における疾患状態を処置することを含む。本明細書中に用いられる場合、用語「処置」または「処置すること」は、次の任意のもの：感染または再感染の予防；症状を軽減することまたはなくすこと；および病原体を減少させることまたは完全に除去することを含む。処置は、予防的に（感染の前に）、または治療的に（感染の後に）もたらされ得る。本発明の方法はまた、微粒子の投与により、生体において変化をもたらすことを含む。
【０１２２】
本発明の方法は、抗原に関連する疾患の危険にさらされた個体において行われ得る。典型的には、本発明の方法は、微生物感染、または抗原と関連する、もしくは抗原に引き起こされた癌の危険にさらされた個体において行われる。好ましい態様では、本発明の方法は、HIVの感染または発症したAIDSの危険にさらされた個体において行われる。
【０１２３】
本明細書中に記載される方法は、疾患によって生じた、または悪化した、疾患および／または任意の状態の処置および／または予防のための特定の抗原に対する免疫応答を誘発する。本明細書中に記載される方法は、典型的には、微生物感染もしくは癌により生じた、または悪化した、微生物感染もしくは癌および／または任意の状態の処置および／または予防のための特定の抗原に対する免疫応答を誘発する。特定の態様では、本明細書中に記載される方法は、AIDSなどのHIV感染により生じた、または悪化した、HIV感染および／または任意の状態の処置および／または予防のための特定の抗原に対する免疫応答を誘発する。
【０１２４】
本発明の方法は、適切な免疫応答を促すために行われる。適切な免疫応答によって、該方法が、増大した抗体の産生および／または抗原に対して特異的なBおよび／またはTリンパ球の産生を特徴とする免疫応答を、免疫した被験体にもたらし得ることが意味され、ここで免疫応答は被験体を続いて起こる感染から保護し得る。好ましい態様では、該方法は増大した抗体の産生および／またはHIV-1 Tatに対して特異的なBおよび／またはTリンパ球の産生を特徴とする免疫応答を免疫した被験体にもたらし得、ここで免疫応答は被験体を続いて起こるHIVの同種または異種の株の感染から保護し、ウイルス負荷を減少させ、非免疫被験体に比してより短い時間で感染の消散をもたらすか、AIDSの症状などの病徴の臨床的発現を妨げるか、または減少させ得る。
【０１２５】
本発明の方法の目的は、個体において免疫応答を生じさせることである。好ましくは、抗原に対する抗体は個体において産生される。好ましくは、抗原に対するIgG抗体が産生される。抗体応答は，ラジオイムノアッセイ、ELISAなどの当該分野で周知の標準的なアッセイを用いて測定され得る。
【０１２６】
好ましくは、細胞性免疫が生じ、特にCD8 T細胞応答が生じる。この場合、微粒子の投与は、例えば抗原経験CD8 T細胞のレベルを増大させ得る。CD8 T細胞の応答は、ELISPOTアッセイ、好ましくはγIFN-ELISPOTアッセイ、CD8のペプチドへの増殖、およびCTLアッセイなどの任意の適切なアッセイを用いて測定され得る（そのためかかるアッセイにおいて検出され得る）。好ましくは、CD4 Th1の応答などのCD4 T細胞の応答もまた生じる。したがって抗原経験CD4 T細胞のレベルもまた増大し得る。かかる増大したCD4 T細胞のレベルは、増殖分析などの適切なアッセイを用いて検出され得る。
【０１２７】
本発明はさらに、本発明の微粒子、すなわち薬学的に許容され得る賦形剤をまた含有する医薬組成物に吸着された抗原を有する微粒子を提供する。かかる「賦形剤」は一般に、非毒性であり、組成物の他の成分と有害に相互作用しない、実質的に不活性な物質のことをいう。
【０１２８】
かかる賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般に組成物を受ける個体において、それ自体は免疫応答を誘導せず、かつ過度な毒性なしで投与され得る製薬剤である。
【０１２９】
薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられる。ここに薬学的に許容され得る塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が挙げられ得る。
【０１３０】
必要とはしないが、抗原組成物は、特にペプチド、タンパク質、または他の類似の抗原に対して安定剤としてはたらく薬学的に許容され得る担体を含むことがまた好ましい。ペプチドに対して安定剤としてもまた作用する適切な担体の例としては、限定されないが、医薬品グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが挙げられる。他の適切な担体としては、また限定されないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）、およびその組み合わせが挙げられる。帯電した脂質および／またはデタージェントを用いることもまた有用であり得る。適切な帯電した脂質としては、限定されないが、ホスファチジルコリン（レシチン）などが挙げられる。デタージェントは、典型的には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性の界面活性剤である。適切な界面活性剤の例としては、例えばTergitol（登録商標）およびTriton（登録商標）界面活性剤(Union Carbide Chemicals and Plastics, Danbury, CT)、ポリオキシエチレンソルビタン、例えばTWEEN（登録商標）界面活性剤(Atlas Chemical Industries, Wilmington, DE)、ポリオキシエチレンエーテル、例えばBrij、薬学的に許容され得る脂肪酸エステル、例えばラウリル硫酸およびその塩（SDS)、ならびに類似の物質が挙げられる。
【０１３１】
薬学的に許容され得る賦形剤、担体、安定剤、および他の補助物質の詳細な論述は、本明細書中に参照によって援用されるREMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991)において入手できる。
【０１３２】
被験体における免疫応答を増大させるために、本明細書中に記載される組成物および方法は、本発明の化合物に加えて、さらに薬理学的薬剤、サイトカインなどの補助的物質/アジュバントを含み得る。適切なアジュバントは、本発明の微粒子に付着した抗原に対する被験体の免疫応答を高める任意の物質を含む。これらは任意の数の経路に影響を及ぼすことにより、例えば抗原/MHC複合体を安定させることにより、より多くの抗原/MHC複合体を細胞表面に存在させることにより、APCの成熟を高めることにより、またはAPCの寿命を長期化させること（例えばアポトーシスを阻害すること）により、免疫応答を高め得る。
【０１３３】
典型的にはアジュバントはワクチンまたは微粒子と同時投与される。本明細書中に用いられる場合、用語「アジュバント」は、抗原の作用などを高める任意の物質のことをいう。
【０１３４】
したがって、アジュバントの一例は「サイトカイン」である。本明細書中に用いられる場合、用語「サイトカイン」は、例えば成長、増殖、または成熟を含む、細胞に種々の効果を及ぼす多数の要因のいずれかをいう。あるサイトカイン、例えばTRANCE、flt-3L、およびCD40Lは、APCの免疫促進能を高める。単独で、または組み合わせて用いられ得るサイトカインの制限のない例としては、インターロイキン-2 (IL-2)、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3 (IL-3)、インターロイキン6 (IL-6)、インターロイキン12 (IL-12)、G-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-1α (IL-1a)、インターロイキン-11 (IL-11)、MIP-la、白血病抑制因子(LIF)、c-kitリガンド、トロンボポエチン(TPO)、CD40リガンド(CD40L)、腫瘍壊死因子関連活性化誘導性サイトカイン(TRANCE)、およびflt3リガンド(flt-3L)が挙げられる。サイトカインは、例えばGenzyme (Framingham, MA), Genentech (South San Francisco, CA), Amgen (Thousand Oaks, CA), R & D Systems and Immunex (Seattle, WA)などのいくつかの業者から市販されている。
【０１３５】
多数のかかる分子の配列はまた、例えばGenBankデータベースから入手することができる。必ずしも明白には述べないが、野生型または精製されたサイトカイン（例えば組換えにより産生された、またはその変異体の）のような類似の生物学的活性を有する分子およびかかる分子をコードする核酸は、本発明の趣旨および範囲内で用いられるものとする。
【０１３６】
本発明の微粒子およびアジュバントを含有する組成物、またはアジュバントと同時投与される本発明のワクチンもしくは微粒子は、それが、アジュバントなしで投与される同等の量のワクチンにより誘発される免疫応答よりも、より高い免疫応答の誘発能を有する場合、「増大した免疫原性」を示す。かかる増大した免疫原性は、アジュバント組成物および微粒子の対照を動物に投与し、ラジオイムノアッセイ、ELISA、CTLアッセイなどの当該分野で周知の標準的アッセイを用いて、該二つの抗体価および／または細胞媒介免疫性を比較することにより測定され得る。
【０１３７】
本発明の方法において、本発明の微粒子は、典型的には、液体形態で送達されるか、または粉末形態で送達される。本発明の微粒子を含有する液体は、典型的には懸濁液である。本発明の微粒子は、個体内への送達に許容され得る液体で投与され得る。典型的には、液体は滅菌緩衝液、例えば滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。
【０１３８】
本発明の微粒子は、典型的には、非経口的に、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、または点滴法のいずれかで送達される。医師は、各特定の患者に対して必要な投与経路を決定し得る。
【０１３９】
ワクチンまたは微粒子は典型的には、経皮的に送達される。用語「経皮」送達は、皮内（例えば真皮または表皮への）、経皮（例えば「経皮的」）および経粘膜投与、例えば薬剤の皮膚または粘膜（例えば口腔内、結膜、または歯肉）組織への、またはこれらを経る通過による送達を意図する。例えば、Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft および Guy (編), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery : Fundamentals and Applications, Robinson および Lee (編), Marcel Dekker Inc., (1987); ならびに Transdermal Delivery of Drugs, 1〜3巻, Kydonieus および Berner (編), CRC Press, (1987)参照。
【０１４０】
送達は、微粒状微粒子を含有する液状懸濁物用の従来の針およびシリンジによるものであり得る。また、種々の液体ジェット式注射器は当該技術分野で公知であり、微粒子を投与するために使用され得る。最も有効な手段および投薬の決定方法は当業者に周知であり、送達用ビヒクル、治療の構成、標的細胞および処置対象の被験体により異なる。単回投与および反復投与が行なわれ得、投薬量のレベルおよびパターンは、主治医によって選択される。液状組成物は、処置対象の被験体に、投薬配合物に適合した様式で、予防有効量および／または治療有効量で投与される。
【０１４１】
また、それ自体が微粒状組成物である微粒子(例えば、粉末)を、適当な経皮粒子送達技術を用いて脊椎動物組織に経皮的に送達することもできる。目的の物質を投与するのに適した種々の粒子送達デバイスが当該技術分野で公知であり、本発明の粒子における使用法が見出されよう。経皮粒子送達系では、典型的には、無針シリンジを用い、固体粒子を制御された投薬量で無傷の(ntact)皮膚および組織内に、または無傷の由で焼き入れる(fire)。粒子媒介型送達技術に適した種々の粒子送達デバイスは、当該技術分野で公知であり、すべて、本発明の粒子における使用に適する。現在使用されているデバイスの設計では、爆発的、電気的またはガス状での放出を用い、コートされたコア担体粒子を標的細胞に推進させる。コートされた粒子はそれ自体を、可動性担体シートに放出可能に結合させ得るか、または表面に剥離可能に結合させ得、この表面に沿ってガス流を通過させ、粒子を該表面から浮上させ、これらを標的へと加速させる。例えば、無針シリンジについて記載した米国特許第5,630,796号を参照のこと。他の無針シリンジ構成は、当該技術分野で公知である。
【０１４２】
かかる粒子送達デバイスからの粒子の送達は、一般的に0.1〜250μmの範囲に近似する大きさを有する粒子を用いて行なわれる。送達される粒子が標的表面を貫通する実際の距離は、粒径(例えば、ほぼ球状粒子幾何構造と仮定した名目上の粒子直径)、粒子密度、粒子が該表面に衝突する期速度、および標的化される皮膚組織の密度および運動学的速度に依存する。これに関し、無針注射における使用のための至適粒子密度は、一般的に約0.1〜25 g/cm3、好ましくは約0.9〜1.5 g/cm3の範囲であり、注射速度は、一般的に、約100〜3,000 m/秒の範囲であるか、またはそれより大きい。適切なガス圧により、10〜70 umの平均直径を有する粒子を、ノズルを介し、超音速の駆動ガス流に近い速度に加速することができる。
【０１４３】
粉末化された組成物は、処置対象の被験体に、投薬配合物に適合した様式で、予防有効量および／または治療有効量で投与される。
【０１４４】
予防上または治療上有効な量の本明細書に記載の抗原を含有する微粒子は、任意の適当な標的組織に、前記粒子送達デバイスにより送達され得る。例えば、粗生物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、、リンパ、血液、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼球、腺および結合組織に到達され得る。
【０１４５】
「治療有効量」は、所望の生物学的または薬理学的効果を与えるのに必要な量であると非常に広義に定義する。この量は、送達される抗原の相対的活性により異なり、送達される抗原の既知の活性に基づく臨床試験により容易に決定され得る。「Physicians Desk Reference」および「Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics」は、既知の医薬用薬剤の場合に必要とされる量を決定する(determined the amount)目的に有用である。投与される粒子の量は、生物体(例えば、動物種)、抗原、投与経路、処置期間の長さおよび、動物の場合は、その動物の体重、年齢および健康に依存する。当業者は、特定の動物を抗原で処置するために必要とされる投薬について充分承知している。
【０１４６】
一般に、微粒子は、マイクログラム単位の量で投与される。コートされた微粒子は、処置対象の被験体に、投薬配合物に適合した様式で、所望の免疫応答をもたらすのに有効な量で投与される。送達される微粒子の量（これは、1μg〜5 mg、より典型的には1〜50μgのペプチドである）は、処置対象の被験体に依存する。正確な必要量は、免疫処置対象の個体の年齢と一般健康状態および選択した具体的なヌクレオチド配列またはペプチドならびに他の因子に応じて異なる。適切な有効量は、本明細書を読めば、当業者により容易に決定され得る。
【０１４７】
異なる型の微粒子混合集団を、単回投薬形態と組み合わせることができ、同時投与することができる。同じ抗原を、異なる微粒子型に組み込んでもよく、これらは、最終配合物中で合わせ、同時投与される。したがって、同じ抗原の多重(multiphasic)送達がなされ得る。あるいはまた、異なる抗原を、異なる微粒子型上に吸着させ、配合物中で合わせてもよい。例えば、配合物は、正荷電微粒子に吸着させた負荷電抗原および負荷電微粒子に吸着させた正荷電抗原を含有し得る。したがって、異なる抗原が単回投薬形態で同時投与され得る。
【０１４８】
以下は、本発明を実施するための特定の態様の実施例である。実施例は、例示の目的のためだけに提供し、本発明の範囲をなんら限定することを意図しない。
【実施例】
【０１４９】
1.  微粒子
試薬
ベンゾイルペルオキシド（BPO）、ポリビニルアルコール（モル質量49000）、スチレン、無水コハク酸（succinic anydride）、メタクリル酸メチルをAldrichから購入した。メタクリル酸／アクリル酸エチル1/1 (モル/モル)統計共重合体（商品名Eudragit（登録商標） L100-55）はRoehm Pharmaにより粉末試料として供給され、250000 g/molの数平均モル質量を特徴とする。ブチルメタクリラート/2-ジメチルアミノエチルメタクリレート/メタクリル酸メチル1/2/1(モル/モル)共重合体（商品名Eudragit（登録商標） E100）はRoehm Pharmaにより粉末試料として供給され、150000 g/molの数平均モル質量を特徴とする。BSAおよびブラッドフォード試薬をSigmaから購入した。メタノール(99,9%, Carlo Erba)および2,2’-アゾビス（イソブチロニトリル）(AIBN) (98.0%, Fluka)は、さらなる精製なしで使用した。メタクリル酸メチル(MMA) (99%, Aldrich)は使用の直前に真空状態で蒸留した。
【０１５０】
蛍光モノマーの合成
2.0 gのフルオレセイン(6.0 mmol)、2.0 gの炭酸カルシウムおよびヒドロキノン(微量)を100 mlのDMFに溶解し、溶液を60°Cで加熱した。塩化アリルをゆっくりと滴下して加え、反応を暗所で30時間進行させた。溶媒を真空蒸発させた後、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離液として80:20のジエチルエーテル−酢酸エチル）により精製した。収率53%, (融点=123〜125°C); 質量分析, m/z (%): 412 (M+, 100), 371 (10), 287 (20), 259 (15), 202 (7); 1H-NMR (CD3OD): δ4.44 (dd, J=5.9および1 Hz, 2 H, O-CH2-CH=), 4.75 (dd, J=5.9および1 Hz, 2 H, O-CH2-CH=), 5.08 (m, 2H, CH2=CH), 5.40 (m, 2H, CH2=CH), 5.58 (m, 1H, CH2=CH), 6.10 (m, 1H, CH2=CH), 6.60 (m, 2H, Ar), 6.98 (m, 3H, Ar), 7.25 (d, J=1 Hz, 1H, Ar), 7.45 (dd, J=7.5および1 Hz, 1H, Ar), 7.85 (m, 2H, Ar), 8.30 (dd, J=7.5 および1 Hz, 1H, Ar)。
【０１５１】
酸微粒子
微粒子A4およびA7を立体構造安定剤としてのヘミスクシナート化ポリ（ビニルアルコール）の存在下でスチレン（モノマー）の分散重合により調製した。微粒子1D、1E、H1Dおよび蛍光H1Dを立体構造安定剤としてのEudragit（登録商標） L100-55の存在下で、メタクリル酸メチル（モノマー）の分散重合により得た。微粒子を分散重合により製造した。かかる微粒子の物理化学的性質は、以下の表1に記載されている。
【０１５２】
典型的な実施例として、微粒子試料A7（ポリスチレンおよびヘミスクシナート化ポリビニルアルコール）の調製法は、次の通りである：1.86 gのヘミスクシナート化ポリビニルアルコール、15.5 mlのスチレン、1.95 gのBPOを窒素雰囲気下で162 mlのエタノール/2-メトキシエタノール 1/1に溶解した；3凍結融解サイクルを行った。162 mlのエタノール/2-メトキシエタノール 9/1に溶解した1.34 gのヘミスクシナート化ポリビニルアルコールから始めて、A4微粒子を同様の手順で調製した。溶液を機械的攪拌(60 rpm)のもとに78℃で48時間加熱した。次いで反応混合物を冷却し、有機溶媒を用いた3サイクルの遠心分離および再分散、それからHPLCグレードの水での2サイクルの後、得られた粒子を凍結乾燥した。その結果もたらされた収率は、それぞれ76%および82%であった。
【０１５３】
Eudragit安定化ポリメチルメタクリレート微粒子の典型的な例として、試料1Dの調製法を記載する：14.73 gのEudragit（登録商標）L100-55を窒素雰囲気下で、200 mlのメタノールに溶解し30分間60℃で加熱した。0.37 g 分の2,2’-アゾビス（イソブチロニトリル）(AIBN)を18.4 gのメタクリル酸メチルモノマーに溶解し、溶液に加えた。1E微粒子を同様の方法にて18.10 gのEudragitから始めて調製した。反応は24時間、継続的攪拌のもとに進行させた。次いで反応混合物を冷却し、メタノールを用いた3サイクルの遠心分離および再分散、それからHPLCグレードの水での2サイクルの後、得られた粒子を凍結乾燥した。その結果もたらされた収率は、それぞれ78%および65%であった。
【０１５４】
Eudragit安定化ポリメチルメタクリレート微粒子のさらなる典型的な例として、試料H1Dの調製法を記載する：7.36 gのEudragit（登録商標）L 100-55を200 mlのメタノール/水 76/24重量%の溶液に溶解し、機械的攪拌（攪拌速度300 g/min）をしながら窒素雰囲気下および還流冷却器下で60℃で加熱した。30分後、18.3 g (183 mmol)のメタクリル酸メチルに溶解した370 mg (2.25 mmol)のAIBNを溶液に加え、反応を24時間進行させた。反応終了時に、ラテックスを冷却し、次いでメタノールおよびHPLCグレードの水を用いた4サイクルの遠心分離 (2000 g/min で10分間)および再分散により精製した。反応の収率は重量分析法で測定したとき、76.2%であった。蛍光H1Dは、蛍光モノマー（上記参照）をメタクリル酸メチルとともに分散反応において反応させることにより得られた。11.0 gのEudragit（登録商標）L 100-55を200 mlのメタノール  水 76/24重量%の溶液に溶解し、機械的攪拌（攪拌速度300 g/min）をしながら窒素雰囲気下および還流冷却器下で60℃で加熱した。30分後、18.3 g (183 mmol)のメタクリル酸メチルに溶解した、370 mg (2.25 mmol)のAIBNおよび5.0 mg (12.1 μmol)の蛍光モノマーを溶液に加え、反応を24時間進行させた。反応終了時に、微粒子を先に記載のように精製した。酸性微粒子調製の実験条件を表1に示す。
【０１５５】
【表１】
2007509903.tif 000004
【０１５６】
塩基性微粒子
微粒子HE1D（直径0.48 μm±0.03）を立体構造安定剤としてのEudragit（登録商標）E100の存在下で、メタクリル酸メチル（モノマー）の分散重合により調製した。14.73 gのEudragitを200mlのメタノール/水 76/24重量%の溶液に溶解し、機械的攪拌（攪拌速度(speed stirring)300 g/min）をしながら窒素雰囲気下および還流冷却器下で60℃で加熱した。30分後、18.3 g (183 mmol)のMMAに溶解した、370 mg (2.25 mmol)のAIBNを溶液に加え、反応を24時間進行させた。反応終了時に、微粒子を先に記載のように精製した。
【０１５７】
【表２】
2007509903.tif 000005
【０１５８】
物理化学的特徴付け
ｉ）形態学的特徴付け：粒子の大きさおよび大きさの分布を、20kVの電圧を増加させながら操作するJEOL JSM-35CF走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して測定した。試料を薄い層(10-30Å)の金により真空下でスパッターしてコーティングした。SEM写真をデジタル化し、Scionイメージプロセシングプログラムによって念入りに作成した。200〜250個体の微粒子の直径をそれぞれの試料に対し測定した。
【０１５９】
ｉｉ）微粒子の外表面上での立体安定剤量の決定：酸性微粒子に対して、微粒子の表面と連結した立体安定剤の量は、酸性基の完全な塩化および遠心分離による微粒子の除去の後、過剰なNaOHの逆滴定によって決定された。塩化は室温にて24時間、ビーカー中0.6gの微粒子試料を10mlの20mM NaOHに分散させることで達成された。次いで、微粒子試料を遠心分離で取り除き、25mlの蒸留水で2回洗浄した。上澄み液を併用し、過剰なNaOHを20mM HClで滴定した。
【０１６０】
塩基性微粒子に対して、立体安定剤の量は、アミン基の完全な塩化および微粒子の除去の後、過剰なHClの逆滴定によって決定された。塩化は室温にて、ビーカー中0.6gの微粒子試料を10mlの20mM HClに分散させることで達成された。微粒子を遠心分離で取り除き、水で2回洗浄した。上澄み液を併用し、過剰なHClを20mM NaOHで滴定した。
【０１６１】
酸性微粒子の物理化学的特性を以下の表3および表4に示す。塩基性微粒子の物理化学的特性を以下の表5に示す。
【０１６２】
【表３】
2007509903.tif 000006
【０１６３】
【表４】
2007509903.tif 000007
【０１６４】
【表５】
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【０１６５】
２．  細胞遊離系におけるタンパク質の吸着および放出実験
表6および7は、酸性および塩基性微粒子の調査結果を示す。
【０１６６】
【表６】
2007509903.tif 000009
【０１６７】
【表７】
2007509903.tif 000010
【０１６８】
典型的な実施例として、BSA(66.432Kda, pI=5.46)およびモデルタンパク質としてのトリプシン(23.783Kda, pI=9.64)の吸着反応が、H1DおよびHE1D試料上で調査された。異なる濃度のタンパク質(10〜250μg/ml)の存在下、pH7.4にて2時間、5.0mgのH1DまたはHE1Dを1.0mlの20mMリン酸ナトリウムバッファ溶液でインキュベートした。次いで微粒子試料を15000g/分で10分間、遠心分離によって除去し、上澄み液上の残留タンパク質の量を、Bradford比色定量法(Bradford, M.M. Anal. Biochem. 1976, 72, 248)またはビシンコニンアッセイ(BCA)を使用して評価した。吸着されたBSAまたはトリプシンの量は、供給量と残留BSAまたはトリプシンとの間の差として計算された。実験は三部構成で行われた(run)(SD＜10%)。放出実験に対して、ペレットを水で2回洗浄し、1M NaClリン酸バッファ(pH7.4)の存在下、室温にて攪拌する条件で2時間放置した。放出されたタンパク質の量はUV/VIS吸収度により決定された。BSAおよびトリプシンによる細胞遊離結合実験は、タンパク質濃度の増加に対して吸着したタンパク質の量が増加したことを示し、微粒子表面に対するタンパク質の高度な適合性を示唆した（図1参照）。
【０１６９】
酸性H1D微粒子が酸性タンパク質に吸着するかどうかを決定するために、β−ガラクトシダーゼ(β-gal)をモデルタンパク質として選択した。β−ガラクトシダーゼをRoche(cat. 567779; Penzberg, Germany)から購入した。その分子量および等電点(isolectric point)は、それぞれ116,000ダルトンおよび5.28である。タンパク質を水中で再懸濁(2mg/ml)し、4℃で保管した。
【０１７０】
H1D/β-gal複合体は、0.5、1、2、5および10μgのβ-galタンパク質および30μgのH1D微粒子(70μl最終用量)によるPBSによって調製された。1時間のインキュベーション後、複合体を13,000rpmで10分間の遠心分離により収集した。上澄み液（非結合タンパク質）をSDS-ポリアクリルアミドのゲル電気泳動(PAGE)で収集し分析した。ペレット(H1D/β-gal複合体)をPBSで2回洗浄し、30μlの0.9% NaCl、5mMリン酸バッファで再懸濁した。試料を5分間沸騰させ、13,000にて15分間回転させた。上澄み液（結合タンパク質）を14% SDS-PAGEで収集(run)し、銀染色法(Davis LG, Dibner MD, Battey JF. In: Davis LG, Dibner MD, Battey JF,編. Basic Methods in Molecular Biology. New York: Elsevier, 1986)により分析した。各々のゲル中に拡散した公知量のβ-gal(0.5、1、2および5μg)と比較して、定量化を密度計ゲル分析器(Quantity-One, BioRad Laboratories, Milan, Italy)を使用して実行した。粒子表面に結合したタンパク質の割合は、次のように決定された：100Ｘ吸着したタンパク質(μg)/投与したタンパク質(μg)
【０１７１】
かくして、β-galの増加用量をH1Dによってインキュベートして吸着させ、微粒子表面上で吸着するタンパク質の量をSDS-PAGE（上部でより詳しく記載されたように）で分析した。結果は、β-galがこれらの酸性微粒子の表面で吸着されることを示した(図2A)。吸着効率は、投与されたタンパク質の用量に対して逆の相互関係を生じ、β-galの低用量(0.5μg)に対しては高かった(40%)(図2B)。
【０１７２】
これらの結果は、たとえ塩基性タンパク質（すなわちHIV-Tat、トリプシン）の結合性効率と比較して低い効率であるといえども、H1D酸性微粒子がまた酸性タンパク質と結合し得ることを示す。これらの結果は、H1Dおよび上記の別の酸性タンパク質、BSAによる異なる結合性細胞遊離実験の結果を確認する。
【０１７３】
酸性微粒子が塩基性タンパク質と強度なイオン相互作用を確立し得る場合、それを確立するために、トリプシン(pI=9.64)による吸着実験がしかも生理的pHにおいて行われた。大きさおよび表面電荷密度におけるそれらの差にもかかわらず、すべての微粒子試料は、幅広い濃度範囲(0-300μg/ml)において、表面上にて高い効率(54-81%)でトリプシンを吸着し得、3% w/wまでの高い負荷値に達した(図3)。平行実験において、モデル酸性タンパク質(BSA)は低い効率(13-48%)で吸着され、かくして低い負荷値に達した(図4)。
【０１７４】
酸性微粒子上でのトリプシン吸着は、主として、粒子表面に共有結合したEudragit L100-55鎖由来のカルボキシル基によるイオン相互作用によって行われる(drive)(図5)。これに反して、BSA吸着は粒子の表面電荷密度と相互関係をもたない。吸着したトリプシンの機能としての微粒子試料H1Dの電気泳動可動性変化を、動的光散乱技術によって測定し、表面適用範囲の程度が増加する一方、ゼータポテンシャル値(ZP)の減少が示された(図6)。結合／放出実験は、タンパク質濃度ならびにバッファpHおよびイオン強度の機能として行われた。新しい比色定量法を、その高度な再生能力および感受性のために使用した(Bradfordの代わりにBCA)。酸性微粒子H1Dは、酸性タンパク質(すなわちBSA)に関して、塩基性タンパク質（すなわちトリプシン）に対し高い吸着率を示す(図7)。
【０１７５】
酸性微粒子H1D上でのトリプシン吸着は、酸性および塩基性バッファ(図8)ならびに高い塩濃度(図9)の存在下で大きく減少し、かくして粒子表面に対するトリプシン相互作用の主要なイオン性質が確認される。
【０１７６】
酸性微粒子表面上でのトリプシン吸着は、可逆的相互作用である：塩および／または洗剤の存在下での複雑なインキュベーションの後、タンパク質は容易に多くの量で取り戻され得る(図10)。
【０１７７】
３．  インビトロ実験
Tatポリペプチド
生物学的に活性なHIV-1(HTLVIII-BH10)のTatタンパク質は、大腸菌の中で産生され、医薬品安全性試験実施基準(GLP)で製造された生成物として精製され、先に記載したような活性に対して試験を行った(Ensoli B, Buonaguro L, Barillari G,ら, Release, uptake, and effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on cell growth and viral transactivation, J. Virol., 1993;67:277-87; Ensoli B, Gendelman R, Markham P,ら, Synergy between basic fibroblast growth factor and HIV-1 Tat protein in induction of Kaposi’s sarcoma, Nature, 1994;371:674-80; Fanales-Belasio E, Moretti S, Nappi F,ら., Native HIV-1 Tat protein targets monocyte-derived dendritic cells and enhances their maturation, function, and antigen-specific T cell responses, J. Immunol., 2002;168: 197-206; およびChang HC, Samaniego F, Nair BC, Buonaguro L, Ensoli B., HIV-1 Tat protein exits from cells via a leaderless secretory pathway and binds to extracellular matrix-associated heparan sulfate proteoglycans through its basic region, AIDS, 1997;11:1421-31)。Tatが７つのシステインを含有するために容易に起こる酸化を防ぐため、Tatタンパク質を−80℃で凍結乾燥させて保管し、微粒子への吸着に対する脱気滅菌PBS(2mg/ml)の使用前、または記載したように(Fanales-Belasioら前出)血清学アッセイに対する0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma, St. Louis, MI)含有脱気PBSの使用前に即座に再懸濁した。さらに、Tatは感光性および熱感受性なので、Tatの取り扱いはいつも暗闇でおよび氷上で行われた。多数のTatの異なるGLPのエンドトキシン濃度は、リムルス変形細胞分解産物分析により試験されるように、いつも検出境界を下回った(＜0.05EU/mg)。
【０１７８】
Tatペプチド
15アミノ酸Tat由来のペプチド(C-末端アミド)を、標準的な方法を使用して合成した(表８)。Kd対立遺伝子に対するTat CTLエピトープを予測するために、HLAペプチドモチーフ検索(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)を使用した。
【０１７９】
【表８】
2007509903.tif 000011
【０１８０】
Tatの微粒子への吸着
微粒子を、脱気滅菌リン酸バッファ食塩水(PBS)で再懸濁し(2mg/ml)、使用する前に4℃で保管した。
【０１８１】
Tat−微粒子複合体を調製するために、適量のTatおよび微粒子を60分間暗闇および氷上でインキュベートし、13,000rpmで10分間回転させた。ペレット(Tat-微粒子複合体)を、適量の脱気滅菌PBSで再懸濁し、即座に使用した。
【０１８２】
フローサイトメトリー
微粒子(50μg)をゆるやかな攪拌の下、室温にて60分間、最終用量の50μl中におけるTatタンパク質の増加量(0.1、1、2、5および10μg)によってインキュベートした。微粒子単独または微粒子−Tat複合体を13,000rpmで15分間回転させ、2回洗浄し、50μlのPBSで再懸濁した。次いで、5μlの微粒子−Tat複合体または微粒子単独を、4℃にて30分間、FITC−標識化抗−Tatモノクローナル抗体(Intracel, Issaquah, WA)、またはFITC−標識化抗−Tatウサギポリクローナル抗体によってインキュベートし、屋内で調製し(Magnaniら., unpublished results)フローサイトメトリーで分析した(FacScan Becton-Dickinson Mountain View, CA)。
【０１８３】
結果は、TatがA4、A7、1D、1EおよびH1D微粒子の表面で吸着することを示した(図11)。最大量の蛍光発光が1μgのTatで検出されたが、結果は計量可能なものでなく、実際に微粒子の負荷効率を表すものでなかった。しかし次節に記載された実験で示されるように、抗体の立体障害のためにそれはあり得そうであった。両クラスの微粒子(半コハク酸化ポリ(ビニルアルコール)の存在下、スチレン(モノマー)の分散重合によって得られたもの、およびEudragit (登録商標) L100-55の存在下、メチルメタクリル酸塩(モノマー)の分散重合によって得られたもの)は安定であり、親液性塩(lyophilisate)または懸濁液として数ヶ月間保管し得た。
【０１８４】
インビトロでの細胞傷害性の分析
プラスミドHIV-1-LTR-CATの完全なコピーを含有し、HIV-1-LTRプロモーターによるクロラムフェニコールアセチル転移酵素(CAT)リポーター遺伝子(reporter gene)の発現を生じる(drive)ヒトHL3T1細胞の単層培養を、NIH AIDS研究および参照試薬プログラム(Bethesda, MD)によって入手し、10%FBS(Gibco)を含有するDMEM(Gibco, Grand Island, NY)中で生育させた。
【０１８５】
HL3T1細胞(1 x 104/100μl)を96ウェルプレート中で接種し、37℃にて24時間培養した。次いで、単独での微粒子(10、30、50、100、300、500および1000μg/ml)またはTat(1μg/ml)(6倍化ウェル)に結合した微粒子を含有する100μlの培養液を細胞に添加した。未処理の細胞およびTat単独でインキュベートした細胞を対照とした。細胞を37℃にて96時間インキュベートし、細胞増殖をRoche (Roche, Milan, Italy)の提供する比色細胞増殖キットI(MTTに基づく)を使用して測定した(Mosmann T., J. Immunol. Meth., 1983;65:55-63)。吸収度を、630nmの参照波長で570nmにて(OD570/630)プレートを読むことで測定した。ティ−スチューデント(t-student)検定を行った。実験を三部構成で行った(SD≦10%)。
【０１８６】
両クラスの微粒子(半コハク酸化ポリ(ビニルアルコール)の存在下、スチレン(モノマー)の分散重合によって得られたもの、およびEudragit(登録商標)L100-55の存在下、メチルメタクリル酸塩(モノマー)の分散重合によって得られたもの)および微粒子−Tat複合体は、未処理またはTatで処理した細胞(p＜0.01)と比較して、50μg/mlまで細胞に対して毒性でなかった(図12)。細胞生存能力の50%減少が、高い用量(300-1000μg/ml)の場合だけに観察された(データは示されない)。
【０１８７】
2H1B(酸性微粒子)の細胞傷害性はまた、上記した未処理細胞と比較して、増加する微粒子の量(10-500μg/ml)によるインキュベーションが続くHL3T1細胞によってアッセイされた。未処理細胞と比較して、2H1Bで処理された試料における96時間のインキュベーションの後、細胞生存能力のいかなる有意な減少も観察されなかった(図13)。これらの結果は、2H1B微粒子が細胞に対して毒性でないことを示す。
【０１８８】
微粒子の細胞摂取
マウスおよびヒト原始細胞の単離を以下のように実行した。１）生後6週間のメスのスイスマウス(Nossan, Italy)に、1.0mlの10%チオグリコール酸塩(Sigma)の腹膜内(i.p.)注射をした。4日目にマウスを屠殺し、マクロファージに対して高濃縮された腹膜滲出細胞を、10U/mlのヘパリンが補充された10mlの氷冷ハンクス平衡塩溶液でi.p.を洗浄して採取した。細胞(4x106細胞)を2回洗い流し、10%熱不活性化FBS、1%抗生物質、2mMグルタミンが補充されたDMEMで再懸濁し、35mmペトリ皿上で接種し、37℃にて加湿された5%二酸化炭素雰囲気中で12時間インキュベートし、マクロファージを付着させた。非付着性細胞を、温めたDMEM媒質により徐々に取り除いた。単層は、マウスF4/80(Caltag Lab., Burlingame, CA)に対するラットモノクローナル抗体を使用した免疫染色および表面マーカー分析によって決定されるような95%純粋なマクロファージであった。２）マウス脾臓細胞を、フィコール勾配(Caselli Eら., J. Immunol., 1999;162:5631-8)を使用した生後10週間のBalb/cメスのマウスの脾臓から精製し、10%FBSが補充されたRPMI1640中で生育させた。ヒト単核細胞および単核細胞由来の樹状細胞をバフィーコートから精製し、記載されたように(Micheletti Fら., Immunol., 2002;106:395-403)特徴付けて培養した。
【０１８９】
HL3T1細胞(1x105)を、12mmのカバーグラスを含有する24ウェルプレート中で接種し、蛍光発光化(fluoresceinated)-H1D微粒子でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、4%冷パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点レーザー走査顕微鏡LSM410(Zeiss, Oberkochen, Germany)で観察した。イメージ獲得、記録およびフィルタリングを、先に記載したように(Neri LMら, Microsc. Res. Tech., 1997;36:179-87)インディ4400グラフィックワークステーション(Silicon Graphics, Mountain View, CA)を使用して実行した。
【０１９０】
ヒト単核細胞および単核細胞由来の樹状細胞(1x105)、ならびにマウス脾臓細胞(4x106)を、24ウェルプレート中で蛍光性H1D微粒子により24時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、製造者の指示に従って前もってポリ−L−溶解素(Sigma)でコーティングしたスライドガラス上に置いた。細胞を4%冷パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(Sigma)で染色し、上記したように共焦点顕微鏡および蛍光性顕微鏡Axiophot 100(Zeiss)で観察した。緑色蛍光(微粒子)が450-490λ、フロースルー510λ、およびロングパス520λフィルターで観察された；青色蛍光(DAPI)がバンドパス365λ、フロースルー395λ、およびロングパス397λフィルターで観察された。同一顕微鏡によるフィールドに対し、緑色、青色および相コントラストイメージをクールスナップCCDカメラ(RS-Photometrics, Fairfax, VA)で撮影した。次いで3つのイメージをAdobe Photoshop 5.5プログラムを使用してオーバーラップした。
【０１９１】
マウスマクロファージ(3x106)を微粒子の存在下、マクロファージあたり4微粒子の比率で、1、2および4時間インキュベートした。非食菌化微粒子を取り除くために細胞を広範囲で洗浄し、2%パラホルムアルデヒドおよび2.5%グルタルアルデヒドで4℃にて30分間固定し、トルイジンブルーで染色した。細胞を相コントラスト顕微鏡(100X)で観察し、食菌化微粒子とともにマクロファージの数を計算した。
【０１９２】
すべての粒子は、食細胞活動と類似した運動学および割合をもつマウスマクロファージによって吸収された(図14)。ヒト単核細胞、単核細胞由来の樹状細胞、マウス脾臓細胞およびHL3T1細胞が蛍光性H1D微粒子によって培養され、共焦点および蛍光性顕微鏡法で観察された場合、同様の結果が得られた(図15)。このデータは、異なる細胞の型によって微粒子が吸収され、化学組成および大きさがそれらの食細胞活動に影響を与えないことを示した。
【０１９３】
免疫蛍光発光
HL3T1細胞(1x105)を、12mmのカバーグラスを含有する24ウェルプレート中で接種し、蛍光発光化-H1D微粒子-Tatタンパク質複合体でインキュベートした。5μg/mlのTatと関連する用量30μg/mlのミクロスフィア(miscrosphere)を使用した。対照は、Tat(5μg/ml)タンパク質単独でインキュベートした細胞または未処理細胞で表された。インキュベーション後、細胞を洗浄し、4%の冷パラホルムアルデヒドで固定し、前に記載したように(Betti Mら., Vaccine, 2001;19:3408-19)抗-Tatモノクローナル抗体(4B4C4)およびヤギCy3-結合抗-マウスIgG第二血清による免疫蛍光発光によって分析した。細胞をDAPIによって着色し、蛍光性顕微鏡で観察した。赤色蛍光(Tat)がバンドパス546λ、フロースルー580λ、およびロングパス590λフィルターで観察された；緑色(微粒子)蛍光および青色蛍光(DAPI)は、上記のように観察された。同一顕微鏡によるフィールドに対し、緑色、赤色、青色および相コントラストイメージを上記のように撮影しオーバーラップした。
【０１９４】
Tat-微粒子複合体は細胞によって容易に吸収され、Tatタンパク質は細胞内の核付近に放出された(図16)。48時間後Tat充填粒子がまだ細胞中で検出可能であるという観察によって示唆されるように、Tatが制御された様式で放出された(図17)。
【０１９５】
Tatタンパク質活性の評価
HL3T1細胞(5x105)を60mmペトリ皿中で接種した。24時間後、細胞を1mlの新鮮な媒質と取り替え、100μMクロロキン(Sigma)の存在下または不在下、Tat単独(0.1、0.25、0.5、１μg/ml)でまたは微粒子(30μg/ml)と結合したTatでインキュベートした。いくつかの実験において、細胞への添加前に室温で16時間、Tat単独またはTat-微粒子複合体を空気および光へ曝露した。前に記載したように(Betti Mら., Vaccine, 2001;19:3408-19)、全体のタンパク質内容物に対して標準化を行った後、48時間後に細胞抽出物のCAT活性を測定した。
【０１９６】
CATの発現は、すべてのTat-微粒子複合体の間で最大でありおよび同様であった(図18)。さらに微粒子に結合したTatの用量の100、250および500ng/mlにおいて、CAT発現は同じ用量のTat単独(図18)によって引き出されたものよりも有意に高いものであり、微粒子の表面にて結合されたTatはタンパク質分解から保護され、および／または複合体から制御された様式で放出されることを示唆した。
【０１９７】
CATの発現はまた、2H1B/TatおよびH1D/Tatでインキュベートされた試料の間で高いものでありおよび同様のものであった(図19)。
【０１９８】
これらの結果は、すべての微粒子が用量依存様式において、生物学的に活性なTatタンパク質の吸着および放出を試験されたこと、ならびに微粒子に結合したTatがそれ本来の構造および生物学的活性を維持することを実証する。
【０１９９】
最終的に、Tatが先に微粒子上にて吸着された場合、空気および光への曝露はTatトランス活性化機能を不活性にしなかったが、一方Tatが遊離した場合、Tatの生物学的活性の損失の原因となった(図20)。かくして、微粒子に結合したTatは酸化から保護された。
【０２００】
凍結乾燥した微粒子／Tat複合体の安定性の評価
室温での保管後、Tat／微粒子複合体が粉末形態において安定であるかどうかを決定するため、詳しく上記したように(段落インビトロでの細胞傷害性の分析およびTatタンパク質活性の評価を参照)、Tat/H1DおよびTat/H1D−フッ化製剤を調製し、凍結乾燥し、室温にて(20-25℃)15日間保管し、PBSで再懸濁してTat活性に対して試験をした。対照物は、調製され即座に(新鮮な)細胞へと添加された同一の製剤で処理された細胞、またはTat単独で処理された細胞によって表された。室温での保管後、Tat/H1DおよびTat/H1D-フッ化複合体は粉末形態において安定であり、Tatタンパク質抗原の生物学的活性を保つ(図20および21)。
【０２０１】
ゲル電気泳動
ゆるやかな攪拌の下、室温にて60分間、微粒子(50μg)を最終用量の50μl中におけるTatタンパク質の増加量でインキュベートした。微粒子-Tat複合体を13,000rpmで15分間回転させ、PBSで2回洗い流し、30μlの0.9%NaCl、リン酸バッファ5mMで再懸濁した。試料を5分間沸騰させ、13,000rpmで15分間回転させた。上澄み液を14%SDS−ポリアクリルアミドゲルで収集し、クマシーブルーで着色した(Davis LG, Dibner MD, Battey JF In: Davis LG, Dibner MD, Battey JF,編. Basic Methods in Molecular Biology. New York: Elsevier, 1986.)。
【０２０２】
遊離Tatの酸化状態に対する曝露は、遊離Tatの空気および光に対する曝露でないのと比較して、Tatのモノマー的生物活性形態の消失、および付随して、酸化Tatの多重結合の発生の原因となった(データは示されない)。反対に、Tatが微粒子に結合された場合、空気および光に対する曝露の前後いずれかで、Tatのモノマー的構造は最もありふれた形態となった(データは示されない)。この結果は前に示されように(図16)、機能的Tatトランス活性化アッセイに従って、微粒子への吸着がTat本来の構造を保ち、酸化から保護することを実証した。
【０２０３】
４．  インビボ実験
Ａ  H1D蛍光性微粒子によるマウス接種
動物の使用は、国内のガイドラインおよび規定のガイドラインに従うものであった。7週齢のメスのBDFマウスに、左側後ろ足の大腿四頭筋にて、100μlのPBSで再懸濁された1mgのH1D−蛍光性微粒子を注射した。対照としてマウスに、右側後ろ足の大腿四頭筋にて、100μlのPBS単独を注射した。注射して15分および30分後、マウスの腹膜内に1mgのInoketan (Virbac, Milan, Italy)および200μg Rompun (Bayer, Milan, Italy)を含有する100μlの等浸透圧溶液の麻酔をかけ、マウスを屠殺した。
【０２０４】
注射位置での筋肉試料を取り除き、即座に液体窒素中へ1分間沈め、-80℃にて保管した。5μmの冷凍切片を調製し、室温にて10分間新鮮な4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄し、DAPI(0.5μg/ml; Sigma)で10分間着色させて核を染色する。PBSによる1回の洗浄後、切片をエタノールで乾燥させ、退色を妨げるために1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンを含有するグリセロール／PBSで顕微鏡標本を作製し、蛍光性顕微鏡(Axiophot 100, Zeiss)で観察した。緑色蛍光(微粒子)が450-490λ、フロースルー510λ、およびロングパス520λフィルターで観察された；青色蛍光(DAPI)がバンドパス365λ、フロースルー395λ、およびロングパス397λフィルターで観察された。同一顕微鏡によるフィールドに対し、緑色および青色イメージをクールスナップCCDカメラ(RS-Photometrics, Fairfax, VA)で撮影した。次いでイメージをAdobe Photoshop 5.5プログラムを使用してオーバーラップした。
【０２０５】
注射後、蛍光性微粒子は筋肉細胞によって容易に吸収され、かくして生物学的分布の研究に対する有用なツールを表す(図22)。
【０２０６】
Ｂ  Tat-吸着化微粒子によるマウス免疫化
動物の使用は、国内のガイドラインおよび規定のガイドラインに従うものであった。7−8週齢のメスのBalb/cマウス(H-2d)(Nossan, Milan, Italy)に、30μgの微粒子に吸着した0.5μgのTatタンパク質、Tatタンパク質単独またはTatタンパク質およびフロイントアジュバントによって免疫化した(一次的免疫化に対するCFA、二次的免疫化に対するIFA)。対照マウスにPBSを単独で注射した。免疫原(100μl)を、後ろ足の大腿四頭筋にて筋肉内(i.m.)注射で与えた。4つの独立した実験を行った。0および2週間目にて(2つの実験)、ならびに0および4週間目にて(2つの実験)マウスを免疫化した。水腫、硬化、赤熱の存在に対して、および活発さ、生命力、体重、運動性、髪の毛のつや等の一般的な状態に対して、動物を1週間に2回、注射した位置で制御した。Tat単独で接種されたマウス、または未処理のマウスと比較して、いかなる局所性有害反応の徴候または全身性有害反応の徴候も、Tat-微粒子複合体を受け入れるマウスには一度も観察されなかった。フロイントアジュバントを接種されたマウスだけが、注射位置にて認識できる肉芽腫を発生させた。免疫化の2週間後に免疫反応を評価した。犠牲となるマウスの腹膜内に1mgのInoketan (Virbac, Milan, Italy)および200mg Rompun (Bayer, Milan, Italy)を含有する100μlの等浸透圧溶液の麻酔をかけた。
【０２０７】
抗−Tat血清学
化学組成および微粒子の大きさが、HIV-1 Tatに対する免疫反応の型および強度に影響を及ぼすかどうかを決定するため、マウス(ｎ＝10)に筋肉内注射で30μgのポリスチレン(A4およびA7)、およびポリメチルメタクリル酸塩(1D、1EおよびH1D)微粒子に吸着した0.5μgのTatタンパク質によって免疫化した。さらに、3つのグループのマウスにTat単独(ｎ＝6)、Tatおよびフロイントアジュバント(ｎ＝10)またはPBS(ｎ＝10)によって免疫化した。一次的免疫化の2週間後、処置グループによる半分の数のマウスが屠殺された。同時に、残りのマウスは二次的免疫化を受け、2週間後に屠殺された。
【０２０８】
個々のマウスの血清学的反応を、96ウェル免疫プレート(Nunc Immunoplate F96 Polysorp, Nunc, Naperville, IL)中の酵素結合免疫吸着検定(ELISA)で測定した。ウェルを100μlのTatタンパク質(0.05MカルボネートバッファpH9.6中1μg/ml)でコーティングした。プレートを密封し、4℃にて12時間、暗闇でインキュベートした。自動洗浄装置(Immunowash 1575, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)にてPBS中0.05% Tween 20(PBS-Tween)によって広範囲に洗浄した後、プレートを3%BSAを含有する150μl/ウェルのPBSで37℃にて120分間ブロックし、洗浄し、次いで2倍のウェル中100μl/ウェルのマウス血清で37℃にて90分間インキュベートし(1:195〜1:100,000に希釈した)、広範囲で洗浄した。免疫複合体を100μl/ウェルのホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)共役化ヒツジ抗−マウスIgG (Amersham Life Science, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)で検出し、1%BSAを含有するPBS-Tweenで1:1,000に希釈した。プレートを室温にて90分間インキュベートし、5回洗浄して室温にて40分間100μl/ウェルのペルオキシダーゼ培養基(ABTS)(Roche, Milan, Italy)でインキュベートした。反応を100μlの0.1Mクエン酸でブロックし、吸収度を自動プレート読み取り機(ELX-800, Bio-Tek Instruments, Winooski, UT)によって405nmにて測定した。カットオフは、PBSを接種された対照マウスの血清の平均OD405(+3 SD)に一致し、3つの独立したアッセイで試験された。抗-Tat IgGエピトープマッピングに対して、Tat(HTLVIII-BH10)の異なる領域を表す8つの合成ペプチド(aa 1-20、21-40、36-50、46-60、56-70、52-72、65-80、73-86)を0.1Mカルボネートバッファ(pH9.6)で10μg/mlにおいて希釈し、96ウェル免疫プレートを100μl/ウェルでコーティングした。アッセイを上記したように行った。各々のペプチドに対するカットオフは、PBSを注射された対照マウスの血清の平均OD405(+3 SD)と一致し、3つの独立したアッセイで試験された。
【０２０９】
抗-Tat IgGアイソタイプに対して、上記したように、プレートをTatタンパク質でコーティングし、1:100および1:200に希釈したマウス血清でインキュベートした。洗浄後、100μlのヤギ抗−マウスIgG1またはIgG2a(Sigma)を、1%BSAを含有するPBS-Tweenで1:100に希釈し、各々のウェルに添加した。免疫複合体を、上記したように、1%BSAを含有するPBS-Tweenで1:7,500に希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ標識化ラビット抗−ヤギIgG (Sigma)によって検出した。各々のIgGサブクラスに対するカットオフは、PBSを注射された対照マウスの血清の平均OD405(+3 SD)と一致し、3つの独立したアッセイで試験された。
【０２１０】
血清抗体反応は、屠殺されたマウスにてELISAによってモニターされた。Tat／微粒子複合体によって免疫性を与えられたすべての5グループのマウスは、特定の抗-Tat抗体を発生させ、それは二次的免疫処置後、および5つの処置グループ間で同様の滴定濃度によって、ならびにTat接種のマウスに対して検出可能であった(表9)。
【０２１１】
【表９】
2007509903.tif 000012
aマウスを０および２週間目に、一度（I免疫化）または二度（II免疫化）免疫化し、２週間後、屠殺した。該抗体応答を、抗原としてTatタンパク質を使用するELISAによって、個々のマウスの段階希釈された血清にて調査した。１つの代表的な実験の結果を、応答したマウスの数対、免疫化されたマウスの総数として表わす。それぞれの群では、応答の平均力価±SDを、括弧内で報告する。Tat単独でワクチン接種されたマウスと比較して、Tat/微粒子複合体で免疫化されたマウスのAb力価における差異は、有意ではなかった（P>0.01）。
【０２１２】
抗体のエピトープ反応性を、Tat/微粒子複合体またはTatで免疫化された全ての処置群の全てのマウス中のタンパク質（残基1〜２０）のNH２末端部位に向けた。第二の反応性エピトープを、二匹のマウス（一匹はA4/Tatで免疫化され（マウスID１０）、およびもう一匹はID/Tatで免疫化された（マウスID９））の血清中で、２１〜４０残基のみで同定した（データは示さない）。
【０２１３】
IgGサブクラスのアイソタイプ分析は、IgG1およびIgG2aアイソタイプの両方の存在を示した。しかしながら、IgG1サブクラスの有病率は、全ての群で観察された（データは示さない）。
【０２１４】
Tat-特異的T細胞活性化
単核細胞を、Falconにより提供された、細胞ストレーナー(strainer)を使用して、脾臓から精製した。細胞を、20mM EDTAを含むPBS中で再懸濁し、室温で４分間、赤血球溶解バッファ(100mM NH4Cl、10mM KHCO3、10 mM EDTA)で処置し、血清無しでRPMI1640(Gibco)にて２度洗浄した。細胞を、10％熱-不活性FBS（Hyclone）を補充したRPMI 1640中で再懸濁し、トリパンブルー排除色素により計測した。精製された脾細胞を処置群によって貯蔵し、細胞免疫応答を評価するために使用した。
【０２１５】
Tat-特異的T-細胞活性化を、異なるアッセイを使用して決定した。
１）脾細胞を、５日間、Tatタンパク質（0.1、１または５μg/ml）またはCon A(10μg/ml)(Sigma)の存在下で、10％熱不活性化FBSを補充した200μｌのRPMI 1640中で、２×１０５/ウェル(６倍にしたウェル)で培養した。メチル-３H-チミジン（2.0 Ci/mmol;ICN）をそれぞれのウェル（1μCi）に加え、細胞を１６時間インキュベートした。[３H]-チミジン取り込みを、β-カウンターで測定した。抗原刺激細胞の６つのウェルの平均cpmを、抗原の非存在下で成長した同様の細胞の６つのウェルの平均cpmで割ることによって、S.I.を計算した。カットオフ（PBS単独で注射した対照マウスの平均S.I.(+2SD)）より高い値は、陽性であるとみなされた。
【０２１６】
２）Balb/c 3T3-TatおよびBalb/c 3T3-pRPneo-cを発現するマウス細胞(BALB/ｃ-対照細胞を参照)の安定したクローン（Ｈ2dハプロタイプ）を、Dulbeccoの最少必須培地プラス10％ FBSおよび G418(350μg/ml、Sigma)中で成長させた。マウス脾細胞を、Tat（0.5μg/ml）の存在下の、BALB/c 3T3-Tatを発現する細胞により、20:1の比で、共培養した。４日間の培養の後、rIL-2(10 U/ml;Roche, Milan, Italy)を培養物および４８時間更に成長させた細胞中に加えた。γINF生成物を、IL-2の添加前および後に、培養上澄み液上で、ELISAによって測定した。96ウェル免疫板（immunoplate）(Nunc Immunoplate F96 Polysorp)を、４℃で１６時間、0.03 M 炭酸塩バッファ中で、100μlの抗-マウス γ INF mAb(1μg/ml;Endogen, Woburn, MA)で被覆した。次いで、空のウェルを、室温で１時間、200μlのPBS-4％ BSA(アッセイバッファ)でブロックし、充分にPBS-0.05％ Tween 20(洗浄バッファ)で洗浄し、室温で１時間、50μlの段階希釈された細胞上澄み液でインキュベートした。滴定曲線（０から20,000 pg/mlの組換えネズミ γINF-gamma, Euroclone, Devon, U.K.）を、それぞれのプレート中に含んだ。それぞれの試料を、二連で試験した。次いで、空のプレートを、室温で１時間、50μl/ウェルのビオチン(biotine)-標識抗-マウス γINF mAb(アッセイバッファ中400 ng/ml;Endogen)でインキュベートし、充分に洗浄し、100μl/ウェルの3,3',5,5'-テトラメチル-ベンジジン（TMP；Sigma）基質で３分間インキュベートし、100μl/ウェル 3 N HClでブロックし、吸光度を４５０nmで読みとった。
【０２１７】
３）Tat-誘導15-merペプチドに応答するT-細胞増殖（Ｋｄ対立遺伝子に対するコンピューター予測CTLエピトープを含む）を測定するために、未処置同系Balb/cマウスからの、照射を受けた脾臓細胞（5×105）（APCとして送達する）を、１時間、２×１０５MのそれぞれのTatペプチドによって、96-平底ウェル中でインキュベートした。免疫化されたマウスからの脾細胞(1×１０５)(あらかじめ、Tat（0.5μg/ml）の存在下でBALB/c 3T3-Tat（20:1の比）を発現する細胞により４日間共培養され、Ficoll勾配を使用して精製した)を、200μlの最終容量および10−５Mの最終ペプチド濃度におけるウェルに加えた。２４時間後、培養培地の部分標本を採集してγIFNの放出を測定し、一方、７２時間の更なる培養の後に、細胞をメチル-３H-チミジン（１μCi/ウェル）で２４時間適用した。取り込まれた放射能を、液体シンチレーション分光法によって測定した。
【０２１８】
かくして、Tatに応答するCD4+T-細胞増殖を、マウス脾細胞を使用して評価した。マウスの脾細胞（第一または第二の免疫化の後２週間で得られた）を0.1、１および５mg/mlのTatタンパク質で５日間培養した。抗原刺激T-細胞増殖を、[３H]チミジン取り込みによって決定した（表１０）。１回の免疫化の後、Tatの最も高い用量に対する特異的応答は、Tat/微粒子複合体およびTatで免疫化された全ての群の脾細胞中で観察された。更に、A7/および１E/Tat処置群に対するTaｔ-特異的CD４+T-細胞応答をまた、１μg/mlのTatの低用量で検出した。２回の免疫化の後、Tat-特異的 T細胞増殖を、微粒子によっておよび無しでの全ての群中の１μg/mlおよび５μg/mlのTat両方で検出し、更に、マウスを、0.1μg/ml程度の組換え型Tatに応答するA4/Tatおよび１D/Tatで免疫化した。
【０２１９】
【表１０】
2007509903.tif 000013
aマウスを０および２週間免疫化し、免疫応答を第１および第２の免疫化の後２週間試験した。細胞を、組換え型Tatタンパク質またはConAによって刺激した。値は、TatまたはConA活性化の後のマウスの脾細胞のSI（５つの脾臓のプール）を表わす。PBSを注射した対照群のものより高いSIは、陽性と考えられた。増殖性応答対Tat単独で免疫化されたマウスにおけるb差は、有意であった（P＜0.05）。
【０２２０】
独立した実験において、マウスを、Tat/微粒子複合体で２度（０および４週目に）免疫化した。マウスの脾細胞（第二の免疫化の後、２週間で得られた）をTatの存在下で、BALB/c 3T3-Tatを発現する細胞によって共培養した。培養の４日後、再刺激された脾臓細胞の培養培地中のγINFの生成物を、ELISAによって測定した。図２３に示されるように、PBSを注射されたマウスと比較して、生じたγINF生成物は、Tat/微粒子複合体で免疫化された５つの全ての群中で有意に増加した。PS粒子（A４およびA７）間およびPMMA粒子間で比較できるこの影響は、H1D/Tat処置群中で大いに明白であった。かくして、本発明者は、微粒子のそれぞれの型に対して１回、２つの処置群中のTat-誘導ペプチドに応答するT-細胞増殖を測定した。４日間のTatの存在下で、BALB/c 3T3-Tatを発現する細胞による共培養の後、A4/Tatをワクチン接種したマウスおよびH1D/Tatをワクチン接種されたマウスの脾細胞を精製し、いくつかのTatペプチドを適用される、照射を受けた未処置脾細胞で共培養した。T細胞増殖を、９６時間の培養の後、３[H]チミジン取り込みによって測定し、γINF放出を、２４時間の培養の後収集された培養上澄み液のアリコートにて試験した。これらの実験の結果は、Tat処置されたマウスに類似する様式で、特異的細胞増殖ならびに、TC34、TC38およびTC39 Tatペプチド（Ｋｄ対立遺伝子に対して、コンピューター予測CTLエピトープを含む）に応答するγINFの放出を示した。更に、より弱いが、他のTatペプチド（TC30、TC32およびTC41を含む）に対する応答を観察した（図２４）。他のTat-ペプチドに対する応答は、観察されなかった（図示せず）。
【０２２１】
インビボのTat-微粒子複合体の安全性の評価
屠殺時、動物を検死に供した。注射の部位の皮膚、皮下組織および骨格筋、ならびに他の器官（肺、心臓、腸、腎臓、脾臓および肝臓）の試料を１０％ホルマリン中で１２〜２４時間固定し、パラフィン中に包埋し、規定通りに、組織学的検査に対して処理した。３つの５μmパラフィン-包埋薄片を、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色し、ジアスターゼ処置(Sigma)によってまたは無しで、過ヨウ素酸-Shiff（PAS）反応に供した。連続的な組織薄片を、Hsuら（J.Histochem. Cytochem. 1981;29:577-80）に従って、アビジン-ビオチン-ぺルオキシダーゼ複合体手法（Vectastain ABC Kit PK-4002, Vector Labs, Burlingame, CA）を使用して、免疫染色した。該抗体のパネルは、α-アクチン検出のためのS-100(Dako, Denmark)、HH-F 35(Dako)、マクロファージ検出のためのCD68およびMac387(Dako)を含んだ。簡単には、脱パラフィン化および脱水の後、内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中で、0.3％ H2O2によってブロックした；次いで、試料を４℃で10〜12時間、一次抗体によってインキュベートした。ビオチン化（Biotinilated）-抗マウスおよび抗ウサギ免疫グロブリン(Sigma)を二次抗体として利用した。接合されたアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼによるインキュベーションならびにジアミノベンジジン（Sigma）および水素ペルオキシダーゼによるインキュベーションに続いて、特異的反応を、検出した。
【０２２２】
組織学的に、写真の２つの型は、注射の部位で観察された。第１の型は小さい病巣から成り立ち、１つまたは２つの筋肉線維を含み、増加した核の数および腸の空間中のわずかなマクロファージ浸潤を示した（図２５ＡおよびＣ）。これらの特徴は、Tat-微粒子複合体またはTat単独を注射したマウス中で広く検出された。写真の第２の型は、筋の筋膜中および周囲の脂肪線維中で見られ、好中球顆粒球およびマクロファージにより囲まれる壊死の中心部によって特徴付けられた（図２５ＢおよびＤ）。マクロファージは、CD68およびMac387モノクローナル抗体に対して良好な反応性を常に示した；TおよびBリンパ球は、炎症性の反応中で、検出されなかった。炎症性細胞のより多い数と同様の病変のこの型は、Tatおよびフロイントアジュバンドを受け取るマウスの大多数中で検出された。他の動物中およびPBSを接種した対照マウス中で、炎症性反応は、外傷性刺激に関して目立たないまたは欠けている(データは示さない)。負荷されたマクロファージ反応または他の型炎症性反応は、他の器官中では観察されなかった。
【０２２３】
化学的組成物および微粒子の大きさまたはTatの用量に関する、炎症性反応における差異は、１回の免疫化の後に検出されなかった。実際は、A4-Tat0.5μgまたは1D-Tat0.5μgによって接種された、2/22(9％)のマウスのみ、炎症性反応を示した。２回の免疫化の後に、微粒子-Tat複合体で処置された14/47(30％)のマウスは、局所の炎症性反応を発達させた。３回の免疫化の後、Tat-微粒子複合体により処置された23/38(60％)のマウスは、接種の部位で、変異炎症性反応を示した。結論として、変異炎症性反応の頻度は、免疫化の数と相互に関係した。
【０２２４】
Tat-処置されたマウスは、約５０％のマウス中の第２の接種の後のみ、局所的炎症を示した（タイプ１写真）；マクロファージ浸潤は、より頻繁に観察されたが、それはTatの用量とは関係がなかった。
【０２２５】
Tatおよびフロイントアジュバンドで処置された全てのマウスは、免疫化の数から独立して、強い炎症性反応を示した；該発生数は、第１の注射の後、70％以上であり、第二および第三の処置の後、90〜100％に上った。これは、おそらく使用されたアジュバントの型によるものである。
【０２２６】
Ｃ  オボアルブミン吸着微粒子によるマウス免疫化
タンパク質
オブアルブミンをSigma（cat. A-2512; St. Louise, MI）から購入した。オブアルブミン分子量および等電点（isolectic point）は、それぞれ45,000ダルトンおよび4.63(Merck Index)である。該タンパク質を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で再懸濁し、４℃で保存した。該タンパク質配列は、配列番号：５２で示される。
【０２２７】
オボアルブミンペプチド
オボアルブミンペプチド（表１１）を、UFPeptides s.r.l(Ferrara,Italy)によって、合成した。ストックを、10-2 M濃度のDMSO中で調製し、-80℃に保ち、使用前にすぐにPBS中で希釈した。
【０２２８】
【表１１】
2007509903.tif 000014
【０２２９】
オボアルブミン/微粒子複合体形成
HE1D微粒子（凍結乾燥した粉末）を、使用前に少なくとも２４時間、２mg/mlで、減菌PBS中で再懸濁した。オボアルブミンおよびHE1D微粒子の適切な容量を混合し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を１０分間13,000 rpmで回転させた。ペレット（オボアルブミン/HE1D 複合体）をPBSの適切な容量中で再懸濁させ、直ちに使用した。
【０２３０】
ゲル電気泳動
HE1D微粒子（30μg）を、穏やかな攪拌下、室温で２時間、オボアルブミンの量を増加させてインキュベートした。HE1D/オボアルブミン複合体を１５分間、13,000rpmで回転させた。上澄み液（非結合タンパク質）を収集し、SDS-PAGEにより分析した。ペレット（HE1D/オボアルブミン複合体）をPBS中で２回洗浄し、30μlのNaCl 0.9％、リン酸バッファ 5mM中で再懸濁した。試料を５分間沸騰させ、１５分間13,000で回転させた。上澄み液（結合したタンパク質）を、14％SDS-ポリアクリルアミドゲル上に流し入れ、銀染色法により分析した(Davis LG, Dibner MD, Battery JF. In:Davis LG, Dibner MD, Battey JF, 編. Basic Methods in Molecular Biology. New York:Elsevier, 1986)。定量化を、それぞれのゲル中で移動したオボアルブミンの既知の量と比較して、密度計ゲル分析器(Quantity-One, BioRad Laboratories, Milan, Itary)を使用して、行った。
【０２３１】
結果は、オボアルブミンが、用量依存様式（図２６A）で、およそ20％の吸収効率（図２６B）で、これらの基本的微粒子の表面で吸収することを示した。
【０２３２】
マウス免疫化
動物使用は、国内のガイドラインおよび規定の政策に従った。７週齢のメス C57BL6/J(H2Kb)マウス(Harlan, Udine, Itary)を、表１２記載のように、100μlの免疫原により、一部位で皮下に免疫化した。マウスの一群を、オボアルブミン/HE1D 複合体で免疫化した。マウスの２つの群を、オボアルブミンおよびフロイントまたはAlumのアジュバントによって免疫化した。オボアルブミンCTL免疫反応が、よく特徴付けられるために、これらの２つの群を含んで、複合体の免疫原性を共通に使用されたアジュバントによって誘導されたものと比較した。更に、ペプチドをワクチン化する目的で送達するために、HE1D微粒子が使用され得るかどうかを決定するために、SIIペプチド（免疫優性(immunodominant)オボアルブミンCTLエピトープを含む）をHE1D微粒子上に吸着し、マウスを免疫化するために使用した。最終的に、マウスの一群を、SIIおよびフロイントアジュバントによって免疫化した。対照を、PBS単独で注射した。免疫原（Immunogenes）を、１日および１４日目に、皮下経路で与え、１０日後に屠殺した。
【０２３３】
【表１２】
2007509903.tif 000015
【０２３４】
実験の進行の間に、動物を、一週間に２度、注射の部位にて、およびその一般的な状態（元気さ、食物摂取、活力、体重、運動性、毛の光沢）に対して制御した。局所のまたは全身性の有害反応の徴候は、これまで、オボアルブミンおよびフロイントもしくはAlumでワクチン接種するマウス、またはPBSを注射するマウスと比較して、タンパク質/またはペプチド/HE1D複合体を受け取るマウス中で、全く観察されなかった。
【０２３５】
IFN-γElispot
脾細胞をフィルター（Cell Strainer, 70 μｍ, Nylon, Becton Dickinson）上で圧搾された脾臓から精製した。細胞を、10％ FBSを含むRPMI 1640中で再懸濁し、IFNγ Elispotによる、細胞毒性(Cytitoxic)反応（CTL）の分析のために使用された。それぞれの実験群につき３つの脾臓のプールを使用した。
【０２３６】
IFN-γ Elispotを、Becton Dickinson(murine IFNgamma ELISPOT. Set; BD Pharmingen; Cat♯551083)によって提供される、市販のキットを使用して、製造業者の指示に従って実行した。簡潔に、ニトロセルロース 96-ウェルプレートを、４℃で一晩中、10μg/mlの抗-IFN-γ mAbによって被覆した。翌日に、該プレートを、PBSで４回洗浄し、３７℃で２時間、10％ ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640でブロックした。脾細胞（2.5および5×105/200μl）を精製し、すぐにウェル（３倍のウェル）に加え、３７℃で１６時間、オボアルブミンペプチド（10-６M）（SII、KVV、CFD、OVA1、OVA2、OVA3）によってインキュベートした。対照を、コンカナバリン A（Sigma;５μg/ml）(陽性対照)または培地単独（陰性対照）でインキュベートした細胞とした。該スポットを、Elispot 読み取り機(Elivis, Germany)を使用して読み取った。該結果を、スポット（SFU）/106 細胞のニート（neat）数として表わす[ペプチド処置されたウェルのスポットの平均の数マイナス陰性対照のスポットの数（それぞれOva+Freund's 20 SFU/106細胞；Ova+Alum 45 SFU/106 細胞;SII+Freundの 40 SFU/106細胞；Ova/HE1D 150 SFU/106 細胞；SII/HEID 150 SFU/106細胞と一致する）]。
【０２３７】
結果は、以下の表１３に示される。それぞれのペプチドに対して、陰性対照は、常に10スポット/10６細胞以下である。結果は、陰性対照のSFU/106細胞を減算されたスポット（SFU）/106細胞の数として表わされる。応答≧30 SFU/106細胞は、陽性であると考えられる。該結果は、オボアルブミン/HE1DおよびSII/HE1D複合体の両方が免疫原性であり、それらがオボアルブミンによって接種される場合、良好なCTL応答を誘導することで知られる２つのアジュバントによって誘導されたものと比較できる、顕在化CTL応答であることを示す。更に、これらの結果は、微粒子がペプチド送達に使用され得ることを示す。
【０２３８】
【表１３】
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【０２３９】
Ｄ  Tat-吸着微粒子によるサル免疫化
Tatタンパク質およびペプチド
86-aa長Tatタンパク質（HTLVIIIB, BH-10 クローン）を、前記のように大腸菌中で発現させ、高圧クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの、連続する一巡で単離した。精製されたTatタンパク質は、SDS-PAGE、およびHPLC分析によって試験されたように、>95％純粋である。Tatが７つのシステインを含むので容易に起こる酸化を防止する場合、Tatタンパク質は、−８０℃で凍結乾燥して保存し、使用する前にすぐに脱気減菌PBS（2mg/ml）中で再懸濁した。更に、Tatは感光性および感熱性であるので、Tatの取り扱いは、常に暗闇、および氷上で行われた。全Tat配列(aa 1〜102)に渡るTatペプチド（10残基によりオーバーラップする15-mer）を、UFPeptides s.r.l(Ferrara, Italy)により合成した。ペプチドストックを、DMSO中、10-2M濃度で調製し、−８０℃で保存し、使用する前に直ちにPBS中で希釈した。
【０２４０】
免疫化プロトコルおよびスケジュール
マウスモデル中のこれらの結果に基づいてH1D粒子を選択し、サル中で予備実験を行った。かくして、安全で免疫原性の研究を、カニクイザル（Macaca fascicularis）（小動物よりヒトに近い非ヒト霊長類モデル）で行った。サルの３つの群を、この調査に含んだ（表１４）。A群の動物を、10μｇのTatタンパク質およびAlumによって皮下で６回（０および4、12、18、21、35週目）免疫化した。B群のマカークを、60μgのH1D微粒子に接合した10μｇのTatタンパク質によって筋内に４回免疫化し（０、4、12、および18週目）、10μgのTatタンパク質およびAlumによって皮下で２回（21および35週目）ブーストした。C群の動物は対照を表わし、該動物に60μgのH1D微粒子単独で筋内に４回、Alum単独で皮下に１回、接種した。
【０２４１】
【表１４】
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【０２４２】
毎日の臨床的モニタリングおよび毎月の血液の化学的測定によって評価する場合、H1D微粒子上に吸着されたTatタンパク質(HID-Tat)の単数または複数の接種において、いずれの動物も、局所的または全身系の有害反応を経験せず、炎症、窮迫、または苦痛の徴候を示さなかった（表１５および表１６）。
【０２４３】
【表１５】
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【０２４４】
【表１６】
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【０２４５】
Tatタンパク質に対する血清抗体の測定
抗-Tat抗体の検出について、96-ウェルマイクロプレート（Nunc-Immuno Plate MaxiSorp Surface;Nunc）を、４℃で１２時間、Tatタンパク質(ウェルにつき100ng/200 μL、0.05 M 炭酸塩バッファ中、ｐH9.6)によって被覆し、次いで、自動プレート洗浄装置(Sorin Biomedica)上の0.05％ Tween 20(PBS/Tween)を含むCa２+およびMg２+無しのPBSで５回洗浄し、非結合Tatタンパク質を取り除いた。次いで、ウェルを、37℃で90分間、１％BSAおよび0.05％ Tween 20(Sigma)(Blocking Buffer, BB)を含むPBSで飽和した。充分な洗浄の後、BB(最小限の血清希釈液：1:100)中で希釈された100μLのそれぞれの血清試料をウェルに加えた。いずれの不特異的結合を矯正するために、それぞれの試料を、TatおよびTatが再懸濁されたバッファの両方に対して、常に二連で評価した。
【０２４６】
それぞれの実験中で、１つの公知の抗-Tat抗体陽性試料および３つの公知の抗-Tat抗体陰性試料を、それぞれ、陽性および陰性対照として使用した。37℃において90分後、プレートを充分に洗浄し、ウェルを37℃で15分間、BBで飽和させた。プレートを洗浄し、100μLの抗サル IgG ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Sigma;BB中にて1:1,000で希釈された）を、それぞれのウェルに加え、37℃で更に90分間インキュベートした。洗浄の後、抗原結合抗体を、37℃で50分間、ABTS基質溶液（Roche Diagnostics）を加えることによって曝露した。
【０２４７】
吸光度を、マイクロプレート読み取り機（Sorin Biomedica）を使用して、405nmで測定した。試料の光学密度（OD）を、それぞれの試料のバックグラウンド（バッファコートウェル）に対して標準化した。それぞれの試料に対して、Tatでコートしたウェルとバッファでコートしたウェルの間のOD差異は、Δ値を規定した。アッセイは、Δ値ならびに陽性および陰性対照の絶対値（標準化の前）の両方が、前に50アッセイ中で観測された値に関して、±10％変動以内であった場合のみ、有効であるとみなされた。同様に、カットオフ値を、絶対ODおよび抗-Tat抗体陰性サル血清からの50試料により得られたΔ値の両方の平均より大きい3 SDとして規定した。
【０２４８】
リンパ球増殖アッセイ
Ficoll-Hypaque(Pharmacia Bioteck AB, Uppsala, Sweden)勾配精製 PBMCを、10％ FCSで補完された完全 RPMI 培地中で再懸濁して、計数し、96-ウェルマイクロタイタープレート中の３倍の、ウェルあたり2×105細胞で接種し、5μg/mLのTatcys22タンパク質（HIV-1IIIB変異体 Tat lot:4203, Advanced BioScience Laboratories, Inc, Rockville, MD）、またはTat配列全体(aa 1〜102)にわたる2μg/mLのTatペプチドプールの非存在または存在下で、５％CO２中37℃で５日間インキュベートした。フィトヘマグルチニン（PHA, HA16, Murex Biotech, Dartford, UK）(2μg/mL)を、陽性対照として使用した。５日目に、培養物を、1.0μCi/ウェルの[３H]チミジン(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)およびβ-カウンター(Perkin-Elmer, Boston, MA)で測定されて取り込まれた放射能によって、16〜18時間適用した。刺激された試料の平均cpm値を、非刺激試料の平均cpm値で割ることによって、刺激指数（S.I.）を算定した。S.I.>３を、陽性として評価した。
【０２４９】
IFNγ-ELISPOTアッセイ
INFγ-ELISpot アッセイを、製造業者の手順に従って、Mabtech(Mabtech AB Gamla Vaermdoev, Sweden)からの試薬で行った。簡潔に、サルから単離されたPBMCを、完全培地中で懸濁し、組換え型TatCys22（5μg/mL）または全体のタンパク質に渡る18個の15-mer Tatペプチド（2μg/mLのそれぞれのペプチド）のプールの存在下で、サル IFN-γ(GZ-4, マウスIｇG1,Mabtech)に対して、モノクローナル抗体(mAb)で被覆した、96-ウェルマイクロタイタープレート（MultiScreen-IP plate, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA）中で接種した（2×105/ウェル、複製物中）。37℃での一晩中のインキュベーションの後、細胞を取り除き、サル IFN-γ（7-B6-1,マウス IgG1, Mabtech）に対してビオチン化したmAbを、該ウェルに加えた。室温（RT）での２時間のインキュベーションの後、該プレートを充分に洗浄し、Streptavidin-ALP(Alkaline Phosphatase, Mabtech)溶液を、該ウェルに加えた。室温での60分のインキュベーションの後、プレートを再び洗浄し、色素基質 BCIP/NBT(Sigma, Milan, IT)を加えた。発育（室温で30〜60分）の後、それぞれのウェル中のスポット形成細胞（SFC）を分析し、ELISPOT読み取り機（AID EliSpot Reader System, Autoimmun Diagnostika GmbH Strassberg, Germany or Automated ELISA-Spot Assay Video Analysis Systems(登録商標)A.EL.VIS GmbH, Hannover, Germany）によって算定し、SFC/106 細胞として発現した。
【０２５０】
結果
結果は、H1D微粒子上に吸着されたTatタンパク質（HID-Tat）が、Tat+Alum免疫化よりもより少ない範囲であるが、体液性および細胞性の免疫応答を誘導するのに効果的であったことを示す（図２７〜図２９）。実際に、図２７および図２８、パネルＤ、Ｅ、およびＦ中で示されるように、Tat+Alum、Th2応答の誘導について最適であることが公知である刺激および抗体による第１ブースト後の、H1D-Tat微粒子のみによって免疫化された３匹のマカークの２匹中で、IｇMおよびIgG抗体の両方を測定した。発現の動態およびこれらの２匹の動物中のIgMおよびIgGの両方に対して測定されるピーク抗体力価（図２７および図２８、パネルE、およびF）は、まさに第１のワクチン接種の後のＡ群（Tat+Alum）からの３匹のサルの２匹中で観察されたものと類似し、H1D-Tatが、抗体応答に対するこれらの２匹のサルを満たさなかったことを示した。しかしながら、サル中で、HID-Tat、IgG(IgMなし)によって免疫化されたM770Fを、第３のHID-Tat接種法（図２７および図２８、パネルＤ）の後に直ちに検出し、注射された動物の少数中のみであるが、このワクチン製剤は、サル中の抗体を誘導する能力が、実際にあることを示した。A群マカーク中で起こった反対の事は、TatおよびAlumを表皮に接種し（図２７および図２８、パネルＡ、Ｂ、Ｃ）、ここでAbをマウントされた３つのワクチンのうちの１つが、第４の接種物の後のみ応答し（図２７および図２８、パネルＡ）、一方、残りの２つが、第１のワクチン投与の後にそのようになり（図２７および図２８、パネルＢおよびＣ）、異種交配された動物およびヒト中で観察された免疫原への応答の一定の異質性との一致を見出した。注として、H1D-Tatを筋内へ注射したが、Tat+Alumを皮下に投与した。送達の経路が、抗体応答の誘導に影響を与えたかどうかが決定されるまで、それは分からない。概して、抗体応答は、B群（H1D-Tat）動物中よりもA群中（Tat+Alum）マカーク中で、より強かった（図２７および図２８）。
【０２５１】
リンパ増殖性の応答は、BおよびTリンパ球の両方に対するTヘルパー応答の良好な指標、最適なおよび耐久性のある抗体の確立のための決定的な事象、ならびにCTL応答であると考えられる。従って、Tヘルパー応答を、Tat抗原Tatcys22変異体またはTatペプチドのプールとして利用することによって測定した。これは、本発明者の前記のデータが、サル中のTatwtタンパク質（Tatcys22変異体またはTatペプチドのプールではない）が、特異的応答の測定を阻害するT細胞増殖を非特異的に活性化するからである。それらは、Tat＋Alum群（図２９）によって免疫化されたマカーク中で観察されたものと比較して、より低くまたはより少なく、一貫して検出されたが、Tatcys22またはTatペプチドのプールのいずれかへの増殖性の応答は、H1D-Tatをワクチン接種したサル中で検出された。Tatcys22変異体またはTatペプチドのプールに応答する細胞を分泌するIFN-γが、Elispotアッセイで測定される場合、応答の同様のパターンはまた、観察された（図３０）。抗体については、Tat+Alum群（図２９および図３０、パネルＡ）と比較すると、特に増殖性の応答（図２９）と比較する場合、細胞応答の発現の動態は、H1D-Tat群（図４１および図４２、パネルＢ）中で、いくぶん遅れた。再び、応答の大きさおよび耐久性における一定の変異性は、両方の実験群（図２９および図３０、パネルＡおよびＢ）中で示された。しかしながら、それぞれの動物に対して、６匹のサル中からの５匹で、良好な相互関係が、免疫応答の異なる測定中で見出され、発見の重要性を強化した(strenghtening)(図２７〜図３０)。
【０２５２】
結論として、これらの予備データは、H1D-Tat微粒子による筋内のワクチン接種が、マカーク中で、安全および免疫原性であったことを示す。抗原用量の効果、投与の経路、接種物の数を評価する更なる調査が、H1D-Tat微粒子の免疫原性を最適化するのに必要である。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】図１は、塩基性(HE1D；A)および酸性(H1D；B)微粒子上へのBSA(黒丸)およびトリプシン(黒四角)吸着を示す。
【図２】図２は、モデル酸性タンパク質β-ガラクトシダーゼを吸着するH1D酸微粒子を示す。H1D微粒子を、増加量のタンパク質とインキュベートした。H1D/β-ガラクトシダーゼ複合体を遠心分離し、上清み(非結合タンパク質)を回収し、SDS-PAGEにより解析した。ペレット(H1D/β-ガラクトシダーゼ複合体)をPBS中で洗浄し、30 mlのNaCl 0.9%、リン酸塩バッファー5 mM中に再懸濁した。試料を5分間煮沸し、13.000で15分間スピンした。上清み(結合タンパク質)SDS-PAGE上に負荷し、銀染色によって解析した。デンシトメータゲル解析装置を用い、材料および方法に記載のようにして、定量を行なった。
【図３】図３は、酸微粒子上のトリプシン吸着を示す。
【図４】図４は、酸微粒子上のBSA吸着を示す。
【図５】図５は、酸微粒子上のトリプシン吸着の表面電荷密度依存性を示す。
【図６】図６は、水中に懸濁したトリプシン/H1D複合体のZP 変化量(variation)を示す。
【図７】図７は、H1D酸微粒子上のタンパク質吸着を示す。
【図８】図８は、酸微粒子(H1D)上のトリプシン吸着のpH依存性を示す。吸着に利用可能なトリプシンの量は、50μg/ml(黒菱形)、150μg/ml(黒丸)および300μg/ml(黒四角)であった。
【図９】図９は、バッファーイオン強度の関数としての、酸微粒子(H1D)上のトリプシン吸着を示す。
【図１０】図１０は、NaClおよび／またはSDSの存在下での酸微粒子(H1D)からのトリプシン放出を示す。２つの独立した実験を示す。吸着に利用可能なトリプシンの量は、250μg/ml(A)および150μg/ml(B)であった。
【図１１】図１１は、抗Tat ポリクローナルウサギ血清を用いたFACS解析による酸ポリマー系微粒子の表面へのTat吸着の解析を示す。２種類の代表的な微粒子、A7（ポリ(スチレン)とヘミスクシナート化ポリビニルアルコールから構成される）(黒丸)および1E（ポリ(メタクリル酸メチル)とEudragit L100-55からなる）(黒四角)を示す。
【図１２】図１２は、微粒子単独またはTat/微粒子複合体の存在下での細胞増殖の評価を示す。HL3T1細胞は、96時間、10μg/ml(白いバー)、30μg/ml(黒いバー)および50μg/ml(灰色のバー)の微粒子単独とともに(A)、またはTat(1μg/ml)に結合させた同じ投与量の微粒子とともに(B)培養した。対照は、未処置細胞(無)または1μg/mlのTat(Tat)とともに培養した細胞で示した。結果は６回の平均(±S.D.)で示す。
【図１３】図１３は、2H1B微粒子のインビトロ細胞傷害性解析を示す。(A)2H1B、(B)2H1B /Tat。HL3T1細胞を、96時間、増加量の2H1B単独(10〜500μg/ml)の存在下で(左パネル)、またはTatタンパク質(1μg/ml)と結合させた同じ投与量の2H1Bとともに(右パネル)培養した。対照は、未処置細胞(無)または1μg/mlのTat(Tat)単独で培養した細胞で示した。結果は６個のウェルの平均(±SD)で示す。
【図１４】図１４は、ポリ(スチレン)とヘミスクシナート化ポリ(ビニルアルコール)で構成されたポリマー系微粒子およびポリ(メタクリル酸メチル)とEudragit L100-55で構成された微粒子のマウスマクロファージ食作用を示す。マウスマクロファージを、微粒子とともに培養し、固定し、トルイジンブルーで染色し、位相差顕微鏡で観察した。結果を、微粒子に食作用した細胞の割合として示す。
【図１５】図１５は、微粒子取込みの解析を示す。ヒト単球(A)、単球由来樹状細胞(B)、マウス脾細胞(C)およびHL3T1細胞(D)を、蛍光H1D微粒子の存在下で、24時間培養し、パラホルムアルデヒド(paraformaldheyde)で固定し、蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡で観察した。蛍光顕微鏡検査の代表的な画像をパネルA、BおよびCに、共焦点顕微鏡検査の代表的な画像をパネルDに示す。
【図１６】図１６は、ポリマー系微粒子がHIV-1 Tatを細胞内に送達および放出することを示す。HL3T1細胞は、Tat(5μg/ml)に結合させた蛍光-H1D(30μg/ml)の存在下で(A)、またはTat単独(5μg/ml)とともに(B)培養し、固定し、抗Tat モノクローナル抗体を用いた免疫蛍光により、解析した。同じ顕微鏡視野について、緑(H1D)、赤(Tat)、青(DAPI)および位相差(細胞)画像を、CCDカメラで撮影し、Adobe Photoshopプログラムでオーバーラップ(overlap)させた。
【図１７】図１７は、ポリ(スチレン)とヘミスクシナート化ポリ(ビニルアルコール)で構成されたポリマー系微粒子(A4、A7)に結合させたHIV-1 Tatタンパク質、およびポリ(メタクリル酸メチル)とEudragit L100-55で構成されたポリマー系微粒子(1D、1EおよびH1D)に結合させたHIV-1 Tatタンパク質の発現の解析を示す。HL3T1細胞を、増加量のTat単独とともに、および各微粒子(30μg/ml)に結合させた同じ量のTatとともにインキュベートした。CAT活性を48時間後に測定した。結果は３回の独立した実験の平均である。
【図１８】図１８は、2H1B微粒子に結合させたTatの生物学的活性の解析を示す。(A)2H1B/Tat、(B)H1D /Tat；および(C)Tat単独。プラスミドHIV-1-LTR-CATの組込まれたコピーを含有するHL3T1細胞（この場合、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子の発現は、HIV-1 LTRプロモーターにより誘導され、生物学的に活性なTatの存在下でのみ起こる）を、2H1B微粒子(30μg/ml)に結合させた増加量のTat(0.125、0.5および1μg/ml)とともに、または同じ投与量のTat単独とともに、100μMクロロキノンの存在下で、インキュベートした。対照は、H1D/Tat複合体(30μg/mlのH1Dならびに0.125、0.5および1μg/mlのTat)および未処置細胞(無)とともにインキュベートした細胞とした。48時間後、CAT活性を細胞抽出物において測定し、タンパク質含量に対して標準化した。結果は、３回の独立した実験の平均(±SD)である。
【図１９】図１９は、新たに作製し、凍結乾燥し室温で保存した後のH1D/Tat複合体の生物学的活性の解析を示す。プラスミドHIV-1-LTR-CATの組込まれたコピーを含有するHL3T1細胞（この場合、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子の発現は、HIV-1 LTRプロモーターにより誘導され、生物学的に活性なTatの存在下でのみ起こる）を、凍結乾燥し該複合体を室温で保存した後のH1D微粒子に結合させたTatの生物学的活性を試験するために使用した。Tat/H1D複合体は、実施例に記載のようにして、Tat(2μg/ml)およびH1D微粒子(30μg/ml)を用いて調製した。複合体を、凍結乾燥し、室温で15日間保存し、PBS中に室温で1時間(1h)または4時間(4h)再懸濁し、次いで、細胞に100μMクロロキノンの存在下で添加した。対照は、調製し、細胞にすぐに添加したH1D/Tat複合体(新鮮)、Tat単独(Tat)および未処置細胞(無)とともにインキュベートした細胞とした。48時間後、CAT活性を細胞抽出物において測定し、タンパク質含量に対して標準化した。
【図２０】図２０は、ポリマー系微粒子がHIV-1 Tatを酸化から保護することを示す。レポーターベクターHIV-1 LTR-CATの組込まれたコピーを含有するHL3T1細胞を、微粒子(30μg/ml)に吸着させたTat(1μg/ml)とともにインキュベートし、空気および光に16時間、室温で曝露した。対照細胞は、同じ投与量の、未処置(Tat)または空気および光への曝露により酸化した(Tat ox)タンパク質とともにインキュベートした。CAT活性の割合を記載(Bettiら, Vaccine, 2001；19:3408-3419)のようにして算出した。結果は、２つの独立した実験の平均である。
【図２１】図２１は、新たに作製し、凍結乾燥し室温で保存した後のTat/H1D-fluo微粒子複合体の生物学的活性の解析を示す。プラスミドHIV-1-LTR-CATの組込まれたコピーを含有するHL3T1細胞（この場合、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子の発現は、HIV-1 LTRプロモーターにより誘導され、生物学的に活性なTatの存在下でのみ起こる）を、凍結乾燥し該複合体を室温で保存した後のH1D-fluo微粒子に結合させたTatの生物学的活性を試験するために使用した。Tat/H1D-fluo複合体は、材料および方法に記載のようにして、Tat(2μg/ml)およびH1D-fluo微粒子(30μg/ml)を用いて調製した。複合体を、凍結乾燥し、室温で15日間保存し、PBS中に室温で1時間(1h)または4時間(4h)再懸濁し、次いで、細胞に100μMクロロキノンの存在下で添加した。対照は、新たに調製したH1D/Tat複合体(新鮮)、Tat単独(Tat)および未処置細胞(無)とともにインキュベートした細胞とした。48時間後、CAT活性を細胞抽出物において測定し、タンパク質含量に対して標準化した。
【図２２】図２２は、H1D-fluo微粒子が、細胞によってインビボで取り込まれることを示し、生体分布(biodistribution)試験ためのツールを表す。注射部位でのH1D-蛍光微粒子の細胞取込みの解析、播種後、15(パネルAおよびC)ならびに30(パネルBおよびD)分後。同じ顕微鏡視野について、緑(H1D-蛍光)および青(核)のオーバーラップさせた画像を示す。それぞれ、パネルAおよびBの白い枠内に示されるA、B：倍率40×；C, D：倍率100×の画像。
【図２３】図２３は、Tat/微粒子複合体でワクチン接種した（第０週および第４週）マウスの脾細胞から放出されたγIFNの解析を示す。第２回の免疫処置から２週間後に得られた脾細胞を、処置群からプールし、BALB/c 3T3-Tat発現細胞と、Tatの存在下で、４日間共培養した。結果を、培養上清み中に放出されたγIFNのpg/mlとして示す。
【図２４】図２４は、A4/Tat(A)、H1D/Tat(B)または単にTat(C)として送達されるTat由来15量体ペプチドに応答したT細胞増殖(左パネル)およびγIFN放出(右パネル)の解析を示す。第０週および第４週に免疫処置し、第２回目の免疫処置の２週間後に屠殺したマウスの脾細胞を、処置群からプールし、BALB/c 3T3-Tat発現細胞と、Tatの存在下で、４日間共培養した。Ficoll精製後、細胞を、放射線照射し、かつTatペプチドをパルスした未処置脾細胞とともに、PHAをともなって、または伴わずに培養した。培養上清みにおけるγIFN放出およびT細胞3[H]チミジン取り込みを、それぞれ、培養の24 および96時間後に測定した。反応性ペプチドに対する結果のみを示し、これらを、PHAなしで成長させた同じ培養物の値と比べた、3[H]チミジン取り込みおよび放出の増加の倍数(fold)として示す。
【図２５】図２５は、播種部位に存在する炎症性反応の組織学的検査を示す。２つの代表的なマウスに、A7微粒子に吸着させたTat(2μg)(A、C)およびフロイントアジュバント中のTat(2μg)(B, D)の筋肉内注射を、第0、4および8週に与えた。A7-Tat播種は、排他的にマクロファージからなる筋線維(C)において若干の炎症性反応(A)を引き起こした。Tatに加えてFreundの播種は、強い炎症性反応を、筋線維周囲の脂肪組織の広範囲に、マクロファージおよび脂肪分解の明白な裂孔の存在を伴って誘導し(B)、場合によっては、不定形な物質および核残屑により構成される広範囲の壊死を伴った(D)。ヘマトキシリン-エオシン染色；AおよびB：40×；C：400×；およびD：200×。
【図２６】図２６は、HE1D 塩基性微粒子に結合するオボアルブミン(酸性タンパク質)を示す。HE1D微粒子を、増加量のオボアルブミンとともにインキュベートした。HE1D/オボアルブミン複合体を遠心分離し、上清み(非結合タンパク質)を回収し、SDS-PAGEにより解析した。ペレット(HE1D/オボアルブミン複合体)をPBS中で洗浄し、30 mlのNaCl 0.9%、リン酸塩バッファー5 mM中に再懸濁した。試料を5分間煮沸し、13.000で15分間スピンした。上清みを(結合タンパク質)SDS-PAGE上に負荷し、銀染色によって解析した。デンシトメータゲル解析装置を用い、材料および方法に記載のようにして、定量を行なった。
【図２７】図２７は、ワクチン接種したサルにおけるTatに対するIgM抗体価を示す。
【図２８】図２８は、ワクチン接種したサルにおけるTatに対するIgG抗体価を示す。
【図２９】図２９は、Tatcys22またはTatペプチドのプールに対するワクチン接種したサルのリンパ増殖性応答を示す。
【図３０】図３０は、Tatcys22またはTatペプチドのプールに応答したワクチン接種したサルのIFNγ-Elispotアッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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