(57)【要約】治療上の使用のための生成物は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）によりアップレギュレートされることが同定された遺伝子またはその遺伝子産物である。その使用は、例えば、動脈保護または血管形成の促進である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンデアセチラーゼ９、
ＮＲ４Ａ１、
ＮＲ４Ａ２、
ＮＲ４Ａ３、
ＫＣＮＮ２、
ＥＨＤ３、
ＡＤＡＭＴＳ−１、
ＦｏｓＢ、
ＣＬＰＴＭ１、
ＤＵＳＰ−１（ＭＫＰ−１）、
溶質運搬ファミリー７、メンバー１（ｙ＋アルギニントランスポーター）、
溶質運搬ファミリー１２（ナトリウム／カリウム／クロリド）トランスポーター）、メンバー２、
ビネキシン−β、
ＧＲＯ−２、
Ｋｉｒ２．１（内向き整流カリウムチャネル）、
ＥＨドメイン結合有糸分裂ホスホプロテイン（エプシン）、
フォークヘッドボックスＣ１（ＦＫＨＬ７／ＦＯＸＣ１）、
ＮＧＦ１−Ａ結合タンパク質２（Ｅｇｒ１結合タンパク質２）、
活性化転写因子３、
Ｈ２．０様ホメオボックス１、
仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ４３４Ｆ０３１８、
ＫＩＡＡ１７１８タンパク質、
基本転写因子結合タンパク質１、
骨形成タンパク質１、
スプロウティ（ショウジョウバエ）ホモログ４、
ｃＡＭＰ反応性エレメント調節因子、
ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログ、サブファミリーＢ、メンバー９、
ｔ（１２；１６）悪性脂肪肉腫由来融合物、から選択される遺伝子または遺伝子産物である、治療用途のための生成物。
【請求項２】
遺伝子がＮｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１およびＮｏｒ１としても公知のＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２およびＮＲ４Ａ３から選択されるオーファン核受容体である、請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
動脈保護または血管形成促進のための医薬の製造用の、請求項１または２に記載の生成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明はＶＥＧＦにより誘導される遺伝子、およびそれらの遺伝子産物に関し、これらは新規な治療上の使用が見出されている。
【０００２】
背景技術：
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ａ）は内皮細胞分化（脈管形成）および胚血管系の発達における血管形成に必須であり、種々の疾患状態において新血管形成で主要な役割を果たしている。ＶＥＧＦに対する２種類のタンパク質チロシンキナーゼ受容体（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ１）が胚における血管発生に必須である。内皮細胞でのＶＥＧＦの生物学的効果は主にＫＤＲによって媒介されるが、近年の発見として、Ｆｌｔ−１がＫＤＲのネガティブ調節因子として働くかもしれないことが示されている。ニューロピリン−１はＶＥＧＦの非チロシンキナーゼ受容体であり、ＫＤＲに対する「結合」コレセプターとして機能し得る。ＫＤＲに結合した後、ＶＥＧＦは内皮細胞における複数の初期シグナル伝達カスケード（ホスホリパーゼＣ−γを含む）を活性化させ、ＰＫＣ活性および細胞内Ｃａ２＋動員の増加、ｐ４２／ｐ４４  ＥＲＫ１および２の活性化、ホスファチジルイノシトール３’キナーゼ依存性Ａｋｔ／ＰＫＢ活性およびｐ１２５焦点接着キナーゼのチロシンリン酸化を導く。続いて、ＶＥＧＦは内皮細胞の生存、増殖および遊走、ＮＯおよびＰＧＩ２の内皮産生および血管透過性の上昇を含む、インビボおよびインビトロでの数々の生物学的活性を誘発する。
【０００３】
内皮細胞内における種々の遺伝子のＶＥＧＦ誘導性アップレギュレーションが報告されている。例えば、Hernandezら、J Exp Med.2001l, 193：607-20；Leeら、J Biol Chem.2002, 277：10445-51；Arkonacら、J Biol Chem.1998, 273：4400-5；Masonら、Am J Physiol Cell Physiol.2002 Mar, 282（3）：C578-87；Kahnら、Am J Pathol.2000, 156：1887-900およびBellら、J Cell Sci.2001 Aug, 114（Pt15）：2755-73を参照。しかし、ＶＥＧＦにより調節される遺伝子発現のプログラムは不明のままである。特に、ＫＤＲの下流へのシグナル伝達およびＶＥＧＦにより誘導される長期生物学的反応の媒介において、おそらく中心的な役割を果たしている初期遺伝子発現事象および転写因子に関する情報が欠けている。
【０００４】
ＷＯ９８／２００２７は、内部肥厚の治療におけるＶＥＧＦの用途、とりわけ遺伝子送達に関するシステムを記載する。
【０００５】
発明の要旨：
本発明は、ＶＥＧＦがその生物学的活性を及ぼす分子メカニズムへの洞察を提供するために意図された試験に基づく。この試験では、１５，０００より多くのヒト遺伝子を提示するオリゴヌクレオチドアレイの分析をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲと組み合わせて用いてＶＥＧＦにより調節される遺伝子発現のパターンを試験した。示された結果のうち、同定されているＶＥＧＦ調節型遺伝子のいくつかはすでに血管形成に関連づけられていたが、ほとんどは血管形成または内皮機能のいずれにおいても役割を果たしていることは確立されていなかった。これらの知見における注目すべき特徴は、密接に関連するオーファン核受容体ファミリーを含むいくつかの前初期遺伝子の迅速なアップレギュレーションである。一方で、これらの知見により血管形成およびＶＥＧＦにより調節される他の細胞性機能の元となるメカニズムの理解が進むはずである。他方、ＶＥＧＦによりアップレギュレートされる遺伝子を用いることにより、所望の治療効果を得ることができるかもしれないことが示される。特に、ＶＥＧＦによりアップレギュレートされる遺伝子は、例えば、ＷＯ９８／２００２７に記載されるように、ＶＥＧＦと同じ意味での治療用途（動脈保護および血管形成の促進を含む）を有する。さらに、診断および活性薬剤のスクリーニングに用途を有する。
【０００６】
適切な遺伝子がｉｎ  ｓｉｔｕで発現され得ること、およびその代わりに対応する遺伝子産物を用いうることが理解される。いずれも従来的な方法で投与してもよい。
【０００７】
発明の説明：
本明細書中に記載の任意の生成物は、ＶＥＧＦについてＷＯ９８／２００２７に記載されている方法と同じ一般的な方法で用いることができる。治療ができる患者および状態は当業者であれば理解できるであろう。本明細書中に記載の生成物を用いる診断試験およびスクリーニング技術も当業者は簡単に理解し、実施するだろう。
【０００８】
例えば、本明細書に報告されている発見に基づいて、特定の遺伝子および遺伝子産物を、内部肥厚（これは狭窄または再狭窄および高血圧を導く）等の治療に用い得ることは明らかである。遺伝子または遺伝子産物（当業者であれば理解するように、本明細書中の目的に関しては活性フラグメントも含む）は治療を必要とする部位に、既知の方法により直接投与してもよいし、または、例えば、ＷＯ９８／２００２７に詳細に記載しているように周囲の不特定の（periadventitiously）位置に投与してもよい。適切なベクター等もこの文献に記載されており、この内容は参照により本明細書中に組み込む。
【０００９】
以下に報告する試験、すなわち、約１８，０００のヒト遺伝子を提示するオリゴヌクレオチドアレイのオリゴヌクレオチドアレイ分析により、これまでＶＥＧＦによりアップレギュレートされるか、および／または血管形成に関連するかのいずれかであると報告されていたいくつかのＶＥＧＦ調節型遺伝子を同定した。本発明の試験において同定した最も多くの遺伝子はＶＥＧＦ調節型遺伝子であり、従来、これらは血管形成または内皮細胞生物学に関係するとされていなかった。オリゴヌクレオチドアレイから得た結果を特異的定量ＲＴ−ＰＣＲ分析と比較すると、オリゴヌクレオチドアレイはＶＥＧＦ調節型遺伝子発現の有用な判断材料であるという見方が支持される。続いて、誘導された、またはダウンレギュレートされた遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにかけると、アレイにより同定した遺伝子から選択した２３遺伝子のうち１６遺伝子がＶＥＧＦにより調節され、各場合において、アレイおよびＲＴ−ＰＣＲで検出された遺伝子発現の変化のパターンおよび規模の両方は非常に密接に一致していた。従来の試験はより少数の遺伝子を分析したものであり、限定された独立した遺伝子発現分析を行ったものであるので、本明細書中に示す知見は、今日までのＶＥＧＦによる遺伝子発現の調節の最も総合的な研究を示すものである。
【００１０】
アレイから得た結果の有効性は、幾つかの公知のＶＥＧＦ誘導性遺伝子および血管形成関連遺伝子の本研究における同定により強調される。ＣＯＸ−２、ＨＢ−ＥＧＦ、分解促進因子およびインターロイキン−８は、ＶＥＧＦによりアップレギュレートされることがこれまでに実証されている。スタニオカルシン（Stanniocalcin）−１、インターロイキン−８、ナイドジェン−２、ホスホリパーゼＡ２−γおよびＣＯＸ−２はコラーゲンマトリックス中での毛細血管形成のｍＲＮＡプロファイリングにおいて誘導されていたが、他方、スタニオカルシン−１、スプロウティ（sprouty）、α２−マクログロブリンおよびＥｇｒ−１は類似モデルの毛細血管形態形成のｃＤＮＡマイクロアレイ分析においてアップレギュレートされていた。本明細書中で報告するＶＥＧＦ調節型遺伝子のうちの１０個（ＣＯＸ−２、ＨＢ−ＥＧＦおよびα２−マクログロブリンを含む）が、ＨＵＶＥＣ中でＶＥＧＦにより増加することが７２６７ヒト遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイを用いて見出された。その中の６個（Ｃｏｔ、Ｃ３Ｇ、ＮＲ４Ａ１、ＤＳＣＲ１、ＨＥＲＰＵＤ１、ＤＵＳＰ−５およびＥｇｒ３）はＶＥＧＦにより調節されるか、血管形成関連型である、と報告されてはいなかった。本出願の試験と、先のマイクロアレイ分析とで共通するＶＥＧＦ調節型遺伝子の数が制限されていることの、最大の理由は多分異なるアレイを使用したことであるが、さらなる原因因子として、先の試験ではおそらくアレイセットを１つしか用いず、限られた数の遺伝子の発現増加を定量ＲＴ−ＰＣＲにより確認したことが挙げられる。これに関連して、個々のオリゴヌクレオチドアレイで発現に顕著な変化を示したいくつかの遺伝子は、同時点での繰り返し分析において再現性よくは変化しなかった点に留意すべきである。さらに、３連のアレイにおいて強く誘導された遺伝子（Ｃ３Ｇを含む）には特異的ＲＴ−ＰＣＲにより確認できないものもあり、これは繰り返し分析を行った場合でさえ、オリゴヌクレオチドからの結果を解釈する際に疑陽性が問題となる可能性があることを示している。これらの結果は、特定の遺伝子の発現変化の評価には、アレイ方法を独立した定量方法で補うことが重要である点を強調するものである。異なるｃＤＮＡアレイの使用と同様に、毛細血管形成の間に同定された示差的に調節される遺伝子での結果における重複の制限はおそらく、毛細血管形成の間における多重相互作用血管形成因子の関与に起因し、血管形成の間に多くの遺伝子がアップレギュレートされるという事実は長期変化を示すが、他方、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦで処理した後に同定される最も印象的な変化の多くは作用開始が早い。
【００１１】
この試験から得られた知見の中でも最も突出したものの１つは、転写因子または転写調節因子をコードする複数の即時誘導性（rapidly-induced）遺伝子の同定である。ＶＥＧＦにより最も著しく誘導される遺伝子のうちの３つは密接に関連した「オーファン」核受容体（Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１およびＮｏｒ１）であり、これらはＮＲ４Ａファミリー核受容体を構成する。これら受容体はそれぞれ、Woroniczら、Nature 1994 Jan 20, 367（6460）：277-81；Zetterstromら、Science 1997 Apr 11, 276（5310）：248-50およびBandohら、Mol Cell Endocrinol.1995, 115：227-30において論じられている。
【００１２】
Ｎｕｒ７７（ＮＲ４Ａ１）の前初期発現は、主に神経細胞および神経内分泌細胞において血清、ＮＧＦおよびいくつかの他の刺激により誘導される。Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１およびＮｏｒ１のノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスにより示される限定的かつ非重複型の表現型は、これらの核受容体が共通であり、かつ独立した生物学的機能を果たすことを示している。Ｎｕｒ７７欠損マウスは明白な表現型は示さないが、Ｎｕｒ７７はＴ細胞受容体を介して誘導されるアポトーシスに必要であり、Ｎｕｒ７７またはＮｏｒ１のいずれかを示すトランスジェニックマウスは大規模なアポトーシスおよび胸腺細胞の減少を示す。セリン／トレオニンキナーゼであるＡｋｔ（これはＶＥＧＦにより強く活性化され、ＶＥＧＦ依存性細胞生存を媒介する主要な経路である）がＮｕｒ７７をリン酸化し、不活性化することが示されていることは注目すべきことである。これら分子はいずれも血管形成または内皮機能に関連することは報告されていないが、本明細書中に示す知見は、Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１およびＮｏｒ１がＶＥＧＦの転写調節に重要な、部分的に重複した、補完機能を果たし得ることを示唆している。
【００１３】
毛細血管形態形成の間に、いくつかの分泌型因子およびサイトカインもまた誘導され、スプロウティもまた誘導された。
【００１４】
クラスリン媒介エンドサイトーシス経路におけるタンパク質をコードする多数の遺伝子がＶＥＧＦにより増加し、これにはＥＨＤ３（Ｅｐｓ１５−ホモロジー（ＥＨ）ドメイン含有ファミリーのタンパク質であり、近年同定されたメンバーである）およびＥＨドメイン結合タンパク質であるエプシン（これはＥｐｓ１５と会合し、Ｅｐｓ１５と共にクラスリン会合型アダプター関連タンパク質複合体（ＡＰ−２）の構成成分である）が挙げられる。ＥＨドメインタンパク質ファミリーの別のメンバーであるＥＨＤ１はＡＰ−２のα−アダプチン成分と複合体を形成し、ＩＧＦ−１受容体の内在化に関係している。ＥＨＤ３自体はエンドサイトーシス小胞に局在し、トランスフェリン含有再利用コンパートメントと共に共局在化している。従って、ＥＨＤ３のＶＥＧＦ誘導性アップレギュレーションは内皮細胞でのクラスリン介在エンドサイトーシスプロセスに特定の役割を有し、おそらく細胞内ＶＥＧＦ受容体輸送に関与している。
【００１５】
以下の説明は、行った実験の詳細について示すものである。入手元を記載していない場合、用いた材料は入手できるグレードで最もグレードが高いものを用いた。
【００１６】
試験：
本明細書中で用いた略語は以下の通りである：Ｅｇｒ−３（初期増殖反応遺伝子−３）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）。
【００１７】
細胞培養およびＶＥＧＦ処理
ＨＵＶＥＣは、TCS CellWorks, Buckinghamshire, UKから購入した。細胞は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍｌヒト上皮細胞増殖因子、１２μｇ／ｍｌウシ脳抽出物、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンスルフェート（BioWhitakker, Berkshire, UK）を補充した内皮細胞基本培地（ＥＢＭ）中で培養した。実験のために、充分にコンフルエントな２〜３継代目のＨＵＶＥＣを、０．３％ＦＢＳ以外は他の補充物を含まないＥＢＭ中で予め一晩インキュベートした。続いて細胞を洗浄して残った血清を取り除き、ＶＥＧＦ（R&D Systems, Europe Ltd, Oxon, UK）と共にインキュベートし、ＲＮＡ抽出前にＰＢＳで２回洗浄した。
【００１８】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ
０分、４５分、９０分、６時間および２４時間の間、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）で処理したＨＵＶＥＣから、メーカーの使用説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Invitrogen, Paisley, UK）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いてＲＮＡをさらに精製した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Invitrogen）をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴ−（ｄＴ）プライマーと共に用いて逆転写を行った。二重鎖ｃＤＮＡをＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（Eppendorf, Cambridge, UK）、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で精製した。ビオチニル化ｃＲＮＡを作製するために、Ｅｎｚｏ  ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ転写標識キット（Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いてインビトロ転写を行った。ＲＮｅａｓｙキットでｃＲＮＡをクリーニングした後、フラグメント化ビオチニル型ｃＲＮＡ（１０μｇ）を４５℃で１６時間一定速度（６０ｒｐｍ）で回転させてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）（Ｕ１３３Ａアレイ）とハイブリダイズさせた。次いで、チップを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ中でストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｅｒで励起波長４８８ｎｍでスキャンした。各時点でのアレイに対するｃＲＮＡの調製およびハイブリダイゼーションはＶＥＧＦ処理の各時点において３個のアレイを用いて３個の独立した細胞培養物から３連で行った。次いで、これらアレイを、独立した未処理コントロール細胞由来の各々３個のＲＮＡ調製物とハイブリダイズさせた３個のコントロールアレイと比較した。
【００１９】
データ分析
比較分析の前に、各チップからのデータを、ヒトハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン、ＧＡＰＤＨおよびＩＳＧＦ−３（ＳＴＡＴ１）をポジティブコントロールとして用いてＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ５．０（Affymetrix）により正規化し、等級付けした。各プローブファミリーについての完全適合と、ミスマッチ度との間の平均差異に基づいて、転写物量を測定した。転写物がチップ上で発現されているか否かを統計上決定するために検出Ｐ値を作製した。２個のチップを比較するために、変化Ｐ値、差異コール（difference call）およびシグナルｌｏｇ比率をソフトウェアにより作製した。本出願の試験では、９個の対交差比較（３個のコントロールＲＮＡ調製物を各３個のＶＥＧＦ処理ＲＮＡと比較した）を各時点について作製した。転写物がＶＥＧＦ処理により示差的に発現されるか否かを決定するために、Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Affymetrix）を用いてさらに全データを分析した。増加または減少を示す転写物をスコアし、９個の交差比較全てにおいて同じ変化を示す転写物をスコア１００と示す。従って、本出願の試験において、転写物は以下の基準より示差的に発現されているとみなす；１）変化Ｐ値＜０．００３（発現増加）または＞０．９９７（発現減少）；２）８８．９より大きいスコア（９個の交差比較のうち８個が同じコールを示す）；３）９個の交差比較の平均シグナルｌｏｇ比率が＞ｌ（２倍より大きい増加を示す）または＜−１（１／２未満への減少を示す）。
【００２０】
逆転写物およびリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて抽出し、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Qiagen）を用いて室温で１５分間処理した。全ＲＮＡ（２μｇ）からオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて反応体積２０μｌでＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）で一本鎖ｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲ用に２００μｌに希釈した。リアルタイムＰＣＲ用の正方向および逆方向プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi）により遺伝子の３’非翻訳領域の配列を用いてフラグメントに対する特異性を確実にするように設計し、増幅されたフラグメントが確実に２００〜２５０塩基対のサイズになるようにした。Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによりプライマーを合成し、推定サイズのフラグメントを特異的に増幅する能力を通常のＲＴ−ＰＣＲ方法により確認した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩキットおよびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Roche Diagnostics, East Sussex, UK）をメーカーの使用説明書に従って用いてリアルタイムＰＣＲを行った。融解曲線を用いて、ＳＹＢＲ緑色結合型蛍光の原因がプライマーダイマーではなくアンプリコンのみの場合の温度を同定した。各サンプルについてＰＣＲを２連で行い、２回の独立した実験に由来するＲＮＡ調製物をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いた。参照遺伝子であるグリセルアルデヒド３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対してデータを正規化し、コントロールと比較して平均増加割合または平均減少割合（±標準偏差）として示す。
【００２１】
結果
ＶＥＧＦ調節型遺伝子発現を調べるために、ＶＥＧＦで処理したＨＵＶＥＣのコンフルエント培養物からｃＲＮＡを調製し、１５，０００より多いヒト遺伝子を示すＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ高密度オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせた。ＶＥＧＦ処理細胞およびコントロール細胞との間のシグナル比のｌｏｇから計算した、ＶＥＧＦにより誘導される発現の変化倍率として示した結果から、８８個の異なる遺伝子が２倍を超えるＶＥＧＦ誘導性アップレギュレーションを示し、１００個の遺伝子が１／２未満のダウンレギュレーションを示した。異なるパターンの遺伝子発現が異なる時点で観察された。４５分後に、ＶＥＧＦで処理したＨＵＶＥＣ中で１８個の遺伝子が未処理のコントロールと比較して２倍より多く増加し、そのうちの１６個は９０分後にも誘導されており、更に後の時点では１個のみがアップレギュレートされていた。組織因子は４５分の時点で最も強く誘導されている遺伝子であったが、後の時点ではアップレギュレートされていなかった。反対に、４５分の時点で変化を示さなかった２０個の遺伝子は９０分後に２倍より高く上昇しており、２８個の遺伝子は６時間後にのみ上昇し、さらに２１個の遺伝子は２４時間後にのみ上昇した。４５分後ではＶＥＧＦによる顕著な遺伝子ダウンレギュレーションは生じず、９０分後には１個の遺伝子がダウンレギュレートされたが、６時間後には１７個の遺伝子がダウンレギュレートされ、２４時間後には８２個がダウンレギュレートされた。
【００２２】
選択した遺伝子のＶＥＧＦ調節型発現のさらなる分析は、試験したいずれの時点においてもＶＥＧＦの影響を顕著には受けないＧＡＰＤＨを参照遺伝子として用いて、異なる時点でのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより行った。遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析用コントロールとしてのＧＡＰＤＨの妥当性について、ＶＥＧＦで処理していない、時間を適合させたコントロール細胞でのＧＡＰＤＨレベルを測定することによりさらに試験した。未処理コントロール細胞におけるＧＡＰＤＨ発現は４８時間にわたり有意には変化しなかった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて既知のＶＥＧＦ調節型遺伝子であるＣＯＸ−２の発現を試験し、このオリゴヌクレオチドアレイ分析により、４５分後および９０分後に３〜４倍に誘導されることを示した。ＣＯＸ−２はＶＥＧＦでの処理の２０分後に顕著に誘導され、この影響は４５分後も持続し、その後、減少するが、最大６時間の間コントロールレベルより２倍以上高いままであった。
【００２３】
転写因子または転写調節に関連する因子はＶＥＧＦ誘導性遺伝子の最も大きい機能的グループを形成し、幾つかの転写因子はＶＥＧＦにより最も強くアップレギュレートされる遺伝子であった。特に、４５分および９０分の時点で、ＶＥＧＦは３個の関連するオーファン核受容体（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２およびＮＲ４Ａ３。これらはまた、Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ  １およびＮｏｒ  １としても公知）をコードする遺伝子の発現を顕著に誘導した。これら遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により、オリゴヌクレオチドアレイ分析から得た結果を確認し、これら遺伝子の最大発現が約４５分の時点で生じ、その後、発現は速やかに減衰し、３時間後にはコントロールレベルに達することが示された。ＶＥＧＦは、４５分後にはいくつかの他の転写因子遺伝子（Ｅｇｒ２、サイクリックＡＭＰ反応性エレメント調節因子２型およびショウジョウバエホメオボックス遺伝子のヒトホモログ）の発現を３倍より高く増加させた。さらに、９０分後には、ＶＥＧＦはＥｇｒ１結合タンパク質２の発現を誘導し、転写因子３、フォークヘッド因子ＦＫＨＬ７およびミオサイトエンハンサー因子２Ｃを活性化する。ＶＥＧＦは、ヒストンデアセチラーゼ９（これは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼの効果を妨害し、転写抑制を引き起こすことにより転写調節において重要な役割を果たすクラスＩＩヒストンデアセチラーゼファミリーの一員である）の６時間後の発現を増加させた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ＨＤＡＣ９の発現の増加が３時間後に検出され、６〜１２時間後に最大に達し、２４時間後に減少するものの発現の基底値は超えたままであることが示された。
【００２４】
ＶＥＧＦは、インターロイキン−８、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子、ＧＲＯ−２および骨形成性タンパク質２を含む種々のサイトカインおよび増殖因子の遺伝子発現を、４５分後に誘導した。９０分後および６時間後に誘導される、分泌型因子をコードする他のＶＥＧＦ誘導性遺伝子はスタニオカルシン−１およびスプロウティホモログ４であった。２４時間後、増殖因子ＩＧＦ−２およびグリア成熟因子−αをコードする遺伝子はＶＥＧＦにより３倍に増加した。しかしながら、２４時間目に最も強く増加した分泌因子はα２−マクログロブリンであり（６倍に誘導）、これはヒト血漿中に高濃度で存在する非常に良く保存されているプロテイナーゼインヒビターである。ＢａｒｒｅｔｔおよびＳｔａｒｋｅｙ，Biochem J.1973, 133：709-24を参照。Ｏｌｓｅｎら（Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93：1792-6）は、毛細血管形態形成の間にスタニオカルシン−１がアップレギュレートされるが、その血管形成における機能または内皮機能は未知であることを議論している。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるこの遺伝子の発現のさらなる分析により、ＶＥＧＦがスタニオカルシン−１の迅速な誘導を引き起こし（これは２０分後に検出可能であった）、４５分後に最大値に達して３時間後まで持続し、その後に減衰するが２４時間の間はコントロールレベルを有意に超えたままであることが示された。
【００２５】
幾つかのシグナル伝達分子がＶＥＧＦにより誘導され、その中でもセリン／スレオニンキナーゼＣｏｔ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８）ならびに二重特異性のフォスファターゼであるＤＵＳＰ−１（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ１）およびＤＵＳＰ−５（ＶＨ３とも称する）は９０分後に最も顕著に発現されるが、Ｃｒｋ特異的グアニンヌクレオチド放出因子Ｃ３Ｇ（約１０倍の誘導）は６時間後に最も顕著に誘導され、Ｒａｃ−３および細胞質Ｃａ２＋非依存性ホスホリパーゼであるホスホリパーゼＡ２−αは２４時間後に最も顕著に誘導された。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＶＥＧＦ誘導性Ｃｏｔ  ｍＲＮＡ発現は４５分後に最大になり、９０分後も増加したままであり、６時間後に基底レベルまで減少することが示された。
【００２６】
ＶＥＧＦは２種類のイオンチャネル（内向き整流カリウムＫ＋チャネルであるＫｉｒ２．１および小コンダクタンスＣａｔ２＋−活性化Ｋ＋チャネルであるＳＫ２またはＫＣＮＮ２）の発現を増加させた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＳＫ２発現のタイムコースを分析すると、９０分後にコントロールレベルを約６倍より高く超えて誘導されており、その後、減少するが最大４８時間の間、基底レベルを有意に超えていることが示された。また、ＶＥＧＦは２個の輸送体分子（Ｎａ＋／Ｋ＋／Ｃｌ−共輸送体（ＳＬＣ１２Ａ２またはＮＫＣＣ１）およびｙ＋システムカチオン性アミノ酸輸送体（ＣＡＴ１またはＳＬＣ７Ａ１））の遺伝子発現を６時間後に誘導した。ＶＥＧＦ誘導性ＣＡＴ１発現のさらなる分析により、４５分後に２．５倍に増加し、最大６時間後にコントロールレベルよりも２倍以上高いままであり、２４時間後に基底レベルに戻ることが示された。
【００２７】
クラスリン媒介エンドサイトーシスにおいて役割を果たすことが公知である、またはそのように推定される幾つかの遺伝子が誘導された。この機能カテゴリーにおいて最も初期に、最も強く誘導された遺伝子は、Ｅｐｓ１５ホモロジー（ＥＨ）ドメイン含有タンパク質であるＥＨＤ３をコードする遺伝子であった。ＥＨＤ３は６時間後および２４時間後に顕著に誘導され、６時間後に６倍の増加を示し、２４時間後に４倍の増加を示すという知見を定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した。ＶＥＧＦはまた、エプシン（クラスリンコート型ビヒクル成分であるＥｐｓ１５およびクラスリン結合型アダプター関連複合体２の両方と会合するＥＨドメイン結合タンパク質）の発現を６時間後に誘導した。クラスリン会合型アダプター関連複合体１のシグマ１サブユニットの発現の増加も２４時間後に生じた。
【００２８】
ＶＥＧＦは、その機能がほとんど規定されていない公知遺伝子のいくつかの発現を顕著に誘導した。このカテゴリーで最も顕著に誘導される遺伝子はＤＳＣＲ１であった。ＤＳＣＲ１の発現は４５分後に約４０倍に増加し、続いてゆっくりと減少したが、最大６時間目まで基底値の約２倍以上のままであった。口唇口蓋裂（cleft lip and palate）関連膜透過タンパク質１（ＣＬＰＴＭ１）をコードする遺伝子もまた、ＶＥＧＦにより誘導された。ＣＬＰＴＭ１遺伝子は一般的な先天性欠損症である口唇口蓋裂と関連して染色体転位により破壊されており、２個のシノラブディス・エレガンス遺伝子と類似性が高いが、他の機能は未知である。
【００２９】
オリゴヌクレオチドアレイ分析により、６時間後および２４時間後に幾つかの遺伝子の顕著なダウンレギュレーションが示された。６時間目にダウンレギュレートされた遺伝子は、細胞表面タンパク質または細胞−細胞接合に関連するタンパク質（密着結合成分クラウディン５、ギャップ結合タンパク質コネキシン３７、上皮Ｖ様抗原１（ＥＶＡ−１）および水チャネルタンパク質であるアクアポリン１を含む）のいずれかをコードする。ＶＥＧＦはまた、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバー、ＴＲＡＩＬおよび１，２−α−マンノシダーゼ（マンノースリッチなオリゴ糖中間体の処理の間にマンノース残基を加水分解するゴルジ関連酵素）の発現を顕著に低下させた。選択したダウンレギュレート型遺伝子の特異的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、コネキシン３７の発現の顕著な減少は９０分後の早い段階で検出可能であり、最大２４時間持続したが、クラウディン５、ＥＶＡ−１、１，２−α−マンノシダーゼおよびＴＲＡＩＬの発現は６時間目および／またはそれより早い時点で減少し、１２時間または２４時間後にはコントロールレベル以上まで戻った。
【００３０】
ＶＥＧＦでの処置２４時間後にダウンレギュレートされる遺伝子の最も大きな機能的クラスは細胞サイクルレギュレーターならびに分裂装置およびＤＮＡ合成に関連する他の遺伝子であった。２４時間目にＶＥＧＦによりダウンレギュレートされる遺伝子はまた、多数の未知の機能または同定されていない遺伝子を含んでいた。
【国際調査報告】
2007528364.tif 000002
2007528364.tif 000003
2007528364.tif 000004
2007528364.tif 000005
2007528364.tif 000006
2007528364.tif 000007
2007528364.tif 000008
2007528364.tif 000009
2007528364.tif 000010
2007528364.tif 000011