(57)【要約】  本発明は、神経変性疾患、虚血現象及び中枢神経系傷害の診断及び治療、並びに組織外傷に又は慢性若しくは急性変性的変化に起因するか否かに関わらず、損傷を受けた神経細胞組織に伴う症候及び兆候の改善又は軽減のための組成物及び方法を提供する。本発明は、具体的には、アネキシンＩＩの発現が、酸化的ストレスによって引き起こされるアポトーシスに関与しているという発見及びアンチセンスアネキシンＩＩ  ＲＮＡ及びアネキシンＩＩ  ｓｉＲＮＡが細胞をこのアポトーシスから保護したという発見に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患又は中枢神経系疾患に罹患している患者に、治療的有効量のアネキシンＩＩ阻害剤を含む薬学的組成物を前記患者に投与して、これにより、前記患者を治療することを含む、神経変性疾患又は中枢神経系疾患に罹患している患者を治療する方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患が発作である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経変性疾患が、高血圧、高血圧性脳血管疾患、全身性低血圧、パーキンソン病、癲癇、うつ病、ＡＬＳ、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病及びＨＩＶによって誘導される認知症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
中枢神経系に対する傷害を患った患者に、該患者を治療する投薬量で、及び該患者を治療する期間にわたって、アネキシンＩＩ阻害剤の治療的有効量を含む薬学的組成物を前記患者に投与することを含む、中枢神経系に対する傷害を患った患者を治療する方法。
【請求項５】
前記傷害がＴＢＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記傷害が脊髄傷害である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記傷害が、動脈瘤の破裂、心停止、心臓性ショック、敗血症ショック、頭部外傷、発作及び腫瘍からの出血からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記アネキシンＩＩ阻害剤が、小化学的化合物ニトロプロシドナトリウム又はトリホスチンＡＧ１０２４である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アネキシンＩＩ阻害剤が、図１に記されている配列（配列番号１）に対するアンチセンス配列である配列を有する連続的ヌクレオチドを含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤が、図３に記されている配列（配列番号３又は配列番号４）を有するアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アネキシンＩＩ阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡが表１ないし３の何れか１つに記載されている配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アネキシンＩＩ阻害剤が、配列番号１２ないし１６からなる群から選択される、表１に記載されている配列を有するｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤が、構造：
５’（Ｎ）ｘ−Ｚ３’      （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ５’  （センス鎖）
（各Ｎ及びＮ’は、その糖残基において修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいリボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙは、連続する各Ｎ又はＮ’が、共有結合によって、次のＮ又はＮ’に連結されているオリゴマーであり、
ｘ及びｙの各々は、１９ないし４０の整数であり；
Ｚ及びＺ’の各々は、存在し、又は存在しないことができるが、存在する場合には、ｄＴｄＴであり、それが存在する鎖の３’末端に共有結合されており；
（Ｎ）Ｘの配列は、アネキシンＩＩのｃＤＮＡに対するアンチセンス配列を含む。）
【請求項１５】
（Ｎ）ｘの配列が、表１、２及び３中に存在するアンチセンス配列の１又は複数を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アネキシンＩＩ阻害剤が、配列番号５又は配列番号６によってコードされるドミナントネガティブペプチド、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００４０４／１８４４号のペプチド＃４１又はＳ−ニトロソグルタチオンからなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アネキシンＩＩ阻害剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アネキシンＩＩ阻害剤が、請求項９ないし１６の何れか１項に記載の阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含むベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
中枢神経系に対する傷害を患った患者における回復を促進又は強化するための医薬の調製のための、治療的有効量のアネキシンＩＩ阻害剤の使用。
【請求項２０】
神経変性疾患に罹患している患者における回復を促進又は強化するための医薬の調製のための、治療的有効量のアネキシンＩＩ阻害剤の使用。
【請求項２１】
構造
５’（Ｎ）ｘ−Ｚ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ５’（センス鎖）
（各Ｎ及びＮ’は、その糖残基において修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいリボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙは、連続する各Ｎ又はＮ’が、共有結合によって、次のＮ又はＮ’に連結されているオリゴマーであり、
ｘ及びｙの各々は、１９ないし４０の整数であり；
Ｚ及びＺ’の各々は、存在し、又は存在しなくてもよいが、存在する場合には、ｄＴｄＴであり、それが存在する鎖の３’末端に共有結合されており；
（Ｎ）Ｘの配列は、アネキシンＩＩのｃＤＮＡに対するアンチセンス配列を含む。）  
【請求項２２】
（Ｎ）ｘの配列が、表１、２及び３中に存在するアンチセンス配列の１又は複数を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｘ＝ｙ＝１９である、請求項２２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本特許出願は、２００４年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／５５６７２４号の優先権を主張するものであり、米国仮特許出願第６０／５５６７２４号は、参照により、その内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、神経変性疾患、虚血現象及び中枢神経系傷害の診断及び治療の分野に関する。
【発明の背景】
【０００３】
脳の虚血
外傷及び卒中などの脳傷害は、西洋社会における死亡率及び身体障害の主な原因である。
【０００４】
外傷性脳傷害（ＴＢＩ；ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ）は、現代社会における入院及び身体障害の最も深刻な理由の一つである。ＴＢＩが外傷直後に発生する一次損傷及び外傷から数日の間に発生する二次損傷に分類され得ることが、臨床的な経験によって示唆されている。現行のＴＢＩの治療は、手術か、あるいは主として対症療法である。
【０００５】
脳血管疾患は、主に、中年及び晩年に発生する。脳血管疾患は、毎年、アメリカで約２０万人の死亡の原因となっているとともに、かなりの神経性身体障害を引き起こしている。卒中の発生は、年齢とともに増加し、人口の中で急速に増大している層である多くの高齢者に影響を与えている。これらの疾病は、虚血−梗塞又は脳内出血の何れかを引き起こす。
【０００６】
卒中は、中断された血液供給の結果として生じる急性の神経傷害であり、脳に対して損傷をもたらす。多くの脳血管疾患は、局所的な神経の欠損の突発的な発症として生じる。欠損は、固定化された状態を保つ場合もあり得、又は、改善し、若しくは徐々に悪化して、通常、虚血の中心部に不可逆的な神経損傷をもたらすのに対して、周辺部の神経的機能障害は、治療可能であり、及び／又は可逆的であり得る。長期間の虚血は、明白な組織壊死をもたらす。脳浮腫が続発し、その後２ないし４日にわたって進行する。梗塞の領域が大きければ、浮腫は、その付随する結果の全てを伴うかなりの腫瘤効果を生じ得る。
【０００７】
周辺部の神経細胞を死滅から救出するために、神経保護薬が開発されているが、有効性が明らかとなっているものは存在しない。
【０００８】
神経細胞組織への損傷は、重い身体障害及び死をもたらすことが可能である。損傷の程度は、傷害された組織の位置及び程度によって主に影響を受ける。急性発作に応答して活性化される内在性カスケードは、機能転帰において役割を果たす。損傷を最小限に抑え、制限し、及び／又は回復するための努力は、臨床的な結果を改善する大きな可能性を秘めている。
【０００９】
アネキシンＩＩ
アネキシンＩＩは、２つの重鎖（ｐ３６、アネキシンタンパク質ファミリーに属する。）と２つの軽鎖（ｐ１０又はｐ１１、Ｓ−１００タンパク質ファミリーに属する。）を含有する四量体である。アネキシンは、カルシウム及びリン脂質を結合し、プラスミノーゲン変換において、補因子として機能する。膜貫通アネキシンは、プラスミノーゲン活性化因子（組織及びウロキナーゼ型の両方）を結合し、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を、最大１５倍活性化する(Cesarman GM, Guevara CA, Hajjar KA:An endothelial cell receptor for plasminogen/tissue plasminogen activator(t-PA).II. Annexin II-mediated enhancement of t-PA-dependent plasminogen activation. J Biol Chem. 1994 Aug 19; 269(33):21198-203; Hajjar KA, Jacovina AT, Chacko J.:An endothelial cell receptor for plasminogen/tissue plasminogen activator. I. Identity with Annexin II. J Biol Chem. 1994 Aug 19; 269(33):21191-7.; Kim J, Hajjar KA.:Annexin II:a plasminogen-plasminogen activator co-receptor. Front Biosci. 2002 Feb 1; 7:d341-8.)。さらに、アネキシンは、プラスミノーゲンのプロセッシングのさらなる工程に影響を与え、プラスミン還元酵素として機能する(Kwon M, Caplan JF, Filipenko NR, Choi KS, Fitzpatrick SL, Zhang L, Waisman DM:Identification of Annexin II heterotetramer as a plasmin reductase. J Biol Chem. 2002 Mar 29; 277(13):10903-11. Epub 2002 Jan 07.)。アネキシンの精製及び酵素反応におけるその使用は、記載されている(Choi KS, Fitzpatrick SL, Filipenko NR, Fogg DK, Kassam G, Magliocco AM, Waisman DM:“Regulation of plasmin-dependent fibrin clot lysis by annexin II heterotetramer”, J Biol Chem. 2001 Jul 6;276(27):25212-21(Epub 2001 Apr 23)。さらに、アネキシンＩＩは、内皮細胞の表面上で、ｔＰＡ及びプラスミノーゲンに対する繊維素溶解促進共同受容体として働き、プラスミンの生成を促進する。
【００１０】
アネキシンＩＩは、プラスミンの生成による、又はプラスミンによって仲介される、他のメタロプロテイナーゼのタンパク質分解活性化によって、細胞外マトリックスを通じて、癌細胞の浸潤能に寄与し得る。細胞内アネキシンＩＩは、細胞増殖及び分化に関与していることが推測されている。骨髄環境中で分泌されるアネキシンＩＩは、破骨細胞形成への関与が推測されている。さらに、アネキシンＩＩは、クロム親和性顆粒が形質膜に付着される際に、クロム親和性顆粒に密接に付随してアネキシンＩＩが見出される副腎クロム親和性細胞の分泌経路への関与が推測されている。
【００１１】
さらに、アネキシンＩＩは、肺胞上皮ＩＩ型細胞からの層状体のエキソサイトーシスの間に、（アラキドン酸と相乗的に）膜融合に関与する(Chattopadhyay S, Sun P, Wang P, Abonyo B, Cross NL, Liu L.:Fusion of lamellar body with plasma membrane is driven by the dual action of Annexin II tetramer and arachidonic acid. J Biol Chem. 2003 Oct 10; 278(41):39675-83. Epub 2003 Aug 05.)。
【００１２】
単量体として、アネキシンＩＩは、ＤＮＡ合成に関与している。アネキシンＩＩのＮ末端は、ＣＲＭ１−経路に対する、Ｌｅｕに富む核外移行シグナル（ＮＥＳ）を含有する。核では、アネキシンＩＩは、細胞周期依存性にリン酸化されており、リン酸化が核外移行を制御している可能性がある。ＮＥＳの変異による強制的な核保持は、細胞増殖の減少をもたらす(Liu J, Rothermund CA, Ayala-Sanmartin J, Vishwanatha JK.:Nuclear Annexin II negatively regulates growth of LNCaP cells and substitution of ser 11 and 25 to glu prevents nucleo-cytoplasmic shuttling of Annexin II. BMC Biochem. 2003 Sep 9; 4(1):10.)。
【００１３】
アネキシンＩＩ発現の疾病関連パターン
アネキシンＩＩは、原発性膵臓癌細胞、胃癌組織中で過剰発現されており、この過剰発現は予後の不良と相関している。アネキシンＩＩの発現は、前立腺癌中では喪失している（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。アネキシンＩＩの軽鎖は、細胞表面上でプロカテプシンＢ（腫瘍中で上方制御されている。）を結合し、そのプロセッシングを促進する(Roshy S, Sloane BF, Moin K.:Pericellular cathepsin B and malignant progression. Cancer Metastasis Rev. 2003 Jun-Sep; 22(2-3):271-86.)。さらに、アネキシンＩＩの軽鎖は、Ｂ型肝炎ポリメラーゼを結合し、その機能を調節する(Choi J, Chang JS, Song MS, Ahn BY, Park Y, Lim DS, Han YS.:Association of hepatitis B virus polymerase with promyelocytic leukemia nuclear bodies mediated by the S100 family protein p11 Biochem Biophys Res Commun. 2003 Jun 13; 305(4):1049-56.)。
【００１４】
上記文献は何れも、神経毒性現象と関連してアネキシンＩＩに対する役割を開示しておらず、特に、発作などの神経変性疾患の診断若しくは治療も開示していない。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、組織外傷又は慢性若しくは急性の変性的変化に起因するものであると否とを問わず、損傷を受けた神経組織を伴う症候及び兆候を改善又は軽減するための組成物及び方法を提供する。
【００１６】
特に、本発明の一実施形態は、アネキシンＩＩ阻害剤を活性成分として含み、薬学的に許容される希釈剤又は担体をさらに含む、１又は複数の薬学的組成物を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態は、中枢神経系に対する傷害を患った患者に、中枢神経系への損傷を軽減するのに十分な投薬量で、薬学的組成物を投与することを含む、中枢神経系に対する傷害を患った患者おける中枢神経系への損傷を軽減する方法を提供する。さらに別の実施形態は、神経変性疾患又は中枢神経系に対する傷害を患った患者において回復を促進又は強化するための医薬の調製のための、アネキシンＩＩ阻害剤の使用を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態は、アポトーシスを調節する化学的化合物を同定するための方法を提供する。
【００１９】
さらに、対象において神経変性疾患又は虚血現象を診断するための方法が提供される。
【００２０】
本明細書において記載されている好ましい方法、材料及び例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。本明細書に記載されている材料及び方法と類似又は均等な材料及び方法を、本発明の実施又は試験において使用することが可能である。本発明の別の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明は、その幾つかの実施形態において、組織外傷又は急性及び慢性の変性的変化に起因するものであると否とを問わず、損傷を受けた神経組織を伴う症候及び兆候を改善又は軽減するための、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、組成物及び方法を提供する。本発明のある種の側面は、組織の損傷又は変性を低減し、又は完全に縮小する薬学的組成物を提供する。さらなる側面において、本発明は、外傷虚血現象後の機能的な改善をもたらす方法を提供する。これらの効果は、アネキシンＩＩの生物活性又はアネキシンＩＩの発現を阻害する因子を投与することによって達成される。
【００２２】
本発明の発明者らは、アネキシンＩＩの発現が、酸化的ストレスによって誘導されるアポトーシスに関与していること、並びにアンチセンスアネキシンＩＩＲＮＡ及びアネキシンＩＩｓｉＲＮＡが、このアポトーシスから細胞を保護することを発見した。
【００２３】
理論に拘泥するものではないが、アネキシンＩＩ阻害剤が、虚血現象の間に生じる神経細胞の神経毒性ストレス誘導性アポトーシスを抑制可能であること、このため、前記虚血現象によって引き起こされた損傷の抑制に寄与し得ることを、出願人は示唆する。
【００２４】
「アポトーシス」という用語は、膜に結合された粒子へのクロマチンの断片化、細胞骨格及び膜構造の変化並びに、他の細胞によるアポトーシス細胞のその後の貪食作用をもたらす、内蔵された細胞死プログラムの実行として、具体的に定義される。さらに、本用語は、アポトーシスを誘導する虚血性疾患病変（例えば、血管の収縮又は閉塞によって一般的に引き起こされる、身体の臓器、組織又は体の一部への、血液供給の減少を伴う虚血性疾患、例えば、心筋梗塞及び卒中）を含むものと理解される。「プログラムされた細胞死」という用語も、「アポトーシス」と互換的に使用することができる。本明細書において使用される場合、本用語は、細胞死が、厳密に、上記アポトーシスプロセスによるものであるか否かを問わず、さらに広く、神経細胞死を包含するものと解釈すべきであることを理解すべきである。
【００２５】
本明細書において使用される「アネキシンＩＩ」という用語は、「カルパクチンＩ」、「リポコルチン２」、「クロモビンディン８」、「ｐ３６」及び「胎盤抗凝固タンパク質ＩＶ（「ＰＡＰ−ＩＶ」）」の別称でも知られる、任意の生物、好ましくはヒトに由来するアネキシンＩＩ遺伝子の発現されたポリペプチド、並びに類似の生物活性を有するその相同体（ラット及びマウスの相同体を含む。）及び断片を表す。本分野において周知である（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1988), 1995 及び1998年に改訂）高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で、アネキシンＩＩ遺伝子に結合する核酸配列によってコードされるポリペプチドも、本用語によって包含される。アネキシンＩＩのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、それぞれ、図１及び２に記載されている。アネキシンＩＩの具体的な断片には、図２に示されている配列のアミノ酸１−５０、５１−１００、１０１−１５０、１５１−２００、２０１−２５０、２５１−３００及び３０１−３３９が含まれる。アネキシンＩＩのさらに具体的な断片には、図２に示されている配列のアミノ酸２５−７４、７５−１２４、１２５−１７４、１７５−２２４、２２５−２７４、２７５−３２４及び３２５−３３９が含まれる。
【００２６】
ＧｅｎｅＢａｎｋ参照番号が、より長いポリペプチドをコードする５０８４５３８７（バリアント１）、５０８４５３８５（バリアント２）及び、これらより短い同じポリペプチドをコードする５０８４５３８９（バリアント３）である３つの異なるスプライスバリアントによってコードされる、少なくとも２つのアネキシンＩＩポリペプチドが存在する。図１に示されているヌクレオチド配列は、スプライスバリアント２（ｇｉ−５０８４５３８５）及びスプライス３（ｇｉ−５０８４５３８９）のＯＲＦである。これらのバリアントは、スプライスバリアント１（ｇｉ−５０８４５３８７）とは、それらのＯＲＦの５’末端が僅かに異なっており、これらのバリアント２及び３は、５’−ＵＴＲが互いに異なっている。図１に対応するポリペプチド配列は、３３９個のアミノ酸を有する。図２を参照。これらのバリアント及び他の任意の類似の微量バリアントは、アネキシンＩＩポリペプチドの定義及びこれらをコードするアネキシンＩＩ遺伝子の定義に含まれる。
【００２７】
「アネキシンＩＩの生物学的効果」又は「アネキシンＩＩ生物活性」とは、アポトーシスにおけるアネキシンＩＩの効果を意味し、本明細書では、「アネキシンＩＩ誘導性アポトーシス」とも称され、これは、直接的又は間接的であり得、理論に拘泥するものではないが、神経毒性ストレスによって誘導されたアポトーシスに対するアネキシンＩＩの効果が含まれる。間接的な効果には、アポトーシスをもたらすシグナル伝達カスケードに関与する複数の分子のうちの１つに結合し、又は該分子対して効果を有するアネキシンＩＩが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
「アネキシンＩＩ阻害剤」とは、上述されているように、アネキシンＩＩの生物学的効果を抑制又は低下させる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体又は小化学的化合物であると否とを問わず、任意の分子を意味する。アネキシンＩＩ阻害剤は、とりわけ、アンチセンスＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブペプチド、リボザイムなどの、アネキシンＩＩプロモーターの阻害剤又はアネキシンＩＩ転写／翻訳の阻害剤であってもよい。
【００２９】
本発明の一側面は、治療的有効量のアネキシンＩＩ阻害剤（ニトロプルシドナトリウムなどの小化学的化合物（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又はアネキシンＩＩ分泌を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ１０２４（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ  ２７８，  ６：４２０５−４２１５（２００３））としてもよい。）；図１に示されている配列（配列番号１）に対するアンチセンス配列である配列を有し、図３に示されている配列のうちの１つ（配列番号３又は配列番号４）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むアンチセンスポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、又は図１に示されている配列（配列番号１）に対するセンス配列であり、且つ前記配列に対するドミナントネガティブペプチドをコードする配列を有し、図４に示されている配列のうちの１つ（配列番号５又は配列番号６）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むセンスポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド、又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能し、表１−３、特に表１に記載されている配列の１つを必要に応じて有するポリヌクレオチド；これらのポリヌクレオチドの何れかを含むベクター；ドミナントネガティブペプチドなどのポリペプチド、例えば、配列番号５又は配列番号６によってコードされるペプチド、アネキシンＩＩを結合することが見出されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００４０４／１８４４号のペプチド＃４１、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又はとりわけ、「Pietropaolo & Compton:Direct interaction between human cytomegalovirus glycoprotein B and cellular Annexin II J Virol 1997, 71:9803-9807」に開示されている抗アネキシンＩＩ抗体などの抗体、必要に応じて、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）を、活性成分として含む、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、さらに、希釈剤又は担体を含有してもよい。
【００３０】
本発明の別の側面は、アネキシンＩＩ阻害剤の治療的有効量を、神経変性疾患及び／又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に罹患している患者に投与することにより、該患者を治療することを含む、神経変性疾患及び／又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に罹患している患者を治療するための方法に関する。投与は、定期的としてもよい。アネキシンＩＩ阻害剤は、ニトロプロシドナトリウムなどの小化学的化合物（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又はアネキシンＩＩ分泌を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ１０２４（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ  ２７８，  ６：４２０５−４２１５（２００３））としてもよい。）；図１に示されている配列（配列番号１）に対するアンチセンス配列である配列を有し、図３に示されている配列のうちの１つ（配列番号３又は配列番号４）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むアンチセンスポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、又は図１に示されている配列（配列番号１）に対するセンス配列であり、且つ前記配列に対するドミナントネガティブペプチドをコードする配列を有し、図４に示されている配列のうちの１つ（配列番号５又は配列番号６）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むセンスポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド、又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能し、表１−３、特に表１の配列番号ｚ−ｚに記載されている配列の１つを必要に応じて有するポリヌクレオチド；これらのポリヌクレオチドの何れかを含むベクター；ドミナントネガティブペプチドなどのポリペプチド、例えば、配列番号５又は配列番号６によってコードされるペプチド、アネキシンＩＩを結合することが見出されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００４０４／１８４４号のペプチド＃４１、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又はとりわけ、「Pietropaolo & Compton:Direct interaction between human cytomegalovirus glycoprotein B and cellular Annexin II J Virol 1997, 71:9803-9807」に開示されている抗アネキシンＩＩ抗体などの抗体、必要に応じて、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）としてもよい。
【００３１】
この側面では、神経変性疾患又は中枢神経系に対する傷害を患った患者において回復を促進又は強化するための医薬の調製のための、アネキシンＩＩ阻害剤（上に詳述されている阻害剤の何れかなど）の治療的有効量の使用がさらに提供される。
【００３２】
さらに、本発明は、（上述のような）病変又は疾病を制御する処置を必要としている患者に、治療的有効量の少なくとも１つの阻害剤（例えば、少なくとも１つのアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチド又前記核酸配列に対する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ又はアネキシンＩＩ配列若しくはアネキシンＩＩタンパク質に対して誘導されたドミナントネガティブペプチド）又はアネキシンＩＩポリペプチドに対して誘導された抗体又は上記阻害剤の何れかを投与することによって、このような処置を必要としている患者における（上述のような）病変又は疾病を制御する方法を提供する。
【００３３】
「化学的化合物」、「小分子」、「化学的分子」、「小化学的分子」及び「小化学的化合物」という用語は、本明細書において互換的に使用され、合成的に製造されてもよく、又は天然の採取源から取得されてもよい、典型的には、２０００ダルトン未満、より好ましくは１０００ダルトン未満又は６００ダルトン未満の分子量を有する任意の種類の化学的部分を表すものと理解される。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド又は両種の組み合わせから構成される任意の分子、すなわち、とりわけ、塩基グアニジン（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、シトシン、チミジン、アデニン、ウラシル又はイノシンの２以上を含む任意の分子を表す。ポリヌクレオチドには、天然のヌクレオチド、化学的に修飾されたヌクレオチド及び合成ヌクレオチド又はこれらの化学的類縁体が含まれ得る。本用語は、「オリゴヌクレオチド」が含み、及び「核酸」を包含する。ポリヌクレオチドは、一般的には、約７５から１０，０００個までのヌクレオチド、必要に応じて、約１００から３，５００個までのヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドとは、一般的には、２ないし７５ヌクレオチドから伸長するヌクレオチドの鎖を表す。
【００３５】
「アンチセンス（ＡＳ）」又は「アンチセンス断片」という用語は、阻害的アンチセンス活性を有するポリヌクレオチド断片を意味し、該活性は、対応する遺伝子（この場合には、アネキシンＩＩ）の内在性ゲノムコピーの発現の減少を引き起こす。アネキシンＩＩＡＳポリヌクレオチドは、ＡＳのアネキシンＩＩ遺伝子へのハイブリダイゼーションを可能とするために、十分な長さの配列と、配列番号１に記載されているアネキシンＩＩ遺伝子の配列内に存在する配列に対する十分な相同性とを有する連続的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。ＡＳの配列は、目的の標的ｍＲＮＡを相補し、ＲＮＡ：ＡＳ二重鎖を形成するために設計される。この二重鎖の形成は、関連するｍＲＮＡのプロセッシング、スプライシング、輸送又は翻訳を抑制することが可能である。さらに、ある種のＡＳヌクレオチド配列は、それらの標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしたときに、細胞ＲＮＡアーゼＨ活性を示すことが可能であり、ｍＲＮＡの分解をもたらす（Calabretta et al, 1996:Antisense strategies in the treatment of leukemias. Semin Oncol. 23(1):78-87）。その場合には、ＲＮアーゼＨは、二重鎖のＲＮＡ成分を切断し、標的ＲＮＡのさらなる分子とさらにハイブリダイズするために、ＡＳを放出できる可能性を秘めている。さらなる作用様式は、転写的に不活性であり得る三重螺旋を形成するために、ゲノムＤＮＡとＡＳの相互作用から得られる。具体的なＡＳ断片は、本明細書に記載されているアネキシンＩＩの具体的な断片をコードするＤＮＡのＡＳである。本発明のＡＳ断片は、必要に応じて、図３に図示されている配列又はその相同的配列を有する。具体的なＡＳ断片は、上記されているアネキシンＩＩの具体的な断片をコードするＤＮＡのＡＳである。ＡＳ断片の送達については、実施例１２を参照。
【００３６】
多くの総説が、アンチセンス（ＡＳ）技術及びその治療的可能性の主要な側面を網羅している(Wright & Anazodo, 1995. Antisense Molecules and Their Potential For The Treatment Of Cancer and AIDS. Cancer J. 8:185-189)。この技術の化学的側面(Crooke, 1995:Progress in antisense therapeutics Hematol Pathol. 1995;9(2):59-72.;Uhlmann et al, 1990 )、細胞的側面(Wagner, 1994:Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature. 1994 Nov 24;372(6504):333-5.)及び治療的側面(Hanania, et al, 1995:Recent advances in the application of gene therapy to human disease. Am J Med. 1995 Nov;99(5):537-52. ;Scanlon, et al, 1995:Oligonucleotide-mediated modulation of mammalian gene expression. FASEB J. 1995 Oct;9(13):1288-96.  ;Gewirtz, 1993:Oligodeoxynucleotide-based therapeutics for human leukemias. Stem Cells. 1993 Oct;11 Suppl 3:96-103)に関する総説が存在する。
【００３７】
特異的遺伝子の発現におけるアンチセンス介入は、合成ＡＳオリゴヌクレオチド配列の使用によって達成することが可能である（Lefebvre-d’Hellencourt et al, 1995. Immunomodulation by cytokine antisense oligonucleotides. Eur. Cytokine Netw. 6:7.; Agrawal, 1996、Antisense oligonucleotides:towards clinical trials, TIBTECH, 14:376.; Lev-Lehman et al., 1997. Antisense Oligomers in vitro and in vivo. In Antisense Therapeutics, A. Cohen and S. Smicek, eds(Plenum Press, New York)）を参照）。ＡＳオリゴヌクレオチド配列は、目的の標的ｍＲＮＡを相補し、ＲＮＡ：ＡＳ二重鎖を形成するために設計される。この二重鎖の形成は、関連するｍＲＮＡのプロセッシング、スプライシング、輸送又は翻訳を抑制することが可能である。さらに、ある種のＡＳヌクレオチド配列は、それらの標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしたときに、細胞ＲＮＡアーゼＨ活性を示すことが可能であり、ｍＲＮＡの分解をもたらす（(Calabretta et al, 1996:Antisense strategies in the treatment of leukemias. Semin Oncol. 23(1):78）。その場合には、ＲＮアーゼＨは、二重鎖のＲＮＡ成分を切断し、標的ＲＮＡのさらなる分子とさらにハイブリダイズするために、ＡＳを放出できる可能性を秘めている。さらなる作用様式は、転写的に不活性であり得る三重螺旋を形成するために、ゲノムＤＮＡとＡＳの相互作用から得られる。
【００３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する配列標的セグメントは、該配列が、それらの相補的テンプレートとのオリゴヌクレオチド二重鎖の形成にとって重要な、適切なエネルギー関連特性を示し、自己二量体化又は自己相補化に対して低い可能性をように選択される（Ａｎａｚｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。例えば、アンチセンス配列融解温度、自由エネルギー特性を決定し、潜在的な自己二量体化形成及び自己相補的特性を推測するために、コンピュータプログラムＯＬＩＧＯ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４）を使用することが可能である。本プログラムは、これらの２つのパラメータ（自己二量体形成及び自己相補性の可能性）の定量的推測の決定を可能とし、「可能性なし」又は「若干の可能性」又は「実質的に完全な可能性」という示唆を与える。一般的に、これらのパラメータで可能性なしという推測を有するこのプログラム標的セグメントの使用が選択される。しかしながら、カテゴリーのうちの１つでは、「若干の可能性」を有するセグメントを使用することが可能である。本分野において公知であるように、選択においては、パラメータのバランスが使用される。さらに、オリゴヌクレオチドは、類縁的な置換が機能に実質的に影響を与えないように、必要とされるように選択される。
【００３９】
本分野で公知であるとおりに、選択において、パラメータのバランスが使用される。さらに、オリゴヌクレオチドも、類縁の置換が機能に実質的に影響を与えないように、必要に応じて選択される。
【００４０】
ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効果的である濃度で有意な毒性を通常示さず、動物では、十分な薬動力学的半減期を示し（Agrawal, 1996. Antisense oligonucleotides towards clinical trials, TIBTECH, 14:376）、ヌクレアーゼ耐性である。アンチセンスによって誘導された、細胞発達と関連する機能喪失表現型が、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について、ニワトリ中での蓋板（ｔｅｃｔａｌ  ｐｌａｔｅ）形成の確立について（Ｇａｌｉｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １１２：１２８５．）、神経外胚葉培養物中での細胞の不均一性の維持に対して必要なＮ−ｍｙｃタンパク質(epithelial vs. neuroblastic cells, which differ in their colony forming abilities, tumorigenicity and adherence)(Rosolen et al., 1990. Cancer Res. 50:6316.; Whitesell et al., 1991. Episome-generated N-myc antisense RNA restricts the differentiation potential of primitive neuroectodermal cell lines. Mol. Cell. Biol. 11:1360.)について示された。分裂促進的及び血管新生的特性を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦｇＦ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害は、飽和的及び特異的な様式で、神経膠腫細胞において、増殖の８０％を抑制した(Morrison, 1991. Suppression of basic fibroblast growth factor expression by antisense oligonucleotides inhibits the growth of transformed human astrocytes. J. Biol. Chem. 266:728.)。疎水性であるので、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜と、良好に相互作用する（Akhter et al, 1991. Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes(liposomes) Nuc. Res. 19:5551-5559）。細胞の形質膜との相互作用に引き続き、それらは、特異的な受容体の関与を予測される飽和的な機序で（Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６４５４）、生きた細胞中へ、能動的（又は受動的に）輸送される（Loke et al, 1989. Characterization of oligonucleotide transport into living cells. PNAS USA 86:3474.）。
【００４１】
「リボザイム」とは、ＲＮＡ触媒能を有し（総説については、Ｃｅｃｈ参照）、標的ＲＮＡ中の特異的部位を切断するＲＮＡ分子である。
【００４２】
本発明に従えば、アネキシンＩＩｍＲＮＡを切断するリボザイムは、アネキシンＩＩ阻害剤として使用され得る。これは、アンチセンス療法が、化学両論的考察によって制限される場合に、必要であるかもしれない（Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ，  ｐｐ．  ３０５−３２５）。次いで、アネキシンＩＩ配列を誘導し得るリボザイムを使用することが可能である。リボザイムによって切断されるＲＮＡ分子の数は、化学両論によって予測される数より多い（Ｈａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，  １９８９；  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  １９８７）。
【００４３】
リボザイムは、ＲＮＡのホスホジエステル結合切断を触媒する。グループＩイントロン、ＲＮアーゼＰ、肝炎δウイルスリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム及びタバコ輪点ウイルスサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）のネガティブストランドから最初に得られたヘアピンリボザイムなど（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  １９９４；米国特許第５，２２５，３４７号、カラム４−５）、幾つかのリボザイム構造ファミリーが同定されている。後２者のファミリーは、リボザイムがローリングサークル複製の間に作製されたオリゴマーからモノマーを分離すると考えられているウイロイド及びウイルソイドから得られる（Ｓｙｍｏｎｓ，  １９８９  ａｎｄ  １９９２）。ハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムモチーフは、遺伝子治療用のｍＲＮＡのトランス切断に対して、最も一般的に適合されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，１９９４）。本発明で使用されるリボザイム種は、本分野において公知であるとおりに選択される。ヘアピンリボザイムは、現在、臨床試験中であり、好ましい種類である。一般的に、リボザイムは、３０ないし１００ヌクレオチド長である。リボザイムの送達は、ＡＳ断片及び／又はｓｉＲＮＡ分子の送達と類似している。
【００４４】
ｓｉＲＮＡとは、その内在性細胞対応物の遺伝子／ｍＲＮＡの発現を減少し、又は停止（妨害）するＲＮＡ分子を意味する。本用語は、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」を包含するものと理解される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、哺乳動物中での配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ８０６）。植物中での対応するプロセスは、一般に、特異的転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと称され、真菌では、沈静化（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも称される。ＲＮＡ干渉応答は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称されるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴としてもよく、これは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起り得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  １８８）。これらの用語及び提案される機序に関する最近の情報については、「Bernstein E., Denli AM., Hannon GJ: The rest is silence. RNA. 2001 Nov;7(11):1509-21; and Nishikura K.: A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. 2001 Nov 16;107(4):415-8」を参照されたい。本発明において使用され得るｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の例は、表１−３に記載されており、使用される化学的修飾は、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０４０３５６１５号（ａｔｕｇｅｎ）に記載されている。
【００４５】
近年、遺伝子を不活化するための最も効率的な方法の１つとして、ＲＮＡｉが浮上してきた（Nature Reviews, 2002, v.3, p.737-47; Nature, 2002, v.418,p.244-51）。１つの方法として、それは、ｄｓＲＮＡ種が特異的なタンパク質複合体に入ることが出来る能力に基づいており、次いで、該複合体において、ｄｓＲＮＡ種は、相補的な細胞ＲＮＡへと標的誘導され、ＲＮＡを特異的に分解する。さらに詳しく述べると、ｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡアーゼ(DICER, Drosha, etc)(Nature, 2001, v.409, p.363-6; Nature, 2003, .425, p.415-9)によって、短い（１７−２９ｂｐ）の阻害的ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと消化される。これらの断片及び相補的ｍＲＮＡは、特異的なＲＩＳＣタンパク質複合体によって認識される。標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断によって、完全なプロセスに至る（Nature Reviews, 2002, v.3, p.737-47; Curr Opin Mol Ther. 2003 Jun;5(3):217-24）。
【００４６】
公知の遺伝子に対するｓｉＲＮＡの調製方法に関する開示については、例えば、「Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 Jun 18;319(1):264-74; Sioud M, Leirdal M., Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods Mol Biol.2004;252:457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ.: Gene specific siRNA selector Bioinformatics. 2004 Feb 12;20(3):430-2. and Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res. 2004 Feb 9;32(3):936-48。「Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR.Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids Biochemistry, 2004 Feb 24;43(7):1921-7」を参照されたい。修飾された／より安定なｓｉＲＮＡの作製については、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０１５１０７（Ａｔｕｇｅｎ）及びＷＯ０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ）及び「Ｃｈｉｕ  ＹＬ，  Ｒａｎａ  ＴＭ．  ｓｉＲＮＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＮＡｉ：ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ＲＮＡ  ２００３  Ｓｅｐ；９（９）：１０３４−
４８  及び米国特許第５８９８０３１号及び第６１０７０９４号（Ｃｒｏｏｋｅ）を参照されたい。
【００４７】
細胞内でｓｉＲＮＡを生成することが可能なＤＮＡをベースとしたベクターが開発されている。本方法は、一般に、効率的にプロセッシングされて、細胞内でｓｉＲＮＡを形成する短いヘアピンＲＮＡの転写を含む。「Paddison et al. PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16:948-958」;「Sui et al. PNAS 2002, 8:5515-5520」;及び「Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553」。これらの報告は、内在的及び外在的に発現された多くの遺伝子を特異的に標的とすることが可能なｓｉＲＮＡを生成するための方法を記載する。
【００４８】
ｓｉＲＮＡの送達については、例えば、「Ｓhen et al(FEBS letters 539: 111-114(2003)), Xia et al., Nature Biotechnology 20: 1006-1010(2002), Reich et al., Molecular Vision 9: 210-216(2003), Sorensen et al.(J.Mol.Biol. 327: 761-766(2003), Lewis et al., Nature Genetics 32: 107-108(2002))及び「Simeoni et al., Nucleic Acids Research 31, 11: 2717-2724(2003）」を参照されたい。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類での阻害に対する使用が成功を収めており、さらなる詳細については、「Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｔｉｎａ  ２４（１）  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４  ｐｐ  １３２−１３８」を参照されたい。
【００４９】
本発明のｓｉＲＮＡ
本発明のｓｉＲＮＡの一般的な仕様
一般的には、本発明で使用されるｓｉＲＮＡは、二本鎖構造を含むリボ核酸を含み、該二本鎖構造は第一の鎖と第二の鎖を含み、該第一の鎖は、連続的ヌクレオチドの第一の伸長を含み、該第一の伸長は標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、及び第二の鎖は、連続的ヌクレオチドの第二の伸長を含み、該第二の伸長は標的核酸に対して少なくとも部分的に同一であり、前記第一の鎖及び／又は前記第二の鎖は、２’位に修飾を有する修飾されたヌクレオチドの複数の群を含み、該鎖内において、修飾されたヌクレオチドの各群は、ヌクレオチドの隣接する基によって一方又は両方側上で隣接しており、ヌクレオチドの隣接する群を形成する隣接ヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチド又は前記修飾されたヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドの何れかである。さらに、前記第一の鎖及び／又は前記第二の鎖は、前記複数の修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、及び修飾されたヌクレオチドの複数の群を含んでもよい。
【００５０】
修飾されたヌクレオチドの群及び／又は隣接ヌクレオチドの群は、多数のヌクレオチドを含むことができ、その数は、１個のヌクレオチドないし１０個のヌクレオチドを含む群から選択される。本明細書に明記されている任意の範囲に関連して、各範囲は、該範囲を規定する２つの数字を含む範囲を規定するために使用されるそれぞれの数字の間にある任意の各整数を開示する。本事例では、このため、前記群は、１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド及び１０個のヌクレオチドを含む。
【００５１】
前記第一の鎖の修飾されたヌクレオチドのパターンは、前記第二の鎖の修飾されたヌクレオチドのパターンと同一であってもよく、前記第二の鎖のパターンと一致してもよい。さらに、前記第一の鎖のパターンは、前記第二の鎖のパターンに対して、１以上のヌクレオチドだけシフトしてもよい。
【００５２】
上述の修飾は、アミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシ及びアルキルを含む群から選択され得る。
【００５３】
ｓｉＲＮＡの二本鎖構造は、一方又は両方側が平滑末端であってもよい。より具体的には、二本鎖構造は、第一の鎖の５’末端及び第二の鎖の３’末端によって規定される二本鎖構造の側が平滑末端であってもよく、又は前記二本鎖構造は、前記第一の鎖の３’末端及び前記第二の鎖の５’末端によって規定される二本鎖構造の側を平滑末端としてもよい。
【００５４】
さらに、２つの鎖の少なくとも１つが、５’末端に少なくとも１つのヌクレオチドの突出を有してもよく、この突出は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドからなり得る。また、鎖の少なくとも一つが、３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドの突出を必要に応じて有してもよい。
【００５５】
ｓｉＲＮＡの二本鎖構造の長さは、典型的には、約１７から２１まで、より好ましくは１８又は１９塩基である。さらに、前記第一の鎖の長さ及び／又は前記第二の鎖の長さは、約１５から約２３塩基まで、１７ないし２１塩基及び１８又は１９塩基の範囲を含む群から、互いに独立に選択してもよい。
【００５６】
さらに、前記第一の鎖と標的核酸間の相補性は完全であってもよく、又は前記第一の鎖と前記標的核酸との間で形成された二重鎖は、少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでもよく、前記二本鎖構造を形成する前記第一の鎖及び前記標的核酸との間に１つのミスマッチ又は２つのミスマッチが存在する。
【００５７】
幾つかの事例では、第一の鎖と第二の鎖の両方がそれぞれ、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの群とヌクレオチドの少なくとも１つの隣接群を含み、修飾されたヌクレオチドの各群は少なくとも１つのヌクレオチドを含み、及び、ヌクレオチドの各隣接群は少なくとも１つのヌクレオチドを含み、第一の鎖の修飾されたヌクレオチドの各群は第二の鎖上のヌクレオチドの隣接基と一致しており、前記第一の鎖の最も末端の５’ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドの基のヌクレオチドであり、前記第二の鎖の最も末端の３’ヌクレオチドは、ヌクレオチドの隣接基のヌクレオチドである。修飾されたヌクレオチドの各群が単一のヌクレオチドからなってもよく、及び／又はヌクレオチドの各隣接群が単一のヌクレオチドからなってもよい。
【００５８】
さらに、第一の鎖上では、ヌクレオチドの隣接群を形成するヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドの群を形成するヌクレオチドに対して３’方向に配置された非修飾ヌクレオチドであり、第二の鎖上では、修飾されたヌクレオチドの群を形成するヌクレオチドは、ヌクレオチドの隣接基を形成するヌクレオチドに対して５’方向に配置された修飾ヌクレオチドである。
【００５９】
さらに、ｓｉＲＮＡの第一の鎖は、８ないし１２個、好ましくは９ないし１１個の、修飾されたヌクレオチドの群を含んでもよく、前記第二の鎖は、７ないし１１個、好ましくは８ないし１０個の、修飾されたヌクレオチドの群を含んでもよい。
【００６０】
前記第一及び第二の鎖は、特に、ポリエチレングリコールなどの非核酸ポリマーから構成され得るループ構造によって連結されてもよい。あるいは、ループ構造は、核酸から構成されてもよい。
【００６１】
さらに、ｓｉＲＮＡの第一の鎖の５’末端は、前記第二の鎖の３’末端に連結されてもよく、又は前記第一の鎖の３’末端は、前記第二の鎖の５’末端に連結されてもよい。
【００６２】
本発明のｓｉＲＮＡの具体的な仕様
本発明は、アネキシンＩＩ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を提供する。本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖がアネキシンＩＩ遺伝子のｍＲＮＡ配列から由来し、アンチセンス鎖がセンス鎖に対して相補的である二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。一般に、標的ｍＲＮＡ配列からの若干の逸脱は、ｓｉＲＮＡ活性を損なうことなく許容される（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ  ２００３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１１），  ２７０５−２７１６を参照。）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを破壊して、又は破壊することなく、転写後の段階で遺伝子発現を阻害する。理論に拘泥するものではないが、ｓｉＲＮＡは、特異的な切断及び分解のためにｍＲＮＡを標的としてもよく、及び／又は標的とされたメッセージからの翻訳を阻害してもよい。
【００６３】
より具体的には、本発明は、構造（構造Ａ）：
５’（Ｎ）ｘ−Ｚ３’  （アンチセンス鎖）
３’Ｚ’−（Ｎ’）ｙ５’（センス鎖）
（各Ｎ及びＮ’は、その糖残基において修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいリボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙは、連続する各Ｎ又はＮ’が、共有結合によって、次のＮ又はＮ’に連結されているオリゴマーであり、
ｘ及びｙの各々は、１９ないし４０の整数であり；
Ｚ及びＺ’の各々は、存在し、又は存在しないことができるが、存在する場合には、ｄＴｄＴであり、その中にそれが存在する鎖の３’末端に共有結合されており；
（Ｎ）Ｘの配列は、アネキシンＩＩのｃＤＮＡに対するアンチセンス配列を含む。）
特に、本発明は、（Ｎ）ｘの配列が、表１、２及び３中に存在するアンチセンス配列の一又は複数を含む、上記化合物を提供する。
【００６４】
本発明の化合物は、共有結合を通じて連結される複数のヌクレオチドからなることが、当業者には自明であろう。このような各共有結合は、各鎖のヌクレオチド配列の長さに沿って、ホスホジエステル結合、ホスホチオアート結合又は両方の組み合わせとしてもよい。他の可能な骨格修飾は、とりわけ、米国特許第５，５８７，３６１号；第６，２４２，５８９号；第６，２７７，９６７号；第６，３２６，３５８号；第５，３９９，６７６号；第５，４８９，６７７号；及び第５，５９６，０８６号に記載されている。
【００６５】
特定の実施形態において、ｘ及びｙは、好ましくは、約１９ないし約２７、最も好ましくは約１９から２３までの間の整数である。本発明の化合物の特定の実施形態では、ｘはｙに等しくてもよく（すなわち、ｘ＝ｙ）、好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９又はｘ＝ｙ＝２１である。特に好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
【００６６】
本発明の化合物の一実施形態では、Ｚ及びＺ’は何れも不存在であり、別の実施形態では、Ｚ又はＺ’の一方が存在する。
【００６７】
本発明の化合物の一実施形態では、化合物のリボヌクレオチドの全てが、それらの糖残基中に修飾が施されていない。
【００６８】
本発明の化合物の幾つかの実施形態では、少なくとも１つのリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されており、好ましくは２’位が修飾されている。２’位の修飾は、好ましくは、アミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシ及びアルキル基を含む群から選択される部分の存在をもたらす。本発明で最も好ましい実施形態では、２’位の部分は、メトキシ（２’−Ｏ−メチル）である。
【００６９】
本発明の幾つかの実施形態では、化合物のアンチセンス及びセンス鎖の両鎖中で、交互のリボヌクレオチドが修飾される。
【００７０】
本発明の特に好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は５’末端がリン酸化されており、３’末端はリン酸化されていてもよく、若しくはリン酸化されていなくてもよく、並びに、センス鎖は５’末端及び３’末端がリン酸されていてもよく、若しくはリン酸化されていなくてもよい。
【００７１】
本発明の化合物の別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドの糖残基が修飾されており、センス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されていない。
【００７２】
本発明は、さらに、細胞中では非修飾形態であり、その後、適切な修飾を施してもよい先述されたオリゴリボヌクレオチドのいずれかを発現することが可能なベクターを提供する。
【００７３】
本発明は、担体中、好ましくは薬学的に許容される担体中に、本発明の化合物の一又は複数を含む組成物も提供する。本組成物は、同一遺伝子に対して２以上の異なるｓｉＲＮＡの混合物を含んでもよい。
【００７４】
本発明の別の化合物は、本発明の１以上の化合物（構造Ａ）に共有結合又は非共有結合された本発明の上記化合物（構造Ａ）を含む。本化合物は、担体、好ましくは、薬学的に許容される担体中に入れて送達してもよく、本発明の１又は複数のｓｉＲＮＡを産生するために、内在性細胞複合体によって細胞内でプロセッシングされ得る。
【００７５】
本発明は、担体と、ヒトアネキシンＩＩの細胞中での発現を下方制御するのに有効な量の１又は複数の本発明の化合物とを含み、該化合物が（Ｎ）Ｘの配列に対して実質的に相補的な配列を含む組成物も提供する。
【００７６】
本発明は、遺伝子のｍＲＮＡ転写物を、本発明の化合物の一又は複数と接触させることを含む、ヒトアネキシンＩＩの発現を、対照と比べて少なくとも５０％下方制御する方法も提供する。
【００７７】
一実施形態において、前記化合物は、アネキシンＩＩポリペプチドを下方制御し、アネキシンＩＩの下方制御は、アネキシンＩＩ機能の下方制御（酵素的アッセイ、又は、とりわけ、固有遺伝子／ポリペプチドの公知の相互作用因子を用いた結合アッセイによって調べてもよい。）、アネキシンＩＩタンパク質の下方制御（とりわけ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又は免疫沈降によって調べてもよい。）及びアネキシンＩＩｍＲＮＡ発現の下方制御（とりわけ、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インシチュハイブリダイゼーション又はマイクロアレイハイブリダイゼーションによって調べてもよい。）を含む群から選択される。
【００７８】
本発明は、神経変性疾患及び／又は中枢神経系に対する傷害に罹患している患者に、治療的有効量で本発明の組成物を投与し、これにより前記患者を治療することを含む、神経変性疾患及び／又は中枢神経系に対する傷害に罹患している患者を治療する方法も提供する。
【００７９】
本発明は、神経変性疾患及び／又は中枢神経系の病変を患った患者において回復を促進するための組成物の調製のための、治療的有効量の又は複数の本発明の化合物の使用も提供する。
【００８０】
本明細書において使用される「治療」という用語は、疾病に付随する症候を改善し、重度を軽減し若しくは疾病を治癒し、又は疾病の発生を抑制するのに有効な治療用物質の投与を表す。
【００８１】
化合物は、各末端領域塩基中のリボヌクレオチドの最大２個が変化された相同体を有してもよく、末端領域は、４つの末端リボヌクレオチドを表し、例えば、１９マー配列では、塩基１ないし４及び／又は１６ないし１９を表し、２１マー配列では、塩基１ないし４及び／又は１８ないし２１を表す。
【００８２】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、表１、２及び３に列記されているオリゴヌクレオチド、好ましくは表１に列記されているオリゴヌクレオチド及び／又はヒトｃＤＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドである。本発明の最も好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示されている阻害的活性を有するオリゴヌクレオチド、好ましくは、ヒトアネキシンＩＩｃＤＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドである。
【００８３】
本発明の最も好ましい化合物は、平滑末端の１９マーオリゴヌクレオチド（すなわち、ｘ＝Ｙ−１９であり、Ｚ及びＺ’がともに存在しない）であり；該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’位及びセンス鎖の３’位がリン酸化されており、交互のリボヌクレオチドが、アンチセンス及びセンス鎖の両方注で、２’位において修飾されており、２’位の部分がメトキシ（２’−Ｏ−メチル）であり、アンチセンス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドの糖残基が修飾されており、センス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されていない。本発明において最も好ましいこのような化合物は、表１のｓｉＲＮＡ番号５である。この化合物のアンチセンス鎖は、配列番号１２を有し、センス鎖は配列番号７を有する。別の好ましい化合物は、表１の他のｓｉＲＮＡである。
【００８４】
本発明の一側面では、前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖構造を含み、このような二本鎖構造は、        
第一の鎖及び第二の鎖を含み、
該第一の鎖は連続的ヌクレオチドの第一の伸長を含み、該第二の鎖は連続的ヌクレオチドの第二の伸長とを含み、
第一の伸長は、アネキシンＩＩをコードする核酸配列と相補的であるか、又は同一であり、前記第二の伸長は、アネキシンＩＩをコードする核酸配列に対して同一であるか又は相補的である。
【００８５】
一実施形態において、前記第一の伸長及び／又は第二の伸長は、約１４から４０個までのヌクレオチド、好ましくは約１８ないし３０個のヌクレオチド、より好ましくは約１９から２７個までのヌクレオチド、最も好ましくは約１９から２３個までのヌクレオチド、特に、約１９から２１個までのヌクレオチドを含む。このような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７から４０個までのヌクレオチド長としてもよい。
【００８６】
さらに、本発明のさらなる核酸は、配列番号７−３６８の何れか１つの少なくとも１４個の連続するヌクレオチド、より好ましくは、上記第一の伸長及び第二の伸長から構成される二本鎖構造の何れかの末端に１４個の連続するヌクレオチド塩基対を含む。
【００８７】
本発明は、本発明の少なくとも１つの二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を取得することと、及び
該化合物を、薬学的に許容される担体と混合することと、
を含む薬学的組成物を調製する方法も提供する。
【００８８】
本発明は、本発明の化合物を、薬学的に許容される担体と混合することを含む、薬学的組成物を調製する方法も提供する。本発明は、同様に、動物の治療及び世話のために獣医学診療において使用するための、特に、哺乳動物の治療及び世話において使用するための医薬及び方法にも関する。
【００８９】
好ましい実施形態において、薬学的組成物の調製において使用される化合物は、薬学的に有効な用量で担体とともに混合される。具体的な実施形態において、本発明の化合物は、ステロイドに、又は脂質に、又は他の適切な分子に、例えば、コレステロールに抱合される。
【００９０】
本発明の化合物は、直接的に、又はウイルス若しくは非ウイルスベクターとともに送達することが可能である。直接送達される場合、配列は、一般的には、ヌクレアーゼ耐性とされる。あるいは、本明細書の以下で論述されているように、配列が細胞中で発現されるように、発現カセット又は構築物中に配列を取り込ませることが可能である。一般的には、構築物は、標的とされる細胞中で配列を発現可能とするために、適切な制御配列又はプロモーターを含有する。本発明の化合物の送達のために必要に応じて使用されるベクターは市販されており、当業者に公知の方法によって、本発明の化合物を送達する目的のために修飾してもよい。
【００９１】
１又は複数のステム及びループ構造（ステム領域は、本発明のオリゴヌクレオチドの配列を含む。）を含む長いオリゴヌクレオチド（典型的には２５ないし５００ヌクレオチド長）は、担体中、好ましくは薬学的に許容される担体中に入れて送達してもよく、本発明のオリゴヌクレオチドである一又は複数のさらに小さな二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を産生させるために、内在性細胞複合体（例えば、上記のようなＤＲＯＳＨＡ及びＤＩＣＥＲ）によって細胞内で加工されてもよいことも想定される。このオリゴヌクレオチドは、タンデムｓｈＲＮＡ構築物と名付けることができる。この長いオリゴヌクレオチドは、一又は複数のステム及びループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各ステム領域は、アネキシンＩＩ遺伝子のセンス及び対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列、好ましくは、表１−３中に存在する配列の一部を含む。特に、本発明において使用されるｓｉＲＮＡは、１つの鎖が配列番号３−５２又は配列番号１０３−１７４又は配列番号２４７−２９５（これらはセンス鎖である。）中に記された配列を５’から３’へと有する連続的ヌクレオチドを含み、複数の塩基が、好ましくは２−Ｏ−メチル修飾によって修飾され得るオリゴヌクレオチド、又はその相同体（各末端領域中の最大２個のヌクレオチドで、塩基が変化している。）である。
【００９２】
オリゴヌクレオチドの末端領域は、１９マー配列中の塩基１−４及び／又は１６−１９（下表１及び２）並びに２１マー配列中の塩基１−４及び／又は１８−２１（下表３）を表す。
【００９３】
さらに、本発明において使用されるｓｉＲＮＡは、１つの鎖が配列番号１２−１６又は配列番号１１９−２２０又は配列番号２９５−３６８（アンチセンス鎖）中に記された配列を５’から３’へと有する連続的ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、又はその相同体（各末端領域中の最大２個のヌクレオチドで、塩基が変化している。）である。
【００９４】
このように、特定の側面において、オリゴヌクレオチドは、二本鎖構造を含み、このような二本鎖構造は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、該第一の鎖は、連続的ヌクレオチドの第一の伸長を含み、該第二の鎖は連続的ヌクレオチドの第二の伸長を含み、第一の伸長は、遺伝子アネキシンＩＩをコードする核酸配列と相補的であるか、又は同一であり、前記第二の伸長は、アネキシンＩＩをコードする核酸配列に対して同一であるか又は相補的である。前記第一の伸長は、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、さらに好ましくは１９個のヌクレオチド又はさらには少なくとも２１個のヌクレオチドを含む。一実施形態において、前記第一の伸長は、約１４から４０個までのヌクレオチド、好ましくは約１８ないし３０個のヌクレオチド、より好ましくは約１９から２７個までのヌクレオチド、最も好ましくは約１９から２３個までのヌクレオチドを含む。一実施形態において、前記第二の伸長は、約１４から４０個までのヌクレオチド、好ましくは約１８ないし３０個のヌクレオチド、より好ましくは約１９から２７個までのヌクレオチド、最も好ましくは約１９から２３個までのヌクレオチド、又は、約１９ないし２１個のヌクレオチドを含む。一実施形態において、前記第一の伸長の前記第一のヌクレオチドは、アネキシンＩＩをコードする核酸配列のヌクレオチドに対応し、前記第一の伸長の最後のヌクレオチドは、アネキシンＩＩをコードする核酸配列のヌクレオチドに対応する。一実施形態において、前記第一の伸長は、オリゴヌクレオチドの少なくとも１４個の連続的ヌクレオチドの配列を含み、このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号７−３６８を含む群から、好ましくは、表１中の連続番号１−５、表２中の１００−１０７及び表３中の１７４−１８１の何れかの配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む群から選択される。さらに、本発明で使用されるｓｉＲＮＡ分子の仕様は、二ヌクレオチドｄＴｄＴが３’末端に共有結合され、及び／又は、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて、おそらくは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む修飾で、糖残基が修飾されているオリゴリボヌクレオチドを与えてもよい。さらに、２’ＯＨ基は、−Ｈ−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２及び−Ｆを含む群から選択される基又は部分によって置換されてもよい。
【００９５】
さらに、本発明において使用されるｓｉＲＮＡは、交互のヌクレオチド中で、修飾された糖が両鎖中に位置するオリゴリボヌクレオチドであってもよい。特に、オリゴリボヌクレオチドは、末端の５’及び３’ヌクレオチド中で糖が非修飾であるセンスストランドの１つ、又は末端の５’及び３’ヌクレオチド中で糖が修飾されているアンチセンス鎖の１つを含み得る。
【００９６】
さらに、本発明において使用されるべきさらなる核酸は、配列番号７−３６８の何れか１つの少なくとも１４個の連続するヌクレオチド、より好ましくは、上記第一の伸長及び第二の伸長から構成される二本鎖構造の何れかの末端に１４個の連続するヌクレオチド塩基対を含む。本発明の核酸の長さ、特に本発明のこのような核酸を形成する各伸長の潜在的長さに鑑みれば、各側に対して配列番号１に詳述されているアネキシンＩＩ遺伝子のコード配列に比して幾つかのシフトが可能であり、このようなシフトは、両方向に最大１、２、３、４、５及び６個のヌクレオチドとすることができ、このようにして生成された二本鎖核酸分子も、本発明に属するものとする。
【００９７】
アネキシンＩＩに対するｓｉＲＮＡは、アネキシンＩＩの公知配列（配列番号１）に基づいて、本明細書に記載されているように本分野で公知の方法を用いて作製することが可能であり、上記様々な修飾によって安定化することが可能である。さらなる情報については、実施例４を参照。
【００９８】
さらに、本明細書に記載されている本発明の方法に関連して、本発明の方法とともに使用され得る本発明のさらなる阻害的ＲＮＡ分子は、表１−３中に詳述されている配列（１９マー及び２１マー）中に存在する少なくとも７−１４の連続するヌクレオチドの伸長を好ましくは含む一本鎖オリゴリボヌクレオチドを含み、該オリゴリボヌクレオチドは、細胞内複合体によって認識される特定の立体構造で二本鎖領域を形成し、及び／又は含むことが可能であり、該オリゴリボヌクレオチドは、アネキシンＩＩの阻害を実施することが可能な、さらに小さなＲＮＡ分子、及びこのようなＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子へと分解される。
【００９９】
例えば、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡを含むアンチセンスＤＮＡ分子などの任意の分子（適切な核酸修飾を有する。）が特に望ましく、本明細書に開示されている全ての使用及び方法のために、対応するそれらのｓｉＲＮＡと同じ能力で使用することができる。
【０１００】
本発明において、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ分子の何れか、又は内在性細胞複合体（ＤＩＣＥＲなど−上記参照）によって加工されて、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ分子を形成し、若しくは本明細書に開示されているｓｉＲＮＡを含む分子を形成する、任意の長い二本鎖ＲＮＡ分子（典型的には、２５−５００ヌクレオチド長さ）は、任意の疾病又は疾患の治療において使用可能であることが理解されるべきである。より具体的には、本発明は、特に神経変性疾患又は中枢神経系疾患などの疾病又は疾患に罹患した患者に、本明細書に開示されているアネキシンＩＩ  ｓｉＲＮＡの一又は複数（又は上述のように、前記ｓｉＲＮＡの１若しくは複数をコードする１若しくは複数の長いｄｓＲＮＡ）を含む薬学的組成物を、治療的有効量で投与して、これにより前記患者を治療することを含む、特に神経変性疾患又は中枢神経系疾患などの疾病又は疾患に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０１０１】
本発明の分子によって治療することができるさらなる疾患には、本明細書に記載されている心筋梗塞（ＭＩ）及びアポトーシス関連疾患が含まれる。本発明のさらなる側面は、アポトーシス関連疾患を治療する方法を提供する。制御されない、病理的細胞増殖、例えば、とりわけ癌、乾癬、自己免疫疾患を伴う疾病又は疾患を治療するための方法、並びに、虚血及び適切な血流の欠如を伴う疾病、例えば、心筋梗塞（ＭＩ）及び卒中を治療するための方法が提供される。
【０１０２】
このように、この側面では、本発明は、ＭＩに罹患している患者に、アネキシンＩＩ阻害剤を治療的有効量で含む薬学的組成物を患者に投与し、これにより前記患者を治療することを含む、ＭＩに罹患している患者を治療する方法を提供する。前記阻害剤は、ニトロプロシドナトリウムなどの小化学的化合物（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又はアネキシンＩＩ分泌を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ１０２４（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ  ２７８，  ６：４２０５−４２１５（２００３））としてもよい。）；アネキシンＩＩ遺伝子へのハイブリダイゼーションを可能とするために配列番号１に記されているアネキシンＩＩ遺伝子の配列内に存在する配列に対して十分な長さと相同性の配列を有し、図３に示されている配列のうちの１つ（配列番号３又は配列番号４）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、又は図１に示されている配列（配列番号１）に対するセンス配列であり、且つ前記配列に対するドミナントネガティブペプチドをコードする配列を有し、図４に示されている配列のうちの１つ（配列番号５又は配列番号６）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むセンスポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、必要に応じて、表１−３（配列番号７−３６８）、特に表１のｓｉＲＮＡ番号１−５、表２の１００−１０７及び表３の１７４−１８１に記載されている配列の何れか１つと同一の配列を有する連続的ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡであるポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド；これらのポリヌクレオチドの何れかを含むベクター；ドミナントネガティブペプチドなどのポリペプチド、例えば、配列番号５又は配列番号６によってコードされるペプチド、アネキシンＩＩを結合することが見出されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００４０４／１８４４号のペプチド＃４１、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））若しくは、その配列が図２に示されている（配列番号２）連続的アミノ酸を含むポリペプチド内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体、必要に応じて、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体；又はリボザイムを含んでもよい。前記薬学的組成物は、希釈剤又は担体をさらに含有してもよい。
【０１０３】
本発明のさらなる方法は、ＭＩに罹患している患者に、本明細書に記載されている阻害剤の何れかなどの、アネキシンＩＩ阻害剤の治療的有効量を含む薬学的組成物を投与し、これにより前記患者を治療することを含む、ＭＩに罹患している患者を治療する方法を提供する。
【０１０４】
本発明のアポトーシス関連疾病治療の側面は、癌又はＭＩに罹患している患者の回復を促進するための医薬の調製のための、アネキシンＩＩ阻害剤の治療的有効量の使用も提供する。阻害剤は、本明細書に詳述されている選択肢の一又は複数であることができる。
【０１０５】
「癌」又は「腫瘍」とは、異常な細胞の、制御されていない増殖塊を表す。これらの用語には、良性又は悪性であり得る原発性腫瘍並びに体内の他の部位に伝播した二次性腫瘍又は転移の両方が含まれる。癌タイプの疾病の例には、とりわけ、癌腫（例えば、乳癌、大腸癌及び肺癌）、Ｂ細胞白血病などの白血病、Ｂ細胞リンパ腫などのリンパ腫、神経芽腫及び悪性黒色腫等の芽細胞腫が含まれる。
【０１０６】
「発現ベクター」という用語は、外来細胞中に異種ＤＮＡ断片を取り込み、該断片を発現する能力を有するベクターを表す。多くの原核及び真核発現ベクターが公知であり、及び／又は市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範疇に属する。
【０１０７】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸から構成される分子を意味し、本用語には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及びペプチド模倣物が含まれる。
【０１０８】
ペプチド模倣物とは、天然の親ペプチドの生物作用を模倣することが可能である非ペプチド構造要素を含有する化合物である。ペプチド模倣物中には、酵素的に切断可能なペプチド結合などの古典的ペプチド特性の幾つかが通常存在しない。
【０１０９】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する２０のアミノ酸の何れか１つ、化学的に修飾されたアミノ酸（下記参照）又は合成アミノ酸からなる分子を表す。
【０１１０】
「ドミナントネガティブペプチド」という用語は、完全なタンパク質と相互作用し、その活性を阻害することが可能であるか、又は他のタンパク質と相互作用し、完全なタンパク質に応答して他のタンパク質の活性を阻害することができるタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片によってコードされるポリペプチドを表す。
【０１１１】
「抗体」という用語は、とりわけ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体を表す。この定義には、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が含まれる。本用語は、完全な抗体又は抗ＧＰＣＲＶ産物抗体の抗原結合ドメインを含む抗体の断片、例えば、Ｆｃ部分を含まない抗体、一本鎖抗体、抗体の可変抗原結合ドメインのみから実質的になる断片などを表す。「抗体」という用語は、ｃＤＮＡワクチン接種によって得られる核酸配列に対する抗体も表し得る。
【０１１２】
本用語は、それらの抗原又は受容体と選択的に結合する能力を保持した抗体断片も包含し、特に、以下のものが例示される。
【０１１３】
（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片であり、軽鎖及び重鎖の一部を生成するために、完全な抗体を、酵素パパインで消化することによって作製することが可能である；
（２）（Ｆａｂ’）２、その後の還元なしに、酵素ペプシンで完全な抗体を処理することによって得ることが可能な抗体の断片；（Ｆａｂ’２）は、２つのジスルフィド結合によって互いに固定された２つのＦａｂ断片の二量体である；
（３）Ｆｖ、２つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された断片として定義される；
（４）一本鎖抗体（ＳＣＡ）、軽鎖の可変領域と、遺伝学的に融合された一本鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結された重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された断片として定義される。
【０１１４】
本発明において使用される「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖の側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性及び特異的な電荷特性を有する。
【０１１５】
本発明の一実施形態において、これらの薬学的組成物の任意の１つが、組織外傷又は慢性の変性的な変化に起因するものであると否とを問わず、損傷を受けた神経組織に伴われる症候及び兆候を改善又は軽減するために使用される。本実施形態は、中枢神経系に対する傷害を患った患者において、中枢神経系に対する損傷を軽減し、又は回復を促進するのに十分な投薬量及び期間にわたって、上記薬学的組成物の何れか１つを前記患者に投与することを含む、中枢神経系に対する傷害を患った患者おける中枢神経系への損傷を軽減し又は回復を促進する方法に関する。本実施形態は、必要に応じて、本明細書に記載されている症状又は傷害の何れかの結果として、中枢神経系に対する傷害を患った患者に、アネキシンＩＩを阻害するのに十分な投薬量及び期間にわたって、本明細書に例示されているように、アネキシンＩＩ阻害剤の治療的有効量を含む薬学的組成物を前記患者に投与し、これによって前記患者を治療することを含む、中枢神経系に対する傷害を患った患者を治療する方法又はプロセスをさらに提供する。
【０１１６】
ある種の神経疾患（例えば、脳虚血又は卒中）では、正常な対象に比べて、脳血液関門（ＢＢＢ）が比較的開放されているため、抗体を含む巨大分子などの大きな分子さえ、脳まで透過することが可能であり、これによって、その後、分子がアネキシンＩＩと相互作用することが可能となる。脳内への送達に関するさらに詳しい情報は、以下の実施例８に記載されている。
【０１１７】
本発明の一側面において、前記薬学的組成物が軽減を目的とし、又は前記薬学的組成物が回復の促進を試みる中枢神経系に対する傷害は、全体的な又は局所的な脳の発作であり得る（これに限定されない）虚血性発作であり、前記傷害は、本明細書中に論述されているように、卒中現象又は外傷性脳傷害であり得る。中枢神経系の傷害又は外傷に関するさらに詳しい情報は、以下に記載されている。
【０１１８】
本発明の別の側面では、先述の薬学的組成物と組み合わせて、薬学的に有効な追加の化合物が投与される。
【０１１９】
「組み合わせて」とは、アネキシンＩＩ阻害剤を含む薬学的組成物の投与の前、同時又は後に、薬学的に有効な追加の組成物が投与されることを意味する。
【０１２０】
本発明のさらなる実施形態において、神経の再生を必要としている対象中に神経の再生を引き起こすために、上記薬学的組成物の任意の１つが使用される。本発明の本実施形態は、損傷を軽減し、又は回復を促進するのに十分な投薬量及び期間にわたって、神経細胞の再生を必要とする患者に、上記薬学的組成物の何れか１つを投与することを含む、前記患者中に神経細胞の再生を引き起こす方法に関する。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、神経細胞の変性又は損傷が関与し、又は推測される任意の疾病、とりわけ、以下の症状の治療に用途を有することが可能である。高血圧、高血圧性脳血管疾患、血栓又は塞栓、血管腫、血液異混和症の場合に発生するような血管の収縮又は閉塞、心停止又は心不全を含む任意の形態の悪化した心機能、全身性低血圧；並びに卒中、パーキンソン病、癲癇、うつ病、ＡＬＳ、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病及び他の何らかの疾病によって誘導された認知症（例えば、ＨＩＶによって誘導された認知症など）などの疾病。これらの症状は、本明細書において、「神経変性疾患」とも称される。動脈瘤の破裂、心停止、心臓性ショック、敗血症ショック、脊髄外傷、頭部外傷、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、発作、腫瘍からの出血などの中枢神経系に対する外傷は、本発明において、「中枢神経系に対する傷害」とも称され、同じく、本発明の化合物及び組成物を用いて治療してもよい。
【０１２２】
特許請求の範囲に記載された本発明の一実施形態は、特に、虚血性発作、卒中又は外傷性脳傷害などの中枢神経系に対する傷害を患った患者の治療用医薬の調製のための方法において、治療的有効量のアネキシンＩＩ阻害剤を使用することを提供する。前記阻害剤は、ニトロプルシドナトリウム（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又はアネキシンＩＩ分泌を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ１０２４（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ  ２７８，  ６：  ４２０５−４２１５（２００３））などの小化学的化合物；図１に示されている配列（配列番号１）に対するアンチセンス配列である配列を有し、図３に示されている配列のうちの１つ（配列番号３又は配列番号４）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むアンチセンスポリヌクレオチド、又は図１に示されている配列（配列番号１）に対するセンス配列であり、且つ前記配列に対するドミナントネガティブペプチドをコードする配列を有し、図４に示されている配列のうちの１つ（配列番号５又は配列番号６）を必要に応じて有する連続ヌクレオチドを含むセンスポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド、又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能し、表１−３、特に表１に記載されている配列の１つを必要に応じて有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド；これらのポリヌクレオチドの何れかを含むベクター；ドミナントネガティブペプチドなどのポリペプチド、例えば、配列番号５又は配列番号６によってコードされるペプチド、アネキシンＩＩを結合することが見出されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００４０４／１８４４号のペプチド＃４１、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ４２７７−４２８６（２００２））又は上に詳述されている抗体などの抗体、必要に応じてポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体であってもよい。薬学的組成物は、さらに、希釈剤又は担体を含有してもよい。
【０１２３】
本発明に従う治療計画は、投与様式、投与のタイミング及び投薬量の観点で、虚血性現象又は中枢神経系傷害の有害な結果からの患者の機能的な回復が改善されるように、すなわち、患者の運動技能（例えば、姿勢、バランス、握持又は歩き方）、認知技能、会話及び／又は感覚知覚（視覚能力、味覚、嗅覚及び自己受容を含む。）の少なくとも１つが、本発明の阻害剤投与の結果として改善する。このように、前記阻害剤は、これらの技能の少なくとも１つを改善することによって、患者の回復を促進又は補強する。
【０１２４】
本発明のアネキシンＩＩ阻害剤を含む薬学的組成物の投与は、静脈内、動脈内、皮下又は脳内を含む、任意の公知の投与経路によって実施することが可能である。特殊化された製剤を使用すれば、これらを、経口的に又は吸入を介して投与することも可能であり得る。組成物を必要としている個体に組成物を投与するための適切な投薬及び治療計画は、以下に詳しく論述されている。
【０１２５】
本発明は、様々な症状の何れかに起因する中枢神経系傷害の有害な結果を治療するために使用することが可能である。血栓、塞栓及び全身性低血圧は、脳虚血発作の最も一般的な原因の１つである。他の傷害は、高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤の破裂、血管腫、血液異混和症、心不全、心停止、心臓性ショック、敗血症ショック、頭部外傷、脊髄外傷、発作、腫瘍からの出血又は他の血液喪失によって引き起こされ得る。
【０１２６】
虚血に発作が伴う場合には、以下に定義されているように、全身的又は局所的な虚血の何れかであり得る。たとえ、傷害からかなり後に投与が行われた場合でさえ、本発明の薬学的組成物の投与は有効であると考えられる。
【０１２７】
「虚血性発作」とは、組織への血液供給の欠乏をもたらす任意の状況を意味する。脳虚血発作は、脳への血液供給の欠乏に起因する。中枢神経系の一部でもある脊髄は、血流減少に起因する虚血に対して、同様に感受性を有する。虚血性発作は、高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤の破裂、血栓又は塞栓、血管腫、血液異混和症の場合に発生するような血管の収縮又は閉塞、心停止又は心不全を含む、任意の形態の悪化した心機能、全身性低血圧、心停止、心臓性ショック、敗血症ショック、脊髄外傷、頭部外傷、発作、腫瘍からの出血又はその他の血液喪失によって引き起こされ得る。本発明は、頭部又は脊髄への打撃などの機械的な力によって引き起こされた中枢神経系に対する傷害を治療するためも有用であると予測される。外傷には、頭部、頸部又は脊柱の任意の部位又は頭部、頸部又は脊柱に対する付属物と外来物体が外傷的に接触することによって生じ得るなど、擦り傷、切開、打撲、刺し傷、圧迫などの組織損傷を含むことが可能である。外傷性傷害の他の形態は、液体の不適切な蓄積によって中枢神経組織の収縮又は圧縮から生じ得る（例えば、正常な脳脊髄液の封鎖若しくは機能不全若しくは硝子体液産生、代謝回転若しくは容量制御、又は硬膜下若しくは頭蓋内血腫若しくは浮腫）。同様に、外傷性収縮又は圧縮は、転移性又は原発性腫瘍などの異常な組織の塊の存在から生じることが可能である。
【０１２８】
中枢神経系に関して本明細書で使用される「局所虚血」とは、血液を脳又は脊髄へ供給する単一の動脈の閉塞から生じ、前記動脈によって供給される領域における細胞要素すべての死滅（頭蓋壊死（ｐａｎ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ））に至る状態を意味する。
【０１２９】
中枢神経系に関して本明細書で使用される「全体的脳虚血」とは、脳全体、前脳、又は脊髄への血流の一般的な減少から生じ、これらの組織全体にわたる選択的に脆弱な領域において神経細胞を死滅させる状態を意味する。これらの場合の各々における病理学的状態は、臨床的な相関現象のため極めて異なる。局所虚血モデルは局所脳梗塞を有する患者へ応用し、一方で全体的虚血のモデルは心停止、及び全身性体血圧の他の原因に類似している。
【０１３０】
本明細書で使用される「神経毒性ストレス」という語は、正常な神経細胞に対して毒性がある（及び前記神経細胞の死滅又はアポトーシスを生じるかもしれない）いずれかのストレスを包含するものとする。このようなストレスは、酸化的ストレス（低酸素症又は高酸素症）又は虚血又は外傷であってもよく、及び／又は前記ストレスは、グルタミン酸塩又はドーパミン又はＡβタンパク質、又は酸化的ストレスを生じる任意の物質又は処理など、インビボで前記細胞に対して毒性のある物質へ前記細胞を供することを包含してもよい。前記神経毒性物質は内因性又は外因性であってもよく、神経毒性という語は、有機リン中毒を含むさまざまな公知の神経毒素への暴露、又はこのタイプのいずれかの他の傷害も包含するものとする。さらに、神経毒性ストレスは、神経変性疾患によって生じ得る。
【０１３１】
さらなる実施形態において、本発明は、神経細胞の再生を必要とする対象に、治療的有効量で活性成分としてのアネキシンＩＩ阻害剤を含み、希釈剤又は担体をさらに含み、必要に応じて本明細書に記載されている薬学的組成物のいずれかである薬学的組成物を前記対象へ投与することをさらに含む、神経細胞の再生を引き起こすための方法又はプロセスを提供する。
【０１３２】
「スクリーニング」実施形態として本明細書で称される本発明のさらなる実施形態は、アネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスを調節する種及び／又は化合物を得るための方法及びプロセスに関する。この実施形態のある側面は、アネキシンＩＩを発現する細胞を、種及び／又は化合物と接触させることと、対照と比較して細胞のアネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスを調節する前記種及び／又は化合物の能力を決定することとを含む、アネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスを調節する種及び／又は化合物を得るためのプロセスを提供する。調べられている細胞は、アネキシンＩＩを発現するように修飾されてもよく、理論に拘泥するものではないが、アポトーシスはアネキシンＩＩの存在によって、又は必要に応じて、過酸化水素、グルタミン酸塩、ドーパミン、Ａβタンパク質若しくは任意の公知の神経毒若しくは虚血若しくは低酸素症などの神経毒性処理によって引き起こされる神経毒性ストレスによって、又は卒中などの神経変性疾患によって誘導されてもよい。さらに、このプロセスは、薬学的組成物を調製するために使用されてもよい。次に、前記プロセスは、前述のプロセスによって得られる種若しくは化合物又はその化学的類縁体若しくは相同体を薬学的に許容される担体と混合することを含む。
【０１３３】
本明細書で使用される、「発現するように修飾されている」細胞とは、形質移入、形質導入、感染、又は前記細胞に前記望ましい遺伝子を発現させるその他の公知の分子生物学的方法によって修飾される細胞を意味する。このような方法を実施するための材料及びプロトコールは、当業者にとって自明である。
【０１３４】
前記スクリーニングの実施形態のさらなる側面は、
（ａ）アネキシンＩＩを発現する細胞を、複数の種及び／又は化合物と接触させること、
（ｂ）アネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスが、対照と比較して、前記種及び／又は化合物の存在下で調節されるかどうかを決定し、もし調節されていれば
（ｃ）アネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスの調節が複数の種及び／又は化合物に含まれるそれぞれの種及び／又は化合物によって影響されるかどうかを個別に決定し、これによりアネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスを調節する種及び／又は化合物を同定すること、を含む、
アネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスを調節する種及び／又は化合物を得るために複数の種又は化合物をスクリーニングするプロセスを提供する。
【０１３５】
前記接触工程にある細胞は、アネキシンＩＩポリペプチドを発現するように修飾されてもよく、理論に拘泥するものではないが、アポトーシスはアネキシンＩＩの過剰発現によって、又は前記細胞を、必要に応じて過酸化水素、グルタミン酸塩、ドーパミン、Ａβタンパク質若しくはいずれかの公知の神経毒又は虚血若しくは低酸素症などの神経毒性処理によって生じる神経毒性ストレスに供した結果として、又は脳卒中などの神経変性疾患によって自発的に誘導されてもよい。さらに、このプロセスは、薬学的組成物を調製するために使用されてもよい。次に、前記プロセスは、前述のプロセスによって同定された種若しくは化合物又はその化学的類縁体若しくは相同体を、薬学的に許容される担体と混合することを含む。
【０１３６】
前記プロセスは、さらに、改善された活性を有する化合物を生じるために、上記プロセスによってアポトーシスを調節することが明らかとなった種又は化合物の修飾と、このような化合物を薬学的に許容される担体と混合することとを含んでもよい。この付加的な作用は、本発明のスクリーニング実施形態において開示されるプロセスのいずれかによって発見された化合物を使用して実施されてもよく、これにより改善された活性を有する化合物を含む薬学的組成物を得る。
【０１３７】
さらに、本発明のスクリーニング実施形態は、
（ａ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子の、相互作用因子への結合を測定することと、
（ｂ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子を、種又は化合物と接触させることと、及び
（ｃ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子の、前記相互作用因子への結合が前記種又は化合物によって影響を受けるかどうかを決定することと、を含む、アネキシンＩＩの生物活性、神経毒性ストレス及び／又は（アネキシンＩＩを通じての）アポトーシスを調節する種又は化合物を得るための非細胞ベースのプロセスを提供する。
【０１３８】
インビトロ系は、とりわけ過酸化水素、グルタミン酸塩、ドーパミン、Ａβタンパク質又は任意の公知の神経毒による処理の結果として、神経毒性ストレスを引き起こすことによって誘導できる（理論に拘泥するものではない。）アポトーシス条件へ供されてもよい。さらに、このプロセスは、薬学的組成物を調製するために使用されてもよい。次に、前記プロセスは、前述のプロセスによって得られる種若しくは化合物又はその化学的類縁体若しくは相同体を、薬学的に許容される担体と混合することを含む。
【０１３９】
本発明によって提供されるスクリーニング実施形態の別の側面は、
（ａ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子と、及び
（ｂ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子が相互作用する相互作用因子と、
（ｃ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子と相互作用因子との相互作用を測定するための手段と、
（ｄ）アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子の前記相互作用因子への結合が種又は化合物によって影響を受けるかどうかを決定する手段とを含む、アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩ遺伝子の生物活性、神経毒性ストレス及び／又はアポトーシスを、細胞中で調節する種又は化合物を得るためのキットである。
【０１４０】
分子間の相互作用を測定し、該相互作用の強度、親和性、結合活性及び他の因子を決定する手段は、本分野で周知である（例えば、Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ、第５版（２００２年４月刊行）、及びＰｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓによって刊行された様々な著者及び編者による「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」を参照されたい。）。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１に含まれる配列又はその断片若しくは相同体に対応するＲＮＡに対する、又は該配列の一つが部分である遺伝子の発現産物に対するアッセイを含む、神経毒性ストレス及び／又は卒中及び／又は癌へ供された細胞を診断するための方法又はプロセスに関し、正常対照と比較したときの前記ＲＮＡ又は発現産物の上方制御に関する知見は、このような細胞が神経毒性ストレス及び／又は脳卒中へ供された可能性を示唆し、さらに、正常対照と比較したときの前記ＲＮＡ又は発現産物の下方制御に関する知見は、このような細胞が癌へ供されたか又は癌性になった可能性を示唆する。
【０１４２】
本発明は、さらに、対照と比較したときの、対象におけるアネキシンＩＩ（例えば、イムノアッセイにおいてアネキシンＩＩを検出することによって）又はアネキシンＩＩ遺伝子（例えば、アネキシンＩＩをコードするｍＲＮＡを検出することによって）の発現レベルの調節を検出することを含む、前記対象において神経変性疾患を診断するための方法又はプロセスを提供する。一実施形態では、対象において、診断されている対象は卒中に罹患したことが疑われる。
【０１４３】
本発明の別の実施形態は、対照と比較したときの、対象におけるアネキシンポリペプチドの発現レベルの調節を検出することを含む、前記対象において神経変性疾患を診断するための方法又はプロセスに関し、前記発現の調節は前記対象における神経変性疾患の可能性を示唆し、実際、本発明の診断方法は、卒中を患っていると疑われる対象に関して実施してもよい。
【０１４４】
前記ポリペプチドの発現レベルは、（図１に記載されるもの、又はその断片若しくは相同体などの）前記アネキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアッセイすることによって、又は前記ポリペプチドを検出する抗体を使用するイムノアッセイの方法によって評価できる。ｍＲＮＡ及びイムノアッセイの両検出は、本分野で周知の方法によって実施できる。アネキシンＩＩポリペプチドのレベルの測定は、免疫組織化学（Microscopy,Immunohistochemistry and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy, M.A.Hayat(Author),Kluwer Academic Publishers, 2002; Brown C.“Antigen retrievalmethods for immunohistochemistry”,Toxicol Pathol 1998; 26(6): 830-831),western blotting(Laemmeli UK:「Cleavage of structural proteins during the assembley of the head of a bacteriophage T4」,Nature 1970; 227: 680-685; Egger & Bienz“Protein(western) blotting”,Mol Biotechnol 1994; 1(3): 289-305),ELISA(Onoratoet al.,“Immunohistochemical and ELISA assays for biomarkers of oxidative stress in aging and disease”,Ann NY Acad Sci 1998, 20; 854: 277-290),antibody microarray hybridization(Huang, “detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system, Immunol Methods 2001 1; 255(1-2):1-13) and targeted molecula
r imaging(Thomas, Targeted Molecular Imaging in Oncology, Kim et al(Eds)., Springer Verlag, 2001）からなる群から選択される方法によって決定される。
【０１４５】
アネキシンＩＩポリヌクレオチドのレベルの測定は、ＲＴ−ＰＣＲ分析、切片上ハイブリッド形成法（“Introduction to Fluorescence In Situ Hybridization: Principles and Clinical Applications”, Andreeff & Pinkel(Editors), John Wiley & Sons Inc., 1999）, polynucleotide microarray and Northern blotting(Trayhurn, “Northern blotting”, Proc Nutr Soc 1996; 55(1B): 583-9; Shifman & Stein, ”A reliable and sensitive method for non-radioactive Northern blot analysis of nerve growth factor mRNA from brain tissues“, Journal of Neuroscience Methods 1995; 59: 205-208）から選択される方法によって決定される。この診断方法は、とりわけ脳卒中を経験したと疑われる患者を診断するために有用であるかもしれない。
【０１４６】
タンパク質発現の文脈において「異常である」とは、対照と比較したときの前記ポリペプチドの発現レベルが少なくとも１０％異なることを意味する。
【０１４７】
さらに、本発明は、アネキシンＩＩの生物活性を調節する薬学的組成物の治療的有効量を、対象に投与することを含む、前記対象において腫瘍又は自己免疫疾患を治療する方法又はプロセスを提供する。
【０１４８】
さらに、本発明は、アネキシンＩＩの生物活性を阻害する薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、前記対象において神経変性疾患を治療する方法又はプロセスを提供する。
【０１４９】
本発明はさらに、医薬品の調製におけるアネキシンＩＩ調節因子の使用について提供し、該医薬品は神経変性疾患の治療に使用されてもよい。
【０１５０】
本発明の別の実施形態は、図３又は図４に記載の配列のうちのいずれか１つを有する連続したヌクレオチド、すなわち配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６若しくは該配列のいずれか１つと又は表１ないし表３、特に表１に開示されたｓｉＲＮＡ配列のいずれかと少なくとも７０％相同性のある配列と、該ポリヌクレオチドのいずれか１つを含むベクターとを含む、実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。該ベクターは、遺伝子療法又は遺伝子ターゲティングの目標とされる特異的な種類に属してもよい。
【０１５１】
本発明の別の側面は、アポトーシスを亢進させるアネキシンＩＩの能力についてのアネキシンＩＩの使用に関する。この側面において、本発明は、すべて個別に又は組み合わせて、アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩｃＤＮＡを含む化合物の治療的有効量又はアネキシンＩＩｃＤＮＡ若しくはポリペプチドを刺激する化合物の治療的有効量を対象に投与することによって、前記対象における腫瘍又は自己免疫疾患を治療する方法又はプロセスを提供する。この側面において、本発明はさらに、腫瘍又は自己免疫疾患に罹患している患者において回復を促進又は亢進させるための医薬品の調製のための、アネキシンＩＩ又はアネキシンＩＩｃＤＮＡを含むベクターの使用を提供する。
【０１５２】
改善された治療特性を有するようにするために、本発明において使用されるべきポリヌクレオチドは全て、修飾を施してもよいことが注目されるであろう。ポリヌクレオチドの治療特性を改善するために、ヌクレオチドの修飾又は類縁体を導入することが可能である。改善される特性には、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／又は細胞膜を透過する能力の増加が含まれる。必要とされる場合、使用及び送達の方法に必要とされるＡＳポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又はリボザイムの生物活性を干渉しない、本分野で公知の任意の方法によって、ヌクレアーゼ耐性が提供される(Iyer et al., 1990; Eckstein, 1985; Spitzer and Eckstein, 1988; Woolf et al., 1990; Shaw et al., 1991)。ヌクレアーゼ耐性を増加させるためにオリゴヌクレオチドに対して施すことができる修飾には、リン酸塩主鎖中のリン又は酸素の複素原子を修飾することが含まれる。これらには、リン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びモルフォリノオリゴマーを調製することが含まれる。ある実施形態において、それは、４個ないし６個の３’末端ヌクレオチド塩基間を結合するホスホロチオエート結合を有することによって提供される。あるいは、ホスホロチオエート結合はすべてのヌクレオチド塩基を結合する。生物活性が保持されるが、ヌクレアーゼに対する安定性が実質的に増加する場合には、本分野で公知の他の修飾を使用してもよい。
【０１５３】
ポリペプチドの機能に対して実質的に影響を与えない、ポリヌクレオチドの全ての類縁体又はポリヌクレオチドに対する全ての修飾を、本発明とともに使用してもよい。前記ヌクレオチドは、自然に存在するか又は合成的に修飾される塩基から選択できる。自然に存在する塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾された塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−ピロピル及び他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン及び６−アザチミン、偽性ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及び他の８置換されたアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン及び他の置換されたグアニン、他のアザアデニン及びデアザアデニン、他のアザグアニン及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンが含まれる。
【０１５４】
さらに、ヌクレオチドの構造が基本的に変化され、治療剤又は実験用試薬としてさらに適しているポリヌクレオチドの類縁体を調製できる。ヌクレオチド類縁体の例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）におけるデオキシリボース（又はリボース）リン酸塩主鎖がペプチドに見られるものと同様であるポリアミド主鎖と置換される場合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類縁体は、酵素による分解に耐性があり、生体内又はインビトロで寿命が延長されることが示されてきた。さらに、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ配列に対してＤＮＡ分子よりも強く結合することが示されてきた。この知見は、前記ＰＮＡ鎖と前記ＤＮＡ鎖との間に電荷反発がないことに起因する。オリゴヌクレオチドに対してできる他の修飾には、ポリマー主鎖、環式主鎖、又は非環式主鎖が含まれる。
【０１５５】
本発明で採用されるポリペプチドは又、それらの治療活性を改善するために修飾され、必要に応じて化学的に修飾されてもよい。前記ポリペプチドに関する場合、「化学的に修飾される」は、そのアミノ酸残基の少なくとも１つがプロセッシングまたは他の翻訳後修飾などの自然なプロセスか、又は本分野で周知の化学的修飾技術のいずれかによって修飾される場合のポリペプチドを意味する。多くの公知の修飾のうち、典型的であるが、これらに限定されない例には、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰリボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、脂質又は脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、又はいずれかの同様のプロセスが含まれる。（核酸配列変化から生じるものなどの）さらなる可能なポリペプチド修飾には以下のものが含まれる。
【０１５６】
「保存的な置換」は、あるクラスのアミノ酸の、前記同一クラスのアミノ酸による置換を指し、クラスは、共通の物理化学的アミノ酸側鎖特性及び本来見られる相同性ポリペプチドにおける高頻度置換によって定義され、それは例えば、標準的なデイホフ頻度交換マトリクス又はＢＬＯＳＵＭマトリクスによって決定される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスは類別されており、それには以下のものが含まれる。すなわち、クラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラス（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）、及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）である。例えば、Ａｓｐの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基への置換は保存的な置換である。
【０１５７】
「非保存的な置換」は、あるクラスにおけるアミノ酸の、別のクラス由来のアミノ酸との置換を指し、例えば、クラスＩＩ残基であるＡｌａの、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎなどのクラスＩＩＩ残基との置換がある。
【０１５８】
「欠失」は、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれ欠失するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のいずれかにおける変化である。
【０１５９】
「挿入」又は「付加」は、自然発生する配列と比較したとき、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加をそれぞれ生じるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列における変化である。
【０１６０】
「置換」は、異別のヌクレオチド又はアミノ酸による、それぞれ１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換を指す。アミノ酸配列に関して、前記置換は保存的であってもよいか又は非保存的であってもよい。
【０１６１】
本発明のさらなる実施形態において、アネキシンＩＩポリペプチド又はポリヌクレオチドは、対象における黄斑変性症を診断又は検出するのに使用されてもよい。検出方法は、対象由来の試料におけるアネキシンＩＩｍＲＮＡ又はアネキシンＩＩポリペプチドについてのアッセイを典型的に含むであろう。
【０１６２】
「検出」は、疾病の検出の方法を指す。この用語は、疾病に対する素因の検出又は前記疾病の重度の検出を指してもよい。
【０１６３】
本発明において利用される「相同体／相同性」が意味するものは、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％の相同性であり、有利には少なくとも約８０％の相同性、より有利には少なくとも約９０％の相同性、さらにより有利には少なくとも約９５％であり、例えば、少なくとも約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％の相同性でさえある。本発明は、これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドが本明細書又は前述のポリヌクレオチド及びポリペプチドと同一の形式で使用できることも包含する。
【０１６４】
あるいは又はそれに加えて、配列に関する「相同性」は、２つの配列のうちの短いほうのヌクレオチド又はアミノ酸残基の数によって分割される同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する位置の数を指すことができ、この場合、前記２つの配列の配列比較はＷｉｌｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎアルゴリズム（（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：  ７２６）に従って決定でき、例えば、２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドの言語長、４つの間隙ペナルティを使用して、配列比較を含む配列データのコンピュータ支援分析及び解釈は商業上入手可能なプログラム（例、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｒ）Ｓｕｉｔｅ，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社，ＣＡ）を使用して簡便に実施できる。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と配列同一性又は相同性の程度と同様であるか又は前記程度を有するといわれるとき、前記ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は前記ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考慮される。本発明の範囲内のＲＮＡ配列は、前記ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と置換することによって、ＤＮＡ配列又はその補体から生じうる。
【０１６５】
それに加えて又はそれに替わるものとして、アミノ酸配列類似性又は相同性は、例えばＮＣＢＩで利用可能なＢｌａｓｔＰプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用して決定できる。以下の参考文献は、２つのポリペプチドのアミノ酸残基の相対的な同一性又は相同性を比較するためのアルゴリズムを提供し、それに加えて又はそれに替わるものとして、前述に関してこれらの参考文献における教示は％相同性を決定するのに使用できる。すなわち、Smithほか、(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489; Smithほか、(1983) Nucl.Acids Res.11:2205-2220; Devereuxほか、(1984) Nucl. Acids Res.12:387-395; Fengほか、(1987) J.Molec.Evol.25:351-360; Higginsほか、(1989)CABIOS 5:151-153;及びThompsonほか、(1994) Nucl.Acids Res.22:4673-4680である。
【０１６６】
２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関して、「少なくともＸ％の相同性を有すること」は、前記配列が最適に整列されるとき、前記２つの配列における同一の残基の％を指す。したがって、９０％のアミノ酸配列同一性は、２つ以上の最適に整列されるポリペプチド配列におけるアミノ酸の９０％が同一であることを意味する。
【０１６７】
アポトーシス調節の脈絡において「調節する」という語の意味は、増大（促進、亢進）又は低下（防止、阻害）のいずれかである。
【０１６８】
本発明は、実例となる様式で記載されており、使用された用語法が制限よりもむしろ記述の言語の本質上において存在するよう企図されることは理解されるべきである。
【０１６９】
上記教示に照らして、本発明の多くの修飾及び改変が可能であることは明らかである。
【０１７０】
本願を通じて、米国特許を含むさまざまな刊行物が、著者及び発行年及び特許番号によって引用される。これらの刊行物及び特許及び特許出願の全開示内容は、本発明が属する分野の状態をより完全に記載するために、参照により、本願に組み込まれる。
【実施例】
【０１７１】
さらなる詳述がなくても、当業者は前述の記載を使用して本発明をその最大限まで利用できると考えられる。それゆえ、以下の好ましい具体的な実施形態は、前記請求された本発明を単に説明するものにすぎず、いかなる意味でも限定されることのないように解釈されるべきである。
【０１７２】
本分野で公知の標準的な分子生物学のプロトコールは、特段の記載がなければ、特にSambrookほか、Molecular Cloning: A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989, 1992)及びAusubelほか、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988)に一般的に従う。
【０１７３】
本分野で公知の標準的な有機合成プロトコールは、特段の記載がなければ、特にＯｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ：  第１巻ないし第７９巻、編者不一、J.Wiley,New York(1941-2003)、Gewertほか、Organic synthesis workbook,Wiley-VCH,Weinheim(2000)、Smith & March、Advanced Organic Chemistry,Wiley-Interscience、第５版（２００１）に一般的に従う。
【０１７４】
本分野で公知の標準的な医薬品化学的方法は、特段の記載がなければ、特にＰｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓによって刊行される著者及び編者不一の「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」シリーズに一般的に従う。
【０１７５】
実施例１：
卒中現象に関与する遺伝子の同定−アネキシンＩＩ
新薬発見のための第一段階として、以下の方法に記載されているように、卒中発症に関与する主要な遺伝子を同定した。
【０１７６】
ｃＤＮＡマイクロアレイ構築の概要
マイクロアレイを利用した差次的遺伝子発現によって、アネキシンＩＩをコードするポリヌクレオチドが見出され、インビボ及びインビトロモデルの両方によって評価した。
【０１７７】
ｃＤＮＡマイクロアレイは、卒中特異的遺伝子が濃縮されたｃＤＮＡライブラリー（サブトラクションライブラリーを含む。）（表Ａ）を組み合わせることによって、構築した。その結果、「卒中チップ」は、約１０，０００の低冗長性卒中特異的ｃＤＮＡクローンが刻み込まれたマイクロアレイからなる。チップ上に印刷されたライブラリーは、表Ａに記載されているとおりであった。
【表Ａ】
2007530029.tif 000002
各ライブラリーは、Ｌ及び番号によって表されている。ＳＤラット中で中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を行い、初代神経細胞は、ラット皮質の初代神経細胞である。正常酸素圧は、正常な酸素濃度を表す。
【０１７８】
ＦＫ５０６（タクロリムス）は、ストレプトミセス・ツクバエシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｓｉｓ）によって産生される公知の免疫抑制剤である。ＦＫ５０６は、低酸素によって誘導される神経細胞の死を遅延又は抑制することによって、神経保護活性を有する。さらに、ＦＫ５０６は、損傷を受けた神経細胞の再増殖を引き起こすことができる。ＦＫ５０６の神経保護活性の基礎を成す具体的分子機序の多くは不明であるが、カルシニューリン及び酸化窒素合成酵素の活性の抑制並びに発作によって誘導される、セラミド及びＦａｓシグナルの生成の抑制に関する示唆が存在する。本発明において、ＦＫ５０６は、虚血によって誘導される損傷によって制御されるのみならず、ＦＫ−５０６の添加によっても制御される遺伝子を特定するのに役立つ。
【０１７９】
発作チップ上に刻印されたライブラリーは、以下のように構築した。
【０１８０】
ａ）サブトラクティブライブラリー：虚血（卒中）モデルは、恒久的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって、ＳＤ及びＳＨＲラット中に作製した。同じ系統の対照ラットは、シャム手術に供した（Ｓｈａｍ）。各群のラットの半分に、０時間の時点で、ＦＫ５０６処理を与えた。サブトラクションライブラリーは、ＭＣＡＯラット中で発現されているが、シャム手術されたラット（ＭＣＡＯ−Ｓｙａｍ）中では発現されていない遺伝子、及びＦＫ５０６で処理されたＭＣＡＯラットで発現されているが（ＦＫ５０６処置から３時間及び６時間後に採取）、ＭＣＡＯ処理されたラット中では発現されていない遺伝子（［ＭＣＡＯ＋ＦＫ５０６］−［ＭＣＡＯ］）を含んでいた。発作チップ中に含まれている別のライブラリーは、７日齢ラットの仔の小脳から得られる初代神経細胞のインビトロ処理から得られた。この細胞を、１６時間、低酸素状態（０．５％  Ｏ２）に供した。低酸素状態下の細胞及び正常酸素濃度（正常酸素）下の対照細胞を、０時間の時点で、ＦＫ５０６（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理し、１６時間後にｃＤＮＡを抽出した。サブトラクションライブラリーは、低酸素状態でＦＫ５０６処理された細胞中で発現されているが、正常酸素状態下でＦＫ５０６処理された細胞中で発現されていないｃＤＮＡ断片から作製された（［低酸素状態＋ＦＫ５０６−［正常酸素状態＋ＦＫ５０６］）。
【０１８１】
ｂ）配列依存性遺伝子同定（ＳＤＧＩ）によって作製されたライブラリー。この技術は、本質的に、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９３９２号に記載されているとおりである。ＳＤＧＩライブラリーは、ＭＣＡＯに供されたラット、ＦＫ５０６による処置から３時間及び６時間後のＭＣＡＯラット、並びにＦＫ５０６による処置から３時間及び６時間後にシャム手術されたラットの脳組織から調製した。ＳＤＧＩライブラリーは、インビトロ実験で、低酸素状態に１６時間供された初代神経細胞から、及びＦＫ５０６で前処理して、低酸素状態に１６時間供された初代神経細胞からも調製した。
【０１８２】
このように、発作チップの調製において使用されるｃＤＮＡライブラリーは、上述のように調製されたので、サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）及び／又は配列依存性遺伝子同定（ＳＤＧＩ）の何れかによって、発作中で差次的に発現されているｃＤＮＡが濃縮された。
【０１８３】
以下に記載されているように、発作チップは、ディファレンシャルハイブリダイゼーション実験に対して使用した。
【０１８４】
卒中チップへのハイブリダイゼーション
当該事象に応答して、遺伝子を活性化させ、又は抑制させ得る発達的、生理的、薬理学的又は他の合図となる事象に（この遺伝子発現アレイ技術は、例えば、米国特許第５，８０７，５２２号に開示されている。）、インビボ又はインビトロの細胞を供し、プローブを作製した。プローブの作製及びマイクロアレイチップの調査におけるそれらの使用は、例えば、米国特許第６，２９１，１７０号に記載されている。
【０１８５】
ハイブリダイゼーションは、以下に従って行った。
【０１８６】
発作チップ上でのハイブリダイゼーションに対して使用されるプローブは、以下の処置によって処理された動物の、対を成す４つの群を使用して調製した。
【０１８７】
１．ＭＣＡＯに加えて、ＦＫ−５０６を与えられた動物を、１．５時間、３及び６時間で屠殺した。これらの動物の皮質を取り出し、プローブ作製のために使用した。
【０１８８】
２．ＭＣＡＯに加えて、ＦＫ−５０６を与えられた動物を、１．５時間、３及び６時間で屠殺した。これらの動物の同側半球全体（手術された側）を取り出し、プローブ作製のために使用した。
【０１８９】
３．ＭＣＡＯに加えて、ビヒクルを与えられた動物は、１．５、３、６、１２、２４及び４８時間の時点で屠殺した。これらの動物の同側の皮質を取り出し、プローブ作製のために使用した。
【０１９０】
４．ＭＣＡＯに加えて、ＦＫ−５０６を与えられた動物は、１．５、３、６、１２、２４及び４８時間の時点で屠殺した。これらの動物の同側の皮質全体を取り出し、プローブ作製のために使用した。
【０１９１】
プローブを標識し、卒中チップにハイブリダイズさせた。
【０１９２】
これらのプローブに加えて、各ハイブリダイゼーションに、Ｃｙ３で標識された共通の対照プローブを添加した。共通の対照プローブは、ＳＤ４ラットの全脳から抽出されたポリＡ  ＲＮＡの混合物であった。
【０１９３】
インシチュ分析のための組織の調製
シャム手術されたラットの脳及びＭＣＡＯに供された脳のパラフィンブロックから、冠状切片を調製した。
【０１９４】
ｃ−ｆｏｓ及びｐ２１など、卒中において影響を受けることが知られている対照遺伝子のハイブリダイゼーション、並びに微小管随伴タンパク質２（神経細胞の細胞体及び樹状突起を染色し、神経細胞の細胞骨格の完全性を示唆する。）ＧＦＡＰ（グリア繊維随伴タンパク質）（この染色は、星状膠細胞に対して特異的であり、ミエリン形成乏突起膠細胞に対しては特異的でなく、膠細胞細胞骨格の完全性を示唆する。）による切片の染色を用いて、モデルの特徴を決定した。これらのハイブリダイゼーションの結果は、以前に報告された結果と合致していた。このように、得られたパラフィンブロックがインシチュハイブリダイゼーション研究に対して適切であること、及び本研究に対して前記モデルが適切であることが実証された。
【０１９５】
結果の要約
発作チップのスクリーニングの結果、６時間のＭＣＡＯを行うと、アネキシンＩＩの発現が誘導されることが見出された。この誘導は、４８時間に最大に達した（皮質−３．５倍、半球全体−５．５倍）。
【０１９６】
インシチュハイブリダイゼーション研究の結果は、上衣（ｅｐｅｎｄｉｍａｌ）細胞及び髄膜上皮性細胞中で、アネキシンＩＩ遺伝子が恒常的に発現されていることを示唆する。ＭＣＡＯは、アネキシンＩＩを発現している白血球及びマクロファージの蓄積をもたらす。アネキシンＩＩ発現の活性化は、神経細胞中には見出されなかった。
【０１９７】
実施例２：
一般的な方法
分子生物学における一般的な方法
本分野において公知であり、具体的に記載されていない標準的な分子生物学的技術は、概ね、「Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992), and in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)」に従った。
【０１９８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、概ね、「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA(1990)」に従って行った。他の核酸技術を伴う反応及び操作は、別段の記載がなければ、概ね、「Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press」及び米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９  号及び第５，２７２，０５７号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている方法に従って行った。
【０１９９】
タンパク質の精製は、実施例６において、以下で記載されているとおりに行った。
【０２００】
本発明のｃＤＮＡを含有するベクターは、当業者によって構築され、転写が必要であれば、配列の所望の転写を達成するために必要な全ての発現要素を含有することが可能である（さらに詳細な説明については、以下の具体的な方法を参照。）。異なる形態の核酸を回収するための機構など、他の有益な特徴もベクター内に含有させることが可能である。プラスミドとして、又はバクテリオファージベクターとして使用することが可能であるので、ファジミドは、このような有益なベクターの具体的な例である。他のベクターの例には、バクテリオファージ、バキュロウイルス及びレトロウイルスなどのウイルス、ＤＮＡウイルス、コスミド、プラスミド、リポソーム及び他の組換えベクターが含まれる。ベクターは、原核生物又は真核生物宿主系において使用するための要素をも含有することが可能である。何れの宿主系が特定のベクターに対して適合するかは、当業者に公知である。
【０２０１】
ベクターは、本分野において公知の様々な方法（リン酸カルシウムトランスフェクション；電気穿孔；リポフェクション；プロトプラスト融合；ポリブレントランスフェクション）のうち任意の一つによって、細胞又は組織中に導入される。宿主細胞は、ベクターで形質転換されることが可能であり、且つポリペプチドの産生を補助する任意の真核細胞及び原核細胞とすることが可能である。形質転換のための方法は、一般に、「Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1992)」、「Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)」、「Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor,MI(1995)」、Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI(1995)」及び「Gilboa, et al.(1986)」に記載されており、例えば、安定な又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔及び組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。さらに、中枢神経系を含むベクターについては米国特許第４，８６６，０４２号を参照し、また、陽性−陰性選択法については、米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０２０２】
免疫学における一般的な方法
本分野において公知であり、具体的に記載されていない免疫学における標準的な方法は、概ね、「Stites et al.(eds), Basic and Clinical Immunology(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994)」及び「Mishell and Shiigi(eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York(1980)」に従った。
【０２０３】
イムノアッセイ
一般的に、ＥＬＩＳＡは、標本を評価するために使用される好ましいイムノアッセイである。ＥＬＩＳＡアッセイは、当業者に周知である。該アッセイでは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を使用することが可能である。適宜、当業者に公知であるように、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの他のイムノアッセイを使用することが可能である。利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学的文献に詳しく記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号及び第５，２８１，５２１号並びに「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９」を参照されたい。
【０２０４】
実施例３：
実験的な検証結果
検証のために、ｓｉＲＮＡを使用した。ｓｉＲＮＡを使用すれば、所望の特異的なｍＲＮＡのレベルを阻害又は抑制することが可能である。アネキシンの内在性ｍＲＮＡレベルを減少させるために、表１でＮｏ．５と表記されているｓｉＲＮＡを使用した。
【０２０５】
アネキシンＩＩ遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡの効果
ＲＥＦ−５２を形質移入された細胞中でのラットアネキシンＩＩ遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡの効果は、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ−ＰＣＲによって測定した。ＧＡＰＤＨの発現は、基準（対照）遺伝子としての役割を果たす。
【表Ｂ】
2007530029.tif 000003
明らかなように、ｓｉＡｎｎ−ＩＩ−ｒＢ（図５に図示されているラットアネキシンＩＩｓｉＲＮＡを含むベクター）は、ラットアネキシンＩＩの発現を８２．８％減少させる。
【０２０６】
この効果は、ウェスタンブロット分析によっても検証された。ｓｉＲＮＡベクターの形質移入後に、アネキシンＩＩタンパク質の発現は、大幅に減少する（市販のアネキシンＩＩ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて測定）。
【０２０７】
アネキシンＩＩ遺伝子を安定的に形質移入されたＢｅ２Ｃ細胞中でのヒトアネキシンＩＩ遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡの効果は、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ−ＰＣＲによって測定した。サイクロフィリンの発現は、基準（対照）遺伝子としての役割を果たす。
【表Ｃ】
2007530029.tif 000004
明らかなように、ｓｉＡｎｎ−ＩＩ−ｒＢ（図５に図示されているヒトアネキシンＩＩｓｉＲＮＡを含むベクター）は、ラットアネキシンＩＩの発現を７６％減少させる。
【０２０８】
この効果は、ウェスタンブロット分析によっても検証された。ｓｉＲＮＡベクター（ｖａｃｔｏｒ）の形質移入後に、アネキシンＩＩタンパク質の発現は、大幅に減少する（市販のアネキシンＩＩ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて測定）。
【０２０９】
アポトーシスに対するアネキシンＩＩ活性の重要性の機能喪失（ＬＯＦ；Ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）検証
ａ）インビボＬＯＦの結果
本明細書に開示されているｓｉＲＮＡのインビボ送達及びＭＣＡＯ実験（実施例９参照）を行った。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡ処理された脳組織中でのアネキシンＩＩ発現の測定：
脳皮質及び線条体から、ＲＮＡ試料を調製し、それぞれ、アガロースゲル分析及び光学密度測定によって、品質と量を評価した。
【０２１１】
逆転写酵素反応を行い、ｃＤＮＡ産物を定量的ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ）に供した
脳の各領域（皮質、線条体）について、４つの独立した定量的ＰＣＲ実験（計２９試料）を行った。内部対照としてＧＡＰＤＨを使用し、アネキシン−ＩＩと平行して検査した。
【表Ｄ】
2007530029.tif 000005
結論
１．ＭＣＡＯ操作の後、アネキシン−ＩＩ遺伝子の発現は、１０ないし３０倍増加する。例えば、ＬＵＣを注入された正常ラット（対照）では、アネキシン−ＩＩ発現のレベルは、ＬＵＣを注入されたＭＣＡＯラットでの１４．８４に比べて０．３９３である。
【０２１２】
２．ｓｉＲＮＡを注入されたラットでは、アネキシン−ＩＩ遺伝子発現の顕著な減少が達成された。ＬＵＣを注入されたＭＣＡＯラットでは、アネキシン−ＩＩ発現のレベルは、Ａｎｎ−ＩＩを注入されたＭＣＡＯラットでの５．６２に比べて１４．８４であった。ＬＵＣを大量投与されたＭＣＡＯラットでは、アネキシンＩＩ発現のレベルは、Ａｎｎ−ＩＩを注入されたＭＣＡＯラットでの８．７５に比べて１６．４６であった。
【０２１３】
３．ｓｉＲＮＡの効果は、皮質では観察されたが、線条体では観察されなかった。可能な説明：
ｉ．ｓｉＲＮＡは、線条体に比べて皮質へ、より効率的に到達した。
【０２１４】
ｉｉ．ＭＣＡＯ操作は、（皮質とは反対に）線条体中でアネキシンの発現を上昇させない。
【０２１５】
ｉｉｉ．線条体中のアネキシンの基底レベルは極めて低いので、ｓｉＲＮＡ活性を測定することは困難である。
【０２１６】
ｂ）インビトロＬＯＦ
分化を誘導するために、３０μＭのレチノイン酸で、ヒトアネキシンＩＩｓｉＲＮＡを発現した安定なＢｅ２Ｃ細胞を処理した。６日後、細胞は完全に分化し、ドーパミン及び低酸素処理に供された。細胞の生存性は、ＸＴＴアッセイ（代謝的に活性な細胞が、テトラゾリウム塩ＸＴＴを還元して、ホルマザンの橙色化合物とする能力に基づいた、細胞増殖アッセイ）を用いて調べた。色素の強度は、代謝的に活性な（「生きた」）細胞の数に比例する。（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １１９，  ２０３−２１０））。図６に示されている結果は、独立した４つの実験の要約である。
【０２１７】
図６から明らかなように、アネキシンＩＩｓｉＲＮＡは、低酸素状態及びドーパミンによって媒介される細胞死から、Ｂｅ２Ｃ細胞を保護する。
【０２１８】
実施例４：
ｓｉＲＮＡの調製
独自のアルゴリズムと遺伝子アネキシンＩＩの公知配列（配列番号１）を用いて、多くのｓｉＲＮＡ候補の配列を作製した。上記仕様に従うｓｉＲＮＡ分子は、本質的に、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【０２１９】
本発明のｓｉＲＮＡは、リボ核酸（又はデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドの合成に関して本分野で周知である任意の方法によって合成することが可能である。例えば、（特に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な）市販の機械を使用することが可能である。オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示されている配列に従って調製される。化学的に合成された断片の重複する対は、本分野で周知の方法を用いて連結することが可能である（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号参照）。鎖は別個に合成され、次いで、管内で互いにアニールさせる。次いで、（例えば、一方が過剰であるために）アニールされなかった一本鎖オリゴヌクレオチドから、ＨＰＬＣによって二本鎖ｓｉＲＮＡを分離する。ｓｉＲＮＡ又は本発明のｓｉＲＮＡ断片に関連して、２以上のこのような配列を合成し、本発明において使用するために一緒に連結することが可能である。
【０２２０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、本分野で公知の手法、例えば、「Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845 ;Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433 ;  Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684 ;and  Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59,」に記載された手法によって合成してもよく、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホルアミダイトなどの共通の核酸保護基及びカップリング基を使用してもよい。修飾された（例えば、２’−Ｏ−メチル化された）ヌクレオチド及び修飾されていないヌクレオチドが、所望に応じて取り込まれる。
【０２２１】
あるいは、本発明の核酸分子は、別個に合成し、例えば、合成及び／又は脱保護の後、連結によって（Moore et al., 1992, Science 256, 9923 ;Draper et al., International PCT publication No. WO93/23569 ;Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247 ;Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951 ;Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204）、又はハイブリダイゼーションによって、合成後一緒に連結することが可能である。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、米国特許出願公開ＵＳ２００４／００１９００１（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載されているように、タンデム合成法を用いて合成することも可能であり、この方法では、ハイブリダイズし、ｓｉＲＮＡ二重鎖の精製を可能とする分離したｓｉＲＮＡ断片又は鎖を与えるために後に切断される切断可能なリンカーによって分離された単一の連続オリゴヌクレオチド断片又は鎖として、両ｓｉＲＮＡ鎖が合成される。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーとすることが可能である。さらなる情報については、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ）を参照されたい。
【０２２２】
上述されているように、表１のｓｉＲＮＡ（以下）は、交互の糖が２’−Ｏ−メチル修飾を有するように、すなわち、交互のヌクレオチドがこのようにして修飾されるように構築された。これらの好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの一つの鎖中で、修飾されたヌクレオチドは番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９であり、反対鎖中では、修飾されたヌクレオチドでは、番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８であった。このように、これらのｓｉＲＮＡは、上述のように、交互の２−Ｏ’−メチル修飾を有する、平滑末端の１９マーＲＮＡ分子である。表２及び３（以下）のｓｉＲＮＡも、このようにして構築される。表２のｓｉＲＮＡは、交互の２−Ｏ’−メチル修飾を有する、平滑末端の１９マーＲＮＡ分子である。表３のｓｉＲＮＡは、交互の２−Ｏ’−メチル修飾を有する、平滑末端の２１マーＲＮＡ分子である。
【０２２３】
表１は、生成され、続いて合成された、遺伝子アネキシンＩＩに対する様々な新規ｓｉＲＮＡ分子を詳しく記している。これらのｓｉＲＮＡの幾つかを調べた。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。さらなるｓｉＲＮＡも、例えば、検査すべき特異的な新規ｓｉＲＮＡでＨｅＬａ又はＨａｃａｔ細胞を形質移入することによって調べることが可能である。次いで、アネキシンＩＩポリペプチドの発現は、アネキシンＩＩポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって測定することが可能である。本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ分子の任意の一つ、特に表１に詳述されている活性分子が新規であり、本発明の一部と考えられる。
【０２２４】
下表１では、ｓｉＲＮＡ１−５のセンス鎖は、それぞれ配列番号７−１１を有し、ｓｉＲＮＡ  １−５のアンチセンス鎖は、それぞれ配列番号１２−１６を有する。下表２では、ｓｉＲＮＡ６−１０７のセンス鎖は、それぞれ配列番号１７−１１８を有し、ｓｉＲＮＡ  ６−１０７のアンチセンス鎖は、それぞれ配列番号１１９−２２０を有する。下表３では、ｓｉＲＮＡ１０８−１８１のセンス鎖は、それぞれ配列番号２２１−２９４を有し、ｓｉＲＮＡ  １０８−１８１のアンチセンス鎖は、それぞれ配列番号２９５−３６８を有する。
【表１】
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【表２−１】
2007530029.tif 000007
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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実施例５：
抗アネキシンＩＩ抗体の調製
アネキシンＩＩに結合する抗体は、完全な状態のポリペプチド又はこれより小さなポリペプチドを含有する断片を、免疫抗原として用いて調製してもよい。例えば、アネキシンＩＩのＮ末端若しくはＣ末端又はアネキシンＩＩの他の任意の適切なドメインに特異的に結合する抗体を産生することが望ましいかもしれない。動物を免疫するために使用されるポリペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡ又は化学合成から得ることが可能であり、所望であれば、担体タンパク質に抱合することができる。ポリペプチドに化学的に結合されるこのような一般的に使用される担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び破傷風トキソイドが含まれる。次いで、動物を免疫するために、結合されたポリペプチドを使用する。
【０２２５】
所望であれば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、例えば、それに対する抗体を産生すべきポリペプチド又はペプチドが結合されたマトリックスに結合し、及び該マトリックスから溶出することによってさらに精製することが可能である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の精製及び／又は濃縮のための、免疫学において一般的な様々な技術が、当業者に公知である（Coligan et al, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994）。
【０２２６】
あらゆる種類の抗体（断片を含む。）を作製する方法が、本分野において公知である（例えば、「Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)」を参照）。適切なアジュバント中で免疫原を調製し、抗体結合を測定し、抗体を単離する全ての必要な工程を含む免疫化の方法、モノクローナル抗体を取得する方法、及びモノクローナル抗体のヒト化は全て、当業者に公知である。
【０２２７】
抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００：ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）ベニアリング又はリサーフェシング（EP 592,106 ;EP 519,596 ;Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991) ;Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814(1994) ;Roguska et al., PNAS 91:969-973(1994)）及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）など、本分野で公知の様々な技術を用いてヒト化することが可能である。
【０２２８】
上記モノクローナル抗体には、１つの種（マウス、ウサギ、ヤギ、ラット、ヒトなど）から得られた抗体並びにキメラ抗体及びヒト化抗体など、２（以上の）種から得られた抗体が含まれる。
【０２２９】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から得られた抗体ライブラリーを用いて、ファージディスプレイ法を含む本分野で公知の様々な方法によって作製することが可能である。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５及びＷＯ  ９１／１０７４１も参照されたい（各々は、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０２３０】
ヒト化抗体、ヒト抗体及び抗体断片を含む、あらゆる種類の抗体に関するさらなる情報は、ＷＯ０１／０５９９８号に見出すことが可能である（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０２３１】
実施例６：
ポリペプチドの調製
ポリペプチドは、幾つかの方法を用いて、作製してもよい。例えば、
１）合成的に：
アネキシンＩＩの公知配列を使用し、市販の機械を用いて、合成ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２３２】
２）組換え法：
アネキシンＩＩポリペプチドを作製する好ましい方法は、アネキシンＩＩ遺伝子のｃＤＮＡを含むポリペプチドを、発現ベクターベクター中にクローニングし、コードされたポリペプチドを発現するために該ベクターを有する細胞を培養し、次いで、得られたポリペプチドを精製することであり、全て、例えば、「Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization A laboratory course manual.” CSHL Press(1996)(さらに、Bibl Haematol. 1965;23:1165-74 Appl Microbiol. 1967 Jul;15(4):851-6 ;Can J Biochem. 1968 May;46(5):441-4 ;Biochemistry. 1968 Jul;7(7):2574-80 ;Arch Biochem Biophys. 1968 Sep 10;126(3):746-72 ;Biochem Biophys Res Commun. 1970 Feb 20;38(4):825-30)を参照。」に記載されているように、本分野で公知の方法を用いて実施される。
【０２３３】
発現ベクターは、異種物質の転写を制御するためのプロモーターを含むことが可能であり、選択的な転写を可能とするために、構成的又は誘導性プロモーターの何れかとであることが可能である。必要な転写レベルを得るために必要とされ得るエンハンサーを、必要に応じて、含めることが可能である。発現ビヒクルは、選択遺伝子を含むことも可能である。
【０２３４】
ベクターは、本分野において公知の様々な方法のうち任意の一つによって、細胞又は組織中に導入することが可能である。このような方法は、一般に、「Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992)」、「Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI(1995), Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA(1988) and Gilboa et al.(1986)」に記載されている。
【０２３５】
３）天然源からの精製：
アネキシンＩＩは、例えば、抗アネキシンＩＩ抗体を用いた免疫沈降、又はアネキシンＩＩを結合することが知られた任意の物質を用いたマトリックス結合アフィニティークロマトグラフィーなど、当業者に公知の多くの方法を用いて、（組織等の）天然源から精製することが可能である。
【０２３６】
タンパク質精製は、例えば、「Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual.” CSHL Press(1996)」に記載されているとおり、本分野で公知であるように実施される。
【０２３７】
実施例７：
ポリヌクレオチドの調製
本発明のポリヌクレオチドは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドの合成に関して本分野で周知である任意の方法によって合成することが可能である。このような合成は、とりわけ、「Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1992 ;48:2223-2311, Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1993 ;49:6123-6194」及び「Caruthers M.H. et. al., Methods Enzymol. 1987 ;154:287-313」に記載されており、チオアートの合成は、とりわけ「Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 1985 ;54:367-402」に記載されており、RNA分子の合成は、「Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P. ;Kap. 2:17-31」に記載されており、それぞれの下流フ゜ロセスは、とりわけ、「Pingoud A. et. al., in IRL Press 1989 Edited by Oliver R.W.A. ;Kap. 7:183-208」及び「Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P. ;Kap. 2:17-31(上記)」に記載されている。
【０２３８】
他の合成手順は、本分野において公知であり（例えば、Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845 ;Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433 ;Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684 ;及びWincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59に記載されている手順）、これらの手順は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホルアミダイトなどの、一般的な核酸保護基及びカップリング基を使用してもよい。修飾された（例えば、２’−Ｏ−メチル化された）ヌクレオチド及び修飾されていないヌクレオチドが、所望に応じて取り込まれる。
【０２３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、別個に合成し、例えば、合成及び／又は脱保護の後、連結によって（Moore et al., 1992, Science 256, 9923 ;Draper et al., International PCT publication No. WO93/23569 ;Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247 ;Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951 ;Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204）、又はハイブリダイゼーションによって合成後に一緒に連結することが可能である。
【０２４０】
（特に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な）市販の機械を使用することが可能である。オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示されている配列に従って調製されることが注目される。化学的に合成された断片の重複する対は、本分野で周知の方法を用いて連結することが可能である（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号参照）。鎖は別個に合成され、次いで、管内で互いにアニールされる。次いで、ＨＰＬＣによって、（例えば、一方が過剰であるために）アニールされなかった一本鎖オリゴヌクレオチドから二本鎖ｓｉＲＮＡを分離する。本発明のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ断片に関連して、２以上のこのような配列を合成し、本発明において使用するために一緒に連結することが可能である。
【０２４１】
本発明の化合物は、米国特許出願公開ＵＳ２００４／００１９００１（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載されているように、タンデム合成法を用いて合成することも可能であり、この方法では、ハイブリダイズし、ｓｉＲＮＡ二重鎖の精製を可能とする分離したｓｉＲＮＡ断片又は鎖を与えるために後に切断される切断可能なリンカーによって分離された単一の連続オリゴヌクレオチド断片又は鎖として、ｓｉＲＮＡ鎖が合成される。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーとすることが可能である。
【０２４２】
ポリヌクレオチドを単離する別の手段は、その配列に基づいて、天然のＤＮＡ断片又は人工的に設計されたＤＮＡ断片を取得することである。このＤＮＡ断片は、当業者に周知である適切な標識系を用いることによって標識される。例えば、Ｄａｖｉｓら（１９８６）を参照されたい。次いで、本分野で周知の方法を用いてλファージｃＤＮＡライブラリー又はプラスミドｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのプローブとして、断片を使用する。一般的には、「Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)」を参照されたい。
【０２４３】
ｃＤＮＡプローブに関連するクローンを含有するコロニーを同定することが可能であり、これらのクローンは、公知の方法によって精製することが可能である。次いで、完全長配列を同定するために、新たに精製されたクローンの末端の配列を決定する。完全長クローンの完全な配列決定は、酵素的消化又はプリマーウォーキングによって行われる。類似のスクリーニング及びクローン選択アプローチは、ゲノムＤＮＡライブラリーから得られるクローンに適用することが可能である。
【０２４４】
本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、特に診断作業用プローブとして使用することが可能である。本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、卒中、神経毒性ストレス又はＴＢＩを受けており、それによって、前記ポリヌクレオチド配列が過剰発現されており、このため、高レベルのｍＲＮＡ遺伝子転写物が存在する細胞を診断するために使用することが可能である。さらに、本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、癌の形質転換を受けている細胞を診断するために使用することが可能であり、この場合には、先述したポリヌクレオチドは過少発現されているであろう（且つ、そのレベルは、診断のために、正常対象中のレベルに対して比較することが可能である）。
【０２４５】
実施例８：
薬理学及び薬物送達
本発明の化合物又は薬学的組成物は、各患者の臨床症状、治療すべき疾病、投与の部位及び方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重並びに医療従事者に公知の他の要素を考慮に入れながら、良質の医療のための原則に従って、投与及び投薬される。
【０２４６】
このように、本明細書において薬学的に「有効な量」は、本分野において公知であるこのような検討事項によって決定される。量は、改善された生存率若しくはより迅速な回復、又は症候の改善若しくは消去などの改善（これらに限定されない。）を達成するのに有効でなければならず、当業者によって、適切な措置として、その他の指標が選択される。
【０２４７】
治療は、一般的には、疾病過程の長さ及び薬物の有効性及び治療されている患者の種に比例した長さを有する。ヒトは、本明細書に例示されているマウス又はその他の実験動物より一般的に長く治療される。
【０２４８】
本発明の化合物は、投与の慣用的経路の何れかによって投与することが可能である。前記化合物は、化合物として、又は薬学的に許容される塩として投与することが可能であり、単独で、又は、薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント及びビヒクルと組み合わせた活性成分として投与することが可能であることに留意すべきである。化合物は、経口、皮下又は非経口的に（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内及び鼻内投与並びに髄腔内及び注入技術を含む。）投与することが可能である。化合物のインプラントも有用である。液体形態は、注射用に調製してもよく、本用語は、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、髄腔内及びその他の非経口投与経路を含む。液体組成物には、有機共溶媒を含む及び含まない水溶液、水性又は油性懸濁液、食用油を有するエマルジョン並びに類似の薬学的ビヒクルが含まれる。さらに、ある種の状況下では、本発明の新規治療において使用するための組成物は、鼻内及び類似の投与のために、エアロゾルとして形成されてもよい。治療されている患者は、温血動物、及び、特に、ヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント及びビヒクル並びにインプラント担体は、一般的には、本発明の活性成分と反応しない、不活性な無毒の固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入材料を表す。
【０２４９】
本発明の化合物を非経口的に投与する場合には、本発明の化合物は、単位投薬注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で一般に調合される。注射に適した薬学的製剤には、無菌水性溶液又は分散液及び無菌注射可能溶液又は分散液中に再構成するための無菌粉末が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散溶媒とすることが可能である。
【０２５０】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することが可能である。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油又はピーナッツ油及びミリスチン酸イソプロピルなどのエステルのような非水性ビヒクルも、化合物組成物のための溶媒系として使用することが可能である。さらに、抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート剤及び緩衝剤など、組成物の安定性、無菌性及び等張性を増強する様々な添加物を添加することが可能である。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗微生物剤及び抗真菌剤によって確保することが可能である。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましい。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によって実現することが可能である。しかしながら、本発明に従えば、使用される全てのビヒクル、希釈剤又は添加物は、化合物と適合的でなければならない。
【０２５１】
無菌注射可能溶液は、所望に応じて、他の様々な成分とともに適切な溶媒の必要量で、本発明を実施する際に使用される化合物を取り込むことによって調製することが可能である。
【０２５２】
本発明の薬学的製剤は、様々なビヒクル、アジュバント、添加物及び希釈剤などの、任意の適合的担体を含有する注射可能製剤中に入れて、患者に投与することが可能であり、又は、本発明で使用される化合物は、徐放皮下インプラント若しくはモノクローナル抗体などの標的化された送達系、ベクター化された送達、イオントフォレーシス、ポリマーマトリックス、リポソーム及び小球体の形態で、患者に、非経口的に投与することが可能である。本発明において有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２号；第５，１６９，３８３号；第５，１６７，６１６号；第４，９５９，２１７号；第４，９２５，６７８号；第４，４８７，６０３号；第４，４８６，１９４号；第４，４４７，２３３号；第４，４４７，２２４号；第４，４３９，１９６号；及び第４，４７５，１９６号が含まれる。このような他の多くのインプラント、送達系及びモジュールが、当業者に周知である。
【０２５３】
本発明において使用される化合物の薬理学的製剤は、患者に、経口的に投与することが可能である。錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末シロップなどの中の化合物を投与するなどの慣用法を使用することが可能である。経口的に又は静脈内にこれを送達し、生物活性を保持する公知の技術が好ましい。一実施形態では、本発明の化合物は、血液レベルを適切なレベルにするために、静脈内注射によって最初に投与することが可能である。次いで、経口剤形によって患者のレベルが維持されるが、上述されているように、患者の状態に応じて、他の投与形態を使用することが可能である。
【０２５４】
一般的に、ヒトに対する化合物の活性用量は、１ないし２週以上、好ましくは、２４ないし４８時間の期間にわたる１投薬／日若しくは２若しくは３回以上／日の投与計画で、又は１−２週以上の期間中連続的な注入によって、１ｎｇ／ｋｇから約２０−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日まで、好ましくは約０．０１ｍｇないし約２−１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。本明細書に開示されている適応症の幾つかについては、長年にわたる、又は生涯にわたる治療も想定される。
【０２５５】
本発明の薬学的組成物の最も適切な投与は、治療されている傷害又は疾病の種類に依存し得ることは自明であろう。このため、急性事象の治療は、傷害の誘導の後、比較的迅速に、活性組成物を全身投与することを必要とするであろう。一方、慢性変性損傷の治療（減少）は、持続的な投薬計画を必要する場合がある。
【０２５６】
アネキシンＩＩ阻害剤の脳内への送達
脳内への化合物の送達は、とりわけ、神経外科的インプラント、血液脳関門破壊、脂質によって媒介される輸送、担体によって媒介される流入若しくは流出、血漿タンパク質によって媒介される輸送、受容体によって媒介されるトランスサイトーシス、吸収によって媒介されるトランスサイトーシス、血液脳関門での神経ペプチド輸送及び薬物標的誘導のための遺伝子工学的「トロイの木馬」など、幾つかの方法によって達成することが可能である。上記方法は、例えば、「“Brain Drug Targeting:the future of brain drug development”, W.M. Pardridge, Cambridge University Press, Cambridge, UK(2001)」に記載されているように行われる。
【０２５７】
実施例９：
実験モデル
ＣＮＳ傷害−ＣＮＳ傷害を治療するためにアネキシンＩＩ阻害剤を使用できる可能性を、動物モデルで評価する。モデルは、対照動物を、阻害剤処理された動物と比較することによって、様々なレベルの複雑性を示す。このような治療の効果は、臨床的転帰、神経学的障害、用量応答及び治療濃度域の観点で評価される。静脈内又は皮下又は経口的に、アネキシンＩＩ阻害剤で、試験動物を処理する。緩衝液又は薬学的ビヒクルのみで、対照動物を処置する。使用されるモデルは、以下から選択してもよい。
【０２５８】
１．閉鎖性頭部外傷（ＣＨＩ）−実験的ＴＢＩは、行動的欠陥の程度及び度合いに関連している神経学的及び神経代謝カスケードに寄与する一連の現象を引き起こす。正中前頭面中の左半球を覆う露出された頭蓋骨上に、予め固定された高さから錘を自由落下させながら、麻酔下で、ＣＨＩを誘導する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １３，５５７，１９９６）。
【０２５９】
２．一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）−成体の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット３００ないし３７０ｇ中に、９０ないし１２０分の一過性局所虚血を実施する。使用される方法は、管腔内縫合ＭＣＡＯである（Longa et al., Stroke, 30, 84, 1989, and Dogan et al., J. Neurochem. 72, 765, 1999）。要約すれば、ハロタン麻酔下で、ポリ−Ｌ−リジンで被覆された３−０ナイロン縫合材料を、外頚動脈中の穴を通して、右内頚動脈（ＩＣＡ）中に挿入する。右ＭＣＡ起点（２０−２３ｍｍ）に、ナイロン糸をＩＣＡ中に押し入れる。９０ないし１２０分後に抜糸し、動物を閉鎖し、回復させる。
【０２６０】
３．永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）−閉塞は永久、片側性であり、ＭＣＡの電気凝固によって誘導される。両方法は、脳皮質の同側の局所脳虚血を引き起こし、反対側を無傷の状態のままとする（対照）。左ＭＣＡは、「Ｔａｍｕｒａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １９８１；１：５３−６０」によってラットについて記載されているように、側頭頭蓋局部切開術を用いて露出される。微少二極性凝固を用いて、ＭＣＡ及びそのレンズ核線条体分岐を、嗅索の内側縁に対して近位側に閉塞する。傷を縫合し、２６℃ないし２８℃に加温された室内の飼育ケージに動物を戻す。動物の温度は、自動サーモスタットを用いて、常時一定に保たれる。
【０２６１】
評価プロセス。アネキシンＩＩ阻害剤の効力は、死亡率、体重増加、梗塞容積、生存した動物における短期及び長期の臨床的及び神経生理学的及び行動的（摂食行動を含む。）転帰によって決定される。梗塞容積は、組織学的に評価する(Knight et al., Stroke, 25, 1252, 1994, and Mintorovitch et al., Magn. Reson. Med. 18, 39, 1991)。ＭＣＡＯ後の機能的転帰を評価するために、階段試験（Montoya et al., J. Neurosci. Methods 36, 219, 1991)又はBederson法に従った運動障害スケール(Bederson et al., Stroke, 17, 472, 1986)を使用する。異なる時点にわたって（最長は２ヶ月である。）、動物を追跡する。各時点（２４時間、１週、３、６、８週）で、動物を屠殺し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドによる心臓灌流を行う。脳を取り出し、プロセッシング及びパラフィン包埋のために、連続冠状２００μｍ切片を調製する。ＴＣＣなどの適切な色素で、切片を染色する。コンピュータ化された画像分析器を用いて、これらの切片中の梗塞部位を測定する。
【０２６２】
上記動物モデルで例示されているようにアネキシンＩＩ阻害剤処理を使用することによって、急性であると慢性であるとを問わず、ヒト脳傷害の処置に対する新たな可能性が得られる。
【０２６３】
実施例１０：
スクリーニングシステム
アネキシンＩＩ遺伝子又はポリペプチドは、その活性を調節する化合物、及び、特に、神経毒性ストレス又は神経変性疾患を調節する化合物を同定及び単離するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。スクリーニングされるべき化合物は、特に、小化学分子、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子、ポリペプチド及びドミナントネガティブ及び発現ベクターなどの物質を含む。
【０２６４】
多種のスクリーニングアッセイが当業者に公知である。選択される具体的なアッセイは、候補遺伝子の活性又はこれによって発現されるポリペプチドの活性に大きく依存する。このため、候補遺伝子の発現産物が酵素活性を有することが知られていれば、酵素活性の阻害（又は刺激）に基づくアッセイを使用することが可能である。候補ポリペプチドが、リガンド又は他の相互作用物質に結合することが知られていれば、アッセイは、このような結合又は相互作用の阻害を基礎とすることが可能である。候補遺伝子が公知の遺伝子である場合には、その特性の多くも公知であり得、これらは、最高のスクリーニングアッセイを決定するために使用することが可能である。候補遺伝子が新規であれば、その候補遺伝子の活性の阻害剤を発見するために使用すべき最良のアッセイを決定するために、何らかの分析及び／又は実験が適切である。分析は、その活性を解明する配列中のドメインを発見するために、配列分析を含むことが可能である。
【０２６５】
本分野において周知であるようにスクリーニングアッセイは、細胞をベースとしたもの、又は細胞をベースとしていないものとすることが可能である。細胞をベースとしたアッセイは、ＨｅＬａ細胞などの真核細胞を用いて実施され、細胞をベースとしたこのようなシステムは、抗アポトーシス機能遺伝子である候補遺伝子（すなわち、遺伝子の発現がアポトーシスを抑制し、又はその他、標的細胞中の細胞死を抑制する。）の活性を直接測定するために特に適している。細胞をベースとしたこのようなアッセイを実行する１つの方法は、テトラサイクリン誘導性（Ｔｅｔ誘導性）遺伝子発現を使用する。Ｔｅｔ誘導性遺伝子発現は、本分野において周知である。例えば、「Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３（１１）：５１８５−５１９０」を参照。
【０２６６】
Ｔｅｔ誘導性レトロウイルスは、３’Ｌｔｒエンハンサー／プロモーターレトロウイルス欠失変異体の自己不活性化（ＳＩＮ）機能を取り込むように設計されている。このベクターの細胞中での発現は、テトラサイクリン又は他の活性類縁体の存在下では、事実上検出不可能である。しかしながら、Ｔｅｔの不存在下では、誘導から４８時間以内に、発現は、最大限まで作動され、誘導性レトロウイルスを保有する細胞の全集団の発現を均一に増加させ、このため、発現が感染細胞集団内で均一に制御されることを示している。
【０２６７】
候補遺伝子の遺伝子産物が特異的な標的タンパク質をリン酸化すれば、このレポーター遺伝子産物のリン酸化はその活性化を引き起こし、その後、発色反応を行うことが可能であるように、特異的なレポーター遺伝子構築物を設計することが可能である。候補遺伝子は、上記Ｔｅｔ誘導性の系を用いて、特異的に誘導することが可能であり、誘導された遺伝子と誘導されなかった遺伝子の比較が、レポーター遺伝子活性化の指標を与える。
【０２６８】
類似の間接的なアッセイでは、候補タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用中の変化に応答するレポーター系を設計することが可能である。レポーターが候補化合物との実際の相互作用に対して応答すれば、発色反応が起こる。
【０２６９】
レポーター遺伝子活性の阻害又は刺激は、特異的な候補プロモーター又はその他の制御要素を介して、その発現レベルを調節することによって測定することも可能である。候補遺伝子の活性を調節する特異的プロモーター又は制御要素を、本分野で周知の方法によって規定する。特異的な候補遺伝子プロモーター又は制御要素によって調節されるレポーター遺伝子を構築する。特異的プロモーター又は制御因子を含有するＤＮＡを、レポーターをコードする遺伝子に実際に連結する。レポーター活性は、プロモーター又は制御要素の特異的活性化に依存する。このため、レポーターの阻害又は刺激は、レポーター遺伝子の刺激／阻害の直接的アッセイである。例えば、「Komarov et al(1999), Science vol 285, 1733-7」及び「Storz et al(1999) Analytical Biochemistry, 276, 97-104」を参照。
【０２７０】
細胞をベースとしない様々なスクリーニングアッセイも、十分、当業者の技術の範疇に属する。例えば、候補タンパク質がキナーゼ活性を有する場合など、酵素活性を測定すべき場合には、標的タンパク質を確定し、標的の特異的リン酸化を追跡することが可能である。本アッセイは、標的リン酸化の阻害又は標的リン酸化の刺激のうち何れかを含むことが可能であり、何れのタイプのアッセイも、本分野で周知である。例えば、キナーゼ活性の測定については、「Ｍｏｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８，  ５２８５」及び「Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００，  １１８０」を参照。具体的には、アネキシンＩＩの酵素活性を測定するためのアッセイが、「Choi KS, Fitzpatrick SL, Filipenko NR, Fogg DK, Kassam G, Magliocco AM, Waisman DM:“Regulation of plasmin-dependent fibrin clot lysis by annexin II heterotetramer”, J Biol Chem. 2001 Jul 6;276(27):25212-21(Epub 2001 Apr 23)」によって提供されている。さらに、アネキシンＩＩが酵素と相互作用し、タンパク質−タンパク質相互作用を通じて、その酵素的活性を制御する可能性が存在する。
【０２７１】
候補ポリペプチドの、相互作用物質とのインビトロ相互作用を測定することも可能である。このスクリーニングでは、ビース上に、候補ポリペプチドが固定される。受容体リガンドなどの相互作用物質を、放射性標識し、添加する。放射性標識された相互作用物質がビーズ上の候補ポリペプチドに結合すれば、ビーズ上に担持されている放射活性の量（候補ポリペプチドとの相互作用に起因する。）を測定することが可能である。本アッセイは、ビーズ上の放射活性の量を測定することによって、相互作用の阻害を示す。
【０２７２】
本発明によれば、何れのスクリーニングアッセイも、アッセイ中で陽性を検査する化学的化合物（上述のとおり）又は他の種を同定する工程を含むことが可能であり、このようにして同定された医薬として産生するさらなる工程を含むことも可能である。このような化合物又はこれらの化学的類縁体若しくは相同体を含む医薬は、本発明の一部であると考えられる。アポトーシスの阻害又は刺激に対して同定されたこのような全ての化合物の使用も、本発明の一部であると考えられる。
【０２７３】
実施例１１：
遺伝子治療
本明細書において使用される「遺伝子治療」という用語は、遺伝的又は後天的疾病又は症状の表現型を治療又は予防するために、目的の遺伝的物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主中に伝達することを表す。目的の遺伝的物質は、インビボでのその産生が望まれる産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）をコードする。例えば、目的の遺伝的物質は、治療的価値を有するホルモン、受容体、酵素、ポリペプチド又はペプチドをコードすることが可能である。あるいは、目的の遺伝的物質は、自殺遺伝子をコードしてもよい。総説としては、一般的には、教科書「“Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ”（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）」を参照されたい。
【０２７４】
本発明の遺伝子治療は、インビボ又はエキソビボで実施することが可能である。エキソビボでの遺伝子治療には、患者からの細胞の単離及び精製、治療的遺伝子の導入並びに遺伝的に変化を受けた細胞の患者中への再導入が必要とされる。修飾されたレトロウイルスなどの複製欠損ウイルスは、治療用アネキシンＩＩｃＤＮＡ又はアネキシンＩＩアンチセンス断片を、このような細胞中に導入するために使用することが可能である。例えば、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）は、臨床遺伝子治療試験における周知のベクターである。例えば、「Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｕｅｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．，  ３，  １０２−１０９（１９９３）」を参照されたい。
【０２７５】
これに対して、インビボ遺伝子治療は、患者から細胞を単離及び精製することを必要としない。アンチセンス断片などの治療用遺伝子又は断片は、典型的には、患者に投与するために、リポソーム中又は「Ｂｅｒｋｎｅｒ，  Ｋ．  Ｌ．，  ｉｎ  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８，  ３９−６６（１９９２）」によって記載されているようなアデノウイルス又は「Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｎ．，  ｉｎ  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８，  ９７−１２９（１９９２）」及び米国特許第Ｎｏ．  ５，２５２，４７９号に記載されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような複製欠損ウイルス中などに「パッケージされて」いる。別のアプローチは、治療用遺伝子又はアンチセンス断片などの断片が血流又は筋肉組織中に直接注射される「裸のＤＮＡ」の投与である。さらに別のアプローチは、治療用遺伝子又はアンチセンス断片などの断片が、ＤＮＡで被覆された金粒子を用いた微粒子銃によって組織中に導入される「裸のＤＮＡ」の投与である。
【０２７６】
遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）によって、又は定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７を参照。）によって、対象に送達することが可能である。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中に、遺伝子治療ベクターを含むことが可能であり、又は、遺伝子送達ビヒクルがその中に埋め込まれた徐放マトリックスを含むことが可能である。あるいは、組換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を、そのままの状態で生産することが可能である場合には、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する一以上の細胞を含むことが可能である。
【０２７７】
本発明の遺伝子治療に対して有用な細胞種は、リンパ球、肝細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞並びに網膜細胞などの眼のあらゆる細胞、上皮及び内皮細胞が含まれる。好ましくは、細胞は、治療されるべき患者から採取されたＴリンパ球、肝細胞、眼のあらゆる細胞又は呼吸器若しくは肺の上皮細胞である。肺の上皮細胞の形質移入は、リポソーム中のＤＮＡベクター、ＤＮＡ−タンパク質複合体又は複製欠損アデノウイルスの噴霧状（ｎｅｕｂｕｌｉｚｅｄ）の調製物の吸入を介して行うことが可能である。例えば、米国特許第５，２４０，８４６号を参照されたい。遺伝子治療の対象の総説については、全般的に、教科書「“Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ”（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）」を参照されたい。
【０２７８】
実施例１２：
アンチセンス断片の治療的送達
本発明の実施に際しては、アンチセンス断片を使用してもよい。アンチセンス断片の長さは、好ましくは約９から約４，０００ヌクレオチドまで、より好ましくは約２０から約２，０００ヌクレオチドまで、最も好ましくは約５０から約５００ヌクレオチドまでである。
【０２７９】
効果的であるためには、本発明のアンチセンス断片は、細胞膜を横切って移動しなければならない。一般に、アンチセンス断片は、おそらくは、特異的な受容体を介した取り込みによって、細胞膜を横切る能力を有している。アンチセンス断片としては、一本鎖分子があり、これらは、ある程度疎水性であり、これによって膜を通した受動拡散が増強される。アンチセンス断片が膜を横切る能力を改善するために、アンチセンス断片に修飾を導入してもよい。例えば、カルボン酸基、エステル基及びアルコール基などの、部分的に不飽和な脂肪族炭化水素鎖及び一以上の極性又は荷電基を含む基にＡＳ分子を連結してもよい。あるいは、好ましくは、膜向性（ｍｅｍｂｒａｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドであるペプチド構造に、ＡＳ断片を連結してもよい。このような修飾されたＡＳ断片は、膜をさらに容易に貫通し（これは、ＡＳ断片の機能にとって不可欠である。）、従って、それらの活性を著しく増強し得る。パルミチル連結されたオリゴヌクレオチドが、「Gerster et al(1998):Quantitative analysis of modified antisense oligonucleotides in biological fluids using cationic nanoparticles for solid-phase extraction Anal Biochem. 1998 Sep 10;262(2):177-84」によって記載されており、ゲラニオール連結されたオリゴヌクレオチドが、「Shoji et al(1998):Enhancement of anti-herpetic activity of antisense phosphorothioate oligonucleotides 5’ end modified with geraniol. J Drug Target. 1998;5(4):261-73」によって記載されている。ペプチド（例えば、膜向性ペプチド）に連結されたオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドの調製は、「Soukchareun et al(1998):Use of Nalpha-Fmoc-cysteine(S-thiobutyl) derivatized oligodeoxynucleotides for the preparation of oligodeoxynucleotide-peptide hybrid molecules. Bioconjug Chem. 1998 Jul-Aug;9(4):466-75」によって記載されている。分子をある種の細胞へ誘導し、該細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する、アンチセンス分子又は他の薬物の修飾が、Ｗａｎｇ（１９９８）によって記載されている。
【０２８０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、薬学的組成物の形態で提供される。これらの組成物は、特に、注射、局所投与又は経口取り込みによる使用のためのものであり、実施例８の薬理学及び薬物送達を参照されたい。
【０２８１】
アンチセンスＲＮＡの作用機序及びアンチセンスツールの使用に対する現在の技術水準は、「Kumar et al(1998):Antisense RNA:function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 1998 Dec;62(4):1415-34」に概説されている。この急速に発展している技術の化学的側面(Crooke, 1995:Progress in antisense therapeutics Hematol Pathol. 1995;9(2):59-72.;Uhlmann et al, 1990 )、細胞的側面(Wagner, 1994:Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature. 1994 Nov 24;372(6504):333-5.)及び治療的側面(Hanania, et al, 1995:Recent advances in the application of gene therapy to human disease. Am J Med. 1995 Nov;99(5):537-52. ;Scanlon, et al, 1995:Oligonucleotide-mediated modulation of mammalian gene expression. FASEB J. 1995 Oct;9(13):1288-96.;Gewirtz, 1993:Oligodeoxynucleotide-based therapeutics for human leukemias. Stem Cells. 1993 Oct;11 Suppl 3:96-103)に関する総説が存在する。アネキシン受容体合成の阻害におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、「Yeh et al(1998):Inhibition of Annexin receptor synthesis by antisense oligonucleotides attenuates OP-1 action in primary cultures of fetal rat calvaria cells. J Bone Miner Res. 1998 Dec;13(12):1870-9」に記載されている。電圧依存性カリウムチャネル遺伝子Ｋｖ１．４の合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、「Meiri et al(1998) Memory and long-term potentiation(LTP) dissociated:normal spatial memory despite CA1 LTP elimination with Kv1.4 antisense. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Dec 8;95(25):15037-42」によって記載されている。Ｂｃｌ−ｘの合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、「Kondo et al(1998):Antisense telomerase treatment:induction of two distinct pathways, apoptosis and differentiation. FASEB J. 1998 Jul;12(10):801-11.」によって記載されている。アンチセンス薬物の治療的使用は、「Stix(1998):Shutting down a gene. Antisense drug wins approval. Sci Am. 1998 Nov;279(5):46, 50 ;Flanagan(1998) Antisense comes of age. Cancer Metastasis Rev. 1998 Jun;17(2):169-76 ;Guinot et al(1998) Antisense oligonucleotides:a new therapeutic approach Pathol Biol(Paris). 1998 May;46(5):347-54」及びその中の参考文献によって記載されている。比較的短時間の間に、培養された初代細胞及び細胞株中でのＡＳヌクレオチド配列のインビトロ使用並びに特異的なプロセスを抑制するために、及び一過性に身体機能を変化させるために、このようなヌクレオチド配列をインビボ投与することに関して多くの情報が蓄積された。さらに、現在では、ヒトでの効果を予測するために、インビトロ及びインビボ動物モデル並びにヒト臨床試験から十分な経験を利用することが可能である。
【０２８２】
実施例１３：
ｓｉＲＮＡの治療的送達
哺乳動物の細胞中に、ｓｉＲＮＡの増強及び改善された送達を行うことを特別に目的とした送達系が開発されている。例えば、哺乳動物細胞中へのｓｉＲＮＡの効率的な送達用のアデノウイルスベースのベクターを記載する「Shen et al(FEBS letters 539:111-114(2003))」;Xia et al., Nature Biotechnology 20:1006-1010(2002), Reich et al., Molecular Vision 9:210-216(2003), Sorensen et al.(J.Mol.Biol. 327:761-766(2003)（陽イオン性リポソームを用いた静脈内注射及び／又は腹腔内注射によって、ｓｉＲＮＡを成体マウスに全身送達するための注射を使用した系を考案した。）、「Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２：１０７−１０８（２００２）」（迅速な尾静脈（ｖａｉｎ）注射による、マウス中へのｓｉＲＮＡの効率的な送達のための系を開発した。）、「Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１，  １１：２７１７−２７２４（２００３）」（適切な修飾を施して、ペプチドをベースとした遺伝子送達系ＭＰＧを用いてｓｉＲＮＡを送達した。）。
【０２８３】
ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類中での阻害のための使用に成功を収めた。さらなる詳細については、「Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｔｉｎａ  ２４（１）  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４  Ｉ  １３２−１３８」を参照されたい。ｓｉＲＮＡのための呼吸器製剤は、Ｄａｖｉｓらの米国特許出願２００４／００６３６５４号に記載されている。コレステロール抱合されたｓｉＲＮＡ（並びにその他のステロイド及び脂質抱合されたｓｉＲＮＡ）を、送達のために使用することが可能である。「Soutschek et al Nature 432:173-177(2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs」及び「Lorenz et al. Bioorg. Med. Chemistry. Lett. 14:4975-4977(2004) Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells」を参照されたい。
【０２８４】
ｓｉＲＮＡの送達のために使用され得るさらなる方法は、実施例８及び１２に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】この図は、ヒトアネキシンＩＩ遺伝子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列−配列番号１を記載する。
【図２】この図は、ヒトアネキシンＩＩに対応するポリペプチドのアミノ酸配列−配列番号２を記載する。
【図３】この図は、２つのアネキシンＩＩアンチセンス断片のヌクレオチド配列（配列番号３及び配列番号４）を記載する。
【図４】この図は、２つのアネキシンＩＩセンス断片のヌクレオチド配列（配列番号５及び配列番号６）を記載する。
【図５】この図は、機能確証実験の損失の結果を説明するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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