(57)【要約】本発明は、癌を治療するための方法および組成物に関する。一実施形態では、方法は唯一の活性剤としてのｃＦＬＩＰ阻害剤の使用を含む。他の実施形態では本発明は、ｃＦＬＩＰ阻害剤と化学療法剤の組合せを使用するｐ５３突然変異による癌の治療に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞を殺傷する方法であって、有効量のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を前記細胞に投与することを含み、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を唯一の細胞毒性薬剤として他の細胞毒性薬剤の実質的な不在下において投与する方法。
【請求項２】
癌を治療する方法であって、治療有効量のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤をその必要のある対象に投与することを含み、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を唯一の細胞毒性薬剤として他の細胞毒性薬剤の実質的な不在下において投与する方法。
【請求項３】
ｐ５３突然変異を有する癌細胞を殺傷する方法であって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項４】
ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療する方法であって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤をその必要のある対象に投与することを含む方法。
【請求項５】
（ｃ）デスレセプター結合要素を投与することをさらに含む、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記デスレセプターがＦＡＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記結合要素がＦＡＳ抗体ＣＨ１１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化学療法剤が５−ＦＵ、オキサリプラチンまたはＣＰＴ−１１である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化学療法剤が５−ＦＵまたはオキサリプラチンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と前記化学療法剤を増強作用比で投与する、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と前記化学療法剤を０．８５未満のＣＩを生成するのに充分な濃度で投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐ５３突然変異は前記癌細胞中でｐ５３が完全に不活性化しているような突然変異である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐ５３突然変異がヒスチジンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ１７５Ｈ突然変異）、またはトリプトファンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ２４８Ｗ突然変異）である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤がｃ−ＦＬＩＰ遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ物質である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤がヌクレオチド配列
ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ（配列番号１）または
ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ（配列番号２）
を有するＲＮＡｉ物質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌を治療するための医薬品の製造における唯一の細胞毒性薬剤としてのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤の使用であって、医薬品が他の細胞毒性薬剤の実質的な不在下における治療用である使用。
【請求項１７】
ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するための医薬品の製造における、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤の使用。
【請求項１８】
前記医薬品が（ｃ）デスレセプター結合要素をさらに含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記デスレセプターがＦＡＳである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記結合要素がＦＡＳ抗体ＣＨ１１である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記化学療法剤が５−ＦＵ、オキサリプラチンまたはＣＰＴ−１１である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記化学療法剤が５−ＦＵまたはオキサリプラチンである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と前記化学療法剤が増強作用比で存在する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と前記化学療法剤が０．８５未満のＣＩを生成するのに充分な濃度で存在する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記ｐ５３突然変異が、前記癌細胞中でｐ５３が完全に不活性化しているような突然変異である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記ｐ５３突然変異がヒスチジンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ１７５Ｈ突然変異）、またはトリプトファンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ２４８Ｗ突然変異）である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤がｃ−ＦＬＩＰ遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ物質である、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤がヌクレオチド配列
ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ（配列番号１）または
ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ（配列番号２）
を有するＲＮＡｉ物質である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
唯一の細胞毒性薬剤としてのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および薬剤として許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含み、他の細胞毒性薬剤の不在下における治療用である、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するための医薬組成物であって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤
および
（ｃ）薬剤として許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
（ｃ）デスレセプター結合要素をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記デスレセプターがＦＡＳである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記結合要素がＦＡＳ抗体ＣＨ１１である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記化学療法剤が５−ＦＵ、オキサリプラチンまたはＣＰＴ−１１である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記化学療法剤が５−ＦＵまたはオキサリプラチンである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と前記化学療法剤が増強作用比で存在する、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と前記化学療法剤が０．８５未満のＣＩを生成するのに充分な濃度で存在する、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ｐ５３突然変異が、前記癌細胞中でｐ５３が完全に不活性化しているような突然変異である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｐ５３突然変異がヒスチジンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ１７５Ｈ突然変異）、またはトリプトファンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ２４８Ｗ突然変異）である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤がｃ−ＦＬＩＰ遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ物質である、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤がヌクレオチド配列
ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ（配列番号１）または
ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ（配列番号２）
を有するＲＮＡｉ物質である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するためのキットであって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤および
（ｃ）（ａ）と（ｂ）を別個、逐次的または同時に投与するための使用説明書を含むキット。
【請求項４３】
ヌクレオチド配列
ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ（配列番号１）または
ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ（配列番号２）
を有するＲＮＡｉ物質。
【請求項４４】
ヌクレオチド配列
ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ（配列番号１）または
ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ（配列番号２）
からなるＲＮＡｉ物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療に関する。詳細には本発明は、ｐ５３突然変異によって特徴付けられる癌を含めた、癌を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−ＦＵ４は、結腸直腸癌、乳癌および好気性菌による消化管の癌を含めた一定範囲の癌の治療において広く使用されている。５−ＦＵの細胞毒性のメカニズムは、ＲＮＡおよびＤＮＡ中へのフルオロヌクレオチドの誤った取り込み、およびヌクレオチド合成酵素チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の阻害に原因があるとされている（Ｌｏｎｇｌｅｙら、２００３）。ＴＳは、メチルドナーとしての５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩（ＣＨ２ＴＨＦ）と共に、デオキシウリジン１リン酸塩（ｄＵＭＰ）のデオキシチミジン１リン酸塩（ｄＴＭＰ）への転換を触媒する。この反応は、ＤＮＡの合成および修復に必要不可欠な、チミジル酸の唯一の細胞内供給源を与える。５−ＦＵの代謝産物、フルオロデオキシウリジン１リン酸塩（ＦｄＵＭＰ）は、ＴＳおよびＣＨ２ＴＨＦと安定した複合体を形成し、酵素阻害をもたらす（Ｌｏｎｇｌｅｙら、２００３）。近年、ＣＨ２ＴＨＦと酵素の結合を阻害するＴＳおよびｄＵＭＰとの安定した複合体を形成する、トミュデックス（ＴＤＸ）およびアリムタ（ＭＴＡ）などの、ＴＳのさらに特異的な葉酸系阻害剤が開発されてきている（Ｈｕｇｈｅｓら、１９９９；Ｓｈｉｈら、１９９７）。ＴＳ阻害は、Ｓ期細胞周期の停止およびアポトーシスをもたらす、ヌクレオチド蓄積の不均衡を引き起こす（Ａｈｅｒｎｅら、１９９６；Ｌｏｎｇｌｅｙら、２００２；Ｌｏｎｇｌｅｙら、２００１）。オキサリプラチンは、進行した結腸直腸癌の治療において５−ＦＵと組み合わせて使用される、第３世代のプラチナ系ＤＮＡ損傷物質である（Ｇｉａｃｃｈｅｔｔｉら、２０００）。薬剤耐性は、化学療法の有効性を制限する主な要因である。トポイソメラーゼ−１阻害剤イリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびＤＮＡ損傷物質オキサリプラチンは、転移性結腸直腸癌の治療用に５−ＦＵと共に現在使用されており、５−ＦＵのみを用いる治療と比較して改善された応答率が実証されてきている（１０〜１５％と比較して４０〜５０％）（１０，１１）。これらの改善にもかかわらず、応答性を示す患者の大部分は、わずか２２〜２４ヶ月の平均生存期間で再発する。明らかに、この疾患を治療するための新しい手法が必要とされる。
【０００３】
ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド）レセプターＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）などのデスレセプターは、それらの天然リガンドによって結合するとデスシグナルを誘発する（１，２）。デスレセプターとのリガンドの結合は、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（Ｆａｓ結合デスドメイン）の漸増をもたらし、次いでプロカスパーゼ８チモーゲンを漸増させて、死誘導シグナル複合体（ＤＩＳＣ）を形成する（Ｎａｇａｔａ、１９９９）。プロカスパーゼ８分子はＤＩＳＣにおいて活性状態になり、カスパーゼ３およびＢＩＤなどのプロ−アポトーシス性下流分子を後に活性化させる。ＦａｓＬ発現は大部分の結腸腫瘍において上方制御され、腫瘍ＦａｓＬはＦａｓ感受性免疫エフェクター細胞のアポトーシスを誘導すると仮定されてきている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９９）。この免疫逃避機構は、腫瘍細胞がＦａｓ仲介アポトーシスに対する耐性を発達させて、オートクリンおよびパラクリン腫瘍細胞死を妨げることを必要とする。
【０００４】
Ｆａｓシグナルの重要な阻害剤はｃ−ＦＬＩＰであり、これはＤＩＳＣにおけるプロカスパーゼ８の漸増およびプロセシングを阻害する（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００１）。差別的なスプライシングによって、長い（ｃ−ＦＬＩＰＬ）および短い（ｃ−ＦＬＩＰＳ）形のｃ−ＦＬＩＰが生じ、これらは両方共ＤＩＳＣ内のＦＡＤＤと結合する。ｃ−ＦＬＩＰＳはＤＩＳＣにおけるカスパーゼ８の活性化を直接阻害し、一方ｃ−ＦＬＩＰＬは、その活性サブユニットへのプロカスパーゼ８の完全なプロセシングを阻害するｐ４３切断形に最初に切断する。ｃ−ＦＬＩＰも、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）デスレセプターＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）によって形成されるＤＩＳＣにおける、プロカスパーゼ８の活性化を阻害する（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００１）。カスパーゼ８の活性化を遮断する以外に、ＤＩＳＣ結合ｃ−ＦＬＩＰは、ＥＲＫ、ＰＩ３−キナーゼ／ＡｋｔおよびＮＦ−κＢシグナル経路の活性化を促進することが報告されてきている（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００１）。したがってｃ−ＦＬＩＰはおそらく、固有の生存経路を活性化させることによって、デスレセプターシグナルをプロアポトーシス性から抗アポトーシス性に転換する。注目すべきは、ｃ−ＦＬＩＰＬは対応する正常組織と比較して結腸腺癌中で過剰発現されることが見出されてきており、ｃ−ＦＬＩＰはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形質転換に貢献し得ることが示唆される（Ｒｙｕら、２００１）。
【発明の開示】
【０００５】
本明細書に記載したように、本出願と同日に出願し、英国特許出願０３２７４９３．３からの優先権を主張する我々の同時係属のＰＣＴ出願中に示したように、本発明者らは、抗ＦＡＳ抗体、例えばＣＨ−１１などのデスレセプターリガンドを使用する治療と５−ＦＵなどの化学療法剤、あるいはラリトレキセド（ＲＴＸ）またはペメトレキセド（ＭＴＡ、Ａｌｉｍｔａ）などの葉酸代謝拮抗薬を組み合わせることによって、癌細胞を殺傷する際に相乗効果が得られることを示している。しかしながら、得られた相乗効果はｃ−ＦＬＩＰを過剰発現する癌細胞において無効となった。
【０００６】
実施例中に記載したように、ｃ−ＦＬＩＰの確かな過剰発現および化学療法剤、例えば５−ＦＵに対する関連耐性がアポトーシスを誘導した細胞系では、ＦＬＩＰ発現の阻害によって、化学療法剤誘導型アポトーシスに対する耐性が逆になった。この影響をさらに調べることによって、本発明者らは、ｐ５３突然変異またはｐ５３欠損遺伝子型を有する幾つかの細胞系を試験した。
【０００７】
驚いたことに本発明者らは、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御は、特定の化学療法剤に対して通常は非常に耐性があるｐ５３突然変異細胞において、幾つかの化学療法剤に応答するアポトーシスを著しく増大させたことを観察した。この驚くべき観察結果によって、ｐ５３突然変異と関係がある癌の治療における、このようなｃＦＬＩＰ阻害剤および化学療法剤の組合せの使用が可能となる。
【０００８】
したがって、本発明の第１の態様では、ｐ５３突然変異を有する癌細胞を殺傷する方法であって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤を前記細胞に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
第２の態様では、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療する方法であって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤をその必要のある対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するための医薬品の製造における、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤の使用を含む。
【００１１】
第４の態様は、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するための医薬組成物であって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤
および
（ｃ）薬剤として許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
第５の態様は、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するためのキットであって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤および
（ｃ）（ａ）と（ｂ）を別個、逐次的または同時に投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
【００１３】
本発明の第１から第５のいずれかの態様では、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および化学療法剤を、他の活性剤の不在下において与え投与することができる。しかしながら、本発明のこれらの態様の好ましい実施形態では、（ｃ）デスレセプター結合要素、または前記結合要素をコードする核酸を提供する。
【００１４】
任意の適切なデスレセプター結合要素を使用することができる。デスレセプターにはＦａｓ、ＴＮＦＲ、ＤＲ−３、ＤＲ−４およびＤＲ−５がある。本発明の好ましい実施形態では、デスレセプターはＦＡＳである。
【００１５】
ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤、化学療法剤、および適用可能な場合はデスレセプターリガンドを、同時、逐次的または同時に投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、化学療法剤、および適用可能な場合は特異的結合要素の前にＣ−ＦＬＩＰ阻害剤を投与する。
【００１６】
本発明で使用するのに好ましい結合要素は、抗体またはその断片である。特に好ましい実施形態では、結合要素はＦＡＳ抗体ＣＨ１１である（Ｙｏｎｅｈａｒａ、Ｓ．、Ｉｓｈｉｉ、Ａ．およびＹｏｎｅｈａｒａ、Ｍ．（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９、１７４７〜１７５６）（例えばＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ニューヨークから市販されている）。
【００１７】
任意の適切なチミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤を、本発明で使用することができる。本発明の方法で使用することができるチミジル酸シンターゼ阻害剤の例には、５−ＦＵ、ＭＴＡおよびＴＤＸがある。好ましい実施形態では、チミジル酸シンターゼ阻害剤は５−ＦＵである。使用することができるプラチナ細胞毒性薬剤の例には、シスプラチンおよびオキサリプラチンがある。本発明の特に好ましい実施形態では、化学療法剤はシスプラチンである。任意の適切なトポイソメラーゼ阻害剤を、本発明で使用することができる。好ましい実施形態では、トポイソメラーゼ阻害剤はトポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばカンプトセシンである。本発明で使用することができる適切なトポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）である。文脈が他に要求しない限り、ＣＰＴ−１１に対する言及は、ＣＰＴ−１１またはその活性代謝産物ＳＮ−３８を含むと解釈すべきである。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と化学療法剤を増強作用比で投与する。本発明の文脈における用語「増強作用比」は、組合せの細胞毒性活性が、いずれかの要素単独の細胞毒性活性、個々の要素の活性に基づいて組合せに関して予想されると思われる付加活性の細胞毒性活性を上回るような比で、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と化学療法剤が存在することを示すために使用する。したがって増強作用比では、個々の要素は相乗的に作用する。
【００１９】
相乗作用は、幾つかの方法を使用して定義することができる。例えば相乗作用は、Ｒｏｍａｎｅｌｉ（１９９８ａ、１９９８ｂ）によって改変されたＫｅｒｎの方法を使用する単位より大きいＲＩとして定義することができる。予想細胞生存率（Ｓｅｘｐ、薬剤Ａ単独で観察した生存率と薬剤Ｂ単独で観察した生存率の積として定義する）と、ＡとＢの組合せに関して観察した細胞の生存率（Ｓｏｂｓ）の比として、ＲＩを計算することができる（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。したがって相乗作用は、単位より大きいＲＩとして定義することができる。
【００２０】
他の方法では、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に従い組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって、相乗作用を決定することができる。１、＜１、および＞１のＣＩ値は、それぞれ付加効果、相乗効果およびアンタゴニスト効果を示す。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と化学療法剤が１未満、好ましくは０．８５未満のＣＩを生成するのに充分な濃度で存在する。
【００２２】
相乗作用は、Ｒｏｍａｎｅｌｉ（１９９８ａ、ｂ）によって改変されたＫｅｒｎの方法を使用する単位より大きいＲＩとして定義することが好ましい。予想細胞生存率（Ｓｅｘｐ、薬剤Ａ単独で観察した生存率と薬剤Ｂ単独で観察した生存率の積として定義する）と、ＡとＢの組合せに関して観察した細胞の生存率（Ｓｏｂｓ）の比として、ＲＩを計算することができる（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。したがって相乗作用は、単位より大きいＲＩとして定義することができる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、前記特異的結合要素と化学療法剤を、１．５より大きい、さらに好ましくは２．０より大きい、最も好ましくは２．２５より大きいＲＩを生成するのに充分な濃度で与える。
【００２４】
したがって、組み合わせた医薬品は好ましいことに、腫瘍細胞を治療するために使用すると相乗効果を生み出す。
【００２５】
本発明の第１、２、３、４および５の態様のいずれかによる本発明は、ｐ５３突然変異を有する任意の癌細胞を殺傷するために使用することができる。この突然変異は、部分的または全体的に細胞中のｐ５３を不活性化させる可能性がある。本発明の一実施形態では、ｐ５３突然変異は、ｐ５３を全体的に不活性化させるｐ５３突然変異である。他の実施形態では、ｐ５３突然変異はヒスチジンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ１７５Ｈ突然変異）である。他の実施形態では、ｐ５３突然変異はトリプトファンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ２４８Ｗ突然変異）である。
【００２６】
実施例中に記載したように、癌細胞に対するｃ−ＦＬＩＰ阻害剤と化学療法剤の組合せの細胞毒性を試験すると共に、本発明者らはｃ−ＦＬＩＰ単独の影響をさらに試験した。本発明者らは、高濃度のｓｉＲＮＡを使用するｃＦＬＩＰの比較的強力な阻害が、ＲＫＯおよびＨ６３０細胞系において化学療法剤の不在下でアポトーシスを誘発したことを予想外に観察した。化学療法剤の不在下でのｃＦＬＩＰ阻害は癌細胞中のアポトーシスを誘発するのに充分であるというこの証拠によって、化学療法戦略としてのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤単独の使用が可能となる。
【００２７】
したがって、本発明の第６の態様では、癌細胞を殺傷する方法であって、有効量のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を前記細胞に投与することを含み、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を唯一の細胞毒性薬剤として他の細胞毒性薬剤の実質的な不在下において投与する方法を提供する。
【００２８】
本発明の第７の態様は、癌を治療する方法であって、治療有効量のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤をその必要のある対象に投与することを含み、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を唯一の細胞毒性薬剤として他の細胞毒性薬剤の実質的な不在下において投与する方法を提供する。
【００２９】
第８の態様は、癌を治療するための医薬品の製造における唯一の細胞毒性薬剤としてのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤の使用であって、医薬品が他の細胞毒性薬剤の実質的な不在下における治療用である使用を提供する。
【００３０】
第９の態様は、癌を治療するための医薬組成物であって、唯一の細胞毒性薬剤としてのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤、および薬剤として許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含み、他の細胞毒性薬剤の不在下における治療用である医薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明の第６から第９の態様は、任意の癌の治療において使用することができる。癌細胞はｐ５３野生型遺伝子型を含む可能性があり、あるいは代替的にｐ５３突然変異遺伝子型を含む可能性がある。この突然変異は、部分的または全体的に細胞中のｐ５３を不活性化させる可能性がある。本発明の一実施形態では、ｐ５３突然変異は、ｐ５３を全体的に不活性化させるｐ５３突然変異である。他の実施形態では、ｐ５３突然変異はヒスチジンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ１７５Ｈ突然変異）である。他の実施形態では、ｐ５３突然変異はトリプトファンとアルギニンの置換をもたらすミスセンス突然変異（Ｒ２４８Ｗ突然変異）である。
【００３２】
任意の適切なｃ−ＦＬＩＰ阻害剤を、本発明の方法で使用することができる。阻害剤はペプチドまたは非ペプチドであってよい。
【００３３】
１つの好ましい実施形態では、前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤は、ｃ−ＦＬＩＰをコードする遺伝子の発現を調節するアンチセンス分子である。
【００３４】
より好ましい実施形態では、前記ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤は、ｃ−ＦＬＩＰ遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ物質である。この物質はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築体またはその転写鋳型、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡであってよい。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ物質は、ｃ−ＦＬＩＰをコードする遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部分と相同的であるｓｉＲＮＡである。
【００３５】
本発明の好ましいＲＮＡｉ物質、および本発明で使用するのに好ましいＲＮＡｉ物質は、１５ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長の間、好ましくは１９ヌクレオチド長と２２ヌクレオチド長の間、最も好ましくは２１ヌクレオチド長である。本発明の特に好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ物質は配列番号１で示すヌクレオチド配列を有する。
【００３６】
ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ（配列番号１）
【００３７】
本発明の他の特に好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ物質は配列番号２で示すヌクレオチド配列を有する。
【００３８】
ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ（配列番号２）
【００３９】
実際このようなＲＮＡｉ物質は、本発明の第１０および１１の独立態様となる。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、本発明の第１０の態様のＲＮＡｉ物質を含むベクターを提供する。
【００４１】
他の態様では、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するためのキットであって、
（ａ）ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および
（ｂ）チミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤および
（ｃ）（ａ）と（ｂ）を別個、逐次的または同時に投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
【００４２】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、文脈が他に要求しない限り、必要に応じて変更を加えて、それぞれの他の態様と同様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
前に記載したように本発明は、ｃＦＬＩＰ阻害に関する癌の治療法に関する。
【００４４】
本発明の方法は、ＦＬＩＰタンパク質の発現を決定することを含み得る。
【００４５】
ＦＬＩＰの発現は、当分野で知られている任意の技法を使用して測定することができる。ｍＲＮＡまたはタンパク質は、遺伝子の発現の上方または下方制御を決定する手段として測定することができる。定量技法が好ましい。しかしながら、半定量または定性技法を使用することもできる。遺伝子産物を測定するのに適した技法には、ＳＡＧＥ分析、ＤＮＡマイクロアレイ分析、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫細胞化学分析、およびＥＬＩＳＡがあるが、これらだけには限られない。
【００４６】
当分野で知られている任意の技法を使用して、ＲＮＡを検出することができる。サンプル由来のＲＮＡの量は非常に少ない可能性があるので、増幅ステップを使用することが好ましい。適切な技法は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、コピーｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）と核酸プローブのアレイのハイブリダイゼーション、およびノーザンブロッティングを含み得る。
【００４７】
例えば、ｍＲＮＡ検出を使用するとき、単離したｍＲＮＡを標準的技法に従ってｃＤＮＡに変換し、核酸プライマーの適切な混合物と共に容器中で増幅反応試薬（ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応試薬など）を用いて変換されたｃＤＮＡを処理し、容器の中身を反応させて増幅産物を生成させ、増幅産物を分析してＦＬＩＰタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現産物の存在を検出することによって、本発明の方法を行うことができる。サザンブロット分析を使用して分析を実施して、増幅産物中の遺伝子産物の存在を検出することが可能である。サザンブロット分析は当分野で知られている。増幅産物中のこのような遺伝子産物の存在を定量的に検出し、類似のプライマーを使用して導いた正常および悪性組織中の知られている存在または不在に関する一群の予想値に対して、検出した産物の量を比較することによって、分析ステップをさらに実施することができる。
【００４８】
例えば遺伝子発現を決定する際に、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法を行う際に、当分野で知られている技法を使用することができる。このような技法の詳細は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９２」中に記載されている。
【００４９】
結合要素
本発明の文脈では「結合要素」は、他の分子、特にレセプター、好ましくはデスレセプターに関する結合特異性を有する分子である。結合要素は、一対の特定の結合要素の一要素であってよい。結合対の要素は自然に由来するか、あるいは全体的または部分的に合成によって生じたものであってよい。分子対の一要素は、突出部または空洞であってよく、分子対の他方の要素の空間上および極性上の特定の編成と特異的に結合し、したがって相補的である領域をその表面に有することができる。したがって、対の要素は互いに特異的に結合する性質を有する。本発明の結合要素、および本発明で使用するための要素は、好ましくはデスレセプターと結合することができる任意の成分、例えば抗体またはリガンドであってよい。
【００５０】
結合要素は、任意のデスレセプターと結合することができる。デスレセプターにはＦａｓ、ＴＮＦＲ、ＤＲ−３、ＤＲ−４およびＤＲ−５がある。本発明の好ましい実施形態では、デスレセプターはＦａｓである。
【００５１】
好ましい実施形態では、結合要素は少なくとも１つのヒト定常領域を含む。
【００５２】
抗体
「抗体」は自然のものであれ、あるいは部分的または全体的に合成によって生じたものであれ免疫グロブリンである。この用語は、抗体結合ドメインであるか、あるいはそれと相同的な結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドも含む。これらは天然供給源由来のものであってよく、あるいはそれらは部分的または全体的に合成されたものであってよい。抗体の例は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメイン；およびダイアボディを含む、免疫グロブリンイソ型、ならびにそれらのイソ型のサブクラスおよび断片である。
【００５３】
幾つかの実施形態で使用するための結合要素、本発明はモノクローナルまたはポリクローナル抗体などの抗体、またはその断片であってよい。抗体の定常領域はヒトのクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥだけには限られないが、これらを含めた任意のクラスであってよい。抗体は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に属してよい。ＩｇＧ１が好ましい。
【００５４】
抗体は幾つかの方法で改変することができるので、用語「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する、任意の結合要素または物質を含むものとして解釈すべきである。したがって、この用語は、天然であれあるいは全体的または部分的に合成されたものであれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた、抗体断片、誘導体、抗体の機能相当物および相同体を含む。他のポリペプチドと融合した、免疫グロブリン結合ドメイン、または相当物を含むキメラ分子が、したがって含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３中に記載されている。
【００５５】
本発明で使用することができるこのような断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ、Ｅ．Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４〜５４６（１９８９））、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））がある。
【００５６】
本発明で使用するための抗体またはポリペプチドの断片は一般に、少なくとも５〜７個の隣接アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９個の隣接アミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０個以上の隣接アミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約３０〜４０個以上の連続アミノ酸のアミノ酸残基の伸張部分を意味する。
【００５７】
このような抗体またはポリペプチド、あるいは断片抗体の「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列を変えることによって、例えばタンパク質をコードする核酸を操作することによって、あるいはタンパク質自体を変えることによって改変された抗体またはポリペプチドを意味する。このような天然アミノ酸配列の誘導体は、好ましくはデスレセプター、例えばＦＡＳ中和および／または結合活性を有するペプチドを与えながら、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、添加、欠失および／または置換を含み得る。このような誘導体は、２５個以下のアミノ酸、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１０個以下、より好ましくは４個以下、および最も好ましくは１個または２個のみのアミノ酸の挿入、添加、欠失および／または置換を含むことが好ましい。
【００５８】
好ましい実施形態では、結合要素はヒト化している。ヒト化抗体を作製するための方法は当分野で知られており、例えば米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する改変型抗体であってよい。したがって結合要素は、ヒト定常領域を含み得る。超可変領域以外の可変領域は、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、および／またはモノクローナル抗体に由来してもよい。このような場合、可変領域全体がマウスモノクローナル抗体に由来する可能性があり、その抗体はキメラ化していると言える。キメラ抗体を作製するための方法は当分野で知られている（例えば米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号を参照のこと）。
【００５９】
モノクローナル抗体および他の抗体を入手し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。このような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域および骨格領域に導入することを含み得る。例えばＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞は、産生する抗体の結合特異性を変えることができるかあるいはできない、遺伝的変異または他の変化に施すことができる。
【００６０】
本発明で使用するための典型的な抗体は、ＦＡＳレセプターと結合することができるＣＨ１１のヒト化相当物または抗体の任意のキメラ化相当物、およびキメラ化されておりヒトの治療において使用することができるＦＡＳレセプターを対象とする任意の他の抗体である。さらに典型的な抗体は、ＦＡＳレセプターの細胞外部分と交差反応し、ＦＡＳレセプターと高い親和性で結合し、ＦＡＳレセプターと共に内在化し、あるいはＦＡＳレセプターを介してシグナルを誘発することができる任意の抗体である。
【００６１】
結合要素の生成
本発明の幾つかの態様で使用することができる結合要素は、化学合成によって全体的または部分的に生成させることができる。結合要素は、充分確立された標準的な液相、または好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができ、これらの一般的記載事項は広範囲で入手可能であり（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ（１９８４）中、Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８４）；およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＢＩ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア中を参照）、あるいは結合要素は、液相法によって、あるいは固相、液相および溶液化学法の任意の組合せによって、例えばそれぞれのペプチド部分を最初に完成させ、次いで望ましく適切な場合は存在する任意の保護基を除去した後に、それぞれの炭酸またはスルホン酸あるいはそれらの反応性誘導体の反応により残基Ｘを導入することによって、溶液中で調製することができる。
【００６２】
本発明で使用するのに適した結合要素を生成する他の好都合な方法は、発現系において核酸を使用することによって、結合要素をコードする核酸を発現させることである。したがって本発明は、ｐ５３突然変異と関係がある癌を治療するための医薬品の製造における、（ａ）細胞死レセプターと結合する特異的結合要素をコードする核酸、および（ｂ）化学療法剤、および（ｃ）ＣＦＬＩＰ阻害剤の使用をさらに提供する。
【００６３】
本発明の核酸、および／または本発明に従い使用するための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、全体的または部分的に合成することができる。好ましい態様では、本発明で使用するための核酸は、前に定義した本発明の結合要素をコードしている。当業者はこのような核酸に対する置換、欠失および／または付加を決定することができるであろうし、これによって本発明で使用するのに適した結合要素がさらに与えられるであろう。
【００６４】
本発明と共に使用するための結合要素をコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参照事項ならびに当分野で知られている技法を使用することによって、当業者により容易に調製することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）、ただしその核酸配列およびクローンが入手可能であるものとする。これらの技法には、（ｉ）例えばゲノム供給源から、このような核酸のサンプルを増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製がある。抗体断片をコードするＤＮＡは、コードＤＮＡを採取すること、発現される部分のいずれかの側の適切な制限酵素認識部位を同定すること、ＤＮＡから前記部分を切断することを含む、当業者に知られている任意の適切な方法で作製し使用することができる。したがってこの部分は、標準的な市販の発現系において適切なプロモーターと動作可能に結合することができる。他の組換え手法は、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅させることである。例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して配列に対する修飾を行って、修飾ペプチドの発現をもたらし、あるいは核酸を発現させるために使用する宿主細胞中のコドンの優先度を考慮することができる。
【００６５】
前に記載した少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形の構築体として、核酸は含まれてよい。構築体は、前述の１つまたは複数の構築体を含む組換え宿主細胞中に含まれてよい。核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、発現を好都合に得ることができる。発現による生成の後、特異的結合要素は任意の適切な技法を使用して単離および／または精製し、次いで適切なものとして使用することができる。
【００６６】
本発明に従い使用するための結合要素コード核酸分子およびベクターは、実質的に純粋または相同的な形で、あるいは核酸の場合は、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないか実質的に含まない形で、例えばそれらの自然環境から提供、単離および／または精製することができる。
【００６７】
さまざまな異なる宿主細胞における、ポリペプチドのクローニングおよび発現のための系はよく知られている。適切な宿主細胞には細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドを発現させるための当分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、および他の多くの細胞がある。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００６８】
大腸菌などの原核生物細胞中の抗体および抗体断片の発現は、当分野で充分確立されている。総説に関しては、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：５４５〜５５１（１９９１）を参照のこと。培養中の真核生物細胞における発現も、結合要素を生成するためのオプションとして当業者には利用可能であり、近年の総説に関しては、例えばＲｅｆｆ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３〜５７６（１９９３）；Ｔｒｉｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：５５３〜５６０（１９９５）を参照のこと。
【００６９】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および適切な他の配列を含めた適切な制御配列を含む、適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、例えば適切なファージまたはファージミドであってよい。さらなる詳細に関しては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。核酸を操作するため、例えば核酸構築体の調製、突然変異誘発、塩基配列決定、ＤＮＡの細胞中への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、多くの知られている技法およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）中に詳細に記載されている。
【００７０】
任意の適切な手段によって、核酸を宿主細胞中に導入することができる。導入は任意の利用可能な技法を使用することができる。真核生物細胞用には、適切な技法は、レトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニア、または例えば昆虫細胞、バキュロウイルスを使用する、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクションおよび形質導入を含み得る。細菌細胞用には、適切な技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含み得る。
【００７１】
当分野でよく知られているように、抗生物質耐性または感受性遺伝子などのマーカー遺伝子は、当該の核酸を含むクローンを同定する際に使用することができる。
【００７２】
導入には、例えば遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を引き起こすことまたはそれを可能にすることが続き得る。
【００７３】
宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に、核酸を組み込むことができる。標準的技法に従いゲノムに関する組換えを促進する配列を封入することによって、組込みを促進することができる。核酸は細胞内の染色体外ベクター上に存在するか、あるいは他の場合は細胞に対して明らかに異種または外来性である可能性がある。
【００７４】
ＲＮＡｉ物質
本明細書に記載するように、本発明で使用するためのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤はＲＮＡｉ物質であってよい。
【００７５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、二本鎖ＲＮＡが強力で特異的な遺伝子サイレンシングを誘導するプロセスである。ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、サイレンシング誘導物質と相同的なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多要素ヌクレアーゼによって、ＲＮＡｉが仲介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡ誘導物質由来の短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むことが知られている。
【００７６】
一態様では本発明は、哺乳動物、好ましくはヒト宿主中で、ＲＮＡｉ物質を使用して発現を調節する、好ましくは標的遺伝子、ｃ−ＦＬＩＰの発現を低下させる方法を提供する。発現を低下させることによって、標的遺伝子またはコード配列の発現のレベルが、対照と比較して少なくとも約２倍、通常少なくとも約５倍、例えば１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍以上、低下または阻害されることが意味される。幾つかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、ｃ−ＦＬＩＰ遺伝子／コード配列の発現が効果的に阻害されるような程度まで低下する。標的遺伝子の発現を調節とは、例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのコード配列を例えばタンパク質、生成物などのポリペプチドへの翻訳を変更すること、例えば減少させることを意味する。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態で使用することができるＲＮＡｉ物質は、二重らせん構造で存在する小さなリボ核酸分子（本明細書では干渉リボ核酸とも呼ぶ）、例えば互いにハイブリダイズした２つの異なるオリゴリボヌクレオチド、または小さなヘアピンを形成して二重らせん構造を生成する１つのリボオリゴリボヌクレオチドである。好ましいオリゴリボヌクレオチドは、１００ｎｔ長を超えない、典型的には７５ｎｔ長を超えないリボ核酸である。ＲＮＡ物質がｓｉＲＮＡである場合、二重らせん構造の長さは典型的には約１５〜３０ｂｐ、通常は約２０および２９ｂｐ、最も好ましくは２１ｂｐの範囲である。ＲＮＡ物質がヘアピン形成中に存在する二重らせん構造の一本鎖リボ核酸、すなわちｓｈＲＮＡである場合、ヘアピンのハイブリダイズ部分の長さは、典型的にはｓｉＲＮＡ型の物質に関して前に与えられた長さと同じであるか、あるいは４〜８ヌクレオチド長い。
【００７８】
幾つかの実施形態では、干渉リボ核酸、例えば前に記載したのと同様のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであるＲＮＡｉ物質の代わりに、ＲＮＡｉ物質は干渉リボ核酸をコードすることができる。これらの実施形態では、ＲＮＡｉ物質は典型的には、干渉リボ核酸をコードするＤＮＡである。ＤＮＡはベクター中に存在することができる。
【００７９】
当分野で知られている任意の適切なプロトコルを使用して、宿主にＲＮＡｉ物質を投与することができる。例えば、ウイルス感染、マイクロインジェクション、小胞の融合、微粒子銃、または流体力学的核酸投与によって、核酸を組織または宿主細胞中に導入することができる。
【００８０】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）は、本発明の方法で使用することができるＲＮＡｉ技法である。ｄｄＲＮＡｉは米国特許第６，５７３，０９９号およびＧＢ２３５３２８２中に記載されている。ｄｄＲＮＡｉは、ＤＮＡ構築体を細胞中に導入して二本鎖（ｄｓＲＮＡ）の生成を誘発し、ＲＮＡｉプロセスの一部として次いでそれを小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断することを含む、ＲＮＡｉを誘発するための方法である。ｄｄＲＮＡｉ発現ベクターは一般に、哺乳動物細胞にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ標的配列を発現させるために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６またはＨ１）を使用する。ｄｄＲＮＡｉ発現カセット系から作製したｓｉＲＮＡ標的配列は、Ｕ６プロモーターを含まないベクターに直接クローニングすることができる。あるいは、ヘアピンｓｉＲＮＡ標的配列を含む短い一本鎖ＤＮＡオリゴをアニーリングし、ｐｏｌＩＩＩプロモーターのベクター下流にクローニングすることができる。ｄｄＲＮＡｉ発現ベクターの主な利点は、それらが長期の干渉効果を与えることができ、細胞中での天然インターフェロン応答を最小限にすることである。
【００８１】
アンチセンス核酸
本明細書に記載するように、本発明で使用するためのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤は、アンチセンス分子またはＲＮＡなどのアンチセンス分子を発現する核酸構築体であってよい。アンチセンス分子は天然または合成であってよい。合成アンチセンス分子は、原型核酸由来の化学的修飾を有する可能性がある。アンチセンス配列は標的ｃ−ＦＬＩＰ遺伝子のｍＲＮＡと相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子はさまざまな機構、例えば翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を低下させることによって、ＲＮＡｓｅＨの活性化、あるいは立体障害を介して遺伝子の発現を阻害する。１つのアンチセンス分子、またはアンチセンス分子の組合わせを投与することができ、組合せは多数の異なる配列を含み得る。
【００８２】
アンチセンス分子は、適切なベクター中のｃ−ＦＬＩＰ配列の全体または一部分を発現させることによって生成させることができ、この場合転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として生成されるように適応している。あるいはアンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも約７、通常少なくとも約１２、より通常は少なくとも約１６ヌクレオチド長、および通常は約５０を超えない、好ましくは約３５ヌクレオチド長を超えないであろう。
【００８３】
内因性ｃ−ＦＬＩＰセンス鎖ｍＲＮＡ配列の特異的な１つまたは複数の領域を、アンチセンス配列によって補われるように選択する。オリゴヌクレオチドに特異的な配列の選択は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルにおいて標的遺伝子の発現の阻害に関して幾つかの候補配列をアッセイする、経験的方法を使用することができる。配列の組合せを使用することもでき、この場合ｍＲＮＡ配列の幾つかの領域をアンチセンス相補用に選択する。
【００８４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当分野で知られている方法によって化学的に合成することができる（Ｗａｇｎｅｒら（１９９３）、上記、およびＭｉｌｌｉｇａｎら、上記を参照のこと。）好ましいオリゴヌクレオチドは、それらの細胞内の安定性および結合親和性を増大させるために、原型ホスホジエステル構造から化学修飾されるものである。骨格、糖または複素環塩基の化学的性質を変える、幾つかのこのような修飾が文献中に記載されてきている。骨格の化学的性質の特に有用な変形は、ホスホロジアミデート結合、メチルホスホネートホスホロチオエート；両方の非架橋酸素がイオウに置換されているホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートである。アキラルリン酸誘導体には３’−Ｏ−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネート、および３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートがある。ペプチド核酸は、リボースリン酸ジエステル骨格全体とペプチド結合を交換することが可能である。糖修飾を使用して安定性および親和性を増大させることもできる。
【００８５】
化学療法剤
任意の適切なチミジル酸シンターゼ阻害剤、プラチナ細胞毒性薬剤またはトポイソメラーゼ阻害剤を本発明で使用することができる。本発明の方法で使用することができるチミジル酸シンターゼ阻害剤の例には５−ＦＵ、ＭＴＡおよびＴＤＸがある。好ましい実施形態では、チミジル酸シンターゼ阻害剤は５−ＦＵである。使用することができるプラチナ細胞毒性薬剤の例には、シスプラチンおよびオキサリプラチンがある。本発明の特に好ましい実施形態では、化学療法剤はシスプラチンである。本発明で使用することができるトポイソメラーゼ阻害剤は、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）である。
【００８６】
治療
「治療」は、ヒトまたは非ヒト動物に利点を与えることができる任意のレジメンを含む。治療は既存の条件の観点のものであってよく、あるいは予防的なものであってよい（予防治療）。治療は治癒、軽減または予防効果を含み得る。
【００８７】
「癌の治療」は癌性増殖によって引き起こされる状態の治療を含み、腫瘍性増殖または腫瘍の治療を含む。本発明を使用して治療することができる腫瘍の例は、例えば骨原性および軟性組織肉腫を含めた肉腫、癌、例えば乳、肺、膀胱、甲状腺、前立腺、結腸、直腸、膵臓、胃、肝臓、子宮、子宮頚および卵巣癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、および急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病を含めた白血病、グリオーマおよび網膜芽細胞腫である。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態では、癌は１つまたは複数の結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌および骨髄性（例えば骨髄）癌である。
【００８９】
投与
前に記載したように、本発明のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤、および本発明で使用するためのｃ−ＦＬＩＰ阻害剤は、任意の適切な方法で投与することができる。さらに、本発明の第１から第５のいずれかの態様では、ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤は、他の治療剤、例えば他の化学療法剤または結合要素と共に併用療法において使用することができる。このような実施形態では、本発明のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤または組成物は、他の化学療法剤と同時、別個または逐次的に投与することができる。
【００９０】
別個または逐次的に投与する場合、それらは任意の適切な時間期間以内、例えば互いに１、２、３、６、１２、２４、４８または７２時間以内で投与することができる。好ましい実施形態では、それらを互いに６時間、好ましくは２時間以内、より好ましくは１時間以内、最も好ましくは２０分以内で投与する。
【００９１】
好ましい実施形態では、本発明のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および／または組成物は、目的とする投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を一般に含むであろう医薬組成物として投与する。
【００９２】
本発明のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および／または組成物は、任意の適切な経路によって治療の必要がある患者に投与することができる。
【００９３】
幾つかの適切な投与経路には経口、直腸、鼻腔、局所（頬および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下および硬膜外を含む）投与がある（がこれらだけには限られない）。静脈内投与が好ましい。
【００９４】
ｃ−ＦＬＩＰ阻害剤、生成物または組成物は、腫瘍部位または他の望ましい部位に局所方式で投与することができ、あるいは腫瘍または他の細胞を標的とする方式で送達することができる。
【００９５】
抗体または細胞特異的リガンドなどの標的系を使用することによって、標的療法を使用して特定の型の細胞に活性物質をより特異的に送達することができる。標的化はさまざまな理由で、例えば物質が許容できないほど毒性である場合、あるいは物質が多すぎる用量を他に必要とする場合、あるいは物質が他の場合標的細胞に入ることができない場合、望ましい可能性がある。
【００９６】
静脈内注射、または疾患部位への注射用に、活性成分は、発熱性物質を含まず適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形であると思われる。当業者は充分に、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張賦形剤を使用して、適切な溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要に応じて含ませることができる。
【００９７】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形であってよい。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固形担体を含むことができる。液状医薬組成物は一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液状担体を含む。生理食塩水溶液、ブドウ糖または他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールを含むことができる。
【００９８】
本発明のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤および／または組成物は、血液を含む特定の組織中に置かれるミクロスフェア、リポソーム、他のミクロ粒子送達系、または徐放性配合物によって投与することもできる。徐放性担体の適切な例には、シェア品、例えば座薬またはミクロカプセルの形である半透性ポリマーマトリクスがある。移植用またはミクロカプセル状の徐放性マトリクスには、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ−Ａ−００５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２（１）：５４７〜５５６、１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７、１９８１、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５、１９８２）がある。ポリペプチドを含むリポソームは、よく知られている方法によって調製することができる：ＤＥ３，２１８、１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８２：３６８８〜３６９２、１９８５；Ｈｗａｎｇら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７７：４０３０〜４０３４、１９８０；ＥＰ−Ａ−００５２５２２；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号。通常リポソームは、脂質含有率が約３０ｍｏｌ．％コレステロールを超える小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、最適な割合のポリペプチド漏出に選択率を調整する。
【００９９】
本発明に従い使用することができる前述の技法およびプロトコル、ならびに他の技法およびプロトコルの例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ、Ａ．（ｅｄ）、１９８０中で見ることができる。
【０１００】
医薬組成物
本発明の医薬組成物、および本発明に従い使用するための医薬組成物は、活性成分以外に、薬剤として許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者によく知られている他の物質を含むことができる。このような物質は非毒性でなければならず、活性成分の有効性に干渉してはならない。担体または他の物質の正確な性質は、経口であってよい投与経路、あるいは例えば静脈内注射による投与経路に依存すると思われる。
【０１０１】
配合物は液体、例えばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含む生理食塩水溶液、または乾燥粉末であってよい。
【０１０２】
用量
本発明のｃ−ＦＬＩＰ阻害剤または組成物は、「治療上有効な量」個体に投与することが好ましく、これは個体に対する利点を示すのに充分な量である。投与する実際の量、ならびに投与の割合および時間行程は、治療する性質および重度に依存すると思われる。
【０１０３】
治療の処方、例えば用量に関する決定などは、最終的には一般医および他の医療医の責任および裁量の範囲内であり、治療する障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および医師に知られている他の要因を典型的には考慮に入れる。
【０１０４】
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例中にさらに記載する。以下の添付の図面を参照されたい。
【実施例】
【０１０５】
材料および方法
細胞培養。全細胞を３７℃において５％ＣＯ２中に保った。ＭＣＦ−７細胞は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランドからのもの）を補った１０％の透析した新生仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ中に保った。ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６ｐ５３−／−同質遺伝子型ヒト結腸直腸癌細胞は、親切なことにＢｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ教授（Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）によって与えられた。ＨＣＴ１１６細胞は、１０％の透析した新生仔ウシ血清、５０ｍｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補ったマッコイの５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた。安定的にトランスフェクトしたＭＣＦ−７およびＨＣＴ１１６細胞系、ならびにトランスフェクトした細胞の「混合群」は、１００μｇ／ｍｌの（ＭＣＦ−７）または１．５ｍｇ／ｍｌの（ＨＣＴ１１６）Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃからのもの）を補った培地中に保った。
【０１０６】
ｃ−ＦＬＩＰ過剰発現細胞系の作製。製造者の使用説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に従い、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳコード領域をＰＣＲにより増幅させ、ｐｃＤＮＡ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯベクターに連結させた。ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞は、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用して、１０μｇのそれぞれのｃ−ＦＬＩＰ発現構築体およびピュロマイシン耐性遺伝子を発現する１μｇの構築体（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共にコトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞を選択し、１μｇ／ｍｌのピュロマイシンを補った培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）中に保った。ｃ−ＦＬＩＰの安定した過剰発現は、ウエスタンブロット分析によって評価した。
【０１０７】
ウエスタンブロッティング。以前に記載されたのと同様に（Ｌｏｎｇｌｅｙら、２００２）ウエスタンブロットを行った。Ｆａｓ／ＣＤ９５、Ｂｃｌ−２およびＢＩＤ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、カスパーゼ８（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、ＰＡＲＰ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オクスフォード、イングランド）、ｃ−ＦＬＩＰ（ＮＦ−６、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）ＤｃＲ３（Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ、ＣＡ）マウスモノクローナル抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、イングランド）と共に使用した。ＦａｓＬウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に使用した。均等な充填を、β−チューブリンマウスモノクローナル一次抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して評価した。
【０１０８】
免疫共沈降反応。２５０μｌのタンパク質Ａ（ＩｇＧ）またはタンパク質Ｌ（ＩｇＭ）、セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）および１μｇの適切な抗体を、４℃で１時間混合させた。抗体結合ビーズは、ＥＬＢ緩衝液（２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＩＰＥＧＡＬ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で３回洗浄した。タンパク質溶解物（２００〜４００μｇ）を次いで加え、混合物は４℃で１時間回転させた。次いでＥＬＢ緩衝液中で５回ビーズを洗浄し、１０％のβ−メルカプトエタノールを含む、１００μｌのウエスタンサンプル用緩衝液（２５０ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、２％のグリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー）中に再懸濁させた。次いでサンプルを９５度で５分間加熱し、遠心分離を施した（５分間／４，０００ｒｐｍ／４℃）。上清を回収し、ウエスタンブロッティングによって分析した。
【０１０９】
細胞生存能力アッセイ。細胞の生存能力は、ＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、Ｓｉｇｍａ）アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８３）によって評価した。薬剤誘導型のＦａｓ仲介アポトーシスを調べるために、９６ウエルプレート上にウエル当たり２，０００〜５，０００個の細胞で、細胞を播種した。２４時間後、一定範囲の濃度の５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＭＴＡまたはＯＸＡで２４〜７２時間、次にアゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体であるＣＨ−１１（ＭＢＬ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）でさらに２４〜４８時間細胞を処理した。化学療法／ｓｉＲＮＡの相互作用を評価するために、２４ウエルプレート上にウエル当たり２０，０００〜５０，０００個の細胞を播種した。２４時間後、ＦＬＩＰ標的（ＦＴ）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣ）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４時間で、一定範囲の濃度のそれぞれの薬剤でさらに７２〜９６時間細胞を処理した。ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれのウエルに加え、さらに２時間３７℃で細胞をインキュベートした。培養培地を除去し、ホルマザン結晶は２００μｌ（９６ウエル）または１ｍｌ（２４ウエル）ＤＭＳＯ中に再吸収させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、イングランド）を使用して、５７０ｎｍにおけるそれぞれのウエルの吸光度を読み取ることによって、細胞生存能力を決定した。
【０１１０】
フローサイトメトリー分析。６ウエルの組織培養プレートのウエル当たり１×１０５で、細胞を播種した。２４時間後、５−ＦＵ、ＴＤＸまたはＯＸＡを培地に加え、細胞をさらに７２時間培養し、その時間の後２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を２４時間加えた。採取した細胞のＤＮＡ含量は、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、Ｆ１）を使用して細胞をヨウ化プロピジウム染色した後に評価した。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション。ＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ  ｓｉＲＮＡ標的探知物質および設計ツール（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）を使用して設計して、ｃ−ＦＬＩＰの両方のスプライシング変異体を阻害した。ｃ−ＦＬＩＰ標的（ＦＴ）およびスクランブル対照（ＳＣ）ｓｉＲＮＡは、Ｘｅｒａｇｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）から得た。使用したＦＴｓｉＲＮＡ配列はＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡであった。使用したＦＬｓｉＲＮＡ配列はＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡであった。使用した対照の非サイレンシングｓｉＲＮＡ配列（ＳＣ）はＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＣＧＴであった。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、製造者の使用説明書に従いオリゴフェクタミン試薬を使用して、Ｏｐｔｉｍｅｍ培地（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃからのもの）中でインキュベートしたコンフルエント状態未満の細胞に行った。
【０１１２】
統計分析。化学療法剤とＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡの間の相互作用の性質は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法（１４）に従い組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって決定した。ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアプログラム（マイクロソフトウインドウズ）を使用して作製したアイソボログラムから、ＣＩ値を計算した。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの定義によれば、０．８５〜０．９のＣＩ値はわずかに相乗的であり、０．７〜０．８５は適度に相乗的であり、０．３〜０．７は相乗的であり、および０．１〜０．３は非常に相乗的である。不対両側ｔ検定を使用して、異なる処理群間のアポトーシスレベルの変化の有意性を決定した。
【０１１３】
結果
実施例１  ５−ＦＵおよびＴＤＸに応答してｃ−ＦＬＩＰＬは上方制御、プロセシングされ、Ｆａｓと結合する。
【０１１４】
ＭＣＦ−７細胞におけるＦａｓ発現の分析によって、それはＩＣ６０用量の５−ＦＵを用いた処理後７２時間で１２倍まで上方制御され、ＩＣ６０用量（２５ｎＭ）のＴＤＸを用いた処理に応答して、さらに充分に上方制御されたことが明らかになった（約７倍）（図１Ａ）。ＦａｓＬ発現はそれぞれの薬剤処理によって影響を受けなかったが、これらの細胞中で非常に発現されたようであった。ＦＡＤＤの発現も、薬剤処理によって影響を受けなかった。幾分驚いたことに、カスパーゼ８、その基質ＢＩＤ共に、プロカスパーゼ８または完全長ＢＩＤのレベルの下方制御の欠如によって示されたように、５−ＦＵ−またはＴＤＸ処理細胞中では活性化されなかった（図１Ａ）。Ｂｃｌ−２はそれぞれの物質に応答して充分に下方制御された。興味深いことに、ｃ−ＦＬＩＰＳではなくｃ−ＦＬＩＰＬが、薬剤処理によって上方制御された。さらにｃ−ＦＬＩＰＬは、ＤＩＳＣにおけるその漸増およびプロセシングを示す、そのｐ４３形にプロセシングされた（図１Ａ）。ＦａｓデコイレセプターＤｃＲ３の発現は、これらの細胞における薬剤処理によって変わることはなかった。
【０１１５】
５−ＦＵおよびＴＤＸ処理細胞におけるカスパーゼ８の活性化の外見上の阻害をさらに調べるために、我々は薬剤処理後のＦａｓとＦａｓＬの間の相互作用を分析した。免疫共沈降反応によって、薬剤処理後の増大したＦａｓ−ＦａｓＬ結合が存在したことを実証し（図１Ｂ）、カスパーゼ８の活性化の阻害はレセプター連結部の下流で起こったことが示唆された。これを支持して、薬剤処理によってＦａｓとｐ４３−ｃ−ＦＬＩＰＬの間の相互作用が増大したことを、我々は見出した（図１Ｃ）。これらの結果は、ＭＣＦ−７細胞中でのＦａｓ仲介アポトーシスの薬剤誘導活性化の阻害における、ｃ−ＦＬＩＰＬの関与を示唆した。
【０１１６】
実施例２  Ｆａｓ標的抗体ＣＨ−１１による薬剤誘導アポトーシスの活性化は、ｃ−ＦＬＩＰＬのプロセシングと同時に起こる。
【０１１７】
活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＦａｓＬの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｓ発現標的細胞のアポトーシスを誘導する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらの免疫エフェクター細胞の影響を模倣するために、アゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１を使用した。５−ＦＵまたはＴＤＸで７２時間、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１処理剤で２４時間、細胞を処理した。ＣＨ−１１単独ではアポトーシスに対してほとんど影響がなかったことを、我々は見出した（図２ＡおよびＢ）。９６時間５−ＦＵ単独による処理によって、５μＭの５−ＦＵに応答して適度な約２倍のアポトーシスの誘導がもたらされた（図２Ａ）。しかしながら、ＣＨ−１１を５−ＦＵ処理細胞に加えることによって、アポトーシスの劇的な増大がもたらされ、５μＭの５−ＦＵとＣＨ−１１の共処理後に約５５％の細胞がサブ−Ｇ１／Ｇ０アポトーシス期であった。同様に、ＴＤＸとＣＨ−１１の組合せはアポトーシスの劇的な活性化をもたらし、２５ｎＭのＴＤＸおよびＣＨ−１１を用いた併用処理後に約６０％の細胞がサブ−Ｇ１／Ｇ０アポトーシス期であった（図２Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞中のＦａｓ発現も強く誘導するＤＮＡ損傷物質ＯＸＡによって誘導された、アポトーシスに対するＣＨ−１１の影響も我々は調べた（図２Ｃ）。５−ＦＵおよびＴＤＸ処理細胞に対するその影響と同様に、ＣＨ−１１はＯＸＡ処理細胞のアポトーシスを誘導し、約５０％の細胞がサブ−Ｇ１／Ｇ０アポトーシス期であった（図２Ｄ）。
【０１１８】
我々は次に、５−ＦＵおよびＣＨ−１１を用いた共処理後の、ＭＣＦ−７細胞中のＦａｓ経路の活性化を分析した。既に示したように、５−ＦＵのみを用いた処理によってＦａｓの劇的な上方制御がもたらされたが、カスパーゼ８の活性化に対しては全く影響がなかった（図２Ｅ）。しかしながら、５−ＦＵおよびＣＨ−１１を用いたＭＣＦ−７細胞の共処理によって、プロカスパーゼ８の完全な消失によって示されたように、カスパーゼ８の劇的な活性化がもたらされた（図２Ｅ）。さらに、アポトーシスの特徴であるＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ）の切断は、５−ＦＵおよびＣＨ−１１を用いて共処理したＭＣＦ−７細胞においてのみ観察した（図２Ｅ）。我々は次に、５−ＦＵおよびＣＨ−１１共処理細胞における、カスパーゼ８の活性化の動態を分析した。５−ＦＵ前処理細胞へのＣＨ−１１の添加後１２時間で、カスパーゼ８は強く活性化された（図２Ｆ）。重要なことに、これと同時にそのｐ４３形へのｃ−ＦＬＩＰＬの完全なプロセシングが起こった（図２Ｆ）。ＣＨ−１１の添加後２４時間当たりでは、プロカスパーゼ８もｃ−ＦＬＩＰＬ（いずれもその完全長および切断形）も検出されなかった。
【０１１９】
同様に、４８時間のＩＣ６０（７２ｈ）用量の５−ＦＵ（５μＭ）またはオキサリプラチン（１μＭ）を用いたＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞の処理によって、Ｆａｓ発現の強い上方制御がもたらされたが（図８Ａ）、カスパーゼ８の活性化はごく適度であり、ＰＡＲＰ切断はもたらされなかった（図８Ｂ）。しかしながら、それぞれの薬剤およびＣＨ−１１を用いた共処理によって、カスパーゼ８の強い活性化およびＰＡＲＰ切断がもたらされた（図８Ｂ）。薬剤およびＣＨ−１１共処理細胞において、カスパーゼ８の活性化は、ｃ−ＦＬＩＰＬのｐ４３−ＦＬＩＰＬへの完全なプロセシングと相関関係があった（図８Ｂ）。さらに、５−ＦＵおよびオキサリプラチン処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞へのＣＨ−１１の添加は、それぞれｃ−ＦＬＩＰＳの約４倍および約８倍の上方制御をもたらした（図８Ｂ）。これらの結果は、化学療法後のＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞中でのＦａｓ仲介アポトーシスの制御における、ｃ−ＦＬＩＰの関与を示唆した。
【０１２０】
我々はさらに、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞系においてアポトーシスを活性化させるＣＨ−１１の能力を調べた。５−ＦＵ、ＴＤＸおよびＯＸＡを用いた処理後４８時間で、ＨＣＴ１１６細胞中においてＦａｓは強く上方制御された（図３Ａ）。４８時間のそれぞれの薬剤単独またはＣＨ−１１単独による処理によって、カスパーゼ８が有意に活性化することはなく、あるいはＰＡＲＰ切断が誘導されることもなかった（図３Ｂ）。しかしながら、それぞれの薬剤で２４時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間の処理は、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断をもたらした。重要なことに、カスパーゼ８の活性化は、薬剤およびＣＨ−１１共処理細胞におけるｃ−ＦＬＩＰＬのプロセシングと相関関係があった（図３Ｂ）。
【０１２１】
薬剤処理後にＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞においてデスレセプター仲介のアポトーシスを行うための細胞内シグナルがｃ−ＦＬＩＰにより制御されたという、仮説をさらに試験するために、本発明者らはｃ−ＦＬＩＰＬまたはｃ−ＦＬＩＰＳを過剰発現するＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞系を作製した。ＨＦＬ１７とＨＦＬ２４細胞系の両方が、ＬａｃＺ発現構築体（ＨＬａｃＺ）でトランスフェクトした細胞と比較して約６倍ｃ−ＦＬＩＰＬを過剰発現し、一方ＨＦＳ１９およびＨＦＳ４４細胞系は、対照細胞系と比較してそれぞれ約５倍および約１０倍までｃ−ＦＬＩＰＳを過剰発現した（図９Ａ）。増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）を行って、それぞれの細胞系におけるそれぞれの化学療法剤のＩＣ５０（７２ｈ）用量を決定した。ｃ−ＦＬＩＰＳの過剰発現は任意の薬剤のＩＣ５０（７２ｈ）用量に対して有意な影響がなく、一方ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現はオキサリプラチンのＩＣ５０（７２ｈ）用量の適度な１．７〜２．０倍の増大を引き起こしたが、他の薬剤のＩＣ５０（７２ｈ）用量に対しては影響がなかったことが分かった（表１）。
【０１２２】
フローサイトメトリーによって、ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は化学療法剤に応答して細胞周期停止に影響を与えることはなかったが、化学療法剤誘導アポトーシスに対して著しい影響があったことが明らかになった（図９Ｂ）。例えば、７２時間の５μＭの５−ＦＵを用いた処理によって、それぞれの細胞系においてＧ１／Ｓ期境界での細胞周期停止がもたらされたが、しかしながら、２つのｃ−ＦＬＩＰＬ過剰発現系におけるアポトーシスのレベルは、対照細胞系と比較して有意に低下しており、約１５％のＨＦＬ１７細胞および約１７％のＨＦＬ２４細胞が、ＨＬａｃＺ細胞系における約４１％と比較してサブ−Ｇ１／Ｇ０アポトーシス期であった（ｐ＜０．０００１、図９Ｂ）。対照的に、２つのｃ−ＦＬＩＰＳ過剰発現系において５−ＦＵにより誘導されたアポトーシスのレベルは、対照ＨＬａｃＺ細胞系中より実際に幾分高かった。他の薬剤を用いて同様の結果を得た、何故ならｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現はオキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１誘導アポトーシスを有意に低下させ、一方ｃ−ＦＬＩＰＳの過剰発現は、化学療法剤誘導アポトーシスを阻害することができなかったからである（図９Ｂ）。ｃ−ＦＬＩＰＬ過剰発現細胞系およびＨＬａｃＺ細胞系（表１）において観察した同様のＩＣ５０（７２ｈ）用量は、ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は化学療法剤誘導型の細胞周期停止に影響を与えず、これらの細胞系中で観察した薬剤誘導アポトーシスの違いにもかかわらず、同様のレベルの増殖阻害をもたらした事実を表す可能性がある。
【０１２３】
実施例４  ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は、化学療法剤誘導型Ｆａｓ仲介の細胞死を阻害する。
【０１２４】
薬剤処理後のＦａｓ仲介アポトーシスの制御におけるｃ−ＦＬＩＰＬの役割をさらに調べるために、我々はｃ−ＦＬＩＰＬを過剰発現する一群のＭＣＦ−７細胞系を開発した。空ベクター（図４Ａ）でトランスフェクトした細胞と比較して、５〜１０倍高いｃ−ＦＬＩＰＬ発現がある細胞系を我々は開発した。ｃ−ＦＬＩＰＬ過剰発現細胞系ＦＬ４４およびＦＬ６４、ならびに空ベクターでトランスフェクトした細胞（ＥＶ６８）は、さらなる特徴付けのために採取した。細胞生存能力アッセイは、５−ＦＵ次にＣＨ−１１を用いたＥＶ６８細胞の処理は、細胞生存能力の非常に相乗的な低下をもたらしたことを示した（ＲＩ＝２．０６、ｐ＜０．０００５）（図４Ｂ）。しかしながら、それぞれ１．１４および１．０１のＲＩ値を有する、５−ＦＵおよびＣＨ−１１で共処理したＦＬ４４またはＦＬ６４細胞において、細胞生存能力の相乗的低下は観察されなかった（図４Ｂ）。さらに、５−ＦＵとＣＨ−１１の共処理は、ＥＶ６８細胞においてカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断をもたらした（図４Ｃ）。対照的に、ＦＬ６４細胞中のｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は、５−ＦＵとＣＨ−１１の共処理に応答するカスパーゼ８の活性化とＰＡＲＰ切断の両方を無効にした（図４Ｃ）。
【０１２５】
我々は次に、葉酸代謝拮抗薬ＴＤＸおよびＭＴＡ、ならびにＤＮＡ障害物質ＯＸＡを用いた処理後の、Ｆａｓ仲介アポトーシスに対するｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現の影響を調べた。３つの薬剤全てが、ＣＨ−１１と組み合わせるとＥＶ６８細胞における細胞生存能力を相乗的に低下させた（図５ＡおよびＢ）。しかしながら、この相乗的相互作用は、ＦＬ４４およびＦＬ６４細胞系におけるｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現によって阻害された（図５ＡおよびＢ）。カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を分析することによって、３つの薬剤全てに応答するＦａｓ仲介アポトーシスは、ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現によって弱まったことを確認した。それぞれの葉酸代謝拮抗薬およびＣＨ−１１を用いた併用処理は、ＦＬ６４細胞ではなくＥＶ６８細胞においてカスパーゼ８の活性化をもたらした（図５Ｃ）。同様に、葉酸代謝拮抗薬およびＣＨ−１１に応答するＰＡＲＰ切断は、ＦＬ６４細胞系において阻害された（図５Ｃ）。幾つかのカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を、５μＭのＯＸＡおよびＣＨ−１１を用いた共処理後にＦＬ６４細胞において観察したが、これはＥＶ６８細胞系と比較してはるかに低下していた（図５Ｄ）。これらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰＬは５−ＦＵ、葉酸代謝拮抗薬およびオキサリプラチンに応答するＦａｓ仲介アポトーシスの重要な制御物質であることを示す。
【０１２６】
同様の実験を、幾つかの他の細胞系およびＣＨ−１１と組み合わせた化学療法剤を使用して行った。これらの結果は図９Ｃに示す。化学療法剤の不在下での５０ｎｇ／ｍＬのＣＨ−１１を用いた処理は、ＨＬａｃＺ対照細胞系において、わずかな程度のアポトーシスを誘導した（データ示さず）。しかしながら、それぞれの化学療法剤およびＣＨ−１１を用いた共処理は、ＨＬａｃＺ細胞系において、高レベルのアポトーシスをもたらした（図９Ｃ）。化学療法剤およびＣＨ−１１に応答した高レベルのアポトーシスも、ｃ−ＦＬＩＰＳ過剰発現細胞系ＨＦＳ１９およびＨＦＳ４４において観察した（図９Ｃ）。対照的に、ＨＦＬ１７およびＨＦＬ２４細胞系におけるｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は、それぞれの化学療法剤およびＣＨ−１１を用いた共処理に応答したアポトーシスを劇的に阻害した（図９Ｃ）。したがって、ｃ−ＦＬＩＰＳではなくｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は、化学療法剤誘導アポトーシスと、化学療法剤およびＦａｓアゴニストＣＨ−１１を用いた共処理に応答して誘導されたアポトーシスの両方からＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞を保護した。
【０１２７】
実施例６  ｃ−ＦＬＩＰのｓｉＲＮＡ標的化は、化学療法剤に対して癌細胞を敏感にさせる。
【０１２８】
ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は、化学療法剤誘導Ｆａｓ仲介の細胞死からＭＣＦ−７およびＨＣＴ１１６細胞を保護したことを立証したので、我々は次にＦＬＩＰ標的（ＦＴ）ｓｉＲＮＡを設計して、両方のｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体を阻害した。１０ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、ＭＣＦ−７細胞において両方のｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体の発現を強く下方制御した（図６Ａ）。ＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞の細胞生存能力分析によって、５−ＦＵを用いた共処理は、細胞生存能力の相乗的低下をもたらしたことを示した（図６Ｂ、ＲＩ＝１．５６、ｐ＜０．００５）。興味深いことに、ＦＴｓｉＲＮＡを用いたＭＣＦ−７細胞のトランスフェクションは、５−ＦＵを用いた共処理の不在下において細胞生存能力を有意に低下させ、２．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞において細胞生存能力を約５０％低下させた（図６Ｂ）。ＦＬＩＰ発現の影響が全くなかったスクランブル対照（ＳＣ）ｓｉＲＮＡは、単独または５−ＦＵと組み合わせて細胞生存能力に対しても影響がなかった（データ示さず）。ＦＴｓｉＲＮＡ単独に応答した細胞生存能力の低下は、アポトーシスの誘導によるものであったように見えた、何故なら、薬剤を用いた共処理の不在下でのＦＴｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、有意なレベルのＰＡＲＰ切断を誘導したからである（図６Ｃ、レーン２）。さらに、ＦＴｓｉＲＮＡと５−ＦＵの併用処理によって、ＰＡＲＰの強力な切断がもたらされ（図６Ｃ）、これらの物質で共処理したＭＣＦ−７細胞において観察した細胞生存能力の相乗的低下は、増大したアポトーシスによるものであったことが示された。
【０１２９】
ＦＴｓｉＲＮＡは、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＬＩＰＬおよびＦＬＩＰＳの発現も強く下方制御した（図７Ａ）。ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨＣＴ１１６細胞におけるカスパーゼ８の活性化を分析することによって、ＦＴｓｉＲＮＡ単独（１ｎＭ）は、ｐ５３／５５チモーゲンのレベルの低下およびｐ４１／４３切断産物の出現によって示されたように、ある程度のカスパーゼ８の活性化を引き起こしたことを示した（図７Ｂ、レーン３）。これはある程度のＰＡＲＰ切断を伴った。高濃度（＞５ｎＭ）では、ＦＴｓｉＲＮＡ単独は、ＨＣＴ１１６細胞においてさらに強いカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を引き起こした（図７Ｃ）。５−ＦＵ（５μＭ）およびＴＤＸ（１００ｎＭ）は、ｐ４１／ｐ４３カスパーゼ８の存在によって示されたように、擬似およびＳＣトランスフェクトＨＣＴ１１６細胞においてある程度のカスパーゼ８の活性化を引き起こしたが、これらの細胞においてＰＡＲＰ切断は観察されなかった（図７Ｂ）。最も強いカスパーゼ８の活性化は、１ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵまたはＴＤＸで共処理した細胞において観察され、ｐ５３／５５チモーゲンの発現は低下し、ｐ４１／４３およびｐ１８カスパーゼ８切断産物の発現は増大した（図７Ｂ、レーン６および９）。さらに、ＦＴｓｉＲＮＡ／化学療法剤処理したＨＣＴ１１６細胞におけるカスパーゼ８の活性化は、強いＰＡＲＰ切断を伴った。細胞生存能力アッセイによって、０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡおよび５μＭの５−ＦＵを用いた共処理は、細胞生存能力の相乗的低下をもたらしたことを示した（図８Ａ、ＲＩ＝２．１０、ｐ＜０．０００５）。対照的にＳＣｓｉＲＮＡは、５−ＦＵの存在下または不在下において細胞生存能力に対して有意な影響がなかった。さらに、ＦＴｓｉＲＮＡならびにＴＤＸおよびＯＸＡを用いた共処理は、細胞生存能力の相乗的低下、ならびにそれぞれ１．６８および２．２６のＲＩ値をもたらした（図８ＢおよびＣ）。これらの結果は、ＨＣＴ１１６およびＭＣＦ−７細胞におけるｃ−ＦＬＩＰ発現の阻害は、化学療法剤誘導アポトーシスに対してこれらの細胞を劇的に敏感にしたことを示す。
【０１３０】
ｃ−ＦＬＩＰのｓｉＲＮＡ標的化がＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞を化学療法剤に対して敏感にする他の証拠は、図１１に示す。２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体の発現を下方制御するために、ＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡを設計した。試験した幾つかのｓｉＲＮＡの中で、１つのＦＬＩＰ標的（ＦＴ）ｓｉＲＮＡが、ナノモル濃度でＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞において、２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体の発現を強く下方制御した（図１１Ａ）。我々はこのＦＴｓｉＲＮＡを使用して、薬剤誘導アポトーシスに対するｃ−ＦＬＩＰ発現の下方制御の影響を分析した。興味深いことに、化学療法剤の不在下での０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、サブＧ０／Ｇ１アポトーシス期中の細胞のフローサイトメトリー分析により評価したように、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞（約９％）と比較してＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞において、有意なレベルのアポトーシス（約２６％）を誘導した（ｐ＜０．０００１；図１１Ｂ）。重要なことに、４８時間ＩＣ６０７２ｈ用量の５−ＦＵを用いて、ＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を共処理することによって、アポトーシスの相加的を超える増大がもたらされ、対照の非サイレンシングｓｉＲＮＡでトランスフェクトした５−ＦＵ処理細胞における約１１％と比較して、約４３％の細胞がアポトーシスを経た（ｐ＝０．００１８；図１１Ｂ）。オキサリプラチン処理後の結果はより一層劇的であり、対照ｓｉＲＮＡおよびオキサリプラチンで共処理した細胞の約１７％と比較して、ＦＴｓｉＲＮＡおよびオキサリプラチンで共処理した約６１％の細胞が４８時間後にサブＧ０／Ｇ１期にあった（ｐ＜０．０００１；図１１Ｂ）。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞におけるカスパーゼ８の活性化を分析することによって、ｐ５３／５５チモーゲンのレベルの低下およびｐ４１／４３切断産物の出現によって示されたように、０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡ単独で、ある程度のカスパーゼ８の活性化を引き起こしたことが示された（図１１Ｃ）。細胞周期のデータと一致して、０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、化学療法剤の不在下である程度のＰＡＲＰ切断をもたらした。５μＭの５−ＦＵを用いた処理も、擬似トランスフェクト細胞および対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞において、適度なカスパーゼ８の活性化を引き起こしたが（ｐ４１／ｐ４３カスパーゼ８の存在により示されたように）、しかしながら、これらの細胞においてＰＡＲＰ切断は観察されなかった（図１１Ｃ）。これまでの所、最も強いカスパーゼ８の活性化は、０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵで共処理した細胞において観察され、ｐ５３／５５チモーゲンの発現は低下し、ｐ４１／４３カスパーゼ８切断産物の発現は増大した（図１１Ｃ）。さらに、ＦＴｓｉＲＮＡ／５−ＦＵ処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞におけるカスパーゼ８の活性化は、完全なＰＡＲＰ切断を伴った。ヌクレオチド合成酵素チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の特異的阻害剤である葉酸代謝拮抗薬トミュデックスに関して、同様の結果を得た（図１１Ｃ）。さらに、強いカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を、個々にいずれかの物質で処理した細胞と比較して、２４時間後にＦＴｓｉＲＮＡおよびオキサリプラチンで共処理した細胞において観察した（図１１Ｃ）。これらの結果を鑑みて、我々はさらに、ＣＰＴ−１１、結腸直腸癌の処理において現在使用されている他の化学療法剤によって誘導されるアポトーシスに対する、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御の影響を調べた。他の薬剤と同様に、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御はＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞を、ＣＰＴ−１１誘導型のカスパーゼ８の活性化およびアポトーシスに対して敏感にした（図１０Ｃ）。
【０１３２】
ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞におけるアポトーシスに対する、ＦＴｓｉＲＮＡおよび化学療法剤の付加的影響を超える影響を考慮して、我々は細胞生存能力アッセイを実施して、その相互作用が相乗的であったかどうかを決定した。細胞生存能力アッセイによって、ＦＴｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵを用いた共処理が、８／９濃度に関して１未満の組合せ指数（ＣＩ）値をもたらしたことを示した（図１１Ｄ）。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの定義に従うと、ＦＴｓｉＲＮＡ／５−ＦＵ共処理に関するＣＩ値は、調べた４／９の濃度の組合せに関して適度な相乗的相互作用、および他の４つの濃度に関して相乗的相互作用が存在したことを示した（図１１Ｄ）。ＦＴｓｉＲＮＡおよびオキサリプラチンを用いた共処理は、調べた全ての濃度に関して細胞生存能力の相乗的低下をもたらし、ＣＩ値は約０．２５〜０．７５の範囲であった（図３Ｄ）。同様に、ＣＰＴ−１１とＦＴｓｉＲＮＡの併用処理は、相乗的または適度に相乗的な細胞生存能力の低下をもたらし、ＣＩ値は約０．５０〜０．８５の範囲であった（図１１Ｄ）。対照ｓｉＲＮＡは、任意の薬剤の存在下または不在下において、細胞生存能力に対して影響がなかった（データ示さず）。集合的にこれらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰ発現の下方制御は、５−ＦＵ、オキサリプラチン、およびＣＰＴ−１１誘導アポトーシスに対してＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞を劇的に敏感にすることを示す。
【０１３３】
実施例７Ａ  アゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１は、ｐ５３非依存的にＣＰＴ−１１およびＴＤＸに応答するアポトーシスを相乗的に活性化させる。
【０１３４】
アゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１はＦａｓ／ＣＤ９５レセプターを活性化させ、アポトーシスを引き起こすことが示されてきている。ｐ５３突然変異結腸癌細胞系におけるＦａｓ／ＣＤ９５レセプターの上方制御の欠如によって、５−ＦＵとＣＨ−１１の間の相乗的相互作用が無効になった。我々の試験では、一定範囲のそれぞれの化学療法剤５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンを用いたｐ５３野生型およびヌル細胞系の処理、次いで２４時間後の抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）のさらに４８時間の添加は、ｐ５３野生型設定における全ての薬剤に関して有意な相乗作用をもたらしたが、ｐ５３ヌル細胞では、この相乗作用は、トポイソメラーゼＩ阻害剤ＣＰＴ−１１およびチミジル酸シンターゼ阻害剤ＴＤＸを用いてのみ見られた。任意の用量でｐ５３ヌル細胞においてオキサリプラチンを用いると、相乗的相互作用は全く見られず、高用量で５−ＦＵとのごくわずかな相互作用が見られた（図１７）。これらの化学療法剤で２４時間、次にＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌでさらに２４時間処理した、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系のヨウ化プロピジウム染色によって、ｐ５３野生型細胞においてそれぞれの薬剤およびＣＨ−１１を用いて相乗的相互作用が見られることを確認し（図１８）、一方ｐ５３ヌル設定では、ＣＰＴ−１１単独およびそれより低い程度でＴＤＸでの処理は、ＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌを用いて有意な相乗作用をもたらした。
【０１３５】
実施例７Ｂ  ＣＨ−１１と５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１とオキサリプラチンの間の相乗作用に対するｐ５３不活性化の影響。
【０１３６】
その天然リガンドＦａｓＬまたはモノクローナル抗体ＣＨ−１１によるＦａｓ／ＣＤ９５レセプターの活性化は、ＤＩＳＣでのプロカスパーゼ８の漸増および活性化をもたらす。プロカスパーゼ８は、その活性サブユニットｐ４１／４３およびｐ１８に切断される。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ＤＮＡの修復および安定性と通常関係があり、アポトーシス初期中にカスパーゼファミリーのメンバーによって切断される。
【０１３７】
ＩＣ６０用量のこれらの化学療法剤で２４時間、次に抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）でさらに２４時間処理した、ｐ５３野生型およびヌル細胞系をウエスタンブロット分析すると、それぞれの薬剤に関してｐ５３野生型細胞系において、ＰＡＲＰ切断およびプロカスパーゼ８の活性化（活性ｐ４１／４３およびｐ１８サブユニットの生成を伴う）をもたらした（図１９）。ｐ５３ヌル細胞系では、ＣＨ−１１を加えた後のＰＡＲＰ切断およびプロカスパーゼ８の活性化は、ＣＰＴ−１１を用いた処理後のみ見られた。
【０１３８】
実施例７Ｃ  ｃ−ＦＬＩＰ制御型の化学的感受性に対するｐ５３状態の影響。
【０１３９】
ｃ−ＦＬＩＰの下方制御はさらに、ｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞が化学療法剤誘導アポトーシスに対して敏感になるかどうかを決定するために、我々はＦＴｓｉＲＮＡを用いてこれらの細胞をトランスフェクトし、化学療法剤（５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１）を用いてこれらの細胞を共処理した。ｐ５３ヌル細胞（ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−）は、ｐ５３野生型細胞より高レベルの２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング形を発現したが（図１２Ａ）、発現は１ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡによって効果的に下方制御された（図１２Ｂ）。１ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡのみを用いたｐ５３ヌル細胞の処理は、７２時間後にアポトーシスの適度な増大をもたらし、ＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における約９％と比較してサブＧ０／Ｇ１期中の細胞は約１４％存在した（ｐ＝０．００８１；図１２Ｃ）。５μＭの５−ＦＵを用いたＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞の共処理は、５−ＦＵ／ＳＣｓｉＲＮＡで共処理した細胞の約１４％と比較して、約２９％アポトーシス期を有意に増大させた（ｐ＝０．０００３；図１２Ｃ）。５μＭのオキサリプラチンを用いたＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞の処理は、オキサリプラチン／ＳＣｓｉＲＮＡで共処理した細胞と比較して、アポトーシスを経る細胞の非常に有意な増大をもたらした（約２７％と比較して約４６％、ｐ＜０．０００１；図４Ｃ）。ＦＴｓｉＲＮＡは、ＳＣ／ＣＰＴ−１１共処理細胞における約２２％と比較して、１μＭのＣＰＴ−１１に応答するＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞のアポトーシスも約３３％増大させた（ｐ＝０．０００２；図１２Ｃ）。これらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰ発現の下方制御が、ｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞において化学療法剤誘導アポトーシス、特にオキサリプラチン誘導アポトーシスを有意に増大させたことを示す。
【０１４０】
我々はさらに、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを使用して、ｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞の化学的感受性に対するｃ−ＦＬＩＰの下方制御の影響を分析した。アポトーシスの付加的増大を超える増大を、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞においてＦＴｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵを用いた併用処理に関して検出した一方で（図１２Ｃ）、細胞生存能力アッセイによって、２／９の組合せのみでわずかな相乗作用を確認した（図１２Ｄ）。同様に、ＦＴｓｉＲＮＡとＣＰＴ−１１の間の相互作用は、３／９の薬剤の組合せのみで適度あるいはわずかに相乗的であったことが分かった（図１２Ｄ）。したがって、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御は５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１誘導アポトーシスに対してＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞を敏感にしたが（図１２Ｃ）、細胞生存能力アッセイによって、ｐ５３野生型親細胞系よりも少ない薬剤の組合せに相乗作用があり、相乗作用の程度が低かったことを示した。しかしながら、オキサリプラチンおよびＦＴｓｉＲＮＡを用いたＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞の共処理は、分析した９つ全ての組合せに関して相乗的あるいは適度に相乗的であり、ＣＩ値は約０．３５〜０．８５の範囲であり（図１２Ｄ）、他の化学療法剤に関して誘導されたアポトーシスのレベルより高い、この組合せに関して誘導されたアポトーシスのレベルを表す可能性が最も高かった（図１２Ｃ）。
【０１４１】
他の結腸直腸癌細胞系における化学的感受性に対するｃ−ＦＬＩＰの影響。
ｃ−ＦＬＩＰが結腸直腸癌における化学的感受性の一般的な調節物質であるかどうか決定するために、我々はこれらの試験を２つの他の結腸直腸癌細胞系モデル、すなわちｐ５３野生型ＲＫＯ細胞系およびｐ５３突然変異Ｈ６３０細胞系に広げた。それぞれの細胞系は２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング形を発現し、ＦＴｓｉＲＮＡは２つの系においてｃ−ＦＬＩＰタンパク質を下方制御した（図１３Ａ）。ＨＣＴ１１６細胞系中と同様に、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御は２つの細胞系を５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１によって誘導されたアポトーシスに対して敏感にした（図５Ｂ）。それぞれの場合において、化学療法剤およびＦＴｓｉＲＮＡを用いた共処理の影響は、付加的影響を超えていた。注目すべきことに、ＣＰＴ−１１に対する増感は２つの系において非常に著しく、ＳＣｓｉＲＮＡ／ＣＰＴ−１１共処理ＲＫＯ細胞の約１５％と比較して、ＦＴｓｉＲＮＡ／ＣＰＴ−１１共処理ＲＫＯ細胞の約４３％がアポトーシスを経て、ＳＣｓｉＲＮＡ／ＣＰＴ−１１共処理Ｈ６３０細胞の約１２％と比較して、ＦＴｓｉＲＮＡ／ＣＰＴ−１１共処理Ｈ６３０細胞の約３２％がアポトーシスを経た。ＭＴＴ分析によって、ＲＫＯ細胞におけるＦＴｓｉＲＮＡとそれぞれの薬剤の間の相乗的相互作用を示し、それぞれの薬剤に関して大部分のＣＩ値は０．７５未満であった（図１３Ｃ）。この相乗作用はＨ６３０細胞ではそれほど顕著ではなく、ＦＴｓｉＲＮＡとＣＰＴ−１１の組合せが最も一貫して相乗的あるいは適度に相乗的であった（図１３Ｃ）。
【０１４２】
集合的に、これらの結果はｃ−ＦＬＩＰが、結腸直腸癌細胞系における化学療法剤誘導アポトーシスを制御する際に重要な役割を果たすことを示す。さらに、ｐ５３野生型、突然変異およびヌル細胞系がｃ−ＦＬＩＰの下方制御後に化学療法剤誘導アポトーシスに対して敏感になる一方で、相乗作用の程度は機能的ｐ５３を欠く細胞系では低いように思われる。
【０１４３】
ｃ−ＦＬＩＰを強くノックダウンすると、化学療法剤の不在下でアポトーシスが誘導される。
既に論じたように、０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡのＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞へのトランスフェクションは、化学療法剤を用いた共処理の不在下でアポトーシスを有意に増大させた（図１０Ｂ）。高濃度のＦＴｓｉＲＮＡを使用して、より完全にＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞におけるｃ−ＦＬＩＰの発現をノックダウンすると、化学療法剤の不在下で、細胞生存能力の劇的な低下（図１４Ａ）、およびＰＡＲＰ切断およびアポトーシスの有意な増大を観察した（図１４ＢおよびＣ）。同様の影響をＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞において観察したが、ＰＡＲＰ切断およびアポトーシスの程度は、ｐ５３野生型細胞系中より低かった（図１４ＢおよびＣ）。しかしながら、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞を高濃度のＦＴｓｉＲＮＡに７２時間曝すことによって、ｐ５３野生型親細胞系において観察したレベルに近いアポトーシスのレベルがもたらされた（図１４Ｄ）。ｐ５３野生型およびヌル細胞系におけるＩＣ５０（７２ｈ）用量のＦＴｓｉＲＮＡは、ＭＴＴアッセイにより測定して、それぞれ約０．７ｎＭおよび約２．５ｎＭであった。さらにＦＴｓｉＲＮＡは、化学療法剤の不在下でＲＫＯおよびＨ６３０細胞においてアポトーシスを強く誘導した（図１４ＥおよびＦ）。これらの細胞系におけるＩＣ５０（７２ｈ）用量は、ＲＫＯ細胞中で約５ｎＭおよびＨ６３０細胞中で約２５ｎＭであると計算した。これらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰは細胞毒性薬剤の不在下でさえも、結腸直腸癌細胞の生存能力の一般的な決定因子である可能性があることを示す。さらに、ｃ−ＦＬＩＰの標的化はｐ５３野生型、突然変異およびヌルおよび結腸直腸癌細胞においてアポトーシスを誘導し、ｃ−ＦＬＩＰがこの疾患を処理するための重要な新しい処理標的となる可能性があることが示唆された。
【０１４４】
ＦＴｓｉＲＮＡトランスフェクション後のｃ−ＦＬＩＰの下方制御の動態を調べることによって、２つのスプライシング形がトランスフェクション後８時間で早くも効率よく下方制御されたことを示した（図１５Ａ）。タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドを用いた処理後に、ｃ−ＦＬＩＰが細胞中で急速に転換されることを示す以前の発見（１６）と、このことは一致する。８時間地点でのｃ−ＦＬＩＰの下方制御は、ＰＡＲＰ切断によって示されたように、プロカスパーゼ８の低下したレベルおよびアポトーシスの兆候と相関関係があった（図１５Ａ）。このことは、高濃度のＦＴｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）に関してより明らかであった。トランスフェクション後１２時間および２４時間までに、１ｎＭおよび１０ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡに応答するプロカスパーゼ８のレベルの低下およびＰＡＲＰ切断以外に、ｐ４１／４３カスパーゼ８切断断片を検出することができた（図１５Ａ）。ウエスタンブロット分析と一致して、フローサイトメトリーによって、ＦＴｓｉＲＮＡトランスフェクション後のアポトーシスの兆候は、６時間と１２時間の間に生じたことを示した（図１５Ｂ）。したがって、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御は、カスパーゼ８の活性化およびアポトーシスの兆候と強く結び付くと思われる。
【０１４５】
ｃ−ＦＬＩＰＬの特異的標的化のアポトーシスに対する影響。
我々の最初の観察結果は、化学療法剤／ＣＨ−１１処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞におけるアポトーシスの活性化と、完全長ｃ−ＦＬＩＰＬの消失が同時に起こったことであった（図９Ｂ）。したがって、２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体を下方制御することの細胞生存に対する影響は、実際にはｃ−ＦＬＩＰＬの下方制御の結果であった可能性があった。さらに、ｃ−ＦＬＩＰ過剰発現細胞系からのデータは、ｃ−ＦＬＩＰＬはより重要な化学的耐性の制御物質であったことを示唆した（図１０Ｂ）。したがって我々は、ｃ−ＦＬＩＰＳの発現に影響を与えずに長いスプライシング形を特異的に下方制御するためにｓｉＲＮＡを設計した（図１６Ａ）。二重標的化ｓｉＲＮＡの影響と同様に、ｃ−ＦＬＩＰＬの特異的な下方制御は、ＰＡＲＰ切断（図８Ａ）およびフローサイトメトリー（データ示さず）によって示されたように、化学療法剤の不在下でＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞のアポトーシスを誘導した。さらに、ＦＬｓｉＲＮＡおよびそれぞれの化学療法剤を用いた併用処理は、増大したアポトーシス（図１６Ｂ）および細胞生存能力の非常に相乗的な低下をもたらした（図１６Ｃ）。同様の細胞生存能力の相乗的低下を、Ｈ６３０およびＲＫＯ細胞系において観察した（データ示さず）。これらのデータは、ｃ−ＦＬＩＰＬの下方制御は２つのスプライシング変異体を下方制御する影響を再現するのに充分であり、２つのスプライシング形のうちｃ−ＦＬＩＰＬが、より重要な結腸直腸癌細胞死の制御物質である可能性があることを示唆する。
【０１４６】
考察
ＭＣＦ−７乳癌細胞およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞中では、５−ＦＵ、ＴＳ標的葉酸代謝拮抗薬ＴＤＸおよびＭＴＡ、ならびにＤＮＡ障害物質ＯＸＡに応答してＦａｓデスレセプターは充分に上方制御されたが、しかしながら、これはアポトーシスの有意な活性化をもたらさなかったことを我々は見出した。活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞によるＦａｓＬの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＦａｓ発現標的細胞のアポトーシスを誘導する（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９９）。これらの免疫エフェクター細胞の影響を我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて模倣するために、我々はアゴニスト性Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ−１１を使用した。ＣＨ−１１は化学療法剤処理した細胞のアポトーシスを強く活性化し、Ｆａｓシグナル経路はｉｎ  ｖｉｖｏでこれらの物質に応答するアポトーシスの重要なメディエーターであることが示唆されたことを、我々は見出した。多くの腫瘍細胞がＦａｓＬを過剰発現し、腫瘍ＦａｓＬはＦａｓ感受性免疫エフェクター細胞のアポトーシスを誘導し、これによって抗腫瘍免疫応答を阻害すると仮定されてきている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９９）。この仮定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ  ｖｉｖｏ試験の両方によって支持されてきている（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９８；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９７）。ＦａｓＬを過剰発現させる戦略は、腫瘍細胞がＦａｓ仲介アポトーシスに対する耐性を増大させて、オートクリンおよびパラクリン誘導の腫瘍細胞死を防ぐことを必要とする。化学療法剤に応答する我々が観察したカスパーゼ８の活性化の欠如は、Ｆａｓ仲介のアポトーシスはＭＣＦ−７およびＨＣＴ１１６および癌細胞中で阻害される可能性があるが、ＣＨ−１１を用いた共処理は、この耐性を克服しＦａｓ仲介のアポトーシスを活性化させるのに充分であったことを示唆する。
【０１４７】
Ｆａｓシグナリングは、ＦａｓＤＩＳＣでのカスパーゼ８の漸増および活性化を阻害することができるｃ−ＦＬＩＰによって阻害することができる（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００１）。多数のｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体が報告されてきているが、しかしながら、２つの形のみ（ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳ）がタンパク質レベルで検出されてきている（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、１９９９）。２つのスプライシング変異体はデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を有しており、これによって変異体はＦＡＤＤと結合し、プロカスパーゼ８分子とＤＩＳＣの接触が遮断される。ｃ−ＦＬＩＰＬはＤＩＳＣでプロセシングされる、何故ならｃ−ＦＬＩＰＬはカスパーゼ８の天然基質であり、カスパーゼ８はそれを切断して約４３ｋＤａの切断形（ｐ４３−ＦＬＩＰＬ）を生成するからである（Ｎｉｉｋｕｒａら、２００２）。切断されたｐ４３−ｃ−ＦＬＩＰＬは、完全長ｃ−ＦＬＩＰＬよりＤＩＳＣとより強く結合する。ｃ−ＦＬＩＰＳは、カスパーゼ８によってＤＩＳＣでプロセシングされない。ｃ−ＦＬＩＰＬは、ｃ−ＦＬＩＰＳよりもＦａｓ仲介の細胞死のさらに強力な阻害剤であるようである（Ｉｒｍｌｅｒら、１９９７；Ｔｓｃｈｏｐｐら、１９９８）。最初にプロアポトーシス効果とアンチアポトーシス効果の両方が、ｃ−ＦＬＩＰに関して示された。しかしながら、増大した細胞死は一過性の過剰発現を使用する実験で主に起こり、カスパーゼの活性化をもたらすプロカスパーゼ８を含めた、他のＤＥＤ含有タンパク質の凝集を引き起こした可能性がある、これらのＤＥＤ含有タンパク質の過剰なレベルによるものであった可能性がある（Ｓｉｅｇｅｌら、１９９８）。ｃ−ＦＬＩＰを安定して過剰発現する細胞系からのデータ、およびｃ−ＦＬＩＰを欠損したマウスからのデータは、ｃ−ＦＬＩＰに関するアンチアポトーシス機能を支持する（Ｙｅｈら、２０００）。
【０１４８】
５−ＦＵおよびＴＤＸを用いた処理後にＭＣＦ−７細胞において、ｃ−ＦＬＩＰＬは上方制御され、そのｐ４３形にプロセシングされたことを我々は見出した。さらに、化学療法剤とＣＨ−１１で共処理した細胞におけるカスパーゼ８の活性化およびアポトーシスは、ｃ−ＦＬＩＰＬのプロセシングと同時に起こった。これらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰＬがこれらの細胞系において薬剤誘導Ｆａｓ仲介アポトーシスの発症を制御したことを示唆した。過剰発現およびｓｉＲＮＡ試験からのデータによって、この仮定はさらに支持された。ｃ−ＦＬＩＰの過剰発現は、カスパーゼ８の活性化を阻害することによって、ＣＨ−１１および５−ＦＵ、ＴＤＸ、ＭＴＡおよびＯＸＡの間の相乗的相互作用を無効にした。さらに、２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング変異体のｓｉＲＮＡ標的化は、細胞生存能力およびＰＡＲＰ切断アッセイによって測定したように、これらの化学療法剤に対して細胞を敏感にした。集合的にこれらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰはこれらの薬剤に応答してアポトーシスを阻害することを示す。
【０１４９】
驚くことに我々は、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳのｓｉＲＮＡ仲介の下方制御は、化学療法剤を用いた共処理の不在下でカスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を誘導したことも見出した（ただし、薬剤を用いた共処理はその影響を増大させた）。本発明者らは、ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は化学療法剤誘導アポトーシス、ならびに化学療法剤およびＦａｓアゴニスト抗体ＣＨ−１１を用いた共処理後に誘導されたアポトーシスから、ＨＣＴ１１６細胞を保護したことを見出した。カスパーゼ８の活性化を阻害すること以外に、ＤＩＳＣ結合ｃ−ＦＬＩＰは、ＥＲＫ、ＰＩ３−キナーゼ／ＡｋｔおよびＮＦκＢシグナル経路の活性化を促進することが報告されてきている（Ｋａｔａｏｋａら、２０００；Ｐａｎｋａら、２００１）。ＮＦκＢ、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＥＲＫシグナル変換経路は、細胞の生存および／または増殖と関係があり、したがって、ｃ−ＦＬＩＰはカスパーゼ８の活性化を阻害することができ、固有の生存および増殖経路を活性化することができる、アダプタータンパク質を漸増させることもできる（Ｓｈｕら、１９９７）。さらにｃ−ＦＬＩＰは、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ４およびＤＲ５によって形成されるＤＩＳＣでのプロカスパーゼ８の活性化も阻害する（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００１）。ｒＴＲＡＩＬは結腸直腸および乳を含めた一定範囲のヒト癌細胞系においてアポトーシスを誘導し、ＴＲＡＩＬレセプターは腫瘍細胞において広く発現されることが示される（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、２００２）。腫瘍中のＤＲ４およびＤＲ５の発現は許容される可能性がある、何故ならｃ−ＦＬＩＰはアポトーシスシグナルを、生存および増殖を促進するシグナルに転換するからである。したがって、ｃ−ＦＬＩＰのｓｉＲＮＡ仲介の下方制御は、ＮＦκＢ、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＥＲＫのＦＬＩＰ仲介の活性化を阻害し、ＴＲＡＩＬＤＩＳＣでのカスパーゼ８の活性化を促進することによって、アポトーシスを誘導することができる。
【０１５０】
ｃ−ＦＬＩＰは５−ＦＵ、ＴＳ標的葉酸代謝拮抗薬およびＯＸＡに応答するＦａｓ仲介アポトーシスの重要な制御物質であることを、我々は見出してきている。我々の結果は、ｃ−ＦＬＩＰはこれらの物質に対する応答の臨床上有用な予測マーカーである可能性があること、およびｃ−ＦＬＩＰは治療上魅力的な標的であることを示唆する。
【０１５１】
さらに我々の発見は、ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は、結腸直腸癌の治療において使用する化学療法剤（５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１）に応答する結腸直腸癌細胞のアポトーシスを阻害することを示す。このことは、結腸直腸癌において観察したｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現の高い発生率を考慮すると非常に臨床的妥当性があり（６）、ｃ−ＦＬＩＰＬの過剰発現は結腸直腸癌における化学的耐性に貢献する可能性があることを示唆する。興味深いことに、ｃ−ＦＬＩＰＳの過剰発現は、化学療法剤誘導アポトーシス、または化学療法剤およびＣＨ−１１を用いた共処理によって誘導されたアポトーシスから、結腸直腸癌細胞を保護することができなかった。これらの結果は、２つのスプライシング形のうちｃ−ＦＬＩＰＬは、結腸直腸癌細胞における化学療法剤に対する耐性のより重要な仲介物質であることを示唆すると思われる。
【０１５２】
我々の試験は、薬剤耐性に関して選択しなかった一群の結腸直腸癌細胞においてｃ−ＦＬＩＰを下方制御することは、異なる作用機構を有する一定範囲の細胞毒性薬剤に対する細胞の感度を増大させることを示す。さらに我々の試験は、ｃ−ＦＬＩＰのみを下方制御することによってアポトーシスを誘導することができることを実証している。
【０１５３】
ｃ−ＦＬＩＰＬ特異的ｓｉＲＮＡを使用する我々のｃ−ＦＬＩＰ過剰発現細胞系および試験から、長いスプライシング形は結腸直腸癌細胞の生存を仲介する際により重要である可能性があるが、しかしながら、この決定的証拠にはｃ−ＦＬＩＰＳ特異的ｓｉＲＮＡの生成が必要であろうことは明らかであると思われる。ｃ−ＦＬＩＰのノックダウン後のアポトーシスの誘導は、ＦａｓおよびＤＲ５などのデスレセプターによって仲介される可能性が最も高い。ＦａｓはＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＲＫＯ細胞中では５−ＦＵに応答して上方制御されるが、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−およびＨ６３０細胞中では上方制御されず（３９）、一方ＤＲ５はＨＣＴ１１６細胞系ならびにＲＫＯおよびＨ６３０系中で構成的に発現されることを、我々は以前に示している（未発表の観察結果）。（化学療法剤の存在下または不在下における）ｃ−ＦＬＩＰ発現のノックダウンは、Ｆａｓおよび／またはＤＲ５ＤＩＳＣでのカスパーゼ８の活性化のｃ−ＦＬＩＰ仲介の阻害を除去し、アポトーシスのカスパーゼ８仲介の活性化をもたらすと考えられる。実際、我々の初期の証拠は、ｃ−ＦＬＩＰのノックダウン後のアポトーシスの発症とカスパーゼ８の活性化は、強く結び付いていることを示唆する。カスパーゼ８の活性化を阻害すること以外に、ＤＩＳＣ結合ｃ−ＦＬＩＰは、抗アポトーシスＥＲＫ、ＰＩ３−キナーゼ／ＡｋｔおよびＮＦ−κＢシグナル経路の活性化を促進することが報告されてきている（７，８）。したがって、ｃ−ＦＬＩＰの消失によってこれらの生存経路のＤＩＳＣ依存性の上方制御が排除され、アポトーシスに対する高い感受性がもたらされることも考えられる。さらに、近年の試験はｃ−ＦＬＩＰＬが、ｐ３８ＭＡＰＫと結合しｐ３８ＭＡＰＫを介したプロアポトーシスシグナルを阻害することによる、非ＤＩＳＣ依存性の抗アポトーシス機能を有する可能性があることを示唆している（４０）。
【０１５４】
ｐ５３腫瘍抑制遺伝子は４０〜６０％の結腸直腸癌において、転写標的遺伝子との配列特異的結合を担う中央のＤＮＡ結合コアドメインにおいて最も頻繁に突然変異する（４１）。ｐ５３はｃ−ＦＬＩＰを転写上方制御し（４２）、それをプロテアソームによるユビキチン仲介の分解の標的とすることが報告されてきており（４３）、ｃ−ＦＬＩＰ発現に対するｐ５３の影響は複雑であることが示唆される。本試験では、２つのｃ−ＦＬＩＰスプライシング形の発現は、同質遺伝子のｐ５３野生型系と比較してｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞系において高かったことを、我々は一貫して見出した。我々はさらに、ｃ−ＦＬＩＰが下方制御されると、ｐ５３の状態がどのようにして細胞生存能力に影響を与えたかを調べた。ｃ−ＦＬＩＰのｓｉＲＮＡ標的化はｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞における化学療法剤誘導アポトーシスを有意に増大させたが、その影響はｐ５３野生型系ほど劇的ではなかった。同様に、ＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡのみに４８時間露出した後のアポトーシスの誘導は、ｐ５３野生型設定より大きかった。しかしながら、ＦＴｓｉＲＮＡのさらに長い露出時間（７２時間）および高濃度（１０〜１００ｎＭ）は、ｐ５３野生型親細胞系において観察したレベルに近い、ＨＣＴ１１６ｐ５３ヌル細胞系におけるアポトーシスのレベルを誘導した。ＦＴｓｉＲＮＡに対するｐ５３野生型とヌル細胞の異なる感受性は、少なくとも一部分はｐ５３ヌル細胞系におけるｃ−ＦＬＩＰ発現の高い構成レベルによるものであったと考えられる。それは、ｃ−ＦＬＩＰ発現の消失に対する細胞系の感度を低下させる、ｐ５３ヌル細胞系におけるＦａｓおよびＤＲ５デスレセプターをコードするｐ５３制御型遺伝子の、低レベルの基礎的および化学療法剤誘導型発現を表す可能性もある。注目すべきことに、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御は、通常オキサリプラチンに対して非常に耐性があるｐ５３ヌル細胞系において、オキサリプラチンに応答するアポトーシスを著しく増大させた（１５）。さらなる分析によって、化学療法剤誘導アポトーシスに対するｃ−ＦＬＩＰ標的化の影響は、ＨＣＴ１１６系に限られなかったことが明らかになった、何故なら、ｐ５３野生型ＲＫＯおよびｐ５３突然変異Ｈ６３０系において同様の結果を得たからである。さらに、高濃度のｓｉＲＮＡを用いたｃ−ＦＬＩＰのより強力なノックダウンは、ＲＫＯおよびＨ６３０細胞系において化学療法剤の不在下でアポトーシスを誘導した。集合的にこれらの結果は、ｃ−ＦＬＩＰは化学療法剤の存在下および不在下において、ｐ５３野生型、ヌルおよび突然変異結腸直腸癌細胞における細胞生存の重要な制御物質であることを示唆する。
【０１５５】
これらの発見には直接的な臨床的妥当性がある、何故なら５−ＦＵ／ロイコボリン／オキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）と５−ＦＵ／ロイコボリン／ＣＰＴ−１１（ＦＯＬＦＩＲＩ）の併用化学療法は、進行した結腸直腸癌の治療において現在広く使用されており、この疾患のアジュバント設定における５−ＦＵ／ロイコボリンと比較して、ＦＯＬＦＯＸは３年生存率を向上させる（７８．２％と７２．９％、ｐ＝０．００２）（４４）ことが近年実証されてきているからである。さらに臨床試験は、結腸直腸および胃腫瘍における有意に増大したｃ−ＦＬＩＰ発現を実証してきており（６、４５）、ｃ−ＦＬＩＰは結腸直腸癌中の妥当な臨床標的であるだけではなく、５−ＦＵ系化学療法レジメンも使用できる場合は、胃癌における標的でもあり得ることが示唆される。結論としてこの試験は、ｃ−ＦＬＩＰは結腸直腸癌における薬剤耐性の重要な臨床マーカーとなる可能性があり、単独あるいは標準的な化学療法剤と組み合わせたｃ−ＦＬＩＰの標的化は、この疾患を治療するための治療能力を有することを示唆する。
【０１５６】
本明細書中で言及した全ての文書は、参照により本明細書に組み込む。記載した本発明の実施形態に対するさまざまな変更形態および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱せずに当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を記載してきたが、特許請求する本発明がこのような特定の実施形態に過度に制限されるはずはないことは、理解されるはずである。実際、当業者には明らかである本発明を実施する記載した形態のさまざまな変更形態は、本発明に含まれるものとする。
【０１５７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１Ａ】５μＭの５−ＦＵおよび５０ｎＭのＴＤＸの処理後７２時間でのＭＣＦ−７細胞における、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、プロカスパーゼ８、ＦＡＤＤ、ＢＩＤ、Ｂｃｌ−２、ｃ−ＦＬＩＰＬ、ｃ−ＦＬＩＰＳ、ＤｃＲ３およびβ−チューブリンのウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１Ｂ】４８時間の５μＭの５−ＦＵおよび５０ｎＭのＴＤＸの処理後の、ＦａｓとＦａｓＬの間の相互作用の分析を示す図である。溶解物はＦａｓＬポリクローナル抗体を使用して免疫沈降させ、Ｆａｓモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによって分析した。
【図１Ｃ】４８時間の５μＭの５−ＦＵおよび５０ｎＭのＴＤＸの処理後の、Ｆａｓとｐ４３−ｃ−ＦＬＩＰＬの間の相互作用の分析を示す図である。溶解物は抗ＦａｓＣＨ−１１モノクローナル抗体を使用して免疫沈降させ、ｃ−ＦＬＩＰモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによって分析した。
【図２Ａ】９６時間薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、５−ＦＵ単独（５μＭ）で処理した、あるいは７２時間５−ＦＵ次にＣＨ−１１でさらに２４時間共処理した、ＭＣＦ−７細胞のフローサイトメトリーを示す図である。
【図２Ｂ】９６時間薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＤＸ単独（５０ｎＭ）で処理した、あるいは７２時間ＴＤＸ次にＣＨ−１１でさらに２４時間共処理した、ＭＣＦ−７細胞のフローサイトメトリーを示す図である。
【図２Ｃ】４８時間５μＭの５−ＦＵで処理したＭＣＦ−７細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。β−チューブリンは充填対照として評価した。
【図２Ｄ】９６時間薬剤なし（対照）、ＣＨ−１１単独（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＯＸＡ単独（５μＭ）で処理した、あるいは７２時間ＯＸＡ次にＣＨ−１１でさらに２４時間共処理した、ＭＣＦ−７細胞のフローサイトメトリーを示す図である。
【図２Ｅ】５μＭの５−ＦＵ単独で９６時間処理した、あるいは７２時間５−ＦＵ次にＣＨ−１１でさらに２４時間共処理したＭＣＦ−７細胞における、Ｆａｓ、プロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２Ｆ】５μＭの５−ＦＵで７２時間、次に２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１で示した時間処理したＭＣＦ−７細胞における、カスパーゼ８の活性化およびｃ−ＦＬＩＰＬプロセシングの動態を調べたウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３Ａ】４８時間５−ＦＵ、ＴＤＸまたはＯＸＡで処理したＨＣＴ１１６細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。均等な充填をβ−チューブリン抗体を使用して評価した。
【図３Ｂ】２００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下または不在下において薬剤なし（対照）、５μＭの５−ＦＵ、１００ｎＭのＴＤＸまたは２μＭのＯＸＡで処理したＨＣＴ１１６細胞における、プロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。それぞれの併用処理用に、化学療法剤で２４時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図４Ａ】ＦＬＩＰＬ（ＦＬ）構築体または空ベクター（ＥＶ）を用いて安定してトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬ発現のウエスタンブロットを示す図である。
【図４Ｂ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１と組み合わせて５μＭの５−ＦＵで処理した、ＥＶ６８、ＦＬ４４およびＦＬ６４細胞におけるＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。併用処理によって、ＦＬ４４（ＲＩ＝１．１４）またはＦＬ６４（１．０１）細胞ではなく、ＥＶ６８細胞において細胞生存能力の相乗的低下がもたらされた（ＲＩ＝２．０６）。
【図４Ｃ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下（＋）または不在下（−）において薬剤なし（対照）または５μＭの５−ＦＵで処理したＥＶ６８およびＦＬ６４細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬ、プロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。それぞれの併用処理用に、５−ＦＵで７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図５Ａ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１の存在下および不在下において５０ｎＭのＴＤＸまたは５００ｎＭのＭＴＡで処理した、ＥＶ６８、ＦＬ４４およびＦＬ６４細胞におけるＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。ＴＤＸ／ＣＨ−１１併用処理によって、ＥＶ６８細胞において細胞生存能力の相乗的低下がもたらされ（ＲＩ＝１．７５）、それはＦＬ４４（ＲＩ＝１．２２）またはＦＬ６４（ＲＩ＝１．１９）細胞において有意に低下した。ＭＴＡ／ＣＨ−１１併用処理によって、ＥＶ６８細胞において細胞生存能力の相乗的低下がもたらされ（ＲＩ＝１．８６）、それはＦＬ４４（ＲＩ＝１．２９）またはＦＬ６４（ＲＩ＝１．０６）細胞において有意に低下した。
【図５Ｂ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１の存在下および不在下において２．５μＭのＯＸＡで処理した、ＥＶ６８、ＦＬ４４およびＦＬ６４細胞におけるＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。ＯＸＡ／ＣＨ−１１併用処理によって、ＥＶ６８細胞において細胞生存能力の相乗的低下がもたらされ（ＲＩ＝２．１３）、それはＦＬ６４（ＲＩ＝１．２２）またはＦＬ４４（１．１９）細胞において有意に低下した。
【図５Ｃ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下（＋）または不在下（−）において５０ｎＭのＴＤＸまたは５００ｎＭのＭＴＡで処理した、ＥＶ６８およびＦＬ６４細胞におけるプロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図５Ｄ】２５０ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下（＋）または不在下（−）において２．５μＭのＯＸＡで処理した、ＥＶ６８およびＦＬ６４細胞におけるプロカスパーゼ８およびＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。それぞれの併用処理用に、５−ＦＵで７２時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図６Ａ】０、１および１０ｎＭのＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳの発現を示す図である。均等な充填をβ−チューブリン抗体を使用して評価した。
【図６Ｂ】５μＭの５−ＦＵを用いた共処理の存在下および不在下において５ｎＭのＦＬＩＰ標的（ＦＴ）またはスクランブル対照（ＳＣ）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞の、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。５−ＦＵおよびＦＴｓｉＲＮＡとの併用処理によって、細胞生存能力の相乗的低下がもたらされた（ＲＩ＝１．９２、ｐ＜０．０００５）。５−ＦＵおよびＳＣｓｉＲＮＡで共処理した細胞では、生存能力の相乗的低下は観察されなかった（ＲＩ＝０．９８）。
【図６Ｃ】薬剤なし、５μＭの５−ＦＵまたは１００ｎＭのＴＤＸで処理した後４８時間でのＨＣＴ１１６細胞、擬似トランスフェクト細胞（Ｍ）、１ｎＭのスクランブル対照でトランスフェクトした細胞（ＳＣ）および１ｎＭのＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞（ＦＴ）における、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図７Ａ】１０ｎＭのＦＬＩＰ標的（ＦＴ）またはスクランブル対照（ＳＣ）ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳの発現を示す図である。均等な充填をβ−チューブリン抗体を使用して評価した。
【図７Ｂ】５μＭの５−ＦＵを用いた共処理の存在下および不在下において２．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞の、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。併用処理によって、細胞生存能力の相乗的低下がもたらされた（ＲＩ＝１．５６、ｐ＜０．００５）。
【図７Ｃ】１０ｎＭのＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡの存在下（＋）および不在下（−）において５−ＦＵで処理した後９６時間でのＭＣＦ−７細胞における、ＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図８Ａ】５μＭの５−ＦＵを用いた共処理の存在下および不在下において０．５ｎＭのＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞の、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞は７２時間後にアッセイした。（ＳＣｓｉＲＮＡではなく）ＦＴｓｉＲＮＡおよびそれぞれの細胞毒性薬剤を用いた併用処理によって、ＲＩ値によって示されたように細胞生存能力の相乗的低下がもたらされた（それぞれの組合せに関してｐ＜０．０００５）。
【図８Ｂ】１００ｎＭのＴＤＸを用いた共処理の存在下および不在下において０．５ｎＭのＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞の、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞は７２時間後にアッセイした。（ＳＣｓｉＲＮＡではなく）ＦＴｓｉＲＮＡおよびそれぞれの細胞毒性薬剤を用いた併用処理によって、ＲＩ値によって示されたように細胞生存能力の相乗的低下がもたらされた（それぞれの組合せに関してｐ＜０．０００５）。
【図８Ｃ】１μＭのＯＸＡを用いた共処理の存在下および不在下において０．５ｎＭのＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞の、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞は７２時間後にアッセイした。（ＳＣｓｉＲＮＡではなく）ＦＴｓｉＲＮＡおよびそれぞれの細胞毒性薬剤を用いた併用処理によって、ＲＩ値によって示されたように細胞生存能力の相乗的低下がもたらされた（それぞれの組合せに関してｐ＜０．０００５）。
【図９Ａ】４８時間５−ＦＵまたはオキサリプラチン（ＯＸＡ）で処理したｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞における、Ｆａｓ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図９Ｂ】２００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を用いた共処理の存在下または不在下において薬剤なし（対照）、５μＭの５−ＦＵ、または１μＭのＯＸＡで処理したｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞における、カスパーゼ８の活性化、ＰＡＲＰ切断およびｃ−ＦＬＩＰ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。それぞれの併用処理用に、化学療法剤で２４時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図１０Ａ】ＨＬａｃＺ、ＨＦＬ１７、ＨＦＬ２４、ＨＦＳ１９およびＨＦＳ４４細胞系におけるｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳの発現を示す図である。
【図１０Ｂ】５μＭの５−ＦＵ、１μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）および５μＭのＣＰＴ−１１を用いた処理後７２時間でのＨＬａｃＺ、ＨＦＬ１７、ＨＦＬ２４、ＨＦＳ１９およびＨＦＳ４４細胞系における、細胞周期停止およびアポトーシスのフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１０Ｃ】５０ｎｇ／ｍＬのＣＨ−１１および２．５μＭの５−ＦＵ、０．５μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）および１μＭのＣＰＴ−１１を用いた共処理後のＨＬａｃＺ、ＨＦＬ１７、ＨＦＬ２４、ＨＦＳ１９およびＨＦＳ４４細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。それぞれの併用処理用に、化学療法剤で２４時間、次にＣＨ−１１でさらに２４時間、細胞を前処理した。
【図１１Ａ】１ｎＭの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＣ）および１ｎＭのＦＬＩＰ標的（ＦＴ）ｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトしたｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳの発現を示す図である。
【図１１Ｂ】０．５ｎＭのＦＴまたは０．５ｎＭのＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞におけるアポトーシスの、フローサイトメトリー分析を示す図である。トランスフェクト細胞は、４８時間薬剤なし、５μＭの５−ＦＵ、または１μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）で共処理した。
【図１１Ｃ】（パネル１）薬剤なし、５μＭの５−ＦＵまたは１００ｎＭのＴＤＸで処理した後４８時間でのＨＣＴ１１６細胞、擬似トランスフェクト細胞（Ｍ）、０．５ｎＭのＳＣでトランスフェクトした細胞、および０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット分析を示す図である。（パネル２）０．５ｎＭのＳＣまたは０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、薬剤なし、あるいは１μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）で２４時間処理したＨＣＴ１１６細胞における、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を示す図である。（パネル３）０．５ｎＭのＳＣまたは０．５ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡでのトランスフェクション、および薬剤なし、２．５μＭまたは５μＭのＣＰＴ−１１での２４時間の処理後のＨＣＴ１１６細胞における、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断を示す図である。
【図１１Ｄ】ＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、５−ＦＵ、オキサリプラチン（ＯＸＡ）およびＣＰＴ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞生存能力は７２時間後にアッセイした。化学療法剤とＦＴｓｉＲＮＡの間の相互作用の性質は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に従い組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって決定した。１、＜１、および＞１のＣＩ値は、それぞれ付加、相乗およびアンタゴニスト効果を示す。結果は少なくとも３つの別個の実験を表す。
【図１２Ａ】ｐ５３野生型（ｗｔ）およびヌルＨＣＴ１１６細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１２Ｂ】１ｎＭの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＣ）および１ｎＭのＦＬＩＰ標的（ＦＴ）ｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１２Ｃ】１ｎＭのＦＴまたは１ｎＭのＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞におけるアポトーシスの、フローサイトメトリー分析を示す図である。トランスフェクトした細胞は、薬剤なし、５μＭの５−ＦＵ、５μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）または１μＭのＣＰＴ−１１で７２時間共処理した。
【図１２Ｄ】ＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、５−ＦＵ、オキサリプラチン（ＯＸＡ）、およびＣＰＴ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞生存能力は７２時間後にアッセイした。化学療法剤とＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡの間の相互作用の性質は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に従い組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって決定した。結果は少なくとも３つの別個の実験を表す。
【図１３Ａ】１ｎＭの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＣ）および１ｎＭのＦＬＩＰ標的（ＦＴ）ｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトしたＲＫＯおよびＨ６３０細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳの発現を示す図である。
【図１３Ｂ】２．５ｎＭのＦＴまたは２．５ｎＭのＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＫＯ細胞、および１ｎＭのＦＴまたは１ｎＭのＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨ６３０細胞におけるアポトーシスの、フローサイトメトリー分析を示す図である。ｓｉＲＮＡトランスフェクトＲＫＯ細胞は、薬剤なし、５μＭの５−ＦＵ、１μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）または２．５μＭのＣＰＴ−１１で７２時間共処理した。ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨ６３０細胞は、薬剤なし、５μＭの５−ＦＵ、２．５μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）または１μＭのＣＰＴ−１１で７２時間共処理した。
【図１３Ｃ】ＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、５−ＦＵ、オキサリプラチン（ＯＸＡ）およびＣＰＴ−１１で共処理したＲＫＯおよびＨ６３０細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞生存能力は７２時間後にアッセイした。化学療法剤とＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡの間の相互作用の性質は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に従い組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって決定した。結果は少なくとも３つの別個の実験を表す。
【図１４Ａ】７２時間ＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。
【図１４Ｂ】０、１および１０ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後２４時間でのｐ５３野生型（ｐ５３＋／＋）およびｐ５３ヌル（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６細胞における、ｃ−ＦＬＩＰ発現およびＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１４Ｃ】４８時間ＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたｐ５３野生型（ｐ５３＋／＋）およびｐ５３ヌル（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６細胞におけるアポトーシスの、フローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１４Ｄ】４８時間および７２時間ＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞における、アポトーシスを示す図である。
【図１４Ｅ】７２時間ＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＫＯ細胞における、アポトーシスを示す図である。
【図１４Ｆ】７２時間ＦＴまたはＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨ６３０細胞における、アポトーシスを示す図である。
【図１５Ａ】０、１および１０ｎＭのＦＴｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、ｃ−ＦＬＩＰの下方制御、カスパーゼ８の活性化およびＰＡＲＰ切断の動態を示す図である。
【図１５Ｂ】１０ｎＭのＦＴまたは１０ｎＭのＳＣｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞におけるアポトーシス誘導の動態の、フローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１６Ａ】１０ｎＭの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＣ）および１０ｎＭのＦＬＩＰＬ特異的（ＦＬ）ｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトしたｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞における、ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳの発現およびＰＡＲＰ切断を示す図である。
【図１６Ｂ】０．５ｎＭのＳＣまたは０．５ｎＭのＦＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、薬剤なし、１μＭのオキサリプラチン（ＯＸＡ）または２．５μＭで２４時間、あるいは５μＭの５−ＦＵで４８時間処理したＨＣＴ１１６細胞における、ＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１６Ｃ】ＦＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、５−ＦＵ、オキサリプラチン（ＯＸＡ）、およびＣＰＴ−１１で共処理したＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞における、ＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞生存能力は７２時間後にアッセイした。化学療法剤とＦＬＩＰ標的ｓｉＲＮＡの間の相互作用の性質は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に従い組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって決定した。結果は少なくとも３つの別個の実験を表す。
【図１７】アゴニスト性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（２００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて使用した化学療法剤５−ＦＵ、トミュデックス（ＴＤＸ）、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンのＭＴＴ細胞生存能力アッセイから計算したＲＩ値のグラフを示す図である。予想細胞生存率（Ｓｅｘｐ、薬剤Ａ単独で観察した生存率と薬剤Ｂ単独で観察した生存率の積として定義する）と、ＡとＢの組合せに関して観察した細胞の生存率（Ｓｏｂｓ）の比として、ＲＩを計算する（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。相乗作用は、１より大きいＲＩとして定義する。
【図１８Ａ】ヨウ化プロピジウムで染色した細胞、５−ＦＵ（５μＭ）、ＴＤＸ（５０ｎＭ）、ＣＰＴ−１１（５μＭ）およびオキサリプラチン（１μＭ）で２４時間、次いでＣＨ−１１（５０ｎｇ／ｍｌ）でさらに２４時間処理したＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞の、フローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１８Ｂ】ＣＨ−１１  ５０ｎｇ／ｍｌとともに、またはなしで化学療法剤で処理した、ＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞系に関するサブＧ０／Ｇ１群を示す図である。
【図１９】ウエスタンブロット分析による、ＰＡＲＰ切断およびプロカスパーゼ８の活性化に対する、５−ＦＵ（５μＭ）、ＣＰＴ−１１（５μＭ）およびオキサリプラチン（１μＭ）で既に２４時間処理したＨＣＴ１１６ｐ５３野生型およびヌル細胞にＣＨ−１１  ２００ｎｇ／ｍｌを２４時間加えることの影響を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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