(57)【要約】【解決手段】本発明は、ヒトの体内では脳を始め、肺、心臓及び骨格筋等に広く存在するプロテインＤ１が、心筋細胞において心肥大を誘導するシグナルカスケードの中心的役割を担っていることを見いだしたことに基づく。具体的には、本発明はＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体の心肥大シグナル伝達経路を阻害することによって、心肥大の誘導を抑制する作用を有する心肥大抑制用の医薬組成物を提供する。また本発明は、上記作用に基づいて、心肥大に起因する心疾患、具体的には心不全、虚血性心疾患または不整脈の予防または治療のために用いられる組成物（心肥大に起因する心疾患の予防または治療用組成物）を提供する。さらに本発明は、当該心肥大シグナル伝達経路の阻害メカニズムに基づいて、心肥大またはその前状態にある被験者の心肥大発生やその進展を抑制する方法を提供する。さらにまた本発明は、上記組成物の有効成分をスクリーニングする方法、並びに心肥大病態モデル非ヒト動物を提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効成分とする、心肥大抑制用医薬組成物。
【請求項２】
有効成分が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現またはその産生物の活性化若しくはリン酸化を抑制する作用を有する物質である、請求項１に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
【請求項３】
有効成分が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型プロテインキナーゼＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、請求項１に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
【請求項４】
有効成分が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである、請求項１に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
【請求項５】
ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効成分とする、心肥大抑制用医薬組成物。
【請求項６】
心肥大が、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体または上皮成長因子受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、請求項１または５に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
【請求項７】
プロテインキナーゼＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大を抑制するか、または心肥大の発生を予防する方法。
【請求項８】
上記物質が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現またはその産生物の活性化若しくはリン酸化を抑制する作用を有するものである、請求項７に記載する方法。
【請求項９】
上記物質が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型プロテインキナーゼＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、請求項７に記載する方法。
【請求項１０】
上記物質が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである、請求項７に記載する方法。
【請求項１１】
ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大を抑制するか、または心肥大の発生を予防する方法。
【請求項１２】
心肥大が、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体または上皮成長因子受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、請求項７または１１のいずれかに記載する方法。
【請求項１３】
プロテインキナーゼＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効成分とする、心肥大に起因する心疾患の発症を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
有効成分が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現またはその産生物の活性化若しくはリン酸化を抑制する作用を有する物質である、請求項１３に記載する医薬組成物。
【請求項１５】
有効成分が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型プロテインキナーゼＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、請求項１３に記載する医薬組成物。
【請求項１６】
有効成分が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである、請求項１３に記載する医薬組成物。
【請求項１７】
ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項１８】
心肥大が、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体または上皮成長因子受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、請求項１３または１７に記載する医薬組成物。
【請求項１９】
プロテインキナーゼＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大に起因する疾患の発症を予防し、また治療する方法。
【請求項２０】
上記物質が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現またはその産生物の活性化若しくはリン酸化を抑制する作用を有するものである、請求項１９に記載する方法。
【請求項２１】
上記物質が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型プロテインキナーゼＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、請求項１９に記載する方法。
【請求項２２】
上記物質が、心筋細胞におけるプロテインキナーゼＤ１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである、請求項１９に記載する方法。
【請求項２３】
ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大に起因する疾患の発症を予防し、また治療する方法。
【請求項２４】
心肥大が、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体または上皮成長因子受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、請求項１９または２３のいずれかに記載する方法。
【請求項２５】
心筋細胞において構成的活性型プロテインキナーゼＤ１のいずれか少なくとも１つが強制発現してなる、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２６】
心肥大の病態モデル動物である、請求項２５に記載するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２７】
心筋細胞においてドミナント・ネガティブ型プロテインキナーゼＤ１が強制発現してなる、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２８】
（１）下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) プロテインキナーゼＤ１を発現し得る細胞に被験物質を接触させる工程、
(b) 上記細胞について、プロテインキナーゼＤ１の発現レベルを測定し、被験物質を接触させない対照の細胞におけるプロテインキナーゼＤ１の発現レベルと対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の細胞に比して、プロテインキナーゼＤ１の発現レベルが低下してなる細胞と接触させた被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【請求項２９】
下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) プロテインキナーゼＤ１を発現し得る細胞に、プロテインキナーゼＤ１活性化剤及び被験物質を接触させる工程、
(b) 上記細胞について、プロテインキナーゼＤ１の活性を測定し、被験物質を接触させない対照の細胞における上記に対応する活性と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の細胞に比して、プロテインキナーゼＤ１の活性が低下してなる細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【請求項３０】
下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) 心筋細胞に、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質受容体または上皮成長因子受容体を刺激する心肥大誘導剤と被験物質を接触させる工程、
(b) 上記心筋細胞について、プロテインキナーゼＤ１の活性、α−アクチニンのサルコメアにおけるリン酸化プロテインキナーゼＤ１の局在性、またはプロテインキナーゼＣεとプロテインキナーゼＤ１との２分子間距離を測定し、心肥大誘導剤だけを接触させた対照の心筋細胞における上記に対応する活性、局在性または２分子間距離と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の心筋細胞に比して、プロテインキナーゼＤ１の活性若しくはα−アクチニンのサルコメアにおけるリン酸化プロテインキナーゼＤ１の局在性が低下してなるか、またはプロテインキナーゼＣεとプロテインキナーゼＤ１との２分子間距離が増大してなる心筋細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【請求項３１】
下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) 構成的活性型プロテインキナーゼＣεまたは構成的活性型プロテインキナーゼＤ１を発現し得る心筋細胞に、被験物質を接触させる工程、
(b) 上記心筋細胞について、プロテインキナーゼＤ１の活性、α−アクチニンのサルコメアにおけるリン酸化プロテインキナーゼＤ１の局在性、またはプロテインキナーゼＣεとプロテインキナーゼＤ１との２分子間距離を測定し、被験物質を接触させない対照の心筋細胞における上記に対応する活性、局在性または２分子間距離と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の心筋細胞に比して、プロテインキナーゼＤ１の活性若しくはα−アクチニンのサルコメアにおけるリン酸化プロテインキナーゼＤ１の局在性が低下してなるか、またはプロテインキナーゼＣεとプロテインキナーゼＤ１との２分子間距離が増大してなる心筋細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【請求項３２】
下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) 請求項２５に記載するトランスジェニック非ヒト動物に、被験物質を投与する工程、
(b) 上記非ヒト動物について心肥大の程度を測定し、被験物質を投与しない対照のトランスジェニック非ヒト動物の心肥大の程度と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、心肥大を低下または抑制させる被験物質を心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【請求項３３】
心肥大に起因する心疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の取得方法である、請求項２８〜３２のいずれかに記載するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心肥大発生機構、より詳細には心肥大を誘導するシグナル伝達経路に関して新たな知見を提供するものである。さらに本発明は、かかる知見に基づいて、心肥大の発生を抑制するために用いられる組成物（心肥大抑制用組成物）に関する。また本発明は、上記作用に基づいて、心肥大に起因する疾患、具体的には心肥大によって生じる心不全などの心機能障害の発症を予防または治療するために用いられる組成物（心肥大に起因する心疾患の予防または治療用組成物）に関する。
【０００２】
さらに本発明は、心肥大発生機構に関する新たな知見に基づいて、被験者について心肥大を抑制する方法、並びに心肥大に起因する心疾患（具体的には心不全等の心機能障害）を予防または治療する方法に関する。
【０００３】
さらにまた本発明は、上記組成物（心肥大抑制用組成物、または心肥大に起因する心疾患の予防または治療用組成物）の有効成分をスクリーニングする方法に関する。また本発明は、心肥大の病態を模倣した病態モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００４】
心臓は個体発生の極めて早期に分化し、分化後すぐに自立拍動を開始する臓器である。心筋細胞は分化後も分裂能を維持し、胎生期の間は活発に分裂増殖を続けるが、出生後はその増殖能は急速に低下する。このため、出生後の心筋細胞には、再生能力がなく、その後の心臓の成長は個々の心筋細胞の大きさが増すという生理的肥大によってのみ行われると考えられている。心臓の肥大（心肥大）は、筋原線維の幅の増加（これは、心筋壁の肥厚化、すなわち「求心性肥大」を生じる）によって引き起こされるか、または筋原線維の長さの増加（これは、室の拡張、すなわち「遠心性肥大」を生じる）によって引き起こされる。これらの対照的な肥大の形態は、それぞれサルコメア（sarcomere）の平行構築（parallel assenbly）及び連続構築（serial assembly）によってもたらされる。
【０００５】
心肥大は、出生後の生理学的適応に応じて、または運動によって誘導されるが、この場合は上記求心性肥大と遠心性肥大が同時にバランスよく生じ、要求量の増加に応じて心臓のポンプ輸送能力を増加させるもので、正常な生理学的現象である。
【０００６】
一方、病的に生じる心臓への負荷も心肥大を誘導する。具体的には、高血圧症や心弁膜症による心室への負荷の増大、あるいは心筋梗塞、心筋炎や心筋症などによる心筋細胞自体の障害が生じると、心臓は主として心筋細胞を肥大化させることにより心拍出量を保つようにその形態を変え、いわゆる心肥大となる。このような心肥大は、ある程度までは心筋細胞障害や機械的負荷に対する代償現象と考えられるが、過剰な負荷が持続的に加わり心肥大が著しいときには、心臓の収縮機能や拡張機能が破綻し、心拍出量が低下して慢性心不全に至るとともに、虚血性心疾患に陥りやすく、致死性の不整脈も発生しやすくなる。また、こうした心臓への病的な負荷は、その負荷に依存して求心性肥大または遠心性肥大のいずれかが優勢であり、心不全に至らないまでも肥大型心筋症または拡張型心筋症の発症を引き起こす。
【０００７】
最近、心肥大は心不全等の心臓疾患への移行の独立危険因子として認識されており、米国の大規模追跡調査であるFramingham Heart Study等により、心肥大があると心不全を始め、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患、不整脈など心血管系疾患の発症率が２.５〜３倍に上昇することも判明している（山崎力、矢崎義雄、「心不全」、第37-45頁、篠山重威編、医薬ジャーナル社、1997年）。従って、過度の心肥大の形成を抑制するか、あるいは心肥大を退縮させる薬剤は、慢性心不全を含む心臓病の発症の進展の防御に有効に使用できると考えられる。
【０００８】
慢性心不全に対する治療法としては、従来心臓の収縮力を改善し、心拍出量を増大する目的で強心薬が主に用いられてきた。しかしながら、強心薬は急性的に自覚症状改善効果、運動耐容能改善効果を示すものの、慢性心不全治療の最終目標である生命予後の改善、すなわち延命効果の面では効果がなく、むしろ予後を悪化させるという結果が得られている（Pacher et al., N.Engl.J.Med., Vol.325, p.1468, 1991）。
【０００９】
一方、心肥大の発生機構に関しては心肥大シグナル伝達経路の存在が指摘されており、刺激因子によって、タンパク質合成、サルコメアの構築及び組織化、並びに遺伝子発現を調節するシグナル伝達経路が活性化されることによって、心肥大が発生し、また進展することが知られている（Chien, K.R., Cell, 98, p555-558, 1999: Nicol,R.L., et al., Ann. Rev. Gen. Gen., 1, p.179-223, 2000: Sugden, P.H. et al, J. Mol. Med., 76, p.725-746, 1998）。
【００１０】
上記刺激因子として、例えばプロテインキナーゼ（例えば、ERK、JNK、及びp38MAPK等のmitogenactivated protein kinase[MAPK]ファミリー）、及び液性因子（例えば、アンジオテンシンII、エンドセリン−１などの血管作動物質、エピネフリンなどの神経因子、カルジオトロフィン１，白血病抑制因子[LIF]等のサイトカン、インスリン、ＩＧＦ−１などの増殖因子）が知られている。上記プロテインキナーゼは、心筋細胞の伸展という機械的な負荷によって活性化される他、液性因子によっても活性化され、かかる活性化反応を介してc-fos、c-myc、c-junなどの転写調節因子が活性化されて、心肥大に関連する蛋白質の誘導が引き起こされると考えられている。また、最近では、機械的刺激やアンジオテンシンII、エンドセリン−１及びエピネフリンなどの刺激によって細胞内カルシウムのレベルが上昇すること、構成的活性型のカルシニューリンを発現するマウスで心肥大が誘導されること（Olson et al., Cell, 93, p.215-223, 1998）等から、心肥大形成におけるカルシウムの役割が注目されている。また、カルモジュリンを強制発現したマウスの心筋において、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（ＣａＭキナーゼII）活性が約２倍に上昇して、顕著な心肥大が観察されること（Mol Endocrinol 14, p.1125-1136, 2000）、構成的活性型ＣａＭキナーゼIVを心臓特異的に発現したマウスに心肥大が確認されること（J Clin Invest 105, p.1395-1406, 2000）等から、ＣａＭキナーゼII及びIVも、心肥大形成を刺激する因子として考えられている。
【００１１】
このため、心肥大の発生を抑制する目的で、これらの刺激因子の産生を阻害するかあるいはこれを介した心肥大シグナル伝達を抑制もしくは遮断する薬剤の開発、並びに臨床応用が進められている（例えば、アンジオテンシンIIの産生阻害剤、α１-遮断薬、エンドセリン受容体拮抗剤等：J. Cardiovasc. Pharmacol., 27, S36-S40, 1996：Br. J. Pharmacol., 118, p.549-556, 1996：Cardiovasc. Res., 23, p.315-333, 1989： Circ. Res., 73, p.887-897, 1993）。しかし、生体内において心肥大の発生機序にはこれらの因子が複数関わっており、単一因子に対する拮抗作用だけでは不十分であることも指摘されている。例えば、アンジオテンシンIIを産生する酵素であるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤は、モデル動物において心肥大の発症進展を抑制し（Brilla et al.,Circulation, Vol.83, p.1771, 1991）、臨床的にも慢性心不全患者に投与した場合に、心肥大を退縮させ、生命予後を延長することが観察されているが（The save Investigation, N. Engl. J. Med., Vol.327, p.678, 1992）、その効果は未だ十分なものとは云えない。実際に、最先端の治療を行っても、慢性心不全の発症後、５年間の死亡率は現在なお約５０％に達している。最近、エンドセリン拮抗薬（Ito et al., Circulation, Vol.89, p.2198, 1994）やバソプレッシン拮抗薬（Tumura et al., Circulation, Vol.94, (Supple. I-264), 1996）がモデル動物において心肥大の形成を抑制することも報告されているが、さらに新しいメカニズムに基づいて、心肥大が抑制できる心疾患予防・治療剤の開発が望まれている。
【００１２】
一方、プロテインキナーゼＤ１（以下、ＰＫＤ１ともいう）は、アミノ末端領域に制御領域を、またカルボキシ末端領域にセリン・スレオニン特異的プロテインキナーゼをコードする触媒領域を有する、約１１０ＫＤａ（910-920アミノ酸残基）からなる蛋白質である。さらに上記の制御領域には、膜相互作用領域（ＴＭ）、連続した亜鉛フィンガー（Cys-rich, Zn-finger like）から構成される２つのＣＲ（Cys-rich）ドメイン、及びＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメインが存在している（図１参照）。
【００１３】
ヒト由来ＰＫＤ１は、制御領域のＣＲドメインと触媒領域との相互作用により分子全体が折り畳まれており、この状態では不活性であると考えられている（不活性型ＰＫＤ１）。しかし、ホスホイノシタイド依存性キナーゼ１（phosphoinositide-dependent kinase 1：ＰＤＫ１）が作用すると、ＰＨドメインまたはその近傍に位置する活性ループ部位（Ser-744 [ＰＨ内], Ser-748 [ＰＨより少し下流]）がリン酸化されて、触媒的に活性化状態に移行する。さらに、ＣＲドメインは、Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール（ＤＧ）またはホルボールエステル（例えばＴＰＡ等）に対して高い親和性を有しており、かかるドメインにこれらの成分が結合すると、ＣＲドメインから触媒領域が解離し、一層活性化され、次いでＣ末端の触媒領域（Ser-916）が自動リン酸化されて分子全体が完全に活性化される（全活性型ＰＫＤ１）ことが知られている（Van Lint, J., et al., J. Biol. Chem. 3, p.1455-1461, 1995： Zugaza, J.L., et al, EMBO J. 15, p.6220-6230, 1996；  Zugaza, J.L., et al, J. Biol. Chem. 272, p.23952-23960, 1997；Iglesias, T., et al., J. Biol. Chem. 273, p.27662-27667, 1998：Iglesias, T., et al., J. Biol. Chem. 273, p.27662-27667, 1998）。
【００１４】
ＰＫＤ１は、同定当初は、その構造的特徴からプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーの一つ（ＰＫＣμ）として同定されたが、触媒領域のアミノ酸配列がＰＫＣファミリーと相違していること等の理由から（ＰＫＣファミリー間ではこの領域のアミノ酸配列は高く保存されている）、今では、ＰＫＣとは別個の独自のプロテインキナーゼファミリーに属していると考えられている。また、幾つかのＰＫＣのアイソフォーム（PKCη、PKCε、PKCβI）が、ヒト由来ＰＫＤ１の活性ループ部位（Ser-744）及びその近傍部位（Ser-748）をリン酸化することによって、ＰＫＤ１を活性化することが示されている（Maeda, Y., et al., EMBO J. 20, p.5982-90, 2001: Waldron, R.T., et al., J. Biol. Chem. 274, p.9224-9230, 1999; Waldron, R.T., et al., J. Biol. Chem. 276, p.32606-32615, 2001）。
【００１５】
ＰＫＤ１は、ヒト体内では、脳、肺、心臓並びに骨格筋等、心臓を問わず、多くの組織に発現し存在している。ＰＫＤ１の一部はゴルジ装置に局在しており（Iglesias, T., et al., FEBS Lett. 454, p.53-56, 1999: Jamora, C, et al., Cell. 98, p.59-68, 1999: Liljedahl, M., et al., Cell. 104, p.409-420, 2001）、ゴルジ機能に重要な役目を担っていることが知られている（Van Lint, J., et al., Trends in Cell Biol.12, p.193-200, 2002）。
【００１６】
このように、従来、ＰＫＤ１について、心臓における生理学的な機能や役割については一切知られていなかったのが実情である。
【００１７】
またプロテインキナーゼＣ（以下、ＰＫＣともいう）に関しては、心筋においてＰＫＣのアイソフォームの一つであるＰＫＣεが顕著に発現しており、サルコメアＺディスクに局在して心肥大に関わっていることが示唆されている（Takeishi, Y., et al., Circ. Res. 86, p.1218-1223, 2000）。更に、構成的に活性なＰＫＣεを遺伝子組換えで強制発現させると心肥大を発生することが報告されている（Mochly-Rosen, D., et al., Circ Res., 86, p.1173-1179, 2000）。
【００１８】
しかしながら、心肥大の発症及び進展に関してＰＫＤ１が関係していること、並びにＰＫＤ１とＰＫＣεとが相互に関係していることについては、一切知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、第１に、慢性心不全などの心疾患の発症・進展に関わる心肥大の抑制に有効な医薬組成物を提供する。より詳細には、本発明は、心肥大シグナル伝達に関わるＰＫＤ１の心筋細胞での機能発現を抑制する物質を有効成分とする心肥大抑制剤（心肥大抑制用医薬組成物）を提供する。第２に、本発明は、かかるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質によって心肥大シグナル伝達を遮断もしくは抑制することによって、心肥大に起因する各種心疾患の発症や進展を抑制することのできる医薬組成物を提供する。さらに本発明は、心肥大を抑制して心肥大の発生を予防する方法、並びに当該心肥大に起因して生じる慢性心不全などの各種心疾患の発症や進展を予防しまた治療する方法を提供する。
【００２０】
さらにまた、本発明は、新たに見いだされた心肥大発生機構に基づいて、心肥大抑制剤、または心肥大に起因して発症・進展する心疾患の治療若しくは予防に有効な成分を探索し選択する方法を提供し、かかる成分を有効成分とする医薬組成物（心肥大抑制用医薬組成物、心肥大に起因する心疾患予防・治療用の医薬組成物）を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、特に心筋細胞においてＰＫＤ１を強制発現させることによって心肥大化を促進してなる、心肥大病態モデル非ヒト動物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、心筋細胞における肥大シグナル伝達におけるプロテインキナーゼＤ１（ＰＫＤ１）の役割、並びにＰＫＤ１とプロテインキナーゼＣε（ＰＫＣε）との相互作用を調べた。その結果の詳細は後述する実施例に示すが、(1)心筋細胞においてＰＫＤ１は著量に発現しており、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を介する刺激（例えば、アンジオテンシンII[ＡｎｇII]やノルエピネフリン[ＮＥ]などによる刺激）によって全活性化（リン酸化）されて、サルコメアＺディスクに移行して局在化すること、(2)当該ＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）はＰＫＣεの活性化に依存しており、心筋細胞内でＰＫＤ１はＰＫＣεと相互作用して、ＰＫＣεによって直接活性化されること、(3)全活性型ＰＫＤ１（（リン酸化ＰＫＤ１）及び活性型ＰＫＣεをそれぞれ心筋細胞内で強制発現させると、心筋細胞は心肥大誘導剤で処理した場合と同様な心肥大化状態を示すが、不活性型ＰＫＤ１（不リン酸化ＰＫＤ１）を強制発現した後、心肥大誘導処理しても心筋細胞の肥大化は見られないこと等、の結果が得られた。かかる結果は、心肥大化シグナル伝達経路におけるシグナル因子としてＰＫＤ１が深く関わっていること、そしてＰＫＤ１はＰＫＣεによって直接活性化されて心肥大を引き起こす、ＰＫＣεの下流ファクターであることを示す。
【００２３】
そしてこれらの結果は、心筋細胞におけるＰＫＤ１活性を阻害することで、その経路のシグナル伝達を遮断して心肥大化を抑制もしくは低下させることができ、心肥大抑制剤並びに心疾患予防・治療剤としての臨床的応用が可能であること、また逆に、心筋細胞におけるＰＫＤ１活性を増大させることで、心肥大化を促進することができ、心肥大病態モデル動物の作成及び提供が可能であることを示唆するものである。
【００２４】
また、ＥＮＨ１は、心肥大シグナルに関与するシグナル因子（ＰＫＣ）を心筋細胞サルコメアＺディスクにリクルートし、そこに繋ぎ止める足場タンパク質であり、心肥大のシグナリングに関わっていることが知られているが（Nakagawa N, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 272(2), p.505-512, 2000）、本発明者らは、今回、ＥＮＨ１のＬＩＭドメインを欠失したスプライス変異体ＥＮＨ２が、上記ＥＮＨ１が介する心肥大シグナルを抑制する内在性アンタゴニストであることを見いだした。この結果は、心筋細胞においてＥＮＨ２を強制発現させることによってＥＮＨ１が関与する心肥大シグナル伝達を抑制制御することができ、心肥大抑制剤並びに心疾患予防・治療剤としての臨床的応用が可能であることを示唆するものである。
【００２５】
本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。具体的には、本発明は下記の態様を包含する：
Ｉ．心肥大抑制用医薬組成物
（１）ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効成分とする、心肥大抑制用医薬組成物。
（２）有効成分が、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する作用を有する物質である、（１）に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（３）有効成分が、ヒト由来のＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも１つのリン酸化を抑制する作用を有する物質である、（１）または（２）に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（４）有効成分が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、（１）または（２）に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（５）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（４）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（６）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（５）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（７）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（５）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（８）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（５）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（９）有効成分が、心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（１）または（２）のいずれかに記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（１０）有効成分が、ＰＫＤ１のアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである（９）に記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（１１）有効成分が、ＰＫＤ１若しくはリン酸化されていてもよいその断片に対する抗体である（１）または（２）のいずれかに記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（１２）ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効成分とする、心肥大抑制用医薬組成物。
（１３）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（１２）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（１４）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（１３）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（１５）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（１３）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（１６）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（１３）に記載の心肥大抑制用医薬組成物。
（１７）心肥大が、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、（１）乃至（１６）のいずれかに記載する心肥大抑制用医薬組成物。
（１８）更に、ｇｐ１３０レセプター阻害剤を含有する（１）乃至（１６）のいずれかに記載する心肥大抑制用医薬組成物。
【００２６】
II．心肥大の抑制、また心肥大発生の予防方法
（１）ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大を抑制するか、または心肥大の発生を予防する方法。
（２）上記物質が、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する作用を有するものである、（１）に記載する方法。
（３）上記物質が、ヒト由来ＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも１つのリン酸化を抑制する作用を有するものである、（１）または（２）に記載する方法。
（４）上記物質が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、（１）または（２）に記載する方法。
（５）上記核酸が発現ベクター内に含まれているものである（４）に記載の方法。
（６）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（５）に記載の方法。
（７）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれているものである、（５）に記載の方法。
（８）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（５）に記載の方法。
（９）上記物質が、心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（１）または（２）に記載する方法。
（１０）上記物質が、ＰＫＤ１のアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである（９）に記載する方法。
（１１）上記物質が、ＰＫＤ１もしくはリン酸化されていてもよいＰＫＤ１の断片に対する抗体である（１）または（２）に記載する方法。
（１２）ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大を抑制するか、または心肥大の発生を予防する方法。
（１３）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（１２）に記載の方法。
（１４）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（１３）に記載の方法。
（１５）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（１３）に記載の方法。
（１６）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（１３）に記載の方法。
（１７）心肥大が、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、（１）乃至（１６）のいずれかに記載する方法。
（１８）更に、ｇｐ１３０レセプター阻害剤を投与することを含む（１）乃至（１７）のいずれかに記載する方法。
【００２７】
III．心肥大に起因する心疾患の予防または治療用医薬組成物
（１）ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効成分とする、心肥大に起因する心疾患の発症を予防または治療するための医薬組成物。
（２）有効成分が、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する作用を有する物質である、（１）に記載する医薬組成物。
（３）有効成分が、ヒト由来ＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも１つのリン酸化を抑制する作用を有する物質である、（１）または（２）に記載する医薬用組成物。
（４）有効成分が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、（１）または（２）に記載する医薬組成物。
（５）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（４）に記載の医薬組成物。
（６）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（５）に記載の医薬組成物。
（７）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（５）に記載の医薬組成物。
（８）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（５）に記載の医薬組成物。
（９）有効成分が、心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（１）または（２）に記載する医薬組成物。
（１０）有効成分が、ＰＫＤ１のアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである（９）に記載する医薬組成物。
（１１）有効成分が、ＰＫＤ１若しくはリン酸化されていてもよいＰＫＤ１の断片である（１）または（２）に記載する医薬組成物。
（１２）ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効成分とする、心肥大に起因する心疾患の発症を予防または治療するための医薬組成物。
（１３）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（１３）に記載の医薬組成物。
（１６）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（１３）に記載の医薬組成物。
（１７）心肥大が、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、（１）乃至（１６）のいずれかに記載する医薬組成物。
（１８）心肥大に起因して生じる心疾患が、心不全、虚血性心疾患、または不整脈である（１）乃至（１７）のいずれかに記載する医薬組成物。
（１９）更に、ｇｐ１３０レセプター阻害剤を含有する（１）乃至（１６）及び（１８）のいずれかに記載する医薬組成物。
【００２８】
IV．心肥大に起因する心疾患の予防または治療方法
（１）ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大に起因する疾患の発症を予防し、また治療する方法。
（２）上記物質が、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する作用を有するものである、（１）に記載する方法。
（３）上記物質が、ヒト由来ＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも１つのリン酸化を抑制する作用を有するものである、（１）または（２）に記載する方法。
（４）上記物質が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、（１）または（２）に記載する方法。
（５）上記核酸が発現ベクター内に含まれているものである（４）に記載の方法。
（６）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（５）に記載の方法。
（７）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれているものである、（５）に記載の方法。
（８）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（５）に記載の方法。
（９）上記物質が、心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（１）または（２）に記載する方法。
（１０）上記物質が、ＰＫＤ１のアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである（９）に記載する方法。
（１１）上記物質が、ＰＫＤ１若しくはリン酸化されていてもよいＰＫＤ１の断片である（１）または（２）に記載する方法。
（１２）ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することを含む、当該被験者について心肥大に起因する疾患の発症を予防し、また治療する方法。
（１３）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（１４）に記載の方法。
（１４）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（１３）に記載の方法。
（１５）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（１３）に記載の方法。
（１６）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（１３）に記載の方法。
（１７）心肥大が、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介する心肥大シグナル伝達によって生じるものである、（１）乃至（１６）のいずれかに記載する方法。
（１８）心肥大に起因して生じる心疾患が、心不全、虚血性心疾患、または不整脈である（１）乃至（１７）のいずれかに記載する方法。
（１９）心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質に加えて、更に、ｇｐ１３０レセプター阻害剤を投与することを含む（１）乃至（１６）及び（１８）のいずれかに記載する方法。
【００２９】
Ｖ．心肥大シグナル伝達を遮断もしくは抑制する方法
（１）心筋細胞に、ＰＫＤ１の機能発現を阻害する物質を、有効量投与することを含む、心肥大シグナル伝達を遮断する方法。
（２）上記物質が、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する作用を有するものである、（１）に記載する方法。
（３）上記物質が、ヒト由来ＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも１つのリン酸化を抑制する作用を有するものである、（１）または（２）に記載する方法。
（４）上記物質が、心筋細胞において発現可能に制御されたドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする塩基配列を有する核酸である、（１）または（２）に記載する方法。
（５）上記核酸が発現ベクター内に含まれているものである（４）に記載の方法。
（６）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（５）に記載の方法。
（７）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれているものである、（５）に記載の方法。
（８）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（５）に記載の方法。
（９）上記物質が、心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（１）または（２）に記載する方法。
（１０）上記物質が、ＰＫＤ１のアンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉエフェクターである（９）に記載する方法。
（１１）上記物質が、ＰＫＤ１若しくはリン酸化されていてもよいＰＫＤ１の断片である（１）または（２）に記載する方法。
（１２）心筋細胞に、ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効量投与することを含む、心肥大シグナル伝達を遮断する方法。
（１３）上記核酸が発現ベクター内に含まれている（１２）に記載の方法。
（１４）上記発現ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである（１３）に記載の方法。
（１５）上記発現ベクターがウイルス粒子または中空ナノ粒子内に含まれている、（１３）に記載の方法。
（１６）上記発現ベクターがリポソームで構成される、（１３）に記載の方法。
（１７）心肥大が、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介する肥大シグナル伝達によって生じるものである、（１）乃至（１６）のいずれかに記載する方法。
（１８）更に、ｇｐ１３０レセプター阻害剤を投与することを含む（１）乃至（１６）のいずれかに記載する方法。
【００３０】
VI．トランスジェニック非ヒト動物
（１）心筋細胞において構成的活性型ＰＫＤ１が強制発現してなる、トランスジェニック非ヒト動物。
（２）構成的活性型ＰＫＤ１が、ヒト由来ＰＫＤ１の ＰＨドメインを欠失してなるもの、ヒト由来ＰＫＤ１のアミノ酸配列の744位及び748位のセリンがグルタミン酸に置換されてなるもの、及びマウス由来ＰＫＤ１のアミノ酸配列の744位及び748位のセリンがグルタミン酸に置換されてなるものより選択される少なくとも１つである、（１）に記載するトランスジェニック非ヒト動物。
（３）心肥大の病態モデル動物である、（１）または（２）に記載するトランスジェニック非ヒト動物。
（４）心筋細胞においてドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１が強制発現してなる、トランスジェニック非ヒト動物。
（５）ドミナント・ネガティブ型プロテインキナーゼＤ１が、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列612位のリジンがトリプトファンに置換されてなるもの、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列618位のリジンがアスパラギンに置換されてなるもの、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列733位のアスパラギン酸がアラニンに置換されてなるもの、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列738位及び742位のセリンがアラニンに置換されてなるもの、マウスＰＫＤ１のアミノ酸配列618位のリジンがメチオニンに置換してなるもの、及びマウス由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列744位及び748位のセリンがアラニンに置換されてなるものより選択される少なくとも１つである
、（４）に記載するトランスジェニック非ヒト動物。
【００３１】
VII．スクリーニング方法
（１）下記の工程を含む、心肥大抑制剤をスクリーニングする方法：
(a) ＰＫＤ１を発現し得る細胞に被験物質を接触させる工程、
(b) 上記細胞について、ＰＫＤ１の発現レベルを測定し、被験物質を接触させない対照の細胞におけるＰＫＤ１の発現レベルと対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の細胞に比して、ＰＫＤ１の発現レベルが低下してなる細胞と接触させた被験物質を、心肥大抑制剤として選択する工程。
（２）下記の工程を含む、心肥大抑制剤をスクリーニングする方法：
(a) ＰＫＤ１を発現し得る細胞に、ＰＫＤ１活性化剤及び被験物質を接触させる工程、
(b) 上記細胞について、ＰＫＤ１の活性を測定し、被験物質を接触させない対照の細胞における上記に対応する活性と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の細胞に比して、ＰＫＤ１の活性が低下してなる細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤として選択する工程。
（３）下記の工程を含む、心肥大抑制剤をスクリーニングする方法：
(a) 心筋細胞に、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を刺激する心肥大誘導剤と被験物質を接触させる工程、
(b) 上記心筋細胞について、ＰＫＤ１の活性、サルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離を測定し、心肥大誘導剤だけを接触させた対照の心筋細胞における上記に対応する活性、局在性または２分子間距離と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の心筋細胞に比して、ＰＫＤ１の活性若しくはサルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性が低下してなるか、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離が増大してなる心筋細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤として選択する工程。
（４）下記の工程を含む、心肥大抑制剤をスクリーニングする方法：
(a) 構成的活性型ＰＫＣεまたは構成的活性型ＰＫＤ１を発現し得る心筋細胞に、被験物質を接触させる工程、
(b) 上記心筋細胞について、ＰＫＤ１の活性、サルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離を測定し、被験物質を接触させない対照の心筋細胞における上記に対応する活性、局在性または２分子間距離と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の心筋細胞に比して、ＰＫＤ１の活性若しくはサルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性が低下してなるか、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離が増大してなる心筋細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤として選択する工程。
（５）構成的活性型ＰＫＣεが、ヒト由来ＰＫＣεにおいてそのアミノ酸配列の156−162領域が欠失してなるものである（４）記載のスクリーニング方法。
（６）構成的活性型ＰＫＤ１が、ヒト由来ＰＫＤ１においてそのアミノ酸配列の744位及び748位のセリンがグルタミン酸に置換されてなるもの、ヒト由来ＰＫＤ１においてそのＰＨドメインが欠失してなるもの、及びマウス由来ＰＫＤ１においてそのアミノ酸配列の744位及び748位のセリンがグルタミン酸に置換されてなるものより選択される少なくとも１つである（４）記載のスクリーニング方法。
（７）被験物質の中から、ヒト由来ＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも１つのリン酸化を抑制する作用を有する物質を選別する方法である（３）乃至（６）のいずれかに記載する方法。
（８）下記の工程を含む、心肥大抑制剤をスクリーニングする方法：
(a) （IV）の（１）〜（３）のいずれかに記載するトランスジェニック非ヒト動物に、被験物質を投与する工程、
(b) 上記非ヒト動物について心肥大の程度を測定し、被験物質を投与しない対照のトランスジェニック非ヒト動物の心肥大の程度と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、心肥大を低下または抑制させる被験物質を心肥大抑制剤として選択する工程。
（９）心肥大に起因する心疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の取得方法である、（１）乃至（８）のいずれかに記載するスクリーニング方法。
（１０）心肥大に起因する心疾患が、心不全、虚血性心疾患、または不整脈である（９）に記載するスクリーニング方法。
【００３２】
VIII．使用
（１）ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸の、心肥大抑制用医薬組成物を製造するための使用。
（２）上記ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質が、ＰＫＤ１の心筋細胞における活性化を抑制する物質であるか、または心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（１）に記載する使用。
（３）ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸の、心肥大に起因する心疾患の発症を予防また治療するための医薬組成物を製造するための使用。
（４）上記ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質が、上記物質が、ＰＫＤ１の心筋細胞における活性化を抑制する物質であるか、または心筋細胞におけるＰＫＤ１遺伝子の発現を阻害する物質である、（３）に記載する使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
Ｉ．心肥大抑制用医薬組成物
心肥大は、運動による負荷亢進のほか、高血圧による圧負荷の亢進や弁膜症による容量負荷の亢進などの病的要因、並びにその他原因不明の病的要因によってもたらされる。本発明が対象とする心肥大は、後者、すなわち病的状態により過剰の血行力学的負荷や液性因子などの種々のストレスが加わることによって、生理的肥大の範囲を超えて容積が増大した心筋の病的状態（例えば、代償性肥大や肥大型心筋症など）を意味する。心臓の負荷がどの部分にかかるかによって左室肥大、右室肥大、両室肥大、心房肥大の部位差が生じるが、これらの肥大形態の別を特に問うものではない。また、心臓にかかる過剰な負荷が圧負荷である場合は壁厚が顕著に増大し内腔は不変若しくは狭小する傾向にあり（求心性肥大）、一方、容量負荷である場合には壁厚はあまり増加せずに内腔が拡大する傾向にある（遠心性肥大）が、本発明においても、これらの別も特に問うものではない。敢えていえば、壁厚の増大形態を示す前者の求心性肥大に対して好適に使用することができる。
【００３４】
また本発明が対象とする心肥大は、７回膜貫通型受容体（ＧＰＣＲ）を介したＧタンパクの活性化、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）を介した受容体型チロシンキナーゼの活性化を通じて生じるシグナル伝達を介して生じるものである。なお、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、アンジオテンシンII（ＡｎｇII）、エンドセリン−１、及びノルエピネフリン（ＮＥ）などの液性因子による刺激を受けると、直下流のヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化し、Ｃａ２＋／イノシトールターンオーバーを活性化し、心肥大関連転写因子群を作動させて心筋細胞内のタンパク質合成を促し、心肥大が惹起されると考えられている。
【００３５】
本発明の心肥大抑制用医薬組成物は、ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質を有効成分とするものである。なお、ここで抑制とはＰＫＤ１の機能発現を１００％抑制（阻止）する場合と、１００％阻止しなくてもＰＫＤ１が本来有する機能を低減させる場合の両者を含む。かかる物質としては、結果として心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能の発現を抑制し得るものであればよく、例えば心筋細胞におけるＰＫＤ１の発現または産生を抑制する物質、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化シグナルを遮断若しくは抑制する物質、並びに心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化（リン酸化を含む）を抑制する物質を挙げることができる。
【００３６】
例えば、心筋細胞におけるＰＫＤ１の発現または産生を抑制する物質としては、心筋細胞におけるＰＫＤ１の発現または産生において、ＰＫＤ１遺伝子の転写、ＲＮＡプロセッシング、輸送、翻訳、及び／又は安定性を抑制する物質を挙げることできる。こうした物質として具体的には、ＰＫＤ１をコードする遺伝子の塩基配列にハイブリダイズし、その転写、ＲＮＡプロセッシング、輸送、翻訳、及び／又は安定性を抑制し得るアンチセンス分子、リボザイム、及びＲＮＡｉエフェクターを例示することができる。
【００３７】
本発明で用いられるアンチセンス分子は、ＰＫＤ１遺伝子のプロモーターまたはその他の制御領域、エキソン、イントロンあるいはエキソン−イントロン境界に結合するように設計される。多くの効果的なアンチセンス分子は、イントロン／エキソン・スプライス接合部とハイブリダイズし得るように設計されている。よって、本発明におけるアンチセンス分子も、ＰＫＤ１遺伝子のイントロン／エキソン・スプライス接合部の５０〜２００塩基内の領域にハイブリダイズするように、当該領域に対して実質的に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましい。
【００３８】
リボザイムは、ＲＮＡ−タンパク質複合体であり、対象の遺伝子（ｍＲＮＡ）に部位特異的に結合してそれを切断することで、タンパク質への翻訳を阻害し、遺伝子機能の発現を抑制する機能を発揮する物質である。本発明で用いられるリボザイムは、ＰＫＤ１遺伝子（ＤＮＡ）から転写されたｍＲＮＡの任意領域とハイブリダイズするように当該領域に対して実質的に相補的な塩基配列を有し、そして結合した対象のオリゴヌクレオチド領域内のリン酸エステルを切断して、ＰＫＤ１への翻訳を阻害するように設計される。
【００３９】
ＲＮＡiエフェクターは、ＲＮＡi（ＲＮＡ干渉）の機能を発揮することによって、ＰＫＤ１のＤＮＡもしくはｍＲＮＡの上流域にハイブリダイズし、ＰＫＤ１遺伝子の発現を特異的に抑制するものである。ＲＮＡiエフェクターとしては、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｓｔＲＮＡ（small temporally regulated RNA）及びｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）等を挙げることができる。なお、ＲＮＡiエフェクターを利用したＲＮＡi技術並びにその方法は、多比良和誠ら編,「ＲＮＡi実験プロトコール」,羊土社発行，2003年等に詳細に記載されており、その内容は援用により本発明の内容に組み込まれる。
【００４０】
また、心筋細胞において発現可能なように制御されたドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする核酸もまた、心筋細胞におけるＰＫＤ１の発現または産生を抑制する物質として理解することができる。例えばＰＫＤ１のＡＴＰ結合部位（例えば、ヒト由来ＰＫＤ１の場合は612位のLys残基、マウス由来ＰＫＤ１の場合は618位のLys残基）における変異は、そのキナーゼ機能を優位に抑制することが知られている。ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１としては、具体的にはヒト由来ＰＫＤ１のアミノ酸配列の618位のリジン（Lys-618）をアスパラギンに置換したもの（K618N PKD1）、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列612位のリジン（Lys-612）をトリプトファンに置換したもの、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列733位のアスパラギン酸（Asp-733）をアラニンに置換したもの、ヒト由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列738位及び742位のセリンをアラニンに置換したもの、マウスＰＫＤ１のアミノ酸配列618位のリジン（Lys-618）をメチオニンに置換したもの、及びマウス由来ＰＫＤ１の アミノ酸配列744位及び748位のセリン（Ser-744、Ser-748）をアラニンに置換したもの等、を例示することができる。
【００４１】
かかるドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする核酸は、通常、当該核酸の心筋細胞における発現に必要な機能性ＤＮＡ配列に、作動可能に結合された状態で用いられる。ここで、機能性ＤＮＡ配列としては、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする核酸が心筋細胞において発現するために必要な制御領域や調節エレメントなどを意味し、例えばポリアデニル化シグナル、上流配列ドメイン、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター等を例示することができる。
例えば、プロモーターとして具体的には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス腫瘍後期プロモーター（Ad MLP）、単純ヘルペスプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、ラウス肉腫(RSV)プロモーター）、ミオシン軽鎖−２プロモーター、α−アクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／スモール熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、ＡＮＦプロモーターなどを挙げることができる、これらのプロモーターは、心筋細胞において組織特異的に発現し得るものであることがより好ましい。
【００４２】
また、ここで「作動可能に結合する」とは、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする核酸が、上記各種の機能性ＤＮＡ配列との結合位置及び方向に係わらず、心筋細胞内で発現し得る状態で存在することを意味する。
【００４３】
また上記とは別の心肥大抑制機序に基づいて、本発明は、心筋細胞において発現可能なように制御されたＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を、心筋細胞内での心肥大シグナルカスケードを抑制制御する物質として提供する。当該核酸も、上記と同様に、通常、当該核酸の心筋細胞における発現に必要な機能性ＤＮＡ配列に、作動可能に結合された状態で用いられる。なお、ＥＮＨ２をコードする塩基配列は、Nakagawa N らによって既に公知となっており（Nakagawa N, Hoshijima M, Oyasu M, Saito N, Tanizawa K, Kuroda S. ENH, containing PDZ and LIM domains, heart/skeletal muscle-specific protein, associates with cytoskeletal proteins through the PDZ domain. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000 Jun 7, 272(2), p.505-12.）、当該文献の内容は援用により、本発明の内容に組み込まれる。  
【００４４】
これらの核酸は、被験者、好ましくはヒトを含む哺乳動物への投与に適した形態を備えていることが好ましい。
【００４５】
かかる形態としては、遺伝子治療用の発現ベクターを挙げることができる。当該遺伝子治療に用いられる発現ベクターは、所望の投与経路に応じて当業界で公知の方法で処方することができる。また、発現ベクターが標的器官（心臓、心筋細胞）に到達するまで、当該発現ベクターから目的核酸の放出あるいは吸収を防止するための方法も当業界で公知であり、同様に本発明に適用することができる。また、当該発現ベクターは、他のベヒクル（例えば、リポソームのような脂質ベースの分子、凝集タンパク質、またはトランスポーター分子）などと複合体を形成した状態で使用することもできる。これらの発現ベクターは、冠動脈または冠状静脈洞への注入により心筋細胞に送達することができる（冠動脈を通じた冠内送達、冠動脈内送達または動脈内送達と呼ばれる）（例えば、米国特許第５７９２４５３号、同第６１００２４２号公報等参照。これらの文献の内容は援用により本発明の内容に組み込まれる。）。
【００４６】
発現ベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターの場合、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする核酸またはＥＮＨ２をコードする核酸は、心筋細胞における発現に必要な機能性ＤＮＡ配列を作動可能に結合した状態で、ウイルス粒子内に封入された状態で使用される。かかるウイルスベクターとしても当業界で公知のものを任意に使用することができ、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、及びポリオーマウイルス等を挙げることができる。
【００４７】
また、上記ウイルスベクターに代えて、粒子形成能を有する物質に心臓組織若しくは心筋細胞を特異的に認識できる生体認識分子が導入されてなる中空ナノ粒子を用いることもできる。当該中空ナノ粒子は、標的とする細胞及び組織に所望の物質を導入するための運搬体として当業界で公知のものである。当該中空ナノ粒子の詳細は、例えば特開２００１−３１６２９８号公報に記載されており、その内容は本明細書に援用されて本発明の内容に組み込まれる。
【００４８】
また心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する物質としては、具体的には、ＰＫＤ１の触媒ドメインからＣＲドメインの解離を抑制する物質、ＰＫＤ１のリン酸化を抑制する物質（例えば、ヒト由来ＰＫＤ１のSer-744、Ser-748またはSer-916のいずれか少なくとも一カ所でのリン酸化を抑制する物質）、ＰＫＣεとＰＫＤ１との複合体形成を抑制する物質、ＰＫＤ１の基質結合部位に選択的に結合して酵素活性を抑制する物質、ＰＫＤ１のサルコメアＺディスク局在を抑制する物質〔例えば、ＰＫＤ１のサルコメアＺディスクへのリクルーティングを抑制する物質、またはＰＫＤ１のサルコメアＺディスク上の足場[例えば、ＥＮＨ１]への結合を抑制する物質などが例示できる〕などを挙げることができる。
【００４９】
かかる物質として、具体的には、ＰＫＤ１またはその任意の部分と免疫反応性である抗体を挙げることができる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。好ましくはモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体の調製方法は、当業界で周知であり、本発明の抗体もこれに準じて調製することができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratry, 1988；米国特許第４,１９６,２６５号公報等参照、これらの文献の内容は援用により本発明の内容に組み込まれる）。本発明で好適に用いられる抗体としては、具体的には、抗−ＰＫＤ１抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両方を意味する）、ＰＫＤ１のＣＲドメインに対する抗体（抗−ＰＫＤ１/ＣＲドメイン抗体）、ＰＫＤ１のＰＨドメインに対する抗体（抗−ＰＫＤ１/ＰＨドメイン抗体）、ＰＫＤ１のリン酸化領域に対する抗体〔例えば、ヒト由来ＰＫＤ１の場合は、(1)Ser-744、Ser-748またはSer-916の少なくとも１カ所を含むＰＫＤ１断片（ペプチド）に対する抗体、または (2)リン酸化されてなるSer-744、Ser-748またはSer-916の少なくとも１カ所を含むＰＫＤ１断片（ペプチド）に対する抗体〕、ＰＫＤ１の触媒領域に対する抗体、抗−不活性型ＰＫＤ１抗体（不活性型ＰＫＤ１を安定化する）、抗−全活性型ＰＫＤ１抗体（活性化状態のＰＫＤ１に結合して立体障害により酵素活性を抑える）などを挙げることができる。
【００５０】
本発明の心肥大抑制用医薬組成物は、有効量の有効成分（ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸）とともに、その種類に応じて、自体公知の薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。当該医薬組成物は、所望の投与方法、例えば経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、腹腔内投与、または冠動脈もしくは冠状静脈洞投与などによって投与することができ、その投与経路に応じて、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、及びカプセル剤などの固体投与形態；溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、リポソーム製剤、注射剤、静注剤、点滴剤及びエリキシルなどの液剤投与形態；貼付剤、軟膏、クレーム及び噴霧剤などの外用投与形態に、調合、成形乃至調製することができる。
【００５１】
これらの医薬組成物（医薬製剤）の調製に利用される担体としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される賦形剤、希釈剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、滑沢剤、溶解補助剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤などが例示できる。また添加剤としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される安定化剤、保存剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、着色剤、香料、風味剤、甘味剤などが例示できる。
【００５２】
また本発明の心肥大抑制用医薬組成物には、有効成分であるＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸に加えて、７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）または上皮成長因子受容体の刺激を介さない心肥大シグナル経路を遮断する物質、例えばサイトカインレセプターブロッカーやＬＩＦ阻害剤などといったｇp１３０レセプターを介する心肥大シグナル経路を遮断する物質（ｇｐ１３０レセプター阻害剤）を配合することもできる。
【００５３】
上記医薬組成物中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。投与量は、投与経路によっても異なるが、通常、１回投与あたりの有効成分の量に換算して、０.１ｐｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
【００５４】
II．心肥大の抑制方法、心肥大発生もしくはその進展の予防方法
本発明の心肥大の抑制方法は、ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸を有効量、心肥大またはその前状態にある被験者に投与することによって達成することができる。また、当該方法は、心肥大またはその前状態にある被験者について、心肥大の発生またはその進展を予防する方法としても有効に使用することができる。
【００５５】
ここで心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸としては、Ｉ．で述べるものを同様に挙げることができる。これらの物質は、心肥大の抑制に有効な量を、薬学的に許容される担体若しくはその他の添加剤とともに、医薬組成物の形態で使用することができる。これら医薬組成物の形態、投与経路、投与方法並びに当該医薬組成物の投与用量（有効成分の投与量）もまた、前述Ｉ．の通りである。
【００５６】
投与対象とする被験者としては、ヒト並びにその他の哺乳動物を挙げることができる。かかる哺乳動物としては、具体的にはラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを制限されることなく例示することができる。
【００５７】
III．心肥大に起因する心疾患の予防または治療用医薬組成物
前述するように、Framingham Heart Study等により、心肥大は、心不全を始め、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患、不整脈など心血管系疾患を招く危険因子であることが知られている。ゆえに、前述の心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質並びにＥＮＨ２をコードする核酸は、心筋細胞内において心肥大を抑制する作用を発揮することに基づいて、同時に心肥大に起因して生じる各種の心疾患の発症を予防しまた治療する薬物として有効に使用することができる。
【００５８】
心肥大に起因して生じる心疾患としては、上記するように心不全（鬱血性心不全、急性左心不全、急性肺性心不全、心原性ショック[心筋梗塞発作、徐脈、頻脈発作]などの収縮不全；肥大型心筋症、アミロイドーシス、収縮性心膜炎、心膜タンポナーデ等の拡張不全）、虚血性心疾患（狭心症や心筋梗塞症）、及び不整脈を例示することができる。
【００５９】
有効成分として使用される、心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質及びＥＮＨ２をコードする核酸としては、Ｉ．で述べるものを同様に挙げることができる。
【００６０】
これらの物質は、心肥大に起因する心疾の予防または治療に有効な量を、薬学的に許容される担体若しくはその他の添加剤とともに、医薬組成物の形態で使用することができる。なお、必要に応じて、公知の心疾患治療薬を配合することもできる。かかる心疾患治療薬としては、限定されないが、βブロッカー、抗高血圧剤、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、エンドセリンレセプターブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＡｎｇIIレセプターブロッカー、サイトカインレセプターブロッカー、ｇｐ１３０レセプター阻害剤などを例示することができる。
【００６１】
医薬組成物の投与形態、投与経路、並びに当該医薬組成物の投与（摂取）用量もまた、前述Ｉ．の通りである。
【００６２】
IV．心肥大に起因する心疾患の予防または治療方法
本発明の心肥大に起因する心疾患の予防または治療方法は、ＰＫＤ１の心筋細胞における機能発現を抑制する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸を有効量、心肥大に起因する心疾患またはその前状態にある被験者に投与することによって達成することができる。また、当該方法は、心肥大の被験者について心肥大から心疾患への進展を予防する方法としても有効に使用することができる。
【００６３】
ここで心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質及びＥＮＨ２をコードする核酸としては、Ｉ．で述べるものを同様に挙げることができる。当該物質は、心肥大に起因する心疾患の予防または治療に有効な量を、薬学的に許容される担体若しくはその他の添加剤とともに、医薬組成物の形態で使用することができる。これら医薬組成物の投与形態、投与経路、投与方法並びに当該医薬組成物の投与用量（有効成分の投与量）もまた、前述Ｉ．の通りである。なお、必要に応じて、公知の心疾患治療薬を併用投与することもできる。かかる心疾患治療薬としては、限定されないが、βブロッカー、抗高血圧剤、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、エンドセリンレセプターブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＡｎｇIIレセプターブロッカー、サイトカインレセプターブロッカー、ｇｐ１３０レセプター阻害剤などを例示することができる。
【００６４】
心肥大に起因する心疾患の種類としては、III．に記載する心不全、虚血性心疾患、不整脈を同様に挙げることができる。また投与対象とする被験者としても、IIに記載するヒト並びにその他の哺乳動物（ラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）を同様に挙げることができる。
【００６５】
Ｖ．心肥大シグナル伝達を遮断する方法
前述する心肥大抑制方法、並びに心肥大に起因する心疾患の予防または治療方法は、心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制することによって、または心筋細胞内でＥＮＨ２を強制発現させることによって行われるが、これは心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制するか、またはＥＮＨ２を強制発現させることによって、ＧＰＣＲ若しくはＥＧＦ受容体を介する心肥大シグナル伝達またはＥＮＨ１が関与する心肥大シグナル伝達を阻害することに基づくものである。
【００６６】
ゆえに本発明は、別の観点から、心筋細胞における心肥大シグナル伝達を遮断または抑制する方法を提供するものである。なお、ここで対象とする心肥大シグナル伝達は、直接的にはＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介した心肥大シグナル伝達である。当該心肥大シグナル伝達の遮断または抑制は、心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を阻害する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸を被験対象物に有効量投与することによって達成することができる。当該被験対象物は、心筋細胞またはそれを有する組織であればよく、培養心筋細胞、培養心臓組織、または生体内に存在する心筋細胞または心臓組織であってもよい。なお、ここで心筋細胞及び心臓組織の由来は特に問わず、ヒトまたはその他の哺乳動物（ラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）を広く挙げることができる。被験対象物に投与する、ＰＫＤ１の機能発現を阻害する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸、並びにその量としては、Ｉ．に前述する物質ならびにその量を同様に挙げることができる。
【００６７】
また、ＰＫＤ１の機能発現を阻害する物質またはＥＮＨ２をコードする核酸と併せて、サイトカインブロッカー等のｇp１３０レセプターを介する心肥大シグナル経路を遮断する物質（ｇｐ１３０レセプター阻害剤）を投与することもできる。こうすることで、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介さない別経路の心肥大シグナル伝達をも併せて遮断することが可能となる。
【００６８】
VI．トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、非ヒト動物の神経細胞内でＰＫＤ１関連タンパクが発現するように構築されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００６９】
なお、ここで非ヒト動物としては、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウシ、ウマ、サル、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を挙げることができる。
【００７０】
トランスジェニック非ヒト動物の一態様として、本発明は、心筋細胞において構成的活性型ＰＫＤ１を強制発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。当該トランスジェニック非ヒト動物は、心筋細胞中のＰＫＤ１が全活性状態（リン酸化）にあることにより心肥大を発症する。このため当該トランスジェニック非ヒト動物は心肥大の病態を模倣したモデル動物（心肥大病態モデル非ヒト動物）として、心肥大の組織学的研究や心疾患への進展メカニズムの解明、ならびにスクリーニング動物として心肥大の抑制剤や心疾患の予防・治療剤の開発に有効に利用することができる。
【００７１】
構成的活性型ＰＫＤ１は、ＰＫＤ１の特定領域のアミノ酸残基を欠失させるかまたは点変異等によって置換させることによって作成することができる。具体的には、ヒト由来ＰＫＤ１の場合は、そのアミノ酸配列中、ＰＨドメインを欠失させる方法または744位及び748位のセリンをグルタミン酸に置換する方法を、マウス由来ＰＫＤ１の場合は、そのアミノ酸配列中、744位及び748位のセリンをグルタミン酸に置換する方法によって作成することができる。
【００７２】
心肥大の病態モデル動物は、具体的には、心筋細胞中に、プロモーター等の機能的ＤＮＡの制御下で構成的活性型ＰＫＤ１をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、これにより心筋細胞中で当該構成的活性型ＰＫＤ１が発現産生してなるトランスジェニック非ヒト動物である。
【００７３】
また別の態様として、本発明は心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現がノックアウトされてなるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。当該トランスジェニック非ヒト動物は、心筋細胞中のＰＫＤ１が不活性状態（非リン酸化）にあることから、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介した肥大シグナル伝達が遮断されており、当該ＧＰＣＲを介した刺激によっても心肥大を発症しない。このため当該トランスジェニック非ヒト動物は、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を介した心肥大シグナルカスケードを遮断したモデル動物として、他の心肥大シグナル経路（例えば、ｇp１３０レセプターを介する心肥大シグナル経路）を通じた心肥大メカニズムの解明や心疾患への進展の解明等に有効に利用することができる。
【００７４】
心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現がノックアウトされてなるトランスジェニック非ヒト動物は、その心筋細胞においてドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１を発現させることによって作成することができる。ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１は、ＰＫＤ１の特定領域（例えば、ＡＴＰ結合領域やリン酸化活性ループ）のアミノ酸残基を欠失させるか、または特定部位（例えば、ＡＴＰ結合部位やリン酸化活性ループ部位）を点変異等によって置換させることによって作成することができる。具体的には、ヒト由来ＰＫＤ１の場合は、そのアミノ酸配列中、612位をリジンがトリプトファンに置換する方法、618位のリジンをアスパラギンに置換する方法、733位のアスパラギン酸をアラニンに置換する方法、または738位及び742位のセリンをアラニンに置換する方法によって作成することができる。またマウス由来ＰＫＤ１の場合は、そのアミノ酸配列中、618位のリジンをメチオニンに置換する方法、または744位及び748位のセリンをアラニンに置換する方法によって作成することができる。
【００７５】
かかるトランスジェニック非ヒト動物は、具体的には、心筋細胞中に、プロモーター等の機能的ＤＮＡの制御下でドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、これにより心筋細胞中で当該ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１が発現産生してなる動物である。
【００７６】
これらのトランスジェニック非ヒト動物を産生するための方法は、一般的に、米国特許第４８７３１９１号公報、Brister et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p.4438-4442 (1985)、特開２００３-５５２６６号公報、並びに「Manipulating the maouse Embryo; A Laboratory Manual」第２版（編集、Hogan, Beddington, Costantimi 及びLong, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994）に記載されており、本発明もこれに準じて行うことができる。なお、これらの文献の内容は、本明細書で援用されることにより本発明の内容に組み込まれる。典型的な方法として、被験動物に導入される所望の遺伝子を、マイクロインジェクションによりその動物の受精卵に移入する方法を例示することができる。マイクロインジェクションされた受精卵は、雌性宿主に移植され、導入遺伝子の発現を指標として子孫の中から所望のトランスジェニック非ヒト動物が選抜取得できる。
【００７７】
Ｖ．スクリーニング方法
本発明は、心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を制御することができる物質をスクリーニングする方法を提供する。特に好ましい物質は、心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する作用を有するものである。当該物質は、心筋細胞におけるＧＣＰＲを介した肥大シグナル伝達を遮断もしくは抑制することによって、心肥大の発症または進展を抑制することができるものと期待できる。さらに当該物質によれば心肥大に起因する心疾患を予防または治療することができると期待される。すなわち、本発明は、心肥大抑制剤または心肥大に起因する心疾患の予防若しくは治療剤の有効成分をスクリーニングする方法を提供する。
【００７８】
当該スクリーニング方法は、基本的には心筋細胞においてＰＫＤ１の機能発現を抑制する作用を発揮する物質を探索することからなるが、具体的には、下記のスクリーニング方法（１）〜（４）を例示することができる。
（１）下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) ＰＫＤ１を発現し得る細胞に被験物質を接触させる工程、
(b) 上記細胞について、ＰＫＤ１の発現レベルを測定し、被験物質を接触させない対照の細胞におけるＰＫＤ１の発現レベルと対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の細胞に比して、ＰＫＤ１の発現レベルが低下してなる細胞と接触させた被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【００７９】
かかる工程により、ＰＫＤ１の発現及び産生を抑制する作用を有する物質を取得することができる。
【００８０】
ここで使用される細胞は、内来性及び外来性を問わず、ＰＫＤ１遺伝子を発現可能な状態で有するものであり、その由来は特に制限されない。好ましくはヒト由来またはヒト以外の哺乳動物由来のＰＫＤ１遺伝子を発現可能な状態で有する細胞である。具体的には、ヒトもしくはヒト以外の哺乳動物に由来する心筋細胞または骨格筋細胞を挙げることができ、心臓または骨格筋から単離調製した培養細胞を好適に使用することができる。また細胞の集合体である組織も当該範疇に含まれる。またヒト由来またはヒト以外の哺乳動物に由来するＰＫＤ１遺伝子を発現可能な状態で有する原核細胞または真核細胞（昆虫細胞を含む）を用いることもできる。
【００８１】
被験物質としては、制限はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、または無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的には、これらの被験物質またはこれらを含む組成物（例えば、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物等を含む）を対象の細胞と接触させることにより行うことができる。また、スクリーニングに際して採用される被験物質と細胞との接触条件は、特に制限されないが、細胞が死滅せず所望の遺伝子を発現できる培養条件を選択することが好ましい（以下のスクリーニング方法においても同じ）。
【００８２】
ＰＫＤ１の発現レベルは、ＰＫＤ１の遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、in situハイブリダーゼイション解析法、デファレンシャル・ハイブリダーゼーション法、ＤＮＡチップ法、ＲＮａｓｅ保護アッセイなどの公知の方法を行うことにより測定することができる。また、ＰＫＤ１の発現レベルは、発現産生されたＰＫＤ１（タンパク質）の量を測定することによっても評価することができる。この場合は、ＰＫＤ１を認識する抗体をマーカーとして用いて、ウエスタンブロット法などの公知の方法で、産生されたＰＫＤ１を検出し、定量する。
【００８３】
かかるスクリーニング方法による心肥大抑制剤または心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分（候補物質）の選別は、被験物質を接触させた細胞におけるＰＫＤ１の発現レベルが、被験物質を接触させない細胞におけるＰＫＤ１の発現レベルに比して、低くなることを指標として行うことができる。  
【００８４】
実施例で示すように、ＰＫＤ１はＧＰＣＲまたはＥＧＦレセプターを介する心肥大のシグナル伝達において中心的な役割を担う成分である。ゆえに上記スクリーニングで選別されるＰＫＤ１の発現及び産生を抑制する物質は、当該心肥大のシグナルカスケードを阻止もしくは抑制することができ、ゆえに心肥大抑制剤の有効成分として、また心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分として使用することが可能である。
【００８５】
（２）下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) ＰＫＤ１を発現し得る細胞に、ＰＫＤ１活性化剤及び被験物質を接触させる工程、
(b) 上記細胞について、ＰＫＤ１の活性を測定し、被験物質を接触させない対照の細胞における上記に対応する活性と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の細胞に比して、ＰＫＤ１の活性が低下してなる細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【００８６】
かかる工程により、ＰＫＤ１の発現及び産生を抑制するか、またはＰＫＤ１の活性を阻害する物質を取得することができる。
【００８７】
ここでＰＫＤ１活性化剤とは、ＰＫＤ１を全活性化（リン酸化）することができるものであればよく、例えば典型的なものとしてＴＰＡ（12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセテート）などのホルボールエステル、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、ＰＫＣ（例えば、ＰＫＣε）を挙げることができる。
【００８８】
ＰＫＤ１の活性測定は、ＰＫＤ１のリン酸化に基づく活性（例えば、ヒト由来のＰＫＤ１の場合、アミノ酸配列のSer-916位のリン酸化に基づく活性）を評価することによって行うことができる。その方法は特に制限されないが、具体的には特定の基質ペプチド（例えば、Syntide-2 [APLARTLSVAGLPGKK]）に対するリン酸化能を評価する方法（リン酸化アッセイ）を例示することができる。当該 リン酸化アッセイは、具体的には、実施例において説明する方法に従って行うことができる。
【００８９】
かかるスクリーニング方法による心肥大抑制剤または心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分（候補物質）の選別は、被験物質を接触させた細胞におけるＰＫＤ１の活性が、被験物質を接触させない細胞におけるＰＫＤ１の活性に比して、低くなることを指標として行うことができる。  
【００９０】
実施例で示すように、ＰＫＤ１は心肥大のシグナル伝達における重要な成分であり、ＰＫＤ１の活性化を介して更に下流のカスケードが起動して心肥大が誘導される。ゆえに上記スクリーニングで選別される物質は、心肥大のシグナリングを阻止もしくは抑制することができ、心肥大抑制剤の有効成分として、また心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分として使用することが可能である。
【００９１】
（３）下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) 心筋細胞に、ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を刺激する心肥大誘導剤と被験物質を接触させる工程、
(b) 上記心筋細胞について、ＰＫＤ１の活性、サルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離を測定し、心肥大誘導剤だけを接触させた対照の心筋細胞における上記に対応する活性、局在性または２分子間距離と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の心筋細胞に比して、ＰＫＤ１の活性若しくはサルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性が低下してなるか、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離が増大してなる心筋細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【００９２】
かかる工程により、作用メカニズムに拘わらず、心筋細胞におけるＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質を取得することができる。
【００９３】
心筋細胞としては、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物に由来する心筋細胞を挙げることができる。かかる細胞としては、好適にはヒトまたはヒト以外の哺乳動物から単離され調製された培養細胞を用いることができる。なお、心筋細胞の集合体である組織もまたこの範疇に含まれる。ＧＰＣＲまたはＥＧＦ受容体を刺激する心肥大誘導剤としては、ＧＰＣＲまたはまたはＥＧＦ受容体を介して心肥大を誘導することが知られている物質を制限なく挙げることができる。例えば、かかる物質として、典型的には、前者としてＡｎｇII、エンドセリン−１及びＮＥが、また後者として上皮成長因子（ＥＧＦ）が知られている。
【００９４】
当該スクリーニング方法では、心筋細胞におけるＰＫＤ１活性、サルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離の少なくとも１つを指標として、所望の物質が選択される。
【００９５】
ＰＫＤ１活性の測定方法としては、上記（２）に記載する方法を用いることができる。
【００９６】
また、サルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性は、リン酸化ＰＫＤ１（全活性型ＰＫＤ１）を特異的に標識し検出できる試薬を用いて心筋細胞を染色し、次いでその試薬に応じた検出方法を用いてリン酸化ＰＫＤ１の心筋細胞内における挙動を観察することによって調べることができる。リン酸化ＰＫＤ１を特異的に標識し検出できる試薬としては、リン酸化ＰＫＤ１を特異的に認識してそれと結合する抗体を挙げることができ、具体的には、ヒト由来のＰＫＤ１の場合は、実施例で使用する、ヒト由来ＰＫＤ１のアミノ酸配列912-918を有するペプチド〔但し、Ser-916位がリン酸化されている〕に対する抗体（抗−全活性型ＰＫＤ１抗体）を例示することができる。好適には、α−アクチニンのサルコメアに対する特異的抗体、上記リン酸化ＰＫＤ１（全活性型ＰＫＤ１）に対する抗体並びに蛍光若しくは化学発光試薬を用いて心筋細胞を処理し、得られた細胞の蛍光像または化学発光像を差異解析する方法を挙げることができる。より具体的な測定方法を実施例に記載する。
【００９７】
細胞内におけるＰＫＣεとＰＫＤ１の２分子間距離は、蛍光蛋白質を利用したＦＲＥＴ（蛍光エネルギー移動）を解析することによって求めることができる。具体的には、当該方法は例えば浜松ホトニクス社製（日本）の3CCD-FRETイメージングシステム（AQUACOSMOS/ASHURA）を用いて行うことができ、かかる方法によれば異なる蛋白質（ＰＫＣεとＰＫＤ１）の相互作用を定量的にモニタリングすることができる。
【００９８】
かかるスクリーニング方法による心肥大抑制剤または心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分（候補物質）の選別は、心肥大誘導剤と被験物質とを接触させた心筋細胞におけるＰＫＤ１活性が、心肥大誘導剤だけを接触させた（すなわち被験物質は接触させない）対照の心筋細胞におけるＰＫＤ１活性に比して低くなること；または心肥大誘導剤と被験物質とを接触させた心筋細胞におけるリン酸化ＰＫＤ１のサルコメアＺディスクへの局在性が、心肥大誘導剤だけを接触させた対照の心筋細胞におけるリン酸化ＰＫＤ１のサルコメアＺディスクへの局在性に比して低下すること；または心肥大誘導剤と被験物質とを接触させた心筋細胞におけるＰＫＣεとＰＫＤ１の２分子間距離が、心肥大誘導剤だけを接触させた対照の心筋細胞におけるＰＫＣεとＰＫＤ１の２分子間距離に比して大きくなること、を指標として行うことができる。  
【００９９】
実施例で示すように、ＰＫＤ１は心肥大のシグナル伝達を担う重要な成分であり、ＰＫＤ１の活性化を介して更に下流のカスケードが起動して心肥大が誘導される。また、ＰＫＤ１は活性化されるとサルコメアＺディスクに移行してそこに局在する。さらに、ＰＫＣεはＰＫＤ１の直接のアクチベーターであり、心肥大シグナリングに際してＰＫＣεとＰＫＤ１とは互いに複合体を形成している。ゆえに上記スクリーニングで選別される物質は、心肥大のシグナリングを阻止もしくは抑制する作用を有するものであり、心肥大抑制剤の有効成分として、また心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分として使用することが可能である。
【０１００】
（４）下記の工程を含む、心肥大抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法：
(a) 構成的活性型ＰＫＣεまたは構成的活性型ＰＫＤ１を発現し得る心筋細胞に、被験物質を接触させる工程、
(b) 上記心筋細胞について、ＰＫＤ１の活性、サルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１（全活性型ＰＫＤ１）の局在性、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離を測定し、被験物質を接触させない対照の心筋細胞における上記に対応する活性、局在性または２分子間距離と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、対照の心筋細胞に比して、ＰＫＤ１の活性若しくはサルコメアＺディスクにおけるリン酸化ＰＫＤ１の局在性が低下してなるか、またはＰＫＣεとＰＫＤ１との２分子間距離が増大してなる心筋細胞に投与した被験物質を、心肥大抑制剤の有効成分として選択する工程。
【０１０１】
かかる工程により、心筋細胞におけるＰＫＤ１の活性化を抑制する物質を取得することができる。
【０１０２】
ここで心筋細胞は、構成的活性型ＰＫＣεまたは構成的活性型ＰＫＤ１を発現し得るように調製されたものが使用される。構成的活性型ＰＫＤ１を発現する心筋細胞は、心肥大誘導剤による刺激を要することなく全活性状態（リン酸化）のＰＫＤ１を発現している。また構成的活性型ＰＫＣεを発現する心筋細胞は、ＰＫＣεの活性により、心肥大誘導剤による刺激を要することなくＰＫＤ１を全活性化（リン酸化）させることができる。
【０１０３】
構成的活性型ＰＫＣεは、ＰＫＣεのＮ末端の偽基質領域が欠失するか、または特定のアミノ酸残基が点変異によって置換してなるものであって（Schonwasser, D.C., et al., Mol. Cell. Biol. 18, p.790-798, 1998）、ヒト由来ＰＫＣεの場合、具体的にはヒト由来ＰＫＣεのアミノ酸配列中、156−162領域を欠失してなるタンパク質を例示することができる。
【０１０４】
構成的活性型ＰＫＤ１は、ＰＫＤ１の特定領域のアミノ酸残基が欠失または点変異等によって置換してなるものであって、ヒト由来ＰＫＤ１の場合、具体的にはそのアミノ酸配列中、ＰＨドメインが欠失してなるもの、または744位及び748位のセリンがグルタミン酸に置換されてなるものを例示することができる。またマウス由来ＰＫＤ１の場合は、そのアミノ酸配列中、744位及び748位のセリンがグルタミン酸に置換されてなるものを例示することができる。
【０１０５】
当該構成的活性型ＰＫＣεまたは構成的活性型ＰＫＤ１を発現し得る心筋細胞は、これらのタンパク質をコードする遺伝子を、通常の遺伝子組み換え技術に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物に由来する心筋細胞（培養細胞）に導入することによって作成することができる。
【０１０６】
かかるスクリーニング方法による心肥大抑制剤または心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分（候補物質）の選別は、被験物質とを接触させた心筋細胞におけるＰＫＤ１活性が、被験物質を接触させない対照の心筋細胞におけるＰＫＤ１活性に比して低くなること；または被験物質とを接触させた心筋細胞におけるＰＫＤ１のサルコメアＺディスクへの局在性が、被験物質を接触させない対照の心筋細胞におけるＰＫＤ１のサルコメアＺディスクへの局在性に比して低下すること；または被験物質とを接触させた心筋細胞におけるＰＫＣεとＰＫＤ１の２分子間距離が、被験物質を接触させない対照の心筋細胞におけるＰＫＣεとＰＫＤ１の２分子間距離に比して大きくなること、を指標として行うことができる。  
【０１０７】
上記スクリーニングで選別される物質は、心肥大のシグナリングを阻止もしくは抑制する作用を有するものであり、心肥大抑制剤の有効成分として、また心肥大に起因する心疾患の予防・治療剤の有効成分として使用することが可能である。
【０１０８】
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに心肥大を有する心肥大病態モデル非ヒト動物を用いてスクリーニングをかけることもできる。
【０１０９】
かかる心肥大病態モデル非ヒト動物としては、前述する構成的活性型ＰＫＤ１を強制発現してなる本発明のトランスジェニック非ヒト動物を例示することができる。かかる心肥大病態モデル非ヒト動物を用いたスクリーニングは下記の工程を経て実施することができる：
(a) 構成的活性型ＰＫＤ１を強制発現してなるトランスジェニック非ヒト動物（心肥大病態モデル非ヒト動物）に、被験物質を投与する工程、
(b) 上記非ヒト動物について心肥大の程度を測定し、被験物質を投与しない対照のトランスジェニック非ヒト動物の心肥大の程度と対比する工程、及び
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、心肥大を低下または抑制させる被験物質を心肥大抑制剤として選択する工程。
【０１１０】
なお、心肥大の程度は、心臓の組織学的評価、臨床学的評価（心エコー図、ドプラー超音波検査、冠動脈造影、胸部レントゲン撮影、心電図など）、または心筋細胞における心肥大マーカーであるＡＮＰの発現レベルから評価することができる。
【０１１１】
かくして選別される候補物質は、さらに心肥大病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに心肥大を有する患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な心肥大抑制用組成物または心肥大に起因する心疾患の予防または治療剤の有効成分を選別取得することができる。
【０１１２】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、心肥大抑制用医薬組成物または心疾患予防または治療用医薬組成物の調製に使用することができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、下記実施例は本発明を何ら限定するものではない。なお、本発明で用いられる遺伝子工学的技術並びに分子生物学的実験操作は、一般に広く用いられている方法、例えばJ.,Sambrook, E., F., Frisch,T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド・スプリング・ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory press）発行、1989年、及びD.,M.,Glover著、ＤＮＡクローニング、IRL発行、1985年などに記載されている方法に従って行うことができる。
【０１１４】
（１）略称
下記の実施例において使用する略称は、特に言及しない限り、次の用語を意味するものとする。
ＡｎｇII： アンジオテンシンII
ＡＮＦ： 心房性ナトリウム利尿因子
ＢｒＤＵ： 5-ブロモ-2’-デオキシウリジン
ＢＳＡ： ウシ血清アルブミン
ＣＡ： 構成的活性型
ＤＮ： ドミナント・ネガティブ型
ＦＢＳ： ウシ胎児血清
ＧＦＰ： 緑色蛍光タンパク質
Ｇ protein： グアニンヌクレオチド結合タンパク
ＧＰＣＲ： ７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体
ＫＤ：kinase dead
ＬＩＦ： 白血病阻害因子
ＮＥ： ノルエピネフリン
ＥＴ１： エンドセリン１
ＥＧＦ： 上皮成長因子
ｂＦＤＦ： 塩基性繊維芽細胞成長因子
ＮＲＣ： ラット新生仔由来心筋細胞
ＰＢＳ： リン酸緩衝生理食塩水
ＰＫＣ： プロテインキナーゼＣ
ＰＫＤ： プロテインキナーゼＤ
ＰＬＣ： ホスホリパーゼＣ
ＴＰＡ：12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセテート
ＤＭＥＭ： Dulbecco'smodified Eagle's Medium
（２）実験材料
下記の実施例において使用する主な材料は下記の通りである。
(1) Lysis 緩衝液Ａ： 50mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、1.3% Triton X-100、 1mM EDTA、1mM dithiothreitol、50mM NaF、1mM Na３VO４、及びプロテアーゼ・インヒビター・カクテル錠（ロッシュ）1錠（50ml当たり）
(2) 抗体：
1)抗-PKD1/2モノクローナル抗体(LCラボラトリーズ社製)（PKD1及びPKD2の両方に反応性を有する）、
2)抗-サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体（clone EA-53：SIGMA製）、
3)抗-H3ヒストンマウス・モノクローナル抗体（05-499：Up State Biotechnology製）
4)抗-全活性型PKD1ポリクローナル抗体：ヒト由来ＰＫＤ１のＣ末領域（Ser-916）がリン酸化されたペプチド（ヒト由来ＰＫＤ１の912-918アミノ酸領域：ＳＥＲＶｐＳＩＬ）で免疫化したウサギの血清から調製した
5)抗-不活性型PKD1ポリクローナル抗体：ヒト由来ＰＫＤ１のＣ末領域のペプチド（ヒト由来ＰＫＤ１の904-918アミノ酸領域：ＥＥＲＥＭＫＡＬＳＥＲＶＳＩＬ）で免疫化したウサギの血清から調製した。
【０１１５】
なお、ヒト由来ＰＫＤ１は、最初にホスホイノシチド依存性キナーゼ１（phosphoinositide-dependent kinase 1）（PDK1）により活性ループ部位（Ser-744、Ser-748）がリン酸化され、触媒的に活性となる。それからＣ末領域（Ser-916）が自己リン酸化され、分子全体が活性型（本明細書では、これを「全活性型」という）となる。従って、Ser-916部位におけるリン酸化は、in vivoにおいてＰＫＤ１が活性化（全活性型ＰＫＤ１）されているか否かの最適な指標となる（Matthews S.A.,  et al., J. Biol. Chem.274, p.26543-26549）。
【０１１６】
ゆえに、以下の実験において使用される、リン酸化されたSer-916部位に対する抗体〔具体的にはリン酸化されたSer-916部位を有するＰＫＤ１断片（ペプチド）に対する抗体：4)抗-全活性型PKD1ポリクローナル抗体〕は、心筋細胞に存在する全活性型ＰＫＤ１を特異的に検出するための有効な抗体である。
【０１１７】
(3) pTB701-HAベクター
ＮＨ２末端にＨＡエピトープを付けた融合タンパクを哺乳細胞内で発現するためのベクターである。発現ベクターpTB701のSV40初期プロモーターの下流に、ＨＡエピトープをコードする塩基配列が挿入されている。
【０１１８】
(4) 構成的活性型ＰＫＣ変異体（CA-PKC）
ＮＨ２末端の偽基質領域が欠損しているか、または点変異（ポイントミューテーション）していることによって、全活性化状態を示しているものである。Prof. Parkerから入手した（Schonwasser, D.C., et al., Mol. Cell. Biol. 18, p.790-798, 1998）。
【０１１９】
1)CA-PKCβI：ヒト由来PKCβIのアミノ酸の22-28領域が欠損したもの
2)CA-PKCδ：ヒト由来PKCδのアミノ酸の147位のAlaがGluに置換したもの
−これらはいずれもpCO2ベクターを用いて発現させた。
【０１２０】
3) CA-PKCε：ヒト由来PKCεのアミノ酸の156-162領域が欠損したもの
−これはpMT2ベクターを用いて発現させた。
【０１２１】
(5)ドミナント・ネガティブ型PKC変異体 (DN-PKCs)
ＡＴＰ結合部位のLysをMetに点変異（ポイントミューテーション）することによって、不活性化状態を示しているものである(Kuroda, S., et al., J. Biol. Chem. 271, p.31029-31032, 1996； Kuroda, S., et al., J. Cell Biol. 144,p.403-411, 1999）。 
【０１２２】
1)PKCβI-HAのドミナント・ネガティブ型変異体（K371M PKCβI-HA）
site-directed mutagenesisによって、ラット由来PKCβI の371位のＡＴＰ結合に必須なLysをMetに置換することによって調製した。
【０１２３】
2)PKCζ-HAのドミナント・ネガティブ型変異体（K281M PKCζ-HA）：
site-directed mutagenesisによって、ラット由来PKCζの281位のＡＴＰ結合に必須なLysをMetに置換することによって調製した。
【０１２４】
3)PKCε-HAのドミナント・ネガティブ型変異体（K440M PKCε-HA）：
site-directed mutagenesisによって、ラット由来PKCεの440位のＡＴＰ結合に必須なLysをMetに置換することによって調製した。
【０１２５】
(6) 構成的活性型ＰＫＤ１(CA-PKD1)
ヒト由来ＰＫＤ１のアミノ酸744位及び748位のSerをGluにそれぞれ置換して調製したものであり、この変異に基づいて全活性化状態を示している（S744E/S748E PKD1）（pEGFPC1-PKD-CA）。
【０１２６】
(7) ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１(DN-PKD1)
ヒト由来ＰＫＤ１のアミノ酸618位のLysをAsnに置換して調製したものであり、この変異に基づいて不活性化状態を示している（SK618N PKD1）（pEGFPC1-PKD-DN）
実施例１  ラット新生仔由来心筋細胞中でのＰＫＤ１の発現とその局在
ウエスタンブロット法を用いて、ラット新生仔由来心筋細胞（ＮＲＣ）内におけるＰＫＤ１とＰＫＤ２の発現状況、並びにその細胞内における局在（分布）を調べた。なお、ＰＫＤ２はＰＫＤ１と異なる遺伝子産物である（Sturany, S., et al., J. Biol. Chem. 276, p.3310-3318, 2001）。さらに、ＮＲＣをＴＰＡで処理して、該処理細胞について同様にＰＫＤ１とＰＫＤ２の発現並びに細胞内の局在を調べた。
【０１２７】
なお、ＴＰＡはＰＫＣ及びＰＫＤのアクチベーターとして知られているホルボールエステルの一種である(Kikkawa U, et al., Adv Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res.,17, p.437-42, 1984； Valverde AM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 30, 91(18), p.8572-6, 1994)。
【０１２８】
ＴＰＡは、また心肥大をも誘導するが（Kinnunen P, et al., Br J Pharmacol., 102 (2), p.453-61, 1991）、その心肥大誘導はあくまでもＰＫＣの活性化によるものであり、その誘導にＰＫＤが介在することは全く知られていなかった。
【０１２９】
（１）ＮＲＣの単離及び初代培養
生後一ヶ月未満のラット新生仔から取り出した心臓を、Goshima(1977)らの方法（Goshima K. et al.,  J Mol Cell Cardiol., 1977 Jan, 9(1), p.7-23）に準じて培養した。
【０１３０】
具体的には、ラット新生仔30匹から心臓を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Mg2＋及びCa2＋を含まない）で血液を洗い流した後、血管を除去して４分割し、さらにＰＢＳで洗浄した。次いでその心臓組織0.3gを、0.1w/v％コラゲナーゼ・タイプI（和光純薬工業）水溶液10ml中で37℃、10〜15分間、処理して、心筋細胞を分離・分散させた。このコラゲナーゼ処理を、新しいコラゲナーゼ水溶液に取り替えてさらに２回繰り返した。処理液を遠心分離することによって回収した心筋細胞（分散細胞）を10mlの培地（DMEM＋10％ FBS）に懸濁し、これを滅菌済みのキムワイプをセットした滅菌フィルターユニット（Millipore製）でろ過して細胞を単離した。得られた心筋細胞を組織培養皿（Falcon製）に移して、50分間、37℃、CO２濃度5％の条件下で培養し、細胞接着力の違いを利用して心筋細胞中に共存する繊維芽細胞をコラーゲン塗布した培養皿基底面に接着させて除去した（a differential adhesion technique）。上清中に存在する心筋細胞をラット新生仔由来心筋細胞（NRC）として使用した。
【０１３１】
なお、取得したＮＲＣは、0.45％グルコース、10％(v/v)ウシ胎児血清（FBS）、2ｍＭ  L-グルタミン、100 units/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び20μＭ 5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（BrDU：sigma）を配合したＤＭＥＭ中に保存した。
【０１３２】
（２）ＴＰＡ処理、及び細胞分画
上記で調製したＮＲＣを、無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）に移し、一晩培養した（CO２濃度5%、37℃）。その後、培地にＴＰＡを終濃度100ｎMとなるように添加して20分間インキュべーションした。次いで、心筋細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、Lysis 緩衝液（Triton X-100が0.1%である以外は、Lysis 緩衝液Ａと同じ組成を有する）で処理して細胞を溶菌し、遠心分離（15000rpm、約10分間）にかけて、上清（細胞質画分）と沈殿物とに分画した。沈殿物はさらにLysis 緩衝液Ａに溶解した。これを軽く遠心分離し、得られた上清を細胞膜画分として取得した。なお、コントロールとして、ＴＰＡで処理しないＮＲＣについても、上記と同様に溶菌処理して、細胞質画分と細胞膜画分とに分画した（未処理物）。
【０１３３】
（３）ウエスタンブロット法
上記で調製したＴＰＡ処理物（細胞質画分と細胞膜画分）及び未処理物（細胞質画分と細胞膜画分）を、それぞれ１レーンに添加するタンパク量が同じになるように１０％ ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけた。泳動後、ポリビニリデン・ジフルオリド（PVDF）膜（Immobilon-P, Millipore製）に転写した。次いで、抗体として、(1)抗-PKD1/2モノクローナル抗体(LCラボラトリーズ社製) 、(2)抗-全活性型PKD1ポリクローナル抗体、(3)抗-不活性型PKD1ポリクローナル抗体、(4)抗-サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体（clone EA-53：SIGMA製）、及び(5)抗-H3ヒストンマウス・モノクローナル抗体（05-499：Up State Biotechnology製）を用いてウエスタンブロッティングを行い、各試料〔ＴＰＡ処理物（細胞質画分と細胞膜画分）及び未処理物（細胞質画分と細胞膜画分）〕中に含まれるＰＫＤ１，ＰＫＤ２，全活性型ＰＫＤ１、不活性型ＰＫＤ１、α-アクチニン、及びヒストンＨ３をそれぞれ染色した。
【０１３４】
次いで、第２抗体試薬としてホースラディシュ由来パーオキシダーゼを結合した抗マウスまたはウサギＩｇＧ（Amasham pharmacia製）を使用し、化学発光によりブロッティング結果がＸ線フィルム上で観察できるようにした。
【０１３５】
（４）結果
結果を図２に示す。各試料〔細胞質画分(Cytoplasm)：未処理物(None)とＴＰＡ処理物(TPA)、及び細胞膜画分(Membrane)：未処理物(None)とＴＰＡ処理物(TPA)〕のいずれもほぼ同量のα-アクチニンとヒストンＨ３が検出された。このことは各レーンに、心筋細胞由来タンパク質量がほぼ均一に存在することを意味する。
【０１３６】
図２の結果から、心筋細胞にはＰＫＤ２は存在せず、ＰＫＤ１のみ存在することが判明した（なお、本発明者等は既に同様な方法で心筋細胞にはＰＫＤ３も存在しないことを確認している。）。全活性型ＰＫＤ１は、ＰＫＤ又はＰＫＣ活性剤であるＴＰＡで処理した心筋細胞の細胞膜画分に大量に存在しており、ＴＰＡ処理ＮＲＣの細胞質画分にも、またＴＰＡ未処理のＮＲＣのいずれも画分にも殆ど発現していなかった（図２の上から２段め参照）。このことは、心筋細胞をＴＰＡ処理することによって心筋細胞中のＰＫＤ１のSer-916位がリン酸化されて全活性型になること、そして全活性型になったＰＫＤ１は、構造が変化することによって膜（あるいは膜画分のタンパク質）への親和性が高まり細胞質から細胞膜へと移動すること（細胞膜への局在化）を示している。
【０１３７】
実施例２    全活性型ＰＫＤ１の心筋細胞内での挙動
実施例１（１）に記載する方法と同様な方法で調製したＮＲＣを、ポリ-L-リジンでコーティングしたガラス製の培養皿（35mm径）に移し、無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）中で一晩培養した（CO２濃度5%、37℃）。これに終濃度が20nＭとなるようにＴＰＡを添加して、更に18時間（CO２濃度5%、37℃）培養した（約１×10３細胞）。培養後、得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４w/v％パラホルムアルデヒドで、室温下30分間処理して固定化し、更に0.25v/v％のTriton X-100を含むＰＢＳ中で４℃、30分間、浸透処理し、次いでブロッキング緩衝液（3w/v％ BSA、2v/v％ FBS, 1v/v％ 正常ヤギ血清及び0.03v/v％ Triton X-100を含むPBS）中でインキュべーションした。
【０１３８】
更に、得られた細胞を、抗体（抗-全活性型PKD1ポリクローナル抗体、抗-不活性型PKD1ポリクローナル抗体、及び抗-サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体）を含むブロッキング緩衝液中で、４℃で16時間インキュべーションした。これをＰＢＳで２回洗浄し、次いで0.3v/v％ Cy3-標識・抗−マウスIgG抗体、及び0.3v/v％ Cy2-標識・抗−ウサギIgG抗体（第２抗体）（いずれもAmersham-pharmacia製）を配合したＰＢＳ中に移して、室温で１時間インキュべーションした。細胞の蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡LSM5 Pascal（Carl Zeiss）で観察した。
【０１３９】
結果を図３Ａに示す。  なお、対照としてＴＰＡ処理しない未処理ＮＲＣ（None）を同様に抗体標識して、細胞の蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡LSM5 Pascalで観察した結果を図３Ｂに示す。
【０１４０】
心筋細胞中のα-アクチニンは、抗−サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体及び第２抗体（蛍光色素標識抗体）と結合して、赤色の蛍光シグナル画像として観察される（図３Ａの左欄、赤のシグナルが心筋細胞のα-アクチニンを示す）。図３Ａと図３Ｂとの対比からわかるように、ＴＰＡ処理した心筋細胞は、サルコメア構造が形成されており（Ｚディスクの可視化）、心肥大が誘導されていることが認められた。
【０１４１】
図３Ａの中欄の上段は、心筋細胞を抗−不活性型PKD1ポリクローナル抗体及び第２抗体（蛍光色素標識抗体）、下段は心筋細胞を抗−全活性型PKD1ポリクローナル抗体及び第２抗体（蛍光色素標識抗体）で、それぞれ処理して得られた画像である。すなわち、中欄の上段は不活性型ＰＫＤ１の細胞内局在を、また下段は全活性型ＰＫＤ１の細胞内局在をそれぞれ示している。この結果から、不活性型ＰＫＤ１は心筋細胞の核周辺に留まっているのに対し、全活性型ＰＫＤ１は、α−アクチニンと同じ画像を示すことから（図３Ａ左欄下段の画像と対比）、心筋細胞のサルコメア（sarcomere）構造のＺディスク周囲に集中していることがわかる。なお、図３Ａの右欄の画像は、左欄の画像と中欄の画像を重ね合わせたもので、黄色（赤×緑）を呈するほど両者の画像が一致していることを示す。
【０１４２】
これらの結果から、心筋細胞をＴＰＡ処理することによって、心肥大が誘導されること、ＰＫＤ１が全活性状態になること、並びに当該全活性型ＰＫＤ１がサルコメアのＺディスク領域に移動することがわかった。通常、サルコメアのＺディスクに存在するタンパク質が心肥大に関係していると考えられることから、以上の結果はＰＫＤ１が心肥大のシグナル伝達に関連していることを示唆するものである。
【０１４３】
実施例３    心肥大誘導による全活性型ＰＫＤ１の心筋細胞内での挙動
ＮＥ（ノルエピネフリン）、ＡｎｇII（アンジオテンシンII）及びＬＩＦ（白血病阻害因子）は心肥大を引き起こす物質として良く知られている（Fischer JE, et al., Nature. 207, p.951-953, 1965： Sanchez Torres G, et al., Arch Inst Cardiol Mex., 48(3), p.549-561, 1978: Matsui H, et al., Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 93, p.149-162, 1996）。また、上記心肥大誘導剤のうち、ＮＥ及びＡｎｇIIはＰＫＣを活性化し、特にＰＫＣのサブユニットであるＰＫＣεはＡｎｇIIによって活性化されてＺディスクに移動することも知られている（Disatnik MH, et al., Exp Cell Res. 1994 Feb, 210(2), p.287-97）。さらに、ＮＥによって、心筋細胞中のＰＫＤ１の発現と活性が制御されることが知られている（Fischer JE, et al., Nature, 1965 Aug 28, 207, p.951-953：  Haworth, R.S., et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 2000, 32, p.1013-1023）。
【０１４４】
我々は、ＮＲＣを各種の心肥大誘導剤（ＮＥ，ＡｎｇII、ＬＩＦ）で処理し、該心筋細胞における全活性型ＰＫＤ１の分布（局在）を、実施例２と同様の方法によって調べた。なお、ＮＥはα-アドレナリン様受容体に作用する心肥大誘導剤であり、下記の実験ではプロプラノールを配合してβ-アドレナリン作動性受容体活性をブロックして用いた。
【０１４５】
具体的には、実施例１（１）に記載する方法と同様な方法で調製したＮＲＣを、ポリ-L-リジンでコーティングしたガラス製の培養皿（35mm径）に移し、無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）中で一晩培養した（CO２濃度5%、37℃）。かかる培養細胞を５試料用意して、(1)100μＭ（終濃度、以下同じ）のＮＥ（プロプラノールを２μＭ配合）、(2)100μＭのＡｎｇII、(3)20nＭのＬＩＦ、(4)100μＭのＮＥ（プロプラノールを２μＭ配合）＋400nＭのGF109203X（具体的には、GF109203Xを添加し30分間処理した後に、ＮＥを添加）、(5)20nＭのＬＩＦ＋400nＭのGF109203X（具体的には、GF109203Xを添加し30分間処理した後に、ＬＩＦを添加）をそれぞれに添加して、更に３８時間（CO２濃度5%、37℃）培養した（約１×10３細胞）。なお、ここでGF109203Xは、ＰＫＤに作用しない選択的なＰＫＣ阻害剤である（Zugaza J.L., et al., The EMBO J. 1996, 15, p.6220-6230）。
【０１４６】
培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４w/v％パラホルムアルデヒドで、室温下30分間処理して固定化し、更に0.25v/v％のTriton X-100を含むＰＢＳ中で４℃で30分間、浸透処理し、次いでブロッキング緩衝液（3w/v％ BSA、2v/v％ FBS, 1v/v％ 正常ヤギ血清及び0.03v/v％ Triton X-100を含むPBS）中でインキュべーションした。得られた細胞を、抗体（抗-全活性型PKD1ポリクローナル抗体、抗-不活性型PKD1ポリクローナル抗体、及び抗-サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体）を含むブロッキング緩衝液中で、４℃で16時間インキュべーションした。これをＰＢＳで２回洗浄し、次いで0.3v/v％ Cy3-標識・抗−マウスIgG抗体、及び0.3v/v％ Cy2-標識・抗−ウサギIgG抗体（第２抗体）（いずれもAmersham-pharmacia製）を配合したＰＢＳに移して、室温で１時間インキュべーションした。細胞の蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡LSM5 Pascal（Carl Zeiss）で観察した。
【０１４７】
(1)ＮＥ処理、(2)ＡｎｇII処理、(3)ＬＩＦ処理、(4)ＮＥ＋GF109203X処理、及び(5)ＬＩＦ＋GF109203X処理した細胞について得られた結果を、それぞれ図４、５，６，７Ａ及び７Ｂに示す。
【０１４８】
図４及び５の結果からわかるように、心肥大誘導剤である(1)ＮＥまたは(2)ＡｎｇIIで心筋細胞を処理すると、いずれの細胞もサルコメア構造が形成され（Ｚディスクの可視化）、心肥大化が誘導されていた。また、いずれもＰＫＤ１が全活性化（リン酸化）され、心筋細胞のサルコメアのＺディスク周囲に移動することが観察された。しかし、いずれの場合も不活性型ＰＫＤ１は心筋細胞の核周辺に留まっていた。
【０１４９】
一方、図６で示すように、ＮＥ及びＡｎｇIIと同じく心肥大を誘導する試薬である(3)ＬＩＦで心筋細胞を処理した場合には、サルコメア構造が形成され（Ｚディスクの可視化）、心肥大化が誘導されたにも関わらず、ＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）もサルコメアＺディスクへの移動も観察されなかった。また、図７Ａからわかるように、予め心筋細胞をGF109203Xで処理してＰＫＣの活性化を阻害しておくと、心肥大誘導剤（ＮＥ）で処理しても心肥大化は生じず、またＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）並びにそのサルコメアＺディスクへの移行も見られなかった。
【０１５０】
また、ここには示していないが、心肥大化作用を有することが知られているエンドセリン１(ＥＴ１)や上皮成長因子（ＥＧＦ）を作用させた心筋細胞でも、図４及び５で示すＮＥ及びＡｎｇIIと同じ観察結果が得られた。一方、心肥大化作用を有することが知られている塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）を作用させた心筋細胞では、図６で示すＬＩＦと同じ観察結果が得られた。
【０１５１】
以上の結果から、(ａ) 心肥大を発生するシグナル伝達経路には、ＮＥ、ＡｎｇII、ＥＴ１、及びＥＧＦによって誘導される心肥大シグナル伝達経路と、ＬＩＦやｂＦＧＦによって誘導される心肥大シグナル伝達経路等の複数の経路があり、ＰＫＤ１は、そのうち前者によって誘導される心肥大シグナル伝達に関わる一成分であること、(ｂ)当該心肥大シグナル伝達においてＰＫＤ１は全活性化（リン酸化）され、心筋細胞のサルコメアのＺディスク領域に移行すること、(ｃ)さらに当該心肥大シグナル伝達経路におけるＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）及びそのＺディスクへの移行は、ＰＫＣの活性化を介して生じるものであることがわかる。
【０１５２】
ＮＥ、ＡｎｇII、ＥＴ１によって誘導される心肥大は、いずれも７回膜貫通型受容体を介したＧタンパク質の活性化を通じて生じると考えられているのに対し、ＬＩＦによる心肥大の発生機構はgp130受容体を介するものである。特に、ＬＩＦ処理ではＰＫＤ１が活性化しなかったことを示す上記の結果は、ＰＫＤ１は７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＣＰＲ）シグナル伝達経路を介した心肥大シグナル伝達経路の一成分であって、この経路を介した心肥大発生メカニズムに深く関わっていることを示唆するものである。また、ＥＧＦによる心肥大化機構は、ＧＰＣＲを全く介さない受容体型チロシンキナーゼによるものであるので、ＰＫＤ１はＧＰＣＲ経路以外にもＥＧＦ受容体下流にも位置することが示唆された。
【０１５３】
実施例４    ＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）の制御
ＰＫＤ１の活性は、その選択的基質であるSyntide-2（APLARTLSVAGLPGKK）に対するリン酸化能力を指標として評価することができる（Valverde, A.M., et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 91, 1994, p.8572-8576）。そこで、心肥大を誘導した心筋細胞に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を、当該Syntide-2に対するリン酸化能力に基づいて評価した。
【０１５４】
具体的には、(1)100nＭ ＴＰＡ、(2)100μＭ ＮＥ、(3)20nＭ ＬＩＦの各々で20分間処理して肥大を誘導したＮＲＣ、並びに(4)400nＭ GF109203X（ＰＫＣ阻害剤）、(5)20nＭ ＴＰＡ＋400nＭ GF109203X、(6)100μＭ ＮＥ＋400nＭ GF109203X、(7)20nＭ ＬＩＦ＋400nＭ GF109203Xの各々で20分間処理したＮＲＣについて、Syntide-2を基質として免疫沈降キナーゼアッセイを行い、各ＮＲＣ中に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を測定した。また、コントロールとして、何も処理しないＮＲＣ（未処理ＮＲＣ）についても同様にして、内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を測定した。
【０１５５】
（１）免疫沈降キナーゼアッセイ
実施例１（１）に記載する方法と同様な方法で調製したＮＲＣを無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）を用いて一晩培養した（CO２濃度5％、37℃）。かかる培養細胞に、(1)100ｎＭのＴＰＡ、(2)100μＭのＮＥ（プロプラノールを２μＭ配合）、(3)20nＭのＬＩＦ、(4)400nＭ GF109203X（PKC阻害剤）、(5)20nＭ ＴＰＡ＋400nＭ GF109203X、(6)100μＭ ＮＥ＋400nＭ GF109203X、または(7)20nＭ ＬＩＦ＋400nＭ GF109203Xをそれぞれに添加して、20分間処理した。得られた細胞をLysis緩衝液Ａで処理して、氷上で60分間、抗−全活性型ＰＫＤ１ポリクローナル抗体とともにインキュべーションした。これをprotein G Sepharose 4Bで処理して、当該樹脂に結合したタンパク質（Protein G Sepharose 4B結合  PKD1−抗PKD1抗体複合体）を回収した。ＰＫＤ１免疫沈降物をLysis緩衝液Ａで１回洗浄し、さらにＮａＦを含まないLysis緩衝液Ａで２回洗浄した。
【０１５６】
得られたＰＫＤ１免疫沈降物を、ＮａＦを含まないLysis緩衝液Ａ中で、0.5 mg/ml immunizing peptide （抗−全活性型PKD１ポリクローナル抗体作成時に被験動物を免疫化するために接種した抗原ペプチド。このペプチドとProtein G Sepharose 4B結合  PKD1−抗PKD1抗体複合体をインキュベートすると、上記抗原ペプチドと抗PKD1抗体とが結合して、その結果PKD1が遊離取得できる。）100μlとともにインキュべーションすることによって、ＰＫＤ１を溶出させた。
【０１５７】
溶出したＰＫＤ１（10μl）をアッセイ混合液（15μl Tris/MgCl2 [100mM Tris, 100mM MgCl2]、5μl ATP [800μM]、0.2μl ３２γ-ATP、及び40μg Syntide-2）とともに、30℃で５分間インキュべーションした。次いで、液体シンチレーションカウンターで、ＰＫＤ１のリン酸化活性を測定した（n=9）。
【０１５８】
（２）結果
結果を図８に示す。棒グラフ中、左から、未処理ＮＲＣ（ネガティブコントロール）、並びに(1)100ｎＭ ＴＰＡ処理，(2)100μＭ ＮＥ（プロプラノール２μＭ配合）、(3)20nＭ ＬＩＦ、(4)400nＭ GF109203X（PKC阻害剤）、(5)100nＭ ＴＰＡ＋400nＭ GF109203X、(6)100μＭ ＮＥ＋400nＭ GF109203X、及び(7)20nＭ ＬＩＦ＋400nＭ GF109203Xで処理したＮＲＣの内在ＰＫＤ１のリン酸化活性を示す。なお、図中、各ＮＲＣの内在ＰＫＤ１のリン酸化活性は、ネガティブコントロールの測定値（CPM,32P）を100％とした場合の、それに対する相対値（％）で示す。
【０１５９】
図８に示すように、ＴＰＡまたはＮＥで処理したＮＲＣに内在するＰＫＤ１は、いずれも未処理ＮＲＣ（ネガティブコントロール）並びにＬＩＦで処理したＮＲＣに内在するＰＫＤ１に比べて、顕著に高いリン酸化活性を示した。一方、ＮＲＣをこれらの心肥大誘導剤（ＴＰＡ，ＮＥ）とＰＫＣ阻害剤（GF109203X）とで同時に処理すると、内在性ＰＫＤ１の活性はネガティブコントロールと同レベルまで抑制された。
【０１６０】
このことから、心筋細胞においてＰＫＤ１のリン酸化は、ＰＫＣの活性化に基づいて生じることがわかる。また、ＬＩＦで処理した心筋細胞については、内在性ＰＫＤ１の活性は未処理ＮＲＣの活性と殆ど変わらなかった。この結果は、上記実施例３で示したように、ＰＫＤ１が、ＬＩＦによって誘導される心肥大シグナル伝達経路とは別個の、ＮＥによって誘導されるＧＰＣＲを介した心肥大シグナル伝達経路に関わる成分であることを裏付けるものである。
【０１６１】
実施例５    ＰＫＤ１の活性を制御するＰＣＫのサブタイプ
実施例３及び４から、心肥大に関連して生じるＰＫＤ１の全活性化にはＰＫＣの活性化が関わっていることが示された。ＰＫＣには複数のサブタイプが存在することが知られているため、ここではＰＫＤ１の全活性化にＰＫＣのどのサブタイプが関わっているかについて調べた。
【０１６２】
この目的のため、具体的にはkinase dead PKCs（PKCα、PKCβI、PKCδ、PKCε、PKCζ）を強制発現させたＮＲＣを、実施例４と同様にして心肥大誘導剤（ＮＥ）で処理し、得られたＮＲＣに内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を免疫沈降キナーゼアッセイで測定した。
【０１６３】
（１）kinase dead PKCsを発現する心筋細胞の調製
実施例１（１）に記載する方法と同様な方法で10cmプラスティックディッシュに調製したＮＲＣに、形質転換試薬（Duo Fect:Q-biogen）を用いてそのマニュアルに従って、kinase dead PKCs（PKCα、PKCβI、PKCδ、PKCεまたはPKCζ）をコードするＤＮＡを導入し、各kinase dead PKCs（PKCα、PKCβI、PKCδ、PKCεまたはPKCζ）を強制発現するようにＮＲＣを形質転換した。
【０１６４】
（２）免疫沈降キナーゼアッセイ
上記、各kinase dead PKCs（PKCα、PKCβI、PKCδ、PKCε、またはPKCζ）を強制発現することによって内在性のＰＫＣｓ活性を抑制したＮＲＣを、各々無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）中で一晩培養した後（CO２濃度5％、37℃）、100μＭのＮＥ（プロプラノールを２μＭ配合）を添加して、20分間処理した。得られた各ＮＲＣを実施例４（１）と同様に処理してＰＫＤ１を取得した。次いで、得られたＰＫＤ１（10μl）を実施例４（１）と同様にアッセイ混合液とともに30℃、５分間インキュべーションし、液体シンチレーションカウンターで、ＰＫＤ１のリン酸化活性を測定した（n=9）。なお、比較実験として野生型ＮＲＣについてＮＥ処理した細胞に内在するＰＫＤ１、及びネガティブコントロールとして未処理の野生型ＮＲＣに内在するＰＫＤ１についても同様にしてリン酸化活性を測定した。
【０１６５】
（３）結果
結果を図９に示す。棒グラフ中、左から、(1)未処理-野生型ＮＲＣ（ネガティブコントロール）、(2)野生型ＮＲＣ＋ＮＥ処理、(3)kinase dead PKCα強制発現ＮＲＣ＋ＮＥ処理、(4)kinase dead PKCβI強制発現ＮＲＣ＋ＮＥ処理、(5) kinase dead PKCδ強制発現ＮＲＣ＋ＮＥ処理、(6)kinase dead PKCε強制発現ＮＲＣ＋ＮＥ処理、及び(7)kinase dead PKCζ強制発現ＮＲＣ＋ＮＥ処理した心筋細胞に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を示す。
【０１６６】
図９に示すように、ＮＲＣにkinase dead PKCεを導入した場合のみ（すなわち、PKCε活性が抑制してなるＮＲＣだけ）が、細胞中の内在ＰＫＤ１活性が未処理野生型ＮＲＣ（ネガティブコントロール）のＰＫＤ１活性と同レベルであり、ＮＥで心肥大を誘導してもＰＫＤ１が全活性化（リン酸化）されないことがわかった。このことは、ＰＫＣのサブユニットのうちＰＫＣεが、心筋細胞（心肥大のシグナル伝達経路）におけるＰＫＤ１の上流に位置するアクチベーターであることを示すものである。
【０１６７】
実施例６    ＰＫＣεとＰＫＤ１の相互作用
以上の実験結果から、ＧＰＣＲを介した心肥大のシグナル伝達にＰＫＣεとＰＫＤ１の活性化が関わっていること、及びＰＫＣεがＰＫＤ１の上流に位置するアクチベーターであることが分かった。そこで次に、心筋細胞におけるＰＫＣεとＰＫＤ１との相互作用について、免疫沈降法を用いて調べた。具体的には、下記の方法によって、ＮＥ（100μＭ）で心肥大を誘導したＮＲＣ中におけるＰＫＣεとＰＫＤ１の相互作用を調べた。
【０１６８】
（１）免疫沈降法
実施例１（１）に記載する方法に従って調製した初代培養ＮＲＣを、実施例３と同様に100μＭのＮＥ（プロプラノールを２μＭ配合）で処理し、当該ＮＥ処理ＮＲＣをLysis緩衝液Ａで処理して、細胞抽出液（Cell Lysate）１mlを得た。そのうち300mlを氷上で60分間、抗−PKD1/2モノクローナル抗体とインキュベートし、これをprotein G Sepharose 4Bで処理して、当該樹脂に結合するタンパク質（抗−PKD1抗体免疫沈降サンプル）を回収した（なお、実施例１に示すようにNRC中にはPKD2は存在しない。）。同じようにして抗−PKDεモノクローナル抗体を用いて、抗−PKDε抗体免疫沈降サンプルを回収した。また、コントロールとして未処理のＮＲＣについても同様に細胞抽出液（Cell Lysate）１mlを取得し、抗−PKDε抗体免疫沈降サンプル及び抗−PKD1抗体免疫沈降サンプルを調製した。
【０１６９】
次に各ＮＲＣについて得られた抗−PKCε抗体免疫沈降サンプル及び細胞抽出液（Cell Lysate）について、第１抗体として抗−PKD1/2モノクローナル抗体、及び第２抗体としてホースラディシュ由来パーオキシダーゼを結合した抗マウスまたはウサギＩｇＧ（Amasham pharmacia製）を使用して、ウエスタンブロット法を行った。抗−PKCε抗体免疫沈降サンプルに関する結果を図１０の第１パネルに、細胞抽出液に関する結果を第３パネルに示す。
【０１７０】
また各ＮＲＣについて得られた抗−PKD1/2抗体免疫沈降サンプル及び細胞抽出液（Cell Lysate）について、第１抗体として抗−PKCεモノクローナル抗体、及び上記の第２抗体を使用して、ウエスタンブロット法を行った。抗−PKD1/2抗体免疫沈降サンプルに関する結果を図１０の第２パネルに、細胞抽出液に関する結果を第４パネルに示す。
【０１７１】
第１及び３パネルで示されるように、ＮＥ処理したＮＲＣの抗−PKD1/2抗体免疫沈降サンプル（すなわち、PKD1を含むサンプル）及びは抗−PKCε抗体免疫沈降サンプル（すなわち、PKCεを含むサンプル）は、それぞれ抗−PKCε抗体及び抗−PKD1/2抗体と反応した。このことから、心肥大を誘導したＮＲＣ中で、ＰＫＣεとＰＫＤ１との複合体が形成されていることがわかる。ＮＥ未処理のＮＲＣ中にはその存在が認められなかったことから、心肥大化過程（心肥大シグナル伝達過程）において活性化したＰＫＣεがＰＫＤ１と反応して複合体を形成すると考えられる。このように、心筋細胞内での肥大過程で、心肥大の誘導に関わることが既に知られているＰＫＣεに、ＰＫＤ１が相互作用することが確認されたことで、さらにＰＫＤ１が心肥大シグナルの主要な構成タンパク質の一つであることが示唆された。
【０１７２】
なお、ＰＫＣεとＰＫＤ１は、in vitroで相互反応することが確認されているが（Waldron, R.T., et al., J. Biol. Chem. 1999, 274, p.9224-9230）、これは、単に株化した培養細胞中でＰＫＣεとＰＫＤ１を強制発現させて両者の相互作用を見たものにすぎない。上記実施例６の結果は、肥大化した心筋細胞（100μM  NE処理）に内在するＰＫＣεとＰＫＤ１とが、互いに活性化して相互反応し複合体を形成することを初めて示したものである。
【０１７３】
実施例７    全活性型ＰＫＤ１による心肥大誘導
上記の実験結果から、心肥大を生じている心筋細胞中にはＰＫＤ１が全活性化（リン酸化）していることが分かった。ここではＰＫＤ１を全活性化（リン酸化）することによって心肥大が誘導されるかどうか（全活性型ＰＫＤ１による心肥大誘導の有無）について調べた。
【０１７４】
（１）
具体的には、まず、ＧＦＰ融合−構成的活性型ＰＫＤ１（GFP-PKD1／CA）をコードするＤＮＡ、またはコントロールとしてＧＦＰ（GFP）をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを、それぞれ形質転換試薬（Duo Fect:Q-biogen）を用いてそのマニュアルに従って、ＮＲＣに導入して形質転換した。
【０１７５】
上記で得られた細胞（形質転換体）を、抗体（抗-サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体）を含むブロッキング緩衝液中で、４℃で16時間インキュべーションした。これをＰＢＳで２回洗浄し、次いで0.3v/v％ Cy3-標識・抗−マウスIgG抗体（第２抗体）（Amersham-pharmacia製）を配合したＰＢＳに移して、室温で１時間インキュべーションした。細胞の蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡LSM5 Pascal（Carl Zeiss製）で観察した。
【０１７６】
結果を図１１Ａに示す。全活性型ＰＫＤ１（GFP-FKD1 CA）を導入したＮＲＣ（下パネル）では、コントロール（上パネル）に比して明らかにサルコメア構造（Ｚディスク）が形成されており、このことから心肥大が誘導されていることが判明した。さらに図１１Ａの下パネルの結果は、全活性型ＰＫＤ１がＺディスクに自発的に局在することを示しており、これから全活性型ＰＫＤ１が単独でＺディスクの形成を誘導している可能性が示唆される。
【０１７７】
（２）構成的活性型ＰＫＤε（ＰＫＤε／ＣＡ）をコードするＤＮＡを有するプラスミドを、、製造者の指示に従って、Rat Cardiomyocyte-Neonatal Nucleofector kit（Amaxa GmbH製）を用いてＡｍａｘａエレクトロポレーターによりエレクトロポレーションを行い、細胞に導入した。得られた細胞（形質転換体）を、（１）と同様の方法により、細胞の蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡LSM5 Pascal（Carl Zeiss製）で観察した。結果を図１１Ｂに示す。この結果は、活性型ＰＫＤεだけが自発的にＺディスクに移行することを示している。
【０１７８】
実施例８    活性型ＰＫＣと心肥大誘導との関係
各ＰＫＣ発現プラスミドを用いて、心肥大を引き起こすＰＫＣアイソフォーム（PKCε、PKCβI及びPKCδ；これらは心臓における主なPKCである）の同定を試みた。
【０１７９】
具体的には、実施例７と同様にして、構成的活性型ＰＫＣ変異体（CA-PKCε、CA-PKCβI、CA-PKCδ）、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＣ変異体（K440M PKCε）を組み込んだ発現ベクターをＮＲＣに導入して形質転換し、その形質転換細胞を抗−サルコメリック-α-アクチニン抗体及び第２抗体で染色して、肥大の有無を、共焦点レーザー顕微鏡（LSM5 Pacal:Carl Zeiss）で観察した。なお、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＣ変異体（K440M PKCε）を発現させたＮＲＣは、心肥大誘導剤であるＮＥまたはＬＩＦで38時間処理し培養した後、免疫染色した。結果を図１２に示す。
【０１８０】
パネルＡは構成的活性型ＰＫＣε（CA-PKCε）を導入したＮＲＣ、パネルＢは構成的活性型ＰＫＣβI（CA-PKCβI）を導入したＮＲＣ、パネルＣは構成的活性型ＰＫＣδ（CA-PKCβδ）を導入したＮＲＣ、パネルＤはドミナント・ネガティブ型ＰＫＣε（K440R PKCε）を導入したＮＲＣであって100μＭのＮＥで処理した細胞（心肥大誘導処理）、パネルＥはドミナント・ネガティブ型ＰＫＣε（K440M PKCε）を導入したＮＲＣであって20nＭのＬＩＦで処理した細胞（心肥大誘導処理）を、それぞれ抗−サルコメリック-α-アクチニン抗体及び第２抗体と反応させてα−アクチニンを視覚化させた画像を示す。
【０１８１】
図１２からわかるように、構成的活性型ＰＫＣεを発現したＮＲＣには、顕著に肥大が生じていることが観察された（パネルＡ）。一方、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＣεを発現したＮＲＣは心肥大誘導剤であるＮＥで処理しても心肥大を生じなかった（パネルＤ）。このことから、ＰＫＣのアイソフォームのうち、ＰＫＣεが心肥大のシグナル伝達に関与していることが判明した。
【０１８２】
実施例９    心肥大を誘導する活性化ＰＫＣε及び全活性化ＰＫＤ
各種形質転換したＮＲＣについて、利尿性ナトリウム因子（ＡＮＦ、肥大マーカー：Tsuchimochi H, et al., Lancet,  1987 Aug 8. 2 (8554) p.336-7）の発現レベルを比較した。具体的には、実施例７と同様にして、構成的活性型ＰＫＣｓ（CA-PKCε、CA-PKCβI、CA-PKCδ）、kinase dead PKCε(KD- PKCε)、構成的活性型ＰＫＤ１（CA-PKD1）、ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１（DN-PKD1）、またはＧＦＰをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを、ＮＲＣに導入して各種の形質転換体を作成した。得られた形質転換細胞について、またそれをさらに心肥大誘導剤（NE又はLIF）処理した細胞について、実施例７の（２）と同様の方法で、第１抗体として抗−ＡＮＦ抗体、第２抗体として0.3v/v％ Cy2-標識・抗−ラビットIgG抗体（第２抗体）（Amersham-pharmacia製）を用いて、免疫染色を行った。同じ細胞数でＮＲＣが増殖している（105）ディッシュを、各形質転換細胞につき３ディッシュずつ用意し、1デッシュあたり３枚の画像（共焦点レーザー顕微鏡（LSM5 Pacal:Carl Zeiss））を観察し、各細胞の画像データの蛍光レベル（すなわち、各細胞におけるＡＮＦの発現レベル）を画像解析ソフトScion image （Scion Corporation社製）を用いて測定した。
【０１８３】
結果を図１３に示す。棒グラフ中、左から、ＧＦＰ発現＋未処理（ネガティブコントロール）、野生型＋NE処理（ポジティブコントロール）、CA-PKCε発現＋未処理、CA-PKCβI発現＋未処理、CA-PKCδ＋未処理、KD-PKCε発現＋未処理、KD-PKCε発現＋NE処理、CA-PKD1発現＋未処理、DN-PKD1発現＋未処理、DN-PKD1発現＋LIF処理、及びDN-PKD1発現＋NE処理したＮＲＣのＡＮＦ発現レベルを示す。その結果、構成的活性型ＰＫＤ１（CA-PKD1）の導入または構成的活性型ＰＫＣε（CA-PKCε）の導入によってＰＫＤ１を全活性化させるかまたはＰＫＣεを活性化させた心筋細胞は、肥大化が生じていることが確認された。この結果は、上記実施例７及び８の結果と一致し、ＰＫＣεの活性化、ＰＫＤの全活性化が、ＧＰＣＲを介した心肥大シグナルの中心的で必要不可欠なカスケードであることを裏付けるものである。
【０１８４】
＜考察＞
以上の実験から、哺乳類の心筋細胞内で、ＰＫＤ１がＰＫＣεによって直接活性化されることにより心肥大が誘導されることがわかった。
【０１８５】
具体的には、心筋細胞においてＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）またはＰＫＣεの活性化によって心肥大が誘導されること（実施例７〜９）、一方、ＰＫＤ１やＰＫＣεのドミナント・ネガティブ変異体を導入した心筋細胞では、ＡｎｇIIやＮＥによる刺激によっても心肥大が誘導されず、肥大シグナルが遮断されること（実施例７〜９）から、ＰＫＣεの活性化並びにＰＫＤ１の全活性化（リン酸化）が、心筋細胞内でのＡｎｇIIやＮＥによる心肥大シグナル（ＧＰＣＲを介した心肥大シグナル）の中心的なカスケードであると考えられる。また、心筋細胞内でのＰＫＤ１の全活性化及びそれによる心肥大誘導には、ＰＫＣεの活性化が必要であり（実施例４及び５）、さらに心肥大した心筋細胞中にはＰＫＣεとＰＫＤ１との複合体形成が認められること（実施例６）から、哺乳類の心筋細胞内のＧＰＣＲを介した心肥大シグナルにおいて、ＰＫＣεはＰＫＤ１の上流に位置するアクチベーターであり、ＰＫＣεの活性化に伴ってＰＫＤ１は活性化され、両者は複合体を形成して心肥大のシグナル伝達を担っていると考えられる。
【０１８６】
なお、上記実験では、ＮＥやＡｎｇIIによって誘導されるＧＰＣＲを介した心肥大シグナル伝達経路に着目したが、ＥＧＦを作用させた心筋細胞でも同様にＰＫＤ１の全活性化並びにそのサルコメアＺディスクへの移行が認められたことから、ＰＫＤ１はＥＧＦ受容体下流にも位置するものと考えられ、ＧＰＣＲを介した心肥大シグナル伝達経路と同様に、ＰＫＤ１を介したカスケードが、ＥＧＦによる心肥大化機構（ＧＰＣＲを介さない受容体型チロシンキナーゼによる心肥大化機構）に存在すると考えられる。
【０１８７】
実施例１０    ＥＮＨ２による心肥大化抑制作用
ＥＮＨ１(Enigma Homologue protein 1) は、ＰＫＣβIの制御領域をbaitとした酵母Two-hybridスクリーニングにより、ラット脳由来ｃＤＮＡライブラリーから単離同定された約60kDaの心臓・骨格筋特異的タンパク質で、Ｎ末端側にＰＤＺドメイン、Ｃ末端側に３つのＬＩＭドメインを有する。また、ＬＩＭドメインを欠失し、そのかわりにT-stretchと呼ばれる相同配列を有するスプライス変異体ＥＮＨ２（ヒト、マウス、ラット）及びＥＮＨ３（マウス、ラット）等も複数見出されている（図１４参照）。
【０１８８】
ＮＲＣをＰＫＣ活性化剤であるホルボールエステル（例えば、ＴＰＡ等）によって心肥大化状態に誘導させると、ＥＮＨ１はＰＤＺドメインを介してα−アクチニンと結合し、サルコメアのＺディスクにトランスロケートすること、また最近では、ＥＮＨ１はＬＩＭドメインを介してＰＫＣβをZディスクにリクルートするScaffold (足場) タンパク質であることが報告されている（Nakagawa N, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 272(2), p.505-512）。
【０１８９】
なお、本発明者らは、上記の報告以後、前記の実験結果から直接ＰＫＣεによりリン酸化され全活性化することが判明したＰＫＤ１が、ＥＮＨ１と相互することを見いだし、その相互作用領域が、ＰＫＤ１のＣ末領域に位置する触媒領域とＥＮＨ１のＬＩＭドメインであることを同定した。また、ＧＣＰＲを介する心肥大誘導剤（ＮＥ，ＡｎｇII等）で心肥大を誘導した心筋細胞内で、全活性型ＰＫＤ１とＥＮＨ１がサルコメアのＺディスクに移行し、そこに局在することを見いだした。一方、ＬＩＦ等のｇp１３０レセプターを介した心肥大誘導剤では、ＰＫＤ１は活性化されずZディスクにも移行しない。このことから、ＰＫＤ１はＧＰＣＲを介したシグナルで活性化し、ＥＮＨ１とともに、心筋細胞サルコメアＺディスクに移行し局在することが判明した。さらに本発明者らは、肥大化した心筋細胞内で、活性化したＰＫＤ１、ＰＫＣε、及びＥＮＨ１が相互に作用し、心筋細胞サルコメアＺディスク上に局在して複合体を形成していることを見いだした（これらはいずれも未発表）。
【０１９０】
（１）実験
実施例１（１）に記載する方法に従って調製したＮＲＣを、ポリ-L-リジンでコーティングしたガラス底製の培養皿（35mm径）に移し、無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）中で一晩培養した（CO２濃度5%、37℃）。これを商品マニュアルに従って、ＦＬＡＧ融合−ＥＮＨ１またはＦＬＡＧ融合−ＥＮＨ２をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドをそれぞれ形質転換試薬（Duo Fect:Q-biogen）と懸濁し、ＮＲＣにその調整液を添加して、心筋細胞を形質転換した。なお、細胞は10％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。形質転換1日後に無血清培地に交換し、それぞれの形質転換細胞（FLAG融合−ENH1発現ＮＲＣ、FLAG融合−ENH2発現ＮＲＣ）を２つにわけて、一方を20ｎＭ ＴＰＡで処理して、ＴＰＡ処理ＮＲＣと未処理のＮＲＣを作成した。
【０１９１】
約１８時間後、各形質転換細胞のＴＰＡ処理ＮＲＣと未処理ＮＲＣを、実施例３と同様な方法を用いて、抗−ANFポリクローナル抗体（T4015, PENINSULA LABORATORIES INC.製）及び抗−FLAGモノクローナル抗体（Sigma製）で、二重染色し、細胞の蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１９２】
（２）結果
結果を図１５に示す。図に示すように、ＥＮＨ１を導入し発現させて心肥大化試薬で処理した場合にはサルコメアが形成され、またＡＮＦの発現が増加して心肥大が認められたが、ＥＮＨ２を導入し発現させたＮＲＣは、心肥大化試薬で処理してもサルコメア形成が見られず、ＡＮＦ発現量が減少していた。このことから、ＬＩＭドメインを持たないスプライス欠失変異体ＥＮＨ２はＥＮＨ１によるサルコメアＺディスクへのＰＫＣの繋ぎとめを拮抗阻害し、心肥大化シグナルカスケードを抑制ないしは遮断する「内在性抗心肥大アンタゴニスト」であることが示唆された。またこのことから、ＥＮＨ２と同じくＬＩＭドメインを持たないスプライス欠失変異体ＥＮＨ３（マウス、ラット）もまた、ＥＮＨ１によるサルコメアＺディスクへのＰＫＣの繋ぎとめを拮抗阻害し、心肥大化シグナルカスケードを抑制ないしは遮断する「内在性抗心肥大アンタゴニスト」として作用すると考えられる。
【０１９３】
図１６に心肥大シグナル制御モデルの概念図を示す。上記の結果から、ＧＰＣＲを介した心肥大シグナル伝達機構において、心筋細胞が肥大化される時、ＥＮＨ１はサルコメアＺディスク上に心肥大シグナル伝達因子を保持し、該Ｚディスク上に保持された状態でＰＫＤ１はＰＫＣεによって活性化され、リン酸化シグナルがさらに下流に伝達されること、そして、ＬＩＭドメインを欠失したＥＮＨ１の変異体であるＥＮＨ２は、ＥＮＨ１が介する心肥大シグナルを抑制し、心肥大化を調節・抑制する内在性アンタゴニストとして機能していることが示唆された。また、これは、心筋細胞内でＥＮＨ１の発現またはその機能活性を抑制することによって心肥大化シグナルカスケードを抑制ないしは遮断することができ、心肥大を抑制できる可能性を示唆するものでもある。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
心筋細胞内でのＰＫＤ１の機能発現を抑制する物質を有効成分とする本発明の心肥大抑制用組成物は、心肥大のシグナルカスケードにおける中心的役割を担うＰＫＤ１の心筋細胞内での機能発現を抑制することによって心肥大の誘導を阻止若しくは抑制することができる。また、ＥＮＨ２をコードする塩基配列を有する核酸を有効成分とする本発明の心肥大抑制用組成物は、心筋細胞の肥大化に際して心肥大シグナル伝達因子を保持するＥＮＨ１の機能を阻害することによって、心肥大の誘導を阻止若しくは抑制することができる。このため、本発明の心肥大抑制用組成物は、心肥大の誘導を抑制することによって、心肥大の発生並びに進展を抑制することができ、心肥大に起因する疾患、具体的には心不全や虚血性心疾患、または不整脈などの心疾患を予防または治療するための医薬品組成物として有効に用いることができる。
【０１９５】
また本発明は、心肥大シグナル経路を介した心肥大の誘導にＰＫＤ１が主要成分として深く関わっていること、並びにＥＮＨ２が心肥大の誘導に関わるＥＮＨ１の内在性アンタゴニストであることを新たに見いだし、これを提供するものである。よって、本発明が提供する心肥大発生メカニズムに関する知見を利用することにより、心肥大の発生を抑制するための有効成分、または心肥大に起因する心疾患の予防または治療のための有効成分をスクリーニングする方法を構築することができる。そして、当該スクリーニング方法によって取得された心肥大抑制物質を用いることによって、心不全、虚血性心疾患または不整脈等の心疾患の予防または治療のために有効な組成物を調製し、提供することができる。
【０１９６】
また上記心肥大発生メカニズムに関する知見を利用することにより、心肥大の病態を模倣した心肥大病態モデル非ヒト動物を作成し提供することができる。かかる心肥大病態モデル非ヒト動物は、心肥大の組織学的研究や心疾患への進展メカニズムの解明、ならびに心肥大の抑制剤や心疾患の予防・治療剤の開発のための有効成分のスクリーニングに有効に利用することができる。  
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】図１は、プロテインキナーゼＤ１のドメイン構造、ならびに不活性型と全活性型の構造的変化を示す概念図である。
【図２】図２は、ラット新生仔由来心筋細胞（以下、ＮＲＣともいう）について、ＴＰＡ（12-O-tetradecanolyphorbol 13-acetate）で処理した場合の、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）と不活性型ＰＫＤ１（未リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布（細胞質[Cytoplasm]、細胞膜[Membrane]）を、ＴＰＡで処理しない細胞（None）と対比した、ウエスタンブロットの結果を示す。なお、ＴＰＡはＰＫＣ及びＰＫＤを活性化することが知られているホルボールエステルの１種である。上段から、各試料を(1)抗−PKD1/2モノクローナル抗体、(2)抗−全活性型PKD1ポリクローナル抗体、(3)抗−不活性型PKD1ポリクローナル抗体、(4)抗−サルコメリック-α-アクチニン・モノクローナル抗体、及び(5)抗−H3ヒストンマウス・モノクローナル抗体で反応させた結果を示す。ＴＰＡ処理したＮＲＣの細胞膜画分に、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）が局在していることがわかる（実施例１）。
【図３】図３は、ＴＰＡで処理したＮＲＣ（図Ａ）及び未処理のＮＲＣ（図３Ｂ）について、α−アクチニン、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）、及び不活性型ＰＫＤ１（不リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色（共焦点レーザー顕微鏡）によって調べた結果を示す図である（実施例２）。図３Ｂ（未処理ＮＲＣ）との対比から、図３Ａ（ＴＰＡ処理ＮＲＣ）ではαアクチニン局在からサルコメア構造形成（心肥大状態）が認められ、ＴＰＡ処理により心肥大が生じることがわかる。またＴＰＡ処理により、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）だけがサルコメアＺディスクに移行して、そこに局在することがわかる。なお、左欄の画像（Merged）は、右欄の画像と中欄の画像を重ね合わせたもので、黄色（赤×緑）を呈するほど、両者の画像が一致することを意味する（以下、図３〜６及び１１において同じ）。
【図４】図４は、α-アドレナリン作動性受容体に作用して心肥大を誘導するノルエピネフリン（以下、ＮＥともいう）（プロプラノール(β遮断薬)を加えることでβアドレナリン受容体の作用を抑制している）で処理したＮＲＣについて、α−アクチニン、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）、及び不活性型ＰＫＤ１（不リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例３）。ＮＥ処理によりサルコメア構造の発達（心肥大状態）が認められた。また、ＮＥ処理により全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）だけがサルコメアＺディスクに移行して、そこに局在することがわかる。
【図５】図５は、心肥大を誘導するアンジオテンシンII（以下、ＡｎｇIIともいう）(100ｎＭ)で処理したＮＲＣについて、α−アクチニン、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）、及び不活性化ＰＫＤ１（不リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例３）。ＡｎｇII処理によりサルコメア構造形成（心肥大状態）が認められた。また、ＡｎｇII処理により全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）だけがサルコメアＺディスクに移行して、そこに局在することがわかる。
【図６】図６は、心肥大を誘導するＬＩＦ（leukemia inhibitory factor：白血病阻害因子）で処理したＮＲＣについて、α−アクチニン、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）、及び不活性化ＰＫＤ１（不リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例３）。ＬＩＦ処理によりサルコメア構造形成（心肥大状態）が認められた。しかし、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）のサルコメアＺディスクへの移行は認められなかった。
【図７】図７Ａは、ＮＲＣについて、ＰＫＣに対する選択的な阻害剤であるGF109203Xで処理した後に、心肥大誘導剤：ノルエピネフリン（NE）（＋プロプラノール）で処理した場合の、α−アクチニンと全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例３）。心肥大状態及び全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）のサルコメアＺディスク上への移行は認められず、GF109203X処理により、ＮＥ（＋プロプラノール）処理による心肥大状態、及び全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）のサルコメアＺディスク上への移行（図３参照）が阻害されることがわかる。またこのことから、ＮＥ（＋プロプラノール）によって誘導される心肥大状態、並びにＰＫＤ１の活性化及びサルコメアＺディスクへの移行は、ＰＫＣの活性化に依存していることがわかる。図７Ｂは、ＮＲＣについて、同様にGF109203Xで処理した後に、心肥大誘導剤：ＬＩＦで処理した場合の、α−アクチニンと全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例３）。ＬＩＦ単独処理と同様に、心肥大状態は認められたが、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）のサルコメアＺディスク上への移行は認められなかった。このことから、ＬＩＦ誘導される心肥大状態は、ＰＫＣの活性化に依存していないこと、またその心肥大にはＰＫＤ１の活性化及びサルコメアＺディスクへの移行も関係していないことがわかる。
【図８】図８は、ＮＲＣまたは各種の薬剤で処理したＮＲＣに内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を調べた結果を示す図である（実施例４）。横軸は、各種薬剤で処理した（または処理しない）ＮＲＣの種類を示す。左から(1)未処理細胞、(2)ＴＰＡ処理、(3)ノルエピネフリン（＋プロプラノール）（ＮＥ）処理細胞、(4)ＬＩＦ処理細胞、(5)GF109203X処理細胞、(6)GF109203X＋ＴＰＡ処理細胞、(7)GF109203X＋ＮＥ（＋プロプラノール）処理細胞、及び(8)GF109203X＋ＬＩＦ処理細胞を示す。縦軸は、各細胞に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性（Phosphorylation activity of PKD1 (%)）を示す。なお、リン酸化活性（％）は、未処理細胞に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を１００％とした場合の相対％である。
【図９】図９は、正常ＮＲＣ、並びに各種のkinase dead PKCs (PKCα、PKCβI、PKCδ、PKCε、PKCζ)を強制発現させてその活性を阻害したＮＲＣについて、ＮＥ（＋プロプラノール）で処理した場合に、内在するＰＫＤ１のリン酸化活性の変化を調べた結果を示す図である（実施例５）。横軸は、ＮＲＣの種類を示す。左から(1)薬剤未処理の野生型ＮＲＣ、(2)ＮＥ処理した野生型ＮＲＣ、(3)ＮＥ処理したkinase dead PKCα強制発現ＮＲＣ、(4)ＮＥ処理したkinase dead PKCβI強制発現ＮＲＣ、(5)ＮＥ処理したkinase dead PKCδ強制発現ＮＲＣ、(6)ＮＥ処理したkinase dead PKCε強制発現ＮＲＣ、及び(7)ＮＥ処理したkinase dead PKCζ強制発現ＮＲＣを示す。縦軸は、各細胞に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性（Phosphorylation activity of PKD1 (%)）を示す。なお、リン酸化活性（％）は、未処理細胞に内在するＰＫＤ１のリン酸化活性を１００％とした場合の相対％である。
【図１０】図１０は、免疫沈降アッセイによって、ＮＥ（＋プロプラノール）で処理したＮＲＣ内で、ＰＫＤεとＰＫＤ１との存在形態を免疫沈降法とウエスタンブロッティング法により調べた結果を示す図である（実施例６）。
【図１１】図１１Ａは、ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)-構成的活性型ＰＫＤ１（GFP-PKD1 CA）（下段）、及びＧＦＰ（上段）を導入して強制発現させたＮＲＣについて、α−アクチニンとＧＦＰ（すなわち、GFP-PKD1 CA、またはGFP）の細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例７）。GFP-PKD1 CAを強制発現させたＮＲＣ〔すなわち、全活性型ＰＫＤ１（リン酸化ＰＫＤ１）を有するＮＲＣ〕だけに、サルコメア構造の形成（心肥大状態））、並びにそのサルコメアＺディスクへの移行が認められた。図１１Ｂは、ＰＫＣε−ＣＡを導入して強制発現させたＮＲＣについて、α−アクチニンと構成的活性型ＰＫＣε（特に、ＰＫＣε−ＣＡ）の細胞内分布を、免疫蛍光法で染色することによって調べた結果を示す図である。α−アクチニンとＰＫＣεについても免疫蛍光が認められた。
【図１２】図１２中、パネルＡは構成的活性型ＰＫＣε（CA-PKCε）を導入して強制発現したＮＲＣ、パネルＢは構成的活性型ＰＫＣβI（CA-PKCβI）を導入して強制発現したＮＲＣ、及びパネルＣは構成的活性型ＰＫＣδ（CA-PKCδ）を導入して強制発現したＮＲＣにおける、α−アクチニンの細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例８）。また、パネルＤ及びＥはドミナント・ネガティブ型ＰＫＣε（DN-PKCε）を導入して強制発現したＮＲＣについて、それぞれＮＥ（＋プロプラノール）及びＬＩＦで処理した細胞におけるα−アクチニンの細胞内分布を、免疫蛍光法による染色によって調べた結果を示す図である（実施例８）。パネルＡ（CA-PKCε強制発現ＮＲＣ）、Ｂ（CA-PKCβI強制発現ＮＲＣ）及びＥ（DN-PKCε強制発現＋LIF処理ＮＲＣ）において、サルコメア構造の形成（心肥大状態）が認められた。
【図１３】図１３は、各種のＮＲＣについて心肥大のマーカーである、利尿性ナトリウム因子（以下、ＡＮＦともいう）の発現レベルを調べた結果を示す図である。横軸の左から、(1)ＧＦＰ導入ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）（Negative control）、(2)野生型ＮＲＣ＋心肥大誘導アリ（ＮＥ処理）、(3)構成的活性型ＰＫＣε（CA-PKCε）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）、(4)構成的活性型ＰＫＣβI（CA-PKCβI）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）、(5)構成的活性型ＰＫＣδ（CA-PKCδ）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）、(6)kinase dead PKCε（KD-PKCε）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）、(7)kinase dead PKCε（KD-PKCε）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導アリ（ＮＥ処理）、(8)構成的活性型ＰＫＤ１（CA-PKD1）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）、(9)ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１（DN-PKD1）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導ナシ（−）、(10)ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１（DN-PKD1）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導アリ（ＬＩＦ処理）、及び(11)ドミナント・ネガティブ型ＰＫＤ１（DN-PKD1）強制発現ＮＲＣ＋心肥大誘導アリ（ＮＥ処理）を示す。縦軸は、各細胞のＡＮＦの発現レベルを示す。なお、各細胞のＡＮＦの発現レベルは、Negative controlのＡＮＦの発現レベルを１とした場合の相対比で示す。
【図１４】図１４は、マウスＥＮＨ１（mENH1）（Enigma Homologue 1）のドメイン構造と、そのＬＩＭドメインを欠失したスプライス変異体であるマウスＥＮＨ２（mENH2）（Enigma Homologue 2）及びマウスＥＮＨ３（mENH3）（Enigma Homologue 3）のドメイン構造を示す。ＰＤＺドメインは全てのＥＮＨ分子のＮ末端側に、またＬＩＭドメインはＥＨＮ１のＣ末端側に３つ存在する。“Ｉ”（インターナルストレッチ）及び“Ｔ”（ターミナルストレッチ）はいずれも機能不明な保存配列である。
【図１５】図１５は、実施例１０の結果を示す図である。ＮＲＣに、予めＮ末端側にＦＬＡＧエピトープタグを付加したＥＮＨ１もしくはＥＮＨ２を強制発現しておき、心肥大誘導能を有するＴＰＡを２０ｎＭ作用させたものを、抗ＦＬＡＧ抗体または抗ＡＮＦ抗体を使用した蛍光抗体法で観察したものである。ＥＮＨ２を導入したＮＲＣのみ、ＴＰＡの心肥大誘導作用が抑制されていることが、心肥大マーカーであるＡＮＦの発現抑制結果により判明した。
【図１６】図１６は、心筋細胞内における７回膜貫通型ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲともいう）を介した心肥大シグナル制御モデルを示す概念図である。当該心肥大シグナル制御には、ＥＮＨ１、ＰＫＣε及びＰＫＤ１、並びにＥＮＨ２が相互関連している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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