(57)【要約】  ヒトの腫瘍を処置するために癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）７ＢＤ−３３−１１Ａの使用と、ＣＤ６３抗原性部位を発現する癌細胞を単離および同定する方法。ＣＤ６３抗原性部位に結合するモノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（ＡＴＣＣに期待寄託番号ＰＴＡ−４８９０）は、抗原性部位を発現する癌細胞に対して細胞毒性を示す。このモノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒト腫瘍の疾患進行を遅延させることに有用である。【選択図】  図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記患者に癌疾患の処置に有用（ガン組織の細胞に対して細胞毒性にしながら特徴づけられる前記抗体またはそのフラグメント）である抗癌抗体を生産するための方法に従って発生される抗癌抗体またはそのフラグメントを投与して、非癌細胞に基本的に良性であること；  そこで、前記抗体またはそのフラグメントは医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される；  前記癌組織によって発現される抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント（モノクローナル抗体の同定された特徴をＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位）である前記抗体、を含む方法。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項３】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、毒素、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーでそれの前記抗体または抗原結合フラグメントを活用させること；（それによって抗体複合体を形成する）、そして、前記患者に前記抗体複合体またはそれの抱合型のフラグメントを投与すること；そこで前記抗体複合体または抱合型のフラグメントは、医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項３の方法。
【請求項５】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項６】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、補体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項７】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となる、方法。
【請求項８】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となる、方法。
【請求項９】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となる、方法。
【請求項１０】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始させるシグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となる、方法。
【請求項１１】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する、方法。
【請求項１２】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を生産するための方法に従って生じられて、前記患者にそれの抗体または抗原結合フラグメントを投与することは、ガン組織の細胞に対して細胞毒性で、非癌細胞に基本的に良性の抗体であり、そこで前記抗体はＰＴＡ−４８９０としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体であって、医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項１３】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項１４】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、抗体複合体が形成されるそれによって毒素、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで前記抗体またはそのフラグメントを活用させること；そして、前記患者に前記抗体複合体ｓまたはそれのフラグメントを投与することを含み、そこで前記抱合型の抗体は医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。  
【請求項１５】
請求項１４の方法、前記抗体またはそのフラグメントが前記サブセットから選択されるその点では、ヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項１６】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項１７】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、補体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項１８】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となる、方法。
【請求項１９】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となる、方法。
【請求項２０】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となる、方法。
【請求項２１】
そこで請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始させるシグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となる、方法。
【請求項２２】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する、方法。
【請求項２３】
細胞表面の上でＣＤ６３抗原性部位を表すヒト腫瘍細胞の細胞毒性の媒介となる方法であって、結合している単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体または抗原で前記腫瘍細胞を接触させることは、それについて前記表されたＣＤ６３抗原性部位（ＰＴＡ−４８９０、それによって細胞細胞傷害が前記結合の結果として起こるのと同程度モノクローナル抗体の同定された特徴をＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいて抗体によって結合されて特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであることを分解することを含む、方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法であって、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが抗体複合体が形成されるそれによって細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで抱合型である、方法。
【請求項２６】
請求項２３の方法であって、、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項２７】
請求項２３の方法であって、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスである、方法。
【請求項２８】
請求項２３の方法であって、ヒト腫瘍組織試料は、大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる、方法。
【請求項２９】
ＡＴＣＣでＰＴＡ−４８９０として寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、細胞試料を提供すること、単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントに前記表されたＣＤ６３抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の同定された特徴をＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣで寄託したクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位であり、前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント細胞試料と接触させ、さらに前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントの結合を決定すること、を含み、それによって、前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞の存在は、決定される、結合アッセイ。
【請求項３０】
細胞試料が大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントと特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表す試料の細胞のための分離またはスクリーニングするための方法であり、前記抗原性部位がモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合していることを特徴とし、該モノクローナル抗体はＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされている方法であって、細胞試料を提供すること；それについて、前記表されたＣＤ６３抗原性部位（４３でありながら特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントである単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体または抗原結合フラグメントを提供すること、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードしたモノクローナル抗体の同定された特徴を持っている抗体が結合しているという特徴を持ち、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを接触させること、そして、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントの結合を決定すること、ＰＴＡ−４８９０としてのＡＴＣＣに寄託されたクローンまたはそれの抗原結合フラグメントによってコードされる単離モノクローナル抗体を特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表すそれによって前記細胞は前記結合によって分離され、前記細胞試料のそれらの存在は確認される、方法。
【請求項３２】
細胞試料が大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍がモノクローナル抗体を特異的に結合する抗原を表す、または、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および／または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを成立している寄託番号ＰＴＡ−４８９０が延長されるにつれて、モノクローナル抗体の同定された特徴をクローンでコードしておく抗原結合フラグメントがそれについてＡＴＣＣで寄託した哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および／または遅延疾患進行を延長する方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を活性化する請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウス抗体である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項３３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に腫瘍細胞の細胞毒性の調停に、この発明は、診断とガン疾患の治療に関するものである；そして、特に癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に対するほとんど（任意に、細胞毒性応答を始めるための手段として、一つ以上の化学療法剤と結合する）。更なる発明は結合アッセイに関するものである。そして、それは本発明のＣＤＭＡＢを利用する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ６３はｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ家族のＴｙｐｅ  ＩＩＩ膜タンパク質である。そして、メンバーがそうである２０の電流は４つの膜貫通の部分の存在によって誰のものを特徴づけた。いくつかの群は、活性化血小板、顆粒球と黒色腫細胞の細胞全体の標本まで上げられる抗体を使用して、それぞれにＣＤ６３を確認した。それらの同族の糖蛋白抗原のそれぞれの相補ＤＮＡのクローニングは、異なる抗原が全く同一の分子であった認識に導いた。Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ（１９９６）のＳｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐは、その後これらの抗体をＣＤ６３抗体に分類した。１９９６のＷｏｒｋｓｈｏｐの前に、ＣＤ６３は複数の名前（黒色腫１抗原、眼メラノーマ結合抗原、黒色腫関連する抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連の膜糖タンパク質３、グラヌロフィジン、メラノーマ結合抗原ＭＬＡｌ）に知られていた。そして、それは時々、その部分性質と識別に導いた抗体に関連があった。このように、抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ  ＭＥ４９１）、ニューロ腺抗原（ＭＡｂｓ  ＬＳ５９、ＬＳ６２、ＬＳ７６、ＬＳＩ１３、ＬＳ１４０とＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂｓ  Ｈ５Ｃ６、Ｈ４Ｆ８とＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ  １２Ｆｌ２）、ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒに特異的なマーカー（ＭＡｂ  ＨＯＰ−２６）とｉｎｔｅｇｒｉｎ−がタンパク質（ＭＡｂ  ６Ｈｌ）を結合したので、ＣＤ６３も示された。交差するとわかった他の抗体は、ＣＤ６３がそうであったヒトで反応する８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１による交差反応性）、ＮＫＩ／Ｃ−３、そして、ＮＫＩ／ｂｌａｃｋ−１３  （Ｖａｎｎｅｇｏｏｒ  ａｎｄ  Ｒｕｍｋｅ，  １９８６；Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）である。  
【０００３】
ＣＤ６３はまず最初に、ＭＡｂ  ＭＥ４９１を使用している黒色腫ｃＤＮＡライブラリーからクローンをつくられた。そして、多数の抗体の一つがヒト黒色腫細胞の標本に対して増えた。ＭＡｂ  ＭＥ４９１の反応性がヒト黒色腫生検の検査で黒色腫進行と反対に相関しているように見えることを示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、通常のメラノサイト（黒色腫進行（異形成母斑と肥大成長は、（ＲＧＰ）腫瘍を段階的に実行する）で、減少する初期のまたは垂直増殖相（ＶＧＰ）の、そして、転移性腫瘍のそれらのようなより進行した黒色腫腫瘍でなしでさえ高等）で低かった。  
【０００４】
ＣＤ６３は、見つかりもして、５３ｋＤａ、活性化に依存する血小板膜を見つけたＭＡｂ  ２．２８（活性化血小板に対して上がる）を使用しているヒト血小板でも、部分的に特徴づけられた糖蛋白。この分子は、刺激されていない血小板で内部顆粒の膜と関係してもいた。同じ検査において、ＭＡｂ  ２．２８も巨核球と内皮細胞で内部顆粒にラベルをつけた。ここで、それは酵素カテプシンＤ（リソソームの区画の既知のマーカー）に抗体で共存した。抗体クラスター形成と表現クローニングで追跡調査、この抗体によって認められる抗原の識別に導いた、ＣＤ６３、そして、更に確立されたそれが区画に特異的なマーカーＬＡＭＰ−ＩとＬＡＭＰ−２で共存したリソソームの区画でその存在。この分子のクローニングは、それをＣＤ６３と確認して、テトラスパニン・ファミリーへのその加入を許した。  
【０００５】
ＣＤ６３の表示は、多くの異なる組織と細胞型で発見されていた。細胞レベルで、それが原形質膜で、更に、細胞内遅いエンドソームの多孔質構造で関連するとわかった。ＣＤ６３の細胞内ストアの流動化によるさらなる表面表現に、特定のケースでは、細胞活性化はリードした。Ｂリンパ球のＭＨＣクラスＩＩで、特にエンドソームにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ複合体を表面に輸出することに関係するｅｘｏｓｏｍｅｓで、そして、分泌された小疱で、ＣＤ６３が共存するともわかって、物理的に結びつきもする。ＣＤ６３がテトラスパニン・ファミリー、例えばＣＤ９、ＣＤ８１の他のメンバーと交流するとわかった。そして、ＣＤＩｌ（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，ｘ）が、Ｂ−とＴ−リンパ球、好中球、乳癌と黒色腫細胞を含む種々の細胞型で、５つのＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３またはインテグリン鎖Ｏｔ３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６またはインテグリン鎖α６）とＣＤ２９（インテグリン鎖Ｐ１）であった。  
【０００６】
癌のＣＤ６３の役割は、不明だった。ＣＤ６３がまず最初に多様なイベント（例えば血小板と顆粒球活性化）、ＭＨＣクラスＩＩに依存する抗原提示、インテグリンに依存する細胞接着と自動運動性に関係しているいくつかの独立群と癌の特定の種類の腫瘍発達によって発見されたにもかかわらず、その機能はまだ完全に説明されていない。現在の証拠がその役割の種々の細胞生理的イベントを支持する場合であっても、これらの機能が互いに独立しているかどうか、または、ＣＤ６３が含まれる下にある一般の細胞機序があるかどうか明らかでない。
【０００７】
いくつかの群は、ＣＤ６３の間の関係と腫瘍（特に黒色腫）の特定の種類の進行を調査した。多数の他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体は、Ｍａｂ  ＭＥ４９１に加えて、進行のさまざまな段階で腫瘍患者から得られる癌試料の免疫組織化学的な（ＩＨＣ）染色のために開発された。減少した染色（ＣＤ６３の最も見込みのある反射している減少した表示として著者によって解釈される）が先進の進行で、そして、腫瘍の転移性の特徴で相互関係のあると述べられた。より最近の調査は、また、テトラスパニン・タンパク質ファミリー（ＣＤ６３を含む）の数人のメンバーといくつかの乳癌から派生した細胞系の生体外感染度の見た目の減少した表現レベル（メッセンジャーＲＮＡの定量化の後で）との間の有意の相関を述べた。エストロゲン剥奪を受ける洗練された乳癌細胞で、ディファレンシャルディスプレイで、もう一つの検査は、ＣＤ６３を確認した。これは、ＣＤ６３表現が調整されるステロイドホルモンでありえる、そして、変えられたＣＤ６３多量および／または機能が胸部腫瘍発達を伴いもするかもしれないことを示した。  
【０００８】
対照的に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ嗜眠状態−５．０１による仕事は、その反応性エピトープが異なる正常組織で不定に表されることを明らかにした。この抗体がＣＤ６３を認識するとわかったにもかかわらず、それは転移性黒色腫（ＭＡｂ  ＭＥ４９１と異なった）を含む初期でより多くの増悪期黒色腫を区別しなかった。そして、それはＣＤ６３抗原がこれらのより進行した腫瘍で存在した、しかし、そのエピトープの一部が異なる段階で腫瘍から細胞でマスキングされる可能性があったことを示唆した。これは中心的なＣＤ６３ポリペプチドの、または他の分子によるＣＤ６３の相互作用に対する変えられた翻訳後修飾によったかもしれない。そして、それは抗体認識と結合のために特異的なエピトープの有効性に影響を及ぼしたかもしれない。これらの結果は、抗ＣＤ６３  ＭＡｂ  ＮＫＩ−Ｃ３でとても染色される、診察（ケイ素とハーシー（１９９３）によって解説される）を支持した進行（例えば原発性、放射増殖相、垂直増殖相と転移性黒色腫）の異なる段階の黒色腫からの組織切片を区別した。他の検査で‖（小足立は、ａｌ．（１９９８）である；小ホワンはａｌ．（１９９８）である）胸部からの、そして、定量的ＰＣＲ、そこの２つのテトラスパニン・ファミリー（ＣＤ９とＣＤ８２）のためのそれらの表現レベルと腫瘍発達との間の有意の相関であった現われたと患者予後によって、非小細胞肺癌からのメッセンジャーＲＮＡの分析、その表現が全ての試料の点で同様だったという点で、そのような相互関係はＣＤ６３のために発見されなかった。これら、明らかに相克、結果の結果として、癌でＣＤ６３の関連を決定的に示す、強くて一貫したデータの不足が、ある。  
【０００９】
現在まで、極めて少ないインビボの研究は、ＣＤ６３の関連とこの分子の最終的な腫瘍抑制器機能を確立することを試みた。本研究のうちの１つにおいて、増加した生存期間までにと同様に減少した腫瘍サイズと転移性の可能性によって示されるように、親の非ＣＤ６３過剰発現している細胞の反応と比較してとき、ヒトのＣＤ６３過剰発現しているＨ−ラス癌遺伝子変わるＮＩＨ−３Ｔ３細胞（皮下に、そして、腹腔内に胸腺欠損のマウスに噴射される）は減少した悪質な／腫瘍化の表現型を現した。これは、悪性変換細胞のヒトＣＤ６３の存在がそれらの悪質な挙動を抑制するかもしれないことを示唆した。最近より多く（ヒトＣＤ６３を表している遺伝子導入マウス・モデルによる仕事）は、そして、ＣＤ６３に対する耐性を誘導するために開発されて、注入されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋ）の腫瘍成長がネズミのメラノーマ細胞ラインを同時形質移入したことが阻害されることができることを示した、そして、ワクシニアウイルスに溶解するヒトＣＤ６３による免疫処置に応じて、生存は増加した。著者によって治療効果が従属するＴリンパ球であることを示唆された、そして、腫瘍発育阻止が動物がＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩを注射されたときｃｏ−が細胞を形質移入して、細胞系をＣＤ６３−ｏｎｌｙなもので形質移入しなかったことを思いつくだけだった時から、その内因性抗ＣＤ６３抗体はこの保護作用に関係しているように見えなかった。この解釈は、野生型動物（浄化されたヒトＣＤ６３でプレ免疫にして、抗ヒトのＣＤ６３抗体を開発したことが示される）において、保護作用が腫瘍細胞の発達に対してなかったという事実で支えられた。仕事はＫＭ３細胞系を使用していてラドフォードその他によって（１９９５）を記載した。そして、まず最初に、有意差がさまざまな形質移入されて非形質移入の細胞系の生体外成長速度の間になかったにもかかわらず、皮内に胸腺欠損のマウスに噴射されるときラット血統（ヒトＣＤ６３で形質移入される）であることがこのタンパク質の表現度が、親の非−形質移入されたＫＭ３細胞を使用しているのを見られるそれと関連して、これらの細胞の成長とｍｅｔａｓｔａｓｔｉｃな可能性を減少させることを示唆したので、ヒト起源であると思われたが、後で特徴づけられた。これらの診察は、ＣＤ６３の潜在的効果と腫瘍細胞のインビボで生体外成長速度に影響を及ぼすために知られている他の癌抑制遺伝子のそれを区別した。さらにまた、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１（それが生体外分析（ラドフォードその他、１９９７）でそれらのランダムな自動運動性を減少させることによって同じ細胞の上に機能効果を持つとわかった）の追加は、それらの生体外成長速度に影響を与えなかった。
【００１０】
本研究もＣＤ６３が細胞外基質（ＥＣＭ）−由来の化学誘引物質（例えばラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンとビトロネクチン）に反応した遊走を促進する可能性があるという、そして、この効果がβｐｔｙｐｅインテグリンの機能的な関係によって媒介となられる可能性があるという診察を記載した、しかし、インテグリンに対する抗体はこれらの結果を妨害することができなかった。しかしながら、ビトロネクチンによって媒介される情報伝達（インテグリンαｖβｓのための既知の配位子）の役割と他のＥＣＭ部品（例えばＣＤ６３トランスフェクション細胞のフィブロネクチン、ラミニンとコラーゲン）によって媒介となられる情報伝達のそれとの間の拮抗する効果であるように見えた。これは、特異的な状況の下で、ＥＣＭ成分の面前で、ＣＤ６３の表示が減少した遊走に導く可能性がある、そして、これが癒着と自動運動性の間の微細な釣合いに依存している可能性があることを示唆した。もう一つの検査において、もう一つの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ  ２．２８）が、菌体群の非常により少ない分数だけの上で以外、類似の効果を進める間、そして、非常によりかなりの総計で加えられる場合にだけ、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ  ７１０Ｆ）はピロメリト酸治療をうけているＨＬ−６０細胞の癒着と伝播を強化した。これらの成績は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が開発されたにもかかわらず、それらの機能効果が全く異なることがありえることを示した。  
【００１１】
テトラスパンニンは、細胞増殖に関係してもいる可能性がある。オーレンその他は（１９９０）、リンパ腫細胞系の上で、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−Ｉ）を認識するネズミのＭＡｂ  ５Ａ６の抗増殖効果を記載した。もう一つの検査において、抗体によるヒトＴ−リンパ球のＣＤ３７の結合は、ＣＤ３７によって誘発された増殖を妨げた。最近では、ＣＤ３７（ＣＤ３７ノックアウト）の表示に欠けた動物モデルでの検査で、この動物からのＴリンパ球がコンカナバリンＡ活性化とＣＤ３／Ｔ細胞受容体約束に反応して野生型動物からそれらと比較して高増殖性であることが分かった。細胞増殖と増殖での機能的な役割がテトラスパニン・ファミリーの共通機能であるかもしれないことを従って、提案された。  
【００１２】
胚芽腫と肝細胞性カルシノーマ細胞による最近の研究で、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体によるこれらの細胞の関わりがＥｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化に導くことが分かった。このシグナル伝達経路は、細胞増殖と増殖イベントと関係していることが示された。平行した仕事において、ＣＤ８１が示したヒトを過剰発現している形質移入された細胞系は、ふざけて形質移入された対照細胞と関連して増殖を増加させた。従って、細胞増殖と関連するイベントでは、そして、細胞接着／自動運動性で、利用できる証拠は、一般のｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓの、そして、ＣＤ６３特にの役割を示していた。両者とも腫瘍発達と転移で中心的な役割を演ずるにつれて、細胞イベントのこれらの２つのタイプは現在強度の調査の標的である。  
【００１３】
これまで、抗ＣＤ６３抗体または特にＣＤ６３を表している細胞を目標とした他の試薬は、報告されなくて、生体外ものの上で、そして、腫瘍細胞の、更に、腫瘍細胞の発達の動物モデルの生存期間のインビボの増殖特性の上で同時の影響を及ぼすことが示されなかった。アミノ酸配列決定と分析でテトラスパニンと他のタンパク質族の間で相同性が現れなかった、または、どんな前に特徴づけられた機能モジュールででも、そして、それはどんな前に既知の酵素活性でも提案しなかった。その結果、シグナル伝達経路の変調でこの一群のタンパク質の役割を調査することは、非常に難しかった。しかしながら、細胞生理の変化に導いた、そして、シグナル伝達経路の変調に本質的に依存していたテトラスパニン−特異試薬を使用して発生する証拠は、テトラスパニンがシグナル伝達性質を持つことを示唆する。ＣＤ６３は、物理的に、そして、機能的に、それ自身二次伝達物質信号の生成に関係するいずれの酵素でもある分子数と関連することが示されたか、物理的におよび／または機能的に、そのような酵素と関連する。  
【００１４】
内皮細胞（それは炎症反応の最初のステップのうちの１つである）でヒト好中球の相互作用を制御している機構を切り裂くようになっている実験で、いくつかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３とＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理が培養内皮細胞層にそれらの癒着を促進することが分かった。さらに、この効果はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在に強く依存していた、多くの細胞内シグナル伝達経路の周知の調節因子、そして、細胞が刺激的な抗体にさらされた特異的な期間に制限された。抗体へのより長い暴露の後、内皮細胞に対する好中球の癒着は、Ｃａ２＋の後の追加に非感受性に、従って、力を関係させているようになって、時間的に（一過性の）イベントを調整した。加えて、ＣＤ６３が物理的にＣＤＩｌ／ＣＤ１８タンパク質複合体と相互に作用するとわかった、そして、特にこの複合体を目標とした試薬は修飾的な信号の媒介となった。ＣＤ６３が物理的に関係しているともわかった本研究において、またはパートである、酵素チロシンキナーゼＬｃｋを含んだ複合体とＨｃｋ。これらの酵素は特異的な表面受容体の活性化に応じて細胞内調節シグナルの媒介となることにおいて中心的な役割を果たすタンパク質の種類のメンバーであって、細胞に特有の生理的変化を結果として〜になるシグナル伝達経路の滝の一部である。もう一つの検査は、モノクローナル抗体によるテトラスパニン（ＣＤ６３を含む）の共同結合がコラーゲン基質にＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の癒着によって誘発された酵素焦点性癒着キナーゼ（品目無差別で）のリン酸化反応または活性を強化することができることを示唆した。これは、インテグリンによって媒介されるチロシンキナーゼ・シグナル伝達経路の変調で、ＣＤ６３（そして、他のテトラスパニン・ファミリーの）の直接の参加を示していた。７１０Ｆ、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂによって表面ＣＤ６３の存在と結合と機能的に交わる可能性がある他のシグナル伝達経路は、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（細胞内シグナル伝達経路のもう一つの有名な調節因子）によるリン酸化反応の変調に依存しているそれらであるように見える。この文脈において、ＰＫＣの時間的関係が決定的に示されなかったにもかかわらず、癒着の、そして、ＭＡｂによる骨髄細胞系ＨＬ−６０の形態学的変化の強化は７１０Ｆ、ホルボールミリステートアセテート（ピロメリト酸）で細胞の前処理に依存していた。しかしながら、独立群によるあと片付け工事は、分子Ｒｏ３１−８２２０（この酵素の特異的阻害剤）がピロメリト酸の結果を妨害した時から、ピロメリト酸によって誘発されたＨＬ−６０分化がＰＫＣ−活性扶養家族であったことを証明した。  
【００１５】
ＣＤ６３と他のテトラスパニン・ファミリーの関連を支援している更なる証拠は、シグナル伝達経路で、チロシン・ホスファターゼ活性で、直接的にまたは超分子複合体の一部として、ＣＤ６３（更に、ＣＤ５３）分子の間の物理的な関係を記載した仕事に起因した。この研究において、抗ＣＤ６３抗体で分離される免疫沈降物複合体はチロシン・ホスファターゼ活性を伴うことが示された、しかし、ＣＤ５３（それはチロシン・ホスファターゼＣＤ４５を一体にすることが示された）のためにとは異なり、ＣＤ６３関連のホスファターゼを特定することは可能でなかった。最近では、テトラスパニン・ファミリーの数人のメンバーが、ＩＩ型ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型歯周指数４Ｋ）（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）を伴うともわかった。それがＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１とＡ１５／ＴＡＬＬＡのために確認されるだけだった時から、この相互作用は非常にはっきりしているように見えた、そして、それはＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２またはＮＡＧ−２で起こるのを見られなかった。加えて、各々のＰＩ−４キナーゼを含有する複合体が一つのテトラスパニン・ファミリーに限られていた時から、テトラスパニン・ファミリーとＰＩ−４Ｋの間の関係は排他的だった。ＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、特に、ほぼ完全に、脂質いかだのような領域（他のテトラスパニン・メンバーと形成されるそれらと異なった）で、細胞内区画で見つけられた。この診察はこのＣＤ６３分数（ＰＩ−４キナーゼと対話するとわかる）がホスホイノシチド生合成経路に関連があるか、従属する特異的な細胞内イベント（Ｃｌａａｓ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１））に関与しているかもしれなかったことを示唆した。そして、それは、二次伝達物質分子（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｔ．，  １９９８）としてのそれらの機能に加えて、膜輸送（エンドサイトーシスとエキソサイトーシス）の調節へのそれらの関与で有名で細胞骨格再編成である。
【００１６】
調節装置としてまたはこれらの酵素の活性から下流の効果器分子として、ＣＤ６３がこれまで、直接伴うとわかったシグナル伝達経路の調節の全ての酵素の直接で重要な参加は、シグナル伝達経路の変調で、ＣＤ６３の関連を支援して、更なる証拠を提供した。  
【００１７】
腫瘍発達に対する導出がしばしば非常に難しくて複合の努力である機構の解明は、明らかに矛盾している診察と、その結果、それによって診察がうまく効果的治療に変換するその人々に珍しいと記録した。腫瘍発達と転移で、そして、シグナル伝達機構でＣＤ６３の関連について現在知られていることを鑑みて、腫瘍細胞で、その機能が変えられる可能性があるかもしれない。  
【００１８】
細胞障害能による抗原特異性の試薬の発現は腫瘍細胞の上で生じて、認められた抗原（ｓ）を表している細胞を結合して、そして、これらの試薬が正常な菌体群の上で重要な有害作用なしで腫瘍細胞の発達（進行と転移）を阻害するように、単独で、あるいは、他の分子と関連して、細胞でインビボの生理活性を持つ、治療的な可能性として非常に有益である、そして、または診断ツール。  
【００１９】
先行特許：  
【００２０】
ＵＳ０５２９６３４８は、細胞代謝に対する抗転写性のおよび／または反複製的な効果を内在化していて、確認しているモノクローナル抗体のために持っている癌細胞表面抗原に特有のモノクローナル抗体を選択する方法を教える。例証として、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５、ＷＭ９８３黒色腫細胞とＳＷ９４８で結腸直腸カルシノーマ細胞を内在化することが示された。加えて、ＭＥ４９１抗体は、ＳＷ９４８細胞で転写と細胞増殖を減少させることが示された。特許出願ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１（そして、その関連したアプリケーション：ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）、ＣＤ６３抗原を含む群の中から選択される卵巣腫瘍標識遺伝子によってコードされる卵巣腫瘍マーカー・ポリペプチドを結合する抗体で卵巣腫瘍の増加または転移を阻害する方法を主張しなさい。卵巣癌を使用している遺伝子発現の連続分析は、候補としてＣＤ６３の識別に導く卵巣腫瘍標識遺伝子を特定するために行われた。特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａ１（そして、その関連したアプリケーションＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を主張する。特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を主張する。特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を主張する。特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を主張する。これらの特許と特許出願は、ＣＤ６３抗原と抗体を特定するが、本発明の単離モノクローナル抗体または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示するのに失敗する。
【特許文献１】ＵＳ０５２９６３４８
【特許文献２】ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１
【特許文献３】ＷＯ０１７５１７７Ａ３
【特許文献４】ＷＯ０１７５１７７Ａ２
【特許文献５】ＡＵ０１５３１４０Ａ５
【特許文献６】ＷＯ０２０５５５５１Ａ１
【特許文献７】ＣＮ１３６４８０３Ａ
【特許文献８】ＣＮ１３２６９６２Ａ
【特許文献９】ＣＮ１３２６９５１Ａ
【発明の開示】
【００２１】
即時の発明者は以前米国特許６，１８０，３５７を与えられた。そして、個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と名付けられた。そして、それは癌疾患の処置に有用である。この文献では「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）が同義的に使われる可能性があって、ハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）によって生産される完全な免疫グロブリンを参照する可能性がある期間、のために、免疫複合体と（適当であるように）免疫グロブリンフラグメントと組換え型のタンパク質は前記免疫グロブリンから生じた（キメラでヒト化の免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域（Ｆｖ）、ｓ、融合タンパク質）で例えばある。それは若干のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能に対する重要な効果なしでポリペプチドで多彩でありえる芸術でよく認識される。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換（保存的置換は好まれる）、削除または追加。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢで標準の化学療法（例えば放射性核種）を活用させることはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中させる。ＣＤＭＡＢは毒素、細胞毒性部位、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。  
【００２２】
『モノクローナル抗体を修正しているガン疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの３５７の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に１つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を可能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害（細胞障害能）か細胞増殖を（細胞分裂停止）性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。  
【００２３】
個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび／または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、抗体が生成したＡＵは抗癌抗体のライブラリに加えられる。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数ででもガン疾患を処置するために役立つ可能性がある。
【００２４】
実質的にＵＳ  ６，１８０，３５７のプロセスを用いて、そして、Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２３１で開示されるように、マウス・モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは患者の乳房腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器抗原は、異なる組織起源から広範囲にわたるヒト細胞系の細胞表面の上で表された。乳癌細胞系ＭＣＦ−７と前立腺癌細胞系ＰＣ−３は、生体外で７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞毒性に影響されやすかった。
【００２５】
胸部に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ細胞毒性の結果と培養の前立腺癌細胞は、生体内に（Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２３１とＳ．Ｎ．  １０／６０３，００６で開示されるように）これらの癌徴候の方へその抗腫瘍活性によって更に延長された。Ｐｒｅ¬臨床異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。  
【００２６】
概説されて、Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２８４とＳ．Ｎ．  １０／６０３，００６で記載されるにつれて、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器はヒト乳癌の予防インビボのモデルで腫瘍成長と全身腫瘍組織量を予防した。モニタリングは、過去３００日後処理を続けた。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は腫瘍を決して呈しなかった、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群の８７．５パーセントは９ヵ月以上のポスト着床でまだ生存していた。逆に言えば、アイソタイプ対照群は、日７２（２３日後処理）までに、１００パーセントの死亡率を持った。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは生存を強化して、乳癌モデルで腫瘍成長（このように遅延疾患進行）を予防した。  
【００２７】
また、概説されて、Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２８４とＳ．Ｎ．  １０／６０３，００６で記載されるにつれて、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器はヒト乳癌の確立したインビボのモデルで有意に腫瘍成長と減少した全身腫瘍組織量を抑制した。日８０（２３日ｐｏｓｔ−処置）までに、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器治療をうけているマウスは、アイソタイプ対照群（ｐ＝０．００１）に、割に８３パーセントの低い平均の腫瘍容積を持った。かなりの抗体有効性として生存を使用して、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群で死亡する危険が６０日後処理ごろアイソタイプ対照群（ｐ＝０．０００６）の約１６パーセントであると推定された。アイソタイプ対照群の１００パーセントは、５０日後処理によって死亡した。比較として、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群の６０パーセントは、１３０日後処理でまだ生存していた。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置が制御処置群と比較して生存利点と還元型の全身腫瘍組織量を与えることを証明した。それが還元型の体重と臨床苦痛を含む毒性の少しの合図も誘導しなかったので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は安全に見えた。このように、それが腫瘍成長を遅延させて、ヒト乳癌のｗｅｌｌ−確立されたモデルで制御処置群と比較して生存を強化したので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は有効だった。  
【００２８】
化学療法剤（シスプラチン）処置単独と比較したまたは組合せの７ＢＤ−３３−１１Ａの効果は、２つの異なる確立した乳癌異種移植モデルで決定された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）モデルにおいて、日６９（５日後療法）で、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、バッファ制御治療をうけている動物（ｐ＜０．００１）と関連して、腫瘍成長の７６パーセントの減少に帰着した。単独でシスプラチン処置または、７ＢＤ−３３−１と結合して、アイソレーション増幅器は制御（ｐ＜０．００１）と関連して、腫瘍サイズの７９と８６パーセントの減少に、それぞれ、帰着した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）のモデルにおいて、日５５（５日後療法）で単独で、そして、アイソレーション増幅器がそれぞれ腫瘍成長、９５パーセント（ｐ＝０．０２４）と９７パーセント（ｐ＝０．１７）で最も大きな減少に示した７ＢＤ−３３−１と結合するシスプラチン処置。日５５でも、バッファ制御に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置単独は、３７パーセント（ｐ＝０．３９５８）、腫瘍成長の減少を示した。ＭＢ−２３１ＭＢ−４６８モデルにおいて、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による処置はシスプラチンで処置に割により大きな動物の幸福に導いた。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置がＭＢ−２３１モデルで単独でシスプラチン処置に割により大きな有効性を持って、両方の乳癌モデルのシスプラチンより少しの副作用（例えば重量減少）でより忍容性が高かったことを示す。  
【００２９】
さまざまな用量で７ＢＤ−３３−１１Ａ処置の有効な効果を決定するために、用量反応の実験は、予防乳癌異種移植モデルで実行された。日５５（５日後療法）で、０．２ｍｇ／ｋｇの投与群は、アイソタイプ制御処置群と関連して８５パーセント腫瘍成長を予防した。日５５でも、２つと２０ｍｇ／ｋｇの投与群は、まだ腫瘍を呈していなかった。類似の結果は日１２５（７５日後療法）過ぎに得られた。ここで、２０ｍｇ／ｋｇの投与群は腫瘍をまだ呈しなかった、そして、２ｍｇ／ｋｇの投与群は若干の最初の腫瘍成長を持った。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置も、生存利点を示した。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群が日１９７（１４７日後療法）まで生存する間、アイソタイプ対照群のマウスのＡＵは日１０４（５４日後療法）までに死亡した。より大きな生存利点さえ、２．０と２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群で観察された；２０ｍｇ／ｋｇの投与群のいずれもまた、日２９０までに死亡しない間、２．０ｍｇ／ｋｇの投与群のわずか５０パーセントは日２９０（２４０日後療法）までに死亡した。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は重要な腫瘍成長減退を示して、最高の服用によって示されている有効性で最も大きな程度で、全３つの用量で生存を増加させた。
【００３０】
乳癌の確立したインビボの腫瘍モデルの薬効に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置も、予防インビボの前立腺癌モデル（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を持った。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ制御抗体より、治療期間の直後に腫瘍成長を抑制することに有意に効果的だった（ｐ＝０．００１）。処置相終了後、７ＢＤ−３３−１１Ａを与えられるマウスは、アイソタイプ対照群のわずか３１パーセントに増大した腫瘍が認められた。ＰＣ−３  ＳＣＩＤ異種移植モデルのために、体重が疾患進行の代わりの指標として使われることができる。日５２に、有意に７ＢＤ−３３−１１Ａ処置（ｐ＝０．００２）は、アイソタイプ制御に割に５４パーセント体重の損失を予防した。マウスは、生存後処理をモニターされた。１１日後処理で、アイソタイプとバッファ制御マウスは、１００パーセントの死亡率に達した。逆に言えば、対照群より３回長く、７ＢＤ−３３−１１Ａは日３８後処理で１００パーセントの死亡率に達した。このように、それがヒト前立腺癌の安定したモデルでアイソタイプ制御処置群と比較して両方とも腫瘍成長、予防された体重損失と拡張した生存を遅延させたので、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置は有効だった。  
【００３１】
前立腺癌の予防的インビボの腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、確立したインビボの腫瘍モデル（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による処置は、再びアイソタイプ制御と比較してあった。７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群が処置の後でアイソタイプ制御処置群と比較して有意により少ない平均の腫瘍容積をすぐ持つ（ｐ＜０．０２４）ことを示された。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照群と比較して３６パーセント腫瘍抑制の媒介となった。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。
【００３２】
薬目標として７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープを確認するために、正常な人体組織の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度は、以前決定された（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６）。本研究は、商業的に入手可能な抗ＣＤ６３抗体（ＲＦ  ＡＣ４とＨ５Ｃ６）と比べると広げられた。組織染色からの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが再びさまざまな細胞型に制限された結合を見せるが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を持つことを示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は、割に各々に類似の染色パターンを見せた。しかしながら、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されてそれとは全く異なった。具体的には、ＲＰＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は正常組織のより幅広い範囲と結合して、通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性でもあった組織で強度にしみをつけている高等を持って、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることにだけでなく組織で大多数の上皮にも結合した。  
【００３３】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で、集団（乳癌患者の間のたとえば〜など）の範囲内のその有病率が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の治療的な使用を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要であると決定している限局化。癌患者から乳房腫瘍の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現について述べるために、５０人の個々の乳癌患者からの腫瘍組織試料は、以前７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６）の表現度のために映写された。現在の仕事は、Ｈｅｒ２抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２）をＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６に、そして、ａｎｔｉ−に７ＢＤ−３３−１１Ａに染色することを比較した。本研究の成績は、前の結果と類似していて、９４と８５パーセントの胸部腫瘍組織はそれぞれＨ５Ｃ６とＲＦＡＣ４エピトープが陽性の間、３６パーセントの腫瘍組織試料が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原のために良い面を染色したことを示した。染色が悪性細胞に制限されたので、患者試料の範囲内の７ＢＤ−３３−１１Ａの表示は癌細胞に特有に見えた。加えて、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４が正常な胸部組織の８つの試料のうちの７つにしみをつける間、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は乳癌患者から正常組織の１０の試料のうちの０にしみをつけた。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原の乳房腫瘍表現度は悪性細胞の細胞膜と細胞質に局所化されるように見えた。そして、ＣＤ６３を治療の魅力的な目標とした。７ＢＤ−３３−１１Ａ表現はホルモン類エストロゲンとプロゲステロンのためにレセプターの乳房腫瘍表示に基づいて更に評価された。そして、それは乳房腫瘍の発現、治療と予後において重要な役割を果たす。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現間のわずかな相互関係と７ＢＤ−３３−１１Ａの表示があった；受容体発現による組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器表現をした。腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果が７ＢＤ−３３−１１Ａのために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示して。Ｓｉｍｉｌａｒ結果は、ＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常にわずかな相互関係を示した、しかし、見た目の相互関係が腫瘍の病期でなかった。しかしながら、全３つの抗体のために、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａは７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が陽性だった乳房腫瘍組織標本の半分が乳癌患者のこれまでに会ったことのない目標とされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２表現が陰性だった完全に異なる染色側面を示した。染色の強度の違いが、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに通常の胸部組織断片のうちの１つを染色した。  
【００３４】
７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原と前立腺の癌患者の範囲内のその有病率の限局化は、前立腺癌患者に７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の有益性を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要である。癌患者から前立腺腫瘍の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現について述べるために、５１人の個々の前立腺の癌患者からの腫瘍組織試料は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度のために映写された。本研究の成績は、８８パーセントの組織標本が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のために良い面を染色することを示した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に通常の組織切片を高輝度でけがしたにもかかわらず、膜状の染色の高等程度が割に正常な試料に腫瘍組織試料にあった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のために染色されなかった１つの胚性のｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｒｏｍａ組織標本が、あった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在間の直接的な相互関係でなく見えた。しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。  
【００３５】
更に７ＢＤ−３３−１１Ａの潜在的治療的な利点を延長するために、さまざまなヒト癌組織の範囲内の抗原の頻度と限局化は、以前決定されもした（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６）。いくつかの癌タイプは、胸部と前立腺癌に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を表した。陽性のヒト癌タイプは、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、子宮（４／４）と腎臓（３／３）を含んだ。若干の癌は、抗原を表さなかった；これらの含まれた卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）とリンパ節（０／２）。ヒト胸部と前立腺の癌組織と同様に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の限局化は、膜の上で、そして、これらの腫瘍細胞の細胞質の範囲内で起こった。それで、生体外で癌細胞系と結合している７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体に加えて、抗原がヒトで、そして、癌のかさ形の上で表されるという証拠が、ある。  
【００３６】
この中に概説されるように、付加的な生化学データも７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる抗原がＣＤ６３であることを示す。これは、２つのモノクローナル抗体（ＲＪＦ  ＡＣ４とＨ５Ｃ６）（ＣＤ６３に対して反応性）が免疫沈降によって７ＢＤ−３３−１１Ａと結合したタンパク質を特定することを示している研究で支えられる。加えて、更なる細菌表現研究は、ＣＤ６３の細胞外ループ２行きのその７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器を解明した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器エピトープも、従属する立体配座であることによって特徴づけられた。これらのＩＨＣと生化学結果は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＣＤ６３抗原と結合することを証明する。このように、証拠の優越性は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＣＤ６３の上で出席しているユニークな高次構造上のエピトープの結合を通して抗癌性の効果の媒介となることを示す。この発明の目的で、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３３−１１Ａによってコードされるモノクローナル抗体と結合するその能力、それの抗原性の結合フラグメントまたはそれの抗体複合体ｓによって特徴づけられる「ＣＤ６３抗原性部位」として定義される。  
【００３７】
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞膜限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。  
【００３８】
本発明は７ＢＤ−３３−１１Ａの発現と使用を記載する。そして、特許ＵＳ  ６，１８０，３５７で記載されて、同一化される過程までに開発される。そして、細胞障害性の分析で、動物モデルの非確立して確立した腫瘍成長の、そして、それらの延長している生存期間のその効果がガン疾患を患う。それが、初めて、標的分子（ＣＤ６３）の上で特に出席しているエピトープと結合して、とてもまた、悪性腫瘍細胞に対して正常細胞でなく生体外細胞障害性の性質を持つ、そして、また、ヒト癌のインビボのモデルで直接腫瘍成長の抑制と生存の強化の媒介となる試薬を記載するという点で、この発明は前進を癌治療の場所において代表する。誰も類似の性質があることが示されなかった時から、これは他のいかなる前述した抗ＣＤ６３抗体にも関する前進である。それが明らかにデモをする時から、それも前進をフィールドに示す、そして、初めて、イベントのＣＤ６３の直接の参加は腫瘍の特定の種類の生育と関連した。それには可能性がある時から、それも前進を癌治療において代表する。そして、ヒト患者で類似の抗癌性の性質を示す。追加貸付は抗癌抗体のライブラリの中のこの抗体の包含が異なる抗癌抗体の適切なコンビネーションの決定によって異なる抗原マーカーを表しているターゲッティング腫瘍の可能性を強化するということである。そして、腫瘍の生育がターゲッティングと抑制性に最も効果的であるとわかる。  
【００３９】
全部で、この発明は、治療薬の目標として、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原の使用を教え、その投与される、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができて、そして、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできる。この発明もＣＤＭＡＢ（７ＢＤ−３３−１１Ａ）とその派生語の用法とそれの抗原結合フラグメントを教える。そして、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らして、この抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の生存を延長するためにその抗原を目標とする。さらにまた、この発明も、診断に役立つことがありえる癌細胞で７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原を見つける効果、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後を教える。  
【００４０】
患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者または互換性を持つ提供者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着している転帰不良を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球による抗癌抗体の送達には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、Ｔｈｅｒｅは抗体の５つのクラスである、そして、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、ネズミの免疫グロブリンＭとＩｇＧ２ａ抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のＣＩ構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動させることができる。ヒト抗体のために、最も効果的補体活性化抗体は、通常、免疫グロブリンＭとＩｇＧｌである。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧｌとＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。  
【００４１】
抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で（いわゆる触媒抗体）さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。  
【００４２】
抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに２つの機構がある。そして、それはより広く受け入れられる。第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第２は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。
【００４３】
制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のｗｅｌｌ−認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点（処置が生存に悪影響を与えないところ）は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準は通常、受け入れられる、そして、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のような調節性体はこれらの利点（１３７−１４３、小ハーシェフェルドは、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２のああという声Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓである：２００２）を発生する薬を承認する。これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。会計年度末の（２００３）より、このプロセス中で承認される１６の薬があった、そして、これらの、４は完全な承認（すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査）に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための１つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅその他は、国立癌研究所９２（３）ジャーナルである：２０５−２１６  ２０００）．そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、充実性腫瘍研究グループ（癌の一団の国際的な専門家）で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、前臨床モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少（それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある）が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；  ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，  ３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  ２００３，  ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。  
【００４４】
したがって、ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。  
【００４５】
それのＣＤＭＡＢと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。細胞毒性がＡＤＣＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、本発明の更なる目的である。
【００４６】
細胞毒性がＣＤＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。  
【００４７】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つＣＤＭＡＢを発生することである。  
【００４８】
図と例（この発明の実施形態が述べられることを確信している）のために、この発明の他の目的と長所は、そこで以下の説明から明らかになる。
【００４９】
（図面の簡単な説明）
特許または帯出者登録簿は色で仕上げられる少なくとも１つの図面を含有する。この特許のコピーまたはカラー図面（ｓ）による特許出願刊行は、要請と必要な料金の支払いに応じて局によって提供される。
図１は、ＭＤＡ−ＭＢ−まる２３１細胞可溶化物（レーン１）または膜（レーン２と３）のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）またはアイソタイプ対照（パネルＢ）と深く探った。分子量マーカーは、左で示される。  
図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−ＨＡで深く探った。レーン１：還元性の状況の下で動く膜。レーン２：膜は、非還元の状況の下で動作する。分子量マーカーは、左で示される。  
図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合の脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜は、ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｔ  Ｆで処置を受けた（ＰＮＡＧアーゼ；レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼとシアリダーゼ（レーン４）の組合せ、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ（レーン５）の組合せまたはバッファ制御（レーン６）。分子量マーカーは、左で示される。  
図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、そして、膜タンパク質が７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１のウエスタンブロット（パネルＢ）。レーンＡアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質（レーンＢ）：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質とレーンＴＭを免疫沈降した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質となりなさい。角箱は、ウエスタンブロットでＳＤＳ−ＰＡＧＥとレーンＴＭでレーンＢから同じ帯域を概説する。分子量マーカーは、左で示される。  
図５は、サーチ・サマリー・テーブル。    
図６は、ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブル。  
図７ａは、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローン作成、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。  
図７ｂは、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル  Ｂ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。  
図８は、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル  Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル  Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＥ）と深く探った。レーン１−５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈殿タンパク質とレインズ６−１０がＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質を含むことを含む。レーン１と６：ＮａＣｌでない、レインズ２と７：１５０ｎｉＭ  ＮａＣｌ、レインズ３と８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レインズ４と９：２０００ｍＭのＮａＣｌとレインズ５と１０：ＲＩＰＡバッファ。  
図９は、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル  Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル  Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅタンパク質染色液（パネルＥ）で深く探った。レーン１：非によって誘発されたベクター（レーン２）単独：非によって誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌ（レーン３）：非−は、一般システムズ理論−ＥＣ２（レーン４）を誘発した：誘発されたベクター（レーン５）単独：誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌとレーン６：誘発された一般システムズ理論−ＥＣ２。分子量マーカーは、左で示される。
図１０は、７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照と抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。  
図１１は、正常な人体組織配列から大腸の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦ  ＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は、粘膜固有層でマクロファージとリンパ球のためにポジティブ染色法を示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６も、粘膜のｅｐｉｔｈｅｌｉｅｕｍのために強い染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１２は、ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体に割に腫瘍細胞のためにより弱いポジティブ染色法を示した。拡大は、２００Ｘである。  
図１３は、ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、ａｎｔｉ−に割に腫瘍細胞のためにネガティブ染色を示したＨｅｒ２抗体を染色している強い良い面を示した。拡大は、２００Ｘである。  
図１４は、ヒトの前立腺癌組織配列から前立腺アデニカルシノーマ  （Ａ）または通常の前立腺（Ｂ）の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞のために強い陽性の膜状の染色を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、通常の前立腺の組織切片で腺上皮の膜状で細胞質の染色を示した。拡大は、２００Ｘである。  
図１５は、７ＢＤ−３３−１１Ａの効果または用量反応の予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関するアイソタイプ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。  
図１６は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による腫瘍を含んだマウス後処理または用量反応の予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植検査のアイソタイプ制御抗体の残存。  
図１７は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。  
図１８は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
図１９は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。  
図２０は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
実施例１  
ウエスタン免疫ブロット法による結合タンパク質の同定  
抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器によって認められる抗原（ｓ）を特定するために、細胞膜標本はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に従属して、膜に移った。後者は、タンパク質がこの抗体によって見つけられるのを視覚化するために、抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器で探索された。  
【００５１】
１．全細胞可溶化物および全膜画分調製
１．１．全細胞可溶化物
ＦＡＣＳによる全部のＣｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｖｉｏｕｓ業績は、抗体７ＢＤ−３３−１１のＡの結合を乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）に示した。その結果、この細胞系から得られる完全細胞膜標本と細胞全体の溶解産物が、抗原識別と特徴描写のために使われた。ＭＢ−からの全細胞可溶化物は、２３１セル、以下の通りに準備された：ペレット（１．５ｇ）がそうであったＭＢ−２３１のセルは２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．４）を含んでいる細胞溶解バッファを２ｍＬで再懸濁した。そして、１５０ｍＭはＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、２ｍＭのナトリウム・オルト・バナジン酸塩、５０ｍＭフッ化ナトリウムである、そして、プロテアーゼ阻害薬カクテル‖（ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；マンハイム（ドイツ））。ペレットはガラス・ホモジナイザーで均質にされて、動くことで暖められた、なぜならば、４°Ｃ．サンプルズの１時間はそれから４°Ｃで１５分の間遠沈殿法（２０，００Ｏｇ）を受けた。そして、洗剤不溶性物質を除去した。上清は集められた、部分標本で分割された、そして、凍る−８０℃。細胞可溶化物のタンパク質濃度はベンゼンヘキサカルボン酸（双シンコニン酸酸）分析で測定された（ピアス；ロックフォード（ＩＬ）。）。  
【００５２】
１．２．全細胞膜全膜画分調製
全細胞膜は、ＭＢ−２３１乳癌細胞の融合性培養組織から準備された。媒体は細胞スタックから除去された、そして、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗われた。細胞は、解離バッファで分離された（ギブコ−ＢＲＬ；グランドアイランド（ＮＹ））プラットフォーム振盪機の３７°Ｃの２０分の間。細胞は採取されて、遠心分離後、細胞ペレットがＰＢＳを中で再懸濁して洗われた４°Ｃ．の１０分の間の９０ＯｇとＰｅｌｌｅｔｓがそれから貯蔵型だった４°Ｃ．で１０分の間９０Ｏｇで再び遠心することで遠心した−必須のものまで８０℃。膜を準備するために、細胞ペレットは解凍されて、５０ｍＬの完全なプロテアーゼ阻害薬カクテルにつき１つの錠剤を含んでいる均質化バッファで再懸濁された（ロシュ；ラヴァルＱＣ）細胞のグラムにつき３ｍＬのバッファの比率で。細胞懸濁液は、細胞を溶解するために氷の上でポリ公共の秤ホモジナイザーを使用している均質化に従属した。細胞ホモジネートを１５，００Ｏｇで核微粒子を除去する４°Ｃの１０分時間遠心分離した。上清は収穫されて、管に分けられて、それから４℃で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された。上清は慎重に除去された、そして、各々の膜ペレットは約５ｍＬの均質化バッファで再懸濁された。全ての管からの膜ペレットは化合して、もう１回分けられて、上清ｔが除かれて慎重にあった４°Ｃ．で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された、そして、ペレットは量られた。１％のトリトンＸ−１００を含んでいる可溶化バッファは、膜ペレットのグラムにつき、３ｍＬのバッファの比率で、ペレットに加えられた。氷の１時間の間、膜は３００ｒｐｍでプラットフォーム振盪機で振盪によって可溶化された。膜懸濁液をペレット不溶性物質に対する７５，６０Ｏｇで遠心分離した。上清は、可溶化された膜タンパク質を含んで、管（タンパク質濃度のために検定される）から、慎重に除去された、そして、貯蔵型の−８０℃。  
【００５３】
２．１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタン免疫ブロット法  
それぞれ、５と１０パーセントのスタッキングと分離ゲルの上で、完全膜画分からのタンパク質とＭＢ−２３１細胞の細胞全体の溶解産物は１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＩＤ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって切り離された。タンパク質は、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングによって終夜、４°Ｃで、移された（ミリポア；ビルリカ（ＭＡ））。完全な転送は膜上へ前染色分子量マーカーの転送を評価することによって定量した。転写後、室温（ＲＴ）の１時間の間、膜はＴＢＳＴの５パーセント（ｗ／ｖ）の脱脂乳によるブロック状態のであった、そして、２つの反復された汚点はそれから以下の通りに探索された：１つの汚点は抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（５つのμｇ／ｍｌ（ＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳の））で探索された、そして、反復された汚点はＩｇＧ２３アイソタイプ対照（５つのμｇ／ｍｌ（ＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳の））と探索された。汚点はＴＢＳＴで１０分の間３回洗われて、それから、西洋わさびＨＲＰ抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（結晶化可能フラグメント）で孵化した（バイオラドＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ヘラクレス（ＣＡ））、ＲＴの１時間の間。ＴＢＳＴによるそれぞれ１０分の間３回を洗った後に、汚点はＴＭＢペルオキシダーゼ基質キットで呈された（ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；バーリンゲーム（ＣＡ））製造業者の指示に従うこと。汚点は、水できれいにされた、そして、画像はゲル・ドキュメンテーションシステム（図１と２）で後天性だった‖（バイオラド；ヘラクレス（ＣＡ））。汚点は、カメラ焦点、開口と画像獲得時間の同じ条件の下で像を造られた。図１において、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は２０−８０ｋＤａの範囲で明らかにタンパク質と結合した、そして、その反応性は細胞全体の溶解産物と完全膜画分を含んでいるレーンで発見されていた。アイソタイプ制御はＭＢ−２３１溶解産物または膜画分で少しのタンパク質もと結合しなかった。そして、７ＢＤ−３３−１１Ａのための結合がはっきりしていたことを示した。ウエスタンブロットで、図２は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器結合の上で、縮分の効果を示した。試料が非還元の状況（レーン２）の下で準備されたとき、この抗体の反応性は発見されているだけだった。ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールのような還元剤は完全に結合（レーン１）を除去した。そして、天然蛋白のそのエピトープに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの認識と結合がジスルフィド結合の存在次第であったことを示した。  
【００５４】
決定する、分散したものは抗原の自然である、ウエスタン免疫ブロット法によって見つけられるにつれて、与えられべきものが異質な糖化にあって、完全膜画分は特異的な炭水化物群を取り出したいくつかのグリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、オルト・グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ）で処置を受けた。処置の後、試料はＩＤ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット法に従属した。酵素の一部が一部の炭水化物を除去する場合、それが抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる抗原（ｓ）の質量の有意な量を占めたことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその違いを見つけることが可能であることが、期待されるであった。図中図３は、認められた抗原（ｓ）のＭＢ−２３１細胞からの完全膜画分のグリコシダーゼ処置が質量の重要な減少に帰着したことをである。これは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認められる抗原が少なくとも１つの糖蛋白から成ることを示した。いくつかの酵素が一緒に使われたとき、抗原（ｓ）の可動性の重要な変動が起こるだけだった事実は、炭化水素部分の少なくとも一部が合成のＮにリンクされた炭水化物から成ることを示した。グリコシダーゼによる膜の処理が分子量シフトに帰着したにもかかわらず、それは結合の強度を減らさなかった。これは、抗体が主に糖蛋白のポリペプチド部分と結合することを示唆した。
【００５５】
実施例２  
７ＢＤ−３３−１１Ａによる抗原結合の同定  
１．ＭＢ−２３１完全膜画分からの抗原の免疫沈降  
全膜抽出物（５ｍｇの総タンパク質量）は適当なＩｘ細胞溶解バッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ  ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、０．０２％のアジ化ナトリウム、２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭのフッ化ナトリウムとプロテアーゼ阻害薬カクテル（ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ））量で１ｍｇ／ｍｌの最終的なタンパク質集中に希釈された、そして、適当な二倍数ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ  ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のナトリウム・コール酸塩、０．２％のＳＤＳ、１％のトリトンＸ−１００と０．０２％のアジ化ナトリウム）量で、最終的なＩｘを得るために、ＲＩＰＡは集中を緩衝する。抜粋は抜粋がそうであった４°Ｃ．  Ｔｏｔａｌ膜でタンパク質Ｇ−セファロース・ビード（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）で２時間の間安全を事前に確認された。そして、除かれて標準的なＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）は０．５ｍｇ／ｍｌの最終的なＢＳＡ集中に加えられた。抜粋が安全を事前に確認される間、抗体複合体ｄタンパク質Ｇ−セファロース・ビード（タンパク質Ｇセファロースの３０のμｌに化学的に架橋させられる抗体の６０のμｇ）は、４℃の潜伏によって、また、２時間のＡｆｔｅｒ遮断（ビードがＩｘ  ＲＩＰＡバッファで５分、二回洗われた抗体複合体ｄ）のための１ｉｎＬの０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡによるブロック状態のであった。終わり−過度に終わり回転子の上で、４°Ｃで、抗体複合体ｄタンパク質Ｇ−セファロース・ビードは、それからＢＳＡを含有する全膜抽出物に加えられて、３時間の間孵化した。２０，００Ｏｇの遠沈殿法の後、１０秒の間、４°Ｃで、解放された断片は除去されて、廃棄された、そして、各々の洗浄ステップの１ｍＬのＲＩＰＡバッファで、ビードは５分の間３回洗われた。ビードは、それから一度、１．５ｍｌのＰＢＳできれいにされた。上述の免疫沈降（ＩＰ）は、７ＢＤ−３３ｌｌＡ複合蛋白Ｇセファロースで、タンパク質Ｇ−セファロース・ビードがＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）と化学的に架橋させられた類似のＩＰと並列に実施された。このステップは、免疫複合体にタンパク質の非特異的な結合の評価を可能にするために実行された。完全にＰＢＳを排出した後に、ビードは非還元の試料バッファの４０のμｌで煮沸された、そして、試料は一部のゲルのウエスタン免疫ブロット法とゲルの残りの部分のクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅによる染色が続くＩＤ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。４０のμｌの、分数（８つのμｌ）はウエスタンブロット法のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに積まれた、そして、残りの分数（３２のμｌ）はクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅでタンパク質染色のために同じゲルの別々のレーンに積まれた。タンパク質染色に指定されるゲルの部分は、クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色液で、終夜暖められた。ウエスタンブロット法に指定されるゲルの部分は、３２０ｎｉＡで２時間の間ＰＶＤＦ膜に転写されて、脱イオン水できれいにされて、ＴＢＳＴで５パーセントの牛乳でＲＴで１時間の間ブロッ��されて、それからＴＢＳＴで５パーセントの乳で７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器で４°Ｃで終夜暖められた。室温の１時間の間、汚点はＴＢＳＴで１０分の間３回洗われて、ＴＢＳＴで５パーセントの乳でＨＲＰ抱合型の結晶化可能フラグメントに特異的なヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（１：５０００）で暖められた。汚点はそれから１０分の間３回洗われて、ＨＲＰのためにＴＭＢ基質の標準手順によって呈された。図４で示されるにつれて、ウエスタン免疫ブロット法とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色されたゲルは並んだであった。そして、参照として分子量マーカーを使用した。クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅで染色された主帯域は、ウエスタンブロットで７ＢＤ−３３−１１Ａで反応したメイン・バンドの同盟者になった。この断面は、図４の上で強調される（長方形挿入紙）。  
【００５６】
２．ペプチドマッピングと質量分析による抗原同定  
上記の実験から、クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅの帯域は、ウエスタンブロットで最も強度の反応性による並んだがそれから切り離されて、商業的に入手可能なキット（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を使用しているｉｎ−ｇｅｌトリプシン性消化に従属したゲルを染色した。ダイジェストのアリコートは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰＢＳＩＩｃ読者（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）の上で、質量分析分析を受けた。手短に言うと、ダイジェストのアリコートは、Ｈ４チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）上へ、手動で汚された。乾燥の後で、ＣＨＣＡマトリックスのアリコート（αシアン基の４ヒドロキシｃｉｎｎａｍｉｎｉｃな酸；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、チップに同じ点上に加えられて、乾燥させておかれた。試料は、それからＰＢＳＩＩｃ読者の上で分析された。アイソタイプの平行した地方からの類似の大きさを設定された帯域はレーンを制御して、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降される抗原の消化によって発生するユニークなペプチド断片の決定を可能にするために、空のゲル地域は７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＩＰからゲル・プラグで並んで謄写刷政府印刷物だった。ユニークなペプチド断片の腫瘤はＰＲＯＦＯＵＮＤ（質量スペクトルから情報を使用しているタンパク質配列データベースを検索するための公的にアクセスできるオンライン道具）を使用して検索された。７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＩＰダイジェストからの試料のユニークなペプチドは、それから、以前ＰＢＳＩＩｃ読者の上で分析された同じ試料点の分析を可能にしたインタフェースを備えているＱＳＴＡＲ（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、ＣＡ）の上で、ＭＳ／ＭＳ分析を受けた。ＭＳ／ＭＳデータは、それから、ＭＡＳＣＯＴ（ＭＳ／ＭＳスペクトルから情報を使用しているタンパク質データベースを検索するための公的にアクセスできるオンライン道具）で分析された。図５は、ＰｒｏＦｏｕｎｄ検索から生じた表についての要約である。推定上の候補として提案された唯一のタンパク質は、重要な信頼度でＣＤ６３であった。図６は、ＭＡＳＣＯＴ検索から生じた要約したテーブルである。高度な確率と同一視された唯一のタンパク質はＣＤ６３であった。そして、前の仮の識別をペプチドマップ・フィンガープリント法で支えた。  
【００５７】
３．  ７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原イド確認  
７ＢＤ−３３−１１Ａのための推定上の抗原のＩＤの確認は、既知の抗ヒトのＣＤ６３モノクローナル抗体（例えばＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６）が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とその逆によって免疫沈降されるタンパク質（ｓ）と反応するかどうかの決定を通して行われた。更なる確認は、ヒトＣＤ６３の細胞外領域のグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（一般システムズ理論）−融合構造物で変わる誘導されたおよび非−誘導されたバクテリアから、全体の溶解産物のウエスタン免疫ブロット法にもよって実行された。ＭＢ−２３１からの免疫沈降物は膜となって、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−ＨＡ、ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＬＴＤ、Ｈａｎｔｓ、英国）、Ｈ５Ｃ６（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）で備えた、そして、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１で、（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）アイソタイプ対照はウエスタン免疫ブロット法が続くＩＤ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。各々の免疫複合体試料からの等しい分数体積を反復されたゲル類上で分析した。ＰＶＤＦ膜の上のエレクトロブロッティングの後、そして、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１アイソタイプ対照と、反復されたゲル類からの汚点は、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、Ｈ５Ｃ６と並列に探索された。図７ａにおいて、材料が７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４を試験モノクローナル抗体の各々によって免疫沈降したクロスＩＰ実験からの結果は、ウエスタン免疫ブロット法によって分析された。図７ｂにおいて、材料が７ＢＤ−３３−１１ＡとＨ５Ｃ６を試験モノクローナル抗体の各々によって免疫沈降したクロスＩＰ実験からの結果は、ウエスタン免疫ブロット法によって分析された。モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ５の各々は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器によって免疫沈降される類似の抗原（ｓ）で交差反応した。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ十字架は、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６によって免疫沈降される類似の抗原（ｓ）で、２０−８０ｋＤａの範囲のウエスタンブロットで、反応したが、免疫複合体でアイソタイプ制御抗体で備えなかった。アイソタイプ制御抗体で探索される汚点は、完全に負だった。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認識されるエピトープがＣＤ６３抗原の範囲内で含まれることを示した。  
【００５８】
交差反応性が全ての抗体によって認められている同じ分子によることがありえたかどうか、または、それが類似の腫瘤で相互に作用している分子の存在によったかどうか決定する、抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器による免疫沈降は、増加性の緩衝厳しさの条件で実施された（５０ｍＭのトリスｐＨ  ７．４、１％のトリトンＸ−１００とＮａＣｌの変更濃度：０、１５０、５００と２０００ｍＭ；更に、先に述べたようにＲＩＰＡバッファ、しかし、５００ｍＭのＮａＣｌを含むことで）。結果として生じる免疫複合体は、それから、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４で、そして、アイソタイプ対照ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１でウエスタン免疫ブロット法によって徹底調査された。図８はＩＰ状況の厳しさを変えることが免疫複合体の形成に少しの検出可能な影響を及ぼさないことを示した。そして、それは抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる分子（ｓ）が抗ＣＤ６３抗体とその逆によって認められもすることを示した。
【００５９】
７ＢＤ−３３−１１ＡがヒトＣＤ６３抗原と直接結合していたことを更に確認するために、ヒトＣＤ６３の細胞外領域（ループＥＣｌとＥＣ２）を含んでいる組換え型の融合ポリペプチドを表している大腸菌の溶解産物に対するウエスタン免疫ブロット法によって、その反応性は評価された。本研究のために、ＣＤ６３（ループ１とループ２−ＥＣｌとＥＣ２、それぞれ）の細胞外ループのＧＳＴ−融合構造物は、細菌発現ベクターＰＧＥＸ−４Ｔ−２（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に適当な相補ＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることによって発生した。ループをコードしている相補ＤＮＡフラグメントは、テンプレート（クローンＭＧＣ−８３３９、ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）として、全身のヒト相補ＤＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）によって得られた。ＥＣｌループをコードしている相補ＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた：５つ』のプライマー（ＥＣ１＿５’）、５’ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＳのものと３』プライマー（ＥＣ１＿３’）（５’ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＧＣＳのもの）。ＥＣ２ループをコードしている相補ＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた：５つ』のプライマー（ＥＣ２＿５’）５  ５’ＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＳのものと３』プライマー（ＥＣ２＿３’）（５’ＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＳのもの）。ＰＣＲ反応の条件は、以下の通りだった：５つの『プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）（３の２つのμＬ）』プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）の２つのμＬ、鋳型ＤＮＡ（ｐＯＴＢ−ＣＤ６３、０．７６ｍｇ／ｍＬ）の０．２のμＬとＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロゲン、バーリントン、ＯＮ）の４５．８のμＬ。ＰＣＲ反応は、以下の通りに実施された：３０が続く５分の間の９４°Ｃは、循環する：１分の間７２°Ｃで３０秒と拡張のために５５°Ｃで焼還して、サイクルにつき３０秒の間の９４°Ｃの融解。  
【００６０】
サブクローニングの後、構造物（ＰＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター単独で負の制御（相補ＤＮＡフラグメントは、ベクターにサブクローニングしなかった）を含む）は大腸菌（船荷証券−２１の重圧となる）に変わった。各々の変換からの一つのアンピシリン耐性コロニーは大きくなった、そして、それぞれの挿入相補ＤＮＡは配列決定された。相補ＤＮＡ配列が正しかったことを確認した後に、クローンの各々は、液体培養で大きくなった、そして、一般システムズ理論−融合構造物の表示は、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ・ガラクトピラノシド）の追加によって誘発された‖（ギブコ−ＢＲＬ；ロックビル博士）。２時間の潜伏の後、室温で、５分の間、バクテリア培養は、２００Ｏｇで遠心された。上清は成廃であった、そして、バクテリア・ペレットは非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファで煮沸された。試料は、それからそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５と１２パーセント）ポリアクリルアミド・スタッキングと分離ゲル類によって分析された）、そして、ウエスタン免疫ブロット法、前述のとおり。汚点膜は７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６、ＲＦＡＣ４で探索された、または、ＩｇＧ２ａアイソタイプで、制御しなさい。図９で例示される結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが特にヒトＣＤ６３（７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で探索される汚点のレーン６）のループ２（アミノ酸１０８−２０２）を認めて、ループ１（アミノ酸３４−５２）を認めないことを明らかにした。細菌溶解産物に対する抗体の特異性は２がａｎｔｉ−をｗｅｌｌ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄしたという診察によって更に確認された。そして、ＥＣ２融合ポリペプチドを表している誘導された大腸菌からの溶解産物だけの上で、ヒトＣＤ６３抗体（ＲＦ  ＡＣ４とＨ５Ｃ６）はまた、類似のサイズ帯域を認識した。上記の結果の全ては、認識されるその７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器を示して、直接、ヒトＣＤ６３に、そして、特にアミノ酸１０８−２０２を含んでいる細胞外領域に結合した。
【００６１】
実施例３  
Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２３１で概説されるように、寄託番号ＰＴＡ−４８９０の下で、２００３年１月８日の２０１１０−２２０９  ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９）、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３３−１１Ａは寄託された。３７の運賃込み条件１．８０８に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。  
【００６２】
抗体産生：  
７ＢＤ−３３−１１Ａモノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度／週でハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）で培養することによって生産された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）で、標準の抗体精製処置によって精製された。
【００６３】
前述のとおり、Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２３１で、７ＢＤ−３３−１１Ａは細胞毒性分析（表２）で、多数の陽性（抗ファス（ＥＯＳ９．１、免疫グロブリンＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧｌ、カッパ、１０マイクログラム／ｍＬ、インテル・メディコ、マーカム、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、カッパ、５マイクログラム／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ホーンビー、ＯＮ）、Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００マイクロモル、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、アジ化ナトリウム（０．１％、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ））で陰性の（１０７．３（抗喘ぎ、ＩｇＧｌ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗喘ぎ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、ＭＰＣ−Ｉ  ｌ（抗原特異性未知数、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、免疫グロブリンＧ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％））対照と比較された。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ  Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、前立腺癌（ＰＣ−３）と非癌（２７ｓｋチャージカップルドデバイス、Ｈｓ８８８ルテチウム）細胞系は、試験された（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡからの全て）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞毒性分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得られた。分析は、下で概説される変化で、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。２日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから、１００マイクロリットルは細胞板に転写されるＮ  Ｃ  Ｃｌｔｌｔｔｇｏｓｅａｉｖｅｏｎｏｓ  ａｏｎｒｒであって、５日の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで孵化した。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、３回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。ＤＰＢＳで希釈される蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、３０分の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで３７℃で暖められた。プレートはパーキン−エルマーＨＴＳ７０００蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで分析された、そして、結果は表１で表化された。データは、平均４つの実験が三通り１０で検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した：４／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋＋）、３／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋）、２／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋）。表１の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体は胸部の細胞毒性と１５が選択的に線をひく前立腺の腫瘍細胞を示した、その一方で、非変わる正常細胞の上に無効を持った。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、前立腺癌細胞系の正の制御抗ファス抗体より大きな殺害を示した。比較のためにも含まれた多数の他の抗体が生物学的細胞０の分析の限定を与えられて予想通りに実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。全体として、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体が多数の癌細胞タイプに対して細胞毒性活性を持つことを示された。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体はその活性で選択的だった。さらにまた、それが非癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、抗体は機能的な特異性を示した。そして、それは治療的な状況の重要な要素である。
【００６４】
【表１】
2007530458.tif 000003
【００６５】
癌と正常な細胞系の前述のパネルに対する、そして、以下の付加的な癌細胞系に対する７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の結合；大腸（ＬＯＶＯ）、膵臓の（ＢｘＰＣ−３）、卵巣の（ＥＳ−２、ＯＣＣ−Ｉ）、そして、前立腺の（ＤＵ−１４５）、そして、以下の付加的な正常な細胞系（チャージカップルドデバイス−１１２）は、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって評価された。細胞は、まず最初にＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋なしで）で細胞単層を洗うことによって、ＦＡＣＳの準備ができていた。細胞解離バッファ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、バーリントン、ＯＮ）はそれから、細胞が４°Ｃ（メディアを洗う）、ＭｇＣｌ２を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、塩化カルシウムと２または２５パーセントのウシ胎児血清（ＦＢＳ）で再懸濁された３７°Ｃ．  Ａｆｔｅｒ遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、適当な細胞密度に等分されて、引き伸ばした以上ペレットを細胞とみなした、そして、Ａｌｅｘａフルーア４８８抱合型の二次抗体の追加に３０分のＰｒｉｏｒのために氷の上で２０のμｇ／ｍＬで７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器または制御抗体（アイソタイプ制御または抗ＥＧＦＲ）を含んでいる染色メディア（ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２と塩化カルシウム＋／−を含んでいる。そして、２パーセントがＦＢＳである）で再懸濁されて、細胞は洗浄メディアで一度洗われた。染色メディアの中のＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の抗体は、それから細胞がそれから最後の時洗われた２０〜３０分の間加えられて、１つのμｇ／ｍＬプロピジウム・ヨウ化物または１．５パーセントのパラホルムアルデヒドを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しているＦＡＣＳｃａｎの上で試料を走らせることによって評価された。細胞のフォワード（国際販売会社）と側方散乱（ＳＳＣ）は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とＳＳＣ探知器に追い迫る。細胞が約１−５単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２とＦＬ３）のための探知器はＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の二次抗体が続く精製されたアイソタイプ制御抗体で染色される走行細胞によって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外（使われるとき）のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約１０，０００の有効な細胞は、分析のために後天性だった、そして、起こられた示された表２で。表２はアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に発表される：５未満（）；５〜５０の（＋）；５０〜１００（＋＋）；１００の（＋＋＋）より上に、そして、括弧において、細胞のパーセンテージは、染色された。  
【００６６】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の代表的なヒストグラムは、図９のために編集された。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、胸部（ＭＢ−４６８）、大腸（ＬＯＶＯ）と前立腺（ＤＵ−１４５）癌細胞系のうちの１つに、類似の結合を胸部（ＭＢ−２３１  ＭＣＦ−７）、大腸（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６とＳＷ５２０）、肺、卵巣、膵臓で前立腺（ＰＣ−３）起源と差動結合の癌線に表示した。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器の結合が非癌細胞にもあった、しかしながら、その結合は細胞毒性を発生しなかった。これは、結合がその同族の抗原の抗体結合の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結合の前後関係がちょうど抗体結合よりむしろｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙで決定的なことを示唆した。
【００６７】
【表２】
2007530458.tif 000004
【００６８】
実施例４  
通常の人体組織染色  
ＩＨＣ検査は、以前、ヒト（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６）で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原分布を特徴づけるために実行された。２つの抗体に対する現在の学業比較された７ＢＤ−３３−１１Ａは、１５からＣＤ６３（ＲＦ  ＡＣ４とＨ５Ｃ６）に対して、以前に生化学方法で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＣＤ６３であると指令した。２４の正常な人体組織に対する抗体の結合は、人間の正常な器官組織配列（傾斜マイク、Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ、ＮＹ）を使用して実行された。ＡＵ第一抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ；ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｈａｎｔｓ、英国）とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３（ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）；そして、２０が制御する（ダコ、トロント、ＯＮ）マウスＩｇＧｉ否定）５つのμｇ／ｍｌ（前の最適化ステップの最適集中であることを分かる）の集中に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、ＯＮ）で希釈した。負の制御抗体は、製造業者によって全ての哺乳類の組織に負であることが示された。ＩＨＣのための処置は、以下の通りである。断面が１時間の間５８℃で乾燥器で乾燥してｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄされて、コプリンのそれぞれ４分の間５回をキシレンに浸漬することによってｄｅｗａｘｅｄした２５のＴｉｓｓｕｅは、揺れる。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％−７５％）を通しての処置の後で、断面は水の中で再水和された。スライドはそれからそれぞれ５分の間高くて、中間で、低い３０の推力設定で電子レンジで調理されるｐＨ  ６（ダコ、トロント、オンタリオ）で１０ｍＭのクエン酸のバッファに没頭していて、最終的に冷たいＰＢＳに浸漬された。スライドはそれから６分の間３％の過酸化水素水に浸漬された。そして、それぞれ５分の間３回、ＰＢＳで洗われて、乾燥して、室温で５分のＵｎｉｖｅｒｓａｌ遮断解決（ダコ、トロント、オンタリオ）で暖められた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、単クローン系マウス抗ＣＤ６３（Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｈａｎｔｓ、英国またはダコ、トロント、オンタリオ）またはアイソタイプ制御抗体‖（黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼ（存在しもしなく哺乳類の組織で誘導性でもない酵素）の方へ指示した；ダコ、トロント、オンタリオ）その働く集中（各々の抗体のための５つのμｇ／ｍＬ）に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、オンタリオ）の希釈されて、そして、室温の１時間の間、終夜孵化した。スライドをＰＢＳそれぞれ５分の間の３回で洗浄した。室温で３０分に供給される（ダコＥｎｖｉｓｉｏｎシステム、トロント、オンタリオ）につれて、主要な抗体の免疫反応性はＨＲＰ抱合型二次抗体で発見されていて／視覚化した。これがスライドに段をつけることになることをＰＢＳそれぞれ５分と室温で１０分の間免疫ペルオキシダーゼ染色のＤＡＢ（３，３’−ジアミノ・ベンジジンｔｅｔｒａｈｙｄｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ、ダコ、トロント、オンタリオ）色原体基質解決を加えることによって開発される呈色反応のための３回で洗浄した。スライドを水道水で洗うことは、色素反応を終了した。マイヤーのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（シグマＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ���、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）による対比染色の後で、滑り面は段階的なエタノール（７５−１００％）でｄｅｈｙｒｄａｔｅｄされて、キシレンで掃除された。マウンティング・メディア（ダコＦａｒａｍｏｕｎｔ、トロント、オンタリオ）を使用して、スライドはｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄされた。スライドはＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（ツァイス・カナダ、トロント、ＯＮ）を使用して顕微鏡的に調べられた、そして、ディジタル画像はノーザンブロットのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ミシソーガ、ＯＮ）を使用することを得て、保存した。結果は読み込まれて、勝ち取られて、病理学者によって解釈された。  
【００６９】
表３は、７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４の結果と正常な人体組織の試験配列のＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３染色の概要を示す。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による組織の染色は、以前に記載され（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６）てそれと類似している。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がさまざまな細胞型に制限された結合を見せたが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を持った点に再び注意されなければならない。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は、割に各々に類似の染色パターンを見せた。しかしながら、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されてそれとは全く異なった。具体的には、抗体が正常組織のより幅広い範囲に結合したＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性でもあってマクロファージを浸透させることだけに縛られていもしなかった組織で強度にしみをつけている高等を持った、リンパ球、そして、線維芽細胞、そして、しかし、また、大多数の上皮組織がある（図１１）。
【００７０】
７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性だった組織は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体（時々より少ない強度で）が陽性でもあった。７ＢＤ−３３−１１Ａが陰性だった組織は、通常、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６が陰性でなかった。これらの結果は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体によって認められる組織のより小さいサブセットと結合することを証明した、そして、組織の範囲内で、染色の強度は時々より少なくもあった。これらの成績は、７ＢＤ−３３−１１Ａのための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体が特にヒトの限定された数の組織と結合したことを示した。一方より異なるエピトープにこれらのＩＨＣ検査のために使用されるＲＰＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体によって認められるが、それも７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３のエピトープに向けられたという生化学証拠を支援した。  
【００７１】
【表３】
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【００７２】
実施例５
ヒト胸部腫瘍組織染色
前のＩＨＣ検査は、ヒト乳癌で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の癌共同を決定するために行われた、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体がヒト癌（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６）を認識するかどうかを調べた。現在では、比較はＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３とｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２抗体を使用して行われた。乳癌組織配列は５０人の乳癌患者に由来した、そして、乳癌患者で非腫瘍性の胸部組織に由来する１０の試料が使われた（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、ＣＡ）。以下の情報は、各々の患者に対して用意されていた：年齢（Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）腫瘍の病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｐｒｏｊｅｓｔｅｒｏｎｅレセプター（ＰＲ）状態に関する性的、アメリカのＪｏｉｎｔ委員会）。実施例４からのＩＨＣのための処置は、続かれた。ＡＵ抗体が、１．５のμｇ／ｍＬの集中が使われた抗Ｈｅｒ２抗体を除いて、５つのμｇ／ｍＬの働く集中で使われた。  
【００７３】
表４、５と６と７は、乳癌組織配列の７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体染色の概要を提供する。全体として、試験される５０人の患者の３６パーセントは、それぞれＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体のために８５と９４パーセントと比較して、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が陽性だった。７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体が同じ組織を染色した症例において、試料の９７パーセントは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（図１２）に、割にＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３で高等強度染色を受けた。１０の中の７ＢＤ−３３−１１Ａ  ０のために、そして、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６のために、それぞれ、乳癌患者からの８つの（２つの試料は、代表的でなかった）正常な胸部組織試料からの抗ＣＤ６３抗原７は、陽性だった。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現間のわずかな相互関係と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度があった；いずれの受容体発現にもよる組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現をした。腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器のために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示した。同様の結果がＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常にわずかな相互関係を示した、しかし、見た目の相互関係が腫瘍の病期でなかった。しかしながら、全３つの抗体のために、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。  
【００７４】
【表４】
2007530458.tif 000006
【００７５】
【表５】
2007530458.tif 000007
【００７６】
【表６】
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【００７７】
７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器染色は、間質細胞が明らかに負だった、そして、悪性細胞のシートが陽性だった正常細胞に、割に癌細胞に特有だった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で見られる細胞局在パターンは、細胞膜と細胞質に限定された。類似の膜状で細胞質の染色結果は、乳房腫瘍組織標本の上で抗ＣＤ６３抗体、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６で得られた。その上、これらの抗体の両方とも、通常の胸部組織試料前文７ＢＤ−３３−１ｌＡｗａｓ否定に関して、この染色限局化パターンを示した。  
【００７８】
ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が陽性だった１８の乳房腫瘍組織標本からの９が乳癌患者（８を表に記入しなさい、図１３）のこれまでに会ったことのない目標とされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２表現が陰性だった完全に異なる染色側面を示した。染色の強度の違いが、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった；７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が非常に陽性だった若干の乳房腫瘍組織切片は、７ＢＤ−３３−１１Ａが乳癌患者の異なる一団を治療的に目標とすることを再び示しているＨｅｒ２とその逆が少し陽性であるだけだった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに通常の胸部組織断片のうちの１つを染色した。  
【００７９】
これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａのための抗原が乳癌患者の約３分の２によって表される可能性がある、そして、それらの半分がＨｅｒ２抗原が完全に陰性だったことを示唆した。染色パターンは患者試料で、抗体が悪性細胞に非常に特有であることを示した、そして、７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原はそれによってそれを魅力的なｄｒｕｇａｂｌｅな目標としている細胞膜の上で存在した。類似的である‖より多くが７ＢＤ−３３−１１Ａの染色を制限して非常に対、ＫＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体は、再び７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器エピトープの可能性を示すＣＤ６３．のより拘束性のエピトープである  
【００８０】
【表７】
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【００８１】
【表８】
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【００８２】
実施例６  
ヒト前立腺の組織染色  
ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が乳癌に加えて他のヒト癌組織の上で表されたかどうか決定する、複数のヒト腫瘍組織配列は、７ＢＤ−３３−１１Ａで探索された（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，００６；Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ、ＣＡ）。それらの研究を進める際に、染色パターンｏｆ７ＢＤ−３３−ｌアイソレーション増幅器は、人間の前立腺腫瘍組織配列（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、ＣＡ）の上で決定された。処置が使用した染色は、実施例４で概説されるものと同様だった。ＡＵ抗体が、５つのμｇ／ｍＬの働く集中で使われた。  
【００８３】
表９で概説されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは８８パーセントのヒト前立腺癌を染色した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に通常の組織切片を高輝度でけがしたにもかかわらず、膜状の染色の高等程度が割に正常な試料に腫瘍組織試料にあった。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原のために染色されなかった１つの胎児性横紋筋肉腫組織標本が、あった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在間の直接的な相互関係でなく見えた。しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。再び７ＢＤ−３３−１１Ａで、前立腺腫瘍組織試料の上で観察される膜状で細胞質の染色が、あった。しかしながら、膜状の染色の程度の増加が、乳房腫瘍組織標本（図１４）で見られてそれと関連してあった。通常の前立腺の組織標本のために、膜状の染色の程度のこの増加は、観察されなかった。
【００８４】
【表９】
2007530458.tif 000011
【００８５】
従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が単に前立腺癌の膜の上でも乳癌の膜で以外見つかるだけではなく見えた。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａには胸部の他に腫瘍タイプで治療薬として可能性があることを示した。  
【００８６】
図中証拠の優越性は、ＣＤ６３の７ＢＤ−３３−１１Ａが異型の上で出席している高次構造上のエピトープの結合を通して抗癌効果の媒介となることをである。実施例２で、抗体が同族の抗原を２３１セルＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降させるのに用いられることができることを７ＢＤ−３３−１１Ａに明らかにされた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体が特にそれに対して結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ（細胞ＥＬＩＳＡ  ｏｒＩＨＣ）に限られていない技術を利用した。  
【００８７】
このように、免疫沈降された７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がそのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害することができることを示されることができた。更なる（７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体で）他のａｎｔｉ−、ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原は分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織にそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。
【００８８】
実施例７
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−２３１予防的用量反応の腫瘍実験  
図１５と１６に示されるデータに関して、６〜８週間目、雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで５００万のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞で入れられた。マウスは、１０の４つの投与群に、ランダムに分けられた。その翌日に、着床０．２、２．０または２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａまたは２０ｍｇ／ｋｇの免疫グロブリンＧアイソタイプ制御抗体は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、腹腔内に投与された。同じ様式の７週の期間の間の１週当たり、抗体はそれから投与された。腫瘍成長はカリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。  
【００８９】
処置（日５５）終了後、０．２ｍｇ／ｋｇの投与群は、アイソタイプ対照群の１５パーセントであった腫瘍成長を持った。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器投与群の腫瘍成長の８５パーセントの減少は、対のｔ検定（ｐ＜０．０００１）で測定されるにつれて、割にアイソタイプ制御に対する有意差であると決定された。２．０と２０ｍｇ／ｋｇの投与群の両方とも、まだ処置（日５５）の終りまでに腫瘍を呈していなかった。この傾向は、治療期間を越えてよく続いた。全ての用量で、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体による処置は、また、アイソタイプ制御処置群に割に生存の増加に導いた。制御処置群のマウスの全ては、日１０４（５４日後療法）までに死亡した。対照的に、０．２ｍｇ／ｋｇの群のマウスは日１９７（１４７日後療法）まで生存した、２．０ｍｇ／ｋｇの投与群のマウスの５０パーセントは日２９０（２４０日後療法）で生存している窓しきいであった、そして、２０ｍｇ／ｋｇの群の１００パーセントはまた、日２９０でまだ生存してもいた。従って、アイソタイプに対する比較の７ＢＤ−３３−１１Ａ処置、全く３つの用量、かなり還元型全身腫瘍組織量と増加した生存は、抗体を制御する。最高の服用の処置は、腫瘍成長（１００パーセント）と生存（全てのマウスは、まだ生存している）で最も大きい増加で最も大きな減少を示した。従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、人を含む他の哺乳類で治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を提案している有力な抗腫瘍性の抗体である。
【００９０】
実施例８  
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−２３１確立した化学療法複合腫瘍実験  
図１７と１８に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで５００万のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが４１日ポスト着床で１００のｍｍ３（範囲４８−１２２  ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法剤シスプラチン、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｎｉＭ  ＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１０または９ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内に投与された。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器またはバッファ制御は、それから日６４  ｐｏｓｔ−着床まで同じ様式で全体で１０の用量のために１週につき３回投与された。シスプラチンは、治療期間の日１、３と９に投与された。腫瘍成長は移植後の日１２５までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定された、または、個々の動物がＣＣＡＣに着くまで、ｅｎｄ−は指す。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。対のｔ検定を使用して、処置と関連する後処理全身腫瘍組織量減少（図１６）が、いずれの７ＢＤ−３３−１１Ａも、シスプラチンまたは２つの組合せであった。日６９（５日後処理）で、両方の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチンと抗体−複合製剤は、バッファ制御処置と比較して平均の腫瘍容積を減少させた；７６（ｐ＜０．００１）、７９（ｐ＜０．００１）と８６パーセント（ｐ＜０．００１）それぞれ。体重が、幸福の代用物として使われた。シスプラチンと７ＢＤ−３３−１１Ａが類似の腫瘍抑制を示したにもかかわらず、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体で処置にシスプラチン  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎ比較で見られる重量減少の同じ程度がなかった。バッファ制御と７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群間のほとんど差が、時点常時監視の上になかった。実際に、バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で処置される群は、治療期間の後、わずかな重量増加を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、特に最終的な服用の明白な投与後であった重量減少を経験した。移植後の（シスプラチンの最終的な服用の後の４日）日５５に、シスプラチン処置群は、体重の２４−３０パーセントの損失を示した。従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンは、ヒト乳癌疾患のよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。しかしながら、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療をうけている動物はシスプラチン投与群より良好な幸福を経験した。これらの結果は薬理学で示唆する、医薬とクオリティオブライフは人を含む他の哺乳類でこの抗体ｆｏｒｔｈｅｒａｐｙの利益を得る。
【００９１】
実施例９  
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−４６８確立した化学療法複合腫瘍実験  
図１９と２０に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで２００万のＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが２７日ポスト着床で１００のｍｍ３（範囲１１−１１９  ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法剤シスプラチン、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｎｉＭ  ＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１０または６ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内に投与された。７ＢＤ−３３−１１でＡまたはバッファ制御は、それから、移植後の日５０まで同じ様式で全体で１１の用量のために１週につき３回が続く第１の週の間、１週につき４回投与された。シスプラチンは、治療期間の日１、６、１１と１６に投与された。腫瘍成長は移植後の日６６までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。
【００９２】
対のｔ検定を使用して、処置と関連する後処理全身腫瘍組織量減少（図１８）が、７ＢＤ−３３−１１Ａかシスプラチンまたは２つの組合せであった。日５５（５日後処理）で、両方の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチンと抗体−複合製剤は、バッファ制御処置と比較して平均の腫瘍容積を減少させた；３７（ｐ＝０．３９５８）、９５（ｐ＝０．０２４）と９７パーセント（ｐ＝０．０１７）それぞれ。体重が、幸福の代用物として使われた。より大きな範囲に、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンが腫瘍抑制を示したにもかかわらず、シスプラチンとの比較処置で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体処置で見られる重量減少の同じ程度がなかった。バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置群間のほとんど差が、時点常時監視の上になかった。実際に、バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で処置される群は、治療期間の間に若干のわずかな重量増加を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、シスプラチンの最終的な服用が投与されたあと、特に明白だった重量減少を経験した。移植後の（シスプラチンの最終的な服用の後の４日）日４８に、シスプラチン処置群は、体重の２０パーセントの損失を示した。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンは、ヒト乳癌疾患のもう一つのよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。しかしながら、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療をうけている動物はシスプラチン投与群よりあるより良好なｗｅｌｌ−を経験した。全部で、７ＢＤ−３３−１１Ａがヒト癌のマルチプル・モデルで重要な利点（改善された生存、割に処置を制御する減少した全身腫瘍組織量と割に化学療法に対するより良好な耐容性）を発生したこれらの結果は、暗示する薬理学の、製薬の、そして、良質な人を含む他の哺乳類の治療のためのこの抗体の生命利点。
【００９３】
図中証拠の優越性は、ＣＤ６３の細胞外ループ２で出席しているエピトープの７ＢＤ−３３−１１Ａが結合を通して抗癌効果の媒介となることをである。実施例２で、抗体が同族の抗原を２３１セルＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降させるのに用いられることができることを７ＢＤ−３３−１１Ａに明らかにされた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体が特にそれに対して結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣに限られていない技術を利用した。  
【００９４】
このように、免疫沈降された７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害することができることを示されることができた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体と同様に、他の抗ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原は分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織にそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。この仕様で言及されるＡＵ特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。  
【００９５】
発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する‖そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。  
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−まる２３１細胞可溶化物（レーン１）または膜（レーン２と３）のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）またはアイソタイプ対照（パネルＢ）と深く探った。分子量マーカーは、左で示される。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−ＨＡで深く探った。レーン１：還元性の状況の下で動く膜。レーン２：膜は、非還元の状況の下で動作する。分子量マーカーは、左で示される。
【図３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合の脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜は、ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｔ  Ｆで処置を受けた（ＰＮＡＧアーゼ；レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼとシアリダーゼ（レーン４）の組合せ、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ（レーン５）の組合せまたはバッファ制御（レーン６）。分子量マーカーは、左で示される。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、そして、膜タンパク質が７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１のウエスタンブロット（パネルＢ）。レーンＡアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質（レーンＢ）：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質とレーンＴＭを免疫沈降した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質となりなさい。角箱は、ウエスタンブロットでＳＤＳ−ＰＡＧＥとレーンＴＭでレーンＢから同じ帯域を概説する。分子量マーカーは、左で示される。
【図５】サーチ・サマリー・テーブル。
【図６】ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブル。
【図７ａ】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローン作成、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
【図７ｂ】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル  Ｂ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
【図８】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル  Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル  Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＥ）と深く探った。レーン１−５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈殿タンパク質とレインズ６−１０がＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質を含むことを含む。レーン１と６：ＮａＣｌでない、レインズ２と７：１５０ｎｉＭ  ＮａＣｌ、レインズ３と８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レインズ４と９：２０００ｍＭのＮａＣｌとレインズ５と１０：ＲＩＰＡバッファ。
【図９】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル  Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル  Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅタンパク質染色液（パネルＥ）で深く探った。レーン１：非によって誘発されたベクター（レーン２）単独：非によって誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌ（レーン３）：非−は、一般システムズ理論−ＥＣ２（レーン４）を誘発した：誘発されたベクター（レーン５）単独：誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌとレーン６：誘発された一般システムズ理論−ＥＣ２。分子量マーカーは、左で示される。
【図１０】７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照と抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
【図１１】正常な人体組織配列から大腸の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦ  ＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は、粘膜固有層でマクロファージとリンパ球のためにポジティブ染色法を示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６も、粘膜のｅｐｉｔｈｅｌｉｅｕｍのために強い染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１２】ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体に割に腫瘍細胞のためにより弱いポジティブ染色法を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１３】ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、ａｎｔｉ−に割に腫瘍細胞のためにネガティブ染色を示したＨｅｒ２抗体を染色している強い良い面を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１４】ヒトの前立腺癌組織配列から前立腺アデニカルシノーマ  （Ａ）または通常の前立腺（Ｂ）の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞のために強い陽性の膜状の染色を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、通常の前立腺の組織切片で腺上皮の膜状で細胞質の染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１５】、７ＢＤ−３３−１１Ａの効果または用量反応の予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関するアイソタイプ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１６】７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による腫瘍を含んだマウス後処理または用量反応の予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植検査のアイソタイプ制御抗体の残存。
【図１７】確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１８】確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【図１９】確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図２０】確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＋  シスプラチンまたはバッファ制御の効果。 
【図１】
2007530458.tif 000012
【図２】
2007530458.tif 000013
【図３】
2007530458.tif 000014
【図４】
2007530458.tif 000015
【図５】
2007530458.tif 000016
【図６】
2007530458.tif 000017
【図７ａ】
2007530458.tif 000018
【図７ｂ】
2007530458.tif 000019
【図８】
2007530458.tif 000020
【図９】
2007530458.tif 000021
【図１０】
2007530458.tif 000022
【図１１】
2007530458.tif 000023
【図１２】
2007530458.tif 000024
【図１３】
2007530458.tif 000025
【図１４】
2007530458.tif 000026
【図１５】
2007530458.tif 000027
【図１６】
2007530458.tif 000028
【図１７】
2007530458.tif 000029
【図１８】
2007530458.tif 000030
【図１９】
2007530458.tif 000031
【図２０】
2007530458.tif 000032
【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年8月13日(2007.8.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産方法に従って生産された抗癌抗体または該抗癌抗体のフラグメントを前記患者に投与することを含み、前記抗体または該抗体のフラグメントが癌組織の細胞に対して細胞障害性であり、また本質的に非癌細胞である性質を持つものであり、ここで、
前記抗体または該抗体のフラグメントは薬学的に許容されるアジュバントと混合された状態にあり、前記癌疾患の処置をメディエートするのに有効な量で投与され、
前記抗体が、前記癌組織によって発現される抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗体は、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特徴を持つ抗体が結合することで特徴とする癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項２】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントがヒト化またはキメラ化されている方法。
【請求項３】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、毒素、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択される構成員と結合させることで、抗体複合体を形成すること、
前記抗体複合体またはその結合フラグメントを、前記患者に投与すること、を含み、
前記抗体複合体または結合フラグメントが、薬学的に許容されるアジュバントと混合された状態にあり、前記癌疾患の処置をメディエートするのに有効な量で投与される方法。
【請求項４】
請求項３の方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントがヒト化またはキメラ化されている、方法。
【請求項５】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が抗体依存型細胞毒性によってメディエートされる方法。
【請求項６】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が補体依存型細胞毒性によってメディエートされる方法。
【請求項７】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が細胞化学結合の加水分解を触媒することによってメディエートされる方法。
【請求項８】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が腫瘍細胞に存在する推定癌抗原に対する免疫応答を生産することによってメディエートされる方法。
【請求項９】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が細胞膜タンパク質の機能を妨げるために該細胞膜タンパク質を標的にすることによってメディエートされる方法。
【請求項１０】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が細胞殺害を開始させるシグナルを生産するのに有効な細胞タンパク質の立体構造変化を生じさせることによってメディエートされる方法。
【請求項１１】
請求項１にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記生産方法が、特定の個体から得た癌細胞および非癌細胞を含む組織試料を利用する方法。
【請求項１２】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産方法にもとづいて生産され、癌組織の細胞に対して細胞障害性であり、非癌細胞に対しては本質的に良性である抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することを含み、
前記抗体がＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、また薬学的に許容されるアジュバントと混合された状態にあり、さらに前記癌疾患の処置をメディエートするのに有効な量で投与される、癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項１３】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントがヒト化またはキメラ化されている方法。
【請求項１４】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントを、毒素、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択される構成員と結合させることで、抗体複合体を形成すること、
前記抗体複合体またはそのフラグメントを、前記患者に投与すること、を含み、
前記結合抗体が、薬学的に許容されるアジュバントと混合された状態にあり、前記癌疾患の処置をメディエートするのに有効な量で投与される方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントが、前記サブセットから選択され、ヒト化またはキメラ化されている方法。
【請求項１６】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が抗体依存型細胞毒性によってメディエートされる方法。
【請求項１７】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が補体依存型細胞毒性によってメディエートされる方法。
【請求項１８】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が細胞化学結合の加水分解を触媒することによってメディエートされる方法。
【請求項１９】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が腫瘍細胞に存在する推定癌抗原に対する免疫応答を生産することによってメディエートされる方法。
【請求項２０】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が細胞膜タンパク質の機能を妨げるために該細胞膜タンパク質を標的にすることによってメディエートされる方法。
【請求項２１】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記抗体または該抗体のフラグメントの細胞障害性が細胞殺害を開始させるシグナルを生産するのに有効な細胞タンパク質の立体構造変化を生じさせることによってメディエートされる、方法。
【請求項２２】
請求項１２にもとづく癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、
前記生産方法が、特定の個体から得た癌細胞および非癌細胞を含む組織試料を利用する方法。
【請求項２３】
細胞表面上のＣＤ６３抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞障害性をメディエートするプロセスであって、
前記腫瘍細胞を単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントと接触させることを含み、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記発現ＣＤ６３抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特徴を持つ抗体によって結合されていること特徴とすることで、前記結合の結果として細胞障害性が生ずるプロセス。
【請求項２４】
請求項２３に記載のプロセスであって、
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化されているプロセス。
【請求項２５】
請求項２３に記載のプロセスであって、
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが、細胞障害性成分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択される構成員と結合し、それによって抗体複合体が形成されるプロセス。
【請求項２６】
請求項２３に記載のプロセスであって、
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化されているプロセス。
【請求項２７】
請求項２３に記載のプロセスであって、
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスである、プロセス。
【請求項２８】
請求項２３に記載のプロセスであって、
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得るプロセス。
【請求項２９】
ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現する細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
細胞試料を提供すること、
単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを提供することであり、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記発現ＣＤ６３抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特徴を持つ抗体によって結合されることを特徴とすること、
前記単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させること、
前記単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を決定することを含み、
それによって、前記単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントに特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現する細胞の存在が決定される結合アッセイ。
【請求項３０】
請求項２９の結合アッセイであって、
前記細胞試料を、大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得るプロセス。
【請求項３１】
単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントに対して特異的に結合し、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特徴を持つ抗体によって結合されることを特徴とするＣＤ６３抗原性部位を発現する試料内の細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、
細胞試料を提供すること、
単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを提供することであり、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記発現ＣＤ６３抗原性部位に結合する前記単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特徴を持つ抗体によって結合されることを特徴とする、前記単離されたモノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを提供すること、
前記単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させること、
前記単離されたモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を決定すること、を含み、
ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現する前記細胞が前記結合によって単離され、前記試料中での該細胞の存在が確認されるプロセス。
【請求項３２】
請求項３１に記載のプロセスであって、
前記細胞試料が、大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られるプロセス。
【請求項３３】
寄託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特徴を持つモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現する哺乳動物のヒト腫瘍を処置することで、延命させる、および／または疾患進行を遅らせる方法であって、
前記哺乳動物の全身腫瘍組織量を低下させるために有効な量で前記哺乳動物に前記モノクローナル抗体を投与することで、疾患進行を遅らせ、および／または生存を延ばすことを含む方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記抗体が細胞障害性部位と結合する方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記細胞障害性部位が放射性同位元素である方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法であって、前記抗体が補体を活性化する方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、前記抗体部位が抗体依存型細胞障害性をメディエートする方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、前記抗体がマウス抗体である方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法であって、前記抗体がヒト化抗体である方法。
【請求項４０】
請求項３３に記載の方法であって、前記抗体がキメラ化抗体である方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】    明細書
【発明の名称】  癌疾患修飾抗体
【技術分野】
【０００１】  
この発明は、癌疾患の診断および処置に関し、特に腫瘍細胞の細胞障害性の調節（メディエーション）、特に細胞障害性応答を開始させるための手段として、癌疾患修飾抗体（CDMAB）を、必要に応じて1種類以上の化学療法剤とともに、使用することに関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを用いる結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】  
ＣＤ６３は、テトラスパニン・ファミリーのＩＩＩ型膜タンパク質であり、その構成員のうち２０種類が４種類の膜貫通領域の存在によって特徴づけられている。いくつかのグループが、活性化血小板、顆粒球、およびメラノーマ細胞の全細胞調製試料に対して作製される抗体を使用して、それぞれ別個にＣＤ６３を同定した。それらの同族の糖タンパク質抗原の各ｃＤＮＡのクローン化は、異なる抗原が全く同一の分子であるという認識に到った。白血球分類に関する第６国際ワークショップ（１９９６）では、それに続いて、これらの抗体をＣＤ６３抗体に分類した。１９９６年度のワークショップに先立って、ＣＤ６３は複数の名称（メラノーマ１抗原、眼メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、ライソソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィシン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡｌ）によって知られており、これらはしばしば、その部分的特徴付けおよび同定をもたらす抗体に関連があった。このように、ＣＤ６３は抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ  ＭＥ４９１）、神経腺抗原（ＭＡｂｓ  ＬＳ５９、ＬＳ６２、ＬＳ７６、ＬＳＩ１３、ＬＳ１４０、およびＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂｓ  Ｈ５Ｃ６、Ｈ４Ｆ８とＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ  １２Ｆｌ２）、骨幹細胞特異的な標識（ＭＡｂ  ＨＯＰ−２６）、ならびにインテグリン関連タンパク質（ＭＡｂ  ６Ｈｌ）とも呼ばれていた。ヒトＣＤ６３と交叉反応することがわかった他の抗体は、８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１による交叉反応性）、ＮＫＩ／Ｃ−３、およびＮＫＩ／ｂｌａｃｋ−１３であった(Vannegoor and Rumke, 1986; Demetrick
et al., 1992; Wang et al., 1992)。
【０００３】  
ＣＤ６３は、最初に、ヒト・メラノーマ細胞調製の際に作製された多数の抗体のうちの１つであるＭＡｂ  ＭＥ４９１を用いてメラノーマｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。ＭＡｂ  ＭＥ４９１の反応性は、ヒト・メラノーマ生検の研究ではＭメラノーマ進行と逆相関しているように見えることが示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は正常なメラニン細胞では低く、メラノーマ進行（ディスプラスティックニーバスおよび水平増殖期（ＲＧＰ）腫瘍）の初期ではよりいっそう高くなり、さらに、より進行したメラノーマ腫瘍（例えば、垂直生長層（ＶＧＰ）にある腫瘍）および転移性腫瘍では減少または消失することもあった。
【０００４】  
活性依存型の血小板膜５３ｋＤａ糖タンパク質であるＭＡｂ  ２．２８（活性化血小板に対して作製）を使用して、ヒト血小板でもＣＤ６３が発見され、部分的に特徴づけられた。この分子は、刺激されていない血小板で体内の顆粒の膜とも関連した。また、同じ研究において、ＭＡｂ  ２．２８は巨核球および血管内皮細胞の内部顆粒を標識し、そこで酵素カテプシンＤ（リソソーム区画の既知マーカー）に対する抗体とともに局在化する。抗体クラスター形成および発現クローニングによる追跡調査によって、この抗体が認識する抗原をＣＤ６３と同定することができ、またリソソーム区画でのその存在がさらに確認され、そこで区画特異的なマーカーＬＡＭＰ−ＩおよびＬＡＭＰ−２で共存した。この分子のクローニングは、ＣＤ６３としてそれを同定し、テトラスパニン・ファミリーにそれが含まれることを認めた。
【０００５】  
ＣＤ６３の発現は、多くの異なる組織および細胞型で検出された。細胞レベルでは、それが形質膜と結合し、また細胞内後期エンドソーム小胞構造にも結合することがわかった。特定のケースでは、細胞活性化は、細胞内に蓄えられたＣＤ６３を動員することによる表面発現の増加をもたらした。ＣＤ６３は、また、Ｂリンパ球、特にエンドソーム、表面に対してＭＨＣクラスＩＩ複合体を送ることに関与するエクソーム、および分泌されたベシクル内のＭＨＣクラスＩＩと共存し、および物理的に関連することもわかった。ＣＤ６３と、テトラスパニン・ファミリーの他の構成員、例えばＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１１（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，Ｘ）、ＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３またはインテグリン鎖α３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６またはインテグリン鎖α６）、およびＣＤ２９（インテグリン鎖β１）とが、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、好中球、乳癌、ならびにメラノーマ細胞を含む種々の細胞型内で、相互作用することがわかった。
【０００６】  
癌におけるＣＤ６３の役割は不明である。最初に、いくつかの異なるグループによって、ＣＤ６３が多様なイベント（例えば血小板および顆粒球活性化、ＭＨＣクラスＩＩ組織に依存する抗原提示、インテグリンに依存する細胞接着および運動性、ならびに癌の特定の種類での腫瘍発達）に関与しているということが発見されたにもかかわらず、その機能はまだ完全に説明されていない。現在の証拠が種々の細胞の生理的イベントでのその役割をサポートしている場合であっても、これらの機能が互いに独立している場合またはＣＤ６３が含まれる根底的な一般的細胞機序がある場合は、不明である。
【０００７】  
いくつかのグループは、CD63と腫瘍の特定の種類の進行、特にメラノーマとの関連を調べた。他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体のいくつかが、Ｍａｂ ＭＥ４９１に加えて、種々の病期分類にある腫瘍を持つ患者から得た癌試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を目的として、発現された。観察されたことは、染色の減少（おそらくＣＤ６３の発現を反映していると著者によって解釈される）が高度な進行に関連していたことであり、また腫瘍の転移特性と相関した。より最近の研究は、CD63を含むテトラスパミン・タンパク質ファミリーのいくつかの構成員の発現レベルの明らかな減少（ｍＲＮＡの定量化後）といくつかの乳癌誘導細胞株の生体外侵襲性とのあいだの有意な相関についても述べていた。別の研究では、エストロゲン欠乏状態にさらされた培養乳癌細胞で、ディファレンシャルディスプレイによってＣＤ６３が同定された。このことは、ＣＤ６３発現がステロイド・ホルモンによって調整されたものであり、改変ＣＤ６３多量性および／または機能もまた乳房腫瘍進行と関連しているかもしれないことを示している。
【０００８】  
対照的に、抗体ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂＦＣ−５．０１による研究は、その反応性エピトープが異なる正常組織で可変的に発現されることを明らかにした。この抗体がＣＤ６３を認識するとわかったにもかかわらず、それは初期の増悪期メラノーマと、転移性メラノーマ（ＭＡｂ  ＭＥ４９１とは異なる）を含むよりいっそう進行した増悪期メラノーマとを、区別しなかったことから、ＣＤ６３抗原がこれらのより進行した腫瘍に存在するが、そのエピトープのいくつかは異なる段階の腫瘍由来の細胞でマスキングされる可能性があった。これは、ＣＤ６３コア・ポリペチドの改変翻訳後修飾に起因した可能性があり、あるいは他の分子とＣＤ６３との相互作用に起因する可能性もあり、それは、抗体認識と結合のために特異的なエピトープの有効性に影響を及ぼす場合がある。これらの結果は、抗−ＣＤ６３  ＭＡｂ  ＮＫＩ−Ｃ３で染色することは、進行の異なる段階のメラノーマ由来の組織切片（例えば一次水平増殖期、垂直生長層）と転移性メラノーマとを区別しなかったというＳｉおよびＨｅｒｓｅｙ（１９９３）によって開示された観察を支持した。他の研究（Adachi et al., 1998; Huang et al.,
1998）では、定量的ＰＣＲによる乳癌由来のｍＲＮＡおよび非小細胞性肺癌由来のｍＲＮＡの分析によって、２つのトランスパニン・ファミリー構成員（ＣＤ９およびＣＤ８２）に関して、それらの発現レベルおよび腫瘍進行と患者横とのあいだに有意な相関があったが、ＣＤ６３では全ての試料でその発現が類似していたという点で、そのような相関はみられなかった。これらの明らかに矛盾する結果として、ＣＤ６３と癌との関連を明確に示す強力かつ一貫したデータが欠如している。
【０００９】  
今までのところ、ＣＤ６３とこの分子の結果として生ずる腫瘍抑制機能との関連を確立する試みは、ほとんどない。本研究の１つでは、ヒトＣＤ６３を過剰発現させるＨ−ラス−形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（胸腺欠損マウスに対して皮下および腹膜内注射）は、腫瘍サイズおよび転移可能性の減少によって、同様に生存時間の増加によって示されるように、親の非ＣＤ６３過剰発現細胞の挙動と比較した場合に、悪性／腫瘍形成性の表現型が減少することを明らかにした。このことは、形質転換細胞内のヒトＣＤ６３の存在は、それらの悪性挙動を抑制する可能性が高いことを示唆した。最近では、ＣＤ６３に対する耐性を誘導するために開発されたヒトＣＤ６３を発現する遺伝子導入マウス・モデルによる研究は、注射されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）の腫瘍増殖が、マウス・メラノーマ細胞株を共同形質移入阻害することができ、ワクシニアウィルス融合ヒトＣＤ６３による免疫に応じて、生存率が上昇することを示した。著者によって示唆されたことは、治療効果はＴリンパ球に依存しており、また内因性抗ＣＤ６３抗体はこの防護効果に関係しているように見えず、その理由として、腫瘍成長阻害が、ＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ同時形質転換細胞を動物に注射し、ＣＤ６３のみの形質転換細胞株を注射しない場合のみに、腫瘍増殖阻害が生ずることである。この解釈は、野生型動物（精製されたヒトＣＤ６３で前免疫化されて、抗ヒトＣＤ６３抗体を発現したことが示される）において、防護効果が腫瘍細胞の発達に対してなかったという事実によって支持された。ＫＭ３細胞株（当初はヒト起源であると考えられたが、後になってヒトＣＤ６３によって形質転換したラット系統であると特徴付けられた）を用いたＲａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）により記載された研究は、親の非トランスフェクトＫＭ３細胞を用いて観察されるものと比較して、種々のトランスフェクション細胞の生体外成長速度と非形質移入細胞株の生体外成長速度とのあいだに有意差が存在しなかったけれども、胸腺欠損マウスに比内注射した場合、このタンパク質の発現が該細胞の増殖および転移可能性を減少させることを示唆した。これらの知見は、ＣＤ６３の潜在的効果と、腫瘍細胞の生体内および生体外成長速度に影響を及ぼすことが知られている他の癌抑制遺伝子の潜在的効果とを区別した。さらにまた、抗体ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１（生体外アッセイ（Ｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）でそれらのランダムな運動性を減少させることによって同一細胞上に機能効果を有することがわかった）を追加しても生体外成長速度は影響されなかった。
【００１０】  
この研究はまた、ＣＤ６３が細胞間マトリックス（ＥＣＭ）誘導化学誘引物質（例えばラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、およびビトロネクチン）に反応して移動を促進する可能性があり、この作用は、β１型インテグリンの機能的な関係によって媒介される可能性があるが、インテグリンに対する抗体は、これらの作用を妨げることができないという観察も開示した。しかし、ビトロネクチン媒介シグナル伝達（インテグリンαｖβ５のための既知のリガンド）の役割とＣＤ６３トランスフェクション細胞の上でフィブロネクチン、ラミニンとコラーゲンのような他のＥＣＭ構成要素によって媒介されるシグナル伝達の役割との間の拮抗作用であるように見えた。このことは、特異的条件下で、ＥＣＭ構成要素の存在下、ＣＤ６３の発現によって移動の減少に到る可能性があり、このことは、癒着と運動性との微妙な釣り合いに依存している可能性があることを示唆している。もう一つの研究では、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（７１０Ｆ  ＭＡｂ）は、ＰＭＡを処置されたＨＬ−６０細胞の付着および伝播を高める一方で、もう一つの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ  ２．２８）は、類似の効果を促進したが、その効果は細胞集団がかなり小さい分画のみであり、またより多くの量を加えた場合のみである。これらの成績は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が発現されたにもかかわらず、それらの機能効果が全く異なることを示した。
【００１１】  
テトラスパニンは、細胞増殖に関係している可能性もある。オレン等（Oren et al.）（１９９０）は、リンパ腫細胞株上で、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−Ｉ）を認識するマウスＭＡｂ５Ａ６が抗増殖効果を示すことを述べた。もう一つの研究において、ヒトＴのＣＤ３７のライゲーション−抗体によるリンパ球は、ＣＤ３７によって誘発された増殖を妨げた。最近では、ＣＤ３７（ＣＤ３７ノックアウト）の発現に欠けている動物モデルによる研究は、この動物由来のＴリンパ球が、コンカナバリンＡ活性化とＣＤ３／Ｔ細胞受容体嵌入とに反応して、野生型動物のそれと比較して、増殖性が高かいことを明らかにした。したがって、細胞増殖および増殖での機能的な役割がテトラスパニン・ファミリーの共通機能であるかもしれないと提案された。肝芽腫と肝細胞癌細胞による最近の研究は、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体によるこれらの細胞の嵌入がＥｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を導くことを明らかにした。このシグナル伝達経路は、細胞増殖および増殖現象に関係していることが示された。平行しておこなわれた研究では、ヒトＣＤ８１を過剰発現させている形質移入された細胞株が、偽形質移入対照細胞と比較して、さらなる増殖を示した。したがって、細胞成長増殖および細胞接着／運動性に関連する現象において、利用できる証拠は、一般のテトラスパニンの役割、特にＣＤ６３の役割を示していた。これら２つのタイプの細胞現象が現在のところ、鋭意研究の対象であり、なぜなら両者とも腫瘍進行および転移で中心的な役割を演ずる。
【００１２】  
これまで、抗ＣＤ６３抗体、または特にＣＤ６３−発現している細胞を標的とした他の試薬が報告されておらず、また腫瘍細胞の生体外および生体内増殖特性に対して、ならびに腫瘍細胞増殖の動物モデルの生残時間に対して同時に影響を及ぼすことも示されていない。
【００１３】  
アミノ酸配列決定および分析は、テトラスパニンと他タンパク質ファミリーとの間に、または任意の事前に特徴づけられた機能モジュールを用いても、相同性を明らかにしなかったし、それは任意の以前から知られている酵素活性を示唆しなかった。その結果、シグナル伝達経路のモジュレーションでタンパク質のこのファミリーの役割を調べることは、非常に難しかった。しかしながら、テトラスパニン特異的な試薬（細胞生理学的変化をもたらし、シグナル伝達経路のモジュレーションに親密に依存する）を使用して生成される証拠は、テトラスパニンが信号伝達性質を持つことを示唆する。ＣＤ６３は、物理的かつ機能的に、それ自身二次伝達物質信号の生成に関係するいずれの酵素、または物理的および／または機能的にそのような酵素と関連する数多くの分子と結合することが示された。
【００１４】  
血管内皮細胞（炎症反応の最初のステップ）でヒト好中球の相互作用を制御している機構を分析する実験は、そのいくつかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３、およびＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理が培養内皮細胞層に対するそれらの付着を促進することを明らかにした。さらに、この作用は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）（多くの細胞内シグナル伝達経路の周知のモジュレーター）の存在に、強く依存しており、またそれは細胞が刺激的抗体にさらされた特異的な期間に制限された。抗体へより長く暴露した後、血管内皮細胞に対する好中球の付着はＣａ２＋を後で追加することに対して非感受性となったことから、動力学的および時間的に調整された（一過性の）現象を含意している。加えて、ＣＤ６３が複雑なＣＤＩｌ／ＣＤ１８タンパク質で物理的に相互作用するとわかり、特にこの複合体を標的とした試薬は、調節性信号を媒介した。この研究では、ＣＤ６３が、酵素チロシンキナーゼＬｃｋおよびＨｃｋを含んだ複合体（またはその一部）と物理的に結合することもわかった。これらの酵素は、タンパク質の一つのクラスをなす構成員であり、特異的な表面受容体の活性化に応じて細胞内調節シグナルを媒介することで中心的な役割を演じ、結果として細胞特異的な生理的変化になるシグナル伝達経路のカスケードの一部である。もう一つの研究は、モノクローナル抗体によるテトラスパニン（ＣＤ６３を含む）の同時ライゲーションは、コラーゲン基質にＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の付着によって誘導された酵素焦点性付着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化または活性を高めることができることを示唆した。これは、インテグリンによって媒介されるチロシンキナーゼ・シグナル伝達経路のモジュレーションで、ＣＤ６３（および他のテトラスパニン・ファミリー構成員）の直接介入を示した。７１０Ｆ抗体ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂによって表面ＣＤ６３の存在およびライゲーションによって機能的に交わる可能性がある他のシグナル伝達経路は、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）によるリン酸化のモジュレーションに依存しているもの（細胞内シグナル伝達経路のもう一つの周知モジュレーター）と思われる。この文脈において、７１０Ｆ  ＭＡｂによる骨髄細胞系ＨＬ−６０の付着および形態学的変化の強化は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による細胞の前処理に依存したが、ＰＫＣが時間的な関係を有するかは、確証的には示されなかった。しかし、独立した群による後期の研究は、この酵素の分子Ｒｏ３１−８２２０  （特異的阻害剤）がＰＭＡの作用を妨げたことから、ＰＭＡによって誘発されたＨＬ−６０分化が従属するＰＫＣ活性に依存することを証明した。
【００１５】  
シグナル伝達経路とＣＤ６３（および他のテトラスパニン・ファミリー構成員）との関連を支持するさらなる証拠は、チロシン・ホスファターゼ活性によるＣＤ６３（およびＣＤ５３）分子間の物理的結合（直接的、または超分子複合体の一部として）を述べた研究に起因した。この研究において、抗ＣＤ６３抗体で単離される免疫沈降物複合体がチロシン・ホスファターゼ活性と関連することが示されたが、ＣＤ５３（チロシン・ホスファターゼＣＤ４５と結合することが示された）とは異なるが、ＣＤ６３関連するホスファターゼを同定することは可能でなかった。より最近になって、テトラスパニン・ファミリーの構成員が、ＩＩ型ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型ＰＩ  ４−Ｋ）を伴うともわかった（Berditchevski et al., 1997）。この相互作用は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、およびＡ１５／ＴＡＬＬＡに関して同定されるのみであり、またＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２またはＮＡＧ−２により生ずることが認められなかったことから、非常に特異的に思われた。また、各ＰＩ−４キナーゼを含む複合体が一つのテトラスパニン・ファミリー構成員に限られていたことから、テトラスパニン・ファミリー構成員とＰＩ−４Ｋとのあいだの関係は排他的だった。ＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、他のテトラスパニン構成員で形成されるものとは異なり、ほぼ完全に脂質ラフト様領域の細胞内区画で見つかった。このＣＤ６３分画（ＰＩ−４キナーゼで相互作用することが知られている）は、二次伝達物質分子としての機能に加えて（Martin, T., 1998）、ホスホイノシチド生合成経路に関与、または従属する特異的な細胞内現象（Claas, C, et al., 2001）に関与している可能性を示唆しており、該経路は、膜細胞内輸送（エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス）の調節と細胞骨格再編成の調節に関与することが周知である。
【００１６】  
ＣＤ６３がこれまでシグナル伝達経路の調節で直接関連することがわかったすべての酵素の直接および重要な介入は、これらの酵素の活性の下流に調節因子として、またはエフェクター分子として、さらなるシグナル伝達経路のモジュレーションによるＣＤ６３の関与を支持する証拠を提供した。
【００１７】  
腫瘍進行に導く機構の解明は、非常に困難であり、また明らかに矛盾している知見によってしばしば特徴づけられる複雑な試みであり、その結果、それらの知見が首尾良く有効な治療に転換されるのは希である。ＣＤ６３と腫瘍進行および転移との関連ならびにＣ６３とシグナル伝達機構との関連について現在知られていることからみれば、腫瘍細胞では機能が改変される可能性がある。
認識された抗原を発現している細胞に結合し、かつ細胞生理活性および生体内生理活性をそれ自体または他の分子に関連して有する腫瘍細胞に対する細胞障害性作用が腫瘍細胞上にある抗原特異性試薬を、これらの試薬が、正常な細胞集団に対する有意な悪影響を生ずることなく、腫瘍細胞の発達、進行、および転移を阻害するように、開発することは、治療的可能性および／または診断ツールとして極度に有益である。
【００１８】
先行特許
米国特許第０５２９６３４８号は、内在化している癌細胞表面抗原のために特異的なモノクローナル抗体を選択する方法と、細胞代謝に関して抗転写性および／または抗複製作用があるモノクローナル抗体を同定する方法とを教示する。実施例として、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５、ＷＭ９８３メラノーマ細胞およびＳＷ９４８大腸癌細胞を内在化することが示された。また、ＭＥ４９１抗体は、ＳＷ９４８細胞において転写および細胞増殖を減少させることが示された。米国特許出願第２００３０２１１４９８Ａ１号（およびその関連出願：ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、およびＡＵ０１５３１４０Ａ５）は、ＣＤ６３抗原を含む群の中から選択される卵巣腫瘍マーカー遺伝子によってコードされる卵巣腫瘍マーカー・ポリペチドを結合する抗体で卵巣腫瘍の増殖または転移を阻害する方法を開示している。卵巣癌を用いた遺伝子形質発現の連続分析は、候補としてのＣＤ６３の同定をもたらす卵巣腫瘍マーカー遺伝子を同定するためにおこなわれた。特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａ１（およびその関連出願ＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新規のポリペチド・ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を開示している。特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａは、新規のポリペチド・ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を開示している。特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａは、新規のポリペチド・ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を開示している。特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａは、新規のポリペチド・ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を開示している。これらの特許および特許出願は、ＣＤ６３抗原および抗体を同定するが、本発明の単離モノクローナル抗体または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示することには失敗している。
【発明の開示】
【００１９】  
発明の概要
本発明は、癌疾患の治療に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するための方法を対象とする「個々に合わせた患者特異的抗癌抗体（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」と題された米国特許第６，１８０，３５７号を既に与えられている。この文書の目的にとって、用語「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とが互換性をもって使用可能であり、それらはハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）、免疫複合体、および必要に応じて、免疫グロブリン・フラグメントおよび該免疫グロブリン・フラグメントに由来する組換えタンパク質（例えばキメラおよびヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組換え免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）、および融合タンパク質）によって産生される完全な免疫グロブリンのことをいう。当該技術分野で、一部のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能に対する有意の効果を生ずることなくポリペプチド内で変化し得ることがよく認識されている。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核酸またはアミノ酸配列における修飾が一般に許容され得る。これらとして、限定されるものではないが、置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加が挙げられる。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢと標準化学療法的手段（例えば放射性核種）との複合体を形成することは、この発明の範囲内にあり、それによって上述の化学療法剤の使用に焦点が合わせられる。ＣＤＭＡＢと、毒素、細胞毒性成分、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞との複合体を形成することで、抗体複合体が形成される。
【００２０】
この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするようなハイブリドーマ細胞株を単離するための’３５７特許に教示された患者特異的抗癌抗体を利用する。これらの抗体を１つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能になる。この出願の文脈の中で、細胞致死（細胞毒性）または細胞成長阻害（細胞分裂抑制）特性を持つ抗癌抗体を、以下、細胞毒性として言及する。これらの抗体は、癌の病期分類および診断の補助として使用することができ、また腫瘍転移の処置に使用することができる。
個々に合せられた抗癌処置は、患者管理方法に変化をもたらすことが期待される。有望な臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて積み上げられるということである。この試料から、既存の癌疾患修飾抗体のパネルをもとに腫瘍の類型分けができる。患者を従来通りに病気分類できるが、利用可能な抗体はさらに患者を病気分類する際に使用し得る。患者の処置は、既存の抗体を用いて直ちにおこなうことができ、さらに／あるいは腫瘍に特有の抗体のパネルを、本明細書中に概説される方法を使用して得ることもでき、あるいは本明細書中に開示される選別法に関連したファージディスプレイ・ライブラリーを用いることにより得ることもできる。処置したものと同様のエピトープのいくつかを他の腫瘍が持ち得る可能性があることから、生じた抗体の全てを抗癌抗体のライブラリーに加えることができる。この方法にもとづいて生成された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する任意の数の患者の癌疾患を処置する上で有用であると思われる。
【００２１】
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号のプロセスを用いることによって、またＳ．Ｎ．１０／３４８，２３１に開示されているように、患者乳房腫瘍生検により得られた細胞でマウスの免疫化をおこなった後に、マウス・モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａを得た。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、異なる組織に由来する広範囲のヒト細胞株細胞の表面上で発現した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７および前立腺癌細胞株ＰＣ−３は、生体外で７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞障害効果の影響を受けやすかった。
培養中の乳房および前立腺癌細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ細胞障害性の結果は、生体内で（Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１およびＳ．Ｎ．１０／６０３００６で開示されるように）、これらの癌徴候に向けてその抗腫瘍活性によってさらに評価された。臨床前異種移植片腫瘍モデルは、治療的有効性の妥当な予測因子と考えられる。
Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２８４およびＳ．Ｎ．１０／６０３００６に概説かつ記述されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａはヒト乳癌の予防生体内モデルで腫瘍増殖および全身腫瘍組織量を抑えた。モニタリングは、処理後３００日間を超えて続けた。７ＢＤ−３３−１１Ａは腫瘍を決して発現せず、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の８７．５パーセントは移植後９ヵ月以上にわたり、依然として生存していた。逆に言えば、アイソタイプ対照群は７２日目（処理後２３日）で、１００パーセント致死率を呈した。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａは生存を高めて、乳癌モデルで腫瘍増殖（したがって遅延疾患進行）を抑えた。
【００２２】
また、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２８４およびＳ．Ｎ．１０／６０３００６でも概説および記述されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａはヒト乳癌の確立した生体内モデルで有意に腫瘍増殖と減少した全身腫瘍組織量を抑制した。８０日目（処置後２３日目）で、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスは、アイソタイプ対照群と比較して８３パーセント低い腫瘍容積を呈した（ｐ＝０．００１）。抗体有効性の程度として生存を使用して、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群で死亡するリスクが処置後約６０日でアイソタイプ対照群（ｐ＝０．０００６）の約１６パーセントであると推定された。アイソタイプ対照群の１００パーセントは、処置後５０日で死亡した。比較として、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の６０パーセントは、処置後１３０日まで生存していた。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置が延命効果を与えて、制御投与群と比較して全身腫瘍組織量を低下させることを証明した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置による体重の減少と臨床上の苦痛を含む毒性のいかなる痕跡も誘導しなかったので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は安全に見えた。このように、ヒト乳癌の安定したモデルの制御−投与群と比較して、ＢＤ−３３−１１Ａ処置によって腫瘍増殖が遅延し、かつ生存を高めたことから、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は有効だった。
単独または併用して化学療法薬（シスプラチン）処置単独と比較した７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を２つの異なる確立した乳癌異種移植片モデルで測定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）モデルにおいて、６９日目（処置後５日間）に、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝液対照処置された動物（ｐ＜０．００１）と比較して、結果として腫瘍増殖を７６パーセント減少させた。シスプラチン処置単独または７ＢＤ−３３−１１Ａとの組み合わせは、対照（ｐ＜０．００１）と比較して、腫瘍サイズを７９パーセントおよび８６パーセント減少させた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）では、５５日目（処置後５日）シスプラチン処置単独または７ＢＤ−３３−１１Ａと組み合わせて、それぞれ腫瘍増殖の最大減少が９５パーセント（ｐ＝０．０２４）および９７パーセント（ｐ＝０．１７）であった。５５日目にも、緩衝液対照と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置単独は、３７パーセント（ｐ＝０．３９５８）腫瘍増殖減少を示した。ＭＢ−２３１およびＭＢ−４６８モデルにおいて、体重で測定されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置はシスプラチン処置と比較して、動物の満足のいく状態をより多くもたらした。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置がＭＢ−２３１モデルでシスプラチン処置単独と比較して有効性がより高く、両方の乳癌モデルでシスプラチンよりも少ない体重損失等わずかな副作用に対して耐性が良好だった。
【００２３】
種々の用量で７ＢＤ−３３−１１Ａ処置の有効な作用を決定するために、用量反応実験を、予防的乳癌異種移植片モデルで行われた。５５日目（処置後５日間）に、０．２ｍｇ／ｋｇの処置群は、アイソタイプ対照投与群と比較して腫瘍増殖を８５パーセント抑制した。５５日目でも、２ｍｇ／ｋｇ処置群および２０ｍｇ／ｋｇ処置群の両方で腫瘍は依然として発現していなかった。類似の結果は１２５日目（処置後７５日間）過ぎても得られたが、２０ｍｇ／ｋｇの処置群は腫瘍を依然として発現せず、２ｍｇ／ｋｇの処置群はある程度の初期腫瘍増殖を呈した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置も、延命効果を示した。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群が１９７日目（処置後１４７日間）まで生存する間、アイソタイプ対照群のマウスのＡＵは１０４日目（処置後５４日間）で死亡した。さらにより大きな延命効果は、２０および２０ｍｇ／ｋｇ７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群で観察された。２０ｍｇ／ｋｇ処置群の５０パーセントのみが２９０日目（処置後２４０日間）で死亡し、一方２０ｍｇ／ｋｇ処置群では２９０日目でも死亡しなかった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は３通りの用量全てで有意な腫瘍増殖減少および生存率増加を示し、最も高い用量で最も高い有効度がみられた。
乳癌の確立した生体内腫瘍モデルの有益な効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置も、予防的生体内前立腺癌モデル（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を持った。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照抗体よりも、治療期間直後の腫瘍増殖抑制が有意に効果的だった（ｐ＝０．００１）。処置相の終了時に、７ＢＤ−３３−１１Ａを投与されたマウスは、アイソタイプ対照群のわずか３１パーセントに増大した腫瘍が認められた。ＰＣ−３  ＳＣＩＤ異種移植片モデルに関して、体重を疾患進行の代用の指標として使うことができる。５２日目に、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照と比較して体重損失を有意に５４パーセント（ｐ＝０．００２）抑えた。マウスを処置後の生存についてモニターした。処置後１１日目で、アイソタイプおよび緩衝液対照マウスの致死率は１００パーセントに達した。逆に言えば、対照群より３倍長く、７ＢＤ−３３−１１Ａは処置後３８日目で１００パーセント致死率に達した。このように、ヒト前立腺癌の安定したモデルで、アイソタイプ対照投与群と比較した場合、両方とも腫瘍増殖の遅延、体体重損失の抑制、および生存期間の延長をもたらしたことから、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は有効だった。
【００２４】
前立腺癌の予防生体内腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａは、確立した生体内腫瘍モデル（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置を再びアイソタイプ対照と比較した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群が、処置直後において、アイソタイプ対照投与群と比較して有意により少ない平均腫瘍容積を持つことが示された（ｐ＜０．０２４）。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照群と比較して３６パーセント腫瘍抑制をメディエートした。７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それに魅力的な抗癌治療薬になる。
薬剤標的として７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープを確認するために、正常ヒト組織の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現は、あらかじめ測定した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６）。本研究を、市販の抗ＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）と比較して評価した。組織染色からの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが再び種々の細胞型に制限された結合を見せるが、マクロファージ、リンパ球、および繊維芽細胞を浸潤させることに結合を持つことを示した。再び７ＢＤ−３３−１１Ａは、種々の細胞型に対する結合は制限されたものであったが、湿潤マクロファージ、リンパ球、および繊維芽細胞に結合した。ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗体は、各々比較して類似の染色パターンを示した。しかし、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されるものとは、全く異なった。具体的には、正常組織に対して広範囲に結合したＲＰＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗体は通常組織でより高い染色強度を呈し、７ＢＤ−３３−１１Ａも、陽性あり、浸潤マクロファージ、リンパ球、および繊維芽細胞のみならず、大多数の組織上皮にも結合した。
【００２５】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の局在と集団内（例えば乳癌患者の間で）でその有病率を測定することは、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療的使用の評価と有効な臨床試験の評価とに重要である。癌患者から乳房腫瘍で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原発現に対処するために、５０人の個々の乳癌患者者からの腫瘍組織試料を、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６）の発現の有無に関して、あらかじめスクリーニングした。現在の研究は、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６に対する７ＢＤ−３３−１１Ａと抗Ｈｅｒ２抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２）に対するに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの染色を比較した。本研究の結果は、以前の結果と類似しており、乳房腫瘍組織の９４および８５パーセントはそれぞれＨ５Ｃ６およびＲＦＡＣ４エピトープに対して陽性であったが、３６パーセントの腫瘍組織試料が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が陽性染色したことを示した。患者試料中の７ＢＤ−３３−１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限られていたことから、癌細胞に対して特異的に思われた。またＨ５Ｃ６およびＲＦＡＣ４が正常な乳房組織の８つの試料のうちの７つを染色する一方で、７ＢＤ−３３−１１Ａは乳癌患者者由来の正常組織の１０試料のうち染色されたものは０個であった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の乳癌腫瘍発現は、悪性細胞の細胞膜と細胞質に局所化されると思われ、ＣＤ６３が治療のための魅力的な標的となる。７ＢＤ−３３−１１Ａ発現を、乳房腫瘍の開発、処置、および予後において重要な役割を果たすエストロゲンおよびプロゲステロン・ホルモンの受容体の乳癌腫瘍発現に基づいて、さらに評価した。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現と７ＢＤ−３３−１１Ａ発現とのあいだにわずかな相関関係があった。受容体発現を呈する組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１１Ａ発現を呈した。腫瘍を該腫瘍の段階または癌が進んだ度合いに基づいて分析した場合、結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａのためにより高い腫瘍の病期でより大きな陽性発現に向かう傾向に示唆した。類似の結果はＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常に少しの相関を示したが、見かけの相関が腫瘍の病期でなかった。しかし、３つの抗体全てについて、結果は小さいサンプルの大きさによって制限された。ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａは、完全に異なる染色プロフィールを示し、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が陽性だった乳房腫瘍組織試料の半分は、乳癌患者のこれまでに応じられていない目標とされた治療的必要を示しているＨｅｒ２発現が陰性だった。７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＨｅｒ２の両方に対して陽性であった乳房腫瘍組織切片間の染色強度にも違いがあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに正常乳房組織切片のうちの１つを染色した。
【００２６】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原と前立腺癌患者の範囲内のその有病率の局在は、前立腺癌患者に７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の利点を評価して、有効な臨床試験を設計する際に重要である。癌患者由来前立腺腫瘍で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原発現に対処するために、５１人の個々の前立腺癌患者からの腫瘍組織試料を、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現の有無に関してスクリーニングした。本研究の結果は、組織試料の８８パーセントが７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原に対して陽性に染色された。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に正常組織切片を高輝度で染色したにもかかわらず、正常な試料に腫瘍組織試料では膜状染色の程度が比較的に高かった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を染色しなかった１つの胚性横紋筋性括約筋腫組織試料があった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との直接的な相関がないように思えた。しかし、それらの結果は試料サイズが小さいことに限られていた。
７ＢＤ−３３−１１Ａの潜在的治療的利点をさらに拡大するために、種々のヒト癌組織中の抗原の頻度および局在も、あらかじめ決定された（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６）。いくつかの癌型は、乳癌および前立腺癌に加えて、７ＢＤ−３３−１１  Ａ抗原を発現した。陽性ヒト癌型として、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、子宮（４／４）、および腎臓（３／３）が挙げられた。一部の癌は、抗原を発現しなかった。これらには卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）、およびリンパ節（０／２）が含まれる。ヒト乳癌および前立腺癌組織と同様に、７ＢＤ−３３−１１Ａの局在は、膜の上で、そして、これらの腫瘍細胞の細胞質の範囲内で起こった。生体外での癌細胞株に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の結合に加えて、抗原がヒトで発現されるという証拠および種々のタイプの癌で発現されるという証拠が存在する。
【００２７】
本明細書中に概説されるように、付加的な生化学データも７ＢＤ−３３−１１Ａによって認識される抗原がＣＤ６３であることを示す。これは、２つのモノクローナル抗体（ＲＪＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）（ＣＤ６３に対して反応性）が免疫沈降によって７ＢＤ−３３−１１Ａに結合したタンパク質を同定することを示している研究で支えられる。また、さらに細菌発現研究は、ＣＤ６３の細胞外ループ２に結合したその７ＢＤ−３３−１１Ａを解明した。７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープも、高次構造に依存していることによって特徴づけられた。これらのＩＨＣおよび生化学結果は、７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３抗原と結合することを証明する。このように、証拠の優越性は７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３上に存在する固有の立体配置的エピトープのライゲーションを通して抗癌作用をメディエートすることを示す。この発明の目的のために、前記エピトープは、モノクローナル抗体と結合するその能力によって特徴づけられる「ＣＤ６３抗原性部位」と定義され、該エピトープは、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａ、その抗原性結合フラグメント、またはその抗体複合体によってコードされた。
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現し、病理学的に関連した癌標的であることを、示した。さらに、このデータもヒト癌組織に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の結合を示し、また診断、治療の予測、または予後兆候用のアッセイであり得るアッセイに対して、適切に使用され得る。加えて、この抗原の細胞膜局在は大部分の非悪性細胞の抗原の発現の欠如によって細胞の癌状態を示し、この知見は、診断、治療の予測、または予後兆候用のアッセイであり得るアッセイに使用し得る抗原、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質またはその変異体の使用を可能にする。
【００２８】
本発明は、米国特許第６，１８０，３５７号に記載されたプロセスによって開発され、細胞障害性アッセイ、動物モデルでの非確立および確立された腫瘍増殖、癌疾患に罹った動物モデルでの生残時間の延長におけるその効果によって同定された７ＢＤ−３３−１１Ａの開発と使用とについて説明する。この発明は、標的分子ＣＤ６３上に存在するエピトープに対して特異的に結合し、正常細胞でなく悪性腫瘍細胞に対して生体外細胞障害性性質を持ち、ヒト癌の生体内モデルで直接腫瘍増殖の阻害と生存の強化をメディエートするとともに、ヒト癌の生体内モデルで直接腫瘍増殖の阻害と生存の強化をメディエートする試薬の開示を初めて開示しているという点で、癌治療の分野の進歩を表す。このことは、以前に記述された抗ＣＤ６３抗体のいずれと比較しても、それらが類似の特性を示さないことから、一つの利点である。それは、明らかに腫瘍の特定の種類の増殖および成長を伴う現象でのCD63の直接関与を、最初に示していることから、この分野での進歩を提供する。また、ヒト患者における類似の抗癌特性を示す可能性を持つことから、癌治療における進歩を示している。抗原抗体のライブラリーにこの抗体を入れることは、腫瘍の増殖および成長を標的にして阻害することに最も効果的ものを見つけるようにして異なる抗癌抗体の適当な組み合わせを決定することで異なる抗原マーカーを発現する腫瘍の標的化をよりいそう可能にする。
全体で、この発明は治療薬のための標的として、投与された場合に哺乳動物で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を低下させることができ、処置された哺乳動物の生存延長に導くこともできる７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の使用を教示する。この発明もＣＤＭＡＢ（７ＢＤ−３３−１１Ａ）およびその誘導体とその抗原結合フラグメントを使用して、その抗原を標的にして哺乳動物で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を低下させ、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の生残性を延長することを教示する。さらにまた、この発明も癌細胞における７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の検出に使用すること教示しており、該抗原は、診断、治療の予測、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の予後に役立つに違いない。
【００２９】
患者が治療または転移発現の初期過程対して不応性である場合、腫瘍に特異的な抗体を生成するプロセスを再処置のために繰り返すことができる。さらにまた、抗癌抗体をその患者から得られる赤血球と結合させて転移の処置のために再注入することができる。転移癌に有効な処置はほとんどなく、転移は通常、死に至る転帰不良を予告するものである。しかし、転移癌は一般に血管化が十分なされており、赤血球による抗癌抗体の送達は腫瘍部位に抗体を濃縮させる効果を有し得る。転移前でさえ、ほとんどの癌細胞は宿主の血液供給にそれらの生存が依存しており、赤血球と複合体を形成した抗体は同様に原位置で腫瘍に対して効果的である。あるいは、抗体を他の血液原細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、およびナチュラルキラー細胞）と結合させてもよい。
抗体には５つのクラスがあり、各々がその重鎖によって与えられる機能に関連している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を介してもたらされると通常、考えられている。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１補体と結合することによって、ヒト補体を活性化させることができ、それによって腫瘍溶解をもたらし得る補体活性化の古典経路が活性化する。ヒト抗体に関して、最も有効な補体活性化抗体は一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞殺害をもたらすＦｃ受容体を持つ動員細胞毒性細胞に対して有効である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣをもたらす。
【００３０】
抗体媒介癌殺害の別の可能なメカニズムは、細胞膜およびその関連糖タンパク質または糖脂質にある種々の化学結合の加水分解を触媒する作用を有する抗体（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものが考えられる。
より広範に受け入れられている抗体媒介癌細胞殺害には、さらに２つの機序がある。第１は、癌細胞にある推定上の抗原に対して、からだが免疫応答を生ずるように誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、成長受容体を標的とし、該受容体の機能を妨げ、あるいは下方制御することでその機能を効果的に喪失させるために、抗体を使用することである。
制ガン剤の臨床上の有用性は、患者に対する許容可能なリスクのプロファイルのもとで薬がもとらす利益にもとづいている。癌治療では、生存は、通常、最も求められている有益性ではあるが、延命に加えていくつかの他の周知の利益がある。処置が生存に悪影響を与えないこれら他の利益として、症状緩和、有害事象に対する保護、再発または疾患を生じない生存期間の延長、および進行期間の延長が挙げられる。これらの基準は通常、受け入れられ、米食品医薬品局（ＦＤＡ）等の規制機関はこれらの有益性を生ずる薬を承認する（Hirschfeld et al. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 ２０02）。これらの基準に加えて、この種の有益性の前兆となってもよい他の指標があることもよく認められる。一つには、米食品医薬局によって承諾される促進承認プロセスは、患者の利点をおそらく予測する代用物があると認める。年末（２００３）より、このプロセスの過程で承認される１６種類の薬があり、それらのうち４種類は完全承認（すなわち研究が代わりの指標によって予測される直接的な患者の利点を示す追跡調査）に移行した。充実性腫瘍で薬物効果を決定するための１つの重要な指標は、処置に対する反応を測定することによる全身腫瘍組織量の評価である（Therasse et al. Journal of the National Cancer Institute 92(3):２０５-216
２０00）。究極的には、ＲＥＣＩＳＴ基準にもとづく客観的な反応で示されるように、適当な対照群と比較して、全身腫瘍組織量に対して示された効果を持つ薬物は、患者に対して直接的な利益をもたらす傾向がある。全身腫瘍組織量に対する効果を示す薬物は、RECIST基準に従う客観的な反応で示すように、適当な対照群と比べて、最終的に直接的な患者の利点生み出す傾向がある。前臨床設定では、全身腫瘍組織量は通常、評価および記録に対してよりいっそう直接的である。前臨床研究が臨床設定に翻訳されることができるという点で、前臨床モデルで生存延長をもたらす薬物は、最大限予想される臨床上の有用性を持つ。臨床治療に対して陽性な反応を生ずることに類似して、前臨床設定で全身腫瘍組織量を低下させる薬物は疾患に有意の直接的な影響を及ぼすことが可能である。生存の延長が制癌剤処置からの臨床転帰後に最も求められるにもかかわらず、臨床上の有用性を持つ他の有益性があり、疾患進行の遅れ、延命、またはその両方に相関することもある全身腫瘍組織量減少が直接的な有益性に到ることができ、また臨床上の影響もあることは、明らかである（Eckhardt et al. Developmental Therapeutics: Successes and Failures
of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th
Annual Meeting, ２０03, pages ２０9-219）。
【００３１】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞と該ハイブリドーマ細胞株がコードしている対応の単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個人に由来する細胞から、癌細胞について毒性であると同時に、非癌細胞については相対的に非毒性である癌疾患修飾抗体を生産する方法を利用することである。
本発明の別の目的は、ＣＤＭＡＢとその抗原結合フラグメントとを教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＡＤＣＣを介して細胞毒性をもたらすＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、ＣＤＣを介して細胞毒性をもたらすＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞毒性の機能が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼす能力であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
この発明の他の目的および利点は、説明および例示の目的で、この発明の特定の実施形態が述べられる以下の説明から明らかになる。
【００３２】
（図面の簡単な説明）
特許またはファイルは、彩色して作成された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を有するこの特許または特許出願公報の写しを必要な手数料とともに要求に応じて特許庁から提供される。
図１は、７ＢＤ−３３−１１Ａ  （パネル  Ａ）またはアイソタイプ対照  （パネル  Ｂ）によってプロービングしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞ライセート  （レーン１）  または膜のウエスタンブロット（レーン２および３）。分子量マーカーを左側に示す。
図２は、７ＢＤ−３３−１１ＡをプローブとしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロット。レーン１：還元条件下で膜を流す。レーン２：非還元条件下で膜を流す。分子量マーカーを左側に示す。
図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合に対する脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜をグリコペプチダストＦ（ＰＮＧアーゼＦ、レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ−グリカナーゼ、およびシアリダーゼの組み合わせ（レーン４）、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびクルコサミニダーゼの組み合わせ（レーン５）、または緩衝液対照（レーン６）にさらした。分子量マーカーを左側に示す。
図４は、７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （パネルＡ）および  ウエスタンブロット  （パネルＢ）。レーンＡ：アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質、レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ  免疫沈降タンパク質、レーンＴＭ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質。四角は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンＢおよびウエスタンブロットのレーンＴＭの同じバンドを描いている。分子量マーカーを左側に示す。
図５は、高度検索サマリー・テーブルである。
図６は、ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブルである。
図７ａは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン  Ａ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；  レーンＢ：  ７ＢＤ−３３−１１Ａ  免疫沈降タンパク質；  レーンＣ：  抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）  免疫沈降タンパク質，  レーンＤ：  ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照  免疫沈降タンパク質、およびレーンＥ：  ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。
図７ｂは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン  Ａ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；  レーンＢ：  ７ＢＤ−３３−１１Ａ  免疫沈降タンパク質；  レーンＣ：  抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）免疫沈降タンパク質、  レーンＤ：  ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照  免疫沈降タンパク質、およびレーンＥ：  ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。
図８は、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＥ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン１〜５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質を含み、レーン６〜１０はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を含む。レーン１および６はＮａＣｌ無し。レーン２および７は１５０ｍＭＮａＣｌ、レーン３および８は５００ｍＭＮａＣｌ、レーン４および９は２０００ｍＭＮａＣｌ、ならびにレーン５および１０はＲＩＰＡ緩衝液を含む。
図９は、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ），抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６，パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）、およびクーマシーコロイダルブルー・タンパク質染色（パネルＥ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン１：非誘導ベクター単独、レーン２：非誘導ＧＳＴ−ＥＣｌ、レーン３：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ２、レーン４：誘導ベクター単独、レーン５：誘導ＧＳＴ−ＥＣ１、およびレーン６：誘導ＧＳＴ−ＥＣ２。分子量マーカーを左側に示す。
図１０は、７ＥＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照、およびいくつかの癌細胞株および非癌細胞に対して特異的な抗ＥＧＦＲの典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図１１は、正常ヒト組織アレイから得た大腸組織切片上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ・陰性対照（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、およびＨ５Ｃ６は、固有層でマクロファージおよびリンパ球に対する陽性染色を示した。ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６もまた、粘膜上皮で強い染色を示した。倍率は２００×である。
図１２は、ヒト乳癌組織アレイ由来の浸潤性腺管癌の組織切片上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ・陰性対照（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗体のいずれかと比較して、腫瘍に対して弱い陽性染色を示した。倍率は２００×である。
図１３は、ヒト乳癌組織アレイ由来の浸潤性腺管癌の組織切片で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体  （Ｂ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。７ＢＤ−３３−１１Ａは、抗Ｈｅｒ２抗体（陰性染色を示した）と比較して、腫瘍に対して強い陽性染色を示した。倍率は２００×である。
図１４は、ヒト前立腺癌組織アレイ由来の前立腺癌（Ａ）または正常前立腺（Ｂ）の組織切片上で７ＢＤ−３３−１１Ａによって得られた結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞に対して強い陽性膜染色を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、正常な前立腺組織切片で腺上皮の膜および細胞質染色を示した。倍率は２００×である。
図１５は、用量応答予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａまたはアイソタイプ対照の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
図１６は、用量反応予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片研究での７ＢＤ−３３−１１Ａまたはアイソタイプ対照抗体によって処置された後の腫瘍マウスの生残性を表す。
図１７は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
図１８は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果を表す。
図１９は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
図２０は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
実施例１
ウエスタン免疫ブロッティングによる結合タンパク質の同定
抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認識される抗原を同定するために、細胞膜標本をはドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、メンブランに移した。後者は、タンパク質がこの抗体によって検出されるのを視覚化するために、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａをプローブとして用いた。  
１．全細胞ライセートおよび全膜分画調製
１．１全細胞ライセート調製
ＦＡＣＳによる以前の研究は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）に対する抗体７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を示した。その結果、この細胞株から得られる全細胞膜標本と全細胞ライセートとを抗原同定および特徴づけに使用した。ＭＢ−２３１細胞から全細胞ライセートを、以下の通りに調製した。すなわち、ＭＢ−２３１細胞ペレット（１５ｇ）を、２０ｍＭトリス、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭナトリウム・オルト・バナジン酸塩、５ＯｍＭ弗化ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビター・カクテル（(Roche Diagnostics; Manheim,
Germany)を含む２ｍＬの細胞溶解緩衝液中に再懸濁した。ペレットをガラス・ホモジェナイザーでホモゲナイズし、撹拌しながら１時間４℃でインキュベートした。次に試料を４°Ｃで１５分間遠心（２０，０００ｇ）にかけ、界面活性剤不溶性物質を除去した。上清を回収し、等分量に分けて、−８０℃で凍らせた。細胞ライセートのタンパク質濃度をＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ（Pierce; Rockford、IL。）によって測定した。
【００３４】
１．２．全細胞膜分画調製
全細胞膜を、ＭＢ−２３１乳癌細胞の密集培養から調製した。培地を細胞スタックから除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗った。プラットフォーム・シェーカー上で３７℃、２０分間、細胞を解離緩衝液（Gibco-BRL; Grand Island, NY）で分離した。細胞を４℃で回収し、１０分間、９００ｇで遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットを、ＰＢＳに再懸濁することで洗い、９００ｇで４℃、１０分間、再び遠心分離した。次に、必要とされるまでペレットを−８０℃で保存した。膜を調製するために、細胞ペレットを解凍し、細胞１ｇあたり３ｍｌ緩衝液の比率で、完全プロテアーゼインヒビター・カクテル５０ｍｌあたり１錠含むホモジナイゼーション緩衝液中に再懸濁した（Roche; Laval QC）。細胞を溶解するために氷上でポリトロン・ホモジナイザーを使用して細胞懸濁液をホモジナイズした。細胞ホモジネートを、核粒子を摘出するために、４°Ｃ、１０分間、１５，０００ｇで遠心分離した。上清を収集し、管に分けた後、７５，６００ｇで９０分間、４℃で遠心分離した。上清を慎重に取り除き、各膜ペレットを約５ｍＬのホモジナイゼーション緩衝液に再懸濁した。すべての管からの膜ペレットを一緒にし、もう1回以上分けて、７５，６００ｇで９０分間、４℃で遠心分離した。上清を注意深く取り除き、ペレットを計量した。１％トリトンＸ−１００を含む可溶化緩衝液を、膜ペレット１グラムあたり緩衝液３ｍｌの比率で、ペレットに加えた。膜の可溶化をプラットフォーム・シェーカー上で３００ｒｐｍ、１時間、氷上で振とうさせておこなった。膜懸濁液を７５，６００ｇで遠心することで、不溶性物質をペレット化させた。上清は、可溶化された膜タンパク質を含んでおり、それを慎重に管から取り除いてタンパク質濃度を測定し、−８０℃で保存した。
【００３５】
２．  １次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン免疫ブロッティング
全膜分画からのタンパク質およびＭＢ−２３１細胞の全細胞ライセートを、５および１０パーセントのスタッキングおよびセパレーティング・ゲル上で、それぞれ１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＩＤ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。エレクトロブロッティングによって、タンパク質をＰＶＤＦメンブラン（ミリポア；  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上に４°Ｃで移した。完全な移動を、メンブラン上へ予め染色された分子量マーカーの移動を評価することで測定した。移動後、メンブランを、室温（ＲＴ）で１時間、５パーセント（ｗ／ｖ）スキムミルク含有ＴＢＳＴでブロックし、次に２つのレプリケート・ブロットを以下のようにしてプロービングした。すなわち、１つのブロットは抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（５μｇ／ｍｌ、５パーセントスキムミルク含有ＴＢＳＴ中）でプロービングし、レプリケート・ブロットをＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（５μｇ／ｍｌ、５パーセント・キムミルク含有ＴＢＳＴ中）でプロービングした）。ブロットを１０分間、ＴＢＳＴ中で３回洗った後、西洋ワサビＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA）で室温、１時間インキュベートした。ＴＢＳＴによる各々１０分間の３回の洗浄後、製造元の指示にしたがって、ブロットをＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（Vector Laboratories; Burlingame,
CA）で発現させた。ブロットを水で濯ぎ、画像をゲル・ドキュメンテーション・システム（図１および２）で獲得していた（Bio-Rad; Hercules, CA）。ブロットをカメラ焦点、絞り、および画像獲得時間の同一条件下で画像化した。図１では、７ＢＤ−３３−１１Ａは２０〜８０ｋＤａ範囲内のタンパク質に明らかに結合し、その反応性は全細胞ライセートと全膜分画とを含んでいるレーンで検出された。アイソタイプ対照はＭＢ−２３１ライセートまたは膜分画でいっさいのタンパク質と結合せず、７ＢＤ−３３−１１Ａに対する結合が特異的であることを示した。図２は、ウエスタンブロット上で７ＢＤ−３３−１１Ａ結合上の試料還元の効果を示した。試料が非還元条件（レーン２）下で調製される場合、この抗体の反応性のみが検出された。還元剤（例えばＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノール）は、完全に結合が除去され（（レーン１）、天然タンパク質上のそのエピトープに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの認識および結合がＳ‐Ｓ結合の存在に依存することが示された。
【００３６】
ウエスタン免疫ブロッティングによって検出される抗原の分散性質が不均一なグリコシル化によるものであったかどうかを判断するために、全膜分画を、特異的な炭水化物群を除去したいくつかのグリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ）で、処置した。処理後、試料を１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにかけた。酵素のいくつかが取り除かれた場合、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって、抗原の質量の有意な量を占めた一部の炭水化物が認識され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその差を検出することは可能であると考えられる。図３は、ＭＢ−２３１細胞からの全膜分画のグリコシダーゼ処置が結果として認識された抗原の質量の有意な減少をもたらしたことを示す。これは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認識される抗原が少なくとも１つの糖タンパク質から成ることを示した。いくつかの酵素が同時に使用される場合のみに抗原の移動における有意な変動が生じたという事実は、炭化水素部分の少なくともいくつかが複合Ｎ結合炭水化物からなることを示した。グリコシダーゼによる膜の処置が結果として分子量推移になったにもかかわらず、それは結合の強度を減らさなかった。このことは、抗体が主に糖タンパク質の部分をポリペチドに結合することを示唆した。
【００３７】
実施例２
７ＢＤ−３３−１１Ａによる抗原結合の同定
１．ＭＢ−２３１全膜分画からの抗原の免疫沈降
全膜抽出物（５ｍｇの総タンパク）を、適当量の１×細胞溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ  ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．０２％ＮａＮ３、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭ弗化ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビター・カクテル（Roche
Diagnostics、Manheim、Germany））で、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、また最終１×ＲＩＰＡ緩衝液濃度を得るために、適当量の２ｘ  ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ  ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％コール酸ナトリウム、０．２％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、および０．０２％ＮａＮ３）で希釈した。抽出物を、タンパク質Ｇ−セファロース・ビーズ（Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden）で４℃、２時間処理することで、前もってクリアにした。全膜抽出物を取り除き、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）ストックを最終ＢＳＡ濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように加えた。抽出物が事前にクリアになっている一方で、抗体複合化プロテインＧ−セファロース・ビーズ（プロテインＧセファロース３０μｌに化学的に架橋する抗体６０μｇ）を４℃、また２時間にわたってインキュベートすることで、１ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡでブロックした。ブロック後、抗体複合化ビーズを、１×ＲＩＰＡ緩衝液で５分間二回洗った。抗体複合化プロテインＧ−セファロース・ビーズを次にＢＳＡ含有全膜抽出物に添加し、３時間、４℃でエンドオーバーエンド・ローテーター上でインキュベートした。２０，０００ｇで４℃、１０分間にわたり遠心した後、未結合分画を除去して破棄し、各洗浄段階において、１ｍＬＲＩＰＡ緩衝液でビーズを５分間、３回洗った。次に、ビーズを１５ｍｌＰＢＳで１回濯いだ。上記の免疫沈降（ＩＰ）を、７ＢＤ−３３−ｌｌＡ複合体形成プロテインＧセファロースで類似のＩＰと平行して実施し、プロテインＧ−セファローズ・ビードを、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（BD
Biosciences、San Diego、CA）と化学的に架橋した。このステップは、免疫複合体にタンパク質の非特異的結合の評価を可能にするために実行された。完全にＰＢＳを排液させた後に、ビードを非還元試料緩衝液４０μｌで沸騰し、試料をＩＤ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後に一部のゲルのウエスタン免疫ブロッティングをおこない、ゲルの残りの部分をクーマシー・コロイダル・ブルーで染色した。４０μｌのうち、各分画（８μｌ）をウエスタンブロッティングのためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に載せ、残留する分画（３２μｌ）を、クーマシー・コロイダル・ブルーによるタンパク質染色のために別のレーン上に載せた。タンパク質染色に指定されるゲルの部分をクーマシー・コロイダル・ブルー染色で一晩インキュベートした。ウエスタンブロッティングに指定されるゲルの部分は、３２０ｍＡで２時間ＰＶＤＦメンブランから移し、脱イオン水で濯ぎ、５パーセント乳含有ＴＢＳＴで室温、１時間ブロッキングし、続いて７ＢＤ−３３−１１Ａを含む５パーセント乳含有ＴＢＳＴで４°Ｃ、一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで１０分間３回洗い、ＨＲＰ複合Ｆｃ特異的ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（１５０００）を含む５パーセント乳含有ＴＢＳＴで室温、１時間インキュベートした。次に、ブロットを１０分間３回洗い、ＨＲＰ用ＴＭＢ基質の標準的方法によって発現させた。図４に示すように、ウエスタン免疫ブロットおよびクーマシー・コロイダル・ブルー染色されたゲルを整列させ、参照として分子量マーカーを使用した。クーマシー・コロイダル・ブルーで染色された主バンドを、ウエスタンブロット上で７ＢＤ−３３−１１Ａと反応した主バンドと並べた。この切片は、図４上で強調されて示されている（長方形差し込み図）。
【００３８】
２．ペプチド・マッピング、および質量分析による抗原同定
上記の実験から、ウエスタンブロット上で最も強い反応性を持つクーマシー・コロイダル・ブルー染色ゲル上に並んだバンドを切り出し、市販のキット（Pierce、Rockford、IL）を使用してゲル・トリプシン消化にかけた。消化産物の等分量を、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  サイファージェン（Ciphergen）ＰＢＳＩＩｃリーダー（Ciphergen Biosystems Inc., Freemont, CA）上で質量分析分析にかけた。手短に言うと、消化産物の等分量を、Ｈ４チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）上に手動でスポッティングした。乾燥後、ＣＨＣＡマトリックスの等分量（αシアノ４−ヒドロキシシンアミン酸；Ciphergen Biosystems Inc.,
Freemont, CA）をチップ上の同一スポット上に添加し、乾燥させた。次に、試料をＰＢＳＩＩｃリーダー上で分析した。アイソタイプ対照レーンおよびブランクのゲル領域上の平行した領域から同様サイズのバンドを、７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＩＰから得たゲル・プラグ上に並べて処理することで、７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降する抗原の消化によって生成される固有のペプチド・フラグメントの決定を可能にする。多数の固有のペプチド・フラグメントを、ＰＲＯＦＯＵＮＤ（質量スペクトルからの情報を使用してタンパク質配列データベースを検索するための公的にアクセス可能なオンライン・ツール）を使用して検索した。７ＢＤ−３３−１１Ａ  ＩＰ消化由来の試料の固有ペプチドを、次に、ＰＢＳＩＩｃリーダー上であらかじめ分析された同一試料スポットの分析を可能にするインタフェースを備えたＱＳＴＡＲ（Applied Biosystems、Foster
City、CA）上でＭＳ／ＭＳ分析にかけた。ＭＳ／ＭＳデータを、次にＭＡＳＣＯＴ（ＭＳ／ＭＳスペクトルから情報を使用しているタンパク質データベースを検索するための公的にアクセス可能なオンライン・ツール）で分析した。図５は、ＰｒｏＦｏｕｎｄ検索から得られた表についての要約である。推定上の候補として示唆された唯一のタンパク質は、有意な信頼度でＣＤ６３であった。図６は、ＭＡＳＣＯＴ検索から得られた要約表である。高度な確率で同定された唯一のタンパク質はＣＤ６３であり、ペプチドマップ・フィンガープリント法によって事前に仮定された同定を支持した。
【００３９】
３．７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原ＩＤ確証
７ＢＤ−３３−１１Ａのための推定抗原のＩＤの確証を、既知の抗ヒトＣＤ６３モノクローナル抗体（例えばＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）が７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降するタンパク質反応するか、もしくは反応しないかの決定を通して、おこなった。さらなる確証を、ヒトＣＤ６３細胞外領域のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合コンストラクトで形質転換させた誘導細菌と非誘導細菌から得た全ライセートのウエスタン免疫ブロッティングによっても実施した。
ＭＢ−２３１全膜由来の免疫沈降物（モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（ＲＦＡＣ４）（Cymbus Biotechnology LTD、Hants、UK）、Ｈ５Ｃ６（BD Biosciences、San Diego、CA）、で調製したものならびにＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１（BD
Biosciences、San Diego、CA）アイソタイプ対照で調製したもの）を一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した後、ウエスタン免疫ブロッティングにかけた。各免疫複合体試料から得た等量の分画を、複製ゲル上で分析した。ＰＶＤＦメンブラン上でエレクトロブロッティングをおこなった後、反復されたゲルからのブロットをモノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、Ｈ５Ｃ６、ならびにＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１アイソタイプ対照と並行してプロービングした。図７ａでは、試験モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＲＦＡＣ４の各々によって免疫沈降する材料があった交叉ＩＰ実験から得た結果を、ウエスタン免疫ブロッティングによって解析した。図７ｂでは、試験モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＨ５Ｃ６の各々によって免疫沈降する材料があった交叉ＩＰ実験から得た結果を、ウエスタン免疫ブロッティングによって解析した。モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、およびＨ５Ｃ５の各々は、７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降した類似の抗原と交叉反応した。さらに、７ＢＤ−３３−１１は、２０ないし８０ｋＤの範囲内で、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６で免疫沈降した類似の抗原とウエスタンブロット上で交叉反応したが、アイソタイプ対照抗体によって調製した免疫複合体とは交叉反応しなかった。アイソタイプ対照によってプロービングされたブロットは完全にネガティブであった。このデータは、７６Ｄ−３３−１１Ａ抗体によって認識されたエピトープがＣＤ６４抗原内に含まれることを示した。
【００４０】
交叉反応性がすべての抗体によって認められている同じ分子に起因するか、またはそれが同程度の質量で相互作用している分子の存在に起因するかを判断するために、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによる免疫沈降を、緩衝液厳密さを増加させる条件（５０ｍＭトリスｐＨ  ７．４、１％のトリトンＸ−１００、および種々の濃度のＮａＣｌ：０、１５０、５００、および２０００ｍＭ、また上記したように、しかし５００ｍＭを含むＲＩＰＡ緩衝液による免疫沈降も）をおこった。次に、結果として生じる免疫複合体に対して、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６、およびＲＦＡＣ４で、またアイソタイプ対照ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１でウエスタン免疫ブロッティングによるプロービングをおこなった。図８は、ＩＰ条件の厳密さを変えることが免疫複合体の形成に任意の検出可能な影響を及ぼさないことを示すもので、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる分子が抗ＣＤ６３抗体とその逆によっても認識されたことが示される。
７ＢＤ−３３−１１Ａが直接ヒトＣＤ６３抗原に結合したことをさらに確認するために、その反応性を、ヒトＣＤ６３の細胞外領域（ループＥＣｌとＥＣ２）を含んでいる組換え型融合ポリペチドを発現している大腸菌のライセートに対してウエスタン免疫ブロッティングによって評価した。本研究のために、ＣＤ６３の細胞外ループのＧＳＴ−融合コンストラクト（各々ループ１とルーム２―ＥＣｌとＥＣ２）を細菌発現ベクターＰＧＥＸ−４Ｔ−２（Amersham Biosciences、Piscataway、NJ）に対して適当なｃＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることによって生成した。ループをコードしているｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ法増幅（ＰＣＲ）によって得た。この際、テンプレートとして完全長ヒトｃＤＮＡを使用した（ＭＧＣ−８３３９クローン（American Type Culture Collection
Manassas, VA））。ＥＣｌループをコードしているｃＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた。すなわち、５’プライマー  （ＥＣ１＿５’）、５’ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧ３’および３’プライマー（ＥＣ１＿３’）、  ５’ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＧＣ３’。ＥＣ２ループをコードしているｃＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた。すなわち、ＰＣＲ  プライマー：  ５’  プライマー  （ＥＣ２＿５’）、  ５’ＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧ３’および３’プライマー  （ＥＣ２＿３’）、５’ＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣ３’ＰＣＲ反応の条件は、以下の通りである。すなわち、５’プライマー（２５ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、３’プライマー（２５ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、テンプレートＤＮＡ（ｐＯＴＢ−ＣＤ６３、０．７６  ｍｇ／ｍｌ）０．２μｌ、ＰＣＲ  スーパーミックス・ハイ・フィデリティ（SuperMix High Fidelity）  （Invitrogen,
Burlington, ON）４５．８μｌ。ＰＣＲ反応を以下のようにおこなった。すなわち、９４℃、５分間の後、１サイクルあたり９４℃で３０秒間の溶融、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を３０サイクルおこなう。
【００４１】
サブクローニング後、ＰＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター単独ネガティブ対照（ベクターにサブクローニングされたｃＤＮＡフラグメントなし）を含むコンストラクトを大腸菌（ＢＬ−２１株）に形質転換した。各形質転換に由来する一つのアンピシリン耐性コロニーを成長させ、各々の挿入ｃＤＮＡの配列決定をおこなった。ｃＤＮＡ配列が正しかったことを確認したあと、クローンの各々を液体培養で増殖させ、ＧＳＴ−融合コンストラクトの発現を１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）の添加によって誘発した。２時間インキュベーションした後、室温で５分間、細菌培養を２０００ｇで遠心した。上清を廃棄し、細菌ペレットを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で沸騰した。次に、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５および１２パーセント）ポリアクリルアミド・スタッキングおよびセパレーティング・ゲルによってそれぞれ分析し、前述のようにしてウエスタン免疫ブロッティングをおこなった。ブロット膜を７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６、ＲＦＡＣ４で、またはＩｇＧ２ａアイソタイプ対照でプロービングした。図９に例示される結果は、７ＢＤ−３３−１１ＡがヒトＣＤ６３のループ２（アミノ酸１０８−２０２）（７ＢＤ−３３−１１Ａでプロービングされたブロットのレーン６）を特異的に認識し、ループ（アミノ酸３４−５２）は認識しないことを明らかにした。細菌ライセートに対する抗体の特異性は、２種類の十分に特徴付けられた抗ヒトＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）もまた、ＥＣ２融合ポリペプチドを発現する誘導された大腸菌のみ上にある類似の大きさのバンドを認識したという知見によって、さらに確認された。上記の結果すべては、７ＢＤ−３３−１１ＡがヒトＣＤ６３を認識してそれに対して、特にアミノ酸１０８−２０２を包含する細胞外領域に対して直接結合する。
【００４２】
実施例３
Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１に概説されるように、ハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａを、ブダペスト条約にもとづいて、寄託番号ＰＴＡ−４８９０として２００３年１月８日付で、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection, １０801,
University Blvd, Manassas, VA ２０1１０-2２０9）に寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８によれば、寄託者は、公衆の利用可能性にかけられた全ての制限が最終的に特許付与によって取り除かれることを確証する。
抗体産生
７ＢＤ−３３−１１Ａモノクローナル抗体を、ＣＬ−１０００フラスコ（BD Biosciences, Oakville, ON）でハイブリドーマを培養（週２回回収および再播種）することによって生産した。抗体の精製は、プロテインＧセファロース４ファースト・フロー（Protein G Sepharose 4 Fast Flow）（Amersham
Biosciences, Baied’Urfe, QC)を用いた標準的な抗体生成法に従っておこなった。Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１に既に記載したように、7BD-33-11Aを、細胞毒性アッセイにおいて、多くの陽性（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、カッパ、２０μｇ／ｍｌ、eBioscience, San Diego, CA）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、カッパ、１０μｇ／ｍｌ、Inter Medico, Markham, ON）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５μｇ／ｍｌ、Cedarlane, Hornby, ON）、シクロヘキシミド（１００μｍｏｌ、Sigma, Oakville, ON）、ＮａＮ３（０．１％、Sigma, Oakville, ON））と、陰性（１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０μｇ／ｍｌ、BD Biosciences, Oakville, ON）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０μｇ／ｍｌ、BD Biosciences, Oakville, ON）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０μｇ／ｍｌ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０μｇ／ｍｌ）対照と比較した（表２）。乳癌（MDA-MB-231（MB-231）、MDA-MB-468（MB-468）、MCF-7）、大腸癌（HT-29、SWl116、SW6２０）、肺癌（NCI H460）、卵巣癌（OVCAR）、前立腺癌（PC-3）、および非癌（CCD 27sk、Hs888
Lu）細胞株を試験した（全てATCC, Manassas, VAから入手）。肝臓／死細胞障害性アッセイを、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）
(Eugene,OR)から入手した。以下の変更を加えた製造元の指示通りに、本アッセイを実行した。２日後、精製された抗体または対照群を培地に希釈し、次に１００μｌを細胞プレートに移し、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間、５分にわたり、インキュベートした。細胞を、予め定められた適当な密度でアッセイ前に播種した。２日後、精製抗体または対照を培養液で希釈し、１００μｌを細胞プレートに移し、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間にわたりインキュベートした。次に、このプレートを反転させて空にし、拭き取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温ＤＰＢＳをマルチ・チャンネル・スクィーズボトルから各ウエルに分注し、3回たたいて、反転させて空にした後、拭き取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むＤＰＢＳで希釈した蛍光カルセイン染料５０μｌを各ウエルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃、３０分間にわたってインキュベートした。プレートをパーキンエルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００蛍光プレート・リーダーに読み取り、データをマイクロソフト・エクセルで分析し、その結果を表１にまとめた。データは、各回３回反復しておこなった試験４回分の平均値を表すもので、以下のようにして定量的に表した。すなわち、4/4実験が細胞障害の閾値を上回った場合(+++)、3/4実験が細胞障害性を上回った場合（++）、および2/4実験が閾値細胞障害を上回った場合(+)とした。表１中の無印の細胞は矛盾しているもの、または閾値細胞障害性未満の効果を示すものを表している。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体は、選択的に乳癌および前立腺腫瘍細胞株における細胞障害性を示し、その一方で非形質転換正常細胞に対してなんら効果を示さなかった。７ＢＤ−３３−１１Ａは、前立腺癌細胞株上のポジティブ対照抗Ｆａｓ抗体よりも高い殺害効果大きな殺害を示した。化学的細胞毒性剤が該薬剤の予想される細胞毒性を誘導する一方で、比較のために含まれた多くの他の抗体も、予想されたように、生物学的細胞アッセイに限界を与えた。全体として、7BD-33-11A抗体が多くの癌細胞型に対して細胞毒性活性を持つことが示された。すべての癌細胞型が影響を受けやすいというわけではないことから、抗体はその活性について選択的だった。さらにまた、それらが非癌細胞型に対して細胞毒性を生じなかったことから、該抗体は機能的特異性を示し、このことは治療的状況で重要な要素である。
【００４３】
【表１】
2007530458.tif 000033
【００４４】
上記癌細胞株および正常細胞株のパネル、以下の別の癌細胞株（大腸（ＬＯＶＯ）、膵臓（ＥｘＰＣ−３）、卵巣（ＢＳ−２、ＯＣＣ−１）、および前立腺（ＤＵ−１４５）、ならびに以下の別の正常細胞株（ＣＣＤ−１１２）に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を、フロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。ＦＡＣＳのための細胞の調製を、最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋）で洗った。細胞解離緩衝液(INVITROGEN, Burlington, ON）を用いて、３７℃で細胞を細胞培養プレートから取り除いた。遠心および回収後、細胞をＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、２または２５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（４℃）（洗浄培地）で再懸濁し、細胞の計数をおこない、細胞を適当な菌体密度に等分し、遠心して細胞をペレット化し、さらに７ＢＤ−３３−１１Ａまたは対照抗体（アイソタイプ対照または抗ＥＧＦＲ）を２０μｇ／ｍｌ含む染色培地（ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２±２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ）で、氷上３０分間、再懸濁した。アレクサ・フルオール（Alexa Fluor）４８８結合二次抗体の添加に先立って、細胞を洗浄培地で一度洗った。次に、染色培地にアレクサ・フルオール（Alexa Fluor）４８８結合二次抗体を、２０〜３０分間に添加した。次に、細胞を最終時間に洗って、1μg/ｍｌヨウ化プロピジウムまたは１．５％パラホルムアルデヒドを含む染色培地で再懸濁した。細胞のフローサイトメトリーによる獲得の評価は、セルクエスト（CellQuest）ソフトウェア（BD Biosciences）を用いてＦＡＣＳｃａｎ上で試料を流すことでおこなった。細胞の正方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）をＦＳＣおよびＳＳＣ検出器上での電圧および増幅利得を調整することで設定した。３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２、およびＦＬ３）のための検出器の調整を、細胞が約１ないし５単位の蛍光強度の中央値を持つように、アレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８結合二次抗体の後に精製されたアイソタイプ対照抗体で染色した細胞を流すことによって、細胞が約１〜５単位の蛍光強度中央値で同一ピークを有するようにして、おこなった。生細胞の獲得は、ＦＳＣおよびヨウ化プロビジウム排除（使用した場合）のゲーティングをおこなうことで獲得した。各試料について、約１０，０００生細胞を分析用に獲得し、表２に示す結果が得られた。表２は、アイソタイプ対照を上回る平均蛍光強度倍増加をまとめたもので、定量的に、５（−）、５ないし５０（＋）、５０ないし１００（＋＋）、１００超（＋＋＋）と表し、括弧内は染色された細胞の比率を表している。  
【００４５】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の典型的なヒストグラムを図９にまとめた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳房（ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７）、大腸（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６、およびＳＷ５２０）、肺、卵巣、膵臓、および前立腺（ＰＣ−３）由来の細胞株で類似の結合を示し、起源と胸部（ＭＢ−４６８）、大腸（ＬＯＶＯ）、および前立腺（ＤＵ−１４５）癌細胞株のうちの１つに対して異なる結合を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａの結合が非癌細胞にもあったが、その結合は細胞障害性を生ずるものではなかった。このことは、更なる結合がその同族の抗原の抗体ライゲーションの結果を必ずしも予測するというわけではなく、自明ではない知見であることをさらに示した。このことは、異なる細胞における抗体ライゲーションの状況がまさに抗体結合よりは細胞障害性で決定的なことを示唆した。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
実施例４
正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究は、ヒトでの７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原分布を特徴づけるために、既に実施されている（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６）．  現在の研究では、あらかじめ生化学方法で測定されたように７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＣＤ６３であることから、７ＢＤ−３３−１１ＡをＣＤ６３に特異的な２種類の抗体（ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）と比較した。２４種類のヒト正常組織に対する抗体の結合をヒト正常器官組織アレイ（Clinomics, Watervliet, NY）を用いておこなった。全ての一次抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ；  ＲＦＡＣ４（Cymbus Biotechnology Ltd., Hants,
UK）およびＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３（BD PharMingen、Oakville、ON）、ならびにマウスＩｇＧ１ネガティブ対照（Dako, Toronto, ON））を抗体希釈緩衝液（Dako, Toronto, ON）で５μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した（以前の最適化ステップで最適濃度であることがわかった）。ネガティブ対照抗体は、製造元によって、全ての哺乳動物組織に対してネガティブであることが示されている。ＩＨＣの手順は以下の通りである。
組織切片を５８℃、１時間、オーブンで乾燥させて脱パラフィンし、コプリン・ジャーで５回、各々４分間、キシレンに浸すことで脱脂した。一連のエタノール洗浄（１００％〜７５％）を通した処置の後に、切片を水中で再水和させた。スライドを１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）（Dako, Toronto, Ontario）に浸し、電圧設定を高、中、および低、各々５分間に設定した電子レンジにかけ、最後に冷ＰＢＳに浸した。次に、スライドを６分間にわたり３％過酸化水素水に浸漬し、各々５分間、ＰＢＳで３回洗い、乾燥し、ユニバーサル・ブロッキング溶液（Dako, Toronto, Ontario）で室温、５分間にわたりインキュベートした。７ＢＤ−３３−１１Ａ、モノクローナル・マウス抗ＣＤ６３（Cymbus Biotechnology Ltd., Hants, UK or Dako, Toronto, Ontario）またはアイソタイプ対照抗体（黒色麹菌グルコースオキシダーゼに特異的。哺乳動物では存在せず、また誘導も不可、Dako, Toronto, Ontario）を抗体希釈緩衝液（Dako,
Toronto, Ontario）で希釈してその作用濃度（各抗体とも５μｇ／ｍｌ）、室温で１時間、一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回（各回５分間）洗った。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Dako Envision System, Toronto, Ontario）を用いて、室温で３０分間、検出および視覚化した。このステップの後に、スライドをＰＢＳで３回（各回５分間）洗い、ＤＡＢ（3、３'-ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Dako, Toronto, Ontario）クロモゲン基質溶液を添加し、室温で１０分間撹拌することで、呈色反応を発現させた。水道水でスライドを洗うことで、色素反応を終了させた。マイヤーのヘマトキシン（Meyer's Hematoxylin）（Sigma Diagnostics,
Oakville, ON）で対比染色した後、スライドを段階的エタノール（７５％〜１００％）で脱水し、キシレンで透明にした。マウント培地（Dako Faramount, Toronto, Ontario）を用いて、スライドにカバーガラスを載せた。スライドを、Axiovert ２０0を用いて、顕微鏡（Zeiss Canada, Toronto, ON）観察し、ノーザン・エクリプス・イメージング・ソフウェア（Northern Eclipse  Imaging Software）（Mississauga, ON）を使用してデジタル画像を撮影および保存した。結果を読み取り、記録（スコア）し、病理学者による解釈をおこなった。
【００４８】
表３は、正常ヒト組織の試験配列の７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＲＦＡＣ４ならびにＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３染色の結果の概要を示す。組織を７ＢＤ−３３−１１Ａで染色することは、既に述べられているもの（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６）と類似している。７ＢＤ−３３−１１Ａが種々の細胞型に対して制限された結合を示したが、浸潤マクロファージ、リンパ球、および繊維芽細胞に結合した点に再び注意されなければならない。ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗体は、互いに比較して類似の染色パターンを示した。しかし、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６の染色パターンは、７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されるものとは全く異なった。具体的には、正常組織のより幅広い範囲に結合したＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗体は、通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが浸潤マクロファージ、リンパ球、および繊維芽細胞のみならず大多数の組織の上皮に対して、陽性であり、かつ結合した（図１１）。
７ＢＤ−３３−１１Ａに対して陽性だった組織は、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体に対しても陽性（時々、より少ない強度で）でもあった。７ＢＤ−３３−１１Ａに対して陰性だった組織は、通常、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６に対しては陰性ではなかった。これらの結果は、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体によって認識された組織のより小さなサブセットに結合した７ＢＤ−３３−１１Ａもまた、しばしば少なかったことを示した。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａに対する抗原が正常組織上で広範囲には発現しなかったこと、また、ヒ抗体が特異的に結合したヒト組織の数が限られていたことを示した。７ＢＤ−３３−１１ＡはＣＤ６３のエピトープに対して特異的ではあるが、これらのＩＨＣ研究で使用されるＲＰＡＣ４またはＨ５Ｃ６によって認識されるものよりも異なるエピトープに対して特異的であった生化学的証拠も支持するものであった。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
実施例５
ヒト乳房腫瘍組織染色  
以前のＩＨＣ検討は、ヒト乳癌で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の癌関連を決定し、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体がヒト癌を認識する見込みがあるかどうかを決定するためにおこなわれた（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６）。現在では、比較はＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３とｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２抗体とを使用して行われた。乳癌患者における非腫瘍性乳房組織から誘導される５０人の乳癌患者と１０個の試料から誘導される乳癌組織アレイを用いたた（Imgenex Corporation, Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）。以下の情報を各患者について用意した。すなわち、年齢、性、アメリカ癌合同委員会（ＡＪＣＣ）腫瘍の病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の状態。実施例４のＩＨＣについての手法に従った。ＡＵ抗体を、１５μｇ／ｍｌの濃度で使われた抗Ｈｅｒ２抗体を除いて、５μｇ／ｍｌの作用濃度で使用した。
表４、５、６、および７は、７ＢＤ−３３−１１Ａ（乳癌組織アレイのＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体染色）の概要を提供する。全体として、検査が行われた５０人の患者の３６パーセントは、ＲＦＡＣ４および７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原に対しては各々８５および９４％が陽性であったのに対して、それぞれＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体に対して陽性であった。7BD-33-11AおよびＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体が同一組織を染色した場合の試料の97パーセントは、7BD-33-11A（図１2）と比較して、のＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３で染色の強度がよりいっそう高かった。７ＢＤ−３３−１１Ａは１０個のうち０個、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗原は８個のうち８個（２つの試料は表れず）について、乳癌患者由来の正常乳房組織試料がそれぞれ陽性であった。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原発現とのあいだにわずかな相関関係があった。すなわち、いずれかの受容体を持つ組織がわずかに高い７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原発現を示した。腫瘍が該腫瘍の病期または癌進行の程度に基づいて分析される場合、結果は７ＢＤ−３３−１１Ａに対して、より高い腫瘍病期で、より大きな陽性発現に向かう傾向を示唆した。同様の結果がＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もまたエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で、かなりわずかな相関を示したが、見かけの相関が腫瘍の病期でなかった。しかし、３種類の抗体全てについて、結果は試料の大きさが小さいことによって制限されたものになった。
【００５１０００５】
【表４】
2007530458.tif 000036
【００５２】
【表５】
2007530458.tif 000037
【００５３】
【表６】
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【００５４】
７ＢＤ−３３−１１Ａ染色は、正常細胞と比べて癌性細胞に特異的であり、間質細胞は明らかに陰性であり、悪性細胞シートは陽性だった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で見られる細胞局在パターンは、細胞膜および細胞質に限定された。類似の膜および細胞質染色結果が、抗ＣＤ６３抗体（乳房腫瘍組織試料上のＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）で得られた。その上、７ＢＤ−３３−１ｌＡが陰性であったのに対して、これらの抗体は両方とも正常乳房組織試料上でこの染色局在パターンを示した。
ｃ−ｅｒｂＢ−２と比べて、７ＢＤ−３３−１１Ａは、完全に異なる染色プロファイルを示し、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が陽性だった１８個の乳房腫瘍組織試料中９つは、Ｈｅｒ２発現に関して陰性であったことから、乳癌患者（表８、図１３）に対するこれまでに応じられていない目標とされた治療的必要性を示している。７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＨｅｒ２の両方に対して陽性であった乳房腫瘍組織切片間の染色強度における差も存在しており、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原に対してかなり陽性であったいくつかの乳房腫瘍組織切片のみがＨｅｒ２に対して、弱陽性であり、その反対に７Ｂ３３−１１Ａが乳癌患者の異なる同齢集団を治療上の標的とすることを再び示している。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに正常乳房組織切片のうちの１つを染色した。
これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａの抗原が乳癌患者の約３分の２によって発現される可能性があり、またそれらの半分がＨｅｒ２抗原に対して完全に陰性であることを示唆した。染色パターンは、患者試料において、抗体が悪性細胞に対して高度に特異的であり、７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原が細胞膜上に存在することで、それを魅力的な薬物可能標的とする。ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体のいずれかに対して７ＢＤ−３３−１１Ａの染色が、類似はしているがかなり制限された染色であることが、ふたたびＣＤ６３上のよりいっそう制限されたエピトープである７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープの可能性を示している。
【００５５】
【表７−１】
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【００５６】
【表７−２】
2007530458.tif 000040
【００５７】
【表８−１】
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【００５８】
【表８−２】
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【００５９】
実施例６
ヒト前立腺組織染色
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が乳癌に加えて他のヒト癌組織上で発現されたかどうか決定するために、複数のヒト腫瘍組織アレイを、７ＢＤ−３３−１１Ａでプロービングした（Ｓ．Ｎ．１０／６０３００６; Imgenex, San Diego, CA）。それらの検討を進める上で、７ＢＤ−３３−１１Ａの染色パターンを、ヒト前立腺腫瘍組織配列上で決定した（Imgenex Corporation, San Diego, CA）。使用される染色手法を、実施例４に概説したものと同じくした。全抗体を、作用濃度を５μｇ／ｍｌとして使用した。
表９に概説されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは８８パーセントのヒト前立腺癌を染色した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に正常組織切片を高強度で染色したにもかかわらず、正常組織と比べて、腫瘍組織試料での膜染色の度合いがかなり高かった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を染色しなかった胎児性横紋筋肉腫組織試料が１つあった。また、腫瘍病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原との直接的な相関がないようにも思えた。しかしながら、結果は試料サイズが小さいことによって制限された。再び７ＢＤ−３３−１１Ａで、前立腺腫瘍組織試料上で観察される膜および細胞質染色の両方が観察された。しかし、乳房腫瘍組織試料で見れられるものと関連して、膜染色の度合いが増加した（図１４）。正常な前立腺組織試料について、膜染色の程度におけるこの増加は、観察されなかった。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が単に乳癌の膜上で見いだされるのみではなく、前立腺癌の膜上でも見出された。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａには乳房の他の腫瘍型における治療薬として可能性があることを示した。
証拠の優越性は、７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３の変異体上に存在する立体配置的エピトープのライゲーションを通して抗癌効果をメディエートすることを示す。実施例２では、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体は発現細胞（例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）からの同族の抗原を免疫沈降させるのに用いることができることが示されている。さらに、限定されるものではないがＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって例示される技術を利用することで、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体が、該抗体に特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現す細胞および／または組織の検出で使用し得ることを示すことができた。
このように、免疫沈降する７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がそのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを使用して、そのような細胞または組織に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害し得ることを、示すことができた。さらに、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体と同様に、他の抗ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降させて、単離する際に用いることができ、該抗原は、同一タイプのアッセイを用いて抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害するのに用いることもできる。
【００６２】
実施例７
生体内ＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞予防的用量反応腫瘍実験
図１５および１６に示されるデータに関して、６〜８週齢雌の重篤複合免疫不全マウスに対して、５００万ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞含有の１００μｌ食塩水を襟首に皮下注射して移植した。マウスをランダムに各群１０匹からなる４つの処置群に分けた。移植の翌日に、２．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤によってストック濃度を希釈した後、３００μｌの容量で、０．２、２．０、または２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａまたは２０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧアイソタイプ対照抗体を腹膜内投与した。次に、抗体を同じ様式で７週間にわたって週一回投与した。腫瘍増殖を７日毎にカリパスで測定するか、または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで測定した。動物の体重を本研究の期間中記録した。
処置（日５５）終了後、０．２ｍｇ／ｋｇの処置群は、アイソタイプ対照群の１５パーセントであった腫瘍増殖を持った。対応のあるｔ検定（ｐ＜０．０００１）で測定されるように、0.2mg/kgの７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群における腫瘍増殖の8５パーセント減少が、アイソタイプ対照と比べて有意差があると判断された。２０および２０ｍｇ／ｋｇ処置群の両方とも、いぜんとして処置（日５５）の終りまでに腫瘍を発現していなかった。この傾向は、治療期間を越えてよく続いた。すべての用量で、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による処置は、また、アイソタイプ対照投与群と比べて生残性増加を導いた。制御投与群のマウス全てが、１０４日目（処理後５4日）までに死んだ。対照的に、０．２のｍｋ／ｋｇ群のマウスは、１９７日目（処置後１４７日）まで生き残っており、２．０ｍｇ／ｋｇ処置群のマウスの５０％は、２９０日目（処置後２４０日）でも依然として生きており、２０ｍｋ／ｋｇ群の１００パーセントは、２９０日目（処置後２９０日）でも依然として生存していた。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、３つの用量全てで、有意に全身腫瘍組織量を低下させ、アイソタイプ対照抗体と比べて生残性を増加させた。最高用量での処置は、腫瘍増殖（１００パーセント）における最大減少と生残性（すべてのマウスは、なおも生存している）における最大増加とを示した。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａはヒトを含む他の哺乳動物における治療に、この抗体の薬理学および製薬利点があることを示唆している有力な抗腫瘍抗体である。
【００６３】
実施例８
生体内ＭＤＡ−ＭＢ−２３１確立化学療法複合腫瘍実験
図１７および１８に示されるデータに関して、６〜８週齢雌の重篤複合免疫不全マウスに対して、５００万ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞含有の１００μｌ食塩水を襟首に皮下注射して移植した。腫瘍の増殖を毎週、カリパスで測定した。大部分の同齢集団が移植後４１日で１００ｍｍ３（範囲４８〜１２２ｍｍ３）の腫瘍容積に達した時点で、８匹のマウスを４つの処置群の各々に無作為割付けた。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法薬シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンとの組合せ、または緩衝液対照を、１２．７ＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤によってストック濃度を希釈した後、容量３００μｌの１０または９ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンとともに、各々腹腔内投与した。７ＢＤ−３３−１１Ａまたは緩衝液対照を、移植後６４日目まで、同様にして、全体で１０用量まで週２回投与した。シスプラチンを治療期間の第１日目、３日目、および９日目に投与した。腫瘍増殖を移植後１２５日目まで７日毎にカリパスで測定するか、または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで測定した。動物の体重を本研究の期間中記録した。本研究終了後、すべての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。  
対応のあるｔ検定を使用して、処置と関連した後処理全身腫瘍組織量減少（図１６）が、いずれの７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、またはそれら２つの組合せでもあった。６９日目（処理後５日）に、７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、および抗体−複合製剤は、緩衝液対照処置と比較した場合の平均腫瘍容積を減少させ、それぞれ７６％（ｐ＜０．００１）、７９％（ｐ＜０．００１）、および８６％（ｐ＜０．００１）であった。体重が、満足のいく状態の代用物として使われた。シスプラチンと７ＢＤ−３３−１１Ａとが類似の腫瘍抑制を示したにもかかわらず、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による処置と比較してシスプラチン処置では同程度の体重損失がなかった。緩衝液対照と７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群との間の差はモニターされた時点ではほとんどなかった。実際に、緩衝液対照と７ＢＤ−３３−１１Ａとで処置される群は、治療期間の後、軽微な増量を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、最終用量の投与の後、特に顕著な体重損失を経験した。移植後５５日目（シスプラチン最終用量後４日）で、シスプラチン投与群は、体重の損失が２４〜３０パーセントであった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよびシスプラチンは、ヒト乳癌疾患の周知のモデルの緩衝液対照と比べて全身腫瘍組織量を低下させた。しかし、体重で測定されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置された動物はシスプラチン処置群よりも良好な満足のいく状態を経験した。これらの結果は、ヒトを含む他の哺乳動物における治療のための、この抗体の薬理学的、製薬的、および生活の質的な利点を示唆する。
【００６４】
実施例９
生体内ＭＤＡ−ＭＢ−４６８確立化学療法複合腫瘍実験
図１９および２０に示されるデータに関して、６〜８週齢雌の重篤複合免疫不全マウスに対して、５００万ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞含有の１００μｌ食塩水を襟首に皮下注射して移植した。腫瘍の増殖を毎週、カリパスで測定した。大部分の同齢集団が移植後２７日で１００ｍｍ３（範囲１１〜１１９ｍｍ３）の腫瘍容積に達した時点で、８匹のマウスを４つの処置群の各々に無作為割付けた。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法薬シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンとの組合せ、または緩衝液対照を、２．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤によってストック濃度を希釈した後、容量３００μｌの１０または６ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンとともに、各々腹腔内投与した。７ＢＤ−３３−１１Ａまたは緩衝液対照を、移植後５０日目まで、同様にして、全体で１１用量まで週２回投与した。シスプラチンを治療期間の第１日目、６日目、１１日目、および１６日目に投与した。腫瘍増殖を移植後６６日目まで７日毎にカリパスで測定するか、または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで測定した。動物の体重を本研究の期間中記録した。本研究終了後、すべての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。  
対応のあるｔ検定を使用して、処置と関連した後処理全身腫瘍組織量減少（図１８）が、いずれの７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、またはそれら２つの組合せでもあった。５５日目（処理後５日）に、７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、および抗体−複合製剤は、緩衝液対照処置と比較した場合の平均腫瘍容積を減少させ、それぞれ３７％（ｐ＜０．３９５８）、９５％（ｐ＜０．０２４）、および８６％（ｐ＜０．０１７）であった。体重が、満足のいく状態の代用物として使われた。７ＢＤ−３３−１１Ａと、より大きな範囲で、シスプラチンと、が腫瘍抑制を示したにもかかわらず、シスプラチン処置と比較して７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による処置で同程度の体重損失がなかった。緩衝液対照と７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群との間の差はモニターされた時点ではほとんどなかった。実際に、緩衝液対照と７ＢＤ−３３−１１Ａとで処置される群は、治療期間中、ある程度の軽微な増量を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、シスプラチン最終用量の投与の後、特に顕著な体重損失を経験した。移植後４８日目（シスプラチン最終用量後４日）で、シスプラチン投与群は、体重の損失が２０パーセントであった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよびシスプラチンは、ヒト乳癌疾患の周知の別のモデルの緩衝液対照と比べて全身腫瘍組織量を低下させた。しかし、体重で測定されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置された動物はシスプラチン処置群よりも良好な満足のいく状態を経験した。全体として、これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａがヒト癌の複数モデルにおける有意な利点（改善された生残性、制御処置と比べて減少した全身腫瘍組織量、および化学療法と比べてより良好な耐容性）を生じたものであり、ヒトを含む他の哺乳動物における治療のための、この抗体の薬理学的、製薬的、および生活の質的な利点を示唆する。
証拠の優越性は、７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３の変異体上に存在する立体配置的エピトープのライゲーションを通して抗癌効果をメディエートすることを示す。実施例２では、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体は発現細胞（例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）からの同族の抗原を免疫沈降させるのに用いることができることが示されている。さらに、限定されるものではないがＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって例示される技術を利用することで、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体が、該抗体に特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現す細胞および／または組織の検出で使用し得ることを示すことができた。
このように、免疫沈降する７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がそのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを使用して、そのような細胞または組織に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害し得ることを、示すことができた。さらに、7BD-33-11A抗体と同様に、他の抗CD63抗体は他の型のCD63抗原を免疫沈降させて、単離する際に用いることができ、該抗原は、同一タイプのアッセイを用いて抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害するのに用いることもできる。
【００６５】
この明細書中で述べた全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当該技術分野の当業者のレベルを示している。全ての特許および刊行物を、あたかも個々の刊行物が参照によって具体的かつ個々に組み込まれるのと同程度に、本明細書中に援用する。
本発明の特定の形態が例示される一方で、それが本明細書中に記載および表示した部分の具体的な形態または配置を限定するものではないことを理解すべきである。種々の変更は、本発明の範囲から逸脱することなくおこなうことが可能であること、また本発明が明細書に示され、かつ述べられることに限られて考慮されるべきものではないことは、当業者にとって明らかである。本発明が目的を実行するために十分適していること、また記載した目的および利点を得ると同様に、それに本来存在するものも得ることに十分適していることは、当業者に容易に理解される。
本明細書中に述べられる任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペチド、生物学的に関連した化合物、方法、手法、および技術は、好ましい実施形態の現在の代表例であり、あくまでも例示を意図したものであって、範囲を限定することを意図したものではない。当業者が想到するその中での変更および他の用途は、本発明の精神の範囲内に包含されるものであり、また添付した特許請求の範囲によって定まる。本発明が具体的な好ましい実施形態と関連して述べられたにもかかわらず、それは特許請求の範囲にクレームされた本発明がそのような具体的な実施形態に限定されるものではないことを理解すべきである。実際、当業者にとって明らかである本発明を実施するための記載された態様の種々の修飾は、特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】  ７ＢＤ−３３−１１Ａ  （パネル  Ａ）またはアイソタイプ対照  （パネル  Ｂ）によってプロービングしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞ライセート  （レーン１）  または膜のウエスタンブロット（レーン２および３）。分子量マーカーを左側に示す。
【図２】  ７ＢＤ−３３−１１ＡをプローブとしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロット。レーン１：還元条件下で膜を流す。レーン２：非還元条件下で膜を流す。分子量マーカーを左側に示す。
【図３】  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合に対する脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜をグリコペプチダストＦ（ＰＮＧアーゼＦ、レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ−グリカナーゼ、およびシアリダーゼの組み合わせ（レーン４）、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびクルコサミニダーゼの組み合わせ（レーン５）、または緩衝液対照（レーン６）にさらした。分子量マーカーを左側に示す。
【図４】  ７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （パネルＡ）および  ウエスタンブロット  （パネルＢ）。レーンＡ：アイソタイプ対照  免疫沈降タンパク質、レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ  免疫沈降タンパク質、レーンＴＭ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質。四角は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンＢおよびウエスタンブロットのレーンＴＭの同じバンドを描いている。分子量マーカーを左側に示す。
【図５】  高度検索サマリー・テーブルである。
【図６】  ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブルである。
【図７ａ】  ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン  Ａ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；  レーンＢ：  ７ＢＤ−３３−１１Ａ  免疫沈降タンパク質；  レーンＣ：  抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）  免疫沈降タンパク質，  レーンＤ：  ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照  免疫沈降タンパク質、およびレーンＥ：  ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。
【図７ｂ】  ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン  Ａ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；  レーンＢ：  ７ＢＤ−３３−１１Ａ  免疫沈降タンパク質；  レーンＣ：  抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）  免疫沈降タンパク質，  レーンＤ：  ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照  免疫沈降タンパク質、およびレーンＥ：  ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。
【図８】  ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＥ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン１〜５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質を含み、レーン６〜１０はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を含む。レーン１および６はＮａＣｌ無し。レーン２および７は１５０ｍＭＮａＣｌ、レーン３および８は５００ｍＭＮａＣｌ、レーン４および９は２０００ｍＭＮａＣｌ、ならびにレーン５および１０はＲＩＰＡ緩衝液を含む。
【図９】  ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ），抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６，パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）、およびクーマシーコロイダルブルー・タンパク質染色（パネルＥ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン１：非誘導ベクター単独、レーン２：非誘導ＧＳＴ−ＥＣｌ、レーン３：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ２、レーン４：誘導ベクター単独、レーン５：誘導ＧＳＴ−ＥＣ１、およびレーン６：誘導ＧＳＴ−ＥＣ２。分子量マーカーを左側に示す。
【図１０】  ７ＥＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照、およびいくつかの癌細胞株および非癌細胞に対して特異的な抗ＥＧＦＲの典型的なＦＡＣＳヒストグラム。
【図１１】  正常ヒト組織アレイから得た大腸組織切片上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ・陰性対照（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、およびＨ５Ｃ６は、固有層でマクロファージおよびリンパ球に対する陽性染色を示した。ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６もまた、粘膜上皮で強い染色を示した。倍率は２００×である。
【図１２】  ヒト乳癌組織アレイ由来の浸潤性腺管癌の組織切片上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ・陰性対照（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗体のいずれかと比較して、腫瘍に対して弱い陽性染色を示した。倍率は２００×である。
【図１３】  ヒト乳癌組織アレイ由来の浸潤性腺管癌の組織切片で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体  （Ｂ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）は、抗Ｈｅｒ２抗体（陰性染色を示した）と比較して、腫瘍に対して強い陽性染色を示した。倍率は２００×である。
【図１４】  ヒト前立腺癌組織アレイ由来の前立腺癌（Ａ）または正常前立腺（Ｂ）の組織切片上で７ＢＤ−３３−１１Ａによって得られた結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞に対して強い陽性膜染色を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、正常な前立腺組織切片で腺上皮の膜および細胞質染色を示した。倍率は２００×である。
【図１５】  用量応答予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａまたはアイソタイプ対照の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１６】  用量反応予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片研究での７ＢＤ−３３−１１Ａまたはアイソタイプ対照抗体によって処置された後の腫瘍マウスの生残性を表す。
【図１７】  確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１８】  確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果を表す。
【図１９】  確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図２０】  確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果を表す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2007530458.tif 000044
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図４】
2007530458.tif 000045
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７ａ】
2007530458.tif 000046
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７ｂ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７ｂ】
2007530458.tif 000047
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８】
2007530458.tif 000048
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2007530458.tif 000049
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
2007530458.tif 000050
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１５】
2007530458.tif 000051
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１６】
2007530458.tif 000052
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１７】
2007530458.tif 000053
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１８】
2007530458.tif 000054
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１９】
2007530458.tif 000055
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２０】
2007530458.tif 000056
【国際調査報告】
2007530458.tif 000057
2007530458.tif 000058
2007530458.tif 000059