(57)【要約】  骨組織再生のために適する生体吸収性プラグインプラントであって、第１部分と、および前記第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、前記第１および第２部分が膨張性材料から形成されているプラグインプラント。骨組織再生のための方法であって、生体吸収性プラグインプラントを提供するステップであって、前記インプラントが第１部分と、および前記第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、前記第１および第２部分が膨張性材料から形成されているステップと、骨の欠損もしくは間隙内へ前記第２部分を挿入するステップであって、第１表面が前記欠損もしくは間隙の外側輪郭に係合するステップと、前記プラグインプラントを体液と接触させ、それにより前記プラグが前記欠損もしくは間隙内へ適合するように前記プラグインプラントのサイズを膨張させるステップとを含む方法。
2007512083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨組織再生のために適した生体吸収性プラグインプラントであって、第１部分と、および前記第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、前記第１および第２部分が膨張性材料から形成されているプラグインプラント。
【請求項２】
円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状である、請求項１に記載のプラグインプラント。
【請求項３】
前記第１部分が第１表面を含み、および前記第２部分が前記第１表面とは反対側の第２表面を含み、前記第１表面が前記第２表面の面積より小さい面積を有する、請求項１または２に記載のプラグインプラント。
【請求項４】
前記第１および第２表面が平面である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項５】
前記第１および第２表面が円形、四角形または長方形の形状を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項６】
前記プラグインプラントがテーパー形状を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項７】
前記第１部分が厚さＸを有し、および前記第２部分が厚さＹを有し、Ｘ：Ｙの比率が１：１から１０：１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項８】
前記膨張性材料が多孔性材料である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項９】
前記膨張性材料が生体吸収性ポリカプロラクトン（ＰＬＣ）を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１０】
前記膨張性材料がＰＬＣフィラメントを１層ずつ積層化するステップによって調製される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１１】
前記材料が、熱溶解積層法（ＦＤＭ）技術を用いることによってＰＬＣフィラメントを１層ずつ積層化するステップによって調製される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１２】
前記ＰＬＣフィラメント層が、０°、６０°および／または１２０°の方向付けを有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１３】
前記膨張性材料が生体吸収性リン酸三カルシウム−ポリカプロラクトン（ＴＣＰ−ＰＬＣ）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１４】
前記ＴＣＰ−ＰＬＣがＴＣＰ−ＰＬＣ（２０：８０％）である、請求項１３に記載のプラグインプラント。
【請求項１５】
前記ＴＣＰ−ＰＬＣが６０〜７０％の多孔性を有する、請求項１３または１４に記載のプラグインプラント。
【請求項１６】
前記プラグインプラントがカテーテルを配置および抜去するための開口部を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１７】
前記プラグインプラントが、親水性溶液、親水性液体および／または体液と接触すると膨張する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１８】
前記プラグインプラントが骨の欠損内へ挿入するために適しており、前記プラグインプラントが前記プラグを骨の外面へ固定するための手段を必要としない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項１９】
生物活性物質をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項２０】
前記プラグインプラントの生体吸収性スカフォールド上に播種された細胞をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプラグインプラント。
【請求項２１】
前記細胞が幹細胞である、請求項２０に記載のプラグインプラント。
【請求項２２】
前記細胞が間葉系幹細胞である、請求項２０または２１に記載のプラグインプラント。
【請求項２３】
骨組織再生のための方法であって、
生体吸収性プラグインプラントを提供するステップであって、前記インプラントが第１部分と、および前記第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、前記第１および第２部分が膨張性材料から形成されているステップと、
骨の欠損もしくは間隙内へ前記第２部分を挿入するステップであって、前記第１表面が前記欠損もしくは間隙の外側輪郭に係合するステップと、
前記プラグインプラントを体液と接触させ、それにより前記プラグが前記欠損もしくは間隙内へ適合するように前記プラグインプラントのサイズを膨張させるステップと
を含む方法。
【請求項２４】
前記インプラントが相互に反対側の第１および第２表面を含み、前記第１表面が前記第２表面の面積より小さい面積を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プラグインプラントが、円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２表面が平面である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１および第２表面が円形、四角形または長方形の形状を有する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記プラグインプラントが、骨細胞が前記プラグインプラント内に進入して骨組織を再生させることを可能にするように、多孔性材料から形成されている、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
頭蓋形成術を実施するための方法である、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プラグインプラントと前記骨の欠損もしくは間隙とが１ｍｍ未満の初期公差を有する、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記初期公差が０．５ｍｍ未満である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記初期公差が０．２ｍｍ未満である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１部分が厚さＸを有し、および前記第２部分が厚さＹを有し、Ｘ：Ｙの比率が１：１から１０：１である、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記膨張性材料が生体吸収性ポリカプロラクトン（ＰＬＣ）を含む、請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記膨張性材料がＰＬＣフィラメントを１層ずつ積層化するステップによって調製される、請求項２３〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記材料が、熱溶解積層法（ＦＤＭ）技術を用いることによってＰＬＣフィラメントを１層ずつ積層化するステップによって調製される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＬＣフィラメント層が、０°、６０°および／または１２０°の方向付けを有する、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記膨張性材料が生体吸収性リン酸三カルシウム−ポリカプロラクトン（ＴＣＰ−ＰＬＣ）を含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＣＰ−ＰＬＣがＴＣＰ−ＰＬＣ（２０：８０％）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＣＰ−ＰＬＣが６０〜７０％の多孔性を有する、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
ドレナージを実施するために前記プラグインプラントの開口部内へカテーテルを配置するステップをさらに含む、請求項２３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記骨欠損内への前記プラグインプラントの挿入が、前記欠損を取り囲んでいる骨の外面へ前記プラグを固定するための手段を必要としない、請求項２３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、望ましくない骨の間隙を美容上修復するための非治療方法である、請求項２３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記プラグインプラントが生物活性物質をさらに含む、請求項２３〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記プラグインプラントが、前記プラグインプラントの生体吸収性スカフォールド上に播種された細胞をさらに含む、請求項２３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が間葉系幹細胞である、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプラグインプラントを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨組織再生のための膨張性生体吸収性インプラントならびに骨組織修復および再生のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨、例えば頭蓋の再建は、現在も進行中の集中的な研究の１つである。頭蓋の再建に関しては、いくつかの報告書は大きく複雑な形状の頭蓋欠損の再建に焦点を当てているが、これに比較してトレフィンにより作製されたバーホールにおける小さいが美容上望ましくない骨の間隙の修復についてはほとんど報告がなされていない。トレフィンにより作製されたバーホールはしばしば、小さいが望ましくない頭皮および皮膚の陥没を生じさせる。硬膜下血腫は、特に患者が事故に関連して、または発作の結果として脳内の血液凝固に起因する頭部損傷を有する場合に多数発生する問題である。これは通常、穿頭ドレナージもしくは洗浄によって治療される。トレフィンによるバーホール手順は、患者の頭蓋骨上へ典型的には直径１４から１９ｍｍの穴を穿孔するステップを含む。
【０００３】
通常は骨が欠損を再生および正常な状態に戻すことができないそれらの欠損を充填するために、様々な骨移植片もしくは骨置換材料が使用されてきた。Ｔｅｓｓｉｅｒ（Ｔｅｓｓｉｅｒ  １９８２）は、欠損を架橋もしくは充填するための分割型頭蓋冠自己移植片の使用について報告している。この技術は安価で単純なアプローチを意味するが、ときには周囲の頭蓋冠骨から移植片を採取するために一次切除術を拡大しなければならない。しかし、骨組織移植片の使用にはいくつかの問題が結び付いている。患者自身の骨が移植片として使用される場合は、外科医は、骨サンプルを採取するために追加の外傷性手術を実施しなければならない。骨移植片が他のヒトから採取される、または動物の骨が使用される場合は、たとえ移植片が患者の組織と適合するように処置された場合でさえ、ウイルス感染もしくは免疫学的問題が発生することがある。
【０００４】
自己移植片を使用するまた別の可能性は、開頭術手順中に骨粉を収集し、それをフィブリン糊のようなヒドロゲルと混合し、その手順後にそのペーストを使用して欠損を充填する方法である（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，１９９８）。
【０００５】
金属を基材とする頭蓋形成術用の材料は、チタン製のプレートやメッシュの形状で広範囲に使用されてきた。高度の生体適合性および機械的強度に取り扱いの容易さおよび正確な固定が組み合わされると、相当に高額の費用も正当と見なされるであろう（Ｂｒｏａｄｄｕｓ，２００２）。医学分野において一般に使用される生体材料であるＳｉｌａｓｔｉｃ（シラスティック）はバーホールカバーとしても使用されるが、報告書としてその生体適合性に関して考察された議論は、そのエラストマーに対する病理的組織反応に起因する異物反応の形成を指摘している（Ｗｉｎｋｌｅｒ，２０００）。
【０００６】
近年には、骨組織の内方成長を、そしてこのためインプラントのより良好なインプラントを可能にする骨誘導性生体材料およびインプラントに関心が向かっている。生体吸収性材料および組織工学技術を使用する傾向は、最終的には自己骨によって置換されるプロテーゼを生じさせた（Ｈａｂａｌ  １９９９，Ｓｔｅｎｄｅｌ  ２００１，Ｓｃｈａｎｔｚ  ２００３ａ，ｂ）。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）は、トレフィンにより作製されたバーホールを再建するため、そして皮膚における術後のくぼみを防止するために様々なアルミナセラミック製インプラントを設計かつ製作してきた。ヒドロキシアパタイトを基材とするセラミック製インプラントは、それらの機械的特性、骨誘導性および組込みの特徴のためにますます人気が高まっている（Ｙａｍａｓｈｉｎａ，１９８９，１９９３，Ｍｉａｋｅ，２０００）。Ｙａｍａｓｈｉｎａは、それらが後頭領域の凸状に適合するように形状がドーム状かつ楕円形であるヒドロキシアパタイトプレートを設計した。この執筆者は、さらにまたバーホール欠損に適合するＨＡ製ボタンならびに線状頭蓋欠損のためのアパタイト顆粒もまた設計した。ヒドロキシアパタイトを基材とする特別設計された「キーホール・ボタン」は、トレフィンによる欠損のためにＫｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２０００）によって設計された。
【０００７】
様々な外科的アプローチおよび植込み型器具は、特にバーホール欠損に関連する急性または慢性硬膜下血腫を治療するために開発されてきた。これらの場合には、頭蓋内もしくは頭蓋周囲の液体を監視もしくは排液するため、そして平行して圧力特徴を監視するためにシャントもしくはカテーテルを配置するのがしばしば望ましい。Ｅｍｏｎｄｓ  ａｎｄ  Ｈａｓｓｌｅｒ（１９９９）は、ｃａｔｈｅｄｅｒの配置を可能にする中空スクリューを開発したが、他方Ｄｕｊｏｖｎｙ  ｅｔ  ａｌ（２００２）はスクリューのために取り付けられた５つのフラップおよびキーホール様開口部を備える円形プレートからなるチタン製の水頭シャントドレナージ用のバーホールカバーを設計した。
【０００８】
米国特許第６，３５０，２８４（‘２８４）号は、剛性プレートならびに孔径３０〜１０００μｍの孔を含有する繊維織物層からなる生体吸収性頭蓋インプラントについて記載している。しかしこのインプラントは、例えば縫合糸、留めびょう、またはスクリューなどを取り付けるための手段によって骨に固定する必要があるので、このため実際的ではない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は上記の問題に対処し、そして詳細には、骨組織再生および骨修復のために適し、容易に使用でき、さらに骨に取り付けるための手段を必要としない新規の改良されたインプラントを提供する。骨の欠損もしくは間隙の骨組織再生は部分的である場合も完全である場合もある；後者については、本願のために骨修復術と表示する。
【００１０】
詳細には、本発明は、骨組織再生のために適する生体吸収性プラグインプラントを開示するが、このときインプラントは第１部分と、および第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、第１および第２部分は膨張性材料から形成されている。
【００１１】
本発明のプラグインプラントは、骨の欠損内へ挿入するために適する任意の形状を有していてよく、例えばプラグインプラントは円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状であってよい。
【００１２】
本発明のプラグインプラントの特定態様によると、第１部分は第１表面を含み、そして第２部分は第１表面とは反対側の第２表面を含み、第１表面は第２表面の面積より小さい面積を有する。本プラグインプラントの第１および第２表面は、円形、四角形もしくは長方形の形状を有してよい。第１および第２表面は平面であってよい。
【００１３】
１つの実施形態によると、本発明のプラグインプラントはテーパー形状を有する。
【００１４】
また別の実施形態によると、本プラグインプラントは厚さＸを有する第１部分と、および厚さＹを有する第２部分とを含み、Ｘ：Ｙの比率は１：１から１０：１である。
【００１５】
本発明のプラグインプラントは、親水性溶液、親水性液体および／または体液と接触すると膨張する材料から作製されている。
【００１６】
膨張性材料は、多孔性材料から形成されてよい。
【００１７】
本発明のプラグインプラントは、好ましくは生体吸収性ポリカプロラクトン（ＰＬＣ）を含む膨張性材料から作製されてよい。例えば、２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬである。本プラグインプラントは、例えば熱溶解積層法（Ｆｕｓｅｄ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＦＤＭ）技術を用いて１層ずつＰＬＣフィラメントを積層化するステップによって調製できる。
【００１８】
本プラグインプラントのＰＬＣフィラメント層は、０°、６０°および／または１２０°の方向付けを有してよい。
【００１９】
さらにまた別の実施形態によると、本プラグインプラントはドレナージ用のカテーテルを配置および抜去するための開口部を含む。
【００２０】
詳細には、本プラグインプラントは骨の欠損もしくは間隙内に挿入するために適しており、本プラグインプラントはプラグを骨の外面へ固定するための手段を必要としない。
【００２１】
本プラグインプラントは、生物活性物質をさらに含んでよい。
【００２２】
本発明は、骨組織再生のための方法であって、
生体吸収性プラグインプラントを提供するステップであって、インプラントが第１部分と、および第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、第１および第２部分が膨張性材料から形成されているステップと、
骨の欠損もしくは間隙内へ第２部分を挿入するステップであって、第１表面が欠損もしくは間隙の外側輪郭に係合するステップと、
プラグインプラントを体液と接触させ、それによりプラグが欠損もしくは間隙内へ適合するようにプラグインプラントのサイズを膨張させるステップと
を含む方法をさらに提供する。
【００２３】
本発明の方法では、本インプラントは相互に反対側の第１および第２表面を含んでいてよく、第１表面は第２表面の面積より小さい面積を有する。
【００２４】
本発明の方法では、本プラグインプラントは、骨細胞がプラグインプラント内に進入して骨組織を再生させることを可能にするように、多孔性材料から形成されてよい。
【００２５】
本方法は任意の骨組織再生のために使用できる。例えば、本方法は頭蓋形成術を実施するための方法であってよい。
【００２６】
本発明の方法では、本プラグインプラントは、プラグインプラントと骨欠損とが１ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満、または０．２ｍｍ未満の初期公差を有するような方法で骨の欠損内へ挿入される。
【００２７】
本発明による方法は、骨欠損を修復するための治療的処置のために使用できる、または望ましくない骨の間隙の美容上の修復のための非治療的処置のために使用できる。
【００２８】
本方法は、骨組織再生および／または骨修復のために適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本明細書に言及した引用文献は、便宜上参考文献リストの形で列挙しており、実施例の最後に付け加えられている。そのような引用文献の全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本発明の１つの態様は、骨組織再生のために適合する生体吸収性プラグインプラントの構築に関する。骨の欠損もしくは間隙の骨組織再生は部分的である場合も完全である場合もある。後者については、本願のために骨修復術と表示する。
【００３１】
骨組織再生のための生体吸収性プラグインプラントおよび方法は、任意のタイプの骨の欠損もしくは間隙に適用できる。本発明のプラグインプラントの特定の用途は、例えば頭蓋形成術である。
【００３２】
本発明によるインプラントは、プラグの形状を有する。本発明のために、骨組織再生および／または骨修復のために適合するプラグインプラントは、欠損もしくは間隙を充填するため、または楔もしくはストッパーとして機能するために使用される、例えば骨の穴のような骨の欠損もしくは間隙内へ実質的にぴったりと適合するインプラントであると規定する。本発明のために、欠損もしくは間隙は骨の窩洞を意味する。用語「欠損」は、疾患と見なすことができて治療的に処置する必要がある状態を意味するが、用語「間隙」は疾患ではなく美容上の目的で非治療的に処置できる状態を意味する。本発明のために、用語「バーホール」は一般に欠損および／または間隙を示すために使用する。本発明のプラグインプラントは「バープラグ」と呼ぶこともできる。それからプラグインプラントが作製される膨張性材料の構造は、さらにまた「スカフォールド」と表示することもできる。
【００３３】
詳細には、本発明は骨組織再生のために適した生体吸収性プラグインプラントを開示するが、本インプラントは第１部分と、および第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、第１および第２部分は膨張性材料から形成されている。
【００３４】
本発明のプラグインプラントは骨の欠損内へ挿入するために適した任意の形状を有していてよく、例えば、本プラグインプラントは円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状であってよい。
【００３５】
本発明のプラグインプラントの特定態様によると、第１部分は第１表面を含み、および第２部分は第１表面とは反対側の第２表面を含み、第１表面は第２表面の面積より小さい面積を有する。本プラグインプラントの第１および第２表面は、円形、四角形もしくは長方形の形状を有してよい。第１および第２表面は平面であってよい。
【００３６】
本発明のプラグインプラントは、親水性溶液、親水性液体および／または体液と接触すると膨張する材料から作製されている。
【００３７】
図１は、バーホール（２）を含む頭蓋（１）ファントムを示しており、これは本発明のためには欠損（２）もしくは間隙（２）であると識別することができる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態を示している図１を参照すると、本プラグインプラントは、第１部分（５）、および第１部分から外側に伸びる第２部分（４）を含む「マッシュルーム」（３）のような形状であってよく、第１および第２部分は膨張性材料から形成されている。しかし本発明のプラグインプラントはマッシュルームの形状には限定されず、骨の欠損内へ挿入するために適した任意の形状を有していてよく、例えば本プラグインプラントは円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状であってよい。
【００３９】
より詳細には、図１に例示した実施形態では、第１部分（５）は第１表面（５）を含み、および第２部分（４）は第１表面とは反対側の第２表面（４）を含み、第１表面は第２表面の面積より小さい面積を有する。図１では、本プラグインプラントの第１および第２表面は、円形の形状を有する。第１および第２表面は平面を有する。しかし、形状は円形には限定されず、例えば、四角形もしくは長方形であってよい。同様に、表面は平面には限定されず、本発明のために適した任意の表面を有していてよく、例えば不整形、円錐形、鋭角形、または楕円形が本発明の範囲内に含まれてよい。
【００４０】
第１および第２部分は、またそれらの厚さによって特徴付けることもできる。詳細には、第１部分（５）は第１表面を含んでいて厚さＸを有するが、他方第２部分（４）は第２表面を有していて厚さＹを有しており、Ｘ：Ｙの比率は１：１から１：１０である。より詳細には、図１では、Ｘ：Ｙの比率は１１：４である。すなわち第１部分（５）は１１層を含むが、他方第２部分（４）は４層を含む。層の数は、プラグインプラントの特定形状によって、ならびに骨、バーホール、およびヒトもしくは動物である患者の特定状態によって当業者により選択されてよい。特定実施例として、本プラグインプラントは、第２部分が１ｍｍの厚さを有し、第１部分の厚さが３ｍｍであるような方法で設計することができる。
【００４１】
図２は、図１の実施形態の等角投影図である。より詳細には、図２は、生分解性ポリマーフィラメントから形成された層状スカフォールド構造を示している。
【００４２】
また別の実施形態によると、本発明のプラグインプラントはテーパー形状を有する、または骨の欠損内へ挿入するために適した任意の形状を有していてよく、例えば本プラグインプラントは円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状であってよい。
【００４３】
図２Ａは、第１表面（５０）を含む第１部分（５０）と、第１表面とは反対側で第２表面（４０）を含む第２部分（４０）とを含むテーパー形状を有するプラグインプラントを示しており、第１表面（５０）は第２表面（５０）の面積より小さい面積を有する。第１部分（５０）プラグインプラントは骨の欠損もしくは間隙内へ挿入されるが、他方第２部分（４０）はプラグインプラントが骨窩洞内へ進入するのを回避して欠損もしくは間隙の輪郭に係合する。
【００４４】
本プラグインプラントの第１および第２表面は、円形、四角形もしくは長方形の形状を有してよい。第１および第２表面は平面であってよい。
【００４５】
図２Ｂは、図１および２の実施形態を示している。
【００４６】
本発明による任意の実施形態によるプラグインプラントならびに第１および第２部分のサイズは、骨の欠損もしくは間隙のサイズによって当業者が選択することができる。例えば、本プラグインプラントは、第２部分が１ｍｍの厚さを有し、第１部分の厚さが３ｍｍであるような方法で設計することができる。本プラグインプラントは、例えば１５ｍｍの第１部分の直径および２０ｍｍの第２部分の直径を有してよい（図１および２を参照されたい）。
【００４７】
親水性溶液、親水性液体および／または体液と接触すると膨張性である、または膨らむ材料（例えばポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である材料と組み合わせた本発明のプラグインプラントの特定形状は、そのプラグを骨へ取り付けるための手段を必要とせずに欠損もしくは間隙内へプラグを「スナップフィット」することを可能にする。
【００４８】
このため本発明のプラグインプラントは、頭蓋形成術用のチタン製プレートの代わりに使用される、または米国特許第６，３５０，２８４号に記載されたインプラントのために必要であるスクリューのような取り付けのための手段を必要とせずに使用できる。したがって、本発明のプラグインプラントは、スクリューなどを骨表面へ取り付けるための挿入穴を必要としない。スクリューが存在しないことは、１つの重要な長所を意味する−それは可能な限り短時間でのバープラグの容易な配置を可能にする。
【００４９】
より詳細には、骨の上（例えば、頭蓋上）のプラグインプラントと欠損もしくは間隙との間で１．０ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満または０．２ｍｍ未満の初期公差は、「スナップフィット」設計が効果的に機能することを可能にする。大きな第２部分（「トップキャップ」）は、プラグインプラントが、その構造（例えば、頭蓋）の骨の厚さより過度に下方へ間違って押し込まれずに、骨の欠損もしくは間隙の輪郭位置にとどまることを保証する。
【００５０】
さらにその上、膨張性材料は、多孔性材料から製造されてよい。例えば、２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬである。より詳細には、６０〜７０％の多孔性を備える２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬである。好ましくは、６５％の多孔性を備える２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬである。これは、プラグインプラントが多孔性構造の弾性圧縮性のために欠損もしくは間隙の輪郭内へより良好に適合することを可能にする。米国特許第６，３５０，２８４号に記載された構造のような剛性構造がそのような能力を有していないことは理解されるであろう。本プラグインプラントのスカフォールドは、完全に相互接続した多孔性構造および約６０〜７０％の多孔性を有してよい。この形態は、スカフォールドが身体内に植え込まれると細胞が捕捉されて増殖するのを可能にする（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。
【００５１】
図５ＡおよびＢならびに図７は、本プラグインプラントがドレナージを実施するためのカテーテルを配置するための開口部（６００、６１０）を含むまた別の実施形態を示している。この設計は、ドレナージ目的でスカフォールド内へある角度で挿入できるカテーテルの容易な配置および抜去を可能にする。
【００５２】
本発明のプラグインプラントを構築するために適した当技術分野において公知の任意の生体吸収性材料を使用できる。例えば、任意の生体吸収性ポリマーまたはコポリマーを使用できる。詳細には、生体適合性であり、緩徐に分解し、そして骨細胞が付着して増殖するのを可能にすることが証明されている生体吸収性ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーは、本発明のために特に適することが証明されている。細胞が発現する時間に伴って、それらは固有の細胞外基質を有するようになり、ＰＣＬが身体により再吸収かつ代謝されるにつれて骨様構造が生じる。熱溶解積層法（ＦＤＭ）として公知のソリッドフリーフォーム・ファブリケーション技術を用いるＴＣＰ−ＰＣＬ（２０％  ｗ／ｖ）ハイブリッドスカフォールドは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）をＰＣＬと組み合わせて、（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）の方法にしたがって調製することができる。より詳細には、６０〜７−％の多孔性、好ましくは６５％の多孔性を備える２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬを使用できる。最も重要には、コンピュータ制御ＦＤＭプロセスは、インビボ骨構造を模倣する適合する機械的強度を備える多孔性スカフォールドの設計および製作を可能にする。このアプローチは、ヒト組織工学の概念を含む。本プラグインプラントのスカフォールド設計は、当技術分野において公知の任意の方法にしたがって構築することができる。例えば、いわゆる「熱溶解積層法」（ＦＤＭ）（Ｉｗａｎ  Ｚｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２）のような迅速なプロトタイピングプロセスによってＰＣＬフィラメントを１層ずつ積層化するステップによって。フィラメントは、任意の適した方向付けにしたがって配置することができ、例えばＰＬＣフィラメント層は、０°、６０°および／または１２０°の方向付けを有してよい（例えば、図６Ａ、Ｂ、Ｃを参照されたい）。
【００５３】
ＰＣＬスカフォールドの設計および作製
生分解性ポリマーインプラントは、ＦＤＭ迅速プロトタイピング技術（ＦＤＭ  ３Ｄ  Ｍｏｄｅｌｌｅｒ、Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  Ｉｎｃ．社製、ミネソタ州イーデンプレーリー）を用いて医用ポリカプロラクトン（ＰＣＬ、粘度１．０〜１．３；アラバマ州バーミングハム）から作製される。スカフォールドは、完全に相互接続した多孔性構造および約６０〜７０％の多孔性を有している。生分解性ポリマーはＴＣＰ−ＰＣＬである。詳細には、三次元ＴＣＰ−ＰＣＬ（２０：８０％）である。より詳細には、６０〜７０％の多孔性、好ましくは６５％の多孔性を備える三次元２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬである。この形態は、スカフォールドが身体内に植え込まれると細胞が捕捉されて増殖するのを可能にする（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。スカフォールド幾何モデルは、最初にＵｎｉｇｒａｐｈｉｃｓ  ＣＡＤソフトウエアで作製され、その後「．ＳＴＬファイル」フォーマットのＳｔｒａｔａｓｙｓ  ＱｕｉｃｋＳｌｉｃｅ（商標）ソフトウエア内へ書き出された。層全体について、単一輪郭およびラスターフィルパターンが採用された。三角形の孔のパターンを形成するために０／６０／１２０(のレイダウンパターンを使用した（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。ＦＤＭフィラメントを生成する方法は当技術分野において公知である。
【００５４】
細胞をスカフォールド上で培養することができる。１例として、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用できる。骨電導性または骨誘導性のいずれかの特性を備える多孔性スカフォールド上に播種されたＭＳＣを用いて骨欠損を修復するために極めて多数の研究が行われてきた。Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｕｄｅｒ（１９９７）は初めて、非常に多数の細胞が骨欠損内へ外科的に植え込まれる前にｃｅｒｅｍａｉｃスカフォールド上で培養される技術を記載した。しかし、臨床的に有用であるためには、培養技術およびスカフォールド特性に関わる問題が克服されなければならない。より確実な石灰化および骨形成速度を達成するために培養中でＭＳＣを拡張させるための改良された技術が最初に開発されなければならなかった。続いて、骨芽細胞内へ分化したＭＳＣの二次元培養を用いた試験は、骨形成性開発の特徴的なパターンを解明し、骨芽細胞内へのＭＳＣの転移を制御する１階層の事象を確立した（Ｎｉｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。二次元培養に加えて、様々な三次元スカフォールド上で増殖したＭＳＣはさらにまたエクスビボ分化および続いてインビボ骨形成へ極めて大きな影響を有する初期の播種密度に関しても研究されてきた。その上、ＭＳＣの密な培養は分化および石灰化を増強することが証明されており、低密度培養に比較して高レベルのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を生じさせた。より良好な骨誘導性環境を達成するために、高度の細胞数を備える細胞シートはさらにまた三次元スカフォールドへも適用されてきた。この細胞シートクラスター技術は、多数の状況においてヒト組織工学に対して有効であることが証明されている。第１に、皮膚および角膜を再建するための単細胞シートを移植するステップは、酵素的処置に比較してより大きな成功が得られることが証明されている（Ｋｕｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。第２に、複数の細胞タイプを用いて複雑な組織を再構築するためには様々な複数の層の細胞シートを利用できる。この技術を用いて、血管は、インビボ移植術を保証するために十分な機械的強度を示す合成もしくは外生的生体物質を用いずに、ヒト細胞を培養するステップによって工学的に作製されてきた（Ｎｉｃｏｌａｓ，１９９８）。最後に、数種のタイプの細胞シートを積層化するステップによって、肝臓、腎臓および血管器官を含む層状構造を作製できる（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００５５】
さらに、本発明はさらにまた提供する。詳細には、本プラグインプラントは骨の欠損もしくは間隙内に挿入するために適しており、本プラグインプラントはプラグを骨の外面へ固定するための手段を必要としない。
【００５６】
本プラグインプラントは、さらに生物活性物質を含んでもよい。
【００５７】
本発明はさらに、骨組織再生のための方法であって、
生体吸収性プラグインプラントを提供するステップであって、インプラントが第１部分と、および第１部分から外側に伸びる第２部分とを含み、第１および第２部分が膨張性材料から形成されているステップと、
骨の欠損もしくは間隙内へ第２部分を挿入するステップであって、第１表面が欠損もしくは間隙の外側輪郭に係合するステップと、
プラグインプラントを体液と接触させ、それによりプラグが欠損もしくは間隙内へ適合するようにプラグインプラントのサイズを膨張させるステップと
を含む方法を提供する。
【００５８】
本発明の方法では、本インプラントは相互に反対側の第１および第２表面を含んでいてよく、第１表面は第２表面の面積より小さい面積を有する。
【００５９】
本発明の方法では、本プラグインプラントは、骨細胞がプラグインプラント内に進入して骨組織を再生させることを可能にするように、多孔性材料から形成されてよい。本プラグインプラントは、円錐、切頭円錐、五面体、切頭五面体、および／またはマッシュルームのような形状であってよい。例えば、第１および第２表面は平面を有してよい。さらに、第１および第２表面は、円形、四角形もしくは長方形の形状を有してよい。
【００６０】
本発明の方法では、本プラグインプラントは、骨細胞がプラグインプラント内に進入して骨組織を再生させることを可能にするように、多孔性材料から形成されてよい。
【００６１】
本発明の方法は、任意の種類の骨構造に対して骨組織再生および骨修復のために使用できるが、しかし本方法は頭蓋形成術を実施するために特に適する。
【００６２】
本方法によると、本プラグインプラントおよび骨の欠損もしくは間隙は１ｍｍ未満の初期公差を有する。詳細には、初期公差は０．５ｍｍ未満である。好ましくは、初期公差は０．２ｍｍ未満である。
【００６３】
本発明の方法は、ドレナージを実施するためにプラグインプラントの開口部内へカテーテルを配置するステップをさらに含んでよい。
【００６４】
本発明の方法の特徴は、骨欠損内へのプラグインプラントの挿入が、欠損を取り囲んでいる骨の外面へプラグを固定するための手段を必要としないことである。
【００６５】
本発明の方法は、ヒトを含む動物における欠損の骨組織再生および骨修復を行なうための治療方法であってよい。本方法は、さらにまた望ましくない骨の間隙を美容的に修復するための非治療方法であってよい。
【００６６】
これまで本発明を一般的に記載してきたが、同様のことは例示によって提供され、本発明を限定することは意図していない以下の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【００６７】
前臨床試験の結果
国立大学病院（ＮＵＨ）で患者１０例に対して前臨床試験を実施した。本試験はシンガポールに所在するＮＵＨの国内・国際倫理審査委員会によって精査され、治験審査委員会によって承認された。適格患者は、慢性硬膜下血腫を有する患者である。彼らには、手術を受ける前に様々な選択肢について情報が与えられた。１例として、図８（左）は２つのバーホールのＣＴスキャンを示している。第３日に撮影された術後ＣＴスキャンにより、ＦＤＭ  ＰＣＬスカフォールド／細胞移植片が正位置に固定され、頭蓋の３Ｄ形状が良好に再構築されていることが明らかになった。質量効果または液体貯留は存在しなかった。ＰＣＬの緩徐な分解動態は、安定性テンプレートを提供し、頭蓋の形状に適応する。腫脹は存在しなかった。植込み３カ月後という早期にインプラントは良好に組み込まれ、石灰化し始めていた（図８ｂ（右））。触知により、周囲頭蓋冠骨内でのインプラントの安定性組込みが明らかになった。毛髪が欠損を被覆する皮膚上で増殖したのが観察された（図９ａ、ｂ）。美容上の効果は明白であり、患者に良好に受け入れられた。
【実施例２】
【００６８】
骨形成を強化するために三次元ＴＣＰ−ＰＣＬスカフォールド内および周囲へ播種されたブタの骨間葉系幹細胞のインビトロおよびインビボ使用。
骨組織工学技術は、骨欠損を修復するための前途有望な技術として出現してきた。細胞培養と生分解性スカフォールドとの組み合わせを用いると、従来型の骨移植術に比較して優れた特性を備える構築物は、骨移植片置換物として移植のために適することが証明される可能性がある。本研究では、我々は三次元ＴＣＰ−ＰＣＬスカフォールド（２０％）上で自家間葉系幹細胞（ＰＭＳＣ）シートを培養し、それらの骨形成性分化ならびにヌードラットの皮下への移植後のインビボ骨形成について試験した。６５％の多孔性を備える２０％  ＴＣＰ−ＰＣＬから構成される構築物をＰＭＳＣのための三次元基質として使用し、８週間までインビトロで培養した。ＰＭＳＣ増殖は、代謝アッセイおよび共焦点イメージング法を用いて定期的間隔で評価した。骨誘導性培地中での８週間の培養後、ＰＭＳＣは生育性を維持しており、スカフォールドの内側および外側の両方で石灰化結節を視認できた。細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は誘導後に＞５０倍へ増加し、可溶性ＡＬＰは培養期間を通して増加し続けた。同様に、骨形成性関連転写産物であるｏｓｔｅｒｉｘ、オステオポンチン（ＯＰＮ）、およびオステオカルシン（ＯＣＮ）についてのｍＲＮＡ発現は誘導後に４〜１０倍へ上昇したが、他方コアＤＮＡ結合因子１（Ｃｂｆａ１）およびコラーゲンＩ型転写産物はわずかにアップレギュレートされた。タンパク質レベルでは、ＯＣＮは１０倍へ増加したが、ＯＰＮレベルは２〜４倍へ上昇した。ヌードラット内への移植後、マイクロＣＴおよびＸ線検査は４週間後に、構築物内で経時的に増加し続けた皮質骨ならびに海綿質骨を検出した。皮質骨のほとんどは構築物の周囲で検出され、海綿質骨は構築物の内側で検出された。組織学検査は、構築物の内側で形成された骨が播種されたＰＭＳＣのプールからの軟骨内骨化によって形成されたことを明らかにした。これらの所見は、ＰＭＳＣ細胞シート構築物がインビトロおよびインビボの両方で増殖かつ骨化し、骨形成性を試験するための有用な三次元モデルを提供することを証明している。さらに、臨床的骨修復のため、特別には荷重負担欠損のために、部位内へ移植するための前播種された骨細胞シートを一緒に用いて、エクスビボの生分解性スカフォールドとしてＴＣＰ−ＰＣＬ構築物を使用する可能性が存在する。
【００６９】
材料および方法：
スカフォールドの作製および特性付け
最近まで、スカフォールドを作製するためのＰＣＬ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）の使用は非臨床用途に制限されていた。この技術を臨床用途へ適合させるために、我々は、同一の化学組成および特性を有する医用ＰＣＬ（アラバマ州バーミングハム）へ切り替えた。医用ＰＣＬ／ＣａＰフレークは、ＦＤＭ作製に先立って社内に構築された押出成形機を用いてフィラメント押出成形工程によってO１．７０±０．１０ｍｍのモノフィラメントへ調製した（図１１および１２）。Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  Ｉｎｃ社製のＦＤＭ迅速プロトタイピングシステムを使用して、４０×４０×４ｍｍ（各々、長さ、幅および高さ）のバルク寸法を備えるスカフォールドを作製した。ＦＤＭの作動原理は他の場所で記載されている（Ｃａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００７０】
スカフォールドの多孔性は、スカフォールドの真の体積とスカフォールドの見かけの体積との比率であると規定されている。真の体積はスカフォールドを作り上げる材料の体積であるが、他方見かけの体積はその中の空隙を含むスカフォールドの全体的な幾何学的体積である。スカフォールドの多孔性を他の場所で報告されたとおりに測定し、スカフォールドの形態および孔径を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって決定した。スカフォールドの表面をゴールドスパッタリングし、１５ｋＶの加速電圧を用いて試験した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ社製、ＸＬ３０  ＦＥＧ、オランダ）。
【００７１】
圧縮試験は、１ｋＮロードセルを用いてＩＸシリーズ自動材料試験機ｖ．７．４３システムソフトウエアによって作動するＩｎｓｔｒｏｎ  ４３０２材料試験システムを用いて行われた。スカフォールドは、ＡＳＴＭ規格Ｄ６９５−９６ガイドラインに準拠して試験された。試験片は、約０．６Ｎの歪みレベルまで１ｍｍ／分の速度で圧縮された。応力−歪み（σ−ε）曲線を計算し、スカフォールドの圧縮剛性（ヤング率）および圧縮降伏強度を決定した。剛性は次に、任意のつま先領域（試験片の初期沈下）を無視して、曲線の最初の線状部分の勾配を規定することによって応力−歪み曲線から計算された。圧縮降伏強度を、（もしあれば）降伏点または線状領域の先端で採取した。
【００７２】
材料の熱反応を試験してポリマーの分別晶出を決定するために、示差走査熱量法（ＤＳＣ）を利用する熱分析を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製の標準アルミニウム製パンおよびカバー内に保持した５〜１２ｍｇの平均サンプル重量と一緒にＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製の熱流束Ｐｙｒｉｓ  ６  ＤＳＣを使用した。これらの試験片を、パージガスとして窒素を使用して、５℃／分のランプ速度で２０〜８０℃まで走査した。晶出分画は、１００％結晶ＰＣＬ1に対して１３９．５Ｊ／ｇの融合値のエンタルピーに基づいて計算した［Ｐｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１］。
【００７３】
ＰＣＬの平均分子量を、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）装置を利用して高性能液体クロマトグラフィーによって決定した。ＰＣＬスカフォールドの切片を切除し、０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）の濃度でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中へ溶解させた。サンプル溶液をさらに０．２μｍの無機膜フィルターに通して濾過し、示差屈折器（Ｗａｔｅｒｓ  ４１０）および吸光度検出屈折器（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０）を装備したＧＰＣを用いてポリマー分子量分布を決定した。サンプルを、移動相としてＴＨＦを用いて、１ｍＬ／分の流量でＳｔｙｒａｇｅｌカラム屈折器に通して溶出させた。ポリスチレン標準物質（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検量線を入手した。重量平均分子量（Ｍw）および数平均分子量（Ｍn）の両方を多分散性（Ｍw／Ｍn）と一緒に評価した。
【００７４】
適切な場合は、９５％の信頼水準（ｐ＜０．０５）に設定したスチューデントのｔ検定を用いて統計的分析を実施した。
【００７５】
細胞の単離および培養
ブタ間葉系幹細胞を、以前に報告されたとおりに単離して培養した（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。適切な倫理的認可が与えられた後にシンガポール国立大学（ＮＵＳ）の動物飼養課からブタを入手し、ＮＵＳ動物実験審査委員会ガイドラインに準拠して骨髄サンプルを除去した。手短には、骨髄からＭＳＣを吸引して勾配遠心分離にかけ、３７℃および５％  ＣＯ2に設定した加湿環境内で、その後２％ファンギゾン（Ｓｉｇｍａ社製、米国ミズーリ州）および２％抗生物質（２００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含有する、本明細書では標準培地と呼ぶダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）低ブドウ糖（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）中において培養した。７５ｃｍ2のフラスコに付き最初に２×１０5ｃｅｌｌｓの密度で細胞を播種した。全実験に対して、２〜４継代の培養だけを使用した。コンフルエンス時に、細胞培地を、骨形成性分化（誘導）を誘導するために標準培地にＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（５０μｇ／ｍＬ）、β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｐｈａｔｅ（１０ｍＭ）およびデキサメタゾン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ社製、米国）を加えたものからなる骨形成性培地に取り替えた。コントロール培養（非誘導）は標準培地中で維持した。全培地を２日毎に取り替えた。
【００７６】
スカフォールドの作製および細胞の播種
各々０／６０／１２０°のレイダウンパターンおよび６５％の多孔性を備えるＴＣＰ−ＰＣＬ（２０：８０％）スカフォールドを、我々の以前の方法（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）にしたがって熱溶解積層法（ＦＤＭ）によって作製した（図１０、１１および１２）。ＴＣＰ−ＰＣＬスカフォールドを４ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍのブロックにカットし、スカフォールド表面の疎水性特性を改善するために１時間にわたり５Ｍ  ＮａＯＨを用いて処置した。次にＮａＯＨ残渣を洗い流すために、ＰＢＳを用いてスカフォールドを完全にすすぎ洗い、少なくとも３０分間にわたり７５％  ＥｔｏＨ中へ浸漬し、風乾させた。次に標準培地中の細胞（２０μＬ中で５×１０5）をスカフォールド内へ播種し、追加の培地を添加する前に３７℃で２時間にわたり付着するに任せた。
【００７７】
細胞シート−スカフォールドの構築
コンフルエント誘導（Ａ群）および非誘導（Ｂ群）のＭＳＣシート（２５ｃｍ2）を、無菌の繊細な鉗子を用いてフラスコから静かに剥がし、事前に播種したスカフォールドの上方に被覆し、１週間にわたり培養した。これらの構築物を次に３群に分けた：ａ）誘導細胞シート−スカフォールド構築物；ｂ）非誘導構築物；８週間まで維持した；ｃ）２Ｄプレート。インビボ植込みのために、スカフォールドサイズは１０ｍｍ×１０ｍｍ×４ｍｍであり、１００万個のＭＳＣを用いて内側に播種し、次に細胞シートフォームを用いて７５ｃｍ2のフラスコを被覆した。植込みに使用した全細胞は、４週間にわたりインビトロで培養した。植込みは２群に分類した：ａ）誘導；ｂ）非誘導シート−スカフォールド構築物。誘導構築物は、骨形成性プロセスを受けて、植込み前に石灰化を経験することが確証された。
【００７８】
細胞生育性およびファロイジン染色
細胞生育性を、二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．社製、米国オレゴン州）の組合わせを使用する生／死アッセイによって評価した。共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＭ）（Ｌｅｉｃａ社製、独国）を用いて、蛍光顕微鏡写真を各群から撮影した。ＦＤＡ／ＰＩ処置の前に、培養ウェルから構築物を取り出し、ＰＢＳ中ですすぎ洗いし、１５分間にわたりＰＢＳ中で２μｇ／ｍＬのＦＤＡと一緒に３７℃でインキュベートした。非無菌ＰＢＳを用いて洗浄した後、試験片を次に室温で２分間にわたりＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム溶液中へ入れた。次にＰＢＳ中でこれらの試験片を再び洗浄し、顕微鏡のカバーガラス上に配置し、共焦点顕微鏡によって視認した。
【００７９】
細胞の標識およびＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ
ＭＳＣはｃＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて標識し、次にＰＢＳを用いて洗浄し、植込み前に製造業者の取扱説明書にしたがって１５分間かけて３７℃で緑色蛍光を用いて標識した。
【００８０】
増殖率を決定するために、細胞／スカフォールド構築物を含有する培養へ１ｍＬのａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｂｅｓ社製、米国オレゴン州）（１０％（ｖ／ｖ））を様々な時点に添加し、３時間インキュベートした。次にアッセイ培地を９６ウェルプレートへ移し、マイクロプレートリーダー（Ｂｒａｎｄ社製、米国カリフォルニア州）を用いて５７０ｎｍおよび６００ｎｍでの吸光度を決定した。減少率は、製品の取扱説明書にしたがって計算した。
【００８１】
アルカリホスファターゼ活性
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（製品番号１０４、Ｓｉｇｍａ社製）からのｐ−ニトロフェノール形成率を測定するステップに基づいて、反応速度アッセイを用いて細胞中アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を決定した。手短には、培地を取り除き、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、英国）を含有する氷温バッファー（５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  トリトン−１００、ｐＨ７．５）を添加するステップによって細胞溶解液を調製した。次に１２，０００×ｇで５分間遠心することによりタンパク質上清を収集し、タンパク質アッセイキット（製品番号５００−０００２、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてタンパク質含量を決定した。サンプル（２０μＬ）を５０μＬのＡＰ試薬と結合し、３７℃で３０分間インキュベートした後に９６ウェルプレート内で活性を測定した。ＡＰ活性は、製品（Ｂｉｏ−Ｒａｄマイクロプレートリーダーｂｅｎｃｈｍａｒｋ  １０８９２、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、米国）の取扱説明書にしたがって４０５ｎｍで読み取り、検量線との比較によって酵素の量を決定した。溶解液中のＡＰ活性は、タンパク質１μｇに付き１分当たり産生したｐ−ニトロフェノールのナノモル量として表示した。
【００８２】
ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社製、米国カリフォルニア州カールズバッド）を製造業者の提案にしたがって用いて、全細胞ＲＮＡを週１回抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびＯｌｉｇｏ  ｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社製、米国カリフォルニア州カールズバッド）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡ合成を実施した。ｃｂｆａ−１、ｏｓｔｅｒｉｘ、コラーゲンＩ型、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００配列検出装置およびＰｒｏｌｉｇｏ社（シンガポール）によって合成された特異的プライマーを用いるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用してリアルタイムＰＣＲによって定量した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｒｉｍｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）プログラムのバージョン２．０を用いてプライマー配列を設計し、全国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）でそれらの特異性について突き止めた。ＰＣＲサイクル中にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの二本鎖ＤＮＡへの直接的結合によって惹起された蛍光の上昇を測定するステップを、ＰＣＲ中の反応産物の上昇を監視した。反応混合物は、製造業者の取扱説明書にしたがって準備した。９５℃での８分間のＴａｑポリメラーゼ活性化ステップに続いて、反応は９５℃で３０秒間にわたる変性ならびに６０℃での１分間にわたるアニーリングおよび伸長（各プライマーについて同一）ならびに７２℃で１分間にわたる延長によるサイクルを繰り返し、７分間にわたる７２℃の最終伸長期間の前に３５サイクル繰り返した。標的遺伝子ＣT値は相対発現単位（ＲＥＵ）として表示し、ＧＡＰＤＨに対して標準化した。反応産物をさらにｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）内へクローニングし、確証するためにシーケンシングした。
【００８３】
ウェスタンブロット法
プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのアプロチニンおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を含有する氷温溶解バッファー（１％  トリトンＸ１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ４０、０．１％  ＳＤＳ）を用いるステップによって、細胞溶解液を調製した。タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を製造業者の提案にしたがって用いて、上清中のタンパク質濃度を決定した。細胞溶解液（４０μｇ）を６〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）ゲルによって分解させ、タンパク質をニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、英国バッキンガムシア）へ移した。トリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）中で室温（ＲＴ）で１時間にわたり５％低脂肪牛乳を用いて非特異的結合を遮断した。膜を次にＴＢＳを用いて２回洗浄し、４℃で一晩かけて０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中で１：１０００に希釈したマウス抗ＯＣＮ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社製、米国メイン州）、抗ＯＰＮ（ＤＳＨＢ社製、米国アイオワ州）または抗アクチン（米国カリフォルニア州、サンタクルーズ）一次抗体のいずれかと一緒にインキュベートし、洗浄し、次にＴＢＳＴ中で１：１０００に希釈した二次抗体と一緒に１時間インキュベートし、洗浄し、そして化学ルミネセンス（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ  ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製、米国）によって発色させた。ＮＩＣＨＤの後援下で開発されたＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＢａｎｋからＯＰＮ抗体を入手し、アイオワ大学生物科学学科（アイオワ州アイオワシティー５２２４２）によって維持された。
【００８４】
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａの組織化学および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）検査
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ組織化学検査結果を利用して、スカフォールド−細胞構築物全体の石灰化度を評価した。手短には、構築物をＰＢＳ中で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ社）を用いて固定し、超純水（ＵＰＷ）を用いて洗浄した。切片（厚さ２５μｍ）を、紫外線照射下で４５分間にわたり１％  ＡｇＮＯ3（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて処置し、ＵＰＷを用いて洗浄した。切片を次に８分間にわたり５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム溶液を用いて処置した；ＵＰＷを用いて再洗浄し、５％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて処置し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウエア、バージョン３．１（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いるデジタルカメラ（ＡｘｉｏＣａｍ；Ｚｅｉｓｓ社製）を装備した解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製、独国イエナ）を用いて骨結節を写真撮影した。
【００８５】
ＳＥＭ分析のために、スカフォールド−構築物中の細胞をカコジル酸バッファー中の３％  ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ中で固定した。固定した細胞を次に１％  ＯｓＯ4（ＰｒｏＳｃｉＴｅｃｈ社製）中でインキュベートし、エタノールを用いて脱水した。構築物を次にヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）（ＰｒｏＳｃｉＴｅｃｈ社製）中に包埋し、スパッタコーター（Ｅｉｋｏ社製、日本）を用いて白金被覆した。サンプルを次にＸＬ３０ＳＥＭ（ＦＥＩ  Ｉｎｃ社製、米国オレゴン州）によって１５Ｋｖで試験した。
【００８６】
組織学検査
ルーチンの組織学的分析のための試験片を３．７％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ社製）中で固定し、ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ（独国）中に包埋し、クライオミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて切片作製した。厚さ７μｍの切片をポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ社製）が前被覆されたスライド上に装填した。切片を次にヘマトキシリンおよびエオシンおよびニュートラルレッドを用いて染色した（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，２００３）。
【００８７】
マイクロＣＴスキャンおよびＸ線分析
Ｓｋｙｓｃａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｏｇｒａｐｈ  １０７６  μＣＴスキャナーを使用して、細胞／スカフォールド構築物中で生じる骨増殖を決定した。試験片を幅６８ｍｍのサンプルホルダー上に置き、構築物は高さおよび幅を走査平面に対して平行となるように配置した。１ｍｍアルミニウムフィルターならびに０．８°の回転ステップおよび１８０°の回転角度と一緒に、５回の平均化を用いて、３５μｍの走査解像度を用いた。約５００枚のスキャンスライスを撮影し、製造業者（Ｓｋｙｓｃａｎ社）の提案にしたがって修正Ｆｅｌｄｋａｍｐアルゴリズムを用いて４°のステップサイズでファイルを再構築した。アウトプットは、後にＭｉｍｉｃｓ  ７．３を用いて３Ｄスタックへ再構築した一連の１２０枚の連続１９６８×１９６８ビットマップ画像であった。Ｍｉｍｉｃｓによって骨増殖の体積および表面積の計算が可能になった。体積および表面積の測定に加えて、細胞／スカフォールド構築物中の新規の骨増殖度についても閾値標準値に基づいて評価した。これらの標準物質（海綿質骨および皮質骨）を、Ｍｉｍｉｃｓのプロファイリング機能を用いて新規に採取したブタの骨のサンプルから計算した。本研究で使用した計算閾値は、皮質骨に対しては６８〜１７３２ＨＵ（Ｈｏｕｓｅｆｉｅｌｄ単位）および海綿質骨に対しては−７０から６７ＨＵであった。
【００８８】
慣習的Ｘ線分析として、Ｍａｍｍｏｍａｔ  ３０００（Ｓｉｅｍｅｎｓ社製）Ｘ線装置を使用してサンプルを分析した。イメージング中に使用した電圧および電流を、最上の明瞭さおよび解像度を達成するために調整した。
【００８９】
異所性植込み
動物を使用する研究のプロトコールは、シンガポール国立大学（ＮＵＳ）動物使用倫理委員会（小動物実験プロトコールＮＩＤＣＲ  ００−１１３）によって審査され、承認された。最初はＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（インディアナ州インディアナポリス）から入手したヌードラットｍｕ／ｒｎｕを飼育し、特別な病原体を含まない条件でＮＵＳ動物飼養施設（ニューヨーク州バッファロー）で維持した。すべての動物の取扱いは層流フード内で実施した。細胞／スカフォールド構築物（動物１匹に付き２片の誘導構築物および２片の非誘導構築物）を、体重が１１０〜１３０ｇの３〜４月齢の免疫不全ラットの背面の皮下へ移植した。移植４、８および１２週間後に移植片を回収し、４％ホルマリン中で固定し、製造業者の提案にしたがって、パラフィン包埋のために１０％  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で脱灰するか、または７０％エタノール中で固定して樹脂（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ８１００、Ｋｕｌｚｅｒ社製、独国）中に包埋されたＴｅｃｈｎｏｖｉｔ  ８１００中に樹脂包埋した。パラフィン切片（１０μｍ）を脱パラフィンし、水和させ、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。プラスチック切片を、Ｈ＆Ｅおよびｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を用いて処理した。インビボでの新規骨形成を定量するために、ＮＩＨ画像を使用して誘導移植片または２片の非誘導移植片のどちらかから５×の倍率で５カ所の代表的な面積を計算した。
【００９０】
統計的解析
全数値は平均値±標準偏差として表示した。全データに二方向ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後試験およびペアワイズ比較（ＳＰＳＳバージョン１１．０２）を受けさせた。有意水準はｐ＜０．０５へ設定した。データは、同一条件下で実施した３回の繰返しの平均値であった。
【００９１】
結果
スカフォールド上のＭＳＣの増殖
スカフォールド上に播種して被覆したＭＳＣの付着および生育性を様々な時点に評価した。３日間の培養後に、ＭＳＣはスカフォールドのバー上に付着し、ｐｈｏｌｌｏｉｎｄ染色はＭＳＣによって形成されて細胞−スカフォールドの接触点上に蓄積したアクチン線維を可視化した。３週間後、スカフォールドのバーはＭＳＣによって十分に被覆され、細胞はスカフォールドの表面上に均等に広がっていた（図１３）。１週間後のスカフォールドの内側の細胞については、ＭＳＣはＥＣＭの産生によってスカフォールドの孔の上方にブリッジを形成した（図１４Ａ）。これからは５週間後に、孔の大多数は細胞およびＥＣＭによって充填され、ほんの少数の死細胞しか観察されなかった（図１４Ｂ）。スカフォールド上に被覆された細胞シートはＥＣＭを形成し、８週間までは生存可能に染色した。図１５Ａ、ＢのＳＥＭ画像は、コラーゲン繊維がＭＳＣによって形成されたことを明らかにした。スカフォールドおよび細胞層の表面上に形成されたシートは、骨形成性誘導後に構築物の内側で形成された（図１６Ａ、Ｂ）。誘導構築物中で形成された石灰結節は、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって最初に３週間後に検出された（図１７Ａ、Ｂ）。
【００９２】
様々な時点での構築物の代謝率は、図１８に示したようにａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素転換率を用いて測定された。骨形成性誘導下での構築物の減少率は、誘導をしていない構築物の減少率よりわずかに高かった。構築物の減少率は第２週には増加し、７週間までは安定性のままであった。プレート上で培養した細胞については、この比率は細胞シート−スカフォールド構築物より高かった。しかし、２つの培養システムは相違する基層および播種密度を有していたので、比較するのは困難である。
【００９３】
ＡＬＰａｓｅ活性
インビトロで構築物の骨形成性能力を定量するために、細胞外および細胞内ＡＬＰａｓｅ活性を監視した。図１９は、培地中へ放出されたＡＬＰが誘導後の培養時間に伴って増加したことを示している。４９日間で、誘導構築物のＡＬＰａｓｅ活性は非誘導構築物に比して１０倍であった。細胞内ＡＬＰａｓｅについて、その活性は１週間後には３０倍以上へ急激に増加し、３週間後にピーク値に達した（図２０）。そのレベルは８週間後まで全培養期間にわたりそのままであった。
【００９４】
骨関連バイオマーカーの発現
インビトロでの構築物の骨形成性分化プロセスを確証するために、構築物のＲＮＡを抽出し、骨関連分子の時間的発現レベル、つまり２種の重要な転写因子であるＣｂｆａ１およびｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）ならびにコラーゲンＩ型（Ｃｏｌ  Ｉ）を監視するためにＲＴ−ＰＣＲを適用した（図２１）。図２２は、ｏｓｔｅｒｉｘおよびｏｃｎ発現レベルが誘導後には少なくとも各々１０および５倍へ有意にアップレギュレートされ、培養期間にわたり高レベルで維持されたことを示している。ＯＰＮ発現レベルも同様にアップレギュレートされ、ｃｂｆａ１およびＣｏｌ  Ｉのレベルは誘導構築物中でわずかに上昇した。骨形成における所定の重要な分子をさらに確証するために、ＯＣＮおよびＯＰＮタンパク質合成についてもウェスタンブロットにより測定した（図２３、２４）。図２４に示したように、ＯＣＮは誘導構築物中では特異的に発現し、その発現は７週間にわたる培養中に安定性のままであった。ＯＰＮ発現は３週間後にはほぼ３〜４倍に増加し、その後はわずかに減少した。
【００９５】
インビボでの骨形成
組換え作製された構築物の骨形成能力を検証するために、誘導および非誘導構築物をヌードラット内へ植え込み、４、８、１２週間後に取り出した（図２５、２６）。図２７Ａ、Ｂ、ＣにおけるＸ線画像は、誘導構築物中で骨形成が生じたことを示している。図８は、皮質骨および海綿質骨の両方が構築物中で形成されたことを証明している。マイクロＣＴスキャンを通すと、皮質骨は主として構築物の外側で形成され、海綿質骨は構築物の内側で形成された。構築物の内側で形成された骨の体積および表面積は、植込み後時間の経過に伴って減少した（図２８、２９Ａ、Ｂ）。植え込まれた細胞が骨形成に及ぼす寄与を決定するために、我々は植え込んだ細胞をｃＦＤＡ標識した。図３０Ａ、Ｂは、主として骨領域内に存在する蛍光性細胞を示しており、これは大多数の骨芽細胞が植え込まれた細胞に由来することを示していた。図３１Ａ、Ｂ、ＣにおけるＨ／Ｅ染色は、構築物中のＭＳＣが軟骨細胞と骨領域との界面で成長板様構造と組織学的に似ていることを表示した。これは、構築物内のＭＳＣが軟骨内骨形成プロセスを経験したことを証明している。
【００９６】
考察
本研究では、我々は、インビトロおよびインビボでＰＭＳＣのシート−スカフォールド構築物のハイブリッドの骨形成について試験した。インビトロ試験結果は、構築物中のＭＳＣが、骨関連タンパク質であるＡＬＰのアップレギュレーションを用いた骨形成性誘導後に増殖して骨芽細胞へ分化できることを証明している。インビボ試験データは、ヌードラットにおける植込み４週間後に全構築物が皮質骨および海綿質骨の両方を形成することを証明した。それは、ＴＣＰ−ＰＣＬスカフォールドを用いたＭＳＣシート組込みのこの実験における新規概念が骨組織工学技術において機能できることを意味している。遺伝子組換え構築物は、特に荷重負担領域における骨置換物の候補となるであろうが、これは実験におけるスカフォールドが以前に報告された主としてポリマーフォームもしくはシートであったスカフォールドより高度の機械的力を維持することができるからである。
【００９７】
引用文献
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ファントム頭蓋（１）についてのドレナージ／洗浄および神経学検査のために作製された典型的なバーホールもしくは欠損（２）を示した図である。
【図２】ケース１のバープラグ（３）設計の正投影図である。プラグインプラント（３）は、第１もしくは上方表面（５）および第２もしくは下方表面（４）を含む。
【図３】図２のケース１のバープラグ（２）設計の等角投影図である。
【図４Ａ】プラグインプラント（３０）の第１もしくは下方表面（５０）が骨の欠損内へ挿入され、プラグインプラントがテーパー形状を有する実施形態を示した図である。
【図４Ｂ】図２および３の実施形態を示した図である。
【図５】ドレナージ用カテーテルを挿入および／または抜去するための開口部をさらに含む、図４ａ、ｂの実施形態を示した図である。
【図６】バープラグ設計におけるＰＣＬフィラメントの０／６０／１２０°の層方向付けを示した図である。（ａ）ＰＣＬフィラメント層の０°の方向付け；（ｂ）ＰＣＬフィラメント層の６０°の方向付け；（ｃ）ＰＣＬフィラメント層の１２０°の方向付け。
【図７】カテーテルの容易な配置および抜去を可能にするケース２のセンターホール・バープラグ設計の正投影および等角投影図である。
【図８】２つのバーホールを示している術後１週間のＣＴを示した図である（左）；ヒト被験者において、術後３カ月にはインプラントは良好に組み込まれ、石灰化し始めた（右）。
【図９】欠損を被覆する皮膚上で毛髪が生長しているのを示している患者２例の術後写真である。
【図１０】２０％  ＴＰＣ  ＰＣＬスカフォールドの構造を示した図である。空ＴＰＣ−ＰＣＬスカフォールドのＳＥＭは、孔径４００〜６００μｍの相互接続孔を明らかにした。
【図１１】シート−スカフォールドの構造を示した図である。
【図１２】シート−スカフォールドの構造を示した図である。
【図１３】３週間後のインビトロ培養の細胞付着（ファロイジン染色）（２００×）。
【図１４】細胞増殖（内側のＦＤＡ−ＰＩ染色）。Ａ）インビトロの１週間後（１００×）。Ｂ）インビトロの５週間後（２００×）。
【図１５】細胞シート−スカフォールドの構造。写真（Ａ）（上面図）および（Ｂ）（側面図）は、スカフォールドを被覆している細胞シートおよび誘導下でのインビトロ培養の３週間後に形成されたコラーゲン繊維を示している。
【図１６】細胞シート−スカフォールドの構造（スカフォールドの内側）。Ａ）は側面図、およびＢ）は上面図である。
【図１７】構築物のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色。写真（Ａ）（１００×）および（Ｂ）（４００×）は、誘導５週間後の、スカフォールド内に形成された石灰結節を示している。
【図１８】Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ。
【図１９】細胞シート−スカフォールド構築物の細胞内ＡＬＰａｓｅ活性。
【図２０】ＥＬＩＳＡによる、培地中へ放出されたＡＬＰａｓｅ。
【図２１】ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。インビトロＲＴ−ＰＣＲプロフィールは、シート−スカフォールド構築物のｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシンおよびオステオポンチンｍＲＮＡ発現レベルは誘導後に有意に上昇したが、コラーゲンＩ型およびＣｂｆａ１発現レベルはわずかしか上昇しないことを証明している。
【図２２】ｏｓｔｅｒｉｘおよびオステオカルシンの発現レベルについてのＲＴ−ＰＣＲアッセイ。ｏｓｔｅｏｒｉｘおよびオステオカルシンの発現レベルは、骨形成性誘導後に１０〜５倍へアップレギュレートされる。データは、ＰＣＲ生成物の密度にしたがって計算した。
【図２３】タンパク質プロフィールは、シート−スカフォールド構築物中のオステオカルシンが骨形成性誘導後に特に観察され、そしてオステオポンチン発現レベルが誘導後に４〜５倍へ急激にアップレギュレートされることを示している。
【図２４】タンパク質プロフィールは、シート−スカフォールド構築物中のオステオカルシンが骨形成性誘導後に特に観察され、そしてオステオポンチン発現レベルが誘導後に４〜５倍へ急激にアップレギュレートされることを示している。
【図２５】シート−スカフォールド構築物の植込み。
【図２６】シート−スカフォールド構築物のインビボ実験の４週間後（Ａ）および８週間後（Ｂ）。
【図２７】軟Ｘ線写真。２５ＫＶ、６．３ＭａｓでＸ線によって可視化した骨形成。（Ａ）ヌードラットにおける植込み４週間後。（Ｂ）８週間後。（Ｃ）１２週間後。骨は主としてスカフォールドの周囲に形成された。
【図２８】皮質骨形成のマイクロＣＴ分析。植え込まれたシート−スカフォールド構築物によって形成された骨の体積および面積はどちらも経時的に減少した。
【図２９】植込みの４週間後（Ａ）および８週間後（Ｂ）のサンプルの組織学検査（ニュートラルレッド染色）。組織学検査データは、骨が主としてスカフォールドの表面上に形成され；線維組織はスカフォールドの内側に形成されたことを示している。
【図３０】植込み８週間後のＨ／Ｅ染色。Ｈ／Ｅ染色は、一部の軟骨細胞様細胞が骨組織下で観察されたので、シート−スカフォールドの骨形成が軟骨内プロセスを経験する可能性があることを示している。（Ａ）２５×；（Ｂ）１００×；および（Ｃ）４００×。
【図３１】蛍光標識細胞は骨を形成した。（Ａ）４週間後；（Ｂ）８週間後。どちらも４００×。新しく形成された骨組織の大半は、緑色蛍光標識ＰＭＳＣから構成された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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