(57)【要約】  本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する液体水性薬学的組成物、このような組成物を調製し、使用する方法、並びに、このような組成物を含有するバイアル、及び第ＶＩＩ因子応答性の症候群の治療におけるこのような組成物の使用に関する。より具体的には、本発明は、化学的及び／又は物理的分解に対して安定化された液体組成物に関する。主要な実施形態は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）；約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）；少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）、ここで、前記金属は、亜鉛は除く、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル及び銅などの酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属からなる群から選択される金属である；および、非イオン性界面活性剤（ｉｖ）を含む液体水性薬学的組成物によって代表される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
を含む、液体水性薬学的組成物。
【請求項２】
前記金属含有剤の金属が、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル及び銅からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記金属含有剤（ｉｉｉ）が、塩化クロム（ＩＩ）、塩化マンガン（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化コバルト（ＩＩ）、塩化ニッケル（ＩＩ）及び塩化銅（ＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から２の何れか1項に記載の組成物。
【請求項４】
前記金属含有剤（ｉｉｉ）の金属が、銅及びマンガンからなる群から選択される、請求項２から３の何れか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記金属含有剤（ｉｉｉ）が、塩化銅（ＩＩ）及び塩化マンガン（ＩＩ）からなる群から選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記金属含有剤（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１μＭである、請求項１から５の何れか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記金属含有剤（ｉｉｉ）の金属が銅であり、前記金属含有剤の濃度が少なくとも５μＭである、請求項１から６の何れか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記金属含有剤（ｉｉｉ）の金属がマンガンであり、前記金属含有剤の濃度が少なくとも１００μＭである、請求項１から６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドがヒト第ＶＩＩａ因子である、請求項１から８の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ配列変異形である、請求項１から９の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と未変性ヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との比が、本明細書に記載されている「インビトロタンパク質分解アッセイ」で検査したときに少なくとも１．２５である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが０．１から１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１から１１の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
約４．０から約８．０までの範囲にあるｐＨを有する、請求項１から１２の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記緩衝剤（ｉｉ）が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、グリシンアミド、リン酸、酢酸、乳酸及びコハク酸の酸及び塩からなる群から選択される少なくとも一つの成分を含む、請求項１から１３の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記緩衝剤（ｉｉ）の濃度が１から１００ｍＭである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記非イオン性界面活性剤（ｉｖ）が、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エチレン／ポリプロピレンブロック共重合体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル及びポリオキシエチレンヒマシ油からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から１５の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１７】
張度改変剤（ｖ）をさらに含む、請求項１から１６の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
張度改変剤（ｖ）が、中性塩、アミノ酸、２から５個のアミノ酸残基のペプチド、単糖、二糖、多糖及び糖アルコールからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも一つの張度改変剤（ｖ）が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選択される中性塩である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記張度改変剤（ｖ）が、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一つと組み合わされた塩化ナトリウムである、請求項１８から１９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記張度改変剤（ｖ）が少なくとも１ｍＭの濃度で存在する、請求項１から２０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも一つの張度改変剤（ｖ）がイオン強度改変剤（ｖ／ａ）である、請求項１から２１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも５０ｍＭのイオン強度を有する、請求項１から２２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
３００±５０ミリオスモル／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する、請求項１から２３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
抗酸化剤（ｖｉ）をさらに含む、請求項１から２４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗酸化剤（ｖｉ）が、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、メチオニン類似物、メチオニン含有ペプチド、メチオニン相同体、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン及びシスタチオニンから選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗酸化剤（ｖｉ）が０．１から５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２５から２６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
防腐剤（ｖｉｉ）をさらに含む、請求項１から２７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
当該防腐剤（ｖｉｉ）が、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンズアルコニウム及び塩化ベンゼトニウムからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
０．１から１５ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
少なくとも５μＭの濃度の銅含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
少なくとも５ｍＭの濃度の張度改変剤（ｖ）と；
を含む、請求項１から２９の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物。
【請求項３１】
０．１から１５ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
少なくとも１００μＭの濃度のマンガン含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
少なくとも５ｍＭの濃度の、少なくとも一つの張度改変剤（ｖ）と；
を含む、請求項１から３０の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物。
【請求項３２】
非経口投与用に適合されている、請求項１から３１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
皮下、筋肉内又は静脈内注射用に適合されている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも約２ｍＭの濃度で、カルシウム（Ｃａ２＋）及び／又はマグネシウム（Ｍｇ２＋）、好ましくはカルシウムをさらに含む、請求項１から３３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；を含む溶液中に、第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）を与える工程を含む、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性薬学的組成物を調製する方法。
【請求項３６】
医薬として使用するための、請求項１から３４の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物。
【請求項３７】
第ＶＩＩ因子応答性の症候群を治療するための医薬を調製するための、請求項１から３４の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物の使用。
【請求項３８】
第ＶＩＩ因子応答性の症候群の治療の方法であって、それを必要とする対象に、請求項１から３４の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物の有効量を投与することを具備する方法。
【請求項３９】
請求項１から３４の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物と任意の不活性ガスを含有する気密容器。
【請求項４０】
前記組成物が抗酸化剤（ｖｉ）を含まない、請求項３９に記載の容器。
【請求項４１】
請求項１から３４の何れか１項に記載の液体水性薬学的組成物を陽イオン交換物質に接触させる工程を具備する液体水性薬学的組成物中の金属イオン濃度を低下させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する液体水性薬学的組成物、このような組成物を調製するため、および使用するための方法、並びに、このような組成物を含有する容器、及び第ＶＩＩ因子応答性の症候群の治療におけるこのような組成物の使用に方向付ける。より具体的には、本発明は、化学的及び／又は物理的分解に対して安定化された液体組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
血漿糖タンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）など、血液凝固過程に関与する様々な因子が同定されている。止血は、血管壁に対する損傷後に循環血液に曝露されている組織因子（ＴＦ）と、総ＦＶＩＩタンパク質重量の約１％に相当する量で、血液循環中に存在するＦＶＩＩａとの間で複合体が形成されることによって開始される。ＦＶＩＩは、主に、一本鎖チモーゲンとして血漿中に存在し、一本鎖チモーゲンは、ＦＸａによって切断されて、二本鎖の、活性化された形態のＦＶＩＩａになる。組換え活性化因子ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ）が、止血促進因子(pro-haemostatic agent)として開発されている。ｒＦＶＩＩａの投与は、抗体形成のために他の凝固因子産物では治療できない、出血している血友病対象に、迅速且つ高度に有効な止血促進反応を与える。第ＶＩＩ因子を欠損している対象における出血、又は正常な凝固系を有するが、著しい出血に見舞われている対象における出血も、ＦＶＩＩａで首尾よく治療することができる。
【０００３】
保存及び送達の両方に適した第ＶＩＩａ因子の投与形態を有することが望ましい。理想的には、薬物製品は、液体として保存され、投与される。あるいは、薬物製品は凍結乾燥され（すなわち、フリーズドライされ）、次いで、患者に使用する前に、適切な希釈剤を添加することによって再構成される。理想的には、薬物製品は、長期保存（すなわち、６ヶ月超）に維持するのに十分な安定性を有する。
【０００４】
最終薬物製品を液体として維持するか、又はフリーズドライするかという決定は、一般に、それらの形態でのタンパク質薬物の安定性に基づく。タンパク質の安定性は、とりわけ、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／融解サイクルの繰り返し及び剪断力への曝露などの因子によって影響を受け得る。活性なタンパク質は、変性及び凝集（可溶性及び不溶性凝集物の形成）などの物理的不安定性、並びに、例えば、加水分解、アミド分解、及び酸化などの化学的不安定性の結果として喪失され得る。タンパク質医薬の安定性の総説については、例えば、「Ｍａｎｎｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９０３−９１８（１９８９）」を参照されたい。
【０００５】
タンパク質の不安定性が発生し得ることは広く理解されているが、具体的なタンパク質の不安定性に関する具体的な問題を予測することは不可能である。これらの不安定性は何れも、低下した活性、増加した毒性及び／又は増加した免疫原性を有する、タンパク質副産物又は誘導体の形成をもたらし得る。実際に、タンパク質の沈殿は、血栓症、剤形及び量の不均一、並びに注射の目詰まりを引き起こすことがある。さらに、例えば、Ｎ末端にある一部のグルタミン酸残基のγカルボキシル化及び炭水化物側鎖の付加などの翻訳後修飾は、保存時に修飾を受けやすい可能性がある部位を与える。また、セリンプロテアーゼである第ＶＩＩａ因子に特有の問題として、自己触媒による断片化が起こり得る（酵素分解）。このように、タンパク質のあらゆる組成物の安全性と有効性は、その安定性と直接関係している。分子運動の可能性が極めて増加することにより、分子の相互作用の確率が増加するので、液体形態で安定性を維持することは、凍結乾燥された形態で安定性を維持することとは、一般的に異なる。増加したタンパク質濃度で凝集物が形成される傾向があるので、濃縮された形態で安定性を維持することも、上記とは異なる。
【０００６】
液体組成物を開発する場合には、多くの要因が考慮される。短期（すなわち、６ヶ月未満）の液体安定性は、一般に、変性及び凝集などの全体的な構造変化の回避に依存する。これらのプロセスは、数多くのタンパク質について文献に記載されており、安定化剤の数多くの例が存在する。実際に、あるタンパク質を安定化するのに有効な因子が別のタンパク質を不安定化するように作用することが周知である。全体的な構造変化に対して、タンパク質が安定化されたら、長期的に安定な（例えば、６ヶ月超）液体組成物を開発することは、当該タンパク質に特有の分解の種類から、タンパク質をさらに安定化させることに依存する。より具体的な分解の種類には、例えば、ジスルフィド結合の混乱、一部の残基の酸化、アミド分解、環状化が含まれ得る。個別の分解種を正確に特定することが常に可能であるとは限らないが、特定の賦形剤が目的のタンパク質を特異的に安定化させる能力をモニターするために、微小な変化をモニターするためのアッセイが開発されている。
【０００７】
注射／注入時に、組成物のｐＨが生理的に適切な範囲にあることが望ましく、そうでないと、患者に対して痛みや不快感がもたらされる場合がある。
【０００８】
タンパク質組成物の総説については、例えば、「Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．：Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ：Ａ  ｃｌｏｓｅｒ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，  ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９３，  １０（４）：３０７−３７７」；及び「Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８  （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），  ４２（２Ｓ）」を参照されたい。
【０００９】
第ＶＩＩａ因子は、複数の分解経路、特に、凝集（二量体化）、酸化、自己分解による切断（ペプチド骨格の切り取り、すなわち「重鎖分解」）を受ける。さらに、沈殿が起こる場合もある。これらの反応の多くは、タンパク質から水を除去することによって、著しく遅らせることが可能である。しかしながら、第ＶＩＩａ因子に対する水性組成物の開発には、液体の状態に戻すときの誤りがなくなるという利点があり、これにより、投薬の正確さが増し、製品の使用を臨床的に簡略化することによって、患者は投薬計画を遵守し易くなる。理想的には、第ＶＩＩａ因子の組成物は、多様なタンパク質濃度の範囲にわたって、６ヶ月を超えて安定であるべきである。これによって、投与の方法に柔軟性が与えられる。一般に、さらに高度に濃縮された形態は、より小容量の投与を可能とし、これは、患者の観点からすると、極めて望ましい。液体組成物は、投与と使用の容易さに関して、フリーズドライされた製品に比べて、多くの利点を有することができる。
【００１０】
今日、組換えによって作製された、市販の唯一のＦＶＩＩポリペプチド組成物は、フリーズドライされた第ＶＩＩａ因子製品であり、これは、使用前に液体の状態に再生される。本製品は、比較的低い第ＶＩＩａ濃度、例えば、約０．６ｍｇ／ｍＬを含有する。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(登録商標)(Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，  Ｄｅｎｍａｒｋ)の一つのバイアル（１．２ｍｇ）は、１．２ｍｇの組換えヒト第ＶＩＩａ因子、５．８４ｍｇのＮａＣｌ、２．９４ｍｇのＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、２．６４ｍｇのグリシルグリシン（ＧｌｙＧｌｙ）、０．１４ｍｇのポリソルベート８０、６０．０ｍｇのマニトールを含有し、２．０ｍＬの注射水（ＷＦＩ、ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、ｐＨ５．５になるように再生される。再生されると、タンパク質溶液は、２４時間、使用するのに安定である。このように、液体の即時使用可能な、又は濃縮された第ＶＩＩ因子製品は、現在のところ、市販されていない。
【００１１】
従って、酵素的分解又は自己触媒生成物など化学的及び／又は物理的分解産物の許容可能な管理を与える、液体の水性第ＶＩＩ因子ポリペプチド薬学的組成物を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１２】
第ＶＩＩ因子又はその類似物（「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」）は、酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列の金属（亜鉛を除く。）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤とともに、液体水性薬学的組成物として調合されたときに、安定性が向上し、それにより、実際に使用する前に保存できる期間が延びることを、本発明者らは発見した。
【００１３】
このように、本発明の一つの側面は、
第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く。）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
を含む、液体水性薬学的組成物に関する。
【００１４】
本発明の第二の側面は、約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く。）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
を含む溶液中に第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）を与える工程を含む、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性薬学的組成物を調製する方法に関する。
【００１５】
本発明の第三の側面は、医薬として使用するための、前記液体水性薬学的組成物に関する。
【００１６】
本発明の第四の側面は、第ＶＩＩ因子応答性の症候群を治療するための医薬を調製するための、前記液体水性薬学的組成物の使用に関する。
【００１７】
本発明の第五の側面は、第ＶＩＩ因子応答性の症候群の治療を必要とする患者に、前記液体水性薬学的組成物の有効量を投与することを含む、第ＶＩＩ因子応答性の症候群を治療する方法に関する。
【００１８】
本発明の第六の側面は、前記液体水性薬学的組成物を含有し、不活性ガスを必要に応じて含有する、気密容器に関する。
【００１９】
本発明の第七の側面は、前記液体水性薬学的組成物を陽イオン交換物質に接触させる工程を含む、液体水性薬学的組成物中の金属イオン濃度を低下させる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
上述のように、本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む、安定化された新規液体水性薬学的組成物の開発に存する。より具体的には、前記液体水性薬学的組成物は、
第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く。）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
を含む。
【００２１】
本発明者らは、即時使用可能な薬学的組成物との関連で、酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く。）が、これまでに安定化剤として使用されていないという印象を抱いている。
【００２２】
本明細書において使用する場合、「酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く。）」という用語は、金属チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル及び銅を包含するものとする。様々な教科書に記載されているように（例えば、“Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｔｔｏｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２−５，  ｐａｇｅ  ５３）、亜鉛並びにカルシウム及び水銀は、遷移金属系列の残りの金属とは異なる特性を有する。この理由のため、本発明との関連で、亜鉛は有用でないと考えられる。
【００２３】
チタン及びバナジウムは、水性環境中において、酸化状態＋ＩＩで存在し得るが、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル及び銅の中から金属を選択することがさらに典型的である。これらの金属に対応する金属含有剤（ｉｉｉ）の実例は、塩化クロム（ＩＩ）、塩化マンガン（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化コバルト（ＩＩ）、塩化ニッケル（ＩＩ）及び塩化銅（ＩＩ）である。金属含有剤（ｉｉｉ）が、２以上の金属、例えば、２以上の第一遷移系列金属を含み得ることを理解すべきである。このように、一部の事例では、２以上の上記金属含有剤を組み合わせて使用し得る。
【００２４】
これまで、最も有望な金属は銅及びマンガンである。対応する金属含有剤（ｉｉｉ）の実例は、塩化銅（ＩＩ）及び塩化マンガン（ＩＩ）である。
【００２５】
一つの金属含有剤（又は複数の金属含有剤）（ｉｉｉ）の濃度は、典型的には、少なくとも１μＭである。望ましい（又は必要な）濃度は、典型的には、選択された一つの金属含有剤（又は複数の金属含有剤）に依存し、より具体的には、酸化状態＋ＩＩの選択された金属の、第ＶＩＩ因子ポリペプチドへの結合親和性に依存する。
【００２６】
異なる実施形態においては、金属含有剤（ｉｉｉ）は、少なくとも５μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも４００μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも８００μＭ、少なくとも９００μＭ、少なくとも１０００μＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも９００ｍＭ又は少なくとも１０００ｍＭの濃度で存在する。
【００２７】
一つの具体的な実施形態において、金属含有剤（ｉｉｉ）の金属は銅であり、前記金属含有剤（ｉｉｉ）の濃度は少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２５μＭ又は少なくとも５０μＭなどである。
【００２８】
別の具体的な実施形態において、金属含有剤（ｉｉｉ）の金属はマンガンであり、前記金属含有剤（ｉｉｉ）の濃度は少なくとも１００μＭであり、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ又は少なくとも５ｍＭなどである。
【００２９】
様々な実施形態において、金属含有剤（ｉｉｉ）（Ｍｅ２＋）とＦＶＩＩポリペプチドのモル比は、０．５超；１超；２超；４超；５超；１０超；２５超；１００超；１５０超；例えば、０．５から２５０の範囲、０．５から１５０、０．５から１００；０．５−２５；１から２５０；１から１００；１から２５；１から１０などの範囲である。
【００３０】
一実施形態において、前記組成物は、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、レブロン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｌａｅｖｕｌａｔｅ）、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、レブロン酸マグネシウム、強酸のマグネシウム塩又はそれらの混合物の一覧から選択されるものなどのカルシウム（Ｃａ２＋）及び／又はマグネシウム（Ｍｇ２＋）をさらに含有する。
【００３１】
一実施形態において、カルシウム（Ｃａ２＋）及び／又はマグネシウム（Ｍｇ２＋）は、少なくとも約０．１μＭの濃度、例えば、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ又は少なくとも約１０ｍＭの濃度で存在する。具体的な実施形態において、前記組成物は、少なくとも２ｍＭのＣａ２＋を含む。
【００３２】
様々な実施形態において、カルシウム（Ｃａ２＋）及び／又はマグネシウム（Ｍｇ２＋）とＦＶＩＩポリペプチドのモル比は、０．００１から７５０；０．００１から２５０；０．００１から１００；０．００１から１０；０．００１から１．０；０．００１から０．５；０．５から７５０；０．５から２５０；０．５から１００；０．５から１０；０．５から１．０；０．００１から０．４９９９；０．００５から０．０５０である。
【００３３】
本発明の一実施形態において、複合体を形成していないカルシウム（Ｃａ２＋）及び／又はマグネシウム（Ｍｇ２＋）の、ＦＶＩＩポリペプチドに対するモル比は、０．５未満であり、例えば、０．００５から０．０５０など０．００１から０．４９９の範囲、又は０．０００から０．０５０の範囲など０．０００−０．４９９の範囲、又は約０．０００である。本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩポリペプチドに対する、複合体を形成していないカルシウム（Ｃａ２＋）のモル比は、０．５未満であり、例えば、０．００５から０．０５０など０．００１から０．４９９の範囲、又は０．０００から０．０５０の範囲など０．０００から０．４９９の範囲、又は約０．０００である。
【００３４】
別の実施形態において、ＦＶＩＩポリペプチドに対する、複合体を形成していないカルシウム及び／又はマグネシウムイオンのモル比は０．５超である。別の実施形態において、ＦＶＩＩ因子ポリペプチドに対する、複合体を形成していないカルシウムイオンのモル比は０．５超である。
【００３５】
カルシウム及び／又はマグネシウム（Ｃａ２＋）と第ＶＩＩ因子ポリペプチドの低相対比率を得るためには、例えば、金属含有剤（ｉｉｉ）を除去せずに、Ｃａ２＋及び／又はＭｇ２＋を除去するのに適した条件下で、前記組成物をイオン交換物質と接触させることによって、過剰なカルシウム及び／又はマグネシウムイオンを除去することが必要であり、又は望ましい場合があり得る。これは、調合工程に先行するプロセス工程から得られる溶液中での、カルシウム及び／又はマグネシウムイオンと第ＶＩＩ因子ポリペプチドの比率が上記限界を超える場合、特に適切である。
【００３６】
薬学的組成物の生物学的効果は、主に、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの存在に帰せられる。
【００３７】
本明細書において使用される、「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」という用語は、野生型第ＶＩＩ因子（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド）、並びに、野生型第ＶＩＩ因子に比較して、実質的に同一の生物学的活性又は向上された生物学的活性を示す第ＶＩＩ因子の変異形を包含する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、それらの切断されていない（チモーゲン）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、及びそれらの各生物活性形態を与えるようにタンパク質分解によって加工された第ＶＩＩ因子ポリペプチド（第ＶＩＩａ因子と表記される場合がある。）を包含するものとする。典型的には、第ＶＩＩ因子は、残基１５２と１５３の間で切断されて、第ＶＩＩａ因子を与える。「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」という用語は、野生型第ＶＩＩａ因子の活性に比べて、第ＶＩＩａ因子の生物活性が実質的に修飾されており、又は幾分減少されている、ポリペプチド（変異形を含む。）も包含する。これらのポリペプチドには、ポリペプチドの生物活性を修飾又は破壊する特異的なアミノ酸配列の変化がその中に導入された第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合するその能力及び（ｉｉ）第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク質分解切断を触媒して、活性化された第ＩＸ又はＸ因子（それぞれ、第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子）を生成する能力に由来する。
【００３９】
本発明において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性（「第ＶＩＩ因子生物活性」）は、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号又はＷＯ９２／１５６８６に記載されているように、又は本明細書のアッセイ４に記載されているように（下記参照）、第ＶＩＩ因子欠損血漿及びトロンボプラスチンを用いて血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量することができる。あるいは、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、（ｉ）第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、脂質膜中に埋め込まれたＴＦと第Ｘ因子を含む系内で、活性化された第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を産生する能力を測定することによって（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水系中で第Ｘ因子加水分解を測定することによって（「インビトロタンパク質分解アッセイ」、下記アッセイ２）；（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を基礎とする装置を用いて、第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ペプチドのＴＦへの物理的結合を即適することによって（Ｐｅｒｓｓｏｎ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．  ４１３：３５９−３６３，１９９７）、（ｉｖ）第ＶＩＩａ及び／又は第ＶＩＩ関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解を測定することによって（「インビトロ加水分解アッセイ」、下記アッセイ１）；（ｖ）又は、ＴＦ独立性インビトロ系でのトロンビンの生成を測定することによって（下記アッセイ３）、定量することができる。
【００４０】
野生型第ＶＩＩａ因子に比べて実質的に同一の生物活性又は向上した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異形には、上述されているような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で調べたときに同じ細胞種中で産生された第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％及び最も好ましくは少なくとも約９０％を示す第ＶＩＩ因子変異形が包含される。野生型第ＶＩＩａ因子に比べて実質的に減少した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異形には、上述されているような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で調べたときに同じ細胞種中で産生された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満（例えば約１０％未満、又は約５％未満など）を示す第ＶＩＩ因子変異形が包含される。野生型第ＶＩＩ因子に比べて、実質的に修飾された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異形には、ＴＦ非依存性第Ｘ因子のタンパク質分解活性を示す第ＶＩＩ因子変異形、及びＴＦを結合するが、第Ｘ因子を切断しない第ＶＩＩ因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同一の生物活性又は野生型第ＶＩＩ因子より優れた生物活性を示すか、あるいは、野生型第ＶＩＩ因子に比べて実質的に修飾され又は減少した生物活性を示すかどうかを問わず、第ＶＩＩ因子の変異形は、一又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によって、野生型第ＶＩＩ因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
野生型第ＶＩＩ因子と同じ生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異形の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５２：１８２−１９２，１９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような、増加したタンパク質分解安定性を示す第ＦＶＩＩａ因子変異形；残基２９０と２９１又は残基３１５と３１６の間で、タンパク質分解によって切断された第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ４８：５０１−５０５，  １９９５）；酸化型の第ＶＩＩａ因子（Ｋｏｒｎｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３６３：４３−５４，  １９９９）；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９に開示されているようなＦＶＩＩ変異形；及びＷＯ  ０２／３８１６２に開示されているような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩ変異形（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＷＯ９９／２０７６７に開示されているような、修飾されたＧｌａドメインを有し、増強された膜結合を示すＦＶＩＩ変異形（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）；ＷＯ  ０１／５８９３５に開示されているような、ＦＶＩＩ変異形（Ｍａｘｙｇｅｎ  ＡｐＳ）が含まれる。
【００４３】
野生型ＦＶＩＩａに比べて増加した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異形の非限定的な例には、ＷＯ  ０１／８３７２５、ＷＯ  ０２／２２７７６、ＷＯ  ０２／０７７２１８、ＷＯ  ０３／２７１４７、ＷＯ  ０３／３７９３２；ＷＯ  ０２／３８１６２（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されているような、ＦＶＩＩ変異形；及びＪＰ２００１０６１４７９（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓ  Ｉｎｓｔ．）に開示されているような、増強された活性を有するＦＶＩＩａ変異形が含まれる。
【００４４】
野生型ＶＩＩ因子に比べて実質的に減少し、又は修飾された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異形の非限定的な例には、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａが含まれる（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２９：３４１３−３４２０，  １９９０）。
【００４５】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの明示的な例には、野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ
、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠如する第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列中に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列中に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、及びＩｌｅ１５３−２２３Ａｒｇまでのアミノ酸配列中に置換、欠失又は付加を有するＦＶＩＩが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
幾つかの実施形態において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子（ｈＦＶＩＩａ）、好ましくは組換えによって作製されたヒト第ＶＩＩａ因子（ｈＦＶＩＩａ）である。
【００４７】
他の実施形態において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子配列変異形である。
【００４８】
幾つかの実施形態において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子とは異なるグリコシル化を有する。
【００４９】
様々な実施形態において、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＶＩＩ因子配列変異形である実施形態において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と未変性のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性の比は、本明細書に記載されている「インビトロタンパク質分解アッセイ」で調べたときに、少なくとも約１．２５、好ましくは少なくとも約２．０又は４．０、最も好ましくは少なくとも約８．０である。
【００５０】
幾つかの実施形態において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、「インビトロ加水分解アッセイ」（下記、「アッセイ」参照）で調べたときに、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と未変性のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性の比が少なくとも約１．２５、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、特に変異形であり；別の実施形態では、前記比は、少なくとも約２．０であり；さらなる実施形態では、前記比は、少なくとも約４．０である。
【００５１】
異なる実施形態において、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、０．１から１５ｍｇ／ｍＬ；０．１から１０．０ｍｇ／ｍＬ；０．５から５．０ｍｇ／ｍＬ；０．６から４．０ｍｇ／ｍＬ；１．０から４．０ｍｇ／ｍＬ；０．１から５ｍｇ／ｍＬ；０．１から４．０ｍｇ／ｍＬ；０．１から２ｍｇ／ｍＬ；又は０．１から１．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００５２】
第ＶＩＩａ因子の濃度は、ｍｇ／ｍＬ又はＩＵ／ｍＬとして、都合よく表され、１ｍｇは、通常、４３０００から５６０００ＩＵ以上を表す。
【００５３】
液体水性薬学的組成物を、ヒトなどの哺乳動物への直接非経口投与に有用とするために、組成物のｐＨ値は、通常、約４．０から約９．０のような、何らかの限度内に保たれる必要がある。所定の条件下で適切なｐＨ値を確保するために、前記薬学的組成物は、約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）も含む。
【００５４】
「緩衝剤」という用語は、約４．０から約９．０までの許容される範囲に溶液のｐＨを維持する緩衝剤又は緩衝剤の組み合わせを包含する。この用語には、さらに、安定化作用を示す二価金属イオンに結合する限られた適切な能力を有する（すなわち、本発明に係る酸化状態＋ＩＩの第一遷移系列金属との金属複合体の形成が限定的である。）緩衝剤又は緩衝剤の組み合わせが包含される。一実施形態において、前記組成物中の緩衝剤又は緩衝剤の組み合わせ及び二価金属イオンは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する二価金属イオンの結合親和性に比べて、約１％以下の結合親和性を示す。
【００５５】
一実施形態において、前記緩衝剤（ｉｉ）は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、グリシンアミド、ヒスチジン（例えば、Ｌ−ヒスチジン）、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グルタル酸、クエン酸（例えば、クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム）、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、リン酸（例えば、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム）、酢酸（例えば、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又は酢酸カルシウム）、乳酸及びコハク酸の酸及び塩からなる群から選択される少なくとも一つの成分である。前記緩衝剤は、特定の範囲のｐＨ値を与えることができる、２以上の成分の混合物を含み得ることを理解しなければならない。例として、酢酸と酢酸ナトリウム、酢酸とヒスチジンなどを挙げることができる。
【００５６】
緩衝剤の濃度は、溶液の好ましいｐＨを維持するために選択される。様々な実施形態において、緩衝剤の濃度は、１から１００ｍＭ；１から５０ｍＭ；１から２５ｍＭ又は２から２０ｍＭである。
【００５７】
一実施形態において、前記組成物のｐＨは、約４．０から約９．０まで（約５．０から約９．０まで、約４．０から約８．０まで、約４．０から約７．５まで、約４．０から約７．０まで；約４．５から約７．５まで；約４．５から約７．０まで；約５．０から約７．５まで；約５．０及び約７．０；約５．０から約６．５まで；約５．０から約６．０まで；約５．５から約７．５まで；約５．５から約７．０まで；約５．５から約６．５まで；約６．０から約７．５まで；約６．５から約７．５まで；又は約６．０から約７．０まで；約６．４から約６．６、又は約６．５、約５．２から約５．７、又は約５．５など）に保たれる。
【００５８】
前記薬学的組成物は、非イオン性界面活性剤も含む。「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（「ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ」）としても知られる。」には、一般的に、空気／溶液界面によって生じるストレス及び溶液／表面によって誘導されるストレス（例えば、タンパク質凝集をもたらす。）からタンパク質を保護する物質が含まれる。
【００５９】
非イオン性界面活性剤の典型的な種類は、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレン／ポリプロピレンブロック共重合体、ポリエチレングリオール（ＰＥＧ）、ポリキシエチレンステアリン酸エステル及びポリオキシエチレンひまし油である。
【００６０】
非イオン性界面活性剤の具体例は、Ｔｗｅｅｎ(登録商標)、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン  ドデシルエーテル）、ポロキサマー  １８８、ポロキサマー  ４０７、ＰＥＧ８０００、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(登録商標)ポリオール、ポリオキシ２３ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ−３５、Ｍｙｒｊ４９及びＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ａである。
【００６１】
一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．００５から２．０重量％の量で存在する。
【００６２】
４つの必須成分に加えて、前記液体水性薬学的組成物は、調製、調合、安定性又は組成物の投与に有益な追加成分を含むことができる。
【００６３】
また、前記組成物は、張度改変剤（ｖ）をさらに含むことができる。
【００６４】
本明細書で使用される「張度改変剤」という用語には、溶液のモル浸透圧濃度に寄与する物質が含まれる。張度改変剤（ｖ）は、中性塩、アミノ酸、２から５個のアミノ酸残基のペプチド、単糖、二糖、多糖及び糖アルコールからなる群から選択される少なくとも一つが含まれる。幾つかの実施形態において、前記組成物は、二以上のこのような物質を、組み合わせて含む。
【００６５】
「中性塩」とは、水溶液中に溶かしたときに、酸でもなく、塩基でもない塩を意味する。
【００６６】
一実施形態において、少なくとも一つの張度改変剤（ｖ）は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、レブロン酸カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム及びレブロン酸マグネシウムなどの、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群から選択される中性塩である。
【００６７】
さらなる実施形態において、前記張度改変剤（ｖ）には、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一つとともに、塩化ナトリウムを含む。
【００６８】
さらなる実施形態において、前記張度改変剤（ｖ）は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、グルコース及びマニトールからなる群から選択される少なくとも一つである。
【００６９】
異なる実施形態において、前記張度改変剤（ｖ）は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１５００ｍＭ、少なくとも１８００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ又は少なくとも２２００ｍＭの濃度で存在する。
【００７０】
一連の実施形態において、前記張度改変剤（ｖ）は、２５から２２００ｍＭ、５０から２２００ｍＭ、１００から２２００ｍＭ、２００から２２００ｍＭ、４００から２２００ｍＭ、６００から２２００ｍＭ、８００から２２００ｍＭ、１０００から２２００ｍＭ、１２００から２２００ｍＭ、１４００から２２００ｍＭ、１６００から２２００ｍＭ、１８００から２２００ｍＭ、又は２０００から２２００ｍＭ；５から１８００ｍＭ、２５から１８００ｍＭ、５０から１８００ｍＭ、１００から１８００ｍＭ、２００から１８００ｍＭ、４００から１８００ｍＭ、６００から１８００ｍＭ、８００から１８００ｍＭ、１０００から１８００ｍＭ、１２００から１８００ｍＭ、１４００から１８００ｍＭ、１６００から１８００ｍＭ；５から１５００ｍＭ、２５から１４００ｍＭ、５０から１５００ｍＭ、１００から１５００ｍＭ、２００から１５００ｍＭ、４００から１５００ｍＭ、６００から１５００ｍＭ、８００から１５００ｍＭ、１０００から１５００ｍＭ、１２００から１５００ｍＭ；５から１２００ｍＭ、２５から１２００ｍＭ、５０から１２００ｍＭ、１００から１２００ｍＭ、２００から１２００ｍＭ、４００から１２００ｍＭ、６００から１２００ｍＭ、又は８００から１２００ｍＭなど、５から２２００ｍＭの濃度で存在する。
【００７１】
本発明の一実施形態において、少なくとも一つの張度改変剤（ｖ）は、イオン強度改変剤（ｖ／ａ）である。
【００７２】
本明細書で使用される「イオン強度改変剤」という用語には、溶液のイオン強度に寄与する物質が含まれる。イオン強度改変剤には、中性塩、アミノ酸、２から５個のアミノ酸残基のペプチドが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、前記組成物は、二以上のこのような物質を、組み合わせて含む。
【００７３】
イオン強度改変剤（ｖ／ａ）の非限定的な例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムなどの中性塩である。一実施形態において、前記イオン強度改変剤（ｖ／ａ）は塩化ナトリウムである。
【００７４】
「イオン強度」という用語は、式：μ＝１／２Σ（［ｉ］（Ｚｉ２））によって定義される（μはイオン強度であり、［ｉ］はイオンのミリモル濃度であり、Ｚｉは、そのイオンの電荷（＋又は−）である。）溶液のイオン強度（μ）である（例えば、Ｓｏｌｏｍｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，  ７８（１２）：１６９１−９２，  ２００１；Ｊａｍｅｓ  Ｆｒｉｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓｃｈｅｎｋ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９７９を参照）。
【００７５】
本発明の異なる実施形態においては、前記組成物のイオン強度張度は、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも６５０ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１６００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、少なくとも２４００ｍＭ、少なくとも２８００ｍｍ又は少なくとも３２００ｍＭなど、少なくとも５０ｍＭである。
【００７６】
幾つかの具体的な実施形態において、張度改変剤（ｖ）及びイオン強度改変剤（ｖ／ａ）の総濃度は、他の任意の成分が張度及びイオン強度に対して有し得る効果に応じて、１から５００ｍＭ、１から３００ｍＭ、１０から２００ｍＭ、又は２０から１５０ｍＭ；又は、１００から１０００ｍＭ、２００から８００ｍＭ、又は５００から８００ｍＭなど１から１０００ｍＭの範囲にある。
【００７７】
一実施形態において、前記組成物は等張であり、別の実施形態において、前記組成物は高張である。
【００７８】
「等張」という用語は、「血清と等張」であること、すなわち、約３００±５０ミリオスモル／ｋｇであることを意味する。張度とは、投与前の溶液のモル浸透圧濃度の指標を意味するものとする。「高張」という用語は、３００±５０ミリオスモル／ｋｇを超えるレベルなど、血清の生理的レベルを超えるモル浸透圧濃度のレベルを表すものとする。
【００７９】
また、本発明の具体的な実施形態は、金属含有剤（ｉｉｉ）と、ナトリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選択される、相当高濃度のイオン強度改変剤（ｖ／ａ）との組み合わせに関する。本実施形態において、イオン強度改変剤（ｖ／ａ）、すなわち、ナトリウム塩、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩は、１５から１０００ｍＭ、２５から１０００ｍＭ、５０から１０００ｍＭ、１００から１０００ｍＭ、２００から１０００ｍＭ、３００から１０００ｍＭ、４００から１０００ｍＭ、５００から１０００ｍＭ、６００から１０００ｍＭ、７００から１０００ｍＭ；１５から８００ｍＭ、２５から８００ｍＭ、５０から８００ｍＭ、１００から８００ｍＭ、２００から８００ｍＭ、３００から８００ｍＭ、４００から８００ｍＭ、５００から８００ｍＭ；１５から６００ｍＭ、２５から６００ｍＭ、５０から６００ｍＭ、１００から６００ｍＭ、２００から６００ｍＭ、３００から６００ｍＭ；１５から４００ｍＭ、２５から４００ｍＭ、５０から４００ｍＭ、又は１００から４００ｍＭなど、１５から１５００ｍＭの濃度で存在する。
【００８０】
これらの実施形態の中で、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムであり得、カルシウム塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム及びレブロン酸カルシウムからなる群から選択することができ、マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、レブロン酸マグネシウム及び強酸のマグネシウム塩からなる群から選択することができる。より具体的な実施形態において、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩は、塩化ナトリウムと組み合わせて使用される。
【００８１】
さらなる実施形態において、前記組成物は（ｖｉ）抗酸化剤をさらに含む。異なる実施形態において、前記抗酸化剤は、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、メチオニン類似物、メチオニン含有ペプチド、メチオニン相同体、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン及びシスタチオニンからなる群から選択される。好ましい実施形態において、前記抗酸化剤はＬ−メチオニンである。
【００８２】
前記抗酸化剤の濃度は、典型的には、０．１から４．０ｍｇ／ｍＬ、０．１から３．０ｍｇ／ｍＬ、０．１から２．０ｍｇ／ｍｌ又は０．５から２．０ｍｇ／ｍＬなど、０．１から５．０ｍｇ／ｍＬである。
【００８３】
上記抗酸化剤の例は本発明に適用可能であるが、多数の具体的な化合物（例えば、メチオニン）が、金属含有剤（ｉｉｉ）の金属イオンと複合体を形成し得ることが想定される。これは、金属含有剤（ｉｉｉ）の有効濃度を僅かに低下させ得る。
【００８４】
この理由のため、特定の実施形態では、前記組成物は、抗酸化剤を含まず、その代わり、大気を除外することによって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの酸化への感受性を調節する。もちろん、抗酸化剤の使用は、大気の調節された排除と組み合わせることもできる。
【００８５】
このため、本発明は、本明細書に定義されている液体水性薬学的組成物を含有し、不活性ガスを必要に応じて含有する、気密容器（例えば、バイアル又はカートリッジ（ペン型塗布器又はシリンジ装置用カートリッジなど））も提供する。
【００８６】
前記不活性ガスは、窒素、アルゴンなどからなる群から選択され得る。前記容器（例えば、バイアル又はカートリッジ）は、典型的には、ガラス又はプラスチック製、特にガラス製であり、必要に応じて、薬学的組成物の完全性を保ちながら、貫通を可能とする、ゴムの隔壁又はその他の密閉手段によって、必要に応じて閉鎖される。この特定の実施形態において、前記組成物は抗酸化剤（ｖｉ）を含まない。さらなる実施形態において、前記容器は、例えば、ラミネート加工されたものなど（例えば、金属（アルミニウムなど）でラミネート加工されたプラスチック袋）、密閉された袋（例えば、密閉されたプラスチック）中に封入されたバイアル又はカートリッジである。
【００８７】
必須成分、張度改変剤（ｖ）、及び必要に応じて含まれる抗酸化剤（ｖｉ）に加えて、前記薬学的組成物は、さらに、防腐剤（ｖｉｉ）を含み得る。
【００８８】
微生物の増殖を遅らせ、これにより、ＦＶＩＩポリペプチドの「複数使用」包装を可能とするために、前記組成物中に防腐剤を含ませることもできる。防腐剤の例には、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンズアルコニウム及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。前記防腐剤は、ｐＨ範囲及び防腐剤の種類に応じて、通常、０．１から２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【００８９】
さらに、前記組成物は、脱アミド化及び異性化を阻害することができる、一又は複数の物質も含み得える。
【００９０】
一実施形態において、前記液体水性薬学的組成物は、
０．１から１５ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
少なくとも５μＭの濃度の銅含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
少なくとも５ｍＭの濃度の張度改変剤（ｖ）と；
を含む。
【００９１】
別の実施形態において、前記液体水性薬学的組成物は、
０．１から１５ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）と；
約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；
少なくとも１００μＭの濃度のマンガン含有剤（ｉｉｉ）と；
非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；
少なくとも５ｍＭの濃度の、少なくとも一つの張度改変剤（ｖ）と；
を含む。
【００９２】
本明細書において使用されるｐＨ値は、「約」として指定され、±０．１である、例えば、約ｐＨ８．０には、ｐＨ８．０±０．１が含まれるものと理解される。
【００９３】
溶液中に溶解された固体及び溶液中に混合された液体について使用する場合ともに、パーセントは（重量／重量）である。例えば、Ｔｗｅｅｎの場合、１００％原液の重量／溶液の重量である。
【００９４】
本発明の組成物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの、安定で、好ましくは即時使用可能な組成物として有用である。さらに、本明細書に記されている原理、ガイドライン及び具体的な実施形態は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの原体貯蔵物についても等しく適用することができると考えられ、逆も同様である。前記組成物は、２℃から８℃までの温度で保存したときに、典型的には、少なくとも６ヶ月、好ましくは最大３６ヶ月間安定である。前記組成物は、２℃から８℃で、少なくとも６ヶ月間保存されたときに、化学的及び／又は物理的に安定であり、特に化学的に安定である。
【００９５】
「安定な」という用語は、（ｉ）２℃から８℃で、６ヶ月間保存した後に、例えば、実質的に、本明細書のアッセイ４に記載されているとおりに、一段階凝固アッセイによって測定した場合、前記組成物が、その初期生物活性の少なくとも５０％を保持すること；又は、（ｉｉ）２℃から８℃で、６ヶ月間保存した後に、重鎖分解産物の含量の増加が、最大で、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの初期含量の４０％（ｗ／ｗ）であることを意味するものとする。
【００９６】
「初期含量」という用語は、組成物を調製した時点で、組成物に添加された第ＶＩＩ因子ポリペプチドの量に関する。
【００９７】
様々な実施形態において、安定な組成物は、２℃から８℃で、６ヶ月間保存した後に、その初期生物活性の少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％など、少なくとも７０％を保持する。
【００９８】
様々な実施形態において、安定な組成物中の重鎖分解産物の含量の増加は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの初期含量の約３０％（ｗ／ｗ）を超えない、約２５％（ｗ／ｗ）を超えない、約２０％（ｗ／ｗ）を超えない、約１５％（ｗ／ｗ）を超えない、約１０％（ｗ／ｗ）を超えない、約５％（ｗ／ｗ）を超えない、又は約３％（ｗ／ｗ）を超えない。
【００９９】
重鎖分解産物の含量を測定する目的で、５μｍの粒径と３００Åの孔径を有する、独自に開発した４．５×２５０ｍｍの、ブチル結合されたシリカカラム上で、逆相ＨＰＬＣを実行した。カラム温度：７０℃。Ａ緩衝液：０．１％  ｖ／ｖトリフルオロ酢酸。Ｂ緩衝液：０．０９％  ｖ／ｖトリフルオロ酢酸、８０％  ｖ／ｖアセトニトリル。３０分で、Ｘから（Ｘ＋１３％）Ｂとなる線形グラジエントで、カラムを溶出した。約２６分の保持時間でＦＶＩＩａが溶出するように、Ｘを調整した。流速：１．０ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。添加：２５μｇ  ＦＶＩＩａ。
【０１００】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「物理的安定性」という用語は、二量体、オリゴマーの形態及び多量体形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの不溶性及び／又は可溶性凝集物の形成並びに分子のあらゆる構造的変形及び変性に関する。物理的に安定な組成物は、視覚的に透明な状態を保つ組成物を包含する。組成物の物理的安定性は、多くの場合、様々な期間、異なる温度で、組成物を保存した後の視覚的な検査及び濁度によって評価される。組成物の視覚的検査は、暗い背景に、鋭く集光された光の中で実施される。目に見える濁りを示す場合、組成物は、物理的に不安定であると分類される。
【０１０１】
「化学的に安定な」という用語には、２から８℃で、６ヶ月間保存した後、例えば、実質的に本明細書のアッセイ４の記載どおりに、一段階凝集アッセイによって測定した場合に、組成物の最初の生物活性の少なくとも５０％を保持する組成物が包含されるものとする。
【０１０２】
「化学的安定性」という用語は、加速された条件で、溶液中に保存した際に、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに何らかの化学的変化が形成されることに関するものとする。例は、加水分解、脱アミド化及び酸化、並びに第ＶＩＩ因子ポリペプチドの断片の形成をもたらす酵素的分解である。特に、硫黄含有アミノ酸は、酸化されやすく、対応するスルホキシドを形成する。
【０１０３】
さらなる側面において、本発明は、約４．０から約９．０までの範囲にｐＨを保つのに適した緩衝剤（ｉｉ）と；酸化状態が＋ＩＩの第一遷移系列金属（亜鉛を除く。）からなる群から選択される金属を含有する、少なくとも一つの金属含有剤（ｉｉｉ）と；非イオン性界面活性剤（ｉｖ）と；を含む溶液中に、第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）を与える工程を含む、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性薬学的組成物を調製する方法も提供する。
【０１０４】
使用方法
当然のことながら、本明細書に記載されている液体水性薬学的組成物は、医学の分野で使用することができる。このため、本発明は、とりわけ、医薬として使用するための、さらに具体的には、第ＶＩＩ因子応答性症候群を治療するための医薬として使用するための、本明細書に記載された液体水性薬学的組成物を提供する。
【０１０５】
従って、本発明は、第ＶＩＩ因子応答性症候群を治療するための医薬を調製するための、本明細書に記載されている液体水性薬学的組成物の使用、及び、第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療を必要としている患者に、本明細書に記載されている液体水性薬学的組成物の有効量を投与することを含む、第ＶＩＩ因子応答性症候群を治療する方法も提供する。
【０１０６】
本発明の調製物は、任意の第ＶＩＩ因子応答性症候群、例えば出血性疾患（凝固因子欠損症（例えば、Ａ型血友病、Ｂ型血友病、凝固因子ＸＩ欠損症、凝固因子ＶＩＩ欠損症）；血小板減少症若しくはフォン・ヴィレブランド病、又は凝固因子阻害剤によって引き起こされる出血性疾患を含む。）、及び脳内出血、又は任意の原因による出血多量を治療するために使用することができる。前記調製物は、手術若しくはその他の外傷に際して患者に投与し、又は抗凝固剤療法を受けている患者にも投与することもできる。
【０１０７】
「有効量」という用語は、資格を有する医師によって決定されるべき有効用量であり、医師は、所望の応答を達成するために、投与量を滴定することができる。投与量を検討するための因子には、作用強度、生物学的利用性、所望の薬物動態／薬力学的特性、治療の症状、患者に関連する因子（例えば、体重、健康、年齢など）、同時に投与される医薬の存在（例えば、抗凝固剤）、投与の時間、又は医療従事者に公知の他の因子が含まれるであろう。
【０１０８】
「治療」という用語は、疾病、症状又は疾患を撲滅する目的で行われる、患者（例えば、哺乳動物、特にヒト）の管理及び介護として定義され、この用語は、症候若しくは合併症の発症を抑え、又は症候若しくは合併症を緩和し、又は疾病、症状若しくは疾患の撲滅するための第ＶＩＩ因子ポリペプチドの投与を含む。第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明の薬学的組成物は、このような治療を必要としている患者に、非経口的に投与され得る。非経口的投与は、シリンジ、必要に応じて、ペン状シリンジを用いて、皮下、筋肉内又は静脈内注射によって実施し得る。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて実施することができる。
【０１０９】
重要な実施形態において、前記薬学的組成物は、本分野で公知の方法に従って、皮下、筋肉内又は静脈内注射に適合される。
【０１１０】
本明細書に記載された薬学的組成物に存在し得る高濃度の塩は、一部の患者群にとって不利であり得る。従って、本発明は、本明細書に記載の液体水性薬学的組成物を、イオン交換物質、脱塩に適した物質に接触させる工程、及び／又は前記組成物を希釈する工程を含む、液体水性薬学的組成物中の塩濃度を低下させるための、使用前の方法も提供する。
【０１１１】
本明細書に記載された薬学的組成物に存在し得る高濃度の金属イオンは、一部の患者群にとって不利であり得る。従って、本発明は、本明細書に記載の液体水性薬学的組成物を、陽イオン交換物質に接触させる工程を含む、液体水性薬学的組成物中の金属イオン濃度を低下させるための、使用前の方法も提供する。
【０１１２】
陽イオン交換物質の例は、Ｃｈｅｌｅｘ−１００（Ｆｌｕｋａ−Ｒｉｅｄｅｌ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。陽イオン交換物質、例えば、Ｃｈｅｌｅｘ−１００は、好ましくは、無菌容器、例えば、ガラス又はプラスチックのカートリッジ中に含有される。
【０１１３】
前記液体水性薬学的組成物は、例えば、陽イオン交換物質を含有するカートリッジを使用直前に通過させることによって、陽イオン交換物質と接触されることが想定される。特定の実施形態において、前記カートリッジは、シリンジ装置の不可欠な部分であることが想定される。
【０１１４】
［実験］
一般的な方法
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性を決定するのに適したアッセイ
本発明において有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、単純な予備的インビトロ検査として実施できる適切なアッセイによって選択し得る。このため、本明細書は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性用の単純な検査（「インビトロ加水分解アッセイ」と称する。）を開示する。
【０１１５】
インビトロ加水分解アッセイ（アッセイ１）
未変性（野生型）第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド（両者は、以降、「第ＶＩＩａ因子」と称される。）は、比活性についてアッセイすることができる。それらは、それらの比活性を直接比較するために、平行してアッセイすることもできる。本アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）中で実施される。色素産生性基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｓｗｅｄｅｎ）、最終濃度１ｍＭを、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の第ＶＩＩａ因子（最終濃度１００ｎＭ）に添加する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ(登録商標)  ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＵＳＡ）中で、４０５ｎｍの吸光度を継続的に測定する。２０分のインキュベート中に生成された吸光度を、酵素を含有しないブランクのウェル中の吸光度から差し引いた後、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と野生型第ＶＩＩａ因子の比を算出するために使用する。
【０１１６】
比＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子ポリペプチド）／（Ａ４０５ｎｍ野生型第ＶＩＩａ因子）。
【０１１７】
これに基づいて、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と未変性第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性の比が、約１．０ｖｓ１．０超である第ＶＩＩ因子ポリペプチドなど、未変性第ＶＩＩａ因子より低い、未変性第ＶＩＩａ因子と同等、又は未変性第ＶＩＩａ因子より高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。
【０１１８】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性は、適切には、１００から１０００ｎＭの濃度で、第Ｘ因子などの生理的基質を用いて、測定することもでき（「インビトロタンパク質分解アッセイ」）、本アッセイでは、適切な色素産生性基質（例えば、Ｓ−２７６５）を添加した後に、生成された第Ｘａ因子が測定される。さらに、前記活性アッセイは、生理的温度で実施することができる。
【０１１９】
インビトロタンパク質分解アッセイ（アッセイ２）
未変性（野生型）第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド（両者は、以降、「第ＶＩＩａ因子」と称される。）は、比活性を直接比較するために、平行してアッセイされる。本アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）中で実施される。０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有する１００μＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）と第Ｘ因子（０．８μＭ）を１５分間インキュベートする。次いで、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミンを含有する５０μＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を添加することによって、第Ｘ因子の切断を停止する。色素産生性基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５，  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，  Ｓｗｅｄｅｎ）、最終濃度０．５ｍＭを添加することによって、生成された第Ｘａ因子の量を測定する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ(登録商標)  ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＵＳＡ）中で、４０５ｎｍの吸光度を継続的に測定する。１０分の間に生成された吸光度を、ＦＶＩＩａを含有しないブランクのウェル中の吸光度から差し引いた後、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性の比を算出するために使用する。
【０１２０】
比＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子ポリペプチド）／（Ａ４０５ｎｍ野生型第ＶＩＩａ因子）。
【０１２１】
これに基づいて、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と未変性第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性の比が、約１．０ｖｓ１．０超である第ＶＩＩ因子ポリペプチドなど、未変性第ＶＩＩａ因子より低い、未変性第ＶＩＩａ因子と同等、又は未変性第ＶＩＩａ因子より高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。
【０１２２】
第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩポリペプチドがトロンビンを生成する能力は、生理的濃度の関連する全ての凝固因子と阻害剤（Ａ型血友病の症状を模倣する場合、第ＶＩＩＩ因子を差し引く。）、及び活性化された血小板（「ｐ．５４３  ｉｎ  Ｍｏｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ９９，  ５４２−５４７」に記載されているとおり（参考文献として本明細書に援用される。））を含むアッセイ（アッセイ３）でも測定することができる。
【０１２３】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性は、一段階凝固アッセイ（アッセイ４）を用いて測定することもできる。この目的のために、検査すべき試料を、５０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％  ＢＳＡ中に希釈し、１０ｍＭ  Ｃａ２＋と合成リン脂質を含有する、４０μＬの第ＶＩＩ因子欠損血漿と８０μＬのヒト組換え組織因子とともに、４０μＬをインキュベートする。凝固時間を測定し、平行して実施されるアッセイで参照標準を使用する標準曲線と比較する。
【０１２４】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの調製及び精製
本発明で使用するのに適した、精製されたヒト第ＶＩＩａ因子は、例えば、「Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：２４１２−２４１６，  １９８６」に記載されているように、又は「欧州特許第０  ２００  ４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）」に記載されているように、好ましくは、ＤＮＡ組換え技術によって作製される。
【０１２５】
第ＶＩＩ因子は、「Ｂｒｏｚｅ  ａｎｄ  Ｍａｊｅｒｕｓ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５５  （４）：１２４２−１２４７，  １９８０」及び「Ｈｅｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｓｉｅｌ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：１８３６−１８４１，  １９８３」によって記載される方法によって作製することもできる。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子なしに、第ＶＩＩ因子を与える。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物は、最終精製工程として、ゲルろ過をさらに含めることによって得ることができる。次いで、公知の手段によって、例えば、数個の異なる血漿タンパク質（第ＸＩＩａ、Ｉｘ又はＸａ因子など）によって、第ＶＩＩ因子を活性化された第ＶＩＩａ因子に変換される。あるいは、Ｂｊｏｅｒｎら（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，  ２６９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９８６，  ｐｐ．５６４−５６５）によって記載されているように、第ＶＩＩ因子は、Ｍｏｎｏ  Ｑ(登録商標)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）などのイオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させることによって、又は溶液中での自己活性化によって活性化され得る。
【０１２６】
第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子の修飾によって、又は組換え技術によって作製することができる。野生型第ＶＩＩ因子に比較したときに変化を受けたアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、公知の手段によって（例えば、部位特異的突然変異誘発によって）アミノ酸コドンを変化させることによって、又は天然第ＶＩＩ因子をコードする核酸中のアミノ酸コドンの幾つかを除去することによって、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾させることによって作製することができる。
【０１２７】
置換は、第ＶＩＩａ因子分子の機能にとって極めて重要な領域外に作製することが可能であり、なお活性なポリペプチドをもたらすことが、当業者に自明であろう。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性にとって不可欠であり、従って、置換を受けないことが好ましいアミノ酸残基は、位置指定突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５を参照）など、本分野で公知の手順に従って同定し得る。後者の技術では、分子内にある、正に帯電した全ての残基に変異が導入され、分子の活性に不可欠であるアミノ酸残基を同定するために、得られた変異分子の凝固、架橋活性をそれぞれに検査する。基質酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性標識などの技術によって決定される三次元構造の分析によっても決定することができる（例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０９：５９−６４を参照）。
【０１２８】
あるヌクレオチドを別のヌクレオチドに交換するために、核酸配列中に変異を導入することは、本分野で公知の任意の方法を用いて、位置指定突然変異導入によって達成され得る。特に有用なのは、目的の挿入物を有する、スーパーコイルを形成された、二本鎖ＤＮＡベクターと、所望の変異を含有する二つの合成プライマーを使用する手法である。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた温度サイクリングの間に、それぞれ、ベクターの反対ストランドに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが伸長する。プライマーが取り込まれると、ねじれた切れ目を含有する変異されたプラスミドが生成される。親ＤＮＡテンプレートを消化し、変異を含有する合成ＤＮＡを選択するために、温度サイクリングに続いて、メチル化されたＤＮＡとヘミメチル化されたＤＮＡに対して特異的であるＤｐｎＩで、産物を処理する。例えば、遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術など、変異形を作製、同定及び単離するための、本分野で公知の他の手法も使用し得る。
【０１２９】
ポリペプチド源の細胞からポリペプチドを分離することは、所望の産物を含有する細胞培地を付着性細胞培養から除去すること；非付着性細胞を除去するための遠心又はろ過などを含む（これらに限定されない。）、本分野で公知の任意の方法によって達成し得る。
【０１３０】
必要に応じて、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをさらに精製し得る。例えば、抗第ＶＩＩ因子抗体カラム上などでのアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：１１０９７，  １９８６；ａｎｄ  Ｔｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７：７７８５，  １９８８参照）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動操作（例えば、調製用等電点電気泳動（ＩＥＦ）、溶解度差（例えば、硫安沈殿）又は抽出などを含む（これらに限定されない。）、本分野で公知の任意の方法を用いて、精製を行うことができる。一般的に、「Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８２」及び「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｊ．Ｃ．  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９」を参照。精製後、前記調製物は、好ましくは、宿主細胞に由来する非第ＶＩＩ因子ポリペプチドの１０重量％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満を含有する。
【０１３１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子又はトリプシン様特異性を有するその他のプロテアーゼ（例えば、第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子及びトロンビンなど）を使用して、タンパク質分解切断によって活性化することができる。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，４５６，５９１；及びＨｅｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：１８３６（１９８３）を参照されたい。あるいは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｍｏｎｏ  Ｑ(登録商標)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）などのイオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させることによって、又は溶液中での自己活性化によって活性化され得る。次いで、得られた活性化された第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調合し、本願に記載されているように投与し得る。
【０１３２】
以下の実施例は、本発明の実施を説明する。これらの実施例は、例示的な目的のためにのみ記載されており、いかなる意味においても、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１３３】
（実施例）
【実施例１】
【０１３４】
重鎖分解（自己触媒切断）に対する、水性ｒＦＶＩＩａ溶液への銅含有及びマンガン含有剤の添加の効果
金属イオンのｒＦＶＩＩａに対する効果を調べるために、以下の手順を踏んだ。
【０１３５】
ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩によって、ｒＦＶＩＩａを以下の溶液に移した。
【０１３６】
ｒＦＶＩＩａ                      １．０ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム                    ２．９２ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ            １．４７ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）
ＰＩＰＥＳ                        １５．１２ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
１Ｍ  ＮａＯＨ                    ｐＨ  ６．５になるように添加
金属含有剤の２つの溶液を調製した。
【０１３７】
塩化銅（ＩＩ），２Ｈ２Ｏ            １０ｍＭ
塩化マンガン，２Ｈ２Ｏ              ２Ｍ
表１にまとめられている濃度に到達するために、銅含有剤とマンガン含有剤を、それぞれ、前記脱塩されたｒＦＶＩＩａ溶液に添加した。ｐＨを６．５になるように調整した。この調合物を５℃の温度で保存し、表１に記されている時点で、分析を行った。
【表１】
2007507419.tif 000002
【０１３８】
表１から明らかなように、基準調合物における重鎖分解産物の含量の増加は、合計２０．２％ポイントであったのに対して、実例の組成物における重鎖分解産物の含量の増加は、それぞれ、６．６％ポイント（［Ｃｕ（ＩＩ）］＝８０μＭ）及び８．３％ポイント（［Ｍｎ（ＩＩ）］＝１０ｍＭ）であった。
【０１３９】
重鎖分解産物の含量は、以下に記載されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定される。
【０１４０】
５μｍの粒径と３００Åの孔径を有する、独自に開発した４．５×２５０ｍｍの、ブチル結合されたシリカカラム上で、逆相ＨＰＬＣを実行した。カラム温度：７０℃。Ａ緩衝液：０．１％  ｖ／ｖトリフルオロ酢酸。Ｂ緩衝液：０．０９％  ｖ／ｖトリフルオロ酢酸、８０％  ｖ／ｖアセトニトリル。３０分で、Ｘから（Ｘ＋１３％）Ｂとなる線形グラジエントで、カラムを溶出した。約２６分の保持時間でＦＶＩＩａが溶出するように、Ｘを調整した。流速：１．０ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。添加：２５μｇ  ＦＶＩＩａ。
【実施例２】
【０１４１】
高イオン強度での、水性ｒＦＶＩＩａ溶液への、銅含有及びマンガン含有剤の添加
金属イオン及び高イオン強度の、ｒＦＶＩＩａの安定性に対する効果を調べるために、以下の手順を踏むことができる。
【０１４２】
ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩によって、ｒＦＶＩＩａを以下の溶液に移した。
【０１４３】
塩化ナトリウム                    ２．９２ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ            ２９．４ｍｇ／ｍＬ（２００ｍＭ）
ＰＩＰＥＳ                        １５．１２ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８        １．０ｍｇ／ｍＬ
メチオニン                        ０．５ｍｇ／ｍＬ
１Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣＬ      ｐＨ６．５になるように添加
及び／又は
塩化ナトリウム                    ２９．２ｍｇ／ｍＬ（５００ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ            １．４７ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）
ＰＩＰＥＳ                        １５．１２ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８        １．０ｍｇ／ｍＬ
メチオニン                        ０．５ｍｇ／ｍＬ
１Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣｌ      ｐＨ６．５になるように添加
両溶液中において、第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）の濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬである。
【０１４４】
金属含有剤の２つの溶液を調製する。
【０１４５】
塩化銅（ＩＩ），２Ｈ２Ｏ            １０ｍＭ
塩化マンガン，２Ｈ２Ｏ              ２Ｍ
実施例１にまとめられている濃度に到達するために、銅含有剤とマンガン含有剤を、それぞれ、前記脱塩されたｒＦＶＩＩａ溶液に添加する。ｐＨを６．５になるように調整する。必要に応じて、不活性ガス下で、この調合物をバイアル中に満たし、密封する。さらに、このバイアルは、大気が容器に入るのを防ぐために、気密性の袋に入れることができる。このバイアルを５℃の温度で保存し、実施例１に記されている時点で、実施例１に記載されているように分析を行う。
【０１４６】
金属（銅又はマンガン）の添加は、重鎖分解産物の形成を減少させることが分かるであろう。金属（銅又はマンガン）に高イオン強度を組み合わせることによって、最も低い増加が得られるであろう。
【実施例３】
【０１４７】
高いイオン強度を有する水性ｒＦＶＩＩａ溶液への銅含有剤の添加
金属イオン及び高イオン強度が、ｒＦＶＩＩａの安定性に対して及ぼし得る相乗効果を調べるために、以下の手順を踏んだ。
【０１４８】
２段階のプロセスで、下表１に列記されている様々な溶液（調合物）の中にｒＦＶＩＩａを移した。
【０１４９】
まず、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩によって、銅が添加されていない様々な溶液中にｒＦＶＩＩａを移した。次に、表記の濃度に達するまで、１０ｍＭ  塩化銅（ＩＩ），２Ｈ２Ｏの溶液を添加することによって、溶液２及び４において、銅の含量が得られた。
【０１５０】
銅溶液を添加した後、６．５になるようにｐＨを調整し、カートリッジに前記調合物を充填した。
【０１５１】
このカートリッジを５℃の温度で保存し、表２に記されているように、０、０．５、１、２及び３ヵ月後に、分析を行った。
【表２】
2007507419.tif 000003
【表３】
2007507419.tif 000004
【０１５２】
銅の添加は重鎖分解産物の形成を減少させることが、表２から明らかである。調合物４において、銅に高イオン強度を組み合わせることによって、最も低い増加が得られる。
【実施例４】
【０１５３】
以下の液体水性薬学的組成物の調合が想定される。
【０１５４】
Ａ）
ｒｈＦＶＩＩａ                １  ｍｇ／ｍＬ（約５０，０００  ＩＵ／ｍＬ）
ＰＩＰＥＳ                    １５．１２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化銅（ＩＩ）                ８０  μＭ
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８    １．０  ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム                ２．９２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ        １．４７  ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）
メチオニン                    ０．５  ｍｇ／ｍＬ
１Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ６．５になるように添加
Ｂ）
ｒｈＦＶＩＩａ              １  ｍｇ／ｍＬ（約５０，０００  ＩＵ／ｍＬ）
ＰＩＰＥＳ                  １５．１２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化マンガン（ＩＩ）        １０  ｍＭ
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８  １．０  ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム              ２．９２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ        １．４７  ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）
メチオニン                  ０．５  ｍｇ／ｍＬ
１Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ６．５になるように添加
Ｃ）
ｒｈＦＶＩＩａ              １  ｍｇ／ｍＬ（約５０，０００  ＩＵ／ｍＬ）
ＰＩＰＥＳ                  １５．１２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化銅（ＩＩ）              ８０μＭ
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８  １．０  ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム              ２．９２  ｍｇ／ｍＬ（５０  ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ        １．４７  ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）
１Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ６．５になるように添加
Ｄ）
ｒｈＦＶＩＩａ              １  ｍｇ／ｍＬ（約５０，０００  ＩＵ／ｍＬ）
ＰＩＰＥＳ                  １５．１２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化マンガン（ＩＩ）        １０  ｍＭ
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８  １．０  ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム              ２．９２  ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ        １．４７ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）
１Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ６．５になるように添加
続いて、薬学的組成物ＡからＤは、窒素又はアルゴンを必要に応じて吹き付けた無菌バイアル又はカートリッジに移すことができる。さらに、それらは、必要に応じて、アルミニウムラミネート加工が施された気密性プラスチックバック中に包装することができる。
【実施例５】
【０１５５】
高イオン強度を有する水性ｒＦＶＩＩａ溶液への、銅含有剤の添加
金属イオン及び高イオン強度が、ｒＦＶＩＩａの安定性に対して及ぼし得る相乗効果を調べるために、以下の手順を踏んだ。
【０１５６】
２段階のプロセスで、下表１に列記されている様々な溶液（調合物）の中にｒＦＶＩＩａを移した。
【０１５７】
まず、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩によって、銅が添加されていない様々な溶液中にｒＦＶＩＩａを移した。次に、表記の濃度に達するまで、１０ｍＭ  塩化銅（ＩＩ），２Ｈ２Ｏの溶液を添加することによって、溶液２及び４において、銅の含量が得られた。
【０１５８】
銅溶液を添加した後、６．５になるようにｐＨを調整し、カートリッジに前記調合物を充填した。このカートリッジを５℃の温度で保存し、表２に記されているように、０、０．５、１、２及び３ヵ月後に、分析を行った。
【表４】
2007507419.tif 000005
【表５】
2007507419.tif 000006
【０１５９】
高いイオン強度を有する溶液に銅を添加すると、重鎖分解産物の形成の増加が最も少なくなることが、表２から明らかである。
【実施例６】
【０１６０】
高イオン強度を有する水性ｒＦＶＩＩａ溶液への、銅含有剤の添加
金属イオン及び高イオン強度が、ｒＦＶＩＩａの安定性に対して及ぼし得る相乗効果を調べるために、以下の手順を踏んだ。
【０１６１】
２段階のプロセスで、下表１に列記されている様々な溶液（調合物）中にｒＦＶＩＩａを移した。
【０１６２】
まず、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩によって、銅が添加されていない様々な溶液中にｒＦＶＩＩａを移した。次に、表記の濃度に達するまで、１０ｍＭ  塩化銅（ＩＩ），２Ｈ２Ｏの溶液を添加することによって、溶液２及び４において、銅の含量が得られた。
【０１６３】
銅溶液を添加した後、６．５になるようにｐＨを調整し、カートリッジ中に前記調合物を充填した。このカートリッジを５℃の温度で保存し、表２に記されているように、０、３、７及び８ヵ月後に、分析を行った。
【表６】
2007507419.tif 000007
【０１６４】
実質的に本明細書のアッセイ４に記載されているように、一段階凝固アッセイにおいて、凝固活性をアッセイした。
【表７】
2007507419.tif 000008
【０１６５】
高いイオン強度を有する溶液に銅を添加すると、凝固活性に関して最も安定な調合物が得られることが、表２から明らかである。
【実施例７】
【０１６６】
水性ｒＦＶＩＩａ溶液への、コバルト含有及びニッケル含有剤の添加
これらの金属イオンが、ｒＦＶＩＩａの安定性に対して及ぼし得る効果を調べるために、以下の手順を踏んだ。
【０１６７】
２段階のプロセスで、下表１に列記されている様々な溶液（調合物）中にｒＦＶＩＩａを移した。
【０１６８】
まず、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩によって、Ｃｏ（ＩＩ）及びＮｉ（ＩＩ）が添加されていない様々な溶液中にｒＦＶＩＩａを移した。次に、表記の濃度に達するために、２Ｍ  ＣＯ（ＩＩ）Ｃｌ２の溶液を添加することによって、溶液２及び３において、Ｃｏ（ＩＩ）含量を得、２Ｍ  Ｎｉ（ＩＩ）Ｃｌ２の溶液を添加することによって、溶液４及び５において、Ｎｉ（ＩＩ）含量を得た。
【０１６９】
Ｃｏ（ＩＩ）及びＮｉ（ＩＩ）溶液を添加した後、６．５になるようにｐＨを調整し、カートリッジに前記調合物を充填した。このカートリッジを５℃の温度で保存し、表２に記されている時点で、分析を行った。
【表８】
2007507419.tif 000009
【表９】
2007507419.tif 000010
【０１７０】
溶液にコバルト又はニッケルを添加すると、重鎖分解産物の形成の増加が最も少ないことが、表２から明らかである。
【国際調査報告】
2007507419.tif 000011
2007507419.tif 000012
2007507419.tif 000013
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