(57)【要約】  本発明は、ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤の同定方法に関し、本方法は、ａ）ＰＫＣ−ζと、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドの少なくとも１種とを、少なくとも１種の推定の阻害剤の存在下で接触させる工程、および、ｂ）ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＰＫＣ−ζと、少なくとも１種の、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドとを、少なくとも１種の想定される阻害剤の存在下で接触させる工程、および、
ｂ）ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
を含む、ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤の同定方法。
【請求項２】
少なくとも１種の想定される阻害剤の非存在下におけるリン酸化と比較して減少しているＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化は、想定される阻害剤の阻害特性に関する指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＫＣ−ζは、哺乳動物由来、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来、より好ましくはラットまたはヒト由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＲＳペプチドは、哺乳動物由来の、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来の、より好ましくはラット由来のＩＲＳ、好ましくはＩＲＳ−１から誘導される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＩＲＳ−１は、ラット由来であり、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ４５８、４６９、４８１、４９８、５２２、５２６、５３０、５３６、５３８、５３９、５４２、５６０、５７０、５７７、５９９、６００、６１２、６２０、６３２、６３５、６６２、および、６６４からなる群より選択され、配列番号は、配列番号１６に示されるラットＩＲＳ−１に相当する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612からなる群より選択され、好ましくはＳｅｒ570である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドは、ｒＩＲＳ−１449-664（配列番号１７）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
阻害剤は、抗体、結合ペプチド、低分子量の化合物（ＬＭＷ）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）ＰＫＣ−ζを、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドの少なくとも１種とを、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を含む想定されるアゴニストの少なくとも１種の存在下で接触させること、および、
ｂ）想定されるアゴニストのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化を測定すること、
を含む、ＩＲＳアゴニストの同定方法。
【請求項１０】
ＩＲＳペプチドのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化と比較して増加しているアゴニストのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化は、想定されるアゴニストの特性に関する指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＫＣ−ζは、哺乳動物由来、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来、より好ましくはラット由来である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＲＳペプチドは、哺乳動物由来の、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来の、より好ましくはラット由来のＩＲＳ、好ましくはＩＲＳ−１から誘導される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＲＳは、ラット由来であり、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ４５８、４６９、４８１、４９８、５２２、５２６、５３０、５３６、５３８、５３９、５４２、５６０、５７０、５７７、５９９、６００、６１２、６２０、６３２、６３５、６６２、および、６６４からなる群より選択され、配列番号は、配列番号１６に示されたラットＩＲＳに相当する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612からなる群より選択され、、好ましくはＳｅｒ570である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドは、ｒＩＲＳ−１449-664（配列番号１７）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）ＰＫＣ−ζを、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドの少なくとも１種とを、少なくとも１種の想定される阻害剤の存在下で接触させる工程、および、
ｂ）ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
を含む、ＰＫＣ−ζ活性の決定方法。
【請求項１７】
ＰＫＣ−ζは、哺乳動物由来、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来、より好ましくはラット由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＲＳペプチドは、哺乳動物由来の、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来の、より好ましくはラット由来のＩＲＳ、好ましくはＩＲＳ−１から誘導される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＲＳは、ラット由来であり、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ４５８、４６９、４８１、４９８、５２２、５２６、５３０、５３６、５３８、５３９、５４２、５６０、５７０、５７７、５９９、６００、６１２、６２０、６３２、６３５、６６２、および、６６４からなる群より選択され、配列番号は、配列番号１６に示されたラットＩＲＳに相当する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612からなる群より選択され、好ましくはＳｅｒ570である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドは、ｒＩＲＳ−１449-664（配列番号１７）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｓｅｒ570、好ましくはＩＲＳ−１449-664を含むＩＲＳ−１ペプチド。
【請求項２３】
ａ）少なくとも１種のＩＲＳペプチド、
ｂ）ＰＫＣ−ζ調製物、および
ｃ）場合により、少なくとも１種の想定されるＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニスト、
を含むキット。
【請求項２４】
ＰＫＣ−ζは、哺乳動物、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来、より好ましくはラット由来である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
ＩＲＳペプチドは、哺乳動物由来の、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来の、より好ましくはラット由来のＩＲＳ、好ましくはＩＲＳ−１から誘導される、請求項２３または２４に記載のキット。
【請求項２６】
ＩＲＳは、ラット由来であり、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ４５８、４６９、４８１、４９８、５２２、５２６、５３０、５３６、５３８、５３９、５４２、５６０、５７０、５７７、５９９、６００、６１２、６２０、６３２、６３５、６６２、および、６６４からなる群より選択され、配列番号は、配列番号１６に示されたラットＩＲＳに相当する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612からなる群より選択され、好ましくはＳｅｒ570である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
ペプチドは、ｒＩＲＳ−１449-664（配列番号１７）である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
Ｓｅｒ570および／またはＳｅｒ612は、好ましくはアラニンに突然変異している、ＩＲＳ−１ペプチド。
【請求項３０】
好ましくはＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位に対する抗体、好ましくはＳｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612に対する抗体、より好ましくはＳｅｒ570に対する抗体を生産するための、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＩＲＳペプチドの使用。
【請求項３１】
ＩＩ型糖尿病を治療用医薬組成物を製造するための、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＩＲＳペプチド、または、請求項２９に記載のＩＲＳ−１ペプチドの使用。
【請求項３２】
ｄ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニストを同定する工程、
ｅ）適量のＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤を提供する工程、および
ｆ）ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤を、場合により製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて、医薬組成物に製剤化する工程、
を含む、医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニストの同定方法、並びに、ＰＫＣ−ζ、および、その他のＩＲＳセリンキナーゼのためのリン酸化部位を含む、選択されたＩＲＳペプチド、および、２型糖尿病の治療のための医薬組成物を同定するための、上記ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、成人で優勢に発症し、血液からグルコースを排除できる組織の感受性の減少を特徴とする。インスリン依存性  糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）に対して、ＩＩ型糖尿病は、膵臓のベータ細胞からのインスリン分泌の障害を特徴としない。
【０００３】
インスリン感受性、または、さらにインスリン抵抗性の低下を引き起こす分子メカニズムは、大学と医薬産業の両方において研究者による徹底的な研究が行われているにもかかわらず、まだ知られていない。近年の研究では、ＩＩ型糖尿病において、活性化インスリン受容体をＧＬＵＴ４のトランスロケーションとグルコース輸送に繋げる第２のメッセンジャー経路が障害を起こしていることが解明されている。特に、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質において、複数のチロシン残基が、活性化インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体およびＪＡＫ１／２によってリン酸化されており、インスリンシグナル伝達下流のプロセスにおいて重要な役割を果たしている（１，２，３）。特にＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２内のホスホチロシンモチーフが、Ｇｒｂ２、細胞内ＰＴＰアーゼＳＨＰ−２、Ｎｃｋ、Ｃｒｋおよびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）を含むＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメインを有する一連のアダプタータンパク質のドッキング部位として役立つ（４〜６）。ＰＩ−３キナーゼは、１１０ｋＤａの触媒サブユニット（ｐ１１０）と、２つのＳＨ２ドメインを含む８５ｋＤａの調節サブユニット（ｐ８５）とで構成され、ＳＨ２ドメインは、ＩＲＳタンパク質内のチロシン−リン酸化ｐＹＭＸＭおよびｐＹＸＸＭモチーフに結合し、ＰＩ−３キナーゼ活性化を誘導する（７）。これにより、セリン／スレオニンキナーゼＰＫＢ／Ａｋｔ（８，９）と、異常なプロテインキナーゼＣアイソフォーム−ζおよび−λ（ＰＫＣ−ζ／λ）（１０，１１）とを含むさらに下流のキナーゼが、ホスホイノシチド依存性キナーゼ１によって刺激される。ＰＫＢおよびＰＫＣ−ζ／λとその下流のシグナルの活性化が、インスリンの代謝作用、例えばＧＬＵＴ４のトランスロケーションおよびグルコース輸送（１０，１１）、ＧＳＫ３セリンリン酸化およびグリコーゲン合成（１２）、ＰＤＥセリンリン酸化および抗脂肪分解（１３，１４）、ならびに、ｍＴＯＲ活性化およびタンパク質合成（１５，１６）の仲介に重要な役割を果たすことが示されている。
【０００４】
インスリンシグナル伝達系の異常調節は、インスリン抵抗性と２型糖尿病を発生させるＩＲＳタンパク質を伴う多因子性のプロセスであり、主要な標的となり得る（１７）。従って、ＩＲＳタンパク質のセリン／スレオニンリン酸化は、インスリンシグナルのフィードバック阻害と、細胞のインスリン抵抗性の発達の両方において重要な役割を果たすことが提唱されている（総論として、１７〜１９を参照）。セリン／スレオニンにおけるＩＲＳ−１の共有結合の修飾が、そのインスリン誘導性のチロシンリン酸化、ＰＩ３−キナーゼの活性化、および、グルコース輸送の刺激を損なうことが示されている（２０）。刺激されていない状態において、ＩＲＳ−１のセリン／スレオニンリン酸化は、細胞中で構成的に発生し（２１）、これは、シグナル伝達を阻害するサイトカインや代謝産物、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α（２２）、遊離脂肪酸、グルコースまたはセラミド（２３）によってさらに促進される。その上、セリン／スレオニン残基におけるＩＲＳ−１の過剰リン酸化は、インスリン抵抗性と２型糖尿病において共通して見出される（２４）。
【０００５】
インスリン抵抗性の発達に重要な役割を果たすにもかかわらず、ＩＲＳ−１のセリンリン酸化は、十分には理解されておらず、これは主に、ＩＲＳ−１に含まれる可能性のあるセリンリン酸化部位が１００を超えることと、これらは、多くのプロテインキナーゼ、例えばｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）（２５）、ＩカッパＢキナーゼ−β（２６）、ＭＡＰキナーゼ（２７）、カゼインキナーゼ（２８）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（２９）、ホスホイノシトール−３−キナーゼ（３０）、プロテインキナーゼＡ（３１）、プロテインキナーゼＣ（３２）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（３３）、および、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）（３４）の基質の一つであることが示されていることが原因である。興味深いことに、ＰＫＢとＡＭＰＫの両方が、ＩＲＳ−１機能の正の調節因子として作用することが発見され、これは、ＩＲＳ−１のセリン／スレオニンリン酸化は、インスリンシグナル伝達を増強するか、または停止させる二重の役割を有する、という考察を証明するものである（３５）。このようなインスリン作用における極めて複雑な調節段階に関する我々の理解は、異なる刺激に応答してセリンリン酸化を受けたＩＲＳ−１の異なるドメイン内の残基を同定することにより改善された。それによれば、ＪＮＫ（２５）などのストレス活性化キナーゼの標的として、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインの近辺に位置するＳｅｒ307が、同定されており、これはまた、インスリン作用の負のフィードバック調節因子としての役割も果たす（３６）。Ｓｅｒ789は、ＡＭＰＫによって標的化され、インスリン作用を正に調節するが（３４）、未同定のキナーゼによるＳｅｒ789のリン酸化もまた、インスリンシグナル伝達を弱めることが発見された（３７）。Ｓｅｒ612、Ｓｅｒ632、Ｓｅｒ662、および、Ｓｅｒ731は、ＰＩ３−キナーゼ相互作用ドメイン内に、または、その近辺に位置するが、これらの部位の機能的な関連は、未だ解明されていない（３８〜４０）。
【０００６】
上述のプロテインキナーゼに対して、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−ζは、セリン／スレオニンキナーゼのＰＫＣファミリーの異常な構成要素であり、これは、インスリンシグナルの下流での導入と、ＩＲＳ−１機能の負のフィードバックコントロールの両方に関与しているようである（１１，４１〜４４）。従って、ＰＫＣ−ζは、ＧＬＵＴ４と共局在化しており、骨格筋（４１）および脂肪細胞（１１）において、インスリンで調節されたＧＬＵＴ４のトランスロケーションとグルコース輸送に必須であることが発見された。さらに、ＰＫＣ−ζの不完全な活性化は、骨格筋のインスリン抵抗性の肥満症依存性を発症させる一因となる可能性がある（４２）。Ｑｕｏｎとその協力者による近年のデータ（４３）によれば、ＩＲＳ−１は、ＰＫＣ−ζの新規の基質の一つであることが示され、それと平行する研究において、Ｚｉｃｋとその協力者（４４）は、このプロセスはＰＩ３−キナーゼ活性化を阻害することを発見しており、これは、ＰＫＣ−ζは、インスリン作用の負のフィードバックコントロールにおける重要な構成要素を示すことを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
まとめると、ＩＲＳ、特にＩＲＳ−１はＰＫＣ−ζと相互作用することが当業界既知であるにもかかわらず、この相互作用の本質はわかっていない。その結果として、ＩＲＳ−ＰＫＣ−ζ相互作用と相互作用する当業界既知の物質はない。しかしながら、ＩＲＳとＰＫＣ−ζの相互作用を阻害することによって、ＩＲＳ、さらに下流のＰＩ３−キナーゼの阻害がダウンレギュレーションされ、それによって順に、ＧＬＵＴ４のトランスロケーションとグルコース輸送が改善される可能性が極めて高いために、上述したような物質の必要性は極めて高いと考えられる。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニストの同定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、この目的は、
ａ）ＰＫＣ−ζと、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドの少なくとも１種とを、少なくとも１種の推定の阻害剤の存在下で接触させる工程、および、
ｂ）ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
を含むＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤の同定方法によって達成される。
【００１０】
本発明は、驚くべきことに、ＩＲＳの配列中で、ＰＫＣ−ζによって特異的に認識される特異的なセリンリン酸化部位が同定されたことに基づく。その結果として、本発明に関して、ＩＲＳ−ＰＫＣ−ζ相互作用を提供する分子メカニズムが同定された。その上、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ＩカッパＢキナーゼ−β、ＭＡＰキナーゼ、カゼインキナーゼ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ、ホスホイノシトール−３−キナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＢ８ＰＫＢ）、および、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のようなその他のプロテインキナーゼも、これらのリン酸化部位を認識できる可能性が高い。それゆえに、プロテインキナーゼ、特にＰＫＣ−ζによってリン酸化されるセリン部位を決定することによって、アンタゴニストまたはアゴニスト様式のいずれかで、この相互作用を妨害する分子の同定が可能になる。
【００１１】
本発明に関して、用語「ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤」は、ＩＲＳとプロテインキナーゼ（例えばＰＫＣ−ζ）との相互作用を妨害する物質を意味する。
【００１２】
本発明に関して、用語「ＩＲＳペプチド」は、ＩＲＳの少なくとも５個、好ましくは７個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなる伸長を含むペプチドを意味する。用語「ＩＲＳペプチド」は、ＩＲＳペプチドは、ＩＲＳ由来のアミノ酸の伸長に加えて、ＩＲＳ由来ではない追加のアミノ酸を含んでもよいことを含む。
【００１３】
本発明の方法はいずれも、好ましくは、インビトロで行われる。
【００１４】
ＰＫＣ−ζは市販されており、例えばカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）から市販されている。さらに、ＰＫＣ−ζの単離方法は、本願で引用された文献で説明されている。
【００１５】
様々な種由来のＩＲＳ、特にＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２の配列は、当業界既知である。本発明において、ラットＩＲＳ−１配列は、配列番号１６で示される。
【００１６】
タンパク質の生産方法、および、その結果としてＩＲＳの生産方法は、当業界既知であり、例えば、適切な細胞でのｃＤＮＡからのタンパク質発現、または、それに続く最初のアミノ酸へアミノ酸を付加することによる生産を含む（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨークを参照）。
【００１７】
その上、タンパク質フラグメントの生産方法は、当業界既知であり（上記参照）、適切なプロテアーゼでのタンパク質の切断、または、そのタンパク質フラグメントをコードする核酸フラグメントの生成、および、それに続くそのフラグメントの適切な細胞での発現を含む。
【００１８】
例えば、１またはそれ以上のアミノ酸を置換すること、または、アミノ酸の伸長を欠失させることによる成熟タンパク質の生産方法は、当業界既知である（上記参照）。これらの方法は、ＩＲＳ遺伝子の部位特異的変異誘発、および、改変された遺伝子の適切な細胞での発現を含む。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、前記少なくとも１種の推定の阻害剤の非存在下におけるリン酸化と比較して減少しているＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化は、前記推定の阻害剤の阻害特性に関する指標である。
【００２０】
好ましくは、ＰＫＣ−ζは、哺乳動物由来、好ましくはげっ歯類またはヒト由来、より好ましくはラットまたはヒト由来である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＩＲＳペプチドは、哺乳動物由来の、好ましくはヒトまたはげっ歯類由来の、より好ましくはラット由来のＩＲＳ、好ましくはＩＲＳ−１から誘導される。
【００２２】
好ましくは、ＩＲＳ−１は、ラット由来であり、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ４５８、４６９、４８１、４９８、５２２、５２６、５３０、５３６、５３８、５３９、５４２、５６０、５７０、５７７、５９９、６００、６１２、６２０、６３２、６３５、６６２、および、６６４からなる群より選択され、前記配列番号は、配列番号１６に示されるラットＩＲＳ−１に相当する。
【００２３】
さらに、ＩＲＳ−１は、ヒト由来であってもよく、少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、上記のラットＩＲＳ−１のＳｅｒ残基に相当するＳｅｒ残基から選択される。
【００２４】
好ましくは、本発明に関して、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位は、Ｓｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612からなる群より選択することもでき、より好ましくはＳｅｒ570である。
【００２５】
本発明の最も好ましい実施形態によれば、前記ペプチドは、ｒＩＲＳ449-664である（配列番号１７）。
【００２６】
好ましくは、前記阻害剤は、結合ペプチド、抗体、および、低分子量の化合物（ＬＭＷ）からなる群より選択される。
【００２７】
用語「結合タンパク質」または「結合ペプチド」は、ＩＲＳと結合し、阻害するタンパク質またはペプチドのクラスを意味し、例えば、これらに限定されないが、ＩＲＳに対して向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質の足場、例えばＩＲＳに対して向けられたアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）が挙げられる。
【００２８】
抗体または抗体フラグメントを製造する手順は、当業者周知の方法に従って実行され、例えば、必要に応じて、例えばフロインドアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で、哺乳動物（例えばウサギ）をＩＲＳで免疫化することによって実行される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．等（１９８１年）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１３４４〜１３４９を参照）。その後、免疫反応の結果として動物中で生産されるポリクローナル抗体は、周知の方法を用いて血液から単離することができ、例えば、カラムクロマトグラフィーによって精製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの既知の方法に従って製造することができる（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３〜２９９）。
【００２９】
本発明に係る用語「抗体」または「抗体フラグメント」はまた、それらの抗体または抗原結合部も意味するものと理解され、これらは組換えによって製造され、必要に応じて改変されており、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性または多重特異性抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ）、または、Ｆ（ａｂ）2フラグメントが挙げられる（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３６８６８４、ＵＳ４,８１６,５６７、ＵＳ４,８１６,３９７、ＷＯ８８／０１６４９、ＷＯ９３／０６２１３、または、ＷＯ９８／２４８８４を参照）。
【００３０】
また、典型的な抗体の代りとして、例えば、ＩＲＳに対するタンパク質の足場、例えば、リポカリンをベースとしたアンチカリンを使用することも可能である（Ｂｅｓｔｅ等（１９９９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１８９８〜１９０３）。リポカリン（例えばレチノール結合タンパク質またはビリン結合タンパク質）の天然のリガンド結合部位は、例えば「コンビナトリアルタンパク質設計」アプローチによって、そのような部位が選択されたハプテン（ここではＩＲＳ）に結合するように改変することができる（Ｓｋｅｒｒａ，２０００年，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８２，３３７〜５０）。その他の既知のタンパク質の足場が、分子認識のための抗体の代用として知られている（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，１３，１６７〜１８７）。
【００３１】
ＬＭＷは、タンパク質、ペプチド抗体または核酸ではない分子であり、分子量が、５０００Ｄａ未満、好ましくは２０００Ｄａ未満、より好ましくは２０００Ｄａ未満、最も好ましくは５００Ｄａ未満を示す分子である。このようなＬＭＷは、ライブラリーから開始するハイスループット法で同定することもできる。
【００３２】
阻害剤は、天然産物の抽出物の形態が可能であり、未精製の形態でも精製した形態のいずれでもよい。このような抽出物は、標準的な手法に従って生産でき、例えば水および／またはアルコールおよび／または有機溶媒抽出、および／または、カラムクロマトグラフィー、および／または、動物、植物または微生物源（例えばヘビ毒、葉または微生物の発酵液）からの沈殿によって生産できる。
【００３３】
本発明に関して、ＩＲＳおよびＰＫＣ−ζは、例えば分析システムに提供され、試験化合物（特に生化学的または化学的試験化合物）と、例えば化学物質ライブラリーの形態で、直接または間接的に接触させる。次に、ＩＲＳのリン酸化に関する試験化合物の影響が測定または検出される。その後、適切な阻害剤を、解析および／または単離することができる。
【００３４】
化学物質ライブラリーをスクリーニングするために、ハイスループット分析の使用が好ましく、これらは当業者既知であるか、または市販されている。
【００３５】
本発明に係る用語「化学物質ライブラリー」は、化学合成された分子や天然産物などの複数の源のいずれかから収集した、または、コンビナトリアルケミストリー技術で生成した複数種の化学物質を意味する。
【００３６】
一般的に、相互作用に対する試験化合物の影響は、ＩＲＳペプチドのリン酸化度を決定することによって測定または検出される。これは、リン特異的抗体を用いることによって実行可能である。このような抗体は、当業界既知であり、例えば、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびセルシグナル（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ）から市販されている。
【００３７】
あるいは、リン酸化度は、分析において放射標識されたＡＴＰを用いて測定してもよい。このようなＡＴＰは、３２−Ｐまたは３３−Ｐで標識することができ、ＩＲＳに取り込まれた放射性のリン酸量は、当業界既知の方法によって測定することができる（実施例２、９を参照）。例えば、オートラジオグラフィで測定されたシグナル強度をリン酸化度の指標とすることができる。
【００３８】
有利には、本発明の方法は、ロボットシステムで行われ、これらは、例えば、ロボット式プレーティング、および、例えばマイクロフルイディクス（すなわちチャネル型の構造を持つ）を用いた、ロボット式の液体トランスファーシステムを含む。
【００３９】
その他の本発明の実施形態において、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利には、スクリーニング方法は自動化かつ小型化されており、特に、小型化されたウェルと、ロボット制御されたマイクロフルイディクスを利用している。
【００４０】
本発明はさらに、ＩＲＳアゴニストの同定方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を含む推定のアゴニストの少なくとも１種の存在下で、ＰＫＣ−ζと、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドの少なくとも１種とを接触させる工程、および
ｂ）推定のアゴニストのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒリン酸化部位のリン酸化を測定する工程、を含む。
【００４１】
この本発明の方法において、ＰＫＣ−ζおよびＩＲＳに関しては、上記で開示された方法に関するものと同じ実施形態が適用される。好ましい実施形態において、前記アゴニストは、ペプチドである。本発明に関して用いることができるペプチドライブラリーは、当業界既知である。
【００４２】
この本発明の方法の好ましい実施形態によれば、前記ＩＲＳペプチドのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化と比較して増加している前記アゴニストのＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化は、前記推定のアゴニストの特性に関する指標である。
【００４３】
本発明はさらに、ＰＫＣ−ζ活性の決定方法に関し、本方法は、
ａ）ＰＫＣ−ζを、ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位を少なくとも１つ含むＩＲＳペプチドの少なくとも１種とを、少なくとも１種の推定の阻害剤の存在下で接触させる工程、および
ｂ）ＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
含む。
【００４４】
その結果として、本発明は、ＰＫＣ−ζ活性を測定する方法を提供する。このような方法は、患者、特に糖尿病患者におけるシグナル伝達系に関するより多くの情報を得るために、異なる患者からのＰＫＣ−ζの活性を測定しなければならない場合に特に有用である。
【００４５】
この本発明の方法において、ＰＫＣ−ζは、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来である。
【００４６】
この本発明の方法と、そこで用いられるＩＲＳに関しては、上記で開示された本発明のその他の方法に関する同じものが適用される。
【００４７】
本発明はさらに、Ｓｅｒ570、好ましくは、配列番号１７で示されたＩＲＳ−１449-664を含むＩＲＳ−１ペプチド、または、そのヒト相同体に関する。
【００４８】
本発明において、この本発明のペプチドは、特に、ＩＲＳ類似体または阻害剤を同定するのに有用であることが判明した。
【００４９】
本発明はさらに、キットを提供し、本キットは、
ａ）少なくとも１種のＩＲＳペプチド、
ｂ）ＰＫＣ−ζ調製物、および
ｃ）少なくとも１種の推定のＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニスト、
を含む。
【００５０】
すでに上述したように、このようなキットは、ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤の同定に極めて有用である。その個々の成分は、すでに上述している。
【００５１】
さらなる形態において、本発明は、Ｓｅｒ570および／またはＳｅｒ612が、好ましくはアラニンに突然変異しているＩＲＳ−１ペプチドを提供する。このようなペプチドは、インビトロまたはインビボでＰＫＣ−ζ活性をブロックするのに有用である。
【００５２】
本発明はさらに、好ましくはＰＫＣ−ζ−Ｓｅｒ−リン酸化部位に対する、好ましくはＳｅｒ498、Ｓｅｒ570、および、Ｓｅｒ612に対する、より好ましくはＳｅｒ570に対する抗体を生産するための、上記で定義されたＩＲＳペプチドの使用に関する。
【００５３】
その結果として、本発明で定義されたＩＲＳペプチドの補助で、ＩＲＳ特異的抗体、特に、ＰＫＣ−ζリン酸化部位に対して向けられた抗体を生産することが可能である。このような抗体は、インビトロでの診断法、同様に、医薬組成物のの両方で役立つ可能性がある。
【００５４】
さらなる形態において、本発明は、２型糖尿病の治療のための医薬組成物を製造するための、上記で定義されたＩＲＳペプチド、または、上記で定義された突然変異したＳｅｒ部位を含むＩＲＳ−１ペプチドの使用に関する。このようなペプチドは、ＩＲＳとＰＫＣ−ζとの相互作用を阻害する可能性があるため、ＩＲＳリン酸化のアンタゴニストとして役立つ可能性がある。
【００５５】
上記医薬組成物を製造するために、本発明で同定されたＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニスト、または、本発明のペプチドは、一般的に、投与様式に応じて、１またはそれ以上の製薬上許容できる添加剤または補助剤、例えば生理緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、例えばプロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸もしくはペプスタチンＡ、または、金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル化剤、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィンおよび／または黄色ワックスなどと共に製剤化される。
【００５６】
さらなる適切な添加剤としては、例えばトリトンＸ−１００またはデオキシコール酸ナトリウムのような界面活性剤、、それに加えて、例えばポリエチレングリコールまたはグリセロールのようなポリオール、例えばスクロースまたはグルコースのような糖類、両性イオン性化合物、例えばグリシン、または、特にタウリンもしくはベタインのようなアミノ酸、および／または、例えばウシまたはヒト血清アルブミンのようなタンパク質が挙げられる。好ましくは、界面活性剤、ポリオールおよび／または両性イオン性化合物である。
【００５７】
好ましくは、生理緩衝溶液のｐＨは、約６.０〜８.０、特に約６.８〜７.８、特に約７.４であり、および／または、生理緩衝溶液の浸透圧モル濃度は、約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルである。本医薬組成物のｐＨは、一般的に、適切な有機または無機緩衝液を用いて、例えば、好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］メタンスルホン酸）、または、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調節される。それぞれの緩衝液の選択は、一般的に、緩衝液の望ましいモル濃度に依存する。例えば注射および輸液には、リン酸緩衝液が適切である。
【００５８】
本医薬組成物は、従来の方式で投与することが可能であり、例えば錠剤またはカプセルのような経口投与形態によって、皮下に埋め込まれたデポジットの形態で粘膜（例えば鼻または口腔）を介して、本発明に係る医薬組成物を含む注射、輸液またはゲルによって投与することが可能である。さらに本医薬組成物は、場合によりリポソーム複合体の形態で、局部的に、および、局所的に投与することも可能である。その上、治療は、医薬組成物の一時的な制御放出を可能にする経皮吸収型製剤（ＴＴＳ）によって行うこともできる。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ０９４４３９８Ａ１、ＥＰ０９１６３３６Ａ１、ＥＰ０８８９７２３Ａ１、または、ＥＰ０８５２４９３Ａ１に記載されている。
【００５９】
注射液は、一般的に、比較的少量の溶液または懸濁液（例えば約１〜約２０ｍｌ）しか体に投与されない場合に用いられる。輸液は、一般的に、大量の溶液または懸濁液（例えば１リットルまたはそれ以上）を投与する予定の場合に用いられる。輸液に対して、注射液の場合、数ミリリットルしか投与されないため、注射液における血液または組織液のｐＨおよび浸透圧とのわずかな差は、それ自体問題ではないか、または、それ自体、痛みの感覚に関してわずかな程度の問題でしかない。それゆえに、本発明に係る製剤の使用前の希釈は、通常は必要ない。しかしながら、比較的大量を投与する場合、本発明に係る製剤は、投与直前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度に希釈すべきである。等張溶液の例としては、０.９％濃度の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。輸液の場合、希釈は、例えば滅菌水を用いて行うことができ、投与は、例えばいわゆるバイパスを介して行うことができる。
【００６０】
本発明はさらに、医薬組成物の製造方法に関し、本方法は、
ａ）上記で定義されたＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニストを同定する工程、
ｂ）適量の前記ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤を提供する工程、および
ｃ）ＩＲＳプロテインキナーゼ阻害剤を、場合により製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて、医薬組成物に製剤化する工程、
を含む。
【００６１】
以下の実施例と図で、本発明をさらに説明するが、これらは、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【００６２】
実施例１：材料
オリゴヌクレオチドプライマーを、ＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，エベルスベルグ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ），ドイツ）から得た。ＢＬ２１コドン・プラス（Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ）およびクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）TM部位特異的変異誘発キットを、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホヤ，カリフォルニア州，米国）から購入した。ワン・ショット・トップ１０（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０）コンピテント細胞を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスルーエ，ドイツ）から得た。プラスミド・ミニプレップ・キットを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）から得た。ポリクローナル抗ＩＲＳ−１抗血清は、Ｊ．Ａ．マッセン博士（Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｍａａｓｓｅｎ，ライデン，オランダ）からの寄贈品であった。ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされる抗ホスホチロシン抗体（ＲＣ２０）と抗ｐ８５α抗体を、トランスダクション・ラボラトリーズ社（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，レキシントン，ケンタッキー州，米国）から得た。モノクローナル抗ＩＲｐ抗体を、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ケンブリッジ，マサチューセッツ州，米国）より購入した。抗ＩＲＳ−１ｐＳ６１６抗体を、バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，カマリロ，カリフォルニア州，米国）から得た。エンハンスト・ケミルミネセンス（ＥＣＬ）検出の二次抗体としての、ＨＲＰ標識抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ抗体を、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，マンハイム，ドイツ）から得た。ラット脳由来のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ−ｒｂ）、組換えヒトプロテインキナーゼＣ−ζ、ビスインドリルマレイミドＩ（ＢＩＭ）、および、ＰＫＣ−ζ偽基質の阻害剤を、カルバイオケム（サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）から得た。アルファトロンビンを、アップステート・バイオテクノロジー社（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，レイクプラシッド，ニューヨーク州，米国）から購入した。分子生物学のための酵素、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、および、改変トリプシン（配列解析グレード）を、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム，ドイツ）から得た。オカダ酸、ホスファチジルセリン、および、小麦胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）を、シグマ（ＳＩＧＭＡ，ミュンヘン，ドイツ）から購入した。ＩＲＳ−１ペプチドは、ホフマン博士（Ｄｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，ＢＭＦＺ，デュッセルドルフ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ），デュッセルドルフ，ドイツ）によって合成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための化学物質、ＧＳＴ遺伝子融合ベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−３、グルタチオンセファロース(R)４Ｂ、および、［γ−32Ｐ］ＡＴＰを、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，フライブルグ，ドイツ）から購入した。ゲルコード・ブルー（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ）染色試薬、リストアー（Ｒｅｓｔｏｒｅ）TMウェスタンブロットストリッピング緩衝液、および、スーパーシグナル（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）基質を、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォード，米国）から���た。ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＸおよびセンサーチップＣＭ５は、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ，フライブルグ，ドイツ）の商品である。その他全ての化学物質は、市販の最高グレードのものである。
【００６３】
実施例２
方法１）融合タンパク質の構築および発現
発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴにクローニングしたウシＰＩ３−キナーゼの調節ｐ８５αサブユニットは、Ｐ．シェパード博士（Ｄｒ．Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，ロンドン，英国）からの親切な寄贈品であった。ラットＩＲＳ−１（ｒＩＲＳ−１449-664、分子量５１.２ｋＤａ）のアミノ酸449-664を含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（４０）によって説明された方法に基づき、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターを用いて製造した。対応するラットＣＤＮＡを、鳥類の骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を用いた逆転写によってラット心臓から単離されたＲＮＡから生成し、続いて、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼと、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−プライマー、ＡＴＡＴＴＧＴＣＧＡＣＣＡＣ−ＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧ、３’−プライマー、ＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＧＧＴＣ−ＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＡＡＴＡ（配列番号１および２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。ＰＣＲ産物を単離し、適切な制限酵素で消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３にサブクローニングした。ラットＩＲＳ−１クローンの同一性を、制限エンドヌクレアーゼ解析とヌクレオチド配列解析によって確認した。このベクターとｐ８５α−ｐＧＥＸ−２Ｔコンストラクトを用いて、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１を形質転換した。形質転換細胞を、０.１ｍｇ／ｍｌアンピシリンが添加された２×ＹＴＡ媒体（１６ｇ／ｌのトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）中でＡ６００ｍｎが０.６〜０.８になるまで成長させ、０.１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で２時間誘導した。融合タンパク質を、グルタチオン−セファロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）中の１０ｍＭグルタチオンで溶出させた。ｐ８５αＧＳＴ−融合タンパク質のＧＳＴ部分を、ＰＢＳ中で、ウシトロンビンを用いてタンパク質分解によって除去した。プロテアーゼを、グルタチオンセファロースカラムに結合した融合タンパク質に添加し、室温で２時間インキュベートし、次に、溶出液を回収した。バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質分析の改変法を用いて、タンパク質を測定した。全てのＧＳＴ融合タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって解析した際の予想分子量を有していた。
【００６４】
２）インスリン受容体キナーゼの製造
ラット肝臓を迅速に取り出し、液体窒素中で即座に凍結し、（４１）で説明されているようにして加工した。簡単に言えば、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、および、２×完全プロテアーゼ阻害剤からなる、氷冷した緩衝液（３.５ｖｏｌ／ｗｔ）を添加し、肝臓を、ＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘおよびＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用いてホモジナイズし、続いて、４℃で、１０,０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清を、室温で６０分間ゆっくり撹拌し、次に、再度、４℃で、１００,０００×ｇで９０分間遠心分離した。次に、上清を、アガロースに結合させた小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）カラムにアプライした。カラムを５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）と０.１％トリトンＸ−１００で洗浄し、ＷＧＡカラムから、０.３ＭのＮ−アセチルグルコサミンを含む上記緩衝液で結合した糖タンパク質を溶出させた。
【００６５】
３）インビトロでのリン酸化分析
インスリン受容体によるｒＩＲＳ−１449-664のリン酸化のために、ＷＧＡで精製した糖タンパク質分画（５μｇ）を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０.２ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１.７ｍＭのＣａＣｌ2、０.６ｍｇ／ｍｌのホスファチジルセリン、および、０.５μｇ／ｍｌのオカダ酸を含むリン酸緩衝液中の１００ｎＭのインスリンと、３０℃で３０分間プレインキュベートした。自己リン酸化を、濃度５０μＭのＡＴＰの添加により開始させ、３０℃で１０分間継続した。基質のリン酸化を、同じ緩衝液中で、５０μＭのＡＴＰの存在下でＰＫＣアイソフォームによる前処理（３０分間）を行って、または、行わないで、等量のｒＩＲＳ−１449-669（１μｇ）を添加することによって開始させ、３０℃で１０分間進行させた（最終容量５０μｌ）。６×サンプル緩衝液（０.３５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６.８）、１０.２８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、３６％（ｖ／ｖ）グリセロール；０.６ＭのＤＴＴ、０.０１２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を添加し、５分間沸騰させたることによって反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、ニトロセルロースにトランスファーした後に、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫検出で解析した。様々なＰＫＣアイソフォームによるｒＩＲＳ−１449-664のセリン／スレオニンのリン酸化を、５０μＭのＡＴＰと２μＣｉ［γ−32Ｐ］ＡＴＰの存在下で、ｒＩＲＳ−１449-664（１μｇ）と、ＰＫＣ−ｒｂまたはＰＫＣ−ζ（０.５μｇ）とをリン酸緩衝液中で３０℃で３０分間インキュベートすることによって（容積２０μｌ）評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を解析し、染色して乾燥させたゲルをオートラジオグラフィで処理した。リン酸取り込みの程度を、切り出したフラグメントのチェレンコフカウンターによって測定した。
【００６６】
４）ＧＳＴプルダウンアッセイ
インビトロでリン酸化されたｒＩＲＳ−１449-664を、グルタチオンセファロースビーズと、ローター上で、４℃で１時間インキュベートした。ペレットを、結合緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4）で３回洗浄した。次に、組換えｐ８５α（０.５μｇ）を添加し、４℃で２時間インキュベートし続けた。３回洗浄した後に、結合したタンパク質を２×サンプル緩衝液２０μｌで溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００６７】
５）イムノブロッティング
８〜１８％勾配のゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、続いて、半乾性のブロッティング装置中でニトロセルロースにトランスファーさせた。次に、このメンブレンを、０.０５％トゥイーン２０と、１％ＢＳＡまたは５％脱脂粉乳とを含むトリス緩衝食塩水中で６０分間ブロックし、適切な抗体（抗ＩＲＳ−１、抗ｐＴｙｒ、抗ｐ８５α）で探査した。大規模に洗浄した後、このメンブレンを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートし、再度洗浄し、次に、タンパク質のバンドを、エンハンスト・ケミルミネセンス（ＥＣＬ）法によって、ルミイメージャー・ワークステーション（Ｌｕｍｉｌｍａｇｅｒ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）（ベーリンガー，マンハイム，ドイツ）上で可視化した。ルミイメージャー・ソフトウェアを用いて、全てのブロットを定量した。報告された  差の有意性を、帰無仮説と、対になっていないデータに関してはｔ統計量を用いることによって評価した。０.０５未満のｐ値を、統計学的に有意とみなした。
【００６８】
６）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＭＳ）によるホスホペプチドマッピング
ＰＫＣ−ζ５０Ｕ（４０μｇ）を用いて、上述の条件化で、５ｎｍｏｌのｒＩＲＳ−１449-664タンパク質を、５０μＭのＡＴＰと０.２５ｍＣｉ／ｍｌ［γ−32Ｐ］ＡＴＰで、６０分間リン酸化した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、リン酸化したｒＩＲＳ−１449-664を、切り出したゲル片中で、トリプシン１００μｇで３０℃で一晩消化した。ペプチドを、５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、５０％アセトニトリルで溶出させ、陰イオン交換カラム（ヌクレオゲル（Ｎｕｃｌｅｏｇｅｌ）ＳＡＸ１０００−８／４６，５０×４.６ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，デューレン，ドイツ）で、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）の金溶媒デリバリーシステムを用いて分離した。ＨＰＬＣの流速は、０.５ｍｌ／分であった。サンプル注入後、ペプチドを、１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮＨ4ＣＨ3ＣＯＯＨ、ｐＨ７.０）と０％緩衝液Ｂ（１ＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ４.０）で開始させて溶出させた。緩衝液Ｂの量は、４０分間までに１０％増加させ、その後の７５分間の間に１０％から５０％に増加させた。０.５ｍＬの分画を回収し、放射活性を、チェレンコフカウンターで測定した。放射性の分画を、逆相ＨＰＬＣで処理した。ペプチドを、Ｃ１８−逆相カラム（ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）３００−５Ｃ１８、２５０ｍｍ×２ｍｍ、粒度５μｍ、孔径３００Ａ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，デューレン，ドイツ）で分離した。ＨＰＬＣ流速を、０.３３ｍｌ／分に調節した。サンプルをアプライした後に、溶出を、１００％の溶液Ａ（０.１％ＴＦＡ）と０％の溶液Ｂ（アセトニトリル／ＴＦＡ（８４／０.１；ｖ／ｖ））で開始させた。溶液Ｂの含量を、１２０分間までに１００％に高めた。再度、回収された分画の放射活性を測定した。放射標識したペプチドを含む分画を、ＥＳＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで処理した。エレクトロスプレー四重極飛行時間型マススペクトロメトリー（ＱＳＴＡＲ  Ｐｕｌｓａｒ  Ｉ，アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，カリフォルニア州，米国）上に、ナノスプレー源（プロタナ（Ｐｒｏｔａｎａ），オーデンセ，デンマーク）を用いてマススペクトルを記録した。選択されたペプチドを、タンデムマススペクトロメトリー様式で解析し、配列と翻訳後修飾をマニュアルの説明によって検索した。
【００６９】
７）部位特異的変異誘発
ｒＩＲＳ−１449-664の、セリン５７０からアラニンへの突然変異体と、セリン６１２からアラニンへの突然変異体を、部位特異的変異誘発によって、クイックチェンジTM部位特異的変異誘発キットを製造元の説明書に従って用いて、テンプレートとしてｐＧＥＸ−５Ｘ−３／ｒＩＲＳ−１449-664を用いて生成した。以下のプライマーを用いた：Ｓ５７０Ａ、５’−ＣＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣＣ（配列番号３）、および、３’−ＧＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧ（配列番号４）；Ｓ６１２Ａ、５’−ＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣ（配列番号５）、および、３’−ＣＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＧ（配列番号６）。
【００７０】
キアゲン配列解析サービス（ヒルデン，ドイツ）により組換え分子を配列解析して、望ましい突然変異の存在を確認した。
【００７１】
８）表面プラズモン共鳴技術による相互作用研究
これまでに、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）TMバイオセンサー（ビアコア，フライブルグ，ドイツ）の操作原理が説明されている（４２）。融合タンパク質のＧＳＴ部分の干渉性の二量体化を回避するために、精製の際にそれらをトロンビンで切断した。ＳＨ２−ドメインのホスホペプチドへの極めて迅速な会合速度がわかっているため、関連する親和性を競合分析によって評価した（４３）。それゆえに、一定濃度のｐ８５α（１００ｎＭ）を、ランニング緩衝液（０.０１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）、０.１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０.００５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ））中で、ＣＭ５センサーチップ表面に結合したものと同一な競合するペプチドの濃度を様々に変えて（５０ｎＭ〜１０μＭ）インキュベートした。室温で１時間プレインキュベートした後に、様々な混合物を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で、流速５μｌ／分、２５℃で連続的に注入した。用いられたペプチドＤＤＧＹＭＰＭＳＰＧＶ（配列番号７）、ＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶ、ＤＤＧＹＭＰＭｐＳＰＧＶ、および、ＤＤＧｐＹＭＰＭｐＳＰＧＶは、ラットＩＲＳ−１のアミノ酸６０５〜６１５を示しており、これを、アプライド・バイオシステムズのモデル４３３ペプチドシンセサイザーで合成した。全てのペプチドを、製造元が説明しているような標準的なアミンカップリング法によって、濃度５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭのＨ3ＢＯ4（ＮａＯＨ，ｐＨ８.５）中で、１μｌ／分で固定した。各結合実験の後に、６Ｍ塩酸グアニジンを２分間注入することによって再生が行われた。ｐＹ６０８とｐＹ６０６〜ｐＳ６１２の相互作用を用いたｐ８５αの反応速度論解析を、ＢＩＡエバリュエーション（ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）３．１ソフトウェア（ビアコア，フライブルグ，ドイツ）と、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）３.０（サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて行った。
【００７２】
９）ＰＫＣによるｒＩＲＳ−１449-664のセリン／スレオニンリン酸化の測定
様々なＰＫＣアイソフォームによるｒＩＲＳ−１449-664のセリン／スレオニンリン酸化を、適量のｒＩＲＳ−１449-664（１μｇ）と、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−ラット脳（０.１〜１.０μｇ）を、μｌの２×リン酸緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０.２ｍＭのＮａ3ＮＯ4、１.７ｍＭのＣａＣｌ2、０.６ｍｇ／ｍｌのホスファチジルセリン、および、０.５μｇ／ｍｌのオカダ酸、５０μＭのＡＴＰ＋２μＣｉ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ）にピペッティングすることによって評価した。この混合物を、最終容積が２０μｌから必要なＡＴＰ容積を引いた値になるように、水で調節した。次に、ストック溶液からのＡＴＰを、最終濃度５０μＭのＡＴＰ＋２μＣｉ［γ−32Ｐ］ＡＴＰになるように添加することによってリン酸化反応を開始させ、３０℃で３０分間インキュベートした。６×サンプル緩衝液４μｌ（０.３５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６.８）、１０.２８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、３６％（ｖ／ｖ）グリセロール；０.６ＭのＤＴＴ、０.０１２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を添加し、５分間沸騰させることによって反応を止めた。次に、このタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、染色して乾燥させたゲルを、解析のためにオートラジオグラフィで処理した。
【００７３】
実施例３
ＩＲＳ−１ドメインは、インスリン受容体によってリン酸化され、ＰＩ３−キナーゼと相互作用する
ＩＲＳ−１とインスリン受容体およびＰＩ３−キナーゼとの相互作用におけるセリン／スレオニンリン酸化の作用を決定するために、我々は、組換えｐ８５αとＧＳＴ−プルダウンアプローチを用いたインビトロでのリン酸化、および、ＰＩ３−キナーゼ相互作用分析を開発した。ラットＩＲＳ−１タンパク質の選択された部分をクローニングし、ＧＳＴ−融合タンパク質として発現させ、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した。このＧＳＴ−融合タンパク質（ｒＩＲＳ−１449-664）は、主要なＰＩ３−キナーゼ結合部位Ｔｙｒ６０８およびＴｙｒ６２８を含むＹＭＸＭまたはＹＸＸＭコンセンサスモチーフ内に可能性のあるチロシンリン酸化部位を含むラットＩＲＳ−１タンパク質の２１６個のアミノ酸（４４９〜６６４）からなるドメインをカバーする（３９）（図１を参照）。コードされた融合タンパク質の構造に基づき、分子量は５１.２ｋＤａと計算され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見かけの重量は５５ｋＤａと決定された。インビトロでのリン酸化とｐ８５α相互作用分析の実験手順を、図２Ａに示す。
【００７４】
融合タンパク質をＷＧＡで精製したインスリン受容体に接触させることによって、インスリンで刺激されたｒＩＲＳ−１449-664の顕著なチロシンリン酸化が誘導された（図２Ｂ，上部のパネル）。定量化により、基準（ｎ＝１０、図２Ｃ）を超える８.８±１.１倍の刺激が示された。ＧＳＴ−プルダウン分析により、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５α調節サブユニットと、チロシンリン酸化されたｒＩＲＳ−１449-664との相互作用の顕著な増加が解明された（図２Ｂ、中央のパネル）。
【００７５】
実施例４
様々なＰＫＣアイソフォームが、ｒＩＲＳ−１449-664のインスリンで刺激されたチロシンのリン酸化、および、それに続くｐ８５αへの会合を阻害する
プロテインキナーゼＣが、インビトロでｒＩＲＳ−１449-664をリン酸化することができる場合を評価するために、我々は、まず、融合タンパク質と、ＰＫＣラット脳およびＰＫＣ−ζとを、［32Ｐ］ＡＴＰの存在下でインキュベートした。次に、ｒＩＲＳ−１449-664を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィによって解析し（図３Ａ）、ＰＫＣによるｒＩＲＳ−１449-664の顕著なリン酸化が検出可能になった。ＰＫＣ阻害剤の存在下で、同量のＰＫＣとインキュベートしたｒＩＲＳ−１449-664は、顕著なリン酸取り込みを示さなかった（図３Ａ）。次に、ＰＫＣ量を高めた場合の用量応答曲線を決定し、最大リン酸化条件を確立し、最大リン酸化条件は、０.５μｇのＰＫＣラット脳またはＰＫＣ−ζで観察された（データ示さず）。この条件を用いて、次に、我々は、ｒＩＲＳ−１449-664のセリンリン酸化の、それに続く自己リン酸化されたＩＲによる活性化への影響を調査した。それゆえに、ｒＩＲＳ−１449-664を、ＰＫＣを用いて、または用いないで処理し、次に、ＷＧＡで精製したＩＲとインキュベートした。その後、ｐ８５αの会合を、ｒＩＲＳ−１449-664を、そのＧＳＴ部分を介してグルタチオンセファロースビーズにカップリングし、ｐ８５α（０.５μｇ）とインキュベートすることによって測定した（概要を図２Ａに示す）。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）、ｐ８５αおよびＩＲＳ−１に対する抗体と免疫ブロッティングすることによって解析した。図３Ｂで示されるように、ＰＫＣラット脳でのｒＩＲＳ−１449-664の前処理により、インスリンで刺激されたチロシンリン酸化の減少と、ｐ８５αとの相互作用が引き起こされる。ｒＩＲＳ−１449-664のＴｙｒ−リン酸化の減少は、２７±４％（ｎ＝９）であり、ｐ８５αの会合はより顕著な阻害を示した（４９±８％）（図３Ｃ）。ビスインドリルマレイミド（ＢＩＭ）の添加によるｒＩＲＳ−１449-664のリン酸化後のＰＫＣ−ｒｂの阻害は、この結果に影響を与えなかった（図３Ｃ）。
【００７６】
さらにＰＫＣの作用をＩＲのレベルで遮断するために、β−サブユニットの自己リン酸化を試験した。自己活性化した受容体を、ＰＫＣ−ｒｂまたはＰＫＣ−ζの存在下で３０℃で１０分間インキュベートした場合、コントロールと比較して、ＩＲの自己リン酸化の顕著な変更は検出可能にはならなかった（図４）。
【００７７】
次に、図３Ｂで説明されている実験法をＰＫＣ−ζに関しても繰り返した。ＰＫＣ−ｒｂと比較しても、なおより顕著な、ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化、およびｐ８５αとの相互作用の減少が観察された（図５Ａ）。データの定量化により、チロシンリン酸化の阻害は、４６±５％（ｎ＝３）、それに付随するｐ８５αのＩＲＳ−１への結合の阻害は、８１±１％であることが示された（図５Ｂ）。
【００７８】
実施例５
ＰＫＣによって標的化されたＩＲＳ−１のセリンリン酸化部位の同定および機能的な解析
以前の研究で、プロテインキナーゼＣによるインスリンシグナル伝達の負の調節は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、および、ＩＲＳ−１のセリン６１２のリン酸化に関与することが示されている（２６）。セリン６１２は、Ｙ６０８における主要なＹＭＸＭモチーフのすぐ隣に局在しており、これは、ＰＩ３−キナーゼの主要な相互作用部位の一つであると説明されている（３９）。
【００７９】
我々は、特異的ＩＲＳ−１ホスホセリン６１２抗体（αｐＳ612）を用いたこの部位のＰＫＣによる修飾を評価した。ラット脳由来のＰＫＣおよびＰＫＣ−ζと３０℃で３０分間インキュベートした後、ｒＩＲＳ−１449-664を、αｐＳ612で強く免疫ブロットした（図６Ａ）；ＢＩＭでのＰＫＣの阻害により、このセリンのリン酸化は明らかに妨害された。
【００８０】
ＩＲＳ−１のホスホセリン６１２の、ＰＩ３−キナーゼとの相互作用に対する影響を特徴付けるために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いた。この目的のために、ラットＩＲＳ−１のアミノ酸６０５〜６１５を示す配列ＤＤＧＹＭＰＭＳＰＧＶ（配列番号７）を含むペプチドを合成し、標準的なアミンカップリングによってチップ表面に固定した。ＳＨ２ドメインのＧＳＴへの融合は、それらのホスホペプチドへの結合に影響を与えるため、結合親和性を過大評価する恐れがあることが報告されている（４４）。それゆえに、組換えｐ８５α融合タンパク質のＧＳＴ部分を切断した。様々な濃度の精製ｐ８５αをバイオセンサーチップにアプライし、そこにペプチドを異なるリン酸化型でカップリングすることによって、ｐ８５αの上記ペプチドへの結合を研究した。これらの実験により、ｐ８５αは、上記ペプチドのチロシンリン酸化型にのみ結合することが示され（図６ＢおよびＣ）、これは文献と一致する（４５）。
【００８１】
次に、我々は、競合する可溶性ペプチドの存在下で、１００ｎＭのｐ８５αの、ペプチドｐＹ６０８（ＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶ）およびｐＹ６０８−ｐＳ６１２（ＤＤＧｐＹＭＰＭｐＳＰＧＶ）への結合をモニターすることによって、上記反応の関連する結合親和性を決定した（図６Ｄ、Ｅ、Ｆ）。ＳＰＲ応答４４０ｓを、注入後に、平衡に対して対数ペプチド濃度でプロットすることによって、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を得た。両方のペプチドは、測定可能な結合活性を示した（図６Ｄ対６Ｅ）。可溶化したペプチドは、ｐ８５αの固定されたペプチドへの結合をマイクロモル濃度で阻害した。ペプチド濃度が〜１０μＭで、完全な阻害が達成された。２つの部位の競合に関する方程式を用いて測定された読み取り値をフィッティングしたところ、０.２６μモル／ｌおよび１６.５６μモル／ｌのｐＹ６０８に関するＩＣ５０（ｒ2＝０.９９８３）、および、０.１５μモル／ｌ、２.８８μモル／ｌのｐＹ６０８−ｐＳ６１２に関するＩＣ５０（ｒ2＝０.９９８９）が得られた。このデータから、ペプチドｐＹ６０８−ｐＳ６１２が、よりよい効率でｐ８５αの結合を阻害したことは明白であり、上記ホスホチロシンの位置＋４でのホスホセリン残基が存在していても、ＩＲＳ−１ホスホペプチドに関するｐ８５αＳＨ２−ドメインの親和性を増加させることが示される。インビトロ系における、インスリンで刺激されたチロシンリン酸化の阻害を促進する可能性があるｒＩＲＳ−１449-664におけるさらなるＰＫＣ−ζリン酸化部位を同定するために、ｒＩＲＳ−１449-664をＰＫＣ−ζとインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。リン酸化されたｒＩＲＳ−１449-664をトリプシンで消化し、ゲルから抽出した。消化によって得られたペプチドを、二次元  ＨＰＬＣによって解析し、その分画における放射活性の含量を、チェレンコフカウンターによってモニターした。最初の陰イオン交換カラムを用いた分離のＨＰＬＣプロファイルは、６個の再現可能な主要なピークを示した（図７Ａ）。共に移動するペプチドを分離するために、各ピークの放射性の分画を溶出プロファイルに従ってプールし、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣで処理した（図７Ｂ）。これにより、１０の別個の放射標識したＲＰ−ＨＰＬＣ分画が生じ、その後これを、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＭＳ）で処理した。ＭＳ解析により得られた結果を、表１にまとめた。ｒＩＲＳ−１449-664配列の３７％をカバーする８種のペプチドを同定することができた。２種のホスホセリンが発見され、それらは、陰イオン交換ＨＰＬＣのピーク４におけるセリン３５８（全長ＩＲＳ−１中のセリン５７０）（ＬＰＧＹＲＨｐＳＡＦＶＰＴＨＳＹＰＥＥＧＬＥＭＨＨＬＥＲ（配列番号８））、および、ピーク５および６におけるセリン２８６（セリン４９８）（ＹＩＰＧＡＴＭＧＴｐＳＰＡＬＴＧＤＥＡＡＧＡＡＤＬＤＮＲ（配列番号９））であった。セリン３５８／５７０を含むホスホペプチドは、取り込まれた放射活性の約１９％に相当した。ホスホセリン２８６／４９８を含むペプチドは、測定された全放射活性の１１％を占めた。
【００８２】
ホスホセリン３５８をＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで同定した。親イオンに対して質量差が９７.９Ｄａのフラグメントイオンが、ホスホペプチドを示す（図８Ａ）。質量差９７.９Ｄａは、リン酸の損失に関連する。フラグメントイオンｂ9とｂ10からのリン酸基（ＨＰＯ3）とリン酸（Ｈ3ＰＯ4）の損失から、リン酸化部位を同定した。このフラグメントイオンの脱リン酸化は、リン酸化は、Ｙ３５５またはＳ３５８によってのみ起こることを示す。Ｓ３５８は、ホスホアミノ酸であり、なぜなら、ｂ4イオンからの脱リン酸化は検出されず、Ｙ３５５でのリン酸化が示されたためである（データ示さず）。
【００８３】
ホスホセリン６１２は、リン酸部位に特異的な抗体によって検出されたにもかかわらず、マススペクトロメトリーでは検出することができなかったが（図６Ａ）、この部位を含むペプチドは、３つの追加のペプチドと共に、ピーク２で見出された。ピーク１およびピーク３は、１つのペプチドしか含んでおらず、これらは、それぞれ放射活性の１３％および２１％をカバーしていた（ＴＨＳＡＧＴＳＰＴＩＳＨＱＫ、および、ＴＰＳＱＳＳＶＶＳＩＥＥＹ−ＴＥＭＭＰＡＡＹＰＰＧＧＧＳＧＧＲ）（配列番号１０および１１）。
【００８４】
見出されたリン酸化部位がセリン５７０および６１２であることをさらに確認するために、セリンからアラニンへの突然変異を含む２種の追加のＧＳＴ融合タンパク質を生成した。これらのＧＳＴ融合タンパク質をＰＫＣ−ζと接触させ、野生型に匹敵するレベルで酵素によってリン酸化した（データ示さず）。その一方で、セリン３５８／５７０をアラニンに変換することによって、陰イオン交換ＨＰＬＣにおけるピーク４が大幅に減少しており（図９Ｂ）、これは、ＩＲＳ−１のセリン５７０は、ＰＫＣ−ζによって標的化される新規のリン酸化部位であることを示す。セリン４００／６１２のアラニンへの突然変異により、ピーク２の減少が起こり（図９Ｃ）、これは、リン酸特異的な抗血清を用いて得られたデータを確認するものである。
【００８５】
実施例６
ｒＩＲＳ−１449-664におけるセリン残基５７０および６１２の機能的な関連
同定されたリン酸部位の機能的な関連を決定するために、ｒＩＲＳ−１449-664のセリン３５８／５７０からアラニンおよびセリン４００／６１２への突然変異体を、インビトロでのリン酸化とｐ８５α相互作用分析で試験した（図１０Ａ）。ＰＫＣ−ζで前処理した後のＩＲによるチロシンリン酸化の結果を比較したところ、野生型ｒＩＲＳ−１449-664に匹敵する減少（３０〜４０％）と、２種の突然変異体が示された（図１０Ｂ，左のパネル）。しかしながら、２種の突然変異体とｐ８５αとの相互作用を比較した場合、有意差が明らかになった。従って、ｐ８５αのＳ５７０Ａへの結合は、ＰＫＣ−ζ処理によってコントロールの４３±４％（ｎ＝３）に減少し、ｒＩＲＳ−１449-664のＳ６１２Ａ突然変異体に関しては２８±３％に減少した（図１０Ｂ，右のパネル）。
【００８６】
用いられる略語は以下の通り：ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＩＲ、インスリン受容体；ＩＲＳ、インスリン受容体基質；ＥＳＩ−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー；ｐ８５、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）−３キナーゼの調節サブユニット；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＰＩ３−キナーゼ、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ；ＲＰ、逆相；ＰＫＣ、プロテインキナーゼＣ；ＰＫＢ、プロテインキナーゼＢ；ＲＴＫ、受容体チロシンキナーゼ；ＳＨ２、ｓｒｃ−相同ドメイン２；ＷＧＡ、小麦胚芽アグルチニン；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＥＣＬ、エンハンスト・ケミルミネセンス。
【００８７】
図１：ＩＲＳ−１の概略図（既知の相互作用パートナー、および、既知のセリン／スレオニンリン酸化部位を含む）である。
上部のパネル：関連するプレクストリン相同（ＰＨ）、および、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインの位置は、多数のチロシンリン酸化部位を含むＣ末端のテールの次に示される。ＰＩ３−キナーゼ、Ｇｒｂ２およびＳＨＰ−２を含む可能性のある結合パートナーもまた示される。中央のパネル：既知の（Ｓ３０７、６１２、６３２、７８９）、および、可能性のあるセリンリン酸化部位は、強調表示される。下部のパネル：ラットＩＲＳ−１の、主要なＰＩ３−キナーゼの結合部位を含むａａ449-664を含むＧＳＴ−融合タンパク質の構築。
【００８８】
図２：ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化、および、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５αサブユニットとの相互作用である。
（Ａ）実験手順の概略図。ＩＲ（５μｇ）を、１００ｎＭインスリンで３０分間プレインキュベートした後に、リン酸緩衝液中で、３０℃で１０分間自己リン酸化させた。その後、基質のリン酸化を、自己リン酸化されたＩＲをｒＩＲＳ−１449-664のアリコート（１μｇ）に添加することによって開始させた。反応を１０分間進行させ、次に、グルタチオンセファロースビーズを添加し、サンプルを、４℃で、ローター上で１時間インキュベートした。ペレットを結合緩衝液で３回洗浄し、組換えｐ８５α（０.５μｇ）を添加し、インキュベートを２時間継続した。洗浄の後に、２×サンプル緩衝液を添加し、続いて５分間沸騰させることによって結合したタンパク質を溶出させた。（Ｂ）方法の章で詳述したように、溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、ホスホチロシン、ｐ８５αおよびＩＲＳ−１に対する抗体を用いて免疫ブロッティングによって解析した。６回の独立した実験のうち代表的なブロットを示す。（Ｃ）ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化の定量化を、ルミイメージャー・ソフトウェアを用いて得た。データは平均値±ＳＥＭである（ｎ＝１０）。
【００８９】
図３：ラット脳由来のＰＫＣの、ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化、および、ｐ８５αとの相互作用に対する作用である。
（Ａ）方法において詳述したように、ｒＩＲＳ−１449-664（１μｇ）を、ラット脳由来のＰＫＣ（ＰＫＣ−ｒｂ）（０.５μｇ）、または、ＰＫＣ−ζ（０.５μｇ）と、２μＣｉ（32Ｐ）−ＡＴＰの存在下（最終濃度５０μＭ）でインキュベートした。ＰＫＣ−ｒｂまたはＰＫＣ−ζにとってそれぞれビスインドリルマレイミドＩ（ＢＩＭ）または偽基質ペプチドによって反応を阻害させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、オートラジオグラフィで処理した。（Ｂ）ＩＲによるｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化、および、ｐ８５αとの相互作用を、図２で説明されているようにして測定した。ｒＩＲＳ−１449-664を、ＰＫＣ−ｒｂ（０.５μｇ）と３０分間プレインキュベートした。代表的なブロットを示す。（Ｃ）インスリンによって刺激されたチロシンリン酸化に対するＰＫＣ−ｒｂの阻害作用、および、インスリンで刺激された値とのｐ８５αの相互作用の定量化を、１００％と設定した。存在する場合、ＩＲによる基質のリン酸化を開始する前に、ＢＩＭを１０分間添加した（図２を参照）。データは平均値±ＳＥＭである（ｎ＝６〜９）。
【００９０】
図４：ＰＫＣアイソフォームの、ＩＲの自己リン酸化に対する作用である。
（Ａ）図２で概説されているようにして、ＩＲの自己リン酸化を行った。１０分間自己リン酸化した後に、ＰＫＣ−ｒｂまたはＰＫＣ−ζのいずれかを添加し、インキュベートをさらに１０分間継続した。次に、ＩＲのβ−サブユニットのチロシンリン酸化を免疫ブロッティングで解析した。（Ｂ）ブロットの定量化をルミイメージャー・ソフトウェアを用いて得た。データは平均値±ＳＥＭである（ｎ＝４〜６）。
【００９１】
図５：ＰＫＣ−ζの、ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化に対する作用、および、ｐ８５αとの相互作用である。
（Ａ）ｒＩＲＳ−１449-664を、ＰＫＣ−ζ（０.５μｇ）と３０分間プレインキュベートした。図２で概説したように、ＩＲによるチロシンリン酸化、および、ｐ８５αとの相互作用を免疫ブロッティングで測定した。（Ｂ）図３で説明されているように、ＰＫＣ−ζの阻害作用の定量化を行った。データは平均値±ＳＥＭである（ｎ＝３）。
【００９２】
図６：表面プラズモン共鳴を用いた、ＰＫＣの標的としてのＩＲＳ−１のセリン６１２の同定、および、ｐ８５αとの相互作用の解析である。
（Ａ）ｒＩＲＳ−１449-664（０.５μｇ）を、様々なＰＫＣ（０.５μｇ）と３０℃で３０分間インキュベートし、ホスホセリン６１２に対する抗体を用いて免疫ブロットした。代表的な実験を示す。（Ｂ）表面プラズモン共鳴を用いた、ｐ８５αの固定されたペプチド（ホスホチロシン６０８を含む、ＩＲＳ−１のアミノ酸６０５〜６１５に相当する）への結合、または、（Ｃ）ｐ８５αの上記ペプチド（ホスホチロシンを含まない）への結合（ｐＹ６０８−ＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶ、および、Ｙ６０８−ＤＤＧＹＭＰＭＳＰＧＶ）。用いられたｐ８５αのタンパク質濃度は、（上から下へ）：１、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００ｎＭであった。（Ｄ）可溶性ペプチドｐＹ６０８−ＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶと競合させることによるｐ８５α結合の阻害、または、（Ｅ）ｐＹ６０８−ｐＳ６１２−ＤＤＧｐＹＭＰＭｐＳＰＧＶと競合させることによるｐ８５α結合の阻害。また、可溶性ペプチドも、チップに固定した。（Ｆ）半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＳＰＲ応答を、平衡（注入後の４４０ｓ）に対する対数ペプチド濃度でプロットすることにより得た。ｐＹ６０８に関するＩＣ５０は、０.２６μモル／ｌ、１６.５６μモル／ｌであり、ｐＹ６０８−ｐＳ６１２に関するＩＣ５０は、０.１５μモル／ｌ、２.８８μモル／ｌであった。
【００９３】
図７：ＰＫＣ−ζによるｒＩＲＳ−１449-664のリン酸化から誘導されたトリプシンのホスホペプチドのＨＰＬＣ解析である。
５ナノモルのｒＩＲＳ−１449-664を、０.５ｎｍｏｌのＰＫＣ−ζを用いて６０分間リン酸化した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、切り出したｒＩＲＳ−１449-664をトリプシンで消化した。回収した32Ｐ−放射標識ペプチド混合物を、イオン交換（Ａ）、および、Ｃ１８逆相ＨＰＬＧ（Ｂ）で分離した。回収された分画の放射活性を、チェレンコフカウンターで測定した。逆相ＨＰＬＣの後、放射性の分画をマススペクトロメトリーによって解析した。
【００９４】
図８：ホスホペプチド３５２〜３７８からのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルである。
（Ａ）親イオンからのリン酸の損失が［Ｍ＋４Ｈ］4+＝８１８.１１であることは、リン酸化を示す。（Ｂ）フラグメントイオンｂ9およびｂ10の脱リン酸化は、リン酸化部位を示す。
【００９５】
図９：ｒＩＲＳ−１449-664、および、突然変異体Ｓ５７０ＡおよびＳ６１２ＡのトリプシンのホスホペプチドのＨＰＬＣ解析である。
組換えＰＫＣ−ζでリン酸化された、野生型ｒＩＲＳ−１449-664（Ａ）、ｒＩＲＳ−１449-664Ｓ５７０Ａ（Ｂ）、および、ｒＩＲＳ−１449-664Ｓ６１２Ａ（Ｃ）から得られたトリプシンペプチドのＨＰＬＣ解析を示す。代表的なＨＰＬＣプロファイルを示す。
【００９６】
図１０：セリン５７０およびセリン６１２の機能的な解析である。
（Ａ）図５で概説されているように、ｒＩＲＳ−１449-664、および、指定された突然変異体を、ＰＫＣ−ζでプレインキュベートし、ＩＲでのチロシンリン酸化で処理し、ｐ８５αと相互作用させた。代表的なウェスタン、ブロットを示す。（Ｂ）ルミイメージャー・ソフトウェアを用いてブロットを定量し、データを、インスリンで刺激されたコントロール値（１００％と設定された）と相関させて示した。結果は平均値±ＳＥＭである（ｎ＝３）。
【００９７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＩＲＳ−１の概略図（既知の相互作用パートナー、および、既知のセリン／スレオニンリン酸化部位を含む）である。
【図２】ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化、および、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５αサブユニットとの相互作用を示す図である。
【図３】ラット脳由来のＰＫＣの、ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化、および、ｐ８５αとの相互作用に対する作用を示す図である。
【図４】ＰＫＣアイソフォームの、ＩＲの自己リン酸化に対する作用を示す図である。
【図５】ＰＫＣ−ζの、ｒＩＲＳ−１449-664のチロシンリン酸化に対する作用、および、ｐ８５αとの相互作用を示す図である。
【図６】表面プラズモン共鳴を用いた、ＰＫＣの標的としてのＩＲＳ−１のセリン６１２の同定、および、ｐ８５αとの相互作用の解析を示す図である。
【図７】ＰＫＣ−ζによるｒＩＲＳ−１449-664のリン酸化から誘導されたトリプシンのホスホペプチドのＨＰＬＣ解析を示す図である。
【図８】ホスホペプチド３５２〜３７８からのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図９】ｒＩＲＳ−１449-664、および、突然変異体Ｓ５７０ＡおよびＳ６１２ＡのトリプシンのホスホペプチドのＨＰＬＣ解析を示す図である。
【図１０】セリン５７０およびセリン６１２の機能的な解析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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