(57)【要約】  本発明は、癌細胞に結合し、細胞ローリング及び転移といったような生理学的現象の中で重要である抗体又はそのフラグメントを提供する。かかる抗体又はそのフラグメントを使用する治療及び診断方法及び組成物も同様に提供される。本発明に従った方法及び組成物は、治療薬をターゲティングする上で、及び腫瘍の成長及び転移、白血病、自己免疫疾患及び炎症性疾患を含めた癌などの疾病の診断、予後診断及び病期診断において使用可能である。同様に提供されているのは、重鎖ｃＤＲ３においてのみ多様性をもつ、相補性結合のためのさまざまな抗原結合ドメインを有する免疫グロブリン結合ドメインライブラリである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ1及びＸ6が疎水性アミノ酸でありＸ2、Ｘ3及びＸ5が任意のアミノ酸である、
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｐro−Ｘ5−Ｘ6
というコンセンサス配列を含む抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
疎水性アミノ酸がロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン及びイソロイシンから成る群から選択されている、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
Ｘ2が塩基性アミノ酸である、請求項１に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項４】
塩基性アミノ酸がアルギニン及びリジンから成る群から選択されている、請求項３に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項５】
Ｘ2及びＸ3がアルギニンである、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】
Ｘ6がイソロイシンである、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】
Ｘ1がロイシン及びメチオニンから成る群から選択され、Ｘ5がセリン及びバリンから成る群から選択されている、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】
コンセンサス配列がその超可変領域内にある、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】
相補的決定領域（ＣＤＲ）がコンセンサス配列の少なくとも一部分を含んでいる、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１０】
ＣＤＲがその重鎖である、請求項９に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１１】
配列番号９、１０、１３、１４、２８及び３１から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１２】
配列番号１７及び配列番号１８から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１３】
配列番号９、１０、１３、１４、２８及び３１から成る群から選択された第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）；配列番号１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖ＣＤＲ及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む第３の重鎖ＣＤＲを含んで成る、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１４】
配列番号５、６、５５、５６、６０及び６１から成る群から選択された１配列を含んで成る、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１５】
ＰＳＧＬ−１、ＧＰＩｂ及び／又はＣＣＲ５の硫酸化エピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１６】
２つ以上のエピトープと交差反応し、各々のエピトープが単数又は複数の硫化チロシン残基を有する、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１７】
各エピトープは２つ以上の酸性アミノ酸の少なくとも１つのクラスタを含んで成る、請求項１５に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１８】
α−２−アンチプラスミン；アミノペプチダーゼＢ；ＣＣ−ケモカイン受容体；７−膜内外セグメント（７ＴＭＳ）受容体；凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ及びＩＸ；フィブリノーゲンガンマ鎖；ヘパリン補因子ＩＩ、セクトグラニンＩ及びＩＩ；ビトロネクチン、アミオイド前駆体、α−２−アンチプラスミン；コレシストキニン；α−コリオゴナドトロピン；補体Ｃ４；デルマタンスルファートプロテオグリカン；フィブロネクチン；及びカストリンから成る群から選択されたタンパク質上に存在する単数又は複数の位置において硫酸化された単数又は複数のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１９】
ＣＣ−ケモカイン受容体が、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ８及びＣＣＲ２ｂから成る群から選択されている、請求項１８に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２０】
Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、転移細胞、Ｔ−ＡＬＬ細胞、ＡＭＬ  細胞、血小板、顆粒球、リンパ球及び単球から成る群から選択された少なくとも１つの細胞型上のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２１】
血小板凝集に結合しかつこれを阻害する、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２２】
配列番号９、１０、２８及び３１の少なくとも１つを含んで成る、請求項２１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２３】
さらに、脂質、炭水化物、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖体分子上のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２４】
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント及び薬学的に許容可能な担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント及び造影剤を含む、診断、予後診断又は病期診断用キット。
【請求項２６】
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメントをコードする単離又は精製済みＤＮＡ配列。
【請求項２７】
請求項２４に記載の単離又は精製済みＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを含む組換え型宿主細胞。
【請求項２９】
該抗体又はそのフラグメントを発現する、請求項２８に記載の組換え型宿主細胞。
【請求項３０】
該抗体又はそのフラグメントの発現を可能にする条件下で請求項２８に記載の組換え型宿主細胞を培養する段階を含む、抗体又はそのフラグメントの産生方法。
【請求項３１】
組換え型宿主細胞又はその培地から該抗体又はそのフラグメントを単離又は精製する段階をさらに含んで成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｘ1及びＸ6が疎水性アミノ酸であり、Ｘ2、Ｘ3及びＸ5が任意のアミノ酸である、
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｐro−Ｘ5−Ｘ6
というコンセンサス配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項３３】
ポリペプチドが実質的に環状又はループ状である請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ポリペプチドが硫酸化ＰＳＧＬ−１、ＧＰ１ｂ及び／又はＣＣＲ５に結合し、ポリペプチドが配列番号５、６、５５、５６、６０又は６１のｓｃＦｖ抗体又はそのフラグメントのものと実質的に類似した親和力で結合している、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、疾病を治療する方法。
【請求項３６】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、細胞ローリングを治療する方法。
【請求項３７】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、感染症を治療する方法。
【請求項３８】
感染症がＨＩＶによりひき起こされている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
投与がＨＩＶの進入を防止する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、炎症を治療する方法。
【請求項４１】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、自己免疫疾患を阻害する方法。
【請求項４２】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、転移を阻害する方法。
【請求項４３】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害する方法。
【請求項４４】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、腫瘍細胞の死亡率を増加させる方法。
【請求項４５】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害する方法。
【請求項４６】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、白血病細胞の死亡率を増加させる方法。
【請求項４７】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、Ｂ−ＣＬＬ細胞の成長及び／又は複製を阻害する方法。
【請求項４８】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、白血病細胞の死亡率を増大させる方法。
【請求項４９】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、抗疾病剤による損傷に対する罹患細胞の感受性を改変する方法。
【請求項５０】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、抗癌剤による損傷に対する腫瘍細胞の感受性を増大させる方法。
【請求項５１】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、抗白血病剤による損傷に対する白血病細胞の感受性を増大させる方法。
【請求項５２】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、抗白血病剤による損傷に対するＢ−ＣＬＬ細胞の感受性を増大させる方法。
【請求項５３】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、血小板凝集を阻害する方法。
【請求項５４】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、再狭窄を阻害する方法。
【請求項５５】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）を惹起する方法。
【請求項５６】
ＡＤＣＣがナチュラルキラー（ＮＫ）又は単球細胞から成るエフェクタ細胞により媒介される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、白血病細胞内のアポトーシスを惹起する方法。
【請求項５８】
必要としている患者に対し請求項２４に記載の医薬組成物を投与する段階を含んで成る、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＴ細胞を刺激する方法。
【請求項５９】
疾病を治療するための医薬品の製造における請求項２４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６０】
患者の体内の疾病を診断、予後診断又は病期診断する方法において、
−  患者由来の細胞を含有する試料を提供する段階、及び
−  請求項１に記載の抗体又はそのフラグメントが患者の細胞に結合するか否かを決定し、かくして該患者に該疾病のリスクがあること又は該患者が該疾病を患っていることを標示する段階、
を含んで成る方法。
【請求項６１】
−  患者由来の細胞を含有する試料を提供する段階、及び
−  請求項１に記載の抗体又はそのフラグメントと患者由来の細胞をインキュベートする段階、
を含む、患者由来の腫瘍細胞をパージする方法。
【請求項６２】
−  パージングがエクスビボで行なわれる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗体又はそのフラグメント又はポリペプチドを選択するための方法において、
（ａ）ファージディスプレーライブラリを提供する段階；
（ｂ）配列番号７、４４及び５３から成る群から選択されたペプチドを提供する段階；
（ｃ）配列番号７、４４、５０及び５３から成る群から選択されたペプチドに結合するｓｃＦｖ抗体又はそのフラグメントを選択するべくファージディスプレーライブラリをパニングする段階；及び
（ｄ）選択されたｓｃＦｖ抗体又はそのフラグメントを産生する段階、
を含んで成る方法。
【請求項６４】
選択されたｓｃＦｖ抗体又はそのフラグメントが、配列番号７、４４及び５３から成る群から選択されたペプチドを結合させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ペプチドが固定化されている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
配列番号２６、４３、４４、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５７、５８及び５９から成る群から選択されている少なくとも１つの可溶性ペプチドの存在下でパニングする段階、
を段階（ｃ）がさらに含んで成る、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
選択された抗体又はそのフラグメントが配列番号２６、４８又は４９を結合させない、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
選択された抗体又はそのフラグメントが配列番号４３を結合させない、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
選択された抗体又はそのフラグメントが配列番号５１、５２又は５４を結合させない、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
請求項６３に記載の方法に従って産生された抗体又はそのフラグメント。
【請求項７１】
相補的結合のためのさまざまな抗原結合ドメインを含む免疫グロブリン結合ドメインライブラリにおいて、重鎖ＣＤＲ３でのみ多様性を有するライブラリ。
【請求項７２】
免疫グロブリン結合ドメインがｓｃＦｖ分子である、請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７３】
免疫グロブリン結合ドメインが、ＤＰ３２から誘導された重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１及び２を含む、請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７４】
免疫グロブリン結合ドメインがＤＰ３２から誘導された軽鎖可変領域を含む、請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７５】
免疫グロブリン結合ドメインが糸状バクテリオファージ粒子の表面上で表示される、請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７６】
硫酸化されたエピトープについて選択を行なう方法において、
−  請求項７１に記載のライブラリを提供する段階；
−  抗原結合ドメインに結合する硫酸化エピトープについてライブラリをパニングする段階、及び
−  硫酸化エピトープを単離する段階、
を含んで成る方法。
【請求項７７】
小分子がＰＳＧＬ−１、ＧＰＩｂ及び／又はＣＣＲ５の硫酸化エピトープに結合する、無機小分子。
【請求項７８】
請求項７７に記載の無機小分子を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌細胞、転移細胞、白血病細胞、白血病及び血小板といったような細胞上に存在し、かつ細胞ローリング、転移、炎症及び自己免疫疾患といったようなさまざまな生理学的現象において重要である特定のエピトープに結合する抗体に関する。より特定的には、該抗体は、抗癌活性、抗転移活性、抗白血病活性、抗ウイルス活性、抗感染活性、及び／又は、その他の疾病例えば炎症性疾患、自己免疫疾患、ＨＩＶ感染、心臓血管疾患例えば心筋梗塞、網膜症疾患及び硫酸化チロシン依存性タンパク質−タンパク質相互作用によりひき起こされる疾病に対する活性を有することができる。さらに、本発明の抗体は、体内の特定の細胞又は部位に向かって治療薬を導くためのターゲティング剤としても使用できる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗体、ファージディスプレー及び組織ターゲティング
【０００３】
治療薬の組織選択的ターゲティングは、製薬業界における新興の研究分野である。ターゲティングに基づく新しい癌治療が、毒性を低減させながら治療の特異性及び効力を増大させ、かくして全体的な効能を増強させるように設計されてきた。標的毒素、放射性ヌクレオチド及び化学療法接合体を腫瘍に対しターゲティングしようとして、腫瘍関連抗原に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）が利用されてきた。さらに、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ２５といったような分化抗原が造血器悪性腫瘍の治療における癌特異的標的として開発利用されてきた。
【０００４】
大規模に研究されてきたにもかかわらず、このアプローチには、いくつかの制限がある。１つの制限は、選択的結合を表示する適切なＭＡｂｓを単離することのむずかしさにある。第２の制限は、うまく抗体を単離するための前提条件として高い抗体免疫原性が必要であるということにある。第３の制限は、最終産物が免疫応答を誘発する非ヒト配列を有するということにある。たとえば、ヒトに対してマウスＭＡｂが与えられた場合、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が生成されることになる。ＨＡＭＡ応答は往々にしてより短かい血清半減期を結果としてもたらし、反復的治療を妨げ、かくして抗体の治療的価値を低減させる。この後者の制限は、マウス由来のキメラ又はヒト化モノクローナル抗体を工学処理することと同時にヒト抗体を発見することに対する関心を刺激してきた。このアプローチのもう１つの制限は、それが、唯一の既知の及び精製された抗原に対して導かれた唯一の抗体種の単離を可能にするということにある。その上、この方法は、それが、正常な細胞と同様に悪性の細胞上にも存在する細胞表面マーカーに対する抗体の単離を可能にする限りにおいて、選択的ではない。
【０００５】
癌を治療するためのＭＡｂｓの治療的効能に影響を及ぼす因子が数多く存在する。これらの因子には、腫瘍細胞上の抗原の特異性とレベル、抗原の不均一性及び腫瘍塊のアクセス可能性が含まれる。癌腫といったような中実腫瘍に比べて、白血病及びリンパ腫は一般に抗体での治療に対するより高い応答性を示してきた。ＭＡｂは、血流中で白血病及びリンパ腫細胞に急速に結合し、リンパ組織内で悪性細胞に容易に進入し、かくしてリンパ系腫瘍をＭＡｂベースの療法に対するすぐれた候補にしている。理想的な系は、悪性後代細胞を産生している基幹細胞の細胞表面上のマーカーを認識するＭＡｂの同定をひき起こす。
【０００６】
抗体、ホルモン及び受容体といったような単離された予め決定された標的タンパク質に結合する無作為の一本鎖変異体フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を選択するためにファージライブラリが使用される。さらに、抗体表示ライブラリ全般、そして特にファージｓｃＦｖライブラリの使用は、特異的な、それでも未認識で未決定の細胞表面部分をターゲティングするためのユニークな分子を発見する代替的手段を容易にする。
【０００７】
白血病、リンパ腫及び骨髄腫は、骨髄及びリンパ組織内に由来する癌であり、細胞の無制御成長に関与している。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、特異的な臨床的及び免疫学的特徴によって定義される不均一性疾患である。ＡＬＬのその他の形態と同様、Ｂ細胞ＡＬＬ（Ｂ−ＡＬＬ）の大部分の症例の決定的な原因はわかっていない。しかしながら、数多くの症例において、該疾病は、単一細胞のＤＮＡ内の後天的遺伝子改変の結果としてもたらされ、異常及び連続的増加をひき起こす。Ｂ−ＡＬＬを患う患者の予後は、小児においても成人においても、その他の白血病患者の場合に比べ著しく悪い。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、リンパ球の数の増加を特徴とする、緩徐進行性の白血病形態である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、正常な状態で骨髄性系の末端分化細胞（赤血球、顆粒球、単球及び血小板）を発生させる始原細胞を伴う不均質な新生物群である。その他の新生組織形成形態の場合と同様にＡＭＬは、単数又は複数のタイプの早期脊髄分化を示す、比較的未分化の芽細胞と正常に分化した脊髄細胞の置換を結果としてもたらす後天的遺伝子改変に結びつけられる。ＡＭＬは一般に、骨髄内で進行し、より低い程度で二次的造血器官内において進行する。ＡＭＬには主として成人が罹患し、１５〜４０才の間で発生率がピークに達するが、小児及びこれより高齢の成人の両方が罹患するものとしても知られている。ほぼ全てのＡＭＬ患者は、異常なレベルの循環未分化芽細胞の徴候が全く無い臨床的寛解に達するために、診断直後の治療を必要とする。
【０００８】
これまでに、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性を誘発するためにさまざまなＭＡｂｓが開発されてきた。ＨＥＲ２（Ｐ１８５）の細胞外ドメインに対して産生され、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を著しく阻害することがわかっているマウスＭＡｂｍｕＭａｂ４Ｄ５は、ＦＤＡにより承認され現在ヒトの乳癌を治療するのに使用されている薬物ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）を生産するためにヒト化された（米国特許５，８２１，３３７号及び５，７２０，９５４号）。結合の後、抗体は、ＨＥＲ２成長因子受容体に依存する腫瘍細胞成長を阻害する能力をもつ。さらに、リンパ腫に関連づけされるものを含めた末梢Ｂ細胞の急速な枯渇をひき起こすＣＤ２０、Rituxan（登録商標）（リツキシマブ）に対するキメラ抗体が、近年ＦＤＡによって承認された（米国特許５，８４３，４３９号）。標的細胞に対するこの抗体の結合は、結果として補体依存性溶解をもたらす。この製品は、最近承認され、現在、低グレードのＢ細胞非ホジキンリンパ腫を治療するため、診療所で使用されつつある。
【０００９】
いくつかのその他のヒト化及びキメラ抗体が開発中であるか、又は臨床試験中である。さらに、正常な骨髄性細胞ならびに大部分のタイプの骨髄性白血病細胞の両方の上で発現されるＣＤ３３抗原と特異的に反応するヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）が、抗癌薬カリチアマイシン、ＣＭＡ−６７６に対し接合された（Sievers et al., Blood Supp. ３０８：５０４ａ（１９９７））。薬物ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）として知られているこの接合体は、近年ＦＤＡの承認を受けた（Caron et al., Cancer Supp.７３：１０４９−５６（１９９４））。その細胞溶解活性に照らし合わせて、現在臨床試験中である付加的な抗ＣＤ３３抗体（Hum Ｍ１９５）が、ゲロニン毒素（McGraw et al., Cancer Immunol. Immunother. ３９：３６７−７４（１９９４））及び放射性同位体131Ｉ（Caron et al., Blood ８３：１７６０−６８（１９９４））、90Ｙ（Jurcic et al., Blood Supp. ９２：６１３ａ（１９９８））及び213Ｂｉ（Humm et al., Blood Supplement３８：２３１Ｐ（１９９７））を含む複数の細胞傷害作用物質に接合された。
【００１０】
白血球抗原ＣＤ４５（ｃＨｕＬｙｍ３）に対するキメラ抗体が、ヒトの白血球及びリンパ腫の治療のために臨床研究されている（Sun et al., Cancer Immunol, Immunother.４８：５９５−６０２（２０００））。インビトロ検定においては、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）検定（Henkart, Immunity １：３４３−４６（１９９４）；Squier and Cohen, Current Opin. Immunol. ６：４４７−５２（１９９４））が観察された。
【００１１】
その標的に対するより高い親和力を有し、より安定となりかつ最適なバイオディストリビューション生物分布を有するように、治療用抗体も同じく特異的に工学処理されてきた。例えば（Presta, Current Pharma. Biotechnol., ３：２３７−５６（２００２）；Presta et al., Biochem. Society Transactions, ３０（４）：４８７−９０（２００２）を参照のこと。
【００１２】
マウスモノクローナルヒト化及びキメラ抗体の構築とは対照的に、ファージディスプレー技術の使用は、完全にヒトの配列を有するｓｃＦｖｓの単離を可能にする。ファージディスプレー技術から誘導された、ｓｃＦｖクローンに基づくヒトＴＧＦα−２受容体に対する完全にヒトの抗体が最近開発された。ＴＧＦａ−２（Thompson et al., J.Immunol. Meth.２２７：１７−２９（１９９９））の結合と競合する能力をもつ完全にヒトのＩｇＧ４へと転換されたこのｓｃＦｖは、強い抗増殖活性を有する。当業者にとって既知であるファージディスプレー技術は、Smith, Science２２８：１３１５（１９８５）；Scott et al., Science ２４９：３８６−９０（１９９０）；Cwirla et al., ＰＮＡＳ８７：６３７８−８２（１９９０）；Devlin et al., Science ２４９：４０４−０６（１９９０）；Griffiths et al., ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（１４）：３２４５−６０（１９９４）；Bass et al., Proteins ８：３０９−１４（１９９０）；McCafferty et al., Nature ３４８：５５２−５４（１９９０）；Nissim et al., ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：６９２−９８（１９９４）；米国特許５，４２７，９０８、５，４３２，０１８、５，２２３，４０９及び５，４０３，４８４号といった刊行物中でより特定的に記述されている。
【００１３】
単離されたｓｃＦｖ抗体分子のためのリガンド
血小板、フィブリノーゲン、ＧＰＩｂ、セレクチン及びＰＳＧＬ−１（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１）は各々、複数の病原性身体条件又は疾病状態、例えば異常な又は病原性の炎症、異常な又は病原性の免疫反応、自己免疫反応、転移、異常又は病原性の接着、血栓症及び／又は再狭窄及び異常又は病原性の凝集において重要な役割を果たしている。かくして、血小板と及びこれらの分子と交差反応する抗体が、これらの及びその他の病原性身体条件が関与する疾病及び障害の診断及び治療において有用であると思われる。
【００１４】
血小板
血小板は、特徴が充分に明らかにされた血液系の成分であり、止血、血栓症及び／又は再狭窄においていくつかの重要な役割を果たす。血管に対する損傷は、一連の逐次的事象により特徴づけされる、止血として知られるプロセスを発動する。損傷を受けた血管に対する初期反応は、血管の内部表面上の罹患領域に対する血小板の接着である。次の段階は、止血血栓を形成し血管壁を封止する、以前に接着した血小板上への多数の血小板層の凝集である。止血血栓はさらにフィブリン重合体の被着により強化される。凝血塊又は血栓は、損傷が修復された時点で初めて分解される。循環血小板は、巨核球の周辺から放出された細胞質粒子である。かくして、血小板は止血中で重要な役割を果たす。血管の傷害の時点で、血小板は損傷を受けた組織表面に接着し互いに付着し合う（凝集 Cohesion）。この事象シーケンスは急速に発生し、血管傷害部位で無組織塊（一般に血小板血栓又は血栓と呼ばれる）を形成する。Aggregation（凝集）とも呼ばれる凝集（cohesion）現象は、さまざまな物質又はアゴニスト例えばコラーゲン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、エピネフリン、セロトニン及びリストセチンによってインビトロで開始され得る。凝集は、血小板の機能の尺度として実施される数多くのインビトロ試験の１つである。
【００１５】
転移における血小板の重要性
腫瘍の転移は、おそらく、癌患者の生存を制限する最も重要な因子である。蓄積されたデータは、宿主血小板と相互作用する腫瘍細胞の能力が転移の不可欠な決定因子の１つを表わすことを示している（Oleksowicz, Thrombosis Res. ７９：２６１−７４（１９９５））。
【００１６】
血小板を凝集させる腫瘍細胞の能力が腫瘍細胞の転移潜在性と相関関係をもつことが実証され、腫瘍により誘発される血小板凝集の阻害がげっ歯類モデルにおける転移の抑制と相関関係をもつことが示されてきた。血小板との腫瘍細胞の相互作用には、膜粘着分子及びアゴニストの分泌が関与することが実証されてきた。免疫関係血小板糖タンパク質の発現が、腫瘍細胞系列上で固定されてきた。血小板免疫関連糖タンパク質ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩｂ／ＩＸ及びインテグリンαｖサブユニットが、乳房の腫瘍細胞系列の表面上で発現されることが実証された（Oleksowicz,（１９９５）、前出；kamiyama et al., J. Lab. Clin. Med. １１７（３）：２０９−１７（１９９１））；
【００１７】
Gasic et al.（ＰＮＡＳ６１：４６−５２（１９６８））は、抗体誘発された血小板減少が、ＣＴ２６結腸腺癌、ルイス肺癌腫及びＢ１６黒色腫により生成される転移の数及び体積を著しく低減させることを示した（Karpatkin et al., J. Clin. Invest.８１（４）：１０１２−１９（１９８８）；Clezardin et al., Cancer Res. ５３（１９）：４６９５−７００（１９９３））。さらに、単一のポリペプチド鎖（６０ｋｄ）が、ＧＰＩｂに密に関連し不完全に又は異常にＯ−グリコシル化されたＧＰＩｂαサブユニットに対応するＨＥＬ細胞の表面膜上で発現されることがわかった（Kieffer et al., J.Biol. Chem. ２６１（３４）：１５８５４−６２（１９８６））。
【００１８】
同様に転移プロセスにも血小板が関与している。転移癌細胞が血流中に入った時点で、腫瘍細胞をコーティングする白血球及び血小板から成る多細胞複合体が形成される。微小塞栓と呼ぶことのできるこれらの複合体は、腫瘍細胞が免疫系から逃れるのを助ける。血小板による腫瘍細胞のコーティングには、血小板によるＰ−セレクチンの発現が必要とされる。
【００１９】
ＧＰＩｂ複合体
止血プロセスにおける各段階は、血小板表面上の受容体の存在を必要とする。止血において重要な１つの受容体が糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ複合体（ＣＤ４２としても知られている）である。この受容体は、内皮下層内のフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の部位における血管壁に対する血小板の接着（初期付着）を媒介する。それは同様に、止血における（a）動脈狭窄領域内の高いせん断によって誘発される血小板の凝集及び（ｂ）トロンビンの低濃度により誘発される血小板活性化というその他の２つの血小板機能においてきわめて重要な役割を有する。
【００２０】
ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、血小板血漿膜の外部表面の主要な成分の１つである。ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、３つの膜貫通ポリペプチドすなわち、ＧＰＩｂのジスルフィド連結された１３０ｋＤａのα鎖及び２５ｋＤａのβ鎖及び非共有会合ＧＰＩＸ（２２ｋＤａ）を含む。全てのサブユニットは、ＣＤ４２複合体の効率の良い細胞表面発現及び機能のため、血小板膜上で等モル量で提示され、１つの複合体の３つのサブユニットの適切な組立てが血漿膜上の完全な発現のために必要とされる、ということを示している。ＧＰＩｂのα鎖は、３つの全く異なる構造ドメインすなわち（１）ロイシン反復配列、及びＣｙＳ結合したフランキング配列を含む球状Ｎ末端ペプチドドメイン；（２）高度にグリコシル化されたムチン様マクログリコペプチドドメイン及び（３）ＧＰＩｂα膜内外及び細胞質配列に対するジスルフィド架橋を含む膜会合Ｃ末端領域から成る。
【００２１】
複数の証拠が、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体のトロンビン結合ドメインとｖＷＦがＧＰＩｂαのアミノ末端において約３００のアミノ酸を包含する球状領域内に常在するということを示している。ヒト血小板ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、血小板の機能と反応性の両方を媒介する主要な膜受容体である。ＧＰＩｂによる内皮下層結合ｖＷＦの認識は、血小板が損傷を受けた血管に接着できるようにする。さらに、ＧＰＩｂαに対するｖＷＦの結合は、細胞骨格又はホスホリパーゼＡ２とＧＰＩｂ−ＩＸとの細胞質ドメインの相互作用が関与しうる血小板活性化をも誘発する。その上、ＧＰＩｂαは、α−トロンビンのための高親和力結合部位を含み、このため、まだほとんど定義されていないメカニズムによる血小板の活性化が容易になっている。
【００２２】
セレクチン及びＰＳＧＬ−１
Ｐ−、Ｅ−及びＬ−セレクチンは、その他の機能の中でも、血管内皮上の白血球のローリングを媒介する接着分子ファミリーの成員である。Ｐ−セレクチンは、血小板中の顆粒内に貯蔵され、トロンビン、ヒスタミン、ホルボールエステル又はその他の刺激分子による活性化の後表面に輸送される。Ｐ−セレクチンは同様に、活性化された内皮細胞上でも発現される。Ｅ−セレクチンは、内皮細胞上で発現され、Ｌ−セレクチンは、好中球、単球、Ｔ細胞及びＢ細胞上で発現される。
【００２３】
ＰＳＧＬ−１（ＣＤ１６２とも呼ばれる）は、ＧＰＩｂと構造類似性を共有するＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン及びＬ−セレクチンのためのムチン糖タンパク質リガンドである（Afshar-Kharghan et al.（２００１）。前出）。ＰＳＧＬは、ＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸転換酵素）分割部位を有するジスルフィド連結されたホモ二量体である。ＰＳＧＬ−１の細胞外部分は、３つのＮ連結型グリコシル化部位を含み、数多くのシアリル化、フコシル化Ｏ連結型オリゴ糖分枝を有する（Moore et al., J. Biol. Chem. １１８：４４５−５６（１９９２））。Ｎ−グリカン部位の大部分及び数多くのＯ−グリカン部位が占有されている。ヒトＨＬ−６０細胞からのＰＳＧＬ−１のＯ−グリカンの構造は決定済みである。これらのＯ−グリカンのサブセットは、セレクチンに対する結合のために必要とされるコア−２、シアリル化及びフコシル化構造である。
【００２４】
ＰＳＧＬ−１は、２６７残基細胞外領域、２５残基膜内外領域及び６９残基細胞内領域を伴って、ＨＬ６０細胞内に３６１個の残基を有する。ＰＳＧＬ−１は、細胞表面上にジスルフィド結合型ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する（Afshar-Kharghan et al., Blood９７：３３０６−１２（２００１））。ＰＳＧＬ−１をコードする配列は、単一のエクソン内にあり、従って、代替的スプライシングは可能であるはずがない。しかしながら、ＨＬ６０細胞中及び大部分の細胞系列中のＰＳＧＬ−１は、細胞外領域内に存在する１０個の残基コンセンサス配列の１５の連続的反復を有するが、多形核白血球、単球及び大部分の未変性白血球を含めた複数のその他の細胞系列内にはこの配列の反復が１４〜１６存在している。
【００２５】
ＰＳＧＬ−１は、好中球上で、２５０ｋＤａ及び１６０ｋＤａの両方の見かけの分子量をもつ二量体として発現されるが、一方ＨＬ６０上では、二量体形態は、およそ２２０ｋＤａである。分子質量の差異は、異なる数の十量体反復の存在によってひき起こされる分子中の多形現象に起因し得る（Leukocyte Typing ＶＩ, 編集；T.Kishimoto et al.（１９９７））。
【００２６】
ＰＳＧＬ−１は同様に、好中球、単球、白血球、Ｂ細胞サブセット及び全てのＴ細胞といった大部分の血液白血球上で発現される（Kishimoto et al.（１９９７）、前出）。ＰＳＧＬ−１は、活性化された内皮上、活性化された血小板上及びその他の白血球及び炎症性部位上で白血球のローリングを媒介し、Ｐ−セレクチン上で好中球のローリングを媒介する。ＰＳＧＬ−１は同様に、Ｌ−セレクチンとの結合を介して好中球−好中球相互作用をも媒介でき、かくして炎症を媒介する（Snapp et al., Blood ９１（１）：１５４−６４（１９９８））。
【００２７】
白血球ローリングは、炎症において重要であり、（傷害部位で固定化されうる血小板上でかつ活性化された内皮により発現される）Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１の間の相互作用は、血管壁上の白血球の係留（tethering）及びローリングのために役立つ（Ramachandran et al., ＰＮＡＳ９８（１８）：１０１６６−７１（２００１）；Afshar-Kharghan et al.（２００１）、前出）。細胞ローリングは転移においても重要であり、内皮細胞上のＰ及びＥ−セレクチンは、転移細胞を結合して血流から周囲の組織内への管外遊出を容易にすると考えられている。
【００２８】
かくして、ＰＳＧＬ−１は全ての白血球上すなわち好中球、単球、リンパ球、活性化された末梢Ｔ細胞、顆粒球、好酸球、血小板上及び一部のＣＤ３４陽性基幹細胞及び或る種のＢ細胞サブセット上に発見された。Ｐ−セレクチンは、活性化された血小板及び内皮細胞上で選択的に発現される。Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１の間の相互作用は、血管壁上の白血球のローリングを促進し、血管部位における白血球の異常な蓄積は、さまざまな病原性炎症を結果としてもたらす。ＰＳＧＬ−１上の個々の硫酸チロシンの立体特異性貢献は、ＰＳＧＬ−１に対するＰ−セレクチンの結合にとって重要である。結合にとっては電荷も同じく重要である。すなわちＮａＣｌの減少（１５０から５０ｍＭ）は、結合を増強させた（Ｋｄ〜７５ｎＭ）。ＰＳＧＬ−１上のチロシン−硫酸化はＰ−セレクチン上のＰＳＧＬ−１の接着を増強するが、究極的に必要とされるものではない。ＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化は、全てのせん断速度でより緩慢なローリング接着を支援し、はるかに高いせん断速度でローリング接着を支援する（Rodgers et al., Biophys. J.８１：２００１−０９（２００１））。その上、血小板上でのＰＳＧＬ−１発現は、白血球内で２５〜１００分の１低いことが示唆されてきたFrenette et al., J. Exp. Med.１９１（８）：１４１３−２２（２０００））。
【００２９】
ヒトＰＳＧＬ−１に対する市販のモノクローナル抗体ＫＰＬ１が生成され、ＰＳＧＬ−１とＰ−セレクチン間及びＰＳＧＬ−１とＬ−セレクチン間の相互作用を阻害することが示された。ＫＰＬ１エピトープは、ＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化領域（ＹＥＹＬＤＹＤ）（配列番号１）に対してマッピングされた（Snapp et al., Blood９１（１）：１５４−６４（１９９８））。
【００３０】
シアリル化、フコシル化されたムチンリガンドを除去するＯ−シアログリコプロテアーゼでの腫瘍細胞の前処理は同様に、腫瘍細胞−血小板複合体形成を阻害した。インビボ実験は、これらの処理のいずれかが、循環する腫瘍細胞とより大きな単球会合を結果としてもたらすことを示しており、血小板結合の減少が循環腫瘍細胞に対する免疫細胞によるアクセスを増大させることを示唆している（Varki and Varki, Braz. J. Biol. Red. ３４（６）：７１１−１７（２００１））。
【００３１】
フィブリノーゲン
正常なヒトフィブリノーゲンの２つの形態、すなわち各々正常な個体内で見い出される正常な（γ）及びγ′が存在する。より豊富な形態である（体内に見られる全フィブリノーゲンの約９０％）である正常フィブリノーゲンは、２つの同一の５５ｋＤａのβ鎖、２つの同一の９５ｋＤａのβ鎖及び２つの同一の４９．５ｋＤａのγ鎖から成る。さほど豊富でない形態（体内に見られる全フィブリノーゲンの約１０％）である正常な変異体フィブリノーゲンは、２つの同一の５５ｋＤａのβ鎖、２つの同一の９５ｋＤａのβ鎖、１つの４９．５ｋＤａのγ鎖及び１つの変異体５０．５ｋＤａのγ′鎖から成る。ガンマ及びガンマダッシュ鎖は両方共、３′末端で代替的スプライシングが、発生している状態で、同じ遺伝子によってコードされる。正常なガンマ鎖は、アミノ酸１−４１１から成り、正常な変異体ガンマ、ダッシュ鎖は、４２７個のアミノ酸から成り、そのうちアミノ酸１−４０７は正常なガンマ鎖内のものと同じであり、アミノ酸４０８〜４２７はＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２）である。この領域は通常、トロンビン分子で占有されている。
【００３２】
フィブリノーゲンは、血液の凝集を生み出すべくイオン化カルシウムの存在下でトロンビンの作用によってフィブリンに転換される。フィブリンは同様に、血栓、及び急性炎症性滲出液の１成分である。
【００３３】
タンパク質硫酸化
タンパク質硫酸化は、糖側鎖又はポリペプチド主鎖のいずれかに対する硫酸塩の酵素的共有結合付着が関与する広く見られる翻訳後修飾である。この修飾は、トランス−ゴルジ区画内に発生する。かかるタンパク質は、分泌タンパク質、顆粒に対し標的されたタンパク質、及び血漿膜タンパク質の細胞外領域を含む。チロシンは、現在硫酸化を受けるものとして知られているアミノ酸残基であるKehoe et al., Chem Biol.７：Ｒ５７−６１（２０００））。その他のアミノ酸、例えばトレオニンも同様に、特に罹患した細胞内で、硫酸化を受ける。
【００３４】
ＧＰＩｂに関しては、ＧＰＩｂの負荷電Ｎ末端球状ドメインは、硫酸化を受けるものとして知られている３つのチロシン残基を含む。血小板及び巨核球により発現されｖＷＦとの結合を介して内皮下層に対する血小板の付着及びその上でのローリングを媒介するＧＰＩｂα（ＣＤ４２）は同様に、Ａsp−２６９とＡsp−２８７の間に負電荷アミノ酸のクラスタを含有する。このように高い酸性及び親水性の環境は、チロシルタンパク質スルフォトランスフェラーゼが酸性アミノ酸残基に隣接するチロシンを特異的に認識し硫酸化することから、硫酸化のための前提条件であると考えられている（Bundgaard et al., J.Biol. Chem.２７２：２１７００−０５（１９９７））。ＧＰＩｂαの酸性領域の完全な硫酸化は、顕著な負荷電密度（すなわち１９アミノ酸ストレッチ内に１３の負電荷）をもつ領域を生成し、それをその他のタンパク質との静電相互作用の候補部位にしている。複数の証拠が、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体を発現するトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞内及び血小板ＧＰＩｂα内で、このドメイン内に含まれた３つのチロシン残基（Ｔyr−２７６、Ｔyr−２７８及びＴyr−２７９）が硫酸化を受けるということを示している。
【００３５】
ＰＳＧＬ−１に関しては、このタンパク質は３つの潜在的な硫酸部位（分子のＮ末端ドメインにある３つのチロシン残基の各々の上）とそれに続いてプロリン、セリン及びトレオニン内で高い１０〜１６の十量体反復を有する。
【００３６】
ＰＳＧＬ−１の硫酸化は、Ｐ−セレクチンの結合に関係するものとして知られており、ＰＳＧＬ−１上の個々の硫酸チロシンの立体特異的貢献は、ＰＳＧＬ−１に対するＰ−セレクチンの結合にとって重要である。しかしながら、少なくとも１つのチロシン残基の硫酸化がＰ−セレクチン結合にとって重要であるといういくつかの指摘が存在する（J. Biol.Chem, Vol.２７３、１２、７０７８−８７）。ＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化は、全てのせん断速度でより緩慢なローリング接着を支援し、はるかに高いせん断速度でローリング接着を支援する（Rodgers et al., Biophys. J.８１：２００１−０９（２００１））。
【００３７】
硫酸化されたＮ末端チロシンが、標的細胞内へのヒト及びサルの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ）の進入のための関連する７膜内外セグメント（７ＴＭＳ）受容体との補助受容体として役立つＣＣＲ５といったＣＣ−ケモカイン受容体の役割に影響を及ぼすことも考えられている。例えば、硫酸化Ｎ末端チロシンは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＨＩＶ−１ｇｐ１２０／ＣＤ４複合体に対するＣＣＲ５の結合及びＣＣＲ５及びＣＤ４を発現する細胞に進入するＨＩＶ−１の能力に貢献すると考えられている。もう１つの重要なＨＩＶ−１コ受容体であるＣＸＣＲ４も同様に硫酸化されている（Farzan et al., Cell９６（５）：６６７−７６（１９９９））。チロシン硫酸化は、ＣＣＲ５依存性進入に比べＣＸＣＲ４依存性ＨＩＶ−１進入においてさほど有意でない役割を果たし、かくしてＣＸＣ−ケモカインファミリ内でのチロシン硫酸化のために役割を果たしている可能性を実証しており、又、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４のＨＩＶ−１の利用における一般的な差異を強調している（Farzan et al., J. Biol. Chem.,２７７（３３）：２９、４８４−８９（２００２））。
【００３８】
ＰＳＧＬ−１及び／又はＧＰＩｂに結合する抗体が、ファージライブラリを用いて同定され、米国出願第１０／０３２，４２３；１０／０３２，０３７；１０／０２９，９８８；１０／０２９，９２６；０９／７５１，１８１；１０，１８９，０３２；及び６０／２５８，９４８号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９，４４２号及びＰＣＴ／ＵＳ０１／４９，４４０号内で開示された。これらの出願において開示された抗体の特定的例には、Ｙ１、Ｙ１７及びＬ３２抗体が含まれている。これらの抗体は、生殖細胞系（ＤＰ３２）から単離され、Ｎ末端チロシンにおいて硫酸化され例えば腫瘍転移といった細胞移動に関与すると考えられている造血細胞のタンパク質上に発見されるエピトープに特異的に結合することが発見された。
【００３９】
以前にＹ１／Ｙ１７／Ｌ３２に結合するものとして同定された硫酸化エピトープは、好ましくは、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、接着、血栓症及び／又は再狭窄、細胞ローリング及び凝集といったさまざまなプロセス内で重要な役割を果たすリガンド及び受容体上に見い出される２つ以上の酸性アミノ酸のクラスタ内部の硫酸化チロシン残基又は硫酸化炭水化物又は脂質部分といったような硫酸化部分の存在によって、特徴づけされる。かかるエピトープは同様に、Ｔ−ＡＬＬ細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移細胞といったような罹患細胞上にも見られる。
【００４０】
これらのエピトープは、これらのプロセスの治療的媒介（ならびにターゲティング作用物質）及び診断手順のための有用な標的である。
【００４１】
目的
本発明の目的は、細胞ローリング、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移及びＨＩＶ進入といったようなプロセスにおいて役立つさまざまな分子上に存在するエピトープに結合する抗体及びポリペプチドを提供することにある。
【００４２】
本発明は同様に、接着、血栓症及び／又は再狭窄及び血小板凝集といったプロセスに関与するエピトープに結合しかつ、心筋梗塞及び再狭窄といったような心臓血管疾患の治療のため及び炎症性疾患のために使用できる抗体及びポリペプチドを提供することをも目的とする。
【００４３】
本発明のもう１つの目的は、ＡＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ−白血病、Ｂ−ＣＬＬ、Ｐre−Ｂ−ＡＬＬ、多発性骨髄腫、転移、ＨＩＶ感染、心臓血管疾患、又は細胞ローリング；炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移といったような細胞機能又は作用が有意な役割を果たすその他の疾病といったような個体のさまざまな疾病状態を診断、予後診断又は病期診断するための方法において抗体及びポリペプチドを利用することにもある。さらに、本発明のこれらの抗体は、特定の細胞又は部位に治療薬を導くためのターゲティング作用物質として使用できる。
【００４４】
本発明のもう１つの目的は、例えばＡＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ−白血病、Ｂ−ＣＬＬ、Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、多発性骨髄腫、転移、ＨＩＶ感染、心臓血管疾患、又は細胞ローリング、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移といったような細胞機能又は作用が有意な役割を果たすその他の疾病といったようなさまざまな疾病状態のための治療方法を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、腫瘍細胞のパージ方法を提供することにある。
【００４５】
本発明の目的は、ＡＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ−白血病、Ｂ−ＣＬＬ、Ｐre−Ｂ−ＡＬＬ、多発性骨髄腫、転移、ＨＩＶ感染、再灌流傷害及び動脈硬化を含めた心臓血管疾患、又は細胞ローリング、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移といったような細胞機能又は作用が有意な役割を果たすその他の疾病といったようなさまざまな疾病状態の治療のための医薬品を製造する上で使用するための抗体及びポリペプチドを提供することにもある。
【００４６】
本発明の目的は、Ｔ−細胞、ＮＫ細胞を刺激しかつ／又は抗体依存性細胞傷害及び／又はアポトーシスを刺激する抗体及びポリペプチドを提供することにもある。
【００４７】
本発明の目的は、細胞ローリング、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、ＨＩＶ進入、接着、血栓症、再狭窄及び血小板凝集といったプロセスに関与する抗体を発現するポリペプチド、発現ベクター及び組換え型宿主細胞を提供することにもある。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、特定的にはｓｃＦｖ分子である免疫グロブリン結合ドメインのライブラリを提供することにある。
【００４９】
該発明のこられの及びその他の目的が本書において提供される。
【発明の開示】
【００５０】
発明の要約
【００５１】
本発明は、Ｘ1及びＸ6が疎水性アミノ酸であり、Ｘ2、Ｘ3及びＸ5が任意のアミノ酸であり、Ｘ2が好ましくは塩基性アミノ酸であり、かつコンセンサス配列がＮ末端からＣ末端まで又はＣ末端からＮ末端まで配置されている、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Pro−Ｘ5−Ｘ6（配列番号３）というコンセンサス配列を含む抗体及びポリペプチドを提供する。該コンセンサス配列は、好ましくは該抗体の超可変領域内にあり、より好ましくはＣＤＲ３領域内にある。好ましくは、コンセンサス配列は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を除外する。本発明はさらに、配列番号５又は配列番号６のｓｃＦｖ抗体の結合能力をもつ抗体及びポリペプチドを提供する。
【００５２】
本発明はさらに、抗体又はポリペプチドを産生するためのプロセスにおいて、ファージディスプレーライブラリを提供する段階、配列番号４のｓｃＦｖ抗体フラグメントの結合能力をもつ抗体及びポリペプチドに結合する配列番号７のペプチドを提供する段階、配列番号７のペプチドに結合するｓｃＦｖ抗体フラグメントについてファージディスプレーライブラリをパニングする段階；及び配列番号７のペプチドに結合するｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む抗体又はポリペプチドを産生する段階を含んで成るプロセスを提供する。
【００５３】
本発明は同様に、免疫グロブリン結合ドメインライブラリ、特定的には相補的結合のためのさまざまな抗原結合ドメインを含むｓｃＦｖ分子のライブラリにおいて、重鎖ＣＤＲ３内にのみ多様性を有するライブラリをも提供する。
【００５４】
本発明は同様に、本発明の抗体及びポリペプチドを含む薬学組成物も提供している。これらの薬学組成物は、細胞ローリング；炎症；自己免疫疾患；血小板凝集；再狭窄；ＨＩＶ感染；転移；腫瘍細胞の成長及び／又は複製；及び白血病細胞の複製に関する又はこれらが関与する身体条件を含むさまざまな身体条件を治療、診断、予後診断又は病期診断するために使用することができる。これらの薬学組成物は、細胞ローリングを阻害する；炎症を阻害する；自己免疫疾患を阻害する；血小板凝集を阻害する；再狭窄を阻害する；ＨＩＶ感染を阻害する；転写を阻害する；腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害して腫瘍細胞の死亡率を増大させる、白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害して白血病細胞の死亡率を増大させる；抗疾病剤による損傷に対する罹病細胞の感受性を改変させる；抗癌剤による損傷に対する腫瘍細胞の感受性を増大させる；抗白血病剤による損傷に対する白血病細胞の感受性を増大させる；腫瘍を有する患者の体内の腫瘍細胞の数の増加を阻害する；癌を有する患者の体内の腫瘍細胞数を減少させる；白血病を有する患者の体内の白血病細胞数の増加を阻害する；及び白血病を有する患者の体内の白血病細胞数を減少させる、ために使用することができる。
【００５５】
本発明はさらに、ＡＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ−白血病、Ｂ−ＣＬＬ細胞、Ｐre−Ｂ−ＡＬＬ、多発性骨髄腫、転移、ＨＩＶ感染、心臓血管疾患、又は細胞ローリング、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移といったような細胞機能又は作用が有意な役割を果たすその他の疾病といったような個体のさまざまな疾病状態の治療のための医薬品を製造する方法をも提供している。
【００５６】
本発明は同様に、患者由来の細胞を含有する試料を提供し、かつ本発明の抗体又はポリペプチドが患者の細胞に結合するか否かを判定し、かくしてその患者がその疾病のリスクをもつか又はその疾病を有していることを標示することによって、患者の体内の疾病を診断、予後診断又は病期診断する方法をも提供する。
【００５７】
本発明は同様に、患者由来の細胞を含有する試料を提供し、患者由来の細胞を本発明の抗体又はポリペプチドと共にインキュベートすることにより、患者由来の腫瘍細胞をパージする方法をも提供する。
【００５８】
定義
抗体（Ａｂｓ）又は免疫グロブリン（Ｉｇｓ）は、抗原に結合するタンパク質分子である。天然に発生する抗体の各々の機能的結合単位は、ジスルフィド結合によって一緒に連結された４つのポリペプチドペプチド（重鎖２個と軽鎖２個）の単位から成る。鎖の各々は定常領域と可変領域を有する。天然に発生する抗体は、その重鎖成分に基づいてＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む複数のクラスに分割され得る。ＩｇＧクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4を含む（ただしこれらに制限されない）複数のサブクラスを包含している。免疫グロブリンは、Ｂ−リンパ球によってインビボで産生され、各々のこのような分子は、特定の異種抗原決定基を認識し、その抗原の一掃を容易にする。
【００５９】
抗体は、抗体複合体を含め、数多くの形態で産生され使用され得る。本書で使用されている「抗体複合体（単複）」という語は、もう１つの抗体又は抗体フラグメント（単複）と単数又は複数の抗体の複合体を意味するべく使用されている。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ及びＦｄフラグメントが含まれる。従って、本発明に従った抗体は、その抗体又はフラグメントの複合体を包含している。
【００６０】
本書で明細書及び特許請求の範囲内で使用されているように、Ｆｖというのは、同じものであるか又は異なるものでありうる、ヒト抗体の重鎖の可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域で構成され、その中で重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に接続、連結、融合又は共有結合付着されているか又はそれと会合させられている分子として定義される。Ｆｖは、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）であり得る。ｓｃＦｖは、フレキシブルなアミノ酸ポリペプチドスペーサ又はリンカーによって連結される、抗体の重鎖及び軽鎖の各々の可変ドメインから成る。リンカーは、有枝又は未分枝であり得る。好ましくは、リンカーは０〜１５のアミノ酸残基、そして最も好ましくは（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（配列番号８）である。
【００６１】
Ｆｖ分子自体は、各々第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第１鎖と第２鎖から成る。軽鎖及び重鎖の可変ドメイン内部の超可変ループは、相補的決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。重鎖及び軽鎖の各々の中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。これらの領域は、抗原結合部位を形成すると考えられており、増強した結合活性を生成するべく特定的に修飾可能である。これらの領域のうち現実に最も可変的であるのは、重鎖のＣＤＲ３である。ＣＤＲ３は、Ｌｇ分子の最も露呈された領域であるものと理解されており、本書に示され提供されているように、観察される選択的及び／又は特異的結合特性の主たる原因となる部位である。
【００６２】
Ｆｖ分子のフラグメントは、もとのＦｖよりも小さく、しかもなおもとのＦｖの選択的及び／又は特異的結合特性を保持している任意の分子として定義される。かかるフラグメントの例としては、（１）Ｆｖの重鎖のみのフラグメントを含むミニボディ、（２）抗体重鎖可変領域の小さな分画単位を含むミクロボディ（国際出願第ＰＣＴ／ＩＬ９９／００５８１号）、（３）軽鎖のフラグメントをもつ類似のボディ及び（４）軽鎖可変領域の機能的単位を有する類似のボディが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００６３】
本書で使用されているように、「Ｆａｂフラグメント」という用語は、免疫グロブリンの一価抗原結合フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖及び重鎖の一部分から成る。
【００６４】
Ｆ（ａｂ′）2フラグメントは、ペプシン消化によって得られる免疫グロブリンの２価の抗原結合フラグメントである。それは、両方の軽鎖及び両方の重鎖の一部を含有する。
【００６５】
Ｆｃフラグメントは、免疫グロブリンの非抗原結合部分である。それは、重鎖のカルボキシ末端部分及びＦｃ受容体のための結合部位を含有する。
【００６６】
Ｆｄフラグメントは、免疫グロブリンの重鎖の可変領域及び第１の定常領域である。
【００６７】
ポリクローナル抗体は免疫応答の産物であり、一定数の異なるＢ−リンパ球によって形成される。モノクローナル抗体は、１つのクローナルＢ細胞から誘導される。
【００６８】
疎水性アミノ酸は、一般にバリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、及びグリシン（Ｇ）である。塩基性アミノ酸は一般にアルギニン、ヒスチジン及びリジンである。
【００６９】
ポリペプチドに適用され本発明内で定義されているカセットというのは、１つの枠組として役立ち単一の単位としてみなされそのように操作される連続的なアミノ酸の一定の与えられた配列を意味する。アミノ酸を、一方又は両方の端部で、置換、挿入、除去又は付着することが可能である。同様にして、アミノ酸ストレッチを一方の端部又は両方の端部で置換、挿入、除去又は付着することができる。
【００７０】
「エピトープ」という用語は、本書では、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体又はその結合フラグメント又はＴ細胞受容体をもつ複合体と相互作用する抗原決定基又は認識部位又は抗原部位を意味するべく使用されている。エピトープという用語は、本書では、リガンド、ドメイン及び結合領域という用語と互換的に使用される。
【００７１】
選択性という語は、本書では、その全ての実体又は実体状態がターゲティング分子に特異的であり得る、実体又は実体状態の混合物から、１つの実体又は細胞状態を選択し結合するターゲティング分子の能力として定義づけされる。
【００７２】
本書に使用されている「親和力」という語は、結合分子（例えば抗体上の１結合部位）とリガンド（例えば抗原決定基）の間の結合強度（会合定数）の１つの尺度である。抗体上の単一抗原結合部位と単一エピトープの間の非共有結合相互作用の総体的結果が、そのエピトープに対する抗体の親和力である。低親和力抗体は抗原を弱く結合させ、容易に解離する傾向をもつが、一方、高親和力の抗体は、抗原をより密に結合させ、より長く結合状態にとどまらせる。「結合活性」という用語は、それが抗原−抗体相互作用の結合価を反映していることから、親和力と異なる。
【００７３】
抗体−抗原相互作用の特異性：  抗原−抗体反応は特異的であるものの、一部のケースでは、１つの抗原により惹起される抗体は、もう１つの関係のない抗原と交差反応し得る。このような交差反応は、２つの異なる抗原がその相同な又は類似の構造、エピトープ又はアンカー領域を共有する場合に、又は１つのエピトープに特異的な抗体が、類似の構造、立体構造又は化学特性を有する無関係のエピトープに結合する場合に起こる。
【００７４】
血小板というのは、骨髄洞内を流れ、その後末梢血流内を循環する巨核球の円板状の細胞質フラグメントである。血小板は、凝固における主要な役割を含め複数の生理学的機能を有する。血小板は、中心に位置設定された顆粒及び末梢の明らかな原形質を含有するが、明確な核を全くもたない。
【００７５】
本書では、アグルチネーションという用語は、懸濁した細菌、細胞、円板又は類似のサイズのその他の粒子を接着させて凝集塊を形成させるプロセスを意味する。このプロセスは、沈降に類似しているが、粒子はさらに大きく、溶解状態ではなく懸濁状態にある。
【００７６】
凝集は、インビトロで誘発される血小板及びトロンビンとコラーゲンの、血栓又は止血血栓の形成を導く逐次的メカニズムの一部としてのクランピングを意味する。
【００７７】
保存的アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質又はそのフラグメントの１つ又は２つのアミノ酸を変更することによるアミノ酸組成物の変化として定義づけされる。置換というのは、その置換が実質的にペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の特性（例えば電荷、等電点、親和性、結合活性、立体構造、溶解度）又は活性を改変しないような、一般的な類似の特性（例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正荷電又は負荷電、極性、非極性）を伴うアミノ酸の置換である。かかる保存的アミノ酸置換のために実施可能な標準的な置換は、以下のようなアミノ酸基の中のものであり得る：
グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）
アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）。
【００７８】
保存的アミノ酸置換は、分子の選択的及び／又は特異的結合特性の主たる原因である超可変領域をフランキングする領域ならびに分子のその他の部分。例えば可変的重鎖カセットの中で行なうことができる。付加的又は代替的には、フルサイズ抗体、ダイアボディ（二量体）、トリアボディ（三量体）及び／又はテトラボディ（四量体）を形成するため、又はミニボディ又はミクロボディを形成するために分子を再構築することにより修飾を達成することができる。
【００７９】
プロモータというのは、ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始するＤＮＡ上の領域である。
【００８０】
ファージディスプレーライブラリ（同じくファージペプチド／抗体ライブラリ、ファージライブラリ又はペプチド／抗体ライブラリとも呼ばれる）は、大きなファージ集合（１０8以上）を含み、各ファージ粒子はペプチド配列を表示する。
【００８１】
薬学組成物というのは、該発明のペプチド又はポリペプチド及び薬学的に受容可能な担体、賦形剤又はその希釈剤、又は抗体−薬学作用物質（抗体−作用物質）複合体及びその薬学的に受容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を含む製剤を意味する。
【００８２】
作用物質というのは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ又はその他のあらゆる温血動物を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）哺乳動物の活性疾患の治療、予防的治療、又は診断において有用である作用物質を意味する。作用物質は、放射性同位体、毒素、オリゴヌクレオチド、組換え型タンパク質、抗体フラグメント、薬学的作用物質、抗癌剤、抗白血病剤、抗転移剤、抗新生物剤、抗疾病剤、抗接着剤、抗血栓剤、抗再狭窄剤、抗自己免疫剤、抗凝集剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗炎症剤から成る群から選択される。このような作用物質のその他の例としては、アシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンを含めた抗ウイルス剤；シロスタゾル、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム、及びアスピリンを含めた抗血栓症／再狭窄剤；ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドを含む抗炎症剤；レフルノミド、デニロイシン、ジフチトクス、サブレウム、WinRho ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドを含めた抗自己免疫剤；及びリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸を含む抗接着／抗凝集剤及びその誘導体、組合せ及び修飾が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００８３】
抗白血病剤というのは、抗白血病性をもつ作用物質である。例えば、抗白血病剤には、白血病性又は未成熟の前白血病性細胞の成長を阻害するか停止させる作用物質、白血病性又は前白血病性細胞を殺す作用物質、白血病性又は前白血病性細胞のその他の抗白血病剤に対する感受性を増大させる作用物質及び白血病細胞の転移を阻害する作用物質が含まれる。本発明においては、抗白血病剤は同様に、腫瘍の血管新生を防止、阻害、遅延又は停止させる抗血管形成活性をもつ作用物質でもあり得る。
【００８４】
抗癌剤というのは、抗癌活性をもつ作用物質である。例えば、抗癌剤には、癌性又は未成熟の前癌性細胞の成長を阻害するか停止させる作用物質、癌性又は前癌性細胞を殺す作用物質、癌性又は前癌性細胞のその他の抗癌剤に対する感受性を増大させるＡＪＫ及び癌細胞の転移を阻害する作用物質が含まれる。本発明においては、抗癌剤は同様に、腫瘍の血管新生を防止、阻害、遅延又は停止させる抗血管形成活性をもつ作用物質でもあり得る。
【００８５】
遺伝子の発現パターンは、さまざまな組織内で、特定の時点でさまざまな条件下などで産生される遺伝子産物の量を分析することにより研究することができる。遺伝子は、遺伝子産物の量が正常な対照例えば非罹患対照内で見られるものよりも高い場合に「過剰発現されている」とみなされる。
【００８６】
一定の与えられた細胞は、一定の与えられた抗体のための結合部位（又はエピトープ）をもつタンパク質をその表面上で発現する可能性があるが、その結合部位は、第１期（病期Ｉ）と呼ぶことのできる１つの状態にある細胞内で隠れた形で存在しうる（例えば立体障害を受けているか又は遮断されている、又は抗体による結合に必要とされる特長が欠如している）。病期Ｉは、例えば、正常な、健常な、非罹患状況でありうる。エピトープが隠れた形で存在する場合、それは、一定の与えられた抗体によって認識されない。すなわち病期Ｉではこのエピトープ又は一定の与えられた細胞に対する抗体の結合は全く存在しない。しかしながら、エピトープは、近くにある又は会合した分子が修飾されているか又は領域が立体配座の変化を受けていることを理由として、例えば修飾自体を受けるか又は遮断解除されることなどによって露呈される可能性がある。修飾の例としては、折畳みの変化、翻訳後修飾の変化、リン脂質化の変化、硫酸化の変化、グリコシル化の変化、などが含まれる。かかる修飾は、細胞が第２期（病期ＩＩ）と呼ぶことのできる異なる状態に入った場合に発生し得る。第２の状態又は第２期の例としては、活性化、増殖、形質転換又は悪性の状況が含まれる。修飾を受けた時点で、エピトープはそのとき露呈され得、抗体は結合し得る。
【００８７】
ペプチドミメティック（peptido-mimetics, peptide mimetics）は、いかなるペプチド結合すなわちアミド結合もアミノ酸の間に含まなくなった分子のことである。しかしながら本発明の状況下では、ペプチドミメティックという用語は、もはや現実に完全にペプチド性でない分子、例えば擬似ペプチド、半ペプチド及びペプトイドを内含することが意図されている。完全に非ペプチドであろうと部分的に非ペプチドであろうと、本発明に従ったペプチドミメティックは、その基礎であるペプチド内の活性基の３次元配置と密に似た反応性化学部分の空間的配置を提供する。これらの分子は小分子、脂質、多糖体又はその接合体を内含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｘ1及びＸ6が疎水性アミノ酸であり、Ｘ2、Ｘ3及びＸ5が任意のアミノ酸であり、Ｘ2が好ましくは塩基性アミノ酸であり、かつコンセンサス配列がＮ末端からＣ末端まで又はＣ末端からＮ末端まで配置されている、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Pro−Ｘ5−Ｘ6（Ｓ３）というコンセンサス配列を含む抗体又はそのフラグメントに関する（本書ではかかる抗体を一般にコンセンサス抗体と呼ぶ）。
【００８９】
本発明のコンセンサス抗体の１実施形態においては、Ｘ2はアルギニン及びリジンから成る群から選択され、Ｘ1及びＸ6はロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン及びイソロイシンから成る群から選択される。好ましくは、この実施形態のコンセンサス抗体は、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択されたコンセンサス配列を含む。より好ましくは、本実施形態においては、コンセンサス抗体は配列番号５を含み（ＣＤＲ３配列は、配列番号９である）、かかるコンセンサス抗体は、本書でＳ１５と呼称されそのように言及される。代替的には、この実施形態におけるコンセンサス抗体は、より好ましくは、配列番号６であり（ＣＤＲ３配列は配列番号１０である）、かかるコンセンサス抗体は本書でＡ３Ｒと呼称されそのように言及される。
【００９０】
本発明のコンセンサス抗体のもう１つの実施形態においては、Ｘ2及びＸ3はアルギニンであり、疎水性アミノ酸Ｘ6は好ましくはイソロイシンである。好ましくはこのもう１つの実施形態のコンセンサス抗体は、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択されたコンセンサス配列を含む。より好ましくは、このもう１つの実施形態のコンセンサス抗体はＡ３Ｒ及び／又はＳ１５である。
【００９１】
本発明のコンセンサス抗体のもう１つの実施形態においては、Ｘ1はロイシン及びメチオニンから成る群から選択されており、Ｘ2及びＸ3はアルギニンであり、Ｘ5はセリン及びバリンから成る群から選択され、Ｘ6はイソロイシンである。好ましくは、このもう１つの実施形態のコンセンサス抗体は、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択されたコンセンサス配列を含む。
【００９２】
本発明のコンセンサス抗体のもう１つの実施形態においては、Ｘ1はロイシンであり、Ｘ2は塩基性アミノ酸から成る群から選択され、Ｘ6は疎水性アミノ酸から成る群から選択される。この実施形態の好ましいコンセンサス抗体は、配列番号１１〜配列番号１６のＤシリーズの抗体を含む。より好ましくは、本発明のコンセンサス抗体はＤ１（ＣＤＲ３領域は配列番号１４であり、完全ｓｃＦｃは配列番号５５である）か又はＤ３（ＣＤＲ３領域は配列番号１３であり、完全ｓｃＦｖは配列番号５６である）。
【００９３】
本発明のコンセンサス抗体は、好ましくは、第２のエピトープよりも第１のエピトープを優先的に結合させ、ここで第１及び第２のエピトープのうちの少なくとも１つは硫酸化されている。第１及び第２のエピトープの例にはＰＳＧＬ−１エピトープ及びＧＰＩｂエピトープが含まれている。より好ましくは、コンセンサス抗体は、ＰＳＧＬ−１及びＧＰＩｂの両方のエピトープを結合し、好ましくは、ＧＰＩｂエピトープに比べＰＳＧＬ−１エピトープに対してより強い親和力での結合を示す。代替的には、コンセンサス抗体は、類似の親和力で第１及び第２のエピトープ（例えばＰＳＧＬ−１及びＧＰＩｂ）を結合する。類似の親和力でＰＳＧＬ−１及びＧＰＩｂに結合する適切な抗体の例としては、Ｄ１及びＤ３、完全ｓｃＦｖ又はＣＤＲ３領域のいずれかが含まれる。
【００９４】
コンセンサス抗体がＡ３Ｒである実施形態においては、好ましくは、コンセンサス抗体は、硫酸化ＰＳＧＬ−１エピトープに対するその結合よりも強い親和力で硫酸化ＧＰＩｂのエピトープを結合させる。特定的には、類似の濃度でのＳ１５及びＡ３Ｒの結合特性の比較に関しては、Ａ３ＲがＳ１５よりも強い親和力で健康なＧＰＩｂ血小板に結合することが発見されてきた。同様に、類似の濃度でＳ１５がＡ３Ｒに比べて強い親和力で（ＰＳＧＬ−１を発現する顆粒球；リンパ球及び単球を含有する）全血細胞に結合することも発見されてきた。
【００９５】
かくして、本発明は、Ｓ１５の親和力に実質的に類似した親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに特異的に結合しかつＧＰＩｂよりも強い親和力でＰＳＧＬ−１に結合する抗体を提供する。より好ましくは、抗体は、位置５１で第３のＮ末端チロシン残基で硫酸化されている硫酸化ＰＳＧＬ−１エピトープに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、Ａ３Ｒのものと実質的に類似した親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに対し特定的に結合し、好ましくはＰＳＧＬ−１よりも強い親和力でＧＰＩｂに結合する。より好ましくは、この実施形態の抗体は、位置４６で第１のＮ末端チロシン残基で硫酸化される硫酸化ＧＰＩｂエピトープに結合する。代替的には、本発明は、（好ましくはＴｒｙ−５１で第３のＮ末端チロシン残基において硫酸化された）硫酸化ＰＳＧＬ−１及び（好ましくは、Ｔｒｙ−２７６で第１のＮ−末端チロシンで硫酸化された）硫酸化ＧＰＩｂに対し、Ｄ１及び／又はＤ３のものと実質的に類似した親和力で特異的に結合する抗体を提供する。
【００９６】
硫酸化されたＰＳＧＬ−１及びＧＰＩｂに対する本発明のさまざまな抗体（例えばＳ１５及びＡ３Ｒ）の親和力の差異の結果として、又これら２つの抗体がコンセンサス配列の位置Ｘ1及びＸ5で異なっていることを理由として、本発明のコンセンサス抗体のコンセンサス配列のＸ1及びＸ5はチロシン硫酸化部位に対するコンセンサス抗体の結合に貢献し得る。従って、コンセンサス配列のＸ1及びＸ5位置内のアミノ酸は、特定の硫酸化されたエピトープが結合のためにターゲティングしているか否かに応じて特異的に選択され得る。換言すると、位置Ｘ1及びＸ5を、特定の硫酸化エピトープに特異的に結合するように抗体を調整するべく改変することができる。その上、Ｓ１５は好ましくは、第３のＮ末端チロシンに硫酸塩修飾を含むＰＳＧＬ−１エピトープに結合し、Ａ３Ｒは好ましくは第１のＮ末端エピトープで硫酸塩修飾をもつＧＰＩｂエピトープに結合することから（一方でＤ１及びＤ３はＰＳＧＬ−１及びＡ３Ｒの両方を同等に結合させる）、コンセンサス配列のＸ1及びＸ6は、それぞれＰＳＧＬ−１及びＧＰＩｂの第３及び第１の硫酸化チロシンに対するＳ１５及びＡ３Ｒの結合と関係する可能性がある。
【００９７】
ＰＳＧＬ−１及び／又はＧＰＩｂに結合する抗体はファージライブラリを用いて同定され、米国特許出願第１０／０３２，４２３号；１０／０３２，０３７号；１０／０２９，９８８号；１０／０２９，９２６号；０９／７５１，１８１号；１０，１８９，０３２号及び６０／２５８，９４８号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９，４４２号及びＰＣＴ／ＵＳ０１／４９，４４０号で開示された。これらの出願において開示された抗体の特定的例には、Ｙ１、Ｙ１７、及びＬ３２抗体が含まれている。これらの抗体は、生殖細胞系（ＤＰ３２）から単離され、Ｎ末端チロシンで硫酸化され例えば腫瘍転移といった細胞移動に関与すると思われている造血細胞のタンパク質上に見られるエピトープに対し特異的に結合することが発見された。
【００９８】
Ｙ１／Ｙ１７／Ｌ３２に結合しているものとして以前に同定された硫酸化エピトープは、好ましくは、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、接着、血栓症及び／又は再狭窄、細胞ローリング及び凝集といったようなさまざまなプロセスにおいて重要な役割を果たすリガンド及び受容体上に見られる２つ以上の酸性アミノ酸のクラスタ内部での硫酸化チロシン残基又は硫酸化炭水化物又は脂質部分といったような硫酸化部分の存在により特徴づけられる。かかるエピトープは同じく、Ｔ−ＡＬＬ細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移細胞といったような罹患細胞上にも発見される。
【００９９】
ＤＰ３２ファミリーから単離された本発明のコンセンサス抗体は、硫酸化チロシンエピトープをもつタンパク質に結合する。かかるタンパク質には、ＰＳＧＬ−１、ＧＰＩｂ、α−２−抗プラスミン；アミノペプチダーゼＢ；ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ８及びＣＣＲ２ｂといったＣＣケモカイン受容体；７膜内外セグメント（７ＴＭＳ）受容体；第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＩＸ因子といった凝固因子；フィブリノーゲンガンマ鎖；ヘパリン補因子ＩＩ；セレクトグラニンＩ及びＩＩといったセクレトグラニン；ビトロネクチン、アミロイド前駆体、α−２−抗プラスミン；コレシストキニン；α−コリオゴナドトロピン；補体Ｃ４；デルマタンスルファートプロテオグリカン；フィブロネクチン；及びカストリン、を含むが、これらに制限されるわけではない。好ましい実施形態においては、本発明のコンセンサス抗体は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ２ｂといったような硫酸化ＣＣケモカイン受容体に対して結合する。硫酸化チロシンは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰβ及びＨＩＶ−１ｇｐ１２０／ＣＤ４に対するＣＣＲ５の結合及びＣＣＲ５及びＣＤ４を発現する細胞に進入するＨＩＶ−１の能力に貢献し得る。
【０１００】
その上、本発明の抗体の結合は、細胞の発達期によっても左右され得る（ＡＭＬ亜型は、日常的プロセッシング及び細胞化学的染色の下で観察される形態を用いてフランス−アメリカ−イギリスシステムに基づいて分類される）。抗体は、Ｍ３亜型以上のものであってＭ０又はＭ１亜型細胞ではないＡＭＬ細胞に結合し得る。さらに、抗体は、Ｍ２亜型細胞に結合してもしなくてもよい。従って、本発明の抗体は、正常な健康な骨髄（例えばＣＤ３４+細胞）に対する低い結合を示す。かかる差異は、ＰＳＧＬ−１発現及び／又は硫酸化の改変、ならびにわずかに異なるエピトープを露呈する考えられるＰＳＧＬ−１の立体配座変化に基づくものであると考えられている。
【０１０１】
従って、コンセンサス抗体は、Ｍ0、Ｍ1、Ｍ2及びＭ3細胞といったような骨髄内の未分化細胞を結合させない可能性がある。コンセンサス抗体が結合するＰＳＧＬ−１は、有意なレベルで発現されず、これらの未分化細胞上で硫酸化されないと考えられている。本発明のコンセンサス抗体は、健康な骨髄細胞（例えばＣＤ３４+細胞）にも同様に結合しない可能性がある。
【０１０２】
より好ましい実施形態においては、本発明のコンセンサス抗体は硫酸化ＰＳＧＬ−１に結合する。特にＳ１５抗体は、硫酸化ＰＳＧＬ−１に対する高い選択性を示す。単球、好中球及びリンパ球といったような炎症に関与する白血球は、アテローム性動脈硬化症といったような疾病の炎症プロセスにおいてＰＳＧＬ−１、Ｐ−セレクチン、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ−１という４つの接着分子によって主として補強される（Huo and Ley, Acta Physiol, Scand., １７３：３５−４３（２００１）；Libby, Sci. Am. May：４８−５５（２００２）；Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. ３８：５７７−５８２（２００１））。コンセンサス抗体特にＳ１５とこれらの中心的分子のいずれかとの干渉は、関連する疾病を抑制する上でのコンセンサス抗体の潜在的役割を示唆している。
【０１０３】
特定的には、Ｐ−セレクチンが細胞の付着及びローリングを制御する。付加的には、Ｐ−セレクチン・ＰＳＧＬ−１の相互作用は、（悪性細胞に関係する場合には）腫瘍形成そして（白血球に関係する場合には）炎症性応答と完全に結びつけられている細胞上の一定数のその他の分子を活性化する（Shebuski and Kilgore, J.Pharmacol. Exp. Ther. ３００：７２９−７３５（２００２））。Ｐ−セレクチンの細胞プロセス調節能力についてのこの理解に基づき、硫酸化ＰＳＧＬ−１についてのコンセンサス抗体及びＳ１５のｓｃＦｖ選択性の増強により、これらがさまざまな悪性及び炎症性疾患を治療するためのより優れた分子となり得る、ということは明白である。さらに、悪性疾患モデルは、悪性細胞に対するＰ−セレクチン結合が、ＰＳＧＬ−１の硫酸化を必要とするということを示した（Ma及びGeng, Immunol. １６８：１６９０−１６９６（２００２））。この必要条件は、コンセンサス抗体の結合、特にＳ１５結合についての必要条件に類似している。かくして、コンセンサス抗体特にＳ１５が、進行性悪性疾患のＰ−セレクチン促進を抑制することができると予想することが可能である。
【０１０４】
特にＸ2及びＸ3がアルギニンであり、Ｘ6がイソロイシンである実施形態における本発明のコンセンサス抗体、好ましくはＡ３Ｒは、同様に硫酸化ＧＰＩｂについて高い選択性を示す。ＧＰＩｂは、トロンビンの低濃度により誘発される血小板活性化及び動脈狭窄の領域における高いせん断によって巻き込まれる血小板の凝集に関与する。ＧＰＩｂについてのこの理解に基づくと、硫酸化ＧＰＩｂについてのコンセンサス抗体及びＡ３ＲのｓｃＦｖ選択性の増強により、それがさまざまな心臓血管及び炎症性の疾病を治療するためのより優れた分子となり得る、ということは明白である。
【０１０５】
好ましくは、本発明のコンセンサス抗体は、Ｔ−ＡＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、Ｐre−Ｂ−ＡＬＬ細胞、β−白血球細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移細胞を含む炎症又は腫瘍形成に関与する少なくとも１つの細胞型上に存在するエピトープに結合する。さらに好ましくは、本発明のコンセンサス抗体は、脂質、炭水化物、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖体分子上のエピトープに結合し得る。かかるエピトープは、好ましくは少なくとも１つの硫酸化部分を有する。代替的にそして好ましくは、本発明のコンセンサス抗体は、ＰＳＧＬ−１を一例とする２つ以上の酸性アミノ酸の少なくとも１つのクラスタ及び単数又は複数の硫酸化チロシン残基を各々有する２つ以上のエピトープと交差反応する。本発明のこれらの抗体又はそのフラグメントは、例えばＰＳＧＬ−１に対する結合の後ＡＭＬ細胞に内在化され得る。このような内在化は、エンドサイドーシス及びプロセス、時間及び温度依存性である活発なプロセスを介して発生し得る。
【０１０６】
抗原結合部位の形成に参与するのは、本発明に従ったＳＩＳ、Ａ３Ｒ、Ｓ１、Ｓ１１、Ｄ１及びＤ３と実質的に同じ親和力で結合する抗体及びコンセンサス抗体の超可変領域である。抗原結合部位は、抗体が結合するエピトープの構造と相補的であり、従って、これらの結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。これらは、各々ＶH及びＶLドメインのβストランドを結びつけるループ上にある抗体の各々の軽鎖及び重鎖上の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）である。これらの領域のうち最も可変的であるのは、重鎖のＣＤＲ３領域である。ＣＤＲ３領域は、Ｉｇ分子の最も露呈された領域であると理解されており、本書に提供されている通り、観察される選択的及び／又は特異的結合特性を決定する上で中心的役割をもつ。
【０１０７】
ファージディスプレーライブラリ内に存在する４９の生殖細胞系のうちの１つであるＤＰ３２は、本発明のコンセンサス抗体が単離されたファージライブラリの特異的生殖細胞系である。従って、ＤＰ３２は、少なくとも重及び軽鎖枠組可変領域、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域及び／又は重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う本発明の抗体を提供する。ＤＰ３２は同様に、超可変領域が適合された３次元構造を提供する。１つの抗体の特異性がその３次元立体構造により決定されるということは周知である。かくして、ＤＰ３２により課せられる制限条件は、本発明の抗体の特異性を決定する上で重要な役割を有し得る。さらに、ＤＰ３２は、さまざまな帯電アミノ酸を有し、これは抗体の抗原認識において構造的役割をもち得る。
【０１０８】
本発明に従うと、ＣＤＲは同様に抗体を産生するべくカセット内に挿入され得る。ポリペプチドに適用され本書で言及されているカセットは、枠組として役立ち単一の単位としてみなされそのように操作される連続するアミノ酸の一定の与えられた配列を意味する。アミノ酸は、片端又は両端で、置換、挿入、除去又は付着可能である。同様にして、アミノ酸のストレッチの片端又は両端で置換、挿入、除去又は付着することもできる。
【０１０９】
カセットのアミノ酸は、表面的には固定され得る一方で、置換、挿入又は付着された配列はきわめて可変的であり得る。カセットは、最終的構成体にとって重要である１つの機能を各々包含する複数のドメインで構成され得る。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態のカセットは、Ｎ末端から、枠組領域１（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、枠組領域２（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、枠組領域３（ＦＲ３）及び枠組領域４（ＦＲ４）を含む。
【０１１１】
該発明の１実施形態においては、カセット内部で全く異なる領域を置換することが可能である。例えば、カセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１超可変領域は、非保存的又は好ましくは保存的アミノ酸置換によって置換え又は修飾され得る。
【０１１２】
本発明においては、Ａ３Ｒ及びＳ１５と同じ親和力で結合する抗体及びコンセンサス抗体は、重鎖及び軽鎖を有し、各々の鎖はそれぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域である第１、第２及び第３の超可変領域を有する。結合選択性及び特異性は、特に、鎖のＣＤＲ３領域、場合によっては軽鎖のＣＤＲ３領域、そして好ましくは重鎖のＣＤＲ３領域によって、そして二次的には軽鎖、好ましくは重鎖のＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域によって決定される。結合選択性及び特異性は、同様に、第１、第２及び／又は第３の超可変領域をフランキングする上流又は下流領域によって二次的に影響され得る。
【０１１３】
好ましくは、コンセンサス抗体のコンセンサス配列は、コンセンサス抗体の超可変領域内部にある。特に、コンセンサス配列は、コンセンサス抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。例えば、コンセンサス配列は２つの超可変領域に重複していてもよいし、又は単数又は複数の超可変領域内に一部分あり又、コンセンサス抗体の可変領域のもう１つの部分内に一部分あってもよい。好ましくは、コンセンサス配列は、ＣＤＲ３領域内にある。同様に好ましくは、コンセンサス配列は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を除外する。
【０１１４】
特に、１実施形態においては、コンセンサス抗体は好ましくは、配列番号９、配列番号１７及び配列番号１８の単数又は複数のアミノ酸配列を内含する。代替的な１実施形態においては、コンセンサス配列は、好ましくは、配列番号１０、配列番号１７及び配列番号１８の単数又は複数のアミノ酸配列を内含する。アミノ酸配列は好ましくは、コンセンサス抗体の超可変領域内にある。特に、アミノ酸配列は、コンセンサス抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。好ましくは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列は、ＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列はＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列はコンセンサス抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１１５】
本発明は同様に、Ｓ１５、Ａ３Ｒ、Ｓ１、Ｓ１１、Ｄ１及び／又はＤ３と実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合する抗体をも提供する。１つの実施形態においては、抗体は、Ｓ１５と実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合し、この実施形態においては、抗体は好ましくは、配列番号９、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列のうちの単数又は複数のものを含む。好ましくは、これらのアミノ酸配列は抗体の超可変領域内にある。特にアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ１領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあってもよい。好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列は、ＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１１６】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、Ａ３Ｒと実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合し、この実施形態においては、抗体は好ましくは、配列番号１０、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列のうちの単数又は複数のものを含む。好ましくは、これらのアミノ酸配列は抗体の超可変領域内にある。特にアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ１領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあってもよい。好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列は、ＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１１７】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、Ｓ１と実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合し、この実施形態においては、抗体は好ましくは、配列番号２８、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列のうちの単数又は複数のものを含む。好ましくは、これらのアミノ酸配列は抗体の超可変領域内にある。特にアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ１領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあってもよい。好ましくは、配列番号２８のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列は、ＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１１８】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、Ｓ１１と実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合し、この実施形態においては、抗体は好ましくは、配列番号３１、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列のうちの単数又は複数のものを含む。好ましくは、これらのアミノ酸配列は抗体の超可変領域内にある。特にアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ１領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあってもよい。好ましくは、配列番号３１のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列は、ＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１１９】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、Ｄ１と実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合し、この実施形態においては、抗体は好ましくは、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列のうちの単数又は複数のものを含む。好ましくは、これらのアミノ酸配列は抗体の超可変領域内にある。特にアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ１領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあってもよい。好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列は、ＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１２０】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、Ｄ３と実質的に同じ親和力で硫酸化ＰＳＧＬ−１及び／又は硫酸化ＧＰＩｂに結合し、この実施形態においては、抗体は好ましくは、配列番号１３、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列のうちの単数又は複数のものを含む。好ましくは、これらのアミノ酸配列は抗体の超可変領域内にある。特にアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ３領域、ＣＤＲ１領域又はＣＤＲ１領域内にあり得る。アミノ酸配列の全て又は一部分のみがＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ１領域内にあってもよい。好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ３領域内にあり、配列番号１７のアミノ酸配列は、ＣＤＲ２領域内にあり、配列番号１８のアミノ酸配列は抗体のＣＤＲ１領域内にある。
【０１２１】
本書で記述され詳述されている２５個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列の全てについて（例えばＣＤＲ、ＣＤＲフランキング領域）、これらのアミノ酸配列がその範囲内に１つ又は２つのアミノ酸置換を内含していること及び好ましくは置換が保存的アミノ酸置換であることを、該発明のさらなる実施形態として理解し考慮すべきである。本書で記述され詳述されている２５個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列の全てについて、これらのアミノ酸配列がその範囲内に、もとの配列と９０％以上の配列類似性をもつアミノ酸配列を内含していることを、該発明の１つの実施形態として理解し考慮すべきである。（Altchul et al., Nucleic Acids Res. ２５；３３８９−４０２（１９９７））。類似の又は相同なアミノ酸は、類似の特性、例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負の帯電、極性、非極性を示す、非同一アミノ酸として定義づけされる。
【０１２２】
アミノ酸類似性又は相同性又は配列同一性百分率は、２つの異なるペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される。抗体配列は、ＤＮＡ配列決定によって決定された。２つの配列は、通常、その目的で設計されたさまざまなコンピュータプログラムの１つを使用することによって整列させられ、各位置のアミノ酸配列Ｑが比較される。その後、アミノ酸同一性又は相同性が決定される。その後、アミノ酸類似体百分率を決定するためにアルゴリズムが適用される。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子間の微妙な関係の検出に対する感度が大幅に増加していることから、アミノ酸配列Ｑを比較することが一般に好ましい。タンパク質の比較には保存的アミノ酸置換の存在を考慮することができ、かくして、非同一アミノ酸が類似の物理的及び／又は化学的特性を有する場合でもなおミスマッチが正の評点を生み出すことができる（Altschul et al.,（１９９７））、前出）。
【０１２３】
該発明の１実施形態においては、軽鎖及び重鎖の各々の３つの超可変領域は、２つの鎖の間及び複数の鎖の内部及び／又は間での３つの超可変部位の中で互換され得る。
【０１２４】
本発明に従うと、コンセンサス抗体及びＳ１５、Ａ３Ｒ及び／又はＤ１／Ｄ３と実質的に同じ親和力で結合する抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体が含まれる。ＩｇＧクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4を含む複数のサブクラスを包含する。
【０１２５】
抗体は、フラグメント、複合体及び多量体といった数多くの形態で提供されうる。本発明に従うと、抗体フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ2及びＦｄ分子を内含する。「フラグメント」という用語には、それらがもとの抗体又はそれより大きいフラグメントの結合特性を保持しているかぎり、Ｆｖｓのフラグメント及びＦａｂｓのフラグメントといったより小さな抗体フラグメントも同じく内含される。かかるフラグメントの例としては、（１）Ｆｖの重鎖のみのフラグメントを含むミニボディ、（２）抗体重鎖可変領域の小さい分画単位を含むミクロボディ（国際出願第ＰＣＴ／ＩＬ９９／００５８１号）、（３）軽鎖のフラグメントを有する類似のボディ及び（４）軽鎖可変領域の機能的単位を有する類似のボディがあると思われる。構成体には、例えばダイアボディ、トリアボディ及びテトロボディといったような多量体が含まれる。「抗体」という用語は、相反する特定のないかぎり又は当該技術分野における情況及び／又は知識に基づいて相反する指示のないかぎり、これらの分子の全て、ならびにその誘導体、組合せ、修飾、相同体、ミメティック及び変異体を包含するように意図されている。
【０１２６】
ｓｃＦｖが組織に浸透し、それらのサイズが比較的小さいためにフルサイズの抗体に比べ急速に血液から一掃されるということが立証されてきた（Adams et al., Br. J.Cancer７７：１４０５−１２（１９８８）；Hudson, Curr. Opin. Immunol １１（５）：５４８−５５７（１９９９）；Wu et al., Tumor Targeting ４：４７（１９９９））。かくして、ｓｃＦｖは、体内からの放射性標識のさらに急速な一掃を可能にするべく腫瘍画像形成といったような放射線標識が関与する診断、予後診断又は病期診断において利用されることが多い。一定数の癌ターゲティングｓｃＦｖ多量体が近年、インビボ安定性及び効能についての臨床前評価を受けてきた（Adams et al.（１９８８）、前出；Wu（１９９９）、前出）。
【０１２７】
標準的には、ＶLのＮ末端残基に対しポリペプチドリンカーによって、ＶHドメインのＣ末端端部が係留状態で、ｓｃＦｖ単量体が設計される。任意には、逆の配向が利用される。すなわち、ＶLドメインのＣ末端端部が、ポリペプチドリンガーを通してＶHのＮ末端残基につながれる（Power et al., J. Immun. Meth.２４２：１９３−２０４（２０００））。ポリペプチドリンカーは標準的に、長さが１５アミノ酸前後である。リンカーが約３〜７個のアミノ酸まで削減される場合、ｓｃＦｖｓを機能的Ｆｖドメインに折畳むことができず、代りに第２のｓｃＦｖと会合してダイアボディを形成する。リンカーの長さをさらに３個未満のアミノ酸まで削減することで、リンカー長、組成及びＦｖドメインの配向に応じて、三量体又は四量体へのｓｃＦｖの会合が強制される（Powers（２０００）、前出）。
【０１２８】
近年、ｓｃＦｖ二量体、三量体及び四量体といったような多価の抗体フラグメントが往々にして標的に対して親抗体の結合よりも高い親和力を提供するということが発見されてきた。このより高い親和力は、腫瘍ターゲティングの利用分野のために薬物動態の改善を含めた潜在的な利点を提供する。付加的には、白血球の係留及びローリングに関与するＰ−セレクチン及びそのリガンドＰＳＧＬ−１を研究するうちに、科学者らは、ＰＳＧＬ−１の二量体形態を発現する細胞が、このより高い結合親和力のためより安定したローリング接着を確立するという結論を下した。これらの接着は、よりせん断に強く、少ないローリング速度変動を示した（Ramachandran et al.,ＰＮＡＳ、９８（１８）：１０１６６−７１（２００１））。
【０１２９】
これらの多価の形態のより大きな結合親和力は、診断及び治療規制において有益であり得る。例えば、ｓｃＦｖを遮断剤として利用して、標的受容体を結合させかくして「天然の」リガンドの結合を遮断することができる。かかるケースでは、標的に対する天然リガンドの望ましくない結合を可能にしうる解離の確率を低減させるべくｓｃＦｖと受容体の間により高い親和力を有することが望ましい。さらに、このより高い親和力は、標的受容体が接着及びローリングに関与する場合、又は標的受容体が血小板といったような高いせん断流の部域内に存在する細胞上にある場合に有用でありうる。
【０１３０】
所望の結合能力をもつ抗体がひとたび選択されかつ／又は開発された時点で、もとの抗体の特性を保持する構成体及びフラグメントを産生することは、本書に提供されている指針を用いる当業者の能力範囲内に充分入るものである。例えば、当初選択された又は開発された抗体の所望の特性を保持する完全抗体分子、Ｆｖ、フラグメント、Ｆａｂ、フラグメント、Ｆａｂ2フラグメント、二量体、三量体及びその他の構成体を作ることができる。
【０１３１】
アミノ酸を置換するもののなお抗体の特性を保持することが望まれる場合、保存的アミノ酸置換を行なうことは、充分に当該技術分野の技術範囲内に入る。さまざまな作用物質に対する接合といったような修飾も同様に、抗体に対し、その結合特性を改変させることなく行なうことができる。より安定した抗体を産生するために行なわれるものといったようなその他の修飾も、抗体に対し、その特異性を改変させることなく行なうことができる。例えば、ペプトイド修飾、半ペプトイド修飾、環状ペプチド修飾、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、主鎖修飾及び残基修飾を実施することができる。修飾済み４抗体又はフラグメントをその結合特性が変化したか否かを査定するためにテストすることも又、本明細書の指針に従って当業者の能力範囲内に入る。
【０１３２】
同様にして、より望ましい特性をもつ分子を得るべく抗体の結合特性を改変することは、本書に提供されている指針を用いて、当業者の能力範囲内に入る。例えば、所望の特性をもつ抗体がひとたび同定された時点で、抗体の変異体を生成するためにランダム又は有向突然変異誘発を使用することができ、これらの変異体を所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【０１３３】
当該技術分野において既知の従来の方法を用いて、当業者であれば同様に、コンセンサス抗体の結合能力をもちかつ／又は硫酸化ＰＳＧＬ−１又は硫酸化ＧＰＩｂに対し特異的に結合しＳ１５及びＡ３Ｒのものと実質的に類似した親和力で結合する付加的な抗体を決定することもできるであろう。例えば、コンセンサス抗体抗体が結合させる分子又は細胞を用いて特定のファージディスプレーライブラリ特に白血病、リンパ腫及び骨髄腫患者から調製されたライブラリをスクリーニングする本書で記述されているバイオパニング方法を用いて、Ｄ１及びＤ３といったような付加的な抗体を単離することができる。
【０１３４】
本発明に従った抗体は同様に、それに挿入するか又は付着してその調製及び同定ならびに診断を助けることのできるタグをも有することができる。このタグはその後分子から除去できる。有用なタグの例としては、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（登録商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇがある（Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen.,３２、６０１−１８（１９９８））。タグは好ましくは、ｃ−ｍｙｃ又はＫＡＫである。
【０１３５】
本発明は、ｓｃＦｖ抗体を提供する。本書で使用されているｓｃＦｖというのは、同一であっても又は異なるものであってもよいヒト抗体の重鎖の可変領域とヒト抗体の軽鎖の可変領域から成り、かつ該重鎖の該可変領域が軽鎖の可変領域に接続、連結、融合又は共有結合付着されているか又はそれと会合されている分子として定義づけされる。
【０１３６】
ｓｃＦｖ構成体は、抗体の超可変ドメインのうちの単数又は複数のものを取込むｓｃＦｖ分子の多量体（例えば二量体、三量体、四量体など）であり得る。全てのｓｃＦｖ誘導された構成体及びフラグメントは、その他の細胞の利益となるように標的細胞に対し選択的及び／又は特定的に結合する。結合選択性及び／又は特異性は、超可変領域により主として決定される。本発明の抗体は、結合親和力及び特異性及び血中半減期の増大を改善できる多価のＦｖ形態に折畳むように構築することができる。
【０１３７】
ｓｃＦｖの多価形態は、他の研究者により設計され産生されてきた。１つのアプローチは、リンカーで２つのｓｃＦｖｓを連結することにあった。もう１つのアプローチには、連結のため２つのｓｃＦｖｓの間のジスルフィド結合を用いることが関与している。二量体又は三量体Ｆｖの産生に対する最も単純なアプローチは、Holliger et al., ＰＮＡＳ９０：６４４４−４８（１９９３）及びKortt et al., Protein Eng. １０：４２３−３３（１９９７）によって報告された。このような１つの方法は、ＦＯＳ及びＪＵＮタンパク質領域の配列を合計してそれらの間にｓｃＦｖのＣ末端でロイシンジッパーを形成することによって、ｓｃＦｖｓの二量体を作るように設計された（Kosteliny et al., J. Immunol. １４８（５）：１５４７−５３（１９９２）；De Kruif et al., J Biol Chem.２７１（１３）：７６３０−３４（１９９６））。もう１つの方法は、ｓｃＦｖのＣ末端においてストレプトアビジンコーディング配列を付加することによって四量体を作るように設計されたストレプトアビジンは、４つのサブユニットから成り、従って、ｓｃＦｖ−ストレプトアビジンが折畳まれた時点で、４つのサブユニットは、四量体を形成するように順応する（Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas ６（３）：９３−１０１（１９９５））。さらにもう１つの方法においては、二量体、三量体及び四量体を作るため、問題のタンパク質内に遊離システインが導入される。遊離システインに問題のタンパク質を架橋するためには、マレイミド基を可変数（２〜４）伴うペプチドベースの架橋剤が使用された。（Cochran et al., Immunity １２（３）：２４１−５０（２０００））。
【０１３８】
この系においては、（本書中以上で記述されているような）ファージライブラリを、１つの抗体のＦｖ領域の一価形態へと折畳むことのみできるｓｃＦｖｓを表示するように設計可能である。さらに、同じく本書で上述した構成体は、細菌発現に適している。遺伝子工学処理されたｓｃＦｖｓは、隣接してコードされた１５アミノ酸のフレキシブルなペプチドスペーサによってつなぎ合わされた重鎖及び軽鎖可変領域を含む。好ましいスペーサは（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（配列番号８）である。そのアミノ酸、成分と合わせてこのスペーサの長さは、かさばらないスペーサを提供し、このためＶH及びＶL領域は、その標的に対する有効な結合を提供する機能的Ｆｖドメイン内へと折畳むことができる。
【０１３９】
スペーサの長さを変動させることが、二量体、三量体及びトリアマー（当該技術分野においては往々にしてそれぞれダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディと呼ばれる）を形成するさらにもう１つの好ましい方法である。二量体は、ｓｃＦｖの２つの可変鎖をつなぎ合わせるスペーサを一般的に５〜１２個のアミノ酸残基まで短縮する条件の下で形成される。この短縮されたスペーサは、同じ分子からの２つの可変鎖が機能的Ｆｖドメインへと折畳むのを防ぐ。その代りに、該ドメインは、もう１つの分子の相補的ドメインと強制的に対合させられて２つの結合ドメインを作り上げる。好ましい方法においては、ダイアボディ構築のために５つのアミノ酸のみのスペーサ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）（配列番号１９）が使用された。この二量体は、２つの同一ｓｃＦｖｓから又は２つの異なるｓｃＦｖｓ集団から形成され得、親ｓｃＦｖ（ｓ）の選択的及び／又は特異的な増強された結合活性を保持し、かつ／又は増大した結合強度又は親和力を示す。
【０１４０】
類似の要領で、トリアボディが、ｓｃＦｖの２つの可変鎖をつなぎ合わせるスペーサを一般に５個未満のアミノ酸残基まで短縮するような条件下で形成され、同じ分子からの２つの可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折畳むのを妨いでいる。その代り、３つの別々のｓｃＦｖ分子が会合して三量体を形成する。好ましい方法においては、トリアボディは、このフレキシブルなスペーサを完全に除去することによって得られた。トリアボディは、３つの同一のｓｃＦｖｓから又はｓｃＦｖｓの２つ又は３つの異なる集団から形成され得、親ｓｃＦｖ（ｓ）の選択的及び／又は特異的な増強された結合活性を保持し、かつ／又は増大した結合強度又は親和力を示す。
【０１４１】
テトラボディが、ｓｃＦｖの２つの可変鎖をつなぎ合わせるスペーサを一般に５個未満のアミノ酸残基まで短縮するような条件下で形成され、同じ分子からの２つの可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折畳むのを防いでいる。その代り、４つの別々のｓｃＦｖ分子が会合して四量体を形成する。テトラボディは、４つの同一のｓｃＦｖｓから又はｓｃＦｖｓの２つ又は３つの異なる集団から形成され得、親ｓｃＦｖ（ｓ）の選択的及び／又は特異的な増強された結合活性を保持し、かつ／又は増大した結合強度又は親和力を示すはずである。トリアボディ又はテトラボディが、スペーサの長さが一般的に５アミノ酸残基により短かい条件下で形成するか否かは、混合物中の特定のｓｃＦｖ（ｓ）のアミノ酸配列及び反応条件によって左右される。
【０１４２】
本発明は同様に、Ｘ1及びＸ6が疎水性アミノ酸であり、Ｘ2、Ｘ3及びＸ5が任意のアミノ酸である、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Pro−Ｘ5−Ｘ6（配列番号３）というコンセンサス配列を含むポリペプチドをも提供する。該ポリペプチドの１つの実施形態においては、Ｘ2はアルギニン、リジンから成る群から選択され、Ｘ1及びＸ6は、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン及びイソロイシンから成る群から選択される。ポリペプチドは好ましくは配列番号５を含み得る。代替的には、ポリペプチドは配列番号６を含み得る。本発明に従ったポリペプチドのもう１つの実施形態においては、Ｘ2及びＸ3はアルギニンであり、疎水性アミノ酸Ｘ6は好ましくはイソロイシンである。本発明に従ったポリペプチドのもう１つの実施形態においては、Ｘ1はロイシン及びメチオニンから成る群から選択され、Ｘ2及びＸ3はアルギニンであり、Ｘ5はセリン及びバリンから成る群から選択され、Ｘ6はイソロイシンである。本発明のポリペプチドは実質的に円形又はループ状であり得る。
【０１４３】
本発明は同様に、ポリペプチドがＳ１５と実質的に類似した親和力で結合するＰＳＧＬ−１に対し特異的に結合するポリペプチドをも提供する。代替的には、又は付加的には、該ポリペプチドは、実質的にＡ３Ｒに類似した親和力でＧＰＩｂに特異的に結合することができる。
【０１４４】
本発明はさらに、本発明の抗体及びポリペプチドをコードする組換え型核酸といったような単離又は精製されたポリペプチドを提供する。かかる単離又は精製されたポリペプチドは、原核又は真核生物発現系内で産生され得る。かかる発現系には、発現ベクター及びかかる発現ベクターでのトランスフェクションを受けた宿主細胞が含まれる。抗体の発現を可能にする条件下での組換え型宿主細胞の培養及び組換え型宿主細胞から又は培地からのかかる抗体の単離又は精製を含む、原核生物及び真核生物系内での抗体及びポリペプチドの産生方法は、当該技術分野において周知である。
【０１４５】
本発明において定義され論述されているような真核生物細胞系というのは、宿主細胞が真核生物である、遺伝子工学方法によりペプチド又はポリペプチドを産生するための発現系のことを意味する。真核細胞発現系は哺乳動物であってもよく、精製後に哺乳動物発現系内で産生されるペプチド又はポリペプチドは好ましくは実質的に哺乳動物汚染物質を含まない。有用な真核発現系のその他の例としては、酵母発現系が含まれる。
【０１４６】
該発明のペプチド又はポリペプチドの産生用の好ましい原核生物系は、発現ベクター用の宿主としてE.coliを使用する。精製後のE.coli系内で産生されるペプチド又はポリペプチドは、実質的にE.coli汚染タンパク質を含まない。原核生物発現系の使用は、本発明において提供される配列の一部分又は全てのＮ末端に対するメチオニン残基の添加を結果としてもたらす可能性がある。ペプチド又はポリペプチドの完全な発現を可能にするためのペプチド又はポリペプチド産生後のＮ末端メチオニン残基の除去は、当該技術分野において既知の通りに実施され得、その一例は適切な条件下でのアエロモナス・アミノペプチダーゼの使用によるものである（米国特許第５，７６３，２１５号）。
【０１４７】
本発明は同様に、硫酸化エピトープを結合させる、例えば抗体又はそのフラグメント又は代替的には小さい無機化合物といったような実体を選択するためのプロセスをも提供する。これらの方法には、硫酸化エピトープを有するペプチドに対してライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメントを固定するためのファージディスプレーライブラリ及び小さい無機化合物を同定するための組合せライブラリ）をパニングすることが関与している。適切なパニング用硫酸化エピトープは、例えばＰＳＧＬ−１、ＧＰＩｂ、α−２−抗プラスミン；アミノペプチダーゼＢ；ＣＣケモカイン受容体例えばＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ８及びＣＣＲ２ｂ；７−膜内外−セグメント（７ＴＭＳ）受容体；凝固因子例えば第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＩＸ因子；フィブリノーゲンガンマ鎖；ヘパリン補因子ＩＩ；セクレトグラニンＩ及びＩＩといったセクレトグラニン；ビトロネクチン、アミロイド前駆体、α−２−抗プラスミン；コレシストキニン；α−コリオゴナドトロピン；補体Ｃ４；デルマタンスルファートプロテオグリカン；フィブロネクチン又はカストリンに基づくか又はこれらから誘導され得る。かかるペプチドは、任意の位置で硫酸化され得る。好ましくは、ペプチドは、ＰＳＧＬ−１（Ｎ末端から位置５１のチロシン残基において硫酸化される場合）、ＧＰＩｂ（特に任意２７６のチロシン残基において、又さらに低いレベルで位置２７９のチロシン残基において硫酸化される場合）、又はＣＣＲ５（特に位置１０のチロシン残基で硫酸化される場合）の領域から誘導された又はこの領域に基づく硫酸化エピトープを含む。１実施形態においては、該方法は、固体支持体上にペプチドを固定化する段階を含む。任意には、該方法は、非硫酸化可溶性ペプチド又は交互のチロシン位置で硫酸化された可溶性ペプチドを用いた競合的パニングを含む。小さい無機化合物を同定するための適切な組合せライブラリのパニングは、当然のことながら、これらの方法を実施するのに使用することもできる。
【０１４８】
本発明の好ましい実施形態においては、硫酸化エピトープを結合させる実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）配列番号７のＰＳＧＬ−１のペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号７の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）について選択するべくライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号７のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１４９】
本発明の好ましい実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＰＳＧＬ−１（配列番号７）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性未硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチド（配列番号２６）の存在下で配列番号７の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）について選択するべくライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号７のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５０】
本発明の好ましい実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＰＳＧＬ−１（配列番号７）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）の存在下で配列番号７の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号７のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＰＳＧＬ−１（配列番号７）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）又は未硫酸化ペプチド（配列番号２６）の存在下で配列番号７の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号７のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＰＳＧＬ−１（配列番号７）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）及び可溶性未硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４３）の存在下で配列番号７の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号７のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５３】
本発明の好ましい実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＰＳＧＬ−１（配列番号７）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４、５０、５７及び５８又はそれらの組合せから選択）及び／又は未硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチド（配列番号４３）の存在下で配列番号７の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号７のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５４】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号４４の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号４４のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５５】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性未硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４３）の存在下で配列番号４４の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号４４のペプチドに結合する選択された実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号７、４８、４９又は５９の可溶性硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチドのうちの単数又は複数のものの存在下で配列番号４４の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号４４のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５７】
本発明のもう１つ実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号７、４８、４９又は５９の可溶性硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチドのうちの単数又は複数のもの及び可溶性未硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチド（配列番号２６）の存在下で配列番号４４の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号４４のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５８】
本発明のもう１つ実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号７、４８、４９又は５９の可溶性硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチドのうちの単数又は複数のもの及び可溶性未硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４３）の存在下で配列番号４４の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号４４のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１５９】
本発明のもう１つ実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号７、４８、４９又は５９の可溶性硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチドのうちの単数又は複数のもの及び可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）のうちの単数又は複数のものの存在下で配列番号４４の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号４４のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１６０】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＣＣＲ５（配列番号５３）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）配列番号５３の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号５３のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１６１】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＣＣＲ５（配列番号５３）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性未硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４３）及び／又は未硫酸化可溶性ＰＳＧＬ−１ペプチド（配列番号２６）の存在下で配列番号５３の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；（ｄ）配列番号５３のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１６２】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＣＣＲ５（配列番号５３）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）及び／又は可溶性硫酸化ＰＳＧＬ−１ペプチド（配列番号７、４８、４９及び／又は５９）の存在下で配列番号５３の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号５３のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１６３】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＣＣＲ５（配列番号５３）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）及び／又は未硫酸化可溶性ＰＳＧＬ−１ペプチド（配列番号２６）の存在下で配列番号５３の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；及び（ｄ）配列番号５３のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１６４】
本発明のもう１つの実施形態においては、実体（例えば本発明の抗体又はポリペプチド）を産生するためのプロセスは、（ａ）ライブラリ（例えば抗体又はそのフラグメント）を提供する段階；（ｂ）ＣＣＲ５（配列番号５３）の固定化されたペプチドを提供する段階；（ｃ）可溶性硫酸化ＧＰＩｂペプチド（配列番号４４及び／又は５０）及び／又は未硫酸化可溶性ＧＰＩｂペプチド（配列番号４３）の存在下で配列番号５３の固定化されたペプチドに結合する実体（例えばファージ粒子）についてライブラリをパニングする段階；（ｄ）配列番号５３のペプチドに結合する実体（例えばｓｃＦｖ抗体を含む抗体又はポリペプチド）を産生する段階を含んで成る。
【０１６５】
ＧＰＩｂ及びＰＳＧＬ−１といったようなタンパク質上に存在する硫酸化チロシンエピトープの治療的ターゲティングのための代替的アプローチにおいては、適切な組換えライブラリのスクリーニングにより、小さい無機化合物を同定することができる。かかる化合物は、ｓｃＦｖ又はＩｇＧベースの治療薬に比べて一定数の利点を有する可能性がある。例えば、無機化合物は、経口投与可能で、免疫交差反応性の低下を含めて、増強されたバイオセーフティプロフィールを有し得る。それは、特に当初選択された鉛化合物を最適化するよう合理的な薬物設計に従って、標的に向かっての高い選択性を提供することができる。その他の利点としては、より低い生産コスト、より長い貯蔵寿命及びさほど複雑でない規制認可プロセスがある。
【０１６６】
該発明のエピトープの一定数の実施形態が例えばＧＰＩｂ及びＰＳＧＬ−１上で同定されてきたことから、非常に狭い特異性を有するか又は代替的にはかかるエピトープを各々担持する複数の全く異なる標的が関与する再灌流傷害といった疾病状態について複数のチロシンエピトープをターゲティングする無機化合物を同定するために、リガンド駆動型アプローチをとることが可能である。リガンド駆動型アプローチは、治療的介入のための標的を同定するためのスクリーニングプロセスを著しく短縮し、一連の焦点合せされたライブラリで実施可能な鉛最適化での同時標的バリデーションを可能にする。
【０１６７】
硫酸化チロシンエピトープをターゲティングすることを専門とする無機化合物が、最初に、Ｙ１といった抗体とＧＰＩｂの残基硫酸化Ｔｙｒ２７６及びＡｓｐ−２７７といったようなその既知の標的の間の３次元相互作用を分析することにより、設計され開発され得る。コンピュータ援用組合せライブラリ設計によって、Ｙ１結合部位を擬態して標的に対する増大した親和力を提供する実体から成る化学物質ライブラリを開発することができる。
【０１６８】
本発明は同様に、硫酸化エピトープに結合するヒト抗体を同定するためのライブラリを提供する。該ライブラリは、相補的結合のためのさまざまな抗原結合ドメインを含む免疫グロブリン結合ドメインのものであり、ここで該ライブラリは、重鎖ＣＤＲ３においてのみ多様性を有する。好ましくは、該免疫グロブリン結合ドメインはｓｃＦｖ分子である。同じく好ましくは、免疫グロブリン結合ドメインは、ＤＰ３２から誘導された重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１及び２を有し、より好ましくは、同様にＤＰ３２から誘導された軽鎖可変領域をも有する。該ライブラリの免疫グロブリン結合ドメインは、例えば糸状バクテリオファージといったような任意の適切なベクターの表面上で表示され得る。１つの実施形態においては、本発明のライブラリは、硫酸化されたモチーフ又はエピトープについて選択するために使用可能である。
【０１６９】
本発明の抗体及びその結合フラグメントは、任意には薬学的に有効な担体と共に、薬物、毒素、調合薬及び放射性同位体といったようなさまざまな作用物質と会合、組合せ、融合又は連絡して、抗疾病及び／又は抗癌活性をもつ薬物−ペプチド組成物、融合又は接合体を形成することができる。かかる接合体及び融合体は同様に、診断、予後診断又は病気診断の目的で使用することができる。
【０１７０】
該発明において有用な担体の例としては、ＨＰＭＡ（親水性重合体）又はその他のあらゆる重合体、例えば親水性重合体ならびにその誘導体、組合せ及び修飾がある。代替的には、大量のドキソルビシンを含有する市販のリポソームであるDoxilといったようなｓｃＦｖＹ１分子で修飾されたリポソームといったような装飾されたリポソームを使用することができる。かかるリポソームは、単数又は複数の所望の作用物質を含有するように調製でき、又、高い薬物−抗体比を提供するべく本発明の抗体と混合させることができる。
【０１７１】
代替的には、抗体又はポリペプチドと作用物質の間の連結は直接連結であってもよい。２つ以上の隣接する分子間の直接連結は、分子内の元素又は元素群の間の化学的結合を介して産生され得る。化学的結合は、例えばイオン結合、共有結合、疎水結合、親水結合、静電結合、又は水素結合であり得る。結合は例えばアミド、炭素−スルフィド、ペプチド及び／又はジスルフィド結合であり得る。抗体を作用物質又はリンカーに付着させるためには、共有結合を形成するべく当該技術分野において既知の通り、アミン、カルボキシ、ヒドロキシ、チオール及びエステル官能基を使用することができる。
【０１７２】
ペプチドと作用物質の間又はペプチドと担体の間、又は担体と作用物質の間の連結は、リンカー化合物を介したものであり得る。本書で使用されているリンカー化合物は、２つ以上の部分をつなぎ合わせる化合物として定義づけされる。リンカーは、直鎖又は有枝鎖であり得る。有枝リンカー化合物は、２重分枝、３重分枝又は４重分枝化合物で構成されていてよい。本発明において有用なリンカー化合物は、ジカルボン酸、マレイドヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジド及び小型ペプチドを有する群から選択されたものを内含する。
【０１７３】
本発明に従って有用であるリンカー化合物のより特定的な例としては（ａ）ジカルボン酸、例えばコハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸；（ｂ）マレイミドヒドラジド、例えばＮ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−ｌ−カルボキシルヒドラジド、及びＮ−［マレイミドウンデカノイン酸］ヒドラジド；（ｃ）（３−［２−ピリジルチオ］プロピオニルヒドラジド）；及び（ｄ）炭素原子数２〜５から選択されたカルボン酸ヒドラジド及びその誘導体、組合せ、修飾及び類似体が含まれる。
【０１７４】
小型ペプチドリンカーを用いた直接的カップリングを介した連結も同じく有用である。例えば抗癌薬ドキソルビシンの遊離糖とｓｃＦｖの間の直接的カップリングを小型ペプチドを用いて達成することができる。小型ペプチドの例としては、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（登録商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＫＡＫが含まれる。
【０１７５】
本発明の抗体及びポリペプチドは、放射性同位体といったような画像形成剤（標示マーカーとも呼ばれる）と結合、接合、複合体形成又はその他の形で会合され得、これらの接合体は診断、予後診断又は病気診断及び画像形成目的で使用可能である。かかる放射線同位体−抗体（又はフラグメント）接合体を有するキットが提供されている。
【０１７６】
診断、予後診断、病期診断及び画像形成のために有用な放射性同位体の例としては、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルル、122mテルル、125mテルル、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123ヨウ素、126ヨウ素、131ヨウ素、133ヨウ素、8lmクリプトン、33キセノン、90イットリウム、2l3ビスマス、77ヨウ素、18フッ素、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムが含まれる。好ましい放射性同位体は、Ｘ線又はあらゆる適切な常磁性イオンに対し不透明である。
【０１７７】
標示マーカー分子は同様に螢光マーカー分子であり得る。螢光マーカー分子の例としては、フルオレセイン、フィコエリスリン又はローダミン又はそれらの修飾又は接合体がある。
【０１７８】
標示マーカーに接合された抗体及びポリペプチドは、疾病状態の診断、予後診断又は病気診断に使用可能である。その上、本発明は同様に患者由来の細胞を含有する試料を提供し、本発明の抗体と共に患者由来の細胞をインキュベートすることにより、患者由来の腫瘍細胞をパージする方法をも提供する。かかる活動は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで実施できる。診断、予後診断又は病気診断がインビボ又はエクスビボで実施される場合、画像形成剤は好ましくは、それが患者に受容できないレベルの危害を加えないという点で、生理学的に受容可能である。受容可能な危害レベルは、疾病の重症度及びその他の選択肢の利用可能性といったような基準を用いて臨床医により決定され得る。
【０１７９】
かくして、本発明は、画像形成剤又は標示マーカー分子に連結された該発明のペプチドを有する画像形成剤を有する。治療の前、途中又は後で治療の効能をインビトロ分析するためのキットを提供する。該発明はさらに、（ａ）細胞を組成物と接触する段階；（ｂ）細胞に結合した放射活性を測定する段階ひいては（ｃ）腫瘍を視覚化する段階を有する、癌、より特定的には腫瘍の診断的位置特定及び画像形成のために画像形成剤を使用する方法を提供する。
【０１８０】
適切な画像形成剤の例としては、ＦＩＴＣ、ＰＥなどといった螢光染料、及び緑色螢光タンパク質といったような螢光タンパク質が含まれる。その他の例としては、変色といったような認識可能な変化を生成するべく基質と反応する放射性分子及び酵素が含まれる。
【０１８１】
１つの例においては、キットの画像形成剤は、ＦＩＴＣといったような螢光染料であり、キットは、癌、より特定的には血液関連癌例えば白血病、リンパ腫及び骨髄腫の治療的効能の分析を提供する。ＦＡＣＳ分析は、例えば診断時点、治療中、寛解中及び再発中といった疾症の各病期における画像形成剤により染色された細胞の百分率及び染色の強さを決定するために用いられる。
【０１８２】
本発明は同様に、患者由来の細胞を含有する試料を提供し、本発明の抗体が患者の細胞に結合するか否かを判定し、かくしてその患者にその疾病のリスクがあること又はその疾病に罹患していることを標示することによる、１人の患者の体内の疾病の診断、予後診断又は病気診断方法をも提供する。かかる活動は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで実施可能である。インビボ又はエクスビボで実施される場合、画像形成剤は好ましくは、それが患者に受容できないレベルの危害を加えないという点で、生理学的に受容可能である。受容可能な危害レベルは、疾病の重症度及びその他の選択肢の利用可能性といったような基準を用いて臨床医により決定され得る。
【０１８３】
癌に関しては、患者の体内の疾病の病期決定には一般に、腫瘍のサイズ、タイプ、場所及び侵襲性に基づいて疾病の分類を決定することが含まれる。腫瘍の特性別に癌を分類するための１つの分類システムは、本書に参考として内含され、癌の病期をＴ、Ｎ及びＭのカテゴリ（Ｔはそのサイズ及び場所に従って原発性腫瘍を表わし、Ｎは局所リンパ節転移を、又Ｍは遠位転移を表わす）に分類する「悪性腫瘍のＴＮＭ分類」（第６版）（Ｌ.Ｈ.Sobin Ed）である。さらに、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶという数字は、病期を表わすために用いられ、各々の数字はＴＮＭ因子の考えられる組合せを意味する。例えば、病期Ｉの乳癌は、腫瘍Ｎグループにより、Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０と定義され、Ｔ１は腫瘍の直径が２cm以下であること、Ｎ０は局所リンパ節転移が全くないこと、Ｍ０は遠位転移が全くないことを表わす。日常的処理及び細胞化学染色の下で観察された形態を用いたフランス−アメリカ−イギリスシステムに基づいて分類される亜型を伴うもう１つのシステムが、ＡＭＬの病期診断を行うのに用いられる。
【０１８４】
さらに、近年提案された世界保健機構（ＷＨＯ）の造血及びリンパ系組織の腫瘍性疾患の病期診断又は分類には、（ＡＭＬに特定的に）従来のＦＡＢ型の疾病カテゴリ、ならびに骨髄異形成と結びつけられたＡＭＬ及び特定の細胞遺伝学的所見と相関関係をもつ付加的な疾病タイプが含まれる。例えば、その他の人々も同じく病理学的分類を提案してきた。例えば、ＡＭＬに特定的な１つの提案には、特異的細胞遺伝学的転座と相関関係をもち形態学的評価及び免疫表現型決定により高い信頼性で認識され得、かつ付随する骨髄異形成変化の重要性を取り込んだ疾病型が含まれる。このシステムは、細胞遺伝学的又は分子遺伝学的研究により裏づけされることになり、新しい認識可能な臨床病理学的実体が記述されるにつれて拡張可能と思われる（Arber, Am.J.Clin. Pathol. １１５（４）：５５２−６０（２００１））。
【０１８５】
本発明の抗体及びポリペプチドは、抗癌剤、抗新生物剤、抗ウイルス剤、抗転移剤、抗炎症剤、抗血栓症剤、抗再狭窄剤、抗凝集剤、抗自己免疫剤、抗接着剤、抗心臓血管症患剤、薬剤又はその他の抗疾病剤と結合、接合又はその他の形で会合され得る。作用物質（剤）というのは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ、又はその他のあらゆる温血動物を含む（ただしこれに制限されるわけではない）哺乳動物の予防的治療又は診断において有用である作用物質を意味する。
【０１８６】
かかる作用物質の例としては、アシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンを含む抗ウイルス剤；シロスタゾル、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム、及びアスピリンを含む抗血栓症／再狭窄剤；ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドを含む抗炎症剤；レフルノミド、デニロイキン・ジフチドクス、スブレウム、ＷｉｎＲｈｏＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドを含む抗自己免疫剤；及びリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸を含む抗接着／抗凝集剤及びその誘導体、組合せ及び修正が含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１８７】
薬剤の例としては、アントラサイクリン、例えばドキソルビジン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビジン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビジン、メトキシモルホリノダウノルビシン及びメトキシモルホリニルドキソルビジン及びその誘導体、組合せ及び修正が含まれる。さらなる薬剤例としては、シスプラチン、タキソール、カリチェアミシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、フルダラビン、イダルビシン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド及びブレオマイシン及びその誘導体、組合せ及び修正が含まれる。
【０１８８】
癌細胞の成長阻害には例えば、（ｉ）癌性又は転移性成長の予防、（ｉｉ）癌性又は転移性成長の減速、（ｉｉｉ）細胞を無傷かつ生きた状態に残しながらの癌細胞の成長プロセス又は転移プロセスの完全な防止、（ｉｖ）徴環境と癌細胞の接触の妨害又は（ｖ）癌細胞の殺滅が含まれる。
【０１８９】
白血病細胞の成長には例えば、（ｉ）白血病性又は転移性成長の予防、（ｉｉ）白血病性又は転移性成長の減速、（ｉｉｉ）細胞を無傷かつ生きた状態に残しながらの白血病細胞の成長プロセス又は転移プロセスの完全な防止、（ｉｖ）徴環境と癌細胞の接触の妨害又は（ｖ）白血病細胞の殺滅が含まれる。
【０１９０】
１実施形態においては、本発明は、当該抗体を投与することによりＡＤＣＣを誘発又は活性化させる方法を提供する。従って、本発明のＳ１５及びＡ３Ｒと実質的に同じ親和力と結合する抗体及びコンセンサス抗体は、ＡＤＣＣを活性化しかつ／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（例えばＣＤ５６＋）、γδＴ細胞及び／又は単球を刺激する可能性があり、このことは細胞溶解を結果としてもたらし得る。一般に、Ｆｃ領域を含む抗体又はその抗体の一部分の投与の後、抗体は例えばＮＫ細胞といったエフェクタ細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合し、パーフォリン及びグランザイムＢの放出及び／又はＦａｓＬ発現の誘発をトリガーし、これが次にアポトーシスを導く。
【０１９１】
標的細胞表面上のＦａｓ受容体に対するエフェクタ細胞上で発現されたＦａｓＬの結合は、Ｆａｓ受容体シグナル変換経路の活性化を介して標的細胞のアポトーシスを誘発する可能性がある。１実施形態においては、該発明のコンセンサス配列を含むＩｇＧ抗体がエフェクタ細胞上でのＦａｓＬ発現を誘発する。関与するエフェクタ細胞のタイプ、サイトカイン（ＩＬ−２及びＧ−ＣＳＦなど）、インキュベーション時間、細胞の表面上に存在する受容体の数及び抗体親和力を含め、さまざまな因子がＡＤＣＣに影響を及ぼしうる。
【０１９２】
本発明の抗体及びポリペプチドが有用な形で連結されうる抗疾病、抗癌及び抗白血病剤の例としては、毒素、放射性同位体及び調合薬がある。
【０１９３】
毒素の例としては、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン又はその誘導体、組合せ及び修正が含まれる。
【０１９４】
放射性同位体の例としては、位置特定及び／又は治療に用いることのできるガンマ放射体、陽電子放射体及びＸ線放射体及び治療に使用できるベータ放射体及びアルファ放射体が含まれる。診断に有用であると以前に記述された放射性同位体は、治療のためにも有用である。
【０１９５】
抗癌又は抗白血病剤の制限的な意味のない例としては、アントラサイクリン、例えばドキソルビジン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビジン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビジン、メトキシモルホリノダウノルビシン及びメトキシモルホリニルドキソルビジン及びその誘導体、組合せ及び修正が含まれる。薬剤の例としてはｃｉｓ−プラチン、タキソール、カリチェアミシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、及びブレオマイシン、及びその誘導体、組合せ及び修正が含まれる。
【０１９６】
１つの実施形態においては、本発明の薬学組成物は、本発明のコンセンサス配列のいずれかを含む抗体又はポリペプチド及び薬学的に受容可能な担体を有する。該抗体又はポリペプチドは、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、転移、腫瘍細胞又は白血病細胞の成長及び／又は複製又は腫瘍患者における腫瘍細胞の、又は白血病患者における白血病細胞の数の増大を阻害するのに有効な量で存在し得る。代替的には、該抗体又はポリペプチドは、腫瘍細胞又は白血病細胞の死亡率を増大させるのに有効な量で存在し得る。同様に代替的には、該抗体又はポリペプチドは、抗疾病剤による損傷に対する罹患した細胞の、抗癌剤による損傷に対する腫瘍細胞の、又は抗白血病剤による損傷に対する白血病細胞の感受性を改変するのに有効な量で存在し得る。さらに代替的には、抗体又はポリペプチドは、腫瘍患者における腫瘍細胞の、又は白血病患者における白血病細胞の数を減少させるのに有効な数で存在しうる。さらに代替的には、抗体又はポリペプチドは、再狭窄を阻害するのに有効な量で存在でき、この場合、コンセンサス抗体は好ましくはＡ３Ｒを含む。抗体又はポリペプチドは同様に、ＨＩＶの進入を阻害する及び／又はＨＩＶ感染を治療するのに有効な量でも存在し得る。代替的には、抗体又はポリペプチドは、特定の細胞又は部位に向かって１つの治療薬を導くためのターゲティング剤として使用可能である。
【０１９７】
本発明の抗体及びポリペプチドは、それを必要とする患者に対し任意の適切な方法を介して投与することができる。方法例としては、静脈内、筋内、皮下、局所、気管内、髄腔内、腹腔内、リンパ球内、鼻腔内、舌下、経口、直腸、経膣、呼吸、口腔、皮内、経皮又は胸腔内投与が含まれる。
【０１９８】
静脈内投与のためには、製剤は好ましくは、患者に対し投与される量が、所望の組成物の約０．１mg〜約１０００mgの有効量となるような形で調製されることになる。より好ましくは、投与量は、所望の組成物の約１mg〜約５００mgの範囲内となる。該発明の組成物は、広い投薬量範囲にわたり有効であり、治療すべき疾病の詳細、患者の体内のペプチド又はポリペプチドベースの医薬組成物の半減期、抗体又はそのフラグメントと複合体化されるあらゆる作用物質及び医薬組成物の物理的及び化学的特性、医薬組成物の投与様式、治療又は診断されるべき患者の詳細、ならびに治療担当医が重要とみなすその他のパラメータといった因子により左右される。
【０１９９】
経口投与のための医薬組成物は、任意の適切な形態であり得る。例としては、錠剤、液体、エマルジョン、懸濁液、シロップ、丸薬、カプレット及びカプセルがある。医薬組成物を作る方法は、当該技術分野において周知である（例えばRemington,The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro（Ed.）Lippincott, Williams & Wilkins（pub）を参照のこと）。
【０２００】
医薬組成物は、時限放出、持続放出、間欠放出又は連続放出を容易にするようにも処方され得る。医薬組成物は同様に、時限、持続、間欠又は連続放出デバイスといったようなデバイスに入れて投与されてもよい。
【０２０１】
局所投与のための医薬組成物は、クリーム、軟こう、ローション、パッチ、溶液、懸濁液、凍結乾燥物及びゲルといったような適切なあらゆる形態をしていてよい。
【０２０２】
本発明の抗体及びポリペプチドを有する組成物は、従来の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、担体などを含むことができる。錠剤、丸薬、カプレット及びカプセルは、ラクトース、でんぷん及びステアリン酸マグネシウムといったような従来の賦形剤を内含し得る。座薬は、ろう及びグリセロールといったような賦形剤を内含し得る。注射溶液は、食塩水といったような無菌で発熱物質を含まない媒質を含み、緩衝剤、安定化剤又は保存剤を内含し得る。従来の腸溶コーティングも使用可能である。
【０２０３】
本発明の抗体及びポリペプチド及びその薬学組成物は、それを必要とする患者において、疾病を治療する（例えば治療には疾病の影響を改善すること、疾病を予防すること又は疾病の進行を阻害することが含まれ得る）方法において使用可能である。かかる方法には、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、転移、腫瘍細胞又は白血病細胞の成長及び／又は複製又は腫瘍患者における腫瘍細胞の、又は白血病患者における白血病細胞の数の増大を阻害する段階が含まれる。さらに、かかる方法には、腫瘍細胞又は白血病細胞の死亡率を増大させること、抗疾病剤による損傷に対する罹患細胞の、抗癌剤による損傷に対する腫瘍細胞の、又は抗癌剤による損傷に対する白血病細胞の感受性を改変することが含まれる。かかる方法にはさらに腫瘍患者における腫瘍細胞の、又は白血病患者における白血病細胞の数を減少させる段階も含まれる。かかる方法は同様に、細胞内へのＨＩＶの進入を阻害するか減少させ、かかる阻害の結果としてＨＩＶの複製を遮断しかくしてＨＩＶ感染を治療する段階をも含む。かかる方法はさらに、再狭窄といった心臓血管疾患を予防する又は阻害する段階を内含している。
【０２０４】
本発明はさらに、例えばＡＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ−白血病、Ｂ−ＣＬＬ、Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、多発性骨髄腫、転移、ＨＩＶ感染、心臓血管疾患又は細胞ローリング、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移といったような細胞機能又は作用が有意な役割を果たすその他の疾病といったようなさまざまな疾病状態の治療用の医薬品の製造において使用するための抗体及びポリペプチドを提供する。かかる医薬品は、本発明の抗体及びポリペプチドを含む。
【０２０５】
この出願全体を通して、さまざまな刊行物、特許及び特許出願に対する参照が指示されてきた。これらの刊行物、特許及び特許出願の教示及び開示は、本発明が関係する技術の現状をより完全に記述する目的で、本書に参考としてその全体が内含される。
【実施例】
【０２０６】
実施例
以下の例は、該発明を理解するのを助け該発明をさらに詳しく例示する目的で記されており、いかなる形であれ、その範囲を制限するものとみなされるべきではない。特定の試薬及び反応条件が記述されているものの、本発明の範囲により包含される修正を加えることも可能である。
【０２０７】
実施例１
当該例は、Ｓ１５抗体フラグメントの結合能力を含めＳ１５ｓｃＦｖ抗体フラグメントの選択、産生及び初期特徴づけを実証している。簡単に言うと、硫酸化ＰＳＧｌ−１を結合させるｓｃＦｖ抗体を同定するために、６つのアミノ酸のランダムＣＤＲ３−ＶＨを伴うＶＨ−ＶＬの特異的足場に基づくファージディスプレーライブラリが利用された。ｓｃＦｖ抗体は、（未成熟ＰＳＧＬ−１分子のアミノ酸４２−５８に対応する、すなわちシグナル配列を含む）Ｎ末端からＣ末端まで又はＣ末端からＮ末端までの成熟ＰＳＧＬ−１分子のアミノ酸配列ｌ−１７を有する合成硫酸化ペプチドに対しパニングすることによって得られた。合成硫酸化ペプチド又はＰＳＧＬ−１を発現する全細胞に対し結合する特異的ファージクローンを同定し特徴づけするために、フローサイトメトリ、特に螢光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及びＥＬＩＳＡが使用された。
【０２０８】
ファージディスプレーライブラリは、ｐＨＥＮベクター内の組合せファージ抗体ライブラリ（ＣＡＴ）から単離したクローンの足場から構築された。足場は、ＶＨ３（１−３、３−２０）及びＶＬ（１１−７）を含有していた。該ライブラリは、６アミノ酸という長さのＣＤＲ３超可変ループのランダム化によって構築された。（ｐＨＥＮ−Ｙ１内に見られるように２つのＥａｇ１部位ではなく）ＣＤＲ３の５′領域に単一のＥａｇ１部位をもつ構成体を提供するため、ＶＬの３′端におけるＥａｇ１制限部位は、ｐＨＥＮ−Ｙ１からＸｍａ１−Ｎｏｔ１フラグメントを切除し、Ｎｏｔ１部位のライゲーション部分の突然変異を伴って（配列番号２０のオリゴヌクレオチド及び配列番号２１のオリゴヌクレオチドをアニールすることによる）新しいフラグメントを挿入することによって、突然変異を受けた。該突然変異は、２つのユニーク部位（Ｅａｇ１及びＸｍａ１）を生成するため及び、同じサイズではあるものの、ランダム化ＣＤＲ３を伴うＰＣＲ産物を導入するために必要とされた。ライゲーションの後、プラスミドは挿入領域で配列決定され、突然変異が確認された。新しいｐＨＥＮ−Ｙ１−ｍｕｔはＥａｇ１及びＸｍａ１で制限され、大きいフラグメントはその後のライゲーションのためのベクターであった。
【０２０９】
可変ＣＤＲ３の調製のための鋳型を、配列番号２２のオリゴヌクレオチド及び配列番号２３のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ産物（鋳型Ａ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから単離し、さらなる増幅のために精製した。鋳型Ａを、配列番号２４及び配列番号２３のＯＮでの増幅のために使用、産物を精製し、鋳型Ｂと呼称した。鋳型Ｂを配列番号２５及び配列番号２３のＯＮで増幅し、精製し、Ｅａｇ１及びＸｍａ１制限酵素で制限させた。Ｅａｇ１及びＸｍａ１を伴う制限されたベクターｐＨＥＮ−Ｙ１−ｍｕｔを精製し、同じ酵素で制限された最後のＰＣＲ産物に対してライゲートさせた。
【０２１０】
ＴＧ１を形質転換するためにライゲーション産物を用いた。３回のライゲーションからの形質転換収量は、２．４×１０6の独立したコロニー形成単位（ＣＦＵｓ）を生成した。１０（１３cm）ＳＯＢＡＧ（Ｂａｃｔｏ−寒天１５ｇ平板について；１リットルあたり２０ｇのＢａｃｔｏ−トリプトン、５ｇのＢａｃｔｏ酵母、８．５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１Ｍのグルコース、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン）平板内での平板固定によりライブラリを増幅した。細菌を、平板からＳＯＢＡＧ培地中に再懸濁させ、２０％のグリセロール中で−７０℃に保った。増幅されたライブラリの力価は、１．５×１０9ＣＦＵ／mlであった。バイオパニング実験を実施するべくファージの形でライブラリをレスキューする目的で、増幅されたライブラリのアリコート（〜１０8ＣＦＵ）を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７に感染させた。このライブラリは、２０6又は６．４×１０7の成員を収納する理論上のライブラリとは異なり、約２．５×１０6個の成員を収納していた。
【０２１１】
ファージディスプレーライブラリと共に配列番号７の固定化されたペプチドをインキュベートし、洗浄により未結合ファージを除去し、結合したファージを特異的に溶出することによって、バイオパニングを実施した。溶出したファージクローンを任意には、さらなる結合サイクル及び任意の増幅の前に増幅させ、ペプチドに対し最もよく結合するような抗体フラグメントを担持するファージクローンに有利に特異的配列のプールを富化させた。複数のパニングサイクル後、個々のファージクローンを特徴づけし、クローンの配列を決定した。
【０２１２】
本発明においては、配列番号７のビオチニル化された硫酸化ペプチドに結合されたストレプトアビジン磁気ビーズと共に溶解した状態でファージディスプレーライブラリをパニングすることにより、Ｓ１５抗体クローンを同定した。このペプチドは化学的に合成されたもので、第３のチロシン残基の硫酸化を含め、ＰＳＧＬ−１内部のアミノ酸４２〜５８に見られるきわめて酸性の強い配列に基づいている。合成ペプチドのＮ末端は、アミノカプロン酸で拡張され、硫酸化エピトープの立体障害を回避するべくカプロンのアミノ基においてビオチニル化されている。配列番号７の合成硫酸化ペプチドを、余剰のペプチドのインキュベーションとそれに続くＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．００５％のTween−２０）での洗浄及びＰＢＳＴ−Ｍ（５％の低脂肪乳が追加されたＰＢＳＴ）による遮断により、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynal）上に固定化させた。パニングのために、ペプチド結合ビーズを２×１０11個のファージと共にインキュベートさせた。非硫酸化ペプチドに結合するｓｃＦｖクローンの単離を回避するべく、パニング溶液に対し、ビオチニル化も硫酸化もされていない同じ線形配列（配列番号４５）のペプチドを添加した。
【０２１３】
ＰＢＳＴ中での高ストリンジェンシー洗浄液を用いて、３回のパニングサイクル（各々３７℃で２０分）を実施した。洗浄後、グリシン０．２Ｍ（ｐＨ２．２）により結合したファージを溶出させ、トリス１Ｍ（ｐＨ９．１）により中和させた。溶出されたファージを、感染性ＴＧ１細菌により増幅させ、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７によりレスキューした。３回のパニングサイクルの時点で最高５０００倍の富化が達成された。第３のパニングサイクルの後、個々のクローンをＣＤＲ３領域内でアミノ酸配列について分析した。これらの選択されたクローンのＣＤＲ３領域アミノ酸配列（配列番号９、２７〜３３、３５．４）は、表１に列挙されている。
【表１】
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【０２１４】
表１に示されている結果は、強いコンセンサス配列が得られたことを示している（全てのＣＤＲ３配列中で第１及び第６位置の疎水性残基、通常は第２位置の塩基性残基及び第４位置のプロリン）。
【０２１５】
ＰＳＧＬ−１の硫酸化部分に基づいて合成硫酸化ペプチドに対する結合をさらに分析するために、パニングされ選択されたクローンからのファージ（図１）及び非硫酸化ｓｃＦｖ上清（図２）を用いたＥＬＩＳＡ分析を実施した。これらの実験は、両方共以前に同定されＰＳＧＬ−１に結合することがわかっているｓｃＦｖ抗体Ｖ１及びＬ３２の分析を内含していた。Ｙ１は、米国特許出願第１０／０２９，９２６号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９，４４０号内で記述されており、Ｌ３２は、米国出願第１０／１８９，０３２号に記述されている）。ＥＬＩＳＡ分析は、「テスト」ウェル中で配列番号７の合成硫酸化ペプチド及び「バックグラウンド」ウェル）中で配列番号２６の合成非硫酸化ペプチドを用いて、並行して実施された。メーカーが推奨する通り、ＮＨ−CovaLinkTM平板（ＮＵＮＣ）上でペプチドをコーティングした。テストウェル内の対応する系からの結合データから、バックグラウンドウェルから得た結合データを差し引いて、図１及び２に示された結果を生成した。合成硫酸化ペプチドに対する結合についての負の対照（ＮＣ）として、無作為に選択したファージクローンを用いた。
【０２１６】
図１は、テスト対象であるパニングされて選択されたファージクローンの全てが合成硫酸化ペプチドに特異的に結合したことを示している。図２は、３回のパニングサイクル後に選択されたクローン上で発現されたｓｃＦｖの全てが合成硫酸化ペプチドに特異的に結合したことを示している。
【０２１７】
表２は、例１の研究において用いられた全てのクローン及びそのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の要約を提供している。
【表２】
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【０２１８】
選択されたクローンからのｓｃＦｖが、ＰＳＧＬ−１を発現するＡＭＬＭ４細胞系統であるＭＬ−２上のＰＳＧＬ−１に対する結合を評価するため、ＦＡＣＳにより分析された。図３に示されているように、選択されたクローン全てからのｓｃＦｖならびにＬ３２が異なる感度でＭＬ−２細胞上でＰＳＧＬ−１に対し結合した。
【０２１９】
パニングされ選択されたクローンからの精製されていないｓｃＦｖ上清を用いたＥＬＩＳＡ分析が、血小板上で発現される糖タンパク質であるグリコカリシンに対する結合を分析する目的で実施された。図４に示された結果は、配列番号９のＣＤＲ３配列を有しＳ１５と呼称されている１つのクローンがその他の選択されたクローン及び以前に同定されたｓｃＦｖＬ３２に比べて低いグリコカリシンに対する親和力を有していたことを表わしている。
【０２２０】
考え合わせると、図３及び４に示されている結果は、グリコカリシンに対する結合に基づきＳ１５が、ＰＳＧＬ−１を発現するＭＬ−２細胞について高い親和力を、又血小板について低い親和力を表示することを示している。この結論は、図５にその結果が示されている（ＰＳＧＬ−１発現細胞である）顆粒球及び血小板に対するｓｃＦｖ結合のＦＡＣＳ分析により確認された。図５は、Ｓ１５が顆粒球に対しては強く結合するものの無傷の血小板に対しては弱くしか結合しないことを明確に示している。
【０２２１】
図６は、ｓｃＦｖの顆粒球／血小板結合比の比較を示している。顕著にも、Ｓ１５はＳ１１、Ｓ９、Ｓ１、Ｓ２０、３．４、３．１、Ｙ１及びＬ３２のものよりも著しく高い顆粒球／血小板結合比を有する。
【０２２２】
図７は、ＰＳＧＬ−１に対し導かれたマウス抗体であるＫＰＬ−１の存在下及び不在下でのＭＬ−２細胞上のＰＳＧＬ−１に対するＳ１５の分析の結果を示す。Ｓ１５は、ＫＰＬ−１の不在下で高い親和力でＭＬ−２細胞結合したが、かかる結合は基本的に、ＫＰＬ−１の存在下で除去された。これらの結果は、ＭＬ−２、細胞上でＰＳＧＬ−１細胞を結合させるＳ１５の特異性を確認している。
【０２２３】
Ｓ１５を、例２に記述されているさらなる実験のため、プロテインＡ親和力カラム上で精製した。
【０２２４】
実施例２
当該例は、類似の要領で精製されたＬ３２及びＹ１ｓｃＦｖに比べた、特にその結合能力を含めた精製済みＳ１５ｓｃＦｖ抗体の特徴づけについて記述している。
【０２２５】
ＰＢＳの存在下でのＭＬ−２細胞に対する精製済みＳ１５、Ｙ１及びＬ３２ｓｃＦｖの結合を分析するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。図８及び９に示された結果は、Ｓ１５が、Ｌ３２及びＹ１と比べてＭＬ−２細胞に対する少なくとも１００倍大きい結合を示すということを表わしている。
【０２２６】
５０％の血漿中でのＭＬ−２細胞に対する精製済みのＳ１５、Ｙ１及びＬ３２  ｓｃＦｖの結合を分析するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。図１０及び１１に示されている結果は、Ｓ１５による結合の絶対値がＬ３２及びＹ１に比べ著しく（少なくとも１０倍）高かったことを表わしている。
【０２２７】
ＭＬ−２細胞に対する精製済みＳ１５ｓｃＦｖ結合の用量依存性も同様に分析し、Ｌ３２及びＹ１のものと比較した。図１２に示されているように、Ｓ１５の用量応答は、１０ナノグラム（ｎｇ）においてさえ、Ｌ３２及びＹ１のものより著しく大きい。
【０２２８】
実施例３
この例は、第１のチロシン位置での硫酸化を含むＧＰＩｂの残基２６８〜２８５に対応する合成ペプチドに対して例１内に記述されたライブラリをパニングすることによって得られたコンセンサス抗体を含む２つの付加的な抗体の同定について記述している。
【０２２９】
当該例は、Ｄ１及びＤ３の抗体フラグメントの結合能力を含め、Ｄ１及びＤ３ｓｃＦｖ抗体フラグメントの選択、産生及び初期特徴づけを実証している。簡単に言うと、硫酸化ＧＰＩｂを結合させるｓｃＦｖ抗体を同定するために、６個のアミノ酸のランダムＣＤＲ３−ＶＨを伴うＶＨ−ＶＬの特異的足場に基づくファージディスプレーライブラリを利用した。ｓｃＦｖ抗体は、（未成熟ＧＰＩｂ分子のアミノ酸２８４−３０１に対応する、すなわちシグナル配列を含む）Ｎ末端からＣ末端までの成熟ＧＰＩｂ分子のアミノ酸配列２６８−２８５（ＧＤＥＧＤＴＤＬＹ（ＳＯ4）ＤＹＹＰＥＥＤＴＥ（配列番号４４）を有する合成硫酸化ペプチドに対しパニングすることによって得られた。合成硫酸化ペプチド又はＧＰＩｂを発現する血小板に対し結合する特異的ファージクローンを同定し特徴づけするために、フローサイトメトリ、特に螢光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及びＥＬＩＳＡが使用された。
【０２３０】
使用したファージディスプレーライブラリは例１で記述されている。
【０２３１】
ファージディスプレーライブラリと共に配列番号４（ＧＤＥＧＤＴＤＬＹSＤＹＹＰＥＥＤＴＥ）の固定化されたペプチドをインキュベートし、洗浄により未結合ファージを除去し、結合したファージを特異的に溶出することによって、バイオパニングを実施した。溶出したファージクローンを任意には、さらなる結合サイクル及び任意の増幅の前に増幅させ、ペプチドに対し最もよく結合するような抗体フラグメントを担持するファージクローンに有利に特異的配列のプールを富化させた。複数のパニングサイクル後、個々のファージクローンを特徴づけし、クローンの配列を決定した。
【０２３２】
本発明においては、磁気ビーズに共有結合した配列番号４４の化学的に合成した硫酸化ペプチドと共に溶解した状態でファージディスプレーライブラリをパニングすることにより、Ｄ１及びＤ３抗体クローンを同定した。配列番号４４の硫酸化ペプチドは、第１のチロシン残基の硫酸化を含め、成熟ＧＰＩｂ内部のアミノ酸２６８〜２８５に見られるきわめて酸性の強い配列に基づいている。Ｓ４４の合成硫酸化ペプチドを、メーカーの指示事項に従ってＥＤ／ＮＨＳが関与する反応によりアミン−磁気ビーズ（Dynal）に対して共有結合させた。ビーズをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．００５％のTween−２０）での洗浄し、ＰＢＳＴ−Ｍ（５％の低脂肪乳が追加されたＰＢＳＴ）により遮断させた。パニングのために、ペプチド結合ビーズを２×１０11個のファージと共にでインキュベートさせた。非硫酸化ペプチドに結合するｓｃＦｖクローンの単離を回避するべく、パニング溶液に対し、硫酸化が欠如しているものの同じ線形配列（配列番号４３）のペプチドを添加した。
【０２３３】
ＰＢＳＴ中での高ストリンジェンシー洗浄液を用いて、３回のパニングサイクル（各々３７℃で２０分）を実施した。洗浄後、グリシン０．２Ｍ（ｐＨ２．２）により結合したファージを溶出させ、トリス１Ｍ（ｐＨ９．１）により中和させた。溶出されたファージを、感染性ＴＧ１細菌により増幅させ、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７によりレスキューした。３回のパニングサイクルの時点で最高５０００倍の富化が達成された。第３のパニングサイクルの後、個々のクローンをＣＤＲ３領域内でアミノ酸配列について分析した。これらの選択されたクローンのＣＤＲ３領域アミノ酸配列（配列番号１１〜１６）は、表３に列挙されている。
【表３】
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【０２３４】
表３に示されている結果は、強いコンセンサス配列が得られたことを示している（全てのＣＤＲ３配列中で第１及び第６位置の疎水性残基、通常は第２位置の塩基性残基及び第４位置のプロリン）。
【０２３５】
ＧＰＩｂの硫酸化部分に基づいて合成硫酸化ペプチドに対する結合をさらに分析するために、パニングされ選択されたクローンからのファージ（図１３）を用いたＥＬＩＳＡ分析を実施した。ＥＬＩＳＡ分析は、「テスト」ウェル中で配列番号４４ＧＰＩｂ硫酸化（ＧＤＥＧＤＴＤＬＹSＤＹＹＰＥＥＤＴＥ）の合成硫酸化ペプチド、「バックグラウンド」ウェル中で配列番号４３（ＧＤＥＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥ）の合成ＧＰＩｂ非硫酸化ペプチド、そしてＰＳＧＬ１−１から誘導された硫酸化及び非硫酸化ペプチドとしてそれぞれ配列番号７（ＱＡＴＥＹＥＹＬＤＹSＤＦＬＰＥＴＥ）及び配列番号２６（ＱＡＴＥＹＥＹＬＤＹＤＦＬＰＥＴＥ）を用いて並行して実施された。メーカーが推奨する通り、ＮＨ−CovakinkTM平板（ＮＵＮＣ）上でペプチドをコーティングした。テストウェル内の対応する系からの結合データから、バックグラウンドウェルから得た結合データを差し引いて、図１３に示された結果を生成した。合成硫酸化ペプチドに対する結合についての負の対照（ＮＣ）として、無作為に選択したファージクローンを用いた。
【０２３６】
図１３は、選択されたファージクローン各々が、合成硫酸化ペプチドの両方すなわちＧＰＩｂ及びＰＳＧＬ−１に特異的に結合したことを示している。クローンは、合成硫酸化ペプチドに対する一定範囲の結合強度を示したが、各々のクローンはＧＰＩｂ及びＰＳＧＬ−１の両方に関してほぼ同じ挙動を表示した。
【０２３７】
選択されたクローンからのｓｃＦｖを、グリコカリシン（血小板内で発現されたＧＰＩｂから誘導された外側膜部分）に対する結合を評価するべくＥＬＩＳＡにより分析した。図１４に示されているように、ｓｃＦｓＤ１及びＤ３は有意な結合を示し、一方Ｄ２及びＤ１６は弱い結合を示し、Ｄ５及びＤ９は負の対照と類似していた。
【０２３８】
選択されたクローンからのｓｃＦｖｓ（実験１回につき１μｇ）をＦＡＣＳにより分析して、ＰＳＧＬ−１を発現するＡＭＬＭ４細胞系列であるＭＬ−２に対する結合を評価した。表４に示されているように、ｓｃＦｖｓの全てがＭＬ−２細胞に対し、異なる感度で結合した。Ｄ１及びＤ３は、恐らくはＰＳＧＬ−１のエピトープとの相互作用を介してＭＬ−２に対する最も強い結合を示した。
【表４】
2007528711.tif 000005
【０２３９】
実施例４
当該例は、本発明のコンセンサス抗体内に入るＣＤＲ３配列を有する複数のｓｃＦｖ抗体の結合を実証している。簡単に言うと、足場としてＹ１−ｓｃＦｖのＣＤＲ３配列を用いて、突然変異体ｓｃＦｖを産生し、血小板及び顆粒球に対する結合に対するこれらの突然変異の効果を査定した。
【０２４０】
Ｙ１−ｓｃＦｖの重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）のＣＤＲ３内の部位特異的突然変異誘発を用いて、（配列内に入る付加的なＣＤＲ３領域を生成した。これらの付加的なｓｃＦｖを次にテストして、血小板及び顆粒球に対する相対的結合を見極めた。
【０２４１】
Ｙ１−ｓｃＦｖは、血小板上に見られる負に帯電したＧＰＩｂαエピトープに結合することがわかっている。Ｙ１のＣＤＲ３Ｈを含む６個のアミノ酸配列内には、第２の位置にアルギニン残基すなわち正に帯電したアミノ酸が存在している。ＧＰＩｂαに対する結合におけるこのアルギニン残基の考えられる静電効果を調べるために、４つの突然変異体ｓｃＦｖｓを構築した。突然変異体Ｒ２Ａのアルギニン残基はアラニンにより置換されている。突然変異体Ａ３Ｒは、位置３に付加的なアルギニンを有し、アラニンに置き換わっている。突然変異体Ｖ５Ｒは、位置５に付加的なアルギニンを有しバリンに置き換わっている。第４のｓｃＦｖは、スクランブルされた突然変異体であった。ｓｃＦｖ突然変異体は、表５に要約されている。
【表５】
2007528711.tif 000006
【０２４２】
血小板に対する結合における４つの突然変異体ｓｃＦｖｓ及びＹ１ｓｃＦｖの比較分析が、以下の通り、ＦＡＣＳ分析によって実施された。
【０２４３】
ｓｃＦｖｓの混合物４００μｇでウサギを免疫することにより、抗ｓｃＦｖ抗体を生成し、メーカーの指示事項に従って、Ｒ−フィコエリスリン接合キット、PhycolinkTM（ProZyme, San Leandro, ＣＡ）を用いて標識した。１時間室温で１０7個の洗浄済み血小板と共にｓｃＦｖｓのアリコート（１０μｇ／ｍＬ）をインキュベートした。その後血小板を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で洗浄し、１時間室温でＲ−フィコエリスリン−抗−ｓｃＦｖ抗体と共にインキュベートした。その後、血小板を洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁し、試料（１０4個の血小板）をＦＡＣＳ（ＶＡＣ Scan, Becton-Dick-inson, ＣＡ）により分析した。
【０２４４】
図１５は、異なるドナーからの血小板を用いた３回の実験からの平均結合＋ＳＥＭを示している。突然変異体Ｒ２Ａは、Ｙ１親ｓｃＦｖに比べて、血小板に対する結合を示しておらず、ＣＤＲ３Ｈの第２の位置にあるアルギニンが血小板結合機能において１つの役割を果たす可能性があるということを示唆している。突然変異体Ｖ５Ｒは、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲内で野生型Ｙ１−ｓｃＦｖに類似した要領で血小板に結合した。しかしながら２０μｇ／mlの濃度では、Ｖ５Ｒの結合は、Ｙ１ｓｃＦｖ（図１５）に比べて２倍高かった。これとは対照的に、突然変異体Ａ３ＲｓｃＦｖは、テストした全ての濃度でＹ１ｓｃＦｖに比べ９倍高い血小板に対する結合を示し、位置２におけるアルギニン残基に隣接する付加的なアルギニン残基が血小板に対する結合を増大させ得ることを示唆した。第２位置での突然変異体が欠如したアルギンについて予想された通り、スクランブルされたｓｃＦｖは血小板に結合できなかった（図１５）。
【０２４５】
ｓｃＦｖは同様に、ＥＬＩＳＡ検定を用いて、精製グリコカリシン及びＧＰＩｂα誘導ペプチドに対するその結合能力についても分析された。図１６は、２回の実験からの５μｇ／mlのｓｃＦｖ＋ＳＴＤＶの平均的結合としてこれらの結果を示している。突然変異体Ｒ２ＡｓｃＦｖ及びスクランブルされたｓｃＦｖは、精製ＧＰＩｂαにもＧＰＩｂα誘導ペプチドのいずれにも結合しなかった。Ｖ５Ｒは、Ｖ１と類似の要領で精製グリコカリシン及びＧＰＩｂα誘導ペプチドに結合した。突然変異体Ａ３Ｒは、Ｙ１に比べて高いグリコカリシンに対する結合を示した。
【０２４６】
血小板凝集に対する突然変異体ｓｃＦｖの効果は、以下の通りに実施した研究において評価された。洗浄した血小板をLumiaggregometer（Chronolog, Havertown, ＰＡ）内で３７℃で５００ｒｐｍで撹拌した。血小板懸濁液及び懸濁媒質を通した光透過の差異を１００％の凝集として考慮した。血小板凝集に対するＡｂ−ｓｃＦｖｓの効果を、アゴニストの添加の前に室温で２分間ｍＡｂ−ｓｃＦｖｓのさまざまな濃度でインキュベートし、４分間凝集を記録することによって評価した。
【０２４７】
血小板凝集に対するＡ３ＲｓｃＦｖの効果は、その増強した血小板結合能力と一貫性あることがわかった。図１７は、この突然変異体が、Ｙ１ｓｃＦｖと比べて、洗浄した血小板中のリストセチン誘発されたｖＷＦ依存性血小板凝集のさらに有効な阻害を示す、ということを示している（それぞれ０．２μＭ及び０．８μＭのＩＣ50）。
【０２４８】
合わせて考慮すると、これらの実験は、Ｙ１−ＣＤＲ３Ｈ内の位置２におけるアルギニン残基が血小板ＧＰＩｂａに対する結合に関連性をもつものであるということを実証している。その上、位置３における付加的なアルギニン残基の付加が血小板結合能力及び抗凝集機能の両方を増大させたことから、かかる結合には静電相互作用が関与し得る。
【０２４９】
実施例５
Ａ３Ｒ及びＹ１ｓｃＦｖｓの生物活性を、高いせん断速度下でポリスチレン表面上の全血血小板の接着及び凝集を臨床的に評価し、かくして生理学的条件を模倣するための新しい方法であるCone and Plate（let）Analyzer（ＣＰＡ）検定においてさらに査定した（Varon et al.,（１９９７）Thromb. Res. ８５（４）：２８３−２９４；Shenkman et al.,（２０００）Thromb. Res.９９（４）：３５３−３６１）。
【０２５０】
これらの実験を以下のように実施した。すなわち、血液試料（０．２ml）を非組織培養４ウェルポリスチレン平板（Nunc, Rockilde, Denmark）上に設置し、このシステムのために特定的に指定された回転テフロン（登録商標）コーンを用いて、１３００秒-1のせん断で一分間流動に付した。該コーンの直径は１４mmで角度は２．４５°であり、これが平板表面全体にわたり恒常な流体せん断応力を誘発した。その後ウェルをＰＢＳで徹底的に洗浄し、May-Grunwald染色で染色し、画像分析システム（Galai, Migdal Haemek, イスラエル）に接続された倒置光顕微鏡（日本、東京、オリンパス）で分析した。
【０２５１】
ＣＰＡ検定における血小板接着に対する１μＭ（２５μｇ／ml）及び２μＭ（５０μｇ／ml）のｓｃＦｖ抗体を評価するために、ＣＰＡ検定を実施した。図１８に示されているように、Ａ３Ｒ突然変異体は、対照における１３％からそれぞれ１μＭ及び２μＭの濃度での７％及び３％までの表面被覆率の減少を示した。これと比較して、Ｙ１−ｓｃＦｖは表面被覆率に対する効果を全くもたず、両方の濃度において対照の場合と類似であった。これらの結果は、Ａ３Ｒ突然変異体が、血小板上のＧＰＩｂ受容体に対するその結合を介してＣＰＡの流動条件下でポリスチレン表面に対する血小板接着を阻害することを示した。
【０２５２】
両方の抗体の平均サイズ（ＡＳ）はわずかに減少した（データ示さず）。これらの結果は、Ａ３ＲｓｃＦｖが、血小板上のＧＰＩｂ受容体に対する結合を介して流動条件下でポリスチレン表面に対する血小板接着を阻害し得ることを示した。
【０２５３】
Ａ３Ｒが硫酸化ＧＰＩｂを結合させ、小動脈内で発生するか又は動脈狭窄によって作り出されるように高いせん断応力条件下で専ら発生するＧＰＩｂとｖＷＦの間の相互作用を防止するという観察事実に基づいて、この抗体は、アテローム性動脈硬化症を防止及び／又は治療するために治療目的で使用することが可能である。
【０２５４】
実施例６
当該例は、健常な多血小板血漿（ＰＲＰ）に対するＳ１５、Ａ３Ｒ及びＹ１の結合特性の比較について記述している。
【０２５５】
血小板に対する異なる濃度でのＹ１、Ａ３Ｒ及びＳ１５の結合を分析するため、２人の健康なドナーから調製されたＰＲＰ試料についてＦＡＣＳ分析を実施し、その結果が表６に示されている。
【表６】
2007528711.tif 000007
【０２５６】
表６の結果は、１μｇの濃度でＡ３Ｒが、Ｙ１よりも強い親和力で血小板に結合するＳ１５よりもさらに強い親和力で血小板に結合することを示している。１μｇでは、両方のＰＲＰ試料の平均幾何平均は、Ａ３Ｒについては１１６、Ｓ１５については２６そしてＹ１については負であった。
【０２５７】
ＧＰＩｂを発現するＰＲＰ（多血小板血漿）に対する結合を評価するため、選択されたｓｃＦｖ（実験１回につき０．５μｇ）をＦＡＣＳにより分析した。表７に示されているように、Ｄ１及びＤ３は、ＰＲＰに対する有意な結合を示し、Ｄ１は比較的高いレベルで結合した。ＰＲＰに対するＤ１の結合のレベルは、ＵＳＳＮ１０／６１１，２３８の例１でその選択について記述されているｓｃＦｖＳ１１（ＬＲＹＰＦＦ）（配列番号３１）が示すものと類似であった。
【表７】
2007528711.tif 000008
【０２５８】
実施例７
当該例は、顆粒球（Ｇ）、リンパ球（Ｌ）及び単球（Ｍ）を含有する健康な全血細胞に対するＳ１５、Ａ３Ｒ及びＹ１の結合特性の比較について記述している。
【０２５９】
全血細胞に対する異なる濃度でのＹ１、Ａ３Ｒ及びＳ１５の結合を分析するため、２人の健康なドナーから調製されたヒトの全血試料についてＦＡＣＳ分析を実施し、その結果が表８に示されている。
【表８】
2007528711.tif 000009
【０２６０】
表８の結果は、全血細胞に対するＳ１５の親和力がＡ３Ｒ及びＹ１の結合親和力よりも高いことを表わしている。０．１μｇの濃度で、両方の全血試料のＳ１５結合の平均幾何平均は中乃至高であり、一方両全血試料のＡ３Ｒ及びＹ１の平均幾何平均は、０．５μｇで負か又はわずかに正であった。
【０２６１】
（リンパ球、単球及び血小板上でゲートした）全血に対する結合を評価するため、ｓｃＦｖｓＤ１、Ｄ３及びＳ１１（実験１回につき０．５μｇ）をＦＡＣＳにより分析した。表９に示されているように、Ｄ１は、その他２つのｓｃＦｖｓに比べて、全ての細胞型に対し最高の結合を示した。
【表９】
2007528711.tif 000010
【０２６２】
実施例８
この例は、コンセンサス配列を含む抗体の特性をさらに研究するための非ヒトインビボ動物モデル系の開発について記述する。初期の目的は、抗体のうちの１つ（又は複数）が、（ａ）血小板に結合すると同時に（ｂ）血小板凝集を阻害する能力をもつ非ヒト哺乳動物種を同定することにあった。
【０２６３】
異なる哺乳動物種から単離された血小板に結合するさまざまなｓｃＦｖ抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析により決定し、相対的結合結果は表１０に要約されている。
【表１０】
2007528711.tif 000011
【０２６４】
テストされた各々の種において、ｓｃＦｖＹ１は、コンセンサス配列を含む抗体の中で最も弱い相対的結合を示した。この観察事実は、突然変異体（Ａ３Ｒ）及びライブラリ（Ｓ１５、Ｓ１１、Ｓ１及び０１）選択型ｓｃＦｖｓが全て、血小板ＧＰＩｂ上で発生するように、硫酸化エピトープについての高い結合能力を有するという結果を裏づけている。
【０２６５】
例えば、ｓｃＦｖｓＡ３Ｒ及びＳ１５は、ヒト及びモルモットの血小板上で（Ｙ１に比べ）５〜９倍大きい結合能力を示し、一方、これらの種に対するＳ１１、Ｓ１及びＤ１の結合能力はＹ１よりも約２５倍大きいものである。
【０２６６】
ｓｃＦｖｓパネルにより結合された非ヒト血小板の種アレイに関しては、Ｓ１１、Ｓ１及びＤ１は各々、イヌ、モルモット及びウサギ由来の血小板を結合させる。Ｓ１５は、イヌ（最高の親和力）、モルモット及びブタ由来の血小板を結合させるものの、ウサギ、マウス又はサル（ヒヒ及びカニクイザル）由来の血小板は結合させない。重要なことに、モルモットは、コンセンサス配列を含む抗体全てが血小板を結合できる同定された単一の非ヒト種である。
【０２６７】
血小板凝集に対する効果
Ｓ１、Ｓ１１及びＤ１はＳ１５に比べてはるかに高い親和力でモルモット由来の血小板に結合するが、血小板凝集の阻害に関しては、これらのｓｃＦｖｓの全てが類似の能力を示す。
【０２６８】
モルモット血小板凝集に対するｓｃＦｖＳ１５の阻害効果（ＩＣ50８０〜１６０μｇ／ml）は、ヒト由来の血小板に対するその阻害効果に比べ約８〜１０分の１であることがわかった。これは、モルモット由来の血小板に対するｓｃＦｖＳ１５抗体の比較的低い結合に起因する可能性がある。
【０２６９】
ヒト及びイヌ由来の血小板に対するＩｇＧ１Ｓ１５及びＩｇＧＹ１抗体の結合は、類似であることがわかった。２つの抗体は、同じ濃度でヒト及びイヌ由来の血小板内で血小板凝集を誘発した。
【０２７０】
モルモットにおけるｓｃＦｖの薬物動態
モルモットにおけるｓｃＦｖ抗体の薬物動態を査定するために、単一ボーラスとしてモルモットに対し１０mg／kgのｓｃＦｖＡ３Ｒを静脈内投与した。異なる時点でのモルモットの血液中のｓｃＦｖＡ３ＲのレベルをＥＬＩＳＡ検定を用いて決定し、血小板結合したｓｃＦｖのレベルを、ＦＡＣＳ分析を用いて決定した。
【０２７１】
キシラジン（２０mg／kg）と混合したケタミン（５０mg／kg）の腹腔内注射で、３匹の雄のモルモット（体重最高５００ｇ）を麻酔した。１０mg／kg（モルモット一匹につき最高５mg）の割合でボーラス静脈内注射によりｓｃＦｖＡ３Ｒを投与した。０分（抗体投与前）そして抗体投与後３分、１０分、２０分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分及び３６０分の時点で、血液試料を収集した。各々の時点で０．５mlの血液を採取した。抗凝固剤として、３．８％のクエン酸ナトリウムを使用した。１５分間３０００×ｇで血液試料を遠心分離することによって血漿を得、−２０℃で保管し、１０分間１５０×ｇで血液試料を遠心分離することによりＰＲＰを得た。抗−ｓｃＦｖＰＥ標識済み抗体を用いてＦＡＣＳ分析により、モルモットのＰＲＰ中で、血小板結合したＡ３ＲｓｃＦｖをテストした。特異的ＥＬＩＳＡにより、血漿ｓｃＦｃＡ３Ｒ抗体濃度を検定した。
【０２７２】
ボーラス投与後異なる時点でモルモットの血小板に対して結合したｓｃＦｖ−Ａ３Ｒ抗体のレベルを評価するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。結果（図１９）は、１０mg／kgのｓｃＦｖ−Ａ３Ｒのボーラス投与から１０分後に、血小板に対して結合したｓｃＦｖのレベルは最大レベルの４０〜８０％であり、１２０分後に最大レベルに達した。血小板に対するｓｃＦｖ−Ａ３Ｒ抗体の結合は３６０分（６時間）の間高レベルにとどまり、ボーラス投与から２４時間後までに９０％減少した。
【０２７３】
Ｔｒｙ−２７６に硫酸化チロシンを有するＧＰＩｂペプチドでコーティングされた平板を用いる（μＭ／ウェル）ＥＬＩＳＡにより、Ａ３Ｒ−ｓｃＦｖの血漿レベルを測定した。ウサギ抗ＶＬ（可変光）抗体を添加しその後抗ウサギＨＲＰ（Sigma）及び３．３′、５．５′−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（Sigma, St.Louis, ＭＯ）基板を添加することにより、結合ｓｃＦｖを検出した。生み出された色の強度を、Ｏ．Ｄ．４５０のＥＬＩＳＡ平板読取り装置（Anthos, Salzburg）によって読みとった。モルモットの血漿又は０．０５％Tween２０及び２０％のスキムミルクを含有するＰＢＳに対し既知の量のこれらの抗体を加えることによって構築された標準曲線から、各試料中のｓｃＦｖの血漿濃度を計算した。
【０２７４】
結果は、ｓｃＦｖＡ３Ｒの血漿濃度が、ボーラス注入から３分後にピークに達し６時間にわたり漸進的に下降した（図２０）ことを示している。モルモットにおけるＡ３Ｒの半減期は１３９±９分であった。
【０２７５】
要約すると、以上の研究は、標的血小板上の飽和レベルの急速な達成及び比較的長い半減期に基づいて、Ａ３Ｒが有利な薬物動態プロフィールを有することの予備的標示を提供している。
【０２７６】
実施例９
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴検出を使用し、２つの相互作用する種の実時間動態分析を可能にする。このシステムは、血小板ＧＰＩｂから誘導されたポリペプチドであるグリコカリシンに対するｓｃＦｖｓＹ１、Ａ３Ｒ及びＳ１５の結合動態を測定するために使用された。
【０２７７】
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００器具（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌｅ，スウェーデン）を用いて、グリコカリシンに対する抗体の結合親和力を決定した。２０μｌｍｉｎ-1の流量で、ｐＨ４．６の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中のＣＭ５チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）上に、グリコカリシン（固定化されたリガンド）を共有結合により固定化させた。全ての結合実験は、０．００５％（ｖ／ｖ）の非イオン洗浄剤、Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン）を含むｐＨ７．４のＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ）中で実施した。平均Ｋａ（会合速度）及びＫｄ（解離速度）動態から、ＢＩＡ評価３．１ソウトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、グリコカリシンに対する抗体の結合親和力（ＫD）を決定した。
【０２７８】
Ａ３Ｒ−ｓｃＦｖは、そのより速い会合速度により示されているように（表１１）、Ｙ１−ｓｃＦｖよりも高い親和力（最高７倍）で血小板グリコカリシンに結合する。これらの結果は、無傷の血小板についてのＦＡＣＳ分析から得られた結果と一致している。Ｓ１５−ｓｃＦｖは同様に、Ｙ１−ｓｃＦｖよりは高いもののＡ３Ｒより低い親和力グリコカリシンに結合する。
【表１１】
2007528711.tif 000012
【０２７９】
実施例１０
本例は、チロシン残基において硫酸化を受けるＰＳＧＬ−１、ＧＰＩｂ及びＣＣＲ５の領域に基づいた合成ペプチドに対するコンセンサス配列を含む抗体の直接的結合について記述している。
【０２８０】
使用された合成ペプチドは以下の通りであった。
【表１２】
2007528711.tif 000013
【０２８１】
使用されたｓｃＦｖｓは、Ｎ０６（負の対照、Ｙ１（Ｐ０３）、Ｓ１５、Ｓ１１、Ｓ１、Ｓ９、ｓ．ｃ．３．１及びＳ１１であった。
【０２８２】
室温で３０分間Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（３．４８ｍｇ／ｍｌ）及びＥＤＣ（３．０７ｍｇ／ｍｌ）で平板を前処理した後、ＮＨＣｏｖａＬｉｎｋTMマイクロタイタ平板（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に対しさまざまな硫酸化及び非硫酸化ペプチドを接着させ、その後水中で１回、０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳ中で３回洗浄した。室温で１時間穏やかに振とうすることにより、５％のスキムミルク及び０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳ緩衝液で平板を遮断した。合成ペプチド（１ウェルあたり１００μＭ）を添加し、その後、０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、平板を室温で乾燥させた。結合のため、室温で１時間インキュベートするよう、平板に対し、プロテインＡ精製済みｓｃＦｖ抗体（０．５μｇ／ウェル）を添加した。ＥＬＩＳＡのためには、６０分間２５℃でインキュベートするべく、平板に対し、遮断用緩衝液中のウサギ抗ヒトＶLポリクローナル抗体（抗−ｓｃＦｖ）を添加した。０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳ緩衝液で５回洗浄することにより、余剰の抗−ｓｃＦｖを除去した。室温で１時間インキュベートするため、遮断用緩衝液中のヤギ抗ウサギＨＲＰ標識済み抗体を添加し、１０回の洗浄により余剰分を除去した。ＴＭＢ顕色剤を５分間添加し、０．５ＭのＨ2ＳＯ4（１００μｌ／ウェル）で中和した。４５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡ平板読取り装置により呈色反応を読みとった。各試料をデュプリケートで検定し、平均を計算した。
【表１３】
2007528711.tif 000014
【０２８３】
表１２及び図２１は、コンセンサス配列を含むテスト対象ｓｃＦｖ抗体全てが、第３のチロシン位置において硫酸化されたＰＳＧＬ−１由来のペプチドに対し有意な形で結合したものの、第１又は第２のチロシン位置で硫酸化されたものには結合しなかったということを表わしている。１本鎖抗体Ｓ１、Ｓ９及び３．１は、第３のチロシン位置で硫酸化されたＰＳＧＬ−１由来のペプチドに対する最強の結合を示した。これらの抗体は同様に、第１のチロシン位置で硫酸化されたＧＰＩｂ由来のペプチドにも結合し、第３のチロシン位置で硫酸化されたＧＰＩｂ由来のペプチドに対し、ｓｃＦｖｓＳ１、Ｓ９及び３．１は最強の結合を、そしてｓｃＦｖｓＳ１５及びＳ１１は中位の結合を示している。第１又は第３のチロシン位置で硫酸化されたＣＣＲ５由来のペプチドではなく、第２のチロシン位置で硫酸化されたＣＣＲ５由来のペプチドに対するこれらの抗体の有意な結合が同様に観察された。１本鎖抗体Ｓ１１は、第２のチロシン位置で硫酸化されたＣＣＲ５由来のペプチドに対し最強の結合を示した。対照抗体ｓｃＦｖでは、全く結合が見られなかった。
【０２８４】
第２のチロシン位置で硫酸化されたＣＣＲ５由来のペプチドで得られた結果は、少なくともｓｃＦｖＳ１１そして場合によってはコンセンサス配列を含むその他の抗体がヒト細胞内のＨＩＶ感染力の阻害剤としての潜在性を有し得るということを示唆している。
【０２８５】
実施例１１
該発明のコンセンサス配列を含むＩｇＧ抗体が、標的細胞特に患者の試料から誘導されたＢ−ＣＬＬ細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力をもつことを実証するために研究が実施された。さらに、二次抗ヒトＦＣ抗体とのＳ１５−ＩｇＧの超架橋により、アポトーシスメカニズムも細胞の殺滅に貢献することが実証された。
【０２８６】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）実験は以下の通りであった。すなわち、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）上で、単核エフェクタ及び標的細胞を分離し、その後、細胞膜の脂質領域内部に螢光染料を安定した形で取込むＰＫＨ２６で標的細胞を標識した。その後細胞を洗浄し、２４時間異なる濃度のＳ１５ＩｇＧ又は対照抗体の存在下で又は不在下で、さまざまなエフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクタ細胞と共にインキュベートした。死細胞をＴＯＰＲＯ（登録商標）（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）で染色し、ゲートした標的細胞についてＦＡＣＳにより分析した。
【０２８７】
健康なドナーからの単核エフェクタ細胞及び３人の患者からのＢ−ＣＬＬ標的細胞を２４時間Ｓ１５−ＩｇＧの存在下及び不在下でさまざまなＥ：Ｔ比で同時インキュベートし、その後ＦＡＣＳ分析を行なった。図２２Ｂは、対照と比較して３０〜５０％のＡＤＣＣで、３つの試料すべてにおいてＳ１５ＩｇＧがエフェクタ細胞の細胞傷害を媒介したことを示している。
【０２８８】
Ｓ１５−ＩｇＧＡＤＣＣは、ナチュラルキラー及び単球性細胞によって媒介される。エフェクタ細胞を、Ｂ−ＣＬＬ細胞のＳ１５ＩｇＧ媒介されたＡＣＣＣをもたらすその能力について分析した。市販の磁気ビーズを用いて、正常なドナー及びＢ−ＣＬＬ患者の両方からのナチュラルキラー（ＣＤ５６＋）及び単球性（ＣＤ１４＋）細胞を単離した。図２３は、正常なドナー及びＢ−ＣＬＬ患者由来のＮＫ細胞がＡＤＣＣをもたらす能力をもち、その結果それぞれ約５０％及び３５％が殺滅することを示している。正常なドナー及びＢ−ＣＬＬ患者の両方からの単球は同様に、ＡＤＣＣをもたらす能力（約５〜１３％）も有している。しかしながら、ＣＤ56+ＮＫ細胞は、Ｂ−ＣＬＬ細胞のＳ１５ＩｇＧ媒介ＡＤＣＣのためのより有意なエフェクタ細胞集団を構成していた。
【０２８９】
アポトーシス実験は以下の通りであった。ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）上で、Ｂ−ＣＬＬ患者由来の単核細胞を分離し、３７℃で１０分間Ｓ１５−ＩｇＧ又は対照抗体の存在下又は不在下で細胞をインキュベートした。その後抗ヒトＦｃ抗体を添加し、３７℃で４〜２４時間インキュベートした。その後、アポトーシスマーカーＡｎｎｅｘｉｎ及びＴＯＰＲＯ（登録商標）で罹病細胞（ＣＤ１９+，ＣＤ５+）を染色し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０２９０】
Ｓ１５−ＩｇＧはアポトーシスを誘発した。ＦＡＣＳ分析は、Ｓ１５−ＩｇＧの存在下でインキュベートさせたＢ−ＣＬＬ患者由来の単核細胞（ＣＤ１９+，ＣＤ５+）が５時間以内で約１０％のアポトーシスを示すということを示した（図２４）。Ｓ１５−ＩｇＧを架橋する二次抗体の添加により、５時間以内に付加的な５０％のアポトーシスが惹起された（図２４）。
【０２９１】
これは、ＰＳＧＬ−１上の硫酸化エピトープに向けられた抗体の架橋が、原発性Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対するシグナルをトリガーするということの強力な証拠となっている。このことは、ＰＳＧＬ１が、架橋効果が例えば単球、ＣＤ５６+ＮＫ−細胞及びγδ+Ｔ−細胞といったＦｃ受容体担持細胞によって媒介され得るインビボでのＢ−ＣＬＬ細胞内のアポトーシスを誘発するための標的であり得る、ということを暗示している。
【０２９２】
Ｓ１５−ＩｇＧとは対照的に、Ｂ−ＣＬＬを含むさまざまなリンパ性悪性疾患の治療のために広く用いられているヒト化抗体リツキンマブは、架橋時点でアポトーシスのいかなる増大も示さなかった（図２５）。
【０２９３】
Ｓ１５−ＩｇＧについて上述したアポトーシス及び架橋効果は、自力ではアポトーシスを誘発しないＰＳＧＬ−１に対して向けられたマウス抗体ＫＰＬ１を用いて阻害され得る（データ示さず）。こうして、アポトーシスシグナルがＰＳＧＬ−１上のエピトープにより媒介されることの確認が得られる。
【０２９４】
さらに、ＦＡＣＳ分析は、Ｓ１５ＩｇＧが正常なＢ−細胞に対するそのわずかな結合とは対照的に、テスト対象である全てのＢ−ＣＬＬ試料に対し結合するということを示した。合わせて考慮すると、該結果により、Ｓ１５−ＩｇＧは、その細胞傷害及びアポトーシス効果がこれらの罹病細胞上で発現されたＰＳＧＬ−１硫酸化エピトープの特異的認識を介して媒介されると思われることから、Ｂ−ＣＬＬの治療における治療薬としての前途有望な候補であるということが示唆されている。
【０２９５】
実施例８
無機化合物ライブラリのスクリーニング。特異的受容体（タンパク質）から誘導された（ペプチドの既知のアミノ酸配列内部の一定の与えられた特異的チロシン残基上で硫酸化された）合成硫酸化ペプチドを、カプロン酸といったような短かいリンカーを介して合成ペプチドにカップリングされるビオチンタグ（ビオチニル化）を用いて調製することができる。同じ合成ペプチドを用いた対照ペプチドを、硫酸化無し及びビオチンタグ（「Ｂ」）無しで調製することが可能である。さらに、その他の無関係のタンパク質由来の合成硫酸化ペプチドを、付加的な対照としてビオチンタグ（「Ｃ」）を有することなく調製することができる。
【０２９６】
上述のビオチニル化ペプチド（「Ａ」）をストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズにカップリングし、余剰の未結合ビオチニル化ペプチドを次に洗浄することができる。ビオチン−ストレプトアビジンペプチド接合体（「Ｄ」）を、「Ａ」に対して結合する分子について、生理学的条件（３７℃、ｐＨ７．０〜７．４、塩濃度、伝導度など）下で余剰の非硫酸化対照ペプチド（「Ｂ」）が大量に存在する中で小型化合物ライブラリに対しスクリーニングすることができる。次に、カップリングした磁気ビーズを２回緩衝液で洗浄し、毎回遠心分離に付して余剰の未結合分子を除去する。磁気ビーズに結合した分子（「Ｅ」）を溶出し、化学的に同定し、さらなるスクリーニングのためにより大量に調製することが可能である。
【０２９７】
選択された化学化合物（「Ｅ」）によるビオチニル化硫酸化ペプチドに対する結合の確認を、さらなるスクリーニングプロセスにより実施することができる。このプロセスには、ビオチニル化されている無関係の硫酸化ペプチドとの競合（プロセス１）か又はビオチニル化ペプチド「Ａ」に対して特異的に結合する抗体又はそのフラグメント（例えばｓｃＦｖ）との競合（プロセス２）が含まれる。
【０２９８】
無関係のビオチニル化硫酸化ペプチドとの競合による再スクリーニング（プロセス１）。化合物が「Ａ」に対し特異的に結合することを確実にするため、第２ラウンドのスクリーニングを実施することができる。余剰の無関係のビオチニル化硫酸化ペプチド「Ｃ」が大量に存在する中で、ビオチン−ストレプトアビジン、ペプチド接合体（「Ｄ」）を、選択された化合物「Ｅ」で再スクリーニングすることができる。その後、管を遠心分離に付し、ビオチン−ストレプトアビジンペプチド接合体がカップリングされた磁器ビーズを緩衝液で２回洗浄し、余剰の未結合分子を除去するべく毎回遠心分離に付す。磁気ビーズに結合した化合物を化学的同定のために溶出させることができる。「Ａ」に対する選択的結合のバリデーション及びインビトロ及びインビボでの効能試験といったようなさらなる研究のためのより大量の化学化合物を調製することが可能である。
【０２９９】
特異的ｓｃＦｖ抗硫酸化抗体との競合による再スクリーニング（プロセス２）は以下の通りであった。「Ａ」を特異的に認識しこれに結合する特異的ｓｃＦｃ抗体が余剰に大量に存在する中での選択された化合物「Ｅ」の各々に対するビオチン−ストレプトアビジンペプチド接合体（「Ｄ」）の結合と競合することにより、「Ａ」に対する好ましい結合親和力をもつ化合物を再スクリーニングすることができる。「Ａ」に対する選択的結合のバリデーション及びインビトロ及びインビボでの効能試験といったさらなる研究のために、ｓｃＦｖ抗体により「Ａ」に対する結合が特異的に阻害される化学化合物を調製することができる。
【０３００】
以上の記述及び例は、単に該発明を例示するためだけに記されたものであり、制限するものとして意図されていない。該発明の本質及び内容を取込んだ開示済みの実施形態の修正を当業者が考案する可能性が存在するため、該発明は、添付のクレーム及びその均等の範囲内に入る全てを内含するものとみなされるべきである。
【０３０１】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】図１は、ＰＳＧＬ−１に対する結合を分析するための本発明に従った選択されたクローンのファージＥＬＩＳＡからの数値データを描いている。
【図２】図２は、ＰＳＧＬ−１に対する結合を分析するための本発明に従った選択されたクローンのｓｃＦｖＥＬＩＳＡからの数値データを描いている。
【図３】図３は、ＰＳＧＬ−１を発現するＭＬ−２に対する結合を分析するためのＬ３２及び本発明に従った選択されたクローン由来のｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析からの数値データを描いている。
【図４】図４は、グリコカリシンに対する結合を分析するためのＬ３２及び本発明に従った選択されたクローン由来のｓｃＦｖのＥＬＩＳＡからの数値データを描いている。
【図５】図５は、血小板及び顆粒球に対する結合を分析するためのＬ３２及び本発明に従った選択されたクローン由来のｓｃＦｖのＥＬＩＳＡからの数値データを描いている。
【図６】図６は、Ｌ３２及び本発明に従った選択されたクローンの顆粒球／血小板結合比の比較を示す。
【図７】図７は、ＫＰＬ−１の存在及び不在下でのＭＬ−２細胞に対するＳ１５の結合を分析している結果を描いている。
【図８】図８は、ＰＢＳ中のＭＬ−２細胞に対する精製済みｓｃＦｖｓの結合の比較を提供するＦＡＣＳ分析からの数値データを描いている。
【図９】図９は、ＰＢＳ中のＭＬ−２細胞に対する精製済みｓｃＦｖの結合の比較を提供するＦＡＣＳ分析からの数値データを描いている。
【図１０】図１０は、５０％の血漿中のＭＬ−２細胞に対する精製済みｓｃＦｖｓの結合の比較を提供するＦＡＣＳ分析からの数値データを描いている。
【図１１】図１１は、５０％の血漿中のＭＬ−２細胞に対する精製済みｓｃＦｖｓの結合の比較を提供するＦＡＣＳ分析からの数値データを描いている。
【図１２】図１２は、ＭＬ−２細胞に対する精製済みｓｃＦｖｓの用量応答のＦＡＣＳ分析を描いている。
【図１３】図１３は、ＧＰ１ｂ及びＰＳＧＬ−１硫酸化ペプチドに対する選択されたファージクローンの結合を描いている。
【図１４】図１４は、グリコカルシンに対するｓｃＦｖｓの結合を示している。
【図１５】図１５は、フローサイトメトリを用いた洗浄済み血小板に対する漸増的濃度でのさまざまなｓｃＦｖｓの結合のグラフである。
【図１６】図１６は、ＥＬＩＳＡ検定を介したグリコカルシンに対するさまざまなｓｃＦｖｓの結合を描いている。
【図１７】図１７は、リストセチンによって誘発される血小板凝集に対するＡ３ＲｓｃＦｖの効果を描いている。
【図１８】図１８は、ＣＰＡ検定を用いたポリスチレンに対する血小板接着に対するＹ１ｓｃＦｖ、Ａ３ＲｓｃＦｖ及び対照ＰＢＳの効果を描いている。
【図１９】図１９は、ポーラス注入法の後のモルモットの血小板に結合したＡ３ＲｓｃＦｖのレベルを描いている。
【図２０】図２０は、ボーラス注入法の後のモルモットにおけるＡ３ＲｓｃＦｖの血漿濃度を描いている。
【図２１】図２１は、ＰＳＧＬ−１、ＧＰＩｂ及びＣＣＲ５の硫酸化領域に基づくペプチドに対するｓｃＦｖの直接結合からの数値データを描いている。
【図２２】図２２は、Ｂ−ＣＬＬ患者試料中のＳ１５ＩｇＧ誘発されたＡＤＣＣを描いている。
【図２３】図２３は、Ｂ−ＣＬＬ患者試料中のＳ１５ＩｇＧで誘発されたＡＤＣＣへの異なるエフェクタ細胞集団の関与を描いている。
【図２４】図２４は、Ｂ−ＣＬＬ患者試料中でアポトーシスを誘発するＳ１５ＩｇＧ及びリツキシマブの能力を描いている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年3月15日(2006.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
本発明に従った抗体は同様に、それに挿入するか又は付着してその調製及び同定ならびに診断を助けることのできるタグをも有することができる。このタグはその後分子から除去できる。有用なタグの例としては、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６（配列番号６３）、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ（配列番号６４）、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（登録商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇがある（Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen.,３２、６０１−１８（１９９８））。タグは好ましくは、ｃ−ｍｙｃ又はＫＡＫである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
小型ペプチドリンカーを用いた直接的カップリングを介した連結も同じく有用である。例えば抗癌薬ドキソルビシンの遊離糖とｓｃＦｖの間の直接的カップリングを小型ペプチドを用いて達成することができる。小型ペプチドの例としては、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６（配列番号６３）、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ（配列番号６４）、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（登録商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＫＡＫが含まれる。