(57)【要約】  本発明は、遊離インドール酢酸（遊離ＩＡＡ）またはその誘導体を含む動物飼料組成物に関する。また、本発明は、本発明による組成物を動物に与えることにより、動物成長を増強する方法に関する。また、本発明は、免疫不全動物、成長不足の動物または遅く成長している動物のごとき成長を促進する処置を必要とする動物における動物の処置方法における遊離ＩＡＡまたはその誘導体の使用に関する。また、本発明は、かかる処置を必要とする動物、特に免疫不全動物または遅く成長している動物の成長速度および／または飼料転換率および／または免疫を増大させる治療用組成物の製造のための遊離ＩＡＡまたはその誘導体の使用に関する。本発明による組成物は、好ましくは、食物または飼料サプリメントの形態で有り得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１キログラム当たり２４０マイクログラムを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む動物飼料組成物。
【請求項２】
１キログラム当たり４０ｇ以下の遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む請求項１記載の飼料組成物。
【請求項３】
１キログラム当たり１００〜１０００ｍｇの遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む請求項１または２記載の飼料組成物。
【請求項４】
該誘導体を遊離ＩＡＡに変換できる酵素をさらに含む請求項１〜３のいずれか１記載の飼料組成物。
【請求項５】
該誘導体が、４−ヒドロキシ−ＩＡＡ、４−メトキシ−ＩＡＡ、５−ヒドロキシ−ＩＡＡ、５−メトキシ−ＩＡＡ、６−ヒドロキシ−ＩＡＡ、６−メトキシ−ＩＡＡ、７−ヒドロキシ−ＩＡＡおよび７−メトキシ−ＩＡＡよりなる群から選択される請求項１〜４のいずれか１記載の飼料組成物。
【請求項６】
芳香族環が、４、５、６および７位の１以上で、メチル、アミノ、ニトロ、フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージドで置換された請求項５記載の飼料組成物。
【請求項７】
該誘導体が、３を超える、好ましくは３、より好ましくは２、最も好ましくは１の工程で遊離ＩＡＡに変換できる請求項１〜４のいずれか１記載の飼料組成物。
【請求項８】
ペレット、ミール、穀物、押出しもしくは拡張した穀物、錠剤、粉末またはボーラスの形態である請求項１〜７のいずれか１記載の飼料組成物。
【請求項９】
政府機関により承認された組成を持つ請求項１〜８のいずれか１記載の飼料組成物。
【請求項１０】
有効量の請求項１〜９記載の該組成物を動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の飼料効率および／または飼料転換率および／または免疫を改善するための方法。
【請求項１１】
かかる処置を必要とする動物において成長を刺激し、および／または免疫系を刺激する治療用組成物の製造のための遊離ＩＡＡまたはその誘導体の使用。
【請求項１２】
遊離ＩＡＡまたはその誘導体が、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の血清レベルを増加できる請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
動物がＩＧＦ−１のレベル低下を有する請求項１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
動物が成長不足および／または弱体化した免疫系を有する請求項１１〜１３のいずれか１記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜９記載の動物飼料組成物を得るための請求項１〜９記載の組成物と１以上の飼料物質または成分とを混合することを特徴とする動物飼料組成物の製法。
【請求項１６】
請求項１〜９記載の動物飼料組成物を得るための動物飼料を遊離ＩＡＡまたはその誘導体で補足する工程を含むことを特徴とする動物飼料組成物の製法。
【請求項１７】
ａ）有効量の遊離ＩＡＡまたはその誘導体と特定の動物種に適した飼料材料とを混合し、
ｂ）飼料材料を該種に与える
ことを特徴とする非ヒト動物を飼育する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遊離インドール酢酸（遊離ＩＡＡ）またはその誘導体を含む動物飼料組成物に関する。また、本発明は、本発明による組成物を動物に与えることにより動物成長を増強する方法に関する。また、本発明は、免疫不全動物、成長不足の動物または遅く成長している動物のごとき、成長を促進する処置を必要とする動物の治療方法における、遊離ＩＡＡまたはその誘導体の使用に関する。また、本発明は、かかる処置を必要とする動物、特に免疫不全または遅く成長している動物における成長速度および／または飼料転換率および／または免疫を増加させる治療用組成物の製造のための遊離ＩＡＡまたはその誘導体の使用に関する。本発明による組成物は、好ましくは食物または飼料のサプリメントの形態であり得る。
【０００２】
発明の背景
従来の食物蛋白質の制限された供給は、世界人口の急速な増加に取り組む大きな問題である。ヒトによって必要とされる必須アミノ酸を有する蛋白質を含む動物の生成は特に重要である。制限された生成促進および製造技術における改善の欠如のために、動物蛋白製造における増加は、世界人口の増加に比例していないようである。
【０００３】
従って、動物蛋白生成の生産性を改善することは非常に望ましいようである。生産性を改善する手段の１つは、動物の成長を増強する飼料組成物を開発することである。
【０００４】
抗生物質、界面活性剤およびエストロゲンのごときある種のクラスの物質の投与により動物の成長速度を促進できることが知られている。しかしながら、これらの各クラスの物質の投与は不利を有し、それがそれらの一般的な受入を抑制してきた。かくして、ある条件下で有効な間に、抗生物質および界面活性剤は、主に疾患を抑制するために作用し、かつ真の成長応答を引き出さないと考えられている。抗生物質のかかる使用が欧州において制限されているが、アメリカおよびアジアでは論争下にあるのはその理由のためである。
【０００５】
また、成長促進剤としてのエストロゲンの使用は、ある種の固有の障害および危険を与える。かくして、エストロゲンは、それらが投与される動物をしばしば格下げする。もう一つの不利は、エストロゲン物質のいくらかが動物の可食部中に残り、消費された場合に個体に対する悪影響をおそらく生成しかねないことである。さらに、既知の物質は、注射または移植の手順により主に投与され、それは費用がかかりかつ時間を消費し、消費者によりしばしば嫌われる。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、動物飼料組成物を提供することである。本発明の他の目的は、動物成長を増強する飼料組成物を提供することである。本発明のさらなるの目的は、飼料組成物を動物に与えることにより動物成長を増強する方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、動物飼料組成物の製法を提供することである。本発明の他の目的、特徴および利点は、本発明がより十分に後記に示されているので明らかになるであろう。
【０００７】
先行技術の物質および方法の不利を克服することができ、非ヒト動物の成長が、それらの通常の飼料または飲料水と共に遊離インドール酢酸（遊離ＩＡＡ）またはその誘導体を動物に経口投与することにより増強できることが今や判明した。
【０００８】
発明の詳細な記載
遊離ＩＡＡおよびその誘導体は既知の化合物である。遊離ＩＡＡは広範囲に研究された自然発生の植物成長植物ホルモンである。植物において、大部分のＩＡＡが、エステル結合を介して糖、またはアミド結合を介してアミノ酸およびペプチドにコンジュゲートした形態（Slovinら 1999, Biochemistry and molecular biology of plant hormones, Elsevier, Amsterdam. P115-140）で生じる。
【０００９】
「遊離ＩＡＡ」なる用語を本明細書に用いて、遊離ＩＡＡが遊離または酸の形態であることを示すが、「コンジュゲートしたＩＡＡ」なる用語は、エステル結合またはアミド結合を介してコンジュゲートするＩＡＡをいう。
【００１０】
１９５６年と同じくらいかなり前に、ヒトに対する遊離ＩＡＡの効果が研究され、０.１ｇ／ｋｇの単回用量が非毒性であったが示された(Mirsky A and Diengott D, Hypoglycemic action of indole-3-acetic acid by mouth in patients with diabetes mellitus, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 93: 109-110,1956)。１９６４年には、遊離ＩＡＡの光酸化生成物が微生物の成長抑制物質として作用することが判明した(Still C, Fukuyama T and Moyed H, Inhibitory Oxidation Products of Indole-3-acetic acid, J. Biological Chemistry, 240,6,2612-2618,1964)。
【００１１】
また、遊離ＩＡＡおよびその誘導体のうちのいくつかの医療的使用は従前に記載されている。ＥＰ １.２９６.６７６は、特に、ヒトにおける腫瘍疾患の治療のための医薬としての遊離ＩＡＡの使用を記載する。ＷＯ０２／０８０９０６は、女性における子宮内膜症を治療するための遊離ＩＡＡの使用を記載する。Nachsonら (Food and Chemical Toxocology 41, 745-752)は、ヒトの前立腺癌細胞系における増殖およびアポトーシスの誘導に対するいくつかの遊離ＩＡＡ誘導体（インドール−３−カルビノールおよび３、３'−ジインドリルメタン）の効果を報告したが、Rossiterら (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12, 2523-2526)ならびにFolkesら (Biochemical Pharmacology 63, 265-272)は、酵素−プロドラッグ指向の癌治療における遊離ＩＡＡおよびいくつかの誘導体の使用を記載した。
【００１２】
遊離ＩＡＡまたはその誘導体は、非ヒト動物、特に、魚、家禽、ウシおよびブタのごとき家畜またはウマ、ネコ、イヌ、ウサギおよび魚のごときペット動物における顕著な成長促進の応答を達成することが予期せぬことに今や判明した。従って、本発明は、好ましくは飼料を介して、動物に遊離ＩＡＡを投与することにより非ヒト動物を飼育する方法を提供する。
【００１３】
遊離ＩＡＡまたはその誘導体を動物に供給でき、動物飼料および／または水において明確に規定された濃度内で投与される場合に、最も有効である。注射および／または移植は不必要であり、動物はそれらの飼料で彼ら自身の自由な選択の遊離ＩＡＡまたはその誘導体を経口的に摂取する。
【００１４】
本発明の具体例により、遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含み、動物成長を増強する動物飼料組成物が提供される。かかる動物飼料組成物は、２５〜１０００マイクログラム／ｋｇ生体重／日（μｇ／ｋｇ ＬＷ／日）の毎日摂取量を可能にするのに十分な濃度における遊離ＩＡＡまたはその誘導体で補足された従来の飼料組成物で有り得る。次いで、かかる飼料組成物は、１ｋｇ飼料当たり０.２ｍｇおよび１０ｇの間の遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含み得る。
【００１５】
１ｋｇ飼料当たり０.２４ｍｇを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含有する飼料組成物、例えば、１ｋｇ飼料当たり０.３０ｍｇを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含有する飼料組成物、または１ｋｇ飼料当たり０.４０ｍｇを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含有する飼料組成物、例えば、１ｋｇ飼料当たり０.６、０.８、１、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００あるいは５００ｍｇを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含有する飼料組成物を動物に直接的に供給する場合に、特に良好な結果が得られた。
【００１６】
従って、本発明は、１キログラム当たり２４０マイクログラムを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む動物飼料組成物に関する。
【００１７】
遊離ＩＡＡまたはその誘導体の濃度の上限は、意図した使用により決定された大部分についてのものである。飼料組成物は、便利な割合で動物飼料に混合された飼料または食物添加物の形態で有り得る。この場合、遊離ＩＡＡまたはその誘導体の濃度は、１０％の高さ、すなわち、１００ｇ／ｋｇで有り得る。また、飼料組成物は、使用準備済み（ready to use）の混合物の形態であり得る。その場合、一旦動物の飼料の毎日摂取量が分かれば、上限は動物についての所望の用量により決定される。毎日の実施において、１、２または４％（１０〜４０ｇ／ｋｇ）の遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む飼料組成物が、貯蔵飼料添加物の形態での貯蔵に最も実用的であると分かった。従って、使用準備済みの飼料または飼料添加物に混合されるべき飼料組成物の好ましい貯蔵形態は、約１〜４％の遊離ＩＡＡまたはその誘導体と、摂取に適した他の乾燥した飼料との混合物である。
従って、本発明は、１キログラム当たり４０ｇ以下の遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む飼料組成物に関する。
１００ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば、５００ｍｇの遊離ＩＡＡまたはその誘導体／ｋｇ飼料添加物を含有する調製物が、遊離ＩＡＡまたはその誘導体を使用準備済みの飼料組成物に正確に与えるために用いるのに最も実用的であった。
【００１８】
従って、また、本発明は、１キログラム当たり１００〜１０００ｍｇの遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む飼料組成物に関する。
【００１９】
当業者は、動物に有効な量の遊離ＩＡＡを供給するために飼料を使用するための準備における遊離ＩＡＡの量を調節しなければならないことを認識するだろう。遊離ＩＡＡのある毎日摂取量が達成されるように、飼料における遊離ＩＡＡ濃度を調節するために、見積もりは、動物または動物の群の飼料摂取でなされなければならない。当業者は、ある（特定の種類または群の）動物の飼料摂取を知っており、通常、１日当たりの飼料摂取は、若鶏の場合のごとき２０％の高さの時々の例外を除いて、動物の体重の０．５〜１０％の間にある。動物は、飼料を摂取する２倍の単位体積の水を通常摂取するだろう。従って、１０ミリグラム遊離ＩＡＡ／ｋｇを含有する飼料組成物を与えた場合、５ｍｇ／ｌの濃度の飲料水、または水中の２.５ｍｇ／ｌ＋飼料中の５ｍｇ／ｋｇの濃度の組合せにより摂取するのと同一量の遊離ＩＡＡを摂取するであろう。
【００２０】
本願明細書に用いた動物飼料組成物は、固体または液体の形態における動物栄養のための組成物を含む。飼料は主エネルギー源および動物用栄養であり、通常動物または植物起源のものである。かくして、飼料は、動物の成長および適切な身体状態の維持を可能にするのに十分な栄養的価値を持つ物質として規定し得る。典型的な具体例において、動物飼料組成物は、ペレット、ミール、穀物、押出しもしくは拡張した穀物（extruded or expanded grain）、錠剤、粉末またはボーラスの形態から成る。特に有利な飼料組成物は、乾燥した飼料および食用糠、エネルギー飼料、蛋白質飼料、ミネラル飼料、ビタミン飼料、酵母生成物、通常のプレミックス、コーンミール、綿実小麦グルテン、トウモロコシ・サイレージ・カブハボタン、甜菜パルプ、りんごパルプ、ライグラス、ウシノケグサ（fescue grass）、アルファルファ飼料濃縮物、および飼料サプリメントよりなる群から選択される食料品を含む。遊離ＩＡＡまたはその誘導体は、菜種種子、綿実、ダイズ、魚粉、小麦ふすま、小麦飼料ミール、ミネラル、ビタミンおよび結合剤のごときいずれかの適当なベース飼料材料と混合でき、または例えば、アミノ酸、塩類、リン、あるいはコーンミールとプレミックスとして調製し得る。１つの特に有利な具体例において、飼料または飼料添加物は、ＦＤＡ、米国農業部門またはカナダの食品監視機関のごとき政府機関により承認された形態および／または組成物である。欧州において、国際食品規格委員会（CAC）の動物飼料の専門調査会ならびに動物福祉法（AWA）は、動物飼料の定義を提供する。１つの有利な具体例において、本発明は、遊離ＩＡＡを補足した、FFDCAのセクション２０１（x）の「動物飼料」の定義内の動物飼料に関連する。
【００２１】
遊離ＩＡＡまたはその誘導体は、動物飼料および／または水に便利に直接的に組み入れられる。飼料中に材料を分散するのに適するいずれの方法も用いることができる。動物飼料および／または水に添加される遊離ＩＡＡまたはその誘導体の量は、最大の有益性を得るために記載された限界内で変更し得る。
【００２２】
従って、本発明は、動物飼料材料を供し、次いで前記飼料材料を有効量の遊離ＩＡＡと混合する工程を含む動物飼料の製法を含む。
【００２３】
本発明による組成物は、カプセルの形態で有り得るが、他の投与形態、錠剤、懸濁剤、乳剤、液体、散剤、ロゼンジ、パスティール（pastille）、丸剤等のごとき好ましくは経口投与形態も可能である。該組成物は、例えば、飼料サプリメント、飼料添加物または医薬組成物の形態を取り得る。
【００２４】
また、本発明により、動物に動物飼料組成物を投与することを含む、非ヒト動物の成長を促す方法、ならびに／または非ヒト動物の飼料効率および／もしくは飼料転換率および／もしくは免疫を改善する方法が提供される。本願明細書に含まれるのは、２４０μｇ／ｌ、５００μｇ／ｌ、または１０００μｇ／ｌを超えるごとき、１リットル液体当たり１２０μｇを超える遊離ＩＡＡまたはその誘導体を含む水のごとき液体が動物に投与される方法である。
【００２５】
本発明による遊離ＩＡＡまたはその誘導体で補足された飼料および／または水は、魚、ウシ、トリおよびブタのごとき家畜の商業的な飼育に特に適している。また、それらは、ウサギ、ウマ、ハトのごときトリ、コイのごとき魚、ネコおよびイヌのごときペット動物に用いてもよい。かかる補助飼料の利用により、非ヒト動物の成長を非常に促進することが可能となるだけではなく、飼料転換率（すなわち、動物体重の１ｋｇの増加を生成するのに必要とされる飼料のｋｇ数）の効率が非常に増大し、その結果、より大きな経済的利益を生じる。
【００２６】
また、本発明による動物飼料組成物および方法は、成長不足を有する動物に適用し得る。動物実験において、遊離ＩＡＡまたはその誘導体が与えられた場合に、貧弱に成長している動物の体重が通常のレベルに増加することが示された。これらの実験は、本発明の化合物および方法が食欲亢進に導き、および／または飼料転換率を改善したという事実の例示である。
【００２７】
この点で、成長不足なる用語は、その種の通常の成長に実質的に遅れて不足した成長と見なされるべきである。かかる動物は、その種内の同一年齢の動物の標準体重分布のメジアンの２５、４０、６０または８０％を超えて下回るごとき、１０％を超える生体重（life weight）を示す。
【００２８】
また、本発明による動物飼料の組成物および方法は、免疫不全動物に適用し得る。免疫不全動物は、障害されたまたは弱体化した免疫系を持つ非ヒト動物として本願明細書に規定される。かかる動物は、その血清中のＩＧＦ−１のレベル低下により通常特徴づけられる。ＩＧＦ−１の血清レベル低下は、２５％、４０％、６０％または８０％を超えるもののごとく、その種における健康な対象の通常のメジアンの１０％を超えて下回るＩＧＦ−１のレベルとして本願明細書に規定される。弱体化した免疫系は、しばしば疾患または悪い生活環境によりもたらされた高死亡率の原因である。
【００２９】
また、本発明は、ＩＧＦ−１の血清レベル低下に関係した様々な他の徴候を示す動物の処置に有用である。従って、ＩＧＦ−１血清レベル低下に関連した状態に苦しむ非ヒト動物におけるＩＧＦ−１血清レベルを増加させる手段を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００３０】
これは、遊離ＩＡＡまたはその誘導体をかかる処置を必要とする非動物に投与することによって、本発明により達成される。かくして、本発明は、免疫不全動物および／または成長不足の動物において、成長速度および／または免疫を増加させるための治療用組成物の製造のための遊離ＩＡＡおよびその誘導体の使用に関する。これは、動物の体重増加および／または疾患または悪い生活環境によりもたらされた死亡率の低下に導き得る。
【００３１】
本願明細書に例示された様々な適応について、投与すべき最適な量の遊離ＩＡＡまたはその誘導体が存在することが判明した。一般的には、健康および通常に成長している動物の成長速度をさらに増加させるために、２５〜１０００μｇ／ｋｇ ＬＷ／日、より特に５０〜５００μｇ／ｋｇ ＬＷ／日の遊離ＩＡＡの毎日摂取で十分である。特に良好な結果は、１５０〜５００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日を投与する場合に得ることができる。本願明細書に後記されるように、アフリカナマズは、平均２１８μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日が投与された場合に７％の著しく改善された飼料転換率を示した。４００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日の用量で与えた場合に５週間で健康な家禽は、１８％を超える体重を得た。類似する結果は、ウシおよびブタ飼育場において得られた。
【００３２】
（特に家畜またはペット動物における）成長不足を示す動物の成長速度を増加させるために、わずかに高用量がしばしば必要とされる。特に良好な結果は、５０〜１０００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日、特に、２５０〜１０００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日、さらに特に、４００〜１０００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日、例えば、５００または７５０〜１０００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日で、６週間未満、４週間未満、より特に３週間未満、例えば、２週間のごとき短期間の間に得られた。
【００３３】
遊離ＩＡＡまたはその誘導体の最適な用量は経験的に決定され、本明細書に規定された限界内で、特定のタイプの飼料、種および飼育場条件に広がるいくらかに依存し得る。当業者は、かかる投与実験のためのスケジュールをセットアップする方法を知っており、本明細書の実施例７の実験計画は有用であり得る。
【００３４】
かくして、本発明の鍵となる化合物は、遊離インドール酢酸である。しかしながら、同等の結果は遊離ＩＡＡの誘導体を用いることにより達成し得る。遊離ＩＡＡの誘導体は、化合物の投与に先立って同一動物体内における遊離ＩＡＡのレベルと比較すると非ヒト動物の体内における遊離ＩＡＡのレベルの増加に導く化合物として本願明細書に規定される。これらの誘導体は様々なカテゴリーに分類できる。
【００３５】
遊離ＩＡＡの誘導体の１つのカテゴリーはコンジュゲートしたＩＡＡである。コンジュゲートしたＩＡＡは、例えば、糖にエステル結合を介してコンジュゲートしたＩＡＡ形態、例えば、ＩＡＡ−グルコース、ＩＡＡ−アルファ−アスパラギン酸１Ｎ−グルコシド、ＩＡＡ−イノシトール、ＩＡＡ−ミオイノシトール、あるいは様々な他の炭水化物に結合したＩＡＡで有り得る。また、ＩＡＡは、例えば、アミノ酸およびペプチドにアミド結合を介してコンジュゲートし得る。その例は、アセトアミド、アルファ−ロイシン、アルファ−アラニン、アルファ−アスパルテート（植物におけるＩＡＡの最も重要なコンジュゲート）、アルファ−グルタメート、アルファ−リジン、アルファ−グリシン、アルファ−バリン、アルファ−フェニルアラニンまたはリジンもしくはトリプトファンを含む遅放性アミドコンジュゲートである。ペプチドとのコンジュゲーションは一般的であるが、他のアミノ酸とのコンジュゲートは異なる植物において発生する。加えて、この群は、遊離ＩＡＡ中で（塩基条件下での）化学的また（ニトリラーゼ活性による）酵素的の双方により分解するインドール−３−アセトニトリルのような対応する酸に容易に変換される３−アセトニトリル誘導体を含む。
【００３６】
本発明に有用であるように、このコンジュゲートしたＩＡＡは、遊離ＩＡＡに変換されなければならない。これは、動物に、エステラーゼ、アミダーゼまたはニトリラーゼのごとき酵素の同時の許可により達成し得る。これは、例えば、動物飼料組成物中にそのコンジュゲートしたＩＡＡと一緒に酵素を混合することにより達成し得る。
【００３７】
かくして、本発明は、遊離ＩＡＡの誘導体を遊離ＩＡＡに変換できる酵素をさらに含む前記の動物飼料組成物に関する。
【００３８】
しかしながら、コンジュゲートしたＩＡＡも、飼料に添加および／または動物自体に投与でき、それによって、コンジュゲートしたＩＡＡの遊離ＩＡＡへの転換のために動物の循環または胃腸管に天然に存在する酵素活性に依拠してもよい。
【００３９】
遊離ＩＡＡはアミダーゼ（アミドヒドリサーゼ（amidohydrolysases））によりアミドから遊離される。遊離ＩＡＡはグルコシダーゼによりグルコシドから遊離され得る。植物において、相当な量のコンジュゲートしたＩＡＡが存在することができ、それは酵素加水分解（グルコシダーゼまたはアミダーゼのごとき）または化学的加水分解のいずれかにより遊離できる。植物における合計のＩＡＡプールのうちアミド結合したＩＡＡは一般的に９０％を構成するが、約１０％はエステル結合し、１％未満は遊離ＩＡＡである。植物において、約１.２μｇ／ｇ乾重量の高さの遊離の＋結合遊離ＩＡＡのレベルは、９日齢のArabidopsisにおいてのごとく判明し得る。植物の生活環の後期にこれらのレベルが低下する。この最大約１％が遊離ＩＡＡである。
【００４０】
また、植物中において、種々のヒドロキシル化、リン酸化、メトキシ化、Ｎ−酸化物およびＮ−メチル化されたインドール誘導体を見出すことができる。また、これらの化合物は、胃、腸、肝臓、または体内の他の場所のいずれかにおいて、遊離ＩＡＡに変換できる。この変換は、酵素的または化学的で有り得る。かくして、また、本発明は、代謝的変換を通じて直接的または間接的のいずれかで遊離ＩＡＡに変換できるこれらの化合物に関する。これらのいわゆる前駆体は、例えば、４−ヒドロキシ−ＩＡＡ、４−メトキシ−ＩＡＡ、５−ヒドロキシ−ＩＡＡ、５−メトキシ−ＩＡＡ、６−ヒドロキシ−ＩＡＡ、６−メトキシ−ＩＡＡ、７−ヒドロキシ−ＩＡＡ、７−メトキシ−ＩＡＡである。
【００４１】
さらに、誘導体なる用語は、自然発生または合成で有り得る化合物である他の置換基とのＩＡＡを含み得る。また、「自然発生の」なる用語は、植物、微生物、哺乳動物細胞、およびヒトまたは動物の身体のごとき生細胞による代謝の結果を包含する。自然において、ハロゲン化インドールアルカロイドは、特に水産生物において見出すことができる（すなわち、６−ブロモインジゴチン）。すべてのタイプの置換基、例えば、第４，５，６および７位にてメチル、アミノ、ニトロ、フルオリド、クロリド、ブロミドおよびヨージドが、芳香環に合成的に導入できる。これらの化合物をすべて用いて、動物における遊離ＩＡＡのレベルを増加し得る。
【００４２】
また、誘導体なる用語は、前記にリストされるような遊離ＩＡＡおよびアナログを形成できる前駆体、例えば、トリプトファン、４−ビドロキシトリプトファン、４−メトキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、５−メトキシトリプトファン、６−ビドロキシトリプトファン、６−メトキシトリプトファン、７−ヒドロキシトリプトファン、７−メトキシトリプトファン、ヒパフォリン（hypaphorine）、トリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、４−メトキシトリプタミン、サイロシン（４−ヒドロキシ、ジメチルトリプタミン）、サイロシビン（４−ホスフェート、ジメチルトリプタミン）、ベオシスチン、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）、５−メトキシトリプタミン、ブフォテニン（ジメチルセロトニン）、Ｏ−メチルブホテニン、メラトニン（５−メトキシ、トリプタミンＮＨ２上のアセトアミド官能基）、６−ヒドロキシトリプタミン、６−メトキシトリプタミン、７−ヒドロキシトリプタミン、７−メトキシトリプタミンを形成できる。遊離ＩＡＡ形成のための他の自然発生の前駆体は、インドール酪酸およびインドール−３−ピルベートである。
【００４３】
また、誘導体なる用語は、遊離ＩＡＡに戻し変換し得る遊離ＩＡＡのアナログまたは代謝物である化合物を包含し得る。また、これらの化合物は、前記の４−、５−、６−および７−ヒドロキシならびにメトキシ−誘導体を包含する。これらの化合物は、例えば、インドール、インドール−３−アセトアルデヒド、インドール−３−エタノール、インドール−３−アルデヒド、インドール−３−メタノール、インドール−３−カルボン酸、３−メチルインドール（スカトール）、インドール−３−アセトアルドキシム、３−アミノメチルインドール、Ｎ−メチルアミノメチルインドール、グラミン（Ｎ−ジメチルアミノメチルインドール）である。
【００４４】
また、誘導体なる用語は、インドキシル（インジカン）、インドレニノン（indoleninone）、３−メチレン−２−オキシンドール、アブリン、イソタンＢ（isotan B）、イサチン、インジカン、インジゴ、インドュルビン（indurubin）、インジゴチン、３−インドリルメチル（スカトリル（skatolyl））、ナイアシンおよび２−オキシンドール−３−酢酸のごとき変更されたインドール発色団を持つ化合物を包含し得る。
【００４５】
また、誘導体なる用語は、３−メチレン−２−オキシンドール、オキシンドール−３−メタノール、オキシンドール−３−アルデヒド、オキシンドール−３−カルボン酸および３−メチルオキシンドールのごとき、植物または植物組織中で一般的に見られる化合物を包含し得る。
【００４６】
また、さらに、本発明は、２−オキシンドール誘導体および４−、５−、６−または７−ヒドロキシ誘導体のごとき他の天然のＩＡＡ誘導体のコンジュゲート（エステルおよびアミド）：ジオキシンドール−３−酢酸、３−Ｏ−ベータ−グルコシル−ジオキシンドール−３−酢酸７−ヒドロキシ−２−オキシンドール−３−酢酸−７'−Ｏ−ベータ−ｄ−グルコピラノシド、グルコピラソニル−ベータ−１,４−グルコピラノシル−ベータ−１−Ｎ−オキシンドール−３−アセチル−Ｎ−アスパラギン酸、グルコピラノシル−ベータ−１−Ｎ−オキシンドール−３−アセチル−Ｎ−アスパラギン酸、２−インドロン−３−アセチルアスパラギン酸、３−（Ｏ−ベータ−グルコシル）−２−インドロン−３−アセチルアスパラギン酸、３−ヒドロキシ−２−インドロン−３−アセチルアスパラギン酸、インドール−３−グリセロホスフェート（塩基性条件下で遊離ＩＡＡに分解する）、インドール−３−グリセロール（塩基性条件下で遊離ＩＡＡに分解する）、グルコシノレート、例えば、インドール−３−イルメチルグルコシノレート（グルコブラシシン）、４−ヒドロキシインドール−３−イルメチルグルコシノレート（４−ヒドロキシグルコブラシシン）、１−アセチル−インドール−３−イルメチルグルコシノレート（１−アセチル−グルコブラシシン）、１−メトキシインドール−３−イルメチルグルコシノレート（ネオグルコブラシシン）、４−メトキシインドール−３−イルメチルグルコシノレート（４−メトキシグルコブラシシン）、１−スルホ−インドール−３−イルメチル（グルコブラシシン−１−スルフェート）（それらはミロシナーゼ（チオグルコシダーゼ）によりインドール誘導体に変換される）の使用に関する。
【００４７】
一般的に、遊離ＩＡＡの誘導体は、好ましくは、化学合成または酵素変換のいずれかにより１工程で、遊離ＩＡＡに合成できる分子である。かかる誘導体の例は、ＩＡＡＩｄオキシダーゼ（AAO１）の作用により遊離ＩＡＡに変換できるインドール−３−アセトアルデヒド（ＩＡＡＩｄ）、またはニトリラーゼＮＩＴ１、ＮＩＴ２またはＮＩＴ３により遊離ＩＡＡに変換できるインドール−３−アセトニトリル（IAN）である(Bartelら, J. Plant growth Regul (2001) 20; 198-216)。あるいは、遊離ＩＡＡの誘導体は、２工程において遊離ＩＡＡに合成できる分子で有り得る。かかる分子の例は、ミロシダーゼ（myrosidase）として知られている酵素の作用に関連するインドールグルコシノレート、インドール−３−アセトアルドキシム（IAOx）、および当業者にとって今や明白な他の多数の前駆体である。あるいは、遊離ＩＡＡの誘導体は３工程以上で遊離ＩＡＡに合成できる分子で有り得る。
【００４８】
従って、本発明は、誘導体が、３を超える工程、好ましくは３工程、より好ましくは２工程、最も好ましくは１工程において遊離ＩＡＡに変換できる遊離ＩＡＡの誘導体を含む動物飼料組成物に関する。
【００４９】
当業者には、今や、動物飼料中の遊離ＩＡＡの誘導体の用量が、遊離ＩＡＡについて本願明細書に与えられた範囲に対応する動物体内での遊離ＩＡＡ濃度を得るために調節されるべきであることは明確であろう。これには、化学的に調製された場合のほとんど完全に完了していない転換および製造中の損失を明らかにしなければならない。従って、誘導体の濃度は、最もよく経験的に確立でき、実施例７において概説されるような実験の設定はこの点で有用であり得る。結果的に、遊離ＩＡＡまたはその誘導体のある濃度が本明細書に言及される場合、これが動物における遊離ＩＡＡのこの特定の濃度を生み出す遊離ＩＡＡの濃度または誘導体の濃度であることを意味する。当業者はこれを知っており、本願明細書に提供されるような教示の助けを借りて誘導体の適切な濃度を決定する方法を知っている。
【００５０】
遊離ＩＡＡは、商品として容易に入手可能である。それは化学合成でき、または生物学的方法において調製できる。ＩＡＡを生成する微生物は自然において広範囲である。酵母、菌類および多数の細菌ならびに植物は、ＩＡＡの前駆体を遊離ＩＡＡに変換することが知られている。細菌によるＬ−トリプトファン変換に加えて、遊離ＩＡＡへのＬ−トリプトファンへの独立した生化学的経路も広範囲に記載されている(J. Plant Growth Regul (2001) 20: 198-216)。
【００５１】
遊離ＩＡＡを生成できるよく知られた細菌は、Azospirillum Brasilense（ＡＢ）である。通常の発酵プロセスにおける増殖相の終わりに、ＡＢはＬ−トリプトファンを遊離ＩＡＡに変換できる。この転換の効率を増加させるために、少量の合成遊離ＩＡＡを培地に添加し得る。フィードバック機構を介して、ＡＢはＬ−トリプトファンの遊離ＩＡＡへの転換を増加させる。
【００５２】
１グラム遊離ＩＡＡ／リットル培養液の最終濃度は作成するのは容易であるが、非常に高濃度でさえ、用いられる微生物に依存して可能である。
【００５３】
発酵を終了後に、微生物を溶解でき、遊離ＩＡＡにおいて富化した粉末を噴霧乾燥または培養液を乾燥させる他の便利な方法により得ることもできる。他の技術を用いて、液体を部分的にまたは完全に除去し得る。
【００５４】
実施例
実施例１：遊離ＩＡＡ源
遊離ＩＡＡまたはその誘導体はいずれかの商業源から得ることができる。別法として、遊離ＩＡＡは微生物学的方法で生成し得る。
この目的のために、Azospirillum brasilence Sp７（ATCC）を培養試験管中の寒天培養物として得た。ＬＢ培地を用いて、その株を２８℃、１７５ｒｐｍにて一晩増殖した。グリセロールを１０％まで培養物に加え、混合し、ナルゲンクレオバイアル（Nalgene creovial）に分割し、次いで−８０℃にて冷凍した。貯蔵物をクレオバイアルに−８０℃にて貯蔵した。
A.brasilenceの種培養を調製するために、１つの貯蔵物（１.２〜１.８ｍｌ）を解凍し、１リットルのＬＢ培地に加え、約２.５の光学密度（ＯＤ６２０ｎｍ）まで２８℃、１７５ｒｐｍにて約２０時間増殖した。
【００５５】
１０リットルの発酵用容器を水ですすぎ、ｐＨ電極を較正した。９リットルのＬＢ培地を調製し、１ｇ／ｌのＬ−トリプトファンおよび０.１ｇ／ｌの遊離ＩＡＡを加えた。培地を２ｍｌの泡止め剤と一緒に発酵用容器に入れた。発酵用容器を１２１℃で３０分間殺菌した。２８℃に冷却した後に、Ｏ２プローブを、Ｎ２およびＯ２で各々０および１００％の空気飽和に較正した。
種培養をオートクレーブ中で別々に殺菌されたフラスコおよび管を介して発酵用容器に移す。添加が完了した場合に、管およびフラスコを除去し、発酵を以下のパラメーターで開始する:
撹拌機速度      ４００ｒｐｍ
温度            ２８℃
通気            ０.７５ ＮＩ／分
ｐＨ            ７
【００５６】
１５分後、試料を採取し、ＯＤ６２０ｎｍを測定し、次いでそのｐＨ値をチェックする。試料は一定間隔で採取し、A.brasilenceの増殖を定量する。増殖速度が低下した場合、付加的な培地を添加して、十分な生物量が遊離ＩＡＡの製造のために形成したことを保証した。活発な増殖相が終わり、長期間継続した場合、遊離ＩＡＡの生成が開始することが判明した。、遊離ＩＡＡ濃度の経過をＬＣ−ＭＳにより追跡した。遊離ＩＡＡの濃度が、約１ｇ／ｌのレベルであった場合、発酵を終了し、細胞を収穫し、約１４００バールにてノノジェット（nonojet）ホモジナイザーにより溶解した。残りの上清および溶解した細胞を殺菌し、噴霧乾燥させて、所望の生成物製剤を得た。
【００５７】
実施例２：貧弱に成長している子ブタの成長速度は遊離ＩＡＡで改善できる
試験をオランダランドレースの１０００頭の雌豚を用いて良好に管理した飼育場内で行った。飼育場はよく試行されるが、技術的性能は最適ではなかった。子ブタの死および成長速度に潜在的な問題が存在した。明確な潜在的な技術的または獣医学的な理由なくして、あまりにも多数の貧弱に成長している子ブタが存在した。飼育場で明確な病態は分からなかった。
３群の子ブタを試験の第１日にて無作為に選択した。その第１の（対照）群は通常の良好に成長している子ブタから成った。Ｂ群は７８頭の貧弱に成長するものから成り、これらを遊離ＩＡＡで処置した。Ｘ群は、処置されなかった５２頭の貧弱に成長するものから成った。
【００５８】
Ｂ群は、飼料中の遊離ＩＡＡを受け、試験の第５日に開始した。Ｂ群のための飼料は、遊離ＩＡＡをデキストロースとまず混合し、次いで、飼料と混合することにより調製した。その目的のために、４グラムの純粋な遊離ＩＡＡ（Aldrich）を９６グラムのデキストロースと混合し、次いで混合物を飼料中に分散した。Ｂ群からのブタは、４％の遊離ＩＡＡ／デキストロース混合物の１２.５ｍｇ／ｋｇのＬＷ／日に対応する５００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日（ＬＷ=生体重）の用量を受けた。
【００５９】
子ブタを試験の開始にて、２日間離乳させた。ＩＧＦ−１測定用血液試料を試験の第５日、および試験の終わりにて各群から採取した。ＢおよびＸの群の２つの檻（１３頭の子ブタ）を第５日および試験の終わりにて重量計測した。ＩＧＦ−１の定量化は、イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）（DSL−５６００ ACTIVETM、DSL、Germany GmbH、Germany）を用いて行った。アッセイ内およびアッセイ間の変動は、ＧＨについて各々、４.０％および９.２％;ＩＧＦ−１について３.０％および１.５％であった。
既に、処置の１週間後に、飼育場主は、Ｂ群およびＸ群の間の明瞭な差に気づいた。Ｂ群において子ブタはより良好に見え、腹部はより良好に満たされ、子ブタの一般的な外観はＸ群においてよりも良好に見え始めた。この現象は、処置が継続した場合に、より断言されるようになった。Ｂ群においてほとんど貧弱に成長しているものはなく、皮膚および毛は非常に良好に見えた。
【００６０】
試験の第１日にて、３群間のＩＧＦ−１レベルに差はなかった（表１）。ＩＧＦ−１レベルは、０.８および１３.１間で低く、平均４.６であった。おそらく離乳のストレスのために、（良好な成長の）対照群ならびに（貧弱な成長の）ＸおよびＢ群間に観察可能な差はなかった。
試験の第２６日にて、ＩＧＦ−１レベルを再測定した。Ｂ群は、健康な対照群（２５.３対２３.６ｎｍol／ｌ）のレベルであり、非処置群Ｘ（１７.２ｎｍol／ｌ）より明らかに高かった、。
【００６１】
【表１】
2007507213.tif 000002
【００６２】
檻Ｂ ３Ｌ（eft）は、檻Ｘ ４Ｌ（eft）からのそれらの隣のものよりも平均８５０グラム多く成長した。檻Ｂ ３Ｒ（ight）は、檻Ｘ ４Ｒ（ight）からのそれらの隣のものと平均して同じ重量を得たが、試験の最初にて３１０グラム軽い重量が測定された。平均において、処置群は（重量測定された檻につき）２１日の期間中ほとんど０.５ｋｇ多く得た（表２）。
【００６３】
【表２】
2007507213.tif 000003
【００６４】
処置を中止した後、Ｂ群からの子ブタはＸ群より引き続き良好であった。Ｂ群からの子ブタは、非処置群より良好に見え始め、非処置群より良好に成長した。これらの特徴は、明らかに、処置群におけるより高いＩＧＦ−１レベルと相関している。
この試験の結果は、５００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日での１４−２１日間の単一処置が貧弱に成長している子ブタにおけるＩＧＦ−１レベルを有効に回復し、通常の良好に発育した子ブタのレベルまで成長を促したことを支持する。この処置の結果、ブタは不足した成長に追いつき、処置を継続する必要なくして、肥育期間に良好となった。
【００６５】
実施例３;健康な産卵鶏の成長は遊離ＩＡＡで改善できる
この実施例において、通常に成長している動物を遊離ＩＡＡで処置した。１０週齡の産卵鶏をその群れにおいて選択して、２群の１０羽の雌鶏を創製した:
−ＧＢ群：１０羽の通常に成長をしている雌鶏、処置していない
−ＧＮＡ群：１０羽の通常に成長をしている雌鶏、遊離ＩＡＡで処置した
処置したトリは、デキストロース中の遊離ＩＡＡの４％混合物の１０ｍｇ／ｋｇ ＬＷ／日に対応する４００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日を含むカプセルを毎日強制飼料させた。雌トリが産卵を開始するまで、処置を継続した。２群を毎週重量測定した。
【００６６】
第１週から、処置群において、非処置群と比較した場合に、体重増加の改善が見られた。体重増加における改善は、試験の最初の４週間で不変であった。ＧＮＡ群は、通常の飼育スケジュールに約２週間先行した。
非常に暑かったので、実験の最後の数週間は、トリには非常にストレスが多く、トリはＩＬＴに対する予防注射を受けた。
【００６７】
【表３】
2007507213.tif 000004
【００６８】
既に１週間後の体重増加は、遊離ＩＡＡが通常の雌トリの成長速度に有益な効果を有することの明確な徴候を与えた。遊離ＩＡＡが通常のトリの成長に有益な効果があり、遊離ＩＡＡが通常の飼育プロセスをスピードアップでき、飼育期間の終わりに非常に強いトリを送達できることが結論できる。５週間の試験後に、それらの飼料中の遊離ＩＡＡを受けたトリは、遊離ＩＡＡを受けなかった対照群より平均で１８％重かった。
【００６９】
実施例４;貧弱に成長している産卵鶏の効率は遊離ＩＡＡで改善できる
産卵鶏の貧弱な成長は雌トリの飼育において大きな問題を構成する。この実施例において、貧弱に成長しているトリを遊離ＩＡＡで処置した。実験飼育場における群れは一様に成長せず、トリの約１０〜１５％は、あまりにも貧弱な成長の効率を有した。
１０週齡の飼育している産卵雌鶏をその群れにおいて選択して、３群の１０羽の雌鶏を創製した:
−ＧＢ群：１０羽の通常に成長している雌鶏、処置していない
−ＳＢ群：１０羽の貧弱に成長している雌鶏、処置していない
−ＧＮＡ群：１０羽の貧弱に成長をしている雌鶏、遊離ＩＡＡを処置した
【００７０】
処置したトリは、デキストロース中の遊離ＩＡＡの４％混合物の１０ｍｇ／ｋｇ ＬＷ／日に対応する４００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日を含むカプセルを毎日強制飼料させた。雌トリが産卵を開始するまで、処置を継続した。異なる群を毎週重量測定した。
第１週から、処置群ＳＮＡにおいて、非処置群ＳＢと比較した場合に、体重増加の改善が見られた。体重増加における改善は、試験の最初の４週間で不変であった。ＳＮＡ群は、通常の成長のスケジュールまで追いつき、数週間でＧＢ群において処置されなかった通常に成長している雌鶏を凌いだ。
非常に暑かったので、実験の最後の数週間は、トリには非常にストレスが多く、トリはＩＬＴに対する予防注射を受けた。
【００７１】
【表４】
2007507213.tif 000005
【００７２】
既に１週間後の体重増加は、遊離ＩＡＡが成長不足の雌トリの成長速度に対して有益な効果を有することの明確な徴候を与えた。そのＳＮＡ群は、この試験期間において最高の体重増加を示す。遊離ＩＡＡが成長不足のトリの処置において、それらが不足した成長に追いつくために、適当に用いてもよいと結論できる。
また、遊離ＩＡＡは、４００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日の用量にてその作用様式に対する雌鶏における抵抗性を誘導しないようであると結論できる。
従って、この実施例の結果は、遊離ＩＡＡの使用が通常の生成のために貧弱に成長している雌トリを通常の飼育スケジュールに戻し、遊離ＩＡＡが成育期間の終わりにて非常に強いトリを送達できることを示す。
【００７３】
実施例５：遊離ＩＡＡを与えた豚繁殖呼吸障害症候群ウイルスの生存動物
この実験をPRRSVの病歴を持つベルギーランドレースの子ブタで行なった。子ブタを第４週にて離乳させ、１つの檻当たり１２頭の子ブタを移動させた。異なる３群からのＩＧＦ−１レベルを５週齡にてテストした。
【００７４】
Ｐ群
これらは大きな問題を持ったブタだった。それらは貧弱に見え、低体重、悪い色を有し、それらのいくつかはStaphylococcus感染を有した。これらの子ブタが肥育サイクルの終了まで生き残らないであろうということが飼育場主および獣医の堅い確信であった。血液試料を１２頭のうち５頭の子ブタから無作為に採取した。
【００７５】
【表５】
2007507213.tif 000006
【００７６】
表５の結果は、ＩＧＦ−１の低レベルにより示されるような免疫系の重篤な障害を示す。明確な相関が、貧弱な成長および健康およびＩＧＦ−１濃度間に存在する。約７キロの動物を５ｍｇの遊離ＩＡＡおよび１２０ｍｇのＮａＣｌおよびＷＰＣ ７０（乳漿蛋白濃縮物）を含む４％遊離ＩＡＡ組成物の１２５ｍｇで１０日間処置した。生成物を餌入れ中で供給し、液体飼料中で混合した。子ブタはすべて同じ餌入れから食べた。この投与量は、７１５μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日での処置に対応する。
【００７７】
１０日間の処置後、１２頭のブタのすべてが依然として生存し、それらの状態は劇的に改善した。それらは、すべて良好なピンク色を有し、より多数の堅い毛はなく、耳は通常の位置にあり、もはやStaphylococcus感染に苦しむ子ブタはいなかった。それらは、体重および筋肉成長において非常に増加し、平均の「通常の」同腹仔仲間まで非常に追いついた。良好な健康についての全ての外的シグナルが今や存在した。
１０日後に、血液試料を５頭の無作為に選定した子ブタから得、それらのＩＧＦ−１濃度を測定した。動物のサイズについてのコードを加えた（Ｋ＝小さい;Ｎ＝通常;Ｚ＝重い）。
【００７８】
【表６】
2007507213.tif 000007
【００７９】
子ブタの健康、体重および状態における劇的な改善がそれらのＩＧＦ−１レベルに反映されなかった。平均のＩＧＦ−１レベルは試験の最初の１０日間で上昇しなかった。本発明者らは、その時点にて、全ての付加的なＩＧＦ−１生成が付加的な成長の過程において依然として用いられると考える。さらに、個体の体重およびＩＧＦ−１レベル間に明確な関連性がある。
１０日後に、遊離ＩＡＡ処置を中止し、動物を普通食に保った。さらに３週間後に、血液試料をその群からの７頭の無作為に選定したブタから再度採取した。
【００８０】
【表７】
2007507213.tif 000008
【００８１】
これらの結果は、処置を中止してでさえ、子ブタのＩＧＦ−１生成が今やかなり増加したことを明らかに示す。
遊離ＩＡＡでの処置は、問題の子ブタの状態を劇的に改善すると結論できる。それらの免疫系はStaphylococcus感染を消失させた。この改善は、ＩＧＦ−１の血清中濃度において直ちに（１０日後に）反映されなかったが、処置が中止された３週間後に、ＩＧＦ−１レベルは（ほとんど）通常のレベルに上昇した。
【００８２】
Ｒ群
これらの子ブタは最良に見えた。それらは離乳前に特別な前スターター飼料を受けた。５頭の子ブタを無作為に選定し、それらのＩＧＦ−１レベルを測定した（表８）。
【００８３】
【表８】
2007507213.tif 000009
【００８４】
特別な前スターターは、この群においてＩＧＦ−１レベルを高めるようである。第１日からのように、これらの子ブタにＰ群と同一の投与量の遊離ＩＡＡを補足した通常の商業的ブタスターター飼料を与えた。特別な徴候は存在しなかった。第１０日にて、血液試料を無作為に選択した６頭の子ブタから採取した。
【００８５】
【表９】
2007507213.tif 000010
【００８６】
Ｒ群における平均のＩＧＦ−１濃度は、９.９ｎｍol／ｌから１５.７２まで２週間で上昇した。
【００８７】
Ｔ群
これらは正常に見える子ブタであった。それらは離乳前に通常の子ブタスターター飼料を受けた。
【００８８】
【表１０】
2007507213.tif 000011
【００８９】
これらの子ブタは通常の成長を有するが、Ｒ群より良好ではない。また、これはより低いＩＧＦ−１レベルに反映される。
これらの子ブタは、Ｐ群およびＲ群と同一の用量の遊離ＩＡＡを補足したそれらの元来のスターター飼料で維持した。また、Ｔ群は、いずれの特定の症状なくして通常に成長していた。血液試料を無作為に選択した５頭のブタから採取し、それらのＩＧＦ−１濃度を測定した。
【００９０】
【表１１】
2007507213.tif 000012
【００９１】
この群における平均のＩＧＦ−１濃度は、１.６から９.３６ｎｍolまで１０日間で上昇した。
【００９２】
実施例６：前スターター飼料中の遊離ＩＡＡを用いる成長不足の子ブタ
幼少においてより低い体重を有する動物が生産期間の全てにわたってより低い効率を有することが一般に受け入れられている。早期の成長における差は、大部分につきストレスおよび／または感染圧力に対する個体の感受性における差により説明できる。この実験は、彼らの生活の初期段階にて健康であるが貧弱に成長しているブタの成長速度に対する遊離ＩＡＡの効果を検討するために設計した。
【００９３】
このテストは、１４００頭の雌ブタを用いて大規模な商業的飼育場で行い、貧弱に成長している子ブタを選択した。選択した子ブタは、いずれの特定の疾患に罹患しておらず、PRRSに対する抗体が陰性である、飼育場での子ブタをテストした（雌豚はPRRSに対して予防注射を受けた）。３９頭の子ブタを離乳７日前に２１日齡にて６００頭の群から選択した。これらの子ブタは、離乳までに３つの飼育雌ブタについて３群に無作為に分けた。２群の子ブタは、前スターター飼料中の遊離ＩＡＡを、５００μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日の用量にて分娩期において受けた。離乳後に、遊離ＩＡＡを離乳１４日後まで同一用量でのスターター飼料中でこれらの２群に補足した。その飼料に加えた遊離ＩＡＡの量は推定の体重および飼料摂取に基づいた。第３群は同一飼料を受けたが、遊離ＩＡＡは含まなかった。
その動物を離乳および１４日後にて体重測定し、死亡をモニターした。３群の体重形成を表１２に与える。
【００９４】
【表１２】
2007507213.tif 000013
【００９５】
遊離ＩＡＡで処置した群は、対照群より良好となった;第２群および第３群の双方は、対照群より多くの重量を得た。遊離ＩＡＡは、貧弱に成長している子ブタの効率を明らかに改善した。対照群において、２頭の動物が死亡したのに対し、遊離ＩＡＡで処置した群においては死亡しなった。
貧弱に成長している子ブタ（小型）は、貧弱な効率および予期される高い薬剤費のために生産からしばしば除外される。遊離ＩＡＡでの処置は、これらの動物を救い、それらの薬剤費を低下させて、飼育場の効率および経済性を改善するために寄与し得る。
【００９６】
実施例７;アフリカナマズに対する異なる濃度の遊離ＩＡＡの効果
約３０グラムの３６０匹の多数の各アフリカナマズ（Clarias gariepinus）をこの試験に用いた。到着１週間後に、魚を１２個の同一水槽に無作為に分散させ、各水槽において３０匹の魚を入れた。水温を２５℃に設定し、照明スケジュールは１２時間の明るさの後に１２時間の暗さが続いた。水循環は１水槽当たり毎時２リットルであり;各水槽中の水の体積は生物量に適応させた。飼料に慣れさせるために、魚に試験開始に先立って２週間基本的な飼料を与えた。
４群を形成させ、各々は、３つの水槽に分けた９０匹の魚からなった。１群は処置を受けず、対照とした。他の３群は、表１３に示した異なる３用量で遊離ＩＡＡ処置を受けた。飼料は、表１３に示した濃度で、遊離ＩＡＡを基本的な飼料と混合することにより調製した。それは、その生物量の２.５％に対応させて、毎日、魚に与えた一定量の飼料である。
【００９７】
【表１３】
2007507213.tif 000014
【００９８】
試験期間を５週間続け、毎週、魚を体重測定した。全試験期間にわたる平均的な成長を表１４に与える。
【００９９】
【表１４】
2007507213.tif 000015
【０１００】
その結果は、第４群（２１８μｇ遊離ＩＡＡ／ｋｇ ＬＷ／日の用量）が、同一飼料摂取にて対照に対して明確でかつ有意な７．１％改善を与えたことを示す。すべての魚が正確に同一の飼料量を受けたため、これは、飼料転換率も同一レベルにて改善したことを意味する。これは魚産業につきかなりの増加で、健康な魚の成長の刺激における遊離ＩＡＡの可能性を反映している。より高用量は対照に比較していずれの明確なポジティブまたはネガティブな応答を示さなかった。従って、この種の処置についての至適用量が経験的に決定されるべきであると結論できる。
【０１０１】
実施例８;ＩＡＡの好ましい混合物
４％遊離ＩＡＡ飼料添加物の貯蔵物を調製した。その目的のために、遊離ＩＡＡ（Aldrich）を９４％プロタミル（protamyl）および２％酵母抽出物と混合した。その貯蔵物から、１．２５％を表１５に後記された飼料添加物に加えた。
【０１０２】
【表１５】
2007507213.tif 000016
【０１０３】
動物に投与すべき所望の用量を保証するために、表１５に記載の飼料添加物を適切な量にて動物飼料に添加し得る。その飼料中の濃度は、動物の飼料の毎日摂取量および動物の体重に依存して変更し得ることは明白であろう。１０ｋｇの動物にｋｇ ＬＷ当たり５００μｇ遊離ＩＡＡの毎日摂取量を供給するために、表１５の混合物の１０グラムの量を動物が１日当たり摂取する飼料の量と混合し得る。
【国際調査報告】
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