(57)【要約】  本発明は、生物活性グレリン、より好ましくはｎ−オクタノイルグレリンに特異的に結合する核酸、ならびにグレリンに媒介される疾患および障害の診断のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性グレリンに結合する核酸。
【請求項２】
生物活性グレリンに特異的に結合する核酸。
【請求項３】
核酸が生物活性グレリンに特異的に結合しない請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
特異的結合がＫｄ値として表され、核酸のＫｄが１０ｐＭ〜１μＭ、より好ましくは１００ｐＭ〜５００ｎＭ、そして最も好ましくは１ｎＭ〜１００ｎＭである請求項２もしくは３に記載の核酸。
【請求項５】
生物活性グレリンがｎ−オクタノイルグレリンである請求項１〜４のいずれかに記載の核酸
【請求項６】
ｎ−オクタノイルグレリンのｎ−オクタノイル部分が、グレリンの位置３のＳｅｒにエステル結合を介して結合している請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
核酸がＬ−核酸、好ましくはシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）である請求項１〜６のいずれかに記載の核酸。
【請求項８】
核酸がデオキシリボ核酸、リボ核酸およびその混合物を含んでなる群から選択される請求項１〜７のいずれかに記載の核酸。
【請求項９】
核酸が図１Ｂに示す二次構造を有する請求項１〜８のいずれかに記載の核酸。
【請求項１０】
核酸が図１Ｂに示す二次構造の内部ループ構造において可変である請求項１〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
核酸が配列番号１に記載の配列を含んでなり、好ましくはそれからなる請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
核酸が配列番号２〜配列番号１５に記載の配列を含んでなり、好ましくはそれからなる請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
生物活性グレリンの結合のための前記請求項のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１４】
結合が、１０ｐＭ〜１μＭ、より好ましくは１００ｐＭ〜５００ｎＭ、そして最も好ましくは１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲内の核酸のＫｄで生物活性グレリンに選択的である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
結合が、生物活性グレリンより１０００倍過剰の生物不活性グレリンの存在下で、より好ましくは生物活性グレリンより１００倍過剰の生物不活性グレリンの存在下で、そして最も好ましくは生物活性グレリンより１０倍過剰の生物不活性グレリンの存在下で生物活性グレリンと異なるグレリンの結合を除く請求項１３もしくは１４に記載の使用。
【請求項１６】
生物活性グレリンがｎ−オクタノイルグレリンである請求項１３〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
結合がインビボもしくはインビトロ結合である請求項１３〜１６のいずれかに記載の使
用。
【請求項１８】
生物活性グレリンの検出のための請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１９】
生物活性グレリンが特異的に検出される請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
非生物活性グレリンが核酸により検出されず、好ましくは核酸により特異的に検出されない請求項１８もしくは１９に記載の使用。
【請求項２１】
生物活性グレリンおよび／もしくは非生物活性グレリンがインビボおよび／もしくはインビトロで検出される請求項１８〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
生物活性グレリンの阻害のための請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項２３】
生物活性グレリンが特異的に阻害される請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
非生物活性グレリンが核酸により阻害されず、好ましくは核酸により特異的に阻害されない請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
生物活性グレリンがｎ−オクタノイルグレリンである請求項２２〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
阻害がインビトロおよび／もしくはインビボ阻害である請求項２２〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
薬剤の製造のための請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項２８】
薬剤が疾患および／もしくは障害の処置および／もしくは予防のためのものである請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
疾患および／もしくは障害が肥満症、エネルギーバランス、食欲、体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧および心臓血管疾患を含んでなる群から選択される請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
疾患および／もしくは障害が生物活性グレリンにより仲介される請求項２８もしくは２９に記載の使用。
【請求項３１】
以下の段階：
（ａ）生物活性グレリンの存在について試験されるべきサンプルを準備する段階、
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸を準備する段階、
（ｃ）サンプルを核酸と反応させる段階
ここで、段階（ａ）は段階（ｂ）の前に行うことができ、または段階（ｂ）は段階（ａ）の前に行うことができる、
を含んでなる生物活性グレリンの検出方法。
【請求項３２】
さらなる段階（ｄ）：
（ｄ）核酸とサンプルとの反応を検出する段階
が設けられる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
段階（ｂ）の核酸が表面に固定される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
核酸が表面と核酸との間の共有化学結合によって表面に固定される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸が核酸の相互作用パートナーにより表面に固定される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
相互作用パートナーが核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
相互作用パートナーが抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり、ここで、抗体が請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸に結合している請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
相互作用パートナーが核酸、好ましくは機能性核酸である請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
機能性核酸がアプタマー、シュピーゲルマー、および核酸に少なくとも部分的に相補的である核酸を含んでなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
核酸が１対の相互作用パートナーの第一のメンバーを含んでなり、そして表面が相互作用パートナーの対の第二のメンバーを含んでなる請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
相互作用パートナーの対がビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、およびビオチンとニュートラアビジンを含んでなる相互作用パートナーの群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
相互作用パートナーの対の第一のメンバーがビオチンである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
生物活性グレリンおよび核酸の固定化複合体が形成される請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
該複合体が検出される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
生物活性グレリンが検出される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
生物活性グレリンが、生物活性グレリンに特異的である検出手段により検出される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
生物活性グレリンが、生物活性グレリンおよび非生物活性グレリンの両方を検出する検出手段により検出される請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
検出手段が核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選択される請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
複合体形成後にサンプルが反応容器から取り除かれる請求項４４〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
生物活性および／もしくは非生物活性グレリンの相互作用パートナーが表面上に固定される請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
相互作用パートナーが核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
相互作用パートナーが生物活性グレリンおよび／もしくは非生物活性グレリンに結合することができる請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
相互作用パートナーが抗体、好ましくはモノクローナル抗体である請求項５１もしくは５２に記載の方法。
【請求項５４】
相互作用パートナーが機能性核酸である請求項５１もしくは５２に記載の方法。
【請求項５５】
機能性核酸がアプタマーおよびシュピーゲルマーを含んでなる群から選択される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
相互作用パートナーが生物活性および／もしくは非生物活性グレリンと複合体を形成する請求項５０〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
生物活性グレリンが検出手段により検出される請求項５０〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
検出手段が請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸である請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
核酸が第二の検出手段を用いて検出される請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
第二の検出手段が核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選択される請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
第二の検出手段が抗体であり、ここで、好ましくは抗体が核酸に特異的である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
第二の検出手段が核酸、好ましくは分子ビーコンである請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
核酸が検出標識を含んでなる請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
検出標識がビオチン、ブロモ−デソキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性標識およびキレート剤分子を含んでなる群から選択される請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
第二の検出手段が検出標識と相互作用する請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がビオチンに対する抗体であるか、または
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がアビジンもしくはアビジン保有分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン保有分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がニュートラアビジンもしくはニュートラアビジン保有分子であるか、または
検出標識がブロモ−デソキシウリジンであり、そして第二の検出手段がブロモ−デソキシウリジンに対する抗体であるか、または
検出標識がジゴキシゲニンであり、そして第二の検出手段がジゴキシゲニンに対する抗体であるか、または
検出標識がキレート剤であり、そして第二の検出手段が放射性核種である
請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
第二の検出手段が第三の検出手段を用いて検出され、好ましくは第三の検出手段が酵素であり、より好ましくは第二の検出手段の検出の際に酵素反応を示し、または第三の検出手段が放射線、より好ましくは放射性核種により発せられる放射線を検出する手段である請求項５０〜６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
複合体形成後にサンプルが容器から、より好ましくは段階（ｃ）および／もしくは段階（ｄ）が行われる反応容器から取り除かれる請求項５６〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸が蛍光部分を含んでなり、そしてここで、蛍光部分の蛍光が、核酸と生物活性グレリンおよび遊離の生物活性グレリンとの間の複合体形成の際に異なる請求項３２に記載の方法。
【請求項７０】
核酸が請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸の誘導体であり、ここで、核酸の誘導体がアデノシンを置換するアデノシンの少なくとも１つの蛍光性誘導体を含んでなる請求項３２および６９に記載の方法。
【請求項７１】
アデノシンの蛍光性誘導体がエテノアデノシンである請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸の誘導体および生物活性グレリンからなる複合体が蛍光を用いて検出される請求項６９〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
生物活性グレリンがｎ−オクタノイルグレリンである請求項３１〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
非生物活性グレリンが、ｎ−オクタノイルグレリンと異なるグレリンである請求項３１〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
シグナルが段階（ｃ）もしくは段階（ｄ）において作り出され、そして好ましくはシグナルがサンプル中の生物活性グレリンの濃度と相関性がある請求項３１〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
サンプルが血液、血漿、血清、液体および組織を含んでなる群から選択される請求項３１〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
方法が診断方法もしくは予測方法である請求項３１〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
方法が疾患および／もしくは障害を診断すること、病期分類すること、および／もしくは予測することのためであり、ここで好ましくは該疾患および／もしくは障害が肥満症、エネルギーバランス、食欲、体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧および心臓血管疾患を含んでなる群から選択される請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性グレリンに結合する核酸、ならびに生物活性グレリンの結合および検出のためのそのような核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリンは、成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａ（ＧＨＳＲ１ａ）の天然リガンドとして同定された。該受容体は、下垂体においてそして脳の視床下部の部分において最も豊富であるが、他の組織においても低濃度で検出されることができる。７０年代後期から、分泌促進物質と名付けられた、合成ペプチドおよび他の化合物は、成長ホルモンの放出を刺激することが示されていた。しかしながら、成長ホルモンの放出に関与する天然リガンドは、１９９９年におけるグレリンの発見まで不明のままであった。グレリンは、そのＮ末端の３番目のアミノ酸（セリン３）でオクタノイル酸側鎖を有する非常に塩基性の２８アミノ酸のペプチドホルモンである。この特異な修飾は、ＧＨＳ受容体での相互作用およびその活性に必要とされる。しかしながら、生体サンプルには、生物活性グレリンの形態であるオクタノイルグレリンおよび修飾されていない、すなわちデス−オクタノイルグレリン（ｄｅｓ−ｏｃｔａｎｏｙｌ  ｇｈｒｅｌｉｎ）の両方の混合物が存在する。精製されたラットグレリンのアミノ酸配列は、ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号１９）であるとタンパク質シーケンサーにより決定された。対応するヒト配列は２つの位置においてのみ逸脱し、アミノ酸位置セリン３で同じｎ−オクタノイル側鎖を保有する（ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号１６））。
【０００３】
天然に存在するｎ−オクタノイル残基に加えて、グレリンの位置３で導入される不飽和のもしくは分枝したオクタノイル基、およびより長い脂肪族鎖は、同様に受容体認識を媒介する。受容体相互作用ドメインは、グレリンの非常にＮ末端に位置し；欠失研究により、グレリン（１−１０）［ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱ、配列番号１７］およびアミノ酸１−５の最小モチーフ（グレリン（１−５）［ＧＳＳＦＬ、配列番号１８］でさえ、ＧＨＳＲ１ａの刺激に十分であるが、両方の場合において、ｎ−オクタノイル残基でのペプチド修飾の強い必要条件が認められることが示される。
【０００４】
グレリンは、アナボリック状態に関連する生理的機能を媒介することが示されている。それは下垂体からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出を直接刺激するが、視床下部ニューロンに作用することによりＧＨに依存しない方法で摂食行動を誘導することもまた、げっ歯類における実験によりグレリンに示された。興味深いことに、グレリン生産の主要部位は胃の胃酸分泌腺においてであり、それが胃、下垂体および視床下部の間のホルモンリンク（ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｌｉｎｋ）として働くことを示唆する。ラットにおけるグレリン投与は、エネルギー摂取および／もしくは食糧利用の変化の結果として体重増加をもたらしたという結果は、そのような役割を裏付ける。さらに、ヒトにおける全身グレリン投与は、試験被験体において空腹感を引き起こし、そして過食を誘導する。これらの結果に基づいて、グレリンは食欲および体重の調節において重要な役割を有し、栄養不良状態の急性ならびに慢性シグナルとして働くと考えられる。この仮説のさらなる裏付けは、グレリンレベルならびに食欲が胃バイパス後の個体において低下され、体重減少をもたらすことにおける該処置の効率に少なくとも部分的に寄与するという結果からもたらされる。プラダーウィリ症候群にかかっている患者からの臨床データもまた、該疾患と関連する過食症および肥満症が著しい高グレリン血症の結果であることを示唆する。さらに、グレリンは高血糖およびインシュリン放出の阻害を誘導することが見出され、グルコース代謝への関与を示唆する。エネルギー代謝におけるこれらの機能に加えて、グレリンはまた多数の他のプ
ロセスにも関係があるとされている。それは多数の神経内分泌腫瘍において発現されること、および下垂体からのＧＨ放出に加えて、ＡＣＴＨ、ＰＲＬおよびコルチゾールの放出を刺激することが見出された。健常人へのグレリンの単回注射は、心拍出量を増加しそして血圧を減少することが見出された。従って、グレリンの作用は、様々な異なる仕事に関与しているように思われる。背景となる情報は、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０から取り出すことができる。
【非特許文献１】Ｍ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．Ｈｏｓｏｄａ，Ｙ．Ｄａｔｅ，Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｈ．Ｍａｔｓｕ，Ｋ．Ｋａｎｇａｗａ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｓ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｓｔｏｍａｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：６５６−６０，１９９９
【非特許文献２】Ｍ．Ｔｓｃｈｏｅｐ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．Ｈｅｉｍａｎ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：９０８−１３，２０００
【非特許文献３】Ａ．Ｍ．Ｗｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８６：５９９２−６，２００１
【非特許文献４】Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１９４−８，２００１
【非特許文献５】Ｎ．Ｎａｇａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１  Ｍａｙ；２８０（５）：Ｒ１４８３−７；Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．
【非特許文献６】Ｖｏｌａｎｔｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００２  Ｍａｒ；８７（３）：１３００−８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＨ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ．
【非特許文献７】Ｊｅｆｆｅｒｙ  ＰＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２  Ｍａｒ；１７２（３）：Ｒ７−１１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．
【非特許文献８】Ｅｇｉｄｏ  ＥＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２  Ｆｅｂ；１４６（２）：２４１−４  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．
【非特許文献９】Ｂｒｏｇｌｉｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００１  Ｏｃｔ；８６（１０）：５０８３−６，Ｇｈｒｅｌｉｎ，ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ＧＨ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．
【非特許文献１０】Ｂｅｄｎａｒｅｋ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｏｃｔ．；４３：４３７０−６  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｇｈｒｅｌｉｎ：ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １ａ．
【発明の開示】
【０００５】
本発明の根底にある問題は、生物活性グレリンの結合の手段を提供すること、そしてさらに特に生物活性グレリンにより媒介される疾患および障害の処置の方法ならびに生物活性グレリンの特異的検出の方法を提供することである。
【０００６】
本発明によれば、この問題は本明細書に添付する独立請求項の主題により解決される。好ましい態様は、従属請求項によりもたらされる。
【０００７】
ヒトグレリンは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドであり、そして脂肪酸側鎖で修飾される。異なる種間の高度のペプチド配列相同性を考慮して、グレリンという用語は、本明細書において用いる場合、哺乳類グレリンが包含されるがこれに限定されるものではない任意のグレリンをさす。好ましくは、哺乳類グレリンは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターおよびヒトグレリンを含んでなる群から選択される。最も好ましくは、グレリンはヒトグレリンである。
【０００８】
グレリンの計算されたｐＩは、１１．０９である。グレリンのこの非常に塩基性の全体的なｐＩにもかかわらず、受容体結合モチーフＧＳＳＦＬ［グレリン（１−５）］は、５．５の計算されたｐＩを有する、むしろ酸性のドメインである。本発明は、酸性の受容体結合ドメインを特異的に認識するが、ペプチドの塩基性の中央およびカルボキシ末端ドメインを認識しない、核酸を全長グレリンで選択することができるという驚くべき結果に基づく。これは、標的分子、すなわちグレリンの電荷および核酸の電荷の両方の静電効果の点において驚くべきことである。標的分子の塩基性ドメインへの負に荷電した核酸の結合は、標的分子の酸性ドメインへの核酸の結合と比較してはるかに有利であるはずである。従って、グレリンの塩基性部分に結合していないが標的分子の酸性ドメインに結合している核酸リガンドを選択することの成功の妥当な予想は、当業者にはなかったことが指摘されなければならない。
【０００９】
アミノ末端の受容体結合モチーフに加えて、本明細書において生物活性グレリンとも呼ばれる生物学的に活性のグレリンは、アミノ酸セリン３でのｎ−オクタノイル基でのそのアシル化を特徴とする。本明細書に開示されるアミノ末端モチーフＧＳＳＦＬの核酸リガンドは、グレリンの生物不活性もしくは非生物活性型からの生物活性型の識別を可能にする。結合は２つの部分、オクタノイル基およびペプチドの存在に厳密に依存し：オクタノイル−グレリンへの核酸の結合は、１０００倍過剰のデスオクタノイル−グレリンの存在下で、より好ましくは１００倍過剰のデスオクタノイル−グレリンの存在下で、そして最も好ましくは１０倍過剰のデスオクタノイル−グレリンの存在下で特異的であるので、これは驚くべきことである。さらに、鏡像異性体のオクタノイル−グレリンは該核酸により認識されず；オクタノイル基は結合に十分ではないということを考えると、結合特性はまたペプチドにも特異的である。
【００１０】
本明細書において好ましい態様として用いる場合、生物活性グレリンは、好ましい態様として天然に存在するグレリンの特性の本質的に全てを示すグレリンである。特に、生物活性グレリンは、好ましい態様として本明細書において用いる場合、より好ましくはＧＨＳ受容体との相互作用を介して、成長ホルモンの放出に関与するかもしくはそれを引き起こすことができる任意のグレリンおよびグレリン誘導体である。これと対照的に、好ましい態様として、非生物活性グレリンは生物活性グレリンと異なる、より好ましくはＧＨＳ受容体との相互作用を介して、より好ましくは成長ホルモンの放出を引き起こさないグレリンである。
【００１１】
本明細書に記述されるような本発明の核酸の特徴は、単独でもしくは任意の組み合わせ
のいずれかで、核酸が用いられる本発明の任意の態様において実現されることができる。
【００１２】
本発明の核酸はまた、本明細書に開示される特定の配列に本質的に相同である核酸も含んでなる。実質的に相同なという用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％であり、そして最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％より大きいように理解されるものとする。
【００１３】
本発明の核酸はまた、１つの態様として本明細書に開示される特定の配列に由来する核酸も含んでなる。「由来する」という用語は、配列番号１に基づくように理解されるものとする。図１Ａに示す挿入部位Ｉｎｓ１〜Ｉｎｓ４は、最大３０ヌクレオチドの長さの任意の配列により、好ましくは最大２０ヌクレオチドの任意の配列により、より好ましくは最大１０ヌクレオチドの任意の配列により、そして最も好ましくはＩｎｓ１では０〜３ヌクレオチド、Ｉｎｓ２では０〜１４ヌクレオチド、Ｉｎｓ３では１〜３ヌクレオチドそしてＩｎｓ４では０〜２ヌクレオチドの任意の配列により表されることができる。Ｉｎｓ２により表される内部ループＩＬ  Ｉａは、改変の最も重要な部位であると考えられる。
【００１４】
本発明の核酸はまた、好ましい態様として以下の一般式
ＣＧＵＧＹＧＮ（０〜３）ＡＧＧＹＡＮ（０〜１４）ＡＡＡＡＣＮ（１〜３）ＵＡＡＲＷＣＣＧＡＡＧＧＵＡＡＣＣＡＷＵＣＣＵＡＣＮ（０〜２）ＡＣＧ（配列番号１）
（式中、ＹはＵもしくはＣを表し、ＲはＡもしくはＧを表し、ＷはＵもしくはＡを表す。それと関連して、添え字のいずれも、特定される最初の数字から出発して特定される最後の数字までの任意の整数およびその間の任意の整数を表すことに注意すべきである。従って、例えば０〜３は０、１、２および３を表す。）
により表されることもできる。
【００１５】
従って、共通配列の配列番号１は、可変長の挿入が様々な態様において認められる、４つの領域を含有する。これらの領域は挿入部位と呼ばれ、そしてＩｎｓ１〜Ｉｎｓ４と名付けられる。図１Ａにおいて配列番号２として記載するＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１によれば、Ｉｎｓ１はヌクレオチド６と７の間に位置し、Ｉｎｓ２はヌクレオチド１３と１４の間に位置し、Ｉｎｓ３はヌクレオチド１８と２０の間に位置し、そしてＩｎｓ４はヌクレオチド４４と４５の間に位置する。表されるクローンにおいて認められる、それぞれの挿入部位の長さは、配列番号１および上記の特定の一般式において示される。
【００１６】
本発明の核酸はまた、１つの態様として、好ましくは当該部分がオクタノイル−グレリンに結合することおよびデスオクタノイルグレリンを識別することに関与する限りにおいて、本明細書に開示される特定の配列に構造的に相同である核酸も含んでなる。構造的相同性は、本発明の好ましい態様と関連して用いられる場合、配列が図１Ｂに表されるような基底ステム（ｂａｓａｌ  ｓｔｅｍ）および内部ループおよび末端ステムループを含んでなる特徴的な二次構造モデルにフォールディングし、好ましくはステム領域に代償的塩基交換が存在する該構造にフォールディングし、そして好ましくは一本鎖の範囲に置換、欠失および／もしくは挿入が存在する該構造にフォールディングし、そして最も好ましくはサイズが図１Ｂにそして配列が配列番号１に対応する該構造にフォールディングするように理解されるものとする。
【００１７】
本発明の核酸（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）もしくは本発明の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）という用語はまた、好ましくは当該部分がグレリンへの結合および非生物活性グレリンから生物活性グレリンを、すなわち、特にデスオクタノイル−グレリンからオクタノイル−グレリンを識別することに関与する限りにおいて、本明細書に開示される核酸配列の一部を含んでなる核酸も含んでなるものとする。そのような核酸は、例
えばトランケーションにより、本明細書に開示されるものから得ることができる。トランケーションは、本明細書に開示されるような核酸の末端のいずれかもしくは両方に関係していることができる。また、トランケーションは、ヌクレオチドの内部配列に関係していることもでき、すなわち、それは、それぞれ、５’および３’末端ヌクレオチドの間のヌクレオチド（１つもしくは複数）に関係していることができる。さらに、トランケーションは、本明細書に開示される核酸の配列からのわずか１個のヌクレオチドほどの欠失を含んでなるものとする。トランケーションはまた、本発明の核酸（１つもしくは複数）の１つより多い範囲に関係していることもでき、ここで、該範囲は、わずか１個のヌクレオチドほどの長さであることができる。
【００１８】
本発明の核酸は、Ｄ−核酸もしくはＬ−核酸のいずれかであることができる。好ましくは、本発明の核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の１つもしくはいくつかの部分はＤ−核酸として存在し、または核酸の少なくとも１つもしくはいくつかの部分はＬ−核酸であることが可能である。核酸の「部分」という用語は、わずか１個のヌクレオチドほどを意味するものとする。そのような核酸は、それぞれ、Ｄ−およびＬ−核酸と本明細書において一般的に呼ばれる。
【００１９】
本発明の核酸もしくは本発明の核酸という用語はまた、好ましくは当該部分もしくは核酸がオクタノイル−グレリンへの結合およびデスオクタノイル−グレリンを識別することに関与する限りにおいて、本明細書に開示される核酸配列およびそれに結合している他の配列を含んでなる核酸も含んでなるものとする。伸長、すなわち、本明細書に開示される特定の核酸配列に結合している追加配列は、該配列が５’末端もしくは３’末端または両方のいずれかで伸長されるようにであることができ、そしてそれはどちらの側にも１００ヌクレオチド程度、好ましくはどちらの側にも５０ヌクレオチド程度、より好ましくはどちらの側にも２０ヌクレオチド程度、そして最も好ましくは配列番号２０として本明細書に開示される完全なもしくは部分的５’−隣接配列および／または配列番号２１として本明細書に開示される完全なもしくは部分的３’−隣接配列を含んでなることができる。本明細書において用いる場合、部分的という用語は、本発明の好ましい態様としてそれぞれの配列の単一ヌクレオチドまたはそれが関連する配列、さらに特に配列番号２０および２１のいずれかに記載の隣接配列において相互に隣接するそのような配列の２個もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列を意味する。
【００２０】
本発明の核酸はさらに長い核酸の一部であり、ここで、このさらに長い核酸はいくつかの部分を含んでなり、ここで、少なくとも１つの部分は本発明の核酸もしくはその一部であることもまた本発明の範囲内である。これらのさらに長い核酸の他の部分は、Ｄ−核酸もしくはＬ−核酸のいずれかであることができる。任意の組み合わせを本発明に関連して用いることができる。さらに長い核酸のこれらの他の部分（１つもしくは複数）は、結合することと異なる機能を示すことができる。１つの可能な機能は、例えば、固定化、架橋、検出もしくは増幅のためのような他の分子との相互作用を可能にすることである。
【００２１】
Ｌ−核酸は、本明細書において用いる場合、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＬ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【００２２】
Ｄ核酸は、本明細書において用いる場合、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＤ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【００２３】
本発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドもしくは両方の組み合わせ（該組み合わせは、例えば、少なくとも１個のＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１個のＤ−核酸からなる範囲のランダムな組み合わせもしくは定義された配列である）からなるかどうかにかかわらず、該核酸はデオキシリボヌクレオチド（１個もしくは複数）、リボヌクレ
オチド（１個もしくは複数）もしくはその組み合わせからなることができる。
【００２４】
本発明の核酸をＬ−核酸として設計することは、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸は、天然に存在する核酸の鏡像異性体である。Ｄ−核酸は、しかしながら、ヌクレアーゼの広範囲に及ぶ存在のために水溶液においてそして特に生体系もしくは生体サンプルにおいてあまり安定ではない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞からのヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解することができない。このために、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物および人体を包含する、そのような系において著しく増加される。Ｌ−核酸の分解性を欠くことのために、いかなるヌクレアーゼ分解産物も生成されず、従って、それに起因するいかなる副作用も認められない。この特徴は、グレリンの存在を伴う疾患および／もしくは障害の治療において用いられる事実上全ての他の化合物からＬ−核酸を画する。
【００２５】
本発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸もしくはＤ，Ｌ−核酸として存在するかどうかまたはそれらがＤＮＡもしくはＲＮＡであるかどうかにかかわらず、一本鎖もしくは二本鎖核酸として存在し得ることもまた本発明の範囲内である。典型的に、本発明の核酸は、一次配列に起因する特定の二次構造を示し、従って３次構造を形成することもできる一本鎖核酸である。しかしながら、本発明の核酸はまた、相互に相補的である２本の鎖が相互にハイブリダイズしているという意味において二本鎖であることもできる。これは核酸に安定性を与え、それは、核酸がＬ型よりむしろ天然に存在するＤ型で存在する場合に有利である。
【００２６】
本発明の核酸は、改変することができる。そのような改変は、核酸の単一のヌクレオチドに関係していることができ、そして当該技術分野において周知である。そのような改変の例は、とりわけ、Ｋｕｓｓｅｒ，Ｗ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４：２７−３８；Ａｕｒｕｐ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２，２０−４；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２３，２０１９−２４；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２，６３３−８；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２，６８３−９５；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，３６，８３１−４１；Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７８３２−８；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，４６９，２１３−４３に記述されている。
【００２７】
本発明の核酸は、多くの部分に分かれた核酸であることができる。多くの部分に分かれた核酸は、本明細書において用いる場合、少なくとも２本の核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２本の核酸鎖は機能単位を形成し、ここで、該機能単位は標的分子に対するリガンドである。少なくとも２本の核酸鎖は、２本の鎖を生成するように核酸を切断することによりもしくは本発明の、すなわち全部の核酸の第１の部分に対応する１つの核酸および全部の核酸の第２の部分に対応するもう１つの核酸を合成することにより本発明の核酸のいずれかから得ることができる。切断および合成の両方とも、上記に例示するような２本より多い鎖がある多くの部分に分かれた核酸を作製するために適用することができると認識されるべきである。言い換えれば、少なくとも２本の核酸鎖は、様々な核酸部分の間である程度の相補性は存在し得るが、相補的でありそして相互にハイブリダイズする２本の鎖と典型的に異なる。
【００２８】
結合定数を決定する可能性は、いわゆるビアコア装置の使用であり、それもまた当業者に既知である。親和性もまた、本明細書において用いる場合、実施例５に記述されるような「ビーズアッセイ」の使用により測定された。本発明の場合にはグレリンである標的による核酸との間の結合の強さを表すために適切な尺度は、いわゆるＫｄ値であり、それは
そのようなものとしてその決定の方法と同様に当業者に周知である。
【００２９】
本発明の核酸は、ある種のＫｄ値を特徴とする。好ましくは、本発明の核酸により示されるＫｄ値は１μＭ未満である。約１μＭのＫｄ値は、標的への核酸の非特異的な結合に特徴的であると言われる。当業者により認識されるように、本発明の核酸のような一群の化合物のＫｄ値は、ある範囲内である。約１μＭの上記のＫｄは、Ｋｄ値の好ましい上限値である。標的に結合する核酸のＫｄの好ましい下限値は、約１０ピコモル以上であることができる。非生物活性グレリンから生物活性グレリンを、すなわち、好ましくはデスオクタノイル−グレリンからオクタノイル−グレリンを識別する個々の核酸のＫｄ値は、１０ｐＭ〜１μＭのこの範囲内、より好ましくは１００ｐＭ〜５００ｎＭの範囲内、そして最も好ましくは１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲内であることは、本発明の範囲内である。
【００３０】
本発明の核酸分子は、それらが標的分子に結合し、そして非生物活性グレリンから生物活性グレリンを、すなわち、好ましくはデスオクタノイル−グレリンからオクタノイル−グレリンを識別することが依然としてできるならば任意の長さを有することができる。本発明の核酸の好ましい長さがあることは、当該技術分野において認識される。典型的に、該長さは１５〜１２０ヌクレオチドの間である。１５〜１２０の間の任意の整数は本発明の核酸の可能な長さであることは、当業者により認識される。本発明の核酸の長さのさらに好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチドおよび約３０〜５０ヌクレオチドの長さである。
【００３１】
本発明の生物活性および生物不活性グレリンの識別のためのアッセイは、当業者が既知であるような標準的技術を用いて行われることができる。好ましい態様として、該アッセイは９６ウェルプレートにおいて行われることができ、ここで、成分は請求項に従って開示されるような反応容器に固定される。場合により、複合体は複合体形成後に反応容器から取り除かれることができる。
【００３２】
１つの態様として、本発明の核酸分子は第二の検出手段により分析され、ここで、該検出手段は分子ビーコンである。分子ビーコンの方法論は、当業者に既知である。簡潔に言えば、分子ビーコンとも呼ばれる核酸プローブは、検出される核酸サンプルの逆相補物であり、そしてこのために、検出される核酸サンプルの一部にハイブリダイズする。核酸サンプルに結合すると、分子ビーコンのフルオロフォア基は分離され、それは蛍光シグナルの変化、好ましくは強度の変化をもたらす。この変化は、存在する核酸サンプルの量と相関性がある。
【００３３】
本明細書において本発明の核酸とも呼ばれる本発明の核酸、および／もしくは本発明のアンタゴニストは、薬剤の作製もしくは製造に用いることができる。そのような薬剤は、場合により追加の製薬学的に活性の化合物と一緒に、本発明の核酸の少なくとも１つを含有し、ここで、本発明の核酸は、好ましくは、製薬学的に活性の化合物自体として作用する。そのような薬剤は、好ましい態様として少なくとも１つの製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。そのような担体は、例えば、水、バッファー、澱粉、糖、ゼラチンもしくは任意の他の許容しうる担体物質であることができる。そのような担体は、当業者に一般的に既知である。そのような薬剤をその処置および／もしくは予防に用いることができる疾患および／もしくは障害および／もしくは病的症状には、肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに心臓血管疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。当業者により認識されるように、本発明の核酸は、グレリンに対するアンタゴニストをそのようなアンタゴニストを必要とする患者に投与することができそしてそのようなアンタゴニストが疾患もしくは障害の原因を取り除くためにまたは少なくとも疾患もしくは障害からの影響を減らすために
適当である任意の疾患において事実上用いることができる。そのような影響には、肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍処置、血圧ならびに心臓血管疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的のために、エネルギーバランスの調節は疾患と見なされる。さらに特に、該使用は、エネルギーバランスの調節がグレリンにより直接的にもしくは間接的に影響を受け、そしてグレリンの生物学的利用能の減少が所望される任意の疾患の処置のためである。同じことが糖代謝、血圧ならびに食欲および体重に当てはまる。場合により全身もしくは局所使用で、本発明の核酸を用いて処置することができるさらなる疾患は、下垂体腫瘍、先端巨大症、中心性（ｃｅｎｔｒａｌ）クッシング症候群、副腎性クッシング症候群、腫瘍随伴性クッシング症候群、異所性クッシング症候群、副腎腫瘍、ストレス、副腎皮質機能亢進症、心不全、心筋梗塞、卒中、副腎皮質不全、低血圧症、大動脈弁狭窄症、肺緊張亢進（ｐｕｌｍｏｎａｌ  ｈｙｐｅｒｔｏｎｉａ）、収縮性心内膜炎、感染症、感染性中毒性低血圧症、血液量減少および低ナトリウム血症を含んでなる群から選択することができるものである。
【００３４】
本発明の核酸ならびにアンタゴニストは、薬剤としてもしくは薬剤の製造のためにだけでなく、美容目的のために、特に肥満症におけるグレリンの関与に関しても使用することができると理解されるべきである。同じ目的で、本発明の核酸ならびにアンタゴニストは、食品添加剤、体重管理の手段および／もしくは食欲制御の手段として用いることができる。本発明の核酸ならびにアンタゴニストを含んでなる組成物は、上記の目的のいずれかのために用いることができる。
【００３５】
本発明の核酸はさらに、薬剤設計の出発材料として用いることができる。基本的に、２つの可能な方法がある。１つの方法は化合物ライブラリーのスクリーニングであり、一方、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは低分子量化合物ライブラリーである。そのようなライブラリーは、当業者に既知である。あるいはまた、本発明の核酸は、薬剤の合理的設計に用いることができる。
【００３６】
薬剤の合理的設計は、本発明の核酸のいずれかから開始することができ、そして本発明の核酸の構造と同様であるかもしくは本発明の核酸の構造の結合媒介部分と同一である構造、好ましくは３次元構造を含む。いずれの場合でもそのような構造は、本発明の核酸と同じもしくは同様の結合特性を依然として示す。薬剤の合理的設計におけるさらなる段階においてもしくは代替段階として、神経伝達物質に結合する核酸の部分の好ましくは３次元構造は、ヌクレオチドおよび核酸と異なる化学基で模倣される。この模倣により核酸と異なる化合物を設計することができる。そのような化合物は、好ましくは小分子もしくはペプチドである。
【００３７】
当業者に既知である競合アッセイを用いることによるような、化合物ライブラリーのスクリーニングの場合、適切なグレリンアナログ、グレリンアゴニストもしくはグレリンアンタゴニストを見出すことができる。そのような競合アッセイは、下記のように設定することができる。本発明の核酸、好ましくは標的に結合するＬ−核酸であるシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を固相に連結する。グレリンアナログを同定するために、標識したグレリンをアッセイに加えることができる。潜在的アナログは、シュピーゲルマーに結合するグレリン分子と競合し、それはそれぞれの標識により得られるシグナルの減少に同調する。アゴニストもしくはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者に既知であるような細胞培養アッセイの使用を含むことができる。
【００３８】
本発明のキットは、本発明の核酸の少なくとも１つもしくはいくつかを含んでなることができる。さらに、該キットは、少なくとも１つもしくはいくつかの陽性もしくは陰性コントロールを含んでなることができる。陽性コントロールは、例えばグレリン、好ましく
は液状で、特にそれに対して本発明の核酸が選択されるかもしくはそれに結合するものであることができる。陰性コントロールは、例えば、グレリンと同様の生物物理学的性質に関して定義されるが、本発明の核酸により認識されないペプチドであることができる。さらに、該キットは、１つもしくはいくつかのバッファーを含んでなることができる。様々な成分は、乾燥もしくは凍結乾燥形態でキットに含有されるかまたは液体に溶解されることができる。キットは１つもしくはいくつかの容器を含んでなることができ、それらはまたキットの１つもしくはいくつかの成分を含有することができる。
【００３９】
それぞれ、実施例および図面に開示される配列のいずれも、そのようなものとして開示され、そして任意のそのような配列を本発明の任意の態様および実施形態において使用することができると理解されるべきである。
【００４０】
本発明は、図面、実施例および配列表によりさらに説明され、それらからさらなる特徴、実施形態および利点を理解することができる。
【００４１】
以下の表は、配列番号を本明細書に記述される様々なクローンおよび識別名にそれぞれ結び付ける。逆の形で示されない場合、核酸配列は（＋）鎖として表され、そして２’ＯＨ−リボヌクイレオチドにより構築される。
【００４２】
【表１】
2007513608.tif 000002
【実施例】
【００４３】
実施例１  グレリンに結合する核酸リガンド
欧州特許出願ＥＰ  ０２０  ２３  ６２７．８および国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８５４２にグレリンに結合する核酸リガンドの作製は記述されている。選択プロセスにおいて得られる、そのような核酸リガンドの１つの群を図１Ａに示す。クローンＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１は、この群における最も豊富な配列であり、そして該群の他のメンバー全てのように、長いバージョンおよび欠失バージョン（Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１［８６］およびＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１［４７］）において機能性である。欠失クローンの伸長のために、示すコア配列に５’−隣接配列および３’−隣接配列を付加することができる。
５’−隣接  ５’−ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＡＣＵＵＣＡＣＵ−３’    配列番号２０
３’−隣接  ５’−ＵＡＣＣＡＣＵＧＵＣＧＧＵＵＣＣＡＣ−３’  配列番号２１
図１Ａに欠失バージョンのみを要約し、そして本特許出願では、これらの欠失クローンに関する結果を提示するだけである。しかしながら、本明細書に開示されるＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１［４７］の特性はまた、全ての欠失配列の全ての伸長バージョンにも関する。
【００４４】
Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１群における個々のクローンは非常に保存されており、そして長い範囲の配列同一性を示す。以下の共通配列は、図１Ａに示すクローンから得られることができる：
ＣＧＵＧＹＧＮ（０〜３）ＡＧＧＹＡＮ（０〜１４）ＡＡＡＡＣＮ（１〜３）ＵＡＡＲＷＣＣＧＡＡＧＧＵＡＡＣＣＡＷＵＣＣＵＡＣＮ（０〜２）ＡＣＧ（配列番号１）
（式中、ＹはＵもしくはＣを表し、ＲはＡもしくはＧを表し、ＷはＵもしくはＡを表す）。
【００４５】
示すように、ヌクレオチド置換は数箇所においてのみ見られる。さらに、配列挿入が存在する、４つの特定の領域があり；これらの挿入部位はＩｎｓ１〜Ｉｎｓ４と呼ばれ、そして配列番号１における文字「Ｎ（ｘ〜ｙ）」に対応する。これらの位置で任意の数の、好ましくは配列番号１の括弧中に示す数の任意のヌクレオチドが挿入されることができる。挿入部位２において、挿入される好ましいヌクレオチドはアデノシン残基である。
【００４６】
Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１の配列は、基底ステム、内部ループおよび末端ステムループ構造を含んでなる、図１Ｂに示す特徴的な二次構造にフォールディングする。該群内の全ての配列の詳細な分析により、配列の挿入部位は主に内部ループ（Ｉｎｓ２）の領域に該当することが示される。末端ステムループならびに基底ステムはいつも同一であり、そしてグレリンに結合する分子のこのファミリーおよびそれらの特定の特性に非常に特徴的であるように思われる。図１Ｂに示す二次構造を破壊しないかもしくはほんのわずかしか破壊しない、当業者に明らかな、いくつかの配列置換は、核酸の特定の機能、すなわち、生物活性グレリンを生物不活性のものから識別することの損失なしに、実施できることを記載する必要がある。欧州特許出願ＥＰ  ０２０  ２３  ６２７．８および国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８５４２に開示されるいくつかの選択において、これらの種類の改変配列は見出された。Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１に記述されている特徴は、配列および構造に関して十分に保存されている配列に移しかえることができる。
【００４７】
実施例２  グレリンに誘発されるカルシウム放出を分析する方法
グレリンに結合するシュピーゲルマーの機能的特性化は、グレリンとヒト成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ）との相互作用をモニターする細胞アッセイ系において行われる。受容体−リガンド相互作用に起因する細胞内カルシウム放出は、蛍光カルシウム指示薬を用いて視覚化される。
【００４８】
ヒトグレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）を発現する安定なトランスフェクションされたＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ，Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手）を透明な底を有するブラック９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にウェル当たり５〜７ｘ１０４個の細胞で接種し、そして１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍ
ｌのストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび２．５μｇ／ｍｌのファンギゾンをさらに含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）において３７℃および５％  ＣＯ２で一晩培養する。
【００４９】
カルシウム指示薬色素ｆｌｕｏ−４を負荷する前に、細胞を２００μｌのＣＨＯ−Ｕ＋（ＵｌｔｒａＣＨＯ培地中５ｍＭのプロベネシド、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で１回洗浄する。次に、５０μｌの指示薬色素溶液（ＣＨＯ−Ｕ＋中１０μＭのｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、０．０８％のｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を加え、そして細胞を３７℃で６０分間インキュベーションする。その後で細胞を１８０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で３回洗浄する。最後にウェル当たり９０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋を加える。
【００５０】
刺激アッセイにおいて、オクタノイル型もしくはデスオクタノイル型のいずれかの、ヒトもしくはラットＬ−グレリンの全長もしくは欠失バージョンを示すように用いる［Ｌ−グレリンおよびデスオクタノイル−Ｌ−グレリンは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手し、そしてＬ−グレリン（１−５）、Ｌ−グレリン（１−１０）およびデスオクタノイル−Ｌ−グレリン（１−５）は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｒｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）からであった］。
【００５１】
それぞれのペプチドを０．２ｍｌの薄型９６チューブプレートにおいて室温で１５〜６０分間ＣＨＯ−Ｕ＋中でインキュベーションする。これらの刺激溶液において、ペプチドはアッセイと比較して１０倍濃縮される。カルシウム放出の検出のために、刺激溶液を細胞に加え（１０μｌ／ウェル）、そして蛍光シグナルの変化をモニターする。蛍光シグナルの測定は、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマルチディテクションプレートリーダー（ＢＭＧ）において４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で行われる。
【００５２】
いくつかのサンプルの平行測定では、９６ウェルプレートの１（垂直）列のウェルを一緒に記録する。４秒の時間差を有する最初の３回の読み取りは、ベースラインの決定のために行われる。次に記録を中断し、そしてプレートを装置から取り出す。マルチチャンネルピペットを用いて、１０μｌの刺激溶液をウェルに加え、次にプレートを再び装置に入れ、そして測定を続ける。４秒の時間間隔で全部で２０回の記録を行う。
【００５３】
各ウェルについて最大蛍光とベースライン値との差（Ｆｍａｘ−Ｆｍｉｎ）を決定し、そしてグレリン濃度に対してプロットする。図２に、ヒトオクタノイル−およびデスオクタノイル−グレリン（全長および欠失ペプチド）の用量反応曲線を示す。全長および欠失オクタノイル−グレリンは、両方とも、しかしながら異なる程度に、カルシウム放出を誘発し：全長オクタノイル−グレリンは３０ｎＭの濃度で最大活性を示し、一方、オクタノイル−グレリン１−５のみはさらに高いペプチド濃度で刺激し、そして観察される濃度範囲で最大シグナル強度に到達しないことが判明する。両方のペプチドのデスオクタノイル型は、アッセイにおいて分析するあらゆる濃度でヒトグレリン受容体を刺激しない。この実験は、グレリンの５個のＮ末端アミノ酸がヒトグレリン受容体の刺激に十分であること、およびオクタノイル基がグレリンの生物活性に必須であることを裏付ける。
【００５４】
実施例３  グレリンに結合するシュピーゲルマーによるグレリン誘発性カルシウム放出の阻害
グレリンに誘発されるカルシウム放出の阻害を実施例２に記述する細胞アッセイを用いて測定した。方法の改変として、阻害アッセイにおける刺激溶液に様々な量のシュピーゲルマーＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１を補足した。コントロールとして、ペプチドのみを有するサンプル（最大カルシウム放出）およびペプチドなしのサンプル（最小カルシウム放出）を分析した。室温で１５〜６０分間のインキュベーション後に、１０μｌの刺激溶液を細胞に
加え、５ｎＭのペプチド最終濃度をもたらした。通常、０．１ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭおよび１００ｎＭのシュピーゲルマー最終濃度を選択した。
【００５５】
各ウェルについて最大蛍光とベースライン値との差（Ｆｍａｘ−Ｆｍｉｎ）を決定する。１００％の活性（阻害なし）および０％の活性（完全な阻害）の値は、コントロールサンプル（「ペプチドのみ」および「ペプチドなし」のサンプル）から得ることができる。全ての他のサンプルでは、対応する活性を「パーセント」単位で計算し、そしてシュピーゲルマー濃度に対してプロットし（阻害曲線）、最大の半分の（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）阻害定数（ＩＣ５０）の決定を可能にする。
【００５６】
図３は、オクタノイル−グレリンの全長および欠失型でＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の阻害活性を分析する、実験から得られる阻害曲線を示す。シュピーゲルマーは、試験するオクタノイル−グレリンの全ての型：全長ペプチド、グレリン１−１０およびグレリン１−５の活性を阻害することが判明する。ＩＣ５０値は、全ての３種のペプチドで有意な偏差を示さない（全長グレリン：７ｎＭ、グレリン１−１０：９ｎＭ、グレリン１−５：５ｎＭ）。シュピーゲルマーの結合領域は、アミノ酸１〜５を含んでなる、グレリンのＮ末端に位置すると結論付けることができる。この最小モチーフへのＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の結合は、細胞アッセイにおけるグレリン生物活性の効率のよい阻害をもたらす。
【００５７】
実施例４  グレリンに結合するシュピーゲルマーによるオクタノイル−グレリンおよびデスオクタノイル−グレリンの識別
グレリンへのシュピーゲルマーＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の結合の特性を実施例３に記述する方法に基づいて競合アッセイにおいてさらに分析した。これらのアッセイでは、シュピーゲルマーを細胞の刺激の前に刺激溶液においてグレリンペプチドの異なる組み合わせとインキュベーションした。
【００５８】
ペプチドの組み合わせのスキームおよび全長グレリンでの実験の結果を図４に要約する（棒は左から右に番号が付けられる）：グレリンなしに、もしくは３００ｎＭの最終濃度のデスオクタノイル−グレリンで、細胞の刺激を検出することはできず（棒１および２）、一方、１０ｎＭの濃度のオクタノイル−グレリンはすでにカルシウム放出を媒介するのに十分であり（棒３）；３００ｎＭのデスオクタノイル−グレリンのさらなる添加（棒４）は細胞刺激を妨げず、生物学的に不活性のデスオクタノイル−グレリンは受容体アンタゴニストではないことを示す。１０ｎＭのオクタノイル−グレリンにより媒介されるカルシウム放出は、３倍過剰のＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１により阻害することができ（棒５）、そしてオクタノイル−グレリンより３０倍過剰（３００ｎＭ）のデスオクタノイル−グレリンの存在でさえ阻害に競合しない（棒６）。対照的に、３００ｎＭのオクタノイル−グレリンおよび３０ｎＭのシュピーゲルマーのアッセイ濃度は、増加したカルシウム放出を示し（棒７）、アッセイ条件下でオクタノイル−グレリンでの刺激増強を達成できるという証拠を与える。この実験は、Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１が、オクタノイル型およびデスオクタノイル型のグレリンを特異的に識別することを示す。
【００５９】
実験を全長ペプチドの代わりにグレリン１−５で繰り返し、同じ結果が示された（図５）。しかしながら、グレリン１−５のより弱い刺激活性に応じて、シグナルは比較上低い。
【００６０】
実施例５  オクタノイル−グレリンへのＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の結合の必要条件
オクタノイル−グレリン上のＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の結合部位は、ペプチドのＮ末端に位置し（実施例３を比較）、そしてオクタノイル基を含む（実施例４を比較）。結合事象のための両方の成分、ペプチドおよび脂肪酸基の重要性および関与を以下の実験において示す。
【００６１】
この実験の論理的根拠は、シュピーゲルマーがエナンチオ特異的にそれらの標的ペプチドに結合し、そしてオクタノイル基自体がアキラル基であることである。グレリンの脂肪酸部分だけでシュピーゲルマーを結合するのに十分である場合、結合事象はペプチド部分に関してエナンチオ選択的ではなく；その場合、Ｄ−ＮＯＸ−Ｂ１１およびＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１は、同様にＤ−オクタノイル−グレリンに結合するはずである。
【００６２】
ＮＯＸ−Ｂ１１をＬ−およびＤ−ＲＮＡとして化学的に合成し、そしてＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いてγ−３２［Ｐ］−ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で放射性標識した。ＲＮＡを１０％変性ポリアクリルアミドゲル上で精製し、そして０．５〜５ｐｍｏｌのＲＮＡを５μＭのビオチニル化Ｄ−グレリンと結合バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０］において３７℃で２ｈインキュベーションした。弱いシュピーゲルマー相互作用でもモニタリングを可能にするために比較的高いペプチド濃度を選択した。次に、一定量のストレプトアビジン結合ＵｌｔｒａＬｉｎｋマトリックスを加えた。マトリックスに結合したグレリン−ＲＮＡ複合体を結合バッファーで洗浄し、シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００）において計数し、そしてＤ−グレリンへの全結合のパーセンテージとしてプロットした。各実験群を三重反復で分析した。実験の結果を図６に示す。
【００６３】
Ｄ−ＮＯＸ−Ｂ１１はＤ−オクタノイル−グレリンに特異的に結合し（棒１および２）、一方、対応するＬ−鏡像異性体は機能しない（棒３および４）ことが判明した。この結果は、オクタノイル残基が主に疎水性基として働き、シュピーゲルマーＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１が効率よく結合する構造でＬ−オクタノイル−グレリンのＮ末端のＧＳＳＦＬモチーフを提示することを示す。Ｌ−オクタノイル−グレリンのペプチドおよびオクタノイル部分は、両方とも、Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１を結合するために必要である。
【００６４】
本明細書、請求項および／もしくは図面に開示される本発明の特徴は、別個にそしてその任意の組み合わせの両方で本発明をその様々な形態で実現するための材料であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】５’−隣接  ５’−ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＡＣＵＵＣＡＣＵ−３’（配列番号２０）および３’−隣接  ５’−ＵＡＣＣＡＣＵＧＵＣＧＧＵＵＣＣＡＣ−３’（配列番号２１）によりあるいは伸長されることができる、Ｌ−ＮＯＸ−Ｂ１１群のメンバー、それらの名称、それらが選択された頻度およびそれらの欠失配列を示し、そして挿入部位Ｉｎｓ１〜Ｉｎｓ４を示す。
【図１Ｂ】欠失クローンＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の二次構造モデルを示し、そして基底ステム、内部ループの５’−および３’−部分（ＩＬ  Ｉａ、ＩＬ  Ｉｂ）、ならびに末端ステムループの領域を示す。
【図２】ヒトグレリン受容体を発現するＣＨＯ細胞を用いる細胞アッセイにおける全長もしくは欠失型のオクタノイル−もしくはデスオクタノイル−グレリンにより媒介される用量依存的カルシウム放出を示す（用量反応滴定）。
【図３】シュピーゲルマーＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１による全長および欠失オクタノイル−グレリンにより媒介されるカルシウム放出の阻害を示す（阻害曲線）。
【図４】棒の下に要約する成分の組み合わせおよび濃度を有する、オクタノイル−グレリン、デスオクタノイル−グレリンおよびＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１での細胞競合アッセイの結果を示す。
【図５】棒の下に要約する成分の組み合わせおよび濃度を有する、オクタノイル−グレリン（１−５）、デスオクタノイル−グレリン（１−５）およびＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１での細胞競合アッセイの結果を示す。
【図６】ビオチニル化したＤ−オクタノイル−グレリンへの放射性標識したＤ−ＮＯＸ−Ｂ１１およびＬ−ＮＯＸ−Ｂ１１の結合を分析する、インビトロ結合アッセイの結果を示す。
【図１Ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【国際調査報告】
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