(57)【要約】本発明は異種セルラーゼ融合構築体に関する。該構築体は、糸状菌エキソセロビオハイドロラーゼ由来の第一触媒ドメイン及びセルラーゼ酵素由来の第二触媒ドメインを含むセルロース分解活性を有する融合タンパク質をコードする。本発明は前記セルラーゼ融合タンパク質及びセルラーゼ酵素組成物を生産する方法だけでなく、異種セルラーゼ融合構築体を含むベクター及び宿主細胞にも関する。【選択図】図１
2007530054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼ融合タンパク質をコードする異種セルラーゼ融合構築体であって、前記構築体の５’末端からの作動可能な結合の中に、
（ａ）シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）エキソ−セロビオハイドロラーゼの第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、及び
（ｃ）セルラーゼ酵素の触媒ドメインである第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子
を含むことを特徴とする、構築体。
【請求項２】
前記第一触媒ドメインの３’及び前記第二触媒ドメインの５’に位置するリンカー配列を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項３】
前記エキソ−セロビオハイドロラーゼがセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を欠いていることを特徴とする、請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項４】
前記リンカー配列の後であり、且つ前記第二触媒ドメインの前に位置するケキシン部位を更に含むことを特徴とする、請求項２に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項５】
前記第一触媒ドメインの５’からの作動可能結合中に位置する、糸状菌分泌性タンパク質のプロモーターを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項６】
前記プロモーターがｃｂｈプロモーターであることを特徴とする請求項５に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項７】
前記プロモーターがトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｃｂｈ１プロモーターであることを特徴とする、請求項６に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項８】
前記第一触媒ドメインがＣＢＨ１エキソ−セロビオハイドロラーゼ由来であることを特徴とする、請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項９】
前記第一触媒ドメインが配列番号６で定義される配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有するＣＢＨ１由来であることを特徴とする、請求項８に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１０】
前記第二触媒ドメインがエンドグルカナーゼ触媒ドメインであることを特徴とする、請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１１】
前記第二触媒ドメインがエキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメインであることを特徴とする、請求項１０に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１２】
前記第二触媒ドメインがバクテリアセルラーゼ由来であることを特徴とする、請求項１０に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１３】
前記第二触媒ドメインがアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａエンドグルカナーゼ１（Ｅ１）触媒ドメイン、 アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８（ＧＨ４８）セルラーゼ触媒ドメイン、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ（ＧＨ７４−ＥＧ）触媒ドメイン、セルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ３（Ｔｆ−Ｅ３）セルラーゼ触媒ドメイン、及びセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ５エンドグルカナーゼ（Ｔｆ−Ｅ５）触媒ドメインから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１４】
前記第一触媒ドメインのエキソ−セロビオハイドロラーゼのセルロース結合ドメインと前記第二触媒ドメインのセルラーゼのセルロース結合ドメインとを欠いていることを特徴とする、請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１５】
前記第二触媒ドメインがアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  Ｅ１触媒ドメインであることを特徴とする、請求項１３に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１６】
前記第二触媒ドメインが配列番号８で定義される配列に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有するアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  Ｅ１触媒ドメインであることを特徴とする、請求項１５に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１７】
第二触媒ドメインの３’に位置するターミネーター配列を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１８】
選択マーカーを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体。
【請求項１９】
（ａ）糸状菌分泌性タンパク質のプロモーターと、
（ｂ）シグナル配列をコードするＤＮＡ分子と、
（ｃ）糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ由来である第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子と、
（ｄ）セルラーゼの触媒ドメインである第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子と、
（ｅ）ターミネーターとを
５’からの作動可能結合の中に含むベクター。
【請求項２０】
選択マーカーを更に含むことを特徴とする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記第一触媒ドメインの３’及び前記第二触媒ドメインの５’に位置するリンカーを更に含むことを特徴とする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
第一触媒ドメインのセルロース結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を欠くことになることを特徴とする請求項１９に記載のベクター。
【請求項２３】
ケキシン部位を更に含むことを特徴とする請求項１９に記載のベクター。
【請求項２４】
前記第二触媒ドメインがバクテリアセルラーゼ由来であることを特徴とする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２５】
第二触媒ドメインのセルラーゼのセルロース結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を欠くことを特徴とする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体を用いて形質転換された糸状菌宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１９に記載の異種セルラーゼ融合構築体を含むベクターを用いて形質転換された糸状菌宿主細胞。
【請求項２８】
異種セルラーゼ融合構築体及び異種セルラーゼ融合構築体を含むベクターからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む組換え糸状菌細胞。
【請求項２９】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項３０】
前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞がトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株であることを特徴とする請求項２９に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項３１】
１以上の天然セルラーゼ遺伝子が糸状菌宿主細胞から欠失していることを特徴とする請求項２９に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項３２】
前記天然セルラーゼ遺伝子がｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２からなる群より選択されることを特徴とする請求項３１に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項３３】
（ａ）エキソ−セロビオハイドラーゼ触媒ドメインである第一触媒ドメインと、
（ｂ）セルラーゼ由来である第二触媒ドメインと、
を含むセルロース分解活性を有する単離されたセルラーゼ融合タンパク質。
【請求項３４】
前記エキソ−セロビオハイドロラーゼがＣＢＨ１であることを特徴とする、請求項３３に記載の単離されたセルラーゼ融合タンパク質。
【請求項３５】
前記第二触媒ドメインがバクテリアセルラーゼ由来であることを特徴とする、請求項３３に記載の単離されたセルラーゼ融合タンパク質。
【請求項３６】
前記バクテリアセルラーゼがエンドグルカナーゼであることを特徴とする、請求項３５に記載の単離されたセルラーゼ融合タンパク質。
【請求項３７】
前記バクテリアセルラーゼがエキソ−セロビオハイドロラーゼであることを特徴とする、請求項３５に記載の単離されたセルラーゼ融合タンパク質。
【請求項３８】
前記バクテリアセルラーゼがアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）株由来であることを特徴とする、請求項３５に記載の単離されたセルラーゼ融合タンパク質。
【請求項３９】
請求項３３に記載の単離されたセルラーゼ融合タンパク質を含むセルロース分解組成物。
【請求項４０】
セルロース分解活性を有する酵素を生産する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の異種セルラーゼ融合構築体又は請求項１９に記載のベクターのいずれかを用いて糸状菌宿主細胞を安定に形質転換する工程と、
（ｂ）セルロース分解活性を有する酵素を生産するために、前記糸状菌宿主細胞に適した条件下において、形質転換された糸状菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｃ）前記酵素を回収する工程とを
含むことを特徴とする、方法。
【請求項４１】
前記糸状菌宿主細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）細胞であることを特徴とする、請求項４０に記載のセルロース分解活性を有する酵素を生産する方法。
【請求項４２】
前記糸状菌宿主細胞がトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞であることを特徴とする、請求項４０に記載のセルロース分解活性を有する酵素を生産する方法。
【請求項４３】
前記エキソ−セロビオハイドロラーゼがＣＢＨ１であり、前記セルラーゼがアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）セルラーゼ及びセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）セルラーゼからなる群より選択されることを特徴とする、請求項４０に記載のセルロース分解活性を有する酵素を生産する方法。
【請求項４４】
前記回収された酵素がセルラーゼ融合タンパク質、セルラーゼ融合タンパク質の成分、セルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項４０に記載のセルロース分解活性を有する酵素を生産する方法。
【請求項４５】
前記回収された１以上の酵素が精製されることを特徴とする、請求項４４に記載のセルロース分解活性を有する酵素を生産する方法。
【請求項４６】
触媒ドメインがエキソ−セロビオハイドロラーゼ由来である第一触媒ドメイン及びセルラーゼ酵素由来である第二触媒ドメインを含むことを特徴とする、セルラーゼ融合タンパク質を発現するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項４７】
トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞であることを特徴とする、請求項４６に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項４８】
前記エキソ−セロビオハイドロラーゼがＣＢＨ１であり、及び前記セルラーゼがバクテリアセルラーゼであることを特徴とする、請求項４６に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項４９】
前記バクテリアセルラーゼがアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）セルラーゼ由来であることを特徴とする、請求項４８に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項５０】
前記バクテリアセルラーゼがアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）Ｅ１、ＧＨ４８及びＧＨ７４セルラーゼから成る群より選択されることを特徴とする、請求項４９に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項５１】
前記融合タンパク質がセルラーゼのＣＢＤを欠くことになることを特徴とする、請求項４６に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項５２】
１以上の天然セルラーゼ遺伝子が前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞から欠失していることを特徴とする、請求項４６に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項５３】
融合タンパク質又はそれらの成分が組換えトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）の生成物であることを特徴とする、セルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分を含む糸状菌セルラーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による委託研究の下でなされた発明に対する権利の記述
この研究の一部はＵ．Ｓ．エネルギー省の請負契約Ｎｏ．ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ０１０３３７の国立リニュウアブルエネルギー研究所の下請契約Ｎｏ．ＺＣＯ−０−３００１７−０１により資金援助された。それに応じて、米国政府はこの発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００４年３月２５日に出願された米国仮出願Ｎｏ.６０／５５６，７１１、標題「セルラーゼ融合タンパク質及びそれをコードするする異種融合タンパク質」に対して優先権を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は異種セルラーゼ融合構築体に関する。前記構築体は、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ由来の第一触媒ドメイン及びセルラーゼ酵素由来の触媒ドメインを含む、セルロース分解活性を有する融合タンパク質をコードする。本発明はセルラーゼ融合タンパク質及びセルラーゼ酵素組成物を生産する方法のほかに、異種セルラーゼ融合構築体を含むベクター及び宿主細胞前記にも関する。
【背景技術】
【０００４】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生産される最も豊富な植物資源である。それらは、ポリマー基質を単体糖類に加水分解することができる細胞外酵素を作り出すバクテリア、イースト及び真菌を含む多くの微生物によって分解され、エネルギー源として使用することができる（Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。再生不可能な資源の限界が近づくにつれ、主要な再生可能資源となるセルロースの可能性は重要となる（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。生物学的過程を経たセルロースの効果的な利用は、食料、飼料及び燃料の貯蔵量を増やすためのアプローチの一つである（Ｏｈｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【０００５】
セルラーゼはセルロース（ベータ−１,４−グルカン又はベータ  Ｄ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカライド等を生成する酵素である。セルロースは伝統的に、エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）及びベータグルコシダーゼ（［ベータ］−Ｄ−グルコシドグルコハイドラーゼ；ＥＣ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７及びＳｈｕｌｅｉｎ，  １９８８）の３つの型に分類されている。エンドグルカナーゼは主に、セルロース繊維のアモルファス部分に作用するのに対して、セロビオハイドラーゼは結晶セルロースを分解することができる。
【０００６】
セルラーゼは多くのバクテリア、酵母、菌類から生産されることが知られている。ある種の菌類はセルロースの結晶構造を分解することができる完全なセルラーゼ系を生産することができる。セルラーゼは発酵により大量に容易に生産することができる。
【０００７】
結晶セルロースをグルコースへ効率良く転換するために、結晶セルロースの加水分解能力を失わずに単離されたＧＢＨ、ＥＧ及びＢＧの各区分由来成分を含む完全セルラーゼ系が必要とされる（Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。特に、ＥＧタイプセルラーゼ及びＣＢＨタイプセルラーゼの組み合わせは、いずれか一方を単独で用いた場合よりも、より効果的にセルラーゼを分解するために相互作用する（Ｗｏｏｄ，１９８５、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４及びＮｉｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０００８】
更に、セルラーゼは当該技術分野において、布製品に対する洗剤成分の洗浄効果を高め、柔軟成分として綿布又は類似のものに対する風合い、外観を改善するのに有用であることが知られている（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。洗浄効果が高められているセルラーゼ含有洗剤組成物（ＵＳ  Ｐａｔ．  Ｎｏ．４，４３５，３０７、ＧＢ  Ａｐｐ．  Ｎｏｓ．  ２，０９５，２７５及び２，０９４，８２６）及び布製品の風合い及び外観を改善するための使用（ＵＳ  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、及び５，７７６，７５７；ＧＢ  Ａｐｐ．  Ｎｏ．  １，３５８，５９９）が各種文献に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、菌類及びバクテリア中で生産されるセルラーゼは注目されている。具体的には、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）（例えばトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）あるいはトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））はセルラーゼの結晶構造を分解する完全なセルロース系を有する。長い間、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）セルラーゼ生産物の古典的な変異誘発、スクリーニング、選択による改良、高度な精製、及び大スケールの安価な発酵条件が発達してきた。トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）の多成分セルラーゼ系はセルロースをグルコースに分解することができるけれども、他の微生物、特にバクテリア株由来の、セルロース分解に効果的な異なる性質を有するセルラーゼも存在する。従って、工業スケールでのセルラーゼ生産のために、これらのタンパク質を糸状菌内で効果的に発現することは有益であると考えられる。しかしながら、多くの研究は糸状菌のバクテリア酵素の生産性が低いことを示している（Ｊｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明において、セルラーゼ酵素の生産及び効果を高めるために、セルラーゼ触媒ドメインのコード領域に融合している糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）触媒ドメインを含む異種セルラーゼ融合構築体を糸状菌宿主細胞中に導入し発現させた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の概要
第一の側面において、本発明は、（ａ）シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、（ｂ）糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ由来であることを特徴とする第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、及び（ｃ）セルラーゼ酵素の触媒ドメインであることを特徴とする第二触媒ドメインをコードするするＤＮＡ分子を５’末端からの作動可能な結合の中に含む異種セルラーゼ融合構築体を含む。
【００１２】
この側面の第一の態様において、前記異種セルラーゼ融合構築体は第一触媒ドメインの３’及び第二触媒ドメインの５’に位置するリンカー配列を更に含む。第二の態様において、前記異種セルラーゼ融合構築体はエキソ−セロビオハイドロラーゼのセルロース結合ドメインを欠いている。第三の態様において、この異種セルラーゼ融合構築体はリンカー配列の後であり、且つ第二触媒ドメインの前に位置するケキシン部位を更に含む。第四の態様において、前記異種融合構築体は第一触媒ドメインの作動可能な結合の５’に位置する糸状菌分泌性タンパク質のプロモーターを含む。第五の態様において、前記プロモーターはｃｂｈ１プロモーター及び、好ましくは、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｃｂｈ１プロモーターである。第六の態様において、第一触媒ドメインはＣＢＨ１エキソ−セロビオハイドロラーゼ由来であり、特に配列６で定義される配列に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有するＣＢＨ１である。第七の態様において、第二触媒ドメインはエンドグルカナーゼ触媒ドメインである。第八の態様において、第二触媒ドメインは、エキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメインである。第九の態様において、前記第二触媒ドメインはバクテリアセルラーゼ由来である。第十の態様において、第二触媒ドメインは、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  エンドグルカナーゼ１（Ｅ１）触媒ドメイン、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＧＨ４８）（ＧＨ４８）セルラーゼ触媒ドメイン、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ（ＧＨ７４−ＥＧ）触媒ドメイン、セルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ３（Ｔｆ−Ｅ３）セルラーゼ触媒ドメイン、及びセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ５エンドグルカナーゼ（Ｔｆ−Ｅ５）触媒ドメインからなる群より選択される。第十一の態様において、前記異種セルラーゼ融合構築体は、第一触媒ドメインのエキソ−セロビオハイドロラーゼのセルロース結合ドメイン及び第二触媒ドメインのセルラーゼのセルロース結合ドメインを欠いている。第十二の態様において、第二触媒ドメインは、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  Ｅ１触媒ドメインであり、特に、配列番号８で定義される配列に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有するアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  Ｅ１触媒ドメインである。第十三の態様において、異種セルラーゼ融合構築体は第二触媒ドメインの３’に位置するターミネーター配列を含む。第十四の態様において、前記異種融合構築体は選択マーカーを含む。
【００１３】
第二の側面において、本発明は、５’末端からの作動可能な結合の中に、糸状菌分泌性タンパク質のプロモーター、シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ由来であることを特徴とする第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、セルラーゼの触媒ドメインであることを特徴とする第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子及びターミネーターを含むベクターを包含する。第一の態様において、前記ベクターは更に選択マーカーを含む。第二の態様において、前記ベクターは第一触媒ドメインの３’及び第二触媒ドメインの５’に位置するリンカーを含む。第三の態様において、このベクターは、第一触媒ドメインのセルロース結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を欠いている。第四の態様においてこのベクターはケキシン部位を含む。第五の態様において、第二触媒ドメインはバクテリアセルラーゼ由来である。第六の態様において、このベクターは第二触媒ドメインのセルラーゼのセルロース結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を欠いている。
【００１４】
第三の側面において、本発明は、本明細書で述べるように、異種セルラーゼ融合構築体で形質転換された糸状菌宿主細胞、又は異種セルラーゼ融合構築体を含むベクターを用いて形質転換された糸状菌宿主細胞を含む。
【００１５】
第四の側面において、本発明は異種セルラーゼ融合構築体を含む組み換え糸状菌細胞、又は異種セルラーゼ融合構築体を含むベクターを包含する。
【００１６】
第三及び第四の側面の特に好ましい態様において、前記糸状菌宿主細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞及び、より具体的にはトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株の宿主細胞である。これらの側面の他の態様において、ｂｃｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２等の天然セルラーゼ遺伝子が糸状菌細胞から欠失している。第三の側面において、天然のセルロース結合ドメインは糸状菌細胞から欠失している。
【００１７】
第五の側面において、本発明はセルロース分解活性を有する単離されたセルラーゼ融合タンパク質を含む。前記融合タンパク質は、エキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメインであることを特徴とする第一触媒ドメイン及びセルラーゼ由来であることを特徴とする第二触媒ドメインを含む。この側面の一の態様において、エキソ−セロビオハイドロラーゼはＣＢＨ１である。第二の態様において、前記第二触媒ドメインはバクテリアセルラーゼ由来である。第三の態様において、前記バクテリアセルラーゼはエンドグルカナーゼであり、及び他の態様においては、前記バクテリアセルラーゼはエキソ−セロビオハイドロラーゼである。第四の態様において、前記バクテリアセルラーゼはアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）株由来である。第五の態様において、本発明は単離されたセルラーゼ融合タンパク質を含むセルロース分解組成物に関係する。
【００１８】
第六の側面において、本発明は、
ａ）第一の側面及び第二の側面で定義する異種セルラーゼ融合構築体又はベクターのいずれかを用いて糸状菌宿主細胞を安定に形質転換する工程と、
ｂ）セルロース分解活性を有する酵素を生産するために形質転換された糸状菌に対して適した条件下で、前記糸状菌宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）前記酵素を回収する工程とを含むセルロース分解活性を有する酵素を生産する方法を含む。
【００１９】
この側面の一の態様において、糸状菌宿主細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり、特にトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞である。第二の態様において、このエキソ−セロビオハイドロラーゼはＣＢＨ１であり、セルラーゼはアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）セルラーゼ又はセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）セルラーゼである。第三の側面において、回収された酵素は、セルラーゼ融合タンパク質、セルラーゼ融合タンパク質の成分、又はセルラーゼ融合タンパク質の組み合わせ及びそれらの成分である。第四の態様において、回収された酵素は精製される。
【００２０】
第七の側面において、本発明は、セルラーゼ融合タンパク質を発現するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞を含む。前記融合タンパク質はエキソ−セロビオハイドロラーゼ由来であることを特徴とする第一触媒ドメイン及びセルラーゼ酵素由来であることを特徴とする第二触媒ドメインを含む。一の態様において、前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞はトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。第二の態様において、前記エキソ−セロビオハイドロラーゼはＣＢＨ１であり、前記セルラーゼはバクテリアセルラーゼである。第三の態様において前記バクテリアセルラーゼはアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）セルラーゼ由来であり、特にアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｅ１、ＧＢ４８又はＧＨ７４セルラーゼ由来である。第四の態様において、前記融合タンパク質は、セルラーゼのＣＢＤを欠いている。他の態様において、前記融合タンパク質はセルラーゼのＣＢＤを含む。第五の態様において、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は天然セルラーゼ遺伝子が欠失している。
【００２１】
第八の側面において、本発明はセルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分を含む糸状菌セルラーゼ組成物を含む。前記融合タンパク質又はそれらの成分は組換えトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）の生産物である。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の定義及び実施例を参照することにより詳細に説明される。本明細書で参照する全ての配列を含む、全ての特許及び刊行物は参照により本発明の明細書に援用する。
【００２３】
他の違った方法で定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び化学用語は、本出願に関係する技術分野において当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）及び  Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ＮＹ  （１９９１）は、本発明の技術分野の当業者が利用する、そして本発明において多く用いられている用語の一般的な辞書である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｓｅｃｏｎｄ  ａｎｄ  ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．，１９８９  ａｎｄ  ２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｎ  Ｗｉｌｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９３は本発明に用いられるそのような技術が記載されている。
【００２４】
記載されている特定の方法、手順、及び試薬は変更されることがあるので、本発明を明細書に記載されている方法、手順及び試薬等に限定することを意図しない。本明細書で述べられているのと同じかあるいは類似の多くの方法及び物質は本発明の実施に用いることができるけれども、本明細書中では特定の好ましい方法及び物質にのみ言及する。
【００２５】
数値範囲は幅を定義している数値を含むものとする。違った形で定義しない限り、核酸配列は左から右に向かって５’から３’方向を示し、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノ末端からカルボキシ末端方向を示す。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴、及び利益は以下の詳細な説明により明確になる。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は本発明の好ましい態様を示すものであり、本発明の説明にのみ用いられる。従って、本発明の範囲を精神を逸脱しない、当業者に明らかな、各種変更及び改造も本発明の範囲である。
【００２７】
１．    定義
「異種セルラーゼ融合構築体」の語は、作動可能な結合の中の異なる遺伝子の部分から成る核酸構築体を意味する。この成分は５’末端から、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメインであることを特徴とする第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子及びセルラーゼ触媒ドメインであることを特徴とする第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子を含む。
【００２８】
「セルラーゼ融合タンパク質」又は「セルロース分解活性を有する融合タンパク質」の語は、セルロース分解活性を有し、且つ、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメイン及びセルラーゼ触媒ドメインの両方を有する酵素を意味する。
【００２９】
「セルラーゼ融合タンパク質の成分」の語はセルラーゼ融合タンパク質の個々の（切断された）フラグメントを意味する。各フラグメントはセルラーゼ加水分解を有し、且つ融合タンパク質の第一又は第二触媒ドメインのいずれかを有する。
【００３０】
「セルラーゼ」の語は、セルロース（ベータ１，４−グルカン又はベータＤ−グルコシド結合）ポリマーをより短いセロオリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース及び／又はグルコースに加水分解する能力のある酵素の類を意味する。
【００３１】
「エキソ−セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）」の語は、ＥＣ３．２．１．９１に分類されるセルラーゼ酵素のグループを意味する。これらの酵素は、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼとしても知られている。ＣＢＨ酵素はセルロースの還元又は非還元末端からセロビオースを加水分解する。ＣＢＨ１タイプの酵素はセルロース還元末端からセロビオースを優先的に加水分解し、ＣＢＨ２タイプの酵素はセルロースの非還元末端を優先的に加水分解する。
【００３２】
「エンドグルカナーゼ（ＥＧ）」の語はＥＣ３．２．１．４として分類されるセルラーゼ酵素のグループを意味する。ＥＧ酵素はセルロース内部のベータ１，４−グルコシド結合を加水分解する。
【００３３】
「ベータグルコシダーゼ」の語は、ＥＣ３．２．１．２１として分類されるセルラーゼ酵素のグループを意味する。
【００３４】
「セルロース分解活性」の語は、エキソグルカナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性又は両方のタイプの酵素活性を包含する。
【００３５】
「触媒ドメイン」の語は、セルラーゼの触媒活性を有するセルラーゼの構造部分又はアミノ酸配列の領域を意味する。この触媒ドメインはセルラーゼの３次構造の構造エレメントであり、セルロースのような基質に結合するセルラーゼの構造エレメントであるセルロース結合部位とは区別されている。
【００３６】
「セルロース結合部位（ＣＢＤ）」の語は、セルラーゼのアミノ酸配列又はセルラーゼのセルロース結合活性を有する酵素の領域を意味する。セルラーゼ結合ドメインは通常、セルロースとセルロース、セルロース誘導体、又他のそれらの等価物であるポリサッカライドとの非共有結合により機能する。ＣＢＤは通常触媒ドメインから独立して機能する。
【００３７】
「第一触媒ドメイン」の語は、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼの触媒ドメインを意味する。
【００３８】
「第二触媒ドメイン」又は「セルラーゼ触媒ドメイン」の語は、セルラーゼ酵素の触媒ドメインを意味する。前記セルラーゼ酵素はセロビオハイドロラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、前記触媒ドメインは第一触媒ドメインの３’末端に作動可能に結合している。
【００３９】
核酸は、他の核酸配列と機能的な位置にある場合に「作動可能に結合する」という。例えば、シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に結合し、プロモーターは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に結合するという。一般に、「作動可能に結合」とは、結合するＤＮＡ配列が隣接することを意味し、異種セルラーゼ融合構築体の場合には、隣接し、且つリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）中にあることを意味する。
【００４０】
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリペプチド鎖の生成に関するＤＮＡの断片を意味し、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）またはリーダー配列及び３’非翻訳（３’ＵＴＲ）またはトレーラー配列）に先行または後に続くコード領域、及び個々のコード断片（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００４１】
本明細書において、「ポリペプチド」という語は、ペプチド結合で結合した一本鎖アミノ酸残基により構成される化合物を意味する。本明細書において、「タンパク質」という語は「ポリペプチド」という語と同義語であり、又は、更に、２以上のポリペプチドの複合物について用いることもできる。
【００４２】
「核酸分子」、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」の語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの退縮の結果セルラーゼ融合タンパク質のような所与のアタンパク質をコードする核酸配列の多様性が生じることは当業者に理解されている。
【００４３】
「異種」核酸配列は、天然の遺伝子において発現することのない配列の一部を有する。例えば、調節配列に関して用いる「異種」という語は、ここで制御されるのと同一の遺伝子の発現を制御する機能を本来有していない調節配列（すなわち、プロモーター又はエンハンサー）について用いられる。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノム部分に対して内因性のものではなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、又はエレクトロポレーション等によって細胞に付加されたものである。「異種」核酸配列は、天然の細胞において得られる調節配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一又は異なる調節配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含有する。異種核酸配列の語は、本発明の異種セルラーゼ融合構築体を包含する。
【００４４】
本明細書で用いる、「ベクター」の語は、異なる宿主細胞間の輸送のために設計された核酸配列又は構築体を意味する。「発現ベクター」の語は、外来細胞内で異種ＤＮＡ配列を取り込みかつ発現する能力を有するベクターを意味する。発現ベクターは、標的細胞中で特定の核酸の転写をさせる特定の核酸エレメントのシリーズを用いて、組換え的に又は合成的に生産される。組換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイスル又は核酸フラグメントの中に取り込まれる。
【００４５】
「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして用いられる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＡＮ構築体を意味する。プラスミドは多くのバクテリア及び幾つかの真核生物の中で、染色体外自己複製遺伝子エレメントを形成する。
【００４６】
「選択マーカー」の語は、細胞の中で発現することができる核酸配列を意味する。選択マーカーの発現は、対応する選択因子の存在下又は対応する育成条件下において、発現される遺伝子を含む細胞に育成する能力を付与する。
【００４７】
本明細書で用いる「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写に直接機能する核酸配列を意味する。プロモーターは通常発現されるべき標的遺伝子を中に含む宿主細胞に適している。プロモーターは他の転写及び転写調節核酸配列（調節配列とも言う）と共に所与の遺伝子の発現に必要である。通常、転写及び翻訳調節配列はプロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又はアクティベーター配列を含むがこれらに限定されない。
【００４８】
「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」の語は、タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸配列を意味する。前記配列は細胞外への成熟型タンパク質の分泌を促進する。細胞外タンパク質の成熟型は分泌過程において切断されるシグナル配列を欠いている。
【００４９】
「宿主細胞」の語は本発明の異種セルラーゼ融合構築体又はこれを含むベクターを含む細胞を意味する。前記宿主細胞は異種セルラーゼ融合構築体の複製、及び／又は転写、あるいは転写及び翻訳（発現）をサポートする。本発明に用いられる宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ等の原核細胞又は酵母、植物、昆虫、両生類又は哺乳類のような真核細胞である。一般的に宿主細胞は糸状菌である。
【００５０】
「糸状菌」の語は当業者に糸状菌であると認識されている全ての糸状菌を含む。好ましい糸状菌は、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）類、及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）類から選択され、好ましくは、糸状菌は、アルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）あるいは、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、又はハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）等の別のこれらの有性型からなる群より選択される（Ｋｕｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６参照）。
【００５１】
糸状菌はキチン、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類からなる細胞壁を有し、菌糸伸長による栄養成長する栄養菌糸により特徴付けられ、炭素異化は必然的に好気性である。
【００５２】
「由来」の語は、「に由来する」、「から得られた」及び「から単離された」の語を含む。
【００５３】
「等しい」アミノ酸配列はオリジナルの参照されるアミノ酸配列と同一ではなく、置換、欠失、付加等により変更された幾つかのアミノ酸を含む、アミノ酸配列を意味する。（等しいアミノ酸配列を含む）タンパク質は参照されるタンパク質と同量の生物活性を必全的に含むこととなる。等しいアミノ酸配列は、オリジナルの参照配列に対して８０-９０％の間のアミノ酸配列の同一性を有する。好ましくは、等しいアミノ酸配列は参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９３％、９５％、９８％及び９９％の同一性を有する。
【００５４】
「置換」は、１以上の核酸又はアミノ酸を異なる核酸又はアミノ酸にそれぞれ置き換えることにより成しうる。置換は通常、１のクラスのアミノ酸が同じクラスのアミノ酸と置換される保存置換として知られる置換に従って行われる。「非保存置換」は１のクラスのアミノ酸が他のクラスのアミノ酸に置き換わる置換である。
【００５５】
「欠失」の語は１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を欠く、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化として定義される。
【００５６】
「付加」の語は、オリジナル参照配列と比較したときに１以上の核酸又はアミノ酸配列の挿入が起こっている核酸又はアミノ酸配列を意味する。
【００５７】
本明細書で用いる、「組換え」の語は、異種の核酸の導入により修飾された細胞又はベクター、あるいは、そのように修飾された細胞由来の細胞を意味する。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞の天然型（非組換え）内では見られない遺伝子を発現するか、あるいは、人為的介入により、天然遺伝子を過剰発現する、もしくは遺伝子の発現を抑制するか、遺伝子を全く発現させない。
【００５８】
細胞に対して用いる「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「遺伝子導入された」の語は、そのゲノム内に、又は数世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして、組み込まれている本発明の異種核酸配列を有する細胞を意味する。
【００５９】
異種セルラーゼ融合構築体又は異種核酸配列を細胞内へ挿入する文脈上用いられる「導入された」の語は、「形質感染」、「形質転換」及び「形質導入」を意味し、原核又は真核細胞内への異種核酸配列又は異種セルラーゼ融合構築体の取り込みを意味することを含む。異種核酸配列又は異種セルラーゼ核酸構築体は細胞内のゲノム内（例えば、クロモソーム、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）にとりこまれ、自律レプリコン内へ転換されるか、あるいは、一時的に発現される（例えば、形質転換されたｍＲＮＡ）。
【００６０】
本明細書で用いる「発現」の語は遺伝子の核酸配列を基に生成されるポリペプチドによる過程を意味する。この過程は転写及び翻訳を含む。
【００６１】
「セルラーゼ融合タンパク質発現」又は「融合発現」の語は、第二セルラーゼ触媒ドメインに融合する第一触媒ドメイン、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後調節処理されたポリペプチドの生成物及びそれらの誘導体を含む「異種セルラーゼ融合構築体」の転写及び翻訳を意味する。
【００６２】
本明細書で用いる「精製」の語は、通常、組換え核酸又は細胞を含むタンパク質を生物学的精製及び／又はカラムクロマオトグラフィーで処理することを意味する。
【００６３】
本明細書で用いる「活性」及び「生物学的活性」の語は、セルラーゼに関係する酵素活性のように、特定のタンパク質に関係する生物学的活性を意味する。所与のタンパク質の生物学的活性は該タンパク質に起因する任意の生物学的活性を意味することは当業者に理解されている。
【００６４】
本明細書で用いる、「豊かにした（高めた）」の語は、糸状菌セルラーゼ組成物の中に見られるセルラーゼ酵素の濃度が、野生型又は自然発生糸状菌セルラーゼ組成物中に見られる濃度よりも高いことを意味する。「豊かにした」、「上昇させた」、及び「高めた」の語は、本明細書において互換的に使用される。
【００６５】
「野生型糸状菌セルラーゼ組成物」は、自然発生糸状菌源から生成され、１以上のＢＧ、ＣＢＨ及びＥＧ成分を含むものを言う。これらの各成分は、糸状菌により生産される割合で見られる。
【００６６】
従って、例えば、自然発生セルラーゼ系は、適切なｐＨにおけるイオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の文献において確立された既知の技術により実質的に純粋な成分へと精製される。精製されたセルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分をその後、酵素液に加え、セルラーゼ高含有溶液を生成する。本発明に包含されるセルラーゼ融合タンパク質の発現により、微生物から生産されるＥＧ又はＣＢＨの量を高めることも可能である。
【００６７】
本明細書で用いる記号、「一つの」及び「この」という語は、他に違った形で定義されていない限り、複数を示す場合にも用いる。
【００６８】
本明細書で用いる「から成る（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は、「含む」の意味に用い、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と等しく用いる。
【００６９】
「ＡＴＣＣ」の語は、バージニア州（ＶＡ）マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）２０１０８にある、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｌｔｕｒｅ．  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ  ｗｗｗ／ａｔｃｃ．org）を言う。
【００７０】
「ＮＲＰＬ」の語は、イリノイ州（ＩＬＬ）ピオリア（Ｐｅｏｒｉａ）にある、アグリカルチャラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ．  Ｃｕｌｔｕｒｅ．  Collection）、あるいは、農務省（ＵＳＤＡ）の北部研究所（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）としても知られている、国立農業飼養研究センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Research）を意味する。
【００７１】
２．    好ましい態様
Ａ．異種セルラーゼ融合構築体及び発現ベクターの成分及び構築
異種セルラーゼ融合構築体又は異種セルラーゼ融合構築体を含むベクターをタンパク質の発現及び分泌のために糸状菌宿主細胞内へ導入し複製する。
【００７２】
異種セルラーゼ融合構築体の成分は、前記構築体の５’からの作動可能な結合の中に、任意でシグナルペプチド、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）であることを特徴とする第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子及びセルラーゼ酵素であることを特徴とする第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子を含む。
【００７３】
他の態様において、異種セルラーゼ融合構築体は、前記構築体の５’からの作動可能な結合の中に、シグナルペプチド、ＣＢＨ触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、第二触媒ドメインのＣＢＤをコードするＤＮＡ分子、及びバクテリアセルラーゼ由来であることを特徴とする第二セルラーゼ触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子を含む。
【００７４】
他の態様において、前記構築体は、前記構築体の５’からの作動可能な結合の中にシグナルペプチド、ＣＢＨの触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、ＣＢＨのＣＢＤをコードするＤＮＡ分子、リンカー、任意で第二触媒ドメインのＣＢＤをコードするＤＮＡ分子及び第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子を含む。
【００７５】
更なる態様において、異種セルラーゼ融合構築体又は発現ベクターは、５’末端からの作動可能な結合の中に、糸状菌分泌性タンパク質のプロモーター、シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、第一触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、リンカー、任意で第二触媒ドメインのＣＢＤをコードするＤＮＡ、第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ及びターミネーターを含む。
【００７６】
一の好ましい発現ベクターは、５’末端からの作動可能な結合の中に、糸状菌の分泌性タンパク質のプロモーター、糸状菌エキソ−セロビオハイドロラーゼシグナル配列をコードするＤＮＡ分子、エキソ−セロビオハイドロラーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子、リンカー、セルラーゼ触媒ドメインをコードするＤＮＡ分子及びターミネーターを含む。
【００７７】
幾つかの態様において、前記ベクターはエキソ−セロビオハイドロラーゼのＣＢＤを含む。他の態様においては、前記ベクターは第二触媒ドメインのセルラーゼのＣＢＤを含む。好ましい態様において、セルラーゼ触媒ドメインのコード配列（セルラーゼＣＢＤを含む場合、又はセルラーゼＣＢＤを欠く場合のいずれか）は、セルラーゼシグナル配列を含まない。本発明の発現ベクター及び異種セルラーゼ融合構築体を含む実施態様の例として、図１、１４及び１６参照のこと。
【００７８】
典型的なプロモーターは、構築プロモーター及び誘発プロモーターの両方を含む。実施例では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ又はアルファグルコシダーゼ遺伝子；アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｇｐｄＡ又はｔｒｐＣ遺伝子；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のｃｂｈ１又はｔｒｐ１遺伝子；アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギンプロテイナーゼコード遺伝子；トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇａｌ、ｅｇｌ２、又は他のセルラーゼをコードする遺伝子のプロモーター；ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、（Ｃｌｏｎ  Ｔｅｃｈ及びＢＡＳＦ）で説明されるテットオン（ｔｅｔ−ｏｎ）又はテット（ｔｅｔ−ｏｆｆ）システムにおけるテット反応エレメント（ｔｅｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＴＲＥ）を含むプロモーター、ベータアクチンプロモーターを含む。幾つかの態様において、前記プロテアーゼは形質転換される宿主細胞の天然のプロモーターである。
【００７９】
一の態様において前記プロモーターは、エキソ−セロビオハイドロラーゼｃｂｈ１又はｃｂｈ２プロモーターであり、とくに、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーターのようなｃｂｈ１プロモーターである。前記トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーターは誘発プロモーターである。ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）Ｎｏ．Ｄ８６２３５参照のこと。
【００８０】
エキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列はシグナル配列をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合している。前記シグナル配列は発現されるべきエキソ−セロビオハイドロラーゼに本来関係するものであることが好ましい。好ましくは、前記シグナル配列は、ＣＢＨをコードするトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子によりコードされる。より好ましくは、前記シグナル配列はＣＢＨ１をコードするトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）遺伝子によりコードされる。更なる態様において、異種セルラーゼ融合構築体のプロモーター及びシグナル配列は同じ源から提供される。幾つかの態様において、前記シグナル配列はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に結合しているトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈ１シグナル配列である。更なる態様において、前記シグナル配列は配列番号２のアミノ酸配列又はこの配列に対して少なくとも９０％の相同な配列を有する。
【００８１】
大部分のエキソ−セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨｓ）及びエンドグルカナーゼはリンカーペプチドによりセルロース結合ドメインと分離している触媒ドメインを有するマルチドメイン構造を有する（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この触媒ドメインは活性部位を含むのに対して、ＣＢＤは酵素がセルロースに結合することによってセルロースと相互作用する（ｖａｎ  Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６及びＴｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【００８２】
数多くのセルラーゼが学術文献に記載されており、その例は、；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉにおいては、ＣＢＨ１を開示するＳｈｏｅｍａｋｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １：  ６９１-６９６，１９８３、ＣＢＨ２を開示するＴｅｅｒｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ５１：４３-５２，  １９８７、ＥＧ１を開示するＰｅｎｔｔｉｌａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ４５：２５３-２６３，１９８６、ＥＧ２を開示するＳａｌｏｈｅｉｍｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ６３：１１−２２，１９８８、ＥＧ３を開示するＯｋａｄａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６４：５５５-５６３，１９８８、ＥＧ４を開示するＳａｌｏｈｅｉｍｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２４９：  ５８４-５９１，１９９７、及びＥＧ５を開示するＳａｌｏｈｅｉｍｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １３：  ２１９-２２８，１９９４を含む。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）以外の株由来のエキソ−セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼの例は、アスペルギルス・アキュレイタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）により生産されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列がＯｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，に開示されている。アスペルギルス・アキュレイタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のベータグルコシダーゼ１をコードするｃＤＮＡのクローニング及び配列決定は、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６に開示されている；アスペルギルスカワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）ＩＦＯ４３０８由来のエンドグルカナーゼＣＭＣ１アーゼ１をコードするｃＤＮＡ配列はＳａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５に開示されている、及びエルウィニアカロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａｒａ）由来のエンドグルカナーゼはＳａａｒｉｌａｈｉｔ  ｅｔ  ａｌ；１９９０に開示されている。これらの酵素をコードする配列は本発明の異種セルラーゼ融合構築体に用いられる。
【００８３】
幾つかの態様において、第一触媒ドメインは糸状菌ＣＢＨ由来である。他の態様において、ＣＢＨはＣＢＨ１タイプエキソ−セロビオハイドロラーゼであり、他の態様において、この触媒ドメインは、ＣＢＨ２タイプエキソ−セロビオハイドロラーゼ由来である。幾つかの態様において、ＣＢＨ１触媒ドメインはトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）由来である。
【００８４】
一の態様において、第一触媒ドメインはトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１の核酸配列によりコードされる。幾つかの態様において、この核酸は、配列番号３の配列、及びそに相同な核酸である。
【００８５】
他の態様において、第一触媒ドメインは配列番号６のアミノ酸配列及びそれらに等しいアミノ酸配列を有する。配列番号６の前記アミノ酸配列の任意の等価物をコードする更なるＤＮＡ配列は、異種セルラーゼ融合構築体に取り込まれる。前記等価物は配列番号６に対して同質の生物活性を有する。
【００８６】
幾つかの態様において、本発明に包含される異種セルラーゼ融合構築体はエキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメインをコードしている配列の３’及びエンドグルカナーゼ触媒ドメインをコードするする配列の５’に位置するリンカーを含む。幾つかの好ましい態様において、このリンカーはエキソ−セロビオハイドロラーゼの触媒ドメインと同じ源由来である。好ましくは、このリンカーはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈ１遺伝子由来である。一の好ましいリンカー配列を図３に示す。他の態様において、この異種セルラーゼ融合構築体又は発現ベクターは２以上のリンカーを含む。例えば、このリンカーは、第一触媒ドメインのコード配列と第二触媒ドメインのコード配列の間だけでなく、第二触媒ドメインのＣＢＤと第二触媒ドメインのコード領域の間にも存在する。通常、リンカーは、約５０乃至６０アミノ残基の間、約１５乃至５０アミノ酸残基の間、及び約２５乃至４５アミノ酸残基の間である。参考文献はトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１のリンカーペプチドについての議論が記載されているＳｒｉｓｏｄｓｕｋ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３である。
【００８７】
リンカー配列に加えて、異種セルラーゼ融合構築体又はセルラーゼ融合構築体を含む発現ベクターはプロテアーゼ切断部位のような切断部位を含む。一の好ましい態様において、前記切断部位はＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドをコードするケキシン部位である。
【００８８】
異種セルラーゼ融合構築体はセルラーゼの第二触媒ドメインに対するコード配列を含む。前記セルラーゼは糸状菌又はバクテリ源由来である。加えて、前記セルラーゼはエキソ−セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）又はエンドグルカナーゼ（ＥＧ）である。幾つかの好ましい態様において、第二触媒ドメインはバクテリアセルラーゼ由来である。ＣＢＨ及びＥＧセルラーゼの源は上でのべた。加えて、エンドグルカナーゼはＣｏｕｔｉｎｈｏ，  Ｐ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ-Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＣＡＺｙ）  ｓｅｒｖｅｒ  ａｔ  ａｆｍｂ．  ｃｎｒｓ-ｍｒｓ．ｆｒ／−ｃａｚｙ／ＣＡＺＹ／ｉｎｄｅｘの分類を用いたグリコシルハイドロラーゼファミリーの１３を超えるファミリーの中に見られる。
【００８９】
特に好ましいバクテリアセルラーゼの第二触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  エンドグルカナーゼ１（Ｅ１）触媒ドメインをコードする配列番号７のＤＮＡ；
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８セルラーゼ触媒ドメインをコードする配列番号９のＤＮＡ配列；
ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ触媒ドメインをコードする配列番号１１のＤＮＡ配列；
ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ３セルラーゼをコードする配列番号１３のＤＮＡ；
ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ５エンドグルカナーゼをコードする配列番号１５のＤＮＡ配列、及び
ｆ）配列番号８、１０、１２、１４及び１６の前記アミノ酸配列に似た質の生物活性を有する任意の等価物をコードするＤＮＡ配列又は相同なＤＮＡ配列、を含む。
【００９０】
幾つかの好ましい態様において、エンドグルカナーゼはアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）Ｅ１であり、ＷＯ  ９１０５０３９；ＷＯ  ９３１５１８６；ＵＳＰ  ５，２７５，９４４；ＷＯ  ９６０２５５１；ＵＳＰ  ５，５３６，６５５及びＷＯ  ００７００３１に開示されているアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）エンドグルカナーゼを参照されたい。ジェンバンク（ＧｅｎＢＡｎｋ）Ｕ３３２１２も参照のこと。幾つかの態様において、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）Ｅ１は配列番号６で定義される配列に対して少なくとも９０％、９３％、９５％及び９８％相同なアミノ酸配列である。
【００９１】
上で述べたように、配列番号１、３、７、９、１１、１３及び１５で示す核酸配列に相同な核酸配列も本発明の異種セルラーゼ融合構築体又はベクターに用いられる。
【００９２】
相同配列は他の種、自然発生対立遺伝子変異体、及び機能的な生物活性を有する誘導体の中に見られる配列を含む。相同配列は、配列アラインメントプログラムを用いて整列させたときに、少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％及び９９％、配列番号１，３，７，９，１１，１３，１５の１の配列に対して相同である。所与の配列の相同体、例えば上で述べたＴｆ−Ｅ３触媒ドメインのコード配列の相同体は、所与の配列の全体の長さに対して８０％より高い配列相同性を有する。
【００９３】
所与の異種セルラーゼ融合構築体又はこの構築体の成分に関して、遺伝子コードの退縮の結果として同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする多くのコード配列が生成されることは理解されている。例えば、３文字のＣＧＴはアミノ酸のアルギニンをコードする。アルギニンは代替的にＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧによりコードされる。それゆえ、そのような代替コードも本発明により包含される核酸配列の中に含まれることが理解される。これらの配列のいずれか及び全部はＣＢＨ触媒ドメイン又はセルラーゼ触媒ドメインとして本明細書に開示されているのと同じ方法で用いることができる。
【００９４】
２の配列の間の相同性を決定するのに用いることができる典型的なコンピュータプログラムは、例えば、ｗｗｗ．  ｎｃｂｉ．  ｎｉｍ．  ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴから入手可能なＢＬＡＳＴＩＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＴＢＡＬＮＳＴＮのような一連のＢＬＡＳＴプログラムを含むがこれらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０  及び  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７も参照のこと。
【００９５】
配列サーチは所定の核酸配列をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＤＮＡ配列及びその他の公共データベースの核酸配列と比較して評価する場合、一般的にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質配列及びその他の公共データベース中のアミノ酸配列に対して全リーディングフレーム内で翻訳されている核酸配列をサーチするのに好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸの両方は１１．０のオープンギャップ・ペナルティ及び１．０の延長ギャップペナルティを含む初期パラメーターを用いて操作し、ＢＬＯＳＵＭ-６２マトリックスを利用する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照。）。
【００９６】
２つ以上の配列間の「同一性％」を決定するために選択された配列の好ましいアラインメントは例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ-Ｗプログラムを用いて実行し、１０．０のオープンギャップ・ペナルティ、０．１の延長ギャップペナルティ及びＢＬＯＳＵＭ３０類似マトリックスを含む初期値パラメーターを用いて操作する。
【００９７】
典型的な方法として、ＣＢＨ又はＥＧ触媒ドメインをコードする核酸の配列伸長はＣＢＨ又はバクテリアＥＧ前駆体を検出するために上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載するような従来のプライマー伸長手順を用いて行い、ｃＤＮＡに逆転写されてないｍＲＮＡの中間体を処理し、及び／または完全長タンパク質をエンコードするＯＲＦを同定することにより行われる。
【００９８】
他の側面において、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１又はＧＨ５Ａ-Ｅ１のアミノ酸配列の核酸配列の全体または一部がプローブとして用いられる。このようなプローブは関連有機体由来の相同性核酸配列を同定及びクローンするために使用できる。
【００９９】
選択プローブを用いたｃＤＮＡ、又はゲノムライブラリーのスクリーニングはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）に記載されているような標準的な手段を用いて行うことができる。中ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【０１００】
配列間の相同性又は同一性を決定するためのアミノ酸配列のアラインメントは「配列比較アルゴリズム」を用いて評価することが好ましい。比較のための配列の最適な位置合わせは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）とウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）のローカル・ホモロジー・アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２：ｐ４８２（１９８１年）、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）とウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）のホモロジーアラインメントアルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、（Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８：ｐ４４３（１９７０年）、パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）とリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）の同様の方法、（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ‘ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５：ｐ２４４４（１９８８年））、コンピュータ化したこれらのアルゴリズムの実施の（例えば、ウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＴＦＡＳＴＡ）、目視検査により、又はケミカルコンピューティンググループ（ＣＨＥＭＩＣＡＬ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）モントリオール、カナダ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｃａｎａｄａ）によるＭＯＥにより実施することができる。
【０１０１】
配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２１５：ｐ４０３−４１０（１９９０年）参照）。ＢＬＡＳＴ解析を遂行するためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォ・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公的に入手可能である。
【０１０２】
本発明の異種のセルラーゼ融合構築体はターミネーター配列も含む。幾つかの態様において、このターミネーター及びプロモーターは、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）エキソ−セロビオハイドロラーゼ遺伝子の同じ源から提供される。他の態様において、前記ターミネーター及びプロモーターは異なる源由来である。好ましい態様において、このターミネーターは、糸状菌の源であり、特にトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の源である。特に適切なターミネーターは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、とくにトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｃｂｈ１及びＡｓｐアスペルギルス・ニガー（Ａｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はＡアスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）由来のグルコアミラーゼターミネーターである（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）。
【０１０３】
異種融合構築体又は融合構築体を含むベクターは選択マーカーも含む。適した選択マーカーの選択は宿主細胞に依存しており、異なる宿主細胞に対しての適切なマーカーは当業者に知られている。典型的なマーカー遺伝子は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のａｒｇＢ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のａｍｄＳ、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）又はトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｐｙｒＧを含む。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換のためのベクター系に有用なマーカーは、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｃｈａｐ．  ６，  ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳＦＵＮＧＩ、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  １９９２に記載されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕａｌｎｓ）由来のａｍｄＳ遺伝子は、アセトアミドを窒素源として、形質転換細胞を育成可能にする酵素であるアセトアミダーゼをコードする（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：４７５−４７９  （１９８５）及びＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４（１９８７））。これらの選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は栄養要求変異体株が最小培地上で育成する能力を再構築し、この選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は抑制薬又は抗体の存在下において育成する能力を形質転換体に付与する。
【０１０４】
典型的な異種セルラーゼ融合構築体を図１及び１４に示す。本発明に包含される異種セルラーゼ核酸構築体及びその他の異種核酸配列を結合するために用いる方法並びにそれらを適切なベクター内へ挿入するために用いる方法は当業者に知られている。結合は通常、ベクターに便利な制限部位における結合により行われる。もし、そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドリンカーが従来の方法に従って用いられる。更に、ベクターは既知の組換え技術を用いて構築される。
【０１０５】
導入された細胞の中で複製可能であり、生育できる限り、あらゆるベクターを用いることができる。数多くの適切なクローニング及び発現ベクターが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３及びＳｔｒａｔｈｅｒｎｅｔ  ａｌ．，  １９８１に開示されている。これらの文献を参照により本明細書に援用する。更に糸状菌に対して適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，  Ｃ．  Ａ．  Ｍ．  Ｊ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｉｎ  ：  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｌ．  Ｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｍｏｒｅ  ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．３９６−４２８に記載されている。適切なＤＮＡ配列は、標準的な技術により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位へ挿入される。そのような手順及び関連するサブクローニング手順は当業者の知識の範囲内である。有用なプラスミドの例は、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１００、ｐＳＬ１１８０（ファルマシア  インク、ペンシルバニア、ニュージャージ）及びｐＦＢ６を含む。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｐＲＡＸ及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｐＴＥＸのような一般的な他のベクターも用いることができる（図１６及び１７）。
【０１０６】
Ｂ．標的宿主細胞
本発明の一の態様において、糸状菌親株又は宿主細胞は、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．）、クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、ハイポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐ．）及びエメリセラ種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｓｐ．）の細胞であるがこれらに限定されない。本明細書で用いる「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」又は「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）」の語は、これまでにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類されてきたもののほかに近年トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）であると分類されたものも含む。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）糸状菌親細胞に適した株は、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（レーシ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ  （ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、及びトリコデルマ・ハリジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）細胞を含む。特に好ましい宿主細胞はＲＬ−３７等のトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４６−５３（１９８４））及びｒｕｔ−３０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５）及びＱＭ９４１４株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９１２）等トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の機能的な等価物及びその誘導株由来の細胞を含む。ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３６３１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６４、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６７、及びＮＲＲＬ  １５０９も参照のこと。
【０１０７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）糸状菌親細胞に適した株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュランタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）細胞を含む。一の態様において、この株はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｒｅ）、例えば、アスペルギルス・ニガーｖａｒ．アワモリ（Ａ．  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）ｄｇｒ２４６（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ，  （２００２）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ  ４１：  ８９−９８）及びＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４、及びＧＡＰ（３−４）（Ｗａｒｄ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３９：７３８−７４３）を含む。
【０１０８】
場合によっては、本発明に包含される異種セルラーゼ融合構築体の導入の前に、１以上のセルラーゼ遺伝子を欠失させたトリコデルマ等の糸状菌宿主細胞株を得ることが好ましい。そのような株は、参照により本明細書に援用されるＵ．  Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２４６，８５３、Ｕ．  Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８６１，２７１、及びＷＯ  ９２／０６２０９に記載の方法により調製される。１以上のセルラーゼ遺伝子を欠く宿主細胞の中でセルラーゼ活性を有するセルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分の発現により、検出及びその後に続く精製工程が簡略化される。クローン化されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の任意の遺伝子、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２だけでなく、ＥＧ３及び／又はＥＧ５タンパク質をコードする遺伝子も欠失される（Ｕ．  Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，４７５，１０１及びＷＯ  ９４／２８１１７参照のこと）。遺伝子欠失は、欠失又は阻害されるべき所望の遺伝子形態を当該技術分野において既知方法を用いて挿入することにより行われる。親糸状菌細胞株は、通常Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ，ｅｄｓ．  Ａｕｂｅｒｔ  Ｊ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．７１−８６（１９８８）及びｌｌｍｅｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６３：１２９８−１３０６  （１９９７）に記載されているように、生理塩及び栄養素を含む培地を用いた標準条件で培養される。イーストモルト抽出物（ＹＭ）ブロス、（ＬＢＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス及び（ＳＤＳａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）ブロス等の市販されている調整培地も用いることができる。
【０１０９】
Ｃ．異種セルラーゼ融合構築体又はベクターの糸状菌宿主細胞への導入及び培養条件
宿主糸状菌細胞は本発明の異種セルラーゼ融合構築体又は異種セルラーゼ融合構築体を含むクローニングベクター又は発現ベクターを用いて遺伝的に修飾される（すなわち、形質導入、形質転換、又は形質感染）。本発明の形質転換の方法は、糸状菌ゲノム内へ構築体又はベクターの一部又は全部を安定に組み込むこととなる。しかしながら、染色体外形質転換ベクターの自己複製を維持する形質転換も意図する。
【０１１０】
異種タンパク質を大量に発現するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞株等の糸状菌細胞株を生産するために多くの標準的形質転換方法を用いることができる。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のセルラーゼ生産株内へＤＮＡ構築体を導入するための幾つかの既知の方法は、Ｌｏｒｉｔｏ，  Ｈａｙｅｓ，  ＤｉＰｉｅｔｒｏ  ａｎｄ  Ｈａｒｍａｎ  （１９９３）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４：  ３４９−３５６；  Ｇｏｌｄｍａｎ，  ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  （１９９０）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １７：１６９−１７４、Ｐｅｎｔｔｉｌａ，  Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，  Ｒａｔｔｏ，  Ｓａｌｍｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ  （１９８７）  ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４、ＥＰ−Ａ−０２４４２３４  及び  Ｈａｚｅｌｌ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００に記載されており、アスペギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に対してはＹｅｌｔｏｎ，  Ｈａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されており、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）に対してはＢａｊａｒ，Ｐｏｄｉｌａ  ａｎｄ  Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８２０２−８２１２に記載されており、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に対してはＨｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｅ  ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  ＵＫに記載されており、及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に対してはＢｒｉｇｉｄｉ，  ＤｅＲｏｓｓｉ，  Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，  Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，  （１９９０），  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ５５：１３５−１３８に記載されている。
【０１１１】
異種セルラーゼ融合構築体又はベクターを糸状菌（例えばハイポクレア・ジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ））内に導入するための他の方法は、粒子又は遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、形質転換前の糸状菌細胞壁の透過（例えば、０．０５Ｍ乃至０．４ＭＣａＣｌ２のような高濃度のアルカリ又は酢酸リチウムを用いることによる）、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション又はアグロバクテリウム仲介形質転換（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２５５，１１５）を含む。
【０１１２】
ポリエチレングリコール及びＣａＣｌ２を用いたプロトプラスト又はスフェロプラストを処理して糸状菌を形質転換する典型的な方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６：５３−５６，１９８９及びＰｅｎｔｔｉｌａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  ｇｅｎｅ，  ６３：１１−２２及びＰｅｎｔｔｉｌａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  ｇｅｎｅ，  ６１：１５５−１６４に記載されている。
【０１１３】
宿主細胞の中に外来核酸配列を導入するための良く知られた任意の方法を用いることができる。異種遺伝子を発現することができる宿主細胞において少なくとも１の遺伝子を効果的に導入することができる所定の遺伝子工学手法が必要とされる。
【０１１４】
本発明は、糸状菌、特にセルラーゼ融合タンパク質に対するコード配列を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞の形質転換体を含む。本発明は更にセルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分を含む糸状菌セルラーゼ組成物の生産に用いる糸状菌形質転換体を更に含む。
【０１１５】
エキソグルカナーゼ触媒ドメインコード配列及びエンドクグルカナーゼ触媒ドメインコード配列を含む異種セルラーゼ融合構築体の導入に続いて、遺伝的に修飾された細胞は、標的宿主細胞の育成のために上で述べたような既知の栄養培地中で培養することができ、プロモーターの活性化及び形質転換体の選択に適するように修飾することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は発現のために選択された宿主細胞のものであり、当業者に明らかな事項である。所与の糸状菌のための好ましい培養条件は、学術文献及び／又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）等の糸状菌の提供元に開示されている。
【０１１６】
成長速度及び固形培養培地上での不規則な外観ではなくスムースな外観を示すコロニーの形成を目安として、糸状菌の適切な形質転換を不安定な形質転換と区別することができる。更に、幾つかのケースにおいて、固形非選択培地上での形質転換体の成長、この培養培地からの胞子の収穫、及び引き続き発芽し成長する胞子の割合の決定、並びに選択培地上での成長により安定性のための更なる試験を行うことができる。
【０１１７】
そのような異種セルラーゼ融合構築体又はこれを含むベクターを導入した細胞の子孫は、異種セルラーゼ融合構築体中に見られる核酸配列によりコードされる融合タンパク質を含むと考えられる。
【０１１８】
本明細書に包含される発明の適用の一の例において、異種セルラーゼ融合構築体を含むトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）等の糸状菌の組換え株はセルラーゼ融合タンパク質だけでなく、セルラーゼ融合タンパク質の成分も生産する。幾つかの態様において、実質的に同じ条件下で育成するけれども、エキソ−セロビオハイドロラーゼ触媒ドメイン及び／又はセルラーゼ触媒ドメインをコードする配列を分離した形で含む異種核酸構築体を誘発するように遺伝的に修飾された、対応する組換糸状菌株と比較して、前記セルラーゼ融合構築体を含む組換え細胞は高められた量のセルロース分解活性を有する。
【０１１９】
幾つかの態様においてこのセルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分はアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）Ｅ１触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン、及び切断されたＢＣＨ１及びＥ１生成物を含む。
【０１２０】
幾つかの態様においてこのセルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分はアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８セルラーゼ触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン、及び切断されたＢＣＨ１及びアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８生成物を含む。
【０１２１】
幾つかの態様においてこのセルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分はアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン、及び切断されたＢＣＨ１及びＧＨ７４生成物を含む。
【０１２２】
幾つかの態様においてこのセルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分はセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ３セルラーゼ触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン、及び切断されたＢＣＨ１及びＥ３生成物を含む。
【０１２３】
幾つかの態様においてこのセルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分はセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ５エンドグルカナーゼ触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン、及び切断されたＢＣＨ１及びＥ５生成物を含む。
【０１２４】
Ｄ．タンパク質発現の解析
異種セルラーゼ融合構築体を用いて形質転換された細胞株による本発明のセルラーゼ融合タンパク質の発現を評価するために、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルにおける、又は特にエキソ−セロビオハイドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性及び／又は生産物に対する機能的なアッセイを実施することができる。
【０１２５】
通常、ノザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ解析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、適切なラベルプローブの使用（核酸コード配列に基づいた）、従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィー等のアッセイがセルラーゼ融合タンパク質発現構築体及びベクター配列の組み込みを評価するために用いられる。
【０１２６】
更に、セルラーゼ酵素の生産及び／又は発現は、例えば、セロビオハイドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性の発現及び／又は生産をアッセイすることにより、サンプルから直接測定することができる。そのようなアッセイは、例えば、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  （２００１）  ３５６：１９−３０；  Ｍｉｔｓｕｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  （１９９０）  ２７５：１３５−１３８、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９７８、及びＳｃｈｕｌｅｉｎ  １９８８に記載されている。これらの文献を参照により本明細書に援用する。単離された不溶及び可溶性基質を加水分解するＣＢＨ１の能力は、Ｓｒｉｓｏｄｓｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  （１９９７）  ５７：４９−５７  及び  Ｎｉｄｅｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  （１９９４）  ４４：９６１−９６６に記載のアッセイ方法を用いて測定することができる。エキソ−セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ−グルコシド活性に用いるのに有用な基質は、結晶セルロース、ろ紙、リン酸膨張セルロース、セロオリゴサッカライド、メチルウンベリフェリル・ラクトシド、メチルウンベリフェリル・セロビオシド、オルトニトロフェニル・ラクトシド、パラニトロフェニル・ラクトシド、オルトニトロフェニル・セロビオシド、パラニトロフェニル・セロビオシドを含む。
【０１２７】
更に、タンパク質発現は、例えばウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡを用いた、組織切片の免疫組織染色又は組織の培養培地の免役アッセイ等の免疫学的方法により評価される。そのようなイムノアッセイは、セルラーゼ、例えば、ＣＢＨの発現を、量的及び質的に評価することができる。そのような方法の詳細は当業者に知られており、そのような方法を行うための試薬は市販されている。
【０１２８】
本発明の一の態様において、組換え宿主細胞により発現されたセルラーゼ融合タンパク質は、発現された全セルラーゼの約０．１乃至８０％である。一の態様において、発現した融合タンパク質の量は培養培地１リットル当たり、約０．１ｍｇ乃至１００ｇ、約０．１ｍｇ乃至５０ｇ、及び約０．１ｍｇ乃至１０ｇタンパク質である。
【０１２９】
Ｅ．セルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分の回収及び精製
通常、細胞培養の中のセルラーゼ融合タンパク質又はセルラーゼ融合タンパク質の成分は培地の中に分泌され、回収され、任意で、例えば、細胞培養培地から不必要な成分を回収することにより、精製される。しかしながら、幾つかのケースにおいて、セルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分は、細胞内に分泌されるのでそのような場合には、細胞溶解物から回収する工程が必要となる。そのようなケースにおいて、前記タンパク質は当業者が通常用いる技術により細胞の中から精製された形態である。精製技術の例は、親和クロマトグラフィー（ｖａｎ  Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １６：  ２１５，１９８４）、イオン交換クロマトグラフィー（Ｇｏｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３６：３７−５０，１９９１  ;  Ｆｌｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：３１４−３１８，  １９８３  ;  Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６：３３６−３４５，１９８４  ;  Ｅｌｌｏｕｚｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３９６：３０７−３１７，１９８７）、疎水相互クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ  ａｎｄ  Ｑｕｅｉｒｏｚ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ８６５：１２３−１２８，  １９９９）及び二相分離（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ７：２８７−２９５，１９９９）を含む。
【０１３０】
一旦、所与のセルラー融合タンパク質又はそれらの成分の発現が達成されると、それにより生産されたタンパク質が当業者に既知の方法により細胞又は細胞培養から精製される。参考文献はＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  １８２，  ｎｏ．５７，  ｐｐ．７７９，１９９０、及びＳｃｏｐｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９０：  ４７９−９１，１９８２である。そのような精製に適した典型的な手順は、抗体親和カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥ等のカチオン交換レジンのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降、及び例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲルろ過を含む。
【０１３１】
セルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分は、各種免疫アッセイに用いる発現したタンパク質に特異性を有するモノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかを生産するために用いられる（例えば、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ｖｏｌ．  １１，  ｎｏ．  １１，  ｐｐ．５７９２−５７９９，１９９１参照のこと）。典型的な実施例は、ＥＬＩＳＡ，競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接蛍光免疫アッセイ等を含む。
【０１３２】
Ｆ．セルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分を含む酵素組成物の使用
各種製品の中に使用されている、セルラーゼ融合タンパク質及びセルラーゼ融合タンパク質の触媒ドメインを含む成分は、洗剤組成物、ストーンウォシュ組成物、ウッドパルプを糖に分解する組成物（例えば、バイオエタノール生成）、及び食用組成物に用いられる。幾つかの態様において、このセルラーゼ融合タンパク質又は成分はそれゆえ、無細胞抽出物として用いられる。他の態様において、異種セルラーゼ融合構築体を発現している糸状菌細胞はバッチ又は連続発酵条件下で育成される。古典的なバッチ培養は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更はなされない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に接種されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨや酸素濃度等の因子を制御することは頻繁になされる。バッチ法では、当該方法における代謝物及びバイオマス組成物は発酵が停止されるまで変化し続ける。バッチ培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に増加し、最終的には、成長速度が減少又は停止する静止期に至る。培養液が未処理の場合には、当該静止期の細胞は、最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の生産の大部分を担う。
【０１３３】
標準的なバッチ法における変法の１つは、フェドバッチ法である。フェドバッチ発酵方法も本発明に適しており、基質が発酵の進行と共に増加して添加されること以外は典型的なバッチ法と同様である。異化を抑制すると細胞の代謝を阻害する傾向にあることから培養液中の基質の量を制限するのが望ましい場合にフェドバッチ法が有用である。フェドバッチ法において基質濃度を実測することは困難であり、それゆえ、例えば、ｐＨ、溶存酸素量、及び廃ガス（例えば、ＣＯ２）分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて基質濃度を推定する。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において良く知られている。
【０１３４】
連続発酵は開放系であり、所定の発酵培養液が連続的にバイオリアクターへ添加され、それと同時に、同量のならし培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）が発酵工程から除去される。一般に、連続発酵では、培地は所定の高密度に維持され、細胞は主として対数期成長にある。
【０１３５】
連続発酵により、細胞の成長又は最終生成物の濃度に影響を与える１又はそれ以上の因子の調節が可能となる。例えば、１の方法は、栄養分（例えば、炭素源）又は一定の割合で提供される窒素量を制限し、その他全ての因子を加減する方法である。別の方式では、培養液の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつも、成長に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続法は定常状態の成長条件を維持することから、排出される培養液に依存する細胞の損失は、発酵における細胞成長速度と等しくなる必要がある。連続発酵工程における栄養分及び成長因子を調節する方法は、生成物の生成速度を最大化する技術と同様に、工業的微生物学の分野において周知である。
【０１３６】
幾つかの製品において、セルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分は、洗剤組成物、ストーンウォッシュ組成物の中に、又は布製品の風合い及び概観を改善するための処理に用いられる。洗剤組成物は、固形セルロースを含む布の洗濯用洗浄媒体に用いることを意図した混合物を意味する。ストーンウォッシュ組成物は販売前に、すなわち製造工程の間に、セルロースを含む布を修飾するために用いる。対照的に、洗浄組成物は汚れた衣類を洗浄することを意図し、製造工程においては使用しない。
【０１３７】
本発明の文脈上用いる、前記組成物にはセルラーゼ、界面活性剤、追加的な加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青味剤及び蛍光染料、固形抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤及び抗酸化剤、及び可溶化剤も含まれる。
【０１３８】
界面活性剤は通常洗剤の中に見られる、アニオン、カチオン及び非イオン性界面活性剤を含む。アニオン界面活性剤は、直鎖、又は分岐鎖のアルキルベンゼンスルホネート；直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；アルキル又はアルケニルスルフェート；オレフィンスルホネート；及びアルカンスルフォネートを含む。両性界面活性剤は、第四アンモニウム塩スルフォネート、及びベタインタイプの両性スルフォネートを含む。そのような両性界面活性剤は同じ分子内に正電荷及び負電荷した基の両方を有する。非イオン性の界面活性剤は、ポリオキシアルキレンエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド、又はそれらのアルキレンオキサイオド付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル、及び同種のものを含む。
【０１３９】
セルロース含有布製品は、天然のセルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（ジュート、フラックス、レミネ、レーヨン及びｌｙｏｃｓｌｌ等）を含むセルラーゼ含有コットン又はコットン以外の素材から作られた、任意の縫製又は非縫製布製品、毛糸、又は繊維である。コットン含有布製品は、綿織物、綿ニット、綿デニム、綿毛糸、原綿等を含む純正コットン又はコットンのブレンドから作られた縫製された、又は縫製されていない布製品を意味する。
【０１４０】
好ましくは、このセルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分を含むセルラーゼ組成物は、洗剤組成物全体に対して約０．００００５重量パーセント乃至約５重量パーセント用いられる。より好ましくは、このセルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に対して約０．０００２乃至約２重量パーセント用いられる。
【０１４１】
セルロース誘導体生成物の加水分解の速さは、ゲノムの中に挿入された異種セルラーゼ融合構築体を有する形質転換体を用いることにより増加させられることから、セルロース又はヘテロ多糖を含む生成物をより早く及びより広範に分解させることができる。紙、コットン、セルロース誘導体を材料とするオムツ等のセルロースから作られた製品をごみ処理場においてより効率的分解させることができる。従って、形質転換体から得られた発酵生成物又は形質転換体のみは、液化によりゴミ埋立地に添加する各種セルロース生産物の分解を補助するための組成物中に用いられる。
【０１４２】
セルロースベースの原材料は、農業廃棄物、草及び材料及び自治体のゴミのような低価格バイオマス（例えば、リサイクルペーパー、庭の木の切り落とし等）に含まれている。エタノールは、セルロース誘導体の発酵により生成される。しかしながらセルロースをエタノールに転換する前に、糖に転換しなければならない。セルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分を含むことによりセルロース分解活性を高めた組成物はエタノールの生成に用いることができる。
【０１４３】
エタノールは、木、草本、都市ゴミ並びに農業及び林業廃棄物等のセルロース誘導体バイオマスから糖化及び発酵工程を経て生産することができる。しかしながら、微生物により生産される自然発生セルラーゼ混合物内にある個々セルラーゼ酵素の割合は、バイオマスの中のセルロースをグルコースへ速やかに転換するには効率的ではない。エンドグルカナーゼは、それ自身がセロビオハイドロラーゼの作用基質となる新しいセルロース鎖末端を生産するように作用するので、セルラーゼ酵素全体の加水分解の効果を改善することが知られている。それゆえ、セルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分からの高められた又は最適化されたエンドグルカナーゼ活性により、発酵により他の化学品に転換することができるエタノール及び糖の生産が大きく高まる。
【０１４４】
従って、本発明のセルラーゼ融合タンパク質及びそれらの成分は、糖組成物の転換へのセルロース加水分解に用いられる。幾つかの態様においてこのセルラーゼ融合構築体又はそれらの成分は発酵微生物の添加の前にバイオマスに添加される。他の態様において、このセルラーゼ融合タンパク質又はそれらの成分は発酵微生物と同時にバイオマスに添加される。いずれかの態様において他のセルラーゼ組成物が任意で存在する場合もある。
【０１４５】
実施例
本発明は以下の実施例においてより詳細に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０１４６】
以下の開示及び実施例において、以下の略語を用いる。
【０１４７】
ＣＢＨ１−Ｅ１（アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａエンドグルカナーゼ１触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン及びリンカー）；
ＣＢＨ１−４８Ｅ（アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８セルラーゼ触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン及びリンカー）；
ＣＢＨ１−７４Ｅ（アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン及びリンカー）；
ＣＢＨ１−ＴｆＥ３（セルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ３セルラーゼのＣＢＤ、リンカー及び触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン及びリンカー）；
ＣＢＨ１−ＴｆＥ５（セルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ５エンドグルカナーゼのＣＢＤ、リンカー及び触媒ドメインに融合しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン及びリンカー）；
ｗｔ％（重量パーセント）、℃（摂氏）、ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（ベースペア）、ｋｂ（キロベースペア）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μＬ（マイクロリットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメーター）、μｍ（マイメーター）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μｍ（マイクロモル）、Ｕ（単位）、ＭＶ（分子重量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）（時間）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、フタル酸緩衝液（水中フタル酸ナトリウム  ２０ｍＭ、ｐＨ５．０）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２］）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ｗ／ｖ（容量対重量）、ｗ／ｗ（重量対重量）、ｖ／ｖ（容量対容量）及びジェネンカー（ジェネンカーインターナショナル・インク  パロアルト、カリフォルニア）。
【実施例１】
【０１４８】
ＣＢＨ１−Ｅ１融合ベクターの構築
ＣＢＨ１−Ｅ１融合構築体は、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーター、開始コドンからｃｂｈ１リンカーの終わりまでのトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１遺伝子配列、及びエンドグルカナーゼコード配列の開始までの５’ＤＮＡの付加的な１２ベース、停止コドン及びトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１ターミネーター（図１４及び１５）を含んでいた。付加的な１２ベース（ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＧ）（配列番号２０）は、制限エンドグルカナーゼＳｐｅｌ及びアミノ酸、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇをコードする。
【０１４９】
Ｅ１遺伝子のオープンリーディングフレームを含むプラスミドＥ１−ｐＵＣ１９をＰＣＲ反応におけるＤＮＡテンプレートとして用いた。等価プラスミドは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５３６，６５５に開示されており、該文献は、放線菌  アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ＡＴＣＣ４３０６８、のＥ１遺伝子のクローニングについても開示されている（Ｍｏｈａｇｈｅｇｌｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）。プラスミドＤＮＡを用いた試験（ｗｏｒｋｉｎｇ）及びＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅の標準的な方法を用いた（Ｓａｒｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１及び２００１）。
【０１５０】
以下の２のプライマーをＥ１エンドグルカナーゼの触媒ドメインのコード領域を増幅するために用いた。
【０１５１】
前方プライマー１＝ＥＬ−３１６（Ｓｐｅｌ部位を含む）
ＧＣＴＴＡＴＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＣＡＣＡＣ（配列番号２１）
後方プライマー２＝ＥＬ−３１７（Ａｓｃｌ部位及び「停止コドン逆相補体」）
ＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣ「ＴＴＡ」ＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＣ（配列番号２２）
ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘポリメラーゼキット（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）増幅反応条件に従い試験を行った。反応条件を以下に記載する。
【０１５２】
５０μＬの総反応容量中、１μＬのｄＮＴＰマスターミックス（最終濃度０．２ｍＭ）、１μＬのプライマー１（最終濃度  ０．５μＭ）、１μＬのプライマー２（最終濃度０．５μＭ）、２μＬのＤＮＡテンプレート（最終濃度５０−２００ｎｇ）、１μＬの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（最終濃度１ｍＭ）、５μＬの１０×Ｐｆｘ増幅緩衝液、５μＬの１０ＸＰＣＲエンハンサー溶液、１μＬのプラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕトータル）、及び３３μＬの水。
【０１５３】
増幅パラメーター；ステップ１―９４℃２分（抗体結合ポリメラーゼの変体のため１サイクルのみ）、ステップ２、９４℃４５秒、ステップ３、６０℃３０秒、ステップ４、６８℃、２分、ステップ５、−ステップ２を２４回繰り返す、及び６８℃を４分。
【０１５４】
適切にサイズ調節されたＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクター内でクローニングし、適切な非選択培地（５０ｐｐｍカナマイシンを含むＬＢ）上で、平板培養された化学的に適合なＴｏｐ１０、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）内で形質転換した。幾つかのコロニーを平板培地から採取し、プラスミド−ミニ−プレップ（小型プラスミド精製）がなされた選択培地（５０ｐｐｍカナマイシンを有するＬＢ）中で、３７℃で一晩育成した。
【０１５５】
正確なサイズの挿入が行われたかを確認するために、幾つかのコロニーからのプラスミドＤＮＡを制限消化した。ＤＮＡ配列決定により正確な配列を確認した。配列の確認に続いて、Ｓｐｅｌ及びＡｓｃｌ制限酵素を用いた制限消化を用いてＥ１触媒ドメインをＴＯＰＯベクターから切り取った。このフラグメントをＳｐｅｌ及びＡｓｃｌ制限酵素を用いて消化されているｐＴｅｘ４ベクター内へ結合させた（図１６及び１７参照）。
【０１５６】
結合混合物を、ＭＭ２９４コンピテントＥ．Ｃｏｌｉ細胞内で形質転換し、適切な選択培地上で（５０ｐｐｍカルベニリシンを有するＬＡ）平板培養し、３７℃で一晩育成した。幾つかのコロニーを平板培地から採取し、５ｍｌのプラスミド−ミニ−プレップ（小型プラスミド精製）がなされた選択培地（５０ｐｐｍのカルベニリシンを含むＬＢ）中で、３７℃で、一晩育成した。正確に結合されたＣＢＨ１−Ｅ１融合ベクターを制限消化で確認した。
【実施例２】
【０１５７】
ＣＢＨ１−Ｅ１融合構築体のトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主株の中での形質転換及び発現
ＣＢＨ１−Ｅ１融合株を用いて各種トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株を形質転換した。宿主株はトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＰＬ−Ｐ３７の誘導体及び天然セルラーゼ遺伝子（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２）が欠失しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の誘導体を含んでいた。
【０１５８】
ＰＬ−Ｐ３７株（Ｓｈｅｒｉ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）菌糸（２８℃で７日間ＤＮＡプレート上で育成した）の胞子形成をしたトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）誘導体のプレートの約１／２標本（又は１−２ｃｍ２）を２５０ｍｌの４バッフル振とうスラスコ内のＹＥＧ（５ｇ／Ｌ攻防抽出物+２０ｇ／Ｌグルコース）５０ｍｌに接種し、２００ｒｐｍで１０−２０時間３０℃で育成した。
【０１５９】
菌糸を、液体容量５０ｍｌのコニカルチューブに移し、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより回収した。上清を吸引除去した。形質転換のためのプロトプラストを生成するために、菌糸のペレットを４０ｍｌのβグルカナーゼ溶液を含む２５０ｍｌのＡＣコーニングボトルに移し、３０℃で２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。プロトプラストは、滅菌ミラクロスを通じて、５０ｍｌのコニカルチューブにろ過することにより収穫した。これらを、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにペレットを形成し、上清を吸引除去した。このプロトプラストペレットを、１．２Ｍのソルビトール５０ｍｌで１回洗浄し、遠沈し、上清を吸引除去し、及び２５ｍｌのソルビトールＣａＣｌ２で洗浄した。プロトプラストをカウントし、その後、ペレットを２０００ｒｐｍで５分遠心し、上清を吸引除去した。このプロトプラストペレットを、１ｍｌあたり、１．２５Ｘ１０８プロトプラストの濃度のプロトプラスト濃縮物を作るのに十分な容量のソルビトールＣａＣｌ２中に再懸濁した。
【０１６０】
発現ベクターＤＮＡの２０μｇのアリコート（容量は２０μＬ未満）を、１５ｍｌのコニカルチューブ内に入れ、このチューブを氷上においた。その後、２００μＬのプロトプラスト溶液を添加し、その後に各形質転換アリコートに５０μＬＰＥＧ溶液を添加した。このチューブを緩やかに混合し、氷上で２０分インキュベーションした。次に、２ｍｌのＰＥＧ溶液を形質転換アリコートチューブに添加し、緩やかに転倒攪拌し、室温で５分インキュベーションした。次に、（総容量が６．２ｍｌになるように）４ｍｌのソルビトール／ＣａＣｌ２溶液をこのチューブに添加した。この形質転換混合物を約２ｍｌづつ３のアリコートに分割した。これらの各３のアリコートに溶解したアセトアミド／ソルビトール  トップアガー（５０℃に維持することにより溶融している）１０ｍｌを含むチューブに添加することにより、積層混合物を作成し、この積層混合物をアセトアミド／ソルビトール  アガーの選択プレート上に注いだ。この形質転換プレートを４乃至７日間３０℃でインキュベートした。
【０１６１】
形質転換はａｍｄＳ選択を用いて行った。アセトアミド／ソルビトールプレート及び積層混合物を形質転換に用いた。ソルビトールを含まない以外は同じ組成のプレートを選択プレートとして用いた。形質転換体は、アセトアミドを含む新しい選択培地へ単離されたコロニーを移すことにより精製した。
【０１６２】
実施例に関して、以下の溶液を以下のように調製した。
【０１６３】
１）６００ｍｇのβ−Ｄ−グルカナーゼ及び４００ｍｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（カタログＮｏ．０４３９−１、ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，  ＣＡ）を含む、４０ｍｌのβ−Ｄ−グルカナーゼ溶液を１．２Ｍソルビトール中で調製した
２）５０ｇのポリエチレングリコール４０００（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ  Ｐｏｏｌｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）及び１．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む２００ｍｌのＰＥＧ溶液を、ｄＨ２Ｏで調製した
３）ソルビトール／ＣａＣｌ２は、１．２Ｍソルビトール及び５０ｍＭＣａＣｌ２を含むように調製した
４）アセトアミド／ソルビトールアガー；
パートＩ−０．６ｇのアセトアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ、９９％  昇華）、１．６８ｇのＣｓＣｌ、２０ｇのグルコース、２０ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌの１０００Ｘ塩（以下参照）を、ｐＨを５．５に調整し、ｄＨ２Ｏで容量を３００ｍｌにし、ろ過及び滅菌を行う
パートＩＩ−２０ｇのノブルアガー、及び２１８ｇのソルビトールをｄＨ２Ｏで７００ｍｌにし、加圧滅菌する
パートＩをパートＩＩに加え、最終容量を１Ｌにする
５）１０００×塩−５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏを、ｄＨ２Ｏで容量を１Ｌにする。この溶液をろ過し、滅菌する
６）アセトアミド／ソルビトール  トップアガーは、トップアガーをノブルアガーと置き換える以外はアセトアミド／ソルビトールアガーと同様に調製する。
【０１６４】
この手順は、Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４，  １９８７に記載されているものと似ている。融合タンパク質発現のレベルを決定するために、個々の糸状菌形質転換体を振とうフラスコの中で育成した。実験は、１６ｇ／Ｌのアルファ−ラクトースをＴＳＦ培地中のセルロースと置換えた以外は、実質的にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８７４，２７６の実施例１に記載されているのと同様に行った。振とうフラスコの中の形質転換体由来の切断されたＥ１タンパク質発現の最も高いレベルは、３ｇ／Ｌ以上であると評価された。
【０１６５】
通常、Ｆｏｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｏｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２７８：  ３１９８８−３１９９７）に記載されている形質転換プロトコルは以下のようである。５％グルコースを含むＶｏｇｅｌｓ最小培地（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７Ａ，  ｐｇ  ７９−１４３、及びＤａｖｉｓ，  Ｒｏｗｌａｎｄ，  ＮＥＵＲＯＳＰＯＲＡ，  ＣＯＮＴＲＩＢＵＴＩＯＮＳ  ＯＦ  Ａ  ＭＯＤＥＬ  ＯＲＧＡＮＩＳＭ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））に、１．５ｍｌの凍結胞子懸濁液を接種する。４８時間後、各培地を、１４Ｌのバイオラフィッテェ（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ）発酵器中の６．２Ｌの同じ培地へと移す。この発酵器を１分間当たり８標準リットルの空気流量で、２５℃で、７５０ＲＰＭで運転した。１時間後、最初のグルコースが消費され、２５％（ｗ／ｗ）のラクトース供給を開し、ラクトースの蓄積を避けるため炭素制限方式（ｆａｓｉｏｎ）で供給した。グルコース及びラクトースの濃度を、グルコースオキシダーゼキット又はラクトースを切断するβガラクトシダーゼを用いたグルコースヘキソキナーゼアッセイキットにより、それぞれモニターした（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏ．，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）。発酵の進行具合をモニターするため定期的にサンプルを採取した。収集したサンプルを、５０ｍｌの遠心管に移し、インターナショナルイクイップメントカンンパニー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＡ）遠心分離機を用いて３／４スピードで遠心分離した。
【０１６６】
振とうフラスコ育成サンプルの上清を、ＭＯＰＳ（モルフォリンプロパンスルホン酸）ＳＤＳ緩衝液及びＬＤＳサンプル緩衝液を用いた条件下でＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図１８に示す。
【実施例３】
【０１６７】
形質転換されたトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）クローン由来のセルロース分解活性のアッセイ
ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質のセルロース分解活性を評価するために以下のアッセイ及び基質を用いた。
【０１６８】
コーンストーバー（ｃｏｒｎ  ｓｔｏｖｅｒ）の予備調製（ＰＣＳ）−コーンストーバー（ｃｏｒｎ  ｓｔｏｖｅｒ）は、Ｓｃｈｅｌｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０５：６９−８６（２００３）に記載のように、２％ｗ／ｗのＨ２ＳＯ４を用いて調製し、ｐＨ４．５の調製物を得るために脱イオン水を用いて複数回洗浄した。酢酸ナトリウムを最終濃度が５０ｍＭになるように添加し、滴定によりｐＨを５．０にした。
【０１６９】
総タンパク質の測定―タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いたビシンコニン酸法により測定した（Ｓｍｉｔｈ  Ｐ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５０：７６−８５，  １９８５）。
【０１７０】
セルロース転換（可溶糖評価）は、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７０−７２：３９５−４０３  （１９９８）に記載されているＨＰＬＣ法により評価した。
【０１７１】
標準的なセルロース誘導体転換アッセイを本実施例で用いた。このアッセイの酵素及び緩衝化基質をコンテナの中に置き、所定の温度で所定の期間の間インキュベーションした。充分量の１００ｍＭグリシンを用いて、ｐＨ１１．０の反応混合物のｐＨを少なくともｐＨ１０にすることにより、反応を停止させた。一旦反応が停止したら、固体を除去するために、反応混合物のアリコートを０．２ミクロンの膜を通過させてろ過した。ＨＰＬＣを用いてこのフィルター処理した溶液を上で述べたように、可溶化糖類のアッセイを行った。反応混合物中のセルロース濃度は約７％であった。この酵素又は酵素混合物を、セルロースのグラム当たり１乃至６０ｍｇの総タンパク質量で投与した。
【０１７２】
実験の１のセットにおいて、５５℃において、５０ｍＭの酢酸緩衝液中１０ｍｇ酵素／ｇセルロースを用いて、１日あたり５５℃で１３．８％ＰＣＳ（７．０６％セルロース）の転換パーセントが測定された。１）天然セルラーゼ遺伝子を含むトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親株サンプルからの上清及び２）本明細書に従って形質転換した対応するトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１−Ｅ１融合株の育成サンプルからの上清の間で比較を行った。２４時間までの間で各種時間間隔でサンプルの反応を停止させた。
【０１７３】
結果を図２３に示す。ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質は親株より転換効率がよいことが明らかである。ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質が２０％のセルロースを転換するのに、６時間掛かる一方で、親セルラーゼは２０％の加水分解に１０時間を必要とする。
【実施例４】
【０１７４】
トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）へのＣＢＨ１−Ｅ１融合構築体の形質転換及び発現
ＣＢＨ１−Ｅ１融合構築体を、実施例１と以下の点において異なる、以下で説明する手順に従い構築した。前方プライマーは、ｃｂｈ１リンカー配列の末端にリーディングフレーム翻訳及びＬｙｓ−Ａｒｇケキシン切断部位（下線）を含むように設計されている。後方プライマーはＧＨ４８末端に停止コドンを含んでいた。
【０１７５】
プライマーは、続くｂｌｕｎｔクローニングを可能にするために５プライムリン酸を有するように設計されていた。ＧＨ４８触媒ドメインは以下の前方及び後方プライマーを用いて増幅した；
ＧＨ４８前方プライマーｂｌｕｎｔＦ４−
ＣＴＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＣＣＣＧＴＡＣＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＧＡＴＧＴＡ（配列番号２３）
ＧＨ４８後方プライマーｂｌｕｎｔＲ５−
ＴＴＡＣＣＣＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＣＧＴＴＣＧ（配列番号２４）。
【０１７６】
増幅は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ‘ｓ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いて行った。６５℃のアニーリング温度を用いた。ＧＨ４８触媒ドメインを含むＤＮＡプラスミドをＰＣＲのテンプレートとして用いた（約０．２μｇのＤＮＡ）。ＧＨ４８遺伝子の単離法についての等しい方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．  Ａｐｐｉｎ．  Ｎｏ．２００３／００９６３４２に記載されている。
【表１】
2007530054.tif 000003
【０１７７】
結合に先立ち、平滑末端を生成するために、全てのＰＣＲ産物をゲル精製し、ムングビーンヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて処理した。増幅された平滑断片を、Ｓｐｅｌ及びＡｓｃｌ制限消化の後に３’オーバーハングを除去するためのヌクレアーゼで処理し、Ｔｒｅｘ４に結合した。新しく生成されたベクターをＥ．ｃｏｌｉ内で形質転換した。プラスミドＤＮＡは形質転換されたＥ．ｃｏｌｉのコロニーから単離された。増幅されたＧＨ４８フラグメントはｐＴｒｅｘ４内の２の異なる位置へ挿入することができるので、正しい位置に挿入されているコロニーを見極めるために、制限消化を行った。想定されるコロニーをＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１７８】
融合ベクターの形質転換をＨａｚｅｌｌ，  Ｂ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：２８２−２８６（２０００）に記載のバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換を用いて行った。
【０１７９】
ＣＢＨ１−４８Ｅ融合タンパク質の発現は実施例３で述べた、ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質の発現に対するものと同様に行った。振とうフラスコの中の形質転換体からの最も高いレベルのＣＢＨ１−４８Ｅタンパク質発現は約０．１ｇ／Ｌであると評価された。
【０１８０】
振とうフラスコの上清サンプルを、ＭＯＰＳ（スルホン酸モルフォリン）ＳＤＳランニングバッファー及びＬＤＳサンプルバッファーを用いた還元条件下で、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）で解析した。結果を図の１９に示す。
【実施例５】
【０１８１】
トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）へのＣＢＨ１−７４Ｅ融合構築体の形質転換及び発現
実施例１と以下の点において異なる、以下で説明する手順に従い、ＣＢＨ１−７４Ｅ融合構築体を構築した。前方プライマーはｃｂｈ１リンカー配列の末端にリーディングフレームの翻訳及びＬｙｓ−Ａｒｇケキシン切断部位を含むように設計されている（下線）。後方プライマーは、触媒ドメインの末端に停止コドンをコードする。
【０１８２】
プライマーは、続く平滑クローニングを可能にするために５プライムリン酸を有するように設計されていた。ＧＨ７４触媒ドメインは以下の前方及び後方プライマーを用いて増幅した；
ＧＨ７４前方プライマーｂｌｕｎｔＦ４−
ＣＴＡＡＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣ（配列番号２５）
ＧＨ７４後方プライマーｂｌｕｎｔＲ４−
ＴＴＡＣＧＡＴＣＣＧＧＡＣＧＧＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＣＣＣＧＴＡＴＡ（配列番号２６）。
【０１８３】
増幅条件及び続くクローニングは実施例４で記載されているように行ったが、本実施例においては、アニーリング温度を６０℃で行った。
【０１８４】
ＧＨ７４触媒ドメインを包含する単離されたＤＮＡフラグメントをＰＣＲのテンプレートとして用いた（約０．２μｇのＤＮＡ）。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．  Ａｐｐｌｎ．  Ｎｏ．２００３／０１０８９８８にＧＨ７４のクローニングが記載されている（ＧＨ７４はこの刊行物のＡｖｉｌｌｌと参照されている）。
【０１８５】
増幅された平滑断片を、Ｓｐｅｌ及びＡｓｃｌ制限消化の後に３’オーバーハングを除去するためのヌクレアーゼで処理し、Ｔｒｅｘ４に結合した。その結果生じた融合構築体を有するベクターを配列決定により確認した。
【０１８６】
融合ベクターのトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）への形質転換をＨａｚｅｌｌ，  Ｂ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：２８２−２８６  （２０００）に記載バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換を用いて行った。
【０１８７】
ＣＢＨ１−７４Ｅ融合タンパク質の発現を実施例２で述べた、ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質の発現に対するものと同様に決定した。振とうフラスコの中の形質転換体由来の最も高いレベルの切断されたＧＨ７４タンパク質発現は約３ｇ／Ｌ以上であると評価された。
【０１８８】
ＭＯＰＳ（スルホン酸モルフォリン）ＳＤＳランニングバッファー及びＬＤＳサンプルバッファーを用いた還元条件下で、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）で振とうフラスコの上清サンプルを解析した。結果を図の２０に示す。
【実施例６】
【０１８９】
トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）へのＣＢＨ１−ＴｆＥ３融合構築体の形質転換及び発現
ＣＢＨ１−ＴｆＥ３融合構築体は、実施例１と以下の点において異なる、以下で説明する手順に従い構築した。
【０１９０】
以下のプライマーをＴｆＥ３セルラーゼの増幅に用いた。
【０１９１】
ＥＬ−３１０前方（Ｓｐｅｌ部位を含む）
ＧＣＴＴＡＴＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＧＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＧ（配列番号２７）
及びＥＬ−３１１後方（Ａｓｃｌ部位を含む）
ＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＧ（配列番号２８）
増幅のためのＤＮＡテンプレートとしてＴｆＥ３遺伝子を含むプラスミドを用いた。等しいテンプレートＤＮＡはＺｈａｎｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３４：  ３３８６−３３９５，１９９５に記載されている。増幅及びそれに続くクローニング条件は実施例１に記載されているのと同じである。ベクター構築及びトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換手順は上で説明した。
【０１９２】
振とうフラスコの中の最も高い発現レベルは、０．４ｇ／Ｌ以上であると評価された。
【０１９３】
振とうフラスコ育成上清サンプルを、ＭＯＰＳ（スルホン酸モルフォリン）ＳＤＳランニングバッファー及びＬＤＳサンプルバッファーを用いた還元条件下で、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）で解析した。結果を図の２１に示す。
【実施例７】
【０１９４】
ＣＢＨ１−ＴｆＥ５融合構築体のトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）への発現及び形質転換
実施例１とは以下の違いを有する手順に従い、ＣＢＨ１−ＴｆＥ５融合構築体を消化した。Ｃｏｌｌｍｅｒ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ， ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． １： ５９４−６０１ （１９８３）に記載されているものと等しいプラスミドをＴｆＥ５の増幅のためのＤＮＡテンプレートとして用いた。
【０１９５】
以下のプライマーを、ＴｆＥ５エンドグルナカーゼを増幅するために用いた。
【０１９６】
ＥＬ−３０８（Ｓｐｅｌ部位を含む）−前方プライマー
ＧＣＴＴＡＴＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣ（配列番号２９）
及びＥＬ−３０９（Ａｓｃｌ部位を含む）−後方プライマー
ＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＧＣ（配列番号３０）
形質転換は上で説明するように行った。振とうフラスコの中の形質転換体からの切断されたＴｆＥ５タンパク質発現は２ｇ／Ｌ以上であると評価された。
【０１９７】
振とうフラスコ育成上清サンプルを、ＭＯＰＳ（スルホン酸モルフォリン）ＳＤＳランニングバッファー及びＬＤＳサンプルバッファーを用いた還元条件下で、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）で解析した。結果を図の２２に示す。
【０１９８】
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【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、本発明に包含される異種セルラーゼ融合構築体の概略図である。前記構築体は、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ１コア（ｃｂｈ１シグナル配列及びｃｂｈ１触媒ドメイン）、ｃｂｈ１リンカー配列、ケキシン部位、Ｅ１コア（アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｅ１エンドグルカナーゼ触媒ドメイン）、ｃｂｈ１ターミネーター及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ選択マーカーを含む。
【図２】図２は、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１シグナル配列（配列番号２）のＤＮＡ配列（配列番号１）；トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１触媒ドメイン（配列番号３）、及びトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１リンカー（配列番号４）である。シグナル配列を下線で示す。触媒ドメインを太字で示す。リンカー配列をイタリックで示す。
【図３】図３は、図２で提供された核酸配列に基づいて予測されるアミノ酸配列（配列番号５）を示す。シグナルペプチドを下線で、触媒ドメインを太字（配列番号６）で、リンカー配列をイタリックで示す。
【図４】図４はアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  エンドグルカナーゼ１（Ｅ１）触媒ドメインをコードする核酸配列（配列番号７）の説明である。
【図５】図５は、図４で提供された核酸配列をもとに予測されるアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ  エンドグルカナーゼ１（Ｅ１）触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図６】図６は、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８  セルラーゼ触媒ドメインをコードする核酸配列（配列番号９）の説明である。
【図７】図７は、図６で提供された核酸配列をもとに予測されるアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４８  セルラーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図８Ａ】図８Ａ−８Ｂは、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ（ＥＧ）触媒ドメインをコードする核酸配列（配列番号１１）の説明である。
【図８Ｂ】図８Ａ−８Ｂは、アシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ７４エンドグルカナーゼ（ＥＧ）触媒ドメインをコードする核酸配列（配列番号１１）の説明である。
【図９】図９は、図８Ａ及び８Ｂで提供される核酸配列を基にしたアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ４７-ＥＧの予測されるアミノ酸配列（配列番号１２）である。
【図１０】図１０は、セルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）Ｅ-３（ＴｆＥ−３）セルラーゼのＣＤＢ、リンカー、及び触媒ドメインをコードする核酸配列（配列番号１３）である。
【図１１】図１１は、図１０で提供される核酸配列を基にしたＴｆＥ−３ＣＢＤ、リンカー、及びア触媒ドメインの予測されるアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【図１２】図１２はセルモビフィダ・フースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）エンドグルカナーゼ５（ＴｆＥ５）のＣＢＤ、リンカー、及び触媒ドメインをコードする核酸配列（配列番号１５）を示す。
【図１３】図１３は、図１２で提供される核酸配列を基にしたＴｆＥ５のＣＢＤ，リンカー及び触媒ドメインの予測されるアミノ酸配列（配列番号１６）である。
【図１４Ａ】図１４は、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１シグナル配列、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１の触媒ドメイン、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）リンカー配列、アミノ酸コドンを含むケキシン切断部位、ＳＫＰ及びアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ-Ｅ１触媒ドメインをコードする配列を含む、実施例１で説明される異種のセルラーゼ融合構築体の核酸配列（２６５６ｂｐ）（配列番号１７）である。
【図１４Ｂ】図１４は、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１シグナル配列、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１の触媒ドメイン、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）リンカー配列、アミノ酸コドンを含むケキシン切断部位、ＳＫＰ及びアシドサーマス・セルロリティクス（Ａｃｉｄｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｕｓ）ＧＨ５Ａ-Ｅ１触媒ドメインをコードする配列を含む、実施例１で説明される異種のセルラーゼ融合構築体の核酸配列（２６５６ｂｐ）（配列番号１７）である。
【図１５】図１５は、図１４の核酸配列を基にしたセルラーゼ融合タンパク質の予測されるアミノ酸配列（配列番号１８）である。
【図１６】図１６は、ｐＴｒｅｘ４プラスミドの概略図を提供する。該プラスミドは、実施例において説明されるように異種融合セルラーゼ構築体の発現に用いられ、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーター、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１シグナル配列、触媒ドメイン、リンカー配列、ケキシン切断部位、及びＳｐｅｌ１及びＡｓｃｌ部位の間に挿入された所望のセルラーゼ遺伝子（例えば、エンドグルカナーゼ）、ｃｂｈ１トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ターミネーター及びａｍｄＳ  アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼマーカー遺伝子を含む。
【図１７Ａ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１７Ｃ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１７Ｄ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１７Ｅ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１７Ｆ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１７Ｇ】図１７Ａ-Ｇは、セルロース触媒ドメインを含む所望のセルラーゼ遺伝子を除いた図１６のｐＴｒｅｘ４プラスミドの核酸配列（配列番号１９）（１０２３９ｂｐ）である。
【図１８】図１８は、セルラーゼ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２を欠失させ、ＣＢＨ１-Ｅ１融合構築体を用いて形質転換されたトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株のクローンの振とうフラスコ育成サンプルの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１及び１０はマーカー（ＭＡＲＫＥＲ  １２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄｅｒｄ）（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）を示す。レーン２−８は、各種形質転換体及びレーン９は形質転換されていないトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株を示す。上部の矢印はセルラーゼ融合タンパク質を示し、下部の矢印は切断されたＥ１触媒ドメインを示す。
【図１９】図１９は、セルラーゼ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２を欠失させ、ＣＢＨ１-ＧＨ４８融合構築体を用いて形質転換ささせたトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株のクローンの振とうフラスコ育成サンプルの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は、形質転換していない対照を示す。レーン２はＭＲＡＲＫＥＲ  １２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄｅｒ（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）を示す。レーン３−１２は各種形質転換体を示す。矢印はＣＢＨ１−ＧＨ４８融合タンパク質を示す。
【図２０】図２０はセルラーゼ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２を欠失させ、ＣＢＨ１-ＧＨ７４融合構築体を用いて形質転換されたトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株のクローンの振とうフラスコ育成サンプルの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は形質転換されていない対照を示す。レーン３は、ＭＲＡＲＫＥＲ  １２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄｅｒ（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）を示す。レーン２及び４−１２は各種形質転換体を示す。上部矢印はＣＢＨ１−ＧＨ７４融合タンパク質を示し、下部の矢印は切断されたＧＨ７４触媒ドメインを示す。
【図２１】図２１はセルラーゼ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２を欠失させ、ＣＢＨ１-ＴｆＥ３融合構築体を用いて形質転換されたトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株のクローンの振とうフラスコ育成の上清サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１はＭＲＡＲＫＥＲ  １２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄｅｒ（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）を示す。レーン２−１２は各種形質転換体を示す。矢印は、ＣＢＨ１−ＴｆＥ３融合タンパク質を発現していない形質転換体に見られた新しいバンドを示す。
【図２２】図２２は、セルラーゼ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２を欠失させ、ＣＢＨ１-ＴｆＥ５融合構築体を用いて形質転換されたトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株のクローンの振とうフラスコ育成サンプルの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１はＭＲＡＲＫＥＲ  １２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄｅｒ（インビトロジェン、カールスバッド、カナダ）を示す。レーン２は形質転換されていない株を示す。レーン３−１２は各種形質転換体を示す。矢印は、ＣＢＨ−ＴｆＥ５融合タンパク質を発現している形質転換体を示す。
【図２３】図２３は、ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質を発現しているトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）に対応する天然セルラーゼ遺伝子を含むトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親株が時間当たりにセルロースを可溶糖に転換する割合（％）を示す。実施例３を参照のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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