(57)【要約】  本発明は、新規ペプチド系化合物並びに画像診断法におけるそれらの使用に関する。さらに具体的には、本発明は、血管新生に関連する受容体に結合するターゲティングベクターとしての上記ペプチド系化合物の使用に関する。この化合物はフルオレセインで標識され、血管新生関連疾患の診断における造影剤として使用し得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドベクターと１以上のフルオレセイン色素を含む化合物又はその生理学的に許容される塩であって、ペプチドベクターがアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含んでいて、ペプチドベクターとフルオレセイン色素が連結している化合物又はその生理学的に許容される塩。
式中、Ｘ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表す。
【請求項２】
２つの環化架橋を含んでいて次の式Ｉで表される、請求項１記載の化合物。
Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｄ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７        （Ｉ）
式中、Ｘ３、Ｇ及びＤは請求項１で定義した通りであり、
ＲａはＸ２、Ｘ４又はＸ６のいずれかと架橋を形成する−（ＣＨ２）ｎ−又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−を表し（式中、ｎは１〜１０の正の整数を表す。）、
Ｘ１は結合又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸残基を表し、１つのアミノ酸残基が適宜スペーサー部分で官能化されているか、或いはアミノ酸残基は酸又はアミン基のような官能性側鎖を有し、
Ｘ２及びＸ４は各々独立に環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、
Ｘ６は環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ７はスペーサー又はバイオモディファイヤー部分であるか、或いは存在せず、
当該化合物は、Ｘ１、Ｘ６又はＸ７基の１以上に適宜スペーサー基を介して連結したフルオレセイン色素を表す１以上のＺ基をさらに含む。
【請求項３】
以下のいずれかの式から選択される、請求項２記載の化合物。
【化１】
2007528846.tif 000020
式中、Ｒａ、Ｘ１、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ５、及びＸ７は請求項１及び請求項２で定義した通りであり、
Ｘ２、Ｘ４及びＸ６はジスルフィド又はチオエーテル結合を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｗ１はスペーサー部分であるか、或いは存在せず、
ｈは１又は２の正の整数であり、
フルオレセイン色素を表すＺ基が少なくとも１つ存在する。
【請求項４】
Ｒａが−（ＣＨ２）−を表す、請求項３記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項５】
Ｘ１が酸又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、該アミノ酸がアスパラギン酸、リシン、グルタミン酸、ホモリシン又はジアミノアルキル酸又はその誘導体から選択される、請求項３又は請求項４記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項６】
Ｘ２、Ｘ４及びＸ６が各々独立にシステイン又はホモシステイン残基を表す、請求項３乃至請求項５のいずれか１項記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項７】
Ｘ３がアルギニンを表す、請求項３乃至請求項６のいずれか１項記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項８】
Ｘ５がフェニルアラニン、チロシン、３−ヨード−チロシン又はナフチルアラニンを表す、請求項３乃至請求項７のいずれか１項記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項９】
Ｘ７が１〜１０単位の単分散ＰＥＧ構成単位を含むか、或いは存在しない、請求項３乃至請求項８のいずれか１項記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物の有効量を、薬学的に許容される１種以上の補助剤、賦形剤又は希釈剤と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
光学イメージング用造影剤として用いられる請求項１乃至９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
造影剤をヒト又は動物の身体に投与してヒト又は動物の身体の少なくとも一部分の画像を生成させる診断法に用いられる光学イメージング用造影剤の製造における、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項１３】
造影剤をヒト又は動物の身体に投与して造影剤が分配された身体の少なくとも一部分の画像を生成させる光学イメージングによるヒト又は動物の身体の画像生成方法であって、該造影剤が請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド系化合物並びに画像診断法又は疾患治療におけるそれらの使用に関する。さらに具体的には、本発明は、血管新生に関連する受容体に結合するターゲティングベクターとしての上記ペプチド系化合物の使用に関する。この化合物は血管新生関連疾患の診断における造影剤として使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
一般に、新しい血管は脈管形成と血管新生という２つの異なる機序で形成される。血管新生は既存の血管からの枝分れによる新しい血管の形成である。このプロセスに対する主な刺激として、組織内の細胞への栄養及び酸素の不十分な供給（低酸素）がある。細胞は血管新生因子の分泌によって応答することがある。血管新生因子は多数存在するが、しばしば言及されるその一例は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。これらの因子は、基底膜のタンパク質を分解するタンパク分解酵素の分泌だけでなく、かかる潜在的に有害な酵素の作用を制限する阻害剤の分泌も惹起する。血管新生因子のもう一つの顕著な作用は内皮細胞を遊走させ分裂させることである。血管の反管腔側に連続層をなす基底膜に付着した内皮細胞は有糸分裂を起こさない。付着の喪失と血管新生因子受容体からのシグナルとの複合作用によって、内皮細胞の移動、増殖及び再配列が起こり、最終的には新血管周囲に基底膜が合成される。
【０００３】
血管新生は創傷治癒及び炎症過程を始めとする組織の増殖及びリモデリングに重要である。血管新生の阻害は抗腫瘍療法の有望な方策であると考えられる。血管新生に伴う形質転換も診断に極めて有望であり、明らかな例は悪性疾患であるが、この方策は、炎症及びアテローム性動脈硬化症を始めとする様々な炎症関連疾患にも極めて有望である。初期アテローム性動脈硬化病変のマクロファージは血管新生因子の潜在的発生源である。これらの因子は心筋梗塞の血管再生にも関与しており、狭窄が短時間で解放された場合にみられる。
【０００４】
新脈管形成又は血管新生、つまり新血管の発生又は増殖に関連した望ましくない病態を以下に示す。これに関しては国際公開第９８／４７５４１号も参照できる。
【０００５】
血管新生に関連した疾患及び適応症は例えば様々な形態の癌及び転移、例えば乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌又は卵巣癌である。
【０００６】
その他の疾患及び適応症は、炎症（例えば慢性）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ及び歯肉炎である。
【０００７】
血管新生に関連したさらに別の疾患及び適応症は、動静脈奇形、星細胞腫、絨毛癌、グリア芽細胞種、神経膠腫、血管腫（小児性、毛細血管性）、肝細胞腫、過形成性子宮内膜症、虚血性心筋症、子宮内膜症、カポジ肉腫、黒色腫、神経芽細胞腫、閉塞性末梢動脈疾患、骨関節炎、乾癬、網膜症（糖尿病性、増殖性）、強皮症、精上皮腫及び潰瘍性大腸炎である。
【０００８】
血管新生には、内皮細胞及び周囲組織に特有の受容体が関与する。これらのマーカーとしては、ＶＥＧＦのような増殖因子受容体及びインテグリンファミリーの受容体がある。免疫組織化学的研究によって、様々なインテグリン（最も重要なのはおそらくαｖクラス）が血管の頂端面で発現され［Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｂｌｏｏｄ  ８０：  ３７−４４６］、循環リガンドによるターゲティングに利用できる［Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：  ５４２−５４６］ことが示されている。α５β１も、フィブロネクチンマトリックスの構築を促進し、フィブロネクチンへの細胞付着を起こす重要なインテグリンである。α５β１は細胞遊走にも重要な役割を果たす。
【０００９】
インテグリンαｖβ３は血管新生との関連が知られている受容体の一つである。αｖβ３インテグリン受容体／リガンド相互作用の拮抗剤がアポトーシスを惹起して血管増殖を阻害するので、血管新生プロセスの臨界期における刺激を受けた内皮細胞の生存はこの受容体に依存していると考えられている。
【００１０】
インテグリンはヘテロ二量体分子であり、αサブユニットとβサブユニットが細胞膜脂質二重層を貫通している。αサブユニットはその細胞外鎖に４つのＣａ２＋結合ドメインを有し、βサブユニットはシステインリッチな細胞外ドメインを多数有している。
【００１１】
細胞接着に関与するリガンド（例えばフィブロネクチン）の多くはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のトリペプチド配列を含んでいる。ＲＧＤ配列は、この配列を提示するリガンドと細胞表面の受容体との間の一次認識部位として作用すると考えられている。リガンドと受容体の二次的相互作用は上記相互作用の特異性を高めると一般に考えられている。こうした二次的相互作用は、リガンドと受容体のＲＧＤ配列に直接隣接した部分又はＲＧＤ配列から離れた部位で起こり得る。
【００１２】
ＲＧＤペプチドは様々なインテグリン受容体に結合することが知られており、臨床に重要な用途をもつ数多くの細胞内事象を調節できる可能性がある。最も広く研究されたＲＧＤペプチドとその模倣体の作用は抗血栓剤としての使用に関するものであり、これらは血小板インテグリンＧｐＩＩｂＩＩＩａをターゲットとする。
【００１３】
αｖβ３又はαｖβ５拮抗剤の投与による組織内での血管新生の阻害は例えば国際公開第９７／０６７９１号及び同第９５／２５５４３号に記載されており、抗体又はＲＧＤ含有ペプチドが用いられている。欧州特許出願公開第５７８０８３号には、一群の単環式ＲＧＤ含有ペプチドが記載されている。
【００１４】
複数の架橋を含む環状ＲＧＤペプチドも、国際公開第９８／５４３４７号及び同第９５／１４７１４号に記載されている。
【００１５】
ＲＧＤ含有ペプチド系化合物のその他の例は、国際公開第０１／７７１４５号、同第０２／２６７７６号及び同第０３／００６４９１号にみられる。
【特許文献１】国際公開第９８／４７５４１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／０６７９１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／２５５４３号パンフレット
【特許文献４】欧州特許出願公開第５７８０８３号明細書
【特許文献５】国際公開第９８／５４３４７号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９５／１４７１４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／７７１４５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０２／２６７７６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０３／００６４９１号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｌｏｏｄ  ８０：  ３７−４４６
【非特許文献２】Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：  ５４２−５４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
血管新生関連疾患のためのさらに特異的な非侵襲性イメージング技術を開発する臨床上のニーズが存在する。かかるイメージング技術は、新しい抗血管新生治療の評価に中心的役割を果たすであろう。血管新生の実際のレベルの評価が可能になると、血管新生関連疾患の初期段階での診断に臨床上有益である。今回、血管新生のレベルの評価に光学イメージングを使用し得るという予想外の知見が得られ、本発明はこの目的のための新規光学イメージング用造影剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
当技術分野のニーズに鑑みて、本発明は、光学イメージングにおける造影剤として或いは治療に用いられるフルオレセインで標識したペプチド系化合物を提供する。血管新生に関連するインテグリン受容体のインビボでの効率的ターゲティング及びイメージングには、化学的に頑強かつ安定で選択的かつ親和性の高いＲＧＤ系ベクターが要求される。さらに、バックグラウンドノイズに付随する問題を軽減するための造影剤の設計に際しては、排泄経路が重要な要因である。これらの厳しい条件は、本明細書に記載したフルオレセイン標識ペプチド化合物によって満足される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、その一態様では、特許請求の範囲に記載した新規ペプチド系化合物を提供する。これらの化合物はインテグリン受容体に対する親和性（例えばインテグリンαｖβ３に対する親和性）を有しており、フルオレセイン色素リポーターで標識されている。
【００１９】
本化合物又はその生理学的に許容される塩はペプチドベクターと１以上のフルオレセイン色素を含んでおり、ペプチドベクターはアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含んでいて、ペプチドベクターとフルオレセイン色素は好ましくは共有結合で連結されている。Ｘ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表す。ペプチドベクターは、αｖβ３受容体のようなインテグリン受容体に対して親和性を有する。
【００２０】
本発明の化合物は、インテグリン受容体に対する親和性を有するアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含む。本化合物は好ましくは追加のアミノ酸、適宜他の部分を含み、Ｘ３−Ｇ−Ｄ配列はインテグリン型受容体に結合するベクターとして機能するペプチドベクターの結合座である。
【００２１】
本発明の化合物は、例えばペプチドベクター部における１以上の環化架橋の形成によって束縛させることができる。単環式ペプチド化合物は、アミノ酸間のジスルフィド結合又はチオエーテル結合の形成によって得ることができる。１つの環化架橋を含むペプチド系化合物は、直鎖ペプチドよりもαｖβ３に対する特異的が高く、一段と好ましい。本発明の化合物は、好ましくはその異なるアミノ酸間に２つの環化架橋を含む。「環化架橋」という用語は、アミノ酸同士の組合せ又はアミノ酸と橋かけし得る官能基をもつ−（ＣＨ２）ｎ−又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−基との組合せをいう。ｎは１〜１０の正の整数を表す。幾つかの好ましい例は、ジスルフィド、−（ＣＨ２）４−カルバ橋のようなジスルフィド模倣体、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオン又はランチオニン）並びにエステル及びエーテルを含む架橋である。好ましくは、１つの架橋がジスルフィド結合を形成し、第二の架橋はチオエーテル（スルフィド）結合を含む。
【００２２】
もう一つの実施形態では、本発明の化合物は次の式（Ｉ）で表され、２つの環化架橋を含む。
【００２３】
Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｄ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７        （Ｉ）
式中、Ｘ３、Ｇ及びＤは既に定義した通りである。
ＲａはＸ２、Ｘ４又はＸ６のいずれかと架橋を形成する−（ＣＨ２）ｎ−又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−を表す（式中、ｎは１〜１０の正の整数を表す。）。
Ｘ１は結合又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸残基を表し、１つのアミノ酸残基は適宜スペーサー部分で官能化され、好ましくは、該アミノ酸残基は酸又はアミン基のような官能性側鎖を有していて、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ホモリシン、ジアミノアルキル酸又はジアミノプロピオン酸から選択される。
Ｘ２及びＸ４は各々独立に環化架橋を形成し得るアミノ酸残基、例えばジスルフィド又はチオエーテル結合を形成するシステインやホモシステイン残基、その他アスパラギン酸やリシンのように環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表す。好ましくは、Ｘ２及びＸ４はシステイン又はホモシステインの残基を表す。
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン又はナフチルアラニン残基、さらに好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨード−チロシン残基を表す。
Ｘ６は環化架橋を形成し得るアミノ酸残基、好ましくはチオール含有アミノ酸残基、好ましくはシステイン又はホモシステイン残基を表す。
Ｘ７はスペーサー又はバイオモディファイヤー部分であるか存在せず、好ましくは単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を１〜１０単位含むものであり、バイオモディファイヤーは薬剤の薬物動態及び血液クリアランス速度を変化させる機能を有する。また、Ｘ７は１〜１０個のアミノ酸残基を表すものでもよく、好ましくはグリシン、リシン、アスパラギン酸又はセリンを含む。さらに好ましくは、Ｘ７はアミノ酸残基とＰＥＧ様構造を共に含むスペーサー又はバイオモディファイアー、例えば１〜１０個のアミノ酸残基とＰＥＧ様構造の組合せ、好ましくはビスアミノエチルエチレングリコールグリシンの組合せである。好ましい実施形態では、Ｘ７は単分散ＰＥＧ様構造の式（ＩＩ）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸からなる単位を表す。
【００２４】
【化１】
2007528846.tif 000002
式中、ｍは１〜１０の整数であり、Ｃ末端はアミド又は酸部分である。バイオモディファイヤーＸ７が化合物の薬物動態及び血液クリアランス速度を変化させることが判明した。バイオモディファイアー基は化合物の組織（筋肉、肝臓など）への取り込みを低減し、バックグラウンド干渉が低減するので診断画像が向上する。バイオモディファイヤーの追加の利点として、分泌は主に腎臓を経る。
【００２５】
本化合物は、さらに、Ｘ１、Ｘ６又はＸ７の１以上に適宜スペーサー基を介して連結したフルオレセイン基を表す１以上のＺ基を含む。
【００２６】
ペプチド系化合物は、式ＩのＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６で形成されるアミノ配列によって規定されるペプチドベクターを含み、このペプチドは血管新生に関連するインテグリン受容体に対して親和性をもつターゲティングベクターをなす。
【００２７】
環化架橋の配置に応じて、本化合物は「離散」、「ネステッド」又は「交差」立体配置を含む。好ましくは、各化合物における２つの架橋は以下の通りである。
ＲａとＸ６の間及びＸ２とＸ４の間（ネステッド立体配置を形成）、
ＲａとＸ２の間及びＸ４とＸ６の間（離散立体配置）、
ＲａとＸ４の間及びＸ２とＸ６の間（交差立体配置を形成）。
【００２８】
別の実施形態では、本発明の化合物は以下のいずれかの式で規定される。
【００２９】
【化２】
2007528846.tif 000003
式中、Ｒａ、Ｘ１、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ５、及びＸ７は式Ｉで定義した通りである。
Ｘ２、Ｘ４及びＸ６はシステイン又はホモシステインのようにジスルフィド又はチオエーテル結合を形成し得るアミノ酸残基を表す。
Ｗ１はスペーサー部分であるか存在せず、好ましくは、例えば式ＩＩについて挙げた部分を始め、グルタル酸及び／又はコハク酸及び／又はポリエチレングリコール系単位から誘導されるもので、フルオレセイン色素をペプチドに連結する。その他の代表的なスペーサー（Ｗ１）要素としては、構造型の多糖類、貯蔵型の多糖類、ポリアミノ酸及びそのメチル及びエチルエステル、ポリペプチド、オリゴ糖及びオリゴヌクレオチドが挙げられ、酵素切断部位を含んでいても含んでいなくてもよい。スペーサー部分Ｗ１の役割は、ペプチド成分の受容体結合ドメインから比較的嵩高い色素を離隔することである。
ｈは１又は２の正の整数である。
また、フルオレセイン色素を表すＺ基が少なくとも１つ存在する。
【００３０】
本化合物は好ましくはＺ基を１個しか含まない。
【００３１】
Ｚで表されるフルオレセイン色素はＸ１、Ｗ１、Ｘ６又はＸ７と好ましくはアミド結合の形成によって連結し得る。
【００３２】
好ましい態様では、式ＩＩＩ〜Ｖの化合物又はその生理学的に許容される塩は以下に挙げる特徴を有する。
【００３３】
Ｒａは好ましくは−（ＣＨ２）−を表す。
【００３４】
さらに、Ｘ１は酸又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸、リシン、ホモリシン、ジアミノアルキル酸又はジアミノプロピオン酸、さらに好ましくはアスパラギン酸又はリシンから選択される。
【００３５】
Ｘ２、Ｘ４及びＸ６は好ましくは各々独立にシステイン又はホモシステイン残基を表す。
【００３６】
Ｘ３は好ましくはアルギニンを表す。
【００３７】
Ｘ５は好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン又はナフチルアラニン、さらに好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨード−チロシンを表す。
【００３８】
Ｘ７及びＷ１は各々式Ｉ及びＩＩ〜Ｖで定義した通りである。好ましくは、Ｘ７は１〜１０単位の単分散ＰＥＧ構成単位を含むか存在せず、Ｗ１は好ましくは存在しない。
【００３９】
Ｚはフルオレセイン色素を表すか或いは存在しないが、化合物が１以上のフルオレセイン色素を含むようにする。
【００４０】
好ましい態様では、化合物は式ＩＩＩ（ネステッド）のもの又は生理学的に許容されるその塩であり、さらに好ましくは上述の好ましい態様で挙げた特徴を有する。
【００４１】
式ＩＩＩ〜Ｖの化合物は２以上の架橋を含んでいて、１つの架橋はジスルフィド結合を形成し、第二の架橋はチオエーテル（スルフィド）結合を含む。式ＩＩＩの好ましい化合物は、架橋によってペプチド部分が「ネステッド」立体配置に折り畳まれるように架橋が配置される。そこで、本発明のこの実施形態の化合物は、１分子部分当たり最大１個のジスルフィド架橋を有する。本発明で規定する化合物は、生体内だけでなく、フルオレセイン標識する際に用いられる条件下で驚異的な安定性を有する。
【００４２】
リポーターＺはフルオレセイン色素、つまりフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体を含む。フルオレセインは黄色色素であり、可視光域で発光する。フルオレセインは典型的にはアルゴンレーザーの４８８ｎｍ線で励起され、５３０ｎｍに発光が認められる。フルオレセイン及びその誘導体は吸光率が比較的高く、蛍光量子収率二優れ、良好な水溶性を有する。過去に大量に使用されているので、これらの特性は十分に明らかにされており、入手が容易で、概してｍｇ当たりの価格が低い。
【００４３】
次の式（ＶＩ）に、フルオレセインを位置番号と共に示す。
【００４４】
【化３】
2007528846.tif 000004
フルオレセインの関連誘導体には、例えばカルボキシフルオレセインがあり、次の式ＶＩＩに示す５−カルボキシフルオレセイン、又は６−カルボキシフルオレセインがある。
【００４５】
【化４】
2007528846.tif 000005
もう一つの関連フルオレセイン誘導体は式ＶＩＩＩに示すフルオレセインイソチオシアネートである。
【００４６】
【化５】
2007528846.tif 000006
さらに一段と好ましいのは、フルオレセインの活性カルボン酸エステル、例えば式ＩＸに示すＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（「フルオレセインＮＨＳエステル」と呼ばれる）を用いることである。スクシンイミジルエステルは、形成されるアミド生成物の安定性が非常に高いので、優れた試薬である。
【００４７】
【化６】
2007528846.tif 000007
Ｚで表されるフルオレセイン色素は、式ＩのＸ１、Ｘ６又はＸ７に、適宜式ＩＩＩ〜Ｖに示すスペーサーＷ１を介して連結し得る。好ましくは、フルオレセインは、ペプチドの適当なアミノ基とのアミド結合の形成によってペプチドベクターにカップリングされる。このような化合物の合成には、フルオレセインの活性エステル、例えばＮＨＳエステル（Ｐｉｅｒｃｅ社カタログ番号４６１００）が特に有用であると考えられる。フルオレセインの好ましいカップリング部位は５位及び６位である。
【００４８】
アミノ酸は好ましくは天然に存在するアミノ酸を表す。多くの事例では、ペプチドのアミノ酸はすべてＬ型であるのが好ましい。ただし、実施形態によっては、ペプチドの１、２又は３個以上のアミノ酸がＤ型であるのが好ましい。かかるＤ型アミノ酸の導入は化合物の血清安定性に多大な影響をもつことがある。
【００４９】
本発明の化合物の幾つかは高親和性ＲＧＤ系ベクターである。本明細書で用いる「高親和性ＲＧＤ系ベクター」という用語は、αｖβ３インテグリンの競合結合アッセイで既知の高親和性リガンドであるエキスタチンとの競合によってＫｉ値を求めたときに＜１０ｎＭ、好ましくは＜５ｎＭのＫｉを有する化合物をいう。かかる競合アッセイの実施方法は当技術分野で周知である。
【００５０】
以下、本発明の好ましい化合物の例を幾つか例示する。化合物Ａ及びＢはフルオレセインをアミド結合の形成によってＲＧＤ含有ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓにコンジュゲートしもので、いずれも「ネステッド」立体配置を与える。
【００５１】
化合物Ａ及びＢ：
【００５２】
【化７】
2007528846.tif 000008
本発明の化合物のその他の例を以下の化合物Ｃ及びＤで例示する。
【００５３】
化合物Ｃ：
この化合物はＲＧＤペプチド（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）をフルオレセインに連結したもので、「離散」立体配置を形成する。
【００５４】
【化８】
2007528846.tif 000009
化合物Ｄ：
この化合物はＲＧＤ−ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）をフルオレセインに連結したもので、「交差」立体配置を形成する。
【００５５】
【化９】
2007528846.tif 000010
本発明の新規化合物は、光学イメージング用造影剤として又は疾患治療用に使用し得る。したがって、上記化合物の治療用又は光学イメージング用造影剤としての使用は、本発明の一実施形態をなす。本発明の好ましい実施形態は、光学イメージング用造影剤用、特に血管新生関連疾患の光学イメージング及び診断用の上記化合物である。
【００５６】
本発明の化合物は、ヒト及び動物における血管新生の検出のための造影剤として有用である。本生成物は前臨床動物モデルにも有用である可能性があり、製薬研究、例えば腫瘍学での新薬の治療効果のモニタリングが可能となる。
【００５７】
本発明は、本発明の化合物又はその塩の有効量（例えばインビボイメージングで画像コントラストの強調に有効な量）を、薬学的に許容される１種以上の補助剤、賦形剤又は希釈剤と共に含んでなる医薬組成物も提供する。
【００５８】
本発明は、さらに、本発明の化合物又はその塩の有効量を、薬学的に許容される１種以上の補助剤、賦形剤又は希釈剤と共に含んでなる疾患治療用の医薬組成物も提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、造影剤をヒト又は動物の身体に投与して身体の少なくとも一部分の画像を生成させる診断法に用いられる光学イメージング用造影剤の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【００６０】
そこで、ヒト又は動物の身体の治療組成物（医薬品）の製造並びに治療又は予防的治療法、好ましくは血管新生関連疾患の治療法における上記化合物の使用は、本発明の別の態様をなす。
【００６１】
また別の態様では、本発明は、造影剤をヒト又は動物の身体（例えば血管系）に投与して造影剤が分配された身体の少なくとも一部分の画像を生成させる光学イメージングによるヒト又は動物の身体の画像生成方法であって、上記化合物を造影剤として用いる方法を提供する。
【００６２】
さらに別の態様では、本発明は、上記化合物を含む造影剤組成物を予め投与しておいたヒト又は動物の身体の強調画像を光学イメージングで生成させる方法であって、身体の少なくとも一部分の画像を生成させることを含む方法を提供する。
【００６３】
さらに別の態様では、本発明は、血管新生に関連した病態に対処するための薬剤によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニタリングする方法であって、本発明の薬剤を身体に投与し、細胞受容体（好ましくは内皮細胞受容体、特にαｖβ３受容体）による上記薬剤の取り込みを検出し、任意ではあるが好ましくは、投与と検出を、例えば薬剤による治療の前後途中のいずれかに繰り返すことを含む方法を提供する。上記検出は光学イメージング技術による。
【００６４】
フルオレセイン及び本発明のフルオレセイン−ペプチド化合物は可視域スペクトルで発光するので、従来の検眼鏡装置を用いて画像を取得できる。さらに、インビボ共焦点顕微鏡観察も応用できる。最近開発された時間領域及び周波数領域イメージング技術も、フルオロフォアの寿命のような追加の特徴を活用して使用できる可能性がある。
【００６５】
本発明の化合物は公知の化学合成法で合成できるが、特に好ましいのは、自動ペプチド合成装置を用いたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５：  ２１４９  （１９６４））である。さらに、フルオレセイン活性エステルのようなフルオレセインのカップリングも自動化法で実施することができ、ペプチドベクターとフルオレセイン基とのアミド結合が得られる。ペプチドベクター及びペプチド化合物は、インビトロスクリーニングで試験する前に。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、質量分析及び分析用ＨＰＬＣで特性決定してもよい。
【００６６】
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００６７】
実施例１
ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
１ａ）１７−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸の合成
【００６８】
【化１０】
2007528846.tif 000011
この構成単位をＦｍｏｃ化学を用いて固相にカップリングした。このカップリングした形態の構成単位をＰＥＧと略す。
【００６９】
１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン
乾燥テトラエチレングリコール（１９．４ｇ、０．１００ｍｏｌ）及び塩化メタンスルホニル（２５．２ｇ、０．２２０ｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）溶液をアルゴン雰囲気下に保ち、氷／水浴中で０℃に冷却した。フラスコに、トリエチルアミン（２２．６ｇ、０．２２０ｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（２５ｍｌ）溶液を４５分間かけて滴下した。１時間後に冷却浴を取り外し、攪拌を４時間続けた。水（６０ｍｌ）を加えた。混合物に炭酸水素ナトリウム（６ｇ、ｐＨ８まで）及びアジ化ナトリウム（１４．３ｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）をこの順序で加えた。ＴＨＦを留去し、水溶液を２４時間還流した（二層が形成した）。混合物を冷却し、エーテル（１００ｍｌ）を加えた。水相を塩化ナトリウムで飽和させた。相を分離し、水相をエーテル（４×５０ｍｌ）で抽出した。これらの有機相を一緒にして塩水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過及び濃縮で、２２．１ｇ（９１％）の黄色油が得られた。生成物はそれ以上精製せずに次の工程に用いた。
【００７０】
１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカナミン
機械的に激しく攪拌した５％塩酸（２００ｍｌ）中の１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン（２０．８ｇ、０．０８５ｍｏｌ）の懸濁液に、トリフェニルホスフィン（１９．９ｇ、０．０７３ｍｏｌ）のエーテル（１５０ｍｌ）溶液を室温で３時間かけて加えた。反応混合物をさらに２４時間攪拌した。相が分離し、水相をジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。水相を氷／水浴中で冷却し、ＫＯＨの添加によってｐＨを約１２に調節した。生成物をジクロロメタン（５×５０ｍｌ）中に抽出した。有機相を一緒にして乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。濾過及び蒸発で１４．０ｇ（８８％）の黄色油が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）分析で、予測通り２１９にＭ＋Ｈピークが得られた。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲ分光分析での特性決定で上記構造を確認した。
【００７１】
１７−アジド−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカナミン（１０．９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍｌ）溶液に、ジグリコール酸無水物（６．３８ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩攪拌した。ＨＰＬＣ分析（カラム：Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４；溶媒：Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配は２０分間で４〜１６％Ｂ；流速：１．０ｍｌ／分；ＵＶ検出波長：２１４及び２８４ｎｍ）は、出発物質が保持時間１８．３分の生成物に完全に添加したことを示していた。溶液を濃縮して定量的収量で黄色シロップを得た。生成物をＬＣ−ＭＳ（ＥＳイオン化）で分析したところ、予測通り３３５に［ＭＨ］＋が得られた。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲ分光分析は構造と一致した。
【００７２】
生成物はそれ以上精製せずに次の工程に用いた。
【００７３】
１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
１７−アジド−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸（８．３６ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）の水（１００ｍｌ）溶液を、Ｈ２（ｇ）−Ｐｄ／Ｃ（１０％）を用いて還元した。ＬＣ−ＭＳ分析で出発物質が完全に転化したことが分かるまで反応を続けた（カラム：Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４；溶媒：Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配は２０分間で４〜１６％Ｂ；流速：１．０ｍｌ／分；ＵＶ検出波長：２１４及び２８４ｎｍ；ＥＳイオン化で得られたＭ＋Ｈは出発物質で３３５、生成物で３０９）。溶液を濾過して、次の工程に直接使用した。
【００７４】
１７−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
上記で得た１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸の水溶液（アミノ酸換算量２５．０ｍｍｏｌ）に、炭酸水素ナトリウム（５．０４ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）及びジオキサン（４０ｍｌ）を加えた。Ｆｍｏｃ−クロリド（７．１１ｇ、０．２７５ｍｏｌ）のジオキサン（４０ｍｌ）溶液を滴下した。反応混合物を一晩攪拌した。ジオキサンを留去し（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）、水相を酢酸エチルで抽出した。塩酸を添加して水相を酸性化し、沈殿をクロロホルム中に抽出した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過及び濃縮して１１．３ｇ（８５％）の黄色シロップを得た。構造はＬＣ−ＭＳ分析で確認した（カラム：Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４；溶媒：Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配は２０分間で４０〜６０％Ｂ；流速：１．０ｍｌ／分；ＵＶ検出波長：２１４及び２５４ｎｍ；５，８分の生成物ピークのＥＳイオン化で得られたＭ＋Ｈは予測通り５３１）。分析結果は、副生物含有量が非常に低いことを示しており、この物質をそれ以上精製せずに用いた。
【００７５】
１ｂ）ＣｌＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【００７６】
【化１１】
2007528846.tif 000012
ＰＥＧ単位を、ＨＡＴＵ活性化法によって初期量０．２５ｍｍｏｌスケールでＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ樹脂に手作業でカップリングした。残りのペプチドは１ｍｍｏｌアミノ酸カートリッジを用いてＡＢＩ  ４３３Ａ自動ペプチド合成装置で合成した。アミノ酸は、カップリングの前にＨＢＴＵを用いて予備活性化した。無水クロロ酢酸のＤＭＦ溶液を用いてＮ末端アミン基を３０分間クロロアセチル化した。樹脂からのペプチドと側鎖保護基（ｔＢｕ以外）の同時除去は、ＴＩＳ（５％）、Ｈ２０（５％）及びフェノール（２．５％）を含有するＴＦＡ中で２時間行った。後処理後、３２２ｍｇの粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で５〜５０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流速：２ｍＬ／分；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：６．３７分）。質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１４０９、実測値１４１５。
【００７７】
１ｃ）チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【００７８】
【化１２】
2007528846.tif 000013
３２２ｍｇのＣｌＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−（ＰＥＧ）ｎ−ＮＨ２を水／アセトニトリルに溶解した。アンモニア溶液を用いて混合物をｐＨ８に調節し、１６時間攪拌した。後処理後、粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で５〜５０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流速：２ｍＬ／分；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：６．２２分）。質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１３７３、実測値１３７８。
【００７９】
１ｄ）ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【００８０】
【化１３】
2007528846.tif 000014
チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−（ＰＥＧ）ｎ−ＮＨ２をアニソール（２００μＬ）、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）及びＴＦＡ（１００ｍＬ）の溶液で６０分間処理し、次いでＴＦＡを減圧除去し、ジエチルエーテルを添加してペプチドを沈殿させた。調製用ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム）による粗製物７０ｍｇの精製を、０〜３０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）を用いて１０ｍＬ／分の流速で４０分間実施した。凍結乾燥後、４６ｍｇの純物質を得た（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で０〜３０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流速：２ｍＬ／分；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：６．８０分）。質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１２５８．５、実測値１２５８．８。
【００８１】
１ｅ）ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【００８２】
【化１４】
2007528846.tif 000015
３０ｍｇの［Ｃｙｓ２−６］シクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２、１６．２ｍｇのフルオレセインＮＨＳエステル及び４μＬのＮ−メチルモルホリンをＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。混合物を遮光して一晩攪拌した。調製用ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ１０２２  Ｃ１８カラム）による反応混合物の精製は、２０〜３０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）を用いて１０ｍＬ／分の流速で４０分間実施した。凍結乾燥後、２１．６ｍｇの純物質を得た（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で１０〜４０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流速：２ｍＬ／分；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：７．０分）。質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１６１６．５、実測値１６１６．３。
【００８３】
実施例２
ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ］−ビス（アミノエチル）エチレングリコール−フルオレセインの合成
２ａ．ＣｌＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の合成
【００８４】
【化１５】
2007528846.tif 000016
ペプチドの合成は、ＡＢＩ  ４３３Ａ自動ペプチド合成装置で１ｍｍｏｌのアミノカートリッジを用いて、０．２５ｍｍｏｌスケールのＯ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂から開始した。アミノ酸はカップリング前にＨＢＴＵを用いて予備活性化しておいた。無水クロロ酢酸を用いてＮ末端をクロロアセチル化した。樹脂からのペプチドと側鎖保護基（ｔＢｕ以外）の同時除去は、ＴＩＳ（５％）、Ｈ２０（５％）及びフェノール（２．５％）を含有するＴＦＡ中で２時間行った。後処理後、３６４ｍｇの粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で５〜５０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；２ｍＬ／分；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：６．５５分）。エレクトロスプレー質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１２９３．５、実測値１２９３．４。
【００８５】
２ｂ．シクロ［ＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の合成
【００８６】
【化１６】
2007528846.tif 000017
２５０ｍｇのＣｌＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２を水／アセトニトリルに溶解した。アンモニア溶液を用いて混合物をｐＨ８に調節し、１８時間攪拌した。
【００８７】
凍結乾燥後、粗ペプチドを白色粉末として得た。（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で５〜５０％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；流速：２ｍＬ／分；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：６．１７分）。エレクトロスプレー質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１２５７．５、実測値１２５７．６。
【００８８】
２ｃ．［Ｃｙｓ２−６］シクロ［ＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の合成
【００８９】
【化１７】
2007528846.tif 000018
シクロ［ＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２をアニソール（５００μｌ）、ＤＭＳＯ（４ｍｌ）及びＴＦＡ（２００ｍｌ）の溶液に溶解した。混合物を室温で１５分間攪拌し、次いでＴＦＡを減圧除去し、ジエチルエーテルを添加してペプチドを沈殿させた。
【００９０】
調製用ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム）による粗物質の精製は、０〜３０％のＢ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）を用いて１０ｍＬ／分の流速で４０分間実施した。凍結乾燥後、４４ｍｇの純物質を得た。（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で０〜３０％のＢ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；流速：２ｍＬ／分；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：５．８８分）。エレクトロスプレー質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１１４３．４、実測値１１４３．５。
【００９１】
２ｄ．［Ｃｙｓ２−６］シクロ［ＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２とフルオレセインとのコンジュゲート
【００９２】
【化１８】
2007528846.tif 000019
１０ｍｇの［Ｃｙｓ２−６］シクロ［ＣＨ２ＣＯＮＨ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、４．７ｍｇのフルオレセインＮＨＳエステル及び５μＬの４−メチルモルホリンをＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、溶液を３時間攪拌した。
【００９３】
調製用ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム）による粗物質の精製は、０〜３０％のＢ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）を用いて１０ｍＬ／分の流速で４０分間実施した。凍結乾燥後、６ｍｇの純物質を得た。（分析用ＨＰＬＣ；勾配：１０分間で０〜３０％のＢ（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；流速：２ｍＬ／分；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μＣ１８（２）５０×４．６ｍｍ；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間：１０．０７分）。エレクトロスプレー質量分析法でさらに生成物の特性決定を行った。Ｍ＋Ｈの予測値１５０１．４、実測値１５０１．４。
【配列表】
2007528846000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月3日(2007.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの環化架橋を含んでいて次の式Ｉで表される化合物。
Ｒa−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｇ−Ｄ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7        （Ｉ）
式中、
Ｘ3はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、
Ｇはグリシンを表し、
Ｄはアスパラギン酸を表し、
ＲaはＸ2、Ｘ4又はＸ6のいずれかと架橋を形成する−（ＣＨ2）n−又は−（ＣＨ2）n−Ｃ6Ｈ4−を表し（式中、ｎは１〜１０の正の整数を表す。）、
Ｘ1は結合又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸残基を表し、１つのアミノ酸残基が適宜スペーサー部分で官能化されているか、或いはアミノ酸残基は酸又はアミン基のような官能性側鎖を有し、
Ｘ2及びＸ4は各々独立に環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ5は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、
Ｘ6は環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ7はスペーサー又はバイオモディファイヤー部分であるか、或いは存在せず、
当該化合物は、Ｘ1、Ｘ6又はＸ7基の１以上に適宜スペーサー基を介して連結したフルオレセイン色素を表す１以上のＺ基をさらに含む。
【請求項２】
以下のいずれかの式から選択される、請求項１記載の化合物。
【化１】
2007528846.tif 000024
式中、Ｒa、Ｘ1、Ｘ3、Ｇ、Ｄ、Ｘ5、及びＸ7は請求項１で定義した通りであり、
Ｘ2、Ｘ4及びＸ6はジスルフィド又はチオエーテル結合を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｗ1はスペーサー部分であるか、或いは存在せず、
ｈは１又は２の正の整数であり、
フルオレセイン色素を表すＺ基が少なくとも１つ存在する。
【請求項３】
Ｘ1が酸又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、該アミノ酸がアスパラギン酸、リシン、グルタミン酸、ホモリシン又はジアミノアルキル酸又はその誘導体から選択される、請求項２記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項４】
Ｘ2、Ｘ4及びＸ6が各々独立にシステイン又はホモシステイン残基を表す、請求項２又は請求項３記載の式ＩＩＩの化合物。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の化合物の有効量を、薬学的に許容される１種以上の補助剤、賦形剤又は希釈剤と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項６】
造影剤をヒト又は動物の身体に投与してヒト又は動物の身体の少なくとも一部分の画像を生成させる診断法に用いられる光学イメージング用造影剤の製造における、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の化合物の使用。
【国際調査報告】
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