(57)【要約】  本発明では、通性細胞内微生物が原因となって引き起こされる感染性疾患に対する通常の治療を補助するための、免疫賦活剤の使用に関する。この型の感染、特に、結核菌（Tuberculosis）による感染において備わる免疫応答を分析することから出発して、可溶性βグリカン型免疫賦活剤をプロスタグランジンEブロック型の抗炎症剤と組み合わせた治療用キットを使用する。これらを共同で使用すると、免疫応答が調節され、それにより各抗生物質での治療時間が短縮可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
通性細胞内微生物による疾患の治療を助ける哺乳動物の免疫応答を増強するキットであって、
ａ）サイトカイン活性の選択的ブロッカーと医薬的に受容可能な担体とを含む第1の化合物、
ｂ）選択的シクロオキシゲナーゼ2阻害因子と医薬的に受容可能な担体とを含む第2の化合物と、
ｃ）該第1の化合物と該第2の化合物のための容器、
を含むキット。
【請求項２】
サイトカイン活性の選択的ブロッカーが好ましくは可溶性βグリカンである請求項1に記載のキット。
【請求項３】
可溶性βグリカンが天然形態、組換え形態、または変異体形態である請求項2に記載のキット。
【請求項４】
可溶性βグリカンが異種発現ベクターによって提供される請求項3に記載のキット。
【請求項５】
サイトカインが、イソ型1、2、および3のTGF-β型インターロイキンである請求項１に記載のキット。
【請求項６】
選択的シクロオキシゲナーゼ2阻害因子がニフルム酸である請求項1に記載のキット。
【請求項７】
疾患の治療中治療を助けるための哺乳動物の免疫応答を増強する方法であって、抗サイトカインの選択的ブロッカーと選択的シクロオキシゲナーゼ2阻害因子の投与を含む方法。
【請求項８】
疾患が、通性細胞内微生物が原因となって引き起こされ、好ましくは、結核、トリパノソーマ症、ハンセン病、およびリーシュマニア症である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重大な公衆衛生問題である感染性疾患、特に、通性細胞内微生物が原因である感染性疾患、例えば、結核、リーシュマニア症、トリパノソーマ症の治療を助けるための免疫賦活剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
開発途上国においては、感染性疾患が死亡の主要な原因の１つとなり続けており、これは、循環器疾患やガンによる死亡を上回っている。感染性疾患には、通性細胞内微生物によって引き起こされる疾患があり、例えば、結核（TB）の場合がそうであり、これはこれら疾患のうちの主要な死亡原因である。多剤耐性株および後天性免疫不全症候群（AIDS）の出現により、この疾患の発症率が増大している（Kochi A. The
global tuberculosis situation and the new control strategy of the World Health
Organization. Tubercle 1991, 72:1-6）。
【０００３】
TBは、動物、主に、ウシ、ネコ、イヌ、および鳥類のような家畜や飼育動物にも感染することができる。トリパノソーマ症やリーシュマニア症のような他の疾患は公衆衛生問題ではあるが、それらの発症率はTBの発症率ほど重要ではない。しかし、これらの全ての疾患において、治療は、患者が呈する免疫学的変化が原因となって複雑である。
【０００４】
AIDSの流行は、肺結核および肺外結核の症例を引き起こし、これらは最近10年間に増加しており、ほぼ全世界において健康問題についての重点的な疾患となっている（Kochi A. The global tuberculosis situation and the new control
strategy of the World Health Organization. Tubercle 1991, 72:1-6, Sudre P, ten
Dam G, and Kochi A., Tuberculosis: a global overview of the situation
today.  Bull World Health Organ 1992；70:149）。
【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染した人では、結核の発症するリスクが10倍である。HIVに感染した個体では、他の感染症、例えば結核の存在により、ウイルスはさらに迅速に増殖することが可能になり、その結果、感染の進行が加速される。感染が進行するにつれて白血球の数と機能が低下し、免疫系はもはや、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の増殖と蔓延を防ぐことができなくなる。
【０００６】
世界の人口の3分の1がヒト型結核菌（Mycobacterium
tuberculosis）に感染していると算定される。感染後には、疾患の発症のリスクはおよそ10％であり、残りの90％は生存能力のある病原菌に潜在的に感染し続ける。この10％にあたる800万人が、毎年、活動性結核であると報告され、その結果、毎年、300万人が死亡している（Kochi A.  The global tuberculosis situation and the new control
strategy of the World Health Organization. Tubercle 1991, 72:1-6, Sudre P, ten
Dam G, and Kochi A. Tuberculosis: a global overview of the situation
today.  Bull World Health Organ 1992；70:149）。さらに、この疾患は血液透析を受けている患者が直面する深刻な問題である。
【０００７】
結核の治療は長期にわたるので、中途脱落が頻繁に生じる。この結果、疾患の再活性化、ならびに通常使用される薬剤（イソナイアジド、エタンブトール、ピラジナミド、リファンピシン、および後者の誘導体であるリファペンチン）に対する多剤耐性株の出現を招く。
【０００８】
トランスフォーミング増殖因子-β型（TGF-β）
【０００９】
TGF-βは、自己分泌因子と傍分泌因子のスーパーファミリーの原型であり、胚発生、細胞の分化と増殖、組織修復、および免疫系の調節の制御に関与する。TGF-βは、リンパ系および上皮系の細胞の増殖に対する強力な阻害因子であり、この抗増殖応答が欠損すると悪性腫瘍の形成に繋がるので、このことからTGF-βとそのシグナル伝達分子は真の「腫瘍抑制因子」であるという考えが支持される。TGF-βは、組織の修復において重要な役割を果たしている。血小板が病巣部位でTGF-βを放出すると、創傷の修復に至る一連の事象が始動し、その過程でTGF-βが主要な役割を担う（Massagu&eacute;, J.（1990）
The transforming growth factor-β family. Annu Rev Cell
Biol 6, 597-641、Massagu&eacute;, J., Brain,S.W. and
Lo,R.S.(2000).  TGF-β signaling in growth control,
cancer, and heritable disorders. Cell 103, 295-309）。
【００１０】
インターロイキンの中でも、TGF-βは特異なサイトカインである。なぜなら、これが細胞性免疫を効率よく抑制する作用にはいくつかのレベルあるからである（Letterio JJ, Roberts AB., Regulation of immune response by TGF-β.  Annu Rev Immunol 1998;16:137-61）。多くの他の型の細胞にも起こることであるが、TGF-βは、リンパ球、特にすでに活性化されている成熟T細胞の増殖は阻害するが（Kehrl JH, Wakefield LM, Roberts AB, Jakowlew S, Alvarez-Mon M,
Derynck R, Sporn M, Fauci AS., Production of transforming growth factor beta by
human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth.
J Exp Med 1986;163:1037-50）、未熟または不活性化されたTリンパ球は、TGF-βの抗細胞分裂作用に対して比較的抵抗性がある。
【００１１】
また、TGF-βはBリンパ球の増殖を阻害し、アポトーシスによるそれらの細胞死を誘導し（Lomo J, Blomhof HK, Beiske K, Stokke T, Smeland EB., TGF-β1 and cyclic AMP promotes apoptosis in resting human B
lymphocytes.  J Immunol 1995; 154:1634-43）、そしてNK細胞とT細胞の細胞溶解性分化と活性を抑制する（Letterio JJ, Roberts
AB., Regulation of immune response by TGF-β.  Annu
Rev Immunol 1998;16:137-61）。TGF-βの別の重要な阻害作用は、マクロファージにおける主要組織適合性複合体（MHC）クラス2分子の発現の抑制であり（Czarniecki
CW, Chiu HH, Wong GH, Mc Cabe SM, Palladino MA, Transforming growth factor beta
1 modulates the expression of class II histocompatibility antigens on human
cells.  J Immunol 1988;140:4217-4232）、それにより、抗原提示の過程が妨害され、Tリンパ球の活性化が妨げられる。T細胞の活性化が妨害される最も重要な結果は、インターロイキン2（IL-2）の分泌の阻害である。なぜなら、このサイトカインは、細胞増殖の必須の誘導因子であるからである。実際、TGF-βはこのメカニズムを介してリンパ球の増殖を阻害すると考えられている。別のTリンパ球細胞分裂促進性サイトカインでマクロファージ活性化因子は、インターロイキン1（IL-1）である。
【００１２】
TGF-βはまた、IL-1受容体の特異的発現を抑制することにより、IL-1の生産を直接および間接的に阻害し、同時に、IL-1可溶性受容体アンタゴニストの放出を増大する。このアンタゴニストはこのサイトカインを捕捉しその受容体への結合を妨げるように機能する（Turner M, Chantry D, Katsikis T, Berger A, Brennan FM, Feldman M.,
Induction of interleukin 1 receptor antagonist protein by transforming growth
factor beta.  J Immunol 1991;21:1635-1639）。
【００１３】
免疫系に対するTGF-βの基本的な抑制因子作用の1つは、マクロファージの脱活性化であり、これは、直接的には酸素フリーラジカルと酸化窒素の生産の阻害を通じて、また間接的にはマクロファージ活性化サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子α（TNF-α）およびインターフェロンγ（INF-γ）ならびにそれらの受容体の生産を抑制することによって行われ得る（Ranges GE, Figari IS, Espevik T, Palladino MA., Inhibition of
cytotoxic T cell development by transforming growth factor beta and reversal by
recombinant tumor necrosis factor alpha.  J Exp Med 1987;
166:991-999.  Prinson DM, Le Claire RD, Lorsbach RB, Parmely MJ, Russell
R., Regulation by transforming growth factor beta-1 of expression and function
of the receptor for INF gamma on mouse macrophages.  J Immunol
1992;149:2028-2038）。
【００１４】
酸化窒素の生産には、TNF-αとINF-γが誘導性酸化窒素合成酵素（iNOS）を活性化することが必要であるが、TGF-βは、この酵素をコードする遺伝子の転写および翻訳の両方を阻害する（Vodovotz Y, Bogdan C., Control of nitric oxide synthase expression
by transforming growth factor beta: implications for homeostasis.  Prog
Growth Factor Res 1994;5:341-351）。さらに、Th-1応答の一部としてのマクロファージの活性化にはINF-γの関与が必須であるが、TGF-βは、その最も効率的な免疫抑制因子作用の1つとして、マクロファージ膜上に発現されるINF-γとその受容体の生産を阻害する（Pinson DM, Le Claire RD, Lorsbach RB, Parmely MJ, Russell R.,
Regulation by transforming growth factor beta-1 of expression and function of
the receptor for INF gamma on mouse macrophages.  J Immunol
1992;149:2028-2038）。
【００１５】
TGF-βは、Th-2サイトカイン、特に、インターロイキン10の効率のよい促進因子である（Schmitt E, Hoehn P, Huels C,
Goedert S, Palm N, Rude E, Germann T., T helper type 1 development of naive
CD-4 T cells requires the coordinated action of interleukin 12 and interferon
gamma and is inhibited by transforming growth factor beta.  Eur J Immunol
1994;24:793-798.  Strober W, Kelsall B, Fuss I, Marth T, Ludviksson B, Ehrhardt
R, Neurath M., Reciprocal IFN gamma and TGF-β responses
regulate the occurrence of mucosal inflammation.  Immunol Today
1997;18:61-64、Maeda Y, Kuwahara H, Ichimura Y Ohtsuki
M, Kurakata S, Shirahishi A., TGF-β enhances macrophage
ability to produce IL-10 in normal and tumor bearing mice.  J Immunol
1995;15:4926-4932）。
【００１６】
TGF-βの持続的な過剰な発現は、種々の疾患において存在する繊維形成や組織損傷の重要な病原因子と関係があるとされている（Wahl SM., Transforming growth factor beta: the good, the bad and the
ugly.  J Exp Med 1994;180:1587-90）。しかし、この重要な繊維形成誘導作用とは別に、いくつかの慢性の炎症性疾患、例えば関節リウマチ、ハンセン病、および結核においては、TGF-βの過剰な生産が原因の一部となっている細胞性免疫のアネルギーが存在する（Letterio
JJ, Roberts AB., Regulation of immune response by TGF-β. 
Annu Rev Immunol 1998;16:137-61、Wahl SM., Transforming
growth factor beta: the good, the bad and the ugly.  J Exp Med
1994;180:1587-90,  Tossi Z, Ellner J., The role of TGF-β in the pathogenesis of human tuberculosis.  Clin Immunol
Immunopathol 1998;87:107-114）。
【００１７】
この病因説は、TGF-β遺伝子を過剰に発現し強い免疫抑制を受けている形質転換動物での観察によって、さらには、TGF-β1をコードする遺伝子が破壊されているマウスによって提示される極めて強い多発性の炎症によっても強められている（Shull MM, Ormsby I, Kier AB, Pawloski S, Diebold R, Yin M, Allen R,
Sidman C, Proetzel G, Calvin D., Targeted disruption of the mouse transforming
growth factor beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. 
Nature 1992;359:693-99.)。通性細胞内病原菌による感染、例えばリーシュマニア症およびトリパノソーマ症の動物モデルにおいては、この疾患が有利に進行するようにTGF-βが過剰に生産されることが観察される（Barral Netto M,
Barral A, Brownell CE, Skeiki YA, Ellingsworth LR, Twardzic DR, Reed SG. 
Transforming growth factor beta in leshmanial infection; a parasite escape
mechanism.  Science 1992;257:545-48、Gazzinelli RT,
Oswald IP, Hieny S, James SL, Sher A.  The microbicidal activity of
interferon gamma treated macrophages against Trypanosoma cruzi, involves an
L-arginine-dependent, nitrogen oxide-mediated mechanism inhibitable by
interleukin 10 and transforming growth factor beta． 
Eur J Immunol 1992;22:2501-06.)。
【００１８】
ヒトのリーシュマニア症およびフィラリア症については、免疫抑制の誘導におけるTGF-βの関与が報告されている（Barral Neto M, Barral A,
Brodskyn C Carvalho EM. Cytotoxicity in human mucosal and cutaneous leshmaniasis.
Parasite Immunol 1995,17:21-28,  King CL, Mahanty S, Humarasawami V,
Abrams JS, Regunthan J, Jeyamaran K, Ottesen EA, Nutman TB, Cytokine control of
parasite specific anergy in human lymphatic filariasis. J Clin Invest 1993,
92:1667-1673.）。ウイルス感染に関しては、AIDSでの免疫不全進行はTGF-βの段階的な増加と関係していることが観察されており（Lotz M, Seth
P, TGF beta and HIV. Annu NY Acad Sci 1993,685:501-511）、HIVとヒト型結核菌（M.tuberculosis）の同時感染の場合には、TGF-βの生産に対する協働的な増強作用が存在し、これによりウイルスの活性を増大して疾患が加速される（Maltman J, Pargnell IB, Graham GJ, Specificity and reciprocity in
the interaction between TGF-β, and macrophage
inflammatory protein 1-alpha. J Immunol 1996,156:1566-1571.）。
【００１９】
ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、その精製されたタンパク質誘導体（PPD）、およびそれらの分子成分、例えばリポアラビノマンナンのいくつかは、多量のTGF-βを生産し分泌するようにマクロファージを誘導する（Tossi Z, Ellner
J.  The role of TGF-β in the pathogenesis of human
tuberculosis.  Clin Immunol Immunopathol 1998;87:107-114）。Th-1応答の一部としてのマクロファージの活性化にはTNF-γの関与が不可欠であり、これは通性細胞内病原菌によって生じる感染性疾患、例えば結核およびリーシュマニア症の制御に必須である（Hern&aacute;ndez Pando R, Orozco EH, Arriaga K, Sampieri A, Larriva Sahd J,
Madrid MV,  Analysis of the local kinetics and localization of interlukin
1 alpha, tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor beta during
the course of experimental pulmonary tuberculosis. Immunology 1997; 90:607-17）。
【００２０】
TGF-βがINF-γの生産についての効率のよいブロッカーであり、同時に、サイトカインTh-2の生産を誘導するという事実から（Schmitt E, Hoehn P,
Huels C, Goedert S, Palm N, Rude E, Germann T, T helper type 1 development of
naive CD-4 T cells requires the coordinated action of interleukin 12 and interferon
gamma and is inhibited by transforming growth factor beta. Eur J Immunol
1994;24:793-798、Strober W, Kelsall B, Fuss I, Marth T,
Ludviksson B, Ehrhardt R, Neurath M, Reciprocal IFN gamma and TGF-β responses regulate the occurrence of mucosal inflammation. Immunol
Today 1997;18:61-64,  Maeda Y, Kuwahara H, Ichimura Y, Ohtsuki M, Kurakata
S, Shirahishi A,  TGF-β enhances macrophage
ability to produce IL-10 in normal and tumor bearing mice.  J Immunol
1995;15:4926-4932）、TGF-βは、これらの疾患の進行に関与している。肺結核の実験モデルにおいて、および活性なヒトの疾患において、TGF-βの高い生産が示されており（Hern&aacute;ndez Pando R, Orozco
EH, Arriaga K, Sampieri A, Larriva Sahd J, Madrid MV, Analysis of the local
kinetics and localization of interlukin 1 alpha, tumor necrosis factor alpha
and transforming growth factor beta during the course of experimental pulmonary
tuberculosis. Immunology 1997; 90:607-17、Hirsch C.
Ellner J, Blinkhorm R, Tossi Z, In vitro restoration of T cell response in
tuberculosis and augmentation of monocyte effector function against
Mycobacterium tuberculosis by natural inhibitors of transforming growth factor
beta. Proc Natl Acad Scie 1997;94:3926-3931.）、これは、リンパ球によって生産されるサイトカインTh-1（INF-γ、IL-2）とTNF-αに媒介される防御性の免疫学的活性の低下と一致する。
【００２１】
活性な肺結核の患者に一般的に存在する細胞性免疫のアネルギーが、TGF-βブロッカー抗体または天然のブロッカーを投与することにより矯正され、その結果、結核菌の細胞内増殖が有意に低下することが生体外での研究により示されている（Hirsch C. Ellner J, Blinkhorm R, Tossi Z, In vitro restoration of T
cell response in tuberculosis and augmentation of monocyte effector function
against Mycobacterium tuberculosis by natural inhibitors of transforming growth
factor beta. Proc Natl Acad Scie 1997;94:3926-3931.）実際に生体外での研究では、TGF-β阻害因子としてのTGF-β中和抗体またはデコリンを使用することによってヒト型結核菌（M.tuberculosis）を排除する免疫系の効率を増進している（Hirsch C.
Ellner J, Blinkhorm R, Tossi Z, In vitro restoration of T cell response in
tuberculosis and augmentation of monocyte effector function against
Mycobacterium tuberculosis by natural inhibitors of transforming growth factor
beta. Proc Natl Acad Scie 1997;94:3926-3931.）。しかし、これらの産物には、それらの活性をブロックするかまたはTGF-βの抗炎症活性の効率を低下させる抗体の形成を引き起こすという欠点があるので、これら阻害因子の使用は躊躇される。
【００２２】
TGF-βの情報伝達経路は、細胞表面でこのリガンドが媒介するI型およびII型受容体の組み合わせから開始される。これら受容体は「情報伝達受容体」のヘテロマーサブユニットと考えることができる。I型およびII型受容体は膜貫通タンパク質であって、その細胞内部分はセリンプロテインキナーゼおよびスレオニンプロテインキナーゼから構成されている。受容体IIのキナーゼが受容体Iのキナーゼをリン酸化するとこれが活性化し、続いて「Smads」と呼ばれるタンパク質の新規ファミリーのメンバーがリン酸化してヘテロマー複合体が形成され、これが核に移動してTGF-βの応答に関与する転写事象を調節する（Massagu&eacute;, J.
(1988).  TGF-β signal transduction. Annu Rev
Biochem 67., 753-791. Massagu&eacute;, J., and Chen, Y.-G. (2000).  Controlling
TGF-β signaling. Genes and Development 14, 627-644.）。この情報伝達受容体ばかりでなく、他の細胞表面タンパク質もTGF-βへの結合が同定されている。βグリカンおよびエンドグリンは膜貫通タンパク質であり、その大きな細胞外ドメインはTGF-βおよび小さい細胞内領域に結合することができ、互いに非常によく似ている。
【００２３】
βグリカンは、内皮を除くほとんどの組織および細胞株中に存在し、対照的に、エンドグリンは主に内皮で発現される。これらの糖タンパク質はTGF-β細胞内情報伝達経路において明確な機能を有するようではないが、両方ともがI型およびII型受容体に対するこのリガンドの細胞外での接近を調節するようである（Massagu&eacute;,
J., and Chen, Y.-G. (2000).  Controlling TGF-β
signaling. Genes and Development 14, 627-644.）。
【００２４】
βグリカンはまた、TGF-β III型受容体としても知られており、ヘパランとコンドロイチン（chondroilin）硫酸型のグリコサミノグリカン（GAG）を含有する膜貫通型プロテオグリカンであり、リガンドが情報伝達受容体と相互作用するのを調節することができるので「共同受容体」と呼ばれる新規の受容体クラスに属する。さらに、GAGを欠いているので、βグリカンは3つの異なるTGF-βイソ体に高い親和性をもって結合する。βグリカンが存在すると、この高い親和性によってこれら情報伝達受容体のリガンドへの低い親和性が補填され、異なるTGF-βイソ体は等位になることができる。
【００２５】
この効果は、「リガンドを提示」する3成分複合体においてβグリカンがTGF-βと受容体IIに会合する能力によって達成されると考えられる（Esparza-L&oacute;pez,
J.,Montiel, J.L., Vilchis-Landeros,M.M., Okadome,T., Miyazono, K., and L&oacute;pez-Casillas,
F. (2001). Ligand binding and functional properties of betaglycan, a
co-receptor of transforming growth factor-β
superfamily.  Specialized binding regions for transforming growth factor-β and inhibin A.  J Biol Chem 276, 14588-14596.）。TGF-βイソ体を等位にする能力は、βグリカンの最も特徴的な機能の1つであるが、Barnett等は、心臓弁の起源となる胚原基が適切に形成される（そのプロセスはTGF-βの存在に依存する）ためにはβグリカンの存在が不可欠であることを明らかにした。
【００２６】
このことから、胚発生に対するTGF-βの調節作用のいくつかは情報伝達機構におけるこの共同受容体の直接的な関与に依存していると信じられるに至っている（Brown, C.B., Boyer, A.S., Runyan, R.B., and Barnett, J.V. (1999).
Requirement of type III TGF-β receptor for endocardial
cell transformation in the heart. Science 283, 2080-2082.）。βグリカンは膜形態ばかりでなく、「可溶性」形態が血清と細胞外マトリックスに存在する。
【００２７】
これの起源は膜近傍のタンパク質分解的解離にあり、解離して受容体の外部領域がその足場を離れて膜に遊離される。可溶性βグリカンの組み換え形態は、膜形態とは反対の機能を有することが示されており、これは、TGF-βの作用に対する強力な中和因子である（L&oacute;pez-Casillas, F.,
Payne, H.M., Andres, J.L., and Massagu&eacute;, J. (1994).  Betaglycan can act as
dual modulator of TGF-β access to signaling receptors:
mapping of ligand binding and GAG attachment sites.  J Cell Biol 124,
557-568.  Vichis-Landeros, M.M., Montiel, J.L., Mendoza, V.,
Mendoza-Hern&aacute;ndez, G., and L&oacute;pez-Casillas, F. (2001).  Recombinant soluble
betaglycan is a potent and isoform-selective transforming growth factor-β neutralizing agent.  Biochemical Journal 355, 215-222.）。培養下の組織細胞を用いて生体外で行われたこれらの研究により、βグリカンをTGF-βの作用を調節する「細胞外スイッチ」であると定義することができた（Attisano,
L., Wrana, J.L., L&oacute;pez-Casillas, F. and Massagu&eacute;, J. (1994).  TGF-βreceptor and actions.  Biochim Biophys Acta 1222, 71-80.）。
【００２８】
プロスタグランジン
【００２９】
プロスタグランジンは、細胞内情報伝達の強力な調節因子であり、高濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）はT細胞が媒介する免疫についての免疫抑制因子機構として作用する（Phipps RP, Stein SH, Roper RL.  A new view of prostaglandin E
regulation of the immune response.  Immunol Today 1991; 12: 349-52）。特定の細胞シグナルの後に、リパーゼの活性化を経由して細胞膜脂質の迅速な再配置が起こり、生理活性な脂質が生じて、これが細胞内および／または細胞外媒介因子としての役割を担うことができる。
【００３０】
これらの脂質のうちで最も重要なものは、20個の炭素の多不飽和脂肪酸であるアラキドン酸であり、これは細胞膜のリン脂質中では通常はエステル化されていて、細胞のホスホリパーゼの活性化により放出される（Serhan CN, Haeggstr&ouml;m JZ, Leslie CC.  Lipid mediator networks
in cell signaling: update and impact of cytokines.  FASEB J 1996;
10:1147-58.）。アラキドン酸の代謝によって生じる産物は、いわゆるエイコサノイドであり、これらはオータコイドと考えられる。なぜなら、これらは、迅速に形成されて局所的な作用を有し、その活性は自然にまたは酵素分解の作用によって失われる、作用範囲の小さい局所ホルモンであるからである。エイコサノイドは多くの生理学的事象および病理学的事象に影響を与え、2つの主要なクラスの酵素：シクロオキシゲナーゼ（COX）およびリポキシゲナーゼによって合成され、それぞれプロスタグランジンおよびロイコトリエンを生産する（Phipps RP, Stein SH, Roper RL.  A new view of prostaglandin E
regulation of the immune response.  Immunol Today 1991; 12:349-52. 
Serhan CN, Haeggstr&ouml;m JZ, Leslie CC.  Lipid mediator networks in cell
signaling: update and impact of cytokines.  FASEB J 1996; 10:1147-58.）。
【００３１】
シクロオキシゲナーゼ経路は、2つの異なる酵素：COX-1（構成的に発現される酵素）とCOX-2（成長因子、サイトカイン、および他の炎症媒介因子に曝された後に炎症を起こした組織中で発現される誘導性の高い酵素）によって媒介される。プロスタグランジンの中では、Eシリーズ（PGE）のものがもっとも幅広く研究されている。PGE-2は重要な免疫抑制因子作用、例えばリンパ球の増殖の低下、NK活性化、およびMHC-II発現を有することを示す証拠が存在している（Goto TR,
Herberman RB, Maluish A, Strong DM,  Cyclic AMP as a mediator of
prostaglandin E induced suppression of human natural killer cell
activity.  J Immunl  1983; 130:1350-55.  Snyder DS, Beller DI,
Unanue ER.  Prostaglandins modulate macrophage expression.  Nature
1982; 299:163-65.）。PGE-2が、Th1およびTh2型応答の調節において顕著な役割を担うこともまた見出されている。
【００３２】
実際、PGE-2は、Th1サイトカイン、インターフェロンγ、インターロイキン2および12の生産を阻害し、マクロファージの活性化をブロックし、インターロイキン1とTNF-αの生産を抑制する（Betz
M, Fox BS.  Prostaglandin E2 inhibits production of Th-1 lymphokines but
not of Th-2 lymphokines.  J Immunol 1991; 146:108-13.  Kuroda E,
Suguira T, Zeki K, Yoshida Y, Yamashita U.  Sensitivity difference to the
suppressive effect of prostaglandin E2 among mouse strains: a possible
mechanism to polarize Th2 type response in BALB/c mice.  J Immunol 2000;
164:2386-95）。PGE-2のこの活性は、細胞内感染においておそらく重要である。なぜなら、結核菌（mycobacteria）による感染はTh1サイトカインの生産を介するマクロファージの活性化によって制御されることが、マウスとヒトにおいて示されているからである（Rook GAW, Hern&aacute;ndez Pando R.  Pathogenesis of
tuberculosis.  Annual Rev Microbiol 1996, 50:259-284.）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
結核は、抗生物質を用いて治療される疾患であるが、それには3種類の抗生物質を組み合わせて6ヶ月間投与することが必要である。これは、患者が治療から脱落する頻度が高くなる原因であり、その結果頻繁な再発および抗生物質に対する耐性が生じる（Rook GAW, Hern&aacute;ndez Pando R.  Pathogenesis of
tuberculosis.  Annual Rev Microbiol 1996, 50:259-284.）。したがって、抗生物質による治療期間を短縮することが可能となる新しい治療案が設計されれば、それは1つの別法である。この状況のもう一つの非常に優れた例はハンセン病で起こる。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
この免疫学的パターンを有する疾患に対する1つの可能性のある有用な治療方針は免疫療法であり、それは、防御免疫反応に有利に作用する物質を投与することにある。通性細胞内微生物が感染している間にTGF-βとプロスタグランジンが担っている重要な免疫調節機能に着目して本発明者らが開発した本発明は、治療を補助することを目的として、通性細胞内微生物、特に、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、リーシュマニア属（Leishmania）、トリパノソーマ属（Trypanosoma）に対して細胞が自己防衛する応答を高めることであり、そのためにTGF-βの免疫抑制因子作用を阻害しながら、その阻害によって生じる起炎症性の副作用を別の経路で軽減することを試みた。
【００３５】
このような理由から、本発明者らが開発した本発明の目的は、通性細胞内生物が原因となって引き起こされる疾患の治療を補助することであり、それによって抗生物質の治療期間を減縮し、および第2の経路では、これら治療の適用時間を短縮して脱落率を低減する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
【００３７】
通性細胞内微生物による感染での免疫応答を明確に理解した上で、本発明を展開するための治療用キットを構築し、これによりこれらの感染で使用される抗生物質治療を補助した。この治療用キットの根底にあるものは、これらの感染により免疫応答が備わった際にTGF-βが望ましくない作用を招来し、その結果これら疾患、特にTBの進行段階で細胞免疫が抑制されるのを選択的に阻害することである。治療用キットでは、中和抗体またはデコリンが使用される代わりに、TGF-βに対する天然アンタゴニストである可溶性βグリカンが使用されるのが好ましい。なぜなら、果たす目的は同じながら可溶性βグリカンの方がより有効である。すなわちこれは「天然アンタゴニスト」であり、したがって投与した場合にその活性をブロックし得る抗体が形成されることは決してないので原則として中和抗体を上回る利点を有する
【００３８】
TGF-βの機能を明確に理解した上で、本発明者らは、その活性をブロックすることによって生じる2つの可能な効果を認定した。そのうちの1つの効果は有用であると考えることができる。なぜなら、TGF-βの作用が無くなれば、細胞性免疫が再度活性化されるからである。しかし、その一方で、本発明者らの実験モデルでは炎症が相当に増大し組織に損傷が起きているのを見出した。これは、TGF-βが強力な抗炎症性サイトカインであるからである。これらの予備的な研究から、選択的TGF-βブロッカーのみを用いて治療はできなが、TGF-βを阻害することによって生じる起炎症性副作用を軽減することが極めて重要であると確定することができた。
【００３９】
通性細胞内微生物による感染における細胞応答の過程を十分に研究すると、疾患による炎症の進行期においてプロスタグランジン、主にE型が過剰に生産されている。したがって、このキットを開発する次の段階は、プロスタグランジン阻害因子を含めることであった。
【００４０】
このために、天然の選択的TGF-β阻害因子を含む治療キットを投与したマウスを実験モデルに使用した。本発明者らは、具体的には、可溶性βグリカンを包括的なプロスタグランジン阻害因子と組み合わせて使用した。本発明者らは、具体的にはインドメタシンを使用したが、これの作用はCOX 1 およびCOX 2の阻害であることはよく知られている。しかし、包括的なプロスタグランジン阻害因子を使用した場合には、望ましくない副作用が生じた。すなわち、期待した有用な作用は得られたが、特に胃粘膜に対するプロスタグランジンの防御作用までもブロックされ、その結果広範囲にびらん性胃炎が生じ、TB自体によるよりも大きな損傷が招来した。
【００４１】
本発明者らの実験モデルにおけるこれらの観察から、本発明者らは、通性細胞内微生物による疾患の抗生物質治療を補佐する治療キットを最も適切な方法で構築するために、まず選択的TGF-β阻害因子を選択的に誘導されるPGE阻害因子と組み合わせて用いることに決定した。これを達成するには、高度に特異的にCOX 2をブロックすることができる薬剤、すなわち、可溶性βグリカンでTGF-βの作用をブロックすると生じる過度の炎症作用を阻害し、胃粘膜には作用しない薬剤を使用する。
【００４２】
COX-2を選択的に阻害することが知られている医薬品には、ニフルム酸、ニメスリド、およびメファム酸が挙げられる。治療用キットの防御効果を証明するために、本発明者らは、種々の実験を行ってこれらの3種類の医薬品の効力を評価し、ニフルム酸がPGEの形成の98％を阻害するという最良の結果を示したのに対し、他の2つの医薬品はPGEの形成の80％から85％をブロックすることを見出した。
【００４３】
使用例
【００４４】
可溶性βグリカンの免疫治療上の作用の有効性を評価するために、本発明者らは、通性細胞内微生物による疾患の1つである結核を選択し（本発明の使用範囲を限定するものではない）、使用例の1つとして本明細書中で記載する。治療の有効性を決定するための状態とするために、本発明者らは、100万個の生存している感染力の強い結核菌（tuberculosis bacilli）をBALB/ｃマウスに気管内注入して、肺結核の実験モデルを作成した。実験モデル（Hern&aacute;ndez
Pando R, Orozco EH, Arriaga K, Sampieri A, Larriva Sahd J, Madrid MV, Analysis
of the local kinetics and localization of interlukin 1 alpha, tumor necrosis
factor alpha and transforming growth factor beta during the course of
experimental pulmonary tuberculosis. Immunology 1997; 90:607-17. 
Hern&aacute;ndez Pando R, Orozco EH, Sampieri, A, Pav&oacute;n L, Velaswuillo C, Larriva SJ,
Madrid MV,  Correlation between the kinetics of Th1/Th2 cells and
pathology in a murine model of experimental pulmonary pathology. 
Immunology 1996; 89:26-33）には、6〜8週齢の雄性BALB/cマウスを使用する。特定の市販培地中で培養されたヒト型結核菌（Mycobacterium
tuberculosis）の参考菌株を使用した。それらの増殖に必要な時間の後、細菌を回収し、使用するまで凍結して保存した。それらを使用する前に、細菌の量と生存性をチェックした。予め麻酔しておいたマウスの気管の中線に沿って切開し、十分な量の生存性の細菌の懸濁液を注入して感染を生じさせることによって肺結核をマウスに誘導した。切開部分を縫合し、動物を隔離した状態に保った。
【００４５】
このモデルにより、本発明者らは、マクロファージによって生産された活性化TNF-αと、IFN-γおよびIL-2を生産する1型ヘルパーTリンパ球（Th1）が結核菌（tuberculosis bacilli）に対する防御を担い、他方2型ヘルパーT細胞はTh-1応答に拮抗し、細胞の免疫応答を体液性免疫へと転換するために疾患の進行が促進されることを確認することができた（Rook GAW, Hern&aacute;ndez Pando R.  Pathogenesis of
tuberculosis.  Annual Rev Microbiol 1996, 50:259-284.  Seah Gt, Scott
M, Rook GAW.  Type 2-cytokine-gene activation and its relationship to
extent of disease in patients with tuberculosis:  J Infect Dis 2000;
181:385-389.）。このモデルでは、感染後1ヶ月の間は、感染を制御するTh-1防御反応が明らかに優性である。続いて、免疫学的な防御の効率を低下させるTh-2活性が徐々に増大し、それにより、ますます増加する細菌が広範囲の肺の病巣（肺炎）とともに存在して疾患が進行し死に至る。感染の進行期の間にはTGF-βが高レベルで生産され、この因子がマクロファージ機能を非活性化しTh-2細胞の活性を刺激する（Hern&aacute;ndez Pando R, Orozco EH, Arriaga K, Sampieri A, Larriva Sahd J,
Madrid MV, Analysis of the local kinetics and localization of interlukin 1
alpha, tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor beta during
the course of experimental pulmonary tuberculosis. Immunology 1997; 90:607-17）。疾患の進行期に可溶性形態のβグリカンを腹腔内投与すると、TGF-β活性はブロックされる。このことにより、Th-1応答は再度活性化されて、細菌の量は有意に減少する。しかし、TGF-βは有効な抗炎症因子であるので、可溶性βグリカンで治療するためにTGF-βの作用をブロックしたマウスでは肺炎の程度が増大した。この問題を回避するために、抗炎症剤を治療に加えた。ニフルム酸が選択された。なぜなら、これは選択的なシクロオキシゲナーゼ2ブロック剤であり、プロスタグランジンの合成をブロックするからである。
【００４６】
すなわちプロスタグランジンも感染の進行期に高濃度に生産されTh-2細胞の刺激に関与しているからである（Betz M, Fox BS. 
Prostaglandin E2 inhibits production of Th-1 lymphokines but not of Th-2
lymphokines.  J Immunol 1991; 146:108-13.  Kuroda E, Suguira T, Zeki
K, Yoshida Y, Yamashita U.  Sensitivity difference to the suppressive
effect of prostaglandin E2 among mouse strains: a possible mechanism to
polarize Th2 type response in BALB/c mice.  J Immunol 2000; 164:2386-95）。ニフルム酸と可溶性βグリカンとを組み合わせて投与することにより、防御免疫応答が大いに刺激され、この応答により可溶性βグリカンのみを投与した場合に比較して肺の結核菌（tuberculosis bacilli）の量が一層減少した。
【００４７】
TGF-β活性をブロックする可溶性βグリカンの最適用量を決定するために、この実験モデルで、本発明者らは、慢性的に感染させたマウスでの用量応答実験を行い、評価パラメーターとして肺および皮膚の遅延型過敏（DTH）反応におけるコロニー形成単位を測定した。続いて、本発明者らは2つの治療案を用いて実験を行った。第一は、可溶性βグリカンのみを用い、感染後30日目、すなわち疾患の後期が始まり、TGF-βが高濃度に達しその濃度が維持される日に治療を始めた。別のグループには、有効な抗炎症剤を追加投与しTGF-βの作用が抑制されて生じる過度の炎症による損傷を回避した。シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）を特異的にブロックし、それによりプロスタグランジンの合成を制限する薬剤であるニフルム酸を選択した。
【００４８】
治療しない対象グループは、肺炎が進行増大し、これは感染後28日目に始まり、60日目には60％を越える肺表面に及んだ。可溶性βグリカンのみを投与したグループは、治療の2ヵ月後に対照グループよりも30％多い肺炎を示した。TGF-βに対する特異的抗体を投与したグループもまた、肺炎の拡大を示し、このことから、この副作用がTGF-βのブロックに起因するものであることを確認した。ニフルム酸のみでの治療、またはニフルム酸と可溶性βグリカンもしくは抗TGF-β抗体の組み合わせでの治療により、治療の2ヵ月後に対照グループと比較して、肺炎に罹患した面積が25％減少した。細菌のコロニー形成単位（CFU）は、治療していない対照グループでは徐々に増大したが、これらは、可溶性βグリカン、抗TGF-β抗体とニフルム酸での治療の30日後には顕著に減少した。治療の60日後には、抗TGF-β抗体で治療した動物は、対照グループと同じレベルのコロニー形成単位を示したが、可溶性βグリカンで治療した動物は50％低いCFUを示した。可溶性βグリカンとニフルム酸の組み合わせで治療した動物は、最も顕著なCFUの低下を示し、対照グループの20倍小さかった。
【００４９】
感染の後期でのTGF-β活性の抑制により、IL-2、TNF-α、IFN-γ、および硝酸合成酵素の発現の増大が誘導されたが、インターロイキン10の発現は低下した。ニフルム酸で治療した動物もまた同じパターンを示したが、可溶性βグリカンとニフルム酸の組み合わせによっては、治療の60日後に、Th-1サイトカインの最も高い発現が生じた。
【００５０】
対照グループのDTH応答は徐々に低下したが、治療したマウスの全てにおいて応答は大きく、特に、ニフルム酸とβグリカンで治療したマウスにおいて大きかった。この治療用キットを用いることにより、本発明者らは、治療した動物の免疫応答を増強させることができ、従来の抗生物質を用いる治療期間が短縮された。
【００５１】
本発明を実施する好ましい方法は、選択的TGF-β阻害因子、好ましくは可溶性βグリカンおよび選択的に誘導されるPGE阻害因子、好ましくは、ニフルム酸を含有するキットを用意し、通性細胞内微生物による疾患、例えば結核、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ハンセン病において抗生物質を用いる通常の治療との組み合わせでこれらを投与することである。一般的に、選択的な誘導PGE阻害因子、好ましくは、阻害作用を生じる治療上有効な一日量でのニフルム酸を治療有効量での天然の選択的TGF-β阻害因子、好ましくは非経口的に週2回体重1kgあたり0.5から2mgの用量での可溶性βグリカンと組み合わせて抗生物質治療と同時に投与を開始した場合には、良好な結果が見られ、これが制約要因にもならなかった。実際、この使用例で示すものとは異なる治療用キットを投与する方法および経路を設計することは完全に可能であり、例えば、可溶性βグリカンは、それがTGF-β中和能力を保持している限りは、野生型形態、組み換え形態、および／または変異体形態で、非経口投与形態で使用することができる。医薬的に許容される担体は、等張性生理食塩水、異種発現用DNAベクター、例えばウイルス遺伝子治療でのアデノウイルス、DNAトランスファー、あるいは、呼吸経路を介する投与担体としてエアゾールを使用する可溶性βグリカンおよびその誘導体の投与用調製物も可能である。
【００５２】
一般的に、キットは、可溶性βグリカンを、上記の段落で記載した種々の形態および投与経路で投与することができるように設計される。その好ましい形態は、1日量で与えられるニフルム酸と共に、週2回用量範囲は1kgあたり0.5から2mg、いずれも医薬的に受容可能な担体中である。この治療用キットは、通性細胞内微生物による感染に対して抗生物質を用いる従来の治療をサポートするために使用されるものであり、決して従来治療に置き換わるものではない。
【００５３】
この治療用キットの別の目的は、これらの疾患の治療時間を短縮し、それにより必要な延長期間にわたり治療から脱落する率を減少させ、続いて同じ理由により生じる多剤耐性を減少させることである。
【国際調査報告】
2007500207.tif 000002
2007500207.tif 000003
2007500207.tif 000004
2007500207.tif 000005