(57)【要約】  本発明は、置換活性化配列を含んで成る、新規の修飾されたコリン分子、又はそのフラグメントもしくは誘導体を提供する。修飾されたコリン分子は、置換活性化配列で切断され、それにより、天然に存在する野生型コリン分子の機能的活性を示す、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を生成する。修飾されたコリン分子は、種々の疫病又は障害、例えばうっ血性心不全及び急性心筋梗塞を処理するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換活性化配列を含んで成る、単離され、修飾されたコリン（corin）分子、又はそのフラグメントもしくは誘導体。
【請求項２】
前記修飾されたコリン分子が、細胞外ドメイン、又はそのフラグメントもしくは誘導体を含んで成る請求項１記載の単離された分子。
【請求項３】
前記細胞外ドメインが、セリンプロテアーゼ触媒ドメイン、並びにCRD1, LDLR1-5, CRD2, LDLR6-8及びSRCRから成る群から選択された少なくとも１つの追加のドメイン、又はそれらのフラグメントもしくは誘導体を含んで成る請求項２記載の単離された分子。
【請求項４】
前記細胞外ドメインが、セリンプロテアーゼ触媒ドメイン、並びにLDLR1-5, CRD2, LDLR6-8及びSRCRドメイン、又はそれらのフラグメントもしくは誘導体を含んで成る請求項３記載の単離された分子。
【請求項５】
前記置換活性化配列が、野生型ヒトコリン活性化配列RILGGを置換する請求項２記載の単離された分子。
【請求項６】
前記置換活性化配列が、DDDDKILGGである請求項２記載の単離された分子。
【請求項７】
前記置換活性化配列が、LKTPRVVGG (配列番号38), LKQARVVGG (配列番号39), DDDDKIVGG (配列番号40),及び DDDDKI (配列番号41)から成る群から選択される請求項２記載の単離された分子。
【請求項８】
前記置換活性化配列が、プロテアーゼにより認識され、そして切断される請求項２記載の単離された分子。
【請求項９】
前記置換活性化配列が、セリプロテアーゼにより認識され、そして切断される請求項２記載の単離された分子。
【請求項１０】
前記置換活性化配列が、タイプIIトランスメンブランプロテアーゼにより認識され、そして切断される請求項２記載の単離された分子。
【請求項１１】
前記置換活性化配列が、エンテロキナーゼにより認識され、そして切断されるDDDDKILGGである請求項２記載の単離された分子。
【請求項１２】
前記置換活性化配列が、トロンビン、第Xa凝固因子、フリン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、アエロシン、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（HAT）、肥満細胞トリプターゼ、MBL−結合セリンプロテアーゼ（MASP-1及びMASP-2）、ヘプシン、MT-SP1/マトリプターゼ、TMRRSS2又はスタブル−スタブロイド（Stubble-stubboid）により認識され、そして切断される請求項２記載の単離された分子。
【請求項１３】
シグナルペプチド配列をさらに含んで成る請求項２記載の単離された分子。
【請求項１４】
前記シグナルペプチド配列が、細菌、菌類、昆虫、植物又は動物である請求項13記載の単離された分子。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドが、IgKシグナル配列である請求項13記載の単離された分子。
【請求項１６】
エピトープ標識をさらに含んで成る請求項２記載の単離された分子。
【請求項１７】
前記エピトープ標識が、アミノ酸標識である請求項16記載の単離された分子。
【請求項１８】
前記エピトープ標識が、ヒスチジン(6xHis)又はシステインである請求項16記載の単離された分子。
【請求項１９】
前記エピトープ標識が、V5又はフラッグである請求項16記載の単離された分子。
【請求項２０】
原核生物又は真核生成物源からである請求項２記載の単離された分子。
【請求項２１】
前記真核生物が哺乳類である請求項20記載の単離された分子。
【請求項２２】
前記哺乳類が、ウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、魚類、羊、昆虫、サル又はヒト動物である請求項21記載の単離された分子。
【請求項２３】
プロテアーゼにより切断された置換活性化配列を含んで成る、活性化され、修飾されたコリン分子。
【請求項２４】
前記置換活性化配列が切断され、それにより、修飾され、活性化されたコリン分子を生成する請求項２記載の単離された分子。
【請求項２５】
請求項２又は24記載の修飾されたコリン分子をコードする単離された核酸分子。
【請求項２６】
請求項25記載の核酸分子に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る相補的核酸分子。
【請求項２７】
DNA又はRNAである請求項25記載の核酸分子。
【請求項２８】
ペプチド核酸分子（PNA）である請求項25記載の核酸分子。
【請求項２９】
ホスホロチオエート誘導体分子である請求項25記載の核酸分子。
【請求項３０】
放射性ラベル、酵素、発色団及び蛍光体から成る群から選択された化合物により検出できるシグナルを直接的に又は間接的に生成するためにラベルされる請求項25記載の核酸分子。
【請求項３１】
請求項25記載の核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項３２】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、BAC, YAC, PAC又はファゲミドである請求項31記載のベクター。
【請求項３３】
適切な宿主細胞に請求項31記載のベクターを含んで成る宿主ベクターシステム。
【請求項３４】
前記適切な宿主細胞が、原核又は真核細胞である請求項33記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３５】
前記原核細胞が、細菌細胞である請求項34記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３６】
前記真核細胞が、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞である請求項34記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３７】
医薬的に許容できる賦形剤及び治療的有効量の請求項２記載の単離され、修飾されたコリン分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項３８】
前記医薬賦形剤が、リン酸緩衝溶液、水、エマルジョン、油/水エマルジョン、湿潤剤、無菌溶液、賦形剤、澱粉、ミルク、糖、クレー、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸の塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、植物脂肪又は油、ガム及びグリコールから成る群から選択される請求項37記載の医薬組成物。
【請求項３９】
リポソーム、ポリマー組成物、又はポリマー微小球として配合される請求項38記載の医薬組成物。
【請求項４０】
錠剤、被覆された錠剤又はカプセルとして配合される請求項38記載の医薬組成物。
【請求項４１】
請求項２記載の単離された分子を含んで成るキット。
【請求項４２】
請求項25記載の核酸分子を含んで成るキット。
【請求項４３】
うっ血性心不全を保護するための方法であって、治療的有効量の請求項２記載の修飾されたコリン分子を投与し、ここで前記分子が血圧を高める方法。
【請求項４４】
高血圧症におけるうっ血性心不全、心臓肥大、心筋障害、心臓線維症、虚血性心疾患、心弁膜疾患、心筋炎、及び子癇前症を保護することである請求項43記載の方法。
【請求項４５】
治療的有効量の請求項２記載の分子を患者に投与することを含んで成る、前記患者におけるうっ血性心不全を予防し、そして処理するための方法。
【請求項４６】
配列番号34のアミノ酸配列から成る修飾されたコリン分子をコードする、配列番号33の核酸配列、及び治療的有効量の遺伝子治療ベクターを含んで成る遺伝子治療組成物。
【請求項４７】
LDLR1-5, CRD2, LDLR6-8, SRCR及びセリンプロテアーゼ触媒ドメイン、又はそれらのフラグメント又は誘導体を含んで成る、コリンの細胞外ドメイン又はそのフラグメントもしくは誘導体、及び置換活性化配列DDDDKILGGを含んで成る、修飾されたコリン分子。
【請求項４８】
前記修飾されたコリン分子が、配列番号34のアミノ酸配列を含んで成る請求項47記載の分子。
【請求項４９】
配列番号33記載の核酸配列を含んで成る、請求項48記載の分子をコードする単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、置換活性化配列（substitute activation sequence）を含んで成る、新規の修飾されたコリン分子又はそのフラグメントもしくは誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景：
セリンプロテアーゼは、種々の生物学的過程、例えば食物消化、ホルモンプロセッシング、血液凝固、補体活性化、創傷治癒及び胚増殖のために必須である（Davie, E. W.など. (1991) Biochemistry 30: 10463-10370; Kraut, J. (1977) Annu. Rev. Biochem. 46: 331-358; Neurath, H.(1986) J. Cell Biochem. 32: 35-49;及び Stroud,R. M. (1974) Sci. Am. 231-74-88）。ほとんどのトリプシン−様セリンプロテアーゼは、分泌されるタンパク質であるが、しかしそれらの細胞外C−末端でトリプシン−様プロテアーゼドメインを含むいくつかのタイプIIトランスメンブランタンパク質が記載されている（Hooper, J.D.など. (2001) J. Biol. Chem. 276: 857-860）。
【０００３】
コリン（corin）は、複数の構造的に異なったドメインから構成されるトリプシンスーパーファミリーのタイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼのメンバーである（Yan, W. など.(1999) J. Biol. Chem. 274: 14926-14935）。成熟コリンは、そのN−末端での細胞質末端、続いてトランスメンブランドメイン（TM、アミノ酸46−66）、縮れたような２個のシステインに富んでいるドメイン（CRD、アミノ酸134−259及び450−573）から構成される幹領域、８個の低密度リポタンパク質受容体反復体（LDLR、アミノ酸268−415及び579−690）、マクロファージスキャベンジャー受容体様ドメイン（SRCR−アミノ酸713−800）、及びそのC−末端でのセリンプロテアーゼ触媒ドメイン（CAT、アミノ酸802−1042）から成る1042個のアミノ酸ポリペプチドである（Yan、W. など（1999）前記）。
【０００４】
コリンの全体的トポロジーは、他のタイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼ、例えばヘプシン（Leytus, S.P. など. (1988)Biochemistty27 : 1067-1074）及びエンテロキナーゼ（Kitamoto, Y. など. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7588-7592）のトポロジーに類似するが、しかしながら、コリンにおけるドメイン構造体の組合せはユニークであると思われる。
【０００５】
コリンは２種のLDLR形（１つは５個の反復体を有し、そして他は３個の反復体を有する）、及び１つのSRCR形を含む。LDLR及びSRCR形はまた、他のタイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼ、例えばエンテロキナーゼ、マトリプターゼTMPRSS2−4にも見出される（Hooper, j. D. など. (2001)前記）。コリン、すなわち縮れたようなシステインに富んでいるドメインを含む、今日までの唯一のトリプシン−様セリンプロテアーゼは、２種のCRD反復体を有し、個々は、10個の保存されたシステイン残基を含む約120個の長さのアミノ酸である。コリンにおけるCRD、LDLR及びSRCR形の機能は定義されるべきである。
【０００６】
コリンのプロテアーゼ触媒ドメインは、トリプシン−様セリンプロテアーゼのドメインと相同である。コリンとプロカリクレイン（(Chung, D. W. など. (1986) Biochemistry 25 : 2410-2417）、第XI因子（Fujikawa, K.など. (1986) Biochemistry 25: 2417-2424）及びヘプシン（Leytus, S. P.など. (1988) 前記）との間のアミノ酸配列同一性は、38〜40％である。トリプシン−様セリンプロテアーゼの必須特徴、例えば触媒性三元体の残基His843, Asp892及びSer985、及び基質特異性ポケットを形成する残基Asp979、Gly1007及びGly1008は保存されている（Yan, W. など. (1999) 前記）。
【０００７】
コリンの基質特異性は、P1位置に基質性残基を好むことが予測される。配列Arg801-Ile802- Leu803-Gly804-Gly805, 又はRILGGは、保存される活性化切断部位を表わし、このことは、Arg801とIle802との間のペプチド結合のタンパク質分解が、触媒的活性のコリン酵素を生成するために必要とされることを示唆する。残基Cys790及びCys912の存在は、コリンの触媒ドメインが、Arg801での活性化切断の後、ジスルフィド結合による細胞表面に結合されたまま存続することを示唆する。インビボでの生理学的条件下でのコリンの活性化を担当する酵素は、未知である。
【０００８】
生来のコリンは、SDS−PAGE及びウェスターンブロット分析において約130kDaの主要バンドとして出現し（Hooper, J. D. など. (2001)前記）、これは、その細胞外ドメインに19個の可能性あるN−結合されたグリコシル化部位を含む組換えヒトコリンについての116kDaの計算された質量と一致する（Yan, W. など. (1999) 前記）。
【０００９】
心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ANP）及び脳タイプのナトリウム排泄増加性ペプチド（BNP）は、それぞれ心房及び心室において心筋細胞により主に生成される循環性ペプチドホルモンである（Levin, E. R.など. (1998) N. Engl. J. Med. 339: 321-328; Wilkins, M. R.など. (1997) Lancet 349 : 1307-1310）。標的器官、例えば腎臓及び抹消血管においては、それらのペプチドホルモンは、それらの受容体に結合し、そして受容体の固有のグアニル酸シクラーゼ活性を刺激し、細胞内cGMPの生成を導く。
【００１０】
ANP及びBNPの生物学的効果は、塩排泄を促進し、血液体積を低め、そして血管耐性を低め、それにより、血圧を低めることである（de Bold, A. J.など. (1981) Life Sci. 28: 89-94; Inagami, T. (1989) J. Biol. Chem. 264: 3043-3046; Brenner, B. M. など. (1990) Physiol. Rev. 70: 665-699; Rosenzweig, A. and Seidman, C. E. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60: 229-255; Wilkins, M. R. など. (1997) 前記; Stein, B. C. and Levin, R. l. (1998) Am. Heart J. 135: 914-923; Liang, F. など. (1997) J. Biol. Chem. 272: 28050-28056）。
【００１１】
BNPはまた、心臓における局部性抗線維症効果を有する（Tamura, N. など. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4239-4244）。正常血圧の維持におけるANP−介在性経路の生物学的重要性は、多くの研究において示されている。ノックアウトマウスにおいては、ANP又はその受容体のいずれかの欠乏は、自発的高血圧を導く（John, S. W. など. (1995) Science 267: 679- 681; John, S. W. など. (1996) Am. J. Physiol. 271: R109-R114 ; Lopez, M. J. など. (1995) Nature 378: 65-68）。
【００１２】
ANP及びBNPは、心筋においてプレ−プロ−ペプチドとして合成され、そしてタンパク質分解性切断がその前駆体を生物学的ペプチドホルモンに転換するために必要とされる（Shields, P. P. and Glembotski, C. C. (1988) J. Biol. Chem. 263: 8091-8098; Ito,T.など. (1988) Proc.Natl.Acad. Sci. USA85 : 8365-8369）。体積過負荷又は肥大性シグナルに応答して、心臓はそれらのホルモンの開放を高め、血液体積を減じ、そして血圧を低める。ANP及びBNPの高められた開放性は、プロ−ANP及びプロ−BNPの高められた合成に寄与している（McBride, K. and Nemer, M. (2001) Can. J. Physio. Pharmacol. 79: 673-681）。
【００１３】
心筋細胞においては、ANPは、126個アミノ酸のプレ−ペプチドとして合成される（Schwartz, D.など. (1985) Science 229: 397-400; Thibault, G.など. (1987) Biochem. J. 241: 265-272）。シグナルペプチドが除去された後、プロ−ANPは、細胞の密な顆粒に貯蔵される。その密な顆粒からの分泌に基づいて、プロ−ANPは、Arg98でのタンパク質分解性切断により心筋細胞の表面上で活性化され、N−末端プロ−ペプチド及び生物学的活性の成熟した26個のアミノ酸のC−末端ペプチドが生成される（Shields, P.P. and Glembotski, C. C. (1988) 前記; Ito,T. など (1988) supra）。
【００１４】
BNPはまた、プレ−プロ−ペプチドとして合成され、そして切断が、成熟活性ペプチドを生成するために必要とされる。プロ−BNPにおける活性化切断配列は、Arg76で存在するタンパク質切断を伴って、プロ−ANPのその配列に類似する。いくつかの研究は、心筋細胞の膜に結合される高分子量トリプシン−様酵素がプロ−ANPの活性化切断を担当することを示す（Seidah, N. G.など. (1986) Biosci. Rep. 6: 835-844; Imada, T.など. (1988) J. Biol. Chem. 263: 9515-9519 ; Sei, C. A.など. (1992)Mol. Endocrinol. 6: 309-319）。
【００１５】
コリンcDNAは、トリプシン−様プロテアーゼとの相同性を共有する、発現された配列標識（EST）についてゲノムデータベースを調べることによりまず同定され、そして続いて、ヒト心臓ライブラリーからクローン化された（Yan, W. など. (1999) 前記）。ノザンブロット及び現場ハイブリダイゼーション分析は、コリンmRNAが、ANP及びBNPペプチドが心臓の心房及び心室において優先的に生成される組織において高く発現されることを示す（Yan, W. など. (1999)前記）。機能的研究（Yan, W.など. (2000) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97: 8525-8529; Wu,F.など. (2002) J. Biol. Chem. 277: 16900-16905）においては、組換えコリンが、プロ−ANPを生物学的活性のANPに、高い配列特異性態様で転換し、このことは、コリンがプロ−ANPコンバーターゼであることを示唆する。さらに、組換えコリンは、プロ−BNPをBNPにプロセッシングする（Yan, W. など. (2000) 前記）。
【００１６】
うっ血性心不全（CHF）は、約480万人のアメリカ人を苦しめる生命−脅威の疾患である。毎年、約550,000人の新しい患者がアメリカ合衆国において診断されている。徴候性代償不全は、左心室の収縮不全のためにCHFを有する患者の入院に関する最も共通する理由である。最も通常の症状は、肺静脈うっ血及び低められた心臓出力に主に起因する呼吸困難及び疲労を包含する。伝統的に、代償不全のCHFを有する患者は、利尿薬、筋変力剤、血管拡張薬及びβブロッカーにより処理される（Braunwald, E.など. (1997) in Heart Disease : A Textbook ofCardiovascularMedicine, Braunwald, E. , ed. , W. B. Saunders, Philadelphia, pp. 445-470）。
【００１７】
治療目的は、ナトリウム及び流体排泄を高め、心臓充填圧力を低め、末梢血管耐性を低め、そして心臓出力を高めることである。CHFを処理するために使用される種々の薬剤は、個々の治療は固有の限界を有するが、症状を改善する。例えば、筋変力剤は、不全心臓の心臓収縮性及び酸素消費を高めるが、しかしまた、心臓不整脈の発生を高め、そして死亡率を高めることができる。ニトログリセリン、すなわち130年前からダイナマイトを製造するために、Alfred Nobelにより最初に製造された血管拡張薬の反復した及び延長された使用は、時間と共に臨床学的効能の低下を伴って、ニトレート耐性をもたらし、新しい虚血性攻撃に対して患者を無防備にする。
【００１８】
CHFの病理生理学の理解の進歩にもかかわらず、進行した疾病に関する効果的な処理は制限されており、そして羅病率及び死亡率は高いままである。CHFの長期にわたる処理への現在のアプローチは、レニン−アンギオテンシンシステム（アンギオテンシン−転換酵素（ACE）インヒビター、アンギオテンシン受容体ブロッカー）、交感神経系（β−ブロッカー）、エンドセリン−１（ET−１）（ET−１受容体アンタゴニスト）、及びナトリウム排泄増加性ペプチドシステム（ANP、BNP及び中性エンドペプチダーゼ（NEP）インヒビターを標的化する（McMurray, J. and Pfeffer, M. A. (2000a) Circulation 105: 2099-2106; McMurray, J. and Pfeffer, M. A. (2000b) Circulation 105: 2223-2228; Corti, R.など. (2001) Circulation 104: 1856-1862）。
【００１９】
臨床学的に、ANP及びBNPの高い血漿濃度が、CHFを有する患者に見出される。それらのナトリウム排泄増加性ペプチドのレベルは、しばしば心室機能不全の程度及び心臓不整脈の進行と相互関係する（Burnett, J. C. , Jr.など. (1986) Science 231: 1145-1147; Gottleib, S. S.など. (1989) J. Am.Coll. Cardiol. 13: 1534-1539）。BNPは現在、CHFにおける診断及び予後マーカーとして使用される（Gottleib, S. S.など. (1989) 前記; Maisel, A. S.など. (2002) M Engl. J. Med. 347: 161-167）。ナトレコル（natrecor）、すなわちヒトBNPの組換え形は、代償不全のCHFに関しての病院での短期処理としてアメリカ合衆国において許可されている。
【００２０】
BNPの注入は、CHFを有する患者における血行力学、及び心臓及び腎臓機能の改良においてニトログリセリンよりも効果的であることが示されている（Colucci, W.c. など. (2001)前記）。ANPはまた、CHF及び腎不全を有する患者を処理するために日本においても使用されている（Hayashi, M.など. (2001) 前記; Mizuno,O.など. (2001) J. Am. Cardiol. 88: 863-866; Allgren, R. L.など (1997) N. Engl. J. Med. 336: 828-834）。ANP及びBNPによる結果は、ナトリウム排泄増加性ペプチドに基づく治療が、重度のCHFを有する患者における症状の緩和及び血行力学及び心臓機能の改良において効果的であることを示す。
【００２１】
コリンの発見は、インビボでのANP及びBNPの両者の生成を高めるための生物学的剤としての組換えコリンの使用の機会を提供する。コリンに基づく治療は、代償不全のCHFの処理においてANP又はBNP単独よりも効果的であり得る。さらに、コリンは、連続的静脈注入により投与されるべきであるANP又はBNPよりも薬物動力学の利点を提供することができる。本発明は、代償不全のCHFに関して生物学的治療としてのコリン新規可溶性形である。
【発明の開示】
【００２２】
発明の要約：
本発明は、野生型ヒトコリン活性化配列とは異なる、置換された活性化配列を含んで成る、新規の修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体、及び安定した修飾されたコリン分子をコードし、発現し、そして使用するための方法を提供する。
１つの態様においては、修飾されたコリン分子は、野生型ヒトコリン活性化配列とは異なる、置換された活性化配列を含んで成る、修飾されたコリンチモーゲン、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。
【００２３】
もう１つの態様においては、修飾されたコリン分子は、活性化され、修飾されたコリン、又はそのフラグメント又は誘導体であり、ここで野生型ヒトコリン活性化配列とは異なる置換された活性化配列が切断され、コリンを活性化する。
本発明は、非コリン分子に融合される、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を含んで成る融合分子を提供する。１つの態様においては、非コリン分子は、エピトープ標識又は受容体分子である。本発明はさらに、修飾されたコリン融合分子をコードし、発現し、そして使用する方法を提供する。
【００２４】
本発明は、第２の異なった源から単離されたコリン分子の一部に融合される、第１の源から単離されたコリン分子の一部を含んで成るキメラ分子を提供する。本発明はさらに、キメラコリン分子をコードし、発現し、そして使用するための方法を提供する。
本発明は、適切な宿主細胞中に導入される、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んで成るベクターを含んで成る宿主ベクターシステムを提供する。本発明はさらに、前記宿主ベクターシステムの製造及び使用方法を提供する。
【００２５】
本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー及び本発明の組成物を含んで成る医薬組成物を提供する。１つの態様においては、医薬組成物は、本発明の修飾されたコリン分子と混合される医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る。
本発明は、本発明の組成物を特徴づけるためのインビトロ及びインビボアッセイを提供する。
【００２６】
組成物を含んで成るキットはまた、本発明により包含される。1つの態様においては、１又は複数の本発明の組成物を含んで成るキットが、コリンリガンド又はインヒビターを同定するためにスクリーニングアッセイに使用される。もう１つの態様においては、１又は複数の本発明の組成物を含んで成るキットは、活性化されたコリン分子を同定するためのスクリーニングアッセイに使用される。
本発明の組成物を使用するための方法が提供される。組成物は、コリンの過剰−、過少−及び/又は異常−発現に関する疾病を処理するために使用され得る。１つの態様においては、組成物は、高血圧に関連する心血管疾患を処理するために使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の特定の記載：
A. 定義：
本出願に使用されるすべての科学的及び技術的用語は、特にことわらない限り、当業界において通常使用される意味を有する。本出願において使用される場合、次の用語又は句は、次のような特定される意味を有する。
【００２８】
本明細書において使用される場合、“コリン”とは、活性化部位を有する、細胞質、トランスメンブラン及び細胞外ドメイン（また、本明細書においては、外ドメインとも言及される）を有するトランスメンブランポリペプチド分子、そのフラグメント又は誘導体を言及する。用語“コリン”とは、野生型ヘプチン、例えばヘプチンチモーゲン、活性化されたコリン分子、及びそのフラグメント又は誘導体；及び修飾されたコリン分子、例えば修飾されたコリンチモーゲン、修飾され、活性化されたコリン分子及びそのフラグメント又は誘導体を包含する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、“野生型”とは、それぞれ、天然に存在する分子と同じヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列を有する核酸又はポリペプチド分子を言及する。野生型コリンポリペプチド分子は、図１及びYan, W.など. (1999) 前記に示されるような天然に存在するコリンのアミノ酸配列、又はそのいずれかのフラグメント又は一部を有する。野生型コリンは、その細胞外ドメインにおける活性化部位の切断に基づいて活性化されるチモーゲン、すなわち酵素前躯体として合成される。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語“活性”とは、機能又は作用を有する分子を言及する。活性は、基質を認識し、結合し、切断し、そして/又は修飾する酵素活性を包含し、ここで前記分子が酵素、例えばプロテアーゼである。
本明細書において使用される場合、用語“チモーゲン”とは、同起源のプロテアーゼによる切断に基づいて、活性化された分子を生成する活性化配列を有する前躯体ポリペプチド分子を言及する。チモーゲンの例は、エンテロキナーゼによる切断に基づいて活性化されるようになる、エンテロキナーゼ置換活性化配列を含んで成る修飾されたコリンチモーゲンである。
【００３１】
本明細書において使用される場合、用語“活性化配列”とは、同起源のプロテアーゼにより切断され、そして切断される場合、分子を生物学的活性にし、例えばプロテアーゼ活性できる分子におけるアミン酸配列を言及する。活性化された分子においては、活性化配列は切断される。コリン分子における活性化配列の例は、R-ILGGである。
本明細書において使用される場合、用語“置換活性化配列”とは、野生型分子に見出される活性化配列を置換するアミノ酸配列を言及する。置換活性化配列の例は、コリンにおける天然に存在する活性化配列R-ILGGにより置換されるDDDDK-ILGGである。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語“修飾された”とは、天然に存在する、すなわち野生型アミノ酸又はヌクレオチド配列とは異なるアミノ酸又はヌクレオチド配列を有する分子を言及する。例えば、修飾されたコリン分子は、置換活性化配列を含むことができる。修飾された分子は、野生型分子の機能又は活性を保持することができる。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語“誘導体”とは、野生型分子のいずれかの修飾又は変更を意味する。誘導体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アミノ酸及び/又はヌクレオチド配列における保存性又は非保存性置換、例えば他のアミノ酸、ヌクレオチド、アミノ酸類似体又はヌクレオチド類似体による置換；１又は複数のアミノ酸及び/又はヌクレオチドの欠失；１又は複数のアミノ酸及び/又はヌクレオチドの挿入；及び前−及び/又は後−翻訳修飾。誘導体分子は、その親分子と配列類似性及び/又は活性を有することができる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語“プロテアーゼ“とは、分子を認識し、そして分子における活性化配列を切断する種類の酵素を言及する。プロテアーゼは、内部ペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼであり得る。他方では、プロテアーゼは、ポリペプチド又はタンパク質分子のN末端又はC末端からペプチド結合を加水分解するエキソペプチダーゼであり得る。プロテアーゼは、活性化配列を受け、そして切断する触媒部位を形成するためのコンホメーションに折りたたむ。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語“触媒部位”とは、活性化配列を受け、そして切断する折りたたまれたプロテアーゼにおける領域を言及する。
本明細書において使用される場合、用語“リガンド”とは、コリンと相互作用するいずれかの分子を言及する。リガンドは、コリンを認識し、そしてそれに結合する分子であり得る。他方では、リガンドは、コリンにより認識され、そして結合される分子であり得る。例えば、コリンが結合し、そして切断する基質は、リガンドであり得る。もう１つの例においては、コリンに結合し、そしてそれを切断する分子はリガンドであり得る。抗−コリン抗体はまた、リガンドであり得る。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語“セリンプロテアーゼ”とは、酵素における触媒部位の一部を形成するユニークセリン残基の存在により特徴づけられる種類のプロテアーゼ酵素を言及する。一般に、個々のセリンプロテアーゼメンバーは、異なった基質特異性を有する。
本明細書において使用される場合、第１のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第１及び第２の配列の比較が、それらが正確に等しいことを示す場合、それぞれ第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列に対して配列“同一性”を有すると言われる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、第１のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、２種の配列の比較が、それらが少数の配列差異を有する（すなわち、第１及び第２の配列がほぼ同一である）ことを示す場合、第２の配列に対して“類似する”と言われる。例えば、２つの配列は、それらの２種の配列間で異なるヌクレオチド又はアミノ酸の％が約60％〜99.99％である場合、お互いに対して類似すると思われる。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語“相補的”とは、塩基対を形成し、それにより、二本鎖核酸分子の形成を介在するために、水素結合を通して結合する能力を有するプリン及びピリミジンヌクレオチド塩基を有する核酸分子を言及する。次の塩基対が相補性に関連される：グアニン及びシトシン；アデニン及びチミジン；及びアデニン及びウラシル。相補性は、二本鎖核酸分子を含んで成るすべての塩基対、又はそれ自体に折りたたまれた一本鎖核酸分子を含んで成るすべての塩基対に適用される。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語“保存性”とは、類似する化学性質を有する異なったアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を言及する。保存性アミノ酸置換は、いずれか他の疎水性アミノ酸によるいずれか疎水性（例えば、非極性）アミノ酸の置換；又はいずれか他の親水性アミノ酸によるいずれか親水性（極性、荷電されていない）アミノ酸の置換；又はいずれか他の正の電荷のアミノ酸によるいずれか正しい荷電されたアミノ酸の置換；又はいずれか他の負に荷電されたアミノ酸によるいずれか負に荷電されたアミノ酸の置換（Creighton, T. E. (1993) Proteins, W. H. Freeman and Company, New York）。
【００４０】
アミノ酸置換は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：いずれか他のそれらの疎水性アミノ酸によるイソロイシン（I）、バリン（V）及びロイシン（L）のいずれかの置換；グルタミン酸（E）によるアスパラギン酸（D）の置換及び逆も真であり；アスパラギン（N）によるグルタミン（Q）の置換及び逆も真であり；及びトレオニン（T）によるセリン（S）の置換及び逆も真である。他の置換はまた、特定のアミノ酸の環境、及びタンパク質の三次構造における役割に依存して、保存性であると見なされ得る。
【００４１】
例えば、グリシン（G）及びアラニン（A）、又はグリシン（G）及びセリン（S）は時折、アラニン（A）及びバリン（V）と同じように、交換可能的であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（M）は、時折ロイシン及びイソロイシン並びに時々バリンと交換され得る。リシン（K）及びアルギニン（R）は、アミノ酸残基の有意な特徴がその電荷であり、そしてそれらの２種のアミノ酸残基の異なったpKが有意でない位置において、時折交換可能である。さらに他の変化が、特定の環境において保存性であると見なされ得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語“非保存性”とは、異なった化学性質を有する異なったアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を言及する。非保存性置換は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：グリシン（G）により置換されるアスペラギン酸（D）；リシン（K）により置換されるアスパラギン（N）；又はアルギニン（R）により置換されるアラニン（A）。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語“可溶性”とは、細胞に結合されないいずれかの分子、又はそのフラグメント及び誘導体を言及する。可溶性分子は、循環することができる。可溶性分子は典型的には、トランスメンブランを欠いている。可溶性分子は典型的には、細胞外ドメインを含む。
【００４４】
アミノ酸残基についての一文字コードは次のものを包含する：A = Ala =アラニン, R = Arg = アルギニン, N = Asn = アスパラギン, D = Asp = アスパラギン酸, C = Cys = システイン, Q = Gln = グルタミン, E = Glu = グルタミン酸, G = Gly = グリシン, H = His = ヒスチジン, I = Ile = イソロイシン, L = Leu = ロイシン, K = Lys = リシン, M = Met = メチオニン, F = Phe = フェニルアラニン, P = Pro =プロリン, S = Ser =セリン, T = Thr = トレオニン, W = Trp = トリプトファン, Y = Tyr = チロシン, V = Val = バリン。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語“哺乳類”とは、ヒト及び家畜動物、例えばネコ、イヌ、ブタ、ウシ、羊、ヤギ、ウマ、ウサギ及び同様のものを包含する。
本明細書において使用される場合、用語“治療的有効量”とは、その必要なヒトに投与される場合、うっ血性心不全又は急性心筋梗塞のための下記に定義されるような処理をもたらすのに十分である、本発明の化合物の量を言及する。“治療的有効量”を構成する本発明の修飾されたコリン分子の量は、タンパク質、病状及びその重症度、及び処理されるヒトの年齢に依存して変化するが、しかし当業者により通常、決定され得る。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語“処理する”又は“処理”とは、哺乳類、好ましくはヒトにおける、高血圧により特徴づけられる疾病−状態の処理を包含し、そして
（ａ）特に、ヒトが前記病状の素因を有するが、しかしそれを有するものとしてまだ診断されていない場合、そのようなヒトにおける病状の発生を妨げ；
（ｂ）心臓疾患を阻害し、すなわちその進行を阻止するか；又は
（ｃ）心臓疾患を軽減し、すなわち病状の回復を引き起こすことを包含する。
【００４７】
B. 本発明の修飾されたコリンポリペプチド分子：
本発明の修飾されたコリン分子は、修飾されたコリンチモーゲン及び活性化され、修飾されたコリン分子、又はそれらのフラグメント又は誘導体と包含する。それらの修飾されたコリン分子は、それらが、切断される場合、修飾されたコリン分子を活性化する置換された活性化配列を含んで成るので、有用である。本発明の修飾されたコリン分子は、安定性である。
【００４８】
その種々の観点においては、本発明は次のものを提供する：修飾されたコリン分子、例えば修飾されたコリンチモーゲン、活性化され、修飾されたコリン、又はそれらのフラグメント又は誘導体；修飾されたコリン分子をコードする核酸分子、又はそのフラグメント又は誘導体；組み換えDNA分子；形質転換された宿主細胞；宿主−ベクターシステム；本発明の組成物を用いるための方法；本発明の組成物の生成方法；アッセイ；修飾されたコリンのインヒビター；及び核酸に基づくアッセイ。
【００４９】
修飾されたコリン分子：
コリン分子の活性化は、触媒的活性酵素、すなわち活性コリンを生成するために、天然に存在する活性化配列Arg801-Ile802-Leu803-Gly804-Gly805 又は R-ILGGにおけるArg801 −Ile802間のペプチド結合の切断により進められ得る。
本発明の修飾されたコリン分子、例えば修飾されたコリンチモーゲン、活性化され、修飾されたコリン、又はそれらのフラグメント又は誘導体は、置換活性化配列を含んで成る。
【００５０】
置換活性化配列は、修飾され、活性化されたコリン分子を生成するプロテアーゼ、例えば同起源のプロテアーゼによる修飾されたコリン分子の切断を可能にするであろう、修飾されたコリン分子における既知活性化配列を提供する。１つの態様においては、修飾されたコリン分子は、アミノ酸Arg801を置換するアミノ酸配列Asp-Asp-Asp- Asp-Lys 又は DDDDKを含んで成るエンテロキナーゼにより特異的に認識される置換活性化配列を含んで成る。そのチモーゲン形での修飾されたコリン分子とエンテロキナーゼ、例えば組み換えエンテロキナーゼとの接触が、置換活性化配列を切断し、そしてその活性化された形での修飾されたコリン分子を生成する。
【００５１】
置換活性化配列の例は、前記に記載される。その置換活性化配列の配列及び長さは、所望する同起源のプロテアーゼによる修飾されたコリンチモーゲンの切断を可能にし、それにより、活性化され、修飾されたコリンを生成するために選択される。
本発明の活性化され、修飾されたコリン分子は、天然に存在する野生型の活性化されたコリンの機能的活性を示す。天然に存在する野生型の活性化されたコリンの機能的活性は、第VII a因子を生成するために、タンパク質基質、例えばプロ-ANP 又は プロ-BNP上の配列Arg-Serの認識及び切断である（Yan, W. et aL (2000) 前記）。類似する態様において、活性化され、修飾されたコリンはプロテアーゼとして機能し、そして野生型の活性化されたコリンと同じ基質を認識し、そして切断することができる。
【００５２】
本発明の実施によれば、本発明の修飾されたコリン分子は、天然に存在する野生型コリン分子の構造と同じか又は類似する折りたたまれた構造を有することができる。例えば、修飾されたコリンは、野生型の活性化されたコリンにより認識される基質を受け、そして切断するための触媒部位を可能にするコンホメーションに折りたたまれ得る。
【００５３】
十分な長さの存在するヒトコリン分子（図１）（Yan, W.など. (1999) 前記, 及び 公開された PCT 特許出願W099/64608号）は次のものを包含する：１）アミノ酸残基１−45を包含する細胞質ドメイン；２）アミノ酸残基46−66を包含するトランスメンブランドメイン；及び３）アミノ酸残基67−1042を包含し、そして２種の縮れたような２個のシステインに富んでいるドメイン、８個の低密度リポタンパク質受容体反復体、マクロファージスキャベンジャー受容体様ドメイン、活性化配列、及びそのセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含んで成る細胞外ドメイン。
【００５４】
本発明は、天然に存在するコリン分子のフラグメント又は誘導体を含んで成る、修飾されたコリン分子を提供する。修飾されたコリン分子のフラグメント又は誘導体は、いずれかの組み合わせ又は順序で結合され、そして/又は連結される、上記のドメインのいずれかの部分を含むことができる。
【００５５】
１つの態様においては、修飾されたコリン分子は、図１に示される配列のアミノ酸残基67−1042又はその一部を包含する、天然に存在するヒトコリン分子の細胞外ドメインを含んで成る。もう１つの態様にいては、修飾されたコリン分子は、エンテロキナーゼ、又は他のプロテアーゼ認識配列、例えばエンテロキナーゼ認識配列を含むよう修飾された天然に存在するコリン分子の細胞外ドメイン又はその一部を含んで成る。そのような態様は、それらはトランスメンブランドメインを欠いているので、典型的には可溶性分子である。
【００５６】
本発明は、天然、合成、半合成又は組み換えのいずれかの源から誘導されたか又は単離され、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。
源は、原核生物又は真核生物を包含する。真核生物源は、動物、植物、菌類又は原生生物を包含する。動物源は、哺乳類、例えばウシ、ブタ、ネズミ（PCT 特許出願 W099/64608号）、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト（Yan, W. など. (1999) 前記）、羊、魚類、鳥類又は昆虫を包含する。
【００５７】
本発明の修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体は、原核又は真核宿主細胞において生成される組み換え分子として発現されるか、又は合成分子として生成され得る。１つの態様においては、組み換え修飾されたコリン分子は、修飾されたコリン分子を包含する封入体を生成する細菌宿主細胞から単離され得る。コリン分子を単離するための他の方法がまた使用され得る。もう１つの態様においては、修飾されたコリン分子は、バキュロウィルス感染された昆虫細胞から単離され得る。
【００５８】
修飾されたコリンの精製：
本発明の修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体は、当業界において良く知られている方法により精製され得る。それらの精製方法は、次のものを包含する：修飾されたコリン分子を選択的に結合する抗体を用いての親和性クロマトグラフィー；修飾されたコリン分子に結合されるエピトープ標識、例えば6xHis標識、V5標識又は他のよく知られている標識を選択的に結合する抗体を用いての親和性クロマトグラフィー（Marchak, D. R. , など. , 1996 in:"Strategies for Protein Purification and Characterization", Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.）；イオン交換クロマトグラフィー；及びゲル濾過クロマトグラフィー。単離及び精製の性質及び程度は、意図される使用に依存するであろう。例えば、精製され、修飾されたコリン分子は、修飾されたコリン分子へのリガンド又は抗体の結合を妨げる他のタンパク質又は、分子を実質的に有さないであろう。
【００５９】
融合分子：
本発明は、非コリン分子コード配列に融合される修飾されたコリン分子を含んで成る融合分子、又はそのフラグメントもしくは誘導体を提供する。
本発明の融合分子は、エピトープ標識、例えばヒスチジン（6xHis）標識又はV5標識、FLAG標識、インフルエンザヘマグルチニン（HA）標識、Mye標識、VSV-G標識又はチオレドキシン（Trx）標識に融合される修飾されたコリン分子を包含する。標識された融合分子は、修飾されたコリン分子の単離及び/又は精製の促進のために有用である（Marshak, D. R. , など., 1996 前記）。
【００６０】
本発明の融合分子は、レポーター分子に融合される修飾されたコリン分子を包含する。レポーター分子は、十分な長さのタンパク質、又はそのフラグメント又は誘導体であり得る。通常使用されるレポーター分子は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（BFP）を包含する。
【００６１】
他の融合分子構成は、マルトース結合タンパク質（MBP）、S−標識、Lex A DNA結合ドメイン（DBD）融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、及びヘルペス単純ウィルス（HSV）B16タンパク質融合体を包含することができる。
【００６２】
融合分子はまた、修飾されたコリン分子と非コリン分子との間に位置する切断部位を包含するよう構築され得、その結果、修飾されたコリン分子は非コリン分子から切断され、そして精製され得る。切断部位は、次の酵素のための認識配列を含むことができる：エンテロキナーゼ、コリン、MT−SP/マトリプターゼ、トリプシン、キモトリプシン、ヒト気道トリプシン−様プロテアーゼ（HAT）、肥満細胞トリプターゼ、エラスターゼ、プラスミン、カリクレイン、TMPRSS2、MBL−結合のセリンプロテアーゼ（MASP-1及びMASP-2）、スタブル−スタブロイド、フリン、トロンビン又は第Xa因子。
【００６３】
キメラポリペプチド：
本発明は、第２の異なった源から単離されたコリン分子のフラグメントに融合される、第１源から単離されたコリン分子のフラグメントを包含する、キメラ分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。前記第１及び第２源は、哺乳類、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、モンキー、サル、羊又はヒト、又は他の源、例えば魚類、鳥類又は昆虫を包含するいずれかの源からであり得る。
【００６４】
修飾されたキメラコリン分子を形成するために使用される１又は複数のコリンフラグメントは、エンテロキナーゼ活性化配列を含むよう修飾され得る。１つの態様においては、修飾されたキメラコリン分子は、第２源からのコリン分子の細胞質ドメインに融合される、第１源からコリン分子の細胞外ドメイン（置換活性化配列を含む）を含んで成る。もう１つの態様においては、修飾されたキメラコリン分子は、第２源からのコリン分子の細胞外ドメインのフラグメントを含んで成り、ここでこのようにして形成されるキメラコリン分子は置換活性化配列を含む。
【００６５】
アミノ酸類似体及び変更されたポリペプチド：
本発明はさらに、アミノ酸類似体を含んで成る、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメントもしくは誘導体を提供する。アミノ酸類似体は、化学的に合成され得、そして右または左形、又はペプチド擬似体を包含する。
【００６６】
本発明はまた、N−又はO−グリコシル化されたアミノ酸残基を包含する、後−翻訳経路により又は化学合成により変更される修飾されたコリン分子を提供する。ポリペプチドのN−末端は、アシル化された又はアルキル化された残基を包含するよう変更され得る。ポリペプチドのC−末端は、エステル化された又はアミド化された残基を含むよう変更され得る。非末端アミノ酸残基は、アミノ酸、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン酸、リシン、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン及びシステインの変更を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６７】
配列変異体：
本発明は、天然に存在するコリン分子の細胞外ドメインにおける配列変動を含んで成る、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。当業者が理解するように、いずれかの数のアミノ酸は、単独で又は他のアミノ酸と組合して変更され得、そして修飾されたコリン分子はまだそれらの機能的活性を保持するであろう（例えば、同起源のプロテアーゼにより切断され、そして/又はその基質を切断する）。修飾されたコリン分子の細胞外ドメインの配列変異体は次のものを包含する：アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、変異体形、対立遺伝子形、相同体及びオルト体。
【００６８】
アミノ酸置換：
修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体は、アミノ酸置換を包含する。修飾されたコリン分子の細胞外ドメインは、保存性又は非保存性アミノ酸置換を有することができる。どの及びいかに多くのアミノ酸残基が修飾されたコリン分子の細胞外ドメインにおいて置換され得るかの決定における案内は、天然に存在するコリン分子の性質に見出され得る。それらの性質は、アミノ酸の長さ、物理的長さ、又は折りたたまれたコンホメーションを包含する。それらの性質は、予測（例えば、アミノ酸配列に基づいて）及び/又は実験（例えば、X−線結晶学に基づいて）により誘導され得る。置換されたアミノ酸は、変異体の修飾されたコリン分子の性質が天然に存在するコリン分子の性質と同一であるか又はそれに類似するよう選択される。
【００６９】
変異体形：
本発明はまた、コリン分子の細胞外ドメインの変異体形を有する修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体も提供する。前記変異体は、野生型コリン分子の細胞外ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。突然変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入、付加、切断、又はタンパク質のプロセッシング又は切断誤差を包含する。変異体は、野生型コリン分子と同じが又は類似する機能的活性を有することができる。
【００７０】
対立遺伝子変異体：
本発明は、天然に存在するコリン分子の対立遺伝子変異体を含んで成る、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座で存在する異なった遺伝子によりコードされる分子である。
【００７１】
相同体：
本発明は、天然に存在するコリン分子の相同体を含んで成る、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。相同体は、同じ遺伝子座からであるが、しかし異なった染色体上のヌクレオチド配列によりコードされる分子である。相同体は、同じか又は類似する機能的活性を有することができる。
【００７２】
オルト体：
本発明は、天然に存在するコリン分子のオルト体を含んで成る、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。オルト体は、異なった種からのヌクレオチド配列によりコードされるコリン分子である。オルト体は、野生型コリン分子と同じか又は類似する機能的活性を有することができる。
【００７３】
置換活性化配列：
本発明は、天然に存在する活性化配列を置換する置換活性化配列をそれぞれ含む、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。置換活性化配列は、コリン分子の天然に存在する活性化配列とは異なる。例えば、ヒトコリン分子の天然に存在する活性化配列は、アミノ酸配列R-ILGGを含んで成る（Yan, W.など. (1999)前記; Yan, W.など. (2000) 前記）。置換活性化配列は、同起源のプロテアーゼにより認識され、そして切断される。
【００７４】
置換活性化配列は、いずれかの種、特に哺乳類源、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、羊又はヒト、又は他の源、例えば魚類、鳥類又は昆虫からのプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列であり得る。
置換活性化配列は、プロテアーゼ、例えばいずれかのセリンプロテアーゼ、トリプシンファミリーのいずれかのメンバー、いずれかのトリプシン−様プロテアーゼ、及びいずれかのタイプIIトランスメンブランプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列であり得る。
【００７５】
活性化配列は、次の酵素により認識され、そして切断されるアミノ酸配列であり得る（Barrett, A. J.など. (eds) (1998) Handbook ofProteolytic Enzymes, Academic Press, London）：エンテロキナーゼ；トロンビン；凝固第Xa因子；フリン；トリプシン；キモトリプシン；クラスターゼ；トロンビン；プラスミン；カリクレイン；アクロシン；ヒト気道トリプシン−様プロテアーゼ（HAT）（Yamaoka, K.など. (1998) J.Biol. Chem. 273:11895-11901）；肥満細胞トリプターゼ；MBL−結合されたセリンプロテアーゼ（MASP−１及びMASP-2）（Matsushita, など. 2000 The Journal of Immunology 164: 2281-2284）；ヘプシン（Torres- Rosado, A.など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7181-7185）；MT-SP1/マトリプターゼ（Takeuchi, T.など. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11054-11061; Lin, C. Y.など. (1999) J.B ol. Chem. 274: 18231-18236）；TMPRSS2（A Paoloni-Giacobina, など. , 1997 Genomics 44: 309-320）；及びスタブル−スタブロイド（Appel, L. F.など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4937- 4941）。
【００７６】
１つの態様においては、置換活性化配列は、TMPRSS3プロテアーゼ又はエピセリアミンプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列、例えば配列LKTPR−VVGG（配列番号38）（A Paoloni-Giacobino, など. , 1997, 前記; B. Lin, など. , 1999 Cancer Res 59: 4180-4184）；又はMT−SP1プロテアーゼ又はエピチンプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列、例えばTRQAR-VVGG（配列番号39）（M Kim, など. , 1999 Immunogenetics 49: 420-428）であり得る。
【００７７】
もう１つの態様においては、置換活性化配列は、エンテロキナーゼプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列、例えば配列DDDDK−IVGG（配列番号40）（Kitamoto, Y. など. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91: 7588-7592; La Vallie, E. R. など. (1993) J.Biol. Chem. 268: 23311-23317）であり得る。もう１つの態様においては、置換活性化配列は、アミノ酸配列DDDDK−I（配列番号41）を含んで成る、ヒト又はウシエンテロキナーゼにより認識され、そして切断される。
【００７８】
変異置換活性化配列：
本発明はまた、上記に記載される置換活性化配列の配列変動を有する置換活性化配列を含んで成る、修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。置換活性化配列は、置換されたアミノ酸が類似する構造又は化学的性質を有する、保存性アミノ酸置換を有することができる。変異体は、非保存性変化を有する。変異置換活性化配列は、同起源のプロテアーゼによる、折りたたまれた修飾されたコリン分子の切断を可能にし、それにより活性化され、修飾されたコリン分子を生成するよう選択される。
【００７９】
置換活性化配列の長さ：
本発明は、約２〜約10個の長さのアミノ酸残基のサイズ範囲の置換活性化配列を含んで成る修飾されたコリン分子を提供する。１つの態様においては、置換活性化配列は、約２〜約６個の長さのアミノ酸である。
置換活性化配列は、折りたたまれた野生型コリン分子において活性化配列の同じか又は類似する距離に及ぶよう選択され得る。１つの態様においては、置換活性化配列は、修飾されたコリン分子の機能的活性に影響を及ぼさないであろう。
【００８０】
どの及びいかに多くのアミノ酸残基が置換活性化配列において変更され得るかの決定における案内は、折りたたまれた修飾されたコリン分子における活性化配列により拡張される距離において見出され得る。折りたたまれた野生型コリン分子における活性化配列を拡張する距離は、野生型コリン分子のアミノ酸配列から推定され、そして/又は野生型コリン分子のX−線結晶構造から実験的に得られる。
【００８１】
例えば、野生型ヒトコリンのアミノ酸配列（Yan, W.など. (1999) 前記）は、折りたたまれたヒト野生型コリン分子における活性化配列を拡張する距離を予測するための基礎として使用され得る。残基RILGGを包含する、野生型ヒトコリン分子の活性化配列は、５個のアミノ酸残基の線状長さに及ぶ（図２）。
【００８２】
C. 本発明の修飾されたコリン核酸分子：
修飾されたコリン分子をコードする核酸分子：
本発明は、“修飾されたコリンポリヌクレオチド配列”、“コリン配列”、“コリン分子配列”、又は“本発明の核酸分子”として本明細書において言及される、本発明の修飾されたコリン分子をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る、種々の単離され、及び組み換えの核酸分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。本発明はまた、修飾されたコリン分子のフラグメント又は誘導体をコードするポリヌクレオチド配列も提供する。本発明はさらに、関連するポリヌクレオチド分子、例えば相補的な修飾されたコリンポリヌクレオチド配列、又はその一部、及び本発明の核酸分子に対してハイブリダイズするそれらを提供する。
【００８３】
修飾されたコリンポリヌクレオチド配列は好ましくは、単離された形で存在し、そしてDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、及び関連する分子、及びそれらのフラグメントを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ゲノムDNA、cDNA、リボザイム及びアンチセンスRNA又はDNA分子、並びに天然源から誘導されるか又は合成されるかにかかわらず、二者択一の主鎖又は塩基に基づいての核酸分子が特に企画される。
本発明の核酸分子は、本発明の修飾されたコリン分子、及び/又はそのフラグメント又は誘導体をコードし、ここで前記コードされた、修飾されたコリン分子は、天然に存在するコリン分子の類似するか又は同一の機能活性を示す。
【００８４】
１つの態様においては、修飾されたコリン分子をコードする単離されたヌクレオチド配列は、図10に示され、位置115でコドンGATで開始し、そして位置2871でのコドンAACで終結する。図10の核酸配列は、位置2134−2148でエンテロキナーゼ活性化切断配列DDDDKをコードする。さらに、図10の核酸配列は、位置１−108でタンパク質分泌のためのIgxシグナル配列をコードし、そして位置2871−2973でV5及び6xHisエピトープ 標識配列をコードする。
【００８５】
本発明の実施によれば、本発明の核酸分子は、修飾されたコリンヌクレオチド配列の単離された十分な長さの又は部分的長さの分子又はオリゴマーであり得る。本発明のコリン配列は、本発明の修飾されたコリン分子のすべて又は一部、例えば細胞質ドメイン、トランスメンブランオメイン及び/又は細胞外ドメインをコードすることができる。細胞外ドメインは、２種の縮れたような２個のシステインに富んでいるドメイン、８個の低密度リポタンパク質受容体反復体、マクロファージスキャベンジャー受容体様ドメイン、置換活性化配列、及びセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含んで成る。
【００８６】
単離された核酸分子：
本発明の核酸分子は好ましくは、単離された形で存在し、ここで前記核酸分子は修飾されたコリン分子配列以外の配列を有する汚染性核酸分子から実質的に分離される。当業者は、単離された、修飾されたコリン分子配列を得るために核酸単離方法を容易に使用することができる。例えば、Sambrook, J.E.など. (1989) in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, N. Y.を参照のこと。本発明はまた、組み換えDNA技法又は化学合成方法により生成される、単離された、修飾されたコリン分子配列も提供する。本発明はまた、種々の哺乳類種、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、羊又はヒト、又は他の源、例えば魚類、鳥類又は昆虫から単離されたヌクレオチド配列を提供する。
【００８７】
単離された核酸分子は、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、及び関連する分子、修飾されたコリン分子をコードする修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子、又はそのフラグメントもしくは誘導体及び修飾されたコリン分子をコードする核酸分子に対してハイブリダイズするそれらを包含する。好ましい核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に同一か又は類似するヌクレオチド配列を有する。ゲノムDNA、RNA、例えば小さな干渉性RNA, cDNA、リボザイム及びアンチセンス分子が特に企画される。
【００８８】
同一及び類似するヌクレオチド配列：
本発明は、本明細書に開示される修飾されたコリン分子配列と同一か又は類似するポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。従って、ポリヌクレオチド配列は、図10に記載されるように、特定の修飾されたコリン分子配列と同一であり得る。他方では、ポリヌクレオチド配列は、開示される配列に類似することができる。
【００８９】
本発明の１つの態様は、修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列と配列同一性又は類似性を示す核酸分子、例えば図10に示されるように、本発明の配列と少なくとも60〜99.9％の配列類似性及び100％までの配列同一性を有する分子を提供する。もう１つの態様は、約75％〜99.9％の配列類似性を示す核酸分子を提供し、そしてもう１つの態様は、約86％〜99.9％の配列類似性を有する分子を提供する。さらにもう１つの態様は、図10に示されるように、本発明の修飾されたコリン分子配列と100％の配列同一性を有する分子を提供する。
【００９０】
相補的ヌクレオチド配列：
本発明はまた、図１及び10に記載されるような配列に対して相補的である核酸分子も提供する。相補性は、十分であっても又は一部であっても良い。十分に相補的であるヌクレオチド配列は、図１及び10のいずれか１つに記載されるような完全なコリン配列に対して相補的である。一部相補的であるヌクレオチド配列は、図１及び10のいずれか１つに記載されるような配列の一部のみに対して相補的である。相補的分子は、アンチセンス核酸分子を包含する。アンチセンス分子は、RNA干渉（RNAi）、DNA干渉、細胞の増殖の阻害、又は天然に存在するコリン分子を発現するか、又は修飾されたコリン分子を発現する細胞の殺害のために有用である（Yan, W. など. (1999)前記）。相補的分子はまた、小さな干渉性RNA（siRNA）も包含する（Elbashir, S.M.など. (2001) Nature 411: 494-498; Hammond, S.M.など (2001) Mat. Rev. Genet 2:110-119）。
【００９１】
ハイブリダイズする核酸分子：
本発明はさらに、図１及び10のいずれか１つに示されるような本発明の修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列に対して選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。ハイブリダイズする核酸分子は、高い緊縮性のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。典型的には、標準の高い緊縮条件下でのハイブリダイゼーションは、約70％〜約100％、配列相補的において異なる２種の相補的核酸分子間で生じるであろう。核酸分子間での高い緊縮性のハイブリダイゼーションは、例えば同一性の程度、ハイブリダイゼーションの緊縮性、及びハイブリダイズする鎖の長さに依存することは当業者に明らかである。高い緊縮性のハイブリダイゼーションを行うための方法及び配合は、当業界において良く知られており、そしてSambrook, J. E.など. (1989) 前記に見出され得る。
【００９２】
一般的に、緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、（１）洗浄のために低いイオン強度及び高い温度、例えば50℃での0.015MのNaCl/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％SDSを使用するか；又は（２）ハイブリダイゼーションの間、42℃で、750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウムと共に、変性剤、例えばホルムアミド、例えば50％（v/v）のホルムアミド、及び0.1％のウシ血清アルブミン/0.1％Ficoll/0.1％ポリビニルピロヂドン/50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）を使用するそれらの条件である。
【００９３】
緊縮条件のもう１つの例は、50％のホルムアミド、５×SSC（0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム、５×Denhardt’s溶液、音波処理されたサケ精子DNA（50mg/ml）、0.1％のSDS、及び10％の硫酸デキストランの42℃での使用、及び0.2×SSC及び0.1％のSDSによる42℃での洗浄を包含する。当業者は、明確且つ検出できるハイブリダイゼーションシグナルを得るために緊縮条件を容易に決定し、そして変えることができる。
【００９４】
核酸フラグメント：
本発明はさらに、本発明の修飾されたヘプシン分子配列のフラグメント、例えば本明細書に開示され、そして図１及び10のいずれか１つに示されるような修飾されたコリン分子配列の一部を有する核酸分子を提供する。フラグメントのサイズは、その意図される使用により決定されるであろう。例えば、フラグメントが置換活性化配列を含んで成る、天然に存在する野生型コリン分子の細胞外ドメインを含んで成る修飾されたコリン分子をコードするよう選択される場合、当業者は、このドメインをコードするのに十分に大きいポリヌクレオチドフラグメントを選択するであろう。フラグメントが核酸プローブ又はPCRプライマーとして使用される場合、そのフラグメントの長さは、プロービング又はプライミング方法の間、比較的少数の誤った陽性を得るよう選択される。
【００９５】
本発明の核酸分子、そのフラグメント、及び本発明のプローブ及びプライマーは、種々の分子生物学的技法、例えばライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーン、又は遺伝子転写及び/又は発現の分析のための手段としてのmRNA転写物の検出及び定量化のために有用である。前記プローブ及びプライマーは、DNA、RNA又はDNA又はRNA分子の誘導体であり得る。少なくとも15個の塩基対のプローブ又はプライマーの長さが、理論的及び実施上の考慮により示唆されている（Wallace, B. and Miyada, G. (1987) MethodsEnzymol. 152: 432-442）。
【００９６】
選択ハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプライマーとして特に有用である修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列のフラグメントは、当業界において知られている方法を用いて、修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列から容易に同定され得る。例えば、修飾されたコリン分子転写体の一部を結合し、そして/又は検出するPCRプライマー組は、アメリカ特許第4,965,188号記載されるPCR方法により製造され得る。本発明のプローブ及びプライマーは、当業者に良く知られている方法により調製され得る（Sambrook, J. E. など. (1989) 前記）。プローブ及びプライマーは、化学合成方法により合成され得る（Gait, M. J. , ed. (1984) in Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, England）。
【００９７】
本発明の１つの態様は、本発明の核酸分子又はそのいずれかの特定部分の特異的増幅を可能にする、修飾されたコリン分子配列に対して相補的である核酸プライマーを提供する。もう１つの態様は、修飾されたコリン分子配列、又はそのいずれかの部分に対して、選択的に又は特異的にハイブリダイズするために相補的である核酸プローブを提供する。
他方では、修飾されたコリン分子配列のフラグメントは、非コリン分子配列に融合される修飾されたコリン分子配列を有する組み換え融合遺伝子を構成するために使用され得る。
【００９８】
融合遺伝子配列：
本発明は、非コリン分子配列に融合される（例えば、連結又は結合される）修飾されたコリン分子配列を包含する融合遺伝子配列を提供する。修飾されたコリン分子配列は、非コリン分子配列に整合して作用可能に融合される。
【００９９】
本発明の融合遺伝子配列は、エピトープ標識、例えばヒスチジン（6xHis）標識、V5標識、FLAG標識インフルエンザヘマグルチニン（HA）標識、Myc標識、VSV-G標識及びチオレドキシン（Trx）標識（但し、それらだけには限定されない）に融合される修飾されたコリン分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【０１００】
本発明の融合遺伝子配列は、十分な長さの又は部分的長さのレポーター遺伝子配列、例えばグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（GEP）（但し、それらだけには限定されない）に融合される修飾されたコリン分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【０１０１】
本発明の融合遺伝子配列は、DNA分子を結合するか、又は他の細胞分子、例えばマルトース結合タンパク質（MBP）、S−標識、Lex A DNA結合ドメイン（DBD）の融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、及びヘルペス単純ウィルス（HSV）BP16タンパク質融合体（但し、それらだけには限定されない）を結合する、タンパク質又はそのフラグメントをコードする遺伝子配列に融合される修飾されたコリン分子をコードするヌクレオチドを包含する。
【０１０２】
本発明の融合遺伝子配列は、切断部位成分をコードする遺伝子配列に融合される修飾されたコリン分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。切断部位は、修飾されたコリン分子コード配列と、切断配列との間に位置する。切断部位成分は、コリントロンビン及び第Xa因子認識配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０３】
キメラヌクレオチド配列：
本発明は、組み換えのキメラ性修飾されたコリン分子をコードするキメラ遺伝子配列を提供する。キメラヌクレオチド分子は、第２の異なった源から単離されたコリン分子の一部に融合される第１源から単離されたコリン分子の一部をコードする。キメラ分子は、整合して、作用可能に融合されるキメラポリペプチドをコードする。
【０１０４】
１つの例においては、キメラヌクレオチド分子は、第２源からのコリン分子の細胞質ドメインに融合される、第１源からのコリン分子の細胞外ドメインをコードし、ここで前記細胞外ドメインは、置換活性化配列を含む。もう１つの例においては、キメラヌクレオチド分子は、第２源からのコリン分子の細胞外ドメインの残る部分に融合される、第１源からのコリン分子の細胞外ドメインの一部をコードし、ここで前記キメラ分子は置換体活性化配合を有する細胞外ドメインを含む。
【０１０５】
コドン使用変異体：
本発明は、開示される修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列とは異なるが、コードされる修飾されたコリン分子の予測されるポリペプチド配列又は生物学的活性を変更しない単離されたコドン−使用変異体を提供する。例えば、多くのアミノ酸は１つよりも多くの三文字コドンにより示される。同じアミノ酸を特定するコドンは、遺伝子コードにおける縮重のために生じる。アミノ酸、すなわちアルギニン（R）をコードするヌクレオチドコドンCGU, CGG, CGC及びCGA；又はアミノ酸、すなわちアスパラギン酸（D）をコードするコドンGAU及びGACが例として挙げられる。従って、プロリンは、それらの特異的ヌクレオチド配列においては異なるが、しかし同一の配列を有するタンパク質分子をまだコードしている１又は複数の核酸分子によりコードされ得る。アミノ酸コード配列は次の通りである：
【０１０６】
【表１】
2007502132.tif 000002
【０１０７】
コドン−使用変異体は、組み換えDNA技法により生成され得る。コドンは、宿主細胞により使用されるコドンの頻度に従って、特定の原核発現宿主における修飾されたコリン分子転写体又は修飾されたコリン分子の生成のレベルを最適化するよう選択され得る。修飾されたコリン分子をコードするヌクレオチド配列を変更するための他の理由は、より所望の性質、例えば延長された半減期又は高められた安定性を有するRNA転写体の生成を包含する。それぞれの修飾されたコリン分子をコードする多数の修飾された変異体コリン分子ヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、単離され得る。
【０１０８】
従って、本発明は、開示される修飾されたコリン分子をコードするか、又は修飾されたコリン分子の生物学的活性を有する分子をコードする、あらゆる可能性ある組み合わせのヌクレオチド配列を生成するためにあらゆる可能なトリプレットコドンの選択を提供する。この特定の態様は、図1及び10のいずれか１つに記載のような配列とは異なる単離されたヌクレオチド配列を提供し、その結果、個々の変異体ヌクレオチド配列は図２及び11に記載されるアミノ酸配列と配列同一性を有するヌクレオチドをコードする。
【０１０９】
変異体ヌクレオチド配列：
本発明は、本発明の修飾されたコリン分子のいずれかの変異体形をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子を提供する。変異体ヌクレオチド配列は、修飾されたコリン分子の細胞外ドメインの変異体形をコードする。変異体ヌクレオチド配列は、本発明の修飾されたコリン分子内の置換活性化配列の変異体形をコードする。１つの態様においては、変異体ヌクレオチド配列は、天然に存在する野生型コリン分子と同じか又は類似する機能的活性を有する変異体の修飾されたコリン分子をコードする。
【０１１０】
本発明の変異体ヌクレオチド配列は、保存性又は非保存性アミノ酸置換を含む。変異体ヌクレオチド配列は、突然変異、例えばアミノ酸置換、欠失、挿入、付加、切断、又はタンパク質のプロセッシング又は切断誤差を包含する。変異体ヌクレオチド配列は、天然に存在するコリン分子の対立遺伝子、相同体又はオルト体変異体を包含する。
【０１１１】
誘導体核酸分子：
本発明の核酸分子はまた、DNA又はRNA分子、及びアンチセンス分子とは異なる誘導体核酸分子を包含する。誘導体分子は、一本鎖DNA又はRNAに、塩基対−依存性態様で結合する、ペプチド核酸（PNA）、及び非核酸分子、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート及びメチルホスホネート分子を包含する（Zamecnik, P. C. など. (1978)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 280284; Goodchild, P.C.など. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146）。ペプチド核酸分子は、アミノ酸残基、例えばリシン及びアミノ基が付加されている核酸オリゴマーを含んで成る。抗−遺伝子剤と称するそれらの小さな分子は、核酸のそれらの相補的（鋳型）鎖に結合することにより転写体延長を停止する（Nielsen, P. E.など. (1993) Anticancer Drug Des 8: 53-63）。
【０１１２】
DNA、RNA及びそれらの類似体の合成方法の再考は、Eckstein, E.など., eds. (1991) in Oligonucleotides and Analogues, IRL Press,New York; 及び Gait, M. J. , ed. (1984) in Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, Englandに見出され得る。さらに、アンチセンスRNA技法のための方法は、アメリカ特許第5,194,428号及び第5,110,802号に記載される。当業者は、本明細書に記載される修飾されたコリン分子ポリヌクレオチド配列を用いて、それらの種類の誘導体核酸分子を容易に得ることができる。例えば、Egholm, M. など.(1992) Innovative and Perspectives in Solid Phase Synthesis, pp. 325-328 又はアメリカ特許第5,539, 082号を参照のこと。
【０１１３】
ラベルされた核酸分子：
本発明は、検出できるマーカーにより結合されるか又はラベルされた本発明の核酸分子を提供する。検出できるマーカーの例は、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発行化合物、金属キレーター又は酵素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ラベルされた核酸分子を生成するための技法は良く知られており、例えばSambrook, J. E. など. (1989) 前記を参照のこと。
【０１１４】
D. 組み換え修飾されたコリン核酸分子：
本発明は、本明細書に記載されるように、修飾されたコリン分子をコードするヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体を包含する組み換えDNA分子（rDNA）を提供する。本明細書において使用される場合、rDNA分子は、インビトロでの分子操作にゆだねられたDNA分子である。組み換えDNA分子を生成するための方法は、当業者において良く知られている（Sambrook, J. E.など. (1989) 前記を参照のこと）。１つの態様においては、本発明の組み換えDNA分子は、１又は複数の発現制御配列及び/又はベクター配列に作用可能に結合される。
【０１１５】
ベクター：
本発明の核酸分子は、組み換えベクター分子を生成するために、ベクターに結合される修飾されたコリン分子をコードする、ポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体をそれぞれ含んで成る組み換え分子であり得る。
【０１１６】
用語、ベクターは、プラスミド、コスミド、BAC、YAC、PAC及びファゲミドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは、適切な宿主細胞内でのrDNAの複製を指図するレプリコンを含んで成る自律的に複製するベクターであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中への組み換えベクターの組み込みを指図する。種々のウィルスベクター、例えば多くの良く知られているレトロウィルス及びアデノウィルスベクターがまた使用され得る（Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6: 616-629）。
【０１１７】
本発明のベクターは、原核又は真核宿主細胞における修飾されたコリン分子、又はそのフラグメント又は誘導体の発現を可能にする。ベクターは、挿入される修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列の転写を可能にする発現制御要素、例えばプロモーター配列を含んで成る発現ベクターであり得、そして適切な宿主細胞における結合された修飾されたコリン分子配列の発現（例えば、転写及び/又は翻訳）を調節するために使用され得る。
【０１１８】
発現制御要素は、種々の起源のもの、例えば天然に存在するもの及び合成のものであり得る。天然に存在する要素は、細胞又はウィルス起源のものであり得る。発現制御要素は、当業界において知られており、そして誘発性プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター及び他の転写調節要素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
翻訳に包含される他の発現制御要素は、当業界において知られており、そしてシャイン−ダルガルノ配列（例えば、原核宿主細胞）、及び開始及び終結コドンを包含する。外因性転写要素及び開始コドンは、種々の起源、すなわち天然及び合成源のものであり得る。
【０１１９】
細胞の環境刺激又は増殖培地により調節されるプロモーター、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素異化に関連する酵素、及びマルトース及びガラクトース利用を担当する酵素のための遺伝子からのそれらのプロモーターが誘発できる。
プロモーター、例えば酵素β−因子、アルコールオキシダーゼ、サイトメガロウィルス及びPGHは、構成的であり得る。再考に関しては、Ausubel, F. M.など. (1987) in Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.  及び Bitter, G. A. など. (1987) MethodsEnzymol. 153:516-544を参照のこと。
【０１２０】
転写の効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーの封入により増大され得る（Scharf, D.など(1994) Results Probl. Cell. Differ. 20: 125-162; Bitter, G. A.など. (1987) 前記）。ウィルスプロモーターは、SV40初期プロモーター、又はレトロウィルスベクターのLTR内に含まれるプロモーターを包含する。他のウィルスプロモーターは、サイトロメガロウィルスプロモーターを包含する（Boshart, M.など (1985) Cefl 41 : 521-530）。
【０１２１】
発現ベクターに使用するための通常使用される真核生物制御配列は、哺乳類細胞、例えばCMVプロモーター及びトリ肉腫ウィルス（ASV）（πLNベクター）と適合できるプロモーター及び制御配列を包含する。他の通常使用されるプロモーターは、サルウィルス40（SV40）からの初期及び後期プロモーター（Fiers, W. など. (1978) Nature 273: 113-120）、又は他のウィルスプロモーター、例えばポリオーマアデノウィルス２及びウシ乳頭腫ウィルスに由来するそれらのプロモーターを包含する。誘発性プロモーター、例えばhMTII（Karin, M. など (1982) Nature 299: 797-802）がまた使用され得る。
【０１２２】
酵素ベクターのための転写制御配列は、解糖酵素の合成のためのプロモーターを包含する（Hess, B.など. (1968) J. Adv. EnzymeReg. 7 : 149 ; Holland, M. J. and Holland, J. P. (1978) Biochemistry17: 4900-4097）。当業界において知られている追加のプロモーターは、CDMSベクターにおいて供給されるCMVプロモーター（Toyama, R. and Okayama, H. (1990)FEBS Lett. 268: 217-221）；３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Hitzeman, R. A. など. (1980) J.Biol. Chem. 255:12073-12080）；及び他の解糖酵素のためのそれらのベクターを包含する。
【０１２３】
特定の翻訳開始シグナルがまた、修飾されたコリン分子配列の効果的翻訳のために必要とされ得る。それらのシグナルは、ATG−開始コドン及び隣接する配列を含む。天然に存在するコリン分子のATG−開始配列又は上流の配列が、適切な発現ベクター中に挿入され得る。他方では、合成ATG−開始コドン及び他の配列が使用され得る。ATG−開始コドンは、挿入体配列の翻訳を確保するために、正しく読み枠を整合して存在すべきである。
【０１２４】
発現制御要素は、コード配列の3’末端で配置され得る。それらの配列は、メッセンジャーRNAを安定化するよう作用することができる。そのようなターミネーターは、いくつかの酵素由来の及び哺乳類遺伝子におけるコード配列に続いて3’末翻訳領域に見出される。
発現ベクターは、薬物耐性、例えばカナマイシン、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子生成物をコードする少なくとも１つの選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。
【０１２５】
発現ベクターは、いずれかのマーカー遺伝子を含むことができる。それらは、それぞれ、tk−マイナス又はaprt−マイナス細胞に使用され得る、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Wigler, M. など. (1977)Cell 11 : 223-232）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I. など. (1980) Cell 22 : 817-823）遺伝子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。また、抗代謝物、抗生物質又は除草剤耐性が、選択のための基礎として使用され、例えばメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler, M. など. (1980) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77: 3567-3570）、アミノグリコシドネオマイシン及びG−418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin, F.など. (1981) J. Mol.Biol. 150: 1-14）、及びクロロスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するals又はpat（Murry, L. E. (1992) in McGraw Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N. Y. , pp 191-196）が使用され得る。
【０１２６】
追加の選択可能遺伝子、例えばトリプトファンの代わりにインドールの細胞による使用を可能にするtrpB、又はヒスチジンの代わりにヒスチノールの細胞による使用を可能にするhisDが記載されている（Hartman, S. C. and Mulligan, R. C. (1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85: 8047-8051）。最近、可視マーカーの使用が普及しており、そしてアントシオニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体の同定のみならず、また特定のベクターシステムに寄与できる一時的又は安定したタンパク質発現の量の定量化のために広く使用される（Rhodes, C.A. など. , 1995 Methods Mol. Biol. 55: 121- 131）。
【０１２７】
ベクターはまた、外因性DNA配列の便利な挿入を可能にする複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含んで成る。本発明の修飾されたコリン分子をコードする組み換え発現ベクターを生成するための方法は、当業界において良く知られている（Sambrook, J. E.など. (1989) 前記; Ausubel, F. M.など. (1989)前記）。
【０１２８】
修飾されたコリン分子を生成するために使用される発現ベクターは、真核生成物宿主細胞と適合できる。そのベクターは、脊椎動物細胞と適合できる。それらのベクターは、発現制御要素、例えば哺乳類遺伝子又は哺乳類ウィルスからのプロモーター及び/又はエンハンサーを包含する。他の発現ベクターは、哺乳類遺伝子又は哺乳類ウィルスからの組織−又は細胞−特異的プロモーター及び/又はエンハンサーを包含する。
【０１２９】
発現ベクターは、他の真核生物宿主細胞、例えば昆虫、植物又は酵母細胞と適合できる。発現ベクターは、発現制御要素、例えば昆虫細胞における発現のためのバキュロウィルスポリヒドリンプロモーターを包含することができる。植物細胞（例えば、熱ショック、RUBISCO、貯蔵タンパク質遺伝子）、ウィルスプロモーター又はリーダー配列、又は植物ウィルスに由来するプロモーター及び/又はエンハンサーがまた使用され得る。
【０１３０】
真核生物細胞発現ベクターは、当業界において良く知られており、そしていくつかの市販源、例えばPSVL 及び pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC,＃31255)、及び類似する真核生物発現ベクターから入手できる。真核生物宿主細胞のための発現ベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：哺乳類宿主細胞のためのベクター、例えばBPV-1;pHyg ; pRSV ; pSV2; pTK2 ; piRES (Clontech) ; pRc/CMV2; pRc/RSV; pSFV1 (Life Technologies); pVPakc Vectors; pCMVvectors; pSG5 vectors (Stratagene); レトロウィルスベクター (例えば pFB vectors (Stratagene) ) ; pCDNA-3 (Invitrogen)又はその修飾された形；アデノウィルスベクター；アデノ関連ウィルスベクター；バキュロウィルスベクター。真核生物宿主細胞のための他の発現ベクターは、酵母のためのpESCベクター（Stratagene）及び昆虫細胞における発現のためのpFastBac（Bibco/BRL, Rockville, MD）を包含する。
【０１３１】
発現ベクターは、細菌宿主細胞における発現のための発現制御要素を含むことができる。それらの発現制御要素は、環境条件、例えば熱ショックにより、又は剤、例えばイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（例えば、IPTG）の付加により誘発され得る（Yamaguchi, N. など. (2002) J.Biol. Chem. 277: 6806-6812）。原核生物の細胞発現ベクターは、当業界において良く知られており、そしていくつかの市販源から入手できる。例えば、pGEX ベクター (Promega, Madison, WI), pTrcHisB ベクター (Invitrogen), pET ベクター (例えば, pET-21, Novagen Corp. ), BLUESCRIPT ファゲミド (Stratagene, LaJolla, CA), pSPORT (Gibco BRL, Rockville, MD), 又は ptrp-lac ハイブリッドが、細菌宿主細胞において修飾されたコリン分子を発現するために使用され得る。
【０１３２】
E. 修飾されたコリン宿主−ベクターシステム：
本発明はさらに、適切な宿主細胞中に導入される、修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体を含んで成る、ベクター、プラスミド、ファゲミド、BAC、YAC又はコスミドを含んで成る宿主−ベクターシステムを提供する。
宿主−ベクターシステムは、本発明の修飾されたコリン分子を転写し、そして/又は発現する（例えば、生成する）ために使用され得る。種々の発現ベクター/宿主システムが、修飾されたコリン分子配列を担持し、そして発現するために使用され得る。宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。
【０１３３】
真核生物宿主細胞：
適切な真核生物宿主細胞の例は、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は動物細胞、例えば哺乳類細胞を包含する。
修飾されたコリン分子を発現するために使用され得る発現システムは、昆虫システムである。１つのそのようなシステムにおいては、オートグラファ・カリホルニア（Autographa californica）核多角体病ウィルス群（AcNPV）がスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞又はトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫において外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。
【０１３４】
修飾されたコリン分子をコードする配列は、ウィルスの非必須領域、例えばポリヒドリン遺伝子中にクローン化され、そしてポリヒドリンプロモーターの制御下に配置され得る。修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列の好結果をもたらす挿入は、ポリヒドリン遺伝子を不活性にし、そしてコートタンパク質を欠いている組み換えウィルスを生成する。次に、組み換えウィルスが、修飾されたコリン分子が発現され得る、S.フルギペルダ細胞又はトリコプルシア幼虫を感染するために使用され得る（Smith, G. E.など. (1983) J. Virol. 46: 584-593; Engelhard, E. K.など. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224- 3227）。
【０１３５】
哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づく発現システムが使用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列が、後期プロモーター及び三分節系リーダー配列を有するアデノウィルス転写/翻訳ベクター中に連結され得る。ウィルスゲノムの非必須E1又はE3領域における挿入は、感染された宿主細胞において修飾されたコリン分子を発現できる生存ウィルスをもたらす（Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウィルス（RSV）エンハンサーが、哺乳類宿主細胞において発現を高めるために使用され得る。
【０１３６】
これまでの研究においては、ヒト胚腎臓（HEK）293細胞が、リポフェクチン介在性トランスフェクション方法を用いて、ヒトコリンcDNAを含んで成るプラスミドによりトランスフェクトされた。そのトランスフェクトされたHEK293細胞は、プロ−ANPを活性化したヒトコリンを発現する（Yan, W.など. (2000)前記）。
酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、多くのベクター、例えば構成又は誘発性プロモーター、例えばβ−因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHが使用され得る。再考に関しては、Ausubel, F. M. など. (1989) 前記及び Bitter, G. A.など. (1987) 前記)を参照のこと。
【０１３７】
植物発現ベクターが使用される場合、修飾されたコリン分子をコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかにより駆動され得る。例えば、ウィルスプロモーター、例えばCaMVの35S及び19Sプロモーター（Brisson, N. など. (1984) Nature 310: 511-514）が、単独で、又はTMVからのオメガリーダー配列と組合して使用され得る（Takamatsu, N. など. (1987) EMBO J. 6: 307-311）。他方では、植物プロモーター、例えばRUBISCO (Coruzzi, G.など. (1984)EMBO J. 3: 1671- 1680; Broglie, R. など. (1984) Science 224: 838-843)の小サブユニット、又は熱ショックプロモーター（Winter, J. and Sinibaldi, R.M. (1991)Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105）が使用され得る。
【０１３８】
さらに、宿主細胞株は、挿入された修飾されたコリン分子ヌクレオチドの発現を調節するか、又は所望する態様で、発現されるタンパク質をプロセッシングするその能力について選択され得る。発現された、修飾されたコリン分子のそのような修飾は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アセチル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアセチル化。タンパク質の前駆体形（例えば、プレプロタンパク質）を切断する後−翻訳プロセッシングはまた、正しい挿入、折りたたみ及び/又は機能のためにも重要であり得る。異なった宿主細胞、例えばCHO、HeLa、MDCD、293、WI38、等は、そのような後−翻訳活性のための特異的細胞機構及び特徴的機構を使用し、そして導入される外来性タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確保するために選択され得る。
【０１３９】
原核生物宿主細胞：
適切な原核生物宿主細胞の例は、属、例えばエスシェリチア（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトコーカス（Streptococcus）及びストレプトミセス（Streptomyces）からの細菌株を包含する。例えば、天然に存在するコリンを生成するためにこれまで使用されて来た（Kazama,Y. など. (1995) J.Biol. Chem. 270: 66- 72）E.コリXL-1 Blue細胞（Stratagene）はまた、修飾されたコリン分子を生成するために使用され得る。
【０１４０】
細菌系においては、多くの発現ベクターが、修飾されたコリン分子のために意図される使用に依存して選択され得る。例えば、多量の修飾されたコリン分子が抗体の誘発のために必要とされる場合、可溶性であり、そして容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指図するベクターが所望される。そのようなベクターは、多機能E.コリクローニング及び発現ベクター、例えばBLUESCRIPT（Stratagene）を包含し、ここで修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列が、アミノ末端Metのための配列、及びガラクトシダーゼの続く７個の残基と読み取り枠を整合してベクター中に連結され、その結果、ハイブリッドタンパク質が生成される。
【０１４１】
他のベクターは、pINベクター（Van Heeke, G. and Schuster, S. M. (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509）及び同様のものを包含する。pGEXベクター（Promega, Madison Wis.）はまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来性タンパク質を発現するためにも使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着により、続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製され得る。そのようなシステムで製造されたタンパク質は、興味あるクローン化されたタンパク質が意図的にGST成分から開放され得るよう、ヘプシン、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むよう企画される。
【０１４２】
細胞中に修飾されたコリン核酸配列を導入するための方法：
修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための方法は、使用されるベクターのタイプ及び使用される宿主系に依存するよく知られた方法である。
【０１４３】
例えば、脊椎動物細胞においては、核酸配列は、次の種々の方法を用いて、ベクター中に導入される：リン酸カルシウム介在性DNAトランスフェクション（Graham, F. L. and Van der Eb, A. J. (1973) Virology 52: 456-467; Wigler, M. など. (1977) 前記）又は他のカチオン介在性トランスフェクション方法、エレクトロポレーション（Neuman, E. など. (1982) EMBO J. 1: 841-845）、マイクロインジェクション（Anderson, W. F. など. 1 (980) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77: 5399- 5403; Cappechi, M. R. (1980) Cell 22 : 479-488;Graessman, A. など. (1979) J. Virol. 32: 989- 994）、又は脂質小胞におけるDNAの封入を包含する脂質方法（Schaefer-Ridder, M. (1982) Science 215 : 166-168）。
【０１４４】
他の方法は、粒子ガン方法を包含する。さらに他の方法は、後期プロモーター及び三分節系リーダー配列を含んで成るアデノウィルス転写/翻訳ベクターの使用を包含する。核酸配列は、核酸配列によりコードされるタンパク質を発現できる生存ウィルスを創造するために、アデノウィルスゲノムの非必須E1又はE3領域に挿入され得る（Logan, J. and Shenk, T (1984)前記）。他方では、レトロウィルストランスファー方法が使用され得る（Gilboa, E. など. (1986) BioTechniques 4: 504-512）。
【０１４５】
植物細胞は、直接的DNA形質転換又は病原体介在性トランスフェクションにより導入され得る。そのような技法の再考に関しては、Hobbs, S. (1992) in McGraw Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N. Y. , pp 191-196 及び Weissbach, A. and Weissbach, H. (1988) in Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York,N. Y. , pp 421-463を参照のこと。他方では、植物の細胞は、金属粒子を用いる粒子ガン方法により導入され得る。
原核生物宿主細胞は、エレクトロポレーション又は塩処理方法により核酸分子と共に導入される（Cohen, S. N.など. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114;  Sambrook, J. E. など. (1989) 前記）。
【０１４６】
形質転換された細胞の選択：
修飾されたコリン分子ヌクレオチド配列と共に導入される細胞は、当業界において良く知られている技法により同定され得る。細胞は、選択され、溶解され、そしてそれらのDNA含有物がDNAゲルブロット方法又は類似する方法を用いて、導入された配列の存在について試験される（Southern, E. M. (1975) J. Mol.Biol. 98: 503-517; Berent, S. L. など. (1985) Biotechniques3 : 208-220）。他方では、本発明の細胞から生成されるタンパク質は、生化学アッセイ又は免疫学的方法によりアッセイされ得る。
【０１４７】
いずれかの数の選択システムが、導入された（例えば、形質転換された又はトランスフェクトされた）細胞を回収するために使用され得る。導入された細胞は、それぞれ、tk−マイナス又はaprt-マイナス細胞に使用され得る、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Wigler, M. など (1977) 前記）又はアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I. など. (1980)Cell22 :817-23）遺伝子の発現に基づいて選択され得る。また、抗代謝物、抗生物質又は除草剤耐性が、選択のための基礎として使用され、例えばメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler, M.など. (1980) 前記）、アミノグリコシドネオマイシン及びG−418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin, F.など. (1981) 前記）、及びクロロスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するals又はpatが使用され得る。
【０１４８】
追加の選択可能遺伝子、例えばトリプトファンの代わりにインドールの細胞による使用を可能にするtrpB、又はヒスチジンの代わりにヒスチノールの細胞による使用を可能にするhisDが記載されている（Hartman, S. C. and Mulligan, R. C. (1988)前記）。最近、可視マーカーの使用が普及しており、そしてアントシオニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体の同定のみならず、また特定のベクターシステムに寄与できる一時的又は安定したタンパク質発現の量の定量化のために広く使用される（Rhodes, C. など. (1995) 前記）。
【０１４９】
F. 細胞及び遺伝子療法：
本発明の修飾されたコリン分子はまた、“細胞療法”として言及される、そのような修飾されたコリン分子のインビボでの発現により、本発明に従って使用され得る。従って、例えば細胞が、その修飾されたコリン分子をコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）によりエクスビボで構築され、次にその構築された細胞が、修飾されたコリン分子により処理されるべき患者に供給される。そのような方法は、当業界において良く知られている。例えば、細胞は、本発明の修飾されたコリン分子をコードするRNAを含むレトロウィルス粒子の使用により、当業界において知られている方法に従って構築され得る。
【０１５０】
本発明の修飾されたコリン分子はまた、“遺伝子療法”として言及される、そのような修飾されたコリン分子のインビボでの発現により、本発明に従って使用され得る。従って、例えばウィルスが、その修飾されたコリン分子をコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）によりエクスビボで構築され、次にその構築されたウィルスが、修飾されたコリン分子により処理されるべき患者に供給される。そのような方法は、当業界において良く知られている。例えば、組換えアデノウィルスは、本発明の修飾されたコリン分子をコードするDNAを含むレトロウィルス粒子の使用により、当業界において知られている方法に従って構築され得る。
【０１５１】
細胞又は遺伝子療法を用いての本発明の修飾されたコリン分子の局部供給は、治療剤を標的領域、すなわち血管の内部の内皮細胞に供給することができる。
インビトロ及びインビボ細胞又は遺伝子療法が企画される。可能性ある治療剤を、定義された細胞集団にトランスファーするためのいくつかの方法は知られている。例えば、Mulligan, R. C. (1993) Science 260: 926-932を参照のこと。それらの方法は、次のものを包含する：直接的な遺伝子トランスファー（例えば、W olff, J. A.など. (1990) Science 247: 1465-1468を参照のこと）；リポソーム介在性DNAトランスファー（例えば、Caplen, N. J.など. (1995) Nature Med. 3: 39- 46; Crystal, R. G. (1995) Nature Med. 1: 15-17; Gao, X. and Huang, L. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280-285を参照のこと）；レトロウィルス介在性DNAトランスファー（例えば、Kay, M. A. など. (1993) Science 262: 117- 119; Anderson (1992) Science 256: 808-813を参照のこと）；及びDNAウィルス介在性DNAトランスファー。
【０１５２】
そのようなDNAウィルスは、アデノウィルス（好ましくは、Ad2又はAd5に基づくベクター）、ヘルペスウィルス（好ましくは、ヘルペス単純ウィルスに基づくベクター）、及びパルボウィルス（好ましくは、“欠損性”又は非自発的パルボウィルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ−関連ウィルスに基づくベクター、最も好ましくはAAV−２に基づくベクター）を包含する。例えば、Ali,M. など. (1994) Gene Therapy 1: 367-384; アメリカ特許第4,797, 368号（引用により本明細書に組込まれる）, 及びアメリカ特許第 5,139, 941号, （引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
【０１５３】
興味ある遺伝子をトランスファーするための特定のベクターシステムの選択は、種々の因子に依存するであろう。１つの重要な因子は、標的細胞集団の性質である。レトロウィルスベクターは集中的に研究され、そして多くの遺伝子療法用として使用されて来たが、それらのベクターは一般的に、非分裂細胞を感染するのには適切でない。さらに、レトロウィルスは腫瘍形成のための可能性を有する。しかしながら、レンチウィルスベクターの分野における最近の開発は、それらの制限のいくつかを回避することができる。Naldini, L.など. (1996) Science 272: 263-267を参照のこと。
【０１５４】
上記に言及されるレトロウィルスプラスミドベクターが由来するレトロウィルスは、Molongネズミ白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、レトロウィルス、例えばラウス肉腫ウィルス、Harrey肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、テナガザル白血病ウィルス、ヒト免疫欠員ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス及び乳癌ウィルスを包含するが、但しそれらだけには限定されない。１つの態様においては、レトロウィルスプラスミドベクターは、Molongネズミ白血病ウィルスに由来する。
【０１５５】
アデノウィルスは、それらが広い宿主範囲を有する利点を有し、静止細胞又は最終的に分化された細胞、例えばニューロン又は肝細胞を感染することができ、そして実質的に非腫瘍形成であるように思える。例えば、Ali, M.など. (1994)、前記、p.367を参照のこと。アデノウィルスは、宿主ゲノム中に組込むように思えない。それらは染色体外に存在するので、挿入突然変異の危険性が非常に低められる。Ali, M.など. (1994)、前記、p373を参照のこと。
【０１５６】
アデノ−関連ウィルスは、アデノウィルスに基づくベクターに類似する利点を示す。しかしながら、AAVは、ヒト染色体19上への部位特異的組込みを示す（Ali, M.など. (1994), 前記、p.377）。
好ましい態様においては、本発明の修飾されたコリン分子をコードするDNAは、心血管疾患、例えば心不全、高血圧症、心臓肥大、心筋障害、心臓線維症、虚血性心疾患、心弁膜疾患、心筋炎、及び子癇前症（但し、それらだけには限定されない）についての細胞又は遺伝子療法に使用される。
【０１５７】
この態様によれば、本発明の修飾されたコリン分子をコードするDNAによる細胞又は遺伝子療法は、診断と同時に又は診断の直後、その必要な患者に提供される。
当業者は、本発明の修飾されたコリン分子をコードするDNA、又は本発明の修飾されたコリン分子のフラグメント、又は誘導体をコードするDNAを含むいずれかの適切な遺伝子療法がこの態様に従って使用され得ることを理解するであろう。そのようなベクターを構成するための技法は知られている。例えば、Anderson, W. F. (1998) Nature 392: 25-30; Verma I. M. and Somia, N. (1998) Nature 389: 239-242を参照のこと。標的部位への修飾されたコリン分子DNA−含有ベクターの導入は、既知の方法を用いて達成され得る。
【０１５８】
細胞又は遺伝子療法ベクターは、１又は複数のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウィルスLTR；SV40プロモーター；及びMiller, A. D and Rosman,G. J. (1989)  Biotechniques 7(9):980-990に記載されるヒトサイトメガロウィルス（CVM）プロモーター、又はいずれか他のプロモーター（例えば、細胞プロモーター、例えば真核細胞プロモーター、例えばヒストン、Pol III 及びβ−アクチンプロモーター）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。使用され得る他のウィルスプロモーターは、アデノウィルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウィルスプロモーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教授から当業者に明らかであろう。
【０１５９】
本発明の修飾されたコリン分子をコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アデノウィルスプロモーター、例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター；又は異種プロモーター、例えばサイトメガロウィルス（CMV）プロモーター；呼吸シンチチウムウィルス（RSV）プロモーター；誘発プロモーター、例えばMMTプロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoA1プロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウィルスチミジンキナーゼプロモーター、例えばヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーター；レトロウィルスLTR（上記に記載される修飾されたレトロウィルスLTRを包含する）；β−アクチンプロモーター；及びヒト成長ホルモンプロモーター。
【０１６０】
レトロウィルスプラスミドベクターは、生成体細胞系を形成するパッケージング細胞系を形質導入するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、引用により本明細書に組込まれるMiller（1990）Human Gene Therapy 1:5-14に記載されるような、PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+#- 86, GP+envAm12、及びDNA細胞系を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは、当業界において知られているいずれかの手段によりパッケージング細胞を形質導入することができる。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、及びCaPO4沈殿を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６１】
１つの変法においては、レトロウィルスプラスミドベクターは、リポソーム中に封入されるか、又は脂質に結合され、そして次に、宿主中に投与される。生成体細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する感染性レトロウィルスベクター粒子を生成する。そのようなレトロウィルスベクター粒子は、インビトロ又はインビボで、真核細胞に形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入され得る核酸細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞及び造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞及び気管支上皮細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６２】
遺伝子療法への異なったアプローチは、患者の細胞が、患者への再導入の後、興味あるタンパク質を生成するよう休眠染色体遺伝子を誘発するためにエクスビボで処理される“トランスカーヨチック療法（transkaryotic theropy）”である。トランスカーヨチック療法は、個人が活性化のために必要な遺伝子の正常な補体を有することを想定する。トランスカーヨチック療法は、新生遺伝子を活性化できるプロモーター又は他の外因性調節配列を、患者の細胞の染色体DNA中にエクスビボで導入し、活性タンパク質−生成細胞を培養し、そして次に、それらが次に十分に確立されるように成る患者中にその活性化された細胞を再導入することを包含する。次に、“遺伝子活性化された”細胞が、興味ある細胞を、有意な時間、たぶん患者の生命が続く限り製造する。アメリカ特許第5,641,670号及び第5,733,761号は、この概念を詳細に開示し、そしてそれらは引用により本明細書に組込まれる。
【０１６３】
G. 医薬組成物：
本発明は、当業者に知られている許容できるキャリヤー又はアジュバントと共に混合される本発明の分子を含んで成る医薬組成物を提供する。医薬組成物は好ましくは、本発明の分子と共に組み合わされる場合、その分子の活性を保持し、そして対象の免疫系と非反応性であるいずれかの材料を含む、適切なキャリヤー及びアジュバントを含む。それらのキャリヤー及びアジュバントは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カルシウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、リン酸緩衝溶液、水、エマルジョン（例えば、油/水エマルジョン）、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基材の物質及びポリエチレングリコール。他のキャリヤーはまた、無菌溶液、錠剤、例えば被覆された錠剤及びカプセルを包含する。
【０１６４】
典型的には、そのようなキャリヤーは、賦形剤、例えば澱粉、ミルク、糖（例えば、スクロース、グルコース、マルトース）、一定のタイプのクレー、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、タルク、植物脂肪又は油、ガム、グリセロール、又は他の既知賦形剤を包含する。そのようなキャリヤーはまた、風味及び着色添加剤又は他の成分を含むことができる。そのようなキャリヤーを含んで成る組成物は、良く知られている従来の方法により配合される。そのような組成物はまた、種々の脂質組成物、例えばリポソーム内に、及び種々のポリマー組成物、例えばポリマー微小球に配合され得る。
【０１６５】
H. キット：
本発明はさらに、研究又は診断目的のためにキットに関する。キットは典型的には、本発明の修飾されたコリン分子を含む、１又は複数の容器を含む。好ましい態様においては、キットは、修飾されたコリン分子を、第２分子により誘導するために適切な形で含む容器を含んで成る。より好ましい態様においては、キットは、配列番号34の修飾されたコリン分子を含む容器を含んで成る。本発明の組成物を、遊離形又は医薬的に許容される形で含んで成るキットがさらに提供される。キットは、その投与のための説明書を含むことができる。本発明のキットは、本発明のいずれかの方法に使用され得る。
【０１６６】
もう1つの態様においては、キットは、本発明の修飾されたコリン分子をコードするDNAを含むことができる。好ましくは、それらの修飾されたコリン分子をコードするDNA配列は、宿主細胞中へのトランスフェクション及びその細胞による発現のために適切なプラスミドに供給される。プラスミドは、宿主細胞においてDNAの発現を調節するためにプロモーター（しばしば、誘発プロモーター）を含むことができる。
【０１６７】
プラスミドはまた、種々の修飾されたコリン分子を生成するためにプラスミド中への他のDNA配列の挿入を促進するための適切な制限部位を含むことができる。プラスミドはまた、コードされるタンパク質のクローニング及び発現を促進するために多くの他の要素を含むことができる。そのような要素は、当業者に良く知られており、そして例えば、選択マーカー、開始コドン、終結コドン、及び同様のものを包含する。より好ましい態様においては、キットは、配列番号33のDNA配列を含む容器を含んで成る。
【０１６８】
I．本発明の修飾されたコリン分子の有用性：
本発明の修飾されたコリン分子は、いずれかの病院、例えば高血圧、心臓肥大、心筋障害、心臓線維症、虚血性心疾患、心弁膜疾患、心筋炎、及び子癇前症（但し、それらだけには制限されない）の心血管疾患を処理するために有用である。
【０１６９】
J. 本発明の修飾されたコリン分子の試験：
本発明の修飾されたコリン分子のインビトロ有用性が、例３〜５に記載されるアッセイ、及び新生児ラット心筋細胞肥大において試験され得る（van Rooij, E. など. (2002) J. Biol. Chem. 277: 48617-48626 及び Liang, F.など. (2003) J.Biol. Chem. 278: 15073-15083）。
【０１７０】
本発明の修飾されたコリン分子のインビボ有用性が、例６に記載されるアッセイ、及び冠状動脈連結の後、マウス心筋梗塞モデル（Feng, Q. など. (2001) Circulation 104: 700-704）、横方向胸大動脈連結により行われる大動脈収縮の後、マウス血圧過負荷モデル（Meguro, T. など.(1999) Circ. Res. 84: 735-740）、マウス血圧過負荷モデル（Rockman, H. A. など. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8277-8281）、マウス遺伝子モデル（Beggah, A. T. など. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 7160-7165）、心筋症ハムスター低体温症−心臓麻痺モデル（Hoshijima, M. など. (2002) Nature Med. 8: 864-871 及び Ikeda, Y. など. (2002) Circulation 105: 502-508）、及びイヌペーシング不全モデル（Shen, W. など. (2002) J. Pharmacol. Exp.Ther. 303: 673-680 及び Shen, W. など. (1999) Circulation 100: 2113-2118）において試験され得る。
【０１７１】
K. 本発明の修飾されたコリン分子の投与：
本発明の修飾されたコリン分子、又はそれらの医薬的に許容できる塩の純粋な形又は適切な医薬組成物での投与は、類似する利用性を付与するための投与又は剤の許容できる態様のいずれかを通して実施され得る。従って、投与は、固体、半固体、凍結乾燥された粉末又は液体投与形、例えば錠剤、坐剤、ピル、軟質弾性及び硬質ゼラチンカプセル、粉末、溶液、懸濁液又はエアロゾル又は同様のものの形で、好ましくは正確な用量の単純な投与のために適切な単位用量形で、経口、鼻腔内、非経口、局部、経皮又は直腸的であり得る。組成物は、従来の医薬的キャリヤー又は賦形剤及び活性剤としての本発明の修飾されたコリン分子を含み、そしてさらに、他の薬物、医薬剤、キャリヤー、アジュバント、等を含むことができる。
【０１７２】
一般的に、投与の意図される形に依存して、医薬的に許容できる組成物は、約１〜約99重量％の本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩、及び99〜１重量％の適切な医薬的賦形剤を含むであろう。好ましくは、組成物は、約５〜75重量％の本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含み、そして残りは、適切な医薬的賦形剤である。
【０１７３】
投与の１つの好ましい経路は、処理される疾病状態の重症度に従って調製され得る便利な毎日の用量レジメを用いて、経口的である。そのような経口投与に関しては、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む医薬的に許容できる組成物は、通常使用される賦形剤、例えば医薬品のマンニトール、ラクトース、スターチ、プレゼラチン化されたスターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロースエーテル誘導体、グルコース、ゼラチン、スクロース、シトレート、プロピルガレート及び同様のもののいずれかの組込みにより形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持効性製剤及び同様のものの形を取る。
【０１７４】
好ましくは、そのような組成物は、カプセル、カプレ又は錠剤の形を取り、そして従って、希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム及び同様のもの；砕解剤、例えばクロスカルメロースナトリウム又はその誘導体；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム及び同様のもの；及び結合剤、例えばスターチ、アカシアガム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースエーテル誘導体及び同様のものを含むであろう。
【０１７５】
投与のもう１つの好ましい経路は、非経口、例えば静脈内、皮下又は筋肉内投与であり、ここで本発明の修飾されたコリン分子が医薬組成物に使用され得る。従って、上記修飾されたコリン分子は好ましくは、許容できる無菌医薬キャリヤー、例えば５％デキストロース、乳酸化されたリンガー液、通常の塩溶液、無菌水、又は静脈内注入のために企画された、いずれか他の市販の生理学的緩衝溶液と共に組合わされるであろう。キャリヤー溶液、及び組成物の用量及び投与の選択は、対象及び特定の臨床学的設定により変化し、そして標準の医学方法により支配されることが理解されるであろう。
【０１７６】
融合タンパク質の投与は、ボーラス静脈内注射、一定の静脈内注入又は両経路の組合せによることができる。他方では又はさらに、適切な賦形剤と共に混合される融合タンパク質は、筋肉内又は皮下部位から循環中に取られる。静脈内、皮下又は筋肉内投与のための典型的な医薬組成物は、当業者により容易に決定され得る。投与される量は、明らかにタンパク質特異的であり、そしてその能力及び薬物力学プロフィールに依存する。非経口投与できる組成物を調製するための実際の方法は、当業者に知られているか又は明らかであり、そしてRemington's Pharmaceutical Science, 18th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)のような出版物により詳細に記載されている。組成物の単一又は複数回の投与は、患者により必要とされ、そして許容されるような用量及び頻度に依存して行われる。いずれにせよ、組成物は、患者を効果的に処理するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供すべきである。
【０１７７】
本発明の修飾されたコリン分子、又はそれらの医薬的に許容できる塩は、例えば身体内でゆっくりと溶解するキャリヤー、例えばポリオキシエチレングリコール及びポリエチレングリコール（PEG）、例えばPEG1000（96％）及びPEG4000（４％）に混合される約0.5〜約50％の活性成分を用いて、坐剤中に配合され得る。
液体の医薬的に投与できる組成物は、本発明の修飾されたコリン分子（約0.5〜約20％）又は医薬的に許容できるその塩、及び任意の医薬的アジュベントを、キャリヤー、例えば水、塩溶液、水性デキストロース、グリセロール、エタノール及び同様のものに溶解し、分散し、等のようにし、それにより、溶液又は懸濁液を形成することにより調製され得る。
【０１７８】
所望により、本発明の医薬組成物はまた、少量の補助物質、例えば湿潤又は乳化剤、pH緩衝剤、酸化防止剤及び同様のもの、例えばクエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ブチル化されたヒドロキシトルエン、等を含むことができる。
そのような用量形を調製するための実際の方法は、当業者に知られているか、又は明らかであろう；例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. , (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990)を参照のこと。投与される組成物は、いずれにせよ、高血圧により特徴づけられる疾病状態の処理のために、本発明の技法に従って、治療的有効量の本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含むであろう。
【０１７９】
本発明の修飾されたコリン分子又はそれらの医薬的に許容できる塩は、次の種々の要因に依存して変化するであろう治療的有効量で投与される：使用される特定の修飾されたコリン分子の活性；修飾されたコリン分子の代謝安定性及び作用の長さ；患者の年齢、体重、一般的健康性、性別及び食事；投与の態様及び時間；排泄の速度；薬剤の組み合わせ；特定の疾病状態の重症度；及び治療を受ける宿主。一般的には、治療的に有効な毎日の用量は、約0.14mg〜約14.3mg/kg体重/日の本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩；好ましくは約0.7mg〜約10mg/kg体重/日；及び最も好ましくは、約1.4mg〜約7.2mg/kg体重/日である。例えば、70kgの患者への投与のためには、その投与量範囲は、約10mg〜約1.0g/日の本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩、好ましくは約50mg〜約700mg/日、及び最も好ましくは約100mg〜500mg/日である。
【０１８０】
L. 好ましい態様：
上記の本発明の要約に示されるような本発明の修飾されたコリン分子のうち、いくつかのグループの修飾されたコリン分子が特に好ましい。
１つの好ましい態様においては、本発明の修飾されたコリン分子は、コリンの細胞外ドメイン、又はそのフラグメント又は誘導体、及び野生型コリン活性化配列RILGGを置換する置換活性化配列を含んで成る。
【０１８１】
より好ましい態様においては、本発明の修飾されたコリン分子は、コリンの細胞外ドメイン、又はそのフラグメント又は誘導体、及び野生型コリン活性化配列RILGGを置換する置換活性化配列DDDDKILGGを含んで成る。
さらにより好ましい態様においては、本発明の修飾されたコリン分子は、コリンの細胞外ドメイン、又はそのフラグメント又は誘導体、及び野生型コリン活性化配列RILGGを置換する置換活性化配列DDDDKILGGを含んで成り、そしてさらに、N−末端IgKシグナル配列及びC−末端エピトープ標識を含んで成る。
【０１８２】
配列番号34の修飾されたコリン分子が、本発明の好ましい態様である。
次の特定の例は、本発明の実施において助けになるガイドとして提供されるが、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１８３】
例１：ヒトコリン発現ベクターの構成：
コリンによるプロ−ペプチドのインビトロプロセッシングを試験するために、十分な長さのヒトコリンポリペプチド及びその誘導体をコードする哺乳類発現ベクターを構成した。
【０１８４】
十分な長さのヒトコリン発現ベクターの構成：
野生型ヒトコリンcDNAを、ヒト心臓cDNAライブラリーからクローン化した（Yan, W. など. (1999)前記）。十分な長さのヒトコリンcDNA配列は、4933個の長さのヌクレオチドであり、そして翻訳開始メチオニンコドン及び翻訳終結コドンを包含するヒトコリンコード配列は、3129個の長さのヌクレオチドである（図１、配列番号１を参照のこと）。野生型コリンポリペプチド配列は、1042個のアミノ酸（図２、配列番号２を参照のこと）から成り、そして約116kDaの計算された質量を有する（Yan, W. など. (1999) 前記）。
【０１８５】
十分な長さのヒトコリンcDNAを含むプラスミド構造体を、記載のようにして生成した（Yan, W. など. (2000)前記）。位置94での翻訳開始コドン〜位置3219でのC−末端アミノ酸のヒトコリンコード領域を、前方向プライマー（5'-ATGAAACAGTCTCCTGCCCTCGCTCCGGAAGAGC-3'；配列番号３）及び逆方向プライマー（5'-GTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTA-3'；配列番号４）を用いてPCRにより増幅し、そして哺乳類発現ベクターpcDNA3.1/V5-His- TOPO(Invitrogen)のPCR生成物部位中に挿入した。この発現ベクターを用いて生成される組換えコリンは、C−末端ウィルスV5エピトープ及び6xHis標識を含み、それにより、抗−V5又は抗−His抗体による組換えタンパク質の検出を促進する。制限酵素消化及びDNA配列決定により確認された、その得られるプライマーpcDNA3.1Corinは、ヒトコロンアミノ酸１−1042、続いてC−末端V5エピトープ及び6xHis標識から成る組換えコリンを発現する。
【０１８６】
トランスメンブラン含有ヒトコリン検出変異体発現ベクターの構成：
内部欠失を含む組換えコリン分子の生成を促進するために、XhoI制限部位を、次の通りにして、PCR方法により、十分な長さのヒトコリンcDNA配列中に導入した。DNA鋳型としてpcDNA3.1Corin（上記参照のこと）を用いて、配列番号２のアミノ酸１−123に対応する、配列番号１における位置１−369のヒトコリンのN−末端領域を、前方体プライマーCor/TMa(5'-GGGGGAATTCATGAAACAGTCTCCTGCCCTCGCTCCGGAAGAGC-3' ; 配列番号5)及び逆方向のプライマーCor/TMb (5'-GGGGCTCGAGCGTAGTCCAGGCTGGAACGTGTTGGTCG-3'; 配列番号6)を用いてのPCRにより増幅した。PCR生成物を、EcoRI及びXhoI（New England Biolabs）により消化し、そしてpcDNA4/HisMaxC (Invitrogen)のEcoR1 及び Xhol 部位中に挿入した。
【０１８７】
この中間体プラスミドは、pcDNA4NCorin1である。再び、DNA鋳型としてpcDNA3.1Corinを用いて、配列番号２のアミノ酸124−1042に対応する、配列番号１における位置370−3129のヒトコリンのC−末端領域を、前方体プライマーCorFL (5'-GGGGCTCGAGGATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAGTCACAGG-3'; 配列番号7)及び逆方向のプライマーCorEnd (5'- GGGGGGGCCCTTAGTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG -3'; 配列番号8)を用いてのPCRにより増幅した。PCR生成物を、Xhol及びApal（New England Biolabs）により消化し、そしてpcDNA4NCorin1 (Invitrogen)のXhol及びApal 部位中に挿入した。得られるプラスミドpcDNA4FLCorinは、ヒトコリンアミノ酸1−123、XhoI部位（CTCGAG）の導入のための２種のアミノ酸挿入体（Leu-Glu）、及びヒトコリンアミノ酸124−1042（配列番号９）から成る組換えコリンを発現する。
【０１８８】
内部欠失変異体１−５を、次の通りにPCR方法によりヒトコリンのトランスメンブラン形で生成した。DNA鋳型としてpcDNA3.1Corinを用いて、ヒトコリンのC−末端領域を、前方向のプライマーCorDe II (5’-GGGGCTCGAGCTCTGTGGAAGGGGTGAGAACTTTCTGTGTGC-3’, 配列番号10), CorDel II (5’-GGGGCTCGAGCTGAATAACTGTAGTCAATGTGAACC-3’, 配列番号11), CorDel III (5’-GGGGCTCGAGGTGGAAGAATGCTCACCTAGTCATTTCAAG-3’, 配列番号12), CorDel IV (5’-GGGGCTCGAGGTGTGTGCAGATGGCTGGCAGGAGATATTG-3’, 配列番号13), and CorDel V (5’-GGGGCTCGAGGACTGTGGGCGCCGCCCTGCTGCCCGAATG-3’; 配列番号14), 及び逆方向プライマーCorEnd（配列番号８）を用いてPCRにより増幅した。
【０１８９】
個々のPCR生成物を、XhoI及びApaIにより消化し、そしてpcDNA4FLCorin1のXhoI及びApaI部位中に挿入した。その得られるプラスミドは、ヒトコリンアミノ酸1−123、２種のアミノ酸挿入体（Leu−Glu）、及びヒトコリンアミノ酸268−1042（欠失１、配列番号15）、449−1042（欠失２、配列番号16）、577−1042（欠失３、配列番号17）、713−1042（欠失４、配列番号18）又は789−1042（欠失５、配列番号19）から成る組換えコリンポリペプチドを発現する。
【０１９０】
内部欠失６を、次の通りにPCR方法によりヒトコリンのトランスメンブラン形で生成した。DNA鋳型としてpcDNA3.1 Corinを用いて、配列番号２のアミノ酸１−259に対応する、配列番号１における位置１−777のヒトコリンのN−末端領域を、前方向プライマーCor/TMa（配列番号５）及び逆方向プライマーDel 62 (5'-GGGGCTCGAGAGGTGAGAAGCAAATTCTGCTGACATTGC-3' ; 配列番号20)を用いてのPCRにより増幅した。PCR生成物を、EcoRl 及びXhol (New EnglandBiolabs)により消化し、そしてpcDNA4/HisMaxC (Invitrogen)のEcoR1 及び Xhol 部位中に挿入した。この中間体プラスミドは、pcDNA4NCorin2である。
【０１９１】
DNA鋳型としてpcDNA3.1 Corinを用いて、配列番号２のアミノ酸415−1042に対応する、配列番号２における位置1247−3129のヒトコリンのN−末端領域を、前方向プライマーDel 61(5'-GGGGCTCGAGAGCGTCATTCAGACTTCATGTCAAGAAGG-3' ; 配列番号21)及び逆方向プライマーCorEnd (配列番号８)を用いてのPCRにより増幅した。PCR生成物を、Xhol及びApalにより消化し、そしてpcDNA4NCorin2のXhol及びApal 部位中に挿入した。この得られるプラスミドは、ヒトコリンアミノ酸１−259、Leu−Glu、及びヒトコリンアミノ酸415−1042から成る組換えコリン（欠失６、配列番号22）を発現した。
【０１９２】
内部欠失７を、次の通りにPCR方法によりヒトコリンのトランスメンブラン形で生成した。DNA鋳型としてpcDNA3.1 Corinを用いて、配列番号２のアミノ酸１−449に対応する、配列番号１における位置１−1347のヒトコリンのN−末端領域を、前方向プライマーCor/TMa（配列番号５）及び逆方向プライマーDel 72 (5'-GGGGCTCGAGAGGTGAGAAGCAAATTCTGCTGACATTGC-3' ; 配列番号23)を用いてのPCRにより増幅した。PCR生成物を、EcoRl 及びXhol (New EnglandBiolabs)により消化し、そしてpcDNA4/HisMaxC (Invitrogen)のEcoR1 及び Xhol 部位中に挿入した。この中間体プラスミドは、pcDNA4NCorin3である。
【０１９３】
DNA鋳型としてpcDNA3.1 Corinを用いて、配列番号２のアミノ酸569−1042に対応する、配列番号１における位置1705−3129のヒトコリンのC−末端領域を、前方向プライマーDel 71(5'-GGGGCTCGAGACCTGCCTGATGCCTGATGAATATGTGG-5' ; 配列番号24)及び逆方向プライマーCorEnd (配列番号８)を用いてのPCRにより増幅した。PCR生成物を、Xhol及びApalにより消化し、そしてpcDNA4NCorin3のXhol及びApal 部位中に挿入した。この得られるプラスミドは、ヒトコリンアミノ酸１−449、Leu−Glu、及びヒトコリンアミノ酸569−1042から成る組換えコリン（欠失7、配列番号25）を発現した。
【０１９４】
十分な長さのヒトコリン及びトランスメンブラン−含有ヒトコリン内部欠失変異体の図解構造体が図３に示される。それらは次のものである：CRD１ドメイン（アミノ酸124−267）を欠いている欠失１；CRD1及びLDLR１−５ドメイン（アミノ酸124−448）を欠いている欠失２；CRD1, LDLR1-5 及び CRD2ドメイン（アミノ酸124−576）を欠いている欠失３；CRD1, LDLR1-5, CRD2 及び LDLR6-8ドメイン（アミノ酸124−712）を欠いている欠失４；CRD1, LDLR1-5, CRD2, LDLR6-8及びSRCRドメイン（アミノ酸124−788）を欠いている欠失５；LDLR1−5ドメイン（アミノ酸260−414）を欠いている欠失６；及びCRD2ドメイン（アミノ酸450−568）を欠いている欠失７。
【０１９５】
トランスメンブラン−含有の修飾されたコリン発現ベクターの構成：
ほとんどのトリプシン−様セリンプロテアーゼのように、コリンは、チモーゲンとして合成される（Yan, W. など (1999) 前記; Yan, W.など. (2000) 前記）。コリンにおける予測される活性化切断配列は、アミノ酸Arg801とIle802との間に存在する。この時点で、コリンの生理学的活性化因子は未知である。酵素的活性のコリンを生成するために、本明細書に記載される細胞に基づくアッセイは、HL-5又は293細胞において発現される未知のセリンプロテアーゼに依存する。酵素的活性のコリンを生成するためのもう１つの方法は、既知のセリンプロテアーゼにより特異的に認識される活性化切断配列、例えばエンテロキナーゼにより認識されるペプチド配列Asp- Asp-Asp-Asp-Lys (DDDDK)を導入することである（Kitamoto, Y. など. (1994)前記）。
【０１９６】
トランスメンブラン−含有の修飾されたヒトコリンを発現するプラスミド構造体を、次の通りにして突然変異誘発キット（Stratagene）を用いてのPCR方法により生成した。DNA鋳型としてpcDNA4FL Corinを用いて、ヒトコリンのC−末端領域を、次の２組のプライマーを用いてのPCRにより増幅した：（１）前方向プライマーEntPCR1a (5'-CAACACGTTCCAGCCTGGACTACGCTC-3' ; 配列番号26)及び逆方向プライマーEntPCR1 b(5'-CCTCCAAGGATCTTATCGTCATCGTCCCCACAGTCTTGTTTAGTACA-3'; 配列番号27)、ヒトコリンアミノ酸116−791、エンテロキナーゼ活性化切断配列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DDDDK)、及びヒトコリンアミノ酸802−805に及ぶ、及び（２）前方向プライマーEntPCR2a（5'-GGTTTAAACGGGCCCTTAGTTTAGGAG-3'; 配列番号28）及び逆方向プライマーEntPCR2b（5'- GACGATGACGATAAGATCCTTGGAGGTCGGACGAGTCG-3'; 配列番号29）、エンテロキナーゼ活性化配列及びヒトコリンアミノ酸802−1042に及ぶ。
【０１９７】
使用されるPCR条件は次の通りであった：95℃−２分；95℃−30秒；56℃−30秒；72℃−２分；30サイクル；及び72℃−10分。PCR生成物を、XhoI及びApaIにより消化し、そしてpcDNA4FL CorinのXhoI及びApaI部位中に挿入した。得られるプライスミドpcDNA4FLCorin-EKは、ヒトコリンアミノ酸１−123、Leu−Glu、ヒトコリンアミノ酸124−791、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、及びヒトコリンアミノ酸802−1042（FLCorin−EK、配列配列番号30）から成る組換えコリンペプチドを発現する。
【０１９８】
可溶性の修飾されたヒトコリン発現ベクターの構成：
タイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼのN−末端トランスメンブランは、細胞表面上の特定の位置にプロテアーゼの活性を制限する調節機構の一部に予測される（Hooper, J.D.など. (2001) 前記）。しかしながら、トランスメンブランは、組換え可溶性エンテロキナーゼ（Lu, D.など. (1997)J.Biol. Chem. 272: 31293-31300）及びマトリプターゼ（Lin, C.Y. など. (1997) J.Biol. Chem. 272:9147-9152 ; Takeuchi, T. など (2000) J.Biol. Chem. 275: 26333-26342）は酵素的に活性であることが示されているので、タイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼの酵素活性のために必要とされるとは思われない。
【０１９９】
ヒトコリンの予測されるN−末端トランスメンブランは、アミノ酸残基46−66を包含する（Yan, W. など. (1999) 前記）。従って、ヒトコリンの細胞外ドメインは、図１における位置199−3129に対応する、図２におけるアミノ酸残基67−1042を包含する。トランスメンブランを欠き、そしてエンテロキナーゼ活性化切断配列を含む可溶性ヒトコリンを発現するプラスミド構造体を次の通りにしてPCR方法により生成した。DNA鋳型としてpcDNA4FLCorin-EKを用いて、トランスメンブランドメインを欠き、そしてエンテロキナーゼ活性化切断配列Asp-Asp-Asp-Asp-Lysを含むヒトコリン領域を、前方向プライマーCorFL-1 (5'-GGGGCTCGAGGATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAGTCACAGG-3'; 配列番号31)、及び逆方向プライマーCorSol2Apa2 (5'-GGGGGGGCCCGTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG-3'；配列番号32)（ヒトコリンアミノ酸124−1024及びエンテロキナーゼ活性化切断配列に及ぶ）を用いてのPCRにより増幅した。
使用されるPCR条件は次の通りであった：95℃−２分；95℃−30秒；56℃−２分；72℃−３分；30サイクル；及び72℃−15分。PCR生成物を、pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中に挿入した。得られるプラスミドは、N−末端Igk分泌シグナル配列（アミノ酸１−36）、Leu−Glu（アミノ酸37−38）、ヒトコリンアミノ酸124−796（アミノ酸39−711）、エンテロキナーゼ活性化切断配列（アミノ酸712−716）、ヒトコリンアミノ酸802−1042（アミノ酸717−957）及びC−末端ウィルスV5及び6xHisエピトープ標識（アミノ酸958−991）から成る組換えコリンポリペプチド、すなわちSolCorin−EK（核酸配列（配列番号33）、アミノ酸配列（配列番号34））を発現する。
【０２００】
ヒトコリンのセリンプロテアーゼドメインは、アミノ酸802−1042である（Yan, W. など. (1999)前記）。エンテロキナーゼ活性化切断配列及びセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含む可溶性ヒトコリンを発現するプラスミド構造体を、次の通りにしてPCR方法により生成した。DNA鋳型としてpcDNA3.1Corinを用いて、ヒトコリンのセリンプロテアーゼドメインを、次の２種の前方向プライマーSoCat1 (5'-CTGCTGCCGACGATGACGATAAGATCCTTGGAGGTCGGACGAGTCG-3', 配列番号35) 及びSolCat2 (5'- AAACAAGACTGTGGGCGCCGCCCTGCTGCCGACGATGACGATAAG-3', 配列番号36)、及び逆方向プライマーCorSol2Apa2(配列番号32)（ヒトコリンアミノ酸787−796、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys及びヒトコリンアミノ酸802−1042に及ぶ）を用いてのPCRにより増幅した。
【０２０１】
使用されるPCR条件は次の通りであった；95℃−２分；95℃−30秒；58℃−１分；72℃−１分；30サイクル；及び72℃−15分。PCR生成物を、pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中に挿入した。その得られるプラスミドは、N−末端Igk分泌シグナル配列（アミノ酸１−36）、ヒトコリンアミノ酸787−796（アミノ酸37−46）、エンテロキナーゼ活性化切断配列（アミノ酸47−51）、ヒトコリンアミノ酸802−1042（アミノ酸52−292）、及びC−末端ウィルスV5及び6xHisエピトープ標識（アミノ酸293−326）から成る組換えコリンポリペプチド、すなわちSolCorinPD-EKの核酸及びアミノ酸配列（アミノ酸配列、配列番号37）を発現する。
Corin-EK 及びSoICorinPD-EKの図解構造体は、図７に示される。SolCorin-EKの核酸及びアミノ酸配列は、それぞれ図10及び11に示される。
【０２０２】
例２：プロ−ANP及びプロ−BNP発現ベクターの構成：
インビトロのコリンによるプロ−ペプチドのプロセッシングを試験するために、ヒトプロ−ANP及びプロ−BNPをコードする哺乳発現ベクターを構成した。
【０２０３】
ヒト野生型プロ−ANP又はヒト野生型プロ−BNPのいずれかを発現するプラスミド構造体を、記載のようにして生成した（Yan, W. など. (2000)前記）。ヒトプロ−ANP（Oikawa, S. など. (1984) Nature 309: 724-726）及びヒトプロ−BNP（Sudoh, T.など. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 1427-1434）のコード領域を、ヒト心臓cDNAライブラリーからPCRにより増幅し、そしてpcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)中に個々に挿入した。この発現ベクターを用いて生成される組換えプロ−ANP及びプロ−BNPは、C−末端ウィルスV5及び6xHisエピトープ標識を含み、それにより、抗V5及び抗−His抗体による組換えタンパク質の検出を促進する。得られるプラスミドを、制限酵素消化及びDNA配列決定により確めた。
【０２０４】
例３：インビトロでのコリンによるプロ−ペプチドのプロセッシング：
インビトロでのコリンによるプロ−ペプチドのプロセッシングを試験するために、培養物における哺乳類細胞を、コリン発現ベクター及びプロ−ペプチド発現ベクターにより同時トランスフェクトする。プロ−ペプチドの切断を、組換えコリン又はプロ−ペプチドに結合されるペプチド標識に対する抗体を用いてウェスターンブロットにより分析する。
【０２０５】
細胞培養物：
ネズミHL−５心筋細胞を、10％FBS、15μg/mlのインスリン、50μg/mlの内皮増殖サプリメント（Upstate Biotechnology Institute）、１μMのレチン酸、0.1mMのノルエピネフリン、100μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、292μg/mlのL−グルタミン及び0.1mMのMEM非必須アミノ酸を含むEx−Cell320培地（JRH Biosciences）において培養した。ヒト293細胞を、10％のFBS及び１％L−グルタミンにより補充されたα−MEM（Life Technologies, Ins.）において培養した。子供ハムスター腎臓（BHK）細胞を、10％FBSにより補充されたEMEM（Life Technologies, Inc.）において培養した。すべての細胞を、５％CO2及び95％空気を含む、保湿されたインキュベーターにおいて37℃で培養した。
【０２０６】
トランスフェクション及びウェスターンブロット分析：
過渡的トランスフェクションを、Lipofection (Invitrogen)を用いて、その製造業者の説明書に従ってHL−５細胞において行った。過渡的又は安定したトランスフェクションを、Lipofection 2000（Life Technologies, Inc.）用いて、その製造業者の説明書に従って、293細胞において行った。対照発現ベクター（pcDNA）又は組換えコリン発現ベクター（pcDNA3.1 Corin）を、組換えプロ−ANP発現ベクター（pcDNApro-ANP）により同時トランスフェクトした。
【０２０７】
ならし培地を、トランスフェクションの48又は72時間後、集めた。プロ−ANPプロセッシングを分析するために、ならし培地における組換えプロ−ANP及びその誘導体、及び組換えコリンを、抗−V5抗体（Invitorogen）により免疫沈澱した。タンパク質を、SDS−PAGEにより分離し、そしてホースラディシュペルオキシダーゼ−接合された抗−V5抗体（Invitrogen）を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。図４に示されるように、プロ−ANPのプロセッシングを、プロ−ANP発現ベクターのみによりトランスフェクトされたHL−５細胞において検出した。しかしながら、組換えコリンの発現はさらに、HL−５細胞におけるプロ−ANPのプロセッシングを増強した。
【０２０８】
cGMPアッセイ：
プロセッシングされた組換えANPの活性を試験するために、cGMPアッセイを、酵素イムノアッセイ（EIA）キット（Biotrak, Amersham Biosciences,Inc.）及び１％L−グルタミンにより補充されたMEM培地を含む96−ウェルプレートにおいて増殖した。集密性細胞を、血清フリーの培地により１度、洗浄した。トランスフェクトされたヒト293細胞又はネズミHL−５細胞から組換えプロ−ANP及びその誘導体を含むならし培地（180μl）を、個々のウェルに添加し、そして37℃で10分間インキュベートした。
【０２０９】
前記細胞を、２％ドデシルトリメチルアンモニウム及び50mMの酢酸ナトリウム（pH5.8）を含む溶解緩衝液20μlにより溶解した。ANP−刺激されたBHK細胞における細胞内cGMP濃度を、Biotrak EIAキットにより決定した。個々の実験条件は、４重反復してアッセイされた。図５に示されるように、十分な長さのヒトコリン発現ベクターによりトランスフェクトされていないか又はトランスフェクトされた293細胞からのならし培地は、BHK細胞におけるcGMPレベルを高めない。トランスフェクトされていないHL−5細胞からのならし培地は細胞内cGMP生成を刺激し；この生成は、十分な長さのヒトコリン発現バクターによりトランスフェクトされたHL−５細胞からのならし培地を用いることにより増強される。
【０２１０】
例４：インビトロでのコリン内部欠失変異体によるプロ−ANPのプロセッシング：
インビトロでのプロ−ペプチドのプロセッシングのためにヒトコリンの種々のドメインについての必要条件を試験するために、培養物における哺乳類細胞を、十分な長さのヒトコリン発現ベクター又は一連のヒトコリン内部欠失変異体発現ベクター（例１を参照のこと）、及びプロ−ペプチド発現ベクターにより同時トランスフェクトする。プロ−ペプチドの切断を、組換えコリン及びプロ−ペプチドに結合される標識に対する抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析する。
【０２１１】
ヒト293細胞を、pcDNApro−ANP、及び十分な長さのヒトコリン内部欠失変異体を発現するプラスミドにより、Lipofectamine 2000を用いて、その製造業者の説明書に従って同時トランスフェクトした。24時間後、組換えヒトプロ−ANP及びその誘導体を含むならし培地を集め、そしてプロ−ANPのプロセッシングを、抗−V5抗体を用いての免疫沈澱により、続いてHRP−接合された抗−V5抗体を用いてのウェスターンブロットにより分析した。
【０２１２】
図６は、十分な長さのヒトコリンポリペプチド、及びCRD1ドメインを欠いている欠失１がプロ−ANPをプロセッシングできるが、ところが欠失２−５は、このアッセイにおいて不活性であることを示す。欠失６及び７はまた、このアッセイにおいて不活性である（データは示されていない）。トランスフェクトされた293細胞から調製された細胞抽出物のウェスターンブロットは、内部欠失変異体構造体のすべてが予測されるサイズのコリンポリペプチドを発現したことを確かにした（図６及びデータは示されない）。
【０２１３】
例５：インビトロでのエンテロキナーゼによる修飾されたコリンのプロセッシング：
インビトロでのエンテロキナーゼによる修飾されたコリンのプロセッシングを試験するために、培養物における哺乳類細胞を、コリン発現ベクターにより同時トランスフェクトする。コリンの切断を、組換えコリンに結合されるペプチド標識に対する抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析する。
【０２１４】
細胞培養物及びトランスフェクション：
ヒト293細胞を、10％FBS及び１％L−グルタミンにより補充されたα−MEM（Life Technologies, Inc.）において培養した。過渡的又は安定したトランスフェクション、Lipofectin 2000 (Life Technologies, Inc.)を用いて、その製造業者の説明書に従って、293細胞において行った。
【０２１５】
エンテロキナーゼによる修飾されたコリンの活性化：
組換えSolCorin-EK 又はSolCorinPD-EKを、安定してトランスフェクトされたヒト293細胞において発現した。SolCorin-EK 又はSolCorinPD-EKを含むならし培地（0.5ml）を集め、そして0, 2, 10, 20又は40単位の精製されたエンテロキナーゼ（Calbiochem）と共に25℃で４時間インキュベートした。コリンの活性化を分析するために、20μlのサンプルを、SDS−PAGE、続いて抗−V5抗体（Invitrogen）を用いてのウェスターンブロットのために使用した。図８に示されるように、長形（Solcorin−EK）及び短形（SolCorin PD-EK）の可溶性の修飾されたヒトコリンの両者を、用量−依存性態様でエンテロキナーゼへの暴露により切断した。
【０２１６】
エンテロキナーゼ活性化され、修飾されたコリンによるヒトプロ−ANPの活性化：
組換えヒトプロ−ANPを、リポフェクタミン2000（Life Technologies, Inc.）を用いて、その製造業者の説明書に従って、ヒト293細胞中に過渡的にトランスフェクトした。プロ−ANP−含有ならし培地を、24時間後、集め、そして後での使用のために氷上に配置した。安定してトランスフェクトされたヒト293細胞からのならし培地におけるSolCorin-EK 又はSolCorinPD-EKの活性化を、上記のようにして行った。エンテロキナーゼを除くために、エンテロキナーゼ切断捕獲キットを用いた（Calbiochem）。ならし培地の個々のサンプルを、100μlのEkaptureアガロースビーズと共に25℃で30分間インキュベートし、そして回転フィルターを通して濾過した。
【０２１７】
対照OPTI-MEM (Life Technologies, Inc.)又はエンテロキナーゼ−消耗されたならし培地（250μl）を、1mlのプロ−ANP含有ならし培地と共に４℃で３時間インキュベートした。プロ−ANPのプロセッシングを、抗−V5抗体を用いての免疫沈澱により、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合された抗−V5抗体を用いてのSDS−PAGE及びウェスターンブロットにより分析した。組換えコリンをまた、それがC−末端ウィルスV5エピトープ標識を含むので、ウェスターンブロットにおける抗−V5抗体により認識する。図９に示されるように、プロ−ANPを、短形（SolCorin−PD−EK）ではなく長形（SolCorin−EK）の可溶性の修飾されたヒトコリンにより、インビトロでのエンテロキナーゼによる活性化に基づいて、ANPにプロセッシングした。
【０２１８】
例６：インビボでの可溶性の修飾されたヒトコリンの活性：
インビボでの可溶性の修飾されたヒトコリンの活性を試験するために、組換えSolCorin−EKを、哺乳類細胞において発現し、精製し、エンテロキナーゼにより活性化し、そして次に、ハムスターにおける利尿及びナトリウム排泄増加を刺激するその能力について試験した。
【０２１９】
組換えSolCorin-EK 又はSolCorinPD-EKの精製：
組換えSolCorin−EKを、安定してトランスフェクトされたヒト293細胞において発現した（例５を参照のこと）。SolCorin−EK発現細胞からのならし培地を、Opticab4カプセル使い捨てカートリッジフィルター（Millipore）を通して濾過し、約10倍に濃縮し、そして20mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaClにおいてダイアフィルトレーションした。次に、脂質を、Zeta PlusBioCapフィルター (Cuno)を通しての濾過により除去した。
【０２２０】
SolCorin−EKを含む濃縮され、そしてダイアルファイルトレーションされたならし培地を、10mMのイミダゾールに対して調節し、次に0.45μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、そして20mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaClにより平衡化されたNi-NTA-Superflow (Qiagen)カラム上に負荷した。カラムを、20mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaCl、20mMのイミダゾールにより洗浄し、そしてタンパク質を、20mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaCl中、20mM〜250mMのイミダゾールのグラジエントのカラムから溶出した。
【０２２１】
SolCorin−EKを含むNi−NTA溶出物を、20mMのトリス−HCl（pH7.5）により平衡化されたPoros50ポリエチレンイミン（PI）（Perseptive Biosystems）アニオン交換カラム上に負荷した。カラムを、20mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaClにより洗浄し、凝集されタンパク質を除去し、そしてタンパク質を、20mMのトリス−HCl（pH7.5）中、300mM〜1MのNaClグラジエントのカラムから溶出した。
【０２２２】
SolCorin−EKを含むPI溶出液を、約50mMのNaClに対して希釈し、10kDaのカットオフを有する限外濾過（Millipore）により濃縮し、そして20mMのトリス−HCl（pH7.5）により平衡化されたDEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)アニオン交換カラム上に負荷した。カラムを、20mMのトリス−HCl（pH7.5）により洗浄し、そしてタンパク質を、20mMのトリス−HCl、１MのNaClのカラムから溶出した。SolCorin−EKを含む溶出液を、20mMのトリス−HCl（pH7.5）により１：２に希釈した。
SolCorin−EK調製物の純度は、分析サイズ排除のクロマトグラフィーにより判断される場合、約94％であることが決定された。SolCorin−EKのサイズ及び結合性を、SDS−ポリアクリスアミドゲルクロマトグラフィー、続いてクーマシーブルー染色により確めた。
【０２２３】
SolCorin−EKのエンテロキナーゼによる活性化：
精製されたSolCorin−EKを、20mMのトリス−HCl、pH7.5、約260mMのNaCl、20mMのCalCl2中、50μgのタンパク質当たり１単位のエンテロキナーゼの割合で組換えエンテロキナーゼ（Novagen）への室温での４時間の暴露により活性化した。凝集されたタンパク質を、Eppendorf微小遠心分離における10,000rpmでの10分間の遠心分離により除去した。活性化されたSolCorin−EKを、1mgのアリコートに分離し、ドライアイス/エタノール浴において急速に凍結し、そして次に、−80℃で貯蔵した。
【０２２４】
心筋障害ハムスターにおける利尿及びナトリウム排泄増加性に対するSolCorin−EKの効果：
BI014.6心筋障害（CM）ハムスター、すなわち常染色体劣性株は、S−サルコグリカン遺伝子に突然変異を有する（Nigro,V.など. (1997) Hum. Mol. Genet 6: 601-607）。BIO14.6ハムスターは、肥大特性及び心不全を伴っての重度の心筋障害を進行するが、しかし比較的に骨格筋表面型を明白に示す。研究は、BIO14.6CMハムスターが、低められた利尿及びナトリウム排泄増加により判断されるように、ANP活性を欠いているが、しかしながら、ANPの生成、開放及び/又は活性化が誘発され得ることを示した（Dlouha, H. and McBroom, M. J. (1986) Proc. Soc. Exp.Biol. Med. 181:411-415）。
【０２２５】
正常（F1B）及びBIO14.6CMハムスターを、次の通りに調製した。イソフルラン（１−２％）麻酔下で、膀胱及び右頚静脈に、それぞれ、尿収集及び薬物投与のためにカニューレ挿入した。血圧測定が必要とされる場合、トランスデューサー圧力を、左頚動脈中に挿入した。手術のために必要とされる時間を包含する約30分後、５％グルコース溶液の注入を、35μl/分で開始し、そして尿を10分間、集め、両者を、実験の間じゅう続けた。尿出力が安定化した後（グルコース注入の開始後、約１時間）、ラットANP、SolCorin−EK又はビークルを、頚静脈中へのポーラス注入としてハムスターに静脈投与した。
【０２２６】
ラットANP（Sigma）の1mg/mlの原液を、0.9％NaClに希釈し、そして1、3、10及び30μg/kgの用量でF1Bハムスターに、及び10、30及び100μg/kgでBIO14.6CMハムスターに、固定された100μlの体積で投与した。20 mM のトリス-HCI, pH 7.5, 約260 mMのNaCI, 2 mMのCaCl2, 45.9 単位/ml のエンテロキナーゼ中、1.27又は1.39mg/mlのいずれかのSolCorin−EKの原液を、溶液濃度及び体重に従って変化する、動物当たり約300μlの体積において、3mg/kgで投与した。ビークル（20 mMのトリス-HCl, pH 7.5, 260 mMのNaCI, 2 mMのCaCl2, 45.9 単位/ml のエンテロキナーゼ）を、体重に従って変化する、動物当たり約300μlの体積で投与した。
【０２２７】
ハムスターにおける利尿及びナトリウム排泄増加を、それぞれ尿体積及び尿ナトリウムを計算することにより測定した。Μl．kg-1. 分-1として表わされる尿体積及びμEg. kg-1. 分-1として表わされる尿ナトリウム（Na+）を、ANP、SolCorin−EK又はビークルのいずれかの静脈内投与の前（基線）及びその後（ピーク応答）、直接的に、10分間の尿プールから計算した。
【０２２８】
BIO14.6CMハムスターを用いての対照実験（示されていない）においては、ラットANPは、最初の10分間のピーク応答において、尿体積及び尿ナトリウム排泄を高めた。図12に示されるように、SolCorin−EKは、BIO14.6CMハムスターにおいて尿体積及び尿ナトリウムの両者のピーク応答を高めた。この上昇は、コリン−処理された動物における基線、及びビークル−処理された動物におけるピーク応答に比較して、統計学的に有意であった（p＜0.05）。従って、可溶性の修飾されたヒトコリンは、心筋障害ハムスターにおいてインビボでANP活性を誘発できる。
【０２２９】
例７：
この例は、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む、経口投与のための代表的医薬組成物の調製を示す。
A.   成分 ％wt/wt
修飾されたコリン分子の化合物           20.0％
ラクトース                             79.5％
ステアリン酸マグネシウム                0.5％
上記成分を混合し、そしてそれぞれ100mgを含むようハードシェルゼラチンカプセルに分散し、ここで１つのカプセルは合計の毎日の投与量を近い。
B.   成分 ％wt/wt
本発明の修飾されたコリン分子           20.0％
ステアリン酸マグネシウム                0.9％
澱粉                                    8.6％
ラクトース                             69.6％
PVP(ポリビニルピロリジン)               0.9％
【０２３０】
上記成分（但し、ステアリン酸マグネシウムを除く）を組合し、そして粒質化液体として水を用いて、粒質化する。次に、配合物を乾燥し、ステアリン酸マグネシウムと共に混合し、そして適切な錠剤化機械により錠剤を形成した。
【０２３１】
C.   成分
本発明の修飾されたコリン分子            0.1g
プロピレングリコール                   20.0g
ポリエチレングリコール400              20.0g
ポリソルベート80                        1.0g
水                                     100ml（十分）
本発明の修飾されたコリン分子を、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール400及びポリソルベート80に溶解する。次に、十分な量の水を、攪拌しながら添加し、100mlの溶液を得、これを濾過し、そしてビンに詰める。
【０２３２】
D.   成分 ％wt/wt
本発明の修飾されたコリン分子           20.0％
ピーナツ油                             78.0％
Span60                                  2.0％
上記成分を溶融し、混合し、そしてソフト弾性カプセル中に充填する。
【０２３３】
E.   成分 ％wt/wt
本発明の修飾されたコリン分子            1.0％
メチル又はカルボキシメチルセルロース    2.0％
0.9％塩溶液                             100ml（十分）
本発明の化合物を、使用の前、セルロース/塩溶液に溶解し、濾過し、そしてビン詰めする。
【０２３４】
例８：
この例は、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む、非経口投与のための代表的医薬組成物の調製を示す。
成分
本発明の修飾されたコリン分子            0.02g
プロピレングリコール400                20.0g
ポリエチレングリコール400              20.0g
ポリソルベート80                        1.0g
0.9％塩溶液                            100ml（十分）
【０２３５】
本発明の化合物を、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール400及びポリソルベート80に溶解する。次に、十分な量の0.9％塩溶液を、攪拌しながら添加し、100mlのI.V.溶液を得、これを0.2μmの膜フィルターを通して濾過し、そして減菌条件下で包装する。
【０２３６】
例９：
この例は、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む、坐剤形のための代表的医薬組成物の調製を示す。
成分 ％wt/wt
本発明の修飾されたコリン分子            1.0％
ポリエチレングリコール1000             74.5％
ポリエチレングリコール4000             24.5％
成分を一緒に融解し、そして蒸気槽上で混合し、そして鋳型中に注ぎ、2.5gの合計重量にする。
【０２３７】
例10：
この例は、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む、吸入剤のための代表的医薬組成物の調製を示す。
【０２３８】
成分 ％wt/wt
超部粉砕された本発明の修飾されたコリン分子     1.0％
超微粉砕されたラクトース                      99.0％
成分を微粉砕し、混合し、そして用量ポンプを備えた吸入器にパッケージする。
【０２３９】
例11：
この例は、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む、噴霧化形のための代表的医薬組成物の調製を示す。
成分 ％wt/wt
本発明の化合物                  0.005％
水                             89.995％
エタノール                     10.000％
本発明の修飾されたコリン分子を、エタノールに溶解し、そして水と共にブレンドする。次に、製剤を、用量ポンプを備えたネブライザーにパッケージする。
【０２４０】
例12：
この例は、本発明の修飾されたコリン分子又は医薬的に許容できるその塩を含む、エアロゾルのための代表的医薬組成物の調製を示す。
成分 ％wt/wt
本発明の修飾されたコリン分子    0.10％
噴射剤11/12                    98.90％
オレイン酸                      1.00％
【０２４１】
本発明の修飾されたコリン分子を、オレイン酸及び噴射剤に分散する。次に、得られる混合物を計量弁を備えたエアロゾル容器中に注ぐ。
本発明はその特定の態様に関して記載されて来たが、種々の変更が行われ得、そして同等のものが本発明の範囲内で置換され得ることは、当業者により理解されるべきである。さらに、多くの修飾が特定の情況、材料、組成物、工程、工程段階、目的物、及び本発明の範囲を適合するために行われ得る。すべてのそのような修飾は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は、ヒトコリンコード領域の核酸配列（配列番号１）を示す。コード配列は、位置１−３でのメチオニン開始コドンATGから出発して、そして位置3127−3129での翻訳終結コドンTAAで終結する、3129個の長さのヌクレオチドである。
【図２】図２は、ヒトコリンポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。十分な長さのヒトコリンは、N−末端細胞質末端、続いてトランスメンブランドメイン（アミノ酸46−66）、２種の縮れたようなシステインに富んでいるドメイン（アミノ酸134−259及び450−573）、８種の低密度リポタンパク質受容体反復体（アミノ酸268−415及び579−690）、マクロファージスキャベンジャー受容体−様ドメイン（アミノ酸713−800）、及びそのC−末端でのセリンプロテアーゼ触媒ドメイン（アミノ酸802−1042）から成る、1042個の長さのアミノ酸である。十分なコリンポリペプチドの図解構造体は図３に示される。
【図３】図３は、トランスメンブランヒトコリン欠失変異体の図解構造体を示す。ヒトコリン内部欠失変異体の構成は、例１に記載される。欠失１はアミノ酸124−267を欠き、欠失２はアミノ酸124−448を欠き、欠失３はアミノ酸124−576を欠き、欠失４はアミノ酸124−712を欠き、欠失５はアミノ酸124−788を欠き、欠失６はアミノ酸269−414を欠き、そして欠失７はアミノ酸450−568を欠いている。
【図４】図４は、ヒトコリンを発現するネズミHL−５細胞における組換えプロ−ANPのプロセッシングを示す。ネズミHL−５細胞を、例３に記載されるような、示される対照、プロ−ANP又は十分な長さのヒトコリン発現プラスミドによりトランスフェクトした。プロ−ANP、ANP及びコリンを、抗−V5抗体を用いてのウェスターンブロットにより、ならし培地において検出した。
【図５】図５は、ヒトコリンを発現するネズミHL−５細胞からのならし培地による細胞内cGMP生成の刺激を示す。ヒト293細胞及びネズミHL−５細胞を、十分な長さのヒトコリン発現プラスミドによりトランスフェクトし、そしてならし培地におけるcGMP−刺激された活性を、例３に記載のようにして測定した。HL−５細胞におけるcGMP−刺激活性は、組換えヒトコリンの発現により有意に高められた。
【図６】図６は、トランスメンブラン−含有の修飾されたヒトコリン欠失変異体によるプロ−ANPのプロセッシングを示す。十分な長さのヒトコリン発現ベクター及び一連のヒトコリン内部欠失変異体発現ベクター、並びにプロ−ANP発現ベクターを、ヒト293細胞中にトランスフェクトした。コリン、プロ−ANP及びANPを、抗−V5抗体を用いてのウェルターンブロットにより、ならし培地において検出した。
【図７】図７は、可溶性の修飾されたヒトコリンポリペプチドの次の図解構造体：（A）十分な長さの野生型ヒトコリン；（B）トランスメンブランドメインを欠いているSolCorin−EK；及び（C）セリンプロテアーゼ触媒ドメインのみを含むSolCorinPD−EKを示す。エンテロキナーゼ活性化切断配列DDDDKを、例１に記載のようにして、SolCorin-EK 及びSolCorinPD-EKにおける天然のコリン活性切断配列の代わりに導入した。
【図８】図８は、エンテロキナーゼによる可溶性の修飾されたヒトコリンの活性化を示す。SolCorin-EK 及びSolCorinPD-EK発現ベクターを、示されるようにしてヒト293細胞中にトランスフェクトした。ならし培地を、示される量の組換えエンテロキナーゼにより処理し、そして可溶性コリンの活性化を、抗−V5抗体を用いて、ウェスターンブロットにより検出した。
【図９】図９は、エンテロキナーゼ−活性化された可溶性の修飾されたヒトコリンによるプロ−ANPの切断を示す。SolCorin-EK 及びSolCorinPD-EK発現ベクターを、示されるようにヒト293細胞中にトランスフェクトした。ならし培地を、示される量の組換えエンテロキナーゼにより処理し、そしてエンテロキナーゼ−消耗されたならし培地を、プロ−ANP発現ベクターによりトランスフェクトされた293細胞からのならし培地に暴露した。コリン、エンテロキナーゼ−活性化されたコリン、プロ−ANP及びANPを、抗−V5抗体を用いてウェスターンブロットにより検出した。
【図１０】図10は、可溶性の修飾されたヒトコリンポリペプチドSalCorin−EKの核酸配列を示す。SolCorin−EKの核酸配列（配列番号33）は、N−末端ATG開始コドン及びIgx分泌シグナル配列（位置１−108）、Leu−Glu（位置109−114）、ヒトコリンアミノ酸−124−796（位置115−2133）、エンテロキナーゼ活性化切断配列（位置2134−2148）、ヒトコリンアミノ酸802−1042（位置2149−2871）、C−末端ウィルスV5及び6xHisエピトープ標識（位置2871−2973）及びTGA終結コドン（位置2974−2976）から成る。
【図１１】図11は、可溶性の修飾されたヒトコリンポリペプチドSalCorin−EKのアミノ酸配列を示す。SolCorin−EKのアミノ酸配列（配列番号34）は、N−末端ATG開始コドン及びIgx分泌シグナル配列（アミノ酸１−36）、Leu−Glu（アミノ酸37−38）、ヒトコリンアミノ酸124−796（アミノ酸39−711）、エンテロキナーゼ活性化切断配列（下線、アミノ酸712−716）、ヒトコリンアミノ酸802−1042（アミノ酸717−957）、C−末端ウィルスV5及び6xHisエピトープ標識（アミノ酸958−991）及びTGA終結コドンから成る。
【図１２】図12は、可溶性の修飾されたヒトコリンが心筋障害ハムスターにおいて利尿及びナトリウム排泄増加を刺激することを示す。SolCorin−EKを、例６に記載のようにして、ヒト293細胞において発現し、精製し、組換えエンテロキナーゼへの暴露により活性化し、そしてBIO14.6CMハムスターにおける尿体積及び尿ナトリウムを高める能力について試験した。尿体積及び尿ナトリウムを、SolCorin−EK（コリン）又は示されるようなビークルの静脈内投与の前（基線）及びその後（ピーク応答）、測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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