(57)【要約】本発明は生物工学および分子生物学の分野に関する。特に本発明は、ヌクレオチド配列の異なるクローニング部位を含む核酸分子の構築および使用に関する。特定の態様では、本発明は、異なるプライマー結合部位を有する組換え部位を含む核酸分子に関する。これらの異なるプライマー結合部位は、2つの組換え部位の間に位置する核酸セグメントの異なる末端を配列決定するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 核酸セグメントの全部または一部に隣接し両端からの核酸セグメントの配列決定を可能にする配列決定プライマー結合部位を含む産物核酸分子の生成をもたらす組換え反応を核酸セグメントに対して行う段階;
(b) 配列決定プライマーが産物核酸分子のプライマー結合部位の両方にハイブリダイズするのを可能にする条件の下で(a)の産物核酸分子を配列決定プライマーとハイブリダイズさせる段階; および
(c) 配列決定反応を行う段階を含み、
配列決定プライマーは両方のプライマー結合部位に結合できるが、2つのプライマー結合部位のうちの1つに結合した場合にだけ5'から3'への伸長を媒介する、
核酸セグメントの全部または一部を配列決定するための方法。
【請求項２】
(a)の組換え反応が、ヌクレオチド配列の異なる2つの核酸分子の間で起こる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
核酸分子が両方とも環状である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
2つの核酸分子の各々が2つの組換え部位を含み、各個別の核酸分子における2つの組換え部位は実質的に互いとは組換えを起こさず、核酸分子の一方にある2つの組換え部位の各々が、他方の核酸分子にある組換え部位のうちの少なくとも1つと適当な条件の下で組換えを起こす、請求項2記載の方法。
【請求項５】
組換え部位の1つまたは複数が以下からなる群より選択される、請求項2記載の方法:
(a) attB部位、
(b) attP部位、
(c) attL部位、
(d) attR部位、
(e) lox部位、
(f) psi部位、
(g) dif部位、
(h) cer部位、
(i) frt部位、
ならびに、組換えを起こす能力を保持している(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、または(i)の組換え部位の変異体、変種、および誘導体。
【請求項６】
核酸分子の一方が2つのattB組換え部位を含み、他方の核酸分子が2つのattP組換え部位を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
2つの配列決定プライマー結合部位がattP部位に位置する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
(a)の産物核酸分子がattL組換え部位に隣接する核酸セグメントを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
2つの配列決定プライマー結合部位がattL部位に位置する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
2つの配列決定プライマー結合部位がattL部位のIHF部位を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
2つの配列決定プライマー結合部位が1、2、3、または4ヌクレオチドだけ異なる、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
2つの配列決定プライマー結合部位が2以上のヌクレオチドだけ異なる場合、異なるヌクレオチドが相互に隣接して位置する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
配列決定プライマーの長さが12から40ヌクレオチドの間である、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
核酸セグメントの少なくとも一端に隣接する配列決定プライマー結合部位が、配列決定される核酸セグメントの35〜45ヌクレオチド内に位置する、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
(a) 核酸セグメントの全部または一部に隣接し両端からの核酸セグメントの配列決定を可能にする配列決定プライマー結合部位を含む産物核酸分子の生成をもたらす組換え反応を核酸セグメントに対して行う段階;
(b) 第1の配列決定プライマーが産物核酸分子のプライマー結合部位の両方にハイブリダイズするのを可能にする条件の下で(a)の産物核酸分子の第1の小部分(subportion)を第1の配列決定プライマーと接触させる段階; および
(c) 配列決定反応を行う段階を含み、
第1の配列決定プライマーは両方のプライマー結合部位に結合するが、2つの結合部位のうちの1つに結合した場合にだけ5'から3'への伸長を媒介する、
核酸セグメントの全部または一部を配列決定するための方法。
【請求項１６】
(e) 第2の配列決定プライマーが産物核酸分子のプライマー結合部位にハイブリダイズするのを可能にする条件の下で(a)の産物核酸分子の第2の小部分を第2の配列決定プライマーと接触させる段階; および
(f) 配列決定反応を行う段階をさらに含み、
第2の配列決定プライマーは両方のプライマー結合部位に結合するが、2つの結合部位のうちの1つに結合した場合にだけ5'から3'への伸長を唯一媒介し、このプライマー結合部位は、第1の配列決定プライマーが5'から3'への伸長を媒介する核酸セグメントの反対端に位置する、
請求項15記載の方法。
【請求項１７】
第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーの長さが各々15から45ヌクレオチドの間である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーはヌクレオチド配列が1、2、3、または4ヌクレオチドだけ異なる、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーはヌクレオチド配列がその3'末端で異なる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第1の配列決定プライマーが、ヌクレオチド配列
2007512838.tif 000041
を含み、第2の配列決定プライマーが、ヌクレオチド配列
2007512838.tif 000042
を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子が、
(a) 第1の組換え部位および第2の組換え部位、
(b) 第1および第2の組換え部位の間に位置する核酸セグメント、ならびに
(c) ヌクレオチド配列の異なる2つのプライマー結合部位に結合できるプライマーを含み、
一方のプライマー結合部位が第1の組換え部位の中に位置し、他方のプライマー結合部位が第2の組換え部位の中に位置する、
単離された核酸分子を含む組成物。
【請求項２２】
プライマーを結合するプライマー結合部位を除いて、核酸分子は一本鎖である、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
2つの異なるプライマー結合部位が1、2、3、または4ヌクレオチドだけ相互と異なる、請求項21記載の組成物。
【請求項２４】
プライマーの長さが10から40ヌクレオチドの間である、請求項21記載の組成物。
【請求項２５】
請求項21記載の組成物および以下からなる群より選択される1つまたは複数の成分を含む、反応混合物:
(a) 1つまたは複数のヌクレオチド三リン酸、
(b) 1つまたは複数のポリメラーゼ、
(c) 1つまたは複数のデオキシヌクレオチド三リン酸、および
(d) 少なくとも1つのジデオキシヌクレオチド三リン酸。
【請求項２６】
核酸分子がベクターである、請求項21記載の組成物。
【請求項２７】
ベクターがプラスミドである、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列5' GAAAATATTG 3'を含む、単離された核酸分子。
【請求項２９】
ベクターである、請求項28記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
ベクターがプラスミドである、請求項29記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
核酸分子が、
(a) 第1の組換え部位および第2の組換え部位、
(b) 第1および第2の組換え部位の間に位置する核酸セグメント、ならびに
(c) ヌクレオチド配列の異なる2つのプライマー結合部位に結合できるプライマーを含み、
一方のプライマー結合部位が第1の組換え部位の中に位置し、他方のプライマー結合部位が第2の組換え部位の中に位置する、
単離された核酸分子を含むキット。
【請求項３２】
以下からなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む、請求項31記載のキット:
(a) 1つまたは複数のヌクレオチド三リン酸、
(b) 1つまたは複数のポリメラーゼ、
(c) 1つまたは複数のデオキシヌクレオチド三リン酸、
(d) 少なくとも1つのジデオキシヌクレオチド三リン酸、
(e) 1つまたは複数の緩衝液、
(f) 1つまたは複数のさらなるプライマーまたはその他の核酸分子、および
(g) 1つまたは複数の取扱説明書のセット。
【請求項３３】
取扱説明書が、配列決定反応におけるキット成分の使用方法を記述する、請求項31記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は生物工学および分子生物学の分野に関する。特に本発明は、ヌクレオチド配列の異なるクローニング部位を含む核酸分子の構築および使用に関する。特定の態様では、本発明は、異なるプライマー結合部位を有する組換え部位を含む核酸分子に関する。これらの異なるプライマー結合部位は、2つの組換え部位の間に位置する核酸セグメントの異なる末端を配列決定するために使われてもよい。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物体(例えば、ウイルスおよび細菌)に存在するタンパク質であり、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼの両方の性質を有するという特徴を持つ。これらのリコンビナーゼ(場合によっては関連タンパク質とともに)は、核酸分子中の特異的な塩基配列を認識し、これらの配列に隣接する核酸セグメントを交換する。リコンビナーゼおよび関連タンパク質は、総称して「組換えタンパク質」と呼ばれる(例えば、Landy, A.、Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照のこと)。
【０００３】
種々の生物体由来の多くの組換え系が報告されている。例えば、Hoessら、Nucleic Acids Research 14(6):2287 (1986); Abremskiら、J. Biol. Chem. 261(1):391 (1986); Campbell, J. Bacteriol. 174(23):7495 (1992); Qianら、J. Biol. Chem. 267(11):7794 (1992); Arakiら、J. Mol. Biol. 225(1):25 (1992); MaeserおよびKahnmann、Mol. Gen. Genet. 230:170-176 (1991); Espositoら、Nucl. Acids Res. 25(18):3605 (1997)を参照されたい。これらの多くはリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する(Argosら、EMBO J. 5:433-440 (1986); Voziyanovら、Nucl. Acids Res. 27:930 (1999))。これらの中で最もよく研究されているのは、バクテリオファージ由来のインテグラーゼ/att系(Landy, A.、Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699-707 (1993))、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系(HoessおよびAbremski (1990) Nucleic Acids and Molecular Biology、第4巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag、pp90-109)、およびサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae) 2Φ環状プラスミド由来のFLP/FRT系(Broachら、Cell 29:227-234 (1982))であろう。
【０００４】
組換え部位
上述の反応が組換え、転位または組込みのいずれと呼ばれるにせよ、リコンビナーゼ、トランスポサーゼまたはインテグラーゼのいずれによって触媒されるにせよ、これらは多くの場合「組換え部位」と呼ばれる、核酸分子上の特異的な認識配列が反応に関与するという鍵となる特徴を共通して持つ。これらの組換え部位は、組込みまたは組換えの最初の段階で、組換えタンパク質が認識し結合する、関与する核酸分子上の核酸の部分またはセグメントである。例えば、Creリコンビナーゼの組換え部位はloxPであり、これは8塩基対のコア配列を挟む2つの13塩基対の逆向き反復配列(リコンビナーゼの結合部位となる)からなる34塩基対の配列である。Sauer, B.、Curr. Opin. Biotech. 5:521-527 (1994)の図1を参照されたい。認識配列の他の例にはattB、attP、attL、およびattR配列があり、これらは組換えタンパク質Intによって認識される。attBは2つの9塩基対のコア型Int結合部位および7塩基対の重複領域を含んだ約25塩基対の配列で、attPはコア型Int結合部位およびアーム型Int結合部位、ならびに補助的なタンパク質組込み宿主因子(IHF)、FISおよび除去酵素(Xis)に対する部位を含んだ約240塩基対の配列である。Landy、Curr. Opin. Biotech. 3:699-707 (1993)を参照されたい。
【０００５】
通常の核酸クローニング
核酸セグメントのクローニングは、現在、多くの研究室で日常業務としておよび多くの遺伝子解析において必須の工程として行われている。これらのクローニングの目的はさまざまであるが、一般に2つの目的が考えられる: (1) pUC、pGem、pBlueScriptなどの比較的少数の公知のベクター中で行われる、大きなDNAまたはRNAセグメント(染色体、YAC、PCR断片、mRNAなど)からの核酸の最初のクローニング、および(2) 機能解析用の専用ベクターへのこれらの核酸セグメントのサブクローニングである。最初のクローニングベクターからより専用のベクターへの核酸セグメントの移入には多くの時間と労力が費やされている。この移入をサブクローニングと呼ぶ。
【０００６】
クローニングの基本的方法は長年知られており、その間にあまり変化していない。典型的なクローニングプロトコルは以下の通りである:
(1) 対象核酸を1つまたは2つの制限酵素で消化する;
(2) 既知の時は関心対象の核酸セグメントをゲル精製する;
(3) 適当な制限酵素による切断、アルカリホスファターゼ処理、ゲル精製などにより適宜ベクターを調製する;
(4) 未切断および自己連結ベクターのバックグラウンドを除去するため適当な対照とともに、核酸セグメントをベクターに連結する;
(5) 得られたベクターを大腸菌(E. coli)宿主細胞に導入する;
(6) コロニーを採種し、一晩、少量培養する;
(7) 核酸ミニプレップを作る; ならびに
(8) 単離されたプラスミドをアガロースゲル(多くの場合、診断上の制限酵素消化の後)でまたはPCRにより解析する。
【０００７】
核酸セグメントのサブクローニングに使用される専用ベクターは、多様な機能を持つ。これらには、種々の生物体で核酸分子を発現するためのベクター; 核酸分子の発現を調節するためのベクター; タンパク質精製を補助するまたは細胞内でのタンパク質の追跡を可能とするタグを供与するベクター; クローニングされた核酸セグメントを改変する(例えば、欠失をもたらす)ためのベクター; プローブ(例えば、リボプローブ)の合成のためのベクター; 核酸配列決定用の鋳型を調製するためのベクター; タンパク質コード領域の同定のためのベクター; さまざまなタンパク質コード領域の融合のためのベクター; 対象とする大量の核酸を供与するためのベクターなどが含まれるが、これらに限定されることはない。特定の研究で、関心対象の核酸セグメントをいくつかの異なる専用ベクターにサブクローニングすることは一般に行われる。
【０００８】
当技術分野で周知のように、簡単なサブクローニングは1日で行なえる(例えば、核酸セグメントが大きくなく、制限酵素部位がサブクローニングベクターの制限酵素部位と適合する)。しかしながら、他のサブクローニングの多く、特に未知の配列や、長い断片、毒性遺伝子、制限酵素部位の位置が適合しない、バックグラウンドが高い、純度の低い酵素などの場合には数週間かかることがある。最も遅くて時間のかかるタイプのサブクローニングの1つは、望ましいクローンを構築するために、ベクターにいくつかの核酸セグメントを順次付加していくものである。このタイプのクローニングの一例は、遺伝子ターゲティングベクターの構築である。遺伝子ターゲティングベクターは、通常、それぞれ標的遺伝子の一部分と同一の2つの核酸セグメントが、選択可能なマーカーを挟むものを含む。そのようなベクターを構築するためには各セグメントを順次クローニングする必要があり、すなわち、第1の遺伝子断片をベクターに挿入し、その後、選択可能マーカー、その後、標的遺伝子の第2の断片を挿入する必要がありうる。これには、クローニングされる各断片ごとに、いくつかの消化、精製、連結、および単離段階が必要になる。したがって核酸断片のサブクローニングは、できるだけ回数を減らすべき雑用と見られることが多い。
【０００９】
例えば以下の参考文献のように、核酸セグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法が記述されている。
【００１０】
Ferguson, J.ら、Gene 16:191 (1981)は酵母核酸の断片をサブクローニングするためのベクターファミリーを開示している。これらのベクターはカナマイシン耐性をコードしている。もっと長い酵母核酸セグメントのクローンは、部分的に消化しサブクローニングベクターに連結することができる。オリジナルのクローニングベクターがアンピシリン耐性を持つならば、カナマイシンで選択するので、形質転換前に精製は不要である。
【００１１】
Hashimoto-Gotoh, T.ら、Gene 41:125 (1986)は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内に固有のクローニング部位を持つサブクローニングベクターを開示している。ストレプトマイシン耐性宿主内では、優性の感受性遺伝子内に挿入または欠失を持つプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択で生存できる。
【００１２】
これらの方法による改善にも関わらず、制限酵素およびリガーゼ酵素を用いた通常のサブクローニングは時間がかかり、比較的信頼性が低い。かなりの労力を費やしても、2日またはそれ以降に、所望のサブクローンが候補プラスミドの中に見つからなければ、別の条件で過程全体を繰り返さなくてはならない。
【００１３】
組換えクローニング
規定の組換え部位での組換えを利用したクローニング系は、米国特許第5,888,732号、同第6,143,557号、同第6,171,861号、同第6,270,969号、および同第6,277,608号にすでに記述されており、これらは参照により具体的に本明細書に組み入れられる。簡単に述べると、本出願および関連出願の節で参照される出願に記述されるGATEWAY(登録商標)クローニングシステムは、バクテリオファージλ系に基づき、野生型(att0)部位から変異した、少なくとも1つおよび好ましくは少なくとも2つの異なる部位特異的組換え部位(例えば、att1およびatt2)を含むベクターを利用する。各変異部位は同じ型の同族パートナーatt部位に対して固有の特異性を持ち(例えば、attB1はattP1と、またはattL1はattR1と)、他の変異型の組換え部位とまたは野生型att0部位とは交差反応しない。組換え部位に挟まれた核酸断片は、デスティネーションベクターと呼ばれることもある受容プラスミド分子上のatt部位の挟む選択可能マーカー(例えばccdB)を置換することにより、GATEWAY(登録商標)システムを用いてクローニングおよびサブクローニングされる。所望のクローンはccdB感受性宿主株の形質転換、および受容分子上のマーカーの陽性選択によって選択される。哺乳類および昆虫におけるチミジンキナーゼ(TK)のように、他の生物体では陰性選択(例えば、毒性遺伝子の使用)のための同様な戦略が使用できる。
【００１４】
att部位のコア領域において特定の残基を変異させることで、数多くの異なるatt部位を生成させることができる。GATEWAY(登録商標)で使用されるatt1およびatt2部位と同様に、さらなる各変異も、同じ変異を持つ同族パートナーatt部位とのみ組換えし、他の任意の変異体または野生型att部位とは交差反応しない固有の特異性を持った新規のatt部位を生成しうる。新規の変異att部位(例えば、attB 1-10、attP 1-10、attR 1-10およびattL 1-10)は、1999年5月28日付で出願された先の米国特許出願第60/136,744号および2000年3月2日付で出願された同第09/517,466号に記述されており、これらの開示全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる。固有の特異性を持った(すなわち、第1の部位はその対応する部位と組換えするが、異なる特異性を持つ第2の部位とは組換えしないまたは実質的に組換えしない)その他の組換え部位が本発明を実践するのに使われてもよい。適当な組換え部位の例には、loxP部位およびloxP511(米国特許第5,851,808号を参照のこと)のような誘導体、frt部位および誘導体、dif部位および誘導体、psi部位および誘導体、ならびにcer部位および誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明はそのような組換え部位を用いて、複数の核酸分子またはセグメントを結合または連結する、より具体的にはそのような複数のセグメントを1つまたは複数の組換え部位を持つ1つまたは複数のベクター(デスティネーションベクターを含む任意のGATEWAY(登録商標)ベクターのような)にクローニングする新規の方法を提供する。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、一つには、少なくとも1つのクローニング部位を含む核酸に関する。本発明は同様に、単一のプライマー(例えば、配列決定プライマー、PCRプライマーなど)が両部位に結合できるが、2つまたはそれ以上の結合部位のうち1つに結合した場合に1つまたは複数の機能活性について唯一機能できるような十分な配列同一性を共有する2つまたはそれ以上のプライマー結合部位を含んだ核酸を含む。さらに、2つのプライマー結合部位が存在する場合、これらの部位の一方または両方は(1) クローニング部位の中に含まれてもよく、(2) クローニング部位の全部を含んでもよく、または(3) クローニング部位だけを含み、さらなる核酸を含まなくてもよい。場合によっては、これらのクローニング部位は、プライマーが一方のプライマー結合部位に結合することを可能にするが、他方のプライマー結合部位に結合することを可能にしないプライマー結合部位を含むことができよう。すなわち、特定の態様では、本発明の核酸分子は異なるヌクレオチド配列を有するプライマーが結合できる2つのクローニング部位を含む。多くの場合には、これらのクローニング部位の1つまたは複数は組換え部位とできよう。
【００１６】
本発明は単一のクローニング部位を含んだ核酸分子ならびにそのような核酸分子を分子クローニング過程およびプライマーを利用するその他の過程で使用する方法をさらに含む。
【００１７】
本発明は本発明の核酸分子を分子生物学的過程(例えば、ポリメラーゼを介した増幅、分子クローニング、ベクター構築など)に使用する方法、およびそのような過程によって生じた核酸分子をさらに含む。特定の態様では、本発明は核酸セグメントが1つまたは複数のクローニング部位によって隣接された核酸分子を含む。これらのクローニング部位は、プライマーが結合できる1つまたは複数のヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の態様では、これらの核酸分子は異なるプライマーが結合できるクローニング部位を含むことができよう。いくつかの態様では、単一のプライマーは両方のプライマー結合部位に結合できるが、このプライマーが2つのプライマー結合部位のうち1つだけに結合した場合に、特定の活性について唯一機能することができよう。
【００１８】
本発明は本明細書に記述される核酸分子を含んだ、反応混合物などの、組成物をさらに含む。これらの反応混合物は1つまたは複数の本発明の核酸分子に加えて、以下の成分の1つまたは複数を含んでもよい: (1) 1つまたは複数のプライマー(例えば、1つまたは複数の配列決定プライマー、1つまたは複数のPCRプライマーなど)、(2) 1つまたは複数の緩衝液(例えば、Tris-HCl、リン酸三ナトリウムなど)、(3) 1つまたは複数のヌクレオチド(例えば、ATP、UTP、CTP、GTP、TTPなど)、(4) 1つまたは複数の酵素(例えば、1つまたは複数のポリメラーゼ)、(5) 1つまたは複数のさらなる成分。
【００１９】
特定の態様では、本発明は
(a) 核酸セグメントの全部または一部に隣接し両端からの核酸セグメントの配列決定を可能にする配列決定プライマー結合部位を含んだ産物核酸分子の生成をもたらす組換え反応を核酸セグメントに対し行う段階;
(b) 配列決定プライマーが産物核酸分子のプライマー結合部位の両方にハイブリダイズするのを可能にする条件の下で(a)の産物核酸分子を配列決定プライマーとハイブリダイズさせる段階; および
(c) 配列決定反応を行う段階を含み、
配列決定プライマーは両方のプライマー結合部位に結合できるが、2つのプライマー結合部位のうち1つに結合した場合にだけ5'から3'への伸長を媒介する、
核酸セグメントの全部または一部を配列決定する方法を含む。
【００２０】
特定の態様では、(a)の組換え反応はヌクレオチド配列の異なる2つの核酸分子の間で起こる。特定の場合には、核酸分子が両方とも環状である。その他の場合には、2つの核酸分子の各々が2つの組換え部位を含む場合、各個別の核酸分子にある2つの組換え部位が多くは実質的に互いとは組換えを起こさず、核酸分子の一方にある2つの組換え部位の各々が他方の核酸分子にある組換え部位の少なくとも一方と適当な条件の下で組換えを起こすことができる。
【００２１】
特定の場合、組換え部位の1つまたは複数が以下からなる群より選択される: (a) attB部位、(b) attP部位、(c) attL部位、(d) attR部位、(e) lox部位、(f) psi部位、(g) dif部位、(h) cer部位、および(i) frt部位、ならびに、多くの場合、組換えを起こす能力を保持している(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)または(i)の組換え部位の変異体、変種、および誘導体。
【００２２】
多くの場合には、本発明の方法および/または組成物を形成するのに使用される核酸分子の一方が2つのattB組換え部位を含むことができ、他方の核酸分子が2つのattP組換え部位を含むことができよう。さらに、そのような態様では2つの配列決定プライマー結合部位がattP部位の中に位置してもよい。
【００２３】
場合によっては、上におよび本明細書の別の箇所に記述されている、(a)の産物核酸分子はattL組換え部位によって隣接された核酸セグメントを含んでもよい。そういった場合には、および本発明の他の態様では、2つの配列決定プライマー結合部位がattL部位の中に位置してもよい。
【００２４】
プライマー結合部位(例えば、配列決定プライマー結合部位)がattP組換え部位またはattL組換え部位の全部または一部の中にある場合、このプライマー結合はIHF部位の全部または一部を含んでもよい(図4を参照のこと)。
【００２５】
2つのプライマー結合部位が同じ核酸分子内に位置する場合、これらのプライマー結合部位は1、2、3、または4ヌクレオチドだけ異なってもよい。多くの場合には、2つの配列決定プライマー結合部位が2以上のヌクレオチドだけ異なる場合、異なるヌクレオチドは相互に隣接して位置する。
【００２６】
本発明の方法および組成物で使用されるプライマーは、長さが12から40、10から60、15から60、20から60、20から40、25から60、25から40、および35から60ヌクレオチドの間を含めて、任意の長さのものであってよい。
【００２７】
多くの場合(例えば、核酸セグメントの全部または一部のヌクレオチド配列を決定しようとする場合)には、少なくとも一方のプライマー結合部位は核酸セグメントの近くに位置するはずである。隣接するプライマー結合部位が核酸セグメントの各端に存在する場合、これらのプライマー結合部位の一方または両方が核酸セグメントの近くに位置することが多いはずである。核酸セグメントに対するプライマー結合部位の位置は、これらの核酸セグメントの全部または一部を配列決定しようとする場合には特に関係がある。これは、核酸セグメントに到達する前に、通常は、比較的少数(例えば、5から10)のヌクレオチドを配列決定することが望ましいからである。これが通常は望ましいという理由は、ヌクレオチド配列データからは、プライマー結合部位から離れた限られた数のヌクレオチドを決定できるだけであるからである。その一方で、核酸セグメントの始まりに当たる配列データを同定できるように、核酸セグメントに到達する前に、少なくともある短いヌクレオチドストレッチの配列を決定することが好都合なことが多い。多くの場合には、プライマー結合部位は配列決定される核酸セグメントより5から100、10から100、20から100、30から100、40から100、50から100、60から100、70から100、80から100、5から80、10から80、20から80、30から80、40から80、50から80、60から80、70から80、5から70、10から70、20から70、30から70、40から70、50から70、60から70、5から60、10から60、20から60、30から60、40から60、50から60、5から50、10から50、20から50、30から50、40から50、5から30、10から30、20から30、35から45、25から55、または35から55ヌクレオチドに位置するはずである。例えば、トポイソメラーゼ(本明細書では「TOPO」とも称される)を介した連結反応を利用して、プライマー結合部位も含むクローニング部位に核酸セグメントを連結する場合、固有のプライマー部位はトポイソメラーゼ認識部位の35から45塩基対の範囲内であることが多いはずである。プライマー結合部位を含むクローニング部位がattL組換え部位である場合、多くの場合には、プライマー結合部位はattLアーム内にあるはずである。
【００２８】
本発明は同様に、
(a) 核酸セグメントの全部または一部に隣接し両端からの核酸セグメントの配列決定を可能にする配列決定プライマー結合部位を含んだ産物核酸分子の生成をもたらす組換え反応を核酸セグメントに対し行う段階;
(b) 第1の配列決定プライマーが産物核酸分子のプライマー結合部位の両方にハイブリダイズするのを可能にする条件の下で(a)の産物核酸分子の第1の小部分(subportion)を第1の配列決定プライマーと接触させる段階; および
(c) 配列決定反応を行う段階を含み、
第1の配列決定プライマーは両方のプライマー結合部位に結合するが、2つの結合部位のうち1つに結合した場合にだけ5'から3'への伸長を媒介する、
核酸セグメントの全部または一部を配列決定する方法を含む。
【００２９】
関連する態様では、本発明は上記に加えて、以下の段階をさらに含む方法を提供する:
(e) 第2の配列決定プライマーが産物核酸分子のプライマー結合部位にハイブリダイズするのを可能にする条件の下で(a)の産物核酸分子の第2の小部分を第2の配列決定プライマーと接触させる段階; および
(f) 配列決定反応を行う段階、
その際に第2の配列決定プライマーは両方のプライマー結合部位に結合するが、2つの結合部位のうち1つに結合した場合にだけ5'から3'への伸長を唯一媒介し、このプライマー結合部位は第1の配列決定プライマーが5'から3'への伸長を媒介する核酸セグメントの反対端に位置する。
【００３０】
特定の態様では、第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーは各々長さが15から45ヌクレオチドの間である。さらに、第1プライマーおよび第2プライマーの長さは互いに無関係であってよい。換言すれば、第1プライマーは長さが32ヌクレオチドであってよく、第2プライマーは長さが29ヌクレオチドであってよい。
【００３１】
さらに、第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーはヌクレオチド配列がお互いと任意数のヌクレオチド(例えば、1、2、3、または4ヌクレオチド)だけ異なってもよい。
【００３２】
特定の態様では、第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーはヌクレオチド配列がその5'または3'末端でまたはその付近で(例えば、3ヌクレオチドの範囲内で)異なってもよい。多くの場合には、第1プライマーおよび第2プライマーはその3'末端で1、2、3、4または5ヌクレオチドのヌクレオチド配列が異なるはずである。特定の場合には、第1プライマーと第2プライマーとの間の相違は全て同じ領域に局在化することができる(例えば、2つのプライマーが2以上のヌクレオチドだけ異なる場合、異なるヌクレオチドの全てが互いに隣接してもよい)。
【００３３】
本発明の特定の方法および組成物では、第1の配列決定プライマーはヌクレオチド配列
2007512838.tif 000002
を含み、第2の配列決定プライマーはヌクレオチド配列
2007512838.tif 000003
を含む。本発明はこれらのヌクレオチド配列を含んだ核酸分子をさらに含む。
【００３４】
本発明は同様に、核酸分子が
(a) 第1の組換え部位および第2の組換え部位、
(b) 第1および第2の組換え部位の間に位置する核酸セグメント、ならびに
(c) ヌクレオチド配列の異なる2つのプライマー結合部位に結合できるプライマーを含み、
一方のプライマー結合部位が第1の組換え部位の中に位置し、他方のプライマー結合部位が第2の組換え部位の中に位置する、
単離された核酸分子(例えば、プラスミドなどのベクター)を含む組成物を提供する。
【００３５】
特定の場合には、これらの組成物中に存在する核酸分子はプライマーが結合するプライマー結合部位を除いて一本鎖である。さらに、これらの核酸分子を含む組成物中に存在する2つの異なるプライマー結合部位は、ヌクレオチド配列が1、2、3、または4ヌクレオチドだけ相互と異なってもよい。
【００３６】
本発明は本明細書に記述される本発明の組成物および以下からなる群より選択される1つまたは複数の成分を含んだ、反応混合物をさらに含む:
(a) 1つまたは複数のヌクレオチド三リン酸、
(b) 1つまたは複数のポリメラーゼ、
(c) 1つまたは複数のデオキシヌクレオチド三リン酸、および
(d) 少なくとも1つのジデオキシヌクレオチド三リン酸。
【００３７】
本発明はヌクレオチド配列5'GAAAATATTG3'(SEQ ID NO: 3)を含んだ核酸分子(例えば、単離された核酸分子)をさらに含む。このような核酸分子はベクター(例えば、プラスミド)であってもよい。このような核酸分子の一例は、図3に図式的に示されているベクターpCR2.1 EcoRI/RVである。これらの単離された核酸分子は、例えば、プラスミドなどのベクターであってもよい。
【００３８】
本発明は同様に、本発明の方法を実践するおよび/または本発明の組成物を含むキットを含む。ある種の態様では、本発明のキットは核酸分子が以下を含む、単離された核酸分子を含む:
(a) 第1の組換え部位および第2の組換え部位、
(b) 第1および第2の組換え部位の間に位置する核酸セグメント、ならびに
(c) ヌクレオチド配列の異なる2つのプライマー結合部位に結合できるプライマー、
【００３９】
その際に一方のプライマー結合部位が第1の組換え部位の中に位置し、他方のプライマー結合部位が第2の組換え部位の中に位置する。
【００４０】
本発明のキットは同様に、以下からなる群より選択される1つまたは複数の成分を含んでもよい:
(a) 1つまたは複数のヌクレオチド(ATP、CTP、TTP、GTP、UTPなどの1つまたは複数のヌクレオチド三リン酸)、
(b) 1つまたは複数のポリメラーゼ、
(c) 1つまたは複数のデオキシヌクレオチド(例えば、1つまたは複数のデオキシヌクレオチド三リン酸)、
(d) 少なくとも1つのジデオキシヌクレオチド(例えば、少なくとも1つのジデオキシヌクレオチド三リン酸)、
(e) 1つまたは複数の緩衝液、
(f) 1つまたは複数のさらなるプライマーまたはその他の核酸分子、および
(g) 1つまたは複数の取扱説明書のセット。
【００４１】
これらの取扱説明書は、例えば、本明細書に記述される方法(例えば、核酸セグメントを配列決定する方法)でキット成分を使用する方法を記述してもよい。
【００４２】
本発明は、本発明のキットから分離される取扱説明書をさらに提供する。このような取扱説明書は印刷された用紙であってもなくてもよい。ある種の態様では、本発明は本明細書に記述される方法を実施するためのおよび/または組成物を調製するための取扱説明書を提供し、これらの取扱説明書は印刷された用紙である。換言すれば、本発明は印刷された取扱説明書を含んだ組成物を含む。これらの取扱説明書は、例えば、ブックレットまたはパンフレットの形態であってもよい。さらに、これらの取扱説明書は本発明の方法を実施する方法および/または本発明の組成物を調製する方法に関する段階的な指導書を提供してもよい。
【００４３】
本発明のその他の態様は当技術分野において知られていることに照らして、以下の図面および発明の説明に照らして、ならびに特許請求の範囲に照らして当業者には明らかであろう。
【００４４】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明において、組換え核酸技術に使用される数多くの用語は広範に使用される。このような用語が与えられる範囲を含めて、明細書および特許請求の範囲の明確な且つさらに一貫した理解を実現するために、以下の定義を示す。
【００４５】
本明細書で用いられる以下のものは、タンパク質に一般に見られる20種の天然に存在するアミノ酸のセットならびに各アミノ酸と関連する1文字および3文字表記である。
2007512838.tif 000004
【００４６】
遺伝子: 本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、または非翻訳RNA(例えば、rRNA、tRNA、アンチセンスRNA)の発現に必要な情報を含む核酸のことをいう。遺伝子がタンパク質をコードする場合、その遺伝子はプロモーターおよび構造遺伝子読み取り枠配列(ORF)、ならびにタンパク質の発現に関与するその他の配列を含む。遺伝子が非翻訳RNAをコードする場合、その遺伝子はプロモーターおよび非翻訳RNAをコードする核酸を含む。
【００４７】
構造遺伝子: 本明細書で用いられる「構造遺伝子」という語句は、伝令RNAに転写され、これが特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳される核酸のことをいう。
【００４８】
クローニング部位: 本明細書で用いられる「クローニング部位」という用語は、核酸分子を別の核酸分子に連結するのに使用できる核酸分子中の特定の位置をいう。クローニング部位の例には制限エンドヌクレアーゼ認識部位、組換え部位、トポイソメラーゼ認識部位、および適切な場合、核酸分子の「付着端」(例えば、3'末端のチミジン突出、3'末端のアデニン突出など)が含まれる。クローニング部位としては、連続15ヌクレオチドの領域内に4つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位の群を含むマルチクローニング部位(MCS)が挙げられる。
【００４９】
宿主: 本明細書で用いられる「宿主」という用語は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意の核酸分子の受容体である、任意の原核生物または真核生物(例えば、哺乳類、昆虫、酵母、植物、鳥類、動物など)のことをいう。核酸分子は対象とする配列、転写調節配列(プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、および同様のものなどの)および/または複製起点を含むことができるが、これらに限定されることはない。本明細書で用いられる「宿主」、「宿主細胞」、「組換え宿主」および「組換え宿主細胞」という用語は同義的に使用される。このような宿主の例としては、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。
【００５０】
転写調節配列: 本明細書で用いられる「転写調節配列」という語句は、(1) 1種もしくは複数(例えば、2、3、4、5、7、10など)種の構造遺伝子の伝令RNAへのまたは(2) 1種もしくは複数種の遺伝子の非翻訳RNAへの転写を調節するように作用する、核酸分子上に任意の配置または配列で含まれる機能的なヌクレオチドのストレッチのことをいう。転写調節配列の例にはプロモーター、エンハンサー、リプレッサー、オペレーター(例えば、tetオペレーター)および同様のものが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５１】
プロモーター: 本明細書で用いられるプロモーターとは転写調節配列の一例であり、具体的には、開始コドンまたは非翻訳RNAをコードする核酸の近傍に位置する遺伝子の5'領域と一般的に記述される核酸である。隣接する核酸セグメントの転写はプロモーターからまたはその近くから開始される。抑制性プロモーターの転写速度は抑制剤に応答して低下する。誘導性プロモーターの転写速度は誘導剤に応答して増加する。構成性プロモーターの転写速度は特に制御されないが、これは一般的な代謝条件の影響下で変化することがある。
【００５２】
挿入断片供与体: 本明細書で用いられる「挿入断片供与体」という語句は、挿入断片を保有する本発明の2つの親核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)の1つのことをいう(図1を参照のこと)。挿入断片供与体分子は組換え部位と両側で隣接した挿入断片を含む。挿入断片供与体は直鎖状または環状とすることができる。本発明の1つの態様では、挿入断片供与体は任意でスーパーコイル状の、環状核酸分子であり、さらにクローニングベクターの配列を組換えシグナルの外側に含む。挿入断片の集団または核酸セグメントの集団を用いて挿入断片供与体を作出する場合には、挿入断片供与体の集団が生じることになり、これが本発明によって使われてもよい。
【００５３】
挿入断片: 本明細書で用いられる「挿入断片」という用語は、より大きな核酸分子の一部である望ましい核酸セグメントのことをいう。多くの場合、挿入断片はより大きな核酸分子に導入されるはずである。例えば、図1でAとラベル付けされている核酸セグメントは、同図に示されるさらに大きな核酸分子(Bとラベル付けされている)に対する挿入断片である。ほとんどの場合、挿入断片は組換え部位、トポイソメラーゼ部位および/またはその他の認識配列によって隣接されるはずである(例えば、少なくとも1つの認識配列がそれぞれの端に位置するはずである)。しかしながら、ある種の態様では、挿入断片は認識配列を一端に含むだけであろう。
【００５４】
産物: 本明細書で用いられる「産物」という用語は、組換えクローニング過程中の第2の組換え事象後に産生される、A配列およびD配列を含んだ望ましい娘分子の1つのことをいう(図1を参照のこと)。産物は、クローニングまたはサブクローニングされた核酸を含む。本発明によれば、挿入断片供与体の集団が使われる場合には、得られる産物分子の集団は挿入断片供与体の挿入断片の集団を全部または一部含むはずであり、多くの場合、挿入断片供与体のオリジナル分子の代表的集団を含むはずである。
【００５５】
副産物: 本明細書で用いられる「副産物」という用語は、クローニングされるまたはサブクローニングされることが望まれるセグメントを欠いた娘分子(組換えクローニング過程中の第2の組換え事象後に産生される新たなクローン)のことをいう。
【００５６】
共挿入体: 本明細書で用いられる「共挿入体」という用語は、両方の親(開始)分子を含んだ本発明の少なくとも1つの組換え中間体核酸分子のことをいう。共挿入体は直鎖状または環状であってもよい。RNAおよびポリペプチドは適切な宿主細胞株、例えば、大腸菌DB3.1 (具体的には大腸菌LIBRARY EFFICIENCY(登録商標)DB3.1(商標)コンピテント細胞)を用い、共挿入体分子上に見られる両者の選択可能なマーカーで選択し、共挿入体から発現されてもよい。
【００５７】
認識配列: 本明細書で用いられる「認識配列」または「認識部位」という語句は、タンパク質、化合物、DNA、またはRNA分子(例えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、トポイソメラーゼ、またはリコンビナーゼ)が認識し結合する特定の配列のことをいう。本発明のいくつかの態様では、認識配列とは組換え部位またはトポイソメラーゼ部位のことをいうこともできる。例えば、Creリコンビナーゼの認識配列は、8塩基対のコア配列に隣接する13塩基対の2つの逆方向反復(リコンビナーゼ結合部位として働く)を含む、34塩基対配列であるloxPである(Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)の図1を参照のこと)。認識配列のその他の例はattB、attP、attL、およびattR配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識される。attBは2つの9塩基対のコア型Int結合部位および7塩基対の重複領域を含んだ約25塩基対の配列である。attPはコア型Int結合部位およびアーム型Int結合部位、ならびに補助的なタンパク質組込み宿主因子(IHF)、FISおよび除去酵素(Xis)に対する部位を含んだ約240塩基対の配列である(Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照のこと)。そのような部位を本発明によって遺伝子操作して、本発明の方法における産物の産生を促進させてもよい。例えば、そのような遺伝子操作部位が組換え反応を不可逆的にさせるようP1またはH1ドメインを欠いている場合(例えば、attRまたはattP)、このような部位をattR'またはattP'と表して、これらの部位のドメインが何らかの方法で改変されていることを示してもよい。
【００５８】
組換えタンパク質: 本明細書で用いられる「組換えタンパク質」という語句は、1箇所または複数箇所(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50箇所など)の組換え部位を含む組換え反応に関与する除去もしくは組込みタンパク質、酵素、補因子または関連タンパク質を含み、これらは野生型タンパク質(Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照のこと)、または変異体、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質)、断片、およびそれらの変種であってもよい。組換えタンパク質の例としてはCre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、SpCCE1、およびParAが挙げられる。
【００５９】
リコンビナーゼ: 本明細書で用いられる「リコンビナーゼ」という用語は、組換え反応において鎖切断および再連結を触媒するタンパク質を指して使われる。部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物体(例えば、ウイルスおよび細菌)に存在するタンパク質であり、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼの両方の性質を有するという特徴を持つ。これらのリコンビナーゼ(場合によっては関連タンパク質とともに)は、核酸分子中の特異的な塩基配列を認識し、これらの配列に隣接する核酸セグメントを交換する。リコンビナーゼおよび関連タンパク質は、総称して「組換えタンパク質」と呼ばれる(例えば、Landy, A.、Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照のこと)。
【００６０】
種々の生物体由来の多くの組換え系が報告されている。例えば、Hoessら、Nucleic Acids Research 14(6):2287 (1986); Abremskiら、J. Biol. Chem. 261(1):391 (1986); Campbell, J. Bacteriol. 174(23):7495 (1992); Qianら、J. Biol. Chem. 267(11):7794 (1992); Arakiら、J. Mol. Biol. 225(1):25 (1992); MaeserおよびKahnmann、Mol. Gen. Genet. 230:170-176 (1991); Espositoら、Nucl. Acids Res. 25(18):3605 (1997)を参照されたい。これらの多くはリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する(Argosら、EMBO J. 5:433-440 (1986); Voziyanovら、Nucl. Acids Res. 27:930 (1999))。これらの中で最もよく研究されているのは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系(Landy, A.、Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699-707 (1993))、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系(HoessおよびAbremski (1990) Nucleic Acids and Molecular Biology、第4巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag、pp90-109)、およびサッカロミセス・セレビジエ2μ環状プラスミド由来のFLP/FRT系(Broachら、Cell 29:227-234 (1982))であろう。
【００６１】
組換え部位: 本明細書で用いられる「組換え部位」という語句は、組換えタンパク質による組込み/組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列のことをいう。組換え部位は組込みまたは組換えの最初の段階で、部位特異的な組換えタンパク質が認識し結合する、関与する核酸分子上で別個の核酸の部分またはセグメントである。例えば、Creリコンビナーゼの組換え部位はloxPであり、これは8塩基対のコア配列を挟む2つの13塩基対の逆向き反復配列(リコンビナーゼの結合部位となる)からなる34塩基対の配列である(Sauer, B.、Curr. Opin. Biotech. 5:521-527 (1994)の図1を参照のこと)。認識部位の他の例には、全て参照により具体的に本明細書に組み入れられる、1999年5月28日付で出願された米国仮特許出願第60/136,744号および2000年3月9日付で出願された同第60/188,000号に、ならびに同時係属中の米国特許出願第09/517,466号および同第09/732,91号に記述されているattB、attP、attLおよびattR配列、ならびに認識タンパク質λ Intによっておよび補助的なタンパク質組込み宿主因子(IHF)、FISや除去酵素(Xis)によって認識される、それらの変異体、断片、変種および誘導体が含まれる(Landy、Curr. Opin. Biotech. 3:699-707 (1993)を参照のこと)。
【００６２】
組換え部位はあらゆる公知の方法によって分子に付加されてもよい。例えば、組換え部位は平滑末端連結反応により、完全にもしくは部分的にランダムプライマーで行われるPCRにより、または組換え部位が隣接した制限部位を用いてベクターに核酸分子を挿入することにより核酸分子に付加することができる。
【００６３】
単離された: 本明細書で用いられる「単離された」という用語は、分子に言及して使用される場合には、分子が自然界に存在する形態以外の形態にあることを意味する。一般に、単離された核酸分子は、例えば、細胞中のゲノムの一部ではない、またはその核酸分子を通常含んだ細胞から物理的に分離された任意の核酸分子とすることができる。もちろん、細胞のゲノム内に挿入された核酸分子は、この核酸分子がそのゲノム中にまたはそのゲノム中のその特定の位置に天然には見られなければ「単離されて」いる。本発明の各種の組成物は単離された核酸分子の混合物を含むと認識されるべきである。このように、「単離された」という用語は、単に分子のその天然状態からの単離に関して用いられるだけであり、その分子が、存在する唯一の構成成分であることを示唆するものではないことが理解されよう。
【００６４】
トポイソメラーゼ認識部位: 本明細書で用いられる「トポイソメラーゼ認識部位」または「トポイソメラーゼ部位」という用語は、部位特異的トポイソメラーゼによって認識され、結合される規定されたヌクレオチド配列を意味する。例えば、ヌクレオチド配列5'-(C/T)CCTT-3'は、ワクシニアウイルスDNAトポイソメラーゼIを含めて、ほとんどのポックスウイルストポイソメラーゼによって特異的に結合され、認識部位の最も3'端のチミジンの下流の鎖を切断して、5'-(C/T)CCTT-PO4-TOPOを含むヌクレオチド配列、すなわち、トポイソメラーゼのチロシン残基を介して3'リン酸塩に共有結合したトポイソメラーゼの複合体を産生することができるトポイソメラーゼ認識部位である(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Shuman, J. Biol. Chem. 266:11372-11379, 1991; SekiguchiおよびShuman, Nucl. Acids Res. 22:5360-5365, 1994を参照のこと; 同じく参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,766,891号; PCT/US95/16099号; およびPCT/US98/12372号も参照のこと)。これと比較して、ヌクレオチド配列5'-GCAACTT-3'は、IA型大腸菌トポイソメラーゼIIIのトポイソメラーゼ認識部位である。
【００６５】
組換えクローニング: 本明細書で用いられる「組換えクローニング」という語句は、核酸分子のセグメントまたはそのような分子の集団がインビトロでまたはインビボで交換される、挿入される、取り替えられる、置換されるまたは改変される、米国特許第5,888,732号、同第6,143,557号、同第6,171,861号、同第6,270,969号および同第6,277,608号(これらの内容は参照により完全に本明細書に組み入れられる)に記述されているものなどの、方法のことをいう。多くの場合、クローニング方法はインビトロの方法である。
【００６６】
規定の組換え部位での組換えを利用したクローニング系は、全てInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAに帰属する、米国特許第5,888,732号、米国特許第6,143,557号、米国特許第6,171,861号、米国特許第6,270,969号および米国特許第6,277,608号に、ならびに2000年3月2日付で出願された係属中の米国特許出願第09/517,466号に、および公表された米国特許出願第20020007051-A1号にすでに記述されており、これらの開示はその全体が具体的に本明細書に組み入れられる。簡単に述べると、これらの特許および特許出願に記述されるGateway(登録商標)クローニングシステムは、所望の核酸分子をインビボでまたはインビトロでクローニングするための少なくとも1つの組換え部位を含むベクターを利用する。いくつかの態様では、この系はバクテリオファージλ系に基づくことができる、野生型(att0)部位から変異した、少なくとも2つの異なる部位特異的組換え部位(例えば、att1およびatt2)を含むベクターを利用する。各変異部位は同じ型の同族パートナーatt部位(すなわち、結合パートナー組換え部位)に対して固有の特異性を持ち(例えば、attB1はattP1と、またはattL1はattR1と)、他の変異型の組換え部位とまたは野生型att0部位とは交差反応しない。異なる部位特異性によって、望ましい分子の方向性のクローニングまたは連結が可能となり、したがって望ましい方向のクローニング分子を供与することができる。組換え部位に挟まれた核酸断片は、デスティネーションベクターと呼ばれることもある受容プラスミド分子上のatt部位の挟む選択可能マーカー(例えばccdB)を置換することにより、Gateway(登録商標)システムを用いてクローニングおよびサブクローニングされる。所望のクローンはccdB感受性宿主株の形質転換、および受容分子上のマーカーの陽性選択によって選択される。哺乳類および昆虫におけるチミジンキナーゼ(TK)のように、他の生物体では陰性選択(例えば、毒性遺伝子の使用)のための同様な戦略が使用できる。
【００６７】
att部位のコア領域において特定の残基を変異させることで、数多くの異なるatt部位を生成させることができる。Gateway(登録商標)で使用されるatt1およびatt2部位と同様に、さらなる各変異も、同じ変異を持つ同族パートナーatt部位とのみ組換えし、他の任意の変異体または野生型att部位とは交差反応しない固有の特異性を持った新規のatt部位を生成しうる。新規の変異att部位(例えば、attB 1-10、attP 1-10、attR 1-10およびattL 1-10)は、2000年3月2日付で出願された先の米国特許出願第09/517,466号に記述されており、この出願は参照により具体的に本明細書に組み入れられる。固有の特異性を持った(すなわち、第1の部位はその対応する部位と組換えするが、異なる特異性を持つ第2の部位とは組換えしないまたは実質的に組換えしない)その他の組換え部位が本発明を実践するのに使われてもよい。適当な組換え部位の例にはloxP部位; loxP部位の変異体、変種またはloxP511(米国特許第5,851,808号を参照のこと)のような誘導体; frt部位; frt部位の変異体、変種または誘導体; dif部位; dif部位の変異体、変種または誘導体; psi部位; psi部位の変異体、変種または誘導体; cer部位; およびcer部位の変異体、変種または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００６８】
抑制カセット: 本明細書で用いられる「抑制カセット」という語句は、サブクローニングベクター中に存在するリプレッサーまたは選択可能なマーカーを含んだ核酸セグメントのことをいう。
【００６９】
選択可能なマーカー: 本明細書で用いられる「選択可能なマーカー」という語句は、核酸セグメントであって、これを含んだ分子(例えば、レプリコン)もしくは細胞を正もしくは負に選択することを可能とするおよび/または核酸セグメントを含むもしくは含まない細胞もしくは生物体の同定を可能とする核酸セグメントのことをいう。選択および/または同定は特定の条件下で行われ、その他の条件下では行われないことが多い。
【００７０】
マーカーは、以下に限定されることはないが、RNA、ペプチドもしくはタンパク質の産生などの活性をコードすることができ、またはRNA、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物もしくは組成物などに対する結合部位を供与することができる。選択可能なマーカーの例には(1) ほかの毒性化合物(例えば、抗生物質)に対する耐性をもたらす産物をコードする核酸セグメント; (2) 受容細胞において別の方法によって欠損している産物をコードする核酸セグメント(例えば、tRNA遺伝子、栄養要求性マーカー); (3) 遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント; (4) 容易に同定できる産物をコードする核酸セグメント(例えば、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー); (5) 別の方法で細胞の生存および/または機能にとって有害となる産物に結合する核酸セグメント; (6) 上記の1番〜5番に記載する核酸セグメントのいずれかの活性を別の方法で阻害する核酸セグメント(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド); (7) 基質を修飾する産物に結合する核酸セグメント(例えば、制限エンドヌクレアーゼ); (8) 望ましい分子を単離または同定するために使用できる核酸セグメント(例えば、特定のタンパク質結合部位); (9) 別の方法で非機能的とできる特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント(例えば、分子の亜集団のPCR増幅のため); (10) 欠損する場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的にまたは間接的に与える核酸セグメント; および/または(11) 受容細胞において毒性である産物(例えば、ジフテリア毒素)もしくは比較的毒性のない化合物を毒性化合物に変換する産物(例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ)をコードする核酸セグメント、(12) 核酸セグメントを含んだ核酸分子の複製、分割または遺伝力を阻害する核酸セグメント; および/または(13) 条件付き複製機能、例えば、ある種の宿主もしくは宿主細胞でのまたはある種の環境条件(例えば、温度、栄養条件など)の下での複製をコードする核酸セグメントが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００７１】
選択および/または同定は当技術分野において周知の技術を用いて達成されてもよい。例えば、選択可能なマーカーはほかの毒性化合物に対する耐性を与えてもよく、選択は宿主細胞の集団を毒性化合物と、選択可能なマーカーを含んだそれらの宿主細胞だけが生存できる条件の下で接触させることによって達成されてもよい。別の例では、選択可能なマーカーはほかの良性化合物に対する感受性を与えてもよく、選択は宿主細胞の集団を良性化合物と、選択可能なマーカーを含まないそれらの宿主細胞だけが生存できる条件の下で接触させることによって達成されてもよい。選択可能なマーカーは適切な条件の選択によって、マーカーを含んでいるまたは含んでいない宿主細胞を同定することを可能としてもよい。1つの局面では、選択可能なマーカーは宿主細胞の視覚スクリーニングによってマーカーの存在することまたは存在しないことを判定可能にしてもよい。例えば、選択可能なマーカーはそれを含んだ細胞の色および/または蛍光の特性を変化させてもよい。この変化は1つまたは複数の化合物の存在下で、例えば、選択可能なマーカーによりコードされるポリペプチドと化合物との間の相互作用(例えば、化合物を基質として用いる酵素反応)の結果として起こってもよい。このような視覚的特性の変化を利用して、選択可能なマーカーを含んだ細胞をそのマーカーを含んでいないものから、例えば、蛍光活性化細胞選別法(FACS)によって物理的に分離することができる。
【００７２】
複数の選択可能なマーカーを同時に使用して、各種の細胞集団を区別してもよい。例えば、本発明の核酸分子は複数の選択可能なマーカーを有してもよく、その1つまたは複数が適当な反応(例えば、組換え反応)によって核酸分子から取り除かれてもよい。反応後、核酸分子は宿主細胞集団に導入されてもよく、選択可能なマーカーの全てを有する核酸分子を含んだそれらの宿主細胞が、1つまたは複数の選択可能なマーカーが取り除かれた(例えば、組換え反応によって)核酸分子を含む宿主細胞と区別されてもよい。例えば、本発明の核酸分子はブラストサイジン耐性マーカーを組換え部位の対の外側におよびβ-ラクタマーゼをコードする選択可能なマーカーを組換え部位の内側に有してもよい。組換え反応および細胞集団への反応混合物の導入後、任意の核酸分子を含む細胞は、細胞集団をブラストサイジンと接触させることにより選択することができる。組換え反応を起こした核酸分子を含むそれらの細胞は、細胞集団を後述の蛍光性β-ラクタマーゼ基質と接触させ、細胞集団の蛍光を観察することによって、未反応の核酸分子を含むものと区別することができる。任意で、望ましい細胞は、例えば、FACSにより望ましくない細胞から物理的に分離されてもよい。
【００７３】
選択スキーム: 本明細書で用いられる「選択スキーム」という語句は、所望の核酸分子またはそれら(具体的には、導入クローンもしくはベクター、目的ベクター、供与体ベクター、発現クローンもしくはベクター、任意の中間体(例えば、共挿入体もしくはレプリコン)および/または副産物を含む混合物由来の産物)を含んだ宿主細胞の選択、濃縮、または同定を可能にする任意の方法のことをいう。1つの局面では、本発明の選択スキームは1つまたは複数の選択可能なマーカーに依る。1つの態様の選択スキームは、組換えクローニングの間に連結されるまたは連結されない少なくとも2つの成分を有する。一方の成分は選択可能なマーカーである。他方の成分は、選択可能なマーカーのインビトロでのもしくはインビボでの発現、または選択可能なマーカーを載せたプラスミドを保有する細胞(または核酸分子、例えば、レプリコン)の生存を制御する。一般に、この制御要素は選択可能なマーカーのリプレッサーまたはインデューサーになるはずであるが、選択可能なマーカーの発現または活性を制御するその他の手段が使われてもよい。リプレッサーまたはアクチベーターのどちらが使用されるかは、当業者には容易に明らかなように、マーカーが正または負の選択用であるかどうか、および種々の核酸セグメントの正確な配列に依存するはずである。いくつかの態様では、選択スキームによって1つまたは複数の望ましい核酸分子(産物などの)だけの選択または濃縮がもたらされる。本明細書で規定されるように、核酸分子を選択する段階は(a) 望ましい核酸分子が存在するかどうか選択するまたは濃縮する段階(「正の選択スキーム」と称される)、および(b) 望ましい核酸分子ではない核酸分子が存在しないように選択するまたは濃縮する段階(「負の選択スキーム」と称される)を含む。
【００７４】
1つの態様では、(逆に実施することができる)選択スキームは3つの形態のうちの1つを取るはずであり、これは図1に関して論述されている。第一に、選択可能なマーカーおよびリプレッサーを用いて本明細書で例示されているように、したがってセグメントDを有し、セグメントCを欠いた分子を選択する。第二は、セグメントCを有する分子を負に選択し、セグメントDを有する分子を正に選択する。第2の形態の可能な態様では、インビトロでの反応産物が導入される細胞にとって毒性がある遺伝子を保有する核酸セグメントを有することができよう。毒性遺伝子は、毒性遺伝産物(毒性タンパク質またはRNA)として発現される核酸であってもよく、またはそれ自体単独で毒性であってもよい(後者の場合には、毒性遺伝子は「遺伝形質」という古典的な定義を有すると理解される)。
【００７５】
このような毒性遺伝子産物の例は当技術分野において周知であり、制限エンドヌクレアーゼ(例えば、DpnI、Nla3など); アポトーシス関連遺伝子(例えば、ASK1またはbcl-2/ced-9ファミリーのメンバー); ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の遺伝子を含めたレトロウイルス遺伝子; NP-1などのデフェンシン; 逆方向反復または対になった回文配列の核酸配列; ΦX174またはバクテリオファージT4由来の遺伝子などのバクテリオファージ溶解遺伝子; rpsLなどの抗生物質感受性遺伝子; pheSなどの抗菌感受性遺伝子、プラスミドキラー遺伝子; GATA-1などの、細菌にとって毒性がある遺伝産物を産生する真核細胞の転写ベクター遺伝子; 抑制機能が存在しない場合に宿主を殺傷する遺伝子、例えば、kicB、ccdB、ΦX174 E (Liu, Q., et al., Curr. Biol. 8:1300-1309 (1998)); レプリコンの安定性および/または複製に負に影響するその他の遺伝子が含まれるが、これらに限定されることはない。または、毒性遺伝子はインビトロで、例えば、制限部位で選択可能とすることができる。
【００７６】
誘導性プロモーターに作動可能に連結された制限エンドヌクレアーゼをコードする多くの遺伝子は公知であり、本発明に使用することができる(例えば、米国特許第4,960,707号(DpnIおよびDpnII); 同第5,082,784号および同第5,192,675号(KpnI); 同第5,147,800号(NgoAIIIおよびNgoAI); 同第5,179,015号(FspIおよびHaeIII): 同第5,200,333号(HaeIIおよびTaqI); 同第5,248,605号(HpaII); 同第5,312,746号(ClaI); 同第5,231,021号および同第5,304,480号(XhoIおよびXhoII); 同第5,334,526号(AluI); 同第5,470,740号(NsiI); 同第5,534,428号(SstI/SacI); 同第5,202,248号(NcoI); 同第5,139,942号(NdeI); ならびに同第5,098,839号(PacI)を参照のこと。(同様にWilson, G.G., Nucl. Acids Res. 19:2539-2566 (1991); およびLunnen, K.D., et al., Gene 74:25-32 (1988)を参照のこと)。
【００７７】
第2の形態では、セグメントDは選択可能なマーカーを保有する。毒性遺伝子によってベクター供与体、共挿入体、および副産物分子を保有する形質転換体は排除されるはずであるが、一方で選択可能なマーカーを使用して、産物を含む細胞を正に選択し、挿入断片供与体だけを保有する細胞を負に選択することができる。
【００７８】
第3の形態では、同一分子上にセグメントAとDの両方をcisで有する細胞は選択されるが、両セグメントを異なる分子上にtransで有する細胞は選択されない。2個の不活性な断片に分割されており、この各1個ずつがセグメントAおよびDに存在する選択可能なマーカーによって、これは具現化することができよう。
【００７９】
セグメントが組換え事象によって接合される場合には、それらが機能的な選択可能マーカーを再構成するように、断片は組換え部位に対して配列される。例えば、組換え事象はプロモーターを構造核酸分子(例えば、遺伝子)と連結可能とし、構造核酸分子の2つの断片を連結可能とし、または生存に必要なヘテロ二量体遺伝産物をコードする核酸分子を連結可能とし、またはレプリコンの一部を連結可能とする。
【００８０】
部位特異的リコンビナーゼ: 本明細書で用いられる「部位特異的リコンビナーゼ」という語句は、典型的には少なくとも以下の4つの活性(またはその組合せ)を有するある種のリコンビナーゼのことをいう: (1) 特異的な核酸配列の認識; (2) 前記配列の切断; (3) 鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性; および(4) 切断された核酸の鎖を再閉するリガーゼ活性(Sauer, B., Current Opinions in Biotechnology 5:521-527 (1994)を参照のこと)。保存性の部位特異的な組換えは、両パートナーに対する高度の配列特異性による相同的な組換えおよび転位とは区別される。鎖交換の機序はDNA合成の非存在下での特異的な核酸配列の切断と再結合を含む(Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949)。
【００８１】
相同的な組換え: 本明細書で用いられる「相同的な組換え」という語句は、類似のヌクレオチド配列を有する核酸分子が結合しヌクレオチド鎖を交換する過程のことをいう。第2核酸分子の所定の位置での相同的な組換えに関与するのに有効な第1核酸分子のヌクレオチド配列はしたがって、第1核酸分子と第2核酸分子の規定の位置との間のヌクレオチド鎖の交換を促すヌクレオチド配列を有するはずである。すなわち、第1核酸は一般に、第2核酸分子の一部分に対しヌクレオチド塩基対合を促進するのに十分に相補的なヌクレオチド配列を有するはずである。本発明の核酸分子は相同的なまたは非相同的な組換えによって宿主細胞ゲノムに挿入されてもよい。
【００８２】
相同的な組換えは2つの再結合パートナー核酸において相同的な配列を必要とするが、いずれかの特定の配列を必要とはしない。前述のとおり、例えば、att部位などの組換え部位で起こる部位特異的組換えは、その語句が本明細書で使われる場合、「相同的な組換え」であるとは考えられない。
【００８３】
ベクター: 本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、有用な生物学的または生化学的特性を挿入断片に供与する核酸分子(例えば、DNA)のことをいう。例としてはプラスミド、ファージ、自己複製配列(ARS)、セントロメア、およびインビトロでまたは宿主細胞で複製することまたは複製されることが可能な、あるいは宿主細胞内で望ましい核酸セグメントを望ましい位置に運搬可能なその他の配列が挙げられる。ベクターは1箇所または複数箇所の認識部位(例えば、2、3、4、5、7、10箇所などの組換え部位、制限部位、および/またはトポイソメラーゼ部位)を有することが可能であり、その部位でベクターの生物学的必須機能を失わずに測定可能な様式で配列を操作することができ、その部位の中で核酸断片をその複製およびクローニングをもたらすようにスプライシングすることができる。ベクターはプライマー部位(例えばPCR用の)、転写および/または翻訳の開始および/または調節の部位、組換えシグナル、レプリコン、選択可能なマーカーなどをさらに供与することができる。明らかに、組換え、転位または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸断片を挿入する方法(以下に限定されることはないが、PCR断片のウラシルN-グリコシラーゼ(UDG)クローニング(米国特許第5,334,575号および同第5,888,795号、このどちらも全体が参照により本明細書に組み入れられる)、T:Aクローニング、および同様のものなどの)を利用して、本発明によって使用されるクローニングベクターの中に断片をクローニングすることもできる。クローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換した細胞の同定に用いるのに適した1種または複数種(例えば、2、3、4、5、7、10種など)の選択可能なマーカーをさらに含むことができる。
【００８４】
サブクローニングベクター: 本明細書で用いられる「サブクローニングベクター」という語句は、多くの場合、適当なレプリコンを含む、環状または直鎖状核酸分子を含んだクローニングベクターのことをいう。本発明では、サブクローニングベクター(図1のセグメントD)は、最終産物の中に組み込まれて、クローニングされた核酸挿入断片に対してまたはそれと共に作用することが望ましい機能要素および/または調節要素(図1のセグメントA)を含むこともできる。サブクローニングベクターは選択可能なマーカー(例えば、DNA)を含むこともできる。
【００８５】
ベクター供与体: 本明細書で用いられる「ベクター供与体」という語句は、望ましい産物の一部となる核酸ベクターを含んだ核酸セグメントを保有する、本発明の2つの親核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)の1つのことをいう。ベクター供与体は、組換え部位が隣接するサブクローニングベクターD(または、挿入断片供与体がクローニングベクターを含んでいなければ、これはクローニングベクターと呼ぶことができる)およびセグメントCを含む(図1を参照のこと)。セグメントCおよび/またはDは、選択スキームについて前述したとおり、所望の産物である娘分子の選択に寄与する要素を含むことができる。組換えシグナルは同じものであってもまたは異なるものであってもよく、同じまたは異なるリコンビナーゼによる作用を受けてもよい。さらに、ベクター供与体は直鎖状または環状であってもよい。
【００８６】
プライマー: 本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、核酸分子(例えば、DNA分子)の増幅または重合の間にヌクレオチド単量体の共有結合によって伸長されうる一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドのことをいう。1つの局面では、プライマーはシークエンシングプライマー(例えば、ユニバーサルシークエンシングプライマー)であってもよい。別の局面では、プライマーは組換え部位またはその一部を含んでもよい。
【００８７】
アダプター: 本明細書で用いられる「アダプター」という用語は、環状または直鎖状の挿入断片供与体分子におよび本明細書に記述されるその他の核酸分子に付加できる1つまたは複数の組換え部位および/またはトポイソメラーゼ部位(またはそのような部位の一部分)を含んだオリゴヌクレオチドまたは核酸の断片またはセグメント(例えば、DNA)のことをいう。部位の一部分を用いる場合、欠けている部分は挿入断片供与体分子によって付与されてもよい。このようなアダプターは環状または直鎖状分子内の任意の位置に付加されてもよいが、アダプターは、通常、直鎖状分子の片端または両端にまたはその付近に付加される。アダプターは、例えば、両端に関心対象の特定の核酸分子が位置づけられる(隣接する)ように配置されてもよい。本発明によれば、アダプターは標準的な組換え技術(例えば、制限消化および連結反応)によって関心対象の核酸分子に付加されてもよい。例えば、最初に環状分子を適切な制限酵素で消化し、アダプターをその切断部位に付加し、アダプターを切断部位に含む環状分子を再編成することによって、アダプターは環状分子に付加されてもよい。その他の局面では、アダプターは相同的な組換えにより、RNA分子の組込みなどにより付加されてもよい。あるいは、アダプターは直鎖状分子の1つまたは複数の末端または両端に直接的に連結され、それによって片端または両端にアダプターを有する直鎖状分子を生じさせてもよい。本発明の1つの局面では、アダプターは直鎖状分子の集団(例えば、切断されたまたは消化されたcDNAライブラリーまたはゲノムDNA)に付加されて、その集団の全部または大部分の片端または両端にアダプターを含んだ直鎖状分子の集団を形成させてもよい。
【００８８】
アダプター-プライマー: 本明細書で用いられる「アダプター-プライマー」という語句は、本明細書に記述される直鎖状核酸分子にまたは環状核酸分子に付加できる1つまたは複数の組換え部位(またはそのような組換え部位の一部)を含んだプライマー分子のことをいう。組換え部位の一部分を用いる場合、欠けている部分は本発明の核酸分子(例えば、アダプター)によって付与されてもよい。このようなアダプター-プライマーは環状または直鎖状分子内の任意の位置に付加されてもよいが、アダプター-プライマーは直鎖状分子の片端または両端にまたはその付近に付加されてもよい。このようなアダプター-プライマーを使用して、1つまたは複数の組換え部位またはその一部分を環状または直鎖状核酸分子に、さまざまな状況でおよび増幅(例えば、PCR)、連結反応(例えば、酵素によるまたは化学/合成による連結反応)、組換え(例えば、相同的なまたは非相同的(非正統的)な組換え)などを含むがこれらに限定されない種々の技術によって付加してもよい。
【００８９】
鋳型: 本明細書で用いられる「鋳型」という用語は、増幅される、合成されるまたは配列決定される二本鎖または一本鎖の核酸分子のことをいう。二本鎖DNA分子の場合には、これらの分子が増幅される、合成されるもしくは配列決定される前に第1および第2の鎖を形成するためにその鎖の変性が行われてもよく、または二本鎖分子は鋳型として直接的に使用されてもよい。一本鎖の鋳型の場合、鋳型の少なくとも一部に相補的なプライマーを適当な条件の下でハイブリダイズし、ポリメラーゼ活性を有する1種または複数種のポリペプチド(例えば、2、3、4、5、または7種のDNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素)が鋳型の全部または一部に相補的な分子を合成してもよい。あるいは、二本鎖の鋳型の場合、1種または複数種の転写調節配列(例えば、2、3、4、5、7種またはそれ以上の種のプロモーター)を1種または複数種のポリメラーゼと組合せて使用して、鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子を作出してもよい。本発明によって新たに合成された分子は、オリジナルの鋳型に比べて同じまたは短い長さのものであってよい。新たに合成される分子の合成または伸長の間のミスマッチ挿入または鎖スリップによって、1つまたは多くのミスマッチ塩基対が生じる可能性がある。すなわち、合成された分子は鋳型に正確に相補的である必要はない。さらに、鋳型核酸の集団を合成または増幅の間に使用して、典型的にはオリジナルの鋳型集団が代表的な核酸分子の集団を産生してもよい。
【００９０】
組込み: 本明細書で用いられる「組込み」という用語は、核酸(例えば、DNA)分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００９１】
増幅: 本明細書で用いられる「増幅」という用語は、ポリメラーゼ活性を有する1種または複数種のポリペプチド(例えば、1、2、3、4種またはそれ以上の種の核酸ポリメラーゼまたは逆転写酵素)を用いて核酸分子のコピー数を増加する任意のインビトロの方法のことをいう。核酸増幅はDNAおよび/もしくはRNA分子またはプライマーへのヌクレオチドの組込みをもたらし、それによって鋳型に相補的な新たな核酸分子を形成させることができる。形成された核酸分子およびその鋳型を鋳型として使用して、さらなる核酸分子を合成することができる。本明細書で用いられる1回の増幅反応は、多ラウンドの核酸複製からなってもよい。DNA増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。1回のPCR反応は、5から100サイクルのDNA分子の変性と合成からなってもよい。
【００９２】
ヌクレオチド: 本明細書で用いられる「ヌクレオチド」という用語は塩基-糖-リン酸塩の組合せのことをいう。ヌクレオチドは核酸分子(DNAおよびRNA)の単量体単位である。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオチド三リン酸ATP、UTP、CTG、GTPおよびdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPなどのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、またはそれらの誘導体を含む。このような誘導体には、例えば、[α-S]dATP、7-デアザ-dGTPおよび7-デアザ-dATPが含まれる。本明細書で用いられるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸(ddNTP)およびそれらの誘導体のこともいう。ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸の例示的な例には、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明によれば、「ヌクレオチド」は未標識とされてもまたは周知の技法によって検出可能に標識されてもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が含まれる。
【００９３】
核酸分子: 本明細書で用いられる「核酸分子」という語句は、任意の長さの連続するヌクレオチド(リボNTP、dNTP、もしくはddNTP、またはそれらの組合せ)の配列のことをいう。核酸分子は全長ポリペプチドまたはその任意の長さの断片をコードしてもよく、あるいは非コード性であってもよい。本明細書で用いられる「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は同義的に使用されてもよく、RNAとDNAの両方を含む。
【００９４】
核酸セグメント: 本明細書で用いられる「核酸セグメント」という語句は、本発明の方法に含まれる(例えば、増幅されるまたは配列決定される)核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)の全部または一部のことをいう。適当な態様では、核酸セグメントはプライマー結合部位によって隣接されるはずである。通常、プライマー結合部位が核酸セグメントに付加される場合、プライマー結合部位とともに核酸セグメントに付加されるプライマー結合部位以外の核酸は核酸セグメントの一部であると考えられない。
【００９５】
オリゴヌクレオチド: 本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、あるヌクレオチドのペントースの3'位と隣接ヌクレオチドのペントースの5'位との間のホスホジエステル結合によって連結された、共有結合しているヌクレオチドの配列を含む合成または天然の分子のことをいう。
【００９６】
ポリペプチド: 本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、任意の長さの連続するアミノ酸の配列のことをいう。「ペプチド」、「オリゴペプチド」または「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語と本明細書において同義的に使用されてもよい。
【００９７】
ハイブリダイゼーション: 本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」という用語は、2つの相補的な一本鎖核酸分子(RNAおよび/またはDNA)が塩基対合して、二本鎖分子を与えることをいう。本明細書で用いられるように、塩基対合が完全に相補的ではなくても、2つの核酸分子はハイブリダイズすることができる。したがって、当技術分野において周知の適当な条件が使われるならば、ミスマッチ塩基は2つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨害しない。いくつかの局面では、ハイブリダイゼーションは「ストリンジェントな条件」下であると言われる。「ストリンジェントな条件」とは、この語句が本明細書で用いられる場合、50％ホルムアミド、5×SSC (750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム)、50 mM リン酸ナトリウム(pH 7.6)、5×デンハルト液、10％硫酸デキストラン、および20 μg/mlの変性された剪断サケ精子DNAを含む溶液中にて42℃で一晩インキュベーションした後、フィルターを0.1×SSC中にて約65℃で洗浄することを意味する。
【００９８】
誘導体: 本明細書で用いられる「誘導体」という用語は、ベクターに言及して使用される場合には、誘導体ベクターが図3、5、8、9または10の1つまたは複数に描かれている少なくとも1つのベクターに類似の配列を共有する1つまたは複数(例えば、1、2、3、4、5など)の核酸セグメントを含むことを意味する。特定の態様では、誘導体ベクターは、(1) 図3、5、8、9または10に描かれているベクターの改変によって得られてもよく、あるいは(2) 図3、5、8、9または10に描かれているベクターの1つまたは複数の要素(例えば、アンピシリン耐性マーカー、attL1組換え部位、TOPO部位など)を含んでもよい。さらに、上で述べたように、誘導体ベクターは図3、5、8、9または10に描かれているベクターの1つまたは複数の要素に対して配列同一性(例えば、ヌクレオチドレベルで少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%などの配列同一性)を共有する1つまたは複数の要素を含んでもよい。誘導体ベクターは同様に、図3、5、8、9または10に描かれているベクターの完全なヌクレオチド配列に対してヌクレオチドレベルで少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%などの配列同一性を共有してもよい。誘導体ベクターは同様に、前記のベクターのいずれかの子孫、および突然変異誘導(例えば、ランダム突然変異誘導)に供された上記のベクターを含む。本発明は図3、5、8、9および10に示されるベクター、ならびにこれらのベクターの誘導体を含む。本発明は図3、5、8、9および10に示されるベクターの1つまたは複数の要素を含んだ核酸分子、ならびに(1) 配列同一性を共有する要素および/または(2) 類似の機能を果たす要素を含んだ核酸分子をさらに含む。
【００９９】
本明細書で用いられる組換え核酸技術および分子細胞生物学の分野において使用されるその他の用語は、適用可能な技術分野の当業者によって一般的に理解されるであろう。
【０１００】
概説
本発明は少なくとも1つのクローニング部位を含む核酸分子に関する。多くの場合には、これらの核酸分子は2つのプライマー結合部位を含むはずである。本発明は同様に、本発明の核酸分子を含んだ組成物、そのような核酸分子によってコードされるポリペプチド、そのような核酸分子を含んだベクターおよびその誘導体、ならびにそのような組成物を含んだキットに関する。これらの発明はさらに、本発明の核酸分子を利用する方法に関する。多くの場合、これらの方法では核酸分子に結合する1つまたは複数のプライマーが利用されるはずである。このような方法には本発明の核酸分子の全部または一部を増幅するおよび/または配列決定する方法が含まれる。
【０１０１】
本発明の核酸分子
本発明の核酸分子は2種類の過程、つまり分子クローニング過程および/またはプライマーを介した過程を行うのに有用なものを含む。これらの核酸分子は多くの場合、少なくとも1つのクローニング部位および/またはプライマーが結合できる少なくとも1つの部位を含むはずである。通常、プライマー結合活性は、使われる特定のプライマーおよびそれらがハイブリダイズするヌクレオチド配列にともなって異なりうる特定の条件の下で評価されるはずである。
【０１０２】
本発明の核酸分子の例は図2に図式的に示されている。図2Aは2つのクローニング部位と2つのプライマー結合部位とを含んだ核酸分子を示す。2つのクローニング部位の間に位置するのが核酸セグメントである。一例として、図2Aに示されているものなどの核酸分子は、クローニング部位の間に位置する核酸セグメントを位置づけるクローニング部位の使用によって生成されてもよい。すなわち、CS1が組換え部位でありCS2がTOPO部位である場合には、これらの部位の間に位置する核酸セグメントは組換えクローニングおよびトポイソメラーゼを介した連結反応の組合せによって、核酸分子に導入されていてもよい。さらに、得られた核酸分子は、例えば、クローニング部位の間に位置する核酸セグメントをセグメントの各端から配列決定するのに使われてもよい。換言すれば、配列決定プライマーは、プライマー結合部位P1で核酸分子にアニールし、核酸セグメントの一端を配列決定するのに使用されてもよい。さらに、配列決定プライマーは、プライマー結合部位P2で核酸分子にアニールし、核酸セグメントの残りの一端を配列決定するのに使用されてもよい。このように、図2Aに示されているものに類似した構造を有する核酸分子は、プライマー結合部位の間に位置するセグメントの両端から配列データを作成するために使われてもよい。
【０１０３】
図2Bは図2Aに示されているものに類似の核酸分子を示しており、2つのプライマー結合部位を含むが1つのクローニング部位しか含まない。図2Cは図2Bに示されているものなどの核酸分子を調製するのに使用できる直鎖状核酸分子を示している。より具体的には、図2Cに示されている直鎖状核酸分子は、クローニング部位を片端におよびプライマー結合部位を両端に含む。例示の目的のためにクローニング部位が組換え部位であるとすれば、分子は、例えば、CS1と核酸セグメントと称されることもある、別の核酸分子の同族組換え部位との間で組換え反応を行うことによって環状化されてもよい。この組換え反応は2つの核酸分子を連結させて、オリジナルの核酸分子の両方を含む直鎖状核酸分子を形成させる。この新たな直鎖状核酸分子を次に、例えば、リガーゼなどの酵素を用いて遊離端を連結することで環状化し、図2Bに示される構造を有する環状核酸分子をもたらすことができる。図2Bに示される核酸分子を次に、例えば、図2Aに示される核酸分子について上で述べたように、本質的にプライマー結合部位の間に位置する核酸セグメントを配列決定するために使用することができる。
【０１０４】
図2に示されるように、本発明の核酸分子のプライマー結合部位は、クローニング部位の中に含まれてもよく、またはクローニング部位の全部およびさらなるヌクレオチド配列を含んでもよい。さらに、これらのプライマー結合部位はクローニング部位を全部および過不足無く含んでもよい。
【０１０５】
本発明の核酸分子は本明細書に記載の組換え部位の1つまたは複数を含んだものを含む。
【０１０６】
本発明の方法で使われる核酸分子は、さまざまな手段によって調製されてもよい。例として、2つのプライマー結合部位の間に位置する核酸セグメントを含んだ核酸分子は、制限酵素消化後のリガーゼを介した連結反応、組換え、トポイソメラーゼを介した連結反応、T/Aクローニングによって、またはプライマー結合部位を増幅産物に付加するようにデザインされたプライマーを使った増幅(例えば、PCR)によって調製されてもよい。さらに、プライマー結合部位は1つの方法(例えば、組換え反応)によって核酸セグメントの片端に付加されてもよく、別のプライマー結合部位は、別の1つの方法(例えば、トポイソメラーゼを介した連結反応)によって同じ核酸セグメントの残りの一端に付加されてもよい。
【０１０７】
プライマーおよびプライマー結合部位
本発明の実施に際して使用されるプライマーは、さまざまな特徴を有してもよい。これらの特徴には含有するヌクレオチド配列、GC/AT含量(例えば、10%〜20%、10%〜30%、10%〜40%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜70%、10%〜80%、20%〜30%、20%〜40%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜70%、20%〜80%、30%〜40%、30%〜50%、30%〜60%、30%〜70%、30%〜80%、40%〜50%、40%〜60%、40%〜70%、40%〜80%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、60%〜70%、60%〜80%などのGC)および長さが含まれる。これらのプライマーに対し選択される特徴は、それらが使われることになる用途および条件を含めて、多くの要因とともに変化するはずである。例えば、使われるプライマーの配列は、多くの場合、それらがハイブリダイズするよう意図される核酸分子の配列に直接関わるはずである。さらに、GC/AT含量およびプライマーの長さは、多くの場合、プライマーが使われることになるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに直接関わるはずである。さらに、使われるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、多くの場合、実施される特定の方法(例えば、PCR法、配列決定法など)に関わるはずである。
【０１０８】
多くの場合には、本発明の核酸分子はヌクレオチド配列が少なくとも1ヌクレオチドだけ異なる2つのプライマー結合部位を含むはずである。これらのプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、例えば、1から10、2から10、3から10、4から10、1から8、1から5、1から3、1から2、2から3、2から5、2から8、または2から10ヌクレオチドだけ異なってもよい。さらに、これらのプライマー結合部位およびこれらの部位に結合するプライマーは、長さが10から100、10から75、10から60、10から50、10から40、10から30、10から25、15から100、15から75、15から60、15から50、15から40、15から30、15から25、20から100、20から75、20から60、20から50、20から40、20から30、20から25、30から100、30から75、30から60、30から50、または30から40ヌクレオチドまで変化してもよい。
【０１０９】
さらに、1つの核酸分子が2つ以上のプライマー結合部位を含む場合、これらのプライマー結合部位は同じ長さのものである必要はない。同様に、プライマー結合部位の長さは、少なくとも一つには、これらの部位にハイブリダイズするようにデザインされたプライマーの長さによって決定されることが多いはずである。換言すれば、プライマー結合部位を構成するものとその部位に結合するようにデザインされたプライマーとの間には密接な関係がある。
【０１１０】
多くの場合には、本発明の実施に際して使用されるプライマーは、本発明の核酸分子に位置する2つのプライマー結合部位に結合できるはずであるが、それらの部位の一方に結合した場合に、特定の活性について唯一機能することができよう。例えば、プライマーがプライマー結合部位に結合し、プライマーの3'末端の1つまたは複数のヌクレオチドがハイブリダイズしなければ、多くの場合、プライマーは5'から3'への伸長反応を媒介できないはずである。このようなプライマーおよびプライマー結合部位の例が実施例1に後述されている。このように、本発明の方法が2つまたはそれ以上のプライマーを利用する多くの場合には、これらのプライマーはヌクレオチド配列が1つまたは複数のヌクレオチドだけ異なることが多いはずである。同様に、多くの場合には、ヌクレオチド相違の少なくとも1つが見出される位置は、プライマーの3'末端でまたは3'末端付近で(3ヌクレオチドで)あることが多いはずである。
【０１１１】
本発明とともに使用されるプライマー結合部位は、多くの場合、クローニング部位の中に含まれるかまたは位置するはずである。同様に、2つ以上のプライマー結合部位が、本発明の実施に際して使用される核酸分子または本発明の核酸分子を含む核酸分子の中に存在する場合、多くの場合には、これらのプライマー結合部位の少なくとも1つはクローニング部位の中に含まれるかまたは位置する。本発明は、そのような核酸分子を含む組成物(例えば、反応混合物)およびそのような核酸分子を利用する方法をさらに含む。
【０１１２】
さらに、本発明のプライマー結合部位およびクローニング部位は、例えば、宿主細胞の染色体に存在してもよい。例えば、宿主細胞の染色体に位置し、さらにプライマー結合部位を含んだ組換え部位を利用して、インビボ組換えにより核酸セグメントをプライマー結合部位の間に位置づけてもよい。その後、これらの染色体が本発明の方法で使用されてもよい。インビボ組換え反応を実施する方法はDrogeら、米国特許出願第2003/0027337A1号に記述されており、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
具体的には、本発明は、本明細書で論じられるプライマー結合部位に加えて、(1) 少なくとも1つの組換え部位(例えば、1つ、2つ、3つまたは4つの組換え部位)、(2) 少なくとも1つの組換え部位および少なくとも1つのトポイソメラーゼ認識配列(例えば、1つ、2つ、3つまたは4つのトポイソメラーゼ認識配列)、ならびに(3) 少なくとも1つの組換え部位、少なくとも1つのトポイソメラーゼ認識配列、および少なくとも1つのT突出部(例えば、各端で3'末端に1ヌクレオチドT突出部を有する直鎖状核酸分子)を含んだ核酸分子を含む。
【０１１４】
本発明の方法を実践するのに適したプライマーは、多くの場合、ある特定の方法で機能すると予想されるようなプライマーをデザインし、次にこのプライマーを試験して、それらが予想どおり機能するかどうかを判定することによって同定されるはずである。このような方法を用い、特定のベクターとともに使われた場合に配列決定反応で機能することが判明したプライマーが実施例1に示されている。pDONR223 mut34変異ベクターは、リン酸化プライマー
2007512838.tif 000005
を利用した実施例1に記述のものに類似の方法によって作出された。しかしながら、mut34配列決定プライマー
2007512838.tif 000006
を用いた配列決定反応では、判読可能な配列データが得られなかった。このプライマーを用いて判読可能な配列決定ができなかった理由は、究明されなかった。
【０１１５】
組換え部位
本発明で用いる組換え部位は、組換え反応の基質として働くことができる任意の核酸であってよい。このような組換え部位は野生型のもしくは天然に存在する組換え部位、または改変された、変種の、派生的なもしくは突然変異による組換え部位であってもよい。本発明で用いる組換え部位の例には、ファージλ組換え部位(attP、attB、attL、およびattR、ならびにそれらの変異体または誘導体などの)ならびにphi80、P22、P2、186、P4およびP1(loxPおよびloxP511などのlox部位を含む)などの、その他のバクテリオファージ由来の組換え部位が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１１６】
本発明で用いる組換え部位および突然変異による、改変された、変種の、または派生的な組換え部位には、参照により具体的に本明細書に組み入れられる、米国特許第5,888,732号、同第6,143,557号、同第6,171,861号、同第6,270,969号および同第6,277,608号に、ならびに1999年11月12日付で出願された米国特許出願第09/438,358号に記述されているものが含まれる。突然変異att部位(例えば、attB 1〜10、attP 1〜10、attR 1〜10およびattL 1〜10)は、2000年3月2日付で出願された米国特許出願第09/517,466号、および2000年12月11日付で出願された同第09/732,914号(US 2002/0007051-A1として公表されている)に記述されており、これらの開示はその全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる。その他の適当な組換え部位およびタンパク質はInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手できるGATEWAY(登録商標)クローニング技術システムに関連するものであり、および付随する製品資料(例えば、カタログ番号10835-031、12537-023、12535-019、および12535-027を参照のこと)に記述されており、これら全ての全開示はその全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる。
【０１１７】
本発明で使用できる組換え部位はatt部位を含む。全て野生型att部位に一致する、野生型att部位(GCTTTTTTATACTAA) (SEQ ID NO: 15)の15 bpコア領域は、1つまたは複数の位置で突然変異されてもよい。他の遺伝子操作att部位と特異的に組換えする遺伝子操作att部位は、コア領域の7塩基対重複領域、つまり6〜12番目の塩基中のおよびその付近のヌクレオチドを変化させることによって構築することができる。このように、本発明の方法、分子、組成物、およびベクターで用いるのに適した組換え部位は、15塩基対のコア領域内に1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換を有するものを含むが、これらに限定されることはない(米国特許第5,888,732号および同第6,277,608号を参照されたく、これらはコア領域をさらに詳細に記述しており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。本発明の方法、組成物、およびベクターで用いるのに適した組換え部位は同様に、この15塩基対のコア領域に少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である、15塩基対のコア領域内に1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換を有するものを含む。
【０１１８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、所定の組換え部位のヌクレオチド配列またはその一部分と少なくとも50%、60%、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、通常、最初の配列アラインメント用のDNAsisソフトウェア(Hitachi Software, San Bruno, California)に続いて多重配列アライメント用のESEEバージョン3.0 DNA/タンパク質配列ソフトウェア(cabot@trog.mbb.sfu.ca)などの公知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。または、そのような決定は、局所相同性アルゴリズム(SmithおよびWaterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981))を利用して2つの配列間で相同性の最も良いセグメントを見出す、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)を用いて達成されてもよい。DNAsis、ESEE、BESTFITまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が本発明による参照配列に、例えば、95％同一であるかどうかを決定する場合、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性の割合が計算されるようにおよび参照配列中のヌクレオチド総数の最大5％までの相同性のギャップが許容されるようにパラメータを設定する。上記のものなどのコンピュータプログラムを使用して、2つのタンパク質間の同一性および相同性の割合をアミノ酸レベルで決定してもよい。
【０１１９】
同じように、attB1、attP1、attL1、およびattR1中のコア領域は、attB2、attP2、attL2、およびattR2中のコア領域がそうであるように、相互に同一である。本発明で用いるのに適した核酸分子は同様に、7塩基対重複領域(コア領域中の6〜12番目の塩基TTTATAC)内に1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含んだものを含む。重複領域はインテグラーゼタンパク質の切断部位によって定義され、鎖交換が起こる領域である。そのような突然変異体、断片、変種および誘導体の例には、(1) 7 bp重複領域の第1位のチミンが欠失されているかまたはグアニン、シトシン、もしくはアデニンで置換されている; (2) 7 bp重複領域の第2位のチミンが欠失されているかまたはグアニン、シトシン、もしくはアデニンで置換されている; (3) 7 bp重複領域の第3位のチミンが欠失されているかまたはグアニン、シトシン、もしくはアデニンで置換されている; (4) 7 bp重複領域の第4位のアデニンが欠失されているかまたはグアニン、シトシン、もしくはチミンで置換されている; (5) 7 bp重複領域の第5位のチミンが欠失されているかまたはグアニン、シトシン、もしくはアデニンで置換されている; (6) 7 bp重複領域の第6位のアデニンが欠失されているかまたはグアニン、シトシン、もしくはチミンで置換されている; および(7) 7 bp重複領域の第7位のシトシンが欠失されているかまたはグアニン、チミン、もしくはアデニンで置換されている核酸分子; あるいはこの7 bp重複領域内の1つまたは複数(例えば、2つ、3つ、4つ、5つなど)のこのような欠失および/または置換の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されることはない。代表的な7塩基対コア領域のヌクレオチド配列が以下に示される。
【０１２０】
(1) 7塩基対重複(TTTATAC)の最初の3位置の範囲内でなされた置換は組換えの特異性に強く影響を及ぼすこと、(2) (TTTATAC)の最後の4位置の中でなされた置換は組換え特異性を部分的に変化させるだけであること、および(3) 7 bp重複の外側での、ただし15塩基対のコア領域内のその他の部位でのヌクレオチド置換は、組換えの特異性に影響を及ぼすことはないが、組換えの効率に影響を与えることを示す改変att部位が構築された。すなわち、本発明の核酸分子および方法には、組換え特異性に影響を及ぼす1、2、3、4、5、6、8、10のまたはそれ以上の組換え部位、具体的には、組換え特異性に影響を及ぼす1つまたは複数の突然変異を有し、15塩基対のコア領域内の7塩基重複に実質的に相当しうる1つまたは複数(例えば、1、2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50など)の異なる組換え部位を含むまたは利用するものが含まれる。このような分子はNNNATACなどのコンセンサス配列を含んでもよく、式中で「N」は任意のヌクレオチド(すなわち、A、G、T/UもしくはC、またはそれらの類似体もしくは誘導体であってもよい)を指す。特定の態様では、コンセンサス配列中の最初の3ヌクレオチドの1つがT/Uであるなら、最初の3ヌクレオチドの残りの2つのうち少なくとも1つはT/Uではない。
【０１２１】
各att部位(attB、attP、attL、およびattR)のコア配列は、インテグラーゼ結合部位、インテグラーゼ切断部位および特異性を決定する配列からなる機能単位に分割することができる。特異性決定因子はインテグラーゼトップ鎖切断部位の後の最初の3位置によって規定される。これらの3位置は次の参照配列において下線で示されている。
2007512838.tif 000007
これらの3位置の改変(64通りの可能な組合せ)を利用して、7塩基対重複領域の最初の3ヌクレオチドについて同じ配列を有するその他のatt部位と高い特異性で組換えするatt部位を作り出すことができる。重複領域の最初の3ヌクレオチドの可能な組合せは表1に示される。
【０１２２】
（表１）組換え特異性を変化させるatt部位の7塩基対重複領域の最初の3ヌクレオチドの改変
2007512838.tif 000008
【０１２３】
本発明の方法、組成物およびベクターで用いるのに適した7塩基対のatt部位重複領域の代表例が表2に示される。本発明は表1に示される1個または複数個(例えば、1、2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50個など)のヌクレオチド配列を含んだ核酸分子をさらに含む。すなわち、例えば、1つの局面では、本発明はヌクレオチド配列GAAATAC、GATATAC、ACAATAC、またはTGCATACを含んだ核酸分子を提供する。
【０１２４】
（表２）本発明の組換え部位で用いるのに適した7塩基対のatt部位重複領域の代表例
2007512838.tif 000009
【０１２５】
上述のとおり、上記の3塩基対領域の3'に位置するヌクレオチドの変化は同様に、組換え特異性に影響を及ぼしうる。例えば、7塩基対重複の最後4位置内での変化は同様に、組換え特異性に影響を及ぼしうる。
【０１２６】
例えば、本発明の実施に際して使用できる突然変異att部位には
2007512838.tif 000010
が含まれる。表3は野生型att部位(attB0、P0、R0、およびL0)ならびに種々の他の適当な組換え部位に対するコア領域周辺の領域の配列を示す。当業者であれば部位の残部は上記の対応部位(B、P、L、またはR)と同じであってもよいことを理解するであろう。
【０１２７】
（表３）att部位のヌクレオチド配列
2007512838.tif 000011
2007512838.tif 000012
【０１２８】
固有の特異性を持った(すなわち、第1の部位はその対応する部位と組換えするが、異なる特異性を持つ第2の部位とは実質的に組換えしない)その他の組換え部位が当業者に知られており、本発明を実践するのに使われてもよい。これらの系に対応する組換えタンパク質が、示された組換え部位とともに本発明によって使用されてもよい。本発明で用いる組換え部位および組換えタンパク質を供与するその他の系には、サッカロミセス・セレビジエ由来のFLP/FRT系、リゾルバーゼファミリー(例えば、γδ、TndX、TnpX、Tn3リゾルバーゼ、Hin、Hjc、Gin、SpCCE1、ParA、およびCin)、およびIS231ならびにその他のバシラス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)転位要素が含まれる。本発明で用いるその他の適当な組換え系には、大腸菌のXerCおよびXerDリコンビナーゼならびにpsi、difおよびcer組換え部位が含まれる。その他の適当な組換え部位は、参照により具体的に本明細書に組み入れられる、ElledgeおよびLiuに供与された米国特許第5,851,808号に見出すことができる。
【０１２９】
組換え反応
当業者は本明細書で提供されるおよび当技術分野において利用できる指針(例えば、米国特許第5,888,732号および同第6,277,608号を参照されたく、これらはその全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる)に基づいて、過度の実験を利用することなく、本明細書に記述される組換え反応を行うための条件を容易に最適化することができる。典型的な反応形態では、第2核酸分子およそ50 ngからおよそ1000 ngが適当な反応条件の下で第1核酸分子と接触されてもよい。各核酸分子は第1核酸分子:第2核酸分子がおよそ25:1からおよそ1:25のモル比で存在してもよい。いくつかの態様では、第1核酸分子は第1核酸分子:第2核酸分子がおよそ10:1から1:10のモル比で存在してもよい。1つの態様では、各核酸分子は第1核酸分子:第2核酸分子がおよそ1:1のモル比で存在してもよい。
【０１３０】
典型的には、核酸分子は水性緩衝液中に溶解されて反応混合物に添加されてもよい。1つの適当な条件セットはCLONASE(商標)酵素混合物(例えば、Invitrogen Corporation、カタログ番号11791-019および11789-013) 4 μl、5×反応緩衝液 4 μlおよび核酸ならびに終量20 μlまでの水である。これによって通常は、BP反応液20 μl中にInt 約200 ngおよびIHF約80 ngならびにLR反応液20 μl中にInt 約150 ng、IHF約25 ngおよびXis 約30 ngが結果的に含まれるはずである。
【０１３１】
LR反応を行うためのタンパク質は、約pH 7.5の約50 mM Tris、約50 mM NaCl、約0.25 mM EDTA、約2.5 mMスペルミジン、および約0.2 mg/ml BSAを含みうる適当な緩衝液、例えば、LR保存緩衝液の中で保存されてもよい。保存時には、LR反応用タンパク質は約37.5 ng/μl INT、10 ng/μl IHFおよび15 ng/μl XISの濃度で保存されてもよい。BP反応を行うためのタンパク質は、約pH 7.5の約25 mM Tris、約22 mM NaCl、約5 mM EDTA、約5 mMスペルミジン、約1 mg/ml BSA、および約0.0025% Triton X-100を含みうる適当な緩衝液、例えば、BP保存緩衝液の中で保存されてもよい。保存時には、BP反応用タンパク質は約37.5 ng/μl INTおよび20 ng/μl IHFの濃度で保存されてもよい。当業者であれば酵素活性は酵素調製物によって異なってもよいことを認識するであろう。上記に示した量を加減して、任意の特定の酵素調製物で活性の量を調整してもよい。
【０１３２】
組換え反応を行うのに適した5×反応緩衝液は100 mM Tris pH 7.5、88 mM NaCl、20 mM EDTA、20 mMスペルミジン、および4 mg/ml BSAを含むことができる。すなわち、組換え反応において、緩衝液終濃度は20 mM Tris pH 7.5、17.6 mM NaCl、4 mM EDTA、4 mMスペルミジン、および0.8 mg/ml BSAとすることができる。当業者であれば、最終反応混合物は混合物を調製するのに使われる試薬とともに添加される追加成分を含んでもよい、例えば、BP反応液はBP CLONASE(商標)から組み入れられる0.005% Triton X-100を含んでもよいことを理解するであろう。
【０１３３】
いくつかの態様、具体的にはattL部位がattR部位と組換えられる態様では、最終反応混合物は組換え酵素および結合される核酸に加えて、約50 mM Tris HCl, pH 7.5、約1 mM EDTA、約1 mg/ml BSA、約75 mM NaClおよび約7.5 mMスペルミジンを含んでもよい。その他の態様、具体的にはattB部位がattP部位と組換えられる態様では、最終反応混合物は約25 mM Tris HCl, pH 7.5、約5 mM EDTA、約1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、約22 mM NaCl、および約5 mMスペルミジンを含んでもよい。
【０１３４】
いくつかの態様、具体的にはattL部位がattR部位と組換えられる態様では、最終反応混合物は組換え酵素および結合される核酸に加えて、約40 mM Tris HCl, pH 7.5、約1 mM EDTA、約1 mg/ml BSA、約64 mM NaClおよび約8 mMスペルミジンを含んでもよい。当業者であれば反応条件は本発明から逸脱することなく若干変えられることを理解するであろう。例えば、反応のpHは約7.0から約8.0まで変えられてもよく; 緩衝液の濃度は約25 mMから約100 mMまで変えられてもよく; EDTAの濃度は約0.5 mMから約2 mMまで変えられてもよく; NaClの濃度は約25 mMから約150 mMまで変えられてもよく; およびBSAの濃度は0.5 mg/mlから約5 mg/mlまで変えられてもよい。その他の態様、具体的にはattB部位がattP部位と組換えられる態様では、最終反応混合物は約25 mM Tris HCl, pH 7.5、約5 mM EDTA、約1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、約22 mM NaCl、約5 mMスペルミジン、および約0.005%界面活性剤(例えば、Triton X-100)を含んでもよい。
【０１３５】
トポイソメラーゼクローニング
本発明は同様に、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列から組換え核酸分子を作出するために、1つまたは複数のトポイソメラーゼを使用する方法を含む。第1の局面では、本発明は1つの鎖に共有結合している二本鎖組換え核酸分子を作出する方法を含む。このような方法は、一方の鎖が共有結合されるが、両方の鎖は共有結合されないように、第1および少なくとも1つの第2のヌクレオチド配列に少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4など)のトポイソメラーゼ(例えば、IA型、IB型および/またはII型トポイソメラーゼ)を連結することに向けられる。第2の局面では、本発明は両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法を含む。このような方法は、リガンドの末端が両方の鎖に共有結合される(すなわち、二本鎖組換え核酸分子は、末端が連結されている位置にニックを含まない)ように、第1および少なくとも1つの第2のヌクレオチド配列に少なくとも1つのトポイソメラーゼを連結することに向けられる。第3の局面では、本発明は、1つの鎖に共有結合されている組換え核酸分子を作出する方法であって、本発明の方法によって連結された基質ヌクレオチド配列は、第2(またはそれ以上)の一本鎖ヌクレオチド配列にまたは核酸分子に共有結合することができる少なくとも1つの一本鎖ヌクレオチド配列を含む方法を含む。トポイソメラーゼを介した核酸の連結方法は、例えば、米国特許第5,766,891号および同第6,548,277号ならびに米国特許出願第2003/0022179A1号および同第2003/0186233A1号に記述されており、これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３６】
1つの鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法は、第2のヌクレオチド配列を第1のヌクレオチド配列に共有結合させられるように、5'端または3'端に部位特異的トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)またはその切断産物を有する第1核酸分子に、第2(または他の)核酸分子、および任意でトポイソメラーゼ(例えば、IA型、IB型および/またはII型トポイソメラーゼ)を接触させることによって行うことができる。トポイソメラーゼを介した方法は、任意の数のヌクレオチド配列、典型的には、ヌクレオチド配列の少なくとも1つが一方または両方の5'端に部位特異的トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)またはその切断産物を有する核酸分子を用いて行うことができる。
【０１３７】
両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法は、例えば、第1末端および第2末端を有する第1核酸分子(ここで第1末端もしくは第2末端または両方の末端において、第1核酸分子は3'端にまたは3'端付近にトポイソメラーゼ認識部位(またはその切断産物)を有する第1核酸分子); 第1末端および第2末端を有する少なくとも1つの第2核酸分子(ここで、第1末端もしくは第2末端または両方の末端において、少なくとも第2の二本鎖ヌクレオチド配列は、3'端にまたは3'端付近にトポイソメラーゼ認識部位(またはその切断産物)を有する); ならびに少なくとも1つの部位特異的トポイソメラーゼ(例えば、IA型および/またはIB型トポイソメラーゼ)を、全ての成分が接触し、トポイソメラーゼがその活性を発揮できるような条件下で接触させることによって行うことができる。本発明のこの方法により作出された共有結合二本鎖組換え核酸は、一つには、どちらの鎖の核酸分子が連結されている位置にもニックがないことを特徴とする。1つの態様では、この方法は、共有結合される2つの末端の3'端にまたは5'端に、トポイソメラーゼ認識部位またはその切断産物をそれぞれ有する、第1核酸分子と第2(または他の)核酸分子を接触させることによって行うことができる。別の態様では、この方法は、少なくとも一方の末端の5'端および3'端に、トポイソメラーゼ認識部位またはその切断産物を有する第1核酸分子と、認識部位を含む第1核酸分子の末端に連結される末端に3'ヒドロキシル基および5'ヒドロキシル基を有する第2(または他の)核酸分子を接触させることによって行うことができる。
【０１３８】
トポイソメラーゼは二本鎖核酸分子の一本鎖を切断する、IA型およびIB型トポイソメラーゼを含むI型と核酸分子の両方の鎖を切断するII型トポイソメラーゼ(ジャイレース)として分類される。IA型およびIB型トポイソメラーゼは1本鎖の核酸分子を切断する。IA型トポイソメラーゼによる核酸分子の切断によって切断部位に5'リン酸塩および3'ヒドロキシルが生じ、IA型トポイソメラーゼが切断された鎖の5'端に共有結合する。これと比較して、IB型トポイソメラーゼによる核酸分子の切断は切断部位に3'リン酸塩および5'ヒドロキシルを生じ、IB型トポイソメラーゼは切断された鎖の3'端に共有結合する。本明細書に開示するように、I型およびII型トポイソメラーゼならびにそれらの触媒ドメインおよび突然変異型は、本発明の方法により両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出するのに有用である。
【０１３９】
IA型トポイソメラーゼには大腸菌トポイソメラーゼI、大腸菌トポイソメラーゼIII、真核細胞トポイソメラーゼII、古細菌(archeal)リバースジャイレース、酵母トポイソメラーゼIII、ショウジョウバエトポイソメラーゼIII、ヒトトポイソメラーゼIII、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)トポイソメラーゼIII、および他のIA型トポイソメラーゼを含むものなどが含まれる(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Berger, Biochim. Biophys. Acta 1400:3-18, 1988; DiGateおよびMarians, J. Biol. Chem. 264:17924-17930, 1989; KimおよびWang, J. Biol. Chem. 267:17178-17185, 1992; Wilson et al., J. Biol. Chem. 275:1533-1540, 2000; Hanai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:3653-3657, 1996, 米国特許第6,277,620号を参照のこと)。配列5'-GCAACTT-3'を認識し、これに結合し、これを切断するIA型トポイソメラーゼである大腸菌トポイソメラーゼIIIは、本発明の方法で特に有用とすることができる(参照により本明細書に組み入れられる、Zhang et al., J. Biol. Chem. 270:23700-23705, 1995)。プラスミドRP4のtraEタンパク質である相同体はLiら、J. Biol. Chem. 272:19582-19587 (1997)によって報告されており、同様に本発明の実施に際して使用することができる。DNA-タンパク質付加体は、酵素が5'-チミジン残基に共有結合し、2つのチミジン残基の間で起こる切断により形成される。
【０１４０】
IB型トポイソメラーゼには、全ての真核細胞に存在する核のI型トポイソメラーゼならびにワクシニアウイルスおよび他の細胞ポックスウイルスによってコードされるものが含まれる(参照により本明細書に組み入れられる、Cheng et al., Cell 92:841-850, 1998を参照のこと)。真核細胞IB型トポイソメラーゼは、酵母、ショウジョウバエおよびヒト細胞を含む哺乳類細胞において発現されるものにより例示される(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、CaronおよびWang, Adv. Pharmacol. 29B: 271-297, 1994; Gupta et al., Biochim. Biophys. Acta 1262:1-14, 1995を参照のこと; 同様にBerger, 前記、1998を参照のこと)。ウイルスのIB型トポイソメラーゼは脊椎動物ポックスウイルス(ワクシニア、ショープ線維腫ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎(ORF)ウイルス、鶏痘ウイルスおよび伝染性軟肬腫ウイルス)および昆虫ポックスウイルス(Amsacta moorei entomopoxvirus)によって産生されるものにより例示される(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Shuman, Biochim. Biophys. Acta 1400:321-337, 1998; Petersen et al., Virology 230:197-206, 1997; ShumanおよびPrescott, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:7478-7482, 1987; Shuman, J. Biol. Chem. 269:32678-32684, 1994; 米国特許第5,766,891号; PCT/US95/16099; PCT/US98/12372を参照のこと; 同様にCheng et al., 前記、1998年を参照のこと)。
【０１４１】
II型トポイソメラーゼには、例えば、細菌ジャイレース、細菌DNAトポイソメラーゼIV、真核細胞DNAトポイソメラーゼIIおよびT偶数(T-even)系ファージがコードするDNAトポイソメラーゼが含まれる(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、RocaおよびWang, Cell 71:833-840, 1992; Wang, J. Biol. Chem. 266:6659-6662, 1991; Berger, 前記、1998)。IB型トポイソメラーゼと同様に、II型トポイソメラーゼは切断作用および連結作用の両方を有する。さらに、IB型トポイソメラーゼと同様に、基質核酸分子は、II型トポイソメラーゼが一本鎖の切断部位と共有結合を形成できるように調製することができる。例えば、仔ウシ胸腺II型トポイソメラーゼは、5'末端から3ヌクレオチドの位置の陥凹した5'トポイソメラーゼ認識部位を含む基質核酸分子を切断し、切断部位の5'の3つのヌクレオチド配列を解離し、核酸分子の5'端にトポイソメラーゼを共有結合することができる(Anderson et al., 前記、1991)。さらに、このようなII型トポイソメラーゼが結合した核酸分子に、3'ヒドロキシル基を有する第2のヌクレオチド配列を接触させると、II型トポイソメラーゼは配列を連結することができ、次いで組換え核酸分子から放出される。このように、II型トポイソメラーゼも本発明の方法を実施するのに有用である。
【０１４２】
トポイソメラーゼの構造分析からIA型、IB型およびII型トポイソメラーゼを含めて、それぞれ特定のトポイソメラーゼファミリーのメンバーがファミリーの他のメンバーと共通の構造的特徴を共有することが示唆される(Berger, 前記、1998年)。さらに、種々のIB型トポイソメラーゼの配列分析から構造が特に触媒ドメインにおいては高度に保存されていることが示唆される(Shuman, 前記、1998; Cheng et al., 前記、1998; Petersen et al., 前記、1997)。例えば、314アミノ酸のワクシニアトポイソメラーゼのアミノ酸81位から314位を含むドメインは、他のIB型トポイソメラーゼと実質的な相同性を共有しており、その単離ドメインは全長トポイソメラーゼと本質的に同じ活性を有するが、その単離ドメインは代謝回転速度が遅く、認識部位との結合親和性が低い(Shuman, 前記、1998; Cheng et al., 前記、1998を参照のこと)。さらに、アミノ末端ドメインにおいて(アミノ酸残基70位および72位で)突然変異している突然変異ワクシニアトポイソメラーゼは、全長トポイソメラーゼと同一の特性を示す(Cheng et al., 前記、1998)。実際に、ワクシニアIB型トポイソメラーゼの突然変異分析によって、トポイソメラーゼの活性に影響を与えずに突然変異させることができる多数のアミノ酸残基が明らかにされており、活性に必要ないくつかのアミノ酸が同定されている(Shuman, 前記、1998)。ワクシニアトポイソメラーゼ触媒ドメインとその他のIB型トポイソメラーゼとの間で共有される高い相同性やワクシニアトポイソメラーゼに関する詳細な突然変異分析を考慮すると、IB型トポイソメラーゼおよび種々のアミノ酸突然変異を有するIB型トポイソメラーゼの単離触媒ドメインは本発明の方法で使用できることが認められよう。
【０１４３】
各種のトポイソメラーゼは一連の配列特異性を示す。例えば、II型トポイソメラーゼはさまざまな配列に結合することができるが、極めて特異的な認識部位を切断する(参照により本明細書に組み入れられる、Andersen et al., J. Biol. Chem. 266:9203-9210, 1991を参照のこと)。これと比較して、IB型トポイソメラーゼには、特異的なヌクレオチド配列(「トポイソメラーゼ認識部位」)に結合しそれを切断する部位特異的トポイソメラーゼが含まれる。トポイソメラーゼ、例えば、IB型トポイソメラーゼによる核酸分子の切断の結果、ホスホジエステル結合のエネルギーは、トポイソメラーゼの特定のチロシン残基とトポイソメラーゼ認識部位の3'ヌクレオチドとの間のホスホチロシル結合の形成によって保存される。トポイソメラーゼ切断部位が核酸分子の3'端に近い場合には、下流の配列(切断部位の3')が解離して、新たに形成された3'末端にトポイソメラーゼが共有結合した核酸分子が生じる。
【０１４４】
1つの鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法は、1) 第1末端および第2末端を有する第1核酸分子であって、第1末端もしくは第2末端または両方の5'端にまたは5'端付近に部位特異的トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)を有し、任意で、1つまたは複数の組換え部位を含む、第1核酸分子; 2) 第1末端および第2末端を有するか、または第1末端および第2末端を有するように作出できる、少なくとも1つの第2核酸分子; ならびに3) 少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など)部位特異的トポイソメラーゼ(例えば、IA型またはIB型トポイソメラーゼ認識部位)を、全ての成分が接触し、少なくとも1つのトポイソメラーゼがその活性を発揮できるような条件下で接触させることによって行うことができる。例えば、トポイソメラーゼは、大腸菌トポイソメラーゼIなどのIA型トポイソメラーゼ、大腸菌トポイソメラーゼIIIまたは真核細胞トポイソメラーゼIIIであってもよい。核酸分子が切断されると、トポイソメラーゼは好ましくは、5'末端に安定に結合される。トポイソメラーゼによる切断の結果、切断された核酸分子は3'突出配列を含むことが多くある。核酸分子が上記の方法によって連結されたら、得られた分子は本明細書の別の箇所に記述されているものなどの、組換え反応に使用されてもよい。
【０１４５】
1つの鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法は、任意の組合せの末端が連結され、その際に連結される末端の一方の鎖が共有結合され、他方の鎖は共有結合されないが、ニックを有するように行うことができる。例えば、第1核酸分子は、ATG開始コドンが第1末端にまたは第1末端付近にあり、ポリAシグナルが第2末端にまたは第2末端付近にコードされるコード配列を含むことができ; および第2核酸分子は、コード配列の上流に位置づけられると機能し、第1末端が第2末端の上流にあるプロモーター要素を含むことができ、部位特異的トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)が第1核酸分子の第1末端の5'端にまたはその付近にあり、トポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)が第1核酸分子の第1末端の5'端を第2核酸分子の第1末端の3'端に共有結合し、それによって二本鎖組換え核酸分子を作出し、ポリペプチドをコード配列から発現することができるような条件下で接触を行う方法を行うことができる。あるいは、トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)が第1核酸分子の第2末端の5'端にまたはその付近にあり、トポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)が第1核酸分子の第2末端の5'端を第2核酸分子の第1末端の3'端に共有結合し、それによってアンチセンス分子を発現させることができる二本鎖組換え核酸分子を作出するような条件下で接触を行う方法を行うことができる。核酸分子が上記の方法によって連結されたら、得られた分子は本明細書の別の箇所に記述されているものなどの、組換え反応に使用されてもよい。
【０１４６】
上記の第1核酸分子および第2核酸分子を使用する別の例として、トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)が第1核酸分子の第1末端および第2末端のそれぞれの5'端にまたは5'端付近にあり、IA型トポイソメラーゼが、第1核酸分子の第1末端の5'端を第2核酸分子の第1末端の3'端に、および第1核酸分子の第2末端の5'端を第2核酸分子の第2末端の3'端に共有結合できるような条件下で接触を行う方法を行うことができる。このように、この方法によって作出される二本鎖組換え核酸分子は環状化され、鎖がトポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)によって共有結合された位置の反対側の各鎖にニックを含む。さらに、第2核酸分子のプロモーターが第1核酸分子の発現を開始することができる。1つの態様では、環状化された二本鎖組換え核酸分子はベクターを含む。核酸分子が上記の方法によって連結されたら、得られた分子は本明細書の別の箇所に記述されているものなどの、組換え反応に使用されてもよい。
【０１４７】
上記の第1核酸分子および第2核酸分子を使用する別の例として、トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)が第1核酸分子の第1末端および第2末端のそれぞれの5'端にまたは5'端付近にあり、トポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)が、第1核酸分子の第1末端の5'端を第2核酸分子の第2末端の3'端に、および第1核酸分子の第2末端の5'端を第2核酸分子の第1末端の3'端に共有結合できるような条件下で接触を行う方法を行うことができる。このように、この方法によって作出される二本鎖組換え核酸分子は環状化され、鎖がトポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)によって共有結合された位置の反対側の各鎖にニックを含む。さらに、第2核酸分子のプロモーターがアンチセンス配列の発現を開始することができる。1つの態様では、環状化された二本鎖組換え核酸分子はベクターを含む。核酸分子が上記の方法によって連結されたら、得られた分子は本明細書の別の箇所に記述されているものなどの、組換え反応に使用されてもよい。
【０１４８】
1つの鎖に共有結合した二本鎖組換え核酸分子を作出する方法は同様に、1) 第1末端および第2末端を有し、第1核酸分子が第1末端もしくは第2末端または両方の5'端にまたは5'端付近に部位特異的トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)を有する第1核酸分子; 2) 第1末端および第2末端を有する、または第1末端および第2末端を有するように作出できる少なくとも1つの第2核酸分子; 3) 末端がそれぞれ5'端および3'端をさらに含む第1末端および第2末端を有する、または第1末端および第2末端を有するように作出できる少なくとも1つの第3核酸分子; ならびに4) 少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など)部位特異的トポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)を、全ての成分が接触し、少なくとも1つのトポイソメラーゼがその活性を発揮できるような条件下で接触させることによって行うことができる。例えば、トポイソメラーゼは、大腸菌トポイソメラーゼIなどのIA型トポイソメラーゼ、大腸菌トポイソメラーゼIIIまたは真核細胞トポイソメラーゼIIIであってもよい。核酸分子が切断されると、トポイソメラーゼは好ましくは、5'末端に安定に結合される。好ましくは、トポイソメラーゼによる切断の結果、切断された核酸分子は3'突出配列を含む。核酸分子が上記の方法によって連結されたら、得られた分子は本明細書の別の箇所に記述されているものなどの、組換え反応またはその他の過程に使用されてもよい。
【０１４９】
部位特異的トポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはIB型トポイソメラーゼ認識部位)またはその切断産物を含む第1核酸分子、少なくとも1つの第2核酸分子、および少なくとも1つの第3核酸分子に関与する、1つの鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する本発明の方法は、任意の組合せの末端が連結され、連結される末端の一方の鎖が共有結合され、一方の鎖にはニックが入るように行うことができる。この態様によれば、末端のいずれかはIA型、II型またはIB型トポイソメラーゼ認識部位を含んでもよく、あるいはその切断産物を含んでもよいが、ただし、第1の二本鎖組換えヌクレオチド分子は5'端にまたは5'端付近にトポイソメラーゼ認識部位(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ認識部位)、またはその切断産物を含み、ただ1つのトポイソメラーゼまたはトポイソメラーゼ認識部位が、連結される末端に存在する。例えば、第1核酸分子が第1末端および第2末端にまたは第1末端および第2末端の各付近に部位特異的IA型トポイソメラーゼ認識部位を含む場合には、この方法は、第1核酸分子および第2核酸分子に、各末端が5'端および3'端をさらに含む第1末端および第2末端を有するまたは第1末端および第2末端を有するように作出できる、少なくとも1つの第3核酸分子を、トポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)を第1核酸分子の第1末端の5'端に第2ヌクレオチド配列の第1末端の3'端と、および第1核酸分子の第2末端の5'端を第3ヌクレオチド配列の第1末端の3'端と共有結合できるような条件下で、接触させる段階をさらに含んでもよい。本発明のこのような方法を実施するために、末端およびトポイソメラーゼ認識部位、またはそれらの切断産物のその他の組合せを使用できることが認識されよう。核酸分子が上記の方法によって連結されたら、得られた分子は本明細書の別の箇所に記述されているものなどの、組換え反応またはその他の過程に使用されてもよい。
【０１５０】
共有結合されたトポイソメラーゼは、連結反応を触媒するほかに、逆反応、例えばIB型トポイソメラーゼがホスホチロシル結合によって連結された認識配列の3'ヌクレオチドと、切断前は核酸分子の3'端を含み、切断後に遊離5'ヒドロキシ基を含むヌクレオチド配列の再連結を触媒することもできる。このように、IB型トポイソメラーゼを用いて組合せ核酸分子を産生する方法が開発されている。例えば、結合型トポイソメラーゼIBを含んだクローニングベクターが開発されており、市販されている(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。このようなクローニングベクターは、直鎖状である場合には、各3'端に共有結合型トポイソメラーゼIBを含む(「トポイソメラーゼ付加」)。このようなベクターにクローニングされるcDNAライブラリー、または制限断片もしくは切断されたゲノムDNA配列を含むものなどのヌクレオチド配列を、例えば、ホスファターゼで処理して5'ヒドロキシル末端を生成し、これを直鎖状トポイソメラーゼ付加ベクターに、トポイソメラーゼがヌクレオチド配列のヒドロキシル基を有する5'端と、共有結合したトポイソメラーゼを含むベクターの3'端を連結することができる条件の下で付加する。5'ヒドロキシル末端を含むように作出されたPCR増幅産物などのヌクレオチド配列は、迅速な連結反応(室温で約5分)でトポイソメラーゼ付加ベクターにクローニングすることができる。トポイソメラーゼ連結反応に固有の迅速な連結や広い温度範囲により、トポイソメラーゼ付加ベクターを使用することは、一般に自動システムを用いて行われる高速大量処理用途に理想的である。
【０１５１】
II型トポイソメラーゼは一般に、組合せ核酸分子の作出またはクローニング法に使用されていないが、上記のIB型トポイソメラーゼは種々の手法に使用されている。本明細書に開示するように、IA型トポイソメラーゼは、IB型トポイソメラーゼについて記述されているものと同様の種々の手法に使用することができる。しかし、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を連結するためにIB型トポイソメラーゼを使用する既報の方法には、結合型トポイソメラーゼはこれが結合している鎖の3'端と、5'ヒドロキシル基を含む第2鎖との連結しか行わないという欠点がある。トポイソメラーゼは相補鎖を連結することができないので、作出される核酸分子はニックを含む。ニックは一般に細胞内で分解されるので、このようなニックの存在は、宿主細胞のトランスフェクションに組換え分子を使用することを妨げることはないが、二本鎖核酸分子にこのようなニックが存在することは組換え分子を直接使用することの大きな制約となる。例えば、プライマー伸長反応はニックで停止するため、ニックを含む核酸分子の鎖はPCRで増幅することができない。すなわち、両方の鎖に共有結合されており、したがって、PCRなどのその後の操作に有用な二本鎖組換え核酸分子を得るには、既報の方法によってトポイソメラーゼを用いて調製された核酸構築体は一般的に、例えば、DNAリガーゼでさらに処理されなければならない。
【０１５２】
核酸構築体を調製する既報の方法も一般に、特に3つ以上のヌクレオチド配列を連結する場合には数多くの段階を必要とし、配列を所定の方向に連結しなければならない場合にはさらに数多くの段階を必要としていた。例えば、連結されるヌクレオチド配列を一般に、逐次的に連結して中間構築体を作出し、この各々をクローニングし、宿主細胞内で増幅し、単離し、特徴づけなければならない。次のヌクレオチド配列を連結できるように、適切な配列を含む構築体が十分な量および形で単離されなければならず、適切な構築体を同定するために、クローニング、増幅、単離および特徴づけの工程が再度実施されなければならない。明らかに、連結される異なるヌクレオチド配列の数が増すにつれ、実施しなければならない本質的に反復的な手法の数も増加し、これによって高価で手間を要し、時間のかかる過程となってしまう。
【０１５３】
本明細書に開示するように、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する本発明の方法の利点は、両方の鎖に共有結合された機能的な二本鎖組換え核酸分子を得るために、別個の連結反応を行う必要がないことである。さらに、数多くの異なる核酸分子が所定の方向に共有結合されなければならない場合に、その後の段階に進むのに先立って、中間構築体をクローニングし、特徴づけて、単離する必要がないように本発明のこの局面の方法を行うことができる。このように、本発明のこの局面の方法は、以前の公知の方法を用いて可能とされたよりもはるかに迅速にかつ実質的にずっと低い価格で、両方の鎖に共有結合した二本鎖組換え核酸分子を作出する手段を提供する。
【０１５４】
さらなる利点として、作出される構築体は二本鎖ヌクレオチド配列が連結された部位にニックがないので、作出される、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子はさらなる手法、例えば、PCR増幅法などのプライマーの伸長を含む特定の手法、またはその他の転写もしくは翻訳法に直接使用できる形で存在する。本明細書に開示するように、片鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する本発明の方法は、ある種の態様において、作出される二本鎖組換え核酸分子がさらなる手法、例えば、PCR増幅法などのプライマーの伸長を含む特定の手法、またはその他の転写もしくは翻訳法に直接使用できる形で存在するという点で同様に有利である。その理由は、ある種の態様では、作出される二本鎖組換え核酸分子は、二本鎖ヌクレオチド配列が連結された部位にニックがない片鎖を含むからである。
【０１５５】
本発明のある種の方法は全体として、ワクシニアトポイソメラーゼなどのIB型トポイソメラーゼまたはIA型トポイソメラーゼの使用に関連して本明細書に例示されている。しかしながら、この方法は、ただ単に成分を適宜調整することにより、例示されているもの以外のトポイソメラーゼを用いても行うことができると認識されよう。例えば、以下にさらに詳細に記述されるように、トポイソメラーゼ認識部位に相補的なヌクレオチド配列を少なくとも部分的に含んだPCRプライマーを用いて、直鎖状核酸分子の一方または両方の3'端にIB型トポイソメラーゼ認識部位を組み入れる方法が開示される。これと比較して、IA型、または必要に応じ、II型トポイソメラーゼに対するトポイソメラーゼ認識部位は、認識部位を含むPCRプライマーを用いることによって核酸分子に組み入れることができる。
【０１５６】
部位特異的IB型トポイソメラーゼによる核酸分子の切断は、共有結合したトポイソメラーゼを含むその末端におよびそれに相補的な鎖に5'突出配列の生成をもたらす。さらに、本明細書に開示されるように、IB型トポイソメラーゼ認識部位を核酸分子に組み入れることができ、トポイソメラーゼによる核酸分子の切断の結果、規定された所定の配列を有する5'突出配列を相補鎖内にさらに作出できるようにPCRプライマーをデザインすることができる。このように、本発明の方法は、成分の核酸分子が所定の方向で作動可能に連結されている二本鎖組換え核酸分子の作出に容易に適応できる。本発明の開示を考慮すれば、IA型トポイソメラーゼ認識部位を、異なる配列のライブラリーを含む核酸分子に組み入れることができるように、または必要に応じて、部位特異的トポイソメラーゼによる切断の結果、3'突出配列をもたらすようにPCRプライマーをデザインすることもできることが認識されよう。
【０１５７】
本明細書に開示するように、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法は、共有結合される各核酸分子の末端にまたは末端付近にトポイソメラーゼを供与することによって既知の方法を拡張させている。例えば、IB型トポイソメラーゼに関しては、本発明の方法は、連結される各直鎖状核酸分子の3'にまたは3'付近にトポイソメラーゼ認識部位、またはその切断産物(すなわち、共有結合したIB型トポイソメラーゼ)を供与する。本明細書で用いられる「トポイソメラーゼ認識部位」という用語は、部位特異的トポイソメラーゼによって認識され、結合される規定されたヌクレオチド配列を意味する。例えば、ヌクレオチド配列5'-(C/T)CCTT-3'は、ワクシニアウイルスDNAトポイソメラーゼIを含めて、ほとんどのポックスウイルストポイソメラーゼによって特異的に結合され、認識部位の最も3'端のチミジンの下流の鎖を切断して、5'-(C/T)CCTT-PO4-TOPOを含むヌクレオチド配列、すなわち、トポイソメラーゼのチロシン残基を介して3'リン酸塩に共有結合したトポイソメラーゼの複合体を産生することができるトポイソメラーゼ認識部位である(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Shuman, J. Biol. Chem. 266:11372-11379, 1991; SekiguchiおよびShuman, Nucl. Acids Res. 22:5360-5365, 1994を参照のこと; 米国特許第5,766,891号; PCT/US95/16099号; PCT/US98/12372号も参照のこと)。これと比較して、ヌクレオチド配列5'-GCAACTT-3'は、IA型大腸菌トポイソメラーゼIIIのトポイソメラーゼ認識部位である。
【０１５８】
核酸分子の一方または両方の末端の5'端もしくは3'端またはその両方に共有結合されたトポイソメラーゼを含むものを含めて、トポイソメラーゼ付加核酸分子は、数多くの方法のいずれかによって作出することができる。場合によっておよび適当な条件下において、I型トポイソメラーゼは一本鎖ヌクレオチド配列を切断することができる。例えば、IA型トポイソメラーゼである、大腸菌トポイソメラーゼIのアミノ末端67 kDaドメインを含むドメインは、トポイソメラーゼ認識部位を含む一本鎖ヌクレオチド配列を切断することができる。トポイソメラーゼが一本鎖ヌクレオチド配列を切断できるような条件である場合、核酸分子の一方の末端の5'端および3'端にトポイソメラーゼ認識部位を含んだ核酸分子の切断は並行して行うことができる。または、トポイソメラーゼの一方または両方が認識および切断のための核酸分子を必要とする場合には、反応は逐次的に行われ、トポイソメラーゼ認識部位のより末端側(遠位側)が最初に切断され、次いで二本鎖の状態でいる内側(近位)部位が切断される。例えば、大腸菌トポイソメラーゼIII認識部位を一方の末端の5'端にまたは5'端付近におよびワクシニアIB型トポイソメラーゼ認識部位を同じ末端の3'端にまたは3'端付近に含み、IB型認識部位がIA型認識部位よりも末端近くにある核酸分子をワクシニアトポイソメラーゼとインキュベートして、IB型トポイソメラーゼ付加核酸分子を作出し、これを大腸菌トポイソメラーゼとインキュベートして、5'端にIA型トポイソメラーゼが結合しており、3'端にIB型トポイソメラーゼが結合している核酸分子を作出することができる。したがって、本発明は、少なくとも一方の末端の一方または両方の末端に結合されたトポイソメラーゼを含む核酸分子を作出する方法を含み、このようなトポイソメラーゼ付加核酸分子をさらに提供する。
【０１５９】
本明細書で用いられる「切断産物」という用語は、トポイソメラーゼ認識部位に言及して使用される場合には、トポイソメラーゼにより、一般的にその認識部位で切断されたヌクレオチド配列であって、IA型もしくはII型トポイソメラーゼの場合にはトポイソメラーゼ認識部位の5'末端ヌクレオチドの5'リン酸基に、またはIB型トポイソメラーゼの場合にはトポイソメラーゼ認識部位の3'末端ヌクレオチドの3'リン酸基に共有結合されたトポイソメラーゼの複合体を含むヌクレオチド配列のことを指す。トポイソメラーゼが共有結合されているトポイソメラーゼ切断核酸分子を含んだこのような複合体は、本明細書で「トポイソメラーゼ活性化」または「トポイソメラーゼ付加」ヌクレオチド配列と称される。トポイソメラーゼが核酸分子を認識部位で切断し、その分子に共有結合されるようになりうる未切断のトポイソメラーゼ認識部位とトポイソメラーゼとを含む核酸分子のように、トポイソメラーゼ活性化核酸分子を本発明の方法に使用することができる。
【０１６０】
両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法の1つの態様では、IB型トポイソメラーゼが存在する場合、各ヌクレオチド配列が切断されて、共有結合されたトポイソメラーゼを含んだ3'末端をもたらすように、トポイソメラーゼ認識部位は、連結される各ヌクレオチド配列の3'末端にまたは3末端付近に存在する。共有結合されるヌクレオチド配列は同様に、トポイソメラーゼ認識部位を含むのと同じ末端に5'ヒドロキシ基を含んでいてもよく、または5'ヒドロキシル基はホスファターゼを用いて作出されてもよい。このようなヌクレオチド配列が接触すると、部位特異的トポイソメラーゼは、3'リン酸を含む各鎖をそれぞれの5'ヒドロキシル基に連結し、それによって直鎖状、環状または正もしくは負のスーパーコイル状核酸分子として産生されうる、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出することができる。
【０１６１】
本発明のある種の局面の方法によってIB型トポイソメラーゼにより連結されるヌクレオチド配列の末端の5'端は、必要に応じて、所定の指向性方向での、ヌクレオチド配列の最初の結合を促進できる、相補的な5'突出配列を含むことが好ましい。または、本発明のある種の局面の方法によってIB型トポイソメラーゼにより連結されるヌクレオチド配列の末端の5'端は、必要に応じて、指向性方向での、鎖侵入によりヌクレオチド配列の最初の結合を促進するために、配列の一方が5'突出配列を有し、他方のヌクレオチド配列が5'端の平滑末端に相補配列を含んだ相補的な5'配列を含む。「5'突出部」または「5'突出配列」という用語は、核酸分子の相補鎖の末端を越えて5'方向に伸長する核酸分子の鎖のことを指すように本明細書で用いられる。好都合には、5'突出部はIB型トポイソメラーゼによる核酸分子の部位特異的な切断の結果として作出されうる(実施例1を参照のこと)。
【０１６２】
本発明のある種の局面の方法によってIA型トポイソメラーゼにより連結されるヌクレオチド配列の末端の3'端は、必要に応じて、所定の指向性方向での、ヌクレオチド配列の最初の結合を促進できる、相補的な3'突出配列を含むことが好ましい。または、本発明のある種の局面の方法によってトポイソメラーゼ(例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼ)により連結されるヌクレオチド配列の末端の3'端は、必要に応じて、指向性方向での、鎖侵入によりヌクレオチド配列の最初の結合を促進するために、配列の一方が3'突出配列を有し、他方のヌクレオチド配列が3'端の平滑末端に相補配列を含んだ相補的な3'配列を含む。「3'突出部」または「3'突出配列」という用語は、核酸分子の相補鎖の末端を越えて3'方向に伸長する核酸分子の鎖のことを指すように本明細書で用いられる。好都合には、3'突出部はIA型またはII型トポイソメラーゼによる切断の結果として作出されうる。
【０１６３】
3'または5'突出配列は任意の配列を有してもよいが、一般に、その配列は、それらが本発明の方法によって一方の核酸分子の所定の末端を第2ヌクレオチド配列の所定の末端に連結することを可能とするように選択される。したがって、3'または5'突出は回文的であってもよいが、回文的突出を有する核酸分子は互いに結合し、そうして2つまたはそれ以上の核酸分子を所定の方向に含む両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子の収率を低下させるため、3'または5'突出は一般的に回文的ではない。
【０１６４】
本発明の1つの局面の方法またはキットに有用な核酸分子は、末端の3'端または5'端にトポイソメラーゼ認識部位を含むように、PCRなどの増幅方法により増幅することができる。さらに、増幅された核酸分子の切断の結果、切断された核酸分子が一方または両方の末端に5'または3'突出部を有するように、PCRに使用される一方または両方のプライマーをデザインすることができる。1つの態様では、第1核酸分子の5'突出配列が第2(または他の)核酸分子の5'突出配列に相補的であり、それによって好ましくは所定の方向でのヌクレオチド配列の結合を促進するようにPCRプライマーをデザインし、その結果それらは本発明の方法により共有結合することができる。本発明によれば、連結される異なる核酸分子のための独自の突出配列をデザインすることによって、任意の数の核酸分子を望ましい順序および/または方向で連結することができる。
【０１６５】
PCRは、本発明の方法に関して2通りの方法で使用されることが認識されるべきである。1つの局面では、望ましい核酸分子、例えば、エピトープタグまたは細胞局在化ドメインなどの関心対象の、転写もしくは翻訳調節要素またはコード配列をコードする核酸分子に特定の特徴を与えるようにPCRプライマーをデザインする。この局面では、増幅の結果、核酸分子が適宜、一方または両方の末端にトポイソメラーゼ認識部位を有するように、PCRプライマーをデザインすることができる。本明細書に開示するように、部位特異的トポイソメラーゼによる増幅産物の切断の結果、切断された核酸分子がトポイソメラーゼ切断末端に5'または3'突出配列を有するように、PCRプライマーは追加の配列を含んでもよい。5'端に結合し、切断するトポイソメラーゼに関与する本発明の1つの態様では(例えば、IA型トポイソメラーゼに関与する態様)、トポイソメラーゼ切断後の再連結を遮断することができ、トポイソメラーゼ付加増幅産物の作出を補助できる架橋用ホスホロチオエート結合(上記参照)を有するようにPCRプライマーをデザインすることができる。
【０１６６】
PCRを用いて作出される突出配列は、PCR反応の人為的結果として作出される一塩基突出を含んでもよい。例えば、校正(proof-reading)機能を持たず、本質的な末端トランスフェラーゼ活性を有するTaqなどのポリメラーゼが通常使用され、各末端に鋳型由来でない1つの3'側A突出を有するPCR産物を産生する。本発明の方法を使用して、これらの増幅産物を、T/Aクローニング反応では、ベクター(おのおの参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,487,993号および同第5,856,144号を参照のこと)であってもよい3'側一塩基T突出または3'側一塩基dU突出を一方または両方の末端に有するトポイソメラーゼ付加核酸分子を連結することができる。
【０１６７】
PCRは同様に、本発明の方法によって作出される、一方または両方の鎖に共有結合された共有結合型二本鎖組換え核酸分子を増幅するために使われてもよい。本発明の方法は、プロモーターを含むヌクレオチド配列、コード配列を含むヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナルを含むヌクレオチド配列を含む3つの基質核酸分子から、発現可能な二本鎖組換え核酸分子を作出することができる。二本鎖組換え核酸分子の作出は、連結される二本鎖ヌクレオチド配列の末端に相補的な3'(または5')突出配列を組み入れることによって促進することができる。例えば、発現可能な二本鎖組換え核酸分子は、第1末端の5'端にIA型トポイソメラーゼおよび第2末端の3'端にIB型トポイソメラーゼを有する第1核酸分子に、第2核酸分子および第3の二本鎖ヌクレオチド配列を接触させることによって作出することができる。プロモーターの上流であるプロモーターを含むヌクレオチド配列の一部に特異的な第1のプライマーおよびシグナルの下流であるポリアデニル化シグナルを含むヌクレオチド配列の一部に特異的な第2のプライマーを有するPCRプライマー対をデザインすることによって、プロモーター、コード配列およびポリアデニル化シグナルを適切な(所定の)方向で含む全長の機能的な二本鎖組換え核酸分子だけが増幅される。特に、例えばコード配列に連結したプロモーターだけを有する部分的な反応産物およびニックを有する反応産物は増幅されない。したがって、本発明の方法に有用であるように核酸分子を特異的にデザインするため、ならびに望ましい成分および特性を有する反応産物だけを特異的に増幅するためにPCRを使用することができる。
【０１６８】
本明細書で用いられる「共有結合された」という用語は、二本鎖組換え核酸分子に言及して使用される場合には、核酸分子が、トポイソメラーゼ媒介連結により両方の鎖に連結される少なくとも2つの核酸分子から作出されることを意味する。例えば、共有結合される核酸分子の一方に共有結合されるトポイソメラーゼは、他方の核酸分子に共有結合されるトポイソメラーゼと同じであっても、異なってもよいことが認識されるべきである。したがって、ワクシニアトポイソメラーゼが一方の核酸分子に共有結合され、別のポックスウイルスまたは真核細胞核IB型トポイソメラーゼが他方の鎖に結合されてもよい。しかし、一般に、トポイソメラーゼは、異なる場合には、同じファミリー、例えばIA型またはIB型またはII型のメンバーであるが、トポイソメラーゼが、例えば5'リン酸に共有結合され、相補的な3'突出を作出する場合には、トポイソメラーゼは、例えば異なるファミリー、例えばIA型とII型由来であってもよい。
【０１６９】
「共有結合される」という用語は同様に、1つの鎖に連結される少なくとも2つのヌクレオチド配列から作出される一本鎖または二本鎖核酸分子に言及して本明細書において使用される。例えば、トポイソメラーゼが、結合する第1核酸分子の5'端を、第2核酸分子の3'端に共有結合することができる条件下において、5'端にまたは5'端付近に結合された1つのトポイソメラーゼを含む第1のトポイソメラーゼ付加核酸分子が第2の二本鎖ヌクレオチド配列と接触する場合に作出される二本鎖組換え核酸分子は、1つの鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出することができる。
【０１７０】
1つの態様では、本発明の方法により作出される両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子は、どちらかの鎖の2つのヌクレオチド配列が連結される部位にニックがないが、分子の別の箇所にニックを有することがある。1つの鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する方法では、少なくとも末端が相補鎖に連結された位置にニックを有する二本鎖組換え核酸分子が作出される。このニックのある二本鎖組換え核酸分子は、当技術分野において周知であるように、ニックのある二本鎖組換え核酸分子を細胞に導入することによって、またはリガーゼを使用するなどの連結反応を二本鎖組換え核酸分子に実施することによって、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子に変換することができる。
【０１７１】
「組換え」という用語は、本発明の方法により、少なくとも2つのヌクレオチド配列を連結することによって作出される核酸分子を言及するために本明細書において使用される。このように、本発明に含まれる二本鎖組換え核酸分子は、天然、例えば減数分裂中に産出されうる核酸分子とは識別される。例えば、本発明のある種の局面の方法により作出される、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子は、核酸分子が連結された部位にまたは部位付近に、相補鎖のそれぞれに1つずつ存在する2つのトポイソメラーゼ認識部位の存在によって同定することができる。
【０１７２】
本発明の方法は、第1末端および第2末端を有し、第1核酸分子が、第1末端もしくは第2末端または両方において、3'端にまたは3'端付近にトポイソメラーゼ認識部位またはその切断産物を有し、同じ末端の5'端にヒドロキシル基を有する(または、例えばホスファターゼとの接触によって有するように作出することができる)第1核酸分子と、第1末端および第2末端を有し、少なくとも第2核酸分子が、第1末端もしくは第2末端または両方において、3'端にまたは3'端付近にトポイソメラーゼ認識部位またはその切断産物を有し、同じ末端の5'端にヒドロキシル基を有する(または、有するように作出することができる)少なくとも1つの第2核酸分子と、トポイソメラーゼを、全ての成分が接触し、トポイソメラーゼがその活性を発揮できるような条件下で接触させることによって実施することができる。適宜、トポイソメラーゼと第1および第2(または他の)核酸分子を接触させ、切断されると、各ヌクレオチド配列は、接触の結果、第1および少なくとも第2のヌクレオチド配列が両方の鎖に共有結合されるように、切断部位の3'端に共有結合されたトポイソメラーゼを含み、5'端にヒドロキシル基を有する、または有してもよい。したがって、本発明は、このような方法によって作出される、両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を提供する。
【０１７３】
本明細書で用いられる「に(で)またはその付近に(で)」は、ヌクレオチド配列の3'(IB型)または5'(IA型またはII型)に対するトポイソメラーゼ認識部位の近位性に言及して使用する場合には、部位が、それぞれ、3'端または5'端から約1〜100ヌクレオチド以内にある、一般に末端から約1〜20ヌクレオチド以内にある、特にそれぞれの末端から約2〜12ヌクレオチド以内にあることを意味する。トポイソメラーゼ認識部位を末端の約10〜15ヌクレオチド以内に位置づける利点は、トポイソメラーゼによる切断の結果、切断部位の下流の配列部分が、共有結合されたトポイソメラーゼを有する残りのヌクレオチド配列から自然に分離することができるということである(一般に「自殺切断(suicide cleavage)」と言われる、例えば、Shuman., 前記、1991; Andersen et al., 前記、1991を参照のこと)。トポイソメラーゼ認識部位が末端からの約12〜15ヌクレオチドより大きい場合には、例えば、トポイソメラーゼ切断部位を含む二本鎖の一部の融解温度より高い温度におけるインキュベーション段階を提供することによって、反応条件を改良することによって、配列の残りから分離するように切断部位の上流または下流のヌクレオチド配列を誘導することができる。
【０１７４】
例えば、一方または両方の末端から約2〜15ヌクレオチドのところにIB型トポイソメラーゼ認識部位を含むように、第1または第2の(または他の)核酸分子を構築するさらなる利点は、部位特異的トポイソメラーゼによる核酸分子の切断により、5'突出が作出されることである。2〜15ヌクレオチドを含むと思われるこのような5'突出配列を、本明細書に開示されているPCR方法を使用して、望ましい任意の配列を有するように、それぞれ、デザインすることができる。したがって、本発明の方法により、切断された第1核酸分子が、選択された第2の(または他の)核酸分子に共有結合される場合、および選択された配列が5'突出配列を有する場合には、2つ(またはそれ以上)の配列が5'突出の相補性により所定の方向に共有結合されるように、第1核酸分子の5'突出は、選択された第2の(または他の)二本鎖配列に相補的であるようにデザインすることができる。上述されるように、例えば、IA型またはII型トポイソメラーゼによる切断の結果作出される3'突出配列に関して同様の方法を使用することができる。
【０１７５】
本明細書で用いられる「第1末端」および「第2末端」を有するヌクレオチド配列への言及は、ヌクレオチド配列が直鎖状であることを意味する。基質核酸分子は、スーパーコイルを含んで、直鎖状または環状であってもよいが、1つまたは複数のトポイソメラーゼによる切断の結果として、直鎖状トポイソメラーゼ付加核酸分子が一般に産生される。例えば、各鎖が切断され、介在する配列が分離し、トポイソメラーゼが各末端に共有結合した直鎖状核酸分子を作出するように、互いから約100ヌクレオチド以内で、相補鎖内に、好ましくは互いから約20ヌクレオチド以内で、相補鎖内に2つのIB型トポイソメラーゼ認識部位を有する環状核酸分子に部位特異的IB型トポイソメラーゼを接触させることができる。
【０１７６】
核酸分子の第1末端または第2末端への言及は、ヌクレオチド配列の任意の特定の方向を意味する意図ではなく、互いに対する末端の相対的な重要性を意味する意図ではないことが認識されるべきである。第1末端および第2末端を有するヌクレオチド配列が二本鎖ヌクレオチド配列である場合には、各末端は5'端および3'端を有する。したがって、例えば、第1末端であっても、第2末端であってもよい同じ末端の、3'端にトポイソメラーゼ認識部位を有し、5'端にヒドロキシル基を有するヌクレオチド配列が本明細書で言及される。
【０１７７】
本発明の方法は、第1核酸分子および第2核酸分子だけを使用して実施しても、または適宜第3、第4またはそれ以上の核酸分子をさらに含んでもよい。一般に、このようなヌクレオチド配列はそれぞれ、3'端または5'端の少なくとも一方またはその付近にトポイソメラーゼ認識部位またはその切断産物を有し、同じ末端の5'端にヒドロキシル基を有しても、またはホスファターゼを使用してヒドロキシル基を作出してもよい。第2のヌクレオチド配列に連結される末端にまたは末端付近に、ヌクレオチド配列がトポイソメラーゼ認識部位を持たない場合には、例えば、トポイソメラーゼ認識部位の相補鎖を含むプライマーを使用した配列のPCR増幅によって、本明細書に開示する方法を使用して、トポイソメラーゼ認識部位をヌクレオチド配列に組み入れることができる。
【０１７８】
「第1のヌクレオチド配列」、「第2のヌクレオチド配列」、「第3のヌクレオチド配列」などの用語は、いくつかのヌクレオチド配列のどれが言及されているかを示す手段を提供するためだけに本明細書において使用される。したがって、特定のヌクレオチド配列に関して具体的に規定される任意の特徴がない場合には、「第1」、「第2」、「第3」などの用語は、ヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の集団もしくは多数のヌクレオチド配列に言及して使用される場合には、ヌクレオチド配列に関する任意の特定の順序、重要性または他の情報を示すことを意図していない。したがって、例示されている方法が、例えば、増幅産物が一方または両方の末端にトポイソメラーゼ認識部位を有するように、PCRを使用して第1核酸分子を増幅することに言及している場合には、第2の(または他の)核酸分子も同様にこのように増幅することができることが認識される。
【０１７９】
「少なくとも第2のヌクレオチド配列」という用語は、第1のヌクレオチド配列以外の1つまたは複数のヌクレオチド配列を意味するために本明細書において使用される。したがって、この用語は第2のヌクレオチド配列だけまたは第2のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列(またはそれ以上)を言及することができる。このように、「第2の(または他の)ヌクレオチド配列」または「第2(および他の)ヌクレオチド配列」という用語は、「少なくとも第2のヌクレオチド配列」という用語が第2、第3またはそれ以上のヌクレオチド配列を言及することができるということを認識して本明細書において使用される。特に記載しない限り、「少なくとも第2のヌクレオチド配列」という用語の意味に含まれるヌクレオチド配列は、第1のヌクレオチド配列と同じまたは実質的に同じであってもよいことが認識されるべきである。例えば、本発明の方法を使用して、第1および第2核酸分子を共有結合することができるように、トポイソメラーゼによる切断の結果作出される相補的な5'突出配列を有することを除いて、第1および第2核酸分子は同じであってもよい。このように、本発明の方法を使用して、任意で、例えば、調節要素などの第3核酸分子が点在してもよく、共有結合された配列を所定の指向性方向、例えば、それぞれ互いに対して5'側から3'側への方向で有してもよい直鎖状の第1および第2核酸分子を作出することができる。
【０１８０】
本明細書に開示するように、本発明の方法は、所定の指向性方向で2つまたはそれ以上の二本鎖ヌクレオチドを共有結合する手段を提供する。「指向性方向」または「所定の指向性方向」または「所定の方向」という用語は、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を特定の順序で共有結合することを言及するために本明細書において使用される。したがって、本発明の方法は、例えば、機能的な発現可能な二本鎖組換え核酸分子を作出するために、コード配列の上流のプロモーター調節要素を共有結合し、コード領域の下流のポリアデニル化シグナルを共有結合するための手段を提供するか、またはそれらがインフレームで転写および翻訳されて融合ポリペプチドを産生することができるように、2つのコード配列を共有結合するための手段を提供する。
【０１８１】
本発明の方法は同様に、第1末端および第2末端を有し、第1末端もしくは第2末端または両方において、第1核酸分子は、IB型トポイソメラーゼが3'端(トポイソメラーゼ付加している)に共有結合しており、同じ末端の5'端にヒドロキシル基を有する(または有するように作出することができる)第1核酸分子と、同じ末端の5'端にヒドロキシル基を有する(または有するように作出することができる)少なくとも第2のIB型トポイソメラーゼ付加核酸分子を接触させることによって行うことができる。トポイソメラーゼおよび5'ヒドロキシル基を有する末端においてトポイソメラーゼ活性化した第1のヌクレオチド配列と、少なくとも第2のヌクレオチド配列を接触させる結果、ホスホジエステル結合が各鎖に形成され、それによって両方の鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出する。
【０１８２】
特定の試薬(例えば、酵素)が認識するおよび/またはその反応を触媒する基質を本発明の方法で使用して、特定の特性を有する核酸分子を産生させることができる。例えば、核酸修飾を触媒する試薬は末端を認識するおよび/または特定の特徴を有する末端を作り出すことができる。このような特徴の一例は3'または5'鎖の末端リン酸基が存在することまたは存在しないことである。このような試薬、またはこのような試薬の組合せを使用して、例えば、(1) 特定のセグメントから、および/または(2) 特異的なニックの「パターン」(例えば、2つまたはそれ以上のセグメントが連結された鎖の一方だけにあるニック、3つまたはそれ以上のセグメントが連結された鎖の交互にあるニックなど)を有するもしくはどちらの鎖にもニックがない核酸分子を調製することができる。
【０１８３】
本発明の方法で使用できる試薬(例えば、酵素)には以下が含まれるが、これらに限定されることはない: リガーゼ(例えば、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼなどのようなDNAおよびRNAリガーゼ)、制限酵素(例えば、EcoRI、HpaII、BamHIなど)、キナーゼ(例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼなど)、ホスファターゼ(例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ)、トポイソメラーゼ、およびポリメラーゼ(例えば、Pfu、Pfx、THERMALACE(商標)(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)などのような校正(proof-reading)ポリメラーゼ、およびTaqポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼなどのような非校正ポリメラーゼ)。
【０１８４】
多くのエンドヌクレアーゼ(例えば、制限エンドヌクレアーゼ)による核酸分子の切断によって結果的に、ヒドロキシル基が一端の3'末端に存在し、リン酸基が残りの一端の5'末端に存在する新たな2つの端が形成される。同様に、エキソヌクレアーゼ(例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼVII、ラムダエキソヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼIIIなど)が核酸分子を消化する際、それらは多くの場合、(1) 5'末端ヒドロキシル基および3'末端リン酸基または(2) 3'末端ヒドロキシル基および5'末端リン酸基を有する末端を生成する。さらに、エキソヌクレアーゼは通常、核酸分子の一本鎖しか消化しないが、一本鎖および/または二本鎖核酸のいずれかを基質として利用することができる。さらに、エキソヌクレアーゼ(例えば、本発明の方法で使用されるエキソヌクレアーゼ)は、核酸分子を3'末端、5'末端、または3'および5'末端の両方から消化することができる。同様に、キナーゼ(例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼなど)を使用して、核酸分子の5'および/または3'末端ヒドロキシル基をリン酸基と置換することができる。
【０１８５】
例えば、PCRによる、核酸分子の増幅に使われる多くのポリメラーゼは、3'末端ヒドロキシル基を有する核酸産物を生成する。さらに、PCR産物の5'末端に、リン酸基、またはその他の化学基が存在することまたは存在しないことは、通常、PCR反応で使われるプライマーが5'末端リン酸基またはその他の化学基を含むかどうかによって決定される。すなわち、5'末端のリン酸基、ヒドロキシル基、またはその他の基は、これらの基をその5'末端に含んだプライマーの使用によってPCR産物に導入することができる。結果的に、PCRを利用して、ヒドロキシル基、リン酸基および/またはその他の基の望ましい配置を直鎖状核酸分子の片端または両端の5'および/または3'末端に(例えば、5'リン酸基および3'ヒドロキシル基を一端にならびに5'ヒドロキシル基および3'ヒドロキシル基を残りの一端に)含んだ核酸分子(すなわち、下記の第1核酸分子)を生成することができる。
【０１８６】
上記の酵素類の各々は、特定の特徴を有する(例えば、1つまたは複数の末端の3'および/または5'末端にヒドロキシル基、リン酸基および/またはその他の基の望ましい配置を有する)核酸分子を生成するのに利用できる一般的な類の手段に相当する。例えば、一端の5'末端および3'末端それぞれが末端ヒドロキシル基を含み、残りの一端の5'末端および3'末端それぞれが末端リン酸基を含む二本鎖の直鎖状核酸分子が調製されてもよい。このような末端は上記の酵素ならびに/または当技術分野において公知のその他の試薬および方法を用いて調製されてもよい。
【０１８７】
このように、本発明は特定の特徴を有する(例えば、1つまたは複数の末端の3'および/または5'末端にヒドロキシル基、リン酸基および/またはその他の基の望ましい配置を有する)核酸セグメントの構築および使用を企図する。このような核酸は、表4に示される特徴を持った第1および第2端を有する二本鎖の直鎖状核酸分子を含むが、これらに限定されることはない。
【０１８８】
（表４）
2007512838.tif 000013
【０１８９】
1つまたは複数の末端の3'および/または5'末端にヒドロキシル基、リン酸基および/またはその他の基の望ましい配置を有する核酸分子は、例えば、分子の1つまたは複数の末端に特定の基(例えば、5'ヒドロキシル基もしくは5'リン酸基および/または3'ヒドロキシル基もしくは3'リン酸基のいずれか)が存在することを必要とする連結反応を利用して、その他の核酸分子に一方向性に連結することができる。
【０１９０】
核酸セグメントを相互に連結することを触媒する多くの試薬は一般に、特定の化学基(例えば、ヒドロキシル基またはリン酸基)を有する末端が存在することを認識するだけである。例えば、T4 DNAリガーゼは、5'末端が末端リン酸基を含む場合、核酸分子の一端の3'末端を同じ核酸分子のまたは異なる核酸分子の別端の5'末端に連結することを触媒できる。さらに、多くのトポイソメラーゼ(例えば、IB型トポイソメラーゼ)は、5'末端が末端ヒドロキシル基を含む場合、核酸分子の末端の3'末端に結合し切断し、この3'末端を同じ核酸分子のまたは異なる核酸分子の末端の5'末端に連結することを触媒できる。さらに、多くのトポイソメラーゼ(例えば、IA型トポイソメラーゼ)は、3'末端が末端ヒドロキシル基を含む場合、核酸分子の末端の5'末端に結合し切断し、この5'末端を同じ核酸分子のまたは異なる核酸分子の末端の3'末端に連結することを触媒できる。
【０１９１】
このような連結反応の一例は望ましい基の配置を1つまたは複数の末端に(例えば、5'リン酸を一端におよび5'ヒドロキシルを残りの一端に)有する第1核酸分子が、分子の片端のみの3'末端のリン酸基に共有結合している、すなわち、二本鎖核酸分子の片鎖の3'末端に結合しているIB型トポイソメラーゼ分子を含んだ第2核酸分子に連結される場合である。そのような場合には、結合型トポイソメラーゼを含んだ第2核酸分子の末端の3'末端は、ヒドロキシル基を含んだ第1核酸分子の末端の5'末端にしか連結されない。すなわち、これらの2つの核酸分子は一方向でしか共有結合されない。
【０１９２】
リン酸基を両端の5'および3'末端の両方に有する直鎖状の二本鎖核酸分子(表4を参照のこと)は、さまざまな方法によって生成することができる。このような分子を産生するのに利用できる方法の一例には、二本鎖核酸分子の両鎖の化学合成が含まれる。これらの個々の鎖を次に、二本鎖分子の形成を可能にする条件の下で混合することができる。
【０１９３】
上記の試薬、およびその他の試薬を用いて、種々の化学基をその末端に有する核酸分子を片鎖または両鎖で相互に共有結合することができる。例えば、5'末端リン酸基およびIB型トポイソメラーゼが片端に結合している3'末端リン酸基を含んだ第1核酸セグメントは、5'および3'末端ヒドロキシル基を片端に含んだ第2核酸セグメントに両鎖で連結されてもよい。この場合には、第1核酸セグメントの3'末端であって、これに結合したトポイソメラーゼ分子を含むその末端が第2核酸分子の末端の5'末端に連結されてもよい。この連結反応は結合型トポイソメラーゼ分子が触媒することができる。さらに、第1核酸セグメントのその同じ末端の5'末端は、リガーゼ(例えば、T4 DNAリガーゼ)と協力して第2核酸セグメントの末端の3'末端に共有結合されうる。2番目の例として、第1核酸セグメントは、5'末端リン酸基を「付着端」に存在したままとする制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって生じた「付着端」(すなわち、突出部)を付けて調製される。この第1核酸セグメントを、適合する「付着端」およびこの「付着端」の5'末端に結合したトポイソメラーゼ分子を含む第2核酸セグメントと接触させる。この結果はこれら2つの核酸セグメントの単一鎖での共有結合である。さらに、連結点での残りの鎖のニックは、反応混合物中にT4 DNAリガーゼなどのリガーゼを含めることによって塞がれてもよい。
【０１９４】
利用可能な末端および特定の機構によるまたは特定の試薬によって触媒される連結反応のための末端を有する核酸セグメントを調製するのに使われる試薬に応じて、任意の数の上記の改変が可能である。このような改変の一例は、言及した第1核酸分子の「付着端」の5'末端がヒドロキシル基を含み(例えば、5'リン酸はホスファターゼによって除去される)、第2核酸分子が、適合する「付着端」の3'末端に結合したIB型トポイソメラーゼを含む場合である。
【０１９５】
方法
本発明の組成物はさまざまな過程で使用されてもよい。通常、これらの過程は2つのプライマー結合部位が利用される方法を含むはずである。このような過程の例には増幅反応、配列決定反応、RT-PCR、および逆転写反応が含まれる。
【０１９６】
例えば、本発明はプライマー結合部位によって隣接された核酸セグメントを増幅する(例えば、PCRにより)方法を含む。通常、これらのプライマー結合部位は配列が1つまたはそれ以上のヌクレオチドだけ異なるはずである。同様に、多くの場合には、両方のプライマー結合部位に結合できるが、これらの部位のうち一方に結合した場合に増幅を唯一媒介できる単一のプライマーを本発明の方法で使用することができる。このようなプライマーおよびプライマー結合部位を利用する増幅反応を使って、二本鎖核酸セグメントの片鎖のみのコピーを産生させることができる。換言すれば、二本鎖核酸分子の片鎖のみが各融解および合成サイクルから反応混合物中に生成される。このように、本発明は二本鎖核酸セグメントの片鎖に相当する一本鎖核酸分子を含む組成物を産生する方法、およびそのような核酸分子を含む組成物を提供する。特定の場合には、そのような組成物中の増幅鎖の非増幅鎖に対する比率は、一方のプライマーのみが5'から3'への伸長を媒介する場合に起こる増幅反応の回数によって決定されるはずである。そのような比率には2:1から200:1、2:1から100:1、2:1から50:1、2:1から25:1、2:1から15:1、2:1から10:1、5:1から200:1、5:1から100:1、5:1から50:1、5:1から25:1、5:1から15:1、5:1から10:1、10:1から200:1、10:1から100:1、10:1から50:1、10:1から25:1、10:1から15:1などのような範囲が含まれる。特定の態様では、本発明は、核酸セグメントに隣接するプライマー結合部位に結合し、生成した二本鎖核酸分子に対する増幅反応で機能する2つのプライマーを用いて増幅反応を行い、続けて片鎖のみが増幅されるのを可能にする条件の下で核酸分子のさらなる増幅のラウンドを行う方法を含む。これらの条件には以下が含まれる: (1) 単一プライマーの存在下でのさらなる増幅に先立って、増幅された二本鎖核酸分子の精製および(2) 一本鎖核酸分子の産生をもたらす後の増幅のラウンドに先立って、二本鎖核酸分子を生成する最初の増幅反応をもたらす増幅過程の間の2つのプライマーのうち一方の本質的に完全な消費。
【０１９７】
本発明は同様に、ヌクレオチド配列が少なくとも1ヌクレオチドだけ異なる2つまたはそれ以上のプライマーを利用する核酸分子の増幅方法を含む。特定の態様では、本発明はヌクレオチド配列の異なるプライマー結合部位によって隣接された核酸セグメントを増幅する方法を含む。多くの場合、このような方法では、各々が2つのプライマー結合部位に結合でき、2つのプライマー結合部位のうち1つに結合した場合にだけ核酸合成を媒介できる2つのプライマーが利用される。特定の態様では、配列プライマーの両方がプライマー結合部位の両方に結合できるが、2つのプライマー結合部位のうち1つに結合した場合にだけ核酸合成を媒介できる。
【０１９８】
核酸増幅の反応および方法は当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第4,683,202号、同第5,681,741号、同第6,544,782号、同第6,566,067号、および同第6,630,333号に記述されており、これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９９】
本発明は核酸セグメントを配列決定する方法をさらに含む。通常、これらの核酸セグメントにはプライマー結合部位が隣接するはずである。多くの場合には、これらのプライマー結合部位は1、2、3、4、または5ヌクレオチドを除いてヌクレオチド配列が同一であるはずである。核酸増幅反応について上記と同様に、多くの態様では、単一プライマーは両方のプライマー結合部位に結合できるが、プライマー結合部位のうち一方に結合した場合に核酸の合成または伸長を唯一媒介できる。
【０２００】
さまざまな方法を利用して、本発明の核酸分子を配列決定してもよい。そのような方法の1つは、鎖終結法またはサンガー法と称される。通常、サンガー配列決定過程は、配列決定される核酸分子を含む二本鎖DNAを一本鎖DNAに変換することによって始まる。これは、例えば、二本鎖DNAをNaOHで変性することによって行うことができる。配列決定の反応混合物は、通常、以下を含む: 配列決定される一本鎖DNA、一本鎖DNAに相補的でありハイブリダイズできる標識プライマー、特定のddNTP (例えば、ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP)のその通常のdNTP対応物(例えば、dATP、dGTP、dCTP、dTTP)との混合物、その他3種のdNTP。ポリメラーゼを介した5'から3'へのプライマー伸長が起こり、ddNTPが成長中の鎖に取り込まれると、個々の核酸分子で終結が起こる。通常、3種の類似の反応混合物をその他のddNTPとそのdNTP対応物の混合物で準備する。各反応混合物中のddNTPのdNTPに対する比率は、合成される核酸鎖の何%が各取込みdd/dNTPで終結するかを決定づける。
【０２０１】
反応の全てが完了したら、通常、標識された断片のサイズをポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって評価し、反応混合物の産物を含有するレーンを互いに比較する。交代性のバンドパターンは、一般に、ゲルを曝露させて核酸分子のヌクレオチド配列を「解読」可能とする写真用フィルムの解読である。核酸の配列決定法は、開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,654,149号を含めて、多数の情報源に記述されている。
【０２０２】
宿主細胞
本発明は同様に、検出可能な活性を有するポリペプチドをコードする1つもしくは複数の核酸配列および/または1つもしくは複数(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)のその他の関心対象の配列を含む本発明の核酸分子の1つまたは複数を含んだ宿主細胞に関する。本発明のこの局面によって使用できる代表的な宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。好ましい態様では、細菌宿主細胞にはエシェリキア(Escherichia)種の細胞(具体的には大腸菌細胞およびさらに具体的には大腸菌株DH10B、Stbl2、DH5α、DB3、DB3.1 (例えば、大腸菌LIBRARY EFFICIENCY(登録商標)DB3.1(商標)コンピテント細胞; Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、DB4、DB5、JDP682およびccdA-over (2000年3月2日付で出願された米国特許出願第09/518,188号、およびLouis Leongらによって2003年6月3日付で出願された「Cells Resistant to Toxic Genes and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第60/475,004号を参照されたく、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる); バシラス(Bacillus)種の細胞(具体的には枯草菌(B. sutilis)およびB. メガテリウム(B. megaterium)細胞)、ストレプトマイセス(Streptomyces)種の細胞、エルウィニア(Erwinia)種の細胞、クレブシエラ(Klebsiella)種の細胞、セラチア(Serratia)種の細胞(具体的にはS. マルセッセンス(S. marcessans)細胞)、シュードモナス(Pseudomonas)種の細胞(具体的には緑膿菌(P. aeruginosa)細胞)、およびサルモネラ(Salmonella)種の細胞(具体的にはS. ティフィムリウム(S. typhimurium)およびS. ティフィ(S. typhi)細胞)が含まれる。適当な動物宿主細胞には昆虫細胞(最も具体的にはキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)細胞、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)Sf9およびSf21細胞ならびにキャベツシャクトリムシハイファイブ(Trichoplusa High-Five)細胞)、線虫細胞(具体的には線虫(C. elegans)細胞)、鳥類細胞、両生類細胞(具体的にはアフリカツメガエル(Xenopus laevis)細胞)、爬虫類細胞、ならびに哺乳類細胞(最も具体的にはNIH3T3、293、CHO、COS、VERO、BHKおよびヒト細胞)が含まれる。適当な酵母宿主細胞には、サッカロミセス・セレビジエ細胞およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞が含まれる。これらのおよびその他の適当な宿主細胞は、例えば、Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA)、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection) (Manassas, Virginia)、およびAgricultural Research Culture Collection (NRRL; Peoria, Illinois)から市販されている。
【０２０３】
本発明のベクターは、例えば、さまざまな適当な細胞中で増殖されてもよい。このような細胞の例にはTOP10細胞(例えば、Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, カタログ番号C404003、C404052、およびC409601を参照のこと)、TOP10F'細胞(例えば、Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, カタログ番号C303006を参照のこと)、およびMACH 1細胞(例えば、Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, カタログ番号C862003およびC869601を参照のこと)が含まれる。ccdBカセットを含むベクターが組換え反応を起こしており、これがTOP10およびMACH 1細胞の中に導入される場合には、より低いバックグラウンドはMACH 1細胞で見られることがデータから示唆される。これらのデータから、MACH 1細胞はTOP10細胞よりもccdB遺伝子発現産物に対して感受性が高いことが示唆される。換言すれば、組換え反応を起こしており、ccdBカセットに取って代わった核酸領域を含むバクターを得るには、TOP10細胞ではなくMACH 1細胞を使用することがいっそう望ましいかもしれない。
【０２０４】
本発明で使用される核酸分子は1つもしくは複数の複製起点(ORI)、および/または1つもしくは複数の選択可能なマーカーを含んでもよい。いくつかの態様では、分子は、少なくとも2つが異なる生物体で(例えば、1つが原核生物でおよび1つが真核生物で)機能できる2つまたはそれ以上のORIを含んでもよい。例えば、核酸は1つまたは複数の原核生物(例えば、大腸菌、バシラスなど)で機能するORIと1つまたは複数の真核生物(例えば、酵母、昆虫、哺乳類細胞など)で機能する別のORIを有してもよい。選択可能なマーカーを同様に、本発明の核酸分子の中に含ませて、異なる生物体での選択を可能にしてもよい。例えば、核酸分子は、1つまたは複数が原核生物で機能し1つまたは複数が真核生物で機能する複数の選択可能なマーカーを含んでもよい。
【０２０５】
本発明の核酸分子の1つまたは複数を含む宿主細胞を産生するために、本明細書に記述される宿主細胞に本発明の核酸分子を導入する方法は当業者によく知られているはずである。例えば、本発明の核酸分子は感染、形質導入、エレクトロポレーション、トランスフェクションおよび形質転換という周知の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。本発明の核酸分子は単独であるいはその他の核酸分子および/またはベクターおよび/またはタンパク質、ペプチドまたはRNAと併せて導入されてもよい。あるいは、本発明の核酸分子はリン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物として、または脂質との複合体で宿主細胞に導入されてもよい。エレクトロポレーションを利用して本発明の核酸分子を宿主に導入してもよい。同様に、このような分子は大腸菌などのケミカルコンピテント細胞に導入されてもよい。ベクターがウイルスであるならば、これはインビトロでパッケージングされてもまたはパッケージング細胞に導入されてもよく、パッケージ化されたウイルスが細胞に形質導入されてもよい。したがって、本発明の核酸分子は1つまたは複数のパッケージングシグナル(例えば、ウイルス核酸分子のパッケージングを命令するウイルスパッケージングシグナル)を含んでもおよび/またはコードしてもよい。故に、本発明のこの局面によって本発明の核酸分子および/またはベクターを細胞に導入するのに適したさまざまな技術が周知であり、当業者にとって日常的である。このような技術は、例えば、これらの技術を詳述する多くの実験マニュアルの例証であって、関連する開示についてその全体が参照により本明細書に組み入れられるSambrook, J., et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 16.30-16.55 (1989), Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, 2nd Ed., New York: W.H. Freeman and Co., pp. 213-234 (1992)およびWinnacker, E.-L., From Genes to Clones, New York: VCH Publishers (1987)の中に詳細に概説されている。
【０２０６】
キット
別の局面では、本発明は、本発明の方法と併せて使用できるキットを提供する。本発明のこの局面によるキットは、本発明の1つまたは複数の核酸分子(例えば、検出可能な活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸配列を含んだ1つまたは複数の核酸分子)、1つまたは複数のプライマー、本発明の分子および/または化合物、本発明の支持体、1つまたは複数のポリメラーゼ、1つまたは複数の逆転写酵素、1つまたは複数の組換えタンパク質(または本発明の方法を実施するためのその他の酵素)、1つまたは複数のトポイソメラーゼ、1つまたは複数の緩衝液、1つまたは複数の界面活性剤、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の停止剤(例えば、ddNTP)、1つまたは複数のトランスフェクション試薬、ピロホスファターゼならびに同様のものからなる群より選択される、1つまたは複数の成分を含むことができる、1つまたは複数の容器を含んでもよい。本発明のキットは同様に、本発明の1つまたは複数の方法を実施するための取扱説明書を含んでもよい。
【０２０７】
本発明は同様に、本発明の方法を好都合に実践するのに有用な成分を含むキットを提供する。1つの態様では、本発明のキットは検出可能な活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んだ、ならびに1つもしくは複数のトポイソメラーゼ認識部位および/または1つもしくは複数の共有結合しているトポイソメラーゼ酵素を含んだ第1核酸分子を含む。本発明のこの局面による核酸分子は、1つまたは複数の組換え部位をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、核酸分子はトポイソメラーゼ活性化ヌクレオチド配列を含む。トポイソメラーゼ付加核酸分子は片端または両端に5'突出配列を含んでもよく、突出配列は同じものであってもまたは異なるものであってもよい。任意で、5'末端のそれぞれが5'ヒドロキシル基を含んでもよい。
【０２０８】
1つの態様では、本発明のキットは検出可能な活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んだ、ならびに1つまたは複数の組換え部位を含んだ第1核酸分子を含む。本発明のこの局面による核酸分子は、1つまたは複数のトポイソメラーゼ部位および/またはトポイソメラーゼ酵素をさらに含んでもよい。
【０２０９】
さらに、キットは、上流もしくは下流の調節要素、またはその他の要素とできる、および片端または両端にトポイソメラーゼ認識部位を含む調節要素を含んだ少なくとも1つのヌクレオチド配列(またはその相補体)を含むことができる。特定の態様では、本発明のキットは、それぞれが異なる調節要素またはその他の要素、例えば、タグもしくはその他の検出可能な分子または細胞局在化ドメインをコードする配列を含んだ、複数の核酸分子を含む。この異なる要素は、異なる種類の特定の調節要素、例えば、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーターとすることができ、あるいは、例えば、転写および翻訳調節要素、エピトープタグなどを含めて、異なる種類の要素とすることができる。このような核酸分子はトポイソメラーゼ活性化することができ、特に選択可能なマーカーなどのポリペプチドがインビトロでまたは1つもしくは複数の細胞種で発現可能であるように、要素を所定の方向で作動可能に共有結合させることを促進する5'突出または3'突出を含むことができる。
【０２１０】
このキットは同様に、第1および第2のプライマーを含むプライマー対が選択され使用されて、キットの成分を用いて作り出される片鎖または両鎖に共有結合された望ましい二本鎖組換え核酸分子を増幅できるような第1および第2のプライマーを含んだ、プライマーを含むことができる。例えば、プライマーは、作り出された二本鎖組換え核酸分子の5'端に、例えば、プロモーター要素を含む核酸分子の部分に一般に位置づけられる要素に相補的な第1プライマーと、作り出された二本鎖組換え核酸分子の3'端に、例えば、転写終結部位を含むまたはエピトープタグをコードする核酸分子の部分に一般に位置づけられる要素に相補的な第2プライマーとを含むことができる。両鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を作出するキットから選択される要素に応じ、適切な第1および第2のプライマーを選択し使用して、全長の機能的構築体を増幅することができる。
【０２１１】
別の態様では、本発明のキットは複数の異なる要素を含み、これらのそれぞれが1つもしくは複数の組換え部位を含むことができおよび/または片端もしくは両端でトポイソメラーゼ活性化されることができ、ならびにこれらのそれぞれが5'突出配列もしくは3'突出配列またはその組合せを含むことができる。5'または3'突出配列は特定の要素に固有とすることができ、または複数の関連する要素、例えば、複数の異なるプロモーター要素に共通とすることができる。特定の態様では、要素の5'突出配列は、1つまたは複数の要素が作動可能に共有結合されて有用な機能、例えば、コザック(Kozak)配列を含む要素および本発明の方法によって要素を作動可能に共有結合できるような相補的5'突出を有することができる翻訳開始部位を含む要素を提供できるようにデザインされる。
【０２１２】
キットの複数の要素は、転写または翻訳調節要素; 細菌、昆虫、酵母、または哺乳類宿主細胞内でのヌクレオチド配列の複製に必要な要素; 制限エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼなどの部位特異的核酸結合タンパク質に対する認識配列を含む要素; エピトープタグまたは薬剤耐性遺伝子などの発現可能な産物をコードする要素; および同様のものを含めて、任意の要素を含むことができる。このように、本発明のキットは、例えば、本発明の方法によって作出された構築体が導入されるまたは発現される特定の細胞に応じて選択できる、異なる要素の好都合な供給源を提供する。キットは同様に、上述のように組合せて、キットの要素を用いて作り出される片鎖または両鎖に共有結合された二本鎖組換え核酸分子を増幅できる、第1および第2のプライマーを含んだPCRプライマーを含むことができる。キットは、任意でトポイソメラーゼ活性化核酸分子であってもまたはトポイソメラーゼ認識部位を含むヌクレオチド配列であってもよい、トポイソメラーゼ認識部位を含む第1核酸分子を第2の(または他の)核酸分子に、少なくとも一方の鎖するのに有用な量の部位特異的トポイソメラーゼをさらに任意で含んでもよい。
【０２１３】
さらに別の態様では、本発明のキットは、検出可能な活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んだ、ならびに各端にトポイソメラーゼ認識部位および/または組換え部位を含んだ第1核酸分子; 本発明の方法によって所定の方向で第1核酸分子に、片端または両端で共有結合することができる第1および第2の増幅産物を産生できる、第1および第2のPCRプライマー対を含む。
【０２１４】
本発明のキットは(1) 本明細書に記述される1つもしくは複数の方法を実施するための取扱説明書および/または(2) 本明細書に記述される1つもしくは複数の組成物の説明書をさらに含んでもよい。これらの取扱説明書および/または説明書は印刷された用紙であってもよい。例えば、これらの取扱説明書および/または説明書は本発明のキットの中に存在する挿入物の形態であってもよい。
【０２１５】
本発明の典型的な製品資料は付録Aとして本明細書に添付されている。本発明は、本発明の方法を行う方法、ならびに本発明の組成物を作出するおよび/または使用する方法を記述している製品資料を含む。
【０２１６】
本明細書に記述される方法および用途に対するその他の適当な変更および適応は、当業者に公知の情報を考慮すれば本発明の説明から容易に明らかであって、本発明の範囲またはその任意の態様から逸脱することなくなされうることが当業者に理解されよう。ここまで本発明を詳細に説明してきたが、説明のためだけに本明細書に含まれており、本発明を限定することを意図するものではない以下の例を参照することによって本発明はさらに明確に理解されるであろう。
【０２１７】
実施例
実施例1
本実施例で、発明者らは、新規のTOPO T/Aクローニング系の作出および試験について記述する。pCR8/GW/TOPOは、TOPOクローニング部位に隣接するattL配列を含むT/A Topoベクターである。このベクターは、pCR2.1/TOPO(例えば、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号K4500-01、K4500-40、K4520-01、K4520-40、K4550-01、K4550-40、K4560-01およびK4560-40を参照のこと)に見られるものと同様の高いクローニング効率と、現行のGATEWAY(登録商標)エントリーベクターに見られる効率的なLR組換え活性を示す。このベクターに新規な配列決定プライマーデザインを用いることでattL部位内での反応の誘導を可能にし、各反応で読み取られるベクター配列の量を最小化した。MACH IおよびTOP10細胞内でのpCR8/GW/TOPOのクローニングおよび増殖、ならびにpBAD DEST 49におけるエントリークローンの正確なLR移入および発現も立証した。
【０２１８】
序論
GATEWAY(登録商標)クローニングは、エントリーベクターからデスティネーションベクターへと読み取り枠(ORF)を移入するために有効なツールであり、その結果、発現構築体が作出される。GATEWAY(登録商標)クローニング試験の第一段階は、選択する挿入断片を含むエントリークローンを獲得または作出することである。現在のところ、エントリーベクターの構築に利用できる方法には次の3つがある: 1) 挿入断片の標準的な制限酵素消化と、pENTRベクターの1つへのその連結; 2) attB付加PCR産物の、ドナーベクターとのBP組換え; または3) CACC付加PCR産物の、pENTR D-TOPOベクターの1つとの一方向性TOPO連結。このPCR法ではプライマーへの塩基の付加が少数でよく、5分間のベンチトップ反応でクローニングが行える。エントリークローンを構築し、確認すれば、LR組換え反応によりORFを任意のデスティネーションベクターに移入することができる。
【０２１９】
本発明者らは、attLならびにTopo T/Aクローニング部位を含む新規のベクター系を作成した。この系のベクターは、pCRファミリーベクターの全ての機能を果たすことができる一方で、エントリーベクターの特性も維持している。これらの特性としては、配列確認の容易さとDNA断片のデスティネーションベクターへの効率的な移入が含まれる。クローニング部位近くに効率的なプライマー結合部位が配置されるため、pCRベクターにおける挿入断片の効率的な配列決定が可能である。pCR8/GW/TOPOにおいてこれを達成するために、attL2部位において、配列決定プライマーはattL2部位と完全にアニーリングするが、attL1部位とはアニーリングしないような突然変異を起こし、また、これらの突然変異がLR組換えに影響を及ぼさないようにデザインした。これらの新しい部位は、現行のドナーまたはエントリーベクターの場合よりもはるかに挿入断片に近いところで起こる確実なDNA配列決定反応を支援するものである。これにより、pCR8/GW/TOPOならびにpCRシリーズがクローニングおよび配列決定効率に機能を果たし、研究者は、下流解析のために挿入断片を適当な任意のデスティネーションベクターに移入することができるようになる。
【０２２０】
材料および方法
attP2部位の突然変異誘発
EcoRIおよびEcoRVエンドヌクレアーゼ消化により、pDONR221(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号12535-019、12536-017)からattP2部位を切断した。得られた711 bp断片をpCR2.1(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号K2000-01)のEcoRIおよびEcoRV部位にクローニングしてpCR2.1 P2 EcoRI/RV(図3)を作出した。
【０２２１】
ほぼ同一のattP/L部位でプライマーの特異的アニーリングを可能にするために、GC対をTA対に変換した2つの変異体を構築した。選択した突然変異誘発部位はCLONASE(商標)タンパク質結合部位間のスペーサー領域内に存在した(図4)。突然変異プライマーは、突然変異部位から、塩基の変更を指示するオリゴヌクレオチドの5'最末端ヌクレオチドを伴って伸長するようにデザインした。変異体12(mut 12)を作出するために、ポリメラーゼ連鎖反応において、リン酸化プライマーGCTA1とGCTA2を、鋳型としてのpCR2.1 P2 EcoRI/RVとともに使用した。得られたPCR産物をゲル精製し、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。この連結物の一部をTOP10細胞に形質転換し、生じたコロニーからプラスミドDNAを単離した。陽性クローンをDNA配列解析によりスクリーニングした。陽性クローンから711 bpのEcoRI/EcoRV断片を切り出し、それをpDONR223(図9)のEcoRIおよびEcoRV部位と連結して、pDONR223 mut12を作出した。pDONR223 mut34変異体は、同様の方法によりリン酸化プライマー
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を用いて作出した。すでに述べたように、Mut34プライマー
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を使用した配列決定反応からは、判読可能な配列決定データは得られなかった。
【０２２２】
attB ccdB/CmR カセットの構築
pDEST15(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, カタログ番号11802-014)を、オリゴ5'ccdBとオリゴ435を用いるPCRの鋳型として使用した。得られたPCR産物をpCR2.1にTOPOクローニングして、pCR2.1-ccdB/CMを作出した。pCR2.1-ccdB/CMを、オリゴヌクレオチド5'GWTA-tccとGWT ccmRを用いるPCRの鋳型として使用して、attB部位を含むPCR産物を作出した。このPCR産物をゲル精製した後、BP反応に使用した。
【０２２３】
pCR8/GW/TOPOの構築
pCR8/GW/TOPOを構築するために、pDONR223 mut 12をEcoRIで直鎖化し、それを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(New England Biolabs)で処理し、SNAPゲル精製キット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA カタログ番号K199925)を使用して1.2%アガロースE-ゲルからゲル精製した。得られたDNA断片を、上記のようにEcoRI制限部位を含むように改変したccdB/CmカセットからなるPCR産物とともにBP反応に使用した。BP反応物20 μlは、attB ccdB/Cm-カセットPCR産物4 μl(約100 ng)、直鎖化pDONR 223 mut 12 300 ng、5×BP CLONASE(商標)緩衝液(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号11789013)4 μlおよびBP CLONASE(商標)ミックス(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号11789-013)4 μlからなった。反応物を室温で1時間インキュベートした。この反応物2 μlを使用して、ケミカルコンピテントDB3.1細胞を形質転換した。1時間増殖させた後、それらの細胞をスペクチノマイシン(100 μg/mL)含有LB寒天プレートに蒔いて培養した。制限消化解析により陽性クローンを確認し、配列解析により挿入断片の存在を確認した。
【０２２４】
次に、pCR8/GW/TOPO mut12をBamHIで消化してCmR遺伝子を欠失させ、pCR8/GW/TOPOを作出した。これは、CmR遺伝子内のEcoRI部位がTOPOアダプター付加の妨げになるかもしれないという懸念があるために行ったものである。ベクターを1.2% E-ゲルで泳動し、切り出し、SNAP精製キットを用いて精製した。精製したベクター5 ngを一晩連結し、その後、それを用いてDB3.1細胞を形質転換した。
【０２２５】
（表５）
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【０２２６】
Mach I増殖解析
pDONR221(KanR)、pDONR223(SpecR)またはpDONR228(図10)(AmpR)のいずれかを用い、標準的なBP反応により、3種類のlacIエントリークローン(ORF=lacI)を作出し、それらを用いてTOP10(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号C404003)またはMACH1(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号C862003)細胞を形質転換した。これらの形質転換から得たコロニーを用い、LB培地(各抗生物質を添加)3 mlに植菌し、37℃で一晩振盪しながら増殖させた。4.5時間後と7時間後にOD600を測定した。上記形質転換体の静置(一晩)培養物、ならびに両細胞株のpENTR D-TOPO-CATおよびpCR8/GW/TOPO-CATを用いて第2の試験を行った。これらの培養物をOD600=2.0となるよう規準化し、100 μg/mlのアンピシリン、50 μg/mlのカナマイシンまたは100 μg/mlのスペクチノマイシンのいずれかを含有するLBで50分の1に希釈した。希釈した培養物を37℃で振盪しながらインキュベートし、植菌後1時間、3時間、4時間および5時間の時点でOD600測定値を記録した。
【０２２７】
TOPO付加のためのベクター調製
pCR8/GW/TOPO 50 μgを、EcoRI 300単位を含む1×EcoRI消化緩衝液(New England Biolabs)400 μl中で37℃にて3時間消化した。3時間の時点でEcoRIを100単位追加し、37℃でさらに1時間インキュベーションを続けた。pH7.5のフェノール/クロロホルム200 μlで、2分間穏やかにボルテックスにかけながら消化物を抽出した。遠心分離14000×gにより水相を分離し、新しい試験管へ移した。消化されたDNAを酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させ、遠心分離14000×g、10分間によりDNAをペレットとした。このペレットを70%エタノールで2回洗浄し、風乾し、水45 μlに再懸濁した。通常の回収量はDNA約40 μgであった。
【０２２８】
TOPOオリゴヌクレオチドの連結とTOPOアダプター付加
最初に、TOPO-1
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オリゴヌクレオチド20 μgとTOPO-4 (5'-AGGGCG-3')オリゴヌクレオチド6 μgを、消化したDNA 45 μlと合わせた。10×リガーゼ緩衝液(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号15224017)8 μlを加え、水を加えて反応物量を80 μlに調整した。T4 DNAリガーゼ(Invitrogen)5単位を加えて反応を開始し、12℃で16時間インキュベートした。インキュベーション後、TEを加えて連結反応物量を400 μlまで増し、フェノール/クロロホルム200 μlで抽出し、酢酸ナトリウムとエタノールでDNAを沈殿させた。このDNAペレットを70% エタノール50 μlで2回洗浄し、風乾した。このDNAペレットをTE 40 μlに再懸濁し、分光光度法により定量した。通常の回収量はDNA約16 μgであった。
【０２２９】
TOPOの付加
連結したDNA  5 μgに、TOPO-5オリゴヌクレオチド(5'-CAACA CTATC GGAAT A-3'(SEQ ID NO: 66)、5'末端でリン酸化されている)3 μg、5×NEB #1(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA カタログ番号M0202S)10 μlおよびワクシニアトポイソメラーゼI 5 μgを加え、水を加えて容量を50 μlに調整した。この反応物を37℃で15分間インキュベートした後、10×TOPO停止緩衝液(1 Mトリス-HCl, pH 7.5, 500 mM EDTA)5 μlを加えた。その後、TOPOアダプター付加ベクターをゲル精製し、Hoechst色素法により定量した。
【０２３０】
TOPOクローニング効率試験
lacZα断片を駆動する細菌lacプロモーターを含む500 bpのPCR断片を用いてTOPOクローニング効率を測定した。この陽性対照断片はInvitrogen社製のTOPO T/Aクローニングキットのいくつか(例えば、カタログ番号K4300-01)に含まれている。この断片をクローニングすると、X-galプレート上で青色コロニーが生じ、クローニング断片を含まないコロニーは白色であった。コロニー総数に対する青色コロニー総数の割合によって、TOPO反応の効率を示した。各TOPO反応では、Taq ポリメラーゼによって生じた500 bpのPCR産物20 ngを使用した。
【０２３１】
他のORFのTOPOクローニング
pCR8/GW/TOPOによるTOPOクローニングのために選択したORFはCAT(0.8 kb)およびGUS(1.8 kb)であった。これらのORFのPCR増幅に使用したプライマーを以下の表7に挙げている。PCR増幅断片は適切な分子量ラダーを用いて定量した。TOPOクローニング反応では、PCR産物1 μlを使用し、TOP10細胞を形質転換した。
【０２３２】
（表６）
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【０２３３】
TOPOクローニングされた2つのORFの移入および発現
CATおよびGUS遺伝子を(両方向に)有するクローンをLR反応によりpBAD DEST49(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号12283-016)に移入した。次に、このLR反応物の一部を使用して、TOP10細胞を形質転換した。生じたコロニーからプラスミドDNAを単離し、制限酵素消化により解析して陽性クローンをスクリーニングした。陽性コロニーを用いてLB-Amp(100 μg/ml) 3mlに植菌し、OD600が0.5に達するまで37℃で振盪しながら増殖させた。次に、この培養物を1.5 mlずつ、2つに分割した。一方の培養物にアラビノースを最終0.2 w/v%となるまで加えた。その後、両培養物を37℃で16時間振盪しながらインキュベートした。遠心分離により培養物を回収し、細胞ペレットをBugBuster HT(Novagen, Madison, WI, カタログ番号70750)600 μlに再懸濁し、室温で10分間インキュベートした。全細胞溶解物15 μlを、還元剤を含む2×サンプル緩衝液15 μlと混合し、10分間煮沸した。これらのサンプルを12%トリグリシンSDS PAGEで解析した。
【０２３４】
結果
pCR8/GW/TOPO(図8)ベクターの重要な特徴の1つが、挿入断片に隣接するattL部位を含む一方で、挿入断片の効率的な配列決定を支援する能力である。現行のDONR/ENTRベクターの場合、配列決定プライマー結合部位はattL配列の外側にある。この理由は、attL部位がほぼ同一であるということにある(attL1とattL2の違いは3塩基のみ)。この相同性から、プライマーが両部位にアニーリングする(そして、そこから伸長する)ため、不明瞭で判別しにくい結果になると思われる。attL部位の外側にプライマー部位がある場合には、不都合な点が２つある: 1) 挿入配列を読み取るには、125 bpのattL部位全体にわたって配列決定反応を行わなければならない；そして2) 配列決定反応がattL部位に進行するにつれて、多くの場合、かなりの量のシグナルが消失する。DNAの純度または配列決定反応の質により、最初からシグナルが低い場合には、att部位にわたるシグナルの消失により、下流に判読できない配列が生じる可能性がある。しかしながら、pCR8/GW/TOPOではこの問題は最小限となる。attL2部位の2塩基を変更することにより、attL1またはattL2部位にアニーニングするが、それらの特定部位からしか伸長しないプライマーをデザインすることができる。この2つのattLプライマー(L-フォワード[GW-1]およびL-リバース[GW-2])は、2つの3’塩基を除き、同一配列である。プライマーの「伸長末端」におけるこのような違いは、特異的アニーリングと正確なattL部位からの伸長を指示するのに十分なものである(図6)。塩基を変更する部位はattL部位の「スペーサー領域」内に存在するように選択したが、その部位は、LR組換え活性(Landy, A.,Annu. Rev. Biochem., 58: 913-949 (1989))またはattB2配列の翻訳に影響を及ぼさないように、近位IHF結合部位とattBコア(Int結合)領域の間にある(図4)。
【０２３５】
ベクターの構築
一連の工程でpCR8/GW/TOPOを構築した。まず、pDonor221のattP2部位を、配列決定プライマーの選択的かつ特異的アニーリングを考慮して突然変異させた。これらの部位からの効率的な配列決定が確認されたところで、この変異型attP部位をpDONR 223にサブクローニングした。最後に、多重クローニング部位をBP反応により付加してpCR8/GWを作出し、次に、これを標準的な手順を用いてT/A TOPOアダプター付加し、pCR8/GW/TOPO(図8)を作出した。
【０２３６】
T/A TOPO QC試験
pCR8/GW/TOPO系を、Platinum taqにより生じた500 bp試験挿入断片と選択したORFをpCR8/GW/TOPOにTOPOクローニングすることにより試験した。TOPOクローニング効率は、標準的なQC法を用いて測定した。試験挿入断片、すなわち、固有のプロモーターを含む500 bpのlacZ-α ORFは効率的にクローニングされ、そのベクターは低いバックグラウンドを示した。まず、2ロットのスーパーコイル状DNAとアダプターオリゴヌクレオチドを調べた。標準的なQC TOPO効率の限界値は95%である(5%バックグラウンド)。試験ロットの一方はMFG QC仕様の範囲内でクローニングされ(効率95.1%)、他方はそれよりやや低かった(93.6%)(表8)。これらの結果は、この系はQC仕様の範囲内のクローニング効率を裏付け得ることを示すが、DNA調製またはアダプターオリゴの品質の変動が結果に影響を及ぼし得ることも示唆している。
【０２３７】
（表７）pCR8/GW/TOPOによるT/A TOPOクローニング
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【０２３８】
pCR8/GW/TOPOからの配列決定
「材料および方法」に記述した新たなattLプライマー (LフォワードおよびLリバース)を用い、いくつかの挿入断片を配列決定した。DNAの品質は配列の鮮明度および長さに影響したが、明澄なミニプレップDNAでは一般に、鮮明、かつ、600 bp以上といった長い配列決定読み取りが得られた。pCR8/GW/TOPO/CATから得られた代表的な配列決定反応結果を図6に示す。
【０２３９】
Mach I細胞のスペクチノマイシン選択との適合性
pCR8/GW/TOPOの重要な特徴の1つが、その増殖がMach I細胞株に適合しているということである。この株はアンピシリン耐性プラスミドの迅速な増殖を助けるとの報告があるが、カナマイシンまたはスペクチノマイシンを用いた場合のMach I増殖を実証したデータはない。この適合性の最初の試験は、カナマイシン(pENTR221)、アンピシリン(pENTR223)またはスペクチノマイシン(pENTR228)をコードするpENTRベクター(全て試験ORFとしてlacIを含む)でMach IおよびTop10の両細胞を形質転換し、個体培地上でコロニー増殖を確認することであった。37℃でインキュベーション16時間後に培養プレートを調べたところ、選択マーカー間、またはMach I細胞とTOP10細胞の間でコロニーの大きさに違いは見られなかった(データは示されていない)。これらのプレートからコロニーを採種し、液体培養で増殖させ、4.5時間と7時間の時点で光学密度を測定した(図7A)。この試験では、Mach I細胞は、4.5時間後、カナマイシンおよびスペクチノマイシン選択下ではおよそ30%以上の細胞密度、そして、アンピシリン選択下ではおよそ40%以上の細胞密度を示した。
【０２４０】
次の試験では、上記のエントリーベクターの静置培養物をO.D.600が2.0となるように規準化した後、それらの各選択培地に1/50希釈した。これらの培養物を37℃で5時間、振盪しながらインキュベートした。インキュベーション中に、密度測定を行ったところ、Mach I細胞でこれらのベクターを増殖させることから得られた増殖速度には若干の増大しか見られなかったことが示唆された。この試験では、pENTR 221(Kan)およびpENTR 228(Spc)を含むMach I形質転換体は、pENTR 223(Amp)の場合よりも若干高い速度で増殖した(図7B)。
【０２４１】
最後に、Mach IとTOP10の両細胞で、pCR8/GW/TOPO-CAT(Spc)の増殖速度をpENTR D-TOPO-CAT(Kan)の場合と比べた。上記のように規準化した培養物を用いた本試験では、供試したベクター/細胞のいずれの組合せでも増殖速度に違いはみられなかった(図7C)。
【０２４２】
次に、pCR8/GW/TOPO (pENTR221中にGUSを伴う(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号11824-026))中の挿入断片を、LR組換えによってpET-DEST49 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, カタログ番号12283-016)に移入した。attL部位の機能性をpCR8-GUSとの反応1回当たりのコロニー総数として確認したところ、pENTR221-GUS反応から得られたコロニー数と本質的に同じであった(表8)。
【０２４３】
（表８）pCR8/GW/TOPOを用いた場合のLR組換え効率
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【０２４４】
pCR8/GW/TOPOから移入されたORFの細菌発現
大腸菌(TOP10)で発現させるため、CATおよびGUSをコードするORF (双方と正方向および逆方向)をpET-DEST49に移入した。コロニーを培養し、アラビノースを添加することで発現を誘導した。生じたコロニーの一部を溶解し、PAGEで分離した。予測された通り、ORFの発現は誘導処理した正方向クローンのみに起こり、組換えタンパク質が産生された。
【０２４５】
pCR8/GW-CATおよびpCR8/GW-GUS(両方向)をpBAD DEST 49(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, カタログ番号12283-016)へ移入し、発現するかどうか調べた。pBAD49-CATおよびpBAD49-GUSはTOP10細胞で発現した。細胞培養溶解物をPAGEで分離し、染色した。
【０２４６】
実施例2
発明の産物例の記載
Taqポリメラーゼと実験者所有のプロトコルを用いてPCR産物を産生する。PCR反応は最終7〜10分の伸長工程で終了する。下記のTOPO(登録商標)クローニング反応のうち1つを設定する。好ましい態様では、表9に示された順序で試薬を加える。エレクトロポレーションのため、塩溶液を4倍希釈して希釈塩溶液を調製する。    
【０２４７】
（表９）
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【０２４８】
穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。氷上に置き、下記のOne Shot(登録商標)ケミカルコンピテント大腸菌を形質転換処理する。形質転換ごとに、氷上でOne Shot(登録商標)大腸菌細胞のバイアル1本を解凍する。TOPO(登録商標)クローニング反応物2 μlをOne Shot(登録商標)ケミカルコンピテント大腸菌のバイアルに加え、穏やかに混合する。氷上で5〜30分間インキュベートする。細胞に42℃で30秒間、振盪せずに熱ショックを与える。その試験管をすぐに氷に移す。室温のS.O.C.培地250 μlを加える。37℃で1時間、振盪しながらインキュベートする。細菌培養物10〜50 μlを、100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有する、予熱したLB寒天プレート上に拡げ、37℃で一晩インキュベートする。対照反応は、キットに含まれている対照PCR鋳型と対照PCRプライマーを用いて行う。使用説明に関しては下記のプロトコルを参照されたい。
【０２４９】
キットの内容および保存
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニングキットは、One Shot(登録商標)TOP10ケミカルコンピテント大腸菌またはOne Shot(登録商標)Mach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌(Invitrogenカタログ番号K2500-20)とともに供給されている。各pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キットはドライアイス上で出荷され、2つのボックスを含んでいる。ボックス1にはpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)試薬が入っており、-20℃で保存する。ボックス2にはOne Shot(登録商標)ケミカルコンピテント大腸菌が入っており、-80℃で保存する。下記の試薬はpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターとともに供給されているものである(ボックス1)。Taqポリメラーゼは実験者が準備する。
【０２５０】
（表１０）
2007512838.tif 000022
【０２５１】
GW1およびGW2プライマーの配列は次の通りである。
2007512838.tif 000023
各プライマー260ピコモルが供給されている。表11に示されている試薬は、One Shot(登録商標)TOP10またはMach I(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌キットとともに入っているものである(ボックス2)。形質転換効率は≧1×109 cfu/mgプラスミドDNAである。
【０２５２】
（表１１）
2007512838.tif 000024
【０２５３】
大腸菌の遺伝子型は次の通りである: TOP10: F- mcrA D (mrr- hsdRMS-mcrBC) F80lacZDM15 DlacC74 recA1 araD139 D(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG；Mach1(商標)-T1R: F- F80lacZDM15 DlacC74 hsdR (rk-, mk+) DrecA1398 endA1 tonA (ファージT1に耐性を付与してある)。Mach1(商標)-T1R大腸菌の親株は、非K-12の野生型W株(ATCC番号9637, S.A. Waksman)である。この親株は通常、バイオセーフティーレベル1(BL-1)として分類されるが、各機関の安全性部門に相談してバイオセーフティーレベルを確認することが奨励される。
【０２５４】
本節に挙げられている製品は、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キットとともに使用できる。さらに詳しくは、本発明者らのウェブサイト(www.invitrogen.com)を参照するか、テクニカルサービスへ問合せされたい。試薬のうちいくつかはpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キットで提供されており、キットとの併用に適したその他の試薬は別途、Invitrogenから入手できる。これらの試薬の注文情報を表12に示す。これ以外の試薬量も使用可能である。
【０２５５】
（表１２）
2007512838.tif 000025
【０２５６】
大腸菌でpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)形質転換体を選択するには、スペクチノマイシンを入手する必要がある。スペクチノマイシン二塩酸塩はSigma社から入手できる(カタログ番号S4014)。使用のためのスペクチノマイシンの調製法に関しては、下記を参照されたい。
【０２５７】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キットは、Invitrogen社製のTOPO(登録商標)クローニングとGateway(登録商標)技術を組み合わせたもので、Taqポリメラーゼにより増幅されたPCR産物を5分の一工程、95%以上の効率で、プラスミドベクターにクローニングする助けとなる。他のpCR(登録商標)ベクター(例えば、pCR(登録商標)2.1-TOPO(登録商標))を用いる場合と同様、クローンを容易に配列決定および同定することができる。同定が終われば、クローンは、事実上どんな系であっても、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)エントリーベクターから、関心対象の遺伝子の発現のために選択したGateway(登録商標)またはMultiSite Gateway(登録商標)デスティネーションベクターへと移入することができる。TOPO(登録商標)クローニングがどのように働くかということ、また、Gateway(登録商標)およびMultiSite Gateway(登録商標)技術について詳しくは、本節の後段を参照されたい。
【０２５８】
クローニング適用にpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターを用いることには次のような利点がある:
・このベクターは、Taqポリメラーゼにより増幅されたPCR産物の、高効率の5分のクローニングが可能となるようTOPO(登録商標)アダプターが付加されている。リガーゼ、PCR後の手順、あるいは制限酵素は必要としない。
・このベクターは、読み取りの必要なベクターコードDNAの量を最小限としつつ、PCR産物の配列決定を助けるため、55塩基対のTOPO(登録商標)クローニング部位内に位置するプライマー結合部位を含む。
・このベクターは、関心対象のPCR産物を、下流解析のため、Gateway(登録商標)デスティネーションベクターに容易に組換え移入できるようにGateway(登録商標)アダプターが付加されている。
・クローニングされたPCR産物の切り出しを簡単にするため、EcoRI部位がTOPO(登録商標)クローニングに隣接している。
【０２５９】
このベクターは、大腸菌での効率的選択のため、スペクチノマイシン耐性マーカーを含む。この特定のマーカーの使用は同様に、アンピシリンまたはカナマイシン耐性Gateway(登録商標)デスティネーションベクターへのPCR産物の組換え移入を可能とする。
【０２６０】
クローニング適用にpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターを用いることには次のような利点がある:
・このベクターは、Taqポリメラーゼにより増幅されたPCR産物の、5分の高効率クローニングが可能となるようTOPO(登録商標)アダプターが付加されている。リガーゼ、PCR後の手順、あるいは制限酵素は必要としない。
・このベクターは、読み取りの必要なベクターコードDNAの量を最小限としつつ、PCR産物の配列決定を助けるため、55塩基対のTOPO(登録商標)クローニング部位内に存在するプライマー結合部位を含む。
・このベクターは、目的のPCR産物を、下流解析のため、Gateway(登録商標)デスティネーションベクターに容易に組換え移入できるようにGateway(登録商標)アダプターが付加されている。
・クローニングされたPCR産物の切り出しを簡単にするため、EcoRI部位がTOPO(登録商標)クローニングに隣接している。
【０２６１】
このベクターは、大腸菌での効率的選択のため、スペクチノマイシン耐性マーカーを含む。この特定のマーカーの使用は同様に、アンピシリンまたはカナマイシン耐性Gateway(登録商標)デスティネーションベクターへのPCR産物の組換え移入を可能とする。
【０２６２】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターの特徴として、Taqにより増幅されたPCR産物の迅速かつ効率的クローニングのためのTOPO(登録商標)クローニング部位(さらに詳しくは、次頁を参照); 関心対象の遺伝子を任意のGateway(登録商標)デスティネーションベクターに組換え移入するためのattLlおよびattL2部位; GW1およびGW2プライマーを用いた配列決定のための、attL1およびattL2部位内にある、特異的にデザインされたプライマー結合部位; 大腸菌において関心対象のPCR産物の基本発現を防ぐrrnB転写末端配列; 大腸菌での選択のためのスペクチノマイシン耐性遺伝子; ならびに大腸菌におけるプラスミドの高コピー複製のためのpUC複製起点が挙げられる。
【０２６３】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターは、直鎖化され、TAクローニング(登録商標)のための3'-チミジン(T)1個の突出部を有し、ベクターにトポイソメラーゼIが共有結合されたものが供給されている(「活性化」ベクターと呼ぶ)。Taqポリメラーゼは、鋳型に依存しない末端トランスフェラーゼ活性を有し、PCR産物の3'末端に1個のデオキシアデノシン(A)を付加する。このキットで供給されている直鎖化ベクターは3'デオキシチミジン(T)残基1個の突出部を有する。これにより、PCR挿入断片はベクターと効率的に連結することができる。
【０２６４】
ワクシニアウイルス由来のトポイソメラーゼIは、特定の部位(CCCTT)で二重らせんDNAと結合し、一方の鎖のホスホジエステル主鎖を切断する(Shuman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10104-10108, 1991)。この崩壊したホスホジエステル主鎖からのエネルギーは、切断された鎖の3'リン酸とトポイソメラーゼIのチロシル残基(Tyr-274)との間の共有結合の形成によって保存される。その後、このDNAと酵素の間のホスホチロシル結合は、最初に切断された鎖の5'ヒドロキシルによるアタックが可能となり、反応が逆転し、トポイソメラーゼが放出される(Shuman, 前記, 1994)。TOPO(登録商標)クローニングはこの反応を利用してPCR産物を効率的にクローニングする。
【０２６５】
Gateway(登録商標)技術は、バクテリオファージλ(Landy, 1989)の部位特異的組換え特性を利用して、関心対象の遺伝子を複数のベクター系に移行する迅速かつ高効率の方法を提供する万能クローニング系である。Gateway(登録商標)技術を用いて関心対象の遺伝子を発現させるには、簡単に言えば、次の通りである:
1. Taqにより増幅されたPCR産物をpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)にTOPO(登録商標)クローニングしてエントリークローンを作出する。
2. このエントリークローンと選択したGateway(登録商標)デスティネーションベクターの間でLR組換え反応を行うことで発現構築体を作出する。
3. この発現構築体を適当な宿主(例えば、細菌、哺乳類、酵母、昆虫)に導入し、組換えタンパク質を発現させる。
【０２６６】
Gateway(登録商標)技術に関してさらに詳しくは、Gateway(登録商標)技術マニュアルを参照するか、本発明者らのウェブサイト(www.invitrogen.com)を参照するか、またはテクニカルサービスへ問合せされたい。Gateway(登録商標)技術マニュアルは、本発明者らのウェブサイトからのダウンロード、またはテクニカルサービスへの問合せにより入手できる。
【０２６７】
ほとんどのGateway(登録商標)エントリーベクター(例えば、pENTR(商標)/D-TOPO(登録商標))にクローニングされた挿入断片は、M13フォワードプライマー(-20)とM13リバースプライマーを用いて配列決定が可能である。M13フォワードプライマー(-20)結合部位およびM13リバースプライマー結合部位は、それぞれattL1部位およびattL2部位の上流と下流に位置し、挿入DNAに到達するまでに、少なくとも130塩基対のベクターコードDNAを読み取る必要がある。より効率的な配列決定を助け、読み取りの必要なベクターコードDNAの量を最小限とするために、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)のattL2部位内の3つのヌクレオチドを突然変異させた。この結果、次のようになる:
・GW1およびGW2プライマーを用い、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)にクローニングされた挿入断片の確実かつ効率的な配列決定が可能となる。
・GW1およびGW2プライマー結合部位がattL1およびattL2部位内に存在するので、読み取りの必要なベクターコードDNA量が55塩基対未満まで最小化される。
・pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターとGateway(登録商標)デスティネーションベクターの間のLR組換え効率には影響しない。
【０２６８】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターはまた、必要に応じてM13フォワードプライマー(-20)およびM13リバースプライマーを用いて配列決定が可能なように、M13 フォワードプライマー(-20)結合部位およびM13リバースプライマー結合部位も含む。
【０２６９】
MultiSite Gateway(登録商標)技術は、所定の順序および方向での複数のDNA断片の同時クローニングを可能とするために、Gateway(登録商標)技術の部位特異的組換え反応(前頁参照)の改良法を用いるものである。Invitrogen社から入手できるMultiSite Gateway(登録商標)スリーフラグメントベクター構築キット(カタログ番号12537-023)は、3つのエントリーベクターにおいてDNA断片の同時クローニングを助けて独自の発現クローンを作り出す。MultiSite Gateway(登録商標)技術およびMultiSite Gateway(登録商標)スリーフラグメントベクター構築キットに関してさらに詳しくは、MultiSite Gateway(登録商標)スリーフラグメントベクター構築キットマニュアルを参照されたい。このマニュアルは、本発明者らのウェブサイトからのダウンロードまたはテクニカルサービスへの問合せにより入手できる。
【０２７０】
図11に示すフローチャートは、Taqにより増幅されるPCR産物の産生およびTOPOクローニングに関する一般工程を示している。
【０２７１】
方法
PCRプライマーのデザイン
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キットの使用に先立ち、PCRプライマーをデザインし、PCR産物を産生する。PCRプライマーのデザインに関する指針を下記に示す。PCRプライマーを適切にデザインすれば、その研究に必要なPCR産物が確実に得られるとされる。PCRプライマーをデザインする際には次のことを考慮する:
・下流発現研究のために、PCR産物をGateway(登録商標)デスティネーションベクターに移入しようとする場合には、そのPCR産物の適切な翻訳開始および終結に必要な配列を含めなければならない。
・エントリークローンとGateway(登録商標)デスティネーションベクターの組換え後に、そのPCR産物をN末端またはC末端タグと融合させたい場合には、そのPCR産物が適当なタグとインフレームにあるようにPCRプライマーをデザインしなければならない(下記のヒントを参照)。組換えタンパク質の適切な発現を可能とするに適切であれば、PCR産物がコザックコンセンサス配列または停止コドンを含むか否かを確認する。PCR産物の最初の3塩基対が機能的コドンとなっていることに注意を要する。
【０２７２】
次頁の図は、PCRプライマーおよびPCR戦略のデザインの助けとして使用できることがある。
【０２７３】
ヒント
エントリークローンとデスティネーションベクターの組換え後に、そのPCR産物をN末端またはC末端タグと融合させたい場合には、フォワードまたはリバースPCRプライマーのデザインに適切であれば、下記のヒントを用いる。
【０２７４】
ヒント1: エントリークローンとデスティネーションベクターの組換え後に、PCR産物をN末端タグとインフレームで融合させるためには、attL1部位内の-AAA-AAA-トリプレットを融合タンパク質の翻訳読み枠とインフレームに保持する(次頁の図における太字のヌクレオチド参照)。
【０２７５】
ヒント2: エントリークローンとデスティネーションベクターの組換え後に、PCR産物をC末端タグとインフレームで融合させるためには、attL2部位内の-TTT-GTA (相補鎖ではTAC-AAA)トリプレットを融合タンパク質の翻訳読み枠とインフレームに保持する(次頁の図における太字のヌクレオチド参照)。
【０２７６】
1つの態様では、PCRプライマーを合成する際、プライマーには5'リン酸を付加してはならず、これは合成されたPCR産物がpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターに連結するのを妨げるからである。
【０２７７】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)のためのTOPO(登録商標)クローニング部位
図12に示した図は、PCRプライマーをデザインし、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)へのTOPO(登録商標)クローニングのためのPCR産物を産生する助けとして使用できることがある。
【０２７８】
TOPO(登録商標)クローニング領域の特徴は次の通りである:
・実際の切断部位を示すために制限部位が標識されている。
・キットに入っているGW1およびGW2プライマーのプライマー結合部位が標識されている。GW2プライマーを用いた配列決定を容易にするため、attL2部位において変異されたヌクレオチドに下線が施されている。
・影付きの領域は、LR組換え後にクローンからGateway(登録商標)デスティネーションベクターへと移入されるDNA配列に相当する。
・デスティネーションベクターとの組換え後にPCR産物をN末端またはC末端タグとインフレームで融合しようとする場合には、適切であれば、融合タンパク質の翻訳読み枠を太字で示したトリプレットとインフレームに保持しなければならない。
【０２７９】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)の配列は、本発明者らのウェブサイト(www.invitrogen.com)からのダウンロードまたはテクニカルサービスへの問合せにより入手できる。pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)に関してさらに詳しくは、下記を参照されたい。
【０２８０】
PCR産物の産生
序論
一旦、適当なPCRプライマーが合成できれば、そのプライマーと適切なDNAポリメラーゼを用いて、PCR産物を産生することができると思われる。好ましい態様では、PCR産物は3'A(1個)の突出部を有する。
【０２８１】
実験者が用意する材料
以下の試薬および装置をPCRに使用する。dNTP (pH 8に調整)はキット中に提供されている。
・Taqポリメラーゼまたはその他の適当なDNAポリメラーゼ
・注釈: 1つの態様では、Invitrogenから入手できるPlatinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼを使用してPCR産物を産出させる。
・サーマルサイクラー
・PCR産物を産生させるための鋳型DNAおよびプライマー。
【０２８２】
ポリメラーゼ混合物
Taqポリメラーゼおよび校正ポリメラーゼを含んだポリメラーゼ混合物を利用して、PCR産物を産生させてもよい。好ましい態様では、この混合物はPCR産物に3' A突出部の存在を確実とするよう10:1を超える比率のTaqポリメラーゼ:校正ポリメラーゼを含む。Platinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ・ハイフィデリティー(Invitrogen)が使われてもよい。十分なTaqポリメラーゼを含まないポリメラーゼ混合物または校正ポリメラーゼのみが使われる場合、3' A突出部は下記の方法を用いてPCR産物に付加されてもよい。
【０２８３】
PCR産物の産生
次のPCR反応液50 μlを準備する: 鋳型DNA 10〜100 ng、10×PCR緩衝液5 μl、dNTPミックス(50 mM) 0.5 μl、PCRプライマー(各100〜200 ng)、終量49 μlまでの滅菌水および全量を50 μlにするTaqポリメラーゼ(1 U/μl)。プラスミドDNAを鋳型として用いるならばもっと少ないDNAを使い、ゲノムDNAを鋳型として用いるならばもっと多くのDNAを使う。プライマーおよび鋳型に適したサイクリングパラメータを使う。全てのPCR産物が完全長であり3'アデニル化されていることを確実とするため、72℃で7分から30分の伸長を最後のサイクル後に行う。
【０２８４】
電気泳動、例えば、アガロースゲル電気泳動を利用して、PCR産物の質を検証する。正しいサイズの1本の分離したバンドが見えるはずである。PCRから1本の分離したバンドを得ていなければ、PCRを最適化して複数のバンドやスメアリングを除く(Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990)。Invitrogenから入手できるPCR Optimizer(商標)キット(カタログ番号K1220-01)は、この参考文献に見出される推奨の多くを取り入れている。詳細は、本発明者らのウェブサイト(www.invitrogen.com)を参照するか、テクニカルサービスへ問合せされたい。例えば、以下に示される方法の1つを用いて、断片をゲル精製する。ヌクレアーゼ源の混入を避けるよう特に注意する。
【０２８５】
TOPO(登録商標)クローニング反応の準備
序論
所望のPCR産物を産生させたら、いつでもこれをpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターにTOPO(登録商標)クローニングし、この組換えベクターをOne Shot(登録商標)コンピテント大腸菌に形質転換できる。実現しうる最高の結果を得ることを確実とするため、必要とするもの全てを準備し使用できる状態にしておくべきである。本発明者らは、開始の前に本節およびOne Shot(登録商標)コンピテント大腸菌の形質転換(以下)という表題の節を読まれることを提案する。TOPO(登録商標)クローニングを行うのは今回が始めてなら、試料と並行して本明細書に記述される対照反応を行う。
【０２８６】
TOPO(登録商標)クローニング反応物の中に塩(200 mM NaCl、10 mM MgCl2)を含めることで形質転換体の数を2倍から3倍に増やせることが分かっている。さらに、反応混合物を塩の存在下で5分を超える間インキュベートすることで同様に、形質転換体の数を増やすことができる。これは、インキュベーション時間が5分を超えて増加するにつれて形質転換体の数が減少するという塩なしでの以前の実験とは対照的である。TOPO(登録商標)クローニング反応物の中に塩を含めることで、より長いインキュベーション時間が可能になる。塩は、トポイソメラーゼIがPCR産物を連結しDNAから解離した後に、DNAに再結合し場合によってニックを入れるのを阻止するからである。この結果は、より高い形質転換効率につながる、より完全な分子である。
【０２８７】
TOPO(登録商標)クローニング反応における塩溶液の使用
塩を含有する反応緩衝液中で(すなわち、キット中に提供されるストック塩溶液を用いて)TOPO(登録商標)クローニングを行うことができる。TOPO(登録商標)クローニング反応物に添加される塩の量は、ケミカルコンピテント細胞(添付の)またはエレクトロコンピテント細胞を形質転換しようと考えているかどうかに応じて変化することに留意されたい。ケミカルコンピテント大腸菌を形質転換するならば、供給のストック塩溶液を使用し、次頁の指示どおりTOPO(登録商標)クローニング反応物を準備する。エレクトロコンピテント大腸菌を形質転換するならば、TOPO(登録商標)クローニング反応物中の塩の量はエレクトロポレーションの間のアーク放電を回避するために50 mM NaCl、2.5 mM MgCl2まで減らされてもよい。ストック塩溶液を水で4倍に希釈して300 mM NaCl、15 mM MgCl2希釈塩溶液を調製する。この希釈塩溶液を使用して、次頁の指示どおりTOPO(登録商標)クローニング反応物を準備する。
【０２８８】
必要な材料
開始の前に以下の材料を手元に置いておくべきである:
・PCR産物(新たに調製した)
・pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクター (キット、ボックス1に同梱されている; 使用するまで-20℃に維持する)
・塩溶液(キット、ボックス1に同梱されている)または必要に応じて希釈塩溶液
・滅菌水(キット、ボックス1に同梱されている)
【０２８９】
TOPO(登録商標)クローニング反応の実施
以下の手順を使ってTOPO(登録商標)クローニング反応を実施してもよい。表13に示される試薬を用いて、およびケミカルコンピテント大腸菌またはエレクトロコンピテント大腸菌を形質転換しようと考えているかどうかに応じて、TOPO(登録商標)クローニング反応物を準備する。好ましい態様では、試薬は示した順に混合する。TOPO(登録商標)ベクター溶液の赤色は正常であり、これを使用して溶液を視覚化する。
【０２９０】
（表１３）
2007512838.tif 000026
* 終わったら試薬は全て-20℃で保存する。塩溶液および水は室温または+4℃で保存することができる。
【０２９１】
反応物を穏やかに混合し、室温(22℃〜23℃)で5分間インキュベートする。ほとんどの場合、5分で分析に十分な数のコロニーが得られるはずである。必要に応じて、TOPO(登録商標)クローニング反応の長さを30秒から30分まで変化させることができる。PCR産物の通常のサブクローニングの場合、30秒で十分かもしれない。大きなPCR産物(1 kbを超える)の場合またはPCR産物のプールをTOPO(登録商標)クローニングするならば、反応時間の増加によってさらに多くのコロニーを得ることができる。反応物を氷上に置き、下記のOne Shot(登録商標)コンピテント大腸菌の形質転換に進む。TOPO(登録商標)クローニング反応物を-20℃で一晩保存してもよい。
【０２９２】
One Shot(登録商標)コンピテント大腸菌の形質転換
序論
TOPO(登録商標)クローニング反応を行ったら、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)構築体をコンピテント大腸菌に形質転換することができる。形質転換を容易にするため、One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌(ボックス2)がキットに同梱されている。必要に応じて、エレクトロコンピテント細胞を形質転換することもできる。ケミカルコンピテントまたはエレクトロコンピテント大腸菌を形質転換するプロトコルは、本節に示されている。
【０２９３】
One Shot(登録商標)化学的形質転換プロトコルの選択
One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌を形質転換するのに2通りのプロトコルが示されている。以下の要因を考慮し、要求に最適のプロトコルを選択する。形質転換体の数を最大限にしたいまたは大きなPCR産物(1000 bpを超える)をクローニングしたいなら、正規の化学的形質転換プロトコルが使われる。形質転換体をできるだけ早く得たいなら、迅速な化学的形質転換プロトコルが使われるが、得られる形質転換体の総数は化学的形質転換プロトコルを用いるよりも少なくなる可能性がある。
【０２９４】
必要な材料
一般的な微生物用備品(すなわち、プレート、スプレッダー)に加えて、以下の試薬および装置が必要になるはずである:
・TOPO(登録商標)クローニング反応物(前頁、工程2より)
・One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌(キット、ボックス2に同梱されている)
・S.O.C.培地(キット、ボックス2に同梱されている)
・pUC19陽性対照(必要に応じて、形質転換効率を検証するため、ボックス2)
・42℃の湯浴(または任意で、キュベットの付いたエレクトロポレータ)
・15 mlの無菌スナップキャップ・プラスチック製培養管(エレクトロポレーションの場合のみ)
・100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLBプレート(形質転換ごとに2枚)
・100 μg/mlのアンピシリンを含有するLBプレート(pUC19対照を形質転換する場合)
・37℃の振盪および非振盪培養器。
【０２９５】
挿入断片が存在するかどうかの青白スクリーニングはない。ほとんどの形質転換体は、ベクターにクローニングされた関心対象のPCR産物を持った組換えプラスミドを含むはずである。キットには方向および読み取り枠を確認するためにマルチクローニング部位中の挿入物を越えて配列決定するための配列決定プライマーが含まれる。TOPO(登録商標)クローニング部位内の全挿入断片を配列決定して、方向および読み枠を確認可能にするGW1およびGW2プライマーがキットに含まれている。
【０２９６】
形質転換ごとに、One Shot(登録商標)コンピテント細胞のバイアル1本と選択プレート2枚が必要になるはずである。
・水浴を42℃に平衡化する(化学的形質転換の場合)またはエレクトロコンピテント大腸菌を用いるならば、エレクトロポレータを準備する。
・ボックス2由来のS.O.C.培地のバイアルを室温まで加温する。
・100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLBプレートを37℃で30分間加温する。pUC19陽性対照を含めているならば、100 μg/mlのアンピシリンを含有するLBプレートを同様に予熱する。
【０２９７】
形質転換ごとにOne Shot(登録商標)細胞のバイアル1本を氷上で解凍する。迅速な化学的形質転換プロトコルを行うなら、100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLBプレートをスプレッディングの前に予熱しておくべきである。
【０２９８】
以下のプロトコルを利用して、One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌を形質転換する。
1. TOPO(登録商標)クローニング反応の実施から得たTOPO(登録商標)クローニング反応物2 μlをOne Shot(登録商標)ケミカルコンピテント大腸菌のバイアルに添加し、穏やかに混合する。ピペットで吸ったり吐いたりして混合しないこと。pUC19対照プラスミドを形質転換するなら、10 pg (1 μl)を使う。
2. 氷上で5から30分間インキュベートする。氷上での長時間のインキュベーションは形質転換効率にわずかな影響を及ぼすように思われる。インキュベーションの長さは実験者の裁量による。氷上での長時間のインキュベーションは形質転換効率にわずかな影響を及ぼすように思われる。インキュベーションの長さは実験者の裁量による。
3. 細胞に42℃で30秒間、振盪せずに熱ショックを与える。
4. その試験管をすぐに氷に移す。
5. 室温のS.O.C.培地250 μlを加える。
6. 試験管にきつくふたをし、この試験管を37℃で1時間水平方向に振盪する(200 rpm)。
7. 予熱した選択プレート上に各形質転換由来の10〜50 μlを拡げ、37℃で一晩インキュベートする。少容量の均等なスプレッディングを確実にするため、S.O.C.培地20 μlを添加する。本発明者らは少なくとも1枚のプレートでは十分に間隔の空いたコロニーを確実に得られるように異なる2容量を平版培養することを推奨する。
8. 有効なTOPO(登録商標)クローニング反応によって数百個のコロニーが得られるはずである。分析用に10コロニーを採種する(「形質転換体の分析」を参照のこと)。
【０２９９】
迅速なOne Shot(登録商標)化学的形質転換プロトコル
以下の代替プロトコルを利用して、One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント大腸菌を迅速に形質転換する。開始の前に、100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLB寒天プレートを37℃で30分間予熱する。
1. 工程2「TOPO(登録商標)クローニング反応の実施」から得たTOPO(登録商標)クローニング反応物4 μlをOne Shot(登録商標)ケミカルコンピテント大腸菌のバイアルに添加し、穏やかに混合する。ピペットで吸ったり吐いたりして混合しないこと。
2. 氷上で5分間インキュベートする。
3. 予熱した選択プレート上に細胞50 μlを拡げ、37℃で一晩インキュベートする。
4. 有効なTOPO(登録商標)クローニング反応によって数百個のコロニーが得られるはずである。分析用に10コロニーを採種する(形質転換体の分析を参照のこと)。
【０３００】
One Shot(登録商標)エレクトロポレーションプロトコル
アーク放電を回避するため、エレクトロコンピテント細胞をエレクトロポレーションに使用することが好ましい。One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rケミカルコンピテント細胞をエレクトロポレーションに使用しないこと。
1. 工程2「TOPO(登録商標)クローニング反応の実施」から得たTOPO(登録商標)クローニング反応物2 μlを、エレクトロコンピテント大腸菌50 μlを含有する滅菌微量遠心管に添加し、穏やかに混合する。ピペットで吸ったり吐いたりして混合しないこと。泡の形成を避けること。細胞を0.1 cmキュベットに移す。
2. 実験者所有のプロトコルおよびエレクトロポレータを用いて、試料をエレクトロポレーションする。
アーク放電の問題が生じた場合、以下を参照されたい。
3. 室温のS.O.C.培地250 μlをすぐに添加する。
4. 溶液を15 mlスナップキャップ管(すなわち、Falcon)に移し、37℃で少なくとも1時間振盪してスペクチノマイシン耐性遺伝子を発現させる。
5. 予熱した選択プレート上に各形質転換由来の10〜50 μlを拡げ、37℃で一晩インキュベートする。少容量の均等なスプレッディングを確実にするため、S.O.C.培地20 μlを添加する。本発明者らは少なくとも1枚のプレートでは十分に間隔の空いたコロニーを確実に得られるように異なる2容量を平版培養することを推奨する。
【０３０１】
有効なTOPO(登録商標)クローニング反応によって数百個のコロニーが得られるはずである。分析用に10コロニーを採種する(形質転換体の分析を参照のこと)。
【０３０２】
形質転換体の分析
陽性クローンの分析
10コロニーを採種し、100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLBまたはSOB培地中でそれらを一晩培養する。One Shot(登録商標)Mach1(商標)-T1Rコンピテント大腸菌を形質転換したなら、プラスミドを単離する前に、100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有する、予熱したLB培地中に一晩増殖させたコロニーを植菌し、その中でそれらを4時間だけ培養してもよい。最良の結果を得るためには、本発明者らはできるだけ多くの単一コロニーを植菌することを推奨する。選択の方法を用いてプラスミドDNAを単離する。自動または手動の配列決定用に超高純度のプラスミドDNAが必要ならば、本発明者らはInvitrogen社製のPureLink(商標)HQミニプラスミド精製キット(カタログ番号K2100-01)を用いることを推奨する。プラスミドを、例えば、制限分析またはPCRにより分析して、挿入断片が存在することや正しい方向であることを確認する。pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)は、TOPO(登録商標)クローニング部位に隣接するEcoRI部位を含む。必要に応じて、EcoRI消化を利用して挿入断片が存在するかどうかをチェックしてもよい。
【０３０３】
配列決定
正しいクローンを同定したら、構築体を配列決定して遺伝子が正しい方向でクローニングされていることを確認してもよい。遺伝子を配列決定するのに役立つGW1およびGW2プライマーがキットに含まれている。pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターの完全な配列は、表11、本発明者らのウェブサイト(www.invitrogen.com)を参照するか、テクニカルサービスへ問合せされたい。
【０３０４】
GW1およびGW2プライマー部位はPCR産物挿入部位から55ヌクレオチド未満に位置し、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)のそれぞれ、attL1およびattL2部位に含まれる。Invitrogen社はattL1およびattL2部位を含むその他のGateway(登録商標)エントリーベクターを提供しているが、GW1およびGW2プライマーは、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)にクローニングされた挿入断片の配列決定に用いるのに唯一適している。これは、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)中のattL2部位内の3つのヌクレオチドが突然変異されているためである。これらの突然変異はGW1およびGW2に基づく配列決定を可能にするが、LR組換え効率に影響を及ぼすことはない。
【０３０５】
長期保存
正しいクローンを同定したら、必ずコロニーを精製し、-20℃の長期保存用のグリセロールストックを作成すること。
1. 単一コロニーを得るために100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLBプレート上にオリジナルコロニーを画線する。
2. 単一コロニーを単離し、100 μg/mlのスペクチノマイシンを含有するLB 1〜2 mlに植菌する。
3. 培養物が静止期に達するまで増殖させる。
4. 培養物0.85 mlを滅菌グリセロール0.15 mlと混合し、凍結バイアルに移す。
-80℃で保存する。
【０３０６】
LR組換え反応を行うための指針
序論
エントリークローンを得たら、Gateway(登録商標)LR Clonase(商標)酵素ミックス(Invitrogen カタログ番号11789-013)を用いてLR組換え反応を行い、関心対象の遺伝子をpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)構築体から選択のいずれかのGateway(登録商標)デスティネーションベクターへ移入して、発現クローンを作出することができる。また、5'および3'エントリークローン、適当なMultiSite Gateway(登録商標)デスティネーションベクター、ならびにLR Clonase(商標)プラス酵素ミックス(Invitrogen カタログ番号12538-013)を用いてMultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応を行い、発現クローンを作出することができる。
【０３０７】
一般的な指針を以下に示す。
ほとんどの場合、LR組換え反応またはMultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応は、スーパーコイル状エントリークローンまたはスーパーコイル状デスティネーションベクターを用いて行われる。関心対象の遺伝子の発現を事実上どんなタンパク質発現系であっても容易にするため、豊富な品揃えのGateway(登録商標)デスティネーションベクターがInvitrogenから入手できる。入手可能なベクターに関する詳細な情報は、本発明者らのウェブサイト(www.invitrogen.com)を参照するか、テクニカルサービスへ問合せされたい。デスティネーションベクターの全てをサポートするマニュアルは、本発明者らのウェブサイトからのダウンロード、またはテクニカルサービスへの問合せにより入手できる。
【０３０８】
大腸菌宿主
LR組換え反応またはMultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応を行ったら、この反応混合物をコンピテント大腸菌に形質転換し、発現クローンを選択することができる。TOP10、Mach1(商標)-T1R、DH5α(商標)、DH10B(商標)、または形質転換に等価なものを含めて、任意のrecA、endA大腸菌株を使用することができる。Gateway(登録商標)またはMultiSite Gateway(登録商標)LR反応混合物を、F'エピソームを含んだ大腸菌株(例えば、TOP10F')に形質転換しないこと。これらの菌株はccdA遺伝子を含んでおり、ccdB遺伝子による負の選択を阻止することがある。
【０３０９】
LR組換え反応の実施
Gateway(登録商標)LR組換え反応を行うため、以下が必要になるはずである:
・関心対象の遺伝子を含んだエントリークローンの精製プラスミドDNA
・選択のデスティネーションベクター
・LR Clonase(商標)酵素ミックス
・5×LR Clonase(商標)反応緩衝液(LR Clonase(商標)酵素ミックスに同梱されている)
・2 μg/μlのプロテイナーゼK溶液(LR Clonase(商標)酵素ミックスに同梱されている)
・TE緩衝液, pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)
・適当なケミカルコンピテント大腸菌宿主および発現用の増殖培地
・適当な選択プレート
【０３１０】
LR組換え反応を行うための使用説明については、Gateway(登録商標)技術マニュアルを参照するかまたは使用しているデスティネーションベクターに関するマニュアルを参照されたい。
【０３１１】
MultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応の実施
MultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応を行えるようにするには、Invitrogen社製のMultiSite Gateway(登録商標)スリーフラグメントベクター構築キット(カタログ番号12537-023)を用いて、初めに5'および3'エントリークローンを作出することが必要になるはずである。5'および3'エントリークローンを作出したら、5'および3'エントリークローン、関心対象の遺伝子を含むエントリークローン、ならびにMultiSite Gateway(登録商標)スリーフラグメントベクター構築キットに同梱されているその他の試薬(LR Clonase(商標)プラス酵素ミックスおよびpDEST(商標)R4-R3デスティネーションベクターを含む)をMultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応で使用して、発現クローンを作出することができる。5'および3'エントリークローンを作出するための使用説明およびMultiSite Gateway(登録商標)LR組換え反応を行うための使用説明については、MultiSite Gateway(登録商標)スリーフラグメントベクター構築キットのマニュアルを参照されたい。
【０３１２】
トラブルシューティング
TOPO(登録商標)クローニング反応および形質転換
表14はいくつかの潜在的な問題やTOPO(登録商標)クローニングおよび形質転換反応のトラブルを解決するのに役立ちうる可能な解決策を収載している。結果を評価する手助けとするため、本発明者らは試料と並行して対照反応を行うこと(以下を参照のこと)を推奨する。
【０３１３】
（表１４）
2007512838.tif 000027
2007512838.tif 000028
【０３１４】
対照反応の実施
初めてキットを使用する場合、結果を評価する手助けとするため、本発明者らは以下の対照TOPO(登録商標)クローニング反応を行うことを推奨する。対照反応の実施には、キットに含まれる試薬を用いたlacプロモーターおよびLacZα断片を含む対照PCR産物の産生が含まれる。いずれの方向にしても対照PCR産物のTOPO(登録商標)クローニングの成功によって、スペクチノマイシンおよびX-galを含有するLB寒天プレート上に青色コロニーが生じるはずである。形質転換ごとに、100 μg/mlのスペクチノマイシンおよびX-galを含有するLBプレートを2枚用意する(本明細書に示される作成法)。Taqポリメラーゼを用いて500 bpの対照PCR産物を産生するため、以下の手順を使う。
1. 0.5 ml微量遠心管の中に、表15に示されるPCR反応物50 μlを準備する。
（表１５）
2007512838.tif 000029
2. 必要に応じて、ミネラルオイル70 μl(1滴)を重層する。
3. 以下のサイクリングパラメータ(表16)を用いて増幅する。
（表１６）
2007512838.tif 000030
4. 反応物から10 μlを取り出し、アガロースゲル電気泳動により分析する。分離した500 bpのバンドが目に見えるはずである。下記の「対照TOPO(登録商標)クローニング反応」へ進む。
【０３１５】
対照TOPO(登録商標)クローニング反応
前頁で産生した対照PCR産物およびpCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)ベクターを用いて、下記のように2通りのTOPO(登録商標)クローニング反応物6 μlを準備する。
1. 対照TOPO(登録商標)クローニング反応物を準備する(表17)。
（表１７）
2007512838.tif 000031
2. 室温で5分間インキュベートし、氷上に置く。
3. 前述の手順を用いて各反応物2 μlを別バイアルのOne Shot(登録商標)コンピテント細胞に形質転換する。
4. 各形質転換混合物10〜50 μlを100 μg/mlのスペクチノマイシンおよびX-galを含有するLBプレートに拡げる。少容量を蒔いて培養する場合、S.O.C.培地20 μlを加えて均等なスプレッディングを確実にする。少なくとも1枚のプレートでは十分に間隔の空いたコロニーを確実に得られるように必ず異なる2容量を平版培養すること。
5. 37℃で一晩インキュベートする。
【０３１６】
実験者が見るべき事項
「ベクター + PCR挿入断片」の反応物では、数百個のコロニーが生じるはずである。これらのうち95%を超えるものが青色になるはずである。「ベクターのみ」の反応物では、コロニーがほとんど生じないはずであり(ベクター + PCR挿入断片のプレートの5%未満)、これらは白色になるはずである。
【０３１７】
形質転換対照
One Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1Rコンピテント細胞の形質転換効率をチェックするため、pUC19プラスミドが含まれている。前述のプロトコルを用いて、1バイアルのOne Shot(登録商標)TOP10またはMach1(商標)-T1R細胞にpUC19 10 pgを形質転換する。S.O.C.培地20 μlを加えて、形質転換混合物10 μlを100 μg/mlアンピシリン含有LBプレートに蒔いて培養する。形質転換効率は1×109 cfu/μg DNA以上になるはずである。
【０３１８】
PCR産物のゲル精製
序論
スメアリング、複数のバンド形成、プライマー二量体人為産物、または大きなPCR産物(3 kb超)にはゲル精製が必要になることがある。PCR産物を精製したいなら、慎重の上に慎重を期して全てのヌクレアーゼ源の混入を取り除く。DNA断片を単離するまたはオリゴヌクレオチドを取り除くプロトコルは多数存在している。最も一般的なプロトコルについては、Current Protocols in Molecular Biology, Unit 2.6 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1994)を参照されたい。3通りの簡単なプロトコルを以下に示す。PCR産物を精製することでクローニング効率が低下することがある(例えば、非常に希薄なPCR産物)。PCRを最適化して1本のバンドを産生させることもできる(上述の「PCR産物の産生」を参照のこと)。
【０３１９】
S.N.A.P.(商標)ゲル精製キットの使用
Invitrogenから入手できるS.N.A.P.(商標)ゲル精製キット(カタログ番号K1999-25)によって、通常のアガロースゲルからPCR産物を素早く精製することができる。
1. 増幅反応物を1〜5%の通常のTAEアガロースゲルで電気泳動する。アガロースゲルを調製するのにTBEを使用しないこと。ホウ酸塩が下記のヨウ化ナトリウムの工程を妨害するからである。
2. PCR産物を含んだゲルスライスを切断し、これを2容量の6 Mヨウ化ナトリウム溶液中にて65℃で融解させる。
3. 1.5容量の結合緩衝液を添加する。
4. 工程3で得た溶液をS.N.A.P.(商標)カラムに負荷する(1回に1 ml以下)。微量遠心分離機中にて3000×gで1分遠心分離し、上清を捨てる。
5. 工程3で得た溶液が残っていれば、工程を繰り返す。
6. 最終洗浄緩衝液900 μlを添加する。
7. 微量遠心分離機中にて最高速度で1分遠心分離し、素通りを捨てる。
8. 工程7を繰り返す。
9. 精製PCR産物をTEまたは滅菌水40 μlに溶出させる。TOPO(登録商標)クローニング反応に4 μlを使用する。
【０３２０】
迅速S.N.A.P.(商標)法
ずっと容易な方法は、PCR産物を含むゲルスライスを簡単に切断し、これをS.N.A.P.(商標)カラムベッドの頂部に置いて、最高速度で10秒間遠心分離することである。TOPO(登録商標)クローニング反応にこの素通り1〜2 μlを使用する。最良の結果を得るためには、ゲルスライスをできる限り小さくすべきである。
【０３２１】
低融点アガロース法
低融点アガロースを使用することが好ましい場合、以下の手順を使う。ゲル精製はPCR産物の希釈および潜在的なクローニング効率の減少をもたらすことに留意されたい。
1. PCR反応物のできるだけ多くをTAE緩衝液に入れた低融点アガロースゲル(0.8〜1.2%)で電気泳動する。
2. 関心対象のバンドを視覚化し、バンドを切り出す。
3. このゲルスライスを微量遠心管に入れて、ゲルスライスが融解するまでこの遠心管を65℃でインキュベートする。
4. アガロースの融解を維持するよう遠心管を37℃に置く。
5. この融解した、PCR産物を含むアガロース4 μlを本明細書に記載のTOPO(登録商標)クローニング反応物に加える。
6. TOPO(登録商標)クローニング反応物を37℃で5〜10分間インキュベートする。これはアガロースの融解を維持するためである。
7. 本明細書に記述される方法を用い、2〜4 μlをOne Shot(登録商標)コンピテント細胞に直接形質転換する。
【０３２２】
PCR産物を精製することでクローニング効率が低下することがある。PCRを最適化して1本のバンドを産生させることもできる。
【０３２３】
増幅後の3' A突出部の付加
序論
校正ポリメラーゼによって増幅されたDNAをTOPO TAクローニング(登録商標)ベクターに直接クローニングすることは、困難であることが多い。校正ポリメラーゼがTAクローニング(登録商標)に必要な3' A突出部を取り除いてしまうためである。Invitrogen社により、平滑末端化された断片をクローニングする簡単な方法が開発されている。実験者にはTaqポリメラーゼ、72℃まで平衡化されるヒートブロック、および任意で次の1つまたは複数が必要になるであろう: フェノール-クロロホルム、3 M酢酸ナトリウム、100%エタノール、80%エタノールおよびTE緩衝液。
【０３２４】
手順
これは3'アデニンを付加する1つの方法にすぎない。その他のプロトコルが適している場合もある。
16. 校正ポリメラーゼによる増幅後、バイアルを氷上に置き、試験管あたり0.7〜1単位のTaqポリメラーゼ加える。よく混合する。緩衝液を交換する必要はない。十分な数のPCR産物が3' A突出部を保持することになろう。
17. 72℃で8〜10分間インキュベートする(サイクリングさせない)。
18. 氷上に置き、TOPO(登録商標)クローニング反応ですぐに使用する。
【０３２５】
TOPO(登録商標)クローニングを進める前に試料を一晩保存するつもりなら、試料を等量のフェノール-クロロホルムで抽出して、ポリメラーゼを除去する。DNAをエタノール沈殿し、PCRの出発量を用いてTE緩衝液に再懸濁する。校正ポリメラーゼによる増幅後、PCR産物をゲル精製してもよい。精製後、Taqポリメラーゼ緩衝液、dATP、および0.5単位のTaqポリメラーゼを加える。この反応物を72℃で10〜15分間インキュベートし、TOPO(登録商標)クローニング反応に用いる。
【０３２６】
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)の特徴
pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)(2817 bp)は以下の要素(表18)を含む。要素は全て機能性が試験されている。
【０３２７】
（表１８）
2007512838.tif 000032
【０３２８】
調製法
LB(ルリア-ベルターニ)培地およびプレート
組成: 1.0%トリプトン、0.5%酵母抽出物、1.0% NaCl, pH 7.0。1リットルの場合、トリプトン10 g、酵母抽出物5 gおよびNaCl 10 gを蒸留水950 mlに溶解する。溶液のpHをNaOHで7.0に調整し、容量を1リットルにする。液体サイクルで20分間加圧滅菌する。溶液を約55℃まで冷却させて、必要に応じ、抗生物質を加える。室温でまたは4℃で保存する。
【０３２９】
LB寒天プレートの場合。上記のようにLB培地を調製するが、但し加圧滅菌の前に寒天15 g/Lを加える。液体サイクルで20分間加圧滅菌する。加圧滅菌後、抗生物質を添加し、10 cm径プレートに注ぎ込む。固まらせてから、ひっくり返し、暗所中にて4℃で保存する。X-galをプレートに添加するため、プレートを37℃まで温める。40 mg/mlのX-galストック溶液(下記参照) 40 μlをピペットで取り、均等に拡げて、15分間乾燥させる。光からプレートを保護する。
【０３３０】
10 mg/mlのスペクチノマイシン・ストック溶液を次のように調製する。スペクチノマイシン(50 mg, Sigma カタログ番号S4014)を滅菌蒸留水5 mlに再懸濁し、ろ過滅菌して、最大2週間まで4℃で保存する。長期保存の場合、この溶液を-20℃で保存する。
【０３３１】
X-gal 400 mgをジメチルホルムアミド10 mlに溶解することにより、40 mg/mlのX-galストック溶液を調製する。この溶液を光から保護して、-20℃で保存する。
【０３３２】
本明細書に記述されるのは、T/A TOPOクローニングの実績ある信頼性をGATEWAY(登録商標)技術の威力および汎用性と組み合わせた新しいクローニング系の作出と試験である。このベクターを構築するうえで、attL領域内のプライマー部位からエントリークローンの配列決定を可能にする配列決定プライマーを新たにデザインしている。これによって不必要なベクター配列は含まれず、ミニプレップDNAから600〜700塩基の明瞭な配列の読み取りが得られた。同様に、TOPOアダプター付加部位の中にccdB負選択カセットを用いることで、pCR2.1系ベクターに関連する高いフォアグラウンドと低いバックグラウンドが維持された。さらに、ほとんどのENTRYベクターで使われているカナマイシンの代わりに、スペクチノマイシン陽性選択をpCR8/GW/TOPOで利用した。これにより、実験者はこのENTRYベクターを、植物発現系で良く使われるカナマイシン選択可能なDESTベクターとともに使用することが可能になるはずである。pCR8/GW/TOPOはMach I大腸菌の増殖に適合することも実証された。この細胞系は他の細胞株に比べ、より速いコロニー生成や液体培地増殖を後押しすることが以前に報告されている。本研究では、種々の選択可能なマーカーをMach IまたはTop10細胞のいずれかで試験したところ、4.5時間で培養密度の増加が少し認められただけであった。
【０３３３】
要約すれば、pCR8/GW/TOPOはGATEWAY(登録商標)技術によって他の系にDNA要素を移入する能力が加わっている一方でpCR2.1/TOPO-T/Aクローニング系の特性を兼ね備えている。
【０３３４】
ここまで、理解を明確にする目的で例示や実例によって本発明を十分に詳述してきたが、本発明の範囲またはその任意の特定の態様に影響を与えることなく、広くて等価な範囲の条件、組成およびその他のパラメータのなかで本発明を修正するまたは変更することによって本発明を実施できること、ならびにそのような修正および変更は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるよう意図されることは当業者には明らかであろう。
【０３３５】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および特許出願は本発明が属する当業者の技術水準を示しており、各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられることが示されるかのごとく同じ程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【０３３６】
（表１９）pCR8/GWの注釈付きヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 71)
2007512838.tif 000033
2007512838.tif 000034
2007512838.tif 000035
2007512838.tif 000036
2007512838.tif 000037
【０３３７】
（表２０）pCR8/GW/TOPOの注釈付きヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 72)
2007512838.tif 000038
2007512838.tif 000039
2007512838.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【０３３８】
【図１】基本的な組換えクローニング反応の概略図である。
【図２】本発明の核酸分子の概略図である。「CS1」および「CS2」とは2つの異なるクローニング部位を指す。「P1」および「P2」とは、ヌクレオチド配列の異なるプライマー結合部位を指す。「NAS」とは核酸セグメントを指す。図2A: 2つのクローニング部位および2つのプライマー結合部位を有する核酸分子。図2Bおよび2C: 1つのクローニング部位および2つのプライマー結合部位を有する核酸分子。
【図３】pCR2.1 EcoRI/RVの概略図である。以下の例に論じられるpDONR221由来の711 bpの断片は、CAT遺伝子のコード領域の部分を含む。
【図４】attP2 mut12部位の作製を図示するものである。attP2部位の部分が二本鎖配列により表されている。斜線矢印はGC対(下線)をAT対に変異させるのに使われる変異プライマーを、プライマーの3'位を矢尻にして表している。左側および右側の枠で囲んだ配列は、それぞれ、attP2に見られるattB2配列の11塩基対および近位のIHFタンパク質結合部位の12塩基対を含む。実線矢印はL-リバース配列決定プライマーの配置を表す。上の鎖は5'から3'方向で示されたSEQ ID NO: 4である。下の鎖は3'から5'方向で示されたSEQ ID NO: 5である。
【図５】pCR8/GWのベクターマップおよびこのベクターの詳細な特徴を示す。スーパーコイル状pCR8/GWのベクターマップが図5Aに示される。TOPO適合クローニング部位のマップが図5Bに示される。これらの部位がpCR8/GW/TOPOに組み込まれており、そのベクターマップは図8に示されている。L-フォワードプライマー(GW-1)およびL-リバースプライマー(GW-2)が特定の塩基変異を太字にして示されている。TOPOクローニング部位は枠で囲まれている。上の鎖は5'から3'方向で示されたSEQ ID NO: 6である。下の鎖は3'から5'方向で示されたSEQ ID NO: 7である。pCR/GWベクターのヌクレオチド配列は表19 (SEQ ID NO: 71)に示されている。pCR8/GW/TOPOベクターのヌクレオチド配列は表20 (SEQ ID NO: 72)に示されている。
【図６】attLプライマーおよびpCR8/GW/TOPOを用いて得られた配列決定データを示す。CAT ORFをPlatinum taqで増幅しpCR8/GW/TOPOとのTOPOクローニング反応に使用した。ミニプレップDNAを配列決定のために使用した。A) L-フォワードプライマーを用いて得られた配列決定データ。図6Aの最上部に示された配列はSEQ ID NO: 8である。B) L-リバースプライマーを用いて得られた配列決定データ。示されているのは各反応から得られた最初と最後の明瞭に解読可能な一連の塩基である。図6Bの最上部に示された配列はSEQ ID NO: 9である。EcoRI適応部位には下線が引かれており、TOPOクローニング部位は枠で囲んで表されている。
【図７】Mach IおよびTOP10増殖速度の分析である。A) カナマイシン(221)、アンピシリン(223)、またはスペクチノマイシン(228)を有するpENTRベクターを含んだMach IまたはTOP10細胞いずれかの採取コロニー由来の培養密度。B) Mach IまたはTOP10細胞いずれかにおけるpENTER D-TOPOおよびpCR8/GW/TOPOの規準化された培養増殖速度。C) Mach IまたはTOP10細胞におけるpENTERベクター(kan、amp、またはspec)の規準化された培養増殖速度。
【図８】pCR8/GW/TOPOのベクターマップおよびこのベクターの詳細な特徴を示す。pCR8/GW/TOPOのヌクレオチド配列は表11 (SEQ ID NO: 10)に示されている。ベクターマップはこのベクターを環状で示しているが、このベクターは直鎖状であってもよい。例えば、このベクターの直鎖型は表11のヌクレオチド683位および684位に相当する末端を有してもよい。さらに、このような直鎖状ベクターの3'端は共有結合したトポイソメラーゼタンパク質を含んでもよい。
【図９】pDONR223のベクターマップおよびこのベクターの詳細な特徴を示す。
【図１０】pDOR228のベクターマップおよびこのベクターの詳細な特徴を示す。
【図１１】Taq増幅PCR産物の産生とTOPOクローニングを説明するフローチャートである。
【図１２】pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)のTOPO(登録商標)クローニング領域(SEQ ID NO: 11)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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