(57)【要約】【課題】本発明は、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するための方法、ＡＬＳの治療における薬物の有効性を評価するための方法、および対象におけるＡＬＳの発症部位を決定するための方法を提供する。【解決手段】各方法は、（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析により試料のタンパク質を分析する工程、および（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含む。幾つかの実施態様において、該方法は、試料の質量スペクトルプロファイルを陽性または陰性標品の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含む。【選択図】図１
2007528487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するための方法であって：
（ａ）対象から試料を得る工程、
（ｂ）試料中のタンパク質を質量分析により分析する工程、
（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および
（ｄ）試料の質量スペクトルプロファイルを陽性または陰性標品の質量スペクトルプロファイルと比較する工程であって、ここで対象におけるＡＬＳが診断される工程
を含む方法。
【請求項２】
標品が陽性標品である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標品が、筋萎縮性側索硬化症を患っている対象から得られた試料を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
標品の質量スペクトルプロファイルが、２．０１キロダルトン(ｋＤａ)タンパク質ピーク、２．１６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．６６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．０１ ｋＤａタンパク質ピーク、３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４２ ｋＤａタンパク質ピーク、３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．４ ｋＤａタンパク質ピーク、４．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．９ ｋＤａタンパク質ピーク、５．１ ｋＤａタンパク質ピーク、５．４ ｋＤａタンパク質ピーク、５．８ ｋＤａタンパク質ピーク、６．２ ｋＤａタンパク質ピーク、６．５ ｋＤａタンパク質ピーク、６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８６ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８８ ｋＤａタンパク質ピーク、７．０２ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７４ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７７ ｋＤａタンパク質ピーク、８．２ ｋＤａタンパク質ピーク、８．６ ｋＤａタンパク質ピーク、８．９３ ｋＤａタンパク質ピーク、９．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．１５ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．６４ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．９ ｋＤａタンパク質ピーク、１１．５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０９ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．２８ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６５ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、および１７．１ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
標品が７Ｂ２タンパク質、シスタチンＣタンパク質、および／またはトランスサイレチンタンパク質、あるいはそれらの治療的フラグメントを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
標品が陰性標品である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
標品が、ＡＬＳを患っていない対象から得られた試料を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
対象がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
試料が、ヒトから得られた脳脊髄液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
筋萎縮性側索硬化症 (ＡＬＳ)の治療における薬物の有効性を評価するための方法であって：
（ａ）筋萎縮性側索硬化症を患っている対象から第１の試料を得る工程、
（ｂ）質量分析により第１の試料中のタンパク質を分析する工程、
（ｃ）第１の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、
（ｄ）対象に薬物を投与する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、
（ｆ）質量分析により第２の試料中のタンパク質を分析する工程、
（ｇ）第２の試料の質量スペクトルプロファイル測定する工程、および
（ｈ）第１の試料の質量スペクトルプロファイルを第２の試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程であって、ここで薬物の有効性が評価される工程
を含む方法。
【請求項１１】
薬物の有効性が、第１の試料の質量スペクトルプロファイルと比べた、第２の試料の質量スペクトルプロファイルの変化として測定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第１の試料の質量スペクトルプロファイルが、２．０１キロダルトン(ｋＤａ)タンパク質ピーク、２．１６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．６６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．０１ ｋＤａタンパク質ピーク、３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４２ ｋＤａタンパク質ピーク、３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．４ ｋＤａタンパク質ピーク、４．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．９ ｋＤａタンパク質ピーク、５．１ ｋＤａタンパク質ピーク、５．４ ｋＤａタンパク質ピーク、５．８ ｋＤａタンパク質ピーク、６．２ ｋＤａタンパク質ピーク、６．５ ｋＤａタンパク質ピーク、６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８６ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８８ ｋＤａタンパク質ピーク、７．０２ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７４ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７７ ｋＤａタンパク質ピーク、８．２ ｋＤａタンパク質ピーク、８．６ ｋＤａタンパク質ピーク、８．９３ ｋＤａタンパク質ピーク、９．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．１５ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．６４ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．９ ｋＤａタンパク質ピーク、１１．５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０９ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．２８ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６５ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、および１７．１ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
第１の試料が７Ｂ２タンパク質、シスタチンＣタンパク質、および／またはトランスサイレチンタンパク質、あるいはそれらの治療的フラグメントを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
対象がヒトである、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
第１および第２の試料が、ヒトから得られた脳脊髄液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発症部位を決定するための方法であって：
（ａ）対象から試料を得る工程、
（ｂ）質量分析により試料中のタンパク質を分析する工程、
（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程であって、ここで（ｉ）３．２６ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４４ ｋＤａタンパク質ピーク、および７．５ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む質量スペクトルプロファイルが対象の四肢におけるＡＬＳの発症を示し、ならびに（ｉｉ）２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、６．４ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．１ タンパク質ピーク、１２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．１ ｋＤａタンパク質ピーク、および１５．９ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む質量スペクトルプロファイルが対象の延髄部位におけるＡＬＳの発症を示す工程
を含む方法。
【請求項１７】
試料が、ヒトから得られた脳脊髄液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府委託研究および開発に関する陳述）
本発明は、国立環境衛生科学研究所によって選定された認可番号ＥＳ０１３４６９のもと政府支援で部分的になされた。政府は本発明において一定の権利を有するであろう。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、筋萎縮性側索硬化症のバイオマーカーおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ルー・ゲーリック病または運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）としても知られている筋萎縮性側索硬化症 (ＡＬＳ)は、中枢神経系の数種の神経変性疾患のうちの一つである。ＡＬＳは、２０，０００人に１人が冒されており、発症平均年齢が５０−５５歳である、最も一般的な成人発症運動ニューロン疾患である。ＡＬＳは、脳、脳幹、および脊髄における運動ニューロンの急速な進行性変性により特徴付けられる（Cleveland et al., Nat. Rev. Neurosci., 2, 806-19 (2001)）。診断時からの患者の生存期間中央値は５年である。
【０００４】
ＡＬＳは、散発性および家族性型の両方が存在する。家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）は、全ＡＬＳ症例のわずか５−１０％である。過去１０年間で、多くの基礎および治験研究が疾患の家族性型の理解に重点をおき、ＦＡＬＳに関連する８つの遺伝子変異体の同定につながった。Ｃｕ/Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）遺伝子の点突然変異体を発現しているトランスジェニックマウスは、毒性機能獲得によりヒトＡＬＳと同様な年齢依存的進行性運動麻痺を発現する（Rosen et al., Nature, 362, 59-62 (1993)、Rosen et al. Hum Mol Genet, 3, 981-987 (1994)、およびBorchelt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8292-8296 (1994)）。
【０００５】
これらの遺伝子変異は、しかしながら、散発性ＡＬＳ (ＳＡＬＳ)を説明しない。ＳＡＬＳの病因は多因子性である。ＳＯＤ１トランスジェニックマウス、インビトロ初代運動ニューロン培養または脊髄スライス培養、インビボ画像研究、および組織試料の死後調査を含む多くの異なるモデル系が、ＡＬＳの病因を理解するために利用されている (Subramaniam et al., Nat. Neurosci., 5, 301-307 (2002)、Nagai et al., J. Neurosci., 21, 9246-9254 (2001)、Menzies et al. Brain, 125, 1522-1533 (2002)、Kim et al. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 62, 88-103 (2003)、およびRanganathan et al., Am. J. Pathol., 162, 823-835 (2003))。これらの研究が治療標的およびいくつもの臨床試験をもたらしてきたとはいえ、疾患の発症を遅らせるまたはＡＬＳ患者の長期生存を長引かせる薬物はない。グルタミン酸アンタゴニストであるリルゾール（リルテック（Rilutek）（登録商標）、Aventis)は現在のところ、ＡＬＳを治療するために入手可能である唯一のＦＤＡ認可薬物である。リルゾールは、しかしながら、平均余命をほんの２〜３ヶ月しか伸ばさない（Miller et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neuron Disorders, 4, 191-206 (2003)）。クレアチンおよびα−トコフェノールは、ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいてＡＬＳの症状を緩和するのにいくばくかの効力が示されたが、ヒトＡＬＳ患者においてはわずかな効力を示す（Groeneveld et al., Annals of Neurology, 53, 437-45 (2003)、およびDesnuelle et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neuron Disorders, 2, 9-18 (2001)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＬＳの治療標的を同定するための改良された方法、および該疾患を診断するための改良された方法が依然として必要である。本発明はそのような方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するための方法を提供する。該方法は、（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析により試料中のタンパク質を分析する工程、（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および（ｄ）試料の質量スペクトルプロファイルを陽性または陰性標品の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含む。
【０００８】
本発明はまた、筋萎縮性側索硬化症の治療における薬物の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は、（ａ）筋萎縮性側索硬化症を患っている対象から第１の試料を得る工程、（ｂ）質量分析により第１の試料中のタンパク質を分析する工程、（ｃ）第１の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、（ｄ）対象に薬物を投与する工程、（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、（ｆ）質量分析により第２の試料中のタンパク質を分析する工程、（ｇ）第２の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および（ｈ）第１の試料の質量スペクトルプロファイルを第２の試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含む。
【０００９】
さらに提供されるのは、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発症部位を決定するための方法である。該方法は、（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析により試料中のタンパク質を分析する工程、（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程であって、ここで（ｉ）３．２６ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４４ ｋＤａタンパク質ピーク、および７．５ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む質量スペクトルプロファイルが対象の四肢におけるＡＬＳの発症を示し、ならびに（ｉｉ）２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、６．４ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．１タンパク質ピーク、１２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．１ ｋＤａタンパク質ピーク、および１５．９ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む質量スペクトルプロファイルが対象の延髄部位におけるＡＬＳの発症を示す工程、を含む。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の長所、並びにさらなる発明の特性は、ここに示された本発明の説明から明白となるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するための方法を提供する。該方法は、（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析により試料中のタンパク質を分析する工程、（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および（ｄ）試料の質量スペクトルプロファイルを陽性または陰性標品の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含む。
【００１２】
本明細書中で用いられる場合、用語「試料」は、対象から単離された生体材料を示す。対象は、任意の適切な動物であり得るが、好ましくは、マウス、ラット、サル、またはヒトなどの哺乳類である。前述の発明の方法は、対象が非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、サル、イヌなど）の場合に、疾患の動物モデルにおけるＡＬＳを診断するのに用いることができることが意図される。好ましい実施態様において、対象はヒトである。該試料は、任意の適切な生体材料を含み得るが、好ましくは特定の組織または生体液から得られた細胞を含む。試料は、任意の適切な組織または生体液から単離され得る。この点において、試料は、血液、血清、血漿、または尿であり得る。ＡＬＳは中枢神経系に影響を及ぼすので、試料は好ましくは、中枢神経系（ＣＮＳ）（すなわち、脳および脊髄）の組織または生体液から単離される。本発明の特に好ましい実施態様において、試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）から単離される。ＣＳＦは、脳および脊髄の衝撃を和らげ、脳細胞外液を調節し、向神経活性物質の分布を可能とし、そして脳により生じた老廃物を回収する。ＣＳＦは、くも膜の内側の領域であるくも膜下腔内の頭蓋および脊椎を流れている。ＣＮＳからのニューロンおよびグリア細胞由来の多くの代謝産物が、ＣＳＦに分泌される。このように、ＣＳＦは脳の代謝状態を反映している。さらに、ＡＬＳ患者由来のＣＳＦは、グルタミン酸、グルタミン合成酵素、トランスグルタミナーゼ活性、γ−アミノ酪酸、および酸化損傷の様々なマーカーのレベルの変化を同定する生化学的アッセイに用いられてきた（例えば、Spreux-Varoquaux et al., Journal of the Neurological Sciences, 193, 73-78 (2002)、Shaw et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neruon Disorders, 1, Suppl. 2, S61-67 (2000)、およびSmith et al., Ann. Neurol., 44, 696-699 (1998)参照）。
【００１３】
試料は、例えば、生検、採血、採尿、腰椎穿刺（すなわち、脊椎穿刺）、脳室穿刺、および大槽穿刺によるなどの、当技術分野で公知の任意の適切な方法で得ることができる。本発明の好ましい実施態様において、試料は、脊椎穿刺または脳脊髄液採取とも呼ばれる、腰椎穿刺により得られる。腰椎穿刺は、通常は３番目と４番目の腰椎骨の間の、ＣＳＦが採取されるくも膜下腔への脊椎針の挿入を含む。腰椎穿刺を不可能または不確実にするであろう腰椎の奇形または感染がある場合、試料は脳室穿刺または大槽穿刺により採取され得る。脳室穿刺は典型的には、切迫脳ヘルニア形成の可能性のあるヒト対象においてなされる。脳室穿刺は、頭蓋内に穴を開け、そしてＣＳＦを採取するために脳の側脳室内に直接針を挿入することを含む。大槽穿刺は、後頭骨（頭蓋の後ろ）の下方への針の挿入を含み、そして針が脳幹に接近するために危険である。
【００１４】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、およびＡＬＳのような多くの神経変性疾患は、疾患の表現型に寄与するタンパク質異常の蓄積または存在により特徴付けられ、ゆえに当技術分野で「タンパク質病（proteinopathies）」とも呼ばれる（Jellinger, Movement Disorders, 18, Suppl 6, S2-12 (2003)、およびPaulson, American Journal of Human Genetics, 64, 339-45 (1999)）。生体試料中に存在する全てのタンパク質およびペプチド配列を一時に採取することは、当技術分野で「プロテオーム」と呼ばれることが多い。このように、本発明の方法は、特定の試料のプロテオームを分析する手段を提供する。当業者は、生体試料に存在するタンパク質のプロテオミクス解析は、試料中の全てのペプチド配列の系統的な分離、同定、および特徴付けを含むことを理解するであろう。試料中のタンパク質は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により分離され得る。適切な方法には、例えば、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、およびゲル電気泳動が挙げられる。好ましくは、試料中のタンパク質は、ゲル電気泳動（例えば、一次元または二次元ゲル電気泳動）を用いて分離される。最も好ましくは、試料中のタンパク質は、試料を二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）に供することによって分離される。２ＤＧＥは典型的には、等電点分離法（ＩＥＦ）を用いた電荷による一次元でのタンパク質の分離を含む。電荷で絞ったタンパク質は、その後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いてサイズにより二次元で分離される（例えば、Lin et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1646, 1-10 (2003)、およびOng et al., Biomol. Eng., 18, 195-205 (2001)参照）。
【００１５】
試料中のタンパク質の分離に続いて、各々のタンパク質は分離媒体から単離され得る。タンパク質は、ゲルからタンパク質「スポット」を抽出するなどの、任意の適切な手法を用いて単離され得る。ゲルからのタンパク質スポットの抽出は典型的には、ゲルからのスポットの物理的切除が挙げられる。
【００１６】
一旦試料中のタンパク質が分離されると、本発明の方法は、質量分析により試料中のタンパク質を分析することを含む。質量分析において、物質は、分子をフラグメント化するのに充分なエネルギーを有する電子ビームで照射される。生じた陽性フラグメント（陽イオンおよびラジカル陽イオン）は、磁場を経て真空で加速され、質量電荷比 (ｍ／ｚ)に基づいて選別される。質量分析計において生じるイオンの多くは単位正電荷を保有するので、値ｍ／ｚは典型的には、フラグメントの分子量に等しい。任意の適切な質量分析法が、本発明の方法と一緒に用いられ得る。適切な質量分析法の例には、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、プラズマ脱離／イオン化質量分析（ＰＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ）、および表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析が挙げられる。質量分析の飛行時間型（ＴＯＦ）法において、荷電（イオン化）分子が真空で生じ、イオン光学アセンブリーにより生じた電場により自由飛行チューブに、またはドリフト時間により加速される。分子が加速されるであろう速度は、加速電位の平方根、分子の電荷の平方根に比例し、分子の質量の平方根に反比例する。荷電分子は、ＴＯＦチューブの下方に移動し、検出器に至る。質量分析法はさらに、例えば、国際特許出願公開第WO 93/24834号、米国特許第5,792,664号、米国特許出願公開第2004/0033530Al、およびHillenkamp et al., Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectroscopy of Large Biomolecules, Biological Mass Spectroscopy, Burlingame and McCloskey, eds., Elsevier Science Publ., pp. 49-60 (1990) に記載されている。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、試料中のタンパク質はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析される。表面増強脱離／イオン化過程とは、基板（この上で試料がエネルギー源に提示される）が脱離／イオン化過程において能動的な役割を果たすこれらの過程をいう。この点において、基板（例えば、プローブ）は、試料提示のための単なる受台ではない。幾つかのタイプの表面増強基板が、表面増強脱離／イオン化過程で使用され得る。一実施態様において、表面は、所定のクラスの分子に優先的に結合する、陰イオン交換基または親水基（例えば、酸化ケイ素）のような親和性材料を含む。このような親和性材料の例には、例えば、シラノール (親水性)、Ｃ８またはＣ１６アルキル（疎水性）、固定化金属キレート（配位共有）、陰イオンまたは陽イオン交換体（イオン性）あるいは抗体（生体特異性）が挙げられる。試料は、誘引力の特定の原則に従って被検分子に結合するために担体結合吸着体にさらされる。被検物が生体分子（例えば、タンパク質）の場合、エネルギー吸収物質（例えば、マトリクス）は典型的には、結合した試料に会合する。レーザーは、その後被検物を脱離およびイオン化するのに用いられ、それは検出器で検出される。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析について、各タンパク質ピークに対する質量精度は、＋／−０．２％である。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析システムは、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（Fremont, CA）から市販されている。表面増強脱離／イオン化法は、例えば、米国特許第5,719,060号、同第6,294,790号、および同第6,675,104号、および国際特許出願公開第WO 98/59360号に記載されている。
【００１８】
当業者は、質量分析解析の出力結果が、「質量スペクトルプロファイル」または「質量スペクトル」と称される、試料中のタンパク質の質量電荷比 (ｍ／ｚ)の関数としての相対強度のプロットであると理解するであろう。タンパク質「ピーク」を示すヒストグラムとして典型的に表される質量スペクトルプロファイルは、分子量の確定に役立ち、そして化合物の構造が解析される。このように、本発明の方法はさらに、試料の質量スペクトルプロファイルを測定することを含む。スペクトルにおける最も強いピークは、基準ピークといわれ、そして全ての他のピークは、基準ピークの強度と比較して記録される。ピーク自体は、典型的には非常に鋭く、そして単に垂直線として表されることが多い。
【００１９】
質量分析の間に試料中のタンパク質のフラグメント化により形成されるイオンは、タンパク質分子により形成される最も安定な陽イオンおよびラジカル陽イオンである。スペクトルにおいて観察される最も高い分子量ピークは典型的には、電子を差し引いた親分子を表し、そして分子イオン (Ｍ＋)と呼ばれる。一般的に、１３Ｃ、２Ｈなどの天然同位体の存在度により計算された分子量を超える小さなピークもまた観察される。特に不安定なプロトンを有する多くの分子は、分子イオンを提示しない。例えば、アルコールの質量スペクトル中の最も高い分子量ピークは分子イオンより１つ少ないｍ／ｚ（ｍ−１）で生じる。フラグメントは、それらの質量電荷比により同定され得るが、失った質量によりそれらを同定することがより有益である場合がある。例えば、メチル基の消失はｍ−１５にピークを発生させるであろうし、一方エチルの消失はｍ−２９にピークを発生させるであろう。
【００２０】
本発明の方法はさらに、試料の質量スペクトルプロファイルを陽性または陰性標品の質量スペクトルプロファイルと比較することを含む。「標品」により、他の分子（例えば、タンパク質）の同定、定量、および／または特徴付けを可能にする試料を意味する。疾患を診断する方法に関して、標品は、特定の疾患または疾患の進行の指標である分子を含む場合「陽性」である。このような指標分子もまた「バイオマーカー」といわれ、そして典型的には、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。標品は、特定の疾患または疾患の進行の指標である分子を欠いているか、または対象が特定の疾患を有しない指標となる分子を含む場合、「陰性」である。本発明の方法において、標品はＡＬＳの陽性または陰性診断を容易にする。標品は、本発明の方法に従って、ＡＬＳに対する特定の診断に到達するように試料と標品が有効に比較され得る限り、任意の陽性または陰性標品であり得る。本発明の好ましい態様において、陽性標品は、ＡＬＳを患っている対象から得られた試料を含む。一方、陰性標品は好ましくは、ＡＬＳを患っていない対象から得られた試料（例えば、ヒト）を含む。
【００２１】
標品がＡＬＳを患っている対象から得られた陽性標品の場合、標品の質量スペクトルプロファイルは、臨床医が信頼できる診断をするのを可能とするであろう、任意の適切な数のバイオマーカーを含み得る。陽性標品の質量スペクトルプロファイルは好ましくは、２．０１キロダルトン（ｋＤａ）タンパク質ピーク、２．１６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．６６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．０１ ｋＤａタンパク質ピーク、３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４２ ｋＤａタンパク質ピーク、３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．４ ｋＤａタンパク質ピーク、４．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．９ ｋＤａタンパク質ピーク、５．１ ｋＤａタンパク質ピーク、５．４ ｋＤａタンパク質ピーク、５．８ ｋＤａタンパク質ピーク、６．２ ｋＤａタンパク質ピーク、６．５ ｋＤａタンパク質ピーク、６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８６ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８８ ｋＤａタンパク質ピーク、７．０２ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７４ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７７ ｋＤａタンパク質ピーク、８．２ ｋＤａタンパク質ピーク、８．６ ｋＤａタンパク質ピーク、８．９３ ｋＤａタンパク質ピーク、９．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．１５ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．６４ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．９ ｋＤａ タンパク質ピーク、１１．５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０９ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．２８ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６５ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、および１７．１ ｋＤａタンパク質ピークからなる群から選択される１以上のバイオマーカーを含む。前述のバイオマーカーの存在は、タンパク質発現レベルにおける異常性（例えば、タンパク質過剰発現の結果として）、異常なタンパク質分解過程、およびタンパク質の異常な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化または酸化）と関連し得る。
【００２２】
このように、本発明の方法に従って、目的の対象(例えば、ヒト)から得られた試料の質量スペクトルプロファイルが、上述のような陽性標品の質量スペクトルプロファイルにおいて観察されるバイオマーカーの１つまたは任意の組合せを含む場合、ＡＬＳのポジティブ診断が生じる。この点において、ＡＬＳのポジティブ診断は、対象から得られた試料の質量スペクトルプロファイルが、２以上、３以上、４以上、またはさらに５以上（例えば、６、７、８、９、１０、または１５）の上記記載の陽性標品と異なるタンパク質ピークを含む場合になされ得る。実際、上記記載のタンパク質ピークの特定のサブセットは、ＡＬＳに関して診断的意義を有し得る。このようなサブセットは、好ましくは２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４６ ｋＤａタンパク質ピーク、３．０１ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８８ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７７ ｋＤａタンパク質ピーク、８．９ ｋＤａタンパク質ピーク、および１３．６５ ｋＤａタンパク質ピークを含み、そのサブセットはＡＬＳを診断する１００％の精度を提供する。あるいは、サブセットは、２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、３．０１ ｋＤａタンパク質ピーク、４．８ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８６ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７４ ｋＤａタンパク質ピーク、８．９３ ｋＤａタンパク質ピーク、および１３．１ ｋＤａタンパク質ピークを含み、そのサブセットはＡＬＳを診断する１００％の精度を提供する。これらのサブセットは、しかしながら、単なる例であり、そしてここで同定したバイオマーカーの任意の適切なサブセットがＡＬＳを診断するのに用いられ得る。加えて、ＡＬＳのポジティブ診断は、試料の質量スペクトルプロファイルを陰性標品の質量スペクトルプロファイルと比較することにより確認され得る。この点において、ポジティブ診断は、陰性標品の質量スペクトルプロファイルが対象 (例えば、ヒト)の試料の質量スペクトルプロファイル中に観察された如何なるバイオマーカーも含まない場合に確認される。
【００２３】
同じく、ＡＬＳのネガティブ診断（すなわち、対象はＡＬＳを有しない）は、目的の対象（例えば、ヒト）から得られた試料の質量スペクトルプロファイルが上述の陰性標品の質量スペクトルプロファイルと実質的に同じ場合に生じる。ＡＬＳのネガティブ診断は、試料の質量スペクトルプロファイルを陽性標品の質量スペクトルプロファイルと比較することにより確認され得る。この点において、ＡＬＳのネガティブ診断は、目的の対象の試料の質量スペクトルプロファイルが上述のような陽性標品の質量スペクトルプロファイル中に観察された如何なるバイオマーカーも含まない場合に確認される。あるいは、ＡＬＳのネガティブ診断は、陰性標品と異なるバイオマーカーの特定のサブセットを用いて確認され得る。
【００２４】
当業者は、目的の対象から得られた試料で同定されたタンパク質ピークの任意の１つまたは組合せ（すなわち、サブセット）は、陽性または陰性標品を限定し得ることを理解するであろう。あるいは、試料中のタンパク質ピークの強度値は、陽性および／または陰性標品と比較した場合に診断情報を提供し得る。換言すると、平均タンパク質ピーク強度値は、ＡＬＳを有する患者とＡＬＳを有しない患者とを識別することができる。一実施態様において、如何なる対象も陽性標品におけるＡＬＳの診断用タンパク質ピークの全てまたは陰性標品に特異的なタンパク質ピークの全てを含まないが、本発明の方法に従ってＡＬＳを有するか、またはＡＬＳを有しないとなお診断され得る。例えば、ヒトから得られた試料は、ＡＬＳの指標となる１つのタンパク質ピークを含むが、陰性標品の指標となる４つのタンパク質ピークを含み得、したがって陰性と診断され得る（すなわち、該個体はＡＬＳを有しない）。
【００２５】
上述の通り、対象におけるＡＬＳの診断は、目的の患者から得られた試料中に陽性標品のバイオマーカーの全てが存在することを必要としない。実際、ＡＬＳの診断は、患者から得られた試料が任意の１つ、陽性標品のバイオマーカーの組合せ、または陽性標品と異なるバイオマーカーの特定のサブセットを含むのであればなされ得る。加えて、ＡＬＳの診断は、対象から得られた試料が陽性標品のバイオマーカーの１以上のフラグメントまたは全長アミノ酸配列を含むのであればなされ得る。さらに、タンパク質の翻訳後修飾の結果として、ＡＬＳの診断は、対象から得られた試料が陽性標品のバイオマーカーの１以上の修飾型 (例えば、グリコシル化型)を含む場合、なされ得ることもまた意図される。 
【００２６】
タンパク質質量分析の目標の一つはタンパク質同定である。このように、本発明の方法はまた、特定の試料由来のタンパク質バイオマーカーの同定も包含する。この点において、タンパク質は当技術分野で公知の任意の適切なタンパク質同定法を用いて同定され得る。適切なタンパク質同定法には、例えば、タンパク質エレクトロブロッティング（protein electroblotting）、エドマン配列決定（例えば、Gevaert et al., Electrophoresis, 21, 1145-1154 (2000)参照）、および質量分析による配列決定（例えば、Kinter and Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectroscopy, Wiley-Interscience (2000)、および米国特許第6,632,339号および同第6,706,529号参照）が挙げられる。質量分析に基づくタンパク質同定法には、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳペプチドマスフィンガープリント法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＰＭＦ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳポストソース分解分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＰＳＤ）が挙げられる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＰＭＦにおいて、典型的には２−Ｄゲル電気泳動により精製した目的のタンパク質は、酵素的または化学的のいずれかで切断されそして得られたペプチド混合物のアリコートが質量分析手法により分析され、それによってタンパク質の質量「フィンガープリント」を生じさせる。質量フィンガープリントは、引き続いてデーターベース（例えば、ＭＯＷＳＥ、ＰｒｏＦｏｕｎｄ、ＰｅｐｔＩｄｅｎｔ、およびＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ）に蓄積されたタンパク質配列の理論上の切断により得られた「仮想」フィンガープリントと比較され、そしてトップスコアのタンパク質が可能性のある候補タンパク質として回収される（例えば、Gevaert et al., 上述, 参照）。ＰＳＤフラグメントは、ＭＡＬＤＩの後にフィールドフリードリフト領域において生じる。ＰＳＤはそもそも、アミド結合切断の結果と仮定されている。しかしながら、ＰＳＤスペクトルの高い複雑性ゆえに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＰＳＤは当技術分野においてタンパク質を同定するのに汎用されない（例えば、Gevaert et al., 上述, 参照)。本発明の好ましい実施態様において、試料中のタンパク質はＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＰＭＦにより同定される。試料中のタンパク質の予備的な同定の際、タンパク質の同定は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降法、および２−Ｄゲル電気泳動が続く等電点分離法などの当技術分野で公知の様々なタンパク質検出法により確認され得る。
【００２７】
本発明の一実施態様において、陽性標品の３．４２ ｋＤａ、１３．３ ｋＤａ、および１３．７ ｋＤａタンパク質ピークはそれぞれ、７Ｂ２タンパク質、シスタチンＣタンパク質、およびトランスサイレチンタンパク質、あるいはそれらのフラグメントまたはバリアント（例えば；７Ｂ２タンパク質のＣ末端フラグメント）に相当する。７Ｂ２タンパク質は、神経内分泌下垂体タンパク質であり、そしてMartens, FEBS Lett., 234, 160-164 (1988)にさらに記載されている。シスタチンＣは、ヒトシステインプロテアーゼインヒビターであり、遺伝性アミロイド血管症に関連している（例えば、Levy et al., J. Exp. Med., 169, 1771-1778 (1989)参照）。ヒトシスタチンＣの前駆体をコードしているｃＤＮＡ配列は、Abrahamson et al., FEBS Lett., 216, 229-233 (1987) に開示されている。トランスサイレチン（プレアルブミンとも呼ばれている）は、チロキシンおよびレチノールを輸送することが知られている四量体ヒト血漿タンパク質である。それは家族性アミロイド多発神経障害（familial amyloidotic plyneuropathy）(ＦＡＰ) アミロイド原線維の主な構成成分であり、そしておよそ６０のアミロイド形成的突然変異バリアントを有する。トランスサイレチンをコードしているヌクレオチド配列は、Tsuzuki et al., J. Biol. Chem., 260, 12224-7 (1985)に開示されており、一方トランスサイレチンのアミノ酸配列は、例えば、Mita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 124, 558-64 (1984)に開示されている。
【００２８】
本発明はさらに、対象において筋萎縮性側索硬化症の治療における薬物の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は、（ａ）筋萎縮性側索硬化症を患っている対象から第１の試料を得る工程、（ｂ）質量分析により第１の試料中のタンパク質を分析する工程、（ｃ）第１の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、（ｄ）対象に薬物を投与する工程、（ｅ）それに薬物を投与した後、対象から第２の試料を得る工程、（ｆ）質量分析により第２の試料中のタンパク質を分析する工程、（ｇ）第２の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および（ｈ）第１の試料の質量スペクトルプロファイルを第２の試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程であって、ここで薬物の有効性が評価される工程、を含む。本発明の他の実施態様に関する上記記載の試料、質量分析解析、および試料の質量スペクトルプロファイルの説明もまた、薬物の有効性を評価するための前述の発明の方法のその同じ局面に適用できる。ＡＬＳに加えて、薬物の有効性を評価するための本発明の方法は、対象において任意の適切な運動ニューロン疾患の治療における薬物の有効性を評価するのに用いられ得る。適切な運動ニューロン疾患には、例えば、進行性球麻痺、進行性筋萎縮、原発性側索硬化症、およびポリオ後症候群が挙げられる。
【００２９】
薬物は、局部的または全身性の治療が所望されるのか、および治療される部位に応じて任意の適切な方法で対象に投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮などを含む）、経口、吸入により、あるいは非経口（静脈内点滴または皮下、腔内、腹腔内、または筋肉注射によることを含む）であり得る。送達はまた、挿菅を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の部位に直接できる。薬物は好ましくは、経口的に対象に投与される。経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、またはタブレットが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法は、ＡＬＳの治療に適切な任意の薬物の有効性を評価するのに用いることができる。適切な薬物には、リルゾール（Rilutek（登録商標）、Aventis）のような現在市販されているもの、およびこれから開発されるものが挙げられる。ＡＬＳに対して活性である薬物は、おそらくは正常なタンパク質発現レベル、正常な翻訳後タンパク質修飾、および／または正常なタンパク質プロセシングを回復することにより、ＡＬＳの症状を改善または解消するであろうことは当業者に明らかであろう。このように、ＡＬＳを患っている対象から単離された第１の試料の質量スペクトルプロファイルは、薬物投与の結果として変化するであろう。それゆえ、対象から単離された第２の試料の質量スペクトルプロファイルが第１の試料の質量スペクトルプロファイル中に存在する１以上のバイオマーカーまたはバイオマーカーのサブセットを含まない、あるいは疾患の進行に特徴的な如何なる新しいタンパク質ピークも示さない場合、薬物はＡＬＳ、または他の運動ニューロン疾患の治療において有効であるとみなされる。例えば、第１の試料の質量スペクトルプロファイルがここで記載されたバイオマーカータンパク質ピークの３つを含む場合、ＡＬＳの治療において有効な薬物は、第２の試料の質量スペクトルプロファイルが第１の試料中に存在するバイオマーカーの１つ、２つを含む、または何れも含まないように、第１の試料の質量スペクトルプロファイルを変化させ得る。一方、ＡＬＳに対して有効でない薬物は、おそらく正常なタンパク質発現レベル、正常な翻訳後修飾、および／または正常なタンパク質プロセシングを回復しないであろう。このように、本発明の文脈において、対象から単離された第２の試料の質量スペクトルプロファイルが第１の試料中に存在する全てのバイオマーカーを含む場合、薬物はＡＬＳの治療において効果がないとみなされる。
【００３１】
第１の試料の質量スペクトルプロファイルは、ここに記載した任意の適切な数のＡＬＳのバイオマーカーを含み得る。第１の試料の質量スペクトルプロファイルは好ましくは、２．０１キロダルトン(ｋＤａ)タンパク質ピーク、２．１６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４ ｋＤａタンパク質ピーク、２．４６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．６６ ｋＤａタンパク質ピーク、２．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．０１ ｋＤａタンパク質ピーク、３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４２ ｋＤａタンパク質ピーク、３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、３．８ ｋＤａタンパク質ピーク、４．４ ｋＤａタンパク質ピーク、４．８  ｋＤａタンパク質ピーク、４．９ ｋＤａタンパク質ピーク、５．１ ｋＤａタンパク質ピーク、５．４ ｋＤａタンパク質ピーク、５．８ ｋＤａタンパク質ピーク、６．２ ｋＤａタンパク質ピーク、６．５ ｋＤａタンパク質ピーク、６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８６ ｋＤａタンパク質ピーク、６．８８ ｋＤａタンパク質ピーク、７．０２ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７４ ｋＤａタンパク質ピーク、７．７７ ｋＤａタンパク質ピーク、８．２ ｋＤａタンパク質ピーク、８．６ ｋＤａタンパク質ピーク、８．９３ ｋＤａタンパク質ピーク、９．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．１５ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．６４ ｋＤａタンパク質ピーク、１０．９ ｋＤａタンパク質ピーク、１１．５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０５ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．０９ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．２８ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．１ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．３ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６５ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．６８ ｋＤａタンパク質ピーク、１３．７ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１５．６ ｋＤａタンパク質ピーク、１６．７ ｋＤａタンパク質ピーク、および１７．１ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選ばれる１以上のバイオマーカーを含む。目的の対象から得られた第１の試料の質量スペクトルプロファイルは、ここに記載した陽性標品の質量スペクトルプロファイル中に観察されたバイオマーカーの１つのバイオマーカー、バイオマーカーの組合せ、またはバイオマーカーのサブセット（またはサブセットの組合せ）を含み得る。
【００３２】
本発明はさらに、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発症部位を決定するための方法を提供する。該方法は、（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析により試料中のタンパク質を分析する工程、および（ｃ）試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含む。３．２６ ｋＤａタンパク質ピーク、３．４４ ｋＤａタンパク質ピーク、および７．５ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む質量スペクトルプロファイルは、対象の四肢におけるＡＬＳの発症を示し、一方２．４ ｋＤaタンパク質ピーク、６．４ ｋＤａタンパク質ピーク、１２．１ タンパク質ピーク、１２．２ ｋＤａタンパク質ピーク、１４．１ ｋＤａタンパク質ピーク、および１５．９ ｋＤａタンパク質ピークからなる群より選択される１以上のバイオマーカーを含む質量スペクトルプロファイルは、対象の延髄部位におけるＡＬＳの発症を示す。本発明の他の実施態様に関する上記記載の試料、試料の質量分析解析、および試料の質量スペクトルプロファイルの説明もまた、ＡＬＳの発症部位を決定するための前述の発明の方法のその同じ局面に適用できる。四肢発症ＡＬＳは、ヒトにおけるＡＬＳの最初の症状が腕または脚で生じる場合に起こり、ＡＬＳ患者の大多数において起こる。延髄発症ＡＬＳは、ヒトにおけるＡＬＳの最初の症状が小脳、髄質、および脳橋を含む脳幹の部位を含む延髄部位で生じるときに起り、典型的に嚥下または会話困難として現れる。
【００３３】
先に議論した、対象におけるＡＬＳの発症部位の決定は、上述のバイオマーカーの全てが目的の対象から得られた試料中に存在することを必要としない。実際、ＡＬＳの発症部位の決定は、患者から得られた試料が上述のバイオマーカーの任意の１つ、組合せ、またはサブセットを含むのであればなされ得る。加えて、ＡＬＳの発症部位の決定は、患者から得られた試料が陽性標品におけるバイオマーカーの１以上のフラグメントまたは全長アミノ酸配列を含むのであればなされ得る。さらに、タンパク質の翻訳後修飾の結果として、ＡＬＳの発症部位の決定は、患者から得られた試料がバイオマーカーの１以上の修飾型（例えば、グリコシル化型）を含む場合になされ得ることもまた意図される。
【００３４】
以下の実施例は本発明をさらに詳しく説明するが、当然のことながら、その範囲の如何なる様式にも限定をするものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３５】
（実施例）
基本手順
対象
運動ニューロン疾患を専門とする有資格の神経内科医により行われたＡＬＳの臨床診断を最近うけた１５人の対象を含む調査集団を集めた。１４人の患者は散発性ＡＬＳの症例であったが、１人の患者はＳＯＤ１遺伝子に変異のない家族性の症例であった。これらの患者の平均年齢は、４９．６±３．４歳（ｎ＝１５）であった。幾人かのＡＬＳ患者は、リルゾール、クレアチン、抗酸化剤、またはそれらの化合物の組合せにより治療されていた。コントロール群には、平均年齢４６．７±３．８歳（ｎ＝２４）の２４人の対象が含まれていた。コントロール患者は、ＡＬＳ群と年齢が同様であり、独立（unpaired）スチューデントｔ検定を用いて解析した場合、統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．４４）。２０患者の盲検集団もまた、本研究に用いた。
【００３６】
試料調製
ヒトＣＳＦを、腰椎穿刺を介して入手し、任意の細胞片を除去するために即座に４℃にて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を等分し、−８０℃で凍結した。試料は使用前に氷上で融解した。ＣＳＦ試料中のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ（Bradford, Anal. Biochem, 72, 248 (1976)）を用いて測定した。タンパク質濃度は、０．１５ μｇ/μｌから０．８ μｇ/μｌまで変化した。全ての実験において、１０ μｇのタンパク質をチップアレイ上にスポットするのに利用した（以下に記述）。
【００３７】
質量分析
質量分析を、ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）技術（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA）を用いて行った。全部で４つのチップタイプを、ヒトＣＳＦ試料をアッセイするのに用いた：Ｈ４（疎水性表面）、ＳＡＸ２（強陰イオン交換表面）、ＷＣＸ２（弱陽イオン交換表面）、ならびにＩＭＡＣ３（固定化金属結合表面）および複数のｐＨ結合条件。２つのプロテインチップアレイ、ＳＡＸ２（強陰イオン性交換）およびＩＭＡＣ３（固定化金属親和性チップ）は、ＣＳＦに対する最高のスペクトルデータを示し、さらなる分析に利用した。ＳＡＸ２チップ上のスポットを１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ ８．５で平衡化し、そして分画した試料をスポットに添加した。ＩＭＡＣ３アレイを、１００ ｍＭ 硫酸亜鉛または１００ ｍＭ 硫酸銅で処理し、その後５０ ｍＭ 酢酸ナトリウムで洗浄した。次いで、それらをＨＰＬＣグレード水およびリン酸緩衝生理食塩水で繰り返し洗浄した。１０ μｇのＣＳＦ試料を、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)の最終濃度が０．１％となるように１％のＴＦＡに希釈した。試料を、製造業者の使用説明書に従ってＣ４ ＺｉｐＴｉｐ ｐｉｐｅｔｔｅ ｔｉｐｓ（Millipore）を用いて分画した。次いで、試料を、ＳＥＬＤＩターゲットチップ表面上で４−ヒドロキシ−α−ケイ皮酸（シナピン酸）の飽和マトリクス溶液と混合した。マトリクスを、ＨＰＬＣグレード水（Sigma, St. Louis, MO）中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル Can）および０．３％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む飽和水溶液として調製した。試料を、ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA）を用いてｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏ充填スペクトルを獲得する前に室温でエバポレートした。個別の実験毎に、全ＣＳＦ試料を、結果の再現性を実証するために２連（すなわち、２つの異なるＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓ上の２つの別々のウェル）で分析した。
【００３８】
また、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ毎に３つの別々の実験実行を行った。したがって、各試料を各実験内で２連で分析し、そして各実験を３回繰り返した。実験毎に、１つのＣＳＦ試料を、４つの選択したｍ／ｚピークからのピーク強度と比較するために内部標品として用いて、質量スペクトルの変動を測定した。これらの選択されたピークに対する分散係数（ＣＶ）は、２５％未満であった。
【００３９】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ Ｒｅａｄｅｒの外部較正を、１０００ Ｄａから２０ ｋＤａまでの範囲のペプチドを含むＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｉｘを用いて行った。乾燥したチップを、最適なレーザー強度および低質量範囲(２−２０ ｋＤａ)に対して１０００ Ｄａ、高質量範囲(２０ ｋＤａ−８０ ｋＤａ)に対して１０，０００ ｋＤａの設定の質量偏向器を有する検出器感度を用いて、較正したＣｈｉｐ Ｒｅａｄｅｒに即座にロードした。これらの設定を、全ての実験の全てのチップで一定に保った。質量／電荷（ｍ／ｚ）比は、飛行時間型（ＴＯＦ）分析を用いて決定した。これらのスペクトルを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐシステム(PBS II series; Ciphergen Biosystems Inc., Palo Alto)を用いて収集した。
【００４０】
データ分析
タンパク質ピークを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによりライセンスされたＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＰＳ）ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１、およびルール学習（Rules Learning）（ＲＬ）パラメーターアルゴリズムで分析した。ＢＰＳは、パターン認識アプローチを規定し、かつ分類ツリーを構築する分類アルゴリズムである。各ツリーは、親ノードおよび枝ノードまたは終端ノードを含む。これらのツリーの各々と関連する、相対的コスト値（relative cost value）がある。アルゴリズムはまた、ピークの感度および特異性に対する値を計算する。感度は、疾患症例の総数に対する正確に分類された疾患症例数の比として定義される。特異性は、コントロール症例の総数に対する正確に分類されたコントロール症例数の比として定義される。低コスト値を規定する短いツリーサイズは、２つのデータ群のよりよい分類を表す。これはまた、分類ツリーがＡＬＳおよびコントロール群を識別する能力を説明するピークのより高い感度および特異性も表す。最終的なツリーのサイズをクロス検証法を用いて測定し、ここで該ツリーをデータの画分上に構築し、次いでデータの残りを該ツリーの誤差率を評価するのに利用する。このツリー構築過程は、データの２つのセット（すなわち、ＡＬＳ対コントロール）の描写に関して最も価値のあるスペクトルを決定する。
【００４１】
ルール学習（Rules Learning）（ＲＬ）パラメーターアルゴリズムを、複雑な有機分子の質量スペクトルを予測するためのルール（例えば、Feigenbaum et al., Artificial Intelligence, 59, 233-240 (1993)参照）および発見的検索パラダイム（heuristic search paradigm）において実行され得る知識ベース問題解決活動としての帰納的学習を検分するために最初に用いた。ＲＬは原始的には、訓練セット内のデータにより、およびデータについての事前知識（例えば、臨床診断または症状、対象の薬物療法）により導かれる、逐次限定（successive specialization）により可能性のあるルールを検索し、診断的バイオマーカーを規定する。
【００４２】
ＲＬは、多くの科学上、商業上、および医療上のデータセットに適用されている（例えば、Lee et al., Environ Health Perspect., 104 Suppl 5, 1059-63 (1996)参照）。ＲＬに採用されている主な方法は、仮説の生成を介して試験し、かつ証拠収集により試験する仮説である。いくつかの異なる種類の統計が、証拠収集の間に用いられる。それらは、その陽性予測値およびｐ値とともに、ルール毎の確信度係数（ｃｆ）の評価を含む。ＲＬプログラムは、データセット内の試料の３分の２から予測的ルールを生成し、最高のルールセットを開発するためにこのルール生成フェーズを３回反復し、そしてその後、ルールが適当な予測をする能力を試験するためにこれらのルールを試料の残りの３分の１に適用するであろう。
【００４３】
実施例１
本実施例は、ＡＬＳ患者から単離された脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタンパク質の質量スペクトルプロファイルの同定を実証する。
【００４４】
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏ Ｗｉｚａｒｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１を用いて、ＳＡＸ２およびＺｎ−ＩＭＡＣ３データセットの両方の一変量分析を行って、コントロールとＡＬＳ対象との間で統計学的に有意なピーク強度を示すＣＳＦスペクトルのピークを同定した。ＣＳＦ試料において全部で３６６個のピーク（ＳＡＸ２チップ上で２０７およびＺｎ−ＩＭＡＣ３チップ上で１５９）を観察し、上述のデータ分析によりひき続き調べた。表１に示すように、５１個のタンパク質ピークを、コントロールとＡＬＳ対象との間のピーク強度において統計学的有意差（発現レベルの増加または減少のいずれか）を示したＳＡＸ２データセットから同定した。これらのスペクトルのピークの多くは、極めて有意なｐ値を示した（ｐ＜０．００１）。４３個のスペクトルのピークもまた、コントロールとＡＬＳ対象との間の発現レベルにおいて統計学的有意差を示したＺｎ−ＩＭＡＣ３データセットから同定した（表２）。全部で、９４個のタンパク質ピーク（２５％）が、コントロールとＡＬＳ対象との間のピーク強度において有意な変化を示した。
【００４５】
【表１】
2007528487.tif 000003
【００４６】
【表２】
2007528487.tif 000004
【００４７】
本実施例は、ＡＬＳを患っていないヒトから単離された試料の質量スペクトルプロファイルと比較した、ヒトＡＬＳ患者から単離された試料の質量スペクトルプロファイルを実証する。
【００４８】
実施例２
本実施例は、ＡＬＳの診断のためのバイオマーカーパターンの同定を実証する。
【００４９】
先に議論したように、２つの異なるコンピューター支援アルゴリズムを用いて、コントロールおよびＡＬＳ対象由来のＣＳＦのプロテオミクス特徴から潜在的な診断バイオマーカーを同定した。第１のアルゴリズムは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＰＳ）ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１であった。ＢＰＳは、疾患の状態を予測するのに用いられる１以上のタンパク質ピークを含む分類ツリーを作成する。ＳＡＸ２データセットについてこのような分類ツリーの例を図１に示す。使用された第１のピークは６２５４ Ｄａであった。カットオフ未満のピーク値を有する１１人の患者は左ノードに属し、そのうちの１００％がＡＬＳ患者である。右ノードは、６８８１ Ｄａピークでさらに分けられた２３人の対象を含む。左ノードの３人の対象の全ては、コントロールであった。次いで、２０人の対象を、９９３９ Ｄａピークで、左ノードに１人の対象、右ノードに１９人の対象に分けた。この分類ツリーは、学習フェーズの間、１００％の感度および特異性でＡＬＳを予測することができた。次いで、ＢＰＳソフトウェアは、データセットをランダム化し、そして分類ツリーを使用して、試験フェーズの間、既知の診断と比較され得る予測を行う。次いで、ＳＡＸ２分類ツリーは、７４％の感度および９５％の特異性でＡＬＳの対象を予測することができた。
【００５０】
ＢＰＳをまた、Ｚｎ−ＩＭＡＣ３ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐデータセットから潜在的なバイオマーカーを同定するために用いた（図２）。この分類ツリーにおいて、１３７７９ Ｄａの単一のタンパク質ピークを、学習フェーズの間、１００％の感度および８９％の特異性でＡＬＳを予測するのに用いた。この同じ分類ツリーは、クロス検証試験フェーズの間、８７％の感度および８９％の特異性でＡＬＳを予測できた。
【００５１】
ＣＳＦから潜在的なバイオマーカーを同定するのに用いられる第２の分析ツールは、ルール学習（Rules Learning）（ＲＬ）プログラムであった。該プログラムは、対象の疾患の状態を予測し得る一連の学習ルールを作成する。該ルールを、学習フェーズの間、データセット対象の３分の２を用いて生成する。生成したルールの３重検証を、最後のルールセットを生成するために実行する。残りのデータセット対象（全体の３分の１）を、分離瓶（separate bin）中に保持し、ランダム化し、次いで、ルールをこの試験フェーズにおける疾患の状態を予測するのに適用する。次いで、予測を対象毎に既知の臨床診断と比較し、ＲＬ生成ルールの感度および特異性を決定した。ＳＡＸ２データセットについては、ＲＬは、７つのタンパク質ピークを用いて９つのルールを同定した。ルール毎に、各予測診断的尺度を表すタンパク質ピークスペクトル強度の絶対値を提供した。例えば、６８２８ Ｄａタンパク質ピークのスペクトル強度値（ｘ）が０．１０３より大きいか、またはそれと同じであり、かつ０．８５６未満である場合、試料はコントロール対象であった。これらのルールは、試験データセットにおいて１００％の感度および８１％の特異性でＡＬＳの疾患の状態を正確に予測した。ＲＬプログラムもまた、Ｚｎ−ＩＭＡＣ３データセットに適用した。このＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐは、ＣＳＦ中の亜鉛結合タンパク質を認識する。ＲＬプログラムは、６５４６、６８６０、７５３０、１３３８０、１５１６０、および１５８７０ Ｄａの６つのタンパク質ピークを用いて７つのルールを作成した。これらのルールは、試験データセットにおいて１００％の精度および９０％の特異性でＡＬＳ疾患の状態を予測した。
【００５２】
ＢＰＳおよびＲＬ分析ツールにより生成した結果を比較し、対象の診断の予測を作成するのに一般に用いられる一連のタンパク質ピークを発見した。一般的な予測バイオマーカーは、６２５０、５８６０、１３７７９、１３９５８、および１５１６０ Ｄａのタンパク質を含んでいた。これらのタンパクのうち２つ（１３７７９および１５１６０ Ｄａ）を、Ｚｎ−ＩＭＡＣ３チップから同定し、ＡＬＳ患者において異なる発現を示す亜鉛結合タンパク質を表しているらしい。これらの５つのタンパク質ピークは、２つの異なるアルゴリズムによる同定により実証されるように最高の予測値を有するバイオマーカーを表している。ＢＰＳはまた、ＳＡＸ２およびＺｎ−ＩＭＡＣ３チップから診断指標として４つの独特のタンパク質ピークを同定し、そしてＲＬプログラムは診断指標としてさらなる８つのタンパク質ピークを同定した。したがって、２つのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓおよび２つのアルゴリズムから、全部で１７個のタンパク質ピークをＡＬＳの診断指標として同定した。全部で９つの誤った対象分類がＢＰＳを用いて見出され、そして如何なる誤った分類もＲＬプログラムを用いて見出されなかった。
【００５３】
実施例３
本実施例は、ＡＬＳを患っているヒトから得られた試料の質量スペクトルプロファイルに存在するタンパク質バイオマーカーの同定を実証する。
【００５４】
ＣＳＦを、上述のように  腰椎穿刺を介してＡＬＳ患者から採取した。バイオマーカーの同定のために試料を高めるために、５００ μｌのＣＳＦ試料を、Ｑ ＨｙｐｅｒＤカラム（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA）を用いた陰イオン交換分画により分画した。画分を、段階溶出を介して分離し、ｐＨ９、ｐＨ７、ｐＨ５、ｐＨ４、およびｐＨ３で収集した。各画分を上述のように質量分析により分析し、目的のバイオマーカーピークを同定した。３つのバイオマーカーピークを、ｐＨ４画分において同定した：６．２ ｋＤａピーク、１３．３ ｋＤａピーク、および１３．７ ｋＤａピーク。この画分を、ＹＭ−３０ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心濾過機（Millipore Corp, Billerica, MA）を用いて濃縮した。フロースルー（flow-through）を、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて乾燥し、ＳＤＳ− ＰＡＧＥサンプルバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に再懸濁し、そして１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。
【００５５】
ゲルの銀染色に続いて、１３．３ ｋＤａおよび１３．７ ｋＤａタンパク質ピークに対応する４つのバンドを、ｐＨ４画分から切り出し、精製した。具体的には、３つのゲルプラグを、パスツールピペットを用いて各バンドから切り出した。ゲル断片を、２００ μｌ ５０％ ＭｅＯＨ／１０％ 酢酸にて室温で３０分間洗浄した。次いで、ゲル断片を、１００ μｌアセトニトリル（ＡＣＮ）にて室温で１５分間脱水した。
【００５６】
タンパク質を、７０ μｌ ５０％ ギ酸／２５％ ＡＣＮ／１５％ イソプロパノール／１０％ 水にて室温で２時間激しく振盪してゲル断片から抽出した。２ μｌの抽出物をＮＰ２０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA）に適用し、そして乾燥させた。１ μｌのエネルギー吸収分子シナピン酸（ＳＰＡ）を、各タンパク質スポットに２回添加した。アレイを、ＰＢＳＩＩｃ質量分析器プロテインチップリーダー（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA）上で解析した。
【００５７】
１３．３ ｋＤａおよび１３．７ ｋＤａピークの結果として生じた質量分光学的「フィンガープリント」を、ＰｒｏＦｏｕｎｄデータベース（Version 4.10.5, The Rockefeller University）にペプチド質量情報を持つ既知のタンパク質配列と比較した。これらの比較に基づき、シスタチンＣおよびトランスサイレチンを、それぞれ１３．３ ｋＤａタンパク質ピークおよび１３．７ ｋＤａタンパク質ピークに対応する候補タンパク質として同定した。
【００５８】
本実施例は、ＡＬＳを患っているヒトから単離された試料に存在する１３．３． ｋＤａおよび１３．７ ｋＤａバイオマーカーに対応するタンパク質の同定を実証する。
【００５９】
実施例４
本実施例は、患者におけるＡＬＳの診断に使用され得るタンパク質バイオマーカーのサブセットの同定を実証する。
【００６０】
上述のようなＳＡＸ２データセットおよびＺｎ−ＩＭＡＣ３についてのＲＬアルゴリズムを用いて、ＡＬＳの診断に用いられ得るバイオマーカーのサブセットを同定した。このようなサブセットの１つは、盲検試験の対象から９２％の感度および８６％の精度でＡＬＳを診断する１０個のバイオマーカーを含んでいた（表３参照）。これらのバイオマーカーは、「初期」段階の疾患に対して最も予測的であった。つまり、このパネルは、症状の発症時の後１１００日間を超えるＡＬＳ患者に対しては予測的でなかった。
【００６１】
第２のサブセットは、１００％の精度でＡＬＳを診断する７つのバイオマーカーを含んでおり（表４参照）、一方、第３のサブセットもまた、１００％の精度でＡＬＳを診断する７つのバイオマーカーを含んでいた（表５参照）。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
【表４】
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【００６４】
【表５】
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【００６５】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、参照により援用されることが個別におよび具体的に示され、かつ本明細書中にその全体が示されているのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【００６６】
本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の指示語の使用は、本明細書中で他に示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注釈がない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書中で他に示されない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意および全ての例、または例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く例証することが単に意図され、そして他に特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして特許請求の範囲の要件を示すと解釈されるべきではない。
【００６７】
本発明の実施に関して、本発明者らが知る最良の形態を含む、本発明の「好適な実施態様」を本明細書中に記載する。それらの好適な実施態様のバリエーションは、上記の説明を読むと、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物および均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションにおける上記要件の任意の組合わせは、本明細書中で他に示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＳＡＸ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）を用いて、ＡＬＳの診断のためにＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより作成した分類ツリーを記述する図である。
【図２】図２は、Ｚｎ−ＩＭＡＣ３ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）を用いて、ＡＬＳの診断のためにＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより作成した分類ツリーを記述する図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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