(57)【要約】本発明は、概して、転移性表現型を発現する腫瘍細胞標的に対して親和性を有する抗体ファージ群の作製方法に関する。本発明はさらに、転移細胞上の細胞表面レセプターに特異的に結合する抗体組成物に関する。本発明は、類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体を提供する。転移性表現型を発現する腫瘍細胞は、活性化細胞表面レセプター（例えば、活性化インテグリンレセプターまたはαｖβ３インテグリンレセプター）を発現する細胞株であり得る。
2007523650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する、抗体。
【請求項２】
配列番号２を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）中にＲ−Ｇ−Ｄ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記相補性決定領域がＣＤＲ−Ｈ３である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記転移細胞が、乳房、脳、肺、肝臓、または骨から選択される組織を標的とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体を含有する、薬学的組成物。
【請求項８】
活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合し、非活性化αｖβ３インテグリンレセプターには結合しない、抗体。
【請求項９】
前記活性化αｖβ３インテグリンレセプターが類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合するリガンド模倣物を含む、抗体。
【請求項１１】
類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物の病状を処置するための方法。
【請求項１２】
前記病状が、腫瘍性疾患、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性の乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍性疾患が前記哺乳動物における腫瘍細胞の転移である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記病状が前記哺乳動物における乳癌の転移である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号２または配列番号４を含む抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物の病状を処置するための方法。
【請求項１６】
前記病状が、腫瘍性疾患、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍性疾患が前記哺乳動物における腫瘍細胞の転移である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記病状が前記哺乳動物における乳癌の転移である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
標的組織への転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体を含む、細胞株。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞改変体が、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫に由来する、請求項１９に記載の細胞株。
【請求項２１】
前記標的組織が脳、肝臓、肺または骨から選択される、請求項１９に記載の細胞株。
【請求項２２】
腫瘍細胞標的に対して親和性を有する抗体ファージ群の作製方法であって、以下：
癌患者のコホートから得た血中リンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のファージライブラリーを提供する工程；
非転移性表現型を発現する細胞株にて該ファージライブラリーをサブトラクトする工程；
該非転移性表現型を発現する細胞株とは結合しない第１の抗体ファージ群を選択する工程；
転移性表現型を発現する細胞株にて該第１の抗体ファージ群をパンニングする工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合する第２の抗体ファージ群を選択する工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合し、かつ、前記腫瘍細胞標的に結合する抗体ファージクローンを精製する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記転移性表現型を発現する細胞株が活性化細胞表面レセプターを発現する細胞株である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記転移性表現型を発現する細胞株が、標的組織に対して転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的組織が、脳、肝臓、肺または骨から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法であって、さらに以下：
前記抗体ファージクローンを（ａ）細胞表面上に活性化インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞への結合；および（ｂ）細胞表面上に非活性化インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞への結合の低下について試験する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞標的が転移細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記転移細胞が転移性の乳癌細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２４に記載の方法であって、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋またはＭｎ＋＋から選択される陽イオン存在下で増加する活性化インテグリンレセプターを発現する前記細胞株に対する前記抗体ファージ群の結合効率を測定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
前記抗体ファージ群が単鎖（ｓｃＦｖ）抗体ファージ群である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
癌治療薬を用いた処置による哺乳動物における腫瘍細胞を検出する方法であって、以下：
活性化インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体組成物に検出可能なマーカーを連結させる工程；
該検出可能なマーカー−抗体組成物複合体を哺乳動物または哺乳動物組織へ接触させる工程；
該検出マーカー−抗体組成物複合体と該哺乳動物組織中の該腫瘍細胞との結合を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記腫瘍細胞が転移性腫瘍細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体の血漿中濃度が少なくとも４ヶ月間検出可能レベルを超えて維持されるように該抗細胞表面レセプター抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物における抗原への免疫応答を誘導または増強するための方法。
【請求項３６】
前記細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、その血漿中濃度が少なくとも４ヶ月間検出可能レベルを超えて維持されるように複数回投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、前記哺乳動物における前記抗インテグリンレセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも２μｇ／ｍｌとするような量および間隔で投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、前記哺乳動物における前記抗細胞表面レセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも５μｇ／ｍｌとするような量および間隔で投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、前記哺乳動物における前記抗細胞表面レセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも１０μｇ／ｍｌとするような量および間隔で投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
活性化インテグリンレセプターに対する前記抗体がヒト抗活性化インテグリンレセプター抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
活性化インテグリンレセプターに対する前記抗体がヒト化抗活性化インテグリンレセプター抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
活性化インテグリンレセプターに対する前記抗体がヒト配列抗活性化インテグリンレセプター抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物の転移性癌疾患を処置するための方法であって、該哺乳動物が前記転移性癌疾患を処置されるように、細胞傷害性物質と結合した転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体を該哺乳動物へ投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
前記細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞傷害性物質が細胞傷害性薬物である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞傷害性物質が放射性同位体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物組織サンプルにおける転移性腫瘍細胞表面上の活性化細胞表面レセプターを検出する方法であって、以下：
該哺乳動物組織を固相に固定化された第１のヒト抗体、および溶液中の第２のヒト抗体と接触させる工程であって、前記活性化細胞表面レセプターが該組織サンプル中に存在する場合に、前記第１の抗体および第２の抗体が前記活性化細胞表面レセプターの異なるエピトープに結合する、工程；
該組織サンプル中の該活性化細胞表面レセプターの存在を示唆する結合である、該第１の抗体および該第２の抗体への該活性化細胞表面レセプターの結合を検出する工程であって、該第１のヒト抗体および第２のヒト抗体が、癌患者のコホートから得られた血中のリンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のファージライブラリーにより提供される該第１のヒト抗体および該第２のヒト抗体をコードする核酸をサブクローニングすることにより産生される、工程；
非転移性表現型を発現する細胞株について該ファージライブラリーをサブトラクトする工程；
該非転移性表現型を発現する細胞株とは結合しない第１の抗体ファージ群を選択する工程；
転移性表現型を発現する細胞株において前記第１の抗体ファージ群をパンニングする工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合する第２の抗体ファージ群を選択する工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合し、かつ、腫瘍細胞標的に結合する抗体ファージクローンを精製する工程；
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記活性化細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の抗体が標識され、前記検出工程が前記活性化細胞表面レセプターへの前記第２の抗体の結合を検出する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記組織サンプルは、前記固相に固定化された第１のヒト抗体群および溶液中の第２のヒト抗体群と接触され、該第１の群および該第２の群の構成要素が前記活性化細胞表面レセプターの異なるエピトープに結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２のヒト抗体群が標識されている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々が、前記活性化細胞表面レセプター上のそれらの各エピトープに対し少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々が、前記活性化細胞表面レセプターに対し少なくとも１０１０Ｍ−１の親和性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体が、前記活性化細胞表面レセプターに対し少なくとも１０１１Ｍ−１の親和性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記活性化細胞表面レセプターに対する前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の結合が１時間以内に平衡に達する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体がＥ．ｃｏｌｉにおける組換え構築物の発現により産生される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の抗体および第２の抗体の分子の少なくとも９０％が前記活性化細胞表面レセプターに免疫反応性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を干渉する方法であって、転移の危険性を有することが疑われる患者を、抗体に接触させる工程を包含し、該抗体は、類似で非転移性の細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合し、該抗体がそれに結合した細胞傷害性部分を有する、方法。
【請求項６３】
前記抗体組成物が配列番号２を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体組成物が配列番号４を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞傷害性部分が化学的毒素である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞傷害性部分が生物学的毒素である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞傷害性部分が放射性物質である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記結合が共有結合である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記結合がリガンド相互作用である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記結合が物理学的相互作用である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
前記結合が管内への封じ込めを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７２】
前記管がリポソームまたは他の血液循環血管である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を同定する方法であって、転移の危険性を有することが疑われる患者を、類似で非転移性の細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体と接触させる工程を包含し、該抗体が該抗体に結合した画像化部分を有する、方法。
【請求項７４】
前記画像化部分が、磁気共鳴スペクトロスコピー、×線スペクトロスコピー、または陽電子放射断層法（ＰＥＴ）によって画像化され得る、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合が共有結合である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記関連が非共有結合である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
哺乳動物の転移性癌疾患を処置するための方法であって、転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体を該哺乳動物に投与する工程、および、該転移細胞のプログラム細胞死を誘導する工程を包含する方法であって、このようにして、該哺乳動物が該転移性癌疾患の処置を受ける、方法。
【請求項７８】
前記細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離Ｂｃ−１２ポリヌクレオチド。
【請求項８１】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または、Ｂｃ−１２と生物学的機能を共有するヌクレオチド配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項８２】
請求項８０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８３】
前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、宿主細胞における該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている、請求項８０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８４】
請求項８０に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または該細胞の子孫。
【請求項８５】
配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離Ｂｃ−１５ポリヌクレオチド。
【請求項８６】
配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または、Ｂｃ−１５と生物学的機能を共有するヌクレオチド配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項８７】
請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８８】
前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、宿主細胞における該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている、請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８９】
請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または該細胞の子孫。
【請求項９０】
哺乳動物中での試験化合物の抗転移活性を決定するための方法であって、以下：
標的組織への転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体を該哺乳動物に投与する工程；
該試験化合物を該哺乳動物へ投与する工程；
コントロール哺乳動物中のコントロール化合物の抗転移活性と比較して、該哺乳動物中の該試験化合物の抗転移活性を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９１】
前記哺乳動物の前記標的組織における転移性病巣を測定する工程をさらに包含する請求項９０に記載の方法であって、コントロール化合物に応答するコントロール動物の転移性病巣に対する前記試験化合物に応答する該哺乳動物の転移性病巣の縮小が該試験化合物の抗転移活性を示す、方法。
【請求項９２】
前記腫瘍細胞改変体および前記試験化合物が前記哺乳動物の末梢血循環へ投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記腫瘍細胞改変体および前記試験化合物が前記哺乳動物の乳腺脂肪パッドへと同所的に投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記哺乳動物が、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記哺乳動物がマウスである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記哺乳動物が免疫欠損マウスである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記腫瘍細胞改変体が、ＢＣＭ−１、ＢＣＭ−２またはＢＭＳである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
前記試験化合物が、抗体、単鎖Ｆｖ抗体、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項９０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府からの支援に関する記述）
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号ＮＣＩ‐ＣＡ９５４５８およびＮＩＡＩＤ‐ＡＩ１４７０２７、ならびに、米国陸軍乳癌研究プログラムにより与えられた助成金番号ＤＡＭＤ１７‐９９‐１‐９３６８によって政府からの支援により行われた。政府は本発明に関し一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００４年２月１３日に出願された米国特許出願第６０／５４４，８０７号、および２００４年１１月１０日に出願された米国特許出願第６０／６２６，７２６号の利益を主張し、これらの全開示は参考として本明細書中に援用される。
【０００３】
（分野）
本発明は、概して、転移性表現型を発現する腫瘍細胞標的に対して親和性を有する抗体ファージ群の作製方法に関する。本発明はさらに、転移細胞上の細胞表面レセプターに特異的に結合する抗体組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
乳癌の肺、肝臓、骨および脳への転移は乳癌患者の主要な死因である。それは血流を介した癌細胞の播種を伴い、接着性かつ浸潤性の腫瘍細胞の機能、ならびに標的部位における生存および増殖能力に依存する。非特許文献１。これらの事象は、αサブユニットおよびβサブユニットから構成される膜貫通接着レセプターのファミリーであるインテグリンによって担われている。非特許文献２；非特許文献３。インテグリンは活性化の別個の状態で存在し、これによってリガンドに対する親和性が決まり、可溶性リガンドが結合するか否かが調節され、どのマトリックスタンパク質が認識されるかが調節され、循環中に見出される動的な流れ条件のもとで細胞が付着、移動、捕捉し得る程度が調節される。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６。
【０００５】
乳癌細胞において見出されるが正常の乳房上皮においては見られないインテグリンがαｖβ３である。このレセプターの発現は浸潤および癌の進行と関連する。非特許文献７；非特許文献８。ヒト乳癌細胞は、活性化または非活性化機能状態にあるαｖβ３を発現し得る。活性化αｖβ３は血流中での乳癌細胞の付着を担い、浸潤性の腫瘍細胞の移動を強力に促進する。特に、マウスモデルにおいて、活性化状態のみが乳癌細胞の循環による標的器官への転移増殖を担い、また、乳癌患者の血液から単離された転移細胞は構成的に活性化形態にあるαｖβ３を発現する。非特許文献６；非特許文献９。活性化の異なる状態の間のインテグリン転移は、ヘテロダイマー内の構造の変化と関連する。非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４。
【０００６】
他のインテグリン類と同様に、αｖβ３は活性化および機能的親和性について種々の状態で存在し得る。αｖβ３の活性化状態または高親和性状態は、非活性化状態とは異なる固有の分子構造を有する。非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１５。
【０００７】
非活性化レセプターとは対照的に、活性化ａｖβ３は、主として、可溶性リガンドタンパク質に結合し、血流における腫瘍細胞と血小板との相互作用を助け、それにより仲介される腫瘍細胞が脈管構造中に見出されるような条件下で捕捉し、侵襲性腫瘍細胞および内皮細胞の移動を非常に強力に促進するという能力を通じて、機能的に特徴付けられる。後者の能力はおそらく新脈管形成にとって非常に重要である。活性化αｖβ３インテグリンの可溶性リガンドへの結合能力は、リガンド模倣物（ｌｉｇａｎｄ−ｍｉｍｅｔｉｃ）であるｓｃＦｖ抗体をαｖβ３の活性化構造へと特異的かつ独占的に結合することを可能にする重要な特性である。
【非特許文献１】Ｂｏｇｅｎｒｉｅｄｅｒら、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」、２００３年、第２２巻、ｐ．６５２４−６５３６
【非特許文献２】Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、「Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」、２００３年、第２０巻、ｐ．２０３−２１３
【非特許文献３】Ｈｏｏｄら、「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ」、２００２年、第２巻、ｐ．９１−１００
【非特許文献４】Ｔａｄｏｋｏｒｏら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２００３年、第３０２巻、ｐ．１０３−１０６
【非特許文献５】Ｓｈａｔｔｉｌら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」、１９９７年、第１００巻、ｐ．１−５
【非特許文献６】Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ」、２００１年、第９８巻、ｐ．１８５３−１８５８
【非特許文献７】Ｌｉａｐｉｓら、「Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．」、１９９６年、第５巻、ｐ．１２７−１３５
【非特許文献８】Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉら、「Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．」、１９９２年、第２３巻、ｐ．１１５９−１１６６
【非特許文献９】Ｒｏｌｌｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ」、２００３年、第１００巻、ｐ．９４８２−９４８７
【非特許文献１０】Ｃａｌｚａｄａら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００２年、第２７７巻、ｐ．３９８９９−３９９０８
【非特許文献１１】Ｂｅｇｌｏｖａら、「Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．」、２００２年、第９巻、ｐ．２８２−２８７
【非特許文献１２】×ｉｏｎｇら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２００１年、第２９４巻、ｐ．３３９−３４５
【非特許文献１３】×ｉｏｎｇら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２００２年、第２９６巻、ｐ．１５１−１５５
【非特許文献１４】Ｐａｍｐｏｒｉら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９９９年、第２７４巻、ｐ．２１６０９−２１６１６
【非特許文献１５】×ｉｏｎｇら、「Ｂｌｏｏｄ」、２００３年、第１０２巻、ｐ．１１５５−１１５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今日、癌、例えば、乳癌が全身に及ぶことを防ぐ治療は知られておらず、そのような薬物をどのように設計および試験するかについてさえほとんど理解されていない。しかし転移は最終的に、乳癌の苦痛および死亡の多くの原因となっている。転移性乳癌細胞を同定する分子および機能的マーカーを同定し、かつ、標的し、それらを特異的に阻害する試薬を作製する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本発明は、概して、転移性表現型を発現する腫瘍細胞である腫瘍細胞標的に対し親和性を有する抗体ファージ群を作製する方法に関する。その転移性表現型を発現する腫瘍細胞は、活性化細胞表面レセプター（例えば、活性化インテグリンレセプターまたはαｖβ３インテグリンレセプター）を発現する細胞株であり得る。本発明はさらに、転移細胞上の細胞表面レセプターに特異的に結合する抗体組成物に関する。この抗体組成物は転移細胞上の活性化細胞表面レセプター（例えば、活性化インテグリンレセプターまたはαｖβ３インテグリンレセプター）に特異的に結合する。本発明はさらに、哺乳動物に治療的な量の抗体組成物の薬学的組成物を投与する工程を包含する癌治療薬を用いた処置による、哺乳動物における病状を緩和するための方法に関する。本発明はさらに、哺乳動物組織サンプルにおける転移性腫瘍細胞表面上の活性化細胞表面レセプターを検出する方法に関し、および、転移の危険性を有することが疑われる患者を抗体組成物と接触させる工程を包含する、病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を同定する方法に関し、この抗体は、この抗体と結合する画像化部分を有する。
【００１０】
非活性化αｖβ３インテグリンレセプターを伴う細胞または腫瘍細胞は、可溶性リガンドと結合できず、そして脈管構造において見出される条件下で、血流としての動的流れの条件下で腫瘍細胞の捕捉を支持しないαｖβ３の構造を参照する。このαｖβ３の非活性化構造は、抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２またはＢｃ−１５）によって認識されない非転移性腫瘍細胞と関連し得る。
【００１１】
一実施形態において、活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体は、類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される。詳細な実施形態において、その抗体はｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２を含む。さらに詳細な実施形態において、その抗体は配列番号２を含む。詳細な実施形態において、その抗体はｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１５を含む。さらに詳細な実施形態において、その抗体は配列番号４を含む。さらなる実施形態において、その抗体は相補性決定領域（ＣＤＲ）中にＲ−Ｇ−Ｄ配列を含む。詳細な局面において、そのＣＤＲはＣＤＲ−Ｈ３であり得る。さらに詳細な局面において、その転移細胞は、乳房、脳、肺、肝臓または骨から選択される組織を標的とする。さらに詳細な局面において、薬学的組成物はその抗体を含む。
【００１２】
本発明はさらに、ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２の発現および産生のためのファージディスプレイベクター中のｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡを提供する。詳細な実施形態において、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡは配列番号１を含む。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号  ＰＴＡ−６３０３、寄託日：２００４年１１月１２日である。本発明はさらに、ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１５の発現および産生のためのファージディスプレイベクター中のｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡを提供する。詳細な実施形態において、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡは配列番号２を含む。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号  ＰＴＡ−６３０４、寄託日：２００４年１１月１２日である。
【００１３】
別の実施形態において、抗体は、活性化αｖβ３インテグリンレセプターと特異的に結合し、非活性化αｖβ３インテグリンレセプターとは結合しない。さらなる局面において、その活性化αｖβ３インテグリンレセプターは、類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される。
【００１４】
別の実施形態において、抗体は、類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生されている活性化αｖβ３インテグリンレセプターと特異的に結合するリガンド模倣物（ｌｉｇａｎｄ  ｍｉｍｅｔｉｃ）を含む。
【００１５】
別の実施形態において、哺乳動物の病状を処置するための方法は、類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する。詳細な局面において、その病状は腫瘍性疾患、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性の乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫である。さらに詳細な局面において、その腫瘍性疾患は哺乳動物における腫瘍細胞の転移であるか、またはその腫瘍性疾患状態は哺乳動物における乳癌の転移である。
【００１６】
詳細な実施形態において、哺乳動物の病状の処置のための方法は、配列番号２または配列番号４を含む抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する。詳細な局面において、その病状は腫瘍性疾患、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫である。さらに詳細な局面において、その腫瘍性疾患は哺乳動物における腫瘍細胞の転移であるか、またはその腫瘍性疾患状態は哺乳動物における乳癌の転移である。
【００１７】
別の実施形態において、細胞株は、標的組織への転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体を含む。さらなる局面において、腫瘍細胞改変体は、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫に由来する。さらなる局面において、標的組織は脳、肝臓、肺または骨から選択される。
【００１８】
別の実施形態において、腫瘍細胞標的に対して親和性を有する抗体ファージ群の作製方法は、癌患者のコホートから得た血中リンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のファージライブラリーを提供する工程、非転移性表現型を発現する細胞株にてファージライブラリーをサブトラクトする工程、非転移性表現型を発現する細胞株とは結合しない第１の抗体ファージ群を選択する工程、転移性表現型を発現する細胞株にて第１の抗体ファージ群をパンニングする工程、転移性表現型を発現する細胞株に結合する第２の抗体ファージ群を選択する工程、転移性表現型を発現する細胞株に結合し、かつ、その腫瘍細胞標的に結合する抗体ファージクローンを精製する工程を包含する。さらなる局面において、転移性表現型を発現する細胞株は、活性化細胞表面レセプターを発現する細胞株である。さらなる局面において、活性化細胞表面レセプターは活性化インテグリンレセプターである。詳細な局面において、活性化細胞表面レセプターはαｖβ３インテグリンレセプターである。さらなる局面において、転移性表現型を発現する細胞株は、標的組織に対して転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体である。さらなる局面において、標的組織は、脳、肝臓、肺、または骨から選択される。さらに詳細な局面において、腫瘍細胞標的は転移細胞である。さらに詳細な局面において、転移細胞は転移性の乳癌細胞である。さらに詳細な局面において、抗体ファージ群は単鎖（ｓｃＦｖ）抗体ファージ群である。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、抗体ファージクローンを、（ａ）細胞表面上に活性化インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞への結合；および（ｂ）細胞表面上に非活性化インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞への結合の低下について試験する工程をさらに包含する。
【００２０】
さらなる実施形態において、この方法は、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋またはＭｎ＋＋から選択される陽イオン存在下で増加する活性化インテグリンレセプターを発現する細胞株に対する抗体ファージ群の結合効率を測定する工程をさらに包含する。
【００２１】
別の実施形態において、癌治療薬を用いた処置による哺乳動物における腫瘍細胞の検出方法は、活性化インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体組成物に検出可能なマーカーを連結させる工程、検出可能なマーカー−抗体組成物複合体を哺乳動物または哺乳動物組織へと接触させる工程、検出マーカー−抗体組成物複合体と哺乳動物組織中の腫瘍細胞との結合を検出する工程を包含する。詳細な局面において、その腫瘍細胞は転移性腫瘍細胞である。
【００２２】
別の実施形態において、哺乳動物における抗原への免疫応答を誘導または増強するための方法は、哺乳動物に対し、抗細胞表面レセプター抗体の血漿中濃度が少なくとも４ヶ月間検出可能レベルを超えて維持されるように転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体を投与する工程を包含する。さらなる実施形態において、細胞表面レセプターは活性化インテグリンレセプターである。さらなる実施形態において、活性化インテグリンレセプターはαｖβ３インテグリンレセプターである。さらなる局面において、抗細胞表面レセプター抗体は、その血漿中濃度が少なくとも４ヶ月間検出可能レベルを超えて維持されるように複数回投与される。さらなる局面において、抗細胞表面レセプター抗体は、哺乳動物における抗インテグリンレセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも２μｇ／ｍｌ、または少なくとも４ヶ月間、少なくとも５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４ヶ月間、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、とするような量および間隔で投与される。詳細な局面において、その哺乳動物はヒトである。さらに詳細な局面において、活性化インテグリンレセプターに対する抗体はヒト抗活性化インテグリンレセプター抗体である。さらに詳細な局面において、活性化インテグリンレセプターに対する抗体はヒト化抗活性化インテグリンレセプター抗体である。さらに詳細な局面において、活性化インテグリンレセプターに対する抗体はヒト配列抗活性化インテグリンレセプター抗体である。
【００２３】
別の実施形態において、哺乳動物の転移性癌疾患を処置するための方法は、哺乳動物の転移性癌疾患が処置されるように、細胞傷害性物質と結合した転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体をその哺乳動物へ投与する工程を包含する。さらなる実施形態において、細胞表面レセプターは活性化インテグリンレセプターである。さらなる局面において、細胞傷害性物質は細胞傷害性薬物である。さらなる局面において、細胞傷害性物質は放射性同位体である。
【００２４】
別の実施形態において、哺乳動物組織サンプルにおける転移性腫瘍細胞表面上の活性化細胞表面レセプターを検出する方法は、哺乳動物組織を、固相に固定化された第１のヒト抗体、および溶液中の第２のヒト抗体と接触させる工程であって、その活性化細胞表面レセプターが組織サンプル中に存在する場合第１の抗体および第２の抗体が活性化細胞表面レセプターの異なるエピトープに結合する工程、組織サンプル中の活性化細胞表面レセプターの存在を示す結合である第１の抗体および第２の抗体への活性化細胞表面レセプターの結合を検出する工程であって、その第１のヒト抗体および第２のヒト抗体が、癌患者のコホートから得られた血中のリンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のファージライブラリーにより提供される第１のヒト抗体および第２のヒト抗体をコードする核酸をサブクローニングすることにより産生される工程、非転移性表現型を発現する細胞株についてそのファージライブラリーをサブトラクトする工程、非転移性表現型を発現するその細胞株とは結合しない第１の抗体ファージ群を選択する工程、転移性表現型を発現する細胞株においてその第１の抗体ファージ群をパンニングする工程、転移性表現型を発現するその細胞株に結合する第２の抗体ファージ群を選択する工程、転移性表現型を発現するその細胞株に結合し、かつ、腫瘍細胞標的に結合する抗体ファージクローンを精製する工程を包含する。
【００２５】
詳細な実施形態において、その活性化細胞表面レセプターは活性化インテグリンレセプターである。別の詳細な実施形態において、その活性化インテグリンレセプターはαｖβ３インテグリンレセプターである。別の実施形態において、第２の抗体は標識され、かつ、その検出工程は活性化細胞表面レセプターへの第２の抗体の結合を検出する。
【００２６】
別のさらなる実施形態において、組織サンプルは固相に固定化された第１のヒト抗体群および溶液中の第２のヒト抗体群と接触させられ、その第１および第２の群の構成要素は活性化細胞表面レセプターの異なるエピトープに結合する。別の詳細な局面において、その第２のヒト抗体群は標識されている。別のさらなる局面において、第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々は、その活性化細胞表面レセプター上のそれらの各エピトープに対し少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を有する。別の詳細な局面において、第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々は、その活性化細胞表面レセプターに対して少なくとも１０１０Ｍ−１の親和性を有する。別の詳細な局面において、第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々は、その活性化細胞表面レセプターに対し少なくとも１０１１Ｍ−１の親和性を有する。さらなる実施形態において、活性化細胞表面レセプターに対する第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の結合は１時間以内に平衡に達する。別の詳細な実施形態において、第１のヒト抗体および第２のヒト抗体はＥ．ｃｏｌｉにおける組換え構築物の発現により産生される。別の詳細な局面において、第１の抗体分子および第２の抗体分子の少なくとも９０％がその活性化細胞表面レセプターに免疫反応性である。
【００２７】
さらなる実施形態において、病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を干渉する方法は、転移の危険性を有することが疑われる患者を、類似で非転移性の細胞と比較した時に転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体であって細胞傷害性部分と結合する抗体に接触させる工程を包含する。詳細な実施形態において、その抗体組成物は配列番号２を含む。さらに詳細な実施形態において、その抗体組成物は配列番号４を含む。別の詳細な実施形態において、その細胞傷害性部分は化学的毒素である。さらに詳細な実施形態において、その細胞傷害性部分は生物学的毒素である。別の詳細な実施形態において、その細胞傷害性部分は放射性物質である。さらに詳細な実施形態において、その結合は共有結合である。別の詳細な実施形態において、その結合はリガンド相互作用である。さらに詳細な実施形態において、その結合は物理学的相互作用である。さらに詳細な実施形態において、その結合は管内への封じ込めを含む。別の詳細な実施形態において、その管はリポソームまたはその他の血液循環血管である。
【００２８】
さらなる実施形態において、病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を同定する方法は、転移の危険性を有することが疑われる患者を、類似で非転移性の細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体であって、その抗体に結合した画像化部分を有する抗体に接触させる工程を包含する。さらなる実施形態において、その画像化部分は、磁気共鳴スペクトロスコピー、×線スペクトロスコピー、または陽電子放射断層法（ＰＥＴ）によって画像化され得る。詳細な実施形態において、その結合は共有結合である。さらに詳細な実施形態において、その結合は非共有結合である。
【００２９】
転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体を哺乳動物に投与する工程、および、その哺乳動物の転移性癌疾患が処置されるように転移細胞のプログラム細胞死を誘導する工程を包含する、哺乳動物の転移性癌疾患を処置するための方法が提供される。１つの局面において、その細胞表面レセプターは活性化インテグリンレセプターである。さらなる局面において、その活性化インテグリンレセプターはαｖβ３インテグリンレセプターである。
【００３０】
本発明は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離Ｂｃ−１２ポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または、Ｂｃ−１２と生物学的機能を共有するヌクレオチド配列を含む単離ポリペプチドを提供する。詳細な局面において、ベクターは、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する単離Ｂｃ−１２ポリヌクレオチドを含む。詳細な局面において、発現ベクターは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する単離Ｂｃ−１２ポリヌクレオチドを含み、その中で、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるそのポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている。詳細な局面において、宿主細胞、またはその子孫は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する単離Ｂｃ−１２ポリヌクレオチドを含む。さらなる局面において、単離Ｂｃ−１２ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明は、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離Ｂｃ−１５ポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または、Ｂｃ−１５と生物学的機能を共有するヌクレオチド配列を含む単離ポリペプチドを提供する。詳細な局面において、ベクターは、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する単離Ｂｃ−１５ポリヌクレオチドを含む。詳細な局面において、発現ベクターは配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する単離Ｂｃ−１５ポリヌクレオチドを含み、その中で、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるそのポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている。詳細な局面において、宿主細胞、またはその子孫は、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する単離Ｂｃ−１５ポリヌクレオチドを含む。さらなる局面において、単離Ｂｃ−１５ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３２】
標的組織への転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体を哺乳動物に投与する工程、試験化合物をその哺乳動物へ投与する工程、コントロール哺乳動物中のコントロール化合物の抗転移活性と比較して、その哺乳動物中の試験化合物の抗転移活性を測定する工程を包含する、哺乳動物中での試験化合物の抗転移活性を決定するための方法が提供される。さらなる実施形態において、その方法は、哺乳動物の標的組織における転移性病巣を測定する工程であって、コントロール化合物に対する応答におけるコントロール動物中の転移性病巣と比較したその試験化合物への応答における哺乳動物中の転移性病巣の縮小がその試験化合物の抗転移活性を示す測定工程を包含する。１つの局面において、腫瘍細胞改変体および試験化合物は哺乳動物の末梢血循環へと投与される。さらなる局面において、腫瘍細胞改変体および試験化合物は、哺乳動物の乳腺脂肪パッドへと同所的に投与される。詳細な局面において、腫瘍細胞改変体は、ＢＣＭ−１、ＢＣＭ−２またはＢＭＳである。さらなる局面において、試験化合物は、抗体、単鎖Ｆｖ抗体、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。さらなる実施形態において、哺乳動物は非ヒト哺乳動物、例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類である。さらに詳細な実施形態において、哺乳動物はマウスまたは免疫欠損マウスである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（詳細な説明）
本発明は、概して、転移性表現型を発現する腫瘍細胞である腫瘍細胞標的に対して親和性を有する抗体ファージ群を作製する方法に関する。転移性表現型を発現する腫瘍細胞は、活性化された細胞表面レセプター（例えば、活性化されたインテグリンレセプターまたはαｖβ３インテグリンレセプター）を発現する細胞株であり得る。本発明はさらに、転移細胞上の細胞表面レセプターに特異的に結合する抗体組成物に関する。この抗体組成物は、転移細胞上の活性化された細胞表面レセプター（例えば、活性化されたインテグリンレセプターまたはαｖβ３インテグリンレセプター）に特異的に結合する。本発明はさらに、この抗体組成物の薬学的組成物の治療的な量を哺乳動物に投与する工程を包含する、癌治療薬を用いた処置による、この哺乳動物の病状を緩和するための方法に関する。本発明はさらに、哺乳動物組織サンプルにおける転移性腫瘍細胞表面上の活性化細胞表面レセプターを検出する方法、ならびに、病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を同定する方法であって、転移の危険性を有することが疑われる患者を、抗体組成物に接触させる工程を包含し、その抗体はその抗体に結合した画像化部分を有する、方法に関する。
【００３４】
現在、活性化された機能的形態のαｖβ３インテグリンは、癌転移（特に、乳癌転移）阻害のための治療的投薬計画における標的として使用され得ることが発見されている。癌患者免疫レパートリーのヒト単鎖Ｆｖ抗体ライブラリーが開発されており、このライブラリーは活性化形態のαｖβ３インテグリンを特異的に認識し得る抗体を含む。本発明は、活性化形態のαｖβ３を妨害し、乳癌転移を予防するこれらの抗体の単離、特徴付けおよびインビボでの使用を提供する。
【００３５】
乳房の腫瘍は小さいサイズにおいてでさえ検出され得るが、現在のところ、これらがいつ転移を開始するのかを予測することができず、またこのプロセスを効率的に抑制することができない。外科手術および抗癌治療の治療的能力を向上させるために、転移細胞を同定し阻害する新たな分子標的が必要とされている。ヒト乳癌細胞モデルおよび乳癌患者の転移細胞を用いたインビトロおよびインビボでの研究によって、転移細胞上での活性化細胞表面レセプター（例えば、機能的に活性化形態の接着レセプターインテグリンαｖβ３）の発現は転移活性を強く促進することが実証されている。この転移に関連する発現を利用するために、癌患者由来ヒト単鎖Ｆｖ抗体ライブラリーを選択することにより、活性化形態のαｖβ３を特異的に認識し、このレセプターの重要な機能をブロックする抗体が得られた。これらの抗体のうちの２つ、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、ＣＤＲ−Ｈ３内のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐインテグリン認識モチーフを介して陽イオン依存様式でαｖβ３と結合する天然のリガンド模倣物であることが見出された。これらの抗体（ただし、そのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ変異体ではない）は、αｖβ３が仲介する腫瘍細胞の接着および移動を妨害し、血液中の転移性乳癌細胞を特異的に認識し、血流中で血小板によって支持される腫瘍細胞の捕捉を阻害した。重要なことに、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、免疫欠損マウスにおいてヒト乳癌細胞による肺でのコロニー化を防止した。これらのデータからは、活性化αｖβ３の機能を中断することにより循環中の腫瘍細胞は不活性化され、それにより乳癌の転移が防止され得ることが示唆される。
【００３６】
マウスαｖβ３インテグリンレセプターを認識する利用可能な試薬は存在しない。このような試薬を入手できるようにすることは、科学界に価値のある研究試薬を提供する。本明細書中で開示されるｓｃＦｖの性質に基づいて、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５はマウスαｖβ３インテグリンレセプターと反応し得ることが予測される。それらが反応する場合、これらの試薬はヒト病状のマウスモデルを利用するインビボ研究における使用に非常に役立つ。マウスαｖβ３インテグリンレセプター試薬は、マウスモデルにおいて多く行なわれている新脈管形成に基づく研究に対して特に有用である。本発明のｓｃＦｖは、おそらくマウスモデルにおいておよび非常に類似したヒトにおいて、血管由来内皮細胞上の活性化マウスαｖβ３インテグリンレセプターと反応することが予測される。
【００３７】
ＳｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、活性化構造のαｖβ３インテグリンレセプターと選択的に結合し、非活性化構造のαｖβ３インテグリンレセプターとは結合しないので、新規試薬である。これまでに試験されたαｖβ３インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞の中で、転移性表現型を有する細胞のみが構成的に活性化された構造のαｖβ３インテグリンレセプターを発現する。
【００３８】
驚くべきことに、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、αｖβ３インテグリンレセプターに対する高い特異性とともに、ＲＧＤリガンドモチーフ（ＣＤＲ−Ｈ３）を利用する。ＲＧＤモチーフを含む他の公知の抗体は、ＲＧＤ配列を認識する複数のインテグリンと反応する。本明細書中で実証されるように、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、ＲＧＤモチーフのための主要なレセプターとして知られているその他のインテグリン（例えば、インテグリンαｖβ５、αｖβ１、αＩＩｂβ３、およびα５β１が挙げられるが、これらに限定されない）には結合しない。
【００３９】
乳癌は非常に異質性であることが知られている。ヒト乳癌細胞のサブセットは、構成的に活性化された機能形態にある接着レセプターであるインテグリンαｖβ３の発現に基づいて同定され得る。この活性化インテグリンは脈管内において血小板の結合および腫瘍細胞の捕捉を促進する。このように、インテグリンαｖβ３の活性化は、転移細胞に標的器官への播種およびコロニー化の成功のために重要でありうる重要な特性を与える。ヒト乳癌細胞株変異体の転移性の低い改変体と高い改変体に対するサブトラクトパンニングによる抗体ファージディスプレイ技術を用いて、多数の癌患者の混合免疫レパートリーを調べた。この手法により、活性化されている機能的構造の腫瘍細胞接着レセプターであるインテグリンαｖβ３を特異的に認識する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が得られた。この抗体は、乳癌細胞モデルの転移性改変体およびＩＶ期乳癌患者の血液サンプルから単離された転移細胞と選択的に反応する。重要なことに、これらの抗体は免疫欠損マウスにおいて、ヒト乳癌細胞による肺のコロニー化を阻害する。
【００４０】
本発明の抗体組成物および方法は、ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が転移性癌細胞（例えば、転移性乳癌細胞）の診断用マーカーとして活性化形態のインテグリンαｖβ３を通知する能力を研究するために有用である。これらのｓｃＦｖ抗体およびその誘導体は、転移性乳癌細胞を特異的に検出し、転移性疾患の局在化を通知する。本発明の抗体組成物および方法は、癌転移（例えば、転移性乳癌）の処置のための治療用抗体組成物を同定するためにさらに有用である。
【００４１】
本発明の抗体組成物および方法は、ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が転移性乳癌の予後マーカーとして活性化形態のインテグリンαｖβ３を検出し通知する能力を研究するために有用である。これらのｓｃＦｖ抗体およびその誘導体は転移傾向を有する乳癌細胞を特異的に検出し得る。
【００４２】
本発明の抗体組成物および方法は、構成的に活性化されているインテグリンαｖβ３に対するヒトｓｃＦｖ抗体およびその誘導体の、乳癌の転移に対する効果を分析するために有用である。活性化形態のインテグリンαｖβ３を発現する細胞の標的化した阻害は、乳癌の転移を抑制し、確立された転移性疾患を妨害し得る。
【００４３】
画像化技術およびマンモグラフィー技術は非常に初期の乳房の腫瘍を検出し得る。しかし、現在の乳癌に対する予後基準は、腫瘍がどれほど進行性なのか、すでに拡散が開始されているのか、およびそれぞれ別の場合において可能な限り最良の結果が達成されるためにはどの処置選択肢を選択すべきかについては明確に示されていない。転移性疾患からの合併症は乳癌における主要な死因である。主要な標的器官（例えば、肺、骨、肝臓および脳）への乳癌の転移は、血流を介した腫瘍細胞の播種を伴う。この環境において標的器官へのコロニー化の成功のために重要な必要条件は、細胞の接着に物理的に抗する血流によって生成される剪断力にもかかわらず、標的器官の脈管内で腫瘍細胞が捕捉する能力である。この捕捉プロセスを支持する機構の１つは、架橋リガンドとして２価または多価の血漿タンパク質により互いが結合している、腫瘍細胞接着レセプターであるインテグリンαｖβ３と血小板インテグリンαＩＩｂβ３との間の相互作用として同定されている。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：５８９２−５９００，１９９６；Ｐｉｌｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２１９３０−２１９３８，２００２；Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９８：１８５３−１８５８，２００１；Ｂａｋｅｗｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１００：１４２０５−１４２１０，２００３；Ｂｉｇｇｅｒｓｔａｆｆら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１７：７２３−７３０，１９９９。
【００４４】
インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットから構成されており細胞外マトリックス内のタンパク質と細胞との接着を仲介する膜貫通型細胞接着レセプターのファミリーである。マトリックス内に固定化されたリガンドタンパク質を認識することに加えて、このレセプターは可溶性のリガンドタンパク質（例えば、ある種の血漿タンパク質）とも反応し得る（但し、レセプター分子が活性化された機能的構造で存在する場合に限る）。Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５８：８３３−８３９，２００２；Ｗｏｏｄｓｉｄｅら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８６：３１６−３２３，２００１。このように、可溶性リガンドのインテグリンによる認識は、レセプターの構造の特異的な変化に厳密に依存する。このことは、細胞がインテグリン依存様式で凝集し、脈管の動的フロー条件下で捕捉する能力を制御する分子スイッチを提供する。この機構は、非活性化インテグリンを発現しながら休止した状態で血流内を循環する白血球および血小板で確立されている。炎症誘発性または血栓誘発性のアゴニストにより刺激した際、これらの細胞型はいくつかの分子変化により迅速に反応し、このような分子変化としては、重要なインテグリン類（例えば、白血球に対するβ２インテグリンおよび血小板に対するαｖβ３）の「休止した」構造から「活性化した」構造への切り替えが挙げられる。これにより、これらの細胞型が脈管内で捕捉し、細胞の凝集が促進され、血栓形成がもたらされる。Ｓａｖａｇｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，８：２７０−２７６，２００１。ヒト乳癌細胞の転移性サブセットは、構成的に活性化形態にあるインテグリンαｖβ３を発現することが実証されている。Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１００：９４８２−９４８７，２００３。αｖβ３の異常な発現は、乳癌、ならびに、前立腺癌、黒色腫、および神経芽細胞腫の転移に役割を果たすが、転移性活性を促進するのは、特に、活性化されている機能的構造のレセプターであることを理解することが重要である。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９８：１８５３−１８５８，２００１；Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９：４２７−４３６，２００２；Ｇｌａｄｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４８：１４２３−１４３４，１９９６；Ｚｈｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：１６５５−１６６４，１９９９；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２４５６５−２４５７４，２０００；Ｖａｎ  Ｂｅｌｌｅら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，３０：５６２−５６７，１９９９；Ｇｕｉら、Ｓｕｒｇｅｒｙ，１１７：１０２−１０８，１９９５。活性化されたレセプターは乳癌細胞の移動を強力に促進し、血流条件下で細胞が捕捉することを可能にする。このように、αｖβ３の活性化は、転移細胞に、標的器官への播種およびコロニー化の成功のために重要でありうる主要な特性を与える。インテグリンによって仲介される腫瘍細胞−血小板相互作用は肺および骨への転移に関与しており、循環中での捕捉を可能にするこ��に加えて、血小板による腫瘍細胞のコーティングは、腫瘍抗原を覆い隠すことにより免疫認識を防止し得、または、腫瘍細胞に増殖因子（例えば、上皮増殖因子または血小板由来増殖因子）を供給し得ることが示唆されている。Ｂｉｇｇｅｒｓｔａｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１７：７２３−７３０，１９９９；Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９：４２７−４３６，２００２；Ａｍｉｒｋｈｏｓｒａｖｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，９０：５４９−５５４，２００３；Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ，１３：２４７−２５３，２００２；Ｆｕｒｇｅｒ，Ｋ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１：８１０−８１９，２００３。首尾良く標的器官に入った腫瘍細胞は、αｖβ３マトリックス相互作用が細胞の生存および増殖を促進させ得るので、新しい環境で生育するためにαｖβ３をさらに利用し得る。例えば、骨マトリックスタンパク質であるオステオポンチンに結合するαｖβ３は悪性度を促進し、オステオポンチンレベルの増大は乳癌における予後の悪さと相関する。Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２４５６５−２４５７４，２０００；Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３：６０５−６１１，１９９７；Ｔｕｃｋら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７９：５０２−５０８，１９９８；Ｒｕｄｌａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：３４１７−３４２７，２００２；Ｄｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５３３６−５３４３，２００２；Ｗａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：５８０１−５８０９，２０００；Ｇｌａｄｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５８：１０２９−１０４０，１９９９。
【００４５】
これらの理由すべてのため、および新脈管形成におけるその確立された役割のために、αｖβ３インテグリンは、最も広範に研究されているインテグリン類の一つであり、この分子のアンタゴニストは、診断用画像化剤として役立ち、標的薬物送達における使用に大きな可能性を有する。Ｂａｋｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１００：１４２０５−１４２１０，２００３；Ｖａｒｎｅｒら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ．Ａｄｖ．Ｏｎｃｏｌ．，６９−８７：６９−８７，１９９６；Ｔｕｃｋｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，４：７２２−７３１，２００３。２つの別の方法がこの分子を標的とするために用いられている。これらの方法のうちの一方は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含むペプチドのαｖβ３との高い結合特異性を利用する。このトリペプチド（細胞外マトリックスタンパク質中に天然に存在する）は、αｖβ３インテグリンの主要な結合部位である。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２：６９７−７１５，１９９６。ＲＧＤに基づくレポータープローブに存在する最初の問題は、速い血中クリアランス、腎臓と肝臓への多い取り込み、および、腫瘍の速い流失によるものであり、現在では、その安定性および結合価を増大させるために化学的に改変した環状化ＲＧＤペプチドによりそれらの問題は対処されている。Ｍｅｎａｒｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５７０−６５７８，２００３；Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１５：４１−４９，２００４；Ｔｈｕｍｓｈｉｒｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，９：２７１７−２７２５，２００３；Ｓｕら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３０：１４１−１４９，２００３。これらの改変ペプチドは次いで放射性同位体に結合させ、腫瘍の画像化のためまたは腫瘍の増殖を阻害するためいずれかのために使用する。そのような分子の１つ、シレンジチド（Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ）は、現在、腫瘍の進行を阻害するためのフェーズＩＩ臨床試験中である。他のアプローチは、抗体を単独または免疫複合体として使用する。癌患者のための治療薬としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発する試みは、分子標的としての癌関連抗原を探すことに重点が置かれている。インテグリンαｖβ３に対する機能ブロック抗体（特に、ｍＡｂ  ＬＭ６０９およびその誘導体）は、重要である接着性腫瘍細胞機能および新脈管形成を妨害することが示されている。Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ，７９：１１５７−１１６４，１９９４；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１，１９９４。ＬＭ６０９抗体もマウスモデルにおいてヒト黒色腫細胞の転移性活性を阻害することが早期に見出された。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９：４２７−４３６，２００２。腫瘍細胞を認識するまたは宿主細胞を支持する抗体は、免疫放射線治療および放射線免疫学的局在決定、ならびに毒素および化学治療薬の送達に用いられている。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５２：２８１−２９６，２００３；Ｐｏｗｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７：３３５−３５０，２００３；Ｋｏｒｔｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ，１８：９５−１０８，２００１；Ｇａｒｎｅｔｔ  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５３：１７１−２１６，２００１。免疫複合体技術の進歩は、十分なヒト抗体が利用可能になったことに伴い、癌治療のための免疫療法を「特効薬」の候補として再び活力を与えた。過去数年間、いくつかのｍＡｂが癌治療薬のためＦＤＡの認可を受けた。これらには、非ホジキンリンパ腫の処置のためのＣＤ２０に対するキメラ抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、および、転移性乳癌の処置のための癌原遺伝子タンパク質であるＨｅｒ−２に対するマウスまたは現在ではヒト化抗体であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ハーセプチン）が含まれる。Ｍｅｎａｒｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５７０−６５７８，２００３；Ｓｍｉｔｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：７３５９−７３６８，２００３；Ｐｅｒｅｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２：３２２−３２９，２００４；Ｓｐｉｇｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，４：３２９−３３７，２００３；Ａｌｉ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，Ｓ１３２−Ｓ１３７，２００３。現在、乳癌治療のための「パイプラインである」治療用ｍＡｂ、および、化学治療または他の投薬計画と組み合わせた新しい臨床試験における試験で選択されたｍＡｂを添付書類中の表にまとめてある。単一の薬剤トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ−２）を用いた臨床試験結果およびパクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ゲンシタビン、白金塩と組み合わせた臨床試験結果は有望であり、長期寛解（＞５年）が報告されることもあった。しかし、化学的処置および抗体に基づく処置を含む現在の治療のいずれもが、転移を有効に停止または抑制し得なかった。したがって、転移細胞を特異的に同定または標的化するという抗体治療の改善による既存の処置選択肢の増強は、乳癌の管理および診断に大きな影響を及ぼす。
【００４６】
転移性ヒト乳癌細胞に関連した標的分子を同定するため、および、このようなマーカーに対するヒト起源の抗体を単離するために、何人かの癌患者の混合免疫レパートリーを、抗体ファージディスプレイ技術を用いて探索した。この手法により、腫瘍細胞接着レセプターであるインテグリンαｖβ３（但し、活性化されている機能的構造に限られる）を認識する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が得られた。この抗体は、乳癌細胞モデルの転移性改変体と、および、ＩＶ期乳癌患者の血液サンプルから単離された転移細胞と、選択的に反応する。重要なことに、これらの抗体は、免疫欠損マウスにおいて、ヒト乳癌細胞による肺のコロニー化を阻害する。これらの抗体はリガンド模倣物として作用する。それらは、その親和性に寄与するＲＧＤインテグリン認識配列を含む。しかし、それらは、抗体−抗原相互作用のリガンド特異性も示す。このように、それらは、上記治療アプローチの両方の利点を組み合わせた可能性を提供する。
【００４７】
ＳｃＦｖ断片は、癌免疫治療に関してＩｇＧ全体と比べていくつかの区別し得る利点を有する。まず第１に、その相対的に小さいサイズ（２７ｋＤａ）により、ｓｃＦｖは、血漿から迅速に除去され、組織中に迅速かつ深く浸透し得る。Ｇａｒｎｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５３：１７１−２１６，２００１。例えば、１２５Ｉ−標識抗ＣＥＡ（癌胎児抗原）ｓｃＦｖはＩｇＧ全体と比べて優れた腫瘍局在性を示した。Ｗｕら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，２：２１−３６，１９９６；Ｍａｙｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６：１７１１−１７１９，２０００。第２に、潜在的な副作用は低減し得る。なぜならば、定常領域の欠失により、ｓｃＦｖが、肝臓および／または腎臓のようなＦｃレセプターを発現する細胞を高密度で有する器官内に保持されないことが確保されるからである。第３に、ｓｃＦｖはＰＣＲに基づくアプローチを用いていくつかの異なる形式（例えば、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体、または二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））に設計し直すことができる。その結果、各抗体断片の大きさ、可撓性および結合価は、インビボ画像化および治療のための具体的な用途に適合させるように調整することができる。Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ，１８：９５−１０８，２００１。これらのｓｃＦｖ抗体は、多くの場合、抗原の関与に続いて腫瘍によって内在化され、高度に毒性の低分子と結合させることができる。さらに、これらの抗体断片は、血液脳関門を通過し得ることが報告されている。Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９９：５６７５−５６７９，２００２。乳癌およびその他の癌の脳への転移は特に解決困難な問題をもたらし、この領域における治療的進歩は非常に大きな影響を及ぼし得る。
【００４８】
別の適用は、乳房の腫瘍が腫瘍形成の開始を担う前駆細胞様または幹細胞様の、小さな、識別可能なサブセットを含むという考え方に対処している。Ａｌ  Ｈａｊｊ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１００：３９８３−３９８８，２００３。
【００４９】
インテグリンに対するｓｃＦｖ抗体のライブラリーは、ヒト乳癌における推定腫瘍開始群を予期して同定し得る特徴を規定するために用いられ得る。他の器官系においては、幹細胞が基底部分を占めており、基礎をなしている基底膜にインテグリンを介して接着している。インテグリンの発現パターンは、幹細胞と分化したその子孫との間では異なることが見出されている。前立腺上皮、精子形成および表皮ケラチノサイトにおいては、β１インテグリンの発現が、推定幹細胞群の同定および単離のために用いられている。Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１１４：３８６５−３８７２，２００１；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９６：５５０４−５５０９，１９９９；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６０：５８９−５９６，２００３。インテグリンの発現は、乳房の腫瘍形成が開始している群のためのマーカーとして用いることができる。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、識別可能な活性化状態の、異なるインテグリンに対する複数の抗体を含む。別の手法においては、インテグリンに対するｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、インテグリンの発現および他のマーカーを規定するために、そして最終的にはこの細胞群を標的とするために使用され得る。
【００５０】
（ｓｃＦＶファージライブラリー）
転移細胞上の細胞表面レセプター（例えば、活性化インテグリンレセプター）に特異的に結合する抗体組成物を同定するためのファージディスプレイライブラリーのためのアプローチのひとつは、ｓｃＦｖファージ−ライブラリーの使用である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３，１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０，１９９０を参照のこと）。バクテリオファージ被覆タンパク質上でのｓｃＦｖライブラリーディスプレイの種々の実施形態について記載されている。ファージディスプレイ手法の改良版も知られており、例えば、ＷＯ９６／０６２１３号およびＷＯ９２／０１０４７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）およびＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）に記載されている（これらは参考として本明細書中に援用される）。Ｆａｂライブラリーのディスプレイも知られており、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号（ＣＡＴ／ＭＲＣ）およびＷＯ９１／１７２７１号（Ａｆｆｙｍａｘ）に記載されている。
【００５１】
良好な結合活性を保持する改変体を同定するために、ディスプレイベクター中にクローニングされるハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、転移細胞に関連した適切な抗原（例えば、転移性腫瘍細胞上の細胞表面レセプターまたは活性化細胞表面レセプター）に対して選択され得る。なぜならば、この抗体または抗体断片はファージまたはファージミド粒子の表面上に存在するからである。例えば、Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１を参照のこと（この文献の内容は参考として本明細書中に援用される）。例えば、Ｆａｂ断片の場合、軽鎖Ｆｄ産物および重鎖Ｆｄ産物はｌａｃプロモーターの制御下にあり、各鎖は、細菌宿主のペリプラズム空間に指向するために、その鎖と融合するリーダーシグナルを有する。抗体断片が適切に組み立てられ得るのはこの空間内である。組み立てられた抗体断片が新しく作られたファージまたはファージミド粒子の被覆に組み込まれることを可能にするファージ被覆タンパク質ドメインとの融合物として重鎖断片は発現される。新しいファージミド粒子の作製には、全ての必要なファージ遺伝子を含むヘルパーファージの添加を必要とする。一旦、抗体断片のライブラリーがファージまたはファージミド表面に呈示されれば、パンニングと呼ばれる工程を次に行なう。これは、ｉ）ファージまたはファージミド粒子の表面上に提示された抗体を所望の抗原と結合させ、ｉｉ）非結合物を洗い流し、ｉｉｉ）結合している粒子を抗原から溶出し、ｉｖ）溶出させた粒子を、さらなる選択ラウンドのための濃縮プールを増幅するために、新鮮な細菌宿主に曝露することによる方法である。代表的には、特異的な結合のために抗体クローンをスクリーニングするのに先立ち、３または４ラウンドのパンニングが行なわれる。このように、ファージ／ファージミド粒子は、結合の表現型（抗体）と遺伝子型（ＤＮＡ）との関連付けを可能にし、このことが抗体ディスプレイ技術の使用を非常に成功させている。しかし、他のベクター形式（例えば、選択および／またはスクリーニングのための、抗体断片ライブラリーの溶菌性ファージベクター中へのクローニング（改変Ｔ７またはλＺａｐシステム））は、このヒト化プロセスのために使用され得る。
【００５２】
所望のハイブリッド抗体および／またはハイブリッド抗体断片の選択後、それらは当業者に公知の任意の技術（例えば、原核細胞による発現または真核細胞による発現等）により多量に産生され得ることが企図される。例えば、ハイブリッド抗体または断片は、起源種の抗体の結合特異性を維持するために必要とされるＣＤＲおよび（必要な場合には）可変領域フレームワークの最小部分（本明細書中で記載される技術にしたがって設計される）が起源種の抗体由来のものであり、抗体の残りの部分は、本明細書中で記載されるように操作され得る標的種の免疫グロブリン由来のものである、抗体の重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来の技術を用いて産生され得、これにより、ハイブリッド抗体重鎖発現のためのベクターを作製し得る。
【００５３】
詳細な実施形態において、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ライブラリーは、種々の癌疾患を有する５名、１０名、１５名、もしくは２０名またはそれ以上の患者の末梢血リンパ球から調製され得る。次に、合成シアリルＬｅｗｉｓＸおよびＬｅｗｉｓＸＢＳＡ複合体を用いて、ヒト高親和性ｓｃＦｖ抗体が完全に選択され得る。ある研究において、これらのヒトｓｃＦｖ抗体は、膵腺癌細胞の細胞表面に結合していることがＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、およびフローサイトメトリーによって実証されているように、シアリルＬｅｗｉｓＸおよびＬｅｗｉｓＸに対して特異的であった。ヌクレオチド配列決定から、少なくとも４つの固有のｓｃＦｖ遺伝子が得られることが明らかになった。Ｋｄ値は１．１〜６．２×１０−７Ｍの範囲であり、これは二次免疫応答由来のｍＡｂの親和性に匹敵した。これらの抗体はヒト腫瘍疾患の処置において糖質抗原の構造および機能を探索するための価値ある試薬となり得る。Ｍａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６９５３−６９５８，１９９９。
【００５４】
さらに詳細な実施形態において、ファージによって提示されたコンビナトリアル抗体ライブラリーは、転移細胞（例えば、細胞表面レセプターまたは転移性腫瘍細胞上の活性化細胞表面レセプター）と結合した適切な抗原に対する広範な抗体を作製および選択するために使用され得る。ファージ被覆タンパク質ｐＶＩＩおよびｐＩＸを用いて、ヘテロダイマー構造の抗体Ｆｖ領域を呈示し得る。この技術の局面は、糸状バクテリオファージのｐＩＸ上に提示される、４．５×１０９個のメンバーの大規模な、ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリーを構築するために展開される。さらに、このライブラリーの多様性、質、および有用性は、６つの異なるタンパク質抗原に対するｓｃＦｖクローンを選択することにより実証された。特に、選択したクローンの９０％以上が、わずか３ラウンドのパンニング後に、それらの各抗原に対して陽性の結合を示した。分析されたｓｃＦｖも高親和性であることが見出された。例えば、反応速度分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよびコレラ毒素Ｂサブユニットに対するｓｃＦｖはそれぞれナノモルおよびナノモル以下の解離定数を有し、免疫処置により得られたｍＡｂと匹敵する、または、それを超える親和性が与えられることが明らかになった。さらに、はっきりと区別し得るタンパク質の間だけでなく、非常に密接に関連するタンパク質（例えば、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（「リシン」）凝集素（ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０）の場合でも、２つのタンパク質間で８０％を超える配列相同性を有しているにもかかわらず、高い特異性を得た。これらの結果は、ｐＩＸ−ディスプレイライブラリーの性能が、ｐＩＩＩ−ディスプレイ形式の性能よりも潜在的に優れている可能性が有り、それにより、ｐＩＸ−ディスプレイライブラリーが広範な標的抗原をパンニングするために理想的に適したものとなっていることを示唆している。Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２６１２−１２６１６，２００１。
【００５５】
抗体または他の結合試薬と抗原との間の特異的な結合は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性を意味する。好ましい結合試薬は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍの親和性で結合する。用語エピトープは抗体に特異的に結合し得る抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、分子（例えば、アミノ酸または糖側鎖）の化学的に活性な表面の基からなり、通常、特異的な３次元構造特性を有し、また、特異的な荷電特性を有する。構造性および非構造性エピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は喪失するが、後者との結合は喪失しない点で識別される。
【００５６】
「患者」、「被験体」または「哺乳動物」は相互変換可能に使用され、哺乳動物（例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類）ならびに実験動物（例えば、ウサギ、ラットおよびマウスならびに他の動物）をいう。動物としては全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物（例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類））が挙げられる。
【００５７】
「処置すること」または「処置」は、症状、合併症、もしくは疾患の生化学的徴候の開始を予防または遅延させるために本発明の抗体組成物、化合物または試薬を投与すること、症状を緩和すること、あるいは、疾患、状態、または障害（例えば、癌、転移性癌、または転移性乳癌）のさらなる進行を停止させることまたは阻害することを包含する。処置は、予防的（疾患の開始を予防するためまたは遅延させるため、またはその臨床的症状もしくは無症状性の症状があらわれることを予防するため）、または治療的抑制、または疾患が生じた後の症状の緩和であり得る。
【００５８】
「癌」または「悪性疾患」は同義語として使用され、制御されていない、異常な細胞の増殖、冒された細胞が局所的にまたは血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がる能力（すなわち、転移）、およびいくつかの特徴的構造および／または分子的特徴のいずれかにより特徴付けられるいくつかの疾患のうちのいずれかをいう。「癌細胞」または「悪性細胞」は、特異的構造特性を有し、分化を欠損し、侵襲および転移することができる細胞として理解される。癌の例は、乳癌、肺癌、脳腫瘍、骨肉種、肝臓癌、腎臓癌、結腸癌、および前立腺癌である（ＤｅＶｉｔａら編、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第６版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００１を参照のこと、この文献はあらゆる目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）。
【００５９】
「癌関連の」とは、被験体細胞における悪性疾患の開始に対する、核酸およびその発現、もしくはその欠損、またはタンパク質およびそのレベルもしくは活性、もしくはその欠損の関係をいう。例えば、癌は、通常の正常細胞では発現されないか、または低レベルで発現される特定の遺伝子の発現と関連し得る。反対に、癌関連遺伝子は、悪性細胞においては（または形質転換が生じている細胞においては）発現されず、または、通常の正常細胞において発現されているよりは悪性細胞において低いレベルで発現されているものであり得る。
【００６０】
癌との関連で、用語「形質転換」とは、悪性になる場合に正常細胞に生じる変化をいう。真核生物においては、用語「形質転換」は、細胞培養物中の正常細胞から悪性細胞への転換を表すために使用され得る。
【００６１】
「増殖細胞」とは、細胞分裂が活発に起こっており、指数関数的に増殖している細胞である。「細胞増殖制御の喪失」とは、通常は適切な細胞分裂の制限を確実にしている細胞周期の制御が失われた細胞特性をいう。この制御を喪失した細胞は、刺激シグナルが無くても通常の速度より速く増殖し、阻害シグナルには応答しない。
【００６２】
「進行癌」とは、原発性腫瘍部位にはもはや局在しない癌、または、米国対癌合同委員会（ＡＪＣＣ）に従い、ＩＩＩ期もしくはＩＶ期である癌を意味する。
【００６３】
「耐容性の良好な」とは、処置の結果として生じ、処置の決定に影響し得る、健康状態の有害な変化が存在しないことをいう。
【００６４】
「転移性」とは、免疫欠損マウスの乳房脂肪パッドおよび／または循環中へ注入した際に免疫欠損マウスの肺、肝臓、骨または脳に二次的腫瘍病変を確立し得る腫瘍細胞（例えば、ヒト乳癌細胞）をいう。
【００６５】
「非転移性」とは、免疫欠損マウスの乳房脂肪パッドおよび／または循環中へ注入した際に免疫欠損マウスの肺、肝臓、骨または脳、または乳癌転移の他の標的器官に二次的腫瘍病変を確立し得ない腫瘍細胞（例えば、ヒト乳癌細胞）をいう。本明細書中で非転移性として用いられ、本明細書中で非転移性として扱われるヒト腫瘍細胞は、免疫欠損マウスの乳房脂肪パッド中に注入した際に原発性腫瘍は確立し得るが、原発性腫瘍から播種は起こらない。
【００６６】
本明細書中で用いられる場合、「リンパ球」は当該技術分野における通常の意味を有し、血液、リンパ、およびリンパ系組織中で見出される単核の非食細胞性白血球のいずれかをいう（例えば、Ｂリンパ球およびＴリンパ球）。
【００６７】
「エピトープ」とは、抗体に特異的に結合し得るタンパク質決定基をいう。エピトープは、通常、分子（例えば、アミノ酸または糖側鎖）の化学的に活性な表面の基からなり、通常、特異的な３次元構造特性を有し、また、特異的な荷電特性を有する。構造性および非構造性エピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は喪失するが、後者との結合は喪失しない点で識別される。
【００６８】
インタクトな「抗体」は、ジスルフィド結合により内部が結合している少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、散在しているフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域とにさらに分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および伝統的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む）との結合を仲介し得る。抗体という用語は、活性化インテグリンレセプターに結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合部分を包含する。結合部分の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結している２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられ得る。
【００６９】
「単鎖抗体」または「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」とは、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨの抗体融合分子をいう。Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域とＶＨ領域との対が１価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３，１９８８を参照のこと）を形成している単一のタンパク質鎖として調製し得る、合成リンカーによる組み換え方法を用いて連結され得る。このような単鎖抗体は、組換え技術またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断により調製され得る「抗体」断片という用語を参照することにより包含される。
【００７０】
「ヒト配列抗体」は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（存在する場合）を有する抗体を包含する。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダム突然誘発もしくは部位特異的突然誘発またはインビボにおける体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。このような抗体は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３７５０４号に記載されているように、非ヒトトランスジェニック動物において作製され得る。しかし、本明細書中で使用される場合、用語「ヒト配列抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体（例えば、ヒト化抗体）を包含することは意図されていない。
【００７１】
さらに、組換え免疫グロブリンが作製され得る。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号（本文献は、あらゆる目的のために、その全体が参考として本明細書中に援用される）、およびＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：  １００２９−１００３３，１９８９を参照のこと。
【００７２】
「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成の抗体分子調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を呈示する。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（存在する場合）を有する単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から入手したＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生され、このＢ細胞は、不死化細胞に融合させたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
【００７３】
「ポリクローナル抗体」とは、細胞表面レセプター（例えば、ヒト活性化インテグリンレセプター）に対する１より多い（２以上の）異なる抗体からなる調製物をいう。このような調製物は種々の異なるエピトープに結合する抗体を含有する。活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、活性化インテグリンレセプターがカウンターレセプターまたは共レセプターと相互作用するのを阻害するように、ヒト活性化インテグリンレセプター上のエピトープに結合し得る。本発明において使用するのに適したこれらの抗体および他の抗体は、当該分野において周知である方法および／または本明細書中で引用する参考文献中に記載される方法にしたがって調製され得る。好ましい実施形態において、本発明において用いられる抗活性化インテグリンレセプター抗体は「ヒト抗体」（例えば、ヒトから単離された抗体）であるか、または「ヒト配列抗体」である（定義は上記）。
【００７４】
「免疫細胞応答」とは、免疫細胞の移動、標的細胞の死滅、食作用、抗体産生、他の可溶性エフェクターの免疫応答などを生じる免疫細胞における生化学的変化を生じる、外部または内部の刺激（例えば、抗原、細胞表面レセプター、活性化インテグリンレセプター、サイトカイン、ケモカイン、および他の細胞）に対する免疫系細胞の応答をいう。
【００７５】
「免疫応答」とは、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の共同作用をいい、これにより、癌細胞、転移性腫瘍細胞、転移性乳癌細胞、侵入病原体、病原体が感染した細胞もしくは組織、または、自己免疫または病理学的炎症の場合には、正常のヒト細胞または組織の選択的損傷、破壊またはヒトの身体からの排除を生じる。
【００７６】
「Ｔリンパ球応答」および「Ｔリンパ球活性」は本明細書中で相互変換可能に用いられ、Ｔリンパ球に依存する免疫応答の構成要素（例えば、Ｔリンパ球の増殖および／またはヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性キラーＴリンパ球、もしくはサプレッサーＴリンパ球への分化、抗体産生を引き起こすかまたは防止するヘルパーＴリンパ球からＢリンパ球へのシグナルの提供、細胞傷害性Ｔリンパ球による特異的標的細胞の死滅、および他の免疫細胞の機能を変化する可溶性因子（例えば、サイトカイン）の放出）をいう。
【００７７】
免疫応答の構成要素は当業者に周知の種々の方法によりインビトロにおいて検出され得る。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球は、放射標識された標的細胞とインキュベートされ得、そして、これらの標的細胞の溶解は放射能の放出により検出され得る；（２）ヘルパーＴリンパ球は、抗原および抗原提示細胞とインキュベートされ得、そして、サイトカインの合成および分泌は標準的方法（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：３７３−８０，１９９５）により測定され得る；（３）抗原提示細胞は、総タンパク質抗原とインキュベートされ得、そして、ＭＨＣにおける抗原の提示はＴリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法（Ｈａｒｄｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４２３０−４，１９８９）によって検出され得る；（４）肥満細胞は、そのＦｃ−εレセプターを架橋する試薬とインキュベートされ得、そして、ヒスタミンの放出は酵素イムノアッセイ（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎら、ＴＩＰＳ，４：４３２−４３７，１９８３）によって測定され得る。
【００７８】
同様に、モデル生物（例えば、マウス）またはヒト患者のいずれかにおける免疫応答産物も当業者に周知の種々の方法により検出され得る。例えば、（１）ワクチン接種に応じた抗体の産生は、臨床研究室において現在用いられている標準的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）により容易に検出され得る；（２）免疫細胞の炎症部位への移動は、皮膚表面を引っ掻き、その引っ掻いた場所の上で移動する細胞を捕捉するために滅菌容器を配置することにより検出され得る（Ｐｅｔｅｒｓら、Ｂｌｏｏｄ，７２：１３１０−５，１９８８）；（３）マイトジェンに応答した末梢血単核細胞の増殖または混合リンパ球反応は、３Ｈ−チミジンを用いて測定され得る；（４）ＰＢＭＣ中の顆粒球、マクロファージ、および他の食細胞の食作用能は、ウェル中にＰＢＭＣと標識粒子とを一緒に入れることにより測定され得る（Ｐｅｔｅｒｓら、Ｂｌｏｏｄ，７２：１３１０−５，１９８８）；および（５）免疫系細胞の分化は、ＣＤ分子（例えば、ＣＤ４およびＣＤ８）に対する抗体でＰＢＭＣを標識し、これらのマーカーを発現するＰＢＭＣ画分を測定することにより測定され得る。
【００７９】
簡便のために、免疫応答は多くの場合、本発明において、「一次」免疫応答または「二次」免疫応答のいずれかとして記載される。一次免疫応答（「防御」免疫応答としても記載される）とは、特定の抗原（例えば、細胞表面レセプター、または活性化インテグリンレセプター）への何らかの初めての曝露（例えば、初回「免疫」）の結果として個体に産生される免疫応答をいう。このような免疫は、例えば、抗原に対する何らかの天然の曝露の結果として（例えば、抗原を示すまたは提示する何らかの病原体の初回感染による）、または個体の何らかの腫瘍の癌細胞（例えば、転移性乳癌細胞）によって提示される抗原から生じ得る。あるいは、個体に抗原を含むワクチンを接種した結果として免疫は生じ得る。例えば、ワクチンは、癌細胞（例えば、転移性乳癌細胞）由来の１以上の抗原を含む癌ワクチンであり得る。
【００８０】
一次免疫応答は時間とともに弱くなりもしくは減衰し得、さらに消失しもしくは少なくとも検出できない程度に減衰し得る。したがって、本発明はまた、本明細書中で「記憶免疫応答」としても記載される「二次」免疫応答にも関する。用語「二次免疫応答」とは、一次免疫応答がすでに生成された後に、個体に誘発される免疫応答をいう。したがって、二次免疫応答は、例えば、弱くなってきたまたは減衰してきた現存する免疫応答を増強するために、あるいは、消失した、またはもはや検出することができない前回の免疫応答を再生するために誘発され得る。二次免疫応答を誘発させるために投与され得る物質は、その物質が一次免疫応答を「ブーストする」と称され得るので、以下「ブースター」と称する。
【００８１】
例えば、限定されるものではないが、二次免疫応答は、一次免疫応答を誘発した抗原を個体に再び導入することにより誘発され得る（例えば、ワクチンを再投与することによる）。しかし、抗原に対する二次免疫応答はまた、実際の抗原を含み得ない他の物質を投与することにより誘発され得る。例えば、本発明は、活性化インテグリンレセプターに対する抗体を個体に投与することにより二次免疫応答を増強するための方法を提供する。このような方法において、実際の抗原は必ずしも活性化インテグリンレセプターに対する抗体とともに投与される必要はなく、この抗体を含有する組成物は必ずしもこの抗原を含有している必要はない。二次免疫応答、すなわち記憶免疫応答は、体液（抗体）応答であっても、細胞性応答であってもよい。二次体液応答、すなわち記憶体液応答は、抗原の初回の提示時に産生された記憶Ｂ細胞が刺激したときに生じる。遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応は、ＣＤ４＋細胞により仲介される、細胞性の二次免疫応答、すなわち記憶免疫応答の１つの型である。抗原に対する初回の曝露が免疫系を初回刺激し、、さらなる曝露によりＤＴＨを生じる。
【００８２】
「免疫交差反応性の」または「免疫反応性の」とは、同じ（「免疫反応性の」）または異なる（「免疫交差反応性の」）抗原を用いて産生された抗体と特異的に反応する抗原をいう。通常、抗原は活性化インテグリンレセプターであり、またはより代表的にはαｖβ３インテグリンレセプターまたはその部分配列である。
【００８３】
「免疫学的反応性条件」とは、抗原の特定のエピトープに対して産生された抗体が、実質的に全ての他のエピトープに結合する抗体よりも、検出可能な程度に強く（通常、バックグラウンドの結合よりも少なくとも２倍強い、好ましくは、少なくともバックグラウンドの結合よりも少なくとも５倍強い）そのエピトープに結合することが可能となる条件をいう。免疫学的反応性条件は抗体結合反応の形式に依存し、代表的には、それらはイムノアッセイプロトコルにおいて利用される。イムノアッセイの形式および条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと。
【００８４】
「細胞表面レセプター」とは、シグナルと、細胞の原形質膜を越えたこのようなシグナルの伝達とを受容し得る分子および分子複合体をいう。本発明の「細胞表面レセプター」の例は、活性化インテグリンレセプター、例えば、転移細胞上の活性化αｖβ３インテグリンレセプターである。
【００８５】
「非特異的Ｔ細胞活性化」とは、その抗原特異性には依存しないＴ細胞への刺激をいう。
【００８６】
「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認識段階および活性化段階と対立するものとして、免疫応答のエフェクター段階に含まれる免疫細胞をいう。例示的な免疫細胞としては、骨髄またはリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞（ＣＴＬ））、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞、および好塩基球を挙げることができる。エフェクター細胞は特異的なＦｅレセプターを発現し、特異的な免疫機能を果たす。エフェクター細胞は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る（例えば、ＡＤＣＣを誘導し得る好中球）。例えば、ＦｃαＲを発現する、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は、標的細胞の特異的死滅および免疫系の他の構成成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。エフェクター細胞はまた、標的抗原、標的細胞、転移性癌細胞、または微生物を食作用し得る。
【００８７】
「標的細胞」とは、本発明のＡｂまたはＡｂ組成物によって標的され得る被験体（例えば、ヒトまたは動物）中の任意の望ましくない細胞をいう。標的細胞はヒト活性化インテグリンレセプターを発現するまたは過剰発現する細胞であり得る。ヒト活性化インテグリンレセプターを発現する細胞としては、腫瘍細胞（例えば、乳癌細胞または転移性乳癌細胞）が挙げられ得る。
【００８８】
転移性癌細胞（例えば、転移性乳癌細胞）における抗体組成物の目的となる標的としては、細胞表面レセプター、増殖因子レセプター、抗体（転移性癌および転移性乳癌などの癌に存在する抗イディオタイプ抗体および自己抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的は、接着性タンパク質（例えば、インテグリン類、セレクチン類、および、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー）である。Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：４２５−４３３，１９９０；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｃｅｌｌ，６２：３，１９９０；Ｈｙｎｅｓ，Ｃｅｌｌ，６９：１１，１９９２。目的の他の標的は増殖因子レセプター（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦ、ｈｅｒ／ｎｅｕ、ＮＧＦＲ、およびＶＥＧＦ）ならびにそのリガンドである。他の標的はＧ−タンパク質レセプターであり、物質Ｋレセプター、アンジオテンシンレセプター、α−アドレナリン作動性レセプターおよびβ−アドレナリン作動性レセプター、セロトニンレセプターおよびＰＡＦレセプターが挙げられる。例えば、Ｇｉｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６２５−６４９，１９８７を参照のこと。他の標的としては、イオンチャンネル（例えば、カルシウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、カリウムチャンネル、多剤耐性を仲介するチャンネルタンパク質）、ムスカリンレセプター、アセチルコリンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、グルタミン酸レセプター、およびドーパミンレセプターが挙げられる（Ｈａｒｐｏｌｄ、米国特許第５，４０１，６２９号および米国特許第５，４３６，１２８号を参照のこと）。他の標的はサイトカインであり、例えば、インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。Ａｇｇｒａｗａｌら編、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｅｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，１９９１を参照のこと。他の標的は、ホルモン、酵素、および細胞内メッセンジャーおよび細胞間メッセンジャー（例えば、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣ）である。薬物も目的の標的である。標的分子は、ヒト、哺乳動物または細菌のものであり得る。他の標的は、抗原、例えば、微生物病原体（ウィルス性および細菌性の両方）由来のタンパク質、糖タンパク質および糖質）、ならびに腫瘍である。さらに他の標的が米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている（この文献は全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）。これらの標的によりスクリーニングされた物質のいくつかは単に標的と結合する。他の物質は標的を作動または拮抗する。
【００８９】
（癌処置）
抗体組成物による活性化インテグリンレセプターの遮断は、患者の癌細胞に対する記憶免疫応答すなわち二次免疫応答を増強し得る。免疫を刺激するために、活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、免疫原性物質、例えば、癌細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および糖質分子を含む）、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞、および細胞表面抗原と組み合わせることができ、または単独で使用することができる。
【００９０】
活性化インテグリンレセプターに対する抗体はワクチン接種プロトコルにしたがう場合に有効である。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験戦略が考案されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２，２０００；Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２，２０００；Ｋｈａｙａｔ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８，２０００；Ｆｏｏｎ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８，２０００を参照のこと。Ｒｅｓｔｉｆｏら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６１：３０２３−３０４３，１９９７も参照のこと。）。これらの戦略のひとつにおいて、ワクチンは自己または同種の腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞性ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように腫瘍細胞に形質転換されている場合に最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであることが示されている。Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：３５３９−４３，１９９３。
【００９１】
活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、いくつかの実験腫瘍モデル、（例えば、乳癌（Ｈｕｒｗｉｔｚら、１９９８、前出）、原発性前立腺癌（Ｈｕｒｗｉｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０：２４４４−８，２０００）および黒色腫（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０：３５５−６６，１９９９））においてワクチンの有効性を向上させるＧＭＣＳＦ修飾腫瘍細胞ワクチンを追加免疫し得る。これらの場合には、非免疫原性腫瘍（例えば、Ｂ１６黒色腫）は、免疫系による破壊を受けやすくなっていた。腫瘍細胞ワクチンは、他の免疫アクチベーター（例えば、ＩＬ２）および、特に、同時刺激分子を発現するように改変され得る。
【００９２】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる「腫瘍特異的抗原」の定義付けにつながった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１０：２８１−７，１９９９）。多くの場合、これらの腫瘍特異抗原は、腫瘍において、および腫瘍が生じた細胞において発現している分化抗原である（例えば、メラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２）。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主において見い出された腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、腫瘍において発現していることが見出されているタンパク質および／またはペプチドの組み換えバージョンに基づくワクチンとともに、これらのタンパク質に対する二次免疫応答、すなわち記憶免疫応答を増強させるためのブースター物質として使用され得る。これらのタンパク質は通常、免疫系によって自己抗原と見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原はタンパク質テロメラーゼを含み得、テロメラーゼは、染色体のテロメアの合成に必要とされ、ヒトの癌の８５％以上で発現されており、体細胞組織では限られた数のみ発現されている（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：２０１１−２０１３，１９９４）。これらの体細胞組織は種々の手段により免疫の攻撃から保護され得る。腫瘍抗原は、タンパク質配列を変更しもしくは２つの関連しない配列間（例えば、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ）で融合タンパク質を形成させる体細胞変異のため、癌細胞で発現される「新生抗原」でもあり得、あるいは、Ｂ細胞腫瘍のイディオタイプでもあり得る。他の腫瘍ワクチンは、ヒトの癌に関係するウィルス（例えば、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）、肝炎ウィルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウィルス（ＫＨＳＶ））由来のタンパク質を含み得る。活性化インテグリンレセプターに対する抗体とともに使用され得る別の形態の腫瘍特異抗原は、腫瘍組織自体から単離された精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含み、腫瘍免疫を誘発させるための抗原提示細胞への送達に非常に有効である（Ｓｕｏｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１５８５−１５８８，１９９５；Ｔａｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：１１７−１２０，１９９７）。
【００９３】
樹状細胞（ＤＣ）は、転移性腫瘍細胞上の活性化インテグリンレセプターに対する抗原特異的な応答を初回刺激するために使用され得る強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエキソビボで産生させることができ、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物と一緒に負荷され得る（Ｎｅｓｔｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：３２８−３３２，１９９８）。ＤＣは、これらの腫瘍抗原も発現するように遺伝子的手段により形質転換され得る。ＤＣは免疫目的のために腫瘍細胞に直接、融合される（Ｋｕｇｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：３３２−３３６，２０００）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫は、より強力な抗腫瘍応答を活性化させるために、活性化インテグリンレセプターに対する抗体を用いて有効にブーストされ得る。
【００９４】
活性化インテグリンレセプターに対する抗体と組み合わせられ得る別の型の黒色腫ワクチンは、免疫アジュバントとともに黒色腫細胞株溶解物から調製されるワクチンである（例えば、ＭＥＬＡＣＩＮＥＴＭワクチン（２種類のヒト黒色腫細胞株の溶解物の混合物）プラスＤＥＴＯＸＴＭ（免疫アジュバント））。ワクチン処置は、さらなる化学的処置を伴っても伴わなくてもよいが、抗活性化インテグリンレセプターによってブーストされ得る。
【００９５】
活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、標準的癌治療により誘発される免疫をブーストするために使用され得る。これらの場合、投与する化学治療薬の用量を減少させることも可能である（Ｍｏｋｙｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８：５３０１−５３０４，１９９８）。活性化インテグリンレセプターに対する抗体と化学治療薬の併用の背後にある科学的根拠は、多くの化学治療化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路において腫瘍抗原レベルの増加を生じるはずであることである。したがって、活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、腫瘍細胞の化学治療薬の放出に対して初回刺激された免疫応答をブーストし得る。活性化インテグリンレセプターに対する抗体による治療と組み合わされる化学治療薬の例としては、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エポエチンα、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲンシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲステロール、メスナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（ＴａｘｏｌＴＭ）、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、サプロイン、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよび酒石酸ビノレルビンが挙げられ得るが、これらに限定されない。前立腺癌処置のために抗活性化インテグリンレセプターと組み合わせることができる好ましい化学治療薬はパクリタキセル（ＴａｘｏｌＴＭ）である。黒色腫の癌処置のために抗活性化インテグリンレセプターと組み合わせることができる好ましい化学治療薬はダカルバジン（ＤＴＩＣ）である。
【００９６】
細胞死によって免疫系の初回刺激を生じ得る他の併用治療は、放射線照射、外科的手術、およびホルモン喪失（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）である（Ｋｗｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１５０７４−９，１９９９）。これらのプロトコルのそれぞれが宿主内に腫瘍抗原の供給源を作製する。例えば、手術時における腫瘍に対するいずれの操作も血液中の癌細胞数を大幅に増加させ得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．  第４版，ｐ．３３８，１９８４）。血管新生インヒビターも活性化インテグリンレセプターに対する抗体と組み合わせることができる。血管新生阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る腫瘍細胞死をもたらす。これらの全てが腫瘍の放出と、活性化インテグリンレセプターに対する抗体がブーストし得る、可能な免疫系の初回刺激を引き起こす。
【００９７】
（抗体治療）
当該分野において十分に理解されているように、生物特異的な捕捉試薬としては、抗体、転移細胞上の活性化インテグリンレセプターに結合する抗体の結合断片（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、およびｓｃＦｖタンパク質およびアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ，Ｔｅｋｎｉｋｒｉｎｇｅｎ  ３０，ｆｌｏｏｒ  ６，Ｂｏｘ  ７００  ０４，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  ＳＥ−１００４４，Ｓｗｅｄｅｎ；米国特許第５，８３１，０１２号を参照のこと。これらは、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。））が含まれる。目的とする用途に応じて、それらは、別の生体分子と特異的に結合するレセプターおよび他のタンパク質を含み得る。
【００９８】
ハイブリッド抗体およびハイブリッド抗体断片には、完全長の重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子、またはその任意の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、抗体軽鎖および抗体重鎖）が含まれる。本明細書中で記載されるような可変領域と、種々の種からの定常領域を有するキメラ抗体も適している。例えば、米国特許出願第２００３００２２２４４号を参照のこと。
【００９９】
初めに、抗体が惹起され得る所定の標的目的を選択する。標的目的に対するモノクローナル抗体を作製するための技術は当業者に周知である。このような技術の例としては、ディスプレイライブラリー、ｘｅｎｏマウスまたはｈｕｍａｂマウス、ハイブリドーマなどを含む技術を挙げられるが、これらに限定されない。標的目的には抗原性を示し得る任意の物質が含まれ、通常は、タンパク質またはタンパク多糖類である。例としては、レセプター、酵素、ホルモン、増殖因子、ペプチドなどが挙げられる。本発明の開示にしたがって使用するのに適しているのは天然に存在する抗体だけではなく、所定の目的に関する操作された抗体および抗体断片も適切であることを理解すべきである。
【０１００】
本明細書中で示す技術に供され得る抗体（Ａｂ）としては、モノクローナルＡｂおよびポリクローナルＡｂ、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖および／またはファージディスプレイ技術またはファージミドディスプレイ技術に由来する抗体断片）が挙げられる。まず第１に、初回の抗体は起源種から得られる。より具体的には、標的抗原に対する特異性を有する起源種抗体の軽鎖、重鎖または両方の可変領域の核酸またはアミノ酸配列が必要とされる。起源種は抗体または抗体ライブラリーを作製するために用いられた任意の種（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなど）である。モノクローナル抗体を作製およびクローニングするための技術は当業者には周知である。所望の抗体を取得した後、可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を、ＣＤＲのいずれかの可能な定義（例えば、Ｋａｂａｔ単独、Ｃｈｏｔｈｉａ単独、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ併用、ならびに、当業者に公知の任意の他のもの）を用いて構成部分（すなわち、フレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ）に分ける。一旦、それが取得されたら、適切な標的種のフレームワークの選択が必要である。ある実施形態は、起源種の抗体配列からのそれぞれ個別のフレームワーク領域と、標的種からの可変アミノ酸配列または遺伝子配列とのアラインメントを含む。アラインメントのための検索プログラムは当該分野において周知である（例えば、ＢＬＡＳＴなど）。例えば、標的種がヒトである場合、このようなアミノ酸配列もしくは遺伝子配列（生殖細胞系または再配列した抗体の配列）またはその翻訳産物の情報源は、任意の適切な参照用データベース（例えば、ＮＣＢＩタンパク質データバンクであるＧｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、ヒト抗体遺伝子データベースであるＶＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）、および免疫グロブリンのＫａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ））中に見出され得る。アラインメントをヌクレオチド配列に基づいて行なう場合、次いで、そのサブセットのどの遺伝子が起源種の抗体と最も近似するアミノ酸相同性を有するのかを決定するために、選択した遺伝子を分析すべきである。データベース中の他の配列と比較してより高い相同性に近いアミノ酸配列または遺伝子配列は、本明細書中で記載される手順にしたがって利用および操作され得ることが企図される。さらに、本明細書中で記載される手順にしたがって操作および選択する時に、所定の標的抗原に対する特異性を示す産物をアミノ酸配列または遺伝子がコードする時、相同性のより低いアミノ酸配列または遺伝子が利用され得る。特定の実施形態において、許容可能な相同性の範囲は約５０％より高い。標的種はヒト以外のものであっても良いことを理解すべきである。
【０１０１】
用語「処置する」とは、癌の処置または改善または予防における成功の任意の徴候（客観的パラメータまたは主観的パラメータ（例えば、症状の軽減、寛解、消失、または、病状が患者にとってより耐えられるものとなること；退化または衰弱の速度が低下すること；または、退化の最終ポイントをより軽度の衰弱とすること）を含む）をいう。症状の処置または改善は、客観的パラメータまたは主観的パラメータ（医師による診察の結果が挙げられる）に基づき得る。したがって、用語「処置」としては、眼疾患に関連した症状または状態の進行を抑制するため、遅延させるため、緩和するため、停止させるためもしくは阻害するための、本発明の化合物または物質の投与が包含される。用語「治療的に有効な」とは、被験体における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、排除、または抑制をいう。
【０１０２】
特定の実施形態において、「組み合わせた」、「組み合わせ治療」および「組み合わせ産物」とは、第１治療薬と本明細書中で用いられる化合物の患者への同時投与をいう。組み合わせて投与した場合、各成分は同時にまたは連続的に任意の順序で異なる時点で投与され得る。したがって、各成分は、所望の治療効果を提供するように、別々にではあるが、時間的に十分接近して投与され得る。
【０１０３】
本発明の方法を用いた癌または転移性癌の「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」としては、眼の感染の危険性が増加しているが、感染の症状をまだ経験していない、すなわち呈していない被験体の症状の発症を抑制すること、感染の症状を阻害すること（その進行を遅延させることまたは停止させること）、症状または感染の副作用からの軽減を提供すること（待機療法を含む）、および感染の症状を緩和すること（後退をもたらす）が挙げられる。
【０１０４】
「投薬量単位」とは、処置される特定の個体のための単位投薬量として適合された物理的に別々の単位をいう。各単位は、必要とされる薬学的キャリアを伴う、所望の治療効果を生じるために計算された、所定量の活性化合物を含有し得る。投薬単位形態の仕様は以下により決定され得る：（ａ）活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果、および（ｂ）そのような活性化合物を混合する技術における固有の制約。
【０１０５】
２以上の核酸配列またはポリペプチド配列との関連において、用語「同一の」またはパーセント「同一性」とは、以下に記載するデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）によって測定した場合に、同一であるまたは特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同一である２以上の配列またはサブ配列をいう。特定の割合で同一とは、すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたる最大の対応について比較および配列した場合に、特定の領域（例えば、本明細書中で記載するコレクチン（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ）をコードするヌクレオチド配列または本明細書中で記載するコレクチンのアミノ酸配列）にわたり約６０％の同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有することをいう。このような配列を、そのとき、「実質的に同一である」という。この用語はまた、試験配列の相補体をいう、あるいは、それに対し適用され得る。この用語はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列を包含する。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ（ｇａｐ）などについて説明し得る。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長または約２５ヌクレオチド長、またはより好ましくは５０〜１００アミノ酸長または５０〜１００ヌクレオチド長の領域にわたり存在する。
【０１０６】
配列の比較のために、代表的には、一つの配列が試験配列と比較するために参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、サブ配列の座標を指定し、そして、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを用いるか、または別のパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１０７】
本明細書中で用いられる場合、「比較ウィンドウ」には、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常的には、約１００〜約１５０からなる長さの群から選択される多数の近接した位置における任意の一部分に対する参照配列を含み、その中で、ある配列は、２つの配列を最適に整列させた後に、近接する位置における同数の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は当該分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，２：４８２、１９８１に記載される局所的相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４８：４４３、１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８の相同性方法に関する探索により、コンピュータ化されたこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＴＦＡＳＴＡ）の実行により、または手作業でのアラインメントおよび視覚的観察（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９５  補遺を参照のこと）により行われ得る。
【０１０８】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５：３３８９−３４０２、１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２１５：４０３−４１０、１９９０にそれぞれ記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書中で記載されるパラメータと共に、本発明の核酸およびタンパク質に関するパーセント配列同一性を決定するために用いられる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公共的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列における長さＷを有する短い文字列を同定することによって、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列した場合に合致するかまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満足する第１のハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは近傍文字列スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）をさす。ヒットしたこれらの最初の近傍文字列は、それらを含む、より長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として働く。ヒットしたこの文字列は、累積アラインメントスコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列、パラメータＭ（合致した残基のペアへのリウォードスコア；常に０より大きい）およびＮ（ミスマッチした残基へのペナルティスコア；常に０より小さい）を用いて計算される。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを計算するためにスコア化マトリックスが用いられる。以下のような場合、文字列のヒットの各方向における延長は停止する：累積アラインメントスコアが、その最大の達成された値から量Ｘだけ下降する；１以上の負のスコア残基アラインメントが蓄積することにより累積スコアがゼロまたはそれ以下となる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、そのアラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）はデフォルトとして文字列長（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を使用して、両鎖の比較を行なう。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして文字列長が３、期待値（Ｅ）が１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５、１９８９を参照のこと）アラインメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を使用して、両鎖の比較を行なう。
【０１０９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書中で相互変換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーをいう。これらの用語は、天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーに対してだけでなく、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーに対しても適用される。
【０１１０】
用語「アミノ酸」とは、天然のおよび合成のアミノ酸、ならびに、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然のアミノ酸は、後に修飾される遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、および、後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造（すなわち、１個の水素、１個のカルボキシル基、１個のアミノ基、および１個のＲ基に結合しているα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）を有するか、または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似した様式で機能を有する化合物をいう。
【０１１１】
アミノ酸は、本明細書中では、一般的に公知の３文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  生化学命名委員会により推奨されている１文字表記によって参照され得る。ヌクレオチドも同様に、一般的に受け入れられている１文字コードによりにより参照され得る。
【０１１２】
「保存的修飾改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的修飾改変体とは、同一のまたは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、実質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重に起因して、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが特定される全ての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載した対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸のバリエーションは「サイレントバリエーション」であり、保存的修飾改変体の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列は、それらの核酸の全ての可能なサイレントバリエーションも表す。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および、通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変しても機能的に同一の分子が生じ得ることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは発現産物に関して表される各配列中に潜在的に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては潜在的に含まれない。
【０１１３】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸またはわずかの割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個別の置換、欠失または付加が「保存的修飾改変」であり、この場合、この変更が化学的に類似したアミノ酸を有するアミノ酸の置換を生じることを認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当該分野において周知である。このような保存的修飾改変体は、本発明の多形改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを除外するものではない。
【０１１４】
以下の８群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【０１１５】
ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、組織化の種々のレベルの点で記載され得る。この組織化の一般的な議論については例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、１９９４）およびＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＰａｒｔＩ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９８０を参照のこと。「１次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「２次構造」は、ポリペプチド内の局所的に並べられた３次元構造をいう。これらの構造は、ドメイン（例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、孔ドメイン、および細胞質側末端ドメイン）として一般に知られている。ドメインはポリペプチドの小型ユニットを形成するポリペプチド部分であり、代表的には１５〜３５０アミノ酸長である。例示的なドメインとしては、例えば、キナーゼドメイン等のような酵素活性を伴うドメインが挙げられる。代表的なドメインは、β−シートおよびα−へリックスの広がりのような、より少ない組織の区分からなる。「３次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造をいう。「４次構造」は、独立した３次元のユニットの非共有結合的な会合により形成された３次元構造をいう。異方性項はエネルギー項としても公知である。
【０１１６】
特定の核酸配列はまた、暗黙のうちに「スプライシング改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は暗黙のうちに、その核酸のスプライシング改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。「スプライシング改変体」はその名が示唆する通り、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物が、異なる（代替の）核酸スプライシング産物が異なるポリペプチドをコードするように、スプライシングされ得る。スプライシング改変体の産生機構は多様であるが、エクソンの選択的スプライシングを含む。同一の核酸を最後まで転写することにより得られる代替ポリペプチドもまた、この定義によって包含される。スプライシング産物の組換え体を含む、スプライシング反応の任意の産物がこの定義に包含される。
【０１１７】
用語「組換え」は、参考文献と共に、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに対して用いられる場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸またはタンパク質、または天然の核酸もしくはタンパク質の改変物の導入によって改変されているか、またはその細胞がそのようにして改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されていない遺伝子を発現するか、またはさもなければ天然の遺伝子を異常発現するか、少なく発現するか、あるいは全く発現しない。
【０１１８】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、代表的には核酸の複合混合物中でその標的サブ配列へハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列に依存し、条件により異なる。より長い配列はより高温において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションにおける広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ」  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ、１９９３中に見いだされる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにおいて特定の配列に対して、融解温度（Ｔｍ）より約５−１０℃低いところで選択される。Ｔｍは（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での）温度であり、標的に対し相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（Ｔｍにおいて標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％は平衡時に占有される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％  ＳＤＳ、４２℃にてインキュベーション、または、５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、６５℃にてインキュベーション（０．２×ＳＳＣ、および  ０．１％  ＳＤＳ中で、６５℃にて洗浄を伴う）。
【０１１９】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするそのポリペプチドが実質的に同一である場合、実質的に同一である。このことは、例えば、遺伝子コードにより可能にされた最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に生じる。このような場合、その核酸は代表的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳを含有する緩衝液中で３７℃にてハイブリダイゼーション、および、１×ＳＳＣ中、４５℃にて洗浄が挙げられる。陽性のハイブリダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。類似のストリンジェンシーの条件を提供するために、代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が利用され得ることを、当業者は容易に認識する。ハイブリダイゼーションパラメーターの決定に関する付加的な手引きは多くの文献（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）の中で提供されている、。
【０１２０】
ＰＣＲのために、アニーリングの温度はプライマーの長さに依存して約３２℃と４８℃との間で変動し得るが、低ストリンジェンシーの増幅のためには温度は約３６℃が代表的である。高ストリンジェンシーのアニーリング温度はプライマーの長さおよび特異性に依存して約５０℃〜約６５℃の範囲であり得るが、高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅のためには約６２℃が代表的である。ストリンジェンシーが高い増幅およびストリンジェンシーが低い増幅の両方に対する代表的なサイクル条件は、変性期間９０℃−９５℃、３０秒間−２分間、アニーリング期間３０秒間−２分間持続、および、約７２℃、１−２分間の伸長期間である。ストリンジェンシーが低い増幅反応およびストリンジェンシーが高い増幅反応のためのプロトコルおよび手引きは、例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．、１９９０中に提供されている。
【０１２１】
「抗体」は、抗原に特異的に結合しそれを認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドをいう。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらは順に免疫グロブリンの分類、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。代表的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要である。
【０１２２】
「薬学的に受容可能な賦形剤」は、薬学的組成物の調製に有用な賦形剤であって通常安全で、無毒かつ好ましく、獣医学的用途ならびにヒト薬学的用途に対し許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合、気体であり得る。
【０１２３】
「薬学的に受容可能な塩およびエステル」は、薬学的に受容可能なもので、かつ望ましい薬理的特性を有する塩およびエステルを意味する。このような塩としては、化合物中に存在する酸性プロトンが無機または有機基材と反応し得る、形成され得る塩が挙げられる。適した無機塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムなどのアルカリ金属を用いて形成されたものが挙げられる。適した有機塩としては、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどのアミン塩基などの有機塩基を用いて形成されたものが挙げられる。このような塩はまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにアルカン−およびアレーン−スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸））を用いて形成した酸添加塩も含む。薬学的に受容可能なエステルとしては、例えば、Ｃ１−６アルキルエステルなどの化合物中に存在するカルボキシ基、スルホニルオキシ基、およびホスホノキシ基から形成されるエステルが挙げられる。２つの酸基が存在する場合、薬学的に受容可能な塩または薬学的に受容可能なエステルは、１酸−１塩（ｍｏｎｏ−ａｃｉｄ−ｍｏｎｏ−ｓａｌｔ）またはエステル、あるいは−２塩（ｄｉ−ｓａｌｔ）またはエステルであり得る；および同様に、２以上の酸基が存在する場合、いくつかのまたは全てのこのような基が塩化され、またはエステル化され得る。本発明で命名される化合物は塩化されない形またはエステル化されない形で、または塩化され、そして／またはエステル化された形で存在し得、そのような化合物の命名は原型（塩化されないおよびエステル化されない）の化合物およびその薬学的に受容可能な塩および薬学的に受容可能なエステルの両方を含むことが意図される。また、本発明で命名されるある種の化合物は１以上の立体異性体形態の中に存在し得、このような化合物の命名は、そのような立体異性体の全ての個々の立体異性体および全ての混合物（ラセミ体であってもそうでなくてもよい）を含むことが意図される。
【０１２４】
用語「薬学的に受容可能な」「生理学的に許容可能な」およびそれらの文法的なバリエーションは、組成物、キャリア、希釈剤および試薬をいう場合、相互変換可能に使用されて、その物質が、その組成物の投与を妨げる程度の望ましくない生理学上な影響をヒトに生じることなしに投与可能であることを表す。
【０１２５】
「治療的有効量」は、疾患の処置のために被検体に投与する場合に、その疾患の処置に効果を示すために十分である量をいう。
【０１２６】
注記されない限り、用語「被検体」または「患者」は、相互変換可能に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、ラット、およびマウス、および他の動物などの実験動物をいう。したがって、本明細書中で用いられる用語「被検体」または「患者」は、本発明の組成物が投与され得る、任意の哺乳動物患者または被検体を意味する。本発明のいくつかの実施形態において、患者は疾患、例えば、ＨＩＶへの耐性の低下が引き起こされる状態に罹患している。本発明の例示的な実施形態において、１以上のコレクチンおよび／または本発明の方法に従う界面活性タンパク質を含有する薬学的組成物を用いた処置について被検体患者を同定するために、受容可能なスクリーニング方法が利用されて、存在する疾患の状況、または患者における状態、または標的化されまたは疑われる疾患もしくは条件と関連した危険性因子を決定する。これらのスクリーニング方法としては、例えば、被験体が眼疾患に罹患しているかどうかを判断するための眼科検査が挙げられる。これらおよび他の日常的な方法は、治療を必要としている被験体を臨床医に選択可能にさせる。本発明の特定の実施形態において、コンタクトレンズの保存、洗浄、再湿潤、および／または殺菌のための眼科用組成物、ならびに人工涙組成物および／またはコンタクトレンズは、１以上のコレクチンおよび／または界面活性剤タンパク質を含有し、それによりコンタクトレンズ装用者の眼疾患の進行を阻害する。
【０１２７】
本発明の薬学的組成物と公知の癌治療薬との「同時投与」は、公知の薬物と本発明の組成物との両方が治療効果を有するようなときにおける、その薬物およびコレクチンおよび／または界面活性タンパク質組成物の投与を意味する。このような併用投与は、本発明の化合物の投与に関して、同時並行の（すなわち、同時の）、抗菌薬の前、またはそれに続いて投与することを包含する。当業者は、特定の薬物および本発明の組成物の投与に対する適切な時機、順序、および投与量を、困難を有することなく決定する。
【０１２８】
同一のファミリーおよび／または同一のファミリーメンバーに由来する適切なフレームワーク領域候補を選択後、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のいずれかもしくは両方が、起源種からハイブリッドフレームワーク領域へのＣＤＲ移植により産生される。ハイブリッド抗体のアセンブリ、またはハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体断片は、上記の局面のいずれかに関して、当業者に公知の従来方法を用いて達成され得る。例えば、本明細書中で記載されるハイブリッド可変ドメインをコードするＤＮＡ配列（すなわち、標的種および起源種由来ＣＤＲに基づいたフレームワーク）は、オリゴヌクレオチド合成および／またはＰＣＲにより産生され得る。ＣＤＲ領域をコードする核酸もまた適切な制限酵素を用いて起源種抗体から単離され、また適切な連結酵素を用いて連結することにより標的種フレームワークへ連結される。あるいは、起源種抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的変異誘発により変化され得る。
【０１２９】
ハイブリッドは、各フレームワーク領域に相当する複数の候補の中から選択されて構築されるので、本明細書中で記載される原理に従う構築物に受け入れられる配列の多くの組み合わせが存在する。従って、ハイブリッドのライブラリーは、個別のフレームワーク領域の異なる組み合わせを有するメンバーが組み合わされたものであり得る。このようなライブラリーは、配列の電子的データベース集合または物理的なハイブリッドの集合であり得る。
【０１３０】
物理的な抗体または抗体断片ライブラリーの構築は、好ましくは合成オリゴヌクレオチドを使用して達成される。一例において、オリゴヌクレオチドは、それらがアニーリングされ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを用いてポリメラーゼによって満たされるように重複した領域を有するように設計される。重複延長の複数の工程が、ＶＬ遺伝子挿入物およびＶＨ遺伝子挿入物を生成するために実行される。それらの断片は、それらが重複延長により融合されて全長軽鎖およびＦｄ重鎖断片を産生し得るようにヒト定常ドメインと重複する領域と共に設計されている。軽鎖Ｆｄ領域および重鎖Ｆｄ領域は重複延長によって共に連結されて、ディスプレイベクターへとクローニングされるための単独のＦａｂライブラリー挿入物を生成する。ヒト化ライブラリー遺伝子の構築に関する他の方法も使用され得る。例えば、このライブラリーは、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）アプローチを用いて重複するオリゴヌクレオチドから構築された。Ｃｈａｌｍｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３０−２：２４９−２５２、２００１。
【０１３１】
種々の形態の抗体フラグメントが作製され、ハイブリッド抗体ライブラリーまたはハイブリッド抗体断片ライブラリーを作成するた目の適切なベクター内へクローニングされ得る。例えば、可変的遺伝子は、必要な定常ドメインの残存部分をフレーム内に含むベクターへとクローニングされ得る。クローニングされ得る付加的な断片の例としては、軽鎖全体、重鎖のＦｄ部分、または軽鎖および重鎖両方のＦｄコード配列を含むフラグメントが挙げられ得る。あるいは、ヒト化のために用いられる抗体断片は単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。
【０１３２】
任意の選択ディスプレイシステムが、本開示に従うライブラリーと合わせて用いられ得る。大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレイ技術により代表されているように当該分野で公知である。多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面に呈示されたこのようなシステムは、標的抗原に結合する特異的抗体断片のインビトロでの選択および増幅のための抗体断片（およびそれをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するために有用であることを立証している。Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６，１９９０。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、リーダーシグナルをコードする遺伝子断片と連結され、それがＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間へとそれらをむかわせ、結果的に、得られる抗体断片がバクテリオファージの表面に、代表的にはバクテリオファージ被覆タンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）に対する融合物として呈示される。あるいは、抗体断片はλファージまたはＴ７キャプシド（ファージボディ）上の外側に呈示される。ファージをベースとしたディスプレイシステムの有利な点は、それらが生物学的なシステムであるので、選択されるライブラリーメンバーは、細菌細胞中で選択されるライブラリーメンバーを含むファージを増殖させることによって単純に増幅可能であることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含まれるので、配列決定、発現および続く遺伝子操作は比較的容易になる。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーを構築するための方法は当該分野で周知である。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２、１９９０；Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：４３６３、１９９１。
【０１３３】
本発明はさらに本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体はＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹを含む。本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、抗体全体（単鎖抗体全体、およびその抗原結合断片を含む）を包含することが意味される。最も好ましくは、抗体は本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、これらとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド架橋されたＦｖ（ｓｄＦｖ）および、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。
【０１３４】
単鎖抗体を含む抗原−結合抗体断片は、可変領域を単独で、または、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの全体または部分と組み合わせた状態で含み得る。可変領域、およびヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせも本発明に包含される。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を包含する。本発明はさらに、本発明の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を包含する。
【０１３５】
本発明の抗体は単一特異的であり、二重特異的であり、三重特異的であり、またはより多重な特異性を有し得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対し特異的であり得、または本発明のポリペプチドならびに異種ポリペプチドまたは固体支持体材料などの異種組成物の両者に特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９，１９９１；米国特許第５，５７３、９２０号；米国特許第４，４７４、８９３号；米国特許第５，６０１，８１９号；米国特許第４，７１４、６８１号；米国特許第４，９２５、６４８号を参照のこと（これらは、それぞれ本明細書中にその全体が全ての目的のために参考として援用される）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７−１５５３、１９９２。
【０１３６】
本発明の抗体は、その抗体により認識されまたは特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープまたは本発明のポリペプチドの一部に関して記載され、または特定され得る。このエピトープまたはポリペプチド部分は本明細書中に記載されるように、例えば、Ｎ−末端およびＣ−末端の位置、近接するアミノ酸残基の大きさにより特定され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体も除外される。従って、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含み、また本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を除外することを可能にする。
【０１３７】
本発明の抗体はまた、それらの交差反応活性に関して記載されまたは特定され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ、またはホモログに結合しない抗体が包含される。本発明のポリペプチドに９５％未満の、９０％未満の、８５％未満の、８０％未満の、７５％未満の、７０％未満の、６５％未満の、６０％未満の、５５％未満の、および５０％未満の同一性（当該分野で公知であり、本明細書中に記載される方法を使用して計算した場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に包含される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書中で記載される）下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのみと結合する抗体がさらに本発明に包含される。本発明の抗体は、それらの結合親和性に関しても記載されまたは特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−ｌ０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、ｌ０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍおよび１０−１５Ｍ未満の解離定数あるいはＫｄを有するものが挙げられる。
【０１３８】
本発明の活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、インビトロおよびインビボにおける診断的方法および治療的方法の両方を含む本発明のポリペプチドの精製、検出、および標的化のための当該分野で公知の方法（これらに限定されない）を含む用途を有する。例えば、その抗体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出（これらは、全ての目的でその全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１３９】
本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と共に組み合わせて用いられ得る。抗体はさらに、Ｎ−末端またはＣ−末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識およびエフェクター分子として有用な分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第０  ３９６  ３８７号を参照のこと、これらはそれぞれ全ての目的でその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１４０】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法により調製され得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原断片は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は単一のクローンに由来する抗体をいい、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含み、それが産生される方法によらない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術を含む広範な当該分野で公知の技術を用いて調製され得る。
【０１４１】
ハイブリドーマ技術としては、当該分野で公知の技術およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１、１９８１、中に教示された方法が挙げられる（これらの文献は、その全体が参考として援用される）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を生成するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するために）などの酵素を用いたタンパク質切断により産生され得る。
【０１４２】
あるいは、活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、組換えＤＮＡ技術およびファージディスプレイ技術の適用を通じて、または当該分野で公知の方法を用いた合成化学を通じて産生され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に呈示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には固体表面またはビーズに結合されたかまたは捕捉された抗原を用いて直接的に選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法に用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え的に融合したＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０、１９９５；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６，１９９５；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８、１９９４；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，１９９７；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０、１９９４；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；ＷＯ９５／２０４０１号；および米国特許第５，６９８、４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号中に開示される方法が挙げられる（これらは、それぞれ全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される全ての目的のために、本明細書中にその全文を参照によりそれぞれ組み入れるものとする。
【０１４３】
上記の参考文献に記載されるように、ファージの選択後に、ファージ由来の領域をコードする領域は単離され、ヒト抗体を含む抗体全体、または任意の他の任意の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、そして哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主中で発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に産生するための技術も、ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：８６４−８６９、１９９２；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４、１９９５；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３、１９８８中に開示されるような当該分野で公知の方法を用いて利用され得る。
【０１４４】
単鎖Ｆｖおよび抗体を生成するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，２５８，４９８号に記載されるものが挙げられ、この文献は全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６−８８、１９９１；Ｓｈｕ、Ｌ．ら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９、１９９３；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０、１９８８。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイにおける用途を含むいくつかの用途のためには、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体の生成のための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２、１９８５；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、１９８６；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１−２０２、１９８９；および米国特許第５，８０７，７１５を参照のこと。抗体は、ＣＤＲ−移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第０  ２３９  ４００号；ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許第５，５３０，１０１および米国特許第５，５８５，０８９号）、表面形成（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０  ５９２  １０６号；欧州特許第０  ５１９  ５９６号；Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８：４８９−４９８、１９９１；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４、１９９４；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３、１９９４）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５、３３２号）を含む種々の技術を用いてヒト化され得る。ヒト抗体は上記のファージディスプレイ方法を含む当該分野で公知の多様な方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号；米国特許第４，７１６，１１１号；米国特許第５，５４５，８０６号；および米国特許第５，８１４，３１８号；およびＷＯ９８／４６６４５号；ＷＯ９８／５０４３３号；ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９８／１６６５４号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；およびＷＯ９１／１０７４１号も参照のこと（この文献はそれぞれ全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０１４５】
本発明のポリペプチドに組換え的に融合させたまたは化学的に結合した（共有結合的および非共有結合的な結合体の両方を含む）抗体が、本発明にさらに含まれる。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に対して特異的であり得る。例えば、抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかで、特定の細胞表面レセプターに対し特異的な抗体に本発明のポリペプチドを融合させるかまたは結合させることによって、特定の細胞型に対して本発明のポリペプチドを標的とするために使用され得る。本発明のポリペプチドに融合させたかまたは結合させた抗体は、当該分野で公知の方法を用いてインビトロイムノアッセイおよび精製方法に使用することもできる。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出、およびＷＯ９３／２１２３２号；欧州特許第０  ４３９  ０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９、１９９４；米国特許第５，４７４，９８１号を参照のこと、この文献は全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２、１９９２；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２、１９９１。
【０１４６】
本発明は、可変領域以外の抗体ドメインに対し融合または結合させた本発明のポリペプチドを含む組成物をさらに包含する。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域、またはその一部に融合または結合され得る。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨｌドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインまたはそれらのドメイン全体もしくは部分の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのインビボでの半減期を増加させるために、または、当該分野で公知の方法を用いたイムノアッセイにおいて使用するために、上記抗体部分と融合または結合され得る。そのポリペプチドはまた、多量体を形成するために上記抗体部分へ融合または結合され得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る。より多量体の形態は、そのポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分へ融合させることにより作製され得る。本発明のポリペプチドの抗体部分への融合または結合のための方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；米国特許第５，６２２，９２９号；米国特許第５，３５９，０４６号；米国特許第５，３４９，０５３号；米国特許第５，４４７，８５１号；米国特許第５，１１２，９４６号；欧州特許第０  ３０７  ４３４、欧州特許第０  ３６７  １６６号；ＷＯ９６／０４３８８号；およびＷＯ９１／０６５７０号を参照のこと（それぞれ全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、ＰＮＡＳ、８８：１０５３５−１０５３９、１９９１；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５５９０−５６００、１９９５；およびＶｉｌら、ＰＮＡＳ、８９：１１３３７−１１３４１、１９９２。
【０１４７】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば本発明は、本発明のポリペプチドを用いて部分的にまたは完全にのいずれかでレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を含む。レセプター特異的な抗体およびリガンド特異的な抗体の両方が含まれる。リガンド結合を抑制しないがレセプターの活性化を抑制するレセプター特異的な抗体が含まれる。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は本明細書中で記載される技術、または当該分野で公知の他の技術により決定され得る。リガンドの結合およびレセプターの活性化をいずれも抑制するレセプター特異的な抗体も含まれる。同様に、リガンドに結合し、リガンドのレセプターへの結合を抑制する中和抗体、ならびにリガンドと結合し、それによりレセプターの活性化を抑制するがレセプターへのリガンドの結合は抑制しない抗体が含まれる。さらにレセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンドに仲介されるレセプターの活性化により影響を受ける生物学的活性の全て、または一部のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る。抗体は、本明細書中で開示される特異的な活性を含む生物学的活性に関するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記抗体アゴニストは当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号を参照のこと、それぞれ全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１９８１−１９８８、１９９８；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５８：３６６８−３６７８、１９９８；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１７８６−１７９４、１９９８；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｄ  Ｒｅｓ．、５８：３２０９−３２１４、１９９８；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：３１７０−３１７９、１９９８；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１１１：２３７−２４７、１９９８；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０５：１７７−１９０、１９９７；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ、９：２３３−２４１、１９９７；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１１２９５−１１３０１、１９７７；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１４：７５５−７６２、１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６：１１５３−１１６７、１９９８；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｍ、８：１４−２０、１９９６。上記のように、転移性細胞上の、活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、次に、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製するために利用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４３７−４４４、１９８９およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２４２９−２４３８、１９９１を参照のこと）。例えば、結合してポリペプチドの多量体化および／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「模倣し」、結果として中和ポリペプチドおよ��／またはそのリガンドに結合する抗イディオタイプ抗体を作製するために使用され得る。このような中和抗イディオタイプ抗体またはこのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片は、ポリペプチドリガンドを中和するために治療的な投薬計画において使用され得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドと結合させるためにおよび／またはそのリガンド／レセプターと結合させるために、そしてそれにより生物学的活性をブロックするために使用され得る。
【０１４８】
転移細胞上の活性化インテグリンレセプターの「インヒビター」「アクチベーター」および「モジュレーター」は、インテグリンレセプター結合またはシグナル伝達のためのインビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いて同定される、阻害分子、活性化分子、または調節分子（例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびそれらのホモログおよび模倣物）をそれぞれ称するために使用される。
【０１４９】
用語「モジュレーター」は、インヒビターおよびアクチベーターを包含する。インヒビターは、例えば、活性化インテグリンレセプターに結合し、部分的または全体的に刺激をブロックし、減少させ、抑制し、活性化を遅延させ、不活化し、脱感作し、または活性を下方制御する物質であり、例えばアンタゴニストである。アクチベーターは、例えば、活性化インテグリンレセプターに結合し、刺激し、増加させ、開放し、活性化し、促進し、活性化を増強し、感作しまたは活性を上方制御する物質であり、例えばアゴニストである。モジュレーターは、例えば、活性化インテグリンレセプターと以下のものとの相互作用を変化させる物質を包含する：タンパク質、ペプチド、脂質、糖質、ポリサッカライド、または例えばリポタンパク質、糖タンパク質などの上記の組み合わせを含むアクチベーターまたはインヒビター、レセプターに結合するタンパク質。モジュレーターは、例えば、変化した活性ならびに天然および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、化学的低分子などを伴う、天然の活性化インテグリンレセプターリガンドの遺伝子改変物を含む。インヒビターおよびアクチベーターのためのそのようなアッセイは、例えば、本明細書中で記載されるように、推定モジュレーター化合物を、活性化インテグリンレセプターを発現する細胞に適用し、次いでインテグリンレセプターシグナル伝達に対するその機能的効果を決定する工程を包含する。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターで処理された活性化インテグリンレセプターを含むサンプルまたはアッセイは、阻害の程度を調べるため、インヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まないコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（インヒビターで処理されていない）の相対的なインテグリンレセプター活性値を１００％とし得る。インテグリンレセプター活性値がコントロールに対して約８０％である場合、必要に応じて５０％または２５〜０％である場合、インテグリンレセプターの活性化の阻害が達成される。コントロールに対するインテグリンレセプター活性値が１１０％、必要に応じて１５０％、必要に応じて２００〜５００％、または１０００〜３０００％以上の場合、インテグリンレセプターの活性化が達成する。
【０１５０】
活性化インテグリンレセプターに結合する分子の能力は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた活性化インテグリンレセプターイムノアドヘシンに結合する推定リガンドの能力により決定され得る。結合の特異性は非活性化インテグリンレセプターへの結合を比較することにより決定され得る。
【０１５１】
一実施形態において、活性化インテグリンレセプターへの抗体の結合は、リガンドまたはレセプターのいずれかを固定化することによりアッセイされ得る。例えば、アッセイは、Ｎｉ−活性化ＮＴＡ樹脂ビーズ上のＨｉｓタグへと融合した活性化インテグリンレセプターの固定化を包含し得る。抗体は適切な緩衝液およびビーズ中に添加され得、所定の温度で一定時間インキュベートされ得る。非結合の物質を洗浄除去後、結合したタンパク質は、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨを有する緩衝液などを用いて放出されて解析され得る。
【０１５２】
（融合タンパク質）
活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、本発明の抗体は、第２のタンパク質に融合させた場合に、抗原性タグとして用いられ得る。活性化インテグリンレセプターに対して惹起された抗体は、そのポリペプチドに対する結合により第２のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、輸送シグナルに基づいた分泌されるタンパク質標的細胞位置により、一旦他のタンパク質に融合すると、インテグリンレセプターは、標的分子として使用され得る。
【０１５３】
ポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみを含むのではなく、他の異種機能的領域も含む。融合は必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。
【０１５４】
さらに、融合タンパク質はまた、そのポリペプチドの特性を向上させるために操作され得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域は、宿主細胞からの精製の間、または次の操作および保存の間の安定性および保存性を向上するためにポリペプチドのＮ−末端に対し付加され得る。また、ペプチド部分は、精製を容易にするためにポリペプチドに添加され得る。このような領域はそのポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの操作を容易にするためのペプチド部分の付加は当該分野で知られており、日常的な技術である。
【０１５５】
さらに、断片および特異的なエピトープを含む抗体組成物または細胞表面レセプター、またはインテグリンレセプターは、イムノグロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせてキメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、増加したインビボでの半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２ドメインおよび哺乳動物イムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。欧州特許出願公開第３９４，８２７号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６、１９８８。（ＩｇＧによって）ジスルフィド架橋された２量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体で分泌されるタンパク質またはタンパク質断片単独の場合よりも、結合および他の分子の中和においてより効率的であり得る。Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４、１９９５。
【０１５６】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４  ５３３号（カナダ出願の第２０４５８６９号に相当する）は、別のヒトタンパク質またはその一部と共にイムノグロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質中のＦｃ部分は治療および診断において有益であり、従って例えば、向上された薬物動態特性を生じ得る（欧州特許出願公開第０２３２  ２６２号）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後でのＦｃ部分の削除が所望され得る。例えば、Ｆｃ部分は、その融合タンパク質が免疫処置のための抗原として使用される場合に、治療および診断を妨げ得る。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５などのヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットなスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８、１９９５；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：９４５９−９４７１，１９９５。
【０１５７】
さらに、ポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を助容易にするペプチドなどのマーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）中で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらのうちで多くのものが市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４、１９８９中に記載されるように、例えばヘキサヒスチジンペプチドは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血液凝集タンパク質に由来するエピトープに相当する。Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７、１９８４．
従って、任意のこれらの上記融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して設計され得る。
【０１５８】
（組換え抗体の発現）
例えば転移細胞上の活性化インテグリンレセプターなどの、細胞表面レセプターに対するキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体は代表的に組換え発現により産生される。組換えポリヌクレオチド構築物は代表的には、天然に結合したまたは異種のプロモーター領域を含む抗体鎖のコーディング配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む。好ましくは、発現調節配列は、真核生物宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションが可能なベクターにおける真核生物のプロモーター系である。一旦このベクターが好適切な宿主の中に導入されると、その宿主はそのヌクレオチド配列を高レベルで発現し、交差反応する抗体を回収し精製するために適切な条件下に維持される。米国特許出願公開第２００２０１９９２１３号を参照のこと、これは全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１５９】
これらの発現ベクターは代表的に、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡに不可欠な部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞を検出可能にするための、例えばアンピシリン耐性、またはハイグロマイシン耐性の選択マーカーを含む。
【０１６０】
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な原核生物宿主の１つである。酵母などの微生物も発現のために有用である。サッカロミセス属は、発現調節配列、複製起源、終結配列および所望される他のものを有する適切なベクターを有する好ましい酵母宿主である。代表的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を含む。誘導的酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素由来のプロモーターが挙げられる。
【０１６１】
哺乳動物細胞は、イムノグロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＮＹ、１９８７を参照のこと。インタクトな異種タンパク質を分泌可能な多数の適切な宿主細胞株が当該分野で開発されており、それらとしては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞株が挙げられる。好ましくは、その細胞は非ヒトのものである。これらの細胞に関する発現ベクターとしては、発現調節配列（例えば、複製起源、プロモーター、エンハンサー）および必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位）が挙げられ得る。Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９、１９８６。好ましい発現調節配列は、外来遺伝子のサイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９、１９９２。
【０１６２】
あるいは、抗体コーディング配列は、トランスジェニック動物のゲノム中に導入し、次いでそのトランスジェニック動物の乳の中に発現させるために導入遺伝子中に組み込まれ得る。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号；米国特許第５，３０４，４８９号；および米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと、それぞれは全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。適切な導入遺伝子としては、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの乳腺特異的な遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な形で連結された軽鎖および／または重鎖をコードする配列が挙げられる。
【０１６３】
目的のＤＮＡ断片を含むベクターは、細胞宿主の型に依存して、周知の方法により宿主細胞へと輸送され得る。例えば、原核細胞に対しては、塩化カルシウムトランスフェクションが通常利用され、一方、他の細胞宿主に対してはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーティクルガン（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）法またはウィルスベースのトランスフェクションが用いられ得る。哺乳動物細胞を形質転換させるために用いられる他の方法としては、ポリブレンの使用、原形質融合、リポソーム、エレクトロポレーション法、およびマイクロインジェクション法（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと）が挙げられる。トランスジェニック動物を作製するために、導入遺伝子は、受精した卵母細胞へとマイクロインジェクションされ得、または胚幹細胞のゲノム中に導入され得、または除核した卵母細胞へとこのような細胞の核は移される。
【０１６４】
一旦発現されると、抗体の集合は培養培地および宿主細胞から精製される。抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該分野の標準的手順に従って精製され得る。通常、抗体鎖は、シグナル配列を伴って発現され、従って培養培地中に放出される。しかし、抗体鎖が天然には宿主細胞により分泌されない場合、その抗体鎖は穏やかな界面活性剤を用いた処理により放出され得る。抗体鎖は次いで、硫安沈殿、固定化標的へのアフィニティークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む従来の方法により精製され得る（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８２を参照のこと）。
【０１６５】
上記方法は、選択された標的に対し特異的な親和性を有する抗体鎖をコードする核酸配列のライブラリーを生じる。この核酸のライブラリーは代表的に、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９の異なるメンバーを有する。通常、単独のメンバーがそのライブラリー中の全配列の２５％または５０％より多くを構成することはない。代表的には、ライブラリーメンバーの少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％または９９．９％が、標的分子に対し特異的な親和性を有する抗体鎖をコードする。２重鎖抗体ライブラリーの場合、重鎖および軽鎖をコードする１組の核酸セグメントそれぞれが、ライブラリーメンバーであるとみなされる。核酸ライブラリーは、遊離形態で存在し得、任意のベクターにおける構成要素として存在し得、またはベクターの構成要素として宿主細胞へとトランスフェクトされ得る。
【０１６６】
核酸ライブラリーは、標的に対し特異的な親和性を有する抗体のポリクローナルライブラリーを作製するために発現され得る。このようなライブラリーの組成は、そのヌクレオチドライブラリーの組成から決定される。従って、このようなライブラリーは代表的に、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９の異なるアミノ酸組成を有するメンバーを有する。通常、単独のメンバーがそのライブラリー中の全ポリペプチドの２５％または５０％以上より多くを構成することはない。標的に対する特異的な親和性を有する抗体鎖ライブラリー中の抗体鎖のパーセンテージは、代表的に、抗体鎖をコードする相当する核酸のパーセンテージよりも低い。この違いは、適切な折り畳みを支持するための好適な１次アミノ酸配列を有しているにもかかわらず、必ずしも全てのポリペプチドが結合のために適切な構造へと折り畳まれるわけではないという事実に起因する。いくつかのライブラリーにおいては、少なくとも２５、５０、７５、９０、９５、９９または９９．９％の抗体鎖が標的分子への特異的な親和性を有する。再び、複数鎖抗体のライブラリーにおいては、各抗体（例えば、Ｆａｂまたはインタクトな抗体）はライブラリーメンバーであるとみなされる。異なる抗体鎖は、標的に対する良好な結合特異性および親和性に関して互いに異なっている。いくつかのこのようなライブラリーは、同一抗原上の異なるエピトープに結合するメンバーを含む。いくつかのこのようなライブラリーは、互いに競合することなく同一の抗原に結合する少なくとも２つのメンバーを含む。
【０１６７】
上述の方法から得られるヒト抗体のポリクローナルライブラリーは、本ライブラリーにおいて高親和性の結合物が高比率を占めることにより、また本ライブラリーが代表的に、天然の集団中に存在する抗体と同じ多様性を示さないことにより、ヒト抗体の天然の集団から区別される。本ライブラリー中で減少される多様性は、全てのヒトイムノグロブリン遺伝子を含まない供給源物質を提供する非ヒトトランスジェニック動物に起因する。例えば、いくつかのポリクローナル抗体ライブラリーは、λ軽鎖を有する抗体を有さない。本発明のいくつかのポリクローナル抗体ライブラリーは、１０、２０、３０または４０未満のＶＨ遺伝子によりコードされる抗体重鎖を有する。本発明のいくつかのポリクローナル抗体ライブラリーは、１０、２０、３０または４０未満のＶＬ遺伝子によりコードされる抗体軽鎖を有する。
【０１６８】
（修飾抗体）
例えば、転移細胞上の活性化インテグリンレセプターなどの細胞表面レセプターに対する修飾抗体もまた本発明に含まれる。
【０１６９】
「修飾抗体」は、化学的に最適化されたか、または分子操作により別の形態へと変化させたヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片の抗体および誘導体をいい、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）または二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）誘導体、または親和性、安定性、もしくは結合価を向上させるための分子進化により得られた改変体が挙げられるが、これらに限定されない。修飾抗体はまた、例えば、その抗体の一部を欠失、付加、または置換することにより修飾されるモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの形態を含む。例えば、定常領域を欠失させ、それを例えば血清半減期等の半減期、安定性または抗体の親和性等を増加させることが意図された定常領域に置き換えることにより、抗体を修飾することができる。
【０１７０】
本発明の抗体結合体は、所定の生物学的応答を改変し、または生物学的応答を作り出すために（例えば、エフェクター細胞を補充するために）使用され得る。薬物部分は古典的な化学治療薬に限定されて構築されるべきではない。例えば、その薬物部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属体外毒素またはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素、またはその活性な断片；腫瘍壊死因子またはインターフェロン−αなどのタンパク質；または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子などの生物学的応答修飾因子が挙げられ得る。他の誘導体としては、ＴＲＩＡＬなどのアポトーシス誘導部分を有する抗体融合タンパク質、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド、ならびに、非浸潤性画像化あるいは腫瘍負荷および微小転移および大型転移を伴う部位への搭載分子の標的化した送達のためのルシフェラーゼまたは蛍光プローブおよびナノ粒子などのレポーター分子を含み得る。
【０１７１】
本発明の特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体および抗体組成物は、例えば、１以上の治療的部分または細胞傷害性部分と結合されまたは複合体化され得る。本明細書中で用いられる場合、「細胞傷害性部分」は単純に、細胞に近接するかまたは細胞に吸収される場合、細胞の生育を阻害するかまたは細胞死を促進する部分を意味する。この点において適切な細胞傷害性部分としては、放射性薬剤または放射性同位体（放射核種）、分化誘導剤、阻害剤および低分子の化学毒物などの化学毒物、毒素タンパク質およびこれらの誘導体ならびにヌクレオチド配列（またはそれらのアンチセンス配列）が挙げられる。従って、その細胞傷害性部分は、非限定的な例として、化学療法薬剤、光活性化毒素または放射性の薬剤であり得る。
【０１７２】
一般的に、治療薬剤は、薬物動態的な安定性および患者に対する全体的な毒性の低減に対する必要性を適切に考慮して、例えば任意の適切な技術によって本発明の抗体および抗体組成物へと結合され得る。治療的な薬剤は、直接的にまたは間接的に（例えばリンカー基を介して）のいずれかで適切な抗体部分へと結合され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、それぞれが他方と反応し得る官能基を有する場合に可能である。例えば、アミノ基、スルフヒドリルなどの求核基は、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニルを含む基と反応可能であり、または良好な脱離基（例えばハロゲン化物）を含むアルキル基と反応可能である。あるいは、適切な化学的リンカー基が用いられ得る。リンカー基は、結合能力への干渉を避けるために、抗体を薬剤から距離を置くためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、抗体の部分上の置換における化学的反応性を増加させるために役割を果たし得、従ってカップリング効率を増加させ得る。化学的反応性の増加はまた、そうでなければ不可能である部分、またはその部分の官能基の使用を促進し得る。
【０１７３】
適切な架橋化学反応は、マレイミドリンカーおよびハロゲン化アルキルリンカー（抗体部分のスルヒドリル基と反応する）およびスクシンイミドリンカー（抗体部分の１級アミンと反応する）を含む。いくつかの１級アミンおよびスルフヒドリル基はイムノグロブリン上に存在し、付加的な基が組換えイムノグロブリン分子へと設計され得る。多様な二官能性または多官能性の試薬の、ホモ機能的およびヘテロ機能的な両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１のカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として利用され得ることは当業者によって明白である。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化糖質残基（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号を参照のこと）を通じて達成され得る。
【０１７４】
別のカップリング方法として、細胞傷害性物質は、例えば、米国特許第５，０５７，３１３号および米国特許第５，１５６，８４０号中に記載されるグリコシル化部位における酸化された糖質基を介して本発明の抗体および抗体組成物に対し結合され得る。さらに別の代替的な、抗体および抗体組成物の細胞傷害性部分または画像化部分へのカップリング方法は、ストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチンのような非共有結合結合対の使用による。これらの実施形態において、その対の１つのメンバーは抗体部分に共有結合的に結合し、結合対のその他のメンバーは共有結合的に細胞障害性部分または画像化部分に結合する。
【０１７５】
本発明の免疫複合体の抗体部分から遊離している時に細胞傷害性部分がより強力である場合、細胞内への内在化の間または内在化の際に開裂可能な、または細胞外環境中に徐々に長期に渡り開裂し得るリンカー基の使用が望ましくあり得る。多数の異なる開裂可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの細胞傷害性部分薬剤の細胞内遊離の機構としては、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定性結合の照射による切断（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補完に仲介される加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解による切断（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号）が挙げられ得る。
【０１７６】
１以上の治療的な、細胞障害性および／または画像化部分を本発明の抗体または抗体組成物へ結合させることが望ましくあり得る。本発明の抗体を多重に誘導体化する（ｐｏｌｙ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ）ことにより、いくつかの細胞障害性の方法が同時に実行され得るか、抗体がいくつかの視覚化技術に対し造影剤として有用となり得るか、または治療的な抗体が視覚化技術により追跡のために標識され得る。一実施形態において、細胞傷害性部分の複数の分子は、１つの抗体分子に対し結合される。別の実施形態において、１以上の型の部分が１つの抗体に結合され得る。例えば、ポリヌクレオチドまたはアンチセンス配列などの治療的な部分は、化学的治療または放射線治療の有効性を高め、ならびに所望の治療的な効果を得るために必要な投薬量を低減させるために、化学毒性部分または放射毒性部分と共に抗体へと結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１以上の部分との免疫複合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１以上の部分が抗体分子に直接的に結合され得、または結合のための複数の部位を提供するリンカー（例えば、デンドリマー）が使用され得る。あるいは、１以上の細胞傷害性部分を保持することが可能なキャリアが使用され得る。
【０１７７】
上記に説明されたように、キャリアは、直接的に、またはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合によるもの、および非共有結合的な会合によるものを含む種々の方法で薬剤を保有し得る。適切な共有結合キャリアとしては、アルブミン（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号）などのタンパク質、ペプチド、およびアミノデキストラン（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号）などの多糖類が挙げられ、その各々は複数の部分の結合のための部位を有する。キャリアはまた、非共有結合などの非共有結合的な会合、またはリポソーム小胞などへのカプセル化（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および米国特許４，８７３，０８８号）により、薬剤を保有し得る。カプセル化キャリアは、化学毒性の治療的な実施形態において特に有用である。なぜならそれらは、化学毒性成分が長期に渡り標的細胞の近傍で濃縮されている間に、治療的な組成物が徐々に放出されるようにすることができるからである。
【０１７８】
細胞毒性部分としての使用にとって好ましい放射性核種は、薬理的投与に適した放射性核種である。このような放射性核種としては１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、および２１２Ｂｉが挙げられる。ヨウ素およびアスタチン同位体は、本発明の治療用組成物において使用するためのより好ましい放射性核種であり、それらの使用に関して多数の文献が蓄積されている。数ミリメートルの有効範囲を有する他のβ放射を放出する放射性核種と同様に、１３１Ｉが特に好ましい。１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または２１１Ａｔは組成物中で使用するために、および、ロドゲン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２１１Ａｔ］アスタトベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−［１３１Ｉ］ヨードベンゾエート（ＳＩＢ）、および、Ｎ−スクシンイミジル５−［１３１Ｉ］ヨード−３−ピリジンカルボキシレート（ＳＩＰＣ）を含む任意のいくつかの公知の結合体試薬を利用する方法において使用するために、抗体部分へと結合体化され得る。任意のヨウ素同位体が列挙されるヨウ素試薬において利用され得る。他の放射性核種が、核医学の分野における当業者に公知の適切なキレート化剤により本発明の抗体または抗体組成物へと結合され得る。
【０１７９】
好ましい化学毒性薬剤としては、メトトレキサートなどの低分子薬物、およびピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい化学毒性の分化誘導因子としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。化学毒性成分は本発明の抗体または抗体組成物と化学的リンカーを介して直接的に結合され得るか、または、同様に本発明の抗体または抗体組成物と組み合わせてキャリア中にカプセル化され得る。
【０１８０】
細胞傷害性部分として使用するための好ましい毒素タンパク質としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス属体外毒素、シゲラ毒素、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、および医薬生化学分野で公知の他の毒素タンパク質が挙げられる。特に血管内に注入される場合、これらの毒素薬剤は患者における望ましくない免疫応答を誘発し得るので、本発明の抗体および抗体組成物に結合するためのキャリア中ではそれらがカプセル化されることが好ましい。
【０１８１】
抗毒素の細胞傷害性部分は、細胞傷害性薬、または細菌もしくは植物起源の酵素的に活性な毒素、あるいはそのような毒素の酵素的に活性な断片（「Ａ鎖」）であり得る。用いられる酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、体外毒素Ａ鎖（シュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシンである。別の実施形態において、抗体は低分子抗癌薬物へ結合される。モノクローナル抗体およびこのような細胞毒性部分の結合体は、多様な二官能性タンパク質カップリング薬剤を用いて作製される。このような試薬の例はＳＰＤＰ、ＩＴ、ジメチルアジポイミデート塩酸などのイミドエステルの二官能性誘導体、スベリン酸ジスクシンイミジルなどの活性なエステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビスアジド化合物、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどのビスジアゾニウム誘導体、トリレン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、および１、５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどの両性活性なフッ素化合物である。毒素の溶解部分は抗体のＦａｂ断片に結合され得る。
【０１８２】
有利なことに、例えば活性化αβ３インテグリンレセプターなどの標的レセプターの外部ドメインに特異的に結合する本発明の抗体および抗体組成物は、リシンＡ鎖へと結合され得る。最も有利には、リシンＡ鎖は、脱グリコシル化され組換え手段を通じて産生される。リシン抗毒素を作製する有利な方法は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８、１０９８、１９８７中に記載され、これは、その全体が参考として援用される。
【０１８３】
本明細書中で用いられる細胞に適用される場合、用語「接触する」は、抗体、抗体組成物、細胞傷害剤または部分、遺伝子、タンパク質および／またはアンチセンス配列が標的細胞へ送達されるか、または標的細胞の近傍に直接置かれるプロセスを記述するために使用される。この送達はインビトロまたはインビボであり得、組換えベクターシステムの使用を包含し得る。
【０１８４】
別の局面において、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素などの治療的な部分に対し結合させた本発明の抗体または抗体組成物あるいはその断片を特徴とする。このような複合体は、本明細書中で「免疫複合体」といわれる。１以上の細胞毒素を含む免疫複合体は、「抗毒素」といわれる。細胞毒素または細胞傷害性物質は、細胞に有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤を含む。例としてはタキソール、サイトハラシンＢ、グラミシディンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、サポリン、ジヒドロキシアントラシンジドン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｄｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。
【０１８５】
本発明の免疫複合体を形成するための適切な治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトレキサレート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化薬（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、その治療的な薬剤は、細胞傷害性物質または放射性毒性剤である。別の実施形態において、治療的な薬剤は、免疫抑制剤である。さらに別の実施形態において、治療的な薬剤は、ＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態において、治療的薬剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ヒドロキシウレアまたはリシンＡである。
【０１８６】
本発明の抗体および抗体組成物はまた、例えば、癌を処置するための細胞障害性放射性医薬品を作製するために、放射性ヨウ素などの放射性毒素に結合され得る。本発明の抗体複合体は、所定の生物学的応答を改変させるために使用され得、その薬物部分は古典的な化学治療剤に限定されて構築されるべきではない。例えば、その薬物部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属体外毒素またはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素、またはこれらの活性な断片；腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γなどのタンパク質；または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子などの生物学的応答修飾因子が挙げられ得る。
【０１８７】
このような治療的部分を抗体へと結合させるための技術は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、ｐｐ．２４３−５６、１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｄｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、ｐｐ．６２３−５３、１９８７；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｉｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｏｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、ｐｐ．４７５−５０６、１９８５；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．３０３−１６  １９８５、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９−５８、１９８２を参照のこと。
【０１８８】
（ポリペプチドまたは抗体組成物の使用）
本明細書中で同定されているポリペプチドまたは抗体組成物のそれぞれ（例えば、細胞表面レセプターに対する抗体、転移細胞上の活性化インテグリンレセプターなどの細胞表面レセプター）は、多くの方法で用いられ得る。以下の記述は例示であるとみなされるべきであり、また公知の技術を利用する。
【０１８９】
本発明のポリペプチドまたは抗体組成物は、抗体をベースにした技術を用いて生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイするために用いられ得る。例えば、組織中でのタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的な方法を用いて研究され得る。Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５、１９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６、１９８７。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体をベースとした方法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、およびヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、などの放射性同位体または他の放射性薬剤、ならびにフルオレセインおよびローダミン、およびビオチンなどの蛍光標識が挙げられる。
【０１９０】
生物学的サンプル中に分泌されるタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タンパク質または抗体組成物はまた画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ線写真、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能な抗体標識またはマーカーが挙げられる。Ｘ線写真のためには、適した標識としては、検出可能な放射腺を放つが被検体には明白には有害ではないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位体が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとしては、関連したｓｃＦｖクローンに対する栄養素を標識することにより抗体へと取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられる。
【０１９１】
放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）などの適切に検出可能な画像化部分を用いて標識されたタンパク質特異的な抗体または抗体断片、放射線不透過物質、または核磁気共鳴により検出可能な物質が哺乳動物へと（例えば、非経口で、皮下、または腹腔内に）導入される。被検体の大きさおよび用いられる画像化システムが診断画像を作成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが、当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被検体に対して、注入される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。標識される抗体または抗体断片は次いで、特異的なタンパク質を含有する細胞の位置において優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １３、１９８２に記載されている。
【０１９２】
従って、本発明は疾患の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞または体液中における本発明の抗体組成物の結合を測定することによりポリペプチドの発現をアッセイする工程；（ｂ）遺伝子発現レベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、それにより、標準的な発現レベルと比較した試験ポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が疾患の指標となる。
【０１９３】
さらに、本発明のポリペプチドまたは抗体組成物は、疾患を処置するために使用され得る。例えば、患者は、欠如または減少されたポリペプチド（例えば、インスリン）のレベルを回復するため、欠如または減少した異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ）のレベルを補充するため、ポリペプチド（例えば、癌遺伝子）の活性を阻害するため、ポリペプチドの活性を活性化するため（例えば、レセプターへの結合により）、遊離のリガンド（例えば、炎症の低減において用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）と競合することにより膜に結合したレセプターの活性を低減させるため、または所望の応答（例えば、血管の成長）を引き起こすための試みにおいて、本発明のポリペプチドまたは抗体組成物を投与され得る。
【０１９４】
同様に、本発明の抗体組成物はまた、疾患の処置に用いられ得る。例えば、本発明のポリペプチドを指向する抗体の投与は、結合してそのポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、膜レセプターへ結合したポリペプチドへの結合などによりそのポリペプチドを活性化し得る。
【０１９５】
（薬学的組成物）
本発明の組成物および方法において有用な、転移性腫瘍細胞上の活性化インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体組成物、リガンド模倣物、これらの誘導体およびアナログは、それ自体をヒト患者へと、立体異性体、プロドラッグ、薬学的に受容可能な塩、水和物、溶媒和物、酸性塩水和物、Ｎ−オキシドまたはその同型の結晶の形態で、またはその化合物が適切なキャリアまたは賦形剤と共に、例えば癌または転移性癌の治療的に有効な量で混合されている薬学的組成物の形態で、投与され得る。
【０１９６】
薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物ならびにその組成物を投与するために用いられる特定の方法により部分的に決定される。従って、その抗体組成物の投与のための広範な種々の適切な薬学的組成物の処方物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １８版、１９９０を参照のこと、この文献は、本明細書中に参考として援用される）。薬学的組成物は一般的に、滅菌され、実質的に等張に処方され、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  ＡｄｍｉｏｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）規則を完全に遵守する。
【０１９７】
（診断的用途）
（診断用試薬としての用途のための本発明の抗体および抗体組成物の特性）
例えば、転移性乳癌細胞などの転移性腫瘍細胞を同定するための、診断的方法に用いるためのヒト抗体は、好ましくは上記の方法を用いて産生される。その方法は、実質的に限定されない数の、任意のエピトープ結合特異性および、任意の所望の抗原に対する非常に高い結合親和性を有する本発明の抗体および抗体組成物を生じる。一般的に、その標的に対する抗体の結合親和性がより高くなるほど、イムノアッセイにおいて標的抗原を除去することなく非特異的に結合した物質を除去するための、よりストリンジェントな洗浄条件が実行可能になる。従って、上記アッセイで用いられる本発明の抗体および抗体組成物は、通常少なくとも１０８、１０９、１０１０，１０１１または１０１２Ｍ−１の結合親和性を有する。さらに、診断用試薬として使用される抗体は、、標準条件下で少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも５時間、およびより好ましくは少なくとも１時間で平衡に達するための十分な速度を有することが望ましい。
【０１９８】
特許請求された方法で用いられる本発明の抗体および抗体組成物は、好ましくは高い免疫反応性、すなわち、それらの標的抗原へ特異的に結合し得るように正確に折り畳まれる抗体分子の高い割合を有する。このようなことは、前述のＥ．ｃｏｌｉ中のこの抗体をコードする配列の発現により達成され得る。このような発現は、通常少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の免疫活性を生じる。
【０１９９】
本発明のいくつかの方法は、本発明の抗体および抗体組成物のポリクローナル調製物を診断用試薬として利用し、他の方法はモノクローナル単離物を利用する。ポリクローナル混合物の使用は、１つのモノクローナル抗体から作製される組成物に対して多数の利点を有する。標的上の複数の部位に対する結合により、単一の部位に結合するモノクローナルのものよりも、ポリクローナル抗体または他のポリペプチドはより強度のシグナル（診断のための）生じ得る。さらに、ポリクローナル調製物は原型的な標的配列の多数の改変体（例えば、対立遺伝子改変体、種改変体、株改変体、薬物誘導性エスケープ改変体）に結合し得るが、一方、モノクローナル抗体は、原型的な配列のみ、またはより狭い範囲のその改変体にしか結合し得ない。しかし、モノクローナル抗体は、密接に関連する抗原が存在するかまたは潜在的に存在する場合に、単一抗原を検出するためには有利である。
【０２００】
前述の方法に従って調製されるポリクローナルヒト抗体を利用する方法において、この調製物は代表的には意図される標的抗原に対する異なるエピトープ特異性を有する抗体の組み合わせを含む。モノクローナル抗体を利用するいくつかの方法において、異なるエピトープ結合特異性を有する二抗体を有することが望ましい。エピトープ結合特異性における差異は、競合アッセイにより決定され得る。
【０２０１】
サンプルおよび標的：任意の種類のサンプルについての診断用試薬としてヒト抗体が使用され得るが、それらはヒトサンプルのための診断用試薬として最も有用である。サンプルは患者の任意の組織または体液から入手され得る。好ましいサンプルの供給源としては、全血、血漿、精液、唾液、涙、尿、便、汗、口腔、皮膚および毛髪が挙げられる。サンプルはまた、体内器官または癌からの生検によって入手され得る。サンプルは診断または研究のために臨床患者から入手され得るか、またはコントロールまたは基礎研究としては疾患ではない被検体から入手され得る。
【０２０２】
この方法は任意の型の標的抗原を検出するために用いられ得る。例示的な標的抗原としては、細菌、真菌および、例えば、ＨＩＶ、肝炎（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、マラリア、リーシュマニア属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのヒト疾患を引き起こすウィルス病原体が挙げられる。他の標的抗原は、その発現レベルまたは組成物がヒト疾患または他の表現型と相関しているヒトタンパク質である。そのような抗原の例としては、接着タンパク質、ホルモン、増殖因子、細胞性レセプター、自己抗原、自動抗体、およびアミロイド沈着が挙げられる。他の目的となる標的としては、癌胎児性抗原などの腫瘍細胞抗原が挙げられる。他の目的となる抗原はクラスＩＭＨＣ抗原およびクラスＩＩＭＨＣ抗原である。
【０２０３】
診断的アッセイのための形式：多様な標準的アッセイ形式の中で所定の標的を検出するために、ヒト抗体が用いられ得る。このような形式としては、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、およびイムノメトリックアッセイが挙げられる。Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出；米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８３９，１５３号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，８７９，２６２号；米国特許第４，０３４，０７４号；米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８３９，１５３号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，８５０，５７８号；米国特許第３，８５３，９８７号；米国特許第３，８６７，５１７号；米国特許第３，８７９，２６２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号；および米国特許第４，０９８，８７６号を参照のこと、それぞれ、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２０４】
イムノメトリックアッセイまたはサンドイッチアッセイは好ましい形式である。米国特許第４，３７６，１１０号；米国特許第４，４８６，５３０号；米国特許第５，９１４，２４１号；および米国特許第５，９６５，３７５号を参照のこと、それぞれ、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。このようなアッセイは固相へと固定化された１つの抗体または抗体の集合を使用し、そして別の抗体または抗体の集合を溶液中で使用する。代表的には、溶液の抗体または抗体の集合を標識する。抗体の集合を使用する場合には、この集合は代表的には、標的抗原内の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を含む。従って、同じ集合を固相および溶液の抗体の両方に用いることが可能である。モノクローナル抗体を使用する場合、異なる結合特異性を有する第１のモノクローナル抗体および第２のモノクローナル抗体が固相および溶液相に対し用いられる。固相および溶液の抗体を順に、または同時のいずれかにより標的抗原と接触させ得る。固相抗体が最初に接触された場合、このアッセイは前向き（ｆｏｒｗａｒｄ）アッセイと称される。逆に、液体の抗体が最初に接触された場合、このアッセイは逆向き（ｒｅｖｅｒｓｅ）アッセイと称される。標的が両方の抗体と同時に接触された場合、このアッセイは同時アッセイと称される。標的に抗体を接触させた後に、サンプルを一定期間インキュベートするが、通常はインキュベートの時間は約１０分〜約２４時間で変動し、通常は約１時間である。次いで、診断用試薬として用いられる抗体に対し特異的に結合しないサンプルの成分を除去するための洗浄工程が行なわれる。固相および溶液の抗体が別個の工程で結合した場合、洗浄は各工程または両方の結合工程後に行われ得る。洗浄後、代表的には、標識された溶液抗体の結合を通じて固相へと連結された標識を検出することによって結合を定量する。通常、所定の対の抗体または抗体の集合、および所定の反応条件について、既知濃度の標的抗原を含むサンプルから検量線が作成される。次いで試験されるサンプル中の抗原濃度を、この検量線に内挿して読み取る。分析物を、平衡において結合している標識された溶液の抗体の量から、あるいは平衡が達成される前の一連の時点における結合した標識溶液抗体の速度論的測定のいずれかによって、測定することができる。このような曲線の傾きは、サンプル中の標的濃度の指標である。
【０２０５】
上記の方法における使用についての適切な支持体としては、例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、および誘導体化したナイロン膜、およびまた、粒子、アガロース、デキストランをベースとしたゲル、ディップスティック、微粒子、ミクロスフィア、磁気粒子、試験管、マイクロタイタープレートウエル、ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）などが挙げられる。固定化は吸着または共有結合によって行なうことができる。必要に応じて、抗体は、アビジンなどの表面結合したリンカーに対する結合のために、ビオチンなどのリンカー分子に対し結合することができる。
【０２０６】
（標識）
アッセイ中で用いられる特定の標識または検出可能な基は、アッセイにおいて使用される抗体の特異的な結合を顕著に抑制しない限りは本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識はイムノアッセイの分野で十分に開発されており、通常、このような方法において有用な最も多い任意の標識が本発明に適用され得る。従って標識は、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明における有用な標識としては、磁気ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン  イソチアシネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１２１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、超微粒気泡などの他の画像化剤（超音波画像化のため）、１８Ｆ、１１Ｃ、１５Ｏ（陽電子放射断層撮影のため）、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ（単一光子放出型断層撮影のため）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡに通常用いられる他の酵素）、および金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの熱量測定的標識が挙げられる。このような標識の使用を記載した特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９３９，３５０号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，２７７，４３７号；米国特許第４，２７５，１４９号；および米国特許第４，３６６，２４１号が挙げられ、それぞれ、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ。）も参照のこと。
【０２０７】
標識は、当該分野で周知の方法に従って、アッセイにおける所望の構成要素へと直接的にまたは間接的に結合させることができる。必要な感度、化合物との結合の容易性、安定性の必要性、入手可能な装置および廃棄の規定等に依存した標識の選択を伴って、上記のように、幅広い種々の標識を使用することができる。
【０２０８】
非放射性の標識はしばしば間接的な手段により結合される。通常、リガンド分子（例えば、ビオチン）は共有結合的に分子へと結合される。リガンドは次いで、固有に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物等のシグナルシステムと共有結合的に結合される、いずれかの抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子と結合する。多数のリガンドおよび抗リガンドが使用され得る。リガンドが、天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキシン、およびコリチゾール）を有する場合、それは標識された天然に存在する抗リガンドと共に使用され得る。あるいは、任意のハプテン化合物または抗原性化合物が、抗体と組み合わせて使用され得る。
【０２０９】
分子はまた、シグナル生成化合物に直接的に、例えば酵素またはフルオロフォアとの結合体化によって結合体化され得る。標識としての所定の酵素は主としてヒドロラーゼであり、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼまたはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、およびルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタルアジンジオン（例えば、ルミノール）を含む化学発光化合物様のものが挙げられる。使用され得る種々の標識またはシグナル生成システムの概説は、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。これは、その全体が全ての目的のために、本明細書において参考として援用される。
【０２１０】
標識の検出手段は当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出手段としては、シンチレーションカウンターが挙げられるか、またはオートラジオグラフィーにおいては写真フィルムである。標識が蛍光性標識である場合は、適切な波長の光によって蛍光色素を励起させ、生じる蛍光を検出することによって、その標識は検出され得る。その蛍光は、写真フィルムまたは電子的検出装置（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管など）により視覚的に検出され得る。同様に、酵素的標識は、その酵素に対する適切な基質を提供し、得られた反応産物を検出することによって、検出され得る。最終的に、単純な熱量標識は、色に関連した標識を観察することによって単純に検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイ（ｄｉｐｓｔｉｃｋ  ａｓｓａｙ）において、種々の結合体化されたビーズがビーズの色を呈するのに対し、複合体された金はしばしばピンク色を呈する。
【０２１１】
いくつかのアッセイ様式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合において、抗原でコーティングされた粒子は標的抗体を含むサンプルによって凝集させられる。この様式においては、この要素のいずれもが標識される必要を有さず、標的抗体の存在は、単純な視覚的観察によって検出される。
【０２１２】
しばしば、活性化インテグリンレセプター、またはαｖβ３インテグリンレセプタータンパク質、および活性化インテグリンレセプターに対する抗体は、検出する可能なシグナルを提供する物質が共有結合または非共有結合のいずれかで連結されることによって標識される。
【０２１３】
（処置レジメン）
本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと共に処方される、１種の抗体または抗体の組み合わせ（例えば、活性化インテグリンレセプターに対する抗体（モノクローナル、ポリクローナルまたは単鎖Ｆｖ；そのインタクトなフラグメントまたはその結合フラグメント）を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの組成物は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の複数の組み合わせ（例えば、２またはそれ以上）を含む。いくつかの組成物において、抗体またはその組成物の抗原結合成分の各々は、別個の、予め選択された抗原のエピトープと結合する、モノクローナル抗体またはヒト配列抗体である。
【０２１４】
予防的適用において、薬学的組成物または医薬は、疾患または状態（すなわち免疫疾患）が疑われるか、さもなければその危険性を有する患者に対し、その危険性を排除または低減させるか、重篤度を減少させるか、または疾患の発症（疾患の生化学的、組織学的および／または行動的な症状、その疾患の進行の間に提示される合併症および中間的な病理学的表現形が挙げられる）を遅延させるために十分な量で投与される。治療的な適用において、組成物または医薬は、このような疾患が疑われるか、またはすでにそのような疾患に苦しんでいる患者に対し、その疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動的な症状）（その疾患の進行における合併症および中間的な病理学的表現型を含む）を治療し、少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。治療的有効用量または予防的な処置を達成する適当な量は、治療的にまたは予防的有効用量と定義される。予防レジメンおよび治療レジメンの両者において、薬剤は通常、十分な免疫応答が達成するまでいくつかの投薬量で投与される。代表的には、上記免疫応答はモニタリングされ、その免疫応答が衰え始める場合には繰り返して投薬が与えられる。
【０２１５】
（有効投薬量）
本明細書中で記載される免疫に関連する状態および疾患（例えば、転移癌）の処置のための、本発明の抗体組成物（例えば、活性化インテグリンレセプターに対する抗体）の有効量は、多くの異なる因子に依存して変動する。この因子としては、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、その患者がヒトであるか動物であるか、投与されるその他の医薬、そして治療が予防的であるか治療的であるかということが挙げられる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた、処理され得るされる。処置投薬量は、安全性および効率性を最適化するために滴定（ｔｉｔｒａｔｅ）される必要がある。
【０２１６】
抗体の投与に関して、投薬量は、宿主の体重１ｋｇあたり、約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常的には０．０１〜５ｍｇの範囲である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。例示的な処置レジメンは、２週間毎に一度、またはひと月に一度、あるいは３〜６か月毎に一度の投与を伴う。いくつかの方法において、投与される各抗体の投薬量が示される範囲内に収まる場合、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与される。抗体は通常複数の場面において投与される。１回の投薬間の間隔は、週ごとでも、月ごとでも、年ごとであってもよい。間隔はまた、患者内の抗体の血中レベルを測定することによって、示されるように、不規則であり得る。いくつかの方法において、１〜１０００μｇ／ｍｌ（そして、いくつかの方法においては２５〜３００μｇ／ｍｌ）の血漿抗体濃度を達成するために、投薬量が調整される。あるいは、より低頻度の投与が必要とされる場合には、抗体は持続性放出処方物として投与され得る。投薬量および頻度は、患者中での抗体の半減期に依存して変化する。通常、ヒト抗体は最長の半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体と続く。投与の投薬量および頻度は、処置が予防的であるか、または治療的であるかに依存して変動し得る。予防的適用においては、長期に渡り比較的少ない投薬量が比較的低頻度の間隔で投与される。残りの一生の間治療を受け続ける患者もいる。治療的な適用においては、疾患の進行が低減されまたは終結するまで、そして好ましくは、患者が部分的にまたは完全に疾患の症状の緩和を示すまで、比較的多くの投薬量が比較的短い間隔で必要とされる時がある。その後、患者は予防レジメンを受け得る。
【０２１７】
免疫原をコードする核酸についての用量は、患者あたり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡである。感染性ウイルスベクターについての用量は、用量あたり１０〜１００、またはそれ以上のウィルス粒子で変動する。
【０２１８】
（投与の経路）
免疫が関連する状態および疾患（例えば、転移癌）を処置するために、免疫応答を誘導するための抗体組成物（例えば、活性化インテグリンレセプターへの抗体）は、非経口手段、局所的手段な、静脈内手段、経口的手段、皮下手段、動脈内手段、頭蓋内手段、腹腔内手段、鼻腔内手段または筋肉内手段によって、脳病変を標的とする抗体調製物のための吸入抗原のような予防処置および／または治療処置のために、投与され得る。免疫原の最も典型的な投与経路は皮下であるが、他の経路も等しく有効であり得る。次に多い共通の経路は筋肉内注射である。この型の注射は、最も代表的には腕または脚の筋肉内に行われる。いくつかの方法においては、薬剤は、沈着物が蓄積している特定の組織へと直接的に注入される（例えば、頭蓋内注射）。筋肉内注射は、静脈内注射よりも抗体の投与のために好ましい。いくつかの方法において、特定の治療的抗体が直接的に頭蓋内に注入される。いくつかの方法において、抗体は持続性放出組成物またはＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイス等のデバイスとして投与される。
【０２１９】
本発明の薬剤は、必要に応じて、種々の免疫関連疾患を含む種々の疾患の処置において、少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。脳への腫瘍転移の場合、本発明の薬剤はまた、本発明の薬剤の血液脳関門（ＢＢＢ）通過を増加させる他の薬物と組み合わせて投与され得  る。
【０２２０】
（処方）
免疫が関連する状態および疾患（例えば、転移癌）を処置するために、免疫応答を誘導するための抗体組成物（例えば、活性化インテグリンレセプターへの抗体）は、活性な治療剤を含む医薬として、すなわち種々の他の薬学的に受容可能な成分を含んで、しばしば投与される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０を参照のこと）。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的適用に依存する。本組成物はまた、所望の処方に依存して、動物またはヒト投与のための薬学的組成物を処方するために通常用いられるビヒクルと定義される、薬学的に受容可能な無毒のキャリアまたは希釈剤を含み得る。希釈剤はその組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼすことがないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝液、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、薬学的組成物または処方物は、他のキャリア、アジュバント、または無毒な、非治療的な、非免疫原的な安定剤等を含み得る。
【０２２１】
薬学的組成物はまた、タンパク質、多糖類（例えば、キトサン）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス官能性ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、アガロース、セルロースなど）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）の大型で、ゆっくりと代謝される巨大分子を含み得る。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激薬剤（すなわち、アジュバント）として機能し得る。
【０２２２】
非経口投与のために、本発明の組成物は、水、油、生理食塩水、グリセロールまたはエタノール等の滅菌された液体であり得る薬学的キャリアを含む生理学的に受容可能な希釈剤中に、その物質の溶液または懸濁液の注入可能な投薬量として投与され得る。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質など）が組成物中に存在し得る。薬学的組成物の他の成分は、例えば落花生油、大豆油、および鉱物油等の、石油、動物、植物または合成的起源のものである。通常、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に、注射可能溶液のための好ましい液体キャリアである。抗体は、活性成分の持続的放出を可能にするような方法で処方され得る蓄積注射またはインプラント調製物の形態で投与され得る。例示的な組成物は、５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなりＨＣｌでｐＨ６．０に調整した水系緩衝液中に処方された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
【０２２３】
代表的には、組成物は液体溶液または懸濁液のいずれかの注入物質として調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液、または液体ビヒクル中の懸濁液に適した固体形態もまた調製可能である。この調製物はまた、上記のようにアジュバント効果を増強するために、リポソームまたは巨大粒子（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはコポリマー）中に乳化されてもよいし、カプセル化されてもよい。Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７、１９９０およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９、１９９７。本発明の薬剤は、蓄積注射、または活性成分の持続的または周期的な放出を可能にする様式で処方され得るインプラント調製物の形態で投与され得る。
【０２２４】
他の投与様式に対して適切なさらなる処方物は、経口用処方物、鼻腔内処方物、および肺処方物、坐剤、および経皮的な適用を含む。
【０２２５】
坐剤について、結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む；このような坐剤は活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含む混合物から形成され得る。経口処方物は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウム等の賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続性放出処方物、または粉末の形状を取り、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含有する。
【０２２６】
局所的な適用は、経皮的送達または皮内送達をもたらし得る。局所的な投与は、コレラ毒素または無毒化した誘導体またはそのサブユニット、あるいはその他の類似の細菌毒素と共に薬剤を同時投与することにより容易にされ得る。Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８５１、１９９８。同時投与は、成分を混合物として、または化学的架橋または融合タンパク質としての発現により得られる架橋分子として使用することにより達成され得る。
【０２２７】
あるいは、経皮的送達は皮膚パッチを用いてか、またはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を用いて達成され得るする。Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：３５２１−２４、１９９５；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８：２０１−１５、１９９８。
【０２２８】
薬学的組成物は、通常、滅菌され、実質的に等張に処方され、食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の品質管理基準（ＧＭＰ）（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）を完全に遵守する。
【０２２９】
（毒性）
好ましくは、本明細書中で記載される治療上有効な量の抗体組成物は、実質的な毒性を生じることなく治療的な恩恵を提供する。
【０２３０】
本明細書中で記載されるタンパク質の毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死となる用量）またはＬＤ１００（集団の１００％が致死となる用量）を決定することによって、決定され得る。毒性効果と治療的効果との間の用量の比が、治療指数である。これらの細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に対し無毒な投薬量範囲を処方する際に使用され得る。本明細書中で記載されるタンパク質の投薬量は、好ましくはほとんど毒性を有さないか、または全く毒性を有さずに有効量を含む循環濃度の範囲内である。この投薬量は、使用される投薬量形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路、および投薬量は、患者の状態に照らして個々の医師により選択され得る（Ｆｉｎｇｌら、１９７５：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ中の第１章を参照のこと）。
【０２３１】
（キット）
本発明の範囲内には、（例えば、モノクローナル抗体、ヒト配列抗体、ヒト抗体、多重特異的分子および二重特異的分子等の）本発明の組成物および使用説明書を含むキットも含まれる。このキットはさらに、少なくとも１つの付加的な試薬、または１以上の付加的な本発明のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる抗原におけるエピトープと結合する、相補的な活性を有するヒト抗体）を含み得る。キットは、代表的には、キットの内容物に関する意図される用途を示すラベルを含む。用語「ラベル」は、任意の記載、またはキット上またはキットと共に供給される記録物質、あるいはさもなければキットに添付された記録物質を包含する。
【０２３２】
明細書中に記載され、さらに以下の実施例に記載される以下のｃＤＮＡクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９に、ブダペスト条約の下で２００４年１１月１２日に寄託されている。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２にあたるこのｃＤＮＡクローンにはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３が付与されている。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５にあたるこのｃＤＮＡクローンにはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４が付与されている。
【実施例】
【０２３３】
（例示的な実施形態）
（実施例１）
（細胞株）
ヒトＭ２１黒色腫およびＵＣＬＡ−Ｐ３肺腺癌細胞を、Ｄｒ．Ｄ．Ｌ．Ｍｏｒｔｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗａｙｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎｔａ  Ｍｏｎｉｃａ、ＣＡより入手した。Ｍ２１−Ｌ細胞を、Ｄｒ．Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手した。Ｍ２１−Ｌ４細胞およびＭ２１−Ｌ１２細胞は、Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９：４２７−４３６、２００２に記載されているものとした。ＭＤＡ−ＭＢ  ４３５ヒト乳癌細胞を、Ｄｒ．Ｊ．Ｅ．Ｐｒｉｃｅ、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸより入手した。免疫欠損マウスの乳房脂肪パッドに親細胞を注入し、上記細胞株に由来する変異体をインビボで肺（肺）または骨（骨）転移から選択した。抗β３サポニン結合体を用いて親細胞を処理することにより、β３インテグリン陰性変異体（β３−）をインビトロで選択した。β３−細胞を、β３野生型（β３ＷＴ）または変異体β３Ｄ７２３Ｒ（β３Ｄ７２３Ｒ）ｃＤＮＡのいずれかによりトランスフェクトした。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８：１８５３−１８５８、２００１。ステージＩＶの乳癌患者の血液サンプルから得た初代転移細胞（ＢＣＭ１、ＢＣＭ２、ＢＭＳ）を、抗上皮抗体ＢｅｒＥＰ４（Ｄｙｎａｌ）を用いた免疫磁気ビーズによる選別によって単離した。これらの細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ  ４３５細胞変異体のレベルと比較可能なレベルのインテグリンαｖβ３を発現する。Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３。細胞をＥＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、ピルビン酸、Ｌ−グルタミン、ビタミンおよび非必須アミノ酸中で培養した。
【０２３４】
（実施例２）
（ｓｃＦｖ抗体ライブラリーおよびファージディスプレイ）
２０名の癌患者（そのうちの５名が乳癌である）から得た末梢血リンパ球の総ＲＮＡから、単鎖Ｆｖ抗体ライブラリーを作製した。このライブラリーから、遺伝子ＩＩＩに対するｓｃＦｖをディスプレイするファージを文献に詳述されている通りにレスキューした。Ｍａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６９５３−６９５８、１９９９。
【０２３５】
タンパク質：組換え組織壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（３量体、５１ｋＤａ）は、厚意によりＳｉｌｉａｎｇ  Ｈｕ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）より提供された。ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（２８．５ｋＤａ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）（５量体、５８ｋＤａ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣＡ１２０、１２０ｋＤａ；「リシン」ＲＣＡ６０、６０  ｋＤａ）はＳｉｇｍａ社より購入した。
【０２３６】
ファージディスプレイベクターｐＣＧＭＴ９の構築：ベクターｐＣＧＭＴ９はｐＣＧＭＴに由来するものとした。プライマーＰ９（５’−ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＴＣＴ−３’）、およびＰ９ｒｅｖ（５’−ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＣＧ−３’）を用い、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３の単鎖ＤＮＡを鋳型として、遺伝子ＩＸ（ｇＩＸ）をＰＣＲにより増幅した。そのＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＮｈｅＩにより消化し、同じ制限酵素を用いて切断したｐＣＧＭＴベクターへと挿入した。このベクター中のｇＩＸの方向を特徴付けるために、ＳｐｅＩ消化およびさらなるＤＮＡ配列決定を行った。
【０２３７】
ｃＤＮＡ鋳型の調製：ＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いることにより、ヒト抹消血リンパ球（ＰＢＬ）の異なる１０サンプルから総ＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とランダムヘキサマーとを用いて、総ＲＮＡから第１鎖のｃＤＮＡを合成した。
【０２３８】
抗体可変領域遺伝子の増幅：ｃＤＮＡおよび先に構築されたｓｃＦｖ−ファージライブラリープラスミドを鋳型として使用し、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子レパートリーの両方をＰＣＲ増幅した。ｃＤＮＡおよびプラスミドの鋳型からＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅するために、Ｖ−Ｂａｓｅ配列リストに収録された先に公表済みの最新の遺伝子セグメントに基づいてプライマーを設計した。全ての１次ＰＣＲ反応を、異なる逆向きプライマーおよび組み合わせられた正方向プライマーを用いて行った。ＶＨ遺伝子レパートリーの増幅のために、１２の異なるヒトＶＨ（ＨＶＨ）逆向きプライマーの１つと、４つのヒト重鎖Ｊ領域（ＨＪＨ）正方向プライマーの等モル混合物とを用いることにより、１２の別々のＰＣＲ反応を設定した。κおよびλＶＬ遺伝子について、個々のＨＶκ／ＨＶλ逆向きプライマーおよびＨＪκ／ＨＪλ正方向プライマーの混合物により規定される１３の別々の反応を用いた同様のアプローチを用いた。２μｌのｃＤＮＡ反応混合物、２μＭのプライマー溶液、２００μＭのｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、および１０μｌのＰｆｕポリメラーゼ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む１００μｌ容量中で、ＰＣＲを実行した。９４℃における５分間の変性後、５単位のＰｆｕポリメラーゼを加え、次いで９４℃で１分間、５７℃で１分間、および７２℃で１分間からなる３０サイクル、そしてサイクリングの終了時に７２℃で１０分間のインキュベートを行った。ＰＣＲ後、種々の反応からは、精製およびアセンブルのため準備する３つの最終的なＶＨ、Ｖκ、およびＶλのプールが得られるように混合された１０の異なるＰＢＬサンプルおよびｓｃＦｖ−ファージライブラリープラスミドの各々からのＶＨ、Ｖκ、およびＶλのサブプールを得た。
【０２３９】
ｓｃＦｖライブラリーの構築：増幅したＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子をアガロース上でゲル精製し、ＶＨフラグメントおよびＶＬフラグメントを鋳型として用いた重複ＰＣＲによってｓｃＦｖ遺伝子を組み立てた。まず、約２０ｎｇのＶＨおよびＶＬの各々を、リンカーを用いてプライマーを用いないＰＣＲにより組み立てた。そこにおいては、このリンカーの末端に作られた相補性を有する短い領域が種々の断片のハイブリダイゼーションを促進した。９４℃、５分間の最初の変性ステップに次いで、プライマーの非存在下で９４℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の５サイクルを行った。外部プライマーＨＶＨ（ＳｆｉＩ）およびＨＪＬ（ＳｆｉＩ）を添加後に、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１．５分間の３０サイクルを実行した。ｓｃＦｖ遺伝子をＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル精製し、同じ制限酵素を用いて切断したファージディスプレイベクターｐＣＧＭＴ９にライゲーションした。約４．５×１０９の独立した形質転換体の多様性を得るために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞へのライゲーション産物のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞を２％グルコース、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、および２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む４０枚のＬＢ寒天（１５０ｍｍ×１０ｍｍ；Ｎｕｎｃ）上にプレートし、３０℃で一晩インキュベートした。このプレートから、１０％グリセロールを含む３００ｍｌのｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（ＳＢ）培地中にクローンを掻き取り、次いで−７０℃で保存した。
【０２４０】
癌患者の血中リンパ球ｃＤＮＡライブラリーから作製したファージディスプレイライブラリーは、約２×１０８個のクローンを含んだ。サブトラクトパンニング（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｐａｎｎｉｎｇ）ストラテジーにおいて、ヒト乳癌細胞モデルの転移性変異体へと特異的に結合し、同じ細胞モデルの非転移性変異体には結合しないクローンを単離した。これらの単離クローンから、３つのアプローチのそれぞれにおいて、さらなる分析および特徴付けのために２０クローンを任意に選び出した。これらの２０クローンの各々に対して、乳癌細胞モデルの転移性変異体と非転移性変異体を比較して、選択的結合特異性を検証した。平均で、選抜した２０クローンのうちの２つが転移細胞にのみ結合し、非転移細胞変異体と転移性細胞変異体との間を厳密に区別した。２つのクローンをさらに分析し、詳細に特徴付けた（ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５）。転移性乳癌変異体に対する特異性を示す残りのｓｃＦｖは、確立された転移性活性を有する細胞と特異的に反応する抗体がサブトラクトパンニングストラテジーによって得られることを示す。これらの抗体は、進行中の研究によりさらに特徴付けられる。
【０２４１】
ｓｃＦｖ−ファージのレスキュー：ｓｃＦｖ−ファージをレスキューするために、２％  グルコース、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１ＬのＳＢ培地に、ライブラリーのグリセロールストックから約５×１０１０の細胞を一晩接種した。培養物を３７℃で、ＯＤ６００が約０．５〜０．７になるまで振盪した。次いで、約４×１０１３のプラークフォーミングユニット（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）のヘルパーファージＶＣＳＭ１３および２ｍｌの０．５Ｍ  イソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。室温で３０分間のインキュベーションの後、この培養物を５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび０．５  ｍＭ  ＩＰＴＧを含む５リットルのＳＢ培地に希釈し、３０℃で２時間増殖させた。次いで、カナマイシンを最終濃度７０μｇ／ｍｌとなるように加え、この培養物を３０℃で一晩増殖させた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌ沈殿によりファージを調製した。
【０２４２】
ｓｃＦｖ−ファージのパンニング：ライブラリーを、３ラウンドまたは４ラウンドのパンニングに供した。イムノチューブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）に吸着させたタンパク質を用いて、特異的なｓｃＦｖ−ファージを親和性により選択した。ＢＳＡ、ＴＮＦ−α、ＳＥＢ、ＣＴＢ、ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０の選択のため、パンニングの第１ラウンドとして５０μｇ／ｍｌ、第２ラウンドとして１０μｇ／ｍｌ、第３および第４ラウンドとして５μｇ／ｍｌのタンパク質ＰＢＳ溶液（１０ｍＭリン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）１ｍｌを用いて、個別のタンパク質で一晩、室温にてイムノチューブをコーティングした。そのイムノチューブを、Ｂｌｏｔｔｏ（４％  スキムミルクＰＢＳ溶液）で１時間室温でブロッキングし、次いで約１０１３ｃｆｕのｓｃＦｖ−ファージを、２％  スキムミルク／２％  ＢＳＡ  ＰＢＳ溶液（ＢＳＡに対するパンニングの時にはＢＳＡは除く）中でイムノチューブへと加えた。室温に保持した２時間のインキュベーション後、結合していないｓｃＦｖ−ファージおよび非特異的結合したｓｃＦｖ−ファージを、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いた１０回の洗浄、ＰＢＳを用いた１０回の洗浄によって溶出させた。特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージを１ｍｌの溶出緩衝液（０．１％  ＢＳＡを含有し、固体グリシンでｐＨ２．２に調整した１００ｍＭ  ＨＣｌ）を用いて、１０分間、室温にて溶出した。溶出物を６０μｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で中和し、新たに調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を感染させるために使用した。このｓｃＦｖ−ファージを次いで増幅し、概略されたようにレスキューし、次のラウンドのパンニングに進んだ。
【０２４３】
ｓｃＦｖファージ結合のＥＬＩＳＡ：ｓｃＦｖ−ファージおよび可溶性ｓｃＦｖの相対的親和性および特異性を６種類のタンパク質抗原に対して評価した。１０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ＴＮＦ−α、ＳＥＢ、ＣＴＢ、ＲＣＡ６０、およびＲＣＡ１２０の溶液を、室温にて一晩マイクロタイタープレート上にコーティングした。残る任意の結合部位をＢｌｏｔｔｏでブロッキングした。一晩の細胞培養物から得たウェルあたり約２５μｌのｓｃＦｖ−ファージまたは可溶性ｓｃＦｖの上清を加え、１時間、３７℃にてインキュベートした。ｓｃＦｖ−ファージ  ＥＬＩＳＡのため、洗浄後に、Ｂｌｏｔｔｏ中に１：１０００で希釈した２５μｌの抗Ｍ１３ｍＡｂ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加し、３０分間、３７℃に置いた。可溶性ｓｃＦｖを用いたＥＬＩＳＡのためには、Ｂｌｏｔｔｏ中の抗フラッグＭ２  ｍＡｂ  ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３０分間、３７℃にてインキュベートした。検出は５０μｌのテトラメチルベンジン基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加を伴い、吸光度を４５０ｎｍにて測定した。
【０２４４】
ｓｃＦｖの精製および親和性測定：ｓｃＦｖ遺伝子を発現ベクターｐＥＴＦｌａｇへとサブクローニングし、発現させて均質に精製した。ＢＩＡｃｏｒｅ装置およびソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、測定された会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）速度定数から解離定数（Ｋｄ）を計算した。ＢＩＡｃｏｒｅの実験のために、タンパク質抗原をＣＭ５チップ上に固定化した。ｓｃＦｖ結合の測定後、チップは７５ｍＭＨＣｌを用いて再生させた。
【０２４５】
（実施例３）
（ファージ抗体のサブトラクトパンニング）
インテグリンαｖβ３と反応するファージディスプレイ抗体を、生存している乳癌細胞上での５ラウンドのサブトラクトパンニングにより単離した。各ラウンドにおいて、そのライブラリー（約５×１０１２  ｃｆｕ）をまず、ＥＭＥＭ、１％ＢＳＡを含まない血清中に懸濁した非活性化αｖβ３を発現する３×１０７のＭＤＡ−ＭＢ４３５変異体細胞上で、室温にて４５分間サブトラクトした。涸渇したライブラリーを次いで活性化αｖβ３を発現する１×１０７のＭＤＡ−ＭＢ４３５変異体細胞上でパンニングした。室温にて３０分後、この細胞を遠心分離し、ＥＭＥＭ中で１０回洗浄した。結合されたｓｃＦｖファージを、１００ｍＭのグリシン／ＨＣｌ、１％ＢＳＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．４を用いて溶出し、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて中和し、大腸菌ＳＬ−１Ｂｌｕｅ中で増幅し、そしてさらなるサブトラクション、選択、精製またはフローサイトメトリーによる細胞結合解析のためにＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて沈殿した。
【０２４６】
ｓｃＦｖの精製：ｓｃｆｖ遺伝子断片を、ｐＥＴＦｌａｇ（ｐＥＴ−１５ｂ由来、Ｎｏｖａｇｅｎ）へとサブクローニングし、また大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）へと形質転換した。発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、抗Ｆｌａｇ  ｍＡｂ  Ｍ２アフィニティーアガロース（Ｓｉｇｍａ）上でＦＬＡＧ−タグ化ｓｃＦｖ断片を記載の通りに精製した。Ｍａｏ、Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９６：６９５３−６９５８、１９９９；Ｇａｏ、Ｃ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７４：１８５−１９７、２００３。モノメリックなｓｃＦｖはＳｅｐｈａｃｒｙｌ−１００  ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。
【０２４７】
フローサイトメトリー：ヒト腫瘍細胞へのｓｃＦｖの結合を、まずクローンされたｓｃＦｖファージを用い、次いで精製ｓｃＦｖタンパク質を用いて、フローサイトメトリーにより解析した。１サンプルあたり、２×１０５個の腫瘍細胞をヤギ血清でブロックし、ｓｃＦｖファージ（２〜５×１０１０）（１時間、室温）、次いでマウス抗Ｍ１３ｍＡｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）（３０分間、氷上）およびヤギ  ＦＩＴＣ−抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ）（３０分間、氷上）とともにか、あるいは精製ｓｃＦｖ（１．２５〜４０μｇ／ｍｌ、定型的には１０〜ｌ５μｇ／ｍｌ）（４５分間、氷上）、次いでマウス抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）（３０分間、氷上）およびヤギＦＩＴＣ−抗マウスとのいずれかとともにインキュベートした。結合／洗浄バッファーは２価の陽イオン（１ｍＭのＣａ２＋、１ｍＭのＭｇ２＋、０．２ｍＭのＭｎ２＋）を含むあるいは含まないＴＢＳであった。あるいは、腫瘍細胞を１０ｍｌの血漿（５０ｎＭのＤ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−アルギニルクロロメチルケトン、ＰＰＡＣＫ、Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５８９２−５９００、１９９６により抗凝固処理されたヒト血液から新たに調製された）中で洗浄し、血漿中に再懸濁し、引き続いて、洗浄することなく、精製ｓｃＦｖ（４５分間、氷上）、次いで抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（３０分間、氷上）およびＦＩＴＣ−抗マウス（３０分間、氷上）と共にインキュベートした。全てのサンプルをヨードプロピジウム（ＰＩ）で逆染色し、ＰＩ陽性の細胞を除外するためのライブゲートセットを用いてＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ上で解析した。
【０２４８】
ｓｃＦｖの配列解析：選択されたクローンの核酸配列解析を３７３−Ａ  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。全ての配列をＫａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上で検索し、それらを先に配列解析されたＶＨおよびＶＬ鎖と比較し、またＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｇｅｎｅｔｉｋ．ｕｎｉ−Ｋｏｅｌｎ．ｄｅ／ｄｎａｐｌｏｔ）においてｓｃＦｖと可能性ある生殖細胞系列遺伝子配列との相関を提案し、Ｖ−部位の利用を調べるために検索した。アラインメントにはＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅを用いた。
【０２４９】
細胞接着および移動：定常条件下での腫瘍細胞接着を上述ように解析した（１９）。接着バッファーはＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２であった。阻害については、細胞を５分間室温にて３μＭのｓｃＦｖまたは２００μＭのＧＲＧＤＳＰＫペプチドのいずれかと共にインキュベートし、次いで阻害剤存在下でプレーティングして、３０分間、３７℃において接着させた。フィブリノゲンに向かう走触性の腫瘍細胞の移動を、上述のようにトランスウェルチャンバー（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）中で解析した（Ｒｏｌｌｉ、Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３）。アッセイの前に、腫瘍細胞を、血清非含有のＥＭＥＭ中で１６時間、３７℃にて飢餓状態にし、洗浄し、次いでＥＭＥＭを含まない血清中で、２μＭのｓｃＦｖまたは２００μＭのＧＲＧＤＳＰＫペプチドの存在または非存在下で１６時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下において移動を可能した。
【０２５０】
血流中での腫瘍細胞の捕捉：血流および血小板との相互作用の間における乳癌細胞の捕捉を、記載される通りに測定した（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８：１８５３−１８５８、２００１。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７１：５８９２−５９００、１９９６）。手短にいえば、腫瘍細胞を、５０ｎＭのＰＰＡＣＫを用いて抗凝固処理されたヒト血液中に懸濁し、５０ｓ−１、２ダイン／ｃｍ２の静脈壁剪断速度においてコラーゲンＩマトリックス上に灌流した。接着事象および細胞相互作用を、蛍光ビデオ顕微鏡検査によって視覚化し、記録し、３０の所定の位置における画像の蓄積によって定量化し、コンピュータ画像解析（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）した。腫瘍細胞をヒドロエチジン（赤色蛍光）（２０μｇ／ｍｌ、３０分間、３７℃）を用いて染色し、洗浄し、１０μＭのメパクリン（緑色蛍光）を含む血液と混合した。血液細胞、腫瘍細胞、および血小板は緑色蛍光を発するようになり、４８８／５１５ｎｍ（励起／発光）において視覚化した。腫瘍細胞を、５４３／５９０ｎｍにおける固有の赤色蛍光によって同定した。阻害を試験するために、腫瘍細胞を３μＭのｓｃＦｖと共に５分間、３７℃でインキュベートし、次いで血液と混合し、ｓｃＦｖ終濃度が３μＭとなるように添加して直ちに灌流した。
【０２５１】
抗体の内在化：チャンバースライドウェル中で生育させた乳癌細胞を、血清非含有のＥＭＥＭ中で２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ｓｃＦｖと共に３時間、４℃または３７℃にてインキュベートし、１０回洗浄し、９５％エタノールで固定し、浸透し、ヨードプロピジウムを用いて染色してアンチフェイド（ａｎｔｉｆａｄｅ）溶液中でマウントし、レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて解析した。
【０２５２】
インビボ転移試験：１×１０５のＢＭＳヒト転移性乳癌細胞を、５０μｇの静脈ボーラス量のｓｃＦｖと共に９週齢のメスＣ．Ｂ１７／ｌｃｒＴａｃ−Ｐｒｋｄｃ  ｓｃｉｄマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）（ｎ＝８から１０）の外側尾部静脈へと注入した。５０μｌのｓｃＦｖボーラス量の注入を、実験の２日目、３日目および４日目に繰り返した。コントロール動物には、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）を注入した。インビボで使用するために、Ｄｅｔｏｘｙ−Ｇｅｌレジン（Ｐｉｅｒｃｅ）上でｓｃＦｖ調製物からエンドトキシンを除去した。残留する痕跡は、０．００１〜０．０７ＥＵのエンドトキシン／ｍｇのｓｃＦｖ（ＬＡＬ  ｔｅｓｔ，Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）であった。３２日目にマウスを安楽死させ、解剖して、肺を摘出してＢｏｕｉｎ溶液中に固定し、解剖顕微鏡下で肺表面の転移性病巣を計数した。同じ肺をパラフィンに包埋し、１０μｍの切片を切り出し、ヘマトキシリン／エオシンを用いて染色した。１つの肺あたり７セットの、３枚の連続した切片を集め、１４０μｍごとに離して置いた。その切片を無作為化しかつコード化して、転移性病巣の総数を計数した。
【０２５３】
確立された転移性疾患を有するマウスを治療するために、構成的に活性化αｖβ３Ｄ７２３Ｒを発現する５×１０５のＤｓＲｅｄ２タグ化ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞を静脈へと注入した。コントロール群の全てのマウスが１週間後に肺転移を発現してから、治療群のマウスに静脈内に４０μｇのｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５を、またはコントロールとしてｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５を、腫瘍細胞の接種後７、９、１１、１４、１６および１８日後に注入した。マウスは１９日目に安楽死させ、肺転移を蛍光顕微鏡下で計数した。動物の取り扱いおよび使用はＮＩＨおよびＡＡＡＬＡＣのガイドラインに従った。
【０２５４】
（実施例４）
（癌患者由来ｓｃＦｖ抗体は活性化依存的に腫瘍細胞インテグリンαｖβ３を認識する）
活性化αｖβ３と特異的に反応する治療用試薬を製造するために、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）のファージディスプレイライブラリーを開発した。このライブラリーは、癌患者血液リンパ球ｃＤＮＡライブラリーに由来し、発現された免疫レパートリーがインテグリンαｖβ３を認識する抗体を含むという仮説を調査し、その活性化形態と非活性化形態を識別することを本発明者らに可能にした（Ｍａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９６：６９５３−６９５８、１９９９）。ＭＤＡ−ＭＢ４３５ヒト乳癌細胞変異体に基づくサブトラクトパンニング手法を設計した。親細胞群の大半は非活性化αｖβ３を発現するが、活性化レセプターを発現する細胞のサブセットを含むことが示された。免疫欠損マウス中の肺および骨転移から単離された変異体細胞が構成的に活性化αｖβ３を発現することから、明らかに、これらの細胞が転移中に選択される。非活性化αｖβ３を均一に発現する細胞群を確立するために、ＭＤＡ−ＭＢ４３５親細胞を限界希釈法によりクローニングし、クローンをαｖβ３の機能について試験した。レセプターがフィブリノゲン指向性の移動および血流中におけるαｖβ３依存性の腫瘍細胞の捕捉を支持しない２０個のクローンを同定し、このレセプターが非活性化インテグリンであることを確認した。プールされたクローン（親Ｃｏｍｂｏ）は、親の群と匹敵し得るレベルでαｖβ３を発現した。構成的に活性形態であるαｖβ３を発現する細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｌｕｎｇ−Ｌｕｎｇを確立した。この変異体は、乳房脂肪パッドに親ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞が注入された免疫欠損マウスの肺転移から得られる（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８：１８５３−１８５８、２００１；Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３）。血流から肺へのコロニー化能力を高めるために、肺変異体を続いて静脈内に注入し、切除した肺から得た腫瘍細胞をその後３週間培養した。親Ｃｏｍｂｏ細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞変異体により共有される抗原に対する抗体を除去する目的で、ｓｃＦｖファージライブラリーをサブトラクトするために用いられる。５ラウンドのサブトラクション、および、親Ｃｏｍｂｏ細胞におけるファージライブラリーおよびＬｕｎｇ−Ｌｕｎｇ細胞におけるパンニングの後、ｓｃＦｖクローンを、ヒト腫瘍細胞上のインテグリンαｖβ３に結合するための能力、およびレセプターの活性化および非活性化形態を区別するためのそれらの能力について、フローサイトメトリーによって解析した（図１）。各クローンは、αｖβ３を発現するまたはそれを欠如しているかのいずれかであるが、その他のインテグリンサブユニットとの組み合わせの中で、各クローンをαｖまたはβ３を発現するヒト腫瘍細胞の群において試験した。これらはＭ２１黒色腫細胞（αｖβ３、その他のβ３インテグリンを有さない）、Ｍ２１−ＬＩＩｂ細胞（αＩＩｂβ３、αｖインテグリンを有さない）、およびＵＣＬＡ−Ｐ３肺腺癌細胞（αｖインテグリン、しかしαｖβ３を有さない）であった。αｖβ３ヘテロダイマーを発現する細胞とのみ反応する２つのｓｃＦ��クローン、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５が同定された。第３のｓｃＦｖクローン、Ｂｃ−２０は、結合したβサブユニットに関わらずαｖ陽性細胞と反応した（図１Ａ）。Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５はＭ２１−Ｌ細胞（αｖインテグリンを有さない）と結合できなかったが、Ｍ２１−Ｌ４細胞とは反応し、そこにおいαｖβ３の発現はトランスフェクションによって回復し、αｖβ３とそれらとの反応性を保証した（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９：４２７−４３６、２００２）。
【０２５５】
Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５によるαｖβ３の認識は、陽イオン依存性を示した。結合は生理学的なＣａ２＋レベルの存在下で測定可能であり、インテグリンを活性化し得る金属イオンであるＭｎ２＋の存在下で顕著に促進される（図１Ａ、Ｂ）。このことをさらに試験するために、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５の結合に関する陽イオンの組み合わせ効果を試験した。Ｍｇ２＋はＢｃ−１２およびＢｃ−１５の結合をＣａ２＋同レベルで支持し、Ｃａ２＋はＭｎ２＋による促進効果を低減させた（図１Ｂ）。ＳｃＦｖＢｃ−２０のαｖ陽性細胞への結合は２価の金属陽イオンを必要としなかった。このことは、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５が優先的に活性化インテグリンαｖβ３を認識することを示し、また、結合の必要性が、フィブリノゲン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチン等のこのレセプターにおける天然の血漿タンパク質リガンドを連想することを示す（Ｓｍｉｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６９：２４７−２５９、２００２；Ｈｕｇｈｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６５７１−６５７４、１９９６）。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５が  αｖβ３をその活性化形態において選択的に認識することを確認するために、ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞モデルにおけるインビトロで作製されかつインビボで選択された変異体に対するこれらの抗体の結合を試験した。Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５はβ３陰性ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞（β３−）およびこれらの細胞の誘導体を発現するβ３野生型（β３ＷＴ）には結合し得なかったが、その後者は、Ｍｎ２＋を用いて活性化したときには認識した。同様のＭｎ２＋依存性は、非活性化αｖβ３を発現するＭＤＡ−ＭＢ４３５親Ｃｏｍｂｏ細胞については事実であった（図１Ｃ）。対照的に、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、Ｍｎ２＋による外在的な刺激を伴うことなく、構成的に活性化されている変異体αｖβ３Ｄ７２３Ｒを発現するＭＤＡ−ＭＢ４３５変異体と結合することができた。Ｍｎ２＋を加えると結合はさらに促進された。重大なことに、ｓｃＦｖｓ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、骨および肺転移、ならびに乳癌患者血液サンプルから単離された転移細胞由来のインビボで選択されたＭＤＡ−ＭＢ４３５変異体を認識する（図１Ｃ）。これらの細胞は構成的に活性形態であるαｖβ３を発現する（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８：１８５３−１８５８、２００１；Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３）。従って、これらの結果は、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５がαｖβ３を認識し活性化された高親和性状態でのその症状（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を求めることを示す。
【０２５６】
（活性化αｖβ３に対する患者由来のｓｃＦｖ抗体は天然のリガンド模倣物である）
患者由来のｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、αｖβ３を発現する腫瘍細胞と結合するために２価の金属陽イオンを必要とし、このレセプターは活性化された機能的形態で存在しなければならないという知見は、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５がαｖβ３の天然のリガンドに類似するということを示す。ｓｃＦｖ抗体と天然のリガンドとの間の類似性を分析するために、Ｂｃ−１２、Ｂｃ−１５およびＢｃ−２０のＤＮＡ配列を決定し、翻訳した（図２Ａ）。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２ｃＤＮＡおよびｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を図２Ｃに示す。タンパク質配列は、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５における重鎖の第３の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）がＲＧＤリガンド認識モチーフを含むことを示した。天然のαｖβ３リガンドに共通のこのモチーフは、Ｂｃ−２０においては欠如している（図２）。ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５のＣＤＲ−Ｈ３におけるＲＧＤモチーフの、活性化インテグリンαｖβ３に対するそれらの特異性への寄与を調べるために、この配列を部位特異的変異誘発法によりＲＧＥに変化させた。ＲＧＤモチーフ内のＤからＥへの変更で、αｖβ３によるリガンド認識が減少するかまたは完全になくなることが知られている。変異したｓｃＦｖのヒト乳癌細胞への結合は、Ｂｃ−１２のＲＧＥ版であるＭｕｔ−１２では強力に低減化され、そしてＢｃ−１５のＲＧＥ版であるＭｕｔ−１５では無効になった（図２Ｂ）。このことはＲＧＤ結合が非常に決定的に抗体−抗原認識を決定することを示す。しかし、これらの抗体は、既知のＲＧＤ結合レセプターである、αｖβ３に関連した血小板インテグリンαＩＩｂβ３とも、他のαｖインテグリン（すなわち、α５β１）とも反応しなかった（図１）。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２：６９７−７１５，１９９６。このことは、共同作用的結合領域が存在し得、抗体の３次構造およびＲＧＤ配列の両方からのαｖβ３の活性化立体構造の観察される選択的認識配列への寄与を伴うことが示唆される。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５に対するｃＤＮＡ配列を図２Ｃに示す。ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１２およびｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５に対するｃＤＮＡ配列を図２Ｄに示す。
【０２５７】
（リガンド模倣物ｓｃＦｖ抗体は、αｖβ３が仲介する接着性腫瘍細胞機能を阻害する）
患者由来のｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は明らかにインテグリンαｖβ３の天然のリガンドを模倣するので、これらの抗体はαｖβ３が仲介するリガンドの結合および接着性腫瘍細胞機能を妨害し得るという仮説が立てられた。定常的条件下で適用した場合、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、これらの細胞中でαｖβ３により独占的に仲介されるプロセスである、固定化されたフィブリノゲンに対するＢＭＳヒト乳癌細胞の接着を効果的に阻害した。Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３。３μＭ  ｓｃＦｖによる阻害の程度は、フィブロネクチン由来ペプチドである２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫにより観察されるものと類似であった（図３Ａ）。ビトロネクチンへのＢＭＳ細胞の接着もまたＢｃ−１２およびＢｃ−１５により阻害されたが、より低い程度までの阻害であった。このタンパク質への接着はこれらの細胞上の他のαｖインテグリンと共にαｖβ３により仲介される。この抗体は、主としてαｖβ３を含まないＢＭＳ細胞インテグリンα２β１により仲介されるＩ型コラーゲンへの乳癌細胞接着に対しては効果を有さなかった。腫瘍細胞の播種のために重大な別の機能は、マトリックス指向性移動である。腫瘍細胞はしばしば、接着性血漿タンパク質が腫瘍領域へと漏れ出す原因となる血管透過因子を産生する。ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５３８１−５３８５、２００２。すなわち、これらのタンパク質のうちで最も多量に存在するフィブリノゲンおよび重合フィブリンの勾配は、腫瘍を支持する血管へと向けて転移細胞を導き得る。乳癌細胞モデルにおいて、固定化フィブリノゲンまたはフィブリンに向かう移動は、インテグリンαｖβ３により独占的に仲介され、そのレセプターの活性化状態を必要とする。Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３。従って、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５がフィブリノゲン指向性移動に影響を与え得るかどうかについて調べた。２μＭの濃度において、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、ＢＭＳヒト乳癌細胞の移動をほとんど完全に阻害した。この効果は２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫペプチドで見られた効果と同様であった（図３Ｂ）。ＲＧＥを含有するｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５は、フィブリノゲン指向性移動に対して全く効果を示さず、Ｍｕｔ−１２はわずかな効果のみを示した。
【０２５８】
循環中で、転移性腫瘍細胞は、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５のような強力な機能のブロッキング抗体と対決する癌患者の免疫監視に激しくさらされる。転移細胞に向かうこの環境における闘いは、標的器官のコロニー化のために必須なプロセスである脈管構造内の腫瘍細胞捕捉とは物理的に対立する、血流により生成される力を分け合うことにより強化される。乳癌細胞インテグリンαｖβ３がその活性化形態において血流中の転移細胞の捕捉を支持し得ることが立証されてきている。従って、脈管構造中の血流条件を模倣するために、そしてリガンド模倣物ｓｃＦｖ抗体が乳癌細胞の捕捉を干渉し得るかどうかを試験するために実験を計画した。ＢＭＳ乳癌細胞を赤色蛍光染料により予め染色し、緑色蛍光染料と混合されたヒト血液へと混合した。この混合物は、５０ｓｅｃ−１の静脈壁剪断速度において血栓形成性のＩ型コラーゲンマトリックス上に渡り灌流した。このマトリックス上で、血小板が容易に接着し、活性化する。Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１２２７−１２３４、２００２。このことが活性化血小板インテグリンαＩＩｂβ３により仲介される血栓形成の局在を引き起こす。活性化インテグリンαｖβ３を発現する乳癌細胞は、血流の間に血小板と相互作用し、接着表面に形成される血栓に対し付着するためにこのレセプターを利用し得る。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８：１８５３−１８５８，２００１。ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、このプロセスを十分に阻害し、一方、非ＲＧＤを含む抗αｖ抗体Ｂｃ−２０は効果を示さなかった（図３Ｃ）。同様の結果を他の転移性乳癌細胞株についても得た。ＲＧＥを含むｓｃＦｖ変異体Ｍｕｔ−１２およびＭｕｔ−１５は、血流の間に、乳癌細胞の捕捉に全く影響を与えなかった。これらの結果は、機能的に活性化された形態のインテグリンαｖβ３を認識するリガンド模倣物ｓｃＦｖ抗体が、乳癌細胞の血小板との相互作用をブロックし得、それにより血流中での癌細胞の捕捉を阻害することを示す。インテグリンαＩＩｂβ３に仲介される接着性血小板機能は、この抗体によっては影響を受けなかった（図３Ｃ、左図）。
【０２５９】
リガンド模倣物としては、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は乳癌細胞接着機能のみならず細胞の生存にも影響を与え得る。αｖβ３に対するリガンド結合の破壊がアポトーシスを刺激し得ることが立証されてきている。Ｓｔｕｐａｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５：４５９−４７０、２００１。代替的経路を経由して、化合物を含む内在化されたＲＧＤは、代替的な経路を経由した前アポトーシス酵素であるカスパーゼ３を活性化することにより、直接的に細胞死を誘導し得る。Ｂｕｃｋｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：５３４−５３９、１９９９。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、許容温度において十分に結合し、かつ付着性のＢＭＳ乳癌細胞により迅速に内在化された。患者の血液サンプルから単離した数種類のヒト乳癌細胞株の増殖は、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５を含むＲＧＤの存在下で妨害され、一方、それらのＲＧＥ変異体版であるＭｕｔ−１２およびＭｕｔ−１５は効果を示さなかった（図３Ｄ）。さらに、循環中に生じるような、乳癌細胞の接着性マトリックスが除去された時においては、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２にさらされることがアポトーシス性の細胞死をもたらした（図３Ｅ）。従って、患者由来のリガンド模倣物抗体は、活性化インテグリンαｖβ３の特異的な接着機能を破壊し得、このレセプターを有する腫瘍細胞の増殖挙動に影響し得る。
【０２６０】
（活性化αｖβ３に対するｓｃＦｖ抗体の抗転移活性は、インビボで血行性乳癌の転移を阻害する）
癌患者の免疫レパートリーが、活性化されていて、転移を支持する形態のインテグリンαｖβ３を特異的に認識する抗体を含むということはすでに示されているので、研究される次の重要な局面は、循環する腫瘍細胞へのこれらの抗体の結合が血流からの転移に影響を与えるかどうかということであった。そのような微小環境において有効であるためには、この抗体は血液中または血漿中で腫瘍細胞インテグリンαｖβ３と結合する必要がある。血液潅流に関する研究によって、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５が血流中の乳癌細胞の捕捉を阻害し得ることが示されており、このことは、これらの抗体がその条件下において腫瘍細胞を認識することを示している。このことを確認するために、ＢＭＳ乳癌細胞を、新鮮なヒト血漿中でＢｃ−１２またはＢｃ−１５の濃度を増加させながら一緒にインキュベートした。４０ｎＭ  ｓｃＦｖ（１μｇ／ｍｌ）において測定した最大結合量の半分を有する飽和可能な様式で抗体は細胞と結合した（図４）。他の転移性乳癌細胞株を用いて同様の結果を得た。このことは、ＲＧＤを含むｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５が多数のＲＧＤ含有血漿タンパク質の存在下で（その中で最も豊富なのは６〜１２μＭの生理学的血漿濃度のフィブリノゲンである）腫瘍細胞インテグリンαｖβ３と結合することを示す。
【０２６１】
リガンド模倣抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５による活性化インテグリンαｖβ３への標的化が、循環する転移性乳癌細胞による標的器官のコロニー化に影響するかどうかを直接調べるために、１×１０５個のＢＭＳヒト乳癌細胞を、メスのＣ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウスの静脈内に、滅菌された、エンドトキシンを含まない、５０μｇのＢｃ−１２またはＢｃ−１５調製物とともに注入した（ｎ＝１群あたりマウス８〜１０匹）。マウスあたりの平均的血液容量２ｍｌにおいて、このこのは１μＭの初期ｓｃＦｖ濃度を提供する。循環中のｓｃＦｖ抗体フラグメントのクリアランス時間は１時間未満である。Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、１８：９５−１０８、２００１。腫瘍細胞は循環中で数日間残存し得る。従って、ｓｃＦｖ抗体注入（５０μｇボーラス用量、静注）を２日目、３日目および４日目に繰り返した。抗体処理したマウスおよびコントロールのマウスは実験中健康に見えた。３２日後、マウスを安楽死させ、解剖し、肉眼的検査により分析した。明白な異常は観察されなかった。肺を切除し、固定して、次いで、肺表面の転移性病巣を計数した。コントロール処理された各マウスは肺に腫瘍病巣を有していた（範囲：肺あたり８〜６８病巣）。全く対照的に、Ｂｃ−１２処理された群ではわずか２匹の動物が、また、Ｂｃ−１５処理された群ではわずか１匹の動物が、肺表面に目視し得る小塊を有していた（図５Ａ）。より多くの細胞用量および異なる乳癌細胞型（３×１０５個のＢＣＭ１細胞／マウス）を用いた、よりチャレンジングな条件下の第２の実験において同様の結果を得た。
【０２６２】
ｓｃＦｖ処置が肺組織への転移コロニー化を減少したか、または実際に抑制したかどうかを分析するために、各マウスの肺をパラフィン中に包埋し、切片化して、ヘマトキシリン／エオシンを用いて染色し、次いで、肺組織内の転移性コロニーの痕跡について組織学的に調べた。肺あたり、１４０μｍ毎に切断した３つの連続する切片を６セット回収した。これらの切片をランダム化し、コードを付けて転移性病巣の合計数を計数した。全てのコントロール動物が肺組織に転移を有しており（範囲：肺あたり７〜４８カウント）、それらは相当な大きさであった（図５Ｂ  上部イメージ）。対照的に、Ｂｃ−１２処理されたマウスは１０匹のうちわずか３匹、そしてＢｃ−１５処理されたマウスは９匹のうちわずか１匹しか、肺組織に顕微鏡で検出可能な転移を有していなかった（範囲：肺あたり０〜５カウント）（図５Ｂ）。従って、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２またはＢｃ−１５の注入は、循環する乳癌細胞による肺でのコロニー化を統計学的に有意なレベル（Ｐ＜０．００５）に干渉した。
【０２６３】
合わせて考えると、このデータは少なくとも数名の癌患者の循環する免疫レパートリーがインテグリンαｖβ３の活性化形態に対する抗体を含むことを示唆する。これらの天然に存在する抗体のインビトロ増幅によって、循環する転移細胞の重要な機能を破壊し、それによりインビボでの乳癌転移を阻害することについて、それらの特異性および可能性が実証した。臨床的に関連する次なる問いは、αｖβ３の活性化形態を標的とすることが、確立された胸部腫瘍および進行中の自然発生的転移を干渉し得るかどうかである。転移細胞ならびに腫瘍を支える血管新生内皮細胞が、構成的に活性化インテグリンαｖβ３を発現することによって正常な接着特性、移動特性および浸潤性特性の正常な制御を明らかに無視するので、このことは説得力を有すると思われる。Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８：１８５３−１８５８、２００１；Ｋｉｏｓｓｅｓら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：３１６−３２０、２００１。
【０２６４】
（実施例５）
（哺乳動物被検体における転移性癌の診断、予後および治療、）
これらの研究は、癌患者のコンビナトリアル抗体ライブラリーが疾患治療能力を有する抗体を含有することを示した。研究により、このような抗体がインビトロで単離され得、これらの抗体が実験動物モデルにおいて転移を阻害するために用いられ得ることが立証されている。この知見に基づいて、転移性癌の長期生存者である患者から得た抗体ライブラリーからは疾患治療能力を有する類似の抗体が高頻度で見いだされると期待され得る。このようなライブラリーが作製され、こうした抗体の存在について探索され得る。
【０２６５】
本発明は、乳癌疾患が全身性に至ることを防止し得る診断的、予後的および治療的なアプローチに向けられたものである。本発明は、転移の治療のための薬物を設計および試験するための方法のさらなる理解を提供する。転移は最終的に乳癌による苦痛および死の多くに関与する。本発明は、それらの特異的な阻害のための治療薬を作り出すために転移性乳癌細胞を同定する標的分子および機能的マーカーを同定するというニーズに向けられたものである。
【０２６６】
コンビナトリアル抗体ライブラリーは、抗体ファージディスプレイ技術およびサブトラクトパンニングおよびスクリーニング手法を用いて単離され得る。例えば、新生物腫瘍、充実性腫瘤、乳癌、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨の癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫などの転移性腫瘍細胞のヒト腫瘍細胞モデルが作製されている。
【０２６７】
乳癌は、非常に異質性であることが知られている。本発明は、接着レセプターであるインテグリンαｖβ３の、その恒常的に活性の機能的形態での発現に基づいて、ヒト乳癌細胞のサブセットが同定され得ることを立証した。この活性化インテグリンは、脈管構造中で、血小板結合および腫瘍細胞捕捉を促進する。このような方法で、インテグリンαｖβ３の活性化は、標的器官の播種およびコロニー形成がうまく行われるために大切である可能性のある、重要な特性を転移細胞に与える。ヒト乳癌細胞株における強転移性改変体に対する弱転移性改変体のサブトラクトパンニングによる抗体ファージディスプレイ技術を用いて、多数の癌患者の組み合わせられた免疫レパートリーを探索した。このアプローチにより、腫瘍細胞接着レセプターであるインテグリンαｖβ３の活性化された機能的構造を特異的に認識する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が得られた。この抗体は本明細書中で記載される乳癌細胞モデルの転移性改変体、およびステージＩＶの乳癌患者血液サンプル由来の単離された転移細胞と選択的に反応する。これらの抗体は、免疫欠損マウスにおいて、ヒト乳癌細胞による肺のコロニー化を阻害する。
【０２６８】
研究によって、転移性乳癌細胞の診断用マーカーとして、インテグリンαｖβ３の活性化形態を報告する、ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の能力が調べられる。ｓｃＦｖ抗体およびそれらの誘導体は転移性乳癌細胞を特異的に検出し、転移性疾患の局在性を報告するために有用である。
【０２６９】
研究によって、転移性乳癌の予後マーカーとして、インテグリンαｖβ３の活性化形態を報告する、ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の能力が調べられる。ｓｃＦｖ抗体およびそれらの誘導体は転移傾向を有する乳癌細胞を特異的に検出するために有用である。
【０２７０】
研究によって、恒常的活性化インテグリンαｖβ３に対するヒトｓｃＦｖ抗体およびそれらの誘導体の、乳癌転移に対する効果が分析される。活性化形態のインテグリンαｖβ３を発現する細胞を標的として阻害することは、乳癌転移の防止および確立された転移性疾患の妨害のために有用である。
【０２７１】
本明細書に引用された全ての刊行物および特許出願は、あらゆる目的のため、あたかも各刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に、あらゆる目的のために参考として援用されることが示されたかのように、本明細書中でその全体を参考として援用される。
【０２７２】
上述の発明は、理解を明確にする目的の説明および例示によってある程度詳細に記述されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくある種の変更および改変がなされ得るということは、本発明の教示に照らして、当業者にとって容易に明らかであることが、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ：患者由来のｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、陽イオンおよび活性化に依存する様式で、腫瘍細胞インテグリンαｖβ３を認識する。１ｍＭ  Ｃａ２＋、１ｍＭ  Ｍｇ２＋、または０．２ｍＭ  Ｍｎ２＋存在下および非存在下でのＴＢＳ中でのフローサイトメトリー分析が示される。抗フラッグＭ２  マウスｍＡｂに続いてＦＩＴＣ−抗マウスＦ（ａｂ’）２とのインキュベーション後に検出される可溶性ｓｃＦｖの結合。（Ａ）ｓｃＦｖのヒト黒色腫細胞（Ｍ２１：αｖβ３プラス他のαｖインテグリン）（Ｍ２１−ＬＩＩｂ：αＩＩｂβ３を含む、αｖインテグリンを含まない）または肺腺癌細胞（ＵＣＬＡ−Ｐ３：αｖインテグリンを含む、β３インテグリンを含まない）に対する結合。（Ｂ）ｓｃＦｖのＭ２１黒色腫細胞に対する結合。（Ｃ）ｓｃＦｖの非活性化形態（β３ＷＴ、親Ｃｏ）または活性化形態（乳癌患者血液から単離されたβ３Ｄ７２３Ｒ、骨、肺、およびＢＭＳ転移性癌細胞）のいずれかの状態にあるαｖβ３を欠損する（β３−）または発現するＭＤＡ−ＭＢ４３５ヒト乳癌細胞の改変体に対する結合。これらの各細胞型について、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５のための複数の独立した実験において同様の結果が得られた。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ａ）Ｂｃ−１２（配列番号２）およびＢｃ−１５（配列番号４）（活性化αｖβ３に特異的）のコンセンサスアミノ酸配列（配列番号７）をＢｃ−２０（αｖに特異的）（配列番号８）と比較した。
【図２Ｂ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ｂ）ｓｃＦｖのＢＭＳヒト乳癌細胞への結合のフローサイトメトリーによる結果は、ＣＤＲ−Ｈ３  ＲＧＤがＲＧＥに変異した場合（Ｍｕｔ−１２およびＭｕｔ−１５）にＢｃ−１２およびＢｃ−１５との結合が失われることを示している。Ｍｕｔ−１５のシグナルは陰性コントロールに相当する。
【図２Ｃ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ｃ）ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２（配列番号１）およびｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５（配列番号３）に対するｃＤＮＡ配列。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３、寄託日：２００４年１１月１２日を有する。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４、寄託日：２００４年１１月１２日を有する。
【図２Ｄ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ｄ）ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１２（配列番号５）およびｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５（配列番号６）に対するｃＤＮＡ配列。ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１２は、ＲＧＥを含むｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２の変異体バージョンである。ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５は、ＲＧＥを含むｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５の変異体バージョンである。
【図３−１】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、αｖβ３が仲介する接着性乳癌細胞機能を阻害する。（Ａ）３μＭのＢｃ−１２、Ｂｃ−１５またはそれらのＲＧＥ変異体であるＭｕｔ−１２、Ｍｕｔ−１５が存在する場合と非存在の場合（２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫペプチドの場合と比較）における、ＢＭＳヒト乳癌細胞と、フィブリノゲン（Ｆｇ）、ビトロネクチン（ＶＮ）またはタイプＩコラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）との接着。タンパク質コーティング濃度：１０μｇ／ｍｌ（ＶＮ、Ｃｏｌ  Ｉ）または２０μｇ／ｍｌ（Ｆｇ）。接着時間：３７℃にて３０分間。（Ｂ）走触性ＢＭＳ細胞のフィブリノゲン基質への移動に対するｓｃＦｖの効果（２μＭ  Ｂｃ−１２、Ｂｃ−１５またはそれらのＲＧＥ変異体であるＭｕｔ−１２またはＭｕｔ−１５を含む場合と含まない場合（２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫペプチドの場合と比較）において、トランスウェルチャンバー中で３７℃にて１６時間）。（Ｃ）血流中での乳癌細胞の捕捉に対するｓｃＦｖの影響。（ヒドロエチジンで標識された転移性ＢＭＳ細胞をヒト血液中（５０ｎＭ  ＰＰＡＣＫを用いて抗凝固処理されている）に懸濁し、コラーゲンＩマトリックス上で静脈壁剪断速度５０ｓ−１にて潅流させた。これらの条件のもと、乳癌細胞は、αｖβ３が仲介する結合により、接着性であって血栓を形成する血小板を捕捉する。腫瘍細胞の接着は、血流中の３０の所定の位置における画像の取得により定量化した。左：同一のｘ、ｙ位置における血小板シグナル（血栓、緑色蛍光）および腫瘍細胞シグナル（赤色蛍光）の代表的イメージ。右：３μＭの非機能性ブロッキング  抗αｖ  ｓｃＦｖ  Ｂｃ−２０または機能性ブロッキング  抗αｖβ３  ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２またはＢｃ−１５の存在下で捕捉された腫瘍細胞の数。（Ｄ）ｓｃＦｖＢｃ−１５はヒト乳癌細胞に内在化され、細胞増殖を減少させる。左：４℃（結合）対３７℃（内在化を可能にする）にてＦＩＴＣ−Ｂｃ−１５と４時間インキュベートしたＢＭＳ細胞の共焦点像。右：２μＭのＲＧＥ含有ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５またはＲＧＤ含有Ｂｃ−１５の存在下での播種後４日目のＢＭＳ細胞培養の位相差画像。
【図３−２】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、αｖβ３が仲介する接着性乳癌細胞機能を阻害する。（Ｅ）３．７μＭ  ｓｃＦｖまたはアポトーシス誘導コントロールとしての１４．３６μＭ  カンプトテシンの存在下または非存在下における極少接着性プレート中でのマトリックスを除去したＢＭＳ乳癌細胞の生存度に対するｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２の効果。アポトーシスの測定は２０時間後の細胞質のヒストンと結合するＤＮＡ断片に基づいた。
【図４】図４：活性化αｖβ３に対する患者由来リガンド模倣物ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、ヒト血漿中の乳癌細胞に内在化して結合し、乳癌の残存に影響する。患者血液サンプルから単離されたヒト転移乳癌細胞（ＢＭＳ）を用いたフローサイトメトリー分析。全ての結合および洗浄工程は、５０ｎＭ  ＰＰＡＣＫを用いて抗凝固した血液から調製した新鮮なヒト血漿中で行なった。
【図５−１】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ：ＳｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＳｃＦｖ  Ｂｃ−１５は血行性乳癌転移を抑制する。（Ａ）左：１×１０５個のＢＭＳヒト乳癌細胞を静脈内注射して３２日後のメスＳＣＩＤマウスの肺。マウスは、１日目、２日目、３日目および４日目に５０μｇのＢｃ−１２またはＢｃ−１５を含む１００μｌのＰＢＳを用いて処理した（静脈内）。コントロールにはＰＢＳのみ与えた。右：各動物の肺表面への転移の数。水平の線は群あたりの転移の平均数を示す。ＳｃＦｖ処理されたマウスは有意に少ない転移を有した（Ｐ＜０．００１、Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ試験による）。（Ｂ）左：ヘマトキシリン／エオシンで染色したマウス肺上部の組織学的切片。各肺について１４０μｍ毎に分離した３つの連続する切片６セットについて転移を計数した。右：各肺の切片において計数された転移の数。水平の線は動物群あたりの転移の平均数を示す。ＳｃＦｖ処理されたマウスは有意に少ない検出可能な転移を有した（Ｐ＜０．００５、Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ試験による）。
【図５−２】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ：ＳｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＳｃＦｖ  Ｂｃ−１５は血行性乳癌転移を抑制する。（Ｃ）肺に確立された乳癌転移に対するＢｃ−１５処置の効果。メスＳＣＩＤマウスに、構成的に活性化したインテグリンαｖβ３Ｄ７２３Ｒを発現する５×１０５個のＤｓＲｅｄ２標識ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞を静脈内注射した。マウスは、７日目、９日目、１１日目および１４日目、１６日目、１８日目にｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５またはそのＲＧＥ変異体Ｍｕｔ−１５の静脈内注射により処理した（４０μｇ／用量）。１９日目に蛍光顕微鏡により転移性病巣を計数した。左：Ｍｕｔ−１５（上）またはＢｃ−１５処理されたマウス（下）の肺組織内の代表的な腫瘍病巣画像（バー：５０μｍ）。右：各動物の肺組織内における転移病巣の数（水平の線：群あたりの転移の平均数）。Ｂｃ−１５処理されたマウスはＭｕｔ−１５処理されたマウスよりも有意に少ない転移を有した（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ両側順位和検定試験による）。
【図６】図６：ＭＤＡ−ＭＢ  ４３５乳癌細胞モデルの親細胞および腫瘍細胞改変体におけるαｖβ３インテグリンレセプターの発現。
【図７】図７：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、転移乳癌細胞において見られるβ３の機能獲得変異体を発現する腫瘍細胞と反応する。フィブリノゲン指向性の移動およびＨＭＶ−１ヒト黒色腫細胞改変体のフローサイトメトリー分析。
【図８】図８：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、血流中において血小板が仲介する乳癌細胞の捕捉を抑制する。
【図１】
2007523650.tif 000003
【図２Ａ】
2007523650.tif 000004
【図２Ｂ】
2007523650.tif 000005
【図２Ｃ】
2007523650.tif 000006
【図２Ｄ】
2007523650.tif 000007
【図３−１】
2007523650.tif 000008
【図３−２】
2007523650.tif 000009
【図４】
2007523650.tif 000010
【図５−１】
2007523650.tif 000011
【図５−２】
2007523650.tif 000012
【図６】
2007523650.tif 000013
【図７】
2007523650.tif 000014
【図８】
2007523650.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月13日(2006.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007523650000001.app
【国際調査報告】
2007523650.tif 000016
2007523650.tif 000017
2007523650.tif 000018