(57)【要約】本発明は、肥満、インスリン非依存性糖尿病、代謝症候群、および他の関連疾患を、ＮＴ−４／５ポリペプチドを投与することによって処置するための方法に関する。本発明はまた、ＮＴ−４／５ポリペプチドを含む組成物およびキットに関する。本発明はまた、個体における、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、腹部肥満、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および代謝症候群のうちのいずれか１つ以上を処置するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における肥満を処置するための方法であって、該方法は、該個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない、方法。
【請求項２】
前記個体が、レプチン耐性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記個体における肥満に関連する障害が処置され、該障害が、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および代謝症候群からなる群より選択される、方法。
【請求項４】
前記個体が、前記処置の結果として体脂肪含有量を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、天然に存在するＮＴ−４／５である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてＰＥＧ分子と連結されている、方法。
【請求項１０】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、該ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体と併せて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
個体において体重を減少させるためかまたは体重増加を防止するための方法であって、該方法は、該個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない、方法。
【請求項１２】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、天然に存在するＮＴ−４／５である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）に連結されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてＰＥＧ分子と連結されている、方法。
【請求項１７】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、該ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体と併せて投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
個体におけるインスリン非依存性糖尿病を処置するための方法であって、該方法は、該個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記個体におけるインスリン非依存性糖尿病に関連する障害が処置され、該障害が、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、腹部肥満、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および代謝症候群からなる群より選択される、方法。
【請求項２０】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、天然に存在するＮＴ−４／５である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）に連結されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてＰＥＧ分子と連結されている、方法。
【請求項２５】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、該ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体と併せて投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
個体における代謝症候群を処置するための方法であって、該方法は、該個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、天然に存在するＮＴ−４／５である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）に連結されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてＰＥＧ分子と連結されている、方法。
【請求項３２】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、該ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体と併せて投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
ＮＴ−４／５ポリペプチドと薬学的に受容可能な賦形剤とを含有する薬学的組成物であって、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、ＰＥＧ分子に連結されている、薬学的組成物。
【請求項３４】
前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、アミノ酸置換を有する成熟ＮＴ−４／５タンパク質のアミノ酸配列を含み、該置換されたアミノ酸が、ＰＥＧ分子に連結されている、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、１位においてＰＥＧ分子と連結されている、薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、前記ＮＴ−４／５ポリペプチドが、５０位においてアミノ酸残基ＳがＣに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、該ＮＴ−４／５ポリペプチドが、５０位においてＰＥＧ分子と連結されている、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／５４６，３９０号（２００４年２月２０日出願）の優先権の利益を主張する。上記仮特許出願は、本明細書において、その全体が参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、肥満、インスリン非依存性（ＩＩ型）糖尿病、代謝症候群もしくは関連疾患の処置、および／または防止における、ＮＴ−４／５ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
肥満は、慢性疾患であり、そして現代社会における主要な健康上の関心事である。米国における成人の約３０％が肥満であり、成人の約６５％は、太り過ぎ（ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ）である。肥満は、社会的な不名誉に関係するだけでなく、寿命の短縮および多くの健康上の問題（高血圧；２型糖尿病；高い血漿インスリン濃度；インスリン抵抗性；異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、および結腸癌；変形性関節症；呼吸器の合併症（例えば、閉塞型睡眠時無呼吸）；胆石症；胆石；動脈硬化；心臓疾患；心拍リズムの異常；および、心臓の不整脈が挙げられる）にも関係する。非特許文献１。
【０００３】
現在の肥満に対する治療としては、標準的な食事および運動、非常に低カロリーの食事、行動療法、薬物療法（食欲抑制剤、熱産生薬（ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ｄｒｕｇ）、食物吸収インヒビターを含む）、機械的デバイス（例えば、顎ワイヤ（ｊａｗ  ｗｉｒｉｎｇ）、ウエストコード（ｗａｉｓｔ  ｃｏｒｄ）およびバルーン）、ならびに外科手術が挙げられる。非特許文献２；非特許文献３。タンパク質節約性改変絶食（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐａｒｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ）は、青年においては体重減少に有効であることが報告されている。非特許文献４。しかし、現在の治療は、多くの肥満患者についてそれほど有効ではない。最も重篤な肥満患者については、外科的介入が必要とされ得る。上記で考察されるような我々の社会における肥満の高い有病率およびそれに伴う深刻な結果を考えると、肥満した人の体重を減少させるのに有用である可能性のある何らかの治療薬は、それらの人の健康に非常に有益な効果を有し得る。肥満した被験体の全体重を顕著な有害な副作用なしに彼らの理想体重へと減少させ、その肥満した被験体が減少した体重レベルを維持するのを助ける薬物に対する必要性が存在する。
【０００４】
糖尿病を有する患者は、膵臓のβ細胞の不十分なインスリン産生に起因するグルコースの処理障害（すなわち、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型、ＩＤＤＭ））を有するか、または標的器官のインスリン抵抗性に起因するグルコースの処理障害（すなわち、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型、ＮＩＤＤＭ））を有する。糖尿病患者の９０％より多くが、ＩＩ型糖尿病に罹患している。ＩＩ型糖尿病は、多くの場合、高脂血症を伴い、そして異常に高レベルのコレステロールもしくはトリグリセリド（すなわち、２２０ｍｇ／ｄｌより高い総コレステロール、もしくは１５０ｍｇ／ｄｌより高いトリグリセリド）は動脈硬化および心筋梗塞の危険因子である。ＩＩ型糖尿病はまた、多くの場合肥満を伴う。ＩＩ型糖尿病、高脂血症、および肥満は、互いに深く関係している；しかし、各状態を改善するためには、複数の医薬が必要とされる。食事制限および身体の運動は、糖尿病の初期段階におけるグルコース寛容を改善し得るのみであり、後期段階においては、グルコースレベルを抑えるために、複数の種類の抗高血糖医薬が多くの場合必要とされる。しかし、現行の抗高血糖医薬はいずれも、最適ではない。患者は、多くの場合深刻な副作用に苦しみ、多くは、最終的にインスリンを必要とする。
【０００５】
ニューロトロフィンは、小さなホモダイマーのタンパク質のファミリーであり、神経系の発達および維持に重要な役割を果たす。ニューロトロフィンファミリーのメンバーとしては、神経発育因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、およびニューロトロフィン−７（ＮＴ−７）が挙げられる。ニューロトロフィンは、他のポリペプチド成長因子と同じく、細胞表面レセプターとの相互作用を介して、それらの標的細胞に影響を与える。現在知られているところによると、２種類の膜貫通糖タンパク質が、ニューロトロフィンのレセプターとして働く。ニューロトロフィン反応性ニューロンは、共通の低分子量（６５〜８０ｋＤａ）の低親和性レセプター（ＬＮＧＦＲ）（これは、ｐ７５ＮＴＲもしくはｐ７５としても知られており、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５に、２×１０−９ＭのＫＤで結合する）；および高分子量（１３０〜１５０ｋＤａ）の高親和性（１０−１１Ｍの範囲のＫＤ）のレセプター（これは、レセプターチロシンキナーゼのｔｒｋファミリーのメンバーである）を有する。Ｔｒｋレセプターファミリーの同定されているメンバーは、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣである。
【０００６】
ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５の両方は、ＴｒｋＢレセプターとｐ７５ＮＴＲレセプターとに同様の親和性で結合する。しかし、ＮＴ−４／５ミュータントマウスとＢＤＮＦミュータントマウスとは、全く対照的な表現型を示す。ＮＴ−４／５−／−マウスは、軽度な感覚の欠損を有するのみで、生存可能かつ繁殖可能であるが、ＢＤＮＦ−／−マウスは、重度の神経の欠損および行動症状を有し、出生後の初期段階に死亡する。非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９。いくつかの刊行物は、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦがインビボにおいて異なる生物学的活性を有することを報告し、そしてこの異なる活性が、部分的に、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦによる、ＴｒｋＢレセプターおよびその下流のシグナル伝達経路の差別的な活性化から生じる可能性があることを示唆する。非特許文献５；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２。
【０００７】
ＩＩ型糖尿病モデル動物Ｃ５７ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、ＢＤＮＦが血中グルコース制御活性および血中脂質制御活性、ならびに抗肥満活性を有することが示されている。特許文献１；非特許文献１３。高脂肪食を与えられたマウスにおいて、ＢＤＮＦが抗肥満活性およびレプチン耐性を改善する活性を有することが、また示されている。特許文献２。ＢＤＮＦまたはＮＴ−４／５が、ＢＤＮＦ遺伝子発現が低下した異型接合体ＢＤＮＦノックアウトマウスにおいて、食行動および肥満を一過性に逆転し得ることがまた報告されている。非特許文献１４。ヒトＴｒｋＢにおけるＹ７２２Ｃ置換という新規のミスセンス変異Ｙ７２２Ｃが、レセプターリン酸化の障害およびＭＡＰキナーゼへのシグナル伝達の障害をもたらすことが報告されており；そしてこの変異は、独特のヒトの過食性肥満症候群を引き起こすとみられる。非特許文献１５。
【０００８】
本明細書において引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
【特許文献１】米国特許第６，３９１，３１２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／００３６５１２号明細書
【非特許文献１】Ｋｏｐｅｌｍａｎ，Ｐ．Ｇ．，「Ｎａｔｕｒｅ」，２０００年，第４０４巻，ｐ．６３５−６４３
【非特許文献２】ＪｕｎｇおよびＣｈｏｎｇ，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」，１９９１年，第３５巻，ｐ．１１−２０
【非特許文献３】Ｂｒａｙ，「Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．」，１９９２年，第５５巻，５３８Ｓ−５４４Ｓ
【非特許文献４】Ｌｅｅら，「Ｃｌｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．」，１９９２年４月，第３１巻，ｐ．２３４−２３６
【非特許文献５】Ｆａｎら，「Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」，２０００年，第３巻，第４号，ｐ．３５０−７
【非特許文献６】Ｌｉｕら，「Ｎａｔｕｒｅ」，１９９５年，第３７５巻，ｐ．２３８−２４１
【非特許文献７】Ｃｏｎｏｖｅｒら，「Ｎａｔｕｒｅ」，１９９５年，第３７５巻，ｐ．２３５−２３８
【非特許文献８】Ｅｒｎｆｏｒｓら，「Ｎａｔｕｒｅ」，１９９４年，第３６８巻，ｐ．１４７−１５０
【非特許文献９】Ｊｏｎｅｓら，「Ｃｅｌｌ」，１９９４年，第７６巻：ｐ．９８９−９９９
【非特許文献１０】Ｍｉｎｉｃｈｉｅｌｌｏら，「Ｎｅｕｒｏｎ」，１９９８年，第２１巻，ｐ．３３５−４５
【非特許文献１１】Ｗｉｒｔｈら，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，２００３年，第１３０巻，第２３号，ｐ．５８２７−３８
【非特許文献１２】Ｌｏｐｅｚら，「Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」，２００３年，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｏ．３８．６
【非特許文献１３】Ｉｔａｋｕｒａら，「Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」，２０００年，第４９巻，ｐ．１２９−３３
【非特許文献１４】Ｋｅｒｎｉｅら，「ＥＭＢＯ  Ｊ．」，２０００年，第１９巻，第６号，ｐ．１２９０−３００
【非特許文献１５】Ｙｅｏら，「Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」，２００４年，第７巻，ｐ．１１８７−１１８９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、ＮＴ−４／５が、糖尿病動物モデルにおいて、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）の処置に有効であり、そしてＮＴ−４／５処置に伴う効果が、体重の減少、食物摂取の減少およびトリグリセリドレベルの減少であるという発見に基づく。本発明はまた、ＮＴ−４／５が、正常動物モデルおよび肥満動物モデルにおいて、体重減少、食物摂取の制御、血中グルコースレベルの制御およびトリグリセリドの減少に有効であるという発見に基づく。
【００１０】
一局面において、本発明は、個体におけるインスリン非依存性糖尿病を処置するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、個体における、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、腹部肥満、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および代謝症候群のうちのいずれか１つ以上を処置するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。これらの障害のいずれかの処置は、インスリン非依存性糖尿病の処置に伴い得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、血中グルコースレベルを制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この個体はヒトであり、そして約７％、約８％、約９％、約１０％もしくはそれより上のＨｂＡ１ｃ値を有する。いくつかの実施形態において、個体における血中グルコースレベルは、低下し、そして概して正常範囲内に維持される。
【００１３】
別の局面において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、血中トリグリセリドレベルを制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、個体における血中トリグリセリドレベルは、低下し、そして概して正常範囲内に維持される。
【００１４】
別の局面において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、インスリン抵抗性を改善するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、個体における血中インスリンレベルは、低下し、そして概して正常範囲内に維持される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、体重を制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。本発明はまた、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、体重を維持するためか、または体重増加を防止するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、体重は、体脂肪含有量の減少に起因して制御または維持される。いくつかの実施形態において、個体における体重は、減少し、そして概して正常範囲内に維持される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、体脂肪含有量を制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、個体の除脂肪体重含有量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ  ｃｏｎｔｅｎｔ）は、概して処置の間維持される。
【００１７】
別の局面において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有するかまたはインスリン非依存性糖尿病の危険性のある個体において、食物摂取を制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、個体におけるインスリン非依存性糖尿病の発症を遅延させるための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態においては、この疾患の発症（例えば、前糖尿病状態からの糖尿病の発症）が遅延される。他の実施形態においては、糖尿病の進行（例えば、糖尿病合併症の発症）が遅延される。いくつかの実施形態においては、個体は、インスリン非依存性糖尿病の危険性を有する。いくつかの実施形態においては、個体におけるインスリン非依存性糖尿病の発症は、遅延されるかまたは防止される。いくつかの実施形態においては、個体におけるインスリン非依存性糖尿病に伴う合併症の発症が、遅延されるかまたは防止される。
【００１９】
本発明はまた、個体において、（肥満を管理することを含めて）肥満を処置するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記肥満は、レプチン耐性を伴う。いくつかの実施形態において、上記肥満は、インスリン非依存性糖尿病を伴う。いくつかの実施形態において、上記肥満は、ＮＴ−４／５耐性を伴う。
【００２０】
本発明はまた、個体において、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症および代謝症候群のうちのいずれか１つ以上を処置するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。これらの障害のいずれかの処置は、肥満の処置を伴い得る。
【００２１】
本発明はまた、個体において体重を制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。本発明はまた、個体において体重を維持するためかまたは体重増加を防止するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２２】
本発明はまた、個体において代謝速度を増加させるための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２３】
本発明はまた、個体において食物摂取を制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２４】
本発明はまた、個体における血中トリグリセリドレベルを制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２５】
本発明はまた、個体における血中グルコースレベルを制御するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２６】
本発明はまた、体重減少を必要とする個体において、体脂肪含有量を減少させるための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。この処置は、上記個体において、除脂肪体重含有量の有意な変化を生じなくともよい。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２７】
本発明はまた、個体において、肥満の発生を遅延させるための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態においては、肥満の発生が遅延される。他の実施形態においては、肥満の進行（例えば、肥満に伴う合併症の発症、ＢＭＩの増加）が遅延される。いくつかの実施形態において、個体における肥満の発生が防止される。いくつかの実施形態においては、個体における肥満に伴う合併症の発症が防止される。いくつかの実施形態においては、上記個体は、肥満の危険性を有するかまたは太り過ぎである。
【００２８】
本発明はまた、個体における代謝症候群を処置するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。本発明はまた、個体における代謝症候群の発症を遅延させる方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態においては、代謝症候群が防止される。いくつかの実施形態においては、上記個体は、代謝症候群の発症の危険性を有する。
【００２９】
本発明はまた、個体における骨減少を防止するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態においては、個体における骨密度が概ね維持される。いくつかの実施形態においては、上記個体は、骨粗鬆症である。
【００３０】
本発明はまた、個体における甲状腺ホルモンを減少させるための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、甲状腺機能亢進症を有する。
【００３１】
本明細書中で記載される方法のいずれかにおいて、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体とともに投与され得る。いくつかの実施形態において、抗体とともに投与することは、ＮＴ−４／５ポリペプチドの治療効力を増強する。いくつかの実施形態において、抗体とともに投与することは、その処置のために必要なＮＴ−４／５の有効量を減少させる。いくつかの実施形態において、抗体とともに投与することは、ＮＴ−４／５投与の頻度を低下させる。ＮＴ−４／５ポリペプチドと抗体とは、同時に、もしくは順次投与され得るか、または１つの共通の処方物で投与され得る。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドへの抗体の結合は、ＮＴ−４／５ポリペプチドのＴｒｋＢレセプターへの結合を顕著には妨害しない。
【００３２】
本明細書に記載されるＮＴ−４／５ポリペプチドの投与は、当該分野で公知の任意の手段による投与であり得る。この手段としては、非経口、静脈内、皮下、吸入を介して、動脈内、筋肉内、心臓内、脳室内、鞘内、腹腔内、および経皮が挙げられる
本明細書に記載される任意のＮＴ−４／５ポリペプチドは、上記の方法のいずれかのために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在するＮＴ−４／５である（本明細書において、交換可能に「ＮＴ−４／５」と称される）。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、成熟ヒトＮＴ−４／５（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、成熟ヒトＮＴ−４／５（配列番号１）の天然に存在する対立遺伝子改変体である。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換を有する、天然に存在するＮＴ−４／５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１つ以上のＰＥＧ分子に連結されている。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、ＮＴ−４／５ポリペプチドのＮ末端において１つ以上のＰＥＧ分子に連結されている。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、１位においてＰＥＧ分子に連結されている。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、５０位においてアミノ酸残基ＳがＣに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、５０位においてＰＥＧ分子に連結されている。
【００３３】
別の局面において、本発明はまた、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを含有する薬学的組成物を提供する。ここで、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、１つ以上のＰＥＧ分子に連結されている。いくつかの実施形態において、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在するＮＴ−４／５配列と比較する場合、１つ以上のアミノ酸置換を含み、そしてこの置換されたアミノ酸は、１つ以上のＰＥＧ分子に連結されている。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１位においてアミノ酸残基ＧがＳまたはＴに変更された、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、１位においてＰＲＧ分子に連結されている。いくつかの実施形態において、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、ここで、このＮＴ−４／５ポリペプチドは、置換された位置においてＰＥＧ分子に連結されている（例えば、Ｃに変更された５０位のＳ）。
【００３４】
別の局面において、本発明は、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドとこのＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、このＮＴ−４／５ポリペプチドと抗体とは、所定の比率で存在する。いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドへのこの抗体の結合は、ＴｒｋＢレセプターへのＮＴ−４／５ポリペプチドの結合を顕著には妨害しない。
【００３５】
別の局面において、本発明は、本明細書において記載される方法のいずれかにおいて使用するためのＮＴ−４／５ポリペプチドを備える、キットを提供する。いくつかの実施形態において、このキットは、容器、本明細書において記載されるＮＴ−４／５ポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有する組成物、および本明細書において記載される方法のいずれかにおいてこの組成物を使用するための使用説明書を備える。このキットは、ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体、およびＮＴ−４／５ポリペプチドとともに抗体を投与するための使用説明書をさらに備え得る。
【００３６】
本明細書において記載される方法は、一般的に、上記処置を必要とする個体を処置するための方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、治療有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドの投与が、肥満およびインスリン非依存性糖尿病を処置するために使用され得るという発見に基づく。
【００３８】
（一般的技術）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学の従来技術（組換え技術を含む）、微生物学の従来技術、細胞生物学の従来技術、生化学の従来技術、および免疫学の従来技術を利用する。このような技術は、文献において十分に説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５））。
【００３９】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、有益な臨床結果または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明のためには、有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、疾患に関連する１つ以上の症状の改善、その症状の重篤度の軽減、その症状の緩和のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、インスリン非依存性糖尿病について、有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、血中グルコースの改善、血中脂質の制御、および／またはインスリン抵抗性のうちのいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態において、有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、インスリン非依存性糖尿病に関連する障害（例えば、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、高インスリン血症、肥満、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、代謝症候群、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性微小血管症、ならびに公知である他の関連疾患および本明細書中に記載される他の関連疾患）のうちのいずれかの改善、その障害の重篤度の軽減、および／またはその障害の緩和があげられ得る。肥満について、有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、体重の低減もしくは維持；食物摂取もしくはカロリー摂取の制御（低減を含む）；代謝率の増加もしくは代謝率低減の阻止；ならびに肥満に関連する障害（例えば、肥満、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、腹部肥満、節食障害、代謝症候群、高血圧、変形性関節症、心筋梗塞、脳卒中、ならびに公知の他の関連疾患および本明細書中に記載される他の関連疾患）のうちのいずれかの改善、その障害の重篤度の軽減、および／またはその障害の緩和；肥満罹患者の生活の質の増大、および／または寿命の延長が挙げられる。
【００４０】
「有効量」とは、有益な臨床結果または望ましい臨床結果（疾患に関連する１つ以上の症状の改善、緩和、および／または低減を含む）をもたらすために十分な量である。インスリン非依存性糖尿病を処置するために、有効量のＮＴ−４／５とは、インスリン非依存性糖尿病に関連する１つ以上の症状を処置または緩和するために十分な量である。「有効量」とは、血中グルコースレベルおよび／もしくは血中脂質レベルの低減；高インスリン血症の低減；インスリン抵抗性の改善；肥満の改善、および／または食物摂取関連糖尿病の制御のうちの１つ以上（これはまた、本発明の種々の実施形態に対応し得る）をもたらすために十分な量である。肥満を処置するために、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドとは、肥満に関連する１つ以上の症状を処置または緩和するために十分な量である。「有効量」とは、体重の低減、食物摂取の制御、代謝率の増加、肥満に関連する疾患から生じる１つ以上の症状の低減、肥満罹患者の生活の質の増大、および／または寿命の延長のうちの１つ以上（これはまた、本発明の種々の実施形態に対応し得る）をもたらすために十分な量である。有効量とは、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と組み合わせて達成されても、そうではなくてもよい。従って、「有効量」とは、１種以上の治療剤を投与する状況で考慮され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と組み合わせた場合に望ましい結果が達成され得るかまたは達成される場合には、有効量で投与されるとみなされ得る。「有効量」は、１回以上の投与で与えられ得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、ＩＩ型糖尿病の発症を「遅延させる」とは、この疾患の発症を延期すること、妨害すること、遅延すること、遅らせること、安定化すること、および／または順延することを意味する。この遅延は、処置される疾患および／または個体の歴史に依存して、種々の長さの時間であり得る。当業者にとって明らかであるように、十分な遅延または顕著な遅延とは、実際には、その個体がその疾患を発症しないという点で、予防を包含し得る。
【００４２】
ＩＩ型糖尿病の「発症」とは、個体における疾患（これは、本発明の種々の実施形態であり得る）の開始および／または進行を意味する。ＩＩ型糖尿病の発症は、本明細書中に記載される標準的な臨床技術を使用して検出可能であり得る。しかし、発症はまた、最初は検出不能であり得る疾患進行も指す。本発明のためには、進行とは、その疾患状態の生物学的経過（この場合、血中グルコースレベル、血中脂質レベル、血中インスリンレベル、グルコース負荷試験、Ｈｂ−Ａ１ｃレベルを試験することによって決定される）、ならびに糖尿病合併症（例えば、心血管疾患、腎症、網膜症、および／または神経障害）の開始および／または悪化を指す。種々のこれらの診断試験としては、血圧、休止心電図および運動心電図（ＥＫＧ）、心エコー図、血管心臓造影図、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニンレベル、尿検査、腎生検、糸球体濾過率（ＧＦＲ）、検眼鏡検査、感覚神経伝達速度および運動神経伝達速度、ならびに末梢神経生検が挙げられるが、これらに限定されない。「発症」とは、出現、再発、および開始を包含する。本明細書中で使用される場合、ＩＩ型糖尿病の「開始」または「出現」とは、初期開始および／または再発を包含する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、ＩＩ型糖尿病の発症の「危険がある」個体とは、検出可能な疾患を有しても有さなくてもよく、そして本明細書中に記載される処置方法の前に、検出可能な疾患を示していても示していなくてもよい。「危険がある」とは、個体が１つ以上のいわゆる危険因子（ＩＩ型糖尿病の発症と相関する測定可能なパラメーターである）を有することを示す。これらの１つ以上の危険因子を有する個体は、これらの危険因子を有さない個体よりも高いＩＩ型糖尿病を発症する可能性を有する。これらの危険因子としては、年齢、食餌、身体活動不全、代謝症候群、肥満、肥満の家族歴および／または糖尿病の家族歴、人種（例えば、ピマインディアン、アメリカ黒人、およびヒスパニックは、危険性が高い）、遺伝性症候群（例えば、若年者の成人発症型糖尿病、ＭＯＤＹ）、以前の疾患の病歴（例えば、女性について妊娠糖尿病の病歴）、疾患の前兆の存在（すなわち、糖尿病前症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
用語「代謝症候群」（症候群Ｘとしても公知である）とは、ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（ＡＴＰ−ＩＩＩ），Ｅ．Ｓ．Ｆｏｒｄら、ＪＡＭＡ，ｖｏｌ．２８７（３），Ｊａｎ．１６，２００２，ｐｐ．３５６３５９において規定される。簡単に述べると、人は、その人が以下の障害：異常な肥満、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール、高血圧、および高い空腹時血漿グルコース、のうちの３つ以上を有する場合に、代謝症候群を有すると規定される。これらについての基準は、ＡＴＰ−ＩＩＩにおいて、以下のように規定される：男性について４０インチよりも大きなウエスト周囲長または女性について３５インチよりも大きなウエスト周囲長によって測定される場合、異常な肥満：１５０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血中トリグリセリド；男性について４０ｍｇ／ｄＬ未満または女性について５０ｍｇ／ｄＬ未満の血中ＨＤＬコレステロール；１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；１１０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時グルコース。
【００４５】
代謝症候群の処置とは、有益な臨床結果または望ましい臨床結果を得るために代謝症候群を有する被験体に対して、本明細書中に記載されるＮＴ−４／５ポリペプチドを投与することを指す。本発明のためには、有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、その疾患に関連する１つ以上の症状の改善、その症状の重篤度の軽減、その症状の緩和のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、代謝症候群の処置について、有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、異常な肥満、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、血圧、および空腹時グルコースレベルのうちのいずれか１つ以上を低減させることが挙げられる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、代謝症候群の発症を「遅延させる」とは、この疾患の発症を延期すること、妨害すること、遅延すること、遅らせること、安定化すること、および／または順延することを意味する。この遅延は、処置される疾患および／または個体の歴史に依存して、種々の長さの時間であり得る。当業者にとって明らかであるように、十分な遅延または有意な遅延は、実際には、その個体がその疾患を発症しないという点で、予防を包含し得る。
【００４７】
代謝症候群の「発症」とは、個体におけるその疾患の発症および／または進行（本発明の種々の実施形態であり得る）を意味する。代謝症候群の発症は、当該分野で公知である標準的臨床技術および本明細書中に記載される標準的臨床技術を使用して、検出可能であり得る。しかし、発症はまた、最初は検出不能であり得る疾患進行も指す。本発明のためには、進行とは、その疾患状態の生物学的経過（この場合、腹囲を測定すること、トリグリセリド、ＨＤＬ、血圧、血中グルコース、グルコース負荷試験、Ｈｂ−Ａ１ｃレベルを試験すること、ならびに代謝症候群の合併症（例えば、心血管疾患および糖尿病）の開始および／または悪化によって決定される）を指す。「発症」とは、発生、再発、および開始を包含する。本明細書中で使用される場合、代謝症候群の「開始」または「発生」とは、初期の開始および／または再発を包含する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、代謝症候群を発症する「危険がある」個体は、検出可能な疾患を有しても有してなくてもよく、本明細書中に記載される処置方法の前に、検出可能な疾患を示しても示さなくてもよい。例えば、その個体は、代謝症候群を規定する２種以下の障害を有し得るか、または全く障害を有さないかもしれない。「危険がある」とは、個体が、１つ以上のいわゆる危険因子（代謝症候群の発症と相関する測定可能なパラメーターである）を有することを示す。これらの１つ以上の危険因子を有する個体は、これらの危険因子を有さない個体よりも代謝症候群の可能性が高い。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「血中グルコースレベルを制御する」または「血中グルコースレベルの改善」とは、個体における血中グルコースレベルを（処置前のレベルと比較して）低減させることを指す。いくつかの実施形態において、血中グルコースレベルは、一般的には、正常範囲内で維持される。いくつかの実施形態において、その血中グルコースレベルは、処置前のレベルと比較して、その個体において少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％のいずれかだけ低減される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「血中脂質レベルを制御する」または「血中脂質レベルの改善」とは、個体における血中脂質レベル（例えば、血中トリグリセリドレベル、コレステロールレベル、および／または非エステル化脂肪酸レベル）を（処置前のレベルと比較して）低減させることを指す。いくつかの実施形態において、血中脂質レベル（例えば、血中トリグリセリドレベル、コレステロールレベル、および／または非エステル化脂肪酸レベル）は、一般的には、正常範囲内で維持される。いくつかの実施形態において、その血中トリグリセリドレベルは、処置前のレベルと比較して、その個体において少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％のいずれかだけ低減される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「インスリン抵抗性」とは、健常人と同じレベルのインスリン活性を示すために必要なインスリンレベルが、その健常人のインスリンレベルよりもかなり高い状態を指す。すなわち、この用語は、インスリンの活性またはインスリンについての感受性が低減した状態を意味する。インスリン活性についての標的器官としては、肝臓、筋（骨格筋）、および脂肪組織が挙げられる。インスリンは、肝臓において、糖新生抑制活性、グルコース放出抑制活性などを示す。インスリンは、筋（骨格筋）および脂肪組織において、グルコース取込み促進活性を示す。ＧＬＵＴ４と呼ばれるグルコース輸送キャリアが、細胞質から細胞膜表面へとトランスロケートすることが、グルコース取込みに関与する。これらの活性は、インスリン抵抗性を評価するために測定され得る。インスリン抵抗性の臨床評価としては、例えば、グルコース負荷試験、オイグリセミック高インスリン血症クランプ法（または短く「グルコースクランプ」）、ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ，参考文献Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３：５７〜６３，２０００）などが挙げられる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「インスリン抵抗性を改善する」とは、インスリンに対する細胞の低下した感受性（例えば、低下した感受性は、末梢組織中へのグルコース取込み、糖原分解の増強、糖新生の増強など（これらはすべて、ＩＩ型糖尿病において観察される）の一種以上の低減として現れる）を（部分的にか完全にか）逆転することを指す。そのような改善のために、血中インスリンレベルが、低減され、（そして血中グルコースレベルが、低減され得る）。改善されたインスリン抵抗性は、グルコース負荷試験、グルコースクランプ、またはＨＯＭＡによって評価され得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「体重を制御する」または「体重の改善」とは、個体において体重を（処置前のレベルと比較して）低減させることを指す。いくつかの実施形態において、体重は、一般的には、正常な範囲内で維持される。体重は、カロリー摂取を低減することおよび／または体脂肪蓄積を低減することによって、低減され得る。いくつかの実施形態において、体重は、処置前のレベルと比較して、その個体において少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％のいずれかだけ低減される。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「食物摂取を制御する」とは、個体における食物摂取を（処置前のレベルと比較して）低減させることを指す。いくつかの実施形態において、その食物摂取は、一般的には、正常な範囲内で維持される。いくつかの実施形態において、食物摂取は、処置前のレベルと比較して、その個体において約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％または約６０％のいずれかだけ低減される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「肥満」とは、被験体において過剰な体脂肪が存在する状態である。肥満は、遺伝的原因であれ環境的原因であれ、何らかの原因に起因し得る。肥満の操作上の定義は、ボディマス指数（ＢＭＩ）（これは、体重を身長（ｍ）の平方で除算したものとして算出される）（ｋｇ／ｍ２）に基づく。「肥満」とは、それ以外は健康な被験体が、３０．０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する状態、または少なくとも１つの共存症を有する被験体が２７．０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する状態を指す。「肥満している被験体」とは、３０．０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する以外は健康な被験体、または２７．０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する少なくとも１つの共存症を有する被験体である。肥満している被験体は、３１．０、３２．０、３３．０、３４．０、３５．０、３６．０、３７．０、３８．０、３９．０および４０．０のうちのいずれか少なくとも１つであるＢＭＩを有し得る。「過体重被験体」とは、２５．０ｋｇ／ｍ２〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する被験体である。
【００５６】
種々の国が、異なるＢＭＩを用いて肥満および過体重を規定し得る。用語「肥満」とは、すべての国における規定を包含する。例えば、肥満に関連する危険増加が、アジアでは比較的低いボディマス指数（ＢＭＩ）にて生じる。アジアの国（日本を含む）においては、「肥満」とは、少なくとも１つの肥満誘発性共存症または肥満関連性共存症（これは、体重低減を必要とするかまたは体重低減によって改善される）を有する被験体が、２５．０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する状態を指す。アジアの国（日本を含む）においては、「肥満している被験体」とは、２５．０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、少なくとも１つの肥満誘発性共存症または肥満関連性共存症（これは、体重低減を必要とするかまたは体重低減によって改善される）を有する被験体を指す。
【００５７】
肥満誘発性共存症または肥満関連性共存症としては、糖尿病、インスリン非依存性（ＩＩ型）糖尿病、グルコース寛容減損、空腹時グルコース減損、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症、高血圧、高尿酸血症、痛風、冠状動脈疾患、心筋梗塞、狭心症、睡眠時無呼吸症候群、ピックウィック症候群、脂肪肝、脳梗塞、脳血栓症、一過性脳虚血発作、整形外科的障害、慢性関節リウマチ、腰痛症、月経異常、および不妊症が挙げられるが、これらに限定されない。特に、共存症としては、高血圧、高脂血症、異脂肪血症、グルコース不耐、心血管疾患、睡眠時無呼吸、真性糖尿病、および他の肥満関連状態が挙げられる。
【００５８】
肥満の「危険がある」個体は、検出可能な疾患を有していても有さなくてもよく、そして本明細書中に記載される処置方法の前に検出可能な疾患を示していても示していなくてもよい。「危険」とは、１つ以上のいわゆる危険因子（これは、肥満の発症と相関する測定可能なパラメーターである）を個体が有することを指す。これらの１つ以上の危険因子を有する個体は、これらの危険因子を有さない個体よりも肥満の可能性が高い。これらの危険因子としては、年齢、食餌、身体活動不全、代謝症候群、肥満の家族歴、人種、遺伝性症候群、以前の疾患の病歴（例えば、節食障害、代謝症候群、および肥満）、疾患の前兆の存在（すなわち、過体重）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２５．０ｋｇ／ｍ２から３０．０ｋｇ／ｍ２未満のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する以外は健康な個体、または２５．０ｋｇ／ｍ２から２７．０ｋｇ／ｍ２未満のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する少なくとも１つの共存症を有する個体は、肥満の危険がある。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、肥満の発症を「遅延させる」とは、この疾患の発症を延期すること、妨害すること、遅延すること、遅らせること、安定化すること、および／または順延することを意味する。この遅延は、処置される疾患および／または個体の歴史に依存して、種々の長さの時間であり得る。当業者にとって明らかであるように、十分な遅延または顕著な遅延とは、実際には、その個体がその疾患を発症しないという点で、予防を包含し得る。例えば、発症を遅延させることの１つの結果は、肥満の危険がある被験体の体重を、本明細書中に記載されるポリペプチドまたは組成物の投与の直前のその被験体の体重と比較して低減させることであり得る。発症を遅延させることの別の結果は、食餌、運動、または薬物療法の結果として以前に失った体重を回復するのを予防することであり得る。発症を遅延させることの別の結果は、肥満の危険がある被験体における肥満の発症の前に処置が施される場合に、肥満が発生するのを防ぐことであり得る。発症を遅延させることの別の結果は、肥満の危険がある被験体における肥満の発症の前に処置が施される場合に、肥満関連性障害の発生および／またはその障害の重篤度を低減させることであり得る。
【００６０】
肥満の「発症」とは、個体における疾患の開始および／または進行（本発明の種々の実施形態であり得る）を意味する。肥満の発症とは、本明細書中に記載される標準的臨床技術を使用して検出可能であり得る。しかし、発症はまた、最初は検出不能であり得る疾患の進行も指す。本発明のためには、進行とは、疾患状態の生物学的経過（この場合には、ＢＭＩを評価するため、胴囲を測定することため、共存症を評価するため、ならびに肥満合併症（例えば、細小動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群、心血管疾患、変形性関節症、皮膚障害、高血圧、インスリン抵抗性、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、および胆石症）の開始および／または悪化を評価するために、身長および体重を評価することによって決定される）を指す。これらの種々の診断試験は、当該分野で公知である。「発症」とは、発生、再発、および開始を包含する。本明細書中で使用される場合、肥満の「開始」または「発生」とは、初期開始および／または再発を包含する。
【００６１】
「個体」または「被験体」とは、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜動物、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有する個体とは、その個体のゲノム上の少なくとも１つのＢＤＮＦ遺伝子座において変異を有する個体であって、その変異が、同じ種の集団中のその変異を有さない集団の平均レベルよりも低いレベルのＢＤＮＦ（例えば、視床下部におけるＢＤＮＦ転写物）の発現または生物学的活性を生じる、個体を指す。より低いレベルのＢＤＮＦの発現または生物学的活性は、より低いレベルのＢＤＮＦの発現または生物学的活性に関連する他の表現型（例えば、精神遅滞、記憶障害、および／または学習欠損）によって評価され得る。いくつかの実施形態において、その変異を有する個体におけるＢＤＮＦ発現またはＢＤＮＦ活性のレベルは、同じ種の平均のレベルまたは活性の約３０％未満、約４０％未満、約４５％未満、約５０％未満、約５５％未満、約６０％未満、約７０％未満のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、ＢＤＮＦの発現レベルまたは生物学的活性は、約５０％未満である。いくつかの実施形態において、その個体は、たった１つしか機能的ＢＤＮＦ対立遺伝子を有さない。いくつかの実施形態において、その個体は、マウスである。いくつかの実施形態において、その個体はヒトではない。いくつかの実施形態において、その個体は、その個体のゲノム上のＢＤＮＦ遺伝子座における変異によって引き起こされる肥満を有する。
【００６３】
「抗体」とは、免疫グロブリン分子であって、標的（例えば、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に対して、その免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を解して特異的に結合可能な、免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するのみならず、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ））；それらの変異体；抗体部分を含む融合タンパク質；および抗原認識部位を含むその免疫グロブリン分子の他の任意の改変型構成をも包含する。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス））の抗体を包含し、その抗体は、特定の何らかのクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、種々のクラスに割り当てられ得る。５つの大きな免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）が存在する。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）へと分割され得る。その種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造は、周知である。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうではないと示されない限りは、複数の言及物を包含することが、留意されるべきである。
【００６５】
（発明の方法）
いくつかの実施形態において、本発明は、個体におけるインスリン非依存性糖尿病を処置するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００６６】
インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病とも呼ばれる）は、インスリン抵抗性に関連する。インスリン非依存性糖尿病についての診断方法は、当該分野で周知である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体における高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、腹部肥満、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および代謝症候群のうちの１つ以上のいずれかを処置するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。これらの障害のうちのいずれかの処置は、インスリン非依存性糖尿病の処置に関連し得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有する個体またはインスリン非依存性糖尿病の危険がある個体において、血中グルコースレベルを制御するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有する個体またはインスリン非依存性糖尿病の危険がある個体において、血中トリグリセリドレベルを制御するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有する個体またはインスリン非依存性糖尿病の危険がある個体において、インスリン抵抗性を改善するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有する個体またはインスリン非依存性糖尿病の危険がある個体において、体重を制御するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本発明は、インスリン非依存性糖尿病を有する個体またはインスリン非依存性糖尿病の危険がある個体において、食物摂取を制御するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体においてインスリン非依存性糖尿病の発症を遅延させるための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その個体は、インスリン非依存性糖尿病の危険がある。正常な血中グルコースレベルを有するが異常に高い血中インスリンレベルを有する個体、または高い正常な範囲内の血中グルコースレベルまたは高くなる傾向があるグルコースレベルを有する個体が、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドで処置されて糖尿病の開始が遅延され得る。糖尿病合併症もまた、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドの投与によって遅延され得る。いくつかの実施形態において、上記個体におけるインスリン非依存性糖尿病の発症が、予防される。いくつかの実施形態において、上記個体におけるインスリン非依存性糖尿病に関連する合併症の発症が、予防される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、個体における肥満を処置するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。従って、その肥満は、遺伝的であろうと（ＢＤＮＦの遺伝的欠損によって引き起こされる以外）環境的であろうと、何らかの原因に起因し得る。いくつかの実施形態において、その肥満は、レプチン抵抗性に関連する。いくつかの実施形態において、その肥満は、インスリン非依存性糖尿病に関連する。いくつかの実施形態において、その肥満は、ＮＴ−４／５抵抗性に関連する。肥満の処置としては、処置後に体重が低減してもはや肥満ではない個体を処置することを包含する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、個体において高血糖、低グルコース寛容、インスリン抵抗性、腹部肥満、脂質障害、異脂肪血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および代謝症候群のうちの１つ以上のいずれかを処置するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。これらの障害のうちのいずれかの処置は、肥満の処置に関連し得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、個体において、体重を制御するため、食物摂取を制御するため、代謝率を増加するため、血中グルコースレベルを制御するため、トリグリセリドレベルを制御するため、または体脂肪量を低減するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満である。いくつかの実施形態において、上記個体は、ＢＤＮＦの遺伝的欠損を有さない。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険があるか、または過体重である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、個体において肥満の発症を遅延させるための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その肥満の開始は、遅延される。他の実施形態において、その肥満の進行（例えば、肥満関連合併症の発症、ＢＭＩの増加）が、遅延される。いくつかの実施形態において、上記個体は、肥満の危険があるか、または過体重である。いくつかの実施形態において、上記個体における肥満の発症は、予防される。いくつかの実施形態において、上記個体における肥満に関連する合併症の発症が、予防される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、個体において代謝症候群を処置するための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。本発明はまた、個体において代謝症候群の発症を遅延させるための方法を提供し、この方法は、その個体に、有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その代謝症候群は、予防される。いくつかの実施形態において、その個体は、代謝症候群を発症する危険がある。
【００７９】
本発明はまた、個体において骨減少を予防するための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態においては、上記個体における骨密度が概ね維持される。いくつかの実施形態においては、上記個体は、骨粗鬆症である。
【００８０】
本発明はまた、個体において甲状腺ホルモンを低減させるための方法を提供する。この方法は、上記個体に有効量のＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記個体は、甲状腺機能亢進症を有する。
【００８１】
本明細書中で記載される方法のいずれかにおいて、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、そのＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドに対する上記抗体の結合は、ＴｒｋＢレセプターに対するそのＮＴ−４／５ポリペプチドの結合を一般的には妨害しない。例えば、上記抗体の存在下における上記ＴｒｋＢレセプターに対する上記ＮＴ−４／５ポリペプチドの結合は、上記抗体の非存在下における結合の約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、および約５０％未満のいずれかだけ低減され得る。いくつかの実施形態において、上記抗体は、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドに対する結合についてＴｒｋＢレセプターと競合するが、そのＴｒｋＢレセプターに対するそのＮＴ−４／５ポリペプチドの結合は、その抗体によって一般的には妨害されない。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、組み合わせた投与とはまた、共処方物（すなわち、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドと上記抗体とが同じ組成物中に存在する（組み合わされている）としての投与、および／または別個の組成物としての投与を包含する。「組み合わせた投与」とは、ＮＴ−４／５ポリペプチドと、そのＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体とが、個体に対して有効量で投与される任意の状況を包含することを意味する。上記ＮＴ−４／５ポリペプチドと上記抗体とは、種々の投与頻度および／または投与間隔にて投与され得ることが、理解される。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、毎日１回〜毎週１回投与され得、一方、上記抗体は、それよりも少ない頻度で投与され得る。上記ＮＴ−４／５ポリペプチドと上記抗体とは、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与され得ること、および種々の投与レジメンが、投与過程を変化させ得ることが、理解される。投与は、肥満の開始前、インスリン非依存性糖尿病の開始前、および／または他の関連疾患の開始前であり得る。
【００８３】
用語「同時投与」とは、本明細書中で使用される場合、上記抗体と上記ＮＴ−４／５ポリペプチドとが、約１５分間以下（例えば、約１０分間以下）の時間間隔で投与されることを意味する。同時投与される場合、上記抗体と上記ＮＴ−４／５ポリペプチドとは、同じ投与（例えば、ニューロトロフィン抗体およびニューロトロフィンの両方を含む、単位投与形態）中、または別個の投与（例えば、上記抗体が、ある投与形態中に含まれ、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、別の投与形態中に含まれる）中に含まれ得る。
【００８４】
一実施形態において、上記抗体と上記ＮＴ−４／５ポリペプチドとは、単一分子中に存在する。例えば、抗体部分とＮＴ−４／５ポリペプチド部分とを含むキメラ融合タンパク質が、作製され得、その抗体部分は、そのキメラタンパク質のＮＴ−４／５ポリペプチド部分に結合しかつ安定化し得る様式である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、上記抗体と上記ＮＴ−４／５ポリペプチドとは、所定の比にて投与される。従って、いくつかの実施形態において、上記抗体と上記ＮＴ−４／５ポリペプチドとの重量比は、約１：１である。いくつかの実施形態において、この比は、約０．００１〜約１と、約１〜約１０００との間であり得、約０．０１〜約１と、約１〜約１００との間であり得、または約０．１〜約１と、約１〜約１０との間であり得る。他の比が、企図される。
【００８６】
ＮＴ−４／５ポリペプチド処置の効力は、ＮＴ−４／５ポリペプチド処置の少なくとも一局面が（上記抗体を同時投与することがないＮＴ−４／５ポリペプチド処置と比較して）改善される場合に、増強され得る。この改善は、ＮＴ−４／５ポリペプチド処置の頻度低減、ＮＴ−４／５ポリペプチドの投与量低減、または処置されるべき疾患に関連する１つ以上の症状のより優れた軽減において反映され得る。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドによる糖尿病の処置または予防は、抗ＮＴ−４／５ポリペプチド抗体の同時投与が、より優れた軽減を可能にする場合（例えば、糖尿病の１つ以上の症状が、ＮＴ−４／５ポリペプチド単独の投与よりも抗体とＮＴ−４／５ポリペプチドとの同時投与によっての方が良好に軽減される場合）に、抗ＮＴ−４／５ポリペプチド抗体の同時投与によって増強される。上記抗体はまた、ＮＴ−４／５ポリペプチド投与によって引き起こされる１つ以上の副作用を低減し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドの通常用量を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％以上低減させるのを可能にするのに十分な抗体が、投与される。この低減は、処置の投与における投与量および／または所定の期間の間の投与量（頻度低減）に関して反映され得る。
【００８７】
上記の実施形態のうちのいずれかにおいて、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在する成熟ＮＴ−４／５（例えば、ヒト成熟ＮＴ−４／５）、天然に存在する成熟ＮＴ−４／５の任意のポリペプチドフラグメント、または本明細書中に記載されるそれらの改変形態であり得る。
【００８８】
ＮＴ−４／５ポリペプチドの種々の処方物が、投与のために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、そのまま投与され得る。他の実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドと、薬学的に受容可能な賦形剤とが、投与される。これらは、種々の処方物中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤は、当該分野で公知であり、これらは、薬学的に有効な物質の投与を促進する、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、所定の形態もしくは所定の粘稠度であり得るか、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤、および乳化剤、容量オスモル濃度を変化させるための塩、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。非経口薬物送達および経口薬物送達のための賦形剤および処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において示される。
【００８９】
一般的には、これらの薬剤は、注射によって（例えば、腹腔内注射によって、静脈内注射によって、皮下注射によって、筋肉内注射によってなど）投与されるために処方されるが、他の投与形態（例えば、経口投与、粘膜投与、経皮投与、吸入など）もまた、使用され得る。投与は、全身投与（例えば、静脈内投与および腹腔内投与）であっても、局所投与であってもよい。従って、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、好ましくは、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液など）と組み合わされる。
【００９０】
種々の方法が、脳へのＮＴ−４／５ポリペプチドの送達を促進するために使用され得る。これらの方法としては、（ａ）神経外科ベースの方法（脳室内薬物注入、血液脳関門（ＢＢＢ）の高浸透圧開放）；（ｂ）薬理学ベースの方法（ペプチド脂質化、リポソーム）；および（ｃ）生理学ベースの方法（ＢＢＢの生化学的開放、化学ペプチド）が挙げられる。キメラペプチドが、ＮＴ−４／５ポリペプチドを、ＢＢＢを介する吸収媒介性トランスサイトーシスまたはレセプター媒介性トランスサイトーシスを受ける脳輸送ベクターに共有結合することによって形成され得る。例えば、脳輸送ベクターは、トランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体であり得る。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．７１：３〜１０（１９９２）を参照のこと。
【００９１】
特定の投与レジメン（すなわち、用量、時期、および反復）は、特定の個体およびその個体の医学的病歴に依存する。一般的には、以下の用量のうちのいずれかが、使用され得る：少なくとも約５０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約２０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約３ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約２ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約７５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約２５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１μｇ／体重ｋｇ；またはそれ以上の用量が、投与される。経験的考慮事項（例えば、半減期）が、一般的には、その投与量の決定に貢献する。数日間以上にわたる反復投与（その状態に依存する）について、その処置は、疾患症状の望ましい抑制が生じるまで、または十分な治療レベルが達成されるまで、持続される。例えば、１週間に１回〜５回の投与が、企図される。他の投与レジメンとしては、１日当たり１回までのレジメン、１週間当たり１回〜５回、またはそれよりも少ない頻度が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１週間当たり約１回、１ヶ月当たり約１回〜約４回投与される。２日間〜７日間までまたは１４日間さえもの間隔が空く時差式投与を含む断続的投与レジメンが、使用され得る。いくつかの実施形態において、処置は、１日１回の投与で開始し得、その後、毎週１回の投与へ（毎月１回の投与へさえ）変化し得る。この治療の進行は、従来技術および従来アッセイによって容易にモニターされ得る。
【００９２】
いくつかの個体において、１回よりも多い投与が、必要とされ得る。投与頻度は、治療経過の間に決定され得そして調整され得る。例えば、投与頻度は、処置されるべき疾患（例え場、肥満およびインスリン非依存性糖尿病）の型および重篤度、薬剤が予防目的のために投与されるのかまたは治療目的のために投与されるのか、以前の治療、患者の臨床病歴およびその薬剤に対するその患者の応答、ならびに主治医の判断に基づいて、決定または調整され得る。代表的には、臨床医は、望ましい結果を達成する投与量に達するまで、ＮＴ−４／５ポリペプチドを投与する。いくつかの場合には、ＮＴ−４／５ポリペプチドの連続的持続性放出処方物が、適切であり得る。持続性放出を達成するための種々の処方物およびデバイスが、当該分野で公知である。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、持続性放出または徐放のための機械ポンプを介してまたはマトリックス床に包埋されて投与され得る。
【００９３】
一実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドについての投与量は、１回以上投与を与えられた個体において経験的に決定され得る。個体は、漸増投与量のＮＴ−４／５ポリペプチドを与えられる。ＮＴ−４／５ポリペプチドの効力を評価するために、その疾患状態のマーカーが、モニターされ得る。そのようなマーカーの例は、血中グルコースレベル、血中脂質レベル（例えば、トリグリセリドまたはコレステロール）、インスリン抵抗性、体重、および食物摂取である。その投与量は、その個体、その疾患（例えば、肥満および糖尿病）の状態、ならびに過去の処置および使用されている現在の処置に依存して変化することが、当業者にとって明らかである。
【００９４】
本発明の方法に従うＮＴ−４／５ポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、その投与の目的が治療目的であるかまたは予防目的であるか、および熟練した実施者にとって公知である他の要因に依存して、連続的であっても断続的であってもよい。ＮＴ−４／５ポリペプチドの投与は、所定の期間にわたって基本的に連続的であってもよいし、または間隔を空けた一連の投与であってもよい。
【００９５】
他の処方物は、当該分野で公知の適切な送達形態（キャリア（例えば、リポソーム）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３〜８５９を参照のこと。リポソーム調製物としては、サイトフェクチン、多重膜リポソーム、および単膜リポソームが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
発現ベクターが、脳（例えば、視床下部）におけるＮＴ−４／５ポリペプチドの発現を指向させるために使用され得る。当業者は、インビボでの外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照のこと。発現ベクターの投与としては、局所投与または全身投与（注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与を含む）および局所投与が挙げられる。別の実施形態において、その発現ベクターは、骨格筋または皮下空間へと直接投与される。
【００９７】
発現ベクターを含む治療組成物またはサブゲノムポリペプチドを含む治療組成物の標的化送達もまた、使用され得る。レセプター媒介性ＤＮＡ送達技術が、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８において記載されている。ポリペプチドを含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおいて、局所投与のために、約１００ｎｇ  ＤＮＡ〜約２００ｍｇ  ＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡという濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコルの間に使用され得る。上記治療ポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。その遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源であっても非ウイルス起源であってもよい（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。そのようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。そのコード配列の発現は、構成的であるかまたは調節されるかのいずれかであり得る。
【００９８】
望ましいポリヌクレオチドの送達および望ましい細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野で周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＷＯ  ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号および米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０  ３４５  ２４２号を参照のこと）、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））ベースのベクター、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／１２６４９、ＷＯ  ９３／０３７６９；ＷＯ  ９３／１９１９１；ＷＯ  ９４／２８９３８；ＷＯ  ９５／１１９８４およびＷＯ  ９５／００６５５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されるような死滅したアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた、使用され得る。
【００９９】
非ウイルス性送達ビヒクルおよび非ウイルス性方法もまた、使用され得る。その方法としては、死滅したアデノウイルス単独に連結されたポリカチオン性縮合ＤＮＡまたは死滅したアデノウイルス単独に連結されていないポリカチオン性縮合ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンド連結型ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／０７９９４；ＷＯ  ９６／１７０７２；ＷＯ  ９５／３０７６３；およびＷＯ  ９７／４２３３８を参照のこと）、ならびに核電荷中和、または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームが、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／１３７９６；ＷＯ  ９４／２３６９７；ＷＯ  ９１／１４４４５およびＥＰ  ０５２４９６８に記載されている。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
【０１００】
疾患の評価は、当該分野で公知の標準的方法を使用して、例えば、適切なマーカー（例えば、血中グルコース、脂質、インスリンレベル、および体重）をモニターすることによって、実施される。
【０１０１】
（組成物およびその組成物の作製方法）
本発明の方法において使用される組成物は、ＮＴ−４／５ポリペプチドまたはＮＴ−４／５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、「ＮＴ−４／５ポリペプチド」とは、天然に存在する成熟タンパク質（互換可能に「ＮＴ−４／５」と呼ばれる）（例えば、以下の表１および米国特許出願公開番号２００３０２０３３８３の図１において示される、成熟ヒトＮＴ−４／５）ならびにＮＴ−４／５の天然に存在するアミノ酸配列改変体；ＮＴ−４／５のアミノ酸配列改変体；成熟ＮＴ−４／５（例えば、成熟ヒトＮＴ−４／５）のペプチドフラグメントおよびそのアミノ酸配列改変体；ならびに成熟ＮＴ−４／５の改変形態およびそのアミノ酸配列改変体、ならびにそのポリペプチドまたはペプチドが天然に存在するアミノ酸以外の部分による置換によって共有結合改変されているペプチドフラグメントを包含し、但し、上記アミノ酸配列改変体、ペプチドフラグメント、およびその改変形態は、天然に存在する成熟ＮＴ−４／５タンパク質の１つ以上の生物学的活性を示す。上記ＮＴ−４／５ポリペプチドはまた、本明細書中に記載されるＮＴ−４／５ポリペプチドの実施形態のうちのいずれかを含む、融合タンパク質および結合体（例えば、半減期延長部分（例えば、ＰＥＧまたはペプチド）に結合体化もしくは融合された、ＮＴ−４／５ポリペプチド）を包含する。考慮中の上記アミノ酸改変体、ペプチドフラグメント（改変体のフラグメントを含む）、またはそれらの改変形態は、いかなる動物種のＮＧＦも、ＢＤＮＦも、ＮＴ−３も含まない。天然に存在するＮＴ−４／５の改変体、ペプチドフラグメント、および改変形態は、米国特許出願公開番号２００３０２０３３８３；同２００２００４５５７６；米国特許第５，７０２，９０６号；同第６，５０６，７２８号；同第６，５６６，０９１号；同第５，８３０，８５８号（これらは、その全体が参考として援用される）に記載されている。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、本明細書中に記載される任意の実施形態の１つ以上のものを含む。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む、天然に存在する配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在する哺乳動物ＮＴ−４／５であり得るか、または天然に存在する哺乳動物ＮＴ−４／５に由来しかつ天然に存在する非哺乳動物ＮＴ−４／５のいかなる部分とも一致しない配列を有するＮＴ−４／５ポリペプチドであり得る、哺乳動物ＮＴ−４／５ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在するヒトＮＴ−４／５であり得るか、または天然に存在するヒトＮＴ−４／５に由来しかつ天然に存在する非ヒトＮＴ−４／５のいかなる部分とも一致しない配列を有するＮＴ−４／５ポリペプチドであり得る、ヒトＮＴ−４／５ポリペプチドである。
【０１０３】
（表１．成熟ヒトＮＴ−４／５のアミノ酸配列、およびその成熟ヒトＮＴ−４／５をコードするヒトヌクレオチド配列）
【０１０４】
【表１】
2007523196.tif 000002
本発明のＮＴ−４／５ポリペプチド（ＮＴ−４／５ポリペプチド（天然に存在するＮＴ−４／５を含む）の改変体、ペプチドフラグメント、改変形態を含む）、融合タンパク質、および結合体は、以下の特徴のうちのいずれか（１つ以上）によって特徴付けられる：（ａ）ＴｒｋＢレセプターに結合して活性化させる能力；（ｂ）そのＴｒｋＢのシグナル伝達機能によって媒介される１つ以上の下流経路を活性化させる能力；（ｃ）インスリン非依存性糖尿病の１つ以上の症状を処置、予防、または軽減させる能力；ならびに（ｄ）肥満の１つ以上の症状を処置、予防、または軽減させる能力。従って、すべてのＮＴ−４／５ポリペプチド（改変体、フラグメント、および改変形態を含む）は、上記のように機能的である。
【０１０５】
改変体の生物学的活性は、当該分野で公知である方法および実施例において記載される方法を使用して、インビトロおよびインビボで試験され得る。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在するＮＴ−４／５タンパク質と比較して増強した活性または低減した活性を有し得る。いくつかの実施形態において、機能的に等価な改変体は、上記ＮＴ−４／５ポリペプチドが由来するネイティブＮＴ−４／５タンパク質と比較して、上記される（または当該分野で公知である）生物学的アッセイのうちの１つ以上に関して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかの活性を有する。いくつかの実施形態において、機能的に等価な改変体は、インビトロ（例えば、実施例６および実施例７において記載されるアッセイ）におけるＴｒｋＢレセプター活性化において、約０．０１ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満の内のいずれかのＥＣ５０（最大有効濃度の半分）を有する。
【０１０６】
ＮＴ−４／５のアミノ酸配列改変体は、天然に存在するＮＴ−４／５（例えば、表１に示される成熟ヒトＮＴ−４）の配列中の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、および／または置換によって天然に存在するＮＴ−４／５とは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを包含する。アミノ酸配列改変体は、一般的には、任意の天然に存在するＮＴ−４／５（例えば、配列番号１において示される成熟ヒトＮＴ−４／５）と少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。いくつかの実施形態において、上記改変体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態において、上記改変体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一である。いくつかの実施形態において、上記改変体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態において、上記改変体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一である。
【０１０７】
ＮＴ−４／５のアミノ酸配列改変体は、以前に単離されたＮＴ−４／５  ＤＮＡにおいて所定の変異を作製することによって、作製され得る。アミノ酸改変体は、ＮＴ−４／５およびＴｒｋＢレセプターの結晶構造に基づいて設計および作製され得る。Ｂａｎｆｉｅｌｄら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：１１９１〜９（２００１）。例えば、ＮＴ−４／５のモノマー間の相互作用に直接には関与しないアミノ酸、およびＮＴ−４／５とＴｒｋＢレセプターとの間の相互作用に直接には関与しないアミノ酸が、例えば、ＰＥＧ付着部位を導入するように変異され得る。当該分野で公知の方法が、天然に存在するＮＴ−４／５タンパク質と比較して１つ以上の生物学的活性が増強または低減したＮＴ−４／５ポリペプチド改変体を設計するために、使用され得る。
【０１０８】
そのような所定の変異を作製するために考慮する２つの原則的変数（変異部位の位置および変異の性質）が、存在する。一般的には、選択される変異の位置および性質は、一般的には、改変されるＮＴ−４／５の特徴に依存する。例えば、候補ＮＴ−４／５アンタゴニストまたは候補ＮＴ−４／５スーパーアゴニストは、最初に、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４の間で同一であるかまたは高度に保存されているアミノ酸残基を位置決めすることによって、選択され得る。その後、それらの残基は、例えば、（１）最初に保存的選択肢で置換し、次に、達成される結果に依存してより極端な選択肢で置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）位置決めした部位に隣接して、同じ種類もしくは異なる種類の残基を挿入すること、あるいは選択肢１〜３の組み合わせによって、連続して改変され得る。
【０１０９】
１つの有用な技術は、「ａｌａスキャンニング」といわれている。ここで、アミノ酸残基または標的残基の群が同定され、そしてアラニンまたはポリアラニンによって置換される。次いで、このアラニン置換に対する機能的感受性を示すそれらのドメインは、アラニン置換の部位においてまたはその部位の代わりに、さらなる改変体または他の改変体を導入することによって洗練される。
【０１１０】
明らかに、例えば、ＮＴ−４／５をＮＧＦ、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３に変換するこのような変化は、本発明の範囲内に含まれない。従って、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は、予め決められており、変異自体の性質は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位において変異の能力を最適化するために、ａｌａスキャンニングまたはランダム変異誘発が、標的コドンまたは標的領域において行われ、その発現されるＮＴ−４／５改変体は、最適な望ましい活性についてスクリーニングされる。
【０１１１】
アミノ酸配列の欠失は、一般に、約１〜３０残基、より好ましくは、約１〜１０残基の範囲であり、そして代表的には連続している。欠失は、ＮＴ−４／５の活性を改変するために、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の間で相同性が低い領域に導入され得る。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＧＦと実質的に相同な領域におけるＮＴ−４／５からの欠失は、ＮＴ−４／５の生物学的活性をより有意に改変する可能性はより高い。連続的な欠失の数は、影響を受けるドメインにおけるＮＴ−４／５の三次構造（例えば、β−プリーツシートまたはαヘリックス）を保存するように選択され得る。
【０１１２】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から、１０００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さに及ぶ、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（すなわち、成熟ＮＴ−４／５配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、より好ましくは、１〜５残基、最も好ましくは、１〜３残基の範囲であり得る。末端挿入の例としては、成熟ＮＴ−４／５を組換え宿主から容易に分泌するために、異種Ｎ末端シグナル配列をＮＴ−４／５分子のＮ末端に融合することが挙げられる。このようなシグナルは、一般に、意図される宿主細胞に対して同種であり、Ｅ．ｃｏｌｉについてはＳＴＩＩもしくはｌｐｐ、酵母についてはα因子、および哺乳動物細胞についてはウイルスシグナル（例えば、ヘルペスｇＤ）が挙げられる。他の挿入は、ＮＴ−４／５のＮ末端またはＣ末端へのポリペプチドの融合を含む。
【０１１３】
改変体の第３の群は、ＮＴ−４／５中の少なくとも１つのアミノ酸残基（好ましくは、１つだけ）が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されたものを含む。例は、アルギニンおよびリジンを他のアミノ酸で置換して、ＮＴ−４／５残基をセリンプロテアーゼによりタンパク質分解させることである。これによって、より安定なＮＴ−４／５の改変体を作る。置換変異誘発のための最も重要な部位としては、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４において見出されるアミノ酸が、側鎖のかさ高さ、電荷または疎水性に関して実質的に異なるが、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＢＤＮＦの種々の動物アナログ内で（例えば、全ての動物のＮＧＦの中で、全ての動物のＮＴ−３の中で、および全てのＢＤＮＦの中で）選択された部位において相同性の程度が高い部位が挙げられる。この分析は、栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の活性の区別に関与し得る残基を強調する。よって、これらの部位における改変体は、このような活性に影響を及ぼし得る。成熟ヒトＮＴ−４／５におけるこのような部位（Ｎ末端から番号付けされる）および例示的な置換の例としては、それぞれ、配列番号１のＮＴ−４／５のＧ７７からＫ、Ｈ、ＱまたはＲへ、およびＲ８４からＥ、Ｆ、Ｐ、ＹまたはＷへ、が挙げられる。目的の他の部位は、その残基が全ての動物種のＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の間で同一であり、このコンホメーションの程度は、全ての４つの因子に共通する生物学的活性を達成することにおける重要性を示唆する。
【０１１４】
例えば、１つ以上のアミノ酸の置換は、保存的置換を含む。保存的置換を行う方法は、当該分野で公知である。例えば、ａｌａ（Ａ）は、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅにより、好ましくは、ｖａｌにより置換され得る；ａｒｇ（Ｒ）は、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｓｎにより、好ましくは、ｌｙｓにより置換され得る；ａｓｎ（Ｎ）は、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇにより、好ましくは、ｇｌｎにより置換され得る；ａｓｐ（Ｄ）は、ｇｌｕによって置換され得る；ｃｙｓ（Ｃ）は、ｓｅｒによって置換され得る；ｇｌｎ（Ｑ）は、ａｓｎによって置換され得る；ｇｌｕ（Ｅ）は、ａｓｐによって置換され得る；ｇｌｙ（Ｇ）は、ｐｒｏによって置換され得る；ｈｉｓ（Ｈ）は、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇによって、好ましくは、ａｒｇによって置換され得る；ｉｌｅ（Ｉ）は、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ノルロイシンによって、好ましくは、ｌｅｕによって置換され得る；ｌｅｕ（Ｌ）は、ノルロイシン、ｉｌｅ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅによって、好ましくは、ｉｌｅによって置換され得る；ｌｙｓ（Ｋ）は、ａｒｇ、ｇｌｎ、ａｓｎによって、好ましくは、ａｒｇによって置換され得る；ｍｅｔ（Ｍ）は、ｌｅｕ、ｐｈｅ、ｉｌｅによって、好ましくは、ｌｅｕによって置換され得る；ｐｈｅ（Ｆ）は、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａによって、好ましくは、ｌｅｕによって置換され得る；ｐｒｏ（Ｐ）は、ｇｌｙによって置換され得る；ｓｅｒ（Ｓ）は、ｔｈｒによって置換され得る；ｔｈｒ（Ｔ）は、ｓｅｒによって置換され得る；ｔｒｐ（Ｗ）は、ｔｙｒによって置換され得る；ｔｙｒ（Ｙ）は、ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒによって、好ましくは、ｐｈｅによって置換され得る；ｖａｌ（Ｖ）は、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ、ノルロイシンによって、好ましくは、ｌｅｕによって置換され得る。
【０１１５】
保存的置換に特に適した部位としては、成熟ヒトＮＴ−４（配列番号１）のＮ末端から数えると、Ｒ１１、Ｇ１２、Ｅ１３、Ｖ１６、Ｄ１８、Ｗ２３、Ｖ２４、Ｄ２６、Ｖ４０、Ｌ４１、Ｑ５４、Ｙ５５、Ｆ５６、Ｅ５８、Ｔ５９、Ｇ７７、Ｒ７９、Ｇ８０、Ｈ８５、Ｗ８６、Ａ９９、Ｌ１００、Ｔ１０１、Ｗ１１０、Ｒ１１１、Ｗ１１２、Ｉ１１３、Ｒ１１４、Ｉ１１５、Ｄ１１６、およびＡ１１８が挙げられる。ＮＴ−４／５の適切なコンホメーションを維持することに関与しないシステイン残基はまた、その分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般に、セリンで置換され得る。この段落に示されるもの以外の部位は、一般に上記に示される欠失研究または挿入研究に適している。
【０１１６】
機能の実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはらせんコンホメーションとしてのその置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）その標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ、を維持することに対するそれらの影響が有意に異なる置換を選択することによって達成され得る。天然に存在する残基は、共通する側鎖の特性に基づいて群に分けられる（これらのうちのいくつかは、いくつかの機能的グループに入り得る）：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１１７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のメンバーと交換することを包含する。
【０１１８】
ＮＴ−４改変体の例としては、以下が挙げられる：Ｅ６７からＳまたはＴへの変異を有する配列番号１のポリペプチド（これは、Ｎ結合型グリコシル化部位を付加する）；配列番号１のアミノ酸残基Ｒ８３からＱ９４まで、Ｇ１からＣ６１まで、Ｇ１からＣ１７まで、Ｃ１７からＣ６１まで、Ｃ１７からＣ７８まで、Ｃ１７からＣ９０まで、Ｃ１７からＣ１１９まで、Ｃ１７からＣ１２１まで、Ｒ１１からＲ２７まで、Ｒ１１からＲ３４まで、Ｒ３４からＲ５３まで、Ｃ６１からＣ７８まで、Ｒ５３からＣ６１まで、Ｃ６１からＣ１１９まで、Ｃ６１からＣ７８まで、Ｃ７８からＣ１１９まで、Ｃ６１からＣ９０まで、Ｒ６０からＣ７８まで、Ｋ６２からＣ１１９まで、Ｋ６２からＫ９１まで、Ｒ７９からＲ９８まで、Ｒ８３からＫ９３まで、Ｔ１０１からＲ１１１まで、Ｇ１からＣ１２１までのポリペプチド；配列番号１のＶ４０〜Ｃ１２１を含むポリペプチド（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端においてあるポリペプチドに融合された、配列番号１のＶ４０〜Ｃ１２１）；Ｃ７８、Ｃ６１、Ｑ５４〜Ｔ５９、Ｒ６０〜Ｄ８２、Ｈ８５〜Ｓ８８、Ｗ８６〜Ｔ１０１が欠失した（残基の示された範囲（両端を含む）の欠失）配列番号１を含むポリペプチド；Ｒ５３からＨへ、Ｋ９１からＨへ、Ｖ１０８からＦへ、Ｒ８４からＱ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、ＹまたはＷへ、およびＤ１１６からＥ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、ＳまたはＴへの変異を有する配列番号１。７０位がＧ、Ｅ、ＤもしくはＰ以外のアミノ酸残基で置換され；７１位がＡ、ＰもしくはＭ以外の残基で置換され；そして／または８３位がＲ、Ｄ、ＳもしくはＫ以外の残基で置換されているＮＴ−４／５（配列番号１）；ならびに環化ＮＴ−４フラグメントもまた含まれる。
【０１１９】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、その２つの配列中のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、以下に記載されるように最大の一致で整列されるときに同じである場合、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、比較ウィンドウにわたってそれらの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０個連続した位置のセグメント、通常は、３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントであって、比較ウィンドウにおいて、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続した位置の参照配列に対して比較され得る。
【０１２０】
比較のための配列の最適な整列は、デフォルトパラメーターを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの整列スキームを実現する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）  Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．  ６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０１２１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」とは、２つの最適に整列された配列を、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたって比較することによって、決定され、ここでその比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、その２つの配列の最適な整列について、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較した場合に、２０％以下、通常５〜１５％、または１０〜１２％の付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、その同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、そのマッチした位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算される。
【０１２２】
ＮＴ−４／５のアミノ酸配列改変体は、天然に存在していてもよいし、例えば、予め単離されたＮＴ−４／５  ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または望ましい改変体ポリペプチドのインビトロ合成によって、合成により調製されてもよい。上記のように、このような改変体は、成熟ＮＴ−４／５（例えば、表１に示される配列）のアミノ酸配列からの１以上のアミノ酸残基の欠失、または挿入または置換を含み得る。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせは、ＮＴ−４／５のアミノ酸配列改変体に達するように作製される。ただし、得られた改変体ポリペプチドは、望ましい特性を有する。そのアミノ酸変化はまた、組換え宿主において発現する際に、ＮＴ−４／５のさらなる改変を生じ得る（例えば、グリコシル化部位を導入するかもしくはその部位が移動する、または（１９８９年２月９日公開のＰＣＴ  ＷＯ８９／０１０４１に従って）膜アンカー配列を導入する）。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で、成熟ヒトＮＴ−４／５をコードする核酸配列（例えば、配列番号２）にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
改変体ポリヌクレオチドはまた、または代わりに、天然の遺伝子、その一部もしくは相補物に対して実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチド改変体は、中程度にストリンジェントな条件下で、そのポリペプチドをコードする天然に存在するＤＮＡ配列（またはその相補的配列）にハイブリダイズし得る。
【０１２５】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」とは、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリダイズ；続いて、０．１％  ＳＤＳを含む、２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣの各々で、６５℃で２０分間の２回洗浄を包含する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、以下である：（１）洗浄のために、低イオン強度および高温（例えば、５０℃で０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）を採用するもの；（２）ハイブリダイゼーションの間に、変性剤（例えば、ホルムアミド）を使用するもの（例えば、５０％（ｖ／ｖ）  ホルムアミド（７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含有する０．１％  ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％  ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含有））（４２℃）；または（３）５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳおよび１０％  硫酸デキストラン（４２℃）と、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％  ホルムアミド中の５５℃での洗浄と、続いて、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる、５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を採用するもの。別の例示的なストリンジェントな条件は、５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、２×デンハルト溶液、および１０％  硫酸デキストラン中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中、４２℃での洗浄である。当業者は、因子（例えば、プローブの長さなど）に適合させるために必要であるような温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識する。
【０１２７】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることは、当業者によって認識される。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。にも拘わらず、コドン使用法が異なることに起因して変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１つ以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／もしくは置換）の結果として変化した内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有していてもよいし、必ずしも有していなくてもよい。対立遺伝子は、標準的技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を使用して同定され得る。
【０１２８】
本発明の方法において使用されるＮＴ−４／５の改変体はまた、ＮＴ−４／５（例えば、表１に示されるヒトＮＴ−４／５）またはその機能的ペプチドフラグメントのアミノ酸配列を含む融合タンパク質を包含する。生物学的に活性なＮＴ−４／５ポリペプチドは、配列（例えば、免疫学的反応性を増強する配列、支持体もしくはキャリアにポリペプチドを結合することを容易にする配列、または再折りたたみおよび／もしくは精製を容易にする配列（例えば、Ｍｙｃ、インフルエンザウイルス血球凝集素由来のＨＡ、Ｈｉｓ−６、ＦＬＡＧなどのエピトープをコードする配列）と融合され得る。これらの配列は、Ｎ末端でまたはＣ末端で、ＮＴ−４／５ポリペプチドに融合され得る。さらに、このタンパク質またはポリヌクレオチドは、他のもの、またはその機能を増すかもしくは細胞でのその位置を特定するポリペプチド（例えば、分泌配列）に融合され得る。上記の組換え融合タンパク質を生成するための方法は、当該分野で公知である。この組換え融合タンパク質は、当該分野で周知の方法によって、生成され得、再折りたたみされ得、単離され得る。
【０１２９】
本明細書に記載されるＮＴ−４／５ポリペプチドは、個体中でのそれらの半減期を増大させるために改変され得る。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、生物学的活性を最小限にしか喪失せずに、全身のクリアランスを減少させるためにＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）され得る。本発明はまた、ＰＥＧ分子に連結されたＮＴ−４／５ポリペプチドを含む組成物（薬学的組成物を含む）を提供する。いくつかの実施形態において、このＰＥＧ分子は、可逆的な連結を介して、ＮＴ−４／５ポリペプチドに連結される。ＰＥＧ化ＮＴ−４／５ポリペプチドの半減期は、非ＰＥＧ化ＮＴ−４／５ポリペプチドの半減期の２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、および３０倍のうちのいずれかあたりより長くまで延び得る。
【０１３０】
ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）は、ＮＴ−４／５ポリペプチドの種々の官能基に、当該分野で公知の方法を用いて連結され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６（２００２）；Ｓａｋａｎｅら．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：１０８５−９１（１９９７）を参照のこと。ＰＥＧは、このポリペプチドの以下の官能基に連結され得る：アミノ基、カルボキシル基、改変されたもしくは天然のＮ末端、アミン基、およびチオール基。いくつかの実施形態において、１つ以上の表面アミノ酸残基が、ＰＥＧ分子により改変され得る。ＰＥＧ分子は、種々の大きさ（例えば、約２〜４０ＫＤａの範囲）であり得る。ＮＴ−４／５ポリペプチドに連結されるＰＥＧ分子は、２０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａのいずれかあたりの分子量を有し得る。ＰＥＧ分子は、一本鎖もしくは分枝鎖であり得る。ＰＥＧをＮＴ−４／５ポリペプチドに連結するために、一方の末端または両方の末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体が、使用され得る。その官能基は、ＮＴ−４／５ポリペプチド上の利用可能な反応性の基の型に基づいて選択される。ポリペプチドに誘導体を連結する方法は、当該分野で公知である。Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６（２００２）。このＮＴ−４／５ポリペプチドとＰＥＧとの間の連結はまた、この連結が、個体中で切断され得るかまたは天然に分解され（可逆的連結または分解可能な連結）得、よって、半減期を改善し得るが、活性の喪失を最小にし得るようなものであり得る。ＮＴ−４／５ポリペプチド上のＰＥＧ連結部位はまた、表面の残基を、ＰＥＧ反応性の基を有するアミノ酸残基（例えば、システイン）に変異させることによって作られ得る。例えば、ヒトＮＴ−４／５（配列番号１）の以下のアミノ酸は、ＰＥＧ結合のために変異され得る：Ｇ１、Ｖ２、Ｓ３、Ｅ４、Ｔ５、Ｓ９、Ｒ１０、Ｔ２５、Ｄ２６、Ｒ２８、Ｔ２９、Ｖ３１、Ｅ３７、Ｅ３９、Ｌ４１、Ｅ４３、Ａ４６、Ａ４７、Ｇ４８、Ｇ４９、Ｓ５０、Ｒ５３、Ｄ６４、Ｎ６５、Ａ６６、Ｅ６７、Ｅ６８、Ｇ６９、Ｄ８２、Ｒ８３、Ｒ８４、Ｈ８５、Ａ１０４、Ｑ１０５、Ｇ１０６、Ｒ１０７、Ｖ１０８、Ｓ１２５、およびＴ１２７。これらは、他の種における対応する残基に適用され得る。
【０１３１】
いくつかのＰＥＧ化ＮＴ−４／５が生成されており、実施例６および７に示される。成熟ヒトＮＴ−４／５の５０位におけるセリン残基は、ＮＴ４−Ｓ５０Ｃを生成するために、システインに変更され得、次いで、ＰＥＧ化され、ここでこのＰＥＧは、５０位のシステインに連結される。ＰＥＧに対するＮ末端特異的な結合の一例は、１位の残基をセリンまたはスレオニンに変異させ、次いで、ＰＥＧ化することである。この場合、ＰＥＧは、１位のセリンに連結される。
【０１３２】
ＮＴ−４／５ポリペプチドはまた、末梢に投与された後に血液脳関門を通って脳に運ばれるというそれらの効率を増大させるために改変され得る。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、抗トランスフェリンレセプター抗体に結合または連結され得る。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．７１：３−１０（１９９２）を参照のこと。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、抗トランスフェリンレセプター抗体に、アビジン／ビオチン相互作用を介して結合され得るかまたは抗トランスフェリンレセプター抗体（例えば、ＯＸ２６抗体）に共有結合され得る。Ｋａｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６９：３４４−５０（１９９４）；Ｙｏｓｈｉｋａｗａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６３：８９７−９０３（１９９２）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．７１：３−１０（１９９２）を参照のこと。ＰＥＧ化ＮＴ−４／５ポリペプチドはまた、抗トランスフェリンレセプター抗体に連結され得る。Ｗｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２５４−９（１９９９）を参照のこと。脳へのＮＴ−４／５ポリペプチドの送達はまた、イムノリポソーム（抗体指向性リポソーム）を用いて達成され得る。ＮＴ−４／５ポリペプチドを有するリポソームは、ＰＥＧに結合され得、次いで、抗トランスフェリンレセプター抗体に結合され得る。Ｈｕｗｙｌｅｒら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４１６４−９（１９９６）。血液脳関門を横断するそれらの能力について具体的に同定されている他の抗体もまた、上記の処方物のいずれかのために使用され得る。Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６：２４０−２（２００２）。
【０１３３】
ＮＴ−４／５ポリペプチドは、組換え手段によって、すなわち、ＮＴ−４／５ポリペプチドをコードする核酸の発現によって生成され得る。組換え細胞培養において、および必要に応じて、細胞培養物からの改変体ポリペプチドの精製は、例えば、改変体の活性のバイオアッセイによるかまたはウサギ抗ＮＴ−４／５ポリクローナル抗体（天然のＮＴ−４／５中にも存在する、その改変体の少なくとも１つの免疫エピトープに結合する）を含むイムノアフィニティーカラムに対する吸着による。４０残基以下の程度の低分子ペプチドフラグメントは、インビトロ法により都合よく生成される。
【０１３４】
ＮＴ−４／５ポリペプチドをコードするＤＮＡは、宿主細胞においてタンパク質を発現するために発現ベクターにクローニングされ得る。ＮＴ−４／５ポリペプチドをコードする核酸の例は、米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号に記載される。ＮＴ−４／５ポリペプチドをその成熟形態でコードするＤＮＡは、そのアミノ末端で分泌シグナルに連結され得る。この分泌シグナルは、好ましくは、ヒト細胞からのＮＴ−４／５の分泌をインビボで通常指向するＮＴ−４／５プレ配列である。しかし、適切な分泌シグナルとしては、他の動物のＮＴ−４／５由来のシグナル、ＮＧＦ、ＮＴ−２、もしくはＮＴ−３に由来するシグナル、ウイルスシグナル、または同じ種もしくは関連する種の分泌ポリペプチドに由来するシグナルも挙げられる。任意の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、そのタンパク質またはポリペプチドを発現するために使用され得る。
【０１３５】
発現されるＮＴ−４／５ポリペプチドは、精製され得る。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、培養培地から分泌タンパク質として回収され得るが、このポリペプチドはまた、分泌シグナルなしで直接発現される場合には、宿主細胞溶解物から回収され得る。当該分野で公知のタンパク質精製法が使用され得る。ＮＴ−４／５ポリペプチドを生成する方法およびその発現されたＮＴ−４／５ポリペプチドを精製する方法は、米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号、および米国特許第６，１８４，３６０号に記載される。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され得、当該分野で公知の方法に従って再折りたたみされ得る。成熟ヒトＮＴ−４／５はまた、市場から（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳｉｇｍａおよびＵｐｓｔａｔｅから）得られ得る。
【０１３６】
本発明はまた、ＮＴ−４／５ポリペプチドおよびそのＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む組成物を提供する。この抗体およびＮＴ−４／５ポリペプチドは、所定の比率で存在し得る。従って、いくつかの実施形態において、その抗体：ＮＴ−４／５ポリペプチドの重量比は、約１：１であり得る。いくつかの実施形態において、この比率は、約０．００１〜約１と約１〜約１０００との間、約０．０１〜約１と約１〜約１００との間、約０．１〜約１と約１〜約１０との間であり得る。他の比率も企図される。いくつかの実施形態において、その抗体およびＮＴ−４／５ポリペプチドは、単一投薬単位で存在する。このＮＴ−４／５ポリペプチドに対する抗体の結合親和性は、約２ｐＭ〜約５００ｎＭであり得る。この結合親和性は、５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、５００ｐＭ、３００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、および１０ｐＭのいずれかあたり未満であり得る。
【０１３７】
本発明において使用される組成物は、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤をさらに含み得る（Ｒｅｎｉｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版（２０００）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編．  Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ．）。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、その投薬量及び濃度で被験体に対して非毒性であり、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール）；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストランが挙げられる）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含み得る。薬学的に受容可能な賦形剤は、さらに本明細書に記載される。
【０１３８】
本明細書に記載されるＮＴ−４／５ポリペプチドは、徐放性であるように処方され得る。徐放性調製物の適切な例としては、ＮＴ−４／５ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（このマトリクスは、成形物品（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態である）が挙げられる。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびルプロリドアセテートから構成される注射可能なマイクロスフェア））、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。使用され得る徐放性薬物送達系の別の例は、Ａｔｒｉｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより製造されるＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）である。例えば、米国特許第６，５６５，８７４号を参照のこと。このＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）薬物送達系は、生分解性縫合糸において使用され、かつ生体適合性キャリア中に溶解されるものに類似した生分解性ポリマーからなる。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、製造時にこの液体送達系にブレンドされ得るか、または製品に依存して、使用時に医師により後に添加され得る。その液体製品が小さなゲージの針を介して皮下注射または筋肉内注射されるか、またはカニューレを通じて接近可能な組織部位に配置される場合、そのキャリアを組織流体中の水で置換することで、そのポリマーが凝集して、固体フィルムまたはインプラントを形成する。次いで、そのインプラント内に囲まれたＮＴ−４／５ポリペプチドは、そのポリマーマトリクスが時間とともに生分解されるにつれて、制御様式で放出される。患者の医療的要求に依存して、このＡｔｒｉｇｅｌ系は、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたって、タンパク質を送達し得る。注射可能な徐放系（例えば、Ａｌｋｅｒｍｅｓによって製造される、ＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標））も、使用され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本発明は、医薬品としての使用および／または医薬品の製造のための使用の文脈のいずれにせよ、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するための組成物（本明細書に記載される）を提供する。
【０１４０】
（治療目的のＮＴ−４／５ポリペプチドを含むキット）
本発明はまた、本発明の方法において使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、精製ＮＴ−４／５ポリペプチド（天然に存在するＮＴ−４／５を含む）を含む１つ以上の容器、および本明細書に記載される本発明の方法のいずれかに従って使用するための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、ＮＴ−４／５ポリペプチドを、疾患（例えば、肥満およびインスリン非依存性糖尿病）を処置するために、本明細書に記載の方法のいずれかに従って投与する記載を含む。このキットは、個体が疾患およびその疾患の段階を有する（例えば、肥満およびインスリン非依存性糖尿病）か否かを同定することに基づいて、処置に適した個体を選択する記載をさらに含み得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、そのキットは、ＮＴ−４／５ポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＮＴ−４／５ポリペプチドをその抗体とともに投与するための指示書をさらに含む。
【０１４２】
ＮＴ−４／５ポリペプチドの使用に関する指示書は、一般に、投薬量、投与スケジュール、および意図される処置のための投与経路に関する情報を含む。その容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）または分割単位用量であり得る。本発明のキット中に与えられる指示書は、代表的には、ラベルまたはパッケージ挿入物上の書面による指示書（例えば、キット中に含まれる一枚の紙）であるが、機械読み取り可能な指示（例えば、磁気記憶ディスクまたは光学記憶ディスクに収容される指示）もまた、許容可能である。
【０１４３】
そのラベルまたはパッケージ挿入物は、その組成物が本明細書に記載される疾患（例えば、肥満およびインスリン非依存性糖尿病）を処置するために使用されることを示す。指示書は、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するために提供され得る。
【０１４４】
本発明のキットは、適切なパッケージ中に存在する。適切なパッケージとしては、バイアル、瓶、ジャー、可撓性パッケージ（例えば、シールされたマイラーバッグまたはプラスチックバッグ）などが挙げられるが、これらに限定されない。特定のデバイス（例えば、吸入器、鼻投与デバイス（例えば、噴霧器）または注入デバイス（例えば、ミニポンプ））と組み合わせて使用するためのパッケージもまた企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、その容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。その容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、その容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。その組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、ＮＴ−４／５ポリペプチドである。その容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。
【０１４５】
キットは、必要に応じて、さらなる構成要素（例えば、緩衝液および説明情報）を提供し得る。通常は、そのキットは、容器およびその容器上にまたはその容器と関連づけてラベルもしくはパッケージ挿入物を含む。
【０１４６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、限定するために提供されるのではない。
【実施例】
【０１４７】
以下に記載される全ての実施例に関して、ヒトＮＴ−４／５を、全ての実験で使用した。従って、以下の実施例において、ＮＴ−４／５とは、ヒトＮＴ−４／５を指す。
【０１４８】
（実施例１：ｄｂ／ｄｂマウスにおける炭水化物および脂質代謝に対するＮＴ−４／５の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
試験動物：４０〜５０ｇの目標範囲内の体重の２４匹の１０〜１２週齢メスｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ  Ｊ  Ｒｊ−ｄｂ／ｄｂ，Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および照射済みのペレット状実験用飼料（ＳＡＦＥ，Ｆｒａｎｃｅ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップ（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｃａｐ）で覆われたケージ１つあたりに４匹収容し、少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０１４９】
ＮＴ−４／５および参照物質の投与：２型糖尿病の治療のための、ロシグリタゾン（３ｍｇ／ｋｇ、Ｓｅｑｕｏｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）、チアゾリジンジオン化合物を、参照として、本実験において使用した。リン酸緩衝化生理食塩水を、この実験においてビヒクルとして使用した。ＮＴ−４／５を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから得た。
【０１５０】
マウスを８匹ずつの３群に分けた（群１〜３）。各群に、ビヒクル（ＰＢＳ）を皮下（ｓ．ｃ．）で、３ｍｇ／ｋｇ  ロシグリタゾンを経口（ｐ．ｏ．）で、または２０ｍｇ／ｋｇ  ＮＴ−４／５を皮下（ｓ．ｃ．）で処置した。１日目から５日目（Ｔ１−Ｔ５）、次に８日目から１２日目（Ｔ８〜Ｔ１２）に、１０ｍｌ／ｋｇの容積を、群２および群３のマウスに５日間連続で毎日１回投与した。
【０１５１】
分析用サンプルの収集：処理の１日前（Ｔ０）に、絶食させていないｄｂ／ｄｂマウスの体重を測定し、イソフルラン麻酔下で、血液サンプルを眼窩から回収した（約３００μＬ／マウス）。同様に、５日目（Ｔ５）、１２日目（Ｔ１２）、１９日目（Ｔ１９）および２６日目（Ｔ２６）に、最後の投与の２時間後、イソフルラン麻酔下で、絶食していないマウスの血液サンプルを眼窩から回収した。血液サンプルを、ＨｂＡｌｃの決定に供し、その後５〜１０分間、室温で維持して、自動的に血餅を形成させ、次いで、２Ｋ１５モデル遠心分離器（Ｓｉｇｍａ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、３５００×ｇで１０〜１５分間、４℃で遠心分離するまで、氷上に置いた。血清のアリコートを、グルコースレベルの測定に使用した。その残りを、使用時まで凍結した。
【０１５２】
ｄｂ／ｄｂマウスにおける血液サンプルの分析：投薬前および投薬後の血清グルコースレベル、ＨｂＡｌｃ、コレステロールおよびトリグリセリド、インスリン、および非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、ならびにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐｉｒａｔｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＡＳＴ）活性およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を、本明細書にさらに記載されるように、異なる時点で決定した。各時点で、および各パラメーターについて、効果の平均％を以下の式に従って計算した：（（Ｔ最後−Ｔ最初）／Ｔ最初）×１００。統計分析は、一元配置分散分析、次に、最終の値に関するビヒクル群に対する多重比較（ダネット検定）に一致した。等分散検定が失敗した場合、順位に関するクラスカル−ウォリス一元配置分散分析を行った。差は、ｐ＜０．０５で有意とみなした。
【０１５３】
（Ｂ．結果）
（１．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＮＴ４／５の血中グルコース制御活性）
処置したマウスの血中グルコースレベルを、グルコースキット（ｒｅｆ．４４２６４０，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ−４分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて決定した。表２は、分析結果をまとめる。その結果はまた、図１にグラフとして示される。
【０１５４】
（表２．ｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベル（ｍＭ）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１５５】
【表２】
2007523196.tif 000003
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定。
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１５６】
ビヒクル処置マウスの血中グルコースレベルは、研究の間中ずっと高いままであった。ロシグリタゾンで処置したマウスにおいて、その血中グルコースレベルは、Ｔ５で約２２．４４ｍＭに低下し、Ｔ１２まで低いままであり、その後、劇的に上昇した。ＮＴ  ４／５で処置したマウスにおけるその血中グルコースレベルは、Ｔ５で１５．７８ｍＭに低下し、Ｔ１２で１３．５６ｍＭに低下し、Ｔ１９で１２．６５ｍＭにさらに低下し、ほぼ正常レベルの血中グルコース（８匹の健康なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを測定することによって決定した約１０．９５±０．４１ｍＭ）に達した。ＮＴ４／５処置マウスにおける血中グルコースのレベルは、研究の残り期間中ずっと、ビヒクル処置マウスのレベルより少なくとも５０％低いままであった。
【０１５７】
ＨｂＡｌｃレベルを、ＨｂＡｌｃキット（ｒｅｆ．  ６５０２６２，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ４シンクロナイザーを用いて決定した。ＨｂＡｌｃは、最近２〜３ヶ月にわたる血中グルコース制御の指標である。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＨｂＡｌｃの正常レベル（８匹の健康な正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを測定することによって決定した）は、約３．５％であった。表３は、その分析の結果をまとめる。この結果は、図２においてグラフとしても示される。
【０１５８】
（表３．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＨｂＡｌｃ（％）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１５９】
【表３】
2007523196.tif 000004
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１６０】
ロシグリタゾン処置マウスおよびＮＴ  ４／５処置マウス両方におけるＨｂＡｌｃのレベルは、Ｔ１２でごくわずかに低下した（それぞれ、１％および０．２％）。しかし、このＨｂＡｌｃレベルは、Ｔ２６で有意に抑制された。ロシグリタゾン処置マウスにおいて、このＨｂＡｌｃレベルは、９．６％低下した。ＮＴ−４／５処置マウスにおいて、Ｔ２６におけるＨｂＡｌｃレベルは、Ｔ０と比較して、３０．４％低下した。
【０１６１】
これらの結果は、短期間および長期間両方の血中グルコースレベルは、ＮＴ−４／５処置マウスにおいて有意に低下したことを実証する。
【０１６２】
（２．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＮＴ−４／５の血中脂質制御活性）
血中トリグリセリドレベルおよび血中総コレステロールレベルは、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ４分析器を用いて、それぞれ、トリグリセリドアッセイキット（ｒｅｆ．４４５８５０，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｔｌｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）および総コレステロールキット（ｒｅｆ．４６７８２５，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｔｌｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）で決定した。この実験の結果を、表４および表５に示した。
【０１６３】
（表４．トリグリセリドレベル（ｍＭ）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１６４】
【表４】
2007523196.tif 000005
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定、または順位に対するクラスカル−ウォリス一元配置分散分析（ＫＷ）、次に、ダネット検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔ）
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１６５】
（表５．コレステロールレベル（ｍＭ）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１６６】
【表５】
2007523196.tif 000006
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１６７】
表４に示されるように、血中トリグリセリドレベルを、ロシグリタゾンまたはＮＴ  ４／５のいずれかで処置したマウスにおいて、正常レベル（１．２±０．０８ｍＭ、８匹の正常な健康Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを測定することによって決定）より下に低下させた。表５に示されるように、ＮＴ  ４／５処置マウスにおける血中コレステロールレベルはまた、約２０〜３０％低下した（統計学的に有意ではない）。
【０１６８】
血清非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）レベルを、非エステル化脂肪酸キット（ｒｅｆ．ＦＡ１１５，Ｒａｎｄｏｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて比色法により決定した。このアッセイの結果を、表６に示す。ロシグリタゾンとは異なり、ＮＴ  ４／５は、これらの条件下で、ＮＥＦＡの血中レベルに有意に影響を及ぼしたようではなかった。
【０１６９】
（表６．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＮＥＦＡレベル（ｍＭ）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１７０】
【表６】
2007523196.tif 000007
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１７１】
これらの結果は、ＮＴ  ４／５がこれらのマウスにおいて血中トリグリセリドレベルを有意に下げることを実証する。
【０１７２】
（３．ＮＴ  ４／５は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいてインスリン抵抗性を改善する）
血中インスリンレベルを、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＴ  Ｐｌｕｓキット（ｒｅｆ．ＩＮＳＲＡＴ０１−８Ｎ，Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。表７は、この分析の結果をまとめる。この結果はまた、図３においてグラフとして示される。
【０１７３】
（表７．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるインスリンレベル（ｎＭ）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１７４】
【表７】
2007523196.tif 000008
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１７５】
ビヒクル処置ｄｂ／ｄｂマウスの血中インスリンレベルは、Ｔ５で４．３５ｍＭに、Ｔ１２で２．２９ｍＭに、Ｔ１９で２．５８ｍＭに、およびＴ２６で１．９６ｍＭに低下した。ロシグリタゾン処置マウスにおいて、血中インスリンレベルは、Ｔ５で３．９４ｍＭに、Ｔ１２で２．８５ｍＭに低下した。Ｔ１９で、血中インスリンレベルは、ロシグリタゾン処置マウスにおいて、Ｔ１９で７．３０ｍＭに戻り、Ｔ２６で６．３３ｍＭに戻った。ＮＴ  ４／５処置マウスにおいて、血中インスリンレベルは、Ｔ５で１．８４ｍＭに低下し（ビヒクルと比較すると統計学的に有意）、Ｔ１２で０．９１ｍＭに低下した。Ｔ１９において、ＮＴ  ４／５処置マウスにおける血中インスリンレベルは、７．６ｍＭに戻り、Ｔ２６で１１．５８ｍＭへとさらに増加した。
【０１７６】
これらの結果は、インスリンレベルがＮＴ  ４／５処置マウスにおいて抑制されたことを実証する。しかし、このインスリンレベルは、これらのマウスにおいて、これらの条件下で、ＮＴ−４／５処置によって正常レベル（約０．１１８±０．０１０ｎＭ、８匹の健康な正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを測定することによって決定）に低下しなかった。ＮＴ  ４／５処置を停止した後のインスリンレベルの増大は、高インスリン血症の反動を示し得、膵臓β細胞のインスリンの貯蔵を増加した。
【０１７７】
（４．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＮＴ  ４／５のＡＳＴ酵素活性およびＡＬＴ酵素活性）
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を、ＡＳＴキット（ｒｅｆ．４４２６６５，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＡＬＴキット（ｒｅｆ．４４２６２０，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）で、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ４分析器を用いて決定した。この実験の結果を、表８に示す。各時点でのＡＳＴ／ＡＬＴの比率を、表９に示す。
【０１７８】
（表８．ｄｂ／ｄｂマウスにおける血清トランスアミナーゼ活性に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１７９】
【表８】
2007523196.tif 000009
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に、ダネット検定
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１８０】
（表９．ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＡＬＴ／ＡＳＴ比率に対するＮＴ  ４／５の効果）
【０１８１】
【表９】
2007523196.tif 000010
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。
【０１８２】
表８および表９に示されるように、ＮＴ  ４／５は、ＡＳＴレベルおよび／またはＡＬＴレベルに対しても、ＡＳＴ／ＡＬＴ比率に対しても、有意な効果を有さなかった。この結果は、ＮＴ−４／５処置が有意な肝臓毒性を有さなかったことを示す。
【０１８３】
（５．ｄｂ／ｄｂマウスにおける体重および食物摂取に対するＮＴ  ４／５処置の効果）
実験期間（Ｔ１〜Ｔ２６）全体にわたって、毎日の個々の体重、ならびに食物摂取／ケージを測定した。この測定の結果を表１０〜１２に示し、図４および図５においてグラフとして示す。
【０１８４】
（表１０．ｄｂ／ｄｂマウスの体重に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１８５】
【表１０】
2007523196.tif 000011
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に、ダネット検定
＊ビヒクルと比較した場合にｐ＜０．０５。
【０１８６】
（表１１．ｄｂ／ｄｂマウスの体重に対するＮＴ−４／５の効果（ベースラインの％として表される）。表１０からのデータを０日目の体重の％として表した）
【０１８７】
【表１１】
2007523196.tif 000012
（表１２．ｄｂ／ｄｂマウスの食物摂取（ｇ／ｋｇ／日）に対するＮＴ  ４／５の効果）
【０１８８】
【表１２】
2007523196.tif 000013
図４ならびに表１０および表１１に示されるように、ＮＴ  ４／５処置マウスは、処置の間に徐々に体重が減った。体重は、ＮＴ  ４／５処置を停止してから約３日後に増え始めたが、ビヒクル処置マウスおよびロシグリタゾン処置マウスの体重より遙かに低いままであった。同様に、図５および表１２に示されるように、Ｎ／Ｔ処置マウスの食物摂取は、劇的に抑制された。食物摂取は、ＮＴ  ４／５処置を停止してから約３日後に増え始めたが、ビヒクル処置マウスおよびロシグリタゾン処置マウスの食物摂取より遙かに少ないままであった。
【０１８９】
これらのデータは、ＮＴ  ４／５が、ｄｂ／ｄｂマウスにおける体重増加および食物摂取を有意に抑制したことを示す。
【０１９０】
（６．ｄｂ／ｄｂマウスにおける筋重量に対するＮＴ  ４／５の効果）
心臓重量および腓腹筋重量を、ビヒクル処置マウス、ロシグリタゾン処置マウス、およびＮＴ  ４／５処置マウスについて、２８日目に測定した。その結果を、表１３に示す。表１３に示されるように、ＮＴ−４／５処置は、ビヒクル処置と比較して、心筋重量および腓腹筋重量を有意に変化させなかった。これらは、ＮＴ−４／５処置の間に筋肉の減少も除脂肪体重の低下もなかったことを示す。
【０１９１】
（表１３．ｄｂ／ｄｂマウスにおける筋重量（ｇ）に対するＮＴ−４／５の効果）
【０１９２】
【表１３】
2007523196.tif 000014
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。
【０１９３】
（実施例２：ｄｂ／ｄｂマウスに対するＮＴ−４／５の用量応答）
（Ａ．実験プロトコル）
実施例１に記載のように維持したｄｂ／ｄｂマウスを、５つの群に分けた（群１〜５）。群１（７匹のマウス）に、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与した。群２（７匹のマウス）、群３（８匹のマウス）、群４（８匹のマウス）、群５（８匹のマウス）に、それぞれ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇの用量でＮＴ−４／５を各々投与した。ビヒクルおよびＮＴ−４／５の両方を、各マウス群に、５日間にわたって１日１回マウスの皮下に投与した。処置を始める１日前（Ｔ０）に、血液サンプルを、血清生体マーカー（グルコース、トリグリセリド、およびコレステロール）のベースラインレベルの決定のために、以前に記載されたように、マウスから集めた。同様に、６日目（Ｔ６）に、血液サンプルを、血清生体マーカーレベルの決定のために収集した。血液サンプルを、実施例１に記載されるのと同じように処理した。
【０１９４】
（Ｂ．結果）
（１．血清生体マーカーに対するＮＴ−４／５の用量応答）
血中グルコース、トリグリセリド、およびコレステロールレベルを、実施例１に記載のように決定した。表１４は、この分析の結果をまとめる。その結果はまた、図６にグラフとして示される。
【０１９５】
（表１４．ｄｂ／ｄｂマウス（１２週齢、メス）の血清生体マーカーに対するＮＴ−４／５の用量応答）
【０１９６】
【表１４】
2007523196.tif 000015
値は、平均±ＳＥＭとして表される
統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に、ダネット検定
＊ｐ＜０．０５
＊＊ｐ＜０．０１
＊＊＊ｐ＜０．００１
マウスの基底の血中グルコースレベルは、約５００〜６００ｍｇ／ｄＬであった。
【０１９７】
２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５の投与は、血中グルコースレベルを約４００ｍｇ／ｄＬに有意に低下させた。５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでのＮＴ−４／５投与はさらに、この血中グルコースレベルを３００ｍｇ／ｄＬ未満に低下させた。マウスの基底の血中トリグリセリドレベルは、約２００〜３００ｍｇ／ｄＬであった。２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５の投与は、６日目に、血中トリグリセリドレベルを約１５０ｍｇ／ｄＬに有意に低下させた。５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでのＮＴ−４／５はさらに、６日目に、この血中トリグリセリドレベルを約１００ｍｇ／ｄＬ以下に低下させた。対照的に、ＮＴ−４／５処置マウスの血中コレステロールレベルは、基底レベルのままであった。
【０１９８】
別の実験において、ビヒクル（ＰＢＳ）または２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは２０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５を、２週間毎日、ｄｂ／ｄｂマウスに皮下注射した。１４日目に、ビヒクルのコントロール群と比較して、全てのＮＴ−４／５処置群において、トリグリセリドレベルの有意な低下を観察した。
【０１９９】
（２．ｄｂ／ｄｂマウスの食餌摂取量および体重に対するＮＴ−４／５の用量応答）
処置の２日前（Ｔ−１）から６日目（Ｔ６）に、マウスの個々の食餌摂取量を毎日測定した。測定の結果を図７および表１５に示す。個々の体重もまた、処置前６日（Ｔ−５）から７日目（Ｔ７）まで、毎日測定した。測定の結果を図８Ａおよび表１６に示す。体重変化率もまた図８Ｂにおいて計算およびプロットし、そして表１７にまとめた。
【０２００】
【表１５】
2007523196.tif 000016
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
＊ビヒクル群と比較した場合にＰ＜０．０５
＊＊Ｐ＜０．０１
＊＊＊Ｐ＜０．００１
【０２０１】
【表１６】
2007523196.tif 000017
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
＊ビヒクル群と比較した場合にＰ＜０．０５
＊＊Ｐ＜０．０１
＊＊＊Ｐ＜０．００１
【０２０２】
【表１７】
2007523196.tif 000018
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
＊Ｐ＜０．０５
＊＊Ｐ＜０．０１
＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２０３】
ＮＴ−４／５処置マウスの食餌摂取量は、ＮＴ−４／５処置の初日に既に有意に低下し、そしてこの低下は実験期間の終了まで継続した。２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５による処置は、ビヒクルと比較して、食餌摂取量を有意に低下させた。同様に、処置マウスの体重は、処置の３日目に減少し始め、そしてこの減少は実験期間の終了まで継続した。図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、ビヒクルと比較して、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでのＮＴ−４／５よる処置は、体重を有意に低下させた。
【０２０４】
メスｄｂ／ｄｂマウス（１２週齢）を４つの群に分け、そしてこれらにビヒクル（ＰＢＳ）または２ｍｇ／ｋｇ用量、５ｍｇ／ｋｇ用量もしくは１０ｍｇ／ｋｇ用量のＮＴ−４／５を、０日目から４日目まで毎日、次いで８日目、１１日目、１５日目、１８日目、２２日目、２５日目および２９日目に皮下注射した。ＮＴ−４／５の投与は、用量依存様式で体重を減少させた。さらに、全ての処置群中、ＮＴ−４／５における体重は、処置期間の間、減少し続けた。３１日目に、５ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５注射群および１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５注射群において、約２０％の体重減少を観察した。
【０２０５】
メスｄｂ／ｄｂマウス（１２週齢）を３つの群に分け、そしてこれらにビヒクル（ＰＢＳ）または５ｍｇ／ｋｇ用量または２０ｍｇ／ｋｇ用量のＮＴ−４／５を、１日目から３０日目まで毎日皮下注射した。ＮＴ−４／５の投与は、用量依存様式で体重を減少させた。２０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５投与の１０日後に、食餌摂取量をビヒクル群の約２０％のレベルに低下させ、そしてこのレベルを３０日目まで持続した。食餌摂取量は、処置停止の約１２日後に、ビヒクル群とほぼ同じレベルに戻った。
【０２０６】
（実施例３：多遺伝子性肥満マウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における炭水化物代謝および体重ホメオスタシスに対するＮＴ−４／５の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｌｅｉｔｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３（補遺１）：Ｓ４−Ｓ１１、２００４を参照のこと）より入手した、９週齢の２８〜３５ｇの範囲の体重の１９匹のオスＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満かつ糖尿病のマウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および照射済みのペレット状実験用飼料（ＰＵＲＩＮＡ）に自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２０７】
（ＮＴ−４／５の投与）
ＮＴ−４／５を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．より取得した。
【０２０８】
これらのマウスを、同等な体重分布および同等な基底のグルコース分布の３つの群（１群あたり６〜７匹のマウス）に分けた。各々の群は、１日目〜５日目、次いで８日目〜１１日目まで、ビヒクル、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５または１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５のいずれかの１日皮下投与量を受けた。基底のレベルの血中グルコースおよび血中トリグリセリドを決定するため、先に記載したように、処置開始の７日前（−７日目）に血液サンプルをマウスから収集した。処置開始後、血液サンプルを毎週収集し、先の実施例において記載したように、グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルを決定した。体重および食餌摂取量を実験期間全体にわたって、１週間に５日、モニタリングした。
【０２０９】
（Ｂ．結果）
図９に示されるように、ＮＴ−４／５は、非飢餓状態の血中グルコースレベルを低下させ（図９Ａ）、そしてこれらのＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスにおいて、ＨｂＡ１ｃレベルによって示されるように用量依存様式で、長期の血糖値制御の向上を示した（図９Ｂ）。ＮＴ−４／５はまた、用量依存様式で、ＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスの体重を減少させ（図１０Ａ）そして食餌摂取量を低下させた（図１０Ｂ）。処置を完了した３０日後であっても、リバウンドの過食もリバウンドの体重増加／オーバーシュートも観察しなかった。
【０２１０】
また、同じ型のマウスに対して、ビヒクル（ＰＢＳ）およびＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ）の１日目および５日目での静脈内注射による実験を実施した。２日目と１５日目との間に、ＮＴ−４／５処置群とビヒクル群との間で約５％〜約１０％の体重減少を観察した。この実験は、有意な体重減少が、ＮＴ−４／５の２つの異なる（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）静脈内投与量の１０日後まで維持され得ることを示す。
【０２１１】
（実施例４．多遺伝子性肥満マウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における、脂質代謝、体重ホメオスタシス、食餌摂取量、水摂取量、電解質平衡、および内分泌機能に対するＮＴ−４／５の効果）
（試験動物）
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手した、１０週齢の２６〜３２ｇの範囲の体重の４０匹のオスＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および照射済みのペレット状実験用飼料（ＰＵＲＩＮＡ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２１２】
（ＮＴ−４／５の投与）
米国特許第６，１８４，３６０号に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＮＴ−４／５を作製した。これらのマウスを、同等な体重分布および同等な基底の血中グルコース分布の６つの群（１群あたり６〜７匹のマウス）に分けた。各々の群は、１日目〜５日目、次いで８日目〜１１日目まで、ビヒクル、３ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、１ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、０．３ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、または０．１ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５のいずれかの１日皮下投与量を受けた。「対として給餌した（ｐａｉｒｅｄ−ｆｅｄ）」コントロール群は、ビヒクルの毎日の注射を受けたが、３ｍｇ／ｋｇ群がその前日に摂取した量と同量の食餌を給餌したのみであった。処置が開始した日（１日目）に、グルコースおよびトリグリセリドを測定するために、基底の血液サンプルを収集した。トリグリセリドレベルを１０日目に測定した。この研究の終了時（１２日目）に、最終の血液サンプルを収集して、グルコースレベル、トリグリセリドレベル、電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）レベル、テストステロンレベル、コルチコステロンレベル、甲状腺ホルモン（全部のＴ４）レベルおよび甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レベルを決定した。血清サンプルの電解質レベル、遊離テストステロンレベル、Ｔ４レベルおよびＴＳＨレベルを、ＡｎｉＬｙｔｉｃｓ（Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ、Ｍ．Ｄ）によって、この製造供給元により使用される標準プロトコルに従って、測定した。他の分析物を、上記のように測定した。体重、食餌摂取量を、研究全体にわたって、１週間に５日、モニタリングした。１日の水摂取量を、５日目〜７日目に測定した。
【０２１３】
（Ｂ．結果）
表１８に示されるように、毎日の皮下のＮＴ−４／５注射は、非飢餓状態の血中トリグリセリドレベル有意に低下させた。注目すべきことに、ＮＴ−４／５の１日の最低皮下投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）でさえも、ＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスにおける非飢餓状態の血中トリグリセリドレベルを有意に低下させた。
【０２１４】
【表１８】
2007523196.tif 000019
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
ビヒクル群と比較した場合に＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【０２１５】
表１９および表２０に示されるように、ＮＴ−４／５注射はまた、用量依存様式で、ＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスの体重（表１９）および食餌摂取量（表２０）を低下させた。３ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５で処置したマウスは、ビヒクルコントロールと比較して約１０％の体重減少を示し、そして１ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５で処置したマウスは、約５％の体重減少を示した。しかしながら、３ｍｇ／ｋｇの群のみが食餌摂取量の有意な低下を示したが、１ｍｇ／ｋｇの群は示さなかった。対として給餌した群のマウスは、最終的に、３ｍｇ／ｋｇの群と極めて同等な量の食餌を摂食し、そして依然として、ビヒクルコントロールと比較して約５％の体重を減少したのみであった。
【０２１６】
【表１９】
2007523196.tif 000020
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
ビヒクル群と比較した場合に、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２１７】
【表２０】
2007523196.tif 000021
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
ビヒクル群と比較した場合に、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【０２１８】
水摂取量、電解質平衡および内分泌機能に対するＮＴ−４／５処置の効果もまた試験した。水摂取量を、５日目〜７日目に測定した。電解質（すなわち、Ｎａ、Ｋ、およびＣｌ）濃度を、１２日目に採取した最終血液サンプルを使用して測定した。ＮＴ−４／５処置（水摂取量試験について、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ；ならびにＮａ、ＫおよびＣｌの濃度試験について、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）も、対として給餌した群のいずれも、これらのいずれの測定におけるビヒクル群との、統計上有意な差異を示さなかった。一元ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を、統計分析のために使用した。
【０２１９】
１日あたり３ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５で処置した群において、全部のチロキシンＴ４を有意に低下させた（約３３％、しかし依然として正常範囲内であった）が、対として給餌した群も１ｍｇ／ｋｇ処置群も低下させなかった（一元ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの事後検定）。いずれの実験群においても、ビヒクルコントロールと比較して、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レベルの変化はなかった（一元ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの事後検定）。
【０２２０】
さらに、ＮＴ−４／５処置（０．１〜３ｍｇ／ｋｇ／日）は、実験終了時（１２日目）、血清コルチコステロンレベルおよびテストステロンレベルを有意に変化させなかった。しかしながら、対として給餌した群のコルチコステロンレベルは、ビヒクル群と比較した場合に約３倍まで有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。一元ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を、統計分析に使用した。このことは、対として給餌した群が常に半飢餓ストレスの状態であったが、ＮＴ−４／５処置群のいずれもその状態ではなかったという可能性と一致する。
【０２２１】
（実施例５．高脂肪食誘導性肥満マウスにおける、炭水化物、脂質および体重ホメオスタシスに対するＮＴ−４／５の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手した、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を患うマウスを、本研究に使用した。Ｅｌ−Ｈａｓｃｈｉｍｉ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１８２７−１８３２（２０００）；Ｓｔｅｐｐａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３０７−３１２（２００１）。２３匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、４週齢で離乳させた。離乳後直ちに、これらのマウスを約５８％の高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）で研究期間全体にわたって太らせた。１３週齢の２８〜４０ｇの範囲の体重のＤＩＯマウスを、本研究に使用した。２２〜２４週齢の年長マウスもまた使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および５８％高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２２２】
（ＮＴ−４／５の投与）
本研究で使用したＮＴ−４／５を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈより取得した。これらのマウスを、同等な体重分布および同等な基底の血中グルコース分布の３つの群（１群あたり７〜８匹のマウス）に分けた。各々の群は、それぞれ、１日目〜５日目、８日目〜１２日目、１５日目〜１６日目に、ビヒクル、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、または１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５のいずれかの１日皮下投与量を受けた。処置開始の５日前（−５日目）、グルコースおよびトリグリセリドを測定するために、基底の血液サンプルを収集した。処置開始（１日目）に続いて、血中グルコースおよび血中トリグリセリドを週に１回測定した。体重、食餌摂取量を、本研究全体を通して週に５日、モニタリングした。５７〜５９日目に、ＤＩＯマウスは、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５または１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５の毎日の注射をそれぞれ受けた。これらマウスは、一晩（約１６時間）飢餓させた後、飢餓状態のグルコースレベルを測定し、そして体重１ｋｇあたりグルコース２ｇの負荷で、経口グルコース寛容試験を行った。
【０２２３】
（Ｂ．結果）
ＮＴ−４／５の投与（２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、用量依存様式で、ＤＩＯマウスの体重（図１１Ａ）および食餌摂取量（図１１Ｂ）を有意に低下させた（Ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ）。ＮＴ−４／５の投与（２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、糖尿病性ではない若齢（１２〜１６週齢）のＤＩＯマウスの、非飢餓状態のグルコースレベルにも非飢餓状態のトリグリセリドレベルにも影響を与えなかった。しかしながら、図１２に示されるように、ＮＴ−４／５の投与（２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、老齢（２２〜２４週齢）のＤＩＯマウスにおいて、これら動物が顕性糖尿病を発症した場合に、飢餓状態のグルコースレベルを有意に低下させ、そしてグルコース寛容を改善した。二元ＡＮＯＶＡ、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を統計分析のために使用した。また、別の研究において、１日目および４日目におけるＮＴ−４／５の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（５ｍｇ／ｋｇ）後に約５％の体重減少を観察し、そしてこの体重減少を、２回目の投与量を接種した後、少なくとも１０日間維持した。
【０２２４】
（実施例６．多遺伝子性肥満マウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における炭水化物、脂質および体重ホメオスタシスに対するペグ化ＮＴ−４／５システイン変異体の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
１０週齢の２７〜３２ｇの範囲の体重の３０匹のオスＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および照射済みのペレット状実験用飼料（ＰＵＲＩＮＡ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２２５】
（ペグ化ＮＴ−４／５（Ｓ５０Ｃ）の作製方法）
本研究において使用した天然型ＮＴ−４／５を、米国特許第６，１８４，３６０号に記載される方法に従って作製した。また、部位特異的にペグ化したＮＴ−４／５を作製した。ＴｒｋＢのドメイン５との複合体におけるＮＴ−４／５の構造を調査して、ＰＥＧ結合部位を形成するため、表面上の利用可能であり、かつ天然のジスルフィド結合を妨害する可能性のなく、そしてまたＮＴ−４／５のモノマーサブユニットとＴｒｋＢドメイン５との間の相互作用をいずれも妨害する可能性のないアミノ酸側鎖を見出した。調査に基づき、ＫＩＲＡアッセイにおけるＴｒｋＢとの機能性結合が、以下の単一システイン変異体について可能であることを見出した：Ｓ５０Ｃ、Ｑ１０５ＣおよびＥ６７Ｃ。次いで、成熟ヒトＮＴ−４／５配列の５０位におけるセリン残基をシステインに変更することによって、単一アミノ酸変異を導入し、ＮＴ−４／５の変異型（ＮＴ４−Ｓ５０Ｃ）を生じるか；１０５位におけるアスパラギン酸残基をシステインに変更することによってか；または６７位におけるグルタミン酸残基をシステインに変更することによって、単一アミノ酸変異を導入した。変異体タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、可溶化し、抽出し、精製しそして天然のＮＴ−４／５のように再折りたたみさせた。再折りたたみしたＮＴ４−Ｓ５０Ｃ、ＮＴ４−Ｑ１０５ＣおよびＮＴ−４−Ｅ６７Ｃをペグ化するため、最初に、０．１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を用いた穏和な還元を実施した。５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ６）に対する透析によって過剰なＤＴＴを除去し、次いで５モル濃度の過剰なｍＰＥＧ−マレイミド（分子量１０，０００Ｄａ、ＳｕｎＢｉｏ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）をこのタンパク質と共に穏やかに撹拌しながら３７℃で数日間インキュベートした。ペグ化タンパク質、非ペグ化タンパク質および未反応のＰＥＧを、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ除去クロマトグラフィーを介して分離した。
【０２２６】
（ペグ化ＮＴ−４／５によるＴｒｋＢ特異的活性化のアッセイ）
ヒトＴｒｋＡを定常発現する細胞株、ヒトＴｒｋＢを定常発現する細胞株またはヒトＴｒｋＣを定常発現する細胞株を使用して、ＮＴ−４／５およびペグ化ＮＴ−４／５の機能活性（すなわち、レセプターのリン酸化）を、以前に記載されたように（Ｓａｄｉｃｋら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３４：３５４−３６１、１９９７）決定した。
【０２２７】
（ＮＴ−４／５およびペグ化ＮＴ−４／５の投与）
マウスを、同等な体重分布の４つの群（１群あたり７〜８匹のマウス）に分けた。各々の群は、それぞれ、ビヒクル単独、１ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、または１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃのいずれかの１回のみの用量を、本研究の初日（１日目）に受けた。最後の群は、１日目〜５日目、次いで７日目〜９日目に、１ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５の１日皮下投与量を受けた。処置開始後９日目に血液サンプルを収集し、血清グルコースレベルおよび血清トリグリセリドを決定した。体重および食餌摂取量を、本研究全体を通して週に５日、モニタリングした。
【０２２８】
（Ｂ．結果）
図１３に示されるように、天然のＮＴ−４／５およびＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃは、ＴｒｋＢ発現細胞株のレセプターのチロシンリン酸化を、用量依存様式で増加させた。しかし、天然のＮＴ−４／５およびＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃは、ｔｒｋＡ発現細胞株のレセプターのチロシンリン酸化もｔｒｋＣ発現細胞株のレセプターのチロシンリン酸化も増加させなかった。実験のコントロールとして、ＮＧＦはｔｒｋＡ発現細胞を活性化し、そしてＮＴ−３はｔｒｋＣ発現細胞を活性化した。
【０２２９】
図１４に示されるように、１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃの単回皮下注射は、食餌摂取量および体重を有意に低下させたが、野生型ＮＴ−４／５（ＷＴ  ＮＴ４）の単回皮下注射はそうではなかった。対照として、１ｍｇ／ｋｇのＷＴ  ＮＴ４の毎日の注射は、１日の食餌摂取量に影響を与えることなく、有意に体重を減少させた。しかしながら、１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃおよび野生型ＮＴ−４／５（ＷＴ  ＮＴ４）単回皮下注射は、血中グルコースレベルおよび血中トリグリセリドレベルを有意に低下させなかった。１ｍｇ／ｋｇの野生型ＮＴ−４／５の１日投与量は、血中グルコースレベル（Ｐ＜０．０５）および血中トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｄｅｒｉｄｅ）レベル（Ｐ＜０．０１）の両方を、有意に（平均して約５０％）低下させた。Ｄｕｎｎｅｔｔの検定に従った一元ＡＮＯＶＡを、統計分析のために使用した。
【０２３０】
ペグ化変異体ＮＴ−４／５（Ｑ１０５Ｃ）は、細胞ベースのアッセイにおいてＴｒｋＢレセプターアゴニスト活性を保持していた。しかしながら、これはインビボでは不活性であった（１週あたり２ｍｇ／ｋｇの注射をしたＮＯＮｃＮＺＯ−１０多遺伝子性肥満マウスに対して、体重にも食餌摂取量にもグルコースにもトリグリセリドにも効果なし）。また、ペグ化ＮＴ−４／５（Ｅ６７Ｃ）は、細胞ベースのアッセイにおいてＴｒｋＢレセプターを活性化させる場合に、活性であった。
【０２３１】
（実施例７．ｄｂ／ｄｂ一遺伝子性肥満マウスにおける、炭水化物、脂質および体重ホメオスタシスに対するペグ化ＮＴ−４／５の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
７週齢の２７〜３４ｇの範囲の体重の３０匹のメスｄｂ／ｄｂマウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および照射済みのペレット状実験用飼料（ＰＵＲＩＮＡ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２３２】
（ペグ化ＮＴ−４／５の作製方法）
成熟ヒトＮＴ−４／５配列の１位のグリシンからセリンへの変異を導入し、ＰＥＧ結合部位を形成するための変異型ＮＴ−４／５（ＮＴ４−Ｇ１Ｓ）を生じた。ＮＴ４−Ｇ１Ｓタンパク質を、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、可溶化し、抽出し、精製し、そして再折りたたみさせた。再折りたたみされたＮＴ４−Ｇ１Ｓを、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）で透析し、そして１．５モル濃度の過剰なメタ過ヨウ素酸ナトリウムで１０分間処理して、Ｎ末端のセリン（またはスレオニン）残基をアルデヒドに酸化した。３０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．５）に対する透析によって、残留する過ヨウ素酸塩を除去した。ＮＴ４−Ｇ１Ｓの正確な濃度を決定し、そして２〜４倍のモル濃度の過剰な２０Ｋ−ｍ−ＰＥＧ−ＨＺ（メトキシポリエチレングリコールヒドラジド）（分子量２０ｋＤａ、ＳｕｎＢｉｏ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）を添加した。この反応物を穏やかに撹拌しながら、３７℃で数日間インキュベートした。未結合のＰＥＧ、ペグ化ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび非ペグ化ＮＴ４−Ｇ１Ｓを、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ除去クロマトグラフィーを介して分離した。
【０２３３】
（ペグ化ＮＴ−４／５によるＴｒｋＢ特異的活性化のアッセイ）
ヒトＴｒｋＡを定常発現する細胞株、ヒトＴｒｋＢを定常発現する細胞株またはヒトＴｒｋＣを定常発現する細胞株を使用して、ＮＴ−４／５および異なる形態のペグ化ＮＴ−４／５の機能活性（すなわち、レセプターのリン酸化）を、以前に記載されたように（Ｓａｄｉｃｋら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３４：３５４−３６１、１９９７）決定した。
【０２３４】
（ＮＴ−４／５およびペグ化ＮＴ−４／５の投与）
野生型ＮＴ−４／５を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．より取得した。マウスを、同等な体重分布の５つの群（１群あたり６匹のマウス）に分けた。各々の群は、ビヒクル、５ｍｇ／ｋｇの上記のとおり作製したＮＴ−４／５、５ｍｇ／ｋｇの２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓ、または５ｍｇ／ｋｇの１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓのうちのいずれかの１回のみの用量を、本研究の初日（１日目）に受けた。２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓは、ＮＴ−４／５ダイマー中の各々のＮＴ−４／５モノマーに対して１つのＰＥＧ分子が結合体化されていることを表し、そして１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓは、ＮＴ−４／５ダイマー中の１つのモノマーのみに対して１つのＰＥＧ分子が結合体化されることを表す。２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓを、イオン交換によって分離した。処置開始の４日前（−４日目）、基底レベルの血清グルコースの決定のため、先に記載したようにマウスより血液サンプルを収集した。処置開始の４日後に、血清グルコースレベルを決定するため、血液サンプルを再度収集した。体重および食餌摂取量を、本研究全体を通して週に５日、モニタリングした。
【０２３５】
（Ｂ．結果）
図１５に示されるように、天然のＮＴ−４／５、２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓは、ＴｒｋＢ発現細胞株のレセプターのチロシンリン酸化を、用量依存様式で増加させた。しかし、天然のＮＴ−４／５、２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓは、ｔｒｋＡ発現細胞株のレセプターのチロシンリン酸化もｔｒｋＣ発現細胞株のレセプターのチロシンリン酸化も増加させなかった。実験のコントロールとして、ＮＧＦはｔｒｋＡ発現細胞を活性化し、そしてＮＴ−３はｔｒｋＣ発現細胞を活性化した。
【０２３６】
さらに、ペグ化ＮＴ−４／５は、インビボ半減期を延長した。図１６に示されるように、２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓの血清半減期は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける４ｍｇ／ｋｇの単回の皮下投与の後、７６４〜９６０分であると見積もられた。天然のＮＴ−４／５の半減期は、約４１〜５２分であった。２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓタンパク質の絶対レベルはまた、天然のＮＴ−４／５タンパク質の絶対レベルよりも、所定のいずれの時点においても数倍程度の量高かった。
【０２３７】
以下の表２１および表２２に示されるように、ＮＴ−４／５およびペグ化ＮＴ−４／５（２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓ）の単回の皮下注射は、ｄｂ／ｄｂマウスの体重増加および食餌摂取量を有意に低下させた。単回の５ｍｇ／ｋｇ用量のタンパク質を投与したメスｄｂ／ｄｂマウス使用したこの実験において、ＮＴ−４／５とペグ化ＮＴ−４／５との間に有意な差異はなかった。
【０２３８】
【表２１】
2007523196.tif 000022
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
ビヒクル群と比較した場合に
＊Ｐ＜０．０５
＊＊Ｐ＜０．０１
＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２３９】
【表２２】
2007523196.tif 000023
値は平均±標準誤差として表される。
統計：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定
ビヒクル群と比較した場合に
＊Ｐ＜０．０５
＊＊Ｐ＜０．０１
＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２４０】
図１７に示されるように、ＮＴ−４／５およびペグ化ＮＴ−４／５（２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓ）の単回の皮下注射は、４日後に、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて非飢餓状態の血清グルコースレベルを低下させる傾向を示した。しかしながら、グルコース低下の効力の相対的な欠如は、これらのｄｂ／ｄｂマウスが以前の研究において使用したマウスよりもずっと若齢であるという事実、およびこれらのマウスが本研究の開始時にまだ糖尿病でなかったという事実と関係付けられ得る。
【０２４１】
（実施例８．ＤＩＯマウスにおける体重ホメオスタシスおよび食餌摂取量に対するペグ化ＮＴ−４／５  対  野生型（ＷＴ）ＮＴ−４／５の差示的な効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を患うマウスを本研究において使用した。２９匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、４週齢で離乳させた。離乳後直ちに、これらマウスを、約５８％の高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）で研究期間全体にわたって太らせた。１３週齢の２８〜４０ｇの範囲の体重のＤＩＯマウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および５８％高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２４２】
（ＮＴ−４／５およびペグ化ＮＴ−４／５の投与）
ＮＴ−４／５をＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．より取得するか、または米国特許第６，１８４，３６０号に記載されるように作製した。ペグ化ＮＴ−４／５を、以下のように作製した：成熟ヒトＮＴ−４／５配列の１位のグリシンをセリンに変更することによって変異を導入し、変異型ＮＴ−４／５（ＮＴ４−Ｇ１Ｓ）を生じた。ＮＴ４−Ｇ１Ｓタンパク質を、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、可溶化し、抽出し、精製しそして再折りたたみした。再折りたたみしたＮＴ４−Ｇ１Ｓを５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）に対して透析し、そして１．５モル濃度の過剰なメタ過ヨウ素酸ナトリウムで１０分間処理して、Ｎ末端のセリン（またはスレオニン）残基をアルデヒドに酸化した。３０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．５）に対する透析によって、残留する過ヨウ素酸塩を除去した。ＮＴ４−Ｇ１Ｓの正確な濃度を決定し、そして２〜４倍のモル濃度の過剰な２０Ｋ−ｍ−ＰＥＧ−ＨＺ（メトキシポリエチレングリコールヒドラジド）を添加した。この反応物を穏やかに撹拌しながら、３７℃で数日間インキュベートした。非結合体化ＰＥＧ、ペグ化ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび非ペグ化ＮＴ４−Ｇ１Ｓを、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ除去クロマトグラフィーを介して分離した。
【０２４３】
マウスを、同等な体重分布および同等な基底の血中グルコース分布の３つの群（１群あたり７〜８匹のマウス）に分けた。各々の群は、それぞれ、ビヒクル、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、または２ｍｇ／ｋｇのペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５の４回（１日目、８日目、１５日目および２２日目）の毎週の静脈内投与量を受けた。体重および食餌摂取量を、本研究全体を通して週に５日、モニタリングした。
【０２４４】
（Ｂ．結果）
図１８に示されるように、処置群（野生型ＮＴ−４／５およびペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５の両方）の体重は、二元ＡＮＯＶＡ（Ｆ＝２０７．０１、Ｐ＜０．０００１）により有意に異なっていた。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定は、ＷＴ  ＮＴ−４／５群とビヒクルコントロール群との間（Ｐ＜０．００１、１６日目〜３８日目；Ｐ＜０．０１、４３日目；他の時点ではいずれも有意ではない）、ならびにペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５とビヒクルコントロールとの間（Ｐ＜０．０５、２〜３日目；Ｐ＜０．０１、４〜５日目；Ｐ＜０．０１、９日目〜１２日目；Ｐ＜０．０１、１６〜１８日目；Ｐ＜０．０５、２１日目および２２日目；Ｐ＜０．００１、２３〜２５日目；他の時点ではいずれも有意ではない）の、有意な対になった差異を示した。１回目の単回投与量のペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５は、体重を減少させるのにより効果的であった。体重の回復は、ペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５の各々の毎週の投薬の後、３〜４日以内に急速に生じた。対照的に、野生型（ＷＴ）ＮＴ−４／５の長期の毎週の投与は、より低い体重を維持するのにより効果的であった。
【０２４５】
図１９に示されるように、処置群の食餌摂取量は、二元ＡＮＯＶＡによって有意に異なっていた（Ｆ＝１１．６２、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定は、各々の処置群とビヒクルコントロール群との間（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１、グラフ中に示されるとおり）の、有意な対になった差異を示した。１回目の単回投与量のペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５は、ＷＴ  ＮＴ−４／５よりも、食餌摂取量を低下させるのにより効果的であった。
【０２４６】
（実施例９．ＤＩＯマウスにおける呼吸商および身体組成に対するＷＴ  ＮＴ−４／５の毎日の皮下投与の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を患うマウスを本研究において使用した。２９匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、４週齢で離乳させた。離乳後直ちに、これらのマウスを、５８％の高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）で研究期間全体にわたって太らせた。１３週齢の２８〜４０ｇの範囲の体重のＤＩＯマウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および５８％高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２４７】
（ＮＴ−４／５の投与）
ＮＴ−４／５をＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．より取得するか、または米国特許第６，１８４，３６０号に記載されるように作製した。マウスを、同等な体重分布の２つの群（１群あたり８匹のマウス）に分けた。これらのマウスを個別に、包括的ケージモニタリングシステム（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｇｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＣＣＭＳ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において、間接的な熱量測定のための準備として、２日間馴化させ、その後処置を開始した。各々の群は、それぞれ、ビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５のいずれかの１日皮下投与量を５回受けた。体重および食餌摂取量を、本研究全体を通して週に５日、モニタリングした。ＣＣＭＳモニタリング、ならびに酸素消費量および二酸化炭素産出量のデータ分析を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ０１２．ｈｔｍｌに説明される、公開されそして通常受容されているプロトコルに従って、実行した。処置開始前（０日目）と処置最終日（５日目）との両方において、ソフトウェアバージョン１．４６を使用したＰＩＸＩｍｕｓ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＧＥ  Ｌｕｎａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、身体組成（すなわち、除脂肪体重の割合、脂肪含量、および骨密度）を決定した。Ｂｒｏｍｍａｇｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２８５：４５４−４５９（２００３）。
【０２４８】
（Ｂ．結果）
図２０に示されるように、ＮＴ−４／５（１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射は、有意に（Ｐ＝０．００２５、スチューデントｔ−検定）呼吸商を低下させた（ＲＱ＝ＶＣＯ２／ＶＯ２、すなわちＣＣＭＳにより測定した、二酸化炭素産出量を酸素消費量で割った割合）。身体は、休眠状態において酸化のために脂肪（ＲＱ  約０．６７）および炭水化物（ＲＱ＝１）を主として使用するので、ＲＱのこの低下は、主要な燃料供給源として、炭水化物に対して、体脂肪（脂肪酸、トリグリセリドおよびコレステロールなど）の利用増加への移行を示す。
【０２４９】
図２１に示されるように、ＮＴ−４／５の毎日の皮下注射（１０ｍｇ／ｋｇ）は、体重（パネルＡ）、食餌摂取量（パネルＢ）および体脂肪含量（パネルＣ）を有意に低下させたが、除脂肪体重（パネルＤ）を低下させなかった。
【０２５０】
ＮＴ−４／５（１０ｍｇ／ｋｇ）処置群における骨密度を、ビヒクル群と比較した。ＮＴ−４／５処置群の骨塩密度は、０日目において０．５２３５±０．０１５８ｇ／ｃｍ２（平均±標準誤差）であり、そして５日目に０．５４５２±０．０１４２ｇ／ｃｍ２（平均±標準誤差）であった。ビヒクル群の骨塩密度は、０日目に０．５０７０±０．０２１０ｇ／ｃｍ２（平均±標準誤差）であり、そして５日目に０．４６９８±０．０１９８ｇ／ｃｍ２（平均±標準誤差）であった。５日目において、ＮＴ−４／５処置群の骨密度の差異は、ビヒクルの骨密度の差異とは有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５、二元ＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの検定）。ビヒクル群の骨密度の低下は、５日目にビヒクル処置群とＮＴ−４／５処置群との両方において見い出される、極度の高レベルの血清コルチコステロンによって確認されるように、５日にわたるＣＣＭＳにおける小さな閉鎖空間中で飼育されるストレスに起因する可能性があった。本研究は、ＮＴ−４／５処置が、食餌誘発性肥満の存在下におけるストレス誘発性の骨減少を防止することを示唆する。
【０２５１】
ＮＴ−４／５（１０ｍｇ／ｋｇ）処置群において、ビヒクルコントロール群と比較した場合、間接的な熱量測定（ｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ０１２．ｈｔｍｌ）によって測定される酸素消費率に基づいて、１日目〜５日目の見積もった累積エネルギー消費に、変化のないことを観察した。
【０２５２】
（実施例１０．ＤＩＯマウスの体重および食餌摂取量に対するＮＴ−４／５  対  ＢＤＮＦの異なる効力）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を患うマウスを本研究において使用した。２２匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、４週齢で離乳させた。離乳後直ちに、これらのマウスを、約５８％の高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）で研究期間全体にわたって太らせた。１３週齢の２８〜４０ｇの範囲の体重のＤＩＯマウスを、本研究に使用した。これらのマウスを、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および５８％高脂肪食（Ｄ１２３３１ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２５３】
（ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦの投与）
ＮＴ−４／５を、米国特許第６，１８４，３６０号に記載されるように作製した。組換えヒトＢＤＮＦを、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）より取得した。ＢＤＮＦ物質は、以下の２つの生物学的アッセイにおいて活性であることを製造供給元により試験された：（ａ）初代ラット基底前脳中隔培養物における、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導（ＥＤ５０＝２５〜５０ｎｇ／ｍＬ）、および（ｂ）ニワトリ胚の８日目の三叉ニューロンにおける神経突起成長の誘導（ＥＤ５０＝０．１〜１ｎｇ／ｍＬ）。
【０２５４】
マウスを、同等な体重分布の３つの群（１群あたり７〜８匹のマウス）に分けた。各々の群は、それぞれ、ビヒクル、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５または２ｍｇ／ｋｇのＢＤＮＦのいずれかの毎週の静脈投与を２回受けた。体重および食餌摂取量を、処置開始前の日（０日目）およびその後、毎日を基準として、記録した。
【０２５５】
（Ｂ．結果）
図２２に示されるように、ＮＴ−４／５（２ｍｇ／ｋｇ）の毎週の静脈内注射は、ＢＤＮＦ（２ｍｇ／ｋｇ）の毎週の注射よりも効果的に体重を減少させた。例えば、２日目に、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５は、体重を有意に減少させたが、２ｍｇ／ｋｇのＢＤＮＦは、体重を有意に減少しなかった。
【０２５６】
図２３に示されるように、ＮＴ−４／５（２ｍｇ／ｋｇ）の毎週の静脈注射は、ＢＤＮＦ（２ｍｇ／ｋｇ）の毎週の静脈注射よりも、食餌摂取量をより効果的に低下させた。例えば、２日目に、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５は、食餌摂取量を有意に低下させたが、２ｍｇ／ｋｇのＢＤＮＦは、食餌摂取量を有意に低下させなかった。
【０２５７】
（実施例１１．正常な痩躯マウスにおける体重および食餌摂取量に対するＷＴ  ＮＴ−４／５の活性）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
通常の食餌のマウスを本研究において使用した。１２週齢の２５〜３１ｇの体重のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス４０匹を、本研究全体にわたって、１２時間の明暗サイクルで、温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）を制御した部屋で、濾過した水道水および標準マウス食（６％脂肪食）を自由に摂取させながら、飼育した。動物施設での受領の際、これらのマウスを、フィルター付きキャップで覆われたケージ１つあたりに１匹収容し、そして少なくとも５日間の馴化期間、観察した。
【０２５８】
（ＮＴ−４／５の投与）
ＮＴ−４／５を、米国特許第６，１８４，３６０号に記載されるように作製した。マウスを、同等な基底の体重分布、同等な食餌摂取量分布および同等な非飢餓状態の血中グルコースレベル分布の５つの群（１群あたり８匹のマウス）に分けた。各々の群は、それぞれ、ビヒクル、１ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５、５ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５または１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５の１日皮下投与量を、１日目〜４日目に４回受けた。体重および食餌摂取量を、毎日を基準としてモニタリングした。非飢餓状態の血中グルコースを、先に記載されるように、１週間に１回（１日目および８日目）測定した。
【０２５９】
（Ｂ．結果）
図２４に示されるように、毎日の皮下注射のＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクルコントロール群と比較して、用量依存様式で体重を有意に減少させた。
【０２６０】
図２５に示されるように、毎日の皮下注射のＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクルコントロール群と比較して、用量依存様式で食餌摂取量を有意に低下させた。
【０２６１】
図２６に示されるように、毎日の皮下注射のＮＴ−４／５（２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクルコントロール群と比較して、用量依存様式で非飢餓状態の血中グルコースを有意に低下させた。
【０２６２】
血中トリグリセリドレベルもまた測定した。毎日の皮下注射のＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクルコントロール群と比較して、用量依存様式で血中トリグリセリドを有意に低下させた。
【０２６３】
また、メスＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて同様の実験を実施した。ビヒクルコントロール群と比較して、統計上有意な体重減少をまた、用量依存様式（２日目に、５ｍｇ／ｋｇに対して約８％、そして１０ｍｇ／ｋｇに対して約１１％）で観察した。
【０２６４】
（実施例１２．ｄｂ／ｄｂマウスの生存時間におけるＮＴ−４／５の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
実施例１に記載されるように維持したメスｄｂ／ｄｂマウスを、２つの群に分けた。群１（８匹のマウス）に、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与した。群２（６匹のマウス）の各々に、２０ｍｇ／ｋｇの用量のＮＴ−４／５を投与した。ビヒクルおよびＮＴ−４／５の両方を、１日目〜２６日目まで１日１回、皮下投与し、次いで生存にてついて経過観察した。死亡率は、開始時の体重の６０％より下への衰弱（すなわち、約４０ｇからの約２４ｇへの低下）によってか、または自然死によって（先に起こるのがどちらでもよい）定義される。
【０２６５】
（Ｂ．結果）
図２７に示されるように、ＮＴ−４／５（２０ｍｇ／ｋｇ）群についての生存の中央値の長さは２５７日であり（ｎ＝６）、一方、ビヒクルコントロール群についての生存の中央値の長さは１９２．５日であった（ｎ＝８）。この６５日の差異は、統計上有意ではない（Ｌｏｇｒａｎｋ検定、χ二乗＝２．２６、Ｐ＝０．１３３１）。なぜなら、おそらく試験した動物の数が十分に大きくないからである。
【０２６６】
（実施例１３．疼痛に対するＮＴ−４／５投与の効果）
ＮＴ−４／５投与後に動物モデルにおいてＮＴ−４／５が疼痛を誘発するかどうかを試験するために、試験のため熱／温度痛覚過敏の動物を使用した。成体オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒより）に、ビヒクル（ＰＢＳ）、ＮＧＦ（２ｍｇ／ｋｇ）、またはＮＴ−４／５（２ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。次いで、定常放射熱源に反応して脚を引っ込めるための待ち時間を測定した。Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４８：５０１−５０５（１９９７）；Ｓｈｕら、Ｐａｉｎ  ８０：４６３−４７０（１９９９）を参照のこと。ビヒクル群とＮＴ−４／５処置群とにおいて、投与の３時間後、５時間後および２４時間後、定常放射熱源に反応して脚を引っ込めるための待ち時間の統計上有意な変化を観察しなかった。しかしながら、ＮＧＦ処置群は、投与の３時間後、５時間後および２４時間後、待ち時間の低下について低下（約４０％〜５０％）を示した。これらのデータは、これらの動物において、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５がＮＧＦとは異なり疼痛を引き起こさなかったことを示す。
【０２６７】
（実施例１４．長期グルコース制御に対するＮＴ−４／５の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
実施例１に記載されるように維持したｄｂ／ｄｂマウスを、５つの群（群１〜群５）に分けた。群１にビヒクル（ＰＢＳ）を投与した。群２、群３、群４、群５の各々に、それぞれ２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量のＮＴ−４／５を投与した。ビヒクルおよびＮＴ−４／５の両方を、各々の群のマウスに、１日目〜２６日目まで１日１回皮下投与した。処置を開始する１日前（０日目）、先に記載されるように、血清の生物マーカー（グルコースおよびインスリン）の基底レベルの決定のため、マウスから血液サンプルを収集した。４５日目に、ＨｂＡ１ｃレベルを測定した。５４日目（ＮＴ−４／５処置の最終投与の２８日後）にグルコース寛容試験を実施した。マウスを一晩（１６時間）飢餓状態にし、その後そのマウスに体重１ｋｇあたり２ｇのグルコースのＩＰ注射を施すことによって、腹腔内（ＩＰ）グルコース寛容試験を行った。血清グルコースおよび血清インスリンもまた測定した。
【０２６８】
（結果）
図２８のパネルＡに示されるように、（２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇ）のＮＴ−４／５処置群におけるＨｂＡ１ｃレベルは、１日目〜２６日目までの毎日のｓｃ注射後の４５日目（投与の１５日後）に、ビヒクル群よりも有意に低かった。図２８のパネルＢは、ＮＴ−４／５処置がグルコース寛容を有意に向上させたことを示す。図２８のパネルＣに示されるように、全ての処置群に対するＮＴ−４／５処置後に、非飢餓状態の血清グルコースレベルを５０％より多く低下させ、そして２９日目まで低いままであった。図２８のパネルＤは、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＮＴ−４／５処置群（６日目、Ｐ＜０．０５）および２０ｍｇ／ｋｇ／日のＮＴ−４／５処置群（６日目および１４日目、Ｐ＜０．０５）による、血清インスリンレベルの有意な低下を示す。これらのデータは、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、ＮＴ−４／５が長期グルコース制御を向上させたことを示す。
【０２６９】
（実施例１５．肥満、糖尿病マウスモデルにおけるＮＴ４／５の生物学的活性に対する、マウスモノクローナルＮＴ４／５抗体Ｍａｂ１２４１とＮＴ４／５との同時投与の効果）
（Ａ．実験プロトコル）
（試験動物）
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより取得したレプチンレセプター変異体ｄｂ／ｄｂマウス（ＢＳＫ．Ｃｇ−ｍ＋／＋  Ｌｅｐｒｄｂ）３２匹を、本研究に使用した。これらのマウスを、乱数表に基づき、相同な初期体重および血糖値を有する各々８匹の動物の４つの群（群１〜群４）に分けた。これらのマウスを、ケージにつき１匹で飼育した。
【０２７０】
（抗ＮＴ４／５およびＮＴ４／５）
抗ＮＴ４／５モノクローナル抗体Ｍａｂ１２４１およびヒトＮＴ４／５の両方を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈより取得した。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイに従って、Ｍａｂ１２４１の一価のＦａｂフラグメントとＮＴ４／５との間の結合親和性は１７０ｎＭであり、ｋｏｎ＝２．２×１０５Ｍ−１ｓ−１であり、ｋｏｆｆ＝０．０３９ｓ−１であった。このＭａｂ１２４１Ｆａｂフラグメントは、表面プラズモン共鳴ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、ＮＴ４／５がヒトＴｒｋＢレセプターに結合する能力を妨害しない（データは示さず）。
【０２７１】
（Ｍａｂ１２４１およびＮＴ４／５の投与）
１日目に、群１〜群４のマウスに、それぞれ、ビヒクル（ＰＢＳ）を皮下（ｓ．ｃ．）に、５ｍｇ／ｋｇのＭａｂ１２４１を腹腔内（ｉ．ｐ．）に、５ｍｇ／ｋｇのＭａｂ１２４１を腹腔内（ｉ．ｐ．）かつ２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５を皮下（ｓ．ｃ．）に、そして２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５を皮下（ｓ．ｃ．）に、処置した。２日目〜５日目に、群１を、ビヒクル（ＰＢＳ）の１日投与量を皮下（ｓ．ｃ．）に処置した。群３および群４を、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５の１日投与量を皮下（ｓ．ｃ．）に処置した。
【０２７２】
（分析のためのサンプルの収集）
処置の開始１日前（０日目）に、非飢餓状態のマウスの体重を量り、そしてイソフルラン麻酔の下で後方眼窩叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）より血液サンプルを収集した（マウス１匹あたり約３００μｌ）。基底の非飢餓状態の血中グルコースレベルを、尾部血液から、Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａグルコースメーターによって測定した。
【０２７３】
（Ｂ．結果）
（体重に対する効果）
各々の群のマウスの体重を、１日目からはじめて１日おきに測定し、そして結果を図２７Ａにグラフで示す。この図に示されるように、１日目〜５日目の毎日の２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５の処置は、小さいが統計上有意な体重減少を生じた。Ｍａｂ１２４１の単独注射は、体重に対して効果を有さなかった。対照的に、１日目の、１日あたり２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５とＭａｂ１２４１の単回注射との同時処置は、５日目および８日目に有意な体重減少を誘導した。ビヒクルコントロール群に対する各々の処置について、二元ＡＮＯＶＡと、Ｂｏｎｆｅｒｒｉｏｎｉ事後検定により対でになった比較とを、統計分析のために使用した。
【０２７４】
（食餌摂取量に対する効果）
各々の群のマウスの食餌摂取量を、１日目から始めて１日おきに測定し、そして結果を図２７Ｂにグラフで示す。この図に示されるように、１日目〜５日目の毎日の２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５の処置は、８日目および１０日目に食餌摂取量を有意に低下させた。しかしながら、Ｍａｂの同時処置は、２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５単独により誘導された食餌摂取量の効果を、有意には変更しなかった。ビヒクルコントロール群に対する各々の処置について、二元ＡＮＯＶＡを、Ｂｏｎｆｅｒｒｉｏｎｉの事後検定により対で比較して、統計分析のために使用した。
【０２７５】
（グルコースレベルに対する効果）
マウスの血中グルコースレベルを、上記の方法を使用して、１日目、４日目および９日目にアッセイした。これらの結果を図２７Ｃにグラフで表す。この図に示されるように、１日目〜５日目の毎日の２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５の処置は、９日目のみに非飢餓状態のグルコースレベルを低下させたが、４日目には低下させなかった。対照的に、毎日の２ｍｇ／ｋｇのＮＴ４／５および１日目のＭａｂ１２４１の単回注射の同時処置は、４日目には非飢餓状態のグルコースレベルを低下させた。同時処置群のグルコースレベルは、９日目には、ビヒクル群よりも有意に低いままであった。ビヒクルコントロール群に対する各々の処置について、二元ＡＮＯＶＡを、Ｂｏｎｆｅｒｒｉｏｎｉの事後検定により対で比較して、統計分析に使用した。
【０２７６】
（Ｃ．結論）
本実験は、低親和性のＮＴ４／５抗体Ｍａｂ１２４１の同時投与が、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて体重および血中グルコースレベルを制御することに関して、ＮＴ４／５タンパク質の毎日の投薬の治療効力を有意に増強することを、実証する。
【０２７７】
本明細書中に記載される実施例および実施形態が例示の目的のみのためであること、およびこれらに照らして種々の改変または変更が当業者に示唆され、これらの改変または変更が本発明の精神および範囲内に包含され得ることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願の各々が、参考として援用されることが具体的かつ別個に示される場合と同じ範囲まで、全ての目的のためそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１】図１は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルに対するＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。血中グルコースレベルは、平均±ＳＥＭ（ｎＭ）として表現される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、血中グルコース濃度（ｍＭ）に対応する。
【図２】図２は、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＨｂＡ１ｃレベルに対するＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。ＨｂＡ１ｃ値は、平均±ＳＥＭ（％）として表現される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、ＨｂＡ１ｃ（％）に対応する。
【図３】図３は、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるインスリン抵抗性に対するＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。血中インスリンレベルは、平均±ＳＥＭ（ｎＭ）として表現される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、インスリンレベル（ｎＭ）に対応する。
【図４】図４は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける肥満に対するＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。体重は、平均±ＳＥＭ（ｇ）として表現される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、体重（ｇ）に対応する。
【図５】図５は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける食物摂取に対するＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。食物摂取は、平均±ＳＥＭ（ｇ／ｋｇ／日）として表現される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、食物摂取（ｇ／ｋｇ／日）に対応する。
【図６】図６Ａは、Ｔ０（ベースライン、左）およびＴ６（右）において種々の用量のＮＴ−４／５で処置されたｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルを示すグラフである。Ｘ軸は、ＮＴ−４／５の用量（ｍｇ／ｋｇ）に対応し、Ｙ軸は、血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）に対応する。図６Ｂは、Ｔ０（ベースライン、左）およびＴ６（右）において種々の用量のＮＴ−４／５で処置されたｄｂ／ｄｂマウスにおける血中トリグリセリドレベルを示すグラフである。Ｘ軸は、ＮＴ−４／５の用量（ｍｇ／ｋｇ）に対応し、Ｙ軸は、血中トリグリセリド濃度（ｍｇ／ｄＬ）に対応する。図６Ｃは、Ｔ０（ベースライン、左）およびＴ６（右）において種々の用量のＮＴ−４／５で処置されたｄｂ／ｄｂマウスにおける血中コレステロールレベルを示すグラフである。Ｘ軸は、ＮＴ−４／５の用量（ｍｇ／ｋｇ）に対応し、Ｙ軸は、血中コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）に対応する。
【図７】図７は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける食物摂取に対するＮＴ−４／５の用量反応を示すグラフである。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、食物摂取（ｇ）に対応する。種々の用量のＮＴ−４／５がグラフに示されている。
【図８】図８Ａは、ｄｂ／ｄｂマウスにおける体重に対する種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、体重（ｇ）に対応する。種々の用量のＮＴ−４／５がグラフに示されている。図８Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスにおける体重変化のパーセントに対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、ＮＴ−４／５処置マウスにおける体重変化のパーセントに対応する。種々の用量のＮＴ−４／５がグラフに示されている。
【図９】図９Ａは、多遺伝子性肥満および糖尿病のマウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における、非空腹時血中グルコースレベルに対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。Ｘ軸の黒色のバーは、処置期間を示す。「＊」は、ビヒクルと比較した場合のＰ＜０．０５の統計的有意差を示す；「＊＊」は、ビヒクルと比較した場合のＰ＜０．０１の統計的有意差を示す；そして、「＊＊＊」は、ビヒクルと比較した場合のＰ＜０．００１の統計的有意差を示す。統計分析のために、二元ＡＮＯＶＡ、その後にボンフェローニの事後検定を使用した。図９Ｂは、多遺伝子性肥満および糖尿病のマウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における、３０日でのＨｂＡ１ｃレベルに対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。統計分析のために、一元ＡＮＯＶＡ（Ｆ＝７．２４９、Ｐ＝０．００５７）、その後ダネット事後検定を使用した。Ｐ値は、グラフに示されるようなビヒクル群に対する。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、多遺伝子性肥満および糖尿病のマウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における、体重（図１０Ａ）および食物摂取（図１０Ｂ）に対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。Ｘ軸の黒色のバーは、処置期間を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、高脂肪食誘導性肥満マウス（ＤＩＯマウス）における、体重（図１１Ａ）および食物摂取（図１１Ｂ）に対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、糖尿病であった高脂肪食誘導性肥満マウス（ＤＩＯマウス）における、空腹時グルコース（図１２Ａ）および経口グルコース負荷（図１２Ｂ）に対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。空腹時グルコースレベル試験および経口グルコース負荷試験を、ＮＴ−４／５の３回の毎日投与の後、６０日目において行った。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、糖尿病であった高脂肪食誘導性肥満マウス（ＤＩＯマウス）における、空腹時グルコース（図１２Ａ）および経口グルコース寛容（図１２Ｂ）に対する、種々の投薬量のＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。空腹時グルコースレベル試験および経口グルコース負荷試験を、ＮＴ−４／５の３回の毎日投与の後、６０日目において行った。
【図１３】図１３は、種々の濃度のＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃ（Ｓ５０Ｃ．２）またはＮＴ−４／５による、ＴｒｋＢ発現細胞株におけるレセプターチロシンリン酸化を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、多遺伝子性肥満および糖尿病のマウス（ＮＯＮｃＮＺＯ−１０）における、１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃの単回皮下注射の、体重（図１４Ａ）および食物摂取（図１４Ｂ）に対する効果を示すグラフである。垂直矢印は、ＮＴ−４／５またはＰＥＧ−ＮＴ４−Ｓ５０Ｃのいずれかの単回注射の時間を示す。水平のバーは、野生型ＮＴ−４／５についての、毎日の皮下注射の期間を示す。統計分析のため、二元ＡＮＯＶＡ、その後にボンフェローニの事後検定が使用された。「＊」は、ビヒクルと比較した場合のＰ＜０．０５の統計的有意差を示す；「＊＊」は、ビヒクルと比較した場合のＰ＜０．０１の統計的有意差を示す；そして、「＊＊＊」は、ビヒクルと比較した場合のＰ＜０．００１の統計的有意差を示す。
【図１５】図１５は、種々の濃度の１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓ（Ｇ１Ｓ  １ＰＥＧ）、２ＰＥＧ−ＮＴ４−  Ｇ１Ｓ（Ｇ１Ｓ  ２ＰＥＧ）またはＮＴ−４／５による、ＴｒｋＢ発現細胞株におけるレセプターチロシンリン酸化を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける、２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１ＳおよびＮＴ−４／５（ＮＴ４）の、４ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与後での血清半減期を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける、非空腹時血清グルコースレベルに対する、Ｎ−４／５、２ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓおよび１ＰＥＧ−ＮＴ４−Ｇ１Ｓの単回皮下注射の効果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ＤＩＯマウスにおける、野生型（ＷＴ）ＮＴ−４／５（ＷＴ  ＮＴ４と称する）の毎週投与後の体重変化  対  ペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５（Ｐｅｇ  Ｇ１Ｓ  ＮＴ４と称する）の毎週投与後の体重変化を示すグラフである。これらのデータは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表すエラーバーとともに平均値を表す。処置群は、二元ＡＮＯＶＡ（Ｆ＝２０７．０１、Ｐ＜０．０００１）により有意に異なった。
【図１９】図１９は、ＤＩＯマウスにおける、野生型ＮＴ−４／５（ＷＴ  ＮＴ４と称する）の毎週投与後の食物摂取の変化  対  ペグ化Ｇ１Ｓ  ＮＴ−４／５（ＰＥＧ  ＮＴ４と称する）の毎週投与後の食物摂取の変化を示すグラフである。これらのデータは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表すエラーバーとともに平均値を表す。「＊」は、ビヒクルコントロール群と比較した場合の、対応する時点および処置の型についてのｐ＜０．０５を示し、そして「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。
【図２０】図２０は、ＤＩＯマウスにおける、ＮＴ−４／５（１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射の、呼吸商（ＲＱ＝Ｖｃｏ２／Ｖｏ２、すなわち、ＣＣＭＳによって測定された、酸素消費に対する二酸化炭素産生の比）に対する効果を示すグラフである。個々のデータ点が表されている（Ｐ＝０．００２５、スチューデントのｔ検定）。
【図２１】図２１は、ＤＩＯマウスにおける、ＮＴ−４／５（１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射の、体重（パネルＡ）、食物摂取（パネルＢ）、体脂肪含有量（パネルＣ）、および除脂肪体重（ｂｏｄｙ  ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）のパーセント（パネルＤ）に対する効果を示すグラフである。データは、ＳＥＭを表すエラーバーとともに平均値を表す。統計分析は、ボンフェローニの事後検定による対比較とともに、二元ＡＮＯＶＡによって行った（＊  Ｐ＜０．０５；＊＊  Ｐ＜０．０１；＊＊＊  Ｐ＜０．００１）。
【図２２】図２２は、ＤＩＯマウスにおける、ＮＴ−４／５（２ｍｇ／ｋｇ）およびＢＤＮＦ（２ｍｇ／ｋｇ）の毎週静脈内注射の体重に対する効果を示すグラフである。データは、ＳＥＭを表すエラーバーとともに平均値を表す。統計分析は、ボンフェローニの事後検定による対比較とともに、二元ＡＮＯＶＡによって行った。「＊」は、Ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示し、そして「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す（ビヒクルコントロール群と比較した場合の、対応する時点および処置の型について）。
【図２３】図２３は、ＤＩＯマウスにおける、ＮＴ−４／５（２ｍｇ／ｋｇ）およびＢＤＮＦ（２ｍｇ／ｋｇ）の毎週静脈内注射の食物摂取に対する効果を示すグラフである。データは、ＳＥＭを表すエラーバーとともに平均値を表す。統計分析は、ボンフェローニの事後検定による対比較とともに、二元ＡＮＯＶＡによって行った。「＊」は、Ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示し、そして「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す（ビヒクルコントロール群と比較した場合の、対応する時点および処置の型について）。
【図２４】図２４は、痩せ（ｌｅａｎ）オスＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射の、体重に対する効果を示すグラフである。データは、ＳＥＭを表すエラーバーとともに平均値を表す。統計分析は、ビヒクルコントロールに対する各処置のボンフェローニの事後検定による対比較とともに、二元ＡＮＯＶＡによって行った。「＊」は、Ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示し、そして「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す（ビヒクルコントロール群と比較した場合の、対応する時点および処置の型について）。
【図２５】図２５は、痩せオスＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射の、食物摂取に対する効果を示すグラフである。データは、ＳＥＭを表すエラーバーとともに平均値を表す。統計分析は、ビヒクルコントロールに対する各処置のボンフェローニの事後検定による対比較とともに、二元ＡＮＯＶＡによって行った。「＊」は、Ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示し、そして「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す（ビヒクルコントロール群と比較した場合の、対応する時点および処置の型について）。
【図２６】図２６は、痩せオスＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＮＴ−４／５（１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射の、非空腹時血中グルコースに対する効果を示すグラフである。データは、ＳＥＭを表すエラーバーとともに平均値を表す。統計分析は、ビヒクルコントロールに対する各処置のボンフェローニの事後検定による対比較とともに、二元ＡＮＯＶＡによって行った。「＊」は、Ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示し、そして「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す（ビヒクルコントロール群と比較した場合の、対応する時点および処置の型について）。
【図２７】図２７は、ｄｂ／ｄｂメスマウスにおける、ビヒクルコントロール群と比較した場合の、１日目〜２６日目までのＮＴ−４／５（２０ｍｇ／ｋｇ／日）の毎日の皮下注射後の生存パーセントを示すグラフである。
【図２８】図２８は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける、長期（１日目〜２６日目までの毎日の皮下注射）グルコース制御に対するＮＴ−４／５の効果を示すグラフである。パネルＡは、４５日目（ＮＴ−４／５投与後１５日目）におけるＨｂＡ１ｃのレベルを示す。パネルＢは、５４日目（ＮＴ−４／５投与後２８日目）に行われたグルコース負荷試験を示す。パネルＣは、０日目〜３０日目の血清グルコースレベルを示す。パネルＤは、０日目〜２０日目の血中インスリンレベルを示す。
【図２９】図２９Ａは、ｄｂ／ｄｂマウスにおける、ＮＴ４／５および／またはＭａｂ  １２４１の体重に対する効果を示すグラフである。体重は、平均±ＳＥＭ（ベースラインの％）として表される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の、統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、体重（ベースラインの％）に対応する。図２９Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスにおける、ＮＴ４／５および／またはＭａｂ  １２４１の食物摂取に対する効果を示すグラフである。食物摂取は、平均±ＳＥＭ（ｇ）として表される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の、統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、食物摂取（ｇ）に対応する。図２９Ｃは、ｄｂ／ｄｂマウスにおける、ＮＴ４／５および／またはＭａｂ  １２４１の血中グルコースレベルに対する効果を示すグラフである。血中グルコースレベルは、平均±ＳＥＭ（ｍｇ／ｄＬ）として表される。「＊」は、ビヒクルと比較した場合の、統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、食物摂取（ｇ）に対応する。Ｘ軸は、実験開始からの日数に対応し、Ｙ軸は、血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月6日(2007.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007523196000001.app
【国際調査報告】
2007523196.tif 000054
2007523196.tif 000055
2007523196.tif 000056