(57)【要約】  本発明は、β-アゴニストに対する個体の気管支拡張反応を予測する方法に関する。本発明は、特に、β2AR遺伝子の特異的アレル変異体の検出、及びβ-アゴニストに関する薬理遺伝学的マーカーとしての使用に関する。
2007534329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息に罹患した対象におけるβ2アゴニストに対する気管支拡張反応を予測及び検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低度の反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 当該反応者、喘息に罹患した非反応者及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) 喘息に関連するβ2AR遺伝子又は遺伝子座のコーディング領域を増幅できる、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成し；
(e) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(f) ステップ（e）で得た増幅PCR産物を配列決定し、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（e）で得た配列決定されたPCR産物の非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(g) ステップ（f）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応喘息個体をスクリーニングして、β2AR遺伝子又は遺伝子座の特異的SNPを検出し、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(h) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体の存在について、ステップ（g）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、当該オリゴヌクレオチドプライマーは標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体に特異的にハイブリダイズし、当該標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記β2アゴニストがサルブタモールである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記のβ2アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量が、約100〜250μgの範囲である、請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
前記の薬理的に活性な量が約200μgである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（a）において、前記のβ2アゴニスト量が吸入器によって送達される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
β2ARのコーディング領域を増幅するために好適な、前記ステップ（d）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC 3' (配列番号2；フォワードプライマー）及び
(b) 5' ACGATGGCCAGGACGATGAGA 3' (配列番号3；リバースプライマー）
からなる群より選ばれる、請求請１記載の方法。
【請求項８】
検出された非同義的多型又はSNPを増幅するために好適な、ステップ（g）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT 3' (配列番号4；フォワードプライマー）及び
(b) 5' CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3' (配列番号:5；リバースプライマー）
からなる群より選ばれる、請求請１記載の方法。
【請求項９】
ステップ（g）において前記PCRが37サイクル行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
SNP又はβ2AR遺伝子もしくは遺伝子座のアレル変異体を確認するために好適な、ステップ（h）における前記オリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCACCCAATAGAAGCCATG 3' (配列番号6；フォワードプライマー)
(b) 5' CATGGCTTCTATTGGGTGC 3' (配列番号7；リバースプライマー)
(c) 5' GCACCCAATGGAAGCCATG 3' (配列番号8；フォワードプライマー) 及び
(d) 5' CATGGCTTCCATTGGGTGC 3' (配列番号9；リバースプライマー)
からなる群より選ばれる、請求請１記載の方法。
【請求項１１】
合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、5〜100塩基の範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子型GGがサルブタモール高反応者に関連し、かつ遺伝子型AAがサルブタモール低反応者に関連する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
気管支拡張を誘導するための、非反応の喘息患者に好適な治療薬の開発に有用である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ヒトにおけるβ2AR遺伝子又は遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するための、マーカー、プライマー及びプローブを提供する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
喘息に罹患した対象におけるβ2AR遺伝子の特異的アレル変異体又は一塩基多型（SNP）を予測及び検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 当該反応者、喘息に罹患した非反応者及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) 喘息に関連するβ2AR遺伝子のコーディング領域を増幅できる、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成し；
(e) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(f) ステップ（e）で得た増幅PCR産物の配列決定を行い、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（e）から得た配列決定されたPCR産物から非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(g) ステップ（f）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応の喘息個体をスクリーニングして、特異的SNP又はアレル変異体を検出し、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(h) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体もしくは遺伝子座変異体の存在について、ステップ（g）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
β2-アゴニストがサルブタモールである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記のβ2-アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量が、約100〜250μgの範囲にある、請求項１６又は１８記載の方法。
【請求項２０】
前記の薬理的に活性な量が約200μgである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップ（a）において、前記β2-アゴニスト量が吸入器によって送達される、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
β2ARのコーディング領域を増幅するために好適な、ステップ（d）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC 3' (配列番号2；フォワードプライマー）及び
(b) 5' ACGATGGCCAGGACGATGAGA 3' (配列番号3；リバースプライマー）
からなる群より選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
検出された非同義的多型を増幅するために好適な、ステップ（g）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT 3' (配列番号4; フォワードプライマー) 及び
(b) 5' CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3' (配列番号5; リバースプライマー)
からなる群より選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（g）における前記PCRが37サイクル行われる。請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
非同義的多型を確認するために好適な、ステップ（h）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCACCCAATAGAAGCCATG 3' (配列番号6; フォワードプライマー)
(b) 5' CATGGCTTCTATTGGGTGC 3' (配列番号7; リバースプライマー)
(c) 5' GCACCCAATGGAAGCCATG 3' (配列番号8; フォワードプライマー) 及び
(d) 5' GATGGCTTCCATTGGGTGC 3' (配列番号 9; リバースプライマー)
からなる群より選ばれる、請求項16記載の方法。
【請求項２６】
合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが5〜100塩基の範囲にある、請求項16記載の方法。
【請求項２７】
合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが8〜24塩基の範囲にある、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子型GGが前記集団中におけるサルブタモール高反応者に関連し、かつ遺伝子型AAがサルブタモール低反応者に関連する、請求項１６記載の方法。
【請求項２９】
気管支拡張を誘導するための、非反応の喘息患者に好適な治療薬の開発に有用である、請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
ヒトにおけるβ2AR遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するためのマーカー、プライマー及びプローブを提供する、請求項１６記載の方法。
【請求項３１】
喘息に罹患した対象におけるβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための薬理遺伝学的マーカーを製造する方法であって、以下：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 当該反応者、喘息に罹患した非反応者及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) 喘息に関連するβ2AR遺伝子又は遺伝子座のコーディング領域を増幅できる、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成し；
(e) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応者及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(f) ステップ（e）で得た増幅PCR産物の配列決定を行い、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（e）で得た配列決定されたPCR産物の非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、喘息に関連する特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(g) ステップ（f）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応者の喘息個体をスクリーニングして、β2AR遺伝子又は遺伝子座の特異的SNPを検出し、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；
(h) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体もしくは遺伝子座変異体の存在について、ステップ（g）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認し、
ここで、標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有し；並びに
(i) β-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための薬理遺伝学的マーカーとしての、ステップ(d)、(g)及び(h)から配列番号4、5、6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマーを確立すること、
を含む、前記方法。
【請求項３２】
前記薬学遺伝学的マーカーが、β2AR遺伝子もしくは遺伝子座の単一の特異的アレル変異体又は一塩基多型（SNP）に関連する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記の同定された非同義的多型もしくはSNP又は特異的単一β2ARアレル変異体が、薬理遺伝子学マーカーとして機能する、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記対象がヒトである、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記β-2アゴニストがサルブタモールである、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記のβ-2アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量が、約100〜250μgの範囲にある、請求項３１又は３５記載の方法。
【請求項３７】
前記の薬理的に活性な量が約200μgである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（a）において、前記のβ-2アゴニスト量が吸入器によって送達される、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
β2ARのコーディング領域を増幅するために好適な、ステップ（d）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC 3' (配列番号2；フォワードプライマー) 及び
(b) 5' ACGATGGCCAGGACGATGAGA 3' (配列番号3；リバースプライマー)
からなる群より選ばれる、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
検出された非同義的多型を増幅するために好適な、ステップ（g）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT 3' (配列番号4; フォワードプライマー) 及び
(b) 5' CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3' (配列番号5; リバースプライマー)
からなる群より選ばれる、請求項３１記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（g）におけるPCRが37サイクル行われる、請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
非同義的多型を確認するために好適な、ステップ（h）におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCACCCAATAGAAGCCATG 3'(配列番号6；フォワードプライマー)
(b) 5' CATGGCTTCTATTGGGTGC 3'(配列番号7；リバースプライマー)
(c) 5' GCACCCAATGGAAGCCATG 3'(配列番号8；フォワードプライマー) 及び
(d) 5' CATGGCTTCCATTGGGTGC 3'(配列番号9；リバースプライマー)
を含む群より選ばれる、請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
前記合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、5〜100塩基の範囲にある、請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
前記合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項３１記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子型GGがサルブタモール高反応者と関連し、かつ遺伝子型AAがサルブタモール低反応者と関連する、請求項３１記載の方法。
【請求項４６】
気管支拡張を誘導するための、非反応の喘息患者に好適な治療薬の開発に有効である、請求項３１記載の方法。
【請求項４７】
ヒトにおけるβ2AR遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するためのマーカー、プライマー及びプローブを提供する、請求項３１記載の方法。
【請求項４８】
喘息に罹患した対象におけるβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための新規薬理遺伝学的マーカーであって、以下：
(a) 配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマー、
(b) 配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び
(c) 配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマー
からなる群より選ばれる、前記マーカー。
【請求項４９】
配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、β2AR遺伝子のコーディング領域を増幅できる、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５０】
配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について反応者及び非反応喘息個体をスクリーニング及び同定して、特異的SNP又はβ2AR遺伝子を検出できる、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５１】
配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、SNP又は特異的アレルβ2AR変異体もしくは遺伝子座変異体の存在について、正常対照個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認できる、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５２】
配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体が、喘息患者におけるβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46においてヌクレオチドAからGへ(A→G)の置換を有することを確認でき、そして薬理遺伝子学的マーカー標的として機能する、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５３】
前記対象がヒトである、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５４】
配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーが以下：
(a) 5' TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC 3' (配列番号2；フォワードプライマー) 及び
(b) 5’ACGATGGCCAGGACGATGAGA 3' (配列番号3；リバースプライマー)
の特徴を有する、請求項４８記載のマーカー。 
【請求項５５】
配列番号4及び5によってスクリーニングする方法がPCRを用いて行われ、当該方法が以下：
（a）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（b）55℃の温度で5秒間、ステップ（a）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（c）60℃の温度で30秒間、ステップ（b）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含む、請求項４８又は５０記載のマーカー。
【請求項５６】
PCRが37サイクル行われる、請求項５５記載のマーカー。
【請求項５７】
配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、以下：
(a) 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT 3' (配列番号4; フォワードプライマー) 及び
(b) 5' CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3' (配列番号5; リバースプライマー)
の特徴を有する、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５８】
配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマーが以下：
(a) 5' GCACCCAATAGAAGCCATG 3 '(配列番号6; フォワードプライマー)
(b) 5' CATGGCTTCTATTGGGTGC 3' (配列番号7; リバースプライマー) 
(c) 5' GCACCCAATGGAAGCCATG 3' (配列番号8; フォワードプライマー) 及び
(d) 5' CATGGCTTCCATTGGGTGC 3' (配列番号9; リバースプライマー) 
の特徴を有する、請求項４８記載のマーカー。
【請求項５９】
前記合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、5〜100塩基の範囲にある、請求項５８記載のマーカー。
【請求項６０】
前記合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項５９記載のマーカー。
【請求項６１】
遺伝子型GGがサルブタモール高反応者に関連し、かつ遺伝子型AAがサルブタモール低反応者に関連する、請求項４８記載のマーカー。
【請求項６２】
気管支拡張を誘導するための非反応の喘患者に好適な治療薬の開発に有用である、請求項４８記載のマーカー。
【請求項６３】
β2-アゴニストに対する喘息患者の気管支拡張反応を予測及び検出するための診断キットであって、以下：
(a) 当該β2AR遺伝子のマーカー領域の増幅のための、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーの第1セット；
(b) 非同義的多型又は一塩基多型(AGA対GGA)の遺伝子型を特定するための、配列番号4及び5を有するプライマーの第2セットであって、当該特定プロセスは、以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；
(c) SNP又は特異的アレルβ2AR変異体もしくは遺伝子座変異体の存在について、アレルを用いて、正常対照個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認するための、配列番号6、7、8及び9を有するプライマーの第3セット、
ここで、当該標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、β2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46においてヌクレオチドAからGへ(A→G)の置換を有する、
を含む、前記キット。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドを用い及びβ2AR遺伝子変異体のAA又はGG遺伝子型に基づく反応型を帰属するための教示を更に含む、請求項６３記載のキット。
【請求項６５】
β2ARのコーディング領域を増幅するために好適なオリゴヌクレオチドプライマーの第1セットが、以下：
(a) 5' TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC 3' (配列番号2；フォワードプライマー) 及び
(b) 5' ACGATGGCCAGGACGATGAGA 3' (配列番号3；リバースプライマー)
からなる群より選ばれる、請求項６３記載のキット。
【請求項６６】
検出された非同義的多型を増幅するために好適なオリゴヌクレオチドプライマーの第2セットが、以下：
(a) 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT 3' (配列番号4; フォワードプライマー）及び
(b) 5' CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3' (配列番号5; リバースプライマー) 
からなる群より選ばれる、請求項６３記載のキット。
【請求項６７】
ステップ（b）におけるPCRが37サイクル行われる、請求項６３記載のキット。
【請求項６８】
非同義的多型を確認するために好適なオリゴヌクレオチドプライマーの第3セットが、以下：
(a) 5' GCACCCAATAGAAGCCATG 3' (配列番号6；フォワードプライマー）、
(b) 5' CATGGCTTCTATTGGGTGC 3' (配列番号7；リバースプライマー)、
(c) 5' GCACCCAATGGAAGCCATG 3' (配列番号8；フォワードプライマー）及び
(d) 5' CATGGCTTCCATTGGGTGC 3' (配列番号9；リバースプライマー）
からなる群より選ばれる、請求項６３記載のキット。
【請求項６９】
前記オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、5〜100塩基の範囲にある、請求項６３記載のキット。
【請求項７０】
前記オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項６３記載のキット。
【請求項７１】
遺伝子型GGがサルブタモール高反応者に関連し、かつ遺伝子型AAがサルブタモール低反応者に関連する、請求項６３記載のキット。
【請求項７２】
気管支拡張を誘導するための、非反応の喘息患者に好適な治療薬を同定するために有用である、請求項６３記載のキット。
【請求項７３】
ヒトにおけるβ2AR遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するためのマーカー、プライマー及びプローブを提供する、請求項６３記載のキット。
【請求項７４】
前記の特定された非同義的多型もしくはSNP又は特異的単一β2ARアレル変異体が、薬理遺伝子学的マーカーとして機能する、請求項６３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、β-アゴニストに対する個体の気管支拡張反応を予測する方法に関する。本発明は特にβ2AR遺伝子の特異的アレル変異体の検出、及びβ-アゴニストに対する反応に関する薬理遺伝学的マーカーとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
喘息は、喘鳴、胸苦しさ及び咳の再発性エピソードによって特徴付けられる気道の慢性炎症性疾患であり、重度に変化し、人によっては頻発する (Suki他, 2003)。肺の気道が狭くなるか又は完全に遮断され、通常の呼吸を妨げる症状である。しかしながら、喘息において、肺のこの閉塞は自発的か又は薬を用いて可逆的である。近年、3種類の主な喘息治療が利用できる（Jeffrey他, 2000): (a) 吸入型糖質ステロイド（Martin, 2003; Settipane他, 2003) (b) ベータ 2-アゴニスト (Eh他, 2003)、及び(c) ロイコトリエンインヒビター (Bjermer他, 2002)。明らかに同一の表現型を有する喘息に罹患した患者において、薬物治療に対する反応は、著しく変化することがある(Drysdale他, 2000)。β2ARアゴニストは、喘息における気管支拡張治療として最も重要な用途として推奨される(National Asthma Education and Prevention Program (1997) Expert Panel Report II)。短くも長くも作用するβ2アゴニストは、様々な直接及び間接的な気管支拡張刺激に対して保護効果を示す(Cockcroft他, 1996)。β-アドレナリン様受容体は、少なくとも3種の異なった群に細分される：心臓、気道平滑筋及び脂肪組織においてそれぞれ古典的に特定されるβ1、β2、β3 (Johnson M, 1998)。β1、β2及びβ3受容体には65〜70%の相同性が存在する。活性化及び不活性化形態でベータアドレナリン様受容体が存在し、静止条件ではこれらの2つの形態が優勢である不活性化状態と平衡にある、という新しい優れた証拠が存在する(Johnson M, 1998)。β2ARは、Gタンパク質のαサブユニット及びグアノシン三リン酸（GTP）の分子と関連する場合に活性化形態にあり、受容体がアデニル酸シクラーゼと結合するのはこのαサブユニットによるものである。GTPのGDPによる置換は、酵素によるATPからcAMPへの変換を触媒し、αサブユニットの受容体に対する親和性を劇的に減少させて分解し、及び受容体が低エネルギーの不活性化形態に戻るのを抑制する(Johnson M, 1998)。β2アドレナリン様受容体は、喘息における気管支拡張に使用されるβ2アゴニスト薬の重要な標的である。β2ARは、結合Gタンパク質であり、細胞外アミノ末端、7つの膜貫通型-スパニング領域、3つの細胞内及び3つの細胞外ループ、及び細胞内カルボキシル末端を有し、身体特に気管支の平滑筋細胞に広く分布し、様々な組織及び臓器中のカテコールアミンの作用を仲介する。β2ARは、約46,500ダルトン（Da）で、413アミノ酸からなる(Drysdale他, 2000)。
【０００３】
β2ARは、クロモソーム 5q31-32上のイントロンのほとんどない遺伝子によってコードされる (Kobilka他, 1987)。Johnson M. (1998)は、ヒト集団のβ2ARタンパク質の構造に顕著な遺伝的変化をもたらすβ2AR遺伝子のコーディング領域に、いくつかの一塩基多型（SNP）を報告している (GenBank受入番号 AF022953.1 GL2570526; AF022954.1 GL2570528; 及びAF022956.1 GI:2570532)。これらのSNPは、β2ARコーディング配列のヌクレオチド46（A又はG）、79（C又はG）及び491（C又はT）に位置し、アミノ酸16 (Arg又はGly)及び27 (Gln又はGlu)での受容体のアミノ末端、及びアミノ酸164（Thr又はIle）での第4の膜貫通型-スパニング領域にそれぞれ生じる変化を起こす。これらのアミノ酸変異体は、組換え細胞研究、これらの変異体を内生的に発現する細胞(CHW-1102)の主要培養物(Green他, 1995)、及び心臓でThr164又はIle164受容体を過剰発現するトランスジェニックマウス(Turki他, 1996)によって証明されるように、明らかな表現型の相違を有する (Green他, 1994)。更に、コーディング配列におけるヌクレオチド523でのC又はAの同義的多型は、日本の家族におけるサルブタモールに対する変化した反応性と関連することが報告されている(Ohe他, 1995)。コーディング領域での上記多型に加えて、5'プロモーター領域でのいくつかのSNPが近年同定され、ヌクレオチド-1023 (A又はG)、-654 (G又はA)、-468 (C又はG)、-367 (T又はC)、-47 (C又はT)及び-20 (T又はC)に位置する (Scott他, 1999)。近年、-709(C又はA)及び-406(C又はT)での更に2つのSNPがDrysdale他 (2000)により報告された。従って、GenBank受入番号 M15169.1のヌクレオチド565〜2110に位置するβ2AR遺伝子の領域に、13つの多型部位が既に同定された。様々な群が上記のβ2ARアミノ酸変異体のいくつかの間の関連を示唆し、様々な条件に対して感受性の増加を示唆した、例えば：高血圧 (Gly16変異体, Hoit他, 2000); アトピー (Gly16変異体, Dewar他, 1998); 夜行性喘息 (Gly16変異体, Turki他, 1995); 肥満の治療に対する反応 (Gly16変異体, Sakane他, 1999); 重症筋無力症 (Argl6変異体, Xu他, 2000); 小児喘息 (Gln27変異体, Dewar他, 1997); 肥満 (Glu27変異体, Large他, 1997); 及び鬱血性心不全による死亡 (Ile164変異体, Liggett他, 1998)を含む。
【０００４】
上で議論したβ2AR遺伝子多型の中には、喘息の疾患調整因子として働くことがあり又はβ-アゴニストに対する気管支拡張反応において公知の個人間の変化に基づくことがある、ことも示唆されてきた(Drysdale他, 2000)。実際に、Martinez他 (1997)は、Arg16変異体について同型又は異型の個体は、Gly16変異体について同型の個体よりもアルブテロールに対して反応する可能性がより高い、ことを報告している。興味深いことに、別のグループは、β-アゴニストであるフォルモテロールによる継続的治療の後の、Gly16変異体について喘息同型の気管支拡張脱感作を報告している (Tan他, 1997)。同時に、しかし、他の研究は、逆の薬物反応とベータ-アゴニストによる規則的な治療との間の相関関係を証明できなかった (Lipworth他, 1999)。
【０００５】
喘息は世界中で最も一般的な疾患の1つである。インドでは1500万〜2000万の喘息患者があり、インドの子供の6%は喘息に罹患している (Chabra S. K., 1998)。喘息は、複雑な多因子性疾患であり、多くの遺伝子及び環境的因子に関連する (Suki他, 2003)。遺伝的因子は、インド人については未だ完全に明らかにされていない。個体の知識の欠如、及び間違った治療を引き起こす現在処方されている喘息薬物のほとんどに対する薬物反応における異人種間の変化に因り、多くの不合理な処方が行われている。これは、ある急性の例では死を招くことがある。これらの状況は、薬物遺伝学的原理に基づいて処方される薬物に対する個体の反応の以前の知識を用いて避けることができる。震え、動悸、頻拍及び効き目に対する寛容のような不合理な薬物処方に因り、様々な副作用も存在する(O'Connor他, 1992, Dennis他, 2000)。本発明で開示される、ヌクレオチド位置46（A/G）のβ2AR遺伝子のアレル変異体は、ベータ-アゴニスト薬物の気管支拡張反応、特にインド人の検出マーカーであることが見出された。時には、喘息に罹患した患者はサルブタモールに反応しないことが観察され、特定の患者がその治療薬に反応しないことを同定するには長時間（日から月）を必要とする。この間に、患者の兆候的な安心を提供することは非常に困難である。医者が治療初期に反応者又は非反応者を同定できる場合には、投薬注入時間は短縮され、患者は別の代替的治療薬を用いる治療を時宜に受けることになる。緊急の場合には、正確かつ時宜な治療が非反応者にすることができ、これにより救命できる場合がある。
【０００６】
米国特許出願第811286号明細書のDrysdale他 (2000)は、β2AR遺伝子の位置-654 (G/A)、46 (A/G)及び252 (G/A)での3つのSNPが白人のβ-アゴニスト薬物の反応を決定する方法を開示している。Drysdale他 (2000)によって請求される本方法及び診断キットは、（プローブ及びプライマー、及び関連する3つのセットを使用するために）より時間がかかり、高価である。更に、その方法は白人への使用に限定される。よって、インドでは1500万〜2000万人の喘息患者が存在し、インドの子供の6%が喘息に罹患しているため、安価で、迅速及び特異的な診断法、及びベータ-アゴニストに対する薬物反応についてインド人をスクリーニングするためのキットを開発する必要性が存在する。本発明で開示されるSNPは、生物学的及び治療的表現型に関連することが見出され、個々の患者の薬物反応の指標として強力な予測力を有する。
【０００７】
喘息は、臨床的に定義するのが難しかった表現型を有する複雑な疾患である。吸入されたベータ-アドレナリン様アゴニストは、喘息治療に最も一般的に使用される医薬品である。β2ARの多型は、受容体の調節に影響を与え得る。本発明の新規性は、インド人の喘息患者におけるベータ-アゴニストに関する薬物反応を決定する薬物遺伝学的遺伝子座としての、一塩基多型との強い関連性を提供する点にある。本発明の新規性は、位置46(A/G)でのβ2AR遺伝子のアレル変異体を検出することによって気管支拡張反応の予測方法を提供する点にある。この一塩基多型は、インド人の喘息患者の薬物反応に専ら関連することが見出された。更に、このSNPは、インド人の薬物反応の指標マーカーであることが見出された。Drysdale他は、白人での薬物反応に寄与する3つのSNPを見出したが、一方、インド人では、これらの3つのSNPは関連していないことが分かり、そのため我々はインド人でのこれらの3つのSNPを考慮することは1つのSNP(A→G)ほど重要でないことを見出した。
【０００８】
本発明はまた、インド人をβ2-アゴニストに対する反応者についてスクリーニングするための、特異的な新規プローブ、プライマー及び診断キットを提供する。本発明は、β2-アゴニストに対するインドの喘息患者の薬物反応を予測するより安価でかつより迅速な方法を更に提供する。このβ2AR遺伝子の多型は、より安価な診断試薬として及び当該疾患の新規治療を開発するために大きな商業的価値を有する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の目的
本発明の主な目的は、β2-アゴニストに対する気管支拡張を検出及び予測する方法を提供する。
本発明の別の目的は、β2AR遺伝子の特異的アレル変異体又は一塩基多型を検出及び予測する方法を提供する。
本発明の更に別の目的は、β2-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための薬理遺伝学的マーカーを製造する方法に関する。
本発明の更に別の目的は、β2アゴニスト喘息患者に対する気管支拡張反応を検出及び予測する診断キットを提供することである。
本発明の更に別の目的は、β2-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための新規薬理遺伝学的マーカーを提供する。
別の目的は、喘息患者をβ2-アゴニストに対する反応者及び非反応者についてスクリーニングする迅速かつ特異的方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、薬物反応を予測するためのβ2ARの薬理遺伝学的遺伝子座の表現型を提供することである。
本発明の更に別の目的は、コーディング領域内のヌクレオチド位置46のβ2AR遺伝子の非同義的（nonsynonymous）アレル変異体（A/G）を検出するための、新規かつ特異的なプローブ及びプライマーを提供することである。
本発明の更に別の目的は、β2AR遺伝子の多型と喘息との関連を研究することである。
【００１０】
発明の概要
本発明は、インド人のβ2サブタイプ、すなわちアドレナリン様受容体遺伝子（β2AR遺伝子）の10つの多型位置の遺伝子型及びハロタイプを開示する。本発明は、ベータ-アゴニスト（β-アゴニスト）に対する気管支拡張反応を予測する方法に関する。本発明は、特にインド人の喘息患者に有用である。本発明は、気管支拡張薬に用いられるβ2-アゴニストに対する重要な標的に因るものと考えられてきた、β2AR遺伝子のアレル変異体（遺伝子型）の検出方法を提供する。本発明は、個体の薬物反応を予測するための診断キットを開発するために有用である。クロモソーム5q31上のβ2AR遺伝子のコーディング領域内の数個のミスセンス多型が、ヒト集団で同定された。本発明はまた、薬物反応を引き起こすβ2AR遺伝子内の特異的レル変異体を検出するための特提的プライマー及びプローブを開示する。
【００１１】
発明の詳細な説明
β2ARは、喘息における気管支拡張に用いられるβ2-アゴニストの重要な標的である。反応及び非反応患者の試料中の当該遺伝子のコーディング領域（1エキソンのみ）の直接的配列決定は、薬物反応に関連する非同義的多型の発見につながった。個体において、アミノ酸であるアルギニンをコードするコドンAGAが、グリシンをコードするGGAに変化した。反応/非反応個体において同型状態で存在する場合には、非同義的多型は、変化した気管支拡張をもたらすことができる。β2AR遺伝子のエキソン領域の非同義的多型は喘息の気管支拡張に関連するので、このことは、変化した感受性に関連する喘息の非同義的多型の発見につながった。当該多型は、in vivoでの変化した感受性を予測するために発見される。更に、数人の喘息患者（反応者及び非反応者）の遺伝子型決定は、β2-アゴニストに対する変化した反応性と著しい関連を示した。これらの結果は、β2-アゴニストに対する変化した感受性の原因となるにすぎない一塩基多型の関連を最初に説明するものである。
【００１２】
本発明は、薬物反応に関連するβ2AR遺伝子の多型の検出に好適な、（配列番号2、3、4、5、6、7、8及び9として挙げた）オリゴヌクレオチド配列も提供する。
【００１３】
本発明は、β2-アゴニストに関する個体の反応を確立するための、1セットの特異的プライマー又はプローブ、及び必要な緩衝剤及びβ2AR遺伝子の多型の同定に好適な付属物を含むベータ-アゴニストに対する個体の反応を予測する診断キットを含む。
【００１４】
従って、本発明の主な実施態様は、喘息に罹患した対象におけるβ2アゴニストに対する気管支拡張反応を予測及び検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低度の反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 当該反応者、喘息に罹患した非反応者及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) β2AR遺伝子又は喘息に関連する遺伝子座のコーディング領域を増幅できる、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成し；
(e) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(f) ステップ（e）で得た増幅PCR産物の配列決定を行い、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（e）で得られた配列決定されたPCR産物の非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(g) ステップ（f）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応喘息個体をスクリーニングして、β2AR遺伝子又は遺伝子座の特異的SNPを検出し、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(h) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体の存在について、ステップ（g）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、当該オリゴヌクレオチドプライマーは標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体に特異的にハイブリダイズし、当該標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法に関する。
【００１５】
本発明のもう1つの実施態様は、  喘息に罹患した対象におけるβ2AR遺伝子の特異的アレル変異体又は一塩基多型（SNP）を予測及び検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低度の反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 当該反応者、喘息に罹患した非反応者及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) β2AR遺伝子又は喘息に関連する遺伝子座のコーディング領域を増幅できる、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成し；
(e) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(f) ステップ（e）で得た増幅PCR産物の配列決定を行い、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（e）で得られた配列決定されたPCR産物の非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(g) ステップ（f）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応者の喘息個体をスクリーニングして、β2AR遺伝子又は遺伝子座の特異的SNPを検出し、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(h) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体の存在について、ステップ（g）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法に関する。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、喘息に罹患した対象におけるβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための薬理遺伝学的マーカーを製造する方法であって、以下：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低度の反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 当該反応者、喘息に罹患した非反応者及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) β2AR遺伝子又は喘息に関連する遺伝子座のコーディング領域を増幅できる、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成し；
(e) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(f) ステップ（e）で得た増幅PCR産物の配列決定を行い、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（e）で得られた配列決定されたPCR産物の非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、喘息に関連する特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(g) ステップ（f）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応者の喘息個体をスクリーニングして、β2AR遺伝子又は遺伝子座の特異的SNPを検出し、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(h) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体の存在について、ステップ（g）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法に関する。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、喘息に罹患した対象においてβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための新規な薬理遺伝学的マーカーに関し、当該マーカーは以下：
a. 配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマー、
b. 配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び
c. 配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマー
を含む。
【００１８】
本発明のもう1つの実施態様は、β2-アゴニストに対する喘息患者の気管支拡張反応を予測及び検出するための診断キットに関し、当該キットは以下：
a. β2AR遺伝子のマーカー領域の増幅のための、配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーの第1セット、
b. 非同義的多型又は一塩基多型（AGA対GGA）の遺伝子型を特定するための、配列番号4及び5を有するプライマーの第2セット、ここで、当該特定プロセスは、以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み、並びに
c. SNP又は特異的アレルβ2ARもしくは遺伝子座変異体の存在について、アレルを用いて、正常対照個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認するための、配列番号6、7、8及び9を有するプライマーの第3セット、
ここで、当該標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、β2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46においてヌクレオチドAからGへ(A→G)の置換を有する、を含む。
【００１９】
本発明の別の実施態様は対象に関し、その対象はである。
【００２０】
更に別の実施態様は、β2-アゴニストに関し、そのβ2-アゴニストはサルブタモールである。
【００２１】
本発明の更に別の実施態様は、β2-アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量に関し、そのβ2-アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量は、約100〜250 μgの範囲である。
【００２２】
本発明のもう1つの実施態様は、β2-アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量に関し、そのβ2-アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量が約200μgである。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、β2-アゴニストであるサルブタモールの送達に関し、そのβ2-アゴニストであるサルブタモールの活性量は、吸入器によって送達される。
【００２４】
本発明の更に別の実施態様は、オリゴヌクレオチドプライマーに関し、β2ARのコーディング領域を増幅するために好適なオリゴヌクレオチドプライマーは、以下：
(a) 5' TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC 3' (配列番号2；フォワードプライマー）及び
(b) 5' ACGATGGCCAGGACGATGAGA 3' (配列番号3；リバースプライマー)
からなる群より選ばれる。
【００２５】
本発明のもう1つの実施態様は、オリゴヌクレオチドプライマーに関し、検出された非同義的多型又はSNPを増幅するために好適なオリゴヌクレオチドプライマーは以下：
(a) 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT 3' (配列番号4；フォワードプライマー）及び
(b) 5' CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3' (配列番号5；リバースプライマー）
からなる群より選ばれる。
【００２６】
本発明の更に別の実施態様は、PCRサイクル数に関し、その実施されるPCR数が37である。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、オリゴヌクレオチドプライマーに関し、β2AR遺伝子もしくは遺伝子座のSNP又はアレル変異体を確認するために好適なオリゴヌクレオチドプライマーは以下：
(a) 5 'GCACCCAATAGAAGCCATG 3' (配列番号6；フォワードプライマー）
(b) 5' CATGGCTTCTATTGGGTGC 3' (配列番号7；リバースプライマー）
(c) 5' GCACCCAATGGAAGCCATG 3' (配列番号8；フォワードプライマー）及び
(d) 5' CATGGCTTCCATTGGGTGC 3' (配列番号9；リバースプライマー）
からなる群より選ばれる。
【００２８】
本発明の更に別の実施態様は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの長さに関し、その合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さは5〜100塩基の範囲にある。
【００２９】
本発明のもう1つの実施態様は、合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプライマーの長さに関し、そのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さは8〜24塩基の範囲にある。
【００３０】
本発明の更に別の実施態様は、遺伝子型に関し、遺伝子型GGはサルブタモールに対する高反応者に関連し、遺伝子型AAはサルブタモールに対する低反応者に関連する。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、気管支拡張を誘導する非反応喘息患者に好適な治療薬の開発に有用である。
【００３２】
本発明の更に別の実施態様は、開発された方法に関し、その開発された方法は、ヒトにおけるβ2AR遺伝子又は遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するためのマーカー、プライマー及びプローブを提供する。
【００３３】
本発明の更に別の実施態様は、薬理遺伝学的マーカーに関し、その薬理遺伝学的マーカーは、β2AR遺伝子もしくは遺伝子座の特異的アレル変異体又は一塩基多型（SNP）に関連する。
【００３４】
本発明のもう1つの実施態様は、非同義的多型又はSNPに関し、その特定された非同義的多型又はSNP、又は特異的単一β2ARアレル変異体は、薬理遺伝学的マーカーとして機能する。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、マーカーに関し、配列番号2及び3を有するマーカー/オリゴヌクレオチドプライマーは、β2AR遺伝子のコーディング領域を増幅できる。
【００３６】
本発明の更に別の実施態様は、マーカーに関し、発列番号4及び5を有するマーカー/オリゴヌクレオチドプライマーは、反応者及び非反応喘息個体を（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型についてスクリーニング及び同定し、β2AR遺伝子の特異的SNPを検出できる。
【００３７】
本発明のもう1つの実施態様は、マーカーに関し、発列番号6、7、8及び9を有するマーカー/オリゴヌクレオチドプライマーは、正常対照個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者をSNP又は特異的アレルβ2ARもしくは遺伝子座変異体の存在について確認できる。
【００３８】
本発明の別の実施態様は、キットに関し、そのキットは、気管支拡張を誘導するための非反応喘息患者に好適な治療薬を同定するために有用である。
【００３９】
本発明の更に別の実施態様は、キットに関し、そのキットは、ヒトにおけるβ2AR遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するためのマーカー、プライマー及びプローブを提供する。
【００４０】
本発明の更に別の実施態様は、キットに関し、特定された非同義的多型もしくはSNP又は特異的単一β2ARアレル変異体は、β2AR遺伝子座の薬理遺伝学的マーカーとして機能する。
【００４１】
本発明の別の実施態様は、キットに関し、そのキットは、単一特異的β2ARアレル変異体もしくはSNP又は非同義的多型であり、β2-アゴニストに関する薬理遺伝学的マーカーとして機能する。
【００４２】
本発明のもう1つの実施態様は、β2AR遺伝子変異体のAA又はGG遺伝子型に基づいてオリゴヌクレオチドを使用し、反応型を帰属するための教示を更に含むキットに関する。
【００４３】
以下の実施例は、本発明の説明のために記載するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００４４】
実施例 1
I.  集団試験: 吸入β2-アゴニストによる気道反応性の測定
本発明の第1ステップとして、出願人は、様々な程度の反応を示す単時間作用型ベータアゴニスト、例えばサルブタモールを患者に投与することによって当該試験を行った。より記述的試験を行うために、我々は、サルブタモールに対する反応に基づいて患者を「高反応者」（good responder）及び「低反応者」（poor responder）と分類した。サルブタモールは、吸入器を用いて経口的又はより一般的に用いられる。吸入器は、確実に、非常に少量の医薬が肺に直接送達させる。喘息の診断は、疾患に一致する兆候及び症状の陽性歴及び可逆的気道閉塞の存在に基づいて行った。他の可能性のある胸部疾患を排除するために、全ての患者は、通常の研究用診断試験及び肺機能試験（PFT）を受けた。肺気量測定法試験では、最小の3つの許容されるマニューバーを実行し、「最上試験」曲線（「最上試験」曲線は、アメリカ胸部学会によって規定されている許容基準を満たす試験として特定され、FVC及びFEV1の最大合計である）を選択した。気道に閉塞兆候を示した患者には、200マイクログラムのサルブタモール（ベータ2-アドレナリン様アゴニスト）を投与し、20分後に試験を繰り返した。これは、気道閉塞の可逆性の程度を評価するために行った。更に2週間の間隔で2〜3回、この方法を繰り返し、FEV1での%年齢変化の最上値を選択し、その喘息患者をサルブタモールに対する高反応者、低反応者又は非反応者と分類した。
【００４５】
実施例 2
II.  β2AR遺伝子中の多型の同定：
発明者らは、5'上流の隣接領域内のインド人の10つの多型部位及びインド人のβ2AR遺伝子のコーディング配列を同定した（表2）。当該発見は、13つの多型部位を報告しているDrysdale他 (2000)の発見とは相違する。表3で示される7つのハロタイプ対は、クラークのアルゴリズム(Clark, 1990)の伸張を用いて非同調的（unphased）遺伝子型から推定された。この方法では、ハロタイプは、可変部位の内のすべての部位での同型又は可変部位の内のたった1つでの異型である個体から直接、帰属される。
【００４６】
実施例 3
III.  薬物反応の指標としての本発明の単一多型：
出願人は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてヒトβ2AR遺伝子のエキソン領域のPCR増幅を行った。これらのプライマーは、DOE Joint Genome Institute及びStanford Human Genome Center (1999年10月6日) (GenBank受入番号 ACO11354)によって提出されたヒトβ2AR遺伝子配列と関連して設計された。精製PCR産物の配列決定は、気管支拡張と関連するヒトβ2AR遺伝子のエキソン領域の異型非同義的多型である、ことを明らかにした。
【００４７】
本発明は、薬物反応に関連するデータベースにおいて、ヒトβ2AR遺伝子配列のエキソン領域の非同義多型を含むヒトβ2AR遺伝子のアレル変異体の配列（GenBank受入番号 ACO11354）を提供する。
【００４８】
【表１】
2007534329.tif 000003
【００４９】
変化の部位は、ヒトβ2AR遺伝子（GenBank受入番号 ACO11354）のプライマー（配列番号2及び3）のフランキングエキソン領域を用いて得られたPCR産物配列と関連する。
【００５０】
A→Gの置換は、ヒトβ2AR遺伝子のエキソン領域のアレル変異体の塩基配列をもたらす、アミノ酸のアルギニンをグリシンへ変化させる。非同義的多型を含むPCR産物配列は、配列番号1のヒトβ2AR遺伝子のエキソン領域内の、配列番号2及び3のプライマーのフランキング非同義的多型を用いて得られた。
【００５１】
データベース（GenBank受入番号 ACO11354）から、多型部位は、塩基位置46に対応する上記配列中の塩基位置857（A＊）である。プライマーは、ヒトβ2AR遺伝子のプライマー（配列番号2及び3）のフランキングエキソン領域を用いて得られたPCR産物に従って、位置857での多型を検出するために用いた（表1）。
【００５２】
実施例 4
IV.  解析と薬物反応との関連性：
本発明者らは、塩基位置46のβ2AR遺伝子内の唯一の多型部位を遺伝子型決定することによって、インド人におけるサルブタモールに対する患者の気管支拡張反応を高い信頼度で予測できる、ことを発見した。更に、数人の喘息患者（反応者及び非反応者）の遺伝子型決定は、β-アゴニストに対する変化した反応と顕著な関連を示した。これらの結果は、β-アゴニストに対する変化した感受性の原因である単一多型の関連の最初の証明である。同型Argl6及び同型Gly16は、インド人の低反応者及び高反応者との関連を示した。同型Arg16及び同型Gly16は、インド人において低反応及び良好な反応との関連を示した（図1d）。更に、陰性の気管支拡張反応を有する同型Arg16喘息患者及び同型Gly16喘息患者の非常に少数、人種の混同の可能性、及び低度の小児喘息患者の使用は、他人(Martinez他 1997)に、インド人喘息患者、特に、非常に多数の喘息患者及び重度の喘息の程度を有する大人のインド人対象を利用した本明細書に記載の本発明者らの試験とは比較できないほどの研究をさせた。出願人は、インド人における喘息関連β2AR遺伝子中にSNPを見出せなかった。
【００５３】
実施例 5
V.  診断キット: 
本発明は、以下：
配列番号2及び3のPCR増幅プライマー、
配列番号4又は5のSNaPshot（登録商標）プライマー、
配列番号6、7、8及び9のオリゴヌクレオチドから選ばれる、少なくとも1つのアレル-特異的オリゴヌクレオチド、並びに
PCR又はハイブリダイゼーション反応用の好適な緩衝剤
を含む、ベータ-アゴニストに対する個体の反応を予測するための診断キットを提供する。
【００５４】
あるいは、β2AR遺伝子内の多型を検出するために用いることができるアレル-特異的オリゴヌクレオチドは、基材に固定されるように提供することもできる。本発明のキットの任意の追加的成分は、例えば、制限酵素、ポリメラーゼ、基質ヌクレオシド・トリホスフェート、標識するために用いられる手段（例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素複合体、酵素基質、及び色原体）を含む。
【００５５】
実施例 6
吸入β2-アゴニストによる気道反応性の測定
疾患と一致する兆候及び症状の陽性歴に基づいて及び可逆性気道閉塞の存在によって、喘息の診断を行った。他の可能性のある胸部疾患を排除するために、全ての患者は、通常の研究用診断試験及び肺機能試験（PFT）を受けた。肺気量測定法試験では、最小の3つの許容されるマニューバーを実行し、「最上試験」曲線（「最上試験」曲線は、アメリカ胸部学会によって規定されている許容基準を満たす試験として特定され、FVC及びFEV1の最大合計である）を選択した。気道に閉塞兆候を示した患者には、200マイクログラムのサルブタモール（ベータ2-アゴニスト）を投与し、20分後に試験を繰り返した。これは、気道閉塞の可逆性の程度を評価するために行った。更に2週間の間隔で2〜3回、この方法を繰り返し、FEV1での%年齢変化の最上値を選択し、その喘息患者をサルブタモールに対する高反応者、低反応者又は非反応者と分類した。
【００５６】
実施例 7
β2AR遺伝子内の多型の同定:
発明者らは、5'上流の隣接領域内の10つの多型部位及びインド人のβ2AR遺伝子のコーディング配列を同定した（表2）。これは、ATG開始部位の上流の1581塩基対からATG開始部位の下流の750塩基対までの10つの多型部位の試験を説明している。Drysdale他 (2000)によってヒトで見出された13つの多型部位は、インド人におけるたった10つの多型部位についての我々の発見とは異なる。表3に示される数個のハロタイプ対は、クラークのアルゴリズム(Clark, 1990)の伸張を用いて非同調的遺伝子型から推定された。この方法では、ハロタイプは、可変部位の内のすべての部位での同型又は可変部位の内のたった1つでの異型である個体から直接、帰属される。
【００５７】
β2AR遺伝子の重複部分は、以下のPCRプライマーを用いて、喘息患者及び正常インド系個体由来のゲノムDNAから増幅した。GeneBank受入番号 ACO11354に対応する位置を表記した。
【００５８】
部分1
プライマーの位置は、+1である開始コドンの第1塩基を基準とする。
フォワードプライマー：nt -1472〜-1448。
リバースプライマー：nt -530〜-548に相補。
942 nt産物（-1472〜-530）。
【００５９】
部分2
フォワードプライマー（配列番号2）：nt -811〜-787。
リバースプライマー（配列番号3）：nt +143〜+122に相補。
954 nt産物（-811〜+143）。
【００６０】
部分3
フォワードプライマー（5）：nt +126〜+148。
リバースプライマー（6）：nt +721〜+699に相補。
595 nt産物（+721〜+126）。
【００６１】
【表２】
2007534329.tif 000004
【００６２】
【表３】
2007534329.tif 000005
【００６３】
実施例 8
β2AR遺伝子内の非同義的多型の同定:
本発明に従うあるオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、PCR及び配列決定によるβ2AR遺伝子のエキソン領域の非同義的多型の同定を記載する。
【００６４】
塩析法を用いてゲノムDNAを末梢血から単離した(Miller他, 1988)。DNA濃度は、波長260 nmで試料の吸収を測定することにより決定した。次いで、オリゴヌクレオチドプライマー2及び3（配列番号2及び3）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により喘息由来のDNAを増幅した。各50μlのPCR反応は、200 ng DNA、それぞれ20 pmolのオリゴヌクレオチドプライマー2及び3 (配列番号2及び3)、1.8単位のTaqポリメラーゼ(Bangalore Genei)及び200 mM デオキシリボヌクレオシド トリホスフェート(dNTP)を10x PCR緩衝剤(100 mM Tris (pH 9.0)、500 mM KCl及び0.1%ゼラチンを含む)に含んだ。
【００６５】
試料を94℃で5分間変性し、次いで変性（94℃、45秒）、アニーリング（56℃、1分）、伸張（72℃、1.2分）及びPerkin Elmer Gene Amp PCR System 9600での72℃で10分の最終伸張を37サイクル行った。この反応は、954 bpのDNA断片を生成した。ポリエチレングリコール/酢酸ナトリウム水溶液 (PEG 8000、1M塩化マグネシウム及び3M無水酢酸ナトリウム, pH 4.8を含む）よって、PCR産物を精製し、PCR産物の両鎖をABI Prism 3100自動DNAシークエンサーで色素ターミネーター化学を用いて直接配列決定した。PCR産物は、データベース(受入番号 AL022326）でβ2AR遺伝子配列のエキソンと同一であることが分かった。ファクテュール・アンド・シークエンス・ナビゲーター（Factura and Sequence Navigator）ソフトウェアプログラムを用いて、配列を対応する野生型配列と並べた。
【００６６】
実施例 9
集団の多型のスクリーニング：
本実施例は、一塩基変異体を選別するために用いるプライマー伸張反応を記載する。数人の喘息患者（反応者/非反応者）及び数人の正常対象由来のDNA試料を実施例2に記載のようにして精製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びSNaPshot ddNTPプライマー伸張キット（PE Biosystems）を用いて、精製PCR産物のプライマー伸張反応を行った。SNapshot技術は分子研究において広く用いられ、多型遺伝子座の正確な同定決定に有用である。しかしながら、全てのSNaPshotプロトコールに従う基本的な方法論は、全ての研究で同じである。しかしながら、各SNaPshotプロトコールはそれ自体独特である。これは、各プロトコールが遺伝子座特異的であるからである。そのため、特異的に働くプロトコールが開発される必要があり、特異的遺伝子座の特定のために発明された。言い換えれば、本研究においてSNaPshot法を用いて開発された反応及びPCR条件は、他の任意の疾患の遺伝子座のために用いられる任意の他のSNaPshot法とは異なる。本発明で提供するSNaPshot法の新規な特異的プロトコールがこの非常に特異的な遺伝子座、すなわちβ2AR遺伝子座のために確立された、ことをこれは意味している。このプロトコールは、配列番号4及び5を有するこれらの特異的に設計かつ開発されたプライマーが使用される場合にのみ、このプロトコールは作動することになる。変異体の最後から2番目の位置までオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、変異体アレルに従って存在する1つのddNTPによってプライマーを伸張した。変性（96℃、10秒）、アニーリング（55℃、5秒）、及び配列番号4及び配列番号5を有するプライマーを用いてPerkin Elmer GeneAmp PCR System 9600での伸張（60℃、30秒）、の30サイクルの反応を行った。取り込まれなかったジデオキシヌクレオチドを除くために、子牛の腸アルカリフォスファターゼ（New England Biolabs）で、プライマー伸張産物を処理した。ABI Prism 3100自動DNAシークエンサーでこの産物を分析した。取り込まれた蛍光標識ジデオキシヌクレオチドの色に拠って、β2AR遺伝子の野生型及び多型アレルを検出した。
【００６７】
実施例 10
β2AR遺伝子のアレル変異体の塩基配列: 
β2AR遺伝子のアレル変異体の塩基配列は、実施例2に記載の方法を用いて得た。
【００６８】
【表４】
2007534329.tif 000006
【００６９】
実施例 11 
非同義的多型と薬物反応との関連：
非同義的SNP又は多型を、「改変コードは野性型配列と同じアミノ酸に対応しない場合、すなわち、異なったアミノ酸をもたらすコーディング領域に置換が存在する場合」として定義した。
【００７０】
本発明者らは、インド人におけるサルブタモールに対する患者の気管支拡張反応は、塩基位置46でのβ2AR遺伝子の一塩基多型部位のみを遺伝子型特定することによって高い信頼性で予測できる、ことを発見した。数人の喘息患者（反応者及び非反応者）の更なる遺伝子型特定は、β2-アゴニストに対する反応と顕著な反応を示した。これらの結果は、β2-アゴニストに対する変化した感受性の専ら原因となる一塩基多型の関連性を最初に証明するものである。同型Arg16及び同型Gly16は、インド人での低及び高反応者との関連を示した（図1d）。更に、陽性の気管支拡張反応を有する同型Arg16喘息患者及び陰性の気管支拡張反応を有する同型Gly16喘息患者の非常に少数、人種の混同の可能性、及び低度の小児喘息患者の使用は、他人（Martinez他, 1997）に、インド人の喘息患者、特に、非常に多くの喘息患者及び重度の範囲の喘息を有する大人のインド人対象を利用した本明細書に開示された発明者らの研究とは比較できないほどの研究をさせた。出願人は、インド人の喘息に関連するβ2AR遺伝子中にSNPを見出せなかった。
【００７１】
AA遺伝子型を有する患者は、確率0.76で低反応者であり、GG遺伝子型を有する患者は確率0.72で高反応者であると予想される。サルブタモール治療に対する反応者の状況及び喘息患者のβ2AR遺伝子の遺伝子型は、インド人と強く関連する（χ2=11.28、df=2、p=0.004）。
【００７２】
実施例 12
塩基位置46の多型の確認のために、配列特異的オリゴヌクレオチド（SSO）ハイブリダイゼーション実験を行った。この実験は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、続いてナイロン膜へのPCR産物のブロッティング、及び配列番号6、7、8及び9の放射標識プライマーによる連続ハイブリダイゼーションによる、目的領域の増幅に基づいた。喘息患者由来のDNAは、オリゴヌクレオチドプライマー2及び3（配列番号2及び3）を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。各50μlのPCR反応は、200 ng DNA、それぞれ20 pmolのオリゴヌクレオチドプライマー2及び3 (配列番号2及び3)、1.8単位のTaqポリメラーゼ (Bangalore Genei)及び200 mM デオキシリボヌクレオシド トリフォスフェート（dNTP)を10x PCR緩衝剤（100 mM Tris (pH 9.0)、500 mM KCl及び0.1%ゼラチンを含む)に含んだ。
【００７３】
上記で得た各1マイクロリットルのPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に転写し、6X SSPE（NaCl 0.9M; NaH2PO4 7O mM; EDTA 6 mM)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、5X デンハルト溶液及び塩基位置46に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号6、7、8及び9の放射標識プライマー）を有する100μg/ml サケ精子DNA中でハイブリダイズした。標準プロトコールにより決められている、各オリゴヌクレオチドの融解点で、緊縮条件下でハイブリダイゼーションを行った。室温で2X SSPE、0.1% SDSで10分間、2回、及び融解点を2℃越える温度で6X SSPE、1% SDSで10分間、1回、フィルターを洗浄し、次いでオートラジオグラフィーに露光した。露光ラジオグラフを、位置46にSNPを含む配列のPCR産物と、配列番号6、7、8及び9の放射標識アレル特異的プライマーとのハイブリダイゼーションから得られるハイブリッドしたスポットについて分析した。配列番号6、7、8及び9のアレル特異的プライマーの結果をそれぞれ図2a、2b、2c、2dに示す。
【００７４】
図2a及び2bにおいて、2つのレーンのうち、各図の1レーンは、配列番号6及び7のアレル特異的プイライマーとハイブリッドしたスポットがアレルAの存在を支持し、同様に、図2c及び図2dにおいて、配列番号8及び9のアレル特異的プライマーとハイブリッドしたスポットが46塩基位置でのアレルGの存在を支持した、ことを示した。
【００７５】
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【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１ａ】図1aは、β2AR内の非同義的多型を含む全てのSNPを示す図である。
【図１ｂ】図1bは、完全なβ2AR遺伝子をカバーする領域のPCR増幅に用いられるプライマーを示す図である。
【図１ｃ】図1cは、インド人における、β2AR遺伝子領域のSNPの位置、及びβ2AR遺伝子領域の連鎖不均衡の同定を示す図である。
【図１ｄ】図1dは、46ヌクレオチド位置でのA/G多型（遺伝子型）の分布を示す図である。
【図２ａ】図2aは、配列番号6を有するアレル特異的プライマーとのハイブリダイゼーションによりAの存在を示す図である。
【図２ｂ】図2bは、配列番号7を有するアレル特異的プライマーとのハイブリダイゼーションによりAの存在を示す図である。
【図２ｃ】図2cは、配列番号8を有するアレル特異的プライマーとのハイブリダイゼーションによりGの存在を示す図である。
【図２ｄ】図2dは、配列番号9を有するアレル特異的プライマーとのハイブリダイゼーションによりGの存在を示す図である。
【図１ａ】
2007534329.tif 000007
【図１ｂ】
2007534329.tif 000008
【図１ｃ】
2007534329.tif 000009
【図１ｄ】
2007534329.tif 000010
【図２ａ】
2007534329.tif 000011
【図２ｂ】
2007534329.tif 000012
【図２ｃ】
2007534329.tif 000013
【図２ｄ】
2007534329.tif 000014
【配列表】
2007534329000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月1日(2007.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息に罹患した対象におけるβ2アゴニストに対する気管支拡張反応を検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低度の反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 喘息に罹患した反応者、非反応者、及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(e) ステップ（d）で得た増幅PCR産物を配列決定し、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（d）で得た配列決定されたPCR産物の非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(f) ステップ（e）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するプライマーを用いて、β2AR遺伝子又は遺伝子座の特異的SNPを検出するために、（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応喘息個体をスクリーニングし、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(g) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体の存在について、ステップ（f）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、当該オリゴヌクレオチドプライマーは標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体に特異的にハイブリダイズし、当該標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記β2アゴニストがサルブタモールである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記のβ2アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量が、約100〜250μgの範囲である、請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
前記の薬理的に活性な量が約200μgである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（a）において、前記のβ2アゴニスト量が吸入器によって送達される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
配列番2〜9を有する合成オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項８】
検出されたSNPが、サルブタモール高反応者に関連する遺伝子型GG、及びサルブタモール低反応者に関連する遺伝子型AAを有する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
喘息に罹患した対象におけるβ2AR遺伝子の特異的アレル変異体又は一塩基多型（SNP）を検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 公知のかつ迅速作用型β2アゴニストの薬理的に活性な量を好適な経路により当該対象に投与し；
(b) β2アゴニストに対する、喘息に罹患した高反応者及び低反応者を表現型的に同定及び分類し；
(c) 喘息に罹患した反応者、非反応者、及び正常個体の血液試料からゲノムDNAを単離し；
(d) 配列番号2及び3を用いて、表現型で分類された反応及び非反応の喘息患者のゲノムDNAを増幅し；
(e) ステップ（d）で得た増幅PCR産物の配列決定を行い、そして、コンピュータを利用してβ2AR遺伝子又は遺伝子座の公知の配列と比較することによって、ステップ（d）から得た配列決定されたPCR産物から非同義的多型又は一塩基多型（SNP）を同定して、特異的β2ARアレル変異体を検出し；
(f) ステップ（e）で同定される非同義的多型又は一塩基多型（SNP）の最後から2番目の位置まで、配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特異的SNP又はアレル変異体を検出するために、（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について当該反応者及び当該非反応の喘息個体をスクリーニングし、このステップは以下のPCR条件：
（i）96℃の温度で10秒間、単離したDNAを変性し、
（ii）55℃の温度で5秒間、ステップ（i）の変性DNAに配列番号4及び5のプライマーをアニールし、そして
（iii）60℃の温度で30秒間、ステップ（ii）のアニールしたDNAの伸張を行うこと
を含み；並びに
(g) 配列番号6、7、8及び9を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SNP又は特異的β2ARアレル変異体もしくは遺伝子座変異体の存在について、ステップ（f）で得た正常個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を確認すること、
ここで、標的SNP又は特異的β2ARアレル変異体は、喘息患者のβ2AR遺伝子又は遺伝子座の（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46でヌクレオチドAからG（A→G）への置換を有する、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記対象がヒトである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
β2-アゴニストがサルブタモールである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記のβ2-アゴニストであるサルブタモールの薬理的に活性な量が、約100〜250μgの範囲にある、請求項９又は１１記載の方法。
【請求項１３】
前記の薬理的に活性な量が約200μgである、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（a）において、前記β2-アゴニスト量が吸入器によって送達される、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
配列番号2〜9を有する合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
検出されたSNPが、サルブタモール高反応者に関連する遺伝子型GG、及びサルブタモール低反応者に関連する遺伝子型AAを有する、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
喘息に罹患した患者においてβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための薬理遺伝学的マーカーを製造する方法であって、配列番号2〜9を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成することを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記対象がヒトである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
配列番号2〜9を有する薬理遺伝学的マーカーの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
喘息に罹患した対象におけるβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための新規薬理遺伝学的マーカーであって、以下：
(a) 配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマー、
(b) 配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び
(c) 配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマー
からなる、前記マーカー。
【請求項２１】
配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、β2AR遺伝子のコーディング領域を検出する、請求項２０記載のマーカー。
【請求項２２】
配列番号4及び5を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、（本発明で開示される配列番号1に関して塩基位置857と同一である）位置46の多型について反応者及び非反応喘息個体を検出して、β2AR遺伝子の特異的SNPを検出する、請求項２０記載のマーカー。
【請求項２３】
配列番号6、7、8及び9を有するオリゴヌクレオチドプライマーが、SNP又は特異的アレルβ2AR変異体もしくは遺伝子座変異体の存在について、正常対照個体及び（反応者及び非反応者を含む）喘息患者を検出する、請求項２０記載のマーカー。
【請求項２４】
前記薬理遺伝学的マーカーの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項２０記載のマーカー。
【請求項２５】
サルブタモール高反応者に関連する遺伝子型GG、及びサルブタモール低反応者に関連する遺伝子型AAを有するSNPを検出する、請求項２０記載のマーカー。
【請求項２６】
気管支拡張を誘導するための非反応の喘患者に好適な治療薬の開発に有用である、請求項２０記載のマーカー。
【請求項２７】
β2-アゴニストに対する喘息患者の気管支拡張反応を予測及び検出するための診断キットであって、以下：
(a) 配列番号2及び3を有するオリゴヌクレオチドプライマーの第1セット；
(b) 配列番号4及び5を有するプライマーの第2セット；及び
(c) 配列番号6、7、8及び9を有するプライマーの第3セット
を含む、前記キット。
【請求項２８】
配列番号2及び3を有するプライマーが、β2ARのコーディング領域を増幅及び検出するために好適である、請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
配列番号4及び5を有するプライマーが、非同義的多型を増幅及び検出するために好適である、請求項２７記載のキット。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドプライマーの第3セットが、非同義的多型を確認するために好適である、請求項２７記載のキット。
【請求項３１】
配列番号2〜9を有する合成オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの長さが、8〜24塩基の範囲にある、請求項２７記載のキット。
【請求項３２】
サルブタモール高反応者に関連する遺伝子型GG、及びサルブタモール低反応者に関連する遺伝子型AAを有するSNPを検出する、請求項２７記載のキット。
【請求項３３】
気管支拡張を誘導するための、非反応の喘息患者に好適な治療薬を同定するために有用である、請求項２７記載のキット。
【請求項３４】
ヒトにおけるβ2AR遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するための、マーカー、プライマー及びプローブを提供する、請求項２７記載のキット。
【請求項３５】
前記の特定された非同義的多型もしくはSNP又は特異的単一β2ARアレル変異体が、薬理遺伝学的マーカーとして機能する、請求項２７記載のキット。
【請求項３６】
気管支拡張を誘導するための、非反応の喘息患者に好適な治療薬の開発のための、請求項１記載の方法の使用。
【請求項３７】
ヒトにおけるβ2AR遺伝子座の単一アレル変異体を予測及び検出するための、マーカー、プライマー及びプローブを提供する、請求項１記載の方法の使用。
【請求項３８】
喘息に罹患した対象におけるβ2AR遺伝子の特異的アレル変異体又は一塩基多型（SNP）を検出及び予測するために有用である、請求項９記載の方法の使用。
【請求項３９】
喘息に罹患した対象におけるβ-アゴニストに対する気管支拡張反応を検出及び予測するための、請求項２０記載の薬理遺伝学的マーカーの使用。
【請求項４０】
β2アゴニストに対する喘息患者の気管支拡張反応を予測及び検出するための、請求項２７記載の診断キットの使用。
【国際調査報告】
2007534329.tif 000019
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