(57)【要約】  液相に、互いに相互変換可能な第１化合物および第２化合物の少なくとも一方、ならびに、第１化合物と第２化合物の間の変換を触媒する少なくとも１種の触媒を含む、参照溶液を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液相に、
互いに相互変換可能な第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方；及び、
前記第１化合物と前記第２化合物の間の変換を触媒する少なくとも１種の触媒、
を含む、参照溶液。
【請求項２】
少なくとも１種の触媒が酵素である、請求項１に記載の参照溶液。
【請求項３】
酵素が加水分解酵素である、請求項２に記載の参照溶液。
【請求項４】
第１化合物がアミド又はエステルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の参照溶液。
【請求項５】
第１化合物がクレアチニンであり、第２化合物がクレアチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の参照溶液。
【請求項６】
少なくとも１種の触媒がクレアチニンアミドヒドロラーゼである、請求項５に記載の参照溶液。
【請求項７】
第１化合物が二酸化炭素であり、酵素が炭酸脱水酵素である、請求項２に記載の参照溶液。
【請求項８】
少なくとも１つの第１区画及び１つの別個の第２区画を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の参照溶液を保持する容器；
前記第１区画に含有されている液体第１相；及び
前記第２区画に含有されている第２相
を含むキットであって、ここで、前記第２相は、前記の第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方及び前記触媒を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項９】
容器がさらに別個の第３区画を含む請求項８に記載のキットであって、第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方が別個の第２区画に含有され、少なくとも１種の触媒が別個の第３区画に含有されている、前記キット。
【請求項１０】
区画間に流体連絡を提供することにより第２相を第１相に移動させる、請求項８または９に記載のキットの操作方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の参照溶液を保持する容器。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の参照溶液の調製方法であって、
液相に、
第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方；及び
少なくとも１種の触媒、
を加える段階、並びに、
前記触媒を加える前または後に、選択した温度について前記第１化合物及び前記第２化合物の平衡濃度を決定する段階、
を含む、前記調製方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、平衡濃度の決定段階が、
第１化合物及び第２化合物の合計濃度を測定すること；及び
それに基づき平衡濃度を計算すること、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、平衡濃度の決定段階が、
第１化合物及び第２化合物それぞれの濃度を測定すること；及び
それらに基づき平衡濃度を計算すること、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、平衡濃度の決定段階が、
少なくとも１種の触媒を加えた後に第１化合物及び第２化合物の平衡濃度を確立させること；
前記第１化合物及び前記第２化合物うちの一方の平衡濃度を測定すること；並びに、
それに基づき前記第１化合物及び前記第２化合物うちの他方の平衡濃度を計算すること、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、平衡濃度の決定段階が、
第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方を予め決定された量で液相に加えること；及び、
所望によりそれに基づき平衡濃度を計算すること、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の参照溶液を、第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方又はそれに基づき誘導されるパラメーターに感受性のセンサーの較正または品質管理に用いることを含む方法。
【請求項１８】
参照溶液を、センサーの較正または品質管理に先立ち、１８〜３２℃、好ましくは２０〜２５℃の温度範囲のコンディショニング温度でコンディショニングする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
参照溶液を、センサーの較正または品質管理に先立ち、０．１〜８時間、好ましくは０．１〜３時間のコンディショニング期間範囲の期間にわたりコンディショニングする、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照溶液、該参照溶液を保持する容器を提供するためのキット、該キットの操作方法、該参照溶液を保持する容器、該参照溶液の調製方法、および該参照溶液の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
試験流体においてパラメーターを測定するためのセンサーは、化学、生物学および生理学のさまざまな分野で幅広く用いられている。
センサーの測定値が正確であることを保証にするために、センサーは定期的に較正すべきである。センサーの較正は、通常、センサーの応答と予め決定されている参照材料のパラメーター値との対応を実験的に決定し、これに従ってセンサーを調整することを包含する。
【０００３】
センサーの性能品質も、センサーの測定値が正確であることを実験的に検証するために、定期的に管理すべきである。これは通常、参照材料の測定パラメーター値を同参照材料の許容範囲(acceptance range)と比較することにより行われる。
【０００４】
較正および日常的品質管理のための参照材料は、問題のパラメーターを示す化合物を含む。パラメーターは、粘度、密度、圧力および導電率などの物理的パラメーターでも、血液のような生理学的液体のガス、電解質もしくは代謝産物のｐＨまたは濃度などの化学的パラメーターでもよい。参照材料は、その寿命の全期間にわたり精密かつ定常的に該パラメーターを示すべきである。したがって、参照材料は、長期にわたり安定な濃度にある化合物、例えば化学平衡にある化合物を含んでよく、その規格を確実に満たすように厳密に管理された条件下で調製し貯蔵されるべきである。
【０００５】
場合によっては、そのような管理された調製および貯蔵条件は、規格を満たすのに十分ではないかもしれない。これは、平衡状態で存在し、互いに相互変換可能な２種の化合物を含む参照溶液の場合にあてはまる可能性がある。そのような２種の化合物間の平衡は、温度に依存する可能性がある。
【０００６】
もしそうであるなら、あらゆる温度変化が、参照溶液の化学組成を徐々に変化させる可能性がある。
そのような参照溶液の一つは溶解ガスを含有してもよい。この場合には、該ガスは、容器の上部空間内の気相と溶液中の溶解相とに分布し得る。そのような系では、２相間のガスの平衡分布は温度に依存する可能性がある。したがって、溶液を操作温度とは異なる温度で貯蔵する場合、ガスの分布は操作温度における平衡分布とは異なり得る。したがって、参照溶液は、操作温度に対応する２層間の平衡状態を確立するために、使用前に長期間のコンディショニングを必要とする可能性がある。
【０００７】
他のタイプの２相参照溶液は、部分的には溶質として且つ部分的には固相として存在し得る難溶性化合物を含む系である。これら２相間の分布は温度に依存し得る。また、該溶液も、操作温度における平衡状態を確立するために、使用前に長期間のコンディショニングを必要とする可能性がある。
【０００８】
さらに別の参照溶液では、２種以上の化合物が平衡状態で存在するような化学反応が関与する。例としては、グルタミンとグルタミン酸／グルタメートの系および二酸化炭素と炭酸の系、ならびにα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−グルコースの変旋光系(mutarotational system)が挙げられる。これらの化合物を含む参照溶液は、操作温度における平衡状態を確立するために、使用前に数日間、数カ月間、または数年間ものコンディショニングを要する可能性がある。
【０００９】
平衡状態にある２種の化合物を含むさらに他の例は、クレアチニンとクレアチンの系である。上記の例と同様に、これら２種の化合物間の平衡は数カ月間または数年間かけないと確立されないので、長期間のコンディショニングが必要となる可能性がある。
【００１０】
Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社への国際公開第ＷＯ０２／１４５３３号パンフレットには、クレアチニンセンサーの較正方法が開示されている。この方法によると、２種の較正溶液が用いられる。第１の較正溶液はクレアチニンの酸性溶液であり、これを最初に中和してから較正に用いる。しかし、この中和処理がこの方法を、日常作業として行うには不便なものとしている。第２の溶液は、特定温度に対応する平衡濃度にあるクレアチニンとクレアチンの溶液である。しかし、組成変化を避けるために、そのような溶液は、使用する直前に調製するか又は特定温度に保たねばならず、これらはともに日常的な使用という点では実用的ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、これまでにも相互変換可能な化合物を検出するための参照溶液が提案されてきたにもかかわらず、長期間コンディショニングおよび／または即時の調製を必要としない参照溶液が依然として必要とされている。したがって、本発明の目的は、そのような参照溶液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一側面において、液相に、互いに相互変換可能な第１化合物および第２化合物の少なくとも一方と、第１化合物および第２化合物間の変換に触媒作用を及ぼす少なくとも１種の触媒とを含む、参照溶液を提供する。
【００１３】
２種の相互変換可能な化合物に限定される従来の参照溶液と比較すると、本発明に従った参照溶液は、第１化合物と第２化合物の間の変換に触媒作用を及ぼす触媒も含有する。触媒は、第１化合物および第２化合物間の変換を促進し、参照溶液の操作温度における２種の化合物間の平衡状態の迅速な実現を確保する。したがって、本発明の参照溶液により、長期間のコンディショニングおよび即時の調製の必要性がなくなる。短縮されたコンディショニング期間の後、本発明の参照溶液は平衡状態にあり、その化学組成は、その温度から完全に決定することができる。このようにして、本発明の参照溶液は、例えば密封アンプルとして提供される場合のように、すぐ使用できる溶液として、容易に提供することができる。
【００１４】
使用前に、該参照溶液は、第１化合物および第２化合物のうち一方の化合物のみを含んでいてもよい。したがって、該溶液を一方の化合物のみ、すなわち第１化合物のみ又は第２化合物のみから調製する場合、触媒が存在し且つ該参照溶液が操作温度に到達すると、第１化合物および第２化合物間の平衡状態が迅速に確立される。
【００１５】
本出願で用いる“参照溶液”という用語は、センサーの較正および／または品質管理のための溶液を意味する。したがって、参照溶液は、それが対象としているセンサーの較正に用いることができ、および／または該センサーの品質管理に用いることができる。
【００１６】
“液相”という用語は、参照溶液の溶媒か、または例えば緩衝液か、または、相互変換可能な化合物以外の１種以上の化合物の溶液であって、該相互変換可能な化合物に対し参照溶液としても働くことができる溶液を意味する。
【００１７】
“化合物”という用語は、化学物質または化学物質の混合物を意味する。本発明によると、センサーにより測定される化学種は、実際は参照溶液の第１化合物および第２化合物のうちの一方であってよく、または第１および／もしくは第２化合物（単数又は複数）から誘導される反応生成物であってもよい。
【００１８】
第１化合物および第２化合物は、互いに可能であるべきである。本出願で用いる“互いに相互変換可能な”という用語は、二つの化合物が、いずれかの方向への化学反応により、互いに変換することができることを意味する。本発明によると、第１化合物および第２化合物は、異なる２相中の同一種、例えばガス状および溶解した二酸化炭素であってもよい。
【００１９】
参照溶液は、単独または組合わせで両方向の変換反応に触媒作用を及ぼす１種以上の触媒を含むことができる。したがって、触媒という用語は、両方向の変換反応に触媒作用を及ぼす単一の触媒か、又は、例えば、一方が一方向の変換反応を触媒し、他方が逆方向の変換反応に触媒作用を及ぼすような、２種の触媒の組合わせとすることができる。
【００２０】
変換反応を触媒するのに必要とされる触媒の量は、系の種類による。参照溶液の寿命の間に、ある程度の触媒活性の損失をもたらす触媒の分解が起こる可能性がある。したがって、触媒濃度は、参照溶液の寿命の全期間にわたり変換反応を触媒する程度に十分なものであるべきである。
【００２１】
触媒は、酵素、すなわち触媒作用を示すタンパク質であるか、酵素の活動に必要な補酵素であることができる。あるいは、触媒は、触媒作用を示す別の化合物であって、酵素の作用を模倣する化合物、例えば酵素模倣性ポリマー(enzyme-mimicking polymer)であることができる。
【００２２】
本発明に用いることができる変換反応の１タイプは、加水分解反応である。加水分解反応は、例えば加水分解酵素である酵素により触媒され得る。したがって、本発明の一態様において、触媒は加水分解酵素である。
【００２３】
アミドおよびエステルは、本発明に用いることができる化合物の群を示す。したがって、本発明の他の態様において、第１化合物はアミドまたはエステルである。
アミドまたはエステルが関与する加水分解反応および変換反応はともに、より実用的なコンディショニング期間と比較して、その反応速度がかなり遅い点に特徴がある。しかしながら、長期間の貯蔵中に、このような参照溶液は、なお著しい組成変化を受ける可能性がある。触媒がなければ、選択した操作温度において実用的な期限内に平衡状態は確立されない。このような参照溶液に触媒を加えると、コンディショニング期間を著しく短縮することができる。
【００２４】
第１化合物および第２化合物としてクレアチニン−クレアチンを含む参照溶液において、触媒は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ酵素、ＥＣ  ３．５．２．１０であり得る。この系において、関係するパラメーターは、クレアチニン、クレアチン、またはそれらから誘導されるパラメーターであり得る。
【００２５】
第１化合物および第２化合物としてグルタミン−グルタミン酸／グルタメートを含む参照溶液において、触媒は、グルタミナーゼ、ＥＣ  ３．５．１．２およびグルタミンシンセターゼ、ＥＣ  ６．３．１．２の酵素の１種以上であり得る。この系において、関係するパラメーターは、グルタミン、グルタミン酸もしくはグルタメート、またはそれらから誘導されるパラメーターであり得る。
【００２６】
第１化合物および第２化合物として二酸化炭素および炭酸を含む参照溶液において、触媒は、炭酸脱水酵素、ＥＣ  ４．２．１．１であり得る。この系において、関係するパラメーターは、二酸化炭素、炭酸、またはそれらから誘導されるパラメーターであり得る。
【００２７】
第１化合物および第２化合物としてα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコースの変旋光的系を含む参照溶液において、触媒は、アルドース１−エピメラーゼともよばれる酵素ムタロターゼ、ＥＣ  ５．１．３．３であり得る。この系において、関係するパラメーターは、２種のグルコース種のいずれか又はそれから誘導されるパラメーターであり得る。
【００２８】
本参照溶液は、相互変換可能な第１化合物及び第２化合物並びに触媒の他に、追加化合物を含んでもよい。該参照溶液は、１種以上の追加パラメーターを分析するための１種以上の追加センサーの較正および／または品質管理にそのまま用いることができる。したがって、該参照溶液は、例えば血液の第１および／もしくは第２化合物（単数または複数）又はそれらから誘導されるパラメーターを分析するためのセンサー用の参照溶液であることに加えて、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ｐＨ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、グルコース、ラクテート、尿素、ビリルビン、ヘモグロビンまたはヘモグロビンの任意の誘導体などの１種以上の更なる血液パラメーターに対しても用いることができる。このような参照溶液は複数のセンサーの較正および／または品質管理に用いることができ、これにより、必要な個々の参照溶液の数が減り、費用の節約になる。
【００２９】
本発明の他の側面は、本発明の参照溶液を保持する容器を提供するためのキットである。該キットは、少なくとも１つの第１区画および１つの別個の第２区画を有する容器；第１区画に含有されている液体第１相；ならびに、別個の第２区画に含有されている第２相を含み、ここにおいて、該第２相は、該参照溶液の第１化合物、第２化合物および触媒の少なくとも１種を含む。
【００３０】
本発明のキットにより、参照溶液中に包含される複数の相が可能になる。該キットでは、参照溶液を、使用する直前に分離されていた相を組み合わせることにより調製することができ、したがって、触媒寿命が乾式貯蔵により延長する。
【００３１】
“別個の区画”という用語は、容器の区画であって、容器の任意の他の区画内に保持されている任意の他の相と接触しないように相を保持するように構成された区画を意味する。
【００３２】
第１区画は、例えば緩衝液を保持するために用いることができ、第１化合物および第２化合物の１種以上ならびに触媒を、別個の第２区画に保持させることができる。あるいは、第１区画を、例えば第１および／もしくは第２化合物（単数または複数）の溶液を保持するために用いることができ、触媒を別個の第２区画に保持させることができ；または、第１区画を溶液中の触媒を保持するために用いることができ、第１および／もしくは第２化合物（単数または複数）を別個の第２区画に保持させることができる。
【００３３】
第１区画および第２区画は、２つの区画に保持されている相を効果的に分離するあらゆる形状をとることができる。したがって、例えば錠剤の包装に用いられるようなブリスターパックに関していうと、第２区画を、第２区画の外側表面に指圧を加えることにより破るか押しのけることができる薄壁によって第１区画から分離することができる。あるいは、第２区画を、例えば、先の尖った端を有するプランジャーを受容するように構成することができる。プランジャーを押し込むと、末端が第２区画の薄壁を貫通して第２区画から第１区画への流体の導管を形成し、これにより相が第２区画から第１区画へ送られる。
【００３４】
容器は、第１化合物および第２化合物の少なくとも一方が第２区画に含有され、触媒が第３区画に含有されるように、別個の第３区画を有していてもよい。本発明のこの態様によると、第１および／または第２化合物（単数または複数）は貯蔵中に触媒から分離される。第１区画を参照溶液の緩衝液を保持するために用いることができる一方、第１および／または第２化合物（単数または複数）を別個の第２区画に保持することができ、触媒を別個の第３区画に保持することができる。
【００３５】
容器は、上記３区画のほかに、例えば相互変換可能な第１化合物および第２化合物ならびに触媒以外の化合物を保持する追加的な別個の区画を含むことができる。
本発明の他の態様において、区画間に流体連絡(fluid communication)を提供することにより第２相を第１相に移動させるキットの操作方法を提供する。したがって、この方法によると、第１化合物および第２化合物の少なくとも一方ならびに触媒とを含有する第２相を液体第１相に移動させて、参照溶液を調製する。
【００３６】
本発明の他の側面において、参照溶液を保持する容器を提供する。該容器は、上記のように第１区画および別個の第２区画を含むことができる。該容器は、当分野で公知のような２区画のシリンジであってもよく、または、２区画のアンプルであってもよい。本発明の参照溶液は、１区画の容器、例えば１区画のアンプルで提供し、該容器内では第１化合物および第２化合物の少なくとも一方ならびに少なくとも１種の触媒のすべてが液相中で混合されるようにしてもよい。
【００３７】
本発明のさらに他の側面において、本発明の参照溶液の調製方法であって、該方法が、液相に、（ａ）第１化合物及び第２化合物の少なくとも一方、並びに（ｂ）少なくとも１種の触媒を加える段階；並びに、少なくとも１種の触媒を加える前または後に、選択した温度に対する第１化合物及び第２化合物の平衡濃度を決定する段階とを含む、前記調製方法を提供する。
【００３８】
段階（ａ）および（ｂ）は、任意の順序、すなわち、最初に段階（ａ）で次に段階（ｂ）、または最初に段階（ｂ）で次に段階（ａ）の順に実施することができる。
本出願でさらに用いる“平衡濃度”という用語は、参照溶液が所定温度において平衡状態にあるとき、すなわち、所定温度において第１化合物および第２化合物間に正味の変換がないときの、参照溶液中の第１化合物および第２化合物の濃度を意味する。
【００３９】
平衡濃度の決定段階は、（ａ）第１化合物および第２化合物の合計濃度を測定すること、及び（ｂ）それに基づき平衡濃度を計算することを含むことができる。
本出願で用いる“それに基づき平衡濃度を計算する”という用語は、第１化合物および第２化合物の合計濃度から、所定温度における各化合物の平衡濃度を算出することを意味する。算出は、平衡データ、例えば温度の関数としての平衡定数を包含する、所定のアルゴリズムに基づいて行うことができる。
【００４０】
第１化合物および第２化合物の合計濃度の決定は、溶液が平衡状態にあるか否かに依存しない。任意の正味の変換、例えば第１化合物から第２化合物への正味の変換は、２種の化合物の合計濃度に影響を及ぼさない。これは、第２化合物の濃度の上昇が、これに対応する第１化合物の濃度の低下により相殺されるためである。
【００４１】
本発明の他の態様において、平衡濃度の決定段階は、（ａ）第１化合物および第２化合物それぞれの濃度を測定すること、及び（ｂ）それらに基づき平衡濃度を計算することを含む。
【００４２】
本発明のさらに他の態様において、平衡濃度の決定段階は、（ａ）触媒を加えた後に第１化合物および第２化合物の平衡濃度を確立させること、（ｂ）化合物の一方の平衡濃度を測定すること、及び（ｃ）それに基づき他方の化合物の平衡濃度を計算することを含む。
【００４３】
本発明のこの態様において、参照溶液は平衡状態にあるべきであり、平衡状態は、相互変換可能な第１化合物および第２化合物間の変換に触媒作用を及ぼす触媒を添加して得られる。平衡状態が確立したら、第１化合物または第２化合物の一方の濃度を測定する。
【００４４】
本出願で用いる“それに基づき他方の化合物の平衡濃度を計算する”は、所定温度において第１化合物の平衡濃度から第２化合物の平衡濃度を算出することを意味する。算出は、平衡データ、例えば温度の関数としての平衡定数を包含する、所定のアルゴリズムに基づいて行うことができる。
【００４５】
その他の態様によると、平衡濃度の決定段階は、第１および／または第２化合物（単数または複数）を予め測定された量（単数または複数）で液相に加えること、及び、所望によりそれ（ら）に基づいて平衡濃度を計算することを含む。
【００４６】
本出願で用いる“予め測定された量（単数または複数）”は、第１および／または第２化合物（単数または複数）を、特定濃度（単数または複数）に相当する量（単数または複数；液相に加える前に例えば秤量手順により測定する）で、加えることを意味する。したがって、添加量は、参照溶液の操作温度における第１化合物および第２化合物の平衡濃度に相当する可能性がある。すなわち、調製したままの参照溶液は、平衡状態にあるか、又は、非平衡濃度に相当する可能性がある。後者の場合、平衡濃度を上記のように、すなわち、平衡データ、例えば温度の関数としての平衡定数を包含するアルゴリズムに基づいて、計算することができる。
【００４７】
本発明の別の側面において、本発明に従った参照溶液を、第１化合物および第２化合物の少なくとも一方またはそれらから誘導されるパラメーターを感じるセンサーの較正または品質管理に用いる。
【００４８】
本出願で用いる“センサー”という用語は、関心のある化学種と選択的に相互作用することができ、それにより、該特定化学種の望ましい特性の関数であり、明確かつ測定可能な応答をもたらす、あらゆる種類のデバイスを意味する。
【００４９】
関連するタイプのセンサーは、例えば先に述べたパラメーターのいずれかを決定するように構成されたもの、例えば、応答が電位の形で現れる電位差センサー(potentiometric sensor)；応答が電流の形で現れる電流センサー；光学センサー；圧電センサー；温度センサー；圧力変化センサー(pressure-change sensor)；音響センサー、またはそれらの任意の組合わせである。
【００５０】
本参照溶液は、触媒の分解が最小限に抑えられる低温で貯蔵することができる。この温度において、相互変換可能な化合物間の平衡は、参照溶液の操作温度におけるそれらの平衡と比較してシフトしている可能性がある。
【００５１】
コンディショニング温度における平衡状態を確立するために、参照溶液を、センサーの較正または品質管理に先立ち、１８〜３２℃、好ましくは２０〜２５℃の温度範囲でコンディショニングする。コンディショニング温度は操作温度に相当し得る。
【００５２】
参照溶液は、０．１〜８時間、好ましくは０．１〜３時間の範囲の期間にわたりコンディショニングすることができる。
本出願で用いる“コンディショニング”という用語は、参照溶液を所定温度に調整されるようにすることを意味する。したがって、コンディショニングは、溶液を所定温度、例えば周囲温度に放置することにより、または参照溶液を加熱もしくは冷却要素(heating or cooling element)により加熱もしくは冷却することにより実施することができる。コンディショニングはまた、参照溶液を提供するキットで行ってもよい。参照溶液を操作温度に近い温度で貯蔵する場合、コンディショニングの必要性はなくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下に、第１化合物および第２化合物がそれぞれクレアチニンおよびクレアチンであり、触媒が、クレアチニンとクレアチンの間の変換を触媒する酵素である、本発明の態様を記載する。
【００５４】
図１は、本発明に従った参照溶液を保持する容器を提供するためのキットを示している。
図２は、酵素の存在下および非存在下での参照溶液のコンディショニング時のクレアチニン濃度対時間に関する比較データを示している。
【００５５】
クレアチニンすなわち２−イミノ−１−メチルイミダゾリジン−４−オンは、脊椎動物の筋肉中でリン酸結合エネルギーの貯蔵および伝達に重要な役割を果たすクレアチンすなわちα−メチル−グアニド酢酸の分解産物である。これらの化合物は、（１）に示すように、互いに相互変換可能である。
【００５６】
【化１】
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【００５７】
血液および尿中のクレアチニンレベルは、腎機能に関する有用な情報を提供する。正常な血中クレアチニン濃度は小児で２０〜８０μＭ、成人で５０〜１３０μｍの範囲にあるが、腎不全または尿毒性症候群を患う個人では１５００μＭにも達することがある。
【００５８】
クレアチニンレベルを決定するために、クレアチニンからクレアチンへの加水分解に基づく酵素的アッセイが開発されている。そのようなアッセイの一つでは、クレアチニンをクレアチンに変換し、このクレアチンをサルコシンに変換し、このサルコシンをグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に酸化する。このようなアッセイについては、例えば国際公開第ＷＯ０２／１４５３３号パンフレットを参照のこと。その後、過酸化水素の濃度を電流測定により決定する。このセンサー系は、クレアチンの濃度を決定するための電極１本と、クレアチニンとクレアチンの合計濃度を決定するための別の電極を含む、二重電極系である。該アッセイにより、クレアチニンおよびクレアチンの合計濃度とクレアチンの濃度との差からクレアチニンの濃度を決定することが可能になる。
【００５９】
クレアチニンとクレアチンの間の非触媒的変換は遅いものの重要である。２５℃、ｐＨ＝７．４におけるクレアチニンからクレアチンへの一次変換に関する速度定数は、２．４×１０−３ｄ−１である。逆反応に関しては、速度定数は１．４×１０−３ｄ−１である。４０℃において、速度定数はそれぞれ１０．１×１０−３ｄ−１および８．５×１０−３ｄ−１である。６℃において、速度定数はそれぞれ２．２×１０−４ｄ−１および０．８×１０−４ｄ−１である。非触媒的変換に必要な時間は、そのまま、日数、月数または年数単位で測定してよい。
【００６０】
クレアチニン−クレアチン系に関し触媒作用を示す酵素はクレアチニンアミドヒドロラーゼであり得るが、これはクレアチニナーゼともよばれる。この酵素は、例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社により供給されるようなものであり、約８０ＩＵ／ｍｇの酵素活性を有し、１〜１２ＩＵ／ｍＬの範囲の濃度で参照溶液に加えることができる。
【００６１】
参照溶液中のクレアチニンとクレアチンの合計濃度は５０〜２０００μＭの範囲にあることができ、これは、周囲温度において約２０〜７５０μＭの範囲のクレアチニン濃度および約３０〜１２５０μＭの範囲のクレアチン濃度に相当する。この範囲のクレアチニン濃度は、それぞれ２０〜８０μＭおよび５０〜１３０μＭである小児および成人の参照範囲(reference range)、ならびに約２００μＭの腎不全および約５００μＭの腎障害の発症レベルを包含しており、したがって、幅広い範囲での実用性を示す。
【実施例】
【００６２】
図１を参照すると、１．５ｍｍのポリエチレンから作成された容器１００は、別個の２区画１１０および１２０を含む。大きい方の区画１１０は２５０ｍＬの容量を有し、ｐＨ＝７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液を２００ｍＬ保持する。小さい方の区画１２０は、５．７ｍｇのクレアチニン、１１．２ｍｇのクレアチンおよび１５００ＩＵのクレアチニンアミドヒドロラーゼの混合物を保持する。小さい方の区画１２０は、６０μｍのポリエステル膜１３０により、大きい方の区画１１０から分離されている。
【００６３】
小さい方の区画１２０の外側表面に中程度の指圧を加えると、膜１３０は、大きい方の区画１１０内に押しのけられ、クレアチニン、クレアチンおよびクレアチニンアミドヒドロラーゼが、大きい方の区画１１０内の緩衝液中に移動する。該溶液は、２５℃の操作温度で３時間コンディショニングした後、すぐに用いることができる。このように調製した参照溶液中のクレアチニンおよびクレアチンの濃度は、それぞれ２５０μＭおよび４２５μｍである。
【００６４】
比較対照研究では、Ａ、ＢおよびＣと表示した３種の容器を上記のように用意し、クレアチニンおよびクレアチンの濃度をＨＰＬＣにより測定した。その後、容器を６℃で１年間貯蔵した。１年間貯蔵後、容器（Ａ）は６℃でさらに１４日間貯蔵し、続いて２５℃で３時間コンディショニングした。容器（Ｂ）は２５℃でさらに１４日間貯蔵し、続いて２５℃で３時間コンディショニングした。第三の容器（Ｃ）は４０℃でさらに１４日間貯蔵し、続いて２５℃で３時間コンディショニングした。
【００６５】
３種の容器Ａ、ＢおよびＣすべてにおけるクレアチニンとクレアチンの濃度を、ＨＰＬＣと上記タイプの較正済みのクレアチニン／クレアチンセンサーにより決定した。クレアチニンおよびクレアチンの濃度は、２５℃においてそれぞれ２５０μＭおよび４２５μMであった、すなわち、濃度は、調製したままの溶液と比較して変化していなかった。
【００６６】
比較のために、酵素を含まないが、その他の点では対応物であるＡ、ＢおよびＣと同一の参照溶液を含有し、Ａ’、Ｂ’およびＣ’と表示した追加の３種の容器を、Ａ、ＢおよびＣと同様の条件下で貯蔵およびコンディショニングした。
【００６７】
容器Ａ’（６℃）からの試料では、クレアチニンおよびクレアチンの濃度はそれぞれ２４３μＭおよび４３２μＭであった。容器Ｂ’（２５℃）からの試料では、クレアチニンおよびクレアチンの濃度はそれぞれ２４３μＭおよび４３２μＭであった。容器Ｃ’（４０℃）からの試料では、クレアチニンおよびクレアチンの濃度はそれぞれ２６０μＭおよび４１５μＭであった。この比較検討によって、酵素を含有しない溶液では、クレアチニン／クレアチンの相対組成が、それらの平衡組成、すなわち２５℃における組成から著しく逸脱し得ることが示された。
【００６８】
図２は、１年間にわたる２５℃での長期コンディショニング中の容器ＡおよびＡ’からの試料に関するクレアチニン濃度対時間を示している。このコンディショニング期間中に、ＡおよびＡ’のクレアチニン濃度を、上記のようにｔ＝０分、ｔ＝１５分、ｔ＝６０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１０００分（約１７時間）、ｔ＝１００００分（約７日）、ｔ＝１０００００分（約７０日）、およびｔ＝５２５６００分（１年）において測定した。
【００６９】
ｔ＝０分、すなわちコンディショニング期間の開始時に、ＡおよびＡ’のクレアチニン濃度はそれぞれ１７９μＭおよび２４３μＭであった。１７９μＭのＡの濃度は、６℃の貯蔵温度での平衡濃度に相当する、すなわち、コンディショニング期間の開始時からこの溶液は平衡状態にある。触媒作用を示す酵素を含有しないＡ’の参照溶液では、このことはあてはまらない。６℃での１年間の貯蔵中に、Ａ’中の溶液のクレアチニン濃度は、最初の濃度の２５０μＭと比較して２４３μＭまで低下した。しかしながら、これは、平衡レベルの１７９μＭをなお大きく上回っていた。
【００７０】
ｔ＝１２０分において、ＡおよびＡ’のクレアチニン濃度はそれぞれ２５０μＭおよび２４３μＭであった。したがって、ｔ＝１２０分において、Ａの参照溶液はすでにその２５℃における平衡状態に達していたが、Ａ’の参照溶液はコンディショニング期間の開始時の濃度と比較して変化していなかった。
【００７１】
ｔ＝５２５６００分、すなわち１年間のコンディショニング後、ＡおよびＡ’のクレアチニン濃度はそれぞれ２５０μＭおよび２４８μＭであった。したがって、この長期コンディショニング期間の後であっても、Ａ’の参照溶液はまだ平衡状態に達していなかった。
【００７２】
この比較検討によって、触媒作用を示す酵素の存在が、平衡の確立に必要なコンディショニング期間を著しく短縮することができ、触媒作用を示す酵素の非存在下においては、平衡の確立がまったく実現可能であり得ないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明に従った参照溶液を保持するためのキットを示す図である。
【図２】酵素の存在下および非存在下での参照溶液のコンディショニング時のクレアチニン濃度対時間に関する比較データを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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