(57)【要約】チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）欠損に関連し、患者がチオプリン類（例えば、メルカプトプリン、アザチオプリン、またはチオグアニン）を用いて処置される場合に潜在的に致死性の毒性を引き起こし得る、ＴＰＭＴのハプロタイプおよび多型が記載される。個々の患者のＴＰＭＴ遺伝子型をアッセイするための、変異対立遺伝子、ならびに、ＰＣＲフラグメント、キットおよび方法が、開示される。さらに、１セットの単一ヌクレオチド多型の遺伝子型を、ＴＰＭＴ表現型についての異なる情報を与えるハプロタイプと組み合わせるアルゴリズムが、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子の変異対立遺伝子またはそのフラグメントを含む、単離されたポリヌクレオチド分子であって、表１に示されるような単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ１〜４１）を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子の変異対立遺伝子またはそのフラグメントを含む、単離されたポリヌクレオチド分子であって、少なくとも２個以上の表１に示されるような単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ１〜４１）を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子の変異対立遺伝子またはそのフラグメントを含む、単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
ａ）ＳＮＰ２６がＭＴ（ＧＧ）であり、ＳＮＰ２９がＷＴ（ＧＧ）である
ｂ）ＳＮＰ２６がＨＴ（ＡＧ）であり、ＳＮＰ２９がＷＴ（ＧＧ）である
ｃ）ＳＮＰ２６がＭＴ（ＧＧ）であり、ＳＮＰ２９がＨＴ（ＡＧ）である
ｄ）ＳＮＰ１０がＭＴ（ＴＴ）であり、ＳＮＰ１７がＭＴ（ＧＧ）である
ｅ）ＳＮＰ１０がＨＴ（ＡＴ）またはＭＴ（ＴＴ）であり、ＳＮＰ１７がＷＴ（ＴＴ）である
ｆ）ＳＮＰ１０がＭＴ（ＴＴ）であり、ＳＮＰ１７がＨＴ（ＧＴ）である
ｇ）ＳＮＰ１０がＨＴ（ＡＴ）またはＷＴ（ＡＡ）であり、ＳＮＰ１７がＨＴ（ＧＴ）である
ｈ）ＳＮＰ１０がＷＴ（ＡＡ）であり、ＳＮＰ１７がＭＴ（ＧＧ）である
ハプロタイプ（組合せ）で、単一ヌクレオチド多型である、ＳＮＰ１０、および／またはＳＮＰ１７、および／または、ＳＮＰ２６およびＳＮＰ２９を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子の変異対立遺伝子またはそのフラグメントを含む、単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
ａ）ＳＮＰ７がＭＴ（ＡＡ）であって、ＳＮＰ８がＷＴ（ＴＴ）であって、ＳＮＰ２０がＭＴ（ＡＡ）であって、ＳＮＰ２６がＷＴ（ＡＡ）であって、ＳＮＰ２９がＷＴ（ＡＡ）である
ｂ）ＳＮＰ７がＭＴ（ＡＡ）であって、ＳＮＰ８がＷＴ（ＴＴ）であって、ＳＮＰ２０がＨＴ（ＡＴ）である
ｃ）ＳＮＰ７がＷＴ（ＴＴ）であって、ＳＮＰ８がＨＴ（ＡＴ）またはＭＴ（ＡＡ）であって、ＳＮＰ２０がＷＴ（ＴＴ）である
ハプロタイプ（組合せ）で、単一ヌクレオチド多型である、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ２０、および／または、ＳＮＰ２６およびＳＮＰ２７を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のポリヌクレオチド分子のいずれか一つに対して完全に相補的である単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
被験体のチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子型を決定するための診断アッセイまたはキットであって、
ａ）該被験体から核酸を単離する工程；
ｂ）チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）ＰＣＲフラグメントを、請求項１〜４に記載のＳＮＰの少なくとも１個を含む該核酸由来の表２のプライマーを用いて特異的に増幅し、それによって増幅されるフラグメントを得る工程；および
ｃ）工程ｂ）において得られる増幅されたフラグメントを遺伝子型決定し、それによって該被験体のチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）の遺伝子型またはハプロタイプを決定する工程、
ｄ）配列決定プライマー、および配列決定試薬を含むキットであって、該プライマーは、請求項１〜４に記載のヒトＴＰＭＴ遺伝子中の多型位置にハイブリダイズするプライマー；および請求項１〜４に記載のヒトＴＰＭＴ遺伝子中の多型位置にすぐ隣接してハイブリダイズするプライマーを含む群から選択される、キット
を含む、診断アッセイまたはキット。
【請求項７】
請求項６において定義されるキットであって、請求項１〜４において定義される配列の群から選択される２個以上〜全ての多型部位の組合せを検出する、キット。
【請求項８】
チオプリン治療に対する患者の個々の応答を決定するための方法であって、該応答として、薬物効能および有害薬物反応が挙げられ、請求項１〜４に記載のヌクレオチドの改変体の同一性を決定する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、癌および免疫抑制の、治療、診断、ならびに薬物代謝の分野のものである。特に、本発明は、チオプリンメチルトランスフェラーゼ欠損についての遺伝学的基礎の特徴付けに関する。多くの単一ヌクレオチド多型は、癌、クローン病、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチまたはエリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｕｔｈｅｍａｔｏｄｅｓ））、多発性硬化症、あるいは、６−メルカプトプリン、６−チオグアニンまたはアザチオプリン（チオプリン類一般もしくはＴＰＭＴ酵素の基質である他の薬物）の標準的な投薬量を用いて処置される臓器移植レシピエント患者における、重篤な造血毒性（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を、少なくとも部分的に担っている。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野）
チオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．１．２．６７）は、芳香族スルフヒドリル化合物および複素環式スルフヒドリル化合物のＳ−メチル化を優先的に触媒する細胞質酵素であって、ＴＰＭＴとしては、抗癌剤である６−メルカプトプリン（６ＭＰ）および６−チオグアニン、ならびに免疫抑制薬であるアザチオプリンが挙げられ、これらは、まとめてチオプリンとして称される。ＴＰＭＴ活性は遺伝的多型を示し、コーカサス人種およびアフリカ系アメリカ人のおよそ９０％は高ＴＰＭＴ活性を有し、１０％は中程度の活性を有し（ヘテロ接合の為）、そして０．３％は常染色体の劣性形質としてＴＰＭＴ欠損を遺伝する（非特許文献１、非特許文献２）。ヒトの肝臓、腎臓、リンパ球、および白血病リンパ芽球におけるＴＰＭＴ活性のレベルは赤血球におけるＴＰＭＴ活性のレベルと相関関係があるので、ＴＰＭＴ活性は赤血球において測定され得る（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【０００３】
メルカプトプリン、チオグアニン、およびアザチオプリンは、固有の活性を有さないプロドラッグであって、それらの抗増殖効果の一つの機構として、チオグアニンヌクレオチド（ＴＧＮ）への細胞内変換と、その後のＤＮＡへの取り込みを必要とする（非特許文献６）。あるいは、これらの薬物は、ＴＰＭＴによって６−メチル−メルカプトプリン（ＭｅＭＰ）もしくは６−メチル−チオグアニン（ＭｅＴＧ）へ代謝されるか、またはキサンチンオキシダーゼによって６−チオ尿酸（６ＴＵ）へ代謝される；ＭｅＭＰ、ＭｅＴＧ、および６ＴＵは不活性代謝産物である。従って、ＴＰＭＴによる６ＭＰ、アザチオプリン、またはチオグアニンの代謝は、ＴＧＮ活性化経路から薬物を遠ざける。６ＭＰおよびアザチオプリンを用いる臨床研究は、赤血球のＴＰＭＴ活性と赤血球のＴＧＮ蓄積との間に逆の相関関係を確立しており、このことは、これらのチオプリンをより非効率にメチル化する患者がチオグアニンヌクレオチドへのより大規模な変換を有することを示す（非特許文献７、非特許文献８）。さらに、ＴＰＭＴ欠損を有する患者は、６ＭＰまたはアザチオプリンの標準的な投薬量を用いて処置される場合、有意により多くの赤血球ＴＧＮを蓄積し、チオプリンの投薬量が実質的に（例えば、８〜１５倍の低下）下げられない限り、重篤な造血毒性に至るか（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）、あるいは、変換酵素であるヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が、プロモーター中のＳＮＰ、ＨＧＰＲＴの活性を低下させるスプライシングもしくはコード領域に起因する機能的欠損を有し、それによって体内のチオプリンの量を低下させない限り、重篤な造血毒性に至る。赤血球のＴＰＭＴ活性の予測測定が幾人かによって提唱されている（非特許文献１２）にもかかわらず、そのような患者の大多数が、重篤な毒性を経験した後でしか同定されない。
【０００４】
不運にも、ＴＰＭＴアッセイは広く使用可能ではなく、新たに診断された白血病を有する患者または臓器移植レシピエントは、しばしば赤血球輸血を与えられ、このことがチオプリン治療が開始される前の彼らの構成的ＴＰＭＴ活性の測定を妨げる。あるいは、ＴＰＭＴ欠損に関与する数個の変異対立遺伝子が記載されており、ＴＰＭＴの遺伝子型と表現型との間の関係は、臨床的に関連のあるＴＰＭＴ対立遺伝子＊２、＊３Ａ、および＊３Ｃ（本出願において、それぞれＳＮＰ４４、ＳＮＰ４７、およびＳＮＰ５０との参照として表される）について、患者および健康な被験体において、非常に明確に定義されている（非特許文献１３、Ｅｖａｎｓら、特許文献１）。このことに基づき、ＳＮＰのヘテロ接合性の形態は、欠損したＴＰＭＴの活性（低下した活性）と相関関係があり、３個のＳＮＰの変異形態は、より欠損したＴＰＭＴの活性（非常に低下した、または非常に低い活性、時には活性無し）と相関関係がある。数個の変異対立遺伝子が中程度の活性または低い活性と関係していることが公知であるにも関わらず、遺伝子型決定による分子診断は、ＴＰＭＴ表現型を８５％〜９５％までしか予測できない（非特許文献１４、非特許文献１５）。
【０００５】
遺伝子型と表現型との間のさらなる関係は、ＴＰＭＴ遺伝子の５’非翻訳領域中の可変性縦列重複配列数（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＶＮＴＲ）の差において見出された（非特許文献１６）。ＶＮＴＲは３種類の重複エレメントＡ、重複エレメントＢ、および重複エレメントＣから構成され、これらの重複エレメントは単位コアの長さ（１７ｂｐまたは１８ｂｐ）およびヌクレオチド配列が異なる。重複Ａおよび重複Ｂは、通常、ＶＮＴＲ中に１〜６回重複され得、重複Ｃは、通常、ＶＮＴＲ中に１個のみ存在する。重複の数に依存して、ＴＰＭＴタンパク質の発現の比率が異なる。ＶＮＴＲ中の重複の数の合計とＴＰＭＴ活性のレベルとの間には逆の相関関係が存在すると考えられるが、この相関関係はたいして強いものではなく、よく研究されていない。
【特許文献１】米国特許第５，８５６，０９５号明細書
【非特許文献１】Ｗｅｉｎｓｈｉｌｂｏｕｍ，Ｒ．Ｍ．およびＳｌａｄｅｋ，Ｓ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８０年、第３２巻、ｐ．６５１−６６２
【非特許文献２】ＭｃＬｅｏｄ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９９４年、第５５巻、ｐ１５−２０
【非特許文献３】Ｖａｎ  Ｌｏｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＷｅｉｎｓｈｉｌｂｏｕｍ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８２年、第２０巻、ｐ．６３７−６５８
【非特許文献４】Ｓｚｕｍｌａｎｓｋｉ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９２年、第２巻、ｐ．１４８−１５９
【非特許文献５】ＭｃＬｅｏｄ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ，１９９５年、第８５巻、ｐ．１８９７−１９０２
【非特許文献６】Ｌｅｎｎａｒｄ，Ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２年、第４３巻、ｐ．３２９−３３９
【非特許文献７】Ｌｅｎｎａｒｄ，Ｌ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，１９９０年、第３３６巻、ｐ．２２５−２２９
【非特許文献８】Ｌｅｎｎａｒｄ，Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９８９年、第４６巻、ｐ．１４９−１５４
【非特許文献９】Ｅｖａｎｓ，Ｗ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１９９１年、第１９巻、ｐ．９８５−９８９
【非特許文献１０】ＭｃＬｅｏｄ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年、第３４１巻、ｐ．１１５１
【非特許文献１１】Ｌｅｎｎａｒｄ，Ｌ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．，１９９３年、第６９巻、ｐ．５７７−５７９
【非特許文献１２】Ｌｅｎｎａｒｄ，Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９８７年、第４１巻、ｐ．１８−２５
【非特許文献１３】Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１年、第１９巻、ｐ．２２９３−２３０１
【非特許文献１４】ＭｃＬｅｏｄ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０００年、第１４巻、ｐ．５６７−５７２
【非特許文献１５】Ｙａｔｅｓ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１９９７年、第１２６巻、ｐ．６０８−６１４
【非特許文献１６】Ａｌｖｅｓ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００１年、第７０巻、ｐ．１６５−１７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、疾患、薬物応答、およびＴＰＭＴの機能不全または調節不全（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に基づく障害を診断するためならびに処置するための手段および方法は、まだ信頼して使用し得ず、必要とされる診断試験の感度および特異性を欠く。従って、本発明の基礎をなす技術的問題は、上記に特定される要求に応じることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書において記載される、ＴＰＭＴ遺伝子座での単一ヌクレオチド多型の同定は、患者における数個の単一ヌクレオチド多型のそれぞれの遺伝子型をＴＰＭＴ表現型についての一つの識別可能な情報と組み合わせるための本明細書において開示されるアルゴリズムと共に、処置をする医師が、潜在的に毒性の投薬量のチオプリン（例えば、メルカプトプリン、アザチオプリン、またはチオグアニン）を用いる処置に先立ち、ＴＰＭＴ欠損患者を彼らの遺伝子型に基づいて予測的に同定することを可能にする。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＴＰＭＴ遺伝子における単一ヌクレオチド多型の発見、およびそれと組み合わせるＴＰＭＴ酵素欠損を予測し得るアルゴリズムに関する。これらの変異対立遺伝子の存在は、患者がメルカプトプリン、アザチオプリン、またはチオグアニンの標準的な投薬量を用いて処置される場合、潜在的に致死性の造血毒性と、直接的に相関関係がある。
【０００９】
これらの単一ヌクレオチド多型の発見およびそれと組み合わせるアルゴリズムに基づき、ＴＰＭＴ欠損の診断を行うため、または、低下したＴＰＭＴ活性もしくは完全に欠損したＴＰＭＴ活性を有するヘテロ接合性の個体（すなわち、１個の変異遺伝子および１個の正常遺伝子を有する人々）を同定するために、個々の患者（被験体）から単離されたゲノムＤＮＡ中のこれらの非活性変異を検出するための方法が開発されている。本発明は、従って、低下したＴＰＭＴ活性を有する患者を彼らの遺伝子型に基づいて同定するための診断試験を提供する。患者のＴＰＭＴ遺伝子型を決定するためのそのような診断試験は、非常に有益である。なぜならば、患者のＴＰＭＴ酵素活性の測定は多くの制限を有するからである。この情報に基づき、本発明者らは、本明細書において、その組合せが新規である一セットの単一ヌクレオチド多型を同定した。新たに開発されたアルゴリズムと組み合わせて、これらのＳＮＰは、ＴＰＭＴ活性を予測し得る。これらの試験は、目的の単一ヌクレオチド多型が見出されるＴＰＭＴ遺伝子の領域のＰＣＲに基づく増幅の工程を包含する。増幅に続いて、増幅されたフラグメントは目的の特定の単一ヌクレオチド多型の存在または非存在についてアッセイされる。これらのアッセイの多くが「手作業で」（例えば、単一ヌクレオチド多型の存在または非存在についてアッセイするための、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）およびプロトコルを用いて、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを配列決定することによって）行われ得るにも関わらず、自動化された手順およびキットが設計される。この自動化された手順およびキットは、代表的な病院、診療所、または商業的な委託研究所において見られる実験室のような、一般的な臨床の実験室における使用のための手順を容易にするために、遺伝子型決定試験のための全ての試薬、プライマー、溶液、その他を含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態は、ヒトゲノム中の相同性の高い偽遺伝子の存在に関する。プライマーがＴＰＭＴ遺伝子の対立遺伝子に特異的であるように設計される場合は常に、本発明者らは、ＴＰＭＴ遺伝子に固有である配列を同定するために、両方の配列（ＴＰＭＴ遺伝子および偽遺伝子）を、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ製）または他のプログラムのようなバイオインフォマティクスのプログラムを用いて比較した。ＴＰＭＴ遺伝子に固有である配列は、例えば、ＴＰＭＴ遺伝子の対立遺伝子に特異的なプライマーが配置され得るＴＰＭＴ遺伝子のイントロンである。ＴＰＭＴ遺伝子のエクソンと偽遺伝子との間の幾つかの相違の為に、プライマーは、このプライマーの３’部分が、二つの遺伝子の間の相違が存在するＴＰＭＴ遺伝子上の場所でちょうど終わるような様式で、配置される。
【００１１】
特に、本発明は、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）の一つ以上の変異対立遺伝子またはそのフラグメントを含む、単離されたポリヌクレオチド分子に関し、このポリヌクレオチド分子は、少なくとも１０個の連続した塩基長であって、１個以上の単一ヌクレオチド多型を含む。この単一ヌクレオチド多型は、表１において総括される。
【００１２】
本発明の一局面は、上記のポリヌクレオチド分子のいずれか一つに対して相補的なポリヌクレオチド分子に関する。
【００１３】
本発明の異なる局面は、個体のチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子型を決定するための診断アッセイに関し、この診断アッセイは、この個体から核酸を単離する工程、この核酸からチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）のＰＣＲフラグメントを増幅する工程を包含する。この核酸は、表１のＳＮＰ１〜ＳＮＰ４１の少なくとも１個、好ましくは２個または３個、そして他の局面においては３個より多くを含み、それによって増幅フラグメントが得られる。この増幅されるフラグメントの大きさは、このフラグメントが検出可能であり、本出願において記載される遺伝子型決定方法のために有用であるために十分な程度に大きければよい。この増幅されるフラグメントの大きさの好ましい範囲は、１４ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドであり、より好ましくは７５ヌクレオチド〜４００ヌクレオチドであり、もっとも好ましくは８０ヌクレオチド〜２６０ヌクレオチドである。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、１個以上のフラグメントに１個、または２個以上のＳＮＰを有する、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。さらに、本発明は、表１のＳＮＰ１〜ＳＮＰ４１の配列を有するポリヌクレオチド分子に対して相補的な、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。
【００１５】
本発明の他の好ましい局面は、本出願において記載される方法を用いる、増幅されたフラグメントの遺伝子型決定に関するが、これらの例に限定されない。
【００１６】
本発明の他の好ましい局面は、ＴＰＭＴ活性と相関関係があるＡ重複、Ｂ重複、およびＣ重複の数を同定するために、ＶＮＴＲ領域を塩基配列決定することである。
【００１７】
本発明のさらに別の局面は、ＴＰＭＴ遺伝子型についての情報とＨＧＰＲＴ遺伝子型についての情報とを組み合わせる。ＨＧＰＲＴ遺伝子のＳＮＰを不活性化することが、より少ないＨＧＰＲＴ酵素を産生するか、ＨＧＰＲＴ酵素を産生しないか、または欠損したＨＧＰＲＴ酵素を産生するので、患者がチオプリン治療下にある場合に毒性がより低い中間体が産生され、処置する医師は、治療計画におけるチオプリン類の投薬量をより正確に調節し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）欠損の常染色体劣性形質は、患者がメルカプトプリン、アザチオプリン、またはチオグアニン（チオプリン類一般またはＴＰＭＴ酵素の基質である他の薬物）の標準的な投薬量を用いて処置される場合、潜在的に致死性の造血毒性と関連する。本発明者らが、単独または好ましくは組合せ（表１のＳＮＰ１〜ＳＮＰ４１）のいずれかでＴＰＭＴ欠損に関連していることを見出した、ＴＰＭＴ遺伝子中の多数の異なる単一ヌクレオチド多型が本明細書において記載される。
【００１９】
本明細書において提供される変異対立遺伝子の配列に基づき、単一ヌクレオチド多型を含むこの変異対立遺伝子の領域に対して相補的であるＰＣＲプライマーが構築される。プライマーは、変異対立遺伝子において変異される位置を含むこの対立遺伝子中の領域に対して相補的なポリヌクレオチドの連続した配列から構成されるが、偽遺伝子を増幅しない。変異ＰＣＲプライマーに対応する、野生型対立遺伝子中の領域に対して相補的なＰＣＲプライマーもまた作成され、本発明の診断方法におけるコントロールとして役立つ。これらのＰＣＲプライマーの大きさは、５塩基〜数百塩基のいずれかの範囲にわたる。しかし、プライマーの好ましい大きさは、１０塩基〜４０塩基の範囲にあり、最も好ましくは１４塩基〜３２塩基の範囲にある。
【００２０】
変異対立遺伝子のキャリアであり得る個々の患者のゲノムＤＮＡのこの領域を増幅するために、標的位置（すなわち、表１のＳＮＰ）の片側または両側に対するプライマーが作成され、当該分野において公知の方法（例えば、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＆  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５章（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１））、ならびに表２のプライマーおよびプローブを用いるＰＣＲ増幅反応において使用される。例えば、ＳＮＰ１に対して、プライマーＳＰ９００２９５ＦおよびプライマーＳＰ９００２９５Ｒが用いられる。好ましいプロトコルおよび方法については、材料および方法の節ならびに実施例を参照されたい。
【００２１】
本発明の方法によると、（偽遺伝子を増幅することなく）増幅された特定のＴＰＭＴフラグメントが得られると、このフラグメントは、この患者が一つ以上の本明細書において記載されるＴＰＭＴ遺伝子の変異対立遺伝子を有するか否かを決定するための幾つかの方法において解析され得る。例えば、この増幅されたフラグメントは、単純に配列決定され得、その配列はＴＰＭＴの野生型ｃＤＮＡ配列と比較され得る。増幅されたフラグメントが一つ以上の本発明において記載される単一ヌクレオチド多型を含み、そして／またはＶＮＴＲがより多数の重複Ａおよび／もしくは重複Ｂ（例えば、３個以上のＢ重複）を含む場合、患者はＴＰＭＴ欠損を有する可能性があるか、またはヘテロ接合性（すなわち、活性が低下している）である可能性があり、従って、メルカプトプリン、アザチオプリン、またはチオグアニンの標準的な量を用いて処置される場合に造血毒性を発症する可能性がある。あるいは、ＰＣＲフラグメントの増幅とＴａｑＭａｎまたは他の遺伝子型決定解析との組合せが、個体のＴＰＭＴ遺伝子型を決定するために用いられる。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、患者のゲノムＤＮＡのフラグメントは、表２のそれぞれのＳＮＰのプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ（Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３年、２１：３７６１−３７６６）解析によって増幅される。
【００２３】
個体がＴＰＭＴについてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを決定するために、ゲノムＤＮＡの変異部位が、野生型のプライマーおよび変異体のプライマーを用いることによって個別に増幅される。野生型のフラグメントのみまたは変異型のフラグメントのみが増幅される場合、この個体は、野生型ＴＰＭＴまたは特定の変異型ＴＰＭＴについてホモ接合性である。しかし、１個より多い型のフラグメントの存在は、この個体がＴＰＭＴ対立遺伝子についてヘテロ接合性であることを示す。
【００２４】
個体のＴＰＭＴ遺伝子型を決定するために本発明に従って行われる診断アッセイの一例は、以下の通りである。この例は、説明を目的として提供され、限定することを意図されない。
【００２５】
被験体由来のＤＮＡを含む組織（例えば、赤血球ではない組織）が得られる。そのような組織の例として、白血球、口腔の内層の粘膜擦過標本、上皮細胞などが挙げられる。個々の被験体のゲノムＤＮＡは、当該分野において公知の方法（例えば、フェノール／クロロホルム抽出または市販のキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）製のＱｉａＡｍｐＴＭＤＮＡキット）によってこの組織から単離される。この被験体のゲノムＤＮＡの一部は、ＴＰＭＴ遺伝子のＰＣＲ増幅のために用いられ得る。ＳＮＰ１〜ＳＮＰ５０を含むＰＣＲプライマーは、表２に列挙され、ＩＤ名中にＦまたはＲ（順方向プライマーおよび逆方向プライマー）で印付けされる。特定のＳＮＰの各々に対して、プライマー一対が選択され得る（例えば、ＳＮＰ１は、ＳＰ９００２９５ＦおよびＳＰ９００２９５Ｒを用いて増幅され得る）。これらの列挙されるプライマーは増幅のための例であり、当業者によって他のプライマーが設計され得る。次に、増幅単位は上記の種々の方法によって解析される。これらの方法として、Ｔａｑｍａｎ解析、塩基配列決定、変異特異的増幅、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ、または当業者に公知である遺伝子型を決定するための他の方法が挙げられる。
【００２６】
従って、患者のＴＰＭＴ遺伝子型に関する情報を取得する効率的かつ平易な方法が、ここで利用可能とされ、この方法は、医師が患者のための治療様式を選択することを助ける。
【００２７】
（定義）
便宜上、本明細書、実施例、および添付される特許請求の範囲において使用される特定の用語および句の意味は、以下に提供される。さらに、その定義自体は、本発明のさらなる背景を説明することを意図される。
【００２８】
本出願における用語「アルゴリズム」とは、多数のＳＮＰのそれらのそれぞれの遺伝子型の連続的な分析を指し、各々のＳＮＰのどの遺伝子型がＴＰＭＴ欠損において予測的な意味を有するかを定義する。明瞭にするために、４個のＳＮＰについての例を提供する。
【００２９】
【化１】
2007517511.tif 000002
結果：
アルゴリズム１（４個のＳＮＰの組合せ）は、言い換えれば、ＳＮＰ−ＡがＧＧであり、ＳＮＰ−ＢがＧ／ＡまたはＡＡであり、ＳＮＰ−ＣがＣＣであり、ＳＮＰ−ＤがＣＣである場合に、低下した酵素活性を予測する。
【００３０】
アルゴリズム２（３個のＳＮＰの組合せ）は、言い換えれば、ＳＮＰ−ＡがＧＧであり、ＳＮＰ−ＣがＣＣであり、ＳＮＰ−ＤがＡＣである場合に、完全に欠損した活性を予測する。
【００３１】
同定されたアルゴリズムは、本出願においてハプロタイプと称される（ハプロタイプ１、ハプロタイプ２、など）。
【００３２】
本明細書において「対立遺伝子改変体」と交換可能に用いられる用語「対立遺伝子」とは、遺伝子の代替的な形態またはその一部を指す。対立遺伝子は相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。被験体が一つの遺伝子の二つの同一の対立遺伝子を有する場合、この被験体はこの遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であると称される。被験体が一つの遺伝子の二つの異なる対立遺伝子を有する場合、この被験体はこの遺伝子についてヘテロ接合性であると称される。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドにおいて互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、変異を含む遺伝子の形態でもあり得る。
【００３３】
用語「遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体」とは、他の個体の遺伝子の同じ領域において見出される数個のヌクレオチド配列の一つを有する、遺伝子の領域を指す。
【００３４】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、二つのペプチドの間、または二つの核酸分子の間の配列の類似性を指す。相同性は、各々の配列中の位置を比較することによって決定され得、各々の配列は比較の目的でアラインメントされ得る。この比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められる場合、この分子はこの位置で相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列によって共有される、一致する位置または相同な位置の数の関数である。
【００３５】
用語「偽遺伝子」とは、同定される遺伝子に対して高い相同性を有する配列を指し、非機能性のプロモーター、開始コドンの欠失、または他の欠損に起因して、一般的には転写も翻訳もされない。ほとんどの偽遺伝子は、イントロンを有さず、主に親遺伝子のコード配列を表す。いくつかの場合において、異なる生物体または異なる組織において、機能的な活性化が起こり得ることが示されている。
【００３６】
用語「イントロンの配列」または「イントロンのヌクレオチド配列」とは、イントロンまたはその一部のヌクレオチド配列を指す。
【００３７】
用語「遺伝子座」とは、染色体中の特定の位置を指す。例えば、遺伝子の遺伝子座とは、その遺伝子の染色体での位置を指す。
【００３８】
用語、遺伝子またはその一部の「分子構造」とは、ヌクレオチドの内容（一つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を含む）、ヌクレオチド配列、メチル化の状態、および／または遺伝子もしくはその一部の任意の他の変更によって定義されるような構造を指す。
【００３９】
用語「変異遺伝子」とは、変異遺伝子を有する被験体の表現型を、変異遺伝子を有さない被験体と比較して変更し得る、遺伝子の対立遺伝子的形態を指す。被験体が変更された表現型を有するためにこの変異についてホモ接合性でなければならない場合、この変異は劣性であると称される。１コピーの変異遺伝子が被験体の遺伝子型を変更するのに十分である場合、この変異は優性であると称される。被験体が１コピーの変異遺伝子を有し、（その遺伝子について）ホモ接合性の被験体の表現型とヘテロ接合性の被験体の表現型との中間の表現型を有する場合、この変異は共優性であると称される。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適切である場合は、リボ核酸（ＲＮＡ）のような、ポリヌクレオチドを指す。この用語は、同等物として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（Ｊ．ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＤ．Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７：１８７（１９９７））、ならびに記載されている実施形態に適用可能であるような、一本鎖（センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含む、ヌクレオチドのアナログから生成されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの誘導体、改変体、およびアナログを含むこともまた理解されるべきである。デオキシリボヌクレオチドとして、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンが挙げられる。明瞭にする目的で、本明細書において核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）のヌクレオチドに言及する場合、用語「アデノシン」、「シチジン」、「グアノシン」、および「チミジン」が用いられる。核酸がＲＮＡである場合、ウラシル基を有するヌクレオチドはウリジンであることが理解される。
【００４１】
用語「多型」とは、一つより多い遺伝子の形態またはその一部の共在を指す。少なくとも二つの異なる形態（すなわち二つの異なるヌクレオチド配列）が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」として言及される。多型領域は、単一ヌクレオチドであり得、その同一性は、異なる対立遺伝子において異なる。多型領域はまた、数個のヌクレオチドの長さであり得る。
【００４２】
「多型遺伝子」とは、少なくとも一つの多型領域を有する遺伝子を指す。
【００４３】
ヌクレオチド配列中の「多型部位」を説明するために、一部位におけるヌクレオチドの可能な改変を表す「多義性コード（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｃｏｄｅ）」がしばしば用いられることがある。多義性コードの一覧は、以下の表において総括される：
【００４４】
【化２】
2007517511.tif 000003
例えば、ヌクレオチド配列中の「Ｒ」は、「ａ」または「ｇ」ヌクレオチドのいずれかがこの位置にあり得ることを意味する。
【００４５】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、遺伝子産物に言及する場合、本明細書において交換可能に用いられる。
【００４６】
本明細書において「調節配列」とも称される「調節エレメント」は、基本的プロモーターからの転写を調節し得るエレメントを含むことを意図され、そしてエンハンサーおよびサイレンサーのようなエレメントを含むことを意図される。本明細書において「エンハンサーエレメント」としても言及される用語「エンハンサー」は、基本的プロモーターからの転写を増加、刺激、または増強し得る調節エレメントを含むことを意図される。本明細書において「サイレンサーエレメント」としても言及される用語「サイレンサー」は、基本的プロモーターからの転写を減少、阻害、または抑制し得る調節エレメントを含むことを意図される。調節エレメントは、代表的には遺伝子の５’隣接領域中に存在する。しかし、調節エレメントは、遺伝子の他の領域中、特にイントロン中に存在することもまた示されている。従って、遺伝子が、イントロン、エクソン、コード領域、および３’隣接配列中に配置された調節エレメントを有することはあり得る。そのような調節エレメントもまた、本発明によって包含されることが意図され、遺伝子の５’隣接領域中の調節エレメントを同定するために用いられ得る任意のアッセイによって同定され得る。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、用語「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」とは、本発明の核酸分子が、遺伝子のいずれかの鎖の、少なくともおよそ６個、１２個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、または１４０個の連続するヌクレオチドにハイブリダイズする能力を指す。
【００４８】
用語「野生型対立遺伝子」とは、被験体において２コピーで存在する場合に野生型表現型をもたらす遺伝子の対立遺伝子を指す。遺伝子中の特定のヌクレオチドの変化は、２コピーのそのヌクレオチドが変化した遺伝子を有する被験体の表現型に影響を及ぼし得ないことから、特定の遺伝子の数個の異なる野生型対立遺伝子が存在し得る。
【００４９】
本明細書において用いられる場合「有害薬物反応（ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」（ＡＤＲ）とは、医薬製品の使用に関係する介入に起因する、感知されるほどに有害または不愉快な反応を指し、将来的な投与からの危険要素を予測し、予防もしくは特定の治療、または投与レジメンの変更、またはその製品の回収の根拠となる。ＡＤＲの最も深刻な形態においては、ＡＤＲは、個体の死をもたらし得る。
【００５０】
用語「薬物応答」は、患者が薬物の投与後に示す任意の応答を意味することを意図される。具体的には、薬物応答として、有益な（すなわち、望ましい）薬物効果、ＡＤＲ、または全く検出不可能な反応が挙げられる。さらに具体的には、用語、薬物応答とは、定量的意味もまた有し得、すなわち、薬物応答は、それぞれあまり有益でない効果または非常に有益である効果、およびそれぞれ弱いＡＤＲまたは重篤なＡＤＲを含む。個々の薬物応答はまた、好ましいまたは好ましくない薬物の代謝も含み、このことは、「代謝が好ましくない個体（ｂａｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）」が体内に薬物を蓄積し、このことによって累積的な過剰投与に起因するこの薬物の副作用を示し得ることを意味する。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、用語「ハプロタイプ」とは、機能的におよび／または位置的に連鎖する二つ以上のＳＮＰの群を指す。本出願のハプロタイプは、一つのアルゴリズムによって記述される。ハプロタイプは、単一のＳＮＰより良い予測的／診断的情報を提供することが期待される。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、用語「ハプロタイプブロック」とは、減数分裂中に母性染色体と父性染色体との間の相同組換えが起こる位置である、組換えホットスポットの間の、ＳＮＰの観察され得る連鎖を指す。染色体上のホットスポットは、およそ５０００〜１００，０００塩基対の間の距離を有する。ホットスポット間のＳＮＰは、ブロックの外のＳＮＰより強く連鎖する。ハプロタイプブロックは、染色体上の多数の隣接するＳＮＰを遺伝子型決定し、どのＳＮＰが連鎖する（比較可能な遺伝子型のパターンを有する）かを解析することを通して実験的に同定され得る。
【００５３】
用語、個体における「欠損したＴＰＭＴ活性」は、ＴＰＭＴ活性が無いか、もしくは非常に低いＴＰＭＴ活性を意味し得るか、または、「欠損したＴＰＭＴ活性」は、非常に低いＴＰＭＴ活性と正常なＴＰＭＴ活性の下限との間の中間の活性を意味し得る。
【００５４】
（診断アッセイおよび予後アッセイ）
本発明は、ＴＰＭＴ欠損と関連する遺伝子の少なくとも一つの多型領域、特定の対立遺伝子改変体、および前記の多型領域のハプロタイプの分子構造を決定するための方法を提供する。一実施形態において、遺伝子の多型領域の分子構造の決定は、対立遺伝子改変体の同一性を決定する工程を包含する。特定の対立遺伝子がＴＰＭＴ欠損と関連する遺伝子の多型領域は、エクソン中に、イントロン中に、イントロン／エクソンの境界に、またはその遺伝子のコード配列のプロモーターあるいは他の５’隣接領域または３’隣接領域中に、位置し得る。
【００５５】
ＴＰＭＴ遺伝子多型を解析する場合、上で論議されるようなＴＰＭＴ偽遺伝子由来の配列の介入を除外するために、ＴＰＭＴ遺伝子特異的な増幅が推奨される。
【００５６】
本発明は、被験体がチオプリンまたはＴＰＭＴによって代謝される構造アナログの代謝において機能的欠損を有するか否かを決定するための方法を提供する。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、被験体由来の細胞のサンプルにおいて、遺伝子の一つ以上の多型領域の特定の対立遺伝子改変体の存在または非存在を検出する工程を包含するものとして、特徴付けられ得る。この対立遺伝子の相違は：（ｉ）少なくとも１個以上のヌクレオチドの同一性における相違、または、（ｉｉ）ヌクレオチド数の相違（その相違は単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドであり得る）であり得る。
【００５８】
ＴＰＭＴ遺伝子のエクソンに対して高相同性であるヒトゲノム中のＴＰＭＴ偽遺伝子の存在に起因して、ほとんどの検出方法は、対立遺伝子改変体を同定することに先立ち、第一に遺伝子の少なくとも一部を増幅することを必要とする。一例は以下に提供される：遺伝子特異的な増幅のためのプライマーは、偽遺伝子に対して相同性を示さない目的の遺伝子上の配列（例えば、目的の遺伝子のイントロン配列、または目的の遺伝子に固有である他の配列）に位置される必要がある。当業者は、バイオインフォマティクスのツール（例えば、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ）またはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ製のＣｌｕｓｔａｌＷＴＭまたは他のプログラム）の補助により目的の遺伝子の相同配列のペアワイズアラインメントを通して、これらの固有の配列を見出す。遺伝子フラグメントの増幅は、例えば、ＰＣＲおよび／またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって、当該分野において公知の方法に従って、行われ得る。一実施形態において、細胞のゲノムＤＮＡは、二つのＰＣＲプライマー、および必要とされる量の増幅ＤＮＡを産生するのに十分に多回のサイクルにわたる増幅に曝される。好ましい実施形態において、これらのプライマーは、４０塩基対〜３５０塩基対離れて位置される。本出願の遺伝子の遺伝子フラグメントを増幅するための好ましいプライマーは、実施例中の表２に列挙される。
【００５９】
好ましい検出方法は、多型部位と重なり、約５個、約１０個、約２０個、約２５個、または約３０個のヌクレオチドを多型領域の周囲に有するプローブを用いる、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションである。この多型領域の特異的な対立遺伝子改変体を検出するためのプローブの例は、表１のＳＮＰ１〜ＳＮＰ４１のいずれかにおいて示されるヌクレオチド配列を含むプローブである。本発明の好ましい実施形態において、この対立遺伝子改変体に特異的にハイブリダイズし得る数個のプローブは、固相支持体（例えば、「チップ」）に結合される。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む種々のプロセスによって固体支持体に結合され得る。例えば、１個のチップは２５０，０００個までのオリゴヌクレオチドを保持し得る（ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。「ＤＮＡプローブアレイ」とも称される、オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを用いる変異検出解析は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４およびＫｏｚａｌら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３において記載される。一実施形態において、１個のチップは、遺伝子の少なくとも一つの多型領域のすべての対立遺伝子改変体を含む。固相支持体は、次いで試験核酸と接触させられ、特異的なプローブへのハイブリダイゼーションが検出される。従って、一つ以上の遺伝子の多数の対立遺伝子改変体の同一性は、簡易なハイブリダイゼーション実験において同定され得る。例えば、表１のＳＮＰ１の位置１６でのヌクレオチドＧまたはＡのヌクレオチド多型の対立遺伝子改変体の同一性、および他の可能な多型領域の対立遺伝子改変体の同一性は、一回のハイブリダイゼーション実験において決定され得る。ＴＰＭＴ遺伝子解析の場合、ハイブリダイゼーション実験に先立ち、ハイブリダイゼーション実験において介入する偽遺伝子の配列を取り除くために、遺伝子特異的な増幅が必要とされる。
【００６０】
代替的な増幅方法として、以下のものが挙げられる：自己持続性配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅方法に続いて、当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出。これらの検出スキームは、検出する核酸分子が非常に低い数で存在する場合、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【００６１】
一実施形態において、遺伝子の少なくとも一部を直接的に塩基配列決定し、対立遺伝子改変体を検出する（例えば、変異を、サンプル配列の配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって、検出する）ために、当該分野において公知の種々の塩基配列決定反応のいずれかが用いられ得る。例示的な塩基配列決定反応として、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７４：５４６３）によって開発された技術に基づく塩基配列決定反応が挙げられる。主題のアッセイを行う場合に、任意の種々の自動化された塩基配列決定の手順が利用され得ることもまた、考えられる（Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８）。自動化された塩基配列決定の手順として、質量分析法による塩基配列決定（例えば、Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒによる、米国特許第５，５４７，８３５号および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１、発明の名称「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」；Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒによる、米国特許第５，５４７，８３５号および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２１８２２、発明の名称「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｖｉａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」、およびＨ．Ｋｏｓｔｅｒによる、米国特許第５，６０５，７９８号および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１、発明の名称「ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：１４７−１５９を参照されたい）が挙げられる。特定の実施形態について、この塩基配列決定反応において、１個、２個、または３個のみの核酸塩基の出現が測定されることを必要とすることは、当業者にとって明らかである。例えば、Ａ−ｔｒａｃｋなど（例えば、１個のヌクレオチドのみが検出される）が行われ得る。
【００６２】
例えば、米国特許第５，５８０，７３２号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｍｉｘｅｄ  ＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｂｅ」および米国特許第５，５７１，６７６号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」において、さらに他の塩基配列決定方法が開示される。
【００６３】
いくつかの場合において、被験者由来のＤＮＡ中の遺伝子の特定の対立遺伝子の存在は、制限酵素解析によって示され得る。例えば、特定のヌクレオチド多型は、別の対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列には存在しない制限部位を含むヌクレオチド配列を生成し得る。
【００６４】
他の実施形態において、電気泳動移動度における変化が、遺伝子の対立遺伝子改変体の型を同定するために用いられる。例えば、一本鎖高次構造多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）が、変異体の核酸と野生型の核酸との間の電気泳動移動度の相違を検出するために用いられ得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ  ９：７３−７９もまた参照されたい）。サンプルの核酸およびコントロールの核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントが変性され、次いで、復元（ｒｅｎａｔｕｒｅ）させられる。一本鎖の核酸の二次構造は、配列によって変化し、その結果の電気泳動移動度の変化は、１個の塩基の変化ですら検出を可能にする。このＤＮＡフラグメントは、標識され得るかまたは標識プローブによって検出され得る。このアッセイの感度は、（ＤＮＡよりもむしろ）二次構造が配列の変化に対してより感受性であるＲＮＡを用いることによって増強され得る。別の好ましい実施形態において、主題の方法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するために、ヘテロ二本鎖解析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【００６５】
さらに別の実施形態において、多型領域の対立遺伝子改変体の同一性は、変性剤の勾配を有するポリアクリルアミドゲル中での多型領域を含む核酸の動きを解析することによって得られ、変性勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）を用いてアッセイされる。ＤＧＧＥが解析の方法として用いられる場合、例えば、ＰＣＲを用い、およそ４０ｂｐの高温融解性のＧＣリッチなＤＮＡであるＧＣクランプ（ｃｌａｍｐ）を加えることによって、ＤＮＡが完全には変性しないことを確実にするように、ＤＮＡは改変される。さらなる実施形態において、コントロールおよびサンプルのＤＮＡの移動度の相違を同定するために、温度勾配が変性剤勾配の代わりに用いられる（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５）。
【００６６】
二つの核酸の間の少なくとも１個のヌクレオチドの相違を検出するための技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、公知の多型ヌクレオチドが中心に配置されるオリゴヌクレオチドプローブ（対立遺伝子特異的プローブ）が調製され得、次いで、完全な一致が見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下において、標的ＤＮＡにハイブリダイズされる（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０；およびＷａｌｌａｃｅら（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３５４３）。そのような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、遺伝子の異なる多型領域における数個のヌクレオチドの変化の同時検出のために用いられ得る。例えば、特定の対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ用のメンブレン（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に結合され、このメンブレンは次いで、標識されたサンプルの核酸とハイブリダイズされる。次いで、ハイブリダイゼーション信号の解析が、このサンプルの核酸のヌクレオチドの同一性を明らかにする。
【００６７】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術が用いられ得る。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、目的の対立遺伝子改変体を、その分子の中心に持ち得る（その結果、増幅は差次的なハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）か、または、片方のプライマーの３’の最末端に持ち得、適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼの伸長を妨害または減少し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８；Ｎｅｗｔｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５０３）。この技術は、Ｐｒｏｂｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを表して「ＰＲＯＢＥ」とも称される。加えて、切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）に基づく検出をもたらすために、変異の領域に新規の制限部位を導入することが所望され得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。
【００６８】
別の実施形態において、対立遺伝子改変体の同定は、例えば、米国特許第４，９９８，６１７号およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０（１９８８））において記載されるように、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を用いて行われる。このＯＬＡのプロトコルは、標的の一本の鎖の隣接配列にハイブリダイズし得るように設計される２個のオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドのうちの１個は、分離マーカー（例えば、ビオチン化されている）に結合し、別の１個は検出可能なように標識される。正確な相補的配列が標的分子において見出される場合、このオリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接し、ライゲーションの基質をもたらすように、ハイブリダイズする。次いで、ライゲーションは、標識されたオリゴヌクレオチドが、アビジン、または別のビオチンのリガンドを用いて回復されることを可能にする。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．らは、ＰＣＲおよびＯＬＡの特質を組み合わせる核酸検出アッセイを記載している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３−８９２７（１９９０））。この方法において、ＰＣＲは、標的ＤＮＡの指数的増幅を達成するために用いられ、標的ＤＮＡは次いでＯＬＡを用いて検出される。
【００６９】
このＯＬＡ法に基づくいくつかの技術が開発されており、遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子改変体を検出するために用いられ得る。例えば、米国特許第５，５９３，８２６号は、ホスホルアミデート結合を有する結合体を形成するために３’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチドおよび５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを用いるＯＬＡを開示する。Ｔｏｂｅら（（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３７２８）において記載されるＯＬＡの別の変形において、ＰＣＲと組み合わされたＯＬＡは、単一のマイクロタイターウェル中での二つの対立遺伝子の判別を可能にする。対立遺伝子特異的プライマーの各々を固有のハプテン（すなわち、ジゴキシゲニンおよびフルオレセイン）で印付けすることにより、各々のＬＡ反応は、異なる酵素レポーターであるアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されるハプテン特異的抗体を用いることによって、検出され得る。この系は、二つの異なる色の産生をもたらすハイスループットフォーマットを用いて、二つの対立遺伝子の検出を可能にする。
【００７０】
本発明はさらに、遺伝子における単一ヌクレオチド多型を検出するための方法を提供する。単一ヌクレオチド多型が、非改変配列の領域によって挟まれる改変部位を構成するので、単一ヌクレオチド多型の解析は、改変部位に存在する単一ヌクレオチドの同一性の決定しか必要とせず、各々の患者について完全な遺伝子配列を決定することは必要でない。そのような単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために、いくつかの方法が開発されている。
【００７１】
一実施形態において、単一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）において開示されるような、特殊化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いることによって検出され得る。この方法によると、多型部位のすぐ３’側の対立遺伝子配列に対して相補的なプライマーが、特定の動物またはヒトから得られた標的分子にハイブリダイズさせられる。この標的分子の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含む場合、この誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端に組み込まれる。そのような組込みは、このプライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、それによって、プライマーの検出を可能にする。このサンプルのエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性は公知であるので、このプライマーがエキソヌクレアーゼに対して耐性となったという知見は、標的分子の多型部位中に存在するヌクレオチドがこの反応において用いられたヌクレオチド誘導体のヌクレオチドに対して相補的であったことを明らかにする。この方法は、大量の無関係な配列データの決定を必要としないという利点を有する。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液に基づく方法が用いられる。Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ら（フランス特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／０２０８７）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙ法において使用されるように、多型部位のすぐ３’側の対立遺伝子配列に対して相補的であるプライマーが使用される。この方法は、この部位のヌクレオチドの同一性を、標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて決定する。ジデオキシヌクレオチド誘導体は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合、このプライマーの末端に組み込まれるようになる。
【００７３】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡＴＭとして公知の代替的な方法は、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）によって記載される。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．らの方法は、標識されたターミネーターと多型部位の３’側の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を用いる。この組み込まれる標識されたターミネーターは、従って、評価されている標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、このヌクレオチドに対して相補的である。Ｃｏｈｅｎら（フランス特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／０２０８７）の方法と対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．らの方法は、好ましくは、プライマーまたは標的分子が固相に固定される異質相（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）アッセイである。
【００７４】
最近、ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするためのいくつかのプライマー誘導性のヌクレオチド組み込みの手順が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２（１９９０）、Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ら、ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、これら全てが、多型部位で塩基間を区別するために、標識されたデオキシヌクレオチドの組み込みに依存するということにおいて、ＧＢＡＴＭと異なる。そのようなフォーマットにおいて、信号は組み込まれるデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドの電気泳動において出現する多型は、その電気泳動の長さに比例する信号をもたらし得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
【００７５】
遺伝子のコード領域中に位置される多型領域の対立遺伝子改変体の同一性を決定するために、上記の方法以外のさらに他の方法が用いられ得る。例えば、変異タンパク質を特異的に認識する抗体を、例えば、免疫組織化学法または免疫沈降法において用いて、変異遺伝子のタンパク質をコードする対立遺伝子改変体の同定を行い得る。野生型遺伝子のタンパク質に対する抗体は、例えば、Ａｃｔｏｎら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：５１８（ヒト遺伝子と交差反応性である抗マウス遺伝子抗体）において記載される。野生型遺伝子のタンパク質または変異形態の遺伝子のタンパク質に対する他の抗体は、当該分野において公知の方法に従って調製され得る。あるいは、遺伝子のタンパク質の活性（例えば、脂質またはリポタンパク質への結合）もまた計測し得る。結合アッセイは、当該分野において公知であり、変異形態のレセプターへの結合が野生型のレセプターへの結合と異なるか否かを決定するために、例えば、被験体から細胞を得る工程、および標識された脂質との結合実験を行う行程を包含する。
【００７６】
多型領域がこの遺伝子のコード領域または非コード領域のいずれかにおいてエクソン中に位置される場合、対立遺伝子改変体の同一性は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、またはｃＤＮＡの分子構造を決定することによって決定され得る。この分子構造は、ゲノムＤＮＡの分子構造を決定するための上記の方法（例えば、塩基配列決定およびＳＳＣＰ）のいずれかを用いて決定され得る。
【００７７】
本明細書において記載される方法は、例えば、上に記載されたもののような、あらかじめパッケージに組まれた診断キットを利用することによって、行われ得る。この診断キットは、少なくとも一つの本明細書にいおいて記載されるプローブまたはプライマー核酸を含み、例えば、被験体がチオプリンまたはアナログを用いて処置される場合に、重篤な副作用を引き起こし得るＴＰＭＴ欠損を有する危険性があるか否かを決定するために、便利に用いられ得る。
【００７８】
上記の診断方法および予後の方法において用いるためのサンプル核酸は、被験体の任意の細胞型または組織から入手され得る。例えば、被験体の体液（例えば、血液もしくは唾液）は、公知の技術（例えば、それぞれ静脈穿刺もしくはスワブ）によって入手され得るか、または心臓のようなヒト組織（生検、移植される臓器）から入手され得る。あるいは、乾燥サンプル（例えば、毛または皮膚）での核酸試験が行われ得る。
【００７９】
診断の手順はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除術から得られる患者の組織の組織切片（固定および／または凍結）上で直接的にインサイチュでも行われ得る。核酸試薬は、そのようなインサイチュの手順のためのプローブおよび／またはプライマーとして用いられ得る（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，１９９２年、ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【００８０】
一つの核酸配列の検出に主に焦点を合わせる方法に加えて、プロファイリングもまた、そのような検出スキームにおいて評価され得る。フィンガープリントプロファイリングは、例えば、ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）手順、ノーザン解析、および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することによって、作製され得る。
【００８１】
本発明の実施において、チオプリン応答について特定のマーカーを示す多数の個体における多型パターンの分布は、上記の方法のいずれかによって決定され、年齢、人種起源、および／または任意の他の統計学的にもしくは医学的に関連のあるパラメータについて一致しており、量的にまたは質的に異なる状態のマーカーを示す患者の多型パターンの分布と比較される。相関関係は、当該分野において公知の任意の方法を用いて得られる。この方法として、名義ロジスティック回帰（ｎｏｍｉｎａｌ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、χ二乗検定、または標準最小二乗回帰分析が挙げられる。このように、特定の多型パターンと特定のチオプリン応答状態との間の統計学的に有意な相関関係（ｐ値として提供される）を確立することが可能である。さらに、特定の多型パターンと、（例えば、特定の治療レジメンからもたらされるような）薬物応答の変化との間の統計学的に有意な相関関係を確立することが可能である。このように、多型パターンを特定の処置に対する応答性と関連付けることが可能である。
【００８２】
本発明の別の実施形態において、二つ以上の多型領域が、いわゆる「ハプロタイプ」を定義するために組み合わせられる。ハプロタイプは、機能的におよび／または空間的に連鎖する二つ以上のＳＮＰの群である。本発明において開示されるＳＮＰを、ハプロタイプを形成するために、互いにまたはさらなる多型領域のいずれかと組み合わせることが可能である。ハプロタイプは、単一のＳＮＰよりよい予測的／診断的情報を与えることが期待される。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態において、薬物応答を予測するＳＮＰ／ハプロタイプのパネルが定義される。この予測的なパネルは、次いで、患者の遺伝子型決定のために、複数のＳＮＰを同時に遺伝子型決定し得る（多重化（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ））プラットフォーム上で用いられる。好ましいプラットフォームは、例えば、遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）またはＬｕｍｉｎｅｘ  ＬａｂＭＡＰＴＭリーダーである。しかし、多重遺伝子型決定のために用いられ得る二次元導波管またはナノ粒子のような、より新たな開発もまた進行中である。Ｚｅｐｔｏｓｅｎ（Ｗｉｔｔｅｒｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって用いられるような薄膜二次元導波管（ＰＷＧ）は、例えば、高屈折率を有する材料（例えば、Ｔａ２Ｏ５またはＴｉＯ２）の１５０ｎｍ〜３００ｎｍの薄膜からなり、この薄膜は、より低い屈折率を有する透明な支持体（例えば、ガラスまたはポリマー）上に堆積させられる。この基質にエッチングまたはエンボス加工される回析格子（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ  ｇｒａｔｉｎｇ）によって、平行レーザー光束がこの導波管の膜に連結される。光は、この膜の中を伝搬し、隣接する媒体への伝搬の方向に対して垂直の強力な即時消退性の場（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ）を作り出す。この場の強さは、導波管表面からの距離が離れると共に指数的に減衰し、この場の浸透長（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｔｈ）は、約４００ｎｍに限定される。この効果は、導波管の表面または導波管の表面付近に位置する発色団のみを選択的に励起するために利用され得る。
【００８４】
診断への適用のために、特異的なキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）が導波管表面に固定される。ＰＷＧチップに適用されるサンプル中の分析物の存在は、分析物またはこのアッセイにおける分析物の結合パートナーの一つに結合される蛍光レポーター分子を用いて検出される。即時消退性の場による蛍光励起によって、発色団の励起および検出は、感知面（ｓｅｎｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）に制限されるが、バルク溶液中の非結合分子からの信号は検出されない。この技術を用いて、ＴＰＭＴ遺伝子中の多型を検出することは可能であるが、偽遺伝子に関して、キャプチャープローブの設計の際に注意する必要がある（遺伝子と偽遺伝子との間の非相同性配列の同定についての上記の議論を参照されたい）。
【００８５】
あるいは、異なる蛍光色を発するナノ粒子が用いられ得、その結果、例えば、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．（２００３年；３（２）：１５３−６１）において論議されるような、一回の反応における数種のＳＮＰアッセイのために、多重化が設定され得る。
【００８６】
患者のハプロタイプのその後の同定および評価は、次いで、特異的かつ個別化された治療を導くことを助け得る。
【００８７】
例えば、本発明は、有害薬物反応についての危険性の増加を示唆する遺伝的多型またはハプロタイプを示す患者を同定し得る。この場合において、この薬物の用量は、ＡＤＲについての危険性が低下するように減量されるべきである。
【００８８】
患者の個々の薬物応答を予測する能力が薬物の処方に影響するべきである（すなわち、薬物の処方は、異なる患者の分類（低／高応答性の患者、低い／好ましい代謝を有する患者、およびＡＤＲ傾向のある患者）にこの薬物の処方が適するように調整されるべきである）ことは、自明である。これらの異なる薬物の処方物は、この薬物の異なる用量を含み得る。すなわち、この医薬製品は少量または多量の活性基質を含む。本発明の別の実施形態において、この薬物の処方物は、有益な効果を促進するおよび／またはＡＤＲについての危険性を低下させる、さらなる基質を含み得る（Ｆｏｌｋｅｒｓら、１９９１年、米国特許第５，３１６，７６５号）。
【００８９】
（単離された多型核酸、およびプローブ）
本発明は、ヒト遺伝子について本明細書において記載される多型位置を含む単離された核酸を提供する。本発明はまた、これらの多型を検出するために有用であるプローブを提供する。
【００９０】
本発明の実施における、分子生物学における多くの従来技術。そのような技術は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻、１９８５年（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４年（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５年（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７年（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻、および第１５５巻（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、ならびにＷｕ編）において完全に説明される。
【００９１】
本発明の核酸は、遺伝的多型の検出のためのプローブとして、および、正常ペプチドまたは改変体ペプチドまたは実施例において列挙される遺伝子によってコードされるポリペプチドの組換え産生のための鋳型として、有用性を見出す。
【００９２】
本発明に従うプローブは、長さが約１０〜１００ｂｐ、好ましくは１４〜７５ｂｐ、および最も好ましくは１５〜２５ｂｐの、本明細書において開示される一つ以上の多型配列または多型位置のすぐ隣に隣接する配列に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする、単離された核酸を含むが、それらに限定されない。さらに、いくつかの実施形態において、全長の遺伝子配列がプローブとして用いられる。一連の実施形態において、これらのプローブは、本明細書において開示される遺伝子中の多型位置の全長にわたる。別の一連の実施形態において、これらのプローブは多型位置のすぐ隣に隣接する配列に対応する。
【００９３】
（キット）
本明細書において示されるように、本発明は、診断方法を提供し、この診断方法は、例えば、多型領域の特定の対立遺伝子改変体がＴＰＭＴ欠損と関連する、本明細書において開示される遺伝子の遺伝子座に存在する多型領域の対立遺伝子改変体の同一性を決定するための診断方法である。好ましい実施形態において、この診断キットは、被験体がチオプリンを用いて処置される場合に重篤な副作用を蒙る危険性があるか否かを決定するために用いられ得る。この情報は、次いで、例えば、そのような個体の処置を最適化するために用いられ得る。
【００９４】
好ましい実施形態において、このキットは、プローブおよびプライマーを含み、これらのプローブおよびプライマーは、遺伝子にハイブリダイズし得、それによってその遺伝子が、ＴＰＭＴ欠損と関連する多型領域の対立遺伝子改変体を含むか否かを同定し得る。このキットはさらに、ＳＮＰの組み合わせからＴＰＭＴ欠損のグレードを同定するアルゴリズムを含む。このキットは、好ましくは、ＴＰＭＴ欠損を有する被験体の診断における使用のための指示書をさらに含む。このキットのプローブまたはプライマーは、本出願において記載されるプローブまたはプライマーのいずれかであり得る。
【００９５】
目的の多型領域を含む遺伝子の領域を増幅するための好ましいキットは、１個または２個以上のプライマーを含む。
【００９６】
（材料および方法）
（ＡＢＩ  ７７００／７９００ＴＭ装置（ＴａｑＭａｎ解析のための）を用いる遺伝子型決定）
ＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いる患者のＤＮＡの遺伝子型決定を、製造者の指示書に従って行った。このＴａｑＭａｎアッセイは、Ｌｅｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３年、２１：３７６１−３７６６）によって論議される。
【００９７】
（ヒト被験体）
全血は、中央診断検査室から廃棄物として得られ、槽の個体標識は不可逆的に除去され、新たな番号によって置き換えられた。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製の市販のキット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いて単離した。
【実施例】
【００９８】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態をさらに説明することを意図しており、その性質において限定することは全く意図しない。
【００９９】
（遺伝子型決定アッセイ）
およそ１３００の匿名化（ａｎｏｎｙｍｙｚｅ）された血液サンプルのＤＮＡを、表１に列挙される５０個のＳＮＰについて遺伝子型決定した。各々のＳＮＰの配列を、各々のＳＮＰが配列の中央にあるものとしてこの表に示す。ＳＮＰが配列上に見出され得る位置もまた、数字で示す。基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として、ＴＰＭＴ遺伝子配列をＮＣＢＩから取得し（登録番号ＡＬ５８９７２３）、ＴＰＭＴ酵素についてのコード配列が５’〜３’方向では与えられないので、この配列を逆方向にし、相補化（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）した。５０個のＳＮＰの全てについて、表２に列挙するような、各々の対立遺伝子についての、異なる色素を有するＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＴａｑＭａｎアッセイを設計した。ＴａｑＭａｎを用いるための一般的なプロトコルは、上記に記述される。プライマーおよびプローブの濃度、ＤＮＡ、ならびにサイクルの温度および時間のような他のパラメータを記載するために、プロトコルの一例を表３に示す。
【０１００】
表１：ＳＮＰ１〜５０のＳＮＰ配列（登録番号ＡＬ５８９７２３（逆方向に相補化）中の周囲の配列および各々の位置を含む）。ベンチマーキング（ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ）のために、９個の基準ＳＮＰを含めた。ＳＮＰ４４、ＳＮＰ４７、およびＳＮＰ５０は、表現型に対する遺伝子型の相関関係が証明されている（上記を参照）。ＳＮＰ４２、ＳＮＰ４３、ＳＮＰ４５、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ４８、およびＳＮＰ４９は、最近の特許出願ＷＯ０３／０６６８９２  Ａ１からのものである。
【０１０１】
【表１−１】
2007517511.tif 000004
【０１０２】
【表１−２】
2007517511.tif 000005
【０１０３】
【表１−３】
2007517511.tif 000006
【０１０４】
【表１−４】
2007517511.tif 000007
表２：ＳＮＰ１〜５０のプライマー配列およびプローブ配列。第一列はＳＮＰ１〜５０についてのＳＮＰ−ＩＤを記載し、第二列は各々のＳＮＰのプライマーおよびプローブのＩＤを記載する。プライマーおよびプローブの命名法は以下の通りである：ＳＰ９００ｘｘｘはそれぞれのＳＮＰを表し（例えば、ＳＰ９００２９５はＳＮＰ１である）、その後に一つ以上のアルファベット文字が続く：ＦおよびＲ（順方向プライマーおよび逆方向プライマーを説明する）、または、４つの塩基記号であるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのうちの一つ（この後に「＋」もしくは「−」が続き、この「＋」もしくは「−」は、プローブを説明する）；プローブの５’色素型を、ＦＡＭ、ＶＩＣ、Ｔｅｔの記号で表す。「＋」プローブはＭＧＢ／ＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒを３’末端に有し、「−」プローブは消光剤（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）としてＴＡＭＲＡを用いる。プライマー名の最後の「Ｏｕｔ」は、ネステッドＰＣＲにおける第一のプライマーすなわち外側のプライマーを表す。「ＡｏＤ」はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製のＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭ（市販のアッセイ）を表す。
【０１０５】
【表２−１】
2007517511.tif 000008
【０１０６】
【表２−２】
2007517511.tif 000009
【０１０７】
【表２−３】
2007517511.tif 000010
【０１０８】
【表２−４】
2007517511.tif 000011
【０１０９】
【表２−５】
2007517511.tif 000012
【０１１０】
【表２−６】
2007517511.tif 000013
表３：ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプロトコルの例
【０１１１】
【表３】
2007517511.tif 000014
（ＴＰＭＴアッセイ）
Ｋｒｏｅｐｌｉｎ，Ｔ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９８）５４：２６５−２７１）において記載される、６−チオグアニンを基質として用いるＨＰＬＣ法によって、赤血球溶解物をＴＰＭＴ活性について分析した。
【０１１２】
（ＶＮＴＲの塩基配列決定）
ＴＰＭＴ遺伝子のＶＮＴＲの塩基配列決定を、製造者によって記載される通りにプロトコルを使用して、以下のプライマーを用い、ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った：
ＶＮＴＲ−Ｓｅｑ１  ｇｃｔｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｔ（順方向）および
ＶＮＴＲ−Ｓｅｑ２  ｇｔｃａｔｔｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｃ（逆方向）
概して、分子技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、２０００年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従って行った。
【０１１３】
プライマーＶＮＴＲ−Ｓｅｑ１およびプライマーＶＮＴＲ−Ｓｅｑ２を用いて増幅したＶＮＴＲ領域は、１〜６回のＡ（ｇｔｃａｔｔｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｃ）の重複、１〜３回のＢ（ｇａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｃｇｇｇｃｇ）の重複、および１回のＣ（ｇａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｃｇｇａｇａ）の重複によって、長さが２３３〜３７７ｂｐの範囲にわたった。
【０１１４】
（結果）
およそ１３００個のＤＮＡサンプルから、本発明者らは、ＴＰＭＴ遺伝子に１３５個の固有のハプロタイプを同定した。表４ａは、全ての多型ＳＮＰの対立遺伝子頻度を示す：本発明者らの１３００個のＤＮＡサンプル中で、２０個のＳＮＰが単形であることを見出した（表４ｂに列挙する）。驚いたことに、９個の基準ＳＮＰのうち５個が試験群において単形であった。基準ＳＮＰとして６個のＳＮＰのうち５個を一つの特許出願から取得し、これらを、ベンチマーク（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）ＳＮＰとして用いることを意図したにも関わらず、である。
【０１１５】
表４ａ：およそ１３００個のサンプル中の、３０個の多型ＳＮＰの全ての対立遺伝子頻度。基準ＳＮＰを、第二列において「Ｒ」で印付けし、連鎖するＳＮＰを網掛けし、特に本文中に言及される他のＳＮＰを、カンマ（，）またはダッシュ（−）のいずれかで印付けする。
【０１１６】
【表４ａ】
2007517511.tif 000015
表４ｂ：２０個の単形ＳＮＰを、試験した１３００個のＤＮＡサンプル中に見出した。
【０１１７】
【表４ｂ】
2007517511.tif 000016
表５は、３０個の多型ＳＮＰの全ての異なるハプロタイプを、ＴＰＭＴ遺伝子上の５’〜３’方向（表の左から右へ）で示す。ＳＰＮの位置を、登録番号ＡＬ５８９７２３（逆方向に相補化）を参照して記述する。よりよい全体像を得るために、野生型の遺伝子型を表５においてカンマ（，）により記号で表し、ヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｃｙｇｏｔｅ）を（ｏ）で印付けし、変異体ホモ接合体（ｈｏｍｏｃｙｇｏｔｅ）を（Ｘ）で印付けする。真の遺伝子型は、この表の下部から読まれ得る。この表から、ＳＮＰ４７とＳＮＰ２７との間で、一つのハプロタイプブロックの別のハプロタイプブロックへの移行が始まることが示され、このことは、おそらく減数分裂における母性染色体および父性染色体の交差点を表し得る。表５においてＳＮＰ２７で始まるＴＰＭＴ遺伝子の下流部分は、ＴＰＭＴタンパク質の最後の４個のエクソンをコードする。このハプロタイプブロックは、ほぼ全ての計測された患者において類似した対立遺伝子頻度を有するＳＮＰを含み、野生型遺伝子型、ヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｃｙｇｏｔｅ）遺伝子型、および変異体遺伝子型の、非常に類似した出現を伴う。
【０１１８】
表５：ＴＰＭＴ遺伝子上の５’〜３’方向（表の左から右へ）での、３０個の多型ＳＮＰの全ての異なるハプロタイプ。基準ＳＮＰを「Ｒ」で印付けし、連鎖するＳＮＰを網掛けし、本文中に言及される他のＳＮＰをダッシュ（−）で印付けする。
【０１１９】
【表５−１】
2007517511.tif 000017
【０１２０】
【表５−２】
2007517511.tif 000018
【０１２１】
【表５−３】
2007517511.tif 000019
【０１２２】
【表５−４】
2007517511.tif 000020
【０１２３】
【表５−５】
2007517511.tif 000021
【０１２４】
【表５−６】
2007517511.tif 000022
【０１２５】
【表５−７】
2007517511.tif 000023
このハプロタイプブロックの例外の一つは、独立したパターンを示すＳＮＰ５０である。この遺伝子の上流部分は、患者ごとに、より独立した対立遺伝子頻度のパターンを示すＳＮＰを含む（おそらく、組換えのホットスポットである）。一つの遺伝子内のこれらの二つの隣接するハプロタイプブロックに起因して、連鎖するＳＮＰを、単に、それらが一つの遺伝子上の隣り合ったものであるという事実から結論付けることは、演繹的に不可能である。しかし、驚いたことに、本発明者らは、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１７、ＳＮＰ４７、およびＳＮＰ５０が互いに連鎖していることを見出した；より正確には、ＳＮＰ１０がＳＮＰ５０に強く連鎖し、ＳＮＰ１７がＳＮＰ４７に強く連鎖することを見出した。なおさらに驚いたことに、本発明者らは、ＳＮＰ２６およびＳＮＰ２９が、基準ＳＮＰ４７および基準ＳＮＰ５０ならびにＳＮＰ１０およびＳＮＰ１７に、以下の様式で連鎖する一個のハプロタイプを表すことを見出した：
ＳＮＰ２６がＨＴでありＳＮＰ２９がＷＴであるとき、ＴＰＭＴ酵素は欠損している。
【０１２６】
ＳＮＰ２６がＭＴでありＳＮＰ２９がＷＴであるとき、ＴＰＭＴ酵素はさらに欠損している。
【０１２７】
ＳＮＰ２６がＭＴでありＳＮＰ２９がＨＴであるとき、ＴＰＭＴ酵素は欠損している。
【０１２８】
同様の様式で、欠損したＴＰＭＴ酵素活性に連鎖する他のハプロタイプを表５から同定することが出来る。
【０１２９】
ＳＮＰ７がＭＴでありＳＮＰ２０がＨＴであるとき、ＴＰＭＴ酵素は欠損している。
【０１３０】
ＳＮＰ７がＷＴでありＳＮＰ８がＨＴでありＳＮＰ２０がＷＴであるとき、ＴＰＭＴ酵素は欠損している。
【０１３１】
表５において、ＴＰＭＴ欠損個体について説明するために、他のハプロタイプが同定され得る。例えば、表５の第１行〜第５７行のハプロタイプのいずれも、以下のＳＮＰの２個から全てまでを用いて、ＴＰＭＴ酵素欠損である個体について説明するために用いられ得る：ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１６、ＳＮＰ１７、ＳＮＰ１８、ＳＮＰ２０、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２３、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２６、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ３２、ＳＮＰ３３、ＳＮＰ３４、ＳＮＰ３６、ＳＮＰ４１。１０個体の例を表５のそれぞれのハプロタイプと共に、表６に示す：
表６：ＴＰＭＴ欠損個体のハプロタイプの例
【０１３２】
【表６】
2007517511.tif 000024
一つの列中の各々のＳＮＰは、同じ列の別のＳＮＰと組み合わされなければならないが、組合せは２個、３個、４個、または全てまでのＳＮＰの組合せまであり得る。ほとんどの場合において、ＳＮＰ２７、ＳＰＮ２８、ＳＰＮ２９、ＳＰＮ３１、ＳＰＮ３３、ＳＮＰ３４、ＳＮＰ３６、ＳＮＰ４１のうちの１個または２個を取得すれば十分である。なぜならば、これらのＳＮＰは互いに非常に強く連鎖するからである（完全な表５を参照されたい）。
【０１３３】
さらなる例は、健康な志願者において測定されたＴＰＭＴ酵素活性と１０個のＳＮＰの個々のハプロタイプの相関関係を、１０個のＳＮＰの個々のハプロタイプと共に示す表７に示される。６−チオグアニンを基質として用いるＨＰＬＣ法によって、赤血球溶解物をＴＰＭＴ活性について分析した。この方法は、Ｋｒｏｅｐｌｉｎ，Ｔ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９８）５４：２６５−２７１）において記載される。この酵素活性を、ｎｍｏｌ／ｇＨｂ／ｈで測定した。このＴＰＭＴ活性は、０ｎｍｏｌ／ｇＨｂ／ｈ〜１０６ｎｍｏｌ／ｇＨｂ／ｈの範囲を示し、４６．６ｎｍｏｌ／ｇＨｂ／ｈの中央値、および４７．６ｎｍｏｌ／ｇＨｂ／ｈの平均値を有した。３４．５ｎｍｏｌ／ｇＨｂ／ｈまでのカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）を設定する場合、ＴＰＭＴ値がこのカットオフより低い本明細書において示される患者のハプロタイプは、それぞれ９３％の感受性および特異性を有する。この例と共に、対応するハプロタイプは、ヒトにおいて異なるＴＰＭＴ表現型を構成するハプロタイプのさらなる例であって、それぞれの患者がチオプリンもしくは誘導体を用いて処置されなければならない場合に、治療の決定の補助として用いられ得る。
【０１３４】
表７：ＴＰＭＴ酵素活性に対するＳＮＰおよびハプロタイプの相関関係
【０１３５】
【表７−１】
2007517511.tif 000025
【０１３６】
【表７−２】
2007517511.tif 000026
【０１３７】
【表７−３】
2007517511.tif 000027
【０１３８】
【表７−４】
2007517511.tif 000028
【０１３９】
【表７−５】
2007517511.tif 000029
【０１４０】
【表７−６】
2007517511.tif 000030
【０１４１】
【表７−７】
2007517511.tif 000031
表８は、ＴＰＭＴ酵素活性と相関関係があるハプロタイプの詳細な総括を示す。特に興味深いものは、ＴＰＭＴ酵素活性が無いハプロタイプ、または、低いあるいは中程度のＴＰＭＴ酵素活性を認めるハプロタイプである。
【０１４２】
表８：ＴＰＭＴ酵素活性と相関関係があるハプロタイプの詳細な総括
【０１４３】
【表８−１】
2007517511.tif 000032
表８、続き：ＷＴ、ＨＴ、またはＭＴである各々のＳＮＰの、対応する遺伝子型は、以下の表から読み得る：
【０１４４】
【表８−２】
2007517511.tif 000033
表８の凡例：ＳＮＰ遺伝子型：ＷＴ＝野生型；ＨＴ＝ヘテロ接合体、ＭＴ＝変異体。ＴＰＭＴ酵素活性：０＝無い、または低い；１＝中程度；２＝正常、または高い。
【０１４５】
ＴＰＭＴ活性が、無い、低い、または中程度であることと相関関係がある、最も優れたハプロタイプの記載の総括を以下に示す：
ハプロタイプ群１：
ＳＮＰ２６がＭＵＴＡＮＴでありＳＮＰ２９がＷＩＬＤＴＹＰＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は無いか、または低い。
ＳＮＰ２６がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥでありＳＮＰ２９がＷＩＬＤＴＹＰＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
ＳＮＰ２６がＭＵＴＡＮＴであり、ＳＮＰ２９がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
【０１４６】
ハプロタイプ群２：
ＳＮＰ２０がＭＵＴＡＮＴであり、ＳＮＰ７がＭＵＴＡＮＴであり、ＳＮＰ８がＷＩＬＤＴＹＰＥであり、ＳＮＰ２６がＷＩＬＤＴＹＰＥであり、ＳＮＰ２９がＷＩＬＤＴＹＰＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は無いか、または低い。
ＳＮＰ２０がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥであり、ＳＮＰ７がＭＵＴＡＮＴであり、ＳＮＰ８がＷＩＬＤＴＹＰＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
ＳＮＰ２０がＷＩＬＤＴＹＰＥであり、ＳＮＰ７がＷＩＬＤＴＹＰＥであり、ＳＮＰ８がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥまたはＭＵＴＡＮＴである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
【０１４７】
ハプロタイプ群３：
ＳＮＰ１０がＭＵＴＡＮＴでありＳＮＰ１７がＭＵＴＡＮＴである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は無いか、または低い。
ＳＮＰ１０がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥまたはＭＵＴＡＮＴであり、ＳＮＰ１７がＷＩＬＤＴＹＰＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
ＳＮＰ１０がＭＵＴＡＮＴでありＳＮＰ１７がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
ＳＮＰ１０がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥまたはＷＩＬＤＴＹＰＥであり、ＳＮＰ１７がＨＥＴＥＲＯＺＹＧＯＴＥである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
ＳＮＰ１０がＷＩＬＤＴＹＰＥでありＳＮＰ１７がＭＵＴＡＮＴである場合、ＴＰＭＴ酵素活性は中程度である。
【０１４８】
本発明のさらなる実施形態として、それぞれの患者において、本明細書において記載される遺伝子型およびハプロタイプのＴＰＭＴ発現に対する相関関係の予測的効力を、多くのＶＮＴＲと組み合せ得る。ところが、より多数の重複は、ＴＰＭＴ活性に対して逆に対応する。
【配列表】
2007517511000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月12日(2006.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007517511000001.app
【国際調査報告】
2007517511.tif 000093
2007517511.tif 000094
2007517511.tif 000095
2007517511.tif 000096
2007517511.tif 000097
2007517511.tif 000098