(57)【要約】ｐ１８５neu腫瘍性タンパク質の様々な断片をコードする配列を含み、ＥｒｂＢファミリーの癌遺伝子を発現している腫瘍に対する免疫応答を誘導できるプラスミドおよびその医薬品組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ１８５neu断片をコードする配列を含むＤＮＡトランスファーベクターであって、前記配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４からなる群より選択されるＤＮＡトランスファーベクター。
【請求項２】
プラスミドである請求項１に記載のＤＮＡトランスファーベクター。
【請求項３】
転写プロモーターをさらに有する請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
前記プロモーターがＣＭＶである請求項３に記載のプラスミド。
【請求項５】
４つのＣｐＧモチーフをさらに含む請求項２に記載のプラスミド。
【請求項６】
８つのＣｐＧモチーフをさらに含む請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
薬剤として許容されるビヒクルおよび賦形剤との混合調剤として、請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡトランスファーベクターを含む医薬品組成物。
【請求項８】
非経口投与に好適である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
注射可能な溶液の形態である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
同時に、逐次的に、または別々に治療的に使用するための、請求項１から６に記載の少なくとも２つの異なるプラスミドを含む組合せ医薬品。
【請求項１１】
ＤＮＡワクチン接種に適切な形態である、請求項１０に記載の組合せ医薬品。
【請求項１２】
ｐ１８５neu陽性腫瘍を発症する危険性がある対象または、ｐ１８５neu発現腫瘍の原発性腫瘍、転移または再発が認められる患者の、予防的または治療的な処置に用いる医薬品組成物を調製するための、請求項１から６に記載のプラスミドの使用。
【請求項１３】
ＤＮＡワクチンの調製のための、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ１８５neuをコードする配列を含むプラスミドベクター、および腫瘍に対するＤＮＡワクチン接種におけるその使用に関する。本発明に記載のプラスミドは、ヒトまたはラットの腫瘍性タンパク質ｐ１８５neuの様々な断片をコードする配列を含み、ＥｒｂＢファミリーの癌遺伝子を発現する腫瘍に対する液性または細胞性免疫応答を誘導することができる。
【０００２】
本発明はまた、前記のプラスミドを含む医薬品組成物およびｐ１８５neuを発現する腫瘍の予防または治療のための使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ｐ１８５neuは、ラットで癌原遺伝子Ｈｅｒ−２／ｎｅｕによりコードされており、また上皮成長因子受容体ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）およびそれに関連する他の受容体（ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４）も含むチロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）のクラスＩファミリーに属している膜受容体である。これらの受容体は、細胞の増殖と分化に関与しており（Ｈｙｎｅｓと  Ｓｔｅｒｎ、１９９４  ＢＢＡ  １１９８：１６５）、したがって、生物学的におよび臨床的に高い関心を集めている。受容体は、３つのよく区別されたドメインすなわち細胞外、膜貫通および細胞質内のドメインからなる。ｐ１８５neuは、増殖と分化プロセスを調節する細胞内シグナル伝達と細胞内情報伝達の機構の複雑なネットワークに関与している（Ｂｏｙｌｅ  １９９２  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｏｎ  ｃｏｌ．４：１５６）。癌遺伝子ｎｅｕは、最初に分離された化学的に誘発したラットの神経膠芽細胞腫にちなんで名付けられている。この活性化されたｎｅｕの型には、「Ａ」の「Ｔ」による置換を引き起こし、結果としてｐ１８５neuの６６４番目のバリン残基のグルタミン酸残基による置換（Ｖａｌ６６４Ｇｌｕ）を引き起こす、１つの点突然変異がある（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：６４９）。
【０００４】
また、ヒトのｎｅｕ相同体であるＥｒｂＢ−２が分離されて特性が明らかにされ、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体もヒトのＥｒｂＢ−２も共に、ＥＧＦＲと有意な相同性を持つことが示された（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｔｅ  ２３０：１１３２；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０）。ラットの配列における遺伝子突然変異が、二量体形成を介する構成的な受容体活性化の原因であるが、ＥｒｂＢ−２陽性のヒト腫瘍で、癌遺伝子の異常発現が認められ（Ｄｉ  Ｍａｒｃｏら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３２４７；Ｋｌａｐｐｅｒら、２０００、Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７７：２５）、まれではあるが、活性化点突然変異と異常なスプライシング機構が確認されている（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ２３：６２；Ｘｉｅら、２０００、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９２：４１２）。その全体的な効果は同程度である。すなわち、遺伝子の増幅と転写レベルの増加よりｐ１８５neu膜受容体が過剰になり、リガンドとは無関係に増殖信号を細胞内で伝達している活性ダイマーが増加するという結果となる。最近報告されたヒトとラットｐ１８５neuの細胞外領域の結晶構造は、このタンパク質は、どのリガンドとも直接結合することなく、他のＥｒｂＢ受容体と相互作用ができ、増殖シグナル伝達の引き金となる強固な立体構造によって特徴づけられることを示している（Ｃｈｏ  ＨＳら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７５６）。
【０００５】
正常な状況では、ヒトｐ１８５neuは、器官形成および上皮の増殖に関係し、胎盤形成および胎生期には高レベルで発現するが、成体組織では極めて少量しか存在しない（Ｐｒｅｓｓら、１９９０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３）。
【０００６】
いくつかの研究により、ヒトｐ１８５neuの過剰発現が、腫瘍形成過程と腫瘍の侵襲レベルに関係があることが示された。ｐ１８５neuの過剰発現が、肺腺癌（Ｋｅｒｎら、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：５１８４）、結腸腺癌（Ｃｏｈｅｎら、１９８９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：８１）、卵巣腺癌（Ｓｌａｍｏｎら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７）および多数のヒト乳癌（Ｓｌａｍｏｎら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７；Ｊａｒｄｉｎｅｓら、１９９３、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６１：２６８）で報告されている。
【０００７】
ｐ１８５neuをプラスミドワクチン接種の最適な標的にする基本的特性は、ａ）ｐ１８５neuが細胞増殖および癌発生に直接関与し、したがって腫瘍の遺伝的不安定性のために、この抗原の発現を喪失したクローン変異体は腫瘍形成能も失うことと、ｂ）主要組織適合抗原系の発現を喪失した腫瘍細胞でも、抗体で認識できるようにする原形質膜上でのｐ１８５neuの発現である（Ｌｏｌｌｉｎｉ  Ｐ．とＦｏｒｎｉ  Ｇ．２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６２）。
【０００８】
活性化されたラット癌遺伝子Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを導入したマウス（ｐ１８５neu陽性乳癌を自然発症する）、およびｐ１８５neu陽性の移植可能な腫瘍細胞株を用いたネズミモデルで実施された研究で、前癌病変を予防し、治癒することができる可能性が実証された。特に、活性化したラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを導入したマウスでの乳癌の予防に関しては、ラットｐ１８５neuの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするプラスミドは、全長ラットｐ１８５neuまたは細胞外ドメイン（分泌された抗原）のみをコードするプラスミドより、効果的に生体内での防御を誘導できることをわれわれは実証した（Ａｍｉｃｉ  Ａ．ら、２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：７０３；Ｒｏｖｅｒｏ  Ｓ．ら、２０００、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５１３３）。同様の結果が、Ｃｈｅｎらによって報告されている（１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：１９６５）。他の研究者達も、未改変のまたはチロシンキナーゼ活性を失うように突然変異させたｐ１８５neuをコードするプラスミドは、ｐ１８５neu陽性細胞接種後の腫瘍発症の予防に効果があることを証明した（Ｗｅｉ  ＷＺら、１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：７４８）。さらに小胞体を介するプロセシングを担い、ｐ１８５neu抗原の細胞質での局在を決める信号（リーダー）を欠くプラスミドも、同じく効果的であることが証明された。ｐ１８５neuの膜発現の場合、様々なプラスミドにより誘導される防御は、主として液性免疫応答で媒介され、細胞質に局在する場合にはＴリンパ球媒介免疫応答で主として媒介された（Ｐｉｌｏｎ  ＳＡら、２００１、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３２０１）。しかしながら、細胞質および膜のどちらにおいても、ｐ１８５neuの過剰発現を誘発するプラスミドを用いる複合ワクチン接種は、腫瘍の増殖を防ぐためにより有効であった（Ｐｉｅｃｈｏｃｋｉ  ＭＰら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３３６７）。
【０００９】
したがって、異なる免疫応答機構間でのバランスが特に重要である可能性がある（Ｒｅｉｌｌｙら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８８０）。さらに、ラットｐ１８５neuの細胞外および膜貫通ドメインをコードするプラスミドを用いるワクチン接種により、ｐ１８５neuを過剰発現している細胞の接種後直ちに、腫瘍の排除に協同して働く免疫系の多くの異なるエフェクター機構（ＴヘルパーおよびＴキラー細胞、抗体、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー細胞、Ｆｃレセプター、ガンマインターフェロンならびにパーフォリン）を介して、直径２ｍｍの腫瘍塊を根治できることが観察されている（Ｃｕｒｃｉｏ  Ｃ．ら、２００３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１１６１）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の説明
ヒトまたはヒト／ラットキメラのｐ１８５タンパク質をコードする様々な構築物をプラスミドベクターに挿入して、腫瘍進行を予防することを目的とする免疫実験で使用した。プラスミドの構築には、膜貫通領域および短縮した細胞外ドメイン部分を含むヒトｐ１８５neuタンパク質の断片をＥｒｂＢ２癌遺伝子配列から調製するか、またはキメラプラスミドを作成するために、その一部をラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡ由来の相同的配列と置換した。
【００１１】
こうして得られたプラスミドを、ヒトｐ１８５neuを過剰発現している腫瘍細胞を接種したマウスにワクチン接種する実験で評価した。切断型のｐ１８５neuを含むプラスミドは、キラーおよびヘルパーＴリンパ球により媒介される抗腫瘍反応性を誘発するが、キメラプラスミドはヒトおよびラットのｐ１８５neuの両方に対する抗体応答を誘発した。
【００１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験の結果に基づき、細胞性および液性の型の強い免疫応答を誘発することができるｐ１８５neu配列を含むプラスミドを選択した。本発明の目的であるこれらのプラスミドは、配列番号１〜１４からなるグループから選択されるｐ１８５neu断片をコードする１つの配列含む（ヒトおよびラットｐ１８５neu参照配列は、それぞれＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ受入れ番号Ｍ１１７３０およびＸ０３３６２で入手できる）。
【００１３】
本発明によれば、ｐ１８５neuをコードする配列は、ヒトへの投与に適切な任意のプラスミドベクターに挿入することができる。コード配列の他に、プラスミドは、転写調節のための機能的エレメント、特にコード配列の上流に位置するプロモーター、好ましくはＣＭＶプロモーター、開始と終止の転写エレメント、アンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子等の選択マーカー、ＣｐＧのモチーフ、ポリアデニル化部位または転写活性因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）を含むことができる。転写調節エレメントは、ヒトで使用されるベクターとして適合しなければならない。好ましい実施の形態においては、本発明のプラスミドは、少なくとも４個、好ましくは少なくとも８個の、最大では８０個までのＣｐＧのモチーフを含む。細菌起源のＣｐＧモチーフ（ＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡ）は、マクロファージを誘導してＩＬ−１２を分泌させ、次にナチュラルキラー細胞によるＩＦＮγ分泌を誘導し、かくてＴヘルパーリンパ球により媒介される応答を活性化する（Ｃｈｕ  Ｒ．Ｓ．ら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６；１６２３）。したがって、プラスミド配列中へＣｐＧモチーフを挿入することにより、免疫応答が増強される。
【００１４】
さらなる実施態様においては、本発明は、薬剤として許容されるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）および賦形剤と共に、上記に定義した１種または複数の異なるプラスミドを含む医薬品組成物を提供する。医薬品組成物は、非経口投与に適した形態で、好ましくは注射可能な溶液の形態で、ＤＮＡワクチン接種に好都合に使用される。ＤＮＡワクチン接種に関する原理と方法は、当業者に知られており、例えば、Ｌｉｕ  ＭＡ  ２００３；Ｊ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  ２５３：４０２に開示されている。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は同時に、逐次に、または別々に対象または患者へ投与する、少なくとも２種の、好ましくは少なくとも４種の、より好ましくは少なくとも８種の異なるプラスミドを含んでいる組合せ製剤を提供する。
【００１６】
本発明にかかるプラスミド、組成物および製剤は、ｐ１８５neu陽性の腫瘍を発症する危険がある対象、またはｐ１８５neu陽性腫瘍の原発性腫瘍、転移もしくは再発を有する患者の予防もしくは治療処置に使用される。予防は、腫瘍が顕在的でないときは一次、腫瘍が前腫瘍性病変である初期過程のときは二次、または腫瘍が再発または転移過程の場合は三次とすることができる。本発明のプラスミドで治療効果が得られる腫瘍には、上皮起源の腫瘍で、特に肺、卵巣および乳房の腺癌、あるいはさらに一般的には、ｐ１８５neuタンパク質を発現している腫瘍があげられる。
発明の詳細な説明
ｐＣＭＶ３．１プラスミド骨格の構築
ヒトｐ１８５neu断片をコードするプラスミドおよびキメラプラスミドを構築するために、ｐＣＭＶ３．１プラスミドの骨格を用いた。制限酵素ＤｒａＩＩＩ（ｎｔ１５３１）およびＢｓｍＩ（ｎｔ３１８９）で、複製起点ｆ１、複製起点およびＳＶ４０初期プロモーター、ネオマイシン抵抗性遺伝子をコードする遺伝子、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む１６５８塩基対の断片を除去して、ヒト癌原遺伝子ＥｒｂＢ−２ｃＤＮＡおよびラット癌原遺伝子Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡ由来の断片を、ｐＣＭＶ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｉｌａｎｏ、イタリア）に挿入した。得られた改変されたプラスミド（ｐＣＭＶ３．１）には、本来のｐｃＤＮＡ３．１と比べていくつかの利点がある。実際、３９００塩基対へのサイズの縮小および無関係な配列の除去は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクション効率の増加に寄与する。
【００１７】
プラスミドｐＣＭＶ３．１ｅｒｂＢ２の構築
プラスミドｐＳＶｅｒｂＢ２から得られたヒトＥｒｂＢ２ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａｌの制限酵素部位でｐＣＭＶ３．１のマルチクローニングサイトに挿入した。このプラスミドを、切断して短くしたｐ１８５neuを発現するプラスミドおよびキメラプラスミドの構築に用いる。
【００１８】
配列４ＸＣｐＧを含むプラスミド：ｐＣＭＶ３．１ｈＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１ｈＥＣＤ−ＴＭ−４ｎｏＣｐＧの構築
プラスミドｐＣＭＶ３．１−ｅｒｂＢ２から細胞質内ドメインをコードする配列を除去した後、癌原遺伝子ＥｒｂＢ２の細胞外領域および膜貫通領域をコードする２つのプラスミドを調製した。この手順は先ず、ＥｒｂＢ２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列中に存在する独特の部位を同定するための制限酵素による分析を含んだ。膜貫通領域末端の約２０ヌクレオチド下流で、酵素ＡｃｃＩＩＩ（ｎｔ２１９５）で認識される独特の部位が同定された。
【００１９】
細胞質ドメインを、独特な制限酵素認識部位を示す酵素ＡｃｃＩＩＩと酵素ＸｂａＩを用いて除去した。ＥｒｂＢ２ＥＣＤ−ＴＭのＤＮＡ３’末端に、翻訳終止シグナルと認識されるヌクレオチドトリプレットＴＡＡを再挿入するために、われわれは、末端に制限酵素認識部位ＡｃｃＩＩＩとＸｂａＩを持つ、２つのセンス（オリゴヌクレオチド＃１、＃３）およびアンチセンス（オリゴヌクレオチド＃２、＃４）オリゴヌクレオチドからなる２つの合成配列を使用した。これらの合成配列中には、４つの反復配列ＣｐＧとｎｏＣｐＧが存在する。後者は陰性対照として用いる。これら２つの新規プラスミドは、ｐＣＭＶ３．１ｈＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１ｈＥＣＤ−ＴＭ−４ｎｏＣｐＧと名付けた。
【００２０】
８ＸＣｐＧを含むプラスミド：ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ−ＴＭ−８ｎｏＣｐＧ配列の構築
さらに非特異的な免疫刺激を付け加えるために、われわれは、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−４ＣｐＧと名付けた免疫刺激性のＣｐＣ配列を４つ含む新規なプラスミド骨格を構築した。このために、われわれは、２つのセンス（オリゴヌクレオチド＃５）およびアンチセンス（オリゴヌクレオチド＃６）オリゴヌクレオチドからなる合成配列により、酵素ＰｍｅＩの２つの制限酵素認識部位の１つを除去し、マルチクローニングサイトに存在するＨｉｎｄＩＩＩとＮｎｅＩに対する制限酵素認識部位が反転するようにｐＣＭＶ３．１を改変した。ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎと名付けたこの新規のプラスミドでは独特の制限酵素認識部位ＸｂａＩおよびＰｍｅＩ中に、ＣｐＧとｎｏＣｐＧ配列の４つの反複を含む、２つのセンス（オリゴヌクレオチド＃７、＃９）およびアンチセンスヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃８、＃１０）からなる２つの合成配列を挿入して、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−４ＣｐＧおよび４ｎｏＣｐＧを得た。その後、ＤＮＡ断片ｈＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧおよびｈＥＣＤ−ＴＭ−４ｎｏＣｐＧを、それぞれｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−４ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−４ｎｏＣｐＧに挿入して、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｈＥＣＤ−ＴＭ−８ｎｏＣｐＧと呼ぶ、２つの新規プラスミドを得た。
【００２１】
ヒトｐ１８５neuの第２のシステインドメインおよび膜貫通領域を含むプラスミド：ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｈ２°ｃｙｓＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧの構築
ヒトｐ１８５neu細胞外ドメインは、第１および第２のシステインサブドメイン（１stｃｙｓおよび２ndｃｙｓ）として知られている２つのシステインリッチ領域を特徴とする。２ndｃｙｓから１stｃｙｓを分離するヌクレオチド領域に位置する細胞外ドメインに、ＢｓｔＥＩＩ（ｎｔ１２５０）の１つの認識部位のみをもつラットｃＤＮＡ配列と異なり、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列は、ＢｓｔＥＩＩ用の２つの制限酵素認識部位を持つ。すなわちラット（ｎｔ１３７２）の認識部位と同じ部位に加えて、さらにＢｓｔＥＩＩ認識部位（ｎｔ９６３）が、細胞外ドメインの１stｃｙｓをコードする部位に存在する。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＥＩＩでプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧを消化すると、細胞外ドメインの第２システイン膜貫通領域、８ＣｐＧ配列およびプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮからなるＤＮＡ断片が得られた。次いで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを認識し、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎマルチクローニングサイトの最初の部分に存在する、プライマーＴ７（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＃１１）からなるセンスオリゴヌクレオチドと、末端にＢｓｔＥＩＩの認識部位を持つ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１２）を用いる酵素的ＤＮＡ増幅（ＰＣＲ反応）により、小胞体を介するラットのｐ１８５ｎｅｕ分泌のシグナルを挿入した。精製、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｔＥＩＩによる増幅断片の酵素消化、引き続くクローニングの後、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｈ２°ｃｙｓ−ＴＭ−８ＣｐＧ（図１）が得られた。このプラスミドを、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧと比較するためにワクチン接種実験に使用した。その後、ヒト配列の２ndｃｙｓおよび膜貫通領域（ｎｔ１３７２〜ｎｔ２２０４）とラット配列の１stｃｙｓ（ｎｔ１〜ｎｔ１２５０）と間の融合タンパクをコードするキメラのｃＤＮＡを調製した。ラットおよびヒトｃのＤＮＡにそれぞれ由来する部分を融合して、全タンパク質配列を再構成することにより、免疫応答を強化できる。
【００２２】
ラットｐ１８５ｎｅｕの第１システインドメインとヒトの第２システインドメインおよび膜貫通領域（ｎｔ１〜ｎｔ１２５０）の配列を含むキメラプラスミド：ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧの構築
第１および第２システインリッチ領域を分離するヌクレオチド領域にある細胞外ドメインで、ＢｓｔＥＩＩ認識部位（ｎｔ１２５０）だけを含むラットｃＤＮＡ配列とは異なり、Ｅｒｂ２の細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列は、ＢｓｔＥＩＩ用の２つの制限酵素認識部位をもつ。すなわちラット配列の場合と同じく１つは位置１３７２（ｎｔ）にあり、もう一方は位置９６３（ｎｔ）、すなわち細胞外ドメインの１stｃｙｓをコードする配列部分にある。ラットｃＤＮＡドメイン（１２５０ｎｔ）とヒトｃＤＮＡ（１３７２ｎｔ）の両方で同じ位置にＢｓｔＥＩＩ認識部位が存在するので、ラット１stｃｙｓとヒト２ndｃｙｓ間での融合産物をコードできるプラスミドが構築できた。実際、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＥＩＩでｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧを消化することにより、ラットｐ１８５neuの分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片を、同じ酵素でｐＣＭＶ３．１ｒＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧを消化して得られるラットの１stｃｙｓをコードするヌクレオチド配列と置換できた。ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒｌ°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧプラスミド産物（図２）は、ラットｐ１８５ｎｅｕの４１２個のアミノ酸の部分とヒトｐ１８５neuの２７４個のアミノ酸部分からなる。この新規のプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧは比較のために、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧを用いるワクチン接種実験に使用した。驚くべきことに、キメラタンパク質をコードする上記プラスミドは、マウスでヒトｐ１８５neuを発現する腫瘍に対し完全な防御を誘導した（表）。この防御は、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧによって誘導される防御と類似している。さらに、両方のプラスミドをワクチン接種した上記マウスの血清の分析では、ヒトｐ１８５neuに対して同程度の抗体価を示した。
【００２３】
ヒトｐ１８５ｎｅｕの細胞外および膜貫通ドメインの短縮した断片をコードできるプラスミド
ヒトｐ１８５neuの細胞外および膜貫通ドメインの短縮した断片をコードする７つのプラスミド、すなわち：ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ（−７０アミノ酸）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ（−１５０アミノ酸）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ（−２３０アミノ酸）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ（−３１０アミノ酸）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧ（−３９０アミノ酸）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ６−ＴＭ−８ＣｐＧ（−４７０アミノ酸）およびｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ７−ＴＭ−８ＣｐＧ（−５５０アミノ酸）の構築。
【００２４】
これらの断片の１番目でコードされた断片は、７０アミノ酸短い（３６０塩基対の欠失）。残りは全て、段階的に８０アミノ酸短い（２４０塩基対の欠失）。
【００２５】
これらの断片は、末端にＮｈｅＩ制限酵素認識部位（オリゴヌクレオチド＃１３−＃１９）をもつ７つの異なるセンスオリゴヌクレオチドと、ｐＣＭＶ３．１のポリリンカーの３’末端にある「ｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨリバースプライミング部位」（８３０〜８５０ｎｔ）と呼ばれる認識部位を認識できる１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃２０）を使用するＤＮＡの酵素的増幅によって得られた。制限酵素ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩの酵素消化に加えて、増幅産物を、ラットｐ１８５neuの小胞体への分泌シグナルを制限部位に挿入して予め得たｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｎｅｕリーダーにクローン化した。ラットｐ１８５neu分泌シグナルのＤＮＡ断片は、センスヌクレオチドとしてプライマーＴ７（オリゴヌクレオチド＃１１）と、末端にＮｈｅＩ認識部位をもつアンチセンスヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃２１）とを用いる、酵素的なＤＮＡ増幅によって得られた。精製およびＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩによる制限消化後の増幅断片を、同じ酵素で消化したプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎにクローン化し、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｎｅｕリーダーを得た。ラットｐ１８５neuの小胞体への分泌シグナルの存在を考慮すると、様々なヒトｐ１８５neu切断型の膜発現が予測される。切断型をコードするプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ（図３）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ（図４）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ（図５）、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ（図６）ならびに対照プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧは、ヒトｐ１８５neuを発現する腫瘍細胞の致死量接種に対してワクチン接種したマウス１００％を予防した（表）。プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧ（図７）は６０％の動物を防御したが（表）、プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ６−ＴＭ−８ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ７−ＴＭ−８ＣｐＧ（図８、９）は、ヒトｐ１８５neuを発現する腫瘍細胞の致死量接種に対して防御効果がなかった（表）。様々なプラスミドで発現される上記タンパク質産物は、小胞体を介して分泌されない。小胞体を介するグリコシド化およびプロセシングに必要なコンセンサス配列の欠如、または−ＮＨ2末端でのアミノ酸の欠失による構造の変化で、膜にタンパク質産物が存在しないことを説明することができよう。したがって、ヒトｐ１８５neuの細胞外および膜貫通ドメインの様々な切断型が、正しく発現されたか、否かをさらに確認するため、−ＮＨ2末端のｍｙｃエピトープで特徴づけられる融合タンパク質をコードする新規プラスミドを生成した。これらの組換えタンパク質は、抗ｍｙｃモノクローナル抗体により認識され、したがって、共焦点顕微鏡でその発現と局在化を解析することが可能である。
【００２６】
最初に、ラット小胞体への分泌シグナル（ｎｅｕリーダー）およびｍｙｃエピトープをコードする新規のプラスミドを生成した。両末端にＮｈｅＩ認識部位をもつセンス（オリゴヌクレオチド＃２２）およびアンチセンス（オリゴヌクレオチド＃２３）からなる合成配列を用いて、クローニングを行った。正しく連結させた後、酵素で認識されないように、ＮｈｅＩ認識部位の５’位を変異させた。われわれは、このようにしてＰＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｎｅｕｌｅａｄｅｒ−ｍｙｃエピトープを得た。このプラスミドを用いて、切断型ヒトｐ１８５neuをコードする配列を、ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩ制限酵素認識部位にクローン化した。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｉｌａｎ、イタリア）を用いて、３Ｔ３ＮＩＨ線維芽細胞をプラスミドでトランスフェクションした。４８時間後にトランスフェクトした細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｒｌ、Ｍｉｌａｎ、イタリア）を用いて、共焦点顕微鏡で解析した。こうして全てのプラスミドにコードされた切断型は、細胞質中にあることが示された。３Ｔ３  ＮＩＨ線維芽細胞を同時に、プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧでトランスフェクションし、一次抗体にｃ−ｅｒｂＢ２／ｃ−ｎｅｕ  Ａｂ−３モノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用い、ＦＩＴＣ結合抗マウス二次抗体（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて共焦点顕微鏡で解析した。かくしてヒトＥＣＤ−ＴＭは、膜で発現することが観察された。前述の最初の４つのプラスミド（ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ）を用いて得られた結果は、細胞応答は抗腫瘍の予防に十分であることを示している。しかしながら、細胞性および液性の応答の同時活性化がより有効な治療には必要であることが知られている（Ｒｉｅｌｌｙら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：８８０）。すでに上記パラグラフで説明したように、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧプラスミドでコードされるキメラタンパク質は、ワクチン接種した動物の１００％を防御することができ、マウスで強い液性応答を誘導することができる。
【００２７】
５つの異なるヒト−ラットキメラｐ１８５neuをコードできるキメラプラスミド
キメラタンパク質をコードするプラスミド構築のために、われわれは、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧを選択した。これらの４つのプラスミドは、ヒトｐ１８５neuを発現する腫瘍細胞の致死量接種に対してワクチン接種したマウスの１００％を予防した。また、たとえこのプラスミドをワクチン接種したマウスのわずか６０％を防御しただけであっても、プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧも選択した。その理由は、コードされるタンパク質は、ワクチン接種したマウスの２０％を防御するｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｈ２°ｃｙｓＥＣＤ−ＴＭ−８ＣｐＧ（２７５アミノ酸）でコードされるプラスミドと、わずか１７アミノ酸しか異ならないからである。われわれは、この１７アミノ酸のペプチド配列が、効果的な免疫応答の誘導に重要なエピトープに対応するという仮説をたてることができる。
【００２８】
ラットｐ１８５neuの一部をコードするＤＮＡ断片が、ＤＮＡの酵素的増幅によって得られた。これらのｃＤＮＡ断片を増幅するために、全て同方向の６つのオリゴヌクレオチド、具体的には、Ｔ７プライマー（オリゴヌクレオチド＃１１）を用いたが、一方の５つのアンチセンスは、適切な位置でラットｃＤＮＡを認識するように設計され、末端にＮｈｅＩ用の制限酵素認識部位（オリゴヌクレオチド＃２４〜＃２８）を有している。精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化した後、増幅した断片を、同じ制限酵素で消化した、対応するプラスミド（ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ、ｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧ）に挿入した。このようにしてわれわれは、アミノ酸６８９個のキメラタンパク質をコードできる、５つの新規プラスミドを得た。これらのアミノ酸うちの２つ（バリン−セリン）は、ラットとヒトＤＮＡ間の接合に使われる制限酵素認識部位ＮｈｅＩに属している。これら２つのアミノ酸の存在が、ヒトとラット両方の部分をヘテロクリティック（ｈｅｔｅｒｏｃｌｙｔｉｃ）にしている。
【００２９】
上記キメラタンパク質は、ヒトｐ１８５neuの短縮部分およびラットｐ１８５neuの増加部分によって異なる。プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ７３−ｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ（図１０）は、ラットのｐ１８５neuの細胞外ドメインの７３アミノ酸およびヒトｐ１８５neuの６１４アミノ酸をコードする。プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ１５３−ｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ（図１１）は、ラットのｐ１８５neuの細胞外ドメインの１５３アミノ酸およびヒトｐ１８５neuの５３４アミノ酸をコードする。プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ２３３−ｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ（図１２）は、ラットのｐ１８５neu細胞外ドメインの２３３アミノ酸およびヒトｐ１８５neuの４５４アミノ酸をコードする。プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ３１３−ｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ（図１３）は、ラットのｐ１８５neu細胞外ドメインの３１３アミノ酸およびヒトｐ１８５neuの３７４アミノ酸をコードする。プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ３９３−ｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧ（図１４）は、ラットのｐ１８５neu細胞外ドメインの３９３アミノ酸およびヒトｐ１８５neuの２９４のアミノ酸をコードする。これらのプラスミドにコードされるヒト／ラットキメラｐ１８５neuが膜発現している間接的な証拠が、５つの新規プラスミドおよび陽性対照としてｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧでマウスを免疫して得られている。全てのワクチン接種したマウスの血清は、ヒトｐ１８５neuに対する特異抗体を含んでいる。さらに、５つの異なるキメラタンパク質をコードするプラスミドでワクチン接種された動物は、ヒトｐ１８５neuを発現する腫瘍細胞を致死量接種されても保護される。
【００３０】
実施例
実施例１−プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧの構築
キメラプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧを構築するために、われわれは、ラットｐ１８５neuの細胞外および膜貫通ドメインを発現するプラスミドｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭから出発した（Ａｍｉｃｉら、２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：７０３）。ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化し、プラスミド骨格から挿入物を分離した。
【００３１】
【表１】
2007508004.tif 000002
【００３２】
混合物を３７℃で４時間インキュベートし、分子量マーカーおよび対照として未消化のプラスミドを用いて、消化産物を１％アガロースゲル上での電気泳動で分離した。プラスミドの線状化を確認後、ＤＮＡを、１／１０量のｐＨ５．２、３Ｍ酢酸ナトリウムと、２倍量の冷無水エタノールを添加して沈澱した。
【００３３】
サンプルを２０分間氷上に保持し、次いでミニ遠心機（ｍｉｎｉｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）１４，０００ｒｐｍで、１２分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの７０％冷エタノールで３回洗浄し、次いで真空下で５分間乾燥し、８４μｌのＨ2Ｏに再懸濁して、制限酵素ＸｂａＩで酵素消化した。
【００３４】
【表２】
2007508004.tif 000003
【００３５】
上記のように、混合物を３７℃で４時間インキュベートし、消化産物を沈澱させ、乾燥した。ＤＮＡは、３０μｌのＨ2Ｏに再懸濁した。プラスミド骨格（４４００ｂｐのｐＣＭＶ）と挿入物（２１００ｂｐのＥＣＤ−ＴＭ）に対応している上記２つのＤＮＡ断片は、１％のアガロースゲル上での電気泳動により分離した。挿入物に対応するバンドを取り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  イタリア）を用いてＤＮＡをゲルから溶離した。これと平行して、ラットｐ１８５ＥＣＤ−ＴＭに対応するＤＮＡ断片をその中にもつ新規プラスミド骨格（ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−４ＣｐＧ）を同じ制限酵素で消化し、アガロースゲル上で溶離させた。
【００３６】
ラットＥＣＤ−ＴＭに対応するＤＮＡ断片および線形化プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−４ＣｐＧを、ライゲーション反応によりｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧを得るために用いた。
【００３７】
【表３】
2007508004.tif 000004
【００３８】
結合反応は、１６℃で４時間インキュベートした。次いでライゲーション反応産物を大腸菌株ＤＨ５αの形質転換に用いた。菌体は塩化カルシウム法を用いてコンピテントにした。
【００３９】
【表４】
2007508004.tif 000005
【００４０】
プラスミドＤＮＡをコンピテントな細胞に侵入させるために、この混合物を氷上に４０分間置き、次いで温度ショックを与えた（４２℃で１．５分、次いで氷上に２分）。ＬＢ増殖培地１ｍｌを加えた後、形質転換した細菌細胞を３７℃で１時間インキュベートして生理的条件を回復させた。次いで細胞懸濁液を６０００ｒｐｍで１分間遠心し、ペレットを１００μｌのＬＢに再懸濁した。
【００４１】
細胞を選択的固形培地（寒天＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ添加ＬＢ）平板に播種し、一夜３７℃で培養した。アンピシリンは、アンピシリン耐性を与えるプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧをもつ細胞を増殖させる。生じたクローンをアルカリ溶菌法で解析して、組換えプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧをもつクローンを選択した。キメラプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧを得るために、プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧを、制限酵素ＢｓｔＥＩＩとＸｂａＩで消化して、ラットｐ１８５neuの膜貫通領域と共に第２システインドメインを除去した。同時に、プラスミドｐＣＭＶ３．１ｈＥＣＤ−ＴＭ−４ＣｐＧを、同じ酵素で消化して、第２システインサブドメインおよびヒト遺伝子の膜貫通領域に対応するＤＮＡ断片を分離した。
【００４２】
【表５】
2007508004.tif 000006
【００４３】
混合物は、６０℃で４時間インキュベートした。Ｘｂａｌによる制限消化法、クローニングを用いる断片の回収、ライゲーション反応およびコンピテントな細胞の形質転換はこれまでに記載されている。
【００４４】
生じたキメラプラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒ１°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧを、自動ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて配列決定して、ヒト遺伝子の２ndシステインサブドメインおよび膜貫通領域に対応する断片が正しく挿入されていることを確かめた。
【００４５】
実施例２−ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験
動物
約７週齢のＢａｌｂ／ｃＡｎＣｒ（Ｈ−２d）雌マウスを、全ての実験に使用した。上記動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ、ＭＩ、イタリア）から供給され、無菌条件で、欧州共同体ガイドラインに従って飼育した。
【００４６】
筋肉内投与とそれに続くｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法
脛側筋肉の望ましくない収縮が生じないようにするために、トリブロムエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．５８ｇおよびｔｅｒｔ−アミルアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）３１０μｌを脱イオン水３９．５ｍｌに溶解して作製したアバッティン（ａｖｅｒｔｉｎｅ）３００μｌを接種して各マウスを麻酔した。次いで注射のために、全マウスの脛側筋肉に対応する部分の毛を剃った。
【００４７】
上記マウスの両前脛側筋肉に、ＤＮＡ５０μｇを含む溶液４０μｌをワクチン接種した。Ｆ．Ｐｅｒｉｃｌｅ博士（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）の指示に従って、上記ＤＮＡを含む混合物は使用直前に調製した。この溶液は、プラスミドＤＮＡ１．２５ｍｇ／ｍｌ、ポリＬ−グルタミン酸ソーダ塩６ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ．ｒ．ｌ．、Ｍｉｌａｎｏ、イタリア）、塩化ナトリウム１５０ｍＭ（Ｆｌｕｋａ、ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）およびエンドトキシンを含まない蒸留水（Ｎｕｃｌｅａｒｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を最終容量１ｍｌに含有する。
【００４８】
接種して約５分後に、処置した範囲に、電気穿孔装置Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｔ８２０、ＢＴＸ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を用いて、強度３７５Ｖ／ｃｍ2で、各２５ｍｓ間、電気インパルスを２回印加する電気穿孔法を適用した。各足の付け根にそれぞれを３ｍｍ離して設置した２個の正方形のスチール電極を用いて、経皮的電気インパルスを印加した。電気穿孔法による遺伝子免疫化を、それぞれの動物に腫瘍細胞接種の２１日および７日前に２回実施した。
【００４９】
腫瘍細胞の接種
マウスに、２×１０5のＤ２Ｆ２／Ｅ２細胞を含む懸濁液を接種した。これらの細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの過形成肺胞結節で自然発症した乳房腫瘍由来で、高いレベルでヒトｐ１８５を発現する。
【００５０】
腫瘍増殖のＩｎ  ｖｉｖｏ評価
腫瘍の増殖は、触診により毎週評価し、腫瘍の大きさは、ゲージを用いての２つの垂直な直径（ｔｗｏ  ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒｓ）で測定した。３ｍｍを超える新生物の塊を腫瘍とみなした。
【００５１】
腫瘍の増殖を、腫瘍接種から１００日後まで、または腫瘍が直径１０ｍｍ超に増殖するまで続け、次いで動物を屠殺した。
【００５２】
【表６】
2007508004.tif 000007
【００５３】
合成してプラスミド構築に用いたオリゴヌクレオチドのリスト
＃１．ＡｃｃＩＩＩ−ＴＡＡ−４ＣｐＧ−ｅｒｂＢ２センス７１  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＡＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＴ３’
＃２．ＸｂａＩ−ＴＡＡ−４ＣｐＧ−ｅｒｂＢ２アンチセンス７１  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴ３’
＃３．ＡｃｃＩＩＩ−ＴＡＡ−４ｎｏＣｐＧ−ｅｒｂＢ２センス７１  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＡＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴ３’
＃４．ＸｂａＩ−ＴＡＡ−４ｎｏＣｐＧ−ｅｒｂＢ２アンチセンス７１  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴ３’
＃５．ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩセンス２７  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＧＣＴ３’
＃６．ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩアンチセンス２７  ｎｔ
５’ＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣ３’
＃７．ＸｂａＩ−４ＣｐＧ−ｎｅｕセンス６８  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＧＴＴＴ３’
＃８．ＰｍｅＩ−ＣｐＧ−ｎｅｕアンチセンス６４  ｎｔ
５’ＡＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴ３’
＃９．ＸｂａＩ−４ｎｏＣｐＧ−ｎｅｕセンス６８  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴ３’
＃１０．ＰｍｅＩ−４ｎｏＣｐＧ−ｎｅｕアンチセンス６４  ｎｔ
５’ＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴ３’
＃１１．Ｔ７プライマー
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’
＃１２．ＢｓｔＥＩＩ−ｎｅｕリーダーアンチセンス３２  ｎｔ
５’ＧＧＣＣＧＧＴＴＡＣＣＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧ３’
＃１３．ｈＥＣＤ１−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣ３’
＃１４．ｈＥＣＤ２−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡ３’
＃１５．ｈＥＣＤ３−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧ３’
＃１６．ｈＥＣＤ４−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣ３’
＃１７．ｈＥＣＤ５−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣ３’
＃１８．ｈＥＣＤ６−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣ３’
＃１９．ｈＥＣＤ７−ＴＭ−センス−ＮｈｅＩ  ３５  ｎｔ
ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡ３’
＃２０．ｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨリバースプライマー２０  ｎｔ
５’ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴ３’
＃２１．ＮｈｅＩ−ｎｅｕリーダー−アンチセンス４３  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ３’
＃２２．Ｈｉｓ−ｍｙｃ−センス−ｎｏＮｈｅＩ  ６９  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＧＧＴＣＡＴＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧ３’
＃２３．Ｈｉｓ−ｍｙｃ−アンチセンス−ＮｈｅＩ  ６９  ｎｔ
５’ＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣ３’
＃２４．ＮｈｅＩ−７３ｎｅｕアンチセンス３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＧＣＡＣＧＴＡＧ３’
＃２５．ＮｈｅＩ−１５３ｎｅｕアンチセンス３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＡＧＡＣＴＴＣＧＡ３’
＃２６．ＮｈｅＩ−２３３ｎｅｕアンチセンス３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡ３’
＃２７．ＮｈｅＩ−３１３ｎｅｕアンチセンス３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣＣＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＡＧ３’
＃２８．ＮｈｅＩ−３９３ｎｅｕアンチセンス３５  ｎｔ
５’ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡ３’
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｈ２°ｃｙｓ−ＴＭ−８ＣｐＧプラスミド。
【図２】ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒｌ°ｃｙｓ−ｈ２°ｃｙｓＴＭ−８ＣｐＧプラスミド。
【図３】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図４】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図５】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図６】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図７】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図８】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ６−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図９】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／ＮｈＥＣＤ７−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図１０】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ７３−ｈＥＣＤ１−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図１１】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ１５３−ｈＥＣＤ２−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図１２】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ２３３−ｈＥＣＤ３−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図１３】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ３１３−ｈＥＣＤ４−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図１４】プラスミドｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎｒ３９３−ｈＥＣＤ５−ＴＭ−８ＣｐＧ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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