(57)【要約】  本発明は、選択性脂肪族ジニトリルを対応するシアノカルボン酸に位置選択的および立体選択的生物変換することに関する。より具体的に、本発明は、２−イソブチル−サクシノニトリルの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸への変換方法を提供し、これは（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）の合成の有用な中間体である。プレガバリンは、特定の大脳疾患を治療するのに、例えば、発作性疾患、疼痛および精神異常の治療および予防に有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2007532125.tif 000006
［式中、Ｃ３が（Ｓ）立体配置を有し；
Ｒ1が、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり；そして
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、−Ｏ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル−ＯＨ、−フェニル−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル−ＯＨ、−フェニル−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、フェニルまたは置換フェニルであり、
但し、Ｒ2がメチルである場合、Ｒ1は水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたはフェニルである］
の化合物の製造方法であって、
（ａ）式ＩＩ：
【化２】
2007532125.tif 000007
の化合物を反応媒体中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；そして
（ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物の（３Ｓ）異性体を回収し；そして場合によって、式ＩＩの化合物の非荷電性（３Ｒ）異性体を回収する
工程を包含する、上記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）で回収した式ＩＩの化合物の非荷電性（３Ｒ）異性体を、有機溶媒の存在下、塩基と共に（３Ｒ）異性体を加熱することによって、式ＩＩの化合物のラセミ化合物にラセミ化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）で回収した非荷電性（３Ｒ）異性体からラセミ化されたラセミ化合物を使用して、工程（ａ）を繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酵素触媒が、ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびアラビドプシス・サリアナ由来のニトリラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
反応媒体が、蒸留水または約５.０〜約１０.０の範囲のｐＨに緩衝化されている水からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉの化合物が（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸であり、式ＩＩの化合物がラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルであり、そして工程（ｂ）で回収した非荷電性異性体が（Ｒ）−２−イソブチルサクシノニトリルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
溶媒中で塩基と共に加熱することによって、工程（ｂ）で回収した非荷電性（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルを、ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルにラセミ化する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）で回収した非荷電性（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルからラセミ化されたラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルを使用して、工程（ａ）を繰り返す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）２−イソブチル−サクシノニトリルを反応媒体中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；
（ｂ）反応媒体から（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸を回収し；
（ｃ）（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸を酸性塩に変換し；そして
（ｄ）酸性塩を水素化し、（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）を形成させる
工程を包含する、（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）の製造方法。
【請求項１０】
非荷電性（Ｒ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸を、工程（ａ）の反応媒体から回収する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
有機溶媒の存在下、塩基と共に加熱することによって、工程（ａ）の非荷電性（Ｒ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸をラセミ化し、ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルを形成し、そしてこのラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルを使用して、工程（ａ）を繰り返す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
酵素触媒が、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞の抽出物、部分的精製酵素、精製酵素または支持体上に固定化された酵素触媒の形態のニトリラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
酵素触媒が、ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびアラビドプシス・サリアナ由来のニトリラーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択された脂肪族ジニトリルを対応するシアノカルボン酸に位置選択性および立体選択性変換するための新規な生体触媒方法に関する。より具体的に、本発明は、２−イソブチル−サクシノニトリルの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸への変換方法を提供し、これは（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルへキサン酸（プレガバリン）の合成の有用な中間体である。プレガバリンは、特定の大脳疾患を治療するのに、例えば、発作性疾患、疼痛および精神異常の治療および予防に有用であり得る。プレガバリンは、大脳機能を改善するのに効果的であるので、これはまた老人患者の治療にも有用である。
【背景技術】
【０００２】
有機ニトリルの対応するカルボン酸およびアミドへの酵素加水分解は、広範囲の有用な化合物に重要な代替の合成方法を提供する。典型的に、高感度な官能基を含む化合物と不適合な状態になる高い反応温度において、強酸または強塩基の触媒を使用して、ニトリルの対応するカルボン酸およびアミドへの慣用的な化学的加水分解が行われる。さらに、乏しい選択性の化学的加水分解は、大量の無機塩と共に、好ましくない副産物を生じ得る。対照的に、高い化学選択性、位置選択性および立体選択性の可能性を与える穏やかな条件下（中性ｐＨ、３０℃）、酵素的ニトリル加水分解が起こる。付加的な有利点として、副産物の無機塩の形成が回避される。
【０００３】
ニトリル変換酵素の最も良く知られた産業上の利用は、ロドコッカス・ロドクラウスＪ１由来のニトリルヒドラターゼを使用するアクリルアミドの製造（Ｔ．Ｎａｇａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ．，１９９２，ｖｏｌ．１０，４０２−４０８）およびニコチンアミドの製造（Ｔ．Ｎａｇａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，ｖｏｌ  ５４，１７６６−１７６９）がある。最近のいくつかの論評（Ｌ．Ｍａｒｔｉｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，ｖｏｌ．７，１２７９−１２９５  およびＤ．Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，１９９８，ｖｏｌ．２，２０７−２１６）は、ニトリル変換酵素の生化学および産業上の利用可能性を記載する。
【０００４】
酵素的ニトリル加水分解は、ニトリルを対応するカルボン酸に変換するニトリラーゼおよびニトリルを対応するアミドに変換するニトリルヒドラターゼによって触媒される。アミドを対応するカルボン酸に加水分解するアミダーゼは、ニトリルをカルボン酸に変換するためにニトリルヒドラターゼと組合せて使用され得る。
【０００５】
対応するニトリルからカルボン酸を製造するためのニトリラーゼ酵素の使用は、ＷＯ  ０２／０７２８５６に開示されている。架橋によるポリマーマトリクスへの酵素の取り込みは、改良された物理的完全性（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および生化学的完全性（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を有する触媒を提供した。
【０００６】
生体触媒を用いる脂肪族α，ω−ジニトリルからのω−ニトリルカルボン酸の位置選択性製造は、米国特許番号第５,８１４,５０８号に開示されている。例えば、ニトリラーゼ活性を有する触媒を使用して、２−メチルグルタロニトリルを４−シアノペンタン酸に変換した。
【０００７】
Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．７３，１２５−１２９は、トランス１，４−ジシアノシクロヘキサンをトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸に変換するためのニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性の両方を有する微生物細胞の使用を記載する。
【０００８】
シアノ置換カルボン酸へのジニトリルの位置選択性生体触媒変換は、脂肪族ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性とアミダーゼ活性との組合せを有する微生物細胞を使用する、一連の脂肪族α，ω−ジニトリル化合物について報告されている（Ｊ．Ｅ．Ｇａｖａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，ｖｏｌ．６３，４７９２−４８０１）。
【０００９】
ニトリルの立体選択性酵素変換は、一方のエナンチオマーで富化されたキラルカルボン酸およびアミドの製造について記載されている（Ｍ  Ｗｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００，４６１−４８６）。アルカリゲネス・ フェカーリスＡＴＣＣ  ８７５０由来の立体選択性ニトリラーゼ酵素を使用して、ラセミ化合物のマンデロニトリルから（Ｒ）−マンデル酸を製造する（Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９１，ｖｏｌ．５７，３０２８−３０３２）。ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  １１２１６由来のニトリラーゼは、２−メチルヘキサニトリルのラセミ混合物中で、（−）−２−メチルヘキサニトリルを未反応のまま残し、（＋）−２−メチルヘキサニトリルを優先的に加水分解する（Ｍ．Ｇｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．，１９９４，ｖｏｌ．１６，４１−４６）。米国特許番号第５，５９３，８７１号は、立体選択性ニトリルヒドラターゼを含む微生物を使用するニトリルから一方のエナンチオマーで富化された２−アルカン酸アミドの製造方法を開示した。立体選択性ニトリルヒドラターゼおよび立体選択性アミダーゼを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属ＡＪ２７０を使用して、ラセミ化合物のα−アリールおよびα−アルキル−置換グリシンニトリルから、鏡像的に純粋なα−アミノ酸およびアミドを製造した（Ｍ．−Ｃ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２，ｖｏｌ．６７，６５４２）。前述の参考文献は、その全体が本明細書中に加入される。
【００１０】
ラセミ化合物のプレガバリンの治療価値、特に抗痙攣薬としてのその効果は、（Ｓ）−エナンチオマーに主に原因があることが見出されている。費用効果的なプレガバリン薬物療法を提供する目的のために、（Ｓ）−エナンチマー富化化合物への多数の合成経路が研究されている。例えば、適切なシアノ置換オレフィンの不斉水素化、続くシアノ基の対応するアミンへの還元により、（Ｓ）−エナンチオマーで実質的に富化されたプレガバリンを提供する（米国特許出願公開番号２００３／０２１２２９０号）。
【００１１】
純粋な化学方法によるプレガバリン、その誘導体およびアナログの合成は、米国特許番号第６,６４２,３９８号；同第６,６３５,６７３号；および同第６,０４６,３５３号に開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の方法において、脂肪族ジニトリルのシアノカルボン酸への位置選択性および立体選択性生体触媒変換は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して達成される。
【００１３】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
2007532125.tif 000002
の化合物の（Ｓ）−エナンチオマーの新規な製造方法に関し、
ここでＣ３は（Ｓ）立体配置を有し；
Ｒ1が、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり；そして
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、−Ｏ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル−ＯＨ、−フェニル−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル−ＯＨ、−フェニル−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、フェニルまたは置換フェニルであり（但し、Ｒ2がメチルである場合、Ｒ1は水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたはフェニルである）；
以下の工程：
（１ａ）式ＩＩ：
【化２】
2007532125.tif 000003
の化合物を反応媒体中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；そして
（１ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物の（Ｓ）−異性体を回収し；そして場合によって、化合物ＩＩの非荷電性（Ｒ）−異性体を回収する工程
を包含する。
【００１４】
式Ｉの化合物は、プレガバリンのような薬学的活性を有する化合物を合成するのに有用である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ1およびＲ2が独立して水素またはＣ1〜Ｃ3アルキルである。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、式ＩＩの化合物は、３Ｒ異性体および３Ｓ異性体を含むラセミ混合物である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態は、ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリル（Ｒ1がＨであり、かつＲ2がメチルである、式ＩＩの化合物）を（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸（Ｒ1がＨであり、かつＲ2がメチルである、式Ｉの化合物）に変換する方法であり、
以下の工程：
（２ａ）ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルを反応媒体中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；そして
（２ｂ）水性混合物から（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸を回収し；そして場合によって、非荷電性（Ｒ）−２−イソブチルサクシノニトリルを回収する工程
を包含する。
【００１８】
反応媒体が水媒体であることが好ましい。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、回収した化合物ＩＩの非荷電性（Ｒ）−異性体は、有機溶媒の存在下、弱塩基と共に加熱することによって実質的にラセミ化される。好ましい塩基は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンであり、そして好ましい溶媒はトルエンである。場合によって、得られたＩＩのラセミ化合物は、工程（１ａ）または（２ａ）にて上で規定された方法のいずれかにおいて再利用され得る。
【００２０】
本発明の１つの実施形態において、酵素触媒は、全微生物細胞、微生物細胞の抽出物、部分的精製酵素、精製酵素または支持体上に固定化された酵素触媒の形態である。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、酵素触媒は部分的精製酵素である。部分的精製酵素の例としては、ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）およびアラビドプシス・サリアナ由来のニトリラーゼ（Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊｕｅｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、ニトリラーゼ酵素触媒は、支持体上に固定化される。固定化されたニトリラーゼ酵素触媒の例としては、ＮＩＴ−１０２  Ｃ２（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ上に固定化されたＮＩＴ−１０２（Ｒｏｈｍ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＥｕｐｅｒｇｉｔ上に固定化されたアラビドプシス・サリアナ由来のニトリラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、固定化されたニトリラーゼ酵素触媒は、ＮＩＴ−１０２  Ｃ２である。
【００２３】
別の実施形態において、反応媒体は、蒸留水または緩衝用水からなる。緩衝用水は、約５.０〜約１０.０の範囲のｐＨに緩衝化されることが好ましく、約６.０〜約８.０の範囲のｐＨに緩衝化されることが最も好ましい。
【００２４】
本発明はまた、（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）の製造方法に関し、
以下の工程：
（ａ）ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルを反応媒体中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；
（ｂ）反応媒体から（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸を回収し；
（ｃ）（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸を酸性塩に変換し；そして
（ｄ）酸性塩を水素化し、（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）を形成させる工程
を包含する。
【００２５】
好ましくは、酸性塩は、式：
【化３】
2007532125.tif 000004
を有し、
ここでＭはＮａ、Ｋ、Ｌｉ、ＮＨ4、ＮＨ2Ｒ6Ｒ7、ＮＨ3Ｒ1またはＮＨ（Ｒ6）2Ｒ7であり、ここでＲ6およびＲ7は互いに独立して（Ｃ1−Ｃ6）アルキルである。
【００２６】
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において利用される特定の用語は、ここに集められる。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２７】
用語「アルキル」は、１〜８個の炭素原子の直鎖基または分枝鎖基であり、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルキル」とは、３〜７個の環炭素原子を含む環状炭化水素から誘導される部分を包含し、直鎖または分枝鎖のアルキル部分で置換された環状炭化水素部分が挙げられる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「アルコキシ」とは、「アルキル−Ｏ−」を意味し、「アルキル」は上で定義される。
【００３０】
用語「アルケニル」とは、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合（これは、鎖に沿って任意の安定な点に生じ得る）を含む、直鎖または分枝鎖のいずれかの立体配置の炭化水素鎖（例えば、エテニルおよびプロペニル）を包含することが意図される。アルケニル基は、典型的に２〜約１２個の炭素原子、より典型的に２〜約８個の炭素原子を有する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ラセミ化合物」とは、一対のエナンチオマーの等モル混合物を意味する。合成が立体中心の発生をもたらす場合、通常、ラセミ化合物が形成される。本明細書中で使用される場合、用語「ラセミ混合物」とは、ラセミ化合物を意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「エナンチオマー」とは、互いの鏡像と分子レベルで重ね合わせることができる化合物をいう。エナンチオマーは、（Ｒ）立体配置または（Ｓ）立体配置のいずれかで存在し得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「立体選択的合成」とは、単一の立体異性体または２つまたはそれ以上の可能な立体異性体の中からの異性体のエナンチオマー富化混合物の形成をもたらす化学反応をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「位置選択的」とは、２つまたはそれ以上の可能な原子または原子グループの中からの単一の原子または原子グループで起こる反応をいう。ジニトリルの位置選択的加水分解は、単一のニトリル基のカルボキシル基への変換をもたらす。
【００３５】
「℃」とは、摂氏温度を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「酵素触媒」とは、ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性とアミダーゼ活性との組合せのいずれかによって特徴付けられる触媒を意味する。触媒は、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞の抽出物の１つまたはそれ以上の細胞成分、部分的精製酵素または精製酵素の形態であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「エナンチオマー過剰率」とは、割合として表されるエナンチオマー混合物中の優性なエナンチオマーのモル比率をいう。
【００３８】
用語「水性反応混合物」とは、主として水媒体中の基質と酵素触媒との混合物を意味する。
【００３９】
用語「ニトリラーゼ活性」とは、ニトリル基をカルボン酸基に変換する酵素活性を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル基をアミド基に変換する酵素活性を意味する。
【００４１】
用語「アミダーゼ活性」とは、アミド基をカルボン酸基に変換する酵素活性を意味する。
【００４２】
ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎである。ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．は、１２９  Ｎ．Ｈｉｌｌ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｓｕｉｔｅ  １０３，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ，９１１０６，Ｕ．Ｓ．Ａに位置する。Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨは、Ｒｕｄｏｌｆ−Ｓｃｈｕｌｔｅｎ−Ｓｔｒａｓｓｅ  ５，Ｄ−５２４２８  Ｊｕｅｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙに位置する。
【００４３】
本発明は、式ＩＩのジニトリルから式Ｉの脂肪族シアノカルボン酸を製造するための酵素方法を提供する。当該分野で一般的に使用される任意の適切な方法を使用して、ジニトリル（ＩＩ）出発物質を製造し得る。
【００４４】
スキーム１は、化学酵素方法が２−イソブチル−サクシノニトリル（Ｖ）の（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸（ＶＩ）への変換に使用される本発明の特定の実施形態を言及する。化合物ＶＩは、スキーム２に説明されるようなプレガバリン（ＶＩＩ）の合成における中間体として使用され得る。スキーム１の工程３は、副産物の（Ｒ）−異性体（Ｖａ）のラセミ化および続く工程２での再利用を描く。
【００４５】
スキーム１の工程１において、ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリル（Ｖ）は、イソバレルアルデヒド（ＩＩＩ）をエチルシアノアセテート（ＩＶ）と共に凝縮し、次いでＫＣＮを添加することによって形成される。ラセミ化合物は、ＶのＣ３炭素原子で作り出される立体中心から生じる。
【００４６】
スキーム１の工程２は、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸（ＶＩ）およびＶの非荷電性（Ｒ）−異性体を生産するジニトリルＶのラセミ化合物の位置選択的加水分解および立体選択的加水分解を描く。
【００４７】
２−イソブチル−サクシノニトリル（Ｖ）の（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸ＶＩへの加水分解を触媒するニトリラーゼは、位置選択性および立体選択性の両方である。位置選択性は、Ｃ１炭素原子のみでシアノ基のカルボキシル基への変換に基づく。Ｖの（Ｓ）−エナンチオマーは優先的に変換に関与し、（Ｒ）−エナンチオマーは基本的に未変化のままであるという点で、反応は立体選択的である。
【００４８】
スキーム２に説明されるように、Ｓ−シアノ酸ＶＩの酸性塩ＶＩａは、続く工程において水素化され、（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）を得る。水素化触媒（好ましくは、ラネーニッケル）の存在下、反応を行う。受容可能な酸性塩は式ＶＩａの化合物を含み、ここでＭはＮａ、Ｋ、Ｌｉ、ＮＨ4、ＮＨ2Ｒ6Ｒ7、ＮＨ3Ｒ6またはＮＨ（Ｒ6）2Ｒ7であり、ここでＲ6およびＲ7は互いに独立して（Ｃ1−Ｃ6）アルキルである。
【００４９】
【化４】
2007532125.tif 000005
【００５０】
ラセミ化合物Ｖの（Ｓ）−シアノ酸ＶＩへの位置選択的および立体選択的変換において、スキーム１に描かれるように、ニトリラーゼ酵素は、（Ｓ）−エナンチオマーと主に反応する。従って、反応混合物は、変換の進行に伴ない（Ｒ）−エナンチオマーＶａに次第に富化される。
【００５１】
本発明の別の目的は、非荷電性（Ｒ）−ジニトリルＶａを再利用するか、または再使用することによって経済的浪費を回避することである。従って、本発明は、（Ｒ）−ジニトリルをラセミ化し（工程３、スキーム１）、次いでスキーム１の工程２によって再利用する方法を提供する。
【００５２】
ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性とアミダーゼ活性との組合せを有する本発明の種々の酵素は、富化単離技術（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（この方法は、富化ニトリルを含む媒体中で成長する微生物の能力に基づいて、微生物を最初に選択する）のようなスクリーニングプロトコルによって見出され得る。富化分離方法は、典型的に、富化ニトリルで補われた炭素制限媒体または窒素制限媒体の使用を包含し、この媒体は所望の生物変換のためのニトリル基質または構造的に類似するニトリル化合物であり得る。ニトリラーゼ活性を有する微生物は、富化ニトリルを含む媒体中で成長するそれらの能力に基づいて最初に選択され得る。Ｇａｖａｇａｎら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）ｖｏｌ．５２，６５４−６５９）は、土壌からグラム陰性細菌Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）を単離するために、唯一の窒素源として２−エチルサクシノニトリルを使用する富化技術を使用した。アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）は、２−メチルグルタロニトリルの４−シアノペンタン酸への選択性変換に有用であることが示された。富化技術をまた使用して、３−シアノピリジンのニコチン酸への変換を触媒する好熱性細菌バチルス・パリダスＤａｃ５２１を単離した（Ａｌｍａｔａｗａｈ  ａｎｄ  Ｃｏｗａｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）ｖｏｌ．２５；７１８−７２４）。微生物細胞の懸濁物をニトリル化合物と接触させ、そして高速液体クロマトグラフィー、ガス液体クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）のような分析手法を用いて対応するカルボン酸の存在について試験することによって、富化技術によって単離された微生物をニトリル加水分解活性について試験し得る。アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）のニトリル加水分解活性を試験するための技術は、米国特許番号第５,８１４,５０８号に報告される。
【００５３】
ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性とアミダーゼ活性を有する微生物が単離されると、酵素工学を利用して、酵素の種々の態様を改良し得る。これらの改良は本発明に有用であり得、そして改良とは、向上した選択性、酵素の触媒効果、高温および広範なｐＨに対する安定性ならびに酵素が水性緩衝液と有機溶媒との混合物を含む反応媒体中で作用できるようにすることを包含する。
【００５４】
向上した収率、スループットおよび特定の生物変換方法に適している製品品質を有することに加えて、ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性とアミダーゼ活性を有する酵素触媒を製造するために本発明において使用され得る種々の技術としては、部位特異的突然変異誘発法を含む合理的設計法およびランダム変異導入法またはＤＮＡシャッフリング技術を利用する指向進化技術のような酵素工学技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
式ＩＩの化合物の式Ｉの化合物への変換のための適切な酵素触媒は、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞の抽出物、部分的精製酵素または精製酵素の形態であり、そしてこのような触媒は支持体上に固定化され得る。
【００５６】
この方法は、蒸留水または反応の開始ｐＨを５.０〜１０.０との間、好ましくは６.０〜８.０との間に維持する緩衝化水溶液中で２−イソブチル−サクシノニトリルを酵素触媒と接触させることによって単相中で行われ得る。適切な緩衝化剤としては、リン酸カリウムおよび酢酸カルシウムが挙げられる。反応が進むにつれて、ジニトリルの対応するニトリル官能基からのカルボン酸のアンモニウム塩の形成に起因して、反応混合物のｐＨは変わり得る。反応は、ｐＨコントロールを含まずに行われ得るか、または適切な酸または塩基が、所望のｐＨを維持するために反応の間に添加され得る。しかし、上で表されるように、酵素工学および指向進化のような技術を使用して広範なｐＨにわたって効果的に作用する酵素触媒を製造することが可能である。
【００５７】
この方法は、二相からなる反応混合物中で行われ得る：酵素および溶解された２−イソブチル−サクシノニトリルを最初に含む水相および主にラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルからなる有機相。二相反応混合物は、２−イソブチル−サクシノニトリルを酵素および緩衝剤の水溶液に添加することによって製造され、添加される２−イソブチル−サクシノニトリルの量は水溶解限度を超える。５０ｍＭのリン酸カリウム（３０℃、ｐＨ７.５）中の２−イソブチル−サクシノニトリルの水溶解限度は、約０.０６Ｍである。反応の間、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルへキサン酸アンモニウム塩が形成され、そして水相の濃度が増大するが、有機相は容量が減り、そして（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルで富化されるようになる。あるいは、この方法はまた、三相からなる反応混合物中で行われ得る：溶解された２−イソブチル−サクシノニトリルを最初に含む水相、主にラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルからなる有機相および不溶性支持体上に固定化された酵素からなる固体相。三相反応混合物は、固定化されていない酵素に代わって不溶性支持体上に固定化された酵素が使用されることを除いて、二相反応混合物に記載される手順によって製造される。
【００５８】
場合によって、酵素は、ポリマーマトリクスまたは不溶性支持体に固定化され得る。固定化酵素触媒は繰り返し、連続的な方法に使用され得、そして固定化されていない酵素触媒よりも酵素的プロセスの生成物から容易に分離され得る。アルギン酸カルシウムもしくはポリアクリルアミドのようなポリマーマトリクスまたはセライトのような不溶性支持体に酵素を固定化する方法は、当業者に周知である。バッチ処理または連続的方法に繰り返し使用され得るので、不溶性支持体上に固定化されたニトリラーゼ酵素であるＮＩＴ−１０２  Ｃ２（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）は、ＩＩのＩＩＩへの変換に特に有用である。反応に使用されるＮＩＴ−１０２  Ｃ２の濃度は、所望の反応速度を得るために選択され、そして触媒の比活性および基質濃度に依存する。典型的に、ＮＩＴ−１０２  Ｃ２は、反応体積１ｍＬあたり約０.００１ｇ〜０.３ｇ（湿重量）の範囲で使用され、反応体積１ｍＬあたり０.０１ｇ〜０.１５ｇ（湿重量）の範囲であることが好ましい。
【００５９】
さらに、微生物細胞から製造され、そしてＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）およびアラビドプシス・サリアナ由来のニトリラーゼ（Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊｕｅｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のように表されたいくつかの凍結乾燥溶解物はまた、ＩＩのＩＩＩへの変換に有用である。水性反応混合物中でＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびＡ．サリアナニトリラーゼをＩと接触させることにより、ＩＩの形成をもたらす。ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびアラビドプシス・サリアナ由来のニトリラーゼを使用する反応は、反応体積１ｍＬあたり０.００１〜０.０４ｇ（乾燥量）の範囲の触媒濃度を使用する二相反応混合物中で行われ得、反応体積１ｍＬあたり０.００２〜０.０２ｇ（乾燥量）の範囲であることが好ましい。
【００６０】
加水分解反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を最適化するように選択される。反応温度は、懸濁物の凝固点のすぐ上（約０℃）〜６０℃の範囲であり得、５℃〜３５℃の反応温度であることが好ましい。
【００６１】
式Ｉの化合物の（３Ｓ）異性体の回収および式ＩＩの化合物の非荷電性（３Ｒ）異性体の回収は、当業者に周知の適切な分離、単離および精製技術を使用して行われ得る。
【００６２】
好ましい回収方法において、式ＩＩの化合物の非荷電性（３Ｒ）異性体は、酢酸エチルのような有機溶媒を用いる抽出によって塩基性水性反応混合物から分離される。式Ｉの化合物の（３Ｓ）異性体の酸性塩は、水層に選択的に溶解され、そして次いで酸性化および酢酸エチルのような有機溶媒での抽出によって単離される。
【００６３】
式Ｉの化合物を使用して、てんかん、けいれん、不安、疼痛および神経変性障害（アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病を含む）のような障害の治療に有用なプレガバリンのような化合物を合成し得る。
【００６４】
式Ｉの特定の化合物の例としては、以下の化合物が挙げられる：
（Ｓ）−３−シアノ−５−メチル−オクタン酸；
（Ｓ）−３−シアノ−５−メチル−ヘプタン酸；
（Ｓ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸；
（Ｓ）−３−シアノ−５−メチル−ノナン酸；
（Ｓ）−３−シアノ−５−エトキシ−ヘキサン酸；
（Ｓ）−３−シアノ−５−シクロヘキシル−ヘキサン酸；および
（Ｓ）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−ヘキサン酸。
【実施例】
【００６５】
実施例１
２−イソブチル−サクシノニトリルの製造
シアノ酢酸エチル（７３３ｇ、６.４８ｍｏｌ）、イソバレルアルデヒド（６１３.９ｇ、７.１３ｍｏｌ）、ピペリジン（５.５ｇ、０.０６５ｍｏｌ）およびヘキサン（０.５Ｌ）の混合物を、連続的に脱水しながら環流状態下に置いた。水がそれ以上回収されなくなったら、混合物を冷却し、そして真空で蒸留し、溶媒を除去した。イソプロパノール（１Ｌ）を残りの油状物に添加し、次いでシアン化カリウム（４２２ｇ、６.４８ｍｏｌ）の水溶液（２Ｌ）を添加した。シアン化カリウム溶液の添加の間、反応混合物を３５℃以下に維持し、次いで４時間約３５℃にしておいた。９５℃の温度に達するまで反応混合物を大気圧下蒸留し、次いでこの温度にて５時間還流させた。反応混合物を冷却し、水（０.５Ｌ）で希釈し、そしてメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（１Ｌ）で抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を水（０.５Ｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空で濃縮し、油状物として２−イソブチル−サクシノニトリル（８７３.４ｇ）を得た。２−イソブチル−サクシノニトリルの精製サンプルを減圧蒸留（０.２７５ｍｍＨｇにて９０℃）によって得ることができる。
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δ０.９３−０.９９（ｍ，６Ｈ），１.４３−１.５０（ｍ，１Ｈ），１.７１−１.７８（ｍ，１Ｈ），１.８１−１.９１（ｍ，１Ｈ），２.６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６.５Ｈｚ），２.９０−２.９７（ｍ，１Ｈ）。
【００６６】
実施例２
ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびアラビドプシス・サリアナニトリラーゼを用いる２−イソブチル−サクシノニトリルからの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸の製造
３つの８ｍＬのねじ口ガラス製バイアルを、２−イソブチル−サクシノニトリル（２０ｍｇ）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（１ｍＬ）（ｐＨ７.５、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））およびＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２もしくはＮＩＴ−１０３（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ.，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）から選択されたニトリラーゼ酵素（１０ｍｇ）の各々で満たした。１つの８ｍＬのねじ口ガラス製バイアルを、２−イソブチル−サクシノニトリル（２０ｍｇ）および１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および２ｍＭＤＴＴ（Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊｕｅｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.８）中のアラビドプシス・サリアナニトリラーゼの溶液（１ｍＬ）で満たした。４つの反応混合物を電磁撹拌バーで１５時間３０℃にて撹拌し、次いで酢酸エチル（２×６ｍＬ）で個々に抽出した。酢酸エチル抽出物を取り出した後、水性部分を４ＮＨＣｌ（０.１５ｍＬ）で処理し、そして酢酸エチル（３×６ｍＬ）で抽出した。酸性化した水性部分の酢酸エチル抽出物を真空で濃縮し、ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびＡ．サリアナニトリラーゼで行った反応について、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＣＭＨＡ）をそれぞれ、７.８ｍｇ（３４.２％収率）、８.８ｍｇ（３８.６％収率）、８.１ｍｇ（３５.５％収率）および４.０ｍｇ（１７.５％収率）で得た。各反応系からの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸のサンプルを過剰な（トリメチルシリル）ジアゾメタンで処理し、それらのメチルエステル誘導体を得、そしてＣｈｉｒａｌｄｅｘTMＧ−ＴＡカラム（３０Ｍ×０.２５ｍｍＩＤ、１２５ミクロンのフィルム厚）のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析し、エナンチオマー純度を測定した。ＮＩＴ−１０１、ＮＩＴ−１０２、ＮＩＴ−１０３およびＡ．サリアナニトリラーゼの反応生成物のエナンチオマー純度は、それぞれ９６.３％、９１.１％、９５.５％および９８.５％のｅ.ｅ．であった（ｅ.ｅ．とは「エナンチオマー過剰率」を意味する）。
【００６７】
実施例３
ＮＩＴ−１０２を用いる２−イソブチル−サクシノニトリルからの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸の製造
３０℃に維持した１２５ｍＬのジャケット付き反応容器を、２−イソブチル−サクシノニトリル（３.３３ｇ）、ＮＩＴ−１０２（０.５ｇ）および５ｍＭＤＴＴおよび１ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）（反応緩衝液）（１２２ｍＬ）で満たした。１２.５時間撹拌した後、生成混合物を酢酸エチル（４×５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を取り出し、そして水性部分を４ＭＨＣｌでｐＨ２.５に調整し、そして酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。酸性化した水性部分の酢酸エチル抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、そして真空で濃縮し、（Ｓ）−ＣＭＨＡ（１.５６ｇ、４１.１％）を得た。反応生成物のサンプルを、（トリメチルシリル）ジアゾメタンで処理し、そして実施例２に記載されるようにＧＣによって分析し、９８.５％ｅ.ｅ．のエナンチオマー純度を示した。
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δ０.９３−０.９７（ｍ，６Ｈ），１.３０−１.３７（ｍ，１Ｈ），１.６１−１.６８（ｍ，１Ｈ），１.８２−１.８９（ｍ，１Ｈ），２.５７−２.６３（ｍ，１Ｈ），２.７２−２.７８（ｍ，１Ｈ），２.９８−３.０６（ｍ，１Ｈ）。
【００６８】
実施例４
ＮＩＴ−１０２  Ｃ２を用いる２−イソブチル−サクシノニトリルからのカリウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートの製造
３０℃に維持した２つの１２５ｍＬのジャケット付き反応容器を、各々２−イソブチル−サクシノニトリル（６.８１ｇ）、ＮＩＴ−１０２  Ｃ２（１.０７ｇ）および反応緩衝液（１１８.２ｍＬ）で満たした。２４時間撹拌した後、生成混合物をデカントし、反応容器中に酵素触媒を残した。反応緩衝液（２０ｍＬ）を各反応容器に添加し、約２分間撹拌し、次いでデカントし、そして生成混合物に添加した。２−イソブチル−サクシノニトリル（６.８１ｇ）および反応緩衝液（１１８.２ｍＬ）を各反応容器に添加し、そして反応混合物を２４時間撹拌することによって、反応を繰り返した。各容器中の４つの反応（全部で８バッチの反応系）が完了した後、生成混合物を合わせ、そしてＭＴＢＥ（３×５００ｍＬ）で抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を取り出し、そして水性部分をリン酸でｐＨ２.１に調整し、そしてＭＴＢＥ（２×５００ｍＬ）で抽出した。酸性化した水性部分のＭＴＢＥ抽出物を真空で濃縮し、油状物を残し、これを水（１００ｍＬ）およびＫＯＨ（８.５ｇ）で処理した。得られた溶液を真空で濃縮し、カリウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエート（２４.２ｇ、３１.３％）を得た。メチル（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートをカリウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートから製造し、そしてキラルＧＣによって分析し、９９.１％ｅ.ｅ．のエナンチオマー純度を示した。
1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ０.７５−０.７８（ｍ，６Ｈ），１.１８−１.２５（ｍ，１Ｈ），１.４３−１.５０（ｍ，１Ｈ），１.５３−１.６８（ｍ，１Ｈ），２.２８−２.３８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６.５Ｈｚ），２.８６−２.９３（ｍ，１Ｈ）。
【００６９】
実施例５
窒素雰囲気下でのＮＩＴ−１０２  Ｃ２を用いる２−イソブチル−サクシノニトリルからの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸の製造
３０℃に維持した１２５ｍＬのジャケット付き反応容器を、２−イソブチル−サクシノニトリル（６.５３ｇ）、ＮＩＴ−１０２  Ｃ２（２.６１ｇ）および反応緩衝液（１２０ｇ）で満たし、そして窒素でパージした。得られた混合物を２４時間撹拌し、次いで２５０ｍＬのガラス製ボトルにデカントし、反応容器中に触媒を残した。使用した触媒を含む反応容器を２−イソブチル−サクシノニトリル（６.５３ｇ）および反応緩衝液（１２０ｇ）で再び満たし、窒素でパージし、そして反応混合物を２４時間撹拌することによって反応を繰り返した。反応サンプル（０.１ｍＬ）を水：メタノール：トリフルオロ酢酸（６０：４０：０.０９、ｖ／ｖ／ｖ）（０.４ｍＬ）と混合し、そして３０℃に維持したＳｙｍｍｅｔｒｙTMＣ８カラム（１５０×３.９ｍｍ）のＨＰＬＣによって分析した。カラムを水：メタノール：トリフルオロ酢酸（６０：４０：０.０９、ｖ／ｖ／ｖ）で溶出し、そして検出を屈折率検出器を用いて行った。
【００７０】
全体で５０バッチ反応系を、触媒を再利用して行った。連続した２バッチ反応系からの生成混合物を合わせ、そして酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。次いで、水性部分を４ＭＨＣｌでｐＨ２に調節し、そして酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。酸性化した水性部分の酢酸エチル抽出物を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空で濃縮し、（Ｓ）−ＣＭＨＡを得た。全体で１６０.８ｇ（４３.２％収率）の（Ｓ）−ＣＭＨＡを５０バッチ反応系から得た。反応系１、２６および５０の初速度は、それぞれ１４.８、１７.４および１５.１ｍＭの（Ｓ）−ＣＭＨＡ／ｈであった。バッチ反応系３９〜５０から単離した（Ｓ）−ＣＭＨＡのメチルエステル誘導体のキラルＧＣ分析は、平均９９.０％ｅ.ｅ．のエナンチオマー純度を示した。
【００７１】
実施例６
周囲大気下でのＮＩＴ−１０２  Ｃ２を用いる２−イソブチル−サクシノニトリルからの（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸の製造
反応系を窒素雰囲気下に代わって周囲大気下で行ったことを除いて、ＮＩＴ−１０２  Ｃ２を使用する２−イソブチル−サクシノニトリルの（Ｓ）−ＣＭＨＡへの変換についての一連のバッチ反応系を、実施例５に記載されるように行った。反応サンプルを実施例５に記載されるようにＨＰＬＣによって分析した。
触媒を再利用して周囲大気下、全体で５０バッチ反応系を行った。４時間で得られる反応サンプルから決定される反応初速度は、それぞれ反応系１、２６および５０について１４.２、１３.２および９.３ｍＭの（Ｓ）−ＣＭＨＡ／ｈであった。
【００７２】
実施例７
ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートの製造
２−イソブチル−サクシノニトリルの（Ｓ）−ＣＭＨＡへの変換からの生成混合物（実施例６、反応系３７〜４４）を合わせ、そして酢酸エチル（２×２５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空で濃縮し、油状物（３２.５ｇ、６２.２％収率）を得、これは主に（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルであった。水性部分を４ＭＨＣｌでｐＨ２に調節し、そして酢酸エチル（２×２５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を４７０ｍＬの体積まで濃縮し、次いでｔｅｒｔ−ブチルアミン（１５.９ｍＬ、１５１.５ｍｍｏｌ）を滴下する間撹拌した。形成された白色結晶塩を濾過によって回収し、そして一晩空気乾燥させ、ｔ−ブチルアンモニウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエート（３０.０ｇ）を得た。メチル（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートをｔ−ブチルアンモニウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートから製造し、そしてキラルＧＣによって分析すると、９９.５％ｅ.ｅ．のエナンチオマー純度を示した。
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δ０.９０−０.９４（ｍ，６Ｈ），１.２６−１.３２（ｍ，１０Ｈ），１.５４−１.６１（ｍ，１Ｈ），１.７８−１.８８（ｍ，１Ｈ），２.３０−２.３５（ｍ，１Ｈ），２.４３−２.５０（ｍ，１Ｈ），２.９６−３.０４（ｍ，１Ｈ）。
【００７３】
実施例８
カリウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートからの（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の製造
カリウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエート（２０ｇ、１０３.５ｍｍｏｌ）、水（５０ｍＬ）、４５％ＫＯＨ（１２ｇ）、イソプロパノール（１２ｇ）およびラネーニッケルの混合物を、５０ｐｓｉの水素下、パー振とう器中で一晩振とうさせた。混合物を濾過し、約５０℃まで加熱し、酢酸（６.５ｍＬ）で処理し、そして室温にて一晩撹拌した。次いで、混合物を４５％ＫＯＨでｐＨ７をやや上回るように調節し、そして真空で濃縮し、ほとんどのイソプロパノールを除去した。イソプロパノール（２０ｍＬ）を混合物に添加し、次いで酢酸で酸性化し、室温にて一晩撹拌し、そして濾過し、白色の結晶性固体として（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（４.３ｇ）を得た。Ｍａｒｆｅｙ試薬（Ｎα−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド）を使用して（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の誘導体を製造し、そしてアセトニトリル：１％トリエチルアミン（ｐＨ３）（３８：６２、ｖ／ｖ）で溶出するＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８カラム（２５０×４.６ｍｍ、５μ）のＨＰＬＣによって分析すると、エナンチオマー純度が１００％ｅ.ｅ．であることが決定された。
【００７４】
実施例９
ｔ−ブチルアンモニウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエートからの（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の製造
ｔ−ブチルアンモニウム（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサノエート（２６ｇ、１１３.９ｍｍｏｌ）、水（４８.８ｍＬ）、エタノール（３５.８ｍＬ）、ＫＯＨ（７.２ｇ、９１％フレーク）およびＳｐｏｎｇｅ  ＮｉｃｋｅｌTM（Ａ−７０００、１６.３ｇ（可湿）、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍｅｔａｌｓ＆Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅｖｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＴＮ）の混合物を、５０ｐｓｉの水素下、パー振とう器中で一晩振とうさせた。混合物を濾過し（セライト）、そしてケーキを水（１０ｍＬ）およびエタノール（５ｍＬ）で洗浄した。酢酸（９.４ｍＬ）を濾液に添加し、そして得られた混合物を４℃にて一晩撹拌した。生成物を濾過し、イソプロピルアルコール（１０ｍＬ）でリンスし、そして真空で乾燥させ、白色固体（１１.１ｇ、６１％）を得た。この物質の一部（１０.０ｇ）をイソプロピルアルコールと水との１：１の混合物から結晶化させ、１００％ｅ.ｅ．で（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（８.８ｇ）を得た。
【００７５】
実施例１０
ＤＢＵを使用する（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルのラセミ化
（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルのラセミ化を、ＮＩＴ−１０２Ｃ  ２を用いてラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリルの生物変換から  回収した物質で行った。（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリル（１.３  ６ｇ、１０ｍｍｏｌ、６９％ｅｅ）、トルエン（５ｍＬ）および１，８−ジア  ザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、０.０７６ｇ、５ｍ  ｍｏｌ）の混合物を２時間還流させた。水（１０ｍＬ）を反応系に添加し、そ  して得られた混合物を酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機  抽出物を連続して５％ＨＣｌ（２０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空  で濃縮し、ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリル（１.１４ｇ、８４％）を得た。エナンチオマー純度をＣｈｉｒａｌｄｅｘTMＧ−ＴＡカラム（３０Ｍ×０.２５ｍｍＩＤ、１２５ミクロンフィルム厚）を使用するＧＣによって決定した。
【００７６】
実施例１１
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ(R)ＩＲＡ−４００を使用する（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリルのラセミ化
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ(R)ＩＲＡ−４００樹脂（湿重量１ｇ、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を、５％ＮａＯＨ（１０ｍＬ）と共に１０分間撹拌し、そして洗浄物が中性になるまで水で洗浄した。エタノール（２５ｍＬ）および（Ｒ）−２−イソブチル−サクシノニトリル（６９％ｅｅ）を樹脂に添加し、そして得られた混合物を２時間還流させた。反応混合物を濾過し、そして真空で濃縮した。残留物を酢酸エチル（２５ｍＬ）に取り出し、そして水（３×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空で濃縮し、ラセミ化合物の２−イソブチル−サクシノニトリル（０.８１ｇ、８１％）を得た。
【国際調査報告】
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