(57)【要約】  ミコフェノール酸の調製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコフェノール酸の単離方法であって：
ａ）ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物を準備する段階；
ｂ）当該混合物と第一の水非混和性溶媒とを混合して水相及び第一の水非混和性相を形成させる段階；
ｃ）当該水相を分離する段階；
ｄ）当該水相と第二の水非混和性溶媒とをｐＨ７未満で混合して水相及び第二の水非混和性相を形成させる段階；
ｅ）第二の水非混和性相を分離する段階；
ｆ）第二の水非混和性相を濃縮する段階；及び
ｇ）ミコフェノール酸を結晶化する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
段階（ｂ）の混合が約８〜約１１のｐＨでなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨが水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムで調節される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第一又は第二の水非混和性溶媒の少なくとも１つがＣ4〜Ｃ7エステル、Ｃ4〜Ｃ7ケトン、又はそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第一又は第二の水非混和性溶媒の少なくとも１つが、酢酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸ｎ−ブチル、又はそれらの混合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第一又は第二の水非混和性溶媒が酢酸エチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｃ）における水相が、段階（ｂ）を繰り返すことにより少なくとも１回更に抽出される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｄ）のｐＨが約５〜約６．５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｄ）のｐＨが、硫酸、リン酸、又は塩酸のうちの少なくとも１つで調節される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｄ）おける水相が、段階（ｄ）を繰り返すことにより少なくとも１回更に抽出される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｆ）における濃縮が蒸留により実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｆ）における濃縮が濾過により実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
濾過が膜濾過により実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
濾過膜がプラスチック濾過膜である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
結晶化が濃縮物を冷却することで実施される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
得られたミコフェノール酸が、ＨＰＬＣ面積（％）で測定した場合に少なくとも９９．５％の純度を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物が全培養液の抽出により調製される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物が：
ａ）ミコフェノール酸を含む発酵培養液を塩基性化し、そして菌糸を除去して塩基性混合物を入手する段階；
ｂ）当該塩基性混合物を酸性化して酸性混合物を入手する段階；及び
ｃ）当該酸性混合物を濾過し、塩基性化して濃縮アルカリ性混合物を入手する段階、
を含んで成る方法により得られる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物の調製方法であって：
ａ）ミコフェノール酸を含む発酵培養液を塩基性化し、そして菌糸を除去して塩基性混合物を入手する段階；
ｂ）当該塩基性混合物を酸性化して酸性混合物を入手する段階；及び
ｃ）当該酸性混合物を濾過し、塩基性化して濃縮アルカリ性混合物を入手する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２０】
段階（ｃ）の濾過が膜濾過により実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
濾過膜がセラミック膜又はプラスチック精密濾過膜である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）における菌糸が濾過により除去される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
菌糸が、精密濾過膜、真空ドラムフィルター、ベルトフィルター、プレスフィルター、ナッツフィルター、遠心分離機、又は固体ボール遠心分離機により除去される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ミコフェノール酸エステルの調製方法であって：
ａ）ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物を準備する段階；
ｂ）当該混合物と第一の水非混和性溶媒とを混合して水相及び第一の水非混和性相を形成させる段階；
ｃ）当該水相を分離する段階；
ｄ）当該水相と第二の水非混和性溶媒とをｐＨ７未満で混合して水相及び第二の水非混和性相を形成させる段階；
ｅ）第二の水非混和性相を分離する段階；
ｆ）第二の水非混和性相を濃縮する段階；
ｇ）ミコフェノール酸を結晶化する段階；及び
ｈ）段階（ｇ）のミコフェノール酸をエステルに変換する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２５】
エステルがモルホリノエチルエステルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
エステルがＣ1〜Ｃ4アルキルエステルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
エステルがメチルエステル又はｔ−ブチルエステルである、請求項２４又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＨＰＬＣ面積（％）により測定した場合に少なくとも約９９．５％の純度を有する、固体のミコフェノール酸。
【請求項２９】
ＨＰＬＣ面積（％）により測定した場合に少なくとも約９９．９％の純度を有する、請求項２８に記載のミコフェノール酸。
【請求項３０】
ＨＰＬＣ面積（％）により測定した場合に約０．１％未満の全不純物含量を有する、固体のミコフェノール酸。
【請求項３１】
ＨＰＬＣ面積（％）により測定した場合に約０．０８％未満の全不純物含量を有する、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のミコフェノール酸。
【請求項３２】
約１４１．６℃〜約１４４．６℃の融点を有する、固体のミコフェノール酸。
【請求項３３】
約１４３．１℃の融点を有する、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のミコフェノール酸。
【請求項３４】
請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のミコフェノール酸、又はそのエステル、及び医薬として許容される賦形剤、を含んで成る医薬組成物。
【請求項３５】
エステルがモルホリノエチルエステルである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
治療的に有効量の請求項３４又は３５に記載の医薬組成物を、必要とする哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類の免疫系を抑制するための当該医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本願は、２００４年４月２６日出願の米国仮出願第６０／５６５，６９４号及び２００４年５月１８日出願の第６０／５７５，５２７号の利益を主張するものであり、これらは引用により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、ミコフェノール酸の単離に関する。
【背景技術】
【０００３】
ミコフェノール酸は、化学名６−［４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−フタラニル］−４−メチル−４−ヘキセン酸、６−［１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル］−４−メチル−４−ヘキセン酸、分子式Ｃ１７Ｈ２０Ｏ６、分子量３２０．３５、ＣＡＳ登録番号２４２８０−９３−１及び構造：
【化１】
2007532585.tif 000002
を有する。
【０００４】
１９８３年にＧｏｓｉｏにより単離されたミコフェノール酸（ＭＰＡ）は、最初によく特徴付けられた抗生物質である(Bentley 2001)。これは、複数種のペニシリウム属(Penicillium)、例えばＰ．ブレビ−コンパクタム(P. brevi-compactum)、Ｐ．スカブラム(P. scabrum)、Ｐ．ナゲミ(P. nagemi)、Ｐ．ロックフォール(P. roqueforti)、Ｐ．パトリス−メイ(P. patris-mei)及びＰ．ビリディカタム(P. viridicatum)(Clutterbuck et al. 1932, Jens and Filtenborg 1983)により産生される。
【０００５】
ＭＰＡは、その抗生物質活性に加え(Abraham 1945)、抗真菌(Gilliver 1946)、抗ウイルス(Ando et al. 1968)、及び抗腫瘍(Noto et al. 1969)特性も有しており、そして、乾癬の処置において臨床的に使用されている(Johnson 1972)。より最近では、強力な免疫抑制剤として知られている(Bentley 2000)。
【０００６】
ＭＰＡの薬理学的特性についての少なくとも１つの原因は、複数の生態系において、それがイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤ）のレベルでグアニン生合成に干渉するためである。従って、ＭＰＡは、核酸生合成に対して顕著な阻害効果を有している(Franklin and Cook 1969)。ＩＭＰＤの阻害は、ＭＰＡのリンパ球特異的免疫抑制作用の根拠でもある。リンパ球は、主に新規グアニン生合成に依存しているため、この経路の低下は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の増殖抑制につながる。
【０００７】
ＭＰＡは、その高い副作用（一次感染症、例えば帯状疱疹及び胃腸の副作用、例えば胃の不快感）発生率により廃止された。２−モルホリノエチルエステル誘導体であるミコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標））は、これらの欠点を有さず、ミコフェノール酸よりも優れたバイオアベイラビリティーを有する。ミコフェノール酸モフェチルは同種腎移植を受けた患者における臓器拒絶反応の予防薬として最近承認された（米国では１９９５年、そして欧州では１９９６年）(Shaw and Nowak 1995, Sollinger 1995)。経口投与後、このエステル型は迅速に遊離酸へと加水分解する。ＭＰＡは、続いて、不活性なグルクロニド代謝物へと主に変換し、これは尿中排泄により排除される(Bentley 2001, Wiwattanawongsa et al. 2001)。
【０００８】
ＭＰＡは、ＷＯ０１／２１６０７、ＷＯ０１／６４９３１及びＧＢ１１５８３８７において、発酵培養液から単離されている。しかしながら、発酵培養液からのＭＰＡの単離は効率的でない。常用の方法により単離されたＭＰＡは、大量の不純物を有する。
【０００９】
本発明は、ミコフェノール酸の効率的な単離方法を提供する。
【００１０】
本発明の概要
本発明は、ミコフェノール酸及びそのエステルに関する。
【００１１】
本発明の１つの態様は、ミコフェノール酸の単離方法であって、ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物を準備し；この混合物と第一の水非混和性溶媒とを混合して水相及び第一の水非混和性相を形成させ；当該水相を分離し；当該水相と第二の水非混和性溶媒とをｐＨ７未満で混合して水相及び第二の水非混和性相を形成させ；第二の水非混和性相を分離し；第二の水非混和性相を濃縮し；そしてミコフェノール酸を結晶化すること、を含んで成る方法に関する。
【００１２】
好ましくは、ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物は、ミコフェノール酸を含む発酵培養液を塩基性化し、そして菌糸を除去して塩基性混合物を入手する段階；当該塩基性混合物を酸性化して酸性混合物を入手する段階；そして当該酸性混合物を濾過し、塩基性化して濃縮アルカリ性混合物を入手する段階、を含んで成る方法により調製される。
【００１３】
ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物はまた、全培養液の抽出により調製されうる。
【００１４】
好ましくは、濃縮アルカリ性混合物と第一の水非混和性溶媒とを約ｐＨ８〜１１で混合する。当該ｐＨは好ましくは水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムで調節する。
【００１５】
好ましくは、第一又は第二の水非混和性溶媒は、Ｃ4〜Ｃ7エステル又はＣ4〜Ｃ7ケトンである。更に好ましくは、第一又は第二の水非混和性溶媒は、酢酸エチル、酢酸イソブチル、又は酢酸ｎ−ブチルのうちの少なくとも１つである。酢酸エチルが最も好ましい。
【００１６】
濃縮アルカリ性混合物と第一の水非混和性相とを混合した後に形成する水相は、好ましくは、第二の水非混和性溶媒と混合する前に少なくとも１回更に抽出される。
【００１７】
好ましくは、前記水相と第二の水非混和性溶媒とを約ｐＨ５〜６．５で混合する。当該ｐＨは、好ましくは硫酸、リン酸、又は塩酸のうちの少なくとも１つで調節される。
【００１８】
第二の水非混和性溶媒と混合した後に形成する水相は、好ましくは少なくとも１回更に抽出される。
【００１９】
かかる抽出の結果として生じる水非混和性相は、好ましくは結晶化前の蒸留により、更に好ましくは濾過により、そして最も好ましくは膜濾過により濃縮される。好ましい濾過膜はプラスチック濾過膜である。
【００２０】
ミコフェノール酸の結晶化は、好ましくは濃縮物を冷却することで実施する。
【００２１】
好ましい態様において、本発明の方法で単離したミコフェノール酸は、ＨＰＬＣ面積（％）により測定した場合、少なくとも約９９．５％の純度を有する。
【００２２】
本発明はまた、ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物を調製するための方法であって、ミコフェノール酸を含む発酵培養液を塩基性化し、そして菌糸を除去して塩基性混合物を入手すること；当該塩基性混合物を酸性化して酸性混合物を入手すること；そして当該酸性混合物を濾過し、塩基性化して濃縮アルカリ性混合物を入手すること、を含んで成る方法を包含する。
【００２３】
濾過は、好ましくは、膜濾過を用いて実施する。好ましい濾過膜は、セラミック膜又はプラスチック精密濾過（microfiltration）膜である。
【００２４】
好ましくは、菌糸は濾過で除去される。菌糸の好ましい除去方法は、精密濾過膜、真空濾過、ベルトフィルター、プレスフィルター、ナッツ（nuts）フィルター、遠心分離機、又は固体ボール遠心分離機を含む。
【００２５】
本発明は更に、ミコフェノール酸エステルの調製方法であって、ミコフェノール酸を含む濃縮アルカリ性混合物を準備し；当該混合物と第一の水非混和性溶媒とを混合して水相及び第一の水非混和性相を形成させ；当該水相を分離し；当該水相と第二の水非混和性溶媒とをｐＨ７未満で混合して水相及び第二の水非混和性相を形成させ；第二の水非混和性相を分離し；第二の水非混和性相を濃縮し；ミコフェノール酸を結晶化し；そして当該ミコフェノール酸をエステルに変換すること、を含んで成る方法に関する。
【００２６】
好ましくは、前記エステルはモルホリノエチルエステルである。更に好ましくは、当該エステルはＣ1〜Ｃ4アルキルエステルであり、そしてより好ましくはメチルエステル又はｔ−ブチルエステルである。
【００２７】
１つの態様において、本発明はまた、ＨＰＬＣ面積（％）で測定した場合、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．９％のの純度を有する固体のミコフェノール酸を包含する。
【００２８】
本発明は更に、約１４１．６℃〜約１４４．６℃の融点、より好ましくは約１４３．１℃の融点を有する固体のミコフェノール酸を包含する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本発明のミコフェノール酸又はそのエステル、及び医薬として許容される賦形剤を含んで成る医薬組成物を包含する。好ましいエステルはモルホリノエチルエステルである。
【００３０】
本発明はまた、免疫系の抑制が必要な哺乳類に、治療的に有効量の本発明の組成物を投与することにより当該哺乳類の免疫系を抑制する方法を包含する。
【００３１】
本発明の詳細な説明
本発明は、ミコフェノール酸の単離方法を包含する。本発明の単離方法は、約０．１％未満の各不純度を有するＭＰＡを製造することができる。更に具体的には、本発明は、この酸の濃縮アルカリ性混合物からミコフェノール酸を精製するための方法を包含する。当該酸を含有する濃縮アルカリ性混合物を発酵培養液から調製する方法も提供する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「混合物」には、不均質混合物又は均質混合物の両方、例えば溶液、懸濁液、又はスラリーが含まれる。不均質混合物は、例えば、抽出の間に形成されることがあり、ここで、ミコフェノール酸は溶媒中で塩基性化により溶解する。不均質混合物は他の不純物を含有することがあるので、透明な溶液は濾過せずには生じ得ない。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「アルカリ性」又は「塩基性」は、約７超のｐＨを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「酸性」は、約７未満のｐＨを意味する。
【００３５】
本明細書を通じて言及されるｐＨ値は、水相のｐＨを指す。
【００３６】
本明細書で使用する場合、単離前のミコフェノール酸の混合物に関しての用語「濃縮」は、約５ｇ／Ｌ以上のミコフェノール酸の濃度を意味する。発酵培養液の容積から算出して、約１／３容積以下の濃縮溶液又は不均質混合物が１容積の発酵培養液から得られる。
【００３７】
当業界で一般的に知られている発酵方法を使用してペニシリウム(penicillium)株からＭＰＡが得ることができ、例えば、ＧＢ１，１５７，０９９又はＪＰ５９０９１８９１において、発酵培養液を得る方法が例示されている。
【００３８】
濃縮混合物は、種々の方法により、例えば、全培養液抽出により発酵培養液から調製することができ、ここで、発酵培養液全体の抽出物が残渣へと濃縮される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、ミコフェノール酸の濃縮アルカリ性混合物を得るための方法を提供する。発酵培養液を最初に塩基性化し、続いて濾過により菌糸を除去することで濾液が得られる。続いて、当該濾液の酸性化によりＭＰＡの固化が引き起こされる。この段階において、結晶又は懸濁液が形成する。ＭＰＡの濃縮は、当業者に知られている任意のフィルター、例えば真空ドラムフィルター、精密濾過膜、ベルトフィルター、プレスフィルター、ナッツフィルター、遠心分離機、又は固体ボール遠心分離機を用いて達成される。濾過後、得られた固体又は懸濁液は、水性溶媒、好ましくは水に添加し、続いて、塩基性化することでＭＰＡのアルカリ水溶液を得ることができる。
【００４０】
好ましくは、発酵培養液は、最初に少なくともｐＨ８、より好ましくは約ｐＨ８〜１１に塩基性化される。
【００４１】
好ましくは、前記濾液は約ｐＨ６未満、より好ましくは約ｐＨ４〜５．５に酸性化される。
【００４２】
当業界で知られている一般的な濾過方法を発行培養液の濾過のために、又は前記方法の他の段階の間に使用することができる。１つの態様において、濾過は、精密濾過膜、例えばセラミック膜又はプラスチック精密濾過膜を用いることで実施される。好ましくは、精密濾過膜技術は、濃縮ミコフェノール酸溶液又は懸濁液を得るための経済的な方法である。
【００４３】
任意の適当なセラミック精密濾過膜、例えば、実施例４において例示されているものも使用することができる。セラミック膜は、Atech Innovations Gmbh (Gladbeck, Germany)、US Filter (Sturbridge, MA)、CeraMem Corporation (Waltham, Massachusetts)、又はPALL (East Hills, NY)等の会社からも得ることができる。精密濾過に適した任意の孔径を使用することができる。好ましくは、孔径は約５０ｎｍ〜約５０００ｎｍであり、より好ましくは約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍである。セラミック膜は、例えば、アルファ−アルミナ、シリカ又はシリコンカーバイドのような材料から作ることができる。通常、当該膜は筒状であるが、断面が四角(quadratic)であってもよい。
【００４４】
別の態様においては、プラスチック精密濾過膜が使用される。任意の適当なプラスチック精密濾過膜、例えば実施例５及び６に例示したものを使用してもよい。孔径、膜材料、又は形状は使用するプラスチック精密濾過膜のタイプによって変化することがある。例えば、ＫＯＣＨ(Wilmington, MA)により作られた膜ＭＦＫ−６１７は約５００ｎｍ未満の孔径を有する。膜ＭＦＫ−６１７は管状であり、そしてＰＥＳから作られている。ＫＯＣＨにより作られた膜ＨＦＭ−１８０は約２５０，０００Ｄのカットオフ値を有し、これは約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍの孔径に等しい。ＨＦＭ−１８０は筒状であり、そしてＰＶＤＦから作られている。
【００４５】
中空繊維型膜も適しており、例えばＰＭ−１００又はＰＭ−５００であり、共にＫＯＣＨにより製造されている。いずれの膜もＰＳで作られている。ＰＭ−１００の分子量カットオフ値は１００，０００Ｄである。ＰＭ−５００のカットオフ値は５００，０００Ｄである。
【００４６】
濃縮アルカリ性混合物を調製した後、上記方法により又は全培養液抽出により、本発明は、当該混合物からミコフェノール酸を単離するための効率的な方法を提供する。
【００４７】
ＭＰＡは、水非混和性溶媒を用いた水性濃縮アルカリ性混合物の抽出により単離されうる。１つの態様において、ＭＰＡは、水非混和性溶媒を用いた、好ましくは塩基性のｐＨでの、濃縮混合物の第一抽出により、アルカリ溶液中の不純物を除去して、続いて、好ましくは酸性ｐＨでの第二抽出により、ＭＰＡ／有機溶媒の溶液を得ることで単離される。
【００４８】
１つの態様において、ＭＰＡは、水性濃縮アルカリ性混合物と水非混和性溶媒とを混合して水相を形成させ、当該水相を分離し、当該水相と水非混和性溶媒とを約７未満のｐＨで混合して水相及び水非混和性相を形成させ、当該水非混和性相を分離し、当該水非混和性相を濃縮し、そして濃縮物からミコフェノール酸を結晶化することにより単離される。
【００４９】
不純物は、水非混和性有機溶媒を用いたアルカリ性の溶液又は混合物の第一抽出から除去されうる。好ましくは、第一抽出は、塩基性ｐＨ、好ましくは少なくとも約８のｐＨ、より好ましくは約８．３〜約９．２のｐＨで行われる。この抽出段階は好ましくは少なくとも２回実施される。
【００５０】
第一抽出の後、水相は、水非混和性有機溶媒を用いた第二抽出のために、約７未満、好ましくは約５〜約６．５のｐＨに酸性化されることがあり、この結果、ミコフェノール酸／当該有機溶媒の溶液が得られる。第二抽出はまた繰り返されることがある。好ましくは、抽出した有機相は一緒にされる。
【００５１】
本発明に係るミコフェノール酸の単離方法は、ＭＰＡの不純物及び関連物質の効率的な除去を提供する。一連のアルカリ抽出と酸抽出を実施することで、ＭＰＡは更に容易に、且つ高レベルの純度で得られる。
【００５２】
ミコフェノール酸は溶液から結晶化により回収されうる。結晶化の前に、当該溶液は濃縮されうる。例えば、当該溶液はエバポレーションで濃縮されうる。エバポレーションは周囲圧又は減圧下で、あるいは、任意に加熱することにより、例えば還流温度で加熱することにより実施してもよい。当該溶液はまた、膜濾過で濃縮してもよい。好ましくは、当該溶液は雰囲気圧で又は減圧下で蒸留することで濃縮される。用語「減圧」とは、１気圧未満、好ましくは約１００ｍｍＨｇ未満の圧力を指す。好ましくは、当該溶液は約１００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００ｇ／Ｌに濃縮される。
【００５３】
前記溶液からのミコフェノール酸の結晶化は、好ましくは、冷却により実施される。好ましくは、酢酸エチルのような溶媒からの結晶化が、前記溶液を約０℃〜約−２０℃、より好ましくは約−１０℃の温度に冷却することでなされる。結晶化に適した他の溶媒としては、限定しないが、酢酸イソブチル、アセトン、イソプロパノール、水（高温）、トルエン／アセトン混合物、エタノール／水混合物又はメタノール／水混合物、通常Ｃ3〜Ｃ7エステル又はＣ3〜Ｃ7ケトン、あるいはＣ1〜Ｃ4アルコールが含まれる。前記溶媒は、結晶化前にミコフェノール酸を溶解するために適当な温度で加熱してもよい。例えば、水が結晶化溶媒として使用される場合、水は少なくとも約５０℃に加熱されうる。
【００５４】
回収した結晶は、好ましくは、約５０℃〜約７０℃の温度で乾燥されうる。好ましくは、当該結晶は、減圧下、すなわち、１気圧未満、好ましくは約１００ｍｍＨｇ未満の圧力のもとで乾燥される。任意に、当該結晶は再結晶化してもよい。再結晶化は、任意に、最初に活性炭で処理した後に実施してもよい。
【００５５】
塩基性のｐＨは、好ましくは水酸化アンモニウム又は他の適当な塩基を用いて得ることができる。塩基の例には、例えば、有機性アミン、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、又はアルカリ(alkali若しくはalkaline)土類金属炭酸塩又は炭酸水素塩が含まれる。塩基の具体例には、例えば、１，８−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ナフタレン、トリエチルアミン、ナトリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム又は塩基性アルミニウムが含まれる。好ましい塩基は水酸化アンモニウムである。
【００５６】
酸性ｐＨは、溶液のｐＨを調節するのに適した酸、例えば、硫酸、リン酸又は塩酸を用いて得られる。好ましい酸には、硫酸又はリン酸が含まれる。
【００５７】
水非混和性有機溶媒は、独立して、各抽出段階で選択されうる。ＭＰＡの抽出に適した任意の水非混和性溶媒が使用されうる。適当な溶媒の例には、限定しないが、Ｃ4〜Ｃ7エステル又はケトンが含まれる。更に具体的には、適当なエステルは、一般式Ｒ1−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＨ又は直鎖若しくは分枝Ｃ１−６アルキルであり、そしてＲ2は直鎖又は分枝Ｃ１−６アルキルである）を有する。適当なエステルの例には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔ−ブチル、ギ酸メチル、ギ酸ｎ−プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ｎ−ブチル、又はギ酸イソブチルが含まれる。更に具体的には、適当な脂肪族ケトンは一般式Ｒ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、それぞれ１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキルである）を有する。脂肪族ケトンの例には、限定しないが、メチルエチルケトン又はメチルイソブチルケトンが含まれる。更に、ジクロロメタン又はジクロロメタンのような溶媒も使用することができる。
【００５８】
本発明のミコフェノール酸は、アッセイで１００％を示す。アッセイとは、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）で説明されているようなある物質の純度又は量の存在についての決定を指す。European Pharmacopoeia, 4th Ed, Council of Europe, Strasbourg, 2001。当該アッセイは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で実施される。
【００５９】
１つの態様において、本発明は、約１４１．６℃〜約１４４．６℃、好ましくは約１４３．１℃の融点を有するＭＰＡを提供する。
【００６０】
１つの態様において、本発明は、少なくとも約９９．５％、より好ましくは少なくとも約９９．９％の純度を有するＭＰＡを提供する。好ましくは、当該ＭＰＡは、ＨＰＬＣ面積（％）で測定した場合、全不純物含量が約０．２％未満、より好ましくは０．０８％未満である。
【００６１】
本明細書で調製されるミコフェノール酸は、エステル、例えば、Ｃ1〜Ｃ4アルキルエステル、例えば、メチル、エチル又はｔ−ブチルエステルに変換されうる。好ましい態様は当該酸のモルホリノエチルエステルである。ミコフェノール酸のエステル化は、当業界で知られている方法により実施されうる。例えば、米国特許第４，７５３，９３５号、第５，５４３，４０８号及び第５，２４７，０８３号、ＷＯ００／３４５０３、及びＷＯ０２／１００８５５を参照のこと。
【００６２】
本発明の医薬製剤は、ミコフェノール酸又はそのエステル若しくは塩を含む。本発明はまた、治療的に有効量の医薬組成物を必要とする哺乳類に投与することで哺乳類の免疫系を抑制する方法を包含する。
【００６３】
前記医薬組成物は、わずかに１つの多型、又は種々の結晶形を含むことがあり、これは非晶形を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１又は複数の賦形剤又は補助剤を含んでもよい。賦形剤の選択及び使用量は、経験、並びに当業界の標準的手順及び参考資料の熟考に基づいて製剤学者により容易に決定されうる。
【００６４】
希釈剤は、固体医薬組成物の嵩を増大させ、且つ当該組成物を含有する医薬剤形を患者及び介護士が取り扱い易いものにする。固体組成物用の希釈剤には、例えば、微晶性セルロース(例えばAvicel（登録商標）)、超微粒セルロース、ラクトース、デンプン、アルファー化デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、糖、デキストレート、デキストリン、デキストロース、第二リン酸カルシウム二水和物、第三リン酸カルシウム、カオリン、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マンニトール、ポリメタクリレート(例えば、Eudragit（登録商標）)、塩化カリウム、粉末状セルロース、塩化ナトリウム、ソルビトール及びタルクが含まれる。
【００６５】
錠剤のような剤形に圧縮された固体の医薬組成物は、圧縮後に活性成分及びその他の賦形剤相互の結合の補助等の機能をもつ賦形剤を含んでもよい。固体医薬組成物用の結合剤には、アカシア、アルギン酸、カルボマー（例えば、カルボポール）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、グアールゴム、硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Klucel（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えばMethocel（登録商標））、液体グルコース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポビドン（例えばKollidon（登録商標）、Plasdone（登録商標））、アルファー化デンプン、アルギン酸ナトリウム及びデンプンが含まれる。
【００６６】
圧縮された固体医薬組成物の患者の胃内での溶解速度は、当該組成物に対する崩壊剤の添加によって増大させることができる。崩壊剤としては、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えばAc-Di-Sol（登録商標）、Primellose（登録商標）)、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン（例えばKollidon（登録商標）、Polyplasdone（登録商標）)、グアールゴム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、微晶性セルロース、ポラクリリンカリウム、粉末状セルロース、アルファー化デンプン、アルギン酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン（例えばExplotab（登録商標）)及びデンプンが含まれる。
【００６７】
非圧縮固体組成物の流動特性を改善し且つ投与の精度を改善するために流動促進剤を添加することができる。流動促進剤として機能する賦形剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、マグネシウム三ケイ酸、粉末状セルロース、デンプン、タルク及び第三リン酸カルシウムが含まれる。
【００６８】
錠剤のような剤形が、粉末状組成物の圧縮により作られる場合、該組成物はパンチ及びダイからの圧力に付される。一部の賦形剤及び活性成分は、パンチ及びダイの表面に付着する傾向を有し、こうして製品に圧痕及びその他の表面凹凸を発生させる可能性がある。付着を軽減しダイから製品を容易に放出させるために潤滑剤を組成物に添加することができる。潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化ヒマシ油、硬化植物油、鉱油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、タルク及びステアリン酸亜鉛が含まれる。
【００６９】
着香剤及び調味料によって、剤形は患者にとって飲みやすいものになる。本発明の組成物中に含まれ得る医薬品用の一般的な着香剤及び調味料には、マルトール、バニリン、エチルバニリン、メンソール、クエン酸、フマル酸、エチルマルトール及び酒石酸がある。
【００７０】
固体及び液体組成物は同様に、その外観を改善し、そして／あるいは患者がその製品及び単位用量レベルを容易に識別できるようにするために任意の医薬として許容される着色料を用いて着色することもできる。
【００７１】
本発明の液体医薬組成物中、ＭＰＡ及び任意の他の固体賦形剤は、水、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリンのような液体担体中に溶解又は懸濁させられる。
【００７２】
液体医薬組成物は、液体担体中に不溶の活性成分又はその他の賦形剤を組成物全体の中に均質に分散させるための乳化剤を含んでもよい。本発明の液体組成物中において有用であり得る乳化剤としては、例えば、ゼラチン、卵黄、カゼイン、コレステロール、アカシア、トラガカント、コンドルス、ペクチン、メチルセルロース、カルボマー、セトステアリルアルコール及びセチルアルコールが含まれる。
【００７３】
本発明の液体医薬組成物は同様に、生成物の口当たりを改善しかつ／又は消化管の内面を被覆するための粘性強化剤を含んでもよい。かかる粘性強化剤には、アカシア、アルギン酸ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースカルシウム又はナトリウム、セトステアリルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ゼラチングアールゴム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリビニルアルコール、ポビドン、炭酸プロピレン、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、デンプントラガカント及びキサンタンガムが含まれる。
【００７４】
風味を改善することを目的として、ソルビトール、サッカリン、サッカリンナトリウム、スクロース、アスパルテーム、フルクトース、マンニトール及び転化糖のような甘味剤を添加してもよい。
【００７５】
保存安定性を改善することを目的として、アルコール、安息香酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール及びエチレンジアミン三酢酸のような保存料及びキレート剤を、摂取にとって安全なレベルで添加してもよい。
【００７６】
本発明によると、液体組成物は、同様に、グルコン酸、乳酸、クエン酸又は酢酸、グルコン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムのような緩衝剤を含んでもよい。
【００７７】
本発明の固体組成物としては、粉末、顆粒、凝集体及び圧縮組成物が含まれる。剤形には、経口、口腔内、直腸内、非経口（例えば、皮下、筋肉内及び静脈内）、吸入及び点眼投与に適した剤形が含まれる。任意な所定の場合において最も適した経路は、治療すべき身体条件の性質及び重度に左右されることになるが、本発明の最も好適な経路は経口である。投与量は、単位剤形の体裁をとっているのが都合良く、医薬業界において周知の方法のいずれかにより調製し得る。
【００７８】
剤形には、錠剤、粉末、カプセル、座薬、サシェ、トローチ及びロゼンジなどを含む固体剤形並びに液体シロップ、懸濁液及びエリキシル剤が含まれる。
【００７９】
本発明の剤形は、前記組成物、好ましくは本発明の粉末状又は顆粒状固体組成物を硬質又は軟質いずれかのシェル内に含有するカプセルであってもよい。当該シェルはゼラチン製であって良く、任意にはグリセリン及びソルビトールのような可塑剤、及び不透明化剤又は着色料を含有してもよい。
【００８０】
活性成分及び賦形剤は、当業界で知られている方法に従い組成物及び剤形へと製剤化されうる。
【００８１】
錠剤化用又はカプセル充填用の組成物を、湿式造粒により調製することができる。湿式造粒では、粉末形態の活性成分及び賦形剤の一部又は全部を配合し、次に液体、典型的には水の存在下でさらに混合して、粉末を顆粒状に凝集させる。顆粒を篩い分け及び／又は粉砕し、乾燥させかつその後さらに、所望の粒度になるまで篩い分け及び／又は粉砕する。次に顆粒は、錠剤化するかそうでなければ錠剤化に先立ち流動促進剤及び又は潤滑剤のようなその他の賦形剤を添加することができる。
【００８２】
錠剤化組成物は、従来の通り乾式配合により調製され得る。例えば、活性成分及び賦形剤の配合された組成物を、小塊又はシート状に圧縮し、次に圧縮して顆粒に砕くことができる。圧縮された顆粒を、引き続き錠剤に圧縮することができる。
【００８３】
乾式造粒に代えて、直接圧縮技術を用いて、配合された組成物を直接圧縮剤形に圧縮することができる。直接圧縮は、顆粒の無いより均質な錠剤を生成する。直接圧縮錠剤化に特に良好に適合した賦形剤としては、微晶性セルロース、スプレー乾燥ラクトース、リン酸カルシウム二水和物及びコロイド状シリカが含まれる。これらの及びその他の賦形剤の直接圧縮錠剤化における適正な使用は、直接圧縮錠剤化に関する特定の処方上の課題について技能と経験を有する当業者にとっては既知のことである。
【００８４】
本発明のカプセル充填物は、最終的な錠剤化段階に付されることがない点を除き、錠剤化に関連して記述された前述の配合物及び顆粒のうちのいずれかを含んで成ることもある。
【実施例】
【００８５】
分析用ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣ分析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｃｉａｎｏ又はＺｏｒｂａｘ  Ｃ8カラムを用いて実施した。溶出剤は、リン酸及びリン酸のカリウム塩を含む水−アセトニトリル混合物である。リン酸のトリエチルアミン塩をリン酸のカリウム塩の代わりに使用してもよい。溶出のｐＨは３．０〜５．９とした。溶出のフローは、約１．５ｍｌ／分とした。溶出温度は２０〜４５℃とした。
【００８６】
実施例１：ミコフェノール酸の精製
（６２０ｋｇの発酵培養液から生成した）１４０ｋｇの濃縮ミコフェノール酸懸濁液は、８００ｍｌの濃縮水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨ８．３〜８．５に調節した。このアルカリ溶液を８０リットルの酢酸エチルで精製した。酢酸エチルを前記アルカリ溶液と混合し、３０分間攪拌し、そして相を分離させた。
【００８７】
得られた（１４７ｋｇの）水相に対し、８０Ｌの酢酸エチルを添加した。ｐＨは硫酸で５．８に調節し、３０分間攪拌し、そして相分離した。
【００８８】
得られた（１５０ｋｇの）水相に対し、４０Ｌの酢酸エチルを添加した。ｐＨは硫酸で５．９に調節し、３０分間攪拌し、そして相分離した。
【００８９】
２つの酸性の抽出物の酢酸エチル相を一緒にし、そして約２００ｇ／Ｌの濃度に最大７０℃で減圧下濃縮した。濃縮した酢酸エチル溶液を６０〜６５℃に加熱し、約３℃／時間の冷却速度で−１０℃に冷却し、そして１８時間−１０℃で結晶化させた。結晶を濾過し、そして冷却した酢酸エチルでカバーウォッシュした。結晶を最大７０℃で減圧下乾燥させた。結晶の質量：１２５０ｇ。アッセイ：９９．０％。
【００９０】
結晶は、活性炭で処理した後に酢酸エチルから再結晶化した。再結晶化した生成物はアッセイで９９．６％を示す。当該結晶のＨＰＬＣ純度は９９．８％である。いずれの不純物も０．１％未満である。
【００９１】
実施例２：ミコフェノール酸の精製
（４２０ｋｇの発酵培養液から生成した）１１９．４ｋｇの濃縮ミコフェノール酸懸濁液に対し、７１．６リットルの酢酸エチルを添加した。ｐＨは濃アンモニウム溶液を用いてｐＨを９．１に調節し、３０分間攪拌し、そして相を分離させた。
【００９２】
（１２６．８ｋｇの）水相に対し、６３．４Ｌの酢酸エチルを添加した。ｐＨは濃アンモニウム溶液を用いてｐＨを９．１〜９．２に調節し、３０分間攪拌し、そして相を分離させた。
【００９３】
得られた（１２９．５ｋｇの）水相に対し、７１．６Ｌの酢酸エチルを添加した。ｐＨは硫酸で５．６〜５．７に調節し、３０分間攪拌し、そして相分離した。
【００９４】
２つの酸性の抽出物の酢酸エチル相を一緒にし、そして約２００ｇ／Ｌの濃度に最大７０℃で減圧下濃縮した。
【００９５】
濃縮した酢酸エチル溶液を６０〜６５℃に加熱し、約３℃／時間の冷却速度で−１０℃に冷却し、そして３時間−１０℃で結晶化させた。結晶を濾過し、そして冷却した酢酸エチルでカバーウォッシュした。結晶を最大７０℃で減圧下乾燥させた。結晶の質量：５５３ｇ。アッセイ：９８．２％。
【００９６】
結晶は、活性炭で処理した後に酢酸エチルから再結晶化した。再結晶化した生成物はアッセイで９９．２％を示す。当該結晶のＨＰＬＣ純度は９９．７％である。いずれの不純物も０．１％未満である。
【００９７】
実施例３：濃縮ミコフェノール酸の調製
発酵培養液（１５ｋｇ）をｐＨ８．０〜１１．０に調節した。アルカリ性の発酵培養液を濾過し、そして濾過した菌糸を水で洗浄した。濾液は３７．６ｋｇであった。９１．１％の発酵した活性物質を濾液で得た。濾液のｐＨを硫酸でｐＨ２．０〜２．２に調節した。濾過助剤（パーライト）を酸性の濾液に添加し、そして沈殿物を濾過した。濾過した沈殿物を５リットルの水の中で懸濁し、そしてこの懸濁液のｐＨを水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８．０〜１１．０に調節した。このアルカリ性の懸濁液を濾過し、そして洗浄して８リットルのアルカリ性の濾液を得た。
【００９８】
このアルカリ性の懸濁液は、ミコフェノール酸の精製のために、例えば実施例１又は２において使用する。
【００９９】
実施例４：濃縮ミコフェノール酸の調製
発酵培養液（４５ｋｇ）をｐＨ８．０〜１１．０に調節した。アルカリ性の発酵培養液を濾過し、そして濾過した菌糸を水で洗浄した。濾液は１１３．７ｋｇであった。９３．２％の発酵した活性物質を濾液で得た。濾液のｐＨを希釈したリン酸でｐＨ４．０〜４．５に調節した。懸濁液を、１００ｎｍ〜２５０ｎｍの孔径の精密濾過セラミック膜で濾過した。濃縮懸濁液（約１０リットル）を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．５〜１１．０に調節した。
【０１００】
このアルカリ性の懸濁液は、ミコフェノール酸の精製のために、例えば実施例１又は２において使用する。
【０１０１】
実施例５：濃縮ミコフェノール酸の調製
発酵培養液（２２０ｋｇ）をほぼｐＨ８．０に調節した。発酵培養液を精密濾過膜プラスチック膜（例えば、ＫＯＣＨのＭＦＫ−６１７及びＨＦＭ−１８０）により濾過した。濾過の間の希釈のために水を連続して添加した。１１００ｋｇの濾液が得られた。濾過した培養液を約ｐＨ４．０に調節し、そして結晶懸濁液を約７０リットルに濃縮した。濃縮酸性懸濁液のｐＨを続いて７．５〜１１．０のアルカリ性のｐＨに調節した。
【０１０２】
このアルカリ性の懸濁液は、ミコフェノール酸の精製のために、例えば実施例１又は２において使用する。
【０１０３】
実施例６：ミコフェノール酸の調製
１４ｍ3の採集した発酵培養液に対し、同容積の飲料水を添加し、続いて１６８リットル（１．２％）の濃アンモニア溶液を添加した。出発時の発酵培養液の１重量％の濾過助剤（パーライト）を添加し、そしてｐＨを、８５％の濃リン酸溶液（約１００リットル）を添加することで８．０〜８．５の間に調節した。処理した培養液は、周囲温度で攪拌せずに少なくとも６時間維持した。濾過は、飲料水によるカバーウォッシュの間に真空ドラムフィルター上で実施した。４２ｍ3の濾液を回収した。発酵培養液の濾液からの収率は約９０％であった。
【０１０４】
濾過した発酵培養液のｐＨは、２０％硫酸溶液（約３０リットル）を添加することで調節した。少なくとも３時間経過した後に、沈殿した粗製結晶を濾過し、そして精密濾過膜（ＫＯＣＨのＭＦＫ−６１７）上で濃縮した。ｐＨ調節済みの４２ｍ3の濾過した発酵培養液を１／４０の容積に濃縮した（約１．０〜１．２ｍ3）。濾過時間は約６０時間であった。濃縮溶液を約２ｍ3の酸性水で希釈し、そしてこの溶液を再び１．０〜１．２ｍ3に濃縮した、濃縮溶液を除去した後、前記装置を０．３〜０．５ｍ3の酸性飲料水で洗浄した。沈殿及び濃縮による収率は約８０％である。
【０１０５】
１．０〜１．２ｍ3の濃縮液と０．３〜０．５ｍ3の酸性飲料水を一緒にし、０．５〜０．６倍量の酢酸エチルを添加し（約０．８ｍ3）、そしてｐＨを濃アンモニア溶液で９．０〜９．２の間に調節した。抽出は３０分間実施し、そしてｐＨは９．０〜９．２の間に調節した。続いて相を分離した。
【０１０６】
水相に対し、０．５〜０．６倍量の酢酸エチル（約０．８ｍ3）を再び添加し（一まとめにした酸性濃縮液の量に対して算出したもの）、そしてｐＨを濃アンモニア溶液／２０％硫酸溶液で９．０〜９．２の間に調節した。抽出は３０分間実施し、そしてｐＨは９．０〜９．２の間に調節した。続いて相を分離した。
【０１０７】
水相に対し、０．５〜０．６倍量の酢酸エチルを添加し（一まとめにした酸性濃縮液の量に対して算出したもの）、そしてｐＨを２０％硫酸溶液で５．８〜６．１の間に調節した。抽出は３０分間実施し、そしてｐＨは５．８〜６．１の間に調節した。続いて相を分離した。
【０１０８】
水相に対し、０．２５〜０．３倍量の酢酸エチルを添加し（一まとめにした酸性濃縮液の量に対して算出したもの）、そしてｐＨを濃アンモニア溶液で６．３〜６．５の間に調節した。抽出は３０分間実施し、そしてｐＨは６．３〜６．５の間に調節した。続いて相を分離した。
【０１０９】
第三及び第四の酢酸エチル相を一まとめにし、そして約２００ｇ／Ｌ（一まとめにした相の蒸発残渣に基づいたもの）になるまで約７０℃で減圧下蒸発させた。蒸発の最終容積は約１５０リットルであった。抽出及び蒸発からの収率は約９０％であった。
【０１１０】
酢酸エチル濃縮液（約１５０リットル）を−１０℃〜−１７℃に冷却し（冷却速度約３℃／時間）、そしてこの温度で少なくとも２時間結晶化した。結晶を４５リットルの冷却した酢酸エチルで洗浄し、そして最大７０℃で減圧下乾燥させた。結晶の質量は約２５ｋｇであった。結晶からの収率は約８７％であった。
【０１１１】
前記結晶（２５ｋｇ）を１０倍の質量：容積（２５０リットル）の酢酸エチル中で６０〜６５℃で溶解させた。この溶液を活性炭で処理し、続いて濾過した。ミコフェノール酸を−１０℃〜−１７℃で結晶化させ、そしてこの結晶を濾過し、そして７５リットルの酢酸エチルを用い−１０℃〜−１７℃でカバーウォッシュした。当該結晶を最大７０℃で減圧下乾燥させた。最終結晶化からの収率は約９０％であった。
【０１１２】
実施例７：ミコフェノール酸の精製
発酵培養液を３つに分けた（３ｘ２２５ｋｇ）。
【０１１３】
最初の２２５ｋｇの発酵培養液に大使、同一容積の水、続いて１．２％の濃アンモニア溶液（当該発酵培養液の質量に対し算出した）を添加し、そしてｐＨを２０％リン酸溶液を添加することで８．０〜８．５に調節した。処理済の培養液を攪拌せずに約６時間維持し、そして精密濾過膜（ＫＯＣＨのＭＦＫ−６１７及びＨＦＭ−１８０）で４０〜４３℃で濾過した。水を希釈のために濾過の間連続して添加した。１１２５ｋｇの濾液が得られた。
【０１１４】
前記濾液のｐＨを、２０％硫酸を添加することで４．０〜４．５に調節した。約３時間後、結晶懸濁液を約７０リットルの容積に濃縮した。濃縮したミコフェノール酸結晶懸濁液（約７０リットル）を回収し、そして精密濾過フィルターを７０リットルの水を用い、当該水を循環させて洗浄した。洗浄液（約７０リットル）についても回収した。
【０１１５】
酸性濃縮液の透過液を、濃アンモニア溶液の添加によりｐＨ８．０〜８．５に調節し、そして次の２２５ｋｇの発酵培養液の希釈及び濾過に使用した。
【０１１６】
第二（２２５ｋｇ）及び第三（２２５ｋｇ）の発酵培養液の濾過及び酸性の沈殿物の濃縮は、第三の酸性沈殿物（４．０〜４．５）の濃縮後に約７０リットルの第一及び７０リットルの第二濃縮液を一緒にし、そして全量を１００ｋｇに濃縮したことを除き、上述したものと同様の方法で実施した。結晶懸濁液を回収し、そして７０リットルの水で洗浄して７４リットルの洗浄液を得た。濃縮液と洗浄液を一まとめにした。
【０１１７】
１７４ｋｇの濃縮ミコフェノール酸懸濁液（６７５ｋｇの発酵培養液から生成）に対し、１０４．４リットルの酢酸エチルを添加し、そしてｐＨを濃アンモニア溶液で９．１に調節した。攪拌を３０分間行い、そして相を分離した。水相（１８３ｋｇ）に対し、１０４．４リットルの酢酸エチルを添加した。ｐＨを濃アンモニア溶液で９．２に調節し、そして攪拌を３０分間行い、そして相を分離した。
【０１１８】
得られた水相（１８５．４ｋｇ）に対し、１０４．４リットルの酢酸エチルを添加し、そしてｐＨを硫酸で５．９〜６．０に調節した。攪拌を３０分間行い、そして相を分離した。得られた水相（１７６．４ｋｇ）に対し、４３．５リットルの酢酸エチルを添加した。ｐＨを濃アンモニア溶液で６．４に調節し、攪拌を３０分間行い、そして相を分離した。２つの酸性抽出物の酢酸エチル相を一まとめにし、そして約２００ｇ／Ｌ濃縮液に約７０℃で減圧下濃縮した。濃縮した酢酸エチル溶液を６０〜６５℃に加熱し、約３℃／時間の冷却速度で−１０℃に冷却し、そして８時間−１０℃で結晶化した。結晶を濾過し、冷却した酢酸エチルでカバーウォッシュし、そして最大７０℃で減圧下乾燥させた。結晶の質量：９７０ｇ。アッセイ：９９．４％。
【０１１９】
結晶を活性炭による処理後に酢酸エチルから再結晶化させた。この結晶のＨＰＬＣ純度は９９．８％である。あらゆる不純物が０．１％未満である。
【０１２０】
実施例８：ミコフェノール酸の精製
ミコフェノール酸は、ｐＨ９．０〜９．２で３回精製する点を除き、実施例７と同様の方法で精製する。
【０１２１】
最終的な結晶のアッセイは１００．０％である。合計の不純物含量は０．０７％である。
【０１２２】
実施例９：ミコフェノール酸
実施例８由来の最終生成物の融点は１４３．１℃であった。
【０１２３】
Ｘ線粉末回折パターンを図１に例示する。
【０１２４】
実施例１０：ミコフェノール酸
実施例８を繰り返した。最終生成物の融点は１４３．１℃であった。
【０１２５】
Ｘ線粉末回折パターンを図２に例示する。
【０１２６】
上述のように本発明を特定の好ましい態様及び具体例を参照して説明してきたが、当業者であれば、本明細書に開示してあるような本発明の精神及び範囲を逸脱しない、上文で説明して例示した発明に対する修飾を理解することができるであろう。実施例は、本発明を理解する助けとなるように記載されているが、これらは本発明の範囲を限定することを何ら意図しておらず、そしてそのように解釈されるべきではない。当該実子理恵は常用の方法については詳細な説明を含んでいない。そのような方法は当業者にとって周知であり、そして多数の刊行物に記載されている。本明細書で言及した全ての引用文献が引用によりそれらの全体が組み入れられる。
【０１２７】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例９で製造したミコフェノール酸の試料の粉末ＸＲＤパターンである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに対応する粉末ＸＲＤ値の表である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１０で製造したミコフェノール酸の試料の粉末ＸＲＤパターンである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａに対応する粉末ＸＲＤ値の表である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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