(57)【要約】増殖が抑えられるように核酸が改変された遺伝子突然変異を含む自由生活微生物、および／または核酸を修復する能力を低下させる遺伝子突然変異を含む自由生活微生物が提供される。また、抗原提示細胞に与え、抗原提示細胞を活性化および／または成熟化するための、改変された微生物を使用する方法も提供される。改変された微生物および／または抗原提示細胞を含むワクチン組成物、ならびにワクチンを用いる方法も提供される。微生物は、さらに、癌または感染症に対するワクチンとして用いるために、腫瘍抗原または感染症抗原のような異種抗原を含むように改変することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロ抗原提示細胞を含むワクチンであって、該抗原提示細胞は、自由生活微生物を含み、該自由生活微生物は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている核酸を含み、その結果、該微生物の増殖が抑えられる、ワクチン。
【請求項２】
前記プロ抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記核酸標的化化合物が、核酸アルキル化剤である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記核酸アルキル化剤が、β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記核酸標的化化合物が照射によって活性化される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記核酸標的化化合物が、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記核酸標的化化合物が、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記微生物が、改変されている核酸を修復する微生物の能力を低下させる遺伝子突然変異を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
前記微生物が、ＤＮＡ修復酵素を欠損している、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記微生物が、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの機能的等価物を欠損している、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記微生物が、ＵｖｒＣ、またはＵｖｒＣの機能的等価物を欠損している、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記微生物が、ＲｅｃＡまたはＲｅｃＡの機能的等価物を欠損している、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記遺伝子突然変異が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群から選択される１以上の遺伝子にあるか、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物にある、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢの両方における遺伝子突然変異か、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記微生物が、ｕｖｒＣにおける遺伝子突然変異を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記微生物が、ｒｅｃＡにおける遺伝子突然変異を含む１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記微生物が細菌である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記細菌が、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記微生物が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａである、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記細菌が、ＤＮＡ修復酵素を欠損している、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記細菌が、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記微生物が、ＵｖｒＣを欠損している、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記微生物が、ＲｅｃＡを欠損している、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記微生物が、抗原を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む異種性発現カセットを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド配列が、前記微生物内で発現するためにコドンを最適化している、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記タンパク質が、シグナルペプチドをさらに含み、かつ前記ポリヌクレオチドが、前記微生物内で発現するためにコドンを最適化している、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２９】
薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３０】
宿主において疾患を予防または処置する方法であって、有効量の請求項１に記載のワクチンを該宿主に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記抗原提示細胞が、前記宿主に対して自家性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、有効量の請求項１に記載のワクチンを該宿主に投与する工程を包含し、ここで前記微生物が該抗原を発現する、方法。
【請求項３３】
前記抗原が、前記微生物に対して異種性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原提示細胞が、前記宿主に対して自家性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
宿主において疾患を予防または処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、該細胞とを接触させることにより、プロ抗原提示細胞に抗原を与える工程であって、ここで、該微生物の該核酸は、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、該微生物の増殖が抑えられる、工程；および、
（ｂ）該与えられたプロ抗原提示細胞を含む、有効量の薬学的組成物を該宿主に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記抗原が、前記微生物に対して異種性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原提示細胞が、前記宿主に対して自家性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
宿主において、疾患を予防、または処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）プロ抗原提示細胞を、自由生活微生物に感染させる工程であって、ここで、該微生物の該核酸は、該核酸と直接的に反応する酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、該微生物の増殖が抑えられる、工程；そして、
（ｂ）感染したプロ抗原提示細胞を含む有効量の薬学的組成物を該宿主に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記抗原提示細胞が、前記宿主に対して自家性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
プロ抗原提示細胞を含むワクチンであって、ここで、該抗原提示細胞は、微生物の核酸の改変を修復する能力を低下させる遺伝子突然変異を含む自由生活細胞を含む、ワクチン。
【請求項４１】
前記プロ抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項４２】
前記微生物が、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項４３】
前記微生物が、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの機能的等価物を欠損している、請求項４２に記載のワクチン。
【請求項４４】
前記微生物が、ＵｖｒＣ、またはＵｖｒＣの機能的等価物を欠損している、請求項４２に記載のワクチン。
【請求項４５】
前記微生物が、ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物を欠損している、請求項４２に記載のワクチン。
【請求項４６】
前記遺伝子突然変異が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡからなる群より選択される１つ以上の遺伝子におけるものであるか、あるいはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の機能的等価物におけるものである、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項４７】
前記微生物が、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの機能的等価物において遺伝子突然変異を含む、請求項４６に記載のワクチン。
【請求項４８】
前記微生物が、ｕｖｒＣ、またはｕｖｒＣの機能的等価物において遺伝子突然変異を含む、請求項４６に記載のワクチン。
【請求項４９】
前記微生物が、ｒｅｃＡ、またはｒｅｃＡの機能的等価物において遺伝子突然変異を含む請求項４６に記載のワクチン。
【請求項５０】
前記微生物が細菌である、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項５１】
前記微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａである、請求項５０に記載のワクチン。
【請求項５２】
前記微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項５１に記載のワクチン。
【請求項５３】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方を欠損している、請求項５２に記載のワクチン。
【請求項５４】
前記微生物が、ＵｖｒＣを欠損している、請求項５２に記載のワクチン。
【請求項５５】
前記微生物が、ＲｅｃＡを欠損している、請求項５２に記載のワクチン。
【請求項５６】
前記微生物が、抗原を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む異種性発現カセットを含む、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドが、微生物における発現のためにコドンを最適化されている、請求項５６に記載のワクチン
【請求項５８】
前記タンパク質がさらにシグナルペプチドを含み、そして前記ポリヌクレオチド配列が微生物における発現のためにコドンを最適化されている、請求項５６に記載のワクチン。
【請求項５９】
薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントをさらに含む、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項６０】
宿主において疾患を予防または処置する方法であって、該宿主に有効量の請求項４０のワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６１】
前記抗原提示細胞が、前記宿主に対して自家性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、有効量の請求項４０に記載のワクチンを該宿主に投与する工程を包含し、ここで、微生物は該抗原を発現する、方法。
【請求項６３】
前記抗原は、前記微生物に対して異種性である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗原提示細胞が、宿主に対して自家性である、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願と相互参照）
本出願は、２００４年２月６日に出願された米国特許出願第１０／７７３，６１８号（その開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）の一部継続出願である。本出願はまた、２００４年６月３０日に出願されたＴｈｏｍａｓ  Ｗ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．らによる米国特許出願、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｒｅｅ−Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（受付番号２８２１７２００２８２０）（その開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）の一部継続出願である。本出願はまた、２００３年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／４９０，０８９号、２００３年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／５１１，８６９号、２００３年１２月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／５３２，５９８号、２００４年２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／５４１，５１５号、および２００４年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／５５６，７４４号（これらの各々の開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）の米国特許法§１１９（ｅ）の下での優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ワクチン組成物および免疫療法に関する。特に、本発明は、個体に特定の抗原を送達するのに用いることができる改変された自由生活微生物の集団を含むワクチン組成物に関する。そのような組成物において、ワクチンは、微生物に取り込まれた異種抗原に対する微生物それ自体に対して向けられる。また、本発明は、樹状細胞のような抗原提示細胞を提供し、樹状細胞のような抗原提示細胞の活性化および成熟を誘導するための改変された微生物の使用、ならびにワクチンとしてのこれらの細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
主に、ウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症の予防を標的とする、臨床的使用のために種々のワクチンが開発されてきた。ワクチンは、生きた弱毒化された微生物、不活化された（死滅した）微生物、または微生物それ自体の成分から調製することができる。生きた弱毒化された微生物は、より毒性ではない微生物に由来する、毒性因子の欠失または改変のような遺伝的改変を含む。不活化ワクチンでは、微生物は化学的にまたは物理的に不活化することができる。理想的には、そのようなワクチンは感染を引き起こすことはできないが、依然として、所望の免疫応答を刺激することができる。不活化されたワクチンの例はポリオおよびインフルエンザウイルス、およびコレラおよび破傷風に対する細菌ワクチンを含むが、生きている弱毒化ワクチンはポリオ、インフルエンザおよびコレラでは同様に任意である。所望の免疫応答を惹起するためには、不活化微生物は不活化に先立って適当な抗原を含むことが重要である。ある場合には、感染性微生物によるデ・ノボ遺伝子発現が最適な免疫応答を刺激するのに必要な故に、微生物の不活化は有意に低下した免疫応答をもたらすことが観察されている。これは、細胞内細菌で特に重要である。細菌を不活化するのに用いられてきた方法は、アセトン、アルコール、ホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはフェノール、加熱、または紫外線照射の使用を含む［Ｐａｃｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（１６）：１５６３（１９９８）］。
【０００４】
微生物それ自体によって引き起こされる感染症を予防するための微生物ワクチンの使用に加えて、微生物は、ある種のタンパク質または抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。そのような組換え微生物は送達ビーヒクルとして用いられ、異種抗原に対する免疫応答を誘導するためにワクチンとして用いることができる。コレラの組換えワクチンは、動物モデルにおいて効果的であることが示されている。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ１サーカムスポロザイト抗原を発現するように改変された生きた弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの経口ワクチンは、マウスをマラリアに対して保護することが示されている［Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｊ  Ｅｘ  Ｍｅｄ  １７２（４）：１０８３（１９９０）］。同様に、米国特許第６，０５１，２３７号は、癌ワクチンとして使用するための、増殖、および拡大し、腫瘍−特異的抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生きている組換え体形態を記載する。そのような組換えワクチンは効果的であり得るが、各微生物株はワクチンを提供するためには遺伝的に改変されなければならない。従って、微生物が組換え抗原を含むか否かに関わらず、いずれかの微生物に適用することができる安全かつ効果的な微生物ワクチンを生産する方法を開発することが望ましいであろう。
【０００５】
樹状細胞（ＤＣ）ベースの免疫療法は、広い範囲の腫瘍タイプの処置のための臨床的利益を提供するために広く調べられ、証明されてきた。自家性樹状細胞（ＤＣ）を単離し、作り出し、引き続いて、患者へのワクチン接種に先立ってエクスビボにてそれに抗原またはペプチドを負荷するために、種々の戦略が現在開発されつつある。免疫メカニズムの理解における最近の進歩は、効果的な抗原負荷に加えて、ワクチン接種について用いられる樹状細胞の活性化および成熟状態の重要性を強調している。未成熟な樹状細胞は抗原の摂取および加工において効果的であるが、活性化された樹状細胞／成熟樹状細胞はその能力を失うが、ＭＨＣ分子という状況はナイーブなＴリンパ球に対して抗原を提示することに関して依然としてより優れている。事実、成熟した樹状細胞は、最初のＴリンパ球応答を誘導し、末梢Ｔ細胞寛容を克服し、抗腫瘍免疫性を増強させるのに優れた抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることが判明している。有望な臨床的データをもたらす樹状細胞に与えて、樹状細胞の活性化および成熟を刺激するための種々の方法の開発にもかかわらず、抗原を合わせて樹状細胞の活性化および成熟化を提供するための標準的で効果的かつコスト的に有利な方法は依然として存在しない。
【０００６】
ペプチドパルス樹状細胞に基づくワクチン組成物とは対照的に、ＤＣワクチンの調製のための組換え送達ベクターの使用は、多様なＭＨＣハロタイプに関連するクラスＩ  Ｔ細胞エピトープおよびクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープが知られていない抗原について、感染した樹状細胞宿主の抗原のプロセシング機構がＭＨＣ提示を構築するという論理的な利点を有する。抗原送達ベクターを用いてエキソビボで感染された培養樹状細胞は、感染に応答して、エピトープの活性化、成熟、およびＭＨＣの制限された提示を生じ得る。しかし、樹状細胞は、時折、選択された抗原送達ベクターにより、不十分に感染される。また、選択された抗原送達ベクターは、時折、樹状細胞の機能または発達に干渉し得る。従って、効果的に樹状細胞に感染し、そして樹状細胞を刺激して活性化および成熟させ、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子にベクター上にコードされた抗原由来のエピトープを提示する組換え送達のプラットフォームが必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ワクチン組成物において有用な自由生活微生物に関する。例えば、本発明は、自由生活微生物（限定されないが、細菌が挙げられる）を提供し、ここで、該微生物の増殖は、十分な微生物の遺伝子発現を維持しつつ抑えられ、そして、増殖の抑制は用量依存的に制御することができる。本発明は、自由生活微生物の増殖を抑えるための方法を提供する。本発明はまた、これらの弱毒化された微生物を含むワクチン組成物を含む。さらに、本発明は、自由生活微生物（例えば、核酸の修復が抑えられ、そして増殖を弱める改変との組み合わせにおいて、特に有用である細菌）を提供する。これらの弱毒化された微生物を含むワクチン組成物および上記ワクチンの使用方法もまた、提供される。本発明はまた、特に、インビトロまたはエクスビボにおいて、樹状細胞のような抗原提示細胞に与えて、この抗原提示細胞の活性化および成熟を誘導するための、改変された微生物（例えば、細菌）および弱毒化されたＬｉｓｔｅｒｉａの新規使用を提供する。得られた抗原提示細胞はワクチンおよび免疫療法において有用である。特定の実施形態において、提供されたワクチンおよび免疫療法は癌に対して向けられる。
【０００８】
１つの局面において、本発明は自由生活微生物（例えば、細菌）を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸（例えば、ゲノム核酸）は、微生物が増殖について抑制されるように改変される。いくつかの実施形態においては、微生物の増殖の抑制は用量依存的に制御可能である。いくつかの実施形態においては、微生物における微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の抑制によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）化合物（あるいは、核酸「標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」化合物ともいう）との反応によって改変されている。１つの実施形態において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の実施形態において、核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、ここでは「Ｓ−５９」ともいう４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの実施形態においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を改変する微生物の能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態においては、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌である。いくつかの実施形態において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している自由生活微生物（例えば、細菌）を含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、自由生活微生物は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態においては、微生物は、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方において（または微生物の属および種に応じて、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方の機能的等価物における）遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物はＲｅｃＡ（または微生物の属および種に応じてＲｅｃＡの機能的等価物）を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＣ（または微生物の属および種に応じてＵｖｒＣの機能的等価物）を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は抗原（例えば、癌抗原、または微生物に対して外来性の感染症抗原）をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与する工程を包含する、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与する工程（ここで、微生物は抗原を発現する）を含む、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ソラレン化合物およびＵＶＡ光と反応した細菌を含むワクチンを包含し、ここで、細菌の増殖は抑えられている。いくつかの実施形態において、細菌の発現は、ソラレン弱毒化細菌が継続してタンパク質抗原を発現できるように、ソラレン改変後に十分に活性である。ここで、細菌は個体に投与されると、抗原に対する免疫応答が誘導される。１つの実施形態において、所望の免疫応答は細菌それ自体に対するものである。１つの実施形態において、細菌は異種タンパク質抗原を発現する組換え株であり、ここで、細菌が個体に投与されると、異種抗原に対する免疫応答が誘導される。異種抗原を含むそのようなワクチンは、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病を含めた種々の疾患を処置または予防するように設計することができる。
【００１１】
感染症の処置または予防には、疾患を引き起こす因子は、ワクチンとして用いられるために本発明の方法に従って調製することができる。１つの実施形態において、ワクチンは、ウイルス、細菌または寄生虫のような疾患を引き起こす因子からの異種抗原を含む本発明の微生物から調製することができる。そのようなワクチンは、細菌ベクターを受けとめる健康上の危険性が、感染性因子により起こり得る感染に関係した危険性よりも有意に少ない場合に、有益なレベルを提供することができる。本発明の方法によって弱毒化される感染症の処置または予防のための異種ワクチンは同様に他の利点を有することができる。まず、感染因子それ自体から直接的に弱毒化生ワクチンまたは死菌ワクチンを調製することができない。第二に、もし生ワクチンが必要であれば、感染剤を弱毒化し、依然として適当な免疫応答を維持することができないであろう。
【００１２】
もう１つの可能性は、細菌ベクターに挿入された抗原が、細菌ベクターによって誘導された先天的免疫応答の不存在下で、個体における免疫応答を刺激しないことである。例えば、自家性細胞が不適切に増殖する疾患は、典型的には免疫応答を刺激しない抗原を含み得る。自家性抗原に対するそのような免疫応答を刺激する方法を見出すことによってそのような疾患と戦うのは有用であろう。１つの実施形態において、増殖する細胞は、免疫応答が増殖する細胞に対して大いに特異的なように、正常な細胞に対するよりも高いレベルで抗原を発現し、または過剰発現する。そのようなワクチンで処置することができる疾患は、限定されるものではないが、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性細胞病を含む。もう１つの実施形態において、ワクチンは、疾患の産物、または疾患となった細胞それ自体よりもむしろ疾患関連標的を標的化することができる。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞を育てるのに必要な新しい血管の生成に必須である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とするワクチンで処置することができる。ＶＥＧＦは腫瘍細胞それ自体に対しては末梢であるが、腫瘍増殖の領域で支配的であり、腫瘍細胞の増殖を潜在的に制限し得る生きたワクチン標的である。もう１つの例は、アルツハイマー病またはクロイツフェルト−ヤーコプ病に特徴的なアミロイドプラークを引き起こすタンパク質のような疾患関連タンパク質に対する応答を誘導する抗原を含むワクチンである。同様に、ワクチンは自己免疫またはアレルギー反応に関与する標的タンパク質であり得る。ワクチンは、自己免疫またはアレルギー反応を引き起こす、Ｂ−細胞またはＴ細胞のような、特異的抗体または細胞に対する応答を誘導することができるイディオタイプ抗原を含むことができる。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が抑制されるように改変された自由生活微生物集団（例えば、細菌集団）を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。１つの実施形態において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物集団の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルで発現されるように、実質的に影響されない。１つの実施形態において、微生物集団の増殖は、少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ抑制される。もう１つの実施形態において、微生物集団の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇだけ抑制される。１つの実施形態において、微生物集団による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物集団による該抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、発現された抗原は、微生物それ自体からの抗原である。１つの実施形態において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの実施形態において、抗原は疾患関連抗原である。１つの実施形態において、抗原は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。１つの実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原である。１つの実施形態において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの実施形態において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい実施形態においては、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物集団とを反応させることによって改変される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される局面によって核酸に標的化される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤を含む。好ましい実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの実施形態において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射によって化合物の活性化に際して反応する。１つの実施形態において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２―オ���サ）ブチル−４，５’、８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、照射による、好ましくはＵＶＡ照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力を弱める。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子、またはそれらの機能的同等遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子、またはその１つ以上の機能的同等遺伝子おけるものである。突然変異がｒｅｃＡ遺伝子である実施形態において、単独であるか、あるいは１以上の他の突然変異と組み合わせられるかを問わず、ｒｅｃＡ突然変異は条件突然変異である。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の少なくとも１つの活性の低下をもたらす。１つの実施形態において、ＲｅｃＡの活性の低下は条件的である。更なる実施形態において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物は細菌である。１つの実施形態において、細菌はマイコバクテリアである。１つの実施形態において、マイコバクテリアはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。１つの実施形態において、細菌は細胞内細菌である。１つの実施形態において、細胞内細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。１つの実施形態において、細胞内細菌はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓである。好ましい実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取に有意に影響すること無く非貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はインターナリン（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｎ）遺伝子におけるものである。１つの実施形態においてＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子である。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における遺伝子突然子を含む。１つの実施形態において、感染細胞のファゴリソソームを逃れる能力を弱める突然変異を、Ｌｉｓｔｅｒｉａは含む。１つの実施形態においてＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合を低下させる突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは１を超える突然変異を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方におけるもの、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における欠失突然変異である。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団（例えば、細菌集団）の増殖が抑えられるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている微生物集団を含むワクチンを含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されておらず、およびここで、該集団の微生物は腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの実施形態において、微生物遺伝子発現は、腫瘍抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現されるように実質的に影響されない。１つの実施形態において、微生物集団の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ抑制される。もう１つの実施形態において、微生物集団の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇだけ抑制される。１つの実施形態において、微生物集団による腫瘍抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物集団による腫瘍抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの実施形態において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐｌ７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物はアルキル化剤を含む。１つの実施形態において、アルキル化剤は、マスタード、マスタード中間体およびマスタード等価物よりなる群から選択される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物はインターカレーター、小溝バインダー、大溝バインダー、静電バインダー、および配列−特異的バインダーよりなる群から選択される核酸標的化群を含む。１つの実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は化合物の活性化に際して核酸と直接的に反応する。１つの実施形態において、化合物の活性化は照射によるものである。１つの実施形態において、照射はＵＶＡ照射である。好ましい実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、該集団の微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力を弱める。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる���から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上におけるものである。突然変異がｒｅｃＡ遺伝子におけるものである実施形態において、単独であるか、あるいは１以上の他の突然変異と組み合わされているかを問わず、ｒｅｃＡ突然変異は条件突然変異である。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の少なくとも１つの活性の低下をもたらす。１つの実施形態において、ＲｅｃＡの活性における減弱は条件的である。さらなる実施形態において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、微生物は細菌、原生動物および真菌類よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物は細菌である。１つの実施形態において、細菌は細胞内細菌である、好ましい実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの接種に有意に影響すること無く非貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、感染した細胞のファゴリソソームから逃れる能力を弱める突然変異を、Ｌｉｓｔｅｒｉａは含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合を低下させる突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは１を超える突然変異を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方におけるものであり、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における欠失突然変異である。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子における欠失突然変異を含む。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、リステリアの核酸が、リステリア集団の増殖が抑えられるように、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ集団を含むワクチンを含み、ここで、リステリア遺伝子発現は実質的に影響されず、ここで、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、リステリア遺伝子発現は、腫瘍抗原が、個体へのＬｉｓｔｅｒｉａの投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて発現されるように実質的には影響されない。１つの実施形態において、リステリア集団の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｋｏｇだけ抑えられる。もう１つの実施形態において、リステリア集団の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇだけ抑えられる。１つの実施形態において、リステリア集団による腫瘍抗原の発現は、リステリア核酸が改変されていないリステリア集団による腫瘍抗原の発現の少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの実施形態において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰおよびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、改変されている核酸を修復するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの能力を弱める。１つの実施形態において、遺伝子突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子の１を超えるものにおけるものである。突然変異がｒｅｃＡ遺伝子におけるものである実施形態において、単独であるか、あるいは１以上の他の突然変異と組み合わされたかを問わず、ｒｅｃＡ突然変異は条件突然変異（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）である。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の少なくとも１つの活性の低下をもたらす。１つの実施形態において、ＲｅｃＡの活性における減弱化は条件的である。１つの実施��態において、遺伝子突然変異は、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの取り込みに有意に影響を及ぼすこと無く非貪食細胞に進入するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの能力を弱める。１つの実施形態において、遺伝子突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、感染細胞のファゴリソソームから逃れる能力を弱める突然変異を、Ｌｉｓｔｅｒｉａは含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子突然変異はＬｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合を低下させる。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは１を超える突然変異を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方におけるものであり、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における欠失突然変異である。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｎａｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子における欠失突然変異を含む。
【００１６】
もう１つの局面において、本発明は、核酸を修復する能力を弱める遺伝子突然変異を含む、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のような単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を提供する。いくつかの実施形態においては、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、この突然変異体株は、ＵｖｒＣに関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、ＲｅｃＡに関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株である。他の実施形態においては、該株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある。本発明は、さらに、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含むワクチンおよびプロ抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防または処置するために改変されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を用いる方法も提供される。
【００１７】
もう１つの局面において、本発明は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む単離された突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供する。いくつかの実施形態においては、該突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態においては、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株はＲｅｃＡに関して欠損している。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、ＵｖｒＣに関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株は株の毒性を減少させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または双方の遺伝子における１以上の突然変異を含む。本発明は、さらに、該突然変異体株を含むワクチンおよびプロ抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防または処置するための改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を用いる方法も提供される。
【００１８】
もう１つの局面において、本発明は自由生活微生物（例えば、細菌）を含むプロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物の増殖の抑制は、用量依存的に制御することができる。いくつかの実施形態において、微生物における微生物遺伝子発現は微生物の増殖の抑制によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体における抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、本明細書中では「Ｓ−５９」とも言われる４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの実施形態において、改変されている核酸を修復する微生物の能力を弱める遺伝子突然変異を、ワクチン中の微生物は含む。いくつかの実施形態において、微生物は細菌である。いくつかの実施形態において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は抗原提示細胞を含むワクチンも提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明が、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は該抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなＴ−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロ抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを特徴とする、ナイーブなＴ細胞をエクソビボおよび／またはインビトロ（相互に排除しない）で活性化させる方法を提供する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、樹状細胞のようなプロ抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は、核酸を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を含み（例えば、この自由生活微生物に感染されている）、この核酸は核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、微生物が増殖を抑えられる。有効量のワクチンを宿主に投与する工程を包含する、上記宿主において疾患を予防または処置するための方法もまた、提供される。宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、微生物が、抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法もまた、提供される。
【００２０】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している自由生活微生物（例えば、細菌）を含む単離されたプロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供する。いくつかの実施形態において、微生物は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群から選択される１以上の遺伝子、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子変異を含む。例えば、微生物は、（微生物の属および種に応じて）ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方の機能的等価物における遺伝子変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞中の微生物はＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＣ（または、微生物の属および種に応じてＵｖｒＣの機能的等価物）を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。有効量の抗原提示細胞を宿主に投与する工程を含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法のように、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与する工程を包含する宿主において疾患の予防または処置する方法も提供される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、樹状細胞のようなプロ抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は、核酸を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を含み（例えば、自由生活微生物に感染されている）、この核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果微生物が増殖を抑えられる。有効量のワクチンを宿主に投与する工程を包含する、上記宿主において疾患を予防または処置するための方法もまた、提供される。宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、微生物が、抗原を発現する）を包含する、上記宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法もまた、提供される。
【００２２】
もう１つの局面において、本発明は、プロ抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、プロ抗原提示細胞とを（インビトロまたはインビボ）にて接触させることを含む、プロ抗原提示細胞に抗原を負荷する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑制されるように改変されている（例えば、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている）。
【００２３】
さらにもう１つの局面において、本発明は、プロ抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、プロ抗原提示細胞とを（インビトロまたはインビボ）にて接触させることを含む、プロ抗原提示細胞を活性化および／または成熟させる方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑制されるように改変されている（例えば、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている）。
【００２４】
なおもう１つの局面において、本発明は以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑制されるように改変されており；次いで、（ｂ）負荷されたプロ抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、微生物は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。
【００２５】
別の局面において、本発明は、以下の工程：（ａ）プロ抗原提示細胞に自由生活細胞を感染させる工程であって、ここで、上記微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変されて、その結果、微生物がその増殖を低下させ；そして（ｂ）感染したプロ抗原提示細胞を含む有効量の薬学的組成物を宿主に投与する工程、を包含する、宿主において疾患を予防また処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【００２６】
さらにもう１つの局面において、本発明は、抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現する改変された微生物とプロ抗原提示細胞とをインビトロまたはエクスビボと接触させることを含む、樹上細胞のような該細胞に抗原を負荷する方法を提供する。いくつかの実施形態において、微生物の増殖は抑えられる。いくつかの実施形態において、微生物は該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は抑えれる。抗原提示はＭＨＣクラスＩ提示またはＭＨＣクラスＩＩ提示であり得る。
【００２７】
もう１つの局面において、本発明は、樹状細胞を活性化し、および／または抗原提示細胞を成熟させるのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、改変された微生物と抗原提示細胞とをインビトロまたはエクスビボで接触させることを含む、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を活性化および／または成熟化させる方法を提供する。１つの実施形態において、微生物の増殖は抑えられる。もう１つの実施形態において、微生物は該細胞の活性化および／または成熟化を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は抑えられる。
【００２８】
さらにもう１つの局面において、本発明は、抗原を提示する（樹状細胞のような）抗原提示細胞を含む有効量の免疫原生組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。１つの実施形態において、微生物の増殖は抑えられている。もう１つの実施形態において、微生物は該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖が抑えられる。１つの実施形態において、免疫応答はＣＤ８＋Ｔ−細胞応答である。もう１つの実施形態において、免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞応答である。
【００２９】
なおもう１つの局面において、本発明は以下の工程（ａ）抗原提示細胞に抗原を負荷し、および抗原提示細胞の活性化および／または成熟化を行うのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａと（樹状細胞のような）抗原提示細胞とをインビトロまたはエクスビボで接触させ；次いで、（ｂ）有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの実施形態において、微生物の増殖は抑えられる。もう１つの実施形態において、抗原提示細胞と接触される微生物は、抗原提示細胞への抗原の提示、および抗原提示細胞の活性化および／または成熟化の双方を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は抑えられる。１つの実施形態において、免疫応答はＣＤ８＋Ｔ−細胞応答である。もう１つの実施形態において、免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞応答である。
【００３０】
もう１つの局面において、本発明は改変された微生物を含むエクスビボまたはインビトロプロ抗原―提示細胞を提供し、ここで、微生物の増殖は抑えられる。もう１つの実施形態において、改変された微生物は樹状細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は抑えられる。もう１つの実施形態において、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【００３１】
なおもう１つの局面において、本発明は（樹状細胞のような）抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。いくつかの実施形態において、微生物は、細菌である。いくつかの実施形態において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は抑えられている。もう１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、該細胞への抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は抑えられる。
【００３２】
なおさらなる局面において、本発明は（樹状細胞のような）抗原提示細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、抗原―提示細胞は改変されたＬｉｓｔｅｒｉａを含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は抑えられている。もう１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は抑えられる。
【００３３】
前述の局面の各々のいくつかの実施形態において、改変された微生物は、改変された細菌である。前述の局面の各々のいくつかの実施形態において、改変された微生物は、細胞内細菌である。
【００３４】
前記局面の各々のいくつかの実施形態において、改変された微生物は改変されたＬｉｓｔｅｒｉａである。前記局面の各々のさらなる実施形態においては、ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。なおさらなる実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子における突然変異を含む。例えば、前記局面のいずれかにおいて、Ｌｉｓｔｅｒｉａは所望によりｕｖｒＡＢにおける突然変異を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、所望により、ｕｖｒＡＢおよびａｃｔＡにおける双方の突然変異を含む。
【００３５】
前記局面の各々の他の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化は架橋剤へのＬｉｓｔｅｒｉａの暴露によって行われたものである。前記局面の各々のいくつかの実施形態において、架橋剤はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。前記局面の各々の他の実施形態において、架橋剤はソラレン誘導体であって、ＬｉｓｔｅｒｉａはＵＶＡ光に暴露される。前記局面の各々のいくつかの実施形態において、架橋剤は（ここでは「Ｓ−５９」ともいわれる）４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
【００３６】
１つの局面において、本発明は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、そして少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌を含むワクチンを提供する。本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与する工程（ここで、細菌は、抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を、さらに提供する。
【００３７】
本発明はまた、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、そしてＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌を含むワクチンを提供する。さらに、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与する工程（ここで、細菌は、抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００３８】
本発明は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、そしてＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含むワクチンを提供する。本発明はまた、有効量のワクチンを宿主に投与する工程（ここで、細菌は、抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００３９】
また、細菌を含むワクチンが提供され、ここで、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより細菌は改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、そしてこの細菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している（例えば、ｕｖｒＡＢ欠失突然変異体）。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、ＲｅｃＡを欠損している。宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、この細菌は、抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法もまた、提供される。
【００４０】
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、その抗原提示細胞は、細菌を含み、その細菌は、その核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、増殖が抑えられ、そして少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している（例えば、ｕｖｒＡＢ欠失突然変異体）。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、ＲｅｃＡを欠損している。有効量のワクチンを宿主に提供する工程を包含する、宿主において疾患を予防または処置する方法もまた、提供される。
【００４１】
本明細書中に記載される改変された微生物を含むワクチン組成物を作製する方法もまた、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明は改変された自由生活微生物（例えば、改変された細菌）およびワクチン組成物における改変された自由生活微生物の使用に関し、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、改変された微生物の微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。本発明はまた、自由生活微生物（例えば、細菌）を提供する。この微生物は、核酸修復が抑えられた突然変異体であり、これは、増殖を抑える改変との組み合わせにおいて有用である。改変された微生物を含むワクチンもまた、提供される。また、本発明は、抗原負荷のための改変された微生物の使用およびインビトロまたはエクスビボでの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化／成熟化の誘導を含む。抗原は改変された微生物によって生産される抗原であってもよく、あるいは組換え微生物によって発現された異種性抗原であってもよい。得られた抗原提示細胞はワクチン組成物における使用、および免疫療法で適当である。得られたワクチン組成物の投与によって刺激された免疫応答はＣＤ４＋またはＣＤ８＋免疫応答であり得る。
【００４３】
１つのそのような改変された微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。本発明者らは、Ｌｉｓｔｅｒｉａが、それが活力が無いように、ソラレン、紫外線Ａ（ＵＶＡ）光での照射の後に細菌のゲノム中で不可逆的架橋を形成する化合物の群によって不活化に対して特に感受性となるように作成した（後記実施例３参照）。モデル抗原の発現を維持しつつ、野生型および改変されたＬｉｓｔｅｒｉａの増殖の抑制が今回示された（後記実施例１〜２および１１参照）。また、改変されたＬｉｓｔｅｒｉａは抗腫瘍応答を供し（後記実施例４および１４〜１６）、抗原特異的Ｔ−細胞応答（実施例５）およびインビボ細胞傷害性応答（実施例２０）を誘導することも示される。ＬｉｓｔｅｒｉａはＤＣによって迅速に貪食され、ファゴリソソーム区画に輸送される。この遭遇の結果、ＤＣの表現型が成熟し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−αを含めた免疫刺激性サイトカインの広いプロフィールが引き続いて分泌される。本発明者らは、今回、組換えＬｉｓｔｅｒｉａでの未成熟ＤＣの感染の結果、コードされた異種抗原のＭＨＣクラスＩ−制限提示と共に、迅速なＤＣ活性化／成熟化がもたらされることを示した。加えて、ファゴリソソーム内でのＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの劣化の結果、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介してコードされた抗原が提示される（後記実施例参照）。
【００４４】
もう１つのそのような改変された微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。また、本発明者らは、ソラレンによる不活化に対して特に感受性であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの弱毒化された株も作成した（後記実施例２１参照）。
【００４５】
加えて、本発明は、自由生活微生物（例えば、細菌）を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物の増殖の抑制は用量依存的に制御可能である。いくつかの実施形態において、微生物における微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の抑制によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの接種に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの実施形態において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、本明細書中では「Ｓ−５９」とも言う４’（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの実施形態においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態においては、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌である。いくつかの実施形態において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。
【００４６】
本発明はまた、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子変異を含む、単離されたＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異体株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ突然変異体株）を提供する。いくつかの実施形態において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約による規定に基づいて、２００３年１０月３日に１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ２０１１０−２２０９，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、登録番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ／ΔｕｖｒＡＢ株である。他の実施形態において、該株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ／ΔｕｖｒＡＢ株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢおよび、ＡｃｔＡを欠損している。本発明は、さらに、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含むワクチンおよびプロ抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防し、または処置するための改変されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の使用方法も提供される。
【００４７】
本発明は、その核酸を修復する能力を弱める遺伝子変異を含む単離されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ突然変異体株を提供する。いくつかの実施形態において、突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子において遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、突然変異株はＲｅｃＡを減弱化されている。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子において遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、該株の毒性を減少させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または両方の遺伝子において１以上の突然変異を含む。本発明は、さらに、突然変異体株を含むワクチンおよびプロ抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防するかまたは処置するための改変されたＢｕｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株の使用方法も提供される。
【００４８】
加えて、本発明は、自由生活微生物（例えば、細菌）を含むプロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物の増殖の抑制は、用量依存的に制御可能である。いくつかの実施形態において、微生物中での微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の抑制によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの実施形態において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物は細菌である。いくつかの実施形態において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなＴ−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロ抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを含む、ナイーブなＴ細胞をエクスビボまたはインビトロにて活性化する方法を提供する。
【００４９】
本発明は、プロ抗原提示細胞を負荷するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることを含むプロ抗原提示細胞に抗原を負荷する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。
【００５０】
また、本発明は、プロ抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることを含む、プロ自己−提示細胞を活性化しおよび／または成熟化する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。
【００５１】
本発明は、さらに、以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変され、次いで、（ｂ）負荷されたプロ抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。
【００５２】
本発明は、抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、それに十分な時間の間、抗原を発現する改変された微生物と抗原提示細胞とをインビトロまたはエクスビボで接触させることを含み、樹状細胞のような抗原提示細胞に抗原を負荷する方法も提供する。
【００５３】
本発明は、樹状細胞の活性化および／または成熟化を行い、および／または抗原提示細胞を成熟させるのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、改変された微生物と抗原―提示細胞とインビトロとエクスビボで接触させることを含む抗原提示細胞を活性化し、および／または成熟化する方法を提供する。
【００５４】
本発明は、抗原を提示する抗原提示細胞を含む有効量の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。
【００５５】
加えて、本発明は、以下の工程（ａ）抗原提示細胞に抗原を負荷し、および抗原提示細胞の活性化および／または成熟化を行うのに適した条件下で、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａと抗原提示細胞とをインビトロまたはエクスビボで接触させ；次いで、（ｂ）有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの実施形態において、微生物の増殖は抑えられる。
【００５６】
また、本発明は、改変された微生物を含むエクスビボまたはインビトロプロ抗原提示細胞を提供し、ここで、微生物の増殖は抑えられる。
【００５７】
加えて、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含み、また、抗原提示細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、抗原提示細胞は、Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む。
【００５８】
１つの局面において、本発明は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、かつ少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌を含むワクチンを提供する。本発明は、宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、上記細菌は、抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法をさらに提供する。
【００５９】
本発明はまた、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、かつＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌を含むワクチンを提供する。さらに、本発明は、宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、上記細菌は抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００６０】
本発明は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、かつＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損しているＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌を含むワクチンをさらに提供する。本発明はまた、宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、上記細菌は抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００６１】
また、細菌を含むワクチンも提供され、ここで、上記細菌は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、かつ少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している（例えば、ｕｖｒＡＢ欠損突然変異体）。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、ＲｅｃＡを欠損している。宿主に有効量のワクチンを投与する工程（ここで、上記細菌は抗原を発現する）を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法もまた、提供される。
【００６２】
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、この抗原提示細胞は、細菌を含み、この細菌は核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌の増殖が抑えられ、そして少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している（例えば、ｕｖｒＡＶ欠損性突然変異体）。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、ＲｅｃＡを欠損している。有効量のワクチンを宿主に提供する工程を包含する、宿主において疾患を予防または処置する方法もまた、提供される。
【００６３】
（Ｉ．ワクチン）
いくつかの実施形態において、本発明のワクチンは、改変された微生物ベースのワクチンである。いくつかの実施形態において、ワクチンは、改変された微生物を使用して調製された抗原提示細胞を含む。直接的にか、または前述のワクチンの調製のためかのどちらかで使用される改変された微生物は、本明細書中に記載されるとおりである。
【００６４】
（Ａ．改変された微生物ベースのワクチン）
本発明は、改変された自由生活微生物、およびワクチン組成物における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。
【００６５】
死滅した微生物ワクチンは、しばしば、生きた弱毒化微生物ワクチンよりも劣ることが観察されている［Ｌａｕｖａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１７３５−１７３９（２００１）］。完全に死滅した微生物においては、デ・ノボ微生物遺伝子発現は実質的に排除される。従って、微生物遺伝子発現の十分なレベルを維持しつつ、増殖が抑制されるような、微生物核酸の適当なレベルへの改変は、死滅した微生物ワクチンよりも効果的であり得、ワクチンが微生物ベクターによって引き起こされる感染症の予防を標的化するか、あるいはベクターが異種抗原を送達するのに用いられるかを問わず、いずれかの微生物ベクターに適用することができるワクチン製剤に対するアプローチを提供する。用語微生物の使用は、それが本発明の全ての実施形態に関連するので、自由生活微生物を意味することを意図し、ウイルスを含むことを意図しないことは理解されるべきであろう。そのような微生物ベースのワクチンは、特異的抗原を個体に送達するのに用いることができる。１つの実施形態において、ワクチンは１を超える抗原を送達する。そのようなワクチンは１以上の抗原に対する免疫応答を刺激するように設計され、その結果、抗原または複数抗原に対して免疫化された個体がもたらされる。生じる免疫応答は抗体媒介応答、細胞媒介応答、またはその双方いずれかであり得る。用語ワクチンは予防ワクチン、すなわち、もし個体が引き続いて天然で抗原に暴露されるならば、予め形成された免疫応答が、剤または抗原を運ぶ細胞と戦う個体の能力を増加させるように、免疫応答を誘導するために与えられるものを含むことを意図する。用語ワクチンは、治療ワクチン、すなわち、ワクチン抗原に関連する疾患をすでに有する個体に与えられるものを含むことを意図し、ここで、ワクチンは免疫応答を誘導し、または個体の存在する抗原に対する免疫応答を増強して、剤または抗原を運ぶ細胞と戦う増大した能力を供することができる。これは、癌細胞のような疾患の細胞に対する免疫応答、ならびにプリオンのような疾患関連タンパク質に対する免疫応答を含む。１つの実施形態において、自由生活微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの実施形態において、自由生活微生物はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアよりなる群から選択される細菌である。
【００６６】
本発明は、（本明細書中に記載される微生物ベースのワクチンと抗原提示細胞ベースのワクチンについて）微生物の核酸の種々のレベルの改変を含む。微生物核酸の代謝はいくつかの方法で起こると理解される。微生物の複製は、微生物を複製するために全微生物ゲノムのＤＮＡをコピーし、引き続いて、ＤＮＡ分子を別々の細胞に分けることを含み、すなわち、細胞が分裂した結果、微生物ゲノムのＤＮＡの完全なコピーと共に有する細胞が得られる。微生物核酸代謝は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写、およびＲＮＡのタンパク質を生産するための翻訳の組合せを含む。微生物ゲノムの転写は、微生物ゲノムのＤＮＡの一部を、ＲＮＡ（メッセンジャーまたはトランスファーＲＮＡいずれか）へのコピーを含む。メッセンジャーＲＮＡの翻訳は、ＲＮＡを読んで、特異的なタンパク質またはタンパク質の一部を生産することを含む。本発明においては、微生物の集団の核酸は、微生物の性質およびその意図した使用に基づいて所望の程度まで改変される。いくつかの実施形態においては、改変の所望の程度は、微生物のゲノムの複製が、タンパク質の生産が十分に活性なままである（すなわち、微生物が代謝的に活性である）ように有意に抑えられるようなものである。改変の性質が何であれ、改変のレベルは、微生物ゲノムの塩基対当たりに平均した改変の数で表すことができることが理解されるべきである。例えば、もし改変が核酸への化合物の共有結合によるものであれば（アダクト）、改変はアダクトの間の塩基対の平均数で表すことができる。いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、１０３〜１０８塩基対当たり約１つの改変、１０４〜１０８塩基対当たり約１つの改変、１０４〜１０７当たり約１つの改変また１０５〜１０７当たり約１つの改変、１０５〜１０６塩基対当たり約１つの改変のレベルまで改変することができる。１つの実施形態において、個体遺伝子の転写および翻訳の十分な活性を維持して（すなわち、いくつかの代謝活性を維持して）、安全かつ効果的なワクチンを達成しつつ、集団が観察可能な増殖を示さないように、改変のレベルを微生物集団においてＤＮＡ複製をブロックするのに必要な最小量に調整する。
【００６７】
１つの局面において、本発明は自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において微生物の増殖の抑制は用量依存的に制御可能である。いくつかの実施形態において、微生物中での微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の抑制によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの実施形態において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の実施形態において、核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、本明細書中では「Ｓ−５９」とも言う４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの実施形態においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌である。いくつかの実施形態において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物が抗原を発現する。
【００６８】
本発明は、さらに、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株または突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を含むワクチンを提供し、ここで、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株または突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株はその核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明は、微生物核酸が、微生物の増殖が抑えられるように改変されている自由生活微生物を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。１つの実施形態において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。１つの実施形態において、微生物の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ抑えられる。別の実施形態において、微生物の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇだけ抑えられる。１つの実施形態において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。１つの実施形態において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの実施形態において、抗原は疾患関連抗原である。１つの実施形態において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。１つの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原である。１つの実施形態において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの実施形態において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい実施形態において、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物とを反応させることによって改変される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される局面によって核酸に標的化される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤を含む。好ましい実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの実施形態において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射によって化合物の活性化に際して反応する。１つの実施形態において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン���ある。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、微生物は遺伝子変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力を弱める。１つの実施形態において、遺伝子変異は、微生物の属および種に依存して、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子にある。１つの実施形態において、突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上である。１つの実施形態において、遺伝子変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性の減弱をもたらす。さらなる実施形態において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物は細菌である。１つの実施形態において、細菌は、細胞内細菌である。好ましい実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取に有意に影響すること無く、非貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子両方に遺伝子変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合を低下させる突然変異を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子および１以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失変異体を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃ��Ａ／ｉｎｌＢ欠失変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子に欠失突然変異を含む。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明は、細菌の増殖が抑えられるように、細菌核酸が改変された細菌を含むワクチン組成物を含み、ここで、細菌遺伝子発現は実質的に影響されない。１つの実施形態において、細菌遺伝子発現は、細菌の個体への投与に際して細菌に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。１つの実施形態において、細菌の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇに抑えられる。別の実施形態において、微生物の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇに抑えられる。１つの実施形態において、細菌による抗原の発現は、細菌核酸が改変されていない細菌による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、細菌核酸は、細菌の放射線への暴露、および細菌核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と細菌との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい実施形態において、細菌核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と細菌とを反応させることによって改変される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される局面によって核酸に標的化される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤を含む。好ましい実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエーテルである。１つの実施形態において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射による、好ましくはＵＶＡ照射による化合物の活性化に際して反応する。１つの実施形態において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は照射による、好ましくはＵＶＡ照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、細菌は遺伝子変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子変異は、改変されている細菌核酸を修復する細菌の能力を弱める。１つの実施形態において、遺伝子変異は、細菌の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、Ｕ���ｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性における減弱をもたらす。好ましい実施形態において、これらの突然変異を含む細菌は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、細菌はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアよりなる群から選択される。１つの実施形態において、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｌｙｍｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌｒａｅｎｓｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓよりなる群から選択される。１つの実施形態において、細菌はマイコバクテリアである。１つの実施形態において、マイコバクテリアはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。１つの実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓはｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは条件ｒｅｃＡ突然変異を含む。１つの実施形態において、細菌は細胞内細菌である。１つの実施形態において、細胞内細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ種に属する。１つの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓはｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは条件ｒｅｃＡ突然変異を含む。１つの実施形態において、細胞内細菌はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓである。１つの実施形態において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓはｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓは条件ｒｅｃＡ突然変異を含む。
【００７１】
１つの局面において、本発明は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌が増殖を抑えられ、そして少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌を含むワクチンを提供する。
【００７２】
本発明はまた、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌が増殖を抑えられ、そしてＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌を含むワクチンを提供する。
【００７３】
本発明は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌が増殖を抑えられ、そしてＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損しているＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌を含むワクチンをさらに提供する。
【００７４】
また、細菌を含むワクチンが提供され、ここで、上記細菌は、その核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変され、その結果、細菌が増殖を抑えられ、そしてこの細菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｒｃｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している（例えば、ｕｖｒＡＢ欠損突然変異体）。いくつかの実施形態において、細菌は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、細菌は、ＲｅｃＡを欠損している。
【００７５】
改変された微生物を含むワクチンは、米国特許仮出願第６０／４４６，０５１号および同第６０／４４９，１５３号に記載される（これらの両方は、本明細書中においてその全体が参考として援用される。
（Ｂ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）ワクチン）
本発明は改変された自由生活微生物、および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）に基づくワクチン組成物の調製における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が抑えられるように改変される。好ましい実施形態において、改変された微生物の微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。本明細書中に記載される改変された微生物のいずれか（微生物ベースのワクチンに関して本明細書中に記載される微生物を含む）は、抗原提示細胞ワクチンの産生において使用され得る。
【００７６】
本発明の１つの実施形態において、本明細書中に記載されるワクチンで用いられる抗原提示細胞はプロ抗原提示細胞である。プロ抗原提示細胞はマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞を含む。他のプロ抗原提示細胞は単球、辺縁層クッパー細胞、小グリア細胞、ランゲルハンス細胞、指状突起樹状細胞、小胞樹状細胞、およびＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、プロ抗原提示細胞は樹状細胞である。他の実施形態において、プロ抗原提示細胞はマクロファージまたは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞はヒト細胞（例えば、ヒト樹状細胞）である。
【００７７】
樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な抗原提示細胞集団であり、そしてナイーブなＴ細胞のプライミングに不可欠である。未熟な樹状細胞は、損傷した組織に移動し、そこで可溶性抗原および粒子性抗原の両方を捕らえ、そして適切な活性化シグナル／成熟シグナルを受ける（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）際に、第二リンパ管に移動する。このリンパ管では、多くのナイーブなＴ細胞にこの抗原を提供することが可能である。成熟した樹状細胞により獲得された抗原の提示は、抗原特異的免疫応答誘導および防御Ｔ細胞応答の刺激のために重要である。従って、いくつかの例において、免疫化された個体において所望の抗原特異的疫応答を刺激するために、ＤＣベースのワクチン組成物を利用することが望ましい。例えば、ワクチン組成物は、例えば、所望の抗原に関連するペプチド、または所望の抗原を発現する組み換えベクターを用いて、エキソビボでの自家性の培養樹状細胞の処理に基づくことができ、そして適切な刺激性のシグナルと協力して、樹状細胞の活性化および成熟を生じ、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に選択された抗原に関連するエピトープを提示する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明はワクチン組成物および処置方法を提供し、このワクチン組成物および処置方法は、所望の光化学的に不活性化された組換えＬｉｓｔｅｒｉａに感染した培養未成熟ヒト樹状細胞の非限定的な例に一部基づく。この組み換えＬｉｓｔｅｒｉａは、好ましくは、ＵｖｒＡＢ遺伝子を欠失し、かつ所望の選択された異種性抗原または内因性抗原を発現し、そして分泌するように遺伝的に操作される。細菌による抗原の発現および／または分泌に対する応答において、感染した樹状細胞は、成熟および活性化、そしてＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子上に異種性抗原に関するエピトープを提示する。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、所望の免疫応答（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａコード異種性抗原について特異的であるＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答または抗体応答）を刺激するために個体に投与される。
【００７９】
本明細書中に記載される改変された微生物に感染したＤＣベースのワクチンの、インビボで免疫応答を刺激する能力の非限定的な例は、以下の実施例５０において提供される。実施例５０は、Ｓ−５９ソラレン／ＵＶＡ不活性化ＬｉｓｔｅｒｉａΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢコーディングニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）に感染した自家性骨髄由来のＤＣで免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、異種性のベクターコード化抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導を記載する。
【００８０】
従って、本発明の１つの実施形態において、未成熟抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は患者から単離され、（微生物に対して異種性のまたは内因性の）抗原を発現する改変された微生物にエキソビボにて感染される。次いで、得られた負荷された抗原提示細胞を自家性ＡＰＣワクチンとして患者に戻して導入し、続いて宿主におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋免疫応答いずれか（または両方）を誘導する。
【００８１】
したがって、本発明の抗原提示細胞ワクチンを調製し、使用する方法の１つの非限定的な例は以下の通りである：未成熟樹状細胞を結腸癌患者から単離し、Ｓ−５９／ＵＶＡ―不活化され、活力の無い代謝的に活性な組換えＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣＥＡワクチンで感染させる。改変されたＬｉｓｔｅｒｉａでの樹状細胞感染の結果、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路へのＣＥＡ腫瘍抗原の効果的な負荷がもたらされる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染は樹状細胞を刺激し、インビボにおける初代Ｔ細胞応答を誘導することができる優れたＡＰＣとなるために樹状細胞で非常に重要な迅速な活性化および成熟化を受ける。樹状細胞の刺激の際に、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６のような共刺激性分子、ＭＨＣ分子、ならびにリンパ節に流れてホーミングするのに必要とされるＣＣＲ７の発現をアップレギュレートする。Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチン−負荷樹状細胞を洗浄し、自家性樹状細胞ワクチンとして患者に戻して、ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞応答を刺激する。
【００８２】
患者（例えば、癌患者）のワクチン接種のために臨床レベルのヒト樹状細胞の産生を含む、抗原提示細胞の調製は、当該分野で公知である。例えば、以下の参考（米国特許公報、米国特許出願公報、参考書、または科学文献）（その各々は、その全体が参考として援用される）は、抗原提示細胞の調製および／または抗原提示細胞ワクチンの使用についての記載を提供する：ＵＳ２００３／０１１９１８７；ＵＳ２００２／０１９２１９３；ＵＳ６，４０３，０８０；ＵＳ６，４４０，７３５；ＵＳ２００２／０１５５１０８；ＵＳ２００４／００３８３９８；ＵＳ２００３／００９２１７７；ＵＳ２００１／００２３０７２；ＵＳ２００１／００２３０７２；ＵＳ２００４／０００９１９４；ＵＳ２００４／００３７８０７；ＵＳ２００３／０１９０６８２；ＵＳ６，４９７，８７６；ＵＳ２００２／０１４１９７７；ＵＳ２００４／００２２７６１；Ｐａｌｕｃｋａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：４３２−９（２００３）．Ｃｈａｎｇら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，７７：４３９−４３（２００３）；Ｓａｎｔｉｎｉら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２１：４９５−５０５（２００３）；Ｈｕｍｒｉｃｈら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７６：２４１−５９（２００３）；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１：３０３−１６（２００２）；Ｓｃｈｕｌｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−４７（２００３）；Ｚｈａｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，１７：６０１−１９（２００２）；Ｗａｌｓｈら，  Ｃｕｒｒ．  ＨＩＶ  Ｒｅｓ．，  １：２０５−２１６  （２００３）；Ｌｕら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：２７−３２（２００３）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：６４５１−８（２００１）；Ｅｓｃｈｅ  Ｃ，Ｓｈｕｒｉｎ  ＭＲ，Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，１９９９年２月；１（１）：７２−８１；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＬｏｔｚｅおよびＴｈｏｍｓｏｎ編，第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄｈｏｄａｐｋａｒ  ＭＶ，Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｎ，Ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年５月；２０（３）：１６７−７４；およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ，Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９８年３月  １９；３９２（６６７３）：２４５−５２。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣベースのワクチンにおいて使用される抗原提示細胞は、単球由来の樹状細胞である。例えば、インビトロでヒト血液単球をＩＬ−４および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とともに培養することにより、樹状細胞ワクチンの（抗原負荷後の）使用に適切な多数の機能的樹状細胞の産生をもたらすことが当該分野で知られている。樹状細胞を誘導する他の公知の方法としては、限定されないが、サイトカインカクテルにおいて培養されたＣＤ３４＋細胞由来の樹状細胞の誘導、ＧＭ−ＣＳＦのみで培養された単球由来の樹状細胞の誘導、末梢血または組織由来の樹状細胞の直接的単離、およびサイトカインカクテルで培養された単球由来の樹状細胞の誘導が挙げられる。
【００８４】
１つの非限定的な例として、結腸直腸癌を含む悪性疾患を有する患者における多くの樹状細胞ワクチンの試験が、実施されている（Ｆｏｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９８：８８０９−１４  （２００１））。Ｆｏｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：４２５４−９（２００１）に記載されるように、上記試験において使用される自家性の樹状細胞は、連続する密度遠心を通して患者由来の白血球搬出産物から濃縮された。簡単に述べれば、ＰＢＭＣは、ｆｉｃｏｌｌ勾配、次にｐｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して遠心する。次いで、得られたＤＣ濃縮産物を外因性サイトカインを添加することなく一晩抗原とともにインキュベートする。次いで、その産物を、メトリザマイド勾配の遠心を通して樹状細胞についてさらに濃縮する。さらなる一晩のインキュベーションに続いて、細胞産物を洗浄し、細胞ワクチンとして患者に注入する。このプロセスにより、白血球搬出産物の１％の樹状細胞から３０〜５０％に得られた樹状細胞産物を濃縮することができる。メトリザマイドを使用する勾配濃縮は、ＣＤ８０、ＣＤ８３，およびＣＤ８６のアップレギュレーションを導き得るが、メトリザマイド濃縮された樹状細胞はなお、ＭＨＣクラスＩの意味（ｃｏｎｔｅｘｔ）におけるＫＬＨのような複合抗原調製物（例えば、外因性腫瘍溶解物、または外因性タンパク質全体を取り込み、プロセシングし、そして提示することが可能である（Ｓｈｉｍｉｚｕら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：２６１８−２４（２００１））。さらに、さらなる成熟シグナル（例えば、ＣＤ４０Ｌ）は、インビトロにおいてＣＴＬを誘導する樹状細胞の能力を増強する。このアプローチで調製され、かつエキソビボでペプチドを負荷された樹状細胞は、ＣＥＡを標的とする臨床試験において使用され、そして幾人かの患者において腫瘍の退行を導いた（Ｆｏｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：８８０９−１４（２００１））。
【００８５】
別の実施形態においては、ＤＣのような未成熟抗原提示細胞を、抗原を発現する改変された微生物でインビトロで感染させる。次いで、得られた負荷された抗原提示細胞を用いて抗原特異的Ｔ−細胞集団をプライムするか、または再刺激し、次いで、これを患者に投与し、それにより、抗原に対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋免疫応答いずれかを誘導する。
【００８６】
もう１つの局面において、本発明は自由生活微生物（例えば、細菌）を含むプロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物の増殖の抑制は用量依存的に制御可能である。いくつかの実施形態において、微生物中の微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の抑制によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、ワクチンの個体への投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原を発現する。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの実施形態において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。いくつかの実施形態において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物は細菌である。いくつかの実施形態において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を含む組成物を宿主に投与することを含み、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量の抗原提示細胞を含む組成物宿主に投与することを含み、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなＴ−細胞または記憶Ｔ−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロ抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞または記憶Ｔ細胞とを接触させることを含む、エクスビボまたはインビトロでナイーブなＴ細胞または記憶Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明は、微生物の増殖が抑えられるように微生物の核酸が改変された自由生活微生物への感染により抗原負荷され、そして／または活性化もしくは成熟した抗原提示細胞を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）を含み、ここで、上記微生物の遺伝子発現は、実質的に影響されない。１つの実施形態において、微生物の遺伝子発現は、実質的に影響されず、その結果、抗原が、個体への上記微生物の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルで発現する。１つの実施形態において、上記微生物の増殖の抑制は、少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｋｏｇに抑えられる。別の実施形態において、微生物の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇに抑えられる。１つの実施形態において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、発現した抗原は、微生物自体に由来する抗原である。１つの実施形態において、微生物は、抗原をコードする異種性核酸配列を含む。１つの実施形態において、抗原は、疾患関連の抗原である。１つの実施形態において、抗原は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性疾患からなる群より選択される疾患に関連する。１つの実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原である。１つの実施形態において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、腫瘍関連ウイルス抗原、癌精巣抗原、胚抗原（ｅｍｂｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの実施形態において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物核酸は、上記微生物を放射線照射に暴露する工程、および微生物と微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物とを反応させる工程からなる群より選択される方法により改変される。好ましい実施形態において、上記微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物との反応により改変される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列特異的結合よりなる群から選択される形態によって核酸に標的化される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤を含む。好ましい実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの実施形態において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射によって化合物の活性化の際に反応する。１つの実施形態において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射による活性化の際に改変を間接的に引き起こす。１つの実施形態において、微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子突然変異の結果、改変された微生物核酸を修復する微生物の能力が弱められる。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に依存して、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に等価な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子にある。１つの実施形態において、突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に等価な遺伝子よりなる群から選択される１つ以上の遺伝子にある。１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性の低下をもたらす。さらなる実施形態において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい実施形態において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの実施形態において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物は細菌である。１つの実施形態において、細菌は細胞内細菌である。好ましい実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取に有意に影響すること無く、非貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子両方に遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染した細胞のファゴリソソームから逃れるＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合を低下させる突然変異を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子および１以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含��。好ましい実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子に突然変異を含む。
【００８８】
別の局面において、本発明は、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含むワクチンを提供し、ここで、上記抗原提示細胞は、微生物の増殖が抑えられるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応により改変された核酸を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を、（例えば、感染により）含む。好ましい実施形態において、微生物の遺伝子発現は、微生物の増殖の抑制により実質的には影響されない。いくつかの実施形態において、微生物の増殖は、少なくとも約０．３ｌｏｇ、少なくとも約１ｌｏｇ、少なくとも約２ｌｏｇ、少なくとも約３ｌｏｇ、少なくとも約４ｌｏｇ、少なくとも約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇに抑えられる。別の実施形態において、微生物の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇに抑えられる。いくつかの実施形態において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。いくつかの実施形態において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤（例えば、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル）である。いくつかの実施形態において、核酸標的化化合物は、照射により活性化される。例えば、いくつかの実施形態において核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射により活性化される、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。いくつかの実施形態において、微生物は、改変されて核酸を修復する能力を弱める遺伝子突然変異（例えば、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群より選択される１つ以上の遺伝子における遺伝子突然変異、あるいはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、微生物はｕｖｒＡおよびｕｖｒＢの両方、あるいはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。代替的な実施形態において、微生物は、ｕｖｒＣにおける遺伝子突然変異を含む。別の実施形態において、微生物は、ｒｅｃＡにおける遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物は、ＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、上記微生物のＤＮＡ修復のための能力は、少なくとも１つのＤＮＡ修復経路について、野生型に対して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％まで低下している。例えば、いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの機能的等価物を欠損している。代替的に、微生物は、ＵｖｒＣ、またはＵｖＣの機能的等価物を欠損している。他の実施形態において、微生物は、ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、少なくと���１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している細菌である。いくつかの実施形態において、上記細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。いくつかの実施形態において、上記微生物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に属する細菌である。例えば、いくつかの実施形態において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種に属する。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素（例えば、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣおよび／またはＲｅｃＡ）を欠損している。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、抗原を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（微生物における発現のために必要に応じてコドンが最適化される）を含む異種性発現カセットを含む（ワクチンの抗原提示細胞を感染させるのに使用する改変された微生物の使用に適切な多くの例示的な抗原が、本明細書中で提供される。例えば、以下の表題「Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」の節および以下の実施例を参照のこと）。いくつかの実施形態において、タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含み、ポリヌクレオチド配列は、微生物における発現のためにコドンを最適化している。いくつかの実施形態において、ワクチンは、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、アジュバントを含む。
【００８９】
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、上記抗原提示細胞は、細菌を含み、上記細菌は、微生物の増殖が抑えられるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応により改変されており、そして上記細菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、上記細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、上記細菌は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方を欠損している（例えば、ＵｖｒＡＢ欠失突然変異体）。いくつかの実施形態において、上記細菌は、ＵｖｒＣを欠損している（例えば、ｕｖｒＣ欠失）。いくつかの実施形態において、上記細菌は、ＲｅｃＡを欠損している。
【００９０】
本発明はまた、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している自由生活微生物（例えば、細菌）を含む抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。
【００９１】
別の局面において、本発明は、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含むワクチンを提供し、ここで、上記抗原提示細胞は、微生物の核酸に対する改変を修復する能力を弱める遺伝子突然変異を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を、（例えば、感染により）含む。いくつかの実施形態において、微生物は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、上記微生物のＤＮＡ修復の能力は、少なくとも１つのＤＮＡ修復経路について、野生型に対して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％まで低下している。いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの両方、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢの機能的等価物を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＣ、またはＵｖＣの機能的等価物を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物を欠損している。いくつかの実施形態において、遺伝子突然変異は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群より選択される１つ以上の遺伝子においてか、あるいはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の機能的等価物におけるものである。いくつかの実施形態において、微生物はｕｖｒＡおよびｕｖｒＢの両方、あるいはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ両方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物は、ｕｖｒＣ、またはｕｖｒＣの機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。代替的な実施形態において、微生物は、ｒｅｃＡ、またはｒｅｃＡの機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物は、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）である。いくつかの実施形態において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢを欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、微生物は、ＵｖｒＣを欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態において、微生物は、ＲｅｃＡを欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、抗原を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む異種性発現カセットを含む（ワクチンの抗原提示細胞を感染させるのに使用する，改変された微生物の使用に適切な多くの例示的な抗原が、本明細書中で提供される。例えば、以下の表題「Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」の節および以下の実施例を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、微生物における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、タンパク質は、さらにシグナルペプチドおよび微生物における発現のためにコドンが最適化されたポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントをさ��に含む。
【００９２】
本明細書中に記載されるＡＰＣベースのワクチンの調製方法もまた、提供される。例えば、ＡＰＣベースのワクチンは、インビトロまたはエキソビボにて抗原提示細胞に負荷し、抗原提示細胞を活性化および／または成熟するのに適切な条件下で、本明細書中に記載される改変された微生物と抗原提示細胞とを接触させることにより調製され得る。さらに、ＡＰＣベースのワクチンは、インビトロまたはエキソビボにて、抗原提示細胞を本明細書中に記載される改変された微生物に感染させることにより調製され得る。
【００９３】
特別な実施形態は本明細書中および特定の実施例で例示されるが、本明細書中に記載された一般的な方法および技術は広く種々の改変された微生物、抗原および疾患により広く適用することができることが理解される。当業者は本明細書中に記載された教示に容易に適合させることができよう。
（Ｃ．  改変された微生物）
種々の改変された微生物が、本発明により提供される。本明細書中に記載される改変された微生物の各々は、本明細書中に記載される任意の微生物ベースのワクチン、および抗原提示細胞ベースのワクチンにおいて使用され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、改変された微生物は、細菌、原生動物または真菌からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、マイコバクテリアである。いくつかの実施形態において、マイコバクテリアは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、細胞内細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｓｉｓに属する（改変された微生物としてのＢ．ａｎｔｈｒａｓｉｓの使用に関するさらなる情報はまた、２００４年６月３０日に出願されたＤｕｂｅｎｓｋｙらによる米国仮特許出願「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（その全体は、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと）。１つの実施形態において、細胞内細菌は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ種である。好ましい実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に属し、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種に属する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、改変された微生物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアからなる群より選択される細菌である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に属する。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属に属する。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属に属する。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｌｙｍｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌｒａｅｎｓｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅである。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅである。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａである。他の実施形態において、改変された微生物は、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ（例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｍｏｏｓｅｒｉおよびＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）である。なおさらなる実施形態において、改変された微生物は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を発現するように改変されたＥ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、改変された微生物は、細胞に感染し、そしてＭＨＣクラスＩ抗原提示およびＭＨＣクラスＩＩ抗原提示をプログラムすることが可能な自由生活微生物である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ワクチンにおいて使用されるか、またはワクチンを作製するために使用される改変された微生物は、野生型の微生物である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、突然変異体微生物である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、組み換え的に操作されている。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンにおけるか、またはＡＰＣベースのワクチンを作製するために使用される改変された微生物は、臨床的に単離した（すなわち、微生物に感染した患者から得られた）ものである。他の実施形態において、ワクチンにおいて使用されるか、またはワクチンを作製するために使用される改変された微生物は、臨床的に単離されたものに由来する。
【００９８】
（１．  微生物複製の抑制）
本発明は、微生物の複製を抑制するための微生物核酸の改変を含む。複製におけるこの抑制を用いて、微生物の個体への投与に際して安全性のレベルを増加させることができる。微生物の増殖する能力は、正常な増殖を供する条件下で微生物の集団を培養することによって測定することができる。微生物の集団の正常な増殖は、微生物の核酸に対する改変を有しない微生物の増殖であると考えられる。微生物ゲノムの改変の結果、微生物が正常な増殖を受けないようなある程度の弱毒化がもたらされるであろう。幾つかの微生物は、固化された増殖培地上でカウントすることができるコロニーを形成する。かくして、微生物の複製の抑制は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数の低下として測定することができる。微生物コロニーのストック溶液は、コロニー形成単位の数が容易に測定できるまで（例えば、５０〜５００ＣＦＵ）系列的に希釈される。典型的には、希釈は１０倍であり、１以上の希釈されたサンプルでカウントされたコロニーの数を用いて、サンプルのｌｏｇ力価を見積もる。例えば、希釈された微生物ストックのアリコットを増殖培地で平板培養し、得られたコロニーをカウントする。希釈のｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）を計算し、（力価として知られた）元のストックのｍＬ当たりのコロニー形成単位を希釈から計算する。ｌｏｇ数はｌｏｇ力価として知られている。例として、１×１０５希釈の０．２ｍＬアリコットを平板培養する２４コロニー形成単位は１．２×１０７力価、または７．０８ｌｏｇ力価ストックを与える。抑制は、微生物核酸の改変後におけるそれに対する微生物核酸の改変に先立っての微生物力価の比較として測定することができる。改変後における微生物の力価に対する未改変微生物の力価の比率のｌｏｇは、ｌｏｇ抑制を表す（または単に２つのｌｏｇ力価の差を表す）。例えば、もし未改変微生物力価が１，２×１０７と測定され、改変された微生物力価が４．３×１０２と測定されれば抑制の得られたレベルは４．４５ｌｏｇである。この方法を用いて、病原体または非病原体であるかを問わず、いずれかの微生物の弱毒化を評価することができる。いくつかの微生物では、直接的に微生物の増殖を測定するよりはむしろ、感染された細胞を殺すその能力によって微生物を測定するプラークアッセイを用いることができる。例えば、ある細胞内細菌は、それが感染できる哺乳動物細胞の群上で増殖させることができる。適当なインキュベーション条件後に該群をプラーク（殺された死滅した細胞を表す細胞層における明瞭な領域）につき観察することができる。前記計算は、プラーク形成単位の数が、微生物の核酸の改変によりプラーク形成単位数の減弱化を評価するためにコロニー形成単位につき置き換えられている場合に同様である。本発明の実施形態では、弱毒化の所望の量は、安全性の所望のレベルおよび微生物の意図した適用に依存して、実質的に増殖が観察されないレベルを含めた、２倍低下からかなり大きなレベルの弱毒化までの範囲とすることができる。複製における２倍弱毒化は、もし与えられた希釈につき、微生物の未改変集団にある（約０．３ｌｏｇ弱毒化）ものとして核酸が改変される場合に、微生物の集団に半分のコロニー（またはプ���ーク）があれば観察されるであろう。幾つかの実施形態において、弱毒化は少なくとも約０．３ｌｏｇ、約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約５ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇである。いくつかの実施形態において、弱毒化は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、また約０．３〜７ｌｏｇ、また約０．３〜６ｌｏｇ、また約０．３〜５ｌｏｇ、また約０．３〜４ｌｏｇ、また約０．３〜３ｌｏｇ、また約０．３〜２ｌｏｇ、また約０．３〜１ｌｏｇの範囲にある。いくつかの実施形態においては、弱毒化は約１〜＞１０ｌｏｇ、１〜８ｌｏｇ、１〜６ｌｏｇ、また約２〜６ｌｏｇ、また約２〜５ｌｏｇ、また約３〜５ｌｏｇの範囲にある。本発明の１つの実施形態において、弱毒化の結果、実質的に完全な不活化がもたらされる（例えば、コロニーまたはプラークが検出限界まで観察されない場合）、ここで、微生物遺伝子発現は十分に活性である。そのような微生物の集団は、微生物核酸を改変して、コロニーまたはプラークが検出の限界で観察されない最低濃度を見出すのに用いられる剤の濃度を滴定することによって達成することができる。
【００９９】
病原体微生物の場合には、微生物の生物学的効果の項目で弱毒化を評価することも可能である。例えば、微生物の病原性は、マウスまたは他の脊椎動物においてメジアン致死率（ＬＤ５０）の測定によって評価することができる。ＬＤ５０は、脊椎動物の集団の半分の死亡がもたらされる脊椎動物に注入された微生物の量（例えば、ＣＦＵ）である。ＬＤ５０値は、弱毒化の量の尺度として改変および未改変微生物につき比較することができる。例えば、もし未改変の微生物の集団が１０３微生物のＬＤ５０を有し、核酸が改変されている微生物の集団が１０５微生物のＬＤ５０を有すれば、微生物はそのＬＤ５０が１００倍増加する、または２ｌｏｇだけ増加するように弱毒化されている。いくつかの実施形態において、ＬＤ５０は２倍〜１０００倍高い。いくつかの実施形態において、すでに比較的高いＬＤ５０を有する弱毒化株を用いる。そのような場合には、ＬＤ５０の改変された微生物での増加は、どのように多くの材料が危害を引き起こすこと無く注入できるかによって制限される。例えば、加熱死滅化生物のＬＤ５０は、単に、マウスへの生物学的材料の負荷および／または細菌壁成分への炎症性反応のため、約１〜５×１０９よりもかなり高いであろう。また、弱毒化の程度は、組織病理学の程度または血清肝臓酵素レベルのような他の生物学的効果によって定量的に測定することもできる。典型的には、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルブミンおよびビリルビンレベルは、本発明の微生物を注入したマウスにつき臨床実験室で測定される。マウスまたは他の脊椎動物におけるこれらの効果の比較は、微生物の弱毒化を評価する方法として、未改変および改変微生物につきなされるであろう。組織に対する微生物の効果の測定に加えて、時間の関数としての、肝臓または脾臓のような感染組織から回収することができる生きた微生物の量もまた、未改変−対−改変微生物を注入したマウスにおいてこれらの値を比較することによって弱毒化の尺度として用いることもできる。
【０１００】
（２．  本発明の微生物によるタンパク質の発現）
いくつかの実施形態において、微生物の増殖の抑制に加えて、微生物の核酸の改変は、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないように制御される。実質的に影響されないためには、微生物遺伝子発現は、核酸の改変に際して完全に活性である必要はない。複製を抑制するように核酸が改変される微生物の集団において、微生物遺伝子発現は、微生物による所望のタンパク質の適切なレベルの発現を供するのに十分に活性であることのみが必要である。適切なレベルの発現は、ある程度、微生物の意図した使用に依存する。例えば、もし微生物がワクチンとして使用されるべき特定の抗原を含むならば、適切な発現は、ワクチンに対する効果的な保護または治療免疫応答を供する発現の最小レベルとして決定されるであろう。微生物遺伝子発現は、そのようなワクチンが効果的な免疫応答を供するか否かを評価するためにインビトロ方法およびインビボ方法の双方において評価することができる。一般に、核酸が改変されている微生物の集団は、特定の抗原に関して微生物の未改変集団と比較することができる。
【０１０１】
１つの可能性は、微生物の集団と混合された抗原提示細胞による注目する抗原の提示を測定することである。微生物は適当な抗原提示細胞または細胞系、例えば、樹状細胞と混合することができ、抗原を認識するＴ細胞への樹状細胞による抗原の提示が測定されることができる。もし微生物が十分なレベルで抗原を発現しつつあるならば、それは、樹状細胞によってペプチド断片に加工され、各々、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩという状況、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。提示された抗原を検出する目的で、特定の抗原に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ細胞系を用いることができる。Ｔ細胞が癌細胞系との融合によって不滅化される場合には、Ｔ細胞はＴ細胞ハイブリドーマであってもよい。そのようなＴ細胞ハイブリドーマ、Ｔ細胞クローン、またはＴ細胞系はＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞いずれかを含むことができる。抗原提示細胞は、抗原がそれにより加工される経路に応じて、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞いずれかに提示することができる。ＣＤ＋８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩという状況抗原を認識し、他方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩＩという状況抗原を認識する。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体による特異的認識を介して提示された抗原によって刺激され、その結果、ＩＬ−２またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のようなある種のタンパク質の生産がもたらされ、これは、（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて）定量的に測定することができる。別法として、ハイブリドーマは、提示された抗原によって、Ｔ細胞ハイブリドーマの刺激に際して活性化されるβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を含むように設計することができる。β−ガラクトシダーゼの生産の増加は、クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのような基材上のその活性によって容易に測定することができ、その結果容易に色が変化させることができる。色の変化は、特異的抗原提示のインジケーターとして直接的に測定することができる（実施例１、２および１１）。本発明の微生物ワクチンの抗原発現を評価するためのさらなるインビトロおよびインビボ方法は実施例５に見出すことができる。また、本発明の微生物によって特定のタンパク質の発現を直接的に測定することも可能である。例えば、放射性標識アミノ酸を細胞集団に加えることができ、特定のタンパク質に取り込まれた放射能の量を決定することができる。細胞集団によって合成されたタンパク質は、例えば、ゲル電気泳動または毛細管電気泳動によって単離し、例えば、タンパク質に対して特異的な抗体との結合によって注目するタンパク質として同定することができ、放射能の量を定量的に測定して、特定のタンパク質の発現レベルを評価することができる。別法として、タンパク質は放射能無くして発現させ、ＥＬＩＳＡアッセイのような種々の方法によって、または酵素結合抗体または蛍光標識抗体を用いる検出でのゲル電気泳動およびウェスタンブロットによって検出することができる。
【０１０２】
微生物核酸の改変は、未改変微生物と比較してタンパク質発現のレベルを低下させる可能性があるが、これは依然として効果的なワクチンを提供することができることを認識すべきである。本発明のいくつかの実施形態で重要なのは、増殖の抑制と適切なタンパク質発現との組合せである。ワクチンの効率は、一般に、微生物によって送達することができる抗原の用量に関係しており、いくつかの場合には、微生物による活性遺伝子発現のあるレベルが重要である。微生物の複製の抑制は数ｌｏｇであり得るが、他方、微生物遺伝子発現は依然として十分に維持される。もし弱毒化微生物の同一用量を未改変微生物のそれと比較すれば、弱毒化微生物集団における（前記した方法によって評価された）得られた抗原発現は、未改変微生物集団における抗原発現の少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。複製において数ｌｏｇ抑制があり得るので、改変された微生物の用量は数ｌｏｇまでは安全に増加させることができ、その結果、ワクチン接種に際して未改変微生物に対する弱毒化微生物によって提示された抗原と同等またはそれよりも大きな量がもたらされる。
【０１０３】
（３．  微生物核酸改変）
微生物の集団の核酸は、種々の方法によって改変することができる。微生物の核酸は物理的手段、例えば、紫外線または電離放射線の放射によって改変することができる。Ｘ−線またはγ−線のような電離放射線を用いて、核酸中で一本鎖または二本鎖の破壊を引き起こすことができる、紫外線放射を用いて、核酸中にピリミジンダイマーを生じさせることができる。適切な量の放射線は、前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対する放射線の効果を評価することによって決定される。
【０１０４】
微生物の核酸は化学的手段によって、例えば、核酸標的化化合物（また、本明細書中で核酸を標的とする化合物とも称される）との反応によって改変することもできる。いくつかの実施形態において、微生物は、その核酸を改変して、その結果微生物の増殖が、抑えられ得る核酸標的化化合物で処理され得る。いくつかの実施形態において、微生物の増殖が抑えられるように、核酸を改変することができる核酸標的化化合物で微生物を処理し、ここで、微生物の集団は、依然として、所望のタンパク質抗原の免疫応答を誘導するのに十分な程度発現させることができる。核酸標的化化合物は、核酸を改変する特定のメカニズムに限定されない。そのような化合物は、核酸と直接的に反応させることによって（すなわち、化合物の全てまたはある割合が核酸に共有結合する）、あるいは（例えば、シングレット酸素または酸素ラジカルの発生を介して酸素ダメージを引き起こすことによってダメージを引き起こす化合物ラジカルを発生させることによってまたは核酸の還元または酸化の他のメカニズムによって）核酸の改変を間接的に引き起こすことによって、核酸を改変する。エンジインは、ＤＮＡ二本鎖の切断をもたらすラジカル種を形成する化合物のクラスの例である［Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８８１−５８８８（１９９３）］。核酸と直接的に反応する化合物は、化合物の活性化に際して、例えば、化合物の照射に際して反応することができる。間接的に反応して核酸の改変を引き起こす化合物は、化合物のいずれかの活性化された種を生じさせ、あるいはいくつかの他の活性な種を生じさせるために同様な活性化を必要とする。核酸標的化化合物の活性化のための手段に限定されないが、本発明の１つの実施形態は、核酸と直接的に反応する、あるいは次いで核酸と反応する反応性酸素種（例えば、シングレット酸素）のような反応性種を生じさせる光活性化化合物の使用を含む。
【０１０５】
核酸標的化化合物は、生物学的サンプルの他の構成要素を有意に改変すること無く核酸を優先的に改変する。そのような化合物は、細胞膜、タンパク質および脂質を有意に改変または損傷すること無く、核酸の適切な改変を提供する。そのような化合物は、これらの他の細胞構成要素を有意ではない程度まで改変することができる。もしそれらの生物学的機能が十分に維持されるならば、細胞膜、タンパク質および脂質のようなこれらの細胞構成要素は有意には改変されない。核酸標的化化合物で微生物を処理する場合、核酸の改変は、微生物の細胞膜、タンパク質および脂質は、微生物遺伝子発現が活性であり（例えば、これに必要な酵素は有意には影響されない）、微生物の表面は、化合物で処理されなかった微生物と同一の抗原性を本質的に維持するように、本質的には影響されずして、微生物の複製が抑えられるようなものである。その結果、そのような化合物は、ワクチンとして有用である十分な抗原性または免疫原性を維持しつつ、微生物の増殖が十分に抑えられるので、ワクチンとして用いられる不活化微生物を調製するのに有用である。化合物は核酸を特異的に改変するので、タンパク質発現の十分なレベルを維持しつつ複製が抑えられるように、改変を所望のレベルまで制御することができる。改変は、化合物濃度、反応媒体のような反応のパラメーターを変化させ、光量またはｐＨのような化合物活性化因子を制御し、あるいは（例えば、脱気することによって物理的に、または酸素スカベンジャーの使用によって化学的に）酸素濃度を制御することにより酸素損傷を引き起こす化合物を制御することによって制御することができる。核酸標的化化合物は、核酸に優先的に結合する傾向を有する、すなわち、核酸に対する測定可能な親和性を有するいずれかの化合物である。そのような化合物は、生物学的サンプルのほとんどの他の構成要素、特にタンパク質、酵素、脂質および膜のような成分に対するよりも核酸に対してより強い親和性を有する。核酸標的化は、遺伝子転写およびタンパク質翻訳についての機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）のような生物学的サンプルの他の構成要素に有意に影響すること無く、核酸の改変に対する特異性を提供する。
【０１０６】
化合物は多数の局面で核酸に標的化することができる。以下の局面のいずれか、またはその組合せによって結合する化合物は、核酸標的化化合物と考えられる。インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合（例えば、リン酸骨格結合）、および（小または大溝における配列認識を介する）配列−特異的結合は、全て、核酸への結合の非共有結合局面である。結合のこれらの局面の１以上を含む化合物は核酸に対して高い親和性を有するであろう。本発明は以下の化合物に限定されないが、核酸への結合のこれらの局面を有数化合物のいくつかの例は以下の通りである：インターカレーターは、アクリジン、アクリドン、プロフラビン、アクリフラビン、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、ベータ−ロドマイシンＡ、ダウノマイシン、チアキサンテノン、ミラシルＤ，アントラマイシン、マイトマイシン、エキノマイシン、キノマイシン、トリオスチン、ジアクリジン、エリプティセン（ダイマー、トリマーおよびアナログを含む）、ノルフィリンＡ、フルオレンおよびフルオレノン、フルオレノジアミン、キナクリン、ベンズアクリジン、フェナジン、フェナントラジン、フェネチアジン、クロルプロマジン、フェノキサジン、ベンゾチアゾール、キサンテン、およびチオキサンテン、アントラキノン、アントラピラゾール、ベンゾチオピラノインドール、３，４−ベンズピレン、ベンゾピレンジオールエポキシド、１−ピレニルオキシラン、ベンズアントラセン−５，６−オキシド、ベンゾジピロン、ベンゾチアゾール、キノロン、クロロキノン、キニン、フェニルキノリンカルボキシアミド、フロクマリン（例えば、ソラレン、イソソラレンおよびその硫黄アナログ）、エチジウム塩、プロピジウム、コラリン、エリプティシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）カチオンおよび誘導体、多環炭化水素およびそのオキシラン誘導体、およびエキニマイシンが例示され；小溝バインダーはジスタマイシン、マイトマイシン、ネトロプシン、他のレキシトロプロシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８および他のＨｏｅｃｈｓｔ染料、ＤＡＰＩ（４，６’−ジアミジン−２−フェニルインドール）、ベレニル、およびトリアニールメタン染料が例示され；大溝バインダーはアフラトキシンが例示され；静電バインダーはスペルミン、スペリミジンおよび他のポリアミンが例示され；および配列−特異的バインダーは三重らせん形成、Ｄ−ループ形成、および一本鎖への直接的塩基対合のような配列−特異的相互作用によって結合する核酸またはアナログが例示される。他の配列−特異的結合化合物はポリピロール化合物、ポリピロールイミダゾール化合物、シクロプロピルピロロインドール化合物および関連する小溝結合化合物を含む［Ｗｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（３）：１６９−１７１（１９９８），Ｗｕｒｔｚら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７（３）：１５３−１６１（２０００），Ａｎｔｈｏｎｅｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １（１）：６７−８１（２００１）］。
【０１０７】
核酸を標的化することに加え、化合物は、核酸と反応することもでき、その結果、核酸への共有結合がもたらされる。核酸アルキル化剤は核酸と共有結合により反応することができる化合物のクラスであり、限定されるものではないが、マスタード（例えば、モノまたはビスハロエチルアミン基、およびモノハロエチルスルフィド基）、マスタード同等物（例えば、エポキシド、アルファ−ハロケトン）およびマスタード中間体（例えば、アジリジン、アジリジンニウムおよびその硫黄アナログ）、メタンスルホネートエステル、およびニトロソ尿素を含む。核酸アルキル化剤は、典型的には、核酸上の求核性基と反応する。核酸と特異的に共有結合により反応する能力をそれに与え、本発明で用いられる微生物の核酸の所望の改変を供するのは、これらの化合物の核酸アルキル化活性および核酸標的化能力の組合せである。これらの化合物の特異性は微生物に入らないクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の使用によってさらに増強させることができる。そのようなクエンチャーは、依然として、核酸標的化化合物を微生物核酸と反応させつつ、微生物の表面との反応を鎮めるであろう。そのようなクエンティングの議論は、ここで引用してその開示を援用する米国特許第６，２７０，９５２号に見出すことができる。微生物核酸の改変は、化合物の濃度および反応の条件を調整することによって制御することができる。適当な濃度および反応条件は、前記にて詳細に記載した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。本発明で用いる化合物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１００ｐＭ〜１ｍＭ、また約１ｎＭ〜１０μＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約１〜２００ｎＭまたは約１〜１００ｎＭの濃度で効果的である。標的化された核酸、核酸、特に、微生物核酸との特異的反応についての核酸反応性化合物、の議論は、ここで引用してその開示を援用する米国特許第６，１４３，４９０号および第６，０９３，７２５号に見出すことができる。
【０１０８】
核酸は、核酸改変を引き起こすのに放射線での活性化を必要とする核酸標的化化合物を用いることによって改変することができる。そのような化合物は前記したように核酸に標的化される。これらの化合物は、限定されるものではないが、アクリジン、アクリドン、アンスリル誘導体、アロキサジン（例えば、リボフラビン）、ベンゾトリアゾール誘導体、平面状芳香族ジアゾ誘導体、平面状芳香族シアノ誘導体、トルイジン、フラビン、フェノチアジン（例えば、メチレンブルー）、フロクマリン、アンゲリシン、ソラレン、ソラレンの硫黄アナログ、キノロン、キノリン、キノキサリン、ナフチリジン、フルオロキノロン、アントラキノン、およびアントラセンを含む。これらの化合物の多くはＤＮＡ光切断剤として用いられる［Ｄａ  Ｒｏｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ７：１７８１（２００１）］。本発明は核酸標的化化合物の活性化方法に限定されないが、典型的には、化合物は特定の波長の光で活性化することができる。光の効果的な波長は化合物の性質に依存し、ほぼ２００〜１２００ｎｍのどこかの範囲とすることができる。これらの化合物のあるものでは、例えば、核酸の近傍に反応性酸素種を生じさせることによって、活性化は、核酸への化合物の直接的結合無くして、核酸の改変を引き起こす。化合物のあるものでは、活性化の結果、核酸への化合物の直接的結合がもたらされる（すなわち、化合物は共有結合する）。これらの化合物のあるものは核酸と反応して、ストランド間架橋を形成することができる。ソラレンは、核酸を架橋させる化合物のクラスの例である。これらの化合物は、典型的には、ＵＶＡ光（３２０〜４００ｎｍ）で活性化される。本発明で用いられるソラレン化合物は、ここで引用してその開示を援用する米国特許第６，１３３，４６０号および第５，５９３，８２３号に例示されている。再度、核酸との特異的反応性を供するのは、核酸標的化、および活性化に際して核酸を改変する能力の組合せである。微生物核酸の改変は、化合物濃度、反応条件および光量を調整することによって制御することができる。適当な濃度および光量は、前記にて詳細に記載した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。化合物濃度および光暴露のレベルに加えて、反応は、サンプルをＵＶＡ光で照射する条件によって影響される。例えば、緩衝化媒体における微生物の集団を照射するための必要な全濃度は、増殖培地（例えば、ＢＨＩ、トリプターゼ・ソイ・ブロス）中で培養される集団から変化しつつある。光反応は増殖培地の内容物によって影響され得、これはソラレンと相互作用でき、それにより、ソラレンのより高い全濃度を必要とする。加えて、微生物の効果的な用量は、生物の成長層、および成長層の間における化合物の存在または不存在に依存するであろう。１つの実施形態において、微生物の集団はソラレンＵＶＡ処理の間に増殖培地を含む。１つの実施形態において、ソラレンを微生物の集団に加え、集団を培養して、ソラレンおよび増殖培地の存在下で微生物を増殖させ、微生物の成長層でのある地点でＵＶＡ処理を行う。１つの実施形態において、適当な量のＵＶＡ光の照射に先立って、ソラレ���の存在下で集団を０．５〜１のＯＤ（１×１０７〜１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）まで増殖させる。ソラレン化合物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１００ｐＭ〜１ｍＭ、また約１ｎＭ〜１０μＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約１〜２００ｎＭまたは約１〜１００ｎＭの濃度で効果的であり、ＵＶＡ光の量は約０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５〜１０Ｊ／ｃｍ２、０．５〜６Ｊ／ｃｍ２または約２〜６Ｊ／ｃｍ２の範囲である。１つの実施形態において、微生物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１〜５０００ｎＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約５〜５００ｎＭ、または約１０〜４００ｎＭのソラレン濃度にて増殖培地の存在下で処理される。１つの実施形態において、増殖培地の存在下で処理された微生物は、約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１〜５０００ｎＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約５〜５００ｎＭ、また約１０〜４００ｎＭの濃度のソラレンの存在下で０．５〜１のＯＤまで増殖させる。０．５〜１のＯＤまでの増殖に続き、微生物集団には約０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５〜１０Ｊ／ｃｍ２、０．５〜６Ｊ／ｃｍ２、または約２〜６Ｊ／ｃｍ２の範囲の量のＵＶＡ光を照射する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、微生物の核酸を改変するのに使用される核酸標的化化合物は、アルキル化剤（例えば、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル）である。他の実施形態において、微生物の核酸を改変するのに使用される核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射により活性化されるソラレン化合物（例えば、本明細書中で「Ｓ−５９」とも称される４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。
【０１１０】
１つの実施形態において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が抑えられるように改変されるような、微生物集団を処理することを含むワクチン組成物の製法を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。別の実施形態において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が抑えられるように改変されるように微生物集団を処理し、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されず、次いで、その微生物集団を用いて抗原提示細胞に抗原を負荷し、抗原提示細胞の活性化／成熟化を誘導することを含む、ワクチン組成物の製法を含む。１つの実施形態において、微生物集団は照射によって処理される。１つの実施形態において、微生物集団は、核酸の改変を間接的に引き起こす核酸標的化化合物と反応させることによって処理される。さらなる実施形態において、核酸標的化化合物は照射によって活性化され、ここで、化合物の活性化は核酸の間接的改変を引き起こす。さらなる実施形態において、核酸標的化化合物の活性化は、核酸を改変する反応性酸素種をもたらす。１つの実施形態において、微生物集団は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することによって処理される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１００ｐＭ〜１ｍＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約１〜２００ｎＭまたは約１〜１００ｎＭの濃度にて反応する。１つの実施形態において、核酸標的化化合物はアルキル化剤を含む。１つの実施形態において、アルキル化剤は、マスタード、マスタード中間体およびマスタード等価物よりなる群から選択される。１つの実施形態において、核酸標的化化合物はインターカレーター、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される核酸標的化基を含む。１つの実施形態において、核酸標的化化合物は、化合物の活性化に際して核酸と直接的に反応する。１つの実施形態において、化合物の活性化は照射による。１つの実施形態において、照射はＵＶＡ照射である。好ましい実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。１つの実施形態において、ソラレン化合物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１００ｐＭ〜１ｍＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約１〜２００ｎＭ、または約１〜１００ｎＭの濃度におけるものであり、ＵＶＡ照射は約０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５〜５Ｊ／ｃｍ２または約２〜４Ｊ／ｃｍ２の量である。１つの実施形態において、微生物集団の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ抑えられる。もう１つの実施形態において、微生物集団の増殖は約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇ、または約２〜５ｌｏｇだけ抑えられる。１つの実施形態において、微生物集団による抗原の発現は、核酸を改変するように処理されていない微生物集団による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの実施形態において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。１つの実施形態において、微生物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのものである。１つの実施形態において、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓであり、抗原はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからのものである。１つの実施形態において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの実施形態において、抗原は疾患関連抗原である。１つの実施形態において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖病よりなる群から選択される疾患に関連する。１つの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原である。１つの実施形態において、腫瘍抗原は分化抗原、組織特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの実施形態において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物は遺伝子変異を含む。１つの実施形態において、遺伝子変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力が弱められる。１つの実施形態において、遺伝子変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｒｖＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子変異は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｒｖＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上におけるものである。１つの実施形態において、遺伝子変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性における減弱をもたらす。さらなる実施形態において、これらの突然変異を有する微生物を、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンで処理する。１つの実施形態において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの実施形態において、微生物は細菌である。１つの実施形態において、細菌は、細胞内細菌である。好ましい実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、好ましくは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの取り込みに有意に影響することなく、非貪食細胞に進入するためのＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異は、インターナリン遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異は、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子からなる群より選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ｉｎｌＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子の両方における遺伝子突然変異を含む。１つの実施形態において、感染した細胞がファゴリソソームから逃れるＬｉｓｔｅｒｉａの能力を弱める突然変異を、Ｌｉｓｔｅｒｉａは含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異は、ｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、アクチンの重合化を低下させる遺伝子突然変異を、Ｌｉｓｔｅｒｉａは含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異は、ａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、ａｃｔＡ遺伝子および１つ以上のインターナリン遺伝子における突然変異を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、ａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子における突然変異を含み、好ましくは、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体を含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのａｎｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体は、ｕｖｒＡＢ遺伝子における欠失突然変異をさらに含む。
【０１１１】
（４．異種性核酸配列を含む微生物）
必要に応じて、ワクチンは、少なくとも１つの異種性核酸配列（すなわち、異種性ポリヌクレオチド）を含む微生物を含む、および／またはその微生物を使用して作製される。いくつかの実施形態において、微生物は、１つ以上の異種性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種性核酸ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクターである。典型的には、必須ではないが、これらの発現カセットまたは発現ベクターは、異種性抗原（すなわち、その抗原を発現する微生物に対して外来である抗原）をコードする。いくつかの実施形態において、微生物内に含まれる発現カセットおよび／または発現ベクターにおける少なくとも１つの配列は、微生物における発現のためにコドンが最適化される。必要に応じて、発現ベクターの抗原コーディング配列および／またはシグナル配列は、微生物における発現のためにコドンが最適化される。
【０１１２】
（ａ．発現カセットおよび発現ベクター）
本明細書中に記載される微生物における使用に適切な発現カセットは、当業者に公知である。例えば、微生物における使用に適切な発現カセットは、典型的には、ポリペプチド（例えば、異種性タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、およびタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むことが知られている。発現カセットは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含み、必要に応じて、さらに、発現カセットはプロモーター、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびコーディング配列を、全てが作動可能に連結されて含み、発現カセットがシグナルペプチド配列および所望のポリペプチド配列を含む融合タンパク質の両方をコードするように含む。原核生物について、発現カセットは、必要に応じて以下の要素：（１）原核生物のプロモーター；（２）シャイン−ダルガーノ配列：（３）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（４）ポリペプチド（例えば、異種性タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、発現カセットはまた、異種性ポリペプチドに関連する転写終止コドンのＣ末端から下流に挿入された転写終止配列を含み得る。例えば、転写終止配列は、細菌の染色体内で安定した組み込みのために設計された構築物中で使用され得る。必要ではないが、異種性遺伝子発現カセットにおける最終の支持要素（ｆｉｎａｌ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として転写終止配列を含むことにより、読み過ごし（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）転写に起因する隣接する遺伝子の発現の調節における極性効果（ｐｏｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔ）を防ぐ。ｒｈｏ依存性転写終止またはｒｈｏ因子非依存性転写終止因子のどちらかを促進する当業者に公知の適切な配列要素は、異種性タンパク質発現カセット内に配置され得る。
【０１１４】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ属のメンバーである微生物について、適切なプロモーターとしては、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡ依存性プロモーター（例えば、ａｃｔＡプロモーター）および構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（例えば、ｐ６０プロモーター）が挙げられる。当業者は、発現カセットおよび発現カセットが配置される宿主細菌の意図的な使用という観点において、発現カセットの使用に適切なさらなる原核生物プロモーターおよび／またはＬｉｓｔｅｒｉａプロモーターを容易に同定することが可能である。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、構成プロモーターである。他の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、誘導プロモーターである。誘導プロモーターは、発現カセットが使用される細菌に対して内因性である分子（例えば、タンパク質）により誘導され得る。あるいは、誘導プロモーターは、発現カセットが使用される細菌に対して異種性である分子（例えば、低分子または小さなタンパク質）により誘導され得る。種々の誘導プロモーターは、当業者によく知られている。
【０１１６】
必要に応じて、プロモーターの３’末端には、ポリプリンシャイン−ダルガーノ配列が存在し、この要素は、３０Ｓリボソームサブユニットの（１６Ｓ  ｒＲＮＡを介する）異種性遺伝子ＲＮＡ転写産物への結合および翻訳の開始に必要とされる。シャイン−ダルガーノ配列は、代表的には、以下のコンセンサス配列５’−ＮＡＧＧＡＧＧＵ−Ｎ５−１０−ＡＵＧ（開始コドン）−３’（配列番号５９）を有する。ポリプリンシャイン−ダルガーノ配列のバリエーションが存在する。特に、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）をコードするＬｉｓｔｅｒｉａ  ｈｌｙ遺伝子は、以下のシャイン−ダルガーノ配列：
【０１１７】
【数１】
2007523879.tif 000002
（配列番号６０、シャインダルガーノ配列には、下線を引く、そして翻訳開始コドンは、太字にする）を有する。
【０１１８】
適切なシグナル配列はまた、当業者に知られている。例えば、微生物が細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）である場合、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする配列は、発現カセットおよび／または発現ベクターにおいて使用され得る。Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける使用に適切なｓｅｃＡ１シグナルペプチドの例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）シグナルペプチドである。微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）における使用に適切なｓｅｃＡ１シグナルペプチドのもう１つの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来のＰａｇ（保護抗原）遺伝子由来である。これらの例示的なｓｅｃＡ１シグナルペプチドの情報を、以下の表１に提供する。
（表１、いくつかの例示的なｓｅｃＡ１シグナルペプチド）
【０１１９】
【表１】
2007523879.tif 000003
本明細書中に記載される改変された微生物における発現カセットに有用なさらなるシグナル配列は、米国特許出願第６０／５３２，５９８号および同第６０／５５６，７４４号に記載される（その各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【０１２０】
発現カセットは、必要に応じて発現ベクター（例えば、プラスミドが挙げられるがこれらに限定されない）内に含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは、組み込みベクターである。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、そのゲノム内に組み込まれた発現カセットを含む。
【０１２１】
例えば、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）における使用に適切な発現ベクターは、当業者に知られている。発現カセットのアセンブリのためのプラスミド構築物骨格（ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）としての使用に適切な種々のベクターが存在する。特定のプラスミド構築物骨格は、細菌染色体由来の異種性遺伝子の発現か、または外来染色体エピソーム由来の異種性遺伝子の発現のどちらが所望されるかに基づいて選択される。
【０１２２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  （Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の細菌染色体への異種性遺伝子発現カセットの導入は、ベクターのＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への配列特異的な組み込みを触媒するリステリオファージ（ｌｉｓｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）インテグラーゼについての発現カセットを含む組み込みベクターを使用して達成され得る。例えば、ｐＰＬ１およびｐＰＬ２として知られた組み込みベクターは、細菌ゲノムの無害領域内で異種性タンパク質発現カセットの安定した単一のコピーの組み込みをプログラムし、そしてこれらは文献（Ｌａｕｅｒら、２００２  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１７８；米国特許公開第２００３０２０３４７２号）に記載されている。組み込みベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドとして安定しており、所望のＬｉｓｔｅｒｉａ骨格への連結を介して導入される。各々のベクターは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的複製起点を欠き、そして染色体のファージ結合部位への組み込みに際してのみベクターが安定であるようにファージインテグラーゼをコードする。所望のプラスミド構築物を用いて開始して、所望のタンパク質を発現する組み換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を産生するプロセスは、ほぼ１週間かかる。ｐＰＬ１およびｐＰＬ２組み込みベクターは、それぞれＵ１５３およびＰＳＡリステリオファージに基づく。遺伝子の天然の配列が組み込みの成功の際に元に戻るように、従って、その天然に発現する機能が損なわれないような様式で、ｐＰＬ１ベクターは、ｃｏｍＫ遺伝子のオープンリーディングフレーム内に組み込み、一方でｐＰＬ２は、ｔＲＮＡ  Ａｒｇ遺伝子内に組み込む。ｐＰＬ１およびｐＰＬ２組み込みベクターは、異種性タンパク質発現カセットを含むプラスミドの構築を容易にするために複数のクローニング部位の配列を含む。ｐＰＬ２組み込みベクターの使用のいくつかの特定の例は、例えば、以下の実施例１９および実施例４６に記載される。
【０１２３】
代替的に、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体への抗原発現カセットの組み込みは、当業者に知られた対立遺伝子交換方法を介して達成され得る。特に、異種性遺伝子発現カセットを含む構築物の一部として抗生物質抵抗性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まないことが所望される組成物では、対立遺伝子交換方法が所望される。例えば、ｐＫＳＶ７ベクター（Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３  ８，１４３−１５７）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込んだｐＫＳＶ７プラスミドを表す、非許容性温度における組み換えクローンを選択するために活用される温度感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａグラム陽性複製起点を含む。ｐＳＫＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターは、異種性タンパク質発現カセットを含むプラスミドの構築を容易にするために複数のクローニング部位の配列を含み、そしてまた、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含む。Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体への挿入のために、異種性抗原発現カセット構築物は、所望の組み込みの正確な位置に対応する染色体ＤＮＡ配列の約１ｋｂまで隣接し得る。ｐＫＳＶ７異種性タンパク質発現カセットプラスミドは、グラム陽性細菌のエレクトロポレーションの標準的な方法に従って、エレクトロポレーションにより所望の細菌株に導入され得る。ｐＫＳＶベクターを使用するＬｉｓｔｅｒｉａの対立遺伝子交換を提供する方法の非限定的な例は、以下の実施例４７に提供される。
【０１２４】
他の実施形態において、安定したプラスミドエピソームからの微生物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）における異種性タンパク質を発現することが所望され得る。複数回の産生のための、継代によるプラスミドエピソームの維持は、プラスミドを含有する細菌についての選別の利点を与えるタンパク質の同時の発現を必要とする。非限定的な例として、異種性タンパク質と組み合わせてプラスミドから同時に発現するタンパク質は、抗生物質耐性タンパク質（例えば、クロラムフェニコール）であっても、または選別の利点を与え得る（野生型細菌における染色体から発現する）細菌タンパク質であってもよい。細菌タンパク質の非限定的な例としては、プリンまたはアミノ酸生合成のために必要とされる酵素（関連するアミノ酸、または他の必要な前駆体高分子を欠く所定の培地下での選択）、あるいはインビトロまたはインビボで選択の利点を与える遺伝子の発現のために必要とされる転写因子（Ｇｕｎｎら  ２００１  Ｊ．Ｉｍｍｕｏｌ．１６７：６４７１−６４７９）が挙げられる。非限定的な例として、ｐＡＭ４０１は、種々のグラム陽性細菌遺伝子における選択された異種性タンパク質のエピソーマルな発現に適切なプラスミドである（Ｗｉｒｔｈら  １９８６  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６５：８３１−８３６）。ｐＡＭ４０１の例示的な使用の更なる記載については、以下の実施例４６を参照のこと。
【０１２５】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの細菌染色体への異種性遺伝子発現カセットの組み込みは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体へのベクターの配列特異的組み込みを触媒するリステリオファージインテグラーゼのための発現カセットを含む組み込みベクターを用いて達成され得る。例えば、上記のように、組み込みベクターｐＰＬ２は、細菌ゲノムの無害領域内で異種性タンパク質発現カセットの安定した単一のコピーをプログラムし、そして、これは文献（Ｌａｕｅｒら２００２  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１７８；米国特許公開第２００３０２０３４７２号）に記載される。組み込みｐＰＬ２ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドとして安定しており、所望のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ骨格への組み込みを介して導入される。ベクターは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的複製起点を欠き、そして染色体のファージ結合部位への組み込みに際してのみベクターが安定であるようにファージインテグラーゼをコードする。ｐＰＬ２組み込みベクターは、ＰＳＡリステリオファージに基づく。遺伝子の天然の配列が組み込みの成功の際に元に戻るように、従って、その天然に発現する機能が損なわれないような様式で、ｐＰＬ２ベクターは、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子内に組み込む。ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種とＢａｃｉｌｌｕｓ種との間で保存される。ｐＰＬ２組み込みベクターは、異種性タンパク質発現カセットを含むプラスミドの構築を容易にするために複数のクローニング部位の配列を含む。代替的に、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的組み込みベクターは、インテグラーゼおよび、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的バクテリオファージ由来の結合部位を使用して誘導される。
【０１２６】
代替的に、インテグラーゼおよびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓファージの結合部位が使用されて、組み込みベクターを誘導し、ワクチン組成物へ所望の抗原発現カセットを組み込む。非限定的な例として、インテグラーゼおよびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ穏和ファージｗ−α（Ｒｅｆ  ｂｅｌｏｓ）由来の結合部位が使用されて、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ組み込みベクターを誘導する（ＭｃＣｌｏｙ，Ｅ．Ｗ．１９５１．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ａ  ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔａｉｎ．  Ｉ．  Ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．Ｊ．Ｈｙｇ．４９：１１４−１２５）。
【０１２７】
代替的に、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体への抗原発現カセットの組み込みは、当業者に知られた対立遺伝子交換方法を介して達成され得る。特に、異種性遺伝子発現カセットを含む構築物の一部として抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まないことが所望される組成物では、対立遺伝子交換方法が所望される。例えば、ｐＫＳＶ７ベクター（Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３  ８，１４３−１５７）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込んだｐＫＳＶ７プラスミドを表す、非許容性温度における組み換えクローンを選択するために活用される温度感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａ由来のグラム陽性複製起点を含む。ｐＳＫＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターは、異種性タンパク質発現カセットを含むプラスミドの構築を容易にするために複数のクローニング部位の配列を含み、そしてまた、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体への挿入のために、異種性抗原発現カセット構築物は、所望の組み込みの正確な位置に対応する染色体ＤＮＡ配列の約１ｋｂまで隣接し得る。ｐＫＳＶ７異種性タンパク質発現カセットプラスミドは、グラム陽性細菌のエレクトロポレーションの標準的な方法に従って、エレクトロポレーションにより所望の細菌株に導入され得る。ｐＫＳＶ７ベクターを使用するＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの対立遺伝子交換を提供する方法の非限定的な例は、以下の実施例に提供される。この結果は、対立遺伝子交換のｐＫＳＶ７ベクターベースの技術が、使用されて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（Ｌｉｓｔｅｒｉａのように、低Ｇ＋Ｃ含有生物である）における遺伝子突然変異を提供することができることを証明する。特に、ｐＫＳＶ７ベクターを使用する対立遺伝子交換は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの株において使用されて、ＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ｕｖｒＡＢ）を欠失するかまたは改変することができるか、あるいは細菌染色体内の所望の任意の位置において所望の抗原発現カセットを付加することができる。
【０１２８】
本発明のワクチン組成物における改変された微生物として使用されるいくつかの組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株に関するさらなる情報は、２００４年６月３０日に出願されたＤｕｂｅｎｓｋｙらによる米国仮特許出願  “Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”に記載される（本明細書中において、その全体が参考として援用される）。
【０１２９】
（ｂ．発現カセットによりコードされる抗原）
本明細書中に記載されるワクチンにおいて使用される微生物および／または本明細書中に記載されるワクチンを作製するために使用される微生物は、必要に応じて微生物に内因性の抗原を発現する。必要に応じて、微生物は、異種性抗原（すなわち、抗原が発現される微生物に対して外来性である）である抗原を発現する。他の場合では、微生物は、内因性抗原および異種性抗原の両方を発現する。異種性抗原を発現する微生物は、異種性抗原をコードする異種性核酸（発現カセットおよび／または発現ベクター）を含む。代替的に、異種性核酸が使用されて、微生物内で内因性抗原を過剰発現し得る。
【０１３０】
従って、いくつかの実施形態において、ワクチン中の、および／またはワクチンを作成するために使用される微生物は、微生物によって発現され得る異種核酸配列を含む様に改変される。異種配列は少なくとも１つの特異的タンパク質抗原をコードことができる。微生物は、当業者に知られた方法によって改変することができる［ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００）］。微生物は、１以上の抗原をコードする１以上の配列を含むように改変することができる。特異的抗原をコードする異種核酸配列は、正確な核酸配列に限定されるものではなく、個体に投与されると、所望の免疫応答を誘導するであろう抗原の発現を供するのに十分な配列である。異種配列は、特定の疾患に関連する抗原として発現され得る。そのような抗原を発現する微生物はワクチンとしてもちいることができ、ここで、該ワクチンは予防的処置または治療的処置として用いることができる。そのようなワクチンによって処理することができる疾患は、以下に記載されるように感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌および他の過剰増殖性病を含む。
【０１３１】
本発明の微生物は、特定の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む様に改変することができる。Ｔ細胞によって認識される非常に多数の腫瘍特異的抗原が同定されている［Ｒｅｎｋｖｉｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｎｕｍｏｔｈｅｒ  ５０：３−１５（２００１）］。腫瘍抗原は分化抗原（例えば、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００）、組織−特異的抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ）、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ  １６Ｅ７）、癌−精巣抗原（例えば）、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、胚抗原（例えば、ＣＥＡ、アルファ−フェトプロテイン）、癌タンパク質抗原（例えば、Ｒａｓ、ｐ５３）、過剰に発現されたタンパク質抗原（例えば、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）、ＭＵＣ１）、または突然変異したタンパク質抗原であり得る。異種核酸配列によってコードされ得る腫瘍抗原は、限定されるものではないが、７０７−ＨＰ、アネキシンＩＩ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、ＢＣＬ−２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ１９０、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ２１０、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ９、ＣＴ１０、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｄｅｋ−ｃａｉｎ、ＤＡＭ−６（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＤＡＭ−１０（ＭＡＧＥ−Ｂ１）、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐｈＡ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＡＬ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、アポトーシスの阻害剤（例えば、サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ＭＤＭ−２、メソセリン、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ネオーポリＡ  ポリメラーゼ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ（ＣＡＧ−３）、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）、Ｐ１５、ｐ１９０、Ｐｍ１／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＡＳ、ＲＣＡＳ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＰ１７、ＳＰＡＳ−１、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＷＴ−１、および、別法として、翻訳されたＮＹ−ＥＳＯ−ＯＲＦ２およびＣＡＭＥＬタンパク質（ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１遺伝子由来）を含む。本発明の微生物は、未だ同定されていない抗原を含めた、腫瘍―特異的免疫応答を誘導することができるいずれかの腫瘍抗原を含む。微生物は、１を超える腫瘍抗原をコードする１を超える異種配列を含むように改変することができる。好ましい抗原はメソテリン［Ａｒｇａｎｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（１２）：３８６２−８（２００１）］、Ｓｐ１７［Ｌｉｍら、Ｂｌｏｏｄ．９７（５）：１５０８−１０（２００１）］、ｇｐ１００［Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４５８（１９９４）］、ＰＡＧＥ−４［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（７）：１４４５−８（１９９９）］、ＴＡＲＰ［Ｗｏｌｆｇａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１７）：９４３７−４２（２０００）］、ＥｐｈＡ２［Ｔａｔｓｕｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１５）：４４８１−９（２００３）］、ＰＲ３［Ｍｕｌｌｅｒ−Ｂｅｒａｔら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７０（１）：５１−９（１９９４）］、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）［Ｒｅｉｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：１７３５−４０（１９９８）；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０２：３９０−７（２００２）］およびＳＰＡＳ−１［米国特許出願公開番号２００２０１５０５８８］を含む。
【０１３２】
本発明の１つの実施形態において、改変された微生物によって発現された異種タンパク質はＣＥＡである。ＣＥＡは、結腸直腸、胃および膵臓の９０％、非小細胞肺癌の７０％、および乳癌の５０％を含めた、ヒト腫瘍のかなりの割合で過剰発現される１５０ｋＤＡ膜細胞内接着糖タンパク質である（Ｈａｍｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓｅｍｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，９：６７−８１）。抗イディオタイプモノクローナル抗体ミミッキングＣＥＡ（Ｆｏｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８７：９８２−９０（１９９５）、またはＣＥＡを発現する組換えワクシニアウイルスを用いるワクチン接種（Ｔｓａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８７：９８２−９０（１９９５））のような種々の免疫療法が調べられてきたが、あいにくと、成功は限られている。それにもかかわらず、研究者らは、ワクチン接種した患者から生じたヒトＴ細胞系によって認識されるＨＬＡ＊０２０１−制限エピトープ、ＣＡＰ−１（ＣＥＡ６０５−６１３）を同定した。このエピトープでパルスしたＤＣを持つ患者のワクチン接種は、臨床的応答を誘導しなかった（Ｍｏｒｓｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５：１３３１−８（１９９９））。最近、ＣＥＡ６０５−６１３ペプチドアゴニストが、位置６１０における異常なアスパルテートからアスパラギンへの置換を持つものとして同定された（ＣＡＰ１−６Ｄ）。このアミノ酸置換はこのペプチドのＭＨＣ結合親和性を改変しなかったが、改変されたペプチドリガンド（ＡＰＬ）の使用の結果、インビトロにて、ＣＥＡ−特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成が改良された。ＣＡＰ１−６Ｄ−特異的ＣＴＬは、天然ＣＥＡを発現する腫瘍細胞を認識し、それを溶解するその能力を維持した（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４５７０−７（１９９７）；Ｓａｌａｚａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８５：３２９−３８（２０００））。Ｆｏｎｇらは、このＡＰＬと共にインキュベートされたＦｌｔ３−リガンド拡大ＤＣでワクチン接種された結腸癌を持つ患者におけるＣＥＡ−特異的免疫の誘導を示した。勇気付けられることには、１２人の患者のうち２人は、ワクチン接種の後、ペプチド−ＭＨＣテトラマー＋Ｔ細胞の誘導と相関する劇的な腫瘍退行を経験した（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１））。一緒に考えると、この研究は、結腸直腸癌に対するＣＥＡ−標的化免疫療法に対する有利な確認を提供する。
【０１３３】
もう１つの実施形態において、改変された微生物によって発現された異種抗原はプロテイナーゼ−３であるか、あるいはプロテイナーゼ−３に由来する。例えば、１つの実施形態において、抗原はＨＬＡ−Ａ２．１−制限ペプチドＰＲ１を含む（ａａ１６９−１７７；ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号：５０））・プロテイナーゼ−３および／またはＰＲ１エピトープについての情報は以下の文献で公に入手可能である：米国特許第５，１８０，８１９号、Ｍｏｌｌｄｒｅｍら、Ｂｌｏｏｄ，９０：２５２９−２５３４（１９９７）；Ｍｏｌｌｄｒｅｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅａｓｅｒｃｈ，５９：２６７５−２６８１（１９９９）；Ｍｏｌｌｄｒｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：１０１８−１０２３（２０００）；およびＭｏｌｌｄｒｅｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：８６６８−８６７３（２００２）。
【０１３４】
従って、いくつかの実施形態においては、改変された微生物（例えば、改変された細菌）はメソテリン、ＳＰＡＳ−１、プロテイナーゼ−３、ＥｐｈＡ２、ＳＰ−１７、ｇｐ１００、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、Ｋ−ｒａｓ、またはＣＥＡのような抗原、あるいはそれらのタンパク質の１つの由来する抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態においては、改変された微生物はメソテリン、ＳＰＡＳ−１、プロテイナーゼ−３、ＳＰ−１７、ｇｐ１００、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＣＥＡのような抗原、またはそれらのタンパク質の１つに由来する抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、改変された微生物はヒトメソテリン、あるいはヒトメソテリンに由来する抗原をコードする核酸分子を含む。他の実施形態において、改変された微生物はヒトＥｐｈＡ２をコードする核酸分子を含むか、あるいはヒトＥｐｈＡ２に由来する。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、改変された微生物は、抗原（例えば、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｇｐ１００、ＰＡＰまたはプロテアーゼ３）をコードする発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、メソテリンである。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＰＳＣＡである。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＷＴ−１である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、サービビンである。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ｇｐ１００である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＰＡＰである。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、プロテアーゼ３である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、改変された微生物中で発現カセットにより発現される抗原は、腫瘍関連抗原と同一ではなく、むしろ腫瘍関連抗原由来である。例えば、抗原は、腫瘍関連抗原のフラグメント、腫瘍関連抗原のバリアント、または腫瘍関連抗原のバリアントのフラグメントを含み得る。いくつかの場合では、その配列が宿主に対して内因性の配列と異なる場合に、抗原（例えば、腫瘍抗原）は、ワクチンにおけるより有意な免疫応答を誘導可能である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原のバリアント、または腫瘍関連抗原のバリアントのフラグメントは、１つ以上のアミノ酸により、腫瘍関連抗原のバリアントまたはその対応するフラグメントと異なる。腫瘍関連抗原由来の抗原は、宿主内で抗原をコードするポリヌクレオチドの発現に際して所望の免疫応答を誘導可能な少なくとも１つのエピトープ配列を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、改変された微生物は、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｇｐ１００、ＰＡＰまたはプロテアーゼ３を由来の抗原をコードする発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、メソテリン由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＰＳＣＡ由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＮＹ−ＥＳＯＴ由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＷＴ−１由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、サービビン由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ｇｐ１００由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、ＰＡＰ由来である。いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンか、または抗原提示細胞ワクチンのどちらかで使用される改変された微生物により発現される抗原は、プロテアーゼ３由来である。
【０１３８】
あるいは、本発明の微生物は、特異的感染症抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。１つの実施形態において、抗原はヒトまたは動物病原体に由来する。該病原体は、所望により、ウイルス、細菌、真菌または原生動物である。例えば、抗原はウイルスまたは真菌または細菌抗原であり得る。
【０１３９】
例えば、抗原は（ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ抗原ならびにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびＬＴＲ領域に由来するタンパク質のような）ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはヒトまたは動物ヘルペスウイルスに由来するかもしれない。１つの実施形態において、抗原は（ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ、ＩＣＰ２７のような即時型タンパク質のような）単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）タイプ１および２、（ｇＢおよびｇＨのような）サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモ（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏ）ウイルス、エプスタインーバールウイルスまたは（ｇｐＩ、ＩＩまたはＩＩＩのような）バリセラゾスタウイルスに由来する（例えば、Ｃｈｅｅら（１９９０）  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  （Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．１２５−１６９；ＭｃＧｅｏｃｈら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４；米国特許第５，１７１，５６８号；Ｂａｅｒら（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：２０７−２１１；  およびＤａｖｉｓｏｎら（１９８６）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９−１８１６参照）。
【０１４０】
もう１つの実施形態において、抗原はＢ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原）Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルスに由来する。例えば、ＷＯ  ８９／０４６６９；  ＷＯ  ９６／１１０８９；  およびＷＯ  ９０／１４４３６参照。ＨＣＶゲノムはＥ１およびＥ２を含めたいくつかのウイルスタンパク質をコードする。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：３８１−３８８（１９９１）参照。
【０１４１】
ウイルス抗原である抗原は、所望により、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ポリオウイルス、リノウイルス等）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ルベラウイルス、デングウイルス等）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ロタウイルス等）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ラビエスウイルス等）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ型等）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ  ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、流行性下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器系シンシチウムウイルス、パラインフルエンザウイルス等）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、限定されるものではないが、単離体ＨＩＶＩ１１ｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＴＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮからの抗原を含めた）ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−１１；（ＨＴＬＶ−１１１、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲ等としても知られた）ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２、とりわけ；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；パピローマウイルス、ダニで生じる脳炎ウイルス等のいずれか１つからのウイルスに由来する。これらのおよび他のウイルスの記載については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｄｉｔｉｏｎ  （Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｄｉｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）参照。
【０１４２】
いくつかの別の実施形態において、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢまたはその融合体）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、Ｐ．６９、ＰＴおよびＦＨＡ）のような細菌性病原体に由来し、あるいはプラスモジウムまたはトキソプラズマのような寄生虫に由来する。１つの実施形態において、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  （例えば、ＥＳＡＴ−６、８５Ａ、８５Ｂ、７２Ｆ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えば、ＰＡ）、またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（例えば、Ｆ１，Ｖ）に由来する。加えて、本発明で用いるのに適した抗原は、限定されるものではないが、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）、結核（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌または真菌肺炎（ＢａｃｔｅｒｉａｌまたはＦｕｎｇａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、中耳炎（Ｏｔｉｔｉｓ  Ｍｅｄｉａ）、淋病（Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、コレラ（Ｃｈｏｌｏｒａ）、チフス（Ｔｙｐｈｏｉｄ）、髄膜炎（Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、単核細胞症（Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ）、ペスト（Ｐｌａｇｕｅ）、細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）またはサルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、在郷軍人病（Ｌｅｇｉｏｎａｉｒｅ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ライム病（Ｌｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、らい病（Ｌｅｐｒｏｓｙ）、マラリア（Ｍａｌａｒｉａ）、血線虫（Ｈｏｏｋｗｏｒｍ）、オンコセルカ症（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ）、充血住吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、トリパノソーマ症（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、リシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、アメーバ症（Ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、フィラリア症（Ｆｉｌａｒｉａｓｉｓ）、ボレリア症（Ｂｏｒｅｌｉａ）および旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）を含めた疾患の原因である公知の病原体から得ることができるか、またはそれに由来することができる。
【０１４３】
本発明の微生物は、自己免疫疾患−特異的抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。Ｔ細胞媒介自己免疫疾患においては、自己抗原に対するＴ細胞応答の結果、自己免疫疾患が起こる。本発明のワクチンで自己免疫疾患を処置するのに用いられる抗原のタイプは、自己免疫応答を担う特異的Ｔ細胞を標的とするであろう。例えば、抗原は自己免疫応答を引き起こすそれらのＴ細胞に特異的なＴ細胞受容体の一部、イディオタイプとすることができ、ここで、本発明のワクチンに取り込まれた抗原は、自己免疫応答を引き起こすそれらのＴ細胞に特異的な免疫応答を誘導するであろう。それらのＴ細胞を排除することは、自己免疫疾患の軽減に対する治療的メカニズムであろう。もう１つの可能性は、自己免疫疾患における自己抗原に対して生成する抗体を標的とする、または抗体を分泌する特異的Ｂ細胞クローンを標的とする免疫応答をもたらすであろう抗原を取り込むことである。例えば、そのようなＢ細胞に対する抗イディオタイプ免疫応答および／または自己免疫疾患における自己抗原と反応する抗体をもたらす微生物にイディオタイプ抗原を取り込むことができる。本発明のワクチン微生物で処置可能な自己免疫疾患は、限定されるものではないが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、ろう瘡、重症筋無力症、白斑、強皮症、乾癬、尋常性天疱瘡、線維菌痛、結腸炎および糖尿病を含む。アレルギー反応を処置するのに同様なアプローチを取ることができ、ここで、ワクチン微生物に取り込まれた抗原は、アレルギー反応を変調するのに効果的なＴ細胞、Ｂ細胞または抗体いずれかを標的とする。乾癬のようないくつかの自己免疫疾患において、疾患の結果、同様に標的とすることができる抗原の発現を伴う過剰増殖性細胞増殖がもたらされる。過剰増殖細胞に対する免疫応答をもたらすそのような抗原が考えられる。
【０１４４】
必要に応じて、本発明の微生物は、ユニークな疾患関連タンパク質の構造を標的とする抗原を含む。これの１つの例は、前記したイディオタイプ抗原を用いる抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞の標的化である。もう１つの可能性は、特定の疾患に由来するユニークなタンパク質構造を標的とすることである。これの例は、アルツハイマー病、クロイツェルフェルト−ヤコープ病（ＣＪＤ）およびウシ海綿状脳障害（ＢＳＥ）のような疾患で観察されるアミロイドプラークを引き起こすタンパク質に対する免疫応答を生じる抗原を取り込むことであろう。このアプローチはプラーク形成の減少を供するに過ぎないかもしれないが、ＣＪＤのような疾患の場合における治癒ワクチンを提供することが可能であろう。この疾患はプリオンタンパク質の感染性形態によって引き起こされる。ワクチンは、該ワクチンによって生じる免疫応答がＣＪＤを引き起こす感染性タンパク質を排除し、減少させまたは制御できるように、プリオンタンパク質の感染性形態に対する抗原を取り込む。
【０１４５】
特定の抗原をコードするポリヌクレオチドは、正確な核酸配列に限定されないが、個体に投与される場合に所望の免疫応答を誘導する抗原の発現を提供するのに十分な配列である。用語「抗原」はまた、本明細書中で使用される場合、抗原性であるタンパク質のフラグメントを含むことが理解される。同様に、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドについて、所与のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は、所望のタンパク質が、個体へ投与される場合に所望の効果（例えば、緩和効果）を提供するために発現される限り変化し得る。
【０１４６】
なお他の実施形態において、抗原は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、代謝性疾患（例えば、Ｉ型糖尿病）、および薬物添加（例えば、ニコチン添加）の発症または進行に関与する生物学的因子から得られるかまたは誘導される。代替的に、組み換え核酸分子によりコードされる抗原は、疼痛調節のために使用され、そしてこの抗原は、疼痛受容体であるか、または疼痛シグナル伝達に関する他の因子である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、抗原は、ヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である。他の実施形態において、抗原は、非ヒトタンパク質であるか、または非ヒトタンパク質（そのフラグメントおよび／またはバリアント）由来である。いくつかの実施形態において、発現カセットによりコードされる融合タンパク質の抗原部分は、非ヒト動物からのタンパク質であるか、非ヒト動物由来のタンパク質である。例えば、抗原が、ヒトにおいて使用されるべきＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンにおいて発現するべき場合であっても、抗原は、マウスメソテリンであるか、またはマウスメソテリン由来であり得る。
【０１４８】
異種性タンパク質発現のためのもう１つの選択肢は、異種性タンパク質が機能的に「インフレーム」挿入されたタンパク質「足場」を使用することである。この組成物において、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープに対応する遺伝子の全ゲノムまたは構成要素は、足場タンパク質内に、かつ足場タンパク質を通して挿入される。足場タンパク質は、高度に発現されたＬｉｓｔｅｒｉａタンパク質（例えば、ＬＬＯまたはｐ６０）であり得るが、もう１つの実施形態では、免疫原性の高度な発現、安定性、分泌、および／または（欠損）について選択される異種性タンパク質であり得る。骨格タンパク質の代表的な例は、ニワトリオボアルブミンまたは他のヒトタンパク質（例えば、βグロブリン、またはアルブミン）である。
【０１４９】
（Ｃ．  発現カセットによりコードされた他のタンパク質）
いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物について使用される微生物は、タンパク質（例えば、サイトカイン）をコードする異種性発現カセットを含む。好ましくは、タンパク質の発現は、動物への投与の際に微生物を含有するワクチンに対する免疫応答の効力を増強する。例えば、本発明の改変された微生物は、必要に応じて、異種性核酸（例えば、細胞溶解素をコードする発現カセットまたは発現ベクター）を含む。本発明の改変された微生物は、必要に応じて、異種性核酸（例えば、発現カセットまたは発現ベクター）を含み、その異種性核酸は、細胞溶解素をコードする。いくつかの実施形態において、本発明のワクチンは、その微生物に対して異種性の細胞溶解素を発現する微生物を含む。ワクチン中で微生物により発現される異種性細胞溶解素は、必要に応じてリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ストレプトマイシン、またはパーフリンゴリシン、あるいはリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ストレプトマイシン、またはパーフリンゴリシンの突然変異体型である。従って、いくつかの実施形態において、ワクチンは、ＬＬＯを発現する改変された非Ｌｉｓｉｔｅｒｉａｌ微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む、および／またはこれらを使用して調製されている。
【０１５０】
例えば、本発明のワクチン組成物は、必要に応じて、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、コレステロール依存性の、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のポアフォーミング（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ）細胞溶解素の発現および分泌により増強される。ＬＬＯは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ由来の重要な毒性因子である。なぜならば、ファゴリソソーム中でのその発現は、Ｌｉｓｔｅｒｉａが宿主細胞の細胞質に逃れることを可能にするからである。重要なことには、他の微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂｉｅｌｅｃｋｉら  Ｎａｔｕｒｅ．１９９０  ３４５：１７５−６），  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｇｉｎｓら，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９  ３１：１６３１−４１），またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  （Ｃｏｎｒａｄｔら，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．１９９９  １：７５３−６４））によるＬＬＯの発現は、これらの生物体またはこれらのタンパク質抗原が細胞質内に進入することを可能にすることが示されている。このことは、ＭＨＣクラスＩ経路を介した改善された抗原提示、続いてＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生を誘導する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、微生物により発現されるＬＬＯタンパク質は、インタクトな微生物から分泌されることを可能にするシグナル配列を含むＬＬＯ融合タンパク質である。この形態では、微生物全体が、宿主の細胞質に接触可能である。いくつかの代替的な実施形態において、微生物により発現されるＬＬＯタンパク質は、シグナル配列を含まず、そして、ＬＬＯタンパク質は、発現され、そして分泌されることなく微生物内に蓄積される。この場合では、ファゴリソソーム内のワクチン微生物の分解および破裂は、最終的に、細胞質への抗原の放出を導く。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、発現される異種性細胞溶解素は、天然に存在する細胞溶解素である。他の実施形態において、発現される細胞溶解素は、天然に生じる細胞溶解素の突然変異形態である。いくつかの場合では、突然変異体細胞溶解素は、天然に生じる細胞溶解素よりもより活性である。
【０１５３】
例えば、中性ｐＨにて天然のタンパク質よりもより活性であるＬＬＯの突然変異体形態は、Ｌｉｓｔｅｒｉａより単離され、そして特徴付けられている（Ｇｌｏｍｓｋｉら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  ７１：６７５４−６５）。これらの突然変異体ＬＬＯタンパク質は、宿主細胞の細胞質において活性を保持し、従って、宿主に対して細胞障害性である。野生型ＬＬＯ活性を調節する最初の刺激は、ｐＨであり、これは、ファゴサイトリソソームとサイトソルとの間で異なる。通常は、ＬＬＯは、ファゴサイトリソソームの酸性環境において活性であるが、細胞質内で有意に活性を減少する。これは、Ｌｉｓｔｅｒｉａが、複製し、そして細胞間で直接広がることにより隣接する細胞に感染するのに十分な間、感染した宿主細胞中で生き残ることを可能にする。細胞質の中性ｐＨ環境において、突然変異体ＬＬＯタンパク質の活性の増加は、未成熟な宿主細胞の細胞死、そして増強した免疫応答（抗リステリア応答を含む）をもたらす。本明細書に記載されるワクチン組成物の文脈において、突然変異体サイトカイン（例えば、本明細書に記載される代替的なＬＬＯタンパク質）は、ＭＨＣクラスＩ抗原のプロセッシングを促進することによりＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増強する手段として非Ｌｉｓｔｅｒｉａ種において有用であり得る。
【０１５４】
突然変異体ＬＬＯタンパク質も、同様に他の利点を有する。例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｕｍ（ＴＢの誘発因子）は、マクロファージのファゴソームの成熟および酸性化をブロックすることが知られている。この機構は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍがファゴソーム内で生き残ることを可能にする。ＢＣＧが未成熟なファゴソームに局在化されたままであるという事実に起因して、ＢＣＧワクチン接種は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を主に誘導する。マイコバクテリアワクチンによる突然変異体ＬＬＯタンパク質の発現および分泌は、ワクチン株が未成熟なファゴソームから逃れる能力を増強する。なぜならば、突然変異体ＬＬＯタンパク質は、未成熟なファゴソームの中性ｐＨにおいて十分に活性であるからである。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、潜在性感染の再活性化の予防に必須であると考えられていることから（ｖａｎ  Ｐｉｎｘｔｅｒｅｎら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  ３０：３６８９−９８）、これはまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強し、このことはＴＢワクチンについて非常に望ましい。
【０１５５】
従って、いくつかの実施形態において、ワクチン組成物において使用されるか、またはワクチン組成物を調製するために使用される改変された微生物は、突然変異体ＬＬＯタンパク質をコードする異種性発現カセットを含む。
【０１５６】
他のサイトカイン（例えば、ストレプトマイシンおよびパーフリンゴリシンＯ）はまた、ワクチンに対する応答の効力を増強するのに使用され得る。
【０１５７】
（ｄ．発現カセットのコドンの最適化）
異種性核酸を含む改変された微生物中の発現カセットは、必要に応じて、コドンを最適化した配列を含む。例えば、改変された微生物中の異種性発現カセットは、必要に応じて、タンパク質（例えば、抗原またはサイトカイン）をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、上記コード配列は、微生物における発現のためにコドンを最適化されている。必要に応じて、発現カセットはまた、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、上記シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はまた、微生物における発現のためにコドンを最適化されている。いくつかの代替的な実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、微生物における発現のためにコドンを最適化されているが、分泌されるべきタンパク質のコード配列は、そうではない。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される（微生物ベースか、またはＡＰＣベースの）ワクチンにおいて使用される改変された微生物（例えば、細菌）は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む異種性発現カセットを含み、ここで、抗原をコードする配列は、微生物における発現のためにコドンが最適化されている。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるワクチンにおいて使用される改変された微生物（例えば、細菌）は、シグナルペプチドに融合した抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む異種性発現カセットを含み、ここで、シグナルペプチドに融合した抗原をコードする配列は、微生物における発現のためにコドンを最適化されている（すなわち、抗原およびシグナルペプチドの両方のコード配列は、微生物における発現のためにコドンを最適化されている）。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、タンパク質をコードする異種性核酸配列は、タンパク質を発現する微生物宿主（例えば、細菌宿主）のコドンの優先性（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に適合するようにコドンを最適化することができる。さらに、発現したタンパク質に融合するシグナルペプチドをコードする配列はまた、微生物宿主（例えば、細菌宿主）のコドン優先性に対応するようにコドンを最適化することができる。好ましい実施形態において、細菌宿主は、Ｌｉｓｔｅｒｉａであり、異種性タンパク質をコードする配列とシグナルペプチドをコードする配列のどちらか、または両方は、コドンを最適化することができる。細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）における抗原およびシグナル配列のコドンを最適化する場合のさらなる情報については、米国特許出願第６０／５３２，５９８号および同第６０／５５６，７４４号（本明細書中で各々は、参考として援用される）を参照のこと）。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、改変された微生物は、以下：（ａ）微生物に融合したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、ポリヌクレオチドは、微生物における発現のためにコドンを最適化されている；そして（ｂ）外来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む異種性発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットによりコードされるポリペプチドは、上記の抗原であるか、または上記の抗原由来である。いくつかの実施形態において、発現カセットは、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、発現カセットが、外来のポリペプチドおよびシグナルペプチドの両方を含む融合タンパク質を発現するように、プロモーターと作動可能に連結する。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、微生物における発現のために必要に応じてコドンを最適化される。
【０１６２】
従って、本発明において使用される微生物は、以下：（ａ）シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで、第１のポリヌクレオチドは、微生物における発現のためにコドンを最適化されている；（ｂ）ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと同じ翻訳リーディングフレームにある；そして（ｃ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む異種性発現カセットを必要に応じて含み、この発現カセットはシグナルペプチドとポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。
【０１６３】
ポリヌクレオチドのコード配列の少なくとも１つのコドンが、コード配列が発現されるべき生物（「標的生物」）により、その本来のコドンよりもより頻繁に使用されるコドンで置き換えられた場合、コード配列を含むポリヌクレオチドはコドンを最適化されている。例えば、少なくとも１つのコドンが細菌の特定の種において優先的に発現するコドンに置き換えられる場合、細菌の特定の種において発現されるべき非細菌性抗原をコードするポリヌクレオチドは、コドンを最適化されている。別の例として、ポリヌクレオチド配列における少なくとも１つのコドンが、アミノ酸についてその本来のヒト配列で使用されるコドンよりも、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより、より頻繁に使用されるコドンで置き換えられる場合、組み換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの発現カセットの一部であるヒト癌抗原をコードするポリヌクレオチドは、コドンを最適化されている。同様に、ポリヌクレオチド配列における少なくとも１つのコドンが、そのアミノ酸について、本来のＬｉｓｔｅｒｉａ配列においてコドンが使用されるよりも、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより、より頻繁に使用されるコドンで置き換えられる場合、組み換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるヒト癌抗原を含む融合タンパク質をコードする発現カセットの一部であるＬｉｓｉｔｅｒｉａシグナルペプチド（例えば、ＬＬＯシグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、コドンを最適化されている。いくつかの実施形態において、コドンを最適化された配列において置き換えられた少なくとも１つのコドンは、同じアミノ酸についてコードする標的生物により、もっとも頻繁に使用されるコドンで置き換えられる。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、コドンを最適化されたポリヌクレオチドにおける少なくとも約１０％のコドンは、標的生物により、より頻繁に（またはもっとも頻繁に）使用されるコドンで置き換えられている。他の実施形態において、コドンを最適化されたポリヌクレオチドにおける少なくとも約２５％のコドンは、標的生物によりより頻繁に（またはもっとも頻繁に）使用されるコドンで置き換えられている。他の実施形態において、コドンを最適化されたポリヌクレオチドにおける少なくとも約５０％のコドンは、標的生物により、より頻繁に（またはもっとも頻繁に）使用されるコドンで置き換えられている。なお他の実施形態において、コドンを最適化されたポリヌクレオチドにおける少なくとも約７５％のコドンは、標的生物によりより頻繁に（またはもっとも頻繁に）使用されるコドンで置き換えられている。
【０１６５】
コドン使用表は、広範な種々の微生物について、公に利用可能である。例えば、コドン使用表は、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／でインターネット上にて認められ得る。ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／からの例示的なコドン使用表（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓについてのコドン利用表（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｉｓｔｅｒｉａ＋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ＋［ｇｂｂｃｔ］））を、以下の表２Ａにおいて利便性のために複写する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについての例示的なコドン使用表もまた、それぞれ以下の表２Ｂ、表２Ｃに提供する。
【０１６６】
（表２Ａ．（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／からの）Ｌｉｓｔｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓについてのコドン利用表）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：３２６２  ＣＤＳ’ｓ  （１０２９００６コドン））
【０１６７】
【表２Ａ】
2007523879.tif 000004
（表２Ｂ．（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／からの）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓについてのコドン利用表）
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ［ｇｂｂｃｔ］：３１２  ＣＤＳ’ｓ（９００２３コドン））
【０１６８】
【表２Ｂ】
2007523879.tif 000005
（表２Ｃ．（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／からの）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについてのコドン利用表）
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［ｇｂｂｃｔ］：３６３  ＣＤＳ’ｓ（１３１４２６コドン））
【０１６９】
【表２Ｃ】
2007523879.tif 000006
本発明のいくつかの実施形態において、コドンを最適化されたコード配列において、コドンの少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％は、標的生物において使用されるアミノ酸についてもっとも好ましいコドンである。他の実施形態において、コドンを最適化されたコード配列におけるコドンの１００％は、標的生物におけるアミノ酸についてのもっとも好ましいコドンである。例えば、以下に示す実施例４８において、コドンが最適化されたとして特徴付けられた配列の全てのコドンは、標的生物について最適な（もっとも頻繁に使用される）コドンであった。以下の表３は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける各アミノ酸についての最適なコドン利用を示す。
【０１７０】
（表３．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓについての最適なコドン利用表）
【０１７１】
【表３】
2007523879.tif 000007
2007523879.tif 000008
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のために最適化された抗原コード配列コドンの非限定的な例は、以下の実施例４８に示される。
【０１７２】
（Ｅ．  突然変異を含む微生物）
いくつかの実施形態において、本発明の改変された微生物は、１つ以上の突然変異を含む。「突然変異」、または「遺伝子突然変異」は、任意の型の突然変異であり得る。例えば、突然変異は、点突然変異、フレームシフト変異、遺伝子の一部または全体の挿入もしくは欠失を構成し得る。さらに、改変された微生物のいくつかの実施形態において、微生物ゲノムの一部は、異種性ポリヌクレオチドで置き換えられている。いくつかの実施形態において、突然変異は、自然に存在するものである。他の実施形態において、突然変異は、人工的な突然変異圧力（ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の結果である。なお他の実施形態において、微生物ゲノム中の突然変異は、遺伝子操作の結果である。遺伝子「ｘｙｚ」が欠失している突然変異体は、本明細書中で代替的にΔｘｙｚ、またはｘｙｚ、あるいはｘｙｚ欠失と称される。例えば、ｕｖｒＡ遺伝子が欠失している細菌株は、本明細書中で代替的にｕｖｒＡ突然変異体、ΔｕｖｒＡ、またはｕｖｒＡ−と称される。さらに、「ｘｙｚ」突然変異体または「ｘｙｚ」株のような特定の突然変異体または株についての参照は、時折ｘｙｚ遺伝子が欠失している突然変異体または株を指すことが当業者に理解される。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本発明は微生物を含むワクチンを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が抑えられるように改変されており、微生物集団は、依然として、免疫応答を誘導するのに十分な程度まで所望の抗原を発現することができ、かつ微生物は、さらに、少なくとも１つの遺伝子突然変異によって弱毒化される。微生物における突然変異は、微生物の種々の特徴に影響し得る。いくつかの場合において、突然変異は、ある種の細胞に侵入する微生物の能力に影響する。例えば、ある種の細胞内細菌は、細菌に存在する受容体に応じて種々の細胞型を侵入することができる。突然変異は、細菌がある細胞型によって取り込まれるが、他の細胞型によっては取り込まれないように、ある受容体の発現を改変することができる。これの例として、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、典型的には、貪食細胞によって取り込まれ、非貪食細胞（例えば、肝臓細胞）に活動的に侵入する。非貪食細胞の侵入が、貪食細胞による摂取が十分に活性でありつつ有意に低下または排除されるＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異を用いることができる。そのような突然変異は良好な免疫応答を提供することができる。というのは、ワクチンは貪食細胞によって優先的に取り込まれ、これは、免疫系に対して細菌抗原を提示するにおいて重要だからである。突然変異は、ある細胞型に侵入する微生物の能力を弱めるいずれの遺伝子に対するものでもあり得、これはＬｉｓｔｅｒｉａにおけるインターナリン遺伝子（例えば、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ）に対する突然変異が例示される。同様な遺伝子が他の細菌に存在でき（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａのインベーシン遺伝子）、これらの遺伝子における突然変異は本発明に含まれる。突然変異は、ビルレンス因子、または増殖および拡大を可能とする遺伝子のような微生物の他の特徴にインパクトを与え、それにより、微生物のビルレンスを低下させる。例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａのａｃｔＡ遺伝子における突然変異は宿主細胞アクチンの重合において欠損を引き起こし、これは、他の細胞まで拡大するＬｉｓｔｅｒｉａの能力を阻害する。Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｌｇ遺伝子における突然変異（リステリオリシン（ＬＬＯ）タンパク質）は、感染細胞のファゴリソソームから逃げるＬｉｓｔｅｒｉａの能力にインパクトを与える。ＬｉｓｔｅｒｉａのｐｌｃＡまたはｐｌｃＢ遺伝子いずれかにおける突然変異は、細胞間を拡大するＬｉｓｔｅｒｉａの能力にインパクトを与える。Ｙｅｒｓｉｎｉａのｙｏｐ遺伝子における突然変異は、マクロファージによる貪食を妨げるＹｅｒｓｉｎｉａの能力に影響する。もう１つの実施形態において、遺伝子突然変異はある種の抗原、例えば、通常、微生物それ自体に対する免疫応答をもたらすであろう抗原の発現を抑制する。もし微生物を、異種抗原を含むワクチンとして用いて、非突然変異微生物と比較して、送達微生物に対して免疫応答が低下することを除き、異種抗原に対する強力な免疫応答を刺激すれば、そのような突然変異は有用であろう。１つの実施形態において、微生物は、１を超える遺伝子における突然変異によって弱毒化される。１つの実施形態において、突然変異の１つは、Ｌｉ���ｔｅｒｉａのインターナリン遺伝子、または他の細菌における同様な遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、突然変異は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのインターナリン遺伝子または他の細菌における同様な遺伝子の１以上におけるものである。１つの実施形態において、突然変異の１つはａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、微生物は、ａｃｔＡ遺伝子および１以上のインターナリン遺伝子において突然変異を持つＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む。好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子における突然変異を含み、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、（別法として、本明細書中では、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢまたはａｃｔＡ−ｉｎｌＢ−という）ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体を含む。本明細書中に記載されたものを含めた種々のＬｉｓｔｅｒｉａ遺伝子の配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ  ００３２１０に見出すことができる。
【０１７４】
微生物は、その核酸に対する改変を修復する微生物の能力を有意に低下させる突然変異を含むであろう。そのような突然変異は、微生物のＤＮＡ修復メカニズムに関与する種々の遺伝子のいずれかにおけるものであろう。［Ａｒａｖｉｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７（５）：１２２３−１２４２（１９９９）］。その核酸に対する損傷を修復するその能力が欠ける微生物は、本発明の微生物の使用に対して付加されたレベルの安全性および有効性を提供する。適当な修復欠損突然変異体を用い、微生物は核酸改変に対してかなり感受性である。微生物の核酸を程度は低いが改変して、所望の量の増殖の抑制を確認することができる。これは、微生物核酸の発現が所望のタンパク質を生じさせるのに十分なように作動させる効率のより大きなウィンドウを提供する。デ・ノボ抗原発現が必要とされる場合、これは効果的な免疫応答を誘導するワクチンを提供する。また、それは、付加されたレベルの安全性を提供する。というのは、達成された増幅の抑制のレベルは、改変された核酸の修復によって損傷（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）できないからである。もう１つの実施形態において、遺伝子突然変異は、例えば、微生物の化合物に対する浸透性を改変することによって、または微生物核酸に接近し、それに結合する化合物の能力を改変することによって、核酸標的化化合物での処理に対する微生物の感受性を改変する。そのような突然変異は、微生物遺伝子発現を実質的に影響されずして、増殖を抑えるプロセスの効率にインパクトを与えることもできる。
【０１７５】
修復欠損突然変異体を用いる利点を説明すると、微生物増殖の抑制のメカニズムを考えることができる。微生物核酸はストランド破壊またはピリミジンダイマーによって、またはモノアダクトまたは架橋のような化学的改変によって改変される。もしこれらの改変の修復に対するメカニズムが無傷であれば、増殖の十分な抑制を達成するには、ある数の改変が必要であろう。核酸の改変が大きくなれば、タンパク質発現の低下は大きくなる。増殖を減弱するのに必要な改変のレベルはタンパク質発現を停止するのに必要なレベルよりもかなり低いが、タンパク質発現は依然としてある程度まで、恐らくは許容できないレベルまで低下するであろう。修復欠損突然変異体の使用は、より低い改変レベルが増殖の適切な減弱をもたらすように、増殖を減弱するのに必要なレベルを有意に低下させる。核酸改変はかなり低いので、タンパク質の発現はあまり影響されず、注目するタンパク質のより高いレベルの発現を供する。そのような修復欠損突然変異体は、ワクチンの安全性が核酸のわずかな改変によって増加させることができ、十分に高いレベルのタンパク質発現、特に、免疫応答が標的とする抗原を残す場合、微生物それ自体に対するワクチンのようなワクチンの製造で特に有用であろう。
【０１７６】
１つの実施形態において、修復欠損突然変異体は、ピリミジンダイマーを修復するＰｈｒＢ（フォトリアーゼ）を作成する能力を欠く。例えば、突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ遺伝子、または機能的に同等な遺伝子におけるものであろう。そのような突然変異体は、微生物の紫外線照射（例えば、ＵＶＢ、ＵＶＣ）と組み合わせて用いて、微生物核酸においてピリミジンダイマーを生じさせ得る。
【０１７７】
１つの実施形態において、修復欠損突然変異体は、ストランド間架橋を修復することができない。そのような突然変異体は、限定されるものではないが、微生物の属および種に応じて、ｕｖｒ遺伝子、すなわち、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣおよびｕｖｒＤ遺伝子、ならびにｒｅｃＡ遺伝子、または機能的に同等な遺伝子における突然変異を含む。突然変異は１以上のこれらの遺伝子におけるものであろう。これらの突然変異は対応する酵素ＵｖｒＡ（ＡＴＰアーゼ）、ＵｖｒＢ（ヘリカーゼ）、ＵｖｒＣ（ヌクレアーゼ）、ＵｖｒＤ（ヘリカーゼＩＩ）およびＲｅｃＡ（レコンビナーゼ）の活性の減弱をもたらす。これらの突然変異体は、ソラレンのような架橋化合物と組み合わせて用いられるであろう。微生物核酸はいくつかの位置においては架橋され、これらの架橋は修復できないので、微生物は複製することができない。というのは、核酸の元のストランドは分離できないからである。それらは修復できないので、非常に少数の架橋が必要であり、微生物核酸は、大部分は、転写に接近可能であり、タンパク質発現は有意には改変されない。好ましい実施形態においては、ストランド間架橋を修復することができない修復欠損微生物突然変異体の集団は、集団中の実質的に各微生物が少なくとも１つの架橋を含み、従って、複製の抑制が実質的に完全であるように、適切に架橋され、ここで、集団の微生物遺伝子発現は十分に活性である。１つの実施形態において、ｒｅｃＡ遺伝子における突然変異は条件突然変異である。そのような突然変異においては、ｒｅｃＡ遺伝子の突然変異の結果、適当なｐＨまたは微生物集団の温度のようなある条件（すなわち、非許容条件）下でのみｒｅｃＡの活性の減弱がもたらされる。条件ｒｅｃＡ突然変異を含む微生物は許容条件下で培養して、微生物の十分なレベルを増殖させ、次いで、処理に対する非許容条件下において播種し、核酸を改変し、次いで、核酸損傷が適切には修復されないような非許容条件下に貯蔵することができる。この例として、ｒｅｃＡ温度感受性突然変異体は３０℃において増殖され、そこでは、それは良好に増殖し、処理して、４２℃において核酸を改変し、この変異体は、ソラレン架橋のような処理に対して非常にそれが感受性であるように、ｒｅｃＡに対して非許容性である。処理された微生物を非許容性条件下で貯蔵することができるが、ワクチン接種に際して、条件はｒｅｃＡの発現を可能とし、いくつかの修復をもたらし、安全性の論点を提示するのが可能である。増殖が望ましい場合、株の増殖がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導できるように、ｒｅｃＡをｌａｃリプレッサーの制御下にある微生物を構築することが可能である。次いで、株からさらなるＩＰＴＧを控え、および／または株の環境からＩＰＴＧを排除することによって、ｒｅｃＡ発現の可能性を、不活化および／または免疫化工程のために排除することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物において（および／または本発明のワクチン組成物を調製するために）使用される微生物は、１つ以上のＤＮＡ修復酵素（すなわち、核酸修復酵素）を欠損している。いくつかの実施形態において、微生物は、ＤＮＡ修復酵素に関して完全に欠損性である（例えば、ＤＮＡ修復酵素欠失突然変異体および点突然変異を含むいくつかの突然変異体）。いくつかの実施形態において、微生物は、部分的に欠損している（例えば、点突然変異を含むいくつかの突然変異体）。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復酵素を欠損している微生物は、条件突然変異体または抑制突然変異体（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、微生物ベースのワクチンまたは抗原提示細胞ワクチンにおいて使用される改変された微生物（例えば、改変された細菌）は、核酸修復について微生物を弱毒化する突然変異を含む微生物である。いくつかの実施形態において、ワクチンとして使用されるか抗原提示細胞ワクチンにおいて使用される改変された微生物は、ＤＮＡ修復酵素を欠損している。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢを欠損している。いくつかの実施形態において、ｕｖｒＡ遺伝子およびｕｖｒＢ遺伝子は、欠失している。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、ＵｖｒＣを欠損している。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、ＲｅｃＡを欠損している。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢを欠損した改変された細菌（例えば、ｕｖｒＡＢ欠失突然変異体）である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、ＵｖｒＣを欠損した改変された細菌である。いくつかの実施形態において、改変された微生物は、ＲｅｃＡを欠損した改変された細菌である。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、本発明のワクチンにおいてか、または本発明のワクチンのために使用される微生物は、ＲｅｃＡを欠損している。いくつかの実施形態において、ＲｅｃＡを欠損している微生物は、ＲｅｃＡ遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＲｅｃＡを欠損している微生物は、条件付きのｒｅｃＡ突然変異体である。いくつかの実施形態において、ＲｅｃＡを欠損している微生物は、抑制可能なｒｅｃＡ遺伝子を含む。
【０１８１】
１つの実施形態において、ｒｅｃＡ遺伝子における突然変異は条件突然変異である。そのような突然変異においては、ｒｅｃＡ遺伝子の突然変異の結果、適当なｐＨまたは微生物集団の温度のようなある条件（すなわち、非許容条件）下でのみｒｅｃＡの活性の減弱がもたらされる。条件ｒｅｃＡ突然変異を含む微生物は許容条件下で培養して、微生物の十分なレベルを増殖させ、次いで、処理に対する非許容条件下において播種し、核酸を改変し、次いで、核酸損傷が適切には修復されないような非許容条件下に貯蔵することができる。この例として、ｒｅｃＡ温度感受性突然変異体は３０℃において増殖され、そこでは、それは良好に増殖し、処理して、４２℃において核酸を改変し、この変異体は、ソラレン架橋のような処理に対して非常にそれが感受性であるように、ｒｅｃＡに対して非許容性である。
【０１８２】
処理された微生物を非許容性条件下で貯蔵することができるが、ワクチン接種に際して、条件はｒｅｃＡの発現を可能とし、いくつかの修復をもたらし、安全性の論点を提示するのが可能である。増殖が望ましい場合、株の増殖がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導できるように、ｒｅｃＡをｌａｃリプレッサーの制御下にある微生物を構築することが可能であるが、光化学的不活性化の間、または免疫化後では、不可能である。次いで、株からさらなるＩＰＴＧを控え、および／または株の環境からＩＰＴＧを排除することによって、ｒｅｃＡ発現の可能性を、不活化および／または免疫化工程のために排除することができる。
【０１８３】
例えば、本発明のワクチンにおける使用のために、ｌａｃ抑制可能なｒｅｃＡ突然変異体であるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を産生するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノム（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔｕｖｒＡＢ）に、２つの発現カセットが導入される。第１の発現カセットは、高活性な構成的なＬｉｓｔｅｒｉａｐ６０プロモーターの制御下でｌａｃ  Ｉｑタンパク質をコードする。第２のカセットはまた、ｐ６０プロモーターの制御下でＲｅｃＡアンチセンスＲＮＡを発現するが、重要なことには、ｌａｃＯｉｐオペレーターは、その３’末端に配置される。従ってＲｅｃＡアンチセンスＲＮＡの発現は、ｌａｃ  Ｉｑタンパク質の存在下で妨害される。この構成において、ｌａｃ  Ｉｑタンパク質の構成的な発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に起因して、機能性ＲｅｃＡタンパク質は、通常の増殖条件下で産生される。ＩＰＴＧの培地への添加により、ｌａｃ  Ｉｑリプレッサーに対するこの誘導分子の結合、そしてその不活性化をもたらす。これは、ＲｅｃＡアンチセンスＲＮＡの高レベルの合成をもたらし、次にＲｅｃＡメッセージの相補的な結合を媒介して、ＲｅｃＡタンパク質の翻訳を阻害する。発現カセットは、ｐＫＳＶ７組み込みベクター上に構築され得、ｃｏｍＫ−ａｔｔＢＢ’結合におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔｕｖｒＡＢ、またはｐｒｆＡレギュロンの３’末端のｏｒｆＸＹＺの下流に導入される。これらのＬｉｓｔｅｒｉａ遺伝子座の各々は、親株の表現型に影響することなしに異種性発現カセットの組み込みに対して許容性であることを示す。この設定において、ｒｅｃＡの発現は、ＵＶＡ光で照射する前に、ＩＰＴＧの発酵培地への添加により遮断される。
【０１８４】
１つの実施形態において、微生物は、修復メカニズムに関連しない少なくとも１つの突然変異と組合せて、その核酸に対する改変を修復する微生物の能力を弱める（好ましくは、有意に低下させる）少なくとも１つの突然変異を含む。修復メカニズムに関連しない突然変異は、ある細胞に侵入する微生物の能力、増殖および拡大を可能とするビルレンス因子または遺伝子における突然変異、またはある抗原の発現を抑える突然変異のような微生物の種々の特徴に影響し得る。そのような突然変異は前記し、限定されるものではないが、インターナリン遺伝子（例えば、ｉｎｌＢ）、ＬｉｓｔｅｒｉａのａｃｔＡ遺伝子、ｈｌｙ遺伝子、ｐｌｃＡ遺伝子、またはｐｌｃＢ遺伝子、侵入遺伝子（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ）またはＹｅｒｓｉｎｉａのｙｏｐ遺伝子における突然変異を含む。１つの実施形態において、微生物は、ａｃｔＡ遺伝子における突然変異を有するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはａｃｔＡ遺伝子およびインターナリン遺伝子における突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはａｃｔＡ突然変異およびｕｖｒＡＢ突然変異、好ましくは（ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢまたはａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−いずれかということができる）ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはａｃｔＡ突然変異、ｉｎｌＢ突然変異およびｕｖｒＡＢ突然変異、好ましくはａｃｔＡ／ｉｎｌＢ／ｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。いくつかの他の実施形態において、微生物は欠失のようなｕｖｒＡＢ突然変異を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む。
【０１８５】
さらに、ワクチンにおいて使用される微生物は、細胞溶解素をコードする遺伝子において少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態において、この突然変異は、突然変異でない細胞溶解素に対してより活性である細胞溶解素を与える。いくつかの実施形態において、細胞溶解素における突然変異は、宿主細胞の細胞質への、微生物の侵入を促進する。いくつかの実施形態において、細胞溶解素における突然変異は、突然変異体の微生物を含むワクチンに対する免疫応答の能力を増強する。このような突然変異体細胞溶解素の例は、中性ｐＨにおいて天然のタンパク質よりもより活性である突然変異体ＬＬＯである（上記およびＧｌｏｍｓｋｉら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３  ７１：６７５４−６５  （２００３）に記載されている）。
【０１８６】
もう１つの実施形態において、本発明は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のような単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を提供する。いくつかの実施形態において、突然変異体リステリア株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約による規定に基づいて、２００３年１０月３日に１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ２０１１０−２２０９，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ株である。他の実施形態において、株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、微生物（例えば、本明細書中に記載される微生物ベースのワクチンまたはＡＰＣベースのワクチンにおいて使用される微生物）は、改変（すなわち、上記のような核酸に対する改変）された核酸を修復する能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸修復経路により微生物の核酸を修復するその能力は、遺伝子突然変異を抑えていない微生物に対して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％まで遺伝子突然変異をおさえることにより減少される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸修復経路により微生物の核酸を修復するその能力は、遺伝子突然変異を抑えていない微生物に対して少なくとも約２５％まで遺伝子突然変異をおさえることにより減少される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸修復経路により微生物の核酸を修復するその能力は、遺伝子突然変異を抑えていない微生物に対して少なくとも約５０％まで遺伝子突然変異をおさえることにより減少される。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本発明は、（野生型に対して）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物（必要に応じて、野生型ベース、またはＡＰＣベースのワクチンにおいて使用される）を提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある微生物は、野生型に対してＤＮＡ修復について抑制される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復についての微生物の能力は、野生型に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％だけ低下する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸修復経路により微生物の核酸を修復するその能力は、遺伝子変異を抑えることなく、微生物に対して少なくとも約２５％まで低下する。少なくとも１つの核酸修復経路により微生物の核酸を修復するその能力は、遺伝子変異を抑えることなく、微生物に対して少なくとも約５０％まで低下する。ＤＮＡ修復を行う微生物の能力を評価する方法は当業者によく知られている。いくつかの実施形態において、微生物は以下の酵素：ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、およびＲｅｃＡの１以上に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、微生物はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、または双方の酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、微生物はＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、微生物は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物はｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物はｒｅｃＡにおける遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、微生物は細菌である。例えば、いくつかの実施形態においては、微生物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【０１８９】
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む、単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株を提供する。いくつかの実施形態において、突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ｕｖｒＡ遺伝子、ｕｖｒＢ遺伝子、または双方の遺伝子が欠失される。いくつかの実施形態において、突然変異体株はＲｅｃＡに関して減弱される。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株、またはＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある寄託された株の突然変異体である。いくつかの実施形態において、突然変異体微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３により分類されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ株である。
【０１９０】
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む、単離された突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供する。いくつかの実施形態において、突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ｕｖｒＡ遺伝子（配列番号：１８）、ｕｖｒＢ遺伝子（配列番号：１９）、または双方の遺伝子が欠失される。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約による規定に基づいて、２００３年１０月３日に１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ２０１１０−２２０９，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５８２５によって確認されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｔｅｒｎｅ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ株であるか、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢに関して欠損している突然変異体微生物である。いくつかの実施形態において、突然変異体微生物は、２００４年、２月２０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５８２５によって確認されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｔｅｒｎｅ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ株である。いくつかの実施形態において、突然変異体株はＲｅｃＡに関して減弱される。いくつかの実施形態において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、ｒｅｃＡタンパク質の発現を温度感受性とするｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含む。いくつかの別の実施形態において、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの突然変異体株が構築され、それは（ＩＰＴＧによって誘導可能な）ｌａｃリプレッサーの制御下にあり、増殖の間にｒｅｃＡの発現を許容するが、（Ｓ−５９／ＵＶＡを用いて）不活化および／またはポスト免疫化の間にはそうではない。いくつかの実施形態において、突然変異体株は、株の毒性を低下させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または双方の遺伝子における１以上の突然変異を含む。
【０１９１】
本発明のいずれの微生物に関しても、ソラレンでの修復欠損（例えば、ｕｖｒ欠損）細菌のＤＮＡの修復は、化合物の濃度、反応条件および光の量を調整することによって制御することができる。適切な濃度、反応条件および光の量は前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。修復欠損突然変異体の使用は、濃度、反応条件および光の量のパラメーターが、微生物の適当な集団を供するための広い範囲の条件にわたって調節することができるように、適切なタンパク質発現を維持しつつ増殖のさらなるレベルの制御を供する。例えば、増殖を、タンパク質発現に有意に影響することなく完全に阻害することができるよりも高い核酸改変密度（ｄｅｎｓｉｔｙ）のより広い範囲があろう。修復欠損株を完全に阻害するのに必要な改変の最終レベルは、非修復欠損株についてよりもかなり低い（実施例３、７、１１および２１参照）。その結果、改変レベルは（完全な不活化を確認する）増殖を停止するのに必要な最小レベルよりもより高くできるが、依然として、タンパク質発現に有害なレベル未満である。かくして、本発明は非修復欠損株で効果的であるが、ｕｖｒ欠損株は、ワクチンとして効果的であろう微生物の望ましい集団を調製するにおいてより大きな柔軟性を提供する。ソラレン化合物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１００ｐＭ〜１ｍＭ、また約１ｎＭ〜１０μＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約１〜２００ｎＭ、または約１〜１００ｎＭの濃度において効果的であり、ＵＶＡ光の量は約０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２０Ｊ／ｃｍ２、また約０．５〜１０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５〜６Ｊ／ｃｍ２、または約２〜６Ｊ／ｃｍ２の範囲である。１つの実施形態において、微生物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１〜５０００ｎＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約５〜５００ｎＭ、または約１０〜４００ｎＭのソラレン濃度において増殖培地の存在下で処理される。１つの実施形態において、増殖培地の存在下で処理された微生物は、約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１〜５０００ｎＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約５〜５００ｎＭ、また約１０〜４００ｎＭの濃度のソラレンの存在下で０．５〜１のＯＤまで増殖される。０．５〜１のＯＤまでの増殖に続き、微生物集団に約０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２０Ｊ／ｃｍ２、また約０．５〜１０Ｊ／ｃｍ２、０．５〜６Ｊ／ｃｍ２または約２〜６Ｊ／ｃｍ２の範囲の量のＵＶＡ光を照射する。
【０１９２】
いずれかの微生物、特に、ｕｖｒ欠損突然変異体細菌においてソラレン架橋を一次的に生成させるためには、まずソラレンおよびＵＶＡ光を与えてアダクトを形成させ、これに続き、第二の量のＵＶＡ光単独を与えて、モノアダクトのいくらかまたはほとんどを変換して架橋させることができる。ソラレンの光化学は、適当なエネルギーのフォトンの吸収がまずモノアダクトを形成することである。フラン側モノアダクトが適切にＤＮＡ二重らせん中に適切に位置すると、さらなるフォトンの吸収はこのモノアダクトを架橋に変換するであろう［Ｔｅｓｓｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：１６６９−１６７６（１９８５）］。サンプルに所望の濃度のソラレンにてより低いＵＶＡ量を与えることができ、未反応ソラレンは、例えば、細菌の洗浄、透析または限外濾過によって除去することができる。ソラレンアダクト（モノアダクトおよび架橋）を含む細菌は、ＵＶＡ光をさらに与えて、細菌に対して有意なさらなるアダクトをもたらさずして、モノアダクトのいくらかまたはほとんどを架橋に変換することができる。これは、最初の光量での低い数のソラレンアダクトの制御された付加を可能とし、次いで、実質的な数のいずれかのモノアダクトを第二の量にて架橋に変換する。これは十分に低いレベルでの微生物ゲノムの改変を可能とし、そこでは、形成されたアダクトの大部分は架橋である。これは、ｕｖｒ欠損突然変異体で複製をブロックするのに特に効果的である。そのような実施形態において、ソラレン化合物は約１０ｐＭ〜１０ｍＭ、また約１００ｐＭ〜１ｍＭ、また約１〜５００ｎＭ、また約１〜２００ｎＭ、または約１〜１００ｎＭの濃度において効果的であり、ＵＶＡ光の量は約０．１〜１０Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２Ｊ／ｃｍ２、また約０．５〜２Ｊ／ｃｍ２の範囲である。細菌の洗浄、透析または限外濾過による未処理ソラレンのほとんどの除去に続き、細菌には０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１〜２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５〜１０Ｊ／ｃｍ２、または約２〜６Ｊ／ｃｍ２の範囲のＵＶＡ光を与えることができる。
【０１９３】
（Ｄ．処方およびインビボにおける効力）
本明細書中に記載された改変された微生物または抗原提示細胞のいずれかを含む、ワクチン組成物のような、免疫原生組成物を含む薬学的組成物が、提供される。本発明のワクチン組成物は、代表的には、微生物核酸が改変されている微生物を含み、および／または抗原−負荷されており、および／または微生物の増殖が抑えられるように微生物核酸が改変された微生物での感染によって活性化された／成熟化された抗原提示細胞を含み、ここで、前記したように、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物（微生物ベースまたはＡＰＣベース）は、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含む。
【０１９４】
本発明のワクチン組成物を用いて、個体において免疫応答を刺激することができる。処方は、種々の投与経路によって個体に投与することができる。そのようなワクチン組成物の投与方法は当該分野で知られており、経口、鼻孔、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下投与経路を含む。ワクチン組成物は、さらに、アジュバント、Ｔ細胞共刺激分子、または抗ＣＴＬＡ４のような抗体のようなワクチンに対する免疫応答を改良することが当該分野で知られたさらなる成分を含むことができる。また、本発明は、本発明の医薬組成物を含む医薬を含む。そのようなワクチンで処置すべき個体はいずれかの脊椎動物、好ましくは家畜動物、スポーツ（ｓｐｏｒｔ）動物を含めた哺乳動物、およびヒトを含めた霊長類である。ワクチンは予防剤として投与することができ、そこでは、個体をワクチン接種して、特定の疾患に対して個体を免疫化する。ワクチンは、いくらかの状況では、癌ワクチンと一緒のようにいずれかの個体に与えることができるが、処置された個体は、癌を発生する高い危険性がある個体に限定される。また、ワクチンは治療剤として投与することができ、そこでは、特定の疾患を有する個体をワクチン接種して、疾患、または疾患関連タンパク質に対する免疫応答を改良する。この実施形態において、ワクチンは、疾患に関連する物理的症状の軽減をもたらすことができる。例えば、癌ワクチンでは、ワクチン接種の結果、腫瘍の増殖が停止され、好ましくは平均腫瘍容量が減少され、より好ましくはいずれかの腫瘍が排除される。１つの実施形態において、平均腫瘍容量は少なくとも約５％、また約１０％、また約２５％、また約５０％、また約７５％、また約９０％または約１００％だけ減少する。同様に、ワクチン接種の結果、腫瘍の転移が停止され、好ましくは腫瘍転移の数の低下がもたらされる。癌ワクチンのさらなる効果は、個体メジアンの生存の延長であろう。ヒトにおいては、メジアン生存は少なくとも約３ヶ月、また少なくとも約６ヶ月、または少なくとも約１２ヶ月だけ延長される。
【０１９５】
ワクチン処方は当該分野で知られている。公知のワクチン処方物は、キャリア、保存剤、安定化剤、アジュバント、抗生物質および他の物質のような１つ以上の可能な添加剤を含み得る。チメロサールまたは２−フェノキシエタノールのような保存剤を添加し得、特に、多重使用または用量を意図したワクチンバイアルで起こり得る不意の汚染に由来する細菌または真菌の増殖を遅らせ、または停止させる。ラクトースまたはグルタミン酸モノナトリウム（ＭＳＧ）のような安定化剤は、温度変動または凍結乾燥プロセスのような種々の条件に対してワクチン処方を安定化させるのに添加され得る。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアジュバントは、必要に応じてワクチンの能力を増加させて、免疫応答をトリガーし、増強しまたは延長するのに添加される。サイトカイン、ケモカイン、ＣｐＧのような細菌核酸配列のようなさらなる物質も潜在的ワクチンアジュバントである。ネオマイシンおよびストレプトマイシンのような抗生物質は、微生物の潜在的に有害な増殖を妨げるために添加される。また、ワクチンは滅菌された水または生理食塩水のような懸濁流体を含むことができる。また、ワクチンは細胞または細菌タンパク質、（卵中で生産されるワクチンからの）卵タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはトキソイド化プロセスからのホルムアルデヒドのような、製造プロセスからの少量の残存物質も含むことができる。
【０１９６】
改変された微生物ベースのワクチンまたはＡＰＣベースのワクチンは、必要に応じて、生理学的に受容可能なキャリアで宿主に投与される。必要に応じて、ワクチン処方物は、アジュバントをさらに含む。当業者に公知の有用なキャリアとしては、例えば、クエン酸重炭酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、緩衝水、０．４％生理食塩水などが挙げられる。
【０１９７】
改変された微生物を含むワクチン組成物は、必要に応じて凍結乾燥される（すなわち、フリーズドライされる）。凍結乾燥調製物は、投与前に、滅菌溶液（例えば、クエン酸重炭酸緩衝液、緩衝水、０．４％生理食塩水など）と合わせられ得る。
【０１９８】
ワクチンの効率は個体、例えば、マウスで見積もることができる。マウスモデルは、人における効率のためのモデルとして認識されており、本発明のワクチンを評価し、規定するのに有用である。マウスモデルを用いて、いずれかの個体におけるワクチンの有効性に対する潜在能力を示す。特定の疾患に対する予防的または治療的効果いずれかを供するその能力につきワクチンを評価することができる。例えば、感染症の場合には、マウスの集団を所望の量の本発明の適切なワクチンでワクチン接種することができ、ここで、微生物は感染症関連抗原を発現する。この抗原は送達微生物それ自体からのものであり得、あるいは異種抗原であり得る。マウスは、引き続いて、ワクチン抗原に関連する感染剤で感染させることができ、感染に対する保護につき評価することができる。感染症の進行は、（ビヒクルのみ、または適当な抗原を含まない微生物でワクチン接種した、または接種していない）コントロール集団に対して観察することができる。
【０１９９】
癌ワクチンの場合には、腫瘍細胞モデルを利用でき、そこでは、所望の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞系を、所望の腫瘍抗原を含む本発明の微生物でのワクチン接種の前（治療モデル）または後（予防モデル）いずれかのマウスの集団に注入することができる。腫瘍抗原を含む微生物でのワクチン接種は、ワクチン接種されていない、ビヒクルをワクチン接種された、または無関係な抗原を発現する微生物を接種されたコントロール集団と比較することができる。加えて、本発明のワクチンの相対的有効性は、微生物核酸が改変されていない微生物の集団と比較することができる。そのようなモデルにおけるワクチンの有効性は、腫瘍注入後の時間の関数としての腫瘍容量の項目にて、あるいは腫瘍注入後の時間の関数としての生存集団の項目にて見積もることができる（例えば、実施例４）。１つの実施形態において、核酸改変微生物でワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量は、ワクチン接種していないか、またはビヒクル、または無関係な抗原を発現する微生物をワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量よりも約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％または約１００％少ない。もう１つの実施形態において、腫瘍容量におけるこの差は、マウスへの腫瘍の移植から少なくとも約１０日、約１７日、約２４日後に観察される。１つの実施形態において、核酸改変微生物でワクチン接種したマウスにおけるメジアン生存時間は、ワクチン接種されていない、またはビヒクル、または無関係な抗原を発現する微生物でワクチン接種されたマウスにおけるよりも少なくとも約２日、約５日、約７日、または少なくとも約１０日長い。本発明のワクチンに対する効果的な免疫応答に加えて、改変された微生物は、より高い用量の微生物が対応する未改変微生物に対して投与できるように、付加されたレベルの安全性を提供する。本発明の１つの実施形態において、核酸改変微生物でのワクチン接種は、対応する未改変微生物の用量と同一である微生物の用量でなされる。もう１つの実施形態において、核酸改変微生物のワクチン接種は、対応する未改変微生物のワクチン接種用量よりも少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約１０２倍、約１０３倍、または少なくとも約１０４倍高く、ここで、前記した得られた腫瘍容量およびメジアン生存時間は核酸改変微生物で観察される。
【０２００】
微生物ベースの組成物またはＡＰＣベースの組成物の特定の処方物（例えば、ワクチン）のもっとも有効な投薬および投与方法は、個々の被験体、疾患の段階、および当業者に公知の他の要因に基づいて変動する。正確な用量は、処置されるべき患者を考慮して個々の担当医により選択される。
【０２０１】
ＡＰＣベースの適切な投薬量範囲に関する情報は、当業者に知られている。例えば、例示的な投薬量は、限定ではないが、以下の特定の実施例および上記の表題「Ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＡＰＣ）ワクチン」の節を含めて、本明細書全体を通して本明細書に参考として援用されている多くの文献において提供される。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物または抗原提示細胞ワクチンの個々の投薬量は、約１×１０３〜約１×１０１０の抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物または抗原提示細胞ワクチンの個々の投薬量は、約１×１０４〜約１×１０９の抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物または抗原提示細胞ワクチンの個々の投薬量は、約１×１０５〜約１×１０１０の抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物または抗原提示細胞ワクチンの個々の投薬量は、約１×１０６〜約１×１０９の抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物または抗原提示細胞ワクチンの個々の投薬量は、約１×１０７〜約１×１０９の抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、投薬量単位の複数回投与は、１日か、あるいは１週間、１ヶ月、１年または数年にわたってのいずれかが好ましい。いくつかの実施形態において、投薬量単位は、数日の間毎日、または数週間の間週に１回投与される。
【０２０３】
（ＩＩ．  使用方法）
本明細書中に記載された改変された微生物、突然変異体株、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる種々の方法が本発明によって提供される。例えば、免疫応答を誘導し、および／または疾患を処置しまたは予防するための、本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる方法が提供される。ワクチンおよび他の組成物を調製するための、改変された微生物および／または突然変異体株の使用方法も提供される。
【０２０４】
例えば、１つの局面において、本発明は、抗原を発現する自由生活微生物を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物を含む組成物はワクチンである。いくつかの実施形態において、微生物を含む組成物はプロ抗原提示細胞である。抗原は前記した微生物に対して異種または自家性であり得る。いくつかの実施形態において、微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。
【０２０５】
また、本発明は、抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの突然変異体を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。抗原はリステリアまたは非リステリア抗原であり得る。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理による）。
【０２０６】
また、本発明は、抗原を発現するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含み、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓの核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処置による）。
【０２０７】
また、本発明は、自由生活微生物を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されている。いくつかの実施形態において、微生物を含む組成物はワクチンである。いくつかの実施形態において、微生物を含む組成物はプロ抗原提示細胞である。
【０２０８】
また、本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処置による）。いくつかの実施形態において、疾患は感染症である。他の実施形態において、疾患は癌である。
【０２０９】
また、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓの核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処置による）。
【０２１０】
また、本発明は医療用途のための自由生活微生物を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられる、および／または微生物がＤＮＡ修復酵素に関して欠損があるように改変されている。医療用途は（例えば、ワクチンとして使用するための）治療的および予防的医療適用双方を含むと理解される。いくつかの実施形態において、微生物は、微生物が増殖について抑えられるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの実施形態において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【０２１１】
他の実施形態において、本発明は、医療で用いるためのプロ抗原提示細胞を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられる、および／または微生物がＤＮＡ修復酵素に関して欠損があるように改変される。いくつかの実施形態において、微生物は、微生物が増殖について抑えられるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの実施形態において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【０２１２】
また、本発明は、医療で用いられる突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株を提供し、ここで、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。
【０２１３】
加えて、本発明は、医療で用いられる突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供し、ここで、突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。
【０２１４】
本発明は、さらに、無関係な、および／または自由生活微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のための自由生活微生物の使用を提供し、ここで、核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されている。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患は自由生活微生物とは無関係な感染症である。
【０２１５】
本発明は、さらに、無関係な、および／または微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のための自由生活微生物の使用を提供し、ここで、微生物は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患は微生物とは無関係な感染症である。
【０２１６】
本発明はまた、細菌を含有する有効量のワクチンを宿主に投与する工程を包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより細菌は改変されており、その結果、細菌は増殖を抑えられる。この細菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損しており、そしてこの細菌は抗原を発現する（発現した抗原は、細菌に対して異種性であっても、細菌に対して内因性であってもよい）。
【０２１７】
本発明はまた、細菌を含む有効量のワクチンを投与することを包含する、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。ここで、増殖を抑えられるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応により、細菌は改変されており、この細菌は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損しており、そしてこの細菌は、抗原を発現する。
【０２１８】
本発明はまた、抗原提示細胞を含有する有効量のワクチンを投与する工程を包含する、宿主において疾患を予防または処置するための方法を提供する。ここで、抗原提示細胞は細菌を含有し、この細菌はその核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応により改変されており、その結果、細菌は増殖を抑えられ、そしてこの細菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素を欠損している。
【０２１９】
加えて、本発明は、無関係な、および／または自由生活微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のためのプロ抗原提示細胞の使用を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変されており、および／またはここで、微生物は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患は自由生活微生物とは無関係な感染症である。
【０２２０】
本発明は、さらに、無関係な、および／またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって引き起こされない疾患用の医薬の製造のためのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの突然変異体株の使用を提供し、ここで、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとは無関係の感染症である。
【０２２１】
もう１つの局面において、本発明は、ナイーブなＴ細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロ抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを含む、ナイーブなＴ細胞を活性化する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。この方法の接触工程はインビトロまたはインビボいずれかで行うことができる。ナイーブなＴ−細胞を活性化するための適当な条件および十分な時間は当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的な実施例で提供される。
【０２２２】
また、プロ抗原提示細胞に抗原を負荷する方法も提供される。該方法は、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）に負荷するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられ、および／または微生物が少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損があるように改変される。該方法の接触工程はインビトロ、エクスビボまたはインビボで行うことができる。抗原は微生物にとって異種または自家性であり得る。抗原提示細胞に負荷するのに適当な条件および十分な時間は、一般に、当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的な実施例で提供される。
【０２２３】
もう１つの局面において、本発明は、プロ抗原提示細胞を活性化し、および／またはその成熟化をもたらすのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを（インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボで）接触させることを含む、プロ抗原提示細胞を活性化および／または成熟化する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変される。該方法の接触工程はインビトロまたはインビボいずれかで行うことができる。抗原は微生物にとって異種または自家性であり得る。抗原提示細胞を活性化し、および／または抗原提示細胞を成熟化させるための適当な条件および十分な時間は、一般に、当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的実施例で提供される。
【０２２４】
もう１つの局面において、本発明は、以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変され；次いで（ｂ）負荷されたプロ抗原提示細胞を含む有効量の組成物（例えば、薬学的組成物）を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗原は、微生物に対して、異種性である。いくつかの実施形態において抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【０２２５】
さらにもう１つの局面において本発明は以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロ抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変され、次いで、（ｂ）負荷されたプロ抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０２２６】
本発明はまた、以下の工程：（ａ）プロ抗原提示細胞を自由生活微生物に感染させる工程であって、微生物の核酸は、その微生物の増殖が抑えられるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応により改変されている工程、および（ｂ）感染したプロ抗原提示細胞を含む有効量の薬学的組成物を宿主に投与する工程、を包含する宿主において疾患を予防または処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【０２２７】
本発明はまた、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含む有効量のワクチンを宿主に投与することを包含する、宿主において疾患（例えば、癌または感染症）を予防または処置するための方法を提供する。ここで、抗原提示細胞は、増殖を抑えられるようにその核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変されている核酸を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を（例えば、感染されることにより）含む。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【０２２８】
さらに、本発明は、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含む有効量のワクチンを宿主に投与することを包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する（、または再刺激する）方法を提供する。ここで、抗原提示細胞は、増殖が抑えられるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することにより改変されている核酸を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を（例えば、感染されることにより）含む。いくつかの実施形態において、抗原は、微生物に対して、異種性である。いくつかの実施形態において、抗原は、宿主に対して内因性である（例えば、いくつかの実施形態において、改変された微生物は、疾患を引き起こす病原体である）。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【０２２９】
本発明は、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含む有効量のワクチンを宿主に投与する工程を包含する、宿主において疾患（例えば、癌または感染症）を予防または処置する方法を提供する。ここで、抗原提示細胞は、核酸に対する改変を修復する能力を弱める遺伝子突然変異を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を（感染されることにより）含む。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【０２３０】
本発明はまた、プロ抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含む有効量のワクチンを宿主に投与することを包含する、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する（または、再刺激する）方法を提供する。ここで、抗原提示細胞は、核酸に対する改変を修復する能力を弱める遺伝子突然変異を含む自由生活微生物（例えば、細菌）を（感染されることにより）含む。いくつかの実施形態において、抗原は微生物に対して異種性である。いくつかの実施形態において、抗原は、宿主に対して内因性である（例えば、いくつかの実施形態において、改変された微生物は、疾患を引き起こす病原体である）。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、宿主に対して自家性である。
【０２３１】
本明細書中に記載されるワクチン組成物は、インビトロおよびインビボにおいてナイーブなＴ細胞応答をプライムするのに使用され得る。しかし、すでに存在する抗原特異的応答を再刺激し、そして拡大するために、本明細書中に記載されるワクチン組成物使用することもできることが理解される。例えば、特定の状況において、癌患者は、臨床的応答をもたらすように再活性化されるかまたは拡大されるべきである、測定可能なレベルの腫瘍特異的Ｔ細胞を有する。
【０２３２】
本発明は、個体のワクチン接種のような、前記組成物を含む医薬および前記組成物の使用方法を含む。１つの実施形態において、本発明は、ワクチンを個体に投与することを含む本発明のワクチンを使用する方法を含む。１つの実施形態において、ワクチン接種は、経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下よりなる群から選択される経路によるワクチンの投与によって行われる。１つの実施形態において、ワクチンは、それに対してワクチンが標的化される疾患の兆候を有しない個体に対する予防方法を用いて投与される。１つの実施形態において、ワクチンは、それに対してワクチンが標的化される疾患の兆候を有する個体に対する治療方法を用いて投与される。１つの実施形態において、ワクチンは、癌を標的とする腫瘍抗原を含み、治療的ワクチン接種の結果、癌の兆候が低下する。１つの実施形態において、ワクチン接種された個体における平均腫瘍容量は少なくとも約５％、また約１０％、また約２５％、また約５０％、また約７５％、また約９０％、または約１００％だけ減少する。１つの実施形態において、ワクチンは予防的または治療的方法いずれかを用いてマウスに投与され、ここで、マウスは、腫瘍細胞を移植してマウスにおいて腫瘍を樹立することができるモデル系であり、ここで、ワクチンは移植された腫瘍の少なくとも１つの抗原を含む。腫瘍は、ワクチンがマウスに投与される後（予防方法）または前（治療方法）いずれかにマウスに移植される。１つの実施形態において、予防または治療方法いずれかを用いて接種されたマウスにおける平均腫瘍容量は、ワクチン接種されない、または無関係な抗原を発現する同様なワクチンビヒクルを接種した同様なマウス（コントロールマウス）における腫瘍容量よりも小さい。１つの実施形態において、ワクチン接種マウスにおける平均腫瘍容量は、コントロールマウスにおける平均腫瘍容量よりも少なくとも約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％または約１００％低い。１つの実施形態において、予防または治療方法いずれかを用いてワクチン接種されたマウスのメジアン生存時間はコントロールマウスにおけるよりも少なくとも約２日、約５日、約７日または少なくとも約１０日長い。
（ＩＩＩ．  キット）
本発明は、本明細書中に記載される改変された微生物および突然変異体株の各々を含有するキット（または製品）をさらに提供する。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるワクチンを含むキット（または製品）を提供する。
【０２３３】
例えば、１つの局面において、本発明は（ａ）その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変され；および（ｂ）宿主において疾患の予防または処置で組成物を用いるための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、指示書はラベル上にある。他の実施形態において、指示書はキット内に含まれるインサート上にある。
【０２３４】
もう１つの局面において、本発明は、（ａ）その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について抑えられるように改変され；および（ｂ）宿主への組成物の投与のための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、指示書はラベル上にある。他の実施形態において、指示書はキット内に含まれるインサート上にある。
【０２３５】
もう１つの局面において、本発明は、（ａ）その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、その核酸を修復するその能力を弱める遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物がその増殖について抑えられるように改変され；および（ｂ）組成物が投与される宿主を選択するための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、指示書はラベル上にある。他の実施形態において、指示書はキット内に含まれるインサートの上にある。
【０２３６】
前記局面の各々のいくつかの実施形態において、組成物はワクチンである。前記局面の各々のいくつかの実施形態において、組成物はプロ抗原提示細胞である。前記局面の各々のいくつかの実施形態において、自由生活微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの実施形態において、微生物はＳ−５９／ＵＶＡ処理されている。いくつかの実施形態において、微生物はＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。
【実施例】
【０２３７】
（実施例１）
（ＯＶＡ抗原の発現を維持しつつ増殖の抑制を供するＬｉｓｔｅｒｉａ株のソラレン処理）
オボアルブミン、異種ニワトリＯＶＡ抗原を発現するように改変されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのいくつかの株を（４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨによって３ｍＭ溶液として固体から調製されたＳ−５９（Ａｓｈ−Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒｉｖｅｒｖｉｅｕ，ＭＩ）（米国特許第５，３９９，７１９号参照））およびＵＶＡ光（３２０〜４００ｎｍ）と反応させた。得られたＬｉｓｔｅｒｉａをアッセイして、生きたＬｉｓｔｅｒｉａのｌｏｇ力価の低下、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａによるＯＶＡ抗原の発現を評価した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＢｅｒｋｅｌｅｙのＤａｎ  Ｐｏｒｔｎｏｙ博士によって供され、実施例８に記載したようにＯＶＡ抗原を含むように改変した。これらはＤＰ−Ｌ４０５６（野生型）、ＤＰ−Ｌ４０２９（１０４０３Ｓ  ΔａｃｔＡ、ＡｃｔＡ遺伝子におけるファージ治癒欠失突然変異、Ｓｋｏｂｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：５２７−５３７（２０００）およびＬａｕｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８４（１５）：４１７７−４１８６（２００２）参照）、ＤＰ−Ｌ４３６４（１０４０３Ｓ  ΔｌｐｌＡ、ホスホリパーゼＡ遺伝子における欠失突然変異）およびＤＰ−Ｌ４０１７（１０４０３Ｓ  ｈｌｙＬ４６１Ｔ、ヘモリシン遺伝子における点突然変異、Ｇｌｏｍｓｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５６（６）：１０２９−１０３８，（２００２）参照）であった。株を３７℃にて３００ｒｐｍにおいてＢＨＩ培地（ブレイン・ハート・インフュージョン、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで（６００ｎｍにおける０．５の吸光度まで）増殖させた。各株の１．０ｍＬアリコットを二連１５ｍＬ試験管に移した。各試験管を４℃にて２３００×ｇにおいて２０分間遠心し、上清を除去し、Ｓ−５９の有りおよび無しにて、１％ＢＳＡを含む５ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を二連試験管に添加した（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）。Ｓ−５９は１００ｎＭの濃度で添加した。サンプルを６ウェル培養プレート中に入れ、ほぼ２Ｊ／ｃｍ２の量でＵＶＡを照射した（ＦＸ１０１９照射デバイス、Ｂａｘｔｅｒ  Ｆｅｎｗａｌ，Ｒｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ，ＩＬ）。次いで、各サンプルを１５ｍＬ試験管に移し、前記したように遠心し、上清を除去した。これらを５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、遠心し、上清を除去し、最終細菌ペレットを０．５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁させた。各々の１００μＬサンプルを用いて、系列希釈によって細菌の力価を決定した。各希釈をＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）プレート上に平板培養し、３７℃で一晩インキュベートし、コロニーをカウントして、細菌の力価を測定した。
【０２３８】
細菌サンプルの抗原提示はネズミＤＣ２．４細胞系（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの樹状細胞、Ｓｈｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８（６）：２７２３−３０（１９９７）参照）および（Ｓｈａｓｔｒｉ博士，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙから入手した）Ｂ３ＺＴ細胞ハイブリドーマを用いて評価した。Ｂ３Ｚは、ＭＨＣクラスＩ分子という状況ＯＶＡ抗原の認識に際してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するｌａｃＺ誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマである。ＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、β−ガラクトシダーゼに対する基質の代謝を用いて、生産されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを評価し、これは、ＤＣ２．４細胞によって提示されたＯＶＡ抗原の量に直接相関する。ＤＣ２．４細胞およびＢ３Ｚ  Ｔ細胞ハイブリッドを、１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清、ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養基（ＲＰＭＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。ＤＣ２．４細胞を２００μＬアリコットにて、９６ウェル培養プレートのウェルに移した（ウェル当たり１×１０５ＤＣ２．４）。細菌サンプルを５０μＬストックにて系列的に、１×１０５ＣＦＵ／ｍＬまで低下した４５０μＬ  ＰＢＳまで希釈した（Ｓ−５９処理サンプルはＣＦＵ等価物であり、すなわち、それはＳ−５９処理に先立ってのコロニー形成単位の数である）。各希釈の２０μＬを、ＤＣ２．４細胞を含有するウェルに移して、ほぼ１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、または１×１０８ＣＦＵ／ｍＬを得る。加えて、ＰＢＳのみの２０μＬアリコットを陰性コントロールとして添加した。サンプルを５％ＣＯ２中で３７℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄して、細胞外細菌を除去した。Ｂ３Ｚ  Ｔ細胞（１×１０５細胞）の２００μＬアリコットおよび１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。陽性コントロールとして、１００ｎＭ  ＳＬ８  ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＬ８  ＯＶＡ抗原、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号：１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＤＣ２．４およびＢ３Ｚ細胞の各々１×１０５を含有するウェルに添加した。サンプルを５％ＣＯ２中で３７℃にて一晩インキュベートした。プレートを４００×ｇにて３分間遠心し、各ウェルを２５０μＬのＰＢＳで洗浄した。１００μＭの２−メルカプトエタノール、９ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１２５％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（（オクタフェノキシ）ポリエトキシエタノール、Ｓｉｇｍａ）、および０．１５ｍＭのＣＰＲＧを含有するＰＢＳの１００μＬアリコットを各ウェルに添加した。サンプルを３７℃にて少なくとも４時間インキュベートした。プレートリーダーを用い、吸光度を６５５ｎｍにおける参照測定にて５９５ｎｍにて測定した。細菌力価、および未処理に対するＳ−５９処理の抗原提示についての結果を（ＤＣ２．４当たり１００細菌）を表４に掲げる。結果は、ＤＣ２．４当たり添加された１００細菌細胞のレベルでは、抗原提示は未処理サンプルのほぼ５５〜８５％であることを示す。細菌力���はほぼ１０４だけ低下したので、これは、十分な抗原提示がＬｉｓｔｅｒｉａの増殖のかなりの抑制を伴って維持されることを示す。
【０２３９】
（表４  １００ｎＭソラレンＳ−５９および２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ光で処理されたＯＶＡ抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株のｌｏｇ弱毒化および抗原提示）
【０２４０】
【表４】
2007523879.tif 000009
＊ＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント。
【０２４１】
ＤＰ−Ｌ４０５６野生型を用いて同様の手法を行った。細菌を１００、２００、４００、８００または１０００ｎＭ  Ｓ−５９で処理し、残りの力価を決定し、前記で詳細に説明したように抗原提示を測定した。細菌力価および抗原提示（ＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａ）についての結果を表５に示し、図１にプロットする。このデータは、抗原提示が、増殖の完全な阻害（すなわち、検出の限界まで）での抗原の提示を含めた、Ｌｉｓｔｅｒｉａ増殖の広い範囲の抑制につき有意であることを示す。
【０２４２】
（表５  種々の濃度のソラレンＳ−５９および２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ光で処理したＯＶＡ抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６のｌｏｇ弱毒化および抗原提示）
【０２４３】
【表５】
2007523879.tif 000010
＊ＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント。
【０２４４】
（実施例２）
（ＯＶＡ抗原の発現を維持しつつ増殖の抑制を供するＬｉｓｔｅｒｉａ株のＤＮＡ標的化アルキル化剤処理）
化合物β−アラニン，（Ｎ−アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（化合物１、ＣｈｅｍＳｙｎ，Ｈａｒｒｉｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＭＯ，米国特許第６，０９３，７２５号）のみを用い、手法は実施例１と同様に行った。用いたＬｉｓｔｅｒｉａ株はＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０１７であった。化合物１（酸性ＢＢＳ（血液バンク生理食塩水）中１ｍＭ、１００ｍＬ  ＢＢＳ当たり１．４８Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の１３５μｌ）を、０、０．５、１、２、５および１０μＭの濃度まで、１×１０８ＣＦＵ／ｍＬにおける５ｍＬの細菌に添加し、サンプルを室温にて２時間インキュベートした。インキュベーションの後、細菌力価および抗原提示を実施例１におけるように評価した。抗原提示では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、または１×１０７ＣＦＵ／ｍＬまで希釈した。ｌｏｇ力価、ｌｏｇ抑制、および化合物１の濃度の関数としての未処理（ＤＣ２．４当たり１のＬｉｓｔｅｒｉａ）のパーセントとしての抗原提示を表６および図２Ａ、Ｂに掲げる。結果は、化合物１が、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖のかなりの抑制でもって、十分な抗原提示を供するにおいて、例えば１μＭでやはり効果的である。
【０２４５】
（表６  種々の濃度の化合物１で処理されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のｌｏｇ弱毒化および抗原提示）
【０２４６】
【表６】
2007523879.tif 000011
＊ＤＣ２．４細胞当たり１Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント。
【０２４７】
（実施例３）
（ｕｖｒＡＢ突然変異体−対−野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのソラレン処理による増殖の抑制の比較）
核酸損傷を修復する能力に欠損がある突然変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のソラレン処理を野生型株と比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７（野生型）およびＣＳＲ６０３（Ａｚｉｚ  Ｓａｍｃａｒ博士，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ｃａｒｏｌｉｎａから得られたｕｖｒＡ、ｒｅｃＡ、ｐｈｒ突然変異体、Ｈａｒｍ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：２６３−２７０（１９７９）参照）。この実施例は、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカーにて３７℃で一晩、ストレプトマイシンを含む３ｍＬのＬＢ培地で増殖させたＡＢ１１５７−対−突然変異体ＣＳＲ６０３の弱毒化を比較する。この２ｍＬアリコットを３０℃の１００ｍＬのＬＢ培地に添加し、６００ｎｍにおける吸光度が０．９ＯＤ、ほぼ１×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるまでほぼ５時間シェーカー上に置いた。各株では、ほぼ０．５ｍＬの細菌ストックを１５ｍＬ試験管に加え、２３００×ｇにおいて４℃にて２０分間遠心した。上清を除去し、各ペレットを、０、１、１０、１００および１０００ｎＭのソラレンＳ−５９を含有する５ｍＬのＰＢＳに懸濁させた。各サンプルを６ウェル培養プレートに移し、実施例１におけるように照射した。実施例１におけるように、サンプルを系列希釈し、力価を測定した。結果を表７および図３に示す。結果は、ｕｖｒＡＢＣ突然変異体のソラレン処理が、与えられたソラレン濃度では細菌の増殖のより大きな抑制がもたらされる（より低い力価が残存）ことを示す。
【０２４８】
（表７  ソラレン処理でのＥ  ｃｏｌｉ野生型−対−ｕｖｒ−ＡＢＣ突然変異体の弱毒化）
【０２４９】
【表７】
2007523879.tif 000012
（実施例４）
（Ｓ−５９処理の有りおよび無しでの、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を用いるマウスの治療的ワクチン接種）
ワクチンとしてのＳ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａの有用性を評価するために、Ｃ５７Ｂ１／６マウスメラノーマ腫瘍モデルを用いた。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）の毛を剃り、１００μＬのＨＢＳＳ中の２×１０５Ｂ１６．Ｆ１０．Ｍｏ５２０．１０細胞（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｒｏｃｋ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓｕｃｈｅｓｅｔｔｓから得られたＢ１６−ＯＶＡ発現メラノーマ細胞、Ｍａｎｄｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：８２１６（１９９８）参照）で皮下移植した。ＯＶＡ抗原を含有するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０１７をＳ−５９処理（実施例１のような量の２０ｎＭ  Ｓ−５９ＵＶＡ）の有りまたは無しにて調製した。加えて、ＯＶＡ抗原無しの野生型ＤＰ−Ｌ４０５６をコントロールとして用いた。Ｓ−５９処理サンプルのｌｏｇ力価を測定して、ソラレン処理によるｌｏｇ抑制を評価した（表８）。ＬｉｓｔｅｒｉａをＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩培地、Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させ、１０〜１２匹のマウスの群を、各株の１００μＬ腹腔内注射で３回ワクチン接種し、ならびにある群をＨＢＳＳビヒクルで注射した。種々の株に対するワクチン接種量（ワクチン接種当たりの合計ＣＦＵ）を表８に示す。量は非Ｓ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａに対する０．１  ＬＤ５０、およびＳ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａに対する最大可能量に対応した。ワクチン接種は腫瘍移植から３、１０および１７日に行った。マウスを触知可能腫瘍につき観察した。一旦観察されれば、腫瘍の対向直径を一週間に２回測定した。もし腫瘍がいずれかの方向で２０ｍｍに測定されれば、マウスを犠牲にした。Ｂ１６−ＯＶＡ移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を図４および表８に示す。群当たりのマウスのパーセント生存を図５にプロットし、メジアン生存を表９に掲げる。本実施例は、高い量のＳ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ株がマウスに安全に投与することができ、良好な抗腫瘍応答をもたらすことを示す。
【０２５０】
（表８  Ｂ１６−ＯＶＡを移植し、かつ同定されたＬｉｓｔｅｒｉａ株をワクチン接種したマウスについての移植後日数における腫瘍容量）
【０２５１】
【表８】
2007523879.tif 000013
（表９  ２０ｎＭ  Ｓ−５９処理（２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）の有りおよび無しでの、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株についてのワクチン接種量およびメジアン生存）
【０２５２】
【表９】
2007523879.tif 000014
＊値は３つの製剤の平均である。
【０２５３】
（実施例５）
（ワクチン接種後における抗原特異的免疫応答の評価）
種々のインビトロおよびインビボ方法を用い、本発明のワクチンを評価することができる。これらの方法をＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンを用いて例示するが、これを用いて、本発明のいずれかの微生物ベースのワクチンの優れた効率を見積もることができる。
【０２５４】
いくつかのアッセイは、ワクチン接種されたマウスの脾臓からの抗原特異的Ｔ細胞の分析を含む。Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ株でワクチン接種し（例えば、０．１ＬＤ５０の腹腔内注射）、ここで、Ｌｉｓｔｅｒｉａを処理して増殖を抑えることができる（例えば、Ｓ−５９処理）。ワクチン接種から７日後に、脾臓を氷冷ＲＰＭＩ１６４０培地に入れ、これから単一細胞懸濁液を調製することによって、マウスの脾臓細胞を収集した（典型的には、群当たり３匹のマウス）。別法として、マウスのリンパ節を同様に収集し、単一細胞懸濁液として調製し、後に記載するアッセイにおいて脾臓細胞を置き換えた。典型的には、脾臓細胞をワクチンの静脈内または腹腔内投与につき評価し、他方、脾臓細胞およびリンパ節からの細胞をワクチンの筋肉内、皮下または皮内投与につき評価する。
【０２５５】
特に断りのない限り、本実施例で用いた全ての抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得ることができる。
【０２５６】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＯＶＡ抗原を有するＬｉｓｔｅｒｉａ株を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用い、マウスモデルにおいて免疫化に際して生じた抗原特異的Ｔ細胞の定量的頻度につき評価する。評価した抗原特異的Ｔ細胞はＯＶＡ特異的ＣＤ８＋またはＬＬＯ特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。このＯＶＡ抗原モデルはワクチンに挿入された異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、注目するいずれかの抗原で置き換えることができよう。ＬＬＯ抗原はＬｉｓｔｅｒｉａに対して特異的であり、ワクチンビヒクルとして用いられるいずれかの微生物ベクターのための適当な抗原に代えて置き換えることができよう。特異的Ｔ細胞は、特異的抗原の認識に際してサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γ）の検出によって評価される。ＰＶＤＦベースの９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を抗ネズミＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ｒ４；５μｇ／ｍＬ）で４℃にて一晩被覆する。プレートを洗浄し、２００μＬの完全なＲＰＭＩで室温にて２時間ブロックする。ワクチン接種したマウス（または非ワクチン接種コントロールマウスからの脾臓細胞をウェル当たり２×１０５細胞にて添加し、約０．０１〜１０μＭの範囲の種々の濃度のペプチドの存在下にて３７℃にて２０〜２２時間インキュベートする。用いたペプチドはＳＬ８、ＯＶＡ、ＬＬＯ１９０（ＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳ、配列番号：２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についてのＭＨＣクラスＩエピトープ、リステリオリシンＯ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗原）、またはＬＬＯ２９６（ＶＡＹＧＲＱＶＹＬ、配列番号：３）についてのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、リステリオリシンＯについてのＭＨＣクラスＩエピトープいずれかであった。洗浄の後、プレートを、ＰＢＳ中に０．５μｇ／ｍＬ中に希釈したＩＦＮ−γに対して特異的な二次ビオチニル化抗体（ＸＭＧ１．２）とともにインキュベートする。室温での２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した１ｎｍ金ヤギ抗ビオチンコンジュゲート（ＧＡＢ−１；  １：２００希釈；Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）とともに３７℃にて１時間インキュベートする。徹底的な洗浄の後、プレートを、スポット発生のための基質（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；  ３０μＬ／ウェル；  Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）とともに室温にて２〜１０分間インキュベートする。次いで、プレートを蒸留水で濯いで、基質反応を停止させる。プレートを風乾した後、各ウェル中のスポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＣＴＬ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いてカウントする。サイトカイン応答は、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞またはＬｉｓｔｅｒｉａ特異的Ｔ細胞いずれかにつき、１０６脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット−形成細胞（ＳＦＣ）の数として表す。
【０２５７】
（細胞内サイトカイン染色アッセイ（ＩＣＳ））
抗原特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の数をさらに評価し、結果をＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られたのと相関付けるために、ＩＣＳを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。マウスのワクチン接種した、およびコントロール群からの脾臓細胞を、ブレフェルジンＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＳＬ８（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞を刺激）またはＬＬＯ１９０（ＬＬＯ特異的ＣＤ４＋細胞を刺激）とともに５時間インキュベートする。ブレフェルジンＡは、Ｔ細胞の刺激に際して生じたサイトカインの分泌を阻害する。無関係なＭＨＣクラスＩペプチドとともにインキュベートした脾臓細胞をコントロールとして用いる。ＰＭＡ（フォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート，Ｓｉｇｍａ）２０ｎｇ／ｍＬおよびイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）２μｇ／ｍＬ刺激脾臓細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α細胞内サイトカイン染色についての陽性コントロールとして用いる。細胞質サイトカイン発現の検出では、細胞をＦＩＴＣ−抗ＣＤ４  ｍＡｂ（ＲＭ４−５）およびＰｅｒＣＰ−抗ＣＤ８  ｍＡｂ（５３−６．７）で染色し、固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で浸透性化し、氷上で、ＰＥ−コンジュゲーテッド抗ＴＮＦ−α  ｍＡｂ（ＭＰ６−ＸＴ２２）およびＡＴＣ−コンジュゲーテッド抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（ＸＭＧ１．２）で３０分間染色する。細胞内ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを発現する細胞のパーセンテージはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって決定し、データは、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分析する。種々の抗体上の蛍光ラベルは全てＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって区別できるので、適当な細胞は、抗ＩＦＮ−γまたは抗ＴＮＦ−αのいずれかまたは双方で染色されるＣＤ８＋およびＣＤ４＋につきゲーティングすることによって同定される。また、このモデルを用いて微生物ワクチンの免疫原性を決定することもでき、ここで、樹状細胞集団、またはマクロファージ集団のようなもう１つの抗原提示細胞は微生物ベクターとともにインキュベートされる。得られた抗原提示細胞はマウスの足に注入され、リンパ節からの細胞集団を前記したようにＴ細胞につき評価される。
【０２５８】
（刺激された脾臓細胞のサイトカイン発現）
マウスの脾臓細胞によるサイトカイン分泌のレベルもまた、コントロールおよびワクチン接種Ｃ５７Ｂ１／６マウスにつき評価することができる。脾臓細胞はＳＬ８またはＬＬＯ１９０で２４時間刺激する。無関係なペプチドＨＳＶ−ｇＢ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳＳＩＥＦ  ＡＲＬ、配列番号：４）での刺激をコントロールとして用いる。刺激された細胞の上清を収集し、ヘルパー−１およびＴヘルパー−２サイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＯ）またはＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて決定する。
【０２５９】
（細胞傷害性Ｔ細胞活性の評価）
インビトロにて、またはインビボでＣ５７Ｂ１／６マウスにて直接的に、その細胞傷害性活性を評価することによって、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに評価することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、その各標的細胞を抗原特異的に認識し、溶解させる。インビトロ細胞傷害性は、クロム放出アッセイを用いて決定される。ナイーブおよびＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ（内部）ワクチン接種マウスの脾臓細胞を、照射されたＥＧ７．ＯＶＡ細胞（ＯＶＡを発現するようにトランスフェクトされたＥＬ−４腫瘍細胞系、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で、または１００ｎＭ  ＳＬ８いずれかで１０：１比率にて刺激して、脾臓細胞集団中のＯＶＡ特異的Ｔ細胞を拡大させる。培養から７日後に、エフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞としてのＥＧ７．ＯＶＡまたはＳＬ８パルスドＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）および陰性コントロールとしてのＥＬ−４細胞単独を用い、標準的な４時間５１Ｃｒ−放出アッセイで決定する。ＹＡＣ−１細胞系（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を標的として用いて、ＮＫ細胞活性を測定して、Ｔ細胞による活性をＮＫ細胞による活性から区別する。特異的細胞傷害性のパーセンテージは１００×（実験的放出−自然発生的放出）／（最大放出−自然発生的放出）として計算される。自然発生的放出は、エフェクター細胞無くして標的細胞のインキュベーションによって決定される。最大放出は、０．１％トリトンＸ−１００で細胞を溶解することによって決定される。実験は、もし自然発生的放出が最大放出の＞２０％であれば分析につき有効であると考えられる。
【０２６０】
インビボでのＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性の評価では、ナイーブなＣ５７Ｂ１／６マウスからの脾臓細胞を２つの同等なアリコットに分割する。各群を３７℃にて９０分間、０．５μｇ／ｍＬにおいて、特異的ペプチド、標的（ＳＬ８）またはコントロール（ＨＳＶ−ｇＢ２）いずれかでパルスする。次いで、細胞を培地中で３回、およびＴＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄した。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識するために、細胞を温ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（１０ｍＬ以下）にｍＬ当たり１×１０７にて再懸濁する。標的細胞懸濁液に、１．２５μＬのＣＦＳＥの５ｍＭストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合する。コントロール細胞懸濁液に、ＣＦＳＥストックの１０倍希釈物を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合する。細胞を３７℃にて１０分間インキュベートする。大容量（＞４０ｍＬ）の氷冷ＰＢＳの添加によって染色を停止する。細胞を室温にてＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントする。各細胞懸濁液をｍＬ当たり５０×１０６まで希釈し、１００μＬの各集団を混合し、ナイーブまたはワクチン接種マウスいずれかの尾静脈を介して注射する。１２〜２４時間後、脾臓を収集し、フローサイトメトリーによって５×１０６細胞を分析する。高（標的）および低（コントロール）蛍光ピークを数え、２つの比率を用いて、標的細胞溶解のパーセンテージを確立する。インビボ細胞障害性アッセイは、インビトロ再刺激の必要性なくして抗原特異的Ｔ細胞の溶解活性の評価を可能とする。さらに、このアッセイはその天然環境におけるＴ細胞の機能を評価する。
【０２６１】
（実施例６）
（Ｓ−５９処理の有りおよび無しにての、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳ分析）
ＯＶＡ抗原の有りまたは無しにてＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６をＳ−５９処理の有りまたは無しにて調製し、それを用いて、投与が静脈内であったことを除いて実施例４と同様にＣ５７Ｂ１／６マウスをワクチン接種した（同様にＨＢＳＳコントロール）。ワクチン接種は、表８および９に示した用量にてナイーブなマウスに対して行った。ワクチン接種から１２日後に脾臓を収集した。脾臓を、実施例５におけるようにＩＣＳおよびＥＳＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。加えて、ＬＤ５０をこれらのＬｉｓｔｅｒｉａにつき評価した。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ双方につき陽性の細胞のパーセントの項目にて、ＬＬＯ１９０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞双方についてのＩＣＳアッセイ結果を表１０および図６Ａ、Ｂに掲げる。２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γＳＦＣの項目にて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを表１１および図７に掲げる。これらの結果は、ＯＶＡを持つＳ−５９処理サンプルは、非Ｓ−５９処理サンプルの１００倍過剰で投与した場合にＯＶＡ特異的応答を刺激することを示す。陽性ＯＶＡ特異的応答はより低い用量では観察されないが、これは、依然として、Ｓ−５９処理サンプルが４ｌｏｇだけ抑制されるにつれて増大した安全性の余地を提供する。加えて、ＬＣ５０は未処理サンプルに対してＳ−５９処理につき１０３倍高く、これは、１００倍高いレベルにおける投与でさえ、未処理Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して安全性の１０倍レベルがあることを示す。
【０２６２】
（表１０  Ｓ−５９処理の有りまたは無しにての、ＯＶＡと共にまたはそれなくして、ＤＰ−Ｌ４０５６でワクチン接種したマウスに対するＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ陽性双方である脾臓細胞のパーセント）
【０２６３】
【表１０】
2007523879.tif 000015
（表１１  Ｓ−５９処理の有りまたは無しにての、ＯＶＡと共にまたはそれなくして、ＤＰ−Ｌ４０５６でワクチン接種したマウスに対する１０６脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γＳＦＣ）
【０２６４】
【表１１】
2007523879.tif 000016
（実施例７）
（対立遺伝子交換によるＬｉｓｔｅｒｉａからのｕｖｒＡＢの欠失についてのｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢの構築）
ソラレンおよびＵＶＡ光での処理によって誘導されたＤＮＡに対する損傷を修復することができないＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異体株を、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける紫外線抵抗性（ｕｖｒ）ＡＢ遺伝子（ＵＶＲＡＢ）を実質的に欠失することによって作り出した。これらの突然変異体はＤＮＡ修復突然変異体、あるいはヌクレオチド切出修復（ＮＥＲ）突然変異体として知られている。ＬｉｓｔｅｒｉａからのｕｖｒＡＢの欠失は対立遺伝子交換によって達成された［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３）］。ｕｖｒＡＢはいずれかのＬｉｓｔｅｒｉａ株から欠失することができる例として、表１２に示すＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株からｕｖｒＡＢを欠失させた。
【０２６５】
（表１２  対立遺伝子交換によるｕｖｒＡＢの欠失で用いる親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株）
【０２６６】
【表１２】
2007523879.tif 000017
ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、およびＵＶおよび他の剤によって与えられたＤＮＡ損傷の他の細菌株においてヌクレオチド−切出修復（ＮＥＲ）で必要なＡＢＣエクシヌクレアーゼ複合体の３つのタンパク質のうち２つをコードする。ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子はＬｉｓｔｅｒｉａゲノム中に同一オペロンを含み、かくして、表１２に示すＬｉｓｔｅｒｉａ株において一緒に欠失させた。ｕｖｒＡＢ遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｎｔｓ、２５６２５４７〜２５６５４６１（配列番号：５）からマップされ、およびｕｖｒＢ遺伝子はＬｉｓｔｅｒｉａｎｔｓ、２５６５４６９〜２５６７４５９（配列番号：６）からマップされる［Ｇｌａｓｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８４９−８５２‘２００１］。対立遺伝子交換によってｕｖｒＡＢを欠失させるために、ｕｖｒＡＢの、各々、ほぼ９００塩基対（ｂｐｓ）上流および下流である順方向および逆方向プライマーを用い、ｕｖｒＡＢ遺伝子をまずＰＣＲによって増幅させた。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢアンプリコンは、ＰＣＲプライマーＬｍ−２５６１６７７Ｆ（配列番号：７）およびＬｍ−２５６８３３０Ｒ（配列番号：８）および鋳型としてのＤＰ−Ｌ４０５６を用いて作り出し、これは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｔｓ．２５６１６７７−２５６８３３０（配列番号：９）を含む６６５４塩基対長であった。Ｌｉｓｔｅｒｉａ野生型株ＤＰ−Ｌ４０５６をブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス・（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）中で３０℃にて一晩培養し、（３ｍｌの一晩の培養の遠心、細菌ペレットの５ｍｌのＰＢＳ中への再懸濁、再遠心、および続いてのＬｉｓｔｅｒｉａペレットの１ｍｌのＰＢＳ中への最終再懸濁によって調製された）１０μＬの洗浄された細菌懸濁液を、供給業者の推奨に従い、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液およびＭｇＳＯ４と共に、各々０．２μＭのＬｍ−２５６１６７７ＦおよびＬｍ−２５６８３３０Ｒプライマー、２μＬのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する１００μＬの最終用量を有するＰＣＲ反応に添加した。成功したＰＣＲは、臭化エチジウムでの染色、およびＵＶ光での照射による可視化に続いて、区別される６６５４ｂｐバンドの存在によって示されるように、ＴＡＥ緩衝液中の０．８％アガロースゲル電気泳動によって確認された。アンプリコン生成物は、５０μＬの最終容量の中のＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ反応から精製された。引き続いて、連結混合物中の５μＬの精製されたｕｖｒＡＢアンプリコンを用い、アンプリコンをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｖｒＡＢプラスミドの正しい構築は、ＢｓｒＦＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化、引き続いての１％アガロース／ＴＡＥ電気泳動によって示され、４６１２、１３８８、１０９４、１８１、８８６および２４２４塩基対の断片を生じた。
【０２６７】
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｖｒＡＢプラスミドを引き続いて用いて、対立遺伝子交換用のプラスミドを作成し、そこでは、ｕｖｒＡＢのｎｔｓ２５６２７０９〜２５６７３２０（４６１２ｂｐｓ）が欠失された。組換えプラスミド構築のための全ての制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。ｕｖｒＡＢ配列の欠失を達成するために、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ／ｕｖｒＡＢプラスミドの１つのアリコット（ほぼ２μｇ）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｒＦＩ、およびＢｇｌＩＩで消化し、１０９２塩基対断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。平行して、第２のアリコット（ほぼ２μｇ）をＸｈｏＩ、ＢｓｒＦＩ、およびＢｇｌＩＩ酵素で消化し、１０５０塩基対断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。適合するＢｓｒＦＩ末端を含有する２つの１０９２ｂｐおよび１０５０ｂｐ断片を一緒に連結し、２１４２ｂｐ連結生成物をＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いて精製した。２１４２ｂｐ連結生成物の１つの部分をＰｓｔＩで消化し、１４８６ｂｐ断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。２１４２ｂｐ連結生成物の第２の部分をＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化し、６２２ｐ断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。対立遺伝子交換のための親プラスミドベクター、ｐＫＳＶ７［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３）］をＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ適合末端を有する６２２ｂｐ断片をｐＫＳＶ７プラスミドベクターに挿入して、ｐＫＳＶ７−Ｋ／Ｐ−３３８に挿入した。引き続いて、ＰｓｔＩ適合末端を有する１４８６ｂｐ断片を、ＰｓｔＩで消化し、ＣＩＡＰで処理したベクター構築体ｐＫＳＶ７−Ｋ／Ｐ−３３８に挿入した。正しい向きでの１４８６ｂｐ構築体での挿入は、１２５３ｂｐ、８６５ｂｐ、および６．９ｋｂの断片サイズを生じるＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって決定した。このプラスミド構築体はｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢとして知られている。ｐＫＳＶ７組変えプラスミドのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢ部分を配列決定して、Ｌｉｓｔｅｒｉａ配列の忠実度およびｎｔｓ．２５６２７０９〜２５６７３２０のｕｖｒＡＢ遺伝子における正しい欠失を確認した（ｕｖｒコーオーディネートｎｔｓ．２５６２５４７〜２５６７４５９からの欠失）。欠失された領域は配列番号：１０であり、残りのアンプリコン配列は配列番号：１１である。
【０２６８】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９のｕｖｒＡＢ遺伝子（表１２）は、従前に記載されているようにプラスミドｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢを用いる対立遺伝子交換によって欠失した（Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３））。プラスミドｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢは、エレクトロポレーションによって、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９に導入された。まず、３７℃にて振盪しつつ、ＢＨＩ中の単離された細菌コロニーからの１０ｍＬ一晩培養物を増殖させることによって、エレクトロポレーションに対してコンピテントとした。次いで、各株のｌｏｇ期培養は、２ｍＬの一晩培養物を２５０ｍＬフラスコ中の１００ｍＬ  ０．５Ｍスクロース／ＢＨＩ（滅菌濾過したもの）中に接種することによって誘導した。培養は、ＯＤ６００＝０．２の細菌密度に達するまで、３７℃にて２〜３時間振盪することによって中期ｌｏｇ期まで増殖させた。引き続いて、培養を処理して、スフェロプラストとして知られたペプチドグリカン細胞壁を欠く細菌を作成した。１００ｕＬのペニシリンＧストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ，滅菌濾過したもの）を中期ｌｏｇ期培養に添加し、続いて、３７℃にて２時間振盪した。スフェロプラスト培養を１００ｍＬ遠心瓶中でペレット化し、４５ｍＬの氷冷ＨＥＰＥＳ／スクロースストック溶液（１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／０．５Ｍスクロース、滅菌濾過したもの）で再懸濁し、遠心によって再度ペレット化した。細菌ペレットを２０ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロースで再懸濁し、４０ｍＬ遠心管に移し、ペレット化し、１０ｍＬ  ＨＥＰＥＳ／スクロースに再懸濁した。次いで、１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬリソソームストックを細菌溶液に加え、徹底的に混合し、振盪することなく培養を３７℃にて１５分間インキュベートしたが、５分間隔で２回軽く倒立させた。次いで、リソソーム−処理培養を５０００ｒｐｍ（３０００×ｇ）において４℃にて１０分間遠心し、１０ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロースに再懸濁させた；各回注意深くかつ徹底的に再懸濁させて、このプロセスを２回反復した。エレクトロコンピテントＬｉｓｔｅｒｉａを得るための最終工程は、細菌ペレットを５００μＬのＨＥＰＥＳ／スクロースに再懸濁させることであった。
【０２６９】
エレクトロポレーションでは、２μｇのｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡを１０μＬのＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９エレクトロコンピテントＬｉｓｔｅｒｉａに加え、溶液を０．１ｃｍのキュベットに加えた。キュベットを、１ＫＶ、４００オーム、２５μＦＤに設定されたエレクトロポレーションデバイスに入れ、次いで、パルスを与えた。これは、典型的には、約５ミリ秒の時定数をもたらした。細胞を直ちに１ｍＬ  ＢＨＩ／スクロース培地に加え、これを３０℃まで予め温め、次いで、振盪しつつ３０℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション時間に続き、細菌をペレット化し、２００ｍｌのＢＨＩブロスに再懸濁し、懸濁液を、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ＢＨＩ／ｃｍ１０）を含有するＢＨＩ−寒天上で平板培養した。次いで、プレートを３０℃にて一晩インキュベートし、その後、ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミド形質転換体に対応するコロニーが目に見えた。プアスミドｐＫＳＶ７は温度−感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａレプリコンを含み、次いで、プレートを３０℃にてインキュベートして、クロラムフェニコール／抵抗性コロニーを可視化しなければならない。
【０２７０】
ｕｖｒＡＢ中に４６１２ｂｐ欠失を含むｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドでのエレクトロポレーションによって形質転換されたＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９中での天然ｕｖｒＡＢ遺伝子の対立遺伝子交換は、従前に記載されているように、プラスミド取り込み、続いての（天然ｕｖｒＡＢを含めた）プラスミド切出および治癒よりなる２工程で達成された［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３）］。ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションしたＬｉｓｔｅｒｉａ  株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９の各々から得られた２つの単離されたクロラムフェニコール−抵抗性コロニーを選択し、次いで、各々の選択されたコロニーを新鮮なＢＨＩ／ＣＭ１０プレート上で画線培養し、３０℃にて一晩インキュベートした。翌日、コロニーを各プレートから選択し、これを用いて、２５０ｍＬフラスコ中に含有された１０ｍＬのＢＨＩ／ＣＭ１０を接種し、次いで、これを振盪しつつ３０℃にて一晩インキュベートした。次いで、一晩培養物の各々の１０μＬを用いて、１０ｍＬの新鮮なＢＨＩ／ＣＭ１０  培地（１：１０００希釈）を接種し、次いで、培養物が静止期に到達するまで、これを振盪しつつ４１℃にて培養した。１０μＬのサンプリングに続き、プラスミド調製を残りの一晩Ｌｉｓｔｅｒｉａ培養物で行って、ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡの存在を確認した。一旦静止期においては、１０μＬの培養物を用いて、１０ｍＬの新鮮なＢＨＩ／ＣＭ１０培地を接種し、これを４１℃にて予め加温し、次いで、振盪しつつ４１℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを各４１℃一晩培養物から採取し、これを用いてＢＨＩ／ｃｍ１０プレート上で単離されたコロニーにつき画線培養し、これを４１℃にて予め加温した。プラスミドｐＫＳＶ７は温度−感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａレプリコンを含むので、４１℃でのインキュベーションは、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中の天然ｕｖｒＡＢ遺伝子でのｐＫＳＶ７−ＤＬＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドの相同組換えを介する組み込み、および細菌細胞増殖および分裂を介するクロラムフェニコール薬物−抵抗性マーカーの増殖および発現から得られるコロニーにつき選択する。この時点で、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドの相同組換えによる組込から得られる、天然ｕｖｒＡＢ遺伝子および４６１２ｂｐ欠失ｕｖｒＡＢ遺伝子からなるｕｖｒＡＢ遺伝子につきメロジプロイドである。
【０２７１】
切出、およびｐＫＳＶ７プラスミドでの天然ｕｖｒＡＢ遺伝子の治癒のために、前記工程からの４１℃にてインキュベートしたＢＨＩ／ＣＭ１０プレートの各々から単一コロニーを選択し、これを用いて、クロラムフェニコールを含まない１０ｍＬのＢＨＩ培地を接種し、次いで、振盪しつつ３０℃にて一晩インキュベートした。次いで、培養を、クロラムフェニコールを含まない１０ｍＬの新鮮なＢＨＩ培地中に１：１０００希釈し、次いで、６時間振盪しつつ３０℃にて一晩インキュベートした。この工程を２回反復した。ｐＫＳＶ７プラスミドレプリコンにつき許容性の温度にて薬物−選択圧なくしての数世代のメロジプロイド中間株の継代に際し、組み込まれたｐＫＳＶ７プラスミドの自然発生切出が起こり、結局は、従前の細菌からプラスミドが治癒される［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１  ４３−１４７（１９９３）］。３番目の１：１０００希釈および６時間のインキュベーション時間に続き、各培養からのサンプルを採取し、これを用いて、（クロラムフェニコールを含まない）ＢＨＩプレート上で単離されたコロニーにつき画線培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。１００の単離されたコロニーを爪楊枝で各ＢＨＩプレートから選択し、５ｍＭ−長ストリークがＢＨＩ／ＣＭ１０プレート上でまず最初のコロニーで作成され、続いてＢＨＩプレートにて作成された。ＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩプレートの各マッチした対が複製であるように、プレートをグリッドを用いてマークした。ＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩ複製プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡでのＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、またはＤＰ−Ｌ４０２９のエレクトロポレーションからの２つのクロラムフェニコール−抵抗性コロニーに由来するＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩプレート上で平板培養したコロニーレプリカのほぼ５％は薬物感受性であった（すなわち、ＢＨＩプレート上のみで増殖）。これらの薬物−感受性コロニーはｕｖｒＡＢに４６１２ｂｐ欠失を含む候補を表す。薬物−感受性コロニーの各々を、ＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩプレート双方上で単離されたコロニーにつき再度画線培養し、３７℃にて一晩インキュベートして、候補クローンが純粋かつ薬物感受性であることを確認した。クロラムフェニコール−感受性コロニーを、プライマーＬｍ−２５６１６７７ＦおよびＬｍ−２５６８３３０Ｒ（ｉｂｉｄ）を用いるＰＣＲに付して、ｕｖｒＡＢ欠失をやはり含むクローンを同定した。天然ｕｖｒＡＢ遺伝子を持つクローンのアンプリコンサイズは６６５４ｂｐｓであり、欠失されたｕｖｒＡＢ遺伝子のアンプリコンサイズは２０４２ｂｐｓであり；クロラムフェニコール−感受性クローンの約５０％はやはり欠失されたｕｖｒＡＢ遺伝子を含んだ。ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９に由来するｕｖｒＡＢ欠失株の２つのクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。グリセロールストック（滅菌ＬＢ／４０％グリセロールで１：１希釈した３０℃一晩培養物）を各ｕｖｒＡＢ突然変位体株につき作成し、−８０℃にて貯蔵した。これらの株は表１３に���すように公知である。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ）を、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約による規定に基づいて、２００３年１０月３日に１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ２０１１０−２２０９，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＰＴＡ−５５６３が割り当てられた。
【０２７２】
（表１３  対立遺伝子交換によって生じたｕｖｒＡＢ突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）
ｕｖｒＡＢ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｓｔｒａｉｎ    ｕｖｒＡＢ突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）
【０２７３】
【表１３】
2007523879.tif 000018
Ｓ−５９ソラレンおよびＵＶＡ光での弱毒化に対する増大した感受性を示すために、正確に実施例１に記載されたように、表１３に示されたｕｖｒＡＢ突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の１×１０９ＣＦＵの調製物を２、２０、１００および５００ｎＭ  Ｓ−５９（Ｌ４０１７／ｕｖｒＡＢおよびＬ４０５６／ｕｖｒＡＢの双方のクローン）または２、１０、２０および１００ｎＭ  Ｓ−５９（Ｌ４０１７／ｕｖｒＡＢのクローン１およびＬ４０２９／ｕｖｒＡＢの双方のクローン）いずれかで処理し、６Ｊ／ｃｍ２（ＦＸ１０１９）の量にてＵＶＡ照射し、ＢＨＩプレート上での希釈物の平板培養によって生存性につきテストした。この実験の結果を表１４Ａ〜Ｂ（Ｓ−５９の量の関数としてのｌｏｇ抑制）および図８およびＡ〜Ｂ（Ｓ−５９の量の関数としてのｌｏｇ残存力価）に示す。結果は、表１３に示されたＤＮＡ  ＮＥＲ修復突然変異体株が、親株と比較して、ソラレンおよびＵＶＡ照射での光化学弱毒化に対して劇的により感受性であることを明らかに示す。このデータは、有意かつ実質的により低いレベルのＳ−５９ソラレンを用いて、その同質遺伝子カウンターパートと比較して、同一程度までｕｖｒＡＢ突然変異体細菌を不活化することができるという明白な証拠を提供する。
【０２７４】
（表１４Ａ  示されたＳ−５９濃度における照射（６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）後におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のｌｏｇ弱毒化）
【０２７５】
【表１４Ａ】
2007523879.tif 000019
（表１４Ｂ  示されたＳ−５９濃度における照射（６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）後におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のｌｏｇ弱毒化）
【０２７６】
【表１４Ｂ】
2007523879.tif 000020
ｕｖｒＡＢ突然変異体株は、悪性な疾患または感染症に関連する異種抗原をコードする発現カセットを組み込むために、親株として直接用いることができる。この配置にて、Ｓ−５９およびＵＶＡ光での光化学弱毒化に続き、細菌はＭＨＣクラスＩ−制限応答をプログラムするその能力を保持する。なぜならば、そのＤＮＡを複製する能力は架橋によって無くなっているが、その遺伝子相補体を発現する能力は実質的に無傷なままだからである。さらに、ｕｖｒＡＢ突然変異体を不活化する有意により少ないＤＮＡ架橋の要件の結果として、ワクチン容量を含む細菌ゲノムの集団という状況は、いずれか１つの遺伝子の発現は、その与えられた遺伝子において、発現の実質的中断がもたらされない低いレベルのＤＮＡ架橋のため、有意には影響されないであろう。最後に、ｕｖｒＡＢ突然変異をいずれかの他の減弱突然変異と組み合わせて、光化学および遺伝子減弱双方を組み合わせる安全かつ効果的なワクチンプラットフォームを駆動することができる。本明細書中に記載した組成物においては、単独またはいずれかの組合せにて、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、またはｕｖｒＣ遺伝子、またはＮＥＲに関与するいずれかのＬｉｓｔｅｒｉａ遺伝子は、タンパク質の機能的形態が発現されないように突然変異させることができる。これらの組成物は、選択された細菌病原体に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのアプローチとして用いて、ワクチン接種した個体において野生型病原体での攻撃に対して保護することができる。別法として、これらの組成物は、いずれかの選択された感染症または悪性病に関連する異種抗原の発現につき安全かつ効果的な組換えワクチンプラットフォームを誘導するためのアプローチとして用いることができる。
【０２７７】
（実施例８）
（対立遺伝子交換による、または部位−特異的組み込みベクターによる選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムへの抗原発現カセットの挿入）
実施例７に記載された株、いずれかの選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株、またはいずれかの細菌株をさらに改変して、悪性病または感染症に関連する異種タンパク質または抗原を発現させることができる。異種タンパク質の発現は、プラスミドが安定に維持されるように、選択された宿主細菌に適合するレプリコンを含むプラスミドを介することができる。別法として、原核生物発現カセットは、実施例７に記載された対立遺伝子交換を含めた種々の方法を用い、あるいは選択されたトランスポゾンまたはバクテリオファージに由来するランダムまたは部位−特異的に組み込まれるベクターにて、宿主細菌のゲノムに安定に組み込むことができる。
【０２７８】
その例として、リステリオファージＰＳＡ（ＳｃｏｔｔＡからのファージ）に由来する、ｐＰＬ２として知られた部位−特異的組込みベクターを利用することによって、実施例７に記載されたｕｖｒＡＢヌクレオチド切出修復（ＮＥＲ）突然変異体株に由来する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの誘導をここで記載する［Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６（２００２）］。具体的には、ｐＰＬ２組込みベクターを作成して、分泌シグナルおよびＰＥＳＴ配列を含む［ＤｅｃａｔｕｒおよびＰｏｒｔｎｏｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５（２０００）］が、ヘモリシン活性を欠く、ＯＶＡとイン−フレーム融合した、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質のアミノ−末端半分を持つ融合パートナーとしてのニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）モデル抗原を発現させる。切形ＬＬＯ−ＯＶＡ融合タンパク質の発現は、ＬＬＯを含めたＬｉｓｔｒｉａビルレンス遺伝子の発現を駆動するｐｒｆＡ−依存性プロモーターであるｈｌｙプロモーターによって駆動される。このベクターはｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡとして知られる。ｐＰＬ２ベクターは、ｔＲＮＡ遺伝子の天然配列が成功した組込みに際して保存され、かくして、その天然の発現された機能を無傷に維持するように、ＬｉｓｔｅｒｉａのｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子内に組み込まれる。
【０２７９】
ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡの構築における最初の工程は、順方向プライマーＫｐｎＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．１２５７〜１２７６（配列番号：１２）および逆方向プライマーＸｈｏＩ−ＬＬＯ１６６５Ｒ（配列番号：１３）のプライマー対を用いるＰＣＲによって、ＤＰ−Ｌ４０５６野生型ＬｉｓｔｅｒｉａゲノムＤＮＡから一緒にｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ配列を増幅することである。４２６ｂｐアンプリコンをＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩＤ  消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）での処理によって調製されたｐＰＬ２プラスミドに連結し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製した。ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ配列を含む修正（ｃｏｒｒｅｃｔ）プラスミドは、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでの消化、および１％アガロース／ＴＡＥ電気泳動によって確認し、４１８ｂｐｓおよび６１１２ｂｐｓのＤＮＡ断片が得られる。この中間プラスミドＤＮＡ構築体はｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴとして知られている。
【０２８０】
順方向プライマーＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ  ＯＶＡ  ｃＤＮＡ  ｎｔｓ．１７４〜１８６（配列番号：１４）および逆方向プライマーＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号：１５）のプライマー対を用い、ＤＰ−Ｅ３６１６  Ｅ．ｃｏｌｉ［Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｏｌ．Ｍｏｌｂｉｏｌ．３１：１６３１−１６４１（１９９９）］からのｐＤＰ３６１７プラスミドＤＮＡを含めた、当業者によって用いられるいずれかの数のプラスミドからＰＣＲによってＯＶＡ配列を増幅させることができる。
【０２８１】
１０１３ｂｐアンプリコンをＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴプラスミドに連結し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの消化、ＣＩＡＰ−での処理によって調製し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製する。ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴおよびＯＶＡ配列を含む修正プラスミド構築体はＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、およびＮｏｔＩでの消化、および１％アガロース／ＴＡＥ電気泳動によって確認し、９９４ｂｐｓ、１５６０ｂｐｓ、および６０３９ｂｐｓのＤＮＡ断片を得る。プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡのＬＬＯおよびＯＶＡ領域の正確な予期された配列は配列決定によって確認される。
【０２８２】
正確に、従前に記載された方法に従い［Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４，４１７７−４１８６（２００２）］、ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡプラスミドを、実施例７に記載された選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖａＡＢ突然変異体株のゲノム中のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に組み込む。簡単に述べれば、まず、エレクトロポレーションによって、または化学的手段によって、プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡをＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＳＭ１０（Ｓｉｍｏｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：７８４−７９１（１９８３））に導入する。引き続いて、コンジュゲーションによって、ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡプラスミドを形質転換されたＳＭ１０から選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株へ移す。記載されたように、ｍｌ当たり７．５μｇのクロラムフェニコールおよびｍｌ当たり２００μｇのストレプトマイシンを含有する薬物−選択的ＢＨＩ寒天プレート上でのインキュベーションに続き、選択されたコロニーを、同一組成を持つプレート上で３回継代によって精製する。ファージ付着部位におけるｐＰＬ２ベクターの組み込みを確認するために、個々のコロニーを拾い、順方向プライマーＮＣ１６（配列番号：１６）および逆方向プライマーＰＬ９５（配列番号：１７）のプライマー対を用い、ＰＣＲによってスクリーニングする。選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｕｒＡＢ突然変異体株のゲノム中のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に組み込まれたｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡプラスミドを有する選択されたコロニーは、４９９ｂｐｓの診断ＤＮＡアンプリコンを生じる。
【０２８３】
実施例１に記載されたように、クローン化されたＣ５７Ｂ１／６−由来樹状細胞系ＤＣ２．４を用い、抗原提示細胞および、引き続いてのＭＨＣクラスＩ経路を介するＯＶＡのプログラム提示によって取り込まれるべきｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡの安定な組込体を保有する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ突然変異体の能力をテストする。Ｌｉｓｔｅｒｉａの貪食細胞に続くクラスＩ分子へのＤＣ２．４細胞によるＯＶＡペプチドの提示は、やはり実施例１に記載されているように、Ｂ３Ｚ細胞とのインキュベーションの後に測定する。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が機能的であって、ここに含まれる実施例に記載されたようにさらに用いることができることをこれらの手法は証明する。
【０２８４】
かくして、本実施例は、ｕｖｒＡＢ遺伝子内で欠失を含むＤＮＡ修復突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株へ、選択された感染症および悪性病に関連するいずれかの所望の抗原をコードする原核生物発現カセットを導入するための指示を供する。該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、実施例１に記載されたソラレンでの処理によって不活化することができ、引き続いて、例えば、感染症および悪性病のための予防および治療ワクチンを含めた種々の適用で用いることができる。
【０２８５】
（実施例９）
（ヌクレオチド−切出修復（ＮＥＲ）突然変異体に由来する細菌ワクチン）
本明細書に記載された実施例は、感染症および悪性病に関連する抗原をコードする組換え送達プラットフォームの光化学処理を介するゲノム不活化を利用するワクチン組成物の効率を説明する。本組成物に従い、ゲノムは不活化され、複製の間に分離することはできないが、転写プロフィールはほとんど無傷のままであり、かくして、ワクチン接種された個体におけるデ・ノボ抗原発現、およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含めた病原体特異的免疫応答の最適な誘導をもたらす。さらに、実施例７に記載されたように、ＤＮＡヌクレオチド切出修復（ＮＥＲ）機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）が、作成された遺伝子欠失を含めたいずれかの数の手段によって不活化されているこの組成物におけるワクチンプラットフォームを利用することによって、これらの突然変異体における光化学不活化に対する感度は劇的に増大する。
【０２８６】
ＤＮＡ修復突然変異体を不活化するかなり少数のＤＮＡ架橋の要件の結果、ワクチン用量を含む細菌ゲノムの集団という状況、いずれかの１つの遺伝子の発現は、その与えられた遺伝子において、発現の実施的中断をもたらさない低レベルのＤＮＡ架橋のため、有意には影響されないであろう。
【０２８７】
かくして、病原体に由来する細菌プラットフォームを利用する遺伝子ベースのワクチンの総じての利用性は、ＮＥＲに欠損があるベクターと光化学不活化を組み合わせることによって劇的に増加させることができる。不活化されたワクチンは疾患を引き起こすことができないが、それは、ベクター−発現異種抗原に特異的な、Ｔ−細胞媒介細胞免疫性を含めた優れた免疫性を誘導するその効果的な能力を依然として保持する。さらに、ｕｖｒＡＢ突然変異をいずれかの他の減弱突然変異と組み合わせて、光化学および遺伝子減弱双方を組み合わせる安全かつ効果的なワクチンプラットフォームを誘導することができる。
【０２８８】
有意には、これらの組成物は、選択された細菌病原体に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのアプローチとして用いて、ワクチン接種された個体における野生型病原体での挑戦に対して保護することができる。この適用に従い、多くの場合において、病原体の減弱された生きた形態に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導することが可能でない。というのは、ワクチンの受ける個々の個体における反応性および疾患の原因についての可能性は高いままであるからである。選択された細菌病原体に関連するサブユニットまたは不活化ワクチンは安全であろうが、他方、これらのワクチンはしばしば効果的ではない。なぜならば、それらは、該病原体の野生型形態での挑戦に対してワクチン接種された個体を保護することが要求される病原体−特異的免疫応答の幅、深さおよび持続性を効果的には誘導しないからである。かくして、当該分野においては、保護されるワクチン接種された個体において該型の免疫応答を誘導する効果的な能力と安全性とを組み合わせるワクチン組成物に対する明らかな要求が存在することがよく知られている。
【０２８９】
それ自体、病原体微生物のヌクレオチド−切出修復（ＮＥＲ）経路における突然変異体は、非ワクチン接種個体において疾患を引き起こすのに十分な量の該微生物で、免疫化された個体における挑戦に対して保護を誘導する安全かつ効果的なワクチンで用いることができる組成物を提供する。ＮＥＲは、ＡＢＣエクシヌクレアーゼとして知られ、かつ遺伝子ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、およびｕｖｒＣによってコードされる３つのサブユニットで作成されたＡＴＰ−依存性ヌクレアーゼによって触媒される。３つのｕｖｒ遺伝子のうちのいずれかの１つ、または１を超えるものにおける突然変異の結果、ソラレンおよびＵＶＡ光を利用する光化学不活化に対して極端に感受性の病原体生物の微生物を含めた細胞がもたらされる。
【０２９０】
その例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ａｎｔｈｒａｘの病因のｕｖｒ遺伝子の突然変異が供される。ヒトで許可されている現在の無細胞ａｎｔｈｒｅｘワクチンは、ミョウバン水酸化物に吸着され（Ｕ．Ｓ．ワクチン）またはミョウバン燐酸塩で沈殿させた（Ｕ．Ｋ．ワクチン）減弱Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの滅菌培養上清に基づく。これらのワクチンはむしろ弱く、保護のための少なくとも６回の免疫化、ならびに年次ブースターを必要とすることはよく知られている。
【０２９１】
本明細書中に記載された組成物において、単独、あるいはいずれかの組合せにおいて、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢまたはｕｖｒＣ遺伝子、またはＮＥＲに関与するいずれかのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ遺伝子は、タンパク質の機能的形態が発現されないように突然変異される。
【０２９２】
その例として、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、またはｕｖｒＣ遺伝子、あるいはＮＥＲに関与するいずれかのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ遺伝子における突然変異は、例えば、実施例７に記載されたように、対立遺伝子交換によって行うことができる。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのｕｖｒ遺伝子は得られた突然変異体株の表現型の標的化欠失および特徴付けを介して同定されていないが、ｕｖｒ遺伝子は、そのｕｖｒ遺伝子が知られている関連生物のゲノムでの相同性サーチを介して同定することができる。例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノム、すなわち、主たる染色体および２つのビルレンスプラスミドはＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓと同一属からの関連細菌と比較することができる。Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ単離体（Ｒｅａｄら２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，２０２８−２０３３）の主な染色体を表すゲノムスカフォールドは、ＡＡＡＣ０１００００００１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓはＮＣ  ０００９６４のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＡ遺伝子はｎｔｓ．３６０９０６４〜３６１１９９７を含み、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＢ遺伝子はｎｔｓ．３６１２００５−３６１３９９０を含む。  ＢＬＡＳＴサーチは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ配列に対する配列をコードするＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢを用いて行った。この分析は、この生物のｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子に対応するＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノムにおいて７２％配列同一性の領域を同定した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡ遺伝子が２２６０２１〜２２８７８３をマップし、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＡ遺伝子に対して７２％の配列相同性を保有する（２０８２／２８６７同一配列相同性整列）。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＢ遺伝子は２２８８６４〜２３０７７１をマップし、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＢ遺伝子に対して７２％配列相同性を保有する（１４０１／１９２５同一配列相同性整列）。かくして、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡＢ遺伝子はＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの主な染色体のｎｔｓ．２２６０２１〜２３０７７１を含む。
【０２９３】
主な細菌染色体のｎｔｓ．２２６０２１〜２３０７７１を含めたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡＢ遺伝子の欠失は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるｕｖｒＡＢ遺伝子の欠失につき実施例７に記載された方法に従って達成することができる。簡単に述べれば、この領域、およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓゲノムのほぼ１０００ｂｐｓ上流および下流双方をＰＣＲによって増幅し、引き続いて、ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターにクローン化する。代替法としてＢａｃｉｌｌｕｓ属−特異的またはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ−特異的温度−感受性（ｔｓ）レプリコンは、ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターに存在するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｔｓレプリコンに代えて置き換えることができる。ｕｖｒＡＢ領域内を特異的にマッピングする便宜な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用い、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢのいずれかの部分、またはｕｖｒＡＢ遺伝子配列の全てを欠失する。最後に、対立遺伝子交換プラスミドをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに導入し、実施例７に記載されたようにＮＥＲ突然変異体を選択する。いずれかの選択されたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株は、例えば、以下の株：Ａｍｅｓ，Ｖｏｌｌｕｍ、Ａ１．ａ／１０、Ａ１．６／２３、Ａ２／２９、Ａ３．ａ／３４、Ａ３．ｂ／５７、Ａ４／６９、Ｂ８０、Δｓｔｅｒｎｅ、ＶＮ４１Δ１、Ｄａｍｅｓ、ＮＮＲＬΔ１、およびＤＮＨ１を含めた、ＮＥＲ−欠損ワクチンの誘導用の親株として用いることができる。加えて、他の減弱突然変異を選択されたＮＥＲ突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株のゲノムに導入して、光化学を遺伝的不活化と組み合せるワクチン組成物を可能とすることができる。そのようなＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓワクチン組成物は、致死因子（ＬＦ）、浮腫因子（ＥＦ）、および保護抗原（ＰＡ）を含めた、ａｎｔｈｒａｘ免疫性および保護の公知の関係に対して免疫応答を誘導することができる。加えて、ＮＥＲ突然変異体ワクチン組成物の発現プロフィールが無傷のままでいるという結果として、２つのビルレンスプラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２および主な染色体から発現されたものを含めた、ａｎｔｈｒａｘ免疫性および保護の他の未知の関係に対する免疫応答も誘導される。
【０２９４】
ワクチンの成分としてＮＥＲ突然変異体を利用する例としてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを用い、本明細書中に記載された組成物を、皮下、胃腸および呼吸器系を含めた感染の経路に従い、全ての３つのタイプのａｎｔｈｒａｘに対する予防または処置免疫化設定いずれかで用いることができる。さらに、安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＮＥＲ突然変異体を生じさせるためのアプローチを採用して、ＮＥＲを利用するいずれかの微生物病原体に対する安全かつ効果的なワクチンを誘導することが認識できる。
【０２９５】
（実施例１０）
（ヒト癌のインビボ処置のための本発明の微生物ベースのワクチンの使用）
ヒト癌の処置または予防の例として、微生物核酸が微生物集団の増殖が減弱されるように改変され、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されない微生物集団を含むワクチンが個体に投与される。微生物は実施例７および８のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットは、例えば、実施例８に記載されたｐＰＬ２組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当該分野におけるものに共通したいずれかの方法によって、微生物に取り込まれる。得られた集団は粗製、または好ましくは精製された形態で処方されることができる。それらは、液体懸濁液として調製することができるか、あるいは凍結乾燥し、投与用の適当なキャリアに再懸濁させることができる。加えて、それらは保存剤（例えばチメロサール、フェノキシエタノール）、安定化剤（例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン）、抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン）または他の物質のような添加剤と共に処方することができる。処方は滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水（例えば、生理学的ｐＨに緩衝化されたリン酸塩）、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
【０２９６】
ワクチンは経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下経路、ならびにいずれかの与えられた悪性病または感染症に関連するいずれかの経路を含めた種々の経路によって投与することができる。有効量のワクチンを処置のために個体に投与することができる。治療的処置では、有効量は、所望の免疫応答をもたらす用量であり、ここで、免疫応答は標的化腫瘍の増殖を遅延させ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは完全に腫瘍を排除する。ワクチンの投与は適当な間隔で反復することができ、ワクチン接種した個体における複数の区別される部位に同時に投与することができる。予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の確率が有意に低下するように、保護的免疫応答をもたらす用量である。ワクチン接種方法は単一用量よりなることができるか、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適当な間隔で反復することができる。
【０２９７】
個体の治療的処置は、初期処置として癌と診断された個体に対して出発することができ、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、腫瘍を外科的に摘出した、あるいは放射線療法で、または化学療法によって処置された個体をワクチンで処置して、個体におけるいずれかの残存する腫瘍を低下または排除することができるか、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。個体の予防的処置は、環境の条件または遺伝的素因いずれかの他の、ある種の癌を縮小させる増大した危険性を有する個体に対して開始される。
【０２９８】
（実施例１１）
（Ｓ−５９ソラレンＵＶＡ処置に続く、ｕｖｒＡＢ突然変異を持つおよび持たないＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９の抗原提示）
実施例７のＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ突然変異体クローンを改変して、実施例８の手法を用いてＯＶＡ抗原を発現させた。この株およびＯＶＡを発現するように改変されたＤＰ−Ｌ４０２９を、種々の濃度にてソラレンＳ−５９で処理した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は３７℃にて一晩増殖させ、２ｍＬアリコットを１００ｍＬのＢＨＩに希釈し、３７℃にてほぼ４時間、０．５のＯＤ６００（ほぼ１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）まで増殖させた。各Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の５ｍＬアリコットを１５ｍＬ試験管に加え、２３００×ｇにて２０分間遠心し、上清を除去し、細菌を５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、ほぼ１×１０９ＣＦＵ／ｍＬが得られた。ｕｖｒＡＢ突然変異体株については、３ｍＭ  Ｓ−５９ストックを１０ｍＬ  ＰＢＳまで３．３μＬ希釈して、１０μＭ溶液が得られ、これの適当なアリコットを１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｎＭの最終濃度までＬｉｓｔｅｒｉａに添加し、他方、ＤＰ−Ｌ４０２９では、Ｓ−５９を５ｍＬの最終容量中の１００、２００、４００、８００および１０００ｎＭの最終濃度まで添加した。これらを６ウェル培養プレートまで移し、０．５Ｊ／ｃｍ２の用量で照射した（ＦＸ１０１９ＵＶＡデバイス）。サンプルを１５ｍＬ試験管に移し、５ｍＬのＰＢＳを加え、それらを２３００×ｇにて２０分間遠心して、未処理ソラレンを洗浄した。上清を除去し、細菌を５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、新しい６ウェルプレートに移した。これらを５．５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ量にて照射して、ソラレンモノアダクトを架橋に変換した。また、各Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のサンプルを、７２℃にて３時間処理することによって加熱死滅させた。ｌｏｇ力価およびＯＶＡ抗原提示は実施例１のように評価した。Ｓ−５９処理サンプルについての結果は表１５Ａおよび図９Ａおよび９Ｂに見出される（バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、ＤＣ２．４細胞当たり１のＬｉｓｔｅｒｉａにおける抗原提示）。双方の加熱死滅させた株についての結果は、検出限界未満の力価を示し（完全な不活化）、加熱死滅させた細菌はＢ３ＺアッセイにおいてＯＶＡ抗原を提示しなかった。結果は、ｕｖｒＡＢ突然変異体は検出限界まで増殖の減弱でさえ非常に強い抗原提示を示すことを示し、ここで、非ｕｖｒＡＢ突然変異体株は（実質的に完全な不活化でのほぼバックグラウンドレベルまでの）増殖の減弱の関数として抗原提示の大きな低下を示す。これは、ｕｖｒＡＢ突然変異体がソラレン減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａという状況ＭＨＣクラスＩ提示を保持し、有効な免疫応答および有意に増大したレベルの安全性を伴ってワクチンを提供するはずであることを示す。
【０２９９】
（表１５Ａ  種々の濃度のソラレンＳ−５９で処理したＬｉｓｔｅｒｉａ株ＵＶＡのｌｏｇ減弱およびＯＶＡ抗原提示）
【０３００】
【表１５Ａ】
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＊ＤＣ２．４細胞当たり１のＬｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント
もう１つの実験は同一の株を用いて行った。この実験では、Ｌｉｓｔｅｒｉａを３７℃にて一晩ＢＨＩ中で増殖させた。これらをＢＨＩに１：５０希釈し、３７℃にて３００ｒｐｍで０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を表１５Ｂに示したレベルまで加えた。これらのサンプルは３７℃にて３００ｒｐｍにおいてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬアリコットを除去して、力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２の量にて照射した（ＦＸ１０１９）。力価後照射を各サンプルにつき決定し、ＯＶＡ抗原提示を前記したように評価した。結果は表１５Ｂおよび図９Ｃおよび９Ｄに見出される（バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａにおける抗原提示）。結果は、親株については、抗原提示がバックグラウンドレベルにあり、そこでは、実質的に完全な不活化があり、他方、ｕｖｒＡＢ突然変異体では、ほぼ１０倍範囲のＳ−５９濃度があり、それを超えて、適切な抗原提示と共に実質的な完全な不活化があることを示す。
【０３０１】
（表１５Ｂ  細菌の増殖の間に種々の濃度の存在するソラレンＳ−５９で処理したＬｉｓｔｅｒｉａ株ＵＶＡのｌｏｇ減弱およびＯＶＡ抗原提示）
【０３０２】
【表１５Ｂ】
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＊ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａで測定した未処理のパーセント
（実施例１２）
（ＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢと比較したＳ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９におけるタンパク質合成）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９およびＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢを３７℃にて一晩ＢＨＩ中で増殖させた。これらをＢＨＩへ１：５０希釈し、３７℃にて３００ｒｐｍにおいて０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点において、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を４０２９については２５００ｎＭのレベルまで、４０２９ｕｖｒＡＢ突然変異体株については２００ｎＭのレベルまで加えた。これらのサンプルを３７℃にて３００ｒｐｍにおいてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０）。１ｍＬアリコットを除去して、力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２の量にて照射した（ＦＸ１０１９）。力価後照射を各サンプルについて測定して、不活化のレベルを評価し、その結果、実質的に完全な不活化が得られた。この処置は、双方の株についての検出の限界まで不活化を提供するほぼ最低のＳ−５９量であることが決定された。各株については、ＯＤ６００−対−力価ＣＦＵ／ｍＬ増殖曲線に基づいて、１×１０１０細菌を１５ｍＬ遠心管に移した。サンプルを２３００×ｇにおいて４℃にて２０分間遠心し、上清を除去し、ペレットを５０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。これを合計３回の洗浄のために反復した。最終ペレットをメチオニンまたはシステイン（Ｇｉｂｃｏ）を含まない２ｍＬのＤＭＥＭに懸濁させ、３０分間振盪しつつ５％ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃でインキュベートした。サンプルを１６００ｒｐｍにて２分間、２ｍＬ遠心管中で遠心し、上清を除去し、メチオニンまたはシステインを含まない２ｍＬのＤＭＥＭを加えた。３５Ｓメチオニン−システインの８０μＣｉアリコットを加え（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンプルを３０分間振盪しつつ、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。サンプルを前記したように遠心し、上清を除去した。各上清の５０μＬアリコットをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル）上へと隣接するレーンに負荷し、１００ボルトにてほぼ１．５時間泳動させた。ゲルを１０％酢酸および３０％エタノールで固定し、次いで、エンハンサー（Ｅｎｌｉｇｈｔｎｉｎｇ、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１５分間浸漬させた。ゲルを８０℃にて３時間乾燥し、Ｘ−線フィルムへの暴露によって可視化した。２つの実験についての結果を図１０に示し、これは、ｕｖｒＡＢ突然変異体株におけるかなりのタンパク質合成を示し、他方、親株は限定されたタンパク質合成を示すことを示す。
【０３０３】
（実施例１３）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖の間における存在するＳ−５９の有りまたは無しにてのＳ−５９／ＵＶＡ不活化の比較）
２つの不活化方法を、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の不活化に関して比較した。第一の方法においては、Ｌｉｓｔｅｒｉａを３００ｒｐｍにおいて３７℃にて一晩ＢＨＩ中で増殖し、次いで、ＢＨＩへ１：５０希釈し、３７℃にて３００ｒｐｍにおいて０．７〜１．００のＯＤ６００まで増殖させた。これらを遠心し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中へ１×１０９／ｍＬのレベルまで懸濁させた。Ｓ−５９を親株については１２０ｎＭのレベルまで、およびｕｖｒＡＢ突然変異体株については３０ｎＭのレベルまで加えた。サンプルを氷上でほぼ６０分間インキュベートし、次いで、１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２の量にて照射した（ＦＸ１０１９）。第２の方法においては、Ｌｉｓｔｅｒｉａを同様に０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を親株については２５００ｎＭのレベルまで、およびｕｖｒＡＢ突然変異体株については２００ｎＭのレベルまで加えた。これらのサンプルを３７℃にて３００ｒｐｍにおいてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬアリコットを取り出して、力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、第一の方法のように照射した。力価後照射を各サンプルにつき決定し、その結果、全てのサンプルについて増殖の実質的に完全な阻害がもたらされた（＞８ｌｏｇ不活化）。ＤＰ−Ｌ４０２９−対−ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ、第二の方法によって処理されたほぼ１×１０１１細菌を含む全サンプルでなされた実験においては、全サンプルを平板培養し、これは、親株についてはほぼ９ｌｏｇ死滅、およびｕｖｒＡＢ突然変異体については＞１０ｌｏｇ死滅を示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａの４つの異なる調製物についての結果を表１６に掲げる。
【０３０４】
（表１６  Ｓ−５９／ＵＶＡでのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−およびａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−の不活化、ｌｏｇ力価不活化を評価するための全サンプルの測定）
【０３０５】
【表１６】
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１つの実験では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９−ＯＶＡおよびＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡを用いて２つの方法を比較した。サンプルを前記したように調製し、２３００×ｇにおいて２０分間遠心し、上清を除去し、細菌をＰＢＳで１回洗浄した。遠心およびＰＢＳ洗浄液を除去した後、最終ペレットをＰＢＳ中の８％ＤＭＳＯに再懸濁し、次いで、液体窒素またはドライアイスいずれかを用いて低温−バイアル中で凍結させ、−８０℃にて貯蔵した。３つのマウス（Ｃ５７Ｂ１／６）の組を２００μｌ中の１×１０８Ｌｉｓｔｅｒｉａを静脈内注射した（ＨＢＳＳにほぼ１：４０希釈した凍結ストック）。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理株に加えて、生きたおよび加熱死滅させたＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ、ならびにＨＢＳＳコントロールで注射をなした。２つのＳ−５９方法の比較のために、マウスを０日に注射した。第２の方法によって調製されたサンプルでは、さらなる組のマウスに第２日および３日または第２日、３日、４日および５日のいずれかに再度注射した。全てのマウスをワクチン接種から７日後に犠牲にし、分析のために脾臓を摘出した。脾臓細胞を実施例５に記載されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＯＶＡ特異的免疫応答につき評価し、ＳＬ８（ＯＶＡ特異的）で細胞集団を刺激した。結果を図１１Ａに示し、これは、親株およびｕｖｒＡＢ突然変異体双方につき、第２の方法によって調製されたＬｉｓｔｅｒｉａの結果、第一の方法によって調製された株についてよりも優れたＯＶＡ特異的免疫応答をもたらす。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、また、ＬＬＯクラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０、またはクラスＩ抗原ＬＬＯ２９６を用いる刺激によって行った。全ての３つの抗原を比較するＥＬＩＳＰＯＴ結果を図１１Ｂに示し、これは、ＬＬＯ特異的ＣＤ４＋応答がＯＶＡ特異的応答と同様であることを示す。また、脾臓細胞を実施例５に記載されたようにＩＣＳによって評価し、ＳＬ８、ＬＬＯ１９０、またはＬＬＯ２９６いずれかで刺激した。結果を図１２Ａ〜Ｃに示し、これは、第２の方法におけるＯＶＡおよびＬＬＯ双方についてのより強力な免疫応答を示す。また、データは、親株よりも優れたｕｖｒＡＢ株についての改良された応答を示す。双方の株において、連続日でのさらなるワクチン接種の結果、ＯＶＡおよびＬＬＯ抗原双方に対する改良された応答がもたらされる（１日−対−３日）
もう１つの実験において、ＤＰ−Ｌ４０２９およびＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ株を、マウスにおける野生型挑戦に対して保護的免疫性を供するその能力につき評価する。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨＢＳＳ、ＤＰ−Ｌ４０５６野生型（＋／−加熱死滅）、ＢＰ−Ｌ４０２７（ＬＬＯ欠失）、ＤＰ−Ｌ４０２９  Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（前記した第一および第二の方法）、ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ  Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（前記した第一および第二の方法）にて、表１７に記載された群にてワクチン接種した。ワクチン接種から２７日後、群当たり３匹のマウスに２×ＬＤ５０を挑戦させ、群当たり６匹のマウスに、１００×ＬＤ５０の野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを挑戦させた。挑戦から３日後に、２×ＬＤ５０を挑戦させたマウスを犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖のために培養した。各マウスからの脾臓または肝臓を、０．５％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含む滅菌蒸留水中でホモゲナイズした。系列１０倍希釈をストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＨＩ寒天プレート上で平板培養し、３７℃において一晩インキュベートした。脾臓または肝臓当たりのコロニー形成単位の数を、野生型挑戦に対する免疫性のサンプルとして測定した。図１６Ａ、Ｂは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理サンプルがＨＢＳＳ（非ワクチン接種）コントロールと比較した器官当たりＣＦＵ中ほぼ３ｌｏｇ低下を与えることを示し、サンプルは第二の方法によって調製されたのであり、これは、第一の方法で調製されたＣＦＵのより大きな低下を示す。加えて、処理されたｕｖｒＡＢ突然変異体株は、処理された親株よりもわずかに良好なＣＦＵ低下を示す。ＣＦＵ低下は野生型でのワクチン接種と同程度に良好ではないが、Ｓ−５９／ｕｖａ処理株はＣＦＵの低下につきいくらか効果を示し、これは、保護的免疫性と大いに相関する。１００×ＬＤ５０で挑戦された６匹のマウスを１０日間生存につきモニターし、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種したマウスのみが生存した。
【０３０６】
（表１７  ２つのＳ−５９／ＵＶＡ方法を比較する保護的免疫性の評価についてのＢａｌｂ／ｃマウスの投与）
【０３０７】
【表１７】
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さらなる実験は、ＨＢＳＳ、ＤＰ−Ｌ４０５６野生型（＋／−加熱死滅）、ＤＰ−Ｌ４０２７（ＬＬＯ欠失）、ＤＰ−Ｌ４４０６ａｃｔＡ（ＬｉｓｔｅｒｉａのａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失二重突然変異体、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約による規定に基づいて、２００３年１０月３日に１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ２０１１０−２２０９，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）により寄託、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５６２）、ＤＰ−Ｌ４０２９＋Ｓ−５９／ＵＶＡ（第二の方法）、ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ＋／−Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（第二の方法のみ）または＋加熱死滅を用いてＢａｌｂ／ｃマウスにおいて行い、ここで、ワクチン接種はＳ−５９および加熱死滅株では毎日、１日、３日または５日間行った。投与は表１８にまとめる。最初のワクチン接種から２９日後に、各群からの３匹のマウスを２０×ＬＤ５０で調製し、各群からの６匹に１００×ＬＤ５０の野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにて挑戦した。これらのマウスを生存につき１０日間モニターした。最初のワクチン接種から３２日後、各群からの３匹のマウスに２×ＬＤ５０の野生型で挑戦し、３日後に犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖につき培養した。加えて、マウス血清の抗Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体力価を、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって評価した。炭酸水素ナトリウム緩衝液中の凍結された粉砕Ｌｉｓｔｅｒｉａを平板培養し、系列希釈にてワクチン接種したマウスからの血清と共にインキュベートし、次いで、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体で結合した抗体を検出した。ＨＲＰ基質を添加し、色変化を定量的に測定することによって抗体のレベルを測定した。これらをナイーブなマウスと比較してＬｉｓｔｅｒｉａ特異的抗体を評価し、そこでは、もしナイーブ血清サンプルの測定を１標準偏差上回るとサンプルをＬｉｓｔｅｒｉａにつき陽性と考えた。脾臓または肝臓当たりのＣＦＵの結果を図１４Ａ、Ｂに示し、抗Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体力価を図１５に示し、生存の結果を図１６に示す。この実験は、３または５ワクチン接種でのＳ−５９処理ｕｖｒＡＢ株の良好なＣＦＵ低下および保護免疫性を示し、未処理ｕｖｒＡＢ株のそれに近づき、野生型株とほとんど同程度に効果的である。
【０３０８】
（表１８  Ｓ−５９／ｕｖａ処理株での保護的免疫性、多重ワクチン接種の評価のためのＢａｌｂ／ｃマウスの投与）
【０３０９】
【表１８】
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（実施例１４）
（マウスモデルにおいてＳ−５９／ＵＶＡ処理株を用いる免疫寛容の破壊の証明）
実施例１３の第二の方法に従い、Ｇｐ−７０−ＡＨ１Ａ５およびＯＶＡを発現するＤＰ−Ｌ４０２９およびＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ株をＳ−５９／ｕｖａ処理した。Ｇｐ−７０はＣＴ−２６腫瘍細胞によって発現される自家性マウス抗原である。ＡＨ１Ａ５は、生きた株において発現されると免疫応答を誘導することが示されている天然配列の単一塩基突然変異である（ＡＨ１ペプチドはＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：２０）、ＡＨ１Ｈ５ペプチドはＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：２１））である。予防免疫化実験では、表１９に従い、Ｂａｌｂ／ｃマウスを８匹のマウスの群にて静脈内ワクチン接種した（１００μＬ）（ワクチン接種の最初の組から７日後に、群当たり３匹のマウスを犠牲にし、脾臓を収集した）。最初のワクチン接種から２１日後に、群当たり残りの５匹のマウスを１×１０５ＣＴ−２６結腸上皮腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）で静脈内注射し、生存につきモニターした。
【０３１０】
（表１９  ワクチン株および処理方法）
【０３１１】
【表１９】
2007523879.tif 000026
収集された脾臓細胞のＴ細胞集団を、細胞を刺激するためにＬＬＯ９１、ＡＨ１、ＡＨ１／Ａ５ペプチドまたはＰ８１５およびＣＴ２６細胞（１５０ｍＭ  Ｓ−５９および３Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡで完全に不活化）を用い、実施例５に従い、ＩＣＳによって評価した。Ｐ８１５細胞をＣＴ２６全細胞刺激についての陰性コントロールとして供する。というのは、Ｐ８１５はＧＰ７０抗原を発現しないからである。結果を図１７に示し、これは、処理されたｕｖｒＡＢと突然変異体が、さらなるワクチン接種で改良することができるＡＨ１Ａ５またはＡＨ１特異的応答をもたらすことを示す。また、実施例５に従い、細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。細胞をＡＨ１Ａ５またはＡＨ１ペプチドいずれかで刺激した。結果を図８Ａ、Ｂに示し、これはｕｖｒＡＢ突然変異体株でのＡＨ１Ａ５およびＡＨ１双方に対する免疫応答を示す。
【０３１２】
（実施例１５）
（ｕｖｒＡＢ欠失を持つソラレン減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を用いるマウスの治療的ワクチン接種）
Ｃ５７Ｂ１／６マウスを用い、Ｂ１６．Ｆ１０，ＭＯ５．１０．Ｈ３（ＯＶＡ＋、これはＯＶＡ発現に対して増大した均一性を有する実施例４で用いた細胞のサブクローンである）メラノーマ腫瘍細胞をマウスに注射して（１００μＬのＨＢＳＳ  ＩＶ中１×１０６）、肺転移を確立した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９−ＯＶＡ、ＤＰ−Ｌ４０２７−ＯＶＡ、ＤＰ−Ｌ４０３８−ＯＶＡ（ａｃｔＡ／４６１Ｔ二重突然変異体）、およびＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡを１０匹のマウスのワクチン接種群で用いた。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ株をＳ−５９処理の有り、無しにて用い（実施例１３の最初の方法により＞８ｌｏｇ死滅）、加熱死滅させたＤＰ−Ｌ４０２９−ＯＶＡをＨＢＳＳのみと共にコントロールで用いた。マウスを、表２０で与えられた用量での腫瘍移植から３日後にワクチン接種した（ＨＢＳＳ中１００μＬＩＶ）。腫瘍移植から３０日後に、群当たり５匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残り５匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移の数およびメジアン生存日数を表２０に示す。ａｃｔＡ−、ａｃｔＡ−ＯＶＡ、およびａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  Ｓ−５９／ＵＶＡ処理および加熱死滅についての肺を図１９Ａに示し、肺転移の数を図１９Ｂにプロットし、生存を図１９Ｃにプロットする。このデータは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ｕｖｒＡＢ突然変異体が治療ワクチンとして投与でき、それにより、非ワクチン接種加熱死滅コントロール、またはＯＶＡなくしてのＤＰ−Ｌ４０２９と比較して有意に低下した肺転移および拡大された生存をもたらすことを示す。
【０３１３】
（表２０  ＯＶＡ肺腫瘍モデルにおけるマウスの治療的ワクチン接種）
【０３１４】
【表２０】
2007523879.tif 000027
（実施例１６）
（ｇｐ７０マウス抗原を発現するＳ−５９不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株での治療的ワクチン接種）
Ｂａｌｂ／ｃマウスを用い、ヒト抗原（該ヒト抗原は本実験とは無関係である）を発現するように改変された（ＡＨ１を発現する）ＣＴ２６腫瘍細胞をマウスに注射して（ＨＢＳＳ中１００μＬ  ＩＶに２×１０５）、肺転移を確立した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９、ＤＰ−Ｌ４０２９−ＡＨ１Ａ５、ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＡＨ１Ａ５、およびＤＰ−Ｌ４４０６ａｃｔＡ−ＡＨ１Ａ５  （ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ二重突然変異体）を、１３匹のマウスのワクチン接種群で用いた。ＡＨ１Ａ５株もまたＯＶＡ抗原を発現する。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＡＨ１Ａ５株を処理、加熱死滅またはＳ−５９処理なくして用いた（実施例１３の第二の方法による）。マウスをワクチン接種し（１００μＬ  ＨＢＳＳ  ＩＶ）、表２１に従って腫瘍移植後４日に始めた。腫瘍移植から１９日後に、群当たり３匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残りの１０匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移についての結果を図２０Ａ（肺の絵）および２０Ｂ（プロットした肺転移の数）に示し、生存を表２１および図２０Ｃ（ΔａｃｔＡサンプル）および２０Ｄ（ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢサンプル）に示す。ＡＨ１Ａ５抗原は、いずれかの免疫化効果がマウスにおいて免疫寛容を破壊するであろうように、マウスに対して内因性である。結果は、Ｓ−５９処理ｕｖｒＡＢ突然変異体株がマウスにおいて寛容を破壊でき、その結果、有意に低下された肺転移および延長された生存をもたらすことを示す。単一ワクチン接種と比較して３日間にわたってワクチンを投与した場合に、治療的効果が改良される（３日間にわたって送達された合計用量は単一日に等しい）。
【０３１５】
（表２１  ＡＨ１Ａ５を発現するように改変されたＬｉｓｔｅｒｉａを用いるマウスの治療的ワクチン接種）
【０３１６】
【表２１】
2007523879.tif 000028
（実施例１７）
（蛍光顕微鏡を用いる樹状細胞におけるＳ−５９／ｕｖａ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ局所化の評価）
抗原提示細胞内のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの接種および分布は、蛍光顕微鏡によって評価した。樹状細胞系ＤＣ２．４は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１×非必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、５×１０４Ｉ．Ｕ．ペニシリン／５×１０４μｇストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１ｎＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を補足した完全なＲＰＭＩ培地、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中にて、皿当たり５×１０５細胞にてペトリ皿中でカバーグラス上で培養し、３７℃にて一晩インキュベートした（これは他の細胞系、例えば、マクロファージＪ７７４で同様に行うことができた）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  株（ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０２７（ＬＬＯ−）およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ）の静止相培養物は、３ｍＬのＢＨＩ培地に細菌コロニーを接種し、３０℃にて一晩増殖させることによって調製した。
【０３１７】
Ｌｉｓｔｅｒｉａの一晩培養物を新鮮なＢＨＩ培地中に１：２０希釈し、３０℃における静止相培養物を０．５〜０．６のＯＤ６００まで増殖させた。ＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ株についての一晩培養物のほぼ１ｍＬも７２℃にて３〜４時間加熱死滅させた。実施例１３の第二の方法に従って調製された、ソラレン不活化ＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ  Ｌｉｓｔｅｒｉａの凍結ストックを解凍し、３７℃にて１時間、静止相で回収した。感染に先立ち、全てのＬｉｓｔｅｒｉａ調製物のＯＤ６００読みが得られ、カバーグラス当たりのＤＣ２．４細胞の数をカウントし、各株についての感染の多重度（ＭＯＩ，ＤＣ２．４細胞当たりの細菌の数）を計算した。新鮮なｌｏｇ相培養物を用いて、５のＭＯＩにて細胞を感染させ、加熱−死滅させた培養物を２０のＭＯＩで用い、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理株を１０のＭＯＩで用いた。
【０３１８】
カバーグラスを２４ウェル皿に移し、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを欠くＲＰＭＩで３回洗浄し、所望のＭＯＩを与えるＬｉｓｔｅｒｉａ株の適当な希釈物を、３７℃にて３０分間、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐフリー培地中で細胞と共にインキュベートした。次いで、カバーグラスをＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐフリー培地で３回洗浄し、３７℃にてさらに３０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、カバーグラスを洗浄し、３７℃にて４時間、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に培地中でインキュベートした。次いで、カバーグラスをＰＢＳ中で洗浄し、室温にて１５分間に、３．５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。固定の後、カバーグラスをＴＢＳ−Ｔｘ緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）で洗浄／浸透化し、室温にて１５分間、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔｘ中でブロックした。カバーグラスを、室温にて３０分間、ウサギ抗Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｏ抗原  抗血清（Ｄｉｆｃｏ）で染色し、ＴＢＳ−Ｔｘ緩衝液中で洗浄した。次いで、サンプルをフルオレセイン標識抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、アクチンをローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。カバーグラスをＴＢＳ−Ｔｘ中で洗浄し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩ−ハードセット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中のスライド上に設置して、細胞核につき染色した。スライドを少なくとも８時間乾燥し、細胞をＮｉｋｏｎ  ＴＥ３００−Ｕ倒立顕微鏡で可視化した。ＣＣＤ  Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ４７４２−９５−１２ＮＲカメラを用いてイメージを撮影し、Ｐｈａｓｅ  ３  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＩｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
【０３１９】
３つのイメージを各視野につき撮影した：１つはＵＶ−２Ｅ／Ｃフィルター（ＣＨＲＯＭＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，ＤＡＰＩ／核を可視化する）を用い、第２のものはＨＹＱ  ＴＲＩＴＣフィルター（ＣＨＲＯＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，アクチンを可視化）のものであり、第３のものはＢ−１Ａ（ＨＹＱ−ＦＩＴＣ）フィルター（ＣＨＲＯＭＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，Ｌｉｓｔｅｒｉａを可視化）を用いるものであった。次いで、３つのイメージを合体させて、Ｌｉｓｔｅｒｉａについての染色がアクチンについての染色と共局所化するか否かを判断した。ファゴリソソームから逃げることができないＬｉｓｔｅｒｉａは緑色で出現し、他方、サイトゾルから逃げることができるものはアクチンを核形成できるものであり、従って、アクチン（赤色）およびＬｉｓｔｅｒｉａ（緑色）の共局所化のため黄色に出現した。リソソームから逃げることができるＬｉｓｔｅｒｉａのパーセンテージを定量するために、視野中のＬｉｓｔｅｒｉａの合計数をカウントし、黄色に出現したＬｉｓｔｅｒｉａの数を、黄色細菌をカウントすることによって、あるいはローダミンイメージからのアクチンの存在を確認することによって決定した（図２１Ａ参照）。ファゴリソソームを逃げるＬｉｓｔｅｒｉａの数は、カウントしたＬｉｓｔｅｒｉａの合計数で割り、ファゴリソソーム逃避のパーセンテージを、表２２に報告し、図２１Ｂに表すように計算した。結果は、加熱死滅株およびＳ−５９／ＵＶＡ処理野生型株はＬＬＯ−株のように振る舞い、すなわち、ファゴリソソームから逃避することができず、他方、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理したｕｖｒＡＢ突然変異体はファゴリソソームから逃避する実質的能力を示すことを示す。
【０３２０】
（表２２  ＤＰ−Ｌ４０５６（＋／−Ｓ−５９／ＵＶＡ、加熱死滅）、ＤＰ−Ｌ４０２７、およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ（＋／−Ｓ−５９／ＵＶＡ、加熱死滅）についてのファゴリソソームから逃げるＬｉｓｔｅｒｉａのパーセンテージ）
【０３２１】
【表２２】
2007523879.tif 000029
（実施例１８）
（グラム染色を用いるＳ−５９ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｉＡＢ−株の可視化）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの野生型およびｕｖｒＡＢ−株を０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を野生型株については２５００ｎＭのレベルまで添加し、ｕｖｒＡＢ−突然変異体株については２００ｎＭのレベルまで添加した。これらのサンプルを３００ｒｐｍにおいて３７℃にてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬアリコットを取り出して力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２（ＦＸ−１０１９）のＵＶＡ量にて照射し、その結果、双方の株について＞８ｌｏｇ不活化が得られた。処理した株を実施例１３に記載したように貯蔵凍結した。これらを解凍し、ｍＬ当たりほぼ１〜２×１０９の濃度にて１５ｍＬの試験管中のＢＨＩ培地に１：１０希釈した。これらを３７℃にて３００ｒｐｍでインキュベートし、０、２、４、６、８時間および一晩（ほぼ１８時間）にてアリコットを取り出した。該アリコットをスライドグラス上に広げ（ほぼ５０μＬ）、風乾した。火炎を３回通すことによってスミヤを加熱固定し、次いで、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｒａｍ  Ｓｔａｉｎキット（カタログ番号２８２−４０７）を用いてグラム染色前に冷却した。スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮り、ネガイメージを図２２に示す。これは、処理された修復欠損株のユニークな性質を示し、これは、遺伝子発現を示す鎖を示すが、細菌が増殖しないように分裂できない。
【０３２２】
（実施例１９）
（さらなる突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の構築）
突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の調製。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は１０４０３Ｓ（Ｂｉｓｈｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２００５（１９８７））に由来した。示された遺伝子のイン−フレーム欠失を持つＬｉｓｔｅｒｉａ株はＳＯＥ−ＰＣＲおよび確立された方法での対立遺伝子交換によって生じさせた（Ｃａｍｉｌｌｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３（１９９３））。突然変異体株ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ（ＤＰ−Ｌ４０１７）は、引用してここに一体化させるＧｌｏｍｓｋｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５６：１０２９（２００２）に記載されている。ａｃｔＡ−突然変異体（ＤＰ−Ｌ４０２９）は、そのプロファージで治癒されている、ここに引用してその全体を援用する、Ｓｈｏｂｌｅら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：５２７−５３７（２０００）に記載されているＤＢ−Ｌ３０７８株である（プロファージ治癒は（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３／０２０３４７２）に記載されている）。ＬＬＯ−突然変異体（ＤＢ−Ｌ４０２７）（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８４：４１７７−４１８６（２００２））、およびＬＬＯ  Δ２６（ＤＰ−Ｌ４０４２）（Ｄｅｃａｔｕｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２（２０００））もまた従前に記載されている。ａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−株の構築は、Ｌ４０２９／ｕｖｒＡＢ（例えば、その出願の実施例７参照）として、２００３年２月６日に出願された同時係属米国仮出願６０／４４６，０５１に記載されている。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−）は２００３年１０月３日にＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−５５６３の受託番号が与えられた。
【０３２３】
対立遺伝子交換によるＬｉｓｔｅｒｉａからのｉｎｌＢの欠失に代えてのｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｉｎｌＢの構築。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０２９からの（または他の選択された突然変異体株からの、または野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａからの）ｉｎｌＢの欠失は、Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１４７（１９９３）によって記載されているように、対立遺伝子交換によって行うことができる。重複ＰＣＲを用いて、対立遺伝子交換手法で用いる構築体を調製することができる。インターナリンＢ遺伝子の源は、ここに引用してその全体を援用する、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ５９１９７５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ、完全なゲノム、セグメント３／１２；ｉｎｌＢ遺伝子領域：ｎｔｓ、９７００８−９８９６３）としてリストされた配列および／またはＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ  ００３２１０（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ，完全なゲノム、ｉｎｌＢ遺伝子領域；  ｎｔｓ．４５７００８−４５８９６３）としてリストされた配列である。
【０３２４】
一次ＰＣＲ反応において、各々、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｌＢ遺伝子の５’および３‘末端から上流および下流の配列のほぼ１０００ｂｐｓを、以下の鋳型およびプライマーを用いて増幅する：
鋳型：ＤＰ−Ｌ４０５６またはＤＰ−Ｌ４０２９ゲノムＤＮＡ
プライマー対１（ｉｎｌＢの５’末端から上流の領域の増幅用）：
Ｌｍ−９６０３  １Ｆ：
【０３２５】
【化１】
2007523879.tif 000030
（配列番号：２２）（Ｔｍ：７２℃）
Ｌｍ−（３‘ｉｎｌＢ−Ｒ＋）９７０２０Ｒ：
【０３２６】
【化２】
2007523879.tif 000031
（配列番号：２３）（Ｔｍ：１１４℃）
（ＩｎｌＢカルボキシ末端の下流の領域に相補的な下線を施した配列）
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：１００７）
プライマー対２（ｉｎｌＢの３‘末端から下流の領域の増幅用）：
Ｌｍ（５‘ｉｎｌＢ−Ｆ＋）９８９１１Ｆ：
【０３２７】
【化３】
2007523879.tif 000032
（配列番号：２４）（Ｔｍ：１１８℃）（下線を施した配列はＩｎｌＢアミノ末端の上流の領域に相補的である）
Ｌｍ−９９９７０Ｒ：
【０３２８】
【化４】
2007523879.tif 000033
（配列番号：２５）（Ｔｍ：７４℃）
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：１０７４）
二次ＰＣＲ反応において、一次ＰＣＲアンプリコンは、対１からの逆方向プライマーおよび対２の順方向プライマーの間の相補性を利用し、重複ＰＣＲを介して融合させる。この結果、配列：ｎｔｓ．９７０２１−９８９１０＝１８８９ｂｐｓをコードするｉｎｌＢの正確な欠失がもたらされる。以下の鋳型およびプライマーは二次ＰＣＲ反応で利用した：
鋳型：きれいにした（ｃｌｅａｎｅｄ）一次ＰＣＲ反応
プライマー対：
Ｌｍ−９６０４３Ｆ：
【０３２９】
【化５】
2007523879.tif 000034
（配列番号：２６）（Ｔｍ：７４℃）
Ｌｍ−９９９６４Ｒ：
【０３３０】
【化６】
2007523879.tif 000035
（配列番号：２７）（Ｔｍ：７４℃）
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：２０３３）
構築プロセスを完成するためのプロトコルは以下の通りである：
一次ＰＣＲ反応（３温度サイクル）を、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および１０μｌの洗浄された３０℃  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６またはＤＰ−Ｌ４０２９一晩培養物を用いて行う。１％アガロースゲルによるＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されるサイズ（１００７ｂｐｓおよび１０７４ｂｐｓ）。一次ＰＣＲ反応をゲル精製し、ＤＮＡはＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１）で溶出する。
【０３３１】
二次ＰＣＲ反応は、鋳型として各一次反応物のほぼ等量（約５μｌ）を利用して行う。二次ＰＣＲ反応からのＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されるサイズは１％アガロースゲル（２０３３ｂｐｓ）によって証明される。Ａｄｅｎｏｓｉｎ残基はＴａｑポリメラーゼにてＬｉｓｔｅｒｉａ  ｄｌ  ｉｎｌＢアンプリコンの３‘に加える。
【０３３２】
次いで、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｄｌ  ｉｎｌＢアンプリコンをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入する。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｌ  ｉｎｌＢプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、２１２３ｂｐ断片をゲル精製する。ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ  ２１２３ｂｐ断片を、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでの消化およびＣＩＡＰでの処理によって調製されているｐＫＳＶ７ベクターに挿入する（ｐＫＳＶ７−Ｄｌ  ｉｎｌＢ）。次いで、ｐＳＫＶ７−ｄｌｉｎｌＢにおけるｉｎｌＢ配列の忠実度を確認する。ｉｎｌＢ遺伝子はｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｉｎｌＢプラスミドでの対立遺伝子交換によって所望のＬｉｓｔｅｒｉａ株から欠失される。
【０３３３】
抗原−発現株の構築。モデル抗原オボアルブミン（ＯＶＡ）の切形を発現する突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ；配列番号：２０）として知られたマウス結腸直腸癌（ＣＴ２６）からの免疫優性エピトープ、および改変されたエピトープＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ；配列番号：２１；  Ｓｌａｎｓｋｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：５２９−５３８（２０００））を調製した。ｐＰＬ２組込みベクター（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３：０２０３４７２）を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムの無毒部位に組み込まれた単一コピーを含むＯＶＡおよびＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡ組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を誘導した。
【０３３４】
ＯＶＡ−発現Ｌｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）の構築。切形ＯＶＡと融合され、かつｐＰＬ２組込みベクターに含まれたヘモリシン−欠失ＬＬＯ（ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡ）よりなる抗原発現カセットをまず調製する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ株は、ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡをファージ−治癒Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６に、ＰＳＡ（ＳｃｏｔｔＡからのファージ）付着部位ｔＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢにて導入することによって誘導される。
【０３３５】
ＰＣＲを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いてヘモリシン−欠失ＬＬＯを増幅する：
源：ＤＰ−Ｌ４０５６ゲノムＤＮＡ
プライマー：
順方向（ＫｐｎＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．１２５７〜１２７６）：
【０３３６】
【化７】
2007523879.tif 000036
（配列番号：２８）
（Ｔｍ：  ＬＬＯ−ｓｐｅｃ：５２℃、総じて：８０℃）
逆方向（ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．２８１１−２７９２）：
【０３３７】
【化８】
2007523879.tif 000037
（配列番号：２９）
（Ｔｍ：  ＬＬＯ−ｓｐｅｃ：５２℃、総じて：１０２℃）
また、ＰＣＲを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いて切形ＯＶＡを増幅する：
源：ＤＰ−Ｅ３６１６  Ｅ．ＣｏｌｉからのｐＤＰ３６１６プラスミドＤＮＡ（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｏｌ．Ｍｏｌｂｉｏｌ．３１：１６３１−１６４１（１９９９））。
【０３３８】
プライマー：
順方向（ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ  ＯＶＡ  ｃＤＮＡ  ｎｔｓ．１７４−１８６）：
【０３３９】
【化９】
2007523879.tif 000038
（配列番号：３０）
（Ｔｍ：ＯＶＡ−ｓｐｅｃ：６０℃、総じて：８８℃）
逆方向（ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）：
【０３４０】
【化１０】
2007523879.tif 000039
（配列番号：３１）
（Ｔｍ：総じて：８２℃）
構築プロセスを完了させるための１つのプロトコルは、まず、ＬＬＯアンプリコンをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次いで、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩベクターをｔＰＬ２ベクター（ｐＰＬ−ＬＬＯ）に挿入することを含む。次いで、ＯＶＡアンプリコンをＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで切断されているｐＰＬ２−ＬＬＯに挿入する（注：ｐＰＬ２ベクターはいずれのＸｈｏＩ部位も含まず；ｐＤＰ−３６１６は、ＯＶＡ逆方向プライマー設計で開発される１つのＸｈｏＩ部位を含む）。構築体ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡは、制限分析（ＫｐｎＩ−ＬＬＯ−ＸｈｏＩ−ＯＶＡ−ＮｏｔＩ）および配列決定によって確認される。正確にＬａｕｅｒらによって記載されているように、プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡを形質転換によってＥ．ｃｏｌｉに導入し、続いて、コンジュゲーションによってＬｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）にまたはｉｎｌＢ−突然変異体またはｉｎｌＢ−ａｃｔＡ−二重突然変異体のようなＬｉｓｔｅｒｉａのもう１つの所望の株に）導入し、それに組み込む。
【０３４１】
ＯＶＡを発現する抗原発現カセットの挿入の記載は、２００３年１０月１５日に出願された「Ｆｒｅｅ−Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｓ」なる発明の名称の米国仮出願第６０／５１１，８６９号の実施例８に見出すこともできる。
【０３４２】
ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨＺ−Ａ５／ＯＶＡを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の構築。ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡ抗原配列いずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａを調製するために、抗原を担うインサートをまずオリゴヌクレオチドから調製し、次いで、（前記したように調製された）ベクターｐＰＬ２−ＬＬＯ−ＯＶＡに連結する。
【０３４３】
以下のオリゴヌクレオチドをＡＨ１またはＡＨ１−Ａ５インサートの調製で用いる：
ＡＨ１エピトープインサート（ＣｌａＩ−ＰｓｔＩ適合性末端）：
頂部ストランドオリゴ（ＡＨ１頂部）：
【０３４４】
【化１１】
2007523879.tif 000040
（配列番号：３２）
底部ストランドオリゴ（ＡＨ１底部）：
【０３４５】
【化１２】
2007523879.tif 000041
（配列番号：３３）
ＡＨ１−Ａ５エピトープインサート（ＣｌａＩ−ＡＶＡＩＩ適合性末端）：
ＡＨ１−Ａ５エピトープの配列はＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：２１）である。
【０３４６】
【化１３】
2007523879.tif 000042
（配列番号：３４）
頂部：
【０３４７】
【化１４】
2007523879.tif 000043
（配列番号：３５）
底部：
【０３４８】
【化１５】
2007523879.tif 000044
（配列番号：３６）
与えられたエピトープのためのオリゴヌクレオチド対を等モル比で一緒に混合し、９５℃にて５分間加熱する。次いで、オリゴヌクレオチド混合物をゆっくりと冷却する。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチド対を、関連制限酵素での消化によって調製したｐＰＬ２−ＬＬＯ／ＯＶＡプラスミドと２００対１モル比で連結する。新しい構築体の同一性は、制限分析および／または配列決定によって確認することができる。
【０３４９】
正確にＬａｕｅｒらによって記載されているように、次いで、形質転換によってプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに導入し、続いてコンジュゲーションによってＬｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）に（またはｉｎｌＢ−突然変異体またはｉｎｌＢ−ａｃｔＡ−二重突然変異体のようなＬｉｓｔｅｒｉａのもう１つの所望の株）に導入し、それに組み込む。
【０３５０】
（実施例２０）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでワクチン接種したマウスにおけるインビボ細胞傷害性活性の評価）
一連の実験を行って、インビボで抗原特異的標的細胞を溶解させるワクチン接種マウスの能力を評価した。最初の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ−）、ＡＨ１／Ａ５を発現するＤＰ−Ｌ４０２９、およびＡＨ１／Ａ５を発現するＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−いずれかで静脈内（ＩＶ）でワクチン接種した。また、ＡＨ１／Ａ５発現株を、実施例１３の第二の方法に従ってＳＳ−５９ＵＶＡで処理した。また、ＡＨ１−Ａ５を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ構築対もＬＬＯおよびＯＶＡを発現する。ワクチン接種は、表２０に示された用量（０．１ＬＤ５０）にて、全ての群について０日に、加えて、Ｓ−５９処理株については１日および２日に行った。各株およびコントロールでは、３匹のマウスの２つの群をワクチン接種した。標的細胞集団は、ＲＰＭＩ１６４０培地中の２０のナイーブなＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓を収集することによって調製した。細胞を解離し、赤血球細胞を溶解させた。白血球細胞をカウントし、４つの等しい集団に分けた。各群に、３７℃において９０分間、０．５μｇ／ｍＬにて、特異的ペプチド、標的ＡＨＩ（ＳｙｎＰｅｐ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡからのＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：２０））、標的ＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：２１）、ＳｙｎＰｅｐ）、またはコントロールの２つの集団（β―ｇａｌ、ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（配列番号：３７））いずれかでパルスした。次いで、細胞を培地中で３回、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄した。カルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で標識するために、細胞をｍＬ当たり１×１０７にて、温かいＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（１０ｍＬ以下）に再懸濁した。細胞懸濁液を標的化するために、１．２５μＬのＣＦＳＥの５ｍＭストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。コントロール細胞懸濁液に、ＣＦＳＥストックの１０倍希釈を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。細胞を３７℃にて１０分間インキュベートした。大容量の（＞４０ｍＬ）の氷冷ＰＢＳの添加によって染色を停止した。細胞を室温にてＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントした。各細胞懸濁液をｍＬ当たり５０×１０６に希釈し、１００μＬの各集団を混合し、第６日に、ナイーブなまたはワクチン接種したマウスいずれかの尾静脈を解して注射した。各株またはコントロールにつき、３匹のマウスの群にβ−ｇａｌおよびＡＨ−１またはβ−ｇａｌおよびＡＨ１−Ａ５を注射した。１２〜２４時間後、脾臓を収集し、合計５×１０６細胞をフローサイトメトリーによって分析した。高い（標的）および低い（コントロール）で蛍光ピークを数え、２つの比率を用いて、ＨＢＳＳコントロール集団に対する標的細胞溶解のパーセンテージを確立した。結果を表２３および図２３Ａに示す（本実施例における表は３匹のマウスについての平均を示し、他方図面は示されたサンプルについての個々のマウスからの代表的なヒストグラムである（必ずしも同一のマウスではない））。Ｓ−５９処理株を用いるワクチン接種は、ｕｖｒＡ−突然��異体についてのＡＨ１に対するわずかに良好な応答、およびＳ−５９処理ａｃｔＡ−株に対するｕｖｒＡＢ−突然変異体についてのＡＨ１−Ａ５に対する有意により高い応答を示す。
【０３５１】
（表２３  ０日における、またＳ−５９処理株については２日および３日に示されたワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのインビボ細胞傷害性）
【０３５２】
【表２３】
2007523879.tif 000045
この実験は、全ての群について１４日に、加えて、Ｓ−５９処理株については１５日および１６日に、さらなるワクチン接種を反復した。標識した標的細胞を２０日に注射した。結果を表２４および図２３Ｂに示す。Ｓ−５９処理ｕｖｒＡＢ−突然変異体に対する応答は、追加免疫ワクチン接種で有意に改良することができ、これはＳ−５９処理ａｃｔＡ−株には当てはまらない。
【０３５３】
（表２４  ０および１４日、またＳ−５９処理については２、３、１５および１６日に示されたワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのインビボ細胞傷害性）
【０３５４】
【表２４】
2007523879.tif 000046
ＯＶＡ発現株についてはＳ−５９処理の有りおよび無しを含めた、同様の実験をａｃｔＡ−、ＯＶＡを発現するａｃｔＡ−、およびＯＶＡを発現するａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−を行った。この実験ではＣ５７Ｂ１／６マウスを用いた。６匹のマウスの群を０日（Ｓ−５９処理については１および２日にも）ワクチン接種し、各群の３匹には６日に標識した標的細胞を注射した。残りのマウスには１４日に（Ｓ−５９処理については１５および１６日に）ワクチン接種し、２０日に標識した標的細胞を注射した。この実験においては、ナイーブな標的脾臓細胞をβ−ｇａｌ（低いＣＦＳＥ）またはＳＬ８（高いＣＦＳＥ）でパルスした。結果を表２５および図２３Ｃに示す。再度、Ｓ−５９処理ｕｖｒＡＢ−突然変異体に対する応答は、追加免疫ワクチン接種で有意に増強される。
【０３５５】
（表２５  示されたようにワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのインビボ細胞傷害性）
【０３５６】
【表２５】
2007523879.tif 000047
（実施例２１）
（ｕｖｒＡＢ欠失の有りおよび無しにての、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＳ−５９／ＵＶＡ処理）
実施例７〜９、およびＣａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏ．，８．１４３−１４７（１９９３）に詳細に記載された対立遺伝子交換方法を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株を改変した。この株のビルレンスを減弱化する（ｐＸＯ１＋、ｐＸＯ２−）。
【０３５７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからのｕｖｒＡＢ遺伝子を同定し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥ０１７０４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株、完全なゲノムのセクション１７または１８、配列：ｎｔｓ．２１２６１３−２１７４７１をコードするｕｖｒＡＢ遺伝子）、ｕｖｒＡＢ遺伝子欠失を持つｐＫＳＶ７に基づくプラスミドを、Ｓｐｌｉｃｅ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  （スプライス重複延長）（ＳＯＥ）ＰＣＲおよび以下に記載する工程を用いて構築した（ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢ）：
一次ＰＣＲ反応：各々、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡＢ遺伝子５’および３’末端から上流および下流のほぼ１０００ｂｐｓを増幅した。
【０３５８】
鋳型：Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｔｅｒｎｅゲノムＤＮＡ
プライマー対１：  ｕｖｒＢ．の５’末端から１０００ｂｐ上流の領域の増幅
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：１０２９）
Ｂａ−２２５０９９Ｆ：
【０３５９】
【化１６】
2007523879.tif 000048
（配列番号：３８）（Ｔｍ：７４℃）
Ｂａ−（３’ｕｖｒＡ−Ｒ＋）２２６１０９Ｒ：
【０３６０】
【化１７】
2007523879.tif 000049
（配列番号：３９）（Ｔｍ：１２０℃）（下線を施した配列はｕｖｒＡカルボキシ末端の下流の領域に相補的である）またはＢａ−２２６１０９Ｒ：
【０３６１】
【化１８】
2007523879.tif 000050
（配列番号：４０）（Ｔｍ：７２℃）
プライマー対２：ｕｖｒＡの３’末端から下流の領域の増幅
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：９９０）
Ｂａ−（３‘ｕｖｒＡ−Ｒ＋）２３０７７９Ｆ：
【０３６２】
【化１９】
2007523879.tif 000051
（配列番号：４１）（Ｔｍ：１２６℃）（下線を施した配列はｕｖｒＢアミノ末端の上流の領域に対して相補的である）またはＢａ−２３０７７９Ｆ：
【０３６３】
【化２０】
2007523879.tif 000052
（配列番号：４２）（Ｔｍ：７０℃）
Ｂａ−２３１７６９Ｒ：
【０３６４】
【化２１】
2007523879.tif 000053
（配列番号：４３）（Ｔｍ：７６℃）
二次ＰＣＲ反応：対１の逆方向プライマーおよび対２の順方向プライマーの間の相補性を利用する、ＳＯＥ  ＰＣＲを介する一次ＰＣＲアンプリコンの融合。配列：ｎｔｓ．２２６１１０−２３０７７９＝４６７０ｂｐｓをコードするｕｖｒＡＢの正確な欠失における結果。
【０３６５】
鋳型：きれいにした（ｃｌｅａｎｅｄ）一次ＰＣＲ反応
プライマー対：（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ：１９７３）
Ｂａ−２２５１１８Ｆ：
【０３６６】
【化２２】
2007523879.tif 000054
（配列番号：４４）（Ｔｍ：７８℃）
Ｂａ−２３１７６１Ｒ：
【０３６７】
【化２３】
2007523879.tif 000055
（配列番号：４５）（Ｔｍ：７４℃）
構築：一次ＰＣＲ反応（３温度サイクル）を、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）およびＳｔｅｒｎｅ株ゲノムＤＮＡを用いて行った。４つの一次ＰＣＲ反応は、スプライス重複延長（ＳＯＥ）で用いるプライマーの有りおよび無し双方にて行った（もしＢａ−（３’ｕｖｒＡ―Ｒ＋）２２６１０９ＲまたはＢａ−（３’ｕｖｒＡ−Ｒ＋）２２６１０９Ｒプライマーを含む反応が有意なアンプリコン産物を生じなかったならば、Ｂａ−２２５０９９Ｆ／Ｂａ−２２６１０９ＲまたはＢａ−２３０７７９Ｆ／Ｂａ−２３１７６９Ｒプライマー対との反応からのアンプリコンに対するこれらのプライマーを用いた）。１％アガロースゲルによるａｎｔｈｒａｃｉｓ一次アンプリコンの予測されるサイズ（１０２９ｂｐｓおよび９９０ｂｐｓ）が確認された。反応物はＳ６カラム（ＢｉｏＲａｄ）またはＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ  １０１）で洗浄した。
【０３６８】
鋳型として各一次反応物のほぼ等量（約５μｌ）を利用し、二次ＰＣＲ反応を行った。１％アガロースゲルによる二次ＰＣＲ反応からのＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されるサイズ（１９７３ｂｐｓ）を確認した。
【０３６９】
ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｄｌ  ｕｖｒＡＢアンプリコンをｐＣＲ２．１−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターに挿入した。プラスミドＢｃｒ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｌ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化し、２０３３ｂｐ断片をゲル−精製した。ＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ２０３３ｂｐ断片を、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩでの消化、およびＣＩＡＰでの処理によって調製されているｐＫＳＶ７ベクターに挿入した（ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢ）。ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢにおけるｄｌ  ｕｒｖＡＢ配列の忠実度を確認した。
【０３７０】
ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢプラスミドでの対立遺伝子交換によって、ｕｖｒＡＢ遺伝子をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅから欠失した。エレクトロポレーションによってプラスミドｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株に導入し、クロラムフェニコール抵抗性につき選択した。エレクトロポレーションの頻度を有意に増大させる凍結工程を用い、エレクトロポレーションを行った。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ培養を３７℃にて振盪しつつ、３ｍｌのＢＨＩ０．５％グリセロール中でＯ／Ｎ増殖させた。０．５ｍｌ培養物を、５００ｍｌのＥ−フラスコ中の５０ｍｌ  ＢＨＩ０．５％グリセロール（ＯＤ６００＝０．１）に移した。サンプルを２００ｒｐｍおよび３７℃にてインキュベートした（または２５０ｍｌフラスコ中の０．１〜０．２ｍｌから２５ｍｌのＢＨＩ０．５％グリセロール）。ＯＤ６００＝０．６〜０．８において（ほぼ１時間４５分）、細菌を５００ｍｌのディスポーサブル滅菌フィルター装置に集めた。細菌を各々冷エレクトロポレーション緩衝液（１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １０％グリセロール  ｐＨ７．４）で３×２５ｍｌ洗浄した。細胞を１／２０の元の容量（５０ｍｌ培養用の２．４５ｍｌのｅ−ポレーション緩衝液）に再懸濁し、氷上に保持した。エレクトロポレーションの効力を、−８０℃にてエレクトロコンピテントＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを凍結することにより増強し得る。氷冷または解凍エレクトロコンピテントＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞の０．２ｍｌ懸濁液を、０．２ｃｍギャップエレクトロポレーションキュベット中の０．２ｍｌ細胞に対して１μｇ（１〜５ｕｌのミニプレプ）の「非常に清浄な」未メチル化プラスミドＤＮＡ（コントロール＝ＤＮＡ無し）。次いで、サンプルを１５分間氷上に保持した。次いで、細胞を２５μＦＤ、２００Ω、２．５ｋＶでパルスした（別法として、０．４ｍｌ細胞を４００Ωにおいて０．４ｃｍキュベット中でパルスした）。時定数はほぼ４〜５ｍ秒であった。パルスの直後、１ｍｌのＢＧＧＭ（１０％グリセロール、０．４％グルコースおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＢＨＩ）を加えた。細胞を滅菌したポリプロピレンチューブに移し、振盪しつつ、３７℃にて１時間３０分インキュベートした。細胞をペレット化し、２００μｌのＢＧＧＭに再懸濁し、選択培地上で平板培養した。
【０３７１】
ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢを４１℃にてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体に組み込んだ。ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢを切り出し、許容される温度にて治癒し、その結果、クロラムフェニコール感受性コロニーが得られた。ＰＣＲプライマーは、染色体上での欠失を検出するように設計した。２０％のクロラムフェニコール感受性コロニーは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体中に欠失を保有した。ｕｖｒＡＢ−株のＰＣＲ分析は、ｐＸＯ１ビルレンスプラスミドの保持を示した。
【０３７２】
３７℃において３００ｒｐｍにてＢＨＩを０．３のＯＤ６００まで増殖させることによって、親株と共に、２つのｕｖｒＡＢ−クローン（クローン８およびクローン３２Ａ）をＳ−５９−処理し、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を表２６に示した濃度まで加えた。これらのサンプルをほぼ１時間激しく振盪しつつ３７℃において３００ｒｐｍにてインキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬのアリコットを取り出して力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ量で照射し（ＦＸ−１０１９）、その結果、以下の表２６および図２４に示すように、親株と比較して６ｌｏｇ低下がもたらされた。これは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｒＡＢ−株につき観察されたのと同様なＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにおけるソラレン処理に対する感度を示す。
【０３７３】
（表２６  ソラレンＳ−５９／ＵＶＡ処理でのＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株−対−ｕｖｒＡＢ−突然変異体の減弱化）
【０３７４】
【表２６】
2007523879.tif 000056
（実施例２２）
（ヒト癌のインビボ処置のための本発明のＡＰＣベースのワクチンの使用）
ヒト癌の処置または予防の例として、負荷され、かつ微生物の増殖が減弱化されるように改変された微生物による感染によって活性化された抗原提示細胞を含むワクチンであって、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないワクチンを個体に投与する。微生物は実施例４および５のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットを、例えば、実施例８に記載されたｐＰＬ２組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当業者に常識であるいずれかの方法によって微生物に取り込ませる。次いで、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を負荷し、本明細書中に概説したもののような方法を用いて改変された微生物で活性化させる。
【０３７５】
得られたＡＰＣワクチンを粗製、または好ましくは精製された形態で処方することができる。ワクチン組成物は液体懸濁液として調製することができる。加えて、それらは保存剤（例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール）、安定化剤（例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン）、抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン）、または他の物質のような添加剤とで処方することができる。処方は、滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水、（例えば、生理学的ｐＨに緩衝化されたリン酸塩）、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
【０３７６】
ワクチンは、経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下経路を含めた種々の経路によって、ならびにいずれかの与えられた悪性病または感染症に関係のあるいずれかの経路によって投与することができる。有効量のワクチンが処置のために個体に投与されるであろう。治療的処置では、有効量は所望の免疫応答をもたらすであろう用量であり、ここで、免疫応答は標的化腫瘍の増殖を遅らせ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは腫瘍を完全に排除するのいずれかである。ワクチンの投与は適切な間隔で反復することができ、かつワクチン接種された個体において複数の区別される部位に同時に投与することができる。予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の確立が有意に低下するような保護的免疫応答をもたらす用量である。ワクチン接種方法は単一用量よりなることができるか、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適当な間隔で反復することができる。
【０３７７】
個体の治療的処置は、初期処置として癌と診断された個体で開始することができるか、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、外科的に腫瘍が除去された、あるいは放射線療法で、または化学療法によって処置された個体をワクチンで処置して、個体におけるいずれかの残存する腫瘍を減少または排除し、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。個体の予防的処置は、環境条件または遺伝的素因のためある癌に罹患する増大した危険性を有する個体で開始されるであろう。
【０３７８】
（実施例２３）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化株に基づく組換え腫瘍Ａｇ分泌ワクチンの生成）
抗原分泌およびＭＨＣクラスＩプロセッシングを容易とするためにリステリオシリン（Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ（ＬＬＯ）の切形された形態と融合させたニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を、選択された減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を評価するための実験においてモデル抗原として用いた。腫瘍抗原発現カセットを、独占的ｐＰＬ２組込みベクターで減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のパネルの染色体上の無毒部位に部位−特異的に組み込んだ。組換えＬｉｓｅｔｒｉａ株は、ウェスタンブロット分析によって測定されるように予測された改変ＬＬＯ−ＯＶＡ融合タンパク質を発現し、分泌した（データは示さず）。液体ブロス培養ならびに細胞内増殖動態学におけるこれらの組換え体の各々の増殖もその親から区別することができた。さらに、組換えＯＶＡ発現株は、未改変親株の２のファクター内にあるＩＶ  ＬＤ５０を有することが示された（表２７）。
【０３７９】
（表２７  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの選択された株）
【０３８０】
【表２７】
2007523879.tif 000057
組込みベクターは、複数組換えＬｉｓｔｅｒｉａワクチン候補の迅速な誘導を促進する。単一構築体を、平行して、いずれかの数のユニークな遺伝子バックグラウンドと接合させて、同質遺伝子株を迅速に作成することができる。
【０３８１】
（実施例２４）
（生きていないが、代謝的には活性なＬｉｓｔｅｒｉａを生産するためのソラレン−誘導ＤＮＡ架橋）
Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのエクスビボ抗原送達プラットホームに対する安全性を確認するために、遺伝子的に減弱されたＬｉｓｔｅｒｉａを用いることに加えて、本発明者らは、ソラレンでの処理を通じて十分に不活化することができるが、代謝的には活性であり、細胞に感染し、ファゴリソソームから逃避し、かつクラスＩ経路を介してコードされた抗原の提示を促進するその能力をかくして保有するＬｉｓｔｅｒｉａ株を作成した。作成されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ソラレン、それらが増殖できないように、ＵＶＡ光照射後に細菌のゲノムにおいて不可逆的な架橋を形成する化合物の群での不活化に対して非常に感受性である。ソラレンー媒介ＤＮＡ損傷を修復することができないＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異体株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび他の細菌におけるヌクレオチド−切出修復に必要な、紫外線光抵抗性（ｕｖｒ）ＡＢ遺伝子（ｕｖｒＡＢ）を欠失することによって創製された（Ｓａｎｃａｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７：２９−６７（１９８８））。ソラレンＳ−５９はＨｅｌｉｎｘとして知られたＤＮＡ架橋技術で用いられるＣｅｒｕｓ化合物のメンバーの１つである（Ｌｉｎ，Ｎ．，Ｐｓｏｒａｌｅｎ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９９８）；  Ｈｅｉ，ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３９：２３９−４８（１９９９））。検出の限界までＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ欠失突然変異体を不活化するソラレン濃度において、無傷ＤＮＡ修復メカニズムを有する親非突然変異体株はＵＶＡ光不活化に対して４ｌｏｇ以上感受性が低い（図２５Ｂ）。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢは、ＭＴＴアッセイにおいて測定されたようにそのミトコンドリア活性を維持し、３５Ｓ−メチオニン−標識パルス−チェイス実験によって測定されたように、そのゲノムレパートリーを発現するその能力を保持した（図２６および図１０）。不活化親株はそうではなかったが、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢは、その遺伝子レパートリーの継続した発現を示した。不活化親株の発現レベルは有意に減少し、これは、十分な不活化に必要なＳ−５９濃度におけるＳ−５９／ＵＶＡ処理が、同様にコードされた腫瘍抗原の発現を含めた、Ｌｉｓｔｅｒｉａ遺伝子産物の発現を有意に減少させることを示す。
【０３８２】
（実施例２５）
（生きていないＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株はＤＣに感染し、ファゴリソソームから逃避する能力を保有する）
代謝活性を維持するに加え、樹状細胞（ＤＣ）の感染に際して、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株によるＭＨＣクラスＩ経路への効果的な抗原負荷を示すのは重要である。本発明者らは、今回、ＬＬＯをコードするｈｌｙ遺伝子の欠失によりファゴリソソームから逃避することができないＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異体（ＤＰ−Ｌ４０２７）でのＤＣの感染は、ＭＨＣクラスＩの意味において、抗原の提示を排除することを示した。
【０３８３】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ感染ＤＣのファゴリソソームからの逃避を示すために、本発明者らは、蛍光顕微鏡測定によって可視化することができる宿主−細胞アクチンフィラメント、いわゆる「アクチンクラウズ」によって細胞質Ｌｉｓｔｅｒｉａが囲まれるという事実を利用する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ表面でのアクチンの重合は、細菌ＡｃｔＡタンパク質および他の宿主細胞因子によって媒介される。ネズミＤＣ細胞系ＤＣ２．４を、３７℃にて３０分間、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｔ、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔＬＬＯ（ＤＰ−Ｌ４０２７）で、１の感染多重度（ＭＯＩ）にて感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって注意深く除去し、ゲンタマイシンの存在下でＤＣを３７℃にてさらに５時間インキュベートして、細胞外細菌の成長を妨げた。野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢで感染されたＤＣ２．４は、Ｌｉｓｔｅｒｉａの細胞質局所化に典型的な、典型的なアクチンクラウズまたはアクチンコメットテイル（ｃｏｍｅｔ  ｔａｉｌ）を示した（図２７）。しかしながら、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬＬＯヌル突然変異体で感染させたＤＣ２．４細胞において、アクチンおよびＬｉｓｔｅｒｉａの共局所化は観察されず、これは、細菌がファゴリソソームから逃避することができなかったことを示す。この結果は、これらのＤＮＡ修復突然変異体が、ファゴリソソームから逃避し、感染した細胞のサイトゾルに入る能力を保有することを示し、そこで、抗原は分泌することができ、これは、ＭＨＣクラスＩ経路を介する直接的提示のための必要な工程である。また、前記実施例１７および図２１を参照されたし。
【０３８４】
（実施例２６）
（生きていないＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢは、感染された樹状細胞（ＤＣ）のＭＨＣクラスＩ経路に抗原を効果的に負荷する）
感染した細胞内のファゴリソソームを逃避するＳ−５９ソラレン不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢのユニークな能力のため、サイトゾルＬｉｓｔｅｒｉａによって分泌された遺伝子産物はプロセッシングされ、ＭＨＣクラスＩ経路を介して提示される。ＤＣのＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するＳ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢの能力をテストするため、ＤＣ２．４細胞を、異なる濃度のＳ−５９で不活化された、ＯＶＡ−発現Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡで１の感染多重度（ＭＯＩ）にて感染させた。親ＬｉｓｔｅｒｉａＯＶＡおよび加熱−死滅Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡはコントロールとして供した。Ｌｉｓｔｅｒｉａの貪食作用に続くクラスＩ分子へのＤＣ２．４によるＯＶＡペプチドの提示は、Ｂ３Ｚ細胞とのインキュベーションの後に測定した。Ｂ３Ｚは、ネズミＫｂクラスＩ分子上に提示されたＯＶＡ２５７−２６４（ＳＬ８）エピトープに特異的なＬａｃＺ−誘導性ＣＤ８＋Ｔ−細胞ハイブリドーマである（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３６９−７６（１９９４））。Ｂ３Ｚ細胞へのＳＬ８のクラスＩ−制限提示の結果、Ｂ３Ｚによるβーｇａｌ合成の誘導がもたらされる。生じたβ−ｇａｌの量は発色性基質ＧＰＲＧの加水分解によって測定することができ、ＡＰＣの表面に提示されたＳＬ８／Ｋｂ複合体の量の指標である。図９Ａおよび９Ｂに示されたように、同族親株はそうでなかったが、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ株は、増殖するその能力とは独立してＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するその能力を維持した（これは、実施例１１に記載されたのと同一のデータである）。７０〜１００ｎＭのＳ−５９濃度を用いる十分な不活化においてさえ、９０％を超えるＢ３Ｚ活性化が維持された。対照的に、無傷ＤＮＡ修復を持つ親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡ株は、より高い濃度のＳ−５９を不活化で用いる場合、Ｂ３Ｚ  Ｔ−細胞ハイブリドーマを活性化するその能力を喪失した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ株とは対照的に、Ｂ３Ｚ活性化、およびＢＨＩ寒天プレート上でコロニーを形成する親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡ株の能力は密接に関連し、これは、生きたＬｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡのみがＤＣ２．４細胞を感染でき、かつＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷できることを示唆する。さらに、加熱−死滅化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡはＢ３Ｚ活性化をもたらさなかった。この結果は、ＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するＬｉｓｔｅｒｉａの能力は、ソラレン−媒介ＤＮＡ損傷を修復するその能力を妨げるように改変された、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる増殖ようの要件とはリンクできないことを示す。
【０３８５】
一次ＤＣのＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡの能力をテストするために、未成熟ネズミＢＭ−ＤＣを、十分に不活化されたＳ−５９ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡで感染させた。生きたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ、親株およびＬ４０２７をコントロールとして供した。図２８に示すように、ＯＶＡ−発現株で感染させたＢＭ−ＤＣはインビトロでＢ３Ｚ細胞を刺激したが、親株は刺激しなかった。生きたおよび生きていないＳ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＵＶＡ突然変異体株（Ｌ５０２９  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ）の間に有意な差は観察されず、これは、一次ＤＣのＭＨＣクラスＩ分子に、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢの増殖する無能力にもかかわらず、ファゴリソソームからサイトゾルへの細菌の逃避に続いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−由来ペプチドが効果的に負荷されることを示唆する。重要なことには、加熱−死滅化によって不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ  ＯＶＡは、ＭＨＣクラスＩ経路においてＯＶＡペプチドのいずれかの有意な提示をもたらさず、これは、加熱−死滅化細菌とのＤＣのインキュベーションの結果、ＭＨＣクラスＩ分子のいずれかの有意な抗原負荷をもたらされないことを示唆する。
【０３８６】
（実施例２７）
（ＬｉｓｔｅｒｉａはヒトＤＣを直接的に感染し、活性化させる）
優れた抗原送達プラットホームの開発のためには、ＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を効果的に送達することに加え、ＤＣの活性化／成熟化が必要であると広く考えられる。イン・サイチュでは、未成熟ＤＣは末梢組織に存在し、そこで、それは継続的に抗原を取り込み、それを加工するが、それは、活性化／成熟化プロセスを開始するいずれの細菌が提供するかのような活性化刺激の遭遇であり、ケモカイン受容体の変調、およびリンパ節を排出するＴ細胞領域へのＤＣのＴ細胞領域への移動に至る。我々は、ヒト単球−由来ＢＣの表現型成熟化およびサイトカイン生産を誘導する野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ（Ｌ−４０５６）の能力を評価した。図２９に示すように、ヒト未成熟ＤＣとＬｉｓｔｅｒｉａとの遭遇は、活性化マーカー、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ（図２９Ａ）、ならびに成熟化マーカー、ＣＤ８３（図２９Ｂ）のアップーレギュレーションに導いた。さらに、Ｌｉｓｔｅｒｉａへのヒト未成熟ＤＣの暴露は、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αのような高レベルのプロ−炎症性サイトカインを分泌するその能力によって示されるように、その免疫―刺激能力を増加させた（図２９Ｃ）。
【０３８７】
（実施例２８）
（Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡはインビトロにてＯＶＡ−特異的免疫性を誘導する）
我々は、インビボにてＯＶＡ−特異的免疫性を誘導するＳ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡワクチンの能力を評価した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡの１×１０８粒子で静脈内ワクチン接種した。ＯＶＡ−特異的免疫性の誘導はワクチン接種から７日後に評価した。顕著には、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡは、図３０に示すように、有意なＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示したが、親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡ株はそうでなかった。さらに、加熱―死滅化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡでのマウスのワクチン接種は、ＯＶＡ−特異的免疫性の誘導をもたらさなかった。
【０３８８】
（実施例２９）
（天然（ＣＡＰ１）または増強されたアゴニスト細胞障害性Ｔリンパ球エピトープ（ＣＡＰ−１−６Ｄ）いずれかを含む全長ＣＥＡを発現する２つの組換え減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ株の構築）
ＣＥＡは、皮内で誘導された消化系上皮および胎児結腸の腺癌で見出される１８０ｋＤａの大きなタンパク質である。ＣＥＡはＧＰＩ−アンカーによって細胞の膜に付着される。該タンパク質は７つの免疫グロブリン−様ドメインを含み、Ｃ−末端は、非特異的交差反応タンパク質、ＮＣＡ、癌性胚抗原遺伝子ファミリーのメンバーと相同性を示す。我々は、ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限ＣＥＡ天然Ｔ細胞エピトープＣＡＰ１（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）（配列番号：５１）または癌患者においてＣＥＡ−特異的免疫性を誘導するのにより優れていることが示されたエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Ｔリンパ球ペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ）（配列番号：５２）（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４５７０−７（１９９７））いずれかを含む全長ＣＥＡを構築することを提案する（表２８）（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１））。
【０３８９】
（表２８）
【０３９０】
【表２８】
2007523879.tif 000058
ＣＥＡ腫瘍抗原発現プラスミドをｐＰＬ２骨格、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムに部位−特異的に組み込まれるベクター（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４１７７−８６（２００２））上に構築する。２つのプラスミドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬＬＯに由来する分泌シグナルおよびＰＥＳＴエレメントが全長ＣＥＡ  ｃＤＮＡと遺伝子的に融合されるように構築されるであろう。遺伝子構築体の５’末端から出発し、融合タンパク質は、ＣＥＡに融合した細菌分泌を促進するためのＬＬＯの末端領域よりなる。ドメインの正確な連結は、重複ＰＣＲによって達成されるであろう。全てのプラスミド構築対の忠実度は、ＤＮＡ配列決定によって確認されるであろう。
【０３９１】
（実施例３０）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ株Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢに組み込まれたｐＰＬ２  ＣＥＡｗｔおよびｐＰＬ２  ＣＥＡ−６１０Ｄを含む２つの減弱化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の誘導、およびＣＥＡ抗原の発現および分泌の確認）
ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に隣接するｐＰＬ２−ＣＥＡ構築体の、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢのゲノムへの組込みは、Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４１７７−８６（２００２）によって従前に記載されたように達成される。簡単に述べれば、まず、形質転換によってプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＳＭ１０に導入し、次いで、接合によってＬｉｓｔｅｒｉａの所望の株に導入する。Ｌｉｓｔｅｒｉａトランス−接合体はクロラムフェニコール（ｐＰＬ２）およびストレプトマイシン（Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）選択培地によって選択され；このプロセスの効率はほぼ１×１０−４である。トランス−接合体の純度を確認し、細菌染色体へのｐＰＬ２骨格の組込みを確認するために、限定された数の候補コロニーを、新鮮な選択培地への画線培養によって３回継代する。ＬｉｓｔｅｒｉａゲノムへのＣＥＡ構築体への正確な取込みはコロニー−ＰＣＲによって確認される。
【０３９２】
抗原発現およびＬＬＯ−ＣＥＡ融合タンパク質の分泌は、全細胞溶解物、およびＴＣＡ沈殿細菌培養流体のウエスタンブロッティングによって測定される。ＬＬＯ−特異的ウサギポリクローナル抗体およびＣＥＡ−特異的モノクローナル抗体を用いて、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからのＬＬＯ−ＣＥＡ融合タンパク質の発現および分泌を確認する。ＣＥＡを発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の生物学的特性をその各親株と比較することができる。新鮮な培地への静止相培養物の１：１００希釈による接種に続いてのブレイン・ハート−・インフージョン（ＢＨＩ）ブロスにおける増殖動態学が測定される。過去に、我々は、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて同様なまたはより大きなサイズのタンパク質を発現させた。しかしながら、細菌における哺乳動物遺伝子産物の組換えタンパク質発現は、各個々のタンパク質に依存した挑戦を主張する。もしＬｉｓｔｅｒｉａにおけるＣＥＡ発現が問題を持ち出すならば、ＣＥＡの断片またはＴ細胞ミニ−エピトープいずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株を構築することができる。ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限ＣＥＡ天然Ｔ細胞エピトープＣＡＰ１（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）（配列番号：５１）またはエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Ｔリンパ球ペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ）（配列番号：５２）、我々の現存する発現構築体のオボアルブミン（ＯＶＡ）内にイン−フレームにて埋め込まれ、それにより、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬＬＯに由来する分泌シグナルおよびＰＥＳＴエレメントは遺伝子的にＯＶＡに融合される。Ｔ細胞ミニ−エピトープの発現および免疫原性は、ｇｐ７０Ｔ細胞ミニ−エピトープ、ＡＨ１およびＡＨ１−Ａ５およびＢ１６Ｔｒｐ１、Ｔｒｐ２、およびｇｐ１００で以前に示されているように保存されている（データは示さず）。
【０３９３】
（実施例３１）
（Ｓ−５９／ＵＶＡ処理によってＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株を十分に不活化するが、最適な代謝活性、腫瘍抗原発現、抗原提示細胞の感染およびファゴリソソーム逃避を保持する条件の確率）
遺伝子発現の結果としての代謝活性は、最小数の架橋で最良に維持される。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡワクチンを十分に不活化し、抗原発現レベルを無傷のまま残す最小量のＳ−５９／ＵＶＡ処理のための条件は容易に確立することができる。不活化条件の例は、ＯＤ６００＝０．５のｌｏｇ−相培養における２００ｎＭまでのＳ−５９ソラレンの付加、続いての、培養が１の光学密度に到達した場合の６Ｊ／ｍ２のＵＶＡ光での不活化である。不活化条件は、Ｓ−５９の濃度、ＵＶＡ用量、ＵＶＡ処理に先立ってのＳ−５９暴露の時間を変化させることによって、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株の細菌増殖の間における処理の時間を変化させることによって最適化される。親Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はコントロールとして用いられる。Ｌｉｓｔｅｒｉａの不活化（ｌｏｇ−死滅）は、ＢＨＩ（ブレイン・ハート・インフージョン）寒天プレート上でコロニーを形成する細菌の無能力によって測定される。加えて、３５Ｓ−パルス−チェイス実験を用いてＳ−５９／ＵＶＡ不活化ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＬＯおよびｐ６０のようなＣＥＡの発現およびビルレンス因子を確認して、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化後に新しく発現されたタンパク質の合成および分泌を測定することができる。３５Ｓ−代謝標識を用いるＬＬＯおよびｐ６０の発現はルーチン的に測定することができる。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡは３５Ｓ−メチオニンの存在下で１時間インキュベートされる。抗原発現、およびＬＬＯ−ＣＥＡ融合タンパク質、内因性ＬＬＯ、およびｐ６０の分泌は全細胞溶解物、および細菌培養流体のＴＥＡ沈殿双方で測定されるであろう。ＬＬＯ−、ｐ６０−およびＣＥＡ−特異的モノクローナル抗体を免疫沈澱で用いて、不活化後に、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの継続した発現および分泌を確認する。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡの発現レベルは、優れた抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導をもたらす我々の現在のＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチン株と比較されるであろう。評価された遺伝子産物の発現レベルに対する限定的影響を持つ再現可能な十分な不活化に導くＳ−５９／ＵＶＡ条件を選択することができる。
【０３９４】
（実施例３２）
（ＭＨＣクラスＩという状況ＣＥＡの効果的な提示をもたらす、不活化（Ｓ−５９／ＵＶＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ＵＶＲ  ＡＢ  ＣＥＡワクチンでのヒト未成熟樹状細胞（ＤＣ）の感染のためのプロトコルおよびワクチン株の確立）
ＤＣのエクスビボ感染のための最適条件は３つの独立したアッセイ：（１）感染に際してのヒト未成熟ＤＣの表現型およびサイトカインプロフィールの変化、（２）同種異系Ｔリンパ球応答を誘導するＬｉｓｔｅｒｉａ−感染ＤＣの能力、および（３）インビトロでＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞系を刺激するＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ感染ＤＣの能力の結果に基づいて決定される。
【０３９５】
（１．生きたおよび十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣＥＡ株で感染されたヒト未成熟ＤＣの表現型およびサイトカイン分泌プロフィールの測定および比較。ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような通常に使用される活性化シグナルとＬｉｓｔｅｒｉａ−感染ヒトＤＣの活性化との比較）
一次ヒトＤＣを感染し、それを活性化する、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ＵＶＲ  ＡＢ  ＣＥＡ株の効率を特徴付け、それを最適化することができる。ヒトＤＣを、従前に記載されているように（Ｆｏｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：１１０３３−４１（２００２））、不動化末梢血液から豊富化する。簡単に述べれば、従前に記載されているように（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：１２９７−３０２（１９９５））、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）上での遠心によって得、次いで、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通す密度遠心によって単球枯渇させる。単球−枯渇ＰＢＭＣを、外因性サイトカインを添加しない、１０％のプールしたヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でインキュベートする。３７℃における１０％ＣＯ２を含む湿潤化インキュベーター中での２４時間の培養の後、１５％（ｗ／ｖ）メトリザミドグラジエント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を通す遠心によってＤＣをさらにリンパ球から豊富化する。豊富化されたＤＣ集団の表現型はフローサイトメトリー（ＨＬＡ−ＤＡ発現、およびＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６発現の欠如）およびデキストラン接種によって確認される。ＤＣのＬｉｓｔｅｒｉａでの感染性を評価するために、ＤＣを、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株と共に異なるＭＯＩにて１時間インキュベートする。生きたＬｉｓｔｅｒｉａは比較として用いる。いずれの細胞外Ｌｉｓｔｅｒｉａも除去するための広範な洗浄の後、感染したＤＣを５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンの存在下でさらにインキュベートして、細胞外細菌を死滅させる。ＤＣのＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株での感染に際しての表現型変化を、感染後の異なる時点でフローサイトメトリーを用い、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現を測定することによって評価する。Ｔヘルパー−１およびＴヘルパー−２タイプサイトカインの発現は、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、感染したＤＣ培養の上澄みから測定する。感染および活性化条件は、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような通常に使用される刺激体と比較する。インビトロでヒトＤＣの優れたかつ一定した刺激および活性化、ならびに親生Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と最も似ているサイトカインの分泌をもたらす感染条件を選択する。もしサイトカインを用いることのない末梢血液から単離されたＤＣの総じての感染性が低ければ、密度勾配遠心に先立ってのＤＣの感染を評価する。さらに、単球−由来ＤＣのようなＤＣのさらなる源は、生きていないおよび生きたＬｉｓｔｅｒｉａに対するその感染性を評価する。簡単に述べれば、陰性選択を用いてヒト単球を豊富化し、１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４を補足した、１×１０６細胞／ｍＬの培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ）に懸濁させる。培養の６〜７日後に、インビトロ培養し��ＤＣ集団の表現型を、フローサイトメトリーおよびデキストラン摂取によって確認する。表現型の変化、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａ感染に際しての単球−由来ＤＣのサイトカイン分泌パターンを従前に記載されているように評価する。
【０３９６】
（２．インビトロで同種異系Ｔ細胞を活性化する、生きたまたは十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣＥＡ株で感染させたヒト未成熟ＤＣの刺激能力の測定および比較）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ−感染ＤＣ集団の刺激能力に取り組むために、混合白血球反応（ＭＬＲ）において一次アロー−反応性Ｔ細胞を刺激するその能力を測定することができる。その活性化／成熟化状態に依存する、インビボで免疫応答を誘導するＡＰＣの相対的能力は、インビトロで同種異系Ｔ細胞応答を刺激するその能力によって反映されると広く信じられている（Ｊｕｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１７：２１１（２００２））。簡単に述べれば、ＤＣを単離し、十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡで感染させる。感染された細胞集団の表現型はフローサイトメトリーによって確認される。種々の数の照射された（３０００ｒａｄ）ＤＣを、９６−ウェルＵ−底部プレート中で５×１０４同種異系レスポンダーと共に培養する（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。ランダムドナーからのＰＢＭＣをレスポンダーとして用いる。６日後、培養を１μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、［３Ｈ］チミジンの取込を、シンチレーションカウンターで放射能を測定することによって決定する。生きていないＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣの刺激能力を、生きたＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣ、ならびにＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような刺激体を用いて活性化されたＤＣと比較する。
【０３９７】
（３．インビトロでＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞系を活性化するＬｉｓｔｅｒｉａ−感染ヒトＤＣ能力の評価。生きたまたは十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａいずれかで感染された未成熟ヒトＤＣと、ペプチド−パルスドＤＣとの比較）
表現型の変化、サイトカイン分泌のプロフィール、ならびにＤＣのアロー−刺激能力は、インビボで抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するＤＣの能力についての間接的尺度を表す。十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株によって発現された組換え腫瘍抗原を発現するＤＣの能力は、Ｌ．Ｆｏｎｇによって創製されたＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞系の活性化に基づいて評価される（未公表データ）。簡単に述べれば、Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ  ３−１に記載されているように、ＨＬＡ＊Ａ０２０１陽性ドナーの末梢血液からＤＣを単離する。最適条件下で感染させた種々の数の照射（３０００ｒａｄ）ＤＣを、５×１０４ＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞と共に９６−ウェルＵ−底プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で共培養した。２４時間後、細胞上清を収集する。Ｔ細胞活性化を、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−２分泌に基づいて測定する。分泌されたサイトカインを、商業的に入手可能なＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定する。生きていないＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣの刺激能力を生きたＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣ、ならびにＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような刺激体を用いて活性化したＤＣと比較する。
【０３９８】
（実施例３３）
（インビトロでＣＥＡ−特異的免疫性を感作し、リードＬｉｓｔｅｒｉａ株を選択する、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−負荷一次ヒトＤＣの能力のさらなる開発のための確認）
Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ−感染ＤＣが、インビトロでナイーブなＣＥＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を感作できることを確認するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡで確立された最適条件下で感染させたヒト未成熟ＤＣを用いて、インビトロでナイーブなＴ細胞を刺激する。天然または改変されたＴ細胞エピトープいずれかを含むリードＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株は、３つの独立したアッセイ：（１）ＤＣ−感作Ｔ細胞培養の［３Ｈ］チミジン取込；（２）５１Ｃｒ放出アッセイで測定された、感作ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞培養の細胞傷害性活性；および（３）ペプチド：ＭＨＣテトラマー染色によって測定されたＣＥＡ−特異的Ｔ細胞の頻度によって測定して、ナイーブなＣＥＡ−特異的Ｔ細胞応答を誘導するその能力に基づいて選択される。最適感染をＤＣの表現型変化によって確認し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現、ならびに感染したＤＣによって分泌されたサイトカインプロフィールを測定することによって評価する。一次Ｔ細胞応答の誘導のために、一定数のＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球（２×１０５／ウェル）を種々の数の照射された（３，０００Ｒ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ−負荷ＤＣとともに、９６−ウェルの丸底マイクロタイタープレート中で７日間共インキュベートする。６日後、培養を１μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、［３Ｈ］チミジンの取込を、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）で放射能を測定することによって決定する。さらに、ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞の誘導を細胞傷害性Ｔ細胞アッセイで評価する。簡単に述べれば、５×１０６ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球を平行して、５×１０６細胞／１．５ｍｌ培地にて、２４−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で、１０：１の比率で、照射された（３，０００Ｒ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ−負荷ＤＣと共に培養する。Ｔ細胞の細胞傷害性活性は、７日後に、標準的な４時間５１Ｃｒ−放出アッセイで評価する。簡単に述べれば、標的細胞系ＳＷ４０３、ＳＷ１４１７、Ａ３７５、およびＴ２を２５０μＣｉの［５１Ｃｒ］中で２時間インキュベートする。この標識工程の間に、Ｔ２細胞もまたＨＬＡ＊０２０１−制限標的ペプチドＣＡＰ１およびＣＡＰ１−６Ｄ無くして、またはそれと共にインキュベートする。標的細胞系をＲＰＭＩで３回洗浄し、９６−ウェルＵ−底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で少なくとも５，０００標的／ウェルと共に三連で平板培養する。エフェクター細胞を記載されたエフェクター／標的比にて５１Ｃｒ−標識標的細胞と共にインキュベートする。４時間の培養の後、上清を収集し、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）でカウントする。パーセント特異的溶解は、式：１００％×（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）によって計算される。最大放出は、０．５％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中での標的細胞の溶解によって測定される。最後に、従前に記載されているように（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ���Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１）、ＣＡＰ１またはＣＡＰ１−６Ｄを提示するＭＨＣ／テトラマーを用い、インビトロ感作の後のＣＥＡ−特異的Ｔ細胞の頻度を測定することができる。インビトロ感作前に得られた低温保存ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、平行して、インビトロ感作培養Ｔ細胞培養物で分析する。合計１×１０６細胞が、室温にて３０分間で、対応するＨＬＡ＊Ａ０２０１フィコエリスリン−標識ＭＨＣ／テトラマーで染色されるであろう。（陽性ゲートで用いられる）ＣＤ８、およびＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６（陰性「ダンプ」ゲート）に対する抗体を推奨される濃度で加え、４℃にて３０分間インキュベートする。染色に続き、サンプルを２回洗浄し、４−色フローサイトメトリーで分析する。我々は、テトラマー染色のために以前バックグラウンドを確立した。２０人のボランティア血液提供者を同一方法で評価し、彼らは、各々、ＣＥＡ６０５−６１３および６１０Ｄテトラマーに対して０．３０％±０．１８％および０．２７％±０．１４％を有した（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１））。
【０３９９】
（実施例３４）
（異種抗原としてのプロテイナーゼ３またはＰＲ１の使用）
前記した具体的な実施例で概説した手法のいくつかは、改変されたＬｉｓｔｅｒｉａによって発現される抗原としてのＣＥＡ抗原の使用を記載するが、当業者であれば、同様な手法を用いて、プロテイナーゼ−３またはプロテイナーゼ−３由来抗原のような異なる抗原を発現する改変されたＬｉｓｔｅｒｉａを調製して、インビトロまたはエクスビボで樹状細胞を感染させ、負荷および活性化／成熟化を行うことができるのは容易に認識するであろう。当業者であれば、次いで、得られたＤＣワクチンを動物または患者に投与して、プロテイナーゼ−３および／またはＰＲ１に対する免疫応答を誘導することができるのも認識するであろう。
【０４００】
例えば、前記実施例に記載されたＬ４０２９−ｕｖｒＡＢ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、プロテイナーゼ−３遺伝子および／またはＰＲ１エピトープをコードするｐＰＬ２ベクター骨格などを含むベクターで改変して、Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに抗原−発現配列を取り込むことができる。１つの例において、ＰＲ１抗原は、ＰＲ１エピトープが埋め込まれている、ＯＶＡに融合された切形ＬＬＯ配列を含むＬＬＯ−ＯＶＡ／ＰＲ１融合タンパク質のような融合タンパク質の一部として発現させることができる。改変されたＬｉｓｔｅｒｉａによって発現され得る抗原性タンパク質（ＬＬＯ−ＯＶＡ／ＰＲ３）のような配列を図３１に示す。
【０４０１】
（実施例３５）
（ファゴリソソームから逃避し、クラスＩ抗原提示を促進する突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａの能力の測定）
抗原提示細胞のファゴリソソームを逃避し、該細胞によるクラスＩ抗原提示を促進する特定の候補突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａの能力を評価するための例示的プロトコルは以下の通りである：まず、ＤＣ２．４細胞をカバーグラス上で増殖させる。次いで、細胞を所望のＬｉｓｔｅｒｉａ株で感染させる（ＭＯＩ＝１００）。０．５ｈｐｉにおいて、細胞を濯いで遊離Ｌｉｓｔｅｒｉａを洗浄除去する。１ｈｐｉにおいて、ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬで加える。５ｈｐｉにおいて、カバーグラスを洗浄し、３．５％ホルムアルデヒド中で固定する。カバーグラスをブロックし、ウサギ−抗Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体（Ｄｉｆｃｏ）で染色し、ヤギ−抗ウサギＦＩＴＣ二次（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で検出する。アクチンをファロイジン−ローダミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で検出する。カバーグラスをＶｅｃｔａｍｏｕｎｔ＋ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で設置し、調査する。前記した実施例１７および実施例２５も参照されたし。
【０４０２】
（実施例３６）
（ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびＬｉｓｔｅｒｉａワクチンでの感染）
ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびＬｉｓｔｅｒｉａワクチンでの感染のための例示的プロトコルの概略を以下に掲げる。
【０４０３】
材料：ヒト末梢血液（血液提供者からのバフィコートが好ましい）；Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ｄＰＢＳｗ／ｏ  Ｃａ、Ｍｇ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）；ＲＰＭＩ−１６４０  ｗ／Ｌ−グルタミン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）；胎児ウシ血清、明確化、加熱不活化（ＨｙＣｌｏｎｅ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）−５００Ｕ／μＬで作成し、−２０℃で貯蔵されたストック溶液；２００Ｕ／μＬで作成され、−２０℃で貯蔵されたストック溶液；Ｃｏｓｔａｒ  ２４−ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）。
【０４０４】
単球単離培地（ＭＩＭ）：溶液１（Ｉｓｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｅｒｃｏｌｌ）を作成するために、５０ｍＬのＮａＣｌ溶液（５００ｍＬ  ｄＨ２Ｏ、４３．８４ｇのＮａＣｌ（１．５Ｍ））を４５０ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌに加え、混合する。溶液２（ＰＢＳ／クエン酸塩）は、１００ｍＬのｄＨ２Ｏ、２０５．６ｍｇのＮａＨ２ＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１．４９ｍＭ）、１．３０ｇのＮａ２ＨＰＯ４（９．１５ｍＭ））、８．１８ｇのＮａＣｌ（１３９．９７ｍＭ）、および３．８２ｇのＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７＊２Ｈ２Ｏ（１３ｍＭ）を混合し、ｐＨを７．２とすることによって調製される。次いで、２５０ｍＬのｉｓｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｅｒｃｏｌｌを２５０ｍＬのＰＢＳ／クエン酸塩と混合する。溶液を滅菌濾過し、４℃で貯蔵する。
【０４０５】
培養培地：ＲＰＭＩ−１６４０ｗ．ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％胎児子牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅからの明確化された加熱不活化ＦＣＳを用いる）。
【０４０６】
方法：ＦｉｃｏｌｌおよびＭＩＭを室温まで温める。２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌを２５０ｍＬ円錐試験管の各々に入れる。血液をｄＰＢＳで二倍希釈し、十分に混合する。２５ｍＬの血液を各試験管中のＦｉｃｏｌｌの頂部に重ねる。試験管を１８〜２０℃にて３０分間、４００×ｇにおいて遠心する。
【０４０７】
単核界面中核をグラジエントから注意深く収集し、清浄な５０ｍＬ試験管に入れる。試験管の残りをｄＰＢＳで満たす。試験管を１００×ｇにて１５分間遠心する。これはリンパ球および単球をペレット化するが、血小板を浮遊したままとする。上清を吸引する。試験管の残りにｄＰＢＳを満たし、遠心し、吸引する工程を、合計３回の洗浄の間に、さらに２回反復する。
【０４０８】
ペレットを２０ｍＬのｄＰＢＳに再懸濁させる。懸濁液を２０ｍＬのＭＩＭに重ねる。サンプルを室温にて３５分間、４００×ｇで遠心する。単球を界面から収集し、培養基を含有する清浄な試験管に移す。もし細菌と共に用いるためにＤＣを培養するならば、抗生物質を用いてはならない。
【０４０９】
サンプルを４００×ｇにて１０分間遠心し、上清を吸引する。ペレットをｄＰＢＳ中で４回洗浄する。最後の洗浄後、細胞ペレットをＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳに再懸濁する。次いで、トリパンブルーを用い、または自動カウンターを用いてヘマサイトメーターでサンプルをカウントする。細胞懸濁液をｍＬ当たり１×１０６細胞まで希釈する。細胞懸濁液の各ｍＬについて、５００Ｕ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２００Ｕ  ＩＬ−４を加える（もしストックが前記したように作成されれば、各々のｍＬ当たり１μＬ）。ウェル当たり１ｍＬをＣｏｓｔａｒ２４−ウェルプレートに平板培養する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度に４８時間置く。
【０４１０】
２日目に、樹状細胞用のフィーディング培地を作成する。これは５００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２００Ｕ／Ｍｌ  ＩＬ−４と共に、培養されたウェル当たり０．５ｍＬ培養基（用いる前に３７℃まで加温）よりなり、各ウェルの頂部からの０．５ｍＬを吸引し、０．５ｍＬの新鮮なフィーディング培地と置き換える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度にさらに４８時間置く。フィーディングを４日に反復する。５日に、細胞は用いる準備ができている。細胞は、常に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４含有培地中に維持しなければならず、あるいはそれをマクロファージに戻す。樹状細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を見るサイトメーターで表現型により調べる。
【０４１１】
ヒトＤＣのＬｉｓｔｅｒｉａ感染：  
第５日樹状細胞（ＤＣ）をペレット化し、ｍＬ当たり２×１０６細胞にて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む新鮮な培地に再懸濁させる。５００μＬの懸濁液を２４ウェルプレートの各ウェルに小分けする。成熟化刺激体または細菌を５００μＬ中に加える。１μｇのＬＰＳを成熟化制御のために用いる（１０００ＵのＩＦＮ−γまたは１μｇのｓＣＤ４０Ｌを加えて、この応答を高めることができる）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染では、ＤＣ当たり１０〜１００Ｌｉｓｔｅｒｉａの間を用いる。細胞を１時間感染し、次いで、細胞外細菌を洗浄して除去し、細胞を、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する培地に再懸濁させる。ｓＣＤ４０Ｌを加えて、ＤＣの生存を増強させ、より大きなＩＬ−１２ｐ７０の放出を促進する。１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γを加えて、成熟化およびＩＬ−１２ｐ７０分泌を高める。ＤＣを、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を見るサイトメーターで表現型により調べる。
【０４１２】
（実施例３７）
（無胞子Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓワクチン株）
ｓｐｏＩＩＥイン−フレーム欠失。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのｓｐｏＩＩＥ領域は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中の同一遺伝子に対する相同性によって同定される。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｐｏｉｉｅのイン−フレーム欠失を単離するために、ｓｐｏＩＩＥ遺伝子をまずＰＣＲによって増幅し、それをｐｃｒ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化する。次に、ｓｐｏＩＩＥ遺伝子のほとんどは、重複延長（ＳＯＥ）による遺伝子スプライシングの技術を用いて欠失される（Ｈｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：５２８−３５（１９９０））。このイン‐フレーム欠失ｓｐｏＩＩＥ遺伝子を、クロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を担い、４２℃では複製することができないシャトルベクターｐＫＳＶ７にクローン化する（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７４：７０５−１１（１９９２））：次いで、欠失されたｓｐｏＩＩＥ遺伝子を含むｐＫＳＶ７をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにエレクトロポレーションし、細胞をクロラムフェニコールの存在下で４２℃で増殖させて、プラスミドが相同組換えによってｓｐｏＩＩＥ遺伝子に組み込まれた株を選択する。クロラムフェニコール選択無しの３０℃におけるさらなる増殖により、プラスミドが切り出され、喪失する。クロラムフェニコール−感受性株は少なくとも１％見出され、その約半分は欠失されたｓｐｏＩＩＥ対立遺伝子を含むはずである（Ｃａｍｉｌｌｉら、（１９９３））。欠失の存在はＰＣＲおよびサザーンブロット分析によって確認される。
【０４１３】
ｓｐｏＩＩＥ／ｕｖｒＡＢ二重欠失株。ｓｐｏＩＩＥ欠失株で開始し、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子のイン−フレーム欠失を行う。もう一度、注目する遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにクローン化する。次いで、ＳＯＥ技術によってｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子のほとんどを欠失させるべきである。このイン−フレーム欠失ｕｖｒＡＢ領域をｐＫＳＶ７にクローン化し、構築体をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｐｏＩＩＥ欠失株にエレクトロポレーションする。クロラムフェニコール−抵抗性を４２℃で選択して、プラスミドのｕｖｒＡＢ領域への組込みにつき選択する。薬物選択無しの３０℃における増殖を行って、プラスミドを喪失した分離体の増殖を促進する。クロラムフェニコール−感受性コロニーを拾い、ＰＣＲによってｕｖｒＡＢ領域の喪失につきテストし、その喪失はサザーンブロット分析によって確認されるであろう。
【０４１４】
（実施例３８）
（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの温度感受性ｒｅｃＡ突然変異体）
３０Ｃでよく増殖し、４２Ｃでソラレンに対して非常に感受性であるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの温度感受性ｒｅｃＡ突然変異体を作り出すために、Ｅ．ｃｏｌｉの温度感受性ｒｅｃＡ突然変異体、ｒｅｃＡ４４（Ｋａｗａｓｈｉｍａら、１９３：２８８−９２（１９８４））のＶ２４６Ｍ突然変異に類似した突然変異をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓで行う。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ突然変異体を作成するために、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの間で保存される配列２４５ＫＶＶＫＮＫ２５０（配列番号：４６）を突然変異させる。Ｖ２４６Ｍ突然変異を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、ミスマッチしたオリゴヌクレオチド突然変異誘発によってクローン化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｒｅｃＡ遺伝子に導入する。突然変異は配列分析によって確認し、それを対立遺伝子交換によってＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢの染色体に導入することができるように、突然変異した遺伝子をｐＫＳＶ７に導入する。別法として、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株からのｒｅｃＡ遺伝子を欠失させ、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｅｃＡ４４（ｔｓ）対立遺伝子で置き換える（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｒｅｃＡはＥ．ｃｏｌｉ中で機能することが知られている（Ｋｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：３９１７−２２（２００２）））。
【０４１５】
（実施例３９）
（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原の活性部位への突然変異の導入）
致死因子突然変異Ｈ６８６Ａはそのプロテアーゼ活性を不活化し、浮腫因子突然変異Ｋ３４６ＱおよびＫ３５３Ｑが（一緒になって）そのアデニルシクラーゼ活性を不活化する（Ｂｒｏｓｓｉｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：１７８１−６（２０００））。これらの突然変異をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株に導入して、ｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢおよびｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢ  ｒｅｃＡｔｓ株のような、ワクチンで用いる。ｌｅｆ（致死因子、配列番号８０、配列番号８１）およびｃｙａ（浮腫因子、アデニルシクラーゼ、配列番号８２、配列番号８３）遺伝子をクローン化し、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））で突然変異誘発して、突然変異体遺伝子を創製する。次いで、突然変異体遺伝子をｐＫＳＶ７に移し、最終的に、対立遺伝子交換によって宿主ｐＸＯ１プラスミドに導入する。
【０４１６】
（実施例４０）
（高レベルでの保護抗原の誘導発現）
（高レベルで保護抗原を発現するためのＳＯＳ調節配列の使用）
Ｃｈｅｏら（Ｃｈｅｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：５９０７−１５（１９９３））は、コンセンサス配列ＧＡＡＣＮ４ＧＴＴＣ（配列番号：４７）が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳＯＳ応答において遺伝子のためのＬｅｘＡレプレッサー部位を規定することを示している。ＳＯＳレギュロンの一部であるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｒｅｃＡおよびｕｖｒＡＢ遺伝子のためのプロモーターの上流の同様なコンセンサス配列を位置させる。高レベルで保護抗原を発現するＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を作成するために、保護抗原遺伝子をＳＯＳ調節配列の制御下に置き、ソラレンでの処置が高レベルの保護抗原を作るように、それをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢ株に導入する。この人工遺伝子をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体に挿入するために、ｐＰＬ２のような組込みベクターを用いる（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４１７７−８６（２００２））。注目する遺伝子、この場合には、プロモーターの制御下にある保護抗原遺伝子をマルチクローニング部位に挿入する。プラスミドはＥ．ｃｏｌｉからＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株に接合させる。それはグラム−陽性菌では複製できないので、それは、染色体への組込みによって維持できるに過ぎない。現在のｐＰＬ２ベクターはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのファージインテグラーゼおよびファージ付着部位を含み、従って、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓファージインテグラーゼ遺伝子およびファージ付着部位を除去し、それらをガンマファージ（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．，９６：３４−９（１９５５））のようなＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのファージからの同様なエレメントで置き換えることによって改変されなければならない。また、ｐＰＬ２ベクターは、典型的には、選択のためのクロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を含む。薬物抵抗性遺伝子は、ワクチンの働きでは望ましくないので、それは除去される。薬物抵抗性遺伝子の１つは、Ｄ−アラニンを合成し、Ｄ−アラニン栄養要求性突然変異体をＤ−アラニンの添加無くして豊富な培地で増殖させるＤ−アラニンラセマーゼについての遺伝子によって置き換えられている。他の薬物抵抗性遺伝子は、グルタミンを合成し、グルタミンを含まない豊富な培地でグルタミンシンテターゼ突然変異体細菌の増殖を可能とするグルタミンシンテターゼについての遺伝子によって置き換えられる。
【０４１７】
（他の誘導プロモーターの使用）
いくつかの実施形態において、例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株がｕｖｒＡＢ突然変異およびｒｅｃＡ突然変異両方を保有する場合、ＳＯＳ応答はＲｅｃＡタンパク質に依存することから、この応答は起こらない。この場合において、異なる種類の誘導プロモーターを使用することが所望される。この使用に適切なプロモーターは、まず、どのタンパク質が、ｕｖｒＡＢ、ｒｅｃＡの二重突然変異体（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）のＳ−５９／ＵＶＡ処理後に高レベルで発現するかを見分けることにより決定することができる。例えば、Ｌｅｎｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１２４３２−１２４３７（２００３）に記載される技術化された質量分析法を、この目的のために使用する。一旦、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理条件下で高レベルで発現するタンパク質を決定すると、高度に発現されるタンパク質の発現を制御するプロモーターは、当業者に知られた技術をとおして見分けることができる。この様式において同定されるプロモーターは保護抗原を発現する遺伝子に融合することができる。次いで、この構築物を、本明細書中に記載される組み込みベクター、または当該分野で知られた別のベクターの１つを使用して突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの染色体に導入することができる。
【０４１８】
（実施例４１）
（例示的突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株）
前記実施例に記載された方法の組合せを用い、種々の異なる突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を調製する。ワクチン組成物で用いるべき例示的突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を表２９にリストする。
【０４１９】
（表２９  Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株および候補ワクチン）
【０４２０】
【表２９】
2007523879.tif 000059
１ＮＥＲ、ヌクレオチド切出修復
３ｌａｃＩ抑制可能プロモーターの制御下にある条件ｒｅｃＡ株も誘導され得る。
４ＨＲ、相同組換え
（実施例４２）
（ソラレン−不活化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株における、保護抗原およびカプセルを含めた、タンパク質発現レベルの特徴付け）
不活化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株が依然として代謝することができるのを示すために、細胞を炭酸水素塩を含む最小培地中でインキュベートする（Ｔｈｏｒｎｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：５０５−１６（１９５７））。そのようなインキュベーションの後、細胞を遠心によって除去し、上清を保存する。上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。クーマシーブルーでの染色の後、保護抗原が目立ち、その存在はウェスタンブロット分析（Ｂｒｏｓｓｉｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：５７３１−４（２０００））によって、および質量分析によって確認される。加えて、質量分析を用いて、Ｌｅｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１２４３２−１２４３７（２００３）に記載された方法を用い、これらの条件下で分泌される他のタンパク質を同定する。ポリグリタメートカプセルがこれらの条件下で作成されるかを評価するために、カプセル合成のための遺伝子をコードするｐＸＯ２を形質導入によって株に導入する（Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４９：２９１−７（１９８５））。カプセルはロケット免疫電気泳動によって測定される（Ｕｃｈｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２３：１２２９−４０（１９９７））。
【０４２１】
（実施例４３）
（減弱化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株で免疫化したＳｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒおよびＡ／Ｊマウスにおける液性および粘膜応答の特徴付け）
マウス免疫化。マウスに筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）経路によってＳ−５９／ＵＶＡワクチンを注射して、いずれの経路の免疫化が最良の細菌−特異的液性および細胞性応答をもたらすかを判断する。また、マウスの鼻孔内（ＩＮ）免疫化をテストして、候補ワクチンによって誘導された粘膜応答を評価する。５μｌの設計されたワクチン製剤の、軽く麻酔したマウスの各鼻孔へのＩＮ免疫化を従前に記載されているように行う（Ｂｏｙａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：５６３６−４３（２００３））。マウスを０．１  ＬＤ５０用量の候補ワクチンで免疫化する。メジアン致死レベルが観察されない８つのＳ−５９／ＵＶＡ不活化ワクチン候補のいずれかを１０８粒子の初期用量で与える。１を超える経路によって免疫化されたマウスを、０．１  ＩＤ５０用量を超えるか、あるいは１０８粒子よりも大きな組合せ用量で注射しない。複数免疫化を与えられたマウスは、全ての注射での終始一貫したワクチン用量を受け取る。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢでの３連続日での免疫化の結果、単一免疫化と比べて増大した液性および細胞性免疫がもたらされるので、同一戦略をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株ワクチンで用いる。また、マウスには、一次免疫化後１４日および２８日にブースター免疫化を与える。
【０４２２】
ＰＡ、ＬＦ、ＥＦ、カプセルおよび全細菌に対する抗体の定量。種々のワクチン候補で免疫化したマウスにおける粘膜および抗体応答を特徴付ける。免疫化に先立って、ならびに免疫化から１週間後に、血清を眼窩後叢から採取する。ＩｇＡレベルの測定のための唾液および鼻洗浄を最終免疫化から１週間後に犠牲時に行う。また、最終免疫化から４５日後に候補ワクチンによって誘導された液性および粘膜免疫性の持続も特徴付ける。ＰＡ、カプセル、および栄養細菌（Ｓｔｅｒｎｅ株）に対する液性および粘膜応答を、従前に公表されているように（Ｂａｌｌａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２５３１−４（１９９６）；Ｒｈｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１０９２５−３０（２００３））、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。簡単に述べれば、Ｉｍｍｕｌｏｎ９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）を、まず、従前に記載されているように（Ｒｈｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１０９２５−３０（２００３））、調製されたポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）カプセルと、または４℃にて１６時間、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で乳鉢および乳棒を用いて液体窒素下で粉砕し、ＴＳＴＡ緩衝液（５０ｍＭトリス［ｐＨ７．６］、１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２％ウシ血清アルブミン）でブロックしたＳ−５９ソラレン／ＵＶＡ不活化細菌と抱合した５μｇ精製ＰＡ、ＬＦ、ＥＦ、ＢＳＡによって被覆する。マウス血漿または粘膜分泌物の系列二倍希釈を、各々、ＰＡ、ＰＧＡ−ＢＳＡ、またはＳｔｅｒｎｅで被覆した９６−ウェルプレートに添加する。固定化抗原へのＡｂｓの結合は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）からのイソタイプ−特異的ペルオキシダーゼ・ヤギ抗マウスμ、γまたはαＨ鎖−特異的抗体とのインキュベーションによって測定する。ビオチニル化ラット抗マウスγ１（クローンＧ１−７．３）、γ２ａ（クローンＲ１９−１５）、γ２ｂ（クローンＲ１２−３）、またはγ３（クローンＲ４０−８２）Ｈ鎖−特異的ｍＡｂｓ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびストレプトアビジン−抱合ペルオキシダーゼをＩｇＧ  Ａｂサブクラス分析で用いる（Ｃｏｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１０７：８４６−５２（１９７１）；Ｃｏｌｅら、Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５Ｂ：４８７−９５（１９７５））。比色反応は、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加によって発色させる。終点力価は、ｌｏｇ２希釈の逆数として表し、コントロールの非免疫化マウスで得られたものを２標準偏差を超えるＯＤ４１５を与える。
【０４２３】
Ｉｇ−分泌細胞の検出のための酵素−結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ。ＰＡ−特異的Ｉｇ−分泌リンパ球の頻度はＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定される（Ｂｏｙａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：５６３６−４３（２００３））。簡単に述べれば、ワクチン接種およびコントロールマウスの脾臓または頸部リンパ節を迅速に切開し、氷冷ＲＰＭＩ  １６４０培地に入れ、単一細胞懸濁液を調製する。９６−ウェルＰＶＤＦ−系プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）を２．５μｇ／ｍｌの精製されたＰＡ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）で一晩被覆する。プレートを洗浄し、３７℃にて２００μｌの完全ＲＰＭＩで２時間ブロックし、細胞懸濁液の系列希釈を９６−ウェルプレートに加える。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２中で６時間平板培養する。抗原特異的抗体形成性細胞（ＡＦＣ）を、イソタイプ−特異的ビオチン−標識抗マウスμ、γまたはαＨ鎖−特異的抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で検出する。２時間の室温でのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ビオチン：１ｎｍ  Ｇｏｌｄコンジュゲート（ＧＡＢ１；Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）を室温にて１時間加える。広範な洗浄の後、３０μｌの銀基質（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；  Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）を各ウェルに加え、スポットの発生をモニターする。各ウェルにおけるスポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＣＴＬ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を用いてカウントする。液性応答は、１０６脾臓またはリンパ節細胞当たりの抗体形成性細胞の数として表される。
【０４２４】
トキシン中和アッセイ。ワクチン候補で免疫化されたマウスで誘導された中和抗体を、致死トキシン（ＰＡ＋ＬＦ）からＪ７７４マクロファージ細胞系を保護する能力につき評価する（Ｍｏｃｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５：６４７−７１（２００１）；Ｂｏｙａｋａら（２００３）；Ｒｈｉｅら（２００３））。簡単に述べると、Ｊ７７４細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓｕｓ，ＶＡ）を５×１０４細胞／ウェルにて９６−ウェル平坦−底プレート（Ｎｕｎｃ）に加え、５％ＣＯ２中で３７℃にて１２時間インキュベートする。テスト血清または粘膜分泌物をＴＳＴＡ緩衝液に系列的に二倍希釈する。ＰＡおよびＬＦ（４００ｎｇ／ｍｌのＰＡおよび４０ｎｇ／ｍｌのＬＦ）を抗血清希釈物に加える。１時間のインキュベーションの後、抗血清／致死トキシン複合体混合物を細胞懸濁液に加え、さらに５時間インキュベートする。細胞生存性はＭＴＴアッセイによってモニターする（５４０ｎｍで測定された吸光度）。アッセイは各プレートに含まれた陰性コントロール（清浄な血清）および陽性コントロール（ＭＡｂｓ、１４Ｂ７および１Ｇ３）（Ｍｉｋｅｓｅｌｌら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，３９：３７１−６（１９８３）；Ｓｔａｒｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ９（２００３））で三連にて行う。各三連サンプル希釈物の平均および標準偏差を計算する。終点は、清浄なコントロール血清と比較して、ａｎｔｈｒａｘトキシンの５０％中和を呈する最大血清希釈として表される。
【０４２５】
（実施例４４）
（改変されたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓでワクチン接種されたＡ／ＪマウスにおけるＰＡ−、ＬＦ−、およびＥＦ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞−媒介応答の特徴付け）
Ｔ細胞増殖。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は、ワクチン接種したおよびナイーブなＡ／ＪマウスのＰＢＭＣ、脾臓およびリンパ節細胞から測定する。脾臓および頸部リンパ節を分散させて、従前に記載されたように単一細胞懸濁液を得る（Ｂｏｙａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：１２２−８（１９９９）；Ｌｉｌｌａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１６２−１６９（２００１）；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．，６５：５１７１−５（１９９７））。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。プールされたリンパ節またはＰＢＭＣからの個々のマウス脾臓からの精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を４×１０６細胞／ｍｌで培養し、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２３．８ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５×１０５−５Ｍのμ−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ）中のＴ−細胞−枯渇非分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞（８×１０６細胞／ｍｌ）の存在下で種々の濃度のＰＡ、ＬＦまたはＥＦで刺激する。脾臓フィーダー細胞の複製は、Ｓ−５９ソラレンでの軽い光化学処理によって阻止される。最終１８〜２０時間の０．５μＣｉのトリチウム化チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ）の添加に先立って、培養物を３７℃および５％ＣＯ２において４日間インキュベートする。細胞をガラス繊維シートに収集し、取り込まれたチミジンの量を、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）にて放射能を測定することによって決定する。
【０４２６】
ＰＡ−、ＥＦ−またはＬＦ−誘導サイトカイン応答の分析。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  （Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。個々のマウスの脾臓またはリンパ節からの精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、１×１０５細胞／ウェルにて、丸底９６−ウェルプレート中で培養し、完全ＲＰＭＩ中、Ｔ細胞−枯渇、非分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞（１×１０５細胞／ウェル）の存在下で種々の濃度のＰＡ、ＬＦまたはＥＦで刺激する。Ｔ細胞−枯渇脾臓フィーダー細胞を、Ｓ−５９での軽い光化学処理によって阻止する。Ｔ細胞培養は３７℃および５％ＣＯ２において２日間インキュベートする。Ｔヘルパー−１およびＴヘルパー−２サイトカインの発現は、Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、抗原−刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清から側定する。
【０４２７】
（実施例４４）
（改変されたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓワクチンでの最後の免疫化用量から４５日後におけるＳｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒおよびＡ／Ｊマウスにおける胞子および致死トキシン挑戦に対する保護の程度の特徴付け）
致死トキシン挑戦に対するマウスの保護。選択された候補ワクチンで免疫化されたマウスを、従前に記載されているごとく（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４５０９−１５（２００１）；Ｒｈｉｅら（２００３））、致死トキシンでの尾静脈注射によって挑戦する。致死トキシンは、記載されているごとく（Ｒｈｉｅら（２００３））、組換えＰＡおよびＮＦ組換えタンパク質（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）を混合することによって調製される。マウス当たりの致死トキシンＩＶ  ＬＤ５０は６μｇのＬＦと混合したほぼ１２μｇのＰＡである。新たに調製された致死トキシンのマウスにおけるメジアン致死性は、公表された値の０．１〜１０のＬＤ５０用量範囲にわたる尾静脈注射によって測定される。保護実験は、同様に、ＬＤ５０用量の５〜１０倍の範囲にわたる致死トキシン挑戦を含む。このモデルにおいては、未保護マウスは２４時間以内に死亡する。最初に、ａｎｔｈｒａｘによる死亡は、トリプシン大豆寒天上で血液を平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートすることによって選択されたマウスで確認される。平板を、２〜３ｍｍの典型的なａｎｔｈｒａｃｉｓ−様「すりガラス」外観を持つコロニーにつき観察する。致死トキシンで処理した全てのマウスは毎日モニターし、２週間後に実験を停止し、全ての保護マウスを犠牲にする。
【０４２８】
胞子調製。Ｓｔｅｒｎｅ株胞子を記載されているように調製する（Ｂａｒｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，１９９９）。簡単に述べると、１００ｍｌ瓶に含有され、３７℃にて５時間振盪された５ｍｌのＦＡ培地（３．３％トリプトン、２％酵母エキス［水に対して一晩透析］、０．２％Ｌ−ヒスチジン、０．８％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４％ＫＨ２ＰＯ４、０．７４％ＮａＣｌ）に単一コロニーを接種する。１／１０ミリリットルのアリコットをＬ寒天プレート上に広げ、３７℃にてインキュベートする。菌叢をプレートから掻き取り、滅菌水で十分に洗浄し、６０℃にて３０分間加熱ショックを与え、水で洗浄し、従前に記載されているように（Ｐａｌｕｃｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：８６８−８７０（１９９９））、水中の５８％Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ−７６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）上で精製し、次いで、水でもう１回洗浄する。次いで、胞子を１０，０００×ｇにてペレットに沈積させ、水中の１％フェノールに再懸濁させる。このプロセスのこの収率はプレート当たり０．５×１０９〜５．０×１０９胞子の範囲であると公表されている。
【０４２９】
致死胞子挑戦に対するマウスの保護。筋肉内（ＩＭ）注射によって与えられる加熱−ショックＳｔｅｒｎｅ株胞子のＬＤ５０値は、１０３〜１０８胞子の用量範囲にわたって決定する。吸入ａｎｔｈｒａｘに対するワクチン接種マウスにおける保護を評価するために、従前に記載されているように（Ｂｒｏｏｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：７０２−１１（２００１））、気管内（ＩＴ）胞子投与によって挑戦実験を行う。簡単に述べれば、固定化し麻酔したマウスの舌をピンセットで外方向かつ横方向に軽く引き、先端からほぼ１インチわずかな角度だけ曲げた平滑１．５インチ２２−ゲージ針を嵌合させたシリンジを用いてワクチンを送達する。我々は、ＩＭまたはＩＴ経路によって投与されたＳｔｅｒｎｅ株ＬＤ５０値はＡ／Ｊマウスにおいてほぼ１０３であり、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいては１０倍高いまでであると予測する。保護実験は１００ＬＤ５０用量胞子挑戦までを含む。胞子で処理した全てのマウスを毎日モニターし、実験は２週間後に停止し、全ての保護されたマウスを犠牲にする。全ての挑戦実験において、死亡までの平均時間は非生存群において決定する。
【０４３０】
（実施例４５）
（マウスにおけるＯＶＡモデル抗原を発現するワクシニアでの挑戦に対するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの保護免疫）
本発明のワクチンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ挑戦に対して保護的免疫化を示す。病原体に対して免疫化し、保護する能力をさらに説明するために、ＯＶＡ抗原を含むまたは含まない、およびＳ−５９ＵＶＡ処理（前記実施例１３の第二の方法）の有りおよび無しにてのＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの方法を用いて、もう１つの微生物、例えば、ＯＶＡ抗原を発現するワクシニアウイルス（ＶＶ−ＯＶＡ）に対して免疫化した。この実験は、非限定的な例示として実施し、他の微生物に対する抗原特異的免疫化が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンの特定の組成物で達成できることを示した。
【０４３１】
一般に、改変されてＯＶＡ（ＶＶ−ＯＶＡ）をモデル抗原の非限定的な例として発現する組み換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）はＬａ  Ｊｏｌｌａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手し、Ｏｐｔｉｃｅｌｌチャンバー（ＢｉｏＣｒｙｓｔａｌ，ＯＨ）を用いてＶｅｒｏ細胞中で調製した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌチャンバーを、Ｌ−グルタミン、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、ＮａＨＣＯ３、および１０％ＦＢＳを補足したイーグルの最小必須培地中のＶｅｒｏ細胞で接種した。細胞がほぼ７５％密集に達すれば、増殖培地を取り出し、１×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬのＶＶ−ＯＶＡの単一のプラークの精製したストックを含有する新鮮な培地で置き換えた。単層が＞５０％細胞病理効果を示せば、細胞および上清を収集し、３凍結−解凍サイクルに付し、低速の遠心分離により清澄化し、上清を−８０℃にて貯蔵した。力価はＶｅｒｏ−７６細胞でのプラークアッセイによって測定する。改変体によるオボアルブミン発現は、マウスへの注射に先立ってウェスタンブロット分析によって確認した。
【０４３２】
Ｃ５７Ｂ１／６マウス（群当たり３）を表３０およじ図４１に従って感作し、ＩＶ経路により追加ワクチン接種した。最初の追加免疫に続いて３０日目に、全てのマウスを１×１０７ＰＦＵのＶＶ−ＯＶＡのＩＰ注射で７日に攻撃した。ＶＶ−ＯＶＡ攻撃後５日目に、マウスを安楽死させ、解剖により卵巣を収集し、肉眼での病理学につき観察した。また、卵巣を合わせ、ワクシニアプラーク形成単位につきアッセイした。個々のマウスからの対となった卵巣を１ｍＬの緩衝液中でホモゲナイズし、凍結（液体窒素）し、各サイクルの間は渦巻かせつつ、３サイクルだけ解凍（３７℃）し、次いで、−８０℃にて貯蔵した。アッセイをするために、サンプルを解凍し、４℃にて遠心してデブリスを除去し、Ｖｅｒｏ細胞への適用のために系列希釈した。Ｖｅｒｏ−７６細胞を６−ウェル組織培養プレート中で平板培養した。細胞単層が約７０〜８５％の密集に到達すると、培地を各ウェルから吸引し、細胞を、卵巣ホモゲネート調製物の適当な希釈１ｍＬを接種した。１時間後、培地を吸引し、３ｍＬの１：１  ２×増殖培地：１．５％アガロースで置き換えた。プラークを培養から３〜４日後に数えた。
【０４３３】
（表３０  ＯＶＡを発現し、かつＯＶＡを発現するワクシニアで攻撃したＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでのマウスのワクチン接種）
【０４３４】
【表３０】
2007523879.tif 000060
＊初期用量、１日および２日用量は１０倍より低い。全ての用量１００μＬ  ＨＢＳＳ。
【０４３５】
この実験から得られた結果は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチンの特定の組成物で免疫化されたマウスにおけるＶＶ−ＯＶＡ挑戦に対する強力な保護を示した。ワクシニアウイルスの挑戦に対する保護の免疫相関（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞ベースの応答であることは、当業者に周知である（Ｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４  ７８１３：７０５２−７０６０）。表３１および図４２は、表３０による実験群からのマウスの卵巣におけるＶＶ−ＯＶＡの力価を示す。詳細には、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活性化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡで免疫化されたが、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活性化ＬｉｓｔｅｒｉａΔａｃｔＡ−ＯＶＡでは免疫化されていないマウスは、ＶＶ−ＯＶＡ（ｐ＝０．０１１８、２方向不対（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ検定）での挑戦に対して保護された。これらのデータは、ＤＮＡ修復の突然変異がソラレンで死滅したが代謝活性を保持し得るワクチン組成物を提供し、その結果これらの遺伝的レパートリを発現し、従って上記抗原を発現する病原体での挑戦に対して保護的である免疫された温血動物における記憶ベースの抗原特異的Ｔ細胞を刺激することができる、明白な証拠を提供する。
【０４３６】
（表３１．  ワクチン接種したマウスの卵巣中のＶＶ−ＯＶＡの力価）
【０４３７】
【表３１】
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（実施例４６）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ発現カセットおよび発現ベクターの構築）
（Ａ．クローニングベクター）
選択した異種性抗原発現カセットの分子構築物を、ｐＰＬ２  （Ｌａｕｅｒら  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２），またはＡＭ４０１（Ｗｉｒｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：８３１−８３６）に挿入し、ｐＰＬ２複数のクローン配列（Ａａｔ  ＩＩ小フラグメント，  １７１  ｂｐｓ）を含むように改変し、テトラサイクリン抵抗性遺伝子（ｐＡＭ４０１−ＭＣＳ，図３２）内でＸｂａＩとＮｒｕＩ認識部位との間に挿入した。通常は、ｈｌｙプロモーターおよび（選択した）シグナルペプチド配列を、ｐＰＬ２プラスミドベクター、またはｐＡＭ４０１−ＭＣＳプラスミドベクター内の特有のＫｐｎＩ部位とＢａｍ  Ｈ１部位との間に挿入した。選択したＥｐｈＡ２遺伝子（Ｎ末端エピトープタグおよびＣ末端エピトープタグを含むように改変した；以下の記載を参照のこと）を、続いて特有のＢａｍ  Ｈ１部位とＳａｃ  Ｉ部位との間の構築物にクローン化した。ＡＭ４０１−ＭＣＳプラスミドベクターに基づく分子構築物を、エレクトロポレーションにより、当該分野で一般的な方法を用いて、リゾチームでも処理した選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に導入した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ形質転換体中の予測された（ｅｘｐｅｃｔ）プラスミド構築物を、クロラムフェニコール含有ＢＨＩ寒天プレート（１０μｇ／ｍｌ）上に形成されたコロニーから制限酵素解析によりＤＮＡを単離することにより確認した。種々のｐＡＭ４０１−ＭＣＳベースの異種性タンパク質発現カセット構築物で形質転換した組み換えＬｉｓｔｅｒｉａを使用して、以下に記載されるとおりに異種性タンパク質の発現および分泌を測定した。
【０４３８】
ｐＰＬ２ベースの異種性タンパク質発現カセットの構築物を、前記方法（Ｌａｕｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４，４１７７−４１８６（２００２））に従って、選択したＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノム中のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に組み込んだ。簡単に述べると、最初にｐＰＬ２異種性タンパク質発現カセット構築プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＳＭ１０（Ｓｉｍｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：７８４−７９１（１９８３））にエレクトロポレーションか、または化学的手段により導入した。続いて、ｐＰＬ２ベースのプラスミドを、形質転換したＳＭ１０から、連結により選択したＬｉｓｔｅｒｉａ株に移した。記載されるとおりに１ｍｌあたり７．５μｇのクロラムフェニコールおよび１ｍｌあたり２００μｇのストレプトマイシンを含む薬物選択ＢＨＩ寒天プレート上でインキュベートした後、選択したコロニーを、同じ組成のプレート上で３回通過させることにより、精製する。ファージの結合部位においてｐＰＬ２ベクターの組み込みを確認するために、個々のコロニーを取り出し、順方向プライマーＮＣ１６（５’−ｇｔｃａａａａｃａｔａｃｇｃｔｃｔｔａｔｃ−３’（配列番号５５））および逆方向プライマーＰＬ９５（５’−ａｃａｔａａｔｃａｇｔｃｃａａａｇｔａｇａｔｇｃ−３’（配列番号５６））のプライマーペアを使用してＰＣＲによりスクリーニングする。選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノム中に、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に組み込まれたｐＰＬ２−ベースのプラスミドを有する選択されたコロニーは、４９９ｂｐの診断用ＤＮＡアプリコンを生産した。
【０４３９】
（Ｂ．プロモーター）
異種性タンパク質発現カセットは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）をコードする遺伝子の転写を誘導し、感染した細胞の微環境内で活性化されるｐｒｆＡ依存性ｈｌｙプロモーターを含んだ。ヌクレオチド２０５５８６−２０５０００（４１４ｂｐ）を、以下に示すプライマー対を使用してＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６からＰＣＲにより増幅した。増幅した領域は、ｈｌｙプロモーター、およびｓｅｃＡ１シグナルペプチド（上記）およびＰＥＳＴドメインを含むＬＬＯの最初の２８アミノ酸を含む。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤについてのこの領域の予測された配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号  ｇｉ｜１６８０２０４８  ｒｅｆ  ＮＣ＿００３２１０．１  ［１６８０２０４８］）に見出すことができる。ＰＣＲ反応において使用するプライマーは、以下のとおりである：
（プライマー対）
順方向  （ＫｐｎＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．１２５７−１２７６）：
【０４４０】
【数２】
2007523879.tif 000062
（配列番号５７）
逆方向  （Ｂａｍ  ＨＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．Ｘ−ｘ）：
【０４４１】
【数３】
2007523879.tif 000063
（配列番号５８）
（制限エンドヌクレアーゼ認識部位に、下線を引いている）
４２２ｂｐのＰＣＲアンプリコンを、プラスミドベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、製造者の手順に従ってクローン化した。ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｈｌｙプロモータープラスミドクローンにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ特異的塩基のヌクレオチド配列を決定した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６は、ＥＧＤ株と比較してｈｌｙプロモーター中でｐｒｆＡボックスに隣接する８個のヌクレオチド塩基の変化を含んだ。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０５６株およびＥＧＤ株についてのｈｌｙプロモーターのアライメントを、以下の図３３に示す。
【０４４２】
ｈｌｙプロモーターおよびｓｅｃＡ  ＬＬＯシグナルペプチドに対応する４２２ｂｐ  ＤＮＡは、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｈｌｙプロモータープラスミドクローンから単離され（ｌｉｖｅｒａｔｅ）、そして当業者に周知の慣習的な方法に従って、ｐＰＬ２プラスミドベクター（Ｌａｕｅｒら、２００２，Ｊ．Ｂａｃｔ）にクローン化する。このプラスミドは、ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ（天然）として公知である。
（Ｃ．  シャインダルガーノ配列）
異種性遺伝子ＲＮＡ転写産物に対する（１６Ｓ  ｒＲＮＡを介した）３０Ｓリボソームサブユニットへ結合しおよび翻訳の開始に必要とされる要素である、ポリプリンシャインダルガーノ配列が、プロモーターの３’末端に含まれる。シャインダルガーノ配列は、代表的には、以下のコンセンサス配列：5’−ＮＡＧＧＡＧＧＵ−Ｎ５−１０−ＡＵＧ（開始コドン）−３’（配列番号５９）を有する。種々のポリプリンシャインダルガーノ配列が存在する。特に、リステオリシンＯ（ＬＬＯ）をコードするＬｉｓｔｅｒｉａ  ｈｌｙ遺伝子が、以下のシャインダルガーノ配列：
【０４４３】
【数４】
2007523879.tif 000064
（配列番号６０）を有する（シャインダルガーノ配列には、下線を引く。翻訳開始コドンは太字にする）。
【０４４４】
（実施例４７）
（対立遺伝子交換を介した発現カセットのＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への組み込み）
異種性発現カセットをＬｉｓｔｅｒｉａの染色体に挿入するために、組み込みベクター（例えば、ｐＰＬ２）を用いることに対する１つの可能性のある代替法として、対立遺伝子交換が使用され得る。
【０４４５】
簡単に述べると、ｐＫＳＶ７異種性タンパク質発現カセットプラスミドをエレクトロポレーションされた細菌を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＢＨＩ寒天培地にプレートすることにより選別し、そして３０℃の許容性の温度でインキュベートする。細菌染色体への単一クロスオーバー組み込み（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は、クロラムフェニコール含有培地における４１℃の非許容性温度にて、いくつかの個別のコロニーを数代継代することにより選別する。最終的に、プラスミドの排除および回復を、クロラムフェニコールを含まないＢＨＩ培地中で３０℃の許容性温度にて、いくつかの個別のコロニーを数代継代することにより達成する。異種性タンパク質発現カセットの細菌染色体への組み込みの検証を、ｐＫＳＶ７プラスミドベクター構築物に含まれない細菌染色体標的配列の異種性タンパク質発現カセット内に定められる領域を増幅するプライマー対を使用して、ＰＣＲにより検証する。
【０４４６】
（実施例４８）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためのコドンを最適化した抗原配列およびシグナル配列）
（Ａ．ＬＬＯシグナルペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１を含む融合タンパク質をコードする、コドンを最適化した発現カセット）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるヒト精巣癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１３２７）の発現のために、発現カセットを設計する。ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯ）に融合したＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする発現カセットの配列およびＬＬＯ  ＰＥＳＴ配列を、図３４に示す。発現カセット中の抗原およびシグナルペプチドをコードする配列を、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためにコドンを最適化した。この発現カセットによりコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を、図３５に示す。
【０４４７】
（Ｂ．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｏｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためのヒトメソテリンコード配列のコドン最適化）
（ヒトメソテリン（癌抗原）をコードする、コドンを最適化したポリヌクレオチド配列を、図３６に示す。図３６に示す配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｏｔｏｇｅｎｅｓにおける発現についてコドンを最適化されている。図３６における配列によりコードされるポリヌクレオチド配列を図３７に示す。
【０４４８】
（Ｃ．Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｏｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためのマウスメソテリンコード配列のコドン最適化）
マウスメソテリン（癌抗原）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を、図３８に示す。図３８に示される配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｏｔｏｇｅｎｅｓにおける発現についてコドンを最適化している。図３８における配列によりコードされるポリヌクレオチド配列を図３９に示す。
【０４４９】
（実施例４９）
（組み換え改変微生物の構築のためのシグナルペプチドのコドン最適化）
改変された微生物における発現カセットにおいて使用され得る、いくつかの例示的なコドンを最適化したｓｅｃＡ１シグナルペプチドを、以下の表３２に示す。
【０４５０】
（表３２  組み換え改変微生物の構築のためのシグナルペプチド）
【０４５１】
【表３２】
2007523879.tif 000065
（実施例５０）
（ソラレンで死滅した代謝的に活性な微生物ワクチンに感染した樹状細胞に基づくワクチン組成物）
（樹状細胞の産生、Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンを用いた感染、および免疫化）
Ｌｕｔｚらの以前に公開された技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９、２２３：７７−９２）を使用して、樹状細胞を産生した。簡単に述べると、骨髄全体を、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００ユニットのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、０．０３ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、および２０ｎｇ／ｍＬ  マウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む培地１ｍＬあたり２×１０５細胞の濃度にて、細菌等級（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｒａｄｅ）のペトリ皿上で培養した。３日目および６日目において、培地の洗浄物に新しいＧＭ−ＣＳＦを補充した。１０日目において、非接着細胞を回収し、表現型的に骨髄性の樹状細胞（高ＭＨＣ  ＩＩクラス、高ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６中間体）であることを検証した。感染のために、ＤＣを、培地１ｍＬあたり２×１０６個懸濁し、次いで、１×１０８個の示されるＬｉｓｔｅｒｉａ株を添加した（感染の最終多重度＝５０個の細菌：１ＤＣ）。試験管を回転ミキサー上で、８ｒｐｍにて１時間３７℃にて混合した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、残った細胞外細菌を除去し、次いで、３×１０６個の各樹状細胞調製物を、各動物に対して静脈に注入した。７日後に、マウスを屠殺し、脾臓を回収し、そして一種類の細胞懸濁液を作成した。
【０４５２】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析のために、まず、細胞を、ブレフェルディンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）の存在下で関連するペプチドを用いて５時間刺激した。細胞を、ＣＤ４  ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）およびＣＤ８  ＰｅｒＣＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ）について表面を染色し、次いで固定し、そして透過させて、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦについて染色した。テトラマー染色について、細胞をエキソビボにて、ＣＤ４  ＦＩＴＣ、ＣＤ８ＰｅｒＣＰ、およびＫｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ）を使用して直接的に染色した。サンプルをフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕獲し、そしてＦｌｏＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。
【０４５３】
顕微鏡検査のためのスライドを、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｏｔｏｓｐｉｎ  ＩＩを使用して作製し、改変したＷｒｉｇｈｔ株を使用して染色した。
【０４５４】
この結果により、Ｓ−５９ソラレン／ＵＶＡ不活性化Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡで感染された自家性骨髄由来のＤＣを用いて静脈内免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける強力なＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、細菌ＵｖｒＡＢ遺伝子の欠失に依存することことを示した（図５０）。図５０（ａ）は、ＣＤ１１ｃｈｉ／ＭＨＣ  クラスＩＩｈｉの二重染色により示されるように、感染前の樹状細胞の遺伝子型の検証を示す。図５０（ｂ）は、示されるＬｉｓｔｅｒｉａワクチンに感染後、および処置後１時間におけるＤＣの顕微鏡写真を示す。これは、Ｓ−５９ソラレン不活性化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ，  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ，またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ−ＯＶＡに感染したＤＣにおける細菌の匹敵するレベルを示す。細胞内細菌の有意なレベルは、加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡに感染したＤＣにおいては観察されなかった。図５０（ｃ）は、免疫化されたマウスからの脾臓のＩＣＳ分析を示す。これは、ＣＤ８＋  ＯＶＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）−特異的Ｋｂ−制限Ｔ細胞の有効なプライミングが、ＤＮＡ修復突然変異（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ）を有するＳ−５９ソラレン／ＵＶＡＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチンに感染したＤＣで免疫化されたマウスのみで起こり、インタクトなＤＮＡ修復（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ−ＯＶＡ）を有するＳ−５９ソラレン／ＵＶＡＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチンに感染したＤＣで免疫化されたマウスでは起こらなかった。図５０（ｄ）は、免疫化されたマウスからの脾臓のＫｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー解析を示す。ＣＤ８＋ＯＶＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）−特異的Ｋｂ−制限Ｔ細胞の有効なプライミングは、ＤＮＡ修復突然変異（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ）を有するＳ−５９ソラレン／ＵＶＡＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチンに感染したＤＣで免疫化されたマウスのみ観察されたが、無傷のＤＮＡ修復（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ−ＯＶＡ）を有するＳ−５９ソラレン／ＵＶＡＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチンに感染したＤＣで免疫化されたマウスでは観察されなかった。
（実施例５１）
（組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ突然変異体株の産生に有用な配列）
組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ突然変異体株は、上の実施例、および２００４年６月３０日に出願された米国仮特許出願「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」に記載される。情報は、上記の組換えＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株のいくつかの構築において使用されるいくつかの配列に関して、以下の表３３に示す。表３２において登録番号またはほかの参照により同定される配列の各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０４５５】
（表３３．  さらなるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号を含む）
【０４５６】
【表３３】
2007523879.tif 000066
2007523879.tif 000067
さらに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＳプロモーター結合領域は、５’−ＣＧＡＡＣＲＮＲＹＧＴＴＹＣ−３’  （配列番号８４；Ｗｉｎｔｅｒｌｉｎｇ，Ｋ．Ｗ．ら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８  １８０：２２０１−２２１１）として同定される。
【０４５７】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列双方を含めた）受託番号は、全ての目的で、ここに引用して、その全体を、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に引用により一体化されるように示されるのと同程度援用される。
【図面の簡単な説明】
【０４５８】
【図１】図１は、樹状細胞系へのＯＶＡ抗原提示の測定と共に、ソラレンＳ−５９濃度（２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）の関数としてのＯＶＡ抗原を含む野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６の減弱化を示す。細菌ｌｏｇ力化価および未処理に対する抗原提示の％（データはＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａについてのものである）をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする。
【図２】図２は、樹状細胞系へのＯＶＡ抗原提示の測定と共に、アルキル化剤化合物Ｉ濃度の関数としての、ＯＶＡ抗原を含む野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６（２Ａ）およびＬＬＯ−突然変異体ＤＰ−Ｌ４０２７（２Ｂ）の減弱化を示す。細菌ｌｏｇ力価および未処理に対する提示された抗原の％（データはＤＣ２，４Ｃ細胞当たりの１Ｌｉｓｔｅｒｉａについてのものである）をμＭ化合物Ｉに対してプロットする。
【図３】図３は、Ｓ−５９濃度（２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）の関数としての、欠損突然変異体ＣＳＲ６０３（ｕｖｒＡ  ｒｅａＡ  ｐｈｒ突然変異体）を修復する野生型Ｅ．ｃｏｌｉの不活化の比較を示す。細菌ｌｏｇ力価をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする（ｌｏｇスケール）。
【図４】図４は、３、７および１４日にワクチン接種されたＣ５７Ｂ１／６マウスへのＢ１６ＯＶＡ腫瘍の移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を示す。テストされたワクチンはＳ−５９処置を伴い、または伴わない。
【図５】図５は、３、７および１４日にワクチン接種されたＣ５７Ｂ１／６マウスへのＢ１６ＯＶＡ腫瘍の移植後の日数の関数としてのパーセント生存を示す。テストされたワクチンはＳ−５９処置を伴い、または伴わない。
【図６Ａ】図６は、Ｓ−５９ＵＶＡ処置（ＰＣＴ）を伴う、および伴わない、ＯＶＡ発現を伴う、および伴わない、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種したマウスからのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ陽性である脾臓細胞の集団を示すフローサイトメトリーの結果を示す。図６ＡはＬＬＯ１９０−２１０に特異的な細胞の集団を示す。図６ＢはＯＶＡに特異的な細胞の集団を示す。
【図６Ｂ】図６は、Ｓ−５９ＵＶＡ処置（ＰＣＴ）を伴う、および伴わない、ＯＶＡ発現を伴う、および伴わない、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種したマウスからのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ陽性である脾臓細胞の集団を示すフローサイトメトリーの結果を示す。図６ＡはＬＬＯ１９０−２１０に特異的な細胞の集団を示す。図６ＢはＯＶＡに特異的な細胞の集団を示す。
【図７】図７は、Ｓ−５９ＵＶＡ処置（ＰＣＴ）を伴うまたは伴わない、示された野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ株でワクチン接種されたマウスからの、ＳＬ８、ＬＬＯ１９０−２０１またはＬＬＯ２９６−３０４いずれかでの刺激に際して、２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図８Ａ】図８は、ｕｖｒＡＢの欠失を伴うおよび伴わない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。ｌｏｇ力価は用いたソラレンＳ−５９（６Ｊ／ｃｍ２）のｎＭ濃度に対してプロットする。図８Ａ、株ＤＰ−Ｌ４０１７（Ｌ４６１ＴＬＬＯ突然変異体）および野生型（ＤＢ−Ｌ４０５６）。図８Ｂ、株ＤＰ−Ｌ４０１７およびＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）。
【図８Ｂ】図８は、ｕｖｒＡＢの欠失を伴うおよび伴わない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。ｌｏｇ力価は用いたソラレンＳ−５９（６Ｊ／ｃｍ２）のｎＭ濃度に対してプロットする。図８Ａ、株ＤＰ−Ｌ４０１７（Ｌ４６１ＴＬＬＯ突然変異体）および野生型（ＤＢ−Ｌ４０５６）。図８Ｂ、株ＤＰ−Ｌ４０１７およびＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）。
【図９−１】図９は、樹状細胞系に対するＯＶＡ抗原提示の測定と共に、ソラレンＳ−５９濃度の関数としての、ＯＶＡ抗原を含むＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。親株（この場合は、ΔａｃｔＡ；９Ａ，９Ｃ）をｕｖｒＡＢ欠失を持つ株（ΔｕｖｒＡＢ；９Ｂ，９Ｄ）と比較する。細菌ｌｏｇ力価および未処理に対する抗原提示の％をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする。図９Ａ、９Ｂ、０．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、Ｌｉｓｔｅｒｉａで１回洗浄、再度５．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、ＤＣ２．４細胞当たり１  Ｌｉｓｔｅｒｉａで測定された抗原提示。図９Ｃ、９Ｄ，ＬｉｓｔｅｒｉａはＳ−５９の存在下で増殖させ、次いで、６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡを照射し、抗原提示は、ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａにて測定した（データの拡大されたプロットを図９Ｃおよび９Ｄにも掲げる）。
【図９−２】図９は、樹状細胞系に対するＯＶＡ抗原提示の測定と共に、ソラレンＳ−５９濃度の関数としての、ＯＶＡ抗原を含むＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。親株（この場合は、ΔａｃｔＡ；９Ａ，９Ｃ）をｕｖｒＡＢ欠失を持つ株（ΔｕｖｒＡＢ；９Ｂ，９Ｄ）と比較する。細菌ｌｏｇ力価および未処理に対する抗原提示の％をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする。図９Ａ、９Ｂ、０．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、Ｌｉｓｔｅｒｉａで１回洗浄、再度５．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、ＤＣ２．４細胞当たり１  Ｌｉｓｔｅｒｉａで測定された抗原提示。図９Ｃ、９Ｄ，ＬｉｓｔｅｒｉａはＳ−５９の存在下で増殖させ、次いで、６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡを照射し、抗原提示は、ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａにて測定した（データの拡大されたプロットを図９Ｃおよび９Ｄにも掲げる）。
【図１０】図１０は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）およびＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ）によって合成されたタンパク質に取り込まれた３５Ｓメチオニン／システインのポリアクリルアミドゲルを示す。
【図１１Ａ】図１１は、ＯＶＡ特異的抗原ＳＬ８、ＬＬＯ特異的抗原ＬＬＯ１９０およびＬＬＯ２９６で刺激された、５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。図１１Ａは、ＯＶＡ特異的抗原で刺激されたプレート上でのスポット形成コロニーを示し、図１１Ｂは、全ての３つの抗原について２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞をプロットする。
【図１１Ｂ】図１１は、ＯＶＡ特異的抗原ＳＬ８、ＬＬＯ特異的抗原ＬＬＯ１９０およびＬＬＯ２９６で刺激された、５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。図１１Ａは、ＯＶＡ特異的抗原で刺激されたプレート上でのスポット形成コロニーを示し、図１１Ｂは、全ての３つの抗原について２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞をプロットする。
【図１２Ａ】図１２は、ＯＶＡ由来Ｔ細胞エピトープＳＬ８（１２Ａ）、ＬＬＯ特異的クラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０−２０１（１２Ｂ）、またはＬＬＯ特異的クラスＩ抗原ＬＬＯ２９６−３０４（１２Ｃ）で刺激された、Ｓ−５９／（ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを示す。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａは図面中では「ＰＣＴ」（光化学処理を表す）で印を付ける。
【図１２Ｂ】図１２は、ＯＶＡ由来Ｔ細胞エピトープＳＬ８（１２Ａ）、ＬＬＯ特異的クラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０−２０１（１２Ｂ）、またはＬＬＯ特異的クラスＩ抗原ＬＬＯ２９６−３０４（１２Ｃ）で刺激された、Ｓ−５９／（ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを示す。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａは図面中では「ＰＣＴ」（光化学処理を表す）で印を付ける。
【図１２Ｃ】図１２は、ＯＶＡ由来Ｔ細胞エピトープＳＬ８（１２Ａ）、ＬＬＯ特異的クラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０−２０１（１２Ｂ）、またはＬＬＯ特異的クラスＩ抗原ＬＬＯ２９６−３０４（１２Ｃ）で刺激された、Ｓ−５９／（ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを示す。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａは図面中では「ＰＣＴ」（光化学処理を表す）で印を付ける。
【図１３Ａ】図１３は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃したマウスからの脾臓（１３Ａ）または肝臓（１３Ｂ）当たりの単離されたコロニー形成単位の数を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃したマウスからの脾臓（１３Ａ）または肝臓（１３Ｂ）当たりの単離されたコロニー形成単位の数を示す。
【図１４Ａ】図１４は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはＤＰ−Ｌ４０２９ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し（１×、３×または５×ワクチン接種）、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃されたマウスからの脾臓（１４Ａ）または肝臓（１４Ｂ）当たりのコロニー形成ユニットの数を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはＤＰ−Ｌ４０２９ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し（１×、３×または５×ワクチン接種）、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃されたマウスからの脾臓（１４Ａ）または肝臓（１４Ｂ）当たりのコロニー形成ユニットの数を示す。
【図１５】図１５は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種された（１×、３×または５×ワクチン接種）でマウスの血清からのＬｉｓｔｅｒｉａ特異的抗体の抗体力価を示す。
【図１６】図１６は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いでＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種した（１×、３×または５×ワクチン接種）、かつワクチン接種から３０日後に２０×ＬＤ５０または１００×ＬＤ５０野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃したマウスのパーセント生存（攻撃後１０日）を示す。
【図１７】図１７は、抗原ＬＬＯ９１、ＡＨ１、ＡＨ１Ａ５、または細胞Ｐ８１５またはＣＴ２６細胞で刺激され、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞についてのＩＣＳアッセイの結果を示す。
【図１８Ａ】図１８は、ＡＨ１Ａ５（１８Ａ）またはＡＨ１（１８Ｂ）抗原で刺激された、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５でワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのスポット形成コロニーを含むプレートを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８は、ＡＨ１Ａ５（１８Ａ）またはＡＨ１（１８Ｂ）抗原で刺激された、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５でワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのスポット形成コロニーを含むプレートを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図１９Ａ】図１９は、ΔｕｖｒＡＢ突然変異を伴うまたは伴わない、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ＤＰ−Ｌ４０２９での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６肺腫瘍を持つマウスからの肺を示す（１９Ａ）。肺転移の数を各ワクチン株につきプロットする（１９Ｂ）。残りのマウスの生存は図１９Ｃにおいてプロットする。
【図１９Ｂ】図１９は、ΔｕｖｒＡＢ突然変異を伴うまたは伴わない、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ＤＰ−Ｌ４０２９での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６肺腫瘍を持つマウスからの肺を示す（１９Ａ）。肺転移の数を各ワクチン株につきプロットする（１９Ｂ）。残りのマウスの生存は図１９Ｃにおいてプロットする。
【図１９Ｃ】図１９は、ΔｕｖｒＡＢ突然変異を伴うまたは伴わない、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ＤＰ−Ｌ４０２９での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６肺腫瘍を持つマウスからの肺を示す（１９Ａ）。肺転移の数を各ワクチン株につきプロットする（１９Ｂ）。残りのマウスの生存は図１９Ｃにおいてプロットする。
【図２０Ａ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２０Ｂ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２０Ｃ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２０Ｄ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理されている野生型Ｌｉｓｔｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｒＡＢ突然変異体によって感染されたＤＣ２．４細胞の蛍光顕微鏡イメージを示し、融合させたイメージ（Ｌｉｓｔｅｒｉａおよびアクチン陽性双方）およびローダミンイメージ（アクチン陽性のみ）を示す。図２１Ｂは、ＬＬＯ−と比較した、野生型およびΔｕｖｒＡＢ株（生、加熱、死滅またはＳ−５９ＵＶＡ処理）についての細胞質に存在するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのパーセンテージのプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ａは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理されている野生型Ｌｉｓｔｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｒＡＢ突然変異体によって感染されたＤＣ２．４細胞の蛍光顕微鏡イメージを示し、融合させたイメージ（Ｌｉｓｔｅｒｉａおよびアクチン陽性双方）およびローダミンイメージ（アクチン陽性のみ）を示す。図２１Ｂは、ＬＬＯ−と比較した、野生型およびΔｕｖｒＡＢ株（生、加熱、死滅またはＳ−５９ＵＶＡ処理）についての細胞質に存在するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのパーセンテージのプロットである。
【図２２】図２２は、グラム染色Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ野生型、およびＳ−５９／ＵＶＡ処理されているΔｕｖｒＡＢ株の陰性イメージ顕微鏡写真を示す。
【図２３Ａ】図２３は、示されたＬｉｓｔｅｒｉａ株またはビヒクルコントロールでワクチン接種されたマウスへの注射に続いての標的細胞集団を示す。非特異的標的細胞に対する抗原特異的標的細胞の低下したレベルは、ワクチン接種に応答するＴ細胞のインビボ細胞傷害性を示す。図２３Ａは、０日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理株については１および２日も）におけるワクチン接種でのＡＨ１−ＡＨ５発現ワクチンについての結果を示す（図２３Ａおよび２３Ｂにおける頂部列は、ＡＨ１標的細胞に対する示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す。底部列は、ＡＨ１−Ａ５標的細胞についての示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す）。図２３Ｂは、１４日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理については１５および１６日）における反復ワクチン接種を有し、図２３Ｃは、ＯＶＡ特異的応答において観察される。
【図２３Ｂ】図２３は、示されたＬｉｓｔｅｒｉａ株またはビヒクルコントロールでワクチン接種されたマウスへの注射に続いての標的細胞集団を示す。非特異的標的細胞に対する抗原特異的標的細胞の低下したレベルは、ワクチン接種に応答するＴ細胞のインビボ細胞傷害性を示す。図２３Ａは、０日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理株については１および２日も）におけるワクチン接種でのＡＨ１−ＡＨ５発現ワクチンについての結果を示す（図２３Ａおよび２３Ｂにおける頂部列は、ＡＨ１標的細胞に対する示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す。底部列は、ＡＨ１−Ａ５標的細胞についての示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す）。図２３Ｂは、１４日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理については１５および１６日）における反復ワクチン接種を有し、図２３Ｃは、ＯＶＡ特異的応答において観察される。
【図２３Ｃ】図２３は、示されたＬｉｓｔｅｒｉａ株またはビヒクルコントロールでワクチン接種されたマウスへの注射に続いての標的細胞集団を示す。非特異的標的細胞に対する抗原特異的標的細胞の低下したレベルは、ワクチン接種に応答するＴ細胞のインビボ細胞傷害性を示す。図２３Ａは、０日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理株については１および２日も）におけるワクチン接種でのＡＨ１−ＡＨ５発現ワクチンについての結果を示す（図２３Ａおよび２３Ｂにおける頂部列は、ＡＨ１標的細胞に対する示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す。底部列は、ＡＨ１−Ａ５標的細胞についての示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す）。図２３Ｂは、１４日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理については１５および１６日）における反復ワクチン接種を有し、図２３Ｃは、ＯＶＡ特異的応答において観察される。
【図２４】図２４は、ｕｖｒＡＢの欠失を伴うおよび伴わない、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株の減弱化を示す。ｌｏｇ力価は、増殖およびＵＶＡ照射（６Ｊ／ｃｍ２）の間に存在するソラレンＳ−５９のｎＭ濃度に対してプロットされる。
【図２５】図２５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ−がＳ−５９／ＵＶＡ光不活化に対してより感受性であることを示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａは中期ｌｏｇ相まで増殖させ、ＰＢＳ中で洗浄し、種々の濃度のＳ−５９と共に５分間インキュベートし、２．１Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光で照射した。Ｌｉｓｔｅｒｉａの変動性はＢＨＩ寒天プレート上での増殖によって評価した。（Ａ）１００ｎＭ  Ｓ−５９で処理したＬｉｓｔｅｒｉａの代表的なＢＨＩ寒天プレート。加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａをコントロールとして供した；（Ｂ）ＢＨＩ寒天プレート上でコロニーを形成するための種々の濃度のＳ−５９で処理されたＬｉｓｔｅｒｉａの変動性。
【図２６】図２６は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理された活力の無いＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢがその代謝活性およびそのゲノムレパートリーの発現を保持することを示す。（Ａ）Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢのＭＴＴアッセイで測定された代謝活性。生きたおよび加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢをコントロールとして供した；（Ｂ）ＭＴＴアッセイで測定された不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株の代謝活性の定量。
【図２７】図２７は、ＤＣを感染し、ファゴリソソームから逃れるその能力を、十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株が保持することを示す。カバーグラス上で増殖させたネズミＤＣ系ＤＣ２．４を３７℃にて３０分間、１のＭＯＩにて感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって注意深く除去し、感染した細胞を、ゲンタマイシンの存在下で３７℃にて５時間インキュベートして、細胞外細菌の増殖を妨げた。ＤＣ２．４細胞を３．５％ホルムアルデヒドで固定し、次いで、ウサギ抗Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体で染色し、ヤギ−抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体で検出した。アクチンはファロイジン−ローダミンで検出し、ＤＡＰＩを用いて核を可視化した。
【図２８】図２８は、十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢが、ネズミ骨髄−由来のＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）のＭＨＣクラスＩ経路へ効果的に抗原を負荷することを示す。第５日に、ＢＭ−ＤＣを、１００のＭＯＩにて３７℃にて３０分間感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって除去した。感染されたＢＭ−ＤＣをＢ３Ｚと共に一晩共インキュベートし、発色性物質ＣＰＲＧの加水分解によって活性を測定した（吸光度）。
【図２９Ａ】図２９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染ヒト未成熟単球−由来ＤＣが、活性化（２９Ａ）および成熟化マーカー（２９Ｂ）をアップレギュレートし、ならびにプロ炎症サイトカインを分泌する（２９Ｃ）ことを示す。ＤＣを、種々のＭＯＩにてＬｉｓｔｅｒｉａで１時間感染させた。感染したＤＣを、ゲンタマイシンの存在下でさらに２４時間培養して、細胞外細菌の増殖を妨げた。表現型の変化は、フローサイトメトｒ−によって測定した。サイトカインのレベルは、サイトメータービーズアレイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、細胞上清から測定した。
【図２９Ｂ】図２９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染ヒト未成熟単球−由来ＤＣが、活性化（２９Ａ）および成熟化マーカー（２９Ｂ）をアップレギュレートし、ならびにプロ炎症サイトカインを分泌する（２９Ｃ）ことを示す。ＤＣを、種々のＭＯＩにてＬｉｓｔｅｒｉａで１時間感染させた。感染したＤＣを、ゲンタマイシンの存在下でさらに２４時間培養して、細胞外細菌の増殖を妨げた。表現型の変化は、フローサイトメトｒ−によって測定した。サイトカインのレベルは、サイトメータービーズアレイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、細胞上清から測定した。
【図２９Ｃ】図２９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染ヒト未成熟単球−由来ＤＣが、活性化（２９Ａ）および成熟化マーカー（２９Ｂ）をアップレギュレートし、ならびにプロ炎症サイトカインを分泌する（２９Ｃ）ことを示す。ＤＣを、種々のＭＯＩにてＬｉｓｔｅｒｉａで１時間感染させた。感染したＤＣを、ゲンタマイシンの存在下でさらに２４時間培養して、細胞外細菌の増殖を妨げた。表現型の変化は、フローサイトメトｒ−によって測定した。サイトカインのレベルは、サイトメータービーズアレイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、細胞上清から測定した。
【図３０】図３０は、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡがインビボにてＯＶＡ−特異的免疫を誘導することを示す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０８ＣＦＵのＳ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡを静脈内投与した。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化親Ｌｉｓｔｅｒｉａ株および加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａをコントロールとして供した。７日後に、脾臓を収集し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによってＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価した。（Ａ）代表的なＥＬＩＳＰＯＴウェルを示す；（Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴによって評価したＯＶＡ−特異的免疫。ワクチン接種したマウスの脾臓細胞を、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドと共に、またはそれなくしてインキュベートした。
【図３１】図３１は、異種抗原ＬＬＯ−ＯＶＡ／ＰＲ３の一次アミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。該図面はＯＶＡ  Ｈ−２Ｋｂエピトープ（配列番号：４９）およびＰＲ３  ＨＬＡ  Ａ−２制限クラスＩエピトープ（ａ．ｋ．ａ．ＰＲ１）（配列番号：５０）も示す。
【図３２】図３２は、化合物４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５‘，８−トリメチルソラレン（Ｓ−５９）を示す。
【図３３】図３３は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＤＰ−ＬＡ０５６株およびＥＧＤ株についてのｈｌｙプロモーターのアライメントを示す。
【図３４】図３４は、ｈｌｙプロモーターを含み、ＬＬＯシグナルペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を含む融合タンパク質をコードするコドンを最適化した発現カセットを示す。シグナルペプチドをコードする配列および上記抗原をコードする配列の両方は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためにコドンが最適化される。
【図３５】図３５は、図３４の発現カセットによりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３６】図３６は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためにコドンを最適化したヒトメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）についてのコード配列を示す。
【図３７】図３７は、ヒトメソテリンについてのアミノ酸配列を示す。
【図３８】図３８は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためにコドンを最適化したマウスメソテリンについてのコード配列を示す。
【図３９】図３９は、マウスメソテリンのアミノ酸配列を示す。
【図４０】図４０は、Ｓ−５９ソラレン／ＵＶＡ不活性化Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡに感染したＤＣ由来の自己骨髄で静脈内免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導が、細菌ｕｖｒＡＢ遺伝子の欠失に依存することを示す。（ａ）ＣＤ１１ｃｈｉ／ＭＨＣクラスＩＩｈｉの二重染色により示される、感染前の樹状細胞の表現型検証。（ｂ）Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンおよび処置を示す、感染後１時間における顕微鏡写真。（ｃ）免疫化マウス由来の脾細胞のＫｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４９）テトラマー分析。
【図４１】図４１は、ワクチンの挑戦実験についてのプロトコールを示す。
【図４２】図４２は、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活性化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡを使用するが、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活性化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡΔＯＶＡを使用しないマウスのワクチン接種が、ＶＶ−ＯＶＡの負荷に対して保護されることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月11日(2007.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007523879000001.app
【国際調査報告】
2007523879.tif 000162
2007523879.tif 000163
2007523879.tif 000164
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2007523879.tif 000166
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