(57)【要約】可溶性Flt-1（sFlt-1）遺伝子を用いる遺伝子療法によって血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害する組成物および方法を提供する。VEGFは、炎症を引き起こすことによって、新生内膜過形成の発生に必須の役割を有する。sFlt-1遺伝子を血管損傷部位に移入することにより、Flt-1媒介VEGFシグナル伝達が遮断され、それによって初期炎症および後期の新生内膜過形成が阻害される。本発明は、冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスクを有する患者における血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸および薬学的に許容される担体を含む組成物であって、該核酸が、血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療するために有効な量のsFlt-1を発現する組成物。
【請求項２】
核酸がベクターに挿入されている、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
ベクターが真核細胞発現プラスミドである、請求項2記載の組成物。
【請求項５】
核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害するために有効な量が、約0.0001 mg〜100 mg／日／患者である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
患者に筋肉内投与する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスクを有する患者に投与する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
患者が高コレステロール血症患者である、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療する薬学的組成物を製造するための、可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸の使用。
【請求項１２】
核酸がベクターに挿入されている、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ （HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、請求項12記載の使用。
【請求項１４】
ベクターが真核細胞発現プラスミドである、請求項12記載の使用。
【請求項１５】
核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項11〜14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、請求項11〜15のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
組成物を約0.0001 mg〜100 mg／日／患者の用量で投与する、請求項11〜16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
組成物を患者に筋肉内投与する、請求項11〜17のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
組成物を、冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスクを有する患者に投与する、請求項11〜18のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
患者が高コレステロール血症患者である、請求項19記載の使用。
【請求項２１】
可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療する方法。
【請求項２２】
核酸がベクターに挿入されている、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ベクターが真核細胞発現プラスミドである、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
核酸を約0.0001 mg〜100 mg／日／患者の用量で投与する、請求項21〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
核酸を筋肉内投与する、請求項21〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
患者が、冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスク因子を有する、請求項21〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
患者が高コレステロール血症患者である、請求項29記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療、より具体的には、fms様チロシンキナーゼ-1（fms-like tyrosine kinase-1：Flt-1）の可溶性断片をコードする遺伝子を用いて、新生内膜過形成を阻害または治療する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生内膜過形成（NIH）は、冠血管形成術後の再狭窄の主な原因である（Libby P, Ganz P、「Restenosis revisited--new targets, new therapies.」、N. Engl. J. Med.、1997、337：418〜9；およびTopol EJ, Serruys PW、「Frontiers in interventional cardiology」、Circulation、1998、98：1802〜20）。血管内皮増殖因子（VEGF）およびその受容体（VEGFR-1：fms-様チロシンキナーゼ1受容体（Flt-1）、VEGFR-2：内皮2型受容体（Flk-1））は、アテローム性動脈硬化症および再狭窄のような血管の炎症および増殖性障害においてアップレギュレートされている（Shibata M, Suzuki H, Nakatani M, Koba S, Geshi E, Katagiri T, Takeyama Y、「The involvement of vascular endothelial growth factor and flt-1 in the process of neointimal proliferation in pig coronary arteries following stent implantation.」、Histochem. Cell Biol.、2001、116：471〜81；Ruef J, Hu ZY, Yin LY, Wu Y, Hanson SR, Kelly AB, Harker LA, Rao GN, Runge MS, Patterson C、「Induction of vascular endothelial growth factor in balloon-injured baboon arteries. A novel role for reactive oxygen species in atherosclerosis」、Circ. Res.、1997、81：24〜33；Chen YX, Nakashima Y, Tanaka K, Shiraishi S, Nakagawa K, Sueishi K、「Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor / vascular permeability factor in atherosclerotic intimas of human coronary arteries.」、Arterioscler Thromb Vasc. Biol.、1999、19：131〜9；およびInoue M, Itoh H, Ueda M, Naruko T, Kojima A, Komatsu R, Doi K, Ogawa Y, Tamura N, Takaya K, Igaki T, Yamashita J, Chun TH, Masatsugu K, Becker AE, Nakao K、「Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human coronary atherosclerotic lesions：possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atheroscleosis.」、Circulation、1998、98：2108〜16）。VEGFは、主に内皮2型受容体Flk-1を通して内皮の再生を誘導して、内皮の機能を改善することによって、そのような障害から動脈を保護すると考えられ、VEGF遺伝子移入またはそのタンパク質の投与によって、内皮損傷後の内皮の再生を誘導し、NIHを減少させる（Baumgartner I, Isner JM、「Somatic gene therapy in the cardiovascular system.」、Annu. Rev. Physiol.、2001、63：427〜50）。しかし、損傷後のNIHの発症におけるVEGFの役割に対しては、依然としてかなりの論争がある（Isner JM、「Still more debate over VEGF.」、Nat. Med.、2001、7：639〜41；およびWare JA. 「Too many vessels? Not enough? The wrong kind? The VEGF debate continues.」、Nat. Med.、2001、7：403〜4）。VEGFが損傷後にアテローム性動脈硬化症またはNIHの発症を引き起こすまたは促進することを示唆する証拠が示されつつある。VEGFは、VEGFの受容体Flt-1を通して、単球の遊走および活性化（Barleon B, Sozzani S, Zhou D, Weich HA, Mantovani A, Marme D、「Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor Flt-1.」、Blood、1996、87：3336〜43）、接着分子（Kim I, Moon SO, Kim SH, Kim HJ, Koh YS, Koh GY、「Vascular endothelial growth factor expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), and E-selectin through nuclear factor-kappa B activation in endothelial cells.」、J. Biol. Chem.、2001、276：7614〜20）、または単球化学遊走タンパク質-1（MCP-1）（Marumo T, Schini-Kerth VB, Busse R、「Vascular endothelial growth factor activates nuclear factor-kappa B and induces monocyte chemoattractant protein-1 in bovine retinal endothelial cells.」、Diabetes 1999、48：1131〜7）を誘導する。さらに、VEGFタンパク質を高コレステロール血症の動物に投与することにより、単球の浸潤および活性化が誘導されて、アテローム発生が増強される（Celletti FL, Waugh JM, Amabile PG, Brendolan A, Hilfiker PR, Dake MD、「Vascular endothelial growth factor enhances atherosclerotic plaque progression.」、Nat. Med.、2001、7：425〜9）。加えて、VEGFは、Flt-1を通して血管平滑筋細胞の遊走を促進する可能性がある（Grosskreutz CL, Anand-Apte B, Duplaa C, Quinn TP, Terman BI, Zetter B, D'Amore PA、「Vascular endothelial growth factor-induced migration of vascular smooth muscle cells in vitro.」、Microvasc. Res.、1999、58：128〜36；およびIshida A, Murray J, Saito Y, Kanthou C, Benzakour O, Shibuya M, Wijelath ES、「Expression of vascular endothelial growth factor receptors in smooth muscle cells」、J. Cell Physiol.、2001、188：359〜68）。
【０００３】
Flt-1の様々な機能も同様に報告されている。単球におけるFlt-1は化学遊走に関与し（Barleon Bら、上記）、平滑筋細胞におけるFlt-1は遊走に関与する（Ishida Aら、上記、およびWang H, Keiser JA、「Vascular endothelial growth factor upregulates the expression of matrix metalloproteinases in vascular smooth muscle cells：role of flt-1.」、Circ. Res.、1998、83：832〜40）。Flt-1は、VCAM-1、ICAM-1、およびMCP-1を通して、化学遊走の重要なメディエータとして作用する（Barleon Bら、上記、Kim Iら、上記、およびMarumo Tら、上記）。Luttunらは、抗Flt-1抗体による処置が、実験的な腫瘍の血管新生、関節炎、およびアテローム性動脈硬化症の発症を減弱させることを報告した（Luttun A, Tjwa M, Moons L, Wu Y, Angelillo-Scherrer A, Liao F, Nagy JA, Hooper A, Priller J, De Klerck B, Compernolle V, Daci E, Bohlen P, Dewerchin M, Herbert JM, Fava R, Matthys P, Carmeliet G, Collen D, Dvorak HF, Hicklin DJ, Carmeliet P、「Revascularizaion of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis, and atherosclerosis by anti-Flt-1.」、Nat. Med.、2002、8：831〜40）。
【０００４】
VEGFの役割に関して報告が一致しない一つの理由は、調べた選択的VEGF阻害剤が存在しないという事実による可能性がある。唯一の既知の内因性VEGF阻害剤は、Flt-1の可溶性型（sFlt-1）であり、このアイソフォームは主に血管内皮細胞によって発現され、VEGFを直接隔離することによって、およびドミナントネガティブ阻害剤として機能することによって、VEGF活性を阻害することができる（Kendall RL, Wang G, Thomas KA、「Identification of a natural soluble form of the vascular endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR.」、Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996、226：324〜8）。同様に、おそらくsFlt-1がVEGFに結合するが、膜結合型Flt-1の外部ドメインにも結合してこれを遮断することから、sFlt-1は、VEGFに対するアンタゴニスト活性によって血管抑制特性を有することが示されている（Kendall RL & Thomas KA、「Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1993、11月15日、90(22)：10705〜9；Goldman CK, Kendall RL, Cabrera G, Soroceanu L, Heike Y, Gillespie GY, Siegal GP, Mao X, Bett AJ, Huckle WR, Thomas KA, Curiel DT、「Paracrine expression of a native soluble vascular endothelial growth factor receptor inhibits tumor growth, metastasis, and mortality rate.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1998、95：8795〜800、国際公開公報第94/21679号）。
【０００５】
国際公開公報第98/13071号は、VEGFチロシンキナーゼ受容体の可溶性型をコードするヌクレオチド配列を哺乳類宿主に遺伝子移入することによって、原発腫瘍の増殖および転移を阻害するための遺伝子治療の方法論を開示している。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、NIHの発症におけるVEGFの役割を明確にすること、ならびに血管壁の炎症および／またはNIHの形成を阻害する組成物および方法を提供することである。本発明者らは、sFlt-1遺伝子を筋肉内にトランスフェクションすると、VEGFシグナル伝達が有効かつ特異的に遮断され、したがって、インビボでVEGF活性が消失することを既に証明した（Zhao Q, Egashira K, Inoue S, Usui M, Kitamoto S, Ni W, Ishibashi M, Hiasa Ki K, Ichiki T, Shibuya M, Takeshita A、「Vascular endothelial growth factor is necessary in the development of arteriosclerosis by recruiting/activating monocytes in a rat model of long-term inhibition of nitric oxide synthesis.」、Circulation 2002、105：1110〜5、およびGoldman CKら、上記）。その後、本発明者らは、高コレステロール血症マウスにおいて、カフ誘発動脈周囲炎症後のNIHの発病におけるVEGFの役割を調べた。このカフモデルは、高コレステロール血症の存在下でのカフの留置が、再現可能な部位制御NIHおよび再形成を誘導する長所を有すること、また、カフ誘導損傷が、血管の炎症を誘導し、ヒトにおいて認められた再狭窄およびアテローム性動脈硬化の損傷と類似の新生内膜の損傷を誘導するという理由から選択された（Lardenoye JH, Delsing DJ, de Vries MR, Deckers MM, Princen HM, Havekes LM, van Hinsbergh VW, van Bockel JH, Quax PH、「Accelerated atherosclerosis by placement of a perivascular cuff and a cholesterol-rich diet in ApoE*3Leiden transgenic mice.」、Circ. Res.、2000、87：248〜53；およびvon der Thusen JH, van Berkel TJ, Biessen EA、「Induction of rapid atherogenesis by perivascular carotid collar placement in apolipoprotein E-deficient and low-density lipoprotein receptor-deficient mice.」、Circulation、2001、103：1164〜70）。
【０００７】
本発明者らは、sFlt-1遺伝子移入によるVEGFの遮断が初期炎症および増殖性の変化を減少させ、したがって、NIHの発症を減少させることを発見した。血管周囲の炎症は、カフ誘発NIHの発病において主要な役割を有する（Egashira K, Zhao Q, Kataoka C, Ohtani K, Usui M, Charo IF, Nishida K, Inoue S, Katoh M, Ichiki T, Takeshita A、「Importance of monocyte chemoattractant protein-1 pathway in neointimal hyperplasia after periarterial injury in mice and monkeys」、Circ. Res.、2002、90：1167〜72、およびWu L, Iwai M, Nakagami H, Li Z, Chen R, Suzuki J, Akishita M, de Gasparo M, Horiuchi M、「Roles of angiotensin II type 2 receptor stimulation associated with selective angiotensin II type 1 receptor blockade with valsartan in the improvement of inflammation-induced vascular injury.」、Circulation、2001、104：2716〜21）。したがって、発現の増加およびVEGF活性によって媒介される血管の炎症および増殖は、カフ誘発血管周囲損傷後のNIHの発病において必須である。
【０００８】
VEGFは、通常、内皮細胞特異的増殖因子であると考えられており、主に内皮2型受容体Flk-1を通して内皮の増殖および再生を誘導することによって血管疾患が減少すると考えられている（Baumgartner Iら、上記）。しかし、機能的VEGF受容体が、内皮細胞以外の細胞の損傷した動脈壁において発現されることが最近の証拠から示唆されている。したがって、Flt-1対Flk-1媒介作用の相対的効果は、標的細胞におけるFlt-1およびFlk-1の相対的発現に依存する可能性がある。本発明者らは、本明細書において、Flt-1が初期段階で損傷性の単球および内膜平滑筋細胞で、ならびに後期段階で新生内膜および内膜平滑筋細胞で増加したことを証明する。Flk-1発現の増加は後期段階に限って認められた。これまでに報告されたFlt-1機能を考慮に入れると（Barleon Bら、上記；Ishida Aら、上記；Wang YHら、上記；Kim Iら、上記；およびMarumo Tら、上記）、VEGFは、Flt-1媒介シグナルを通して炎症および血管平滑筋細胞の移動を引き起こし、したがって、カフ誘発動脈周囲損傷後にNIHを引き起こす可能性がある。
【０００９】
骨髄における造血幹細胞が血管損傷後に動員されて、新生内膜細胞に分化することを示唆する証拠が示されつつある。Sataらは、血管形成術後の再狭窄、移植関連動脈硬化症、および高脂血症誘発アテローム性動脈硬化症のモデルの血管損傷において、新生内膜および中膜細胞のかなりの割合が、平滑筋細胞および内皮細胞に分化した骨髄由来前駆細胞であったことを報告した（Sata M, Saiura A, Kunisato A, Tojo A, Okada S, Tokuhisa T, Hirai H, Makuuchi M, Hirata Y, Nagai R、「Hematopoietic stem cells differentiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis.」、Nat. Med.、2002、8：403〜9）。Flt-1は、幹細胞の動員および移動の重要なメディエータである（Luttun A, Tjwa M, Moons L, Wu Y, Angellilo-Scherrer A, Liao F, Nagy JA, Hooper A, Priller J, De Klerck B, Compernolle V, Daci E, Bohlen P, Dewerchin M, Herbert JM, Fava R, Matthys P, Carmeliet G, Collen D, Dvorak HF, Hicklin DJ, Carmeliet P.、「Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1.」、Nat. Med.、2002、8：831〜40）。本発明者らは、本明細書において、新生内膜または中膜における細胞が、カフ留置後に骨髄移植マウスにおいて骨髄起源のマーカーを発現することはまれであることを証明し、このことは、このモデルにおける新生内膜形成に対して骨髄由来細胞がほとんど関与していないことを示している。
【００１０】
カフ留置後のVEGF媒介性の炎症のメカニズムを理解するために、本発明者らは、様々な炎症遺伝子の遺伝子発現を評価した。sFlt-1遺伝子移入は、炎症性サイトカイン、接着分子、ケモカイン、およびケモカイン受容体の遺伝子発現の増加を減少させた（図5）。これらのデータは、VEGFがインビトロで内皮細胞において接着分子（VCAM-1およびICAM-1）またはMCP-1を誘導することを示すこれまでの報告と一致する（Kim Iら、上記、およびMarumo Tら、上記）。動脈損傷後の新生内膜過形成の発症におけるこれらの炎症促進分子の本質的な役割が報告されている（Egashira Kら、上記、Usui M, Egashira K, Ohtani K, Kataoka C, Ishibashi M, Hiasa KI, Katoh M, Zhao Q, Kitamoto S, Takeshita A.、「Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy inhibits restenotic changes (neointimal hyperplasia) after balloon injury in rats and monkeys.」、Faseb J.、2002、Mori E, Komori K, Yamaoka T, Tanii M, Kataoka C, Takeshita A, Usui M, Egashira K, Sugimachi K.、「Essential role of monocyte chemoattractant protein-1 in development of  restenotic changes (neointimal hyperplasia and constrictive remodeling) after balloon angioplasty in hypercholesterolemic rabbits.」、Circulation、2002、105：2905〜10、およびOguchi S, Dimayuga P, Zhu J, Chyu KY, Yano J, Shah PK, Nilsson J, Cercek B、「Monoclonal antibody against vascular cell adhesion molecule-1 inhibits neointimal formation after periadventitial carotid artery injury in genetically hypercholesterolemic mice.」、Arterioscler Thromb. Vasc. Biol.、2000、20：1729〜36）。sFlt-1遺伝子移入は、VEGFおよびFlt-1遺伝子発現の増加を減少させ、このことは、VEGFが平滑筋細胞、内皮細胞、および損傷性の単球のような疾患を有する動脈壁の細胞内でオートクラインループのメカニズムによってその活性を調節することを示した。VEGFの正のフィードバックは、Flt-1刺激によって単球によるVEGF産生の増強を示したこれまでの研究によって支持されている（Bottomley MJ, Webb NJ, Watson CJ, Holt L, Bukhari M, Denton J, Freemont AJ, Brenchley PE.、「Placenta growth factor (PlGF) induces vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion from mononuclear cells and is co-expressed with VEGF in synovial fluid.」、Clin. Exp. Immunol.、2000、119：182〜8）。したがって、sFlt-1遺伝子移入は、主に炎症（単球の動員および活性化）を抑制することによってカフ誘発NIHを減少させた。
【００１１】
併せて考慮すると、VEGFおよびその受容体のシグナルは、カフ誘発血管周囲カフ損傷後の遅延型NIHのみならず、初期炎症の発症にとっても必須であるように思われる。本明細書に示したデータは、VEGFが、カフ誘発動脈周囲損傷後の前炎症因子および前動脈硬化因子として作用するという考え方を支持する。
【００１２】
本発明は、以下の（１）〜（３０）を提供する：
（１）可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸および薬学的に許容される担体を含む組成物であって、該核酸が、血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療するために有効な量のsFlt-1を発現する組成物；
（２）核酸がベクターに挿入されている、（１）記載の組成物；
（３）ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、（２）記載の組成物；
（４）ベクターが真核細胞発現プラスミドである、（２）記載の組成物；
（５）核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の組成物；
（６）核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の組成物；
（７）血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害するために有効な量が、約0.0001 mg〜100 mg／日／患者である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の組成物；
（８）患者に筋肉内投与する、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の組成物；
（９）冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスクを有する患者に投与する、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の組成物；
（１０）患者が高コレステロール血症患者である、（９）記載の組成物；
（１１）血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療する薬学的組成物を製造するための、可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸の使用；
（１２）核酸がベクターに挿入されている、（１１）記載の使用；
（１３）ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ （HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、（１２）記載の使用；
（１４）ベクターが真核細胞発現プラスミドである、（１２）記載の使用；
（１５）核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（１１）〜（１４）のいずれか一項に記載の使用；
（１６）核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、（１１）〜（１５）のいずれか一項に記載の使用；
（１７）組成物を約0.0001 mg〜100 mg／日／患者の用量で投与する、（１１）〜（１６）のいずれか一項に記載の使用；
（１８）組成物を患者に筋肉内投与する、（１１）〜（１７）のいずれか一項に記載の使用；
（１９）組成物を、冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスクを有する患者に投与する、（１１）〜（１８）のいずれか一項に記載の使用；
（２０）患者が高コレステロール血症患者である、（１９）記載の使用；
（２１）可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療する方法；
（２２）核酸がベクターに挿入されている、（２１）記載の方法；
（２３）ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、（２２）記載の方法；
（２４）ベクターが真核細胞発現プラスミドである、（２２）記載の方法；
（２５）核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（２１）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法；
（２６）核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、（２１）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法；
（２７）核酸を約0.0001 mg〜100 mg／日／患者の用量で投与する、（２１）〜（２６）のいずれか一項に記載の方法；
（２８）核酸を筋肉内投与する、（２１）〜（２７）のいずれか一項に記載の方法；
（２９）患者が、冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスク因子を有する、（２１）〜（２８）のいずれか一項に記載の方法；および
（３０）患者が高コレステロール血症患者である、（２９）記載の方法。
【００１３】
ポリヌクレオチド
本明細書において用いられるように、「可溶性Flt-1（sFlt-1）遺伝子」とは、sFlt-1タンパク質をコードして発現するポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。そのようなポリヌクレオチドまたは核酸は、DNAまたはRNAであってもよい。それは、天然材料からの単離または合成によって得ることができる。
【００１４】
本明細書において用いられるように、「単離されたポリヌクレオチドまたは核酸」とは、その当初の環境（例えば、天然に存在する場合は天然の環境）から切り離され、したがって、その天然の状態から「人工的に」変化しているポリヌクレオチドまたは核酸である。
【００１５】
したがって、この用語は、例えば（a）天然に存在する生物のゲノムDNAにおいて、核酸（すなわち、核酸の5'および3'末端に存在する配列）に天然に隣接するコード配列を含まない天然に存在するゲノムDNA分子のDNA断片；（b）得られた分子が天然に存在する如何なるベクターまたはゲノムDNAとも同一でないように、ベクターまたは原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み入れられた核酸；（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって産生された断片、または制限断片のような個別の分子；ならびに（d）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列に及ぶ。例えばcDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーなどのDNAライブラリーにおいて起こるような、異なるDNA分子の無作為で特徴が調べられていない混合物、トランスフェクトされた細胞、または細胞クローンに存在する核酸は、特にこの定義から除外される。
【００１６】
天然に存在する核酸は、マウス、ラット、およびヒトを含む哺乳類に由来してもよい。配列番号：1に示されるような既知のヒトsFlt-1遺伝子（Kendall RLら、1993、上記、GenBankアクセッション番号U01134）、および配列番号：3に示されるようなマウスsFlt-1遺伝子（GenBankアクセッション番号D88690）を用いることができる。本発明において用いられるsFlt-1遺伝子は、その既知の配列に基づいて合成することができる。例えば、適したDNAの一部をPCRプライマーとして用いて、適した起源に由来するmRNAについてRT-PCR反応を行うことによって、sFlt-1のcDNAをクローニングすることが可能である。そのようなクローニングは、Maniatis T.ら、「Molecular Cloning」、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）などの参考文献に従って、当業者が容易に行うことができる。
【００１７】
sFlt-1遺伝子から発現されたポリペプチドがsFlt-1と機能的に同等である限り、sFlt-1遺伝子は、1つもしくは複数の核酸の部分的欠失、置換、または挿入を有してもよく、またはその5'末端および／もしくは3'末端でそれにライゲーションした他のヌクレオチド配列を有してもよい。本明細書において、「sFlt-1活性」とは、VEGFに結合するがシグナル伝達が起こらない活性を意味する。
【００１８】
本明細書において、「機能的に同等」という用語は、被験ポリペプチドがsFlt-1の特徴である生物学的に重要な活性を保持していることを意味する。sFlt-1の生物学的に重要な活性には、炎症および血管平滑筋細胞の移動を阻害するVEGF阻害活性が含まれる。したがって、本発明には、得られたタンパク質がsFlt-1活性を保持する限り、1つもしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、本発明にはまた、得られたポリヌクレオチドがsFlt-1と機能的に同等であるタンパク質をコードする限り、配列番号：1に記載のヌクレオチド配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。sFlt-1の決定は、Duan, D-S, R.ら（1991）、J. Biol. Chem.、266：413〜418に記述されるようなVEGF結合アッセイ法、および国際公開公報第94/21679号に記述されるマイトゲン阻害アッセイ法のような、当業者に周知の方法によって行うことができる。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法によって得ることができる。そのような方法の例には、部位特異的変異誘発（Kramer WおよびFritz, HJ（1987）、Methods in Enzymol.、154：350〜367）、ハイブリダイゼーション技術（E.M. Southern、J. Mol. Biol.、1975、98：503〜517）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（R.K. Saikiら、Science 1985、230：1350〜1354；R.K. Saikiら、Science、1988、239：487〜491）が含まれる。より具体的には、当業者は一般的に、配列番号：1に示されるポリヌクレオチドもしくはその一部をプローブとして用いて、または配列番号：1に示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、配列番号：1に示されるポリヌクレオチドと相同性が高いポリヌクレオチドを他の動物から単離することができる。さらに、ハイブリダイゼーション技術またはPCR技術によって単離することができるポリヌクレオチド、および配列番号：1に示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも同様に、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。そのようなポリヌクレオチドの例には、国際公開公報第94/21679号に開示されるポリヌクレオチドが含まれる。
【００２０】
上記のポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件で行われる。ハイブリダイゼーションは、いくつかのミスマッチを含む核酸配列間のハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする緩衝液を用いて行ってもよい。高ストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、核酸分子がほぼ完全に相補的である場合に限って安定なままであると考えられる。cDNAのG+C含有量、塩濃度、および温度を含む多くの要因により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。例えば、ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることによって、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増加させてもよい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための温度条件は、ストリンジェンシーに大きく影響を及ぼし、融解温度（Tm）を用いて調節することができる。Tmは、ハイブリダイズする塩基対のヌクレオチドの構成比によって、およびハイブリダイゼーション溶液の組成（塩、ホルムアミド、およびドデシル硫酸ナトリウムの濃度）によって変化する。いくつかのメンブレンに基づくハイブリダイゼーションのために用いられる溶液において、ホルムアミドのような有機溶媒を加えると、反応はより低い温度で起こる。したがって、関連するパラメータを考慮する場合、当業者は、経験または実験に基づいて、適したストリンジェンシーを得るために適当な条件を選択することができる。
【００２１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、65℃、2×SSC、0.1％SDSを含む条件、およびこの条件と同等のストリンジェシーを有する条件が含まれる。一般的に、温度がより高ければ、平衡時にハイブリダイズする二つの鎖の相同性はより高くなる。上記のような高ストリンジェンシー条件で単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：2に示されるアミノ酸配列とアミノ酸レベルでより高い相同性を有するポリペプチドをコードすると予想される。この意味において、「高い相同性」とは、アミノ酸配列の全体で少なくとも65％またはそれ以上、より好ましくは70％またはそれ以上、なおより好ましくは80％、さらにより好ましくは90％またはそれ以上、および最も好ましくは95％またはそれ以上の同一性を意味する。
【００２２】
ポリペプチド
上記の核酸によってコードされるsFlt-1タンパク質には、配列番号：2に示されるヒトsFlt-1、配列番号：4に示されるマウスsFlt-1、およびその変異体が含まれる。変異体は、好ましくは、ヒトsFlt-1遺伝子と少なくとも65％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。より好ましくは、変異体は、ヒトsFlt-1遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の同一性を有する。例えば、本発明の単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号：1が、先行技術の配列より長いまたは同等の長さである場合、本発明の配列の全長について比較を行う。または、本発明の単離されたポリヌクレオチドが先行技術の配列より短い場合、本発明の配列と同じ長さの先行技術配列のセグメント（相同性の計算に必要な如何なるループも除外する）について比較を行う。
【００２３】
二つの配列間の同一性（％）の決定は、KarlinおよびAltschul（S. KarlinおよびS.F. Altschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1990、87：2264〜2268；S. KarlinおよびS.F. Altschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1993、90：5873〜5877）によるBLASTアルゴリズムのような任意の通常の数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。BLASTアルゴリズムは、Altschulら（S.F. Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215：403）のBLASTNおよびBLASTXプログラムに組み入れられる。ヌクレオチド配列をBLASTNに従って分析する場合、適したパラメータには、例えばスコア＝100、ワード長＝12が含まれる。一方、BLASTXによるアミノ酸配列の分析にとって適したパラメータには、例えばスコア＝50およびワード長＝3が含まれる。比較目的でギャップを含むアラインメントを得るために、Altschulら（1997）、Nucleic Acids Res.、25：3389に記述されるようにGapped BLASTを利用することができる。または、PSI-Blastを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを用いる場合、好ましくはそれぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）に関するデフォルトパラメータを用いる。しかし、当業者は、特定の目的に適合するように、パラメータを容易に調節することができる。そのような分析に関する特異的な技法は当技術分野で既知である（例えば、世界中のウェブに存在する国立バイオテクノロジー情報センターのBLASTウェブサイト、www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）。配列を比較するために利用可能な数学的アルゴリズムのもう一つの例は、MyersおよびMiller（1988）、CABIOS 4：11〜17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためのALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウエイト残基テーブル（PAM120 weight residue table）、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いることができる。
【００２４】
特定のアミノ酸配列の1つもしくは複数のアミノ酸残基を欠失、付加、および／または置換することによって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、当初の生物活性を保持することが知られている（Mark, D.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1984）、81：5662〜5666、Zoller, M.J. & Smith, M.、Nucleic Acids Research（1982）、10：6487〜6500；Wang, A.ら、Science 224：1431〜1433、Dalbadie-McFarland, G.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1982）、79：6409〜6413）。
【００２５】
置換、欠失、付加、および／または挿入によって変異したアミノ酸の数は特に限定されない。通常、これは、アミノ酸残基の総数の10％またはそれ未満、好ましくは5％またはそれ未満、およびより好ましくは1％またはそれ未満である。
【００２６】
アミノ酸置換は、1つまたは複数の予想される、好ましくは非必須アミノ酸残基で行ってもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなくタンパク質の野生型配列（例えば、配列番号：2に示される配列）から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は、生物活性にとって必要である。アミノ酸は、好ましくはアミノ酸の側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に置換される。したがって、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当技術分野において定義されている。これらの群には、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００２７】
ベクター
本発明のsFlt-1遺伝子は様々なベクターに組み入れてもよい。ベクターが遺伝子のインビボ発現を可能にする限り、任意のベクターを用いることができる。ベクターの例には、プラスミド、リポソーム、およびウイルスベクターが含まれる。
【００２８】
プラスミドベクターとして、好ましくはpCAGGS（Gene 108：193〜200（1991））、pBK-CMV、pcDNA3.1、およびpZeoSV（Invitrogen、Stratagene）を含む真核細胞プラスミドを用いる。そのような発現ベクターにおいて、本発明の遺伝子は、プロモーター／エンハンサー要素に機能的に結合させることができる。プロモーター／エンハンサー要素は、遺伝子のインビボ発現に関して最適化するように選択してもよい。プロモーターは、誘導型または構成的であってもよく、任意で組織特異的であってもよい。ワクシニアウイルス7.5K、SV40、HSV、アデノウイルスMLP、MMTV、LTR、およびCMVプロモーターのような、哺乳類細胞において増殖するウイルスゲノムから単離されたプロモーターを用いてもよい。
【００２９】
または、本発明のsFlt-1遺伝子は、静電気的リポソームのような脂質二重層で構成される任意の既知のリポソームに封入することができる。本発明のsFlt-1遺伝子を含むリポソームは、不活化センダイウイルス（Hemagglutinating virus of Japan；HVJ）のようなウイルスに融合させることができる。HVJ-リポソームは、通常のリポソームと比較して細胞膜に対して非常に高い融合活性を有する。特に、HVJ株として、Z株（ATCCから入手可能）が好ましいが、他のHVJ株（例えば、ATCC VR-907およびATCC VR-105）を同様に用いてもよい。
【００３０】
ウイルスベクターも同様に用いることができる。ウイルスベクターは、DNAウイルスまたはRNAウイルスとなりうる。ウイルスベクターの例には、無毒化レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルスエンベロープ（HVJ-E、センダイウイルス）、SV40、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）が含まれる。上記のウイルスベクターの中で、アデノウイルスの感染効率は、他のウイルスベクターよりかなり高いことが知られている。この点において、好ましくはアデノウイルスベクター系を用いることができる。
【００３１】
上記のベクターおよびリポソームは、既知の方法に従って調製することができる（「実験医学別冊・遺伝子治療の基礎技術（Supplement of Experimental Medicine, Basic Technology in gene Therapy）」、羊土社（1996）；「実験医学別冊・遺伝子導入＆発現解析実験法（Supplement of Experimental Medicine, Experimental Methods in Gene Introduction and Expression analysis）」、羊土社（1997）；「遺伝子治療開発研究ハンドブック（Handbook for Development and Research of Gene Therapy）」、日本遺伝子治療学会編、NTS（1999）、J. Clin. Invest. 93：1458〜1464（1994）；Am. J. Physiol.、271：R1212〜1220（1996）等）。
【００３２】
遺伝子治療物質
本発明のsFlt-1遺伝子を有するベクターを、適当な遺伝子治療物質中に調製することができる。本明細書において用いられる「遺伝子治療物質」という用語は、遺伝子治療のための投与剤形として用いられる薬学的組成物を意味する。組成物は、下記の投与レジメ（例えば、液体）に応じて変化してもよい。例えば、遺伝子を適当な溶媒（PBSのような緩衝液、生理食塩液、滅菌水等）に溶解することによって、注射剤を調製してもよい。次に、注射液を必要に応じてフィルターで濾過滅菌し、無菌的な容器に充填してもよい。通常の担体等を注射剤に加えてもよい。HVJ-リポソームのようなリポソームは、懸濁液、凍結製剤、遠心濃縮凍結製剤等の形状であってもよい。
【００３３】
本発明の遺伝子治療物質は、sFlt-1が、血管壁の炎症を阻害もしくは治療するため、またはNIHの形成を阻害するために有効な量で発現されるように、sFlt-1遺伝子を有するベクターを含む。そのような阻害作用は、下記の実施例に記述されるように決定することができる。例えば、炎症-阻害作用は、Mac3-陽性単球数を測定することによって決定することができる（実施例2、実施例3および実施例4、図3Eを参照のこと）。NIH形成阻害作用は、内膜の面積、内膜／中膜比、および狭窄（％）を測定することによって決定することができる（実施例4、図3B、図3Cおよび図3Dを参照のこと）。VEGF、Flt-1、CCR1、IL-6、CCR2、MCP-1、Flt-1、CXCR2、エオタキシン、VCAM-1、またはICAM-1の発現レベルも同様に、炎症およびNIH形成阻害作用の指標として用いることができる（実施例3および実施例5を参照のこと）。VEGFレベルに関して、VEGF121またはその対応するアイソフォームを除く、VEGF188およびVEGF164またはその対応するアイソフォームを決定すべきである。発現レベルは、ノザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングのような既知の方法を用いてmRNAレベルまたはタンパク質レベルに関して測定することができる（例えば、Maniatis, T.ら、上記）。または、NIHは、心血管造影術（CAG）または血管内超音波（IVUS）によって測定することができる。これらの方法によって得られたデータを、通常のNIHのない部位に関して得られたデータと比較することによって、NIH形成阻害作用を決定することができる。
【００３４】
遺伝子移入法
本発明の遺伝子治療物質を、インビボ法またはエクスビボ法によって標的細胞または患者の組織に導入してもよい。インビボ法は、体内への遺伝子治療物質の直接導入を可能にする。エクスビボ法において、特定の細胞をヒトから採取して、遺伝子治療物質を細胞に導入して、得られた細胞をその後体内に戻す（日経サイエンス（Nikkei Science）1994年4月号、20〜24頁；月刊薬事（Monthly Yakuji）36(1)：23〜48（1994）；実験医学別冊（Supplement To Experimental Medicine）12(15)（1994）；遺伝子治療開発研究ハンドブック（Handbook for Development and Research of Gene Therapy）, NTS（1999））。本発明によれば、インビボ法が好ましい。
【００３５】
遺伝子を細胞に移入する方法の例には、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いる直接DNA導入法等が含まれる。
【００３６】
組織に遺伝子を移入する方法の例には、内部型リポソーム法、静電気型リポソーム法、HVJ-リポソーム法、改善型HVJ-リポソーム法（HVJ-AVEリポソーム法）、受容体媒介遺伝子導入、パーティクルガン法、裸のDNA法、陽性荷電ポリマーによる導入法が含まれる。
【００３７】
トランスジーンの発現を増強するために、遺伝子移入後に電気穿孔を適用してもよい。効率的な遺伝子移入またはトランスジーン発現のために、マイクロインジェクションまたはウイルスベクターも同様に用いることができる。
【００３８】
治療すべき疾患または症状に対して適切な投与を行うための適当な方法および部位を、本発明の遺伝子治療のために選択する。本発明の遺伝子治療物質は、血管損傷部位に非経口投与、好ましくは筋肉内投与することができる。
【００３９】
本発明の物質の用量は、患者の年齢、性別、および症状に応じて変化するが、sFlt-1遺伝子は、約0.0001 mg〜約100 mg／日／成人患者の用量、好ましくは約0.001〜約10 mg／日／成人患者の用量で投与することができる。HVJ-リポソーム型を用いる場合、本発明の遺伝子は、約1〜約4000 μg、好ましくは約10〜約400 μg／成人患者の範囲で投与することができる。
【００４０】
本発明の治療物質を、数日に1回、数週間に1回、または週に1回投与してもよい。投与回数は、患者の症状に応じて選択すべきである。治療の目的に応じて、複数の投与が適している。
【００４１】
本発明の遺伝子治療は、血管壁の炎症および／またはNIHの形成を阻害するために有効である。血管壁の炎症およびNIHの形成は、冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、または動脈硬化症によって引き起こされる血管損傷後に認められる症状である。本発明の遺伝子治療は、これらの疾患のリスクを有する患者に適用することができる。これらの疾患のリスク因子には、高コレステロール血症が含まれる。
【００４２】
本明細書において引用した全ての刊行物は、本発明が属する技術分野の現状をより詳細に記述するために、参照として本明細書に組み入れられる。
【００４３】
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例を参照して、本発明を詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によって如何なるようにも制限されないことに注意すべきである。
【００４４】
一般的方法
以下の方法は、以下の実施例全てに対して一般的なものである。
【００４５】
発現ベクター
3.3 kbマウスsFlt-1遺伝子（GenBankアクセッション番号D88690；ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：3および4に示す）を、マウス肺cDNAライブラリーから得て（Kondo K, Hiratsuka S, Subbalakshmi E, Matsushime H, Shibuya M、「Genomic organization of the flt-1 gene encoding for vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-1 suggests an intimate evolutionary relationship between the 7-Ig and the 5-Ig tyrosine kinase receptors.」、Gene、1998、208：297〜305）、真核細胞発現ベクタープラスミドcDNA3（Invitrogen）のマルチクローニング部位、BamH1(5')およびNot1(3')部位にクローニングした。このプラスミドにおいて、遺伝子発現は、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーターによって制御される。
【００４６】
実験動物
C57BL/6Jの遺伝的バックグラウンドを有するアポリポタンパク質Eノックアウトマウス（8〜10週齢）を、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory）（Bar Harbor, ME）から購入して、市販の標準的な飼料を与えた。カフの留置および遺伝子移入は、既に記述された通りに実施した（Zhao Qら、上記；およびEgashira Kら、上記）。非狭窄性のポリエチレンカフ（1.5-mm ng；PE20、0.38-mm内径、1.09-mm外径）を左大腿動脈の周囲にゆるく留置した。空のプラスミドまたはsFlt-1プラスミド（300 μg／100 μl PBS）のいずれかを、その直後および10日後に27ゲージ針を用いて右大腿筋に注射した。トランスジーンの発現を増強するために、これらの動物に、注射直後に注射部位に電気穿孔を行った。電気パルス発生装置CUY21（BTX）を用いて、100 V 50 msの電気パルスを6回適用した。
【００４７】
骨髄がβガラクトシダーゼ（LacZ）を広く発現するROSA26マウスの骨髄に置換されたC57BL/6Jの遺伝的バックグラウンドを有する野生型マウスにも、カフの留置を行った（Sata Mら、上記）。致死的に放射線を照射した野生型マウスに、ROSA26マウスからの骨髄細胞1×106個を投与した。骨髄移植の4週間後、カフを左大腿動脈周囲に留置した。大腿動脈を摘出して、X-gal溶液によって7時間染色した後、4％パラホルムアルデヒドにおいてさらに固定した。
【００４８】
組織病理学および免疫組織化学
マウスをペントバルビタールによって麻酔し、大腿動脈を採取して、3.7％ホルムアルデヒドのリン酸緩衝生理食塩溶液中で一晩固定して、パラフィン包埋した（Egashira Kら、上記）。カフ留置大腿動脈の全長に及ぶ連続切片（厚さ5 μm）を、組織学的分析のために用いた。各条件につきマウス2匹から凍結切片を作製した。切片は全て、ヘマトキシリン-エオジン（HE）またはワンギーソン（van Gieson）で通常どおりに染色した。Mac-3（PharMingen）染色を用いて単球／マクロファージを検出した。増殖しつつある細胞核抗原（Santa Cruz Biotech, CA）を用いて血管の増殖を検出した。フォンウィルブランド因子に対する抗体（vWF；Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を用いて、内皮細胞を標識した。マッチさせた一次抗体およびフルオレセイン結合二次抗体による間接的免疫蛍光二重染色を用いて、平滑筋細胞または単球におけるVEGF受容体との同時局在に関して染色した：ウサギ抗マウスFlt-1（Santa Cruz Biotech）、ウサギ抗マウスFlk-1（Santa Cruz Biotech）、ラット抗マウスMac-3、抗平滑筋アクチン（α-SMA）（Boehringer Mannheim）、FITCまたはローダミンに結合させた抗ウサギIgG、およびFITCまたはローダミンに結合させた抗ラットIgG（Santa Cruz Biotech）。
【００４９】
カフ留置大腿動脈の切片における内膜損傷の定量
内膜損傷を定量するために、等間隔の断面10枚を、全てのマウスで調べた。画像解析ソフトウェアを用いて、外部の弾性層と内部の弾性層の間の中膜の総断面積を測定した；内皮細胞の単層と内部弾性層の間の内膜の総断面積を測定した。
【００５０】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応およびRNアーゼ保護アッセイ法
TRIzol試薬（Gibco-BRL）を用いて、集めた試料（各々の群についてn＝5〜7）からRNAを調製した。製造元のプロトコールに従って、反応容積20 μl中で総RNA 1μgからランダムヘキサマーと共に逆転写酵素を用いて第一鎖DNAを合成した（GeneAmp RNA PCRキット；Perkin-Elmer）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）25 μlを用いて、得られた逆転写酵素（RT）産物の10％を増幅した。VEGFの増幅のために用いたプライマーは、5'-GGA TCC ATG AAC TTT CTG CT-3'（配列番号：5）および5'-GAA TTC ACC GCC TCG GCT TGT C-3'（配列番号：6）であり、三つのVEGFアイソフォーム（それぞれ、VEGF 188、164、および121）に関して予想される大きさは654 bp、582 bpおよび450 bpであった。内部対照であるβアクチンに関するプライマーは、5'-ATG GAT GAC GAT ATC GCT-3'（配列番号：7）および5'-ATG AGG TAG TCT GCT AGG T-3'（配列番号：8）であり、予想産物は550 bpであった。PCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分離し、エチジウムブロマイドによって可視化して写真撮影し、スキャニング密度測定法によって分析した。
【００５１】
RNアーゼ保護アッセイ法は、製造元（PharMingen）のプロトコールに従って、二つの注文製の鋳型セットと総RNA 5μgを用いて行った。RNアーゼ消化後、保護されたプローブを変性ポリアクリルアミドゲルで分解して、BASS-3000システム（富士フイルム）を用いて定量した。各ハイブリダイズしたプローブの値は、各鋳型セット内に含まれる内部対照であるL32およびGAPDHの値に対して標準化した。
【００５２】
統計分析
データは平均値±SEとして表記される。差に関する統計分析を分散分析によって比較した。事後（post hoc）分析は、多重比較検定に関するボンフェローニ補正を用いて行った。0.05未満のP値は、統計学的に有意であると見なされた。
【００５３】
結果
実施例1：血漿脂質レベル
血漿中の総コレステロール、トリアシルグリセロール、および高密度リポタンパク質-コレステロールレベルを、市販のキット（和光純薬、大阪、日本）によって決定した。三つの群、すなわち対照群、空のプラスミド群およびsFlt-1群において、血清中の総コレステロールおよびトリアシルグリセロールレベルに統計学的有意差を認めなかった。総コレステロールおよびトリアシルグリセロールレベルは、対照群において503±11 mg／dLおよび38±6 mg／dL、空のプラスミド群において512±16 mg／dLおよび40±5 mg／dL、ならびにsFlt-1群において497±10 mg／dLおよび39±3 mg／dLであった。
【００５４】
実施例2：インビボプラグアッセイ法
インビボマトリゲルプラグアッセイ法を用いて、VEGF活性に及ぼすsFlt-1遺伝子移入の影響を測定した（Zhao Qら、上記；およびEgashira Kら、上記）。単独（300 μl）または組換えVEGFタンパク質（100 ng／ml）と混合したマトリゲルマトリクスをC57BL/6Jマウスの脇腹に皮下注射した。次に、マトリゲルを注射の7日または14日後に除去して、組織病理学的分析によって血管新生および炎症を調べた。
【００５５】
カフ留置の7日後、組換えVEGFタンパク質を含むマトリゲルプラグでは、マトリゲル単独（それぞれ、8±3および5±2）と比較すると、有意な血管新生反応（CD31陽性細胞数／mm2、380±29）、および炎症反応（Mac-3陽性細胞数／mm2；87±10 個／mm2）が認められた。可溶性のFlt-1遺伝子移入は、VEGFに対する血管新生反応（11±5／mm2）および炎症反応（6±3／mm2）の双方を、VEGFを含まないマトリゲルプラグと類似のレベルまで抑制したが、空のプラスミドを注射した場合には抑制しなかった。
【００５６】
実施例3：VEGF mRNAの発現および免疫反応性の増加
二つのVEGFアイソフォーム（188および164）のmRNAレベルは、カフ留置後に顕著に増加したが、対照の無傷の動脈では検出不可能に低かった（図1A、図1B）。7日目にピーク発現を認めた。VEGF 121 mRNAは、カフの留置前後で検出不能であった。
【００５７】
免疫組織化学染色において、対照動脈における弱い染色と比較して、VEGFが7日目では内膜および外膜における炎症傷害の近傍において、ならびに21日目ではカフ留置動脈の三つの層の細胞において増加することが示された（図1C）。vWF染色によって検出される内皮層は、カフの留置前後で保存された（図1C）。
【００５８】
Flt-1は、対照の無傷の動脈における内皮層を除いて検出不能であったが、カフ留置後7日目および21日目には、内膜、中膜および外膜において劇的に増加した（図1C）。VEGFR-2（Flk-1）は、7日目では増加しなかったが、21日目では増加した。VEGF受容体の位置を特定するために、免疫蛍光二重染色を行った（図2）。7日目、中膜および新生内膜におけるα-SMアクチン陽性細胞は、Flk-1をごくわずかしか発現しなかったが、それらはFlt-1を発現した（図2A）。Mac-3陽性細胞は、Flt-1を発現するがFlk-1を発現しない新生内膜、中膜、および外膜に動員された。同様に、外膜におけるいくつかのα-SMアクチン陽性細胞（おそらく外膜筋線維芽細胞）はFlt-1を発現した。21日目、新生内膜および中膜における多くのα-SMアクチン陽性細胞が、双方のVEGF受容体を発現した（図2B）。
【００５９】
実施例4：新生内膜過形成の発生の経時的変化
マウスを1日、3日目、7日目、14日目および21日目に屠殺した。公表されているように（Lardenoye JHら、上記；Egashira Kら、上記；Wu Lら、上記；およびMoroi M, Zhang L, Yasuda T, Virmani R, Gold HK, Fishman MC, Huang PL、「Interaction of genetic deficiency of endothelial nitric oxide, gender, and pregnancy in vascular response to injury in mice.」、J. Clin. Invest.、1998、101：1225〜32）、カフ留置後7日以内に、そのほとんどがMac3-陽性単球である単核白血球が、外膜、中膜および内膜に動員された（図2）。7日後、新生内膜傷害が発症して、経時的に肥厚した（図3A）。単球の浸潤は、自然に減少し、α-SMアクチン陽性細胞は新生内膜に主に出現した。21日目、管腔の狭窄を伴う著しいNIHを発症した。新生内膜における細胞は、主にα-SMアクチン陽性細胞で構成された。
【００６０】
骨髄由来前駆細胞が新生内膜の形成に関与するか否かを決定するために、本発明者らは、βガラクトシダーゼを発現する骨髄を移植したマウスを用いた。正常およびカフ留置動脈のβガラクトシダーゼ（LacZ）を、カフ留置後21日目に染色した。LacZ-陽性細胞は新生内膜または中膜にはほとんど認められなかった（図4）。外膜に動員されたいくつかの単核白血球は、LacZに関して陽性であった。
【００６１】
実施例5：可溶性Flt-1遺伝子移入は、カフ誘発新生内膜過形成を減少させる
sFlt-1トランスフェクトマウスでは、7日目の空のプラスミドトランスフェクトマウスと比較して、炎症（Mac-3陽性細胞）および増殖（PCNA指数）が顕著に少なかった（図3E）。sFlt-1遺伝子の移入によって、カフ留置後21日目にNIH（新生内膜領域、内膜／中膜比、および管腔の狭窄の増加）は有意に減少した（図3A、図3B、図3Cおよび図3D）。
【００６２】
一連の炎症性サイトカイン、ケモカイン、およびケモカイン受容体の遺伝子発現を、カフ留置後7日目にRNアーゼ保護アッセイ法によって調べた（図5）。遺伝子発現はカフ留置後にアップレギュレートされた。sFlt-1遺伝子移入は、ランテス（RANTES）、MIP-1α、TGF-β、MIP-2の遺伝子発現に影響を及ぼさなかったが、CCR1、IL-6、CCR2、MCP-1、Flt-1、CXCR2、エオタキシン、VCAM-1、ICAM-1、およびVEGFの遺伝子発現の増加を防止または減少させた。
【００６３】
産業上の利用可能性
本発明は、臨床での重要な意味を有する可能性がある。sFlt-1遺伝子移入によるVEGFの遮断は、炎症性血管疾患および他の炎症障害に関する魅力的な抗VEGF治療となりうる。特に、本遺伝子治療は、冠血管形成術後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫によって引き起こされた血管損傷後のNIHの発症を阻害するために有用である。したがって、本発明の組成物および方法は、高コレステロール血症患者を含むこれらの疾患のリスクを有する患者に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】カフを留置した大腿動脈におけるVEGF発現を示す。Ａ、VEGF mRNAレベルの経時的変化を示す写真。カフ留置後の動脈VEGFおよびβアクチンmRNAの発現。mRNAレベルは表記の時間で評価された。これは、異なる5回の実験からの代表的なアッセイである。Ｂ、Aにおけるデータの密度測定分析。それぞれの試料におけるVEGF mRNAの発現は、同じ試料におけるβアクチンmRNA発現によって標準化された。各バーについてN＝5。* 対照の無傷の動脈に対してP＜0.01。Ｃ、カフの留置後7日目または21日目に、VEGF、VEGF受容体1（Flt-1）、VEGF受容体2（Flk-1）、またはvWFに対して免疫組織化学的に染色した、無傷またはカフを留置した大動脈の断面を示す写真。バーは50 μmを示す。
【図２】カフを留置した大腿動脈におけるVEGF受容体、単球、およびα-SMアクチンの免疫蛍光染色を示す。Ａ、カフ留置後7日目に、Flt-1（VEGF-R1、緑）およびα-SMアクチン（赤）、Flk-1（VEGF-R2、緑）およびα-SMアクチン（赤）、ならびにMac-3（緑）およびFlt-1（VEGF-R1、赤）によって染色した、カフ留置大腿動脈の顕微鏡写真。バーは10 μmを示す。Ｂ、カフ留置後21日目でのカフ留置大腿動脈におけるFlt-1（VEGF-R1）およびα-SMアクチンならびにFlk-1（VEGF-R2）およびα-SMアクチンによって染色したカフ留置大腿動脈の顕微鏡写真。単一の蛍光-陽性細胞は緑または赤に染色されたが、二重陽性細胞は黄色に染色された。尺度のバーは10 μmを示す。
【図３】カフを留置した大腿動脈の組織病理学を示す。Ａ、カフ損傷誘導NIHの経時的変化とsFlt-1遺伝子移入の効果を示す写真。3日目、7日目および21日目でワンギーソンエラスチカ（van Gieson Elastica；vGE）で染色した対照（無傷）およびカフ留置動脈の断面の顕微鏡写真。尺度のバーは100 μmを示す。Ｂ、ＣおよびＤ、カフ留置後21日目の新生内膜肥厚（B）、内膜／中膜比（C）、狭窄（％）（D）におけるsFlt-1遺伝子移入の効果。Ｅ、カフ留置後7日目の炎症および増殖の変化におけるsFlt-1遺伝子移入の効果。* 対照およびsFlt-1群に対してP＜0.01。
【図４】カフ留置後の新生内膜の発達における骨髄由来細胞の関与を示す。骨髄移植マウスにおけるカフ留置後21日目にLacZで染色した断面の顕微鏡写真。新生内膜または中膜にはLacZ陽性細胞を認めなかった。LacZ-陽性細胞は、外膜（矢印）のみに存在した。これは動物6例からの代表的な試料である。尺度のバーは50μmを示す。
【図５】カフ留置大腿動脈におけるケモカインおよびケモカイン受容体（MCP-1、CCR2、ランテス、CCR1、MIP-1α、CXCR2、エオタキシン、MIP-2）、接着分子（ICAM-1、VCAM-1）、サイトカイン（IL-6、TGF-β）、VEGF、およびFlt-1におけるsFlt-1遺伝子移入の効果を示す写真である。データは、対応するGAPDH mRNAに対する各mRNAの比として表記される。* 対照部位に対してP＜0.01；†空のプラスミド群に対してP＜0.01；NSは有意ではないことを示す。N＝5〜6。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月13日(2007.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性Flt-1（sFlt-1）をコードする核酸および薬学的に許容される担体を含む組成物であって、該核酸が、血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害または治療するために有効な量のsFlt-1を発現する組成物。
【請求項２】
核酸がベクターに挿入されている、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）ベクターからなる群より選択される、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
ベクターが真核細胞発現プラスミドである、請求項2記載の組成物。
【請求項５】
核酸が配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
核酸が、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等であり且つ少なくとも65％の同一性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
血管壁の炎症および／または新生内膜過形成を阻害するために有効な量が、約0.0001 mg〜100 mg／日／患者である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
患者に筋肉内投与する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
冠血管形成術後再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、または浮腫のリスクを有する患者に投与する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
患者が高コレステロール血症患者である、請求項9記載の組成物。
【国際調査報告】
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