(57)【要約】  本発明は出力シグナルを監視することによって核酸ハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。いくつかの有利な実施形態には、シグナルを増大させることができる技術が含まれる。そのような技術の一つでは、触媒的検出、例えばペルオキシダーゼまたは他の酵素によるものを行なう。もう一つの技術では、ハイブリダイゼーションが起こった後に核酸を拡大するための「オンチップ」増幅を行なう。
2007512810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、
前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、前記標的ポリヌクレオチドが前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ、
前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドを延長するステップ、および
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
検出ゾーンが電極を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドが生物学的試料に由来する核酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記標的ポリヌクレオチドが核酸タグ配列を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
標的ポリヌクレオチドを延長するステップが、前記標的ポリヌクレオチドを第１環状分子にハイブリダイズさせ、前記標的ポリヌクレオチドを前記第１環状分子に沿って延長することにより、第１ローリングサークル増幅産物を生じさせることを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
標的ポリヌクレオチドを延長するステップが頭尾増幅手続きを実行することを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記触媒的検出試薬を前記延長された標的ポリヌクレオチドと会合させることをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項８】
前記触媒的検出試薬が、消耗されずに何度も酸化および還元されうる試薬を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記触媒的検出試薬がペルオキシダーゼを含み、前記決定ステップが、電極から前記ペルオキシダーゼへの電子の移動によって電圧または電流が生成されているかどうかを決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
電子移動媒介物質が前記電極から電子を受け取り、前記電子を前記ペルオキシダーゼに移動させる、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記ペルオキシダーゼが電子を過酸化水素に移動させる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記ペルオキシダーゼが核酸プローブに結合される、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記ペルオキシダーゼが核酸と静電的に相互作用する分子に結合される、請求項９の方法。
【請求項１４】
核酸と静電的に相互作用する前記分子が、カチオン性ポリマー、カチオン性ペプチド、ポリアミン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項９の方法。
【請求項１６】
前記触媒的検出試薬を前記延長された標的ポリヌクレオチドと会合させる、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記第１ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第２環状分子中の配列に相補的な配列を含む第１ブリッジ核酸を、前記第１ローリングサークル増幅産物および前記第２環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第２環状分子に沿って延長することにより、第２ローリングサークル増幅産物を生成させること
をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項１８】
前記決定ステップが、前記第１ローリングサークル増幅産物、前記第２ローリングサークル増幅産物、前記ブリッジ核酸、または先に挙げた核酸の任意の２以上に結合される触媒的検出試薬によって、シグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記触媒的検出試薬が前記第２ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記第２ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第３環状分子中の配列に相補的な配列を含む第２ブリッジ核酸を、前記第２ローリングサークル増幅産物および前記第３環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第２環状分子に沿って延長することにより、第２ローリングサークル増幅産物を生成させること
をさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２１】
前記決定ステップが、前記第１ローリングサークル増幅産物、前記第２ローリングサークル増幅産物、前記第３ローリングサークル増幅産物、前記第１ブリッジ核酸、前記第２ブリッジ核酸または先に挙げた核酸の任意の２以上に結合される触媒的検出試薬によってシグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記触媒的検出試薬が前記第３ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、
前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含む検出ゾーンと、前記標的ポリヌクレオチドが前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ、
前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドに、第１ブリッジをハイブリダイズさせるステップ、および
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項２４】
前記標的ポリヌクレオチドが生物学的試料に由来する核酸配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記標的ポリヌクレオチドが核酸タグ配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２６】
第１ブリッジが延長される、請求項２３の方法。
【請求項２７】
第１ブリッジがローリングサークル増幅によって延長される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
第２ブリッジが前記第１ブリッジに取り付けられる、請求項２３の方法。
【請求項２９】
触媒的検出試薬がペルオキシダーゼを含む、請求項２３の方法。
【請求項３０】
ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、
前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、前記標的ポリヌクレオチドが前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ、
前記標的ポリヌクレオチドを第３ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ、
前記第３ポリヌクレオチドを前記プローブポリヌクレオチドにライゲートするステップ、および
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項３２】
前記標的ポリヌクレオチドが生物学的試料に由来する核酸配列を含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記標的ポリヌクレオチドが核酸タグ配列を含む、請求項３１の方法。
【請求項３４】
前記第３ポリヌクレオチドを伸長することをさらに含む、請求項３１の方法。
【請求項３５】
第１ブリッジを前記伸長された第３ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることをさらに含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
第１ブリッジがローリングサークル増幅によって伸長される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
第２ブリッジを前記伸長された第１ブリッジにハイブリダイズさせる、請求項３６の方法。
【請求項３８】
触媒的検出試薬がペルオキシダーゼを含む、請求項３１の方法。
【請求項３９】
ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
試料中の標的ポリヌクレオチドの量を定量する方法であって、
前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、前記標的ポリヌクレオチドが前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ、
前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドを延長するステップ、
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルを、検出するステップ、および
シグナルのレベルに基づいて試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの量を定量するステップ
を含む方法。
【請求項４１】
前記標的ポリヌクレオチドが生物学的試料に由来する核酸配列を含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記標的ポリヌクレオチドが核酸タグ配列を含む、請求項４０の方法。
【請求項４３】
検出ゾーンが電極を含む、請求項４０の方法。
【請求項４４】
標的ポリヌクレオチドを延長するステップが、前記標的ポリヌクレオチドを第１環状分子にハイブリダイズさせること、および前記標的ポリヌクレオチドを前記第１環状分子に沿って延長することにより、第１ローリングサークル増幅産物を生じさせることを含む、請求項４０の方法。
【請求項４５】
標的ポリヌクレオチドを延長するステップが頭尾増幅手続きを実行することを含む、請求項４０の方法。
【請求項４６】
前記触媒的検出試薬を前記延長された標的ポリヌクレオチドと会合させることをさらに含む、請求項４０の方法。
【請求項４７】
前記触媒的検出試薬が、消耗されずに何度も酸化および還元されうる試薬を含む、請求項４０の方法。
【請求項４８】
前記触媒的検出試薬がペルオキシダーゼを含み、前記決定ステップが、電極から前記ペルオキシダーゼへの電子の移動によって電流が生成しているかどうかを決定することを含む、請求項４０の方法。
【請求項４９】
電子移動媒介物質が前記電極から電子を受取り、前記電子を前記ペルオキシダーゼに移動させる、請求項４８の方法。
【請求項５０】
前記ペルオキシダーゼが電子を過酸化水素に移動させる、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記ペルオキシダーゼが核酸プローブに結合される、請求項４８の方法。
【請求項５２】
前記ペルオキシダーゼが核酸と静電的に相互作用する分子に結合される、請求項４８の方法。
【請求項５３】
核酸と静電的に相互作用する前記分子が、カチオン性ポリマー、カチオン性ペプチド、ポリアミン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群より選択される、請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項４８の方法。
【請求項５５】
前記触媒的検出試薬を前記延長された標的ポリヌクレオチドと会合させる、請求項４０の方法。
【請求項５６】
前記第１ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第２環状分子中の配列に相補的な配列を含む第１ブリッジ核酸を、前記第１ローリングサークル増幅産物および前記第２環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第２環状分子に沿って延長することにより、第２ローリングサークル増幅産物を生成させること
をさらに含む、請求項４４の方法。
【請求項５７】
前記決定ステップが、前記第１ローリングサークル増幅産物、前記第２ローリングサークル増幅産物、前記ブリッジ核酸、または先に挙げた核酸の任意の２以上に結合される触媒的検出試薬によってシグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記触媒的検出試薬が前記第２ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項５６の方法。
【請求項５９】
前記第２ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第３環状分子中の配列に相補的な配列を含む第２ブリッジ核酸を、前記第２ローリングサークル増幅産物および前記第３環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第２環状分子に沿って延長することにより、第２ローリングサークル増幅産物を生成させること
をさらに含む、請求項５６の方法。
【請求項６０】
前記決定ステップが、前記第１ローリングサークル増幅産物、前記第２ローリングサークル増幅産物、前記第３ローリングサークル増幅産物、前記第１ブリッジ核酸、前記第２ブリッジ核酸または先に挙げた核酸の任意の２以上に結合される触媒的検出試薬によってシグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記触媒的検出試薬が前記第３ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項６０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００３年１１月１０日に出願された「ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤ  ＨＡＶＩＮＧ  ＩＮＣＲＥＡＳＥＤ  ＳＥＮＳＩＴＩＶＩＴＹ（増加した感度を持つ核酸検出方法）」と題する米国仮特許出願第６０／５１８，８１６号に基づく優先権を主張し、前記仮特許出願の開示は全て参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は増加した感度を持つ核酸検出方法に関する。いくつかの有利な実施形態において、本方法は、合成的に延長された核酸と電極表面との間で起こる触媒サイクルの電気化学的検出を含む。
【背景技術】
【０００３】
少なくとも一部に相補的ヌクレオチド配列を持つ他のポリヌクレオチドに対するワトソン−クリック型の塩基対形成によるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの検出は、広範囲にわたる多様な研究用途、医学的用途、および工業的用途に役立つ基本的プロセスである。標的配列を含有するポリヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションは、遺伝子発現解析、ＤＮＡ配列決定、およびゲノム解析に有用である。具体的用途としては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク，１９８９）、ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ「ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ」第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９３）、Ｍｉｌｌｉｇａｎら，１９９３，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，３６：１９２３−１９３７、Ｄｒｍａｎａｃら，１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１６４９−１６５２、Ｂａｉｎｓ，１９９３，Ｊ  ＤＮＡ  Ｓｅｑ  Ｍａｐ，４：１４３−１５０などに記載されているように、診断アッセイにおける疾患関連ポリヌクレオチドの同定、試料中の新規標的ポリヌクレオチドに関するスクリーニング、ポリヌクレオチド混合物中の特異的標的ポリヌクレオチドの同定、変異配列の同定、遺伝子タイピング、特異的標的ポリヌクレオチドの増幅、および不適切に発現される遺伝子の治療的遮断などが挙げられる。
【０００４】
各固定化プローブが支持体に機能的に接続され、固定化プローブに対するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することができる場合、固定化プローブは標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの検出に有用である。最も一般的には、ＤＮＡプローブを使って、そのプローブ配列に相補的な標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドが検出される。固定化プローブの支持体はしばしば「チップ」と呼ばれる平坦な表面であるか、ビーズまたは他の粒子の表面であることができる。プローブは通常、既知の配置またはアレイで固定化され、それが、塩基対形成規則に基づいて既知ポリヌクレオチドと未知ヌクレオチドとを対応づけるための媒体になる。好ましくは、プローブアレイを使って同定される未知物を同定するプロセスが自動化される。アイデンティティが既知である多数の固定化プローブを持つマイクロアレイは、相補的結合を決定するために用いられ、遺伝子発現および遺伝子発見の超並列的な研究を可能にする。例えば、単一のＤＮＡチップを使った実験により、研究者は何千もの遺伝子に関する情報を得ることができる。例えばＨａｓｈｉｍｏｔｏらは、固定化一本鎖プローブのアレイであって、少なくとも一つのプローブが検出すべき標的遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を持ち、各プローブが電極の表面または光ファイバーの先端に固定化され、二本鎖核酸に結合する能力を持つ電気化学的または光学的に活性な物質を使って、相補的固定化プローブに対する標的遺伝子のハイブリダイゼーションが検出されるようになっているものを開示している（米国特許第５，７７６，６７２号および第５，９７２，６９２号）。
【０００５】
核酸ハイブリダイゼーションが起こっているかどうかを検出するためのもう一つの方法は、核酸を取り囲む対イオンの量を反映するシグナルを検出することである。したがって、ハイブリダイズした核酸は、一本鎖核酸よりも多くの対イオンに取り囲まれる傾向を示すだろう。対イオンは通例、例えば三価イオンの二価イオンへの還元などにより、電気化学的反応によって検出される、このように、対イオンは電子移動化学種として機能する。
【０００６】
電気化学的定量はＡ．Ｂ．Ｓｔｅｅｌら「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  Ｇｏｌｄ（金上に固定化されたＤＮＡの電気化学的定量）」Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７０：４６７０−７７（１９９８）に記載されている（この論文は参照によりその全文が明示的に本明細書に組み入れられる）。この刊行物においてＳｔｅｅｌらは、表面固定化ＤＮＡと相互作用する化学種としてのコバルト（ＩＩＩ）トリスビピリジルおよびルテニウム（ＩＩＩ）ヘキサアミン（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  （ＩＩＩ）  ｈｅｘａａｍｉｎｅ）の使用を記述している。
【０００７】
汎用チップ
場合によっては、検出すべき特異的配列に相補的になるように設計された一組の固定化プローブを使って、各チップを、検出すべき配列に対して専用に製造しなければならないことが、チップ技術の欠点になる。単一生物に特異的なチップは大きな製造投資を必要とし、そのチップは狭く限定された範囲の試料にしか使用することができない。対照的に、「汎用チップ」または「汎用アレイ」は、プローブが生物特異的な配列または産物を標的としていないので、生物非依存的である。遺伝子発現解析にしばしば用いられる特定の組織、生理状態、または発生段階に特異的なチップも同様に、限定された範囲の試料に使用するために、かなりの製造投資を必要とする。汎用チップは、関心対象の組織、生理状態、または発生段階を研究するための制約のないアプローチを提供する。ポリヌクレオチド検出に汎用チップを用いることにより、製造品質管理を改善することができる。
【０００８】
汎用チップ設計へのアプローチの一つでは、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを持つオリゴヌクレオチドの考えうる配列を全て含む一組のオリゴヌクレオチドプローブをチップ表面に取り付ける。これらのアレイに必要なプローブは、簡単な組合せアルゴリズムを使って設計することができる。チップを、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリダイズ可能な他の材料を含有しうる混合物と共にインキュベートし、既知の配列を持つ各プローブに対するハイブリダーゼションを測定する。しかしそのようなアレイの特異性は損なわれる場合がある。なぜなら、配列が異なると、ストリンジェントなハイブリダイゼーションのための要件も異なりうるからである。また、そのような汎用アレイではフレームシフトに起因する偽陽性が防止されない。例えば、６ヌクレオチド長のプローブを持つ汎用アレイの場合、試料ポリヌクレオチドの最後の４ヌクレオチドは、ある６ヌクレオチドプローブの相補的な最後の４ヌクレオチドにハイブリダイズしうるが、この試料ポリヌクレオチドはその６ヌクレオチドプローブ配列全体にはハイブリダイズしないだろう。
【０００９】
Ｓｕｙａｍａら（２０００，Ｃｕｒｒ  Ｃｏｍｐ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：１２−１３）は、試料の遺伝子発現プロファイリングを行なうための汎用チップシステムを開示している。このチップシステムではプローブに対する転写物の結合に代えて「ＤＮＡコンピューティング」を利用する。ＳｕｙａｍａらのＤＮＡコンピューティングシステムでは、汎用チップ上の一組の汎用固定化プローブに対するコード化されたアダプターの結合を測定することによって、どの転写物が存在するかを間接的に決定する。試料中に存在する転写物の一領域に相補的な領域を持つコード化されたアダプターだけが、その後の操作および処理ステップを受けて、汎用チップ上のプローブに結合する能力を持つアダプターを生成させることになる。
【００１０】
タグ
汎用チップを製造するためのもう一つのアプローチでは、標的ポリヌクレオチド中に自然には存在しない一組のタグ配列を使用し、これらのタグが汎用チップ上の相補的プローブに結合する。そのような用途を持つタグは、時には「アドレスタグ」または「ジップコード」と呼ばれたり、標的を同定するための「バーコード」に類似しているとみなされたりする。そして、検出、同定、追跡、選別、回収、その他の操作は、標的ポリヌクレオチドの配列ではなく、タグ配列に対して行われる。オリゴヌクレオチドタグは、ポリヌクレオチドに共有結合させるか、ポリヌクレオチド中に組み込むことができる。少なくとも二つのドメイン（プローブに相補的なタグ配列を持つドメインと、標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な配列を持つドメイン）を持つことでリンカーとして機能する別個のオリゴヌクレチドのハイブリダイゼーションにより、タグは、あるポリヌクレオチドと関係づけられた状態になりうる。オリゴヌクレオチドタグを使用するシステムは、複雑な混合物中の個々の分子を操作し同定するための手段として、例えば標的ヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを検出するための手段として、または薬物候補を求めてゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、もしくはコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする際の補助手段などとして、提案されている。ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，８９：５３８１−５３８３、Ａｌｐｅｒ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：１３９９−１４０１、Ｎｅｅｄｅｌｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９０：１０７００−１０７０４。
【００１１】
偽シグナル
タグ付きポリヌクレオチドの有用性は、あるタグと、表面に固定化されたその相補的プローブとの間で達成される特異的ハイブリダイゼーションの成功に大きく依存する。オリゴヌクレオチドタグによるポリヌクレオチドの同定を成功させるには、偽陽性シグナルおよび偽陰性シグナルの数を最小限に抑えるべきである。残念なことに、偽シグナルは珍しくない。なぜなら、塩基対形成および塩基スタッキングの自由エネルギーは、二重鎖構造または三重鎖構造をとっているヌクレオチド配列の間で、大きなばらつきを持ちうるからである。例えば、グアノシン−シトシン（Ｇ−Ｃ）対の数がもう一つの二重鎖と比べて相違しているタグ−プローブ二重鎖は異なる融点を有するので、ハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー要件も相違しているだろう。また、スタッキングエネルギーが相違するので、アデノシン（Ａ）とチミジン（Ｔ）の反復配列がその相補鎖に結合しているものからなるタグ−プローブ二重鎖は、ＧとＣの反復配列がミスマッチを含有する部分的に相補的な標的に結合しているものからなる同じ長さの二重鎖より、安定性が低いということも起こりうる。このようなスタッキングエネルギーの相違を埋め合わせるには、特殊な試薬がしばしば必要になる。
【００１２】
偽シグナルは上述の「フレームシフト」にも起因しうる。この問題は、「無コンマ（ｃｏｍｍａ−ｌｅｓｓ）」コードを用いることによって対処されてきた。この無コンマコードは、その相補的タグに対して見当ずれ（フレームシフト）を起こしたプローブが、そのコドンのそれぞれについて一つ以上のミスマッチを持つ二重鎖をもたらし、それが不安定な二重鎖を形成させることを保証する。
【００１３】
偽シグナルに関わる上記の問題を考慮して、十分なタグレパートリーを提供するが、それと同時に、自然の塩基対形成および塩基スタッキング自由エネルギー差を変化させるために特殊な試薬を使用したり、無コンマコード用のコード化システムを苦心して作ったりしなくても、偽陽性シグナルおよび偽陰性シグナルの発生を最小限に抑えるような、オリゴヌクレオチドに基づくさまざまなタグ付けシステムが、研究者によって開発されている。そのようなタグ付けシステムは、例えばコンビナトリアル化合物ライブラリーの構築および使用、ＤＮＡの大規模マッピングおよび配列決定、遺伝子による同定、および医学的診断など、多くの分野に応用される。
【００１４】
Ｂｒｅｎｎｅｒらは、ポリヌクレオチド断片の末端に反応性部分を介してタグを取り付ける「汎用」チップシステムを開示している。このシステムでは、あるタグとそれとは別のタグに対する相補鎖との間に形成される任意のミスマッチ二重鎖またはミスマッチ三重鎖の安定性が、そのタグとそれ自身の相補鎖との間に形成される完全にマッチしたどの二重鎖よりも、はるかに低くなるような配列を持つ多サブユニットオリゴヌクレチドタグのレパートリーを設計することによって、偽シグナルが回避される。米国特許第５，６０４，０９７号、第５，６５４，４１３号、第５，８４６，７１９号、第５，８６３，７２２号、第６，１４０，４８９号、第６，１５０，５１６号、第６，１７２，２１４号、第６，１７２，２１８号、第６，３５２，８２８号、第６，２３５，４７５号。Ｍｏｒｒｉｓら（米国特許第６，４５８，５３０号、ＥＰ０７９９８９７）は、タグおよび相補的プローブのアレイを使って、細胞およびウイルスを含む組成物を標識し追跡すること、ならびに細胞およびウイルス表現型の解析を容易にすることを開示している。
【００１５】
ある代替方法では、多成分タグ付けシステムであって、タグがポリヌクレオチドに取り付けられるではなく、所定のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを適合させ、インデックス化し、かつ／または検出するためにポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる別個の成分上に、タグが見いだされるようなシステムを使用する。米国特許第６，２６１，７８２号ならびにその関連特許および関連出願（Ｌｉｚａｒｄｉら）に開示されている方法では、核酸切断試薬を使って「付着末端」を生成させ、さまざまな付着末端に相補的な末端を持つアダプター−インデクサー（ａｄａｐｔｅｒ−ｉｎｄｅｘｅｒ）オリゴヌクレオチドを試料に加えることで、切断されたポリヌクレオチド断片を何組かにインデックス化し、アダプター−インデクサーの付着末端に相補的な付着末端を持つライゲーター−ディテクター（ｌｉｇａｔｏｒ−ｄｅｔｅｃｔｏｒ）オリゴヌクレオチドを加え、試料全体を複数の検出子プローブとハイブリダイズさせ、ライゲーター−ディテクターを検出子プローブに共有結合させ、最後に、検出子プローブへのライゲーター−ディテクターのカップリングを検出することによって、試料中の標的ポリヌクレオチドを選別し、同定することを可能にする。
【００１６】
汎用アレイ中の固定化捕捉プローブにハイブリダイズするドメインと標的を含有する分析物にハイブリダイズするドメインとを持つ二官能性リンカーを使用するもう一つの多成分システムが、Ｂａｌｃｈらによって米国特許第６，３３１，４４１号に開示されている。Ｂａｌｃｈらは、標的配列と、捕捉プローブに相補的なユニーク汎用配列との両方を含有するアンプリコンを生成させるための、標的ポリヌクレオチドの増幅も開示しており、このユニーク汎用配列は、ＰＣＲプライマーまたはＬＣＲプライマーによって導入することができる（米国特許第６，３３１，４４１号）。
【００１７】
既存の電流測定技術によって得られる感度よりも高い核酸検出感度を得ることが望ましい場合がある。例えば、標的鎖がプローブにハイブリダイズしているかどうかを識別することは、標的が試料中に極めて少量しか存在しない場合や、ハイブリダイゼーションに先だって標的を（ＰＣＲまたはＲＣＡなどによって）増幅することが不可能もしくは非現実的である場合は特に、既存の技術では困難なことがある。したがって当技術分野では、増加した感度を持つ核酸検出方法が必要とされながらも、まだ満たされていない。
【発明の開示】
【００１８】
本発明の一態様は、試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、試料を、標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、標的ポリヌクレオチドが捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ；捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドを延長するステップ；および試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、自らは消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップ、を含む方法である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、試料を、標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、標的ポリヌクレオチドが捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ；捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドに、第１ブリッジをハイブリダイズさせるステップ；および試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、自らは消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップ、を含む方法である。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの態様は、試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、試料を、標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、標的ポリヌクレオチドが捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ；標的ポリヌクレオチドを第３ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ；第３ポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにライゲートするステップ；および試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、自らは消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップ、を含む方法である。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、試料中の標的ポリヌクレオチドの量を定量する方法であって、試料を、標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、標的ポリヌクレオチドが捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ；捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドを延長するステップ；試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、自らは消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができる触媒的検出試薬によって生成されるシグナルを、検出するステップ；およびシグナルのレベルに基づいて試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの量を定量するステップ、を含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、概して、ある試料における特定配列を持つ標的核酸の存在を検出する方法に関する。本発明のいくつかの好ましい実施形態には、検出ゾーンにおけるポリヌクレオチドハイブリダイゼーションを使った標的核酸の検出が含まれる。いくつかの有利な実施形態では、そのような検出ゾーンが電極表面を含み、アッセイチップ上（好ましくは汎用アッセイチップ上）に設置される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、アッセイチップ上でのプローブ核酸への標的核酸のハイブリダイゼーションに起因する電気シグナル（電流または電圧など）を測定することによって、標的核酸が検出される。特定の実施形態では、検出試薬（例えば酸化または還元されうる薬剤）を、プローブ核酸にハイブリダイズさせた標的核酸と会合させることによって、電流を生成させることができる。いくつかの実施形態では、検出試薬が電子の移動に１回だけ参加する。しかし、いくつかの実施形態では、検出試薬が消耗されることなく酸化還元反応に繰り返し参加することができる。検出試薬が繰り返し参加できる場合、それを「触媒的」検出試薬と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、触媒的検出試薬が酵素などの酸化還元部分である。いくつかのさらなる実施形態では、ハイブリダイズした標的核酸のそれぞれに多くの検出剤を会合させることによって、および／または触媒的酸化／還元反応に参加する検出試薬を利用することによって、プローブへの標的核酸のハイブリダイゼーションに起因する電流の振幅を増加させる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本方法は、標的と、静電的相互作用によって標的核酸と会合するポリアミン、他のカチオン性ペプチド、またはカチオン性ポリマーに連結した検出試薬（酸化還元部分など）との相互作用により、負に帯電した標的鎖の存在を検出することに基づく。別の実施形態では、本方法は、標的鎖を、追加プローブ、すなわち「検出子プローブ」（次にこれを酸化還元部分と連携させる）へのその配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいて検出することに基づく。検出子プローブを「シグナルプローブ」と呼ぶ場合もある。検出子プローブと連携させる酸化還元部分の例は本明細書で論じる。
【００２５】
核酸検出に役立つさまざまな技術および電子移動化学種は、ＷＯ２００４／０４４５４９、２００３年４月２４日に出願された「ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＴＡＧ  ＡＳＳＡＹ（汎用タグアッセイ）」と題する米国特許出願第１０／４２４，５４２号に開示されており、これらはどちらも参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。さらなる実施形態は、２００３年５月２日に出願された「ＥＬＥＣＴＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤ  ＴＯ  ＭＥＡＳＵＲＥ  ＤＮＡ  ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ  ＴＯ  ＡＮ  ＥＬＥＣＴＲＯＤＥ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＰＲＥＳＥＮＣＥ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＯＸＹＧＥＮ（分子状酸素の存在下で電極表面へのＤＮＡの付着を測定するための電気化学的方法）」と題する米国特許出願１０／４２９，２９１号、２００３年５月２日に出願された「ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＥＬＥＣＴＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＯＭＡＴＩＣ  ＣＥＬＬ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ（体細胞突然変異の電気化学的検出方法）」と題する米国特許出願第１０／４２９，２９３号、および２００４年８月２３日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７４１２で議論されており、これらは全て参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【００２６】
特に、米国特許出願第１０／４２９，２９３号では、標的鎖がプローブ鎖にハイブリダイズした後に標的鎖を伸長することによってシグナルを増強する方法が議論されており、この技術は「オンチップ増幅」と呼ばれることもある。この出願は線状オンチップ増幅および分岐状オンチップ増幅を開示している。
【００２７】
フルオレセインおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の使用を含む他のさまざまな核酸検出技術が米国特許第６，３９１，５５８号（Ｈｅｎｋｅｎｓら）に開示されており、この文献は参照によりその全文が明示的に本明細書に組み入れられる。
【００２８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態には、検出ゾーンにおけるポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの検出が含まれる。一般に、検出ゾーンはアッセイチップ上に設置され、ハイブリダイゼーションの検出は、酸化還元反応によって生成する電流を検出することによって行なわれるだろう。多くの有利な実施形態の基礎となる理論は、プローブと標的との間にハイブリダイゼーションが起こった場合にのみ、酸化還元反応が起こること、または酸化還元反応の程度が強くなることである。
【００２９】
通例、この技術を実行する際には、関心対象の配列に相補的な複数の核酸プローブを使用する。汎用チップを使用する場合は、核酸プローブが、標的鎖に取り付けられたタグに相補的な配列を含有するだろう。また、その標的鎖は関心対象の配列も含有する。したがって、試料中の配列を検出するとは、生物学的試料からの天然配列またはネイティブ配列を直接検出することを指すか、または処理された試料（この場合、処理された試料は生物学的試料に由来する配列を改変するか生物学的試料に由来する配列に付加することによって作製される）中の何らかの他の配列（タグ配列など）を検出することを指しうる。
【００３０】
一定の好ましい実施形態では、プローブの長さは約１０〜２５塩基対の範囲にあり、約１７塩基対の長さが最も好ましい。好ましくは、プローブ鎖は検出ゾーン内に位置する。特に好ましい実施形態では、検出ゾーンが、液体媒質と接触している電極などの表面を含み、プローブ鎖はその表面上に、プローブ鎖もまたその液体媒質と接触するような形で固定化される。好ましくは、表面は、電極への核酸プローブ鎖の取り付けが容易になるようにアビジンまたはストレプトアビジンなどのタンパク質層で被覆される金電極または炭素電極である。このタンパク質層は、イオンまたは他の電子移動化学種が液体媒質から電極へと通過でき、そしてその逆も起こりうるように、多孔性を示すべきである。プローブ鎖をアビジン層に取り付ける際には、まずプローブ鎖をビオチン複合体に共有結合し、次にそのビオチンをアビジンに付着させることが好ましい。もう一つの選択肢として、例えば金電極に核酸を共有結合させるためにチオール結合を使用することなどにより、プローブ鎖を表面に直接取り付けることもできる。炭素電極または他の任意の適切な導体の電極も使用することができる。
【００３１】
この技術をさらに実行するにあたって、プローブに対して検査すべき核酸試料は、当業者に知られている任意の適切な方法でプローブと接触させることができる。例えば、試料は複数の標的鎖を含みうる。標的鎖を上述の液体媒質に導入し、固定化プローブと混じり合わせることができる。標的鎖がプローブ鎖の一領域に相補的な領域を含有する場合は、ハイブリダイゼーションが起こりうる。
【００３２】
好ましくは、各プローブ鎖が標的鎖と相互作用してハイブリダイゼーションに参加する機会が最大になるように、標的鎖の数はプローブ鎖の数を超える。しかし、いくつかの実施形態では、標的鎖の数が比較的少数になるだろう。そのような実施形態には、特定の標的を単離または増幅することが不可能であるか、非現実的であるか、望ましくないアッセイが含まれる。細菌またはウイルスなどの病原体の存在を検出する場合は、そうであることが多い。
【００３３】
どの標的鎖も関心対象の配列を含有しない場合は、固定化プローブと導入した標的との間には、一般に、ハイブリダイゼーションはほとんど、または全く起こらないだろう。しかし、標的鎖が関心対象の配列（または汎用チップを使用している場合は適切なタグ）を含有する場合は、それがプローブ鎖に結合しうる。１以上のハイブリダイゼーション事象が起こった後は、そのハイブリダイゼーションを検出するために使用できる技術が数種類ある。
【００３４】
いくつかの技術では、酸化還元反応に参加する能力を持つ部分を、ハイブリダイズしたＤＮＡと静電引力によって会合するように導入することができる。別の技術では、酸化還元反応に参加する能力を持つ部分を、配列特異的検出子プローブを使って導入することができる。検出子プローブは一般に、標的鎖の一領域に相補的な領域を含有する核酸鎖であり、検出子プローブと酸化還元反応に参加する能力を持つ部分との間で相互作用が可能であるような形で、１以上の部分にカップリングされる。いくつかの好ましい実施態様では、検出子プローブがフルオレセイン分子に連結され、酸化還元部分がＨＲＰであり、そしてまたそれはフルオレセインに結合する能力を持つフルオレセイン抗体にコンジュゲートされる。もう一つの選択肢として、ストレプトアビジンまたはアビジンＨＲＰコンジュゲートに結合するビオチン部分に、検出子プローブを連結することができる。さらに、ＨＲＰ以外の酵素を酸化還元部分として用いることができる。そのような酵素には、例えばグルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および他のペルオキシダーゼ、例えば熱安定性大豆ペルオキシダーゼおよびミクロペルオキシダーゼなどがある。
【００３５】
さらに、本発明のいくつかの実施形態は、以下のステップの任意の組合せを含みうる：特定の配列を持つ第１核酸を試料が含有するまたは含有すると疑われるような患者試料源または環境試料源から生物学的試料を抽出するステップ；生物学的試料から第１核酸を精製または単離するステップ；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）などの技術を使って第１核酸を増幅するステップ；一本鎖型の第１核酸（またはその増幅産物）を単離するステップ；第１核酸を伸長または他の方法により拡張する目的で、第２核酸を環化させるステップステップ；第２核酸を伸長または他の方法により拡張するステップ；上記核酸の１以上をハイブリダイゼーションが可能なアッセイ環境に導入するステップ；相補性の度合いに基づいて、一部の核酸はハイブリダイズし、他の核酸はハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーを制御するステップ；ハイブリダイズした核酸の１以上をチップ上で増幅するステップ；およびハイブリダイゼーションを、好ましくは触媒的酸化還元部分を使って、検出するステップ。
【００３６】
ハイブリダイズした核酸のシグナルを増強するために一定の技術を使用できることを発見した。これらの技術は、試料中に少量のＤＮＡが存在するアッセイでは特に有用であることがわかった。例えば、この技術は感染性疾患を検出するためのアッセイに特に有用である。なぜなら、被疑病原体から利用できる核酸の量は通例、抽出される試料と比較して極めて少ないからである。ハイブリダイズした核酸のシグナルを増強するのに特に有用な技術には、触媒的検出およびオンチップ増幅が含まれる。本発明の技術は、場合によっては、１〜１０分子の量しかない試料中の核酸を検出することができる。
【００３７】
触媒的検出
いくつかの実施形態には、電極表面でそれ自体が電子移動を起こす対イオン（例えばルテニウム錯体）の代わりに触媒的検出部分を使用することが含まれる。触媒的検出スキームでは、通例、酸化／還元を起こすことができる２以上の部分が存在し、それらの少なくとも一つは１サイクルを超える酸化還元サイクルに参加することができる。これらの部分の一部はこのようにして「再利用」されるので、検出可能なシグナルは、それらの部分の全てが１回の酸化還元サイクルしか起こさない場合よりも、大きくなるだろう。いくつかの実施形態では、触媒的検出部分が、自らは消耗されることなく数多くの酸化／還元サイクルに参加することができる酵素である。
【００３８】
いくつかの好ましい実施形態では、電子移動スキームに、過酸化水素から水への酸化還元変換を利用する。そのような実施形態では、この反応を触媒するためにセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼを使用することが有利である。ＨＲＰは、その安定性、高い回転率、および高感度電気化学媒介物質の入手しやすさゆえに、好ましい検出試薬である。ホスファターゼ、ミクロペルオキシダーゼを含む他のペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼなどの他の酵素も、この目的に使用することができる。特に好ましい実施形態では、ＨＲＰを使った電気化学的検出が、以下のように進行する。：
ＨＲＰＲ＋Ｈ２Ｏ２＋２Ｈ＋→ＨＲＰＯ＋２Ｈ２Ｏ
ＨＲＰＯ＋ＭｅｄＲ→ＨＲＰＲ＋ＭｅｄＯ
ＭｅｄＯ＋ｎｅ−→ＭｅｄＲ
【００３９】
上記の反応において、下付き文字Ｒは、ある化学種がその還元型であることを示し、下付き文字Ｏは酸化型を示す。
【００４０】
上記の第１ステップでは、還元状態にあるＨＲＰが過酸化水素と水素との反応に電子を供給して水を生じさせ、酸化状態のＨＲＰが残る。次のステップでは、酸化状態にあるＨＲＰが、電極表面から酵素へと電子を往復輸送することができる電子移動媒介物質（Ｍｅｄと表記）から電子を受け取る。好ましい媒介物質には、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびフェロセン誘導体が含まれる。第３ステップでは、移動媒介物質が電極表面から電子を受け取る。この特定例では、電子が電極から移動媒介物質、酵素を経て、最終的に水分子に至る。水の形成は基本的に、ＨＲＰにおける電子不足が電子移動を誘発し、電極を通る検出可能な電流を生み出すように、反応を駆り立てる。
【００４１】
図１に、Ｈ２Ｏ２から水への変換においてＨＲＰおよびＴＭＢを用いる触媒サイクルを示す。ＨＲＰの代わりに他の酵素、特に他のペルオキシダーゼを使用できること、およびＴＭＢの代わりに他の電子移動媒介物質を使用できることは、当業者には理解されるだろう。
【００４２】
検出可能な酸化還元プロセスがハイブリダイゼーション事象の信頼できる指示薬として役立つように、ペルオキシダーゼなどの酵素を、ハイブリダイズした核酸に会合させるために使用することができる特に有用な技術が、二つある（それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示す）。
【００４３】
これらのうち第１の技術の一例を図２Ａに示す。図示するように、電極表面１０は固定化捕捉プローブ２０を含有する。標的核酸鎖２２を捕捉プローブ２０にハイブリダイズさせる。捕捉プローブ２０および標的鎖２２の両方の核酸鎖に会合した複数の酸化還元部分２４が示されている。いくつかの実施形態では、酸化還元部分２４がＨＲＰなどの酵素である。酸化還元部分は酵素コンジュゲートであってもよい。これは、核酸と会合させる目的でアッセイに導入する前に、ある酵素が別の化学種にコンジュゲートされることを意味する。一定の有利な実施形態では、酵素がポリアミン、カチオン性ペプチド、またはカチオン性ポリマーにコンジュゲートされる。スペルミジンまたはスペルミンなどのポリアミンは、過ヨウ素酸カップリング化学またはグルタルアルデヒドによるコンジュゲーションを含むさまざまなコンジュゲーションスキームによって、ＨＲＰにコンジュゲートすることができる。有用なカチオン性ペプチドとして、ポリリジンおよびポリアルギニンが挙げられる。カチオン性ポリマー、例えばアミン基を含有するものなども、使用することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションがＥＤＣ促進（ＥＤＣ−ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ）コンジュゲーションを使って達成される。これは、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇｒｅｇ  Ｔ．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９９６，Ａｃａｄｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ）の４２０〜４３５頁などに記載されており、その全文は参照により明示的に本明細書に組み入れられる。酵素の上にまたは酵素にカップリングされる部分の上にカチオン電荷を置く技術は、当技術分野では他にも種々知られており、それらも使用することができる。
【００４４】
次に、カチオン性酵素コンジュゲートは、標的の負に帯電したリン酸エステル主鎖と会合することができる。次に、酵素によって触媒される反応が電流を生成し、その電流を、試料中に標的核酸が存在するしるしとして測定することができる。いくつかの好ましい実施形態では、酵素がＨＲＰであり、反応が、水を生じる過酸化水素と水素との反応である。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的をまず、電極表面上に固定化されている捕捉プローブにハイブリダイズさせる。次に、ポリアミン−ＨＲＰコンジュゲートを溶解した状態で提供することにより、標的に結合させる。未結合のＨＲＰを洗浄した後、電極を電気化学モニターに接続する。Ｈ２Ｏ２と媒介物質がどちらも十分な濃度で存在する場合は、固定電位で強い触媒電流が表面固定化ＨＲＰから生じる。生成する電流は表面固定化ＨＲＰの量に比例し、結果として、標的中のヌクレオチド塩基数に比例する。
【００４５】
代替的方法として、第２の検出方法の一例を図２Ｂに示す。ここでは、電極表面１０が、ハイブリダイズした標的鎖２２を持つ固定化捕捉プローブ２０を含有している。追加の核酸検出子プローブ３０は、標的鎖２２に（好ましくは標的鎖の増幅された領域で）ハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、試料由来の標的鎖を捕捉プローブに直接ハイブリダイズさせる。別の実施形態では、試料中の標的鎖を増幅し、その結果得られた増幅産物を捕捉プローブにハイブリダイズさせる。そしてまた、検出子プローブ３０はハプテン３２で標識され、そのハプテンには、酸化還元部分２４に連結された抗体３４が結合しうる。数多くの適切なハプテンを使用することができる。好ましいハプテンの例はフルオレセイン、ジゴキシゲニン、またはビオチンであり、その場合、対応する抗体は、それぞれフルオレセイン抗体、ジゴキシゲニン抗体、またはビオチン抗体であるだろう。もう一つの選択肢として、ビオチンをハプテンとして使用する場合は、アビジンまたはアビジン類似体を、そのビオチンへの結合親和性ゆえに、抗体の代替物として使用することができる。抗体３２は、適当な酸化還元部分２４、例えばＨＲＰのような酵素に連結することが有利である。いくつかの実施形態では、抗体をアビジン−ＨＲＰコンストラクトに連結することができる。単一の標的に結合することができる複数の検出子プローブを使用することが、一般に有利である。ハイブリダイゼーションの検出は、ここでも、ＨＲＰなどの酸化還元部分の存在による触媒的電流に基づく。電流は酸化還元部分の存在量に比例し、その存在量は、捕捉された標的にハイブリダイズした検出子プローブの数に比例する。いくつかの実施形態では、酵素−抗体複合体が付着しうる部位を各検出子プローブが複数含有することで、電気シグナルをさらに増強することができる。
【００４６】
このタイプの触媒的検出は一般にさまざまな利点を示す。例えば、定量分析に関して、感度および検出限界が有意に改善されうる。各標的分子が１つの検出試薬で標識される他の大部分の検出方法とは異なり、高感度酵素触媒電気化学反応による１標的分子あたり複数ラベルの検出が可能である。
【００４７】
さらに、本発明のいくつかの実施形態は、以前の技術よりも低い検出ノイズレベルを特徴とする。メチルホスホネートＤＮＡまたはＰＮＡなどの非荷電捕捉プローブを使用すると、電流検出範囲は約０ナノアンペア〜１００マイクロアンペアになりうる。非荷電捕捉プローブは同時係属中の米国特許出願第１０／４２９２９１号および第１０／４２９２９３号に詳述されており、その全文は参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
【００４８】
また、触媒的検出技術を用いることによって、反応時間を短縮し、アッセイを単純化することができる。
【００４９】
オンチップ増幅
チップなどの基板上にある核酸二重鎖のシグナルを増強するためのもう一つの技術は、捕捉プローブへのハイブリダイゼーション後に標的核酸を増幅または延長することである。次に、増幅または延長された標的核酸を検出試薬に結合させることができる。好ましくは、ハイブリダイズしていない捕捉プローブでの電流と、プローブ／標的二重鎖での電流との差が、できる限り大きくなるように、標的鎖を伸長する。この技術は「オンチップ増幅」と呼ぶことができ、米国特許出願第１０／４２９２９３号に開示されている（この出願は参照によりその全文が明示的に本明細書に組み入れられる）。
【００５０】
さまざまなオンチップ増幅法を使用することができる。オンチップ増幅の一方法を図３Ａに図示する。この場合、ハイブリダイズした標的鎖の３’末端または５’末端を、電極上のＤＮＡ量を増大させる頭尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）重合の標的にすることができる。通例、ここに示すように（固定化プローブおよび標的鎖は数えないで）３つの異なるオリゴヌクレオチドが使用されるだろう。すなわち、第１オリゴマーは、ハイブリダイズした標的鎖の３’末端に相補的であり（プライマー配列の相補鎖を標的とする）、その５’末端に配列Ａを含有する。第２オリゴマーは、５’−Ａ＊Ｂ−３’という配列を持つ（ここにＡ＊はＡに対して相補的である）。第３オリゴヌクレオチドは５’−ＡＢ＊−３’という配列を持つ。図３Ａに図示するように、これらのオリゴマーは示したとおりのポリマー産物を形成することができる。頭尾重合は鎖が所望の長さに達するまで続けることができる。一般に、頭尾重合を行なう場合、最終的なポリヌクレオチドの長さは、一つには、頭尾オリゴマーの競合する環化反応によって制限される。しかし一般的には、液体媒質中の頭尾オリゴマーの濃度が高いほど、電極に取り付けられる線状ポリマーは長くなるだろう。
【００５１】
オンチップ増幅のもう一つの方法を図３Ｂに図示する。この方法ではローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いる。好ましくは、試料由来の結合した標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物の３’末端に相補的な領域を持つ前形成のサークル（約４０〜３００ヌクレオチド）を、捕捉プローブにハイブリダイズさせた標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物にハイブリダイズさせる。次に、ＲＣＡが起こって、試料由来の結合した標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物が伸長されるように、連続移動性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）ＤＮＡポリメラーゼを加えることができる。好ましくは、試料由来の標的核酸を、約１０〜１０，０００コピーのサークルによって伸長させる。次に、検出試薬をＲＣＡ産物に結合させる。
【００５２】
オンチップ増幅のためのさらにもう一つの技術を図３Ｃに図示する。この技術は「ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）」増幅または「分岐（ｂｒａｎｃｈ）」増幅と呼ぶことができる。というのも「ブリッジ化（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）」と「分岐化（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）」は、この文脈では同義だからである。この方法では、試料由来の標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物または伸長産物を、捕捉プローブにハイブリダイズさせる。第１前形成サークルを試料由来の標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物にハイブリダイズさせ、ＲＣＡを行なって第１ＲＣＡ産物を生じさせる。第１ＲＣＡ産物中の配列に相補的な配列と第２前形成サークル中の配列に相補的な配列とを含むブリッジ核酸を用意する。ブリッジ核酸を第１ＲＣＡ産物にハイブリダイズさせ、第２前形成サークルを使って第２ＲＣＡ手続きを行なうことにより、第２ＲＣＡ産物を生じさせる。次に、検出試薬を、試料由来の標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物、第１ＲＣＡ産物、ブリッジ核酸、第２ＲＣＡ産物、あるいは先に挙げた核酸の任意の２以上に結合させる。所望であれば、第１ＲＣＡ手続きおよび／または第２ＲＣＡ手続きを頭尾重合または他の伸長手続きで置き換えうることは、理解されるだろう。また、ローリングサークル増幅に前形成のサークルを使用するのではなく、標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物あるいはブリッジ核酸にハイブリダイズする配列を各末端に含有する線状分子を、ハイブリダイゼーション後に環化させて、ＲＣＡ用の環状テンプレート生成させうることも理解されるだろう。
【００５３】
さらに、ブリッジ増幅技術を使用する場合は、「超ブリッジ化（ｈｙｐｅｒｂｒｉｄｇｉｎｇ）」または「超分岐化（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｉｎｇ）」と呼ばれる技術を使って分岐化の程度を増加させることが有利になりうる。超ブリッジ化の一例を図３Ｄに示す。ここでは、第２ＲＣＡ産物中の配列に相補的な配列と第３前形成サークル中の配列に相補的な配列とを含む第２ブリッジ核酸が用意される。第２ブリッジ核酸を第２ＲＣＡ産物にハイブリダイズさせ、第３前形成サークルを使って第３ＲＣＡ手続きを行なうことにより、第３ＲＣＡ産物を生じさせる。次に、検出試薬を、試料由来の標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物、第１ＲＣＡ産物、第１ブリッジ核酸、第２ＲＣＡ産物、第２ブリッジ核酸、第３ＲＣＡ産物、あるいは先に挙げた核酸の任意の２以上に結合させる。所望であれば、第１ＲＣＡ手続き、第２ＲＣＡ手続き、第３ＲＣＡ手続き、またはそれらの任意の組合せを、頭尾重合または他の伸長手続きで置き換えうることは、理解されるだろう。また、ＲＣＡ手続きのいずれかに前形成のサークルを使用するのではなく、標的核酸またはそこから生じさせた増幅産物もしくは伸長産物、第１ブリッジ核酸、あるいは第２ブリッジ核酸にハイブリダイズする配列を各末端に含有する線状分子を、ハイブリダイゼーション後に環化させて、ＲＣＡ用の環状テンプレート生成させうることも理解されるだろう。
【００５４】
ローリングサークル増幅または頭尾重合などの伸長技術を、超ブリッジ化プロセスと一緒に使用することが、一般に有利である。伸長は一般に、ハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸と識別しやすくするために、電気化学的に検出することができる核酸材料を付加する目的を満たすが、このプロセスは、核酸が長いほど追加のブリッジを付加することができる位置が多くなるという点でも有益でありうる。
【００５５】
ブリッジ化および超ブリッジ化は、核酸の存在量を指数的に増加させることができるので、とりわけ有用な技術になりうる。ブリッジ化技術および超ブリッジ化技術のさらなる議論は、例えばＵｒｄｅａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：９２６（１９９４）、Ｈｏｒｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（２３）：４８３５−４８４１（１９９７）、Ｌｉｚａｒｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，２２５−２３２（１９９８）、Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅら（米国特許第６，２９１，１８７号）、Ｌｉｚａｒｄｉら（ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３）などに見いだすことができ、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【００５６】
オンチップ増幅を含むアッセイを行なう場合は、ブリッジ化ステップを使ってまたはブリッジ化ステップを使わずに、ハイブリダイゼーションを検出することができる。ハイブリダイズした核酸にＨＲＰを会合させるために検出プローブを使用すると仮定すると、以下の２つの例は、ブリッジ化を特徴としないアッセイおよびブリッジ化を特徴とするアッセイにおいて取られうるステップを、それぞれ略述するものである。
【００５７】
ブリッジ化を用いない方法は、一般に以下のステップを含む：１）標的をプローブに結合させる；２）（随意）ライゲーションにより特異性を決定する；３）結合した標的上でＲＣＡを行なう；４）フルオレセインなどのエピトープを含有する検出プローブを加える；抗体がエピトープに結合することができるような形で酸化還元部分に連結された抗体を加える；５）酸化還元部分の存在に関係する酸化還元活性を検出する。
【００５８】
ブリッジ化ステップを特徴とする方法は、一般に以下のステップを含む：１）標的をプローブに結合させる；２）（随意）ライゲーションにより特異性を決定する；３）結合した標的上でＲＣＡを行なう；４）ブリッジ核酸および第２サークルを加える；５）ブリッジでＲＣＡを行なう；６）ＲＣＡ産物にハイブリダイズする検出子プローブであって、フルオレセインなどのエピトープを含有するものを加える；７）エピトープに結合することができるような形で酸化還元部分に連結された抗体を加える；８）酸化還元部分の存在に関係する酸化還元活性を検出する。
【００５９】
オンチップ増幅を行なった後、増加したＤＮＡ量は、より大きくより検出しやすいシグナルを生成することができる。これはアッセイ目的には有利でありうる。なぜなら、プローブと標的の両方が通例、何らかの検出可能シグナルを生じるからである。標的のシグナルが増強されると、ハイブリダイズした捕捉プローブとハイブリダイズしていない捕捉プローブとの相違が大きくなるだろう。しかし、場合によっては、メチルホスホネートおよびＰＮＡなどの核酸類似体を捕捉プローブとして使用することができる。別の実施形態では、メチルホスホネートおよびＰＮＡなどの核酸類似体を、検出子プローブとして使用することができる。
【００６０】
したがって、核酸のオンチップ増幅は、ハイブリダイズした標的のシグナルを増強するのに有用な技術の一つである。オンチップ増幅は単独で使用するか、触媒的検出などの他のシグナル増強技術と一緒に使用することができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態は、以下のステップを含む：（１）電極表面上に固定化した捕捉プローブに標的をハイブリダイズさせるステップ；（２）高い連続移動性および鎖置換能を持つポリメラーゼを使ってオンチップローリングサークル増幅を行なうステップ；（３）チップ上の増幅産物に検出子プローブを結合させるステップ；および（４）高い電気化学反応性を持つ酵素から生成される触媒的シグナルを検出するステップ。
【００６１】
オンチップ増幅とＨＲＰによる触媒的検出との両方を使って直接病原体検出を行なうためのシグナル増幅を、図４に図解する。基板８上に位置する２つの電極表面１０Ａおよび１０Ｂが示されている。捕捉プローブ２０Ａおよび２０Ｂ（異なる配列を持つもの）がそれぞれ電極表面１０Ａおよび１０Ｂに固定化される。標的鎖２２がアッセイに導入される。この標的２２は捕捉プローブ２０Ａに相補的であるが、捕捉プローブ２０Ｂには相補的でない。したがって標的２２は捕捉プローブ２０Ａにハイブリダイズするが、２０Ｂにはハイブリダイズしない。標的２２がハイブリダイズすると、それはオンチップ増幅によって伸長され、その結果伸長した部分はオンチップＲＣＡ産物２３と呼ぶことができる。次に、複数の酸化還元部分２４がアッセイに導入される。これらの部分はカチオン電荷を含有し、核酸のリン酸基と静電的に会合する。酸化還元部分は捕捉プローブ２０Ａおよび２０Ｂ、標的鎖２２、およびＲＣＡ産物２３と会合する。複数の酸化還元反応２８が各酸化還元部分で起こる。これらの酸化還元反応は電子の移動を含み、それは、電子が電極１０Ａおよび１０Ｂを通過する際に電流を生成する。１０Ａ電極における反応量は１０Ｂ電極における反応量を超えるので、１０Ａ電極における検出可能な電気シグナルの方が大きくなる。これは、２０Ａ捕捉プローブが標的２２に相補的であり、かつ捕捉プローブ２０Ｂは標的２２に相補的でないと、アッセイ使用者が結論できるということを意味する。
【００６２】
ＲＣＡおよびシグナル結合のスキームを図５に示す。この実例では、存在するＤＮＡをさらに増加させ、シグナルを増強するために、分岐化（「ブリッジ化」ともいう）が用いられる。ここでは捕捉プローブ１０が電極表面１０に固定化される。次に、第１サークル５０をプローブ２０に（捕捉プローブ１０上の「Ｐ２」がサークル５０上の「Ｃ２」に相補的である区域で）ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後にＲＣＡが進行して、固定化された捕捉プローブ２０から伸びる第１ＲＣＡ産物２３Ａが生成する。次に、ブリッジ６０を第１ＲＣＡ産物２３Ａにハイブリダイズさせる（第１ＲＣＡ産物２３Ａの「Ｐｔ」領域はブリッジ６０の「Ｃｔ」領域に相補的である）。次に、第１サークル５０Ｂがブリッジ６０にハイブリダイズする（ブリッジ６０の「Ｐｘ１６」領域は、第２サークル５０Ｂの「Ｃｘ１６」領域に相補的である）。次に、第２サークル５０Ｂがブリッジ６０にハイブリダイズした場所でＲＣＡが進行して、第２ＲＣＡ産物２３Ｂが生成する。次に、検出子プローブ３０が第２ＲＣＡ産物２３Ｂにハイブリダイズする。検出子プローブ３０に取り付けられたフルオレセイン（ＦＬ）が示されており、そのフルオレセインにはＨＲＰが（例えば抗体複合体によって）カップリングされる。その場合、ＨＲＰは酸化還元反応に参加して、電極１０で検出可能な電子の流れを誘発することができる。核酸配列も記載する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、オスターヤング矩形波ボルタンメトリー（ＯＳＷＶ）を使って、ＲＣＡによるシグナル増幅を記録することができる。この技術を使った場合、非サークル対照は−２００ｍＶの電圧で約０．０５０μＡの電流を生成することが観察された（「非サークル」対照では、ハイブリダイゼーション後にＲＣＡが起こらない）。非相補対照捕捉プローブ（配列６５．５）も、−２００ｍＶの電圧で約０．０５μＡの電流を生じることが観察された（「非相補」対照では、標的が捕捉プローブに相補的でなく、したがってハイブリダイズしない）。しかし、ハイブリダイズし、ＲＣＡによる増幅を受けた標的は、−２００ｍＶの電圧で約０．４５０μＡの電流を生成した。
【００６４】
固定化プローブのｉｎ−ｓｉｔｕライゲーションを用いる代替的伸長方法の一例を図６に示す。図示するように、捕捉プローブ２０を電極１０上に固定化し、固定化プローブの遊離端を超えて伸びる領域を持つ相補的標的２２を、捕捉プローブ２０にハイブリダイズさせる。次に、標的２２のうち捕捉プローブ３０を超えて伸びている区間に相補的な領域を持つ第３ポリヌクレオチド８０を、ハイブリダイズした標的２２にハイブリダイズさせる。次に、第３ポリヌクレオチド８０を固定化捕捉プローブ３０にライゲートする。これを達成するために、第３ポリヌクレオイド８０は、標的２２がプローブ２０に相補的である領域の直ぐ隣に位置する標的２２中の配列に、ハイブリダイズしうる。もう一つの選択肢として、プローブ２０に相補的な標的配列と第３ポリヌクレオチド８０に相補的な標的配列との間にはギャップが存在してもよい。ギャップが存在する実施形態では、ライゲーションに先だってポリメラーゼを使ってギャップを埋めることができる。第３ポリヌクレオチド８０を例えばローリングサークル増幅などによって延長すると有利である。また、多くの実施形態では、固定化された核酸にブリッジ６０をハイブリダイズさせることも有利である。これらのブリッジの伸長は、電極上に固定化された核酸の量をさらに増強する。次に、図６に示すように、遷移金属錯体（例えばルテニウム錯体）または酵素（例えばＨＲＰ）などの酸化還元部分２４が、最初に起こったプローブ／標的ハイブリダイゼーションの指示薬として、核酸と会合しうる。
【００６５】
病原体検出の一例を図７に示す。ここでは、病原体由来の標的ヌクレオチド２２が固定化プローブ２０にハイブリダイズし、ブリッジ６０が標的２２に取り付けられ、ブリッジ６０がローリングサークル増幅によって伸長されることにより、ＲＣＡ産物２３が作られる。この例では、酸化還元部分２４がブリッジ６０およびＲＣＡ産物２３とだけ会合する。これは病原体検出において有利である。なぜなら、検出に利用できる標的の量は非常に少ない場合が多いからである。酸化還元部分２４がプローブ２０および標的２２と会合するのを防ぐような形でのアッセイの調製は、荷電主鎖を含有しないホスホネートおよびＰＮＡなどの核酸類似体を用いることによって達成することができる。この技術は、核酸ハイブリダイゼーションが起こっていない電極での電子移動が引き起こす背景ノイズを最小限に抑えることにより、真の陽性結果を、比較上はるかに顕著にするために使用することができる。
【実施例】
【００６６】
実施例１：オンチップ増幅、ブリッジ化、および触媒的検出を用いる核酸アッセイ
以下のプロセスを核酸検出アッセイに使用した。
【００６７】
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．から入手可能な脱グリコシル化型アビジン）で修飾した電極表面にビオチン化捕捉プローブを固定化した。この固定化捕捉プローブはＤＮＡ伸長のプライマーとしても役だった。
【００６８】
電極表面に固定化された捕捉プローブに、環状５８マーＤＮＡ（サークル１）をハイブリダイズさせた。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるプライマー伸長を、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよび他の必要な化学薬品の存在下で開始させた。ＲＣＡの作用により、ｄＮＴＰｓが、前記サークルの何千もの反復コピーから構成される一本鎖コンカテマーＤＮＡ分子に変換された。使用したサークルの量は極めて少なく、数百〜数千ＤＮＡ分子の範囲だった。
【００６９】
ステップ２におけるＲＣＡ産物と第２環状ＤＮＡ（サークル２）の間をブリッジするもう一つのＤＮＡ分子を、ステップ２で生成したコンカテマーＤＮＡ分子にハイブリダイズさせた。次に第２環状ＤＮＡを、そのブリッジＤＮＡ分子にハイブリダイズさせた。ＲＣＡ反応を再び行なった。この第２ＲＣＡ反応は分岐ＤＮＡをもたらした。したがって逐次的なＲＣＡによるシグナル増幅は指数的である。
【００７０】
ＲＣＡによって生じた分岐ＤＮＡの一部に相補的でありかつ２つのフルオレセイン分子で修飾されている１５マーＤＮＡ分子を、分岐ＤＮＡにハイブリダイズさせた。次に、検出子プローブとして役立つように、その１５マーフルオレセイン修飾ＤＮＡに、抗フルオレセインＰＯＤを結合させた。
【００７１】
サークル１の検出は、ＴＭＢを媒介物質として、ＰＯＤによるＨ２Ｏ２の水への還元によって行なった。読出しは定常状態電流−時間曲線である。極めて低濃度のサークル１の存在下での電流応答は、サークル不在下での電流応答より数倍大きかった。
【００７２】
実施例２：オンチップ増幅、ブリッジ化、および触媒的検出を用いる代替的核酸アッセイ
電極表面上に固定化したアビジンによって固定化された捕捉プローブは、標的に相補的な配列を含有する。次に、試料核酸をプローブにハイブリダイズさせる。標的内の配列に相補的な配列を含有する環状プローブを加える。このサークルは、後続のステップで使用する検出子プローブに相補的な特異的配列も含有する。
【００７３】
好ましくは１００ｎｔより小さいサイズを持つこのサークルは、まず、電極上に固定化したプローブにハイブリダイズさせた標的核酸に結合する。ポリメラーゼ酵素の存在下で、標的核酸をプライマーとして、サークル配列は一定温度で複数回コピーされる。その結果、検出子プローブに相補的である複数コピーの配列を含むサークルの配列に相補的な複数の反復配列を含有する表面固定化伸長ＤＮＡ分子が得られる。オンチップＲＣＡ用の好ましいＤＮＡポリメラーゼには、高い連続移動性および強い鎖置換特徴を持つもの、例えばΦ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大（クレノウ）フラグメント、およびシークエナーゼなどがある。
【００７４】
洗浄後に、伸長されたＤＮＡ産物を、ＲＣＡ産物の一部に相補的なハプテン標識検出子プローブにハイブリダイズさせる。次に、フルオレセインまたはジゴキシギニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｉｎｉｎ）などのハプテンが抗体−ＨＲＰコンジュゲートに結合し、電子移動媒介物質および過酸化水素の存在下で、酵素的電子移動反応により、触媒的電流を生成する。
【００７５】
あるいは、上述のように検出子プローブをＲＣＡ産物にハイブリダイズさせるのではなく、以下のように第２ＲＣＡ産物を生成させる。この実施形態では、ＲＣＡ産物の一部に相補的なヌクレオチド配列および第２環状プローブに相補的な核酸配列を含む線状ブリッジ核酸を、そのブリッジ核酸が第１サークルからの増幅産物をその５’末端で、そして第２サークルをその３’末端でブリッジするように、ＲＣＡ産物にハイブリダイズさせる。ＲＣＡ時に、第１サークルは第１サークルの相補配列の繰り返しを複数含有する線状ＤＮＡ産物を生成し、一方、第２サークルは第２ＲＣＡ産物を生成する。結果として、数百万倍〜数十億倍の増幅が一定温度で数時間のうちに達成され、ＤＮＡ標的の高感度な検出が可能になる。増幅後に、両サークルから生成したＤＮＡ産物中に存在する反復配列に、検出子プローブを結合させる。最後に、抗Ｆｌ−ＨＲＰコンジュゲートが検出子プローブに結合し、触媒的電気化学的検出により、シグナルがさらに増幅される。
【００７６】
手続きを簡単にするために検出子プローブを増幅溶液中に加えることもできる。
【００７７】
実施例３：パッドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブサークルの使用
パッドロックプローブサークル（ＰＬＰＣ）を以下の核酸検出アッセイで抗フルオレセイン−ＨＲＰコンジュゲートと共に使用した。
【００７８】
ＦＶ−ＰＬＰ  ７５．０３（ＰＬＰＣ，配列番号１３）の２５０ｎＭ試料を使って、１：１００、１：１０００、および１：１０，０００の希釈液を調製した。捕捉プローブ（６５．４）（配列番号２６）をチップ上に固定化した後、各希釈度のサークルを捕捉プローブに３７℃で１５分間結合させた。次に、結合したサークルを利用するオンチップＲＣＡ反応を６０℃で１時間進行させた。
【００７９】
次に、固定化核酸を０．２５μＭ  ＦＬ−Ｔ７−ＦＬシグナルプローブと共にハイブリダイゼーション緩衝液中、室温で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ／カゼイン中の抗フルオレセイン−ＨＲＰの１：２００希釈液をチップと共に室温で２０分間インキュベートした。定常状態電流測定を、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｋ−Ｂｌｕｅ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手したもの）中で３０秒間行なった。
【００８０】
結果を表１に示す。表示のとおり、電極あたりのＰＬＰＣ分子数は、電極における検出可能電流と直接的関係を持つことが観察された。
【００８１】
【表１】
2007512810.tif 000003
【００８２】
ＨＲＰ触媒法を使った検出をルテニウム錯体静電検出と比較した。例えば、ルテニウムヘキサミン（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｅｘａｍｉｎｅ）などのルテニウム錯体を使った検出は、触媒的プロセスではなく、移動した電子をルテニウム錯体に渡し、移動した電子はそこに留まる。これは、還元されたルテニウム錯体が再利用されてより多くの電子を受け取るようにはならないことを意味している。したがって、このように非触媒的であるプロセスは、使用される酸化還元部分（ルテニウムヘキサミンなど）の量によって、その正確さが制限される。触媒的検出を非触媒的検出と比較した結果を図８に示す。図の上側に、触媒的検出を棒グラフとして、対応する時間経過と共に示す。ルテニウム錯体を使った非触媒的検出は、下部の４つの線グラフに示す。ルテニウム結果において、各グラフについて１２のシグナルは４パッドチップでの３回の読みに対応する。最も低い４シグナルのセットはＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎのみであり、次の４つはＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ＋捕捉プローブを表し、最も高い４つはＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ＋捕捉プローブ＋捕捉されたアンプリコンのＲＣＡ産物を表す。
【００８３】
図８に示すように、触媒的検出の方が、極めて希薄な試料では特に、高い感度が可能である。例えば触媒的検出法では、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、および０の希釈度は全て、対応する電流に基づいて互いに容易に識別される。しかしルテニウム検出では、１：１００および１：１０００の希釈度は容易に識別されるが、１：１０，０００の希釈度と０の希釈度に対応する電流の間には認知できる相違がない。したがって、ルテニウムを使った場合、検出限界は希釈度１：１０００と希釈度１：１０，０００の間のどこかにあるが、ＨＲＰを使った場合の検出限界がそれよりかなり低い。
【００８４】
実施例４：定量的検出
試料中の標的核酸を定量することができる本発明のさらなる応用例を図９に示す。図示するように、濃度が２５ｐＭ、２５０ｐＭ、および２５００ｐＭの標的核酸を、触媒的プロセスを使って検出した。検出可能な電流は存在する標的核酸の濃度と共に変化した。これにより、実際の濃度がわからない場合に、試料中の標的核酸濃度を、検出された電流に基づいて予測することが可能になるだろう。この実施形態の実用的応用例には、例えば特定試料における病原体の蔓延を決定することが含まれる。より具体的には、この技術は、特定ウイルスによる感染を患っている患者におけるウイルス量を決定するために使用することができるだろう。
【００８５】
実施例５：標的、ブリッジ、およびサークルの濃度を変化させつつ、オンチップ増幅および触媒的検出を使って行なったハイブリダイゼーションの検出
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて以下のプロセスを使用した。
【００８６】
表２に列挙する成分を使って、電極表面上に沈着させる薄膜を調製した。
【００８７】
【表２】
2007512810.tif 000004
【００８８】
この溶液２μｌを遺伝子チップ上のさまざまな電極スポットに移し、乾燥させた。安定な被膜が施され、真空乾燥された。乾燥した薄膜を乾燥器中に一晩保存した。
【００８９】
乾燥した薄膜を１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０中に３７℃で１５分間置いた後、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１０ｍＭ  ＮａＣｌ中ですすぎ洗いした。
【００９０】
このアッセイで使用した配列を図１０（図１０‐１、図１０‐２）に示す。標的（７０．５２）（配列番号７）、ブリッジ（３９．２９）（配列番号１１）、およびサークル（７５．０３）（配列番号１３）のハイブリダイゼーションは、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１Ｍ  ＬｉＣｌまたは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で２．５ｎＭの各成分を混合することにより、溶液状態で行なった。その混合物を８０℃まで１０分間加熱し、室温に冷却した。
【００９１】
捕捉プローブへの上記混合物のハイブリダイゼーションは、混合物１０μｌを各チップ表面に適用し、３７℃で１５分間インキュベートし、実験台上で室温まで冷却することによって行なった。
【００９２】
ハイブリダイゼーション後に、チップ表面上の溶液を吸い取り紙で取り除き、続いてｐＨ７．５の１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１Ｍ  ＬｉＣｌまたは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。
【００９３】
電極を吸い取り紙で乾燥させ、ＲＣＡ作業溶液２０μｌを各チップの表面に移した。ＲＣＡを３７℃で１時間行なった。ＲＣＡ作業溶液１０μｌは、１０Ｘ緩衝液１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．５μｌ、２Ｍ  ＫＣｌ  ０．５μｌ、水６．５μｌおよびｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを含有した。
【００９４】
チップ表面に残っているＲＣＡ作業溶液を吸い取り紙で乾燥させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌですすぎ洗いし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌに保存した。
【００９５】
次に検出子プローブ（２つのフルオレセインで修飾されたＴ７配列の一部）とのハイブリダイゼーションを行なった。これを達成するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０５％ＢＳＡ中、０．２５μＭの検出子プローブを、ハイブリダイゼーション溶液中に用意した。ハイブリダイゼーションは３７℃で１５分間行い、実験台上で室温まで冷却した。
【００９６】
吸い取り紙でチップを乾燥し、１  ＸＰＢＳ（０．００８Ｍ  ＮａＰｉ＋０．００２Ｍ  Ｋｐｉ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１Ｍ  ＫＣｌ  ｐＨ７．４）ですすぎ洗いした。
【００９７】
チップ表面に残っているＰＢＳ溶液を吸い取り紙で除去した。次に、０．５％カゼインを含有するＰＢＳ中の抗フルオレセイン−ＰＯＤの１：２００希釈液を含有するハイブリダイゼーションウェルにチップを適用した。
【００９８】
チップを吸い取り紙で乾燥させた後、１ＸＰＢＳですすぎ洗いし、１ＸＰＢＳ中に保存した。
【００９９】
Ｋ−ｂｌｕｅ溶液を受け取ったままの状態で使用した。測定はＡｇ／ＡｇＣｌ（Ａｇ線）に対して−２００ｍＶで３０秒間行なった。
【０１００】
チップ上に沈着させる溶液を調製する際に、２種類の標的核酸濃度を使用し、４種類のブリッジ核酸濃度およびサークル核酸濃度を使用した。それらの濃度を表３に示す。
【０１０１】
【表３】
2007512810.tif 000005
【０１０２】
アッセイの結果を図１１に示す。図示するように、標的、ブリッジ、およびサークル核酸鎖の濃度を変化させると、標的核酸の濃度と相関関係にある電流レベルがもたらされたことから、試料中に存在する標的核酸のレベルの定量における上述した方法の有効性が実証された。
【０１０３】
実施例６：ＨＲＰを使った検出を伴う２段階ＲＣＡ
以下の実施例では、電気化学的検出アッセイを行なう際に「２段階」ＲＣＡ手続きを使用した。このプロセスを図１２に図解する。図示するように、合成的に調製された第１サークル１００が、捕捉プローブによって捕捉され、プライマー伸長が起こる。図１２では、セグメント化されたサークルおよび線状核酸分子が描かれている。各セグメントはそれが含有するユニークな塩基配列によって定義される。ＲＣＡプロセスが起こると、サークルが回転を完了する度に、それらのセグメントが反復される。例えば、４つのセグメントを含有する第１サークル１００を示し、そのうちの１つのセグメントを「Ｃｘ２４７」と呼ぶ。「Ｃｘ２４７」セグメントは、最初に固定化された鎖の第１アンプリコン１０２上の「Ｐｘ２４７」と呼ばれるセグメントに相補的である。第１サークルのもう一つのセグメントを「Ｃｎ」と呼ぶ。「Ｃｎ」セグメントはアンプリコン１０２上の相補的「Ｐｎ」セグメントに相補的である。
【０１０４】
次のステップでは、第２サークル１１０にハイブリダイズしたプライマーを含有するＲＣＡ開始複合体を使って、二次増幅が起こる。図１２に示す第２サークル１１０は３つのセグメントを含有し、そのうちの２つは、それぞれ「Ｐｘ２４７］および「Ｔ７」と呼ばれる。次にこのＲＣＡ開始複合体が第２ＲＣＡプロセスを実行する。さらに、第２ＲＣＡの産物は、第１ＲＣＡの産物にハイブリダイズすることができる。図１２に示すように、第１アンプリコン１０２はセグメントＰｘ２４７を含有し、第２アンプリコン１１２は配列Ｃｘ２４７を含有する。Ｐｘ２４７とＣｘ２４７は相補的であるので、これら２つの鎖の間にこれらのセグメントでハイブリダイゼーションが起こりうる。ハイブリダイゼーションの結果は、電極に取り付けられる核酸の量を効果的に増加させ、それによって、核酸の存在に基づく検出可能な電気シグナルを増強するということである。
【０１０５】
さらに、追加のＲＣＡ開始複合体（第３環状分子にハイブリダイズしたプライマーを含有するもの）を利用する「多段階」ＲＣＡ手続きを使用することができる。図１２に示すように、第３サークル１２０は、第３ＲＣＡを行なって第３アンプリコン１２２を生じさせることができる第２ＲＣＡ開始複合体中に使用される。ここでは、「ｔ７」と呼ばれるセグメントが、第２アンプリコン１１２上のＰｔ７と呼ばれるセグメントに相補的である。先ほどと同様に、相補的領域はハイブリダイズすることができ、電極に取り付けられた核酸の量をさらに増加させることができる。さらに、多段階ＲＣＡ手続きは追加のＲＣＡ開始複合体を伴い、例えば第４、第５、第６、および／または第７ＲＣＡプロセスあるいはそれ以上の、追加のＲＣＡ手続きを特徴とすることができると考えられる。そのような手続きのＲＣＡ産物は、それらがアッセイ内で他の任意のＲＣＡ産物にハイブリダイズすることができるように調製することができる。さまざまなＲＣＡ産物のそれぞれが別の鎖にハイブリダイズすることができて、各ＲＣＡ産物が最初に固定化された鎖に直接的または間接的に取り付けられることになるように、さまざまなＲＣＡ産物を設計することが有利である。
【０１０６】
ＨＲＰによる検出を伴う２段階ＲＣＡを以下のように行なった。電極表面上に捕捉プローブを固定化することにより、それぞれが１２個の電極を含有するアッセイチップを調製した。プローブは、検査対象であるライゲートされたＰＬＰサークル標的に特異的であるという理由で選択された。次にチップを１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５／２００ｍＭ  ＮａＣｌ中に３７℃で２０分間浸漬した。矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中の５μＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋内で行なった。１２パッドチップ上に標的含有溶液２０μｌを加えることによって、標的ハイブリダイゼーションを行なった。チップを６０℃で１０分間および室温で３０分間インキュベートした。チップを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ですすぎ洗いした。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を含有するＲＣＡ溶液を１チップに２０μＬずつ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｍｇ２Ｃｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、フルオレセインタグを含有する検出子プローブ４００ｎＭ、およびφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ２０単位と共に加えた。次に、ＲＣＡを室温で５分間進行させた。１０ｎＭ汎用ＰＬＰおよび１５ｎＭ  ＲＣＡ開始複合体のライゲーションによって得た汎用サークル溶液２μｌを各チップに加え、３７℃で１時間インキュベートした。チップをＰＢＳ緩衝液ですすぎ洗いした。ＰＢＳ／０．５％カゼイン中の１：２００希釈抗フルオレセインＨＲＰコンジュゲート５０μｌを各チップに加え、室温で３０分間インキュベートした。チップをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０ですすぎ洗いした。定常状態電流をＫ−Ｂｌｕｅ溶液中でＡｇ線に対して−２００ｍＶで測定した。
【０１０７】
結果を図１３に示す。図示するように、観察された電流は第２ＲＣＡ段階後の方が、第１ＲＣＡ段階後よりも高い。
【０１０８】
実施例７：ルテニウムヘキサミンを使った検出を伴う２段階ＲＣＡ
Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋を使った矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）による検出を伴う２段階ＲＣＡを以下のように行なった。ライゲートされたＰＬＰサークルに特異的な捕捉プローブを固定化したチップを、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５／２００ｍＭ  ＮａＣｌに３７℃で２０分間浸漬した。矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中の５μＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋内で行なった。１２パッドチップ上に標的含有溶液２０μｌを加えることによって、標的ハイブリダイゼーションを行なった。チップを６０℃で１０分間および室温で３０分間インキュベートした。チップを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ですすぎ洗いした。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を含有するＲＣＡ溶液を１チップに２０μＬずつ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｍｇ２Ｃｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、およびφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ２０単位と共に加えた。次に、ＲＣＡを室温で５分間進行させた。１０ｎＭ汎用ＰＬＰおよび１５ｎＭ  ＲＣＡ開始複合体のライゲーションによって得た汎用サークル溶液２μｌを各チップに加え、３７℃で７０分間インキュベートした。チップをＰＢＳ緩衝液ですすぎ洗いした。ＳＷＶを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中の５μＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋内で行なった。
【０１０９】
結果を図１４に示す。図示するように、観察される電流はＲＣＡ後の方がＲＣＡ前より高く、ＲＣＡ後の検出可能電流は濃度と相関関係を示す。
【０１１０】
本明細書に記載した技術を用いることにより、ブリッジ化、伸長、触媒的検出、およびそれらのさまざまな組合せによって、ＤＮＡ標的の超高感度検出を可能にすることができる。オンチップＲＣＡは標的の限局的増幅および検出を可能にする。したがって、ＰＣＲまたは他のタイプの増幅スキームより優れた、ＤＮＡ診断の多重化ならびに細菌またはウイルスの検出を行なうための技術を実施することができる。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態は、電気化学的検出だけでなく、他のタイプの検出様式、例えば蛍光、化学発光、および比色法などにも使用することができる。いくつかの実施形態は、マイクロプレートアッセイ、マイクロアレイアッセイ、メンブレンおよびフィルターアッセイ、ならびにさまざまな形式の電極基板上での電気化学的アッセイに使用することができる。
【０１１２】
さらに、いくつかの実施形態は、ＰＣＲおよび細胞培養などの標的増幅を行なわずに用いることができる。例えば細菌を検出する場合、１個の細菌細胞は数千コピー〜数十億コピーのｒＲＮＡを含有し、その各々は、数千ヌクレオチド〜数十万ヌクレオチドの範囲にわたる長さを持つ。ここに開示する技術には、１標的分子につき複数の検出子試薬および酵素触媒型電気化学的検出という利点があり、これを感染性疾患の迅速かつ直接的な検出に利用することができる。
【０１１３】
さらに、いくつかの実施形態は、試料中の標的核酸のレベルを定量するために用いることができる。ある個体中で病原生物がどの程度増殖しているかを測定する場合にそのような定量は役立つ。特に、いくつかの実施形態は、感染した個体におけるウイルス量を測定するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ＨＲＰおよびＴＭＢを使ってＨ２Ｏ２を水に変換する触媒サイクルを表す図である。
【図２Ａ】ハイブリダイズした核酸に静電的に会合した検出部分を表す図である。
【図２Ｂ】ハイブリダイズした核酸に検出子プローブを使って会合した検出部分を表す図である。
【図３Ａ】頭尾重合を用いるオンチップ増幅を説明する図である。
【図３Ｂ】ローリングサークル増幅を用いるオンチップ増幅を説明する図である。
【図３Ｃ】分岐技術をローリングサークル増幅と併せて用いるオンチップ増幅を説明する図である。
【図３Ｄ】超分岐技術をローリングサークル増幅と併せて用いるオンチップ増幅を説明する図である。
【図４】オンチップ増幅と触媒的検出の両方を用いる病原体直接検出用のシグナル増幅を説明する図である。
【図５】オンチップ増幅と、検出子プローブ（そこにＨＲＰがカップリングできるもの）のハイブリダイゼーションとの両方を用いるプロセスを表す図である。
【図６】ｉｎ−ｓｉｔｕライゲーションおよびＲＣＡを用いるハイブリダイゼーションの直接検出の一例を表す図である。
【図７】病原体検出の一例を表す図である。
【図８Ａ】ＨＲＰを用いる触媒的検出と、ルテニウム錯体を用いる標準的な電気化学的検出との比較を表す図である。
【図８Ｂ】ＨＲＰを用いる触媒的検出と、ルテニウム錯体を用いる標準的な電気化学的検出との比較を表す図である。
【図８Ｃ】ＨＲＰを用いる触媒的検出と、ルテニウム錯体を用いる標準的な電気化学的検出との比較を表す図である。
【図９】試料中の核酸標的の濃度と検出可能電流との関係を表す図である。
【図１０−１】ＨＰＶ検出アッセイにおいて標的、捕捉プローブ、およびブリッジとして使用した核酸配列を表す図である。
【図１０−２】ＨＰＶ検出アッセイにおいて標的、捕捉プローブ、およびブリッジとして使用した核酸配列を表す図である。
【図１１Ａ】標的、ブリッジ、およびサークル核酸鎖の濃度を変化させたアッセイの結果を表す図である。
【図１１Ｂ】標的、ブリッジ、およびサークル核酸鎖の濃度を変化させたアッセイの結果を表す図である。
【図１１Ｃ】標的、ブリッジ、およびサークル核酸鎖の濃度を変化させたアッセイの結果を表す図である。
【図１２】サークルが捕捉プローブによって捕捉され、捕捉された核酸を増幅するために多段階ＲＣＡが行なわれるＲＣＡ手続きを表す図である。
【図１３Ａ】２段階ＲＣＡとＨＲＰを使った検出とを用いるアッセイの結果を表す図である。
【図１３Ｂ】２段階ＲＣＡとＨＲＰを使った検出とを用いるアッセイの結果を表す図である。
【図１４Ａ】２段階ＲＣＡとルテニウムヘキサミンを使った検出とを用いるアッセイの結果を表す図である。
【図１４Ｂ】２段階ＲＣＡとルテニウムヘキサミンを使った検出とを用いるアッセイの結果を表す図である。
【図１４Ｃ】２段階ＲＣＡとルテニウムヘキサミンを使った検出とを用いるアッセイの結果を表す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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