(57)【要約】  抗CEACAM6抗体および抗体断片、それらをコード化する核酸、それらを製造する方法、ならびにそれらの組成物を用いて癌を治療する方法が提供される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、抗CEACAM6抗体または抗体断片の有効量を、それらを必要とする患者に対して投与することを含む方法。
【請求項２】
抗体または抗体断片がヒト化されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗体または抗体断片がキメラである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
抗体または抗体断片がScFvである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ScFvがマウス型またはヒト化されている、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が上皮性または骨髄起源である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
請求項1に記載の方法であって、前記癌が消化管の癌、肺癌、乳癌、白血病、子宮頚癌、子宮体癌、卵巣癌、脳の癌、前立腺癌、肝臓癌、および腎臓癌からなる群より選択される少なくとも1の癌である方法。
【請求項８】
請求項1に記載の方法であって、前記癌が結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および急性骨髄性白血病からなる群より選択される少なくとも1の癌である方法。
【請求項９】
患者がヒトまたは非ヒト動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
患者がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1に記載の方法であって、抗体または抗体断片が非経口的に、腹腔内、静脈内もしくは皮下に、経口的に、鼻腔に、吸入で、または直腸に投与される方法。
【請求項１２】
請求項1に記載の方法であって、抗体または抗体断片が5 mg/m2から2000 mg/m2の投与量で静脈内に投与される方法。
【請求項１３】
CEACAM6を発現している細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を抗CEACAM6抗体または抗体断片の有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
前記細胞が癌細胞である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト化されたマウス型抗CEACAM6抗体または抗体断片。
【請求項１６】
モノクローナル抗体13.1のCDRを含んでなる、請求項15に記載の抗体。
【請求項１７】
PEGで修飾された、請求項15に記載の抗体。
【請求項１８】
抗CEACAM6 ScFv。
【請求項１９】
モノクローナル抗体13.1のCDRを含んでなる、請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFv。
【請求項２０】
PEGで修飾された、請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFv。
【請求項２１】
CEACAM6に対して高い親和性を有する、抗CEACAM6抗体の断片。
【請求項２２】
モノクローナル抗体13.1のCDRを含んでなる、請求項21に記載の断片。
【請求項２３】
PEGで修飾された、請求項21に記載の断片。
【請求項２４】
請求項15に記載の抗体または抗体断片が少なくとも1の他の部分と結合した複合体。
【請求項２５】
請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFvが少なくとも1の他の部分と結合した複合体。
【請求項２６】
請求項21に記載の断片が少なくとも1の他の部分と結合した複合体。
【請求項２７】
請求項15に記載の抗体または抗体断片、および少なくとも1の医薬賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２８】
請求項27に記載の医薬組成物であって、前記賦形剤が水、pH緩衝液、湿潤剤、塩、還元剤、糖、グリセロール、グリコール、油、保存剤、および抗菌剤からなる群より選択される組成物。
【請求項２９】
請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFvおよび少なくとも1の医薬賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３０】
請求項29に記載の医薬組成物であって、前記賦形剤が水、pH緩衝液、湿潤剤、塩、還元剤、糖、グリセロール、グリコール、油、保存剤、および抗菌剤からなる群より選択される組成物。
【請求項３１】
請求項21に記載の断片および少なくとも1の医薬賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３２】
請求項31に記載の医薬組成物であって、前記賦形剤が水、pH緩衝液、湿潤剤、塩、還元剤、糖、グリセロール、グリコール、油、保存剤、および抗菌剤からなる群より選択される組成物。
【請求項３３】
請求項15に記載の抗体または抗体断片をコード化する核酸。
【請求項３４】
請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFvをコード化する核酸。
【請求項３５】
請求項21に記載の断片をコード化する核酸。
【請求項３６】
請求項15に記載の抗体または抗体断片を産生する方法であって、抗体または抗体断片をコード化する核酸で宿主細胞を形質転換すること、および宿主細胞から抗体または抗体断片を分離することを含む方法。
【請求項３７】
請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFvを製造する方法であって、請求項18に記載の抗CEACAM6 ScFvをコード化する核酸で宿主細胞を形質転換すること、および宿主細胞から抗CEACAM6 ScFvを分離することを含んでなる方法。
【請求項３８】
請求項21に記載の断片を製造する方法であって、断片をコード化する核酸で宿主細胞を形質転換すること、および宿主細胞から断片を分離することを含んでなる方法。
【請求項３９】
CEACAM6の過剰発現を診断する方法であって：
患者からの試料を抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させること；
抗体または抗体断片およびCEACAM6の間に複合体が形成されたかどうかを判定すること；および
複合体の形成を患者におけるCEACAM6の過剰発現と関連付けること、または
複合体が存在しないことを、患者においてCEACAM6の過剰発現がないことと関連付けること
を含んでなる方法。
【請求項４０】
抗体または抗体断片がモノクローナル抗体である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
抗体または抗体断片がマウス型抗体またはヒト化抗体である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
患者がヒトである、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
試料が生検試料である、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
抗体または抗体断片がヒト化されている、請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
抗体または抗体断片がキメラである、請求項39に記載の方法。
【請求項４４】
抗体または抗体断片がScFvである、請求項39に記載の方法。
【請求項４５】
ScFvがマウス型またはヒト化されている、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
CEACAM6の過剰発現が関与する癌または血液学的な悪性腫瘍を診断する方法であって：
患者からの試料を抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させること；
抗体または抗体断片およびCEACAM6の間に複合体が形成されたかどうかを判定すること；および
複合体の形成を、患者においてCEACAM6の過剰発現が関与する癌または血液学的な悪性腫瘍が存在することと関連付けること、または
複合体が存在しないことを、患者においてCEACAM6の過剰発現が関与する癌または血液学的な悪性腫瘍が存在しないことと関連付けること
を含んでなる方法。
【請求項４７】
抗体または抗体断片がモノクローナル抗体である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
抗体または抗体断片がマウス型抗体またはヒト化抗体である、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
患者がヒトである、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
試料が生検試料である、請求項46に記載の方法。
【請求項５１】
抗体または抗体断片がヒト化されている、請求項46に記載の方法。
【請求項５２】
抗体または抗体断片がキメラである、請求項46に記載の方法。
【請求項５３】
抗体または抗体断片がScFvである、請求項46に記載の方法。
【請求項５４】
ScFvがマウス型またはヒト化されている、請求項53に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、2004年3月27日に出願された米国の仮出願番号60/557,258に対する優先権を主張し、本明細書の一部として援用する。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗-CEACAM6抗体および抗体断片、それらをコード化する核酸、それらの製造方法、ならびにそれらの化合物を用いて癌を治療する方法に関する。
【０００３】
背景の説明
CEACAM6、すなわち癌胎児抗原細胞接着分子6またはCD66は、癌胎児抗原(CEA)に関するものであり、共にタンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。CEACAM6は、細胞表面癌遺伝子であり、同種親和性および異種親和性相互作用が可能な免疫グロブリン様（Ig様）ドメインで構成される(Beauchemin N, et. al., Exp Cell Res. 252(2): 243-9, 1999; Kuroki, et. al. J Leukoc Biol. 70(4): 543-50, 2001)。それは、3つのIg様C2ドメインを含み、短いC-末端の細胞質側末端を有する、320のアミノ酸長さの細胞表面GPI結合型糖タンパク質である。正常なヒト組織におけるCEACAM6の発現プロフィールは、種々の上皮組織および骨髄性細胞において中程度の発現を示す。しかしながら、CEAおよびCEACAM6の調節が解除された細胞表面の発現は、約50％のヒトの癌において認められる(25)。CEACAM6のヒト組織での発現の免疫組織化学的な研究は、正常な結腸直腸の粘膜と比較した場合、増殖性ポリープおよび腺腫の増殖細胞において激しい染色を示した(26)。これらの知見は、結腸直腸癌を引き起こす、結腸上皮細胞における最も早期の分子現象の一部を示す。しかしながら、CEACAM6の調節が解除された細胞表面での発現は、結腸直腸癌および膵臓癌を含むヒトの癌の50％以内で認められる。さらに、調節が解除されたCEACAM6の過剰発現は、それらの細胞外マトリックス(ECM)に対する固着部が取り除かれた場合、細胞の分化およびアポトーシスを阻止することが示されるが(Ordonez, et. al, Cancer Research, 60, 3419-3424, 2000)、これはアノイキス(anoikis)として既知のプロセスであり、癌化を伴い、CEACAM6を癌遺伝子として強く暗示する。
【０００４】
固形のおよび血液学的な悪性腫瘍を含むヒトの疾患の治療を目的とした、治療的なモノクローナル抗体（非複合体または複合体）の利用は、十分に確証および確立されている。キメラまたはヒト化のモノクローナル抗体は、それらの減少した免疫学的副作用のため、治療的な適用に対して特に有用である。このアプローチの有効性および効力は、進行段階の疾患を有する患者において完全な反応が認められる、非ホジキンリンパ腫（リツキサンを用いてCD20抗原をターゲッティングする）および乳癌（ハーセプチンを用いてHer-2/Neuをターゲッティングする）に対して確認されている。
【０００５】
それ故、CEACAM6のような上方制御された癌遺伝子を特異的にターゲッティングする、新規の治療に対する緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、CEACAM6に対する高親和性の抗体および抗体断片を提供する。ここで用いられる場合、抗体という用語は、全長、つまり当該分野において認識される完全な抗体を意味する。本明細書の文脈における断片という用語は、高い親和性および特異性でCEACAM6に結合する能力が残っている抗体の一部を意味する。抗体断片は、本来の全ドメイン構造由来のドメインがいくつ含まれるか、および／または除外されているかに基づいて定義される。それ故、断片は可変重鎖(VH)または可変軽鎖(VL)または単鎖Fv (VH-VL)またはFab(VL-CL-VH-CH1)またはFab2(VL-CL-VH-CH1)2 、あるいは新規の小分子、PEG、もしくは他のタンパク質ドメイン、または標識化剤（蛍光色素）に結合した上記のいずれもを意味し得る。このような断片の好ましい例は、単鎖抗体可変領域断片(ScFv)である。この用語はここで用いられる場合、逆の記述がない限り、一般的に、完全な抗体分子または断片を指す。
【０００７】
これらの抗体は、好ましくはヒト化もしくはキメラもしくはScFv（マウス型またはヒト化）の抗体または断片である。本発明の抗体および断片は、さらに、治療的使用を目的とした医薬製剤として提供される。本発明はさらに、ヒト化CEACAM6抗体をコード化する組み換えDNA分子、および組み換えで抗体を産生または製造するための発現システムを提供する。
【０００８】
本発明の抗CEACAM6抗体は、癌のようにCEACAM6が過剰発現している状態の治療に有用である。抗体依存性細胞障害活性(ADCC)および補体依存性障害活性(CDC)によってアポトーシスおよび細胞の死滅を誘発するために、前記抗体は、細胞表面において特に高い親和性相互作用を通して作用する。1つの実施形態において、本出願人は、CEACAM6を標的にするヒト化モノクローナル抗体を開発した。本出願人は、ここで述べられている細胞死滅試験法において、高親和性の抗CEACAM6抗体の有効性および効力を示す。さらなる実施形態として、本出願人は、大腸菌中で発現されたヒト化抗体を開発するために、デザインアルゴリズムに基づく構造を利用する。
【０００９】
本発明は、抗CEACAM6抗体の有効量を投与する治療的方法であって、癌、特に上皮または骨髄起源の癌のように、CEACAM6が過剰発現する疾患を被っている患者に対して投与する方法を提供する。CEACAM6が過剰発現する癌には、結腸直腸の癌、膵臓癌、胃癌等を含む消化管の癌；肺癌、乳癌、急性骨髄性白血病を含む白血病；子宮頸癌、子宮体癌、および卵巣癌のような女性の生殖性の癌；脳、前立腺、肝臓、腎臓腫瘍のような他の上皮癌が含まれる。出願人は、既知のマウス型抗CEACAM6モノクローナル抗体13.1が、組織培養において膵臓癌細胞のアポトーシスを促進し、治療的な適用に用いられ得ることを発見した。
【００１０】
それ故、本発明は、癌を治療する方法であって、抗CEACAM6抗体または抗体断片の有効量を、それらを必要とする患者に対して投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はヒト化される。
【００１２】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はキメラである。
【００１３】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はScFvである。
【００１４】
もう1つの実施形態において、ScFvはマウス型であるかまたはヒト化される。
【００１５】
本発明のもう1つの実施形態において、癌は、上皮性または骨髄起源である。
【００１６】
1つの実施形態において、癌は、消化管の癌、肺癌、乳癌、白血病、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、脳の癌、前立腺癌、肝臓癌、および腎臓癌からなる群より選択される少なくとも1つの癌である。
【００１７】
さらにもう1つの実施形態において、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および急性骨髄性白血病であってよい。
【００１８】
もう1つの実施形態において、患者はヒトまたは非ヒト動物である。
【００１９】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片は、非経口的に、腹腔内、静脈内、もしくは皮下に、経口的に、鼻腔に、吸入で、または直腸に投与される。
【００２０】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片は、5 mg/m2 から 2000 mg/m2の投与量で静脈内に投与される。
【００２１】
本発明はまた、CEACAM6を発現する細胞におけるアポトーシスを誘発する方法であって、細胞を有効量の抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させることを含んでなる方法を提供する。好ましい実施形態は、上記で述べた通りである。もう1つの実施形態において、前記細胞は癌細胞である。
【００２２】
本発明はまた、ヒト化されたマウス型抗CEACAM6抗体または抗体断片を提供する。好ましい実施形態において、抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体13.1のCDRを含む。もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はPEGで修飾される。
【００２３】
本発明はまた、抗CEACAM6 ScFvを提供する。好ましい実施形態において、ScFvはモノクローナル抗体13.1のCDRを含む。もう1つの実施形態において、ScFvはPEGで修飾される。
【００２４】
本発明はまた、CEACAM6に対して高い親和性を有する抗CEACAM6抗体の断片を提供する。好ましい実施形態において、前記断片はモノクローナル抗体13.1のCDRを含む。もう1つの実施形態において、前記断片はPEGで修飾される。
【００２５】
本発明はまた、上記で述べた抗体または断片が少なくとも1つの他の部分に結合した複合体を提供する。
【００２６】
本発明はまた、上記で説明したような抗体または断片および少なくとも1の医薬賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明の1つの実施形態において、賦形剤は、水、pH緩衝液、湿潤剤、塩、還元剤、糖、グリセロール、グリコール、油、保存剤、および抗菌剤のうち1以上である。
【００２８】
本発明はまた、上記で述べたような抗体または断片を提供する。
【００２９】
本発明はまた、上記で述べたような抗体または断片を製造する方法であって、宿主細胞を抗体または抗体断片をコード化する核酸で形質転換すること、および宿主細胞から抗体および抗体断片を分離することを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、CEACAM6の過剰発現を診断する方法であって：
患者からの試料を抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させること；
複合体が抗体または抗体断片およびCEACAM6の間で形成されているかどうかを判定すること；ならびに
複合体の形成を、患者におけるCEACAM6の過剰発現と関連付けること、または
複合体が存在しないことを、患者におけるCEACAM6の過剰発現がないことと関連付けること
を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、CEACAM6の過剰発現に関する癌または血液学的な悪性腫瘍を診断する方法であって：
患者からの試料を抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させること；
複合体が抗体または抗体断片およびCEACAM6の間で形成されたかどうかを判定すること；ならびに
複合体の形成を、患者におけるCEACAM6の過剰発現に関する癌または血液学的な悪性腫瘍の存在と関連付けること、または
複合体が存在しないことを、患者におけるCEACAM6の過剰発現に関する癌または血液学的な悪性腫瘍が存在しないことと関連付けること
を含む方法を提供する。
【００３２】
1つの実施形態において、抗体または抗体断片はモノクローナル抗体である。
【００３３】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はマウス型抗体またはヒト化抗体である。
【００３４】
もう1つの実施形態において、患者はヒトである。
【００３５】
もう1つの実施形態において、試料は生検試料である。
【００３６】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はヒト化される。
【００３７】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はキメラである。
【００３８】
もう1つの実施形態において、抗体または抗体断片はScFvである。
【００３９】
本発明のもう1つの実施形態において、ScFvはマウス型であるかまたはヒト化される。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
本発明は、同様の要素を示すために同様の参照指示が用いられた図と組み合わせて以下の詳細な説明を読むことによってより理解されるであろう：
出願人は、CEACAM6タンパク質が、CEACAM6を過剰発現する細胞においてアポトーシスを誘導し、細胞死を引き起こすための標的であるということを発見した。アポトーシスは、ADCCおよびCDCを誘導する抗体を用いて細胞を処理することによって引き起こされる。
【００４１】
本発明のヒト化抗体は、2つの全長可変重鎖および2つの全長可変軽鎖を含む完全な免疫グロブリン、例えばIgG、IgA、IgM、IgE、およびIgD、ならびにCEACAM6を過剰発現している細胞においてアポトーシスを誘発するサブ配列を含んでなる。特定のサブ配列には、例えば、ScFv、Fab、Fab’、または(Fab)2断片のような単鎖が含まれる。
【００４２】
癌性細胞のような一定の細胞におけるCEACAM6の過剰発現は、治療上の標的を提供することが発見された。高親和性の抗体によるこの標的の認識および結合は、常軌を逸脱した細胞のアポトーシスまたはプログラム細胞死をもたらす。CEACAM6に結合するおよびアポトーシスをもたらすモノクローナル抗体は、KohlerおよびMillsteinによって最初に述べられたように (Kohler et al., 1975, Nature, 265:495-497.1, 本明細書の一部として援用する)、当該分野において既知の方法により作られてよい。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、一度重要な選択基準を決定すれば、種々の方法で作られてよい。
【００４３】
ヒト化（再形成または相補性決定領域CDR移植とも呼ばれる）は、現在、異種の出所由来のモノクローナル抗体(Mab)の免疫原性を減少させるため、およびヒトの免疫系におけるそれらの活性を改善するための確立した技術である。分子生物学の技術を用いて操作されたMabを産生する方法は相対的に簡単であるが、ヒトのフレームワークへのげっ歯類のCDRの単純な移植は、元のMabの結合親和性および特異性を常に再構成するわけではない。抗体をヒト化するために、設計は元の分子の機能を再現する重要なステップである。この設計には、種々の選択または選定基準が含まれる：CDRの存在、用いられるヒトのフレームワーク、およびげっ歯類のMabに由来する残基のヒトのフレームワーク領域への置換（逆突然変異）である。このような逆突然変異の位置は、配列／構造分析によって、または可変領域3次元構造の相同性モデルの分析によって、主に同定される。選択された位置においてアミノ酸を変えるために、ファージライブラリを用いることができる。同様に、げっ歯類のCDRを移植するのに最も適したヒトのフレームワークを選択するために、多くのアプローチが用いられる。1つの方法では、げっ歯類のMabに対する配列同一性に関係なく、よく特徴付けられたヒトMabの限られた部分集合（多くの場合その配列は入手可能である）を用いてよい（固定されたフレームワークアプローチと呼ばれる）。ある方法は、げっ歯類の可変領域に対して高いアミノ酸同一性を有する可変領域を用いてよく（相同性の整合または適合度）；他の方法がコンセンサス配列または生殖系列の配列を用いてよい一方で、さらに他の方法は、それぞれいくつかの異なるヒトMab由来の軽鎖または重鎖可変領域中のフレームワーク配列の断片を選択する。ヒト化のための他のアプローチは、表面のげっ歯類の残基をヒトMabにおいて見られる最も一般的な残基で置換することである（「再表面化」または「被覆」）。
【００４４】
本発明のヒト化ScFvを作るために用いられる方法に基づくある構造は、以下に概要を記載する選択基準を提供する：
【表１】
2007530679.tif 000002
1つの実施形態において、本発明のヒト化抗体および／またはキメラ抗体には、モノクローナル抗体13-1のCDRまたはコンセンサスCDRが含まれる。モノクローナル抗体13-1の完全な配列を、以下に提供する：
マウスモノクローナル抗体13-1軽鎖（配列番号：1）：
NIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS ASGYIYMHWY QQKPGQPPKL LISLASNLESGVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDVATY YCQHSRELPL TFGAGTKLEL KRADAAPTVSIFPPSSEQLT SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMSSTLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC
マウスモノクローナル抗体13-1重鎖（配列番号：2）：
EVQXVETGGG LVRPGNSLKL SCLTSGFTFS NYRMHWLRQP PGKRLEWIAV ITVKSDNYGAKYAESVRGRF TISRDDSKSS VYLQMNRLRE EDTATYYCCR TPWVYAMDCW GQGTSVIVSSAKTTPPSVYP LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSDLYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT VPEVSSVFIFPPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE VHTAQTQPRE EQFNSTFRSVSELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKVSLTCMITDFF PEDITVEWQW NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFVYSKLNVQ KSNWEAGNTFTCSVLHEGLH NHHTEKSLSH SPGK
本明細書の一部として援用する、Akashi,S., Kato,K., Torizawa,T., Dohmae,N., Yamaguchi,H., Kamachi,M., Harada,A., Imanaka,T., Shimada,I. および Takio,K. Structural characterization of mouse monoclonal antibody 13-1 against a porphyrin derivative: identification of a disulfide bond in CDR-H3 of Mab 13-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 240 (3), 566-572 (1997)を参照されたい。
【００４５】
一度、抗体分子のDNA配列が得られると、種々の宿主中での発現を目的とした適切なベクターにおけるプロモーターに動作可能に結合してよい。このようなベクター-宿主系は、プロメガ社またはインビトロゲン社のような会社から容易に入手可能である。
【００４６】
タンパク質を作るために抗体をコード化するベクターの発現に有用な細胞は、大腸菌のような細菌、酵母のような真核細胞系、またはバキュロウイルス系を用いる昆虫細胞、またはCHO細胞のような哺乳類の細胞である。
【００４７】
マウス型およびヒト化抗体断片はまた、COS細胞、CHO細胞、多発性骨髄腫細胞、およびバキュロウイルスにおいて、確立された現存の方法を用いて産生される。
【００４８】
広範な種類のリンカー配列がVLおよびVHの結合のために用いられてよいが、システインのようなスルフヒドリル基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のようなカルボキシル基、リジンまたはアルギニンのようなアミン等の活性基を有するアミノ酸を組み込むことは、他の薬剤、細胞障害性薬剤、または検出試薬と複合体を形成するのに有用である。本発明において述べられている方法によって作られたCEACAM6に対する有用な「高親和性の」抗体は、当該分野において既知の試験法で細胞を死滅させる活性または細胞障害性を試験されてよい。ここで提供されている実施例において細胞障害活性試験法と表題をつけた例において述べられている方法によって、そのような試験法の1つは具体化される。ここで述べられている方法はまた、細胞を死滅させる効果があり、それ故癌の治療に有用である抗体の定性的な濃度を決定することを可能にする。抗CEACAM6抗体が有用な可能性がある癌には、結腸直腸の癌、膵臓癌、胃癌等を含む消化管の癌; 肺癌、乳癌、急性骨髄性白血病を含む白血病; 子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌のような女性の生殖器の癌; 脳、前立腺、肝臓、腎臓の腫瘍のような他の上皮癌が含まれる。出願人は、既知のマウス型抗CEACAM6モノクローナル抗体13.1が、組織培養において膵臓癌細胞のアポトーシスを促進し、そのような治療的適応に対して有用であろうことを発見した。
【００４９】
治療されるべき患者は、ヒトまたは非ヒト動物であってよい。好ましくは、前記動物は哺乳類である。動物の例には、イヌ、ネコ、家畜、サル（例えばCyanomolgus）が含まれる。
【００５０】
「高親和性」は、本発明の抗体について述べるために用いられる場合、本願において述べられ、実証された細胞障害性試験によって判定した場合に、CEACAM6を有する細胞のアポトーシスを引き起こすことができる抗CEACAM6抗体を意味する。
【００５１】
本発明において得られるモノクローナル抗体、特にキメラ抗体およびヒト化抗体は、治療的な適応に対して有用である。細胞死をもたらすそのような抗体は、10 ng/ml〜100 μg/ml、好ましくは100 ng/ml〜50 μg/ml、最も好ましくは 1 μg/ml〜20 μg/mlのIC50 濃度を有する。ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む本発明のモノクローナル抗CEACAM6抗体、特にScFv抗体断片は、10-10 〜10-7 M、好ましくは10-9 〜10-8 Mの結合親和性を有する。
【００５２】
DNAマイクロアレイは、ここで述べられている抗体治療から利益を得られる腫瘍を決定するために、相関性RT-PCR、ノーザンおよびウェスタンブロッティング（これらの技術は当業者に既知である）と組み合わせて、ヒト癌細胞株上の腫瘍抗原CEACAM6の過剰発現を示すために用いられてよい。同じ正常な組織または細胞と比較して、CEACAM6を2倍以上、好ましくは5倍以上、または最も好ましくは10倍以上過剰発現している腫瘍組織または細胞は、抗CEACAM6抗体を用いた治療に対して最も好ましい。さらに、CEACAM6を標的とする抗体を利用したヒトの癌組織の免疫組織化学的な分析は、過剰発現、すなわち正常な組織と比較して増加した発現を決定するために用いられ得る。
【００５３】
本発明の抗体は、単独の治療的薬剤として与えられてもよく、または併用治療において用いられてもよい。併用治療のための他の薬剤には、ゲムシタビン, 5-フルオロウラシル,イリノテカン, シスプラチン, オキザリプラチン, EGF 受容体モノクローナルおよび VEGF モノクローナル抗体, 前立腺癌または生殖性の癌におけるホルモン治療, ドキソルビシン, イダルビシン, Ara-C, マイロターグ, カルボプラチン, タキソテレ, チロシンキナーゼ阻害剤 (PDGFR, c-Kit, EGFR 等)が含まれ、放射性イオン(ヨウ素, イットリウム等)との複合抗体として; 種々の毒素(ジフテリア, シュードモナス等)との複合抗体として; タキソテレ, ドキソルビシン、または上記に列挙したような化学療法剤との複合抗体として; プロテインキナーゼ阻害剤および他のシグナル伝達阻害剤／活性化因子との複合抗体として用いられる。蛍光性もしくは放射性の標識、ビオチン-アビジンもしくはストレプトアビジン、ELISA分析を行うための試薬、ガドリニウムのようなMR試薬、MR試薬をキレート化するためのキレート化成分のように、検出または診断の適応において有用である他の複合体が作製されてもよい。このような診断用試薬は当該分野において既知であり、疾患、特に癌の診断に有用である。検出試薬は、蛍光標識または放射性標識のように光学的手法を用いる検出可能な標識として、研究用試薬にとって有用であろう。
【００５４】
本発明の抗体は、当該分野において一般的に既知である方法および賦形剤により、医薬的投与のために調製されてよい(Remington’s Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin)。賦形剤には、水、クエン酸またはリン酸緩衝液のようなpH緩衝液、ツイーンまたは他の界面活性剤のような「湿潤剤」、塩化ナトリウムのような塩、チオールのような還元剤、デキストロース、ラクトース、スクロース等のような糖、グリセロール、グリコール、油、保存剤、抗菌剤等が含まれてよい。抗体は、リポソームのような特殊輸送媒体中に配合されてもよい。製剤は、投与のために、液体、粉末、固体、またはゲル形態として調製されてよい。投与は、静脈内、腹腔内、皮下のように非経口的な経路で、経口的に、鼻腔に、吸入で、座剤により直腸に、または他の既知の薬物投与の経路でなされてよい。抗CEACAM6抗体の修飾は、PEG化のように薬理学的な効能を改善するためになされてよい。
【００５５】
投与量および投与計画は、薬理学における技術者によって容易に決定される。本発明の抗体は、5 mg/m2 から2000 mg/m2、好ましくは50 mg/m2 から1000 mg/m2、最も好ましくはl00 mg/m2 から500 mg/m2で、静脈内に投与されてよい。
【００５６】
本発明は、CEACAM6の過剰発現を診断する方法も提供し、：
患者からの試料を抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させること；
抗体または抗体断片およびCEACAM6の間で複合体が形成されたかどうかを判定すること；および
複合体の形成を、患者におけるCEACAM6の過剰発現と関連付けること、または
複合体が存在しないことを、患者においてCEACAM6の過剰発現がないことと関連付けること
が含まれる。
【００５７】
本発明は、CEACAM6の過剰発現に関与する癌または血液学的な悪性腫瘍を診断する方法も提供し：
患者からの試料を抗CEACAM6抗体または抗体断片と接触させること；
抗体または抗体断片およびCEACAM6の間で複合体が形成されたかどうかを判定すること；および
複合体の形成を、患者においてCEACAM6の過剰発現に関与する癌または血液学的な悪性腫瘍が存在することと関連付けること、または
複合体が存在しないことを、患者においてCEACAM6の過剰発現に関与する癌または血液学的な悪性腫瘍が存在しないことと関連付けること
が含まれる。
【００５８】
これらの方法はそれぞれ、試料中にCEACAM6が存在する場合、抗CEACAM6抗体または抗体断片およびCEACAM6の間での検出可能な複合体の形成に依存する。検出可能な量の複合体が形成された場合、分析は陽性である。検出可能な量の複合体が形成されない場合、結果は陰性である。それ故、これらの方法は、医学的な診断において広く用いられている他の周知の抗体試験法に類似している。抗体は、検出の増強のために蛍光標識されてもよい。腫瘍におけるCEACAM6を検出するためのもう1つの方法は、RT-PCRの後でCEACAM6のDNAの配列を決定することである。この方法は、CEACAM6のメッセージおよび腫瘍が進展の間に獲得した新しい突然変異を首尾よく同定する。この方法は、非小細胞肺癌におけるEGFR突然変異および慢性骨髄性白血病におけるBCR-Abl突然変異に利用される。特に好ましい実施形態において、試料は周知の臨床的な方法を用いて得られる生検試料である。生検試料の例は、超音波誘導内視鏡検査、腫瘍（肝臓転移）の生検を誘導するCT、または手術によって得られる。組織は一般的に、RNAまたはDNAを単離するために、加工され、パラフィン中に包埋され、または急速凍結される。
【００５９】
ここで述べられているアミノ酸および核酸配列に関して、本発明には、アミノ酸または核酸が、ここで述べられている特異的な配列に対して、少なくとも70%, 75%、好ましくは 80%, 85%、さらに好ましくは少なくとも 90%, 95%, 97%, 98% 、または99%の同一性または相同性を有する実施形態も含まれる（以下の実施例を参照）。これらの核酸は、ストリンジェントな条件下で、ここで述べられている核酸配列の相補鎖とハイブリッド形成してよい。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語には、ポリヌクレオチドがその標的配列と、他の配列よりも検出可能な程度に高い度合いでハイブリッド形成すると思われる条件についての基準が含まれる（例えば少なくともバックグラウンドの2倍）。ストリンジェントな環境は、pH 7.0 〜8.3において塩濃度がNaイオンとして約1.5 M未満、典型的には約 0.01 〜1.0 M Naイオン濃度 (または他の塩)、且つ温度は、短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）に対しては少なくとも約30℃であり、長いプローブ（例えば50ヌクレオチドより大きい）に対しては少なくとも60℃であり、例えば、高いストリンジェンシーの条件には、50％ホルムアミド、1 M NaCl, 1％ SDS中において、37℃でのハイブリダイゼーション、および0.1X SSC 中における 60 〜65℃での洗浄が含まれる(全て本明細書の一部として援用される、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, New York (1993); および Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)を参照されたい)。アミノ酸およびポリヌクレオチドの同一性、相同性、および／または類似性は、ClustalW アルゴリズム（MEGALIGN*, Lasergene, ウィスコンシン)を用いて決定することができる。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明の特異的な実施形態を例示するために提供されるが、このように限られるものではない。
【００６１】
ヒトの膵臓癌細胞株におけるCEACAM6の発現
膵臓癌細胞株(11，12，13)およびヒトの膵臓癌生検試料（14，15）についての3つの遺伝子配列プロファイリングの研究は、遺伝子の数が高度に過剰発現していることを明らかに示した。これら3つの研究による高度に過剰発現した遺伝子のうち、CEACAM6は正常な膵臓細胞と比較して25倍の増加であり、ある研究において最も発現が見られた(11)。
【００６２】
DNAマイクロアレイは、RT-PCR、ノーザンおよびウェスタンブロッティングと併用して、いくつかのヒトの膵臓癌細胞株上における腫瘍抗原CEACAM6の過剰発現を示すために用いられる。さらに、膵臓癌細胞株上のCEACAM6を標的とするマウスモノクローナル抗体（Mab13-1）および膵臓癌患者の生検試料（30のうち25）を利用した免疫組織化学的な分析では、正常な膵臓組織と比較して増大した発現が確認された。
【００６３】
ウェスタンブロッティング
この研究において、11のヒト膵臓癌細胞株(Capan-2, CFPAC-l, Panc-1, ASPC-1, MiaPaCa-2, CaPan-1, BXPC-3, Hs766T, Su.86.86, Mutj 、および HPAF-2)を密集状態まで組織培養で培養した。それぞれの細胞株を遠心沈殿させ、溶解緩衝液に溶解し、SDS-PAGE上を流し、ニトロセルロースへ移し、ならびにCEACAM6(13.1)に対するマウス型モノクローナル抗体および抗アクチン抗体（コントロール）でプロービングした。
【００６４】
図1は、11のヒト膵臓癌細胞株におけるCEACAM6の発現を示すウェスタンブロットを示したものである。図1のデータには、以下の細胞株が含まれる：M-マーカー, l: Capan-2, 2: CFPAC-1, 3: Panc-1, 4: ASPC-1, 5: MiaPaCa-2, 6: CaPan-l, 7: BXPC-3, 8: Hs766T, 9: Su.86.86, 10: Mutj, 11: HPAF-2。45kDaのバンドはアクチン対照である。
【００６５】
図1は、CEACAM6の高度な発現を有する5の細胞株、すなわち細胞株CFPAC-1、ASPC-1、CaPan-1、BXPC-3、およびHPAF-2を示す。これらの細胞株の2つ、すなわち株Hs766T および Su.86.86は発現が低く、グリコシル化のために全てMr 75kDaに遊走している。
【００６６】
ヒトの癌組織配列
30のヒト膵臓癌患者の生検試料は、抗原を回収するためにパラフィンを取り、マイクロ波を当てたが、凝固凍結した場合、前記ステップを省略した。両方の型の切片は、アセトンで固定し、αNCAモノクローナル抗体(13.1)を用いて染色し、ならびに抗-Msおよび抗-Rb免疫グロブリンの混合物を用いて加工した。すすいだ後、スライドをアビジン-HRPと共にインキュベートし、すすぎ、さらにDAB中でインキュベートした。前記スライドをヘマトキシリンで対比染色した。試験した30の患者の試料のうち、25が腫瘍性膵管細胞の細胞表面の激しい染色を示した。周辺の正常な組織ははっきりとは染色されず、正常な膵臓細胞由来の腫瘍細胞の輪郭を描いた。
【００６７】
図2は、4つの代表的な膵臓腺癌患者の生検試料の、マウス型抗CEACAM6モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的な染色の結果を示す。悪性の管の表面上皮の激しい濃茶色の染色が明らかである。
【００６８】
細胞障害活性試験
抗CEACAM6モノクローナル抗体が膵臓癌細胞の死滅を媒介できることを示すために、出願人はインビトロ障害活性試験を用いた。この試験法は、セルタイター（CellTiter）96非放射性細胞増殖試験(プロメガ社, マディソン, WI)を利用する。0日目に、MiaPaCa およびHPAF-2膵臓癌細胞を96ウェルマイクロタイタープレート(ファルコン製, #3072)中における0.1mLの培地に蒔いた。1日目に、商業的に入手可能な抗CEACAM6試薬の段階希釈液10μLを、4回反復してプレートに加えた。37℃で4日間、加湿インキュベーター中でインキュベートした後、2mg/ml の[3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3 カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム, 分子内塩; MTS]および電子カップリング試薬であるフェナジンメトスルフェート (PMS, DPBS中において0.92mg/ml)の20：1の混合液20μLをそれぞれのウェルに添加し、37℃で4時間インキュベートした。吸光度は、モデル7520マイクロプレート読み取り装置(ケンブリッジテクノロジー, Inc.)を用いて、490nmで測定した。
【００６９】
図3は、バックグラウンド吸光度に対して修正された吸光度から算出されたコントロールの残存パーセンテージを示す。細胞の残存している画分は、モノクローナル抗体の平均吸光度の値を対照の平均吸光度の値で割ることによって決定される。評価された2つの膵臓癌細胞株について、マウス型抗CEACAM6モノクローナル抗体(13-1)は、IC50 ＝1〜10μg/mlである膵臓癌細胞のアポトーシスを促進した。これは、アノイキス、すなわち形成異常を防止し、且つ正常な組織構造を保持する監視メカニズムが原因である可能性が高い。当業者にとって理解できるように、図3は、抗CEACAM6モノクローナル抗体が2つの異なる膵臓癌細胞株において、1〜10μg/mlの濃度で細胞を死滅させる効果があることを示す。
【００７０】
設計によるヒト化
マウス型抗CEACAM6モノクローナル抗体のVLおよびVH領域の配列は、質量分析ペプチドマッピングによって特徴付けられる。VLおよびVH領域の配列は、NCBIタンパク質配列データベースにおけるものと同一であった。PSI-BLAST検索は、抗CEACAM6モノクローナル抗体(13-1)のVLおよびVHと最も高い配列類似性を有するマウス型モノクローナル抗体の結晶構造を同定するために用いられる。設計サイクルを表1に示す。
【表２】
2007530679.tif 000003
出願人は、1MCP、すなわちホスホリルコリンに対するマウス型モノクローナル抗体の結晶構造を、分子モデリングのために最も良い構造として同定し、タンパク質データベースから抽出した。図4のように、1MCPのVLおよびVHドメインの配列アラインメントは、抗CEACAM6のVLおよびVHを用いて、プログラムClustal Wを使用して行った。抗CEACAM6モノクローナル抗体のVLおよびVHの分子モデリングは、プログラムICM（内部配位メカニズム）を用いたオクタンシリコングラフィックスワークステーション上で1MCPの結晶構造を用いて行われ、Sybyl 6.9 (Tripos)中で改良された。
【００７１】
グリシン-セリンリンカーは、以下の順序(GS GSGS (cys) GSGSG)でシステイン残基を用いて、VLのC-末端とVHのN-末端を結合するように構成された(間隔 ≒ 33°A)。図5のように、前記システイン残基は、薬剤複合分子を産生するためのポテンシャル部位としてリンカーに導入された。
【００７２】
マウス型CEACAM6相同性モデルおよび配列は、VLおよびVHドメインに対して最も適したヒトの受容器を同定するために用いられた。設計は、プログラムQUANTA(アクセルリーズ製, 最新版 2000)を利用したモデル化構造の分析を含む、プログラムファスタ（fasta）(33)を用いたKabatデータベース(32)による検索に基づく。ケアは、L鎖およびH鎖の間の界面における限界構造および配列を保存するために用いた。
【００７３】
図6は、出願人によるマウス型抗CEACAM6のVL鎖のヒト化を示す。灰色の配列には、ヒトの受容器の配列と同一の相補性決定領域（CDR1,2,および3）が含まれる。フレームワーク領域における1位および53位の残基は、これらがヒトにおいて見られるように突然変異してよく、CDRに対して充填される。図6のように、出願人の軽鎖の設計は、ヒトの配列163.15（kabatデータベース id 047292）(34)に基づいた。この配列の最初の3つの残基は、意味をなさない（おそらくプライマー配列の結果）ようなので、出願人はそれらをヒトの配列中に見られる最も一般的な残基（すなわちDIV）に変えた。出願人の最初の実施形態には、CEACAM6のCDRをヒトのフレームワークに直接移植することが含まれる。2つ目の実施形態において、出願人はヒトの49位のTyrをCEACAM6の軽鎖に見られるSに変えた。
【００７４】
モデルより、Ser49は結合部位において最も有名なフレームワーク残基であり、結合親和性は突然変異により評価されてよい。このモデルは、重鎖のCDR-H3においてM100aと相互作用する可能性があることを示す。軽鎖において近くのCDR残基とも相互作用する可能性がある。N-末端は時に、抗原の結合において重要であり、それ故出願人の3つ目の実施形態は、ヒトの1位のAspがCEACAM6の軽鎖に見られるAsnに変化している。モデルから、このAsnは、CDR-L3におけるPro95およびCDR-L1におけるLys27と相互作用し、CDR-H2におけるGlu61とも相互作用し得る。出願人の3つ目の実施形態のみ、逆突然変異を2つ有する。
【００７５】
図7は、出願人によるマウス型抗CEACAM6のVH 鎖のヒト化を示す。グレーの配列はヒトの受容器の配列と同一の相補性決定領域(CDR 1, 2 、および 3)である。フレームワーク領域における24、37、48、および99位の残基は、これらが人において見られるように突然変異してよく、CDRに対して充填される。
【００７６】
重鎖に対して、出願人はKabatデータベース(32)を検索したが、成功しなかった。それ故、出願人はNCBI非重複性データベースを検索した。もう一度、プログラムQUANTA(アクセルリーズ製, 最新版 2000)を用いたモデル化構造の分析を含むファスタ(33)を用いて検索を行った。軽鎖および重鎖の間の界面における限界構造および残基を保持するように注意した。重鎖の設計は、ヒトの配列AAC51024(NCBI 目録 1791061)(35)に基づいた。3つのCDR全てがマウス型CEACAM6と同じ長さであることに注目すべきである。
【００７７】
配列の長さは、配列の組成よりも高次構造のよりよい指標であるので、これらの結果は、CDR-H3ループが同様の高次構造をとる可能性があることを示す。出願人の組成物の1つの実施形態には、CEACAM6 のCDRをヒトのフレームワークに直接移植することが含まれる。2つ目の実施形態では、ヒトの24位のAlaをCEACAM6の重鎖において見られるThrに変換し、同様に48位のValをIleに変換する。
【００７８】
Thr24はCDR-11に対する標準的な残基であり、Phe27および29と相互作用する可能性が高い。Ile48は、ヒト化の実験において通常の逆突然変異であり、CDR-H2の高次構造を支持するように見えるモデルに由来する。3つ目の実施形態は、異常な93位のCysのAlaへの突然変異、および37位のValのロイシンへの突然変異である。Leu37は、軽/重界面における残基であり、マウス型を保ってよい。モデルにおけるCys93はTyr99と相互作用するように見える。モデルからは見られないが、Cys93はCDR-H3におけるCys102とジスルフィド結合を形成してよい(36)。あるいは、Cys93には金属結合部位が含まれてよい。
【００７９】
遺伝子合成、細菌性の発現、およびタンパク質精製
以下の表2のように、出願人は、マウス型ScFvおよび9種のヒト化抗CEACAM6 ScFvのVL-グリシン-セリン リンカー-VH構築物の変異体を構築するために、遺伝子合成アプローチを利用した。
【表３】
2007530679.tif 000004
10の構築物全ては、N-末端に位置するヒスチジン標識を有するpET19bベクターにクローニングされた。DNAの配列決定で、これらの構築物の確実性を確かめた。これらの構築物の2つ（マウス型SvFcおよび変異体8ヒト化ScFv）は、タンパク質の良好な発現を伴うBL21 (DE3) PlysS適格細菌中で発現され、85％より高い純度に精製される。実験的手法の詳細は、以下に述べられている。図8は、マウス型ScFvおよびヒト化ScFv変異体6の細菌性の発現およびニッケル親和性カラムを用いた精製の結果を示す。ウェスタンブロットは、抗-ヒスチジン抗体(キアゲン製)を用いてプロービングした。発現時点は0，2、および4時間である。
【００８０】
細菌性の発現
出願人は、上記に記載したように、マウス型ScFvおよび9種のヒト化ScFvの変異体を準備した。これらの構築物は、ヘキサ-ヒスチジン標識に対する5’コード化配列を含むNcoI - BamHl含有挿入部位としてpET19bベクターにクローニングされる。全ての構築物のDNAの配列決定は、N-末端から出発部位に位置するインフレームのヘキサ-ヒスチジン標識を伴う挿入の確実性を示した。2つのScFv（マウス型ScFvおよびヒト化ScFv 変異体8）は、大腸菌中で首尾よく発現された。発現した組み換えタンパク質は、Ni2+ 親和性クロマトグラフィーカラムを用いて85％まで精製された。
【００８１】
DNAは、キアゲンミニ（Qiagen Mini） および マキシプレパレーションキット (キアゲン製, CA)を用いて微生物から分離された。DNAおよびアミノ酸配列としての配列情報を、以下に提供する：
【表４】
2007530679.tif 000005
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
2007530679.tif 000018
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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組み換えタンパク質の発現
表3では、組み換えタンパク質の発現に対する出願人の方法のステップの概要を述べる。
【表２４】
2007530679.tif 000025
変性条件下でのヒスチジン標識されたタンパク質の精製
氷上で15分間、細胞ペレットを解凍し、1g湿重量当たり5mlの緩衝液(PBS, 8M 尿素, pH 8.0)中に再懸濁する。室温で30〜60分間、細胞を撹拌し、その後、溶解産物を室温で20分間、10,000×gで遠心分離し、上清を回収する。変性条件下でのNi-NTA スーパーフロー (キアゲン製)を用いたヒスチジン標識されたタンパク質の精製には、カラムをカラムの5倍の量の緩衝液1(100mM NaH2PO4, l0mM トリス-HCl, 8M 尿素, pH 8.0)で平衡化すること、溶解産物を流速1ml/minのカラムに適用すること、および緩衝液1でA280が0.01より低くなるまで洗浄すること、その後、緩衝液2(100mM NaH2PO4, l0mM トリス-HCl, 8M 尿素, pH 6.3)でA280が0.01より低くなるまで洗浄することが含まれる。最後に、タンパク質を緩衝液3(100mM NaH2PO4, l0mM トリス-HCl, 8M 尿素, pH 4.5)を用いて溶出する。
【００８２】
タンパク質の再折りたたみ
溶出されたタンパク質を、低いタンパク質濃度に維持する(10-50 μg/ml)。4倍量の再折りたたみ緩衝液(20mM トリス, 025mM NaCl, 0.5% NP-40, 0.4mM PMSF, 2mM GSH, 0.2mM GSSG, l00mM EDTA, pH 7.8)を、再び折りたたむために4℃で24時間用いる。再び折りたたまれた試料を、20mM トリス-HCI, 120MM NaCl, 5% グリセロール, pH 7.4を用いて、4℃で24時間透析する。不溶性の凝集体を遠心分離により除去する。試料を、凍結乾燥によりまたはアミコン(Amicon)濃縮機を用いることにより濃縮する。
【００８３】
タンパク質の精製
AKTAプライム（アマシャムバイオサイエンス製）液体クロマトグラフィータンパク質精製システムを、イオン交換、疎水性、およびゲルろ過カラムを経時的に用いて、組み換えタンパク質を95％より高くさらに精製するために用いた。抗体断片は表面の組成および等電点において広く変動するので、一般的な精製スキームはあり得ない。新しい手法がこれらの抗体断片に対して設計される。タンパク質の純度は、SDS-PAGEおよび銀染色を用いて分析することができる。
【００８４】
当業者が認識する場合、タンパク質を未変性の状態で産生することが望ましい。代替の発現方法が必要となる唯一の場合は、自然発現が構造-機能研究に対して十分な物質を産生しない場合である。出願人は、マウス型ScFvおよびヒト化ScFvの変異体8が封入体において見られるということを見出した。組み換えタンパク質は、これらの封入体から精製され、天然の状態に再び折りたたまれた。十分機能的な分子は、その後、さらなるカラム精製ステップ(AKTA Prime, FPLC システム)により得ることができ、結合を調べることにより活性を評価できる。
【００８５】
ある実施形態において、出願人の方法は、pET19bベクターに基づく残りの8構築物に対する、高いレベルのタンパク質の発現を提供する。他の実施形態において、出願人の方法は、pET15もしくは25 (ノバゲン製) または pPROEX-Hta (インビトロゲン製) または pQE (キアゲン製) または pGex-GST (インビトロゲン製)のような他のベクターを用いる。
【００８６】
ある実施形態において、細菌性の発現は機能性分子を提供する。他の実施形態において、バキュロウイルス発現システムが利用される。これらの実施形態には、pFastBac ベクター(インビトロゲン製)またはpQE-トリシステム(キアゲン製)の使用が含まれる。後者のベクターは、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞における単一構築物を用いた対応するタンパク質の発現のために用いることができる。一般的に、組み換えバキュロウイルスは、シャトルベクターの同時形質移入によって産生することができ、バキュロウイルスのゲノムDNAをSf9およびSf21のような昆虫細胞へ直線化することができる。同時形質移入、ウイルス増幅、およびウイルスタイター決定のためのプラーク試験に対する最適化されたプロトコルは、異なる提供者のプロトコルから得られるであろう。
【００８７】
さらに他の実施形態において、出願人は哺乳類細胞における発現のためにpQE-トリ-システム(キアゲン製)を用いる。このベクターは、リン酸カルシウム、リポフェクション、またはエレクトロポレーションのような伝統的な形質移入技術により、細胞に導入され得る。タンパク質の発現に続き、抗-ヒスチジン抗体(キアゲン製)を用いたウェスタンブロッティングが行われる。
【００８８】
当業者が認識する場合、タンパク質の再折りたたみは、多くの異なる有用な技術を用いて挑戦することができる。ある実施形態において、出願人は上記で記載したような真核生物の系を用いる。出願人は、良好な溶解性および機能性を有するマウス型およびヒト化ScFvの変異体8を首尾よく再び折りたたんだ。出願人の構築物は、組み換えヒト型CEACAM6抗原を用いて結合親和性を調べることができ、これはGST-標識された構築物としてpGexベクター（インビトロゲン製）にクローニングしたものである。DNAの配列決定は、挿入の確実性を強めた。抗体断片について上記で述べたように、ヒト型CEACAM6抗原は、細菌またはバキュロウイルス中で発現させることができ、GST親和性クロマトグラフィーをAKTAプライムゲルろ過クロマトグラフィーと組み合わせて用いることにより、95％より高い純度まで精製することができる。
【００８９】
プレートは一晩、4℃で、PBS/BSA中において、抗-ヒスチジン標識された抗体または抗-GST抗体でコーティングされる。PBS-ツイーンでウェルを4回洗浄した後、精製されたヒスチジン標識されたScFvまたはGST標識されたCEACAM6を加え、室温で2時間インキュベートする。PBS-ツイーン中で4回洗浄した後、CEACAM6またはScFvを加え、室温で1〜2時間インキュベートし、抗-GST抗体または抗-ヒスチジン抗体でそれぞれ洗浄し、プロービングする。二次抗体をPBS/BSAに加え、室温で45分間インキュベートする。PBS-ツイーン中で4回洗浄した後、基質溶液(TMB)を加え、発色をマイクロプレート読取装置でモニターする。これらのデータを、本来のマウス型抗CEACAM6モノクローナル抗体(マウス型 IgG1 13.1)と比較および対照する。
【００９０】
BIAコア技術は抗原-抗体相互作用の親和性を測定するための標準的な方法となり、細菌中で産生された組み換え抗体断片の結合動力学を親のモノクローナル抗体と比較するための手段を提供する。出願人は、操作された1価の抗体断片に対して決定された動力学的定数が、親のモノクローナル抗体からのタンパク質分解性の切断により生じた親の1価の抗体断片に対して得られた定数に匹敵することを発見した(35)。
【００９１】
実時間での生体分子相互作用分析（BIA）において、抗原（CEACAM6）を含有する溶液を表面上に連続的に流す一方で、抗体(ScFvまたはIgGI)はセンサーチップの表面に固定化され、逆もまた同様である。試料のセンサー表面への移動は、マイクロフルイディクスカートリッジで調節される。緩衝溶液は、一定の流速でセンサー表面上にくみ出される。試料のパルスが注入されると、分析物のリガンドに対する結合が、共鳴ユニット(RU)として発現する反応の増加として観察され、時間の関数に従い、且つセンサーグラムとして表される。このデータから、結合速度定数が計算され得る。この注入の最後に、試料が緩衝液の連続的な流れによって置換される。反応における減少は、リガンド表面からの分析物の解離を反映し、収集されたデータは相互作用に対する解離速度定数を計算するために用いられる。
【００９２】
抗CEACAM6モノクローナル抗体が膵臓癌細胞を死滅させることを媒介できると示すために、出願人は、インビトロ細胞障害性試験を用いた。これは、セルタイター 96 非放射性細胞増殖試験 (プロメガ社製,マディソン, WI)を利用する。CEACAM6 (CFPAC-1, ASPC-1, Capan-1, BXPC-3、および HPAF-2)を発現している膵臓癌細胞株を、0日目に96ウェルマイクロタイタープレート(ファルコン製, #3072)における培地0.1ml中に蒔く。1日目に、商業的に入手可能な抗CEACAM6 Mabの段階希釈液10μL、マウス型ScFvおよびヒト化ScFv生成物の9種の変異体を、4回反復してプレートに加える。
【００９３】
37℃で4日間、加湿インキュベーター中でインキュベートした後、2mg/mlの[3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム, 分子内塩; MTS]および電子共役試薬であるフェナジンメトスルフェート(PMS, DPBS中において0.92mg/ml)の20：1の混合物20μLをそれぞれのウェルに加え、37℃で4時間インキュベートする。吸光度はモデル7520マイクロプレート読取装置（ケンブリッジテクノロジー,Inc.）を用いて、490nmで測定する。そのデータは、バックグラウンドの吸光度に対して補正された吸光度から計算される、コントロールの残存パーセンテージとして表される。細胞の残存画分は、モノクローナル抗体の平均吸光度を対照の平均吸光度で割ることにより決定されてよい。
【００９４】
上記で論じたとおり、我々は本来のマウス型ScFvおよびヒト化ScFvの変異体8を細菌性に発現させ、且つ我々は今回、5つの異なる培養の膵臓癌細胞株におけるこれらの抗体断片の効力を評価した。図9は、細菌性に発現したマウス型ScFvおよびヒト化ScFvの変異体8が膵臓癌細胞株に発現しているCEACAM6に対して活性のある抗体断片であることを示す。
【００９５】
膵臓癌のマウスモデルにおけるマウス型ScFvの治療的有効性
CEACAM6を過剰発現しているBXPC-3膵臓癌細胞株が本研究に用いられた。このマウスは雄性、胸腺欠損のヌードマウスであり、隣接領域に1000万の細胞を接種した。腫瘍は平均値50 mm3まで成長した。8匹のマウスが対照群であり、8匹のマウスが処置された群であった。治療は、組み換えのマウス型ScFvを5mg/kgまたは10mg/kg、腹腔内に毎日2週間投与した後、28日目に開始した。腫瘍容積を毎週測定した。全ての動物は、両方の群において体重を維持した。データは、治療されない動物と比較して、治療により腫瘍容積が50〜70％減少したことを示す（図10）。
【００９６】
HPAF-2細胞を抗-CEACAM6 Mabで処置することによるアポトーシスの促進
アポトーシスを仲介する抗- CEACAM6モノクローナル抗体(Mab)のメカニズムを確認するために、22,000以下のプローブからなるヒトアフィメトリックス製U133Aオリゴヌクレオチド遺伝子配列を用いて、遺伝子発現プロファイル(GEP)研究を行った。HPAF-2膵臓癌細胞を1μg/mL 抗-CEACAM6 Mabで6および24時間処理した。対照は、処理されないHPAF-2細胞であった。全RNAは、製造業者の指示に従ってRNイージーミニキット(キアゲン製, CA)を用いて抽出した。細胞から分離された全RNA量は、分光光度的なOD260 の測定によって、>25μg/試料の収量として定量した。T7結合性オリゴ(dT)プライマーを用いて第1の鎖のcDNAを産生するために、5μgのmRNAを用いた。第2の鎖の合成の後、インビトロ転写（アンビオン製）をビオチン標識されたUTPおよびCTP (エンゾーダイアグノティクス製)を用いて行い、40〜80倍のRNAの比例した増幅を生じた。45℃で、HG- U133A 2.0アフィメトリックス製配列(サンタクララ, CA)に対して一晩ハイブリダイゼーションする前に、40μgのビオチン標識されたRNAを50〜150ヌクレオチドサイズまで断片化した。このチップ上のそれぞれの遺伝子を、10〜20のオリゴヌクレオチドで置換し、「プローブセット」と名付けた。これらのセットに対する標識されたmRNAのハイブリダイゼーションの強度は、特定の遺伝子の発現レベルを示す。洗浄の後、配列をストレプトアビジン-フィコエリトリン(分子プローブ)を用いて染色し、ヒューレットパッカード製スキャナー上で走査した。配列のそれぞれの特徴に対する強度は、ジーンチップソフトウェア(アフィメトリックス製, CA)を用いることにより得られ、それぞれの遺伝子の単一の生の発現レベルは、整えられた平均アルゴリズムを用いることにより、それぞれの遺伝子を表す10〜20のプローブ対から得られた。同様の型のそれぞれのクリップに対する全体的な強度が等しくなるように強度の値が調整される。全ての遺伝子チップの換算因子間の平均(±SD)差は、0.75±0.15であった。GAPDH3’と5’の割合 (1.02±0.10)は、試料の全体的に高い質を示す。よく測定された遺伝子は、ハイブリダイズされた試料の80％より多くが、2より大きいシグナル強度とバックグラウンドノイズの比を有する遺伝子として定義された。Mabで処理されたものを対照試料と比較し、「強い増加因子」または「強い減少因子」のリストを、アフィメトリックスデータ分析プログラム(アフィメトリックス製 MAS 5.0)を利用して作成した。基礎的なガイドは、これらのリストをジーンスプリング（GeneSpring） (バージョン5.0)に移入するため、および強い増加因子または減少因子のそれぞれの共通部分を得るために用いた。遺伝子発現プロファイルを、さらに、アポトーシスを促進するおよび避ける場合に含まれる遺伝子によって、並びに癌遺伝子を含有する成長シグナルにおける自給自足および成長阻害シグナルに対する非感受性によって分類した。
【００９７】
結果は、いくつかのアポトーシスのタンパク質が、6時間および24時間においてそれぞれ強く上方制御されたことを示した。無処理のHPAF-2細胞と比較して、6時間において著しく過剰発現したアポトーシスのタンパク質は、カスパーゼ-2であった(〜10倍)。しかしながら、24時間におけるカスパーゼ-2のレベルは、無処理のHPAF-2細胞と比較して4倍以内まで減少した。この結果は、HPAF-2細胞を抗-CEACAM6 Mab 1μg/mLで6，24，48、および72時間処理した後、34kDaまで移動する活性カスパーゼ-2 (アブカム社製, MA)に対してウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行うことで確認した（図11）。無処理の細胞においては基礎レベルのカスパーゼ-2が見られ（遺伝子発現プロファイル分析においても観察される）、抗CEACAM6 Mabを用いた処理の後6時間ではカスパーゼ-2のレベルが増大し、48時間では増加が残った。しかしながら、アポトーシスを起こす細胞の場合、そのレベルは基本レベルより下に低下する。カスパーゼ-2をエフェクターまたはイニシエーターのカスパーゼグループに割り当てることは困難であった。それはイニシエーター(カスパーゼ-9およびCED-3)に対する配列相同性を有するが、その切断特異性はエフェクター(カスパーゼ-3 および -7)により近い。中期／後期の遷移の間に生じる細胞死は、カスパーゼ-2（DNA損傷に応答して活性化され得る）および／またはアポトーシス誘導因子ならびにカスパーゼ-9および-3活性化因子チトクロムcのような細胞死エフェクターの放出を伴うミトコンドリア膜透過化処理によって特徴付けられることが発見された(28)。カスパーゼ-2の活性化の機序がまだ決定されていないが、カスパーゼ-2は、プログラム細胞死の制御において重要且つ特異的な役割を果たしている。
【００９８】
診断または予後のマーカー
抗-CEACAM6モノクローナル抗体は、診断および／または予後のマーカーとして発展してきた。免疫増強剤化学療法前の243の結腸直腸の患者の生検であって、無作為化された管理下臨床試験からの組織マイクロアレイにおける免疫組織化学的な分析は、CEACAM6の過剰発現はCEAまたはCEACAM1と比較して、全体として低い残存率となることが独立して予想されることを示した。この組織配列において、患者の55％でCEACAM6の過剰発現が存在し(Jantscheff P, Terracciano L, Lowy A. et al. Expression of CEACAM6 in resectable colorectal cancer: a factor of independent prognostic significance. J. Clin. Oncol. 2003, 21(19): 3638-46)、それを、臨床的なマーカーおよび結腸直腸癌における潜在的な治療標的として確認した。我々は、30の膵臓癌患者も分析し、75％より多い患者において彼らの腫瘍にCEACAM6の存在が見られた。それ故、マウス型またはヒト化モノクローナル抗体および／または抗体断片(ScFv)は、いくつかの癌またはCEACAM6を過剰発現している（正常な対照と比較して2倍より多い）血液学的な悪性腫瘍における診断または予後のマーカーとして有用であろう。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態が詳細に説明されている一方で、これらの実施形態に対する修飾および適応が、本発明の範囲から外れることなく当業者にとってなされ得ることを明確にすべきである。
【０１００】
明らかに、上記の説明を考慮に入れた上での本発明の多数の修飾または変化は可能である。それ故、付属の特許請求の範囲内において、本発明はここで明確に述べられたものとは異なる方法で実行されてもよいと理解されるべきである。
【０１０１】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図1は、11のヒト膵臓癌細胞株におけるCEACAM6の発現を示すウエスタンブロットであり、レーンは左から右にM: marker, 1: Capan-2, 2: CFPAC-1, 3: Panc-l, 4: ASPC-1, 5: MiaPaCa, 6: CaPan-1, 7: BXPC-3, 8: Hs766T, 9: su.86.86, 10: Mutj, 11: HPAF-2である。45kDaのバンドはアクチン対照である；
【図２】図2は、4つの代表的な膵臓腺癌患者の生検試料の免疫組織化学的染色を示す；
【図３】図3は、抗CEACAM6モノクローナル抗体の存在下における、2つの異なる膵臓癌細胞株のパーセント残存率を示したグラフである；
【図４】図4は、1MCPのVH および VL を有するマウス抗CEACAM6のVH および VL 鎖の配列アラインメントに基づく構造を示したチャートである（配列番号：23および24）；
【図５】図5は、1MCPの構造的同位に構築され、薬剤のように他の部分に付着するために、システイン残基を有するgly-serリンカー(ggggsggggscggggs) (配列番号: 25)を含むマウス型抗CEACAM6 のVH および VL SCFV 鎖の相同性モデルを示す；
【図６】図6は、マウス型抗CEACAM6のVL鎖のヒト化を示すチャートである。アステリスクは、全ての問い合わせ配列がちょうど同じアミノ酸を有する位置（配列の同一性と呼ばれる）を示す。2つの点は、解析された配列全てが化学的に類似するアミノ酸(すなわち、全て酸性または全て無極性 ; 配列保存と呼ばれる)を有する、配列中の位置を示す。1つの点は、より低い化学的類似性（より低い配列保存）を示す。注釈がないことは、化学的類似性が存在しないことを示す；
【図７】図7は、マウス型抗CEACAM6のVH鎖のヒト化を示すチャートである(配列番号: 26および27)。アステリスクは、全ての問い合わせ配列がちょうど同じアミノ酸を有する位置（配列の同一性と呼ばれる）を示す。2つの点は、解析された配列全てが化学的に類似するアミノ酸(すなわち、全て酸性または全て無極性 ; 配列保存と呼ばれる)を有する、配列中の位置を示す。1つの点は、より低い化学的類似性（より低い配列保存）を示す。注釈がないことは、化学的類似性が存在しないことを示す；
【図８】図8は、マウスScFv およびヒト化 ScFv の変異体8のウェスタンブロットを示す。
【図９】図9は、細菌性に発現したマウス型ScFv およびヒト化 ScFvの変異体8が、CEACAM6を発現する膵臓癌細胞株に対する活性抗体断片であるということを示す。パネル中に示されたデータは、CEACAM6に対するマウス型ScFv（黄色）およびヒト化ScFv（変異体8）抗体断片が、CEACAM6を発現する5つの異なる膵臓癌細胞株において細胞を死滅させることに対して効果的であるということを示す。IC50は、細胞株に依存して0.07 〜4.0μg/mL の範囲であると評価する。
【図１０】図10は、毎日腹腔内に投与されたマウス型ScFv 抗体断片が、生理食塩水で処理された動物と比較して、腫瘍量を50〜70％減少させる効果があることを示す。
【図１１】図11は、抗-CEACAM6 Mab (1μg/mL)で処理したHPAF-2膵臓癌細胞の切断されたヒトカスパーゼ-2のウェスタンブロット分析である。（A）0時間および6時間、(B)0時間、24時間、48時間、および72時間。切断されたカスパーゼ-2は、34kDa以内まで移動する。
【図１】
2007530679.tif 000026
【図２】
2007530679.tif 000027
【図３】
2007530679.tif 000028
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007530679.tif 000032
【図８】
2007530679.tif 000033
【図９】
2007530679.tif 000034
【図１０】
2007530679.tif 000035
【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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