(57)【要約】  ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）活性を阻害する化合物及び疾患治療におけるその調製方法及び使用方法を開示する。ＰＩ３−Ｋ活性を阻害する化合物及びＰＩ３−Ｋ阻害化合物を使用して、癌細胞成長を阻害するか又は、ＰＩ３−Ｋが白血球の機能において役割を担う免疫疾病及び炎症を治療する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩ；
【化１】
2007500249.tif 000021
［式中、ｎは、０〜２から選択された整数であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、アリール、ヘタリール、アラルキル、ヘタラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアリール、少なくとも１個の置換基で置換されたヘタリール、少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキル及び少なくとも１個の置換基で置換されたヘタラルキルからなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキル、ＣＯ−Ｒ５、ＳＯ２−Ｒ５；ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、ＣＯ−Ｎ−Ｒ４及びＲ５からなる群から選択された構成要素であり；かつ
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたシクロアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアリール及び少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキルからなる群から選択された構成要素である］によって表される一般構造を有する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１−５について、以下の基を使用する場合には；
アルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルであり；
シクロアルキルは、Ｃ３−８シクロアルキルであり；
アルケニルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ２−１８アルケニルであり；
アラルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルで置換された炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であり；かつ
置換基は、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、カルボキシ、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、フェノキシ、ハロフェノキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、メルカプト、フェニルチオ、ピリジルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−３アルカノイルアミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、４〜６員の環式アミノ、Ｃ１−３アルカノイル、ベンゾイル及び５〜１０員の複素環式化合物からなる群から選択された化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１−５について、以下の基を使用する場合には；
アリールは、炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であり；
ヘタリールは、酸素、硫黄及び窒素から選択された１〜６個のヘテロ原子を含有する複素単環式芳香族化合物又は複素二環式芳香族化合物であり；
アラルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルで置換された炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であり；かつ
置換基は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルホニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ及びチオキソからなる群から選択された構成要素である化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、ｎは、１であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、フェニル、ナフチル、ヘタリール、少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキル、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキルフェニル、少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル、ベンジル、及び少なくとも１個の置換基で置換されたベンジルからなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、アラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキル、ＣＯ−Ｒ５又はＳＯ２−Ｒ５；ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、ＣＯ−Ｎ−Ｒ４及びＲ５からなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、Ｃ１−６アルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキル、シクロアルキル、フェニル、及び少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル、アラルキル、ベンジル、及び少なくとも１個の置換基で置換されたベンジルからなる群から選択された構成要素であり；かつ
置換基は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、フェノキシル、ハロフェノキシ、フェニルチオ、ピリジルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、Ｃ１−３アルカノイルアミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、４〜６員の環式アミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−３アルカノイル、ベンゾイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ、チオキソ及び５〜１０員の複素環式化合物からなる群から選択された構成要素である化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、ｎは、１であり、かつＲ１−５について、以下の基を使用する場合には；
アルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５であり；
アルケニルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ２−１８であり；
アリールは、炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であり；
シクロアルキルは、Ｃ３−８環状アルキルであり、
ヘタリールは、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された１〜６個のヘテロ原子を含有する複素単環式芳香族化合物又は複素二環式芳香族化合物であり；
アラルキルは、炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であり、かつ直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルで置換されており；
ヘタラルキルは、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された１〜６個のヘテロ原子を含有する複素単環式芳香族化合物又は複素二環式芳香族化合物であり、かつ直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルで置換されており；かつ
置換基は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、フェノキシル、ハロフェノキシ、フェニルチオ、ピリジルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、Ｃ１−３アルカノイルアミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、４〜６員の環式アミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−３アルカノイル、ベンゾイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ、チオキソ及び５〜１０員の複素環式化合物からなる群から選択された構成要素である化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、ｎは、１であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル、少なくとも１個の置換基で置換された直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル、及び少なくとも１個の置換基で置換されたベンジルからなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ３は、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキルから選択された構成要素であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、少なくとも１個の置換基で置換された直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、シクロアルキル、フェニル、少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル、ベンジル、及び少なくとも１個の置換基で置換されたベンジルからなる群から選択された構成要素であり；かつ
置換基は、メチル、ハロゲン、ハロフェニルオキシ、メトキシ、エチルオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、トリフルオロメチル、ｔ−ブチル及びニトロからなる群から選択された構成要素である化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、ｎは、１であり；
Ｒ１は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル及びフェニルからなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ２は、フェニル、Ｃ１−６アルキルフェニル、Ｃ１−６ジアルキルフェニル、Ｃ１−６アルコキシフェニル、ハロフェニル、ジハロフェニル及びニトロフェニルからなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ３は、水素及び直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキルから選択された構成要素であり；
Ｒ４は、ハロゲン、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロフェノキシ、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ及びハロ−Ｃ１−４アルキルからなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであり；かつ
Ｒ５は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキルである化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物であって、ｎは、１であり；
Ｒ１は、フェニル又はｔ−ブチルであり；
Ｒ２は、メチルフェニル、ジメチルフェニル、ｔ−ブチル、メトキシフェニル、クロロフェニル、ジクロロフェニル、フルオロフェニル及びニトロフェニルからなる群から選択された構成要素であり；
Ｒ３は、水素であり；
Ｒ４は、塩素、フッ素、フェノキシ、ベンジルオキシ、クロロフェノキシ、メトキシ、エトキシ及びトリフルオロメチルからなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであり；かつ
Ｒ５は、メチルである化合物。
【請求項９】
前記化合物が、インビトロでのＰＩ３−Ｋ活性の阻害において１０μＭより小さいＩＣ５０を有するか、又は細胞でのＰＩ３−Ｋ活性の阻害において２０μＭより小さいＩＣ５０を有する、請求項１から８までの何れか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１から８までの何れか１項に記載の化合物又はその塩及び製剤学的に許容される担体を有する医薬組成物。
【請求項１１】
評価化合物のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）ポリペプチドの阻害剤としての効力のスクリーニング及び特性決定を行う方法において、前記方法は、（ａ）ＰＩ３−Ｋポリペプチド活性を請求項１から８までの何れか１項に記載の評価化合物の存在下で計測する段階；（ｂ）前記評価化合物の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチド活性と、当量の基準化合物としての既知のＰＩ３−Ｋ阻害剤の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチド活性とを比較する段階を含み、その際、前記評価化合物の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチド活性が前記基準化合物の存在下での活性と比べて低ければ、前記評価化合物が前記基準化合物と比べて効力が高い阻害剤であることを示し、かつ前記評価化合物の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチド活性が前記基準化合物の存在下での活性と比べて高ければ、前記評価化合物が前記基準化合物と比べて効力の低い阻害剤であることを示す方法。
【請求項１２】
ＰＩ３−Ｋが役割を担う疾患を治療する方法において、前記疾患の患者に、請求項１から８までの何れか１項に記載の化合物又はその塩の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
疾患が、癌又は免疫及び炎症の疾病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
疾患が、白血球のＰＩ３−Ｋ機能の破綻である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
癌細胞の成長を阻害する方法において、前記癌細胞と、有効量の請求項１から８までの何れか１項に記載の化合物又はその塩とを接触させることを含む方法。
【請求項１６】
前記癌細胞は、ＰＩ３−Ｋ媒介性のシグナリングにＰＴＥＮの変異、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の増幅又はＰＩ３−キナーゼの変異を介して変化がみられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌及びＰＩ３−Ｋ活性に変化がみられる他の癌を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞内のＰＩ３−Ｋ媒介性のシグナリングに作用させる方法において、前記細胞と、有効量の請求項１から８までの何れか１項に記載の化合物又はその塩とを接触させることを含む方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ＰＩ３−Ｋ媒介性のＡｋｔのリン酸化に作用する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、概してホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）酵素、特にＰＩ３−Ｋの活性の阻害剤並びにかかる物質の使用方法に関する。
【０００２】
先行技術
全ての細胞の連絡の挙動は、外部シグナル、例えばホルモン、神経伝達物質及び成長因子を細胞内二次メッセンジャーに変換するシグナリング系によって制御されている。ホスホイノシチドポリリン酸（ＰＩＰｎ）は、細胞のシグナリングにおいて鍵となる脂質二次メッセンジャーである（マルチン著、細胞発生生物学年次報告書１４号：２３１〜２６１４頁（１９９８年）（Martin, Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 14:231-2614. (1998)）。その活性はそのリン酸化状態によって決められるので、その脂質を修飾する酵素は、シグナリング事象の正常な実施にとって中心的存在である（レスリーら著、化学紀要１０１号：２３６５〜２３８０頁（２００１年（Leslie, et al., Chem Rev, 101:2365-80. (2001)））。そのプロセスの破綻は、多くの疾病状態、例えば癌、糖尿病、炎症及び心臓血管性疾患に共通するものである。
【０００３】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）によるホスホイノシチドポリホスフェートＰＩ（３，４，５）Ｐ３又はＰＩＰ３の生成は、細胞の増殖、分化、アポトーシス及び移動を制御する経路において重要である。ＰＩＰ３レベル及びその脂質生成物レベルの正常な調節に作用する改変は、種々の癌の型と関連している（フィリップスら著、癌８３号：４１〜４７頁（１９９８年）（Phillips et al., Cancer 83:41-47. (1998)）、シャイエステら著、ネイチャージェネティクス２１号：９９〜１０２頁（１９９９年）（Shayesteh, et al., Nat Genet, 21:99-102. (1999)）、マーら著、癌遺伝子１９号：２７３９〜２７４４頁（２０００年）（Ma, er al., Oncogene, 19: 2739-44. (2000)））。ＰＩ３−Ｋシグナリングの調節に作用する変異は、異常な増殖及び腫瘍形成をもたらす（リーら著、サイエンス２７５号：１９４３〜１９４７頁（１９９７年）（Li, et al., Science, 275:1943-7. (1997)）、テンら著、癌研究５７号：５２２１〜５２２５頁（１９９７年）（Teng, et al., Cancer Res, 57:5221-5. (1997)）、シャイエステら著、遺伝科学２１号：９９〜１０２頁（１９９９年）（Shayesteh, et al., Nat Genet, 21:99-102. (1999)）、マーら著、癌遺伝子１９号：２７３９〜２７４４頁（２０００年）（Ma, er al., Oncogene, 19: 2739-44. (2000)））。
【０００４】
ＰＩ３−Ｋは、成長因子の刺激に応じて受容体型チロシンキナーゼによって活性化されると、ＰＩＰ３の形成を触媒する。ＰＩ３−Ｋは、細胞のＰＩＰ３レベルを増加させることによって、シグナル伝達経路において作用する所定の分子複合体を形成を誘導する。とりわけ、ＰＩ３−Ｋ活性は、その下流の標的、ＰＫＢ／Ａｋｔの活性化を介してアポトーシスを抑制し、そして細胞の生存を促進する（フランケら著、セル８１号：７２７〜７３６頁（１９９５年）（Franke, et, al., Cell, 81:727-736. (1995)）、ダッタら著、生物化学紀要２７１号：３０８３５〜３０８３９頁（１９９６年）（Datta, et al., J Biol Chem, 271:30835-9. (1996)））。脂質ホスファターゼＰＴＥＮ及びＳＨＩＰは両方とも、細胞内のＰＩＰ３レベルを、ＰＩ（４，５）Ｐ２、又はＰＩ（３，４）Ｐ２の何れかに変換することによって低下させる作用を有する２種の酵素である。
【０００５】
現在、ＰＩ３−キナーゼ酵素ファミリーは、それらの基質特異性に基づいて３つのクラスに分けられている。クラスＩのＰＩ３−Ｋは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸及びホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）をリン酸化して、それぞれホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸及びホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸を生成できる。クラスＩＩのＰＩ３−Ｋは、ＰＩ及びホスファチジルイノシトール−４−リン酸をリン酸化するのに対して、クラスＩＩＩのＰＩ３−ＫはＰＩをリン酸化できるにすぎない。ヒトにおいては、８種の別々のＰＩ３−Ｋアイソフォームが特性決定されている。
【０００６】
ＰＩ３−キナーゼの初期の精製及び分子クローニングによって、該キナーゼはｐ８５及びｐ１１０サブユニットから構成されるヘテロ二量体であることが明らかになった（オーツら著、セル６５号：９１〜１０４頁（１９９１年）Otsu et al., Cell, 65:91-104. (1991)；ハイルスら著、セル７０号：４１９〜４２９頁（Hiles et al., Cell, 70:419-29. (1992)））。それ以降、４種の別々のクラスＩのＰＩ３−Ｋが同定されており、それらはＰＩ３−Ｋアルファ、ベータ、デルタ及びガンマと称されており、それぞれ別々の１１０ｋＤａの触媒サブユニット及び調節サブユニットから構成されている。特に、その触媒サブユニットのうちの３種、すなわちｐ１１０アルファ、ｐ１１０ベータ及びｐ１１０デルタは、それぞれ同一の調節サブユニットｐ８５と相互作用する一方で、ｐ１１０ガンマは、別の調節サブユニットｐ１０１と相互作用する。ＰＩ３−キナーゼアルファ、ベータ及びデルタの亜型のそれぞれにおいては、このｐ８５サブユニットが、標的タンパク質中においてそのＳＨ２ドメインとリン酸化されたチロシン残基（適切な配列のコンテクスト内に存在する）との相互作用によってＰＩ３−キナーゼを形質膜に局在させる。ｐ８５の２種のアイソフォーム、ユビキタスに発現されるｐ８５アルファと、主として脳及びリンパ組織中に見出されるｐ８５ベータとが同定されている。ｐ８５サブユニットと、ＰＩ３−キナーゼｐ１１０アルファ、ベータ又はデルタの触媒サブユニットとの会合は、それらの酵素の触媒活性及び安定性にとって明らかに必要とされるものである。更に、Ｒａｓタンパク質の結合も、ＰＩ３−キナーゼ活性をアップレギュレートする。細胞のＰＩ３−キナーゼ、一般的に、特にＰＩ３−Ｋアルファ及びＰＩ３−Ｋガンマの機能についての情報がここ最近で多数蓄積しているが、個々のアイソフォームが担う役割は、依然として明確に規定されるべきである。ｐ１１０アイソフォームに関する詳細は、米国特許番号第５８５８７５３号；同第５８２２９１０号；及び同第５９８５５８９号に見い出すこともできる。
【０００７】
酵素ファミリーの個々のメンバーに対する特異的な阻害剤は、それぞれの酵素の機能を解明する非常に貴重な手段を提供する。ＰＩ３−Ｋ阻害剤の実験的使用は、通常の機能時及び疾病時のＰＩ３−Ｋ活性の役割についての現在の理解をもたらしている。この理解にあたって使用される主要な薬理学的手段は、ウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）（ポウィスら著、癌研究５４号：２４１９〜２４２３（１９９）（Powis, et al., Cancer Res, 54:2419-23. (199)）、及びバイオフラボノイド化合物、例えばクエルセチン（マターら著、生物化学・生物物理研究論文１８６号：６２４〜６３１頁（１９９２年）（Matter et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:624-631. (1992)））及びＬＹ２９４００２（ヴラホスら著、生物化学紀要、２６９号：５２４１〜５２４８頁（１９９４年）（Vlahos, et al., J Biol Chem, 269:5241-8. (1994)）である。ＰＩ３−Ｋを阻害するのに必要なウォルトマンニン濃度は１〜１００ｎＭに及び、かつ阻害は触媒部位の共有結合修飾を介して生ずる（ワイマンら著、分子細胞生物学１６号：１７２２〜１７３３頁（１９９６年）（Wymann et al., Mol. Cell. Biol. 16:1722-1733. (1996)））。バイオフラボノイドのクエルセチンは、ＰＩ３−Ｋを３．８μＭというＩＣ５０で有効に阻害するが、選択性が欠けている。それというのも、それはまたＰＩ４−キナーゼ及び幾つかのプロテインキナーゼへの阻害活性を示すからである。ＬＹ２９４００２はクエルセチンをモデルとして用いて作製された合成化合物であり、ＰＩ３−Ｋを１００μＭというＩＣ５０で阻害する（ブラホスら著、生物化学紀要２６９号：５２４１〜５２４８頁（Vlahos, et al., J Biol Chem, 296:5241-8. (1994)））。クエルセチン及びＬＹ２９４００２は両方ともＰＩ３−ＫのＡＴＰ結合部位の競合阻害剤であるが、ＬＹ２９４００２のみがＰＩ３−Ｋ阻害についての特異性を示し、かつ他の型のキナーゼには作用しない。ウォルトマンニン及びＬＹ２９４００２は両方ともＰＩ３−Ｋの生物学的役割を特性決定するために集中的に使用されているが、何れも個々のＰＩ３−Ｋアイソフォームについての選択性を示さない。従って、これらの化合物を個々のクラスＩのＰＩ３−キナーゼの役割の研究に活用することは制限される。
【０００８】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、細胞増殖疾患に有用な新型の薬物療法、特に抗癌剤であると見込まれている。ＰＩ３−Ｋ阻害剤として、ウォルトマンニン（Ｈ．ヤノら著、生物化学紀要２６３号、１６１７８頁（１９９３年）（H.Yano et al., J. Miol. Chem., 263, 16178. (1993)）及び、以下に式によって示されるＬＹ２９４００２（Ｊ．ヴラホスら著、生物化学紀要２６９号、５２４１頁（１９９４年）（J. Vlahos et al., J.Biol. Chem., 269, 5241. (1994)））が公知である。しかしながら、より強力な癌細胞成長の阻害活性を有するＰＩ３−Ｋ阻害剤の創作が望まれている。
【０００９】
多くの発癌のシグナリング経路はＰＩ３−Ｋによって媒介されるので、ＰＩ３−Ｋ活性を標的とする阻害剤は癌治療に応用することができる。比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用する研究によって、ＤＮＡ配列のコピー数が頻発して異常な、卵巣癌の発生又は進行に関与する遺伝子をコードしうる幾つかの領域が明らかになった。卵巣癌及び他の癌の約４０％においてコピー数が増加することが見い出されたある領域は、ＰＩ３−Ｋアルファの触媒サブユニットのｐ１１０アルファをコードするＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含有する。このＰＩＫ３ＣＡのコピー数とＰＩ３−キナーゼ活性との関連によって、ＰＩＫ３ＣＡは癌遺伝子の候補になる。それというのも、広範囲の癌に関連する機能がＰＩ３−キナーゼ媒介性のシグナリングと関連しているからである。ＰＩＫ３ＣＡは、卵巣癌においてしばしばコピー数が増加され、かつこのコピー数の増加はＰＩＫ３ＣＡの転写、ｐ１１０アルファタンパク質発現及びＰＩ３−キナーゼ活性の増加に関連する（シャイエステら著、ネイチャージェネティクス２１号：９９〜１０２頁（１９９９年）（Shayesteh, et al., Nature Genet, 21:99-102. (1999)））。更に、ＰＩ３−Ｋ活性の増加及びＡｋｔの活性化を示す卵巣癌細胞株をＰＩ３−キナーゼ阻害剤で処理すると、増殖が低下し、かつアポトーシスが増加した（シャイエステら著、ネイチャージェネティクス２１号：９９〜１０２頁（１９９９年）（Shayesteh, et al., Nature Genet, 21:99-102. (1999)）、ユアンら著、癌遺伝子１９号：２３２４〜２３３０頁（２０００年）（Yuan et al., Oncogene 19:2324-2330. (2000)））。このように、ＰＩ３−Ｋアルファは、卵巣癌において重要な役割を担っている。増幅されたＰＩＫ３ＣＡを有する頸部癌細胞株においては、遺伝子生成物の発現が増加し、かつ高いＰＩ３−キナーゼ活性と関連していた（マーら著、癌遺伝子１９号：２７３９〜２７４４頁（２０００年）（Ma et al., Oncogene 19:2739-2744, (2000)））。このように、頸部癌におけるＰＩ３−キナーゼアルファの発現の増加は、細胞増殖を促進し、かつアポトーシスを減らしうる。更に、ＰＩＰ３を分解する脂質ホスファター及び腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ、３′ホスファターゼの変異は、癌に関連する最も一般的な変異の１種であり、特に神経膠芽細胞腫、前立腺癌、子宮癌及び乳癌と関連している（リーら著、サイエンス２７５号：１９４３〜１９４７頁（１９９７年）（Li et al., Science 275:1943-1947. (1997)）、テンら著、癌研究５７号：５２２１〜５２２５頁（１９９７年）（Teng et al., Cancer Res. 57: 5221-5225. (1997)）、アリら著、国立癌研究所紀要９１号：１９２２〜１９３２（１９９９年）（Ali et al., J. National Cancer Institute, 91: 1922-1932. (1999)）、シンプソン、パーソン著、実験細胞研究２６４号：２９〜４１頁（２００２年）（Simpson and Parsons, Exp. Cell Res. 264:29-41. (2002)））。ＰＩ３−Ｋ活性は、その下流の標的ＰＫＢ／Ａｋｔの活性化を介してアポトーシスを抑制し、かつ細胞の生存を長期にわたって促進する（フランケら著、セル８１号：７２７〜７３６頁（１９９５年）（Franke, et, al., Cell, 81:727-736. (1995)）、ダテートら著、生物化学紀要２７１号：３０８３５〜３０８３９頁（１９９６年）（Dattaet, et al., J Biol Chem, 271:30835-30839. (1996)））。Ａｋｔの活性化及び増幅は、多くの癌に見��れる（テスタ、ベリコーサ著、米国科学アカデミー紀要９８号：１０９８３〜１０９８５頁（２００２年）（Testa and Bellicosa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10983-10985. (2002)））。
【００１０】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤での処理は、幾つかの癌細胞株の増殖を阻止し、かつ卵巣癌腫に加え腫瘍異種移植モデルに有効な処理であることが示されている。Ａｋｔは、多数の小細胞癌ではない肺癌細胞株において活性化され、そしてＰＩ３−Ｋ阻害剤での処理は、それらの細胞の増殖停止をもたらす（ブログナルドら著、癌研究６０号：６３５３〜６３５８頁（２０００年）（Brognard et al., Cancer Res. 60:6353-6358. (2000)）、リーら著、生物化学紀要、電子出版（２００３年）（Lee et al., L. Biol. Chem. electronic publication, (2003)））。このＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ経路はまた、多数のヒト膵臓癌細胞株中で構成的に活性化され、そしてＰＩ３−Ｋ阻害剤での処理はそれらの細胞株のアポトーシスを誘導する。腫瘍の成長及び転移の減少は、膵臓癌の異種移植モデルにおけるＰＩ３−Ｋ阻害剤での処理についても観察された（ペルジーニら著、外科研究紀要９０号：３９〜４４（２０００年）（Perugini et al., J. Surg. Res. 90:39-44. (2000)）、ボンダーら著、分子癌療法１号：９８９〜９９７頁（２００２年）（Bondar et al., Mol. Cancer Ther. 1:989-997. (2002)））。ＬＹ２０４００２での処理は、ＰＴＥＮ欠損ヒト悪性神経膠腫細胞の成長停止及びアポトーシスを誘導した（シングウら著、神経外科紀要９８号：１５４〜１６１頁（２００２年）（Shingu et al., J. Neurosurg. 98:154-161. (2003)））。ＬＹ２９４００２は、ヒト結腸癌細胞株の成長停止及びマウス中の結腸癌腫の異種移植片の腫瘍成長の抑制をもたらす（センバら著、臨床癌研究８号：１９５７〜１９６３頁（２００２年）（Semba et al., Clin Cancer Res.8: 1957-1963. (2002)））。ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、インビトロでの足場非依存性の成長及びインビボでの肝臓癌細胞の転移を阻害する（ナカニシら著、癌研究６２号：２９７１〜２９７５頁（２００２年）（Nakanishi et al., Clin Cancer Res. 62: 2971-2975. (2002)））。バーキットリンパ腫細胞をＬＹ２９４００２で処理すると、アポトーシスが誘導される（ブレナンら著、癌遺伝子２１号：１２６３〜１２７１頁（２００２年）（Brennan et al., Oncogene 21: 1263-1271. (2002)））。ＬＹ２９４００２はまた、多種の薬剤に耐性を有する細胞のアポトーシスを誘導することが示されている（ニコルソンら著、癌著述集１９０号：３１〜３６頁（２００３年）（Nicholson et al., Cancer Lett. 190: 31-36. (2003)））。このように、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋ又はＰＫＢ／Ａｋｔレベルの活性化又は増加を示す多くの腫瘍並びにＰＴＥＮを欠損する腫瘍に好適な療法剤でありうる。
【００１１】
幾つかの研究は、ＰＩ３−Ｋ経路を標的とする作用物質が、種々の癌の型における標準的な化学療法剤の作用を高めうることを示している。このように、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、所定の癌についての新規アジュバント療法としての価値を有しうる。ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＡＫＴの構成的なリン酸化及び活性化を示す膵臓癌腫細胞のアポトーシスを誘導し、かつ最適以下の用量は、最適以下の用量のゲムシタビンと組み合わせた際に付加的な腫瘍成長の阻害をもたらす（Ｎｇら著、癌研究６０号：５４５１〜５４５５ＰＩ３−Ｋ（２０００年）（Ng, et al., Cancer Res, 60:5451-5. (2000)）、ボンダーら著、分子癌療法１号：９８９〜９９７ＰＩ３−Ｋ（２００２年）（Bondar et al., Mol. Cancer Ther. 1:989-997. (2002)））。ＰＩ３−Ｋ阻害はまた、膵臓癌腫細胞の非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）スリンダクに対する応答性を増加させる（イプ−シュナイダーら著、胃腸外科紀要７号：３５４〜３６３頁（２００３年）（Yip-Schneider, et al., J Gastrointest Surg, 7:354-63. (2003)））。マウスの膵臓癌の異種移植モデルにおいては、ウォルトマンニンとゲミシタビンとの組合せはまた、それぞれの作用物質を単独で用いる処理に対して腫瘍のアポトーシス誘導の効能を増加させる（Ｎｇら著、臨床癌研究７号：３２６９〜３２７５頁（２００１年）（Ng, et al., Clin Cancer Res, 7:3269-75. (2001)））。無胸腺マウスの卵巣癌の異種移植モデルにおいては、ＬＹ２９４００２とパクリタクセルとの組合せ処理は、パクリタクセルによって誘導される腫瘍細胞のアポトーシスの効能の増加をもたらし、かつＬＹ２９４００２のレベルを減らして使用することを可能にして、その際、皮膚科学的毒性をほとんどもたらさない（フーら著、癌研究６２号：１０８７〜１０９２頁（２００２年）（Hu, et al., Cancer Res, 62:1087-92. (2002)））。ＨＬ６０ヒト白血病細胞は、ＰＩ３−Ｋ阻害剤で処理すると、細胞毒性薬剤での処理に対する感作を示し、Ｆａｓによって誘導されるアポトーシスを示し、このことは、治療薬剤耐性の急性骨髄性白血病におけるＰＩ３−Ｋ阻害の役割を示唆している（オゴールマンら著、白血病１４号：６０２〜６１１頁（２０００年）（O'Gorman, et al., Leukemia, 14:602-11. (2000)）、オゴールマンら著、白血病研究２５号：８０１〜８１１頁（２００１年）（O'Gorman, et al., Leuk Res, 25:801-11. (2001)））。ＰＩ３−Ｋ阻害は、進行性結腸癌細胞株において、酪酸ナトリウム、ゲムシタビン及び５−フルオロウラシルのアポトーシス作用を高める（ワンら著、臨床癌研究８号：１９４０〜１９４７頁（２００２年）（Wang, et al., Clin Cancer Res, 8:1940-7. (2002)））。ＬＹ２９４００２は、ＰＴＥＮ変異又はｅｒｂＢ２過剰発現を示す乳癌細胞株において、ドキソルビシン、トラスツズマブ、パクリタクセル、タモキシフェン及びエトポシドによって誘導されるアポトーシスを増加する（クラークら著、分子癌療法１号：７０７〜７１７頁（２００２年）（Clark, et al., Mol Cancer Ther, 1:707-17. (2002)））。ＰＩ３−Ｋ阻害は、小細胞癌の肺癌細胞におけるエトポシドのアポトーシス誘導作用を増加する（クリスタルら著、分子癌療法１号：９１３〜９２２（２００２年）（Krystal, et al., Mol Cancer Ther, 1:913-22. (2002)））。
【００１２】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤はまた、癌治療用の化学療法剤の作用を高めるのに加え、腫瘍の放射線治療に対する反応を高めうる。ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、構成的に活性なＨ−ｒaｓについてトランスフェクションされた乳癌細胞の放射線耐性を元に戻し（リアンら著、分子癌療法２号：３５３〜３６０（２００３年）（Liang. et al., Mol Cancer Ther, 2:353-60. (2003)））、かつＰＩ３−Ｋ阻害剤は、放射線によって誘導される腫瘍血管内皮細胞のアポトーシス及び細胞毒性を高める（エドワーズら著、癌研究６２号：４６７１〜４６７７頁（２００２年）（Edwards, et al., Cancer Res, 62:4671-7. (2002)））。このように、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、腫瘍細胞及び腫瘍血管の放射線療法に対する反応を両方とも高めるのに使用できるものであった。
【００１３】
米国特許第６４０３５８８号は、優れたＰＩ３−Ｋ阻害活性及び細胞成長阻害活性を有するイミダゾピリジン誘導体を開示している。米国特許第５５１８２７７号は、ＰＩ３−Ｋデルタ活性を阻害する化合物を開示しており、それにはＰＩ３−Ｋデルタ活性を選択的に阻害する化合物が含まれる。しかしながら、これら全種の化合物は、本発明の化合物とは異なる構造を有する。
【００１４】
発明の概要
ＰＩ３−Ｋポリペプチド阻害剤を開発することが有利であることが見出されている。特に、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋアイソザイムの役割を調査すること、及びそのアイソザイムの活性を調節する医薬品の開発することにとって望ましい。
【００１５】
本発明の一実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩ；
【００１６】
【化１】
2007500249.tif 000002
［式中、ｎは、０〜２から選択された整数であってよい］によって表される一般構造を有する、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物を提供することである。
【００１７】
一実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、アリール、ヘタリール、アラルキル、ヘタラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアリール、少なくとも１個の置換基で置換されたヘタリール、少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキル及び少なくとも１個の置換基で置換されたヘタラルキルからなる群から選択された構成成分であってよい。別の実施態様においては、Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキル、ＣＯ−Ｒ５、ＳＯ２−Ｒ５；ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、ＣＯ−Ｎ−Ｒ４及びＲ５からなる群から選択された構成成分であってよい。付加的な実施態様においては、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたシクロアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアリール及び少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキルからなる群から選択された構成成分であってよい。
【００１８】
本発明の一実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される一般構造を有し、その式中、前記のアルキル、シクロアルキル又はアラルキルは、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ２−１８アルケニルであるか若しくはアラルキル基が、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、カルボキシ、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、フェノキシ、ハロフェノキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、メルカプト、フェニルチオ、ピリジルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−３アルカノイルアミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、４〜６員の環式アミノ、Ｃ１−３アルカノイル、ベンゾイル及び５〜１０員の複素環式化合物の基からなる群から選択された１〜５個の置換基で置換された、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物である。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される一般構造を有し、その式中、前記アルキルは、１〜１５個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素鎖であり、前記アリールは、６〜１４個の炭素原子を有する芳香族環状炭化水素基であり、前記ヘタリールは、酸素、硫黄及び窒素から選択された１〜４個のヘテロ原子を含有する５又は６員の複素単環式化合物の基であるか又は、酸素、硫黄及び窒素から選択された１〜６個のヘテロ原子を含有する縮合複素二環化合物の基であり、前記置換されたアリールは、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルホニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ及びチオキソからなる群から選択された１〜４個の置換基で置換されたＣ６−１４アリール基であり：かつ前記置換されたヘタリールは、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルホニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ及びチオキソ基からなる群から選択された１〜４個の置換基で置換されたヘタリールである、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物である。
【００２０】
本発明の別の実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される一般構造を有し、その式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ナフチル、ヘタリール置換されたＣ１−６アルキル及びフェニル置換されたＣ１−６アルキルからなる群から選択された構成要素であり；Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、アラルキル置換されたＣ１−６アルキル、アラルキル基、ＣＯ−Ｒ５又はＳＯ２−Ｒ５；ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、ＣＯ−Ｎ−Ｒ４及びＲ５からなる群から選択された構成要素であり；かつＲ４及びＲ５は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、シクロアルキル及びアラルキル基からなる群から選択された構成要素であってよい、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物である。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される一般構造を有し、その式中、ｎは、１であり；Ｒ１は、直鎖状Ｃ１−６アルキル、分枝鎖状Ｃ１−６アルキル及びフェニル基からなる群から選択された構成要素であり；Ｒ２は、フェニル、Ｃ１−６アルキルフェニル、Ｃ１−６ジアルキルフェニル、Ｃ１−６アルコキシフェニル、ハロフェニル、ジハロフェニル及びニトロフェニル基からなる群から選択された構成要素であり；Ｒ３は、水素、直鎖状Ｃ１−６アルキル及び分枝鎖状Ｃ１−６アルキル基から選択された構成要素であり；Ｒ４は、アリールオキシ、アルキルアリールオキシ、ハロアリールオキシ、直鎖状Ｃ１−６アルキル、分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６、ハロアリール及びハロ−Ｃ１−４アルキルアリール基からなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであり；かつＲ５は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル基である、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物である。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される一般構造を有し、その式中、Ｒ１は、フェニル又はｔ−ブチル基であり；Ｒ２は、メチルフェニル、ジメチルフェニル、ｔ−ブチル、メトキシフェニル、クロロフェニル、ジクロロフェニル、フルオロフェニル及びニトロフェニル基からなる群から選択された構成要素であり；Ｒ３は、水素であり；Ｒ４は、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロフェノキシ、直鎖状Ｃ１−６アルキル、分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６、ハロフェニル及びハロ−Ｃ１−４アルキルフェニル基からなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであり；かつＲ５は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−４アルキル基である、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物である。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施態様は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される一般構造を有し、その式中、Ｒ１は、フェニル又はｔ−ブチルであり；Ｒ２は、メチルフェニル、ジメチルフェニル、ｔ−ブチル、メトキシフェニル、クロロフェニル、ジクロロフェニル、フルオロフェニル及びニトロフェニル基からなる群から選択された構成要素であり；Ｒ３は、水素であり；Ｒ４は、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロフェノキシ、直鎖状Ｃ１−６アルキル、分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６、ハロフェニル及びハロ−Ｃ１−４アルキルフェニル基からなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであり；かつＲ５は、メチル基である、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）阻害剤として有用な化合物である。
【００２４】
本発明は更に、新規医薬品組成物、特に本発明の化合物及び製剤学的に許容される担体を有するＰＩ３−Ｋ阻害剤及び抗腫瘍剤に関する。
【００２５】
本発明の更なる実施態様は、ＰＩ３−Ｋによって作用を受ける疾患（特に癌）を治療する方法において、本発明の化合物の有効量をヒト又は動物に投与する方法に関する。
【００２６】
本発明の付加的な特徴及び利点は、本発明の特徴を一緒に例示する付属の図と関連して以下に記載する詳細な説明から明らかである。
【００２７】
詳細な説明
目下のところ、図で説明する実施例を参照し、かつその同一物を説明するために、特定の用語を本明細書中で使用する。それにもかかわらず、それによって本発明の範囲は限定されないという意図が理解されるはずである。この開示を所有する当業者に想起される本明細書中で説明する本発明の特徴の変更又は更なる変形、本明細書中で説明する本発明の原理の付加的な適用が、本発明の範囲内で考慮されるべきである。
【００２８】
本発明の実施態様は、ＰＩ３−Ｋ阻害剤及び抗腫瘍剤として有用な新規化合物に関する。本発明の化合物は、以下の一般式：
【００２９】
【化２】
2007500249.tif 000003
［式中、ｎは、０〜２から選択された整数であってよい］の１種によって表される。
【００３０】
一実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、アリール、ヘタリール、アラルキル、ヘタラルキル、少なくとも１個の置換基で置換された置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアリール、少なくとも１個の置換基で置換されたヘタリール、少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキル及び少なくとも１個の置換基で置換されたヘタラルキルからなる群から選択された構成要素であってよい。別の実施態様においては、Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキル、ＣＯ−Ｒ５、ＳＯ２−Ｒ５；ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、ＣＯ−Ｎ−Ｒ４及びＲ５からなる群から選択された構成要素であってよい。付加的な実施態様においては、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたシクロアルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたアリール及び少なくとも１個の置換基で置換されたアラルキルからなる群から選択された構成要素であってよい。
【００３１】
本発明によれば、式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩによる化合物は、それを使用する場合に、種々の構成成分で置換されていてよい。従って、アルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルであってよい。一実施態様においては、シクロアルキルは、Ｃ３−８シクロアルキルであってよい。別の実施態様においては、アルケニルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ２−１８アルケニルであってよい。更に別の実施態様においては、アラルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルで置換された炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であってよい。更に別の実施態様においては、任意の置換基は、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、カルボキシ、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、フェノキシ、ハロフェノキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、メルカプト、フェニルチオ、ピリジルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−３アルカノイルアミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、４〜６員の環式アミノ、Ｃ１−３アルカノイル、ベンゾイル及び５〜１０員の複素環式化合物の基からなる群から選択されてよい。
【００３２】
別の実施態様においては、式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩのＲ１−５は、それを使用する場合に、それぞれ無関係に、種々の構成成分から選択されていてよく、その際、その構成成分は場合により少なくとも１個の置換基で置換されていてよい。従って、アリールは、炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物の基であってよい。一実施態様においては、ヘタリールは、酸素、硫黄及び窒素から選択された１〜４個のヘテロ原子又は１〜６個のヘテロ原子を含有する複素単環式芳香族化合物又は複素二環式芳香族化合物であってよい。別の実施態様においては、アラルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキル基で置換された炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物であってよい。付加的な実施態様においては、置換基は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルホニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ及びチオキソからなる群から選択されてよい。
【００３３】
一実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、フェニル、ナフタリル、ヘタリール、少なくとも１個の置換基で置換された置換されたＣ１−６アルキル、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキルフェニル、少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル及びベンジルからなる群から選択された構成要素であってよい。一実施態様においては、Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、アラルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキル、ＣＯ−Ｒ５又はＳＯ２−Ｒ５；ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、ＣＯ−Ｎ−Ｒ４及びＲ５からなる群から選択された構成要素であってよい。別の実施態様においては、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、Ｃ１−６アルキル、少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキル、シクロアルキル、フェニル、少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル、ベンジル及びアラルキル基からなる群から選択された構成要素であってよい。
【００３４】
付加的な実施態様においては、結合構成成分は、非置換か又は少なくとも１個の置換基で置換されていてよい。一実施態様においては、アルキルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５であってよい。別の実施態様においては、アルケニルは、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ２−１８アルケニルであってよい。付加的な実施態様においては、アリールは、炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物の基であってよい。更に別の実施態様においては、シクロアルキルは、Ｃ３−８環状アルキルであってよい。更に別の実施態様においては、ヘタリールは、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された１〜６個のヘテロ原子を含有する複素単環式芳香族化合物又は複素二環式芳香族化合物であってよい。更に別の実施態様においては、前記アラルキルは、炭素単環式芳香族化合物又は炭素二環式芳香族化合物の基であってよく、かつ直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５アルキルで置換されていてよい。更なる実施態様においては、前記ヘタラルキルは、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された１〜４個のヘテロ原子又は１〜６個のヘテロ原子を含有する複素単環式芳香族化合物又は複素二環式芳香族化合物であってよく、かつ直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−１５で置換されていてよい。更に、任意の置換基は、無関係に、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、フェノキシル、ハロフェノキシ、フェニルチオ、ピリジルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、Ｃ１−３アルカノイルアミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、４〜６員の環式アミノ、ホルミル、メルカプト、Ｃ１−４アルキル−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、スルホ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−３アルカノイル、ベンゾイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、オキソ、チオキソ、５〜１０員の複素環式化合物及びそれらの組合せ物からなる群から選択された構成要素であってよい。
【００３５】
更に特定の実施態様においては、構成成分は、非置換か又は少なくとも１個の置換基で置換されているかの何れであってもよい。それに応じて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ無関係に、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、フェニル、ナフチル、少なくとも１個の置換基で置換された直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル及び少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルからなる群から選択された構成要素であってよい。一実施態様においては、Ｒ３は、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アラルキル及び少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アルキルから選択された構成要素であってよい。別の実施態様においては、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ無関係に、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、少なくとも１個の置換基で置換された直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、シクロアルキル、フェニル、少なくとも１個の置換基で置換されたフェニル、Ｃ１−６アラルキル及び少なくとも１個の置換基で置換されたＣ１−６アラルキルからなる群から選択された構成要素であってよい。更に別の実施態様においては、任意の置換基は、メチル、ハロゲン、ハロフェニルオキシ、メトキシ、エチルオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、トリフルオロメチル、ｔ−ブチル及びニトロからなる群から選択された構成要素であってよい。
【００３６】
一実施態様においては、Ｒ１は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル及びフェニルからなる群から選択されていてよい。別の実施態様においては、Ｒ２は、フェニル、Ｃ１−６アルキルフェニル、Ｃ１−６ジアルキルフェニル、Ｃ１−６アルコキシフェニル、ハロフェニル、ジハロフェニル及びニトロフェニルからなる群から選択されていてよい。付加的な実施態様においては、Ｒ３は、水素及び直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキルから選択されていてよい。更に別の実施態様においては、Ｒ４は、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロフェノキシ、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロフェニル及びハロ−Ｃ１−４アルキルからなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであってよい。更なる実施態様においては、Ｒ５は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−６アルキルであってよい。
【００３７】
別の実施態様においては、Ｒ１は、フェニル又はｔ−ブチルであってよく；Ｒ２は、メチルフェニル、ジメチルフェニル、ｔ−ブチル、メトキシフェニル、クロロフェニル、ジクロロフェニル、フルオロフェニル及びニトロフェニルからなる群から選択された構成要素であってよく；Ｒ３は、水素であってよく；Ｒ４は、塩素、フッ素、フェノキシ、ベンジルオキシ、クロロフェノキシ、メトキシ、エトキシ及びトリフルオロメチルからなる群から選択された少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルであってよく；かつＲ５は、メチルであってよい。
【００３８】
用語「置換されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル又はアラルキル」は：（ｉ）ニトロ、（ｉｉ）ヒドロキシ、（ｉｉｉ）シアノ、（ｉｖ）カルバモイル、（ｖ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、（ｖｉ）カルボキシ、（ｖｉｉ）Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、（ｖｉｉｉ）スルホ、（ｉｘ）ハロゲン、（ｘ）Ｃ１−４アルコキシ、（ｘｉ）フェノキシ、（ｘｉｉ）ハロフェノキシ、（ｘｉｉｉ）Ｃ１−４アルキルチオ、（ｘｉｖ）メルカプト、（ｘｖ）フェニルチオ、（ｘｖｉ）ピリジルチオ、（ｘｖｉｉ）Ｃ１−４アルキルスルフィニル、（ｘｖｉｉｉ）Ｃ１−４アルキルスルホニル、（ｘｉｘ）アミノ、（ｘｘ）Ｃ１−３アルカノイルアミノ、（ｘｘｉ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、（ｘｘｉｉ）４〜６員の環式アミノ、（ｘｘｉｉｉ）Ｃ１−３アルカノイル、（ｘｘｉｖ）ベンゾイル及び（ｘｘｖ）５〜１０員の複素環式化合物の基からなる群から選択された１〜５個の置換基で置換されていてよいＣ１−１５アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ２−１８アルケニル又はアラルキル基を意味する。
【００３９】
不定形名詞及び定形名詞の単数形は、本明細書及び後の特許請求の範囲において使用される場合には、特に文脈から明らかに示されない限り、複数形の指示対象を含むということを留意しなければならない。
【００４０】
本発明の説明及び特許請求の範囲においては、以下の専門用語を、以下に説明する定義に従って使用する。
【００４１】
用語「アルキル」は、特に記載がない限り、１〜１５個、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素鎖、好ましくはメチル又はエチル基を意味する。
【００４２】
用語「アリール」は、特に記載がない限り、本明細書全体を通して、芳香族環炭化水素基を意味するのに使用する。６〜１４個の炭素原子を有するアリールが好ましい。それは部分的に飽和性であってよい。かかるアリールの好ましい例は、フェニル及びナフチル基である。
【００４３】
用語「ヘタリール」は、特に記載がない限り、本明細書全体を通して、酸素、硫黄及び窒素から選択された１〜４個のヘテロ原子を含有する５又は６員の単環式化合物又は複素環式化合物の基、若しくは酸素、硫黄及び窒素から選択された１〜６個のヘテロ原子を含有する縮合複素二環式化合物の基であり、前記基はそれぞれ、（ｉ）ハロゲン、（ｉｉ）Ｃ１−４アルキル、（ｉｉｉ）Ｃ１−４ハロアルキル、（ｉｖ）Ｃ１−４ハロアルコキシ、（ｖ）Ｃ１−４アルコキシ、（ｖｉ）Ｃ１−４アルキルチオ、（ｖｉｉ）ヒドロキシ、（ｖｉｉｉ）カルボキシ、（ｉｘ）シアノ、（ｘ）ニトロ、（ｘｉ）アミノ、（ｘｉｉ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、（ｘｉｉｉ）ホルミル、（ｘｉｖ）メルカプト、（ｘｖ）Ｃ１−４アルキル−カルボニル、（ｘｖｉ）Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、（ｘｖｉｉ）スルホ、（ｘｖｉｉｉ）Ｃ１−４アルキルスルホニル、（ｘｉｘ）カルバモイル、（ｘｘ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、（ｘｘｉ）オキソ及び（ｘｘｉｉ）チオキソ基からなる群から選択された１〜４個の置換基で置換されていてよい基を意味するのに使用する。
【００４４】
用語「置換されたアリール」は、本明細書全体を通して、（ｉ）ハロゲン、（ｉｉ）Ｃ１−４アルキル、（ｉｉｉ）Ｃ１−４ハロアルキル、（ｉｖ）Ｃ１−４ハロアルコキシ、（ｖ）Ｃ１−４アルコキシ、（ｖｉ）Ｃ１−４アルキルチオ、（ｖｉｉ）ヒドロキシ、（ｖｉｉｉ）カルボキシ、（ｉｘ）シアノ、（ｘ）ニトロ、（ｘｉ）アミノ、（ｘｉｉ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、（ｘｉｉｉ）ホルミル、（ｘｉｖ）メルカプト、（ｘｖ）Ｃ１−４アルキル−カルボニル、（ｘｖｉ）Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、（ｘｖｉｉ）スルホ、（ｘｖｉｉｉ）Ｃ１−４アルキルスルホニル、（ｘｉｘ）カルバモイル、（ｘｘ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、（ｘｘｉ）オキソ及び（ｘｘｉｉ）チオキソ基からなる群から選択された１〜４個の置換基で置換されていてよいＣ６−１４アリール基を意味するのに使用する。このアリールは、その任意の位置で置換されていてよい。従って、アリールがフェニルである場合、そのフェニル環は、パラ、メタ、オルト位及びその任意の組合せで置換されていてよい。
【００４５】
用語「置換されたヘタリール」は、本明細書全体を通して、前記のヘタリールが、（ｉ）ハロゲン、（ｉｉ）Ｃ１−４アルキル、（ｉｉｉ）Ｃ１−４ハロアルキル、（ｉｖ）Ｃ１−４ハロアルコキシ、（ｖ）Ｃ１−４アルコキシ、（ｖｉ）Ｃ１−４アルキルチオ、（ｖｉｉ）ヒドロキシ、（ｖｉｉｉ）カルボキシ、（ｉｘ）シアノ、（ｘ）ニトロ、（ｘｉ）アミノ、（ｘｉｉ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、（ｘｉｉｉ）ホルミル、（ｘｉｖ）メルカプト、（ｘｖ）Ｃ１−４アルキル−カルボニル、（ｘｖｉ）Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、（ｘｖｉｉ）スルホ、（ｘｖｉｉｉ）Ｃ１−４アルキルスルホニル、（ｘｉｘ）カルバモイル、（ｘｘ）モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキル−カルバモイル、（ｘｘｉ）オキソ及び（ｘｘｉｉ）チオキソ基からなる群から選択された１〜４個の置換基で置換されていてよいヘタリールを意味するのに使用する。
【００４６】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、置換基が塩素及びフッ素であることを説明するのに使用する。付加的に、このハロゲンは、機能的に可能であれば臭素であってよい。
【００４７】
本発明の化合物は、置換基の型に応じて幾何異性体又は互変異性体であってよい。本発明は、これらの分離された形の異性体及びその混合物をも対象に含む。更に、これらの幾つかの化合物は、その分子中に不斉炭素を含有してよい；かかる場合においては、異性体が存在しうる。本発明はまた、これらの光学異性体の混合物及びその単離された形の異性体にまで及ぶ。
【００４８】
本発明の幾つかの化合物は、塩を形成してよい。塩形成物が薬理学的に許容される限り、特に限定されるものではない。酸付加塩の特定の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の塩、有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩である。塩基性塩の特定の例は、例えば金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等を含有する無機塩基との塩、又は有機塩基、例えばメチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等との塩である。本発明は更に、本発明の化合物又はその塩の種々の水和物及び溶媒和物並びにその多形を含む。
【００４９】
以下、本発明の化合物の代表的な製造方法を説明する。これらの方法においては、出発物質又は中間生成物中に存在する官能基は、官能基の種類に応じて、保護基で好適に保護されていてよい。製造技術の観点においては、官能基を、容易に元の官能基に戻すことができる基で保護することが有利でありえる。必要であれば、この保護基を除去し、所望の生成物を得る。かかる官能基の例は、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ基等である。これらの官能基を保護するために使用されてよい基の例は、例えば、グリーン、ワッツ著、「有機合成における保護基」第２版（Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" second edition）に示されている。
【００５０】
ピラゾロ［３，４−ｂ］キノリン−５−オン及びピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−オン化合物を合成する一般的な手順を、以下に説明する：
【００５１】
【化３】
2007500249.tif 000004
【００５２】
反応器に、エチルアルコール（１０ｍＬ）中に溶解されたアミノピラゾール（１．０ミリモル）を装入した。適切なアルデヒド（１．０ミリモル）及びジメドン（１．０ミリモル）を前記の溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６〜８時間にわたって還流させた。次いで、この反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物をｎ−ヘキサンを用いて粉砕し、結晶化を導いた。この固形生成物を濾別し、ｎ−ヘキサンを用いて十分に洗浄し、そして室温条件下で乾燥させた。収率：３０〜７５％、純度：９０〜９５％。
【００５３】
【化４】
2007500249.tif 000005
【００５４】
反応器に、エチルアルコール（１０ｍＬ）中に溶解されたアミノピラゾール（１．０ミリモル）を装入した。適切なアルデヒド（１．０ミリモル）及びメルドラム酸（１．０ミリモル）を前記の溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６〜８時間にわたって還流させた。次いでこの反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物を、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率：５０〜７５％、純度：９０〜９５％。
【００５５】
本発明の所望の化合物は、当業者に知られている官能基変換法によって製造してもよく、このことは置換基の種類に応じて行ってよい。反応順序等は、目的化合物及び利用されるべき反応型に従って適切に変更してよい。本発明の他の化合物及び出発化合物は、前記方法と同様に又は当業者に知られている方法によって好適な材料から容易に製造できる。前記の製造方法によって得られたそれぞれの反応生成物は、遊離の塩基又はその塩として単離及び精製する。この塩は、慣用の塩形成法によって製造できる。この単離精製段階は、慣用の化学的技術、例えば抽出、濃縮、蒸発、結晶化、濾過、再結晶、種々の型のクロマトグラフィー等を利用することによって実施する。
【００５６】
種々の形の異性体は、異性体間の物理化学的差異を使用する慣用の手順によって単離してよい。例えば、ラセミ化合物は、慣用の光学分割法によって（例えば、慣用の光学活性酸、例えば酒石酸等とのジアステレオマー塩を形成させ、次いでその塩を光学分割することによって）分離して、光学的に純粋な異性体を得てよい。ジアステレオマー混合物は、慣用の手段、例えば分別結晶法又はクロマトグラフィーによって分離してよい。更に、光学異性体は、適切な光学活性の出発化合物から合成してもよい。
【００５７】
第１表に、本発明の代表的な化合物の構造を列挙する。
【００５８】
第１表
【００５９】
【表１】
2007500249.tif 000006
【００６０】
【表２】
2007500249.tif 000007
【００６１】
【表３】
2007500249.tif 000008
【００６２】
【表４】
2007500249.tif 000009
【００６３】
【表５】
2007500249.tif 000010
【００６４】
【表６】
2007500249.tif 000011
【００６５】
本発明の一実施態様は、ＰＩ３−Ｋアルファの活性を阻害する化合物に関する。本発明は更に、ＰＩ３−Ｋアルファの活性を阻害する方法、例えば、細胞、特に癌細胞中でのＰＩ３−Ｋアルファ活性を調節する方法を提供する。ＰＩ３−Ｋアルファ活性を臨床現場で調節し、ＰＩ３−Ｋアルファ活性によって媒介される疾病又は疾患を改善する方法が特に有利である。このように、過剰な又は不適切なＰＩ３−Ｋアルファ活性を特徴とする疾病又は疾患の治療を、本発明によるＰＩ３−Ｋアルファのモジュレーターの使用を介して施すことができる。
【００６６】
本発明の化合物は、他のＰＩ３−Ｋアイソフォーム、例えばＰＩ３−Ｋベータ、ガンマ及びデルタに対する阻害活性をも示す。従って、本発明は、それぞれのＰＩ３−Ｋアイソザイムの生理学的役割の更なる特性決定を可能にする方法をも提供する。更に、本発明は、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を有する医薬組成物、及びかかるＰＩ３−Ｋ阻害化合物の製造方法並びにその使用方法を提供する。
【００６７】
本明細書で説明された方法は、ＰＩ３−Ｋアイソフォームの活性を細胞内で阻害する化合物、好ましくは特異的に阻害する化合物の使用に利する。本方法において有用な細胞は、内因性ＰＩ３−Ｋを発現させる細胞を含み、その際、内因性とは、細胞が、ＰＩ３−Ｋアイソフォームポリペプチド又はその生物学的に活性な断片をコードする１種以上のポリヌクレオチドをその細胞へ組換え導入することなく、ＰＩ３−Ｋを発現させることを示す。本方法はまた、外因性ＰＩ３−Ｋアイソフォームを発現させる細胞の使用を含み、その際、その細胞内にはＰＩ３−Ｋアイソフィーム又はその生物学的に活性な断片をコードする１種以上のポリヌクレオチドが、組換え手順を用いて導入されている。
【００６８】
その細胞は、インビボ、すなわち生存している対象物、例えば動物又はヒト内に存在していてよく、その際、ＰＩ３−Ｋを療法的に使用してＰＩ３−Ｋ活性をその対象物中で阻害できることが特に有利である。代替的に、エクスビボ又はインビトロ法のために、その細胞を別々の細胞として単離するか又は組織内に存在していてよい。本発明に含まれるインビトロ法はまた、ＰＩ３−Ｋ酵素又はその生物学的に活性な断片と本発明の阻害化合物とを接触させる段階を含んでよい。このＰＩ３−Ｋ酵素は、例えば精製及び単離された酵素であってよく、その際、この酵素は、天然資源（例えば、組換え技術により改変されることなくＰＩ３−Ｋポリペプチドを正常に発現させる細胞又は組織）から単離するか、又は組換え技術によって外因性酵素を発現させるように改変された細胞から単離する。
【００６９】
化合物の酵素活性（又は他の生物学的活性）阻害剤としての相対的な効能は、それぞれの化合物がその活性を予め規定された範囲まで阻害する濃度を測定し、次いでその結果を比較することによって設定できる。一般的に、好ましい測定は、生化学アッセイにおける活性の５０％を阻害する濃度、すなわち５０％阻害濃度又は「ＩＣ５０」である。ＩＣ５０の測定は、当該技術分野で公知の慣用技術を使用して遂行できる。一般的に、ＩＣ５０は、所与の酵素の活性を、検討中の阻害剤の濃度範囲の存在下で計測することによって測定できる。次いで、実験的に得られた酵素活性の値を、使用された阻害剤濃度に対してプロットする。５０％の酵素活性（阻害剤の不存在下での活性と比較して）とする阻害剤濃度をＩＣ５０値とする。同様に、他の阻害濃度は、適切な活性の測定を介して規定できる。例えば、状況によっては、９０％阻害濃度、すなわちＩＣ９０等を設定することが望ましい。
【００７０】
本発明にかかる化合物は、キナーゼ阻害活性、特にＰＩ３−Ｋ阻害活性を示すので、ＰＩ３−Ｋが役割を担う異常な細胞成長を阻害するのに活用できる。従って、本化合物は、ＰＩ３−Ｋの異常な細胞成長作用が関連する疾患、例えば再狭窄、アテローム硬化症、骨疾患、関節炎、糖尿病性網膜症、乾癬、前立腺肥大症、アテローム硬化症、炎症、血管形成、免疫疾患、膵臓炎、腎臓病、癌等の治療に有効である。特に、本発明にかかる化合物は、顕著な癌細胞成長阻害作用を有しており、かつ癌、好ましくは全種の充実性癌及び悪性リンパ腫、特に白血病、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、脳腫瘍等の治療において有効である。
【００７１】
従って、本発明は、評価化合物のＰＩ３−Ｋポリペプチド阻害剤としての効力を特性決定する方法において、前記方法は、（ａ）ＰＩ３−Ｋポリペプチド活性を評価化合物の存在下で計測する段階；（ｂ）前記評価化合物の存在下でのＰＩ３ポリペプチド活性と、当量の基準化合物（例えば、本明細書中に記載された本発明にかかるＰＩ３−Ｋα阻害化合物）の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチド活性とを比較し、その際、前記評価化合物の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチド活性が前記基準化合物の存在下での活性と比べて低ければ、前記評価化合物が前記基準化合物と比べて効力の高い阻害剤であることを示し、かつ前記評価化合物の存在下でのＰＩ３−Ｋポリペプチドの活性が前記基準化合物の存在下での活性と比べて高ければ、前記評価化合物が前記基準化合物と比べて効力の低い阻害剤であることを示す段階を含む方法を提供する。
【００７２】
本発明は更に、評価化合物のＰＩ３−Ｋポリペプチド阻害剤としての効力を特性決定する方法において、（ａ）ＰＩ３−Ｋ活性を基準の百分率だけ阻害する対照化合物（例えば、本明細書中に記載された本発明にかかるＰＩ３−Ｋアルファ阻害化合物）の量を測定し、これによって前記対照化合物についての基準の阻害量を規定する段階；（ｂ）ＰＩ３−Ｋポリペプチド活性を阻害の基準の百分率だけ阻害する前記評価化合物の量を測定し、これによって前記評価化合物についての基準の阻害量を規定する段階；（ｃ）前記評価化合物についての基準の阻害量と、前記対照化合物についての基準の阻害量とを比較し、その際、前記評価化合物についての基準の阻害量が前記対照化合物についての基準の阻害量と比べて低ければ、前記評価化合物が前記対照化合物と比べて効力の高い阻害剤であることを示し、かつ前記評価化合物についての基準の阻害量が前記対照化合物についての基準の阻害量と比べて高ければ、前記評価化合物が前記対照化合物と比べて効力の低い阻害剤であることを示す段階を含む方法を提供する。
【００７３】
一実施態様においては、本方法は、ＰＩ３−Ｋアルファポリペプチド活性を５０％、６０％、７０％又は８０％だけ阻害する化合物の量である基準の阻害量を使用する。別の実施態様においては、本方法は、ＰＩ３−Ｋアルファポリペプチド活性を９０％、９５％又は９９％だけ阻害する化合物の量である基準の阻害量を利用する。これらの方法は、化合物の基準の阻害量を、インビトロでの生化学アッセイ、インビトロでの細胞ベースのアッセイ又はインビボでのアッセイにおいて測定することを含む。
【００７４】
本発明は更に、ＰＩ３−Ｋアルファ活性の負のモジュレーターを同定する方法において、（ｉ）ＰＩ３アルファポリペプチド活性を評価化合物の存在下及び不存在下で計測する段階及び（ｉｉ）ＰＩ３−Ｋアルファ活性を減らし、かつ本発明にかかる化合物とＰＩ３−Ｋアルファへの結合について競合する評価化合物を負のモジュレーターと同定する段階を有する方法を提供する。更に、本発明は、ＰＩ３−Ｋアルファ活性を阻害する化合物を同定する方法において、（ｉ）ＰＩ３−Ｋアルファポリペプチドと、本発明にかかる化合物とを評価化合物の存在下及び不存在下で接触させる段階；及び（ｉｉ）前記評価化合物を、この化合物が本発明にかかる化合物とＰＩ３−Ｋアルファへの結合について競合した際に、ＰＩ３−Ｋアルファ活性の負のモジュレーターと同定する段階を有する方法を提供する。従って、本発明は、ＰＩ３−Ｋアルファ活性の負のモジュレーター候補をスクリーニングする方法及び／又は負のモジュレーターとしての候補物の作用機構を証明する方法を提供する。かかる方法は、他のＰＩ３−Ｋアイソフォームに対して同時に利用し、そのアイソフォームにわたる評価化合物の比較活性及び／又は本発明にかかる化合物に対する評価化合物の比較活性を設定できる。
【００７５】
これらの方法においては、ＰＩ３−Ｋポリペプチドは、キナーゼ活性を示すペプチド断片又はペプチドのアロステリックモジュレーターを同定する方法を提供する結合ドメインからの断片であってよい。これらの方法は、ＰＩ３−Ｋペプチド又はそのサブユニットを、内因的又は外因的に発現させる細胞において利用できる。従って、かかる方法に利用されるポリペプチドは、溶液中に遊離しているか、固体支持体に付着しているか、細胞表面上にディスプレイされるように改変されているか、又は細胞内に局在していてよい。次いで、その活性の変化又はＰＩ３−Ｋポリペプチドと、評価されている作用物質との結合複合体の形成を計測してよい。
【００７６】
ヒトＰＩ３−Ｋポリペプチドは、当該技術分野で公知かつ実践されている方法による生化学的又は細胞ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ、例えば受容体−リガンド相互作用を調査するメラニン細胞アッセイ系、酵母ベースのアッセイ系、及び哺乳細胞発現系に適用できる。文献については、ジャヤウィクレーム、コスト著、バイオテクノロジーについての現代の見解８号：６２９〜６３４頁（１９９７年）（Jayawickreme and Kost, Curr Opin Biotechnol, 8:629-34(1997)）を参照のこと。自動小型化ＨＴＳアッセイはまた、例えばヒューストン、バンクス著、バイオテクノロジーについての現代の見解８号：７３４〜７４０頁（１９９７年）（Houston and Banks, Curr Opin Biotechnol, 8:734-40(1997)）の記載と同様と解される。かかるＨＴＳアッセイは、化合物のライブラリーをスクリーニングし、所望の特性を示す特定の化合物を同定するために使用される。任意の化合物のライブラリー、例えば化学薬品のライブラリー、天然生成物のライブラリー及びランダムな又は指定されたオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド又は他の有機化合物を有する組合せのライブラリーを使用してよい。
【００７７】
本発明はまた、ＰＩ３−Ｋ活性を療法的又は予防的に阻害する方法を提供する。この方法は、症状又は病状がＰＩ３−Ｋ発現又は活性によって媒介される任意の容態であるか又はその容態になりうるヒト又は動物の治療において、ＰＩ３−Ｋ活性の阻害剤をその有効量で投与することを含む。
【００７８】
本明細書中で使用される「治療」は、疾患に罹患しうるが、依然としてその疾患と診断されていない動物において疾患が生ずるのを防ぐこと；疾患を阻害すること、すなわちその発達を停止させること；疾患を緩和すること、すなわちその退行をもたらすこと；又は疾患を改善させること、すなわち疾患が関与する激しい病状を軽減することを意味する。「疾患」は、医学的な疾患、疾病、容態、症候群等を含むと意図され、限定されるものではない。
【００７９】
本発明にかかる方法は、対象動物、好ましくは哺乳類、特に好ましくは霊長類、殊に好ましくはヒトを治療する種々の様式を含む。治療できる哺乳動物は、例えば愛玩動物（ペット）、例えばイヌ及びネコ；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ及びヤギ；実験用動物、例えばラット、マウス、ウサギ、モルモット及び非ヒト霊長類及び動物園の見本動物である。非哺乳動物は、例えばトリ、サカナ、爬虫類及び両生類である。
【００８０】
一実施態様においては、本発明にかかる方法は、炎症疾患にかかっているか又はかかりうる対象を療法的又は予防的に治療するために利用できる。本発明の一実施態様は、ＰＩ３−Ｋが炎症プロセスの媒介という側面に介入することに由来する。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、炎症は、一般的に白血球（例えば、好中球、リンパ球等）の活性化及び遊走移行によって媒介されるプロセスに関係し、かつＰＩ３−Ｋはかかる現象を媒介しうるので、ＰＩ３−Ｋのアンタゴニストを、炎症が関与する損傷の抑制のために使用できるということが理論化される。
【００８１】
本明細書中で使用される「炎症」は、組織の損傷又は分解によって惹起され、有害な作用物質及び損傷組織を両方とも分解するか、弱めるか又は遮断（隔離）させる限局性の保護反応を意味する。炎症には、白血球の流入及び／又は好中球の遊走が顕著に関与している。炎症は、病原微生物及びウイルスの感染又は非感染媒介、例えば心筋梗塞又は脳卒中に引き続いて起こる障害又は再潅流、外部抗原に対する免疫反応及び自己免疫反応から惹起されることがある。従って、本発明を適用できる免疫疾患は、特異的防御系の反応が関与する疾患並びに非特異的防御系の反応が関与する疾患を含む。
【００８２】
本発明にかかる療法的方法は、炎症性細胞活性化が関与する疾患の治療方法を含む。「炎症性細胞活性化」は、刺激物質（例えば、限定されるものではないが、サイトカイン、抗原又は自己抗体）による増殖性細胞反応の誘導、可溶性メディエーター（例えば、限定されるものではないが、サイトカイン、酸素ラジカル、酵素、プロスタノイド又は血管活性アミン）の生成又は炎症細胞（例えば、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球（すなわち、多形核白血球、例えば好中球、好塩基球、好酸球）、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及び内皮細胞）内での新たなメディエーター（例えば、限定されるものではないが、主な組織適合性抗原又は細胞接着分子）の新たな細胞表面発現又はその数の増加を意味する。これらの細胞におけるこれらの表現型の１つ又は組合せの活性化が、炎症疾患の開始、永続化又は悪化をもたらしうることが当業者によって評価されるはずである。
【００８３】
更なる実施態様においては、本発明は、ＰＩ３−Ｋ阻害化合物を、造血系由来の癌細胞、好ましくはリンパ系由来の癌細胞、特に好ましくはＢリンパ球又はＢリンパ球前駆細胞に関連するか又は由来する癌細胞の成長又は増殖を阻害するために使用する方法を含む。本発明にかかる方法を使用する治療を適用できる癌は、例えば、限定されるものではないが、リンパ腫、例えばリンパ球及び細網内皮組織の悪性新生物、例えばバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫等；多発性骨髄腫；並びに白血病、例えばリンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病等である。
【００８４】
本発明にかかる化合物は、純粋な化学物質として投与してよいが、一般的には化合物を医薬組成物又は配合物の形で投与するのが好ましい。従って、本発明はまた、ＰＩ３−Ｋ活性のモジュレーターとして有効な化学的又は生物学的化合物（「作用物質」）と、生物学的適合性医薬担体、アジュバント又は賦形剤とを有する医薬組成物を提供する。本組成物は、その作用物質を唯一の有効成分として有するか、若しくは１種以上の添加剤又は他の製剤学的に許容される担体と混合された他の作用物質、例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、オリゴペプチド又はポリペプチド、薬剤又はホルモンと組合せて有してよい。担体及び他の成分は、それらがその配合物の他の成分と適合し、かつその受容物にとって有害でない限り、製剤学的に許容されるものと解されてよい。
【００８５】
医薬組成物の配合技術及び投与技術は、レミントン製薬科学、第１８版、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州、１９９０年（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co, Easton, Pa., 1990）見い出すことができる。本発明にかかる医薬組成物は、任意の慣用の方法、例えば混合、溶解、造粒、糖剤製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、閉じ込め、溶融紡糸、噴霧乾燥又は凍結乾燥法を使用して製造できる。しかしながら、最適な医薬配合物は、当業者によって投与経路及び所望の投与量に応じて決定される。かかる配合物は、投与される作用物質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に作用することがある。これらの医薬組成物は、治療される容態に応じて配合し、そして全身投与に又は局所投与してよい。
【００８６】
本医薬組成物は、製剤学的に許容される好適な担体を含有するように配合し、かつ場合により、有効化合物を製剤学的に使用できる製剤に加工するのを容易にする添加剤及び助剤を有してよい。一般的に、投与様式によって担体の性質が決まる。例えば、非経口投与用の配合物は、有効化合物の水溶液を水溶性の形で有してよい。非経口投与に好適な担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水及び他の生理学的に適合する溶液から選択してよい。非経口投与に好ましい担体は、生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液、又は生理緩衝食塩水である。組織投与又は細胞投与のためには、浸透されるべき特定の障壁に適切な浸透剤がその配合物中に使用される。かかる浸透剤は、一般的に、当該技術分野で公知である。タンパク質を有する製剤については、その配合物は、安定化材料、例えばポリオール（例えば、スクロース）及び／又は界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）等を有してよい。
【００８７】
代替的に、非経口使用のための配合物は、適切な油性注射用懸濁液として調製された有効化合物の分散液又は懸濁液を有してよい。好適な親油性溶媒又は賦形剤は、脂肪油、例えば胡麻油、及び合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド若しくはリポソームである。水性注射用懸濁液は、その懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含有してよい。この懸濁液は、場合により、高度に濃縮された溶液の調製するために化合物の溶解度を増加させる好適な安定化剤又は作用物質を含有してよい。有効作用物質のｐＨに反応する可溶化及び／又は持効性をもたらす水性ポリマー、例えばメタクリルポリマー、例えばＲｏｈｍ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．社（ピスカタウエイ、ニュージャージー州）から市販されている一連のＥＵＤＲＡＧＩＴ．ＲＴＭを、コーティング又はマトリックス構造として使用してもよい。エマルション、例えば水中油形分散液及び油中水形分散液を使用してもよく、これらを場合により乳化剤又は分散剤（界面活性物質；界面活性剤）によって安定化させてもよい。懸濁液は、懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、酸化水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天、トラガカントゴム及びそれらの混合物を含有してよい。
【００８８】
非経口投与には、有効作用物質を含有するリポソームを利用してもよい。リポソームは、一般的に、リン脂質又は他の脂質物質に由来する。リポソーム中の組成物は、他の成分、例えば安定化剤、保存剤、添加剤等を含有してよい。好ましい脂質は、例えばリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）であり、天然物及び合成物の両方を含む。リポソーム形成法は、当該技術分野で公知である。例えば、プレスコット（編）、細胞生物学方法論第１４巻、３３頁、アカデミック出版、ニューヨーク（１９７６年）（Prescott(Ed.), Methods in Cell Biology, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, New York (1976)）を参照のこと。
【００８９】
この作用物質を経口投与に好適な投与量で有する医薬組成物は、当該技術分野で公知の製剤学的に許容される担体を使用して配合してよい。経口投与用に配合される製剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、糖剤、トローチ剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、エリキシル剤、懸濁剤、又は粉末剤の形であってよい。例として、経口使用のための医薬製剤は、有効化合物と固形添加剤とを組み合わせて、場合によりその得られた混合物を粉砕し、そしてその顆粒の混合物を加工することによって得てよく、所望により好適な助剤を添加した後に、錠剤又は糖剤の中心錠を得てよい。経口用の配合物は、非経口使用について記載されたものと同様の液状担体、例えば緩衝水溶液、懸濁液等を利用してよい。
【００９０】
好ましい経口用の配合物は、例えば錠剤、糖剤及びゼラチンカプセルである。これらの製剤は、１種以上の添加剤、例えば、限定されるものではないが；
ａ）希釈剤、例えば糖、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール又はソルビトール；
ｂ）結合剤、例えばケイ酸アルミニウムマグネシウム、コーンスターチ、小麦、米、ジャガイモ等；
ｃ）セルロース材料、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ゴム、例えばアラビアゴム及びトラガカントゴム並びにタンパク質、例えばゼラチン及びコラーゲン；
ｄ）崩壊剤又は可溶化剤、例えば架橋したポリビニルピロリドン、デンプン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウム、若しくは発泡性組成物；
ｅ）滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、若しくはそのマグネシウム又はカルシウム塩、及びポリエチレングリコール；
ｆ）風味剤又は甘味剤；
ｇ）着色剤又は顔料、例えば製品を識別するため又は有効化合物の量（投与量）を特徴付けるためのもの；及び
ｈ）他の成分、例えば保存剤、安定化剤、膨潤剤、乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節用の塩、及び緩衝液を含有してよい。
【００９１】
ゼラチンカプセルは、例えばゼラチンから構成される押込嵌めカプセル並びにゼラチンとコーティング、例えばグリセロール又はソルビトールとから構成される軟質封入カプセルである。押込嵌めカプセルは、充填剤、結合剤、滑沢剤及び／又は安定化剤等と混合された１種以上の有効成分を含有してよい。軟質カプセル中では、有効化合物は、好適な流体、例えば脂肪油、液状パラフィン又は液状ポリエチレングリコール中に溶解又は懸濁されていてよく、その際、安定化剤が含まれるか又は含まれない。
【００９２】
糖剤の中心錠に、好適なコーティング、例えばアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してよい濃縮糖溶液を提供してよい。
【００９３】
本医薬組成物は、その有効作用物質の塩として提供してよい。塩は、水性又は他のプロトン溶媒中では、対応する遊離の酸又は塩基の形と比べて溶解性が高い傾向にある。製剤学的に許容される塩は、当該技術分野で公知である。酸性成分を含有する化合物は、好適な陽イオンと製剤学的に許容される塩を形成できる。製剤学的に許容される好適な陽イオンは、例えばアルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）及びアルカリ土類（例えば、カルシウム又はマグネシウム）陽イオンである。
【００９４】
本発明にかかる構造式Ｉ〜ＩＩＩの化合物は、好適な酸と製剤学的に許容される酸付加塩を形成できる。例えば、バージら（Berge et al）は製剤学的に許容される塩を創薬科学紀要６６号：１頁（１９７７年）（J Pharm Sci, 66:1 (1977)）に記載している。この塩は、本発明にかかる化合物の最終的な単離及び精製の間にその場で調製するか又は遊離の塩基官能基と好適な酸とを反応させることによって別個に調製してよい。
【００９５】
前記内容を考慮して、本明細書中に説明される本発明にかかる化合物に関するあらゆる言及は、前記構造式の化合物並びにその製剤学的に許容される塩及び溶媒和物、並びにそのプロドラッグを含むものと意図される。
【００９６】
製剤学的に許容される担体中に配合された本発明にかかる化合物を有する組成物を製造し、適切な容器内に位置させ、そして治療される容態を示すために標識してよい。従って、それらはまた製品、例えば本発明にかかる化合物の投与形とその化合物の使用指示を含む標識とを有する容器と検討される。また、本発明のもとではキットが検討される。例えば、このキットは、医薬組成物の投与形と、医学的な容態の治療におけるその組成物の使用指示を含む包装挿入物とを有してよい。何れにしても、標識上に表示された容態は、炎症疾患、癌等の治療を含んでよい。
【００９７】
ＰＩ３−Ｋ活性の阻害剤を有する医薬組成物は、任意の慣用の方法、例えば非経口及び経腸技術によって対象物に投与してよい。非経口投与様式は、その組成物が胃腸管を介する以外の経路、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、骨髄内、筋肉内、関節内、鞘内及び心室内注射によって投与される様式を含む。経腸投与様式は、例えば、経口（例えば頬及び舌下）及び直腸投与を含む。経上皮投与様式は、例えば、経粘膜投与及び経皮投与を含む。経粘膜投与は、例えば経腸投与並びに経鼻、吸入及び肺深部への投与；膣投与；及び直腸投与を含む。経皮投与は、受動的又は能動的な経皮性又は経皮的様式、例えばパッチ、及びイオン浸透導入機器並びにペースト剤、ロウ膏又は軟膏剤の表面塗布を含む。非経口投与は、高圧技術を使用して遂行してもよい。
【００９８】
外科的技術は、デポー（貯留）組成物、浸透圧ポンプ等の移植を含む。炎症治療に好ましい投与経路は、限局性疾患、例えば関節炎のための局所的又は表面送達、又は分布性の疾患のための全身性送達、例えば再潅流障害又は全身性容態、例えば敗血症のための静脈内送達であってよい。 他の疾病、例えば気道に関する疾病、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息及び気腫については、投与を噴霧剤、エアロゾル、粉末剤等の吸入又は肺深部への投与によって達成してよい。
【００９９】
腫瘍性疾病、特に白血病及び他の分布性の癌の治療のためには、一般的に非経口投与が好ましい。化合物の配合物は、その化合物を非経口投与に引き続いて生体内分布を最適化するものが望ましい。このＰＩ３−Ｋ阻害化合物は、化学療法、放射線療法、及び／又は外科療法の適用前、適用の間又は適用後に投与してよい。
【０１００】
前記のとおり、作用物質それ自体及びその作用物質の配合物の特性は、投与された作用物質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に作用することがある。かかる薬物動態学的及び薬力薬物学的情報をインビトロ及びインビボでの前臨床研究を介して収集し、次いでヒトにおいて臨床実験過程の間で確認してよい。このように、本発明にかかる方法において使用される任意の化合物について、療法的有効量を、生化学的アッセイ及び／又は細胞ベースのアッセイから最初に推定できる。次いで、ＰＩ３−Ｋ発現又は活性を調節する所望の循環濃度範囲を達成する投与量を、動物モデルにおいて明確に示す。ヒトでの研究が実施される際には、適切な投与量レベル及び種々の疾病及び容態の治療の持続時間に関する更なる情報が得られるはずである。
【０１０１】
かかる化合物の毒性及び療法的な効能は、細胞培養物及び実験動物を使用して、例えばＬＤ５０（個体群の５０％についての致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％についての療法的に有効な用量）を測定する標準的な製剤学的手順によって測定してよい。毒性作用と療法作用との用量比は「治療係数」であり、これは一般的に比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現される。大きい治療係数を示す化合物、すなわち中毒量が有効量と比べて実質的に高い化合物が好ましい。かかる細胞培養物アッセイ及び付加的な動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用についての投与量の範囲を明確に示すのに使用できる。かかる化合物の投与量は、毒性をほとんど有さないか又は全く有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。
【０１０２】
本発明にかかる方法のために、用量の時期及び順序を調節する任意の有効な投与の計画を使用してよい。本作用物質の用量は、その作用物質の有効量を有する製剤学的な投与量の単位を含むことが好ましい。本明細書中で使用される「有効量」は、１回以上の製剤学的な投与量の単位の投与を介してＰＩ３−Ｋの発現及び活性を調整すること及び／又は対象物の生理学的パラメータの測定可能な変化を導くことに十分な量を意味する。
【０１０３】
ヒトを対象とする実験的投与量レベルは、体重１キログラムにつき約０．００１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇの有効作用物質の規模である。一般的に、この有効作用物質の投与量単位は、効能、投与経路等に応じて約０．０１ｍｇ〜約１００００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇを有する。好適な用量は、投与経路に応じて、体重、体表面積、又は器官の大きさにより計算してよい。最終的な用量投与計画は、所属医師によって良好な診断という観点から決定され、その際、薬剤の作用を変更する種々の要因、例えばその作用物質の特異的活性、疾病状態の正体及び発病性、患者の応答性、患者の年齢、容態、体重、性別及び食事並びに任意の感染症の発病性が検討される。
【０１０４】
考慮されてよい付加的な要因は、例えば投与時間及び投与頻度、薬剤の組合せ、反応感受性及び療法に対する許容度／反応である。本明細書中で記載された任意の配合物に関する治療に適切な投与量の更なる改善は、熟練従業者によって、必要以上に実験を行うことなく、特に投与量情報及び開示されたアッセイ並びにヒト臨床試験で得られた薬物動態学的データを考慮しつつ慣例的になされる。適切な投与量は、体液又は他の試料中の作用物質の濃度を測定するために設定されたアッセイの使用を介して用量反応データと一緒に確認してよい。
【０１０５】
投与頻度は、作用物質及び投与経路の薬物動態学的パラメータに依存する。投与量及び投与は、有効成分の十分なレベルを提供するか又は所望の作用を維持するように調節する。従って、本医薬組成物は、一回量又は複数回の別々の量で、持続注入法によって、その作用物質の所望の最小のレベルを維持するのに必要な持効性デポー剤として、又はその組合せ物として、投与してよい。短時間作用性の医薬組成物（すなわち、半減期が短い）を、１日１回又はそれ以上（例えば、１日２回、３回又は４回）投与してよい。長時間作用性の医薬組成物を、３〜４日ごと、毎週、又は２週間に１回投与してよい。持続注入法には、ポンプ、例えば皮下用、腹腔内用、硬膜下用のポンプが好ましい。
【０１０６】
以下に実施例を、本発明を理解すること及び実施例が関係する当業者に知られている慣用の方法の理解を前提とすることの更なる手助けのために提供する。かかる方法は多くの文献、例えばサムブルークら著、分子クローニング：ラボラトリマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリ出版（１９８９年）（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）、アズベルら（編）分子生物学最新プロトコール、ジョンウィレイアンドサンズ社（１９９４年）（Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)）；及びアズベルら（編）分子生物学ショートプロトコール第４版、ジョンウィレイアンドサンズ社（１９９９年）（Ausubel et al. (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc. (1999)））に詳細に記載されている。以下に記載される特定の材料及び条件は、本発明の特定の実施態様の例示が意図されており、かつその妥当な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１０７】
実施例
実施例１
９６４０７６（３−ｔ−ブチル−４−（２−クロロフェニル）−７，７−ジメチル−１−（４−メトキシフェニル）−４，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノリン−５（６Ｈ）−オン）の合成及び特性決定
【０１０８】
【化５】
2007500249.tif 000012
【０１０９】
反応器に、エチルアルコール（２０ｍＬ）中に溶解された１−（４−メトキシフェニル）−３−ｔ−ブチル−５−アミノピラゾール（５００ｍｇ、２．０３ミリモル）を装入した。次いで、２−クロロ−ベンズアルデヒド（２１８ｍＬ、２．４３ミリモル）及びジメドン（２８５ｍｇ、１．０ミリモル）を前記溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６時間にわたって還流させた。
【０１１０】
次いで、この反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物をｎ−ヘキサンを用いて粉砕し、結晶化を導いた。この固形生成物を再び溶解させ、そしてカラムクロマトグラフィーによって更に精製し、純粋な生成物（１１０ｍｇ）を得て、次いでＮＭＲによって特性決定した：
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８，１．０２，１．１，１．２３，２．０３，２．１４，３．８５，５．６７，６．３２，７．０２，７．１４，７．２３，７．４４。
【０１１１】
実施例２
９６４０２８（３−ｔ−ブチル−４−（４−メチルフェニル）−７，７−ジメチル−１−（４−メチルフェニル）−４，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノリン−５（６Ｈ）−オン）の合成及び特性決定
【０１１２】
【化６】
2007500249.tif 000013
【０１１３】
反応器に、エチルアルコール中（１０ｍＬ）中に溶解された１−（４−メチルフェニル）−３−ｔ−ブチル−５−アミノピラゾール（１８０ｍｇ、０．７８ミリモル）を装入した。次いで、ｐ−トルアルデヒド（１１０ｍｇ、０．９４ミリモル）及びジメドン（１１０ｍｇ、０．７８ミリモル）を前記溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６時間にわたって還流させた。次いで、この反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物をｎ−ヘキサンを用いて粉砕し、結晶化を導いた。この固形生成物（１７８ｍｇ）を濾別し、洗浄し、そして室温条件下で乾燥させ、次いでＮＭＲによって特性決定した：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８２，１．０３，１．１４，１．２３，２．２５，２．４１，５．４０，６．２２，７．００，７．１８，７．３１，７．４３。
【０１１４】
実施例３
１，３−ジ−ｔ−ブチル−４−ｐ−トリフルオロメチルフェニル−１，４，５，７−テトラヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−オンの合成及び特性決定
【０１１５】
【化７】
2007500249.tif 000014
【０１１６】
反応器に、エチルアルコール（５ｍＬ）中に溶解された１，３−ジ−ｔ−ブチル−５−アミノピラゾール（５０ｍｇ、０．２６ミリモル）を装入した。次いで、ｐ−トリフルオロメチルベンズアルデヒド（４４．６ｍｇ、０．２６ミリモル）及びメルドラム酸（３６ｍｇ、０．２６ミリモル）を前記溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６時間にわたって還流させた。次いで、この反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物をシリカ上でのクロマトグラフィーによって、ヘキサンとエチルアセテートとの混合物を用いて溶出させつつ精製した。この固形生成物（７０ｍｇ）を単離し、次いでＮＭＲによって特性決定した：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．１２，１．５９，２．６７，３．１２，４．４０，７．１４，７．５１，８．２３。
【０１１７】
実施例４
１，３−ジ−ｔ−ブチル−４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−４，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−１，２，８−トリアザ−ｓ−インダセン−５−オンの合成及び特性決定
【０１１８】
【化８】
2007500249.tif 000015
【０１１９】
反応器に、エチルアルコール（５ｍＬ）中に溶解された１，３−ジ−ｔ−ブチル−５−アミノピラゾール（４０ｍｇ、０．２０ミリモル）を装入した。次いで、３，４−ジメトキシベンズアルデヒド（３４ｍｇ、０．２０ミリモル）及び１，３シクロペンタジオン（３６ｍｇ、０．２６ミリモル）を前記溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６時間にわたって還流させた。次いでこの反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物をシリカ上でのクロマトグラフィーによって、ヘキサンとエチルアセテートとの混合物を用いて溶出させつつ精製した。この固形生成物（６０ｍｇ）を単離し、次いでＮＭＲによって特性決定した：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９５，１．５６，２．２７，２．４９，３．５９，３．６９，３．７１，５．００，６．５８，３，６１，６．７８。
【０１２０】
実施例５
４−（３，４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−１，３−ジ−ｔ−ブチル−４，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，２，１０−トリアザ−シクロヘプタ［ｆ］インデン−５−オンの合成及び特性決定
【０１２１】
【化９】
2007500249.tif 000016
【０１２２】
反応器に、エチルアルコール（５ｍＬ）中に溶解された１，３−ジ−ｔ−ブチル−５−アミノピラゾール（４０ｍｇ、０．２０ミリモル）を装入した。次いで、３，４−ジベンジルオキシベンズアルデヒド（６５ｍｇ、０．２０ミリモル）及び１，３シクロヘプタジオン（３６ｍｇ、０．２６ミリモル）を前記溶液に、室温で撹拌しつつ添加した。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６時間にわたって還流させた。次いでこの反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去した。この残留物をシリカ上でのクロマトグラフィーによって、ヘキサンとエチルアセテートとの混合物を用いて溶出させつつ精製した。この固形生成物（１８ｍｇ）を単離し、次いでＮＭＲによって特性決定した：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．０３，１．６４，２．４２，５．０７，５．２８，６．７２，７．３１，７．３７。
【０１２３】
実施例６
１−（１，３−ジ−ｔ−ブチル−４−ｐ−トリル−４，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）−エタノンの合成及び特性決定
【０１２４】
【化１０】
2007500249.tif 000017
【０１２５】
反応器に、エチルアルコール（５ｍＬ）中に溶解された１，３−ジ−ｔ−ブチル−５−アミノピラゾール（４０ｍｇ、０．２０ミリモル）を装入する。次いで、ｐ−トルアルデヒド（２３ｍｇ、０．２０ミリモル）及び１，３ペンタジオン（３６ｍｇ、０．２６ミリモル）を前記溶液に、室温で撹拌しつつ添加する。この反応混合物を８０℃まで加熱し、そして６時間にわたって還流させる。次いでこの反応器を室温まで冷却し、そして溶媒を減圧下で回転式蒸発装置上で除去する。この残留物をシリカ上でのクロマトグラフィーによって、ヘキサンとエチルアセテートとの混合物を用いて溶出させつつ精製する。
【０１２６】
実施例７
組換えＰＩ３−Ｋポリペプチドの単離及び精製
ｐ１１０触媒サブユニットとＧＳＴタグ付きｐ８５調節サブユニットとから構成される組換えヘテロ二量体ＰＩ３−Ｋアルファを、Ｓｆ９細胞内でバキュロウイルス発現系を用いて発現させた。発現用構築物を、アレックス・トーカー博士(Dr.Alex Toker)（ハーバード大学（Harvard University））の研究室から入手した。この方法は当業者には十分知られており、かつストイアノフら著、サイエンス２６９号、６９０〜６９３頁（１９９５年）（Stoyanov et al., Science269, 690-693(1995)）及びストイアノフら著、生物化学紀要３２４号：４８９〜４９５頁（１９９７年）（Stoyanov et al., Biochem. J. 324: 489-495. (1997)）にも記載されている。
【０１２７】
回収された細胞沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａＶＯ３、ロイペプチン１μｇ／ｍｌ、ペプスタチン１μｇ／ｍｌ）を含有する３ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのフッ化ナトリウム、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０％のグリセロール、０．１％のＩｇａｐａｌ）中で再び懸濁させた。この懸濁液を、１時間にわたって４℃で回転によって細胞を破壊しつつインキュベートして、次いで穏やかにボルテックスにかけて、細胞溶解を確保する。この溶液を、１４０００ｇで１５分にわたって遠心分離し、そしてこの上清を１０ｍｌの緩衝液Ａの添加によって希釈した。この希釈上清を、緩衝液Ａで予め平衡化された３ｍｌのグルタチオン−アガロース樹脂（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ａｇａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添加し、そして１時間にわたって４℃で回転させつつインキュベートした。この樹脂をカラム内に流出させ、そして３５ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、そしてタンパク質を１０ｍＭのグルタチオンを用いて緩衝液Ａ中に溶出させた。２０個の０．５ｍｌ分画を回収し、そしてタンパク質の存在を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリスグリシンゲル（１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｔｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｇｅｌ）（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ社製）上で評価した。標的タンパク質を含有する分画をプールし、そしてＭｉｃｒｏｓｅｐ３０Ｋ濃縮器（Ｐａｌｌ−Ｇｅｌｍａｎ社製）を使用して濃縮した。この濃縮タンパク質を、３ｍｌの最終緩衝液（２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈し、そして更に２回濃縮し、あらゆる界面活性剤を除去した。このタンパク質を５０％のグリセロール中に希釈し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１２８】
実施例８
ＰＩ３−Ｋ活性アッセイ及びＰＩ３−Ｋ阻害剤のスクリーニング
ＧＳＴ−ＧＲＰ１−ＰＨ発現ベクターを、マーク・レモン氏（ペンシルバニア大学（University of Pennsylvania））から入手した（カヴランら著、生物化学紀要２７３号：３０４９７〜３０５０８頁（１９９８年）（Kavran, et al., J Biol Chem, 273: 30497-30508(1998)））。Ｅ．コリからのタンパク質の発現及び精製を、以下のように実施した：ＬＢ／ａｍｐプレートにこの発現ベクターを含有するＥコリの冷凍グリセロールストックを塗り、そして３７℃で一夜増殖させた。単一のコロニーを選択し、そしてそれを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２０ｍｌのＬＢ培地中に植菌し、一夜増殖させた。この一夜培養した物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルのＬＢ培地に添加し、そしてＯ．Ｄ．６００が０．８〜１．０になるまで増殖させた。タンパク質発現を、０．１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして培養物を３７℃で継続して一夜増殖させた。細胞を４０００ｇで２０分にわたって遠心分離することによって回収した。沈殿物を、タンパク質精製を実施するまで−８０℃で冷凍させて貯蔵した。ＧＳＴタグ付きタンパク質の精製を、以下のように行った：この沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦ、０．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．７μｇ／ｍｌのペプスタチン）を有する２５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＢＭＥ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＮａＶＯ３、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍのスクロース）中に、再び懸濁させた。この細胞を、超音波によって３分にわたって溶解させ、そしてトリトンｘ−１００を最終濃度０．０１％になるまで添加した。この混合物を１００００ｒｐｍで１５分にわたって遠心分離することによって澄明にした。この上清と、緩衝液Ａで予め平衡化された５ｍｌのグルタチオン−アガロース樹脂（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ａｇａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）と混合した。このタンパク質をその樹脂に、１時間にわたって４℃で回転させつつ結合させた。この樹脂をカラムに移し、そして３０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。このタンパク質を、１０ｍＭのグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用して緩衝液Ａ中に溶出させた。２０個の１ｍｌ分画を回収し、そしてタンパク質レベルを１２％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。精製タンパク質を含有する分画を、プールし、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１２９】
ＰＩ３−キナーゼ反応を、５０ｎｇの組換えＰＩ３−Ｋと一緒に基質としての１０ピコモルのジＣ８ＰＩ（４，５）Ｐ２（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とを含有する５ｍＭのヘペス（ｐＨ７）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び２５μＭのＡＴＰを含有する反応緩衝液中で実施した。この反応を、室温で１〜３時間にわたって進行させ、次いでＥＤＴＡを最終濃度が１０ｍＭになるまで添加することによってクエンチさせた。最終反応容量は、１０μｌであった。阻害について評価されるべき化合物を、ストックからＤＭＳＯ中に最終濃度が１μＭになるまで添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。
【０１３０】
この基質からＰＩ（３，４，５）Ｐ３への変換を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社によって開発された増幅型ルミネセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）（ＡＬＰＨＡ（Ｒ））技術を使用する競合アッセイを使用して測定した。０．２５ピコモルの組換えＧＳＴ−Ｇｒｐ１−ＰＨドメインタンパク質及び０．２５ピコモルのビオチン化ジＣ６ＰＩ（３，４，５）Ｐ３（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、それぞれの反応混合物に添加した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｒ）ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）検出キット（ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）からのドナービーズ及びアクセプタービーズを、最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるまで添加した。最終容量は２５μｌであった。この反応物を３７℃で２時間にわたってインキュベートし、そして発光シグナルをＦｕｓｉｏｎα型マイクロプレートリーダ上で読み取った。酵素活性の％阻害率を、無酵素（阻害率１００％）及びＤＭＳＯ単独（阻害率０％）対照と比較することによって決定した。
【０１３１】
基質のＰＩ（３，４，５）Ｐ３への変換の検出に使用される代替法は、競合蛍光偏光アッセイであった。１２５ピコモルの組換えＧＳＴ−Ｇｒｐ１−ＰＨドメインタンパク質及び２５ピコモルのＴＡＭＲＡ−Ｉ（１，３，４，５）Ｐ４（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、それぞれの反応混合物に添加した。最終容量は２５μｌであった。偏光値を、マイクロプレートリーダ上で５５０ｎｍ励起／５８０ｎｍ偏光用発光フィルタを使用して測定した。このアッセイでは、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｉ（１，３，４，５）Ｐ４又はＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｉ（３，４，５）Ｐ３を、蛍光トレーサーとして置き換えることもできた。酵素活性の％阻害率を、無酵素（阻害率１００％）及びＤＭＳＯ単独（阻害率０％）対照と比較することによって決定した。
【０１３２】
実施例９
ＰＩ３−Ｋ阻害剤についてのＩＣ５０の測定
潜在的なＰＩ３−Ｋ阻害剤のライブラリーについて、ＰＩ３−Ｋアルファに対する活性を以下のように評価した。同定された有効化合物から、ライブラリーに存在する種々の化学物質群から１２種を代表例として選択し、それらを更なる分析に供した。ＩＣ５０値を、選択された本発明にかかる化合物について測定した。酵素活性アッセイを前記と同様に、ＩＣ５０値の測定を可能にする化合物濃度の範囲の存在下で実施した。酵素活性及び％阻害率を、前記と同様にＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｒ）発光アッセイ又は蛍光偏光アッセイを使用して決定した。これらの阻害剤は他のＰＩ３−Ｋアイソフォーム、例えばＰＩ３−Ｋベータ、ガンマ及びデルタに対抗する活性を示してもよい。
【０１３３】
実施例１０
癌細胞に対するＰＩ３−Ｋ阻害剤の作用の特性決定
選択された化合物について、卵巣対癌及び乳癌細胞株に対抗する選択的活性を評価した。
【０１３４】
卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３については、ＰＩ３−Ｋシグナリングに変化はみられず、かつＰＩ３−Ｋ阻害剤での処理によって生成された抗増殖作用にほとんど感受性を有さないはずである一方で、ＯＶＣＡＲ３細胞株については、ＰＩ３−Ｋ活性の増幅を介してＰＩ３−Ｋシグナリングに変化がみられ、その感受性を有するはずである。ＳＫＯＶ３細胞を９６ウエル型細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）内に、１ウエルにつき２００００細胞の密度で、１０％のウシ胎児血清及び２０ｍＭのＬ−グルタミンを有するＭｃＣｏｙｓ５Ａ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）中で播いた。ＯＶＣＡＲ３細胞を、１ウエルにつき１５０００細胞の密度で、２０ｍＭのｌ−グルタミン、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン、１０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２．５ｇ／Ｌのグルコース及び２０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）中で播いた。２４時間後に、化合物を細胞培地に最終濃度が１μＭになるまで添加し、そしてこの細胞をその化合物の存在下で４８時間にわたって、０．５％のウシ胎児血清を含有する培地中で増殖させた。生存率を、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して測定して、そしてＤＭＳＯ単独対照（生存率１００％）と比較した。生存率の低下をもたらす化合物は、細胞増殖の阻害又はアポトーシス（プログラム細胞死）の誘導の何れかによって作用しうる。ライブラリー内の０９６型構造群の代表的な化合物は、細胞増殖及び生存率について選択的作用を示した。
【０１３５】
インビトロでのスクリーニングを使用してＰＩ３−Ｋ阻害剤と同定されており、かつ生存率について細胞特異的作用を示す本発明にかかる化合物に構造的にも関連するライブラリー内に存在する化合物について、卵巣対癌細胞株に対抗する活性を評価した。これらの多くの化合物はまた、細胞増殖について同様の選択的作用を示す。第２表に、選択された本発明にかかる化合物についての２回の別個の細胞増殖実験の結果をまとめる。
【０１３６】
選択された化合物を、卵巣対癌細胞株に対して、増殖阻害に有効な濃度を測定する濃度の範囲で評価した。
【０１３７】
第２表
本発明にかかる化合物について卵巣対癌細胞株についての選択的作用を評価した異なる２回の実験の一覧
【０１３８】
【表７】
2007500249.tif 000018
【０１３９】
この活性プロファイルを示すＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋ活性の増幅又はＰＩ３−Ｋ活性の調節に作用する変異、例えば腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ遺伝子変異の何れかによってＰＩ３−Ｋシグナリングに変化がみられる多くの腫瘍細胞株及び腫瘍の型に対して有効でありえる。それらは、例えば乳癌、前立腺癌、結腸癌及び卵巣癌である。
【０１４０】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤については、乳癌細胞株に対抗する選択的活性をも評価した。細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、ＰＴＥＮ、すなわちＰＩ３−Ｋシグナリングの負の調節因子の変異型であり、かつそれらの細胞内ではＰＩ３−Ｋシグナリングが異常に活性化する一方で、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は正常のＰＴＥＮの発現を示し、かつＰＩ３−Ｋシグナリングは正常に調節される。
【０１４１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、９６ウエル型細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）内に、１ウエルにつき２００００細胞の密度で、１０％のウシ胎児血清及び２０ｍＭのＬ−グルタミンを有するＲＭＰＩ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）中で播いた。２４時間後に、化合物を細胞培地に、最終濃度が１０ｎＭ〜１００μＭに及ぶまで添加し、そしてこの細胞をその化合物の存在下で４８時間にわたって、０．５％のウシ胎児血清及び２０ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＭＰＩ培地中で増殖させた。生存率を、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して測定して、そしてＤＭＳＯ単独対照（生存率１００％）と比較した。生存率の低下をもたらす化合物は、細胞増殖の阻害又はアポトーシス（プログラム細胞死）の誘導の何れかによって作用しうる。ライブラリー内の０９６型構造群の代表的化合物は、細胞増殖及び生存率について選択的作用を示した。選択された化合物を、肺対癌細胞株に対して、その成長阻害に有効な濃度を測定する濃度範囲で評価した。
【０１４２】
実施例１１
ＰＩ３−Ｋ阻害剤によるＰＫＢ／Ａｋｔを介する、ＰＩ３−Ｋ媒介性のシグナリングに対する作用
ＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化及び活性化は、ＰＩ３−Ｋ活性に依存しているので、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は細胞のホスホ−Ａｋｔレベルを低下させる。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、ＰＩ３−Ｋシグナリングの異常な活性化の結果として、構成的に高いホスホ−Ａｋｔレベルを示す。
【０１４３】
この細胞内をＰＩ３−Ｋ阻害剤で処理した際のホスホ−Ａｋｔレベルに対する作用を、以下のように測定した。細胞を６ウエル型細胞培養皿内で、１ウエルにつき５×１０５細胞の密度で、１０％のウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＭＰＩ培地中で平板培養した。２４時間後に、培地を除去し、そして２ｍＭのＬ−グルタミンを含有する無血清ＲＭＰＩで置き換えた。この細胞は一夜にわたり血清飢餓状態であった。
【０１４４】
本化合物を、無血清培地内に最終濃度が５０μＭになるまで希釈し、そしてその細胞に添加した。この細胞を、ＰＩ３−Ｋ阻害剤の存在下で４時間にわたってインキュベートした。ホスホ−Ａｋｔレベルを、以下の方法の一つを使用して測定した。
【０１４５】
ホスホ−Ａｋｔレベルをイムノブロッティングを使用して測定するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして氷で冷却された溶解緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、５０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１００ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０％のグリセロール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、及び１０μｇ／ｍｌのアプロチニン）中で溶解させた。全タンパク質の濃度を、ＢＣＡアッセイを使用して測定した。全ての細胞溶解タンパク質のうちの３０μｇをＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液内に希釈し、そして１０％アクリルアミドゲル上に装填し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングし、次いで４℃で抗体と一緒に一夜インキュベートした。この膜をＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のトウィーン−２０）中で洗浄し、そしてＨＲＰ結合抗体（ＴＢＳ−Ｔ中で５％のミルクで希釈された）と一緒に、室温で１時間にわたってインキュベートした。この膜を広範に洗浄し、そしてそのタンパク質を化学発光検出によって可視化した。ホスホ−Ａｋｔレベルに作用する化合物は、イムノブロッティングによって検出されたホスホ−Ａｋｔ量の相対的な差異として観察された。
【０１４６】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤での処理に続いての細胞のホスホ−Ａｋｔレベルに対する作用を、ＰａｔｈＳｃａｎホスホ−ＡｋｔＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（ホスホ−Ａｋｔ検出用のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ）を使用して定量した。このキットを、製造業者のプロトコールによって使用した。４５０ｎｍでの吸光度を、それぞれの試料について測定し、そしてそれをホスホ−Ａｋｔレベルに相当するものとして直接使用した。
【０１４７】
ホスホ−Ａｋｔレベルの％低下率を、空の試料（０％）及びＤＭＳＯ単独で処理された対照試料（１００％）に対して標準化することによって決定した。ＰＩ３−Ｋ阻害剤で処理すると、このアッセイによって決定されたように、ホスホ−Ａｋｔレベルが２０〜６０％低下した。このデータは、これらの化合物が細胞のＰＩ３−Ｋ媒介性のシグナリングに作用しうることを示している。
【０１４８】
第３表に、この構造群の幾つかの化合物についてのデータ、具体的にはインビトロでの酵素活性阻害についてのＩＣ５０、細胞のｍＩＣ５０及びＰＩ３−Ｋ媒介性のシグナリングに変化がみられる腫瘍細胞に対する抗増殖活性、並びに細胞のホスホ−Ａｋｔレベルに対する作用をまとめる。
【０１４９】
第３表
本発明にかかる化合物についてのデータ一覧
【０１５０】
【表８】
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【０１５１】
実施例１２
ＰＩ３−Ｋ阻害剤による３−Ｄ培養系において増殖した腫瘍細胞に対する作用
ＰＩ３−Ｋ阻害剤を、他の細胞培養モデルと比較してより厳密に腫瘍の環境を模擬する三次元マトリックス内で増殖した腫瘍細胞に対する作用についてアッセイする。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、マトリックス溶液、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に入れて、２×１０６細胞／ｍｌで混合し、そしてこの混合物のうち１００μｌを２４ウエル型細胞培養プレートのそれぞれのウエルに添加した。それぞれのウエルは直径６．５ｍｍであり、１ウエルにつき２×１０５細胞を添加する。マトリックスを凝固させ、１０％のウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＭＰＩ培地をそれぞれのウエルに添加する。約１４日間の培養の後に、本化合物を細胞培地に最終濃度が１０ｎＭ〜１００μＭに及ぶまで添加し、そしてこの細胞をその化合物の存在下で７日間にわたって、０．５％のウシ胎児血清及び２０ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＭＰＩ培地中で増殖させる。
【０１５２】
この処理に続いて、三次元マトリックス内での細胞増殖を、細胞生存度アッセイ、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ３５８２）を使用して計測してよい。１ウエルにつき１．２ｍｌのアッセイ用溶液を添加し、その細胞を３時間にわたってインキュベートする。５５０ｎｍでの吸光度を、それぞれのウエルについて測定し、そして細胞数に相当するものとして直接使用する。更に、生細胞を標識するフルオレセインジアセテート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）及び死細胞を標識するヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）で染色後に蛍光顕微鏡を使用して、生細胞と死細胞とを区別及び観察してよい。
【０１５３】
本発明にかかるＰＩ３−Ｋ阻害剤は、１種の阻害剤の抗増殖作用と基準のＰＩ３−Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２のその作用とを比較する第６表の代表的データによって示されるように、この腫瘍細胞増殖モデルにおいて抗増殖作用を示す。本発明にかかるＰＩ３−Ｋ阻害剤はまた、他の制癌剤、例えばパクリタクセル又はドキソルビシンと組み合わされた際には、抗増殖活性の向上を示す。
【０１５４】
第４表
腫瘍細胞増殖の三次元モデル内でのＰＩ３−Ｋ阻害剤の作用
【０１５５】
【表９】
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【０１５６】
実施例１３
腫瘍成長の阻害
癌細胞の増殖についての阻害剤のインビボでの効能を、当該技術分野において公知の幾つかのプロトコールによって確認できる。ＰＩ３−Ｋ経路が脱調節されたヒト腫瘍細胞、例えばＬｎＣａＰ、ＰＣ３、Ｃ３３ａ、ＯＶＣＡＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、０日目に、ヌードマウスの側腹部内に皮下注射する。マウスを、賦形剤処理群、本化合物処理群又はその組合せ処理群に割り当てる。化合物の投与を、１〜７日目に開始してよい。実験の持続時間にわたって、皮下投与を、毎日又は１日おきに行うか又はその化合物を持続注入ポンプによって送達してよい。
【０１５７】
この実験の過程を通して、皮下腫瘍の大きさを追跡してよい。この実験の終了時に、この腫瘍を切除及び秤量し、そしてそれぞれの処理群の腫瘍の平均重量を算出する。
【０１５８】
代替的に、細胞株、例えばＯＶＣＡＲ−３を、雌ヌードマウスの腹腔内に、腹腔内注射してよい。実験に持続時間にわたって、皮下投与、静脈内投与、又は腹腔内投与を、毎日又は１日おきに行うか又はその化合物を持続注入ポンプによって送達してよい。この実験の終了時に、腫瘍を切除及び秤量し、そしてそれぞれの処理群の腫瘍の平均重量を算出する。ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、他の制癌剤、例えばパクリタクセル又はドキソルビシンと組み合わされた際に、腫瘍成長に対抗する活性の向上を示す。
【０１５９】
前記の取り合わせは、本発明の原理の適用を説明するにすぎないものと解されるべきである。多くの変更及び代替的な取り合わせが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく考案されてよい。本発明は図面で示され、かつ本発明の最も実用的かつ好ましい１つ以上の実施態様であると現在考えられるものと関連して個々に詳細に完全に上記される一方で、特許請求の範囲において説明される本発明の精神及び概念から逸脱することなく多くの変更がなされうることは当業者にとって明らかである。
【国際調査報告】
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