(57)【要約】ｒａｐＩ、ｒａｐＭおよび／またはｒａｐＱ酵素を用いるラパマイシン特異的な標識方法について記載されている。また、本発明の方法に有用な粗酵素抽出物の生成方法についても記載されている。特異的に標識されたラパマイシンの診断ツールとしての用途が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化試薬の存在下でデスメチルラパマイシンをラパマイシン特異的メチラーゼと反応させる工程を含む、ラパマイシンを特異的に標識する方法。
【請求項２】
メチル化試薬がＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メチラーゼが、ｒａｐＩメチラーゼ、ｒａｐＭメチラーゼ、およびｒａｐＱメチラーゼからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メチラーゼが粗酵素抽出物の形態にある、請求項１から３いずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
粗酵素抽出物が以下の工程によって調製される、請求項４に記載の方法：
（ａ）調節制御配列に作動できるように結合した、酵素をコードする核酸配列で形質導入された細胞培養物からラパマイシン特異的酵素を発現させる工程であり、酵素がｒａｐＩメチラーゼ、ｒａｐＭメチラーゼ、およびｒａｐＱメチラーゼからなる群より選択される前記工程；
（ｂ）細胞を濃縮して、それらを緩衝液中に再懸濁する工程；
（ｃ）混合物をリゾチームおよびヌクレアーゼとともにインキュベートする工程；
（ｄ）細胞を断片化する工程；および
（ｅ）遠心分離して、上清を回収する工程。
【請求項６】
工程（ｃ）におけるインキュベーションが、さらにプロテアーゼインヒビターを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
反応混合物が約３４℃で約１時間インキュベートされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
インキュベーションの終わりに、メタノールが反応物に添加される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＨＰＬＣ解析の前に沈殿物が遠心分離によって除去される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＰＬＣ解析が、ジオキサン、酢酸およびトリエチルアミンを含む移動相によって、Ｃ１８カラム内において４５℃で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、特異的に標識されたラパマイシン。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、特異的に標識されたラパマイシン、および生理学的に適合する担体を含む組成物。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に従って産生されるメチル化ラパマイシン、ならびに、陰性対照、メチル化試薬、バイアル瓶、試験管、および使用説明書からなる群より選択される、１又はそれ以上の成分を含む、特異的に標識されたラパマイシンを産生するキット。
【請求項１４】
請求項１１に記載の標識ラパマイシンを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
ラパマイシン（Rapamycin）は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によって産生される大環状トリエン抗生物質であって、特にカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対して、インビボおよびインビトロにおいて抗真菌活性を持つことが発見された。［C. Vezina et al., J. Antibiot. 28, 721 (1975); S. N. Sehgal et al., J. Antibiot. 28, 727 (1975); H. A. Baker et al., J. Antibiot. 31, 539 (1978); 米国特許第３，９２９，９９２号、および米国特許第３，９９３，７４９号］。ラパマイシンの免疫抑制効果が説明されている。別の大環状分子であるＦＫ−５０６も、免疫抑制剤であることが示されている。これらの化合物は、他の多様な治療適応症についても有用であることが分かっている。ラパマイシンは、Rapamune（登録商標）という名称で市販されている。
【０００２】
ラパマイシンエステルである３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２エステル［米国特許第５，３６２，７１８号記載］は、ＣＣＩ−７７９としても知られ、インビボ動物腫瘍モデル、および第１相臨床試験において、多様な腫瘍細胞株に対して抗腫瘍活性をもつことが示されている。［Gibbons, J., Proc. Am. Assoc. Can. Res. 40: 301 (1999); Geoerger, B., Proc. Am. Assoc. Can. Res. 40: 603 (1999); Alexandre, J., Proc. Am. Assoc. Can. Res. 40: 613 (1999); およびAlexandre, J., Clin. Cancer. Res. 5(November Supp.): Abstr. 7 (1999)］。
【０００３】
アセテート、プロピオネートもしくはメチオニン［N. L. Paive and A.L. Demain, J Natl Products, 54(1): 167-177 (Jan-Feb 1991)］、またはシキミ酸［P.AS. Lowden, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 40(4):777-779 (2001)］などの標識前駆体化合物を発酵培養物に添加して、これらの化合物でラパマイシンを標識することが記載されている。これらの方法においては、細菌がラパマイシンを合成するにつれて、標識物質の一部は、新たに産生されたラパマイシンに取り込まれる。標識ラパマイシンは、その一部は標識をもつかもしれない他の分子の混合物から精製される。しかし、これらの方法は、単離されたすべてのラパマイシン分子が同程度に、または同じ位置に標識されているとは限らないという点で、一貫性のない結果をもたらす。
【０００４】
望まれるのは、ラパマイシンを特異的に標識して、均一な標識分子を産生させる方法である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要旨
本発明に記載されている方法では、特異的メチラーゼを用いてラパマイシンだけを均一に標識する。メチラーゼは、粗細胞抽出物に存在し、インビトロで、標識メチル基を精製されたデスメチル−ラパマイシン（desmethyl-rapamycin）に加える。この系においては、ラパマイシンが、標識される唯一の分子である。これは、同位体標識、例えば、放射活性を付けられ得る。標識物質の単離は、標準的な方法を用い、非常に単純である。標識ラパマイシンは、その質量および／または放射活性標識に基づいて、容易に同定することができる。
【０００６】
本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
ラパマイシンの生合成に関与する遺伝子クラスターは、配列決定され、解析されている［Schwecke et al., PNAS USA 92, 7839-43 (1995); Molnar et al., Gene 169, 1-7 (1996); Aparicio et al., Gene 169, 9-16 (1996)］。コアポリケチドの合成および環化は、ｒａｐＡ、ｒａｐＢ、ｒａｐＣおよびｒａｐＰのタンパク質産物によって媒介されるが、その後、この分子にさらなる修飾が行われる。これらの修飾には、酸化およびメチル化が含まれる。
【０００８】
３つの遺伝子ｒａｐｌ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱが、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（SAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases）として同定されている。ＲａｐＩはＣ−４１ヒドロキシルをメチル化し、ＲａｐＭおよびＲａｐＱは、Ｃ−７およびＣ−３２ヒドロキシル基をメチル化する［Chung et al., J. Antibiotics 54, 250-256 (2001)］。
【０００９】
本発明の方法は、これらのラパマイシン特異的メチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）を利用して、デスメチルラパマイシンを効率的にインビトロで標識する。
【００１０】
遺伝子ｒａｐｌ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱによってコードされる３つの酵素が本発明の方法で用いられる。これらの酵素は、本発明の方法において、個別に用いることもでき、またはそれらの混合物を用いることもできる。
【００１１】
本明細書に定義されているように、「ラパマイシン」という用語は、以下のラパマイシン核（nucleus）を含む免疫抑制化合物群を定義するものである。
【化１】
2007534337.tif 000002
【００１２】
「デスメチルラパマイシン」という用語は、上記の塩基性ラパマイシン核を含むが、１又はそれ以上のメチル基の欠損を含む免疫抑制化合物群を意味する。１つの実施形態において、ラパマイシン核は、７、３２、または４１位のいずれか、またはこれらを組み合わせた位置からメチル基を失っている。他のデスメチルラパマイシンの合成を、メチル基がラパマイシン核の他の位置から欠落するように遺伝子操作によって行うことも可能である。デスメチルラパマイシンの産生については既述されている。例えば、３−デスメチルラパマイシン［米国特許第６，３５８，９６９号］、および１７−デスメチルラパマイシン［米国特許第６，６７０，１６８号］参照。
【００１３】
「デスメチルラパマイシン」および「−Ｏ−デスメチルラパマイシン」という用語は、別段の記載がない限り、参考文献および本明細書を通して代替可能に用いられる。
【００１４】
本発明に従って用いられるラパマイシンは、免疫陽性特性を保持しつつ、ラパマイシン核の誘導体として、化学的または生物学的に修飾されうる化合物を含む。したがって、「ラパマイシン」という用語は、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミン、および、核上の官能基が、例えば還元または酸化によって修飾されているラパマイシンを含む。また、「ラパマイシン」という用語は、ラパマイシンの製薬的に許容される塩であって、酸性部分または塩基性部分を含むために、そのような塩を形成することができる製薬的に許容される塩を含む。
【００１５】
本明細書において、製薬的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、乳酸、ニコチン酸、コハク酸、シュウ酸、リン酸、マロン酸、サリチル酸、フェニル酢酸、ステアリン酸、ピリジン、アンモニウム、ピペラジン、ジエチルアミン、ニコチンアミド、ギ酸、尿素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、リチウム、桂皮酸、メチルアミノ酸、メタンスルホン酸、ピクリン酸、酒石酸、トリエチルアミノ酸、ジメチルアミノ酸、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むが、これらに限定されない。さらなる製薬的に許容される塩も、当業者に知られている。
【００１６】
１つの実施形態において、ラパマイシンのエステルおよびエーテルは、ラパマイシン核の４２位および／または３１位のヒドロキシル基のものであり、エステルおよびエーテルは、（２７−ケトンの化学的還元後の）２７位のヒドロキシル基のものであり、また、オキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンは、ラパマイシン核の（４２−ヒドロキシル基の酸化後の）４２位のケトン、および２７−ケトンのものである。
【００１７】
別の実施形態において、ラパマイシンの４２−および／または３１−エステルおよびエーテルは、以下の特許文献に記載されている：アルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号）、アミノアルキルエステル（米国特許第４，６５０，８０３号）、フッ素化エステル（米国特許第５，１００，８８３号）、アミドエステル（米国特許第５，１１８，６７７号）、カルバメートエステル（米国特許第５，１１８，６７８号）、シリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号）、アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号）、アセタール（米国特許第５，５１，４１３号）、アミノジエステル（米国特許第５，１６２，３３３号）、スルホン酸塩および硫酸エステル（米国特許第５，１７７，２０３号）、エステル（米国特許第５，２２１，６７０号）、アルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号）、Ｏ−アリールエーテル、Ｏ−アルキルエーテル、Ｏ−アルケニルエーテル、およびＯ−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号）、カーボネートエステル（米国特許第５，２６０，３００号）、アリールカルボニルカルバメートおよびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号）、カルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号）、ヒドロキシエステル（米国特許第５，３６２，７１８号）、ヒンダードエステル（米国特許第５，３８５，９０８号）、複素環式エステル（米国特許第５，３８５，９０９号）、ジェム２置換（gem-disubstituted）エステル（米国特許第５，３８５，９１０号）、アミノアルカノイックエステル（米国特許第５，３８９，６３９号）、ホスホリルカルバメートエステル（米国特許第５，３９１，７３０号）、カルバメートエステル（米国特許第５，４１１，９６７号）、カルバメートエステル（米国特許第５，４３４，２６０号）、アミジノカルバメートエステル（米国特許第５，４６３，０４８号）、カルバメートエステル（米国特許第５，４８０，９８８号）、カルバメートエステル（米国特許第５，４８０，９８９号）、カルバメートエステル（米国特許第５，４８９，６８０号）、ヒンダードＮ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号）、ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号）、Ｏ−アルキルエーテル（米国特許第５，６６５，７７２号）、およびラパマイシンのＰＥＧエステル（米国特許第５，７８０，４６２号）。これらのエステルおよびエーテルの調製については、上記の特許文献に記載されている。
【００１８】
さらに別の実施形態において、ラパマイシンの２７−エステルおよびエーテルが、米国特許第５，２５６，７９０号に記載されている。これらのエステルおよびエーテルの調製については、上記の特許文献に記載されている。
【００１９】
さらに別の実施形態において、ラパマイシンのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンが、米国特許第５，３７３，０１４号、第５，３７８，８３６号、第５，０２３，２６４号、および第５，５６３，１４５号に記載されている。これらのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンの調製については、上記の特許文献に記載されている。４２−オキソラパマイシン（42-oxorapamycin）の調製については、米国特許第５，０２３，２６３号に記載されている。
【００２０】
別の実施形態において、ラパマイシンは、ラパマイシン［米国特許第３，９２９，９９２号］、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル［米国特許第５，３６２，７１８号］、および４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン［米国特許第５，６６５，７７２号］を含む。ＣＣＩ−７７９を含む、ラパマイシンのヒドロキシエステルの調製および用法については、米国特許第５，３６２，７１８号および第６，２７７，９８３号に記載されている。
【００２１】
本明細書に示されている実施例では、７−Ｏ−デスメチル−ラパマイシン［米国特許第６，３９９，６２６号］および３２−Ｏ−デスメチルラパマイシンのメチル化が例示されているが、これらの化合物は、本発明を限定するものではない。
【００２２】
Ｉ．ｒａｐＩ酵素、ｒａｐＭ酵素、およびｒａｐＱ酵素
１つの実施形態において、本明細書で定義されているラパマイシンメチル化酵素は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクスからの粗酵素抽出物の形態で用いられる。さらなる実施形態において、粗酵素抽出物は、Ｓ．ヒグロスコピクス細胞［アメリカン・タイプカルチャーコレクション（the American Type Culture Collection），Manassas，Virginia，US、アクセッション番号ＡＴＣＣ２９２５３、または別の供給源から入手可能］から調製される。１つの実施形態において、これらの細胞は、キムら（Kim, W-S. et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2908-2910）に記載されているような方法を用いて、振とうフラスコ発酵で培養される。別の実施形態において、無細胞抽出物を調製するために、細胞を遠心分離によって回収し、約１グラムの細胞材料を、約２０ｍＬの適当な緩衝液中に再懸濁する。さらに別の実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、ｐＨ約６である。さらに別の実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５である。次に、細胞を破壊して、細胞残渣を遠心分離で除去する。１つの実施形態において、上清を、例えば、−７０℃で凍結する前に、〜１０％のグリセロールになるよう調整される。別の実施形態において、細胞培養物から粗酵素抽出物を調製する代替的な方法は、当業者にとって容易に明らかであろう。
【００２３】
さらに別の実施形態において、これらの酵素は、古典的なタンパク質単離法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、カラムクロマトグラフィーなどによって、さらに精製される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、酵素は、古典的なインビトロでの転写および翻訳法を用いて、組換え技術によって合成される。
【００２５】
ｒａｐＩ、ｒａｐＭ、およびｒａｐＱの酵素遺伝子の核酸配列は、PubMedNCBIオンラインデータベースから、Ｓ．ヒグロスコピクス（S.hygroscopicus）に対するアクセッション番号Ｘ８６７８０で、入手可能である。ｒａｐＱメチラーゼ遺伝子の核酸配列は、CDSのヌクレオチド番号９０７９８〜９１４３３に位置し、タンパク質番号：ＣＡＡ６０４６３．１がアミノ酸配列を提示している。ｒａｐＭメチラーゼ遺伝子の核酸配列は、ＣＤＳのヌクレオチド番号９２９９２〜９３９４５の相補鎖上に位置し、タンパク質番号：ＣＡＡ６０４６６．１がアミノ酸配列を提示している。ｒａｐＩメチラーゼ遺伝子の核酸配列は、ＣＤＳのヌクレオチド番号９７６２２〜９８０４０４に位置し、タンパク質番号：ＣＡＡ６０４７０１がアミノ酸配列を提示している。また、T. Schwecke, et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 92 (17), 7839-7843 (1995); I. Molnar, et al, Gene 169 (1), 1-7 (1996), および J. F. Aparicio, et al., Gene 169 (1), 9-16 (1996)も参照。前記の核酸およびアミノ酸の配列は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２６】
別の実施形態において、本明細書に記載されたラパマイシンメチル化酵素をコードする遺伝子を、その発現を調節する調節制御（regulatory control）配列に作動できるように結合した適当なベクターにクローニングする。本明細書において、「作動できるように結合した」配列は、対象の遺伝子に隣接した発現調節配列と、対象の遺伝子を調節するためにトランスまたは少し離れたところから作動する発現調節配列との両方を含む。発現調節配列は、適切な転写開始（プロモーター）および終結；翻訳効率を向上させる配列（例えば、シャイン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）部位またはリボソーム結合部位）；および、所望であれば、コードされている産物の分泌を促進する配列を含む。天然型、構成型、および／または誘導型のプロモーターなど、非常に多数の発現調節配列が当業者に知られており、利用可能である。
【００２７】
１つの実施形態において、調節制御配列は、調節可能または誘導可能なプロモーターを含む。このような調節可能または誘導可能なプロモーター系は既に多く記載されており、多様な供給源から入手可能である。誘導型プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外部から供給される化合物によって、または環境要因、例えば温度によって調節できる。誘導型プロモーターおよび誘導系は、限定されるわけではないが、例えば、インビトロジェン社（Invitrogen）、クロンテック社（Clontech）、およびアリアッド社（Ariad）など、多様な商業的供給源から入手可能である。他に多くの系が記載されており、当業者によって容易に選択されうる。例えば、誘導型プロモーターはＴ７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許公開番号ＷＯ９８／１００８８］を含む。１つの実施形態において、これらの系は、細菌系で用いるために選択される。
【００２８】
別の実施形態において、下記に説明するように、酵素をコードする１又はそれ以上の遺伝子を、誘導型プロモーターの下でその酵素を発現させる市販のベクター、すなわちｐＥＴ２４誘導型プラスミド発現ベクター［ノバジェン社（Novagen）］にクローニングする。しかし、当業者は、その酵素を発現させるために別のベクターおよび／または別の適当なプロモーターを容易に選択することができる。
【００２９】
ベクターは、当技術分野で知られているか、または上記されているような任意のベクターであってよく、裸の（naked）ＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポソン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどが含まれる。宿主細胞へのベクターの導入は、当技術分野で知られているか、または上記されているような任意の方法で行うことができ、トランスフォーメーション、トランスダクション、およびエレクトロポレーションなどが含まれる。分子を（プラスミドまたはウイルスとして）宿主細胞に導入することも、当業者に知られているか、本明細書を通して検討されている技術を用いて行うことができる。１つの実施形態において、標準的なトランスフォーメーション技術、例えば、塩化カルシウム（CaCl2）媒介型トランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションが用いられる。
【００３０】
酵素をコードする核酸配列は、適当な発現ベクターにクローニングされたら、発現のための適当な宿主細胞に導入される。１つの実施形態において、適当な宿主細胞は、原核生物（すなわち、細菌）細胞から選択される。下記の実施例において、宿主細胞は大腸菌（Escherichia coli）細胞である。しかし、当業者は、選択された酵素を発現させるために、別の適切な宿主細胞を容易に選択することができる。
【００３１】
１つの実施形態において、下記に説明するように、粗酵素抽出物は組換え技術を用いて調製される。［一般的には、サムブルック（Sambrook）ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NYを参照］。例えば、ラパマイシンメチラーゼ遺伝子で形質導入された細胞を、メチラーゼの発現が可能な条件下で培養する。誘導可能または調節可能なタンパク質の場合、これらの条件は、誘導剤を供給することを含む。培養後、細胞を遠心分離によってペレット化し、還元剤、およびリン酸緩衝液を含み、中性ｐＨに調整された適当な緩衝液に再懸濁する。１つの実施形態において、緩衝液は、ｐＨ７〜７．５の５０〜１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液が、１ｍＭ〜２ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有するものを含む。別の実施形態において、リゾチームを、最終濃度１００μｇ／ｍｌにて添加する。さらに別の実施形態において、適当なヌクレアーゼ［例えば、商標ベンゾナーゼ（Benzonase）ヌクレアーゼ］を、０．５〜２．０μＬ／ｍＬ細胞にて添加する。さらに別の実施形態において、細胞懸濁液を、例えば、３０℃で１５分間インキュベートする。さらに別に実施形態において、プロテアーゼインヒビター（例えば、フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を、最終濃度０．５〜１．５ｍＭにて細胞に加える。
【００３２】
さらなる実施形態において、細胞を適当な手段によって断片化する。１つの実施形態において、断片化を機械的手段、例えば氷上での超音波処理によって行う。細胞残渣を除去し、生じた上清を、凍結する前に５〜１５％グリセロール（ｖ／ｖ）に調整する。ここで、得られた粗酵素抽出物を、本発明のラパマイシン特異的メチル化反応に使用することが可能になる。
【００３３】
他の実施形態において、酵素を産生および単離するための代替的な方法は、当業者にとって容易に明らかであろう［サムブルック・ジェイ（Sambrook J.）ら、2000. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY］。
【００３４】
産生、精製、および単離するための方法は、本発明を制限するものではない。
【００３５】
ＩＩ．メチル化反応
本明細書記載のラパマイシンメチラーゼを、粗抽出物または別の適当な形態で用いて、メチル化反応を以下の通りに行う。約４５〜６５％ ｖ／ｖの粗メチラーゼ抽出物を、約８〜１３０μＭのデスメチルラパマイシン溶液、約０．２〜０．４ｍＭのメチル化試薬、約４〜１０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ、例えば、硫化マグネシウム（ＭｇＳＯ4））、および約５０〜１００ｍＭの濃度の適当な緩衝液で、ｐＨ６．５〜７．５に調整されたものを含む反応物に添加する。別の実施形態において、より精製された形態のメチラーゼを、より低容量、例えば約１０〜約４５％ｖ／ｖメチラーゼで用いる。
【００３６】
１つの実施形態において、メチル供与体はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（SAM）である。本発明で使用するために選択される場合、ＳＡＭは、一般に最終濃度約０．２〜０．４ｍＭで存在する。
【００３７】
別の実施形態において、ラパマイシン溶液は、適当な溶媒中で約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜３ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬのラパマイシンである。選択されたラパマイシン用の適当な溶媒は、メタノール、エタノールおよびジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはこれらの混合物を含む。
【００３８】
適当な緩衝液は、生理学的に適合する緩衝液の中から容易に選択することができ、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（MES）緩衝液、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）緩衝液、またはリン酸カリウム緩衝液などである。
【００３９】
これらの成分を混合した後、反応を進行させる。反応温度は、約０．５〜３時間、または１〜２時間、２０℃から約３７℃まで変化させることができる。１つの実施形態において、反応混合物を約３４℃で約１時間インキュベートする。
【００４０】
インキュベーションの終わりに、１から２容量のクエンチング反応物、例えば、エタノール、メタノール、またはエチルアセテートを添加して反応を停止させる。
【００４１】
沈殿物を通常の方法によって除去する。１つの実施形態において、沈殿物を遠心分離によって除去する。さらなる実施形態において、遠心分離は、１４，０００ ｒｐｍにて１０分間行われる。しかし、他の除去法および／または遠心分離条件が当技術分野において知られている。
【００４２】
精製は、当業者に知られている任意の適当な方法によって行うことができる。適当な方法には、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（TLC）、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。１つの実施形態において、ＨＰＬＣ解析は、６０％のジオキサン、０．０５％の酢酸および０．０３％のトリエチルアミンから成る移動相でＣ１８カラム（３．９×１５０ ｍｍ）を４５℃で用いて行われる。別の実施形態において、ＨＰＬＣ解析は、７５分間にわたって４０％のＡ：６０％のＢから１５％のＡ：８５％のＢまで変化する移動相の勾配を用いてＣ１８カラム（４．６×２５０ ｍｍ）により行われるが、ここで、溶媒Ａは、水中１０ｍＭの酢酸アンモニウムであり、溶媒Ｂはメタノールである。
【００４３】
ＩＩＩ．組成物および用途
生体内でのラパマイシンの代謝的運命を調査および／または観察するためには、標識ラパマイシンが必要である。１つの実施形態において、標識ラパマイシンを用いて、ラパマイシンに結合した細胞／構造体を同定する。ラパマイシンは、密度標識または放射性標識によって均一にタグ付けすることができる。上記したように標識されたラパマイシンは、非標識の天然型ラパマイシンの構造および性質をもつであろうが、密度標識または放射性標識が定常的に取り込まれるため、簡単に検出することができる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明は、１又はそれ以上の本明細書に記載の酵素を含む、ラパマイシンを特異的に標識するためのキットを提供する。このキットは、追加的成分、例えば、陽性対照（例えば、メチル化ラパマイシン）、陰性対照、試薬（例えば、緩衝液、リゾチーム、ヌクレアーゼ）、バイアル瓶、試験管、および本発明の方法を実行するための使用指示書をさらに含むことが可能である。
【００４５】
ある特定の環境においては、本発明に従って産生された標識ラパマイシンを、生理学的に適合する担体を含む組成物に入れて送達することが望ましい。これらの組成物は、本発明に従って産生された標識ラパマイシン化合物を、当業者に公知の技術、例えば、分けても質量スペクトロメトリーまたはシンチレーションカウンティングを用いて容易に追跡（すなわち、観察）できるという点で有利である。
【００４６】
以下の実施例は、ラパマイシン特異的メチル化のための本発明の方法を具体的に説明するものである。本発明の詳細な説明を一読すれば、これらの実施例が、本発明を、具体的に示された反応条件および試薬に限定するものではないことが容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００４７】
Ａ．メチラーゼ遺伝子の増幅
遺伝子を、Ｓ．ヒグロスコピクスＡＴＣＣ２９２５３のゲノムＤＮＡから、公開されているラパマイシン遺伝子クラスターの配列を用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅した(Schwecke, T. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839-7843）。次に、ＲａｐＩ、ＲａｐＭおよびＲａｐＱタンパク質を、ノバジェン社（Novagen）のｐＥＴ２４誘導型プラスミド発現ベクターを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株細胞で発現させた。このベクターでは、クローニングされたベクターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってＴ７プロモーターから発現され、ＩＰＴＧを加えることによって発現が活性化される。
【００４８】
Ｂ．酵素抽出物の調製
インビトロでのメチル化反応にとって最適な条件を確立するために、キム（Kim）ら（Kim, W-S. et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2908-2910）に記載されているような方法を用いて、振とうフラスコ発酵で培養されたＳ．ヒグロスコピクス［ＡＴＣＣ２９２５３］の細胞から粗酵素抽出物を調製した。細胞を遠心分離法によって回収し、０．２Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０で洗浄し、細胞ペレットを、抽出前に凍結した。約８から１０ｇの融解した細胞材料を、２０ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）の中に再懸濁した。クローニングされたメチラーゼタンパク質の粗抽出物については、２５ｍＬの誘導細胞の培養物を遠心分離によって回収し、ペレットを凍結した。このペレットを、１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む、１０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁した。その後、リゾチームを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるまで添加し、商標ベンゾナーゼ（Benzonase）（商標）ヌクレアーゼを添加した（１μＬ／ｍＬ細胞）。細胞を、氷上で１から２分間超音波処理し、〜３０，０００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離して細胞残渣を除去した。上清を、−７０℃で凍結する前に〜１０％グリセロールになるよう調整した。
【００４９】
Ｃ．７−デスメチルラパマイシンのメチル化
約６５μＬの粗メチラーゼ抽出物を、３μｌの１ｍｇ／ｍＬ ７−デスメチル−ラパマイシン（７−ｄｍｒ）溶液、５μｌの４ｍＭ ＳＡＭ、４μｌの０．１Ｍ ＭｇＳＯ4、２３μｌの０．５Ｍ リン酸緩衝液を含み、ｐＨ７．５に調整された反応物に添加した。組換え細胞抽出物を用いたメチル化反応を、５０μＬの抽出物、および３８μＬの緩衝液を用いた以外には、上記したように実施した。ＲａｐＭメチラーゼ抽出物および２つのデスメチルラパマイシン基質、７−Ｏ−デスメチル−ラパマイシン（7-dmr）および３２−Ｏ−デスメチル−ラパマイシンを含む反応物のＨＰＬＣクロマトグラフは、ＲａｐＭメチラーゼが、７−ｄｍｒが基質である場合にのみ、ラパマイシン（rapa）を生成したことを示している。この酵素は、３２−ｄｍｒを修飾しないため、このクローニングされた酵素がその基質特異性をインビトロで保持していることを示唆している。さらに、ＳＡＭが添加されていない試料は、７−ｄｍｒのラパマイシンへの変換を示さなかった。
【００５０】
Ｄ．メチルトリチウム（Methyl-tritiated）ＳＡＭによるラパマイシンの標識
ラパマイシンを標識するに、同じタイプのインビトロ反応を用いた。例えば、ＲａｐＭをメチル化するための反応混合物は、以下のものを含んでいた：１０μＬの０．５Ｍ ＫＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．５、４μＬの０．１Ｍ ＭｇＳＯ4、３３μＬの１００μＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン−（メチル−3Ｈ）、３μＬの１ｍｇ／ｍＬ ７−デスメチル−ラパマイシン（エタノール中）、および５０μＬの抽出物。以下のスキームは、ＲａｐＭメチラーゼの７−ｄｍｒ基質に対する作用によって生成されるはずの標識ラパマイシン分子の例を示している。
【化２】
2007534337.tif 000003
【００５１】
トリチウム化物質は、ＨＰＬＣ解析では、ラパマイシン標準と区別することができなかった。質量スペクトルのデータは、標識物質がトリチウム化ラパマイシンと合致することを示唆した。
【００５２】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって、範囲を限定されるべきものではない。実際、本明細書に記載されたものに加え、本発明のさまざまな改変が、以上の説明および添付の図面から、当業者に明らかになろう。そのような改変は、添付の請求の範囲の範囲に含まれるものとする。
【００５３】
さらに、値はおおよそのものであり、説明のために提示されていることを、さらに理解されるべきである。
【００５４】
特許、特許出願、刊行物、手順などが、本出願全体にリストされており、それらの開示内容は、それら全体が参照されて本明細書に組み込まれる。本明細書と別の文献との間に不一致が存在する限りは、本明細書の開示内容の記載が用いられる。
【国際調査報告】
2007534337.tif 000004
2007534337.tif 000005