(57)【要約】  ２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を調節する薬剤を同定する方法であって、１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および基質の水酸化を測定することを含んでなる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
基質の水酸化を測定すること
を含み、
それによって、薬剤が２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を調節するかどうかを測定する、方法。
【請求項２】
基質はアスパラギン残基において水酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アスパラギン残基は、バリン−アスパラギン、アスパラギン酸−バリン−アスパラギン、イソロイシン−アスパラギンまたはロイシン−アスパラギン配列の一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基質は、ＩκＢ−α、ｐ１０５、ＦＥＭ−１、ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄ、ＧＡＢＰβ、タンキラーゼ１／２、２−５Ａ−ｄ−Ｒ、ガンキリン、マイオトロフィン、Ｍ１１０、ＦＧＩＦ（胎児性グロビンを誘導する因子）、またはそのいずれかのフラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
基質は、ｐ１０５もしくはｐ１０５のＡｓｎ７７８を含んでなるそのフラグメントまたはｐ１０５のペプチドアナログもしくはｐ１０５のＡｓｎ７７８に等価なアスパラギンを含んでなるそのフラグメントであり、Ａｓｎ７７８または前記等価アスパラギンの水酸化が測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼはＪｍｊＣタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＪｍｊＣタンパク質は、低酸素誘導性因子を阻害する因子（ＦＩＨ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基質の水酸化は、２−オキソグルタル酸のターンオーバーをモニターすることによって測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
基質の水酸化は、質量分析によって測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
基質の水酸化は、アンキリンリピートタンパク質によって調節されるプロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子の転写または発現をモニターすることによって測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定される薬剤を薬学的に許容可能なレシピエントと共に処方することをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの活性を選択的に調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）基質の水酸化を測定すること、
（ｂ）（ｉ）１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、第２の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）基質の水酸化を測定すること、
を含み、
それによって、薬剤が第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの活性を調節するかどうかを測定する、方法。
【請求項１３】
試験薬剤は第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの活性を阻害する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼはＦＩＨである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
第２の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼはＰＨＤである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼはＰＨＤである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
第２の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼはＦＩＨである、請求項１２、１３および１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
基質は、請求項２〜５のいずれか一項において規定されるとおりである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の基質に対する２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を選択的に調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）第１の基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）第１の基質の水酸化を測定すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）第２の基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）第２の基質の水酸化を測定すること、
を含み、
ここで、前記第１および第２の基質のうちの少なくとも１つは、１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなり、
それによって、薬剤が、第１の基質に対する２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を選択的に調節するかどうかを測定する、方法。
【請求項２０】
１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる第１および／または第２の基質は、請求項２〜５のいずれか一項において規定されるとおりである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の基質はＨＩＦであり、第２の基質は１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の基質はＨＩＦであり、第１の基質は１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
第１および第２の基質は異なり、それぞれ１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
２−オキソグルタル酸オキシゲナーゼは請求項６または７において規定されるとおりである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
試験薬剤は、アンキリンリピートまたはそのアナログを含んでなるポリペプチドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
アナログは、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼによって水酸化されることが可能なアスパラギン残基を欠くアンキリンリピートである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のアッセイ方法によって同定される薬剤。
【請求項２８】
治療によるヒトまたは動物身体の処置の方法における使用のための請求項２７に記載の薬剤。
【請求項２９】
アンキリンリピートを含有するタンパク質の増加もしくは減少したレベルまたは活性に関連する状態の処置あるいはアンキリンリピートを含有するタンパク質の活性を調節することが所望される状態の処置のための医薬品の製造における請求項２７に記載の薬剤の使用。
【請求項３０】
アンキリンリピートを含有するタンパク質はＩκＢ−α、ｐ１０５、ＦＥＭ−１、ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄ、ＧＡＢＰβ、タンキラーゼ１／２、２−５Ａ−ｄ−Ｒ、ガンキリン、マイオトロフィン、Ｍ１１０またはＦＧＩＦである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記状態は、虚血、癌、炎症性障害、免疫障害、貧血およびβサラセミアよりなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項３２】
アンキリンリピートを含有するタンパク質の増加もしくは減少したレベルまたは活性に関連する状態を処置するかあるいはアンキリンリピートを含有するタンパク質の活性を調節することが所望される状態の処置の方法であって、請求項２７に記載の薬剤の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含んでなる、方法。
【請求項３３】
細胞におけるアンキリンリピートを含有するタンパク質仲介活性を調節する方法であって、細胞と２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を阻害する物質とを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項３４】
ヒトまたは動物身体の処置の方法における使用のための２−オキソグルタル酸オキシゲナーゼによる水酸化を受け難いアンキリンリピート配列アナログを含んでなる、ポリペプチド。
【請求項３５】
２−オキソグルタル酸オキシゲナーゼを阻害するインビトロあるいはインビボ方法におけるアンキリンリピートもしくはそのアナログを含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３６】
２−オキソグルタル酸オキシゲナーゼは、請求項６または７において規定されるとおりである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドは、ＩκＢ−α、ｐ１０５、ＦＥＭ−１、ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄ、ＧＡＢＰβ、タンキラーゼ１／２、２−５Ａ−ｄ−Ｒ、ガンキリン、マイオトロフィン、Ｍ１１０、ＦＧＩＦ（胎児性グロビンを誘導する因子）、またはそのいずれかのフラグメントである、請求項３５または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼによるアンキリンリピートタンパク質の水酸化のモジュレーターを同定するためのアッセイに関する。そのような酵素活性を調節する薬剤も提供する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞器官の組織における二原子酸素濃度の減少は、影響を受けた組織に対する酸素の供給を改善することによって、正常酸素状態を回復するために作動する低酸素応答を誘発する。応答は、エリスロポエチンおよび血管内皮増殖因子をコードする遺伝子を含む遺伝子のアレイに関与し、αβ−ヘテロ二量体転写因子である低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）（このうちα−サブユニットは低酸素常態化でアップレギュレートされる）によって仲介される。低酸素応答に関与する遺伝子には、血管新生に関与する遺伝子が含まれる。低酸素応答の調節は、癌、循環器系および他の疾患の両方の両方に対する新規の治療法を開発する観点から興味深い。
【０００３】
２−ＯＧおよび第一鉄依存性酵素のスーパーファミリーは、（プロリン−４−ヒドロキシラーゼによって触媒されるプロリンから４−ヒドロキシプロリンへの変換のような）非活性型Ｃ−Ｈ結合の水酸化、Ｃ−Ｃ結合の不飽和化および酸化的環化を含む広範な酸化的反応を触媒する。
【０００４】
ほとんどの場合、（それらの構造的関係、補助基質としての二原子酸素の要求性、および補因子としての第一鉄の要求性によって規定されるような）２−ＯＧオキシゲナーゼのスーパーファミリーに属する酵素は、実際には、補助基質として２−ＯＧを使用する。これらの場合、二原子酸素分子の４電子酸化力は、基質の２電子酸化（例えば、プロリン−４−ヒドロキシラーゼによって触媒される反応におけるプロリンから４−ヒドロキシプロリンへ）および２−ＯＧの酸化に繋がり、コハク酸およびＣＯ2を生じる（ケ(Que)Nat.Struct.Biol.（２０００年）７  １８２−１８４）。
【０００５】
ＦＩＨまたはＰＨＤ酵素のような２−ＯＧオキシゲナーゼによって触媒される典型的な水酸化反応の化学量論は、以下のとおりである：
２ＯＧ＋基質＋Ｏ2  →  コハク酸＋ＣＯ2＋生成物
（例えば、プロリン）                （例えば、ヒドロキシプロリン）
【０００６】
プロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＥＧＬＮおよびＨＰＨとしても公知であるＰＨＤ）酵素、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、ならびに低酸素誘導性因子を阻害する因子（ＦＩＨ）を含む所定の２−ＯＧオキシゲナーゼは、医薬品化学の現在の標的である。ＰＨＤ、およびＦＩＨの阻害は、治療様式における使用のための低酸素応答を誘導する手段として認識される。
【０００７】
バイオインフォマティクス解析に繋がるＦＩＨの配列およびその結晶構造は、ＦＩＨを、（ｉ）二本鎖βヘリックスまたはジェリーロール構造エレメントを含有する２−ＯＧオキシゲナーゼとして、（ｉｉ）ＦＩＨがいわゆるタンパク質のＪｍｊＣファミリーのメンバーであるとして、同定している。ＪｍｊＣタンパク質は、少なくとも１つジェリーロール構造エレメントを含有するか、または含有すると予測されるクピンファミリーに関連する。ＪｍｊＣタンパク質のいくつかは、重要な生物学的プロセスまたは疾患状態、例えば、先天性心疾患に関与していると、同定されている。ＪｍｊＣタンパク質の多くは、転写調節に関与する２−ＯＧオキシゲナーゼであることが提唱されている。該分野の課題は、２−ＯＧオキシゲナーゼ（そのうちのいくつかは、転写調節および他のシグナル伝達経路に関与するＪｍｊＣタンパク質として特徴付けられる）の基質を規定することである。
【０００８】
現在、ＳＭＡＲＴドメインデータベースには、４００を超えるＪｍｊＣドメインタンパク質が存在する（シュルツ(Shultz)らＰＮＡＳ（１９９８年）９５  ５８５７−５８６４）。これらのうち多くは、クロマチン構造の調節、およびそれ故、転写制御に関与する遺伝子産物として認識される（クリッソルド(Clissold)およびパンティング(Ponting)ＴＩＢＳ（２００１年）２６  ７−９）。
【０００９】
アンキリン（ＡＮＫ）リピートモチーフは、２つの逆平行α−ヘリックス、続いて、それを次のリピートに接続するβ−バルジおよびβ−ヘアピン含有ループよりなり、そのそれぞれは３３残基を含有する（図１）。リピートは、数リピートから２４リピートまでのタンデム形態で生じる（レビューについては、セジウィック(Sedgwick)およびスメルドン(Smerdon)ＴＩＢＳ（１９９９年）２４  ３１１−３１６を参照のこと）。伸長されたβ−ヘアピンを含有するループ、または「フィンガー」は、表面上に溝を形成する。
【００１０】
現在、ＳＭＡＲＴドメインデータベースには、ＡＮＫを含有する３５００を超える配列を見出すことができる（シュルツ(Shultz)らＰＮＡＳ（１９９８年）９５  ５８５７−５８６４）。これらの３５００配列のうち、３０００を超えるものが真核生物由来であり、１３５が細菌由来であり、そして４が古細菌(Archaea)由来である。３０００の真核生物ＡＮＫタンパク質配列のうち、２６００を超えるものが後生生物由来であり、６００を超えるものがそれぞれヒトおよびマウス由来である。多くのアンキリンタンパク質はまた、植物にも存在し、ここで、それらは、調節およびシグナル伝達に関与する。
【００１１】
ＡＮＫリピートを含有するタンパク質は、しばしば、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。高度に保存されたコアは、特に、他のタンパク質とのほとんどの相互作用に関与する「フィンガー」における変動可能な表面が暴露された残基の足場としての役割を果たす（セジウィック(Sedgwick)およびスメルドン(Smerdon)ＴＩＢＳ（１９９９年）２４  ３１１−３１６）。それらの機能は広範に変動し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビター、転写調節因子、細胞骨格形成体、発生調節因子および毒素さえも含む。アンキリンリピートタンパク質の欠損は、多くのヒト疾患において見出されている。
【００１２】
本発明者らは、ＦＩＨに対するまだ未知の多くの基質を同定している。これらの基質はすべて、アンキリン構造エレメント、またはそのフラグメントを含有する。従って、本発明者らは、ＪｍｊＣタンパク質とアンキリンタンパク質との間の連結を確立し、アンキリンタンパク質がＪｍｊＣタンパク質によって水酸化される転写調節の新規の機構を同定している。ＦＩＨに対する基質であることが示されるアンキリンタンパク質は、虚血性疾患、癌、炎症および免疫に関連するシグナル伝達経路を含む治療観点から重要である多様な生物学的経路に関与する。
【００１３】
従って、２−ＯＧオキシゲナーゼおよびアンキリン基質、またはそのフラグメントは、ＦＩＨのような２−ＯＧオキシゲナーゼおよび２−ＯＧオキシゲナーゼのＪｍｊＣファミリーの他のメンバーのインヒビターおよびアクチベーターのようなモジュレーターを同定するためのアッセイ／スクリーニングにおいて使用され得る。インヒビターおよびアクチベーターは、２−ＯＧオキシゲナーゼによるアンキリン基質、もしくはそのフラグメントの水酸化を阻害または増強する薬剤である。
【００１４】
さらに、そのようなアッセイ／スクリーニングは、アンキリンを水酸化する２−ＯＧオキシゲナーゼまたはアンキリンに対して作用しない２−ＯＧオキシゲナーゼに選択的であるモジュレーターを同定するために使用してもよい。そのようなアッセイ／スクリーニングはまた、特定の基質または基質の基に対する単一の２−ＯＧオキシゲナーゼの活性に選択的であるモジュレーターを同定するために使用してもよい。
【００１５】
そのようなアッセイ／スクリーニングによって同定されるモジュレーターは、例えば、虚血性疾患、癌、炎症、免疫、貧血およびβサラセミアの処置における医薬において有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、本発明は、
２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ｉ）１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）基質の水酸化を測定すること、
を含み、
それによって、薬剤が２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を調節するかどうかを測定する方法と、
第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの活性を選択的に調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）基質の水酸化を測定すること、
（ｂ）（ｉ）１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、第２の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）基質の水酸化を測定すること、
を含み、
それによって、薬剤が第１の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの活性を選択的に調節するかどうかを測定する方法、ならびに
第１の基質に対する２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を選択的に調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなる基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）第１の基質の水酸化を測定すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）第２の基質、またはそのフラグメントの存在下、基質が試験薬剤の非存在下で水酸化される条件において、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼと試験薬剤とを接触させること、および
（ｉｉ）第２の基質の水酸化を測定すること、
を含み、
ここで、前記第１および第２の基質のうちの少なくとも１つは、１つもしくはそれ以上のアンキリンリピートを含んでなり、
それによって、薬剤が、第１の基質に対する２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性を選択的に調節するかどうかを測定する方法を提供する。
【００１７】
基質は、好ましくは、アスパラギン残基において水酸化される。アスパラギン残基は、バリン−アスパラギン、アスパラギン酸−バリン−アスパラギンまたはイソロイシン−アスパラギン配列の一部である。好適な基質として、ＩκＢ−α、ｐ１０５、ＦＥＭ−１、ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄ、ＧＡＢＰβ、タンキラーゼ１／２、２−５Ａ−ｄ−Ｒ、ガンキリン、マイオトロフィン、Ｍ１１０、ＦＧＩＦ（胎児性グロビンを誘導する因子）、ならびにそのフラグメント、誘導体およびアナログが挙げられる。２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼは、好ましくは、ＪｍｊＣタンパク質である。ＪｍｊＣタンパク質は、好ましくは、低酸素誘導性因子を阻害する因子（ＦＩＨ）である。
【００１８】
本発明の方法は、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定される薬剤を薬学的に許容可能なレシピエントと共に処方することをさらに含んでなり得る。
【００１９】
本発明に従うアッセイによって同定される薬剤もまた提供される。本発明の薬剤は、治療によるヒトまたは動物身体の処置の方法における使用のために提供される。本発明はまた、アンキリンリピートを含有するタンパク質の増加もしくは減少したレベルまたは活性に関連する状態の処置あるいはアンキリンリピートを含有するタンパク質の活性を調節することが所望される状態の処置のための医薬品の製造における本発明の薬剤の使用を提供する。本発明はまた、アンキリンリピートを含有するタンパク質の増加もしくは減少したレベルまたは活性に関連する状態を処置するかあるいはアンキリンリピートを含有するタンパク質の活性を調節することが所望される状態の処置の方法であって、本発明に従う薬剤の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含んでなる、方法を提供する。状態は、好ましくは、虚血、癌、炎症性障害、免疫障害、貧血およびサラセミアよりなる群から選択される。
【００２０】
本発明は、インビボまたはインビトロで、細胞におけるアンキリンリピートを含有するタンパク質仲介活性を調節する方法であって、細胞と２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤とを接触させることを含んでなる、方法をさらに提供する。
【００２１】
本発明はまた、２−オキソグルタル酸オキシゲナーゼを阻害するインビトロまたはインビボ方法におけるアンキリンリピートもしくはそのアナログを含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、ならびにヒトまたは動物身体の処置の方法における使用のための２−オキソグルタル酸オキシゲナーゼによる水酸化を受け難いアンキリンリピート配列アナログを含んでなるポリペプチドを提供する。
【００２２】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＦＩＨによりアスパラギン残基において水酸化されるＩκＢ−αのフラグメントである。
【００２３】
配列番号２は、ＦＩＨによりアスパラギン残基において水酸化されるｐ１０５のフラグメントである。
【００２４】
配列番号３は、ＦＩＨによりアスパラギン残基において水酸化されるＦＥＭ−１のフラグメントである。
【００２５】
配列番号４は、ＦＩＨによりアスパラギン残基において水酸化されるｐ１０５のフラグメントである。
【００２６】
配列番号５は、ＦＩＨによりアスパラギン残基において水酸化される保存されたコンセンサス配列である。
【００２７】
配列番号６〜配列番号９は、実施例において使用されたプライマーの核酸配列である。
【００２８】
配列番号１０は、ＦＩＨのアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１１は、ＨＩＦ  Ｃ末端トランス活性化ドメイン標準ペプチドであるＣＡＤのアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１２は、ＦＩＨにより水酸化されるＢｃｌ−３のフラグメントである。
【００３１】
配列番号１３は、ＦＩＨにより水酸化されるＰ１９−ＩＮＫ４ｄのフラグメントである。
【００３２】
配列番号１４は、ＦＩＨにより水酸化されるＧＡＢＰβのフラグメントである。
【００３３】
配列番号１５は、ＦＩＨにより水酸化されるタンキラーゼのフラグメントである。
【００３４】
配列番号１６は、ＦＩＨにより水酸化される２−５Ａ−ｄ−Ｒのフラグメントである。
【００３５】
配列番号１７は、ＦＩＨにより水酸化されるガンキリン／ｐ２８−ＩＩのフラグメントである。
【００３６】
配列番号１８は、ＦＩＨにより水酸化されるマイオトロフィンのフラグメントである。
【００３７】
配列番号１９は、ＦＩＨにより水酸化されるＭ１１０のフラグメントである。
【００３８】
配列番号２０は、ＦＩＨにより水酸化されるＦＧＩＦのフラグメントである。
【００３９】
配列番号２２は、２−ＯＧオキシゲナーゼによって水酸化されるアスパラギン残基を含んでなる配列モチーフである。
【００４０】
配列番号２２は、ｐ１０５アンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２３は、内因的に水酸化されるＩＫＢ−αのペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
アッセイ
本発明者らは、アンキリンリピートまたはアスパラギン残基を含んでなるアンキリンリピートのフラグメントを含有するタンパク質の水酸化は、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性オキシゲナーゼによって仲介されることを示した。２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ、および特に、ヒト２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの作用は、アンキリンリピートを含有するタンパク質の制御のための新規の標的を表す。
【００４３】
特に、本発明者らは、ＩκＢ−αがＦＩＨにより水酸化されることを示した。ＩκＢ−αは、細胞質においてｐ５０およびｐ６５サブユニットよりなるＮＦκＢヘテロ二量体の配列測定において役割を果たす。ＩκＢ−α上のＮ末端シグナル認識ドメインは、ＩκＢ−αの分解を仲介するリン酸化の標的である。ＩκＢ−αが分解され、その細胞濃度レベルが低い場合、遊離のＮＦκＢは核に転位され、ここで、それは、多様なアクチベーターに会合し、炎症反応に関与する多くの遺伝子の転写を開始する。
【００４４】
ＮＦκＢ経路は炎症反応において重要であることが公知であり、例えば、それらの安定性が改変されるようなアンキリンタンパク質を修飾する２ＯＧオキシゲナーゼの阻害による経路におけるアンキリンタンパク質の活性の調節は、炎症反応に関連する疾患の処置に有用である。所望の医薬効果は、ｐ１０５およびＩκＢ−αのようなＮＦκＢタンパク質とｐ５０／ｐ６５転写複合体との間の相互作用を減少または増加することによって達成されるような炎症ならびに免疫の調節を含む。
【００４５】
アンキリンタンパク質はまた、癌およびアポトーシスを含む他の疾患状態にも関連する。従って、アンキリンタンパク質の濃度および安定性のような生物学的特性の調節は腫瘍細胞の生存の阻害に有用であり、これは、ｐ５３およびＡＳＰＰ１もしくは２の相互作用を促進するかまたはｐ５３とｉＡＳＰＰとの相互作用を減少するか、あるいは他の手段によって達成され得、癌組織に対して作用し得る。
【００４６】
同様に、アポトーシスの増殖および／または阻害は、腫瘍抑制タンパク質ｐ１６もしくはｐ１８とサイクリン依存性キナーゼの相互作用を減少するか、あるいは例えば、虚血もしくは低酸素賞またはそうでなければ損傷を受けた組織を改善するための他の手段によって達成され得る。
【００４７】
１つもしくはそれ以上アンキリンドメインまたはそのフラグメントを含有するタンパク質を基質として使用して、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ活性のモジュレーターを同定するために行うことができる、異なる多くのアッセイについて以下に記載する。
【００４８】
典型的に、アッセイは、ＦＩＨのようなヒト２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼまたはヒト２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのフラグメントもしくは変異体を利用する。非ヒト２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ、またはそのフラグメントもしくは変異体を使用することもできる。これらの成分を以下に詳細に記載する。これらの成分のそれぞれは、要求される場合、精製形態もしくは例えば、細胞抽出物として非精製形態で、またはそのような抽出物由来の関連成分の精製によって、提供され得る。あるいは、関連成分を、組換え発現技術を使用して発現させ、アッセイにおける使用のために精製することができる。あるいは、成分は、細胞に基づくアッセイにおいて使用される細胞において、組換え的に発現させてもよい。
【００４９】
アッセイ条件は、市販の試薬または当該分野において記載の試薬のスクリーニングに関与する標準的な技術を使用して、最適化することができる。
【００５０】
典型的に、関連成分をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター内で提供される。そのような発現ベクターは当該分野において日常的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡならびに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび例えば、必要であり得、十分なタンパク質発現を可能にするために正確な配向で配置されるポリアデニル化シグナルのような他のエレメントの使用に関与し得る。適切なベクターについては、当業者にきわめて容易に理解されよう。プロモーター配列は、選択されるアッセイ形式に依存して、誘導性または構成性プロモーターであってもよい。プロモーターは組織特異的であってもよい。
【００５１】
アッセイ方法
本発明は、アンキリンリピートまたはそのフラグメントを含有する基質に対する２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性を調整する薬剤を同定するため、特に、アンキリンリピートまたはそのフラグメントにおけるアスパラギン残基のアスパラギン水酸化をモニターするためのアッセイ方法を提供する。方法は、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの基質の存在下、試験物質の非存在下でアスパラギン水酸化を生じる条件下で、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼと潜在的なインヒビターまたはアクチベーターのような試験物質とを接触させること、および基質のアスパラギン水酸化の程度を測定することを含んでなる。あるいは、アッセイは、活性の増加についてアッセイすることによって、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの活性を増加する物質を検出するために使用することができる。
【００５２】
本明細書に記載の実験において、ＦＩＨが、ＩκＢ−α、ｐ１０５、ＦＥＭ−１、ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄ、ＧＡＢＰβ、タンキラーゼ１／２、２−５Ａ−ｄ−Ｒ、ガンキリン、マイオトロフィン、Ｍ１１０、ＦＧＩＦおよびアスパラギン残基を含んでなるそのペプチドフラグメントを水酸化することを見出した。特に、ＩκＢ−αおよびｐ１０５は、転写活性化を制御するシグナル伝達経路に関与し、そのためこれらのタンパク質の水酸化を調節することは転写活性化を調節する。転写活性化のこのような阻害または活性はまた、本発明のアッセイの基礎として使用することができる。
【００５３】
本発明のそのようなアッセイは、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性のインヒビターを同定するために使用することができ、従って、好ましくは、アスパラギン水酸化が試験物質の非存在下で生じる条件下で行われる。代替的に、アッセイは、例えば、試験物質の非存在下で行われるアッセイと比較して、アスパラギン基質の水酸化の増加を探索することによって、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性のプロモーターを探索するために使用することができる。アッセイはまた、低酸素条件下などの水酸化が減少するまたは認められない条件下で行うことができ、水酸化の存在または増加は、そのような条件下でモニターし得る。本発明のアッセイはまた、アンキリンリピートを含有するタンパク質に対してアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を有し、かつ例えば、プロリルヒドロキシラーゼのような他のヒドロキシラーゼでは活性を有さないかもしくはほとんど活性を有さない２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼに特異的であるインヒビターまたはアクチベーターを同定するために使用することができる。
【００５４】
本発明はまた、アンキリンリピートを含有するタンパク質に対してアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を有する２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの同定のためのアッセイ方法を提供する。方法は、典型的に、試験ポリペプチドを提供すること；アンキリンリピートを含有するタンパク質がＦＩＨ、または他の２−ＯＧオキシゲナーゼによって、アスパラギン残基において水酸化される条件下で、アンキリンリピートを含有するタンパク質と試験ポリペプチドとを接触させること、およびアンキリンリピートを含有するタンパク質がアスパラギン残基において水酸化されるかどうかを測定することを含んでなる。
【００５５】
２−オキソグルタル酸(2-oxoglutatarate)依存性オキシゲナーゼ
本発明のアッセイにおいて使用される２−ＯＧオキシゲナーゼは、１つもしくはそれ以上のＡＮＫタンパク質の水酸化を触媒する２−ＯＧおよび第一鉄依存性酵素のスーパーファミリーの任意のメンバーであり得る。２−ＯＧオキシゲナーゼおよび２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼという用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００５６】
典型的に、２−ＯＧオキシゲナーゼは、タンパク質のＪｍｊＣファミリーまたはクピンファミリーのメンバーである（ヒューイットソン(Hewitson)ら、２００２年、J.Biol.Chem.２７７：２６３５１−２６３５５）。２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼは、好ましくは、二本鎖βヘリックスまたはジェリーロールモチーフとして公知の構造エレメントを含有する。好ましくは、ＪｍｊＣタンパク質は、クロマチン構造の調節および、従って、転写制御に関与する。より好ましくは、ＪｍｊＣタンパク質はＦＩＨである。
【００５７】
本発明のアッセイにおいて使用することができる他の２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼとしては、例えば、クラバミン(clavaminte)シンターゼ、デアセトキシセファロスポリンＣシンターゼ、コラーゲン−プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、コラーゲンプロリル−３−ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、アスパルチルヒドロキシラーゼ、フィタノイル補酵素Ａヒドロキシラーゼまたはγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼが挙げられる。２ＯＧ依存性オキシゲナーゼは、哺乳類、好ましくは、ヒトポリペプチドであり得る。
【００５８】
ヒト２−ＯＧオキシゲナーゼとして、ＡｌｋＢ、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、リジンヒドロキシラーゼ、内因性増殖因子ドメインを水酸化することが公知のアスパルチル／アスパラギンヒドロキシラーゼ、フィタノイルＣｏＡヒドロキシラーゼ、γ−ブチロベタインヒドロキシラーゼ、トリメチルリジンヒドロキシラーゼ；ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、およびＦＩＨに緊密に関連する酵素を含むＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼイソ型が挙げられる。ＦＩＨに緊密に関連する酵素としては、次の番号によって参照されるＳＷＡＬＬデータベースにおけるそれらのタンパク質を挙げることができる：ヒト(Homo sapiens)におけるＱ９ＮＷＪ５、Ｑ８ＴＢ１０、Ｑ９Ｙ４Ｅ２、Ｏ９５７１２、Ｑ９Ｈ８Ｂ１、Ｑ９ＮＷＴ６、ならびにハツカネズミ(Mus musculus)におけるＱ９１Ｗ８８およびＱ９ＥＲ１５ならびにこれらの酵素の相同物。
【００５９】
ＦＩＨのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。本発明の方法において使用されるＦＩＨは、配列番号１０に示される配列を含んでなり得るか、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。
【００６０】
いくつかの実施態様では、本発明のアッセイにおける２−ＯＧオキシゲナーゼの変異（変種）形態を使用することが所望される。例えば、変異体は、天然に存在する酵素と比較して増加した溶解度を有し得る。
【００６１】
本発明のアッセイにおける使用のためのＦＩＨの変異体またはフラグメントは、アンキリンリピートを含有するタンパク質の１つもしくはそれ以上の残基を、好ましくは、アスパラギン残基、特に、ｐ１０５のＡｓｎ７７８において水酸化する能力を有する。好ましくは、ＦＩＨの変異体は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは、７０％を超える、より好ましくは、約８０％、９０％、９５％または９９％を超える配列同一性を有する。そのような変異体は、ペプチドがアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、対立遺伝子変異体およびタンパク質配列内あるいは一末端または両末端における単一のアミノ酸またはアミノ酸の群の欠失、修飾もしくは付加を含むことができる。好ましくは、配列番号１０の変異体は、ＦＩＨと同じドメイン構造、即ち、８ストランドのβバレル型ジェリーロールを有する。
【００６２】
アミノ酸置換は、例えば、１、２または３〜１０、２０または３０置換から作製され得る。保存的置換は、例えば、以下の表に従って作製され得る。２番目のカラムの同じブロック、好ましくは、３番目のカラムの同じラインのアミノ酸は、相互に置換することができる。
【００６３】
【表１】
2007530522.tif 000002
【００６４】
本発明の範囲内の変異体ポリペプチドは、任意の適切な方法、例えば、遺伝子シャフリング（分子育種）技術によって作製してもよい。
【００６５】
ＦＩＨの機能的擬似体または誘導体もまた、ヒドロキシラーゼ活性を有し、特に、アンキリンリピートアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を維持する本発明のアッセイにおいて使用することができる。そのような活性フラグメントは、例えば、異なる、即ち異種リガンドのための結合タンパク質を含む融合タンパク質の一部として含まれ得る。
【００６６】
本発明のアッセイにおける使用のためのオキシゲナーゼおよび基質であるタンパク質は、化学的に修飾、例えば、翻訳後修飾してもよい。例えば、２−ＯＧオキシゲナーゼは、タンパク質分解を受けていた可能性があるかまたはグリコシル化、水酸化、リン酸化、アセチル化、メチル化され得るかまたは修飾アミノ酸残基を含んでなり得る。それらはまた、それらの精製を援助するためのヒスチジン残基の付加または水酸化もしくはリン酸化を含む核酸への転移を促進するための各局在化配列の付加によって、修飾することができる。
【００６７】
基質
本発明のアッセイにおいて使用される基質は、１つもしくはそれ以上のアンキリンリピート、またはアンキリンリピートの１つもしくはそれ以上のフラグメントを含んでなる。基質は、少なくとも１つのアンキリンリピートまたは２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼによって水酸化されるアスパラギン残基を含んでなるそのフラグメントを含んでなる。
【００６８】
アンキリンリピートアミノ酸配列は、構造的アンキリンリピートモチーフをフォールディング形成することが可能である。アンキリンリピートモチーフは、２つの逆平行α−ヘリックス、続いて、それを次のリピートに接続するβ−バルジおよびβ−ヘアピン含有ループよりなり、そのそれぞれは３３残基を含有する（図１）。基質は、１つのそのようなリピートまたは２つもしくはそれ以上、例えば、３〜２４、５〜２０または８〜１２リピートを含んでなり得る。伸長されたβ−ヘアピンを含有するループ、または「フィンガー」は、表面上に溝を形成する。
【００６９】
基質は、フォールドされた形態であってもまたはフォールドされていない形態であってもよい。従って、基質は、フォールドされていないか、もしくは部分的にフォールドされた形態で２つの逆平行αヘリックス、β−バルジおよびβ−ヘアピンループを形成するためにフォールディングすることが可能であるポリペプチド配列のすべてまたは部分を含んでなり得る。典型的に、基質が３つもしくはそれ以上のアンキリンリピート配列を含んでなる場合、基質はフォールドされた形態である。
【００７０】
基質は、フラグメントが水酸化され得るアンキリンリピートの１つもしくはそれ以上のフラグメントを含んでなり得る。フラグメントは、好ましくは、アスパラギン残基を含んでなり得る。フラグメントは、典型的に、少なくとも５アミノ酸長、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０または少なくとも３０アミノ酸長である。フラグメントは、典型的に、アンキリンリピートを含有するタンパク質においてフォールドし、β−ヘアピンターンの前にβ−バルジを形成する配列を包含する。好ましくは、フラグメントは、配列モチーフＤＶＮＡを含む。他の好適なモチーフは、ＶＮ、ＤＶＮ、ＬＮおよびＩＮである。配列は、以下の式の配列であってもよい：
ＡＡ1−ＡＡ2−Ｎ−ＡＡ3
式中：
ＡＡ1はＤ、Ｅ、ＮまたはＱ（好ましくは、Ｄ）であり、
ＡＡ2はＶ、ＬまたはＩ（好ましくはＶ）であり、
ＡＡ3はＡ、ＶまたはＩ（好ましくはＡ）である。
【００７１】
フラグメントは、好ましくは、前記配列モチーフの一方または両側のいずれかにおいて少なくとも１アミノ酸、例えば、少なくとも２、３、４、５、８もしくは１０アミノ酸を含んでなる。さらなるアミノ酸は、好ましくは、Ｎ末端から前記配列モチーフである。
【００７２】
ＤＶＮＡモチーフを含んでなるＨＩＦのフラグメントは、本発明の方法において有用な基質の間に含まれない。ＨＩＦでは、ＤＶＮＡモチーフはアンキリンリピートの部分を形成しない。
【００７３】
現在、ＳＭＡＲＴドメインデータベースには、ＡＮＫを含有する３５００を超える配列を見出すことができる（シュルツ(Shultz)らＰＮＡＳ（１９９８年）９５  ５８５７−５８６４）。これらの３５００配列のうち、３０００を超えるものが真核生物由来であり、１３５が細菌由来であり、そして４が古細菌(Archaea)由来である。３０００の真核生物ＡＮＫタンパク質配列のうち、２６００を超えるものが後生生物由来であり、６００を超えるものがそれぞれヒトおよびマウス由来である。多くのアンキリンタンパク質はまた、植物にも存在し、ここで、それらは、調節およびシグナル伝達に関与する。好ましくは、基質は、ヒトＡＮＫタンパク質、またはそのようなヒトタンパク質のフラグメントもしくは誘導体である。
【００７４】
基質は、典型的に、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質、またはそのようなタンパク質のフラグメントもしくは誘導体である。基質は、他のタンパク質とのほとんどの相互作用に関与する特に「フィンガー」における多様な表面露出残基のための足場としての役割を果たすタンパク質−タンパク質相互作用に関与するＡＮＫタンパク質の高度に保存されたコアを含んでなり得る（セジウィック(Sedgwick)およびスメルドン(Smerdon)ＴＩＢＳ（１９９９年）２４  ３１１−３１６）。
【００７５】
ＡＮＫタンパク質は、ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄのようなサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビター；ＧＡＢＰβのような転写調節因子；細胞骨格形成体；マイオトロフィンのような発生調節因子；毒素；ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、タンキラーゼ１／２もしくはエンドリボヌクレアーゼ２−５Ａ（アデニン）依存性ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｌ）のような酵素；または網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質の調節因子であるガンキリン、ミオシンリン酸化の調節因子であるＭ１１０（ＭＹＰＴＩ）もしくは胎児性ヘモグロビン（Ｈｂ）発現を調節する胎児性グロビンを誘導する因子（ＦＧＩＦ）のような他の調節因子タンパク質であってもよい。基質は、これらのタンパク質のいずれか１つのフラグメント、誘導体またはアナログであってもよいが、但し、それはアンキリンリピートを含んでなる。
【００７６】
基質は、天然に存在するタンパク質であってもまたは組換えもしくは合成タンパク質であってもよい。例えば、合成タンパク質は、マイン(Main)らCurrent Opin.Struct.Biol.１３：４８２−４８９（２００３年）に記載のような１つもしくはそれ以上の理想化されたアンキリンリピートを含んでなり得る。
【００７７】
１つの好適な実施態様において、ＡＮＫタンパク質はＮＦκＢシグナル伝達経路に関与する。基質は、ＮＫκＢに結合するＩκＢ−αマイオトロフィンであっても、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログであってもよい。基質は、ＩκＢ−αであってもまたはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログであってもよい。ＩκＢ−αの好適なフラグメントは、配列番号１に示される配列のすべてまたは部分を含み、配列番号１の１６位でＮ残基を包含する。
【００７８】
ＩκＢはＦＩＨによって水酸化される。従って、好適なアッセイでは２−ＯＧオキシゲナーゼはＦＩＨであり、基質はＩκＢ−αまたはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログである。
【００７９】
基質は、ＮＦκＢタンパク質ｐ１０５であってもまたはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログであってもよい。ｐ１０５の好適なフラグメントは、配列番号２または４に示される配列のすべてまたは部分を含み、配列番号２の１６位でＮ残基を包含する。ｐ１０５の誘導体の例を実施例に示す。従って、ｐ１０５の好適なフラグメントはｐ１０５のＡｓｎ７７８を含んでなり、ｐ１０５の好適なペプチドアナログ、およびそのフラグメントは、ｐ１０５のＡｓｎ７７８に等価なアスパラギンを含んでなる。ｐ１０５のより長い好適なフラグメントは、ｐ１０５のアミノ酸５３７〜８０９を包含するｐ１０５アンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）であり、配列番号２２に示される。
【００８０】
さらに好適な基質はＦＥＭ−１またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログである。ＦＥＭ−１の好適なフラグメントは、配列番号３に示される配列のすべてまたは部分を含み、配列番号３の１６位でＮ残基を包含する。
【００８１】
ＮＯＴＣＨは、基質としての使用のための別の好適なアンキリンタンパク質である。ＮＯＴＣＨのフラグメント、誘導体またはアナログもまた、本発明のアッセイにおいて使用することができる。
【００８２】
本明細書に記載のアンキリンリピートを含有するタンパク質の誘導体またはアナログおよびそのフラグメントは、規定されたアンキリンリピートを含有するタンパク質のいずれか１つと同じ機能を有し、前記規定されたタンパク質、およびそのフラグメントといくつかの配列同一性を共有する他の種由来のタンパク質を含む。好ましくは、そのようなアナログまたは誘導体は、前記タンパク質またはフラグメントに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％の同一性を有する。誘導体およびそのフラグメントはまた、１つもしくはそれ以上アミノ酸欠失、置換もしくは挿入が作製されているタンパク質およびフラグメントを含む。タンパク質が２−ＯＧオキシゲナーゼによって水酸化され得るアスパラギン残基を保持する限り、修飾、欠失または挿入は、単一のアミノ酸またはアミノ酸の群によるもの、例えば、タンパク質配列内の２もしくは３〜１０もしくは１２置換であり得る。保存的置換は、上記の表に従って作製され得る。
【００８３】
水酸化がＡＮＫタンパク質と別のシグナル分子(signally molecule)との相互作用をモニターすることによって測定されるアッセイでは、アッセイは、典型的に、相互作用が生じるのに適切な条件下で行われる。基質がＡＮＫタンパク質のフラグメントである場合、フラグメントは、水酸化のためのアスパラギン残基に加えて、他のシグナル伝達分子と相互作用するドメインを含んでなるフラグメントである。
【００８４】
薬剤は、アンキリンタンパク質およびその同系の結合パートナーの相互作用を増加または減少し得る。例えば、マイオトロフィンＩκＢ−α、ＮＯＴＣＨまたはｐ１０５では、結合パートナーは、腫瘍抑制遺伝子産物ｐ５３、ＮＦ−κＢ転写因子ｐ５０／ｐ６５、転写複合体ＣＳＬ／マスターマインド(Mastermind)もしくはＥｔｓタンパク質ＧＡＢＰがあり得るが、これらに限定されない。ＧＡＢＰβでは、結合パートナーは、典型的に、ＧＡＢＰαである。タンキラーゼ１／２の結合パートナーは、ＴＲＦ１、ＩＲＡＰおよびＧｒｂ１４のようなその複数の基質のいずれか１つであり得る。ガンキリンの結合パートナーは、ＣＤ４Ｋ／サイクリンＤまたはＲｂであり得、Ｍ１１０の結合パートナーはタンパク質ホスファターゼＩｃであり得る。
【００８５】
調節をモニターするための方法
本発明のスクリーニングまたはアッセイ方法のいずれかの正確な形式は、日常的技能および知識を使用して、当業者によって変動することができる。当業者であれば、適切な制御された実験をさらに用いる必要性をよく知っている。本発明のアッセイは、１つもしくはそれ以上のアンキリンドメインまたはそのフラグメントを含んでなる基質のアスパラギン水酸化をモニターすること、基質および補助基質の利用（例えば、２−ＯＧ、酸素もしくは基質の消費（即ち、枯渇））をモニターすること、または酵素とその基質との間の予想される生成物の生成をモニターすることを必要とし得る。例えば、例えば放射性２−ＯＧからのコハク酸または二酸化炭素の生成をモニターすることができる。誘導体がオルト−フェニレンジアミンと比較して、改善された感受性を付与するように、活性はまた、オルト−フェニレンジアミンまたは１,２−ジメトキシ−４,５−ジアミノベンゼン、もしくは１,２−メチレンジオキシ−４,５−ジアミノベンゼンのいずれかのような他の芳香族ジアミンによる２−ＯＧの誘導によって、測定され得る。
【００８６】
本発明のアッセイ方法はまた、システムにおける成分間の直接的相互作用をスクリーニングすることもあり得る。あるいは、シグナル伝達経路におけるアンキリンリピート含有基質の他のタンパク質への結合のようなダウンストリーム効果および転写活性化のようなアンキリンリピートを含有するタンパク質によって仲介されるダウンストリーム効果をモニターするアッセイを行うことができる。転写活性化は、適切なレポーター構築物を使用するか、あるいは遺伝子のアップレギュレーションまたはアンキリンリピートを含有するタンパク質によって直接的もしくは間接的に調節されることが公知である遺伝子の発現パターンの改変をモニターすることによって、モニターすることができる。
【００８７】
水酸化を測定するための多様な方法は当該分野において公知であり、本明細書において記載および例示されている。基質または補助基質利用などによる２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの活性、ペプチド水酸化または水酸化もしくは非水酸化生成物によって仲介されるダウンストリーム効果のような生成物の出現を測定するための任意の適切な方法を使用することができる。
【００８８】
ＦＩＨのような２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの基質としてのアンキリンリピートを含有するタンパク質の同定は、アンキリンリピートを含有するタンパク質の水酸化のインヒビターおよびアクチベーターをスクリーニングするためのアッセイ方法の基礎を提供する。特に、ｐ１０５のＡｓｎ７７８残基がアスパラギンヒドロキシラーゼによって水酸化されるという本発明者らの所見は、このプロセスのインヒビターまたはプロモーターをスクリーニングするように設計されたアッセイ方法の基礎を提供する。アンキリンリピートを含有するタンパク質またはそのアナログの水酸化をモニターするための任意の適切な方法を使用することができる。関連するアスパラギン残基または別の位置の水酸化を直接モニターするためのアッセイを行うことができる。あるいは、補因子および補助基質の枯渇をモニターするためのアッセイを行うことができる。あるいは、そのようなアッセイは、例えば、同じシグナル伝達経路におけるタンパク質と別の分子との間の相互作用もしくはアンキリンリピートを含有するタンパク質によって仲介される転写をモニターすることによって、水酸化のダウンストリーム効果またはアンキリンリピートを含有するタンパク質の水酸化の実際の阻害をモニターすることができる。アンキリンリピートを含有するタンパク質アスパラギンヒドロキシラーゼの活性のエンハンサーの同定のためのアッセイも提供される。
【００８９】
基質、酵素および潜在的インヒビター化合物は、インヒビターの非存在下で、基質のアスパラギン残基の水酸化を提供する条件下で共にインキュベートされ得、インヒビター効果は、基質の水酸化を測定することによって測定され得る。これは、任意の適切な手段によって達成され得る。小さなポリペプチド基質を回収し、質量分析またはクロマトグラフィーのような物理的分析か、または同じシグナル伝達経路において別のタンパク質に結合する能力のような機能分析に供することができる。そのような方法は当該分野などにおいて公知であり、日常的技能および知識を使用して実施することができる。測定は、定量的または定性的であり得る。両方の場合において、但し、特に後者では、定量的測定は、適切なコントロール、例えば、潜在的インヒビターを伴わずにインキュベートされる基質と比較して行うことができる。
【００９０】
この様式で同定されるインヒビター化合物を回収して、薬学的組成物として処方することができる。
【００９１】
アンキリンリピートを含有するタンパク質と別のシグナル伝達タンパク質との間の相互作用は、例えば、蛍光偏光の使用、ホモジニアス時間分解蛍光(homogenous time resolved fluorescence)、基質または水酸化された基質生成物に特異的な抗体の使用、表面プラズモン共鳴または質量分析によって、典型的に、モニターすることができる。第１の例では、試験ポリペプチドに付着した染料の蛍光偏光は、相互作用が生じる場合に変化し、相互作用は試験ポリペプチドの水酸化に依存する。第２の例では、試験ポリペプチドは、結合事象がチップに及ぼされる力の変化によって検出され得るように構築されるチップ上に固定化され得る。「生来」または「ソフトイオン化」質量分析は、ヒドロキシラーゼ活性のためのアッセイとして使用することができ；従って、アンキリンリピートタンパク質、またはそのフラグメントと、別のタンパク質との間の相互作用が質量分析によって観察される一方、水酸化時に、この相互作用を減少または廃止することができる。アンキリンリピートを含有するタンパク質によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることが公知である遺伝子の転写および発現をモニターすることができる。
【００９２】
代替的実施態様では、レポーター構築物が提供され得、ここで、アンキリンリピートを含有するタンパク質に関与するシグナル伝達経路によって仲介されるプロモーターが提供され、これは、レポーター遺伝子に操作可能に連結される。例えば、次いで、発色、蛍光、蛍光共鳴または分光測定アッセイにおいて使用され得る酵素のような任意の適切なレポーター遺伝子を使用し得る。
【００９３】
典型的に、２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼおよび基質は、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）または二原子酸素のような補助基質の存在下で接触される。２−ＯＧの代わりをする代替的補助基質もまた、使用することができる。２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ活性は、補助基質のターンオーバーを測定することによって、測定することができる。これは、水酸化された基質またはコハク酸のような反応生成物の存在および／または量を測定することによって、達成することができる。生成物の量は、基質の量と比較して、測定することができる。測定される生成物は、水酸化された基質であり得る。例えば、水酸化の程度は、反応において発生する水酸化された基質、コハク酸または二酸化炭素の量を測定するか、または２−ＯＧまたは二原子酸素の枯渇を測定することによって、測定することができる。これらのそれぞれをモニターするための方法は、化学的文献において公知である。
【００９４】
活性は、他のレポーター分子をモニターすることによって、測定することができる。例えば、２−ＯＧオキシゲナーゼ、例えば、２−ＯＧオキシゲナーゼの活性部位への基質の結合をモニターすることができる。
【００９５】
アスパラギンヒドロキシラーゼ活性は、ミリハルジュ  Ｊ.(Myllyharju J.)らＥＭＢＯ  Ｊ.１６（６）：１１７３−１１８０（１９９１年）もしくはカンリフ  Ｃ.Ｊ.(Cunliffe C.J.)らＢｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.２４０  ６１７−６１９（１９８６年）に記載のようにコハク酸およびＣＯ2に対する前記２−ＯＧのターンオーバーを測定することによって、またはＣＯ2、重炭酸もしくはコハク酸生成についての他の適切なアッセイによって、測定することができる。
【００９６】
非使用の２−ＯＧを、化学的試薬によって誘導体化し、ヒドラジン誘導体およびオルト−フェニレンジアミン誘導体（但しこれらに限定されない）によって例示し、定量し、試験ポリペプチドの水酸化の程度を示すために使用することができる間接的発色段または蛍光団を付与し得る。「クラーク型」電極または蛍光クエンチングを使用する電極（但しこれらに限定されない）によって例示される溶存酸素電極を使用して、アッセイ混合物における酸素の消費を追跡し得、次いで、これを使用して、上記に類似の様式で試験ポリペプチドの水酸化の程度を示すことができる。
【００９７】
あるいは、エンドポイント測定は、基質（合成および組換えペプチドを含む）の所望の生成物への変換に基づき得る。アッセイを迅速に行うことができ、ハイスループットスクリーニングに適切であり得るように、ペプチドを修飾して、アッセイを容易にすることができる。
【００９８】
例えば、本明細書において例示される逆相ＨＰＬＣ（例えば、Ｃ−４オクタデシルシランカラムを使用する）を使用して、出発合成ペプチド基質を、アスパラギンが水酸化された生成物から分離し得る。これは、後者がカラムにおいてより短い保持時間を有するからである。このアッセイの修飾またはヒドロキシラーゼ活性のための代替的アッセイは、例えば、当該分野において周知である質量分析、分光測定、および／または蛍光技術を用いることができる（マシミレムブワ  Ｃ.(Masimirembwa C.)ら、Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening（２００１年）４（３）２４５−２６３、オウィキ  Ｊ.(Owicki J.)（２０００年）J.Biomol.Screen.５（５）２９７−３０５、ゲルシュコヴィチ  Ａ.(Gershkovich A)ら、（１９９６年）J.Biochem.&Biophys.Meths.３３（３）１３５−１６２、クラーフト  Ｇ.(Kraaft G.)ら、（１９９４年）Meths.Enzymol.２４１  ７０−８６）。蛍光技術は、分光測定もしくは蛍光アッセイを行うまたは最適化するような方法において修飾される基質のバージョンを用いることができる。
【００９９】
例えば、基質を、例えば、ビーズまたはプレート上に固定化し、抗体、または残基が水酸化されない場合とは異なるアスパラギンが水酸化される場合の親和性を伴う基質に結合する他の結合分子を使用して、適切な残基の水酸化を検出することができる。そのような抗体は、当該分野において周知である標準的な技術によって得ることができる。
【０１００】
アンキリンリピート基質の水酸化および非水酸化形態の間を区別する分子の結合は、適切な標識の存在の測定を必要とし得る当業者に利用可能な技術を使用して評価することができる。
【０１０１】
本発明のアッセイ方法はまた、インビボアッセイの形態をとることができる。インビボアッセイは、関連のポリペプチドまたはペプチドが細胞に導入された１つもしくはそれ以上のベクターから発現される酵母株のような細胞系統において実施することができる。
【０１０２】
アッセイは、細胞に基づくアッセイ、器官に基づくアッセイまたはインビボで行われる動物全体のアッセイを使用して行うことができる。そのようなアッセイは、２−ＯＧオキシゲナーゼまたは基質の内因性発現を利用し得る。本発明の他の形態では、特定の内因性２−ＯＧオキシゲナーゼのアップレギュレーションは、その発現の刺激因子によって達成され得る。そのような刺激因子は、増殖因子であってもまたは特定の２−ＯＧオキシゲナーゼをアップレギュレートする化学物質であってもよい。本発明の別の形態では、ヌクレオチド構築物を、細胞またはトランスジェニック動物に導入し、１つもしくはそれ以上の特異的２−ＯＧオキシゲナーゼの産生を増加することができる。あるいは、ヌクレオチド構築物を、１つもしくはそれ以上の特定の２−ＯＧオキシゲナーゼの発現を減少または廃止するように細胞に導入することができる。相同組換え、アンチセンス発現、リボザイム発現およびＲＮＡ干渉（但しそれらに限定されない）を含む適切な方法については本明細書において概要されており、当業者に公知である。
【０１０３】
本発明の上記の形態によって得られる組織培養細胞、器官、動物および他の生物学的系は、２−ＯＧオキシゲナーゼのさらなる供給源を提供するために使用し得るか、または特定の２−ＯＧオキシゲナーゼの活性を阻害、増大、阻止またはそうでなければ調節し得る試験物質の活性のアッセイ、もしくは特に比較アッセイのために使用し得る。
【０１０４】
２−ＯＧオキシゲナーゼの活性は、上記の方法のいずれかあるいは細胞、組織、または２−ＯＧオキシゲナーゼの改変された活性の効果を、直接的もしくは間接的に測定するインビボで行われる他のアッセイによってアッセイすることができる。
【０１０５】
アンキリンリピート、またはそのフラグメントは、さらなるポリペプチドに融合し、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのための基質として使用することができる。２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ活性は、融合ペプチドの活性を調節することができる。従って、本発明のさらなる形態は、融合ポリペプチドの活性のアッセイを提供する。
【０１０６】
アンキリン基質の水酸化は、例えば、２−ＯＧオキシゲナーゼ、低酸素誘導性因子を阻害する因子（ＦＩＨ−１）を使用する実施例８に記載の新規のアッセイを使用して、測定することができる。ＦＩＨとＨＩＦトランス活性化ドメイン（残基７８６〜８２６）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘発性フラグメントとの反応については先に記載されており、ここで、放射性の二酸化炭素の検出を用いる該反応を含む代替的アッセイが用いられた。新規のアッセイ手順は、先に使用されたアッセイと同じ結果を与えるが、より安全かつより効率的な代替物である。
【０１０７】
ＦＩＨによって２−ＯＧの消費をアッセイする（従って、その触媒活性を測定する）ために、本発明者らは誘導プロセスを開発し、ここで、２−ＯＧは、オルト−フェニレンジアミンＯＰＤ、または他の適切な誘導試薬によって蛍光生成物を形成する一方、コハク酸、または他の生成物は形成しない。
【化１】
2007530522.tif 000003
【０１０８】
３−（２−カルボキシメチル）−２（１Ｈ）−キノキサリノンを付与するＯＰＤと２ＯＧのα−ケト酸モチーフの反応の蛍光生成物は上記で例示されており、例えば、Molecular Devices,Tecan,BMG Labtechnologies,JascoおよびPerkin Elmerにより製造されるような標準的な装置によって容易に検出することができ、蛍光生成物の生成がハイスループットスクリーニング（例えば、９６ウェルプレート技術を用いるもの）において使用することができることを実証する広範な前例が存在する。
【０１０９】
さらに、使用する誘導試薬の性質を修飾することによって、蛍光生成物の性質を同調させることができることを実証する広範な前例が存在する。例えば、１,２−ジメトキシ−４,５−ジアミノベンゼン、または１,２−メチレンジオキシ−４,５−ジアミノベンゼンのいずれかを使用することによって、方法の感度を増加し得る（ミューリング(Muehling)ラJournal of Chromatography  Ｂ２００３  ３８３−３９２、ナカムラ(Nakamura)らChem.Pharm.Bull.１９８７年６８７−６９２）。
【０１１０】
従って、２−ＯＧの消費についてのこの新規のアッセイを使用して、ＦＩＨおよびＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼのような２−ＯＧオキシゲナーゼ、ＡｌｋＢ、フィタノイルＣｏＡヒドロキシラーゼ、トリメチルリジンヒドロキシラーゼ、γ−ブチロベタインヒドロキシラーゼおよびコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼのようなヒト酵素、カルバペネムシンターゼのような植物病原体における酵素、ならびにデアセトキシセファロスポリンＣシンターゼおよびクラバミン酸シンターゼのような抗生物質産生生物体における酵素による触媒を測定することができる。新規アッセイは、放射性ＣＯ2の放出に基づく現存の手順よりも安全であり、複雑ではない。新規アッセイは、アッセイ容器からの気体の放出（放射性２−ＯＧ方法の別の欠点である）、または放射性同位元素の使用を必要としない。このアッセイ手順はまた、ハイスループット、例えば、９６、３８４、または１５３６ウェルプレート形式に適合する。それは、酵素を利用する他のタイプの２−オキソ酸についてのアッセイにおける使用に適する。
【０１１１】
選択性
単一の標的としてか、または選択されたヒドロキシラーゼ群ならびにファミリー全体において、アンキリンリピートタンパク質アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を選択的に調節することは有利であり得る。従って、アンキリンリピートタンパク質アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を調節する薬剤は、好ましくは、選択的または特異的であり、即ち、それらは、アンキリンリピートタンパク質におけるアスパラギン残基を水酸化する他のヒドロキシラーゼと比べて、アンキリンリピートタンパク質アスパラギンヒドロキシラーゼに対して増加または増強された効果を有する。
【０１１２】
いくつかの状況において、ＦＩＨおよび１つもしくはそれ以上の上記の酵素、特に、１つもしくはそれ以上のＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼイソ型を選択的に阻害することが有利であり得ることも認識されている。さらに、上記の酵素のいくつかを阻害する際に、ＦＩＨを阻害しないことが有利であり得、方法は、ＦＩＨのインヒビターではないＰＨＤインヒビターを発見するための方法において使用することができる。本発明は、改変された、即ち、増強または減少されたアンキリンタンパク質活性に関連する状態の処置のための医薬品の製造におけるそのような選択的インヒビターの使用を提供する。
【０１１３】
異なる酵素に対する活性を比較して、特に、２−ＯＧオキシゲナーゼまたはＦＩＨ、ＡｌｋＢ、プロコラーゲンプロリルおよびリジルヒドロキシラーゼ、Ｍｉｎａ５３、ホスファチジルセリン受容体、ＳＭＡＲＴデータベースに従ってＪｍｊＣタンパク質として特徴付けられている２−ＯＧオキシゲナーゼ、ならびに／あるいはＰＨＤ１、ＰＨＤ２およびＰＨＤ３を含むＰＨＤ酵素のいずれかを含むがこれらに限定されない２−ＯＧオキシゲナーゼの特定の形態に選択的であるインヒビターを検出してもよい。
【０１１４】
異なる基質に対する所定の２−ＯＧオキシゲナーゼの活性を比較して、インヒビターが、単一の基質、または基質の群に対する２−ＯＧオキシゲナーゼの活性に特異的であるかどうかを測定してもよい。例えば、インヒビターが、ＦＩＨによるＨＩＦの水酸化を選択的に阻害することができるが、アンキリンの水酸化を阻害しない、またはその逆かどうかを測定すること。単一の基質は、例えば、ＨＩＦイソ形であってもよい。
【０１１５】
試験化合物
本明細書に記載のアッセイ方法を使用してスクリーニングされ得る化合物は、薬物スクリーニングプログラムにおいて使用される天然または合成の化学化合物であり得る。いくらかの特徴付けられたまたは特徴付けられていない成分を含有する植物、微生物または他の生物体の抽出物もまた、使用することができる。
【０１１６】
コンビナトリアルライブラリー技術（固相合成およびパラレル合成方法論を含む）相互作用を調節する能力について潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法を提供する。とりわけ、天然の生成物、小さな分子およびペプチドのすべての様式についてのそのようなライブラリーおよびそれらの使用は当該分野において公知である。ペプチドライブラリーの使用は、所定の状況において好適であり得る。
【０１１７】
潜在的インヒビター化合物は、ポリペプチド、市販のコンビナトリアルライブラリーなど由来の小さな分子であり得る。使用することができる小さな分子化合物としては、２−ＯＧアナログ、もしくはアンキリンリピートアナログ、または酵素の作用を阻害する２−ＯＧおよびアンキリンリピートの両方の特徴を組み入れるアナログが挙げられる。
【０１１８】
潜在的促進薬剤は、広範な供給源、特に市販されている小さな化合物のライブラリーからスクリーニングすることができる。酸素含有化合物は、スクリーニングしようとする化合物（例えば、２−ＯＧアナログ）に含まれ得る。
【０１１９】
基質のアスパラギン水酸化を増加、強化、刺激、分裂、減少、干渉または全体的もしくは部分的に破壊し、従って、活性を調節し得る試験化合物は、本明細書に記載のアッセイ方法を使用して同定および／または入手することができる。
【０１２０】
アスパラギン水酸化を増加または強化する薬剤は、試験陽性薬剤の非存在下で水酸化を制限または防止する条件下で同定および／または入手され得る。そのような薬剤を使用して、２−ＯＧオキシゲナーゼのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を強化、増加、増強または刺激することができる。
【０１２１】
多様な局面において、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって、アンキリンリピートを含有するタンパク質アスパラギン水酸化のモジュレーター、例えば、アンキリンリピートを含有するタンパク質に対する２−ＯＧオキシゲナーゼのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を阻害もしくは減少、増加もしくは強化する物質であると同定される薬剤または化合物を提供する。
【０１２２】
モジュレーターの同定後、基質を精製および／または調査し、さらに（例えば、修飾し）および／または製造することができる。モジュレーターを使用して、例えば、当業者に周知および本明細書に記載の方法によって、ペプチドまたは非ペプチド類似体を入手することができる。モジュレーターを修飾して、例えば、本明細書に記載のように選択的に増加することができる。以下に記載のように、それは治療状況において使用することができる。
【０１２３】
２−ＯＧオキシゲナーゼを調節する化合物は、本発明の化合物として有用であり得るか、または本発明のアッセイにおいて試験物質として使用され得る。２−ＯＧオキシゲナーゼを調節する化合物、およびそのような化合物のファミリーは、当該分野、例えば、アオヤギ(Aoyagi)ら（２００２年）Hepatology Research２３（１）：１−６、アオヤギ(Aoyagi)ら（２００３年）Free Radical Biology and Medicine３５：４１０補遺１、フィリップ(Philipp)ら、（２００２年）Circulation１０６（１９）：１３４４補遺Ｓ、イバン(Ivan)ら、（２００２年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９９（２１）：１３４５９−１３４６４、ンヲグ(Nwogu)ら、（２００１年）Circulation１０４（１８）：２２１６−２２２１、マイイリハルジュ(Myllyharju)およびキビリッコ(Kivirikko)（２００１年）Ann Med３３（１）：７−２１、オオタ(Ohta)ら、（１９８４年）Chemical and Pharm Bulletin３２（１１）：４３５０−４３５９、フランクリン(Franklin)ら、（２００１年）Biochem J.３５３：３３３−３３８、フランクリン(Franklin)（１９９７年）Int J.Biochem Cell Biol２９（１）：７９−８９、ダウエル(Dowell)ら、（１９９３年）Eur J Med Chem２８（６）：５１３−５１６、バーダー(Baader)ら、（１９９４年）Biochem J.３００：５２５−５３０、バーダー(Baader)ら、（１９９４年）Eur J Clin Chem and Clin Biol３２（７）：５１５−５２０、ビッケル(Bickel)ら（１９９８）Hepatology２８（２）：４０４−４１１、ビッケル(Bickel)ら、（１９９１年）J.Hepatology１３：Ｓ２６−Ｓ３４補遺３、米国特許第６,２００,９７４号明細書、同第５,９１６,８９８号明細書、米国特許出願２００３−０１７６３１７、同第２００３−０１５３５０３号明細書および同第２００４−００５３９７７号明細書、国際公開第０２／０７４９８１号パンフレット、国際公開第０３／０８０５６６号パンフレット、国際公開第０４／０３５８１２号パンフレット、カンリフ(Cunliffe)ら、（１９９２）J.Med.Chem.３５：２６５２−２６５８、ヒガシデ(Higashide)ら、（１９９５年）J.Antibiotics３８：２８５−２９５、カンリフ(Cunliffe)ら、（１９８６年）Biochem.J.２３９（２）：３１１−３１５、フランクリン(Franklin)ら、（１９８９年）Biochem.J.２６１（１）：１２７−１３０、フリードマン(Friedman)ら、（２０００年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９７（９）：４７３６−４７４１、ウー(Wu)ら、（１９９９年）J.Am.Chem.Soc.１２１（３）：５８７−５８８、DE-A-３８１８８５０、ワング(Wang)ら、（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＵＳ：１５６７６−１５６８３ならびにラーナー(Lerner)ら、（２００１年）Angew Chem.Int.Edit.４０：４０４０−４０４１において公知である。
【０１２４】
これらの化合物のいくつか、特に国際公開第０２／０７４９８１号パンフレットおよび国際公開第０３／０８０５６６号パンフレットに記載の化合物は、一般に、以下の式を所有する：
Ｒ1Ａ*Ｂ*Ｃ*Ｄ*（Ｒ2）y    （Ａ）
式中、基Ｒ1は、触媒中に、他の残基と共に２−オキソグルタル酸の５−カルボン酸に結合するアルギニン残基の側鎖と静電的相互作用を形成することが可能であり、Ａ*Ｂは、独立して、炭素、酸素、窒素またはイオウである２原子の鎖であって、該鎖は官能基化することができ、ｙは０もしくは１であり、Ｃ*Ｄは、独立して、炭素、酸素、窒素、またはイオウである２原子の鎖であり、該鎖は官能基化することができ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ｙが０もしくは１である場合、それらのうち少なくとも１つの原子が金属基にキレート結合することが可能であり、ｙが１である場合、前記鎖は金属基にキレート結合することが可能であるＲ2に付着するように、単結合および／または二重結合および／または三重結合によって相互に連結される。一般に、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのうち少なくとも１つは炭素ではない。典型的な鎖として、Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＣおよびＣ−Ｏ−Ｃ−ＣならびにＣ−Ｃ−Ｃ＝Ｏが挙げられる。鎖の原子は、環の部分を形成することができる。
【０１２５】
他の適切な薬剤は、以下の式（Ａ）〜（Ｆ）を所有する
【化２】
2007530522.tif 000004
式中、Ｒ1およびＲ5のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、官能基化することができる１個もしくはそれ以上、例えば、２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ鎖原子、特にメチルを場合により含有する分岐あるいは直鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル鎖、アラニン、フェニルアラニン、バリンおよびグルタミン酸のような任意のアミノ酸側鎖、１もしくは２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ原子を場合により含有する４〜７員複素環あるいは別のまたはアリールオキシアルキルのような前記芳香環によって置換される前記アルキル鎖に融合し得る１もしくは２個のＮ、ＯまたはＳ原子を場合により含有する５もしくは６員芳香環であり、Ａ1は、ＣＨ2またはＯであり、Ｒ2およびＲ3のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、場合により、１、２、３、４もしくは５個のハロ置換基を伴う官能化することができる１個のもしくはそれ以上、例えば、２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ鎖原子を場合により含有する分岐あるいは直鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル鎖、１もしくは２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ原子を場合により含有する４〜７員環複素環、あるいは別の環または前記芳香環によって置換される前記アルキル鎖に融合し得る１もしくは２個のＮ、ＯまたはＳ原子を場合により含有する５もしくは６員芳香環である、
【化３】
2007530522.tif 000005
式中、Ｒ２は上記で規定される通りであり、
【化４】
2007530522.tif 000006
は単結合であり、ＴはＣＨ2もしくはＣ＝Ｏであり、または
【化５】
2007530522.tif 000007
は二重結合であり、ＴはＣＨであり；Ａ2はＨもしくは−ＸＣＯ2Ｒ4であり；Ｘは単結合あるいは１個もしくはそれ以上、例えば、２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ鎖原子を場合により含有し、場合により、例えば、ハロ、ＯＨ、ＮＨＲ2もしくはＮＨＣＯＲ4によって置換される分岐または直鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル鎖であり、ここで、Ｒ2およびＲ4は上記で規定される通りであり、Ｒ4はＨ、１個もしくはそれ以上、例えば、２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ鎖原子を場合により含有する分岐あるいは直鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、１もしくは２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ原子を場合により含有する４〜７員複素環、あるいは別の環またはその塩に融合し得る１もしくは２個のＮ、ＯまたはＳ原子を場合により含有する５もしくは６員芳香環を表す、
【化６】
2007530522.tif 000008
式中、同じかもしくは異なり得る各ＸはＮＨ、ＮＲ”であり、ここで、Ｒ”は、ＯＨ、官能基化することができる１個もしくはそれ以上、例えば、２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ鎖原子を場合により含有する分岐または直鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル鎖、あるいはＯであり、即ち、ＸＲ1は典型的に、ＯＨであるかあるいは分岐または直鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル鎖を有するＯ−アルキル、具体的にはＭｅＯであり、同じかもしくは異なり得る各Ｙは、ＯまたはＳであり、同じかもしくは異なり得る各Ｒ1は上記で規定されるとおりである、
Ｑ−(ＣＨ2)ｍ−ＣＯＯＨ    （Ｄ）
式中、ｍは０または１であり、Ｑは（Ｒ1Ｒ6）xＺを表し、ここで、ｘは０、１または２であり、Ｒ1は上記で規定されるとおりであり、Ｒ6はＲ1について規定されるとおりであり、ＺはＰ＝Ｏ(ＯＨ)2、Ｂ(ＯＨ)2もしくはＳＯ3Ｈ、またはその塩、典型的に、ナトリウム塩である、あるいは、
【化７】
2007530522.tif 000009
式中、同じかもしくは異なる各Ｒ1は上記で規定されるとおりであり；Ｒ11はＯＨまたはＲ10ＮＨを表し、ここで、Ｒ10はＨＯ、Ｒ1ＣＯまたはＨＯＯＣ(Ｘ)xであり、ここで、Ｒ1は上記で規定されるとおりであり、ｘは０または１であり、ＸはＲ1Ｒ1Ｃであり、ここで、同じであるかもしくは異なる各Ｒ1は上記で規定されるとおりであり；あるいはＲ10はアミノ酸残基Ｈ2Ｎ(Ｒ1Ｒ1Ｃ)ＣＯ−であり、ここで、同じであるかもしくは異なる各Ｒ1は上記で規定されるとおりであり；ｎは１または２であり、Ｒ12はＨまたは直鎖もしくは分岐Ｃ1〜Ｃ6アルキルであり；あるいはその塩である。典型的に、ＸはＣＨ2またはＣＨＯＨである。本発明の別の局面は、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの（２−ＯＧと比較して）改善された補助基質として作用する２−ＯＧのアナログに関する。そのような化合物は３−フルオロ２−ＯＧである。この化合物を２−ＯＧの代わりにするアッセイでは、類似の条件下で２−ＯＧを使用する場合に観察される場合よりも高いレベルのアスパラギン水酸化が実証される。
【０１２６】
これらのアナログは以下の式を所有する：
【化８】
2007530522.tif 000010
式中、Ｚ1およびＺ2のそれぞれは、独立して、水素、ＳＨまたはハロゲン、好ましくは、フッ素のような電子吸引基、もしくはメトキシのようなアルコキシであり、Ｒ12は上記で規定される通りであるか、またはその塩である。好ましくは、Ｚ1およびＺ2のうちの一方は水素であり、他方はフッ素（３−Ｆ−２−ＯＧ）である。
【０１２７】
前記アルキル基および鎖は、典型的に、アルコール、フッ素、チオール、カルボン酸、ホスホン酸またはホスフィン酸、スルホン酸または他のキレート基によって、鎖の場合、典型的に、アルキル基を介して、官能基化される。
【０１２８】
本明細書に記載の式において、分岐または直鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、tert−ペンチルまたは第一級、第二級もしくは第三級ヘキシル基であってもよい。Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰのようなヘテロ原子は、１つもしくはそれ以上の炭素原子の代わりになり得る。好ましくは、アルキル基はメチルであり、好適な複素環はピロリジン(pyrolidine)およびテトラヒドロピランであり、好適な芳香環はベンゼン、ナフタレンおよびピリジンである。
【０１２９】
典型的に、Ｒ1およびＲ5のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、官能基化することができる１個もしくはそれ以上のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ鎖原子を場合により含有する分岐または直鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル鎖、任意のアミノ酸側鎖、１もしくは２個のＮ、Ｓ、ＯまたはＰ原子を場合により含有する４〜７員複素環、あるいは別の環または前記芳香環によって置換される前記アルキル鎖に融合し得る１もしくは２個のＮ、ＯまたはＳ原子を場合により含有する５〜６員芳香環である。
【０１３０】
典型的に、Ａ1はＣＨ2である。
【０１３１】
典型的に、Ａ2はＸＣＯ2Ｒ4である。
【０１３２】
典型的に、Ｒ11はＲ10ＮＨを表し、式中、Ｒ10はＲ1ＣＯまたはＨＯＯＣ(Ｘ)xであり、ここで、Ｒ1は上記で規定されるとおりであり、ｘは０または１であり、ＸはＲ1Ｒ1Ｃであり、ここで、同じであるかもしくは異なる各Ｒ1は上記で規定されるとおりであり；Ｒ10はアミノ酸残基Ｈ2Ｎ(Ｒ1Ｒ1Ｃ)ＣＯ−であり、ここで、同じであるかもしくは異なる各Ｒ1は上記で規定されるとおりである。
【０１３３】
典型的に、Ｚ1およびＺ2のそれぞれは、独立して、水素または電子吸引基である。
【０１３４】
典型的に、式（Ｆ）の化合物において、Ｒ12はＨである。あるいは、Ｒ12は直鎖または分岐のＣ1〜Ｃ6アルキルであり得る。
【０１３５】
式（Ａ）の化合物はヒドロキサム酸である。好適な化合物として、Ｒ5がアリールオキシアルキル、具体的には、フェニルオキシメチルもしくはフェニルアルキルオキシメチルのようなオキシルオキシメチル、具体的には、ベンジルオキシメチルもしくはｐ−ヒドロキシベンジルオキシメチルのような置換ベンジルオキシメチルであり、ならびに／あるいはＲ2および／またはＲ3がＨＯＣＨ2である化合物が挙げられる。
【０１３６】
典型的な化合物は、Ｎ−フェノキシ−アセチル−（Ｌ）−アラニン−ヒドロキサミド（Ｉｓ４１）および対応する（Ｄ）異性体（Ｉｓ４３）ならびに対応するチロシン誘導体（Ｉｓ４４および４５）ならびにＬ−およびＤ−フェニルグリシン誘導体（Ｉｓ４６および４７）を含み、ベンゾヒドロキサム酸およびＮ−フェノキシアセチル−Ｄ−フェニルアラニンヒドロキサム酸（Ｉｓ４２）を伴う。
【０１３７】
これらの化合物は、一般に、ワルター(Walter)ら、Tetrahedron、１９９７年、５３,７２７５−７２９０およびBiorg.Chem１９９９年、２７,３５−４０の方法に従って、調製することができる。
【０１３８】
式（Ｂ）の化合物は環式ヒドロキサム酸である。好適な化合物は、Ｘが単結合もしくはメチルであり、および／またはＲ2がＨもしくはフェニルアルキル、具体的にはベンジルであり、および／またはＲ4がＨもしくはメチルである化合物である。典型的な化合物として、（１−ヒドロキシ−２,５−ジオキソ−ピロリジン−３−イル）酢酸（Ｉｓ５２）、（１−ヒドロキシ−２,５−ジオキソ−ピロリジン−３−イル）カルボン酸（ＡＮＵ２）およびそのＮ−ベンゾイルオキシ誘導体（ＡＮＵ１）が挙げられ、（１−ベンジルオキシ−２,５−ジオキソ−ピロリジン−３−イル）酢酸（Ｉｓ５０）ならびに対応するメチルエステル（Ｉｓ６４）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｃ１）を伴う。Ｉｓ５２（Ｒ2＝Ｈ、Ｔ＝Ｃ＝Ｏ、Ｘ＝ＣＨ2Ｒ4＝Ｈ）は高度に活性であり、２−オキソグルタル酸とのその構造的類似を反映していることに留意すること。これらの化合物は、シュリヒト(Schlicht)ら（米国特許第４４４６０３８号明細書）の一般的手順を使用して、調製することができる。
【０１３９】
式（Ｃ）の化合物は、ヒドロキシ酢酸およびメルカプト酢酸の２−オキソグルタル酸またはオキサリル誘導体のアナログである。好適な化合として、ＸがＯであり、および／またはＲ1がＨもしくはメチルである化合物が挙げられる。典型的な化合物として、オキサリルグリコール酸ジメチル（Ｉｓ１０）ならびにその遊離酸（Ｉｓ１４）およびオキサリルチオグリコール酸ジメチル（Ｉｓ１１）が挙げられる。これらの化合物は、フランクリン(Franklin)ら、J.Med.Chem１９９２年、３５,２６５２−２６５８またはクオン(Kwon)ら、J.Am.Chem.Soc.１９８９年、１１１,８５４−１８６０に従って、調製することができる。
【０１４０】
式（Ｄ）の化合物は、ホスホン酸、スルホン酸、またはボロン酸基を所有するカルボン酸ならびにこれらの塩である。典型的に、Ｒ’およびＲ6は水素である。好適な化合物として、リン酸（ここで、ｘが０、１もしくは２（それぞれＣ３、４および５）である）、ならびに３−スルホ−プロピオン酸二ナトリウム（Ｉｓ６３）およびその遊離酸、ならびに３−ボロノ−プロピオン酸（Ｉｓ６２）が挙げられる。
【０１４１】
式（Ｅ）の化合物は、Ｎ−アセチル化アミノ酸またはポリカルボン酸である。典型的な化合物は、Ｒ1がＨであり、および／またはＲ12がＨもしくはエチルである化合物である。Ｒ11がＲ10ＮＨを表す場合、化合物は、典型的に、Ｒ10がグリシンのような天然アミノ酸のアシル基であるようなジペプチドである。典型的に好適なそのような化合物として、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（Ｃ１８）、シクロ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ）（Ｃ１９）、β−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（Ｃ２０）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（Ｃ２１）およびＺ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（Ｃ２２）が挙げられる。他の典型的な化合物として、Ｒ10が、Ｌ−アスパラギン酸（Ｃ６）およびＬ−グルタミン酸（Ｃ７）のＮ−アセチル化誘導体であるようなアセチルまたはベンゾイルであり、即ち、Ｒ10がグルタミン酸（Ｃ１５およびＩｓ９０）のアセチルおよびＮ−ベンゾイル化誘導体であり、即ち、Ｒ10がベンゾイルである化合物が挙げられる。他の典型的な化合物として、Ｒ11がジエチル２−（ヒドロキシルアミノ）−グルタル酸のような−ＮＨＯＨであり（Ｉｓ５１はこの化合物のラセミ形態である）化合物およびＲ11が２−ヒドロキシグルタル（Ｉｓ５７）のようなＯＨである化合物が挙げられる。Ｒ11がＨＯＯＣ(Ｘ)xである場合、Ｘは具体的には、ＣＨ2またはＣＨＯＨである。化合物は、典型的に、クエン酸（Ｃ１２）、トリカルボン酸（Ｃ１３）およびコハク酸ならびにエタントリカルボン酸のトリメチルエステル（Ｉｓ７２）である。
【０１４２】
式（Ｆ）の化合物は２−オキソグルタル酸のアナログである。好適な化合物として、３−フルオロ−２−オキソグルタル酸（Ｉｓ１８）のような３−フルオロ−２−オキソグルタル酸化合物（即ち、Ｚ1はＨであり、Ｚ2はＦである）および対応するジメチルエステル（Ｉｓ１９）が挙げられる。
【０１４３】
酸である化合物は、ナトリウム塩のような塩の形態で存在することができる。
【０１４４】
治療処置のために、化合物は、例えば、抗腫瘍療法、別の抗腫瘍化合物または放射線療法もしくは化学療法のような治療のための他の任意の活性な物質と組み合わせて使用することができる。
【０１４５】
２−ＯＧオキシゲナーゼインヒビターとして使用することできるさらなる化合物は、本発明者らの同時係属の英国特許出願第０４１９１２８.４号明細書（本明細書において参考として援用される）において開示されている。
【０１４６】
アンキリンリピートタンパク質ならびにそのようなタンパク質のフラグメントおよびアナログを含むそのアナログもまた、２−ＯＧオキシゲナーゼ活性のインヒビターとして使用することができる。本明細書において規定される物質のいずれも、インヒビター、特に、ＨＩＦのような非アンキリンリピートを含有する物質に対する２−ＯＧオキシゲナーゼ活性のインヒビターとして使用することができる。アナログは、典型的に、本明細書に記載のアンキリンリピートを含有するタンパク質（但し、２−ＯＧオキシゲナーゼによって水酸化されるアスパラギン残基を欠く）のいずれかであり得る。アスパラギン残基は、典型的に、別のアミノ酸によって置換される。置換基は、好ましくは、上記の表に示されるように保存的である。
【０１４７】
治療アプリケーション
アンキリンリピート、またはそのフラグメントを含んでなる基質に対する２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ活性に影響を及ぼす能力を有することが見いだされる物質または組成物のような薬剤は、多くの状況における治療的および他の潜在的使用を有する。特に、２−ＯＧオキシゲナーゼの特定の基質における選択的インヒビターである薬剤は、治療方法において特に有用である。治療処置のために、そのような化合物は、例えば、別の抗腫瘍化合物または放射線療法もしくは化学療法のような治療による抗腫瘍療法のための他の任意の活性な物質と組み合わせて使用することができる。
【０１４８】
アンキリンリピートまたはそのフラグメントを含んでなる基質に対する２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのアスパラギン水酸化活性を調節する能力を有する１つもしくはそれ以上の一次スクリーニング（例えば、無細胞系における）を使用して同定される薬剤は、１つもしくはそれ以上の二次スクリーニングを使用して、さらに評価することができる。二次スクリーニングは、アンキリンリピートタンパク質活性の量の増加または減少を試験することがあり得、例えば、標的遺伝子のレベルまたは薬剤の非存在下と比較して薬剤の存在下で存在するプロセスによって明白である。
【０１４９】
一般に、本発明に従う薬剤、化合物または物質は、単離および／または精製された形態、即ち、実質的に純粋で提供される。これは、少なくとも約９０％の有効成分、より好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９８％を表す組成物であることを含み得る。しかし、そのような任意の組成物は、正確な送達、放出および／または活性な薬剤の安定化に必要であるような不活なキャリア材料または他の薬学的および生理学的に許容可能な賦形剤を含み得る。以下に記載のように、本発明に従う組成物は、開示されるようなモジュレーター化合物、抗腫瘍剤のような治療用途の１つもしくはそれ以上の他の分子への添加を含み得る。
【０１５０】
本発明のアッセイによって得られる生成物
本発明は、本発明のアッセイ方法によって得られる化合物、および薬学的組成物のような前記化合物を含んでなる組成物をさらに提供し、ここで、化合物は薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤との混合物である。キャリアは、液体、例えば、食塩水、エタノール、グリセロールおよびその混合物、または例えば、錠剤の形態、もしくはデポ剤処方として処方されるゲルのような半固形形態、もしくは経皮パッチのような経皮的に投与可能なビヒクルにおける固体であり得る。
【０１５１】
水酸化は、アンキリンリピートタンパク質の生物学的効果を修飾し、それ故、例えば、ＦＩＨを阻害することによって水酸化の程度を調節し、医薬アプリケーションを有する。従って、本発明は、アンキリンリピートを含有するタンパク質のアスパラギン標的残基の水酸化を干渉する薬剤を患者に投与することを含む処置の方法をさらに提供する。そのような薬剤は、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性のインヒビターを含み得る。
【０１５２】
治療／予防目的は、アンキリンリピートを含有するタンパク質レベルもしくは活性の減少または次善の増加に関連する状態、または正常なアンキリンリピートを含有するタンパク質レベルを有する状態の処置に関連し得るが、但し、ここで、アンキリンリピートを含有するタンパク質活性の増加もしくは減少のようなアンキリンリピートを含有するタンパク質活性の調節が所望される。
【０１５３】
当該分野において２−ＯＧオキシゲナーゼ活性を阻害することが公知である化合物を使用して、アンキリンリピートタンパク質に関連する疾患を処置することができる。
【０１５４】
処置し得る状態として以下が挙げられる：
（ｉ）虚血状態、例えば、冠動脈、脳血管および末梢血管不全を含む器官虚血。治療は、２つの方法で適用され得る；明らかにされた組織損傷、例えば、心筋梗塞を追跡すること（組織損傷を制限するために）、または予防的に虚血を防止すること、例えば、アンギナの処置における冠動脈側副路の促進；
（ｉｉ）癌；ＨＩＦαは、腫瘍細胞において通常アップレギュレートされ、腫瘍増殖および血管新生に対して主要な効果を有する。この治療アプリケーションは、好ましくは、アンキリンリピートタンパク質と比較して、１つもしくはそれ以上のＨＩＦイソ形態に選択的な治療用薬剤を必要とする；
（ｉｉｉ）炎症性障害；
（ｉｖ）糖尿病のような免疫障害；
（ｖ）貧血およびβサラセミア。
【０１５５】
ヒト、器官、または細胞の群におけるアンキリンリピートを含有するタンパク質アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を調節することは、治療利益を得るために異なる方法で開発され得る。
【０１５６】
本発明の薬剤は、細胞の生存もしくは増殖を促進し、および／または（ｐ５３とＡＳＰＰ１もしくはＡＳＰＰ２との相互作用を減少すること、またはｐ５３とｉＡＳＰＰとの相互作用を増加すること、または腫瘍抑制タンパク質ｐ１６もしくはｐ１８とサイクリン依存性キナーゼとの相互作用を減少することによって、達成され得るような）アポトーシスを阻害し得る。そのような薬剤は、虚血、低酸素またはそうでなければ損傷を受けた組織の処置において有用である。
【０１５７】
本発明の薬剤は、（ｐ５３とＡＳＰＰ１もしくはＡＳＰＰ２との相互作用を促進すること、またはｐ５３とｉＡＳＰＰとの相互作用を減少すること、または腫瘍抑制タンパク質ｐ１６もしくはｐ１８とサイクリン依存性キナーゼとの相互作用を促進することによって、達成され得るような）腫瘍細胞の生存を阻害し得る。そのような薬剤は癌組織に対して活性である。
【０１５８】
本発明の薬剤は、（ｐ１０５およびＩκＢ−αのようなＮＦκＢタンパク質とｐ５０／ｐ６５転写複合体との間の相互作用を減少または増加することによって達成され得るような）炎症ならびに免疫の調節をし得る。
【０１５９】
２−ＯＧオキシゲナーゼの活性を阻害する本発明の薬剤は、貧血（例えば、鎌状赤血球貧血）およびβサラセミアの処置に有用であり得る。そのような薬剤は、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）の導入を介して作用し得る。ＨｂＦは、２−ＯＧオキシゲナーゼによる水酸化によって不活性化される因子によって導入されると考えられる。２−ＯＧオキシゲナーゼを阻害することによって、因子の該失活が減少し、従って、さらにＨｂＦが産生される。
【０１６０】
水酸化されてタンパク質に通常見いだされない残基を付与するアンキリンを含有するタンパク質は、２−ＯＧオキシゲナーゼによって触媒されるプロセスのような翻訳後プロセスまたは、または他のプロセスのいずれかによって調製することができる。そのような修飾されたアンキリンを含有するタンパク質は、虚血、癌、炎症性障害および免疫障害の処置において使用することができる。水酸化は、好ましくは、アスパラギン残基においてである。
【０１６１】
同様に、水酸化されたアンキリンを含有するタンパク質の構造アナログは、虚血、癌、炎症性障害および免疫障害の処置において使用することができる。
【０１６２】
薬剤の治療有効量は、典型的に、それを必要とする被験体に投与される。治療有効量は、状態の徴候を改善するかまたは状態によって被験体に引き起こされる苦痛を軽減する量である。
【０１６３】
薬学的組成物
多様なさらなる局面では、本発明は従って、薬学的組成物、医薬品、薬物またはそのような目的のための他の組成物（該組成物は、アンキリンリピートを含有するタンパク質に対するアスパラギンヒドロキシラーゼ活性のインヒビターを含む本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の薬剤、化合物もしくは物質を含んでなる）；医学的処置の方法におけるそのような組成物の使用；例えば、上記のような医学的状態の処置（防止的処置を含み得る）のためのそのような組成物の患者への投与を含んでなる方法；そのような任意の目的、例えば、本明細書に記載の条件の処置のための投与のための組成物、医薬品または薬物の製造におけるそのような薬剤化合物または物質の使用；ならびにそのような薬剤、化合物またはそのような物質と、薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクルもしくはキャリア、および場合により他の成分とを混合することを含んでなる薬学的組成物を作製する方法を提供する。
【０１６４】
一実施態様では、薬学的組成物を提供するための方法は、典型的に以下
（ａ）本発明のアッセイ方法によって薬物を同定すること、および
（ｂ）このようにして同定される薬剤を薬学的に許容可能な賦形剤と共に処方すること、を含んでなり得る。
【０１６５】
本発明の薬学的組成物は、本発明に従う薬剤、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなり得る。
【０１６６】
薬剤は、単一の活性な薬剤としてかまたは別の薬剤との組み合わせかもしくは他の任意の活性な物質と共に、例えば、抗腫瘍療法、別の抗腫瘍化合物または放射線療法もしくは化学療法のような治療のために使用することができる。
【０１６７】
本発明の医学的処置の方法において使用される薬剤が何であっても、投与は、好ましくは、「予防有効量」または「治療有効量」にあり（但し、場合に応じて、予防は治療とみなされ得る）、これは個体に利益をもたらすのに十分である。投与される実際の量、ならびに速度および投与の時間経過は、処置するものの性質および重症度に依存する。処置の処方、例えば、用量などの測定は、一般医および他の医師の責任に範囲内にある。
【０１６８】
薬剤または組成物は、例えば、上記のように、処置しようとする状態に依存して同時もしくは連続のいずれかで、単独または他の処置の組み合わせで投与することができる。
【０１６９】
本発明に従う、および本発明に従う使用のための薬学的組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤または当業者に周知の多の材料を含み得る。特にそれらは薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。そのような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の効力を干渉すべきではない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、経口、または注入、例えば、皮膚、皮下または静脈内により得る投与経路に依存する。
【０１７０】
経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、散剤または液体の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体のキャリアを含み得る。液体の薬学的組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油のような液体のキャリアを含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれ得る。
【０１７１】
静脈内、皮膚または皮下注入または罹患部位での注入のために、有効成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸リンゲル液のような等張性ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することは十分に可能である。保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加物は必要に応じて含まれ得る。
【０１７２】
リポソーム、特にカチオン性リポソームは、キャリア処方において使用され得る。上記の技術およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、オソル  Ａ.(Osol,A.)（編）、１９８０年に見出すことができる。
【０１７３】
物質または組成物は、局在化された様式で特定の部位に投与され得るか、または例えば、動脈内ステントに基づく送達を使用して、それが特定の細胞もしくは組織を標的化する様式で送達され得る
【０１７４】
標的化治療を使用して、抗体または細胞特異的リガンドのような標的化システムの使用によって、活性な物質を所定のタイプの細胞により特異的に送達することができる。標的化は、様々な理由により、例えば、薬剤が許容されない毒性である場合、またはそれ以外では薬剤が極めて過渡な用量を必要とする場合、またはそれ以外では薬剤が標的細胞に進入することができない場合に、所望され得る。
【０１７５】
さらなる実施態様では、本発明は、アンキリンリピートタンパク質レベルまたは活性の増加もしくは減少に関連する状態の処置のための医薬品の製造における本発明の薬剤の使用を提供する。状態は、例えば、虚血、癌、および炎症および免疫障害よりなる群から選択され得る。
【０１７６】
以下の実施例により本発明を例示する。
【実施例】
【０１７７】
実施例１：実験の詳細
酵母ツーハイブリッドライブラリースクリーニング
ＨＵＶＥＣ  ｃＤＮＡライブラリー（ｐＰＣ８６において構築された）を、Ｙ１９０酵母株および標準的なプロトコルを使用して、ｐＤＢＬｅｕ(Invitrogen)にクローニングされたＦＩＨベイトとの同時形質転換によりスクリーニングした。ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーもまた、ＦＩＨベイトでスクリーニングした。これは、ｐＡＳ１−ＣＹＨ２にクローニングされたＦＩＨを含有する株ＡＨ１０９および株Ｙ１８７(BD Biosciences)に予め形質転換された市販のヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（ｐＡＣＴ２において構築された）を利用する酵母接合によって実施した。
【０１７８】
免疫沈降およびイムノブロッティング
ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞抽出物は、Igepal溶解緩衝液（「Complete」プロテアーゼ阻害剤、Roche Molecular Biochemicalsを含有する１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７.６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2０.５％  Igepal ＣＡ６３０）において調製した。ｐ１０５／ＦＩＨ相互作用を分析するために、ｐ１０５のＣ末端領域に対する抗体を使用して、ｐ１０５免疫沈降を実施した（サルメロン(Salmeron)ら、J.Biol.Chem.（２００１年）２７６  ２２２１５−２２２２２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、免疫沈降されたタンパク質を、Immobilon−Ｐ膜(Millipore)上に移し、モノクローナル抗ＦＩＨ抗体（宿主ライブラリーにおいて調製した）によるイムノブロッティングのために処理した。ＩｋＢα／ＦＩＨ相互作用を分析するために、ＦＩＨ免疫沈降を、ポリクローナルＦＩＨ抗血清（宿主ライブラリーにおいて調製した）を使用して実施し、抗ＩｋＢα抗体（クローン１０ｂ、Ｒ.ヘイ(R.Hay)博士、St.Andrew's University）でイムノブロットした。
【０１７９】
クローニング、細菌発現ならびにｐ１０５およびＩκＢ−αの精製
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の下流のｐ１０５のアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）（アミノ酸残基５３７〜８０９）に対応するプラスミド（ベル(Bell)らMol.Cell.Biol.（１９９６）１６  ６４７７−６４８５）を大腸菌(E.coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質添加し、３７℃で、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを補充した２ＴＹ培地において増殖させた。一旦、ＯＤ600が０.８に到達したら、温度を２８℃に低下させ、ＩＰＴＧを０.５ｍＭまで添加した。４時間後、遠心分離によって細胞を回収した。グルタチオンSepharoseＴＭ４Ｂ樹脂(Amersham Biosciences)を伴う標準的なプロトコルを使用して、ＧＳＴタグ化タンパク質を精製した。トロンビンを使用して、タグを必要な場所で切断した。グルタチオンSepharoseＴＭ４Ｂ樹脂を使用する第２の精製工程により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって＞９０％純度のタンパク質を得た。Quickchangeシステム(Stratagene)ならびに次のプライマー（前方：ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣおよび後方：ＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣ）を使用して、ＧＳＴ  ｐ１０５  Ｌ６６８Ｋ変種を作製した。
【０１８０】
ｉκＢ−α／ｐＧＥＸ−２Ｔ構築物（ジャフリ(Jaffray)らMol.Cell.Biol.（１９９５年）１５  ２１６６−２１７２）を大腸菌(Escherichia coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞(Stratagene)に形質転換し、本質的にｐ１０５フラグメントについて上記に記載のとおりに、組換えタンパク質を発現および精製した。
【０１８１】
ＦＩＨアッセイ
表１に示すペプチドを、精製したＦＩＨと共に、潜在的基質として試験した。アスパラギンの水酸化の提唱された部位を表中で強調する。
【０１８２】
【表２】
2007530522.tif 000011
【０１８３】
さらに、ｐ１０５  ＡＲＤおよびＩκＢ−αもまた、基質としてアッセイした。ヒューイットソン(Hewitson)ら、J.Biol.Chem.（２００２年）２７７  ２６３５１−２６３５５に記載のとおりに、放射性標識２ＯＧを使用して、基質を２ＯＧの脱炭酸についてアッセイした。ＦＩＨを、５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７.５中、３７℃で２０分間、アスコルビン酸、２ＯＧ、Ｆｅおよびカタラーゼを伴う５ｎｍｏｌの各基質と共にインキュベートした。
【０１８４】
発現および２９３Ｔ細胞からのｐ１０５  Ｌ６６８Ｋ／Ｒ８７０Ａの精製
２９３Ｔ細胞における発現のために、Ｃ末端ＰＫ−エピトープタグ(Invitrogen)を伴うｐ１０５を含有するｐｃＤＮＡ３.１／ＧＳプラスミドを、Quickchangeシステム(Stratagene)を使用して、修飾した。先に記載のプライマーを使用して、Ｌ６６８Ｋ変種を作製した。Ｒ８７０Ａ変異は、プライマー（前方：ＴＣＴＧＧＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣ）および（後方：ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＡ）によって作製した。図６(Roche Molecular Biochemicals)を使用して、得られるｐ１０５  Ｌ６６８Ｋ／Ｒ８７０Ａプラスミドを、２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトした（５μｇＤＮＡ／１５ｃｍプレート）。トランスフェクションの３６時間後、２ｍｌ（「Complete」プロテアーゼ阻害剤(Roche Molecular Biochemicalsを含有する１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０.５％IgepalＣＡ６３０、２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７.６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）／１５ｃｍプレートにおいて細胞を溶解した。次いで、溶解物を、１０,０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。次いで、溶解物を、３０μｌ抗ＰＫアガロースコンジュゲート（抗Ｖ５、クローンＶ５−１０Agaroseコンジュゲート、Sigma）と共に、ローター上、９０分間、４℃でインキュベートした。次いで、ビーズを溶解緩衝液中で６回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製したタンパク質を展開した。
【０１８５】
トリプシン消化物
ゲル内消化物のために、ゲル片を２０ｍＭ重炭酸アンモニウム中２０ｍＭトリプシンと共にインキュベートし、３７℃で１６時間、インキュベートした。溶液消化物のために、標準的なアッセイ条件下でのＦＩＨを伴うインキュベーション後、基質の２５μＭサンプルをアッセイから取り出し、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中２.５μＭトリプシンと合わせて、室温で８時間、インキュベートした。
【０１８６】
質量分析
インビトロおよびインビボの両方で産生させたｐ１０５サンプルを内部標準としてＡＮＧ  ＩＩＩおよびｈＡＣＴＨペプチドを伴うリフレクトロンモードのEttanTMＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  Ｐｒｏ質量分析器(Amersham Biosciences)を使用して、分析した。インビトロで産生されたＩκＢ−αのトリプシンフラグメントを、サブスタンスＰ、ｈＡＣＴＨおよびインスリン（Ｂ鎖、酸化型）キャリブレーション標準を使用するリフレクトロンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ２Ｔ質量分析器(Micromass)を使用して、分析した。
【０１８７】
ＬＣ−ＭＳ
JupiterＣ４ ＨＰＬＣカラム（１５ｃｍ×４.６ｍｍ）を使用して、１ｍｌ／分の流速で５〜９５％アセトニトリル／０.０５％ギ酸の直線勾配を使用し、ＦＩＨとのインキュベーション後の基質ペプチドを精製した。カラムからの溶離液をMicromass ＺＭＤ四重極質量分析器によりポジティブモードで分析した。
【０１８８】
ＮＭＲ
ＦＥＭ−１およびＩκＢ−αペプチド（２ｍｇ）の両方を、標準的なアッセイ条件下でＦＩＨと共にインキュベートした。ペプチドを、５〜９５％アセトニトリルの直線勾配を伴うJupiter Ｃ４  ＨＰＬＣカラム（１５ｃｍ×４.６ｍｍ）を使用して、アッセイ混合物から精製した。ペプチドを凍結乾燥し、次いで、内部化学シフト対照として１,４−ジオキサン（1Ｈ３.７５０、13Ｃ６７.８０ｐ.ｐ.ｍ.）を含有する正味の2Ｈ2Ｏ中に再溶解した。ＮＭＲスペクトルを、インバース−広帯域パルスフィールド勾配プローブを具備したBruker Avance ＤＲＸ５００を使用して、得た。
【０１８９】
実施例２：ＦＩＨの新規の基質の同定
ＦＩＨは、ＨＩＦ−１α相互作用タンパク質の酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて最初に同定された（マホン(Mahon)らGenes Dev(２００１年)）ことから、ＦＩＨ酵素−基質相互作用は、このシステムで検出することができることを示す。ＨＵＶＥＣ  ｃＤＮＡライブラリーを、ベイトとしてのＦＩＨによりスクリーニングした。これから、９種の独立したタンパク質を示す１１５個のポジティブなクローンを得た。これらのうち、１つは、ＨＩＦ−１α基質（残基５２０〜８２６）に対応し、スクリーニングの完全性を確認する一方、２種のアンキリンリピートドメインを含有するタンパク質を単離した：ｐ１０５（最小ドメインは残基６４２〜９６９である）に対応する６１クローンならびにＵＡＣＡ（コイルドコイルドメインおよびアンキリンリピートを伴うブドウ膜の自己抗原(uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeat)、最小ドメインの残基１４０〜１４１６）に対応する６クローン。両方のアンキリンリピートドメインを含有するタンパク質は、アスパラギンの水酸化の候補部位を含有した（ＨＩＦ−１αサブユニット配列との比較による）。
【０１９０】
さらに、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーもまた、ＦＩＨベイトでスクリーニングした。これから、３種のタンパク質を示す３個のポジティブなクローンを得た。１つのクローンは、アスパラギンの水酸化の候補部位をも含有するアンキリンリピートドメインを含有するタンパク質Ｆｅｍ−１ｂ（残基４５６〜６２７）に対応した。
【０１９１】
実施例３：ＦＩＨとｐ１０５／ＩｋＢαとの間のインビボ相互作用
組織培養物においてＦＩＨとｐ１０５／ＩｋＢαとの間に内因性の相互作用が存在するかどうかを測定するために、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞由来の抽出物を使用して、同時−免疫沈降実験を実施した。抗ｐ１０５免疫沈降を実施し、抗ＦＩＨ抗体で探査した。ｐ１０５においてＦＩＨが検出されたが、コントロールの免疫沈降物では検出されなかった（図２）。ＩｋＢα／ＦＩＨ相互作用を分析するために、ＦＩＨ免疫沈降を実施し、抗ＩｋＢα抗体でイムノブロットした。ＦＩＨにおいてＩｋＢαが特異的に検出されたが、コントロールの免疫沈降物では検出されなかった。これらのデータは、内因性ＦＩＨは、培養細胞において、アンキリンリピートドメインを含有するタンパク質（ｐ１０５およびＩｋＢα）と会合することができることを示す。
【０１９２】
実施例４：ＦＩＨは、ＨＩＦ−ａ以外のタンパク質を水酸化することができる。
２ＯＧの脱炭酸を測定するアッセイを使用して、高度に精製された（＞９５％の純度）組換えＦＩＨを、個別に、潜在的基質としてのｐ１０５、ＩκＢ−αおよびＦＥＭ−１ペプチドのそれぞれと共にインキュベートした。結果は、明らかに、２ＯＧの脱炭酸がこれらの代替的基質の存在下、ＨＩＦ−１αＣＡＤにほぼ等価な量で、刺激されることを示す。ＧＳＴ融合型およびｐ１０５のアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）を包含するポリペプチドの遊離な形態の両方もまた、ＦＩＨ仲介２ＯＧターンオーバーの重要な刺激を引き起こす。ｐ１０５ＡＲＤのＦＩＨによって水酸化されるべき提唱されるアスパラギン残基のアラニン残基への変異は、２ＯＧターンオーバーの実質的な減少をもたらす。標準的なアッセイ条件下におけるＦＩＨとＩκＢ−αとのインキュベーションもまた、ｐ１０５  ＡＲＤについて観察されるのと同じ程度でターンオーバーを刺激する（表２）。
【０１９３】
【表３】
2007530522.tif 000012
【０１９４】
直接的なペプチド基質の水酸化を確認するために、ペプチド基質のそれぞれとのアッセイ混合物を、ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳの両方によって、アッセイした。後者の技術を使用して、ＦＥＭ−１およびＩκＢ−αペプチドの両方が、標準的なアッセイ条件下で水酸化されることを観察した（図３）。標準的なアッセイ条件下でのＦＩＨとのインキュベーション後、ｐ１０５およびＦＥＭ−１ペプチドの２Ｄ−ＮＭＲスペクトルは、合成ＨＩＦ−１α７８８−８０６について先に認められるように、アスパラギンの水酸化と一致した。
【０１９５】
実施例５：ＦＩＨのさらなるアンキリンペプチド基質
ＦＩＨのさらなるアンキリンペプチド基質には、以下が含まれることを見出した：
・ｐ１９−ＩＮＫ−４ｄ−サイクリン依存性キナーゼ４／６（ＣＤＫ）インヒビター
・ＧＡＢＰβ［ＧＡ結合タンパク質］−ＧＡＢＰαに結合する転写調節因子
・タンキラーゼ１／２−ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼは、ＴＲＦ１、ＩＲＡＰおよびＧｒｂ１４を含む複数の基質に結合する
・２−５Ａ−ｄ−Ｒ［２−５Ａ（アデニン）依存性ＲＮａｓｅ(RNaseL)］−エンドリボヌクレアーゼ
・ガンキリン−Ｒｂ（網膜芽細胞腫）タンパク質の調節因子は、ＣＤＫ４／サイクリンＤ、Ｒｂに結合する
・マイオトロフィン−発生調節因子は、ＮＦκＢに結合する
・Ｍ１１０［ＭＹＰＴ１］−ミオシンリン酸化の調節因子は、タンパク質ホスファターゼ１ｃに結合する。
・ＦＧＩＦ［胎児性グロビンを誘導する因子］−胎児性Ｈｂ発現の調節因子
【０１９６】
対応するアンキリンタンパク質の生物学的活性の説明（または関連文献の参照）は、「The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition」モサヴィ、ＬＫ(Mosavi,LK)ら、（２００４年）Protein Science１３：１４３５−１４４８に認められる。
【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
実施例６：ｐ１０５のトリプシン消化物および質量分析
トリプシン消化分析を、ｐ１０５およびＩκＢ−αにおける水酸化の部位の確認のために使用した。しかし、ｐ１０５トリプシン消化パターンの考慮から、修飾されたアスパラギン残基を含有することが提唱されているｐ１０５から産生されるトリプシンペプチドは、ＣＡＦまたはＭＳ／ＭＳ技術のいずれかを使用するＡｓｎ残基に対するＭＡＬＤＩリフレクトロンモードでの分析および配列測定の両方に大き過ぎることが示された。従って、質量１,５２６Ｄａのトリプシンフラグメントを産生するｐ１０５  ＡＲＤ  Ｌ６６８Ｋ変種を作製した。この変種を、野生型ｐ１０５ＡＲＤの場合のように発現させ、同じプロトコルを使用して精製した。標準的なアッセイ条件下で、ＦＩＨとのインキュベーション後、ｐ１０５とＦＩＨとをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２.５％ゲル）によって分離した。ゲルからのｐ１０５の切り出し後、アッセイサンプルおよびＦＩＨと共にインキュベーションしなかったｐ１０５の両方においてトリプシン消化を実施した。得られるサンプルを、ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ質量分析によって分析した。
【０１９９】
結果は、明らかに、ＦＩＨとのインキュベーション後、１,５４２Ｄａでのピークが水酸化された１,５２６Ｄａペプチド、即ち、＋１６Ｄａに対応するスペクトルにおいて出現することを示す。このピークは、ＦＩＨインキュベーションを伴わないかまたは他のコントロールを伴うこれまで分析されたすべてのｐ１０５サンプルからは認められない。
【０２００】
組換えＩκＢ−αを、トリプシン消化後、標準的なアッセイ条件下で、ＦＩＨと共にインキュベートした。得られるトリプシンフラグメントを、直線およびリフレクトロンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の両方を使用して分析した。結果は、フラグメントの水酸化を実証した。
【０２０１】
実施例７：ＦＩＨの内因性供給源を使用するｐ１０５の水酸化
ｐ１０５のインビボ水酸化を実証するために、細胞を、全長ｐ１０５  Ｌ６６８Ｋ／Ｒ８７０Ａ変種で形質転換した。第２の変異を導入して、予想される水酸化ペプチドと重複する質量１,５４２Ｄａのペプチド（ｐ１０５  ＡＲＤには存在しない）の産生を取り出した。ｐ１０５  Ｌ６６８Ｋ／Ｒ８７０Ａのゲル精製から回収されたトリプシン消化またはタンパク質を行い、サンプルをエレクトロスプレーイオン化ＭＳ／ＭＳを使用するＬＣ−ＭＳによって分析した。ＭＳ／ＭＳ分析は、予想されるペプチドの正確な配列（ＶＡＡＧＡＤＶＮＡＱＥ）を同定し、水酸化の位置がＡｓｎ７７８であることを実証した（図４）。
【０２０２】
Ｘ線結晶構造は、２種の設計されたコンセンサス配列の人工ＡＮＫタンパク質（括弧内はＰＤＢ−ＩＤ）に加えて、次の生物学的ＡＮＫタンパク質が利用可能である；アンキリン−Ｒ（１ｎ１１）、５３ＢＰ２−ｐ５３（１ｙｃｓ）、ＧＡ−結合タンパク質（１ａｗｃ）、細胞周期インヒビターｐ１９ｉｎｋ４Ｄ（１ｂｄ８、１ｂｉ８、１ｂｌｘ）、ｐ１８ｉｎｋ４Ｃ（１ｉｈｂ、１ｇ３ｎ、１ｂｕ９）、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ（１ｂｉ７）、ＩκＢ−α−（ｐ５０−ｐ６５ヘテロ二量体複合体）（１ｉｋｎ、１ｎｆｉ）、ＩκＢ−β（１ｏｙ３、１ｋ３ｚ）、Ｂｃｌ３（１ｋｌａ、１ｋｌｂ）、NotchＮＩＣＤ（１ｏｔ８）、Ｓｗｉ６（１ｓｗ６）、Ｐｙｋ−２関連タンパク質β（１ｄｃｑ）、Ｓａｎｋ  Ｅ３＿５人工ＡＮＫタンパク質（１ｍｊ０）、３ＡＮＫ人工ＡＮＫ（１ｎ０ｑ）および４ＡＮＫ人工ＡＮＫ（１ｎ０ｒ）。
【０２０３】
ＡＮＫリピートのコンセンサス配列（メイン(Main)らCurr Opin Struct Biol（２００３年）１３  ４８２−４８９）は、アスパラギン残基が上記のように水酸化され得る保存されたモチーフＤＶＮＡを含有する。ＤＶＮＡモチーフは、リピートに連結するβ−ヘアピンターンの前の「バルジ」の部分である。
【０２０４】
ＡＮＫ結晶構造の重ね合わせおよびＹ２Ｈ結果に基づいてモデリングされた構造は、分析された構造において、ＤＶＮＡモチーフが、ＡＮＫタンパク質の同じ登録リピート（第４および第５）間に生じることを示す（図５）。結晶構造のそれぞれは、微生物から発現された組換えタンパク質を使用して入手されたが、細菌ゲノムにはＦＩＨ−１相同物は存在せず、特徴付けられていないＪｍｊＣドメインタンパク質は極少数しか存在しないため、対応するアスパラギンでの水酸化が何故観察されなかったについての説明が提供される。
【０２０５】
ＩκＢ−αのＤＶＮＡモチーフは、その第４および第５のＡＮＫリピート間のループ上にバルジを生じる。リピート４の２９位のＡｓｎ２１０原子ＯＤ１およびＮＤ２は、リピート５の２５および２７位のそれぞれループ骨格原子Ｇｌｙ２４０Ｏ（３.３Å）およびＤ２４２Ｎ（２.８Å）原子とＨ結合相互作用する（図６）。この理由のため、アスパラギン残基は、特に、溶媒に暴露されない。ＦＩＨとＩκＢ−αとの間の相互作用をモデリングすることにより、ＩκＢ−αリピート４ループのコンホメーションの変化が、ＦＩＨによって水酸化が生じるのに必要であることが示唆される。ＨＩＦ−１αについて測定されるように、ｐｒｏ−Ｓ位でのＩκＢ−αアスパラギン残基の水酸化をモデリングすることによって、Ａｓｐ２０８（リピート４、２７位）とリピートの２９位のＡｓｎ２１０上に導入される水酸基との間にＨ結合が作製される（図６）。さらなるＨ結合の存在は、タンパク質の安定性を増加し得るか、またはタンパク質−タンパク質認識／安定性の新規の部位を提供する。
【０２０６】
ピリン(pirin)、ＪｍｊＣドメインタンパク質は、Ｂｃｌ−３、ＡＮＫタンパク質と相互作用することが報告されている（デチェンド(Dechend)らOncogene（１９９９）１８  ３３１６−３３２３）。ピリン(pirin)およびｂｃｌ−３の間の結晶構造間のモデリングされた相互作用は、ｂｃｌ−３における第５および第６リピート間にあるＢｃｌ−３のＤＶＮＡモチーフがピリン(pirin)の活性部位に配置されることを示す（パング(Pang)らJ.Biol.Chem.（２００４年）２７９  １４９１−１４９８）。ピリン(pirin)の触媒活性は示されていないが、その金属は、３個のヒスチジンおよびアスパラギン酸によって、配位されており、それは、クエルセチン２,３ジオキシゲナーゼと類似の二重βヘリックスモチーフを含有する。ＡＮＫタンパク質ＩκＢ−αに構造的に関連するＡＮＫタンパク質Ｂｃｌ３とのその相互作用は、これらの異なる２つのＪｍｊＣ−ＡＮＫ相互作用間の進化の関係を示唆する。
【０２０７】
実施例８：２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼによる水酸化を測定するためのハイスループットアッセイ
ＯＰＤは、Acros Organicsより購入し、ヘプタンおよび石油エーテル（１２０−１４０）から再結晶化した。ＤＴＴはMelford Laboratories由来であった。カタラーゼおよび硫酸アンモニウム鉄はSigma由来であった。ＦＩＨおよびＧＳＴタグ化ＨＩＦ７８６−８２６を、先に記載のとおりに調製した（ヒューイットソン(Hewitson)らJ.Biol.Chem.２００２年２６３５１−２６３５５）。
【０２０８】
走査する蛍光および励起スペクトルをPerkin Elmer ＬＫ−５０Ｂ分光計に記録した。
【０２０９】
１ｍＭ  ＤＴＴ、０.６ｍｇ／ｍｌカタラーゼ、２ＯＧ、基質および５０ｍＭ Tris／ＨＣｌ  ｐＨ７.５を８８μｌの最終容積で混合し、３７℃で５分間、水浴中で加温することによって、ＦＩＨ活性のアッセイを行った。同時に、酵素および鉄（２０ｍＭ  ＨＣｌ中５００ｍＭストックとして調製し、水で希釈する）を室温で３分間、混合した。反応は、１２μｌの酵素／鉄混合物の基質／補因子混合物への添加によって、開始した。反応は、２００μｌの０.５Ｍ  ＨＣｌの添加によって停止し；次いで、誘導を、０.５Ｍ  ＨＣｌ中１０ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤの１００μｌの添加、および加熱ブロックにおける１０分間、９５℃での加熱によって達成した。卓上マイクロ遠心機において最大速度で、５分間の遠心分離後、上清（５０μｌ）を３０μｌの１.２５Ｍ  ＮａＯＨの添加によって塩基性にし、３４０ｎｍの励起フィルターおよび４２０ｎｍの蛍光フィルターを伴うNovostar(ＢＭＧ Labtechnologies Ltd.)上で蛍光を測定した。
【０２１０】
ＯＰＤと２−オキソグルタル酸との間の反応の生成物を、１Ｈおよび１３Ｃｎｍｒならびに質量分析によって特徴付け、蛍光生成物を生じることが予想されるように、環化反応の促進を確認した。
【０２１１】
ＮＭＲデータ：
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ6）δ［ｐｐｍ］：７.７１（ｍ,１Ｈ,ＣＨAr）,７.５０（ｍ,１Ｈ,ＣＨAr）,７.３０（ｍ,２Ｈ,ＣＨAr）,３.０３（ｔ,２Ｈ,ＣＨ2）,２.７４（ｔ,２Ｈ,ＣＨ2）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ6）δ［ｐｐｍ］：１７４.７（Ｃquart）,１６１.１（Ｃquart）,１５５.４（Ｃquart）,１３２.５（Ｃquart/Ar）,１３２.３（Ｃquart/Ar）,１３０.３（ＣＨAr）,１２８.９（ＣＨAr）,１２３.９（ＣＨAr）,１１６.１（ＣＨAr）,３０.４（ＣＨ2）,２８.５（ＣＨ2）
【０２１２】
１の蛍光スペクトルは、最大応答が塩基性条件下で得られることを示し、３４０ｎｍで励起し、４２０ｎｍで蛍光を測定した。
【０２１３】
２ＯＧの濃度について発達した蛍光の線形性は、１ｍＭ２ＯＧまで実証され（図８）、ＧＳＴ、ＦＩＨ、カタラーゼ、ＤＴＴ、およびＦｅが個別および組み合わせの両方で存在しても、ここで報告されたアッセイ手順において使用される最大濃度まで、蛍光の発達に対する影響が認められないことを示した（図９）。
【０２１４】
実施例９：ＩＫＢ−αの内因性水酸化の実証
（ａ）精製
ＤＭＥＭにおいて増殖させたＨｅＬａ  Ｓ３細胞の５リットルの懸濁液を、遠心分離によってペレット化し、２５０ｍｌのIgepal１６−３０溶解緩衝液(Sigma)に再懸濁した。細胞溶解物を、２０,０００ｇ、２０分間の遠心分離によって澄明にした。２５ｍｌのプロテインＡ−Sepharoseビーズコンジュゲートを、最初に、細胞溶解物に添加し、１晩、４℃でインキュベートして、Sepharoseビーズと非特異的に相互作用するタンパク質を沈殿させた。ＩＫＢ−α１０Ｂ抗体をSepharoseビーズにコンジュゲートし、細胞溶解物と共に８時間、回転させながら４℃でインキュベートした。上清を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットによる分析のために保持した。抗体−Sephroseビーズコンジュゲートを、５０容積の溶解緩衝液で７回洗浄し、コンジュゲートと非特異的に会合するタンパク質を取り出した。４ｍｌの１０ｍＭグリシン、ｐＨ２.５を使用して、ＩＫＢ−αを抗体から溶出させ、１０％トリクロロ酢酸による沈殿で濃縮した。沈殿物を１００μｌの冷アセトンで洗浄し、１００μｌの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填緩衝液に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
【０２１５】
（ｂ）トリプシン消化
（ａ）に記載の免疫沈降を介して、ＩＫＢ−αを得た。ＩＫＢＡに対応するバンドをゲルから切り出し、約１ｍｍ平方に切断し、水で広範に洗浄した。次いで、ゲル片を、１００μｌの５０％アセトニトリルで１５分間、振盪しながら洗浄した。上清を取り出した後、ゲル片を、５０μｌアセトニトリル中、室温で、振盪せずにインキュベートした。５分後、過剰のアセトニトリルを取り出し、ゲル片を、５０μｌの０.１Ｍ重炭酸アンモニウム(Sigma)中で再水和させた。さらに５分後、５０μｌのアセトニトリルを添加し、混合物を、室温で振盪せずにインキュベートした。１５分後、すべての過剰な液体を取り出し、ゲル片をSpeedVacにおいて乾燥させた。
【０２１６】
乾燥させたゲル片を、５０μｌの１０ｍＭ  ＤＴＴ（０.１Ｍ重炭酸アンモニウム中に溶解した）に再水和し、５６℃で４５分間、インキュベートした。過剰のＤＴＴを取り出し、５０μｌの５５ｍＭヨードアセトアミド（０.１Ｍ重炭酸アンモニウム中に溶解した）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。すべての過剰な液体を取り出し、ゲル片を、上記のように、再度、重炭酸アンモニウム／アセトニトリルで洗浄した。ゲル片をＳｐｅｅｄＶａｃにおいて乾燥させ、５０μｌの２０μｌ／ｍｌブタトリプシン(Promega)中に再懸濁し、１晩３７℃でインキュベートした。
【０２１７】
インキュベーション後、上清をきれいなチューブに移し、ゲル片を１００μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで５分間、振盪しながら洗浄した。さらなる１００μｌのアセトニトリルを添加し、さらに６０分間、振盪させた。上清を取り出し、保持した。ゲル片を、１００μｌの０.１％トリフルオロ酢酸(Fischer)で５分間、振盪しながら洗浄した。さらなる１００μｌのアセトニトリルを添加し、さらに６０分間、振盪させた。すべての上清をプールし、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて乾燥させた。ペレットを２０μｌの０.１％トリフルオロ酢酸に再懸濁し、１晩、５０℃でインキュベートした。すべての液体をSpeedVacにおいて乾燥させ、質量分析の前に、５％アセトニトリル／０.１％ギ酸に再懸濁した。
【０２１８】
（ｃ）質量分析
Ｃ４Jupiter ＨＰＬＣカラム(Phenomenex)を使用して、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を実施した。５〜９５％アセトニトリル／０.１％ギ酸の直線勾配を使用して、ペプチドを分離し、Waters Q-Tof Micro Mass Spectrometerを使用して分析した。水酸化されたＩＫＢ−αを８.５分後にカラムから溶出し、ペプチド（ＣＧＡＤＶＮ*Ｒ）の正体を、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によって確認し、ここで、Ｎ*は水酸化されたアスパラギン残基に対応する。（Ｎ末端システインを、アルキル化、続いて、脱水によって修飾した）。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】ＡＮＫリピートタンパク質ＩκＢ−α−ＮＦκＢ複合体からＮＦκＢを取り出した構造（１ｎｆｉ）のリボン表示である。リピートには、Ｎ末端からＣ末端の方向で１〜６の番号が付されている。
【図２】ＨｅＬａ細胞における内因性ＦＩＨおよびｐ１０５タンパク質の会合を表す。Ａ）.抗ｐ１０５（α−ｐ１０５ｃ  ＩＰ）およびコントロール（ＣＯＮ  ＩＰ）免疫沈降物を伴う細胞溶解物（インプット）を、抗ｐ１０５抗体（α−ｐ５０ＩＢ）と共にイムノブロットし、ｐ１０５タンパク質の回復、および抗ＦＩＨ抗体（α−ＦＩＨ  ＩＢ）を確認した。抗ＦＩＨイムノブロットは、ｐ１０５免疫沈降物におけるＦＩＨの特異的回収を示す。
【図３】ＦＩＨ処置ペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を例示する。上から順に：（１）ＦＥＭ−１＋ＦＩＨ、（２）ＦＥＭ−１のみ、（３）ＩκＢ−α＋ＦＩＨ、（４）ＩκＢ−αのみ、（５）ＣＡＤ＋ＦＩＨ、（６）ＣＡＤのみ。
【図４】水酸化アスパラギン残基を含有するｐ１０５由来のトリプシン消化フラグメントのエレクトロスプレーイオン化ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図５】アスパラギン（黒色スティック）を示す１３種のＡＮＫタンパク質Ａ  ＩｋＢ−α；Ｂ  ５３ＢＰ２；Ｃ  ｉＡＳＰＰ；Ｄ  ＦＥＭ１−ｂ；Ｅ  Ｎｏｔｃｈ；ＮＩＣＤ；Ｆ  ｐ１０５（ＮＦｋＢ−１）；Ｇ  ＵＡＣＡ；Ｈ  ｂｃｌ−３；Ｉ  ＩＬＫ；Ｊ  ｐ１８ＩＮＫ４Ｃ；Ｋ  ｐ１９ＩＮＫ４Ｄ；Ｌ  ＧＡＢＰ−ｂ；Ｍ  ｓｗｉ６のリボン表示である。
【図６】ＩκＢ−α（１ｉｋｎ）のリボン表示である。ＤＶＮＡ（２０８〜２１１）モチーフ（β−バルジに留意）は、Ａｓｎ２１０側鎖からリピート５の骨格原子へのＨ結合（破線）を伴うスティックとして表される。水酸化されたＨＩＦ−１αについて見出されるのと同じ立体化学（ｐｒｏ−Ｓ）でＡｓｎ２１０Ｃβ上の水酸基をモデル化することによって、Ａｓｐ２０８の側鎖とＡｓｎ２１０の導入された水酸基との間のＨ結合の作製が、どのようにしてβ−バルジを安定化し得るかを示す。
【図７】ＯＰＤと２−オキソグルタル酸との間の反応の生成物を特徴付ける質量分光分析の結果を示す。１）０.２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液中１２５μＭキノキサリノン、２）０.５Ｍ  ＨＣｌ溶液中２５０μＭ、３）０.５Ｍ  ＨＣｌ中１０ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤのａ）励起（蛍光＝４２０ｎｍ）およびｂ）蛍光（励起＝３４０ｎｍ）スペクトル。
【図８】ＯＰＤと多様な濃度の２−ＯＧとの反応を例示する。引用した濃度は、１００μｌ(micol)容積での濃度であり、アッセイのセクションにおいて記載されるとおりに作製される。
【図９】インキュベーション中に発生した蛍光に対するアッセイ成分の影響を示すチャートである。黒色棒＝インキュベーションなし、灰色棒＝１５分間のインキュベーション。緩衝液＝５０ｍＭ  Tris／ＨＣｌ  ｐＨ７.５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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