(57)【要約】  本発明の目的は、ＡＣＥ阻害に適した食料品を提供することである。別の目的は、血圧低下効果を有するそのような食料品を提供することである。また更なる目的は、高濃度のＡＣＥインヒビターを有する食料品を提供することである。一つ以上のこれらの目的は、アンギオテンシン変換酵素インヒビターの調製のための、トリペプチドＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ、及び／またはそれらの塩］の使用により、本発明によって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオテンシン変換酵素インヒビターの調製のための、トリペプチドＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ、及び／またはそれらの塩］の使用。
【請求項２】
前記トリペプチドがＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、またはＴ］である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記トリペプチドがＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｍ、Ｓ、またはＴ］である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記アンギオテンシン変換酵素インヒビターが機能性食料品である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
５ｍｇ／ｇ以上のＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、またはＡ］の量を含む、ヒトにおける血圧低下に適した食料品。
【請求項６】
ＸＰＰの量が１０ｍｇ／ｇ以上である、請求項５に記載の食料品。
【請求項７】
ＸＰＰの式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、またはＴである、請求項５または６に記載の食料品。
【請求項８】
ＸＰＰの式中、Ｘ＝Ｍ、Ｓ、またはＴである、請求項７に記載の食料品。
【請求項９】
ＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ］を含む食料品の調製方法であって、以下の工程：
ａ）加水分解化タンパク質産物を生成する、配列ＸＰＰを有するタンパク質を含む基質の酵素的加水分解
ｂ）前記加水分解化タンパク質産物からのトリペプチドで富化した分画の分離
ｃ）トリペプチドＸＰＰで富化した固体を得るための、工程ｂ）からの前記分画の乾燥
ｄ）前記食料品の調製における成分としての、工程ｃ）で調製された固体の使用
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターの調製のための特定のペプチドに関する。本発明は更に、ＡＣＥ阻害に適した食料品、及びそのような食料品の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧または高い血圧は、心臓血管疾患（ＣＶＤ）についての主な危険因子の一つであると解されている。血圧を調節するメカニズムの一つは、レニン−アンギオテンシン系である。これは、アンギオテンシンＩＩの形成を導く反応のカスケードであり、この物質は強力な血管収縮性を有し、それ故血圧上昇効果を有する。このカスケードで鍵となる酵素の一つ：アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）の阻害は、アンギオテンシンＩＩの形成を減少し、かくして血圧低下効果を有する。長期的な人の介入研究により、低量のＡＣＥインヒビターの規則的な取り込みが、25％までＣＶＤを減少することが示されている(Gerstein等 (2000), The Lancet 355, 253-259)。
【０００３】
食料品中のＡＣＥインヒビターは周知である。そのような食料品は、例えばミルクや乳製品の発酵によって調製されている。プラシーボ制御の研究では、サワーミルク中のＶＰＰ及びＩＰＰの血圧低下効果が高血圧のヒトにおいて示された(Hata, Y等, (1996), American Journal of Clinical Nutrition 64, 767-771)。
【０００４】
「穏やかな高血圧を有する人に適切」であることを主張している市販の発酵乳製品は、日本のカルピス食品工業によって生産されているLactobacillus helveticusで発酵されたカルピス(登録商標)サワーミルクである。別の市販の発酵乳製品は、Valio社により生産されるEvolusであり、それは「低血圧を補助する最初の欧州機能性食品」であることを主張している。これらの発酵乳製品は、Lactobacillus helveticus (Lb. helveticus)株で発酵されている。前記製品は、カゼインのタンパク分解により生産されるin vitroＡＣＥ阻害に関与する生体活性ペプチド（ＶＰＰ及びＩＰＰ）を含む。
【０００５】
当該技術分野で同定された別の可能性は、乳タンパク質の酵素的タンパク分解によるＡＣＥ阻害食料品の調製である。WO 01/85984は、酵素トリプシンを使用するカゼイン単離物のタンパク分解によるＡＣＥ抑制組成物の調製を記載している
【非特許文献１】Gerstein等 (2000), The Lancet 355, 253-259
【非特許文献２】Hata, Y等, (1996), American Journal of Clinical Nutrition 64, 767-771
【特許文献１】WO 01/85984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＡＣＥ阻害に適した食料品を提供することである。別の目的は、血圧低下効果を有するそのような食料品を提供することである。また更なる目的は、高濃度のＡＣＥインヒビターを有する食料品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一つ以上のこれらの目的は、アンギオテンシン変換酵素インヒビターの調製のための、トリペプチドＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ、及び／またはそれらの塩］の使用により、本発明によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
一般的な一つの文字コードは、アミノ酸を記載するために通常使用されているようにここで使用される。ここでの重量パーセンテージは、他に記載がなければ全重量に対するものとして表されるであろう。酵素は一つより多い酵素の混合物を含むものとここで解される。
【０００９】
本発明によれば、本発明に係るトリペプチドＸＰＰはヒトの消費の後で比較的安定であり、本発明に係るペプチドＸＰＰは有効なアンギオテンシン変換酵素インヒビターであることが見出された。好ましくはアンギオテンシン変換酵素インヒビターは、機能的な食料品である。
【００１０】
ＸＰＰでは、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫである。好ましくはＸ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、またはＴであり、より好ましくはＸ＝Ｍ、Ｓ、またはＴである。
【００１１】
本発明は、１ｍｇ／ｇ以上のＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ］、好ましくは２５ｍｇ／ｇ以上の量のＸＰＰを含む、アンギオテンシン変換酵素阻害に、及びヒトにおいて血圧を低下するのに適した食料品を提供し、より好ましくは前記食料品は５０ｍｇ／ｇ以上、更により好ましくは１００ｍｇ／ｇ以上のＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ、好ましくはＸ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、またはＴ、より好ましくはＸ＝Ｍ、Ｓ、またはＴ］の量を含む。
【００１２】
本発明に係る食料品は、ヒトの消費に適した製品として規定され、ここで本発明に係るＸＰＰは、顕著なＡＣＥ阻害効果が得られるように有効量の成分として使用された。
【００１３】
ここで理論的に整合が取れることを望まないが、本発明に係るトリペプチドは、以下の理由により良好なＡＣＥインヒビターであると解される：
・サイズが比較的小さいこと（２から１０アミノ酸の間の長さ）
・中性または正に荷電していること
・負に荷電した残基からならないこと
・疎水性で分枝したアミノ酸からなること
・Ｃ末端プロリン残基を有すること。
【００１４】
更に、二つの連続したＰｒｏ残基の存在に対して、ＸＰＰの場合ではＡＣＥによる最後の二つの残基の放出が、立体障害により有意に妨害されると解される。
【００１５】
更に、Ｃ末端のＰＰ（-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ）配列の存在は、ヒトの消化酵素、ヒトの腸内上皮細胞のブラッシュボーダー膜と会合したペプチダーゼ、及びヒトの血液循環中のぺプチダーゼに対して、前記ペプチドをより安定にすると解される。それ故、前記ペプチドを含む食料品の消費は、ヒトの身体内で前記ペプチドの有効な吸収を導き、ＡＣＥ阻害と血圧の低下を誘導するであろうと解される。
【００１６】
これらの観察を要約すると、あまり長くなく、中性または正に荷電した疎水性アミノ酸からなり、Ｃ末端Ｐｒｏ［または-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ］配列を有するいずれかのペプチドが、本質的にＡＣＥに対する良好なインヒビターであることが推定できる。
【００１７】
一般的にこの結果は、最も良好なＡＣＥ阻害ＸＰＰペプチドが、中性で疎水性のアミノ酸からなるという観察と一致する。Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅのような大きな疎水性残基が含まれない理由は、おそらく二つのＰｒｏ残基と組み合わせたこれらの残基が前記酵素の活性剤に正確にフィットするにはあまりに嵩高いという事実から導かれる。
【００１８】
ＣＰＰが含まれる理由は、ＡＣＥがＺｎ含有酵素であり、Ｚｎ原子と基質の相互作用が基質と酵素の間の結合には必須であり、Ｃｙｓの遊離スルフィドリル基の存在がこの相互作用を嗜好するという事実から導かれる。
【００１９】
以下のタンパク質（及びそれらの前駆体）が、例えばその構成タンパク質及び供給源の主要構造の範囲内で、記載されたＸＰＰ配列を含むように同定されている：
ＣＰＰ：コラーゲン［ニワトリ］、トロポニン［ニワトリ］、チログロビン［ウシ］
ＭＰＰ：アルブミン［エンドウマメ、ヤエナリ］、ミオシン［ウシ、ニワトリ、ブタ、酵母］、ゼイン［トウモロコシ］
ＳＰＰ：コラーゲン［ニワトリ］、カゼイン［ウシ］、レグミン［ヤエナリ、Sativumマメ］
ＴＰＰ：コラーゲン［ニワトリ］、グルテニン［コムギ］、クルセフェリン［レープ］、レグミン［綿花］、ミオシン［酵母］、ゼイン［トウモロコシ］
ＫＰＰ：ミオシン［ブタ、ニワトリ、酵母］、カゼイン［ブタ］
【００２０】
これらのタンパク質材料は、例えば基質として使用しても良く、そこから本発明に係るペプチドが遊離しても良い。当業者は、これを達成するための既知の発酵または既知の酵素処理、例えば酵素的加水分解を使用する方法を知っているであろう。
【００２１】
発酵または加水分解条件の最適化を通じて、本発明に係る生物学的な活性分子ＸＰＰの生産が最大化されて良い。生産を最大化することを試みる当業者は、加水分解時間、加水分解温度、酵素のタイプ及び濃度等のような反応パラメーターを調節する方法を知っているであろう。
【００２２】
好ましくは、ＸＰＰの生産において、ＸＰＰのモル収率は高い。ＸＰＰのモル収率は、加水分解の前の出発材料に存在するタンパク質の総量におけるＸＰＰ断片のモル量によって、生産されたＸＰＰのモル量を割り算したものとして規定される。
【００２３】
酵素的加水分解で使用される酵素は、ＸＰＰを含む基質を有効に加水分解できるいずれかの酵素であって良く、そこから一つ以上のＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ］の遊離が生じる。
【００２４】
酵素処理は、従来の態様で実施されて良い。それは、前記基質への酵素（または酵素の混合物）の添加と、酵素的加水分解を実施するのに適した制御条件下での生成反応混合物の維持を含む。制御される条件は、温度、ｐＨ、反応時間、及び酵素濃度を含む。反応混合物の好ましい温度は、４０−６０℃、より好ましくは４５−５５℃、最も好ましくは約５０℃である。反応混合物のｐＨは、好ましくは５から９、より好ましくは６−８、最も好ましくは約７である。酵素濃度は、反応混合物の総重量に基づいて２−１０重量％、より好ましくは３−１０重量％、最も好ましくは４−６重量％である。反応時間（加水分解時間）は、好ましくは２−５０時間、より好ましくは２−１０時間、最も好ましくは４−８時間である。
【００２５】
別の好ましい実施態様では、加水分解工程は、前記基質の加水分解を引き起こすであろう微生物での発酵工程によって置換されても良い。
【００２６】
発酵槽中の材料と基質は、均一な発酵媒体を達成するために従来法で混合されて良い。
【００２７】
発酵は有利には、２５から５０℃、好ましくは３５から４５℃で、３から８０時間、好ましくは６から２５時間で実施されて良い。
【００２８】
有利には、酵素処理と任意の発酵の後、いくつかの付加的な反応工程が実施されて良い。
【００２９】
好ましくは、本発明によれば、以下の工程を含むＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ］を含む食料品の調製方法が使用される：
ａ）加水分解化タンパク質産物を生成する、配列ＸＰＰを有するタンパク質を含む基質の酵素的加水分解
ｂ）前記加水分解化タンパク質産物からのトリペプチドで富化した分画の分離
ｃ）トリペプチドＸＰＰで富化した固体を得るための、工程ｂ）からの前記分画の乾燥
ｄ）前記食料品の調製における成分としての、工程ｃ）で調製された固体の使用。
【００３０】
酵素的加水分解工程ａ）の後、任意の分離工程または濃縮工程が存在しても良い。この工程は、例えば濾過、遠心分離、またはクロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせによって、当業者に既知のいずれかの方法で実施されて良い。好ましくは分離工程は、限外濾過（ＵＦ）及び／またはナノ濾過（ＮＦ）法を使用して実施される。濾過工程で使用される膜の孔のサイズ、並びに膜の荷電は、トリペプチドＸＰＰの分離を制御するように使用されて良い。荷電したＵＦ／ＮＦ膜を使用するタンパク質加水分解産物の濾過は、Y. Poilot等, Journal of Membrane Science 158 (1999) 105-114に記載されている。例えば電気透析はWO 00/42066に記載されている。そのような分離工程の産物は、ここでＡＣＥ分画と称される。
【００３１】
任意に加水分解産物は、トリペプチドＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ］で富化した固体を得るために乾燥されて良い。この工程は、例えばスプレー乾燥または凍結乾燥といった従来法で実施されて良い。
【００３２】
調製された乾燥固体は、以下ではＡＣＥ固体と称される。ＡＣＥ分画及び／またはＡＣＥ固体は、食料品における成分として有利に使用されて良い。
【００３３】
本発明に係る食料品、またはそこから由来する食料品は、低温殺菌または滅菌されて良い。
【００３４】
本発明に係る食料品は、いずれかの食品タイプを有して良い。それらは、香料、糖類、果肉、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等のような食料品に添加される通常の食品成分を適切な量で含んで良い。
【００３５】
好ましくは前記食料品は、50-200mmok/kgのＫ＋、及び/または15-60mmol/kgのＣａ２＋、及び/または6-25mmol/kgのＭｇ２＋、より好ましくは100-150mmok/kgのＫ＋、及び/または30-50mmol/kgのＣａ２＋、及び/または10-25mmol/kgのＭｇ２＋、最も好ましくは110-135mmok/kgのＫ＋、及び/または35-45mmol/kgのＣａ２＋、及び/または13-20mmol/kgのＭｇ２＋を含む。
【００３６】
好ましくは前記食料品は、フルーツジュース製品、乳製品、凍結菓子製品、またはスプレッド/マーガリンである。これらの好ましいタイプの食料品は、以下に幾分詳細に記載され、例として記載される。
【００３７】
・フルーツジュース製品
本発明に係るフルーツジュース製品の例は、オレンジ及びグレープフルーツのような柑橘類、トロピカルフルーツ、バナナ、ピーチ、ピアー、ストロベリーから由来するジュースであり、そこにＡＣＥ固体及び/またはＡＣＥ分画が添加される。
【００３８】
・乳製品
本発明に係る乳製品の例は、ミルク、乳製品スプレッド、クリームチーズ、乳飲料、及びヨーグルトであり、そこでＸＰＰが食料品の調製の間で生産される。前記食料品は、乳飲料のようなものとして使用されても良い。別法としてまたは加えて、香料または他の添加剤が添加されて良い。乳製品はまた、水または乳製品にＡＣＥ固体及び/またはＡＣＥ分画を添加することによって調製されても良い。
ヨーグルトタイプの製品のための組成物の例は、約50-80重量％の水、0.1-15重量％のＡＣＥ固体、0-15重量％のホエーパウダー、0-15重量％の糖類（例えばスクロース）、0.01-1重量％のヨーグルトカルチャー、0-20重量％の果肉、0.05-5重量％のビタミンとミネラル、0-2重量％の香料、0-5重量％の安定剤（増粘剤またはゲル化剤）である。
【００３９】
ヨーグルトタイプの製品のための典型的な提供量は、50から250ｇ、一般的には80から200ｇであろう。
【００４０】
・凍結菓子製品
本発明の目的のため、用語「凍結菓子製品」は、アイスクリームのような凍結菓子を含むミルク、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベット、アイスミルク及びフローズンカスタード、ウォーターアイス、グラニタス、及び凍結果肉プーリを含む。
【００４１】
好ましくは、凍結菓子中の固体濃度（例えば糖類、脂肪、香料等）は、３重量％より多い、好ましくは１０から７０重量％、例えば４０から７０重量％である。
【００４２】
アイスクリームは典型的に、０から２０重量％の脂肪、０．１から２０重量％のＡＣＥ固体、甘味料、０から１０重量％のノンファットミルク成分、及び乳化剤、安定剤、防腐剤、香料成分、ビタミン、ミネラル等のような任意成分を含み、残部は水であろう。典型的にアイスクリームは、２０から４００％、とりわけ４０から２００％のオーバーランに曝気され、−２から−２００℃、とりわけ−１０から−３０℃の温度に凍結される。アイスクリームは通常、約０．１重量％の濃度でカルシウムを含む。
【００４３】
・他の食料品
本発明に係る他の食料品は、食品のためのベース材料として加水分解化タンパク質を使用して、または適切な量の成分としてＡＣＥ固体のような派生製品を使用して、共通の一般的知見に基づいて当業者により調製できる。そのような食料品の例は、焼いた食品、乳製品タイプの食品、スナック等である。
【００４４】
有利には前記食料品は、例えばスプレッドといった油と水を含むエマルションである。油水エマルションはここで、油と水を含むエマルションとして規定され、水中油型（Ｏ/Ｗ）エマルション、及び油中水型（Ｗ/Ｏ）エマルション、および水中油中水（Ｗ/Ｏ/Ｗ/Ｏ/Ｗ）エマルションといったより複雑なエマルションを含む。油はここで脂肪を含むものと規定される。好ましくは前記食料品は、スプレッド、凍結菓子、またはソースである。好ましくは本発明に係るスプレッドは、３０−９０重量％の植物油を含む。有利にはスプレッドは４．２−６．０のｐＨを有する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
ＡＣＥ阻害効果について、大量のペプチドをスクリーニングした（ＩＣ５０値を測定した）。更に、ヒトの血清、ＨＵＶＥＣ、Ｃａｃｏ−２細胞、及び以下に記載される胃腸の酵素への曝露の間での安定性について、全てのペプチドをスクリーニングした。
【００４６】
実施例１で使用された材料及び方法は以下に記載される。
【００４７】
セルカルチャー
Ｃａｃｏ−２細胞を、American Type Culture Collection (ATCC)から得て、30-40継代で実験で使用した。細胞を７５ｃｍ２の培養フラスコ(Corning Costar, Badhoevedorp, The Netherland)で培養した。培養培地は、20％(v/v)胎児ウシ血清、1％(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、及び1％(v/v)ＮＥＡＡで補ったＤＭＥＭ（高グルコース、Ｌ-グルタミン含有）からなった。空気中に5％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で37℃で細胞を維持した。安定性の実験については、細胞を12穴細胞培養プレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)に植菌し、少なくとも21日間培養した。
【００４８】
ＨＵＶＥＣ細胞
ＨＵＶＥＣ細胞をCambrex Bio Science (Verviers, Belgium)から得て、1-5継代で実験で使用した。細胞を７５ｃｍ２の培養フラスコ(Corning Costar, Badhoevedorp, The Netherland)で培養した。培養培地は、2％(v/v)胎児ウシ血清、0.04％(v/v)ヒドロコルチコイド、0.4％(v/v)ヒト線維芽細胞増殖因子ベーシック（ヘパリン含有）、0.1％(v/v)血管内皮増殖因子、0.1％(v/v)ヒト組換えインスリン様増殖因子、0.1％(v/v)アスコルビン酸、0.1％(v/v)ヒト組換え上皮増殖因子、0.1％(v/v)ゲンタマイシン、アンホテリシン−Ｂ、及び0.1％(v/v)ヘパリンで補ったＥＢＭ−２からなった。空気中に5％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で37℃で細胞を維持した。安定性の実験については、細胞を12穴細胞培養プレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)に100.000細胞/ウェルの密度で植菌し、少なくとも2日間培養した。
【００４９】
試験製品
ペプチド混合物１は、ＶＰＰ、ＩＰＰ、ＩＩＡＥＫ、ＩＴＰ、ＶＦ、ＦＹ、ＫＶＬＰＶＰ、及びＨＬＰＬＰからなった。混合物２は、ＶＡＰ、ＧＰＲ、ＣＰＰ、ＭＰＰ、ＳＰＰ、ＴＰＰ、ＰＩＰ、及びＰＬＰからなった。合成ペプチドは、Bachem（トリペプチドＫＰＰ及びＧＰＲ）から注文したか、ユトレヒト大学(Dr. M. Egmond)から得た。
【００５０】
前記ペプチドは、５０μｌのmilliQ水またはＤＭＳＯに５ｍｇの濃度で別個に溶解された。いくつかのペプチドについては、前記濃度は純度のため較正された（ＩＴＰ60％、ＫＶＬＰＶＰ85％）。残りのペプチドは＞９５％の純度であった。ジペプチドを除く全てのペプチドをmilliQ水に溶解した。ＦＹはＤＭＳＯに溶解した。ＦＹはまだ不溶性であったため、いくらかのＨＣｌ（0.3Ｍの最終濃度）を添加した。ＶＦは0.3Ｍ ＨＣｌに直接溶解した。混合物１を調製するため、５０μｌの各ペプチドを共に混合し、１００μｌのmilliQ水を添加し、５mgの各ペプチドを含む５００μlの溶液を生成した（0.06Ｍ ＨＣｌ及び10％ＤＭＳＯ中）。混合物２を同様の方法で調製したが、更に５０μｌのｍｉｌｌｉＱ水を添加した点で異なった。混合物の２の最終組成も、１０ｍｇ/ｍｌの各ペプチドであった。
【００５１】
ペプチドの安定性試験
血清、ＨＵＶＥＣ、及びＣａ−ｃｏ−２細胞を使用する安定性試験
ペプチド混合物を、0.1、1、及び10μg/Lの最終濃度でヒト血清(Cambrex Bio Science, Verviers, Belgium)に添加した。ペプチド混合物を含む血清を、３７℃で0、1、2、5、10、20、60、120、240、及び360分間インキュベートした。1.5mlのサンプルを各時点でエッペンドルフチューブに回収した。その直後に、30μlの10％(v/v)トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と5μlの10μgのUC-13-IPP/10mlをサンプルに添加した。その後サンプルを100℃で5分間インキュベートし、次いでIEC Micromax RF遠心器(Boom BV Meppel)で10.000rpmで20分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブに回収し、更なる分析のため-20℃で貯蔵した。実験は三重で実施した。
【００５２】
細胞を12穴プレートで培養した。ペプチド混合物を、胎児ウシ結成を含まず、20％(v/v)固相抽出胎児ウシ血清を含む培養培地に加えた。ＨＵＶＥＣについては、0.1、1、及び10μg/mlのペプチドを含む400μlの培地を、培養プレートのウェルに添加した。3回130μlの培地を、0、5、10、20、30、60、90、及び120分のインキュベーションで回収した。Ｃａｃｏ−２細胞については、0.1、1、及び10μg/mlのペプチドを含む330μlの培地を、培養プレートの各ウェルに添加した。3回110μlの培地を、0、5、10、20、30、60、90、180、及び360分のインキュベーションで回収した。実験は三重で実施し、全てのサンプルを直接ドライアイスに配置して-20℃で貯蔵した。ペプチド定性測定のため、TFA及びUC13-IPP（それぞれ0.2％(v/v)及び60ng/mlの最終濃度）をサンプルに添加した。細胞を含まないウェルをコントロールとして使用した。
【００５３】
ＡＣＥ阻害アッセイ1：酵素ベースのアッセイ（ＥＥＡ）
ＡＣＥ及び合成基質（Abz-FRK-(Dnp)P-OH）を、白色光学プレート96ミクロプレート(Packard Bioscience)で実施するＡＣＥ阻害アッセイで使用した。基質はAdriana K. Carmona (Dept. of Biophysics, Escola Paulista de Medivina, Universidae Federal de Sao Paulo, Brazil)の寄贈であった。Abz-FRK-(Dnp)P-OHのストック溶液をＤＭＳＯ中で調製した。ε３６５＝17300Ｍ−１cm−１のモル吸光係数を使用して分光光学的に測定した。アッセイバッファーの組成は、100ｍＭのＮａＣｌを含む100ｍMトリス/ＨＣｌバッファー、ｐＨ7.0であった。4μlのアッセイバッファー中のサンプル溶液を各ウェルに添加した。コントロールの場合では、バッファーのみを添加した。サンプルを蛍光測定器(Fluostar, BMG labtechnologies)で三重に測定した。装置は最初に150μlの基質（アッセイバッファー中に3.75μM)を分散し、次いで各ウェルに20μlのＡＣＥ（0.00625ユニット/ml）を添加した。λｅｘ＝320nm及びλｅｍ＝420nmの蛍光を測定することにより、ＡＣＥ活性を10サイクル(約10分)測定した。生データを傾斜/秒に変換し、ＡＣＥ阻害活性を以下の等式を使用して計算した。
【００５４】
ＡＣＥ阻害（％）＝［１−（Ｓ平均−Ｂ平均）／（Ｃ平均−Ｂ平均）］×１００
式中、
Ｓ平均＝サンプル（ペプチド＋基質＋ＡＣＥ）の平均結果
Ｂ平均＝バックグランド（基質）の平均結果
Ｃ平均＝コントロール（ＡＣＥ＋基質）の平均結果
【００５５】
ＡＣＥ阻害アッセイ２：修飾Matsuiアッセイ
ＡＣＥ阻害活性を、Matsui等(Matsui, T.等 (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56: 517-518)の方法に従って、以下に記載の修飾をしてアッセイした。
【００５６】
表１：MatsuiＡＣＥ阻害アッセイの方法。120μlの最終容量を有する1.5mlチューブに成分を添加した。
【表１】
2007513900.tif 000002
【００５７】
各サンプルに対して、75μlの3mMヒプリルヒスチジンロイシン（Hip-His-Leu, Sigma chemicals Co.;この化学物質を200mM NaClを含む250mMホウ酸、pH8.3に溶解した）；20μlの0.1U/mlＡＣＥ（Sigmaから得た）または水、及び25μlのサンプルまたは水を混合した（表1参照）。混合物を37℃でインキュベートし、125μlの0.5MＨＣｌを添加することにより30分後に停止した。その後225μlのビシン/NaOH溶液（1M NaOH：0.25Mビシン(4：6)）を添加し、その後25μlの0.1M TNBS(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸, Fluka, Switzerland; 0.1M Na2HPO4中)を添加した。37℃で20分間インキュベートした後、4mlの0.2M NaH2PO4中の4mM Na2SO3を添加し、416nmでの吸光度をUV/Vis分光光度計(CPSコントローラー, Netherlandsを備えたShimadzu UV-1601）で測定した。
ＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）活性の量を、インヒビターの不存在下でのＡＣＥの変換速度と比較した阻害のパーセンテージとして計算した：
【００５８】
ＡＣＥＩ（％）＝(((Ｃ１−Ｃ２)−(Ｓ１−Ｓ２)／(Ｃ１−Ｃ２))×１００    （１）
式中、
Ｃ１＝ＡＣＥ阻害成分なしの吸光度（＝最大のＡＣＥ活性）［ＡＵ］
Ｃ２＝ＡＣＥ阻害成分とＡＣＥなしの吸光度（バックグランド）［ＡＵ］
Ｓ１＝ＡＣＥとＡＣＥ阻害成分の存在下での吸光度［ＡＵ］
Ｓ２＝ＡＣＥ阻害成分の存在下だがＡＣＥなしの吸光度［ＡＵ］
【００５９】
ＨＰＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳを使用するペプチドの定性
全ての測定は、Waters Quattro-IIまたはQuattro-Ultimaの三重の4重極子質量分析計で実施した。ＬＣ分離を、0-50％アセトニトリル／0.1%(v/v)ＴＦＡを使用して、3μmの粒子で実装された150×2.1mmのInertsil 5 ODS3カラム(Chompack)で25℃で実施した。カラムの流速は0.2ml/分であった。ポストカラムメイクアップ後の全流量は0.05/分であり、プロピオン酸とプロパノール-2の7/3(v/v)混合物を含んだ。勾配係数を、ポジティブＥＳＩモードでＭＲＭマススペクトロメトリーを使用して分析した。キャピラリー電圧は4ｋＶであった。ソース及びネブライザー温度は、それぞれ100℃及び250℃であった。乾燥とネブライザーガス流量は、それぞれ300l/h及び17l/hであった。衝突ガスは、7.9e-4mbarの圧力でアルゴンであった。分析されたペプチドについてのMSデータが表2に示されている。
【００６０】
表２：選択されたペプチドについてのMSパラメーターの記載
【表２】
2007513900.tif 000003
【００６１】
in vitro胃腸消化
発酵したまたは加水分解したミルクタンパク質を胃と小腸における典型系的な条件に供することにより、ヒトの胃腸管におけるペプチドを安定性を研究した。2.0gのNaCl、2.9gのペプシン、及び0.45gのRhizopus oryzae由来のAmano Lipase F-AP15を含む820mlの水中に、80mlの発酵したまたは加水分解したミルクタンパク質を溶解することにより、胃の条件として擬制した。液をＨＣｌでｐＨ3.5に調節し、ぺドル(50rpm)で攪拌し、60分間37℃で維持した。次いで、刺激した胃液に9ｇのパンクレアチンと125mgの塩水抽出物を添加し、ＮａＨＣＯ３で6.8にｐＨを調節することにより、腸の条件として擬制した。刺激した腸液を、ぺドル(50rpm)で攪拌し、37℃で120分維持した。in vitro胃腸消化の間の各種の時点で、サンプルを回収した。回収後、サンプルを直接95℃で30分過熱し、その後-20℃で貯蔵した。
【００６２】
実施例1の結果が表3に示されている。
【００６３】
表３：ＬＣ−ＭＳで測定した、ヒト血清、ＨＵＶＥＣ、Ｃａｃｏ−２細胞、及び胃腸プロテアーゼ（ＧＩ条件）に曝した間のペプチドの安定性
【表３】
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【００６４】
表３で使用された記号の説明
＋＝安定
−＝細胞または血清によりかなり分解
＋／−＝細胞または結成によりゆっくりと分解
ＮＤ＝測定不能
【００６５】
表３は、全てのＸＰＰ［式中、Ｘ＝Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＫ］が、中程度から良好なＡＣＥインヒビターであることを示す（低いＩＣ５０値）。それにこれらのペプチドは、試験された他のペプチドと比較して、ヒトの血清に供された場合にゆっくりと分解を示し、ＨＵＶＥＣ、Ｃａｃｏ−２、及び胃腸酵素に供された場合に比較的安定である。
【国際調査報告】
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