(57)【要約】本発明は、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されている遺伝子組み換えブタからの心臓弁の異種移植片に関し、さらに患者を治療するため該異種移植片を用いることに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ心臓弁の異種移植片を患者に移植することを含む、患者を治療する方法であって、前記異種移植片の細胞が、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されているものである、前記の患者を治療する方法。
【請求項２】
前記心臓弁の異種移植片が三尖弁又はその一部である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記心臓弁の異種移植片が僧帽弁又はその一部である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記心臓弁の異種移植片が大動脈弁又はその一部である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記心臓弁の異種移植片が肺動脈弁又はその一部である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記心臓弁の異種移植片が心膜組織である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ブタ心臓弁の異種移植片及び保存液を含む製造物であって、前記異種移植片の細胞が、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されているものである、前記製造物。
【請求項８】
前記保存液が、生理食塩水、組織保存剤、又は凍結保護物質である、請求項７記載の製造物。
【請求項９】
前記凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルブミン、単糖類、二糖類、又は血清である、請求項８記載の製造物。
【請求項１０】
ブタから異種移植片を準備すること（ここで、前記異種移植片は心臓弁の部分を含み、前記ブタのゲノムはα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されているものを含み、前記破壊により、前記ブタの内皮細胞は対照のブタ細胞と比べてその表面におけるＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃの発現が減少しているか又は検出できないものとなっている）、及び前記異種移植片を固定剤に接触させることを含む、ヒトに移植するための異種移植心臓弁を調製する方法。
【請求項１１】
前記固定剤が、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピンジアルデヒド、脂肪族ジアミン、芳香族ジアミン、カルボジイミド、及びジイソシアネートからなる群より選ばれるものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記固定剤がグルタルアルデヒドである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記異種移植片を凍結／解凍のサイクルに供することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質、及び成長因子からなる群より選ばれる薬剤に前記異種移植片を接触させることをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記異種移植片を滅菌することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
ブタからの心臓弁の異種移植片を含む製造物であって、前記ブタのゲノムはα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されているものを含み、前記破壊により、前記ブタの内皮細胞は対照のブタ細胞と比べてその表面におけるＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃの発現が減少しているか又は検出できないものとなっている、前記のブタからの心臓弁の異種移植片を含む製造物。
【請求項１７】
前記異種移植片がステントに取り付けられている、請求項１６記載の製造物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、米国出願第６０／５５７２３８号（２００４年３月２９日出願）に対する優先権を主張するものであり、参照してここに組み込まれる。
【連邦政府の援助による研究又は開発に関する陳述】
【０００２】
−−
【発明の背景】
【０００３】
本発明は、心臓弁の異種移植片に関し、特に、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されている動物からの心臓弁異種移植片に関する。
【０００４】
損傷した心臓弁又は病変した心臓弁の代わりに人工心臓弁が使用される。人工心臓弁には、大動脈弁、僧帽弁（二尖弁）、三尖弁、及び肺動脈弁が含まれる。機械的弁と生体型弁の二つの基本的な種類の人工心臓弁がある。機械的心臓弁は、一方向の血流をもたらすためピボット式の機械的閉塞を使用する一方、生体型弁は、天然の生体弁小葉から作られる。機械弁は、熱分解炭素からなり、消耗することはないが、終生、抗凝血剤が必要であり、血栓症及び出血の合併症の発生率が高くなる。
【０００５】
生体弁は、本来の弁に類似するものであり、終生にわたって抗凝血剤を必要とするものではないが、経時的に消耗する（一般的に約１０年後）。異種間移植材料(heterograft)又は異種移植材料(xenograft)（すなわち、移植受容体と異なる種からの心臓弁）を利用することにより、元の心臓弁の構造及び特性の多くを移植組織において保持することができる。個体に一旦移植されると、異種移植片は、超急性拒絶反応(hyperacute  rejection)（ＨＡＲ）を引き起こす（それは、移植の数分から３時間以内に起こる）。ＨＡＲはいくつかの手法により克服することができる。ＨＡＲが回避される場合、同種移植片の拒絶を防止するのに効果的な免疫抑制剤療法があったとしても、該組織は数日〜数週間以内に拒絶され得る。異種移植片は、受容者（レシピエント）への移植の前に免疫原性を減らすため化学的に処理することができ、あるいは、移植に備えて種々の物理的処理に供することができる。
【発明の要約】
【０００６】
本発明は、ブタの心臓弁及び市販可能なブタ心臓弁異種移植片がガラクトースα１，３ガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン三糖（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃ）（すなわち、Ｇａｌ抗原又はα−ｇａｌ抗原）について陽性であるという知見に基づいている。α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ核酸配列が破壊されておりかつＧａｌ抗原が減少しているか又は検出可能なＧａｌ抗原が存在しない遺伝子組み換えブタからの心臓弁の異種移植片を用いることにより、移植時の異種移植片の免疫原性を低減することができ、そして、該異種移植片の耐久性を引き延ばすことができる。
【０００７】
一態様において、本発明は、患者を治療する方法に関する。該方法は、ブタ心臓弁の異種移植片を患者に移植することを含み、該異種移植片の細胞は、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されていることを含む。該心臓弁の異種移植片は、三尖弁もしくはその一部、僧帽弁もしくはその一部、大動脈弁もしくはその一部、又は肺動脈弁もしくはその一部でありうる。該心臓弁の移植片は、心膜組織でありうる。
【０００８】
もう一つの態様において、本発明は、ブタ心臓弁の異種移植片及び保存液を含む製造物に関し、ここで、該異種移植片の細胞は、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されていることを含む。該保存液は、生理食塩水、組織保存剤、又は凍結保護物質でありうる。該凍結保護物質は、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルブミン、単糖類、二糖類、又は血清でありうる。
【０００９】
さらに本発明は、ヒトに移植するための異種移植心臓弁を調製する方法にも関する。該方法は、ブタから異種移植片を準備すること（ここで、該異種移植片は心臓弁の部分を含むものであり、該ブタのゲノムはα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されており、該破壊により、該ブタの内皮細胞は対照のブタ細胞と比べてその表面におけるＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃの発現が減少しているか又は検出できないものとなっている）、及び該異種移植片を固定剤に接触させることを含む。該固定剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピンジアルデヒド、脂肪族ジアミン、芳香族ジアミン、カルボジイミド、及びジイソシアネートからなる群より選ばれるものでありうる。グルタルアルデヒドは特に有用な固定剤である。該方法は、該異種移植片を凍結／解凍のサイクルに供することをさらに含むことができる。該方法は、抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質、及び成長因子からなる群より選ばれる薬剤に該異種移植片を接触させることをさらに含むことができる。該方法は、該異種移植片を滅菌することをさらに含むことができる。
【００１０】
他の態様において、本発明は、ブタからの心臓弁の異種移植片を含む製造物に関し、ここで、該ブタのゲノムはα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されているものであり、該破壊により、該ブタの内皮細胞は対照のブタ細胞と比べてその表面におけるＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃの発現が減少しているか又は検出できないものとなっている。該異種移植片はステントに取り付けることができる。
【００１１】
特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明に係る当業者が通常理解するところと同じ意味を有するものである。本明細書に記載するものに類似するか又は等価な方法及び材料を用いて本発明を実施することができるが、適当な方法及び材料を以下に記載する。ここで述べるすべての公報、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、参照して明細書全体に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書を考慮する。なお、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【００１２】
本発明の他の特徴及び効果は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかになる。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
一般的に、本発明は、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ核酸配列が破壊されている遺伝子組み換えブタから心臓弁の異種移植片を提供するものである。α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ核酸配列の破壊により、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が減少した又は検出できない遺伝子組み換えブタがもたらされ、その結果、そのようなブタからの内皮細胞は、その表面におけるＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃ（すなわちＧａｌ抗原）の発現が、対応する対照のブタと比べて減少しているか又は検出できないものとなっている（図５及び６）。「減少」は、対照のブタに対して、存在するＧａｌ抗原のレベルが３％未満であることを意味する。野生型ブタからの心臓組織及び心臓弁は、Ｇａｌ抗原陽性である。図１〜３をそれぞれ参照。市販可能なブタ心臓弁装置（免疫原性を減少させるインビトロ処理を受けている）でも検出可能なＧａｌ抗原を有する（図４）。従って、そのような異種移植片は、移植後時間が経過すると拒絶されるようになる。かくして、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタ（それは、Ｇａｌ抗原が減少しているか又は検出できないものである）からの異種移植片を用いることにより、異種移植片の免疫原性をさらに減少させることができる。さらに、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタ又は野生型ブタから得られる異種移植片の処理は、該異種移植片上のＧａｌ抗原のレベルを検出することによりモニターすることができる。
【００１４】
（α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ核酸配列が破壊されているブタ）
内因性のα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ核酸配列が破壊されているゲノムを含む遺伝子組み換えブタを作るため、核移植を用いることができる。例えば、内因性のα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子が不活性化され、それにより、活性なα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が妨げられるように、胎児繊維芽細胞を遺伝子操作することができ、その後、それを除核卵母細胞と融合させることができる。該卵母細胞の活性化の後、該卵を胚盤胞期まで培養し、受容者に移植する。Ｃｉｂｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９８）２８０：１２５６−１２５８，及びＳｈａｒｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００３）７５（４）：４３０−４３６参照。成熟した体細胞（例えば、卵丘細胞及び乳房細胞がある）をブタの生産に使用することもできる。例えば、Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）３９４（６６９１）：３６９−３７４、及びＷｉｌｍｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９７）３８５（６６１９）：８１０−８１３参照。核を、遺伝子操作した成熟体細胞から取り出すことができ、そして、除核卵母細胞に移植することができる。活性化の後、該卵を、２〜８細胞期又は胚盤胞期まで培養することができ、そして、適当な受容者に移植することができる。Ｗａｋａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，上記。破壊された内因性α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子について異型接合である遺伝子組み換えブタをかけ合わせて同型接合のブタを生産することができる。
【００１５】
異型接合又は同型接合の動物から得られる細胞の表面にＧａｌ抗原が存在するかどうかを判定するため、組織を、該動物から取り出し、例えば、ＯＣＴ（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ，Ｓａｋｕｒａ）包埋剤を用いて包埋することができる。組織は、切片にし、ガラススライド上に置き、空気乾燥し、そして、使用まで−８０℃で保存することができる。切片をアセトン中で固定し、水中で洗浄し、該スライドをブロックし、次いでレクチンＧＳＩＢ４とともにインキュベートすることで、Ｇａｌ抗原について組織切片を染色することができる。ＧＳＩＢ４は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販可能である。直接的又は間接的に該レクチンを標識することができる。適当な標識には、放射性核種（例えば125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ、32Ｐ、33Ｐ、又は14Ｃ）、蛍光成分（例えばフルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ、ローダミン、又はＰＥ）、発光成分（例えばＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡが供給するＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）、特定波長の光を吸収する化合物、又は酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）があるが、これらに限定されるものではない。該レクチンを、ビオチンとの結合により間接的に標識し、次いで、上記分子で標識したアビジン又はストレプトアビジンを用いて検出することができる。標識を検出又は定量する方法は、該標識の性質に依存し、当該技術において知られている。検出手段の具体例には、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、色彩計（比色計）、蛍光計、照度計、及び濃度計が含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者によく知られたこれらの方法の組合せ（「多段」分析を含む）を用いて分析感度を高めることができる。
【００１６】
（心臓弁異種移植片の取得）
ここで使用する用語「心臓弁（の）異種移植片」は、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼの核酸配列が破壊されている遺伝子組み換えブタからの、心膜組織、又は、心臓弁（例えば大動脈弁、三尖弁、二尖弁、又は肺動脈弁）もしくは心臓弁の一部（例えば小葉状の部分）を指す。遺伝子組み換えブタから完全な心臓を取り出し、適当な心臓弁の組織を摘出することにより、心臓弁の異種移植片を得ることができる。ある実施態様では、隣接組織を除くように弁の一部を切り出すことができる。例えば、弁は、個々の小葉として摘出することができる。一方、弁をそっくりそのまま摘出することができ、それは、房室口及び腱索を囲む線維輪を含んでいる。付着する組織、斑、カルシウム沈着等を除去することもできる。当該技術で知られている方法を用いて、ブタの腹膜又は心膜を採取することができる。例えば、米国特許第４７５５５９３号（参照して明細書全体に組み込まれる）に記載される腹膜採取法を参照。
【００１７】
動物を殺した後できる限りすみやかに心臓を取り出すことが特に有効である。典型的に、心臓組織の損傷を最小限に抑えるため、心臓の採取は、寒中（すなわち、概ね約５℃〜約２０℃の範囲）で厳格な無菌法の下行われる。その心臓は、適当な滅菌等張液又は他の組織保存液中に置かれる。
【００１８】
ある実施態様において、異種移植片は、ステント、リング等を用いて支持することができる。例えば、２つ又は３つの小葉を、一般的に円形の支持ワイヤーフレーム又はステントに縫い付けることができる。このワイヤーフレーム又はステントは、弁の小葉に安定した支持構造を提供することができ、そして、弁が閉じる時に該小葉組織にかかるストレスを低減するため、調節された柔軟度を付与することができる。小葉の交連及び尖頭に対して縫いつけ点を付与するため、生体適合性の覆い布を該ワイヤーフレーム又はステント上に設けることができる。同様に、移植において患者心臓内の適切な位置に弁構造物を縫いつけるための取り付け部位を設けるべく、布で覆われた縫合リングを該ワイヤーフレーム又はステントに取り付けることもできる。
【００１９】
既知の手法を用いてヒトへの移植用に異種移植片を調製することができる。例えば、米国特許第６３８３７３２号及び第６１０２９４４号参照（参照して明細書全体に組み込まれる）参照。例えば、異種移植片を固定剤に接触させることができる。典型的に、これは、細胞外成分にあるタンパク質をなめす又は架橋させるため行われ、異種移植片の免疫原性をさらに弱め又は減少させるため行われる。この処理のため任意の固定剤を用いることができ、そして、二以上の固定工程を行うことができ、あるいは、二以上の固定剤を用いることができる。適当な固定剤には、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピンジアルデヒド、脂肪族ジアミン、芳香族ジアミン、カルボジイミド、及びジイソシアネートがある。グルタルアルデヒドが特に有用である。例えば、約０．００１％〜約５％のグルタルアルデヒド（例えば０．１〜５％）を含有しかつ約７．４のｐＨを有する緩衝溶液に異種移植片を接触させることができる。任意の適当な緩衝液を用いることができ、それは、リン酸緩衝塩溶液又はトリヒドロキシメチルアミノメタンを含み、固定の間、ｐＨの制御を維持することができる。典型的に、固定は、１〜１４日（例えば１〜５日又は３〜５日）行うことができる。
【００２０】
一方、蒸気の形態の固定剤に異種移植片をさらすことができる。蒸気の形態の固定剤には、気化されたアルデヒド固定剤（例えば気化されたホルムアルデヒド）があるが、これに限定されるものではない。例えば、約０．００１％〜約５．０％（例えば約０．０１％〜約５．０％）の濃度及び約７．４のｐＨを有する気化された固定剤に異種移植片をさらすことができる。気化された固定剤にさらすことにより、異種移植片に残存する化学物質を少なくすることができる。
【００２１】
固定の後、残存する化学物質を除去するため異種移植片をゆすぐことができ、そして、残存する未反応のアルデヒド基を封鎖するため０．０１〜０．１Ｍのグリシン（例えば０．０１〜０．０５Ｍのグリシン）を添加することができる。
【００２２】
ある実施態様において、異種移植片の細胞を殺すため、異種移植片を凍結／解凍のサイクルに供することができる。任意の知られた方法を用いて異種移植片を凍結させることができる。例えば、異種移植片を液体窒素に浸漬することができ、あるいは、異種移植片を冷凍器に置いてゆっくり凍らせることができる。異種移植片を、室温（約２５℃）において約１０分間等張塩溶液浴に浸漬することにより、解凍することができる。
【００２３】
抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質、成長因子、又は異種移植片の受容者への組み込みを向上させる他の薬剤により、異種移植片を被覆することができる。
【００２４】
ある実施態様において、異種移植片を滅菌することができる。例えば、液体系（例えば、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドを用いる）、エチレンオキシドもしくはプロピレンオキシド、又は放射線を用いて、異種移植片を滅菌することができる。さらに、本発明の異種移植片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理することができ、あるいは、組織の適応性を高めるため、フィシン又はトリプシンのようなタンパク質分解酵素による限定消化によって処理することができる。
【００２５】
異種移植片は、使用のため必要になるまで凍結保存することができる。異種移植片を凍結させるため、凍結保護物質（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、アルブミン、単糖類及び二糖類、又は胎児ウシ血清などの血清）を含む溶液に異種移植片を接触させることができる。例えば、該溶液は、約０〜２５％のＤＭＳＯ、０〜２５％のグリセロール、又は０〜５０％のアルブミンを含有することができる。
【００２６】
例えば開心術を含む既知の手術法を用いて、あるいは、内視鏡手術及び経管腔移植などの低侵襲法を用いて、当業者により、前記の心臓弁の異種移植片を損傷したヒトの心臓に移植することができる。そのような手術法を行うための特定の器具は当業者に知られるものである。
【００２７】
（製造物）
異種移植片を、包装材料と組み合せたり、製造物として販売したりすることができる。製造物を製造するための構成要素及び方法はよく知られている。該製造物は、本明細書に記載される一以上の要素と組み合わせることができる。例えば、緩衝塩溶液、組織保存剤、又は凍結保護物質などの保存液とともに異種移植片を無菌容器に包装することができる。ある実施態様において、異種移植片はステントに取り付けられる。患者を治療するため異種移植片をどのように使用することができるかを記載した説明書を含めることもできる。
【００２８】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、該実施例は請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２９】
野生型のブタ（すなわちα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に破壊がないもの）からの心臓弁と、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタからの心臓弁について、Ｇａｌ抗原が存在するかどうか評価を行った。心臓組織及び／又は心臓弁を心臓から切り出した。それぞれの小さな部分をＯＣＴ（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ、Ｓａｋｕｒａ）包埋剤にいれ、−８０℃で凍結させた。すべての試料について、５ミクロンの切片を凍結ＯＣＴ包埋組織から切り出し、標準的な免疫組織学的方法を用いて染色した。α−ｇａｌ抗原（ガラクトースα１，３ガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン三糖）の発現を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＧＳＩＢ４レクチン（ＧＳＩＢ4−ＨＲＰ）の結合により検出し、標準的なＤＡＢ染色を用いて視覚化した。α−ｇａｌ抗原に対するレクチン結合の特異性は、レクチン結合を阻害する１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖を用いた拮抗阻害（競合阻害）（ＧＳＩＢ4−ＨＲＰ＋１０ｍＭα−Ｇａｌ糖）により実証された。Ｇａｌ抗原は、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタの心臓において検出できなかった（図５及び６）が、野生型ブタからの心臓及び心臓弁において検出することができた（図１〜３）。
【００３０】
市販可能なブタ生体心臓弁を切片にし、上述したとおりＧａｌ抗原について染色した。図４に示すとおり、市販可能な装置においてＧａｌ抗原を検出することができた。
【他の実施態様】
【００３１】
当然のことながら、本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、上記説明は、例示を目的とするものであり、添付の請求の範囲に規定される本発明の技術的範囲を限定するものではない。他の態様、効果、及び変更・修飾も請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】正常な（ＧＴ+/+）ブタ心臓組織のＧＳＩＢ４（グリフォニア・シンプリシフォリア(Griffonia  simplicifolia)ＩＢ４レクチン）染色を示す顕微鏡写真である。図１Ａでは、ＧＳＩＢ４−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＧＳＩＢ４レクチン）を用いた染色により、微小血管内皮上でのα−ｇａｌ抗原の広範な発現（矢印）が検出されている。図１Ｂでは、１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖による競合によってレクチン染色が阻害されている。
【図２】正常な（ＧＴ+/+）心臓弁組織のＧＳＩＢ４染色を示す顕微鏡写真である。図２Ａは、ＧＳＩＢ４−ＨＲＰによる染色を示す。図２Ｂは、１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖による競合を示す。
【図３】正常な（ＧＴ+/+）心臓弁組織のＧＳＩＢ４染色を示す顕微鏡写真である。図３Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す。図３Ｂは、ＧＳＩＢ４−ＨＲＰによる染色を示す。図３Ｃは、１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖による競合を示す。
【図４】８つの市販のブタ生体弁装置のＧＳＩＢ４染色を示す顕微鏡写真である。図４Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す。図４Ｂは、ＧＳＩＢ４−ＨＲＰによる染色を示す。図４Ｃは、１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖による競合を示す。
【図５】正常なＧＴ+/+（Ａ〜Ｃ）心臓弁とα−ｇａｌ欠損ＧＴ-/-（Ｄ〜Ｆ）心臓弁のＧＳＩＢ４染色の比較を示す顕微鏡写真である。図５Ａ及びＤは、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す。図５Ｂ及びＥは、ＧＳＩＢ４−ＨＲＰによる染色を示す。図５Ｃ及びＦは、１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖による競合を示す。
【図６】α−ｇａｌ欠損（ＧＴ-/-）心臓僧帽弁組織のＧＳＩＢ４染色を示す顕微鏡写真である。図６Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す。図６Ｂは、ＧＳＩＢ４−ＨＲＰによる染色を示す。図６Ｃは、１０ｍＭのα−ｇａｌ三糖による競合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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