(57)【要約】本発明は、植物の根圏に適用するための、向上した保存安定性、アザジラクチンの徐放性を有するアザジラクチン含有ニーム種子抽出物の改善された顆粒製剤であって、担体である不活性微粒子、不活性化剤／結合剤である少なくとも１種の親油性物質、着色剤および、アザジラクチンを含むニーム種子抽出物を含み、アザジラクチンの徐放性を適用箇所で効果的に提供する製剤に関する。また本発明は、該製剤の製造方法に関する。この方法は、担体を親油性物質でコーティングし、次いでコーティング済み担体にニーム種子抽出物を含浸した後、着色剤および最終的に親油性物質を噴霧し、５０℃未満の温度で乾燥してコーティングすることに基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
向上した保存安定性およびアザジラクチンの徐放性を有するアザジラクチン含有ニーム種子抽出物の顆粒製剤であって、その組成が以下の成分を含む製剤：
成分                    Ｗｔ．／Ｗｔ（％）
ｉ．ニーム種子抽出物        ０．０３〜５０．００
ｉｉ．担体                  ４８．５０〜９９．３０
ｉｉｉ．着色剤              ０．０１〜０．０４
ｉｖ．親油性物質            ０．５０〜１．５０
【請求項２】
以下の成分を含む請求項１の好ましい顆粒製剤：
成分                    Ｗｔ．／Ｗｔ（％）
ｉ．ニーム種子抽出物        ０．０７５〜１２．５
ｉｉ．担体                  ８６．７〜９９．２０
ｉｉｉ．着色剤              ０．０２〜０．０３
ｉｖ．親油性物質            ０．６０〜０．７５
【請求項３】
ニーム種子抽出物中のアザジラクチン含量が０．０３〜５．０ｗｔ／ｗｔ％の範囲である、請求項１の顆粒製剤。
【請求項４】
ニーム種子抽出物中のアザジラクチン含量が好ましくは１．０ｗｔ／ｗｔ％までである、請求項３の顆粒製剤。
【請求項５】
使用される担体が、珪質物質、好ましくは砂から選択される、請求項１の顆粒製剤。
【請求項６】
使用される担体が好ましくは川砂である、請求項１の顆粒製剤。
【請求項７】
使用される砂の粒子サイズが１２〜３２メッシュ、好ましくは１６〜３２メッシュの範囲である、請求項６の顆粒製剤。
【請求項８】
砂の含水量が２．０％未満である、請求項７の顆粒製剤。
【請求項９】
使用される親油性物質が、植物および動物起源からなる群から選択される低融点の炭化水素ろう、好ましくは蜜ろうおよびパラフィンワックスである、請求項１の顆粒製剤。
【請求項１０】
着色剤が、クリスタルバイオレット、メチルバイオレット、天然ビキシン、ターメリックおよびその混合物からなる群から選択される合成および／または天然起源のものである、請求項１の顆粒製剤。
【請求項１１】
請求項１の顆粒製剤の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）場合により担体を水で洗浄し、約６０℃で乾燥し、ふるい分けして乾燥担体を得る段階、
ｂ）有機溶媒に溶解された親油性物質で段階（ａ）の乾燥済み担体をコーティングする段階、
ｃ）溶媒に溶解されたニーム種子抽出物を段階（ｂ）のコーティング済み担体に含浸させ、約４０℃〜５０℃の温度の熱気流中で乾燥する段階、
ｄ）溶媒に溶解された着色剤を噴霧することによって段階（ｃ）の含浸済み材料をコーティングし、約４０℃〜５０℃で乾燥する段階、および
ｅ）最終的に段階（ｄ）の材料を親油性物質でコーティングし、約４０℃〜５０℃で乾燥して、所要の顆粒製剤を得る段階。
【請求項１２】
段階（ａ）および（ｂ）で使用される担体が砂の珪質物質である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
使用対象の好ましい担体が川砂である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
使用される川砂の粒子サイズが１２〜３２メッシュ、好ましくは１６〜３２メッシュの範囲である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
川砂の含水量が２．０％未満までである、請求項１３の方法。
【請求項１６】
段階（ｂ）および（ｅ）で使用される有機溶媒が、低沸点の炭化水素、エーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、例えばｎ−ヘキサン、石油エーテル、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エチル等からなる群から選択される、請求項１１の方法。
【請求項１７】
段階（ｂ）および（ｅ）で使用される親油性物質が、植物および動物起源からなる群から選択される低融点の炭化水素ろう、好ましくは蜜ろうおよびパラフィンワックスである、請求項１１の方法。
【請求項１８】
段階（ｃ）で使用されるニーム種子抽出物を、エーテル、ケトン、アルコール、アルデヒド、エステル、例えばジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、メタノール等からなる群から選択される溶媒に溶解する、請求項１１の方法。
【請求項１９】
段階（ｃ）で使用されるニーム種子抽出物が、０．０３％〜５．０％の範囲、好ましくは１．０％ｗｔ／ｗｔ％までのアザジラクチンを含む、請求項１１の方法。
【請求項２０】
段階（ｄ）で使用される着色剤が、クリスタルバイオレット、メチルバイオレット、ビキシン、ターメリックおよびその混合物からなる群から選択される合成および／または天然の着色剤である、請求項１１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、向上した保存安定性、植物の根圏に適用するためのアザジラクチン（azadirachtins）の徐放性を有する改良された顆粒製剤であって、ニーム種子抽出物、不活性担体微粒子、親油性物質、および着色剤を含む製剤に関する。また本発明は前記顆粒製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物を害虫から保護することは複雑な課題である。通常、種々の害虫は、その生活環を通してずっと、植物の種々の部分の成長に影響する。一般的な慣例では、植物防疫用化学物質または殺虫剤（pesticides）を適用して、種々の害虫から植物を保護する。その目的は、農業、園芸、草花栽培および造林において高い作物収量を得ることである。これらの化学物質は、庭園植物、芝生および家庭用植物を保護するためにも使用される。害虫および疾患に起因するほとんどの損傷は、植物の目に見える気生部分で発生し、ゆえに慣例では、植物防疫用化学物質を気生部分に噴霧して、害虫を駆除（control）する。慣用の植物防疫用物質は、ほとんどの場合、害虫に対して接触毒として作用し、死またはその抑制を生じさせ、植物の保護をもたらす。接触毒性に基づいて作用する植物防疫用物質の有効性は、製剤の種類、効果的な被覆を提供する噴霧メカニズムの効率および植物の気生部分に対する活性化合物の浸透性に依存する。一般に、空中噴霧では、噴霧時に吹き流されるせいで製品の２０〜３０％の浪費が生じることが報告され、したがって高価な活性成分が浪費され、加えて、本質的に、空気、水および土壌中に有毒な化合物が漏出し、環境の汚染が生じる。これらの問題は全身性植物防疫用分子を使用して回避することができる。この分子は、種々の送達系、例えば顆粒、ペレット等によって植物の根圏に送達された場合に、植物が吸収することができる分子である。
【０００３】
ほとんどの植物防疫用化学物質は、標的でない生物およびヒトに有毒である。加えて、これらは環境中に長期間残留する。これらの化学物質についての環境問題および毒性に関する懸念についての認識が高まったせいで、標的の害虫に対して活性であるが、ヒトおよび標的でない生物には安全であり、かつ生分解性で、環境に有害でない代替分子に関する需要が存在している。
【０００４】
ニームツリー（Azadirachta indica A. Juss）の種々の部分、例えば葉、樹皮、種子等の抽出物は昆虫および疾患抑制特性を有することがずっと以前から知られている。特に種子カーネルは、最も活性なリモノイド（limonoids）、例えばアザジラクチンＡおよびＢならびに構造上の関連化合物、例えばアザジラクチンＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、等を、ニンビン（nimbin）、サラニン（salannin）、アザジラジオン（azadiradione）等とともに有する。すべての天然アザジラクチンはEpilachna varivestisに対して非常に高い成長障害活性を有し、そのＬＣ５０は０．３〜２．８ｐｐｍの範囲であることが報告されている（H. Rembold and I. Puhlmann, 1995）。ニーム種子／ニームツリーの実から１００種を超えるテルペノイド化合物が報告される。アザジラクチンＡは４００種を超える昆虫に対して試験されており、摂食抑制物質、昆虫成長調節物質、殺卵剤等として活性であり、したがって昆虫集団を減少させることがわかっている。これは神経性の殺虫剤（neurotic insecticide）とは異なる。これらは天然物質であるため、分解性が高く、環境に残留物を残さない。さらにニーム成分は標的生物および哺乳類に安全であることが報告され、ゆえに作物および公衆衛生において使用される慣用の有毒な物質に代わる理想的な物質である。
【０００５】
ニームツリーの種々の部分から粗製または半粗製形式でこれらの活性成分を抽出して、液状および固形製剤、例えば粉末剤、水分散性顆粒剤等の剤形の商業的に許容されるビヒクル中で使用する種々の方法が報告されている。脂質成分の除去後に得られる粗製のニーム種子抽出物は、通常、約２０〜４５％のアザジラクチンＡおよびＢを含み、強力な昆虫成長調節物質および摂食抑制物質であり、市販の害虫駆除用製剤中の強力な活性成分であることが示されている。しかし、これらの活性分子はかなり大きくて複雑であり、酸および塩基感受性官能基を有し、通常の製剤成分と接触すると不安定である傾向がある。ゆえにこれらの抽出物の市販製剤を安定な形式で首尾良く開発するための重大な制限を招く。
【０００６】
従来、アザジラクチンは液状剤形で広く製剤化されて、エマルジョンまたは溶液剤として農作物に適用されてきた。種々の有機溶媒および他の無機添加物が担体として使用され、費用効果が高くて効果的な送達系が作成されている。このような担体を市販製剤中で使用することはかなり制限される。その理由は、多数の溶媒がアザジラクチンの分解を引き起こすことによって有害であることが報告されるからである。Dureja（1999）は、種々の溶媒中で、２９＋／−１℃で２５日間、アザジラクチンＡの分解を研究している。その結果、メタノールおよびアセトン中で５０％、塩化メチレン、四塩化炭素およびクロロホルム中で７５〜８０％、エタノールおよび水中で約８５％のアザジラクチンＡの分解が示された。
【０００７】
保存安定性アザジラクチン含有抽出物および製剤、およびその製造方法が提案されている。
【０００８】
米国特許第4,556,562号では、アザジラクチンの濃度を２０００〜４０００ｐｐｍの範囲に希釈し、そのｐＨを３．５〜６．０の範囲に調節することによってエタノールエマルジョン中のアザジラクチンの安定性が増加したことが報告される。
【０００９】
米国特許第4,946,681号では、２〜５％未満の水しか含有しない非プロトン溶媒の溶液中のアザジラクチンの高い安定性が報告される。
【００１０】
米国特許第5,001,146号では、極性非プロトン溶媒の濃度を少なくとも５０容量％に調節し、含水量を１５容量％未満に減少させることによってアザジラクチンの安定性が向上することが示される。
【００１１】
米国特許第5,001,146号では、アザジラクチンの安定性が、使用される溶媒の種類に依存すること、および安定性には、列挙される特定の非プロトン性およびアルコール溶媒中での保存が必要であることがさらに示される。
【００１２】
米国特許第5,736,145号では、アザジラクチンＡを含有する保存安定性水性組成物が報告され、米国特許第5,827,521号では、８０容量％を超える脂肪族ジヒドロキシル化アルコールを、場合により日焼け止め（sunscreens）および抗酸化剤とともに含有する安定なアザジラクチン製剤が示される。
【００１３】
米国特許第5,352,697号では、エポキシド、好ましくはエポキシ化植物油が存在することによって溶液中のアザジラクチンの安定性が向上することが記載される。すべてのこれらの方法では、ニーム種子カーネルから有機溶媒を用いて調製された液状剤形のアザジラクチンを含有する抽出物の安定性に関する向上が記載される。
【００１４】
欧州特許第9216109号では、ニーム種子の抽出物を、高い安定性を有する固形剤形で製造することが記載される。
【００１５】
米国特許第5,635,193号では、水分および揮発性極性溶媒をそれぞれ１％および５％未満に制限することによって、アザジラクチンを含有する固形物を安定化することが報告される。０．０５％〜２％界面活性物質および９９％の固形希釈物を用いて製剤化された場合の抽出物に関して高い安定性が示唆される（５４℃で２週間の保存後に７５％のアザジラクチン）。しかし、固形希釈物および界面活性物質の種類に関する詳細は提供されなかった。
【００１６】
米国特許第5,695,763号、欧州特許第579,624号およびインド特許第181,845号では、ニーム種子のカーネルからの安定なニーム種子抽出物の調製が報告された。
【００１７】
安定なアザジラクチンを含む種々の抽出物が報告されているが、製剤化状態でのアザジラクチンの有効（貯蔵）期間は依然として問題である。液状製剤中の種々の界面活性物質、有機溶媒、および種々の組み合わせの溶媒および界面活性物質中でアザジラクチンは不安定であり、これは長期間の貯蔵において安定な市販製品を開発するための重大な制限である。
【００１８】
通常の殺虫製剤は、ほとんどの場合に石油から作成される種々の溶媒を含有し、特に有機農業、獣医学的適用、等のための専用の殺虫製剤では、このような溶媒の使用が抑制されるという問題がある。低い割合でさえ、このような溶媒を使用する際には、大量の界面活性物質および他の添加物を必要とし、したがって製剤のコストが高くなる。また、液状製剤における広範な成分の使用およびそれに関連するこのような製剤の不安定性についての問題は、アザジラクチン含有作物保護物質の商業的成功に関する深刻な懸念である。
【００１９】
さらに、アザジラクチン、特にアザジラクチンＡ、は非常に光不安定性であり、植物表面に適用すると急速に分解する傾向があることが見出された。昆虫に対する植物の保護を提供する際のアザジラクチンの作用様式は、合成化学分子とかなり異なる。後者は、ほとんどの場合、その接触毒性に起因して作用する。アザジラクチンは忌避物質、摂食抑制物質および成長調節物質として作用し、ゆえに、その駆除のためには、昆虫系に曝露し、吸収させ、あるいは侵入させる必要がある。
【００２０】
木や果実に穴をあける種類の昆虫および硬い外皮（scale）を持つ身体を有する昆虫は、葉面散布によって駆除するのが困難である。これは接触の欠如のせいである。このような昆虫の駆除には、全身性特性を有する化合物が理想的である。アザジラクチンは全身性特性を有することが報告されていて、植物の根圏に適用すると、容易に植物に吸収される。ゆえに、アザジラクチンを植物の根圏に送達する送達系は、穴をあける昆虫ならびに外皮に包まれている昆虫から植物を効果的に保護することを保証する。アザジラクチンを含有する製剤の水性エマルジョンを土壌に適用してもよいが、このエマルジョンは水および土壌に完全に曝露されることによって急速に分解する傾向があり、長期間の保護には利用できない。ゆえに、既存の液状製剤および葉面散布用製剤のいずれを用いても、効果的かつ経済的なアザジラクチンの使用は不可能である。アザジラクチンを植物の根圏に輸送し、その含量の重大な損失が全くなく、その後、植物防疫のためにそれを緩徐に放出する効率的な送達系に関する必要性が存在する。この必要性は顆粒製剤によって達成することができる。この種類の製剤は、農業および園芸作物において全身性植物防疫用物質の送達に使用されている。
【００２１】
顆粒は、１９４０年代の後期に開発されて以降、最も広く使用され、最も多用途の利用可能な殺虫剤送達系である。これらの系では、顆粒は植物防疫用物質のための希釈剤ならびに担体として作用する。単位重量の顆粒あたりに多数の粒子が存在することにより、害虫には有害であるが、望ましい生活型への損傷および望ましくない吹き流れをもたらさない割合で単位領域あたりに顆粒を適用することが可能である。利用可能な顆粒担体は、大多数が天然の、無機および植物性の両者であり、また、天然（植物性）または合成成分からなる合成物もある。しかし、それらが効果的であるためには、（ａ）適切な液体保持／吸着能（ｂ）化学的不活性および（ｃ）自由流動性の特性を有する必要がある。
【００２２】
無機カテゴリーの担体には、粘土、アタパルガイト、ベントナイト、カオリン、海泡石、珪藻土（kieselguhr）、珪藻土（diatomaceous earth）、タルク、れんが破片砂（brick fragments sand）、ホワイトカーボンおよびバーミキュライトが含まれる。植物性カテゴリーには、トウモロコシ穂軸、クルミ殻、もみ殻、および木、デンプン天然植物線維および４〜８０メッシュ（米国標準）の範囲内の個別の粒子の軽石が含まれる。粘土は低コストであるが、製剤化前に不活性化剤で処理する必要があることが多い。その目的は活性成分の分解を防止することである。トウモロコシ穂軸は不活性顆粒担体の主な供給源であるが、その過度の使用および時折の乾燥条件によって供給が不十分になり、コストがかかる選択肢になる。
【００２３】
顆粒生成物の有効性は、活性成分の性質だけでなく、担体として使用される不活性成分の性質にも依存する。この担体は活性成分の輸送機構として作用するものである。担体が活性成分を効果的に放出しないと、活性化合物はその目的の標的に決して到達しない。重要なことに、このような担体は活性成分に対して不活性であるべきであろうし、また、活性成分の分解を引き起こすべきではない。
【００２４】
ゆえに、効果的な担体の選択は顆粒製剤の開発の成功において必須の段階である。実際の決定的な課題は、アザジラクチンに適切な担体を選択することである。これは、酸性／塩基性およびイオン性の性質の、これらの担体および、顆粒化に使用される他の添加物と非常に反応性のその性質が原因である。
【００２５】
発明者らは、アザジラクチン顆粒製剤に関する通常の担体、例えば砂、ベントナイト、粘土等の適合性を試験した。アザジラクチンは、慣用の様式で製剤化された場合、これらの担体と接触すると急速な分解を非常に被りやすいことが観察される。これにより、アザジラクチンを含有する製剤に関してこれらの担体を直接使用することは制限される。さらに、アザジラクチンは容易に水に溶解し、結合剤を用いずにこれらの担体を含浸する通常の方法では、アザジラクチンは水と接触するやいなや土壌中に即時放出される。これは望ましくない。通常の担体、例えば砂およびベントナイトとともに、既知の結合剤、例えばポリビニルアルコール、ロジン、圧縮泥ろう（pressmud wax）、糖、粘土を使用することは制限されている。その理由は、それらがアザジラクチンの急速な分解を引き起こしたからである。
【００２６】
したがって、アザジラクチンの高い安定性を提供し、アザジラクチンを所望のように植物の根圏に送達可能な固形担体を同定する必要性が存在する。
【００２７】
アザジラクチン分子は熱不安定性であるため、顆粒調製物の押出法では、複数の成分、例えば乳化剤、ポリマー、結合剤、乾燥剤等を必要とし、また、押し出し時のかなり高い温度によって工程中にその分解が生じる。
【００２８】
ゆえに、ほとんどの場合に合成化学分子に適切な、先行技術において報告される種々の顆粒化工程は、利用可能な担体および添加物を用いても、生体分子、例えばアザジラクチンには理想的ではない。
【００２９】
顆粒殺虫製剤の調製に関して報告される種々の先行技術の方法は、２種の異なる工程に基づくものであった。１．押出顆粒化工程、この工程は、活性成分を、種々の添加物、例えばろう、界面活性物質、ポリマー、無機塩等と混合する段階、融解させ／水中で混合する段階および押出型を通してその液状物を押し出して所望の直径の顆粒を形成させる段階を含む。次いで押出物を乾燥機に入れ、顆粒の含水量を減少させて、自由流動性の生成物を得る。２．噴霧製剤化工程、この場合、殺虫剤を適切な溶媒に溶解し、あるいは融解させた状態で不活性粒子上に噴霧する。
【００３０】
顆粒製剤の重要な特徴の１つは、殺虫活性化合物を制御様式で放出するその能力である。いくつかの先行技術の方法では、顆粒化剤形からの活性物質の制御放出が達成されることが既知であった。この制御放出はカプセル化工程によって達成されるものである。このカプセル化は粒子状物質をコーティングする段階を含む。このコーティングは長期間にわたって活性物質を放出するためのものである。このような工程は、コーティング材料であるポリマーでない有機材料、例えば脂肪およびろうの有機ポリマーの使用に基づいて開発されている。典型的な先行技術の工程は、例えば米国特許第2800457号、第2800458号、第3041466号、第3415758号、第3429827号、第3594327号、第3639256号および第3674704号に記載される。
【００３１】
殺生物性材料をエラストマーマトリックス中に導入し、害虫を破壊する効果的な割合で放出させることができることが周知である。米国特許第3417181号では、有機スズ毒物をエラストマー型マトリックスに溶解し、水への曝露時に拡散溶解機構によって放出させることができることが教示される。生物活性物質、例えば有機殺虫剤は、エラストマー、例えば天然ゴム、スチレン−ブタジエンゴム等に溶解性であることが必要とされた（米国特許第3590119号、第3426473号、第3851053号および第3639583号）。
【００３２】
先行技術の方法では、第三相材料を使用して不溶性有機物質をプラスチック分注用ユニットから射出させることが既知である。この第三相材料は（ａ）該プラスチック中である程度溶解し、（ｂ）溶液中の該有機物質を運搬するか、あるいは該物質が該ディスペンサーの表面に到達する移動経路として働く。これらの複合特性を顆粒にもたらすために、無機塩、塩基、酸および有機溶媒、ポリマー等を使用する、種々の化学物質および条件、例えば乳化、重合、架橋等が必要であろう（米国特許第2956073号、第3116201号、第3705938号、第3864468号）。
【００３３】
殺虫顆粒剤は、マクロおよびマイクロカプセル化の両工程によって製造し、セラミック材料中に入れ、生分解性ポリマーに包含し、多孔性無機支持体と混合し、セルロース誘導体（cellulosic derivatives）でコーティングし、ポリ尿素化合物と混合し、石膏および他の支持体で包含して、殺虫剤を環境から保護し、害虫集団を実質的に駆除する試みにおいて制御放出が保証されている。
【００３４】
上記先行技術の特許文献に加えて、下記特許文献は、アザジラクチンを含む顆粒製剤および／またはその製造方法に言及する。
【００３５】
米国特許第4,065,558号、第4341759号、第4,370,160号、第4,464,317号、第4,485,103号、第4,732,762号、第4,971,796号、第5,130,171号、第5,229,356号、第5,435,821号、第5,484,600号、第5,556,631号、第5,562,914号、第5,945,114号、第6,090,415号、欧州特許第0200288号、第0848906号、第0966882号、英国特許（GB Patent）第2127690号、インド特許（IN Patent）第189,080号、WO 0205641、02087342および9409627。
【００３６】
様々な種類の顆粒製剤を製造するための先行技術の諸方法
【表０−１】
2007530665.tif 000002
【表０−２】
2007530665.tif 000003
【表０−３】
2007530665.tif 000004
【表０−４】
2007530665.tif 000005
【表０−５】
2007530665.tif 000006
【００３７】
本出願においては、上記先行技術の文献が完全に考慮されている。また、上記表に提供される詳細から明らかであるように、制限事項はアザジラクチンを含む先行技術の組成物およびこれらの組成物の製造方法の両者に関連している。本発明は、先行技術の制限事項を克服することによって、アザジラクチンを含む組成物および該組成物の製造方法を提供している。
【００３８】
ゆえに、アザジラクチンを含有するニーム種子抽出物の効果的かつ安定な顆粒製剤およびアザジラクチンベースの顆粒を安定な形式で取得する方法に関する必要性が存在する。アザジラクチンを含有するニーム種子抽出物を含む改良された顆粒製剤を提供することによって、発明者らはこの目的を達成している。この顆粒製剤は、植物の根圏に適用された場合に、昆虫による損傷から植物を保護するためのものである。改良された顆粒製剤では、保存安定性が向上していて、有効成分であるアザジラクチンは顆粒から徐々に放出される。また、効率的な顆粒製剤化を達成するために使用される担体は、容易に入手可能な固形材料であり、これは親油性物質でコーティングされている場合にのみ、熱不安定性アザジラクチンに適合することがわかっている。
【００３９】
本発明の驚くべき結果では、ニーム種子抽出物を含有する製剤において、不活性化剤および結合剤の特性を付与する親油性物質を使用することによって、向上した保存安定性およびアザジラクチンの徐放性がともに提供される。これは先行技術の顆粒製剤では決して達成されていない。
【特許文献１】米国特許第4,065,558号
【特許文献２】米国特許第4,341,759号
【特許文献３】米国特許第4,370,160号
【非特許文献１】H. Rembold and I. Puhlmann, 1995
【特許文献４】米国特許第4,556,562号
【特許文献５】米国特許第4,946,681号
【特許文献６】米国特許第5,001,146号
【特許文献７】米国特許第5,736,145号
【特許文献８】米国特許第5,827,521号
【特許文献９】米国特許第5,352,697号
【特許文献１０】欧州特許第9216109号
【特許文献１１】米国特許第5,635,193号
【特許文献１２】米国特許第5,695,763号
【特許文献１３】欧州特許第579624号
【特許文献１４】インド特許第181,845号
【特許文献１５】米国特許第2,800,457号
【特許文献１６】米国特許第2,800,458号
【特許文献１７】米国特許第3,041,466号
【特許文献１８】米国特許第3,415,758号
【特許文献１９】米国特許第3,429,827号
【特許文献２０】米国特許第3,594,327号
【特許文献２１】米国特許第3,639,256号
【特許文献２２】米国特許第3,674,704号
【特許文献２３】米国特許第3,417,181号
【特許文献２４】米国特許第3,590,119号
【特許文献２５】米国特許第3,426,473号
【特許文献２６】米国特許第3,851,053号
【特許文献２７】米国特許第3,639,583号
【特許文献２８】米国特許第2,956,073号
【特許文献２９】米国特許第3,116,201号
【特許文献３０】米国特許第3,705,938号
【特許文献３１】米国特許第3,864,468号
【特許文献３２】米国特許第4,464,317号
【特許文献３３】米国特許第4,485,103号
【特許文献３４】米国特許第4,732,762号
【特許文献３５】米国特許第4,971,796号
【特許文献３６】米国特許第5,130,171号
【特許文献３７】米国特許第5,229,356号
【特許文献３８】米国特許第5,435,821号
【特許文献３９】米国特許第5,484,600号
【特許文献４０】米国特許第5,556,631号
【特許文献４１】米国特許第5,562,914号
【特許文献４２】米国特許第5,945,114号
【特許文献４３】米国特許第6,090,415号
【特許文献４４】欧州特許第0200288号
【特許文献４５】欧州特許第0848906号
【特許文献４６】欧州特許第0966882号
【特許文献４７】英国特許（GB Patent）第2,127,690号
【特許文献４８】インド特許（IN Patent）第189,080号
【特許文献４９】WO 0205641
【特許文献５０】WO 02087342
【特許文献５１】WO 9409627
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
本発明の目的は、アザジラクチンを本質的に含むニーム種子抽出物の改良された顆粒製剤であって、昆虫による損傷から植物を保護するための製剤を提供することである。
【００４１】
本発明の別の目的は、植物の根圏に適用できる顆粒製剤を提供することである。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、向上した保存安定性を有する顆粒製剤を提供することである。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、植物の根圏に適用された場合に、アザジラクチンを徐々に放出する顆粒製剤を提供することである。
【００４４】
本発明の別の目的は、全身性適用のための顆粒製剤を提供することである。
【００４５】
本発明のなおさらに別の目的では、親油性物質を不活性化剤として使用して、アザジラクチンを担体との接触に起因する分解から保護する。
【００４６】
本発明のさらに別の目的は、水と、使用対象のニーム種子抽出物間の接触を確立するための透過性の膜として働く結合剤である親油性物質を提供することである。
【００４７】
本発明の別の目的は、アザジラクチンを含有するニーム種子抽出物が、含浸対象の不活性微粒子と親油性物質コーティングの間に挟まれている製剤を提供することである。
【００４８】
本発明のさらに別の目的は、安全で、生分解性で、環境に負担をかけない製剤を提供することである。
【００４９】
本発明のなおさらに別の目的は、有毒で分解されにくい植物防疫用化学物質の代替物を製剤用に提供することである。
【００５０】
本発明のさらに別の目的では、固形担体を親油性物質でコーティングすることによって修飾して、製剤中で使用されるニーム種子抽出物のアザジラクチンの安定性を向上させる。
【００５１】
本発明のなおさらに別の目的は、天然起源の、環境上安全で、不活性であり、所望の活性を達成する担体および他の成分を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００５２】
本発明は、向上した保存安定性、アザジラクチンの徐放性を有する、植物の根圏に適用するためのニーム種子抽出物の改良された顆粒製剤に関する。該製剤は、担体である砂、結合剤である少なくとも１種の親油性物質、着色剤およびアザジラクチン含有ニーム抽出物を含み、適用箇所で徐々にかつ効果的なアザジラクチンの放出を提供する。また本発明は、該製剤の製造方法に関する。この方法は、親油性物質によって担体をコーティングし、次いでコーティング済み担体にニーム種子抽出物を含浸した後、着色剤および最終的に親油性物質を噴霧し、５０℃までの温度で乾燥してコーティングすることに基づく。
【００５３】
前記一般的説明および下記詳細な説明はともに、単に例示的かつ説明的な記載であり、特許請求されている本発明についてさらに説明を提供するためのものであることが理解されるべきである。
【００５４】
表の説明：
表１−製剤の配合表および水中実施試験におけるアザジラクチン放出のパーセンテージ
表２−アザジラクチンの安定性データ
表３−本顆粒製剤で処理されたイネ実生に寄生させたＢＰＨの致死率
表４−イネ実生におけるアザジラクチンの全身性吸収についてのモニタリング
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
上記目的にしたがって、本発明では、向上した保存安定性を有し、植物の根圏に適用されるとアザジラクチンを制御放出して昆虫による植物の損傷を防止する改良された顆粒製剤を記載する。該組成物は以下の成分を含む：
成分                      Ｗｔ．／Ｗｔ（％）
ｉ．ニーム種子抽出物      ０．０３〜５０．００
ｉｉ．担体                ４８．５０〜９９．３０
ｉｉｉ．着色剤            ０．０１〜０．０４
ｉｖ．親油性物質          ０．５０〜１．５０
本発明のある実施態様では、以下の成分を含む好ましい顆粒製剤を記載する：
成分                      Ｗｔ．／Ｗｔ（％）．
１．ニーム種子抽出物      ０．０７５〜１２．５０
２．担体                  ８６．７０〜９９．２０
３．着色剤                ０．０２〜０．０３
４．親油性物質            ０．６０〜０．７５
【００５６】
本発明の別の実施態様では、顆粒製剤の製造方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
ａ）場合により担体を水で洗浄し、約６０℃で乾燥し、ふるい分けして乾燥担体を得る段階、
ｂ）有機溶媒に溶解された親油性物質で段階（ａ）の乾燥済み担体をコーティングする段階、
ｃ）溶媒に溶解されたニーム種子抽出物を段階（ｂ）のコーティング済み担体に含浸させ、４０℃〜５０℃の範囲の温度の熱気流中で乾燥する段階、
ｄ）溶媒に溶解された着色剤を噴霧することによって段階（ｃ）の含浸済み材料をコーティングし、約４０℃〜５０℃未満で乾燥する段階、および
ｅ）最終的に段階（ｄ）の材料を親油性物質でコーティングし、約４０℃〜５０℃未満までで乾燥して、所要の顆粒製剤を得る段階。
【００５７】
本発明では、０．０３〜５ ０％の範囲のアザジラクチン含量を有するニーム種子抽出物を使用する。
【００５８】
アザジラクチン含量は好ましくは１．０％までである。使用される担体は、珪質物質、好ましくは砂から選択される。使用対象の好ましい担体は川砂である。使用される砂の粒子サイズは、１２〜３２メッシュ、好ましくは１６〜３２メッシュサイズの範囲である。使用される砂の含水量は２．０％未満までである。コーティングに使用される親油性物質は、植物および動物起源の低融点の炭化水素ろうカテゴリーからなる群から選択され、好ましくは蜜ろうおよびパラフィンワックスである。使用される着色剤は、合成および天然物質、例えばクリスタルバイオレット、メチルバイオレット、天然ビキシンターメリックおよびその混合物からなる群から選択される。
【００５９】
本発明は、低沸点の炭化水素、エーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、例えばｎ−ヘキサン、石油エーテル、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エチル等からなる群から選択される親油性物質を溶解するための有機溶媒を提供する。
【００６０】
使用されるニーム種子抽出物は、エーテル、ケトン、アルコール、アルデヒド、エステル、例えばジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、およびメタノール等からなる群から選択される溶媒に溶解する。
【００６１】
アザジラクチンを含有するニーム抽出物は、ニーム種子から調製し、植物防疫用物質としての目的の適用のために使用する。アザジラクチンは、接触毒性によってではなく、昆虫の成長を調節する特性によって害虫を駆除し、全身性特性を有するため、送達系を用いて、通常は固形顆粒剤形で、効果的に使用できる。これにより、顆粒が植物の根圏に適用されると、植物がアザジラクチンを吸収することになる。また、前記方法を用いると、昆虫、例えば木や果実に穴をあける虫および硬い外皮の身体で本質的に包まれている虫が効果的に駆除される。該方法は、顆粒で処理済みの植物を昆虫が摂食した場合に、アザジラクチンを昆虫内に侵入させる。慣用の液状アザジラクチン製剤では、噴霧として植物に適用された場合に、これらの昆虫を効果的に駆除することができない。
【００６２】
アザジラクチンは、種々の担体の酸性または塩基性の性質およびイオン性の性質のせいで、それらと非常に反応性であるため、安定な顆粒製剤の開発のためには適切な担体を選択することが重要である。カプセル化または種々の成分の混合、および押出による顆粒の作成段階を含む種々の工程はかなり複雑であり、また、コストがかかる設備および成分を必要とするために製品が非常に高価になる。また、これらの工程をアザジラクチンに関して使用するためには制限がある。その理由は、過酷な工程条件、例えば高温、種々の成分の融解、化学物質、例えば界面活性物質、ポリマー、タンパク質性材料、ｐＨ調節剤、イオン性溶媒、水等が使用されるからである。これらはアザジラクチンに非常に有害であり、工程中の分解を引き起こす。
【００６３】
アザジラクチン含有ニーム抽出物用の単純で費用効果の高い顆粒製剤を開発することを目的にして、発明者らは、農業的に許容される担体、例えば砂、ベントナイト等を最初に試験している。顆粒化は、種々の溶媒、例えば酢酸エチル、メタノール、シクロヘキサノン等に溶解されたアザジラクチン含有ニーム抽出物の溶液を噴霧することによって実行する。これらの製剤中のアザジラクチンの安定性を５４℃での標準の促進条件下で評価すると、アザジラクチンの高分解性が示された。したがって、従来既知の方法によって製剤化された場合、これらの担体は不適切である。さらに、アザジラクチンは非常に水溶性が高く、水中での放出はかなり急速である。これは理想的な顆粒製剤には望ましくない。発明者らは、安価な担体、例えば砂、ベントナイト等および種々の添加物を使用して複数の製剤を作成し、その安定性および、水と接触した場合のアザジラクチンの放出を研究している。そして驚くべきことに、親油性物質を結合剤として使用して砂顆粒上にコーティングされたアザジラクチンの放出現象を研究するうちに、アザジラクチンに関して認められる制限が解決された。製剤化の１つによって、アザジラクチンの高い安定性が提供された。この製剤化は以下の工程を含む。
【００６４】
原産地で入手可能な天然川砂を調達し、水で浄化して、泥および低密度不純物を除去する。乾燥済みの砂をふるい分けして、１６〜３２メッシュサイズを有する粒子を得る。
【００６５】
前記砂を、親油性溶媒、例えば炭化水素に溶解された１％、好ましくは０．５％、最も好ましくは０．２５％の親油性物質、好ましくは蜜ろうまたはパラフィンワックスでコーティングする。このコーティングは、任意の通常の噴霧方法によって、あるいはろう溶液を砂顆粒と直接接触させることによって行う。ろうの溶解に使用される炭化水素は、沸点約６０〜８０℃の低級炭化水素、ヘキサン、石油エーテル等から選択される。ろう含浸済み顆粒を５０℃未満までの熱気流下で乾燥して、自由流動性粒子を得る。こうして得られたろう含浸済み砂粒子を、適切な溶媒に溶解された１．２％アザジラクチン、最も好ましくは０．１％アザジラクチンに相当するアザジラクチン含有ニーム抽出物で処理する。アザジラクチン含有ニーム抽出物の溶解に使用される溶媒は、本質的に中〜極性の溶媒、例えばエステル、アルコール、ケトン、アルデヒド等であってよい。好ましい溶媒は、酢酸エチル、メタノールおよびアセトンである。ろうでコーティング済みの顆粒に対するアザジラクチン含有ニーム抽出物溶液の処理は、直接処理によって、あるいは噴霧、混合、および好ましくは５０℃未満までの熱気流下または減圧下での乾燥によって達成し、自由流動性顆粒を得てよい。こうして得られたアザジラクチンコーティング済み粒子を、親油性溶媒、例えば炭化水素に溶解された１％、好ましくは０．５％、最も好ましくは０．２５％の親油性物質、好ましくは蜜ろうまたはパラフィンワックスでさらに処理する。この処理は、任意の通常の噴霧方法によって、あるいはろう溶液を砂顆粒と直接接触させることによって行う。ろうの溶解に使用される炭化水素は、沸点約６０〜８０℃を有する低級炭化水素、ヘキサン、石油エーテル等から選択される。得られた顆粒を通常の乾燥方法によって乾燥して、好ましくは５０℃未満まで、ならびに／あるいは減圧下で結合溶媒を除去する。こうして得られた顆粒はアザジラクチンを保持し、その製造工程中にいかなる変化もなく、高い保存安定性および適用部位での生物活性化合物の徐放性（「水中流出試験」での観察では１０〜１５％）を有し、その目的用途に関して所望の活性を提供する。
【００６６】
顆粒製剤中に存在する生物活性化合物の量は、目的の活性、例えば、非限定的に、木および／または作物の昆虫による損傷を減少させ、あるいは排除する活性を有するのに有効な任意の量であってよい。好ましくは、殺虫製剤中に存在するアザジラクチンの量は、顆粒製剤の重量ベースで約０．０３重量％〜約５．０重量％であり、より好ましくは顆粒製剤の重量ベースで約０．０３〜約１．０重量％である。ニーム種子抽出物に関して言えば、このニーム種子抽出物は、好ましくは、殺虫顆粒製剤の約０．０７５〜約５０．０ｗ／ｗ％の範囲の量で存在する。最も好ましくは、殺虫製剤中に存在するアザジラクチンは約０．０３〜５．０ｗ／ｗ％の範囲である。
【００６７】
生物活性化合物、例えばアザジラクチンの製造方法は米国特許第5,695,763号に記載されている。この文献はその全体が本明細書中に援用される。一般にアザジラクチンは、好ましくはニームツリーの種子から回収し、この回収は、種子を押しつぶし、次いで押しつぶされた種子からアザジラクチンおよび他の活性成分を水で抽出することによって行う。水からのアザジラクチンおよび他の活性成分の抽出は、水と混和性でなく、水よりアザジラクチンの溶解度が高い非水性溶媒を使用して、あるいは２０°〜８０℃の範囲の混濁温度（turbidity temperature）を有する界面活性物質を使用して達成する。次いで濃縮アザジラクチンを第二の抽出溶液から回収する。次いでこのアザジラクチン含有溶液を濃縮して、アザジラクチンを含有する濃縮物を作成し、これを液状炭化水素に加えて、アザジラクチンを含む沈殿を形成させ、次いでこの沈殿を回収して、殺虫製剤に使用する。また、インド特許第181,845号に記載の方法を、アザジラクチンを含むニーム種子抽出物の調製のために採用することができる。また、米国特許第5,124,349号および第5,397,571号に記載の方法にしたがって、アザジラクチンを回収することができる。前者は、粗く粉砕されたニーム種子を非極性溶媒で脱脂し、次いで極性非プロトン溶媒を使用して脱脂済みニーム種子からアザジラクチンを抽出することを含むニーム抽出物の調製を記載している。米国特許第5,397,571号に記載の方法は、非極性および極性溶媒の共溶媒（co-solvent）混合物で粉砕済みニーム種子を抽出して、この種子の親水性アザジラクチン（azadiracthins）含有部分および疎水性ニーム油部分をともに有するニーム抽出物を得ることを含む。各溶媒を除去することによって、上で得られた疎水性および親水性抽出物を濃縮して、アザジラクチンおよび他の親油性成分を含有する「ニーム抽出物」を得る。次いで、このニーム抽出物を低極性溶媒で処理して、抽出物のアザジラクチン含有部分を沈殿させる。この固形物をろ過によって分離し、乾燥して、それに含まれる約１０〜２０％のアザジラクチンを得る。押しつぶし、固液抽出、クロマトグラフィー、沈殿等を含む他の慣用の方法を、アザジラクチンを含有するニーム種子抽出物の調製に関して使用してもよい。
【００６８】
本発明で使用される親油性有機物質に関しては、蜜ろう、またはパラフィンワックス、好ましくはパラフィンワックスであり、顆粒製剤の重量ベースで約２重量％またはそれ未満、好ましくは顆粒の重量ベースで０．２５〜１．０重量％である。
【００６９】
担体に関しては、砂、好ましくは天然砂、およびその化学的な関連粒子、最も好ましくは川砂であり、これは１６〜３２メッシュサイズである。砂の含水量は好ましくは２％未満までである。
【００７０】
さらに、アザジラクチン含有ニーム抽出物の含浸後に着色剤を組み入れて顆粒製剤を識別可能にしてよい。着色剤は、合成化合物、例えばクリスタルバイオレット、メチルバイオレット、ブリリアントブルー、インジゴカーミン、エリスロシン、アルラレッド、タトラジン（tatrazine）、サンセットイエロー、ファストグリーン、カーモシン（carmosine）、ポンソー(ponceau)４Ｒ、コチニールレッドＡ、レッド２Ｇ、グリーンＳ、ブラウンＨＴ、ブリリアントブラックＢＮ、酸化鉄、キノリンイエロー、リソールルビンＢＫ（lithol rubine BK）等または天然起源の、例えばクルクミン、ルテイン、カロテン、リコペン、カーミン、ベタニン、アントキシアニン（anthoxyanin）、クロロフィル、カーボンブラック、ビキシン、カプサンシン（capsanthin）等であってよく、その重量は顆粒製剤の重量ベースで１％未満、最も好ましくは０．０５％であってよい。着色剤はろうの最終コーティング前に組み入れることができる。着色剤をメタノールまたは酢酸エチルに溶解し、ニーム種子抽出物でコーティングされた顆粒上に噴霧し、５０℃未満の気流下および／または減圧下で乾燥する。
【００７１】
本明細書中に記載の顆粒製剤は、適切な慣用の設備において慣用の混合（mixing／blending）技術、例えば種々の成分を固形担体に噴霧し、あるいは直接加えることによって調製できる。好ましくは、親油性物質を炭化水素溶媒、好ましくはヘキサンに溶解し、アザジラクチン含有ニーム抽出物の処理前および後に、砂顆粒に噴霧するか、あるいは加える。アザジラクチン含有ニーム抽出物の溶液は、適切な溶媒、好ましくは低沸点の極性溶媒、例えばアセトン、酢酸エチル等に溶解し、次いでろうでコーティング済みの砂粒子上に噴霧するか、あるいは直接適用することによって調製する。ろう、アザジラクチン含有ニーム抽出物および着色剤の各適用段階の終了時に、５０℃未満の温度で、ならびに／あるいは真空下で、コーティング済み顆粒の乾燥を実行する。
【００７２】
本発明の顆粒アザジラクチン製剤の分析では、アザジラクチン含量の保持が示され、製造工程中の変化は全くなかった。
【００７３】
本明細書中に記載の顆粒アザジラクチン製剤は保存安定性であり、これはこの製剤を熱分解の促進に付することによって証明される。ゆえに、元々存在するアザジラクチンの重量の８５％が、密封容器中、５４℃で２８日間の保存後に残存する。これは温度２５℃の平均保存条件で２年間の有効期間に相当する。
【００７４】
さらに、本発明の顆粒アザジラクチン製剤は市販の農芸化学用顆粒製剤の望ましい仕様を満たす。この基準は、このような顆粒が、顆粒を水と接触させたときに、１０分間にその名目値の１５％未満の活性成分しか放出しないべきであろうというものである。ゆえに本発明は、まさに最小成分および低コストの設備を使用することによってアザジラクチン顆粒製剤の費用効果の高い製造方法を提供し、該方法および方法後の保存中のアザジラクチンの高い安定性；生物活性に関して十分な量のアザジラクチンの放出、および一般的な顆粒の仕様を満たすことを実証する。
【００７５】
すべて天然物質を含有し、さらに長期間保存可能である本発明の顆粒製剤の能力は、市販の他の液状製剤と比べて利点を有する。その理由は、多数の具体的適用において、環境問題のせいで有機溶媒の使用が抑制されるからである。
【００７６】
ゆえに、上述の本発明の特徴によって、本方法および製品は、商業上の適用の成功に関して類のないものになる。
【００７７】
本発明の追加の特徴および利点は、以下の説明中に部分的に記載され、部分的にはその説明から自明になり、あるいは本発明の実施によって習得されるであろう。本発明の目的および他の利点は、明細書および特許請求の範囲で具体的に指摘される要素および組み合わせによって実現および取得される。
【００７８】
これらの利点および他の利点を達成するために、および本発明の目的にしたがって、本明細書中で具体化され、広く記載されるように、本発明は、担体である砂、不活性化剤および結合剤である少なくとも１種の親油性物質、生物活性化合物、例えばアザジラクチンおよび他のリモノイドを含有するニーム抽出物を含む、アザジラクチン含有ニーム抽出物の顆粒製剤に関する。
【００７９】
以下に挙げる実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００８０】
顆粒製剤化におけるアザジラクチンのカプセル化
種々の担体、結合剤／添加物を使用して、アザジラクチンを含有するニーム種子抽出物を顆粒製剤に製剤化する。適切な方法を使用して活性成分のカプセル化および安定性の重要なパラメータを評価する。その目的は、ニーム種子抽出物に理想的な担体および結合剤を同定することである。
【００８１】
インド規格局の規格IS: 6940-1982に規定の方法のように「水中流出試験（water run-off test）」にしたがって、すべてのこれらの製剤におけるアザジラクチンのカプセル化の程度を測定する。この方法では、コットンで栓をされた１００ｍｌビュレットに顆粒１０ｇをとり、水５０ｍｌを顆粒に加える。１５分後にビュレットから水を回収し、インド規格局の規格IS: 14299-1995に規定の方法のようにＨＰＬＣによってアザジラクチン含量を分析する。顆粒からのアザジラクチン放出のパーセンテージを表１に挙げる。
【００８２】
Ａ．慣用の方法によって調製されたニーム種子抽出物顆粒
アザジラクチン含有ニーム抽出物の顆粒製剤１および２を以下の慣用の様式によって調製する。２リットルの三角フラスコ中で砂粒子４７４ｇを白色粘土２０ｇと混合する。ポリ酢酸ビニル１ｇを沸騰水１５ｍｌに溶解し、これにニーム種子抽出物１．２２ｇ（０．１％アザジラクチンに相当）、ノイゲン１．１６ｇ、クリスタルバイオレット０．１５ｇおよび糖５ｇを加える。内容物を十分に混合して、透明な溶液を得る。次いで内容物を十分に撹拌しながら、この溶液を砂−粘土混合物にゆっくり加える。添加完了後、湿性顆粒をガラストレー上に移し、５０℃未満までの温度で８時間乾燥する（製剤１）。
【００８３】
この顆粒を水中「流出試験」に付して、カプセル化の程度を調査する。その結果、顆粒化産物からアザジラクチンの９０％放出が示される。昆虫駆除に使用される顆粒がこの試験に付された場合、概してその活性成分の約１５％を放出する。
【００８４】
製剤１のカプセル化をさらに改善するために、以下に記載のように顆粒を蜜ろうでコーティングする。
【００８５】
蜜ろう１．２５ｇをｎ−ヘキサン１５ｍｌに溶解する。１リットルの三角フラスコにとった上記顆粒２５０ｇにこのろう溶液を滴加する。内容物を数分間十分に混合し、ガラストレー中に移し、気流下または熱風乾燥器（over）中、５０℃未満の温度で２時間乾燥する（製剤２）。得られたろうでコーティング済みの顆粒を水中流出試験に付する。その結果、アザジラクチンの７２％放出が示される。これはろうでコーティングされていない顆粒と比べてわずかな改善でしかない。
【００８６】
これにより、不活性担体、例えば砂を使用する農芸化学用顆粒の慣用の製造方法はアザジラクチンに適さないことが示される。その理由は、それらが水と接触するとアザジラクチンを急速に放出するからである。これは望ましくない。０．２５〜０．５％のレベルでろうでコーティングしても、わずかなカプセル化の改善しか得られていない。カプセル化を改善するために０．５％より多量のろうを使用し得ない。その理由は、顆粒粒子の凝塊が認められるからである。低カプセル化に加えて、この顆粒はアザジラクチンに関する短い有効期間を示し、これは顆粒の調製に使用される複数の成分の存在に起因するであろうことが示される。この成分はアザジラクチンに対するその有害な影響のせいで分解を引き起こしている。ゆえに、慣用の顆粒調製物中で一般に認められるいくつかの成分の使用は、アザジラクチン顆粒の調製に適用される場合、制限を有するであろう。
【００８７】
Ｂ．顆粒剤形のアザジラクチン含有ニーム種子抽出物の含浸に関する研究。
最低の添加物数しか有さないが、改善されたカプセル化およびアザジラクチンに関する安定性を有する方法および組成物を同定する目的で、顆粒組成物３〜３０を調製した。担体、例えば砂およびベントナイト、結合剤または添加物、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ロジン、蜜ろう、パラフィンワックス、圧縮泥ろう、テレピン油、ニーム油、マツ油およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用した。これらの製剤（各１００ｇ）の組成を表１に挙げる。その調製工程は以下の通りである。
【実施例２】
【００８８】
製剤の調製：実施例Ｉ−Ａに記載の手順のように製剤を調製する。
【実施例３】
【００８９】
製剤３〜２４：これらの製剤は、前処理を行わずに砂を使用して調製する。
【００９０】
段階１：砂調製：ふるい分け済みの川砂、粒子サイズ１６〜３２メッシュ、を水で洗浄し、結合含水量が２％未満に達するまで熱気流（５０〜７０℃）下で乾燥する。市販のベントナイトを洗浄せずに直接使用する。
【００９１】
段階２：アザジラクチン含有ニーム種子抽出物の含浸：砂またはベントナイトのふるい分け済みの粒子（１２〜３０メッシュ）約９８．７ｇを三角フラスコにとる。これに、酢酸エチル５ｍｌに溶解された約０．３ｇのニーム種子抽出物（０．１％アザジラクチンに相当）の溶液をゆっくり加える。内容物を十分に混合し、気流下で乾燥する。
【００９２】
段階３：ニーム抽出物含浸済み顆粒を覆う種々の結合剤のコーティング：ニーム種子抽出物含浸済み顆粒を三角フラスコにとり、５ｍｌの（蜜ろう０．２５〜１ｇ；ロジン０．１〜０．５ｇ、テレピン油１ｇ；ニーム油１ｇ）に溶解された単独または組み合わせの種々の結合剤の溶液を滴加する。内容物を十分に混合し、気流下で乾燥して、自由流動性顆粒を得る。
【実施例４】
【００９３】
製剤：２５〜３０
これらの製剤では、ニーム種子抽出物および他の結合剤をコーティングする前に蜜ろう／パラフィンワックスでプレコーティングされた砂およびベントナイト顆粒を用いる。その目的はカプセル化の改善である。この工程は以下の段階を含む：
【００９４】
段階１：川砂の調製：川砂をふるい分けして、１６〜３２メッシュのサイズの砂粒子を得る。この粒子を水で洗浄し、結合含水量が２％未満に達するまで熱気流下で乾燥する。市販のベントナイトを洗浄せずに直接使用する。
【００９５】
段階２：担体上のろうのプレコーティング：段階１で得られた砂またはベントナイト約９８ｇに、ｎ−ヘキサン約５ｍｌに溶解された結合剤（蜜ろう０．２５ｇ；パラフィンワックス０．２５ｇ）の溶液を滴加する。ろう物質が砂表面全体に均一に分布するように内容物を十分に混合し、気流中で乾燥して、自由流動性粒子を得る。
【００９６】
段階３：アザジラクチン含有ニーム種子抽出物の含浸：０．３ｇのニーム種子抽出物（０．１％アザジラクチンに相当）をメタノール約５ｍｌに溶解し、段階２で得られたろうでコーティング済みの粒子にこの溶液を滴加する。内容物を十分に混合し、気流下または熱風乾燥器中で５０℃で２時間乾燥する。
【００９７】
段階４：ニーム種子抽出物含浸済み顆粒上のろうのポストコーティング：段階３で得られたニーム種子抽出物含浸済み顆粒を、段階２のように調製されたろう（蜜ろう０．７５ｇ；パラフィンワックス０．７５ｇ；圧縮泥ろう０．７５ｇ）の各溶液でゆっくり処理する。内容物を十分に混合し、気流下または熱風乾燥器中で５０℃未満の温度で２時間乾燥して、自由流動性顆粒を得る。
【００９８】
段階２以後の水の使用を回避する。その理由は、水はアザジラクチンを分解することが知られており、また、好ましくは低温での乾燥を困難にするからである。ゆえに、性質上親水性の通常の結合剤、例えばグアールガム、アラビアゴム等は、溶媒に不溶性であるせいで、使用し得ない。
【００９９】
実施例１Ａに記載の「水中流出」試験を使用してカプセル化の程度を試験し、その結果を表１に挙げる。
【０１００】
【表１−１】
2007530665.tif 000007
【表１−２】
2007530665.tif 000008
（注記：Ａｚａ＝アザジラクチン）
【０１０１】
上記結果では、結合剤を全く用いずに、アザジラクチン含有ニーム抽出物を直接砂上にコーティングすることによって作成された顆粒（製剤３）はアザジラクチンの急速な放出をもたらしたことが示される。結合剤、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールはアザジラクチンの制御放出を提供していないが、蜜ろうおよびロジンはアザジラクチンに徐放性を付与している。さらに、ろうでプレコーティングされた砂またはベントナイト担体を用いて作成された顆粒は、比較的高いカプセル化を提供している。
【実施例５】
【０１０２】
アザジラクチン含有ニーム抽出物の高カプセル化を保持する種々の担体および添加物を用いる顆粒の安定性：
実施例１の「水中流出」試験において約１５％アザジラクチンを放出することを基準にしてカプセル化の改善を示している製剤（表２）について、５４＋／−２℃での促進条件下でその安定性を研究する。各製剤の顆粒約８０ｇを気密性ガラスバイアルにとり、熱風乾燥器中で２８日間インキュベートする。指定の間隔で乾燥器からサンプルを取り出し、インド規格局の規格IS: 14299-1995に規定の方法のようにＨＰＬＣによってアザジラクチンを分析する。これらの製剤中のアザジラクチンの分解を表２に挙げる。
【０１０３】
【表２−１】
2007530665.tif 000009
【表２−２】
2007530665.tif 000010
ＮＡ＝分析されていない
【０１０４】
上記結果においては、担体である砂および不活性化剤／結合剤である蜜ろうからなる製剤は、ベントナイト担体および結合剤／添加物であるロジン、テレピン油、ニーム油からなる製剤より高いアザジラクチン安定性を有することが示される。一方、後者の方が高いアザジラクチンのカプセル化を示している（実施例１）。しかし、アザジラクチンの安定性を考慮すると、これらの添加物は本製剤において使用するのに適していないことがわかった。砂担体および不活性化剤／結合剤である蜜ろう／パラフィンワックスからなる製剤は安定性および高カプセル化をともに示している。この安定性およびカプセル化は、アザジラクチン含有抽出物をろうでコーティングされた砂顆粒上にコーティングするとさらに改善される。これは本出願の主要問題における発明概念の１つである。
【実施例６】
【０１０５】
Ａ．コメ（イネ）に寄生するNilaparvata lugens（トビイロウンカ、ＢＰＨ）昆虫に対するアザジラクチン含有ニーム種子抽出物の顆粒製剤の効力
アザジラクチン含有顆粒製剤２５を、本発明にしたがって調製し、ＢＰＨ昆虫に対して試験する。バイオアッセイに使用される昆虫は、実験室で飼育されている昆虫群由来である。イネ実生をトレーで栽培し、実験室で維持し、３０日齢の実生を研究に使用する。ペットビン（pet jars）（それぞれビン１、ビン２およびビン３）にとった水２００ｍｌに必要量の顆粒（それぞれ５．５、１１および２２ｇ）を加えることによって、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍのアザジラクチンを含有する試験溶液を調製する。一束のイネ実生を処理溶液に浸す。生物効力の評価では、処理の２４時間後に各ペットビン（１〜３）由来の９実生を取り出し、各濃度に関して３つの複製物を素焼鉢に入れる（３ｘ３プラント）。顆粒で処理されないプラントはコントロールとしての役割を有する。次いでこの実生をマイラーケージ（直径１０ｃｍ＆高さ３０ｃｍ）に入れる。新たに出現した１０ＢＰＨ若虫を各ケージに移し、各マイラーケージの上面を濡れた綿モスリン布で覆う。研究中ずっと継続して鉢に水をまく。処理後１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、および１４日目にＢＰＨ昆虫の致死率を観察する。補正済みの致死率はアボットの式を使用して決定する。
【０１０６】
表３：本発明の顆粒製剤で処理されたイネ実生に寄生させたＢＰＨの致死率。
【表３】
2007530665.tif 000011
＊補正済み致死率を括弧内に示す。
【０１０７】
上記生物効力の結果では、顆粒に起因するＢＰＨの９３〜１００％致死率が示される。
【０１０８】
Ｂ．アザジラクチン顆粒で処理されたイネ植物によるアザジラクチンの全身性吸収：
顆粒処理水を含有する３つのビン中で浸漬されたイネ実生において、アザジラクチンの全身性吸収をモニターする。１日目および３日目に各ビンから実生を取り出し、抽出し、ＨＰＬＣによってアザジラクチン含量を分析する（表４）。
【０１０９】
【表４】
2007530665.tif 000012
【０１１０】
上記ＨＰＬＣの結果では、それぞれ２５、５０および１００ｐｐｍを提供するものであった顆粒の用量に比例してイネ実生によるアザジラクチンの吸収が示される。
【実施例７】
【０１１１】
本発明にしたがって大量のアザジラクチン含有ニーム種子抽出物の顆粒を製造する場合には、以下の段階が含まれる。
【０１１２】
段階１：砂調製：原料の川砂４４５０ｋｇをふるい振とう装置でふるい分けすることによって、必要とされる粒子サイズ１１９０μｍ／５５０μｍ（１６〜３２メッシュ）の砂を得る。撹拌装置を備えた軟鋼タンクにこの砂をとり、約７０℃の熱水で洗浄して、粘着性不純物を除去する。水を捨て、得られた浄化済みの砂を軟鋼乾燥器に移す。通常の条件下で６０℃で４時間乾燥を行う。砂中の含水量が＜０．０５％である浄化済みの砂１０００ｋｇを得る。乾燥砂９８９．３ｋｇをコーティングパン上に積載する。
【０１１３】
段階２：プレろうコーティング：ｎ−ヘキサン５８．３ｋｇ（バッチサイズの５．８３％に相当）をステンレス鋼３０４の混合用容器にとる。撹拌しながら、徐々に、パラフィンワックス２．５ｋｇ（０．２５％に相当）を加える。この添加は６０℃で行う。パラフィンワックスは、典型的には１時間以内に、ｎ−ヘキサンに完全に溶解する。このパラフィンワックス溶液を１４．５ｋｇ／時間の割合で砂上にゆっくり噴霧し、この場合、パンを１０ｒｐｍの速度で回転させる。同時に、熱風送風機の機構を用いて、５０℃未満の温度を維持して、好ましくは約４７℃で乾燥を行い、砂上のパラフィンワックスの均一なコーティングを保証し、このコーティング工程を４時間実行する。
【０１１４】
段階３：アザジラクチン含有ニーム種子抽出物の含浸：酢酸エチル５８．３ｋｇ（バッチサイズの５．８３％に相当）をステンレス鋼３０４の混合用容器にとる。撹拌しながら、徐々に、１００％アザジラクチン１．０ｋｇに相当する抽出物約３．２４５ｋｇ（バッチサイズの０．１２％に相当）を加える。抽出物がメタノール中で完全に溶解するまで撹拌を継続する。典型的には１時間以内である。１０ｒｐｍの速度で回転するパンにおいて、こうして得られたニーム種子抽出物の溶液を１４．５ｋｇ／時間の割合でろうコーティング砂顆粒上にゆっくり噴霧する。同時に、熱風送風機の回転機構を用いて、５０℃未満の温度を維持して、好ましくは約４２℃で乾燥を行い、ろうコーティング砂顆粒上のニーム種子抽出物の均一な含浸を保証する。この工程を４時間実行する。
【０１１５】
段階４：着色物質でのコーティング：エチルアルコール１１．６ｋｇ（バッチサイズの１．１６％に相当）をステンレス鋼３０４の混合用容器にとる。撹拌しながら、徐々に、メチルバイオレット０．２ｋｇ（バッチサイズの０．０２％に相当）を加える。それが完全に溶解するまで撹拌を継続する。典型的には１時間である。１０ｒｐｍの速度で回転するパンにおいて、アザジラクチン含有ニーム種子抽出物含浸済み砂顆粒上に３ｋｇ／時間の割合で穏やかにこの溶液を噴霧する。同時に、熱風送風機の機構を用いて、５０℃未満の温度を維持して乾燥を行う。着色物質の均一なコーティングを保証するために、この工程を４時間実行する。
【０１１６】
段階５：ポストろうコーティング：ｎ−ヘキサン５８．３ｋｇ（バッチサイズの５．８３％に相当）をステンレス鋼３０４の混合用容器にとる。撹拌しながら、徐々に、パラフィンワックス５ｋｇ（バッチサイズの０．５％に相当）を加える。この添加は６０℃で行う。パラフィンワックスは、典型的には１時間以内に、ｎ−ヘキサンに完全に溶解する。１０ｒｐｍの速度で回転するパンにおいて、着色コーティング済み砂顆粒上に１４．５ｋｇ／時間の割合で穏やかにこの溶液を噴霧する。同時に、熱風送風機の機構を用いて、５０℃未満の温度、好ましくは４７℃を維持して乾燥を行う。着色コーティング済み砂顆粒全体のパラフィンワックスの均一なコーティングを保証するために、この工程を４時間実行する。
【０１１７】
段階６：包装：高密度ポリエチレンドラム、段ボール箱、または軟鋼ドラム内の、それぞれ厚さが少なくとも０．０６２ｍｍの厚手で二重のポリエチレン（polythene）袋に乾燥済み製剤化産物をパッケージする。パッケージサイズには、５、１０および２０キログラムがある。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
１）向上した保存安定性を有するアザジラクチン含有顆粒状害虫駆除製剤。
２）顆粒製剤からの有効成分アザジラクチンの徐放性。これは長期間の効力をもたらす。
３）費用効果の高い製剤およびその単純な製造方法。
４）有機農業に理想的な環境に負担をかけない顆粒製剤。
５）本顆粒製剤で使用される固形担体および他の成分の容易な入手可能性。
【国際調査報告】
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