(57)【要約】  本発明は、肝硬変におけるＩＬ−６の使用に関する。
2007517018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓傷害の治療および／または予防用の医薬の製造のための、低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分または円順列誘導体または塩の使用。
【請求項２】
肝臓傷害が肝硬変である請求項１記載の使用。
【請求項３】
肝硬変が代償性肝硬変である請求項２記載の使用。
【請求項４】
肝硬変が非代償性肝硬変である請求項２記載の使用。
【請求項５】
治療が肝臓切除を含む請求項２記載の使用。
【請求項６】
用量が０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇ体重の範囲である請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
用量が約０．１ｍｃｇ／ｋｇである請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
用量が約１ｍｃｇ／ｋｇである請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
用量が約１０ｍｃｇ／ｋｇである請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ＩＬ−６が１つ以上の部位でグリコシル化されている請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
ＩＬ−６がグリコシル化されていない請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
融合タンパク質が免疫グロブリン（Ｉｇ）融合を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
融合タンパク質がＩＬ−６およびｇｐ８０またはｇｐ８０の断片を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
機能性誘導体が、アミノ酸残基の１個以上の側鎖として存在する１個以上の官能基に結合した部分を少なくとも１つ含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記部分がポリエチレン部分である請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
医薬が、ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体を発現する細胞を含有する請求項１記載の使用。
【請求項１７】
医薬が、ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを含有する請求項１記載の使用。
【請求項１８】
ベクターがレンチウイルスベクターである請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を、任意には薬学的に許容され得る担体とともに、必要とする患者に投与することを含む、肝臓傷害の治療および／または予防方法。
【請求項２０】
肝臓傷害が肝硬変である請求項記載の方法。
【請求項２１】
肝硬変が代償性肝硬変である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
肝硬変が非代償性肝硬変である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
治療方法が肝臓切除を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
用量が０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇ体重の範囲である請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
用量が約０．１ｍｃｇ／ｋｇである請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
用量が約１ｍｃｇ／ｋｇである請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
用量が約１０ｍｃｇ／ｋｇである請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を毎日投与する請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を週３回投与する請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を週１回投与する請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＬ−６が１つ以上の部位でグリコシル化されている請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＬ−６がグリコシル化されていない請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
融合タンパク質が免疫グロブリン（Ig）融合を含む請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
融合タンパク質がＩＬ−６およびｇｐ８０またはその断片を含む請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
機能性誘導体が、アミノ酸残基の１個以上の側鎖として存在する１個以上の官能基に結合した部分を少なくとも１つ含む請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記部分がポリエチレン部分である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＩＬ−６またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体を発現する細胞を投与する請求項１９記載の方法。
【請求項３８】
ＩＬ−６またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを投与する請求項１９記載の方法。
【請求項３９】
ベクターがレンチウイルスベクターである請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
切除を含む肝硬変の治療およびまたは予防方法であって、有効な低用量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体を必要とする患者に投与することを含む、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクター、またはこれらを産生する細胞を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項４１】
肝臓傷害の治療または予防方法であって、有効な低用量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体を必要とする患者に投与することを含む、低用量のＩＬ６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項４２】
肝臓傷害が肝硬変である請求項４１記載の治療方法。
【請求項４３】
前記必要とする患者が末期肝臓機能不全に罹患している請求項４１または４２記載の治療方法。
【請求項４４】
前記必要とする患者が肝臓切除外科処置後の肝臓機能不全に罹患している請求項４１または４２記載の治療方法。
【請求項４５】
前記必要とする患者が、急性肝臓機能不全に罹患している請求項４１または４２記載の治療方法。
【請求項４６】
傷害が切除によって引き起こされたものである請求項４１記載の治療方法。
【請求項４７】
前記必要とする患者が移植ドナーである請求項４６記載の治療方法。
【請求項４８】
投与を、切除処置前、切除処置中および／または切除処置後に行なう請求項４６または４７記載の治療方法。
【請求項４９】
投与される低用量が０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇ体重の範囲である請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を毎日投与する請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を週３回投与する請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を週１回投与する請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
肝硬変が重症である請求項４１記載の治療方法。
【請求項５４】
肝硬変が急性である請求項４１記載の治療方法。
【請求項５５】
後に組織生着を行なう肝臓傷害の治療方法であって、有効な低用量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体を、必要とする患者に投与することを含む、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む治療方法。
【請求項５６】
肝臓傷害が肝硬変である請求項５５記載の治療方法。
【請求項５７】
肝硬変が重症である請求項５６記載の治療方法。
【請求項５８】
肝硬変が急性である請求項５６記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓傷害におけるＩＬ−６の使用の分野におけるものである。特に、本発明は、肝硬変の治療および／または予防用の医薬の製造のためのＩＬ−６の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓傷害の一般的な原因のほとんどは、肝硬変をもたらす。肝硬変は、機能性の肝臓組織の周囲領域に非機能性の瘢痕組織を生じ、再生性肝臓小結節の形成が付随して起こる正常肝臓組織の破壊を伴う。
【０００３】
肝臓の損傷または傷害は、多様な原因を有し得る。これは、たとえば、ウイルス感染または細菌感染、アルコール中毒、免疫障害または癌によるものであり得る。
【０００４】
ウイルス性肝炎（たとえば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスによるもの）は、マネージメントが不十分な、世界中で大勢の人々を苦しめている疾患である。既知の肝炎ウイルスの種類数は、常に増加している。Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス以外に、ウイルス関連肝炎を引き起こす少なくとも４種類の他のウイルスがこれまでに見出されており、Ａ型、Ｄ型、Ｅ型およびＧ型肝炎ウイルスと呼ばれている。
【０００５】
時折、通常は毒性のない物質が、乱用すると肝毒性となり得る（たとえば、アセトアミノフェン（APAP）過量摂取およびエタノールなど）。
【０００６】
アルコール性肝臓疾患は、世界中に蔓延しているもう１つの疾患であり、アルコールの慢性消費と関連する。免疫性肝炎は稀な自己免疫疾患であり、管理が不十分である。肝臓傷害は、胆管の損傷もまた含む。原発性胆汁性肝硬変（PBC）は、肝内胆管の破壊を特徴とする自己免疫肝臓疾患である。
【０００７】
最近、肝臓傷害は、遺伝子療法の副作用であることがわかった。たとえば、小葉中心肝細胞壊死を特徴とする急性肝細胞性傷害は、肝臓を標的とするウイルス系遺伝子療法の主な副作用である（Nielsen et al., 1998; Bao et al., 1996）。
【０００８】
いくつかの研究により、アルコール性肝炎、肝硬変、ウイルス性肝炎および原発性胆汁性肝硬変などの疾患における肝臓への損傷は、Ｔヘルパー細胞−１（Th1）応答と関連することが示されている（Nishimura and Ohta, 1999）（Okamoto et al., 1998）（Harada et al., 1997）（Lee et al., 1999）（Baroni et al., 1999）。高レベルのＦＡＳリガンドおよびそのレセプター（CD95）がＢ型およびＣ型肝炎患者の肝臓において報告され（Luo et al., 1997）（Hiramatsu et al., 1994; Okazaki et al., 1996）、したがって、ＦＡＳリガンドは、肝細胞アポトーシスを導く主な細胞傷害性因子の１つであると考えられている。ＦＡＳリガンドおよびそのレセプターもまた、アルコール性肝臓疾患において上昇しており、これもまた、Ｔｈ１サイトカインが、アルコール性肝炎において誘導される自己免疫プロセスに関与していることを示す（Galle et al., 1995; Taieb et al., 1998; Fiore et al., 1999）。
【０００９】
肝硬変の治療は、アルコールなどの毒性作用物質の使用中止、ビタミン類サプリメントを含む適切な栄養の摂取、および合併症（発症している場合）の治療を含む。肝臓移植は、現在、唯一の治療法であり、進行した肝硬変を有する人を救済し得る。
【００１０】
肝硬変の初期段階では、患者は代償性に分類され、肝臓組織の損傷は起こっているが、患者の肝臓はまだ血中の代謝産物の解毒ができることを意味する。加えて、代償性肝臓疾患を有する患者の多くは症状を示さない。肝硬変の後期段階では、患者は、非代償性に分類され、血中の代謝産物を解毒する能力が弱まったことを意味する。この段階では、以下の臨床特性：出血性食道静脈瘤、腹水、黄疸および脳障害が示され得る（Zakim D, Boyer T D. Hepatology: A Textbook of Liver Disease, 第2版, 第1巻, 1990, W. B. Saunders Company, Philadelphia）。
【００１１】
また、肝臓は、切除または傷害後、生物学的に非機能性の瘢痕組織を伴って治癒するのではなく、生物学的に機能性のある実質塊を再生し得る、唯一の哺乳動物の器官であるという点で特異である。
【００１２】
大部分の肝臓切除後に患者は術前の肝臓塊を回復できることは周知である（Hadjis, 1990）。したがって、充分な機能性の肝臓塊の再生を誘導する能力は、肝臓機能不全による多くの死亡を抑制し得る重要な進歩となり得る。肝細胞増殖を誘導または増強できることにより、肝臓の悪性腫瘍の切除が許容され、健常肝組織の増加が促進されよう。これにより、残った機能性の肝臓塊が少なすぎることが原因の肝臓機能不全による患者の術後の死亡が抑制される。同じことは、たとえば、本来の肝臓に充分な肝機能を回復し得る割合での再生が誘導されるならば、中毒性、代謝性またはウイルス性の原因による劇症肝不全に罹患した患者についてもあてはまる。
【００１３】
Ｋｏｋｕｄｏら（1992）は、外来の添加された因子、特にトランスホーミング増殖因子−α（TGF-α）による、たとえば肝切除術後の硬変した肝臓の再生応答を詳しく調べるための動物モデルを確立した。かかるモデルでは、小結節性肝硬変を、ＣＣＬ４およびフェノバルビタールの同時投与によって確立した。肝臓でのＤＮＡ合成（DNA内への3Hチミジン取込み）を、ＴＧＦ−α処置ありまたはなしでの（肝切除術後０および１２時間後）の肝硬変ラットにおいて部分肝切除術の２４時間後に試験した。
【００１４】
ＩＬ−６は、プロ炎症性サイトカインとしてだけでなく、抗炎症性サイトカインとしても作用する（Jones et al., 2001）。ＩＬ−６の機能的特性は、きわめて多様であり、これは、このサイトカインを示すために当初使用されていた用語に反映されている（Horst Ibelgaufts’ COPE: Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia）。
【００１５】
ＩＬ−６の生物学的活性は、２種類の異なるタンパク質（一方はＩＬ−６レセプターという名称であり（IL-6Rまたはgp80、Jones et al., 2001に概説）、他方は、ｇｐ１３０という名称である（Hirano et al., 1994に概説））を含む膜レセプター系に媒介される。ｇｐ８０の細胞外ドメインに相当するＩＬ−６Ｒの可溶性形態（sIL-6R）は、血中および尿中において糖蛋白として見出されるヒトの身体の天然産物である（Novick et al., 1990, 1992）。ｓＩＬ−６Ｒ分子の例外的な特性は、これが、ヒト細胞を含む多くの細胞型に対して強力なアゴニストとして作用することである（Taga et al., 1989 ; Novick et al., 1992）。ｇｐ８０の細胞質内ドメインがなくても、ｓＩＬ−６Ｒはなお、ＩＬ−６に応答してｇｐ１３０の二量体化を誘発することができ、これは、次に、後続のＩＬ−６特異的シグナル伝達および生物学的効果を媒介する（Murakami et al., 1993）。ｓＩＬ−６Ｒはｇｐ１３０との２つの型の相互作用を有し、これらは、ともにＩＬ−６特異的生物学的活性に必須であり（Halimi et al., 1995）、活性なＩＬ−６レセプター複合体は、２つのｇｐ１３０鎖、２つのＩＬ−６Ｒおよび２つのＩＬ−６リガンドによって形成される六量体構造であると提案された（Ward et al., 1994; Paonessa et al., 1995）。
【００１６】
限定的な細胞分布を有するコグネイトＩＬ−６Ｒ細胞型（cellular）の発現とは対照的に（Jones et al., 2001に概説）、膜内外に存在する（trans-membrane spanning）ｇｐ１３０の発現は、ほとんどすべての器官（心臓、腎臓、脾臓、肝臓、肺、胎盤および脳が挙げられる）で見られる（Saito et al., 1992）。
【００１７】
ＩＬ−６単独では、可溶性ＩＬ−６Ｒが投与されない限り、特異的活性を誘導しないことを示す多くの異なる例がある。たとえば、ＩＬ−６は、ｓＩＬ−６Ｒと組合せた場合でのみ、マウス骨髄と骨芽細胞との共培養物において破骨細胞形成を誘導する（Jones et al., 2001に概説）。また、多くのニューロン細胞はＩＬ−６を産生することができるが、ＩＬ−６自体による刺激に対しては依然、非応答性のままである。しかしながら、ニューロン細胞の分化および生存は、ｓＩＬ−６Ｒの作用により媒介され得る（Hirota 1996, Martz 1998）。
【００１８】
可溶性ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６を一緒に連結したキメラ分子が報告されている（Chebath et al., 1997）。これは、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラと称されている。このキメラＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子は、可溶性ＩＬ−６レセプター（sIL-6R）およびＩＬ−６をコードするｃＤＮＡの全コード領域同士を融合することによって作製された。組換えＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、ＣＨＯ  細胞において産生させた（Chebath et al., 1997、W099/02552）。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物よりも、高い効率でｇｐ１３０鎖にインビトロで結合する（Kollet et al., 1999）。
【００１９】
前記のように、インターロイキン−６シグナル伝達は、ｇｐ１３０とリガンドレセプター複合体とのホモ二量体化によって助長される。続いて、細胞内シグナル伝達が、ｇｐｌ３０会合細胞質内チロシンキナーゼ（JAK1、JAK2およびTYK2）の活性化ならびにＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化によって誘発される（Murakami et al., 1993, Gerhartz et al., 1996）。対照的に、ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＣＮＴＦの高親和性レセプターは、ｇｐｌ３０とｇｐｌ３０関連タンパク質（LIFレセプター）間のヘテロ二量体化によって細胞を活性化する（Davis et al., 1993）。かかるホモ二量体またはヘテロ二量体は、Ｊａｋ−Ｔｙｋファミリーの細胞質内チロシンキナーゼによる別個のしかし重複するチロシンリン酸化パターンを活性化する（Boulton et al., 1994）。これは、このファミリーのタンパク質に関連する種々の細胞応答に寄与し得る。
【００２０】
ＩＬ−６シグナル伝達は、肝臓再生に関与する転写因子の誘導に必要であると認識されているが、当該技術分野では、肝臓保護／再生のためのＩＬ−６  投与に関して意見が分かれているようである。一方において、ＩＬ−６欠損マウスは、部分肝切除術後に肝臓再生が損なわれたが、肝臓再生はＩＬ−６投与によって再構築されたことが示された（Cressman et al., 1996）。ＩＬ−６投与の有益な効果はまた、重篤な病理的状態の肝臓（たとえば、切除後の虚血モデルまたはＣＣＬ４単独によって誘導した急性肝臓傷害モデル）においても報告された（それぞれ、Selzner 1999 および Kovalovich 2000）。また、ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒの融合タンパク質も肝臓傷害の治療に有益であることが示された（W099/02552）。しかしながら、肝臓保護／再生に対して有益な効果を有すると報告された高用量のＩＬ−６（たとえば、500〜1000mcgの範囲のIL-6/kg）は、かかる大用量を用いると予期される望ましくない副作用の可能性に関して実現可能とみなされない場合がある。他方では、マウスでの部分肝切除術後の再生の動物モデルにおいて、ＩＬ−６Ｒに融合させたＩＬ−６（Hyper-IL6）でのみ肝臓の再構築の促進が誘導され得るがＩＬ−６単独では誘導され得ないと報告された（Peters et al., 2000）。
【００２１】
したがって、広範な肝毒性作用物質および遺伝子治療用ベクターによって引き起こされる肝臓損傷の治療のための新規なストラテジー（特に、速やかな肝細胞増殖を促進するもの）が、このように必要である。
【発明の開示】
【００２２】
本発明は、肝臓傷害の治療および／または予防用の、好ましくは、代償性肝硬変または非代償性肝硬変であり得る肝硬変の治療用の（より好ましくは肝臓切除により治療された肝硬変のための）医薬の製造のための、低用量の、好ましくは０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分もしくは円順列誘導体もしくは塩（すなわち、本発明による物質）使用に関する。本発明による物質は、１つ以上の部位がグリコシル化されたもの、および／またはグリコシル化されていないものであり得る。
【００２３】
一実施態様において、本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）と融合させたＩＬ−６の使用を提供し、一方、別の実施態様において、本発明は、可溶性レセプターであるｇｐ８０の細胞外部分と融合させたＩＬ−６の使用を提供する。
【００２４】
本発明はまた、機能性誘導体が、アミノ酸残基の１個以上の側鎖として存在する１個以上の官能基に結合した部分、好ましくはポリエチレン部分を少なくとも１つ含む本発明による物質の低用量の使用を提供する。
【００２５】
ある側面において、本発明による医薬ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体を発現する細胞を含有し得る。
【００２６】
別の側面において、本発明による医薬は、ＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクター、好ましくはレンチウイルス系ベクターを含有し得る。
【００２７】
加えて、本発明は、低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩（０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇ体重の範囲）を、任意選択で薬学的に許容され得る担体とともに、必要とする患者に投与することを含む、肝臓傷害の治療および／または予防方法を提供する。好ましくは、用量は、０．１ｍｃｇ／ｋｇ、１ｍｃｇ／ｋｇおよび／または１０ｍｃｇ／ｋｇである。低用量の本発明による物質は、毎日、週３回または週１回投与され得る。
【００２８】
本発明による治療方法は、肝臓傷害、好ましくは、肝硬変（これは、代償性肝硬変または非代償性肝硬変であり得る）の治療を意図したものである。本発明の方法にしたがって投与される物質は、１つ以上の部位がグリコシル化されたもの、および／またはグリコシル化されていないものであり得る。
【００２９】
また、本発明の方法にしたがって投与される融合タンパク質は、融合免疫グロブリン（Ig）またはそのｇｐ８０断片との融合体を含み得る。
【００３０】
一実施態様において、本発明による機能性誘導体は、アミノ酸残基の１個以上の側鎖として存在する１個以上の官能基に結合した部分、好ましくはポリエチレン部分を少なくとも１つ含み得る。
【００３１】
また、本発明による方法は、ＩＬ−６またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体を発現する細胞の投与、またはＩＬ−６またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含むベクター、好ましくは、レンチウイルス系ベクターの投与を含む。
【００３２】
加えて、本発明は、有効な低用量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体を、必要とする患者に投与することを含む、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む、肝臓傷害、たとえば、肝硬変（重症肝硬変または急性肝硬変）の治療方法を提供する。該方法は、末期肝臓機能不全、たとえば肝臓切除外科処置後のもの、急性肝臓機能不全、肝臓切除処置によって引き起こされた傷害に罹患した、前記必要性がある患者の治療のためのものであり得る。該方法はまた、移植ドナーにおいて肝臓拒絶反応により引き起こされた傷害に使用され得る。より詳しくは、本発明による物質の投与は、肝臓切除前、肝臓切除中および／または肝臓切除後に行なわれ得る。好ましくは、本発明による物質の低用量は、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇ体重の範囲であり、毎日、好ましくは週３回、より好ましくは週１回投与する。加えて、有効な低用量の本発明の物質は、ＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターの投与により、必要とする患者に投与され得る。
【００３３】
本発明はまた、有効な低用量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体を、必要とする患者に投与すること、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む、後に組織生着を行なう肝臓傷害の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、低用量のＩＬ−６による処置が、硬変した肝臓の肝臓切除モデルにおいて効率的であるという所見に基づく。肝臓のかかる重症の硬変した状態において、低用量のＩＬ−６（０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲）を用いて得られた有益な結果は、予想外であった。
【００３５】
したがって、本発明は、肝臓傷害、たとえば、肝硬変の治療および／または予防用の医薬の製造のための、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲の低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩の使用に関する。
【００３６】
用語「治療する」および「予防する」は、本明細書で使用する場合、肝硬変の症状または原因（１つまたは複数）ならびに肝硬変に伴う症状または疾患、特に、該疾患と関連する神経構造上および行動上の変化のいずれかまたはすべての予防、抑制、軽減、改善または逆転と理解されたい。
【００３７】
用語「肝硬変」は、本明細書で使用する場合、肝臓傷害とも称する。この疾患およびその原因は、「発明の背景」に詳細に記載している。
【００３８】
用語「用量」は、１回に投与されるべき量（たとえば、特定量の薬物適用など）に関する。
【００３９】
用語「投薬量（dosage）」は、用量の量（size）、頻度および回数の決定および調節に関する。
【００４０】
本発明は、肝臓傷害（肝硬変など）の治療および／または予防の新たな可能性を提供する。現在、肝硬変の治療は、アルコールなどの毒性作用物質の回収（withdrawing）、ビタミン類サプリメントを含む適切な栄養の摂取、および合併症（発症している場合）の治療を含む。肝臓移植は、現在、唯一の治療法であり、進行した肝硬変を有する人を救済し得る。したがって、本発明は、実質的な進歩を提示する、すなわち、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲の低用量のＩＬ−６は実験的肝硬変において有意に有益な効果を示す。以下の実施例に示すように、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲の低用量のＩＬ−６は、肝硬変の確立された動物モデルにおいて試験した異常の改善に関して有意な効果を示した。
【００４１】
用語「切除」は、器官または他の構造の一部または全部の摘出をいう。
【００４２】
本発明は、速やかな肝細胞増殖を許容する低用量のＩＬ−６の投与による、広範な肝毒性作用物質および遺伝子治療用ベクターによって引き起こされる肝臓損傷の治療に関する。
【００４３】
得られた結果は、機能が代償性の肝硬変の存在および切除において、ＩＬ−６の腹腔内注射により、大部分の肝臓の切除後での術後死亡率は上昇せず、高用量および低用量の両方を用いた場合で、成熟肝細胞の大量増殖が誘導されることにより、大半の実質組織の喪失に対する生理学的応答が増強されることを明白に示す。
【００４４】
また、得られた結果により、ＳＴＡＴ−３およびＡＰ−１のＩＬ−６誘導による活性化が、硬変した肝臓における肝細胞性増殖の増強に、ある役割を果たすことが示され、これは、既報のＩＬ−６の「最終的な生物学的効果」をさらに裏付ける。
【００４５】
また、一実施態様において、肝臓切除前のＩＬ−６処置により、非肝硬変肝臓に通常存在する（Streetz 2003）が、硬変した肝臓では減衰される、ＮＦ−κＢの活性化が回復されることが示された。
【００４６】
ＳＴＡＴ−３およびＡＰ−１に加え、ＮＦ−κＢも、ＩＬ−６での処置後の肝臓の細胞におけるアポトーシスの減少に、ある役割を有することがわかった。これは、硬変した肝臓におけるＩＬ−６誘導性肝臓塊拡張もまた、ＩＬ−６の抗アポトーシス効果によって媒介され得ることを示唆する。
【００４７】
本発明の別の実施態様では、肝硬変動物において、ｇｐ８０の発現は、正常対照と比べ、全肝由来および単離した肝細胞由来の両細胞において有意に増大することがわかった（図６）。一方、肝硬変動物において、ｇｐ１３０の発現は、全肝では正常対照と比べて有意に減少したが、肝硬変動物において、ｇｐ１３０の発現は、精製肝細胞由来の細胞では正常対照と比べて有意に増加した（図６）。したがって、得られた結果は、硬変した肝臓由来の肝細胞は、ＩＬ−６レセプターのｇｐ８０とｇｐ１３０の両サブユニットを過剰発現することを示し、硬変した肝臓の肝細胞（特に、切除後）は、ＩＬ−６処置に対して高度に応答性であり、したがって、肝臓再生の誘導において低用量のＩＬ−６が高用量と同様に有効であることを示唆する。
【００４８】
得られた結果では、対照の硬変した未処置ラットに対し、ＩＬ−６処置ラットにおいて、新生物発生のリスクの増加は示されていない。特に、重症の形成異常または肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症率は、対照動物では８％（２／２５）であり、ＩＬ−６動物では３．３（１／３０）であった。
【００４９】
処置動物間において、再生している硬変した実質における新脈管形成の研究では、硬変した小結節内部の微小血管密度の異常な増加、異型（unpaired）細動脈または未分化内皮は示されなかった。データをＨＣＣ発症と相関させた。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「ムテイン」は、得られる生成物の活性を元のＩＬ−６と比べて大幅に変化させることなく、ＩＬ−６の天然に存在する成分のアミノ酸残基の１個以上が、異なるアミノ酸残基で置き換わっているか、もしくは欠損しているか、または１個以上のアミノ酸残基がＩＬ−６の元の配列に付加されているＩＬ−６のアナログをいう。これらのムテインは、公知の合成により、および／または部位特異的突然変異誘発技術、あるいは、これに適当な任意の他の公知の手法により調製される。
【００５１】
本発明によるムテインとしては、ＩＬ−６をコードする本発明によるＤＮＡまたはＲＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）にコードされるタンパク質が挙げられる。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が慣用的に「ストリンジェント」とよぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件をいう。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology（前出）, Interscience, N. Y., §§6.3  and 6.4 （1987, 1992）、ならびに Sambrook et al.,（Sambrook, J. C., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. （1989） Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
【００５２】
限定されないが、ストリンジェントな条件の例としては、研究対象のハイブリッドの推定Ｔｍより１２〜２０℃低く、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、３７℃で３０〜６０分間、次いで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、６８℃で３０〜６０分間における洗浄条件が挙げられる。当業者は、ストリンジェントな条件がまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解している。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubel（前出）を参照のこと。
【００５３】
任意のかかるムテインは、好ましくは、ＩＬ−６のものと充分に重複する（duplicative）アミノ酸配列を有する（たとえば、ＩＬ−６と実質的に類似する、またはさらに良好な活性を有する）。
【００５４】
ＩＬ−６の特徴的な活性は、ＩＬ−６レセプターのｇｐ８０部分に結合できる能力および／または肝細胞増殖を誘導できる能力である。ムテインが、ＩＬ−６レセプターのｇｐ８０部分に結合できる実質的な能力および／または肝細胞増殖を誘導できる実質的な能力を有するならば、これは、ＩＬ−６と実質的に類似した活性を有するとみなされ得る。したがって、任意の所与のムテインがＩＬ−６と少なくとも実質的に同じ活性を有するか否かは、肝細胞をかかるムテインに供することを含む常套的な実験法によって決定され得、肝細胞増殖を誘導するか否かを、たとえば、ＢｒｄＵもしくは標識されたメチオニン取込みを測定することにより、または単に細胞（未処理対照細胞とＷＴ  ＩＬ−６で処理した細胞に関する細胞）を計測することにより決定し得る。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのｇｐ１３０への結合を測定するためのＥＬＩＳＡ型アッセイが、ＷＯ９９／０２５５２の第３９頁の実施例７に詳細に記載されている（これは、引用により完全に本明細書に組み込まれる）。当業者には、ＩＬ−６のｇｐ８０への結合のための類似したＥＬＩＳＡ型アッセイが開発され得ることが認識されよう。
【００５５】
変異体が、ＧＰ８０の結合性領域への実質的な結合活性を有するならば、これは、ＩＬ−６と実質的に類似した活性を有するとみなすことができる。
【００５６】
したがって、任意の所定の変異体がＩＬ−６と少なくとも実質的に同じ活性を有するか否かは、かかる変異体を、たとえば、ＷＯ９９／０２５５２の実施例７に記載のような単純なサンドイッチ結合アッセイに供し、固定されたｇｐ８０または可溶性ｇｐ８０（ｇｐ８０細胞外断片）に結合するか否かを測定することを含む常套的な実験法によって決定され得る。
【００５７】
好ましい実施形態において、任意のかかるムテインは、成熟ＩＬ−６の配列と、少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、該配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【００５８】
同一性は、配列の比較により調べる２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較対象の配列の長さに関して、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【００５９】
正確な一致がない配列の場合、「同一性％」を決定し得る。一般に、比較対象の２つの配列をアラインメントし、配列間の最大相関関係を得る。これは、配列のいずれか一方または両方に「ギャップ」を挿入し、アラインメントの程度を向上させることを含み得る。同一性％は、比較対象の配列のおのおのの完全長に関して（いわゆる全体アラインメント）（同じまたは非常に類似した長さの配列に特に好適である）、またはより短い規定の長さに関して（いわゆる局所アラインメント）（長さが同じでない配列により適する）決定し得る。
【００６０】
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。このため、たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１（Devereux J et al., 1984）で入手可能なプログラム、たとえば、プログラム  ＢＥＳＴＦＩＴ  ａｎｄ  ＧＡＰが、２つのポリヌクレオチド間の同一性％ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性％および相同性％を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman（1981）の「局所相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最大の単一の領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該技術分野において公知である（たとえば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム  （Altschul S F ら, 1990, Altschul S Fら, 1997, NCBIのホームページ（www.ncbi.nlm.nih.gov）からアクセス可能）および  ＦＡＳＴＡ  （Pearson W R, 1990;Pearson 1988）。
【００６１】
本発明にしたがって使用され得るＩＬ−６のムテイン、またはこれをコードする核酸としては、本明細書に示した教示および手引きに基づき、必要以上の実験をせずに、当業者により常套的に得られ得る置換ペプチドまたはポリヌクレオチドに実質的に対応する有限な一群の配列が挙げられる。
【００６２】
本発明によるムテインに対する好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。ＩＬ−６の保存的アミノ酸置換には、充分に類似した物理化学的特性を有し、かつ群のメンバー間での置換が分子の生物学的機能を保存している一群内の同義アミノ酸が含まれ得る（Grantham, 1974）。特に、挿入または欠失が数個のアミノ酸（たとえば３０個未満、好ましくは１０個未満）のみを伴い、かつ機能的コンホメーションに必須のアミノ酸（たとえば、システイン残基）が除去または置換されない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を改変することなく前記規定配列において行なわれ得ることは明白である。かかる欠失および／または挿入によって生じるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
好ましくは、同義アミノ酸群は表Ａに規定されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｂに規定されるものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｃに規定されるものである。
【００６４】
【表１】
2007517018.tif 000003
【００６５】
【表２】
2007517018.tif 000004
【００６６】
【表３】
2007517018.tif 000005
【００６７】
本発明における使用のため、ＩＬ−６ポリペプチドのムテインを得るのに使用され得るタンパク質内でのアミノ酸置換の生成の例としては、任意の公知の方法の工程（たとえば、Markらの米国特許第4,959,314号、同第4,588,585号および同第4,737,462号; Kothsらの同第5,116,943号、 Namenらの同第4,965,195号; Chongらの同第4,879,111号;およびLeeらの同第5,017,691号に示されるものなど）ならびに米国特許第4,904,584号（Shawら）に示されたリシン置換タンパク質が挙げられる。
【００６８】
本発明との関連において有用なＩＬ−６の特定のムテインは、既報されている（Ｗ０９４０３４９２Ａ１）。さらにまた、ＥＰ６６７８７２Ｂ１には、野生型ＩＬ−６と比べて改善された生物学的活性を有する変異型ＩＬ−６が記載されている。この他、ＥＰ６５６７１１Ｂ１には、ＩＬ−６のスーパーアゴニストを単離するための方法が記載されている。変異型またはスーパーアゴニストは、本発明にしたがって使用され得る。
【００６９】
用語「融合タンパク質」は、ＩＬ−６、またはムテインもしくはその断片を、別のタンパク質と融合された状態で含有するポリペプチドをいい、これは、体液中で長期の滞留時間を有する。ＩＬ−６は、したがって、別のタンパク質、ポリペプチドなど（たとえば、免疫グロブリンまたはその断片）と融合されたものであり得る。
【００７０】
「機能性誘導体」は、本明細書で使用する場合、残基の側鎖またはＮまたはＣ末端基として存在する官能基から、当該技術分野において公知の手段により調製され得る、ＩＬ−６の誘導体ならびにそのムテインおよび融合タンパク質を包含し、薬学的に許容され得る状態を維持している（すなわち、ＩＬ−６の活性に実質的に類似したタンパク質の活性を破壊せず、かつこれを含有する組成物に対して毒性を付与しない）限り、本発明に含まれる。
【００７１】
このような誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖が挙げられ得、これは、抗原性部位をマスクし、体液中でのＩＬ−６の滞留時間を延長しえる。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアもしくは第一級または第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）またはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえば、セリル残基もしくはスレオニル残基のもの）が挙げられる。
【００７２】
本発明による「活性画分」は、たとえば、ＩＬ−６の断片であり得る。断片という用語は、分子の任意の部分集団、すなわち、所望の生物学的活性を維持したより短いペプチドをいう。断片は、ＩＬ−６分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片を、ｇｐ８０に結合する性質およびまたは肝細胞増殖を誘導する性質について試験することにより容易に調製され得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから１度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは公知であり、所望の生物学的活性を維持している断片の測定は、常套的な実験法を伴うに過ぎない。
【００７３】
ＩＬ−６の活性画分、そのムテインおよび融合タンパク質として、本発明は、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体（単独のもの、または分子と会合したもの、または残基（たとえば、糖残基またはリン酸残基）に結合したもの）またはタンパク質分子同士または糖残基との凝集体をさらに包含する。ただし、前記断片はＩＬ−６と実質的に類似した活性（たとえば、ｇｐ８０のＩＬ−６結合性部位に結合する活性および／または肝細胞増殖を誘導する活性）を有するものとする。
【００７４】
本明細書において、用語「塩」は、ＩＬ−６分子またはそのアナログのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の手段により形成され得、無機塩（たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛の塩など）、および有機塩基との塩（たとえば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリシン、ピペラジン、プロカインなどと形成されるものなど）が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、無機酸（たとえば、塩酸または硫酸など）との塩および有機酸（たとえば、酢酸またはシュウ酸など）との塩が挙げられる。もちろん、任意のかかる塩は、ＩＬ−６の生物学的活性（たとえば、肝細胞増殖を誘導する能力およびまたはｇＰ８０のＩＬ−６結合性部位に結合する能力）を維持していなければならない。
【００７５】
ＩＬ−６の「アイソフォーム」は、ｇｐ８０に結合することができるタンパク質、または選択的スプライシングによって生成し得るその断片である。
【００７６】
用語「円順列誘導体」は、本明細書で使用する場合、末端同士を直接またはリンカーを介してのいずれかで互いに結合して環状分子を作製し、次いで該環状分子を別の位置で開裂して末端が元の分子の末端と異なる新たな線状分子が作製された線状分子をいう。円順列誘導体のものとしては、その構造が、環化した後開裂された分子に相当する分子が挙げられる。したがって、円順列誘導体分子は、線状分子として最初から合成され、環化工程および開裂工程を経ないものであってもよい。円順列誘導体の調製は、Ｗ０９５／２７７３２に記載されている。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の物質は、１つ以上の部位がグリコシル化されている。
【００７８】
ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのグリコシル化された形態は、ＷＯ  ９９／０２５５２  （ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３２１）に記載されており、これは、本発明にしたがう非常に好ましいキメラ分子である。該文献に記載されたＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、組換え糖タンパク質であり、天然に存在する可溶性ＩＬ−６レセプターδ−Ｖａｌ（Novickら, 1990）の全コード配列を、天然に存在する成熟ＩＬ−６の全コード配列（ともにヒト起源に由来）に融合させて得られたものである。当業者には、グリコシル化されたＩＬ−６が、組換え手段によって、すなわち、真核生物の発現系における発現によって作製され得ることが認識されよう。
【００７９】
本発明によるＩＬ−６は、任意の適切な真核生物または原核生物細胞型（たとえば、酵母細胞、昆虫細胞、細菌など）において産生され得る。これは、好ましくは哺乳動物細胞において、最も好ましくは、遺伝子工学的に改変されたＣＨＯ細胞（ＷＯ  ９９／０２５５２に記載）において産生される。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の物質はグリコシル化されていない。好都合には、該分子を、次いで、グリコシル残基を合成することはできないが、通常、高い産生量の組換えタンパク質を有する細菌細胞において産生させ得る。非グリコシル化されたＩＬ−６の作製は、たとえばＥＰ５０４７５１Ｂ１に詳細に記載されている。
【００８１】
またさらなる実施形態において、本発明による物質は、融合免疫グロブリンを含有する、すなわち、本発明による分子は、免疫グロブリンの全部または一部に融合されている。免疫グロブリン融合タンパク質の作製方法は、当該技術分野でよく知られており、たとえば、ＷＯ  ０１／０３７３７に記載のものである。当業者には、得られる本発明の融合タンパク質が、ＩＬ−６の生物学的活性を保持していることが理解されよう。得られる融合タンパク質は、理想的には、改善された性質（たとえば、体液中での滞留時間（半減期）の延長、特異的活性の増大、発現レベルの増加または融合タンパク質の精製の促進など）を有する。
【００８２】
好ましくは、本発明による物質は、Ｉｇ分子の定常領域に融合させる。該物質は、たとえば、ヒトＩｇＧ１の重鎖領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインなど）と融合させ得る。Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明による融合タンパク質の作製に適する（たとえば、アイソフォームＩｇＧ2もしくはＩｇＧ4、または他のＩｇクラス（ＩｇＭもしくはＩｇＡ）など）。融合タンパク質は、単量体または多量体、ヘテロ多量体もしくはホモ多量体であり得る。
【００８３】
本発明による物質の機能性誘導体は、該タンパク質の性質、たとえば、安定性、半減期、バイオアベイラビリティ、ヒト身体による耐容性または免疫原性を改善するために、高分子に結合させてもよい。
【００８４】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、アミノ酸残基の１個以上の側鎖として存在する１個以上の官能基に結合した部分を少なくとも１つ含有する、本発明による物質の機能性誘導体に関する。
【００８５】
非常に好ましい実施形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結させた本発明の物質に関する。ＰＥＧ化は、公知の方法、たとえば、ＷＯ  ９２／１３０９５に記載のものなどにより行い得る。
【００８６】
好ましくは、本発明の物質は、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲の量で使用される。本発明の好ましい実施形態では、該物質を毎日投与する。さらに好ましい実施形態では、該物質を週３回投与する。なおさらに好ましい実施形態では、該物質を週１回投与する。
【００８７】
低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩は、本発明にしたがって、肝臓傷害、たとえば、
Ａ−末期肝臓機能不全から慢性肝臓疾患（ウイルス性（ＨＢＶ、ＨＣＶ、他の肝炎）の非代償性肝硬変が原因または外毒素（アルコール性）が原因であり得る）
Ｂ−肝臓切除外科処置後の肝臓機能不全（たとえば、肝細胞性癌腫の肝臓切除（肝臓遺残組織を伴う）後に引き起こされる）
Ｃ−急性肝不全（ウイルス感染（ＨＣＶ）、中毒性（アルコール，  パラセタモール，  乱用，  キノコ中毒）が原因、および外傷が原因による）
において使用され得る。
【００８８】
本発明による低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩での治療は、肝臓塊を拡張して生存率を改善するため、およびたとえば、末期肝臓機能不全から慢性肝臓疾患を有し、適合ドナーがいなくて肝臓移植を待っている患者の肝臓移植を遅延するために有益であり得る。
【００８９】
本発明による低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩での治療は、予期しない術後の肝臓機能不全を示す患者、または術後肝不全を示す患者において有益であり得る。たとえば、続発性新生物により肝臓を切除した患者である。
【００９０】
本発明による低用量のＩＬ−６、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩での治療は、硬変した肝臓の再生および外科処置の回避を補助し得る。
【００９１】
本発明のさらなる目的は、肝臓傷害、たとえば肝硬変の治療および／または予防のための、ＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩を、任意選択で１種類以上の薬学的に許容され得る担体（希釈剤または賦形剤）とともに含有する医薬組成物を提供することである。
【００９２】
「薬学的に許容され得る」の定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げず、かつ投与対象の宿主に対して毒性でない任意の担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与では、ＩＬ−６は、ビヒクル（たとえば、生理食塩水，  デキストロース溶液，  血清アルビミンおよびリンゲル溶液）中にて注射用の単位投薬形態に製剤化され得る。
【００９３】
ＩＬ−６は、その投与の必要性がある患者に、種々の様式で投与され得る。投与経路としては、肝臓内、皮内、経皮（たとえば、低速放出製剤にて）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路が挙げられる。任意の他の治療上有効な投与経路が使用され得、たとえば、上皮または内皮の組織からの吸収、またはＩＬ−６をコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（たとえば、ベクターにより）、インビボでＩＬ−６の発現および分泌を引き起こす遺伝子療法によるものである。加えて、ＩＬ−６は、生物学的に活性な薬剤の他の成分（たとえば、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなど）とともに投与してもよい。
【００９４】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のためには、ＩＬ−６は、薬学的に許容され得る非経口用ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）ならびに等張性を維持する添加剤（たとえば、マンニトール）または化学的安定性を維持する添加剤（たとえば、保存剤およびバッファー）と組合せて、液剤、懸濁剤、乳剤または凍結乾燥した散剤として製剤化され得る。製剤は、一般的に用いられる手法によって滅菌する。
【００９５】
本発明のさらなる目的は、有効な量／用量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体または塩を、任意選択で薬学的に許容され得る担体とともに、必要とする患者に投与することを含む、肝臓傷害、たとえば肝硬変などの治療および／または予防方法を提供することである。
【００９６】
「有効な量」は、上記の疾患の経過および重篤度に影響を与え、かかる病理の低減または寛解を導くのに充分な活性成分の量をいう。有効な量は、投与経路および患者の状態に依存する。
【００９７】
個体に、単回用量または反復用量として投与される投薬量は、種々の要因（ＩＬ−６薬物動態学的性質、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、併用療法、処置の頻度ならびに所望の効果が挙げられる）に応じて異なる。確立された投薬範囲の調整および操作は、充分、当業者の能力の範囲である。
【００９８】
本発明は、急性的および重症的に傷害された肝臓（肝炎を伴う亜広汎（ｓｕｂｍａｓｓｉｖｅ）壊死の場合など）の治療のため医薬の製造における低用量のＩＬ−６またはムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体の使用に関する。
【００９９】
本発明はまた、硬変した肝臓の治療のため、たとえば切除および／または組織生着処置を含む重症の状態の肝臓の治療のため、医薬の製造において、ＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む低用量のＩＬ−６またはそのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体の使用に関する。
【０１００】
有効な低用量／量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体を、必要とする患者に投与することを含む、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む肝臓傷害、たとえば肝硬変などの治療方法は、本発明のさらなる目的である。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態において、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲のＩＬ−６の投与量が非常に好ましい。
有効な低量のＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体を、必要とする患者に投与することを含む、またはＩＬ−６、そのムテイン、融合タンパク質、活性画分もしくは円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、必要とする患者に投与することを含む、肝臓の傷害、たとえば肝硬変の治療方法であって、切除および／または組織生着処置を含む該治療方法は、本発明のさらなる目的である。
【０１０２】
低用量のＩＬ−６は、移植前、移植中および／または移植後に投与し得る。低用量のＩＬ−６は、切除処置前、切除処置中、切除処置後に、肝臓組織のレシピエントおよび／またはドナーの両者に投与し得る。
【０１０３】
移植の際、全肝、肝臓の一部、肝臓組織、肝細胞または幹細胞に行なわれる低用量のＩＬ−６の投与が、本発明にしたがって実行された。
【０１０４】
用語「移植」は、本明細書では、患者自身の身体または別の人（ドナー）から採取した組織または細胞を生着させることをいう。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態において、０．１〜１０ｍｃｇ／ｋｇの範囲のＩＬ−６の投与量が非常に好ましい。
次に、以下の非限定的な実施例および添付の図面にしたがって本発明をより詳細に説明する。
【０１０６】
本発明を充分に記載してきたが、当業者には、広範な均等のパラメータ、濃度および条件の範囲内で、必要以上の実験をせずに、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明を行い得ることが認識されよう。
【０１０７】
本発明を、その特定の実施形態に関して記載したが、さらなる改良が可能であることを理解されたい。本特許出願明細書は、一般的に本発明の原理にしたがう本発明の任意の変形、使用または適応を包含し、本発明が属する技術分野において既知または慣用的な実務の範囲内である場合、および以下の添付の特許請求の範囲に記載された前述の本質的な特徴に適用され得る場合、本開示からのかかる逸脱を含むものとする。
【０１０８】
本明細書で引用した参考文献、たとえば、学術論文もしくは要約諸、公開もしくは未公開の米国もしくは外国の特許出願、発行済の米国もしくは外国の特許、または任意の他の参考文献などは、引用により本明細書に完全に組み込まれる（引用した参考文献に示されたすべてのデータ、表、数値および文章を含む）。加えて、参考文献内に引用された参考文献の全内容もまた、引用により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１０９】
公知の方法の工程、従来の方法の工程、公知の方法または従来の方法を参照することは、決して、本発明の任意の側面、説明または実施形態が関連技術において開示、教示または示唆されているという是認（admission）ではない。
【０１１０】
特定の実施形態の前述の説明では、本発明の一般的本質を充分示したため、当該技術分野の技能の範囲内の知識を適用することにより（本明細書に引用した参考文献の内容を含む）、必要以上の実験をせずに、本発明の一般的概念を逸脱することなく、種々の適用用途のために、かかる特定の実施形態は容易に改良および／または適応がなされよう。したがって、かかる適応および改良は、本明細書に示した教示および手引きに基づき、開示した実施形態の均等の範囲の意味に含まれるものとする。また、本明細書における語法または専門用語は、説明の目的のためであって、限定の目的のためではないため、当業者は、本明細書の専門用語または語法を、当業者の知識との組み合わせで、本明細書に示した教示および手引きに鑑みて解釈すべきであることを理解されたい。
【実施例】
【０１１１】
実施例１
ラットにおける肝硬変の誘導およびＩＬ−６の投与の手順
実験は、いずれの急性外科的ストレス前の「初期の（ｂａｓａｌ）」硬変した肝臓の機能性の肝臓塊の拡張における、および大部分の外科的切除後の硬変した肝臓の再生応答の増大における、ＩＬ−６処置の主な生物学的効果を評価するために構築した。
【０１１２】
特に、本研究は、肝臓切除処置を受けるヒトの代償性（Ｃｈｉｌｄ−Ｐｏｕｇｈ  Ａ）肝硬変を模擬する「代償性肝硬変」のモデルに焦点を当てた。
【０１１３】
本試験は、雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄｏｗｌｅｙラット（体重１５０〜１７５  ｇｒ）において行った。動物を、１２時間の明／暗サイクルに維持し、標準的なラット用試料と水を随意に摂取させた。
【０１１４】
実験用中心葉肝硬変を、四塩化炭素（ＣＣｌ４）およびフェノバルビタールによって誘導した。ＣＣｌ４の肝毒性効果を増強させるため、ＣＣｌ４処置の最初から１０回目の最後まで、ラットには、慢性的に、フェノバルビタール（０．３５  ｇ／Ｌ）を飲用水にて摂取させた。ＣＣｌ４（オリーブ油中で１：９に希釈）を、１週間に１回、１０週間、胃内経路（強制投与）により投与した。０．２ｍｌ／ｋｇの開始用量は、各強制投与後、７日間の間、観察した各動物の毎日の体重変化に応じて±０．２ｍｌ／ｋｇ変化させた。理論的なＣＣｌ４用量の半量を強制投与にて第９日および第１０日に投与した。１０回目の強制投与後にいずれの処置も中止し、ラットを５日間、安静にさせた。
【０１１５】
ＩＬ−６注射の効果を、硬変した肝臓に対する効果および肝臓の切除後の硬変肝実質の再生に対する効果の両方に関して評価した。
【０１１６】
本試験は、３９匹の対照および施術（operation）時に基準を満たした８０匹のＩＬ−６動物において行なった。
【０１１７】
麻酔は、吸入および腹部正中切開により行なう外科的処置のいずれかにより与えた。肝臓間膜（ligament）を、門脈圧亢進による副行循環（collateral circle）の止血（haemostasis）に注意して切開した。肝臓の有茎皮弁（pedicle）を作製し、間膜間を切開した。次いで、肝臓の左葉および正中葉を、肝静脈を個々に結紮した後に切除した。壁縫合（wall closure）は、非吸収性縫合糸での連続縫合により行なった。
【０１１８】
肝臓機能を、「Ｃｈｉｌｄ−Ｐｏｕｇｈ」臨床パラメータ：
ａ．  門脈体循環性脳障害による神経損傷の存在または非存在；
ｂ．  腹水の存在または非存在
にしたがって評価した。
【０１１９】
これらのパラメータは、施術時と致死時の両方において考慮し、これにより、各動物を機能が代償性のまたは非代償性の肝硬変を有するものに分類した。以下の実験において、施術時に代償性肝硬変を有し、「広汎性肝硬変」または「門脈域（porto-portal）線維化を伴う不完全な（incomplete）肝硬変」（それぞれ、肝葉の８０〜１００％および５０〜７９％が関与する硬変性変化、非硬変実質における門脈域線維化と関連）を示す動物のみ、軽微な硬変変化を示すものとして体系的に除外とした。
【０１２０】
すべての組織学的評価は、切除した正中葉および左葉由来のヘマトキシリン−エオシン染色検体に関して行なった。
【０１２１】
肝細胞増殖は、ＢｒｄＵ取込みによって測定した。ＢｒｄＵ取込みは、抗ＢｒｄＵ抗体によって検出し、ＢｒｄＵ染色肝細胞の割合は、２０高倍率視野（４０×）で評価した。
【０１２２】
動物のＢｒｄＵ条件（assumption）は、結腸粘膜細胞ＢｒｄＵ取込みの解析によって制御された。
【０１２３】
肝細胞性増殖をＢｒｄＵ取込みによって評価しようとした場合、ラットには、飲用水にてＢｒｄＵを（１  ｇ／Ｌ）、最初のＩＬ−６注射から肝臓の切除まで（「初期の」硬変した肝臓に対するＩＬ−６効果）または施術時から致死まで（硬変した肝臓の再生に対するＩＬ−６効果）を摂取させた。
【０１２４】
前記の肝硬変ラットで対照群を構成した。
【０１２５】
ＩＬ−６を、５００、１００、１０、１または０．１ｍｃｇ／ｋｇの用量にて投与した肝硬変ラットで、処置群を構成した。ＩＬ−６、ＩＬ−６  １００、ＩＬ−６  １０、ＩＬ−６  １およびＩＬ−６  ０．１は、それぞれ、ＩＬ−６処置動物、１００ｍｃｇ／ｋｇ、１０ｍｃｇ／ｋｇ、１ｍｃｇ／ｋｇおよび０．１ｍｃｇ／ｋｇのＩＬ−６で処置したラットを示す。用量５００ｍｃｇ／ｋｇおよび１００ｍｃｇ／ｋｇを高用量とし、一方、１０ｍｃｇ／ｋｇ〜０．１ｍｃｇ／ｋｇの範囲の用量を低用量とした。
外科処置の６および５日前にＩＬ−６を５００、１００、１０、１および０．１ｍｃｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与し、３回目のＩＬ−６注射は、肝臓の切除後の開腹縫合の直前に行なった（同用量）。
【０１２６】
ＩＬ−６注射の効果を、硬変した肝臓に対する効果および肝臓の切除の硬変肝実質の再生に対する効果の両方に関して評価した。
【０１２７】
硬変した肝臓に対するＩＬ−６効果の評価は：
１．術中死亡率
を考慮した。
【０１２８】
肝臓の切除後の硬変肝実質の再生に対するＩＬ−６効果の評価は：
１．術後死亡率；
２．致死時の肝臓機能；
３．再生した肝臓塊の割合として測定した肝臓の再生（以下の等式：
肝臓再生率（％）＝１００×［Ｃ−（Ａ−Ｂ）］／Ａ
（式中、Ａは、肝臓切除時の概算肝臓重量であり［このデータは、１５匹の対照および２４匹のＩＬ−６処置動物において調査および確認した（データ示さず）］、
Ｂは、切除した肝臓の重量であり、
Ｃは、致死時での再生した肝臓の重量である）
により算出）
４．致死時での肝臓試料におけるＢｒｄＵ取込み
を考慮した。
【０１２９】
値は、平均値±ＳＤで示した。統計学的解析が一方向ＡＮＯＶＡの後、異なる亜群を比較するダネットｔ検定によって行なわれた。
【０１３０】
肝硬変の誘導後、肝臓の左葉および正中葉を切除し、肝臓切除後の硬変肝実質の再生に対するＩＬ−６の薬理学的効果を調べた。以下のパラメータをモニターした：１．術後死亡率、２．致死時での肝臓機能の評価、３．肝臓再生、および４．致死時でのＢｒｄＵ取込み。
【０１３１】
実施例２
肝臓切除後の硬変肝実質の再生に対するＩＬ−６の薬理学的効果
肝硬変の誘導後、肝臓の左葉および正中葉を切除した。得られた結果は、機能的代償性肝硬変が存在する場合、ＩＬ−６の腹腔内注射は、大部分の肝臓の切除する術中死亡率を増加させないことを示す。
【０１３２】
肝臓切除後の硬変肝実質の再生に対するＩＬ−６  薬理学的効果を調べた。以下のパラメータをモニターした：１．術後死亡率、２．致死時での肝臓機能の評価、３．肝臓再生、および４．致死時でのＢｒｄＵ取込み。
【０１３３】
対照動物の７．１％の死亡率（２／２８）に対し、ＩＬ−６処置ラットでは２．８％（２／７０）が観察された。対照１匹および処置ラット１匹が肝不全で死亡し、その他の２匹は、原因不明で死亡した。処置群では、すべての死亡例が高用量群において起こったことに注目されたい。
【０１３４】
前記臨床パラメータにしたがう肝臓機能の評価を、９４匹のラットにおいて行なった：
ａ．  門脈体循環性脳障害による神経損傷はまったく観察されなかった；
ｂ．  腹水は、４匹のラットにおいて観察された：１／２６対照（４．１％）および３／２６  ＩＬ−６高用量動物（１１．５％）。
【０１３５】
平均肝臓再生率を、２４匹の対照、１２匹のＩＬ−６  ０．１、１２匹のＩＬ−６  １、１６匹のＩＬ−６  １０、１５匹のＩＬ−６  １００および１１匹のＩＬ−６  ５００動物から算出すると、以下のとおりである（図２）：
ａ．対照間では、平均値１６．５±１０．１、中央値１６，３；
ｂ．ＩＬ−６  ０．１動物間では、平均値２５．５±１５．７、中央値２７．５；
ｃ．ＩＬ−６  １動物間では、平均値３８．４±１０．８、中央値４０．４；
ｄ．ＩＬ−６  １０動物間では、平均値２９．０±１３．４、中央値２５．９；
ｅ．ＩＬ−６  １００動物間では、平均値４０．２±９．９、中央値４２．１；
ｆ．ＩＬ−６  ５００動物間では、平均値３２．２±１２．１、中央値３１．３。
【０１３６】
平均値間の差は統計学的に有意であった（ｔダネット＜０．０５）。
【０１３７】
４．致死時でのＢｒｄＵ取込み
７匹の対照、９匹のＩＬ−６  ０．１、８匹のＩＬ−６  １、７匹のＩＬ−６  １０、９匹のＩＬ−６  １００および７匹のＩＬ−６  ５００ラットに、肝臓の切除後、ＢｒｄＵを摂取させた。ＢｒｄＵ染色肝細胞の計測数を示す（図３）：
ａ．対照間では、平均値５２．２±１４．９、中央値  ５３；
ｂ．ＩＬ−６  ０．１動物間では、平均値６５．３±８．２、中央値６５．３；
ｃ．ＩＬ−６  １動物間では、平均値６８．４±１１．９、中央値６５．５；
ｄ．ＩＬ−６  １０動物間では、平均値６０．８±１０．０、中央値６０．０；
ｅ．ＩＬ−６  １００動物間では、平均値７９．４±８．１、中央値７８．４；
ｆ．ＩＬ−６  ５００動物間では、平均値８０．９±１０．７、中央値８３．７。
【０１３８】
この場合では、平均値間の差は、対照をＩＬ−６  ０．１、１、１００および５００動物と比較した場合、統計学的有意性を有した（ｔダネット＜０．０５）。統計学的有意性は、用量１０ｍｃｇ／ｋｇで処置した動物の亜群を考慮した場合は、明白ではなかった。
【０１３９】
これらのデータは、機能的代償性肝硬変が存在する場合、ＩＬ−６の腹腔内注射は：
大部分の肝臓の切除した後の術後死亡率を増加させない；
高容量を用いた場合および低用量（１０ｍｃｇ／ｋｇを除く）を用いた場合ともに、成熟肝細胞の大量増殖を誘導することにより実質組織の大半の喪失に対する生理学的応答を増強する
ことを明白に示す。
【０１４０】
実施例３
硬変した肝臓における肝細胞性再生に対するＩＬ−６の作用に関与する転写因子
転写因子（これは、ＩＬ−６により直接活性化される）、たとえば、ＳＴＡＴ−３およびＡＰ−１の、硬変した肝臓における肝細胞性再生に対するＩＬ−６の作用における関与を調べた。また、ＩＬ−６処置後に観察された増殖性肝細胞性応答におけるＮＫ−κＢ活性化の関与の可能性も、機能が代償性の肝硬変の状態において調べた。
【０１４１】
実験は、実施例１に記載のようにして処置した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄｏｗｌｅｙラットにおいて行なった。特に、動物が、既に記載の基準を満たすことを評定することに充分注意した。
【０１４２】
まず、ＩＬ−６注射後の異なる時点で致死させた肝硬変ラットから得た肝臓断片を検査した。ラットは、用量１００ｍｃｇ／ｋｇのＩＬ−６で、すでに記載の注射手順にしたがって処置した。
【０１４３】
次に、対照または肝臓切除後の異なる時点のＩＬ−６処置ラット（既述したとおりに行なった）から得た肝臓断片を検査した。
硬変肝臓における転写因子活性化に対するＩＬ−６の効果：
シフトアッセイ（実施例４の詳細を参照）により、ＩＬ−６腹腔内注射により、硬変した肝臓において明白なＳＴＡＴ−３活性化が惹起されることが示され、これは、注射の１時間後および２時間後に検出可能であり、４時間後にやや減少した。（図４）。
【０１４４】
また、ＩＬ−６腹腔内注射は、硬変した肝臓において明白なＡＰ−１活性化も惹起することが観察され、これは、注射の１時間後および２時間後に検出可能であり、４時間後ではさらに明白であった（図４）。
【０１４５】
加えて、シフトアッセイにより、ＩＬ−６腹腔内注射は、ＮＦ−κＢの一過性の活性化を惹起することが観察され、これは、注射の１時間後および４時間後で検出可能であり、２時間後にピークを示した（図４）。第１の注射の２４時間後に第２のＩＬ−６用量を注射すると、同一の応答が得られた（図示せず）。
【０１４６】
肝臓の切除後の硬変した肝臓における転写因子活性化に対するＩＬ−６の効果もまた調べ、以下のことが観察された：
１−対照動物では、肝臓切除により中程度のＳＴＡＴ−３活性化が誘導され、これは、外科的処置後、１時間後で明白であり、２時間後にさらに増加した。外科的処置の最後でのＩＬ−６腹腔内注射により、早期で増強されたＳＴＡＴ−３活性化が誘導された（図５）。実際、ＳＴＡＴ−３結合活性は、外科処置の３０分後に高レベルで存在し、少なくとも４時間持続した。スーパーシフト解析（特異的抗体を用いる）により、ＳＴＡＴ−３特異性のシグナルを確認した。
【０１４７】
２−対照動物では、肝臓切除により、基底レベルを超える中程度のＡＰ−１活性化が誘導され、これは、外科処置の２時間後に観察された。外科的処置の最後でのＩＬ−６腹腔内注射により、早期で増強されたＡＰ−１活性化が誘導された（図５）。実際、ＡＰ−１結合活性は、外科処置の３０分後に高レベルで存在し、少なくとも４時間持続した。スーパーシフト解析（特異的抗体を用いる）により、ＳＴＡＴ−３特異性のシグナルの確認した。
【０１４８】
３−対照動物では、肝臓切除により、基底レベルを超える有意なＮＦ−κＢ活性化は誘導されなかった。一方、外科的処置の最後でのＩＬ−６腹腔内注射では、ＮＦ−κＢ活性化が誘導された（図５）。実際、ＮＦ−κＢ結合活性は、外科処置の３０分後および６０分後に存在し、その後は基底レベルまで減少した。
【０１４９】
これらの結果は、ＩＬ−６誘導性のＳＴＡＴ−３およびＡＰ−１の活性化が、硬変した肝臓における肝細胞性増殖の増強に、ある役割を果たすことを示し、ＩＬ−６の「最終生物学的効果」をさらに裏付ける。
【０１５０】
ＮＦ−κＢの試験は、肝臓切除前のＩＬ−６処置により、非肝硬変肝臓において通常存在するＮＦ−κＢの活性化（Streetzet al. 2003）が回復するが、硬変した肝臓では減衰することを示す。
【０１５１】
肝臓の細胞におけるアポトーシスの減少におけるＮＦ−κＢの既報の役割は、硬変した肝臓におけるＩＬ−６誘導性肝臓塊拡張が、ＩＬ−６の抗アポトーシス効果にも媒介され得ることを示す。
【０１５２】
実施例４
電気泳動移動度シフトアッセイ
５００ｍｇの肝臓を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含有するホモジナイゼーションバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ  ｐＨ  ７．６、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍスクロース、１０％グリセロール）中でホモジナイズし、１００，０００ｇで５０分間遠心分離し、核ペレットを得た。核を、溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ７．９、２５％グリセロール、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５  ジチオトレイトールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解し、−８０℃で保存した。８マイクログラムの抽出物を、放射性標識二本鎖オリゴヌクレオチド（５ｎｇ）とともに、２０分間２５℃で、結合バッファー（１０ｍＭトリス  ｐＨ７．８、５％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオトレイトール、０．５ｕｇのポリｄＩ−ｄＣ）中でインキュベートし、非変性５％ポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ  ｌ×中）上で電気泳動した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた。用いたプローブは、高速液体クロマトグラフィーにより精製したオリゴヌクレオチドで、以下の塩基配列のものであった：
１．ｃ−ｆｏｓプロモーター内の血清誘導性因子結合性エレメント由来のＳｔａｔ３部位
５’−ＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧ−３’
２．ＡＰ−１部位：５’−ＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣ−３’  
３．ＮＦ−κＢ部位：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣＡ−３’。
【０１５３】
各プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびｇ−３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。競合実験では、１００倍過剰の特異的非標識プローブを、抽出物とともに、放射性標識プローブの添加前に２０分間インキュベートした。スーパーシフトアッセイを、３０分間、核抽出物を、１μｇの抗Ｓｔａｔ３抗体（サンタクルーズバイオテック）とともにインキュベートすることにより行なった。ローディングコントロール使用のため、核抽出物を、八量体１に対するＤＮＡ結合活性（その部位は、多くのハウスキーピング遺伝子に存在する）についても、以下のプローブ：５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＣＴ−３’を用いて解析した。
【０１５４】
実施例５
慢性肝硬変の状態におけるＩＬ−６レセプターの発現
種々の生理病理学的状態により、ＩＬ−６レセプターの発現が変更され得、それにより、ＩＬ−６に対する細胞応答性がモジュレートされることが報告されている。その文献では、生理作用（physiologic）として、慢性肝硬変の状態の肝臓におけるＩＬ−６の量の増加が報告されている。したがって、ＩＬ−６のこの増加が、特異的膜レセプターの発現の増加とも関連しているのか否かを詳しく調べた。
【０１５５】
実験は、実施例１に記載のようにして処置した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄｏｗｌｅｙラットにおいて行なった。特に、動物が、既に記載の基準を満たすことを評定することに充分注意した。
【０１５６】
ラットは、用量１００ｍｃｇ／ｋｇのＩＬ−６で、すでに記載の注射手順にしたがって処置した。
【０１５７】
実験は、肝臓切除時に得た肝臓断片において行なった。正常で肝硬変でない動物由来の肝臓を対照として使用した。
【０１５８】
硬変した肝臓では、肝細胞とは異なる系統の細胞（Ｉｔｏ、筋線維芽細胞、卵型細胞および炎症性細胞）の増加が見られたため、全肝ホモジネートおよび硬変した肝臓から精製した肝細胞の両方を解析した。同様の手順を正常肝臓においても行なった。
【０１５９】
肝細胞を、膜構造、特に、レセプターを破壊し得る酵素処置（たとえば、コラゲナーゼなど）を回避する機械的組織分離を用いる革新的な手順により得た（Dr Giovanna Mazzoleni, Dept Biomedical Sciences and Biotechnology, Viale Europa 11, 25100 Brescia, methodological procedure 近刊）。
【０１６０】
１００ｍｇの肝臓または１６ｍｇの肝細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含有する１ｍｌの溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ２、１０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１％  Ｉｇｅｐａｌ、１％デソシコレート（desossicholate）、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4）中でホモジナイズし、４℃で２０分間インキュベートし、１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。４０マイクログラムを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ｇｐ８０およびＧｐ１３０に対するポリクローナル抗体（サンタクルーズ）でプローブし、ＥＣＬで現像した。
【０１６１】
肝硬変動物では、ｇｐ８０の発現は、全肝由来の細胞抽出物および単離した肝細胞由来の細胞抽出物の両方において、正常対照と比べて有意に増加した（図６）。
【０１６２】
肝硬変動物では、ｇｐ１３０の発現は、全肝由来の細胞抽出物において、正常対照と比べて有意に減少した。対照的に、肝硬変動物において、ｇｐ１３０の発現は、精製した肝細胞由来の全細胞抽出物において、正常対照と比べて有意に増加した（図６）。
【０１６３】
文献データは、肝臓の細胞では、ＩＬ−６に対する応答性が、ＩＬ−６レセプター複合体の特定のｇｐ８０サブユニットの存在に依存することを示す。加えて、ｇｐ８０の増加またはｇｐ８０およびｇｐ１３０サブユニットの両方の増加により、ＩＬ−６に対する細胞応答性の増加が誘導されることが示された。
【０１６４】
硬変した肝臓由来の肝細胞が、ＩＬ−６レセプターのｇｐ８０およびｇｐ１３０の両サブユニットを過剰発現するを示すこれらの結果は、硬変した肝臓の肝細胞がＩＬ−６処置に対して高度に応答性であることを示唆する。
【０１６５】
実施例６
ＩＬ−６が肝硬変ラットの肝臓において発癌性効果を誘導する否かの評価
ＩＬ−６により誘導される肝細胞性増殖が、肝細胞性癌腫の発生率の増加と関連するか否かを、処置肝硬変ラット対未処置肝硬変ラットで、さらに詳しく調べた。続いて、新生組織形成または形成異常の存在、さらに、肝細胞癌腫発生のリスク増加のマーカーとみなされる実質組織血管新生の変化の存在を直接証明するため、肝硬変ラットの再生している肝臓を、盲検条件下で、組織学的検査および免疫組織化学的検査に供した。この形態学的評価は、最終的に、種々の癌遺伝子の免疫組織化学的評価によって完結させた。
【０１６６】
本試験は、実験の最後に得た肝臓検体において行なった（動物致死、実施例２）。
【０１６７】
実験は、対照ラットおよび用量５００および１００ｍｃｇ／ｋｇのＩＬ−６で処置したラットを用い、すでに記載（実施例２）の注射手順にしたがって行なった。
【０１６８】
すべての組織学的評価は、１匹の動物あたり最低２つのヘマトキシリン−エオシン染色検体において行なった。特に、新生組織形成および形成異常の存在を注意深く詳しく調べた。
【０１６９】
いくつかの免疫組織化学的評価を、１つの免疫組織化学的反応につき１匹の動物あたり最低２つの検体において行なった。
【０１７０】
再生している硬変した実質における新脈管形成を詳しく調べた。これには、硬変した肝葉における微小血管密度で示される洞様毛細血管形成の検査、胆道構造と関連しない細動脈（対でない細動脈）の検査および内皮分化の評価を含めた。
【０１７１】
本試験は：
−毛細血管の証明（demonstration）のための抗第ＶＩＩＩ因子抗体；
−細動脈の証明のための抗平滑筋特異的アクチン抗体；
−内皮分化を調べるためのＵＬＥＸレクチン  
により行なった。
【０１７２】
再生している硬変した実質における癌遺伝子発現の試験では、
−Ｐ５３；
−ＭＩＢＩ  １；
−Ｂｃｌ−２
の発現の評価を詳しく行なった。
【０１７３】
５５匹のラット由来の検体をモニターした（２５匹の対照、２１匹のＩＬ−６  １００および９匹のＩＬ−６  ５００）。２匹の対照（８％）および１匹のＩＬ−６  １００（４．８％）は、重症の形成異常または肝細胞性癌腫（ＨＣＣ）を示した。残りのすべての検体は、様々な程度の肝硬変および肝臓の線維化を示したが、細胞の形成異常またはＨＣＣは示さなかった。
【０１７４】
また、組織学的解析で形成異常またはＨＣＣを示した３匹の動物は、対でない細動脈に関する試験において陽性であり、さらにまた、２匹の対照は、微小血管密度の試験でも陽性であり、１匹は内皮分化の評価でも陽性であった。
【０１７５】
残りのすべての検体は、洞様毛細血管形成が肝硬変の重篤度および伝播（diffusion）と直接的に関連することを明白に示し、対照とＩＬ−６処置動物間で微小血管密度の差は観察されなかった。さらにまた、これらの場合では、対照でもＩＬ−６処置動物でも胆道構造と関連しない細動脈は観察されず、すべての場合において、ＵＬＥＸレクチンでは、再生している内皮の正常分化が示された。
【０１７６】
Ｐ５３およびＭＩＢＩ  １の試験は常に陰性であった。これとは対照的に、４例（１匹の対照、１匹のＩＬ−６  ５００および２匹のＩＬ−６  １００）において、Ｂｃｌ−２は、限局的に陽性であった。これらの４匹の動物において、組織学的解析および新脈管形成の試験は完全に陰性であり、組織学的解析において形成異常またはＨＣＣを示した３匹の動物は、試験した癌遺伝子の過剰発現を示さなかったことに注目されたい。
【０１７７】
得られた直接および間接データでは、新生物発生のリスクの増加は示されなかった。
【０１７８】
特に、重症の形成異常または肝細胞癌の発生率は、対照動物では８％（２／２５）であり、ＩＬ−６動物では３．３（１／３０）であった。
【０１７９】
処置動物において、再生している硬変した実質における新脈管形成の試験では、硬変した小結節内部での微小血管密度、対でない細動脈または未分化内皮の異常な増加は示されなかった。データは、ＨＣＣ発症と相関させた。
【０１８０】
癌遺伝子発現は、ほとんど完全に陰性であった。Ｂｃｌ−２のみが、対照およびＩＬ−６動物において、それぞれ、４％および１３．３％の限局的陽性率を示した。
【０１８１】
これらの結果は、高用量のＩＬ−６は、肝細胞性癌腫発症と関連する有意な事象を誘導しないことを示す。
【０１８２】
実施例７
機能的に非代償性の硬変した肝臓に対するＩＬ−６の薬理学的効果
以下の実験の目的は、機能的代償性肝硬変ラットの肝臓に対してＩＬ−６により誘導される効果が、肝臓機能の明白な障害と関連する、より重症の肝硬変においても観察される否かを検証することであった。
【０１８３】
実験の対象は、機能的非代償性肝硬変を発症し、開腹またはＩＬ−６注射時に腹水の徴候を伴った実施例１の実験のラット、および故意に非代償性肝臓機能を達成するために長期の処置に供した少数の動物である。実験には、１３匹の対照および１９匹のＩＬ−６の３２匹のラットを含めた。ＩＬ−６群のうち、１１匹の動物には、用量１００ｍｃｇ／ｋｇ、３匹に用量５００ｍｃｇ／ｋｇ、２匹に用量１０ｍｃｇ／ｋｇ、２匹に用量１ｍｃｇ／ｋｇ、および１匹に用量０．１ｍｃｇ／ｋｇを投与した。
【０１８４】
対照間では４６．２％の死亡率（６／１３）に対し、ＩＬ−６ラット間では、１０．５％（２／１９）が観察された。１例では、死亡率は、急性術中出血と関連し、７匹のラット（５匹の対照および２匹のＩＬ−６）は、心肺機能不全により死亡した。
【０１８５】
割合：（切除した肝臓／ラット体重）×１００（１３匹の対照動物および１９匹のＩＬ−６ラットから外挿）（図７）は：
対照間では、平均値１９．４４±５．１９、中央値１８．７；
ＩＬ−６動物間では、平均値２３．６±７．１、中央値２３．８
を示した。
平均値間の差は、統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．０７７）。
【０１８６】
高用量（Ｈ．Ｄ．）のＩＬ−６（５００および１００ｍｃｇ／ｋｇ）で処置したこれらの１４匹を考慮すると、結果は：
ＩＬ−６  Ｈ．  Ｄ．：平均値２３．６±５．０、中央値２４．４
であった。
【０１８７】
この場合、差は統計学的に有意であった（ｐ＝０．０４４）。同じ結果（ｐ＝０．０３４）が、
１００ｍｃｇ／ｋｇのＩＬ−６で処置した１１匹のラットのみを考慮した場合にでも得られた：
ＩＬ−６  １００：平均値２４．２７±５．３、中央値２５．１。
【０１８８】
割合（切除した肝臓／ラット体重）×１００は、１０ｍｃｇ／ｋｇのＩＬ−６で処置したラットでは１７．５および１５、１ｍｃｇ／ｋｇで処置したラットでは４３．５および２７．３、０．１ｍｃｇ／ｋｇで処置したラットでは１５．８であった。
【０１８９】
５匹の対照および５匹のＩＬ−６ラット（３匹のＩＬ−６  １００）に、肝臓の切除前にＢｒｄＵを摂取させた。ＢｒｄＵ染色肝細胞の計測数は（図８）：
対照間では、平均値１７．４±８．６、中央値１７．２；
ＩＬ−６動物間では、平均値３４．３±１４．８、中央値４２．１
を示した。
【０１９０】
差は有意ではなかった（ｐ＝０．０５８）。
肝臓切除後の硬変肝実質の再生に対するＩＬ−６の薬理学的効果
１．術後死亡率
対照では４２．８％の死亡率（３／７）に対し、ＩＬ−６処置ラットでは５３％（９／１７）が観察された。１例を除くすべての動物は、肝不全により死亡した（１匹のＩＬ−６動物は、内臓摘出により死亡した）。
２．致死時での肝臓機能の評価
すべての動物は、致死時（術後第７日）に重症の腹水を示した。
３．肝臓再生
平均肝臓再生率を、４匹の対照および８匹のＩＬ−６動物（６匹のＩＬ−６  １００、１匹のＩＬ−６  ５００および１匹のＩＬ−６  １０）から算出した。
【０１９１】
ａ．対照間では、平均値８．６±９．８、中央値７．１；
ｂ．ＩＬ−６動物間では、平均値２２．５±１１．４、中央値２２．  ３
が観察された（図９）。
【０１９２】
平均値間の差は統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．０６９）。
【０１９３】
２３．５±１２．８、１３．６および２３．２の再生率が、それぞれ、６匹のＩＬ−６  １００動物ならびにＩＬ−６  ５００およびＩＬ−６  １０ラットについて算出された。
４．致死時でのＢｒｄＵ取込み
１匹の対照および４匹のＩＬ−６ラット（３匹のＩＬ−６  １００および１匹のＩＬ−６  １０）に、肝臓の切除後にＢｒｄＵを摂取させた。ＢｒｄＵ染色肝細胞の計測数は：
ｇ．対照ラットにおいて１２．９％のＢｒｄＵ染色肝細胞（hepatocite）；
ｈ．３匹のＩＬ−６  １００およびＩＬ−６  １０ラットにおいて、それぞれ、８９．１％、８７．６％、３３．９％および６１．４％
を示した。
【０１９４】
これらのデータは、機能的非代償性肝硬変が存在する場合、ＩＬ−６の腹腔内注射は、機能的代償性肝硬変が存在する場合に検出されるのと同じ生物学的効果を誘発し、ＩＬ−６動物間の術中死亡率の明白な低下をもたらすことを示唆する。
【０１９５】
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【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】対照未処置ラットに対するＩＬ−６処置（高および低ＩＬ−６用量による）における術中死亡率を示す。
【図２】未処置対照に対するＩＬ−６処置の表示した用量での肝臓の切除後のＩＬ−６処置後の肝臓再生（generation）の％を示す。
【図３】図２の場合のようなＩＬ−６処置後のＢｒｄＵ取込み％を示す。
【図４】硬変した肝臓におけるＩＬ−６注射後の転写因子の発現を示す。
【図５】ＩＬ−６処置ラットまたは対照未処置肝硬変ラットにおける硬変した肝臓の切除後の転写因子の発現を示す。
【図６】正常ラットおよび肝硬変ラットにおける、全肝または精製した肝細胞でのＩＬ−６レセプターｇｐ８０およびｇｐ１３０の発現を示す。
【図７】対照の機能的非代償性硬変未処置ラットに対するＩＬ−６処置の、表示した用量での［切除した肝臓（ｇ）／ラット体重（ｇ）］×１００の割合を示す。
【図８】対照の機能的非代償性硬変未処置ラットに対するＩＬ−６処置由来の切除した肝葉におけるＢｒｄＵ取込みの％を示す。
【図９】対照の機能的非代償性硬変未処置ラットに対するＩＬ−６処置の、表示した用量での肝臓の切除後の肝臓再生の％を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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