(57)【要約】  本発明は、宿主ストリング含有量が増大した変異体タンパク質を生成するための新規方法、および、これらの方法を使用して操作されたタンパク質に関する。
2007512846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親タンパク質と比較して、宿主のための変異体タンパク質を生成する方法であって：
Ａ．該親タンパク質配列を、該宿主の種の２種またはそれ以上の天然タンパク質配列と比較すること；
Ｂ．各天然タンパク質配列の対応するアミノ酸ストリングを有する１つまたはそれ以上の該親タンパク質配列のアミノ酸ストリングを分析すること；および、
Ｃ．１つまたはそれ以上の該親タンパク質配列のアミノ酸を、天然タンパク質配列の対応するアミノ酸ストリングにより、アミノ酸ストリング毎の方式で置換すること、
を含み、
Ｄ．ここで、該変異体タンパク質は、該親タンパク質と比較して増加した宿主ストリング含有量を有し、そして、
Ｅ．ここで、該置換アミノ酸は、第１の天然タンパク質からの第１のストリング中の第１の置換、および第２の天然タンパク質からの第２のストリング中に第２の置換を含む、
方法。
【請求項２】
該置換アミノ酸が、２種またはそれ以上の天然タンパク質のコンセンサスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該宿主の種がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該親タンパク質ファミリーがマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該天然タンパク質配列が、生殖系列配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
置換の１つが、最も相同な天然配列からの対応する残基ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
置換の１つが、相同天然配列のコンセンサスからの対応する残基ではない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
置換の１つが、表面に露出していない位置で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該変異体タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
置換の１つがＣＤＲ中のものではない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
置換の１つが、ＶＨ／ＶＬ中間面の一部である位置で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該変異体抗体が、該親タンパク質の約２分の１よりも低くない抗原への親和性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該変異体抗体が、該親タンパク質より約２倍高い抗原への親和性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
該変異体タンパク質が、天然タンパク質配列と比較して、約８５％より低いフレームワーク領域同一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
該変異体タンパク質が、約０.６より低いフレームワーク領域均一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
該変異体抗体が、ＣＤＲ残基の約５オングストローム以内の置換を含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
該抗体が、該親抗体と比較して、調節されたエフェクター機能を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
該エフェクター機能がＡＤＣＣである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該方法から１種より多い変異体タンパク質が生成され、変異体タンパク質のセットを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該変異体タンパク質のセットが、約５アミノ酸より多く異なっている少なくとも２種の変異体タンパク質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの変異体タンパク質をさらに合成する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該１つまたはそれ以上のアミノ酸ストリングの分析が、ＣＤＲ領域に適用されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該変異体タンパク質が、溶解性、安定性、発現、親和性、免疫原性、活性および機能性からなる群から選択される少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該１つまたはそれ以上のアミノ酸ストリングの分析が、理論上のＭＨＣアグリトープへの結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該ストリングが、９個のアミノ酸の長さである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
特定の様式で機能するようにコンピューターに命令する、コンピューターで読むことができるメモリーであって、
Ａ．親タンパク質配列と２種またはそれ以上の宿主天然タンパク質配列を比較する比較モジュール；
Ｂ．親タンパク質配列と、１種またはそれ以上の天然タンパク質配列との比較を提供する、分析モジュール；
Ｃ．該親タンパク質配列の１個またはそれ以上のアミノ酸を、天然タンパク質配列の対応するアミノ酸ストリングにより、アミノ酸毎の方式で置き換える、置換モジュール；
を含み、
Ｄ．ここで、該変異体タンパク質が、該親タンパク質と比較して増加した宿主ストリング含有量を有する、
メモリー。
【請求項２７】
親タンパク質と比較して宿主の変異体タンパク質を生成する方法であって：
Ａ．該親タンパク質の配列を、２種またはそれ以上の天然タンパク質配列と比較すること；
Ｂ．該親タンパク質配列中のアミノ酸を、１種またはそれ以上の天然タンパク質配列中のアミノ酸により置換すること、ここで、置換は、ストリング内の該親タンパク質と比較して、該変異体タンパク質の天然タンパク質配列への配列同一性を高めるものである、
を含み、
Ｃ．ここで、該変異体タンパク質は、該親タンパク質と比較して増加した宿主ストリング含有量を有する、
方法。
【請求項２８】
親タンパク質と比較して宿主の変異体タンパク質を生成する方法であって：
Ａ．該親タンパク質の配列を、該宿主の種の２種またはそれ以上の天然タンパク質配列と比較すること；
Ｂ．１つまたはそれ以上の該親タンパク質配列のアミノ酸ストリングを各天然タンパク質配列の対応するアミノ酸ストリングと対比して分析すること；および、
Ｃ．１つまたはそれ以上の該親タンパク質配列のアミノ酸を、天然タンパク質配列の対応するアミノ酸ストリングにより、アミノ酸ストリング毎の方式で置換すること、
を含み、
Ｄ．ここで、該変異体タンパク質が、増加した宿主ストリング含有量を有する、
方法。
【請求項２９】
該置換アミノ酸が、２種またはそれ以上の天然タンパク質のコンセンサスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該宿主の種がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
該親タンパク質がマウスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
該天然タンパク質配列が、生殖系列配列である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
置換の１つが、最も相同な天然配列からの対応する残基ではない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
置換の１つが、相同天然配列のコンセンサスからの対応する残基ではない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
置換の１つが、表面に露出していない位置で行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
該変異体タンパク質が抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
置換の１つがＣＤＲ中のものではない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
置換の１つが、ＶＨ／ＶＬ中間面の一部である位置で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
該変異体抗体が、該親タンパク質の約２分の１よりも低くない抗原への親和性を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該変異体抗体が、該親タンパク質より約２倍高い抗原への親和性を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
該変異体タンパク質が、天然タンパク質配列と比較して、約８５％より低いフレームワーク領域同一性を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
該変異体タンパク質が、約０.６より低いフレームワーク領域均一性を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該変異体抗体が、親タンパク質と比較して約２８個よりも少ないアミノ酸置換を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
該変異体抗体が、ＣＤＲ残基の約５オングストローム以内の置換を含まない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
該抗体が、該親抗体と比較して、調節されたエフェクター機能を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
該エフェクター機能がＡＤＣＣである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該方法から１種より多い変異体タンパク質が生成され、変異体タンパク質のセットを形成する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
該変異体タンパク質のセットが、約５アミノ酸より多く異なっている少なくとも２種の変異体タンパク質を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの変異体タンパク質をさらに合成する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該ストリングが、ＣＤＲ領域に適用されない、請求項２８に記載の方法。
【請求項５１】
該変異体タンパク質が、溶解性、安定性、発現、親和性、免疫原性、活性および機能性からなる群から選択される少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項５２】
該１つまたはそれ以上のアミノ酸ストリングの分析が、理論上のＭＨＣアグリトープへの結合を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５３】
該ストリングが、９個のアミノ酸の長さである、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、ＵＳＳＮ６０／５２７,１６７（２００３年１２月４日出願）；６０／５８１,６１３（２００４年６月２１日出願）；６０／６０１,６６５（２００４年８月１３日出願）；および、６０／６１９,４８３（２００４年１０月１４日出願）に、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）の利益を主張する；これら全部の全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、宿主ストリング（string）含有量が高められた変異体タンパク質を生成させるための新規方法、および、これらの方法を使用して操作された（engineered）タンパク質に関する。
【０００３】
発明の背景
有用なヒトの治療剤である可能性を有する多くのタンパク質は、異種起源のものである。治療目的での異種タンパク質の使用は、例えば、齧歯類で抗体を生成させるハイブリドーマ技術の成功が確立されていること、および異種タンパク質の効力がヒトの対応物よりも高い可能性があることを含む、様々な理由で有利であり得る。異種タンパク質は、潜在的治療分子の豊かな供給源であるが、比較的利用されていないもののままである。この理由の１つは、ヒトに投与されたとき、非ヒトタンパク質がしばしば免疫原性であり、従ってそれらの治療的有用性を著しく低減させることである。加えて、ヒト起源の操作されたタンパク質でさえ、タンパク質配列の変化のために、免疫原性になることがある。
【０００４】
免疫原性は、外来と認識される物質に対する複雑な一連の反応の結果であり、中和および非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、免疫、過敏反応、およびアナフィラキシーを含み得る。タンパク質配列、投与の経路および頻度、および患者集団を含むがこれらに限定されない、いくつかの要因がタンパク質の免疫原性に寄与できる。免疫原性は、タンパク質治療の効力および安全性を複数のやり方で限定し得る。効力は、中和抗体の形成により直接低減され得る。効力はまた、典型的には血清からの迅速なクリアランスを導く中和または非中和抗体に結合して、間接的に低減され得る。免疫反応が高められると、重篤な副作用および死亡さえ起こり得る。中和抗体が内在性タンパク質と交差反応し、その機能を妨害するときに、ある特別なクラスの副作用が起こる。
【０００５】
モノクローナル抗体の臨床的成功のために、これらのタンパク質の免疫原性の低減は、研究の活発な分野である。抗体は、多数の高度に保存された抗体配列および高解像度の構造情報の財産のために、免疫原性の低減方法の開発のための独特なシステムである。抗体の免疫原性を低減するために、多数の戦略が開発されてきた。これらの全アプローチの中心的な目標は、抗原への親和性を維持しながら、非ヒトおよび対応する免疫原性の含有量を低減することであった。
【０００６】
「ヒト化」と呼ばれる、抗体の免疫原性の低減に使用される主な方法は、原則的に、「ドナー」（典型的にはマウスまたはラット）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、「アクセプター」（ヒト）の可変の軽鎖（ＶＬ）および可変の重鎖（ＶＨ）フレームワーク（ＦＲ）に移植することに依存する（Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA))。この戦略は、「ＣＤＲ移植」(Winter ＵＳ５２２５５３９）と呼ばれる。最初に移植されたコンストラクトで失われた親和性を回復するために、選択されたアクセプターのフレームワーク残基の対応するドナー残基への「逆突然変異」がしばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３）。これらの方法を使用して操作された抗体の重要な臨床適用にもかかわらず、これらの方法は、免疫原性を低減する能力に関して信頼性が低い（nonrobust）ままである。数々のヒト化抗体が、臨床研究において実質的な免疫反応を誘起し、免疫反応の発生頻度は、患者の６３％と高い（Ritter et al., 2001, Cancer Research 61: 6851-6859)。
【０００７】
現在のヒト化方法の不完全な免疫原性低減能力は、ドナー−アクセプターアプローチにより負わされる重大な限定に起因する。歴史的に、単一のドナーの使用は、単一の異種抗体をヒトのバイオ治療薬（biotherapeutic）として適合させる操作を目的とする方法の一部であった。しかしながら、単一のアクセプターの使用は必要とされない。対照的に、アクセプター抗体の使用、およびそれを選択するための大域的相同性の使用は、免疫原性の低減方法に実質的な制限をかける。主要な問題は、非ヒト配列とヒト配列との間の包括的配列類似性をヒト免疫原性の測定基準として使用することが、根本的に欠陥を有することである。これは、ヒトらしさ（humanness）の程度の測定が、免疫反応の基礎をなす分子メカニズムを正確に説明しないことを意味する。免疫系は、ヒトタンパク質に対する大域的配列類似性に基づいて抗原を認識しない。むしろ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む免疫細胞は、ほんの少数の残基のみを含む直鎖または立体構造的モチーフを認識する。抗原認識において鍵となる段階は、ペプチド−ＭＨＣ−Ｔ細胞受容体複合体の形成である。ＡＰＣは、ＭＨＣアグリトープと呼ばれる短い（約９個の残基）直鎖ペプチド配列を認識するＭＨＣ分子を発現する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞エピトープをペプチド−ＭＨＣ複合体の文脈で認識するＴ細胞受容体を発現する。ヒトタンパク質に存在するＭＨＣアグリトープを認識するＴ細胞は、典型的にはアポトーシスを経るか、または反応不顕性になるが、ＭＨＣ分子に結合した外来性アグリトープを認識するＴ細胞は、免疫反応に参加し得る。従って、あるタンパク質の免疫原性に相当する量は、そのヒト配列への大域的配列類似性よりも、むしろその個々のヒトエピトープの配列含有量である。
【０００８】
ドナー−アクセプターモデルおよびそれが負わせる大域的配列相同性の使用は、実際のところは失敗する。ＣＤＲが不可侵のものとして扱われるので、構造的矛盾がＣＤＲ−ＦＲ境界に導入される。外来ドナーＣＤＲのヒトアクセプターフレームワークへの移植は、外来ＣＤＲ中のエピトープのみならず、ＦＲ−ＣＤＲ境界にも多数のエピトープを含む、かなりの数の非ヒトエピトープを各可変鎖に創成する。このＦＲ−ＣＤＲの矛盾は、大域的相同性から離れ、より局所的な配列相同性を見ると明らかである。ＣＤＲ移植は、一般的に、ＣＤＲを犠牲にして、フレームワークのドナー−アクセプター相同性を最大にする（Clark, 2000, Immunology Today 21: 397-402)。皮肉なことに、このことは、頻繁にヒト抗体に対する低い大域的相同性をもたらす。抗体の抗原結合決定因子の注意深い分析により、事実上、ＣＤＲの残基の大部分が抗原の結合に関与しないことが示されるので、非ヒト抗体の機能的決定因子をヒトのもののフレームワークに与えるための、この「切り取りおよび貼り付け」のアプローチは実際には不要である（MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262: 732-745）。ＦＲ−ＣＤＲの矛盾は、配列レベルで免疫学的問題の原因となるだけでなく、構造的レベルで立体構造的問題も引き起こす。結果として、ＣＤＲ移植を基礎とするヒト化方法は、しばしば、１０−１００倍の抗原親和性の喪失をもたらし、フレームワーク内でのドナー残基への逆突然変異を必要とする。この逆突然変異の方法は、本質的に全ての現在のヒト化の努力の顕著な特徴であり、またさらなる非ヒトエピトープを導入するので、これらの方法の非効率性を強調する。
【０００９】
抗体の免疫原性を低減するための免疫エピトープアプローチを採用する方法が、探究されてきた（ＵＳ５７１２１２０；ＵＳ２００３／０１５３０４３）。これらの方法の中心は、異種抗体内の事実上免疫原性のエピトープである配列を決定することである。免疫原性を決定するために、理論および実験の両方で様々な方法が記載されてきた。これには、両親媒性らせんの形成の潜在能力、ＭＨＣへの結合、Ｔ細胞活性化アッセイにおける反応性の決定が含まれる。これらの戦略と本発明とを区別する特徴は、本発明が、特定のエピトープの免疫原性に関する仮定を行わないことである。むしろ、主要な目標は、ヒト配列のアラインメントと比較することにより決定して、異種抗体におけるヒト直鎖配列ストリングの含有量を最大化することである。関連配列のデータセットは、ＭＨＣとの相互作用の欠如、Ｔ細胞受容体との相互作用の欠如、提示に必要な適切なプロセシングの欠如および寛容を含む、あらゆる関連する理由で非免疫原性であるストリングを含む。
【００１０】
ＵＳ５７１２１２０およびＵＳ２００３／０１５３０４３に記載の方法が、局所的レベルの配列操作、即ち、タンパク質の構造、安定性、溶解性および機能を維持する要求についての重大な関心に取り組むのに失敗している点で、さらに欠点があることに注目される。従って、免疫原性低減のための配列ストリングアプローチはＣＤＲ移植よりも正確であるが、局所的配列含有量と、局所的および大域的構造レベルでの立体構造的適合性の両方を考慮するタンパク質設計方法論と組み合わせると、最適になるであろう。宿主ストリング含有量を評価するためのスコア付け関数の提供に加えて、本発明はまた、タンパク質の他の関連特性を評価するスコア付け関数を説明し、それらは、免疫原性の低減並びにタンパク質の構造および機能的最適化に同時に用い得る。
【００１１】
まとめると、ドナー−アクセプターモデルは、免疫原性の低減方法に重大な制限を負わせる。配列に関して、大域的配列相同性は、免疫原性には不適切な測定基準である。構造に関して、立体構造的矛盾を回復するために逆突然変異が必要であり、それにより非ヒトエピトープが創成または再導入される。本発明は、ドナー−アクセプターモデルの外に、従ってそれが負わせる配列および構造的制限の外に踏み出す、抗体の免疫原性を低減する新規方法を説明する。記載する方法の中心的戦略は、それがヒト直鎖配列ストリングの含有量を最大化することである。このようにして、典型的にはヒト配列のアラインメントに含まれる局所的配列情報を利用することにより、免疫原性に局所的配列レベルで取り組む。この戦略は、より正確な免疫原性の測定を提供するのみならず、移植により導入される問題を回復するために、逆向きではなくむしろ前向きの置換を設計することを可能にする。要するに、免疫原性に局所的配列ストリングのレベルで取り組むことにより、結合決定因子とヒトらしさとの間の最適なバランスを設計できる。
【００１２】
本発明は、タンパク質の免疫原性を低減するための新規方法を説明する。それは、天然ヒト配列に含まれる非免疫原性情報を活用して、配列ストリングのレベルで免疫原性含有量についてタンパク質配列をスコア付けする。さらに、説明される方法は、コンピューター処理による配列および構造をベースとするタンパク質操作方法における最近の進歩を利用して、ヒト配列含有量とタンパク質の機能性との間の最適なバランスを定量的かつ系統的に決定する。免疫グロブリンタンパク質ファミリーについて利用可能なヒト配列情報の財産があるので、ヒト抗体への適用が力説される。他のタンパク質への適用も可能である。
【００１３】
発明の要旨
本明細書で開示される発明は、タンパク質の免疫原性を低減するための新規方法を提供する。その方法は、配列ストリングの含有量を最大にする。好ましい実施態様では、本発明の方法は、ヒト配列ストリングの含有量を最大にする。
【００１４】
本発明の目的は、タンパク質のヒト配列ストリング含有量の評価に使用し得るスコア付け関数を提供することである。好ましい実施態様では、スコア付け関数は、天然のタンパク質配列のセットを構成するストリングに対する、あるタンパク質配列のストリングの類似性を比較する。他の好ましい実施態様では、配列のセットは、アラインメントされた生殖系列配列のセットである。さらなる好ましい実施態様では、配列のセットは、成熟配列を含む。最も好ましい実施態様では、配列はヒト配列である。
【００１５】
本発明の目的は、タンパク質の構造および／または機能の適格性の評価に使用し得るスコア付け関数を提供することである。
【００１６】
本発明の目的は、本明細書に記載の方法を使用して操作された、親タンパク質のタンパク質変異体を提供することである。好ましい実施態様では、親タンパク質は、免疫グロブリンである。
【００１７】
本発明の目的は、本発明のタンパク質変異体をスクリーニングおよび試験するための実験方法を提供することである。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載のタンパク質変異体をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、場合により制御配列に機能し得るように結合したその核酸を含むベクターを提供する。本発明は、そのベクターを含有する宿主細胞、およびそのタンパク質変異体を産生および場合により回収する方法を提供する。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載のタンパク質変異体、および生理的または医薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、本明細書で開示のタンパク質変異体を含む新規抗体およびＦｃ融合体を提供する。その新規抗体およびＦｃ融合体は、治療製品において用途を見出し得る。
【００２１】
本発明は、本明細書で開示のタンパク質変異体の治療的処置および診断的使用を提供する。
【００２２】
図面の簡単な説明
図１．ヒト生殖系列の配列および多様性。ヒトＶＨ鎖（図１ａ）、ヒトＶＬカッパ鎖（図１ｂ）、並びにＶＨおよびＶＬカッパＪ鎖（図１ｃ）をコードすると知られている配列を示す。ＶＬラムダ生殖系列配列は提供しない。生殖系列配列を、Kabat の番号付けスキーム（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）に従い番号付ける。可変領域の各領域を、図１ａおよび１ｂ中で番号付けの上に示す。これらは、フレームワーク領域１ないし３およびＣＤＲ１ないし３を含む。Kabat のＣＤＲを形成する位置に下線を付す。生殖系列鎖を、当分野で知られている通り、ＶＨについて７個のサブファミリーに、そしてＶＬについて６個のサブファミリーにグループ分けし、これらのサブファミリーを共にグループ化し、空白の行で分ける。ＩｇＧ軽鎖カッパＪ鎖（ＩＧＫＪ１−ＩＧＫＪ５）を形成する５個の生殖系列の配列、およびＩｇＧ重鎖Ｊ鎖（ＩＧＨＪ１−ＩＧＨＪ５）を形成する６個の生殖系列を、図１ｃに示す。カッパおよびラムダ軽鎖Ｊ鎖は、ＶＬκおよびＶＬλ生殖系列と各々組み合わさり、軽鎖可変領域を形成し、重鎖Ｊ鎖は、ＶＨ生殖系列および重鎖多様性（heavy diversity）（Ｄ）生殖系列（示さず）と組み合わさり、重鎖可変領域を形成する。ＶＨＣＤＲ３は、ＶＨ生殖系列の一部ではなく、ＤおよびＪ遺伝子にコードされる。
【００２３】
図２．式１、２および３により記載される量を図解説明する。図２ａでは、位置ｉ＝１５で始まるストリングについて、親配列ｓとしてのマウス抗体ｍ４Ｄ５ ＶＨ配列（ＶＨ＿ｍ４Ｄ５）の領域を、ヒト配列ｈとしてのＶＨヒト生殖系列配列（ＶＨ＿１−２）からの相同領域と比較して、ＩＤストリング（式１）を図解説明する。各配列から３０個の残基のみを示し、関連ストリングを構成する残基を太字で示す。図２ｂでは、位置ｉ＝１５（太字で示す）で始まる親配列ｓストリングおよびアラインメントされた７個のＶＨヒト生殖系列配列のセットの相同領域について、ＩＤｍａｘ（式２）を図解説明する。図２ｃでは、親配列の全てのストリング（ｉ＝１ないしｉ＝２２）およびアラインメントされた７個のＶＨヒト生殖系列配列のセットの相同領域について、ＨＳＣ（式３）を図解説明する。
【００２４】
図３．ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。図３ａは、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬの配列を示す。図３ｂは、ヒトＶＬκ生殖系列の各配列中の対応する残基と比較した、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬの各残基の同一性を示す。黒い水平線は、図１に提示した通りの７個の異なるサブファミリーを線引きし、黒い垂直線は、そのドメインの異なるフレームワークおよびＣＤＲ領域（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順）を線引きする。灰色の四角形は、生殖系列配列が、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬ配列中の対応する位置の残基と同じアミノ酸同一性を有することを示す。白色の四角形は、これらの２個の配列が、その位置で異なることを示す。図３ｃは、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬとヒトＶＬκ生殖系列の各配列との間の連続する８−および９−ｍｅｒのストリングを示す。黒色の水平および垂直線は、図３ｂに記載の通りである。灰色の四角形は、生殖系列配列が、その位置を中心とする９−ｍｅｒのストリングを含み、それが、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬ配列中の対応するストリング（対応する残基を中心とする）に対して、９個のうち８個または９個のうち９個が一致する対であることを示す。図３ｄは、モデル化されたＷＴ ＡＣ１０可変領域の構造を示す。軽鎖を灰色のリボンとして示し、重鎖を黒色のリボンとして示し、ＣＤＲ残基を黒色の線として示す。
【００２５】
図４．ＷＴ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。ここでは軽鎖を黒色のリボンとして示し、重鎖を灰色のリボンとして示すことを除き、図は、図３の図の説明文で記載した通りである。
【００２６】
図５．ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＬは、ＷＴ ＡＣ１０のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｌｋ＿４−１のフレームワークから誘導した。ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＬとＷＴ ＡＣ１０ ＶＬとの差異を、図５ａの配列中で太字の残基として、そして図５ｄ中で黒い球と棒として示す。
【００２７】
図６．ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＨは、ＷＴ ＡＣ１０のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｈ＿１−３のフレームワークおよびＦＲ４中の置換Ｑ１０８ＬおよびＡ１１３Ｓ（Kabat の番号付け）から誘導した。
【００２８】
図７．最適化ＨＳＣを有するＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体。最適化ＨＳＣを有するＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体。実施例１に記載の計算のアウトプット配列の重複しないセットを示す。各反復（iteration）（Ｉｔｅｒ）に、以下を提供する：構造コンセンサス（Structural Consensus）；構造優先（Structural Precedence）；ヒトストリング含有量（ＨＳＣ）；ヒトストリング類似性（ＨＳＳ）；Ｎ９最大；フレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）；および、ＷＴからの突然変異の数（Ｍｕｔｓ）。アウトプット配列を、そのセット中の他の配列からの突然変異的距離に基づきクラスター化した。これらのクラスターを、水平黒色線により線引きする。「クラスター」カラムは、この突然変異距離を定量的に提供する。親ＷＴ ＡＣ１０配列との差異を、灰色で示す。位置を Kabat の番号付けスキームに従って番号付け、最上段に付す。黒色水平線により一括される明灰色の領域は、計算においてマスクされた、Kabat に定義されるＣＤＲの中または近傍にある残基を示す。ＷＴ Ｃ２２５ ＶＬからの配列の差異を、暗灰色で示す。
【００２９】
図８．Ｌ１ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００３０】
図９．Ｌ２ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００３１】
図１０．Ｌ３ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００３２】
図１１．Ｈ１ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００３３】
図１２．Ｈ２ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００３４】
図１３．Ｈ３ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００３５】
図１４．ＡＣ１０変異体と標的抗原ＣＤ３０との間の結合を測定する AlphaScreen（商標）アッセイ。競合変異体抗体の存在下、発光シグナルの低下として、特徴的な阻害曲線が観察される。各特定の曲線について、低および高抗体濃度でのベースラインにより各々与えられる最大および最小発光シグナルに対して結合データを標準化した。曲線は、非線形回帰を使用する一部位競合モデルへのデータのフィットを表し、それらのフィットは、各抗体のＩＣ５０を提供する。
【００３６】
図１５．図１１．ＡＣ１０ ＷＴおよび変異体全長抗体のＣＤ３０標的抗原への結合を示す、ＳＰＲセンサーグラム（sensorgram）。曲線は、会合期および解離期からなり、その分離は各曲線上の小さい棘によりマークされている。
【００３７】
図１６．ＡＣ１０変異体とヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａとの結合を測定する AlphaScreen（商標）アッセイ。
【００３８】
図１７．ＷＴおよびＡＣ１０変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。精製したヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として、Ｌ５４０ホジキンリンパ腫細胞を標的細胞として使用し、Cytotoxicity Detection Kit (LDH, Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN ）を使用してＬＤＨ活性を測定することにより、溶解をモニターした。サンプルを三重にして（in triplicate）行い、誤差評価を提供した（ｎ＝３、＋／−Ｓ.Ｄ.）。図１７は、様々な抗体濃度でのＡＤＣＣの用量依存性を示し、曲線は、非線形回帰を使用する、Ｓ字用量依存モデルへのデータのフィットを表す。未加工のデータを図１７ａおよび１７ｂに提示し、一方図１７ｃでは、標的細胞の Triton-X100 溶解による最大細胞毒性の割合の目盛りに、データを標準化した。
【００３９】
図１８．エフェクター機能の増強を提供するＦｃ変異体を含むＷＴ（Ｈ０／Ｌ０）およびＨ３／Ｌ３ ＡＣ１０抗体のＡＤＣＣ能力を測定する、細胞をベースとするアッセイ。未加工のデータを標的細胞の Triton-X100 溶解による最大細胞毒性の割合の目盛りに標準化した。
【００４０】
図１９．選択されたＨ３Ｌ３二次ＡＣ１０変異体と標的抗原ＣＤ３０との間の結合を測定する、AlphaScreen（商標） アッセイ。
【００４１】
図２０．Ｌ３.７１ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４２】
図２１．Ｌ３.７２ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４３】
図２２．Ｈ３.６８ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４４】
図２３．Ｈ３.６９ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４５】
図２４．Ｈ３.７０ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４６】
図２５．Ｆｃ領域にアミノ酸の改変を含み得る、ＣＬ□定常軽鎖を有するＬ３.７１ ＡＣ１０変異体ＶＬ（図２５ａ）およびＩｇＧ定常鎖を有するＨ３.７０ ＡＣ１０変異体ＶＨ（図２５ｂ−２５ｅ）を含む、ＡＣ１０変異体抗体のアミノ酸配列。図２５ｂは、ＩｇＧ１重鎖を提供し、突然変異し得、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４として太字で示される位置は、残基Ｓ２３９、Ｖ２６４、Ａ３３０およびＩ３３２を表す。図２５ｃは、図２５ｂに記載の重鎖の一例を提供し、ここでは、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ ＩｇＧ１定常領域を有するＨ３.７０ ＡＣ１０変異体ＶＨ領域を含む。図２５ｄは、ＩｇＧ２重鎖を提供し、突然変異し得、太字でＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５と示される位置は、残基Ｓ２３９、Ｖ２６４、Ａ３３０、Ｉ３３２、Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５、−２３６およびＧ２３７を表す（ここで、−２３６は、ＥＵインデックスの位置２３６の欠失を表す）。図２５ｅは、図２５ｄに記載の重鎖の一例を提供し、ここで、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｐ２３３Ｅ／Ｖ２３４Ｌ／Ａ２３５Ｌ／−２３６Ｇ ＩｇＧ２定常領域を有するＨ３.７０ ＡＣ１０変異体ＶＨ領域を含む。
【００４７】
図２６．ＷＴ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４８】
図２７．ＷＴ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００４９】
図２８．ＷＴ Ｃ２２５のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｌｋ＿６Ｄ−２１のフレームワークおよびＦＲ４中のＬ１０６Ｉ（Kabat の番号付け）置換に由来する、ＣＤＲ移植Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５０】
図２９．ＷＴ Ｃ２２５のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｈ＿４−３０−４のフレームワークおよびＦＲ４中のＡ１１３Ｓ（Kabat の番号付け）置換に由来する、ＣＤＲ移植Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５１】
図３０．最適化ＨＳＣを有するＣ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体。実施例２に記載の計算のアウトプット配列の重複しないセットを示す。
【００５２】
図３１．最適化ＨＳＣを有するＣ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体。実施例２に記載の計算のアウトプット配列の重複しないセットを示す。
【００５３】
図３２．Ｌ２ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５４】
図３３．Ｌ３ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５５】
図３４．Ｌ４ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５６】
図３５．Ｈ３ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５７】
図３６．Ｈ４ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５８】
図３７．Ｈ５ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００５９】
図３８．Ｈ６ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００６０】
図３９．Ｈ７ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００６１】
図４０．Ｈ８ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００６２】
図４１．全長抗体Ｃ２２５変異体のＥＧＦＲ標的抗原への結合を示すＳＰＲセンサーグラム。センサーグラムは、Ｃ２２５ ＷＴ（Ｌ０／Ｈ０）と変異体（Ｌ０／Ｈ３、Ｌ０／Ｈ４、Ｌ０／Ｈ５、Ｌ０／Ｈ６、Ｌ０／Ｈ７、Ｌ０／Ｈ８、Ｌ２／Ｈ３、Ｌ２／Ｈ４、Ｌ２／Ｈ５、Ｌ２／Ｈ６、Ｌ２／Ｈ７、Ｌ２／Ｈ８、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ３／Ｈ４、Ｌ３／Ｈ５、Ｌ３／Ｈ６、Ｌ３／Ｈ７、Ｌ３／Ｈ８、Ｌ４／Ｈ３、Ｌ４／Ｈ４、Ｌ４／Ｈ５、Ｌ４／Ｈ６、Ｌ４／Ｈ７およびＬ４／Ｈ８）全長抗体のＥＧＦＲセンサーチップへの結合を示す。曲線は、曲線は、会合期および解離期からなり、その分離は各曲線上の小さい棘によりマークされている。
【００６３】
図４２．Ｃ２２５ ＷＴ（Ｌ０／Ｈ０）および変異体（Ｌ０／Ｈ３、Ｌ０／Ｈ４、Ｌ０／Ｈ５、Ｌ０／Ｈ６、Ｌ０／Ｈ７、Ｌ０／Ｈ８、Ｌ２／Ｈ３、Ｌ２／Ｈ４、Ｌ２／Ｈ５、Ｌ２／Ｈ６、Ｌ２／Ｈ７、Ｌ２／Ｈ８、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ３／Ｈ４、Ｌ３／Ｈ５、Ｌ３／Ｈ６、Ｌ３／Ｈ７、Ｌ３／Ｈ８、Ｌ４／Ｈ３、Ｌ４／Ｈ４、Ｌ４／Ｈ５、Ｌ４／Ｈ６、Ｌ４／Ｈ７およびＬ４／Ｈ８）全長抗体の、細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。精製ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、Ａ４３１類表皮癌細胞を、標的細胞として１０：１エフェクター：標的細胞比で使用し、Cytotoxicity Detection Kit (LDH, Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN）を使用するＬＤＨ活性の測定により、溶解をモニターした。サンプルを三重にして行い、誤差評価を提供した（ｎ＝３、＋／−Ｓ.Ｄ.）。図４２は、アッセイのために最小および最大溶解レベルに標準化した、様々な抗体濃度でのＡＤＣＣの用量依存性を示す。曲線は、非線形回帰を使用する、Ｓ字用量依存モデルへのデータのフィットを表す。
【００６４】
図４３．ＷＴ ＩＣＲ６２ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００６５】
図４４．ＷＴ ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００６６】
図４５．ＣＤＲ移植ＩＣＲ６２ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。ＣＤＲ移植ＩＣＲ６２ ＶＬは、ＷＴ ＩＣＲ６２のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｌｋ＿１−１７のフレームワークおよびＦＲ４中のＬ１０６Ｉ（Kabat の番号付け）置換から誘導した。
【００６７】
図４６．ＣＤＲ移植ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。ＣＤＲ移植ＩＣＲ６２ ＶＨは、ＷＴ ＩＣＲ６２のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｈ＿１−ｆのフレームワークおよびＦＲ４中の置換Ａ１０７ＴおよびＳ１０８Ｌ（Kabat の番号付け）から誘導した。
【００６８】
図４７．最適化ＨＳＣを有するＩＣＲ６２ ＶＬおよびＶＨ変異体。
【００６９】
図４８．Ｌ３ ＩＣＲ６２ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００７０】
図４９．Ｈ９ ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００７１】
図５０．Ｈ１０ ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造。
【００７２】
図５１．先行技術の方法によりヒト化されたＶＨ配列と、本発明の方法によるものとの比較。先行技術の抗体には、Ｃｔｍ０１、Ａ５Ｂ７、Zenapax、ＭａＥ１１、１１２９、ＭＨＭ２、Ｈ５２、Huzaf、Ｈｕ３Ｓ１９３、Ｄ３Ｈ４４、ＡＱＣ２、２Ｃ４、Ｄ３Ｈ４４、Ｈｆｅ７Ａ、５Ｃ８、ｍ４Ｄ５、Ａ.４.６.１、Campath、ＨｕＬｙｓ１１、Ａ.４.６.１、Mylotarg、ＭＥＤＩ−５０７、ｈｕＨ６５＿ｖｈ、ＥＰ−５Ｃ７、９Ｆ３、ＨＰＣ４、３８Ｃ２、Ｂｒ９６、１Ａ６および６.７が含まれる。ＡＣ１０ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３、Ｃ２２５ Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ８、並びにＩＣＲ６２ Ｈ９およびＨ１０を含む、本発明を使用して設計された配列を、右に並置する。図５１ａは、式３により定義される通りの宿主ストリング含有量（ＨＳＣ）を提供し、図５１ｂは、式３ａにより定義される通りの精密（exact）ストリング含有量（ＥＳＣ）を提供し、図５１ｃは、式１０により定義される通りのフレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）を提供する。全計算について、ウインドウサイズｗは９であった。
【００７３】
図５２．先行技術の方法によりヒト化されたＶＬ配列と、本発明の方法によるものとの比較。先行技術の抗体には、Ｃｔｍ０１、Ａ５Ｂ７、Zenapax、ＭａＥ１１、１１２９、ＭＨＭ２、Ｈ５２、Huzaf、Ｈｕ３Ｓ１９３、Ｄ３Ｈ４４、ＡＱＣ２、２Ｃ４、Ｄ３Ｈ４４、Ｈｆｅ７Ａ、５Ｃ８、ｍ４Ｄ５、Ａ.４.６.１、Campath、ＨｕＬｙｓ１１、Ａ.４.６.１、Mylotarg、ＭＥＤＩ−５０７、ｈｕＨ６５＿ｖｈ、ＥＰ−５Ｃ７、９Ｆ３、ＨＰＣ４、３８Ｃ２、Ｂｒ９６、１Ａ６および６.７が含まれる。ＡＣ１０ Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、Ｃ２２５ Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＩＣＲ６２ Ｌ２を含む、本発明を使用して設計された配列を、右に並置する。図５２ａは、式３により定義される通りの宿主ストリング含有量（ＨＳＣ）を提供し、図５２ｂは、式３ａにより定義される通りの精密ストリング含有量（ＥＳＣ）を提供し、図５２ｃは、式１０により定義される通りのフレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）を提供する。全計算について、ウインドウサイズｗは９であった。
【００７４】
発明の詳細な説明
定義
本発明をより詳細に理解し得るように、数個の定義を以下に記載する。かかる定義は、文法的均等物を包含することを意図する。
【００７５】
「アミノ酸」は、本明細書で使用するとき、特定の、定義された位置に存在し得る、２０個の天然産生アミノ酸の１つ、または、任意の非天然の類似物を意味する。
【００７６】
「アミノ酸の改変」は、本明細書において、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を意味する。ここで好ましいアミノ酸の改変は、置換である。
【００７７】
「アミノ酸の置換」または「置換」は、本明細書において、タンパク質配列中の所定の位置での、アミノ酸の他のアミノ酸との置き換えを意味する。
【００７８】
「抗体」は、本明細書では、認められている免疫グロブリン遺伝子の全部または一部により実質的にコードされる１個またはそれ以上のタンパク質からなるタンパク質を意味する。認められている免疫グロブリン遺伝子には、例えば、ヒトでは、カッパ（κ）、ラムダ（λ）および重鎖の遺伝子座が含まれ、それらは、無数の可変領域の遺伝子、並びに各々ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＡのアイソタイプをコードする定常領域の遺伝子ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）およびアルファ（α）を共に含む。本明細書における抗体は、全長抗体および抗体フラグメントを含むことを意図しており、任意の生物に由来する天然抗体、操作された抗体、または、実験、治療もしくは他の目的のために組換え的に生成された抗体に言及し得る。「ＩｇＧ」は、本明細書で使用されるとき、認められている免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するタンパク質を意味する。ヒトでは、このクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。
【００７９】
本明細書で意味する「対応する」または「均等な」残基は、第１と第２のタンパク質の間、または、第１のタンパク質と複数のタンパク質のセットとの間で、類似または相同な配列および／または構造的環境を表す残基である。相同性を確立するために、第１のタンパク質のアミノ酸配列を、第２のタンパク質の配列と直接比較する。当分野で知られている１つまたはそれ以上の相同性アラインメントプログラム（例えば種間で保存されている残基を使用する）を使用して、配列をアラインメントした後、アラインメントを維持するために必要な挿入および欠失を可能にし（即ち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を回避する）、第１のタンパク質の一次配列中の特定のアミノ酸に均等な残基を定義する。保存残基のアラインメントは、好ましくは、そのような残基の１００％を保存するべきである。しかしながら、７５％より高い、またはわずか５０％の保存残基のアラインメントも、均等な残基の定義に適切である。対応する残基は、その構造が決定されているタンパク質について、三次構造のレベルで第１と第２のタンパク質の間で構造的相同性を決定することによっても定義し得る。この場合、均等な残基は、タンパク質の特定のアミノ酸残基の２個またはそれ以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が、アラインメント後に相互に０.１３ｎｍ以内、好ましくは０.１ｎｍ以内であるものとして定義される。アラインメントは、最良のモデルが方向付けられ、位置付けられて、そのタンパク質の水素ではないタンパク質の原子の原子座標の最大の重複が得られた後に達成される。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインの相補性決定領域を意味する。ＣＤＲに含まれる残基の系統的同定は、Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) により、そして代替的に Chothia (Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273: 927-948) により開発された。本発明のために、ＣＤＲを、Chothia により定義されたＣＤＲより僅かに小さい残基のセットと定義する。本明細書では、ＶＬ ＣＤＲは、位置２７−３２（ＣＤＲ１）、５０−５６（ＣＤＲ２）および９１−９７（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義し、ここで、番号付けは Chothia に従う。Chothia および Kabat により定義されるＶＬ ＣＤＲは同一であるので、これらのＶＬ ＣＤＲ位置の番号付けはまた、Kabat に従う。ＶＨ ＣＤＲは、本明細書では、位置２７−３３（ＣＤＲ１）、５２−５６（ＣＤＲ２）および９５−１０２（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義し、ここで、番号付けは Chothia に従う。これらのＶＨ ＣＤＲ位置は、Kabat の位置２７−３５（ＣＤＲ１）、５２−５６（ＣＤＲ２）および９５−１０２（ＣＤＲ３）に対応する。
【００８１】
「フレームワーク」は、本明細書で使用するとき、ＣＤＲとして定義される領域を除いた、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、さらに、ＣＤＲにより分離される連続的領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に細分できる。
【００８２】
「生殖系列」は、本明細書で使用するとき、あるタンパク質の天然の遺伝子レパートリーおよびその関連対立遺伝子を構成する配列のセットを意味する。
【００８３】
「宿主」は、本明細書で使用するとき、科、属、種または亜種、個体のグループまたは単一の個体さえも意味する。個体の宿主グループは、ＭＨＣ対立遺伝子組成などの様々な基準に基づいて選択できる。好ましい実施態様では、宿主は、イヌ、マウス、霊長類またはヒトである。最も好ましい実施態様では、宿主はヒトである。
【００８４】
「宿主ストリング」または「宿主配列」は、本明細書で使用するとき、天然産生の宿主タンパク質の任意の部分をコードするストリングまたは配列を意味する。
【００８５】
「ヒト化」抗体は、本明細書で使用するとき、ヒトフレームワーク領域および１つまたはそれ以上の非ヒト（通常マウスまたはラット）抗体由来のＣＤＲを含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。「ヒト化」の方法により、ドナー抗体が「ヒト化される」と言う。
【００８６】
「同一性」は、本明細書で使用するとき、最大の同一性を達成する配列のアラインメントの後で第２の配列中の残基と同一である、第１の配列中の残基の数を意味する。
【００８７】
「免疫エピトープ」または「エピトープ」は、本明細書では、関心のあるタンパク質に位置する、アミノ酸の直鎖の配列を意味する。エピトープは、それらの免疫原性の可能性について分析し得る。エピトープは、任意の長さ、好ましくは９−ｍｅｒであり得る。
【００８８】
「免疫原性」は、本明細書では、中和および非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、炎症およびアナフィラキシーを含むがこれらに限定されるものではない免疫反応を誘起するタンパク質の能力を意味する。
【００８９】
「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、本明細書では、免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされる１つまたはそれ以上のタンパク質からなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンは、抗体を含むが、これに限定されるものではない。免疫グロブリンは、全長抗体、抗体フラグメントおよび個々の免疫グロブリンドメインを含むがこれらに限定されるものではない、数々の構造的形態を有し得る。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、本明細書では、タンパク質構造の当業者により確認される通りの独立した構造的成分として存在する、免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは、典型的には、特徴的なβ−サンドイッチ折り畳みトポロジー（folding topology）を有する。抗体のＩｇＧクラス中の既知のＩｇドメインは、ＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）、ＣＨ３（Ｃγ３）、ＶＬおよびＣＬである。
【００９０】
「天然配列」または「天然タンパク質」は、本明細書で使用するとき、いかなる実験的改変もなく存在すると決定されたタンパク質を意味する。実験的に決定された配列に基づいて、天然に存在すると予測できる配列もまた含まれる。かかる予測配列の一例は、生殖系列組換えの確立されたパターンに基づいて、存在すると予測できる抗体である。この場合、予測される抗体レパートリーのサイズが大きいことは、全ての成熟組換え抗体を実際に実験的に決定することを非現実的にする。
【００９１】
「親」または「親タンパク質」は、本明細書で使用するとき、後に改変されて変異体を生成するタンパク質を意味する。親タンパク質は、天然産生タンパク質または天然産生タンパク質の変異体もしくは操作された変形物であり得る。親タンパク質は、タンパク質自体、親タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列に言及し得る。従って、「親抗体」は、本明細書で使用するとき、後に改変されて変異体抗体を生成する抗体を意味する。従って、「親配列」は、本明細書で使用するとき、親タンパク質または親抗体をコードする配列を意味する。
【００９２】
「位置」は、本明細書で使用するとき、タンパク質配列中の場所を意味する。位置は、連続的に、または、確立された様式に、例えば Kabat、Chothia、および／または Kabat におけるもののようなＥＵインデックスに従って、番号付け得る。
【００９３】
「タンパク質」は、本明細書では、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、天然産生のアミノ酸およびペプチド結合、または、合成ペプチド模倣（peptidomimetic）構造からなり得る。
【００９４】
「低減された免疫原性」は、本明細書では、親タンパク質と比較したときの、免疫系を活性化する能力の低下を意味する。例えば、タンパク質変異体は、中和または非中和抗体を、親タンパク質よりも低い力価または少ない患者で誘起するならば、「低減された免疫原性」を有すると言える。タンパク質変異体はまた、親タンパク質と比べて、１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子に低下した結合を示すならば、または、Ｔ細胞活性化を低下した割合の患者で誘導するならば、「低減された免疫原性」を有すると言える。
【００９５】
「残基」は、本明細書で使用するとき、タンパク質中の位置およびそれに伴うアミノ酸の同一性を意味する。例えば、プロリン９（Ｐｒｏ９とも呼ばれ、Ｐ９とも呼ばれる）は、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＨ領域中の残基である。
【００９６】
「スコア付け関数」は、本明細書では、タンパク質中の１つまたはそれ以上のアミノ酸の改変の適格性を評価するための、任意の式または方法を意味する。スコア付け関数は、物理的または化学的エネルギーの項を含んでよく、または、知識−、統計−、配列−をベースとするエネルギーの項などを含んでよい。
【００９７】
「ストリング」は、本明細書で使用するとき、タンパク質の任意の部分をコードする連続的配列を意味する。ストリングは、２個またはそれ以上の直鎖残基を含んでよく、連続的残基の数は、「ウインドウ」または「ウインドウサイズ」により定義される。２−２０のウインドウサイズが好ましく、７−１３がより好ましく、９が最も好ましい。
【００９８】
「標的」は、本明細書で使用するとき、あるタンパク質により特異的に結合される分子を意味する。標的は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化学的化合物であり得る。抗体の標的は、その抗原であり、その標的抗原とも呼ばれる。
【００９９】
「可変領域」は、本明細書で使用するとき、軽鎖（カッパおよびラムダを含む）および重鎖免疫グロブリンの遺伝子座を各々形成するＶＬ（ＶκおよびＶλを含む）および／またはＶＨ遺伝子のいずれかにより実質的にコードされる１つまたはそれ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３個の超可変領域により遮られる「フレームワーク」または「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲は、例えば Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983) 参照) および Chothia におけるものなど、正確に定義されてきた。抗体のフレームワーク領域は、構成要素の軽鎖および重鎖を組み合わせたフレームワーク領域であり、主に抗原への結合を担うＣＤＲを位置づけ、整列させるのに役立つ。
【０１００】
「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、本明細書で使用するとき、少なくとも１つのアミノ酸の改変のために親タンパク質配列と異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変を、例えば、親と比較して約１ないし約１０個のアミノ酸の改変を、好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸の改変を有する。タンパク質変異体配列は、本明細書では、親タンパク質配列と、好ましくは少なくとも約８０％の相同性を、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。従って、「免疫グロブリン変異体」は、本明細書で使用するとき、少なくとも１つのアミノ酸の改変のために親免疫グロブリンと異なる免疫グロブリンを意味する。
【０１０１】
「野生型またはＷＴ」は、本明細書では、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子の変動を含む。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【０１０２】
本発明のタンパク質変異体は、それ自体幅広い範囲の供給源に由来する親タンパク質から誘導し得る。親タンパク質は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ（dromedary）、サル、好ましくは哺乳動物並びに最も好ましくはヒトおよびマウスおよびラットを含むがこれらに限定されるものではない任意の生物由来の１つまたはそれ以上の遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい実施態様では親タンパク質は非ヒトであるが、いくつかの本発明の実施態様では、親タンパク質は、ヒトまたはヒトに類似であり得る。親タンパク質は、１つより多いタンパク質鎖を含んでもよく、従って、モノマーまたはホモ−もしくはヘテロ−オリゴマーを含むオリゴマーであり得る。好ましい実施態様では、親タンパク質は抗体であり、親抗体と呼ばれる。親抗体は、天然産生である必要はない。例えば、親抗体は、非ヒトおよびキメラ抗体を含むがこれらに限定されるものではない、操作された抗体であり得る。親抗体は、例えば、遺伝子導入マウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458）または選択方法と組み合わせてヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108）を使用して得られる、完全にヒトのものであり得る。親抗体は、天然産生である必要はない。例えば、親抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体（Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402）を含むがこれらに限定されるものではない、操作された抗体であり得る。親抗体は、１つまたはそれ以上の天然抗体遺伝子により実質的にコードされる抗体の操作された変異体であり得る。ある実施態様では、当分野で知られている通り、親抗体は、親和性に関して成熟したものであるか、または他のやり方で操作されたものである。本発明の親抗体は、任意の抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされ得、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＧクラス、あるいは、抗体のＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する配列を含み得る。
【０１０３】
事実上、任意の結合パートナーまたは抗原を、本発明のタンパク質により標的化し得る。従って、治験で使用を承認されたか、または開発中の数々の生物治療用タンパク質および抗体が、本発明の免疫原性低減方法の恩恵を受け得る。好ましい実施態様では、本発明の免疫原性の低いタンパク質は、抗体である。その免疫原性の低い抗体は、抗体のＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する配列を含み得、ＩｇＧクラスが好ましい。本発明の免疫原性の低い抗体は、全長抗体または抗体フラグメントであり得る。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である可能性が高い。
【０１０４】
抗体の定常領域は、それを治療的により効果的にするために、いくつかの方法で改変し得る。例えば、定常領域は、治療特性を増強する置換を含み得る。最も好ましい置換および最適化エフェクター機能特性は、ＵＳＳＮ１０／６７２,２８０、ＰＣＴ ＵＳ０３／３０２４９およびＵＳＳＮ１０／８２２,２３１、並びにＵＳＳＮ６０／６２７,７７４（１１／１２／２００４出願、"Optimized Fc Variants" と題する）に記載されている。本発明で用途を見出し得る他の既知のＦｃ変異体には、ＵＳ６,７３７,０５６；ＰＣＴ ＵＳ２００４／０００６４３；ＵＳＳＮ１０／３７０,７４９；ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５１１２；ＵＳ２００４／０１３２１０１；ＵＳＳＮ１０／６７２,２８０；ＰＣＴ／ＵＳ０３／３０２４９；ＵＳ６,７３７,０５６,ＵＳ２００４／０００２５８７；ＷＯ２００４／０６３３５１；Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572; Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 に記載のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。代替的実施態様では、定常領域は、当分野で知られている通り、１つまたはそれ以上の操作された糖形態を含み得る (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); (US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); (Potelligent（商標） 技術 [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb（商標） 糖修飾操作技術 [GLYCART biotechnology AG, Zuerich, Switzerland])。
【０１０５】
本発明のタンパク質変異体は、幅広い範囲のタンパク質製品で用途を見出し得る。ある実施態様では、タンパク質は治療用、診断用または研究用試薬であり、好ましくは治療用である。あるいは、本発明のタンパク質は、農業または工業的用途に使用し得る。好ましい実施態様では、タンパク質は、疾患の処置に使用される治療剤である。「疾患」は、本明細書では、本発明のタンパク質を含む医薬組成物の投与により改善され得る障害を意味する。疾患には、自己免疫疾患、免疫疾患、感染性疾患、炎症性疾患、神経疾患並びに癌を含む腫瘍および新生物性疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、本発明のタンパク質は、患者に投与される唯一の治療的活性物質である。あるいは、本発明のタンパク質は、細胞毒性物質、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害物質、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤（cardioprotectant）または他の治療物質を含むがこれらに限定されるものではない、１種またはそれ以上の他の治療剤と組み合わせて投与される。本発明のタンパク質は、他の治療措置と組み合わせ得る。例えば、ある実施態様では、そのタンパク質で処置すべき患者は、放射線治療も受けてもよく、かつ／または手術を受けてもよい。代替的実施態様では、本発明のタンパク質は、他の治療的化合物に結合しているか、または機能し得るように連結している。治療的化合物は、細胞毒性物質、化学療法剤、毒物、放射性同位元素、サイトカインまたは他の治療的活性物質であり得る。また他の実施態様では、本発明のタンパク質は、腫瘍の事前標的化（pretargeting）またはプロドラッグ治療で利用するためのタンパク質または分子に結合させ得る。本発明のタンパク質の他の改変が、本発明では企図されている。例えば、そのタンパク質は、様々な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結させ得る。
【０１０６】
本発明のタンパク質および１種またはそれ以上の治療的に活性な物質を製剤化した医薬組成物が企図されている。本発明のタンパク質の製剤は、所望の精製度のタンパク質を、場合により医薬的に許容し得る担体、補助剤または安定化剤と混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.,1980)、凍結乾燥製剤または水性の液剤の形態で、保存用に製造する。インビボ投与に使用しようとする製剤は、好ましくは、無菌である。本明細書で開示するタンパク質は、免疫リポソームとして製剤化し得、またはマイクロカプセルに封入し得る。製剤中の本発明のタンパク質の濃度は、約０.１ないし１００重量％で変動し得る。好ましい実施態様では、タンパク質の濃度は、０.００３ないし１.０モル濃度の範囲である。患者を処置するために、治療的に有効な用量の本発明のタンパク質を投与し得る。厳密な用量は、処置目的に依存し、既知技法を使用して当業者により確認される。投与量は、０.０１ないし１００ｍｇ／体重ｋｇまたはそれ以上の範囲、例えば０.１、１、１０または５０ｍｇ／体重ｋｇであり得、１ないし１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。好ましくは滅菌水性液剤の形態での、本発明のタンパク質を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、肺内、吸入、膣、非経腸、直腸、または眼内を含むがこれらに限定されるものではない、様々なやり方で行い得る。当分野で知られている通り、医薬組成物は、導入様式に応じて製剤化し得る。
【０１０７】
方法論の説明
本発明は、タンパク質の免疫原性を低減するための新規方法を提供する。記載する方法の中心的原理は、ヒト配列のアラインメントを使用して、ヒト直鎖配列ストリングの含有量を最大化する置換を設計することである。抗体への適用のために、この免疫原性の低減へのアプローチは、ヒト化方法で用いられる単一のドナー−アクセプターモデルの使用を排除する。ヒトアクセプター配列を演繹的に選択する必要により負わされる制限の外に踏み出すことにより、より免疫学的に適切な免疫原性の低減へのアプローチが可能になる。配列情報および構造情報を使用して、起こり得るアミノ酸置換をスコア付けし得る。スコア付けの結果を使用して、タンパク質変異体ライブラリーを設計し、その後それを実験的にスクリーニングして好ましい置換を決定する。実験データからのフィードバックは、後の設計と実験的スクリーニングの反復の指針となり得、最終的に、生物物理学的制約と免疫学的制約との間の最適なバランスでタンパク質変異体を操作することを可能にする。
【０１０８】
配列
本明細書で記載する方法の中心は、宿主配列のセットが、直鎖配列ストリングが免疫原性である可能性を有する程度に関する情報を提供することである。従って、用いる配列のセットは、重要なパラメーターである。最も一般的な実施態様では、それらの配列は、配列および／または構造において親配列に相同であるヒト配列のセットである。当分野で知られている通り、いくつかのタンパク質は、共通の構造骨格を共有し、配列において相同である。この情報を使用して、タンパク質ファミリーの特定の位置への洞察を獲得し得る。配列アラインメントをしばしば実行し、どのタンパク質残基が保存され、どれが保存されていないかを決定する。即ち、タンパク質配列のアラインメントを比較および対照することにより、ある位置での可変性の程度を観察し得、各位置で天然に産生するアミノ酸のタイプを観察し得る。従って、本発明のために、典型的には、親配列とヒト配列のセットとの間、そしてヒト配列のセットの間に存在する保存または類似残基を同定できるように、配列をアラインメントする。配列アラインメントの方法は、当分野で周知であり、配列および構造的相同性をベースとするアラインメントが含まれる。
【０１０９】
タンパク質配列情報は、哺乳動物を含むがこれらに限定されるものではない、任意の生物に由来する天然産生タンパク質の配列アラインメントから、入手、編集および／または作成できる。本発明の好ましい実施態様は、バイオ治療薬の免疫原性の低減を対象とするので、セットを構成する配列は、最も好ましくはヒトである。配列の供給源は、幅広く変動し得、公的または私的に編集されたデータベースであり得、SwissProt、GenBank および Entrez、並びに EMBL Nucletide Sequence Database を含むがこれらに限定されるものではない１つまたはそれ以上の既知の一般的タンパク質および核酸配列のデータベースを含み得る。本発明の好ましい実施態様は、免疫グロブリンの免疫原性の低減へのその適用であるので、Kabat データベース (Johnson & Wu, 2001, Nucleic Acids Res 29:205-206; Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res 28:214-218)、IMGT データベース (IMGT, the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Re. 28:219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res 29:207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res 31:307-310) および VBASE を含むがこれらに限定されるものではない数々の免疫グロブリンデータベースは、配列を得るために有用であり得る。
【０１１０】
当分野で周知の通り、免疫グロブリンは高度の配列および構造的相同性を保有し、従って、配列のアラインメントは豊かな情報を提供する。これらのアラインメント中に欠失および挿入が存在するために、免疫グロブリンファミリーまたはサブファミリー中で保存された位置への標準化された参照を可能にするように、番号付けの慣習を採用した。当業者は、これらの慣習は、免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的番号付けからなり、従って任意の所定の番号付けスキームにより定義される任意の所定の免疫グロブリンの位置は、必ずしもその連続的配列または代替的番号付けスキームのものに対応しないことを理解するであろう。本発明で論じる全可変領域について、番号付けは、Kabat の番号付けスキーム (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) に従う。本発明で論ずる全定常領域の位置について、番号は、Kabat におけるもののように、ＥＵインデックスに従う。Chothia (Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273: 927-948）を含むがこれに限定されるものではない、代替的番号付けスキームは、本発明で用途を見出し得る。
【０１１１】
最も好ましい実施態様では、使用するヒト配列のセットは、アラインメントされたヒト生殖系列免疫グロブリン配列のセットである。例えば、図１ａ−１ｃは、ヒト抗体可変領域生殖系列（ＶＨ、ＶＬおよびＪ鎖）を構成する配列のセットを、対応する各位置での多様性と共に提供する。免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖カッパ可変領域のヒト生殖系列レパートリーは、報告されている (Matsuda et al., 1998, J Exp Med 188: 2151-2162; Zachau, 2000, Biol Chem 381:951-954; Pallares et al., 1999, Exp Clin Immunogenet 16(1): 36-60; Barbie & Lefranc, 1998, Exp Clin Immunogenet 15(3): 171-83 The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments. Barbie V, Lefranc MP)。ヒトらしさの測定基準としてこのタイプの配列情報を使用する理論的根拠は、ヒト生殖系列を構成するストリングは、最小の免疫原性であるに違いないということである。配列は、ヒトのゲノムまたは生殖系列配列である必要はない。他の好ましい実施態様では、ヒト抗体可変領域配列は、生殖系列情報からではなく、むしろ、例えばハイブリドーマ技術またはｃＤＮＡライブラリーから得られる成熟抗体から誘導される。
【０１１２】
ヒト免疫グロブリン生殖系列の遺伝子の多くについて、数種の異なる対立遺伝子が同定されている。対立遺伝子の多くで検出される多型は、その遺伝子のアミノ酸配列を変更しないが、数々の場合にその配列が変更される。本明細書に記載する方法において使用する配列のセットを選択するに当たり、異なる配列のセットを選択し得る。特定の遺伝子の代表として単一の対立遺伝子を選択する場合、最も注意深いアプローチは、生殖系列全体のコンセンサスに最も近い配列を選択することである。それにより、この配列のサブセットが、集団全体の内で代表される可能性が最も高いであろう。あるいは、コンセンサスから最も遠い代表的配列を選択することにより、もっと大きい配列多様性をサンプリングできる。より大きい多様性を得る他のアプローチは、各生殖系列に存在する複数の対立遺伝子を使用することである。現時点では、その集団内の対立遺伝子頻度に関する定量的データは、殆どまたは全くない。対立遺伝子頻度が入手可能になったら、標的患者集団内の特定の非コンセンサス対立遺伝子への寛容の見込みに関して、より情報に基づく決断をなすことができる。
【０１１３】
特定の位置での使用について、２個またはそれ以上の可能な置換を評価するとき、両方ともヒト生殖系列に見出される場合、決断は主観的であり得る。そのような場合、特定の遺伝子の発現レベルの差異を反映し得るさらなる情報を組み込むことができる（Cox et al. Eur J Immunol. 1994 Apr;24(4):827-36）。かかる戦略の根底にある仮定は、特定の生殖系列（または対応する配列ストリング）の相対的発現レベルは、相対的免疫原性に相関するということである。
【０１１４】
本明細書で開示する方法に使用される配列は、その免疫原性を低減しているタンパク質とのアラインメントを可能にする十分な相同性を有する相同タンパク質のものである。発現されるヒトゲノム内に特定のタンパク質配列が少しでも見出されるならば、そのペプチドには生来の寛容があると主張し得る。そのような提案は、タンパク質の免疫原性の低減に使用できる可能な配列の数を非常に増やす。しかしながら、そのような場合、構造的に相同ではないタンパク質のアラインメントは、禁制的である可能性が高い。加えて、寛容を発生させるストリングを産生するためのタンパク質のプロセシングは、構造的に決定され得る。従って、特定のストリングは、その天然の文脈では非免疫原性であるが、変更された構造の文脈では免疫原性であり得る。
【０１１５】
スコア付け関数−ストリング含有量
タンパク質変異体の適格性を評価するために、親タンパク質中のアミノ酸の改変は、様々なスコア付け関数を使用してスコア付けされ得る。本明細書に記載の免疫原性低減方法の好ましい実施態様の中心にあるのは、宿主配列のセットに存在する宿主直鎖配列ストリングの含有量を最大化するのに、少なくとも１つのスコア付け関数を利用することである。典型的には、常にではないが、コンピューターを使用して可能なアミノ酸置換をスコア付けする。
【０１１６】
ある実施態様では、置換を、宿主配列のセットにおけるそれらの占有度、即ち、所定のアミノ酸が、所定の位置での多様性の一部であるか否か、に従ってスコア付けし得る。可変位置での考慮されるアミノ酸のリストを生成させるための、位置特異的アラインメント情報の使用は、当分野で周知である；例えば Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4): 371-5; Lehmann et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1543(2):408-415; Rath & Davidson, 2000, Protein Sci, 9(12):2457-69; Lehmann et al., 2000, Protein Eng 13(1):49-57; Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90(6):2256-60; Desjarlais & Berg, 1992, Proteins 12(2):101-4; Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243(4):574-8 参照。従って、例えば、図１ｂのヒト配列にアラインメントさせた親の非ヒトＶＬκ配列について、位置１で考慮される置換は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＶａｌであろう。より好ましい実施態様では、置換は、列挙したヒト配列のセットにおけるそれらの頻度に基づいてスコア付けされる。例えば、先の例では、ＡｓｐおよびＧｌｕは、位置１で最も頻繁に生じ、従って、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＶａｌより好ましい置換であり得る。このスコア付け関数の根拠は、アラインメント中の所定の位置での所定のアミノ酸の頻度は、それが宿主ストリング中にある可能性に比例するというものである。
【０１１７】
占有度および頻度は、低減された免疫原性の可能性を有する置換の設計に、比較的率直な概算を提供する。それらの使用は、しかしながら、親配列の文脈を考慮に入れない。頻度は、置換がストリングの宿主含有量を高める可能性に比例するが、それは直接的な測定ではない。アラインメントされた宿主配列のセットに存在する情報を免疫原性の測定により正確に取り入れるために、それを含むストリングの文脈において、所定の位置の直鎖性または連結性を考慮するアプローチを用いることができる。この最も好ましい実施態様では、非宿主ストリングを除去し、それをより免疫原性の低いストリング、即ち、宿主配列のセットに存在するもの、に置き換える可能性に基づき、親配列中の置換をスコア付ける。このスコア付け方法は、均等な位置のウインドウの内での、親ストリングの宿主ストリングに対する同一性またはパーセント同一性の計算を用い得る。ある実施態様では、配列ｓ中のストリングの配列ｈ中の宿主ストリングに対する同一性（ＩＤストリング）は、式１に従い、所定のウインドウサイズにおけるアミノ酸配列同一性の合計として提示できる：
式１
【数１】
2007512846.tif 000003
式中、ｗは、ストリングウインドウサイズであり、ｉは、ストリング中の最初の位置であり、ａａｓｊは、配列ｓの位置ｊのアミノ酸であり、ａａｈｊは、宿主配列ｈの位置ｊのアミノ酸であり、クロネッカー（Kronecker）のデルタ関数を使用して、一致（例えば、位置ｊの親および宿主のアミノ酸が両方ともセリンである場合）に１の値を、そして一致がない（例えば、位置ｊの親アミノ酸がセリンであるが、宿主アミノ酸はロイシンである場合）ならば０を返す。図２ａは、マウス抗Ｈｅｒ２抗体ｍ４Ｄ５（ＶＨ＿ｍ４Ｄ５）のＶＨ領域を親配列として、そしてＶＨヒト生殖系列（ＶＨ＿１−２）由来の相同領域をヒト配列ｈとして使用して、式１を例示説明する。
【０１１８】
さらなる実施態様では、式２で計算される通り、位置ｉでの宿主ストリング含有量の最も免疫学的に適切な測定は、配列ｓのストリングとアラインメント中の任意の宿主配列との間の最大の同一性であると仮定する：
式２
【数２】
2007512846.tif 000004
式中、ＨＳは、宿主配列のセットである。換言すると、位置ｉでのＩＤストリングが宿主配列のいずれかのｗに等しく、同様にＩＤｍａｘ＝ｗである場合、ｉ番目のストリングは、最小の免疫原性であると仮定する。式２により表されるＩＤｍａｘ量の概念を、図２ｂに例示説明する。
【０１１９】
最後に、式３の通り、全ての直接関係する配列位置に亘るＩＤｍａｘ値を合計することにより、これらの式をまとめて、配列の総宿主ストリング含有量（ＨＳＣ）について、単一の数値的測定基準を計算できる：
式３
【数３】
2007512846.tif 000005
式中、Ｌは配列の長さであり、ＨＳは、アラインメント中の宿主配列のセットである。完全な宿主配列は、ＨＳＣ１００を有する。代わりに、そのような配列は、１００％宿主であると言い得る。式３により表されるＨＳＣ量の概念を、図２ｃに例示説明する。代替的実施態様では、式３は、最終的スコアがアラインメント中の各宿主配列の相対的利用度に依存するように、さらに改変できる。宿主によってより頻繁に発現される配列に由来するストリングは、より寛容されると期待され、従って、スコア付けシステム中でより高い影響を対応して与えられ得る。
【０１２０】
代替的実施態様では、式３ａの通り、精密ストリング含有量（ＥＳＣ）を測定できる：
式３ａ
【数４】
2007512846.tif 000006
式中、ａａｓｉ..ｉ＋ｗ−１の表記は、タンパク質中の位置ｉないし位置ｉ＋ｗ−１の連続的配列ストリングを表す。この実施態様では、サイズｗの完全な一致のみをスコアに数える。
【０１２１】
式３および３ａのスコア付けシステムは、規定されたサイズのウインドウに亘って評価した局所的配列同一性および／または類似性に基づくので、高いＨＳＣを有する配列を、異なる位置で宿主配列のセットの異なるメンバーに最大に似ている配列セグメントで構築できることは、注目に値する。
【０１２２】
上記の宿主性（hostness）の測定は、より一般的に使用される式４の大域的同一性の測定よりも、免疫学的に意味がある可能性が高い：
式４
【数５】
2007512846.tif 000007
式４は、免疫系の分子の振る舞いを捉えるために特に意味がある、連続的配列の同一性の程度を無視する。
【０１２３】
式３に似たさらなるスコア付け関数も可能である。例えば、当業者に理解されるように、ＩＤｍａｘ＝ｗ−１、ｗ−２などのストリングの宿主性に関して、いくらかの不確実性がある。ある代替的実施態様では、様々なアミノ酸置換行列（例えば、ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭ６２など）のいずれかを使用して同一性の代わりに配列類似性を比較し、式５の通り、宿主ストリング類似性（ＨＳＳ）スコアを提供する：
式５
【数６】
2007512846.tif 000008
式中、Ｓは、任意の２個のアミノ酸を比較する置換スコアである。またさらなる代替法では、式６の通り、同一性の程度に従い、配列同一性に重みを付ける：
式６
【数７】
2007512846.tif 000009
式中、ｆは、ＩＤｍａｘに応じて、連続または非連続関数である。例えば、完全な一致に、完全に近い一致より大きく重みを付けることができ（例えば、ｆ（ｗ）＝１、ｆ（ｗ−１）＝.５など）、そして乏しい一致を放棄できる（例えば、ｆ（ｗ−３）＝ｆ（ｗ−２）＝０）。
【０１２４】
ストリングウインドウサイズ
クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣタンパク質の基本的結合ユニットは、両方とも９個のアミノ酸である。好ましい実施態様では、親配列を創成し、スコア付けるのに使用するウインドウサイズｗは、９である。しかしながら、さらなるペプチド隣接残基（ＰＦＲ）が、クラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体のＴ細胞認識（ＴＣＲを介する）に影響を与えることができ（例えば、Arnold et al., 2002, J Immunology 169(2): 739-49 参照）、位置Ｐ−１の残基（最初のＭＨＣ結合位置の１つ前の位置）およびＰ１１が最も影響力があることも知られている。これらの効果は、本発明の望ましい目標である免疫寛容に影響を与え得るので、より大きいウインドウサイズ（例えば、１２）を使用できる。しかしながら、類似のウインドウサイズで最適化された配列は、高度に相関することに留意すべきである。
【０１２５】
ＨＳＣの最適化
ストリングスコア付けシステムの定義は有用であるが、高いＨＳＣを有する配列を発見する効率的な方法も望ましい。従って、本発明のさらなる態様は、記載したスコア付けシステムをもって、動的なＨＳＣ最適化方法を提供することである。
【０１２６】
最適化方法の望ましい特徴には、以下が含まれるがこれらに限定されるものではない：１）アウトプット配列は、それらの宿主ストリング含有量において、最適または最適に近い（設計の制約に従う）；２）最適化配列の性質を調節するために、構造的制約を使用できる；そして、３）複数の最適に近い解を生成できる。加えて、いくつかの好ましい実施態様では、最小数の置換を使用して、宿主ストリング含有量を最大化し得る。
【０１２７】
好ましい実施態様では、ＨＳＣ最適化のための反復アルゴリズムは、以下の通りに働く。１）親配列および宿主配列のセットを定義する；２）本明細書でマスキングと呼ばれる、機能的または構造的に重要な位置での突然変異の制約を定義する。好ましい実施態様では、抗体に適用するために、ＣＤＲ残基（本明細書で定義する通り、あるいは、Kabat または Chothia で定義される通り）および／または中間面（interface）の内または構造的近傍の位置を、突然変異できないように、マスク、ロックまたは固定する（いくつかの実施態様では、可能な突然変異が親アミノ酸の保存的置換である場合、この制約を緩和できる）。好ましい実施態様では、ＣＤＲ残基または中間面の５オングストローム以内の位置をマスクする。他の好ましい実施態様では、ＣＤＲ残基または中間面の６.５オングストローム以内の位置をマスクする；３）宿主配列セグメント（定義する長さまで：１−６の長さが典型的である）を、アラインメントから集め、各位置のために蓄積する：突然変異の制約を破るセグメントは集めない；４）式７でストリングインパクト（String Impact）（ＳＩ）として定義される、ＨＳＣに対するその可能な影響について、現在の親配列の文脈で、各セグメントを分析する：
式７
【数８】
2007512846.tif 000010
式中、ｙｍ（ｚ）は、位置ｍでセグメントｘを置き換える長さｚの宿主セグメントであり、ｓ（ｙｍ）および親は、これらのセグメントを含む親配列のバージョンである（親配列はｘｍ（ｚ）を含有する）。５）単一のストリングを、全ての蓄積した宿主ストリングから無作為に選択する；式８の通り、選択の確率には偏りがあり、ＨＳＣに対する影響に比例し、現在の親配列に対する突然変異の数に反比例する：
式８
【数９】
2007512846.tif 000011
この選択されたストリングを、現在の親配列の中に、アミノ酸ストリング上のその対応する親アミノ酸の代わりに、アミノ酸ストリング毎の方式で置換する。この種の選択の偏りは、元の配列の撹乱を最小にして、宿主ストリング含有量を最適化する傾向がある。６）さらなる最適化が不可能になる（宿主ストリング含有量に好都合な影響を有するセグメント置換がなくなる）まで、段階４および５を繰り返す。
【０１２８】
そのようなアルゴリズムは、本質的に非決定的であるので、アルゴリズムの独立した実行は、異なる解をもたらす傾向がある（これは、好ましい特徴である）。好ましい実施態様では、かかるアルゴリズムを、多数回適用して様々な独特の解のアレイを生成する。代表的配列をさらなる分析に優先できるように、これらの解をさらにクラスター化できる。例えば、ある実施態様では、最短距離単連結階層的クラスター化（nearest neighbor single linkage hierarchical clustering）アルゴリズムを使用して、類似性スコアに基づく関連グループに配列を割り当て、解の配列群を突然変異の距離に従い類似配列の群にクラスター化する。クラスター化アルゴリズムは、配列を代表的グループにクラス分けするのに有用であり得る。代表的グループは、例えば類似性により定義し得る。類似性の測定には、配列類似性およびエネルギー的類似性が含まれるが、これらに限定されるものではない。従って、コンピューター処理スクリーニングのアウトプット配列を局所的最小の周辺にクラスラー化し得、これは、本明細書でクラスター化された配列のセットと呼ばれる。配列空間中で近い配列のセットは、他のセットから区別し得る。ある実施態様では、各クラスター化されたセット内の配列のサブセットのみを実験的に試験することにより、クラスター化された配列のセットの全域の多様性をサンプリングし得る。例えば、各クラスター化された配列のセットからの最低エネルギー配列を実験的に試験するものに含めることにより、全部または殆どのクラスター化されたセットを幅広くサンプリングできる。最適化ＨＳＣを有する解の配列空間は大きくあり得るので、さらなる方法を適用して幅広い配列のセットを確実に創成できる。好ましい実施態様では、その手順で生成される個々のフレームワーク配列を、別々にクラスター化し、高いＨＳＣを有する非重複的基礎フレームワーク領域（ＦＲ）のリストを生成する。次いで、これらの基礎ＦＲを、コンピューター処理的にＣＤＲと共に全組合せで組み立て、解の配列の二次リストを生成する（それは、通常、一次セットといくらかの重複を有する）。あるいは、基礎ＦＲを実験的ライブラリー、例えば組み合わせの（combinatorial）ライブラリーに組み合せ得る。
【０１２９】
フレームワークの多様性
このアルゴリズムの適用は、ＨＳＣが元の親配列より高い変異体タンパク質の解を生成させる。それは、置換されたストリングがアラインメントの異なるメンバーに由来する解も、頻繁に生成させる。本発明を使用して誘導される変異体配列は、一般的に、他の方法論を使用して生成される配列と比べて、独特の特性を有する。例えば、抗体の文脈では、本発明のタンパク質変異体は、頻繁に、異なる宿主生殖系列配列の組合せからそれらの宿主ストリング含有量を得る。これは、単一のＦＲ内でさえ真であり得る。これらの特性の定量は、本発明を使用して誘導される配列の性質の定義に有用である。明確な区別は、任意の単一の生殖系列配列の精密ストリング含有量（ウインドウｗに亘る完全な一致を意味する）と、全生殖系列配列（ＩＤｍａｘ＝ｗであるストリングの含有量）のセット内の正確なｗ−ｍｅｒストリング含有量との比較から生じる。変異体配列ｖの単一生殖系列の精密ストリング含有量（ＳＧＥＳＣ）は、従って、
式９
【数１０】
2007512846.tif 000012
として定義し得る。
【０１３０】
この量は、ストリング最適化配列が最も近い単一生殖系列配列とストリング同一性を有する程度を提供する。この定義を使用して、複数の生殖系列配列と対照的に、所定の変異体配列ｖの高い宿主ストリング含有量が単一生殖系列から誘導される程度を評価することも可能である。フレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）は、以下の通りに定義される：
式１０
【数１１】
2007512846.tif 000013
。
【０１３１】
換言すると、変異体配列の精密ストリング含有量が、単一の生殖系列配列のみに由来するならば、ＦＲＨは１.０に近い。類似または同一の量が、非抗体タンパク質に定義できることに留意すべきである。あるいは、本発明で創成される変異体配列の多くでよくあることであるが、ＦＲＨ値は、有意に１より小さく、値は０.４ないし１.０の範囲にあり、このことは、期待される通り、複数の生殖系列サブファミリーおよび配列の貢献により高い精密ストリング含有量を有する配列を見いだせることを示す。下記の実施例５でより詳細に記載する通り、本発明を使用して生成される変異体配列は、高いＨＳＣ値を有するが、多くは低いＦＲＨ値を有する。このことは、それらのＨＳＣが複数の生殖系列フレームワークに由来することを示す。
【０１３２】
さらなるスコア付け
上記のスコア付け方法は、アラインメントされた宿主配列のセットに存在する情報を、親配列における宿主直鎖配列ストリングの含有量を最大化するための免疫原性の測定基準として使用する。そのようなスコア付け関数に加えて、他のスコア付け関数および方法を用い得る。かかる追加的スコア付け関数は、上述の直鎖ストリングスコア付け関数と同じ目標に、即ち、親タンパク質の免疫原性の低減に、利用し得る。あるいは、そのような追加的スコア付け関数は、例えば、タンパク質安定性、溶解性、発現、薬物動態および／またはタンパク質機能の局面、例えば標的リガンドへの親タンパク質の親和性、特異性、エフェクター機能、および／または酵素活性など、の最適化などの、他の目標を達成するために使用し得る。例えば、さらなるスコア付け関数を用いて、抗体可変ドメインのその標的抗原に対する親和性を増強し得る。そのような追加的スコア付け関数は、最適化タンパク質変異体の生成に静的または動的に用い得る。数々の実施態様を、本発明の上述の直鎖ストリングスコア付け方法と共に使用し得る好ましい追加的スコア付け関数として後述する。しかしながら、これらは、本発明をこれらの実施態様に束縛することを意味ぜず、最適タンパク質変異体を設計し得るように、親タンパク質のアミノ酸改変の適格性をスコア付けする任意の方法を、本発明の新規直鎖ストリングスコア付け方法と組み合わせ得ることが明確であるべきである。
【０１３３】
好ましい実施態様では、置換を、親タンパク質の構造とそれらの構造的適合性に基づきスコア付けする。そのようなスコア付け方法は、例えば、Ｘ線結晶解析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）技法により得られるような、タンパク質の三次元構造を記載する構造座標を必要とし得る。適するタンパク質の構造はまた、新生（de novo）および相同性モデリングを含むがこれらに限定されるものではない、構造生物学の分野で知られている方法により生成し得る構造モデルから入手し得る。構造をベースとするスコア付け関数には、物理または化学エネルギーの項を記載または概算する何個のポテンシャルを含めてもよく、これには、ファンデルワールスポテンシャル、水素結合ポテンシャル、原子溶媒和ポテンシャルまたは他の溶媒和モデル、二次構造性向ポテンシャル、静電気的ポテンシャル、ねじれポテンシャル、エントロピーポテンシャルおよび／またはさらなるエネルギー項が含まれるがこれらに限定されるものではない。他の好ましい実施態様では、スコア付け方法はまた、タンパク質配列および／または構造の統計に由来する知識をベースとするポテンシャル、スレッディング（threading）ポテンシャル、参照エネルギー、偽エネルギー、相同性をベースとするエネルギーおよび配列アラインメントに由来する配列の偏りを含むがこれらに限定されるものではない、配列情報に由来し得る。代替的に好ましい実施態様では、構造および配列をベースとするポテンシャルの両方を使用して、本発明の直鎖ストリングスコア付け方法と組み合わせ得る１つまたはそれ以上のスコア付け関数を生成する。
【０１３４】
最も好ましい実施態様では、Protein Engineering with Analogous Contact Environments と題する２００３年１２月８日に出願されたＵＳＳＮ６０／５２８,２２９；および Protein Engineering with Analogous Contact Environments と題する２００４年８月１７日に出願されたＵＳＳＮ６０／６０２,５６６に記載の、配列および構造をベースとするスコア付け関数を使用して置換の構造および機能の整合性を評価するスコア付け方法を使用する。この方法は、配列アラインメント情報と構造情報を組み合わせ、１つまたはそれ以上の置換と、タンパク質構造の鋳型との構造的適合性を予測する。この方法により生成される最短距離構造をベースとするスコアには、実施例に提供する通りの、構造コンセンサスおよび構造優先が含まれる。この方法は、それらの実質的配列および構造相同性に起因する免疫グロブリンの構造的適格性を評価する適用に、特に良好に適する。
【０１３５】
好ましい実施態様では、ＵＳ６,１８８,９６５；ＵＳ６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳ６,７０８,１２０；ＵＳ６,８０４,６１１；ＵＳ６,７９２,３５６；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／８１２,０３４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＵＳＳＮ１０／１０１,４９９；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＵＳＳＮ１０／６６６,３１１；ＵＳＳＮ１０／６６５,３０７；ＵＳＳＮ１０／８８８,７４８；ＰＣＴ ＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴ ＷＯ９９／２４２２９；ＰＣＴ ＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴ ＷＯ０２／２５５８８に記載の通りのタンパク質設計自動化（Protein Design Automation）（登録商標）（ＰＤＡ（登録商標））技法に実質的に類似するスコア付け関数またはコンピューター処理設計プログラムを使用して、置換をスコア付けする。他の好ましい実施態様では、(Raha et al., 2000, Protein Sci. 9: 1106-1119）、ＵＳＳＮ０９／８７７,６９５およびＵＳＳＮ１０／０７１,８５９に記載の通り、Sequence Prediction Algorithm（商標）（ＳＰＡ（商標））技術に実質的に類似するコンピューター処理設計方法を使用する。他の好ましい実施態様では、ＵＳＳＮ１０／３３９,７８８に記載のコンピューター処理方法を使用する。
【０１３６】
他の好ましい実施態様では、最適化配列を、宿主抗体との表面類似性についても評価する。類似性の確認は、Ｂ細胞受容体により認識される可能性のある新規３Ｄエピトープを導入する確率を低減するために重要であり得る。好ましい実施態様では、位置ｉでの表面類似性は、以下の通りに定量する：
式１１
【数１２】
2007512846.tif 000014
ここで、ｆｉｅｘｐは、位置ｉの溶媒への部分的接触性（fraction accessibility）であり、近接性（ｉ,ｊ）は、タンパク質三次元構造における位置ｉおよびｊの空間的近接性であり、Ｓはアミノ酸類似性の測定値であり、Ｔは、類似性比較のストリンジェンシーを調節するために使用する温度要素である。この式から、位置ｉの領域において配列が同一である場合、表面スコア１.０に近づくことが理解されよう。あるいは、スコア１.０はまた、位置が完全に埋没している（即ち、ｆｉｅｘｐ＝０）場合、その位置はＢ細胞受容体に接近可能ではないので、達成できる。より低いスコアは、変異体配列と、最も類似する宿主配列との間に有意な差異がある表面位置を表す。好ましい実施態様では、２つの位置の間の近接性は、それらの距離と逆に関係し（例えば、距離のガウスまたは指数関数）、位置のそれ自体への近接性は、１.０である。好ましい実施態様では、近接性の関数の減少を、位置のパッチが典型的な抗体エピトープのサイズに対応するように調節する。
【０１３７】
他の表面特性も望ましいことがある。例えば、最適化変異体配列を、一般的に溶解性を低下させると期待される、非極性アミノ酸の露出について評価し得る。そのような場合、非極性の露出がより低い変異体配列を、別のものより優先できる。変異体配列について、表面静電特性も評価し得る。好ましい実施態様では、実験的にスクリーニングされる変異体のセットを限定するために、ＨＳＣが最適化された複数の変異体について表面特性を評価する。
【０１３８】
他の実施態様では、置換行列または他の知識をベースとするスコア付け方法を使用して、タンパク質の構造および機能を保持する可能性が高い代替配列を同定する。そのようなスコア付け方法を使用して、所定の置換または置換のセットがどの程度保存的であるかを定量できる。殆どの場合、保存的突然変異は、タンパク質の構造および機能を有意に撹乱しない（例えば、Bowie et. al., 1990, Science 247: 1306-1310, Bowie & Sauer, 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, and Reidhaar-Olson & Sauer, 1990, Proteins 7: 306-316 参照）。しかしながら、非保存的突然変異は、タンパク質構造を不安定化させ、活性を低減させることができる（例えば、Lim et al., 1992, Biochem. 31: 4324-4333 参照）。ＢＬＯＳＵＭ６２を含むがこれに限定されるものではない置換行列は、配列と標的の構造の間の適合性の定量的測定を提供し、それを使用して非撹乱的置換の突然変異を予測できる（Topham et al., 1997, Prot. Eng. 10: 7-21)。特性が改善されたペプチドを設計するための置換行列の使用は、開示されている (Adenot et al., 1999, J. Mol. Graph. Model. 17: 292-309）。置換行列には、ＢＬＯＳＵＭ行列（Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 10917）、ＰＡＭ行列、デイホフ（Dayhoff）行列などが含まれるが、これらに限定されるものではない。置換行列の概説には、例えば Henikoff, 1996, Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 353-360 参照。所定の関心のあるタンパク質およびそのホモログのアラインメントに基づいて、置換行列を構築することも可能である；例えば、Henikoff & Henikoff, 1996, Comput. Appl. Biosci. 12: 135-143 参照。
【０１３９】
好ましい実施態様では、免疫原性をスコア付けする他の方法を追加的に使用し得る。最も好ましくは、１つまたはそれ以上のＭＨＣ分子へのペプチドの結合を考慮する関数を使用して、免疫原性をスコア付けし得る。例えば、よくあるＭＨＣ対立遺伝子に高親和性で結合すると予測される免疫エピトープがないか、または最小数であるように、置換をスコア付けする。これらのスコア付け方法は、例えば、ヒト生殖系列ストリングを使用するスコア付けがあまり正攻法ではない、ＶＨ ＣＤＲ３における置換の設計に有用であり得る。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープのいくつかの同定方法が当分野で知られており、抗体中のエピトープをスコア付けするのに使用し得る。例えば、ＷＯ９８／５２９７６；ＷＯ０２／０７９２３２；ＷＯ００／３３１７；ＵＳＳＮ０９／９０３,３７８；ＵＳＳＮ１０／０３９,１７０；ＵＳＳＮ６０／２２２,６９７；ＵＳＳＮ１０／３３９７８８；ＰＣＴ ＷＯ０１／２１８２３；およびＰＣＴ ＷＯ０２／００１６５；Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942-948; Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561; WO 98/59244; WO 02/069232; WO 02/77187; Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933; および Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353-2358 参照。所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用の結合スコアを決定するために、配列をベースとする情報を使用できる（例えば、Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942-948; Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561 参照)。所定のペプチドがコンピューター処理的に所定のＭＨＣ分子のペプチド結合溝に置かれ、相互作用エネルギーが決定される、構造をベースとする方法を使用することが可能である（例えば、ＷＯ９８／５９２４４およびＷＯ０２／０６９２３２参照）。かかる方法は、「スレッディング」方法と呼ばれることもある。あるいは、純粋に実験的な方法を使用できる；例えば、関心のあるタンパク質に由来する重複するペプチドのセットを、Ｔ細胞活性化および／または他の免疫反応の局面を誘導する能力について、実験的に試験できる（例えばＷＯ０２／７７１８７参照）。好ましい実施態様では、行列の方法 (Sturniolo et. al., 前出; Marshall et. al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933, および Hammer et. al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353-2358 参照) を使用して、タンパク質配列に沿って各々９個の残基のフレームについてＭＨＣ結合性向スコアを計算する。これらの残基のサブセットについてのみスコアを考慮することも可能であり、または、関心のある９残基のフレームの前後のペプチド残基の同一性も考慮することが可能である。行列は、異なるヒトのクラスＩＩ ＭＨＣ分子中のペプチド結合ポケットと相互作用する特定のアミノ酸の結合スコアを含む。最も好ましい実施態様では、行列中のスコアは、実験的なペプチド結合研究から得る。別の好ましい実施態様では、所定のアミノ酸の所定のポケットへの結合のスコアを、実験的に特徴解析された対立遺伝子から、そのポケットに沿って並ぶ同一または類似の残基を有するさらなる対立遺伝子に外挿する。外挿法によりもたらされる行列は、「仮想行列」と呼ばれる。
【０１４０】
代替的実施態様では、脱アミド部位、糖修飾部位、酸化部位、タンパク質分解切断部位などの、タンパク質内の反応性部位を予測するさらなるスコア付け関数を用いる。
【０１４１】
上述のスコア付け関数および／または他のスコア付け関数の組合せの使用が企図されていることが、当業者に理解されよう。ある実施態様では、このことは、別々の計算の結果のアウトプットを評価することにより達成できる。あるいは、スコア付け関数を、１つのスコア付けの項にまとめ得る。この後者の戦略は、異なるスコア付けの項に別々に重みをつけることを可能にし、かくしてスコア付けの項の相対的貢献に対してさらなる制御を提供し、所望の操作戦略のためにスコア付け関数を調節する能力をより高める。
【０１４２】
さらなる配列の最適化
好ましい実施態様では、上述のスコア付け関数を使用して最適化タンパク質変異体を操作した後、タンパク質変異体のさらなる最適化を実施し得る。このように、最適化タンパク質変異体を、さらなる最適化のための一次変異体または鋳型と考えることができ、この一次変異体の変異体を、二次変異体と考えることができる。本発明の変異体配列は、好ましくは、構造的に重要な位置の置換が許可または奨励されない（例えばマスキング）、ＨＳＣを高める手順に由来するので、これらの位置が二次分析で変動可能とされるならば、ＨＳＣのさらなる最適化が可能である見込みが強い。タンパク質親和性、発現、特異性、溶解性、活性およびエフェクター機能を含むがこれらに限定されるものではない、他の特性の最適化が可能である。従って、一次分析で誘導された変異体配列は、さらなる最適化のための変異体を代表することができる。好ましい実施態様では、二次分析は、１）ＨＳＣに中立の、正の、または最小の影響を有する二次アミノ酸の多様性を同定するための、鋳型配列のストリング分析；２）段階１で誘導された多様性を使用する、二次変異体配列の実験的産生；および３）二次変異体配列の実験的スクリーニングの各段階を含む。
【０１４３】
これらの目的のために、アミノ酸ｘからアミノ酸ｙへの位置ｍでの単一の置換のストリングインパクト（ＳＩ）を、式７（ここで、セグメントの長さｚ＝１）の通りに定量できる。理解されるように、最大の可能なストリングの増加（内部位置での単一の置換について）はｗであり、最大の可能な減少はｗである。
【０１４４】
最も好ましい実施態様では、一次変異体における置換は、本明細書でストリング中立およびストリング陽性置換と各々呼ばれる、ゼロまたは正のストリングインパクトをもたらす置換として選択する。他の実施態様では、負のストリングインパクトをもたらす置換、即ち、ストリング陰性置換も、二次変異体の操作に考慮し得る。次いで、二次変異体を実験的に構築、発現および試験し得る。抗原親和性、エフェクター機能、安定性、溶解性、発現などに関して好都合な特性を示す二次置換を次の変異体において組み合わせ、より最適化された治療剤候補を生成させ得る。
【０１４５】
非異種タンパク質の最適化
上記の最適化は、異種タンパク質の免疫原性の低減に限定されないことが理解できる。ストリングインパクトについての可能な置換の評価は、最適化された特性を有するタンパク質変異体を操作するための置換多様性を生成するために、優れた戦略を提供する。このアプローチの明確な利点は、免疫原性のリスクが最小であるタンパク質変異体を生成することであり、その重要性は詳細に議論され、本発明の主要な目標である。このアプローチのさらなる利点は、ストリングインパクトの評価に使用される配列が典型的には天然に進化した宿主配列に由来するので、設計された変異体が、安定性、溶解性および他の好ましい特性に効果的に富むことである。この能力の有用性は、タンパク質に不利益または有害な無数のアミノ酸の改変があるという事実にある。良質の変異体多様性のセットをスクリーニングすることにより、所望の特性を有するタンパク質変異体が得られる機会が増える。良質の変異体多様性のセットを生成するストリングインパクトアプローチの能力は、より大きい多様性をサンプリングする位置の突然変異への寛容がより大きいこと、および、天然に進化した配列のセットにあるアミノ酸が相同タンパク質の構造、安定性、溶解性、機能などと適合する性向がより大きいことに由来する。
【０１４６】
変異体設計へのこのストリングインパクトアプローチは、上記の二次変異体の生成のみならず、恐らく既に最小の免疫原性であるタンパク質中のアミノ酸の改変を操作するのにも使用し得る。これには、例えば、天然の宿主タンパク質が含まれ得る。あるいは、そして好ましい実施態様では、ストリングインパクト戦略を適用して、ヒト化（Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402）された、または、例えば遺伝子導入マウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458）または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108）を使用して得られる、「完全にヒト」である抗体可変領域（ＶＨまたはＶＬ）における改変を操作し得る。上記の一次変異体配列の最適化と同様に、ここで記載するストリングインパクト分析は、ＨＳＣに中立の、正の、または最小の影響を有し、潜在的に他の好ましい特性を有する二次多様性の同定に使用できる。次いで、そのような多様性を使用して、免疫原性のリスクを高めずに、これらの配列の最適化バージョンをスクリーニングできる。
【０１４７】
実験的産生、スクリーニングおよび試験
タンパク質変異体の産生およびスクリーニングの方法は、当分野で周知である。抗体の分子生物学、発現、精製およびスクリーニングの一般的方法は、Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; および Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76 に記載されている。また、２００３年３月３日に出願されたＵＳＳＮ１０／３３９７８８、２００３年９月２９日に出願されたＵＳＳＮ１０／６７２,２８０および２００４年３月２６日に出願されたＵＳＳＮ１０／８２２,２３１に記載の方法を参照。
【０１４８】
本発明のある実施態様では、ライブラリー配列を使用して、そのメンバーの配列をコートする核酸を創生する。それは、次いで、所望により宿主細胞にクローニングされ、発現され、アッセイされ得る。これらの実務は、周知の手順を使用して実施され、本発明で用途を見出し得る様々な方法が、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)、および Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) に記載されている。本発明のタンパク質変異体をコードする核酸は、タンパク質を発現するために発現ベクターに導入され得る。発現ベクターは、典型的に、機能し得るように連結されたタンパク質を含み、それは、制御または調節配列、選択可能マーカー、任意の融合体パートナーおよび／または付加的エレメントと機能的関係に置かれる。本発明のタンパク質変異体は、タンパク質変異体をコードする核酸を含有する核酸、好ましくは発現ベクターを形質移入された宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こすのに適切な条件下で培養することにより産生させ得る。幅広い様々な適する宿主細胞を使用し得、それには哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、本発明において用途を見出し得る様々な細胞株が、the American Type Culture Collection から入手可能なＡＴＣＣ細胞株カタログに記載されている。外来核酸の宿主細胞への導入方法は、当分野で周知であり、使用する宿主細胞により変動する。
【０１４９】
好ましい実施態様では、タンパク質変異体は、発現後に精製または単離される。タンパク質は、当業者に周知の様々なやり方で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、クロマトグラフィー技法、電気泳動、免疫学、沈殿、透析、濾過、濃縮および等電点電気泳動の技法が含まれる。当分野で周知の通り、例えば細菌のプロテインＡ、ＧおよびＬなどの様々な天然タンパク質が抗体に結合し、これらのタンパク質は、本発明において精製のために用途を見出し得る。精製は、しばしば特定の融合体パートナーにより可能にすることができる。例えば、タンパク質は、ＧＳＴ融合体が用いられているならばグルタチオン樹脂を、Ｈｉｓ−タグが用いられているならばＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーを、ｆｌａｇ−タグが使用されているならば固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製し得る。適する精製技法の一般的手引きには、Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994 を参照。
【０１５０】
タンパク質変異体は、インビトロアッセイ、インビボおよび細胞をベースとするアッセイ、並びに選択技術を使用するものを含むが、これらに限定されるものではない様々な方法を使用して、スクリーニングし得る。スクリーニングの手順において、自動化および高処理量スクリーニング技術を利用し得る。スクリーニングは、例えば免疫標識、同位元素標識、または蛍光もしくは比色染料などの低分子標識などの融合体パートナーまたは標識を使用してもよい。
【０１５１】
好ましい実施態様では、タンパク質変異体の機能的および／または生物物理的特性を、インビトロアッセイにおいてスクリーニングする。好ましい実施態様では、タンパク質を、例えばその反応を触媒する能力またはその標的への結合親和性などの機能性についてスクリーニングする。結合アッセイは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）およびＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）をベースとするアッセイ、AlphaScreen（商標）（発光増幅近接均質化アッセイ（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay））、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）としても知られる）、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、ゲル電気泳動およびゲル濾過を含むクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されるものではない、当分野で知られている様々な方法を使用して実施できる。これらおよびその他の方法は、いくつかの融合体パートナーまたは標識を利用し得る。アッセイは、色素生産性、蛍光、発光または同位元素標識を含むがこれらに限定されるものではない、様々な検出方法を用いてもよい。タンパク質の生物物理的特性、例えば、安定性や溶解性を、当分野で知られている様々な方法を使用してスクリーニングし得る。タンパク質の安定性は、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態との間の熱力学的平衡を測定することにより決定し得る。例えば、本発明のタンパク質変異体は、化学変性剤、熱またはｐＨを使用して折り畳まれていなくすることができ、この転移を、円二色性分光法、蛍光分光法、吸光分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法およびタンパク質分解を含むがこれらに限定されるものではない方法を使用して、モニターし得る。当業者にはわかるように、折り畳まれたものおよび折り畳まれていないものへの転移の動力学的パラメーターも、これらおよび他の技法を使用してモニターし得る。タンパク質変異体の溶解性および包括的な構造の整合性は、当分野で知られている広範囲の方法を使用して定量的または定性的に測定し得る。タンパク質変異体の生物物理学的特性の特徴分析のために本発明において用途を見出し得る方法には、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーや逆相高速液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、質量分析、紫外吸光分光法、蛍光分光法、円二色分光法、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、分析的超遠心分離、動的光散乱法、タンパク質分解およびクロスリンク、濁度測定、フィルター遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光染料結合アッセイ、タンパク質染色アッセイ、顕微鏡およびＥＬＩＳＡまたは他のアッセイによる凝集体の検出が含まれる。Ｘ線結晶構造解析技法およびＮＭＲ分光法を用いる構造分析も、用途を見出し得る。
【０１５２】
好ましい実施態様では、１またはそれ以上の細胞をベースとする、またはインビボのアッセイを使用して、タンパク質変異体をスクリーニングする。そのようなアッセイのために、典型的に、細胞がライブラリーに属する個々の変異体または変異体の集積物に曝されるように、精製または未精製のタンパク質を外来的に添加する。これらのアッセイは、典型的に、しかし常にではないが、タンパク質の機能；つまり、タンパク質の、標的に結合し、何らかの生物化学的事象、例えばエフェクター機能、リガンド／受容体結合阻害、アポトーシスなどを媒介する能力をベースとする。そのようなアッセイは、しばしば、例えば、細胞の生存、細胞の死、細胞形態の変化、細胞の天然遺伝子またはレポーター遺伝子の発現などの転写活性化などの、タンパク質に対する細胞の反応をモニターすることを含む。例えば、そのようなアッセイは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣを誘起する抗体変異体の能力を測定し得る。いくつかのアッセイには、標的細胞に加えて、付加的細胞または成分、例えば、血清の補体または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのエフェクター細胞を添加する必要があり得る。かかる付加的細胞は、いかなる生物由来でもよく、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来である。タンパク質は、標的を発現しているある一定の細胞株のアポトーシスを引き起こし得、または、それらは、アッセイに添加された免疫細胞による標的細胞への攻撃を媒介し得る。細胞の死亡または生存度をモニターする方法は当分野で知られており、染料、免疫化学、細胞化学および放射活性試薬の使用を含む。例えば、カスパーゼ染色アッセイは、アポトーシスの測定を可能にし得、放射活性基質またはアラマーブルー（alamar blue）などの蛍光染料の取込または放出は、細胞増殖または活性化のモニタリングを可能にし得る。好ましい実施態様では、DELFIA（登録商標） EuTDAをベースとする細胞傷害アッセイ (Perkin Elmer, MA）を使用する。あるいは、死亡した、または損傷した標的細胞は、例えば乳酸デヒドロゲナーゼなどの１またはそれ以上の天然細胞内タンパク質の放出を測定することによりモニターし得る。転写活性化も、細胞をベースとするアッセイにおいて機能をアッセイする方法として役立ち得る。この場合、上方調節され得る天然遺伝子またはタンパク質をアッセイすることにより反応をモニターし得、例えば、ある種のインターロイキンの放出を測定し得、あるいは、読出しはレポーターコンストラクトによってもよい。細胞をベースとするアッセイは、タンパク質の存在に対する反応として、細胞の形態変化の測定も含み得る。このようなアッセイのための細胞タイプは、原核でも真核でもよく、当分野で知られている様々な細胞株を用い得る。あるいは、変異体タンパク質をコードする核酸で形質転換または形質移入された細胞を使用して、細胞をベースとするスクリーニングを実施する。つまり、タンパク質変異体は細胞に外来的に添加されない。例えば、ある実施態様では、細胞をベースとするスクリーニングは、細胞表面ディスプレイを利用する。細胞表面上での変異体のディスプレイを可能にする融合体パートナーを用いることができる（Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399）。
【０１５３】
当分野で知られているように、スクリーニング方法のサブセットは、好都合なライブラリーのメンバーを選択するものである。当該方法は、本明細書において、「選択方法」と呼ばれ、これらの方法は、本発明においてタンパク質変異体のスクリーニングのために用途を見出す。タンパク質のライブラリーが選択方法を使用してスクリーニングされる場合、好都合である、つまり、何らかの選択基準に合うライブラリーのメンバーのみが、増殖、単離および／または観察される。理解されるように、最も適合する変異体のみが観察されるので、そのような方法は、ライブラリーのメンバーの適合性を個別にアッセイする方法によりスクリーニングできるものよりも大きいライブラリーのスクリーニングを可能にする。選択は、タンパク質の表現型をその遺伝子型に、つまり、タンパク質の機能をそれをコードする核酸に共有結合的または非共有結合的に連結させる、いかなる方法、技法または融合体パートナーによっても可能である。例えば、選択方法としてのファージディスプレイの使用は、ライブラリーのメンバーの遺伝子ＩＩＩタンパク質への融合により可能になる。このように、例えばタンパク質の標的への結合親和性などの何らかの基準に合うタンパク質変異体の選択または単離は、それをコードする核酸も選択または単離する。一度単離したら、変異体をコードする遺伝子または複数の遺伝子を増幅させ得る。このパニング（panning）と呼ばれる単離と増幅のプロセスは、繰り返してもよく、好都合なタンパク質変異体をライブラリー中で豊富にさせることが可能になる。最終的に、結合した核酸の核酸配列解読により、遺伝子の同定が可能になる。
【０１５４】
本発明でタンパク質ライブラリーのスクリーニングに用途を見出し得る様々な選択方法が当分野で知られている。これらには、ファージディスプレイ (Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996；Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838；Smith, 1985, Science 228:1315-1317） 並びに選択的ファージ感染 (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551）、選択的感染性ファージ (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630）および遅延感染力パニング (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904）などの派生物、細菌 (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34；Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10；Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648；Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80）、酵母 (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44；Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557）、および哺乳動物細胞 (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219）上でのディスプレイなどの細胞表面ディスプレイ (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399）、並びにポリソームディスプレイ (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026）、リボソームディスプレイ (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942）、ｍＲＮＡディスプレイ (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302；Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405-408）、およびリボソーム不活性化ディスプレイ系（Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543）などのインビトロディスプレイ技術 (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５５】
本発明において用途を見出し得る他の選択方法には、周辺質発現および細胞測定スクリーニング (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542）、タンパク質フラグメント相補性アッセイ (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344；Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146）、および選択モード（Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728）で使用する酵母ツーハイブリッドスクリーニング (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246）を含むがこれらに限定されるものではないインビボの方法などの、ディスプレイに頼らない方法が含まれる。別の実施態様では、発現ベクターの特異的配列に結合し、従って融合体パートナーおよび付随する変異体ライブラリーのメンバーを、それらをコードする核酸と共有結合的または非共有結合的に連結させる融合体パートナーにより、選択が可能になる。例えば、ＵＳＳＮ０９／６４２,５７４；ＵＳＳＮ１０／０８０,３７６；ＵＳＳＮ０９／７９２,６３０；ＵＳＳＮ１０／０２３,２０８；ＵＳＳＮ０９／７９２,６２６；ＵＳＳＮ１０／０８２,６７１；ＵＳＳＮ０９／９５３,３５１；ＵＳＳＮ１０／０９７,１００；ＵＳＳＮ６０／３６６,６５８；ＰＣＴ ＷＯ００／２２９０６；ＰＣＴ ＷＯ０１／４９０５８；ＰＣＴ ＷＯ０２／０４８５２；ＰＣＴ ＷＯ０２／０４８５３；ＰＣＴ ＷＯ０２／０８０２３；ＰＣＴ ＷＯ０１／２８７０２；およびＰＣＴ ＷＯ０２／０７４６６は、本発明で用途を見出し得るそのような融合体パートナーおよび技法を記載している。別の実施態様では、タンパク質の発現が、何らかの増殖、複製または生存的利点を細胞に与えるならば、インビボ選択を行うことができる。
【０１５６】
「指向進化」法と呼ばれる選択方法のサブセットは、選択中に好都合な配列の接合または交配を含み、時には新しい突然変異の組込みもあるものである。当業者に理解されるように、指向進化法は、ライブラリー中の最も好都合な配列の同定を促進でき、スクリーニングされる配列の多様性を高めることができる。本発明においてタンパク質変異体のスクリーニングのために用途を見出し得る様々な指向進化法が当分野で知られており、ＤＮＡシャフリング (PCT WO 00/42561 A3；PCT WO 01/70947 A3）、エクソンシャフリング (US 6,365,377；Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428）、ファミリーシャフリング（Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291；US 6,376,246）、RACHITT（商標） (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354- 359；PCT WO 02/06469）、STEP およびインビトロ組換えのランダムプライミング（priming） (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261；Shao et al., 1998, Nucleic acids Res 26:681-683）、エキソヌクレーゼ媒介遺伝子集合（US 6,352,842；US 6,361,974）、Gene Site Saturation Mutagenesis（商標）（US 6,358,709）、Gene Reassembly（商標） (US 6,358,709）、SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253）、ＤＮＡフラグメント化法 (Kikuchi et al., Gene 236:159-167）、一本鎖ＤＮＡシャフリング (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137）および AMEsystem（商標）指向進化タンパク質操作技法 (Applied Molecular Evolution）(US US 5,824,514；US 5,817,483；US 5,814,476；US 5,763,192；US 5,723,323）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５７】
好ましい実施態様では、タンパク質変異体の免疫原性を実験的に決定して、変異体が、親タンパク質と比べて低減または除去された免疫原性を確かに有することを確認する。エピトープの実験的確認に、いくつかの方法を使用できる。好ましい実施態様では、エクスビボのＴ細胞活性化アッセイを使用して、免疫原性を実験的に定量する。この方法では、適合するドナーの抗原提示細胞およびナイーブＴ細胞を、１回またはそれ以上、関心のあるペプチドまたはタンパク質全体で攻撃する。次いで、数々の方法を使用して、例えば、サイトカインの産生のモニタリング、またはトリチウム標識チミジンの取込の測定により、Ｔ細胞活性化を検出できる。最も好ましい実施態様では、インターフェロンガンマの産生を、Elispot アッセイ (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24）を使用してモニターする。タンパク質に対して免疫反応を起こした患者から血清が入手できるならば、特定のエピトープに応答する成熟Ｔ細胞を検出することが可能である。好ましい実施態様では、活性化Ｔ細胞によるインターフェロンガンマまたはＩＬ−５の産生を、Elispot アッセイを使用してモニターするが、トリチウム標識チミジンの取込または他のサイトカインの産生などの、Ｔ細胞活性化または増殖の他のインジケーターを使用することも可能である。他の適するＴ細胞アッセイには、Meidenbauer et al., 2000, Prostate 43, 88-100; Schultes & Whiteside, 2003, J. Immunol. Methods 279, 1-15; および Stickler et al., 200, J. Immunotherapy, 23, 654-660 に開示のものが含まれる。好ましい実施態様では、上記のＴ細胞活性化アッセイに使用されるＰＢＭＣドナーは、タンパク質応答性障害の処置を必要としている患者に共通するクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子を含む。例えば、殆どの疾患および障害について、その集団中によくある対立遺伝子の全てを含むドナーを試験するのが望ましい。しかしながら、特定のＭＨＣ対立遺伝子と関連する疾患または障害について、タンパク質応答性障害への罹病性を与える対立遺伝子のスクリーニングに集中するのがより適切であり得る。好ましい実施態様では、野生型またはタンパク質変異体に対して免疫反応を起こすＰＢＭＣドナーまたは患者のＭＨＣハプロタイプを、反応を起こさない患者のＭＨＣハプロタイプと比較する。このデータは、臨床前および臨床研究の先導に使用し得、またタンパク質治療剤に好都合または不都合に応答する可能性が特に高い患者の同定を補助する。
【０１５８】
代替的な好ましい実施態様では、免疫原性を遺伝子導入マウス系で測定する。例えば、完全または部分的ヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子を発現するマウスを使用し得る。代替的実施態様では、齧歯類および霊長類を含む１種またはそれ以上の動物にタンパク質変異体を投与し、抗体形成をモニターすることにより、免疫原性を試験する。非ヒト霊長類のＭＨＣ分子の配列、そして故にペプチド結合特異性は、ヒトの配列およびペプチド結合特異性と非常に類似であり得るので、定義されたＭＨＣハプロタイプを有する非ヒト霊長類が特に有用であり得る。同様に、ヒトＭＨＣペプチド結合ドメインを発現する遺伝子操作されたマウスモデルを使用し得る (例えば、Sonderstrup et al., 1999, Immunol. Rev. 172: 335-343; および Forsthuber et al., 2001, J. Immunol. 167: 119-125 参照）。
【０１５９】
本発明のタンパク質の生物学的特性は、細胞、組織および生物全体の実験で特徴解析し得る。当分野で知られている通り、疾患または疾患モデルに対する処置への薬物の効力を測定するために、または、薬物の薬物動態、毒性および他の特性を測定するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルが含まれるがこれらに限定されるものではない動物で、しばしば、薬物を試験する。それらの動物は、疾患モデルと呼ばれることがある。治療剤は、しばしば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよび遺伝子導入マウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むがこれらに限定されるものではないマウスで試験される。かかる実験法は、治療剤として使用しようとするタンパク質の潜在能力の決定のために、意味のあるデータを提供し得る。任意の生物、好ましくは哺乳動物を、試験に使用し得る。例えば、それらのヒトとの遺伝子的類似性のために、サルは適する治療モデルであり得、故に本発明のタンパク質の効力、毒性、薬物動態または他の特性の試験に使用し得る。薬物としての承認には、ヒトでの試験が最終的に必要とされ、従って当然これらの実験が企図される。従って、本発明のタンパク質をヒトで試験して、それらの治療効力、毒性、免疫原性、薬物動態および／または他の臨床的特性を決定し得る。
【０１６０】
本発明のある実施態様では、宿主のための変異体抗体は、親抗体と比較して、２種またはそれ以上の天然の抗体に由来する２個またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。この実施態様では、変異体抗体中の第１の結果的変異体ストリングを、第１の天然抗体と最も相同にし、変異体抗体中の第２の結果的変異体ストリングを、第２の天然抗体中の対応するストリングに最も相同にし、置換はＣＤＲ中になく、そして少なくとも１つの得られるストリングは、相同天然配列のコンセンサスではない。好ましい実施態様では、変異体抗体中の変異体ストリングは、ＣＤＲ残基を含まない。さらなる好ましい実施態様では、第１および第２の天然抗体は、異なるサブファミリーに由来する。
【０１６１】
本発明の他の実施態様では、宿主のための変異体抗体は、親抗体と比較して、３種またはそれ以上の天然の抗体に由来する２個またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。この実施態様では、変異体抗体中の第１の結果的変異体ストリングを、第１の天然抗体と最も相同にし、変異体抗体中の第２の結果的変異体ストリングを、第２の天然抗体中の対応するストリングに最も相同にし、変異体抗体中の第３の結果的変異体ストリングを、第３の天然抗体中の対応するストリングに最も相同にし、置換はＣＤＲ中になく、そして少なくとも１つの得られるストリングは、相同天然配列のコンセンサスではない。さらなる実施態様では、第１、第２および第３の天然抗体は、異なるサブファミリーに由来する。さらに追加的な実施態様では、変異体抗体はさらに、第４の結果的変異体ストリングを含み、それは、第４の天然抗体中の対応するストリングに最も相同とする。さらなる実施態様ならば、変異体抗体は、表面に露出しない位置で作成される少なくとも１つの置換を含み、第１、第２および第３の天然抗体は、異なる抗体グループに由来し、それらの置換の１つは、ＶＨ／ＶＬ中間面の一部である位置で行われ、少なくとも１つのアミノ酸置換は、逆突然変異ではない。
【０１６２】
他の実施態様では、第１、第２および第３の天然抗体は、異なる抗体グループに由来する。
【０１６３】
他の実施態様では、変異体抗体は、表面に露出しない少なくとも１つの置換を含む。
【０１６４】
他の実施態様では、これらの置換の少なくとも１つは、ＶＨ／ＶＬ中間面の一部である位置で行われる。
【０１６５】
他の実施態様では、変異体抗体は、逆突然変異ではない少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１６６】
本発明のある実施態様では、宿主のための変異体抗体は、親抗体と比較して、約７５％より高い宿主ストリング含有量（ＨＳＣ）を有する変異体ＶＨ抗体領域、および約６０％より低いフレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）を含み、ここで、ＨＳＣおよびＦＲＨは、ウインドウサイズ９で計算される。
【０１６７】
本発明のある実施態様では、宿主のための変異体抗体は、親抗体と比較して、約２０％より高い精密ストリング含有量を有する変異体ＶＨ抗体領域；および約６０％より低いフレームワーク領域均一性を含み、ここで、ＨＳＣおよびＦＲＨは、ウインドウサイズ９で計算される。
【０１６８】
本発明のある実施態様では、宿主のための変異体抗体は、親抗体と比較して、約３５％より高い精密ストリング含有量を有する変異体ＶＬ抗体領域、および約６０％より低いフレームワーク領域均一性を含み、ここで、ＨＳＣおよびＦＲＨは、ウインドウサイズ９で計算される。
【０１６９】
本発明のある実施態様では、宿主のための変異体抗体は、親抗体と比較して、第１の天然抗体からの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換の第１のセット、および第２の天然抗体からの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換の第２のセットを含み、ここで、該第２の抗体由来の該置換アミノ酸の本体は、該第１の天然抗体の対応するアミノ酸と異なり、置換はＣＤＲにはなく、少なくとも１つの置換は、相同天然配列のコンセンサスではない。さらなる実施態様では、変異体抗体は、第３の天然抗体からの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換の第３のセットをさらに含み、ここで、該第３のセットの置換アミノ酸の本体は、該第１および第２のアミノ酸置換のセットからの対応するアミノ酸の本体と異なる。さらなる実施態様では、変異体抗体は、第４の天然抗体からの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換の第４のセットを含み、ここで、該第４のセットの置換アミノ酸の本体は、該第１、第２および第３のアミノ酸置換のセットからの対応するアミノ酸の本体と異なる。他の実施態様では、変異体抗体は、複数の天然抗体からの１個またはそれ以上のアミノ酸の複数のセットを含み、任意のセットの置換アミノ酸の本体は、アミノ酸置換の他のセットからの対応するアミノ酸の本体と異なる。
【０１７０】
実施例
以下に本発明を例示説明するための実施例を提供する。これらの実施例は、本発明をいかなる特定の適用または作業理論にも制限することを意味しない。
【０１７１】
免疫グロブリン可変領域への言及のために、Kabat の番号付けスキームに従って、位置を番号付けする。免疫グロブリン定常領域への言及のために、Kabat におけるものの通り、ＥＵインデックスに従って位置を番号付けする（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）。
【０１７２】
実施例１．ＡＣ１０の免疫原性の低減
本明細書に記載の発明の方法の適用を例示説明するために、そしてタンパク質の免疫原性の低減へのその広い適用性を裏付けるために、親配列として抗ＣＤ３０抗体ＡＣ１０（Bowen et al. Journal of Immunology, 1993, 151: 5896）を使用する異種抗体の実施例を提供する。マウスＡＣ１０可変領域の構造モデルを、当分野で知られている標準的抗体モデル化法を使用して構築した。図３および４は、ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨドメイン（各々Ｌ０ ＡＣ１０ ＶＬおよびＨ０ ＡＣ１０ ＶＨと呼ばれる）の配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。この抗体のＣＤＲ移植を、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴを使用してＶＬにはｖｌｋ＿４−１およびＶＨにはｖｈ＿１−３と決定される、最も相同な宿主生殖系列フレームワークの文脈にＡＣ１０のＣＤＲを置くことにより構築した。これらのＣＤＲ移植の配列およびストリング含有量を、図５および６に、モデル化したＡＣ１０の構造と共に、ＣＤＲ移植ＡＣ１０可変鎖とＷＴとの間の突然変異の差異を強調して示す。
【０１７３】
ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ配列にストリング最適化アルゴリズムを適用することにより、免疫原性が低減されたＡＣ１０変異体を生成した。このアルゴリズムは、多様なヒトＶＬκおよびＶＨ生殖系列配列に存在する複数のアミノ酸突然変異を帰納的にサンプリングし、各配列の宿主ストリング含有量（ＨＳＣ）を、上記の式３に従い、ウインドウサイズｗ＝９を使用して計算する。この計算のセットでは、ＣＤＲ中の残基およびＣＤＲまたはＶＬ／ＶＨ中間面に近い残基はマスクされた。即ち、突然変異することを許可されなかった。ＣＤＲは、Chothia (Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273: 927-948）により定義されたＣＤＲよりも僅かに少ない残基のセットとして定義した。本発明のために、ここでは、ＶＬ ＣＤＲを、位置２７−３２（ＣＤＲ１）、５０−５６（ＣＤＲ２）および９１−９７（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義し、ここで、番号付けは Chothia に従う。Chothia および Kabat により定義されるＶＬ ＣＤＲは同一であるので、これらのＶＬ ＣＤＲ位置の番号付けは、Kabat にも従う。本発明のために、ここでは、ＶＨ ＣＤＲを、位置２７−３３（ＣＤＲ１）、５２−５６（ＣＤＲ２）および９５−１０２（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義し、ここで、番号付けは Chothia に従う。これらのＶＨ ＣＤＲ位置は、Kabat の位置２７−３５（ＣＤＲ１）、５２−５６（ＣＤＲ２）および９５−１０２（ＣＤＲ３）に対応する。これらの計算でマスクする残基は、ＶＬについて位置１−４、２５−３４、３６、３８、４３、４４、４６、４８−５８、６０、６３−６９、７１、８７および８９−９８、そしてＶＨについて２、４、２４、２６−３５、３７、３９、４４、４５、４７、５０−５８、６０、６１、７１、７３、７６、７８、９１および９３−１０６と設定され、ここで、番号付けは Kabat に従う。決定的である可能性がある残基のマスキングは、より多くの宿主抗体変異体を生成させるための伝統的アプローチであるが、しかしながら、それは本発明の一実施態様にすぎず、位置がマスクされない計算も企図されている。この計算を、１００個の別々の相互作用において、ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨについて実行し、ＷＴよりも高い宿主ストリング含有量の多い、多様なＡＣ１０変異体のセットを生成させた。図７は、各々ＡＣ１０ ＶＬ ＨＳＣ計算１およびＡＣ１０ ＶＨ ＨＳＣ計算１と呼ばれる、ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ領域についてのこれらの計算から、クラスター化した重複しないアウトプット配列のセットを示す。各反復（Ｉｔｅｒ）、ＨＳＣ（式３）、ＨＳＳ（式５）並びにＷＴからの突然変異の数（Ｍｕｔ）および同一性（陰をつけた残基）を提示する。ＨＳＣスコアに加えて、最短距離の構造をベースとするスコア付け方法 (Protein Engineering with Analogous Contact Environments と題する２００３年１２月８日出願のＵＳＳＮ６０／５２８,２２９）を使用して、各配列をその構造および機能的整合性について評価した。「構造コンセンサス」および「構造優先」と呼ばれる構造適格性の２つの測定値も、図７に提供する。その Analogous Contact Environments の方法は、配列および構造情報の豊富さのために、抗体に特に良好に適するが、任意の構造をベースとする、および／または配列をベースとするスコア付け方法を使用して、変異体配列の構造および機能の適格性を評価し得る。それらのセット中の他の配列からの突然変異距離をベースとして、アウトプット配列をクラスター化し、これらのクラスターを、図中の水平黒色線により線引きする。「クラスター」の列は、各配列とそのクラスター内の残りの配列との間の定量的突然変異距離を提供する；クラスターの値が低い配列は、その特定の配列クラスターのより代表的なものである。
【０１７４】
これらの計算を使用して、ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体のセットを生成させた。いくつかの場合では、ストリングおよび構造スコア並びにモデル化されたＡＣ１０構造の目視検査を使用して、アウトプット配列にさらなる置換を行い、適格性を評価した。図８−１３は、ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体の各々について、配列、宿主ストリング含有量およびモデル化されたＡＣ１０構造上にマッピングされた突然変異の差異を提示する。ＡＣ１０ ＶＬ ＨＳＣ計算１の反復３６は、Ｌ１ ＡＣ１０ ＶＬの前駆体として役立ち、反復３７は、Ｌ２ ＡＣ１０ ＶＬの前駆体として役立ち、反復３は、Ｌ３ ＡＣ１０ ＶＬの前駆体として役立った。ＡＣ１０ ＶＨ ＨＳＣ計算１の反復１５は、Ｈ１ ＡＣ１０ ＨＬの前駆体として役立ち、反復５５は、Ｈ２ ＡＣ１０ ＶＨの前駆体として役立ち、そして反復１８は、Ｈ３ ＡＣ１０ ＶＨの前駆体として役立った。
【０１７５】
表１および２は、ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体について、ＷＴおよびＣＤＲ移植ＡＣ１０配列と比較した、親配列からの突然変異の数、構造適格性スコアおよび宿主ストリングスコアを提示する。上述の構造および宿主ストリング分析に加えて、各配列をその宿主生殖系列に対する大域的相同性について分析した。配列中の各ストリングについて、ＮＩＤｍａｘと呼ばれる、生殖系列に対する最大の同一性の一致も決定した。これは、宿主生殖系列中の対応するストリングに対する最大の同一性が、示される値である、各配列中のストリングの総数を表す。ｗ＝９について、表１および２は、各配列について、Ｎ９ｍａｘ、Ｎ８ｍａｘ、Ｎ７ｍａｘおよびＮ＜６ｍａｘを列挙する。Ｎ９ｍａｘは、９個の残基のうち９個が、宿主生殖系列中の少なくとも１つのストリングと一致する配列中のストリングの数を表し、Ｎ８ｍａｘは、９個の残基のうち８個が、宿主生殖系列中の少なくとも１つのストリングと一致するストリングの数を表し、Ｎ７ｍａｘは、９個の残基のうち７個が、宿主生殖系列中の少なくとも１つのストリングと一致するストリングの数を表し、Ｎ＜６ｍａｘは、９個の残基のうち６個またはそれより少ない残基が、宿主生殖系列中の少なくとも１つのストリングと一致するストリングの数を表す。この最後のカテゴリー（ＩＤ＜６）は、例えば、スコアの乏しいストリングの数と見なし得る。上述の構造および宿主ストリング分析に加えて、宿主生殖系列に対するその大域的相同性について、各配列を分析した；表１および２は、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴを使用して決定した、各配列について最も相同であるヒト生殖系列配列（最も近い生殖系列）およびその生殖系列への対応する同一性（最も近い生殖系列に対するＩＤ）を提示する。最後に、各変異体のフレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）をｗ＝９について評価し、表１および２に提示し、複数の生殖系列配列と対照的に、各変異体の宿主ストリング含有量が単一の生殖系列に由来する程度を提供する。
【表１】
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【表２】
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【０１７６】
重要な観察は、ＣＤＲ移植抗体は、単一のヒト生殖系列配列（ヒト化の用語では、「アクセプター」配列）に最も相同であるが、本発明は、配列の様々な領域において様々な宿主生殖系列配列に相同である変異体を説明していることである。このことは、本発明のＡＣ１０変異体とＣＤＲ移植ＡＣ１０変異体のフレームワーク領域均一性（ＦＲＨ）スコアの有意な差異から明らかである。さらに、ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨは、それらの全配列に亘り、ヒト生殖系列サブファミリー４（ＶＬ）および１（ＶＨ）に各々最も相同であるが、数々のＡＣ１０変異体は、異なるフレームワークの異なるサブファミリーに最も相同である。加えて、ＣＤＲ移植抗体は、親配列に最も相同な配列でもある単一の生殖系列配列に最も相同であるが、本発明は、ＷＴに最も相同な生殖系列配列である必要がない様々なヒト生殖系列配列に最も相同である、所定の抗体のための抗体のセットを提示する。例えば、表１は、ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＬが、ＷＴ ＡＣ１０親に最も相同なヒト生殖系列でもある４−１に最も相同であることを示す。しかしながら、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、３つの異なるヒト生殖系列−３−１１、１−３９および４−１に、各々最も相同である。従って、本発明の変異体は、ＣＤＲ移植抗体よりも、実質的により多量の多様性を探索する。このことの１つの明らかな利点は、本発明の方法が、抗原親和性に関して、成功の機会をより多く提供することである。ヒト化方法における「アクセプター」の選択は、１回の賭けである；ドナーＣＤＲが実際にそのアクセプターＦＲに適合しない場合、ＷＴの親和性を回復する逆突然変異のセットが存在しないことがある。対照的に、本発明の方法は、免疫原性低減プロセスにおいてより多様な配列および構造空間のサンプリングを可能にするので、最終的にＷＴの親和性またはそれ以上を有する免疫原性の低いバージョンを得る機会が増える。より高い配列多様性をサンプリングするさらなる利点は、いくつかの配列が、例えば安定性、溶解性およびエフェクター機能に関して、他のものより最適な特性を有し得ることである。例えば、ＵＳＳＮ６０／６１４,９４４およびＵＳＳＮ６０／６１９,４０９（２００４年１０月１４日に出願され、「Immunoglobulin Variants Outside the Fc Region with Optimized Effector Function」と題する）に開示の通り、抗体の可変領域は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）などのエフェクター機能に影響を与え得る。
【０１７７】
ＡＣ１０ ＷＴ（Ｌ０およびＨ０）および変異体（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）の可変領域の遺伝子を、回帰的（recursive）ＰＣＲを使用して構築し、全長軽鎖カッパ（ＣＬκ）および重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１Ｚｅｏ（Invitrogen）にサブクローニングした。全配列を配列解読し、配列の忠実度を確認した。重鎖遺伝子（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）（野生型または変異体）を含有するプラスミドを、軽鎖遺伝子（ＶＬ−ＣＬκ）を含有するプラスミドと、全ての組合せ（Ｌ０／Ｈ０、Ｌ０／Ｈ１、Ｌ０／Ｈ２、Ｌ０／Ｈ３、Ｌ１／Ｈ０、Ｌ１／Ｈ１、Ｌ１／Ｈ２、Ｌ１／Ｈ３、Ｌ２／Ｈ０、Ｌ２／Ｈ１、Ｌ２／Ｈ２、Ｌ２／Ｈ３、Ｌ３／Ｈ０、Ｌ３／Ｈ１、Ｌ３／Ｈ２、Ｌ３／Ｈ３）で、２９３Ｔ細胞に共形質移入する。ここで、例えばＬ２／Ｈ３は、Ｈ３ ＡＣ１０ ＶＨと一対にしたＬ２ ＡＣ１０ ＶＬを表す。培地を形質移入の５日後に回収し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Pierce, Catalog # 20334）を使用して、上清から抗体を精製した。
【０１７８】
ＷＴおよび変異体抗体を、ＣＤ３０抗原を結合するそれらの能力について、実験的に試験した。ＡＣ１０ ＷＴおよび変異体抗体によるヒトＣＤ３０への結合親和性を、定量的かつ極度に鋭敏な方法である、AlphaScreen（商標）アッセイを使用して測定した。AlphaScreen（商標）アッセイは、ビーズをベースとする非放射性発光近接アッセイである。ドナービーズのレーザー励起が酸素を励起し、それがアクセプタービーズに十分近ければ、それが化学発光事象のカスケードを生成させ、最終的に５２０−６２０ｎｍでの蛍光放射を導く。AlphaScreen（商標）アッセイを、抗体をスクリーニングするための競合アッセイとして適用した。ストレプトアビジンをドナービーズ（Perkin Elmer）に取り付けるため、にＷＴ ＡＣ１０抗体を標準的方法でビオチン化した。抗ＤＩＧアクセプタービーズ（Perkin Elmer）に取り付けるために、市販のＣＤ３０をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）（Roche Diagnostics）に結合させた。競合的ＡＣ１０変異体の非存在下で、ＷＴ抗体とＣＤ３０が相互作用し、５２０−６２０ｎｍでシグナルを産生する。タグのないＡＣ１０変異体の添加は、ＷＴ ＡＣ１０／ＣＤ３０相互作用と競合し、蛍光を量的に低減させ、相対的結合親和性の決定を可能にする。図１４ａおよび１４ｂは、AlphaScreen（商標）アッセイを使用して、ＷＴ（Ｈ０Ｌ０）およびＡＣ１０変異体抗体のＣＤ３０への結合を示す。非線形回帰を使用して、データを一部位競合モデルにフィットさせた。これらのフィットは、図中の曲線により表される。これらのフィットは、各抗体について、阻害濃度５０％（ＩＣ５０）（即ち、５０％の阻害に必要とされる濃度）を提供し、かくしてＷＴと比べた相対的結合親和性の決定を可能にする。表３は、これらの結合曲線に対するフィットについて、ＩＣ５０およびＷＴと比べたＩＣ５０の倍率を提供する。ＡＣ１０変異体は、ＣＤ３０結合親和性のアレイを示し、数々の変異体が、ＷＴ ＡＣ１０に匹敵するか、またはそれより良好な親和性で、ＣＤ３０を結合する。
【０１７９】
また、ＡＣ１０変異体の抗原親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Biacore, Uppsala, Sweden）を使用して測定した。ＳＰＲは、タンパク質−タンパク質相互作用の直接的結合速度および親和性の測定を可能にし、従って AlphaScreen（商標）アッセイに優れた補完的な結合アッセイを提供する。ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させたＣＤ３０（R&D Systems）を、プロテインＡ ＳＰＲチップに固定し、表面をＦｃでブロックし、ＷＴおよび変異体ＡＣ１０抗体を幅広い濃度でチップ上に流した。得られるセンサーグラムを、図１５に示す。これらの濃度系列について、BiaEvaluation 曲線フィッティングソフトウェアを使用して大域的ラングミュアフィットを実行し、これらの曲線について、会合速度（on-rate）定数（ｋａ）、解離速度（off-rate）定数（ｋｄ）および平衡結合定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を提供する。表３は、ＳＰＲデータに関し、ＷＴと比べたＫＤおよびＫＤ倍率を提供する。ＳＰＲおよびAlphaScreen（商標）アッセイにより決定される変異体の順位付けの優れた一致は、データの的確さを支持する。
表３．ＡＣ１０変異体のＣＤ３０結合
【表３】
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【０１８０】
本発明の変異体の抗原親和性および生物物理学的特性の評価に加えて、それらを、全長抗体の文脈でエフェクター機能についても試験し得る。親免疫グロブリンの免疫原性が低減された複数の変異体を生成させる１つの利点は、それにより、より大きい配列多様性の度合いのサンプリングが可能になり、多様性は最適な特性を提供し得ることである。いくつかの配列は、例えばエフェクター機能に関して、他のものより最適な特性を有し得る。例えば、ＵＳＳＮ６０／６１４,９４４およびＵＳＳＮ６０／６１９,４０９（２００４年１０月１４日に出願され、「Immunoglobulin Variants Outside the Fc Region with Optimized Effector Function」と題する）に開示の通り、抗体の可変領域は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）などのエフェクター機能に影響を与え得る。
【０１８１】
エフェクター機能を媒介する能力におけるいかなる差異をも探索するために、AlphaScreen（商標） アッセイを使用して、ＦｃγＲＩＩＩａについてＡＣ１０変異体の親和性を測定した。ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を、Mammalian Gene Collection (MGC:22630）から得られたクローンからのＰＣＲにより入手し、その受容体をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させ、スクリーニングを可能にした。タグ付きＦｃγＲＩＩＩａを２９３Ｔ細胞に形質移入し、分泌されたＦｃγＲＩＩＩａを含有する培地を回収し、精製した。競合アッセイと同様に、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合に関するＡＣ１０変異体のスクリーニングに AlphaScreen（商標）アッセイを適用した。ビオチン化ＷＴ ＡＣ１０抗体をストレプトアビジンドナービーズ（Perkin Elmer）に結合させ、ＧＳＴ融合ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａを抗ＧＳＴアクセプタービーズ（Perkin Elmer）に結合させた。結合データを図１６ａおよび１６ｂに示し、得られるＩＣ５０およびＷＴに対するＩＣ５０の倍率を、表４に提供する。また、ＳＰＲを使用してＡＣ１０変異体のＦｃγＲＩＩＩａ親和性を測定した。ＧＳＴ融合ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８アイソフォーム）をチップに固定し、ＷＴおよび変異体ＡＣ１０抗体を幅広い濃度でチップ上に流した。標準的曲線フィッティング方法を使用してデータをフィットさせることから、結合定数を得た。これらの結合曲線へのフィットから得られる平衡解離定数（ＫＤ）および計算されるＷＴと比べた改善または低減倍率（ＫＤ倍率）を、表４に示す。
表４．ＡＣ１０変異体のＦｃγＲＩＩＩａ結合
【表４】
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【０１８２】
ＣＤ３０発現細胞に対してエフェクター機能を媒介するＡＣ１０変異体の能力を評価するために、ＡＣ１０変異体を、細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイで試験した。ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をバフィーコートから単離し、エフェクター細胞として使用し、ＣＤ３０陽性Ｌ５４０ホジキンリンパ腫細胞を標的細胞として使用した。Ｌ５４０標的細胞を１ウェル当たり２０,０００個で９６ウェルプレートに播き、１μｇ／ｍｌで開始し、１／２ログ毎に濃度を低下させて、トリプリケートで、設計した抗体により処理した。Ficoll 勾配を使用して単離され、ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖ／Ｆとアロタイプ分析されたＰＢＭＣを、Ｌ５４０細胞の２５倍過剰で添加し、Cytotoxicity Detection Kit (LDH, Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN) を製造業者の指示に従って使用してＬＤＨ活性について処理するまで、４時間共培養した。Wallac 1420 Victor2 （商標）を使用してプレートを読んだ。図１７ａ−１７ｃは、結果を示す。グラフは、抗体がそれらの相対的強度（potency）を反映してそれらのＥＣ５０において異なるのみならず、それらの相対的効力（efficacy）を反映して飽和濃度の抗体により得ることができる最大ＡＤＣＣレベルにおいても異なることを示す。これら２つの用語、強度と効力は、所望の臨床特性を表すのに漠然と使用されることもある。しかしながら、現在の実験の文脈では、それらは特定の量として示されるので、ここで明確に定義する。現在の実験の文脈で使用される「強度」は、ＥＧＦＲ標的化タンパク質のＥＣ５０を意味する。現在の実験の文脈で使用される「効力」は、飽和レベルでの抗体の最大の起こり得るエフェクター機能を意味する。ＡＤＣＣを媒介する能力の差異は、抗原親和性の差異、変異体可変領域がＦｃγＲ結合を実行する能力の差異、またはそれらの両方に起因し得る。それにも関わらず、抗体可変領域のＦｃγＲ結合およびエフェクター機能への貢献は、臨床的候補を選択するのに重要なパラメーターであり得る。可変領域のエフェクター機能に対する全体的または部分的な影響に基づく抗体の臨床的候補の選択は、抗体治療剤の新しい一面を表す。
【０１８３】
ＣＤ３０結合、ＦｃγＲＩＩＩａ結合およびＡＤＣＣの結果に基づき、Ｈ３／Ｌ３ ＡＣ１０変異体を可能性のあるバイオ治療薬候補として選択した。この抗体は、抗癌治療剤としての臨床使用を企図しているので、そのエフェクター機能を最適化するのが有利であり得る。以前に記載した通り、抗体の定常領域において置換を操作して、好都合な治療特性を提供できる。最も好ましい実施態様では、ＵＳＳＮ１０／６７２,２８０、ＰＣＴ ＵＳ０３／３０２４９およびＵＳＳＮ１０／８２２,２３１、並びにＵＳＳＮ６０／６２７,７７４（１１／１２／２００４に出願され、「Optimized Fc Variants」と題する）に記載の最適化されたＦｃγＲへの結合および／または増強されたエフェクター機能をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸の改変を、本発明のＡＣ１０変異体と組み合わせる。これらの研究から得られる、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含む数々の最適化Ｆｃ変異体を、quick change mutagenesis（Stratagene）を使用して、Ｈ０／Ｌ０およびＨ３／Ｌ０ ＡＣ１０抗体中で構築した。抗体を上記の通りに発現および精製した。図１８ａおよび１８ｂは、上記の通りに実行されるＡＤＣＣアッセイの結果を示し、ＷＴ（Ｈ０／Ｌ０）とＨ３／Ｌ３ ＡＣ１０を最適化Ｆｃ変異体との組合せにおいて比較する。Ｈ０／Ｌ０およびＨ３／Ｌ３ ＡＣ１０と比較して、Ｆｃ変異体抗体の強度および効力にかなりの増強が観察される。
【０１８４】
上記の通り、本発明の変異体配列は、好ましくは、構造的に重要な位置の置換は許可されない（または奨励されない）ＨＳＣ増大手順に由来するので、これらの位置が二次分析において変動を許可されるならば、ＨＳＣのさらなる最適化が恐らく可能である。残基のマスキングのために、変異体中の突然変異は、ＣＤＲおよびＶＬ／ＶＨ中間面から離れて生じることが注目される。これは、親においてこれらの決定的な領域またはその近くに突然変異を有し、故に抗原親和性を乱す可能性が有意に高いＣＤＲ移植抗体と、対照的である。このことは、ＣＤＲ移植抗体はＷＴの抗原親和性を回復するために典型的にドナー配列への逆突然変異を必要とするという事実により確証される。かかる逆突然変異は、通常、宿主配列に関する構造および免疫原性の文脈の外で行われ、最終的変異体の宿主ストリング含有量の劇的な低減を引き起こす。対照的に、本発明で提示される変異体は、宿主ストリングと構造的適格性について同じ文脈内で同時に最適化され、逆突然変異を行う必要がない。それでもなお、抗原親和性の増大またはさらなるＨＳＣの改善のために、例えば、計算ではマスクされた残基および／またはＣＤＲもしくはＶＬ／ＶＨ中間面の中またはそれらの近くの残基を突然変異させることにより、１つまたはそれ以上の後の置換を探索し得る。従って、Ｈ３／Ｌ３変異体を、さらなる最適化のための一次変異体または鋳型と考えることができ、Ｈ３／Ｌ３の変異体を、二次変異体と考えることができる。ＣＤＲ移植抗体を用いる逆突然変異と対照的に、本発明の変異体の二次置換は、宿主生殖系列に関して前向きまたは中立の突然変異を含み、故に、ＨＳＣを改善するだけであるか、またはそれに影響しないと期待される。二次変異体を生成させるさらなる利点は、良質の構造およびストリング多様性を探索することにより、例えば親和性、活性、特異性、溶解性、発現レベルおよびエフェクター機能などの他の特性も最適化できることである。
【０１８５】
ＨＳＣに中立の、正の、または最小の影響を与える、および／または、抗原親和性および／またはエフェクター機能の最適化に有意な潜在能力を有する二次置換のセットを設計するために、Ｈ３／Ｌ３配列にストリング分析を実行した。表５は、７０ＶＬ（表５ａ）および６４ＶＨ（表５ｂ）の単一突然変異のこのセットを提供する。Ｈ３の列は、ＷＴ Ｈ３アミノ酸を提供し、Ｓｕｂの列は、設計された置換を提供する。位置は、Kabat の番号付け様式に従って番号付けし、Kabat のＣＤＲ位置を太字にする。式７に従い定義される、提供されるストリングインパクトは、一次変異体配列、ここではＨ３／Ｌ３と、二次変異体配列との間のＨＳＣの差異を記載する。
【０１８６】
表５ａ．Ｌ３ ＡＣ１０の二次変異体
【表５】
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【０１８７】
【表６】
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【０１８８】
表５ｂ．Ｈ３ ＡＣ１０の二次変異体
【表７】
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【０１８９】
【表８】
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【０１９０】
quick change mutagenesisを使用して二次Ｈ３／Ｌ３変異体を構築し、全長抗体を上記の通りに発現させ、精製した。Ｈ３変異体は、Ｈ３変異体ＶＨ鎖（Ｈ３.１−Ｈ３.６４）をＬ３ ＶＬと組み合わせて含み、Ｌ３変異体は、Ｌ３変異体ＶＬ鎖（Ｌ３.１−Ｌ３.７０）をＨ３ ＶＨと組み合わせて含んだ。AlphaScreen（商標）アッセイを使用してＨ３／Ｌ３二次変異体のＣＤ３０およびＦｃγＲＩＩＩａ（先に記載した通り）への結合を測定し、そしてタンパク質Ａへの結合を、タンパク質Ａアクセプタービーズに直接結合したビオチン化ＡＣ１０およびストレプトアビジンドナービーズを使用して測定した。図１９は、選択されたＡＣ１０変異体のＣＤ３０への結合の AlphaScreen（商標）結合曲線を提供する。ＣＤ３０、ＦｃγＲＩＩＩａおよびタンパク質Ａへの結合について、ＷＴ Ｈ３／Ｌ３と比べたＩＣ５０倍率を、表５に提供する。数々のＨ３／Ｌ３二次変異体は、親のＨ３／Ｌ３に匹敵するか、または改善されたＣＤ３０抗原への結合を提供し、これらの置換の組合せを含むさらなる変異体の操作を可能にし、このことは、ＨＳＣおよび／または抗原親和性にさらなる増強を提供し得る。
【０１９１】
抗原親和性、エフェクター機能、安定性、溶解性、発現などに関して好ましい特性を示す二次置換を後の変異体において組み合わせ、より最適化された治療剤候補を生成させ得る。Ｌ３.７１、Ｌ３.７２、Ｈ３.６８、Ｈ３.６９およびＨ３.７０と呼ばれる、記載した二次置換の組合せを含む２つの新しいＶＬおよび３つの新しいＶＨ変異体を設計した。図２０−２４は、これらの新しいＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体の各々について、配列、宿主ストリング含有量およびモデル化されたＡＣ１０構造上にマッピングされた突然変異の差異を提示する。表６は、これらのＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体について、親配列からの突然変異の数、構造適格性スコア、宿主ストリングスコアおよび相同性スコアを提示する。
【０１９２】
【表９】
2007512846.tif 000023
【０１９３】
提供されるＡＣ１０変異体抗体は、抗癌治療剤の臨床的候補であるので、それらのエフェクター機能を最適化するのが有利であり得る。以前に記載した通り、抗体の定常領域で置換を操作して、好都合な臨床的特性を提供できる。本発明の変異体のエフェクター機能を変更するＦｃ改変との組合せを予想する。最も好ましい実施態様では、ＵＳＳＮ１０／６７２,２８０、ＰＣＴ ＵＳ０３／３０２４９およびＵＳＳＮ１０／８２２,２３１並びにＵＳＳＮ６０／６２７,７７４（１１／１２／２００４に出願され、「Optimized Fc Variants」と題する）に記載の最適化されたＦｃγＲへの結合および／または増強されたエフェクター機能をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸の改変を、本発明のＡＣ１０変異体と組み合わせる。最適な抗ＣＤ３０臨床候補は、親の抗ＣＤ３０抗体と比べて免疫原性を低減し、かつエフェクター機能を増強するアミノ酸の改変を含み得る。図２５ａ−２５ｃは、増強されたエフェクター機能を提供する１つまたはそれ以上の改変をＳ２３９、Ｖ２６４、Ａ３３０およびＩ３３２に含む数々の可能な変異体ＩｇＧ１定常領域と組み合わせた、上記の通りのＬ３.７１／Ｈ３.７０ＡＣ１０を含むＡＣ１０変異体の軽鎖および重鎖配列を提供する。
【０１９４】
ヒトＩｇＧ１は、治療的抗体に最も一般的に使用される定常領域であるが、他の実施態様は、他のＩｇＧ免疫グロブリン鎖の定常領域またはそれらの変異体を利用し得る。ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣなどのエフェクター機能および血清半減期は、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むこれらの異なるクラスの抗体間で有意に異なる（Michaelsen et al., 1992, Molecular Immunology, 29(3): 319-326）。数々の研究が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４変異体を、これらの間のエフェクター機能の差異の決定因子を調査するために探索した。例えば、Canfield & Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173: 1483-1491; Chappel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(20): 9036-9040; Chappel et al., 1993, Journal of Biological Chemistry 268:25124-25131; Tao et al., 1991, J . Exp. Med. 173: 1025-1028; Tao et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 661-667; Redpath et al., 1998, Human Immunology, 59, 720-727 参照。当分野で知られている方法を使用して、相互に有意な配列または構造相同性を有するタンパク質において、対応するか、または均等である残基を決定することが可能である。同様に、例えば、ＵＳＳＮ６０／６２１,３８７および６０／６２９,０６８に記載の通り、最適な特性を提供するために、そのような方法を使用して、他の免疫グロブリンクラスの定常領域を含む抗体またはＦｃ融合体におけるアミノ酸の改変を操作することが可能である。一例として、ＩｇＧ２の比較的乏しいエフェクター機能を、鍵となるＦｃγＲ結合残基を、より良好なエフェクター機能を有するＩｇＧ、例えばＩｇＧ１中の対応するアミノ酸と置き換えることにより改善し得る。例えば、ＦｃγＲ結合に関して、ＩｇＧ２とＩｇＧ１との間の鍵となる残基の差異には、Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５、−２３６（ＩｇＧ１と比べた、ＩｇＧ２における欠失を表す）およびＧ３２７が含まれ得る。従って、これらの残基の１つまたはそれ以上が対応するＩｇＧ１のアミノ酸、即ちＰ２３３Ｅ、Ｖ２３４Ｌ、Ａ２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６でのグリシンの挿入を表す）およびＧ３２７Ａで置き換えられる１つまたはそれ以上の親ＩｇＧ２のアミノ酸の改変は、増強されたエフェクター機能を提供し得る。さらに、１つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸の改変、例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅまたはこれらの上記の通りの組合せは、親ＩｇＧ２と比べて増強されたＦｃγＲ結合およびエフェクター機能を提供し得る。図２５ａ、２５ｄおよび２５ｅは、この実施態様を例示説明し、数々の可能な変異体ＩｇＧ２定常領域と組み合わせた、Ｌ３.７１／Ｈ３.７０ ＡＣ１０を含むＡＣ１０変異体の軽鎖および重鎖の配列を提供する。
【０１９５】
図２５において定義される、増強されたエフェクター機能を提供するＦｃの改変は、エフェクター機能の最適化について本発明をこれらの改変のみに制限することを意味しない。例えば、ＵＳ６,７３７,０５６、ＰＣＴ ＵＳ２００４／０００６４３、ＵＳＳＮ１０／３７０,７４９およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５１１２に記載の通り、置換Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｄ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡおよびＰ３９６Ｌは、最適化されたＦｃγＲ結合および／または増強されたＡＤＣＣを提供する。さらに、Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572 に開示の通り、置換Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６ＹおよびＥ３３３Ｓは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対する増強された結合および増強されたＣＤＣを提供する。Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 に記載の通り、置換Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｅ、Ｍ４２８ＬおよびＭ４２８Ｆは、増強されたＦｃＲｎへの結合および改善された薬物動態を提供する。改変は、Ｆｃ領域に限定される必要はない。Ｆａｂおよびヒンジ領域における突然変異の差異が、最適化されたＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑ結合および／またはエフェクター機能を提供し得ることも可能である。例えば、ＵＳＳＮ６０／６１４,９４４およびＵＳＳＮ６０／６１９,４０９（２００４年１０月１４日に出願され、「Immunoglobulin Variants Outside the Fc Region with Optimized Effector Function」と題する）に開示の通り、抗体のＦａｂおよびヒンジ領域は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）などのエフェクター機能に影響し得る。従って、Ｆｃ、Ｆａｂおよび／またはヒンジ領域に置換を含む免疫グロブリン変異体が企図される。例えば、それらの抗体を、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１および／またはヒンジ領域における１つまたはそれ以上の置換と組み合わせ得る。さらに、ＵＳＳＮ６０／６２１,３８７（１０／２１／２００４出願、「IgG Immunoglobulin Variants with Optimized Effector Function」と題する）に記載の通り、非ＩｇＧ１免疫グロブリンにおいて他の免疫グロブリンクラス中の対応するアミノ酸へのさらなる改変を行い、より最適な特性を提供し得る。例えば、ある実施態様では、図２５に提示の抗体と類似するＩｇＧ２抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３にある１つまたはそれ以上の対応するアミノ酸への改変を含み得る。他の実施態様では、図２５に提示の抗体と類似するＩｇＧ２抗体は、ＩｇＧ１のＣＨ１およびヒンジの置換を全て含み得る。即ち、該ＩｇＧ２変異体は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびヒンジの全体を含む。
【０１９６】
実施例２．Ｃ２２５の免疫原性の低減
本明細書に記載の発明の方法のさらなる適用を例示説明するために、そしてタンパク質の免疫原性の低減へのその広い適用性を裏付けるために、Ｃ２２５の可変領域を親配列として使用する第２の異種抗体の実施例を提供する（セツキシマブ（cetuximab）、Erbitux（登録商標）, Imclone）（ＵＳ４,９４３,５３３；ＰＣＴ ＷＯ９６／４０２１０）。Ｃ２２５は、マウス抗ＥＧＦＲ抗体であり、そのキメラ版は、癌の処置に現在承認されている。マウスＣ２２５の可変領域の構造モデルを、当分野で知られている標準的抗体モデル化方法を使用して構築した。図２６および２７は、Ｃ２２５のＶＬおよびＶＨドメインの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。この抗体のＣＤＲ移植を、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴを使用して、ＶＬにはｖｌｋ＿６Ｄ−２１、ＶＨにはｖｈ＿４−３０−４と決定される最も相同なヒト生殖系列フレームワークの文脈にＣ２２５のＣＤＲを置くことにより構築した。これらのＣＤＲ移植の配列およびストリング含有量を、図２８および２９に、モデル化したＣ２２５の構造と共に、ＣＤＲを移植されたＣ２２５の可変鎖とＷＴとの間の突然変異の差異を強調して示す。
【０１９７】
複数のアミノ酸置換ではなく単一のものをサンプリングすることを除き、ＡＣ１０について上記したのと同様に、ＷＴ Ｃ２２５ ＶＬおよびＶＨ配列にストリング最適化アルゴリズムを適用することにより、免疫原性が低減された変異体を生成させた。各配列のＨＳＣを、ウインドウサイズｗ＝９を使用して最適化し、同じＣＤＲおよびＶＬ／ＶＨ中間面に近接する残基のセットをマスクした。計算は、Ｃ２２５ ＶＬおよびＶＨについて、１００回の別々の反復で行い、ＷＴより宿主ストリング含有量が高い多様なＣ２２５変異体のセットを生成させた。図３０は、Ｃ２２５ ＶＬおよびＶＨ領域について、各々Ｃ２２５ ＶＬ ＨＳＣ計算１およびＣ２２５ ＶＨ ＨＳＣ計算１と呼ばれる、これらの計算のアウトプット配列の重複しないセットを示す。ＨＳＣスコアに加えて、その構造整合性を評価するために、各配列の構造コンセンサスおよび構造優先を評価した（Protein Engineering with Analogous Contact Environments と題する２００３年１２月８日出願のＵＳＳＮ６０／５２８,２２９）。
【０１９８】
ＨＳＣを最適化するために、アルゴリズムが単一の置換のみではなく複数のアミノ酸置換をサンプリングすることを許可されるのを除き、類似の計算の第２のセットをＣ２２５のＶＬおよびＶＨの配列で実行した。図３１は、Ｃ２２５のＶＬおよびＶＨ領域について、各々Ｃ２２５ ＶＬ ＨＳＣ計算２およびＣ２２５ ＶＨ ＨＳＣ計算２と呼ばれる、これらの計算のアウトプット配列の重複しないセットを示す。ここで、ＨＳＣスコアに加えて、「構造コンセンサス」および「構造優先」（ＵＳＳＮ６０／５２８,２２９およびＵＳＳＮ６０／６０２,５６６）と呼ばれる構造適格性の２つの測定値を使用し、各配列をその構造および機能的整合性について評価する。それらのセット中の他の配列からの突然変異距離をベースとして、アウトプット配列をクラスター化し、これらのクラスターを、図中の水平黒色線により線引きする。
【０１９９】
上記および図３０および３１に提示の計算を使用して、Ｃ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体のセットを生成させた。いくつかの場合では、ストリングおよび構造スコア並びにモデル化されたＣ２２５構造の目視検査を使用して、アウトプット配列にさらなる置換を作成し、適格性を評価した。図３２−４０は、Ｃ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体の各々について、配列、構造スコア、ストリングスコアおよびモデル化されたＣ２２５構造上にマッピングされた突然変異の差異を提示する。Ｃ２２５ ＶＬ ＨＳＣ計算１の反復２１は、Ｌ２ Ｃ２２５ ＶＬの前駆体として役立ち、Ｃ２２５ ＶＬ ＨＳＣ計算２の反復１７は、Ｌ３ Ｃ２２５ ＶＬの前駆体として役立ち、Ｃ２２５ ＶＬ ＨＳＣ計算２の反復３８は、Ｌ４ Ｃ２２５ ＶＬの前駆体として役立ち、Ｃ２２５ ＶＨ ＨＳＣ計算１の反復２３は、Ｈ３、Ｈ４およびＨ５ Ｃ２２５ ＶＨの前駆体として役立ち、Ｃ２２５ ＶＨ ＨＳＣ計算２の反復５は、Ｈ６ Ｃ２２５ ＶＨの前駆体として役立ち、Ｃ２２５ ＶＨ ＨＳＣ計算２の反復４１は、Ｈ７ Ｃ２２５ ＶＨの前駆体として役立ち、Ｃ２２５ ＶＨ ＨＳＣ計算２の反復４４は、Ｈ８ Ｃ２２５ ＶＨの前駆体として役立った。
【０２００】
表７および８は、Ｃ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体について、ＷＴおよびＣＤＲ移植Ｃ２２５配列と比較した、突然変異、構造適格性および宿主ストリング含有量のスコアを提示する。加えて、配列中の各ストリングについて、ＮＩＤｍａｘと呼ばれる、生殖系列に対する最大の同一性の一致も決定した。これは、ヒト生殖系列中の対応するストリングに対する最大の同一性が示した値である、各配列中のストリングの総数を表す。ｗ＝９について、表７および８は、各配列について、Ｎ９ｍａｘ、Ｎ８ｍａｘ、Ｎ７ｍａｘおよびＮ＜６ｍａｘを列挙する。また、フレームワーク領域均一性も提供する。上述の構造および宿主ストリング分析に加えて、ヒト生殖系列に対するその大域的相同性について、各配列を分析した；表７および８は、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴを使用して決定した、各配列について最も相同であるヒト生殖系列配列（最も近い生殖系列）およびその生殖系列への対応する同一性（最も近い生殖系列に対するＩＤ）を提示する。
【０２０１】
【表１０】
2007512846.tif 000024
【０２０２】
【表１１】
2007512846.tif 000025
【０２０３】
再度、ＣＤＲを移植されたＣ２２５抗体は、単一のヒト生殖系列配列に最も相同であるが、本発明のＣ２２５変異体は、配列の様々な領域において様々なヒト生殖系列配列に相同である。ＣＤＲを移植されたＣ２２５ ＶＨは、その配列全体に亘り、ヒト生殖系列サブファミリー４に最も相同であるが、Ｈ４ Ｃ２２５ ＶＨは、ＦＲ１のサブファミリー４、ＦＲ２のサブファミリー３およびＦＲ３のサブファミリー２に最も相同である。加えて、ＣＤＲ移植抗体は、親配列に最も相同な配列でもある単一の生殖系列配列に最も相同であるが、本発明は、ＷＴに最も相同な生殖系列配列である必要がない様々なヒト生殖系列配列に最も相同である、所定の抗体のための抗体のセットを提示する。例えば、表７は、ＣＤＲ移植Ｃ２２５ ＶＬが、ＷＴ ＡＣ１０にも最も相同なヒト生殖系列であるｖｌｋ＿６Ｄ−２１に、最も相同であることを示す。しかしながら、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、３つの異なるヒト生殖系列−ｖｌｋ＿３−１１、ｖｌｋ＿１Ｄ−１３およびｖｌｋ＿６Ｄ−２１に、各々最も相同である。従って、本発明の変異体は、ＣＤＲ移植抗体よりも、実質的に多量の多様性を探索する。
【０２０４】
Ｃ２２５可変領域の遺伝子を、上記の通りに構築し、Ｆａｂとしての発現のためにマウス定常領域を含むｐＡＳＫ８４ベクター（Skerra, 1994, Gene 141: 79-84）にサブクローニングした。選択されたＣ２２５変異体を、ＥＧＦＲ抗原に結合するそれらの能力について、実験的に試験した。Ｌ２／Ｈ３およびＬ２／Ｈ４ Ｃ２２５ ＦａｂをｐＡＳＫ８４ベクターから大腸菌（E. Coli）でＨｉｓタグと共に発現させ、ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。上記と同様のＳＰＲを使用して、Ｃ２２５変異体の抗原親和性を試験した。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（R&D Systems から購入した）を、ＣＭ５チップのデキストランマトリックスにＮＨＳ連結化学を使用して共有結合させた。Ｃ２２５ Ｆａｂを、ＥＧＦＲセンサーチップの表面と様々な濃度で反応させた。これらの濃度系列について、BiaEvaluation 曲線フィッティングソフトウェアを使用して大域的ラングミュアフィットを実行した。これらのフィットから誘導される会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、平衡結合定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）、並びに予測される飽和結合シグナル（Ｒｍａｘ）を、フィット曲線の実際のデータの曲線からの平均偏差を定量するＣｈｉ２と共に表９に提示する。データは、Ｌ２／Ｈ３およびＬ２／Ｈ４Ｃ ２２５変異体の両方が、ＥＧＦＲ抗原を結合することを示す。
【０２０５】
【表１２】
2007512846.tif 000026
【０２０６】
抗ＥＧＦＲ変異体を全長抗体の文脈で調査するために、Ｃ２２５ ＷＴ（Ｌ０およびＨ０）および変異体（Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ８）領域を、上記の通りに哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１Ｚｅｏ（Invitrogen）にサブクローニングした。軽鎖と重鎖のプラスミドの全ての組合せを２９３Ｔ細胞に共形質移入し、上記の通りに抗体を発現、回収および精製した。Ｃ２２５ ＷＴ（Ｌ０／Ｈ０）および変異体（Ｌ０／Ｈ３、Ｌ０／Ｈ４、Ｌ０／Ｈ５、Ｌ０／Ｈ６、Ｌ０／Ｈ７、Ｌ０／Ｈ８、Ｌ２／Ｈ３、Ｌ２／Ｈ４、Ｌ２／Ｈ５、Ｌ２／Ｈ６、Ｌ２／Ｈ７、Ｌ２／Ｈ８、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ３／Ｈ４、Ｌ３／Ｈ５、Ｌ３／Ｈ６、Ｌ３／Ｈ７、Ｌ３／Ｈ８、Ｌ４／Ｈ３、Ｌ４／Ｈ４、Ｌ４／Ｈ５、Ｌ４／Ｈ６、Ｌ４／Ｈ７およびＬ４／Ｈ８）抗体の結合を、上記と同様にＳＰＲを使用して決定した。上記の通りに、全長抗体をＥＧＦＲセンサーチップ上に流す。図４１は、これらの実験から得られるＳＰＲセンサーグラムを示す。これらの曲線は、会合期および解離期からなり、その分離は各曲線上の小さい棘によりマークされている。非常に粗い概算として、会合期の終わり近くで達するシグナルのレベルを、相対的結合のインジケーターとして使用できる。全曲線について、このシグナルレベルは平均レベルの２５％以内にあり、このことは、抗体変異体はいずれもＥＧＦＲへの結合能力を有意に失っていないことを示す。
【０２０７】
抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲ発現細胞に対してエフェクター機能を媒介する能力を評価するために、Ｃ２２５変異体を細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイで試験した。ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、Ａ４３１類表皮癌細胞を標的細胞として使用し、上記の通り、Cytotoxicity Detection Kit を使用するＬＤＨ活性の測定により、溶解をモニターした。図４２は、ＷＴおよび変異体Ｃ２２５抗体について、様々な抗体濃度でのＡＤＣＣの用量依存性を示す。結果は、数々のＣ２２５変異体が、強度および効力に関して、ＷＴ Ｃ２２５に匹敵するか、またはそれより良好なＡＤＣＣを有することを示す。これらのデータに抗原親和性データおよび他のデータと共に重みをつけ、最適な抗ＥＧＦＲ臨床候補を選択し得る。上記でＡＣ１０変異体で例証した通り、本発明のＣ２２５変異体と、エフェクター機能を変更するアミノ酸の改変の組合せが企図されている。
【０２０８】
実施例３．ＩＣＲ６２の免疫原性の低減
本明細書に記載の発明の方法の適用をさらに例示説明するために、そしてタンパク質の免疫原性の低減へのその広い適用性を裏付けるために、抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２（Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80）を親配列として使用する実施例を提供する。ラットＩＣＲ６２可変領域の構造モデルを、当分野で知られている標準的抗体モデル化方法を使用して構築した。図４３および４４は、ＩＣＲ６２のＶＬおよびＶＨドメインの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。この抗体のＣＤＲ移植を、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴを使用して、ＶＬにはｖｌｋ＿１−１７と、そしてＶＨにはｖｈ＿１−ｆと決定される最も相同なヒト生殖系列フレームワークの文脈にＩＣＲ６２のＣＤＲを置くことにより構築した。これらのＣＤＲ移植の配列およびストリング含有量を、図４５および４６に、モデル化したＩＣＲ６２の構造と共に、ＣＤＲを移植されたＩＣＲ６２の可変鎖とＷＴとの間の突然変異の差異を強調して示す。
【０２０９】
複数のアミノ酸置換ではなく単一のものをサンプリングすることを除き、ＡＣ１０について上記したのと同様に、ＷＴ ＩＣＲ６２ ＶＬおよびＶＨ配列にストリング最適化アルゴリズムを適用することにより、免疫原性が低減された変異体を生成させた。各配列のＨＳＣを、ウインドウサイズｗ＝９を使用して最適化し、同じＣＤＲおよびＶＬ／ＶＨ中間面に近接する残基のセットをマスクした。計算は、ＩＣＲ６２のＶＬおよびＶＨについて、１００回の別々の相互作用で行い、ＷＴより宿主ストリング含有量が高い多様なＩＣＲ６２変異体のセットを生成させた。図４７は、ＩＣＲ６２のＶＬおよびＶＨ領域について、各々ＩＣＲ６２ ＶＬ ＨＳＣ計算１およびＩＣＲ６２ ＶＨ ＨＳＣ計算１と呼ばれる、これらの計算のアウトプット配列の重複しないセットを示す。ＨＳＣスコアに加えて、その構造的整合性を評価するために、各配列の構造コンセンサスおよび構造優先を評価した（Protein Engineering with Analogous Contact Environments と題する２００３年１２月８日出願のＵＳＳＮ６０／５２８,２２９）。
【０２１０】
上記および図４７に提示の計算を使用して、ＩＣＲ６２のＶＬおよびＶＨ変異体のセットを生成させた。いくつかの場合では、ＨＳＣおよび構造優先スコア並びにモデル化されたＩＣＲ６２構造の目視検査を使用して、アウトプット配列にさらなる置換を作成し、適格性を評価した。図４８−５０は、ＩＣＲ６２のＶＬおよびＶＨ変異体の各々について、配列、宿主ストリング含有量およびモデル化されたＩＣＲ６２構造上にマッピングされた突然変異距離を提示する。ＩＣＲ６２ ＶＬ ＨＳＣ計算１の反復２０は、Ｌ２ ＩＣＲ６２ ＶＬの前駆体として役立った。ＩＣＲ６２ ＶＨ ＨＳＣ計算１の反復１は、Ｈ９の前駆体として役立ち、ＩＣＲ６２ ＶＨ ＨＳＣ計算２の反復５は、Ｈ１０ ＩＣＲ６２ ＶＨの前駆体として役立った。
【０２１１】
表１０および１１は、ＩＣＲ６２のＶＬおよびＶＨ変異体について、ＷＴおよびＣＤＲ移植ＩＣＲ６２配列と比較した、突然変異、構造適格性および宿主ストリング含有量のスコアを提示する。加えて、配列中の各ストリングについて、ＮＩＤｍａｘと呼ばれる、生殖系列に一致する最大の同一性、並びにフレームワーク領域均一性も提供する。上述の構造および宿主ストリング分析に加えて、宿主生殖系列に対するその大域的相同性について、各配列を分析した；表１０および１１は、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴを使用して決定した、各配列について最も相同である宿主生殖系列配列（最も近い生殖系列）およびその生殖系列への対応する同一性（最も近い生殖系列に対するＩＤ）を提示する。
【０２１２】
【表１３】
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【０２１３】
【表１４】
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【０２１４】
再度、ＦＲＨおよび最も近い生殖系列の有意な差異から観察される通り、ＩＣＲ６２変異体は、配列の様々な領域において様々な宿主生殖系列配列に相同である。ＩＣＲ６２ ＷＴおよびＬ２／Ｈ９可変領域の遺伝子を、上記の通りに構築し、改変されたｐＡＳＫ８４ベクター（Skerra, 1994, Gene 141: 79-84）にサブクローニングした。ＩＣＲ６２のＦａｂを、ＥＧＦＲ抗原を結合するそれらの能力について、実験的に試験した。ＷＴおよびＬ２／Ｈ９ ＩＣＲ６２のＦａｂをｐＡＳＫ８４ベクターから大腸菌でＨｉｓタグと共に発現させ、ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。ＣＭ５チップに共有結合させたＥＧＦＲを様々な濃度でＩＣＲ６２抗体と反応させ、上記と同様のＳＰＲを使用して、ＩＣＲ６２抗体の抗原親和性を試験した。上記の通り、データのフィットを表１２に提供する。BiaEvaluation 曲線フィッティングソフトウェアを使用して、濃度系列についてフィットを実行した。わかるように、Ｌ２／Ｈ９ ＩＣＲ６２は、ＷＴに匹敵する親和性でＥＧＦＲ抗原に結合する。
【０２１５】
【表１５】
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【０２１６】
実施例４．免疫グロブリンのストリング多様性の探索
ＨＳＣに基づく突然変異多様性の生成は、Ｈ３／Ｌ３ ＡＣ１０について上記した一次変異体−二次変異体戦略よりもかなり広範である。実際に、任意の親タンパク質について、置換が親配列の宿主ストリング含有量に正または中立の影響をもたらす置換を設計できる。再度、そのような戦略の利点は、抗原親和性、活性、特異性、溶解性、発現レベルおよびエフェクター機能を含むがこれらに限定されるものではない、最適化された特性を有する可能性のある、免疫原性が最小である変異体の多様なセットをそれが生成することである。そのような変異体のセットを設計し、例えば、非ヒト抗体、ヒト化またはそれ以外のやり方で操作された抗体 (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402), (Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)）、および、例えば遺伝子導入マウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458）、または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108）を使用して得られる「完全なヒト」抗体を含むがこれらに限定されるものではない、他の親免疫グロブリンの多様性を探索し得る。
【０２１７】
実施例５．本発明の方法により生成された変異体タンパク質の独特な特性
本明細書に記載の発明の方法は、同じまたは類似の目標を目指して他の方法で生成される変異体タンパク質と比べて、数々の独特な特性を保有する変異体タンパク質を生成させる。図５１および５２は、本発明のＡＣ１０、Ｃ２２５およびＩＣＲ６２のＶＨ（図５１）およびＶＬ（図５２）変異体の宿主ストリング含有量（ＨＳＣ、式３）、精密ストリング含有量（ＥＳＣ、式３ａ）およびフレームワーク領域均一性（ＦＲＨ、式１０）を、先行技術の方法により「ヒト化された」数々の抗体可変領域と比較して提供する。変異体配列の精密ストリング含有量が、専ら単一の生殖系列配列に由来するならば、ＦＲＨは１.０に近づく。あるいは、本発明により創成される変異体配列の多くでよくあることであるが、ＦＲＨ値は、１より有意に小さくてもよく、０.４ないし１.０の範囲にある値は、期待される通り、高い精密ストリング含有量を有する配列を、複数の生殖系列サブファミリーおよび配列の貢献により発見できることを示す。同時に、本発明を使用して操作した変異体配列は、高い宿主ストリング含有量を有し、従って、ヒトにおいて免疫原性である可能性が低いと予測される。例えば、図５１に示す通り、本発明を使用して、一般的にＨＳＣ値が７５％より高い変異体ＶＨ配列を生成させた。これらの多くは、０.６より低いＦＲＨ値を有し、このことは、それらのＨＳＣが複数の生殖系列フレームワークに由来することを示す。図５２に記載の通り、同様の傾向が、本発明を使用して生成される変異体ＶＬ配列に適用される。
【０２１８】
例示説明のために本発明の特定の実施態様を上記で説明したが、添付の特許請求の範囲に記載した本発明から逸脱せずに、膨大な詳細の変形をなし得ることが当業者に理解される。全参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１ａ】図１は、ヒト生殖系列の配列および多様性を示す。図１ａは、ヒトＶＨ鎖をコードすると知られている配列を示す。
【図１ｂ】図１は、ヒト生殖系列の配列および多様性を示す。図１ｂは、ヒトＶＬカッパ鎖をコードすると知られている配列を示す。
【図１ｃ】図１は、ヒト生殖系列の配列および多様性を示す。図１ｃは、ＶＨおよびＶＬカッパＪ鎖をコードすると知られている配列を示す。
【図２ａ】図２は、式１、２および３により記載される量を図解説明する。図２ａでは、ＩＤストリング（式１）を図解説明する。
【図２ｂ】図２は、式１、２および３により記載される量を図解説明する。図２ｂでは、ＩＤｍａｘ（式２）を図解説明する。
【図２ｃ】図２は、式１、２および３により記載される量を図解説明する。図２ｃでは、ＨＳＣ（ｓ）（式３）を図解説明する。
【図３】図３は、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４】図４は、ＷＴ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図５】図５は、ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図６】図６は、ＣＤＲ移植ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図７】図７は、最適化ＨＳＣを有するＡＣ１０ ＶＬおよびＶＨ変異体を示す。
【図８】図８は、Ｌ１ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図９】図９は、Ｌ２ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図１０】図１０は、Ｌ３ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図１１】図１１は、Ｈ１ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図１２】図１２は、Ｈ２ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図１３】図１３は、Ｈ３ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図１４】図１４は、ＡＣ１０変異体と標的抗原ＣＤ３０との間の結合を測定する AlphaScreen（商標）アッセイを示す。
【図１５】図１５は、ＡＣ１０ ＷＴおよび変異体全長抗体のＣＤ３０標的抗原への結合を示す、ＳＰＲセンサーグラムである。
【図１６】図１６は、ＡＣ１０変異体とヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａとの結合を測定する AlphaScreen（商標）アッセイを示す。
【図１７】図１７は、ＷＴおよびＡＣ１０変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。
【図１８】図１８は、エフェクター機能の増強を提供するＦｃ変異体を含むＷＴ（Ｈ０／Ｌ０）およびＨ３／Ｌ３ ＡＣ１０抗体のＡＤＣＣ能力を測定する、細胞をベースとするアッセイを示す。
【図１９】図１９は、選択されたＨ３Ｌ３二次ＡＣ１０変異体と標的抗原ＣＤ３０との間の結合を測定する、AlphaScreen（商標）アッセイを示す。
【図２０】図２０は、Ｌ３.７１ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２１】図２１は、Ｌ３.７２ ＡＣ１０ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２２】図２２は、Ｈ３.６８ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２３】図２３は、Ｈ３.６９ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２４】図２４は、Ｈ３.７０ ＡＣ１０ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２５】図２５は、Ｆｃ領域にアミノ酸の改変を含み得る、ＣＬ□定常軽鎖を有するＬ３.７１ ＡＣ１０変異体ＶＬ（図２５ａ）およびＩｇＧ定常鎖を有するＨ３.７０ ＡＣ１０変異体ＶＨ（図２５ｂ−２５ｅ）を含む、ＡＣ１０変異体抗体のアミノ酸配列を示す。
【図２６】図２６は、ＷＴ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２７】図２７は、ＷＴ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２８】図２８は、ＷＴ Ｃ２２５のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｌｋ＿６Ｄ−２１のフレームワークおよびＦＲ４中のＬ１０６Ｉ（Kabat の番号付け）置換に由来する、ＣＤＲ移植Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図２９】図２９は、ＷＴ Ｃ２２５のＣＤＲおよびヒト生殖系列配列ｖｈ＿４−３０−４のフレームワークおよびＦＲ４中のＡ１１３Ｓ（Kabat の番号付け）置換に由来する、ＣＤＲ移植Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３０】図３０は、最適化ＨＳＣを有するＣ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体を示す。
【図３１】図３１は、最適化ＨＳＣを有するＣ２２５ ＶＬおよびＶＨ変異体を示す。
【図３２】図３２は、Ｌ２ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３３】図３３は、Ｌ３ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３４】図３４は、Ｌ４ Ｃ２２５ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３５】図３５は、Ｈ３ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３６】図３６は、Ｈ４ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３７】図３７は、Ｈ５ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３８】図３８は、Ｈ６ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図３９】図３９は、Ｈ７ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４０】図４０は、Ｈ８ Ｃ２２５ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４１】図４１は、全長抗体Ｃ２２５変異体のＥＧＦＲ標的抗原への結合を示すＳＰＲセンサーグラムである。
【図４２】図４２は、Ｃ２２５ ＷＴおよび変異体全長抗体の、細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。
【図４３】図４３は、ＷＴ ＩＣＲ６２ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４４】図４４は、ＷＴ ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４５】図４５は、ＣＤＲ移植ＩＣＲ６２ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４６】図４６は、ＣＤＲ移植ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４７】図４７は、最適化ＨＳＣを有するＩＣＲ６２ ＶＬおよびＶＨ変異体を示す。
【図４８】図４８は、Ｌ３ ＩＣＲ６２ ＶＬの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図４９】図４９は、Ｈ９ ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図５０】図５０は、Ｈ１０ ＩＣＲ６２ ＶＨの配列、宿主ストリング含有量および構造を示す。
【図５１】図５１は、先行技術の方法によりヒト化されたＶＨ配列と、本発明の方法によるものとの比較を示す。
【図５２】図５２は、先行技術の方法によりヒト化されたＶＬ配列と、本発明の方法によるものとの比較を示す。
【図１ａ−１】
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【図１ａ−２】
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【図１ａ−３】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１ａ】
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【図５１ｂ】
2007512846.tif 000089
【図５１ｃ】
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【図５２ａ】
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【図５２ｂ】
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【図５２ｃ】
2007512846.tif 000093
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月7日(2006.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007512846000001.app
【国際調査報告】
2007512846.tif 000094
2007512846.tif 000095