(57)【要約】インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−Ｒ）に特異的な抗体を提供する。該抗体およびその断片は、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉの結合をブロッキングすることも可能である。アンタゴニスト抗体を使用して、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉの結合をブロッキングするか、または実質的にＩＧＦ−ＩＲ活性化を阻害することも可能である。ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、薬剤組成物、製造物品、またはキットに含むことも可能である。ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、癌を治療する方法もまた、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体が、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５またはそのいずれか１つの断片からなる群より選択されるＩＧＦ−１Ｒ抗体を含む、前記抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４またはそのいずれか１つの断片からなる群より選択される、請求項１の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４またはそのいずれか１つの断片からなる群より選択される、請求項１の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
前記抗体が、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の少なくとも１つの軽鎖および／または前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の少なくとも１つの重鎖を含む、請求項１、２または３の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
前記抗体が、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項４の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
前記抗体が、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の異なる軽鎖由来のＣＤＲおよび／または前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の異なる重鎖由来のＣＤＲを含む、請求項５の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
前記抗体が、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の少なくとも１つのＶＬ可変領域またはＶＨ可変領域を含む、請求項１、２または３の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
ａ）ヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合に関して交差競合する（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）特性；
ｂ）ヒトＩＧＦの同一エピトープに結合する特性；
ｃ）実質的に同じＫｄで、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する特性；および
ｄ）実質的に同じ解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）で、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する特性
からなる群より選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１〜７のいずれか１つ記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
ａ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ分子；
ｂ）Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体；または
ｃ）ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体
である、請求項１〜８のいずれか１つ記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４からなる群より選択されるＩｇＧである、請求項９の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１つ記載の抗体またはその部分および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１つ記載の抗体を産生する、単離細胞株。
【請求項１３】
癌または腫瘍治療用の医薬品製造のための、請求項１〜１０のいずれか１つのＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１つ記載の抗体の、重鎖またはその抗原結合部分、あるいは軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）受容体抗体、特にＩＧＦ−Ｉ受容体へのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合のアンタゴニストに関する。本出願はまた、癌を含む、哺乳動物における特定の病的状態の療法または診断における、該抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ；ソマトメジン−Ｃとも呼ばれる）は、インスリン、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）およびより遠縁のものとして神経増殖因子もまた含む、関連ポリペプチドホルモンファミリーのメンバーである。これらのホルモン増殖因子は各々、高親和性で結合する同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体を有するが、いくつかはまた、（より低い親和性ではあるが）他の受容体ともまた結合可能である（概説には、ＲｅｃｈｌｅｒおよびＮｉｓｓｌｅｙ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４７：４２５−４２（１９８５）を参照されたい）。ＩＧＦ−Ｉは、細胞分化および細胞増殖を刺激し、アポトーシスを阻害し、そして増殖を維持するため、大部分の哺乳動物細胞種に必要とされる。これらの細胞種には、とりわけ、ヒト二倍体線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔリンパ球、神経細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および骨髄幹細胞が含まれる。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉ受容体相互作用が細胞増殖を仲介する、非常に多様な細胞種の概説に関しては、Ｇｏｌｄｒｉｎｇら，  Ｅｕｋａｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．，  １：３１−３２６（１９９１）を参照されたい。
【０００３】
ＩＧＦ−Ｉが刺激する細胞増殖または分化につながる伝達経路の第一の段階は、ＩＧＦ−Ｉ受容体へのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（または生理学的濃度を超えるインスリン）の結合である。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、２種のサブユニット：アルファ・サブユニット（完全に細胞外であり、そしてリガンド結合において機能する、１３０〜１３５ｋＤａタンパク質）およびベータ・サブユニット（９５ｋＤａ膜貫通タンパク質、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む）で構成される。ＩＧＦ−ＩＲは、チロシンキナーゼ増殖因子受容体ファミリーに属し（Ｕｌｌｒｉｃｈら，  Ｃｅｌｌ  ６１：２０３−２１２，  １９９０）、そしてインスリン受容体に構造的に非常に類似である（Ｕｌｌｒｉｃｈら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：２５０３−２５１２，  １９８６）。さらなるファミリーメンバーには、インスリン関連受容体、並びにＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン受容体由来の各１サブユニットで構成される、いわゆるハイブリッド受容体が含まれる。ＩＧＦ−ＩＲは、まず、一本鎖プロ受容体ポリペプチドとして合成され、グリコシル化、プレタンパク質転換酵素によるタンパク質分解的切断、およびジスルフィド結合によってさらに翻訳後修飾され、２つの細胞外１３０〜１３５ｋＤアルファ・サブユニットおよび２つの膜貫通９０〜９５ｋＤａベータ・サブユニットで構成される、成熟４６０ｋＤａへテロ四量体に組み立てられる（ＭａｓｓａｇｕｅおよびＣｚｅｃｈ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：５０３８−６０４５，  １９８２）。ベータ・サブユニット（単数または複数）は、すべてのＩＧＦ−１Ｒ機能に必要な本質的な受容体チロシンキナーゼ活性を所持し（Ｋａｔｏら，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ８：４０−５０，  １９９４）、一方、アルファ・サブユニットは完全に細胞外であり、そしてＩＧＦ−１Ｒのリガンド結合活性を所持する。
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルは、下垂体成長ホルモン（ＧＨ）の存在に依存する。ＧＨ依存性ＩＧＦ−Ｉ合成の主要な部位は肝臓であるが、多数の肝臓外組織もまた、ＩＧＦ−Ｉを産生する（ＤａｕｇｈａｄａｙおよびＲｏｔｗｅｉｎ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．  １０：６８−９１（１９８９））。多様な新形成性組織もまた、ＩＧＦ−Ｉを産生可能である（ＷｅｒｎｅｒおよびＬｅＲｏｉｔｈ，  Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：１８３−２２３（１９９６））。したがって、ＩＧＦ−Ｉは、自己分泌機構またはパラ分泌機構とともに、内分泌機構を介して、正常な、そして異常な細胞増殖の制御因子として作用しうる。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合する。ＩＧＦへの結合に際して、ＩＧＦＢＰは、循環を通じてＩＧＦを輸送するか、またはタンパク質分解的切断および不活性化からＩＧＦを保護しうる。ＩＧＦ−ＩＲと相互作用する遊離ＩＧＦの利用可能性は、ＩＧＦＢＰによって調節される。ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦ−Ｉの概説に関しては、Ｇｒｉｍｂｅｒｇら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １８３：１−９，  ２０００を参照されたい。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を維持する際にＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＲが役割を果たすというかなりの証拠がある。ＩＧＦ−ＩＲレベルは、肺（Ｋａｉｓｅｒら，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １１９：６６５−６６８，  １９９３；Ｍｏｏｄｙら，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５２：１１６１−１１７３，  １９９３；Ｍａｃａｕｌｅｙら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５０：２５１１  ２５１７，  １９９０）、乳房（Ｐｏｌｌａｋら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ３８：２２３−２３０，  １９８７；Ｆｏｅｋｅｎｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４９：７００２−７００９，  １９８９；Ｃｕｌｌｅｎら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４９：７００２−７００９，  １９９０；Ａｒｔｅａｇａら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８４：１４１８−１４２３，  １９８９）、前立腺（Ｈｅｌｌａｗｅｌｌら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２：２９４２−２９５０，  ２００２）および結腸（Ｒｅｍａｏｌｅ−Ｂｅｎｎｅｔら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ７５：６０９−６１６，  １９９２；Ｇｕｏら，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １０２：１１０１−１１０８，  １９９２）の腫瘍中で上昇する。野生型ＩＧＦ−１Ｒに加えて、形質転換細胞および腫瘍細胞はまた、各々ＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン受容体由来の単一のアルファ・サブユニットおよびベータ・サブユニットで構成される、いわゆるハイブリッド受容体を発現することも可能である（Ｓｏｏｓら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２７０：３８３−３９０，  １９９０およびＢａｉｌｙｅｓら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２７：２０９−２１５，  １９９７）。ＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化増進が、ヒト髄芽腫（Ｄｅｌ  Ｖａｌｌｅら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ８：１８２２−１８３０，  ２００２）およびヒト乳癌（Ｒｅｓｎｉｋら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：１１５９−１１６４，  １９９８）で検出されてきている。トランスジェニックマウスにおいて、前立腺上皮でＩＧＦ−Ｉ発現が制御解除されると、新形成が導かれる（ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：３４５５−６０，  ２０００）。さらに、ＩＧＦ−Ｉは、ヒト神経膠腫の自己分泌刺激因子であるようであり（Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：２４７５−２４７８，  １９９３）、一方、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する線維肉腫の増殖を刺激した（Ｂｕｔｌｅｒら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：３０２１−２７，  １９９８）。さらに、ＩＧＦ−Ｉが「高めの正常」レベルである個体は、ＩＧＦ−Ｉレベルが「低めの正常」範囲である個体に比較して、一般的な癌のリスクが増加している（Ｒｏｓｅｎら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  １０：１３６−４１，  １９９９）。これらの腫瘍細胞種の多くは、培養中、ＩＧＦ−Ｉに応答して増殖シグナルを出し（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８２：３５４  ３５９，  １９８８；Ｆｒｅｅｄら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３：５０９−５１４，  １９８９）、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでは、増殖のための自己分泌ループまたはパラ分泌ループが生じると仮定されている（ＬｅＲｏｉｔｈら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｓ．  １６：１４３−１６３，  １９９５；Ｙｅｅら，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３：５０９−５１４，  １９８９）。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現が、結腸直腸癌で見出されている（Ｗｅｂｅｒら，  Ｃａｎｃｅｒ  ９５：２０８６−２０９５，  ２００２）。結腸直腸癌における療法ターゲットとしてのインスリン様増殖因子系の概説に関しては、Ｈａｓｓａｎ  Ａ．Ｂ．  ＆  Ｍａｃａｕｌａｙ（Ａｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １３：３４９−３５６，  ２００２）を参照されたい。多様なヒト腫瘍の増殖において、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉ受容体の相互作用が果たす役割の概説に関しては、Ｍａｃａｕｌａｙ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ６５：３１１−３２０，  １９９２、並びにＷｅｒｎｅｒおよびＬｅＲｏｉｔｈ，  Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：１８３−２２３，  １９９６を参照されたい。
【０００６】
ＩＧＦ−１Ｒが決定的な役割を果たしていることを立証するため、腫瘍細胞生物学において、ＩＧＦ−１Ｒの活性および／または発現に干渉する、いくつかのアプローチが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用されてきている。ＩＧＦ−ＩＲ  ＲＮＡに対するアンチセンス発現ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＩＧＦ−ＩＲへの干渉が、ＩＧＦ−Ｉが仲介するかまたはＩＧＦ−ＩＩが仲介する細胞増殖の阻害につながることが示されてきている（例えば、Ｗｒａｉｇｈｔら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：５２１−５２６，  ２０００を参照されたい）。アンチセンス戦略は、いくつかの正常細胞種およびヒト腫瘍細胞株において、細胞増殖を阻害するのに成功した。増殖はまた、ＩＧＦ−Ｉの環状ペプチド類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら，  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆ．  ３：１９９−２０５，  １９９２；およびＰｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  １２：３８８３−３８８９，  １９９２）、またはＩＧＦ−Ｉ  ＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現するベクター（Ｔｒｏｊａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９４−９７，  １９９２）を用いても阻害可能である。さらに、ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体、特にαＩＲ３と称するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｋｕｌｌら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：６５６１−６５６６，  １９８３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、いくつかの腫瘍細胞株の増殖を阻害可能である（Ａｒｔｅａｇａら，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．，  ２２：１０１−１０６，  １９９２；Ｒｏｈｌｉｋら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １４９：２７６−２８１；Ａｒｔｅａｇａら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８４：１４１８−１４２３，  １９８９；Ｋａｌｅｂｉｃら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：５５３１−５５３４，  １９９４）。さらに、ＩＧＦ−１Ｒに対する一本鎖抗体は、異種移植片モデルにおいて、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の増殖を阻害し（Ｌｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４９：２４３−２５２，  ２０００）、そして細胞表面受容体の下方制御を導く（Ｓａｃｈｄｅｖら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：６２７−６３５（２００３））こともまた示された。別の戦略において、ＩＧＦ−１Ｒの優性ネガティブ突然変異体を細胞中で同時発現することによって、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性に干渉すると（Ｐｒａｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１：２１８１−２１８５，  １９９４；Ｌｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９：３２５５８−３２５６４，  １９９４およびＪｉａｎｇら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：６０７１−７７，  １９９９）、やはり、形質転換表現型を逆転させ、腫瘍形成を阻害し、そして転移性表現型減少を誘導することも可能である。
【０００７】
ＩＧＦ−ＩＲ活性はまた、アポトーシスの制御にも寄与する。アポトーシスはプログラム細胞死としても知られ、リンパ球成熟および制御、並びに神経系成熟を含む、非常に多様な発生プロセスに関与する。発生における役割に加えて、アポトーシスはまた、腫瘍形成に対する重要な細胞性保護手段と関係するとも見なされてきた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｃｅｌｌ  ６５：１０９７−１０９８，  １９９１；Ｌａｎｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：７８６−７８７，  １９９３）。多様な遺伝子傷害によるアポトーシスプログラムの抑制は、悪性腫瘍の発展および進行に寄与しうる。
【０００８】
ＩＧＦ−Ｉは、ＩＬ−３の枯渇（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）によって誘導されるアポトーシスから造血細胞を保護し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔａｒｄｕｃｈｙ，  Ｇ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：５３５  ５４０，  １９９２）、そしてＲａｔ−１／ｍｙｃＥＲ細胞において、血清枯渇によるアポトーシスから保護する（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｅ．ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３２８６−３２９５，  １９９４）。ＩＧＦ−Ｉの抗アポトーシス機能は、細胞周期の拘束後段階において、そしてまたエトポシドまたはチミジンによって細胞周期進行がブロッキングされた細胞において、重要である。ｃ−ｍｙｃが駆動する線維芽細胞は、生存のため、ＩＧＦ−Ｉに依存することが立証されており、これによって、ＩＧＦ−ＩＲには、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＲの増殖効果とは別の役割である、アポトーシスを特異的に阻害することによる、腫瘍細胞維持に重要な役割があることが示唆される。これは、Ｂｃｌ−２などの他の抗アポトーシス遺伝子が、腫瘍細胞生存を促進する際に発揮すると考えられる役割と類似であろう（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら，  Ｃｅｌｌ  ５７：７９−８８，  １９８９；Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｒｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：３３４−３３６，  １９９０）。
【０００９】
アポトーシスに対するＩＧＦ−Ｉの保護効果は、ＩＧＦ−Ｉと相互作用するため、細胞上に存在するＩＧＦ−ＩＲを有することに依存する（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：３７３９−３７４１，  １９９５）。ＩＧＦ−ＩＲに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた研究によって、ラット同系腫瘍のＩＧＦ−ＩＲレベル、アポトーシスの度合い、および腫瘍原性能力の間に定量的な関係があることが同定されたことからもまた、腫瘍細胞の維持において、ＩＧＦ−ＩＲが抗アポトーシス性に機能していることが裏付けられた（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：３７３９−３７４１，  １９９５）。過剰発現されたＩＧＦ−ＩＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エトポシドが誘導するアポトーシスから腫瘍細胞を保護し（Ｓｅｌｌら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：３０３−３０６，  １９９５）、そしてさらにより劇的なことに、野生型レベルよりＩＧＦ−ＩＲレベルが減少すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで、腫瘍細胞の大規模なアポトーシスが引き起こされることが見出された（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：２４６３２４６９，  １９９５）。
【００１０】
ＩＧＦ−Ｉレベルの増加、ＩＧＦ−ＩＩレベルの増加、および／またはＩＧＦ−ＩＲ受容体レベルの増加と関連して、アポトーシスを誘導するかまたは細胞増殖を阻害する潜在的な戦略には、ＩＧＦ−ＩレベルまたはＩＧＦ−ＩＩレベルを抑制するか、あるいはＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−Ｉの結合を防止することが含まれる。例えば、ＩＧＦ合成および／または分泌を減少させるため、長期作用性ソマトスタチン類似体オクトレオチドが使用されてきている。ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し、そして実験動物系において腫瘍形成を阻害するため、可溶性ＩＧＦ−ＩＲが用いられてきている（Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：４０１３−２０，  １９９６）。さらに、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＲ発現を減少させるため、ＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＧＦ−Ｉのペプチド類似体、およびＩＧＦ−ＩＲに対する抗体が用いられてきている（上記を参照されたい）。しかし、これらの化合物のいずれも、ヒト患者への長期投与には適切でなかった。さらに、ＩＧＦ−Ｉは、小人症、骨粗しょう症、筋量減少、神経障害または糖尿病の治療のため、患者に投与されてきているが、しばしば、ＩＧＦＢＰへのＩＧＦ−Ｉの結合は、ＩＧＦ−Ｉを用いた治療を困難にするか、または無効にしている。
【００１１】
したがって、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＲが過剰発現している際に、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲが、癌および他の増殖障害のような障害において有する役割を考慮すると、ＩＧＦ−ＩＲの発現および／または活性を阻害可能な、ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体を生成することが望ましいであろう。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体が、自己免疫疾患の特定の患者に存在することが報告されているが、これらの抗体はいずれも精製されておらず、そして診断法または臨床法用に、ＩＧＦ−Ｉ活性を阻害するのに適切であるとは示されていない。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｐｅｄｉａｔ．  Ｒｅｓ．  ３２：４５５  ４５９，  １９８８；Ｔａｐｐｙら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：１７０８−１７１４，  １９８８；Ｗｅｉｇｈｔｍａｎら，  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：２５１−２５７，  １９９３；Ｄｒｅｘｈａｇｅら，  Ｎｅｔｈｅｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ４５：２８５−２９３，  １９９４を参照されたい。さらに、ＩＧＦ−１Ｒに対するモノクローナル抗体は、細胞増殖を刺激しうると報告された（Ｘｉｏｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５３５６−５３６０，  １９９２）。
【００１２】
ＷＯ  ０２／０５３５９６は、ＸＥＮＯＭＩＣＥＴＭを用いて得た抗ＩＧＦ−ｌＲ  ＩｇＧ抗体を発現するハイブリドーマ、および該ハイブリドーマを用いて癌を治療する方法を開示する。
【００１３】
したがって、ヒトにおいて疾患を治療するのに使用可能な高親和性ヒト抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を得ることが望ましいであろう。本明細書において、我々は、ファージ−ディスプレイライブラリーを用いて得た、ＩＧＦ−１Ｒに対する完全ヒト抗体、および該抗体を用いて、動物の癌を治療する方法を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の概要
本発明は、ＩＧＦ−ＩＲに結合する単離抗体またはその抗原結合部分、好ましくはマウス、ラット、霊長類およびヒトＩＧＦ−ＩＲに結合するもの、そしてより好ましくはヒト抗体であるものを提供する。本発明は、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合を阻害するＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供し、そしてまた、ＩＧＦ−ＩＲチロシンリン酸化を活性化するＩＧＦ−ＩＲ抗体も提供する。
【００１５】
本発明は、該抗体および薬学的に許容しうるキャリアーを含む薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、抗腫瘍剤または画像化試薬などの別の構成要素をさらに含むことも可能である。
【００１６】
本発明はまた、診断法および療法も提供する。診断法には、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、ＩＧＦ−ＩＲ発現組織の存在または位置を診断する方法が含まれる。療法は、該抗体を投与する必要がある被験者に、好ましくは別の療法剤の投与と組み合わせて、該抗体を投与することを含む。
【００１７】
本発明は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を産生する、ハイブリドーマなどの単離細胞株を提供する。
本発明はまた、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の重鎖および／または軽鎖あるいはその抗原結合部分をコードする核酸分子も提供する。
【００１８】
本発明は、該核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞とともに、該核酸分子にコードされるポリペプチドを組換え的に産生する方法を提供する。
ＩＧＦ−ＩＲ抗体の重鎖および／または軽鎖あるいはその抗原結合部分を発現する非ヒトトランスジェニック動物もまた、提供する。本発明はまた、治療する必要がある被験者を、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の重鎖および／または軽鎖あるいはその抗原結合部分をコードする核酸分子の有効量で治療する方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の詳細な説明
定義および一般的技術
本明細書に別に定義しない限り、本発明と関連して用いる科学的用語および技術的用語は、一般の当業者に通常理解される意味を持たなければならない。さらに、文脈によって別であることが必要とされない限り、単数の用語は複数形を含むものとし、そして複数の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して用いる術語およびこれらの技術は、当該技術分野において周知であり、そして一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用されそして論じられる、多様な一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、並びにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９９）を参照されたい。
【００２０】
製造者の仕様書にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、酵素反応および精製技術を行う。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、並びに医学的化学および薬学的化学の実験法および技術と関連して用いる術語は、当該技術分野において周知であり、そして一般的に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬剤調製、配合、および搬送、および患者の治療のため、標準的技術を用いる。
【００２１】
以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解するものとする：
本明細書において、用語「インスリン様増殖因子Ｉ」または「ＩＧＦ−Ｉ」および「インスリン様増殖因子ＩＩ」または「ＩＧＦ−ＩＩ」は、典型的には、Ａ〜Ｄすべてのドメインを有する増殖因子を指す。ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの断片は、より少ないドメインでＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを構成し、そしてＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの変異体は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩのいくつかのドメインを反復して有することも可能であり；どちらも、ＩＧＦ−Ｉ受容体に結合するそれぞれの能力をなお保持するならば、該用語に含まれる。用語「ＩＧＦ−Ｉ」および「ＩＧＦ−ＩＩ」には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物種いずれかに由来する増殖因子、そして特にヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが含まれる。本明細書において、該用語には、成熟型、プレ型、プレプロ型、およびプロ型、天然供給源から精製された型、化学的に合成された型または組換え的に産生された型が含まれる。ヒトＩＧＦ−Ｉは、Ｊｅｎｓｅｎ  Ｍ．ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：６０９−６１１，  １９８３）に公表されたｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＩＧＦ−ＩＩは、Ｊｅｎｓｅｎ  Ｍ．ら（ＦＥＢＳ  １７９：２４３−２４６，  １９８５）に公表されたｃＤＮＡ配列によってコードされる。天然対立遺伝子変異が存在し、そして各個体のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸相違によって立証されるように、こうした変異が個体のなかで生じうることが理解されるであろう。
【００２２】
用語「ＩＧＦ−Ｉ受容体」および「ＩＧＦ−ＩＲ」は、本明細書において用いた場合、典型的には細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの細胞性受容体とともに、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに結合する能力を保持するその変異体および断片を指す。用語「ＩＧＦ−Ｉ受容体」および「ＩＧＦ−ＩＲ」は、天然供給源由来であるか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に産生されたか、または組換えＤＮＡ技術の方法を含む遺伝子操作によって得られた、可溶性型を含む。ＩＧＦ−ＩＲ変異体または断片は、Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．ら（ＥＭＢＯ，  ５：２５０３−２５１２，  １９８６）に公表されたヒトＩＧＦ−ＩＲアミノ酸配列のドメインいずれかと、好ましくは少なくとも約６５％の配列相同性、そしてより好ましくは少なくとも約７５％の配列相同性を共有する。
【００２３】
用語「ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ生物学的活性」は、本明細書において用いた場合、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの分裂促進活性、遊走促進（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）活性、抗アポトーシス活性または形態形成活性、あるいはＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩがＩＧＦ−ＩＲに結合した結果として生じる活性いずれかを指す。用語「ＩＧＦ−ＩＲ活性化」は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに誘導される、ＩＧＦ−ＩＲのベータ・サブユニット内のチロシンキナーゼ活性を指す。ＩＧＦ−ＩＲの活性化は、ＩＧＦ−ＩＲにＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが結合した結果として生じることも可能であり、そしてこれに対して現在まで記載されてきていないが、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ結合とは独立に生じることも可能である。さらに、「ＩＧＦ−ＩＲ活性化」は、ＩＧＦ−ＩＲにＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体が結合した後、生じることも可能である。ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ生物学的活性は、例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが誘導する細胞増殖、細胞散乱、または細胞遊走のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、測定可能である。マウス３Ｔ３ヒトＩＧＦ−ＩＲトランスフェクション線維芽細胞などのＩＧＦ−ＩＲ発現細胞において、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩがＤＮＡ合成を誘導する能力を試験するのに適したアッセイで、ＩＧＦ−ＩＲ受容体アンタゴニストの効果を測定することも可能である（実施例８に記載する）。例えば、ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取り込みを測定することによって、ＤＮＡ合成をアッセイすることも可能である。ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに反応した増殖およびＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取り込みをブロッキングする能力によって、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの有効性を決定することも可能である。動物モデルにおいて、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの効果を試験することもまた可能である。
【００２４】
用語「ポリペプチド」は、天然または人工的なタンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を含む。ポリペプチドは単量体または多量体であることも可能である。
【００２５】
用語「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」は、その由来または得られた供給源に基づいて、（１）天然状態で付随する、天然会合構成要素が会合していないか、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されたか、または（４）天然に存在しない、タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学的に合成されたか、または天然に派生する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、天然会合構成要素から「単離」されているであろう。タンパク質はまた、当該技術分野に周知のタンパク質分離および精製技術を用いた単離によって、天然会合構成要素を実質的に含まないようにされていることも可能である。
【００２６】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０〜７５％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋である」か、「実質的に均質である」か、または「実質的に精製されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体であることも可能である。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％  Ｗ／Ｗ、より一般的には約９５％、そして好ましくは９９％より純粋であろう。タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、当該技術分野に周知の染色剤でゲルを染色して単一ポリペプチドバンドを視覚化するなど、当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、タンパク質純度または均質性を示すことも可能である。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは精製に関して当該技術分野に周知である他の手段を用いることによって、より高い解像度を提供することも可能である。
【００２７】
用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残ったアミノ酸配列が、天然存在配列の対応する位に同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも長さ５、６、８アミノ酸であり、好ましくは少なくとも長さ１４アミノ酸であり、より好ましくは少なくとも長さアミノ酸であり、通常、少なくとも長さ２０アミノ酸であり、さらにより好ましくは、少なくとも長さ７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸である。
【００２８】
用語「ポリペプチド類似体」は、本明細書において、アミノ酸配列の部分に実質的な同一性を有し、そして以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸のセグメントで少なくとも構成されるポリペプチドを指す：（１）適切な結合条件下でのＩＧＦ−ＩＲへの特異的な結合；（２）ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合をブロッキングする能力、または（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲ細胞表面発現またはチロシンリン酸化を減少させる能力。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然存在配列に対して、保存的アミノ酸置換（または挿入もしくは欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも長さ２０アミノ酸、好ましくは少なくとも長さ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸あるいはそれより長く、そしてしばしば、全長天然存在ポリペプチドと同じ長さであることも可能である。
【００２９】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、そして（５）こうした類似体の他の物理化学的特性または機能的特性を与えるかまたは修飾するものである。類似体は、天然存在ペプチド配列以外の配列の多様な突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎｓ）を含むことも可能である。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を、天然存在配列（好ましくは、ポリペプチドの分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外の部分）で行うことも可能である。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させてはならない（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを壊すか、または親配列を特徴付ける、他の種類の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例は、本明細書に各々援用される、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ニューヨーク（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ監修，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載される。非ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性に類似の特性を持つ薬剤として、薬剤産業において一般的に用いられる。非ペプチド化合物のこれらの種類は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される。本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；並びにＥｖａｎｓら  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９（１９８７）。こうした化合物はしばしば、コンピュータ化分子モデリングの補助で開発される。療法的に有用なペプチドに構造的に類似であるペプチド模倣体を用いて、同等の療法的効果または予防的効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド擬似体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち、望ましい生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、１以上のペプチド連結が、当業者に周知の方法によって：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結に、場合によって置換されている。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を、同じ種のＤ−アミノ酸で体系的に置換して（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）、より安定なペプチドを生成することもまた可能である。さらに、当該技術分野に知られる方法によって、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドを生成することも可能であり（本明細書に援用されるＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：３８７（１９９２））；例えばペプチドを環状化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによって、生成することも可能である。
【００３０】
「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然存在免疫グロブリンにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一対で構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、抗原認識に主に関与する、約１００〜１以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を明示する。ヒト軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖と分類される。重鎖は、μ、Δ、γ、α、またはεと分類され、そしてそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体アイソタイプを明示する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖には、約１０のさらなるアミノ酸の「Ｄ」領域が含まれる。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７章（Ｐａｕｌ，  Ｗ．監修，  第２版，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州（１９８９））（すべての目的のため、本明細書に完全に援用される）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００３１】
免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結された、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域によって並列され、特異的エピトープへの結合が可能になる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖はどちらも、ＦＲ１ドメイン、ＣＤＲ１ドメイン、ＦＲ２ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン、ＦＲ３ドメイン、ＣＤＲ３ドメインおよびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  メリーランド州ベセスダ（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義にしたがう。
【００３２】
「抗体」は、損なわれていない免疫グロブリン、または特異的結合に関して、損なわれていない抗体と競合する、その抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない抗体の酵素的切断または化学的切断によって、産生可能である。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、並びに少なくとも、該ポリペプチドへの特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリン部分を含有するポリペプチドが含まれる。
【００３３】
Ｆａｂ断片は、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなり；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなり；そしてｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，  １９８９）はＶＨドメインからなる。
【００３４】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、単一タンパク質鎖として作成することを可能にする合成リンカーによってＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成されて、一価分子を形成している抗体である（Ｂｉｒｄら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，  １９８８およびＨｕｓｔｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，  １９８８）。ディアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いており、それによってこれらのドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を生成している、二価二重特異性抗体である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４６４４８，  １９９３およびＰｏｌｊａｋ，  Ｒ．Ｊ．ら，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，  １９９４を参照されたい）。１以上のＣＤＲを共有的にまたは非共有的に分子に取り込んで、イムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）にすることも可能である。イムノアドヘシンは、より大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能であるし、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（単数または複数）を共有的に連結することも可能であるし、またはＣＤＲ（単数または複数）を非共有的に取り込むことも可能である。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが目的の特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【００３５】
抗体が１以上の結合部位を有することも可能である。１より多い結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であることも可能であるし、または異なることも可能である。例えば、天然存在免疫グロブリンは２つの同一結合部位を有し；一本鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合部位を有し、一方、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００３６】
「単離抗体」は、（１）天然状態で付随する、他の天然会合抗体を含む、天然会合構成要素と会合していないか、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然に存在しない、抗体である。
【００３７】
単離抗体の例には、ＩＧＦ−ＩＲを抗原として用いてアフィニティー精製されたＩＧＦ−ＩＲ抗体、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでハイブリドーマまたは他の細胞株によって合成された抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体、およびトランスジェニックマウス由来のヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体が含まれる。
【００３８】
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列由来の１以上の可変領域および定常領域を有する抗体すべてを含む。
好ましい態様において、可変ドメインおよび定常ドメインはすべて、ヒト免疫グロブリン配列由来である（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、以下に記載するように、多様な方式で調製可能である。
【００３９】
「ヒト化抗体」は、非ヒト種由来であり、ヒトにおける免疫応答を回避するかまたは無効にするように、重鎖および軽鎖のフレームワークおよび定常ドメインの特定のアミノ酸が突然変異されている抗体である。あるいは、非ヒト種の可変ドメインにヒト抗体由来の定常ドメインを融合させることによって、ヒト化抗体を産生することも可能である。ヒト化抗体をどのように作成するかの例は、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および第５，８７７，２９３号に見出すことも可能である。
【００４０】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１以上の領域および１以上の他の抗体由来の１以上の領域を含有する抗体を指す。好ましい態様において、１以上のＣＤＲがヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体由来である。より好ましい態様において、すべてのＣＤＲがヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体由来である。別の好ましい態様において、１より多いヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体由来のＣＤＲを、キメラ抗体中でうまく組み合わせる（ｍｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ）。例えばキメラ抗体は、第一のヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１を含むことも可能であり、これを第二のヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３と組み合わせることも可能であり、そして重鎖由来のＣＤＲが第三のＩＧＦ−ＩＲ抗体由来であることも可能である。さらに、フレームワーク領域は、１つの同一ＩＧＦ−ＩＲ抗体由来であることも、ヒト抗体などの１以上の異なる抗体由来であることも、またはヒト化抗体由来であることも可能である。「中和抗体」または「阻害性抗体」は、過剰量のＩＧＦ−ＩＲ抗体が、ＩＧＦ−ＩＲに結合するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの量を少なくとも約２０％減少させる場合、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへのＩＧＦ−ＩＲの結合を阻害する抗体である。好ましい態様において、抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに結合するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの量を少なくとも４０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは８０％、またはさらにより好ましくは８５％減少させる。結合の減少は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイにおいて測定されるように、一般の当業者に知られるいかなる手段によっても測定可能である。ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合の減少を測定する例を、以下の実施例４に示す。
【００４１】
「活性化抗体」は、ＩＧＦ−ＩＲを発現している細胞、組織、または生物に添加した際、等モル量のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによって達成される活性化に比較して、少なくとも約２０％、ＩＧＦ−ＩＲを活性化する抗体である。好ましい態様において、該抗体は、等モル量のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによって達成される活性化レベルの、少なくとも４０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは８０％、またはさらにより好ましくは８５％、ＩＧＦ−ＩＲ活性を活性化する。より好ましい態様において、活性化抗体は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの存在下で添加される。別の好ましい態様において、チロシンリン酸化およびＩＧＦ−ＩＲの活性化の量を測定することによって、活性化抗体の活性を測定する。
【００４２】
一般の当業者は、本明細書の解説にしたがって、抗体の断片または類似体を容易に調製可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近くに存在する。公的な、または私有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配列データベースに、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列データを比較することによって、構造ドメインおよび機能ドメインを同定可能である。好ましくは、コンピュータ化比較法を用いて、構造および／または機能が知られる他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定する。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が、Ｂｏｗｉｅら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）に記載されている。
【００４３】
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書において、例えばＢＩＡｃｏｒｅ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラおよびニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内でタンパク質濃度の改変を検出することによって、リアルタイムで二重特異性相互作用の解析を可能にする光学的現象を指す。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．ら  Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  ５１：１９−２６（１９９３）；Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．ら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７（１９９１）；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｂ．ら  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ８：１２５−１３１（１９９５）；およびＪｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｂ．ら  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：２６８−２７７（１９９１）を参照されたい。
【００４４】
用語“Ｋｏｆｆ”は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の解離速度定数を指す。
用語“Ｋｄ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合可能な分子決定基いずれかが含まれる。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、そして通常、特定の３次元構造特性とともに、特定の荷電特性を有する。解離定数が１Ｍ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満、そして最も好ましくは１ｎＭ未満のとき、抗体は抗原に特異的に結合すると言う。
【００４５】
本明細書において、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は、慣用的用法にしたがう。本明細書に援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，  Ｅ．Ｓ．  ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ監修，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１））を参照されたい。２０の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α−，α−２，５二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非慣用的アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適した構成要素であることも可能である。非慣用的アミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書に用いるポリペプチドの表記法においては、標準的用法および慣例にしたがって、左側方向がアミノ末端方向であり、そして右側方向がカルボキシ末端方向である。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドいずれかあるいはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型の、少なくとも長さ１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を意味する。該用語には、ＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型が含まれる。
【００４７】
用語「単離ポリヌクレオチド」は、本明細書において、ゲノム、ｃＤＮＡあるいは合成起源またはそのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源に基づいて、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）「単離ポリヌクレオチド」が天然に見られる際のポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合していないか、（２）天然には連結されていないポリヌクレオチドに、機能可能であるように連結されているか、または（３）天然には、より大きい配列の一部として存在しない。
【００４８】
用語「オリゴヌクレオチド」には、本明細書において、天然存在オリゴヌクレオチド連結および非天然存在オリゴヌクレオチド連結によって連結された、天然存在ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般的に、長さ２００塩基以下を含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜６０塩基であり、そして最も好ましくは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または４０塩基までである。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブ用に一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子突然変異体の構築において使用するため、二本鎖であることも可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれであることも可能である。
【００４９】
用語「天然存在ヌクレオチド」は、本明細書において、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾ヌクレオチド」は、本明細書において、修飾または置換糖基等を持つヌクレオチドを含む。
【００５０】
用語「オリゴヌクレオチド連結」は、本明細書において、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート等のオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、その開示が本明細書に援用される、ＬａＰｌａｎｃｈｅら  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎら  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎら  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  英国オクスフォード（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。望ましい場合、検出のためオリゴヌクレオチドを標識することも可能である。
【００５１】
「機能可能であるように連結された」配列には、目的の遺伝子と隣接する発現調節配列、およびトランスにまたは遠距離で目的の遺伝子を調節するように作用する発現調節配列の両方が含まれる。用語「発現調節配列」は、本明細書において、連結しているコード配列の発現およびプロセシングを達成するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を増進する配列（すなわちコザックのコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増進する配列；並びに望ましい場合、タンパク質分泌を増進する配列が含まれる。こうした調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なり；原核生物では、こうした調節配列には、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ；真核生物では、一般的に、こうした調節配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「調節配列」は、最小限、存在が発現およびプロセシングに必須である構成要素すべてを含むよう意図され、そして存在が好適であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列、および融合パートナー配列が含まれることもまた可能である。用語「ベクター」は、本明細書において、連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すよう意図される。ベクターの１種が「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループを指し、この中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することも可能である。別種のベクターがウイルスベクターであり、この中で、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結することも可能である。
【００５２】
特定のベクターは、導入された宿主細胞において、自律複製が可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入した際に宿主細胞ゲノムに組み込まれることも可能であり、そしてそれによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、機能可能であるように連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。
【００５３】
こうしたベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用可能であり、これはプラスミドが、ベクターの最も一般的に用いられる型であるためである。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば複製不全レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの発現ベクターの他の形を含むと意図される。
【００５４】
用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、本明細書において、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すよう意図される。こうした用語は、特定の対象細胞だけでなく、こうした細胞の子孫も指すよう意図されることが理解されなければならない。突然変異または環境の影響いずれかのために、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない可能性もあるが、本明細書において、やはり用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００５５】
用語「選択的にハイブリダイズする」は、本明細書において、検出可能にそして特異的に結合することを意味する。本発明記載のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびその断片は、非特異的核酸への認識可能な量の検出可能な結合を最小限にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー」または「非常にストリンジェント」な条件を用いて、当該技術分野に知られそして本明細書に論じるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することも可能である。「高ストリンジェンシー」または「非常にストリンジェント」な条件の例は、一方のポリヌクレオチドを膜などの固体表面に固定し、このポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドと、６ｘＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％ホルムアミド、ＳＸデンハート試薬、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション緩衝液中、４２℃のハイブリダイゼーション温度で１２〜１６時間インキュベーションし、次いで、１ｘＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの洗浄緩衝液を用いて５５℃で２回洗浄する方法である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、ｐｐ．９．５０−９．５５もまた、参照されたい。
【００５６】
用語「配列同一性パーセント」は、核酸配列の文脈において、最大に対応するように並列させた際、２つの配列において同一である残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、一般的には少なくとも約１８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチド、４８ヌクレオチド以上のストレッチに渡ることも可能である。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用可能な、当該技術分野に知られるいくつかの異なるアルゴリズムがある。例えば、ウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソンのプログラムである、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて、ポリヌクレオチド配列を比較することも可能である。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列および検索配列間の最適重複領域の並列および配列同一性パーセントを提供する（本明細書に援用される、Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３：６３−９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３２：１８５−２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：２２７−２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７６：７１−８４（１９９８））。別に明記しない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いる。例えば、本明細書に援用されるＧＣＧバージョン６．１に提供されるような、デフォルトパラメーター（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスに関するＮＯＰＡＭファクター）を伴うＦＡＳＴＡを用いて、またはデフォルトパラメーターを伴うＧａｐを用いて、核酸配列間の配列同一性パーセントを決定することも可能である。
【００５７】
核酸配列への言及は、別に明記しない限り、その相補体も含む。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補配列を含む、その相補鎖を含むと理解しなければならない。
【００５８】
分子生物学業において、研究者らは、用語「配列同一性パーセント」、「配列類似性パーセント」および「配列相同性パーセント」を交換可能に用いる。本出願において、これらの用語は、核酸配列のみに関して、同一の意味を持たなければならない。
【００５９】
用語「実質的類似性」または「実質的配列類似性」は、核酸またはその断片に言及した際、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、別の核酸（またはその相補鎖）に最適に並列させた場合、上に論じるようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの配列同一性の周知のアルゴリズムいずれかによって測定した際に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基に、ヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００６０】
ポリペプチドに適用した際、用語「実質的同一性」は、デフォルトギャップ荷重を用い、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで、２つのペプチド配列を最適に並列させた際、２つのペプチド配列が、少なくとも７５％または８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば荷電または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似性の度合いを上方に調整して、置換の保存性を修正することも可能である。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、本明細書に援用される、Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９９４）を参照されたい。類似の化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；並びに６）イオウ含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６１】
あるいは、保存的置換は、本明細書に援用されるＧｏｎｎｅｔら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５（１９９２）に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて、正の値を有する変化いずれかである。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて、負でない値を有する変化いずれかである。
【００６２】
配列同一性とも称される、ポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、多様な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を用いて、類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、デフォルトパラメーターを伴って用いて、相同など、緊密に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することも可能な「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含有する。
【００６３】
生物の異なる種由来のポリペプチドまたは野生型タンパク質および突然変異体タンパク質間。例えばＧＣＧ、バージョン６．１を参照されたい。デフォルトパラメーターまたは推奨されるパラメーターを用い、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを用いて、ポリペプチド配列を比較することもまた可能である。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列および検索配列間の最適重複領域の並列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００））。異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースに本発明の配列を比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いた、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、本明細書に援用される、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。
【００６４】
相同性に関して比較するポリペプチド配列の長さは、概して、少なくとも約１６アミノ酸残基、一般的には少なくとも約残基、より一般的には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基であり、そして好ましくは約３５残基より多いであろう。多数の異なる生物由来の配列を含有するデータベースを検索する際、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【００６５】
本明細書において、用語「標識」または「標識された」は、抗体における別の分子の取り込みを指す。１つの態様において、標識は検出可能マーカーであり、例えば放射標識アミノ酸の取り込み、または標識されたアビジン（例えば光学法または比色法によって検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの付着によって行われることも可能である。別の態様において、標識またはマーカーは療法性、例えば薬剤コンジュゲートまたは毒素であることも可能である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する多様な方法が当該技術分野に知られており、そして使用可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ・ホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、第二のレポーターによって認識される、あらかじめ決定されたポリペプチド・エピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ・タグ）、ガドリニウム・キレートなどの磁気剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノール、およびピューロマイシン、並びにその類似体および相同体。
【００６６】
いくつかの態様において、多様な長さのスペーサーアームによって標識を付着させて、潜在的な立体障害を減少させる。
用語「剤」は本明細書において、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的材料からの抽出物を指す。用語「薬学的剤または薬剤」は、本明細書において、患者に適切に投与された場合、望ましい療法効果を誘導可能な化学化合物または組成物を指す。本明細書の他の化学用語は、本明細書に援用されるＴｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．監修，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  サンフランシスコ（１９８５））に例示されるように、当該技術分野の慣用的用法にしたがって用いられる。
【００６７】
用語「抗新生物剤」は、本明細書において、ヒトにおける新生物、特に、癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病などの悪性（癌性）病変の発展または進行を阻害する機能特性を有する剤を指す。転移の阻害は、しばしば、抗新生物剤の特性である。
用語「患者」には、ヒトおよび獣医学的被験者が含まれる。
【００６８】
ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体およびその性質決定
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および／または定常領域を所持する抗体に関連する問題をある程度回避する。こうしたマウスまたはラット由来配列の存在は、抗体の迅速なクリアランスを導きうるし、または患者による、抗体に対する免疫応答の生成を導きうる。
【００６９】
したがって、１つの態様において、本発明は、ヒト化抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。好ましい態様において、本発明は、げっ歯類が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類にヒト免疫グロブリン遺伝子を導入することによって、完全ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。より好ましいのは、完全ヒト抗ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体である。ヒトＩＧＦ−ＩＲに対して向けられる完全ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体は、マウスまたはマウス誘導体化モノクローナル抗体（Ｍａｂ）に固有な免疫原性反応およびアレルギー性反応を最小限にし、そしてしたがって投与した抗体の有効性および安全性を増加させると期待される。完全ヒト抗体の使用は、反復抗体投与が必要である可能性もある、炎症および癌などの、慢性および再発性ヒト疾患の治療に実質的な利点を提供すると期待されることも可能である。別の態様において、本発明は、補体に結合しないＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。
【００７０】
好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５、またはそのいずれか１つの断片から選択される。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４、またはそのいずれか１つの断片から選択される。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４、またはそのいずれか１つの断片から選択される。
【００７１】
表１は、上記のｓｃＦｖ、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５抗体のアミノ酸配列を示す。
表１
【００７２】
【表１−１】
2007528201.tif 000002
【００７３】
【表１−２】
2007528201.tif 000003
【００７４】
【表１−３】
2007528201.tif 000004
【００７５】
【表１−４】
2007528201.tif 000005
【００７６】
別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９由来の軽鎖アミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列由来の１以上のＣＤＲを含む。別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９由来の重鎖アミノ酸配列、あるいはこれらのアミノ酸配列由来の１以上のＣＤＲを含む。
【００７７】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体のクラスおよびサブクラス
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子であることも可能である。好ましい態様において、抗体はＩｇＧであり、そしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプである。より好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体はサブクラスＩｇＧ１である。別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＩｇＧ１である抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５と同一クラスおよび同一サブクラスである。
【００７８】
当該技術分野に知られる方法いずれによってＩＧＦ−ＩＲ抗体のクラスおよびサブクラスを決定することも可能である。一般的に、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて、抗体のクラスおよびサブクラスを決定することも可能である。こうした抗体は商業的に入手可能である。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットとともに他の技術によって、クラスおよびサブクラスを決定することも可能である。
【００７９】
あるいは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインのすべてまたは部分を配列決定し、そのアミノ酸配列を免疫グロブリンの多様なクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列に比較し、そして抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって、クラスおよびサブクラスを決定することも可能である。
【００８０】
分子選択性
別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに対して、インスリン受容体、Ｒｏｎ受容体、Ａｘｌ受容体、ＮＧＦ受容体、およびＭｅｒ受容体に対する選択性よりも、少なくとも５０倍高い選択性を有する。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の選択性は、インスリン受容体、Ｒｏｎ受容体、Ａｘｌ受容体、ＮＧＦ受容体、およびＭｅｒ受容体に対するよりも、１００倍を超えて高い。さらにより好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、インスリンに対して、いかなる認識可能な特異的結合も示さない。さらにより好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＩＧＦ−ＩＲ以外のいかなるタンパク質に対しても認識可能な特異的結合をまったく示さない。本明細書の解説にしたがって、当該技術分野に周知の方法を用い、ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩＲ抗体の選択性を決定することも可能である。例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡを用いて、選択性を決定することも可能である。好ましい態様において、ウェスタンブロットを用いて分子選択性を決定することも可能である。
【００８１】
ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩＲ抗体の結合親和性
本発明の別の側面において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、高親和性でＩＧＦ−ＩＲに結合する。１つの態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、１ｘ１０−８Ｍ以下のＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。より好ましい態様において、該抗体は、１ｘ１０−９Ｍ以下のＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。さらにより好ましい態様において、該抗体は、５ｘ１０−１０Ｍ以下のＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。別の好ましい態様において、該抗体は、１ｘ１０−１０Ｍ以下のＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。別の好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択される抗体と実質的に同じＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。別の好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択される抗体由来の１以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。さらに別の好ましい態様において、該抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列の１つを含む抗体と実質的に同じＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。別の好ましい態様において、該抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列の１つを含む抗体由来の１以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。
【００８２】
本発明の別の側面において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、低い解離速度を有する。１つの態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、１ｘ１０−１ｓ−１以下のＫｏｆｆを有する。好ましい態様において、Ｋｏｆｆは、５ｘ１０−５ｓ−１以下である。別の好ましい態様において、Ｋｏｆｆは、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択される抗体と実質的に同じである。別の好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択される抗体由来の１以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＩＧＦ−ＩＲに結合する。さらに別の好ましい態様において、該抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列の１つを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＩＧＦ−ＩＲに結合する。別の好ましい態様において、該抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９、またはその断片から選択されるアミノ酸配列の１つを含む抗体由来の１以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＩＧＦ−ＩＲに結合する。
【００８３】
当該技術分野に知られる方法いずれによって、ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩＲ抗体の結合親和性および解離速度を決定することも可能である。１つの態様において、競合的ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって、結合親和性を測定することも可能である。表面プラズモン共鳴によって、解離速度を測定することもまた可能である。より好ましい態様において、表面プラズモン共鳴によって、結合親和性および解離速度を測定する。さらにより好ましい態様において、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、結合親和性および解離速度を測定する。ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ヒトＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメインへのＩＧＦ−ＩＲ抗体の結合に関する結合親和性および解離速度を決定する例を、以下の実施例１０に記載する。
【００８４】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体の半減期
本発明の別の目的にしたがって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも１日間の半減期を有する。好ましい態様において、抗体またはその部分は、少なくとも３日間の半減期を有する。より好ましい態様において、抗体またはその部分は、４日間以上の半減期を有する。別の態様において、抗体またはその部分は、８日間以上の半減期を有する。別の態様において、以下に論じるように、抗体またはその抗原結合部分がより長い半減期を有するように、これらを誘導体化するかまたは修飾する。
【００８５】
別の好ましい態様において、ＷＯ  ００／０９５６０号、２０００年２月２４日公開に記載されるように、血清半減期を増加させるため、抗体が点突然変異を含有することも可能である。
【００８６】
一般の当業者に知られる手段いずれかによって、抗体半減期を測定することも可能である。例えば、適切な期間にわたって、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって、抗体半減期を測定することも可能である。適切な動物いずれか、例えばカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）などのサル、霊長類またはヒトにおいて、抗体半減期を測定することも可能である。
【００８７】
本発明はまた、本発明のヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体と同じ抗原またはエピトープに結合するＩＧＦ−ＩＲ抗体も提供する。さらに、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ結合およびＩＧＦ−ＩＩ結合をブロッキングすることが知られるＩＧＦ−ＩＲ抗体と交差競合するＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。非常に好ましい態様において、既知のＩＧＦ−ＩＲ抗体は、別のヒト抗体である。好ましい態様において、ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５と同じ抗原またはエピトープを有する。別の好ましい態様において、ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５と同じ抗原またはエピトープに結合する抗体由来の１以上のＣＤＲを含む。さらに別の好ましい態様において、同じ抗原またはエピトープに結合するヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９、またはその断片から選択されるアミノ酸配列の１つを含む。別の好ましい態様において、同じ抗原またはエピトープに結合するヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列の抗体由来の１以上のＣＤＲを含む。
【００８８】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体が同じ抗原に結合するかどうかは、当該技術分野に知られる多様な方法を用いて決定可能である。例えば、あるＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、ＩＧＦ−ＩＲ抗体に結合することが知られる抗原、例えばＩＧＦ−ＩＲを捕捉して、抗体から抗原を溶出させ、そして溶出した抗原に試験ＩＧＦ−ＩＲ抗体が結合するかどうかを決定することによって、試験ＩＧＦ−ＩＲ抗体が同じ抗原に結合するかどうかを決定することも可能である。飽和条件下でＩＧＦ−ＩＲ抗体をＩＧＦ−ＩＲに結合させ、そして次いで、試験抗体がＩＧＦ−ＩＲに結合する能力を測定することによって、該抗体がＩＧＦ−ＩＲ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定することも可能である。試験抗体が、ＩＧＦ−ＩＲ抗体と同時にＩＧＦ−ＩＲに結合可能である場合、試験抗体はＩＧＦ−ＩＲ抗体とは別個のエピトープに結合する。しかし、試験抗体が、同時にはＩＧＦ−ＩＲに結合不能である場合、試験抗体は、ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体と同じエピトープに結合するか、または重複するエピトープ結合部位を共有する。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または表面プラズモン共鳴を用いて、この実験を行うことも可能である。好ましい態様において、表面プラズモン共鳴を用いて、実験を行う。より好ましい態様において、ＢＩＡｃｏｒｅを用いる。ＩＧＦ−ＩＲ抗体が別のＩＧＦ−ＩＲ抗体と交差競合するかどうかもまた決定可能である。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体が別のＩＧＦ−ＩＲ抗体と同じエピトープに結合可能であるかどうかを測定するのに用いられるのと同じ方法を用いることによって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体が別の抗体と交差競合するかどうかを決定することも可能である。
【００８９】
軽鎖および重鎖の使用法
本発明はまた、ヒトλ遺伝子（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｓ．Ｃ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６４：２２０−２３２，  １９９６）またはκ遺伝子（Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｋ．ら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：１０１７−１０２８，  ２００１）にコードされる可変配列を含むＩＧＦ−ＩＲ抗体も提供する。好ましい態様において、軽鎖可変配列は、Ｖλ  １ｅ、１ｃ、３ｒ、３ｉ、または６ａ遺伝子ファミリーにコードされる。１つの態様において、可変配列は、Ｖκ  Ａ２７、Ａ３０、またはＯ１２遺伝子ファミリーにコードされる。より好ましい態様において、軽鎖は、生殖系列から１０以下のアミノ酸置換、好ましくは６以下のアミノ酸置換、そしてより好ましくは３以下のアミノ酸置換を含む。好ましい態様において、アミノ酸置換は保存的置換である。
【００９０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体λ軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を提供する。本明細書の解説にしたがって、一般の当業者は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体軽鎖および生殖系列軽鎖がコードするアミノ酸配列を決定し、そして生殖系列配列および抗体配列間の相違を決定することも可能である。
【００９１】
好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＬは、生殖系列アミノ酸配列に比較して、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＬのいずれか１以上と同じアミノ酸置換を含有する。例えば、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＬは、抗体ＰＧＩＡ−０３−Ａ９に存在するものと同一の１以上のアミノ酸置換、抗体ＰＧＩＡ−０３−Ｂ２に存在するものと同一の別のアミノ酸置換、および抗体ＰＧＩＡ−０１−Ａ８と同一の別のアミノ酸置換を含有することも可能である。この方式で、例えばＩＧＦ−ＩＲに対する抗体の親和性、または該抗原からの該抗体の解離速度を改変するため、抗体結合の異なる特徴をうまく組み合わせることも可能である。別の態様において、アミノ酸置換は、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＬのいずれか１以上に見られるのと同じ位で行われるが、同じアミノ酸を用いるよりも、保存的アミノ酸置換が行われる。例えば、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の１つの生殖系列に比較したアミノ酸置換がグルタミン酸であるならば、アスパラギン酸を保存的に置換することも可能である。
【００９２】
同様に、アミノ酸置換がセリンであれば、スレオニンを保存的に置換することも可能である。別の好ましい態様において、軽鎖は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＬのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。別の非常に好ましい態様において、軽鎖は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の軽鎖のＣＤＲ領域と同じアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、軽鎖は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域由来のアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、軽鎖は、異なる軽鎖由来のＣＤＲ由来のアミノ酸配列を含む。より好ましい態様において、異なる軽鎖由来のＣＤＲは、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５から得られる。別の好ましい態様において、軽鎖は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるＶＬアミノ酸配列を含む。別の態様において、軽鎖は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８から選択される核酸配列、その断片、またはそれらから１〜１０のアミノ酸挿入、欠失または置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。別の態様において、抗体またはその部分はラムダ軽鎖を含む。
【００９３】
本発明はまた、ヒト重鎖またはヒト重鎖由来の配列を含む、ＩＧＦ−ＩＲ抗体またはその部分も提供する。１つの態様において、重鎖アミノ酸配列は、ヒトＶＨ  ＤＰ−１４、ＤＰ−４７、ＤＰ−５０、ＤＰ−７３、またはＤＰ−７７遺伝子ファミリー由来である。より好ましい態様において、重鎖は、生殖系列から８以下のアミノ酸変化、より好ましくは６以下のアミノ酸変化、そしてさらにより好ましくは３以下のアミノ酸変化を含む。
【００９４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列を提供する。本明細書の解説にしたがって、一般の当業者は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体重鎖および生殖系列重鎖がコードするアミノ酸配列を決定し、そして生殖系列配列および抗体配列間の相違を決定することも可能である。
【００９５】
好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＨは、生殖系列アミノ酸配列に比較して、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＨのいずれか１以上と同じアミノ酸置換を含有する。上で論じたのと同様、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＨは、抗体ＰＩＮＴ−８Ａ１に存在するものと同一の１以上のアミノ酸置換、抗体ＰＩＮＴ−９Ａ２に存在するものと同一の別のアミノ酸置換、および抗体ＰＩＮＴ−１１Ａ４と同一の別のアミノ酸置換を含有することも可能である。この方式で、例えばＩＧＦ−ＩＲに対する抗体の親和性、または該抗原からの該抗体の解離速度を改変するため、抗体結合の異なる特徴をうまく組み合わせることも可能である。別の態様において、アミノ酸置換は、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＨのいずれか１以上に見られるのと同じ位で行われるが、同じアミノ酸を用いるよりも、保存的アミノ酸置換が行われる。
【００９６】
別の好ましい態様において、重鎖は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＨのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。別の非常に好ましい態様において、重鎖は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の重鎖のＣＤＲ領域と同じアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５Ａ１の重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域由来のアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖は、異なる重鎖由来のＣＤＲ由来のアミノ酸を含む。より好ましい態様において、異なる重鎖由来のＣＤＲは、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５から得られる。別の好ましい態様において、重鎖は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるＶＨアミノ酸配列を含む。別の態様において、重鎖は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８から選択される核酸配列、その断片、またはそれらから１〜１０のアミノ酸挿入、欠失または置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされるＶＨアミノ酸配列を含む。別の態様において、置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００９７】
表２は、ｓｃＦｖ  ＰＧＩＡ−０１−Ａ１〜ＰＧＩＡ−０５−Ａ１をコードする核酸配列を示す。
表２
【００９８】
【表２−１】
2007528201.tif 000006
【００９９】
【表２−２】
2007528201.tif 000007
【０１００】
【表２−３】
2007528201.tif 000008
【０１０１】
【表２−４】
2007528201.tif 000009
【０１０２】
【表２−５】
2007528201.tif 000010
【０１０３】
【表２−６】
2007528201.tif 000011
【０１０４】
【表２−７】
2007528201.tif 000012
【０１０５】
【表２−８】
2007528201.tif 000013
【０１０６】
ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合の阻害
別の態様において、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉの結合および／またはＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩＩの結合を阻害する、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲはヒトのものである。別の好ましい態様において、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ヒト抗体である。別の態様において、該抗体またはその部分は、１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ間の結合を阻害する。好ましい態様において、ＩＣ５０は１０ｎＭ以下である。より好ましい態様において、ＩＣ５０は１ｎＭ以下である。ＩＣ５０は、当該技術分野に知られる方法いずれによっても測定可能である。典型的には、ＩＣ５０は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または細胞に基づくアッセイによって測定可能であり、この場合、抗体は、放射標識ＩＧＦの結合を阻害する能力に関して評価される。好ましい態様において、ＩＣ５０は細胞に基づくリガンド競合結合アッセイによって測定される。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの存在下で、ＩＧＦ−ＩＲの活性化を防止する、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。好ましい態様において、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、受容体に占有された際にＩＧＦ−ＩＲが誘導する、ベータＩＧＦ−１Ｒサブユニットの細胞質ドメイン内のチロシンリン酸化を阻害する。より好ましい態様において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの細胞外結合に反応してＩＧＦ−１Ｒが誘導する、ＩＧＦ−１Ｒベータ・サブユニットのキナーゼドメイン内のチロシン１１３１、１１３５、および１１３６で生じるチロシンリン酸化を阻害する。別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、下流細胞事象が生じることを阻害する。例えば、抗ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−Ｉで細胞を処理した際にいずれも通常リン酸化される、Ｓｈｃおよびインスリン受容体基質（ＩＲＳ）１および２、Ａｋｔ１またはＡｋｔ２、Ｅｒｋ１／２のチロシンリン酸化を阻害可能である（Ｋｉｍら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：４５４３−４５５０，  １９９８）。ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、またはＦＡＣＳによって、ＩＧＦ−ＩＲベータ・サブユニット上のチロシンリン酸化レベルを測定することによって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体が、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの存在下で、ＩＧＦ−ＩＲの活性化を防止しうるかどうかを決定することも可能である。
【０１０８】
本発明の別の側面において、該抗体は、該抗体で処理した細胞からのＩＧＦ−ＩＲの下方制御を引き起こす。１つの態様において、ＩＧＦ−ＩＲは、細胞のエンドソーム経路に吸収され、そして異化される。ＩＧＦ−ＩＲ抗体がＩＧＦ−ＩＲに結合した後、ＩＧＦ−ＩＲに結合した抗体は吸収される。免疫沈降、共焦点顕微鏡、またはウェスタンブロットを含む、当該技術分野に知られる方法いずれかによって、ＩＧＦ−ＩＲの下方制御を測定することも可能である。好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択されるか、あるいはその重鎖、軽鎖または抗原結合領域を含む。
【０１０９】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体結合によるＩＧＦ−ＩＲの活性化
本発明の別の側面は、活性化ＩＧＦ−ＩＲ抗体を伴う。活性化抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの影響を増幅するかまたはその代わりになるため、阻害抗体とは異なる。１つの態様において、活性化抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに結合可能であり、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの非存在下で、ＩＧＦ−ＩＲを活性化させる。この種の活性化抗体は、本質的に、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの部分的模倣体または完全模倣体である。別の態様において、活性化抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの影響を増幅する。
【０１１０】
この種の抗体は、それ自体ではＩＧＦ−ＩＲを活性化せず、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの存在下で、ＩＧＦ−ＩＲの活性化を増加させる。低レベルのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの存在下または非存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞を抗体で処理することによって、模倣抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を増幅ＩＧＦ−ＩＲ抗体から容易に区別可能である。抗体がＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの非存在下でＩＧＦ−ＩＲ活性化を引き起こすことが可能である場合、例えば、ＩＧＦ−ＩＲチロシンリン酸化を増加させる場合、抗体は模倣抗体である。抗体が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの非存在下でＩＧＦ−ＩＲ活性化を引き起こすことが不可能であるが、ＩＧＦ−ＩＲ活性化の量を増幅させることが可能である場合、抗体は増幅抗体である。
【０１１１】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体による、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＧＦ−ＩＲチロシンリン酸化、ＩＧＦ−ＩＲレベル、および腫瘍細胞増殖の阻害
本発明の別の態様は、ＩＧＦ−ＩＲチロシンリン酸化および受容体レベルをｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。１つの態様において、動物にＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与すると、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍において、ＩＧＦ−ＩＲホスホチロシンシグナルの減少が引き起こされる。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、少なくとも２０％、ホスホチロシンシグナル減少を引き起こす。より好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、少なくとも５０％、より好ましくは６０％、ホスホチロシンシグナル減少を引き起こす。さらにより好ましい態様において、抗体は、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、ホスホチロシンシグナル減少を引き起こす。好ましい態様において、チロシンリン酸化レベルを測定するおよそ２４時間前に、抗体を投与する。
【０１１２】
後に記載するものなど、当該技術分野に知られる方法いずれによって、チロシンリン酸化レベルを測定することも可能である。例えば実施例５、並びに図４および図６を参照されたい。好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択されるか、あるいはその重鎖、軽鎖または抗原結合領域を含む。
【０１１３】
別の態様において、動物にＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与すると、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍において、ＩＧＦ−ＩＲレベル減少が引き起こされる。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、未処置動物に比較して、少なくとも２０％、受容体レベル減少を引き起こす。より好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、未処置動物の受容体レベルの少なくとも５０％、より好ましくは６０％、受容体レベル減少を引き起こす。さらにより好ましい態様において、抗体は、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、受容体レベル減少を引き起こす。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲレベルを測定するおよそ２４時間前に、抗体を投与する。後に記載するものなど、当該技術分野に知られる方法いずれによって、ＩＧＦ−ＩＲレベルを測定することも可能である。好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択されるか、あるいはその重鎖、軽鎖または抗原結合領域を含む。
【０１１４】
別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞増殖を阻害する。腫瘍細胞は、限定なしに、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血病細胞、肉腫細胞、多発性骨髄腫細胞、または中胚葉細胞を含むいかなる細胞種由来であることも可能である。異種移植片腫瘍研究に使用する、一般的な腫瘍細胞株の例には、Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞、ＤＵ−１４５（前立腺）細胞、ＭＣＦ−７（乳房）細胞、Ｃｏｌｏ２０５（結腸）細胞、３Ｔ３／ＩＧＦ−ＩＲ（マウス線維芽細胞）細胞、ＮＣＩ  Ｈ４４１細胞、ＨＥＰ  Ｇ２（肝細胞腫）細胞、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１（乳房）細胞、ＨＴ−２９（結腸）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ（乳房）細胞、Ｕ２６６細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞、ＲＰＭＩ８２２６細胞、およびＡ４３１細胞が含まれる。好ましい態様において、抗体は、未処置動物における腫瘍の増殖に比較して、腫瘍細胞増殖を阻害する。より好ましい態様において、抗体は、腫瘍細胞増殖を５０％阻害する。さらにより好ましい態様において、抗体は、腫瘍細胞増殖を６０％、６５％、７０％、または７５％阻害する。１つの態様において、動物を抗体で処置し始めて、少なくとも７日後に、腫瘍細胞増殖の阻害を測定する。より好ましい態様において、動物を抗体で処置し始めて、少なくとも１４日後に、腫瘍細胞増殖の阻害を測定する。別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体とともに、別の抗新生物剤を動物に投与する。好ましい態様において、抗新生物剤は、腫瘍細胞増殖をさらに阻害することが可能である。さらにより好ましい態様において、抗新生物剤は、アドリアマイシン、タキソール、タモキシフェン、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵ）またはＣＰ−３５８，７７４である。好ましい態様において、抗新生物剤およびＩＧＦ−ＩＲ抗体の同時投与は、２２〜２４日の期間の後、少なくとも５０％、より好ましくは６０％、６５％、７０％または７５％、より好ましくは８０％、８５％または９０％、腫瘍細胞増殖を阻害する。
【０１１５】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体によるアポトーシスの誘導
本発明の別の側面は、細胞死を誘導するＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。１つの態様において、抗体はアポトーシスを引き起こす。該抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかでアポトーシスを誘導可能である。一般的に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与すると、正常細胞のアポトーシスより優先的に腫瘍細胞のアポトーシスが引き起こされるように、腫瘍細胞は、正常細胞よりアポトーシスにより感受性である。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与すると、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼ経路に関与する、セリン−スレオニンキナーゼＡｋｔの活性化が達成される。
【０１１６】
次いで、ＰＩキナーゼ経路が細胞増殖およびアポトーシス防止に関与する。したがってＡｋｔの阻害はアポトーシスを引き起こしうる。より好ましい態様において、該抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、ＩＧＦ−Ｉ発現細胞およびＩＧＦ−ＩＩ発現細胞のアポトーシスを引き起こす。好ましい態様において、該抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択されるか、あるいはその重鎖、軽鎖または抗原結合領域を含む。
【０１１７】
抗体および抗体産生細胞株を産生する方法
免疫
本発明の１つの態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のある程度またはすべてを含む非ヒト動物を、ＩＧＦ−ＩＲ抗原で免疫することによって産生される。好ましい態様において、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭであり、これは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の巨大断片を含み、そしてマウス抗体産生が不全である、操作されたマウス系統である。例えば、Ｇｒｅｅｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）、並びに米国特許第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第５，９８５，６１５号、第５，９９８，２０９号、第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、第６，１１４，５９８号および第６，１３０，３６４号を参照されたい。また、ＷＯ  ９１／１０７４１、１９９１年７月２５日公表、ＷＯ  ９４／０２６０２、１９９４年２月３日公表、ＷＯ  ９６／３４０９６およびＷＯ  ９６／３３７３５、どちらも１９９６年１０月３１日公表、ＷＯ  ９８／１６６５４、１９９８年４月２３日公表、ＷＯ  ９８／２４８９３、１９９８年６月１１日公表、ＷＯ  ９８／５０４３３、１９９８年１１月１２日公表、ＷＯ  ９９／４５０３１、１９９９年９月１０日公表、ＷＯ  ９９／５３０４９、１９９９年１０月２１日公表、ＷＯ  ００／０９５６０、２０００年２月２４日公表およびＷＯ  ００／０３７５０４、２０００年６月２９日公表も参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭは、全ヒト抗体の成人様ヒト・レパートリーを産生し、そして抗原特異的ヒトＭａｂを生成する。第二世代ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭは、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の、メガベースサイズの生殖系列配置ＹＡＣ断片を導入することを通じて、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含有する。その開示が本明細書に援用される、Ｍｅｎｄｅｚら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。
【０１１８】
本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を免疫することによって、非ヒト非マウス動物からＩＧＦ−ＩＲ抗体を作成する方法もまた提供する。すぐ上に記載する方法を用いて、こうした動物を産生することも可能である。米国特許５，９９４，６１９に記載されるように、これらの特許に開示される方法を修飾することも可能である。好ましい態様において、非ヒト動物は、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマであることも可能である。別の態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリンの「ミニ遺伝子座」を有する動物である。ミニ遺伝子座アプローチにおいて、Ｉｇ遺伝子座由来の個々の遺伝子を含むことを通じて、外因性Ｉｇ遺伝子座を模倣する。したがって、動物に挿入するため、１以上のＶＨ遺伝子、１以上のＤＨ遺伝子、１以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および第二の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）を構築物中に形成する。このアプローチは、とりわけ、本明細書に援用される、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，５９１，６６９号、第５，６１２，２０５号、５，７２１，３６７号、第５，７８９，２１５号、および第５，６４３，７６３号に記載される。
【０１１９】
ミニ遺伝子座アプローチの利点は、迅速に、Ｉｇ遺伝子座の部分を含む構築物を生成し、そして動物に導入可能である点である。しかし、ミニ遺伝子座アプローチの潜在的に不都合な点は、完全なＢ細胞発展を支持するのに十分な免疫グロブリン多様性がなく、抗体産生がより低い可能性もあることである。
【０１２０】
ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体を産生するため、いくつかまたはすべてのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物をＩＧＦ−ＩＲ抗原で免疫して、そして抗体または抗体産生細胞を動物から単離する。ＩＧＦ−ＩＲ抗原は、単離および／または精製されたＩＧＦ−ＩＲであることも可能であり、そして好ましくはヒトＩＧＦ−ＩＲである。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗原は、ＩＧＦ−ＩＲの断片、好ましくはＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメインである。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗原は、ＩＧＦ−ＩＲの少なくとも１つのエピトープを含む断片である。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗原は、細胞表面上にＩＧＦ−ＩＲを発現する細胞、好ましくは細胞表面上にＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する細胞である。
【０１２１】
当該技術分野に知られる方法いずれかによって、動物の免疫を行うことも可能である。例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ニューヨーク；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマなどの非ヒト動物を免疫する方法は、当該技術分野に周知である。例えばＨａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、上記、および米国特許５，９９４，６１９を参照されたい。好ましい態様において、アジュバントとともにＩＧＦ−ＩＲ抗原を投与して、免疫応答を刺激する。
【０１２２】
こうしたアジュバントには、完全または不完全フロイントのアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が含まれる。こうしたアジュバントは、局所沈着中に隔離することによって、ポリペプチドが迅速に分散するのを防止することも可能であるし、または宿主を刺激して、マクロファージおよび免疫系の他の構成要素の走化性因子を分泌させる物質を含有することも可能である。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合、免疫スケジュールは、数週間に渡って展開される、ポリペプチドの２以上の投与を伴うであろう。
【０１２３】
抗体および抗体産生細胞株の産生
ＩＧＦ−ＩＲ抗原で動物を免疫した後、該動物から、抗体および／または抗体産生細胞を得ることも可能である。動物から出血させるかまたは動物を屠殺することによって、該動物からＩＧＦ−ＩＲ抗体含有血清を得る。血清は、動物から得たままで用いることも可能であるし、血清から免疫グロブリン分画を得ることも可能であるし、また血清からＩＧＦ−ＩＲ抗体を精製することも可能である。この方式で得た血清または免疫グロブリンはポリクローナルであり、ポリクローナル抗体は、得られうる抗体の量が限定され、そして異質な多数の特性を有するため、不都合である。別の態様において、免疫動物から、抗体産生不死化ハイブリドーマを調製することも可能である。免疫後、動物を屠殺し、そして当該技術分野に周知であるように、脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。好ましい態様において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。融合させ、そして抗生物質選択した後、ＩＧＦ−ＩＲ、その部分、またはＩＧＦ−ＩＲ発現細胞を用いてハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい態様において、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて、最初のスクリーニングを行う。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、本明細書に援用されるＷＯ  ００／３７５０４に提供される。
【０１２４】
別の態様において、自己免疫障害を有し、そしてＩＧＦ−ＩＲ抗体を発現するヒトから抗体産生細胞を調製することも可能である。白血球細胞を単離し、そして該細胞を蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）に供することによって、またはＩＧＦ−ＩＲもしくはその部分でコーティングしたプレート上でパニングすることによって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を発現する細胞を単離することも可能である。これらの細胞をヒト非分泌骨髄腫と融合させ、ヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体を発現するヒトハイブリドーマを産生することも可能である。一般的に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体がＩＧＦ−ＩＲに対して低い親和性を有する可能性があるため、これはより好ましくない態様である。
【０１２５】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、そして以下にさらに論じるような、確固としたハイブリドーマ増殖、抗体高産生、および望ましい抗体特性を含む、望ましい特性に関して、さらにスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで同系動物において、免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスにおいて、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞培養において、拡大することも可能である。
【０１２６】
ハイブリドーマを選択し、クローニングし、そして拡大する方法は、一般の当業者に周知である。
好ましくは、免疫動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、そして該非ヒト動物と同じ種由来の骨髄腫に、脾臓Ｂ細胞を融合させる。より好ましくは、免疫動物はＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭであり、そして骨髄腫細胞株は、骨髄腫細胞株ＮＳＯ−ｂｃｌ−２などの非分泌マウス骨髄腫である。
【０１２７】
１つの側面において、本発明はヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい態様において、ハイブリドーマは、上述のようなマウスハイブリドーマである。別の好ましい態様において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマなどの非ヒト非マウス種で産生される。別の態様において、ハイブリドーマはヒトハイブリドーマであり、この場合、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を発現するヒト細胞とヒト非分泌骨髄腫を融合させる。
【０１２８】
抗体を作成する核酸、ベクター、宿主細胞、および組換え法
核酸
本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体をコードする核酸分子を提供する。１つの態様において、核酸分子は、ＩＧＦ−ＩＲ免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖をコードする。好ましい態様において、単一の核酸分子がＩＧＦ−ＩＲ免疫グロブリンの重鎖をコードし、そして別の核酸分子が、ＩＧＦ−ＩＲ免疫グロブリンの軽鎖をコードする。さらに好ましい態様において、コードされる免疫グロブリンはヒト免疫グロブリン、好ましくはヒトＩｇＧである。コードされる軽鎖は、λ鎖またはκ鎖、好ましくはλ鎖である。
【０１２９】
軽鎖の可変領域をコードする核酸分子は、Ａ３０、Ａ２７またはＯ１２  Ｖκ遺伝子由来であることも可能である。別の好ましい態様において、軽鎖をコードする核酸分子は、Ｊκ１、Ｊκ２、またはＪκ４由来の連結領域を含む。さらにより好ましい態様において、軽鎖をコードする核酸分子は、生殖系列から１０以下のアミノ酸変化、好ましくは６以下のアミノ酸変化、そしてさらにより好ましくは３以下のアミノ酸変化を含有する。
【０１３０】
本発明は、生殖系列配列に比較して、少なくとも３アミノ酸変化を含有する軽鎖（ＶＬ）の可変領域をコードする核酸分子であって、該アミノ酸変化が、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５の１つのＶＬ由来の、生殖系列からのアミノ酸変化と同一である、前記核酸分子を提供する。本発明はまた、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子も提供する。本発明はまた、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の軽鎖のいずれか１つの１以上のＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子も提供する。好ましい態様において、核酸分子は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の軽鎖のいずれか１つのすべてのＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の１つのＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、あるいは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、もしくは配列番号３８、またはその断片の１つの核酸配列を含む。
【０１３１】
別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つの１以上のＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、または配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８のいずれか１つの１以上のＣＤＲの核酸配列を含む。より好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つのすべてのＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、あるいは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８のいずれか１つのすべてのＣＤＲの核酸配列を含む。本発明はまた、上述のＶＬ、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９の１つのアミノ酸配列を含むＶＬに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬのアミノ酸配列をコードする核酸分子も提供する。本発明はまた、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８、またはその断片の１つの核酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列も提供する。別の態様において、本発明は、非常にストリンジェントな条件下で、上述のようなＶＬをコードする核酸分子、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、ＶＬをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８の１つの核酸配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、ＶＬをコードする核酸配列、あるいは遺伝暗号の縮重を除いてハイブリダイズする核酸配列も提供する。
【０１３２】
本発明はまた、ＤＰ−１４、ＤＰ−４７、ＤＰ−５０、ＤＰ−７３、またはＤＰ−７７  ＶＨ遺伝子由来の重鎖（ＶＨ）可変領域をコードする核酸分子も提供する。別の態様において、ＶＨをコードする核酸分子は、ＪＨ６またはＪＨ５由来の連結領域を含む。別の好ましい態様において、Ｄセグメントは、３−３、６−１９、または４−１７由来である。さらにより好ましい態様において、ＶＨをコードする核酸分子は、生殖系列遺伝子から１０以下のアミノ酸変化、好ましくは６以下のアミノ酸変化、そしてさらにより好ましくは３以下のアミノ酸変化を含有する。非常に好ましい態様において、ＶＨをコードする核酸分子は、生殖系列配列に比較して、少なくとも１アミノ酸変化を含有し、該アミノ酸変化は、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の１つの重鎖由来の、生殖系列配列からのアミノ酸変化と同一である。さらにより好ましい態様において、ＶＨは、生殖系列配列に比較して、少なくとも３アミノ酸変化を含有し、該アミノ酸変化は、抗体ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の１つのＶＨ由来の、生殖系列配列からのアミノ酸変化と同一である。
【０１３３】
１つの態様において、核酸分子は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５のＶＨのアミノ酸配列、またはこれらのいずれか１つの断片をコードする核酸配列を含む。好ましい態様において、核酸分子は、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４のアミノ酸配列、またはそのいずれか１つの断片をコードする核酸配列を含む。好ましい態様において、核酸分子は、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、およびＰＩＮＴ−１１Ａ４のアミノ酸配列、またはそのいずれか１つの断片をコードする核酸配列を含む。表２は、ｓｃＦｖ  ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５の核酸配列を示す。
【０１３４】
別の態様において、核酸分子は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の重鎖の１以上のＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましい態様において、核酸分子は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、またはＰＩＮＴ−１２Ａ５の重鎖のＣＤＲのすべてのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９の１つのＶＨアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、あるいは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８の１つの核酸配列を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つの１以上のＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、あるいは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８のいずれか１つの１以上のＣＤＲの核酸配列を含む。好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれか１つのすべてのＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、あるいは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８のいずれか１つのすべてのＣＤＲの核酸配列を含む。
【０１３５】
別の態様において、核酸分子は、すぐ上に記載するようなＶＨ、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の１つのアミノ酸配列を含むＶＨに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＶＨのアミノ酸配列をコードする。本発明はまた、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８の１つの核酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列も提供する。別の態様において、ＶＨをコードする核酸分子は、非常にストリンジェントな条件下で、上述のようなＶＨ、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の１つのアミノ酸配列を含むＶＨをコードする核酸配列にハイブリダイズするものである。本発明はまた、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８の１つの核酸配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、ＶＨをコードする核酸配列、あるいは遺伝暗号の縮重を除いてハイブリダイズする核酸配列も提供する。
【０１３６】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体を産生するいかなる供給源から、ＩＧＦ−ＩＲ抗体またはその可変領域の全重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方をコードする核酸分子を得ることも可能である。抗体をコードするｍＲＮＡを単離する方法は、当該技術分野に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。ｍＲＮＡを用いて、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはｃＤＮＡクローニングに用いるｃＤＮＡを産生することも可能である。本発明の１つの態様において、上述のように、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を発現するハイブリドーマから、好ましくは、融合パートナーの一方として、例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ、非ヒトマウストランスジェニック動物、または非ヒト非マウストランスジェニック動物などの、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物細胞を有するハイブリドーマから、核酸分子を得ることも可能である。別の態様において、ハイブリドーマは、非ヒト非トランスジェニック動物由来であり、例えばヒト化抗体用に使用可能なものである。
【０１３７】
重鎖の可変ドメインまたはその抗原結合ドメインと、重鎖の定常ドメインをコードする核酸分子を融合させることによって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の全重鎖をコードする核酸分子を構築することも可能である。同様に、軽鎖の可変ドメインまたはその抗原結合ドメインと、軽鎖の定常ドメインをコードする核酸分子を融合させることによって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖をコードする核酸分子を構築することも可能である。ＶＨセグメントが、ベクター内の重鎖定常領域（ＣＨ）セグメント（単数または複数）に機能可能であるように連結され、そしてＶＬセグメントが、ベクター内の軽鎖定常領域（ＣＬ）セグメントに機能可能であるように連結されるように、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする核酸分子を、それぞれ、すでに重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードしている発現ベクター内に挿入することによって、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする核酸分子を全長抗体遺伝子に変換することも可能である。
【０１３８】
あるいは、連結によって、例えば標準的分子生物学的技術を用いて、ＣＨ鎖をコードする核酸分子に、ＶＨ鎖をコードする核酸分子を連結することによって、ＶＨ鎖またはＶＬ鎖をコードする核酸分子を全長抗体遺伝子に変換する。ＶＬ鎖およびＣＬ鎖をコードする核酸分子を用いて、同じことが達成可能である。ヒト重鎖および軽鎖の定常領域遺伝子の配列は当該技術分野に知られる。例えば、Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．  第９１−３２４２号，  １９９１を参照されたい。次いで、全長重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を導入しておいた細胞から、これら核酸を発現させ、そしてＩＧＦ−ＩＲ抗体を単離することも可能である。
【０１３９】
好ましい態様において、重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列をコードし、そして軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列をコードする。
【０１４０】
別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の重鎖またはその抗原結合ドメイン、あるいはＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖またはその抗原結合ドメインのいずれかをコードする核酸分子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し、そしてＩＧＦ−ＩＲ抗原で免疫しておいた非ヒト非マウス動物から、単離可能である。他の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を産生する、非トランスジェニック動物由来のＩＧＦ−ＩＲ抗体産生細胞から、またはＩＧＦ−ＩＲ抗体を産生するヒト患者から、核酸分子を単離することも可能である。ＩＧＦ−ＩＲ抗体産生細胞からｍＲＮＡを単離する方法は、標準的技術によって単離し、ＰＣＲおよびライブラリー構築技術を用いてクローニングし、そして／または増幅し、そして標準的プロトコルを用いてスクリーニングして、ＩＧＦ−ＩＲ重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を得ることも可能である。
【０１４１】
核酸分子を用いて、以下に記載するように、多量のＩＧＦ−ＩＲ抗体を組換え的に発現することも可能である。核酸分子を用いて、以下にさらに記載するような、キメラ抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ディアボディ、突然変異抗体および抗体誘導体を産生することもまた可能でありうる。やはり以下に記載するように、核酸分子が、非ヒト非トランスジェニック動物由来であるならば、核酸分子を抗体ヒト化に用いることもまた可能である。
【０１４２】
別の態様において、本発明の核酸分子を、特異的抗体配列に対するプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いることも可能である。例えば、核酸分子プローブを診断法に用いることも可能であるし、または核酸分子ＰＣＲプライマーを用いて、ＤＮＡの領域を増幅することも可能であり、これはとりわけ、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の可変ドメインを産生する際に使用する核酸配列を単離するのに使用可能である。好ましい態様において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。より好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域由来である。さらにより好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、１以上のＣＤＲのすべてまたは一部をコードする。
【０１４３】
ベクター
本発明は、重鎖またはその抗原結合部分をコードする、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はまた、軽鎖またはその抗原結合部分をコードする、本発明の核酸分子を含むベクターも提供する。本発明はまた、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片、およびそのプローブをコードする核酸分子を含むベクターも提供する。
【０１４４】
本発明の抗体または抗体部分を発現させるため、上述のように得た部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、該遺伝子が、転写調節配列および翻訳調節配列に機能可能であるように連結されるように、発現ベクターに挿入する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が含まれる。ベクター内の転写調節配列および翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する、意図される機能を果たすように、抗体遺伝子をベクターに連結する。用いる発現宿主細胞と適合するように、発現ベクターおよび発現調節配列を選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別個のベクターに挿入することも可能である。好ましい態様において、両遺伝子を同一発現ベクターに挿入する。標準法（例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位がまったく存在しない場合は平滑端連結）によって、発現ベクターに抗体遺伝子を挿入する。好適なベクターは、上述のように、いかなるＶＨ配列またはＶＬ配列も容易に挿入し、そして発現させることが可能であるように、操作された適切な制限部位とともに、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。
【０１４５】
こうしたベクターにおいて、スプライシングは、通常、挿入されたＪ領域のスプライス・ドナー部位、およびヒトＣ領域に先行するスプライス・アクセプター部位間で起こり、そしてまた、ヒトＣＨエクソン内に存在するスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コードする１０領域の下流の天然染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることも可能である。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端に、インフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることも可能である。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であることも可能である。
【０１４６】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において、抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を所持する。当業者は、制御配列の選択を含めて、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの要因に応じる可能性もあることを認識するであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列には、哺乳動物細胞において、高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えばレトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サル・ウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、並びに天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強い哺乳動物プロモーターが含まれる。ウイルス制御要素のさらなる説明、およびその配列に関しては、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を所持することも可能である。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えばすべてＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞中、メトトレキセート選択／増幅とともに用いるため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【０１４７】
非ハイブリドーマ宿主細胞、およびタンパク質を組換え的に産生する方法
ＩＧＦ−ＩＲ抗体の重鎖若しくはその抗原結合部分および／または軽鎖若しくはその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に用いることも可能である。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するために知られるいかなる方法によることも可能である。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は、当該技術分野に周知であり、そしてデキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、およびポリヌクレオチド（単数または複数）のリポソーム中の被包、微粒子銃、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。さらに、ウイルスベクターによって、哺乳動物細胞に核酸分子を導入することも可能である。細胞を形質転換する方法は当該技術分野に周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（これらの特許は本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１４８】
発現宿主として入手可能な哺乳動物細胞株が当該技術分野に周知であり、そしてこれらにはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えばＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびハムスター細胞が含まれる。どの細胞株が高発現レベルを有するかを決定することによって、特に優先される細胞株を選択する。使用可能な他の細胞株は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞、および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分、軽鎖および／またはその抗原結合部分をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主に導入すると、宿主細胞における抗体発現、より好ましくは宿主細胞を増殖させる培地への抗体分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。抗体は、標準的タンパク質精製法を用いて、培地から回収可能である。
【０１４９】
さらに、いくつかの既知の技術を用いて、産生細胞株からの本発明の抗体（またはその部分）の発現を増進することも可能である。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増進させる、一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５号、および第０  ３２３  ９９７号、並びに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して、完全にまたは部分的に論じられる。
【０１５０】
異なる細胞株によって、またはトランスジェニック動物において、発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化を有する可能性がある。しかし、本明細書に提供する核酸分子にコードされるか、または本明細書に提供するアミノ酸配列を含む抗体はすべて、抗体のグリコシル化に関わりなく、本発明の一部である。
【０１５１】
トランスジェニック動物
本発明はまた、本発明の抗体を産生するのに使用可能な、本発明の核酸分子を１以上含む、トランスジェニック非ヒト動物も提供する。抗体を、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたは他の哺乳動物のミルク、血液または尿などの組織または体液中で産生し、そしてそこから回収することも可能である。例えば米国特許第５，８２７，６９０号、第５，７５６，６８７号、第５，７５０，１７２号、および第５，７４１，９５７号を参照されたい。上述のように、ＩＧＦ−ＩＲまたはその部分で免疫することによって、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を産生することも可能である。
【０１５２】
別の態様において、標準的トランスジェニック技術により、動物に本発明の核酸分子を１以上導入することによって、非ヒトトランスジェニック動物を産生する。Ｈｏｇａｎ、ｓｉｅｒｒａを参照されたい。トランスジェニック動物を作成するのに用いるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞または体細胞であることも可能である。トランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラヘテロ接合体、および非キメラホモ接合体であることも可能である。例えば、Ｈｏｇａｎら，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎら，  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）；およびＰｉｎｋｅｒｔ，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。別の態様において、トランスジェニック非ヒト生物は、目的の重鎖および／または軽鎖をコードする、ターゲティングされた破壊および置換を有することも可能である。好ましい態様において、トランスジェニック動物は、ＩＧＦ−ＩＲ、好ましくはヒトＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸を含み、そして発現する。別の態様において、トランスジェニック動物は、一本鎖抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体などの修飾抗体をコードする核酸分子を含む。ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、いかなるトランスジェニック動物において作成されることも可能である。好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、血液、ミルク、尿、唾液、涙、粘液、および他の体液中に、前記のコードされるポリペプチドを発現する。
【０１５３】
ファージディスプレイライブラリー
本発明は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体またはその抗原結合部分を産生する方法であって、ファージ上のヒト抗体ライブラリーを合成し、ＩＧＦ−ＩＲまたはその部分でライブラリーをスクリーニングし、ＩＧＦ−ＩＲに結合するファージを単離し、そしてファージから抗体を得る工程を含む、前記方法を提供する。抗体ライブラリーを調製する１つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト宿主動物を、ＩＧＦ−ＩＲまたはその抗原性部分で免疫して免疫応答を生成し、抗体産生に関与する細胞を宿主動物から抽出し；抽出した細胞からＲＮＡを単離し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生し、プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、そして抗体がファージ上で発現されるように、ファージディスプレイベクター内にｃＤＮＡを挿入する工程を含む。本発明の組換えＩＧＦ−ＩＲ抗体をこの方法で得ることも可能である。
【０１５４】
ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製したヒトＶＬ  ｃＤＮＡおよびＶＨ  ｃＤＮＡを用いて調製した、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって、本明細書に開示するＩＧＦ−ＩＲ抗体に加えて、本発明の組換えＩＧＦ−ＩＲヒト抗体を単離することも可能である。こうしたライブラリーを調製し、そしてスクリーニングする方法論は、当該技術分野に知られる。ファージディスプレイライブラリーを生成するための商業的に入手可能なキットがある（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするのに使用可能な他の方法および試薬もある（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら  ＰＣＴ公報第ＷＯ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２を参照されたい）。
【０１５５】
好ましい態様において、望ましい特性を持つヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体を単離するため、本明細書に記載するようなヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体をまず用い、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９３／０６２１３号に記載されるエピトープ・インプリンティング法を用いて、ＩＧＦ−ＩＲに対して、類似の結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択する。この方法で用いる抗体ライブラリーは、好ましくは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９２／０１０４７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓら，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（１９９３）に記載するように調製され、そしてスクリーニングされる、ｓｃＦｖライブラリーである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、好ましくは、抗原としてヒトＩＧＦ−ＩＲを用いてスクリーニングされる。
【０１５６】
最初のヒトＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを選択したら、「組み合わせ」実験を行って、最初に選択したＶＬセグメントおよびＶＨセグメントの異なる対を、ＩＧＦ−ＩＲ結合に関してスクリーニングして、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択する。さらに、抗体の品質をさらに改善するため、天然免疫応答中の抗体のアフィニティー成熟に関与するｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異プロセスに類似のプロセスで、好ましいＶＬ／ＶＨ対（単数または複数）のＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内で、ランダムに突然変異させることも可能である。それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ３またはＶＬ  ＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーであって、生じるＰＣＲ産物が、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域にランダム突然変異が導入されているＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするように、特定の位で、４つのヌクレオチド塩基のランダム混合物が「混入されている（ｓｐｉｋｅｄ）」、前記ＰＣＲプライマーを用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域を増幅することによって、このｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティー成熟を達成することも可能である。これらのランダム突然変異ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントを、ＩＧＦ−ＩＲへの結合に関して、再スクリーニングすることも可能である。
【０１５７】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーから、本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体をスクリーニングし、そして単離した後、選択した抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージから（例えばファージゲノムから）回収し、そして標準的組換えＤＮＡ技術によって、他の発現ベクターにサブクローニングすることも可能である。望ましい場合、核酸をさらに操作して、以下に記載するような、本発明の他の抗体型を生成することも可能である。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現するため、抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクターにクローニングし、そして上述のように、哺乳動物宿主細胞に導入する。
【０１５８】
クラス・スイッチング
本発明の別の側面は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のクラスを別のものにスイッチングしうる機構を提供することである。本発明の１つの側面において、ＣＬまたはＣＨをコードするいかなる核酸配列も含まないように、当該技術分野に周知の方法を用いて、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子を単離する。次いで、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子を、異なるクラスの免疫グロブリン分子由来のＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列に、機能可能であるように連結する。これは、上述のように、ＣＬ鎖またはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて、達成可能である。例えば、元来ＩｇＭであったＩＧＦ−ＩＲ抗体を、ＩｇＧにクラス・スイッチングすることも可能である。さらに、クラス・スイッチングを用いて、１つのＩｇＧサブクラスを別のものに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換することも可能である。望ましいアイソタイプを含む本発明の抗体を産生するのに好ましい方法は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の重鎖をコードする核酸およびＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖をコードする核酸を単離し、重鎖の可変領域を得て、重鎖の可変領域を、望ましいアイソタイプの重鎖の定常ドメインと連結し、細胞において軽鎖および連結した重鎖を発現させて、そして望ましいアイソタイプのＩＧＦ−ＩＲ抗体を収集する工程を含む。
【０１５９】
抗体誘導体
上記の核酸分子を使用し、一般の当業者に知られる技術および方法を用いて、抗体誘導体を生成することも可能である。
【０１６０】
ヒト化抗体
ヒト抗体生成と関連させて、上で議論したように、免疫原性が減少した抗体を産生することには、利点がある。免疫原性減少は、適切なライブラリーを用いたヒト化技術およびディスプレイ技術を用いて、ある程度、達成可能である。当該技術分野に周知の技術を用いて、ネズミ（ｍａｒｉｎｅ）抗体または他の種由来の抗体をヒト化するかまたは霊長類化することも可能であることが認識されるであろう。例えばＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３−４６（１９９３）およびＷｒｉｇｈｔら  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２１２５−１６８（１９９２）を参照されたい。組換えＤＮＡ技術によって、目的の抗体を操作して、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換することも可能である（ＷＯ  ９２／０２１９０、並びに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照されたい）。好ましい態様において、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換する一方、重鎖、軽鎖または重鎖および軽鎖両方のＣＤＲをすべて維持することによって、ＩＧＦ−ＩＲ抗体をヒト化することも可能である。
【０１６１】
突然変異抗体
別の態様において、核酸分子、ベクター、および宿主細胞を用いて、突然変異ＩＧＦ−ＩＲ抗体を作成することも可能である。抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインを突然変異させて、抗体の結合特性を改変することも可能である。例えば、１以上のＣＤＲ領域で、突然変異を作成して、ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体のＫｄを増加させるかまたは減少させ、Ｋｏｆｆを増加させるかまたは減少させ、あるいは抗体の結合特異性を改変することも可能である。部位特異的突然変異誘発における技術が、当該技術分野に周知である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の可変領域において、生殖系列に比較して変化していることが知られるアミノ酸残基で、突然変異を作成する。より好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５の１つの可変領域またはＣＤＲ領域において、生殖系列に比較して変化していることが知られるアミノ酸残基で、１以上の突然変異を作成する。別の態様において、可変領域またはＣＤＲ領域において、生殖系列に比較して変化していることが知られるアミノ酸残基であって、そのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９に提示されるか、またはその核酸配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に提示される、前記アミノ酸残基で、１以上の突然変異を作成する。
【０１６２】
別の態様において、核酸分子は、フレームワーク領域の１以上で突然変異される。突然変異をフレームワーク領域または定常ドメインで作成して、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の半減期を増加させることも可能である。例えば、本明細書に援用される、ＷＯ  ００／０９５６０、２０００年２月２４日公表を参照されたい。１つの態様において、１、３、または５の点突然変異があることも可能であり、そして１０以下の突然変異があることも可能である。フレームワーク領域または定常ドメイン中で突然変異を作成して、抗体の免疫原性を改変するか、別の分子への共有結合または非共有結合の部位を提供するか、あるいは補体結合などの特性を改変することもまた、可能である。単一の突然変異抗体において、フレームワーク領域、定常ドメイン、および可変領域の各々で、突然変異を作成することも可能である。あるいは、単一の突然変異抗体において、フレームワーク領域、可変領域、または定常ドメインの１つのみで、突然変異を作成することも可能である。
【０１６３】
１つの態様において、突然変異前のＩＧＦ−ＩＲ抗体に比較して、突然変異したＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域いずれにも１０より多いアミノ酸変化はない。より好ましい態様において、突然変異ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域いずれにも５より多いアミノ酸変化はなく、より好ましくは３より多いアミノ酸変化はない。別の態様において、定常ドメインには、１５より多いアミノ酸変化はなく、より好ましくは１０より多いアミノ酸変化はなく、さらにより好ましくは５より多いアミノ酸変化はない。
【０１６４】
修飾抗体
別の態様において、別のポリペプチドに連結した、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のすべてまたは部分を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンを作成することも可能である。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の可変領域のみをポリペプチドに連結する。別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＨドメインを第一のポリペプチドに連結し、一方、ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＶＬドメインを第二のポリペプチドに連結し、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗体結合部位を形成可能である方式で、第二のポリペプチドが第一のポリペプチドと会合する。別の好ましい態様において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが互いに相互作用可能であるように、リンカーによって、ＶＨドメインが、ＶＬドメインと分離されている（以下の一本鎖抗体以降を参照されたい）。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体を目的のポリペプチドに連結する。融合抗体は、ポリペプチドをＩＧＦ−ＩＲ発現細胞または組織に向けるのに有用である。ポリペプチドは、毒素、増殖因子、または他の制御タンパク質などの療法剤であることも可能であるし、あるいは西洋ワサビ・ペルオキシダーゼなどの、容易に視覚化可能な酵素などの診断剤であることも可能である。さらに、２（以上）の一本鎖抗体が互いに連結されている、融合抗体を生成することも可能である。これは、一本鎖ポリペプチド上に二価抗体または多価抗体を生成しようと望む場合、または二重特異性抗体を生成しようと望む場合、有用である。
【０１６５】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を生成するため、ＶＬ領域およびＶＨ領域が柔軟なリンカーによって連結された連続一本鎖タンパク質として、ＶＨ配列およびＶＬ配列を発現可能であるように、柔軟なリンカーをコードする別の断片、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号３９）をコードする別の断片に、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、機能可能であるように連結する（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４を参照されたい）。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみを用いた場合、一価であることも可能であるし、２つのＶＨおよびＶＬを用いた場合、二価であることも可能であるし、または２より多いＶＨおよびＶＬを用いた場合、多価であることも可能である。
【０１６６】
別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲコード核酸分子を用いて、他の修飾抗体を調製することも可能である。例えば、本明細書の解説にしたがい、標準的分子生物学的技術を用いて、「カッパボディ（Ｋａｐｐａ  ｂｏｄｉｅｓ）」（Ｉｌｌら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０：９４９−５７（１９９７））、「ミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｍａｒｔｉｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０３  ９（１９９４））、「ディアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））、または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら  “Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ”  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ７：５１−５２（１９９２））を調製することもまた可能である。
【０１６７】
別の側面において、キメラ抗体および二重特異性抗体を生成することも可能である。異なる抗体由来のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むキメラ抗体を作成することも可能である。好ましい態様において、キメラ抗体のＣＤＲは、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖または重鎖の可変領域のＣＤＲすべてを含み、一方、フレームワーク領域は、１以上の異なる抗体由来である。より好ましい態様において、キメラ抗体のＣＤＲは、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲすべてを含む。フレームワーク領域は、別の種由来であることも可能であるし、そして好ましい態様において、ヒト化されていることも可能である。あるいは、フレームワーク領域は、別のヒト抗体由来であることも可能である。
【０１６８】
１つの結合ドメインを通じてＩＧＦ−ＩＲに、そして第二の結合ドメインを通じて第二の分子に、特異的に結合する、二重特異性抗体を生成することも可能である。二重特異性抗体を、組換え分子生物学技術を通じて産生することも可能であるし、または物理的にともにコンジュゲート化することも可能である。さらに、１より多いＶＨおよびＶＬを含有し、ＩＧＦ−ＩＲに、そして別の分子に、特異的に結合する、一本鎖抗体を産生することも可能である。例えば（ｉ）および（ｉｉ）例えばＦａｎｇｅｒら  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）、並びにＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ、上記とともに、そして（ｉｉｉ）例えばＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）とともに、周知の技術を用いて、こうした二重特異性抗体を生成することも可能である。好ましい態様において、二重特異性抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに、そして癌または腫瘍細胞上、高レベルで発現される別の分子に結合する。より好ましい態様において、他の分子は、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ｅｒｂＢ２受容体、ＶＥＧＦ−２もしくは３、ＣＤ２０、またはＥＧＦ−Ｒである。
【０１６９】
別の態様において、上述の修飾抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択される抗体の１つ由来の１以上の可変領域または１以上のＣＤＲ領域を用いて調製される。別の態様において、修飾抗体は、アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９に提示されるか、または核酸配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に提示される、１以上の可変領域または１以上のＣＤＲ領域を用いて調製される。
【０１７０】
誘導体化抗体および標識抗体
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化するか、または別の分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結することも可能である。一般的に、抗体またはその部分は、ＩＧＦ−ＩＲ結合が誘導体化または標識によって不都合に影響されないように、誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載するヒトＩＧＦ−ＩＲ抗体の損なわれていない型および修飾型両方を含むよう意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分を、別の抗体（例えば二重特異性抗体またはディアボディ）、検出剤、細胞傷害剤、薬剤、および／または別の分子と抗体または抗体部分の会合を仲介しうるタンパク質またはペプチド（例えばストレプトアビジン・コア領域またはポリヒスチジン・タグ）などの、１以上の他の分子実体に、機能的に連結する（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または別の方式によって）ことも可能である。
【０１７１】
誘導体化抗体の１種は、（例えば二重特異性抗体を生成するため、同種のまたは異なる種類の）２以上の抗体を架橋することによって、産生される。適切な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離された２つの別個の反応基を有する、ヘテロ二官能性であるもの（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性であるもの（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）が含まれる。こうしたリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォードから入手可能である。
【０１７２】
別種の誘導体化抗体は標識抗体である。本発明の抗体または抗体部分を誘導体化可能な有用な検出剤には、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド・リン光体等を含む、蛍光化合物が含まれる。抗体はまた、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等の、検出に有用な酵素で標識されることも可能である。抗体を検出可能酵素で標識する場合、酵素を用いて、識別可能な反応産物を産生することが可能なさらなる試薬を添加することによって、抗体が検出される。例えば、剤、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加すると、検出可能な茶色の反応産物が生じる。また、抗体をビオチンで標識し、そしてアビジンまたはストレプトアビジン結合を間接的に測定することを通じて、抗体を検出することも可能である。抗体をガドリニウムなどの磁気剤で標識することも可能である。また、第二のレポーターによって認識される、あらかじめ決定されたポリペプチド・エピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ・タグ）で抗体を標識することも可能である。いくつかの態様において、多様な長さのスペーサーアームによって標識を付着させて、潜在的な立体障害を減少させる。
【０１７３】
また、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を放射標識アミノ酸で標識することも可能である。診断目的および療法目的に、放射標識を用いることも可能である。例えば、放射標識を用いて、Ｘ線または他の診断技術によって、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍を検出することも可能である。さらに、癌性細胞または腫瘍に対する毒素として、放射標識を療法的に用いることも可能である。ポリペプチドの標識の例には、限定されるわけではないが、以下の放射性同位体または放射性核種――３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれる。
【０１７４】
ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基またはエチル基、あるいは炭水化物基などの化学基で誘導体化することもまた可能である。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するのに、例えば血清半減期を増加させるか、または組織結合を増加させるのに有用でありうる。
【０１７５】
薬剤組成物およびキット
本発明はまた、哺乳動物における過剰増殖障害を治療するための薬剤組成物であって、療法的に有効な量の本発明の化合物および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記薬剤組成物にも関する。１つの態様において、前記薬剤組成物は、脳、肺、扁平細胞、膀胱、胃、膵臓、乳房、頭部、首部、腎臓、卵巣、前立腺、結腸直腸、食道、婦人科または甲状腺の癌などの癌の治療用である。別の態様において、前記薬剤組成物は、限定なしに、血管形成術後の再狭窄および乾癬などの非癌性過剰増殖障害に関する。別の態様において、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲの活性化が必要な哺乳動物を治療するための薬剤組成物であって、療法的に有効な量の本発明の活性化抗体および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記薬剤組成物に関する。活性化抗体を含む薬剤組成物を用いて、十分なＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを欠く動物を治療することも可能であるし、あるいは骨粗しょう症、脆弱さ（ｆｒａｉｌｔｙ）、または哺乳動物が分泌する活性成長ホルモンがあまりにも少ないか、もしくは哺乳動物が成長ホルモンに反応不能である障害を治療することも可能である。本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体を、被験者に投与するのに適した薬剤組成物に取り込むことも可能である。典型的には、薬剤組成物は、本発明の抗体および薬学的に許容しうるキャリアーを含む。本明細書において、「薬学的に許容しうるキャリアー」には、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容しうるキャリアーの例には、１以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等とともに、これらの組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが含まれることが好ましいであろう。抗体または抗体部分の有効期間または有効性を増進する、湿潤剤などの薬学的に許容しうる物質、あるいは湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの少量の補助物質が含まれることも可能である。
【０１７６】
本発明の組成物は、多様な型であることも可能である。これらには、例えば、液体、半固体および固体投薬型、例えば液性溶液（例えば注射可能溶液および注入可能溶液）、分散物または懸濁物、錠剤、ピル、粉末、リポソームおよび座薬が含まれる。好ましい型は、意図される投与様式および療法適用に応じる。典型的な好ましい組成物は、他の抗体でのヒトの受動免疫に用いられるものと類似の組成などの、注射可能溶液または注入可能溶液の形である。好ましい投与様式は、非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好ましい態様において、静脈内注入または静脈内注射によって、抗体を投与する。別の好ましい態様において、筋内注射または皮下注射によって、抗体を投与する。
【０１７７】
療法組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で、無菌であり、そして安定でなければならない。溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、または高濃度の薬剤に適した他の秩序だった構造として、組成物を配合することも可能である。必要に応じて、上に列挙する成分の１つまたは組み合わせを含む、適切な溶媒中に、必要な量のＩＧＦ−ＩＲ抗体を取り込み、その後、ろ過滅菌することによって、無菌注射可能溶液を調製することも可能である。一般的に、基本的な分散媒体および上に列挙するうち必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、活性化合物を取り込むことによって、分散物を調製する。無菌注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、先に滅菌ろ過した溶液由来のさらなる望ましい成分いずれかを加えた、活性成分の粉末が生じる。例えばレシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって、溶液の適切な流動性を維持することも可能である。組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによって、注射可能組成物の吸収持続をもたらすことも可能である。
【０１７８】
当該技術分野に知られる多様な方法によって本発明の抗体を投与することも可能であるが、多くの療法適用には、好ましい投与経路／投与様式は、腹腔内、皮下、筋内、静脈内または注入である。当業者に理解されるであろうように、投与経路および／または投与様式は、望ましい結果に応じて多様であろう。１つの態様において、単回用量として本発明の抗体を投与することも可能であるし、または多数回用量として投与することも可能である。
【０１７９】
特定の態様において、迅速な放出に対して活性化合物を防御するであろうキャリアーを伴って、活性化合物を調製することも可能であり、例えば移植物、経皮パッチ、および微量被包搬送系を含む、徐放配合物がある。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ乳酸などの、生物分解性、生体適合性ポリマーが使用可能である。こうした配合物を調製するための多くの方法が特許されるか、または当業者に一般的に知られる。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ監修，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，  ニューヨーク，  １９７８を参照されたい。
【０１８０】
特定の態様において、本発明のＩＧＦ−ＩＲを、例えば不活性希釈剤または吸収可能食用キャリアーとともに、経口投与することも可能である。化合物（および望ましい場合、他の成分）を、硬または軟ゼラチンカプセル中に封入するか、錠剤中に圧縮するか、または被験者の食餌中に直接取り込むこともまた可能である。経口療法投与のため、摂取可能錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、ウェーファー等の形で、賦形剤とともに化合物を取り込んで、そして用いることも可能である。非経口投与以外で本発明の化合物を投与するには、その不活性化を防止する物質で化合物をコーティングするか、またはこうした物質と化合物を同時投与する必要がある可能性もある。
【０１８１】
補助的活性化合物もまた、組成物中に取り込むことも可能である。特定の態様において、本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体を、化学療法剤、抗新生物剤、または抗腫瘍剤などの、１以上のさらなる療法剤と同時配合し、そして／または同時投与する。例えば、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、１以上のさらなる療法剤と同時配合し、そして／または同時投与することも可能である。これらの剤には、限定なしに、他のターゲットに結合する抗体（例えば１以上の増殖因子またはサイトカイン、その細胞表面受容体、あるいはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体）、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合タンパク質、抗新生物剤、化学療法剤、抗腫瘍剤、ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＧＦ−ＩＲ活性化をブロッキングするペプチド類似体、可溶性ＩＧＦ−ＩＲ、および／または当該技術分野に知られる、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ産生または活性を阻害する１以上の化学剤、例えばオクトレオチドが含まれる。活性化抗体を含む薬剤組成物には、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、細胞増殖を増加させるかまたはアポトーシスを防止する因子と配合することも可能である。こうした因子には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩなどの増殖因子、および／またはＩＧＦ−ＩＲを活性化するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの類似体が含まれる。こうした併用療法は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体とともに同時投与剤が、より低い投薬量であることを必要とする可能性もあり、こうして多様な単剤療法に関連しうる毒性または合併症を回避する。１つの態様において、組成物は、抗体および１以上のさらなる療法剤を含む。
【０１８２】
本発明の薬剤組成物は、本発明の抗体または抗体部分の「療法的有効量」または「予防的有効量」を含むことも可能である。「療法的有効量」は、必要な調剤および投薬期間で、望ましい療法的結果を達成するのに有効な量を指す。抗体または抗体部分の療法的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、並びに抗体または抗体部分が、個体において望ましい反応を誘発する能力などの要因にしたがって多様である可能性もある。療法的有効量はまた、抗体または抗体部分のいかなる毒性の有害な効果よりも、療法的に有益な効果が上回るものである。「予防的有効量」は、必要な調剤および投薬期間で、望ましい予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、予防的用量は、疾患以前または疾患の初期段階にある被験者で用いられるため、予防的有効量は、療法的有効量より少ないであろう。
【０１８３】
投薬措置を調整して、最適な望ましい反応（例えば療法反応または予防反応）を提供することも可能である。例えば、単一の巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）を投与することも可能であるし、長期に渡って数回の分割用量を投与することも可能であるし、あるいは療法状況の要求によって指示されるのにつれて、用量を比例して減少させるかまたは増加させることも可能である。抗体を含むか、または抗体および１以上のさらなる療法剤を含む併用療法を含む、薬剤組成物を、単回用量または多数の用量用に配合することも可能である。調剤の投与および均一性を容易にするため、非経口組成物を、投薬単位型で配合することが特に好適である。本明細書において、投薬単位型は、治療しようとする哺乳動物被験者用の、単回投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な薬剤キャリアーと組み合わせて、望ましい療法効果を生じると計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位型の規格は、（ａ）活性化合物のユニークな特性および達成しようとする特定の療法効果または予防効果、および（ｂ）治療のためこうした活性化合物を製剤する業に固有の、個体における感受性の限界によって決定され、そしてこれらに直接依存する。特に有用な配合物は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０の緩衝液中、５ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−ＩＲ抗体である。
【０１８４】
本発明の抗体または抗体部分の療法的有効量または予防的有効量の典型的な限定されない範囲は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ、そしてさらにより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投薬値は、軽減しようとする状態の種類および重症度に応じて多様でありうることに注目すべきである。特定の被験者いずれに関しても、個体の必要性にしたがって、そして組成物を投与するかまたはその投与を監督する個人の専門的判断にしたがって、長期に渡って、特定の投薬措置を調整すべきであること、および本明細書に示す投薬範囲が例示のみであり、そして請求する組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことが、さらに理解されるものとする。１つの態様において、抗体またはその抗原結合部分の療法的有効量または予防的有効量を、１以上のさらなる療法剤とともに投与する。
【０１８５】
本発明の別の側面は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体およびこれらの抗体を含む薬剤組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または薬剤組成物に加えて、診断剤または療法剤を含むことも可能である。キットはまた、診断法または療法で使用するための使用説明書も含むことも可能である。好ましい態様において、キットは、以下に記載する方法で使用可能な抗体またはその薬剤組成物および診断剤を含む。別の好ましい態様において、キットは、以下に記載する方法で使用可能な、抗体またはその薬剤組成物、およびさらなる抗新生物剤、抗腫瘍剤、または化学療法剤などの、１以上の療法剤を含む。
【０１８６】
本発明はまた、哺乳動物において、異常な細胞増殖を阻害する薬剤組成物であって、ある量の化学療法剤と組み合わせて、ある量の本発明の化合物を含み、その量の該化合物、塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および化学療法剤が、一緒になって、異常な細胞増殖を阻害するのに有効である、前記薬剤組成物にも関する。多くの化学療法剤が、現在、当該技術分野に知られる。１つの態様において、化学療法剤は、分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、介入性抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的反応修飾剤、抗ホルモン剤、例えば抗アンドロゲン剤、および抗血管形成剤からなる群より選択される。
【０１８７】
ＭＭＰ−２（マトリックス−メタロプロテイナーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ−９（マトリックス−メタロプロテイナーゼ９）阻害剤、およびＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤などの抗血管形成剤を、本発明の化合物と組み合わせて用いることも可能である。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ（セレコキシブ）、ＢＥＸＴＲＡＴＭ（バルデコキシブ）、およびロフェコキシブが含まれる。有用なマトリックス・メタロプロテイナーゼ阻害剤は、ＷＯ  ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公表）、ＷＯ  ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公表）、欧州特許出願第９７３０４９７１．１号（１９９７年７月８日出願）、欧州特許出願第９９３０８６１７．２号（１９９９年１０月２９日出願）、ＷＯ  ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公表）、ＷＯ  ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公表）、ＷＯ  ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公表）、ＷＯ  ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公表）、ＷＯ  ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公表）、ＷＯ  ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公表）、欧州特許刊行物６０６，０４６（１９９４年７月１３日公表）、欧州特許刊行物９３１，７８８（１９９９年７月２８日公表）、ＷＯ  ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公表）、ＷＯ  ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公表）、ＷＯ  ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公表）、ＷＯ  ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公表）、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３号（１９９８年７月２１日出願）、欧州特許出願第９９３０２２３２．１号（１９９９年３月２５日出願）、英国特許出願第９９１２９６１．１号（１９９９年６月３日出願）、米国仮出願第６０／１４８，４６４号（１９９９年８月１２日出願）、米国特許第５，８６３，９４９号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第５，８６１，５１０号（１９９９年１月１９日発行）、および欧州特許刊行物７８０，３８６（１９９７年６月２５日公表）に記載され、これらの文献はすべて本明細書に完全に援用される。好ましいＭＭＰ阻害剤は、関節痛を示さないものである。より好ましいのは、他のマトリックス・メタロプロテイナーゼ（すなわちＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）に比較して、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。本発明で有用なＭＭＰ阻害剤のいくつかの特定の例は、ＡＧ−３３４０、ＲＯ３２−３５５５、ＲＳ１３−０８３０、および以下のリストに列挙される化合物である：３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−エキソ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ  ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４フルオロ−ベンジルオキシ）ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン���ヒドロキシアミド；４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）ベンゼンスルホニル］（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロブチル）−アミノ］−プロピオン酸；４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；（Ｒ）３−［４（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロフェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；３−エキソ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−イシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−エンド−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサイシクロ［３．２．１］オクタン−３カルボン酸ヒドロキシアミド；および（Ｒ）３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；並びに前記化合物の薬学的に許容しうる塩および溶媒和物。
【０１８８】
本発明の化合物はまた、シグナル伝達阻害剤、例えば、ＥＧＦ−Ｒ（上皮増殖因子受容体）反応を阻害可能な剤、例えばＥＧＦ−Ｒ抗体、ＥＧＦ抗体、およびＥＧＦ−Ｒ阻害剤である分子；ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤、例えばＶＥＧＦ受容体およびＶＥＧＦを阻害可能な分子；並びにｅｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばｅｒｂＢ２受容体に結合する有機分子または抗体、例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）とともに使用可能である。ＥＧＦ−Ｒ阻害剤は、例えば、ＷＯ  ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公表）、ＷＯ  ９８／１４４５１（１９９８年４月９日公表）、ＷＯ  ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公表）、および米国特許第５，７４７，４９８号（１９９８年５月５日発行）に記載され、そしてこうした物質は、本明細書に記載するように、本発明において使用可能である。ＥＧＦＲ阻害剤には、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ  ２２Ｍａｂ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ／Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、ＥＭＤ−５５９０（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、ＭＤＸ−４４７／Ｈ−４７７（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、並びに化合物ＺＤ  １８３４、ＺＤ−１８３８およびＺＤ−１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ  ７５１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＰ  ７０１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、レフノミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｕｇｅｎ）、ＣＩ−１０３３（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）、ＣＩ−１０３３／ＰＤ  １８３，８０５（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）、ＣＬ−３８７，７８５（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）、ＢＢＲ−１６１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｎａａｍｉｄｉｎｅ  Ａ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＣ−３９４０−ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＢＩＢＸ−１３８２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＯＬＸ−１０３（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ＶＲＣＴＣ  ３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＥＧＦ融合毒素（Ｓｅｒａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ＤＡＢ−３８９（Ｓｅｒａｇｅｎ／Ｌｉｇａｎｄ）、ＺＭ−２５２８０８（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄ）、ＲＧ−５０８６４（ＩＮＳＥＡＭ）、ＬＦＭ−Ａ１２（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＷＨＩ−Ｐ９７（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ）、ＫＴ−８３９１（協和発酵）およびＥＧＦ−Ｒワクチン（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ／Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ＣＩＭ））が含まれる。これらのＥＧＦ−Ｒ阻害剤および他のＥＧＦ−Ｒ阻害剤を本発明で使用可能である。
【０１８９】
ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＳＵ−１１２４８（Ｓｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ＳＨ−２６８（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、およびＮＸ−１８３８（ＮｅＸｓｔａｒ）もまた、本発明の化合物と組み合わせ可能である。ＶＥＧＦ阻害剤は、例えば、ＷＯ  ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日公表）、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７号（１９９９年５月３日出願）、ＷＯ  ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日公表）、ＷＯ  ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日公表）、米国特許第５，８３４，５０４号（１９９８年１１月１０日発行）、ＷＯ  ９８／５０３５６（１９９８年１１月１２日公表）、米国特許第５，８８３，１１３号（１９９９年３月１６日発行）、米国特許第５，８８６，０２０号（１９９９年３月２３日発行）、米国特許第５，７９２，７８３号（１９９８年８月１１日発行）、ＷＯ  ９９／１０３４９（１９９９年３月４日公表）、ＷＯ  ９７／３２８５６号（１９９７年９月１２日公表）、ＷＯ  ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日公表）、ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日公表）、ＷＯ  ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日公表）、ＷＯ  ９９／１６７５５（１９９９年４月８日公表）、およびＷＯ  ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公表）に記載されており、これら文献はすべて、本明細書に完全に援用される。本発明で有用ないくつかの特定のＶＥＧＦ阻害剤の他の例は、ＩＭ８６２（Ｃｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体；並びにＲｉｂｏｚｙｍｅおよびＣｈｉｒｏｎの合成リボザイム、アンギオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）である。これらのＶＥＧＦ阻害剤および他のＶＥＧＦ阻害剤を、本明細書に記載するように、本発明で使用可能である。
【０１９０】
ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ｐｌｃ）、並びにモノクローナル抗体ＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）および２Ｂ−Ｉ（Ｃｈｉｒｏｎ）などのＥｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばＷＯ  ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公表）、ＷＯ  ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日公表）、ＷＯ  ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日公表）、ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公表）、ＷＯ  ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日公表）、ＷＯ  ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公表）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日発行）、および米国特許第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日発行）に示されるものは、本発明の化合物とさらに組み合わせ可能であり、これらの文献はすべて、本明細書に完全に援用される。本発明で有用なｅｒｂＢ２受容体阻害剤はまた、米国仮出願第６０／１１７，３４１号、１９９９年１月２７日出願、および米国仮出願第６０／１１７，３４６号、１９９９年１月２７日出願にも記載されており、これら出願はどちらも、本明細書に完全に援用される。前述のＰＣＴ出願、米国特許、および米国仮出願に記載されるｅｒｂＢ２受容体阻害剤化合物および物質とともに、ｅｒｂＢ２受容体を阻害する他の化合物および物質が、本発明にしたがって、本発明の化合物とともに使用可能である。
【０１９１】
本発明の併用の別の構成要素は、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤である。用語「シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤」または「Ｃｏｘ−２選択的阻害剤」は、本明細書において交換可能に使用可能であり、シクロオキシゲナーゼ−１よりも、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物を含み、そしてまた、これらの化合物の薬学的に許容しうる塩も含む。
【０１９２】
実際のところ、Ｃｏｘ−２阻害剤の選択性は、試験を行う条件および試験する阻害剤に応じて、多様である。しかし、本明細書の目的のため、Ｃｏｘ−２阻害剤の選択性は、Ｃｏｘ−１の阻害に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのＩＣ５０値を、Ｃｏｘ−２の阻害に関するＩＣ５０値で割った比（Ｃｏｘ−１  ＩＣ５０／Ｃｏｘ−２  ＩＣ５０）として、測定可能である。Ｃｏｘ−２選択的阻害剤は、Ｃｏｘ−２  ＩＣ５０に対するＣｏｘ−１  ＩＣ５０の比が１より大きい阻害剤いずれかである。好ましい態様において、この比は２より大きく、より好ましくは５より大きく、さらにより好ましくは１０より大きく、さらにより好ましくは５０より大きく、そしてさらに好ましくは１００より大きい。
【０１９３】
本明細書において、用語「ＩＣ５０」は、シクロオキシゲナーゼ活性の５０％阻害を生じるのに必要な化合物濃度を指す。本発明の好ましいシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、約１μＭ未満、より好ましくは約０．５μＭ未満、そしてさらにより好ましくは約０．２μＭ未満のシクロオキシゲナーゼ−２  ＩＣ５０を有する。
【０１９４】
好ましいシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、約１μＭより高く、そしてより好ましくは２０μＭより高い、シクロオキシゲナーゼ−１  ＩＣ５０を有する。こうした好ましい選択性は、一般的なＮＳＡＩＤが誘導する副作用の発生率を減少させる能力を示しうる。
【０１９５】
やはり本発明の範囲内に含まれるのは、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤のプロドラッグとして作用する化合物である。本明細書において、Ｃｏｘ−２選択的阻害剤に関連して、用語「プロドラッグ」は、被験者の体内で、代謝プロセスまたは単純な化学反応プロセスによって、活性Ｃｏｘ−２選択的阻害剤に変換可能な化学化合物を指す。Ｃｏｘ−２選択的阻害剤のプロドラッグの一例はパレコキシブであり、これは三環シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤バルデコキシブの療法的に有効なプロドラッグである。好ましいＣｏｘ−２選択的阻害剤プロドラッグの例は、パレコキシブ・ナトリウムである。Ｃｏｘ−２阻害剤のプロドラッグのクラスは、米国特許第５，９３２，５９８号に記載される。
【０１９６】
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、例えば、Ｃｏｘ−２選択的阻害剤メロキシカム、式Ｂ−１（ＣＡＳ登録番号７１１２５−３８−７）、あるいはその薬学的に許容しうる塩またはプロドラッグであることも可能である。
【０１９７】
【化１】
2007528201.tif 000014
【０１９８】
本発明の別の態様において、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、Ｃｏｘ−２選択的阻害剤、ＲＳ  ５７０６７、６−［［５−（４−クロロベンゾイル）−１，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチル］−３（２Ｈ）−ピリダジノン、式Ｂ−２（ＣＡＳ登録番号１７９３８２−９１−３）、あるいはその薬学的に許容しうる塩またはプロドラッグであることも可能である。
【０１９９】
【化２】
2007528201.tif 000015
【０２００】
本発明の別の態様において、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、置換ベンゾピランまたは置換ベンゾピラン類似体である、クロメン／クロマン構造クラスのものであり、そしてさらにより好ましくは、置換ベンゾチオピラン類、ジヒドロキノリン類、またはジヒドロナフタレン類からなる群より選択される。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうるベンゾピラン類には、米国特許第６，２７１，２５３号に記載される置換ベンゾピラン誘導体が含まれる。本発明の実施に有用な他のベンゾピランＣｏｘ−２選択的阻害剤は、米国特許第６，０３４，２５６号および第６，０７７，８５０号に記載される。
【０２０１】
本発明のさらなる好ましい態様において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、式Ｉ：
【０２０２】
【化３】
2007528201.tif 000016
【０２０３】
式中：
Ｚ１は、部分的不飽和または不飽和ヘテロシクリルおよび部分的不飽和または不飽和炭素環からなる群より選択され；
Ｒ２４は、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびアリールからなる群より選択され、ここでＲ２４は、置換可能な位で、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシおよびアルキルチオから選択される１以上のラジカルで場合によって置換される；
Ｒ２５は、メチルまたはアミノからなる群より選択され；そして
Ｒ２６は、Ｈ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロシクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、Ｎ−アリールアミノカルボニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、Ｎ−アリールアミノアルキル、Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、Ｎ−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノスルホニルから選択されるラジカルからなる群より選択される
の一般構造に示す三環シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤のクラス；
あるいはそのプロドラッグ
から選択可能である。
【０２０４】
本発明の好ましい態様において、上記式Ｉに示すシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、表３に例示する化合物群から選択され、これらには、セレコキシブ（Ｂ−３）、バルデコキシブ（Ｂ−４）、デラコキシブ（Ｂ−５）、ロフェコキシブ（Ｂ−６）、エトリコキシブ（ＭＫ−６６３；Ｂ−７）、ＪＴＥ−５２２（Ｂ−８）、またはそのプロドラッグが含まれる。
【０２０５】
上に論じるＣｏｘ−２選択的阻害剤の選択される例に関するさらなる情報を、以下のように見出すことも可能である：セレコキシブ（ＣＡＳ  ＲＮ  １６９５９０−４２−５、Ｃ−２７７９、ＳＣ−５８６５３、および米国特許第５，４６６，８２３号中）；デラコキシブ（ＣＡＳ  ＲＮ  １６９５９０−４１−４）；ロフェコキシブ（ＣＡＳ  ＲＮ  １６２０１１−９０−７）；化合物Ｂ−２４（米国特許第５，８４０，９２４号）；化合物Ｂ−２６（ＷＯ  ００／２５７７９）；およびエトリコキシブ（ＣＡＳ  ＲＮ  ２０２４０９−３３−４、ＭＫ−６３３、ＳＣ−８６２１８、およびＷＯ  ９８／０３４８４中）。
表３
【０２０６】
【表３−１】
2007528201.tif 000017
【０２０７】
【表３−２】
2007528201.tif 000018
【０２０８】
本発明のより好ましい態様において、Ｃｏｘ−２選択的阻害剤は、セレコキシブ、ロフェコキシブおよびエトリコキシブからなる群より選択される。
本発明の好ましい態様において、Ｂ−９に示す構造を有し、三環シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤、バルデコキシブ、Ｂ−４（例えば米国特許第５，６３３，２７２号を参照されたい）の療法的に有効なプロドラッグであるパレコキシブ（例えば米国特許第５，９３２，５９８号を参照されたい）を、シクロオキシゲナーゼ阻害剤の供給源として、好適に使用することも可能である。
【０２０９】
【化４】
2007528201.tif 000019
【０２１０】
パレコキシブの好ましい型はパレコキシブ・ナトリウムである。
本発明の別の態様において、国際公報第ＷＯ  ００／２４７１９号に先に記載された、式Ｂ−１０を有する化合物ＡＢＴ−９６３が、好適に使用可能な、別の三環シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤である。
【０２１１】
【化５】
2007528201.tif 000020
【０２１２】
本発明のさらなる態様において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ＷＯ  ９９／１１６０５に記載されるフェニル酢酸誘導体シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤のクラスから選択可能である。ＷＯ  ０２／２００９０は、ＣＯＸ−１８９と称され（また、ルミラコキシブとも称され）、ＣＡＳ登録番号２２０９９１−２０−８を有する化合物である
類似の構造を有し、本発明のＣｏｘ−２選択的阻害剤として作用しうる化合物が、米国特許第６，３１０，０９９号、第６，２９１，５２３号、および第５，９５８，９７８号に記載される。
【０２１３】
式Ｂ−１１に示す構造を有するＣｏｘ−２選択的阻害剤、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド（ＮＳ−３９８、ＣＡＳ  ＲＮ  １２３６５３−１１−２）の適用に関するさらなる情報が、例えば、Ｙｏｓｈｉｍｉ，  Ｎ．ら，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ９０（４）：４０６−４１２（１９９９）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｂｈａｐ．ｃｏｍ／Ｓｃｉｅｎｃｅ−＿Ｓｐｅｃｔｒａ／２０−１−ａｒｔｉｃｌｅ．ｈｔｍ（０６／０６／２００１）で入手可能なＦａｌｇｕｅｙｒｅｔ，  Ｊ．−Ｐ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ中；およびＩｗａｔａ，  Ｋ．ら，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ７５（２）：１９１−１９４（１９９７）に記載されている。
【０２１４】
【化６】
2007528201.tif 000021
【０２１５】
イヌ炎症モデルにおける、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤、ＲＷＪ  ６３５５６の抗炎症活性の評価が、Ｋｉｒｃｈｎｅｒら，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８２，  １０９４−１１０１（１９９７）に記載された。
【０２１６】
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，１８０，６５１号に記載されるジアリールメチリデンフラン誘導体が含まれる。
化合物のこのファミリーに含まれ、そして本発明においてシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる特定の物質には、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、および（Ｅ）−４−［（４−メチルフェニル）（テトラヒドロ−２−オキソ−３−フラニリデン）メチル］ベンゼンスルホンアミドが含まれる。
【０２１７】
本発明で有用なシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤には、ダルブフェロン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＳ−５０２（三共）、ＬＡＳ  ３４４７５（Ａｌｍｉｒａｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｆａｒｍａ）、ＬＡＳ  ３４５５５（Ａｌｍｉｒａｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｆａｒｍａ）、Ｓ−３３５１６（Ｓｅｒｖｉｅｒ）、ＳＤ  ８３８１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国特許第６，０３４，２５６号に記載される）、ＢＭＳ−３４７０７０（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、米国特許第６，１８０，６５１号に記載される）、ＭＫ−９６６（Ｍｅｒｃｋ）、Ｌ−７８３００３（Ｍｅｒｃｋ）、Ｔ−６１４（富山）、Ｄ−１３６７（Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌ−７４８７３１（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＴ３（Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＧＰ−２８２３８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＦ−３８９（Ｂｉｏｆｏｒ／Ｓｃｈｅｒｅｒ）、ＧＲ−２５３０３５（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、６−ジオキソ−９Ｈ−プリン−８−イル−桂皮酸（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、およびＳ−２４７４（塩野義）が含まれる。
【０２１８】
上述のＳ−３３５１６に関する情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｕｒｒｅｎｔ−ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ／ＮＥＷＳ／Ｉｎｆｌａｍ１．ｈｔｍ、２００１年１０月４日のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇｓ  Ｈｅａｄｌｉｎｅ  Ｎｅｗｓに見出されることが可能であり、ここでは、Ｓ−３３５１６がテトラヒドロイソインデ誘導体であり、シクロオキシゲナーゼ−１およびシクロオキシゲナーゼ−２に対して、それぞれ、０．１ｍＭおよび０．００１ｍＭのＩＣ５０値を有することが報告された。ヒト全血において、Ｓ−３３５１６は、ＥＤ５０＝０．３９ｍｇ／ｋｇを有すると報告された。
【０２１９】
シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる化合物には、米国特許第６，３９５，７２４号に記載されるように、１以上のリンカーに共有結合した２〜１０のリガンドを含有する、多結合化合物が含まれる。シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤として作用しうる化合物には、米国特許第６，０７７，８６８号に記載されるコンジュゲート化リノール酸が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第５，９９４，３８１号および第６，３６２，２０９号に記載される複素環芳香族オキサゾール化合物が含まれる。本方法および組成物で有用なＣｏｘ−２選択的阻害剤には、米国特許第６，０８０，８７６号および第６，１３３，２９２号に記載される化合物が含まれることも可能である。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３６９，２７５号、第６，１２７，５４５号、第６，１３０，３３４号、第６，２０４，３８７号、第６，０７１，９３６号、第６，００１，８４３号および第６，０４０，４５０号に記載されるピリジン類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３４０，６９４号に記載されるジアリールベンゾピラン誘導体が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３７６，５１９号に記載される、１−（４−スルファミルアリール）−３−置換−５−アリール−２−ピラゾリン類が含まれる。
【０２２０】
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，１５３，７８７号に記載される複素環が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，０４６，２１７号に記載される２，３，５−三置換ピリジン類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３２９，４２１号に記載されるジアリール二環複素環が含まれる。シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤として作用しうる化合物には、米国特許第６，２３９，１３７号に記載される、５−アミノまたは置換アミノ１，２，３−トリアゾール化合物の塩が含まれる。
【０２２１】
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，１３６，８３１号に記載されるピラゾール誘導体が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，２９７，２８２号に記載される、ベンゾスルホンアミドの置換誘導体が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３０３，６２８号に記載される、二環カルボニルインドール化合物が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３１０，０７９号に記載されるベンズイミダゾール化合物が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３００，３６３号に記載される、インドール化合物が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，０７７，８６９号に記載される、アリールフェニルヒドラジド類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，１４０，５１５号に記載される、２−アリールオキシ、４−アリールフラン−２−オン類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第５，９９４，３７９号に記載される、ビスアリール化合物が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，０２８，２０２号に記載される、１，５−ジアリールピラゾール類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，０４０，３２０号に記載される、２−置換イミダゾール類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，０８３，９６９号に記載される、１，３−および２，３−ジアリールシクロアルカノおよびシクロアルケノピラゾール類が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３０６，８９０号に記載される、インドールアルカノール由来のエステルおよびインドールアルキルアミド由来の新規アミドが含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，３０７，０４７号に記載される、ピリダジノン化合物が含まれる。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として作用しうる物質には、米国特許第６，００４，９４８号に記載される、ベンゾスルホンアミド誘導体が含まれる。本発明の方法および組成物に有用なＣｏｘ−２選択的阻害剤には、米国特許第６，１６９，１８８号、第６，０２０，３４３号、第５，９８１，５７６号（（メチルスルホニル）フェニルフラノン類）；米国特許第６，２２２，０４８号（ジアリール−２−（５Ｈ）−フラノン類）；米国特許第６，０５７，３１９号（３，４−ジアリール−２−ヒドロキシ−２，５−ジヒドロフラン類）；米国特許第６，０４６，２３６号（炭素環スルホンアミド類）；米国特許第６，００２，０１４号および第５，９４５，５３９号（オキサゾール誘導体）；並びに米国特許第６，３５９，１８２号（Ｃ−ニトロソ化合物）が含まれることも可能である。
【０２２２】
本発明で有用なシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、薬学的に許容しうる限り、いかなる供給源によって供給されることも可能である。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、天然供給源から単離され、そして精製されることも可能であるし、または合成されることも可能である。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、薬剤製品で使用するため、業界において慣用的な品質および純度のものでなければならない。
【０２２３】
抗生存剤には、ＩＧＦ−ＩＲ抗体および抗インテグリン剤、例えば抗インテグリン抗体が含まれる。
【０２２４】
有用な診断法
ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的試料においてＩＧＦ−ＩＲを検出することも可能である。限定なしに、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降を含む、慣用的なイムノアッセイにおいて、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いることも可能である。本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、ヒト由来のＩＧＦ−ＩＲを検出することも可能である。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、カニクイザルおよびアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）などの旧世界霊長類、チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）並びに類人猿由来のＩＧＦ−ＩＲを検出することも可能である。
【０２２５】
本発明は、生物学的試料中のＩＧＦ−ＩＲを検出する方法であって、生物学的試料を本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体と接触させ、そしてＩＧＦ−ＩＲに結合した結合抗体を検出して、生物学的試料中のＩＧＦ−ＩＲを検出する方法を提供する。１つの態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を検出可能標識で直接標識する。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体（一次抗体）は未標識であり、そして二次抗体またはＩＧＦ−ＩＲ抗体と結合可能な他の分子が標識される。当業者に周知であるように、一次抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合可能な二次抗体を選択する。例えば、ＩＧＦ−ＩＲ抗体がヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧであることも可能である。多くの抗体に結合可能な他の分子には、限定なしに、どちらも商業的に入手可能なプロテインＡおよびプロテインＧ、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈが含まれる。抗体または二次検出抗体に適した標識が上に開示されており、そしてこれらには、多様な酵素、置換（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）基、蛍光物質、発光物質、磁気剤および放射能物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な置換基複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；磁気剤の例にはガドリニウムが含まれ；そして適切な放射能物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【０２２６】
別の態様において、検出可能物質で標識したＩＧＦ−ＩＲ標準および非標識ＩＧＦ−ＩＲ抗体を利用した、競合イムノアッセイによって、生物学的試料中のＩＧＦ−ＩＲをアッセイすることも可能である。本アッセイにおいて、生物学的試料、標識ＩＧＦ−ＩＲ標準、およびＩＧＦ−ＩＲ抗体を合わせて、そして非標識抗体に結合した標識ＩＧＦ−ＩＲ標準の量を測定する。生物学的試料中のＩＧＦ−ＩＲの量は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体に結合した標識ＩＧＦ−ＩＲ標準の量に反比例する。
【０２２７】
上に開示するイムノアッセイをいくつかの目的で使用することも可能である。１つの態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、細胞培養中の細胞に存在するＩＧＦ−ＩＲを検出することも可能である。好ましい態様において、多様な化合物を用いて細胞を処理した後、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、チロシンリン酸化レベル、ＩＧＦ−ＩＲのチロシン自己リン酸化レベルおよび／または細胞表面上のＩＧＦ−ＩＲの量を測定することも可能である。この方法を用いて、ＩＧＦ−ＩＲを活性化するかまたは阻害するのに、あるいは細胞表面上または細胞内のＩＧＦ−ＩＲの再分配を生じるのに使用可能な化合物を試験することも可能である。この方法において、細胞の１つの試料をある期間、試験化合物で処理し、一方、別の試料を処理しないままにしておく。チロシン自己リン酸化を測定する場合、細胞を溶解し、そして上述のイムノアッセイ、またはＥＬＩＳＡを用いる実施例ＩＩＩに記載するようなイムノアッセイを用いて、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンリン酸化を測定する。ＩＧＦ−ＩＲの総レベルを測定しようとする場合、細胞を溶解し、そして上述のイムノアッセイの１つを用いて、総ＩＧＦ−ＩＲレベルを測定する。細胞の固定後に、本発明の抗体を用いて組織培養細胞を染色して、細胞表面ＩＧＦ−ＩＲのレベルを測定することも可能である。一般の当業者の標準的実施によって、二次検出抗体とともに、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞表面への一次（ＩＧＦ−ＩＲ）抗体の結合量を測定することが可能になる。細胞を界面活性剤または毒素で透過処理して、通常非透過性の抗体が浸透するようにし、こうしてＩＧＦ−ＩＲが局在する細胞内部位を標識することも可能である。
【０２２８】
ＩＧＦ−ＩＲチロシンリン酸化を測定するため、または総ＩＧＦ−ＩＲレベルを測定するため、好ましいイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットである。ＩＧＦ−ＩＲの細胞表面レベルのみを測定しようとする場合、細胞を溶解せず、そして上述のイムノアッセイの１つ（例えばＦＡＣＳ）を用いて、ＩＧＦ−ＩＲの細胞表面レベルを測定する。ＩＧＦ−ＩＲの細胞表面レベルを測定するのに好ましいイムノアッセイには、ビオチンまたは１２５Ｉなどの検出可能標識で、もっぱら細胞表面タンパク質を標識し、膜内在性タンパク質を含有する、細胞の界面活性剤可溶性分画をＩＧＦ−ＩＲ抗体で免疫沈降し、そして次いで、検出可能標識を含有する総ＩＧＦ−ＩＲ分画を検出する工程を含む。ＩＧＦ−ＩＲの局在、例えば細胞表面レベルを決定する別の好ましいイムノアッセイは、免疫蛍光または免疫組織化学を用いることによる。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、免疫組織化学、膜内在性タンパク質の細胞表面標識および免疫沈降などの方法が、当該技術分野に周知である。例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。さらに、ＩＧＦ−ＩＲの活性化または阻害いずれかに関して、多数の化合物を試験するため、イムノアッセイをハイスループットスクリーニングにスケールアップすることも可能である。
【０２２９】
本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、組織または組織由来の細胞におけるＩＧＦ−ＩＲレベルを測定することも可能である。好ましい態様において、組織は疾患組織である。より好ましい態様において、組織は腫瘍またはその生検である。該方法の好ましい態様において、組織またはその生検を患者から切除する。次いで、組織または生検をイムノアッセイに用いて、上に論じる方法によって、例えばＩＧＦ−ＩＲレベル、ＩＧＦ−ＩＲの細胞表面レベル、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンリン酸化レベル、またはＩＧＦ−ＩＲの局在を決定する。該方法を用いて、腫瘍が高レベルのＩＧＦ−ＩＲを発現しているかどうかを決定することも可能である。
【０２３０】
上述の診断法を用いて、腫瘍が高レベルのＩＧＦ−ＩＲを発現するかどうかを決定することも可能であり、これは、腫瘍がＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いた治療によく反応するかどうかの指標となりうる。該診断法を用いて、腫瘍が高レベルのＩＧＦ−ＩＲを発現する場合、潜在的に癌性であること、または低レベルのＩＧＦ−ＩＲを発現する場合、良性であることを決定することもまた可能である。さらに、該診断法を用いて、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いた治療（以下を参照されたい）が、腫瘍が発現するＩＧＦ−ＩＲをより低レベルにし、そして／またはチロシン自己リン酸化をより低レベルにするかどうかを決定することも可能であり、そしてしたがって治療が成功するかどうかを決定することも可能である。一般的に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体がチロシンリン酸化を減少させるかどうか決定する方法は、目的の細胞または組織におけるチロシンリン酸化レベルを測定し、細胞または組織をＩＧＦ−ＩＲ抗体またはその抗原結合部分とインキュベーションし、次いで、細胞または組織中のチロシンリン酸化レベルを再測定する工程を含む。ＩＧＦ−ＩＲまたは別のタンパク質（単数または複数）のチロシンリン酸化を測定することも可能である。該診断法を用いて、小人症、骨粗しょう症、または糖尿病の個体の場合にそうである可能性があるように、組織または細胞が、十分に高いレベルのＩＧＦ−ＩＲを発現していないか、または十分に高いレベルの活性化ＩＧＦ−ＩＲを発現していないか、決定することも可能である。ＩＧＦ−ＩＲまたは活性ＩＧＦ−ＩＲレベルが低すぎるという診断を用いて、活性化ＩＧＦ−ＩＲ抗体、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩあるいはＩＧＦ−ＩＲレベルまたは活性を増加させる他の療法剤での治療を行うことも可能である。
【０２３１】
本発明の抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて、ＩＧＦ−ＩＲを発現する組織および臓器を位置決定することもまた可能である。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍を位置決定することも可能である。本発明のＩＧＦ−ＩＲ抗体の利点は、投与に際して免疫応答を生じないことである。該方法は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体またはその薬剤組成物を、こうした診断試験を必要とする患者に投与して、そして該患者を画像解析に供し、ＩＧＦ−ＩＲ発現組織の位置を決定する工程を含む。画像解析は医学業に周知であり、そして限定なしに、Ｘ線解析、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影法（ＣＥ）を含む。該方法の別の態様において、患者を画像解析に供するのでなく、患者から生検を得て、目的の組織がＩＧＦ−ＩＲを発現しているかどうかを決定する。好ましい態様において、患者において画像化可能な検出可能剤で、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を標識することも可能である。例えば、Ｘ線解析に使用可能なバリウムなどの造影剤で抗体を標識することも可能であるし、あるいはＭＲＩまたはＣＥに使用可能なガドリニウム・キレートなどの磁気造影剤で標識することも可能である。他の標識剤には、限定なしに、９９Ｔｃなどの放射性同位体が含まれる。別の態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は標識されず、そして二次抗体、または検出可能で、そしてＩＧＦ−ＩＲ抗体に結合可能な他の分子を投与することによって画像化される。
【０２３２】
有用な療法
別の態様において、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲ活性を阻害する必要がある患者にＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与することによって、ＩＧＦ−ＩＲ活性を阻害する方法を提供する。本明細書に記載する抗体の種類はいずれも療法的に使用可能である。好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体である。別の好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲはヒトのものであり、そして患者はヒト患者である。あるいは、患者は該ＩＧＦ−ＩＲ抗体が交差反応するＩＧＦ−ＩＲを発現する哺乳動物であることも可能である。獣医学的目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして、該抗体が交差反応するＩＧＦ−ＩＲを発現する非ヒト哺乳動物（すなわち霊長類、あるいはカニクイザルまたはアカゲザル）に該抗体を投与することも可能である。こうした動物モデルは、本発明の抗体の療法的有効性を評価するのに有用である可能性もある。
【０２３３】
本明細書において、用語「ＩＧＦ−ＩＲ活性が有害である障害」は、疾患および他の障害であって、該障害を患う被験者において、高レベルのＩＧＦ−ＩＲの存在が、該障害の病態生理に関与するか、または該障害を悪化させるのに寄与する要因に関与するかいずれかであることが示されているか、または推測されている、前記疾患または他の障害を含むよう意図される。したがって、高レベルのＩＧＦ−ＩＲ活性が有害である障害は、ＩＧＦ−ＩＲ活性の阻害が、該障害の症状および／または進行を軽減すると期待される障害である。こうした障害は、例えば、細胞表面上のＩＧＦ−ＩＲレベルの増加によって、または障害を患う被験者の罹患細胞または組織におけるＩＧＦ−ＩＲのチロシン自己リン酸化の増加によって、立証可能である。ＩＧＦ−ＩＲレベルの増加は、例えば、上述のようにＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて検出可能である。
【０２３４】
好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍を有する患者にＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与することも可能である。腫瘍は固形腫瘍であることも可能であるし、またはリンパ腫などの非固形腫瘍であることも可能である。より好ましい態様において、癌性であるＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍を有する患者に、抗ＩＧＦ抗体を投与することも可能である。さらにより好ましい態様において、肺、乳房、前立腺、または結腸の腫瘍を有する患者に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与する。非常に好ましい態様において、該方法は、腫瘍の重量または体積が増加しないようにするか、あるいは腫瘍の重量または体積を減少させる。別の態様において、該方法は、腫瘍上のＩＧＦ−ＩＲを内在化させる。好ましい態様において、抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択されるか、あるいは重鎖、軽鎖またはその抗原結合領域を含む。
【０２３５】
別の好ましい態様において、不適切に高いレベルのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを発現する患者に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与することも可能である。当該技術分野において、高レベルのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ発現は、多様な一般的な癌を導きうることが知られる。より好ましい態様において、前立腺癌、神経膠種、または線維肉腫の患者に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与する。さらにより好ましい態様において、該方法は、癌の異常な増殖を停止させるか、あるいは重量もしくは体積を増加させないか、または重量もしくは体積を減少させる。
【０２３６】
１つの態様において、前記方法は、脳、扁平細胞、膀胱、胃、膵臓、乳房、頭部、首部、食道、前立腺、結腸直腸、肺、腎臓、卵巣、婦人科または甲状腺の癌などの癌の治療に関する。本発明の方法にしたがって、本発明の化合物で治療可能な患者には、例えば、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部および首部の癌、皮膚または眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、婦人科腫瘍（例えば子宮肉腫、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌または外陰癌）、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌（例えば甲状腺、副甲状腺または副腎の癌）、柔組織の肉腫、尿道の癌、ペニスの癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、小児期固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、中皮腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、腎臓または尿管の癌（例えば腎細胞癌、腎盂の癌）、あるいは中枢神経系の新生物（原発性ＣＮＳリンパ腫、脊椎（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ）腫瘍、脳幹神経膠腫または下垂体腺腫）を有すると診断された患者が含まれる。
【０２３７】
抗体を、１回投与することも可能であるが、より好ましくは複数回投与する。抗体を毎日３回から６ヶ月ごとに１回投与することも可能である。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、毎週１回、２週ごとに１回、毎月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、そして６ヶ月ごとに１回などのスケジュールであることも可能である。抗体を、経口経路、粘膜経路、頬側経路、鼻内経路、吸入可能経路、静脈内経路、皮下経路、筋内経路、非経口経路、腫瘍内経路または局所経路を介して投与することも可能である。抗体を腫瘍部位から離れた部位に投与することも可能である。抗体を、ミニポンプを介して連続投与することもまた可能である。抗体を１回、少なくとも２回、あるいは少なくとも状態が治療されるか、緩和されるか、または治癒されるまでの期間に渡って投与することも可能である。一般的に、抗体によって、腫瘍または癌が増殖を停止するか、あるいは重量または体積が減少するならば、腫瘍が存在する限り、抗体が投与されるであろう。抗体は、一般的に、上述のような薬剤組成物の一部として投与されるであろう。抗体の投薬量は、一般的に、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ、そしてさらにより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。当該技術分野に知られる方法いずれかによって、抗体の血清濃度を測定することも可能である。抗体はまた、癌または腫瘍が発生するのを防止するため、予防的に投与されることも可能である。これは、「高めの正常」レベルのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを有する患者において、特に有用である可能性もあり、これはこれらの患者が一般的な癌を発展させるリスクがより高いことが示されているためである。Ｒｏｓｅｎら、上記を参照されたい。
【０２３８】
別の側面において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、癌または腫瘍などの過剰増殖障害を有する患者に、抗新生物薬剤または分子などの他の療法剤と同時投与することも可能である。１つの側面において、本発明は、哺乳動物において、過剰増殖障害を治療する方法であって、前記哺乳動物に、療法的に有効な量の本発明の化合物を、限定されるわけではないが、分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、介入剤、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的反応修飾剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、マトリックス・メタロプロテイナーゼ阻害剤、遺伝療法剤および抗アンドロゲン剤からなる群より選択される抗腫瘍剤と組み合わせて投与することを含む、前記方法に関する。より好ましい態様において、抗体を、抗新生物剤、例えばアドリアマイシンまたはタキソールと投与することも可能である。別の好ましい態様において、抗体および併用療法を、放射療法、化学療法、光力学的療法、手術または他の免疫療法とともに投与する。さらに別の好ましい態様において、抗体を別の抗体とともに投与する。例えば、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を腫瘍または癌細胞増殖を阻害することが知られる抗体または他の剤、例えばｅｒｂＢ２受容体、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２０、またはＶＥＧＦを阻害する抗体または剤とともに投与することも可能である。
【０２３９】
抗体とさらなる療法剤の同時投与（併用療法）は、ＩＧＦ−ＩＲ抗体およびさらなる療法剤を含む１つの薬剤組成物を投与すること、並びに一方はＩＧＦ−ＩＲ抗体を含み、そして他方（単数または複数）はさらなる療法剤（単数または複数）を含む、２以上の別個の薬剤組成物を投与することを含む。さらに、同時投与療法または併用療法は、一般的に、抗体およびさらなる療法剤が、互いに同時に投与されることを意味するが、該療法は、抗体およびさらなる療法剤が異なる時点で投与される例もまた、含む。例えば、抗体を３日ごとに１回投与し、一方、さらなる療法剤を毎日１回投与することも可能である。あるいは、さらなる療法剤で障害を治療する前に、またはこうした治療に続いて、抗体を投与することも可能である。同様に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体の投与は、他の療法、例えば放射療法、化学療法、光力学的療法、手術または他の免疫療法の前に、またはこれらに続いて、行うことも可能である。
【０２４０】
抗体および１以上のさらなる療法剤（併用療法）を、１回、２回、あるいは少なくとも状態が治療されるか、緩和されるか、または治癒されるまでの期間、投与することも可能である。好ましくは、併用療法は複数回投与される。併用療法を毎日３回から６ヶ月ごとに１回投与することも可能である。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、毎週１回、２週ごとに１回、毎月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、そして６ヶ月ごとに１回などのスケジュールであることも可能であるし、またはミニポンプを介して連続的に投与することも可能である。併用療法を、経口経路、粘膜経路、頬側経路、鼻内経路、吸入可能経路、静脈内経路、皮下経路、筋内経路、非経口経路、腫瘍内経路または局所経路を介して投与することも可能である。併用療法を腫瘍部位から離れた部位に投与することも可能である。一般的に、併用療法によって、腫瘍または癌が増殖を停止するか、あるいは重量または体積が減少するならば、腫瘍が存在する限り、併用療法が投与されるであろう。
【０２４１】
さらなる態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は放射標識、免疫毒素、または毒素で標識されているか、あるいは毒性ペプチドを含む融合タンパク質である。ＩＧＦ−ＩＲ抗体またはＩＧＦ−ＩＲ抗体融合タンパク質は、放射標識、免疫毒素、毒素、または毒性ペプチドを、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍細胞または癌細胞に向ける。好ましい態様において、放射標識、免疫毒素、毒素、または毒性ペプチドは、ＩＧＦ−ＩＲ抗体が腫瘍細胞または癌細胞表面のＩＧＦ−ＩＲに結合した後、吸収される。
【０２４２】
別の側面において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を療法的に用いて、特定の細胞のアポトーシスが必要な患者において、特定の細胞のアポトーシスを誘導することも可能である。多くの場合、アポトーシスのターゲットとなる細胞は、癌性細胞または腫瘍細胞である。したがって、好ましい態様において、本発明は、アポトーシスの誘導が必要な患者に、療法的に有効な量のＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与することによって、アポトーシスを誘導する方法を提供する。好ましい態様において、抗体は、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５から選択されるか、あるいは重鎖、軽鎖またはその抗原結合領域を含む。
【０２４３】
別の側面において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて、高レベルのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＲが非癌性状態または疾患と関連している非癌性状態を治療することも可能である。１つの態様において、該方法は、高レベルのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＲレベルまたは活性によって引き起こされたかまたは悪化させられた非癌性病的状態を有する患者に、ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与する工程を含む。好ましい態様において、非癌性病的状態は、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、または糖尿病の合併症として見られるような、特に眼の、不適切な微小血管増殖である。より好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、非癌性病的状態の進行を遅延させる。より好ましい態様において、ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、少なくとも部分的に、非癌性病的状態を停止するかまたは逆転させる。
【０２４４】
本発明の抗体はまた、眼科疾患、特に緑内障、網膜炎、網膜症（例えば糖尿病網膜症）、ブドウ膜炎、眼の羞明、黄斑変性（例えば年齢関連黄斑変性、湿型（ｗｅｔ−ｔｙｐｅ）黄斑変性、および乾燥型（ｄｒｙ−ｔｙｐｅ）黄斑変性）の治療または防止、並びに眼の組織に対する急性傷害に関連する炎症および疼痛の治療または防止に有用であろう。該化合物はさらに、術後の眼の疼痛および炎症の治療または防止に有用であろう。
【０２４５】
別の側面において、本発明は、必要がある患者に、活性化ＩＧＦ−ＩＲ抗体を投与する方法を提供する。１つの態様において、必要がある患者に、ＩＧＦ−ＩＲ活性を増加させるのに有効な量の活性化抗体または薬剤組成物を投与する。より好ましい態様において、活性化抗体は、正常なＩＧＦ−ＩＲ活性を回復可能である。別の好ましい態様において、低身長、神経障害、筋量減少または骨粗しょう症を有する患者に、活性化抗体を投与することも可能である。別の好ましい態様において、細胞増殖を増加させるか、アポトーシスを防止するか、またはＩＧＦ−ＩＲ活性を増加させる１以上の他の因子とともに、活性化抗体を投与することも可能である。こうした因子には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩなどの増殖因子、および／またはＩＧＦ−ＩＲを活性化させるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ類似体が含まれる。
【０２４６】
遺伝子治療
遺伝子治療を介して、本発明の核酸分子を必要とする患者に投与することも可能である。該療法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏいずれであることも可能である。好ましい態様において、重鎖および軽鎖両方をコードする核酸分子を患者に投与する。より好ましい態様において、核酸分子がＢ細胞の染色体に安定して組み込まれるように、核酸分子を投与するが、これはこれらの細胞が抗体産生用に特殊化されているためである。好ましい態様において、前駆体Ｂ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションするかまたは感染させて、そして必要な患者に再移植する。別の態様において、目的の細胞種を感染させることが知られるウイルスを用いて、前駆体Ｂ細胞または他の細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏで感染させる。遺伝子治療に用いられる典型的なベクターには、リポソーム、プラスミド、またはレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏいずれかで感染させた後、治療した患者から試料を採取して、そして当該技術分野に知られ、そして本明細書に論じられるイムノアッセイいずれかを用いることによって、抗体発現レベルを監視することも可能である。
【０２４７】
好ましい態様において、遺伝子治療法は、ヒト抗体またはその部分の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子の有効量を投与し、そして該核酸分子を発現させる工程を含む。別の態様において、遺伝子治療法は、ヒト抗体またはその部分の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子の有効量を投与し、そして該核酸分子を発現させる工程を含む。より好ましい方法において、遺伝子治療法は、ヒト抗体またはその部分の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子の有効量、およびヒト抗体またはその部分の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子の有効量を投与し、そして該核酸分子を発現させる工程を含む。遺伝子治療法はまた、タキソール、タモキシフェン、５−ＦＵ、アドリアマイシンまたはＣＰ−３５８，７７４などの別の抗癌剤を投与する工程も含むことも可能である。
【０２４８】
本発明がよりよく理解されるため、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみが目的であり、そしていかなる方式でも、本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。
【実施例】
【０２４９】
実施例
（実施例１）
ＩＧＦ−ＩＲ結合性ｓｃＦｖの選択
Ｖａｕｇｈａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）１４：３０９−３１４）に記載される１．３８ｘ１０１０ライブラリーの拡大型であるｓｃＦｖファージミドライブラリーを用いて、ヒトＩＧＦ１Ｒに特異的な抗体を選択した。３つの選択方法論を使用した；パニング選択、可溶性選択、およびトランスフェクション細胞株表面上の選択。
【０２５０】
パニング法では、可溶性ＩＧＦ１Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合タンパク質（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌ）または対照融合タンパク質（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートのウェル上に、４℃で一晩コーティングした。さらに、可溶性ＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤ（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートのウェルに、４℃で一晩、共有カップリングした。どちらの場合もウェルをＰＢＳで洗浄し、そしてＭＰＢＳ（ＰＢＳ中３％粉乳）中、３７℃で１時間ブロッキングした。精製したファージ（１０１２形質導入単位（ｔｕ））を、３％  ＭＰＢＳ  １００μｌの最終体積中、１時間ブロッキングした。ＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤ融合タンパク質選択では、ブロッキングしたファージをブロッキングした対照融合タンパク質ウェルに添加し、そして１時間インキュベーションした。次いで、ブロッキングし、そして除外した（ｄｅｓｅｌｅｃｔｅｄ）ファージを、ＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤ融合タンパク質でコーティングしてブロッキングしたウェルに移し、そしてさらに１時間インキュベーションした。共有カップリングしたＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤを用いた選択では、ブロッキングしたファージを、カップリングしたＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤを含有するブロッキングしたウェルに直接添加し、そして１時間インキュベーションした。どちらの場合も、ウェルをＰＢＳＴ（０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で５回洗浄し、次いでＰＢＳで５回洗浄した。結合したファージ粒子を溶出し、そして指数関数的に増殖している大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＴＧ１  １０ｍｌを感染させるのに用いた。感染した細胞を２ＴＹブロス中、３７℃で１時間増殖させ、次いで２ＴＹＡＧプレート上に蒔き、そして３０℃で一晩インキュベーションした。コロニーをプレートから１０ｍｌ  ２ＴＹブロス中に掻き取り、そして−７０℃で保存するため、１５％グリセロール溶液を添加した。
【０２５１】
第１周期のパニング選択由来のグリセロールストック培養物をヘルパーファージに重複感染させ、そして第２周期のパニングのため、レスキューしてｓｃＦｖ抗体を発現するファージ粒子を得た。ヒトＩＧＦ１Ｒに特異的な抗体発現ファージ粒子を単離するため、この方式で、全部で３周期のパニングを行った。
【０２５２】
可溶性選択法では、最終濃度５０ｎＭのビオチン化ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤ融合タンパク質を、上述のようなｓｃＦｖファージミドライブラリーとともに用いた。１ｍｌの３％  ＭＰＢＳ中の精製ｓｃＦｖファージ（１０１２ｔｕ）を３０分間ブロッキングし、次いでビオチン化した抗原を添加し、そして室温で１時間インキュベーションした。１ｍｌの３％  ＭＰＢＳ中、３７℃で１時間ブロッキングしておいた、５０μｌのＤｙｎａｌ  Ｍ２８０ストレプトアビジン磁気ビーズに、ファージ／抗原を添加し、そして室温でさらに１５分間インキュベーションした。磁気ラックを用いてビーズを捕捉し、そして１ｍｌの３％  ＭＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中で５回、次いでＰＢＳ中で２回洗浄した。最後のＰＢＳ洗浄後、ビーズを１００μｌ  ＰＢＳに再懸濁し、そして５ｍｌの指数関数的に増殖している大腸菌ＴＧ−１細胞を感染させるのに用いた。感染した細胞を３７℃で１時間インキュベーションし（３０分間は静止状態で、３０分間は２５０ｒｐｍで振盪して）、次いで２ＴＹＡＧプレート上に蒔き、そして３０℃で一晩インキュベーションした。出てきたコロニーをプレートから掻き取り、そして上述のようにファージをレスキューした。上述のように、さらに２回の周期の可溶性選択を行った。
【０２５３】
細胞表面選択では、ヒトＩＧＦ１ＲでトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞およびトランスフェクションしていない対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ウェルあたり４ｘ１０５細胞で蒔き、そして集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達させた。精製ファージ（１０１２形質導入単位（ｔｕ））を、培地（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）中の４％粉乳の最終体積５００μｌ中、１時間ブロッキングした。ブロッキングしたファージを、ブロッキングしたトランスフェクションしていない対照細胞に添加し、そして１時間インキュベーションした。次いで、ブロッキングし、そして除外したファージを、ヒトＩＧＦ１ＲでトランスフェクションしてブロッキングしたＮＩＨ３Ｔ３細胞に移し、そして室温で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴ（０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で２回、次いでＰＢＳで２回洗浄した。結合したファージ粒子を溶出し、そして指数関数的に増殖している大腸菌ＴＧ１  １０ｍｌを感染させるのに用いた。感染した細胞を２ＴＹブロス中、３７℃で１時間増殖させ、次いで２ＴＹＡＧプレート上に蒔き、そして３０℃で一晩インキュベーションした。コロニーをプレートから１０ｍｌ  ２ＴＹブロス中に掻き取り、そして−７０℃で保存するため、１５％グリセロール溶液を添加した。
【０２５４】
（実施例２）
ＩＧＦ−ＩＲ抗体発現および精製
以下に記載するように、クローンをＩｇＧ形式に変換した。再編成（ｒｅｆｏｒｍａｔｔｉｎｇ）は、ヒト重鎖定常ドメイン、および哺乳動物細胞における適切な発現のための制御要素を含有するベクターに、ｓｃＦｖ由来のＶＨドメインをサブクローニングすることを伴う。同様に、適切な制御要素とともに、ヒト軽鎖定常ドメイン（ラムダまたはカッパクラス）を含有する発現ベクターに、ＶＬドメインをサブクローニングする。
【０２５５】
ｓｃＦｖクローン由来の適切なドメインをコードする核酸配列を増幅し、その後、制限酵素消化し、そして適切な発現ベクターに連結した。重鎖（ＩｇＧ１定常ドメイン）をｐＥＵ１にクローニングし、軽鎖（ラムダクラス）をｐＥＵ４にクローニングし、そして軽鎖（カッパクラス）をｐＥＵ３にクローニングした（Ｐｅｒｓｉｃ，  Ｌ．ら，  Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７））。
【０２５６】
部位特異的突然変異誘発
再編成前に、いくつかのｓｃＦｖ（ＰＧＩＡ−０３−Ａ１１を含む）が、ＩｇＧ１重鎖ベクターにＶＨをクローニングするのを邪魔する内部ＢｓｔＥＩＩ制限部位を、ＶＨドメイン内に含有することが観察された。キットに記載される方法を用いて、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）部位特異的突然変異誘発によって、内部制限部位を除去した。制限部位を除去するが、同じアミノ酸配列を維持するオリゴを設計した。配列決定を行って、部位が正しく突然変異されたことを確実にした。突然変異誘発プライマーを表４に示す。
表４
【０２５７】
【表４】
2007528201.tif 000022
【０２５８】
ＶＨ／ＶＬクローニングＰＣＲ
制限部位が存在しないことに関して、すべての配列をチェックしたら、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする核酸配列を、別個のＰＣＲ反応で増幅した。
【０２５９】
５０μｌの２ｘＰＣＲマスターミックス、５μｌの順方向プライマー（＠１０μＭ）、５μｌの逆方向プライマー（＠１０μＭ）、および４０μｌの水を用いて、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン各々に関して、１００μｌのＰＣＲ反応をセットアップした。ｓｃＦｖ配列にしたがってプライマーを配置し、そしてこれらを表５に示す。
表５
【０２６０】
【表５】
2007528201.tif 000023
【０２６１】
ｐＣＡＮＴＡＢ６（ＷＯ  ９４／１３８０４、図１９および図２０）中にｓｃＦｖをコードする適切な核酸を含有する、単一細菌コロニーを、各ＰＣＲ反応に摘み取り、そして以下のパラメーター：９４℃５分間、９４℃１分間、３０周期の５５℃１分間および７２℃１分間、並びに７２℃５分間を用いて試料を増幅した。
【０２６２】
消化
製造者の指示にしたがってＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ  ８ウェル精製キット（カタログ番号２８１４４、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いてＰＣＲ産物を清浄にした。増幅したＶＨ  ＰＣＲ産物の２５μｌアリコットをＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化した。増幅したＶＬ  ＰＣＲ産物の２５μｌアリコットをＡｐａＬＩおよびＰａｃＩで消化した。
ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製キットを用いて、消化したＶＨ  ＰＣＲ産物およびＶＬ  ＰＣＲ産物を清浄にした。
【０２６３】
連結および形質転換
清浄にした消化ＰＣＲ産物のアリコットを、同じ制限酵素で消化した適切なベクターに連結した。ＶＨドメインをｐＭＯＮ２７８１６（ｐＥＵ１）に連結し、そして軽鎖クラスに応じて、ＶＬドメインをｐＭＯＮ２７８２０（ｐＥＵ３）またはｐＭＯＮ２７８１９（ｐＥＵ４）いずれかに連結した（Ｐｅｒｓｉｃら，  Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，  １９９７）。あらかじめ調製しておいた化学的にコンピテントなＤＨ５α大腸菌を、熱ショックによって各連結反応の一部で形質転換し、そしてアンピシリンを含有する２ｘＴＹ寒天プレート上で一晩増殖させた。
【０２６４】
スクリーニング
個々のアンピシリン耐性コロニーを、９６ウェルプレート中、液体２ＴＹ培地（アンピシリンを含有する）中に摘み取り、そして一晩増殖させた。培養したら、ＰＣＲによってコロニーをスクリーニングして、ベクターが適切なドメインを含有するかどうかを決定した。プライマーＰＥＣＳＥＱ１およびｐ９５を用いて、ＶＨ含有プラスミドをスクリーニングし、そしてプライマーＰＥＣＳＥＱ１およびｐ１５６を用いて、ＶＬ含有プラスミドをスクリーニングした。
【０２６５】
スクリーニングＰＣＲに用いたものと同じプライマーを用いたＤＮＡ配列決定によって、挿入物を含有するコロニーを解析した。
表６は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
表６
【０２６６】
【表６−１】
2007528201.tif 000024
【０２６７】
【表６−２】
2007528201.tif 000025
【０２６８】
【表６−３】
2007528201.tif 000026
【０２６９】
【表６−４】
2007528201.tif 000027
【０２７０】
ｓｃＦｖをＩｇＧまたはＦａｂに変換した後、生じた抗体を、例えばＰＩＮＴ−７Ａ２  ＩｇＧおよびＰＩＮＴ−７Ａ２  Ｆａｂと称した。
【０２７１】
ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂの発現
機能する重鎖遺伝子カセットの発現をＧＶプロモーターによって駆動し、そしてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルによって終結させた。ＧＶプロモーターは、最小ＣＭＶプロモーターに酵母Ｇａｌ４上流活性化配列の５つのリピートを加えて構成される合成プロモーターである（Ｃａｒｅｙ，  Ｍ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５（１９９０），  ３６１−３６４）。該ベクターはまた、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ由来のｄｈｆｒ発現カセットも含有した。酵母Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６トランス活性化ドメインの融合体由来のキメラ・トランス活性化因子（ＧＶ）を発現するよう形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ／ＧＶ）細胞（Ｃａｒｅｙ，  Ｍ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５（１９９０），  ３６１−３６４）を、製造者の指示にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターで同時にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１ｘＨＴサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間増殖させ、そして次いで、培地からヒポキサンチンおよびチミジンを除去する（ＩＭＤＭ＋１０％の透析したＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ことによって、細胞を選択下に置いた。１０日後、細胞プールを９６ウェルプレートにクローニングし、そして培養１４日後、９６ウェルプレートをスクリーニングして、そして発現が最高であるクローンを拡大した。４００ｍｌのＩＭＤＭ＋１０％の透析したＦＢＳの培地を含有する１つの１７００ｃｍ２ローラーボトルに、１つの集密Ｔ７５フラスコを蒔くことによって、ローラーボトル中で発現を行った。
【０２７２】
ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂの精製
Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ組換えプロテインＡカラム１ｍｌを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって、ＩＧＦ−１Ｒ免疫グロブリンの精製を達成した。２０ｍｌのＧＩＢＣＯ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４（＃１２３８８−０１３）、１分間あたり１ｍｌで、カラムを平衡化した。抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧを含有する馴化培地を０．２ミクロンろ過し、次いで、１分間あたり０．５ｍｌで平衡化カラムに適用した。６０ｍｌのＰＢＳ、１分間あたり１ｍｌで、未結合タンパク質をカラムから洗い流した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．８を加えた０．１Ｍグリシン２０ｍｌ、１分間あたり１ｍｌで、ＩｇＧを溶出させた。溶出物を２ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｃｌ  ｐＨ８．３中に、攪拌しながら収集した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−３０ろ過装置を用いて、溶出物（２２ｍｌ）をおよそ１．５ｍｌに濃縮した。濃縮物をＰｉｅｒｃｅ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒカセット中、２ｘ１ｌのＰＢＳに対して透析した。透析後、ＩｇＧを０．２ミクロンフィルターに通過させ、アリコットして、そして−８０℃で凍結させた。還元および非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーによってＩｇＧを性質決定し、そして１．４５ＯＤ単位が１ｍｇ／ｍｌに等しいという計算吸光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によってＩｇＧを定量化した。Ｎ末端アミノ酸配列決定およびアミノ酸組成解析によって、サブセットをさらに性質決定した。
【０２７３】
（実施例３）
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によるＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体の親和性定数（Ｋｄ）の決定
表面プラズモン共鳴技術、すなわちＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いて、ＩＧＦ１Ｒに対する抗体の結合動力学を測定した。２つの方法によって、抗体を間接的にＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５研究等級センサーチップ上に捕捉した。すべての実験に関して、可動相緩衝液はＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）であり、そして５μｌ／ｍｉｎの流速で捕捉を行った。最初の捕捉法では、センサーチップを、４００ｎＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）および１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物で、７分間活性化した。活性化後、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．８）中、５０μｇ／ｍｌのプロテインＡを７分間経過するまで注入し、そして未反応基を１Ｍエタノールアミンで７分間、反応停止させた。この方法では、各測定前に、新鮮な抗体を共有結合プロテインＡ上に捕捉した。別の捕捉法では、プロテインＡに関して上述するように、マウス抗ヒトＩｇＧをチップに適用した。
【０２７４】
４０μｌ／分で各実験注入を行った。１〜１０μｇ／ｍｌのＩＧＦ１Ｒ細胞外ドメインを、可動相中、５０ｐＭ〜５０ｎＭの間の濃度で、７つの試料試験管に希釈した。各注入期間は１分間であり、その後、解離相測定のため、可動相緩衝液を５分間注入した。注入および解離後、水中の２．２５〜４．５Ｍ塩化マグネシウムで１〜２分間処理してチップを再生した。表７は、各注入からブランクフローセル対照を減じることによって補正し、次いで、ＢＩＡｅｖｌｕｔｉｏｎソフトウェアを用いて７つの濃度すべてに関して動力学を同時に計算した結果を示す。試験する抗体リガンド相互作用の性質を順守して、物質移動曲線フィッティングモデルを伴うラングミュアーフィットを用いた。
表７
【０２７５】
【表７】
2007528201.tif 000028
【０２７６】
（実施例４）
抗体が仲介する、ＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−ＩＩ結合のブロッキング
本発明の抗体が、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ結合を阻害する能力を決定する実験を、４８ウェル組織培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５４８）中で行った。ヒトＩＧＦ−ＩＲを発現するＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３非トランスフェクション線維芽細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４０−０７１）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０−０８１）および５０Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、＃１５０７０−０６３）を補った０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃１１９６０−０４４）中、ウェルあたり６ｘ１０４細胞で蒔いた。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を非特異的細胞結合の対照として用いた。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションして、細胞を付着させ、そして８０〜９０％集密にした。次いで、重層培地を、ウェルあたり０．５ｍｌの、ＤＭＥＭ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０−０８０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび０．１％ウシ血清アルブミン（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ、プロテアーゼ不含、テキサス州カービル）からなる飢餓培地と交換し、そしてプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。続く結合工程はすべて、４℃で行った。試験抗体を氷冷飢餓培地で望ましい最終濃度に希釈し、そしてウェルあたり１００μｌ添加した。すべての試料を２つ組で行った。３０分後、ウェルあたり１００μｌ中の２００ｐＭ放射リガンドを添加することによって、ＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、＃ＮＥＸ２４１）またはＩＧＦ−ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、＃ＩＭ２３８）放射リガンド結合を開始し、そして結合をさらに２．５時間行った。氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０４０−１１７）で細胞単層を３回洗浄し、そして各ウェルに０．５ｍｌの２％ドデシル硫酸ナトリウム／０．２Ｎ  ＮａＯＨを添加し、そしてプレートを６０℃に１５分間加熱することによって、細胞および関連する放射能を遊離させた。ガンマシンチレーション分光によって、溶解物に関連する放射能を定量化した。あるいは、記載する同じ実験を、試験抗体と３７℃で１０分間プレインキュベーションし、次いで４００ｐＭのヨウ素化放射リガンドを添加した後、３７℃で１０分間インキュベーションして行った。
【０２７７】
図２は、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上、４℃での［１２５Ｉ］標識ＩＧＦ−１結合を阻害するＩＧＦ−１Ｒ抗体７Ａ６、９Ａ２、および１２Ａ１、並びに［１２５Ｉ］標識ＩＧＦ−２結合を阻害するＩＧＦ−１Ｒ抗体７Ａ４、８Ａ１、および９Ａ２を用いた競合結合実験の代表的なグラフを示す。
【０２７８】
表８は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体に関して得たＩＣ５０値を示す。商業的に入手可能なＩＧＦ−１Ｒ抗体２４−５７（＃ＭＳ−６４３−ＰＡＢＸ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州フレモント）およびαＩＲ３（＃ＧＲ１１ＳＰ２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を対照として用いた。ＭＯＰＣ−２１（＃Ｍ−７８９４、Ｓｉｇｍａ）をＩｇＧ１アイソタイプ対照として用い、そしてＵＰＣ−１０（＃Ｆ−０５２８）をＩｇＧ２ａアイソタイプ対照として用いた。
表８
【０２７９】
【表８】
2007528201.tif 000029
【０２８０】
（実施例５）
抗体が仲介する、インスリン／インスリン受容体結合のブロッキング
４８ウェル組織平底培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５４８）の細胞に基づくアッセイにおいて、本発明のモノクローナル抗体が、インスリン受容体へのインスリンの結合を阻害する能力を試験する実験を行った。ヒトＩＧＦ−ＩＲでトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または親（未トランスフェクション）ＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４０−０７１）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０−０８１）、１００μＭヒポキサンチンナトリウム＋１．６μＭチミジン；ＨＴサプリメント（Ｇｉｂｃｏ、＃１１０６７−０３０）を補ったＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃１２４４０−０５３）５００μｌ中、ウェルあたり６ｘ１０４細胞で蒔いた。親３Ｔ３細胞をバックグラウンド放射能の対照として用いた。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションして、細胞を付着させ、そして８０〜９０％集密にした。培地をプレートからデカントし、ウェルあたり５００μｌのＩＭＤＭ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０−０８０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび０．１％ウシ血清アルブミン（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ、プロテアーゼ不含、テキサス州ケリービル）からなる飢餓培地すなわちアッセイ培地と交換し、そしてプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。冷アッセイ培地中で抗体を望ましい最終濃度に希釈し、そしてウェルあたり１００μｌを添加した。すべての試料を２つ組で行った。プレートを４℃で３０分間インキュベーションした。［１２５Ｉ］ブタ・インスリン受容体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、＃ＮＥＸ１０４）を冷アッセイ培地中、１００ｐＭの濃度に希釈し、そしてウェルあたり１００μｌを添加した。プレートを４℃で２．５時間インキュベーションし、次いで、培地を吸引し、そして冷ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０４０−１１７）で３回洗浄した。５００μｌの０．２  ＮａＯＨ、２％  ＳＤＳを添加し、そしてプレートを６０℃で１５分間インキュベーションすることによって細胞を溶解した。試料を１２ｘ７５試験管（Ｓａｒｓｔｅｄ、＃５５．４７６、５ｍｌ）に移し、そしてガンマカウンター上のシグナルを読み取った。図３は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が、ヒト・インスリン受容体を発現するＣＨＯ細胞へのインスリンの結合を阻害しないことを示す。本発明の抗体をすべて試験し、そしてこれらはすべて２００ｎＭより高いＩＣ５０を有した。インスリン受容体マウスモノクローナル抗体４７−９（＃ＭＳ−６３３−ＰＡＢＸ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州フレモント）を実験の陽性対照として用いた。
【０２８１】
（実施例６）
ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるインスリン受容体活性化の阻害
本発明の抗体はいずれも、全長ヒト・インスリン受容体を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのインスリンの結合を有意にブロッキングしないが、本発明の抗体が、インスリンが誘導するインスリン受容体チロシンリン酸化および活性化を防止しないことを確実にすることが望ましかった。この目的のため、ヒト・インスリン受容体を発現するＣＨＯ細胞を完全培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４０−０７１）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０−０８１）、１００μＭヒポキサンチンナトリウム＋１．６μＭチミジン；ＨＴサプリメント（Ｇｉｂｃｏ、＃１１０６７−０３０）を補ったＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃１２４４０−０５３））中、６ウェルクラスターに蒔き、そしてウシ胎児血清の代わりに０．５％  ＢＳＡを含有する上記培地を用いて、約８０％集密な細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩飢餓させた。ディッシュを３７℃の循環水槽に入れ、そして１００ｎＭの試験抗体とともに、インスリンなしで、またはヒト・インスリン（Ｓｉｇｍａ、最終濃度１ｎＭ）と、２ｍｌの新鮮な飢餓培地を添加した。３７℃で１５分間インキュベーションした後、ディッシュを氷水上で冷却し、そして氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を溶解し、そして０．３ｍｌ溶解緩衝液（１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−２８５０、Ｐ−５７２６）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−８３４０）カクテル）中に掻き取って採取した。１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離することによって溶解物を清澄にし、そして次いで上清分画の同等のアリコットを、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％  Ｎｕ−ＰＡＧＥゲル、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、そしてニトロセルロース（ＢＡ−８３、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にトランスファーした。インスリン受容体ベータ鎖に対する抗体（ｓｃ−７１１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ホスホチロシンインスリン受容体キナーゼドメインに対する抗体（＃４４−８０２、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、または総タンパク質装填量を知るためのアクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ−２０６６）で膜を探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。図４に示すように、アクチンに関して同等のタンパク質装填条件下で、細胞にインスリンを添加した際は、インスリン受容体のキナーゼドメインの総インスリン受容体リン酸化が観察され、そして陽性対照インスリン受容体ブロッキング抗体（ＭＳ−６３３−ＰＡＢＸ、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）のみが、インスリンに対して１０００倍モル過剰で、インスリン受容体のチロシンリン酸化を有意に阻害した。したがって、本発明の抗体は、インスリン結合も、また、インスリンが仲介する、損なわれていないヒト・インスリン受容体上の受容体チロシンキナーゼリン酸化も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害しない。
【０２８２】
（実施例７）
ＩＧＦ−ＩＲ  ｍＡｂと３Ｔ３  ｈｕ−ＩＧＦ−１Ｒ線維芽細胞の飽和性でそして特異的な結合
本発明のモノクローナル抗体が、ヒトＩＧＦ−１受容体でトランスフェクションしたマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞に、飽和性でそして特異的な方式で、直接結合する能力を試験する実験を行った。モノクローナル抗体１１Ａ４および８Ａ１、並びに陰性対照としてヒトＩｇＧを、自社内で、それぞれ、１９．２μＣｉ／μｇタンパク質、１７．５μＣｉ／μｇタンパク質、および１６．１μＣｉ／μｇタンパク質の比活性に、Ｉｏｄｏｇｅｎで［１２５Ｉ］ヨウ素化した。指数関数的に増殖しているヒトＩＧＦ−１受容体トランスフェクタントＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いた。総結合を測定するため、０．２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−７８８８）および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５６３０−１０６）を含有する氷冷ハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１４１７０−１１２）５０μｌ中の非酵素性細胞解離溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１３１５１−０１４）で細胞培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３１５１）から解離させておいた１０４のヒトＩＧＦ−１受容体トランスフェクタントＮＩＨ−３Ｔ３細胞と、多様な濃度の［１２５Ｉ］ヨウ素化モノクローナル抗体または対照ＩｇＧを、３つ組で、非固着性微量遠心分離試験管（ＶＷＲカタログ番号２０１７０−６５０）中で混合した。混合物を氷上で７０分間インキュベーションした。インキュベーション後、試験管を１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして吸引によって上清分画を取り除いた。０．２％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含有する氷冷ハンクス緩衝塩溶液５０μｌで細胞ペレットを洗浄し、そして１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして吸引によって上清分画を取り除いた。生じた細胞ペレットをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｂｒａ  Ｑｕａｎｔｕｍガンマカウンターで計測した。対応する濃度の［１２５Ｉ］−ヨウ素化モノクローナル抗体または対照ＩｇＧに加えて、２００倍過剰の非標識モノクローナル抗体または対照ＩｇＧを、１０４細胞のヒトＩＧＦ−１受容体トランスフェクタントＮＩＨ−３Ｔ３細胞と混合したことを除いて、総結合測定と同一の様式で、非特異的結合を測定した。対応する対の総結合カウントから、非特異的結合カウントを減じることによって、特異的結合を得た。図５は、対照ＩｇＧと対比した、ヒトＩＧＦ−１受容体トランスフェクタントＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対する１１Ａ４および８Ａ１モノクローナル抗体の飽和性でそして特異的な結合を示す、代表的なグラフである。１１Ａ４、８Ａ１およびＩｇＧアイソタイプ対照のＫｄは、それぞれ、２．２３８、４．００８、および１８６．２であった。
【０２８３】
（実施例８）
ＩＧＦ−１依存性細胞増殖の阻害
ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体のＩｇＧ型を添加すると、３Ｔ３−ｈｕ−ＩＧＦＲ−１Ｒ線維芽細胞のＤＮＡ合成がブロッキング可能であるかどうかを評価するため、ＩＧＦ−１ＲでトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０−０８１）、２０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０−０８０；Ｈｅｐｅｓ）、および０．１％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ、プロテアーゼ不含、テキサス州カービル）を補ったＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１１９６０−０５１）の飢餓培地１００μｌ中、９６ウェルＵ底プレートに、２ｘ１０４／ウェルの細胞密度で蒔いた。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベーションして、細胞を付着させた。マルチチャネルを用いて、飢餓培地５０μｌをプレートから取り除き、そして５０μｌのあらかじめ温めておいた新鮮な飢餓培地／ウェルと交換した。ＩＧＦ−１Ｒ抗体および組換えヒト・インスリン増殖因子−１（ｒＨｕ  ＩＧＦ−１、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ、＃ＨＩＧ−１１００、ロット＃ＨＩＧ９０−１３９）を望ましい最終濃度の４倍に飢餓培地で希釈し、そしてウェルあたり各２５μｌ添加した。すべての試料を２つ組で行った。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションした。刺激の最後の１６時間、１０μｌの希釈ＢｒｄＵ標識溶液（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６４７２２９、細胞増殖Ｅｌｉｓａ、ＢｒｄＵ、比色分析）をすべてのウェルに添加した（最終濃度１０μＭ）。プレートを逆さにして、ペーパータオル上に穏やかにブロッティングすることによって培地をデカントした。次いで、プレートを６０℃で１時間乾燥させた。次いで、Ｆｉｘ  Ｄｅｎａｔ溶液（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６４７２２９）をウェルあたり２００μｌ添加して、そして室温で３０〜４５分間インキュベーションした。次いで、プレートを再びペーパータオル上でデカントし、そして２％  ＢＳＡ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ）を含有するダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０４０−１１７）２００μｌを各ウェルに添加して、室温で３０分間ブロッキングした。ＰＢＳをデカントし、そしてウェルあたり１００μｌの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（モノクローナル抗体、クローンＢＭＧ  ６Ｈ８、ペルオキシダーゼとコンジュゲート化されたＦａｂ断片）を添加し、そして室温で９０分間インキュベーションした。ペーパータオル上でプレートをデカントし、そして軽く叩くことによって、抗体コンジュゲートを取り除いた。プレートを２７５μｌ／ウェルの洗浄溶液（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６４７２２９）で３回リンスした。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（テトラメチル−ベンジジン、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６４７２２９）をウェルに添加し、そして室温で５〜３０分間インキュベーションした。２５μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ、＃ＶＷ３２３２−１）を添加し、そして徹底的に混合しながらおよそ１分間インキュベーションして、さらなるプレート発色を止めた。５９５ｎｍの参照波長に対して、４５０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレート読取装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、モデル＃３５５０���上、光学密度を測定した。図６は、ＩＧＦ−１が駆動する、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞の増殖を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が阻害する能力を示す、代表的なグラフである。
【０２８４】
表９は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、アッセイ条件下で、これらの細胞のＩＧＦ−１依存性増殖を阻害する能力を示す。
表９
【０２８５】
【表９】
2007528201.tif 000030
【０２８６】
（実施例９）
抗体が仲介する、ＩＧＦ−Ｉ誘導性チロシンリン酸化の阻害、または抗体が仲介する、ＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化の増進
本発明の抗体が、ＩＧＦ−Ｉが仲介するＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化／活性化をブロッキング可能であるかどうか、または本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＩＧＦ−１の非存在下で、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化／活性化を増進可能であるかどうかを決定するため、ＥＬＩＳＡ実験を行った。受容体関連チロシンリン酸化の増加によって、ＩＧＦ−Ｉが仲介するＩＧＦ−１Ｒの活性化を検出した。
【０２８７】
ＥＬＩＳＡプレート調製
１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２００ｎｇのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、＃ＭＳ−６４１−ＰＡＢＸ）で、ウェルを４℃で一晩コーティングすることによって、ＥＬＩＳＡ  ９６ウェル捕捉プレートを調製した。２００μｌのブロッキング緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を室温で２時間添加することによって、未占有の結合部位をブロッキングした。洗浄と洗浄の合間にペーパータオル上でプレートをブロッティングして、洗浄緩衝液（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でプレートを３回洗浄した。
【０２８８】
ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞からの溶解物の調製
ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、９６ウェルプレート中、１００μｌ血清不含培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、および０．１％ＢＳＡを補ったＤＭＥＭ高グルコース培地）中で、３ｘ１０４／ウェルで蒔いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションして、細胞を付着させた。培地をデカントし、そして望ましい濃度の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含有する１００μｌ血清不含培地と交換した。すべての測定を３つ組で行った。プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。６０ｎＭのヒトＩＧＦ−Ｉ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ；テキサス州カービル）をウェルあたり２０μｌ添加することによって、細胞を刺激するか、またはヒトＩＧＦ−１を添加せずにインキュベーションして、ＩＧＦ−１の非存在下での抗体のアゴニスト作用（ａｇｏｎｉｓｍ）に関して試験した。プレートを３７℃で１０分間インキュベーションした。プレートを逆さにして、そしてペーパータオル上に穏やかにブロッティングすることによって培地をデカントした。細胞を４℃で、ＰＢＳで３回洗浄した。ウェルあたり１５０μｌの溶解緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−８３４０）、およびホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−２８５０およびＰ−５７２６）阻害剤カクテルを含有するＭ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ））を添加することによって、細胞を溶解した。多数回ピペッティングすることによって溶解物を混合した後、各ウェルから１００μｌの溶解物を、上述のようなＥＬＩＳＡ捕捉プレートに移した。プレートを室温で２時間インキュベーションした。
【０２８９】
抗ホスホチロシン抗体を用いたＥＬＩＳＡ
プレートを逆さにすることによって細胞溶解物を取り除き、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄し、そしてペーパータオル上でブロッティングした。西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（４Ｇ１０−ＨＲＰ）にコンジュゲート化した抗ホスホチロシン抗体１／１０００希釈をウェルあたり１００μｌ添加し、そしてプレートを室温で１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液でプレートを６回洗浄し、そしてペーパータオル上でブロッティングした。ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−４４４４）を添加して、そして暗所中、室温で２〜５分間、プレート発色を進行させることによって、４Ｇ１０−ＨＲＰのプレート結合を検出した。各ウェルに１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、発色反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレート読取装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュルス）を用いて、参照波長としての５９５ｎｍに対して４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０２９０】
アッセイのアゴニスト型の結果を図８に示す。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上の受容体をリン酸化する能力を最低限しか、またはまったく示さない。
【０２９１】
本発明のいくつかの抗体を用いた、少なくとも２回の独立のＥＬＩＳＡ実験の結果を表１０に示す。これらの実験によって、本発明の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＩＧＦ−１が仲介するＩＧＦ−１Ｒチロシンリン酸化をブロッキングする能力が立証された。図９は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体７Ａ２、７Ａ４、８Ａ１、１１Ａ５、１１Ａ１１、および１１Ａ１２、並びにこのアッセイで示された阻害の代表的なグラフを示す。
表１０
【０２９２】
【表１０】
2007528201.tif 000031
【０２９３】
（実施例１０）
ＩＧＦ−１Ｒチロシンリン酸化に対するＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体の影響
本発明の抗体が、ＩＧＦ−１Ｒのリガンド依存性チロシンリン酸化をブロッキングする能力が示されたことから、本発明の抗体が、細胞上のＩＧＦ−１Ｒに結合した際、ＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を直接刺激する能力を評価した。この目的のため、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞の１２ウェルクラスターを、１２ウェル組織培養プレート中、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、約８０％集密まで増殖させた。培地を、血清の代わりに０．１％ＢＳＡを含有する上記培地と交換した。ディッシュを３７℃水槽に入れ、そして１０ｎＭのＩＧＦ−１または試験モノクローナル抗体で１０分間刺激した。次いで、ディッシュを氷水上に置き、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして７５μｌ  １％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、並びにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル中に、各ウェルから細胞を掻き取って採取することによって、細胞溶解物を調製した。１０，０００ｘｇ、５℃で２０分間、掻き取った懸濁物を遠心分離することによって溶解物を清澄にし、そして次いで、ＢＳＡを標準として用い、ブラッドフォード法によって、総タンパク質に関して、２μｌの各上清分画をアッセイした。次いで、既知の体積の清澄にした細胞溶解物を、４−１２％  Ｎｕ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてニトロセルロースにトランスファーした。製造者の指示のとおりに、ウサギ抗ｐＹ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ＃４４−８０４）を用いてウェスタンブロットをインキュベーションし、そしてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌを用いて検出することによって、リン酸化ＩＧＦ−１Ｒを検出した。ＢｉｏＭａｘ  ＭＲ−１フィルム上に２０秒間曝露して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓレーザー濃度計を用いてバンド強度に関してスキャンし、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアで解析した。バンド強度（体積）を各試料に関して装填した総タンパク質で割り、処理しなかったものまたはアイソタイプ対照抗体に対する、ＩＧＦ−１Ｒチロシンリン酸化の度合いを決定した。図７は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上の受容体をリン酸化する能力を最小限しか、またはまったく持たなかったことを示す。この実験の結果によって、本発明の大部分の抗体が、対照抗体に比較した際、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を誘導する検出可能な能力を示さないことが示された。ＩＧＦ−１Ｒに対して測定可能なアゴニスト活性を示したＩＧＦ−１Ｒ抗体（例えば１１Ａ１、２４−５７）は、ＩＧＦ−１Ｒチロシンリン酸化を刺激する際、ＩＧＦ−Ｉよりはるかに有効でなかった。
【０２９４】
（実施例１１）
ＩＧＦ−Ｉまたはモノクローナル抗体によるＩＧＦ−１Ｒのエンドサイトーシス
［１２５Ｉ］標識ＩＧＦ−Ｉに比較して、本発明の［１２５Ｉ］標識モノクローナル抗体の細胞内集積を間接的に測定することによって、ＩＧＦ−１Ｒの細胞内集積速度を調べた。これらの実験では、本発明の抗体のサブセット、特に８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４に重点を置いた。この目的のため、ヒトＩＧＦ−ＩＲを発現している５．０ｘＥ５のＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を含有する２４ウェルクラスターを、ウェルあたり０．５ｍｌの、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび０．２％ＢＳＡを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で一晩培養した。単層を３７℃水槽中、０．３ｎＭの試験モノクローナル抗体またはＩＧＦ−Ｉとともに、１時間経過するまでインキュベーションした。ディッシュを氷水上に置いて、抗体またはリガンドのさらなる内在化を阻害し、そして濃ＨＣｌでｐＨ２．０に調整した氷冷ＰＢＳ、または対照としてのｐＨ７．４の氷冷ＰＢＳで、２０分間に渡って４回、細胞単層を洗浄した。低ｐＨ洗浄工程によって、４℃で、細胞から、細胞表面に結合した放射標識抗体またはＩＧＦ−Ｉの９５％より多くが、効率的に取り除かれる。続いて、ウェルに関連する放射能および細胞を、ウェルあたり０．７５ｍｌの、０．２Ｎ  ＮａＯＨを補った２％ドデシル硫酸ナトリウム中に収集し、そしてガンマシンチレーション分光によって、細胞溶解物放射能を定量化した。総モノクローナル抗体またはリガンド結合を、ｐＨ７．４のＰＢＳで細胞を洗浄した後に保持される細胞関連放射能と定義した。細胞内モノクローナル抗体またはリガンドを、ｐＨ２．０のＰＢＳで細胞を洗浄した後に保持される細胞関連放射能と定義した。細胞表面会合モノクローナル抗体またはリガンド結合を、総結合および細胞内結合の間の相違と定義した。図１４は、［１２５Ｉ］標識ＩＧＦ−１に比較して、［１２５Ｉ］標識モノクローナル抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４の細胞内集積を間接的に測定することによる、ＩＧＦ−１Ｒの細胞内集積の速度を示す。図１４に示す結合等高線は、ＩＧＦ−Ｉおよび試験モノクローナル抗体のエンドサイトーシスおよび細胞内集積が、異なる速度ではあるが、３７℃で、受容体結合に続いて起こることを示す。
【０２９５】
（実施例１２）
ＩＧＦ−１Ｒ下方制御
１）フローサイトメトリーを用いて、表面受容体レベルを測定し、そして２）ウェスタンブロット解析を用いて総受容体レベルを測定することによって、ＩＧＦ−１ＲでトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のＩＧＦ−１Ｒ下方制御に対するＭａｂの影響を試験した。本発明の抗体、特に８Ａ１、９Ａ２、１１Ａ４を用いて、実験を行った。これらの細胞において、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御が観察された。例えば図１１および図１２を参照されたい。ＩＧＦ−１Ｒレベルは、本発明の抗体を添加して３時間後に、５０％より多く減少した。
【０２９６】
ＦＡＣＳ解析用の細胞を調製するため、６ウェルプレート中、ウェルあたり４ｍｌの増殖培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、０．２９ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン、１０００μｇ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ高グルコース培地）中で、ＩＧＦ−１ＲでトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を蒔いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションし、細胞を付着させた。試験１時間前に、プレートから培地を取り除き；４ｍｌの血清不含培地を添加し；ピペットで真空吸引することによって、血清不含培地を取り除き；そしてウェルあたり４ｍｌの別の血清不含培地を添加した。試験のため、血清不含培地中でＩＧＦ−１Ｒ抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌに希釈し、そして望ましい時点で、ウェルあたり４ｍｌの、抗体を含む培地または含まない培地を用いて、プレート中の血清不含培地を交換した。次いで、プレートを残りの時間、３７℃でインキュベーションした。細胞採取時、培地を取り除き、Ｃａ／Ｍｇを含まない冷ＰＢＳでプレートを１回洗浄し、そして次いで、ウェルあたり２ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と３７℃で３分間交換した。次いで、トリプシン処理した細胞試料を、５ｍｌの完全増殖培地を含有する試験管中に氷上で収集した。試験管を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして次いで、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＣａおよびＭｇ不含ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム）で１回洗浄した。細胞数を決定した。９６ウェル丸底プレート中、０．５〜２ｘ１０５細胞／ウェルを蒔いた。プレートを遠心分離し、そしてプレートからＦＡＣＳ緩衝液をデカントし、そしてこれを、一次抗体としてＩｇＧ対照抗体または抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を最終濃度１０μｇ／ｍｌで含有するＦＡＣＳ緩衝液５０μｌと交換した。プレートを４℃で３０分間インキュベーションした。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液でプレートを２回洗浄した。プレートを逆さにして、そしてペーパータオル上に穏やかにブロッティングすることによって培地をデカントし、そして次いで細胞を懸濁するため、新たな緩衝液と交換することによって細胞を洗浄して、そして次いで細胞ペレットを収集した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈したＦＩＴＣコンジュゲート化ロバ抗マウスまたはロバ抗ヒト抗体と細胞を、４℃で３０分間インキュベーションした。染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し；２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し；そして直ちにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｉｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州サンホセ）上に流して、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、カリフォルニア州サンカルロス）を用いて解析した。光散乱で同定される生存細胞上でのみ蛍光強度を解析した。蛍光強度の幾何平均（平均チャネル蛍光またはＭＣＦ）を計算し、そして細胞表面上のＩＧＦ−１Ｒの相対発現を決定するのに用いた。
【０２９７】
トランスフェクション細胞上のＩＧＦ−１Ｒレベルに対する本発明の抗体の効果を評価するのに加えて、これらの抗体が腫瘍細胞株からのＩＧＦ−１Ｒを下方制御する能力を試験することが望ましかった。６ウェルクラスター中、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ１２培地（１：１）を用いて、Ａ５４９細胞（非小細胞肺癌ヒト株、ＡＴＣＣ）を蒔いた。９０％集密に達した後、１０ｎＭの試験抗体またはＩＧＦ−１を含有する、ウェルあたり２ｍｌの新鮮な培地で、培地を交換した。抗体またはリガンドを添加した後、選択した時間に、細胞単層を氷冷ＰＢＳでリンスし、次いで、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、並びにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する、ウェルあたり０．３ｍｌの、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に掻き取って採取した。１０，０００ｘｇ／２０分間遠心分離することによって清澄にした後、上清分画由来の等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって、ｓｃ−７１３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて総ＩＧＦ−１Ｒに関して、そして総タンパク質装填量を知るためアクチンに関して（Ｓｉｇｍａ  Ａ−２０６６）、解析した。図１３に示すように、対照ヒトＩｇＧまたはＩＧＦ−１に比較して、８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４  ＩＧＦ−１Ｒ抗体で、Ａ５４９腫瘍細胞を処理すると、時間に依存して、総ＩＧＦ−１Ｒの優先的な損失が観察された。これに関連して、得られた結果は、ヒトＩＧＦ−１Ｒを過剰発現するＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を用いて観察されるものとよく一致した。このように、ヒトＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する線維芽細胞とともに、内因性ＩＧＦ−１Ｒを発現するヒト腫瘍細胞株両方の総ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を立証可能であった。
【０２９８】
（実施例１３）
ＦＡＣＳによって評価した、モノクローナル抗体によるＩＧＦ−１Ｒ下方制御
ヒトＩＧＦ−１ＲでトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を用いて、モノクローナル抗体が、細胞表面ＩＧＦ−１Ｒのレベルを減少させる能力を試験した。本発明の抗体、特に８Ａ１、９Ａ２、１１Ａ４、および商業的に入手可能なマウスＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体（アルファ−ＩＲ３）を用いて、これらの実験を行った。１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中、６ウェルクラスター中で、細胞をおよそ８０％集密に増殖させた。実験を開始する１時間前に、培地を血清不含ＤＭＥＭ（結合培地）と交換し、そして１μｇ／ｍｌの試験抗体を含有する結合培地中、３７℃／５％ＣＯ２で、８時間経過するまで、細胞をインキュベーションした。
【０２９９】
ＦＡＣＳ解析によって、試験モノクローナル抗体によるＩＧＦ−１Ｒの下方制御の度合いを決定した。選択した時点で、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を欠くＰＢＳで細胞を１回洗浄し、そして次いで、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞をプレートから取り除いた。各ウェル由来の細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ  ５ｍｌ中に収集し、そして１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって収集した。細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を欠き、そして０．１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に再懸濁した。細胞（０．５〜２．０ｘＥ５）を９６ウェル丸底プレート中に蒔き、前のように、遠心分離して細胞をペレットにし、そして１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧまたは同族ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液５０μｌに再懸濁した。氷上で３０分間置いた後、細胞を再びペレットにし、そしてＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した、１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート化ロバ抗マウスＩｇＧまたはロバ抗ヒトＩｇＧと、細胞を、氷上で３０分間インキュベーションした。染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、最終体積２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンカルロス）を備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）上で解析した。光散乱で同定される生存細胞上でのみ蛍光強度を解析した。平均チャネル蛍光（ＭＣＦ）を計算し、そして３７℃で、時間の関数として、細胞表面上のＩＧＦ−１Ｒの相対発現を決定するのに用いた。図１０に示す結果によって、本発明の試験した抗体はすべて、細胞表面ＩＧＦ−１Ｒレベルを減少させるのに有効であったことが示される。
【０３００】
（実施例１４）
エピトープマッピング研究
本発明の抗体がＩＧＦ−１Ｒを認識し、そしてＩＧＦ−１Ｒへのリガンド結合をブロッキングすることが立証されたことから、本発明の抗体のサブセットを用いて、エピトープマッピング研究を行った。これらの実験では、特に７Ａ４、８Ａ１、９Ａ２、１１Ａ４、および１１Ａ１１抗体に重点を置いた。本発明の抗体が、ＩＧＦ−１Ｒの同じ部位または別個の部位に結合するか、評価するため、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞に対する競合結合アッセイを行い、そして商業的に入手可能なマウスＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体を用いて、ＩＧＦ−１Ｒ上に既にマッピングされているエピトープと、本発明の抗体に認識されるエピトープを比較した。この目的のため、Ｉｏｄｏｇｅｎおよび当業者に知られる標準的技術を用いて、１７．４〜２０．３μＣｉ／μｇの比活性に、本発明の抗体を放射標識した。放射ヨウ素化ＩＧＦ−Ｉを商業的供給源（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；＃ＮＥＸ２４１）から購入した。ヒトＩＧＦ−１Ｒを安定して発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２ｘＥ４細胞／ウェルで、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０−０８１）および１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００７０．０３、ユタ州ローガン）を補った１ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃１１９９５−０４０）中、２４ウェル組織培養プレート中に蒔いた。およそ８０％集密になるまで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションし、そして次いで、増殖培地を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０−０８０）および０．５％  ＢＳＡ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ、３０％溶液、プロテアーゼ不含、テキサス州カービル）を含有する１．０ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭと交換し、そしてこの飢餓培地中、上記温度で一晩インキュベーションを続けた。結合アッセイを開始するため、ディッシュを氷水上に置き、そして培地を、６０ｎＭの選択した競合剤を含有する０．２５ｍｌ／ウェルの氷冷飢餓培地と交換し、続いて直ちに、０．６ｎＭの各試験放射標識モノクローナル抗体またはＩＧＦ−Ｉを含有する、等体積の氷冷飢餓培地を添加した。４℃で３時間、結合を進行させ、次いで、細胞単層を０．７５ｍｌ／ウェルの氷冷ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０７０−１１７）で３回洗浄した。０．２Ｎ  ＮａＯＨを補った０．７５ｍｌの２％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、＃２４７３０−０２０）を添加し、そしてディッシュを５０℃に１５分間加熱することによって、ディッシュから細胞および会合する放射能を遊離させた。ガンマシンチレーション分光によって、溶解物放射能を定量化した。各ウェルは、平均１．８ｘＥ５細胞を含有し、そして放射リガンドの既知の比活性に基づいて、溶解物の１分間あたりのカウント（ＣＰＭ）を、１００万細胞あたりに結合した放射リガンドフェントモルに変換した。図１５に示す結果は、本発明の８Ａ１および７Ａ４抗体が、これらのアッセイ条件下で試験した他の抗体より、ＩＧＦ−Ｉ結合に関して、より有効な競合剤であることを示す。さらに、８Ａ１および７Ａ４は、共通の、おそらく同一のＩＧＦ−１Ｒエピトープを共有するようであり、このエピトープは、試験された商業的マウス抗Ｉ���Ｆ−１Ｒモノクローナル抗体すべて（２４−５７、＃ＭＳ−６４３−ＰＡＢＸ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州フレモント；アルファＩＲ３、＃ＧＲ１１ＳＰ２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州サンディエゴ；２４−３１、＃ＭＳ−６４１−ＰＡＢＸ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ；２４−６０、＃ＭＳ−６４４−ＰＡＢＸ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）に認識される、報告される（Ａｄａｍｓら，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ５７：１０５０−１０９３，  ２０００）エピトープと重複する。対照的に、９Ａ２、１１Ａ４、および１１Ａ１１ヒトＩＧＦ−１Ｒは、７Ａ４および８Ａ１に認識されるものと別個であるが、おそらく共有されるかまたは重複するＩＧＦ−１Ｒエピトープを認識するようであった。これらの実験によって、本発明の抗体を異なる結合群に割り当てることが可能となった。これらはまた、本発明のいくつかの抗体が、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する商業的に入手可能なマウス抗体と同一のエピトープまたは類似のエピトープを認識するようであることも示した。図１６は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４に対して、別個のエピトープがあることを示す。
【０３０１】
（実施例１５）
ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた、腫瘍増殖／ＩＧＦ−１Ｒ発現の阻害
モデルの確立：
この実験では３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒ−Ｓ細胞株を用いた。１ｘ１０＾６細胞／マウスを、１０μｌの６０％  ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液によって、メス・ヌードマウスにｓｃ接種した。細胞注射６日後、７０匹のマウス（６０〜７０ｍｍ３の腫瘍を持つ）をランダムに以下のような７群（１０匹／群）に分けた。第７日、第１０日および第１３日に、化合物を投与した。
【０３０２】
群１、ＰＢＳ、２００μｌ、ＩＰ
群２、ヒトＩｇＧ、５００μｇ、ＩＰ
群３、２４−５７、５００μｇ、ＩＰ
群４、８Ａ１、１００μｇ、ＩＰ
群５、８Ａ１、５００μｇ、ＩＰ
群６、１１Ａ４、１００μｇ、ＩＰ
群７、１１Ａ４、５００μｇ、ＩＰ。
【０３０３】
監視：
ノギス（ｖｅｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）によって、腫瘍サイズを週２回記録した。式：ｍｍ３＝長さｘ（幅）２ｘ０．５２によって、体積を計算した。体重を週１回記録した。
図１７は、１ｘ１０＾６の３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒ−Ｓ細胞／マウスを、１０ｍｌの６０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＰＢＳ溶液によって、メス・ヌードマウスにｓｃ接種した結果を示す。腫瘍を持つマウスをランダムに分け、そして第７日、第１０日および第１３日に、化合物を投与した。すべてのマウスを、第１６日に屠殺した。ノギスによって腫瘍サイズを週２回記録した。式：ｍｍ３＝長さｘ（幅）２ｘ０．５２によって、体積を計算した。体重を週１回記録した。
【０３０４】
ヒトｍＡｂ、８Ａ１および１１Ａ４はどちらも、有意な腫瘍遅延効果を有した。腫瘍増殖阻害効果は、代理マウスｍＡｂ、２４−５７に匹敵する。
図１８は、１ｘ１０＾６の３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒ−Ｓ細胞／マウスを、１０ｍｌの６０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＰＢＳ溶液によって、メス・ヌードマウスにｓｃ接種した結果を示す。腫瘍を持つマウスをランダムに分け、そして第７日、第１０日および第１３日に、化合物を投与した。すべてのマウスを、第１６日に屠殺した。ノギスによって腫瘍サイズを週２回記録した。式：ｍｍ３＝長さｘ（幅）２ｘ０．５２によって、体積を計算した。体重を週１回記録した。
【０３０５】
第１５日に残ったＩＧＦ−ＩＲの量は、ＰＢＳ対照では９７．２％であり、ヒトＩｇＧ対照では１０２．８％であり、１００μｇレベルの８Ａ１  ＩｇＧでは１８．６％であり、そして５００μｇレベルの８Ａ１  ＩｇＧでは２４．６％であった。８Ａ１  ＩｇＧは、１００μｇ（４５％腫瘍遅延）または５００μｇ（５６％腫瘍遅延）いずれでも、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害した。２つの処置群間の相違は有意ではない（Ｐ＞０．１）。これらの結果は、１００μｇを超える用量がより有効でない可能性もあることを示す。
【０３０６】
図１９は、１ｘ１０６の３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒ−Ｓ細胞／マウスを、１０ｍｌの６０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＰＢＳ溶液によって、メス・ヌードマウスにｓｃ接種した結果を示す。腫瘍を持つマウスをランダムに分け、そして第７日、第１０日および第１３日に、化合物を投与した。すべてのマウスを、第１６日に屠殺した。ノギスによって腫瘍サイズを週２回記録した。式：ｍｍ３＝長さｘ（幅）２ｘ０．５２によって、体積を計算した。体重を週１回記録した。
【０３０７】
第１５日に残ったＩＧＦ−ＩＲの量は、ＰＢＳ対照では９７．３％であり、ヒトＩｇＧ対照では１０２．７％であり、１００μｇレベルの１１Ａ４  ＩｇＧでは１５．１％であり、そして５００μｇレベルの１１Ａ４  ＩｇＧでは１１．９％であった。このグラフは１１Ａ４の用量反応を示す。ここでも、１００μｇを超える用量で、さらなる有効性は見出されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１】図１ａ〜ｓは、生殖系列配列に対する、ｓｃＦｖ、ＰＩＮＴ−６Ａ１、ＰＩＮＴ−７Ａ２、ＰＩＮＴ−７Ａ４、ＰＩＮＴ−７Ａ５、ＰＩＮＴ−７Ａ６、ＰＩＮＴ−８Ａ１、ＰＩＮＴ−９Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ１、ＰＩＮＴ−１１Ａ２、ＰＩＮＴ−１１Ａ３、ＰＩＮＴ−１１Ａ４、ＰＩＮＴ−１１Ａ５、ＰＩＮＴ−１１Ａ７、ＰＩＮＴ−１１Ａ１２、ＰＩＮＴ−１２Ａ１、ＰＩＮＴ−１２Ａ２、ＰＩＮＴ−１２Ａ３、ＰＩＮＴ−１２Ａ４、およびＰＩＮＴ−１２Ａ５  ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖ抗体の軽鎖領域および重鎖領域のアミノ酸配列の並列を示す。クエリー配列および第一の生殖系列配列間の相違を太字および下線で示す。ＣＤＲ配列を灰色の囲みで強調する。
【図２】図２ａおよび２ｂは、それぞれ、ＩＧＦ−ＩＲ抗体７Ａ６、９Ａ２、および１２Ａ１による、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞へのＩＧＦ−Ｉ結合の阻害、並びにＩＧＦ−ＩＲ抗体７Ａ４、８Ａ１、および９Ａ２による、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞へのＩＧＦ−ＩＩ結合の阻害を示す。
【図３】図３は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が、ヒト・インスリン受容体を発現しているＣＨＯ細胞へのインスリンの結合を阻害しないことを示す。
【図４】図４は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体のいくつかが、リガンド結合に反応したインスリン受容体活性化をブロッキングしないことを示す。
【図５】図５は、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞への、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１および１１Ａ４の飽和性でそして特異的な結合を示す。
【図６】図６は、ＩＧＦ−１が駆動する、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞の細胞増殖を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が阻害することを示す。
【図７】図７は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上のＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を誘導する能力が、最小限であるかまたはまったくないことを、ウェスタンブロット解析によって示す。
【図８】図８は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上のＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を誘導する能力が、最小限であるかまたはまったくないことを、ＥＬＩＳＡ形式を用いて示す。
【図９】図９は、ＩＧＦ−１が駆動する、ＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインのチロシンリン酸化を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体７Ａ２、７Ａ４、８Ａ１、１１Ａ５、１１Ａ１１、および１１Ａ１２が阻害する、相対的能力を示す。
【図１０】図１０は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上で、長期に渡って、表面ＩＧＦ−１Ｒ発現量を減少させることを、ＦＡＣＳによって示す。
【図１１】図１１は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１および１１Ａ４が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上で、長期に渡って、細胞会合ＩＧＦ−１Ｒ総発現を減少させうることを、ウェスタンブロット解析によって示す。
【図１２】図１２は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞上の表面ＩＧＦ−１Ｒレベルを減少させうる（受容体下方制御）ことを示す。
【図１３】［００２６］図１３は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞によって発現されるＩＧＦ−１Ｒレベルを減少させうる（受容体下方制御）ことを示す。
【図１４】図１４は、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているヒト前立腺癌細胞を用い、［１２５Ｉ］標識ＩＧＦ−１に比較して、［１２５Ｉ］標識した本発明のモノクローナル抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４の細胞内集積を間接的に測定することによって、ＩＧＦ−１Ｒの細胞内集積速度を示す。
【図１５】図１５は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上のＩＧＦ−１Ｒの同一のエピトープまたは異なるエピトープに結合することを示す。
【図１６】図１６は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１、９Ａ２、および１１Ａ４が、ＩＧＦ−ＩＲ上に別個の結合エピトープを有することを示す。
【図１７】図１７は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１および１１Ａ４が、腫瘍増殖を阻害し、そしてヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上のＩＧＦ−１Ｒ発現を減少させることを示す。
【図１８】図１８は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体８Ａ１が、腫瘍増殖を阻害し、そしてヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上の腫瘍ＩＧＦ−１Ｒ発現を減少させることを示す。
【図１９】図１９は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体１１Ａ４が、腫瘍増殖を阻害し、そしてヒトＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞上の腫瘍ＩＧＦ−１Ｒ発現を減少させることを示す。
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１１】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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