(57)【要約】本発明は、少なくとも1種の安定化されたTat抗原を含有する少なくとも1種の抗HIVワクチン組成物を含むワクチン組成物、並びにヒトHIV感染を予防及び／又は治療するためのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解に耐性の少なくとも1つの安定化Tat抗原を含み、該安定化抗原が：
a)    HIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントと、Tatの非金属リガンドとの複合体、
b)    R52L、R55L、R57L、R78A、G79A、E80A及びK89Lの置換を除く、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメント、及び
c)    b)で規定される、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたTatタンパク質又はTatフラグメントと、Tatの非金属リガンドとの複合体
からなる群より選択されることを特徴とするHIVワクチン組成物。
【請求項２】
a)又はc)の前記非金属リガンドが、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオチド又は本質的にそれらの混合物であることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
a)又はc)の前記非金属リガンドが、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸及びヘパリン又はヘパラン硫酸のようなポリ硫酸グリコサミノグリカンから選択されるポリ硫酸化糖類であることを特徴とする請求項2に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ヘパリンが、15000 Daの分子量を有するヘパリン又は6000 Daの分子量を有するヘパリンフラグメントであることを特徴とする請求項3に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
a)又はc)の前記非金属リガンドがHIV Vprタンパク質であることを特徴とする請求項2に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
b)の前記Tatタンパク質又は前記Tatフラグメントが、位置22、25、27、30、31、34及び／又は37に位置する1〜7のシステインの、疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されている請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
少なくとも位置25、27、30及び31の4のシステインが、疎水性アミノ酸で置換されているか及び／又は疎水性基で修飾されている請求項6に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、トリプトファン及びフェニルアラニンからなる群より選択され、及び／又は前記疎水性基がS tert-ブチルであることを特徴とする請求項6又は7に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記安定化Tat抗原が、不活化Tatタンパク質又は不活化Tatフラグメントに由来することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記不活化Tatタンパク質又は前記不活化Tatフラグメントが、位置22、34及び37の各システインのセリンへの置換、又は位置52及び53の各アルギニンのグルタミンへの置換を含むことを特徴とする請求項9に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記Tatタンパク質又は該タンパク質のフラグメントが、101アミノ酸のTatタンパク質、86アミノ酸のTatタンパク質、Tatのフラグメント1〜57及び前記タンパク質又はフラグメントに含まれる少なくとも11アミノ酸のフラグメントから選択されることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記安定化Tat抗原が、配列番号1のTatタンパク質又はこの配列の少なくとも11アミノ
酸のフラグメントに由来することを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
a)の前記Tatタンパク質又は前記Tatフラグメントが、多価カチオン、好ましくは二価カチオン、例えばZn2+又はCd2+から選択される金属イオンとも複合体化されていることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
b)又はc)の前記修飾Tatタンパク質又は前記修飾Tatフラグメントが、多価カチオン、好ましくは二価カチオン、例えばZn2+又はCd2+から選択される金属イオンとも複合体化されていることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記Tatタンパク質又は前記Tatフラグメントがモノマーであることを特徴とする請求項1〜14のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記Tatタンパク質又は前記Tatフラグメントがオリゴマー、好ましくはダイマーであることを特徴とする請求項1〜14のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記オリゴマー、好ましくはダイマーが、前記Tatタンパク質及び／又は該タンパク質のフラグメントの位置22、25、27、30、31、34及び37のシステインの1つを伴う分子間ジスルフィド結合による共有結合で形成されることを特徴とする請求項16に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記ジスルフィド結合が、位置22、34又は37のシステインの1つを伴うことを特徴とする請求項17に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
Tatダイマーが、2つのTatタンパク質又は位置22及び37のセリンと位置25、27、30及び31のロイシンとを含む少なくとも11アミノ酸の2つのTatフラグメントの位置34のシステイン間のジスルフィドブリッジによる結合で形成されることを特徴とする請求項18に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記オリゴマー、好ましくはダイマーが、前記Tatタンパク質及び／又は該タンパク質のフラグメントの、金属イオン、好ましくは多価カチオン、特に二価カチオン、例えばZn2+及びCd2+による非共有結合で形成されることを特徴とする請求項16に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
任意に修飾されていてよい前記Tatタンパク質及び／又は該タンパク質のフラグメントが、前記タンパク質及び／又は前記フラグメントをコードするポリヌクレオチド又は組換えベクターの形にあることを特徴とする請求項1〜20のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
医薬的に許容される媒体及び／又はアジュバント及び／又は担体物質を含むことを特徴とする請求項1〜20のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
請求項1〜20のいずれか1つに記載の安定化抗原と、医薬的に許容される媒体及び／又は担体物質とからなることを特徴とする請求項22に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントが水酸化アルミナであることを特徴とする請求項22に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
ヒトにおけるHIV感染の予防及び／又は治療用のワクチンとしての、請求項1〜21のいず
れか1つに記載の安定化Tat抗原。
【請求項２６】
請求項1〜21のいずれか1つに記載の安定化Tat抗原の、ヒトにおけるHIV感染の予防及び／又は治療用のワクチンを製造するための使用。
【請求項２７】
-   請求項14で規定されるTatの金属リガンド、及び／又は請求項2〜5のいずれか1つで規定されるTatの非金属リガンドと結合した
-     請求項1、6〜12及び15〜19のいずれか1つで規定される、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメント
からなることを特徴とするペプチド複合体。
【請求項２８】
R52L、R55L、R57L、R78A、G79A、E80A及びK89Lの置換を除く、請求項1、6〜12及び15〜19のいずれか1つで規定される、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントから選択されることを特徴とするタンパク質又はペプチドフラグメント。
【請求項２９】
少なくとも：
-     いずれの適切な手段により、請求項1、9〜18及び21のいずれか1つで規定されるHIV
Tatタンパク質又はTatフラグメントを作製し、同時に又は逐次的に
-     請求項2〜5のいずれか1つで規定されるTatの非金属リガンドとの複合体を形成し、及び／又は請求項1、6、7及び8のいずれか1つで規定されるTat配列のアミノ酸残基の少なくとも1つを疎水性アミノ酸で置換し、及び／又は該アミノ酸残基の少なくとも1つを疎水性基で修飾する
ことを含むことを特徴とする、安定化Tat抗原を作製する方法。
【請求項３０】
a)  請求項1、6〜13及び15〜19のいずれか1つで規定される、HIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントをコードする配列と、Tatのペプチドリガンドをコードする配列とを含むポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド混合物、及び
b)    R52L、R55L、R57L、R78A、G79A、E80A及びK89Lの置換を除く、請求項1、6〜12及び15〜19のいずれか1つで規定される、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド混合物。
【請求項３１】
請求項30のa)又はb)で規定されるポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項３２】
請求項30のa)で規定される混合物のポリヌクレオチドをそれぞれが含む、組換えベクターの混合物。
【請求項３３】
請求項30〜32のいずれかで規定されるポリヌクレオチド、組換えベクター又は混合物で改変された真核細胞。
【請求項３４】
請求項13又は14で規定される金属イオンの、HIV Tatタンパク質又は該タンパク質の少なくとも11アミノ酸のフラグメントを安定化するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化(stabilized) Tat抗原及び抗HIV免疫化のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群(AIDS)は、ヒト免疫不全ウイルス(HIVタイプ1 (HIV-1)又はタイプ2 (HIV-2))を原因とする性感染性疾患である。この疾患は絶えず増加し、現在では、世界で4200万人を超える個体が感染している。この理由から、この汎流行病に対抗するためのワクチンの開発が、最も急務である。
【０００３】
多くのワクチンアプローチが20年近く開発されているが、有効なワクチンの開発には至っていない。しかし、感染サイクル及びAIDS段階の進行の原因となるウイルスタンパク質についての知見が常に増加しており、このことが新規な有望なワクチン標的：HIV調節タンパク質の使用への道を開いている。元来は軽視されていたこれらのタンパク質は、ここ数年、ウイルス複製におけるそれらの役割のために多くの研究の主題となっている。
【０００４】
これらのタンパク質のうち、HIVのTat転写調節物質は、特に有用なワクチン標的である。なぜなら、AIDS段階へ進行しないことは、高力価抗Tat抗体と特異的細胞毒性細胞との存在に関係するからである(Zaguryら, J. Hum. Virol., 1998, 1: 282〜292; Reら, J. Clin. Virol., 2001, 21: 81〜89; Van Baalenら, J. Gen. Virol., 1997, 78: 1913〜1918)。
【０００５】
Tat遺伝子は、HIV株によって99〜103アミノ酸のタンパク質をコードする2つのエキソンを含む。最初の72アミノ酸をコードするエキソン1は、完全トランス活性化活性を有し、5つのドメインを含む。(1) 細胞タンパク質との相互作用に重要であるN末端ドメイン(位置1〜21)、(2) トランス活性化に関わる、7つのシステイン残基(位置22、25、27、30、31、34及び37)を含有する(そのうちの6つは強く保存される)システインリッチドメイン(位置22〜37)、(3) トランス活性化に関わる、位置38〜48に相当するセントラル(コア)ドメイン、(4) 核局在化、経細胞輸送及びウイルスLTR (長末端反復)のTAR (トランス活性化応答)要素への結合に関わる配列を含み、Tatのヘパリンへの結合にも関わる塩基性ドメイン(位置49〜57)、及び(5) グルタミンリッチドメイン(位置50〜72)。サイズが変動するエキソン2は、トランス活性化活性は有さないがインテグリン受容体へのTatの結合に必要なRGDモチーフ(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸；位置78〜80)を含むC-末端ドメイン(位置73からC末端の端まで)をコードする。
【０００６】
99〜103アミノ酸のTatタンパク質の他に、細胞培養での継代の間のHIV変異により、位置87で停止コドンが発生することによりインビトロで産生される86アミノ酸の短縮されたTatタンパク質も存在する。
【０００７】
単離され精製された組換え又は合成Tatタンパク質は、非常に安定で、特に変性及び還元(100 mM DTT; Tosiら, Eur. J. Immunol., 2000, 30: 1120〜1126)に耐性があるオリゴマー(ダイマー又はトリマー)を形成するように溶液中で結合する。よって、Tat調製物は不均質であり、モノマー、ダイマー及びトリマーの混合物を含む(米国特許出願第2003/0158134号)。しかし、Tatオリゴマーの形成に関与する相互作用の実際の性質は知られていない。特に位置37のシステインを伴うジスルフィドブリッジ、又は特に多価カチオン、好ましくは二価カチオン(亜鉛、カドミウム)を伴うその他の強い化学的相互作用が示唆されている(Battagliaら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201: 701〜708; Frankelら, Science, 1988, 240: 70〜73; Huangら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1996, 227
: 615〜621; Misumiら, Aids Research and Human Retroviruses, 2004, 20: 297〜304)。
【０００８】
Tatは、ウイルス複製に必須の転写因子であり(Fischerら, Nature, 1986, 320: 367〜371)、これは潜在HIVの活性化及びその他の細胞遺伝子発現の調節解除の両方を行うことができる。なぜならそれは、感染細胞により放出され、その他の感染細胞又は非感染細胞に組み込まれる特殊性を有するからである(経細胞輸送：Ensoliら, J. Virol., 1993, 67: 277〜287; Changら, Aids, 997, 11: 1421〜1431)。Tatがインビトロで毒性効果を有することが示されている。これらの効果は、アポトーシスに関わる細胞シグナルの調節解除、免疫系の遺伝子、例えばインターロイキン2遺伝子及びインターフェロン−α遺伝子、又は主要組織適合複合体(MHC)クラスI及びクラスII分子をコードする遺伝子の一部分の発現の調節解除、及び／又は血管新生の誘導を含む。
【０００９】
ウイルス感染におけるTatの種々の形の相対的な役割は明らかにされておらず、抗ウイルス免疫におけるそれらの役割は研究されていない。実際に、Tatオリゴマーは、いずれの生物活性も有さないようである。なぜなら、まず、哺乳動物細胞から産生される細胞外Tatタンパク質はモノマーであり、次に、Tatの種々の形を特異的に認識する抗体を用いるTatのトランス活性化活性の阻害は、モノマーのみが細胞に進入可能でありウイルスLTRをトランス活性化できるからである(Riceら, Virology, 1991, 185: 451〜454; Tosiら、上記)。
【００１０】
よって、Tatは多くの生物活性を有し、ウイルス蔓延及び病理発生の両方：AIDS段階への進行及びAIDS関連病理、例えばカポジ肉腫、において役割を演じている可能性がある。
よって、修飾されていない、生物学的に活性なTatタンパク質は、サルをHIV-1感染に対して防御することができるが(Cafaroら, Nat. Med., 1999, 5: 643〜650)、毒性タンパク質の使用は、ヒト免疫化のための免疫原として構想できない。
この理由から、ヒトにおいてワクチンとして用いることができる生物学的に不活性なTat誘導体を得るための種々のアプローチが考えられている。
【００１１】
不活化は、ウイルスゲノムの転写、次いでその他の活性、例えばT細胞増殖抑制の阻害をトランス活性化するTatの能力を排除することに主に関係する。これらの研究は、次の手段により得られるTatの生物学的に不活性な誘導体の発見をもたらした。
-     Tat遺伝子の配列における変異：(i) -NH2又は-COOH端の欠失、あるいはシステイン残基の欠失又は置換(国際出願WO 95/31999)、(ii) システインリッチドメインの全てのシステイン残基の保存的置換(システイン→セリン、国際出願WO 03/054006)、(iii) 位置49〜72及び／又は73〜101、特に位置49〜57の少なくとも2アミノ酸残基の置換(K51T、R52L、R55L、R57L)、RGDドメインの置換(G79A)又は位置88〜92の置換(K89L、E92Q)及び任意に位置27のシステインの置換(C27S) (国際出願WO 03/057885)、並びに(iv) アミノ酸残基(C22、T23、N24、Y26、K28/29、C30、C31、F32、K33、E35、F38、K41、Y47、A57)の欠失、又はアミノ酸残基の置換(T23A、N24A、C22G、K41T；国際出願WO 99/27958)。
【００１２】
-     非進行性の血清反応陽性個体に天然に存在するTat遺伝子変異の分析：N-末端領域又はエキソン2での変異形(国際出願WO 01/12220)；C22S置換を有する、Oyi単離体に由来する変異形(国際出願WO 00/61067)。
【００１３】
-     Tatタンパク質の化学的又は物理的処理：(i) アルデヒド、例えばホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドでの処理(PCT国際出願WO 96/27389)、(ii) ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるシステインのカルボキシメチル化(PCT国際出願WO 99/33872)、並びに(iii) 特に過酸化水素若しくは過ヨウ素酸ナトリウムとの、又は照射による酸化(米国特許出願第2003/0215797号; 国際出願WO 01/12220; Cohenら, P.N.A.S., 1999, 96: 10
842〜10847)、及び
-     混入RNA及びエンドトキシンを排除するための方法による、組換えTatタンパク質の精製(PCT国際出願WO 03/073984)。
【００１４】
システイン22及び37がセリンで置換されたTat誘導体が免疫原性であること(Caselliら,
J. Immunol., 1999, 162: 5631〜5638)、及びTatのカルボキシメチル誘導体が免疫原性であり、サルにおける疾患の進行の減速を誘導できること(Pauzaら, P.N.A.S., 2000, 97, 3515〜3519)が特に示されている。
これらの結果は、生物学的に活性であるか又は予め不活化されたTat免疫遺伝子(immunogene)が、有効なHIVワクチンの確立に寄与できることを示す。しかしながら、ワクチンの有効性は、強い免疫応答を誘発するその能力に大きく依存する。現在、Tat分子はその免疫抑制能力について知られており(Cohenら,上記)、動物、特にサルにおいて弱く免疫原性である。よって、カルボキシメチル化されたTatトキソイドにより誘発される疾患の減速は、5回の一連の免疫化を必要とし(Pauzaら, P.N.A.S., 2000, 97: 3515〜3519)、生物学的に活性なTat分子により与えられる防御は、プロトコルによると、9又は10回の一連の免疫化の後に得られている(Cafaroら, 上記)。
【００１５】
したがって、HIVに対して有効なワクチンを開発するために、従来技術のTat抗原のものに比べて免疫原性が増大したTat由来抗原を開発する真の必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、そのような抗原を開発することを目的とした。
本発明者らは、驚くべきことに、Tatタンパク質は非常に不安定であり、タンパク質分解酵素により迅速に分解されることを示した。Tatのこの特徴の証明により、Tatの安定性を向上させることにより、そのタンパク質分解の感受性が低減され、かつ生物におけるその半減期及びその免疫原性が増大されるはずであるという仮説を導いた。この仮説は、非修飾のTatの免疫原性を、リガンドとの複合体の形成又は疎水性基の組み込みのいずれかにより予め安定化されたTatの免疫原性と比較することにより、確かめられた。非修飾のTat又はシステインが比較的免疫原性でないアセトアミドメチル基でブロックされたTatトキソイドと比べると、安定化Tat誘導体は、動物において少なくとも10倍高い(10〜35倍)抗Tat抗体力価を誘導し、Tat特異的細胞応答を誘導することができる。さらに、これらの誘導体は低減されたトランス活性化活性を示し、このことは毒性がないことを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の主題は、タンパク質分解に耐性の少なくとも1つの安定化Tat抗原を含み、該安定化Tat抗原が：
a)    HIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントと、Tatの非金属リガンドとの複合体、
b)    R52L、R55L、R57L、R78A、G79A、E80A及びK89Lの置換を除く、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメント、及び
c)    b)で規定される、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたTatタンパク質又はTatフラグメントと、Tatの非金属リガンドとの複合体
からなる群より選択されることを特徴とするHIVワクチン組成物である。
【００１８】
c)における2つの修飾の組み合わせは、a)又はb)における修飾の1つだけ行って得られるものよりも、Tatの免疫原性における増加をより大きくすることを可能にする(少なくとも5倍)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義
「Tat抗原」の用語は、ヒト又は哺乳動物において、特異的な体液性及び／又は細胞性の応答を誘発できるTatタンパク質又はこのタンパク質の少なくとも11アミノ酸のフラグメントのモノマー又はオリゴマー、特にダイマーを意味することを意図する。上記のTat抗原は、上記で規定されるように、生物学的に活性であるか、あるいはTat遺伝子の配列の変異、特にシステインリッチ領域のシステイン残基のセリンでの置換により又はTatの物理的処理(照射)若しくは化学的処理(アルデヒドの作用、酸化)により不活化されているかのいずれかである。
【００２０】
「Tatオリゴマー」の用語は、1又は複数の共有及び／又は非共有結合による、互いに同一又は異なる(ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマー) Tatモノマー(タンパク質及び／又はフラグメント)の結合を意味することを意図する。共有結合オリゴマーは、システイン残基の酸化によるジスルフィドブリッジの形成又はその他の化学結合(オキシム、ヒドラゾン)の形成に特に起因するか、あるいはグルタルアルデヒドのようなホモ二官能性基若しくは3-((2-アミノエチル)ジチオ)プロピオン酸塩酸塩のようなヘテロ二官能性基との反応に起因する。非共有結合オリゴマーは、ロイシンジッパーモチーフ又は金属イオン、例えば亜鉛若しくはカドミウムにより形成され得る。
【００２１】
「Tatタンパク質」(又は「Tat」)の用語は、株に応じて約86〜103アミノ酸の配列に相当する、いずれのHIV株(HIV-1又はHIV-2)のTatタンパク質を意味することを意図する。
【００２２】
「Tatの非金属リガンド」の用語は、Tat又はTatフラグメントに結合できる金属イオン以外の化合物を意味することを意図する。これは、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオチド(DNA、RNA)又は本質的に(in nature)それらの混合物(糖脂質、糖タンパク質)であり得る。これは、特に、HIV Vprタンパク質；ポリ硫酸化糖類、例えばデキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸及びポリ硫酸グリコサミノグリカン、特にヘパリン、ヘパラン硫酸、及びRusnatiら, J. Biol. Chem. 1998, 273: 16027〜16037に記載される化合物を含む。
【００２３】
「Tatの金属リガンド」の用語は、金属イオン、特に多価カチオン、好ましくは二価カチオン、例えば亜鉛(Zn2+)及びカドミウム(Cd2+)を意味することを意図する。
【００２４】
「安定化Tat抗原」の用語は、キモトリプシンを用いる2時間の消化(酵素／基質の比が1/50 (W/W))の後に、コア領域のエピトープ(KGLGISYGRK)に指向された抗Tat抗体により認識されるTat誘導体の割合が、同じ消化の後に同じ抗体により認識される非修飾のTatの割合よりも少なくとも20%さらに大きく、好ましくは少なくとも50%さらに大きくなるような物理的又は化学的修飾を含む、上記で規定されるTatタンパク質又はTatフラグメントの誘導体を意味することを意図する。
【００２５】
「疎水性アミノ酸」の用語は、L (ロイシン)、V (バリン)、I (イソロイシン)、A (アラニン)、M (メチオニン)、F (フェニルアラニン)、W (トリプトファン)若しくはY (チロシン)から選択される天然アミノ酸、又は天然ペプチド鎖の-CO-と-NH-との間に位置するR側鎖を有する炭素、すなわち-CHR-基が、天然タンパク質又は天然ペプチドの構造の一部分を形成しないモチーフで置換されている、タンパク質に由来しないアミノ酸のいずれかを意味することを意図する。限定しない例としては、ノルロイシン(Nle)及びシクロヘキサアラニン(Cha)が挙げられる。
【００２６】
「疎水性基」の用語は、アルキル又はアリール、たとえば：S-tert-ブチル、ネオペン
チル、イソブチル、イソプロピル、1-メチルプロピル、ベンジル、インドイル(indoyl)又はナフチルを意味することを意図する。上記の疎水性基は、1-ヨード-2,2-ジメチルプロパン、α-ブロモトルエン、tert-ブチルジスルフィド又はN-tert-ブチルアクリルアミドの種類の試薬により、アミノ酸上に導入できる。上記の疎水性基で修飾されるTat又はTatフラグメントのアミノ酸残基は、官能性を持たせることができる極性アミノ酸又は荷電アミノ酸である。これらのアミノ酸のうち、次の反応性官能基を有するものが挙げられる：-OH [セリン(S)、スレオニン(T)又はチロシン(Y)]、-SH [システイン(C)]、-NH2 [リジン(K)又はアルギニン(R)]、あるいは-COOH [アスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)]。
【００２７】
上記のワクチン組成物の有利な実施形態によると、上記のTatの非金属リガンドは、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオチド又は本質的にそれらの混合物である。
上記のワクチン組成物のこの実施形態の有利な配置によると、上記の非金属リガンドは、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸及びポリ硫酸グリコサミノグリカン、例えばヘパリン及びヘパラン硫酸から選択されるポリ硫酸化糖類である。
好ましくは、上記のTat/ポリ硫酸化糖類複合体、例えばTat/ヘパリン複合体は、等モル複合体である。
好ましくは、上記のヘパリンは、分子量が15000 Daのヘパリン、又はTatに高い親和性で結合する分子量が6000 Daのヘパリンフラグメントである。
【００２８】
上記のワクチン組成物のこの実施形態の別の有利な配置によると、上記のTatの非金属リガンドは、HIV Vprタンパク質である。
【００２９】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、上記のTatタンパク質又は上記のTatフラグメントは、位置22、25、27、30、31、34及び／又は37に位置する1〜7のシステインの置換及び／又は修飾により修飾される。
好ましくは、上記のシステインは、S-tert-ブチル基(CysStBu)を用いて修飾されるか、又はロイシン、トリプトファン及びフェニルアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸を用いて置換される。好ましくは、少なくとも位置25、27、30及び31の4つのシステインは、上記で規定するように、疎水性アミノ酸で置換されるか及び／又は疎水性基で修飾される。
【００３０】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、不活化されたTatタンパク質又はTatフラグメントに由来する上記の安定化Tat抗原(不活化Tat抗原)は、好ましくは、位置22、34及び37の各システインのセリンへの置換(TatC(22,34,37)S)、又は位置52及び53の各アルギニンのグルタミンへの置換(TatR(52,53)Q)を含む。好ましくは、これは、位置22、34及び37のシステインがセリンに置換され、かつ位置25、27、30及び31のシステインがS-tert-ブチル基で修飾されているか又はロイシン、トリプトファン若しくはフェニルアラニンで置換されているTat抗原である。このような抗原は、高い免疫原性能力と、ウイルスLTRをトランス活性化する能力が存在しないことにより示される、毒性の欠如との両方を示す。
【００３１】
上記の組成物の別の有利な実施形態によると、上記のTatタンパク質又は該タンパク質のフラグメントは、101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)、86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)、Tatフラグメント1〜57及び上記のタンパク質又はフラグメントに含まれる少なくとも11アミノ酸のフラグメント、好ましくは11〜50アミノ酸を含むもの、好ましくは11〜35アミノ酸を含むもの、さらにより好ましくは15〜25アミノ酸を含むものから選択される。
【００３２】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、上記のTat抗原は、配列番号1のTatタンパク質又はこのタンパク質の少なくとも11アミノ酸のフラグメントに由来する。
【００３３】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、a)における上記のTatタンパク質又は上記のTatフラグメントは、多価カチオン、好ましくは二価カチオン、例えば亜鉛(Zn2+)又はカドミウム(Cd2+)から選択されるTatの金属リガンドとも複合体化される。a)におけるTat複合体は、よって、金属リガンドと非金属リガンドとの両方を含む。
【００３４】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、b)又はc)において修飾される上記のTatタンパク質又は上記のTatフラグメントは、多価カチオン、好ましくは二価カチオン、例えば亜鉛(Zn2+)又はカドミウム(Cd2+)から選択されるTatの金属リガンドとも複合体化される。b)及びc)において修飾される上記のTatの複合体は、よって、それぞれ、非金属リガンド、及び金属リガンドと非金属リガンドとの両方を含む。
【００３５】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、上記のTatタンパク質又は上記のTatフラグメントはモノマーである。
【００３６】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、上記のTatタンパク質又は上記のTatフラグメントは、Tat (タンパク質及び／又はフラグメント)のモノマーの共有結合及び／又は非共有結合により形成されるオリゴマーである。好ましくは、これはダイマーである。共有結合したオリゴマーは、特に、Tatアミノ酸配列のシステイン残基、特にシステインリッチ領域のシステイン、好ましくは位置22、34又は37のシステインの1つを伴う少なくとも1つの分子間ジスルフィド結合を含む。本発明によると、ジスルフィドブリッジに関わらないシステインの少なくとも1つは、上記で規定されるように疎水性基で置換されるか及び／又は疎水性基で修飾されることができ、残りのシステインは、例えば、スルフヒドリル基を含まないアミノ酸、たとえばセリンに置換される。あるいは、オリゴマーは、金属イオン、例えば亜鉛又はカドミウムにより非共有的に結合もできる。
【００３７】
上記のワクチン組成物の別の有利な実施形態によると、a)又はc)における複合体のTatタンパク質及び／又はTatフラグメント、あるいはb)で修飾されるTatタンパク質及び／又はTatフラグメントは、該タンパク質及び／又はフラグメントをコードする組換えベクター又はポリヌクレオチドの形である。
【００３８】
本発明による安定化Tat抗原は、特に：
a)    101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)又は86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)と、ポリ硫酸化糖類、例えばデキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸及びヘパリンとの好ましくは等モル複合体である複合体、例えば分子量15000 Daのヘパリン又は分子量6000 Daのヘパリンフラグメントとの複合体、
b)    位置22、25、27、30、31、34及び37においてS-tert-ブチル基で修飾されたシステインを含む101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)又は86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)、
c)    位置22、34及び37においてセリンを含み、位置25、27、30及び31においてS-tert-ブチル基で修飾されたシステインを含む101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)又は86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)、
【００３９】
d)    位置22、25、27、30、31、34及び37でロイシンを含む101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)又は86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)、
e)    位置22、25、27、30、31、34及び37でフェニルアラニンを含む101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)又は86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)、
f)    位置22、25、27、30、31、34及び37でトリプトファンを含む101アミノ酸のTatタンパク質(Tat101)又は86アミノ酸のTatタンパク質(Tat86)、
g)    位置22及び37においてセリンを含み、位置25、27、30及び31においてロイシンを含
む修飾された2つのTatタンパク質又は2つのTatフラグメントの、位置34におけるシステイン間のジスルフィドブリッジによる結合で形成されたTatダイマー、
【００４０】
h)    b)、c)、d)、e)、f)又はg)で規定されるTatタンパク質又はTatダイマーと、ポリ硫酸化糖類、例えばデキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸又はヘパリンとの好ましくは等モル複合体である複合体、例えば分子量15000 Daのヘパリン又は分子量6000 Daのヘパリンフラグメントとの複合体、並びに
i)    本発明で規定されるようにして任意に不活化されたか及び／又は修飾された、101若しくは86アミノ酸のTatタンパク質及び／又はTatフラグメントの非共有結合オリゴマーと、ポリ硫酸化糖類、例えばデキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸又はヘパリンとの複合体であって、該TatオリゴマーがZn2+イオンによる非共有結合により形成される複合体。これは特に、分子量15000 Daのヘパリン又は分子量6000 Daのヘパリンフラグメントとの等モル複合体である、
により表される。
【００４１】
上記のワクチン組成物の別の実施形態によると、これは、医薬的に許容される媒体(vehicle)及び／又は担体物質及び／又はアジュバントを含む。
この実施形態の有利な配置によると、上記のワクチン組成物は、上記で規定される安定化抗原と、医薬的に許容される媒体及び／又は担体物質とからなる。
【００４２】
本発明によるワクチン組成物は、非経口(皮下、筋肉内、静脈内)、経腸(経口、舌下)又は局所(直腸、経膣)の投与に適する生薬の形(galenic form)にある。
【００４３】
医薬的に許容される媒体、担体組成物及びアジュバントは、一般的に用いられるものである。
アジュバントは、油性エマルジョン、無機物質、細菌抽出物、サポニン、水酸化アルミナ(alumina hydroxide)、モノホスホリル-リピドA及びスクアレンからなる群より選択されるのが有利である。
担体物質は、単層又は多層リポソーム、ISCOMS、ビロソーム、ウイルス様粒子、サポニンミセル、本質的に糖類(ポリ(ラクチド-コ-グリコリド))又は金を含有する固形ミクロスフェア及びナノ粒子からなる群より選択されるのが有利である。
【００４４】
この実施形態の別の有利な配置によると、上記のワクチン組成物は水酸化アルミナを含む。
この実施形態のさらに別の有利な配置によると、上記のワクチン組成物は、少なくとも1つの別のHIV抗原、例えばRev、Nef、gag若しくはgp 160、又は該抗原の少なくとも11アミノ酸のフラグメントを含む。
【００４５】
本発明の主題は、ヒトにおけるHIV感染の予防及び／又は治療用のワクチンとしての、上記で規定される安定化Tat抗原でもある。
【００４６】
本発明の主題は、ヒトにおけるHIV感染の予防及び／又は治療用のワクチンを製造するための、上記で規定される安定化Tat抗原の使用でもある。
【００４７】
本発明の主題は、
-     上記で規定されるTatの金属リガンド及び／又はTatの非金属リガンドと結合した
-     上記で規定されるようなTat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメント
からなることを特徴とするペプチド複合体でもある。
【００４８】
本発明の主題は、R52L、R55L、R57L、R78A、G79A、E80A及びK89Lの置換を除く、上記で規定されるような、Tat配列の少なくとも1つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換及び／又は疎水性基での修飾により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントから選択されることを特徴とするタンパク質又はペプチドフラグメントでもある。
【００４９】
本発明の主題は、少なくとも：
-     いずれの適切な手段により、上記で規定されるようなHIV Tatタンパク質又はTatフラグメントを作製し、そして同時又は逐次的に、
-     上記で規定されるようなTatリガンドと複合体を形成し、及び／又は上記で規定されるようなTat配列の少なくとも1つのアミノ酸残基を疎水性アミノ酸で置換し、及び／又は疎水性基で修飾する
ことを含むことを特徴とする、安定化Tat抗原を作製する方法でもある。
【００５０】
本発明の主題は、金属イオン、好ましくは多価カチオン、好ましくは二価カチオン、例えばZn2+及びCd2+の、HIV Tatタンパク質又はTatの少なくとも11アミノ酸のフラグメントを安定化するための使用でもある。上記で規定される金属イオンの使用は、Tatをタンパク質分解から保護しかつ共有結合オリゴマー形の形成を阻害することにより、Tatを安定化する。
【００５１】
本発明の主題は、
a)    上記で規定されるような、HIVタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントをコードする配列と、Tatのペプチドリガンドをコードする配列とを含むポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド混合物、及び
b)    R52L、R55L、R57L、R78A、G79A、E80A及びK89Lの置換を除く、上記で規定されるような、Tat配列の少なくとも1のアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換により修飾されたHIV Tatタンパク質又は少なくとも11アミノ酸のTatフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチド(DNA又はRNA)又はポリヌクレオチドの混合物でもある。
本発明によると、Tatタンパク質及び／又は該タンパク質のフラグメントのコーディング配列及びTatのペプチドリガンドのコーディング配列は、単一ポリヌクレオチドに含まれるか、又は2つの別々のポリヌクレオチドに含まれる。
【００５２】
本発明の主題は、それぞれ、a)又はb)で規定されるポリヌクレオチドからなる挿入フラグメント、及びa)で規定される混合物の2つのポリヌクレオチドのそれぞれからなる挿入フラグメントを含む組換えベクター又は2つの組換えベクターの混合物でもある。
好ましくは、上記の組換えベクターは、上記のポリヌクレオチドが、転写及び翻訳のための適切な調節要素の制御下にある発現ベクターである。
【００５３】
本発明の主題は、上記で規定される組換えベクター又は組換えベクターの混合物で形質転換された原核又は真核細胞でもある。
興味対象のポリヌクレオチドを、それを真核宿主細胞に導入して維持するために挿入可能な種々のベクターが、それ自体で知られている。適切なベクターの選択は、このベクターに考えられる使用(例えば、興味対象の配列の複製、この配列の発現、該配列の染色体外の形での維持又は宿主の染色体物質への挿入)、及び宿主細胞の性質にも依存する。とりわけ、興味対象の配列が予め挿入されたウイルスベクター、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びAAVを用いることができる。ベクターの表面タンパク質をコードする配列中に、ベクター表面でのTat抗原の露出を可能にする部位で、興味対
照のポリヌクレオチドを挿入することもできる。特に、Tat又はTatフラグメントをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスカプシドタンパク質の配列に挿入して、組換えウイルス粒子の表面でTatを露出させることができる。
【００５４】
上記のポリヌクレオチド(単離されたか又はプラスミドベクターに挿入された)を、宿主細胞に、物理的方法、例えばエレクトロポレーション若しくはマイクロインジェクションを用いて、又は細胞質膜を横切ることを可能にするいずれの物質、例えば輸送体(transporters)、例えばナノ輸送体、リポソーム、脂質若しくはカチオン性ポリマーとそれらを結合させることにより、導入することもできる。さらに、これらの方法は、有利には、例えばエレクトロポレーションをリポソームと組み合わせることにより、組み合わせることができる。
【００５５】
上記で規定されるポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換細胞は、特に、本発明による安定化Tat抗原の作製のために、又はヒトにおけるHIV感染の予防及び／又は治療用のワクチンとして有用である。
【００５６】
本発明によるポリヌクレオチドは、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA)に記載されるもののような標準的なプロトコルに従う、それら自体で知られる通常の方法により得られる。例えば、これらは、核酸配列のPCR又はRT-PCR増幅により、相同プローブを用いるハイブリダイゼーションのためのゲノムDNAライブラリのスクリーニングにより、又は完全若しくは部分的な化学合成により得ることができる。組換えベクターは、それら自体で知られる通常の組換えDNA及び遺伝子工学の方法により、構築して宿主細胞に導入することができる。
【００５７】
上記で規定されるTatタンパク質及びそのフラグメント、並びに誘導されるペプチド複合体及び修飾されたタンパク質及びペプチドは、当業者に知られる通常の方法により、特に固相若しくは液相合成によるか、又は適切な細胞系(真核又は原核)での組換えDNAの発現により、作製される。
【００５８】
より具体的には：
-     疎水性基で修飾されたアミノ酸を含むTatタンパク質及びそのフラグメントは、Merrifieldら(J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149〜) (1964)により初めに記載されたFmoc技術に従う固相により合成され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製される。
-     疎水性アミノ酸で置換されたアミノ酸を含むTatタンパク質及びそのフラグメントは、DNA配列に変異を導入する当業者に知られるいずれの手段により得ることができる、対応するcDNAから作製される。該cDNAは、真核又は原核発現ベクターにクローニングされ、組換えベクターにより改変細胞において産生されるタンパク質又はフラグメントは、いずれの適切な手段により、特にアフィニティクロマトグラフィーにより精製される。そして、
-     ペプチド複合体は、Tatリガンドを、Tat又はそのフラグメントの1つと、パートナーが相互作用することを可能にする条件下で接触させることにより得られる。
【００５９】
本発明によるTat抗原は、従来技術の抗原に比べて次の利点を有する：
-     安定性が増加しているので、これらはより免疫原性である。動物における抗Tat抗体力価は、非修飾Tat又はシステインがアセトアミドメチル基でブロックされているTatトキソイドで免疫化して得られるものよりも少なくとも10倍高い。
-     これらは、体液性及び細胞性の応答の両方を誘導する。比較実験は、同じ条件下で、非修飾のTatが弱い体液性応答を誘導するが、細胞性応答を誘導できないことを示す。
-     これらは、毒性が存在しないことを示す、それらのトランス活性化活性が低減され
ている。
-     これらは均質であり(homogeneous) (再現可能な方法による製造)、明確に規定されている。
【００６０】
上記の配置の他に、本発明は、本発明の安定化Tat抗原の使用の実施例及び添付の図面に言及する、以下の記載から明らかになるその他の配置も含む。添付の図面において：
-     図1は、Tat86 (■)及びTat101 (●)の構造の二色性分析を示す。各スペクトルは、5 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7.0中で15μMの濃度のTat86及びTat101タンパク質の試料の、0.2 nmの分解能で、0.5秒の積算時間及び2 nmの帯域幅で得られた遠(distant) UV領域(190 nm〜250 nm)での4回の測定の結果である。
【００６１】
-     図2は、TAT101のタンパク質分解の速度論を説明する。遊離のTat101タンパク質(TAT-101SH；10μg/100μl)を、トリプシン(上のパネル)又はキモトリプシン(下のパネル)の存在下に、50 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7 (酵素/基質の比が1/200 (W/W))中に37℃でインキュベートした。種々の消化時間(30秒、1分、2分、5分及び6分)で得られたペプチドフラグメントを、トリプシン切断部位(塩基性アミノ酸：アルギニン(R)又はリジン(K))、又はキモトリプシン切断部位(優先順序が減少する順番で、芳香族アミノ酸：チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)又はトリプトファン(W)、次いで疎水性脂肪族アミノ酸：ロイシン(L)又はイソロイシン(I))を示す矢印により具体的に示す。
【００６２】
-     図3は、TAT101 (10μg/100μl)の酵素消化により発生するペプチドのプロフィール、及び各TAT101/ヘパリン等モル複合体(100μl中の10μgのTAT101に相当する)の逆相高速液体クロマトグラフィーによる比較分析を示す。Tat101タンパク質(*)並びにTat101/Hep 3000 (●)、Tat101/Hep 6000 (■)及びTat101/Hep 15000 (▲)複合体を、50 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7中のトリプシンの存在下に(酵素/基質の比が1/200 (W/W))、37℃で15分間インキュベートした。矢印は、分解されなかったTat101の位置を示す。
【００６３】
-     図4は、BALB/cマウスにおけるTat101、Tat101/Hep15000及びTat101/Hep6000の免疫原性のELISAによる比較分析を示す。記載する値は、最後の免疫化の14及び28日後に測定した、抗体力価の逆数に相当する。
-     図5は、BALB/cマウスをTat101 (A)及びTat101/Hep6000 (B)で免疫化することにより産生される血清の抗原性プロフィールを示す。血清は、Tat全配列を代表する、15アミノ酸の長さの18のオーバーラップペプチド(ペプチド1〜18)について、ELISAにより分析する。吸光度の値を、光学密度のミリ単位(mUOD)で表す。
【００６４】
-     図6は、遊離のTat86 (TAT86：下のパネル)又はS-tert-ブチル基で修飾されたTat86
(TAT86 C(22-37)StBu：上のパネル)のプロナーゼEでの消化により得られたフラグメントのペプチドマッピングを表す。消化は、50 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7中に、酵素/基質の比が1/20 (W/W)及びTat基質の最終濃度が10μg/20μlで、37℃で15分間行う。
【００６５】
-     図7は、遊離のTat101 (TAT101：下のパネル)又はS-tert-ブチル基で修飾されたTat101 (TAT101 C(22-37)StBu：上のパネル)のプロナーゼEでの消化により得られたフラグメントのペプチドマッピングを表す。消化は、50 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7中に、酵素/基質の比が1/20 (W/W)及びTat基質の最終濃度が10μg/20μlで、37℃で15分間行う。
【００６６】
-     図8は、BALB/cマウスにおけるTat101及びTat101C(22-37)StBuの免疫原性のELISAによる比較分析を示す。記載される値は、最後の免疫化の25日、35日及び47日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
-     図9は、BALB/cマウスにおけるTat86、Tat86C(22-37)StBu、Tat86C(22-37)L及びカルボキサミド化により作製されたTatトキソイド(Tat86C(22-37)Scam)の免疫原性のELISA
による比較分析を示す。記載される値は、最後の免疫化の14日及び28日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
【００６７】
-     図10は、BALB/cマウスにおけるTat86C(22-37)S、Tat86C(22-37)F、Tat86C(22-37)W及びTat86C(22-37)L誘導体の免疫原性のELISAによる比較分析を示す。記載される値は、最後の免疫化の14日及び28日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
【００６８】
-     図11は、ヘパリン6000に対するTat86、Tat86C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)Lの結合のELISAによる比較分析を示す。吸光度の値は、光学密度のミリ単位(mUOD)で表す。
-     図12は、遊離の形又はヘパリン複合体化の形でのTat86C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)Lの免疫原性のELISAによる比較分析を示す。記載される値は、最後の免疫化の14日及び28日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
【００６９】
-     図13は、SWISS (非近交系)マウスにおける、アジュバントの非存在下でのTat101/Hep6000、Tat101C(22,34,37)S、C(25,27,30,31)StBu/Hep6000、Tat86/Hep6000、Tat86C(22-37)StBu/Hep6000及びTat86C(22-37)L/Hep6000の免疫原性のELISAによる分析を示す。記載される値は、最後の免疫化の14日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
-     図14は、Tat86 (A)、Tat86C(22-37)StBu (B)及びTat86C(22-37)StBu/Hep6000 (C)での免疫化により誘発される細胞性応答を示す。免疫されたマウスの脾細胞による粉砕した(triturated)チミジンの取り込みを、増加する濃度のTat (0.01〜0.5μM)を用いる刺激の後に測定した。
【００７０】
-     図15 (A、B及びC)は、Tat誘導体のトランス活性化能力の減少を示す。HIV-1 LTRの転写制御下にGFP遺伝子を含むレポータープラスミドでトランスフェクションされたHela細胞を、クロロキン及びTat又はTat誘導体の存在下でインキュベートした。
-     図16は、BALB/cマウスにおけるTat101、Tat101/PPS及びTat101/デキストランの免疫原性のELISAによる比較分析を示す。記載される値は、水酸化アルミナの存在下での単回免疫化の14日及び28日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
【００７１】
-     図17は、SWISSマウスにおける、Zn2+及び／又はヘパリンと複合体化したか又は複合体化していないTat101及び不活化誘導体(Tat101R(52,53)Q)の、アジュバントの非存在下での免疫原性のELISAによる比較分析を示す。記載される値は、最後の免疫化の14日及び28日後に測定した抗体力価の逆数に相当する。
【００７２】
-     図18は、非架橋ゲルを用いる電気泳動による、Tatのオリゴマーの形の見かけに対するZn2+の影響の分析を示す。Tat101 (58μMの最終濃度)を、PBS緩衝液(pH 7.4)中に、ZnCl2 (Tatのシステインに対して6倍過剰(6-fold excess))の存在下、又はZnCl2の非存在下で、種々の時間(T)、周囲温度にて、攪拌せずに暗中でインキュベートした。インキュベーションの最後に、試料をマレイミド(20 mM)で、反応性システインをブロックしかつ変性又はゲルでの試料の移動の間のジスルフィドブリッジの形成を妨げるように、処理した。次いで、試料をSDSの存在下に95℃で7分間変性させ、その後、ゲルにロードした。ZnCl2の非存在下でインキュベートしたTat101 (レーン1: T = 0分；レーン2: T = 1時間；レーン3: T = 24時間；レーン4: T = 5日)。ZnCl2の存在下でインキュベートしたTat101 (レーン5: T = 1時間；レーン6: T = 5日)。
【００７３】
-     図19は、Tatのトランス活性化能力に対する、TatのZn2+での安定化の影響がないことを示す。HIV-1 LTRの転写制御下にGFP遺伝子を含むレポータープラスミドでトランスフェクションしたHela細胞を、クロロキン及びZnCl2とプレインキュベートしたか又はZnCl2とプレインキュベートしていない種々の濃度のTat (nM)の存在下でインキュベートし、次いで、細胞の蛍光をフローサイトメトリにより分析した。
【００７４】
実施例1：Tat及びその誘導体の作製
Tatタンパク質は、HIV-1のNDK単離体のものに相当する(Groeninkら, J. Virol., 1991,
65, 1968〜1975)。その配列を図2 (配列番号1)に示す。このタンパク質は、以下、Tat101という。同様に、このタンパク質のフラグメント1〜86を、以下、Tat86 (配列番号2)という。HIV-1のNDK単離体(配列番号1)は、SWISSPROT及びTrEMBLデータベースに1999〜2000の間に報告された最初のHIV-1単離体の66配列から得られたコンセンサス配列を表す。
【００７５】
1)    Tat及びそのS-tert-ブチル誘導体(TatStBu)の化学合成
Tatの化学合成を、固相で、APPLIED BIOSYSTEMS 433Aデバイスにて、当業者に知られるFmoc/tert-ブチルストラテジを用いて行う。システインリッチ領域の7つのシステイン残基を、S-tert-ブチル (S(tBu))基で保護する。簡単に、合成スケールは1 mMであり、すなわち、Tat101について0.2 mmol/gで500 mgのFmoc-Asp(OtBu)-PAL-PEG-PSレジン、かつTat86について0.21 mmol/gで476 mgのFmoc-Glu(OtBu)-PAL-PEG-PSレジンである。1 mMの各保護されたアミノ酸を、各カップリングサイクルで用いる。各Fmocアミノ酸の活性化は、ジシクロヘキシルカルボジイミド/1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール対を用いて行う。カップリングは、0.25 Mのジイソプロピルエチルアミン/N-メチルピロリドンの存在下に行う。レジンの切断及び脱保護(1時間30分)は、乾燥させたレジン(一晩、減圧下で)を10 mlのトリフルオロ酢酸(TFA：9.5)/トリイソプロピルシラン(0.25)/水(0.25；V/V/V)の溶液と混合することにより行う。焼結ガラス上での濾過の後に、反応混合物を100 mlの冷却(4℃) tert-ブチルメチルエーテル中に沈殿させ、2500 rpmで15分間遠心分離する。得られた固体を、50 mlの15%酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥させる。得られた粗合成物を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、セミ分種C4カラム(21×250 mm, 5μM, 300Å JUPITER)で精製する。合成された各誘導体(Tat86C(22-37)StBu及びTat101C(22-37)StBu)の均質化したフラクションは、そのアミノ酸組成及び質量分析により特徴付ける。
【００７６】
同様のストラテジを用いて、システイン22、34及び37がセリンで置換され、システイン25、27、30及び31がS-tert-ブチル基で保護されたTat101誘導体(Tat101C(22,34,37)S,C(25,27,30,31)StBu)を得た。
【００７７】
Tat86及びTat101は、S-t-ブチル基の脱保護により、上記の誘導体(Tat86C(22-37)StBu及びTat101C(22-37)StBu)から得る。簡単に、システイン当たり1等量のタンパク質と50等量のジチオスレイトールを、6M尿素を含む脱気した50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 8.5に、10-4Mの最終濃度で溶解する。反応の進行を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、C4分析カラム(15 cm×416 mm, 5μM, 300Å JUPITER)で監視する。2時間後に反応は定量的であるとみられ、反応混合物を、TFA/H2Oの水溶液(50/50; V/V)でpH 2まで酸性にし、最終容量50 mlまでTFA/H2Oの水溶液(1/999; V/V)で希釈する。次いで、反応混合物を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、セミ分取C4カラム(25 cm×10 mm, 5μM, 300Å JUPITER)で精製する。合成した各誘導体(Tat86及びTat101)の均質化したフラクションを、そのアミノ酸組成及び質量分析により特徴付ける。
【００７８】
Tat101及びTat86について用いたものと類似のストラテジを用いて：
- Tat101の配列をカバーする、長さ15アミノ酸の18のオーバーラップペプチド、
- システインリッチ領域の7つのシステインのそれぞれがセリン(Tat86Ser、コントロール)に置換されたか又は疎水性アミノ酸、例えばロイシン(Tat86C(22-37)L)、フェニルアラニン(Tat86C(22-37)F)又はトリプトファン(Tat86C(22-37)W)に置換されたTat86誘導体、
- 位置52及び53のアルギニンのそれぞれがグルタミン(Tat101R(52,53)Q)に置換されたTat101誘導体
を合成した。
【００７９】
2)    組換えTatタンパク質及びそれに由来する変異体の作製
組換えTatタンパク質(Tat86及びTat101)及びその変異体の産生を、大腸菌(E. coli)において行った。簡単に、Nde I及びHind III制限部位に挟まれたTatタンパク質のヌクレオチド配列を、上記のタンパク質をコードする全Tat遺伝子の配列を代表する8のオーバーラップ合成ヌクレオチドプライマを用いて再構築した。プライマを、それらの相補領域によりハイブリダイズさせ、得られたハイブリダイゼーション産物を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、Nde I及びHind III制限部位で挟まれたTat遺伝子の5'及び3'端に対応する上記のプライマを用いて増幅した。PCR増幅フラグメントを、次いで、原核発現ベクターpET3a (NOVAGEN)にクローニングし、Tatタンパク質を、供給業者により推奨される標準的プロトコルに従って、得られた組換えベクターから大腸菌において発現させた。組換えTatタンパク質を、ヘパリンカラムでの通過及びクロマトグラフィーの標準的なプロトコルに従う逆相高圧クロマトグラフィーにより精製した。
【００８０】
あるいは、Tat遺伝子を、大腸菌又は昆虫細胞又は哺乳動物細胞において、それぞれT7プロモーター、p10プロモーター及びサイトメガロウイルス初期プロモーターのアクチベータとニワトリβ-アクチンプロモーターとのハイブリッドであるプロモーターの制御下でTatの発現を可能にするプラスミドpTriEx-1 (NOVAGEN)にクローニングした。
【００８１】
類似のストラテジを用いて、システインリッチ領域の7つのシステインのそれぞれがセリン(Tat86Ser、コントロール)に置換されたか又は疎水性アミノ酸、例えばロイシン(Tat86C(22-37))に置換されたTat86変異体を作製した。
【００８２】
3)    ポリ硫酸化糖類又は金属イオン(Zn2+)と複合体化したTatの作製
ヘパリン(分子量15 000；H3393 (SIGMA))及び分子量6000 (H5284, SIGMA)及び3000 (H3400, SIGMA)のそのフラグメントを、Tat/ヘパリンのモル比1/1で、PBS緩衝液中のTat101又はTat86と混合し、複合体を1時間〜一晩の間の期間、20℃でインキュベートした。Tat101から得られた複合体をTat101/Hep3000、Tat101/Hep6000及びTat101/Hep15000とよび、Tat86についても同様にする。Tat101又はTat86と、その他のポリ硫酸化糖類、例えばデキストラン硫酸 (Dextran；D7037, SIGMA)及びペントサンポリ硫酸 (PPS；SIGMA)との複合体を、Tatとヘパリンとの複合体について記載したようにして調製した。このようにしてTat101から得られた複合体を、Tat101/Dextran及びTat101/PPSとよぶ。
類似のストラテジを、Tat101又はTat86とZn2+イオンとの複合体(Tat101/Zn；Tat86/Zn)を作製するのに用いた。
【００８３】
Tat101、Tat86又はTatの不活化誘導体、例えばTat101R(52,53)Qと、Tat以外の2つのリガンド、例えば多価カチオン、特に二価カチオン、例えばZn2+及びポリ硫酸化糖類、例えばヘパリンとの複合体も作製した。より具体的には、2つのリガンドをPBS緩衝液中のTatと混合し(Tat/ヘパリン等モル比；ZnCl2はTatに対して6倍過剰(6-fold excess))、次いで混合物を周囲温度で1時間インキュベートする。このようにして得られる複合体を、Tat101/Zn/Hep6000及びTat101R(52,53)Q/Zn/Hep6000とよぶ。
【００８４】
4)    Tatオリゴマーの作製
Tatの共有結合ダイマーを、システイン残基の酸化により作製した。より具体的には、Tatのモノマー誘導体、例えば誘導体Tat101C(22-31; 37)Sを、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 8に溶解した(最終濃度10-4M)。溶液を、攪拌しながら周囲温度で(約20℃)で48時間インキュベートした。反応媒質を、TFA (TFA/H2O, 1/1, v/v)含有溶液を用いてpH 2に酸性化した。Tatダイマーは、最終的に、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、分析C4カラム(15 cm×4.6 mm, 5μM, 300Å JUPITER)を用いて精製した。Tat誘導体のダイマー種は、アミノ酸分析および質量分析により確かめた。
【００８５】
実施例2：Tatは、構造的にフレキシブルであり、タンパク質分解に対して特に感受性である
1) 材料及び方法
a)    Tatの調製
Tat86及びTat101は、実施例1に記載のようにして、化学合成又は組換えDNA技術により作製した。
【００８６】
b)    Tat101のタンパク質分解に対する感受性の分析
Tat101タンパク質を、最終濃度0.1 g/lで、50 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7.0に即座に溶解し、酵素/基質比が1/200 (W/W)で、酵素(トリプシン又はキモトリプシン、Roche Diagnostics GmbH)とともに37℃でインキュベートした。種々のインキュベーション時間(30秒、1分、2分、5分、6分)で、5μlの5% TFAを、酵素消化を停止するために加え、産生されたペプチドフラグメントを、質量分析(ESI-MS, Quattro II, Micromass)にオンラインでつないだ液体クロマトグラフィーにより同定した。
【００８７】
c)    Tat86及びTat101タンパク質の二色性分析
円偏光二色性測定を、円二色計(CD6, Yvon Jobin)を用いて周囲温度で行った。5 mM リン酸カリウム緩衝液、pH 7.0中の15μMの試料溶液を、0.45μmのメンブレンで予め濾過し、その後、2 mm光路長を有する石英のキュベットに移した。各スペクトルは、0.2 nmの分解能で、0.5秒の積算時間及び2 nmの帯域幅を用いて得られた遠UV領域(190 nm〜250 nm)での4回の測定の結果である。
【００８８】
2)    結果
円偏光二色性研究は、Tat86及びTat101タンパク質がともに二次構造を失っていることを示し(図1)、これらがβ-シート及びα-へリックスを有さないフレキシブルな構造をとっていることを示す。タンパク質の弱い構造組織化は、かなりのフレキシビリティを誘導し、よって、低い熱力学的耐性とタンパク質分解への高い感受性を誘導する。このことは、Tatタンパク質に当てはまることである。なぜなら、これはタンパク質分解に特に感受性であるからである。特に、101アミノ酸のTatタンパク質を用いた分析により、トリプシン又はキモトリプシンと37℃で30秒間インキュベーションしただけで最初の切断を受けることを示す(図2)。
【００８９】
本発明者らは、Tatの安定性の向上は、そのタンパク質分解感受性を減少させ、生物におけるその半減期及びその免疫原性を増大させるはずであるとの仮説を提唱した。この仮説は、修飾されていないTatの免疫原性を、予め安定化した(pre-stabilized) Tat分子の免疫原性と比較することにより確認した。Tatの安定化は、リガンドとの複合体化又は疎水性基の組み込みのいずれかにより行った。
【００９０】
実施例3：Tat101とTatリガンド(ヘパリン、Zn2+)との複合体形成によるTatの安定化
1)    材料及び方法
a)    Tat/リガンド複合体の産生
遊離、又はヘパリン若しくはZn2+イオンと複合体化したTat86及びTat101タンパク質は、実施例1に記載のようにして作製する。
【００９１】
b)    Tat101及びTat101/ヘパリンのタンパク質分解に対する感受性の分析
分析は、トリプシンとのインキュベーション期間を15分にし、Tatタンパク質の濃度を0.5 g/lにする以外は実施例2に記載の条件下で行う。
【００９２】
c)    動物における、Tat及びTat/リガンド複合体により誘導される抗体応答の分析
Tat及びその誘導体により誘導される抗体応答の分析を、BALB/cマウス及びSWISSマウス
(非近交系)で行った。種々の免疫原を、等しい容量の水酸化アルミナと混合し、BALB/cマウス当たり5μgのTatタンパク質の割合で、最終容量100μlで腹腔内注射した。マウスを、14日間空けて2回免疫した。血液試料を、2回目の免疫化の14及び28日後に採取した。
あるいは、SWISSマウスを、マウス当たり16μgのTatタンパク質の割合で、最終容量100μlで、アジュバントの非存在下にTat及びその誘導体で皮下免疫した。マウスを、14日間空けて2回免疫した。血液試料を、2回目の免疫化の14日後に採取した。
【００９３】
次いで、血清を、免疫酵素アッセイ(ELISA)により、抗Tat抗体の存在について試験した。これらの実験において、TatをELISAプレートに予め吸着させた。ELISAプレートを、0.1%ウシ血清アルブミンで飽和させた。血清希釈物を、最終的に、プレートで4℃にて一晩インキュベートした。抗Tat抗体の存在は、マウス抗体に特異的なペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体、及び基質としてABTSを用いて視覚化した。
【００９４】
d)    Tat101及びTat101/Hep6000での免疫化により産生される血清の抗原性プロフィール
このプロフィールは、免疫酵素アッセイを用いて確立した。全Tat配列を代表する、長さ15アミノ酸の18のオーバーラップペプチドを、実施例1に記載のようにして固相で合成した。次いで、ペプチドをELISAプレートのウェルに吸着させた(10μg/100μl/ウェル)。ELISAプレートを、0.1%ウシ血清アルブミンで飽和させた。試験すべき抗Tat101及びTat101/ヘパリン6000血清試料の希釈物をプレートに加え、インキュベーションを4℃で一晩継続した。抗Tat抗体の存在は、マウス抗体に特異的なペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体、及び基質としてABTSを用いて視覚化した。
【００９５】
2)    結果
a)    TatとTat101に対するリガンドとの複合体の形成は、タンパク質分解についてのTat101の安定性を増大させることを可能にする
Tat/リガンドのモル比が1/1の3つの種類のTat/ヘパリン複合体を、Tat101と分子量15000、6000及び3000のヘパリン(タンパク質に対する親和性が減少する)とから作製した。遊離のTatタンパク質及び複合体化Tatタンパク質のタンパク質分解に対する感受性の比較分析は、遊離のTatが15分間で完全に分解されるのに対し、複合体化されたときはよりゆっくりと分解されることを示す(図3)。低親和性のヘパリン3000フラグメントは、比較的小さいTat保護を与えるが、高い親和性を有するヘパリン15000及びヘパリン6000フラグメントは、よりよいタンパク質の保護を与える(図3)。つまり、Tatとヘパリン又はヘパリンフラグメントとの間の複合体の形成は、タンパク質分解についてTatを安定化することを可能にする。より小さい程度で、TatとZn2+との間の複合体の形成も、タンパク質分解についてTatを安定化することを可能にする(表I：実施例6、結果を参照)。
【００９６】
b)    Tatとヘパリンとの複合体の形成は、Tatに対して誘導される体液性応答を増大させることを可能にする
水酸化アルミナと混合したTat101、又は水酸化アルミナと混合したTat101/Hep15000若しくはTat101/Hep6000複合体のいずれかでのBalB/cマウスの免疫化により誘導される抗Tat抗体応答を、ELISAにより分析した。結果は、Tat101がヘパリン15000又は6000と予め複合体化されるときに、体液性応答が増大することを示す(図4)。Tat101により誘導される抗体力価は、Tat101/Hep15000及びTat101/Hep6000により誘導されるものよりも10倍低い。
【００９７】
SWISSマウスにおいてアジュバントの非存在下で行った同様の実験は、Tat/ヘパリン複合体(Tat101/Hep6000及びTat86/Hep6000)も、非近交系の集団で、アジュバントの非存在下で免疫応答を誘導できることを示す(図13)。
さらに、ヘパリンリガンドとの相互作用は、Tatのある特定の抗原性部位をマスクし、その他のものを露出させることができ、かつ遊離のTatタンパク質に天然に存在するもの
ではない決定因子に対して体液性応答を誘導できるので、Tat101及びTat101/Hep6000に対して産生された抗体の抗原特異性をELISAにより分析した。このことを行うために、Tat101及びTat101/Hep6000で免疫したマウスの血清を、全Tat配列を代表する、長さ15アミノ酸の一連の18のオーバーラップペプチドの存在下でインキュベートした。
【００９８】
図5に示す結果は、Tat101/Hep6000での免疫化により産生される抗Tat抗体の抗原特異性は、遊離のTat101での免疫化により産生されるものに類似することを示す。
特に、Tat101での免疫化は、領域1〜15に対して指向された抗体(力価＞1/3000)を主に誘導し、領域71〜90及び86〜101に対する抗体(力価＜1/400)をより弱く誘導する。Tat101/ヘパリンでの免疫化に由来する血清は、同じ抗原性プロフィールを示す。さらに、両方の場合において、免疫優性領域は、N-末端領域に位置する。Tatのヘパリン6000との複合体化は、産生される抗Tat抗体の抗原特異性を変更することなく、体液性応答の強度を増大させることができる。
【００９９】
実施例4：疎水性基の組み込みによるTatの安定化
1)    材料及び方法
a)    Tat及びその誘導体の作製
Tat及びシステイン残基がS-tert-ブチル (StBu)の種類の疎水性基を用いてブロックされたその誘導体を、実施例1に記載されるようにして固相で合成した。
【０１００】
b)    Tat86及びTat86C(22-37)StBuのタンパク質分解に対する感受性の分析
Tat86及びTat86C(22-37)StBuタンパク質を、0.5 g/lのTatタンパク質の最終濃度で50 mM リン酸カリウム緩衝液、pH 7.0中に即座に溶解し、酵素/基質比を1/20 (W/W)で、プロナーゼE (Roche Diagnostics GmBH)と37℃でインキュベートした。15分間のインキュベーションの後に、5μlの5% TFAを、酵素消化を停止するために加え、産生されたペプチドフラグメントを、質量分析(ESI-MS, Quattro II, Micromass)とオンラインで連結した液体クロマトグラフィーにより同定した。
【０１０１】
c)    動物における、Tat86及びTat86C(22-37)StBuにより誘導される抗体応答の分析
この分析は、血清を最終免疫化の14及び28日後(図9)、又は25、35及び47日後(図8)に採取した以外は、Tat/ヘパリン複合体について実施例3に記載したようにして行った。
【０１０２】
d)    Tat及びその誘導体により誘導される細胞性応答の分析
種々の抗原を、体液性応答の誘導について記載したのと同じプロトコル(実施例3)に従って調製して注射した。2回目の免疫化の10日後に、動物の脾臓を回収して小片に切断した。マウス脾臓細胞を、次いで、Tat86の一連の希釈の存在下でインキュベートした。37℃で3日間の刺激の後に、粉砕したチミジンを加え、18時間後に細胞を回収して、標準的なプロトコルに従って、組み込まれた放射活性を測定することにより細胞増殖を評価した。
【０１０３】
e)    Tat及びその疎水性誘導体のヘパリン結合性の分析
Tat86、Tat86C(22-37)L及びTat86C(22-37)StBu抗原を、ELISAプレートのウェルに吸着させた(0.1μg/ウェル)。次いで、プレートを、0.3%ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH 7で飽和させた。ヘパリン−アルブミン−ビオチンコンジュゲートの一連の希釈を、ウェルに加えた。4℃で一晩のインキュベーションの後、Tat86又はその誘導体に結合したヘパリン−アルブミン−ビオチンコンジュゲートを、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン、及び基質としてABTSを用いて視覚化した。
【０１０４】
2)    結果
a)    TatシステインのStBu基でのブロッキングは、Tat配列の大部分の安定性を増大する
ことを可能にする
第二のアプローチにおいて、安定化コアの創成を目的として、Tatタンパク質を疎水性基の組み込みにより安定化させた。Tatのシステインリッチ領域の位置22の残基と位置37の残基との間に位置する7つのシステインを、S-tert-ブチル (StBu)の種類の疎水性基を用いて修飾した。Tatの安定性に対するこの種類の修飾の効果を評価するために、その7つのシステインがStBu基でブロックされたTat86タンパク質(Tat86C(22-37)StBu)、及びシステインが遊離であるTat86タンパク質(Tat86)を合成した。同様に、システインが遊離のTat101タンパク質(Tat101)、及びシステインがStBuでブロックされたTat101タンパク質(Tat101C(22-37)StBu)も合成した。プロナーゼのタンパク質分解作用についてのこれら4つのタンパク質の安定性の比較分析は、4つのタンパク質のそれぞれのタンパク質分解に由来するフラグメントの間に著しい違いを示す(図6及び7)。つまり、Tat101及びTat86に由来するフラグメントは、ほとんどサイズが小さいが、Tat101C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)StBuに由来するものは、主にサイズが大きい。これらの結果は、システインが遊離のTatタンパク質は広範にタンパク質分解されるが、システインが疎水性基でブロックされたものは、酵素作用に対して部分的に保護されていることを示す。Tat101C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)StBuの消化産物中に、アミノ酸13からアミノ酸52までの範囲の多くの長いフラグメントと、C-末端領域のいくつかの長いフラグメントとが存在していることは、酵素作用についての保護が疎水性基挿入領域で発揮されているが、そこから離れたところでも発揮されることを示す。
【０１０５】
b)    TatシステインのStBuの種類の疎水性基でのブロッキングは、Tatに指向される体液性応答を増加させることを可能にする
まず、Tatの長い形(Tat101)の免疫原性に対するStBu基の組み込みの影響を評価した。結果は、Tat101が、Tat101C(22-37)StBuにより誘導されるよりも15倍弱い抗体応答を誘導することを示す(図8)。Tatの短い形(Tat86)、Tat86C(22-37)StBu及びカルボキサミド化により作製したTatトキソイド(Tatcam)の免疫原性の比較分析は、Tat86C(22-37)StBuが、Tat86により提供されるよりも30倍を超えて大きく、Tatcamトキソイドにより誘導されるよりも10倍大きい抗体応答を誘導することを示す(図9)。つまり、StBu基の組み込みは、Tat101及びTat86の免疫原性を著しく増加することを可能にする。
【０１０６】
SWISSマウスにおいてアジュバントの非存在下で行った同様の実験は、TatStBu誘導体が非近交系集団において、アジュバントの非存在下で免疫応答を誘導できることを示す(図13)。
【０１０７】
c)    Tatに組み込まれる疎水性基は、免疫原性の増加の原因である
Tatの免疫原性の増加における疎水性基の役割を、7つのシステインがそれぞれロイシン(Tat86C(22-37)L)、フェニルアラニン(Tat86C(22-37)F)又はトリプトファン(Tat86C(22-37)W)で置換されたTat86分子の免疫原性を、7つのシステインがセリン(Tat86C(22-37)S)で置換されたTat分子との比較により研究することにより、明らかにした(図10)。
【０１０８】
d)    ヘパリンとの複合体化と疎水性ゾーンの創成との組み合わせは、Tatの免疫原性を増加させる
実施例3及び4に示す結果は、分子中に疎水性ゾーンを創ること、又は複合体を形成することのいずれかにより、Tatの免疫原性を実質的に増加させ得ることを証明する。これらの2つのアプローチは、Tatの2つの別々の領域を用いて行われた。具体的には、ヘパリンとの複合体の形成は、残基49から残基57までに位置するTatの塩基性領域により媒介されるが、7つのシステインは、分子の22〜37のゾーンに一緒にまとめられる。
よって、まず、疎水性の性質のTat分子がヘパリンと相互作用できるかを証明し、次に、新しく形成された化合物が免疫原性特性のさらなる増加を示すかを証明するために、研究を行った。
【０１０９】
ELISAアッセイを用いるTat86、Tat86C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)Lのヘパリン結合の研究は、3つの分子が、同じヘパリン結合能力を示すことを示す(図11)。
【０１１０】
予めヘパリン6000と複合体化した遊離のTat86C(22-37)StBuでのBALB/cマウスの免疫化の後に、Tat誘導体について実施例3に記載する条件下で、抗体応答をELISAにより分析した。
Tat86C(22-37)StBu/Hep6000複合体を用いる免疫化により得られた抗体力価は、Tat86C(22-37)StBuを用いる免疫化により誘導されるものよりも5倍大きい(図12)。これらの結果は、ヘパリンとの複合体化が、Tat誘導体の免疫原性も増加させ、よって、2つの修飾の組み合わせが、それぞれの修飾単独で得られるものよりも、免疫原性をより大きく増加させることを可能にすることを示す。
【０１１１】
SWISSマウスにおいてアジュバントの非存在下で行った同様の実験は、2つの修飾の組み合わせが、非近交系集団においてアジュバントの非存在下で、これらの修飾の1つのみで得られるものよりも、免疫原性をより大きく増加させることを可能にすることを示す(図13)。
【０１１２】
e)    遊離又はヘパリンと複合体化したTat86C(22-37)StBu誘導体は、動物においてT細胞を誘導する
抗Tat抗体の応答が疾患の進行を制限することにおいて必須の役割を演じているが、Tatに指向された細胞性応答も、ウイルス感染についての保護において重要な位置を占める。この理由のために、抗Tat細胞性応答に対するTatの高免疫原性誘導体の影響を評価した。図14に示す結果は、Tat86で免疫されたマウスの脾細胞はTatの存在下でインビトロにおいて増殖しないことを示し、このことは、Tat86の野生型での免疫化が、動物において特異的T細胞の誘導を可能にしないことを示す(図14A)。一方、Tat86C(22-37)StBu (図14B)及びTat86C(22-37)StBu/Hep6000 (図14C)を用いる免疫化に由来する脾細胞は、Tat86の存在下で「インビトロ」において増殖し、このことは、これら2つの免疫原を用いる免疫化によりT細胞が明らかに活性化されることを示す。
【０１１３】
実施例5：Tat誘導体のトランス活性化特性の分析
1)    材料及び方法
緑蛍光タンパク質EGFPの遺伝子をHIV-1 LTRの転写制御下に含む、pLTR-Gとよばれるレポータープラスミドを構築し、Hela細胞に安定的にトランスフェクションさせた。
より具体的には、転写開始部位に対する位置-137〜+58に及ぶHIVのAVR-2単離体のLTRの配列(Jonesら, Curr. Opin, Cell. Biol., 1993, 5: 461〜468及びGenBankアクセッション番号K02007)を、Stemmerら, Gene, 1995, 164: 49〜53に記載される方法に従って合成した。このようにして得られた合成LTRを、HindIII及びSacIIで消化して、プロモーターのないEGFP遺伝子の上流で、プラスミドpEGFP-1 (Clontech)の同じ部位にクローニングして、プラスミドpLTR-Gを得た。
【０１１４】
プラスミドpLTR-Gを用いて安定的にトランスフェクションされ、Tatの存在下で活性化可能な(activatable)様式でEGFPを発現するHela細胞系統を選択した。
レポータープラスミドでトランスフェクションされたHela細胞の系統を、実施例1に記載されるようにして作製したTat又はTat誘導体の存在下で、及びクロロキン(100μMの最終濃度)の存在下で、血清フリーの培地中にインキュベートした。37℃で3時間のインキュベーションの後に、10%ウシ胎児血清を含有するDMEM培地を加えた。次いで、細胞を37℃で45時間インキュベートして、細胞の蛍光をフローサイトメトリにより分析した。
【０１１５】
2)    結果
図15は、HIV LTRをトランス活性化できるTat101及びTat86とは逆に、Tat誘導体のトランス活性化活性は減少されることを示す。Tat101又はTat86のものに比べてトランス活性化活性が60%しか減少されなかった誘導体Tat101C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)StBuを除いて、その他全ての誘導体のトランス活性化能力は実質的に廃止される(Tat101又はTat86に比べて95%〜99%減少される)。
【０１１６】
実施例6：タンパク質分解についてのTat及びその誘導体の耐性の測定
Tat及びその誘導体のタンパク質分解耐性を、抗Tat17S とよばれるモノクローナル抗体により認識され、かつ3つの疎水性残基(L、I及びY)を含有する事実のためにキモトリプシンに特に感受性である、コア領域のBエピトープ(KGLGISYGRK)の持続性の分析により研究した。コア領域を選択したのは、以下の理由からである：(i) この領域は、研究した全てのTat誘導体において修飾されない、(ii) この領域は、ヘパリンタイプのリガンドとの結合に参加しない(実施例3)、そして(iii) この領域は、Tatの疎水性誘導体において修飾されない(実施例4)。
【０１１７】
1)    材料及び方法
Tat及びその誘導体を、50 mMリン酸緩衝液、pH 7に溶解する。2.5μgのTat又はその誘導体の1つを、リン酸緩衝液のみ又はキモトリプシンを酵素/基質の比が1/50 (W/W)で含有するリン酸緩衝液の存在下でインキュベートする。37℃で2時間後、PMSF (最終濃度5 mM)を加えることにより反応を停止する。300μlのリン酸緩衝液、pH 7を加え、反応媒質の一連の希釈をELISAプレートのウェルに分配する。4℃で一晩のインキュベーションの後、プレートを、0.3%のウシ血清アルブミン及び0.003%チメロサールを含む100 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2を200μl加えることにより飽和させる。37℃で1時間のインキュベーションの後に、プレートを、0.05% tween 20を含有する0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2で洗浄する。Tatのコア領域に特異的な抗Tat17Sモノクローナル抗体を含有する腹水を、ELISAプレートのウェルで1/100にてインキュベートする。周囲温度で2時間のインキュベーションの後、プレートを前と同じ緩衝液で洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンヤギポリクローナル抗体を加える(希釈：1/5000)。周囲温度で30分間のインキュベーションの後、プレートを前と同じ緩衝液で洗浄し、ウェルにABTSを加える。周囲温度で30分間のインキュベーションの後、414 nmでの吸光度を、オートマチックリーダー(Multiskan MCC340, Titertek)を用いて測定する。
【０１１８】
キモトリプシンの作用に耐性であったTatの割合は、キモトリプシンの存在下でのTatの希釈(Tat chymo)の、キモトリプシンの非存在下でのTatの希釈(リン酸緩衝液中のTat：Tat bf)に対する比として確立する。この比は、種々の抗体及び基質のインキュベーション後の1に等しい光学密度として測定される。この比は、全てのTat誘導体(Tat誘導体chymo/Tat誘導体bf)について測定される。野生型Tatと比べた誘導体の安定性は、各Tat誘導体について得られた比を野生型Tatについて測定された比で割り、その解に100を掛けることにより決定される((Tat誘導体chymo/Tat誘導体bf)／(野生型Tat chymo/野生型Tat bf)×100)。120%より大きいパーセンテージは、野生型Tat (100%に等しい値)と比較した安定性の増加に相当する。
【０１１９】
2)    結果
タンパク質分解に対するTat誘導体の感受性を、次の表I及びIIに示す。
【０１２０】
【表１】
2007530647.tif 000002
【０１２１】
【表２】
2007530647.tif 000003
【０１２２】
表I及びIIは、リガンド、例えばポリ硫酸化糖類(ヘパリン、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸)又は金属イオン、特に二価カチオン、例えばZn2+とのTatの複合体化、あるいはTatの疎水性の性質の増加は、本発明によるTat誘導体の耐性がタンパク質分解について増加したことにより示されるように、Tatの安定性を増大させることを示す。これに比べて、極性アミノ酸で置換されたコントロール誘導体であるTat86Serは、Tat86よりも安定性が小さい。
【０１２３】
実施例7：種々のリガンドと複合体化したTatにより誘導される抗体応答の比較分析
1)    材料及び方法
a)    Tat/リガンド複合体の作製
遊離、又はデキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸若しくはZn2+イオンと複合体化した
Tat101タンパク質及び不活化誘導体Tat101R(52,53)Qを、実施例1に記載のようにして作製する。
【０１２４】
b)    動物における、Tat及びTat/リガンド複合体により誘導される抗体応答の分析
Tat101並びにTat101/Dextran及びTat101/PPS複合体により誘導される抗体応答の分析を、BALB/cマウスにおいて行った。種々の免疫原を、等しい容量の水酸化アルミナと混合し、最終容量100μl中にBALB/cマウス当たり5μgのTatタンパク質の割合で、腹腔内注射した。血液試料を免疫化の14及び28日後に採取した。
あるいは、BALB/cマウスを、遊離又はZn2+及び／又はヘパリンと複合体化したTat101又は不活化誘導体であるTat101R(52,53)Qで、アジュバントの非存在下で、最終容量100μl中にマウス当たり5μgのTatタンパク質の割合で、皮下免疫した。マウスは、14日の間隔で2回免疫した。2回目の免疫化の14日後に、血液試料を採取した。
【０１２５】
次いで、血清を、実施例3に記載されるような免疫酵素アッセイ(ELISA)により、抗Tat抗体の存在について試験した。
【０１２６】
2)    結果
水酸化アルミナと混合したTat101、又は水酸化アルミナと混合したTAT101/Dextran若しくはTat101/PPS複合体のいずれかで免疫したBALB/cマウスにより誘導される抗Tat抗体応答を、ELISAにより分析した。結果は、Tat101をポリ硫酸化糖類と予め複合体化したときに体液性応答が増大され(図16)；Tat101で誘導される抗体力価は、Tat101/Dextran又はTat101/PPSで誘導されるものよりも10倍低いことを示す。結果は、Tat/Hep6000及びTat/Hep15000複合体(実施例3及び図4)で得られるものに匹敵する。
【０１２７】
遊離又はZn2+及び／又はヘパリンと複合体化したTat101又は不活化誘導体であるTat101R(52,53)Qでの、アジュバントの非存在下のBALB/cマウスの免疫化により誘導される抗Tat抗体応答は、Tat/ヘパリン複合体(Tat101/Hep6000)とは異なって、Tat/Zn複合体が、アジュンバトの非存在下では免疫応答の増加を誘導できないことを示す(図17)。一方、Tat/ヘパリン/Zn複合体は、Tat/ヘパリン複合体のように振る舞い、アジュバントの非存在下に免疫応答の増加を誘導することができる。Tat101及びTatの不活化誘導体(Tat101R(52,53)Q)は、類似の結果を示す。
【０１２８】
実施例8：Zn2+を用いて安定化したTat形の分析
1)    方法
a)    Tat形の電気泳動分析
実施例1に記載のようにして調製したTat101タンパク質(最終濃度58μM)を、PBS緩衝液(pH 7.4)中に、ZnCl2 (Tatのシステインに対して6倍過剰)の存在下又はZnCl2の非存在下で、種々の期間、周囲温度にて攪拌せずに暗中でインキュベートした。
【０１２９】
Tatのオリゴマー形の見かけは、機能的な孔(dynamic pores)を形成する非架橋ポリマーからなるゲルでの電気泳動、及びプロテイン50 Plus LabChipキット(Agilent Technologies)を用いるバイオアナライザ(Agilent 2100, Agilent Technologies)での分析により分析した。チップを、製造業者により提供されるプロトコルに従って準備した。チップのチャネルを、ゲルの混合物及びタンパク質検出用の蛍光マーカーで充填した。
【０１３０】
PBS中に、ZnCl2の存在下又は非存在下でインキュベートしたTat101の試料を、マレイミド(20 mM)とプレインキュベートして、反応性システインをブロックして、変性又はゲル中での試料の移動中のジスルフィドブリッジの形成を妨げた。
次いで、Tat試料をSDSの存在下に95℃で7分間変性させ、その後、チップにロードした。次いで、チップをバイオアナライザにロードし、各試料を分離チャネルで分離して、45
秒間で蛍光(670 nm〜700 nm)を測定することにより検出した。
【０１３１】
b)    Tat形のトランス活性化能力の分析
実験プロトコルは、実施例5に記載したものである。
【０１３２】
2)    結果
a)    Zn2+を用いて安定化したTat形の電気泳動分析
Tatの電気泳動分析(図18)は、Tatが時間の経過につれてダイマー又はトリマーを形成するように進化する不安定な分子であることを示す。5日間のインキュベーションの後(レーン4)、オリゴマー形に相当する2つのバンドが主に見出される。はじめのものが主であり、ダイマーの形に相当するが、次のものはトリマーの形に相当する。レーン1、2及び3で観察できるモノマーの形は、その部分について、実質的に消滅している。一方、ZnCl2の存在下では、Tatのモノマーの形に相当する1つのバンドのみが見出される(レーン6)。非共有結合のホモダイマー又はヘテロダイマーをもたらし得る亜鉛は、よって、システインにより媒介される分子間ジスルフィドブリッジの形成をブロックすることにより、Tatを安定化する。
【０１３３】
b)    Zn2+を用いて安定化されたTat形のトランス活性化能力の分析
亜鉛での安定化がTatの生物活性を損なうかを評価するために、ZnCl2の存在下又は非存在下でのTatのトランス活性化能力を分析した。図19は、レポータープラスミドでトランスフェクションした細胞が、Tat又はZnCl2で予め希釈したTatの類似の濃度について蛍光を放射することを示し、このことは、亜鉛がその主要な生物活性を減じることなくTatを安定化することを示す。
【０１３４】
上記から明らかなように、本発明は、上記で具体的に記載した実施の方法、実行及び応用に限定されない。逆に、本発明は、本発明の関係又は範囲のいずれかから逸脱しない範囲で当業者が想到し得る全てのその変形を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】Tat86 (■)及びTat101 (●)の構造の二色性分析を示す。
【図２】TAT101のタンパク質分解の速度論を説明する。
【図３】TAT101 (10μg/100μl)の酵素消化により発生するペプチドのプロフィール、及び各TAT101/ヘパリン等モル複合体(100μl中の10μgのTAT101に相当する)の逆相高速液体クロマトグラフィーによる比較分析を示す。
【図４】BALB/cマウスにおけるTat101、Tat101/Hep15000及びTat101/Hep6000の免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図５】BALB/cマウスをTat101 (A)及びTat101/Hep6000 (B)で免疫化することにより産生される血清の抗原性プロフィールを示す。
【図６】遊離のTat86 (TAT86：下のパネル)又はS-tert-ブチル基で修飾されたTat86 (TAT86 C(22-37)StBu：上のパネル)のプロナーゼEでの消化により得られたフラグメントのペプチドマッピングを表す。
【図７】遊離のTat101 (TAT101：下のパネル)又はS-tert-ブチル基で修飾されたTat101 (TAT101 C(22-37)StBu：上のパネル)のプロナーゼEでの消化により得られたフラグメントのペプチドマッピングを表す。
【図８】BALB/cマウスにおけるTat101及びTat101C(22-37)StBuの免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図９】BALB/cマウスにおけるTat86、Tat86C(22-37)StBu、Tat86C(22-37)L及びカルボキサミド化により作製されたTatトキソイド(Tat86C(22-37)Scam)の免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図１０】BALB/cマウスにおけるTat86C(22-37)S、Tat86C(22-37)F、Tat86C(22-37)W及びTat86C(22-37)L誘導体の免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図１１】ヘパリン6000に対するTat86、Tat86C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)Lの結合のELISAによる比較分析を示す。
【図１２】遊離の形又はヘパリン複合体化の形でのTat86C(22-37)StBu及びTat86C(22-37)Lの免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図１３】SWISS (非近交系)マウスにおける、アジュバントの非存在下でのTat101/Hep6000、Tat101C(22,34,37)S、C(25,27,30,31)StBu/Hep6000、Tat86/Hep6000、Tat86C(22-37)StBu/Hep6000及びTat86C(22-37)L/Hep6000の免疫原性のELISAによる分析を示す。
【図１４】Tat86 (A)、Tat86C(22-37)StBu (B)及びTat86C(22-37)StBu/Hep6000 (C)での免疫化により誘発される細胞性応答を示す。
【図１５】図15 (A、B及びC)は、Tat誘導体のトランス活性化能力の減少を示す。
【図１６】BALB/cマウスにおけるTat101、Tat101/PPS及びTat101/デキストランの免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図１７】SWISSマウスにおける、Zn2+及び／又はヘパリンと複合体化したか又は複合体化していないTat101及び不活化誘導体(Tat101R(52,53)Q)の、アジュバントの非存在下での免疫原性のELISAによる比較分析を示す。
【図１８】非架橋ゲルを用いる電気泳動による、Tatのオリゴマーの形の見かけに対するZn2+の影響の分析を示す。
【図１９】Tatのトランス活性化能力に対する、TatのZn2+での安定化の影響がないことを示す。
【図１】
2007530647.tif 000004
【図２】
2007530647.tif 000005
【図３】
2007530647.tif 000006
【図４】
2007530647.tif 000007
【図５】
2007530647.tif 000008
【図６】
2007530647.tif 000009
【図７】
2007530647.tif 000010
【図８】
2007530647.tif 000011
【図９】
2007530647.tif 000012
【図１０】
2007530647.tif 000013
【図１１】
2007530647.tif 000014
【図１２】
2007530647.tif 000015
【図１３】
2007530647.tif 000016
【図１４】
2007530647.tif 000017
【図１５】
2007530647.tif 000018
【図１６】
2007530647.tif 000019
【図１７】
2007530647.tif 000020
【図１８】
2007530647.tif 000021
【図１９】
2007530647.tif 000022
【配列表】
2007530647000001.app
【国際調査報告】
2007530647.tif 000023
2007530647.tif 000024
2007530647.tif 000025
2007530647.tif 000026
2007530647.tif 000027
2007530647.tif 000028
2007530647.tif 000029
2007530647.tif 000030
2007530647.tif 000031
2007530647.tif 000032
2007530647.tif 000033
2007530647.tif 000034
2007530647.tif 000035
2007530647.tif 000036