(57)【要約】【課題】【解決手段】αウイルス非由来構造成分で構成され、構造遺伝子の少なくとも１つの遺伝子導入による欠失または置換により、複製欠損にされたαウイルス由来ベクターを含むウイルス粒子であって、前記粒子の構造成分がαウイルス由来ベクターのゲノムによってコードされないことを特徴とする粒子。αウイルス非由来構造成分およびαウイルス由来ベクターをコードする遺伝子を細胞株内でトランス発現し、次に、細胞培養の上清内に存在するウイルス粒子を回収することから成る前記粒子の産生方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
αウイルス非由来構造成分で構成され、構造遺伝子の少なくとも１つの遺伝子導入による欠失または置換により、複製欠損にされたαウイルス由来ベクターを含むウイルス粒子であって、前記粒子の構造成分がαウイルス由来ベクターのゲノムによってコードされないことを特徴とする粒子。
【請求項２】
構造成分が単体ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質に相当することを特徴とする、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
構造成分がレトロウイルスの構造タンパク質に相当することを特徴とする、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
αウイルスがセムリキ森林熱ウイルスであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項５】
αウイルス由来ベクターのゲノムがＭＬＶベクターの拡大カプシド配列を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項６】
αウイルス由来ベクターのゲノムがｐｓｉ配列を欠いていることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項７】
αウイルス由来ベクターのゲノムが５’に配置された真核生物プロモーターを含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項８】
αウイルス由来ベクターが突然変異ｐ２６Ｓプロモーターを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項９】
生体外で真核生物細胞を感染させるための請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス粒子を含む薬剤組成。
【請求項１１】
癌治療用医薬品の製造のための請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項１２】
αウイルス非由来構造成分で構成され、少なくとも１つの遺伝子導入による欠失または置換により、複製欠損にされたαウイルス由来ベクターを含むウイルス粒子の取得方法であって、構造遺伝子が、
‐  αウイルス非由来構造成分およびαウイルス由来ベクターをコードする遺伝子を細胞株内でトランス発現し、
‐  細胞培養の上清内に存在するウイルス粒子を回収する
ことから成ること特徴とする方法。
【請求項１３】
構造成分がＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質に相当することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トランス発現がＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現ベクターおよびαウイルス由来ベクターによる細胞株の共トランスフェクションにより得られ、共トランスフェクションが、それぞれ異なる２つの段階、すなわちＶＳＶ−Ｇエンベロープの遺伝子を発現するベクターによる株のトランスフェクション、ついで、αウイルス由来ベクターによる第二トランスフェクション、で実行されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トランスフェクションされた細胞株が２９３Ｔ細胞株であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
構造成分がレトロウイルスの構造タンパク質に相当することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
トランス発現が、αウイルス由来ベクターによる、複製欠損レトロウイルスを生産するカプシド化細胞株のトランスフェクションにより得られることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カプシド化細胞株が、レトロウイルスのＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子を発現する第一ウイルス要素と、レトロウイルスのＥＮＶ遺伝子を発現する第二ウイルス要素による細胞株の安定トランスフェクションにより得られることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
トランス発現が、レトロウイルスのＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子を発現する第一ウイルス要素と、レトロウイルスのＥＮＶ遺伝子を発現する第二ウイルス要素およびαウイルス由来ベクターの導入による２９３Ｔ細胞株の三重トランスフェクションにより得られることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
αウイルスがセムリキ森林熱ウイルスであることを特徴とする、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
αウイルス由来ベクターのゲノムがＭＬＶベクターの拡大カプシド配列を含むことを特徴とする、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
αウイルス由来ベクターのゲノムがｐｓｉ配列を欠いていることを特徴とする、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
αウイルス由来ベクターのゲノムが５’に配置された真核生物プロモーターを含むことを特徴とする、請求項１２から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
αウイルス由来ベクターが突然変異ｐ２６Ｓプロモーターを含むことを特徴とする、請求項１２から２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己増殖にしたがって複製のために不全化されたαウイルス由来ベクターを含む新しいウイルス粒子に関する。本発明はまた前記ウイルス粒子の調製方法にも関する。
【０００２】
以下の記述においては、本発明は特に、αウイルスのカテゴリーに入るセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）との関係で記述する。もちろんこの特定の例は本発明の範囲を何ら限定するものではなく、たとえばシンドビスウイルス等あらゆるαウイルスを想定することができる。
【背景技術】
【０００３】
αウイルスのゲノムは、二つの読み取りのためのフェーズ、すなわち酵素機能タンパク質をコードする第一フェーズと、構造タンパク質をコードする第二フェーズを含むプラス極性の一本鎖ＲＮＡの形状を有する。複製は細胞の細胞質内で行われる。感染サイクルの第一段階では、ゲノムＲＮＡの５’末端が、ゲノムＲＮＡの相補マイナス鎖を生成するＲＮＡ−ポリメラーゼ作用ポリタンパク質（ｎｓＰ１−４）に翻訳される。第二段階では２つのＲＮＡ、すなわち
‐  翻訳により他のｎｓｐタンパク質を生成しウイルスに対しゲノムとなる二次ウイルスゲノムに相当するプラスゲノムＲＮＡ
‐  感染粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡ
の生成のための鋳型としてマイナス鎖が使用される。
【０００４】
より詳細には、サブゲノムＲＮＡは、ｎｓｐ４タンパク質をコードするＲＮＡ配列の３’末端のレベルに存在するｐ２６Ｓプロモーターから転写される。プラスゲノムＲＮＡ／サブゲノムＲＮＡ比は、タンパク質がタンパク質分解によりｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４に自己切断することにより制御される。実際にはウイルス遺伝子の発現は２つの段階で行われる。第一段階ではプラスゲノム鎖とマイナス鎖の主合成がある。第二段階では、サブゲノムＲＮＡ合成がほぼ独占的になり、その結果、大量の構造タンパク質が生成される。
【０００５】
αウイルスの複製様式が判明したことならびにそのゲノムが単純であることにより、これらのウイルスを使用し、標的細胞内で導入遺伝子の発現を得ることができる遺伝子導入システムが出現した。
【０００６】
遺伝子治療においてαウイルス由来ベクターを使用できるようにする際に避けて通れない条件の１つは、このベクターが自己複製する能力をもたないということである。セムリキウイルスを複製に対し欠損がある状態にするために複数の方法が提案されている。
【０００７】
第一の方法は、導入遺伝子をｐ２６Ｓプロモーターに依存させた状態で、導入遺伝子のためにセムリキＲＮＡの構造遺伝子を除去することを内容とする。そのようなベクターはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。しかしながら、粒子がない状態で使用される遺伝因子を用いることにより、導入効率が低い限り、この方法は生体内への適用に関してはほとんど有利性はない。
【０００８】
別の方法は、単体のＤＮＡまたはＲＮＡの形態ではなく組み換えウイルス粒子の形態のセムリキベクターで標的細胞を感染させるものである。これを行うために、少なくとも２つのプラスミド、すなわち構造遺伝子を欠くセムリキベクターのＲＮＡを保有する第一プラスミドと、ｐ２６Ｓプロモーターに依存するセムリキ構造遺伝子を保有する第二プラスミドとで細胞株をトランスフェクトする。細胞の中心には、欠損ＲＮＡ、すなわちそれだけが、ｎｓＰ２の配列内に含まれているカプシド配列も含むため、導入遺伝子を保有するセムリキＲＮＡが形成される。理論上はこの方法によって複製粒子は発生しないが、特に相補配列と組み換えウイルスが重畳すること、および産生細胞の細胞質内にウイルスＲＮＡが豊富にあることにより、組み換えの発生は依然として頻繁である。
【０００９】
Ｒｏｌｌｓの文献（１、２）（非特許文献１，２）は、構造遺伝子を、ＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードし、場合によっては導入遺伝子に関連付けられた遺伝子に置換することによりゲノムが変更されたＳＦＶベクターについて記述している。したがって、このようにして得られた感染粒子はＶＳＶ−Ｇエンベロープで構成され、αウイルスを欠いたベクターを含む。しかしながら、記述されているシステムは、自立的に自己複製するその能力のため、きわめて危険である。また文献ＷＯ０３／０７２７７１（特許文献１）には同等のシステムが記述されている。
【００１０】
Ｌｅｂｅｄｅｖａらの文献（３）（非特許文献３）は、
‐  複製機能を確保するベクター（Ｓｒｅｐβｇａｌ：セムリキベクター（ＳＦＶ）レプリカーゼをコードする遺伝子、ならびに導入遺伝子としてのβ‐ガラクトシダーゼ）
‐  構造遺伝子をコードするベクター：カプシドをコードするＳｃａｐＳｅｎｖ、ならびに対照としてのＳＦＶのエンベロープ、あるいはＳＦＶのｅｎｖがＭＬＶ（Ｍｏｌｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）レトロウイルスのｅｎｖ配列に置換される由来ベクター
によるＢＨＫ細胞のコエレクトロポレーション、およびこのようにして生成されるウイルス粒子の分析について記述している。しかしながら、このシステムにおいては、導入遺伝子、ここではβ‐ガラクトシダーゼの導入遺伝子を運ぶＳＦＶベクターの移動は、ＳＦＶカブシドのタンパク質によるこの組み換えゲノムＲＮＡのカプシド化の従属下にある。
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ０３／０７２７７１
【非特許文献１】Rolls, M.M., Webster, P., Balba, N.H.& Rose, J.K. 「自己複製ＲＮＡからの水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質の発現により生成される新種の感染粒子」  Cell 79, 497-506 (1994).
【非特許文献２】Rolls, M.M., Haglund, K. & Rose, J.K. 「最小ＲＮＡウイルス由来ベクターにおける付加遺伝子の発現」  Virology 218, 406-411 (1996).
【非特許文献３】Lebedeva, L., Fujita, K., Nihrane, A. & Silver, J. 「マウス白血病ウイルスエンベロープをコードするセムリキ森林熱ウイルスベクター由来感染粒子」  Journal of Virology 71(9), 7061-7067. (1997).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
言い換えれば、本発明が解決しようとする課題は、αウイルス、特にセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）由来ベクターの移動方法を改善し、その結果、複製粒子を生成することができる産生株内におけるあらゆる組み換えのリスクを防止することである。
【００１３】
本発明が解決しようとする別の課題は、指向性が天然ウイルスの標的細胞に限定されないαウイルス由来ベクターを含むウイルス粒子を調製することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
出願人は、αウイルス非由来構造成分をコードする遺伝子、ならびに複製欠損にされたαウイルス由来ベクターを細胞株内でトランス発現させることにより、上の２つの目的を同時に満たすウイルス粒子を生成することに成功した。
【００１５】
一実施形態によれば、αウイルス非由来構造成分は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードする水泡性口内炎のウイルスの単体ＥＮＶ遺伝子に相当する。
【００１６】
ＶＳＶ−Ｇエンベロープを使用するといくつもの長所がある。まず、水泡性口内炎のウイルスのエンベロープタンパク質により、αウイルスに重畳可能なエンドサイトーシスによる細胞侵入法を行うことができる。またＶＳＶ−Ｇはきわめて安定で、超遠心分離法により濃縮することができ、非経口的投与を行うことが可能になる。またこのタンパク質により、このタンパク質を含む粒子に対しきわめて強い指向性が付与され、その結果、本発明のウイルス粒子の使用範囲がショウジョウバエからほ乳類まで様々な生物に拡大される。
【００１７】
この第一の実施形態によれば、トランス発現は、有利な点は異なる２つの段階でおこなわれる共トランスフェクション、すなわちＶＳＶ−Ｇエンベロープの遺伝子を発現するプラスミドによる株のトランスフェクション、ついで、αウイルス由来ベクターによる第二トランスフェクション、により得られる。実際には、共トランスフェクションは２９３Ｔ細胞上で行われる。
【００１８】
第二の実施形態によれば、αウイルス非由来構造成分をコードする遺伝子はレトロウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子に相当する。
【００１９】
この場合、トランス発現が、αウイルス由来ベクターによる、複製欠陥レトロウイルスを生産するカプシド化細胞株のトランスフェクションにより得られる。この種の株は、たとえばＰｈｅｎｉｘ（登録商標）システム（http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html）など、当業者にとっては既知のものである。特にＭＬＶ（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｒｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）の構造遺伝子を使用するカプシド化株を使用することができる。
【００２０】
既知のように、これらの株はＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子を発現する第一プラスミドと、レトロウイルスまたは別のエンベロープをもったウイルス（４）のＥＮＶ遺伝子を発現する第二プラスミドによる安定トランスフェクションにより得られる。
【００２１】
しかしながら、レトロウイルスのＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子を発現する第一ウイルス要素と、レトロウイルスのＥＮＶ遺伝子を発現する第二ウイルス要素およびαウイルス由来ベクターの導入による、たとえば２９３Ｔ細胞などの細胞株の三重トランスフェクションにより、ウイルス粒子を調製することも可能である。
【００２２】
特に、インテグラーゼ（ＩＮ）および逆転写酵素（ＲＴ）をコードするＰＯＬ遺伝子の核酸配列の欠失により、突然変異によるトランス相補レトロウイルス配列の欠損的特徴をさらに強調することが可能である。
【００２３】
上で記述したような本発明の２つの実施形態においては、αウイルス由来ベクターは複製欠陥にされている。実際にはこの特性は、構造遺伝子の欠失、あるいは構造遺伝子をベクターのゲノムにおいて意味がある導入遺伝子に置換されることにより得られる。
【００２４】
別の特徴によれば、αウイルス由来ベクターのゲノムはｐｓｉ配列と呼ばれるウイルス粒子によりカプシド化が可能な信号を含む。
【００２５】
第一の実施形態によれば、ｐｓｉ配列は、
‐  ５’プライマー：  ＬＮＣＸＰｓｉ２ａ：５’−ＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣ−３’  および
‐  ３’プライマー：  ＬＮＣＸＰｓｉ２ｂ：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧ−３’
というプライマーを基にしたＰＬＮＣＸベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法による増幅により得られるＭＬＶベクターの拡大カプシド配列に相当する。
【００２６】
有利な点は、ｐｓｉ配列はサイズが縮小され最小配列に相当する。この変更は、ｐｓｉ配列が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）機能をもつことができる場合には有利である。このようにＩＲＥＳ機能によりＳＦＶのｐ２６Ｓプロモーターをなくすことができ、その結果、ゲノムＲＮＡから導入遺伝子の翻訳が得られる。
【００２７】
逆説的だが、出願人は、レトロウイルスのカプシド化信号は必ずしも必要であるとは限らなかったことも証明した。実際、トランスフェクト細胞の細胞質内に見られるセムリキベクターの組み換えＲＮＡの量は、トランスフェクト細胞がレトロウイルス粒子内に優先的にカプシド化されるような量である。この現象は、セムリキウイルスの非構造的タンパク質の発現により誘導される細胞遺伝子消失により際立つ。ＳＦＶウイルス複製複合体の細胞内局在性も重要な役割を果たすことがある（５）。その場合、好ましい実施形態においては、ベクターのゲノムはｐｓｉ配列を欠く。
【００２８】
出願人はまた、セムリキ森林熱ウイルス由来ベクターに基く相補作用システムを用いて生成したレトロウイルス粒子により、上で記述したようなカプシド化レトロウイルス配列を含むベクターを移動させることが可能であることも証明した（１１）。このシステムにおいては、１ミリリットルあたり１０６個程度の粒子の力価が得られることが示されている。また、レトロウイルスカプシド化信号が存在することにより、粒子の力価が１対数分程度改善されることも示されている。これらの粒子は、レセプターを発現する細胞を、使用するレトロウイルスのエンベロープに相当する両種性ウイルス（Ｐｉｔ２）に形質導入するのに有効に使用される。このような所見は、ＬｉおよびＧａｒｏｆｆ法（１１）により生成されるレトロウイルス粒子の生体安全性に直接の影響を及ぼす。この一環として、ＬｉおよびＧａｒｏｆｆ法により生成された粒子は、１０６部／ｍｌに近い力価において、レトロウイルスのＧＡＰ／ＰＯＬまたはＥＮＶ配列を発現する組み換えＳＦＶゲノムを含むことが示されている。
【００２９】
出願人はまた、たとえばエレクトロポレーション等、セムリキベクターの組み換えＲＮＡ用に通常使用されるトランスフェクション方法は、大きな細胞障害をきたしたことも確認した。エレクトロポレーションよりも穏やかな方法による産生細胞のトランスフェクションが行えるよう、αウイルス由来ベクターが変えられ、たとえばベクターの配列の５’に配置されたＣＭＶプロモーター等、真核生物プロモーターから発現できるようになった。
【００３０】
最後に、有利な点は、αウイルスのベクターのｐ２６Ｓプロモーターは消失される。ＳＦＶ ２６Ｓｍ２ベクター、ならびにより少なくはＳＦＶ ２６Ｓｍ１ベクターは、競争によるゲノムＲＮＡのカプシド化を低減することができる検出可能なサブゲノムＲＮＡをもはや発現しなくなる。
【００３１】
したがって本発明による粒子は、αウイルス非由来構造成分で構成され、構造遺伝子の少なくとも１つの遺伝子導入による欠失または置換により、複製欠損にされたαウイルス由来ベクターを含むウイルス粒子に相当し、前記粒子の構造成分はαウイルス由来ベクターのゲノムによってコードされることはない。
【００３２】
また本発明は生体外で細胞を感染させるためのウイルス粒子の使用にも関する。出願人は、このようにして製造した粒子は、きわめて多種類のヒトおよびヒト以外の真核生物に感染することができたことを示した。
【００３３】
本発明は、本発明のウイルス粒子を含む医薬品組成にも関する。
【００３４】
同様に、本発明は癌治療用医薬品の製造のためのウイルス粒子の使用にも関する。
【００３５】
本発明および本発明によりもたらされる長所は、以下の例から明らかになろう。
【実施例１】
【００３６】
例１：ＶＳＶ−Ｇエンベロープを発現する細胞株からのウイルス粒子の産生
【００３７】
Ｉ：方法
【００３８】
１：細胞株および細胞培養
‐  ２９３Ｔ／１７：ヒトの胚期の腎臓由来の一次株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、
‐  Ｈｅｌａ：ヒトの細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、
‐  ＱＭ７：ウズラの筋肉由来の株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６２）、
‐  ＬＭＨ：ニワトリの肝臓由来の株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１１７）、
上の４つの細胞株は１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で培養される。（Ｂｉｏｗｅｓｔ）
‐  ＨｅｐＧ２：１０％のＦＣＳを含むＥＭ内で培養されるヒト肝癌細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）、
‐  ＢＨＫ２１：５％のＦＣＳおよび８％のトリプトースリン酸水溶液を含むＧＭＥＭ内で培養されるハムスターの腎臓由来の株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、
‐  ＣＥＳＣ：リファレンス２６により得られ培養されるニワトリの胚、
‐  １０％のＦＣＳを含むグレース昆虫細胞用培地（カタログ番号  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂ８５５０２）内で２７℃で培養されるＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、
‐  Ｓｐ２／Ｏ：１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０内で培養されるマウスリンパ芽球様細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）
【００３９】
２／ＳＦＶベクターの作製
ＳＦＶベクターの構造を図１に示す。
【００４０】
ａ／２６Ｓｍ１ベクター
ＳＦＶの２６Ｓ内部プロモーターはｐＳＦＶ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲにより変異され、このベクターは構造遺伝子を欠き、２つのプライマー、すなわち
‐  ５’‐ＡＴＣＣＴＣＧＡ“ＡＧＡＴＣＴ”ＡＧＧＧ‐３’の配列において「“ ”」で表すＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を含む２６Ｓｍ１Ｆプライマー
‐  ５’‐ＣＡＡＴ“ＡＴＣＧＡＴ”ＴＡＣＴＡＧＣＧＡＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧＧＡ‐３’の配列において「“ ”」で表すＣｌａＩ制限酵素認識部位を含む２６Ｓｍ１Ｒプライマー
が存在すると鋳型として使用される。
【００４１】
次に、図２に示すようなｐ２６ｍ１プロモーターに導くためにｐ２６Ｓプロモーター内にサイレント変異を導入する。次に、このようにして増幅された物質はｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミド内でクローン化される（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ）（図１）。すると、ＭＬＶウイルス由来ＲＳというレトロウイルス配列が突然変異プロモーター２６ＳとＩＲＥＳ配列の間に挿入される。次に、突然変異２６Ｓ配列、ＭＬＶのレトロウイルス配列、およびＥＧＦＰ遺伝子を含む断片がＢｇｌＩＩおよびＨＰａＩにより切除され、ＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩ制限酵素認識部位間のｐＳＦＶ１ベクター内にクローン化される。最後に、変質ＳＦＶレプリコンを含む１０．５ｋｐｂの断片が、ＩＥ ＣＭＶプロモーターと、ＩＲＥＳ  ＧＦＰ配列が欠失したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター内のＳＶ４０ｐＡポリアデニル化信号の間でクローン化される。
【００４２】
ｂ／ＳＦＶ２６ｍ２ベクター
内部プロモーターは、２つのプライマー、すなわち第一の２６Ｓｍ１Ｆプライマーと、５’‐ＡＴ“ＡＴＣＧＡＴ”ＴＡＣＴＡＧＣＧＡＡＣＴＡＡＴＣＴＡＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴ‐３’の配列において「“ ”」で表す制限酵素認識部位を含む２６Ｓｍ２Ｒプライマーが存在すると鋳型として使用されるＳＦＶ１プラスミドからＰＣＲにより突然変異される。
２６Ｓｍ２Ｒプライマーにより、図２に示すようなｐ２６Ｓプロモーターの変性が生じる。次に、増幅された物質はＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩにより消化され、対応する断片をなくすために同じくＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩにより消化される２６Ｓｍ１ベクター内でホスホジエステル結合される。
【００４３】
３／ＳＦＶ２６Ｓｍ１または２６Ｓｍ２ベクターによる２９３Ｔ細胞株のトランスフェクションならびにウイルス粒子の回収
カルシウム／リン酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクションキットを使用する２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションが行われる。２９３Ｔ細胞は、１ウェルあたり８・１０５の割合で６ウェルプレートに移され、３７℃で一晩培養された後、トランスフェクトされる。トランスフェクションは２つの段階で行われる。初日は、ＩＥ ＣＭＶプロモーターの影響下で、ＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードする遺伝子を含む５μｇのｐＭＤＧプラスミドによりトランスフェクトされる（６）。二日目の第二段階では、細胞が５μｇのＳＦＶ ２６Ｓｍ１または２６Ｓｍ２ベクターによりトランスフェクトされる。第二のトランスフェクト培地は１３時間から１７時間、細胞に接触した状態で放置する。三日目に培地を回収し、感染粒子の放出が可能な新鮮培地に換える。ウイルス粒子を含む培地は５、６時間後に回収する。
【００４４】
４／ＳＦＶ２６Ｓｍ１または２６Ｓｍ２ベクターおよびＳＦＶ ＧＡＧＰＯＬおよびＳＦＶ ＥＮＶベクターによるＢＨＫ２１細胞株のトランスフェクションならびにウイルス粒子の回収
ＢＨＫ２１細胞を電圧３５０Ｖ、キャパシタンス７５０μｍにて５・１０６／ｍｌ（すなわち４・１０６個の細胞）エレクトロポレーションする。エレクトロポレーション用に使用されるＲＮＡは種々のベクター（２６Ｓｍ１またはｍ２、ＳＦＶ ＧＡＧＰＯＬおよびＳＦＶ ＥＮＶ）に対応し、ＳＰ６ポリメラーゼＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎキットを用いて線状化された１．５μｇのＤＮＡを使用することにより転写される。エレクトロポレーションに際しては、２２μｌの転写産物がエレクトロポレーションされる。組み換え粒子の回収は１４時間から１６時間後に行われる。上清はろ過され、２μｇ／ｍｌのポリブレン下で標的細胞に付着される。
【００４５】
５／ウイルス粒子による細胞株の感染
トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞株の上清が回収され、次に０．４５μｍフィルター（ＨＡ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過され、次に、ｍｌあたり５μｇの割合で使用されるポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮培地にて種々の細胞株とともに培養される。感染細胞内のＧＦＰの発現の検査はオリンパスＩＸ５０蛍光顕微鏡を使用して行われる。トランスフェクションの定量化はＢｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのフローサイトメトリーＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）を使用して行われる。試験検査用としては種々の試薬中で上清が使用される。
‐  ＲＮＡｓｅＡ １ｍｌあたり１０μｇ（Ｓｉｇｍａ）
‐  アクチノマイシンＤ １ミリリットルあたり１μｇ（Ｓｉｇｍａ）
‐  ＤＮＡｓｅＩ １ミリリットルあたり１００単位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
‐  ジェネティシン １ミリリットルあたり１ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）
‐  プロマイシン １ミリリットルあたり３μｇ（Ｃａｙｌａ）
【００４６】
６／ウイルス粒子の濃縮
トランスフェクションされた２９３細胞の上清はＳＷ４１ローター内で４℃にて１時間、１５００００ｇで遠心分離される。濃縮されたウイルスは３００μｌのＰＢＳおよび２５μｌの溶液内で懸濁状態に戻され、この溶液は５・１０５個の細胞を感染するのに使用される（２９３Ｔ、ＢＨＫ−２１、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ｓｐ２／Ｏ、ＬＭＨ、ＱＭ７）。
【００４７】
７／ノーザン・ブロット
トータルＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を使用してトランスフェクションまたは感染された１０６個の細胞のＲＮＡを抽出する。非トランスフェクション２９３Ｔ細胞のＲＮＡは対照として抽出される。２μｇの各ＲＮＡはホルムアルデヒド 変性ゲル上で電気泳動をうけ、ＲＮＡはプラスに帯電したナイロン膜に転送される（Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ノーザン・ブロットのハイブリダイゼーションは標準手順に従い行う。センサーはｐＥＧＦＰＣ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の７９０  ｂｐ  Ａｇｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ  ＧＥＰ断片に対応し、断片はマーキングされ（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（登録商標）ＩＩＤＮＡｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）、使用前に、カラム上で純化される（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ（登録商標）Ｇ５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。
【００４８】
ＩＩ／結果
【００４９】
１／ベクターの機能
ＳＦＶ ２６Ｓｍ１および２６Ｓｍ２ベクターはＳＦＶベクターに相当し、その２６Ｓプロモーターは、ＳＦＶのゲノムＲＮＡのパッケージングと、２６Ｓプロモーターの影響下で転写により発生するサブゲノムＲＮＡの間の競争関係を防止するために突然変異されている。２つのベクターの機能は２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによりチェックされている。ＧＦＰの強力な発現が観察されたことは、変性ＳＦＶベクターの転写および翻訳が正しいことを示唆している。次にこの第一の結果は、ＳＦＶ２６Ｓｍ１ベクターによりトランスフェクションされた２９３細胞から抽出されたＲＮＡを基にしたノーザン・ブロット上の分析により確認された。
【００５０】
図３の二行目が示すように、ＧＦＰセンサーにより、ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡに対応する２つのバンドが存在することがわかり、後者は２６Ｓプロモーターがまだ機能していることを示唆している。
【００５１】
追加の突然変異を含む第二のＳＦＶ ２６Ｓｍ２ベクター上で同じ試験が実施される。ＧＦＰの検出およびノーザン・ブロットによる分析により、２６Ｓｍ２内にもたらされた突然変異により、転写によるサブゲノムＲＮＡの産生が禁止されることが確認された（図３の三行目を参照のこと）。
【００５２】
２／ウイルス粒子の産生
２９３Ｔ細胞はｐＭＤＧプラスミド、次に上に示したようにＳＦＶ ２６Ｓｍ１またはＳＦＶ ２６Ｓｍ２ベクターにより、共トランスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞の上清は２９３Ｔ新鮮細胞またはＢＨＫ２１細胞上に移動される。得られたＧＦＰが強くかつ急速に発現したことは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを発現する細胞を用いてＳＦＶベクターを移動することが可能であることを示している（図４）。
【００５３】
３／得られたウイルスのＢＨＫ２１、２９３ＴおよびＱＭ７細胞株への感染力
結果を下表に示す。
感染から２４時間後、ＦＡＣＳ分析によりウイルス力価が検出される。感染日における細胞数に対する、ＧＦＰを発現する細胞の百分率割合により、組み換え粒子の力価（ＩＰ／ｍｌ）を計算することが可能である。
【００５４】
【表１】
2007512827.tif 000003
【００５５】
この表が示すように、２９３ＴおよびＱＭ７細胞と比べ、ＢＨＫ２１細胞で最も高い力価が得られる。
【００５６】
４／標的細胞を含むＧＦＰの発現はＳＦＶウイルス粒子による真の形質導入によるものである。
ＧＦＰの発現が、自由ＧＦＰの初期トランスフェクションまたは擬似形質導入により生じたプラスミドの移動によるものではなく、ＳＦＶベクターの発現によるものであることを確認するために以下の検査を実施する。
【００５７】
まず、感染細胞から抽出したＲＮＡからノーザン・ブロットによりＳＦＶのＲＮＡが検出される（図５）。産生細胞の場合と同様、ＳＦＶ ２６Ｓｍ１ベクターにより感染された細胞内には、ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡの双方が見られる。反対に、ＳＦＶ ２６Ｓｍ２ベクターにより感染された細胞内にはゲノムＲＮＡしか見られない。信号の強度はＳＦＶベクターが強力に複製されることを示唆している。しかしながら、標的細胞内のＧＦＰの強い発現がＳＦＶのＲＮＡの移動に対応していること、したがって標的細胞、ここでは２９３Ｔ細胞にプラスミドが確かに移動したことを確認するために、高濃度ＤＮａｓｅＩ（１０００ＵＩ／ｍｌ）を形質導入上清に加える。ＳＦＶウイルス粒子の力価はＤＮａｓｅＩがない場合に得られる力価と同様であるが、そのことは第二トランスフェクションというよりも形質導入であることを示唆している。しかしながらこのような結果は、プラスミドがその導入後、トランスフェクションされ次に形質導入細胞内に送られた細胞内でカプセル化されるという仮定において得られる。場合によっては発生するこのような現象を検査するために、標的細胞を１ミリリットルあたり１マイクログラムの割合のアクチノマイシンＤで前処理し、次に感染性上清で培養する。アクチノマイシンＤは、ｐＳＦＶ２６Ｓｍ１またはｍ２プラスミド内のＳＦＶベクターのゲノムと同様に、ＲＮＡ ＰＯＬ ＩＩによって阻止される遺伝子の発現を抑制するが、ＳＦＶのレプリカーゼに対しては何ら作用しない。アクチノマイシンＤが存在する場合でもしない場合でもＧＦＰの同様の発現が見られることから、転写されるのはＲＮＡであることが確認される（表２を参照のこと）。
【００５８】
次に、ＧＦＰの発現がＳＦＶベクターの発現または標的細胞内の擬似形質導入によるものであるかどうかを確認する。実際、ＧＦＰは、あらゆる発現とは無関係に、レトロウイルス粒子を介して受動的に転写されうること示した文献もいくつかある（７）。反対の命題を確認するために、ジェネティシンおよびプロマイシンという２つの翻訳阻止剤で標的細胞を前処理する。処理後、標的細胞が示すＧＦＰの発現はほとんど検出不可能であり、そのことは、観察されるＧＦＰは受動的な転写ではなく形質導入によるものであることを示している（表２）。さらに、ＧＦＰを強く発現するｐＥＧＦＰＣ１プラスミドとＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの共トランスフェクションではＧＦＰの擬似形質導入は生じない。同様に、ＳＦＶベクター単体でトランスフェクションされた細胞由来上清ではＧＦＰの発現は誘導されず、そのことは、擬似粒子の形成を促進するにはＶＳＶ−Ｇが存在しなければならないことを証明している。ＶＳＶ−Ｇ小胞内でＳＦＶのＲＮＡが保護されていることを確認するために、形質導入の前にＲＮａｓｅＡで上清を処理する。ＲＮａｓｅＡによる処理は感染力価には作用しないことから、ＳＦＶのＲＮＡが確かに保護されていることが確認される（表２）。これらの結果を全てを考慮すると、標的細胞内のＧＦＰの発現はＳＦＶウイルス粒子による真の形質導入によるものであると結論される。
【００５９】
【表２】
2007512827.tif 000004
【実施例２】
【００６０】
Ｉ／方法
【００６１】
１／構造：
例１において記述した構造を使用した。
ＣＭＶプロモーターをＳＰ６原核生物プロモーターに置換した別の２つの派生構造も使用した。
‐  第一の構造ｓｐＳＦＶ２６Ｓｍ１はＳＦＶ２６Ｓｍ１から直接派生したものである。
‐  第二の構造ｓｐＳＦＶ２６Ｓｍ１ΨはｐＳＦＶ１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＢｇｌ ＩＩ−Ｓｍａ Ｉ消化により得られるもので、プラスミドの内部では、ｐＩＲＥＳ２ ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））のＢｇｌ ＩＩ−Ｈｐａ断片がクローン化され、ｎｓｐ４遺伝子の末端３’を含み２６Ｓｍ１Ｆおよび２６Ｓｍ１Ｒプライマーを使用して生成されたＰＣＲ断片の導入により変性される（例１の２ａ項を参照のこと）。
【００６２】
これらの構造は生体外で転写され、次にＲＮＡがエレクトロポレーションにより産生細胞内に導入される。生体外転写はＢｓｔＢ Ｉ切断によるプラスミドの線状化後に行われる。転写は、キャップ類似体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、ＳＰ６ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、リボヌクレオチド（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））がある状態で行われる。
【００６３】
２／細胞：
２９３、Ｐｈｏｅｎｉｘ（http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html）由来組み換えレトロウイルスの産生細胞を、相補体除去ウシ胎仔血清（Ａｂｃｙｓ）が存在するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）内で培養する。
【００６４】
産生細胞はＳＦＶ２６Ｓｍ１または２６Ｓｍ２プラスミドを用いて５・１０５個の細胞に対し４μｇのＤＮＡの割合で、６ウェルプレートのウェル内にトランスフェクションされる。トランスフェクションはリン酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ（登録商標））を使用して行われる。
【００６５】
ＲＮＡの形態でＳＦＶベクターを発現する２つの構造の場合、トランスフェクションはエレクトロポレーションにより行われる。すなわち生体外で生成されたレプリコン４０μｌを４０・１０５個の細胞に接触させ、ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓシステム（Ｅｑｕｉｂｉｏ（登録商標））を使用してエレクトロポレーションする。
【００６６】
用いるトランスフェクション方法がどうであっても、トランスフェクションから２０時間後に培地を交換する。この交換から１６時間後、培地を回収し、感染を実施する。回収の際、培地を０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））でろ過する。
【００６７】
３／感染：
１２ウェルプレートで培養される２９３Ｔ細胞の感染には、ろ過された上清を用いる。感染は、ウイルス／細胞の相互作用に必要なポリカチオン、すなわち５μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））が存在する状態で行われる。感染当日は、計数のために２９３Ｔ標的細胞のウェルがトリプシン処理される。
感染から２４時間後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（登録商標））を行うために細胞がトリプシン処理される。感染日における細胞数に対する、ＧＦＰを発現する細胞の百分率割合により、組み換え粒子の力価（ＩＰ／ｍｌ）を計算することが可能である（表３）。
【００６８】
４／検査：
例１において実施した検査と同一の検査を実施した：
‐  ＲＮＡｓｅＡ １ｍｌあたり１０μｇ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））
‐  アクチノマイシンＤ １ミリリットルあたり１μｇ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））
‐  ＤＮＡｓｅＩ １ミリリットルあたり１００単位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））
‐  ジェネティシン １ミリリットルあたり１ｍｇ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））
【００６９】
ＩＩ／結果：
【００７０】
１／感染：
感染の結果を表３にまとめた。
ＩＰ／ｍｌ：ｍｌあたりの感染粒子数；  ＮＲ：実施せず
【００７１】
【表３】
2007512827.tif 000005
【００７２】
ＧＦＰを発現する細胞が存在することから、レトロウイルス粒子の翻訳によるＳＦＶ組み換えＲＮＡを移動することが可能であることが確認される。しかしながら、観察される力価が低いことは、より高い力価を得るにはＳＦＶベクターの細胞毒性を検査することが必要であることを示している。実際、ＳＦＶのＲＮＡの産生とレトロウイルスタンパク質の産生の間には拮抗作用が存在する。ＳＦＶのプロテインの産生が増加するとレトロウイルスタンパク質の産生は減少する。現在までにＳＦＶの複数の突然変異体が記述されており、有効に使用することができるだろう（８）。
【００７３】
レトロウイルスのカプシド化配列の有無はカプシド化の効果に大きな影響を及ぼしているようには思えない。ここでは、Ｍｕｒｉａｕｘら（９）の所見のように、カプシド化を促進するにあたってはＲＮＡの細胞間濃度が高いことが決定的な役割を果たしているように思われる。ｐｓｉレトロウイルス配列の影響は低毒性ベクターという状況下で再度評価しなければならない。
【００７４】
また、これらの結果は、ＳＦＶベクターに基づいた「ヘルパー」システムを使用する時、おそらく組み換えレトロウイルスの産生の汚染が存在することを示唆しているように思われる（１０、１１）。これらの汚染物質は、レトロウイルスのトランス相補性配列の発現に用いられるＳＦＶベクター、あるいは組み換えレトロウイルスの配列を含むＳＦＶベクターのいずれかを含むレトロウイルス粒子で形成される。この所見は、本発明のウイルス粒子とは反対に、臨床目的でのレトロウイルスベクター産生についてのこれらの態様の使用に疑問を投げかけるものである。
【００７５】
参考文献
1. Rolls, M.M., Webster, P., Balba, N.H.& Rose, J.K. 「自己複製ＲＮＡからの水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質の発現により生成される新種の感染粒子」  Cell 79, 497-506 (1994).
2. Rolls, M.M., Haglund, K. & Rose, J.K. 「最小ＲＮＡウイルス由来ベクターにおける付加遺伝子の発現」  Virology 218, 406-411 (1996).
3. Lebedeva, L., Fujita, K., Nihrane, A. & Silver, J. 「マウス白血病ウイルスエンベロープをコードするセムリキ森林熱ウイルスベクター由来感染粒子」  Journal of Virology 71(9), 7061-7067. (1997).
4. Russell SJ, Cosset FL. 「レトロウイルスベクターの宿主域の変更」  J Gene Med 1, 300-11. (1999).
5. Salonen A, Vasiljeva. L, Merits A. Magden J, Jokitalo E, Kaariainen L., 「セムリキ森林熱ウイルス複製複合体をエンドソーム区画に向ける、適切に折り畳まれた非構造タンパク質」  J Virol. 77, 1691-702. (2003).
6. Naldini, L.ら  「生体内遺伝子導入およびレンチウイルスベクターによる非分割細胞の安定形質導入」  Science 272, 263-267 (1996).
7. Liu, M.L., Winther, B.L, & Kay, M.A. 「濃縮擬似水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）‐モロニーマウス白血病ウイルス由来レトロウイルスベクターを使用することによる肝細胞の擬似形質導入：肝臓遺伝子導入用ＶＳＶ−Ｇおよび両種性ベクターの比較」  J Virol. 70, 2497-2502. (1996).
8. Lundstrom K, Abenavoli A, Malgaroli A, Ehrengruber MU. 「導入遺伝子発現の長期間の強化により細胞毒性および温度感受性が低下した新種のセムリキ森林熱ウイルスベクター」  Mol Ther.2, 7202-9. (2003).
9. Muriaux, D., J. Mirroら  「ＲＮＡはレトロウイルス粒子の構造成分である。」  Proc Natl Acad Sci USA 98, 5246-51. (2001).
10. Whalfors JJ, Xanthopoulos KG, Morgan RA. 「レトロウイルスパッケージング細胞内のレトロウイルスベクターＲＮＡのセムリキ森林熱ウイルス介在産生」  Hum Gene Ther 8, 2031-41. (1997).
11. Li KJ. Garoff H. 「αウイルスベクターによるレトロウイルスベクターへのイントロン含有遺伝子のパッケージング」  Proc Natl Acad Sci USA95, 3650-4. (1998).
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１はセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）由来ベクターの構造の略図である。
【図２】図２はｐ２６Ｓプロモーター内で行われる突然変異を示す図である。天然配列（Ｗｔ）に対するｐ２６Ｓｍ１およびｐ２５Ｓｍ２突然変異体内に導入された突然変異を囲んである。
【図３】図３は、ｐＥＧＦＰＣ１のＧＦＰセンサーによる、変性ＳＦＶベクター（１：ｐＥＧＦＰＸＣ１；、２：ｐ２６Ｓｍ１；、３：ｐ２６Ｓｍ２；、４：導入遺伝子なしのＳＦＶ）を発現する、産生細胞を基にして行われたノーザン・ブロットの結果である。
【図４】図４は、ＳＦＶ（ｐ２６Ｓｍ１およびｐ２６Ｓｍ２）由来であってＶＳＶ−Ｇ擬似粒子によって移動されるベクターを発現するための細胞２９３ＴおよびＢＨＫ２１の能力を示す図である。
【図５】図５は、ｐＥＧＦＰＣ１のＧＦＰセンサーによる、ｐＭＤＧプラスミドによりトランスフェクトされた細胞の上清に感染された細胞、ならびに変性ＳＦＶベクター（１：ｐＥＧＦＰＸＣ１；、２：ｐ２６Ｓｍ１；、３：ｐ２６Ｓｍ２）を基にして行われたノーザン・ブロットの結果である。
【図１】
2007512827.tif 000006
【図２】
2007512827.tif 000007
【図３】
2007512827.tif 000008
【図４】
2007512827.tif 000009
【図５】
2007512827.tif 000010
【配列表】
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【国際調査報告】
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2007512827.tif 000014
2007512827.tif 000015
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