(57)【要約】  本願発明は，MHC(主要組織適合複合体)クラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，及び，サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質から成る群から選ばれた少なくとも二種の物質を活性成分として含むＴリンパ球の活性化を抑制する免疫疾患治療用の医薬組成物に関する。
2007523158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，及び，サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質から成る群から選ばれた二種以上の物質を活性成分として含むＴリンパ球の活性化を抑制する免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記MHCクラスII分子とCD4との結合を遮断可能な物質が，(1)前記MHCクラスII分子に対する抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域にLAG3の可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)前記単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)前記単純融合された単量体タンパク質の前記ヒンジ領域に結合されたLAG3の可溶性細胞外領域のN末端の，別のLAG3の可溶性細胞外領域のC末端への結合により形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)前記連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；及び，(6)グリコシル化された形態の前記(2)〜(5)によるタンパク質から成る群から選択される請求項１記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項３】
前記共刺激分子が，B7,CD154,CD70,OX40L，ICOS-L，4-1BBL，HVEM，FASL又はPDLであり，これらの受容体がそれぞれCD28とCTLA-4，CD40，CD27，OX40，ICOS，4-1BB，LIGHT，FAS又はPD-1である請求項１記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項４】
前記B7分子とCD28との結合を遮断可能な物質が，(1)前記B7分子に対する抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域にCTLA4の可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)前記単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)前記単純融合された単量体タンパク質の前記ヒンジ領域に結合された前記CTLA4の可溶性細胞外領域のN末端の，別のCTLA4の可溶性細胞外領域のC末端への結合により形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)前記連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；及び，(6)グリコシル化された形態の前記(2)〜(5)によるタンパク質から成る群から選択される請求項３記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項５】
前記接着分子が，LFA-3，ICAM-1又はVCAM-1であり，これらの受容体がそれぞれCD2，LFA-1又はVLA-4である請求項１記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項６】
前記LFA-3と前記CD2との結合を遮断可能な物質が，(1)前記LFA-3に対する抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域に前記CD2の可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)前記単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)前記単純融合された単量体タンパク質の，前記ヒンジ領域に結合された前記CD2の可溶性細胞外領域のN末端の，別のCD2の可溶性細胞外領域のC末端への結合により形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)前記連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；及び，(6)グリコシル化された形態の前記(2)〜(5)によるタンパク質から成る群から選択される請求項５記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項７】
前記サイトカインが，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，TNF，TGF，IFN，GM-CSF，G-CSF，EPO，TPO又はM-CSFであり，これらの受容体がそれぞれIL-1R，IL-2R，IL-3R，IL-4R，IL-5R，IL-6R，IL-7R，TNFR，TGFR，IFNR，INF-αR，-βR及び-γR，GM-CSFR，G-CSFR，EPOR，cMpl，又はgp130である請求項１記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項８】
前記TNFと前記TNFRとの結合を遮断可能な物質が，(1)前記TNFに対する抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域に前記TNFRの可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)前記単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)前記単純融合された単量体タンパク質の前記ヒンジ領域に結合された前記TNFRの可溶性細胞外領域のN末端の，別のTNFRの可溶性細胞外領域のC末端への結合により形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)前記連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，前記ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；及び，(6)前記(2)〜(5)によるグリコシル化された形態のタンパク質から成る群から選択される請求項７記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項９】
前記免疫疾患が，自己免疫疾患又は移植拒絶である請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【請求項１０】
前記自己免疫疾患が，慢性関節リウマチ，多発性硬化症，重症筋無力症，グレーブス病，橋本甲状腺炎，アジソン病，白斑，強皮症，グッドパスチャー症候群，ベーチェット病，クローン病，強直性脊椎炎，ぶどう膜炎，血小板減少性紫斑病，尋常性天疱瘡，小児糖尿病，自己免疫貧血，クリオグロブリン血症，アドレノロイコジストロフィ（ALD）及び全身性エリテマトーデス(SLE)から成る群から選択される請求項９記載の免疫疾患治療用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は，MHC(主要組織適合複合体)クラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，及び，サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質から成る群から選ばれた二種以上の物質を活性成分として含み，Ｔリンパ球の活性化を抑制することにより免疫疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応とは，各種異物，細菌又はウイルスなどの非自己から自己を保護する過程である。免疫系は，自己を攻撃しないように精巧に設計されている。しかし，このような免疫反応が自己を攻撃して身体に害を及ぼす場合があり，その代表的な例が臓器又は組織移植後の免疫拒絶と自己免疫疾患である。
【０００３】
臓器又は組織移植による疾病治療において，最も大きな問題点はレシピエントがドナーから組織又は臓器の移植を受けた後，深刻な移植拒絶を示すということである。移植拒絶は，レシピエントとは遺伝的背景の異なるドナーからの移植片を，レシピエントが異物として認識して排除しようとする免疫反応を意味する。このような移植拒絶は，Ｔリンパ球による細胞性免疫と抗体による体液性免疫の複雑な協同作用により起こるが，主にはＴリンパ球による細胞性免疫である。
【０００４】
移植拒絶を治療するための一つの方法は，Ｔリンパ球の活性を抑制する化合物の使用を含む。そのような免疫抑制剤には，ミゾリビン(MZ)，サイクロスポリン(CsA)，タクロリムス(FK-506)，アザチオプリン(AZ)，レフルノミド(LEF)，プレドニゾロン又はメチルプレドニゾロン(methylpredonisolon)などの副腎皮質ステロイド，デオキシパーグアリン〔deoxypergualin(DGS)〕及びシロリムスなどがある。
【０００５】
国際特許公開WO1999/65908号は，ピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物を免疫抑制剤として利用して自己免疫疾患を治療する方法を開示しており，国際特許公開WO2000/21979号は，環状テトラペプチド化合物を利用して臓器移植拒絶反応又は自己免疫疾患を治療する方法を開示している。一方，免疫細胞が自己と非自己（外来）物質を区別できずに自己を攻撃する場合があるが，このような現象を「自己免疫」という。このような自己免疫は，人体の全ての部位に亘って疾病を誘発できる。自己免疫疾患の例として，慢性関節リウマチ，多発性硬化症，重症筋無力症，グレーブス病，橋本甲状腺炎，アジソン病，白斑，強皮症，グッドパスチャー症候群，ベーチェット病，クローン病，強直性脊椎炎，ぶどう膜炎，血小板減少性紫斑病，尋常性天疱瘡，小児糖尿病，自己免疫貧血，クリオグロブリン血症，アドレノロイコジストロフィ(ALD)，全身性エリテマトーデス(SLE)が挙げられる。
【０００６】
国際特許公開WO1996/40246号は，多発性硬化症のようなＴ細胞で媒介される自己免疫疾患を治療及び予防する方法に関する。この方法は，患者に接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ細胞表面の受容体の拮抗剤を，治療又は予防有効量で投与することを含む。拮抗剤には，Ｔ細胞受容体gp39に特異的に結合する抗体又はこの断片である。
【０００７】
国際特許公開WO2002/22212号は，少なくとも一つの免疫調節抗体及び少なくとも一のＢ細胞枯渇抗体，例えば，CD19，CD20，CD22，CD23又はCD27を標的とする抗体の組み合せを利用し，自己免疫疾患，好適にはＢ細胞媒介自己免疫疾患を治療する方法を開示している。
【０００８】
しかし，上述した化合物を利用して免疫疾患を治療する場合には，深刻な副作用を引き起こし，使用が制限されていた。国際特許公開WO1996/40246号に記載されているように，抗体を単独で投与する場合には十分な治療効果を達成し難い。又，自己免疫疾患又は移植拒絶はＴリンパ球の活性化により始まるため，国際特許公開WO2002/22212号のようにＢ細胞の機能を遮断することは，効率的な免疫反応の抑制につながらない。
【０００９】
発明の開示
より効果的な免疫抑制剤を開発するために，本願発明者等が行った集中した徹底的な研究により，Ｔリンパ球の活性化に関与するいくつかのタンパク質の群の少なくとも二つから選ばれたタンパク質を同時に遮断したとき，Ｔリンパ球の活性を周知の方法と比較して効果的に抑制できることが見出された。
【００１０】
一の態様において，本願発明は，MHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，及び，サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質から成る群から選ばれた二種以上の物質を活性成分として含み，Ｔリンパ球の活性化を抑制することにより免疫疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００１１】
本願発明の上記及び他の目的，特徴及び他の利点は，添付図面と共に，下記の詳細な記載により明確に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本願発明は，MHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，及び，サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質から成る群から選ばれた二種以上の物質を活性成分として含み，Ｔリンパ球の活性化を抑制することにより免疫疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【００１３】
当業界に周知のように，Ｔリンパ球は抗原提示細胞の表面上の「MHC(主要組織適合複合体) クラスII分子」と結合した形態の抗原のみを認識し，次いで，活性化されて抗原に対する免疫反応を起こす。このとき，MHCクラスII分子以外に，Ｔリンパ球に活性化信号を送る分子が抗原提示細胞上に存在し，これらの分子は「共刺激分子」と呼ばれる。いわゆる「接着分子」は，信号を送る機能と共に抗原提示細胞とＴリンパ球との間の細胞内接着性を強化する機能を有する。一方，多様な「サイトカイン」がＴ細胞の活性化を含んだ免疫反応に関与している。
【００１４】
「MHCクラスII分子」はＴリンパ球の活性化を開始する分子であって，この受容体にはCD4とLAG3がある。MHCクラスII分子は抗原と結合した後，Ｔリンパ球の表面上のそれらの受容体(CD4)により認識され，Ｔリンパ球を活性化させる。従って，このようなMHCクラスII分子の機能は，該MHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断することにより抑制できる。そのような抑制作用を示し得る物質には，これに制限されるものではないが，MHCクラスII分子の抗体及び遊離型のMHCクラスII分子の受容体が含まれる。ここで，遊離型のMHCクラスII受容体は，MHCクラスII分子と特異的に結合できる全ての受容体を含み，好適には，MHCクラスII受容体又はその可溶性細胞外領域が免疫グロブリン(Ig)全体又はそのFc断片と結合したIg融合タンパク質である。更に，該Ig融合タンパク質は更にグリコシル化されたIg融合タンパク質であり得る。
【００１５】
「共刺激分子」にはB7(B7.1及びB7.2)，CD154，CD70，OX40L，ICOS-L，4-1BBL，HVEM，FASL，PDL(PDL-1及びPDL-2)があり，これらの受容体はそれぞれCD28及びCTLA-4，CD40，CD27，OX40，ICOS，4-1BB(CD137)，LIGHT，FAS(CD95)，PD-1である。共刺激分子は，抗原提示細胞の表面上に発現されており，Ｔリンパ球の表面上に発現されているそれらの受容体と結合してＴリンパ球を活性化させる。従って，共刺激分子によるＴ細胞の活性化は，共刺激分子とその受容体との結合を遮断することにより抑制できる。そのような抑制作用を示し得る物質には，これに制限されるものではないが，共刺激分子の抗体又は遊離型の共刺激分子の受容体が含まれる。ここでは，遊離型の共刺激分子の受容体は，共刺激分子と特異的に結合できる全ての受容体を含み，好適には，共刺激分子の受容体又はその可溶性細胞外領域が免疫グロブリン又はそのFc断片と結合したIg融合タンパク質である。更に，該Ig融合タンパク質は更にグリコシル化された形態であってもよい。
【００１６】
「接着分子」にはLFA-3，ICAM-1，VCAM-1があり，これらの受容体はそれぞれCD2，LFA-1，VLA-4である。接着分子は抗原提示細胞の表面上に発現されており，Ｔリンパ球の表面上に発現されているそれらの受容体と結合してＴリンパ球を活性化させる。従って，接着分子によるＴ細胞の活性化は，接着分子とその受容体との結合を遮断することにより抑制され得る。そのような抑制作用を示し得る物質には，これに制限されるものではないが，接着分子の抗体又は遊離型の接着分子の受容体が含まれる。ここでは，遊離型の接着分子の受容体は，接着分子と特異的に結合できる全ての受容体を含み，好適には接着分子の受容体又はその可溶性細胞外領域が免疫グロブリン又はこのFc断片と結合したIg融合タンパク質である。更に，Ig融合タンパク質は更にグリコシル化された形態であってもよい。
【００１７】
「サイトカイン」には，これらに限定されるものではないが，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，TNF，TGF，IFN，GM-CSF，G-CSF，EPO，TPO，M-CSFなどがあり，これらの受容体はそれぞれIL-1R，IL-2R，IL-3R，IL-4R，IL-5R，IL-6R，IL-7R，TNFR，TGFR，IFNR(例えば，IFN-γRα-鎖，IFN-γRβ-鎖)，ＩＦＮ-αR，-βR及び-γR，GM-CSFR，G-CSFR，EPOR，cMpl，gp130である。サイトカインは，Ｂリンパ球又はＴリンパ球上のそれらの受容体と結合して免疫反応を起こす。従って，サイトカインによる免疫反応は，サイトカインとその受容体との結合を遮断することにより抑制できる。そのような抑制作用を示し得る物質には，これに制限されるものではないが，サイトカインに対する抗体又は遊離型のサイトカインの受容体が含まれる。ここで，遊離形態のサイトカインの受容体は，サイトカインと特異的に結合できる全ての受容体を含み，好適にはサイトカインの受容体又はその可溶性細胞外領域が免疫グロブリン又はそのFc断片と結合した免疫グロブリン融合タンパク質である。更に，Ig融合タンパク質は更にグリコシル化された形態であってもよい。
【００１８】
I.  抗体
本願発明でMHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質にはMHCクラスII分子の抗体が含まれ得る。共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質には共刺激分子の抗体が含まれ得る。接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質には接着分子の抗体が含まれ得る。サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質にはサイトカインの抗体が含まれ得る。
【００１９】
抗体は，ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。これらは全て商業的に入手可能であるか，又は当業界に公知の方法により製造できる。ポリクローナル抗体は，一般的に，哺乳動物を適切な量の抗原で1回以上の回数で免疫化させ，抗体価が所望の数値に至ったとき，免疫化した哺乳動物から抗血清を回収することにより製造される。所望により，公知方法を用いて精製し，使用時まで冷凍緩衝液中で保存し得る。一方，モノクローナル抗体は哺乳動物に抗原を注射し，生じたＢリンパ球を分離し，該Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合し，得られたハイブリドーマ細胞を培養することにより製造できる。これらの工程の詳細な事項は当業界で周知である。
【００２０】
II.  免疫グロブリン融合タンパク質
本願発明でMHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質にはMHCクラスII分子の受容体とのIg融合タンパク質が含まれ得る。共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質には共刺激分子の受容体とのIg融合タンパク質が含まれ得る。接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質には接着分子の受容体とのIg融合タンパク質が含まれ得る。サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質にはサイトカイン受容体とのIg融合タンパク質が含まれ得る。以下，MHCクラスII分子の受容体，共刺激分子の受容体，接着分子の受容体及びサイトカインの受容体は「受容体」と総称される。
【００２１】
ここで使用される「Ig融合タンパク質」の用語は，受容体タンパク質又はその可溶性細胞外領域と免疫グロブリン又はそのFc断片が連結された形態を含む融合タンパク質を意味する。詳細には，Ig融合タンパク質には，単純融合された単量体，単純融合された二量体，連鎖融合された単量体，連鎖融合された二量体及びこれらのグリコシル化された形態が含まれる。
【００２２】
ここで使用される「可溶性細胞外領域」の用語は，リン脂質から構成された細胞膜を貫通する内在性タンパク質の細胞外部に露出されている部分であって，この内在性タンパク質は主に疎水性アミノ酸から構成されている一つ以上の膜貫通領域を有する。そのような細胞外領域は主に親水性アミノ酸からなり，典型的にはタンパク質の折り畳み構造の表面に位置しており，そのため，水溶性の環境で可溶性である。ほとんどの細胞表面受容体タンパク質において，リガンドと結合する機能を担うのは細胞外領域であり，細胞内領域は細胞内の信号伝達において重要な役割を担う。
【００２３】
ここで使用される「免疫グロブリン」の用語は，様々な種類の抗原を特異的に認識する抗原受容体として寄与する，Ｂ細胞において生成されるタンパク質分子を指す。この分子は，二の同一な軽鎖（Ｌ鎖）と二の同一な重鎖（Ｈ鎖）から構成されるＹ字状の構造を有し，四の鎖はヒンジ領域におけるＨ鎖のジスルフィド架橋を含む多くのジスルフィド結合により互いに固定されている。Ｌ鎖及びＨ鎖は可変領域と定常領域を含む。Ｌ鎖の可変領域はＨ鎖の可変領域と結合して二の同一な抗原結合部位を形成する。Ｈ鎖の定常領域の性質により，免疫グロブリン(Ig)は，A(IgA)，D(IgD)，E(IgE)，G(IgG)及びM(IgM)の五のアイソタイプに分けられる。補体活性化，Fc受容体媒介ファゴサイトーシス，抗原依存細胞毒性のような免疫グロブリン分子の生物学的機能は，Ｈ鎖のFc領域の構造決定要素（相補性決定領域）により媒介される。このようなＨ鎖のFc領域は，本願発明による二量体タンパク質の構築に使用され，全てのアイソタイプの免疫グロブリンから由来し得る。
【００２４】
ここで使用される「免疫グロブリンのFc断片」の用語は，抗原の結合力はないが，容易に結晶化される断片であって，ヒンジ領域及びCH2ドメインとCH3ドメインを含み，抗体のエフェクター物質及び細胞への結合に関与する部分を指す。
【００２５】
ここで使用される「連鎖融合」の用語は，受容体タンパク質の可溶性細胞外領域のC末端に，受容体タンパク質の可溶性細胞外領域のN末端が結合され，これにより，この受容体タンパク質の二の可溶性細胞外領域が一の長いポリペプチドを形成している状態を指す。
【００２６】
ここで使用される「単純融合された単量体タンパク質」の用語は，免疫グロブリンFc断片のヒンジ領域への受容体タンパク質の可溶性細胞外領域の結合により形成された一のポリペプチドから成る単量体構造を有する融合タンパク質を指す。本願発明において，単純融合された単量体タンパク質は，便宜上「受容体タンパク質名称/Fc」と表記され得る。例えば，LAG3の可溶性細胞外領域と免疫グロブリンFc断片が結合した，単純融合された単量体タンパク質はLAG3/Fcと表記される。所望により，免疫グロブリンFc断片の由来を表記できる。例えば，免疫グロブリンFc断片がIgG1から由来した場合は，LAG3/IgG1Fcと表記される。
【００２７】
ここで使用される「単純融合された二量体タンパク質」の用語は，単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域における分子内ジスルフィド結合の形成により結合された，二量体構造の融合タンパク質を指す。本願発明において，このような単純融合された二量体タンパク質は，便宜上「[受容体タンパク質名称/Fc]2」と表記され得る。例えば，LAG3のタンパク質の可溶性細胞外領域と免疫グロブリンのFc断片との結合により製造された単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域における分子内ジスルフィド結合の形成により融合した場合，得られた二量体構造の融合タンパク質は[LAG3/Fc]2と表記される。更に，所望により免疫グロブリンFc断片の由来を表記できる。例えば，Fc断片がIgG1から由来した場合は，[LAG3/IgG1Fc]2と表記される。
【００２８】
ここで使用される「連鎖融合された単量体タンパク質」の用語は，受容体タンパク質の可溶性細胞外領域のN末端が，該受容体タンパク質の可溶性細胞外領域のC末端に結合し，前者の可溶性細胞外領域のC末端が，免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域に結合している，一つのポリペプチドから形成された単量体構造の融合タンパク質を意味する。本願発明において，連鎖融合された単量体タンパク質は，便宜上「受容体タンパク質名称−受容体タンパク質名称/Fc」と表記され得る。例えば，LAG3の可溶性細胞外領域と免疫グロブリン分子のFc断片の結合により製造された，単純融合された単量体タンパク質LAG3の可溶性細胞外領域が，LAG3の可溶性細胞外領域に結合した場合，得られた連鎖融合された単量体タンパク質はLAG3-LAG3/Fcと表記される。所望により，Fc断片の由来を表記することができる。例えば，Fc断片がIgG1から由来した場合は，LAG3-LAG3/IgG1Fcと表記される。
【００２９】
ここで使用される「連鎖融合された二量体タンパク質」の用語は，連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域における分子内ジスルフィド結合により結合された二量体構造の融合タンパク質を指す。本願発明において，連鎖融合された二量体タンパク質は，便宜上「[受容体タンパク質名称−受容体タンパク質名称/Fc]2」と表記され得る。例えば，各々が単純融合タンパク質のLAG3可溶性細胞外領域のLAG3タンパク質の可溶性細胞外領域への結合により製造された二つの連鎖融合された単量体タンパク質が，ヒンジ領域における分子内ジスルフィド結合の形成により融合された場合，得られた二量体構造の融合タンパク質は[LAG3-LAG3/Fc]2と表記される。ここで，この単純融合単量体タンパク質は，LAG3可溶性細胞外領域の免疫グロブリン分子のFc断片への結合により形成されている。所望により，Fc断片の由来を表記できる。例えば，Fc断片がIgG1から由来した場合，該融合タンパク質は，[LAG3-LAG3/IgG1Fc]2と表記される。
【００３０】
一方，単純融合された単量体タンパク質又は単純融合された二量体タンパク質は，当業界に知られた通常の方法により製造することができる。連鎖融合された単量体タンパク質又は連鎖融合された二量体タンパク質は，本願発明の発明者が既に出願した国際特許公開WO2003/010202号に記載した製造方法を利用して得ることができる。
【００３１】
本願発明による連鎖融合された二量体タンパク質は，通常，(a)免疫グロブリン分子のFc断片をコードする遺伝子と受容体タンパク質の可溶性細胞外領域をコードする遺伝子を用いて単純融合された単量体タンパク質をコードするDNA構築物を製造し；(b)製造された単純融合された単量体タンパク質コードDNA構築物と及び受容体タンパク質の可溶性細胞外領域をコードする遺伝子に，制限酵素の認識配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で各々挿入し；(c)認識配列を認識する制限酵素を使用して，単純融合された単量体タンパク質をコードするDNA構築物と，受容体タンパク質の可溶性細胞外領域をコードする遺伝子の制限酵素の認識配列を切断し；(d)開裂したDNA断片をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体タンパク質をコードするDNA構築物を製造し，(e)製造された連鎖融合された単量体タンパク質をコードするDNA構築物をベクターに操作可能に連結し，組み換え発現プラスミドを作製し；(f)組み換え発現プラスミドで宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトし；及び，(g)形質転換体又はトランスフェクタントを連鎖融合された単量体タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の発現に適切な条件下で培養して，その後，所望の連鎖融合された二量体タンパク質を分離，精製することにより製造される。
【００３２】
本願発明によると，受容体タンパク質の可溶性細胞外領域をコードするDNA配列上の一以上のヌクレオチドを，Ｏ結合又はＮ結合グリコシル化が発生するように変異させ，得られたDNAを適当な動物宿主細胞で発現させ，宿主系を用いてグリコシル化を誘導してもよい。一の様態として，本願発明によるグリコシル化した連鎖融合された二量体融合タンパク質は，配列Asn-X-Ser/Thrを付加することにより，Ｎ結合グリコシル化を誘導又は増加するように受容体タンパク質の可溶性細胞外領域をコードするDNA配列を変異させることにより製造され得る。
【００３３】
本願発明を，MHCクラスII分子，並びに，共刺激分子の例としてのB7分子，接着分子の例としてのLFA-3分子，及びサイトカインの例としてのTNFを用いて詳細に記載する。
【００３４】
「MHCクラスII分子」は，MHCクラスII分子と特異的に結合できるCD4及びLAG3受容体により認識される。従って，MHCクラスII分子とCD4との結合を遮断するために，LAG3の免疫グロブリン融合タンパク質を利用できる。詳細には，MHCクラスII分子とCD4との結合を遮断可能な物質には，(1)MHCクラスII分子の抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域にLAG3の可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域の分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)単純融合された単量体タンパク質のヒンジ領域に結合されたLAG3の可溶性細胞外領域のN末端の，別のLAG3分子の可溶性細胞外領域のC末端への結合により形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；(6) グリコシル化された形態の(2)〜(5)によるタンパク質が含まれる。
【００３５】
「B7分子」は，B7分子と特異的に結合できるCD28とCTLA4により認識される。特に，B7分子はＴリンパ球の表面上に発現されているCD28と結合してＴリンパ球を活性化させる。対照的に，B7分子は，別の受容体のCTLA4(Ｔリンパ球が活性化された以後に発現される)と結合すると，Ｔリンパ球の活性化を抑制する。従って，B7分子とCD28との結合を遮断するために，CTLA4のIg融合タンパク質を利用することが好ましい。詳細には，B7分子とCD28との結合を遮断可能な物質には(1)B7分子の抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域にCTLA4の可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域の分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)単純融合された単量体タンパク質のヒンジ領域に結合されたCTLA4の可溶性細胞外領域のN末端の，別のCTLA4の可溶性細胞外領域のC末端への結合により形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域での分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；(6)グリコシル化された形態の(2)〜(5)によるタンパク質が含まれる。
【００３６】
「LFA3分子」のＴリンパ球活性化機能は，LFA-3とＴリンパ球表面上のCD2との結合を遮断することにより抑制できる。そのような免疫抑制物質には(1)LFA-3の抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域にCD2の可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域での分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)単純融合された単量体タンパク質のヒンジ領域に結合されたCD2の可溶性細胞外領域のN末端が，別のCD2の可溶性細胞外領域のC末端に結合して形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域での分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；(6)グリコシル化された形態の(2)〜(5)によるタンパク質が含まれる。
【００３７】
「TNF」の免疫反応活性化機能は，TNFとＴリンパ球表面上のTNFRとの結合を遮断することにより抑制できる。そのような免疫抑制物質には(1)TNFの抗体；(2)免疫グロブリン分子のFc断片のヒンジ領域にTNFRの可溶性細胞外領域が結合して形成された，単純融合された単量体タンパク質；(3)単純融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域での分子内ジスルフィド結合により結合された，単純融合された二量体タンパク質；(4)単純融合された単量体タンパク質のヒンジ領域に結合されたTNFRの可溶性細胞外領域のN末端が，別のTNFRの可溶性細胞外領域のC末端に結合して形成された，連鎖融合された単量体タンパク質；(5)連鎖融合された単量体タンパク質の二つの分子が，ヒンジ領域での分子内ジスルフィド結合により連結された，連鎖融合された二量体タンパク質；(6)グリコシル化された形態の(2)〜(5)によるタンパク質が含まれる。
【００３８】
III.  免疫疾患
本願発明による活性成分はＴリンパ球の活性化を抑制できるため，望ましくないＴリンパ球の活性化により誘発される各種疾病を治療することに利用できる。そのような疾病の代表的な例には，移植拒絶と自己免疫疾患がある。
【００３９】
「移植拒絶」とは，移植片(移植される生体の一部であって，細胞，組織又は臓器)のドナーとレシピエント間の遺伝的背景が異なることにより生じる免疫応答を意味し，(1)ドナーの移植片由来の免疫細胞がレシピエントを異物として認識し，レシピエントを攻撃することにより誘発される，「移植片対宿主疾患(GVHD)」と呼ばれる疾患，及び(2)レシピエントがドナーの移植片を異物として認識し，移植片を攻撃することにより誘発される移植片拒絶と呼ばれる疾患を含む。
【００４０】
一方，免疫細胞が自己と非自己（外来）物質を区別できずに自己を攻撃して発生する疾病を自己免疫疾患と総称する。詳細には，自己免疫疾患には，慢性関節リウマチ，多発性硬化症，重症筋無力症，グレーブス病，橋本甲状腺炎，アジソン病，白斑，強皮症，グッドパスチャー症候群，ベーチェット病，クローン病，強直性脊椎炎，ぶどう膜炎，血小板減少性紫斑病，尋常性天疱瘡，小児糖尿病，自己免疫貧血，クリオグロブリン血症，アドレノロイコジストロフィ（ALD），全身性エリテマトーデス(SLE)が含まれる。
【００４１】
IV.  医薬組成物
本願発明の医薬組成物は，好適には，MHCクラスII分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，共刺激分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，接着分子とその受容体との結合を遮断可能な物質，及び，サイトカインとその受容体との結合を遮断可能な物質から成る群から選ばれた二種以上の活性成分を，治療学的有効量で製薬学的に許容される担体に混入させた形態であり得る。
【００４２】
本願発明の医薬組成物に使用される担体は，製薬分野で通常的に使用される担体，補助剤及びビヒクルを含み，総括的に「製薬学的に許容される担体」という。本願発明の医薬組成物に使用され得る製薬学的に許容される担体は，これらに限定されるものではないが，イオン交換，アルミナ，アルミニウムステアレート，レシチン，血清タンパク質(例えば，ヒト血清アルブミン)，緩衝物質(例えば，リン酸ナトリウム，グリシン，ソルビン酸，カリウムソルベート，飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセライド混合物)，水，塩又は電解質(例えば，硫酸プロタミン，リン酸水素二ナトリウム，リン酸水素カリウム，塩化ナトリウム及び亜鉛塩)，コロイドシリカ，マグネシウムトリシリケート，ポリビニルピロリドン，セルロース系基質，ポリエチレングリコール，ナトリウムカルボキシメチルセルロース，ポリアリレート，ワックス，ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックコポリマー，ポリエチレングリコール及び羊毛脂が含まれる。
【００４３】
本願発明の医薬組成物は所望の組織に到達できる限り，如何なる一般的な経路により投与されてもよい。従って，本願発明の医薬組成物は局所投与，経口投与，非経口投与，眼内投与，経皮投与，直腸投与，腸管投与などにより投与でき，溶液，懸濁液，錠剤，丸薬，カプセル，徐放性製剤などに製剤化できる。本願発明の明細書で用語「非経口」は，皮下，鼻内，静脈内，腹腔内，筋肉内，関節内，滑液嚢内，胸骨内，心臓内，硬膜内，病素内及び頭蓋骨内の注射又は注入技術を含む。
【００４４】
一の態様として，本願発明の医薬組成物は，非経口的投与のための水溶性溶液として製造できる。好適には，ハンクス液，リンガー液又は物理的に緩衝された塩水のような適切な緩衝溶液を使用できる。水溶性注射用懸濁液(Aqueous injection suspensions)は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール又はデキストランのように，懸濁液の粘度を増加させることができる物質を添加できる。更に，油性の注射用懸濁液のような活性成分の懸濁液は，親油性溶媒又は担体，例えばゴマ油のような脂肪酸，オレイン酸エチルのような合成脂肪酸エステル，トリグリセライド又はリポソームを含む。ポリカチオン性非脂質アミノポリマーもビヒクルとして使用され得る。懸濁液はタンパク質の変種の溶解度を増加させ，高濃度の溶液を製造するために適合する安定化剤又は薬剤を任意に含んでもよい。
【００４５】
本願発明の医薬組成物は，好適には滅菌注射用の水性又は油性懸濁液のような滅菌注射用製剤の形態であり得る。このような懸濁液は，適当な分散剤又は湿潤剤(例：Tween80)及び懸濁化剤を使用し，本分野で周知の方法により製剤化され得る。滅菌注射用製剤は，1,3-ブタンジオール中の溶液のような非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射溶液又は懸濁液であってもよい。許容され得るビヒクル及び溶媒には，マンニトール，水，リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。又，溶媒又は懸濁化媒質としては，通常，滅菌不揮発油が使用される。この目的のために，合成モノグリセライド又はジグリセライドを含む，刺激性の少ない如何なる不揮発油も使用し得る。オレイン酸及びそのグリセライド誘導体のような脂肪酸が，薬製学的に許容される天然油(例：オリーブ油又はヒマシ油)，特にこれらのポリオキシエチル化されたものと同様に，注射製剤に有用である。
【００４６】
水性組成物は主に細菌を除去するためのフィルターによるろ過により，殺菌剤との混合により，又は照射を組み合わせて滅菌される。滅菌された組成物は，例えば凍結乾燥により固化して，固形組成物を得ることができ，実際の使用のためには，これを滅菌水又は滅菌希釈液に溶解させる。
【００４７】
本願発明による活性成分を含有する医薬組成物は，室温での安定性を増加させ，コストのかかる低温貯蔵の必要性を減らし，貯蔵寿命を延長させるために凍結乾燥され得る。凍結乾燥工程は，凍結，一次乾燥及び二次乾燥の工程から成り得る。凍結後，組成物を加圧下で加熱し，水蒸気を蒸発させる。二次乾燥工程で，残余水分が乾燥生成物から除去される。
【００４８】
本願発明の医薬組成物と関連して使用される用語「治療学的有効量」は，本願発明の組成物が適用される免疫疾患に対し，改善又は治療効果を達成できる活性成分の量を意味する。本願発明の医薬組成物の治療学的有効量は，患者の年齢，性別，適用部位，投与頻度，投与期間，剤形，補助剤の種類などにより変化し得る。典型的には，本願発明の医薬組成物は，0.01〜1000μg/kg/日，より好適には0.1〜500μg/kg/日，最も好適には1〜100μg/kg/日の量で投与する。
【００４９】
本願発明を下記の実施態様により，添付の図面を用いて，より具体的に説明する。しかし，下記の実施態様は本願発明を例示するためのものにすぎず，本願発明の範囲はこれらの実施態様に限定されない。
【００５０】
下記の実施態様１はLAG3に関する。LAG3/Fc及びLAG3-LAG3/Fc融合タンパク質のアミノ酸配列及び該融合タンパク質をコードするDNA配列，並びに該融合タンパク質の製造に利用されたプライマーの配列についての情報を下記の表１に要約した。 
【００５１】
【表１】
2007523158.tif 000003
【００５２】
実施態様１：本願発明によるIg融合タンパク質をコードするDNA構築物の製造
A. 単純融合された単量体タンパク質LAG3/FcをコードするDNA構築物の製造 
a. LAG3の可溶性細胞外領域をコードするDNA断片 
LAG3の可溶性細胞外領域をコードするDNA断片は，EcoRI制限部位及びリーダー配列(配列番号8のアミノ酸配列1-22)をコードする配列(配列番号7のヌクレオチド配列)を有するプライマー(配列番号1のヌクレオチド)と，SpeI制限部位及びLAG3の上記可溶性細胞外領域の3’末端の一部をコードする配列(配列番号7のヌクレオチド)を有するアンチセンスプライマー(配列番号4のヌクレオチド)を使用し，ポリメラーゼ連鎖反応法により構築した。この反応のための鋳型cDNAは，健常な成人の単球(Ｔリンパ球)から抽出したmRNAの逆転写PCR(RT-PCR)により構築した。
【００５３】
健常な成人の血液を採取し，RPMI-1640(ギブコ  ビーエルアール（Gibco BRL）, 米国)で1：1に希釈した後，これをフィコール−ハイパック(Ficoll-hypaque)(アメーシャム(Amersham),米国)を使用し，密度勾配遠心分離して，上部に形成されたＴリンパ球の層を得た。この細胞を，RPMI-1640で3回洗浄し，ここに10％のウシ胎児血清(FBS)（ギブコ  ビーエルアール，米国)含有RPMI-1640培地を添加して，この細胞の濃度を5×105細胞/mlにし，その後，フィトヘマグルチニン−エム(Phytohemagglutinin-M)〔カルビオケム(Calbiochem)，ドイツ)〕を2μg/mlで添加した後に刺激した。
【００５４】
mRNAはTri試薬 (エムアールシー（MRC），米国)]mRNAキットを使用して精製した。まず，2×107個のヒトＴリンパ球をリン酸緩衝生理食塩水（PBS，pH7.2)で3回洗浄した後，1mlのTri試薬を数回混ぜてRNAを溶解させた。このチューブに0.2mlのクロロホルムを添加して十分に混合し，室温で15分間インキュベートした後，4℃，15,000rpmで15分間遠心分離した。この溶液の上澄みを1.5mlのチューブに移し，0.5mlのイソプロパノールを添加した後，4℃，15,000rpmで15分間遠心分離した。上澄みを捨てた後，ペレットを75％のエタノール,-25％のDEPC(シグマ（Sigma）,米国)で処理した三次蒸留水1mlに再懸濁し，4℃，15,000rpmで15分間遠心分離した。上澄みを完全に除去し，空気中で乾燥させて残余エタノールを除去した後，RNAをDEPCで処理した三次蒸留水50μlに再懸濁した。
【００５５】
一次cDNAを，1.5mlのチューブ中で精製された2μgのmRNAと1μlのオリゴdT(dT30，プロメガ（Promega），米国)プライマーを混合することにより10μM合成し，70℃で2分間加熱した後，氷中で2分間冷却することにより合成した。その後，この混合物に200UのM-MLV逆転写酵素(プロメガ,米国)，10μlの5X反応緩衝溶液[250mMのトリス-HCl，pH 8.3，375mMの塩化カリウム(KCl)，15mMの塩化マグネシウム(MgCl2)及び50mMのDTT]，1μlのdNTP(それぞれ10mM，タカラ，日本)，及びDEPCで処理した三次蒸留水を50μlになるように添加した後，42℃で1時間反応させた。
【００５６】
b. 免疫グロブリンG1のFc断片をコードするDNA断片
免疫グロブリンG1のFc断片をコードするDNA断片は，SpeIの制限部位と免疫グロブリンG1(IgG1)のヒンジ領域の5’末端の一部をコードする配列を有するプライマー(配列5のヌクレオチド配列)とXbaIの制限部位とIgG1Fcの3’末端をコードする配列を有するアンチセンスプライマー(配列番号6のヌクレオチド配列)を使用してポリメラーゼ連鎖反応により構築した。この反応のための鋳型cDNAは回復期にある原因不明の発熱を有する患者の末梢血液細胞(Ｂリンパ球)から抽出したmRNAのRT-PCRにより構築した。
【００５７】
c. 単純融合された単量体タンパク質LAG3/FcをコードするDNA構築物 
上記で生成したLAG3の可溶性細胞外領域をコードするDNA断片及び免疫グロブリンのFc断片をコードするDNA断片の両方をSpeIで消化し(restrict)，T4 DNAリガーゼ(ユーエスビー（USB）,米国)を用いて連結することにより，単純融合された単量体タンパク質LAG3/Fcを製造した。
【００５８】
d. 単純融合された単量体タンパク質LAG/FcをコードするDNA構築物のクローニング 
単純融合されたタンパク質LAG/FcをコードするDNA構築物をEcoRIとXbaIで消化し，市販されているクローニングベクターpBluescript KS II(+)〔ストラタゲン(Stratagene),米国〕のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全コード領域配列をDNAシークエンシングにより確認した(配列番号7)。このときに生成された融合タンパク質は単純融合された単量体タンパク質であってLAG3/Fcと命名され，LAG3/Fcの単純融合された単量体タンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号8に該当する。
【００５９】
B. 連鎖融合された単量体タンパク質LAG3-LAG3/FcをコードするDNA構築物の製造 
可溶性細胞外領域連鎖融合された単量体タンパク質LAG3-LAG3/FcをコードするDNA構築物を製造するために，EcoRIの制限部位とリーダー配列(配列番号8のアミノ酸配列1-22)をコードする配列(配列番号7のヌクレオチド配列)を有するプライマー(配列番号1のヌクレオチド配列)と，上記LAG3の可溶性細胞外領域の3’末端の一部をコードする配列(配列番号7のヌクレオチド配列)を有するアンチセンスプライマー(配列番号4のヌクレオチド配列)を使用するPCRにより，LAG3の可溶性細胞外領域をコードするDNA断片を構築した。又，LAG3の可溶性細胞外領域のリーダー配列の終止部(配列番号7のヌクレオチド配列)をコードするプライマー(配列番号3のヌクレオチド配列)と，XbaIの制限部位とIgG1 Fcの3’末端をコードする配列を有するアンチセンスプライマー(配列番号6のヌクレオチド配列)とを使用するPCRにより，単純融合された単量体タンパク質LAG3/FcをコードするDNA断片を構築した。これらのPCRにおいては，単純融合された単量体タンパク質LAG3/FcをコードするDNA構築物(配列番号7のヌクレオチド配列)を鋳型として使用した。
【００６０】
ＰＣＲは，1μlの一次cDNA，2UのPfu DNAポリメラーゼ(ストラタゲン,米国)，10μlの10 X 反応緩衝溶液[200mMのトリス-HCI，pH8.75，100mMの硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]，100mMの塩化カリウム(KCl)，20mMの塩化マグネシウム(MgCl2)]，1％のTriton(登録商標)X-100，1mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)，3μlのプライマー1(10μM)，3μlのプライマー2(10μM)，2μlのdNTP(それぞれ10mM)を入れて，三次蒸留水で100μlにして実施した。反応条件は94℃で5分間処理した後，95℃で1分，58℃で1分30秒，72℃で1分30秒ずつ31サイクル反応させ，72℃で15分間更に反応させ，PCR生成物が完全な平滑末端を有するようにした。
【００６１】
ポリメラーゼ連鎖反応産物を0.8％のアガロースゲル電気泳動した後，QiaexIIゲル抽出キット (キアゲン(Qiagen),米国)を利用して精製した。精製されたポリメラーゼ連鎖反応産物をBamHIで切断した後，フェノール−クロロホルム抽出方法で抽出した。次いで，BamHIで切断された二種のDNA断片をリガーゼで結合させた。
【００６２】
C. 連鎖融合された単量体タンパク質LAG3-LAG3/FcをコードするDNA構築物のクローニング
連鎖融合された単量体タンパク質LAG3-LAG3/FcをコードするDNA構築物を，EcoRIとXbaIで消化し，市販されているクローニングベクターのpBluescript KSII(+)(ストラタゲン,米国)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全コード領域の配列をDNAシークエンシングにより確認した(配列番号9)。ここで生成された融合タンパク質は連鎖融合された単量体タンパク質であってLAG3-LAG3/Fcと命名され，その推定アミノ酸配列は配列番号10に該当する。
【００６３】
ベクターとして使用する10μgのpBluescript KS II (+)(ストラタゲン,米国)を，15UのEcoRIと15UのXbaI，5μlの10X反応緩衝溶液[100mMのトリス-HCl，pH 7.5，100mMの塩化マグネシウム(MgCl2)，10mMのDTT，500nMの塩化ナトリウム(NaCl)]，5μlの0.1％のBSA(タカラ，日本)と混合した後，三次蒸留水で50μlとした後，37℃で2時間反応させてDNAを消化した。PCR反応生成物を0.8％のアガロースゲル電気泳動した後，QiaexIIゲル抽出キット (キアゲン,米国)で精製した。
【００６４】
EcoRIとXbaIで消化したpBluescript KS II(+)(ストラタゲン,米国)100ngを，制限酵素で消化した20ngのポリメラーゼ連鎖反応産物，0.5UのT4 DNAリガーゼ(アメーシャム,米国)，1μlの10X反応緩衝溶液[300mMのトリス−HCl，pH 7.8，100mMの塩化マグネシウム(MgCl2)，100mMの DTT，10mMの ATP]と混合した後，三次蒸留水で10μlとし，その混合物を16℃の水浴で16時間インキュベートした。
【００６５】
E. coil Top10(ノヴェックス（Novex）,米国)を塩化ルビジウム(RbCl)法(シグマ,米国)でコンピテント細胞とした後，プラスミドで形質転換させ，アンピシリン(シグマ,米国)を50μg/ml含有するLB固体培地に塗布し，37℃で16時間インキュベートした。生成したコロニーを，50μg/mlのアンピシリンを含有するLB液体培地4mlに接種した後，37℃で16時間インキュベートした。このうち1.5mlから，サムブルック  ジェイ他(Sambrook J et al.)の文献(分子クローニング，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，p1.25-1.31，p1.63-1.69，p7.26-7.29，1989)に記述されたアルカリ分解法でプラスミドを精製した後，EcoRＩとXbaＩで消化してクローニングの有無を確認した。
【００６６】
全コード領域の配列をジデオキシチェーンターミネーション法(サンガー  エフ他(Sanger F. et al.) ，ピーエヌエーエス(PNAS)，米国，1977，vol.74，p5483)を利用したDNAシークエンシング法により下記のように確認した。上記でアルカリ分解法により精製したプラスミドとSequenase(登録商標)ver. 2.0（アメーシャム,米国)を用いて，マニュアルに従い，ＤＮＡシークエンシング反応を行った。反応混合物を6％のポリアクリルアミドゲルに載せ，電圧を1800〜2000V，温度を50℃に維持しながら2時間電気泳動して，ゲルを乾燥した後，Ｘ線フィルム(コダック（Kodak），米国)に露出することによりDNA配列を確認した。
【００６７】
実施態様２：本願発明による免疫グロブリン融合タンパク質をコードするDNA構築物の製造
他のタンパク質であるTNFR1，TNFR2，CD2又はCTLA4について，単純融合された二量体タンパク質及び連鎖融合された二量体タンパク質を，実施態様１と同様の方法により製造した。より詳しい製造方法は，本願発明の発明者により出願された国際特許公開WO2003/010202号に記載されている。TNFR1，TNFR2，CD2又はCTLA4の免疫グロブリン融合タンパク質のDNA及びアミノ酸配列についての情報を下記の表２に要約した。
【００６８】
【表２】
2007523158.tif 000004
【００６９】
実施態様３：単純/連鎖融合された二量体融合タンパク質LAG3/FCの発現及び精製 
CHO-K1細胞（ATCC CCL-61，卵巣，チャイニーズハムスター，モンゴルキヌゲネズミ)で融合タンパク質を発現させるために，LAG3-LAG3/Fc融合遺伝子を含むBluescript KSII(+)プラスミドを形質転換した大腸菌から抽出した後，EcoRI及びXbaIを使用して消化して得たLAG3-LAG3/Fc断片を動物細胞の発現ベクターであるpCR（登録商標）3(インヴィトロゲン(Invitrogen),米国)プラスミドのEcoRI/XbaI部位に挿入し，動物細胞発現ベクターを構築した。これらは，pLAG33-Top10’と命名され，2004年1月13日付で国際寄託機関の韓国微生物保存センター(KCCM,韓国ソウル市西大門区弘済1洞361-221ユリムビル所在)に，寄託番号KCCM 10556として寄託した。
【００７０】
トランスフェクションは，上記LAG3-LAG3/Fc融合遺伝子を含んだプラスミドpLAG33Ig DNAをLipofectamine(登録商標)試薬（ギブコ  ビーエルアール，米国）と混合することにより行なった。1〜3×105細胞/ウェル濃度のCHO-K1細胞を6ウェル組織培養プレート(ヌンク(Nunc),米国)に接種し，10％のFBS-DMEM培地で50〜80%になるまで培養した。その後，LAG3-LAG3/Fc融合遺伝子を含むプラスミドpLAG33Ig DNA1〜2μg及びリポフェクトアミン(ギブコ  ビーエルアール,米国)2〜25μlと15〜45分間反応させたDNAリポソーム複合体を，無血清DMEM培地中，細胞培養プレートに添加した。5時間インキュベートした後，血清を20％含むDMEM培地を添加して更に18〜24時間インキュベートした。最初のトランスフェクションの後，細胞を1.5mg/mlのGeneticin(G418，ギブコ  ビーエルアール,米国)が添加された10％のFBS-DMEM培地にて3週間インキュベートし，形成されたコロニーを分離して増幅培養した。融合タンパク質の発現は，パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIg(ケーピーエル(KPL),米国)を使用した酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により分析した。
【００７１】
ELISAは，次のような方法で行った。まず，1mg/mlのパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIg(ケーピーエル,米国)を0.1Mの重炭酸ナトリウムに1：2000に希釈した後，96ウェルフレキシブルプレート(ファルコン(Falcon),米国)に100μlずつ分注して樹脂製ラップで封じた後，4℃で16時間以上インキュベートし，検査プレートの表面にコートした。これを洗浄緩衝溶液 [１X PBS中の0.1％のTween-20]で3回洗浄した後，希釈緩衝液（1X PBS 48.5ml,FBS1.5ml,Tween-20 50μl）を180μlずつ分注した。最初のウェルに20μlの培養液の上澄みを入れた後，マイクロピペットを利用して連続的に希釈し，ポジティブコントロールとして0.01μg/μlのヒト免疫グロブリンG(シグマ,米国)を，ネガティブコントロールとしてトランスフェクションしていないCHOK-1細胞の培養液を同様に希釈した。希釈後，96ウェルELISAプレート(ファルコン,米国)をアルミホイルで包んで37℃で1時間30分間インキュベートした後，洗浄緩衝液で3回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(ケーピーエル,米国)を希釈緩衝液で1：5000に希釈した後，これを100μlずつ分注してアルミホイルで包んで37℃で1時間反応させた。反応が終わった後，プレートを洗浄溶液で3回洗浄した後，TMBマイクロウェルパーオキシダーゼサブストレートシステム(TMB microwell peroxidase substrate system)(ケーピーエル,米国)を利用して発色させ，マイクロプレートリーダー(バイオラド(Bio-RAD)，モデル550，日本)で波長655nmに対する吸光度を測定することにより発現の存在を確認した。
【００７２】
これらのトランスフェクタントが生産した融合タンパク質を精製するために，上記のように無血清培地の一つ，CHO-S-SFM II(ギブコ  ビーエルアール,米国)へのトランスフェクタントの適応を下記のように行った。約3×105個の細胞を6ウェルプレートに接種して37℃で16時間以上，5％の CO2で培養して定着させた後，顕微鏡下でプレートの約30〜50%の面積に細胞が付着したことを確認し，その後，この細胞を，10％のFBS DMEM及びCHO-S-SFM IIを8：2の比率で含む培地で培養した。この比率で3回連続継代培養した後，6：4の比率で3回，4：6の比率で3回，3：7の比率で3回，2：8の比率で3回，及び1：9の比率で3回連続継代培養，そして最終的に100％の CHO-S-SFM II培地で培養した。発現量をELISAにより測定した。
【００７３】
これらのトランスフェクタント細胞を，CHO-S-SFM II(ギブコ  ビーエルアール,米国)で大量に培養した後，それぞれの融合タンパク質を含有する培養液を200Xgで12分間遠心分離して細胞残渣を除去し，ハイトラッププロテインAカラム(HiTrap protein A column)（アメーシャム,米国)を利用した次の方法で精製した。20mMのリン酸ナトリウム(pH 7.0，シグマ,米国)を1ml/minの速度で2分間通過させた後，10mlの上澄みを同一速度で通過させ，プロテインAに融合タンパク質を結合させた。20mMのリン酸ナトリウム(pH 7.0)を2分間同一速度で通過させて洗浄した後，0.1Mのクエン酸(pH 3.0，シグマ,米国)を3分間同一速度で通過させながら500μlずつ1.5mlのチューブに順次的に抽出物を分注した。これを1MのトリスpH 11.0，USB，シグマ)を利用してpH 7.0に合わせ，各チューブの融合タンパク質の存在有無は，前述のようにELISAにより確認した。精製した融合タンパク質をセントリコン30(Centricon 30)（アミコン(Amicon),米国)を使用し，2000Xg，かつ4℃で，30分間遠心分離して濃縮した。
【００７４】
実施態様４：単純／連鎖融合された二量体タンパク質CD2，CTLA4，TNFRの発現及び精製 
単純/連鎖融合された二量体タンパク質CD2，CTLA4，TNFRを，実施態様３と同じ方法により製造した。この方法は，本願発明の発明者が出願した国際特許公開WO2003/010202号により詳細に記載されている。このようにして得られた組み換え発現プラスミドは，それぞれpCD22Ig(図１)，pCT44Ig(図２)，pTR2Ig-Top’(図４)と命名した。
【００７５】
更に，実施態様３及び実施態様４で精製したタンパク質が所望の単純融合された二量体タンパク質[CD2/Fc]2，[LAG3/Fc]2，[CTLA4/Fc]2及び連鎖融合された二量体タンパク質[CD2-CD2/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2であるかを確認するためにSDS-PAGEを実施した(図５ａ)。同様に[TNFR1/Fc]2，[TNFR2/Fc]2，[TNFR2-TNFR1/Fc]2，TNFR2-TNFR2/Fc]2に対してもSDS-PAGEを実施した(図５ｂ)。
【００７６】
実施態様５：単純融合された二量体タンパク質又は連鎖融合された二量体タンパク質の単独又は複合使用によるＴリンパ球の増殖抑制効果の評価
A. 単純融合された二量体タンパク質の単独使用によるＴリンパ球の増殖抑制効果
発熱患者のＢリンパ球にエプスタインバーウイルス(Ebstein-Barr virus)をトランスフェクションさせて調製したＢリンパ球細胞株のWT100B1SをＴリンパ球の抗原提示細胞として使用するために，10％のウシ胎児血清（FBS)含有RPMI 1640中で培養した。その後，この細胞を2,000rpmで2分間遠心分離した後，この細胞ペレットを5.0×105細胞/mlの濃度で10％のFBS含有RPMI 1640に懸濁し，ガンマ線(3000rad)を照射した。
【００７７】
Ｔリンパ球は健常人からフィコール−ハイパック[Ficoll-hypaque (アメーシャム,米国)]を利用して集めた血液から単離し，2.0×106細胞/mlの細胞懸濁液を得るように10％のFBS含有RPMI 1640中で培養した。
【００７８】
一次混合リンパ球反応(MLR)を下記のように実施した。15mlのWT100B1S細胞懸濁液を15mlのＴリンパ球と150mmの細胞培養皿中で混合した。3日間培養した後，15mlの10％のＦＢＳ含有RPMI 1640を添加して3日間更に培養した。6日間培養した後，生きているＴリンパ球をフィコール−ハイパック (アメーシャム,米国)を用いて単離した。このように単離したリンパ球を，45％のFBS，45％のRPMI 1640及び10％のDMSOを含む培地中で凍らせた後，液体窒素中に保存した。
【００７９】
一次MLRからのＴリンパ球を二次MLRに再度かけた。まず，凍結したＴリンパ球を溶かした後，RPMI 1640培地を利用して2回洗浄し，10％のFBS含有RPMI 1640に3.0×10５細胞/mlの濃度で再懸濁した。
【００８０】
抗原提示細胞として使用するWT100B1Sは上記の方法通りに新しく培養した。細胞にガンマ線(3000rad)を照射し，7.5×104細胞/mlの濃度で10％のFBS含有RPMI 1640に懸濁した。このWT100B1S細胞懸濁液を100μlずつ96ウェル平底プレートに入れて，単純融合された二量体タンパク質[TNFR2/Fc]2，[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2，[LAG3/Fc]2をそれぞれ最終濃度10，1，10-1，10-2，10-3，10-4μg/mlになるように各ウェルに添加した。その後，上記一次MLRからのＴリンパ球を100μlずつ各ウェルに添加した。このプレートを5％のCO2インキュベーター中，37℃で2日間インキュベートした後，各ウェルに10％のFBS含有RPMI 1640を100μl添加して2日間更にインキュベートした。4日間の培養中，最後の6時間は細胞を1.2μCi/mlの3H-チミジン(アメーシャム)で処理した。
【００８１】
その後，96ウェル細胞培養プレートを4℃，110Xgで，10分間遠心分離してＴリンパ球を沈殿させた。上澄みを除去した後，200μlの1Xリン酸緩衝食塩水（PBS)で洗浄した。プレートを同一条件で遠心分離してPBSを除去した。残っている3H-チミジン(アメーシャム)を除去するために予め冷却した200μlの10％のTCA(trichloridic acid)（メリック(Merck)）を添加して2分間振った後，4℃で5分間反応させた。
【００８２】
このプレートを上記と同一条件で遠心分離した。上澄みを除去した後，200μlの予め冷却した70％のエタノールを各ウェルに添加し，その後，4℃で5分間放置してＴリンパ球を固定した。このプレートを遠心分離した後，上澄みを除去し，上記の方法と同一条件で，細胞を10％のTCAを処理して残っている3H-チミジン(アメーシャム)を完全に除去した。
【００８３】
その後，各ウェルに100μlの2％のSDS(pH8.0)/0.5N水酸化ナトリウム(NaOH)を添加し，37℃で30分間インキュベートしてＴリンパ球を溶解した。このプレートを，25℃，110Xgで10分間遠心分離して細胞残渣を沈殿させ，50μlの上澄みを96ウェルサンプルプレート(Wallac)に移した。上澄みに1.5倍のオプティフェーズスーパーミックス（OptiPhase SuperMix）(ワラック(Wallac))を入れて，このプレートを5分間振った。1450マイクロベータ・トリラックス・マイクロプレート液体シンチレーション及び発光カウンター(1450 MicroBeta TriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter)(ワラック)を利用し，カウント毎分（cpm）として記録された放射活性の測定により3Hチミジンの導入を評価することにより，Ｔリンパ球の増殖を測定した(図６ａ)。
【００８４】
図６ａに示すように，単純融合された二量体タンパク質[TNFR2/Fc]2，[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2，及び[LAG3/Fc]2は全てＴリンパ球の増殖を抑制した。特に，[CTLA4/Fc]2及び[LAG3/Fc]2が[TNFR2/Fc]2及び[CD2/Fc]2と比較してより効果的なＴリンパ球の増殖抑制効果を示した。
【００８５】
B. 単純融合された二量体タンパク質の複合投与によるＴリンパ球の増殖抑制効果
単純融合された二量体タンパク質を別々には使用せず，[CTLA4/Fc]2＋[TNFR2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[LAG3/Fc]2及びコントロールとしての[CTLA4/Fc]2を利用すること以外は上記実施態様５のAと同一の方法により，Ｔリンパ球の増殖抑制効果を確認した(図６ｂ)。
【００８６】
図６ｂに示すように，[CTLA4/Fc]2単独のみならず[CTLA4/Fc]2＋[TNFR2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[LAG3/Fc]2，の組み合わせは全てＴリンパ球の増殖を抑制した。又，単純融合された二量体タンパク質を二種の組み合わせで使用する場合が，単独投与する場合よりＴリンパ球の増殖を効果的に抑制することが確認された。
【００８７】
C. 連鎖融合された二量体タンパク質の単独投与によるＴリンパ球の増殖抑制効果
単純融合された二量体タンパク質の代わりに，連鎖融合された二量体タンパク質 [TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2を単独で利用すること以外は実施態様５のAと同一の方法によりＴリンパ球の増殖抑制効果を評価した(図６ｃ)。
【００８８】
図６ｃに示すように，[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2は全てＴリンパ球の増殖を抑制した。又，単純融合された二量体タンパク質を単独投与する場合よりは，連鎖融合された二量体タンパク質を単独投与する場合に，Ｔリンパ球の増殖の抑制効果がより強いことが確認された。
【００８９】
D. 連鎖融合された二量体タンパク質の複合投与によるＴリンパ球の増殖抑制効果
単純融合された二量体タンパク質の代わりに，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2を単独ではなく組み合わせて，並びにコントロールとしての[CTLA4-CTLA4/Fc]2単独を利用すること以外は実施態様５のAと同一の方法によりＴリンパ球の増殖抑制効果を評価した（図６ｄ）。
【００９０】
図６ｄに示すように，[CTLA4-CTLA4/Fc]2単独投与のみならず[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2の複合投与は全てＴリンパ球の増殖を抑制した。又，連鎖融合された二量体タンパク質を複合投与した場合が，単独投与した場合よりＴリンパ球の増殖を更に効果的に抑制することが確認された。特に，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2がＴリンパ球の増殖抑制効果が最も強いことが確認された。
【００９１】
実施態様６：単純融合された二量体タンパク質又は連鎖融合された二量体タンパク質の単独又は複合使用によるコラーゲン誘発関節炎緩和効果の評価
A. 単純融合された二量体タンパク質の単独使用によるコラーゲン誘発関節炎緩和効果
精製したタイプIIコラーゲン，Arthrogen-CIAアジュバント(コンドレックス(Chondrex),米国)を0.05Mの酢酸に，2mg/mlの濃度で溶解し，DBA/1マウスの尾に一匹当たり100μgの量で注射し，コラーゲン誘発関節炎(CIA)を発病させた。追加免疫は不完全フロイントアジュバント(ジフコ(Difco),米国)を用いて3週間後に行った。
【００９２】
DBA/1マウスを100μgのタイプIIコラーゲンで免疫化した後，3〜4週間後に関節炎の症状が現れた。関節炎が現れてから3〜5日が経過すると，マウスの足が赤く腫れ，炎症性関節炎は3〜4週間以上持続した。炎症が弱化しても関節は永続的に硬直した。下記の表３に示す関節炎の重症度を評価するための視覚的スコアシステムに基づいて，関節炎の重症度を関節における紅疹と腫れの発症について一週間に2〜3回測定した(各実験群で5匹のマウスにおける重症度の平均値を求めた)。
【００９３】
【表３】
2007523158.tif 000005
【００９４】
単純融合された二量体タンパク質[TNFR2/Fc]2，[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2及び[LAG3/Fc]2を，それぞれPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解してCIA発生マウス（CIA mice developing）に腹腔内投与した。二量形態のCD2/Fc，TNFR2/Fc，CTLA4/Fc及びLAG3/Fcを各実験群当り5匹のラットに19日〜45日間，2日に1回ずつ10μgの投与量で注射し，関節炎重症度を評価した(図７ａ)。
【００９５】
図７ａに示すように，単純融合された二量体タンパク質をCIA発生マウスに単独投与した場合，PBSを注射したコントロール群と比較して，45日目に測定した重症度を基準として約26〜38％の減少した。
【００９６】
B. 単純融合された二量体タンパク質の複合投与によるCIA緩和効果
単純融合された二量体タンパク質を単独ではなく，[CTLA4/Fc]2＋[TNFR2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[CD2/Fc]2，及び[CTLA4/Fc]2＋[LAG3/Fc]2の組み合わせで，[CTLA4/Fc]2を単独でコントロールとして利用すること以外は実施態様６のAと同一の方法により，CIAマウスにおける関節炎の重症度を評価した(図７ｂ)。
【００９７】
図７ｂに示すように，[CTLA4/Fc]2＋[TNFR2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[LAG3/Fc]2の組み合わせ，並びに単独の[CTLA4/Fc]2がマウスに於いて関節炎の重症度を緩和した。又，単純融合された二量体タンパク質の二種を複合投与する場合，単独投与する場合よりマウスの関節炎の重症度を緩和させる効果に優れていることが確認された。
【００９８】
C. 連鎖融合された二量体タンパク質の単独投与によるCIA緩和効果
単純融合された二量体タンパク質の代わりに，連鎖融合された二量体タンパク質[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2を単独投与すること以外は上記実施態様６のAと同一の方法により，CIAマウスの関節炎の重症度を評価した(図７ｃ)。
【００９９】
図７ｃに示すように，連鎖融合された二量体タンパク質[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2は全てCIAマウスの関節炎の重症度を減少させた。連鎖融合された二量体タンパク質の単独投与は，単純融合された二量体タンパク質を単独投与した場合よりもマウスにおける関節炎の重症度の緩和に優れており，単純融合された二量体タンパク質を複合投与した場合と同様の関節炎緩和効果を発揮した。
【０１００】
D. 連鎖融合された二量体タンパク質の複合投与によるCIA緩和効果
単純融合された二量体タンパク質の代わりに，単独投与ではなく，連鎖融合した二量体タンパク質 [CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2の組み合わせで，[CTLA4-CTLA4/Fc]2をコントロールとして単独で使用すること以外は実施態様６のAと同一の方法によりCIAマウスにおける関節炎の重症度を評価した(図７ｄ)。
【０１０１】
図７ｄに示すように，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2の組み合わせ，かつ，コントロールとして単独の[CTLA4-CTLA4/Fc]2がCIAマウスにおける関節炎の重症度を緩和した。又，連鎖融合された二量体タンパク質を複合投与する場合が，単独投与する場合より関節炎緩和効果に優れていることが確認された。
【０１０２】
実施態様７：単純融合された二量体タンパク質又は連鎖融合された二量体タンパク質の単独又は複合使用の移植片対宿主疾患（GVHD）に対する治療効果の評価
A. 単純融合された二量体タンパク質のGVHDに対する治療の効果
この試験においては体重20〜25gの8〜12週齢の雌マウスC57bL/6及びBDF1[(C57bL/6×DBA/2)F1]を使用し，滅菌されたフィルタートップマイクロアイソレータ(filter-top microisolator)で飼育した。レシピエントマウスにはドナーマウスの脾細胞を移植する前日に，バクトリムを投与した。BDF1(H-2Kb/d)のレシピエントマウスは，延世大学の微生物学教室から全身に700cGyのガンマ線を照射したものを利用した。ドナーマウスから収得した脾細胞を10％のRPMI及び 1％ののペニシリン／ストレプトマイシンを含んだ培地を用いて調製し，細胞を400gで10分間遠心分離して回収した。
【０１０３】
移植片対宿主疾患（GVHD）を誘発するために，ガンマ線を照射したBDF1のレシピエントマウスに同種ドナーマウスのC57bL/6マウス(H-2Kb)の生きている脾細胞(25 × 106個)を逆噴射法を利用して移植した。
【０１０４】
その後，単純融合された二量体タンパク質の[CD2/Fc]2，[LAG3/Fc]2，[CTLA4/Fc]2それぞれをPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDのレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した。ここで，コントロールレシピエントマウスにはPBSを投与した。上記レシピエントマウスは，一日おきにマウスの体重を測定することにより生存が追跡調査された(図８ａ)。
【０１０５】
図８ａに示すように，コントロールレシピエントマウスの場合，GVHDの進行により体重が急速に減少し，ドナーマウスの活性化したＴリンパ球の増殖により，レシピエントマウスの脾細胞数が減少した。脾細胞をレシピエントマウスに移植してから2週間程度経過した後，本試験に使用された全てコントロールマウスが，深刻な体重減少を表し，死亡に至った。一方，単純融合された二量体タンパク質の[CD2/Fc]2，[LAG3/Fc]2，[CTLA4/Fc]2がそれぞれ単独投与されたマウスの場合は全て，GVHDによる致死率がコントロールに比べて減少した。単純融合された二量体タンパク質をGVHDマウスに単独投与した場合，[LAG3/Fc]2が最も長い約4週間の生存期間を表して最も良い免疫抑制効果を表し，続いて[CTLA4/Fc]2，[CD2/Fc]2の順序で，単独投与によりGVHDマウスの生存率が増加する結果を示した。
【０１０６】
B. 単純融合された二量体タンパク質の単独投与又は複合投与によるGVHDに対する治療効果
単純融合された二量体タンパク質[CD2/Fc]2，[LAG3/Fc]2，[CTLA4/Fc]2それぞれをPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDのレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した。同様に，単純融合された二量体タンパク質の混合物[CD2/Fc]2＋[CTLA4/Fc]2又は[LAG3/Fc]2＋[CTLA4/Fc]2をそれぞれPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDのレシピエントマウスに，移植後，0，2，4，6日目に腹腔内投与した(図８ｂ)。
【０１０７】
図８ｂに示すように，単純融合された二量体タンパク質を複合投与した場合，単純融合された二量体タンパク質を単独で投与した実施態様７のAの結果と比較して，GVHDマウスのより高い生存率が得られた。特に[LAG3/Fc]2＋[CTLA4/Fc]2の混合物をGVHDマウスに投与した場合，個体の全てが約40日以上の生存期間を表し，GVHDの致死率を最も多く減少することが示された。これらの結果は，各群それぞれ10匹のマウスで生存期間を測定し，測定された生存期間から平均値を計算して得られた(表４)。これらの結果はGVHDの治療には，単純融合二量体タンパク質を単独で使用するよりは，二種以上の組み合わせで投与することが更に有効であることを示す。
【０１０８】
【表４】
2007523158.tif 000006
【０１０９】
C. 単純融合された二量体タンパク質及び連鎖融合された二量体タンパク質によるGVHDに対する治療効果の比較
(1) CTLA-4
単純融合された二量体タンパク質の[CTLA4/Fc]2をPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0,2,4,6日目に腹腔内投与した。同様に，連鎖融合された二量体タンパク質の[CTLA4-CTLA4/Fc]2をPBSに２００μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0,2,4,6日目に腹腔内投与した（図８ｃ）。
【０１１０】
図８ｃに示すように，GVHDレシピエントマウスに[CTLA4/Fc]2を単独投与した場合，約26日の最大生存期間を示した。これに対し，GVHDレシピエントマウスに[CTLA4-CTLA4/Fc]2を単独投与した場合，約38日の最大生存期間を示した。これらの結果は，各群それぞれ10匹のマウスの生存期間を測定し，測定した生存期間から平均値を計算することにより得られた（表５）。これらの結果は，連鎖融合された二量体タンパク質が，単純融合された二量体タンパク質より，GVHDの治療により有効であることを表している。
【０１１１】
【表５】
2007523158.tif 000007
【０１１２】
(2) TNFR2
単純融合された二量体タンパク質の[TNFR2/Fc]2をPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した。同様に，連鎖融合された二量体タンパク質の[TNFR2-TNFR2/Fc]2をPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した(図８ｄ)。
【０１１３】
図８ｄに示すように，GVHDレシピエントマウスに[TNFR2/Fc]2を単独投与した場合に，約20日の最大生存期間を示した。これに対し，GVHDレシピエントマウスに[TNFR2-TNFR2/Fc]2を単独投与した場合，約35日の最大生存期間を示した。これらの結果は，連鎖融合された二量体タンパク質が，単純融合された二量体タンパク質より，GVHDの治療に，より有効であることを表している。
【０１１４】
D. [TNFR2-TNFR2/Fc]2と[TNFR2-TNFR2/Fc]2及び[TNFR2-TNFR1/Fc]2のGVHDに対する治療効果の比較
単純融合された二量体タンパク質の[TNFR2/Fc]2をPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した。同様に，連鎖融合された二量体タンパク質の[TNFR2-TNFR2/Fc]2又は[TNFR2-TNFR1/Fc]2をPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した(図８e)。
【０１１５】
図８eに示すように，GVHDレシピエントマウスに，[TNFR2/Fc]2を単独投与した場合，約20日の最大生存期間を示した。これに対し，GVHDレシピエントマウスに[TNFR2-TNFR1/Fc]2を単独投与した場合は約30日の最大生存期間を示し，[TNFR2-TNFR2/Fc]2を単独投与した場合は約35日の最大生存期間を示した。これらの結果は，単純融合された二量体タンパク質より連鎖融合された二量体タンパク質が，GVHDの治療に，より有効であることを表している。又，[TNFR2-TNFR1/Fc]2と[TNFR2-TNFR2/Fc]2は効果の面でほぼ類似したが，[TNFR2-TNFR2/Fc]2がより優れた免疫抑制効果を保持していることが確認できた。
【０１１６】
E. 連鎖融合された二量体タンパク質の単独投与又は複合投与によるGVHDに対する治療効果
連鎖融合された二量体タンパク質の[CD2-CD2/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[TNFR2-TNFR1/Fc]2を，それぞれPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した。同様に，連鎖融合された二量体タンパク質の複合体である[CD2-CD2/Fc]2＋[CTLA4-CTLA4/Fc]2又は[LAG3-LAG3/Fc]2＋[CTLA4-CTLA4/Fc]2を，個々にPBSに200μg/0.5mlの濃度で溶解し，GVHDレシピエントマウスに，移植後0，2，4，6日目に腹腔内投与した(図８f)。
【０１１７】
図８fに示すように，コントロールマウスの場合，約2週間後には，100％の致死率を示し(表６)，これらの結果は上記の結果と同様である。実施態様７のBによる単純融合された二量体タンパク質の場合と同様に，連鎖融合された二量体タンパク質も単独投与よりは複合投与が，GVHDマウスの生存率の改善に，より有効であることが分かった。連鎖融合された二量体タンパク質 [CD2-CD2/Fc]2＋[CTLA4-CTLA4/Fc]2と[LAG3-LAG3/Fc]2＋[CTLA4-CTLA4/Fc]2を複合投与した場合，脾細胞の注入後，約10週後までもそれぞれ40%及び50%の生存率を示した。これらの結果は，GVHDの治療のために，連鎖融合されたタンパク質を二種又はそれ以上の組み合わせで投与することが，単独で投与するよりも治療効果がより高いことを示唆している。
【０１１８】
【表６】
2007523158.tif 000008
【０１１９】
本願発明によるIg融合タンパク質は全てＴリンパ球の活性化を抑制することが確認できた。特に，単純融合された二量体タンパク質よりは，連鎖融合された二量体タンパク質がより強い抑制効果を有していた。又，単純融合された二量体タンパク質も連鎖融合された二量体タンパク質も，単独投与よりは，複合投与する場合にＴリンパ球の活性化をより効果的に抑制できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本願発明による連鎖融合された単量体タンパク質CD2-CD2/Fcを発現する組み換え発現プラスミドpCD22Igの遺伝子マップを示したものであり；
【図２】本願発明による連鎖融合された単量体タンパク質CTLA4-CTLA4/Fcを発現する組み換え発現プラスミドpCT44Igの遺伝子マップを示したものであり；
【図３】本願発明による連鎖融合された単量体タンパク質LAG3-LAG3/Fcを発現する組み換え発現プラスミドpLAG33Igの遺伝子マップを示したものであり；
【図４】本願発明による連鎖融合された単量体タンパク質TNFR2-TNFR1/Fcを発現する組み換え発現プラスミドpTR21Ig-Top'の遺伝子マップを示したものであり；
【図５ａ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質([CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2，[LAG3/Fc]2)及び連鎖融合された二量体タンパク質([CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2)のSDS-PAGEの結果を示したものであり；
【図５ｂ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質(1：[TNFR1/Fc]2，2：[TNFR2/Fc]2)及び連鎖融合された二量体タンパク質(3：[TNFR2-TNFR1/Fc]2，4：[TNFR2-TNFR2/Fc]2)のSDS-PAGEの結果を示したものであり；
【図６ａ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質([TNFR2/Fc]2，[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2，[LAG3/Fc]2)がＴリンパ球の増殖を抑制することを示したグラフであり；
【図６ｂ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質の混合物 [CTLA4/Fc]2＋[TNFR2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[LAG3/Fc]2並びに[CTLA4/Fc]2のＴリンパ球増殖抑制効果を示したグラフであり；
【図６ｃ】本願発明による連鎖融合された二量体タンパク質([TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2)のＴリンパ球の増殖に対する抑制効果を示したグラフであり；
【図６ｄ】本願発明による連鎖融合された二量体タンパク質の混合物 [CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2並びに[CTLA4-CTLA4/Fc]2単独のＴリンパ球の増殖に対する抑制効果を示したグラフであり；
【図７ａ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質([TNFR2/Fc]2，[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2，[LAG3/Fc]2)のマウスのコラーゲン誘発関節炎（CIA）の重傷度を緩和させる効果を示したグラフであり；
【図７ｂ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質の混合物 [CTLA4/Fc]2＋[TNFR2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2＋[LAG3/Fc]2並びに[CTLA4/Fc]2単独のマウスのCIAの重傷度を緩和させる効果を示したグラフであり；
【図７ｃ】本願発明による連鎖融合された二量体タンパク質[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2のマウスのCIAの重傷度を緩和させる程度を示したグラフであり；
【図７ｄ】本願発明による連鎖融合された二量体タンパク質の混合物 [CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[TNFR2-TNFR2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2＋[LAG3-LAG3/Fc]2)が関節炎並びに[CTLA4-CTLA4/Fc]2単独のマウスのCIAの重傷度を緩和させる効果を示したグラフであり；
【図８ａ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質[CD2/Fc]2，[CTLA4/Fc]2，[LAG3/Fc]2のマウスの移植片対宿主疾患（GVHD）に対する生存率の改善効果を示したグラフであり；
【図８ｂ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質の混合物[CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2，[CD2/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2のマウスの移植片対宿主疾患(GVHD）に対する生存率の改善効果を示すグラフであり；
【図８ｃ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質[CTLA4/Fc]2及び連鎖融合された二量体タンパク質[CTLA4-CTLA4/Fc]2のマウスの移植片対宿主疾患（GVHD）に対する生存率の改善効果を示すグラフであり；
【図８ｄ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質[TNFR2/Fc]2及び連鎖融合された二量体タンパク質[TNFR2-TNFR2/Fc]2のマウスの移植片対宿主疾患（GVHD）に対する生存率の改善効果を示すグラフであり；
【図８ｅ】本願発明による単純融合された二量体タンパク質[TNFR2/Fc]2及び連鎖融合された二量体タンパク質([TNFR2-TNFR1/Fc]2及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2)のマウスの移植片対宿主疾患（GVHD）に対する生存率の改善効果を示すグラフであり；
【図８ｆ】本願発明による連鎖融合された二量体タンパク質([CD2-CD2/Fc]2，[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2)，及びこれらの混合物([CD2-CD2/Fc]2＋[CTLA4-CTLA4/Fc]2，[LAG3-LAG3/Fc]2＋[CTLA4-CTLA4/Fc]2のマウスの移植片対宿主疾患（GVHD）に対する生存率の改善効果を示すグラフである。
【図１】
2007523158.tif 000009
【図２】
2007523158.tif 000010
【図３】
2007523158.tif 000011
【図４】
2007523158.tif 000012
【図５ａ】
2007523158.tif 000013
【図５ｂ】
2007523158.tif 000014
【図６ａ】
2007523158.tif 000015
【図６ｂ】
2007523158.tif 000016
【図６ｃ】
2007523158.tif 000017
【図６ｄ】
2007523158.tif 000018
【図７ａ】
2007523158.tif 000019
【図７ｂ】
2007523158.tif 000020
【図７ｃ】
2007523158.tif 000021
【図７ｄ】
2007523158.tif 000022
【図８ａ】
2007523158.tif 000023
【図８ｂ】
2007523158.tif 000024
【図８ｃ】
2007523158.tif 000025
【図８ｄ】
2007523158.tif 000026
【図８ｅ】
2007523158.tif 000027
【図８ｆ】
2007523158.tif 000028
【配列表】
2007523158000001.app
【国際調査報告】
2007523158.tif 000029
2007523158.tif 000030