(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプルに入っている興味の持たれる免疫組織化学的エピトープまたは核酸配列をインサイチュ検出する新規な組成物および方法に向けたものであり、これは、酵素標識結合分子と前記興味の持たれるエピトープまたは配列を酸化還元に不活性な還元種および可溶金属イオンの存在下で結合させることで前記金属イオンから金属原子への還元が前記酵素がつなぎ止められている地点または付近で起こり易くすることを含んで成る。ホスファターゼと接触した時に活性化されて還元形態になることで金属イオンに還元を受けさせて不溶な金属にする新規なホスフェート誘導体である還元剤を記述する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルに入っている興味の持たれる免疫組織化学的エピトープまたは核酸配列をインサイチュ検出する方法であって、酵素標識結合分子と前記興味の持たれるエピトープまたは配列を酸化還元に不活性な還元種および可溶性金属イオンの存在下で結合させることで前記金属イオンから金属原子への還元が前記酵素がつなぎ止められている地点または付近で起こり易くすることを含んで成る方法。
【請求項２】
前記酵素標識結合分子が抗体を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酵素標識結合分子がアビジンまたはストレプトアビジンを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記酵素標識結合分子がヌクレオチド配列を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記酸化還元に不活性な還元種が前記酵素標識結合分子用の基質である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がアルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、アルファ−およびベータ−ガラクトシダーゼ、アルファ−およびベータ−グルコシダーゼ、一般的にエステラーゼおよびベータ−ラクタマーゼから成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記酵素がアルカリ性ホスファターゼでありそして前記基質がアスコルビン酸ホスフェートである請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記酵素がアルカリ性ホスファターゼでありそして前記基質がヒドロキノンホスフェート誘導体である請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記酸化還元に不活性な還元種がヒドロキノンモノ−およびジ−ホスフェート、ナフトヒドロキノンモノ−およびジ−ホスフェートおよびアントラヒドロキノンモノ−およびジ−ホスフェートまたはこれらの誘導体から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化還元に不活性な還元種がセサモールホスフェート、オイゲノールホスフェートおよびアルファ−トコフェロールホスフェートまたはこれらの誘導体から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記金属が銀および金から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
以下に示す一般構造（ＩＶ）
【化１】
2007528986.tif 000011
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、Ｈ、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよいが、両方のＺがＨであることはあり得ない］
で表される化合物。
【請求項１３】
両方のＺがＰＯ３２−である請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
一般構造（Ｖ）：
【化２】
2007528986.tif 000012
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよい］
で表される化合物。
【請求項１５】
一般構造（ＶＩ）：
【化３】
2007528986.tif 000013
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよい］
で表される化合物。
【請求項１６】
一般構造（ＶＩＩ）：
【化４】
2007528986.tif 000014
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよい］
で表される化合物。
【請求項１７】
Ｒ１がＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２）３−Ｈである請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
生物学的サンプルに入っている興味の持たれるバイオマーカーを検出するためのキット
であって、各容器が抗−バイオマーカー結合分子、酸化還元に不活性な還元種、前記還元種を活性にする酵素および金属イオンを保持するに適する、１個以上の容器を含んで成るキット。
【請求項１９】
前記抗−バイオマーカー結合分子が抗体である請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体にハプテン標識が付いている請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
前記抗−バイオマーカー結合分子がオリゴヌクレオチド配列である請求項１８記載のキット。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチド配列にハプテン標識が付いている請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
前記酵素標識がホスファターゼである請求項１８記載のキット。
【請求項２４】
前記酸化還元に不活性な還元種がアスコルビン酸ホスフェートである請求項１８記載の化合物。
【請求項２５】
興味の持たれるエピトープまたはヌクレオチド配列を有する生物学的サンプルをインサイチュ染色する方法であって、
（ａ）前記組織をハプテンを有する結合分子と接触させ、
（ｂ）前記ハプテンを標識酵素と結合しているハプテン結合パートナーと接触させ、そして
（ｃ）前記生物学的サンプルと前記標識酵素用の基質である酸化還元に不活性な還元種を金属イオンの存在下で接触させる、
段階を含んで成る方法。
【請求項２６】
前記結合分子が抗体、ヌクレオチド配列およびアフィニティーパートナーから成る群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ハプテンがフルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびジニトロフェノールから成る群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素標識がホスファターゼである請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記金属が銀および金から成る群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
銀金属の還元に先立って前記生物学的サンプルを金で前以て処理しておく段階を実施する請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記酸化還元に不活性が還元種をヒドロキノンモノ−および／またはジ−ホスフェート、ナフトヒドロキノンモノ−および／またはジ−ホスフェート、アントラヒドロキノンモノ−および／またはジ−ホスフェート、セサモールホスフェート、オイゲノールホスフェートおよびアルファ−トコフェロールホスフェートまたはこれらの誘導体から成る群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
興味の持たれるエピトープまたはヌクレオチド配列を有する生物学的サンプルをインサイチュ染色する方法であって、
（ａ）前記組織をビオチニル化一次抗体と接触させ、
（ｂ）前記ビオチニル化一次抗体と結合させた前記生物学的サンプルをストレプトアビジ
ン−アルカリ性ホスファターゼと接触させ、そして
（ｃ）前記段階（ｂ）の生物学的サンプルとアスコルビン酸ホスフェートを銀イオンの存在下で７より高いｐＨで接触させる、
段階を含んで成る方法。
【請求項３３】
前記Ｚがホスフェートである請求項１４記載の化合物。
【請求項３４】
前記Ｚがホスフェートである請求項１５記載の化合物。
【請求項３５】
前記Ｚがホスフェートでありそして前記Ｒ１がメチルである請求項１６記載の化合物。
【請求項３６】
銀金属の還元に先立って前記生物学的サンプルを金で前以て処理しておく段階を実施する請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００３年６月２４日付けで出願した仮米国出願６０／４８２，５９６（これの内容は引用することによって全体が本明細書に組み入れられる）の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般に、化学の分野に関し、詳細には、酵素が媒介する反応を用いて金属原子を局部的に付着させることで免疫組織化学的エピトープおよび核酸配列をインサイチュ検出する新規な方法に向けたものである。
【背景技術】
【０００３】
現代の標準では、組織染色は百年以上さかのぼる古代技術である。最近では、いろいろな種類の化学品および生物化学的染色液を組織断片に加える手順を自動化する努力が成されている。この目的で創案された装置には、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ系列のデュアルカルーセルが基になった装置、例えば３２０、ＥＳ（商標）、ＮｅｘＥＳ（商標）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（商標）およびＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（商標）ＸＴなどが含まれる。そのような装置が記述されている特許には特許文献１、２、３および４（これらは全部引用することによって全体が本明細書に組み入れられる）が含まれる。別の種類の自動染色装置は特許文献５および６（これらは両方とも引用することによって全体が本明細書に組み入れられる）に記述されているＴｅｃｈＭａｔｅ（商標）系列の染色装置である。
【０００４】
組織化学ではいろいろな手作業の検出化学が長年に渡って開発されてきた。一般的には、興味の持たれる分子マーカーまたは標的を生体分子検定で同定した後、病理学者または他の医学専門家による解釈が可能なように、それを光顕微鏡で見ることができるようにする必要がある。１番目の検出段階は、抗−標的一次抗体にビオチン、ジゴキシゲニン、
フルオレセイン、または興味の持たれる生物学的標的の場所を確認する目的で用いられる他のハプテンなどによる標識を検出可能様式で付けることを伴う。次に、酵素または他のレポーター分子と結合させておいた抗−ハプテン二次抗体を用いて前記一次抗体の場所を確認する。典型的な酵素系は通常の技術者に公知であり、それにはホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼが含まれる。その後、前記酵素が前記一次抗体−二次抗体複合体の直ぐ近隣で起こる発色性基質の沈澱に触媒作用を及ぼす。色原体、例えばニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）；四塩酸３，３’−ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）；および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などは良く知られている。別法として、酵素と基質の相互作用によって化学発光シグナルを生じさせて、それを写真フィルムで捕捉することも可能である。
【０００５】
他の標識には、二次抗体の１２５Ｉ標識（これは写真フィルムで検出可能である）、フルオレセインイソチオシアネート標識付き二次抗体（これは紫外光で検出可能である）；１２５Ｉ標識付き蛋白質Ａ（これはＩｇＧ分子のＦｃ領域と結合することから二次抗体の代わりに使用可能である）、金標識付き二次抗体（これが二次抗体と一緒に一次抗体と結合すると赤色として直接見ることができる）、ビオチニル化二次抗体（これを当該二次抗体と一緒にインキュベートした後にビオチンと強力に結合する酵素結合アビジンと一緒にインキュベートするとシグナルが増強される、と言うのは、１個の抗体分子に多数のビオチン分子が結合し得るからである）が含まれる。典型的に用いられる酵素にはアルカリ性ホスファターゼ（「ＡＰ」）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）
が含まれる。
【０００６】
免疫組織化学的検出を金属で増強させることが特許文献７（引用することによって全体が本明細書に組み入れられる）に教示されている。特許文献７は、生物学的サンプルに酸化触媒が存在するか否かを検出するための組成物および方法に向けたものである。その組成物は、発色性基質に酸化を触媒の存在下で２種以上の共沈還元金属と一緒に受けさせることで生じさせた沈澱物を含んで成る。強いシグナルが発生し、そのシグナルを用いて標的分子に局在する酸化触媒を検出する。標的分子は核酸、抗体または細胞表面抗原であり得る。特許文献７は、特に、酸化触媒の検出では発色性沈澱物および２種以上の金属に頼っている。酸化重合させたＤＡＢをニッケルイオンで前以て処理しておくことで前記ＤＡＢを銀で増感させることが非特許文献１に教示されている。
【０００７】
免疫組織化学的検出を金属で増強させる例（より最近の）には特許文献８が含まれる。特許文献８は、ゼロ酸化状態の金属を金属イオンから生じさせる方法に向けたものであり、その方法は、セシウム、周期律表の１ｂ、２ａ、４ａおよび８族から選択される少なくとも１種の金属の金属イオン、酸素含有酸化剤、およびヒドロキノン、ヒドロキノン誘導体または没食子酸ｎ−プロピルの中の少なくとも１種から選択される還元剤を準備し、酸化還元酵素を準備し、前記酵素と前記金属イオンと酸化剤と還元剤を一緒にし、そして前記金属イオンの少なくともいくつかに還元を受けさせてゼロ酸化状態の金属を生じさせることを含んで成る。特に銀イオンはホースラディッシュペルオキシダーゼの近くで過酸化水素およびヒドロキノンと接触すると還元を受けて銀金属が生じることが教示されている。
【０００８】
興味の持たれる免疫組織化学的エピトープおよびＤＮＡ標的を明視野光顕微鏡で可視的に同定するにより良好な生化学的技術の必要性が継続して存在する。
【特許文献１】米国特許第５５９５７０７号
【特許文献２】米国特許第５６５４１９９号
【特許文献３】米国特許第６０９３５７４号
【特許文献４】米国特許第６２９６８０９号
【特許文献５】米国特許第５３５５４３９号
【特許文献６】米国特許第５７３７４９９号
【特許文献７】米国特許第５，１１６，７３４号（Ｈｉｇｇｓ他）
【特許文献８】米国特許第６，６７０，１１３号（Ｈａｉｎｆｅｌｄ）
【非特許文献１】Ｍｅｒｃｈａｎｔｈａｌｅｒ他、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈ．Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３７：１０  １５６３−６５（１９８９）
【発明の開示】
【０００９】
（発明の要約）
本発明は、生物学的サンプルに入っている興味の持たれる免疫組織化学的エピトープまたは核酸配列をインサイチュ検出する新規な組成物および方法に向けたものであり、これは、酵素標識結合分子と前記興味の持たれるエピトープまたは配列を酸化還元に不活性な
還元種および可溶性金属イオンの存在下で結合させることで前記金属イオンから酸化状態がゼロの金属への還元に触媒作用が前記酵素がつなぎ止められている地点または付近で及ぶようにすることを含んで成る。ホスファターゼ酵素と接触した時に活性化されて還元形態になった時に金属イオンに還元を受けさせて酸化状態が０の不溶な金属粒子を生じさせる新規なホスフェート誘導体である還元剤を記述する。
【００１０】
本発明は、また、以下に示す一般構造（ＩＶ）
【００１１】
【化１】
2007528986.tif 000002
【００１２】
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、Ｈ、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよいが、両方のＺがＨであることはあり得ない］
で表される化合物にも向けたものである。好適な化合物は両方のＺ＝ホスフェートである化合物である。
【００１３】
本発明は、また、一般構造（Ｖ）：
【００１４】
【化２】
2007528986.tif 000003
【００１５】
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよい］
で表される化合物にも向けたものである。特に好適な化合物はＺ＝ホスフェートである化合物である。
【００１６】
本発明は、また、一般構造（ＶＩ）：
【００１７】
【化３】
2007528986.tif 000004
【００１８】
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよい］
で表される化合物にも向けたものである。特に好適な化合物はＺ＝ホスフェートである化合物である。
【００１９】
本発明は、また、一般構造（ＶＩＩ）：
【００２０】
【化４】
2007528986.tif 000005
【００２１】
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよく、そして
Ｚは、ＰＯ３２−、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、エステルまたはβ−ラクタムであってもよい］
で表される化合物にも向けたものである。特に好適な２種類の化合物はＲ１＝メチルまたはＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２）３−ＨおよびＺ＝ホスフェートである化合物である。
【００２２】
本発明は、また、興味の持たれるエピトープまたはヌクレオチド配列を有する生物学的サンプルをインサイチュ染色する方法にも向けたものであり、この方法は、（ａ）前記組織をハプテンを有する結合分子と接触させ、（ｂ）前記ハプテンを標識酵素と結合しているハプテン結合パートナー（ｈａｐｔｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒ）と接触させ、そして（ｃ）前記生物学的サンプルと前記標識酵素用の基質である酸化還元に不活性な還元種を金属イオンの存在下で接触させる段階を含んで成る。
【００２３】
本発明は、また、興味の持たれるエピトープまたはヌクレオチド配列を有する生物学的サンプルをインサイチュ染色する方法にも向けたものであり、この方法は、（ａ）前記組織をビオチニル化一次抗体と接触させ、（ｂ）前記ビオチニル化一次抗体と結合させた前記生物学的サンプルをストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼと接触させ、そして（ｃ）前記段階（ｂ）の生物学的サンプルとアスコルビン酸ホスフェートを銀イオンの存在下で７より高いｐＨで接触させる段階を含んで成る。また、銀の付着を向上させる目的で場合により金イオンによる予備処理段階を用いることも可能である。
（好適な態様の説明）
本発明は、最初に結合分子を興味の持たれるエピトープまたは配列と結合させることを通して興味の持たれる免疫組織化学的エピトープまたは核酸配列を検出する方法に向けたものである。前記結合分子に、酸化還元に不活性な還元種から還元剤への変換に触媒作用を及ぼす酵素による標識を付けておくことで、発色で検出可能な金属の還元が前記酵素がつなぎ止められている地点または付近で起こるようにする。より具体的には、本発明は、酸化還元に不活性な酵素基質１種または２種以上、即ちアスコルビン酸ホスフェートの脱燐酸化に触媒作用を及ぼし得るアルカリ性ホスファターゼおよび他の酵素、即ちグルコシダーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど（前記アスコルビン酸ホスフェートは酵素の触媒作用で脱燐酸化を受けた後に銀および／または金イオンに還元を受けさせて金属銀および／または金原子を生じさせる能力を有する極めて効率の良い還元剤になる）を標識として用いる新規な方法によるものである。前記還元は興味の持たれるエピトープまたはヌクレオチド配列の所または付近で起こることから、沈澱して来る酸化状態が０の金
属である銀／金は前記エピトープもしくは配列の近くに蓄積し、それによって、顕微鏡による診断手順で前記エピトープを目で検出する度合が大きく向上する。
【００２４】
本発明は、また、この上に示した方法で用いる目的で特別に合成した新規な化合物にも向けたものである。アスコルビン酸ホスフェート（ＺがＰＯ３２−である一般式Ｉを参照）基質が最も好適であり、これは、これの酵素であるアルカリ性ホスファターゼによって脱燐酸化を受けると結果としてアスコルビン酸塩イオン、即ち銀および金カチオンの良好な還元剤になる。一般的には、以下に示す式（Ｉ）−（ＶＩＩ）で表される化合物が優れた基質である。
【００２５】
【化５】
2007528986.tif 000006
【００２６】
一般構造Ｉ−ＶＩＩの場合、ＺはＰＯ３２−、ガラクトシル、グルコシル、エステルまたはベータ−ラクタムであってもよい。一般構造ＩＩ−ＩＶの場合、２個のＺの中の一方
はまたＨであってもよい。
【００２７】
一般構造ＩＩ−ＩＶの場合、少なくとも１個のＺはＰＯ３２−、ガラクトシル、グルコシル、エステルまたはベータ−ラクタムであるべきである。
【００２８】
一般構造ＩＩの場合、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよい。
【００２９】
一般構造ＩＩＩ−ＶＩＩの場合、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよい。
【００３０】
一般構造ＩＩＩ−ＩＶの場合、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよい。
【００３１】
本明細書で用いる用語は本分野の通常の技術を持つ化学者に公知である。それにも拘らず、そのような用語に与えられる範囲および本明細書および請求の範囲の明確な一定した理解が得られるようにする目的で下記の定義を示す。
【００３２】
インサイチュ検出は、組織または無傷の細胞標本の中に入っている興味の持たれる生物学的特徴を見ることができるようにすることを意味する。組織は、例えば固定されてパラフィンに埋め込まれた厚みが４−８μｍの組織断片、例えば通常は顕微鏡用ガラススライドの上に置かれた組織断片であり、その後、それを調製して免疫組織化学の目的で染色するか、或はオリゴヌクレオチドプローブを用いてインサイチュハイブリッド形成を行う。無傷の細胞には、シトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎｓ）、ＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（商標）（Ｃｙｔｙｃ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）および染色を受けさせる目的で他の方法で調製された無傷の細胞が含まれる。インサイチュは、また、組織群が顕微鏡用ガラススライドの上に置かれた状態も指し得る。
【００３３】
色原体：通常は着色している検出可能な反応生成物をもたらす酵素基質。典型的な色原体の例には、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）；四塩酸３，３’−ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）；および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）が含まれる。更に多くの色原体が知られていて、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）などの如き供給業者を通して入手可能である。
【００３４】
結合分子：これの相補的結合部位の近くに来た時に前記部位と結合する相補的結合部分を有する如何なる分子であってもよい。標的ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリッド形成し得る配列を有するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴマーおよび抗体が結合分子の２例である。更に別の結合対はストレプトアビジン−ビオチン対であり、これを本明細書ではまた「アフィニティーパートナー」とも呼ぶ。その結合蛋白質ストレプトアビジンはビオチンに対して固有の親和性を示す。ビオチンは解剖病理学実験室の全体に渡ってストレプトアビジンの結合パートナーとして広く用いられている。商業的に入手可能な一次抗体のほとんど全部にビオチンが標識として付いており、その結果として、ストレプトアビジン結合体を用いてその一次抗体の場所を確認することができる。本発明では、ビオチン−ストレプトアビジン結合モチーフを用いてストレプトアビジンとＡＰを一緒に局在させる。ビオチン標識を付けておいた二次抗体は組織の中の結合部位を標的にし、そしてストレプトアビジン−ＡＰ結合体は、ストレプトアビジンがビオチンと結合することでＡＰを同じ場所に運ぶ。
【００３５】
キット：興味の持たれるバイオマーカーを検出するに必要な反応体を保持する２個以上の槽、容器、デバイスなどが包装されている組み合わせ。このキットには当該方法を実施するための取り扱い説明書が付いている。そのようなキットにはＡＰ標識付き抗体、核酸、リガンドなどが入っている可能性がある。生物学的サンプルの中に入っている興味の持たれるバイオマーカーを検出するための本キットは、各容器が抗−バイオマーカー結合分子、酸化還元に不活性な還元種、前記還元種を活性にする酵素および金属イオンを保持するに適する１個以上の容器を含んで成る。
【００３６】
標識酵素は、抗体、核酸または結合蛋白質、例えばストレプトアビジンなどと結合しているアルカリ性ホスファターゼまたは他の酵素であり得る。そのような標識酵素が果たす機能は、酸化還元に活性な還元種が酸化還元に不活性な還元剤前駆体からもたらされる生成に触媒作用を及ぼす機能である。他の酵素はアルファ−およびベータ−ガラクトシダーゼ、アルファ−およびベータ−グルコシダーゼ、一般的にエステラーゼおよびベータ−ラクタマーゼ、特にセファロスポリナーゼおよびペニシリナーゼであり得る。
【００３７】
酸化還元に不活性な還元種は、還元種／還元剤、例えばアスコルビン酸塩またはヒドロキノンジアニオンなど［これは適切な条件下で可溶金属イオン、例えば銀（＋）または金（＋３）などに還元を受けさせて銀または金原子を生じさせ、その結果として、それを明視野光顕微鏡を用いて目で特定の点として見ることができるようにする］の前駆体である。本発明の好適な酸化還元に不活性な還元種はアスコルベートホスフェートであるが、本明細書では他の多くの還元種も教示する。
【００３８】
銀のシグナルを増幅させる目的で使用可能な他の還元剤はヒドロキノン、アスコルビン酸、２−アミノフェノールおよび４−アミノフェノールである。それらは、更に、金属イオンに還元を受けさせて金属の酸化状態をゼロにする作用も示し、それらを典型的には前記シグナルの補足または増幅の目的で用いる。他の還元剤も本分野の通常の技術者に良く知られており、それらを本明細書で教示する還元剤の代わりに用いることも可能である。
【００３９】
本明細書に開示する発明では、還元剤として完全に不活性ではあるが、アルカリ性ホスファターゼによる触媒作用によってホスフェート基が加水分解を受けた後に反応性を示すようになって金属イオンに還元を受けさせて金属の酸化状態（０）にする能力を有するようになる新規な一連のホスフェートおよびジホスフェートおよび関連誘導体を利用する。以下の構造で示す不活性な還元剤前駆体はアスコルビン酸ホスフェート、即ち特に好適な態様である。それはアルカリ性ホスファターゼの存在下で加水分解を受けて活性のある還元剤であるアスコルビン酸になり、これは金、銀および他の金属のカチオンに還元を受けさせて金属（０）にする能力を有する：
【００４０】
【化６】
2007528986.tif 000007
【００４１】
更に別の新規な有機還元剤前駆体には、α−トコフェロールホスフェート、セサモールホスフェートおよびオイゲノールホスフェートが含まれ、これは一般構造Ｖ−ＶＩＩ［ここで、Ｚ＝ＰＯ３２−、そしてＲは、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよい］で示される。
【００４２】
本発明でアルカリ性ホスファターゼを標識として用いかつアスコルベートホスフェートを基質として用いると下記のいくつかの利点が存在する：
（１）アルカリ性ホスファターゼは完全に発達した酵素の中の１つであり、それのＫｃａｔ／Ｋｍは１ｘ１０９リットル／モル・秒の拡散律速限界に近い。
（２）アルカリホスファターゼの最適ｐＨは９−１０であり、これは当該基質の脱燐酸化によって放出されるヒドロキノンの放出速度が最大の時の還元電位に一致する。
（３）アリールおよびアルキルホスフェートおよびジホスフェートはかなり安価に合成可能である。
（４）アリールおよびアルキルホスフェートおよびジホスフェートはアルカリ性ホスファターゼの優れた基質である。
（５）アリールおよびアルキルホスフェートおよびジホスフェートは一般にかなり安定なことから長期間に渡って分解を起こさないように配合可能である。
（６）アルカリ性ホスファターゼは大部分の酵素に比べて熱および化学品による劣化に耐える非常に安定な酵素である。
（７）アルカリ性ホスファターゼはかなり小型であることから他の生物学的分子と結合させる方法が開発されている。
（８）アスコルビン酸ホスフェートはＡＰの優れた基質でありかつアスコルベートは非常に高い還元電位を有する、即ちそれはＡｇ＋およびＡｕ＋３に還元を定量的かつ迅速に受けさせることに加えて副生成物はデヒドロアスコルベートのみである。
【００４３】
別の優れた還元剤はヒドロキノンジアニオンである。以下に示す構造は、銀カチオンの如き電子受容体の存在下でｐＨが９−１０の時の平衡状態のヒドロキノン−ベンゾキノンの構造を示している。ヒドロキノンジアニオンが銀カチオンに還元を受けさせて不溶な金属を生じさせる責任を負っている実際の種である。ｐＨが高いとヒドロキノンの生成が好都合になる：
【００４４】
【化７】
2007528986.tif 000008
【００４５】
一般構造ＩＩ−ＩＶは、また本発明の主題でもある数種のヒドロキノン誘導体である。ヒドロキノンジホスフェート（両方のＺ＝ホスフェートである一般構造ＩＩ）がアルカリ性ホスファターゼ酵素による脱燐酸化に好適な基質であり、これは、ｐＨが７−１１の時に脱燐酸化を受けてヒドロキノンジアニオン、即ち銀カチオン用の好適な還元剤になる。他のヒドロキノン様誘導体は一般構造ＩＩＩ−ＩＶで表され、ナフトヒドロキノン（ＩＩＩ）およびアントラヒドロキノン（ＩＶ）である。それらは、示すように、アリール環内のいずれかの位置がＲ１およびＲ２で置換されていてもよくそして酸素がＺで置換されていてもよい。置換基Ｒ１およびＲ２は、おおよそ、前記部位で反応が起こり得るがそれでも所望のｐＨでジアニオンが生じる能力が保持されるならば如何なる部分であってもよい。本明細書に含める有機置換基のリストは完全ではなく、妥当ないくつかの置換基には下記が含まれる：Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルおよびスルホネート。
【００４６】
本発明では、以下の構造に示すように、選択した標識−基質対に応じて、いろいろな酵素標識を用いることができる。例えば、エステラーゼをモノ−およびジエステルと協力させて用いてもよい。また、基質であるモノ−およびジ−ガラクトシドおよびモノ−およびジグルコシドに脱保護を受けさせようとする場合には、また、ガラクトシダーゼおよびグルコシダーゼも使用可能である。以下に示す「Ｚ」基には、ホスフェート、ガラクトシル、グルコシル、エステルおよびベータ−ラクタムが含まれる。好適なベータ−ラクタムはセファロスポリンである。本発明の範囲内に入る糖には、当該還元種の酸素と結合する還元末端部を有するいずれも含まれる。Ｒ基はＨ、アルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシアルキル、ＮＨ２、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−、ニトロ、エーテル、チオエーテルまたはスルホネートであってもよい。
【００４７】
【化８】
2007528986.tif 000009
【００４８】
最後に示した構造物、即ちＣ３’ベータ−ラクタム（即ちセファロスポリン）もまた酵素標識としてのベータ−ラクタマーゼと協力させて使用可能である。前記ベータ−ラクタムのＲ基はアルキル、アリール、即ちチオフェン、メチルまたはベンジルであってもよい。
【００４９】
ガラクトシル、グルコシルおよび他の糖のヒドロキノンおよびアスコルベート誘導体が、不活性な基質の酵素代謝回転によってＴＷＯ還元剤、即ちヒドロキノンまたはアスコルベートおよび炭水化物（銀イオンに還元を受けさせて金属銀を生じさせる能力も有する還元末端部を有する）をもたらす点で特に価値がありかつ興味の持たれるものである：
【００５０】
【化９】
2007528986.tif 000010
【００５１】
アルカリ性ホスファターゼに加えて、また、酸性ホスファターゼも標識として使用可能であり、この場合には、当該基質が有するホスフェート基の脱保護をｐＨ＜７で起こさせるべきである。そのような反応で放出されたアスコルビン酸はそれでもｐＨ＜７で優れた還元能力を保持している。
【００５２】
銀金属が核形成部位、例えば金粒子などに付着すると言った良く知られた傾向（「金属組織学」）を利用して、金による前処理段階を設けることで、固定されているアルカリ性ホスファターゼの直ぐ隣接する領域に「種を植え付ける（ｓｅｅｄ）」ことも可能である。本明細書の実施例に示すように、ＳＡ−ＡＰ結合体をビオチニル化結合分子と結合させた後、金イオンをＡｕＣｌ３の形態でアスコルベートホスフェートと一緒に付着させた。前記アスコルベートホスフェートがＡＰによって脱燐酸化を受けると結果として還元剤であるアスコルベートが生じ、その後、それが金イオンに還元を受けさせて金属金を生じさせる。次に、金属金が核形成部位として働くことで、銀イオンが還元を受けて銀金属になることによるシグナルが更に増幅される。
【００５３】
本発明の特定の面を説明する目的で以下の実施例を含めるが、限定として解釈されるべきではない。
実施例
【実施例１】
【００５４】
銀（Ｉ）にアルカリ性ホスファターゼ媒介還元を受けさせるためのホスフェート
ミクロタイタープレート（図１参照）の穴に硝酸銀を一定分量（５０ｍＭのＡｇＮＯ３を１００μＬ）で入れた。前記銀溶液にアスコルビン酸−２−ホスフェート（穴Ａ１、Ｂ１）、セサモールホスフェート（穴Ａ２、Ｂ２）、ヒドロキノン−１，４−ジホスフェート（穴Ａ３、Ｂ３）または２，２，５，７，８−ペンタメチル−６−クロマノールホスフェート（穴Ａ４、Ｂ４）のいずれかの５０ｍＭ溶液を１００μＬ添加したが、全く反応が現れなかった。ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ（０．２ｍｇ／ｍＬを５μＬ）を縦列Ｂの穴に加えると、各溶液から金属銀（０）が微細な黒色沈澱物として生じるか或は容器の壁が銀で被覆された。
Ａ：５０ｍＭのＡｇＮＯ３を１００μＬと５０ｍＭの基質ホスフェートを１００μＬ
Ｂ：５０ｍＭのＡｇＮＯ３を１００μＬと５０ｍＭの基質ホスフェートを１００μＬと１
００ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）中０．２ｍｇ／ｍＬのウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を５μＬ。
【実施例２】
【００５５】
ニトロセルロース上のアルカリ性ホスファターゼ、硝酸銀および基質ホスフェート
ニトロセルロース紙にアルカリ性ホスファターゼ（０．２ｍｇ／ｍＬを５μＬ）を加えた後、乾燥させた（図２を参照）。前記ホスフェートの各々の斑点をニトロセルロース上に０．１Ｍのトリス（ｐＨ９）中０．０５Ｍの溶液５μＬとして付けた。各斑点を乾燥させた後、それに０．０５ＭのＡｇＮＯ３を５μＬ加えた時に黒色の沈澱を観察したのはアルカリ性ホスファターゼを加えた斑点の所のみであった。
【実施例３】
【００５６】
ＡＰ−ＳＡ結合体を高いｐＨで用いてＡｇのナノ粒子を扁桃腺上にオフラインで発生
Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（商標）自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を用いて分析用スライドの調製を実施した。手作業でシグナルを発生させる目的で前記スライドを取り出した。本実施例の範囲内で用いる用語「緩衝液」は、氷酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてｐＨを９にしておいた脱イオン（ｄＩ）Ｈ２Ｏ中０．１Ｍのトリス緩衝液［Ｔｒｉｚｍａベース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）］を指す。下記が前記装置で採用した手順である：パラフィン被覆組織をスライド上で７５℃に４分間加熱しそしてＥＺＰｒｅｐ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）を体積を調整して用いて７５℃で２回処理した後、液体カバースリップ（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｐ）と一緒にＥＺＰｒｅｐを体積を調整して加える。７５℃で４分後にスライドを濯ぎ、そして自動脱パラフィン（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を体積を調整して液体カバースリップと一緒に加えることで前記組織からパラフィンを７６℃で４分間かけて除去した。そのスライドを４０℃に冷却して３回濯いだ後、ＡＮＴＩ−ＣＤ２０抗体（クローンＬ２６、Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）の添加に続いて液体カバースリップそしてインキュベーションを４０℃で１６分間行う。そのスライドを濯いだ後、前記組織をビオチニル化万能二次抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃７６０−４２０５）で処理することで、ビオチンと抗−ＣＤ２０抗体が同一場所に位置するようにした後、液体カバースリップそしてインキュベーションを４０℃で８分間行う。そのスライドを２回濯いだ後、前記装置から取り出して、それらに現像を受けさせる準備が出来るまで、１Ｘの反応用緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）に入れて貯蔵した。
【００５７】
そのスライドを１Ｘの反応用緩衝液から取り出して、緩衝液で１０回濯いだ後、そのスライドに緩衝液を３００μＬ添加することに加えてＡＰ−ＳＡ結合体（緩衝液中０．１４ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μＬ添加する。そのスライドを３７℃で１５分間インキュベートした後、緩衝液で１０回濯いだ。そのスライドを３００μＬの緩衝液に続いて５０μＬのＡｕＣｌ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（緩衝液中２．５μｇ／ｍＬ）そして５０μＬのアスコルビン酸ホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（緩衝液中０．１Ｍ）で処理した。そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートした後、緩衝液で１０回濯いだ。そのスライドを３００μＬの緩衝液に続いて５０μＬの酢酸銀（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（緩衝液中０．１Ｍ）そして５０μＬのアスコルビン酸ホスフェート溶液で処理した後、３７℃で２０分間インキュベートした。そのスライドを再び緩衝液で１０回濯いだ後、ＩＳＨ赤色対比染料（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）を対比染料として加えた。そのスライドを前記対比染料と一緒に３分間インキュベートした後、緩衝液で濯いだ。そのスライドにエタノールとキシレンを用いた脱水を受けさせた後、カバースリップを取り付け、その後にスライドを顕微鏡で見た。
【００５８】
図３に示したグレースケール写真で分かるように、正常な扁桃腺では正常なＢ細胞の細胞膜および細胞質領域に染色部が存在する。染色強度はＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｖ−Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）を用いて検出した正対照（図５）のそれに匹敵している。
【実施例４】
【００５９】
ＡＰ−ＳＡ結合体を高いｐＨで用いてＡｇのナノ粒子を扁桃腺上にオンラインで発生
この実施例と実施例３の間の主な差は、実施例３ではスライドをＡＰ−ＳＡを用いた現像を行う前に装置から取り出したが、この実施例では染色段階の完全な自動化を示す点にある。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ装置を用いて分析用スライドの調製を実施した。本実施例の範囲内で用いる用語「緩衝液」は、氷酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてｐＨを９にしておいた脱イオンＨ２Ｏ中０．１Ｍのトリス緩衝液［Ｔｒｉｚｍａベース−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］を指す。下記が前記装置で採用した手順である：パラフィン被覆組織をスライド上で７５℃に４分間加熱しそしてＥＺＰｒｅｐを体積を調整して用いて７５℃で２回処理した後、液体カバースリップと一緒にＥＺＰｒｅｐを体積を調整して加える。７５℃で４分後にスライドを濯ぎ、そして自動脱パラフィンを体積を調整して液体カバースリップと一緒に加えることで前記組織からパラフィンを７６℃で４分間かけて除去した。そのスライドを４０℃に冷却して３回濯いだ後、ＡＮＴＩ−ＣＤ２０抗体（クローンＬ２６、Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）の添加に続いて液体カバースリップそしてインキュベーションを４０℃で１６分間行う。そのスライドを濯いだ後、前記組織をビオチニル化万能二次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃７６０−４２０５）で処理することで、ビオチンと抗−ＣＤ２０抗体が同一場所に位置するようにした後、液体カバースリップそしてインキュベーションを４０℃で８分間行う。そのスライドを緩衝液で２回濯いだ後、液体カバースリップを取り付けそしてＡＰ−ＳＡ結合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、緩衝液中０．１４ｍｇ／ｍＬを１００μＬ）を加えた後、インキュベーションを７０℃で１６分間行う。そのスライドを緩衝液で濯ぎ、液体カバースリップを取り付けた後、ＡｕＣｌ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１．２５μｇ／ｍＬ）とアスコルビン酸ホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．０５Ｍ）を１：１で緩衝液に入れることで生じさせた溶液を１００μＬ加えた。そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートし、緩衝液で濯いだ後、液体カバースリップで覆った。そのスライドに酢酸銀（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．０５Ｍ）とアスコルビン酸ホスフェート（０．０５Ｍ）が１：１の溶液を全体で１００μＬ加えた後、そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートした。そのスライドを緩衝液で３回濯ぎ、洗浄剤が洗い流されるまで処理した後、それにエタノールとキシレンを用いた脱水を受けさせ、次にカバースリップを前記スライドに取り付けた後、そのスライドを顕微鏡で見た。
【００６０】
図４に示したグレースケール写真で分かるように、正常な扁桃腺では正常なＢ細胞の細胞膜および細胞質領域に染色部が存在する。染色強度はＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｖ−Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）を用いて検出した正対照（図５）のそれに匹敵している。
【実施例５】
【００６１】
骨格筋上の抗−デスミン
ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ骨格筋を切断した後、光顕微鏡用ガラススライドの上に置いた。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍのＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置を用いて断片からパラフィンを除去した。その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋの上に置いたままプロテアーゼ１（Ｖｅｎｔａｎａ）で４分間処理した。次に、断片を抗−デスミン（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０−２５１３）モノクローナル抗体と一緒にして３７℃で１６分間インキュベートした。前記装置上で反応用緩衝液を用
いた洗浄を行った後、ウサギ抗−マウス抗体を３７℃で８分間インキュベートした。次に、断片を反応用緩衝液で濯いだ後、マウス抗−ウサギ抗体と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０−０８０）。次に、その断片を反応用緩衝液で濯いだ後、ビオチニル化二次抗体であるビオチニル化万能二次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃７６０−４２０５）の混合物と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした。その断片を濯いだ後、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＳＡ−／Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ／ＶＲｅｄ  Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号２５３−２１８１）を３７℃で１６分間インキュベートした。次に、その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置から取り出した。次に、そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで洗浄した後、２．５μｇ／ｍｌの水素テトラブロモ金酸塩（ＩＩＩ）水化物（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４４，２１２）（５００μｌ）と一緒にして３７℃で４分間インキュベートした。その溶液を脱イオンＨ２Ｏで濯いだ後、各断片に０．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）中５０ｍＭのＡｇＮＯ３（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｓ−０１３９）を２５０μｌおよびＰＶＡ（平均分子量７０，０００から１００，０００、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ−１７６３）が５％入っている０．５ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ１０．０）中１００ｍＭのアスコルビン酸ホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ａ−８９６０）を２５０μｌ加えた。そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートした。そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで濯いだ後、対比染色無しにカバースリップで覆った。結果を図６に示す。
【実施例６】
【００６２】
脳上の抗−Ｓ１００
ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ脳組織を切断した後、光顕微鏡用ガラススライドの上に置いた。ＶｅｎｔａｎａのＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置を用いて断片からパラフィンを除去した。次に、断片を抗−Ｓ１００ポリクローナル抗体（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０−２５２３）と一緒にして３７℃で１６分間インキュベートした。次に、その断片を反応用緩衝液で濯いだ後、ビオチニル化二次抗体であるビオチニル化万能二次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃７６０−４２０５）の混合物と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした。その断片を濯いだ後、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＳＡ−／Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ／ＶＲｅｄ  Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号２５３−２１８１）を３７℃で１６分間インキュベートした。次に、その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置から取り出した。次に、そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで洗浄した後、２．５μｇ／ｍｌの水素テトラブロモ金酸塩（ＩＩＩ）水化物（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４４，２１２）（５００μｌ）と一緒にして３７℃で４分間インキュベートした。その溶液を脱イオンＨ２Ｏで濯いだ後、各断片に０．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）中５０ｍＭのＡｇＮＯ３（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｓ−０１３９）を２５０μｌおよびＰＶＡ（平均分子量７０，０００から１００，０００、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ−１７６３）が５％入っている０．５ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ１０．０）中１００ｍＭのアスコルビン酸ホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ａ−８９６０）を２５０μｌ加えた。そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートした。そのスライドにＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄによる対比染色を受けさせた後、カバースリップで覆った。結果を図７に示す。
【実施例７】
【００６３】
脳上のウサギ負対照
ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ脳を切断した後、光顕微鏡用ガラススライドの上に置いた。ＶｅｎｔａｎａのＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置を用いて断片からパラフィンを除去した。次に、断片をウサギ負対照（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０−２０２３）と一緒にして３７℃で１６分間インキュベートした。次に、その断片を反応用緩衝液で濯いだ後、ビオチニル化二次抗体であるビオチニル化万能二次抗体（Ｖ
ｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃７６０−４２０５）の混合物と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした。その断片を濯いだ後、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＳＡ−／Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ／ＶＲｅｄ  Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号２５３−２１８１）を３７℃で１６分間インキュベートした。次に、その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置から取り出した。次に、そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで洗浄した後、２．５μｇ／ｍｌの水素テトラブロモ金酸塩（ＩＩＩ）水化物（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４４，２１２）（５００μｌ）と一緒にして３７℃で４分間インキュベートした。その溶液を脱イオンＨ２Ｏで濯いだ後、各断片に０．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）中５０ｍＭのＡｇＮＯ３（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｓ−０１３９）を２５０μｌおよびＰＶＡ（平均分子量７０，０００から１００，０００、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ−１７６３）が５％入っている０．５ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ１０．０）中１００ｍＭのアスコルビン酸ホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ａ−８９６０）を２５０μｌ加えた。そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートした。そのスライドにＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄによる対比染色を受けさせた後、カバースリップで覆った。結果を図８に示す。
【００６４】
図７には灰−黒色染色が観察されたが、これを図８には灰−黒色染色が観察されないことと比較することによって、図７に示されている染色パターンは抗原に特異的であることが分かる、と言うのは、図８は負のウサギ対照を用いて実施した時の図であるからである。図９は、抗−Ｓ１００を用いて脳組織に関して実施したケースと同じではあるが、ＶｅｎｔａｎａのＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｖ−Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて検出した図である。染色パターンは図７に見られるそれと同じであることが観察されるであろう。
【実施例８】
【００６５】
非酵素的増幅を用いた骨格筋上の抗−デスミン
この実施例では、銀シグナルの化学的増幅を用いることで元々の銀付着量をアスコルベートによる還元の関数として増加させることができることを示す。ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ骨格筋を切断した後、光顕微鏡用ガラススライドの上に置いた。ＶｅｎｔａｎａのＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置を用いて断片からパラフィンを除去した。その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋの上に置いたままプロテアーゼ１（Ｖｅｎｔａｎａ）で４分間処理した。次に、断片を抗−デスミン（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０−２５１３）モノクローナル抗体と一緒にして３７℃で１６分間インキュベートした。前記装置上で反応用緩衝液を用いた洗浄を行った後、ウサギ抗−マウス抗体を３７℃で８分間インキュベートした。次に、断片を反応用緩衝液で濯いだ後、マウス抗−ウサギ抗体と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０−０８０）。次に、その断片を反応用緩衝液で濯いだ後、ビオチニル化二次抗体であるビオチニル化万能二次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃７６０−４２０５）の混合物と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした。その断片を濯いだ後、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＳＡ−／Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ／ＶＲｅｄ  Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号２５３−２１８１）を３７℃で１６分間インキュベートした。次に、その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置から取り出した。次に、そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで洗浄した後、２．５μｇ／ｍｌの水素テトラブロモ金酸塩（ＩＩＩ）水化物（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４４，２１２）（５００μｌ）と一緒にして３７℃で４分間インキュベートした。その溶液を脱イオンＨ２Ｏで濯いだ後、各断片に０．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）中５０ｍＭのＡｇＮＯ３（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｓ−０１３９）を２５０μｌおよびＰＶＡ（平均分子量７０，０００から１００，０００、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ−１７６３）が５％入っている０．５ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ１０．０）中１００ｍＭのアスコルビン酸ホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ａ−８９６０）を２５０μｌ加えた
。そのスライドを３７℃で２０分間インキュベートした。そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで濯いだ。次に、それを０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）中２５ｍＭの４−メチルアミノフェノール（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃１２９７２０）と１２ｍＭのＡｇＮＯ３溶液に入れて３７℃で１０分間インキュベートすることでシグナルを増幅させた。図１０に、増幅させたシグナルを非酵素的増幅を受けさせていない実施例９（図１１）のそれと比較して示す。
【実施例９】
【００６６】
非酵素的増幅を用いた骨格筋上の抗−デスミン
ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ骨格筋を切断した後、光顕微鏡用ガラススライドの上に置いた。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓのＢｅｎｃｈＭａｒｋスライド染色装置を用いて断片からパラフィンを除去した。その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋの上に置いたままプロテアーゼ１で４分間処理した。次に、断片を抗−デスミンモノクローナル抗体と一緒にして３７℃で１６分間インキュベートした。前記装置上で反応用緩衝液を用いた洗浄を行った後、ウサギ抗−マウス抗体を３７℃で８分間インキュベートした。次に、断片を反応用緩衝液で濯いだ後、マウス抗−ウサギ抗体と一緒にして３７℃で８分間インキュベートした。次に、その断片を反応用緩衝液で濯いだ後、ビオチニル化二次抗体の混合物と一緒にしてインキュベートした。その断片を濯いだ後、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼの溶液を１６分間インキュベートした。次に、その断片をＢｅｎｃｈＭａｒｋ自動スライド染色装置から取り出した。次に、そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで洗浄した後、２．５μｇ／ｍｌの水素テトラブロモ金酸塩（ＩＩＩ）水化物（５００μｌ）と一緒にして３７℃で４分間インキュベートした。その溶液を脱イオンＨ２Ｏで濯いだ後、各断片に０．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）中５０ｍＭのＡｇＮＯ３を２５０μｌおよびＰＶＡ（平均分子量７０，０００から１００，０００）が５％入っている０．５ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ１０．０）中１００ｍＭのアスコルビン酸ホスフェートを２５０μｌ加えた。そのスライドを３７℃で１０分間インキュベートした。そのスライドを脱イオンＨ２Ｏで濯いだ。図１１に、増幅無しシグナルを実施例８（図１０）のそれと比較して示す。
【実施例１０】
【００６７】
ヒドロキノン−１，４−ジホスフェートの合成
ヒドロキノンと２当量のオキシ塩化燐と２当量の無水ピリジンを無水トルエン（０．１Ｍになるように）に入れて３０分間反応させた。その混合物を更に３０分間還流させた後、周囲温度になるまで冷却した。ケイソウ土の詰め物に通す濾過で塩化ピリジニウムを除去した後、少量の乾燥トルエンで濯いだ。その濾液に濃縮を真空下４０℃で受けさせた後、その残留物に炭酸アンモニウム水溶液による加水分解をｐＨが７になるまで受けさせた。その生成物をフラッシュＣ１８シリカゲル使用逆相分離で精製することで所望の生成物を得て、それをＭＳ、１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲで確認した。
【実施例１１】
【００６８】
アントラヒドロキノン−１，４−ジホスフェートおよびナフトヒドロキノン−１，４−ジホスフェートの合成
アントラヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンを出発材料として用いる以外は実施例１０の手順を実施する。
【実施例１２】
【００６９】
基質であるホスフェートの一般的合成：セサモールホスフェートの合成
乾燥させておいた５００ｍｌの丸底フラスコに窒素雰囲気下でＰＯＣｌ３（８９．５ミリモル）を移した。２００ｍＬの乾燥ジクロロメタンにセサモール（３５．８ミリモル、１当量）とトリエチルアミン（７１．７ミリモル）を入れることで生じさせた溶液を前記
ＰＯＣｌ３溶液に４時間かけて滴下した。撹拌を周囲温度で一晩行った後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。その残留物を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解させた後、セライトに通す濾過で塩を除去した。その生成物に１００ｍＬの飽和炭酸アンモニウムによるクエンチを受けさせる（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）ことで分離を起こさせて生成物を水の中に入り込ませた。その有機層を廃棄した後、ロータリーエバポレーターを用いて水相を乾燥させることで所望ホスフェートを８．２グラム（９０％の収率）得た。生成物の同定をＭＳで立証し、そしてＨＰＬＣを２１４ｎｍで用いた分析で生成物の純度は９９％を超えることが分かった。
【実施例１３】
【００７０】
基質であるホスフェートの一般的合成：オイゲノールホスフェートおよびＰＭＣＰホスフェート合成
オイゲノールまたはＰＭＣＰ（２，２，５，７，８−ペンタメチル−６−クロマノール）を出発材料として用いる以外は実施例１２の手順を繰り返す。
【００７１】
本発明の方法および組成物は多様な態様の形態で取り入れ可能であるが、本明細書に説明かつ記述したのはそれの中の少しのみであることは理解されるであろう。本発明の精神からも必須特徴からも逸脱しない限り本発明は他の具体的形態で具体化可能である。記述した態様はあらゆる面で単に説明として解釈されるべきであり、制限として解釈されるべきではない。従って、この上に行った説明ではなく添付請求の範囲で本発明の範囲を示す。本請求の範囲の意味および相当物の範囲内に入るあらゆる変形は本発明の範囲内に含まれるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、４個の穴が２つの縦列に配列している８個のミクロタイター穴の写真である。縦列Ａは、１００ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）に５０ｍＭの硝酸銀が１００μＬと５０ｍＭのホスフェート基質が１００μＬ入っている対照縦列である。縦列Ｂに入っている成分も同じではあるが、これには、１００ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）中０．２ｍｇ／ｍＬのウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）が５μＬ添加されている。縦列Ｂは、アルカリ性ホスファターゼの媒介で還元基質が放出され（即ちアスコルビン酸−２−ホスフェートからアスコルビン酸）そして放出された還元基質によって硝酸銀から銀金属粒子への還元が付随して起こる作用を示している。
【図２】図２は、１００ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）中０．２ｍｇ／ｍＬのウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）を５μＬと１００ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）中５０ｍＭのホスフェート（実施例１で得た）溶液を５μＬと５０ｍＭの硝酸銀を５μＬ用いて処理したニトロセルロース紙上の４斑点の写真である。アスコルビン酸−２−ホスフェート（ＡＡＰ）、セサモールホスフェート（ＳＰ）、ヒドロキノン−１，４−ジホスフェート（ＨＱＰ）、２，２，５，７，８−ペンタメチル−６−クロマノールホスフェート（ＰＭＣＰ）。
【図３】図３は、ＡＰ−ＳＡ結合体、金前処理そしてアスコルビン酸ホスフェート（ＡＡＰ）使用銀還元を用いて染色した正常な扁桃腺組織のグレースケール顕微鏡写真である。
【図４】図４は、ＡＰ−ＳＡ結合体、金前処理そしてＡＡＰ使用銀還元を用いて染色した正常な扁桃腺組織のグレースケール顕微鏡写真（ただ１つの差は銀シグナルをオンラインで完全に生じさせた点のみである）である。
【図５】図５は、図３−４のための正対照のグレースケール顕微鏡写真である。
【図６】図６は、金前処理、ＡＡＰおよびＡｇＮＯ３を用いてインキュベーションを２０分間行うことで検出した骨格筋上の抗−デスミン抗体の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、金前処理、ＡＡＰおよびＡｇＮＯ３を用いてインキュベーションを２０分間行うことで検出した脳上の抗−Ｓ１００の顕微鏡写真である。
【図８】図８は、金前処理、ＡＡＰおよびＡｇＮＯ３を用いてインキュベーションを２０分間行うことで検出した脳上のウサギ負対照の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、Ｖｅｎｔａｎａ  ＶＲｅｄ検出を用いた脳組織上の抗−Ｓ１００抗体の顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、金前処理、ＡＡＰおよびＡｇＮＯ３を用いてインキュベーションを１０分間行いそして４−メチルアミノフェノール増幅を１０分間行った時の骨格筋上の抗−デスミン抗体の顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、非酵素的増幅を全く行なわない時の骨格筋上の抗−デスミン抗体の顕微鏡写真である。増幅段階を設けない以外は図９に示した条件と同じ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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