(57)【要約】  ＦＲＩＬ感受性癌細胞の増殖及び／又は生存を阻害するタンパク質のＦＲＩＬファミリのある種のメンバーの能力が開示される。ＦＲＩＬタンパク質は、そのようなＦＲＩＬ感受性癌を治療する方法、そのような癌の治療のための医薬の製造、及びそのような癌を視覚化、検出若しくは位置決めのために使用することができる。ＦＲＩＬ感受性癌は、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞皮膚リンパ腫を含む。
2007513879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲＩＬ感受性癌細胞の増殖及び／又は生存を阻害する方法であって、前記癌細胞を、該癌細胞が感受性であるＦＲＩＬタンパク質と接触することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＦＲＩＬ感受性癌細胞がＢ細胞リンパ腫及びＴ細胞皮膚リンパ腫から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂ細胞リンパ腫が成熟Ｂ細胞リンパ球由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂ細胞リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記非ホジキンリンパ腫が、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、外套膜細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫、小胞中心細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、末端領域Ｂ細胞リンパ腫、結節末端領域Ｂ細胞リンパ腫、結節外末端領域Ｂ細胞リンパ腫、脾臓末端領域Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ芽球Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、及びワルデンストロームのマクログロブリン血症から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ細胞リンパ腫がＢ細胞白血病群である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂ細胞白血病が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、前駆体Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、前駆体Ｂリンパ芽球白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、及びバーキット細胞白血病から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ細胞リンパ腫が、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、原発性滲出液リンパ腫、びまん性混合Ｂ細胞リンパ腫、及び未分化Ｂ細胞リンパ腫から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＲＩＬ感受性癌細胞が哺乳動物の生体内にある、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒト患者である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＦＲＩＬ感受性癌細胞が生体外の細胞培養中にある、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
癌細胞がＦＲＩＬタンパク質に感受性であるか否かを決定する方法であって、
前記細胞をＦＲＩＬタンパク質と接触し、そして、前記ＦＲＩＬタンパク質が該細胞の増殖及び／又は生存を阻害するか否かを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項１３】
癌を患っている哺乳動物の患者がＦＲＩＬタンパク質を用いた治療から利益を得るか否かを決定する方法であって、
前記患者の癌細胞をＦＲＩＬタンパク質と接触し、そして、前記ＦＲＩＬタンパク質が該細胞の増殖及び／又は生存を阻害するか否かを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
ＦＲＩＬ感受性の癌を患っている哺乳動物の患者を治療する方法であって、
前記患者に、該癌の増殖及び／又は成長を阻害するＦＲＩＬタンパク質の治療的に有効量を含む医薬組成物を投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
哺乳動物の患者におけるＦＲＩＬ感受性癌を視覚化し、検出し、又は位置決めする方法であって、検出可能に標識したＦＲＩＬタンパク質を前記患者に投与し、そして、該標識を視覚化し、検出し、及び位置決めすることを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記ＦＲＩＬが天然のＦＲＩＬタンパク質及び組換えＦＲＩＬタンパク質から成る群から選択される、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記天然のＦＲＩＬタンパク質が天然のＤｌ−ＦＲＩＬタンパク質、天然のＰｖ−ＦＲＩＬタンパク質、及び天然のＰａ−ＦＲＩＬタンパク質から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＲＩＬタンパク質がＮ末端リーダー配列を欠失している成熟ＦＲＩＬタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＲＩＬタンパク質が配列番号２、３又は６に含まれるアミノ酸配列に対応する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＲＩＬ感受性癌を治療するための医薬の製造におけるＦＲＩＬタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連分野
本出願は、２００３年１１月１２日に出願された米国特許仮出願シリアルナンバー第６０／５１９，１８２号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、Ｂ細胞リンパ腫及び他のＦＲＩＬ感受性癌を治療するための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、先駆細胞貯蔵因子のＦＲＩＬファミリーのメンバーであるタンパク質及びその変異体を用いたそのような障害の治療のための方法及び製造物に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国では、毎年１００万を超える新規癌ケースと診断され、癌に対する多くの療法及び治療処方計画があるもの、米国における５０万を超える人々が毎年癌により死亡する。国立癌研究所によれば、リンパ腫は、米国では毎年約６０，０００の新規症例をもって診断される第５番目に多い共通の悪性腫瘍であり、癌関連の死因の第６番目の先導的な原因である。
【０００４】
リンパ腫の腫瘍の範疇は、Ｂ細胞リンパ腫であり、非ホジキンのリンパ腫及びＢ細胞白血病を含む。Ｂ細胞の非ホジキンのリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）は全てのリンパ腫の症例の主要なものを示し、米国では毎年約５０，０００の新規症例がある。Ｂ細胞の急性リンパ球性リンパ腫（Ｂ−ＡＬＬ）は、１５歳以下の子供への影響が支配的であり、米国では毎年約２，０００の新規症例を示す。
【０００５】
Ｂ−ＮＨＬ及びＢ−ＡＬＬに対する５年生存は、５０％ないし６５％であるが、これらの疾患は、完全に治癒するのは極めて稀である。Ｂ細胞癌による多大な死者と、既知の方法によるこの疾患を治療することの困難さを考慮しても、Ｂ細胞癌を治療するための新規な方法及び組成物の発見は必要である。
【０００６】
ＦＲＩＬタンパク質のファミリーは、増殖及び／又は分化を阻害することによる前駆細胞を保護する能力を有するマルトース結合植物レクチンとして以前に同定され、記載された。（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｂｌｏｏｄ  ９０，Ｓｕｐｐｌ．１，３０８（ａｂｓｔｒａｃｔ）；Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１７３−１７９；Ｃｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６４６−６５０；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２５０２７：１−９）。しかしながら、本開示の前に、ＦＲＩＬタンパク質は、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞皮膚リンパ腫を含む癌細胞に関して、何らかの活性又は有用性を有することは知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、部分的には、ある種のレクチンがＢ細胞リンパ腫、Ｔ細胞皮膚リンパ腫及び他のＦＲＩＬ感受性癌の治療に有用であるという発見に依存する。具体的には、本発明は、ＦＲＩＬタンパク質のファミリーの同定、及びこれらのタンパク質は、元々前駆細胞における効果について同定され、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞皮膚リンパ腫及びある種の他の癌の増殖及び／又は生存を阻害するために有用であるという驚くべき発見に依存する。さらに、本発明は、そのムテイン、キメラ及び融合を含む有用なＦＲＩＬタンパク質変異体の同定及び開発に依存する。
【０００８】
つまり、一側面において、本発明は、癌細胞を、該癌細胞が感受性であるＦＲＩＬタンパク質と接触させることによって、ＦＲＩＬ感受性癌細胞の増殖及び／又は生存を阻害する方法を提供する。ある側面において、ＦＲＩＬ感受性癌細胞は、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞皮膚リンパ腫から選択される。
【０００９】
特定の態様において、Ｂ細胞リンパ腫は、成熟Ｂ細胞リンパ球由来であり、Ｂ細胞リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫であり、即ち、非ホジキンリンパ腫は、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、外套膜細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫、小胞中心細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、末端領域Ｂ細胞リンパ腫、結節末端領域Ｂ細胞リンパ腫、結節外末端領域Ｂ細胞リンパ腫、脾臓末端領域Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ芽球Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、及びワルデンストロームのマクログロブリン血症から選択される。
【００１０】
特定の態様において、Ｂ細胞リンパ腫は、Ｂ細胞白血病であり、即ち、Ｂ細胞白血病は、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、前駆体Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、前駆体Ｂリンパ芽球白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、及びバーキット細胞白血病から選択される。
【００１１】
特定の態様において、Ｂ細胞リンパ腫は、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、原発性滲出液リンパ腫、びまん性混合Ｂ細胞リンパ腫、及び未分化Ｂ細胞リンパ腫から選択される。
ある態様において、ＦＲＩＬ感受性癌細胞は、哺乳動物の生体内にある。特定の態様において、哺乳動物は、ヒト患者である。他の態様において、ＦＲＩＬ感受性癌細胞は、生体外の細胞培養にある。
【００１２】
別の態様において、本発明は、癌細胞がＦＲＩＬタンパク質に感受性であるか否かを、該細胞をＦＲＩＬタンパク質と接触させることによって決定し、そして、ＦＲＩＬタンパク質が該細胞の増殖及び／又は生存を阻害するか否かを決定することによる方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、癌を患っている哺乳動物の患者がＦＲＩＬタンパク質を用いる治療から利益を得るであろうか否かを、患者の癌細胞をＦＲＩＬタンパク質と接触させ、そして、ＦＲＩＬタンパク質が該細胞の増殖及び／又は生存を阻害するか否かを決定することによって決定する方法を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、癌細胞の増殖及び／又は生存を阻害するＦＲＩＬタンパク質の治療的に有効量を含む医薬組成物をＦＲＩＬ感受性癌の患者に投与することによって哺乳動物の患者を治療する方法を提供する。
【００１５】
別の側面において、本発明は、検出可能に標識したＦＲＩＬタンパク質を患者に投与し、患者内でその標識を視覚化し、検出し、又は位置決めすることによって哺乳動物の患者においてＦＲＩＬ感受性癌を視覚化し、検出し、又は位置決めする方法を提供する。
【００１６】
先行する側面のいずれかのある態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、天然のＦＲＩＬタンパク質及び組換えＦＲＩＬタンパク質から選択することができる。特定の態様において、天然のＦＲＩＬタンパク質は、天然のＤｌ−ＦＲＩＬタンパク質、天然のＰｖ−ＦＲＩＬタンパク質、又は天然のＰａ−ＦＲＩＬタンパク質であることができる。ある特定の態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、Ｎ末端のリーダー配列を欠失している成熟ＦＲＩＬタンパク質である。ある特定の態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号６に含まれるアミノ酸配列に対応する。ある態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、配列番号１又は配列番号５を含む核酸から発現される。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＦＲＩＬ感受性癌の治療のための医薬の製造におけるＦＲＩＬタンパク質の使用を提供する。ある態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、選択的に癌細胞を殺すための標準的な化学療法又は試薬と組合わせる。ある態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、毒物又は標的分子に結合される。
【００１８】
図面の簡単な説明
下記の図は、本発明の態様を例証するものであり、特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書に言及された特許、科学及び医学刊行物は、本発明がなされた当時の当業者に利用可能であって知識を確立する。本明細書に引用された、発行された米国特許、公開され及び係属中の特許出願、及びその他の引用文献の完全な開示は、参照により本明細書に援用される。
【００２０】
定義
本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、その他、下記に定義されない限り、当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有することが意図される。本明細書に使用される技術に関する参考文献は、当該技術分野において共通して理解される技術を意味することが意図され、当該技術の変形、又は当業者に明白であろう均等な又は後に開発された技術の置換を含む。加えて、本発明である特定事項をより明確に及び簡潔に記載するために、以下の定義は、本明細書及び前述の特許請求の範囲において使用されるある用語のために提供される。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語「ＦＲＩＬ感受性癌」は、癌細胞を本発明のＦＲＩＬタンパク質と接触させることが統計的に有意な程度に該細胞の増殖及び／又は生存を阻害するいずれかの癌の形態を意味する。癌細胞は、過形成細胞、生体内で増殖の接触阻害の欠如を示す細胞、非転移性腫瘍細胞、又は転移細胞であってもよい。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「天然のＦＲＩＬタンパク質」は、タンパク質が天然に発現するマメ科植物（ｌｅｇｕｍｅ）から単離したＦＲＩＬタンパク質を意味する。
本明細書で使用されるように、用語「組換えＦＲＩＬタンパク質」は、タンパク質が組換え遺伝子によって発現する生物から単離したＦＲＩＬタンパク質を意味し、該生物には限定されないが、ＦＲＩＬタンパク質をコードする組換え構築物でトランスフェクトされた細菌、酵母、植物又は動物細胞が含まれる。組換えＦＲＩＬタンパク質は、天然のＦＲＩＬタンパク質と同一のアミノ酸配列を有することができ、又は、１若しくはそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換を含むアミノ酸配列を有することができ、限定されないが、Ｎ末端の付加若しくは欠失、Ｃ末端の付加若しくは欠失、及びキメラタンパク質を含む。
【００２３】
本明細書に使用されるように、用語「ＦＲＩＬタンパク質」は、さらに修飾されることなく、いずれかの天然のＦＲＩＬタンパク質又は組換えＦＲＩＬタンパク質を意味する。
アミノ酸に関して本明細書に使用されるように、用語「パーセント同一性」及び「配列同一性」は、同一性を最大にする２つの配列の整列に基づく該配列の類似性の程度、及び配列の整列における同一のヌクレオチド又は残基の数、全ヌクレオチド又は残基の数、及びギャップの長さの関数である上記程度の測定を意味する。多数のアルゴリズム及びコンピュータープログラムは、標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するために利用することができる。例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）。本明細書に使用されるように、パーセント同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムについてのデフォルト値に基づく。
【００２４】
タンパク質調製について本明細書に使用されるように、用語「実質的に純粋な」は、意図的に含まれる他の化合物の重量を除き、少なくとも６０％（乾燥重量で）の関心のあるタンパク質を含有する調製物を意味する。ある態様において、前記調製物は、意図的に含まれる他の化合物の重量を除き、関心のあるタンパク質の乾燥重量で、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析のいずれかの適当な方法によって測定することができる。調製物が意図的に本発明のタンパク質の２つ又はそれ以上を含む場合、「実質的に純粋な」調製物は、本発明のタンパク質の全乾燥重量が、意図的に含まれる化合物の重量を除き、少なくとも６０％の全乾燥重量である調製物を意味する。２つ又はそれ以上の本発明のタンパク質を含有するそのような調製物について、本発明のタンパク質の全重量は、意図的に含まれる他の化合物の重量を除き、調製物の全乾燥重量の少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％であり得る。したがって、本発明のタンパク質が、投与、安定化、保存等の目的のために、１つ又はそれ以上の他のタンパク質（例えば、血清アルブミン）又は化合物（例えば、希釈剤、界面活性剤、賦形剤、塩、多糖、糖類、脂質）と混合した場合、そのような他のタンパク質又は化合物の重量は、調製物の純度の計算において無視される。
【００２５】
本明細書で使用されるように、句「ＡはＢと接触する」にあるような用語「接触する」は、ＡとＢを一緒に溶液中で混合すること、又は溶液Ａを基質上のＢに注ぐことによって、分子レベルでＡとＢが相互作用するのに十分な物理的近位にもらすことを意味する。本明細書において使用されるように、句「ＡはＢと接触する」とは、「ＢはＡと接触する」に均等であることを意図し、そして、限定されないが、いずれかの要素が他に対して固定化され、又はいずれかの要素が他に対して動かされることを含む。
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「標識される」は、標準的な化学的、生化学的、生物学的なアッセイ又は視覚化アッセイによって検出を促進するために化学的に構築され又は修飾されることを意味し、限定されてないが、該アッセイには、放射アッセイ（例えば、放射活性アイソトープアッセイ）、光学分光学的アッセイ（例えば、蛍光、化学ルミネッセンス、生物ルミネッセンスアッセイ）、免疫アッセイ（例えば、酵素連結免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫放射アッセイ）、ＣＡＴスキャン又は磁気共鳴視覚化アッセイを含む。
【００２７】
本明細書で使用されるように、用語「治療的に有効な量」は、意味のある患者の利益（例えば、癌細胞の増殖率における統計学的に有意な減少、癌細胞の実際の数若しくは力価における統計学的に有意な減少、固形腫瘍のサイズにおける増加率の統計学的に有意な減少、固形腫瘍のサイズにおける統計学的な有意な減少）を示すのに十分である医薬組成物の各々の活性成分の全体量又は方法を意味する。個別の活性成分を適用し、単独で投与した場合、その用語は、成分単独を意味する。併合して適用した場合、その用語は、組合わせて連続的に又は同時に投与して、治療効果に帰着する活性成分（複数）の組合わせた量を意味する。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「増加する」及び「減少する」は、それぞれ、統計学的に有意な増加（即ち、ｐ＜０．１）及び統計学的に有意な減少（即ち、ｐ＜０．１）を引き起こすことを意味する。
【００２９】
本明細書で使用されるように、用語「阻害する」は、基準レベル、又は特定の治療のない場合に期待されていたレベルに対して、増殖率（即ち、細胞の再生産）又は生存率のような特定の特徴において減少を引き起こすことを意味する。
【００３０】
本明細書で使用されるように、用語「統計学的に有意な」は、関連した帰無仮説の下で１０％未満の可能性（即ち、ｐ＜０．１）を有することを意味する。
本明細書で使用されるように、可変についての数値域の詳細は、本発明がその数値域内での値のいずれかに等しい変数で実行してもよいことを示唆することを意図する。つまり、本質的に不連続である変数について、変数がその数値域内でのいずれかの整数に等しいものとなり得て、その範囲の端点を含む。同様に、本質的に連続である変数について、変数がその数値域内でのいずれかの実数に等しいものとなり得て、その範囲の端点を含む。例として、及び、限定されることなく、０と２との間における数値を有するとして記載される変数は、その変数が本質的に不連続である場合、数値０、１又は２を取ることができ、そして、その変数が本質的に連続である場合、数値０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は０以上及び２以下のいずれかのその他の実数を取ることができる。
【００３１】
本明細書で使用されるように、その他、具体的に指示がない場合、単語「又は」は、「及び／又は」の包含的意味で使用され、そして、「いずれか／若しくは」の限定的意味で使用されない。
【００３２】
一般的考察
本発明は、部分的に、ある種のレクチンが、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞皮膚リンパ腫及びその他のＦＲＩＬ感受性癌の治療に有用であるという発見に依存する。具体的には、本発明は、ＦＲＩＬタンパク質がＢ細胞リンパ腫及びＴ細胞皮膚リンパ腫を含むある種の癌性細胞に結合し、それらの細胞の増殖及び／又は生存を阻害するという発見に依存する。ＦＲＩＬタンパク質はまた、非癌性細胞（例えば、Ｆｌｔ３受容体発現前駆細胞）にも結合するが、それらの細胞の増殖及び／又は生存を阻害する能力が減少しているか、又は能力を有しない。つまり、本発明のＦＲＩＬタンパク質は、ある種の癌の増殖及び／又は生存を選択的に阻害することができ、そして、したがって、それらは、そのような癌の患者に対する治療に有用であり得る。加えて、そのような癌細胞に選択的に結合する能力のために、標識したＦＲＩＬタンパク質はそのような癌を資格化し、検出し、又は位置決めするマーカーとして使用することができる。
【００３３】
ＦＲＩＬタンパク質
ＦＲＩＬタンパク質は、増殖の誘導の有無を問わず、分化を阻害する意味において、前駆細胞を保護する能力を有するものとして初期に同定され、そして、「ピラルチン（ｐｙｌａｒｔｉｎ）」として意味された（例えば、米国特許第６，０８４，０６０号）マンノース／グルコース特異的なマメ科植物レクチンである。前記タンパク質はまた、トランスフェクトされていない細胞ではなく、ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３受容体でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を刺激することが生物学的アッセイに示され、そして、したがって、Ｆｌｔ３  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｌｅｃｔｉｎｓ（ＦＲＩＬ）と明示される（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｂｌｏｏｄ  ９０，Ｓｕｐｐｌ．１，３０８（ａｂｓｔｒａｃｔ）；Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１７３−１７９；Ｃｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６４６−６５０；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２５０２７：１−９を参照）。しかしながら、本発明との関連において、下記の実施例で記載されるように、ＦＲＩＬタンパク質は、Ｆｌｔ３受容体を発現しない癌細胞に結合することが示される。したがって、Ｆｌｔ３受容体に結合する能力は、本タンパク質の用途に必然的ではなく、明示のＦＲＩＬは、前記タンパク質の歴史的な名称として理解され、機能的要件として理解されるべきではない。
【００３４】
第一のＦＲＩＬタンパク質は、アジマメ（ｈｙａｃｉｎｔｈ  ｂｅａｎ）（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｌａｂ  ｌａｂ）において同定されたが、ＦＲＩＬタンパク質は、現在、限定されずれに、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、セフェノスタイリス・ステノカルパ（Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ  ｓｔｅｎｏｃａｒｐａ）、シサー・アリティナム（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、セフェノスタイリス・ステノカルパ（Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ  ｓｔｅｎｏｃａｒｐａ）、ファセオルス・アキュチフォリウス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）、ファセオルス・ルナトゥス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ）、ビグナ・シネンシス（Ｖｉｇｎａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、及びボアンドゼイア・サブテラネア（Ｖｏａｎｄｚｅｉａ  ｓｕｂｔｅｒｒｎｅａ）を含む他のマメ科植物（ファセオレアエ族）において同定されている。本発明に有用な天然のＦＲＩＬタンパク質は、限定されないが、アジマメ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｌａｂ  ｌａｂ）（「Ｄｌ−ＦＲＩＬ」）、ファセオルス・ブルガリス（「Ｐｖ−ＦＲＩＬ」）及びファセオルス・アキュチフォリウス（「Ｐａ−ＦＲＩＬ」）を含む。
【００３５】
天然のＦＲＬタンパク質は、α鎖及びβ鎖のヘテロ二量体として発現し、α鎖の約１５−２０ｋＤとβ鎖の約１２−２０ｋＤの計算した分子量を有する。α鎖及びβ鎖は、初期には一本鎖のポリペプチドとして発現するが、その後、切断される。該タンパク質はまた、Ｎ連結の糖付加部位を有するようである。
【００３６】
１つのＤｌ−ＦＲＩＬタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。該配列は、成熟タンパク質から切断される２２アミノ酸のリーダー配列より開始する。残基２３−１４５は、β鎖を構築し、そして、残基１４６−２８６はα鎖を構築する。成熟の天然タンパク質においては、Ｃ末端は、しばしば、少なくとも１４残基の欠失を含む、様々な程度で切断される。配列番号２のタンパク質は、Ｃｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６４６−６５０の配列に基いているが、その後のデータに基づいていくつかの変化を有する。Ｋｏｔｌａｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），ＵＢＥＰ  ２００２  Ｎｉｎｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｕｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃３５は、配列番号３に提供されるアミノ酸配列を有するアジマメ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｌａｂ  ｌａｂ）由来の追加のＦＲＩＬタンパク質を記載した。Ｃｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）の天然のＤｌ−ＦＲＩＬタンパク質に対する本タンパク質の関係は未知である。配列番号３の配列のタンパク質は、免疫グロブリンカッパ鎖由来の８アミノ酸のリーダー配列をもって開始され、天然のタンパク質の部分ではない。およそ１２９−１３５に対する９残基は、β鎖を構築し、そして、およそ１３０−１３６から２７６までの残基はα鎖を構築する。上述したように、Ｃ末端は、少なくとも約１４残基の欠損を含み、様々な程度で切断され得る。Ｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８７８９−１８７９３は、配列番号４に提供されるアミノ酸配列を有するアジマメ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｌａｂ  ｌａｂ）由来のＦＲＩＬ様タンパク質を記載した。天然のＤｌ−ＦＲＩＬタンパク質に対する本タンパク質の関係は未知である。
【００３７】
１つのＰｖ−ＦＲＩＬタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に提供される。該配列は、成熟タンパク質から切断される２２アミノ酸のリーダー配列より開始する。残基２３−１４５は、β鎖を構築し、そして、残基１４６−３０１はα鎖を構築する。成熟の天然タンパク質においては、Ｃ末端は、しばしば、様々な程度で切断される。
【００３８】
各々のＦＲＩＬタンパク質の場合において、Ｎ末端又はＣ末端の欠失若しくは付加は、内部の挿入、欠失及び置換と同様に、生物学的活性に影響を与えることなく行われるようである。
【００３９】
天然のＦＲＩＬタンパク質に加えて、本発明は、組換えＦＲＩＬタンパク質を利用することができる。組換えＦＲＩＬタンパク質は、天然のＦＲＩＬタンパク質と同一のアミノ酸配列を有し、又は１以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むアミノ酸配列を有することができる。例えば、天然のＦＲＩＬタンパク質のＮ末端リーダー配列は、欠失され、又は代替のリーダー配列で置換され得る。Ｃ末端配列はまた、切断され、又は置換されることができる。融合タンパク質はまた、精製タグ又はエピトープ（例えば、ポリ−Ｈｉｓタグ、ｃ−ｍｙｃエピトープ）を付加し、又は配列（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド又は免疫グロブリンドメイン）を標的として、生産することができる。内部置換、欠失及び挿入はまた可能である。ある態様において、組換えタンパク質は、２以上の天然のＦＲＩＬタンパク質の配列を混ぜ合わせることによって生産されるキメラ配列である。そのような組換えＦＲＩＬタンパク質が発現する宿主に応じて、組換えタンパク質はまた、転写後のプロセッシング、例えば、α及びβ鎖の切断、Ｎ末端のリーダー配列の除去、及び／又はＣ末端の切断若しくは崩壊における相違のために、天然のＦＲＩＬタンパク質とは異なることができる。
【００４０】
多くの組換えＦＲＩＬ変異体の記述は、例えば、米国特許第６，３１０，１９５号；ＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ９８／５９０３７、及びＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ０１／４９８５１に見出すことができ、その完全な開示は参照により本明細書に援用される。一般的な事項として、組換えＦＲＩＬタンパク質は、キメラタンパク質を含み、天然のＦＲＩＬタンパク質と、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも５５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有して生産することができる。ある態様において、組換えＦＲＩＬタンパク質は、天然のＦＲＩＬタンパク質（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号６）と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有することができる。２つのタンパク質又は２つの核酸分子の間のアミノ酸配列の同一性及び核酸配列の同一性は、標準的な方法に従って測定することができる（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８；Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐｐｓ．１２７−１４９，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８８；Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２５：３５１−３６０；ａｎｄ  ｔｈｅ  ＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照）。
【００４１】
天然である又は組換えであるとを問わず、全てのＦＲＩＬタンパク質が、本発明に有用であるとは限らない。具体的には、有用なＦＲＩＬタンパク質は、問題になっている癌細胞に結合し、そして、該細胞の増殖及び／又は生存を阻害しなければならない。ＦＲＩＬタンパク質は、実施例において下記に記載されるように、単純なインビトロアッセイを用いて癌細胞に結合する能力について試験することができる。ＦＲＩＬタンパク質はまた、実施例において下記に記載されるように、単純なインビトロアッセイを用いて異なる癌細胞株の増殖及び／又は生存を阻害する能力について試験することができる。
【００４２】
全ての天然のＦＲＩＬタンパク質は、本発明において有用であるとは限らない。例えば、スフェノスタイリス・ステノカルパ（Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ  ｓｔｅｎｏｃａｒｐａ）のＦＲＩＬタンパク質（「Ｓｓ−ＦＲＩＬ」）は、これまでに試験した癌細胞のいずれにも結合せず、その増殖及び／又は生存を阻害しないようである。しかしながら、Ｓｓ−ＦＲＩＬは、まだ試験されていない癌の治療に有用であるかもしれないという可能性がある。同様に、全ての組換えＦＲＩＬがいずれの癌細胞にも結合せず、その増殖及び／又は生存を阻害しないとすれば、本発明に有用であるとも限らないであろう。
【００４３】
ＦＲＩＬ感受性癌
本発明のＦＲＩＬタンパク質は、いずれかのＦＲＩＬ感受性癌を治療するために使用することができる。そのような癌は、定義により、ＦＲＩＬタンパク質が癌細胞の増殖及び／又は生存を阻害する癌であり、そのような癌は、本明細書に記載されるアッセイによって同定することができる。ＦＲＩＬ感受性癌は、当該技術分野において周知であるタンパク質結合、細胞増殖及び／又は細胞毒性についての標準的なアッセイによって同定することができる。
【００４４】
例えば、特定のＦＲＩＬタンパク質の結合活性は、標準的なアッセイにおいて標識したＦＲＩＬタンパク質（下記を参照）を用いて決定することができる。つまり、例えば、ＦＲＩＬの結合量は、培養の細胞に結合した検出可能に標識したＦＲＩＬの量を測定することによって決定することができる。代わりに、競合アッセイは、ＥＣ５０、即ち、細胞に結合した標識したＦＲＩＬタンパク質の５０％を溶出するために必要とされる遊離のＦＲＩＬタンパク質の濃度を決定するために使用することができる。一態様において、Ｄｌ−ＦＲＩＬは、ＥＣ５０の０．５ないし０．８μｇ／ｍｌで、ＦＲＩＬ感受性の癌性Ｂ細胞に結合し、そして、ＥＣ５０の２ないし４μｇ／ｍｌで正常なヒトＢ細胞に結合することを示した。同様に、５倍を超えるＦＲＩＬタンパク質の濃度が、ＦＲＩＬ感受性Ｂリンパ腫と均等な正常なヒトＢ細胞の死滅を達成するために必要であることが見出された。下記の実施例に記載されるように、Ｄｌ−ＦＲＩＬタンパク質は、低い結合活性で正常なＢ細胞に結合し、そして、正常なＢ細胞は、Ｄｌ−ＦＲＩＬ感受性ではない。逆に、Ｄｌ−ＦＲＩＬは、高い結合活性で成熟Ｂ細胞リンパ腫細胞に結合し、それらのＢ細胞はＦＲＩＬは感受性である。一方、Ｄｌ−ＦＲＩＬは、ある種の癌細胞（例えば、下記の実施例に記載されるＫＧ−１脊髄癌細胞株）に、それらの生存を有意に阻害することなく結合する。したがって、ＦＲＬタンパク質の結合は、ＦＲＩＬを介した生存の阻害及び／又は生存におそらく必要である。
【００４５】
このように、ＦＲＩＬタンパク質が癌細胞に結合することを示すことに加えて、ＦＲＩＬタンパク質が、癌細胞がＦＲＩＬ感受性であることを結論付ける前に、増殖及び／又は生存を阻害することができることを示すことは必要である。細胞の増殖及び生存を決定する方法は、当該技術分野において知られ、限定されることはなく、生存している細胞をカウントする方法（例えば、血球計算版、コールター細胞カウンター、又はＧｕａｖａ  ＰＣＡ装置）、及び標識した栄養素の取り込み又は代謝率を測定する方法（例えば、３Ｈ−チミジン、ＸＴＴ）を含む。細胞増殖を決定するこれらの方法及び他の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載される。
【００４６】
現在の実験証拠に基づくと、ＦＲＩＬ感受性癌は、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫、及び、具体的には、成熟Ｂリンパ球由来のＢ細胞リンパ腫を含む。Ｂ細胞リンパ腫の例は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、外套膜細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫、小胞中心細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、末端領域Ｂ細胞リンパ腫、結節末端領域Ｂ細胞リンパ腫、結節外末端領域Ｂ細胞リンパ腫、脾臓末端領域Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ芽球Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストロームのマクログロブリン血症）を含む。同様に、Ｃｕｎｅｏ（２０００），Ａｔｌａｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｏｎｃｏｌ。Ｈａｅｍａｔｏｌ．を参照。Ｂ細胞リンパ腫の他の例は、Ｂ細胞白血病群（例えば、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、前駆体Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、前駆体Ｂリンパ芽球白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、バーキット細胞白血病）、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、原発性滲出液リンパ腫、びまん性混合Ｂ細胞リンパ腫、及び未分化Ｂ細胞リンパ腫を含む。
【００４７】
ＦＲＩＬ感受性癌はまた、下記の実施例において記載されるように、Ｔ細胞皮膚リンパ腫を含む。
治療方法
別の側面において、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫又はＴ細胞皮膚リンパ腫のようなＦＲＩＬ感受性癌と診断された哺乳動物を治療するための方法であって、癌が感受性であるＦＲＩＬタンパク質の治療的に有効な量を含む医薬組成物を哺乳動物に投与することによる治療方法を特色とする。哺乳動物は、ヒト患者であることができ、又は、ある態様では、哺乳動物は、非ヒト霊長類、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）、家畜若しくは飼育用動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ）、又はペット（例えば、ネコ及びイヌ）であることができる。
【００４８】
一側面において、本発明は、患者（例えば、ヒト患者）が、ＦＲＩＬタンパク質を含む医薬組成物を用いた治療から利益を得るであろうＦＲＩＬ感受性癌を患っているか否かを決定する方法を提供する。本方法は、患者由来の癌細胞とＦＲＩＬタンパク質とを接触させ、そして、ＦＲＩＬタンパク質が癌細胞の増殖及び／又は生存を阻害するかどうかを（例えば、外部標準、又は同じ患者由来の癌細胞の非処理の対照サンプルとの比較によって）決定することを含む。典型的には、患者が患っている癌のカテゴリーに対して有効であることが知られているＦＲＩＬタンパク質が選択される。癌がＦＲＩＬ感受性であることが決定されれば、患者はＦＲＩＬタンパク質による治療を受けることができる。
【００４９】
ＦＲＩＬタンパク質の医薬組成物について選択した特定の製剤に適したいずれの投与経路も使用することができ、限定されずに、静脈内、動脈内、筋内、皮下、腹腔内、鼻腔内、肺臓内、直腸内及び膣内のような非経口経路を含む。経口投与はまた、ある種の製剤について使用することができる。医薬製剤は、影響を受けた領域に局所的に（例えば、腫瘍の塊に直接に）投与することができ、又は全身的に投与することができる。本発明のＦＲＩＬタンパク質は、ある種の癌性細胞を死滅し、正常細胞を死滅しないので、本発明の組成物はまた、例えば、癌が体内を通じて転移される状況において全身に投与することも可能である。治療的に有効な量を構成要素とするであろうＦＲＩＬタンパク質の正確な量は、選択されたＦＲＩＬタンパク質の活性、治療されるべき癌の性質、治療されるべき癌の程度、及び患者の年齢、体重及び一般的な健康、並びにいずれかの併用療法の使用に依存するであろう。一般的な事項として、全身的に投与した場合、治療的に有効な量は、一日当り５００ｎｇ／ｋｇ（即ち、患者の全体重１ｋｇ当り５００ｎｇのＦＲＩＬタンパク質）ないし１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であることができる。ある態様において、治療的に有効な量は、一日当り１μｇ／ｋｇないし５０ｍｇ／ｋｇ、又は一日当り５μｇ／ｋｇないし２５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００５０】
ＦＲＩＬタンパク質の投与は、疾患の診断に応じて、患者が徴候を表す前、又は疾患が進行した後に開始することができる。例えば、ＦＲＩＬタンパク質は、高い投与量の放射又は発癌物質に晒された患者に予防的に投与することができる。その代わりに、癌の特徴的な徴候（例えば、疲労、急激に増大しているリンパ節、息切れ、痛み）をまだ提示していない、新規にＢ細胞癌（例えば、陽性生検の薬効）と診断されたヒト患者は、一次治療としてＦＲＩＬタンパク質を用いて治療することができる。又は、ある態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、他の標準的な関連する癌のための治療との組み合わせて補助療法として投与することができる。
【００５１】
一般的事項として、ＦＲＩＬタンパク質を用いた患者の治療は、伝統的な癌療法、例えば、外科、ステロイド療法、放射線療法、化学療法、又は１又はそれ以上のこれらの療法の組み合わせを用いて併用することができる。
【００５２】
つまり、ある態様において、ＦＲＩＬタンパク質、及び選択的にＢ細胞を死滅する試薬を含む医薬組成物は、正常のＢ細胞並びに癌性Ｂ細胞を含む患者のＢ細胞の全部又は実質的に全部を死滅するために、Ｂ細胞癌と診断された患者に投与される。治療後、患者は、骨髄（又は他の造血臓器、例えば、嚢包又は胎児肝臓）における前駆細胞由来の新規な健常Ｂ細胞を発生することができるであろう。したがって、全てのＢ細胞を死滅する治療を使用することは、癌性Ｂ細胞の全部を死滅することを確実にするであろう。この内容において、「選択的にＢ細胞を死滅する試薬」は、治療的に有効な量の治療が寛容され得るような体内における他の細胞に対して、優先的にＢ細胞を死滅する試薬である。例えば、選択的のＢ細胞を死滅する試薬は、Ｂ細胞上のみに発現する細胞表面マーカー（限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ１２１ｂ、及びＣＤ１３８細胞表面タンパク質を含む）に結合する抗体又は抗体毒性複合体であり得る。
【００５３】
本発明の別の態様において、癌細胞の増殖及び／又は生存は、インビトロにおいて、細胞をＦＲＩＬタンパク質、又はＦＲＩＬタンパク質を含む医薬組成物と接触することによって減少される。例えば、癌細胞におけるＦＲＩＬタンパク質の効果は、ＦＲＩＬ感受性癌を同定し、又は異なるＦＲＩＬタンパク質の相対的な効率を評価する調査目的について、インビトロで試験され得る。同様に、培養した癌細胞は、該細胞の増殖及び／又は生存を阻害するために有用なＦＲＩＬタンパク質の投与量を予測し又は決定するために使用することができる。つまり、異なるＦＲＩＬタンパク質、及び様々なＦＲＩＬタンパク質の異なる投与量が培養中の細胞に接触され、異なる癌の治療のために最も効果的なＦＲＩＬタンパク質を同定することができる。
【００５４】
別の側面において、癌組織及び癌でない組織の混合物を含有する組織は、患者から除去され、組織を患者に戻す前に培養して増殖させ、ＦＲＩＬタンパク質を用いて治療することができる。例えば、骨髄は、一群の骨髄細胞に影響を与える癌を患っている患者から除去し、骨髄を生体外で（放射線療法又は標準的な化学療法のような併用療法と伴に又は伴わずして）ＦＲＩＬタンパク質を用いて処置することができ、そして、ＦＲＩＬで処置した骨髄細胞は患者内に再導入することができる。
【００５５】
医薬製剤
別の側面において、本発明は、ＦＲＩＬ感受性癌の治療、又はそのような治療に使用する薬剤の製造ために使用する実質的に純粋なＦＲＩＬタンパク質を含む医薬製剤を提供する。
【００５６】
医薬製剤は、乾燥形態（例えば、単独で又は安定化剤と伴に凍結乾燥）、又は液体溶液若しくは懸濁液（例えば、医薬的に受容可能な担体又は希釈剤）でＦＲＩＬタンパク質を含むことが可能である。液体の非経口的投与のための医薬的に受容可能な担体は、限定されないが、水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、植物油、硬化ナフタレン、又はその適した混合物を含む。ＦＲＩＬタンパク質はまた、緩衝剤又は賦形剤とともに製剤化することもできる。
【００５７】
ある態様において、ＦＲＩＬタンパク質は、放出制御した粒子又は移植可能な装置中に製剤化することができる。例えば、そのような粒子又は装置は、ＦＲＩＬタンパク質の放出を制御するために、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、エチレン−ビニルアセテートコポリマーなどから形成することができる。他の可能性のある有用な非経口の輸送システムは、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、及びリポソームを含む。
【００５８】
ＦＲＩＬタンパク質はまた、癌の治療に有用な他の医薬又は治療薬との組み合わせて製剤化することができる。例えば、ＦＲＩＬタンパク質は、化学療法薬、放射線療法薬、ステロイド、選択的にＢ細胞を死滅する試薬と伴に組み合わせることができる。本発明に使用することができる化学療法薬は、限定されないが、シタラビン、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、アレムツズマブ、ベキサロテン、デニロイキンジフチトクス、クロラムブチル、フルダラビン、クラドリビン、ゲムツズマブ−オゾガミシン、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブ、ビンクリスチン、プレドニソロン、エトポシド、ミトキサントロン、及びトレチノインＡＴＲＡを含む。
【００５９】
医薬製剤を製剤化する方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍａｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。
【００６０】
ＦＲＩＬタンパク質は、標準的な手法で容易に精製することができる。タンパク質を精製する方法は、当該技術分野において知られ、限定されることなく、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミノドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫沈降、免疫吸着、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はこれらの方法のいずれかの組み合わせを含む。これらの方法及びその他の適した方法は、例えば、Ｍａｒｓｔｏｎ（１９８７），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｍａｒｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｌｅｙ（１９９０），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０），Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０８４，０６０に記載されている。ＦＲＩＬファミリーメンバーの分子はまた、固相支持体（例えば、セファロースビーズ）に結合し得るマンノースに結合することによって精製することができる。
【００６１】
マメ科植物（例えば、アジマメ、インゲンマメ）由来のＦＲＩＬタンパク質の精製は、急速に及び費用をかけずに達成することができる。例えば、ＦＲＩＬタンパク質は、マンノース−アフィニティークロマトグラフィー又はオボアルブミンアフィニティークロマトグラフィーによって、粉にしたマメ科植物の抽出物から精製することができる。ＦＲＩＬタンパク質は、マメ科植物に相対的に豊富である。例えば、Ｄｌ−ＦＲＩＬは、ヒアシンスマメの質量の約０．０２％を占める。
【００６２】
精製したＦＲＩＬタンパク質はまた、組換え方法によって作製することもできる。つまり、ＦＲＩＬタンパク質は、当業者に周知の組換え技術によって、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、Ｓ．セレヴィジアエ）、植物（例えば、シロイヌナズナ、ウキクサ、タバコ、又はトウモロコシ）、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、及び哺乳動物（例えば、ＣＨＯ細胞）にＦＲＩＬタンパク質をコードする核酸配列を導入することによって作製することができる。例えば、ＦＲＩＬタンパク質をコードする核酸配列は、組換えバキュロウイルス粒子を発生するために使用され得るバキュロウイルスベクターに挿入することができる。組換えバキュロウイルスで遺伝子導入した昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）はＦＲＩＬタンパク質を発現するであろう。溶菌後、ＦＲＩＬタンパク質は精製することができる。
【００６３】
代わりに、組換えＦＲＩＬタンパク質は、タバコ又はシロイヌナズナのような双子葉植物において生産され得る。例えば、シロイヌナズナ植物は、ＦＲＩＬタンパク質をコードする核酸分子を運搬するアグロバクテリア・トゥメファシネスの菌株を用いて形質転換することができる。所望の核酸分子を有するアグロバクテリアを生産するベクターを作製するための方法は、当該技術分野において既知である（例えば、ＭｃＢｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ（１９９０），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４（２）：２６９−２７６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９４０，８３８  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４６４，７６３を参照）。
【００６４】
ＦＲＩＬタンパク質をコードする核酸配列は、限定されず、配列番号１又は５の核酸配列を含む、配列番号２、３又は６のタンパク質をコードする何れかの配列を含む。加えて、本明細書において記載さえる組換えＦＲＩＬ変異体のいずれかをコードする核酸配列を設計し、そして、生産することができる。
【００６５】
癌細胞を視覚化、検出及び位置決めする方法
別の側面において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）における癌細胞を視覚化し、検出し、又は位置決めする方法であって、患者に検出可能に標識したＦＲＩＬタンパク質を投与し、そして、患者内で標識を視覚化し、検出し又は位置決めすることを含む方法を提供する。癌に結合する高い結合活性を有するＦＲＩＬタンパク質を選択することによって（下記の実施例に記載するように）、標識は、癌細胞が存在する体内における位置又は領域に選択的に位置するであろう。これらの領域（例えば、リンパ節）は、癌細胞を死滅させ、又は除去するために、処置（例えば、ＦＲＩＬ処置、放射線療法又は化学療法）又は外科的な切除に供されることが可能である。
【００６６】
ＦＲＩＬタンパク質は、標準的な技術によって標識することができ、限定されないが、放射線アッセイ（例えば、放射活性アイソトープアッセイ）、分光学的アッセイ（例えば、蛍光、化学ルミネッセンス、バイオルミネッセンスアッセイ）、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチアッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫放射アッセイ）、ＣＡＴスキャン又はＭＲＩアッセイを含む、標準的な化学的、生化学的、生物学的又は視覚化アッセイによって検出可能である。例えば、蛍光団又は蛍光性分子は、カップリング試薬、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、およびジマレイミドの手法によって、ＦＲＩＬタンパク質に結合することができる。検出可能な標識の例は、限定されないが、放射活性標識、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、若しくは３５Ｓ；蛍光標識、例えば、フィコエリトリン及びフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；及びＭＲＩ視覚化試薬、例えば、ガドリニウム含有分子（例、ガドペンテト酸塩）を含む。代替の態様において、検出可能な標識は、間接的に検出することができ、例えば、それ自身を直接的に検出できる別の分子又は化学的部分に対するエピトープ又は結合パートナーである。
【００６７】
下記の実施例は、本発明のある種の好ましい態様をさらに例証することを意図し、そして、当然に限定されない。当業者は、僅かな日常的な実験を用いて、本明細書に記載される特定の物質及び手法に対して多くの均等物を確証すると認め、又は確証できるであろう。そのような均等物は本明細書、及び上記の特許請求の範囲の範囲内であろうと考えられる。
【実施例】
【００６８】
実施例１
ＦＲＩＬは高い結合活性をもってヒトＢ細胞の悪性腫瘍に結合する
異なる悪性Ｂ細胞株及び正常Ｂ細胞に対する非限定的なＦＲＩＬタンパク質、即ち、Ｄｌ−ＦＲＩＬの結合活性を決定した。
【００６９】
これらの研究について、正常ヒトＢ細胞は、Ｒｏｓｅｔｔｅ−Ｓｅｐ  Ｂ細胞分離抗体カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａから商業的に利用可能である）を用いて健常な正常志願者の末梢血から単離し、混在している非Ｂの白血球細胞及び赤血球細胞を除去した。調製物の精製は、フィコエリトリンに結合した抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を蛍光的に用いて決定し、次いで、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて細胞を解析した。Ｂ細胞の調整物は、＞７０％  ＣＤ１９−陽性であった。
【００７０】
加えて、様々な癌性Ｂ細胞、即ち、ＣＣＲＦ−ＳＢ（バーキットＢ−ＡＬＬ細胞株）及びＪＭ１（非ホジキンリンパ腫細胞株）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、及びゲンタマイシンを含む）で培養した。
【００７１】
本研究において使用されるＤｌ−ＦＲＩＬは、前述したようにフジマメ、ドリコス・ラブ・ラブ・プルプレウスから単離した（例えば、Ｃｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６４６−６５０）。簡単には、フジマメ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｌａｂ  ｌａｂ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）の種は、Ｓｔｏｋｅｓ  Ｓｅｅｄｓ（Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）から購入し、そして、直接使用し、温室で生育した。乾燥種は、コーヒーミル又はＲｅｔｚｅｌミルで微紛まで挽き、そして、粉末を４℃で４時間、各々ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２の１ｎＭを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌの５容積中で抽出した。マメの固形物は、１０，０００×ｇで２０分間遠心することによってペレット化した。上清のｐＨは、酢酸でｐＨ４．０まで酸性にし、２度目の遠心によって上清を清浄化し、そして、最終的に、ｐＨは、水酸化ナトリウムで８．０に再調整した。ＦＲＩＬタンパク質の１回工程のアフィニティー精製は、メチルα−Ｄ−マンノピラノシド・セファロースマトリックス（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯから商業的に利用可能である）に結合させることによって達成した。ゲル（即ち、マトリックス）は、２２℃で１０分間、マメの粗抽出物を用いてひっくり返し、各々１ｎＭのＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを用いて４回注意深く洗浄し、ついて、１００ｍＭ  メチルα−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから商業的に利用可能である）を用いて溶出した。精製したＤｌ−ＦＲＩＬタンパク質の精製は、高精度液体クロマトグラフィー／サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）によって評価したように、９６％  Ｄｌ−ＦＲＩＬであった。
【００７２】
Ｄｌ−ＦＲＩＬは、取扱説明書に記載されるように、室温で３０分間、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから商業的に利用可能である）の２０倍モルの過剰量で２ｍｇのＤｌ−ＦＲＩＬをインキュベートすることによって、ビオチニル化Ｄｌ−ＦＲＩＬ（Ｄｌ−ＦＲＩＬ−Ｂｉ）を生産するためにビオチニル化した。
【００７３】
約５×１０５の癌又は正常Ｂ細胞をかき集め、塩類溶液で洗浄し、そして、４℃で１５分間、ビオチニル化したＤｌ−ＦＲＩＬの異なる量（即ち、０．１、０．５、１、２．５、１０、及び２５μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、４℃で１０分間、０．１μｇのストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡ−ＰＥ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いてインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いてＦＲＩＬ結合について蛍光的に解析した。
【００７４】
図１に示されるように、ビオチニル化したＤｌ−ＦＲＩＬは、正常なヒトＢ細胞より、腫瘍細胞株の１つ、即ち、ＣＣＲＦ−ＳＢに高い結合活性をもって結合した。興味深いことに、ビオチニル化Ｄｌ−ＦＲＩＬは、ＪＭ１腫瘍細胞株と同様には結合しなかった。正常ヒトＢ細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞、及びＪＭ１細胞は、ＦＬＴ３受容体を発現せず、これらの細胞の表面上にＤｌ−ＦＲＩＬの追加の結合標的を示す。
【００７５】
Ｄｌ−ＦＲＩＬの正常ヒトＢ細胞への結合は、活性化にも影響せず、又は増殖をも誘導しなかった。抗ＩＧＭ及びＩＬ−４、又はＬＰＳのいずれかによる活性化マーカーＢ７．２（ＣＤ８６）の誘導は、Ｄｌ−ＦＲＩＬの存在によって影響されなかった（データ示さず）。ＦＲＩＬはまた、正常ヒトＢ細胞、ＪＭ１細胞、及びＣＣＲＦ−ＳＢの増殖をも誘導しなかった（データ示さず）。興味深いことに、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞（最高の結合活性でＤｌ−ＦＲＩＬに結合した）ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞は、Ｄｌ−ＦＲＩＬ結合によって死滅されたようだ。
【００７６】
実施例ＩＩ
ＦＲＩＬは高い結合活性で結合する癌性Ｔ細胞及びＢ細胞を死滅する
ＦＲＩＬが高い結合活性で結合し、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞を死滅するという実施例Ｉにおける観察に基づいて、異なるヒトリンパ球様細胞株及び骨髄性細胞株とＤ１−ＦＲＩＬ相互作用を試験した。これらの研究について、Ｂ細胞株は、バーキットリンパ腫株、ＲＡＪＩ、Ｄａｕｄｉ、ＲＪ２．２．５、ＲＡＭＯＮ、Ｆａｒａｇｅ、及びＧＡ−１０細胞；白血病細胞株、ＳＲ及びＥＨＥＢ細胞；びまん性混合リンパ腫細胞株、ＨＴ及びＤＢ；未分化Ｂリンパ腫細胞株、ＭＣ１１６；濾胞性リンパ腫細胞株、ＲＬ；及びプレＢ白血病細胞株、ＪＭ１、ＮＡＬＭ−６及びＳＵＰ−Ｂ１５を含む。試験した非Ｂ細胞株は、好酸球腫瘍細胞、ＥＯＬ−１；ＡＭＬ細胞株、ＫＧ−１及びＫＧ−１ａ；単球腫瘍細胞株、ＴＨＰ−１；Ｔ白血病細胞株、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ及びＪｕｒｋａｔ；及び皮膚Ｔリンパ腫細胞株、ＨｕＴ７８及びＬｏｕｃｙを含む。ＲＪ２．２．５細胞株は、Ｄｒ．Ｊｅｒｒｙ  Ｂｏｓｓ（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｒｏｇｉａ（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔｏ  Ａｃｏｌｌａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｂｒｉａ，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙからの許可を得て））によって提供され、一方、ＮＬＡＭ−６、ＥＨＥＢ、及びＥＯＬ−１細胞株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｅｍａｎｙ）から入手した。上記で言及した他の細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。すべての細胞株は、ＲＰＭＩ完全培地（１０％  ウシ胎児血清、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、及びゲンタマイシンを含む）中で培養した。
【００７７】
これらの腫瘍細胞、並びにＣＣＲＦ−ＳＢ及びＪＭ１細胞（実施例Ｉに記載される）は、実施例Ｉに記載されるビオチニル化したＤｌ−ＦＲＩＬで染色した。Ｄｌ−ＦＲＩＬは、試験したすべての成熟Ｂ細胞腫瘍（Ｄａｕｄｉ，ＲＡＪＩ，ＲＪ．２．２．５，ＲＡＭＯＳ，Ｆａｒａｇｅ，ＧＡ１０，ＥＨＥＢ，ＤＢ，ＨＴ，ＣＣＲＦ，及びＭＣ１１６）；皮膚Ｔリンパ腫、ＨｕＴ７８及びＬｏｕｃｙ；及び骨髄性腫瘍細胞株、ＫＧ−１に高い結合活性を持って結合した。Ｄｌ−ＦＲＩＬは、正常なヒトＢ細胞及び濾胞性リンパ腫細胞株、ＲＬに中間の結合活性で結合した。Ｄｌ−ＦＲＩＬは、ＥＯＬ−１、ＫＧ−１ａ、ＴＨＰ−１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ、ＳＲ、ＪＭ１、ＮＡＬＭ−６及びＳＵＰ−Ｂ１５細胞株には結合しなかった（表Ｉ）。
【００７８】
次に、全ての腫瘍細胞株は、Ｄｌ−ＦＲＩＬ仲介の死滅について試験した。腫瘍細胞は、濃度増加（０．３１２、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、及び２０μｇ／ｍｌ）の精製したＤｌ−ＦＲＩＬ（即ち、ビオチニル化していないＦＲＩＬ）を有するＲＰＭＩ完全培地中で４８時間、３８℃でインキュベートし、ＸＴＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて細胞の生存について評価した。
【００７９】
図２は、ＦＲＩＬ結合の結合活性が死滅のレベルと一致したことを示す。Ｄｌ−ＦＲＩＬに高い結合活性で結合した細胞（ＲＡＪＩ、ＨＴ、ＣＣＲＦ、及びＭＣ１１６）は効果的に死滅した；Ｄｌ−ＦＲＩＬに中間の結合活性で結合した細胞（ＲＬ）は、Ｄｌ−ＦＲＩＬによる死滅の効果はより小さかった。正常ヒトＢ細胞は、ＲＬ細胞より僅かに低い結合活性でＤｌ−ＦＲＩＬと結合することが予測されたが、死滅の効果はより小さかった。
【００８０】
非常に低い結合活性か又は全く結合活性なくしてＤｌ−ＦＲＩＬに結合した、本アッセイで試験した３つの細胞株（ＫＧ−１、ＳＲ及びＪＭ１）は、精製したＤｌ−ＦＲＩＬによって死滅しなかった。ＪＭ１細胞は、癌性プレＢ細胞株であり、Ｄｌ−ＦＲＩＬによって死滅しなかったが、これは、可能性として、Ｄｌ−ＦＲＩＬがインビトロでこの細胞株の増殖中に結合する細胞表面分子の発現の欠如のためである。別の可能性は、ＪＭ１細胞がプレＢ細胞であるため、それらが、より成熟した癌性Ｂ細胞ほど、高いレベルのＤｌ−ＦＲＩＬを発現しないことである。更なる研究では、表Ｉに概要されるように、試験した全てのＢ細胞腫瘍由来の細胞株はＦＲＩＬに結合し、そして死滅したことが示された。
【００８１】
いくつかのＴ皮膚リンパ腫株は、同様にＤｌ−ＦＲＩＬによって死滅した（ＨｕＴ７８及びＬｏｕｃｙ；表Ｉ及び図３）。しかしながら、正常のヒトＴ細胞は、Ｄｌ−ＦＲＩＬに結合せず、死滅しなかった（図３）。興味深いことに、ＡＭＬ細胞株、ＫＧ−１は、ＦＲＩＬに結合したが、Ｄｌ−ＦＲＩＬによっては死滅しなかった（図３）。
【００８２】
結腸癌腫瘍株ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＸ−１、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５−１；肺癌腫ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ６９：及び神経腫瘍株ＳＮＢ７５及びＵ２５１を含むいくつかの追加の腫瘍タイプを試験した。これらの細胞株は、低い結合活性か又は全く結合活性がないかのいずれかで、Ｄｌ−ＦＲＩＬタンパク質に結合したが、死滅しなかった。しかしながら、これらの細胞は、高い結合活性で他のＦＲＩＬと結合することができ、そして、他のＦＲＩＬタンパク質はこれらの細胞の増殖及び／又は生存を阻害することができる可能性はある。さらに、Ｄｌ−ＦＲＩＬタンパク質は、他の結腸癌、肺癌腫及び／又は神経腫瘍細胞株を阻害することができる可能性はある。
【００８３】
【表１】
2007513879.tif 000003
表１は、異なるヒトリンパ球様細胞株及び骨髄性腫瘍細胞株とのＤｌ−ＦＲＩＬの相互作用を要約する。Ｄｌ−ＦＲＩＬは、すべてプレＢ細胞腫瘍由来の、ＪＭ１、ＮＡＬＭ−６、及びＳＵＰ−Ｂ１５を除いて、全てのＢリンパ腫細胞株を死滅した。結合は、骨髄性細胞株、ＫＧ−１ａを除いて死滅へと導いた。
【００８４】
Ｄｌ−ＦＲＩＬは、リンパ腫細胞を急速に死滅する。この死滅のモードは、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて７−ＡＡＤ（細胞不浸透性色素）及びアネキシン−Ｖ（アポトース的細胞上の反転したホスファチジルセリンに結合する）を取り込んで細胞のパーセントに基づくアッセイを用いて決定することができる。図４に示されるデータは、５μｇ／ｍｌのＤｌ−ＦＲＩＬが３０分でＭＣ１１６細胞を死滅し、大部分がネクローシスを介した経路を通じているようであることを示す。ＪＭ１細胞は、ＦＲＩＬに結合せず、ネクローシス及びアポトーシス群において増加を示さなかった。
【００８５】
これらの結果は、様々な癌性Ｂ細胞の精製したＤｌ−ＦＲＩＬへの結合の強い結合活性がこれらの細胞の効果的な死滅へと導くことを示した（図２）。Ｄｌ−ＦＲＩＬは接触時間内にＢ細胞リンパ腫のネクローシスを誘導した。このＤｌ−ＦＲＩＬ死滅は、補体仲介ではなかった（データ示さず）。
【００８６】
実施例ＩＩＩ
リンパ腫細胞のＤｌ−ＦＲＩＬ死滅はレクチン仲介である
Ｂリンパ腫細胞のＤｌ−ＦＲＩＬを仲介した死滅は、レクチンのグリカン結合特性によって仲介された。図５は、１００ｍＭ又は２５０ｍＭのいずれかの競合糖、α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いたＤｌ−ＦＲＩＬのプレインキュベーションがＢリンパ腫細胞株の死滅を阻害したことを示す。
【００８７】
実施例ＩＶ
Ｄｌ−ＦＲＩＬは癌性Ｂ細胞を高い効率で死滅する
次に、Ｄｌ−ＦＲＩＬによる死滅の動態を決定した。正常の末梢血Ｂ細胞及びＭＣ１１６細胞（ＦＲＩＬ感受性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株）は、０．２μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌの精製したＤｌ−ＦＲＩＬの存在下で培養した。接触後の様々な時間（即ち、接触後の３０分、６０分、１８０分、及び３６０分）で、生存率を実施例ＩＩに記載されるように評価した。
【００８８】
図６に示されるように、ＦＲＩＬとの接触後３０分以内に、癌性Ｂ細胞死は、ＦＲＩＬの１マイクログラム未満／ｍｌの濃度でさえ観察された（図６、白四角を参照）。６時間以内に、１．０μｇ／ｍｌの精製したＤｌ−ＦＲＩＬを含有する培養中の９０％強のリンパ腫細胞が死滅し（図６、黒四角）、より長い培養はこれらの培養から成長して生存する細胞を示さなかった（データ示さず）。この死滅は、補体独立であり、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）機構を通じて媒介しなかった。同様に、この死滅は、血清の存在に依存しておらず、そして、完全なウシ胎児血清の両方を含有する培地、定義された培地又は血清を欠如した培地において観察された（データ示さず）。さらに、この死滅は、ラジオアイソトープを必要としなかった。正常なヒトＢ細胞の死滅の低いレベルはまた、始終より高い濃度のＦＲＩＬで観察された正常なＢ細胞死滅のより高いレベル（図６、黒丸）で、１マイクログラム未満／ｍｌのＦＲＩＬ濃度で観察された（図６、白丸）。つまり、ＦＲＩＬは、有意な治療的な割合を示す。
【００８９】
実施例Ｖ
異なるＦＲＩＬタンパク質による癌性Ｂ細胞の死滅
Ｄｌ−ＦＲＩＬ及びＰｖ−ＦＲＩＬは、同様の結合特性及び標的アフィニティーを共有する。したがって、それらは、同一又は類似の細胞群に結合し、かつそれらを死滅することが期待された。対照的に、他のレクチンは、同一の結合特性を共有するか、又は標的細胞について類似のアフィニティーを有しないかのいずれかであるＦＲＩＬタンパク質を含み、増殖を阻害し、仮にあったとしても、同程度までこれらの標的細胞を死滅することが期待された。この一例は図７に示され、Ｄｌ−ＦＲＩＬ（黒三角）及びＰａ−ＦＲＩＬ（黒四角）によってＢ細胞腫瘍株（ＣＣＲＦ−ＳＢ）の死滅のレベルを統計学的に示す。Ｐａ−ＦＲＩＬはＢ細胞リンパ腫への結合の効果はより小さいが、効果的にはＢ細胞腫瘍株を死滅しない。それにもかかわらず、Ｐａ−ＦＲＩＬタンパク質は、有意であり、利益的な効果を有し、したがって、本発明の方法において有用であることができる。
【００９０】
実施例ＶＩ
ＦＲＩＬは特異的に癌性Ｂ細胞を死滅する
ＦＲＩＬタンパク質の死滅活性が癌性Ｂ細胞に特異的であるかどうかを決定するために、ＦＲＩＬ非感受性Ｔ−ＡＬＬ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、及びＦＲＩＬに感受性な癌性Ｂ細胞株、ＭＣ１１６の混合した培養物は、精製したＦＲＩＬタンパク質を培地に添加することによってＦＲＩＬタンパク質と接触させた。特定量の培養時間後、残りの細胞を解析した。
【００９１】
本研究について、ＡＴＣＣからのＣＣＲＦ−ＣＥＭ及びＭＣ１１６細胞をＲＰＭＩ完全培地（１０％  ウシ胎児血清、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、及びゲンタマイシンを含む）中で培養する。ＭＣ１１６細胞は、膜内部キレーティング色素、ＰＫＨ−Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標識化するが、細胞からは浸出しない。
【００９２】
次に、およそ等しい数のＰＫＨ−Ｒｅｄ標識したＭＣ１１６細胞を未標識のＭＣ１１６細胞又は未標識のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のいずれかと混合した。培養中のＰＫＨ−Ｒｅｄ細胞のパーセントはＧｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて決定した。
【００９３】
ＦＲＩＬ感受性のＭＣ１１６細胞は、０．１、０．５又は５．０μｇ／ｍｌのＤｌ−ＦＲＩＬの存在下で３７℃で培養した場合、標識及び未標識のＭＣ１１６細胞の両方は死滅し、したがって、培地中のＰＫＨ−Ｒｅｄ陽性細胞のパーセントは相対的に一定のままである。対照的に、ＦＲＩＬに感受性でないＣＣＲＦ−ＣＥＭ及び標識したＭＣ１１６細胞を０．１、０．５又は５．０μｇ／ｍｌのＤｌ−ＦＲＩＬの存在下で３７℃で培養した場合、標識したＭＣ１１６細胞だけが死滅し、培養中のＰＫＨ−Ｒｅｄ陽性細胞のパーセントは減少した（図８）。この実験は、培養物とＦＲＩＬとの接触が区別して癌性Ｂ細胞を死滅することを示した。
【００９４】
実施例ＶＩＩ
ＦＲＩＬは前駆細胞を害することなしに癌性Ｂ細胞を死滅する
実施例ＶＩに記載したのと類似する研究において、ＨＴ細胞は、ヒト女性由来の臍帯血細胞と一緒に培養した。培養細胞は、培地にＦＲＩＬタンパク質を添加することによってＦＲＩＬタンパク質と接触する。特定時間（例えば、１週間）の培養後、生存している細胞をカウントし、それらがＹ染色体を含有しているかを決定するためにそれらのＤＮＡを分析する。
【００９５】
ＦＲＩＬタンパク質との接触後、培養中に残っている生存の細胞だけが女性細胞（すなわち、Ｙ染色体を欠如している）である。これらの細胞は、前駆細胞であり、女性の臍帯血由来の正常なＢ細胞である。前駆細胞は、ＦＲＩＬタンパク質によって静止期に誘導されるが、生存しており、そして、ＦＲＩＬタンパク質が培地から枯渇した後に、増殖及び／又は分化を再開することができる。または、細胞は洗浄され、ＦＲＩＬタンパク質を欠如している培地中に置換され得る。
【００９６】
実施例ＶＩＩＩ
リンパ腫をもつ動物のＦＲＩＬによる治療
動物は、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、及びサルを含み、Ｂ又はＴリンパ腫を有し、インビトロでＦＲＩＬタンパク質による死滅に感受性であることを示すが、ＦＲＩＬの毎日の注入で治療する。ＦＲＩＬの投与量は、静脈内又は腹腔内に、１日当たり、全体重の１ｋｇ当たり生理食塩水中のＦＲＩＬタンパク質の０．１ｍｇ及び５０ｍｇの間であることができる。ＦＲＩＬ治療は、１日又は連続した日数で毎日１回又は連日投与で輸送することができる。この治療は、複数回繰り返すことができる。腫瘍サイズの減少又は腫瘍の成長率の減少は、リンパ腫がＦＲＩＬに感受性であることを示す。
【００９７】
実施例ＩＸ
ＦＲＩＬによるＢ細胞非ホジキンリンパ腫を患っているヒトの治療
癌性Ｂ細胞を含有する生検は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を患っていると疑いのあるヒト患者から採取する。生検の細胞は、ＦＲＩＬタンパク質に感受性であるかどうか（すなわち、細胞がＦＲＩＬタンパク質と接触した場合に死滅する及び／又はそれらの増殖が阻害されるかどうか）を決定するために、ＦＲＩＬタンパク質と接触させる。
【００９８】
患者の癌性Ｂ細胞はＦＲＩＬタンパク質に感受性であれば、次に患者は治療的に有効量のＦＲＩＬタンパク質の投与によって治療を受ける。投与はいずれの経路もとることができるが、本実施例では、患者は、静脈内に１日当たり、全体重の１ｋｇ当たり生理的食塩水中のＦＲＩＬタンパク質の約５μｇ及び５０ｍｇの間で受ける。ＦＲＩＬ処置の患者の状態における改善は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫がＦＲＩＬ感受性であることを示す。
【００９９】
実施例Ｘ
ＦＲＩＬによるＢ細胞急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）を患っているヒトの治療
ＡＬＬを患っている２人の患者は、初期には、第１−３日において４５ｍｇ／ｍ２でダウノルビシンに加えて、第１−７日において１００ｍｇ／ｍ２でシタラビンで最初の７日間を治療した。
【０１００】
患者の１人は、ダウノルビシンとシタラビンの化学療法に加えて、治療的に有効な量のＦＲＩＬタンパク質（例えば、静脈内に１日当たり、全体重の１ｋｇ当たり５μｇないし５０ｍｇのＦＲＩＬタンパク質））を受ける。ＦＲＩＬによる治療を受けた患者の状態における相対的な改善は、Ｂ細胞ＡＬＬがＦＲＩＬ感受性であることを示す。
【０１０１】
実施例ＸＩ
ＦＲＩＬによるＴ細胞皮膚リンパ腫を患っているヒトの治療
癌性Ｔ細胞を含有する生検は、Ｔ細胞皮膚リンパ腫を患っていると疑いのあるヒト患者から採取する。生検の細胞は、ＦＲＩＬタンパク質に感受性であるかどうか（すなわち、細胞がＦＲＩＬタンパク質と接触した場合に死滅する及び／又はそれらの増殖が阻害されるかどうか）を決定するために、ＦＲＩＬタンパク質と接触する。
【０１０２】
患者の癌性Ｔ細胞はＦＲＩＬタンパク質に感受性であれば、次に患者は治療的に有効量のＦＲＩＬタンパク質の投与によって治療を受ける。投与はいずれの経路もとることができるが、本実施例では、患者は、静脈内に１日当たり、全体重の１ｋｇ当たり生理的食塩水中のＦＲＩＬタンパク質の約５μｇ及び５０ｍｇの間で受ける。ＦＲＩＬ処置の患者の状態における改善は、Ｔ細胞皮膚リンパ腫がＦＲＩＬ感受性であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、ビオチニル化したＤｌ−ＦＲＩＬとそれに続く二次のストレプトアビジン−ＰＥの指示した濃度で染色した正常のヒトＢ細胞（白四角）、及び２種のＢ細胞腫瘍細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ（黒丸）及びＪＭ１（黒三角）のパーセントを示す折れ線グラフの概略図である。
【図２】図２は、Ｄｌ−ＦＲＩＬによる接触後の生存細胞の数（ＸＴＴを使用）を示す折れ線グラムの概略図である。試験した細胞株は：ＫＧ−１ａ（白四角）；ＪＭ１（白丸）；ＳＲ（白三角）；ＲＬ（黒長方形）；ＲＡＪＩ（黒丸）；ＭＣ１１６（黒四角）；ＨＴ（黒三角）；及びＣＣＲＦ（黒ひし形）であった。
【図３】図３は、濃度増加したＤｌ−ＦＲＩＬを用いて、正常Ｔ細胞（白四角）、Ｔ細胞白血病ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（黒ひし形）、プレＢ白血病ＪＭ１（Ｘ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫ＨｕＴ７８（黒三角）、及びＢ急性リンパ球性白血病ＣＣＲＦ−ＳＢ（黒四角）のインキュベーション後のＴ細胞、並びにＢ及びＴ腫瘍細胞株を比較した折れ線グラフの概略図である。
【図４】図４は、Ｄｌ−ＦＲＩＬが細胞アポトーシスを誘導するかどうかを決定するために、Ｄｌ−ＦＲＩＬで処理したＭＣ１１６（ＦＲＩＬ感受性）及びＪＭ１（ＦＲＩＬ非感受性）細胞のアネキシン−Ｖ及び７−ＡＡＤ染色の概略図である。
【図５】図５は、１００ｍＭのメチルα−Ｄ−マンノピラノシドによるＤｌ−ＦＲＩＬを介したＭＣ１１６リンパ腫細胞及びＲＡＪＩバーキットリンパ腫細胞の死滅の阻害を示す棒グラフの概略図である。
【図６】図６は、Ｄｌ−ＦＲＩＬの０．２μｇ／ｍｌ（白印）又は１０μｇ／ｍｌ（黒印）によるＢ細胞（丸）及びＭＣ１１６リンパ腫細胞（四角）のインキュベート後のＢ細胞及びリンパ腫細胞の死滅を示す折れ線グラフの概略図である。
【図７】図７は、Ｄｌ−ＦＲＩＬ（黒三角）及びＰａ−ＦＲＩＬ（黒四角）によるＢ細胞腫瘍株（ＣＣＲＦ−ＳＢ）の死滅レベルを示す折れ線グラフの概略図である。
【図８】図８は、ＦＲＩＬ非感受性Ｔ細胞白血病ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の存在下でのＦＲＩＬ感受性ＭＣ１１６Ｂリンパ腫細胞の死滅を示す折れ線グラフの概略図である。
【図１】
2007513879.tif 000004
【図２】
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【図３】
2007513879.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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