(57)【要約】  本発明は、虚血性心疾患（例えば冠動脈心疾患または虚血性心筋症）を有する患者の細胞治療において、幹細胞および前駆細胞を処理するために、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の転写を増強する化合物の使用に関する。このような骨髄から単離された細胞を、例えばｅＮＯＳ転写エンハンサーを用いて処理してから投与することにより、それらの機能的な活動が改善され、心臓の新血管形成と心臓の再生が改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性心疾患の患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞を処理するための医薬品を製造するための、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーの使用。
【請求項２】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーは、式Ｉ：
【化１】
2007509873.tif 000004
で示される化合物、その立体異性体もしくはそれらのいずれかの配合比の混合物、または、それらの製薬上許容できる塩である請求項１に記載の使用。
式中、ｎは、１、２または３であり；
Ｒは、フェニルまたはＨｅｔａｒ基であり、これらはいずれも、非置換であるか、または、Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｃ1〜Ｃ3−アルキル；Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシメチル；２−アミノ−３，３，３−トリフルオロプロピル−；ＣＦ3；Ｃ3〜Ｃ5−アルカンジイル；フェニル；ヘテロアリール；ベンジル；ヘテロアリール−メチル−；ＯＨ；Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ；フェノキシ；トリフルオロメトキシ；２，２，２−トリフルオロエトキシ；（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）ＣＯＯ；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）メルカプト；フェニルメルカプト；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）スルホニル；フェニルスルホニル；ＮＨ2；（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ；ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＣＯＮＨ−；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＳＯ2ＮＨ−；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＣＯ；フェニル−ＣＯ；−ＯＣＨ2Ｏ−；−ＯＣＦ2Ｏ−；−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−；ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＣＯＮＨ2；−ＣＯＮＨ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＣＯＮ（ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル））；ＣＮ；−ＳＯ2ＮＨ2；−ＳＯ2ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＳＯ2Ｎ（ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル））；ピロリジニル；ピペリジニル；モルホリニル；および、チオモルホリニルからなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なる置換基を有し；ここにおいて、ヘテロアリール、フェニル、ヘテロアリールを含む基およびフェニルを含む基（これらは、場合により、該フェニルまたは該Ｈｅｔａｒ基の置換基に存在する）は全て、非置換であるか、または、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｃ1〜Ｃ3−アルキル、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ、および、ＣＦ3からなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なる置換基で置換されており；
ヘテロアリールおよびＨｅｔａｒ基は、互いに独立して、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なるヘテロ原子を含む、５員環〜１０員環の芳香族の単環式または二環式の複素環である。
【請求項３】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーは、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド、および、２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸インダン−２−イルアミドから選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
幹細胞および／または前駆細胞は、患者の骨髄から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
幹細胞および／または前駆細胞を、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーと、６時間〜４８時間インキュベートする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
虚血性心疾患は、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、急性冠症候群、狭心症、心筋梗塞、虚血性心筋症、または、うっ血性心不全である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
処理した幹細胞および／または前駆細胞を、静脈内、冠動脈内または心筋内への注射または注入によって患者に投与する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーを用いることを含む、虚血性心疾患の患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞を処理するための医薬品を製造する方法。
【請求項９】
虚血性心疾患の患者由来の幹細胞および／または前駆細胞を、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーで処理することを含む、機能的な活動が改善された幹細胞および／または前駆細胞を製造する方法。
【請求項１０】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーを含む、虚血性心疾患の患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞を処理するための医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性心疾患（例えば冠動脈心疾患または虚血性心筋症）を有する患者の細胞治療において、幹細胞および前駆細胞を処理するための、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の転写を増強する化合物の使用に関する。このような細胞（例えば骨髄から単離することができる細胞）を、ｅＮＯＳ転写エンハンサーで処理してから投与することによって、それらの機能的な活動が改善され、心臓の新血管形成と心臓の再生が改善される。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患（例えば冠動脈心疾患または虚血性心筋症）を有する患者において、梗塞後の心不全が、未だに罹患率および死亡率の主要な理由である。閉塞した動脈の迅速な再潅流により、早期死亡率が著しく減少しているもの、梗塞領域の進行性膨張と左心室腔の拡張を特徴とする心室リモデリングプロセスは、急性心筋梗塞から生存した患者において心不全を発症させることが多い。リモデリングを元に戻す主要な目的は、梗塞領域内の新血管形成の刺激、同様に心筋細胞再生の増強であると考えられる。
【０００３】
近年の調査結果により、出生後の新血管形成と心臓の再生における、内皮の幹細胞および前駆細胞の基本的な役割が確立された。危険な虚血後の新血管形成の改善は、例えば心筋梗塞または肢虚血のような現象後の重要な治療選択肢である。近頃まで、成人における虚血組織の新血管形成は、成熟した内皮細胞の移動と増殖、すなわち血管新生というプロセスに限定されると考えられていた。一方、循環する内皮の前駆細胞（ＥＰＣ）が虚血部位に戻り、新生血管の形成に寄与することを示す証拠はますます増えている（Ｃ．Ｋａｌｋａ等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００年，９７：３４２２〜７）。胎児における初期内皮の前駆細胞（血管芽細胞）からの血管の発達と同様に、このプロセスは脈管形成と称される。
【０００４】
循環する前駆細胞の重要性は、それらの補充が遺伝的に阻害されていると、腫瘍の血管新生が阻害されるということで実証されている。ＥＰＣは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または間質細胞由来因子（ＳＤＦ）−１によって、骨髄から循環系に移動させることができる。ＶＥＧＦとＳＤＦ−１はいずれも、低酸素の組織で大いにアップレギュレートされることから、ＶＥＧＦとＳＤＦ−１は、危険な虚血の後に、循環する前駆細胞を補充して、内因性の修復メカニズムを増強するためのホーミングシグナルを構成することが示唆される（Ｓ．Ｈ．Ｌｅｅ等，Ｅａｒｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ａｎｄ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０００年，３４２：６２６〜３３）。
【０００５】
近年の実証研究により、骨髄または血液から得られた前駆細胞は、梗塞した心筋の再生に寄与し、虚血性の心筋の新血管形成を増強することが裏付けられている（Ａ．Ａ．Ｋｏｃｈｅｒ等，Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００１年，７：４３０−６；Ｄ．Ｏｒｌｉｃ等，Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１年  ，４１０：７０１−５；Ｓ．Ｆｕｃｈｓ等，Ｃａｔｈｅｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏ−ｏｐｔｉｏｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３年，４１：１７２１〜４）。その上、成人の前駆細胞の静脈内注入または心筋内注射により、実験的に心筋梗塞を誘発させた後、および、慢性の虚血性心疾患を有する患者の両方において、心臓の機能が持続的に改善された。成人の幹細胞および前駆細胞の冠動脈内注入は、急性心筋梗塞を有する患者と慢性虚血性心筋症を有する患者の両方において、実行可能かつ安全であることが、臨床的に実証されている（Ｂ．Ａｓｓｍｕｓ等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＴＯＰＣＡＲＥ−ＡＭＩ），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２年，１０６：３００９〜１７；Ｂ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｅｒ等，Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２年，１０６：１９１３−８）。このような細胞治療は、自己細胞治療として患者に施されるものであり、局部的および全体的な左心室機能における顕著な改善につながる。
【０００６】
虚血性心疾患を有する患者の細胞治療を成功させる必要条件はホーミングであり、従って、特に血管内の投与経路が選択される場合、心臓の標的とする領域に移植した細胞が生着することである。間葉細胞、造血幹細胞および前駆細胞のような、様々なタイプの骨髄幹細胞および前駆細胞の数は、虚血性心疾患を有する患者と健康なコントロールとで類似しているが、残念なことに虚血性心疾患を有する患者由来の幹細胞および前駆細胞の機能的な活動は損なわれており、それらのホーミング能は減少する。このような、冠動脈心疾患を有する患者由来の幹細胞および前駆細胞の機能的な欠動により、臨床的な細胞治療に関する治療上の可能性が限定される。これは、特に、虚血組織に侵入しホーミングするために化学誘引物質の濃度勾配に対して前駆細胞が溢出することを必要とする血管内投与経路が用いられる場合に当てはまる。幹細胞および前駆細胞の機能的な活動およびホーミング能は、例えばＶＥＧＦまたはＳＤＦ−１に応答したそれらのコロニー形成活性または移動活性を決定することによって評価することができる。細胞治療前の幹細胞および前駆細胞の移動またはコロニー形成活性をモニターすることは、細胞治療からより多くの利益を引き出す可能性のある患者を同定するための代用試験として役立たせることができる。一方で、近年、健康なドナーマウス由来の、完全な機能を有する骨髄から誘導されたＥＰＣは、新血管形成機能が損なわれたマウスモデルにおいて、老齢の宿主の心臓の血管新生を回復させることが説明されている（Ｊ．Ｍ．Ｅｄｅｌｂｅｒｇ等，Ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ａｇｉｎｇ−ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００２年，９０：ｅ８９〜ｅ９３）。従って、投与前の適切な手段（例えば薬理学的または遺伝子操作）によって、虚血性心疾患を有する患者由来の機能が損なわれた幹細胞および前駆細胞の活動を回復させ、それによって細胞治療から得られる患者の治療上の利点を高めることが有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
驚くべきことに、虚血性心疾患を有する患者由来の幹細胞および前駆細胞の機能障害は、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーとのインキュベートによって顕著に改善することができることが発見された。患者の細胞を再投与する前にエクスビボでｅＮＯＳ転写エンハンサーで処理することによって生産される内皮型一酸化窒素合成酵素の増強された発現により、これらの細胞の機能的な活動が改善または回復され、これは、以下に概略を説明するように、インビトロで遊出分析を用いることと、インビボでの後肢虚血のマウスモデルの両方において実証されている。後者のモデルにおいて、血流測定により大腿動脈を結紮した後の新血管形成を測定したところ、ｅＮＯＳ転写エンハンサーでの前処理の後に、投与された虚血性心疾患を有する患者由来の幹細胞および前駆細胞の有益な作用が、実質的に増加することが発見された。このような観察された作用は、実際には、内皮のＮＯ合成酵素の増強された活性によって引き起こされ、ＮＯ形成は、ｅＮＯＳおよびＮＯ形成の阻害剤であることがわかっているＮ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）の作用を阻害することによって証明されている。ｅＮＯＳ転写エンハンサーとＬ−ＮＭＭＡ両方の存在下で、虚血性心疾患を有する患者由来の幹細胞および前駆細胞をインキュベートすると、機能的な活動の改善が起こらなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の目的は、虚血性心疾患を有する患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞を処理するための内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーの使用、同様に、虚血性心疾患を有する患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞を処理するための医薬品を製造するための、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーの使用、および、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーを用いることを含む、虚血性心疾患を有する患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞を処理するための医薬品を製造する方法、および、細胞を内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーで処理することを含む、虚血性心疾患を有する患者の細胞治療における幹細胞および／または前駆細胞の治療方法である。
【０００９】
内皮のＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ、ＮＯＳ−ＩＩＩ）は、アルギニンの酸化によってメッセンジャー分子の酸化窒素（一酸化窒素；ＮＯ）を生産する３種のイソ酵素の群に属する。内皮から生じるＮＯは、多数の重要な心臓血管メカニズムにおいて中心的な重要性を有する。ＮＯは、血管拡張性の作用を有し、血小板の凝集、内皮への白血球の付着、および、内膜の平滑筋細胞増殖を阻害する。内皮のＮＯ合成酵素は、転写段階、転写後段階いずれにおいても生理学的および病態生理学的な調節を受けやすい。内皮細胞におけるｅＮＯＳ発現のアップレギュレーションは、冠動脈心疾患やアテローム発生のような心臓血管疾患などの様々な状態を治療し、予防する有効な手段である。ｅＮＯＳ転写を増強する化合物は、例えば、ＷＯ０２／０６４１４６、ＷＯ０２／０６４５４５、ＷＯ０２／０６４５４６およびＷＯ０２／０６４５６５で説明されている。これらの参考文献には、虚血性心疾患を有する患者の細胞治療における、このような細胞のエクスビボでの処理によって生じる幹細胞および前駆細胞の機能的な能力への有益な作用は説明されていない。近年、幹細胞および前駆細胞の骨髄から循環系への移動に関するｅＮＯＳの重要性が説明されている（Ａ．Ａｉｃｈｅｒ等，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｏｒ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３年；９：１３７０〜１３７６）。
【００１０】
好ましい本発明の実施形態において、ＷＯ０２／０６４１４６、ＷＯ０２／０６４５４５、ＷＯ０２／０６４５４６およびＷＯ０２／０６４５６５、ならびに、対応特許文書、例えばＵＳ２００３／０００８９１５、ＵＳ２００３／００２２９３５、ＵＳ２００３／００２２９３９およびＵＳ２００３／００５５０９３（これらの内容は、この参照により開示に含まれる）で開示されたｅＮＯＳ転写エンハンサーが用いられる。より好ましい本発明の実施形態において、式Ｉで示されるｅＮＯＳ転写エンハンサーが用いられ、これは、その立体異性体のいずれか、もしくはそれらのあらゆる配合比の混合物、または、それらの製薬上許容できる塩である。
【００１１】
【化１】
2007509873.tif 000002
式中、ｎは、１、２または３であり；
Ｒは、フェニルまたはＨｅｔａｒ基であり、これらはいずれも、非置換であるか、または、Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｃ1〜Ｃ3−アルキル；Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシメチル；２−アミノ−３，３，３−トリフルオロプロピル−；ＣＦ3；Ｃ3〜Ｃ5−アルカンジイル；フェニル；ヘテロアリール；ベンジル；ヘテロアリール−メチル−；ＯＨ；Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ；フェノキシ；トリフルオロメトキシ；２，２，２−トリフルオロエトキシ；（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）ＣＯＯ；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）メルカプト；フェニルメルカプト；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）スルホニル；フェニルスルホニル；ＮＨ2；（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ；ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＣＯＮＨ−；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＳＯ2ＮＨ−；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＣＯ；フェニル−ＣＯ；−ＯＣＨ2Ｏ−；−ＯＣＦ2Ｏ−；−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−；ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＣＯＮＨ2；−ＣＯＮＨ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＣＯＮ（ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル））；ＣＮ；−ＳＯ2ＮＨ2；−ＳＯ2ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＳＯ2Ｎ（ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル））；ピロリジニル；ピペリジニル；モルホリニル；および、チオモルホリニルからなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なる置換基を有し；ここにおいて、ヘテロアリール、フェニル、ヘテロアリールを含む基およびフェニルを含む基（これらは、場合により、前記フェニルまたは前記Ｈｅｔａｒ基の置換基に存在する）は全て、非置換であるか、または、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｃ1〜Ｃ3−アルキル、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ、および、ＣＦ3からなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なる置換基で置換されており；
ヘテロアリールおよびＨｅｔａｒ基は、互いに独立して、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なるヘテロ原子を含む、５員環〜１０員環の芳香族の単環式または二環式の複素環である。
【００１２】
式Ｉで示される化合物における基または置換基（例えばフェニル、ヘテロアリール、アルキルなど）が数箇所に存在し得る場合、それらはいずれも、互いに独立して指定された意味を有し、従って、いずれの場合においても互いに同一でもよいし、または異なっていてもよい。例えば、ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ基において、アルキル置換基は、同一でもよいし、または異なっていてもよい。
【００１３】
アルキル残基は、直鎖状でもよいし、または、分枝鎖でもよく、非環式でもよいし、または、環状でもよい。これはまた、それらがその他の基（例えばアルコキシ基、アルコキシカルボニル基またはアミノ基）の一部である場合、または、それらが置換されている場合にも適用される。
【００１４】
アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、これらの残基のｎ−異性体、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルである。また、本明細書において、用語「アルキル」は特に、少なくとも３個の炭素原子を含む、シクロアルキル残基、および、シクロアルキル−アルキル−残基（シクロアルキルで置換されたアルキル）を含む。このようなシクロアルキル残基の例は、シクロプロピル、および、シクロブチルである。シクロアルキル基は、１個またはそれ以上の、同一または異なる（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキル残基で置換されていてもよく、特にメチルで置換されていてもよい。その上、特に他の指定がない限り、本明細書において用語「アルキル」はまた、非置換のアルキル残基、同様に、１個またはそれ以上の、例えば１、２、３または４個の、同一または異なる残基、例えばフェニル基で置換されたアルキル残基も含む。置換されたアルキル残基（例えばフェニルアルキル）において、置換基は、望ましいいずれの位置に存在していてもよい。
【００１５】
Ｃ3〜Ｃ5−アルカンジイルの例は、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、および、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−基である。
【００１６】
特に他の指定がない限り、上述のフェニル残基、および、複素環式の残基（ヘテロアリール残基など）は、非置換であってもよいし、または、上記の定義で指定された置換基のうち１、２、３または４個を有していてもよく、これらは、望ましいいずれの位置に存在していてもよい。一置換されたフェニル残基において、置換基は、２位、３位または４位に存在でき、二置換されたフェニル残基において、置換基は、２，３位、２，４位、２，５位、２，６位、３，４位、または、３，５位に存在できる。三置換されたフェニル残基において、置換基は、２，３，４位、２，３，５位、２，３，６位、２，４，５位、２，４，６位または３，４，５位に存在できる。４カ所置換されたフェニル残基において、置換基は、２，３，４，５位、２，３，４，６位、または、２，３，５，６位に存在できる。
【００１７】
特に他の指定がない限り、ヘテロアリール残基および複素環式の残基（例えばＨｅｔａｒ基）は、好ましくは、１、２または３個の同一または異なるヘテロ原子を含む複素環から誘導されたもの、より好ましくは、１または２個の同一または異なるヘテロ原子を含む複素環から誘導されたものである。ヘテロ環式基における環は、好ましくは５員環、６員環または７員環であり、より好ましくは、５員環または６員環である。式Ｉで示される化合物に存在する残基が生じる可能性がある単環式および二環式の複素環系の例は、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、１，３−ジオキソール、１，３−オキサゾール（＝オキサゾール）、１，２−オキサゾール（＝イソオキサゾール）、１，３−チアゾール（＝チアゾール）、１，２−チアゾール（＝イソチアゾール）、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピラン、チオピラン、１，４−ジオキシン、１，２−オキサジン、１，３−オキサジン、１，４−オキサジン、１，２−チアジン、１，３−チアジン、１，４−チアジン、１，２，３−トリアジン、１，２，４−トリアジン、１，３，５−トリアジン、１，２，４，５−テトラジン、アゼピン、１，２−ジアゼピン、１，３−ジアゼピン、１，４−ジアゼピン、１，３−オキサゼピン、１，３−チアゼピン、インドール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾジオキソール、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、チエノチオフェン、１，８−ナフチリジン、およびその他のナフチリジン、プテリジン、または、フェノチアジンであり、これらはいずれも、それぞれの型が既知であり、安定で、本化合物の定義に合致するのであれば、飽和型（ペルヒドロ型）、または、部分的に不飽和の型（例えば、ジヒドロ型またはテトラヒドロ型）、または、最大限不飽和の型であり得る。本明細書で用いられる用語「ヘテロアリール」は、両方の環が芳香族である二環式の残基、同様に、一方の環だけが芳香族である二環式の残基を含む。独立して、同様のことがＨｅｔａｒ基にも当てはまる。適切な複素環としては、例えば、飽和複素環のピロリジン、ピペリジン、モルホリンおよびチオモルホリンが挙げられる。不飽和の複素環は、例えば、環系内に１、２または３個の二重結合を含んでいてもよい。また、５員環および６員環は、具体的には芳香族であってもよい。
【００１８】
これらの複素環から誘導することができる置換基は、適切な炭素原子のいずれかを介して結合されていてもよい。また、環の窒素原子上に水素原子または置換基を有する含窒素複素環から誘導された残基、例えば  ピロール、イミダゾール、ピロリジン、モルホリン、ピペラジンは、特にそれぞれの複素環式の残基が炭素原子に結合している場合、環の窒素原子を介して結合されていてもよい。例えば、チエニル残基は、２−チエニル残基、または、３−チエニル残基として存在でき、フリル残基は、２−フリル残基、または、３−フリル残基として存在でき、ピリジル残基は、２−ピリジル残基、３−ピリジル残基、または、４−ピリジル残基として存在でき、ピペリジニル残基は、１−ピペリジニル残基（＝ピペリジノ残基）、２−ピペリジニル残基、３−ピペリジニル残基、または、４−ピペリジニル残基として存在でき、（チオ）モルホリニル残基は、２−（チオ）モルホリニル残基、３−（チオ）モルホリニル残基、または、４−（チオ）モルホリニル残基（＝チオモルホリノ残基）として存在できる。炭素原子を介して結合している１，３−チアゾールまたはイミダゾールから誘導された残基は、２位、４位または５位で結合させることができる。
【００１９】
ヘテロ環式基が置換されている場合、ヘテロ環式基は、１、２、３または４個の同一または異なる置換基を有することができる。複素環中の置換基は、望ましいいずれの位置に存在していてもよく、例えば、２−チエニル残基または２−フリル残基においては、３位、および／または、４位、および／または、５位に存在でき、３−チエニル残基または３−フリル残基においては、２位、および／または、４位、および／または、５位に存在でき、２−ピリジル残基においては、３位、および／または、４位、および／または、５位、および／または、６位に存在でき、３−ピリジル残基においては、２位、および／または、４位、および／または、５位、および／または、６位に存在でき、４−ピリジル残基においては、２位、および／または、３位、および／または、５位、および／または、６位に存在できる。また、適切な含窒素複素環は、Ｎ酸化物、または、製薬上許容できる酸から誘導された対イオンを含む第四級塩として存在していてもよい。例えば、ピリジル残基は、ピリジン−Ｎ酸化物として存在できる。
【００２０】
本発明は、式Ｉで示される化合物の全ての立体異性体を含む。式Ｉで示される化合物に存在する不斉中心は、いずれも互いに独立して、Ｓ配置またはＲ配置を取ることができる。本発明は、可能性のある全ての鏡像異性体、および、ジアステレオ異性体、ならびに、２種またはそれ以上の立体異性体のあらゆる配合比の混合物、例えば、鏡像異性体および／またはジアステレオ異性体の混合物を含む。従って、本発明に従って用いられる鏡像異性体として存在できる化合物は、鏡像異性的に純粋な形態（左旋性の対掌体としてでもよいし、右旋性の対掌体としてでもよい）、ラセミ化合物の形態、および、２種の鏡像異性体のあらゆる配合比の混合物の形態で存在できる。シス／トランス異性の場合、本発明は、シス型とトランス型の両方、同様に、これらの型のあらゆる配合比の混合物を含む。これら全ての型は、本発明に含まれる。個々の立体異性体の製造は、必要に応じて、一般的な方法によって、例えばクロマトグラフィー、または、結晶化によって、立体化学的に均一の出発原料を合成に使用することによって、または、立体選択的な合成によって混合物を分離することによって行うことができる。場合により、立体異性体の分離の前に、誘導体化を行ってもよい。立体異性体の混合物の分離は、式Ｉで示される化合物の段階で行ってもよいし、または、合成の最中に中間体の段階で行ってもよい。本発明はまた、式Ｉで示される化合物の全ての互変異性型も含む。
【００２１】
式Ｉで示される化合物が、１またはそれ以上の酸性または塩基性基を含む場合、本発明はまた、それらに対応する製薬的または毒物学的に許容できる塩、特に、それらの製薬的に利用可能な塩も含む。従って、式Ｉで示される、酸性基を含む化合物は、これらの基に存在させることができ、本発明に従って、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、または、アンモニウム塩として用いることができる。このような塩のより具体的な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、または、アンモニアまたは有機アミンとの塩、例えばエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、または、アミノ酸が挙げられる。式Ｉで示される、１個またはそれ以上の塩基性基（すなわちプロトン化することができる基）を含む化合物が存在してもよく、本発明に従って、無機または有機酸との付加塩の形態で用いることができる。適切な酸の例としては、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、および当業者既知のその他の酸が挙げられる。式Ｉで示される化合物が同時に、分子内に酸性の基と塩基性の基を含む場合、本発明はまた、上述の塩の形態に加えて、分子内塩またはベタイン（両性イオン）も含む。それぞれの塩は、式Ｉで示される化合物から当業者既知の一般的な方法によって得ることができ、例えば、溶媒または分散剤中で、それらと有機または無機酸または塩基とを接触させることによって、または、その他の塩との陰イオン交換または陽イオン交換によって得ることができる。
【００２２】
本発明はさらに、式Ｉで示される化合物の溶媒化合物、例えば、水和物またはアルコールの付加物の使用、および、式Ｉで示される化合物の活性代謝産物、および、式Ｉで示される化合物の誘導体およびプロドラッグ（生理学的に許容でき、切断可能な基を含む）、例えばエステル、アミド、および、式Ｉに示されたＮ−Ｈ基が、Ｎ−アルキル基（例えばＮ−メチル）、または、Ｎ−アシル基（例えばＮ−アセチルまたはＮ−アルギニル（ａｒｇｉｎｉｎｙｌ））で置き換えられている化合物、例えば、Ｎ−アシル基に存在する官能基で形成された製薬上許容できる塩（ただし、幹細胞および前駆細胞のエクスビボでの処理に適した条件下で本発明に従って用いられる場合、望ましい活性を示すという条件で）の使用を含む。
【００２３】
特に好ましくは、式Ｉで示される化合物が本発明に従って用いられ、ここにおいて、そこに含まれる１個またはそれ以上の可変部分が以下に示す好ましい意味を有し、好ましい意味の全ての組み合わせが本発明の目的に含まれる。全ての好ましい式Ｉで示される化合物に関して、本発明はまた、全ての立体異性体およびそれらのあらゆる配合比の混合物、および、それらの製薬上許容できる塩の使用も含む。
【００２４】
ｎ、すなわちポリメチレン鎖（ＣＨ2）nにおけるすなわちＣＨ2基の数は、好ましくは、１または３である。本発明の一実施形態において、ｎが１の式Ｉで示される化合物、すなわち式Ｒ−ＣＯＯＨで示される酸のインダン−２−イルアミドが用いられる。その他の本発明の実施形態において、ｎが３の式Ｉで示される化合物、すなわち、式Ｒ−ＣＯＯＨで示される酸の６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプタン−６−イルが用いられる。
【００２５】
Ｒは、好ましくは、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、４−ブロモフェニル、４−（Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ）フェニル、４−トリフルオロメトキシフェニル、２−ブロモ−４−フルオロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニル、３，４−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、４−クロロ−２−メチルフェニル、２−ヒドロキシ−４−メチルフェニル、２−ヒドロキシ−４−エトキシフェニル、２−メトキシ−４−メチルフェニル、４−フェノキシフェニル、３−フルオロ−４−メチルフェニル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル、１−（４−クロロフェニル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル、１−（４−フルオロフェニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−５−イル、１Ｈ−インドール−４−イル、１Ｈ−インドール−６−イル、１−イソプロピル−２−トリフルオロメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル、１−メチル−３−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−キノキサリン−６−イル、１−フェニル−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル、２−（２−ヒドロキシピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル、２−（４−シアノフェニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル、２，４−ジメチルオキサゾール−５−イル、２，４−ジメチルピリミジン−５−イル、２，４−ジメチルチアゾール−５−イル、２，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル、２，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−イル、２，５−ジメチル−１−ピリジン−４−イルメチル−１Ｈ−ピロリル、２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル、２，６−ジクロロピリド−３−イル、２，６−ジメトキシピリド−３−イル、２，６−ジメチルピリド−３−イル、２−アミノ−４，６−ジメチルピリド−３−イル、２−アミノ−６−クロロピリド−３−イル、２−アミノ−ピリド−３−イル、２−クロロ−６−メチルピリド−３−イル、２−クロロピリド−４−イル、２−シクロプロピル−４−メチル−チアゾール−５−イル、２−ジメチルアミノ−４−メチル−チアゾール−５−イル、２−ジメチルアミノピリド−４−イル、２−エチル−５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル、２−ヒドロキシ−６−メチルピリド−３−イル、２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル、２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル、２−メチルピリド−３−イル、２−メチル−６−トリフルオロメチルピリド−３−イル、２−メチルチアゾール−５−イル、２−（モルホリン−４−イル）ピリジン−４−イル、２−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−５−イル、２−（ピロリジン−１−イル）ピリジン−４−イル、３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル、３−アミノ−５，６−ジメチルピラジン−２−イル、３−アミノ−５−メチルピラジン−２−イル、３−アミノピラジン−２−イル、３−ジメチルアミノ−４−メチルフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル、１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−���ル、３−メタンスルホニルアミノ−２−メチルフェニル、３−メタンスルホニルアミノフェニル、３−メチル−イソオキサゾール−４−イル、３−（モルホリン−４−イル）フェニル、３−（ピペリジン−１−イル）フェニル、３−（ピロリジン−１−イル）フェニル、４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）フェニル、４，６−ジメチルピリド−３−イル、４−アミノ−２−エチルスルファニルピリミジン−５−イル、４−アミノ−２−メチルピリミジン−５−イル、４−クロロ−３−メタンスルホニルアミノ−フェニル、４−クロロ−３−スフファモイルフェニル、４−メチル−３−メチルアミノフェニル、４−メチルチアゾール−５−イル、ピリド−２−イル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−３−イル、５−アミノ−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル、５−メタンスルホニル−２−メチルフェニル、５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル、５−メチルイソオキサゾール−３−イル、５−メチルピリド−３−イル、５−メチルピラジン−２−イル、６−クロロピリド−３−イル、６−シアノピリド−３−イル、６−ジメチルアミノピリド−３−イル、６−エチニルピリド−３−イル、６−メトキシメチルピリド−３−イル、６−メトキシピリド−３−イル、６−メチル−２−メチルアミノピリド−３−イル、６−メチルアミノピラジン−２−イル、６−メチルピリド−３−イル、６−（モルホリン−４−イル）ピリド−３−イル、６−（ピロリジン−１−イル）ピリド−３−イル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル、６−トリフルオロメチルピリド−３−イル、および、ピリミジン−４−イルから選択される。
【００２６】
ヘテロアリールは、好ましくは、１、２または３個の、より好ましくは  １または２個の、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される同一または異なるヘテロ原子を含む、５員環〜１０員環の、芳香族の、単環式または二環式の複素環である。ヘテロアリールは、最も好ましくは、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、キナゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、および、インダゾリルからなる群より選択される。
【００２７】
Ｈｅｔａｒ基は、好ましくは、１、２または３個の、より好ましくは１または２個のＮ、ＯおよびＳからなる群より選択される同一または異なるヘテロ原子を含む、５員環〜１０員環の、芳香族の、単環式または二環式の複素環である。Ｈｅｔａｒ基は、最も好ましくは、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、キナゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、および、インタゾリルからなる群より選択される。
【００２８】
特に好ましい本発明の実施形態において、ｎが１であり、Ｒ基がＲについて好ましいものとして上記で列挙した意味のいずれか一つを有する式Ｉの化合物が、その立体異性体のいずれかで、もしくはそれらのあらゆる配合比の混合物として、または、それらの製薬上許容できる塩として使用される。その他の特に好ましい本発明の実施形態において、ｎが３であり、Ｒ基がＲについて好ましいものとして上記で列挙した意味のいずれか一つを有する式Ｉの化合物が、その立体異性体のいずれかで、もしくはそれらのあらゆる配合比の混合物として、または、それらの製薬上許容できる塩として使用される。このような特に好ましい式Ｉで示される化合物の例は、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド、および、２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸インダン−２−イルアミドである。
【００２９】
本発明に従って用いられる化合物、具体的には、式Ｉで示される化合物およびそれらの前駆体は、文献で説明されている方法または当業者既知の類似の方法に従って合成することができる。式Ｉで示される化合物は、例えば、それぞれの式Ｒ−ＣＯＯＨで示される酸またはそれらの誘導体、およびそれぞれのアミンからアミド結合を形成することによって合成することができる。この目的を達成するために、それぞれのアミンを、例えば水、イソプロパノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、トルエンまたはジオキサンのような不活性溶媒に溶解させ、そして例えばトリエチルアミンまたは水酸化ナトリウムのような塩基の存在下で、適切なカルボン酸誘導体（例えばカルボン酸塩化物）と、例えば室温で、反応させることができる。また、式Ｉで示される化合物は、例えばジイソプロピルエチルアミンのような塩基と、適切なカップリング試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、または、ＴＯＴＵのようなカルボジイミド）の存在下で、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサンまたはジメチルホルムアミドのような不活性溶媒中で、例えば室温で、それぞれのアミンとそれぞれの酸とをカップリング反応させることにより得ることもできる。必要に応じて、得られたアシルアミンは続いて、官能化させ、さらなる化合物を得ることもできる。式Ｉで示される化合物の合成のための全ての反応そのものは、当業者周知であり、文献で説明されている手法に従って、または、それらと同様にして標準的な条件下で行うことができ、このような文献は、例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ，Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、または、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ），ニューヨークである。個別の場合の環境に応じて、式Ｉで示される化合物の合成の際に生じる副反応を防ぐために、保護基を導入することによって一時的に官能基をブロックし、合成の後の段階でそれらを脱保護すること、または、前駆体の基（例えばアミノ基の前駆体であるニトロ基）の形態で官能基を導入すること（ここにおいて、後の反応工程で、望ましい官能基に変換される）が、必要であるか、または有利であり得る。このような、個別の場合において適切な合成法および保護基および前駆体の基は、当業者既知である。必要に応じて、式Ｉで示される化合物は、一般的な精製手法、例えば再結晶またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。式Ｉで示される化合物の製造のための開始化合物は、市販のものでもよいし、または、文献の手法に従って、または、それらと同様にして製造することもできる。
【００３０】
本発明に係るｅＮＯＳ転写エンハンサーで処理される成人の幹細胞および前駆細胞の単離およびさらなる操作は、文献で説明されている標準的な方法、または、文献で説明されている方法と類似した方法に従って行うことができ、これらは  当業者周知である。用いられる細胞は、患者の骨髄から得ることができ、骨髄は、通常の吸引法によって採取されるため、骨髄の幹細胞および前駆細胞であるか、または、骨髄から誘導された幹細胞および前駆細胞であり得る。骨髄は、通常の手順によって調整されるが、この手順に、単核細胞を分離するために密度勾配遠心分離による分画化が含まれていてもよい。洗浄した後に、この細胞を通常の細胞培地に懸濁するが、この細胞培地は、例えば市販のＸ−Ｖｉｖｏ媒体（キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ），イーストラザフォード，ニュージャージー州，米国）であり、これは、血清非含有媒体であり、ヒトでの適用に適している。さらなる操作のために細胞を懸濁でき、実験的な調査に適したその他の細胞培地として、市販のＲＰＭＩ１６４０媒体（シグマ（Ｓｉｇｍａ），セントルイス，ミズーリ州，米国）が挙げられる。一般的に、得られた細胞懸濁液は、造血細胞の前駆細胞などを含む不均質な細胞集団からなる。得られた細胞懸濁液は、特徴付けすることができ、例えば造血および間葉幹細胞および前駆細胞集団は、一般的な抗体を用いたフローサイトメトリー解析のような標準的な技術によって同定される。このような細胞の機能的な活動は、例えば、コロニー形成単位分析で、または、上述したようにＶＥＧＦまたはＳＤＦ−１に応答したそれらの移動能力を決定することによって評価することができ、以下でより詳細に述べる。細胞懸濁液は、内皮の前駆細胞か、または、それに発達することができる細胞を含み、これらの細胞は、順に、内皮細胞に発達し、新生血管形成を惹起し、すなわち梗塞領域の新血管形成を促進する。骨髄のほかにも、本発明に従って用いられる前駆細胞は、例えば、患者の脂肪組織または循環する血液から類似の手法によって得ることもでき、それによりそれぞれ脂肪組識から得られた前駆細胞、または、循環する血液から得られた前駆細胞が得られる。血液から得られた細胞集団は通常、再投与の前に、エクスビボで数日間培養される。体循環に存在する内皮の前駆細胞は、骨髄細胞から誘導されるため、「骨髄から誘導された」のような用語は、患者の骨髄から得られた細胞、同様に、回収された血液から得られた細胞を意味するものとして適切に用いることができる。
【００３１】
虚血性心疾患を有する患者由来の幹細胞および前駆細胞の損なわれた機能的な活動およびホーミング能を改善し、従ってそれらの再投与後の新血管形成を改善するための、該細胞の懸濁液のエクスビボでの処理は、細胞培養に関する標準的な条件下で行うことができる。懸濁液（適切な媒体（例えばＸ−Ｖｉｖｏ）、例えば、完全な処方であって、さらなる物質の添加を必要としない媒体中の懸濁液が可能である）中の細胞濃度は、約１０００００／ｍｌ〜約５００００００／ｍｌ、の範囲が可能であり、例えば約１００００００／ｍｌである。ｅＮＯＳ発現エンハンサーでの処理に用いられる媒体のｐＨは一般的に、細胞の操作中のｐＨとして、約６.５〜約７.５の範囲、特に、約６.８〜約７.３の範囲である。細胞懸濁液は、適切な製薬上許容できる溶媒、例えば水または有機溶媒（例えば、エタノールのようなアルコール、またはポリプロピレングリコールのようなポリグリコール、またはジメチルスルホキシド、または、このような溶媒の混合物）中のｅＮＯＳ転写エンハンサーの溶液と混合される。また、ｅＮＯＳ転写エンハンサーの溶液は、塩、緩衝物質または可溶化剤のような、製薬上許容できる助剤を含んでいてもよい。得られた混合物中でのｅＮＯＳ転写エンハンサーの濃度は一般的に、約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、特に約０.１μＭ〜約１００μＭ、例えば約１μＭ〜約１０μＭ、例えば約５μＭである。次に、この混合物を、滅菌条件下で、一般的には約３７℃の温度で、湿潤した雰囲気（例えば約５％の二酸化炭素を含む空気からなっていてもよい）でインキュベートする。インキュベート時間は、個別の環境（例えば用いるｅＮＯＳ転写エンハンサーの有効性）に依存する。一般的に、インキュベート時間は、約６時間〜約４８時間、例えば約１２時間〜約２４時間の範囲であり、例えば約１８時間である。循環する血液から得られた前駆細胞が本発明に従って用いられる場合、ｅＮＯＳ転写エンハンサーとのインキュベートは、上述の、通常このような細胞を用いて行われる培養中に行ってもよい。含まれるｅＮＯＳ転写エンハンサーは、体内で望ましい作用を与える医薬物質でもあるので、得られた混合物を調整しないで直接患者に投与できる。あるいは、処理された細胞は、まず得られた混合物から遠心分離によって分離し、例えば緩衝溶液で洗浄し、例えばＸ−Ｖｉｖｏのような媒体に再懸濁し、この懸濁液を患者に投与してもよい。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、上述の、ｅＮＯＳ転写エンハンサーでの処理によって改善された機能的な活動を有する幹細胞および／または前駆細胞を生産するための方法、すなわち、改善された機能的な活動を有する幹細胞および／または前駆細胞を製造する方法であり、本方法は、虚血性心疾患を有する患者由来の幹細胞および／または前駆細胞を、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーで処理することを含む。また、虚血性心疾患を有する患者の細胞治療において幹細胞および前駆細胞の処理に使用するための、ｅＮＯＳ転写エンハンサー、例えば式Ｉで示される化合物、および／または、それらの製薬上許容できる塩、および、場合により１種またはそれ以上の助剤、例えば塩または緩衝物質または可溶化剤を含む医薬品（または、医薬組成物もしくは医薬製剤）、同様に、このような使用のためのさらなる要素（例えば固形のｅＮＯＳ転写エンハンサーを溶解させるのに適した溶媒または媒体）および使用説明書と共に上記医薬品を含む、このような処理に使用するためのキットまたはパッケージも本発明の目的である。本医薬品は、例えば、ボトル、アンプルまたはバイアルに含まれる固形のｅＮＯＳ転写エンハンサー（これは続いて、ｅＮＯＳ転写エンハンサーを細胞懸濁液に添加する前に溶解される）、または、ｅＮＯＳ転写エンハンサーの溶液（細胞懸濁液に直接添加することができる）を含む。
【００３３】
ｅＮＯＳ転写エンハンサーでの処理後に得られた幹細胞および／または前駆細胞の懸濁液は、患者に、静脈注射または注入によって全身投与してもよいし、または、例えば心筋内注射または冠動脈内注射または注入によって、心臓または心臓に近い血管に直接投与してもよい。梗塞した心筋または冠状血管への直接投与は、外科手術の間に、または、カテーテル法を介して施すことができ、以下により詳細に概略を説明する。適切な投与法は当業界で確立されており、当業者周知である。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「虚血性心疾患」は、心筋の１またはそれ以上の領域への不十分な血液供給が発生しているかまたはすでに発生したか、または、医師により新血管形成または血管新生の回復が望まれるあらゆる心疾患を含むものとし、例えば、例えば、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、急性冠症候群、狭心症、心筋梗塞、虚血性心筋症、および、うっ血性心不全のような病気が挙げられ、後者の病気は虚血による場合がある。本発明に従って治療することができる虚血性心疾患は、急性または慢性疾患であり得る。
【実施例】
【００３５】
ｅＮＯＳ転写エンハンサーの合成
４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド
２−アミノインダン塩酸塩４３.７０ｇ（２５８ｍｍｏｌ）、および、トリエチルアミン５３.４３ｇ（５２８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン２５０ｍｌに添加し、４−フルオロベンゾイル塩化物４２.８９ｇ（２７０ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を室温で２時間撹拌した。次に、得られた混合物を氷／ＨＣｌ混合物に注ぎ、得られた沈殿をろ過し、ＮａＨＣＯ3溶液と水で洗浄し、真空中で乾燥させた。粗生成物をメタノールから結晶化した。収率：白色の結晶性生成物４７.８ｇ（７３％）。
融点：１６７℃
マススペクトル：２５６.１［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）：２.９６（ｄｄ，２Ｈ，Ｈ１／３），３.２５（ｄｄ，２Ｈ，Ｈ３／１），４.７０（６重項，１Ｈ，Ｈ２），７.１２〜７.１９（ｍ，２Ｈ，Ｈ４，７／５，６），７，２０〜７，２８（ｍ，２Ｈ，Ｈ５，６／４，７），７.３０（ｔ，２Ｈ，Ｈ３１，５１），７.９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｈ２’，６’），８.６８（ｄ，１Ｈ，ＮＨ）。
【００３６】
以下の典型的な一般的な手順Ａ、ＢおよびＣのような手法に従って、式Ｉで示されるさらなる化合物を合成した。
【００３７】
手順Ａ
１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド塩酸塩０.５ｍｍｏｌ（９６ｍｇ）、および、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０.５ｍｍｏｌ（８７μｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）２.５ｍｌに溶解させ、それぞれの酸０.５ｍｍｏｌのＤＣＭ２.５ｍｌの溶液に添加し、１０分間室温で撹拌した。次に、それぞれのアミン０.７ｍｍｏｌを添加し、一晩撹拌し続けた。次に、得られた溶液を２ＮのＨＣｌで２回、飽和ＫＨＣＯ3溶液で１回洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過した。乾燥するまで蒸発させた後に得られた残留物を、酢酸エチル／ヘキサン、または、メタノール／ジエチルエーテル混合物から結晶化するか、または、ＨＰＬＣによって精製した。
【００３８】
手順Ｂ
テトラヒドロフラン５ｍｌ中のそれぞれの酸０.７５ｍｍｏｌおよびＤＩＰＥＡ２７１μｌ（１.５７５ｍｍｏｌ）に、Ｏ−［（シアノ−エトキシカルボニル−メチレン）アミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＯＴＵ）２７１ｍｇ（０.８２５ｍｍｏｌ）（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶解した）を添加した。室温で１５分撹拌した後、ＤＭＦ１ｍｌ中の、それぞれのアミン塩酸塩０.９ｍｍｏｌと、ＤＩＰＥＡ１７２μｌ（１ｍｍｏｌ）の混合物を添加した。６時間撹拌した後に、この混合物をろ過し、蒸発させた。残留物を酢酸エチルに溶解させ、１ＮのＨＣｌ２０ｍｌと、５％炭酸水素ナトリウム溶液２０ｍｌで連続的に洗浄した。得られた有機相を蒸発させ、分取用ＨＰＬＣ（ＲＰ１８，アセトニトリル／水）によって精製した。
【００３９】
手順Ｃ
それぞれのアミン２.５ｍｍｏｌを、トリエチルアミン５５０ｍｇおよびジオキサン５ｍｌと混合し、次にそれぞれのカルボン酸塩化物２.５ｍｍｏｌを添加し、この混合物を２時間にわたり室温で撹拌した。次に、得られた混合物を、氷／ＨＣｌ混合物に注ぎ、得られた沈殿を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。このようにして得られた残留物を、分取用ＨＰＬＣによって分画した。
【００４０】
製造された化合物の例として、以下のものが挙げられる。
２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸インダン−２−イルアミド
融点：１４７.５℃
マススペクトル：３１８.２［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）：２.９１〜２.９９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１／Ｈ−３），３.２２〜３.３０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３／Ｈ−１），４.６９（６重項，１Ｈ，Ｈ−２），７.１３〜７.１９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−７またはＨ−５，Ｈ−６），７.２１〜７.２８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−７またはＨ−５，Ｈ−６），７.５０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６’／Ｈ７’），７.８０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７’／Ｈ６），７.８８（ｓ，１Ｈ，Ｈ４’），８.７１（ｄ，１Ｈ，ＮＨ）。
【００４１】
ｅＮＯＳ転写活性化の測定
ｅＮＯＳ転写の活性化を、Ｌｉ等，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８年，５３：６３０〜６３７に詳細に説明されているようにして測定した。簡単に言えば、ｅＮＯＳ遺伝子の開始コドンの５’にある３.５ｋＢの長いフラグメントをクローニングし、配列解析し、ホタルルシフェラーゼ発現プラスミドにクローニングし、レポーター遺伝子活性によってｅＮＯＳプロモーターの活性化をモニターした。このプロモーター−レポーター構築物が安定してトランスフェクションされ、かつそれらを発現するヒト内皮細胞系を、化合物試験に用いた。細胞を、化合物と１８時間インキュベートした。全ての化合物は、予め滅菌ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。完全培地中のＤＭＳＯの最終濃度を、０.５％とした。これらの細胞におけるレポーター遺伝子発現の誘導を、標準的なルシフェラーゼ分析システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州，米国；カタログ番号Ｅ１５０）を製造元の説明書に従って用いて測定した。化合物とインキュベートされた細胞におけるルシフェラーゼ誘導を、溶媒のみとインキュベートされた細胞における誘導と比較した。両方の活性の比率（転写誘導比（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ），ＴＩＲ）を、化合物濃度の関数としてプロットした。典型的には、ＴＩＲ値は、比１の低い濃度で始まり、このとき化合物の作用は示されないが、最大ＴＩＲ値、ＴＩＲ（ｍａｘ）までくると、ｅＮＯＳ転写の増加が示される。化合物濃度の関数としての転写誘導比のＥＣ50値を、図を用いて決定した。
【００４２】
骨髄細胞の単離
年齢１８〜７５歳の、総計９人の健康なコントロールと、２５人の慢性的に冠動脈心疾患に罹っており心筋梗塞歴がある患者から、骨髄穿刺液を回収した。患者は、局所壁運動異常、開存しているもともとの血管（ｐａｔｅｎｔ  ｎａｔｉｖｅ  ｖｅｓｓｅｌ）、冠状動脈バイパス移植片、または、側副動脈を有する必要があった。心筋虚血は、骨髄から得られた前駆細胞を移動させることがわかっているため、過去４週間に誘導型または安静時心筋虚血の徴候を示した患者を除外した。さらなる排除基準は、進行性または慢性の感染の存在、過去２ヶ月以内の手術または外傷、悪性の病気の証拠、進行性の胃腸出血、１６０／１００ｍｍＨｇを超える制御不能な高血圧、過去２年間以内の発作（ｓｔｒｏｋｅ）、ＡＶ動脈瘤、腎不全または肝不全、血小板減少症（血小板数＜１０００００／μｌ）、貧血（ヘモグロビン＜８.５ｇ／ｄｌ）、知的障害、その他の臨床試験での登録、または、参加への不本意性とした。また、妊娠した女性および閉経前の女性も除外した。ホスピタル・オブ・ヨハン・ヴォルフガング・ゲーテ・ユニバーシティ・オブ・フランクフルト（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｊｏｈａｎｎ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｇｏｅｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，ドイツ）の倫理審査委員会によりこのプロトコールは認可され、ヘルシンキ宣言に従って本研究が行われた。それぞれの患者から、書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【００４３】
それぞれの参加者から、総計で５０ｍｌの骨髄穿刺液を得た。骨髄幹細胞および前駆細胞を密度勾配遠心分離によって単離した。２回の洗浄工程の後に、細胞を、Ｘ−ｖｉｖｏ１０培地（ゲンタマイシンおよびフェノールレッド非含有；キャンブレックス，イーストラザフォード，ニュージャージー州，米国）１０ｍｌに再懸濁した。この細胞懸濁液は、造血細胞の前駆細胞などを含む不均質な細胞集団からなる。
【００４４】
骨髄幹細胞と前駆細胞を、フローサイトメトリーによって解析した。造血細胞および間葉細胞の幹細胞および前駆細胞集団を同定するために、ヒトＣＤ４５（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），フランクリン・レイクス、ニュージャージー州，米国）、ＣＤ３４（ＦＩＴＣ標識；ＢＤファーミンジェン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ），サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）、ＣＤ１３３（ＡＰＣ標識；ＢＤファーミンジェン）、ＣＤ１４（ＦＩＴＣ標識；ＢＤファーミンジェン）、ＣＸＣＲ４（ＡＰＣ標識；ＢＤファーミンジェン）、および、ＣＤ４９ｄ（ＡＰＣ標識；ＢＤファーミンジェン）に対して向けられた標識抗体を直接用いた。この系のパネルを、ＢＤファーミンジェンから得て（ＦＩＴＣ標識ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、および、ＣＤ５６を含む）、さらにＣＤ１５およびグリコホリンＡ（いずれもＢＤファーミンジェン製）に対して向けられたＦＩＴＣ標識抗体を直接用いることによって完成させた。
【００４５】
ｅＮＯＳ転写エンハンサーを用いた骨髄細胞の処理
ｅＮＯＳ転写エンハンサー４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミドとインキュベートするために、Ｘ−Ｖｉｖｏ１０細胞培地１ｍｌ中の、１００００００個の幹細胞および前駆細胞の懸濁液１ｍｌを、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミドのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１μｌ（ＤＭＳＯ１ｍｌ中に４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド１.２７５ｍｇを溶解させることによって製造された）と混合した。得られた混合物中の４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミドの濃度は、５μＭであった。ｅＮＯＳ転写エンハンサーである４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド、および、ｅＮＯＳ阻害剤ＮG−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）とインキュベートするために、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミドに加えて、Ｌ−ＮＭＭＡ（シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を、細胞懸濁液に添加し、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミドの濃度が５μＭであり、Ｌ−ＮＭＭＡ濃度が１ｍＭの混合物が得られた。５％二酸化炭素を含む空気の雰囲気下で、３７℃の温度で１８時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって単離し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｘ−Ｖｉｖｏ１０に懸濁した。
【００４６】
骨髄細胞の機能的な活動の測定
コロニー形成活性を評価するために、骨髄幹細胞および前駆細胞（１×１０5／培養皿）を、メチルセルロースプレート（幹細胞因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−３、インターロイキン−６を含む、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４５３５；セルシステム（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ），Ｓｔ．Ｋａｔｈａｒｉｎｅｎ，ドイツ）に撒いた。１４日間インキュベートした後に、プレートを位相差顕微鏡で観察し、コロニー形成単位−顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ；コロニー＞５０細胞）をカウントした。
【００４７】
骨髄幹細胞および前駆細胞の移動能力を評価するために、総計で１×１０6個の骨髄幹細胞および前駆細胞を、Ｘ−Ｖｉｖｏ１０（２５０μｌ）に懸濁し、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（バイオコート・インバージョン・アッセイ（ＢｉｏＣｏａｔ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ），孔径８μｍ，ベクトン・ディッキンソン・ラボウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ），ツーオークパーク（Ｔｗｏ  Ｏａｋ  Ｐａｒｋ），ベッドフォード，マサチューセッツ州，米国）を充填した改良型ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーの上部チャンバーに置いた。次に、このチャンバーを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、または、１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１のいずれかが追加された内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ）５００μｌを含む２４ウェル培養皿に置いた。３７℃で２４時間インキュベートした後に、移動した細胞をカウントした。
【００４８】
インビボの後肢虚血マウスモデル
体重１８〜２２ｇの８〜１０週齢の無胸腺ＮＭＲＩヌードマウス（ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、バーハーバー，メイン州，米国）の使用によって、後肢虚血のマウスモデルで骨髄幹細胞および前駆細胞の新血管形成能力を調査した。浅枝および深枝を含む大腿動脈近位部分、同様に、伏在動脈の遠位部分を、７−０シルク縫合糸で結紮した。電気コアグレーターを用いて、結紮間の全ての動脈の枝を取り除いた。３個の外科用ステープルを用いて、上を覆っている皮膚を閉じた。２４時間後に、骨髄幹細胞および前駆細胞のＸ−Ｖｉｖｏ１０懸濁液を、静脈注射した（５×１０4、５×１０5、または、５×１０6細胞／マウス；ｎ＝５／グループ）。２週間後に、肢の潅流を決定した。具体的には、レーザードップラー血流メーター（Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＭｏｏｒＬＤＩ−Ｍａｒｋ２，ムーア・インスツルメンツ（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），ウィルミントン，デラウェア州，米国）を用いて、虚血性の肢（右）／正常な肢（左）の血流比を測定した。スキャンを開始する前に、マウスを３７℃の加熱プレートに置き、温度の変動を最小化した。レーザードップラーカラーイメージを２回記録した後、着色されたヒストグラムの画素数に基づき虚血性および非虚血性の肢の平均潅流を計算した。周辺の光や温度などの変動を最小化するために、計算された潅流は、非虚血性の肢の潅流に対する虚血性の肢の潅流の比で示した。
【００４９】
組織学的な評価のために、虚血性および非虚血性の肢から採取された内転筋と半膜様筋の５μｍの凍結標本で、組織の血管新生を決定した。内皮細胞を、ＣＤ１４６に対して向けられたＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ），テメキュラ，カリフォルニア州，米国）で染色した。毛細管密度は、毛細血管数／筋細胞で示された。ヒト骨髄幹細胞および前駆細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ標識抗体（ＢＤファーミンジェン，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）、および、ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ標識抗体で共染色することによって同定した。
【００５０】
患者への骨髄細胞の投与
患者へのｅＮＯＳ転写エンハンサーで処理した骨髄細胞の投与は、前駆細胞を移植するための以下のカテーテル法によって行うことができた。特大の（０.５ｍｍ）オーバー・ザ・ワイヤー（ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｗｉｒｅ）バルーンカテーテルを、予め埋め込まれたステントに侵入させた。内皮を通じて注入された細胞の付着と起こり得る遊出を可能にするために、バルーンを低圧で膨らませ、血流を３分間完全にブロックし、その間に、閉塞したバルーンの遠位に前駆細胞懸濁液３.３ｍｌをバルーンカテーテルの中心ポートを介して注入した。この手順を３回繰り返して、総計１０ｍｌの前駆細胞懸濁液の注入を完了させた（その際、バルーンをしぼませて３分再流させることによって中断し、大規模な虚血を最小化した）。冠動脈内の細胞移植が完了した後、冠動脈造影を繰り返し、血管の開存と造影剤のスムーズな流れを確認した。
【００５１】
統計的分析を標準的な方法によって行った。特に他の指定がない限り、継続的な可変値の結果は、平均±標準偏差で示した。２より多いサブグループを用いた実験のｔ検定（両側）またはＡＮＯＶＡによって、グループ間の比較を解析した。多重範囲検定（Ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）、および、ペアごとの多重比較を、ボンフェローニ補正を用いたｔ検定（両側）で行った。ピアソンχ2検定によって、カテゴリーごとの可変値比較を作製した。インビトロでの骨髄幹細胞および前駆細胞の特徴のブラインド評価の後に、試験結果とインビボでの研究結果とを統合した。インビトロでの骨髄幹細胞および前駆細胞のインビボでの新血管形成能力に関する決定基を同定するために、多変量の線形回帰分析を行った。Ｐ値＜０.０５を統計学的に有意とみなした。全ての解析は、ＳＰＳＳ１１.５（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，シカゴ，イリノイ州，ＵＳＡ）で行われた。
【００５２】
以下の結果が得られた。
【００５３】
ｅＮＯＳ転写の活性化の測定
本化合物の４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミドは、ｅＮＯＳ転写の活性化に関するルシフェラーゼ分析で、０.８μＭのＥＣ50値を示し、４.１０のＴＩＲ（ｍａｘ）値を示した。
本化合物の２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸インダン−２−イルアミドは、ｅＮＯＳ転写の活性化に関するルシフェラーゼ分析で、０.１４μＭのＥＣ50値を示し、２.７のＴＩＲ（ｍａｘ）値を示した。
【００５４】
骨髄細胞の機能的な活動の測定
上記患者からの骨髄幹細胞および前駆細胞のコロニー形成活性は、３７.３±２５.０ＣＦＵ−ＧＭ／培養皿であり、それに対して、健康なコントロールからの細胞では、１１３.８±７０.４ＣＦＵ−ＧＭ／培養皿であった（Ｐ＝０.００９）。
上記患者からの骨髄幹細胞および前駆細胞のＶＥＧＦに対する移動反応は、移動した細胞が３４.０±２４.２×１０００個であり、それに対して、健康なコントロールからの細胞では、移動した細胞は５４.８±２９.３×１０００個であった（Ｐ＝０.０２７）。
上記患者からの骨髄幹細胞および前駆細胞のＳＤＦ−１に対する移動反応は、移動した細胞が４６.３±２６.２×１０００個であり、それに対して、健康なコントロールからの細胞では、移動した細胞は１０８.６±４０.４×１０００個であった（Ｐ＜０.００１）。
ＰＢＳで１８時間処理した後の健康なコントロールからの骨髄幹細胞および前駆細胞のＳＤＦ−１に対する移動反応は、移動した細胞が１２６.５.３±４１.７×１０００個であり、それに対して、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド（５μＭ）で１８時間処理した後の健康なコントロールからの細胞では、移動した細胞は１１１.２±３８.５×１０００個であった（Ｐ＜０.０１）。
ＰＢＳで１８時間処理した後の上記患者からの骨髄幹細胞および前駆細胞のＳＤＦ−１に対する移動反応は、移動した細胞が３８.０±１３.７×１０００個であり、それに対して、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド（５μＭ）で１８時間処理した後の上記患者からの細胞では、移動した細胞は７４.０±２０.７×１０００個であった（Ｐ＜０.０１）。
４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド（５μＭ）とＮG−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）（１ｍＭ）で１８時間処理した後の上記患者からの骨髄幹細胞および前駆細胞のＳＤＦ−１に対する移動反応は、移動した細胞が２３.９±７.４×１０００個であり、それに対して、４−フルオロ−（Ｎ−インダン−２−イル）ベンズアミド（５μＭ）で１８時間処理した後の健康なコントロールからの細胞では、移動した細胞は７４.３±２１.５×１０００個であった（Ｐ＜０.０１）。
【００５５】
インビボでの後肢虚血マウスモデル
細胞濃度５×１０5細胞／マウス（この濃度で、健康なコントロールからの骨髄幹細胞および前駆細胞を用いた最大の治療効果が達成される）で、幹細胞および前駆細胞の作用の比較を行った。
様々な試験グループにおいて、指定した通りに骨髄幹細胞および前駆細胞を投与した後の、以下に示すレーザードップラーから得られた相対的な血流値（虚血性の肢（右）／正常な肢（左）の血流比（パーセント））が決定された。
【００５６】
【表１】
2007509873.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月31日(2005.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性心疾患の患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞をエクスビボで処理するための医薬品を製造するための、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーの使用。
【請求項２】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーは、式Ｉ：
【化１】
2007509873.tif 000005
で示される化合物、その立体異性体もしくはそれらのいずれかの配合比の混合物、または、それらの製薬上許容できる塩である請求項１に記載の使用。
式中、ｎは、１、２または３であり；
Ｒは、フェニルまたはＨｅｔａｒ基であり、これらはいずれも、非置換であるか、または、Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｃ1〜Ｃ3−アルキル；Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシメチル；２−アミノ−３，３，３−トリフルオロプロピル−；ＣＦ3；Ｃ3〜Ｃ5−アルカンジイル；フェニル；ヘテロアリール；ベンジル；ヘテロアリール−メチル−；ＯＨ；Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ；フェノキシ；トリフルオロメトキシ；２，２，２−トリフルオロエトキシ；（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）ＣＯＯ；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）メルカプト；フェニルメルカプト；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）スルホニル；フェニルスルホニル；ＮＨ2；（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ；ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）アミノ；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＣＯＮＨ−；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＳＯ2ＮＨ−；（Ｃ1〜Ｃ3−アルキル）−ＣＯ；フェニル−ＣＯ；−ＯＣＨ2Ｏ−；−ＯＣＦ2Ｏ−；−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−；ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＣＯＮＨ2；−ＣＯＮＨ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＣＯＮ（ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル））；
ＣＮ；−ＳＯ2ＮＨ2；−ＳＯ2ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル）；−ＳＯ2Ｎ（ジ（Ｃ1〜Ｃ4−アルキル））；ピロリジニル；ピペリジニル；モルホリニル；および、チオモルホリニルからなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なる置換基を有し；ここにおいて、ヘテロアリール、フェニル、ヘテロアリールを含む基およびフェニルを含む基（これらは、場合により、該フェニルまたは該Ｈｅｔａｒ基の置換基に存在する）は全て、非置換であるか、または、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｃ1〜Ｃ3−アルキル、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ3−アルコキシ、および、ＣＦ3からなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なる置換基で置換されており；
ヘテロアリールおよびＨｅｔａｒ基は、互いに独立して、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される１、２、３または４個の同一または異なるヘテロ原子を含む、５員環〜１０員環の芳香族の単環式または二環式の複素環である。
【請求項３】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーは、４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）ベンズアミド、および、２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸インダン−２−イルアミドから選択される、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
幹細胞および／または前駆細胞は、患者の骨髄から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
幹細胞および／または前駆細胞を、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーと、６時間〜４８時間インキュベートする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
虚血性心疾患は、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、急性冠症候群、狭心症、心筋梗塞、虚血性心筋症、または、うっ血性心不全である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
処理した幹細胞および／または前駆細胞を、静脈内、冠動脈内または心筋内への注射または注入によって患者に投与する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーを用いることを含む、虚血性心疾患の患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞をエクスビボで処理するための医薬品を製造する方法。
【請求項９】
虚血性心疾患の患者由来の幹細胞および／または前駆細胞を、エクスビボで、内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーで処理することを含む、機能的な活動が改善された幹細胞および／または前駆細胞を製造する方法。
【請求項１０】
内皮型一酸化窒素合成酵素の転写エンハンサーを含む、虚血性心疾患の患者の細胞治療において、幹細胞および／または前駆細胞をエクスビボで処理するための医薬品。
【国際調査報告】
2007509873.tif 000006
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2007509873.tif 000008