(57)【要約】  天然型ブラジキニンＢ１受容体についてのヌル表現型に対して非天然型のブラジキニンＢ１受容体遺伝子を組み込んだ、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物を作製する。本発明の例示部分は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体遺伝子をコードする導入遺伝子を含むターゲティング構築物が、天然マウスブラジキニンＢ１プロモーターの下流に挿入され、作動可能に連結されているトランスジェニックマウスを開示した。このターゲティング構築物はまた、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシン耐性遺伝子も含む。生じるトランスジェニック動物は、ブラジキニンＢ１受容体に関して「ヒト化」されており、天然の機能性Ｂ１受容体活性についてのヌルバックグラウンド上に有効に存在する。これらの動物は、ｌｏｘＰが導入されたマーカー遺伝子が存在しないトランスジェニック子孫を生産するためにＣｒｅ欠失（ｄｅｌｅｔｅｒ）系統と交配し得る。ここに記載のトランスジェニック動物は、・・・するモデルを提供する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物（例えばラット又はマウス）Ｂ１ブラジキニン受容体に比べて、ヒトＢ１ブラジキニン受容体に選択的である化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。
2007508814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトブラジキニンＢ１受容体タンパク質又はこの機能的等価物をコードする導入遺伝子の少なくとも１コピーを含むゲノムを有し、及びトランスジェニック動物がヒト化Ｂ１ブラジキニン受容体結合プロフィールを示すように、天然型ブラジキニンＢ１受容体に関してヌル表現型を示す、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
ヒトブラジキニンＢ１受容体タンパク質又はこの部分をコードする前記導入遺伝子が、天然型ブラジキニンＢ１をコードする遺伝子を直接置換する、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
ヒトブラジキニンＢ１受容体タンパク質又はこの部分をコードする前記導入遺伝子が、天然型ブラジキニンＢ１をコードする遺伝子を直接置換し、及び前記ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子が天然ブラジキニンＢ１受容体タンパク質に作動可能に融合している、請求項３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
少なくとも、ヒトブラジキニンＢ１受容体タンパク質又はこの機能的等価物をコードするヌクレオチド配列及びｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）マーカー遺伝子を含む遺伝子ターゲティング構築物を含み、及びトランスジェニック動物がヒト化Ｂ１ブラジキニン受容体結合プロフィールを示すように、天然型ブラジキニンＢ１受容体に関してヌル表現型を示す、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記遺伝子ターゲティング構築物を、天然型ブラジキニンＢ１をコードする遺伝子を直接置換するようにトランスジェニック動物のゲノムに挿入した、請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項９に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記ｌｏｘＰが導入された遺伝子が除去された、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記ｌｏｘＰが導入された遺伝子が除去された、請求項１０に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部には、生物学的活性量の天然型Ｂ１ブラジキニン受容体の代わりに機能性非天然Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質を発現するトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物は、非天然型のＢ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組込みによって作製され、天然型受容体の発現を制御する領域に直接指向して、これを置換する。あるいは、非天然型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ランダムに又は的を定めて、ヌルＢ１ブラジキニン受容体バックグラウンドへと差し向けられる。ここで例示する「ヒト化」マウスを含むがこれに限定されない、本発明のトランスジェニック動物は、インビトロ及びインビボアッセイの両方においてヒト選択的化合物の効果を評価するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＤｒａｙとＰｅｒｋｉｎｓ（１９９３，ＴＩＮＳ  １６：９９−１０４）及びＰｒｏｕｄとＫａｐｌａｎ（１９８８，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：４９−８３）は、２つの哺乳動物ブラジキニン受容体タンパク質サブタイプ、Ｂ１及びＢ２をこれらの薬理的性質に基づいて定義している。ノナペプチドブラジキニン（ＢＫ）及びデカペプチドＬｙｓ−ＢＫ（カリジン）は、カリクレインのタンパク質分解作用によって高分子タンパク質前駆体キニノーゲンから放出される。ＢＫとカリジンはどちらもＢ２受容体を活性化する。これらのＢ２受容体アゴニストは、次に、カルボキシペプチダーゼによって分解されてＢ１受容体アゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ９ＢＫ及びｄｅｓ−Ａｒｇ１０カリジンを産生するか又はアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によって分解されて不活性ペプチドを生じる。ＢＫとカリジンは、Ｂ２ブラジキニン受容体サブタイプにおいて等能性アゴニストとして働く。これに対し、ＢＫはＢ１ブラジキニン受容体サブタイプでは完全に不活性である。
【０００３】
Ｂ２及びＢ１ブラジキニン受容体はＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリーの成員である。以下のものを含む、数多くの哺乳動物Ｂ１及びＢ２受容体遺伝子が単離され、特性決定されている：
ヒトＢ１ブラジキニン−それぞれ１９９８年１月２８日及び１９９９年１０月１２日にＭｅｎｋｅらに発行された米国特許第５，７１２，１１１号及び同第５，９６５，３６７号、並びにＭｅｎｋｅら（１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１５８３−２１５８６）；
ウサギＢ１ブラジキニン−ＭａｃＮｅｉｌら、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６４：２２３−２２８；
マウスＢ１ブラジキニン−Ｈｅｓｓら、１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：１−８；
ラットＢ２ブラジキニン−ＭｃＥａｃｈｅｒｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，７７２４−７７２８；
ヒトＢ２ブラジキニン−Ｈｅｓｓら（１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８４：２６０−２６８）；及び
ラットＢ１ブラジキニン−Ｊｏｎｅｓら、１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４（３），４２３−４３３。
【０００４】
Ｈｅｓｓら（１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：１−８）は、Ｂ１受容体アゴニストの選択性が種特異的である、すなわちマウス、ヒト及びウサギＢ１受容体を比較したとき種特異的であることを示している。
【０００５】
ＢｏｃｋとＬｏｎｇｍｏｒｅ（２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４（４）：４０１−４０７）は、Ｂ１及び／又はＢ２ブラジキニン受容体活性の公知の調節因子の最新情報を提示している。この著者らの総説に示されているように、Ｂ２受容体は正常組織で発現されるが、Ｂ１受容体は発現されないことは、学会において広く受け入れられている。炎症、疼痛、組織損傷を生じさせる生物学的過程は、Ｂ１受容体活性並びに細菌感染を速やかに誘導することができる。このような病的条件下でのＢ１受容体の見かけ上の誘導性は、抗炎症薬／鎮痛薬としてのＢ１受容体アンタゴニストの使用についての治療ウインドウを提供すると考えられ、したがって、Ｂ１受容体を魅力的な薬剤標的にしている。
【０００６】
国際公開広報第ＷＯ０３／０１６４９５号は、天然型受容体と共にヒトＢ１ブラジキニン受容体を発現するトランスジェニックラットを開示する。
【０００７】
Ｐｅｓｑｕｅｒｏら（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７（１４）：８１４０−８１４５）は、Ｂ１ブラジキニン受容体欠損マウスを開示している。著者らは、これらのＢ１受容体欠損マウスが健常であり、繁殖可能であることを示している。細菌性ＬＰＳ誘導性低血圧の鈍化、炎症組織における多核白血球の蓄積減少、並びに脊髄反射の低下などの様々な表現型が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このために、げっ歯動物（例えばラット又はマウス）Ｂ１ブラジキニン受容体と比較して、非天然型（例えばヒト）Ｂ１ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にし、したがって、例えばヒトＢ１ブラジキニン受容体に対する潜在的調節因子の特異性の薬力学的性質を評価するためのモデル系を提供する動物モデルへの需要がなおも存在する。本発明は、ヌル天然Ｂ１ブラジキニン受容体バックグラウンドでヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質を発現する様々な「ヒト化」トランスジェニックマウスモデルを開示することにより、この現在も続く需要に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び／又は体細胞に組み込まれている、非ヒト動物細胞に関する。このようなトランスジェニック非ヒト動物細胞の作製は、本発明のさらなる側面、すなわち、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック胚、初期創始動物、同腹子、「ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）」動物、並びにｌｏｘＰが導入された領域が除去されている動物（ここでは「ｌｏｘＰが除去された（ｆｌｏｘｅｄ−ｏｕｔ）」動物と称する）及びこれらのトランスジェニックマウスの続く全ての子孫及び後代を含むがこれらに限定されない、非ヒトトランスジェニック動物を可能にする。
【００１０】
このために、本発明は、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、（１）非機能性になっており、及び（２）プロモーターフラグメントに作動可能に連結された、ヒト型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び／又は非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子、ｌｏｘＰが導入された動物、ｌｏｘＰが除去された動物並びにありとあらゆる続く子孫及び後代に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物（例えばラット又はマウス）Ｂ１ブラジキニン受容体と比較して、ヒトＢ１ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、（１）非機能性になっており、及び（２）プロモーターに作動可能に連結された、ヒト型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び／又は非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子、ｌｏｘＰが導入された動物、ｌｏｘＰが除去された動物並びにありとあらゆる続く子孫及び後代に関する。特定実施態様では、非天然ヒト化形態のＢ１ブラジキニン受容体は、内在性マウスＢ１ブラジキニンプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されている。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、ここで開示するトランスジェニック動物に由来する細胞及び／又は組織、並びにこのようなトランスジェニック動物を、対象とする細胞系を生産するためのソースとして使用することによって生成される細胞系に関する。したがって、本発明の１つの実施態様は、好ましくは天然Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質についてのヌル表現型を担持し、機能性ヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、本発明のトランスジェニックマウスに由来する細胞、組織及び／又は細胞系に関する。
【００１３】
本発明は、機能性形態のヒトＢ１ブラジキニン受容体をコードする導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び／又は体細胞に安定に組み込まれており、好ましくは標的動物が最終的に天然型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質に関してヌル表現型を示し、キメラマウスの作製及びヒトＢ１ブラジキニン受容体導入遺伝子についてホモ接合の動物を生産するための続く交配を可能にする、トランスジェニックげっ歯動物、すなわちトランスジェニックマウスを例示する。しかし、本発明は、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、チンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザルなどのトランスジェニック非ヒト霊長動物、及びトランスジェニックウシなどの他の非ヒトトランスジェニック動物の作製を考慮する。トランスジェニックマウスが好ましく、ここで例示する。
【００１４】
ここで使用する、「機能性」という用語は、細胞内又はインビトロ系において存在するとき、天然又は未変化の状態又は環境にあるかのごとく正常に機能する遺伝子又はタンパク質を表わすために使用される。したがって、機能性でない（すなわち「非機能性」、「破壊された」、「変化した」等）遺伝子は、野生型、天然又は非変性タンパク質として機能しないタンパク質をコードするか、若しくは全くタンパク質をコードしない。このような非機能性遺伝子は、非機能性遺伝子を、機能性形態の遺伝子を含む標的染色体の領域に特異的に指向して、野生型又は天然遺伝子の「ノックアウト」を生じさせる、ここで述べる相同的組換え事象の産物であり得る。
【００１５】
ここで使用する、「調節因子」は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体などの哺乳動物Ｂ２又はＢ１ブラジキニン受容体の発現又は活性の変化を生じさせる、又はそれぞれの受容体とこのリガンド、又はアンタゴニスト又はアゴニストのような他のタンパク質との相互作用の変化を生じさせる化合物である。
【００１６】
本発明のトランスジェニック動物に関してここで使用するとき、本発明者らは「導入遺伝子」及び「遺伝子」に言及する。遺伝子とは、タンパク質又は構造ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び／又は導入遺伝子はまた、当技術分野において公知の遺伝子調節エレメント及び／又は構造エレメントを含み得る。ここで使用し、例示するとき、導入遺伝子は、遺伝子を含む遺伝子構築物である。導入遺伝子は、ここで例示する、プラスミドに基づく遺伝子ターゲティング構築物を通した相同的組換えのような、当技術分野で公知の方法によって動物の細胞内の１又はそれ以上の染色体に組み込まれる。ひとたび組み込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物のゲノム内の少なくとも１つの位置、好ましくは染色体に担持される。対象導入遺伝子は、マウス又は他の哺乳動物の標的ゲノム内に取り込まれ、この後、安定に組み込まれて所望機能を実施することができるようにこれらの生殖細胞及び／又は体細胞に導入される。染色体は標的動物への導入遺伝子の安定な組込みのために好ましい標的であるが、「ゲノム」という用語は、核ＤＮＡ（染色体又は染色体外ＤＮＡ）並びに細胞質内に局在するミトコンドリアＤＮＡを含む、生物のＤＮＡ相補物全体を指す。したがって、本発明のトランスジェニックマウスは、導入遺伝子（例えばヌル天然Ｂ１バックグラウンド上の機能性形態のヒトＢ１ブラジキニン遺伝子）の発現が、動物モデルをヒトＢ１受容体に対するＢ１受容体調節因子の特異性に関して試験するという所望作用を達成するように、げっ歯動物の生殖細胞又は体細胞のいずれか又は両方（好ましくは両方）に１又はそれ以上の導入遺伝子を安定に組み込んでいる。導入遺伝子を生殖細胞系に導入し、これによって子孫に情報を伝える能力を与えることが好ましい。実際に子孫が遺伝子情報の一部又は全部を有している場合、これらもまたトランスジェニック動物である。
【００１７】
ここで使用する、「動物」という用語は、トランスジェニック動物に言及するとき、この用語の使用はヒトを除外することを除いて、全ての哺乳動物を包含し得る。また、胚及び胎児段階を含む、全ての発達段階の個々の動物も包含する。「トランスジェニック動物」又はより詳細には「非ヒトトランスジェニック動物」は、微量注入、標的遺伝子送達（例えば、相同的組換え）又は組換えウイルスでの感染のような、細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作によって直接又は間接的に受け入れた遺伝情報を担持する１又はそれ以上の細胞を含む非ヒト動物である。上記のように、この導入されたＤＮＡ分子（例えば遺伝子ターゲティング構築物内に含まれる導入遺伝子）は、染色体内に組み込まれ得るか、又は染色体外複製ＤＮＡであり得る。考慮される動物は、トランスジェニック創始動物、同腹子、ｌｏｘＰが導入された動物、ｌｏｘＰが除去された動物、これらの初期動物から産生される将来の子孫及び後代、及び言うまでもなく、意図する遺伝子ターゲティング戦略の遺伝子型結果及び／又は予想表現型を有する、この後産生される系統（近交系又は非近交系）を含むが、いかなる意味においてもこれらに限定されない。
【００１８】
ここで使用する、「げっ歯動物」は、噛むための一対の上顎切歯と下顎切歯を有し、歯は絶えず成長し、切歯と粉砕用臼歯の間の間隙が明らかである、げっ歯目の成員である種に関する。トランスジェニック動物の作製のための好ましい例は、トランスジェニックマウス（例えばハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
ここで使用する、「創始動物」は、微量注入された卵又は胚盤胞から発生するトランスジェニック動物を指す。創始動物は、遺伝子産物の何らかの適切なアッセイによって機能性遺伝子の発現に関して試験される。
【００２０】
ここで使用する、「ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）」動物は、遺伝子、導入遺伝子及び／又は標的構築物を受容した動物であり、この受容した遺伝子等の領域の部分が、後の時点での側面配列の制御された除去を可能にする配列特異的部位が側面配置されている。ｌｏｘＰが導入された動物は、ここでは、トランスジェニック動物のゲノム内の側面配列の除去を生じさせるＣｒｅリコンビナーゼの生成と共に、対象とする配列（選択マーカー遺伝子など）に側面配置されているｌｏｘＰ部位の挿入を用いる、公知のＣｒｅリコンビナーゼ系の使用によって例示される。
【００２１】
ここで使用する、「ｌｏｘＰが除去された（ｆｌｏｘｅｄ−ｏｕｔ）」動物は、側面配列（ｐＧＫ−ｎｅｏカセットのＣｒｅ仲介性欠失（又は除去）を受けた例示動物など）が、上記の項で述べたように、除去された動物である。
【００２２】
ここで使用する、「系統」という用語は、ある創始動物の直接の子孫であり、これらの生殖細胞系に安定に組み込まれた少なくとも１つの導入遺伝子座を担持する動物を指す。
【００２３】
ここで使用する、「近交系」という用語は、全ての内在性遺伝子座において遺伝的に同一である動物を指す。当技術分野において使用するとき、近交系は、ある動物から別の動物への再現性、動物の間での細胞又は組織を移入する能力、及び内在性遺伝子の役割を特定するための規定された遺伝子試験を実施する能力を与えるために使用され得る。このような近交系は、微量注入のために使用されるマウスが樹立近交系株の成員である系統から開発され得る。
【００２４】
ここで使用する、「遺伝子型」という用語は、生物の遺伝子構成である。
【００２５】
ここで使用する、「表現型」という用語は、遺伝子型と環境の相互作用から生じる、細胞又は生物が有する形態的、生理的及び／又は生化学的形質の集積である。表現型のこの定義は、非天然導入遺伝子が動物に導入され、この遺伝子型プロフィールを変化させて、これにより動物内でのこの導入遺伝子の発現が１又はそれ以上の化合物に対する新しい薬理的選択性を生じさせ、このような選択性が対象導入遺伝子の機能的発現に基づく、生化学的形質を含む。このために、「表現型発現」という用語は、産物、例えばポリペプチド又はタンパク質の生産をもたらす、若しくは接合体又は生物の天然表現型の発現を変化させる、１又はそれ以上の導入遺伝子の発現に関する。
【００２６】
Ｂ１ブラジキニン「ヒト化」マウスの作製はこれまで報告されておらず、このようなトランスジェニック動物がインビボでヒトＢ１ブラジキニン受容体の化合物選択性を模倣することは明らかではなかった。本発明の最重要点は、このようなヒト化トランスジェニック動物がこのような表現型を有することを明らかにし、天然マウス形態のヌル表現型に対するこのヒト受容体の機能的発現を示して、これによりここで述べる様々なアッセイを、ヒトＢ１ブラジキニン受容体の調節因子を選択する上で有用なものにすることに関する。以下の実施例は説明として提示するものであり、様々な他の実施態様が当業者には明白であるので、以下は本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び／又は体細胞に組み込まれている、非ヒト動物細胞に関する。このようなトランスジェニック非ヒト動物細胞の作製は、本発明のさらなる側面、すなわち、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック胚、初期創始動物、同腹子、「ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）」動物、並びにｆｌｏｘｅｄ領域が除去されている動物（ここでは「ｌｏｘＰが除去された（ｆｌｏｘｅｄ−ｏｕｔ）」動物と称する）及びこれらのトランスジェニックマウスの続く全ての子孫及び後代を含むがこれらに限定されない、非ヒトトランスジェニック動物を可能にする。
【００２８】
このために、本発明は、天然型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、（１）非機能性になっており、及び（２）内在性マウスＢ１ブラジキニン受容体プロモーターフラグメントに作動可能に連結された、ヒト型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び／又は非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子、ｌｏｘＰが導入された動物、ｌｏｘＰが除去された動物並びにありとあらゆる続く子孫及び後代に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物（例えばラット又はマウス）Ｂ１ブラジキニン受容体と比較して、ヒトＢ１ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、天然マウス型Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、（１）非機能性になっており、及び（２）ヒト型Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、マウス起源の非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び／又は非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。特定実施態様では、非天然ヒト化形態のＢ１ブラジキニン受容体は、内在性マウスＢ１ブラジキニンプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されている。ここで使用するとき、「作動可能に連結された」は、互いに対する方向が変化し得る２つのエレメントの間の機能的連結を表わすために使用される。この特定の場合、プロモーターは、遺伝子構築物内でコード配列から様々な距離に置かれるが、コード配列の発現を指令するために遺伝子のコード配列に作動可能に連結され得ることは当技術分野において了解されている。「プロモーター」という用語は当技術分野において周知であり、ここで使用するとき、遺伝子の転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼの結合に関わる核酸配列又はフラグメントを表わすことが意図されている。ここで使用するプロモーターはまた、場合により、どちらの方向にも及びＲＮＡ転写を開始させる領域から上流又は下流で機能する能力を備えた、真核生物プロモーターの利用を上昇させる付加的なシス作用性核酸領域（例えばエンハンサー配列）を含み得る。
【００３０】
本発明のさらなる実施態様は、ここで開示するトランスジェニック動物に由来する細胞及び／又は組織、並びにこのようなトランスジェニック動物を、対象とする細胞系を生産するためのソースとして使用することによって生成される細胞系に関する。したがって、本発明の１つの実施態様は、好ましくは天然Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質についてヌル表現型を担持し、機能性ヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、本発明のトランスジェニックマウスに由来する細胞、組織及び／又は細胞系に関する。したがって、本発明の１つの実施態様は、天然Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質に関して非機能性であり、機能性ヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス；並びに機能性ヒトＢ１ブラジキニン受容体を発現するが、天然Ｂ１ブラジキニン受容体に関してヌル表現型を有する、初期創始動物、同腹子、ｌｏｘＰが導入された動物及び続く全ての子孫及び後代マウスを含む、後にトランスジェニックマウスを生じさせる関連トランスジェニックマウス細胞及び胚に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物（例えばラット又はマウス）Ｂ１ブラジキニン受容体と比較して、ヒトＢ１ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。本発明の１つの特定実施態様では、このような動物モデルを、胚幹細胞における相同的組換えによって天然マウスＢ１ブラジキニン受容体コード領域をヒトＢ１ブラジキニン受容体で置換することによって作製した。正しい相同的組換え事象を有する胚幹細胞を使用して、ヒトＢ１ブラジキニン受容体を発現するが、機能的量のマウスＢ１ブラジキニン受容体タンパク質を発現しないマウスを開発した。ここで、ホモ接合Ｂ１ブラジキニン受容体ヒト化マウスの薬理学的及び分子学的分析は、マウス型受容体ではなくヒト型受容体に伴う性質を示すことを明らかにする。
【００３１】
本発明の１つの特定実施態様は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列が、胚幹（ＥＳ）細胞における相同的組換えを通した指定遺伝子ターゲティングによって類似マウスＢ１ブラジキニン受容体コード領域を置換している、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び／又は非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。指向性構築物の構築、ＥＳにおける指定相同的組換え及び選択方法に関する一般原則は当技術分野において周知であり、数多くのソース、例えばいずれも参照によりここに組み込まれる、（１）Ｂｒａｄｌｅｙら、１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４；及び（２）Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２版；Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．（編集）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００において検討し得る。本発明の実施例では、２つの標的構築物を図１Ａ及び１Ｂに示すように作製し、ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列をマウスＢ１ブラジキニン受容体コード配列領域にノックインするための戦略を説明する。同じく図２では、非ｌｏｘ導入動物（ｐＧＫ−ｎｅｏカセットを含む）を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウス系統に交配することにより、陽性選択マーカーを発現するコード領域が除去された、ｌｏｘＰが除去された動物を作製できることを示す。簡単に述べると、指向性構築物は、マウスＢ１ブラジキニン受容体イントロン配列の下流にヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列及びヒト又はマウスのいずれかのＢ１ブラジキニン３’ＵＴＲ領域を含む。指向性構築物の３’ＵＴＲ領域内に、ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（例えばＧ４１８）などの陽性選択マーカーが存在する。このコード配列は、トランスジェニックマウスの生成前又は生成後の何らかの時点でこの陽性選択マーカーの除去を可能にする、２つのＬｏｘＰ部位が側面配置されている。ヒトＢ１ブラジキニンコード配列がマウスゲノム内のマウスＢ１ブラジキニンコード領域を置換する指定相同的組換え事象を促進するために、５’調節及び３’ＵＴＲ領域に相同な２つの延長領域内にこの領域全体をクローニングする。最後に、この指向性ベクターは、予測する相同的組換え事象が起こった場合に組み込まれると予想される領域の外側に存在する陰性選択マーカー（ＴＫ遺伝子など）を含み得る。本発明のこの例示部分では、２４０Ｎｅｏｒ  ＥＳクローンをさらなる分析のために単離した。２４０クローンのうちの８０個から６個の「ノックイン」クローンをさらなる分析のために特定し、２個のノックインＥＳクローンを、ヒトＢ１ブラジキニンノックイン構築物の生殖細胞系伝達を含むキメラマウスを作製するために、雌性マウスへの移植用の胎盤胞に注入するために選択した。サザンブロット分析（図３Ａ）及びＰＣＲ遺伝子型分類（図３Ｂ）、並びにＤＮＡ塩基配列分析は、ヘテロ接合交配からの対立遺伝子伝達の予想されるパターンを示す。
【００３２】
ここで開示する例示ノックインマウスは、実施例６で示すように、マウスではなくヒト型の受容体の薬理学的性質を示す。このデータは、マウスＢ１ブラジキニン機能又はこの生物学的等価形態のヒトによる置換に関してホモ接合のトランスジェニックマウスは、トランスジェニック動物が、今やヒトＢ１ブラジキニン受容体の選択的薬理特性を付与するように有効量の機能性導入遺伝子産物を発現する、定義可能な表現型を示すことを明らかにする。この表現型は、ヒトＢ１受容体の選択的アンタゴニストの作用を示す機能アッセイによって詳述する。２つの系統のヒトＢ１ブラジキニンノックインマウスは、ｄｅｓ−Ａｒｇ１０カリジン（ＤＡＫ）の存在下でＢ１受容体に拮抗する、予測された応答を示した。野生型マウスでは、実施例６に示すように、胃底のＤＡＫ応答はヒトＢ１選択的アンタゴニスト（ここでは「化合物Ｎｏ．１」と称する）に対して非感受性であるが、系統１３のホモ接合置換マウスに関する結果は、Ｂ１応答が化合物Ｎｏ．１によってブロックされ（Ｋｂ＝０．２７ｎＭ）、したがってヒト受容体の性質を有することを指示する。したがって、ここで例示するヒト化マウスを含むがこれらに限定されない、本発明のトランスジェニックマウスは、インビトロ及びインビボアッセイの両方においてヒト選択的化合物の効果を評価するために有用である。内在性アゴニストの添加又は刺激から生じる内在性アゴニストの自然放出は、ヒト受容体を活性化し得る。受容体の活性化に拮抗するヒト選択的化合物の能力は、これらの動物モデルにおける化合物の効果の測定を可能にする。このために、ここで述べるようなヒト化Ｂ１トランスジェニックモデルは、ペプチド、タンパク質又は非タンパク質様有機又は無機分子を含むが、必ずしもこれらに限定されない、受容体活性の何らかの潜在的調節因子（例えばアンタゴニスト又はアゴニスト）をスクリーニングするために有用である。本発明のトランスジェニック動物は、Ｂ１受容体の発現に関してヒト化されたげっ歯動物などの、非ヒト動物モデルにおいてヒト選択的化合物の効果を評価するための改善されたモデルを提供する。外因性アゴニストの添加又は刺激から生じる内在性アゴニストの自然放出は、ヒト受容体を活性化し得る。受容体の活性化に拮抗するヒト選択的化合物の能力は、化合物の効果の測定を可能にする。このようなトランスジェニック動物は、ヒトＢ１受容体を選択的に（又は非選択的に）調節する低分子量分子の能力を検討するために野生型試験動物を使用することに伴う歴史的な問題を克服する。このようなアッセイは、野生型Ｂ１ブラジキニン発現を上昇させる物質（細菌リポ多糖類など）による試験動物の処置を考慮させたが、Ｂ１ブラジキニン発現が上昇し、血液−脳関門の性質を変化させる範囲で、変動する結果を与えた。成功した場合でも、ヒトに選択的な化合物の性質を評価することはできなかった。この問題を回避するために、それぞれの種の薬理学的性質がヒトＢ１ブラジキニン受容体に一致する種を特定するための試みが為された。難点は、ある種が、考慮する１つの化学物質シリーズに関してはヒトと類似の性質を有し得るが、必ずしも全ての化学物質シリーズに関してではないということである。また、遺伝的にヒトに密接に関連する種（非ヒト霊長動物など）が使用できる。しかし、この選択肢には化合物を検定する処理量が低いという難点がある。
【００３３】
ヒト化Ｂ１Ｒマウスは、完全フロイントアジュバント、カラゲナン、ホルマリン、ストレプトゾトシン又はリポ多糖による処置などの、炎症性疼痛についての動物モデルにおける機械的、熱又は化学的刺激に対する疼痛応答に関して評価し得る。加えて、ナイーブヒト化Ｂ１マウスは、熱及び化学的有害刺激、例えばカプサイシンに対する応答性に関して試験し得る。最後に、神経障害性疼痛、例えば神経結紮についての動物モデルにおける機械的、熱又は化学的刺激に対する応答性を評価することができる。Ｂ１Ｒ置換マウスの表現型が野生型マウスに類似しており、Ｂ１Ｒノックアウトマウスとは異なる場合は、マウスにおいてヒトＢ１Ｒが発現され、キニン系活性化に対して応答する。ヒト化Ｂ１Ｒマウスがこれらの刺激に対して適切に応答する場合は、ヒトＢ１Ｒに選択的に作用する試験化合物の能力を試験することができる。ヒト選択的化合物はヒト化マウスにおいて活性であり、野生型マウスでは活性でない。また、ヒト化Ｂ１ＲマウスがＢ１Ｒノックアウトマウスに類似し、野生型マウスには類似しない表現型を有する場合、これは、ヒトＢ１Ｒアゴニスト、ｄｅｓ−Ａｒｇ１０カリジン及びマウスＢ１Ｒアゴニスト、ｄｅｓ−Ａｒｇ９ブラジキニンが応答を誘発する能力が測定されることを示唆する。ｄｅｓ−Ａｒｇ１０カリジンは応答を誘発するが、ｄｅｓ−Ａｒｇ９ブラジキニンは応答を誘発しない場合、マウスにおいて発現されるヒトＢ１Ｒは応答の潜在能を有するが、げっ歯動物において生成されるキニンはヒト受容体を活性化する上で無効である。他方で、ｄｅｓ−Ａｒｇ１０カリジン又はｄｅｓ−Ａｒｇ９ブラジキニンのいずれもが、マウスＢ１Ｒを誘導する物質で処置した動物において活性でない場合、ヒトＢ１Ｒの誘導は低下し得る。
【００３４】
ヒトＢ１Ｒマウスの誘導の分析は、組織から作製したＲＮＡを用いる定量的ＰＣＲによって分子レベルで検討し得る。これらのデータと野生型及びヘテロ接合マウスとの比較は、ヒトＢ１Ｒが適切な組織及びレベルで発現されるかどうかを判定する。この受容体の誘導は、炎症性疼痛又は神経障害性疼痛についての動物モデルで同様に観測することができる。
【００３５】
ヒト化Ｂ１Ｒマウスがキニン系の活性化に対して適切に応答すれば、様々な動物モデルへのヒト選択的化合物の効果を試験するのに役立つ。これらは、アテローム性動脈硬化症に関連する血管炎症、敗血症性ショック、気道炎症、関節炎及び癌における血管新生などの末梢炎症過程のモデルを含む。加えて、Ｂ１Ｒは神経炎症応答に関与すると考えられ、したがって、Ｂ１Ｒマウスは、アルツハイマー病モデル、脳水腫、てんかん及びパーキンソン病モデルにおいてヒト選択的Ｂ１Ｒ調節因子の効果を試験するのに有用である。したがって、このモデルは、Ｂ１Ｒに作用する化合物が有効であると考えられる治療適応症のスペクトルを評価する上で大きな価値を持つ潜在的可能性を有する。
【００３６】
本発明の１つの好ましい実施態様は、キメラマウスの作製及びヒトＢ１ブラジキニン受容体導入遺伝子についてホモ接合の動物を生産するための続く交配を可能にする、機能性形態のヒトＢ１ブラジキニン受容体をコードする導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び／又は体細胞に安定に組み込まれた、トランスジェニックげっ歯動物、特にトランスジェニックマウスの作製である。しかし、本発明は、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、チンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザルなどのトランスジェニック非ヒト霊長動物、及びトランスジェニックウシなどの他の非ヒトトランスジェニック動物の作製を考慮する。トランスジェニックマウスが好ましく、ここで例示する。
【００３７】
Ｂ１ブラジキニン受容体について「ヒト化」された非ヒトトランスジェニック動物の作製における好ましい側面は、ここで例示するようなマウス遺伝子の指定置換、又はブラジキニン受容体マウスＢ１（−／−）バックグラウンドから単離して培養した標的ＥＳ細胞などの、マウスＢ１（−／−）バックグラウンドに対する標的導入遺伝子の可能な挿入である。したがって、ある実施態様では、内在性非ヒトＢ１対立遺伝子は、ヒトＢ１導入遺伝子の発現を妨げないために、内在的にコードされたマウスＢ１の発現を抑制する又は排除するように機能的に破壊する。ヌルバックグラウンドは、非機能性である変化した天然Ｂ１ブラジキニン遺伝子を有する動物、すなわちノックアウト、を生産することによって生成される。前記動物は、ヘテロ接合（すなわち二倍体ゲノムの一対の染色体の各々の上に異なる対立遺伝子を有する）、変化したＢ１ブラジキニン遺伝子に関してホモ接合（すなわち二倍体ゲノムの一対の染色体の各々の上に同一の対立遺伝子を有する）、ヘミ接合（すなわち二倍体ゲノムの一対の染色体の一方の上だけに存在する対立遺伝子を有する）、又はここで開示する例示的なヒト化Ｂ１ブラジキニンマウスなどの非天然Ｂ１ブラジキニン遺伝子についてホモ接合であり得る。導入遺伝子は、胚、胎児又は成体多能性幹細胞に組み込み得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２、また、参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，４６４，７６４号、同第５，４８７，９９２号、同第５，６２７，０５９号、同第５，６３１，１５３号及び同第６，２０４，０６１号も参照のこと）。導入遺伝子は、電気穿孔、微量注入及びリポフェクションを含む、当技術分野で公知の様々な方法によって胚幹細胞に導入することができる。導入遺伝子を担持する細胞を胚盤胞に注入することができ、次にこれを偽妊娠動物に移植する。代替的実施態様では、導入遺伝子標的胚幹細胞を受精卵又は桑実胚と同時インキュベートし、この後雌性動物に移植することができる。妊娠後、得られる動物はキメラ創始トランスジェニック動物である。創始動物は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体に関してヘテロ接合のＦ１動物を生産するために野生型動物と交配する、さらなる実施態様において使用できる。さらなる実施態様では、これらのヘテロ接合動物を異種交配して、この体細胞及び生殖細胞がヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列についてホモ接合である成育可能なトランスジェニック胚を得ることができる。他の実施態様では、ヘテロ接合動物を使用した細胞系を生産することができる。例えば導入遺伝子を、標的ＥＳ細胞内の特定ゲノム部位に導入遺伝子を差し向けるために使用できる相同な腕（Ｃａｐｐｅｃｃｈｉ、前出参照）を有する、遺伝子ターゲティングベクター内に含め得る。このような異種ＤＮＡは、電気穿孔によって胚幹細胞に組み込むことができる。導入遺伝子を適切に担持する胚幹細胞を胚盤胞の内部細胞塊に注入する。キメラ動物を生産し、次にこれを異種交配して、全ての細胞が導入遺伝子を担持する動物を得る。以下で述べる微量注入と共に、ＥＳ細胞に基づく手法はトランスジェニックマウスを作製するための好ましい方法である。ここで例示するよ���に、ＥＳ細胞における遺伝子ターゲティングによって遺伝子機能を破壊する一般的手順は、ＥＳ細胞ゲノム内の対応する染色体との相同的組換えを受けるように設計された指向性構築物を作製することである。指向性構築物は、典型的には、これらが陽性選択マーカーなどの付加的な配列を標的遺伝子のコードエレメントに挿入され、これによって標的遺伝子を機能的に破壊するように作製される。このために、本発明はまた、相同的組換えによって、第二の「ヒト化」指向性構築物をマウスゲノムの異なる領域（例えば参照によりここに組み込まれる米国特許第６，４６１，８６４号に述べられているＲｏｓａ２６遺伝子座などの、構成的発現を促進する領域）へと指向することを指令する、１個の遺伝子指向性構築物によって不活化された内在性Ｂ１遺伝子を有する非ヒト動物（例えば非霊長類哺乳動物）を生産する方法に関する。
【００３８】
本明細書全体を通じて述べるように、本発明の１つの側面は、天然Ｂ１ブラジキニン受容体のヌルバックグラウンド上に非天然遺伝子を含む導入遺伝子を有するトランスジェニック動物である。この方法は、その細胞が、機能性Ｂ１ブラジキニン受容体及び変化した天然Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする天然遺伝子についてヘテロ接合である本発明のトランスジェニック動物を提供することを含む。これらの動物を、非天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子を含む導入遺伝子についてヘミ接合である本発明のトランスジェニック動物と交配して、変化した天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子についてヘテロ接合であり、及び非天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子についてヘミ接合である動物を得る。後者の動物を異種交配して、非天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子についてホモ接合又はヘミ接合であり、及び変化した天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合である動物を得る。特定実施態様では、前記方法の工程において生産されるいずれかの動物から細胞系を生産し、細胞を単離する。したがって、天然野生型遺伝子は、全能ＥＳ細胞（例えばここで述べるような）において選択的に不活化され、本発明のトランスジェニックマウスを作製するために使用される。特定の変化を染色体対立遺伝子に挿入するための標的相同的組換えを使用することにより、何らかの遺伝子領域を不活化する又は所望突然変異を生じさせるための手法が使用可能である（例えばＰｅｓｑｕｅｒｏら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：８１４０−８１４５参照）。したがって、本発明は、Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質の産生欠損をもたらす破壊されたＢ１ブラジキニン受容体遺伝子についてヘテロ接合又はホモ接合であり、さらに内在性又は異種プロモーターのいずれかの制御下での非天然型ブラジキニンＢ１受容体遺伝子の付加のためのバックグラウンドとして役立つ、二倍体動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。前記細胞、胚及び非ヒトトランスジェニック動物は、Ｂ１ブラジキニン受容体対立遺伝子の少なくとも１個が、野生型レベル未満のＢ１ブラジキニン受容体活性が生じるように変異している、Ｂ１ブラジキニン受容体についての２個の染色体対立遺伝子を含む。破壊されたＢ１ブラジキニン受容体遺伝子についてホモ接合の二倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは、野生型二倍体細胞と比較して、Ｂ１ブラジキニン受容体活性の少なくとも約５０％から約１００％の低下を示し得る。破壊されたＢ１ブラジキニン受容体遺伝子についてヘテロ接合の二倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは、野生型二倍体細胞と比較して、Ｂ１ブラジキニン受容体活性の少なくとも約１０％から約１００％の低下を示し得る。
【００３９】
ここで使用する命名法及びトランスジェニックプロトコール、細胞培養、分子遺伝学及び分子生物学における実験手順は当技術分野において周知であり、一般に用いられている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養及び導入遺伝子組込み（例えば電気穿孔、微量注入、リポフェクション）には標準手法を使用する。一般に酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び精製工程は製造者の仕様書に従って実施する。手法及び手順は、一般に、当技術分野における慣例的な方法及び本書類全体を通じて提供する様々な一般的参考文献に従って実施する。この中の手順は当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供するものである。この中に含まれる全ての情報は参照によりここに組み込まれる。
【００４０】
以下の実施例は説明として提示するものであり、様々な他の実施態様が当業者には明白であるので、以下は本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。例えば、（１）プラットフォームとしてマウスＢＫ１機能を除去するためのブラジキニンＢ１ノックアウトの作製、及び次に一般的又は組織特異的プロモーターの制御下でＲｏｓａ２６遺伝子座に哺乳動物（例えばヒト）ＢＫ１Ｒを「ノックイン」すること、；（２）プラットフォームとしてマウスＢＫ１機能を除去するためのブラジキニンＢ１ノックアウトの作製、及び次にＢＫ１Ｒプロモーターの全ての必要なシス作用性領域を保持しながら、特定哺乳動物ＢＫ１Ｒ（例えばｈＢＫ１Ｒゲノムコード領域をマウスＢＡＣ上に組換えたヒトゲノムＢＡＣ又はマウスＢＡＣ）を含むＢＡＣを使用してそれぞれのＢＫ１Ｒ遺伝子を「ノックイン」すること。この筋書きで、好ましい戦略は、ヒト遺伝子をマウスＢＡＣに組換え、これをＢ１ノックアウトに導入することである。やはり、当業者はブラジキニンＢ１及びＢ２受容体遺伝子と調節エレメントの近接性を考慮すべきである。Ｂ１プロモーターを含むＢＡＣクローンはまた、Ｂ２受容体遺伝子も含むと考えられる。当業者は、破壊される領域がＢ１受容体発現に影響を及ぼさないことが極めて確実であることを条件として、ＢＡＣクローン内のＢ２遺伝子も破壊し得る。ＢＡＣ導入遺伝子においてＢ２遺伝子を破壊しない場合、代替法は、ヒト化Ｂ１マウスＢＡＣをＢ１／Ｂ２二重ノックアウトに導入することである；（３）プラットフォームとしてマウスＢＫ１機能を除去するためのブラジキニンＢ１ノックアウトの作製及び一般的又は組織特異的調節構築物を使用してそれぞれのＢＫ１Ｒ  ｃＤＮＡを発現する、慣例的なトランスジェニック哺乳動物（例えばヒト）構築物の導入；及び（４）ＲＮＡｉテクノロジーを使用して内在性マウスＢＫ１Ｒをノックダウンすること及び次に（１）、（２）及び／又は（３）のアプローチを使用して対象導入遺伝子を導入すること、を含むがこれらに限定されない、他の方法を使用して本発明の「ヒト化」マウスを作製し得る。上述したように、このようなマウスを作製するための方法は当技術分野において公知であり、このような技術参考文献は参照によりここに組み込まれる。これらの付加的な方法の１つを実施するとき、当業者は、Ｂ２受容体遺伝子とＢ１プロモーターの間の近接性（Ｂ２受容体転写産物の終端とＢ１受容体導入遺伝子の開始点の間は１０ｋｂ又はそれ以下）を理解することが重要である。したがって、気づかないうちにＢＫ１Ｒ及び／又はＢＫ２Ｒプロモーター領域の両方／いずれかについての調節機能を低下させることがないターゲティング戦略を選択することが重要である。
【００４１】
Ｂ１ブラジキニン「ヒト化」マウスの作製は報告されておらず、このようなトランスジェニック動物がヒトＢ１ブラジキニン受容体の化合物選択性をインビボで模倣することは明らかではなかった。本発明の最重要点は、このようなヒト化トランスジェニック動物がこのような表現型を有することを明らかにし、天然マウス形態のヌル表現型に対するこのヒト受容体の機能的発現を示して、これによりここで述べる様々なアッセイを、ヒトＢ１ブラジキニン受容体の調節因子を選択する上で有用なものにすることに関する。以下の実施例は説明として提示するものであり、様々な他の実施態様が当業者には明白であるので、以下は本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４２】
ヒトブラジキニンＢ１受容体置換構築物、ｐＢ１Ｒ−ＫＩ１の構築
染色体１２番ＢＡＣクローンＲＰ２３−１５８Ｍ２３のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ０６８４５９からのＤＮＡ配列を、ヒトＢ１受容体をマウスＢ１受容体で置換するための構築物の設計において使用した。この構築物は、プラスミドベクターへの前記ＤＮＡのクローニングを容易にするための制限エンドヌクレアーゼと共に個々の断片のオーバーラップエクステンションＰＣＲによって構築する。構築物ｐＢ１Ｒ−ＫＩ１は、１．２ｋｂの５’マウスゲノムＤＮＡ側面配置領域、ポリ（Ａ）シグナルを含む３’非翻訳ゲノムＤＮＡの１２６ヌクレオチドと１０５９ｂｐのヒトＢ１受容体コード配列、Ｌｏｘ  Ｐ部位が側面配置された、陽性選択のためのＮｅｏカセット、７．４ｋｂの３’マウスＢ１受容体側面配置ＤＮＡ、及び陰性選択のためのＴＫ遺伝子から成る。この構築物の作製において実施する工程を以下に述べる。図１Ａは最終的なターゲティング構築物を示す。
【００４３】
工程１−マウスＢ１ゲノムＤＮＡ５’フランクの入手：１２２７ヌクレオチドの５’フランキング領域を、最初に正プライマー、ＭｍＨｓＢ１Ｆ３  ５’−ＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号１）及び逆プライマー、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ  ５’−ＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＡ  ＡＡＴＴＧＡＣ−３’（配列番号２）を用いて、マウスＳＶ／Ｊ系統ゲノムＤＮＡのＰｆｕポリメラーゼを使用することによって入手した。Ｐｆｕポリメラーゼを使用するＰＣＲ条件は、５０μｌの容量で９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び７２℃、２分間の２５サイクルであった。ｐＢ１Ｒ−ＫＩ１の作製における全てのＰＣＲ工程に関して、ＰＣＲ反応物の約１／１０のアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析して、反応物の収率、産物の純度、及び産物が予想した大きさを示すかどうかを判定した。反応産物を精製し、一次反応物０．２５μｌを、プライマー、ＭｍＨｓＢ１Ｆ１  ５’−ＣＣＣＴ  ＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号３）及び逆プライマー、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ  ５’−ＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＡ  ＡＡＴＴＧＡＣ−３’（配列番号２）を用いて一次反応と同じサイクリング条件で、２５サイクルのＰＣＲの２回目の半入れ子（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ラウンドにおいて使用した。Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒは、マウスＢ１受容体コード配列についての翻訳開始コドンのすぐ上流のマウスゲノムＤＮＡ配列に同一な２４ヌクレオチド及び翻訳開始コドンを含む、ヒトＢ１受容体コード配列に同一な１８ヌクレオチドを含む。
【００４４】
工程２−ＰＣＲオーバーラップエクステンションのためのヒトＢ１受容体コード配列の一部の入手：正プライマー、Ｈｙｂｒｉｄプライマー  ５’ＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号４）及び逆プライマー、ＭｍＨｓＢ１Ｒ１  ５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号５）を用いたＰＣＲによるヒトＢ１受容体コード配列の一部を含む１０８３ヌクレオチドのＰＣＲフラグメントを、前の項で述べた条件を用いて２回のＰＣＲによって入手した。ブラジキニンＢ１受容体をコードするヒト遺伝子の単離及び特性決定は、参照によりここに組み込まれる、１９９８年１月２７日発行の米国特許第５，７１２，１１１号に開示されている。ＨｙｂｒｉｄプライマーＦは、マウスＢ１受容体コード配列についての翻訳開始コドンのすぐ上流のマウスゲノムＤＮＡ配列に同一な２４ヌクレオチド及び翻訳開始コドンから始まる、ヒトＢ１受容体配列に同一な１８ヌクレオチドを含む。
【００４５】
工程３−ＰＣＲによる工程１及び工程２の産物の連結：工程１からの１２２７ヌクレオチドの５’フランキング領域及び工程２からの１０８３ヌクレオチドのヒトＢ１受容体コード配列をＱｉａｑｕｉｃｋカラムで精製し、６０μｌ溶出緩衝液中で溶出した。精製産物（各々１μｌ）を混合し、Ｐｆｕポリメラーゼと正プライマー、ＭｍＨｓＢ１Ｆ１  ５’−ＣＣＣＴ  ＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号３）及び逆プライマー、ＭｍＨｓＢ１Ｒ１  ５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号５）を用いるＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は、５０μｌの容量で、９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び７２℃、３分間の３０サイクルであった。生じた約２１４６ヌクレオチドの産物を精製し、ＴＯＰＯ  ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングベクターにサブクローニングした。いくつかのクローンを選択し、ＤＮＡ塩基配列分析に供して、産物の配列を確認し、ＰＣＲの間に起こった可能性のある塩基変化を特定した。
【００４６】
工程４−内在性ポリ（Ａ）シグナルを含むヒトＢ１受容体３’領域の入手：内在性ポリ（Ａ）シグナルを含むヒトＢ１受容体３’非翻訳領域を、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、正プライマー、ＨｕＢ１ｐＡＦ  ５’−ＧＧＣＣＧＡＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号６）及び逆プライマー、ＨＳＢ１ｐＡＲ＿ＮｏｔＩ  ５’−ＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡ  ＴＴＡＧＧ−３’（配列番号７）を用いるＰＣＲによって入手した。ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを使用したＰＣＲ条件は、５０μｌの容量で、９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び７２℃、１分間の４０サイクルであった。生じたＰＣＲフラグメントをＴｏｐｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングベクターにサブクローニングし、クローンのＤＮＡ塩基配列を確認した。この産物をヒトＢ１受容体コード配列の残りの部分に連結するために、ヒトＢ１受容体コード配列の８１８位のユニークＥｃｏＲＩ部位を利用した。クローン化したフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ  ＲＩ及びＮｏｔ  ＩでＴｏｐｏ  Ｂｌｕｎｔから切り出し、Ｅｃｏ  ＲＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化した哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３内のヒトＢ１受容体と連結した。生じた構築物のクローンをＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。
【００４７】
工程５−マウスＢ１  ５’フランク／ヒトＢ１ｃｄｓとポリ（Ａ）シグナルを含むヒトＢ１  ３’領域の連結：工程３からのプラスミドＤＮＡ、ヒトＢ１受容体コード配列に連結したマウスＢ１受容体５’フランキングＤＮＡ、及び工程４からの内在性ポリＡシグナルを含むヒトＢ１受容体３’非翻訳領域とヒトＢ１受容体コード配列をＰＣＲ反応において結合させた。正プライマー、ＭｍＨｓＢ１Ｆ１  ５’−ＣＣＣＴ  ＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号３）及び逆プライマー、ＨＳＢ１ｐＡＲ−ＮｈｅＩ  ５’−ＧＣＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＧ−３’（配列番号８）を使用させた。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを使用するＰＣＲ条件は、５０μｌの容量で、９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び７２℃、３分間の３１サイクルであった。
【００４８】
工程６−工程５からのブラントｘＮｈｅフラグメントのＨｐａＩｘＮｈｅＩ  ｐＢＳＮｅｏＴＫへの連結：約２．４ｋｂの工程５からの産物を精製し、次に制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩで消化した。次にこのフラグメントを、ＨｐａＩ及びＮｈｅＩ消化したｐＢＳＮｅｏＴＫと連結した。連結物を細菌に形質転換し、プラスミドを作製して、所望制限パターンに関してスクリーニングした。
【００４９】
工程７−ｐＢＳＮｅｏＴＫ誘導体からのＳａｌＩフラグメントによるＮｏｔＩのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへの導入：４．４ｋｂフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ及びＳａｌＩでの消化によって工程６で得たプラスミド構築物から単離した。この４．４ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにサブクローニングした。
【００５０】
工程８−マウスＢ１受容体３’フランキングゲノムＤＮＡの入手：７３９７ヌクレオチドの３’フランキング領域を、正プライマー、ＭＲ３ｆｌ＿２ｆ  ５’ｇｃｇｔｃｇａｃＴＧＧＴＴＡＴＴＣＣＴＡＣ  ＡＧＣＡＡＣＧＧ−３’（配列番号９）及び逆プライマー、ＭＲ３Ｆｌ＿１ｒ  ５’ｇｃｇｔｃｇａｃＴＧＴＧＡＧ  ＡＴＧＣＡＣＡＣＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１０）を用いてＳＶ／Ｊ系統からのマウスゲノムＤＮＡからＰＣＲによって入手した。生じたフラグメントを精製し、Ｔｏｐｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングベクターにサブクローニングして、挿入物のＤＮＡ塩基配列を確認した。
【００５１】
工程９−マウスＢ１ゲノムＤＮＡ３’フランクの、ＳａｌＩ消化した工程７からのプラスミドＤＮＡへのクローニング：工程８からの３’フランキング領域挿入物を有するクローンを制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化し、７．４ｋｂフラグメントをアガロースゲル上で精製した。工程７からのプラスミドＤＮＡをＳａｌＩで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、この後７．４ｋｂの３’フランクと連結した。生じたクローンを、正しい方向に関して制限分析によってスクリーニングし、この後ＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。
【００５２】
工程１０−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の付加：工程６で作製したプラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩ及びＤｒａで消化した。消化したＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＣｌａＩ部位に平滑末端を形成した。この平滑末端にＮｏｔＩリンカーを連結し、この後ＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋカラムで精製した。精製したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によってフラグメントを分離した。約２１５３ヌクレオチドのバンドを切り出し、精製した。工程９からの構築物をＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、この後、ＴＫ遺伝子を含むＮｏｔＩ消化したフラグメントと連結した。連結混合物をＸＬ−２Ｂｌｕｅ化学的コンピテント細胞に形質転換し、クローンを標準手法によって単離した。クローンを制限酵素地図作成によってスクリーニングし、正しいパターンを有するクローンを選択して、胚幹細胞に導入するＤＮＡを提供するために大規模プラスミド生産を実施した。
【実施例２】
【００５３】
ヒトブラジキニンＢ１受容体置換構築物２、ｐＢ１Ｒ−ＫＩ２の構築
染色体１２番ＢＡＣクローンＲＰ２３−１５８Ｍ２３のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ０６８４５９からのＤＮＡ配列を、ヒトＢ１受容体をマウスＢ１受容体で置換するために、ｐＢ１Ｒ−ＫＩ２の設計において使用した。この構築物は、プラスミドベクターへの前記ＤＮＡのクローニングを容易にするための制限エンドヌクレアーゼと共に個々の断片のオーバーラップエクステンションＰＣＲによって構築する。構築物ｐＢ１Ｒ−ＫＩ２は、２．２ｋｂの５’マウスゲノムＤＮＡフランキング領域、１０５９ｂｐのヒトＢ１受容体コード配列、内在性Ｂ１受容体ポリ（Ａ）シグナルを含むマウスゲノムＤＮＡの５６６ヌクレオチド、Ｌｏｘ  Ｐ部位が側面配置された陽性選択のためのＮｅｏカセット、３．６ｋｂの３’マウスＢ１受容体側面配置ＤＮＡ、及び陰性選択のためのＴＫ遺伝子から成る。この構築物の作製において実施する工程を以下に述べる。図１Ｂは最終的なターゲティング構築物を示す。
【００５４】
工程１−マウスＢ１ゲノム５’フランキングＤＮＡの入手：正プライマー、ＭｍＧＢ１＿Ｆ５  ５’−ＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴ  ＴＣＡＧＴＣＡＣＧ−３’（配列番号１１）又はＭｍＧＢ１＿６Ｆ  ５’−ＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴ  ＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）と逆プライマー、ＭＢ１Ｇ＿Ｒ  ５’ＡＡＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧ−３’（配列番号１３）又はＭＢ１Ｇ＿Ｒ２  ５’ＴＴＴＣＴ  ＧＣＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１４）を組み合わせて、マウスＳｖＪ系統（〜５０ｎｇ）からのＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼを用いて、５０μｌの容量で９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び６８℃、３分間の３５サイクルを実施した。２２５０又は２４５７ヌクレオチドの産物を精製した。ｐＢ１Ｒ−ＫＩ２の作製における全てのＰＣＲ工程に関して、ＰＣＲ反応物の約１／１０のアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析して、反応物の収率、産物の純度、及び産物が予想した大きさを示すかどうかを判定した。
【００５５】
工程２−内在性ポリ（Ａ）シグナルを有するマウスＢ１受容体３’フランキングゲノムＤＮＡの入手：正プライマー、ＭｕＢＡＣ．１ｆ  ５’−ＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号１５）及び逆プライマー、ＭｕＢＡＣ．２ｒ  ５’−ＡＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧ−３’（配列番号１６）を、マウスＳＶ／ＪゲノムＤＮＡの３１７７ｂｐフラグメントのＰＣＲのために使用した。ＰＣＲ条件は、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼを用いて、５０μｌの容量で９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び６８℃、９分間の４０サイクルであった。ＰＣＲ産物を精製した。
【００５６】
工程３−ヒトＢ１ｃｄｓとマウスＢ１受容体３’ゲノムＤＮＡの連結：工程２からの精製ＰＣＲ産物を、ＭｒｐＡ＿ＯＦ  ５’−ＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＴＴＴＡＴＡＡ−３’（配列番号１７）と逆プライマー、ＭｒｐＡ＿１ｒ  ５’−ｇｃｇｃｔａｇｃＣＡＡＡＣＴＴＧＧＣＡ  ＡＡＴＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１８）の組合せを用いたＰＣＲ反応における鋳型として、５９８ヌクレオチドフラグメントを得た。正プライマー、ＭｒｐＡ＿ＯＦは、終結コドンを含む、ヒトＢ１受容体コード配列に同一の２５ヌクレオチド、及びマウスＢ１受容体についての終結コドンを含む、マウスゲノムＤＮＡに同一の２２ヌクレオチドを含む。逆プライマー、ＭｒｐＡ＿１ｒは、マウスゲノムＤＮＡに同一の２０ヌクレオチド及びＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。ヒトＢ１受容体コード配列は、正プライマー、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ  ５’ＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号４）及び逆プライマー、ＭｒｐＡ＿ＯＲ  ５’−ＴＴＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＴＣＡＣＴＴＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１９）を使用するＰＣＲによって入手し、１１０２ヌクレオチドフラグメントを得た。正プライマー、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆは、コード配列の開始部のすぐ上流のマウスゲノムＤＮＡ配列に同一な２４ｂｐ、及びこれに続く、翻訳開始コドンを含む、ヒトＢ１受容体に同一な１８ｂｐを含む。ＰＣＲのための鋳型は、ｐＢ１Ｒ−ＫＩ１構築の工程６からのヒトＢ１受容体コード配列を含むプラスミドＤＮＡであった。ＰＣＲ条件は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて、５０μｌの容量で９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び６８℃、１分３０秒間の２０サイクルであった。精製したＰＣＲ産物（各々３ｎｇ）を、正プライマー、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ  ５’ＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴ  ＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号４）及び逆プライマー、ＭｒｐＡ＿１ｒ  ５’−ｇｃｇｃｔａｇｃＣＡＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号２０）を使用する２回目のＰＣＲ反応において混合し、１６５７ｂｐの産物を得た。ＰＣＲ条件は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて５０μｌの容量で、９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び６８℃、３分間の２０サイクルであった。
【００５７】
工程４−ヒトＢ１受容体コード配列／マウスＢ１受容体  ３’ゲノムＤＮＡを有するマウスＢ１受容体５’ゲノムＤＮＡのクローニング：工程１からの精製したＰＣＲ産物を、正プライマー、ＭｍＧＢ１＿６Ｆ  ５’−ＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＧ−３’（配列番号２１）及び逆プライマー、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ  ５’−ＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＡ  ＡＡＴＴＧＡＣ−３’（配列番号２）で再び増幅した。この産物を精製し、工程３からの最終ＰＣＲ産物と混合した。（各々４ｎｇ）正プライマー、ＭｍＧＢ１＿６Ｆ  ５’−ＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＧ−３’（配列番号２１）及び逆プライマー、ＭｒｐＡ＿１ｒ  ５’−ｇｃｇｃｔａｇｃＣＡＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号２０）を有するオーバーラップエクステンションＰＣＲは、３８５２ｂｐの産物をもたらした。ＰＣＲ条件は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて５０μｌの容量で、９４℃、２５秒間、６０℃、２５秒間及び６８℃、４分３０秒間の１８サイクルであった。
【００５８】
工程５−マウスＢ１受容体５’ゲノムＤＮＡ／ヒトＢ１受容体コード配列／マウスＢ１受容体  ３’ゲノムＤＮＡのｐＢＳＮｅｏＴＫへのクローニング：工程４からの３８５２ヌクレオチドの最終ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩで消化した。ベクターｐＢＳＮｅｏＴＫを制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩ及びＮｈｅＩで消化し、ＮｈｅＩ消化したＰＣＲ産物（このＰＣＲ産物の他方の末端は、Ｐｆｕポリメラーゼを使用する結果として平滑であり、したがってＨｐａＩと適合性である）と連結した。生じたプラスミドのクローンを、制限酵素地図作成を用いて正しい方向に関してスクリーニングし、正しいクローンをＤＮＡ塩基配列分析によって分析して方向を確認し、ＰＣＲ誘導の変異を特定した。
【００５９】
工程６−ｐＢＳＮｅｏＴＫ誘導体からのＳａｌＩフラグメントによるＮｏｔＩのｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔへの導入：５．８ｋｂフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ及びＳａｌＩでの消化によって工程５からのプラスミド構築物から単離した。この５．８ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。
【００６０】
工程７−マウスＢ１受容体３’フランキングゲノムＤＮＡの入手：Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼを使用したマウスＳｖ／ＪゲノムＤＮＡに関するＰＣＲを、正プライマー、ｍｇ３＿Ｆ１  ５’−ｇｇｔｃｇａｃＴＧＧＴＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧ−３’（配列番号２２）及び逆プライマー、ｍｇ３＿Ｒ２  ５’−ｇｇｔｃｇａｃＴＧＡＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号２３）を用いて実施した。ＰＣＲは３６２８ヌクレオチドのフラグメントを生じ、これをＴｏｐｏＢｌｕｎｔにサブクローニングした。
【００６１】
工程８−マウスＢ１受容体３’フランキングゲノムＤＮＡと工程６からのプラスミドＤＮＡの連結：工程７からのＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩでＴｏｐｏＢｌｕｎｔから切り出し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。工程６で生産したプラスミドをＳａｌＩで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、マウスＢ１受容体３’フランキングＤＮＡを含むＳａｌＩフラグメントと連結した。クローンを単離し、マウスＢ１受容体フランキングＤＮＡの正しい方向に関して制限酵素地図作成によってスクリーニングした。クローンのＤＮＡ塩基配列分析を実施して構築物を確認し、ＰＣＲ誘導のエラーを特定した。
【００６２】
工程９−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の付加：実施例１の工程６で作製したプラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩ及びＤｒａで消化した。消化したＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＣｌａＩ部位に平滑末端を形成した。この平滑末端にＮｏｔＩリンカーを連結し、この後ＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋカラムで精製した。精製したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によってフラグメントを分離した。約２１５３ヌクレオチドのバンドを切り出し、精製した。工程８からの構築物をＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、この後、ＴＫ遺伝子を含むＮｏｔＩ消化したフラグメントと連結した。連結混合物をＸＬ−２Ｂｌｕｅ化学的コンピテント細胞に形質転換し、クローンを標準手法によって単離した。クローンを制限酵素地図作成によってスクリーニングし、正しいパターンを有するクローンを選択して、胚幹細胞に導入するＤＮＡを提供するために大規模プラスミド生産を実施した。
【実施例３】
【００６３】
ヒトブラジキニンＢ１受容体ノックイン（ＫＩ）マウスの作製
実験材料及び方法−ＥＳ細胞のトランスフェクション：Ｖ６．５マウスＥＳ細胞（Ｅｇｇａｎら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４）を、ミトマイシンＣ処理したネオマシン耐性初代支持線維芽細胞上に１，０００単位／ｍｌ  ＥＳＧＲＯを含む１５％ＦＢＳを添加したＥＳ細胞適格ＤＭＥＭ中で記述されているように（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．（編集），２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）培養した（全てのＥＳ細胞培養試薬はＣｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡから入手した）。記述されているように（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．（編集），２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ＮｏｔＩ線状ｐＢ１Ｒ−ＫＩ２ターゲティングベクター２０μｇ及び約６×１０６ＥＳ細胞を使用して電気穿孔を実施した。ネオマイシン耐性及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）陰性コロニーの選択を、３０分後及びこの後７日間にわたって２５０μｇ／ｍｌゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）及び２μＭガンシクロビール（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で実施した（ターゲティング工程の総説については図２参照）。ＥＳコロニーを採取し、ゲノムＤＮＡを記述されているように（Ｌａｉｒｄら、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４２９３）単離した。標的ＥＳコロニーを、２個のプライマー（５’プライマー：  ５’−ＣＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣ−３’［配列番号２４］及び３’プライマー：  ５’−ＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＧＡ  ＧＡＡＧＴＧ−３’［配列番号２５］）を用いたマウスゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製した１．１ｋｂの５’外側プローブを使用して、ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって特定し、直接ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。野生型及び標的対立遺伝子をそれぞれ８．２ｋｂ及び４．５ｋｂと特定した。分析した８０個のＥＳクローンのうちで、６個を単一の相同的組換えノックイン対立遺伝子を担持する標的と特定し、特性決定した。
【００６４】
微量注入及び動物交配：ここで使用する全ての動物プロトコールは、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｉｎ  Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，ＰＡによって承認された。ＥＳ細胞を、記述されているように（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．（編集），２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）宿主胎盤胞に注入してキメラを作製し、この後、生殖細胞系伝達されたＢ１ノックイン対立遺伝子を担うマウスを誘導するためにＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。記述されているように（Ｌａｉｒｄら、同上）ゲノムＤＮＡを単離し、上述したようにサザンブロット分析によって遺伝子型分類を実施した（図３Ａ参照）。ノックイン対立遺伝子についてのヘテロ接合のマウスを交雑させ、ホモ接合ノックイン子孫を生産した。
【００６５】
結果−ヒトＢ１受容体ノックイン対立遺伝子を担持するマウスの作製：２つの独立した標的ＥＳクローンを微量注入し、両方のクローンから、生殖細胞系を通してノックイン対立遺伝子を伝達されたキメラを誘導した。ノックイン対立遺伝子についてヘテロ接合のマウスは概ね正常であり、予想された割合で対立遺伝子を伝達した。ノックイン対立遺伝子についてホモ接合のマウスも、正常な成長と挙動を示す。
【実施例４】
【００６６】
ヒトＢ１置換マウスについてのＰＣＲ遺伝子型分類アッセイ
野生型マウスＢ１受容体に特異的なプライマーセット及びヒトＢ１受容体に特異的な２番目のセットを開発した。正プライマー、ＭｍＢ１ｆ  ５’−ＴＴＣＴＡＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２６）及び逆プライマーＭｍＢ１ｒ  ５’−ＧＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＡＧ−３’（配列番号２７）を使用したマウス特異的反応は、マウスＢ１受容体染色体に特異的な３１９ｂｐ産物を生じる。正プライマー、ＨｓＢ１ｆ  ５’−ＴＣＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号２８）及び逆プライマーＨｓＢ１ｒ  ５’−ＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号２９）を使用したヒト特異的反応は、ヒトＢ１受容体コード配列が存在する染色体に特異的な２０３ｂｐの産物を生じる（図３Ｂ）。ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを使用する２０μｌ容量でのＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間、この後９４℃、３０秒間、６０℃、３０秒間及び７２℃、１分間の３５サイクルであった。プライマー濃度は反応当り１０ｐｍｏｌｅであり、マウスゲノムＤＮＡ鋳型は約５０ｎｇ／反応、及びＭｇＣｌ２は１．５ｍＭの最終濃度である。遺伝子型分類アッセイは単一又は多重反応のいずれかで使用することができ、反応産物を２％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルで分析する。
【実施例５】
【００６７】
ヒトＢ１置換染色体のＤＮＡ塩基配列分析
２匹の１２系統及び１３系統の置換マウスにおけるヒトＢ１受容体の完全性をＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。正プライマー、Ｍｆ＿１ｆ  ５’−ＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧ−３’（配列番号３０）及び逆プライマー、Ｍｆ＿２ｒ  ５’−ＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＣＴＡＡＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番号３１）は、ヒトＢ１受容体コード配列の側面に位置するマウスゲノムＤＮＡ配列に基づき、１４８１ヌクレオチドの産物を生じる。５０μｌの反応容量でＥｘｐａｎｄポリメラーゼを使用してマウスゲノムＤＮＡ約１００ｎｇからフラグメントを増幅した。９４℃で１分間のプレインキュベーション後、９４℃、３０秒間、６０℃、３０秒間及び７０℃、１分３０秒間の３５サイクルを実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で評価し、次にＱｉａＱｕｉｃｋカラムを使用して精製した。ＰＣＲ産物を標準サイクルシーケンシングプロトコールによって配列決定し、ＡＢＩ３７７で分析した。予想されたように、ホモ接合置換マウスからの産物は、側面位置マウスゲノムＤＮＡの一部及び完全なヒトＢ１受容体コード配列を含んだ。加えて、マウス／ヒト接合部では、ヘテロ接合マウスのＤＮＡ配列が混合していた。これらのデータは、遺伝子ターゲティング及びヒトＢ１受容体コード配列の完全性を確認する。
【実施例６】
【００６８】
機能アッセイ：ホモ接合ヒトＢ１ノックアウト（ＫＯ）マウス
ヒトＢ１受容体遺伝子によるマウスＢ１遺伝子の置換についてホモ接合のマウス系統、１３系統におけるＢ１受容体活性を評価するため、ホモ接合ヒトｂ１マウス胃底及び回腸組織に関して機能アッセイを２回実施した。選択的ヒトＢ１受容体化合物（化合物Ｎｏ．１）を、これらのノックインマウスからの受容体に対するアンタゴニスト活性に関して試験した。詳細には、２匹のホモ接合マウスをＣＯ２で安楽死させた。これらの胃と回腸を切除し、胃底部分を大弯に沿って切開して半分に分割した。正中切開に沿って切断して約１ｍｍ×０．６ｃｍの内側縦細片を得た。各々の胃から２つの胃底細片を得た。回腸は、盲腸から約４ｃｍで切断した。各々の回腸を２つの断片に分け、全筋肉を使用した。組織を、クレブス緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３及び１１．１ｍＭデキストロース）を含む５ｍｌジャックホルダー（ｊａｃｋｅｄ  ｈｏｌｄｅｒｓ）に入れ、３７℃で５％ＣＯ２／９５％Ｏ２を通気した。回腸の各々の断片を、絹糸４−０によって一方の端をガラス棒に、他方の端をＳｔａｔｈａｍ−Ｇｏｕｌｄ力変換器に結びつけた。各々の組織に１グラムの圧力を適用し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ７７５８レコーダーによって収縮を記録した。最大応答のために１時間の平衡終了時に全ての組織に５０ｍＭ  ＫＣｌを与える。組織を２０分ごとに１時間にわたって洗浄した。化合物Ｎｏ．１  ３０ｎＭを、２つの処理回腸又は２つの処理胃底組織に添加し、１時間インキュベートした。ＤＡＫ投与の３０分前にＭＫ−４２２  ０．１μＭ及びチオルファン１μＭを浴に添加する。プレインキュベーション後、ＤＡＫ（１０−１０Ｍ−３×１０−５Ｍ）の累積用量−反応を実施する。
【００６９】
【化１】
2007508814.tif 000003
【００７０】
表１は、ＤＡＫ及び化合物Ｎｏ．１に関する試料希釈を示す。ＤＡＫはクレブス溶液に希釈する。２５０μｌ中に２５μｌを添加することによって完全な対数希釈を実施する。化合物Ｎｏ．１はＤＭＳＯに希釈する。
【００７１】
【表１】
2007508814.tif 000004
【００７２】
結果−（実験Ｎｏ．１）：系統Ｎｏ．１３のホモ接合マウスは、野生型におけるように完全なＤＡＫ収縮応答を示した。しかし、これらのマウスは、ラットＢ１活性の代わりにヒトブラジキニンＢ１受容体活性を示した。化合物Ｎｏ．１についてのＫｂは、胃底では０．２７ｎＭ、回腸では０．１１ｎＭであった。これらのデータは結合データ（ｈｂ１＝０．０４ｎＭ、ラットｂ１＝５９１ｎＭ）と一致する。代表的データを以下の表２並びに図４Ａ及び４Ｂに示す。
【００７３】
【表２】
2007508814.tif 000005
【００７４】
結果−（実験Ｎｏ．２）：系統Ｎｏ．１３のホモ接合マウスは、野生型におけるように完全なＤＡＫ収縮応答を示した。実験Ｎｏ．１におけるように、これらのＢ１受容体ヒト化マウスは、ラットＢ１活性の代わりにヒトブラジキニンＢ１を示した。化合物Ｎｏ．１についてのＫｂは、胃底では０．２３ｎＭ、回腸では０．２１ｎＭであった。これらのデータは結合データ（ｈｂ１＝０．０４ｎＭ、ラットｂ１＝５９１ｎＭ）と一致する。代表的データを以下の表３並びに図５に示す。
【００７５】
【表３】
2007508814.tif 000006
【実施例７】
【００７６】
Ｃｒｅを介した組換えによるｐＧＫｎｅｏの除去
ヒトＢ１Ｒ受容体についてヘテロ接合又はホモ接合であるマウスをＲｏｓａ−ＳＡ−Ｃｒｅマウスに交配した。ヒトＢ１Ｒ受容体についてヘテロ接合であるＣｒｅ陽性子孫を異種交配した。ヒトＢ１Ｒ＋／−、Ｃｒｅ＋異系交配の子孫からゲノムＤＮＡを作製し、ＰＣＲによってヒトＢ１Ｒ遺伝子に連結されたｐＧＫｎｅｏの存在に関して試験した。Ｎｅｏ遺伝子の存在を調べるために、ｎｅｏ遺伝子内に位置する正プライマー、Ｎｅｏ２ｆ  ５’−ＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴ  ＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３２）を、マウスゲノムＤＮＡに位置する逆プライマー、Ｎｅｏ２ｒ  ５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＡ  ＧＡＧＴＡＡＴＣＧＧ−３’（配列番号３３）と組み合わせて使用した。ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを使用したＰＣＲ条件は、マウスゲノムＤＮＡ５０ｎｇを鋳型として、９５℃、１０分間に続いて、９５℃、３０秒間、６０℃、３０秒間及び７２℃、１分間の３５サイクルであった。９３７ヌクレオチドの産物の増幅は、Ｎｅｏ遺伝子の存在の指標である。
【００７７】
第二プライマーセットによるＰＣＲは、Ｃｒｅを介したｐＧＫｎｅｏカセットの欠失の指標であった。正プライマー、Ｆｌｏｘ１ｆ  ５’−ＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＡＡＴＣＧＧ−３’（配列番号３４）及び逆プライマー、Ｆｌｏｘ１ｒ  ５’−ＧＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧ  ＧＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧ−３’（配列番号３５）を、マウスゲノムＤＮＡ５０ｎｇ及びＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼによる以下の条件を用いたＰＣＲ反応において使用した：９５℃、１０分間に続いて、９５℃、３０秒間、６０℃、３０秒間及び７２℃、１分間の３５サイクル。Ｆｌｏｘ１ｆ×Ｆｌｏｘ１ｒプライマーセットは、野生型マウス染色体から５７９ヌクレオチド産物を増幅し、Ｃｒｅを介したｐＧＫｎｅｏ遺伝子の欠失を受けた染色体から６８８ヌクレオチド産物を増幅する。ｐＧＫｎｅｏを含む染色体の増幅は、２４４７ヌクレオチド産物を生じる。アッセイにおいて使用したＰＣＲ条件では、この産物は効率よく増幅されない。野生型マウス染色体と、ｐＧＫｎｅｏのＣｒｅ仲介性欠失を受けたヒトＢ１受容体コード配列を含む染色体との間の１０９ヌクレオチドの差は、３４ヌクレオチドのＬｏｘＰ部位の存在及びマウスゲノムＤＮＡを最初の構築物に導入するために使用したクローニング部位とＬｏｘＰ部位の間に位置する配列から生じる。この差は、ホモ接合野生型染色体、５７９ヌクレオチドの単一バンド、ヘテロ接合マウス、５７９及び６８８ヌクレオチドの２つのバンド、及び、ホモ接合ヒト化Ｂ１Ｒ置換マウス、６８８ヌクレオチドの単一バンド、についての効率的な診断パターンとして役立つ。
【実施例８】
【００７８】
ブラジキニンＢ１受容体ｍＲＮＡレベルの定量
ＴａｑＭａｎテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を使用したリアルタイムＰＣＲによってブラジキニンＢ１受容体ｍＲＮＡの量を測定した。マウスＢ１受容体ｍＲＮＡを検出するのに特異的なプライマーセット及びプローブを開発した。マウス特異的正プライマーは  ５’−ＡＧＣＴＧＴＧＡＧ  ＣＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴ−３’（配列番号３６）の配列を有し、逆プライマーは  ５−ＴＴＴＧＧＴＴＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号３７）の配列を有しており、このプライマーセットは、イントロン／エクソン境界部に及ぶ８２塩基対の産物を増幅する。マウス特異的産物をプローブ  ６ＦＡＭ−ＧＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡ  ＡＣＣＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号３８）で検出する。ヒトＢ１受容体ｍＲＮＡに特異的なプライマー／プローブセットは、１個のエクソン内のマウス５’ＵＴＲと２番目のエクソン上に存在するヒトＢ１受容体コード配列との間のハイブリッドである転写産物を検出する。ヒトブラジキニンＢ１受容体ヌクレオチド配列の存在の指標である、このキメラ転写産物は、イントロン／エクソン境界部に及ぶ８２塩基対の産物を増幅する正プライマー  ５’−ＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＴ−３’（配列番号３９）及び逆プライマー  ５’−ＧＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡ−３’（配列番号４０）で検出する。マウス／ヒト産物は蛍光プローブ  ６ＦＡＭ−ＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号４１）で検出する。
【００７９】
各々の遺伝子型、すなわち、実施例４で述べたようにマウスゲノムＤＮＡの遺伝子型分析によって判定した、マウスＢ１受容体ＤＮＡ配列について野生型、ヒトＢ１受容体ＤＮＡ配列についてヘテロ接合又はホモ接合の３匹のマウスから組織を切除した。試料採取した組織は、脳、脊髄、回腸、胃、心臓、肺及び脾臓を含んだ。加えて、Ｂ１受容体機能を試験するために、実施例６で述べたＢ１受容体ｍＲＮＡの誘導を生じさせるようにインキュベートしておいた組織から、回腸及び胃底からの試料を入手した。これらの試料を誘導胃底又は誘導回腸と称した。ポリトロンを使用してＱｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴにおいて組織を均質化した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミディプレップキットを使用し、製造者（ＵＳＡ−Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）の述べているプロトコールに従って全ＲＮＡを調製した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｌｉｇｏｔｅｘ手順を用いて全ＲＮＡをさらにｍＲＮＡに精製した。ｍＲＮＡ試料をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で分析して、純度と量を判定した。このｍＲＮＡを使用して、製造者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡを精製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（ＵＳＡ−Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を用いて濃縮して、１ｎｇ／μｌに希釈した後、ＴａｑＭａｎ分析に供した。
【００８０】
ＴａｑＭａｎ反応は、１ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ５μｌ及び最終濃度２００ｎＭのプライマープローブ混合物５μｌから成った。プライマー／プローブ混合物は、マウス特異的正及び逆プライマーとマウス特異的プローブ又はマウス／ヒトハイブリッド特異的正及び逆プライマーとヒト特異的プローブから成った。全ての反応について、最終濃度２００ｎＭのＧＡＰＤＨプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を内部対照としてプライマー／プローブ混合物に含めた。２Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）１０μｌで総反応容量を２０μｌとした。反応は、９６穴様式で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、又は３８４穴様式で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した。各々の試料を３回試験した。各々の実験の一部として、げっ歯動物ＧＡＰＤＨを含むプラスミドＤＮＡ及びマウスＢ１受容体又はキメラマウス／ヒトＢ１受容体のいずれかを含むプラスミドＤＮＡの、各々の穴に付き１００，０００コピーから出発する１０倍連続希釈を実施することにより、各々のプライマー／プローブセットに関する５点標準曲線を作成した。まず適切な転写産物についての標準曲線に基準化し、次に各々の穴で検出されたＧＡＰＤＨの量に基準化することによってデータを解析した。各遺伝子型についての３匹の個々の動物の結果を合わせて、図６ＡからＣに示すように平均値と標準誤差をグラフで表わした。これらの結果は、マウス／ヒトＢ１受容体転写産物の発現のパターン及びレベルが内在性マウスＢ１受容体のものに類似することを示す。さらに、マウス／ヒトハイブリッド転写産物が内在性マウスＢ１受容体と同様にして誘導できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、ヒトＢ１ブラジキニン受容体のコード領域がマウスＢ１ブラジキニン受容体のコード領域を置換している、標的置換ベクターｐＢ１Ｒ−ＫＩ１（Ａ）及びｐＢ１Ｒ−Ｋ２（Ｂ）を示す。マウスＢ１ブラジキニン受容体５’及び３’領域は無傷のままであり、マウスｐＧＫプロモーターによって駆動されるｎｅｏｒ遺伝子は、この選択マーカーの選択後除去のためにｌｏｘＰ部位が側面配置されている。チミジンキナーゼ遺伝子は、陰性選択マーカーとして使用するために５’及び３’相同領域の外側に位置する。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、ヒトＢ１ブラジキニン受容体のコード領域がマウスＢ１ブラジキニン受容体のコード領域を置換している、標的置換ベクターｐＢ１Ｒ−ＫＩ１（Ａ）及びｐＢ１Ｒ−Ｋ２（Ｂ）を示す。マウスＢ１ブラジキニン受容体５’及び３’領域は無傷のままであり、マウスｐＧＫプロモーターによって駆動されるｎｅｏｒ遺伝子は、この選択マーカーの選択後除去のためにｌｏｘＰ部位が側面配置されている。チミジンキナーゼ遺伝子は、陰性選択マーカーとして使用するために５’及び３’相同領域の外側に位置する。
【図２】図２は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列によるマウスＢ１ブラジキニン受容体コード配列の直接置換のための方法を示す。標的遺伝子座への指定相同的組換えは、ヒトにおけるマウスコード領域置換並びにｌｏｘＰ部位が側面配置されたｐＧＫ−Ｎｅｏカセットを生じさせる。この指定遺伝子置換についてヘテロ接合又はホモ接合の細胞又はトランスジェニック動物の処置は、Ｃｒｅリコンビナーゼの投与によって又はこれらのトランスジェニック動物をＣｒｅリコンビナーゼ発現マウス系統と交配することによってｌｏｘＰが導入され得る。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、（Ａ）５’外側プローブで探査したマウスゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化産物（図２に示すような）のサザンブロット及び（Ｂ）置換マウスの作製を確認するためのＰＣＲ遺伝子型分類を示す。野生型（天然マウス）及びヒトＢ１受容体の両方に特異的なプライマーセットを開発した。マウス特異的反応は３１９ｂｐフラグメントを生産し、ヒト特異的反応は２０３ｂｐフラグメントを生じる。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、実験Ｎｏ．１に関する、ホモ接合マウスの（Ａ）胃底及び（Ｂ）胃回腸におけるＤＡＫ誘導収縮へのヒトＢ１受容体アンタゴニスト（化合物Ｎｏ．１）の作用を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、実験Ｎｏ．１に関する、ホモ接合マウスの（Ａ）胃底及び（Ｂ）胃回腸におけるＤＡＫ誘導収縮へのヒトＢ１受容体アンタゴニスト（化合物Ｎｏ．１）の作用を示す。
【図５】図５は、実験Ｎｏ．２に関する、ホモ接合マウス胃底におけるＤＡＫ誘導収縮へのヒトＢ１受容体アンタゴニスト（化合物Ｎｏ．１）の作用を示す。
【図６】図６ＡからＣは、定量的ＰＣＲを使用して測定した、（Ａ）野生型、（Ｂ）ヘテロ接合及び（Ｃ）ホモ接合トランスジェニックマウスの脳、心臓、正常回腸、誘導性回腸、誘導性胃底（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｕｎｄｕｓ）、肺、脊髄、脾臓及び胃におけるマウスＢ１ブラジキニン受容体ｍＲＮＡ（白い棒）及びヒトＢ１ブラジキニン受容体ｍＲＮＡ（斜線の棒）のレベルを示す。
【図１Ａ】
2007508814.tif 000007
【図１Ｂ】
2007508814.tif 000008
【図２】
2007508814.tif 000009
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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