(57)【要約】  本発明は純粋なタクロリムス、及びタクロリムスを精製するための方法を提供する。当該方法においては、タクロリムスの充填用試料を湿潤吸着樹脂のベッドに並置し、充填用試料及びベッドをＴＨＦ、アセトニトリル、又はそれらの組み合わせ、水、及び任意で、少なくとも１つの追加の有機溶媒を含んで成る溶離剤を用いて溶出し、溶離剤の中間留分を回収し、そしてタクロリムスを回収し、不純物のレベルが減少するまでタクロリムスを更に結晶化及び再結晶化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＬＣで約０.５０面積パーセント未満の全不純物含有量を有するタクロリムス。
【請求項２】
ＨＰＬＣで約０.１６面積パーセント未満の全不純物含有量を有する、請求項１に記載のタクロリムス。
【請求項３】
ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満のアスコマイシンを有するタクロリムス。
【請求項４】
ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満のアスコマイシンを有する、請求項３に記載のタクロリムス。
【請求項５】
ＨＰＬＣで約０.０７面積パーセント未満のジヒドロタクロリムスを有するタクロリムス。
【請求項６】
ＨＰＬＣで約０.０５面積パーセント未満のジヒドロタクロリムスを有する、請求項５に記載のタクロリムス。
【請求項７】
ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.１９を有するタクロリムス。
【請求項８】
ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.６０を有するタクロリムス。
【請求項９】
ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.６０を有する、請求項８に記載のタクロリムス。
【請求項１０】
ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.８３を有するタクロリムス。
【請求項１１】
ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.８３を有する、請求項１０に記載のタクロリムス。
【請求項１２】
ＨＰＬＣで約０.０８面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.４５を有するタクロリムス。
【請求項１３】
ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.４５を有する、請求項１２に記載のタクロリムス。
【請求項１４】
ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満の任意の個々の不純物を有するタクロリムス。
【請求項１５】
ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の任意の個々の不純物を有する、請求項１４に記載のタクロリムス。
【請求項１６】
ａ）タクロリムスの充填用試料（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｈａｒｇｅ）を調製すること；
ｂ）タクロリムスの充填用試料を吸着樹脂のベッド上に充填すること；
ｃ）充填用試料及びベッドをＴＨＦ、アセトニトリル、又はそれらの混合物、及び水を含んで成る溶離剤を用いて溶出し、溶出物を得ること；
ｄ）溶出物の主な画分を回収すること；
ｅ）主な画分からタクロリムスを回収すること；
ｆ）タクロリムスを結晶化すること；及び
ｇ）タクロリムスを再結晶化すること
を含んで成る、タクロリムスを精製するための方法。
【請求項１７】
前記吸着樹脂がＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記充填用試料が有機溶媒、又は水と混合した有機溶媒中のタクロリムスの溶液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記充填用試料が吸着樹脂の充填部分に吸着するタクロリムスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記吸着が有機溶媒中でタクロリムスの溶液を調製すること、当該溶液を吸着樹脂の部分及び水と混合すること、及び当該残りの溶液から吸着した充填用試料を分離することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離が濾過による、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記有機溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、アセトニトリル（ＡＣＮ）、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、エステル（例えば、酢酸エチル）、及び双極子非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）から成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記有機溶媒がＴＨＦ、アセトン又はアセトニトリルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
段階ｃ）の溶離剤が少なくとも１つの有機溶媒を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記吸着樹脂のベッドがカラム内に入れられている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
段階ｄ）の前に前記ベッドが吸着樹脂の第二のベッドと流体連絡して置かれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のベッドが第一のベッドから分離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記の系に追加の吸着樹脂のベッドを接続することを更に含んで成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
追加の量の水が最後のカラムに添加される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
段階ｅ）における単離が、リン酸の存在下で、約７０℃以下の温度で、約７６０ｍｍＨｇ以下の圧力において主な画分を濃縮すること、水不混和性溶媒及び塩基を添加すること、水不混和性溶媒相を分離すること、及びそれを濃縮することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
前記水不混和性溶媒が酢酸エチル又はジクロロメタンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記塩基がアンモニア溶液である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
段階ｆ）における結晶化が、酢酸エチル及びシクロヘキサンにタクロリムスの油性残渣を溶解すること、水を添加してタクロリムスの結晶化を誘導すること、及び結晶化したタクロリムスを回収することを含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項３４】
溶解段階の前に、油性残渣を酢酸エチルで希釈し、再び濃縮して油性残渣にする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
段階ｇ）における再結晶化が、酢酸エチルにタクロリムスを溶解すること、油性残渣を得るまで溶液を濃縮すること、酢酸エチルに油性残渣を溶解すること、シクロヘキサンを当該溶液に添加すること、水を添加してタクロリムスの結晶化を誘導すること、及びタクロリムスを再結晶化することを含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１６に記載の方法により得たタクロリムス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、純粋なタクロリムス、及び吸着樹脂を用いてマクロライド・タクロリムスを精製する方法に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００４年１２月２２日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６３８,６２８号、及び２００４年１２月２３日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６３８,８１５号の利益を主張するものである。その内容は、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
マクロライドは、置換基として１又は複数のデオキシ糖を有する多員ラクトン環である。タクロリムス（ＦＫ ５０６）は、免疫抑制剤でもあるマクロライド抗生物質である。シクロスポリンよりも効力のあるタクロリムスは、Ｔ−リンパ球に対して選択的な阻害作用を有することが報告されている。
【０００４】
タクロリムスは典型的には発酵により得られる。典型的に、得られたタクロリムスは、様々な手段、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出することのできるいくつかの不純物を含む。医薬化合物における不純物の存在は望ましくなく、多くの管轄における保健機関、例えば米国の食品医薬品局は、薬剤中の不純物の許容されるレベルに関するガイドラインを確立してきた。任意の薬剤における、不純物のレベルを減少させる方法に関する必要性及び商業上の有用性は、自明である。
【０００５】
米国特許第４,８９４,３６６号、同第６,５７６,１３５号、同第６,８８１,３４１号及び同第６,４９２,５１３号は、タクロリムスの精製方法を開示する。
【０００６】
その発明者（Ｆｕｊｉｓａｗａ）の錠剤は、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）の名前で市販されている。ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）錠剤を分析し、いくつかの不純物を含むことが見出した。錠剤の不純物プロファイルを表１に要約する。
【０００７】
【表１】
2007523201.tif 000002
【０００８】
従って、以前得られていたものより高い純度のタクロリムス、及びタクロリムスを精製するためのより効果的な方法に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
１つの実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.５０面積パーセント未満、好ましくは約０.１６面積パーセント未満の全不純物含有量を有するタクロリムスを対象にする。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満のアスコマイシンを有するタクロリムスを対象にする。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０７面積パーセント未満、好ましくは約０.０５面積パーセント未満のジヒドロタクロリムスを有するタクロリムスを対象にする。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.１９を有するタクロリムスを対象にする。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.６０を有するタクロリムスを対象にする。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.８３を有するタクロリムスを対象にする。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０８面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.４５を有するタクロリムスを対象にする。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の任意の個々の不純物を有するタクロリムスを対象にする。
【００１７】
１つの実施態様において、本発明はタクロリムスを精製するための方法を提供する。本方法は、タクロリムスの充填用試料（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｈａｒｇｅ）を調製すること、タクロリムスの充填用試料を吸着樹脂のベッドに充填すること、充填用試料及びベッドをＴＨＦ及び／又はアセトニトリル及び水を含む溶離剤で溶出すること（溶出物を得るために）、溶出物の主な画分を回収すること、主な画分からタクロリムスを回収すること、タクロリムスを結晶化すること、更にそれを再結晶化することを含んで成る。好ましくは、上記の方法で得たタクロリムスは、上記のようなレベルの不純物を有する。タクロリムスは、任意の起源からであることができる。
【００１８】
別の側面において、本発明は、上記の方法で調製したタクロリムスに関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書中で用いる場合、「周囲温度」という用語は、約０℃〜約４０℃、好ましくは約１０℃〜約３５℃の温度を指す。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、「減圧」という用語は、約７６０ｍｍＨｇ未満の圧力を指す。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、「貧溶媒（ａｎｔｉ−ｓｏｌｖｅｎｔ）」という用語は、周囲温度で通常液体である物質であって、その中ではタクロリムスがよくてもやや溶けにくい物質を指す。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「不純物」という用語は、保持時間を決定するのに用いられるクロマトグラフィー装置の少なくとも検出限界に関して、タクロリムスとは異なる保持時間を有する任意の化合物に関する。異なる保持時間は、例えば下記のＨＰＬＣ法により測定することができる。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、「不純物ＲＲＴ１.１９」という用語は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、約１.１９のＲＲＴに現れる不純物に関する。この不純物はタクロリムスの異性体である。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「不純物ＲＲＴ０.６０」という用語は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、約０.６０のＲＲＴに現れる不純物に関する。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、「不純物ＲＲＴ０.８３」という用語は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、約０.８３のＲＲＴに現れる不純物に関する。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「不純物ＲＲＴ１.４５」という用語は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、約１.４５のＲＲＴに現れる不純物に関する。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、アスコマイシン及びジヒドロタクロリムスという用語は、それぞれＲＲＴ０.９５及びＲＲＴ１.２５を指す。それらはタクロリムス中の不純物であり、ＨＰＬＣ分析（例えば、本明細書中の下記のもの）においてタクロリムスと関連して約０.９５及び１.２５の保持時間を有する。液体の混合物又は組み合わせとの関連で本明細書中で用いる場合、「容量パーセント（ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒｃｅｎｔ、ｐｅｒｃｅｎｔ−ｂｙ−ｖｏｌｕｍｅ）」（ｖｏｌ−％）という用語は、以下のように計算した体積分率を指す（種Ａについて例示）：
ｖｏｌ−％A＝ＷｔA×ρA／（ＷｔA×ρA＋ＷｔB×ρB）
ＷｔA及びＷｔBは、それぞれ種Ａ及びＢのグラム量であり、ρA及びρBは、それぞれ種Ａ及びＢの密度（ｇ／ｍｌ）である。
【００２８】
１つの実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.５０面積パーセント未満、好ましくは約０.１６面積パーセント未満の全不純物含有量を有するタクロリムスを対象にする。
【００２９】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満のアスコマイシンを有するタクロリムスを対象にする。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０７面積パーセント未満、好ましくは約０.０５面積パーセント未満のジヒドロタクロリムスを有するタクロリムスを対象にする。
【００３１】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.１９を有するタクロリムスを対象にする。
【００３２】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.６０を有するタクロリムスを対象にする。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.８３を有するタクロリムスを対象にする。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０８面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.４５を有するタクロリムスを対象にする。
【００３５】
別の実施態様において、本発明は、ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満、好ましくは約０.０２面積パーセント未満の任意の個々の不純物を有するタクロリムスを対象にする。
【００３６】
１つの実施態様において、本発明はタクロリムスを精製する（すなわち、タクロリムス中の不純物含有量を減少させる）ための方法を提供する。本方法は、タクロリムスの充填用試料を調製すること、タクロリムスの充填用試料を吸着樹脂のベッドに充填すること、溶出物を得るために充填用試料及びベッドをＴＨＦ及び／又はアセトニトリル及び水を含む溶離剤で溶出すること、溶出物の主な画分を収集すること、主な画分からタクロリムスを回収すること、タクロリムスを結晶化すること、更にそれを再結晶化することを含んで成る。好ましくは、上記の方法で得たタクロリムスは、上記のようなレベルの不純物を有する。タクロリムスは、任意の起源からであることができる。
【００３７】
本発明の実施においては、不純物の減少又は分離は主に、溶出物を得るための溶離剤を用いて、タクロリムスの充填用試料で充填した吸着樹脂のベッドを溶出することにより達成される。本発明の実施において有用な吸着樹脂は、当業界で良く知られており、好ましくは化学的に修飾されることのできる架橋された、非イオン性スチレン−ジビニルベンゼン材料である。アクリルタイプの吸着樹脂も知られている。吸着樹脂は、様々な化学種を吸収し、そして脱着することのできる表面を有する、高度に多孔質な構造を有する。この吸収及び脱着は、環境、例えば用いる溶媒により影響を受ける。極性溶媒（例えば、水）の存在下では、吸着樹脂は疎水性の挙動を示す。非極性溶媒が用いられる場合（例えば、炭化水素）、吸着樹脂はいくらか極性の挙動を示し得る。典型的には、吸着樹脂はマクロレティキュラー（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）構造を有し、少なくとも約３００ｍ2／ｇの表面積を有する。
【００３８】
本発明の実施において有用な吸着樹脂としては、例えば、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓから入手可能なＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ樹脂；ＸＡＤ４、ＸＡＤ７ＨＰ、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ７６１、及びＸＡＤ１１８０が挙げられる。Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉから入手可能であるＤｉａｉｏｎ吸着樹脂も有用である；例えば、ＨＰ１０、ＨＰ２０、ＨＰ２１、ＨＰ３０、ＨＰ４０、ＨＰ５０、ＳＰ８００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ＳＰ２０５、ＳＰ２０６、ＳＰ２０７、ＨＰ１ＭＧ及びＨＰ２ＭＧ。ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０は、本発明の実施における使用に対して好ましい吸着樹脂の例である。ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０は、マクロレティキュラー架橋芳香族ポリマーである。それは、特許を受けたマクロレティキュラー構造（連続的なポリマー相及び連続的な細孔相の両方を含む）、高い表面積、及び表面の芳香族の性質から吸着特性を得た、非イオン性の疎水性架橋ポリマーである。表面積は５００ｍ2／ｇ以上である。多孔率は、０.６０ｍｌ／ｍｌ以上である。ＰＤＳ０２０５Ａ−Ｊａｎ．９８−１／２の製品データシートは、この樹脂について更なる情報を与える。
【００３９】
充填用試料は、有機溶媒又は水と混合した有機溶媒中でタクロリムスの溶液として、或いはタクロリムスを充填した充填部分すなわち吸着樹脂の充填部分に吸着したタクロリムスとして調製することができる。
【００４０】
吸着樹脂のベッド上に充填する前にタクロリムスの充填用試料を吸着樹脂の充填部分に吸着させる（置く）場合、この吸着は任意に水を含む有機溶媒中においてタクロリムスの溶液を調製すること、及び吸着樹脂の部分と水をその溶液と混合することを包含する。吸着樹脂は、ベッドを調製するのに用いるものと同一であることができ、又は異なる吸着樹脂であることができる。吸着樹脂の充填部分は、そのベッドの約３３パーセント〜約５０％の体積であることができる。吸着樹脂上でのタクロリムスの吸着が実質的に完了した後、充填用試料は残りの溶液から分離される。分離は濾過によることができる。充填用試料を生成するためにカラムを再循環する方法を用いる場合、カラムは簡単に再循環系から分離される。
【００４１】
充填用試料が充填又は置かれる溶液を調製するのに用いる有機溶媒は、好ましくは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、アセトニトリル（ＡＣＮ）、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、エステル（例えば、酢酸エチル）、及び双極子非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）から成る群から選択される。より好ましくは、有機溶媒はＴＨＦ，アセトン又はＡＣＮであり、そして最も好ましくは、ＴＨＦ及びＡＣＮである。
【００４２】
水の添加は、溶媒：水の比を減少させ、それにより吸着樹脂上のタクロリムスの吸着を増大させる。
【００４３】
タクロリムス溶液の充填用試料、吸着樹脂の充填部分、及び水の混合は、撹拌機（例えば、撹拌槽型反応器）を備えた任意の便利な容器中に存在することができる。
【００４４】
一例としては、タクロリムス溶液の充填用試料は約１００ｇ／ｌであることができ、水の体積は溶液の体積の少なくとも約５倍であることができる。吸着樹脂の充填部分のかさ体積は、溶液の体積とだいたい同じであることができる。吸着樹脂の充填部分におけるタクロリムスの吸着を得るために、決まりきった実験により比率を最適化することを、当業者は知っているだろう。
【００４５】
この実施態様の後の段階においては、タクロリムスを充填した充填部分を湿潤吸着樹脂で調製したベッドに並置する。ベッドは適切な容器の中に入れられる。好ましくは、ベッドはカラム、好ましくはまるい横断面のカラム内に入れられる。ベッドを調製するために、所望の量の吸着樹脂を、水又は水及び溶媒（例えば、ＴＨＦ又はＡＣＮ）の混合物と混ぜる。
【００４６】
タクロリムス及び不純物の分離（それにより、タクロリムス中の不純物のレベルが減少し、純粋なタクロリムスが調製される）は、溶離剤を充填用試料に通し、その後それに並置し且つ流体連絡した吸着樹脂のベッドに通すことにより行う。任意で、溶離剤は、本方法の最初の段階でタクロリムスの溶解に使用する溶媒の群から選択される追加の有機溶媒を含んで成る。
【００４７】
充填用試料を有機溶媒、又は水と混合した有機溶媒中でタクロリムスの溶液として調製する場合、この溶液を湿潤吸着樹脂で調製したベッドに注入し、カラムをタクロリムス溶液の流れと接触させ、吸着樹脂の充填部分の内部や周囲を流れる溶液の流れに溶離剤を導入することにより、タクロリムスのサンプルを徐々に吸着樹脂の充填部分に吸着させる。
【００４８】
第一の溶出の後、そのベッドは第二のベッドと流体連絡して置かれ、それにより第一のベッドからの溶離剤は第二のベッドを通って溶出する。第一及び第二のベッドの溶出の後、第二のベッドは第一のベッドから分離することができ、好ましくは分離し（すなわち、流体連絡を壊し）、第二のベッドだけを通して溶出を継続する。任意で、溶離剤は約３３〜３７容量パーセントを有するＴＨＦと水の混合物である。溶離剤画分は回収して水で希釈することができ、その後第三のベッド（カラム）に通すことができる。任意で、追加のカラムをこの系に接続することができ、より精製された産物を得るために追加の量の水で希釈する。好ましくは、吸着樹脂上でのタクロリムスの吸着を増大させるために、追加の量の水を最後のカラムに添加する。
【００４９】
溶離剤は、水及び有機溶媒、例えばＴＨＦ、ｃａｎ及びそれらの混合物を含む。好ましい溶離剤は、基本的には、約２０容量パーセント〜約５０容量パーセント、最も好ましくは約３１容量パーセント〜約４０容量パーセントのＴＨＦを有する、ＴＨＦ及び水の混合物である。有機溶媒、例えばメタノール、アセトニトリル、アセトン、又はｎ−ブタノールを、ＴＨＦ／水の溶離剤とともに使用する場合、ＴＨＦの含有量は３８容量パーセント未満、好ましくは約４〜約３８容量パーセントである。別の好ましい溶離剤は、約３０容量パーセント〜約７０容量パーセント、最も好ましくは約４０容量パーセント〜約６５容量パーセントのアセトニトリルを有する、アセトニトリルと水の混合物である。溶離剤がアセトニトリルと水の混合物である場合、溶離剤は約０.０００５〜約０.００３部のリン酸及び１部の溶離剤も含むことができる。
【００５０】
ベッドの総断面積（溶離剤の流れに対して垂直に測定）に依存する比率で、溶離剤を充填用試料及びそれに並置した吸着樹脂のベッドを通して溶出させる。好ましくは、流速（断面積に関する）は、約２５ｃｍ／時未満、好ましくは約１５ｃｍ／時未満である。溶出速度が低下すると時間は増大するが、分離効率は向上する。分離効率を増大させるための好ましい溶出速度は、約９ｃｍ／時〜約１１ｃｍ／時である。
【００５１】
溶出画分の含有量及び組成は、任意の便利な手段により測定することができる。タクロリムス中の不純物、特にアスコマイシン及びジヒロドタクロリムスの検出及び定量化は、本明細書中の下記のＨＰＬＣ法により実施することができる。
【００５２】
とりわけカラム充填並びに溶離剤の組成及び流速に依存して、最終的な単離産物がＨＰＬＣで約０.１面積パーセント以下のアスコマイシンを有するように、主な画分を回収する。
【００５３】
必要であれば、不純物から分離し、それにより減少したレベルの不純物を有するタクロリムスは、任意の便利な手段（例えば、抽出、凍結乾燥、蒸発、貧溶媒の添加）により溶出物から単離することができる。水、アルカン及びシクロアルカンは有用な貧溶媒であり、そして他のものは当業界で知られている。単離法は組み合わせることができる。例えば、貧溶媒は濃縮した溶離剤と混合することができる。
【００５４】
好ましい単離方法は、７０℃以下、好ましくは６０℃以下、好ましくは７６０ｍｍＨｇ以下の圧力で、初期の体積の約５０パーセントまで主な画分を濃縮することを含み、それにより濃縮したタクロリムス画分が得られる。好ましくは、タクロリムスを安定化するための濃縮の前に、溶離剤１リットルあたり約１〜約１０ｍｌのリン酸を添加する。
【００５５】
任意で、濃縮した主な画分を保持時間の間、周囲温度で保持する。保持時間を用いる場合、好ましい保持時間は約１〜４日である。水不混和性溶媒、例えば酢酸エチル又はジクロロメタン、及び塩基、例えばアンモニア溶液を、濃縮したタクロリムス画分に添加し、そして水不混和性溶媒相を分離し濃縮する。ｐＨが約９以下になるまで塩基を添加した。
【００５６】
不純物の更なる減少は、回収した産物をいくつかの追加の処理、例えば結晶化及び再結晶化にかけることにより達成することができる。
【００５７】
タクロリムスの油性残渣の結晶化は、タクロリムスの油性残渣を酢酸エチル及びシクロヘキサンに溶解すること、水を添加してタクロリムスの結晶化を誘導すること及び結晶化したタクロリムスを回収することを含んで成る。好ましくは、溶解段階の前に、油性残渣を酢酸エチルで希釈し、再び濃縮して油性残渣にする。好ましくは、水を滴下により添加する。典型的に、水：タクロリムスの比は、結晶化工程において、１ｋｇのタクロリムスに対して０.０１５ｋｇ〜０.３ｋｇ水である。
【００５８】
タクロリムスの再結晶化は、酢酸エチルにタクロリムスを溶解すること、油性残渣を得るまで溶液を濃縮すること、酢酸エチルに油性残渣を溶解すること、この溶液にシクロヘキサンを添加すること、水を添加してタクロリムスの結晶化を誘導すること及び結晶化したタクロリムスを回収することを含んで成る。好ましくは、溶解及び濃縮段階を繰り返すことができる。好ましくは、色及び繊維を除去するためにこの溶液を木炭で処理する。濃度は上記の通りである。好ましくは、得られたタクロリムスを更に乾燥させる。
【００５９】
本発明の実施では、最後のクロマトグラフィー段階を連続した３つのカラムを用いて実施することで、アスコマイシン及びジヒドロタクロリムスが顕著に減少し、そして溶媒混合物への調節された水の添加及び調節された結晶化時間により不純物ＲＲＴ１.１９が顕著に減少した。
【００６０】
本発明の方法により達成したタクロリムスの精製は、本明細書中の下記のＨＰＬＣ法により測定することができる。
【００６１】
具体的な実施態様においては、少なくとも不純物であるアスコマイシン及びジヒドロタクロリムスのレベルを減少させて、高純度のタクロリムスを調製する。他の不純物のレベルも減少させる。本方法は：吸着樹脂、特にマクロレティキュラー樹脂、例えばＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０及びＤｉａｉｏｎＨＰ２０の充填部分を用いて又は用いずに、タクロリムスの溶液を含んで成るタクロリムスの充填用試料を調製する段階；湿潤吸着樹脂、特にＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０及びＤｉａｉｏｎＨＰ２０（容器、特にカラムに入れることのできる）に充填用試料を充填する段階；溶離剤、すなわちテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及び水の混合物（約２０容量パーセント〜約５０容量パーセント、特に約３１容量パーセント〜約４０容量パーセントのＴＨＦ）、又はアセトニトリル（ＡＣＮ）及び水の混合物（約３０容量パーセント〜約７０容量パーセント、最も特別には約４０容量パーセント〜約６５容量パーセントのアセトニトリル）で、充填部分及び吸着樹脂を溶出する段階；約６０パーセント超、好ましくは約６０パーセント〜約９０パーセントの初期のタクロリムスを含む、少なくとも溶離剤の主な画分（中間留分）を回収する段階、（初期の純度に依存して）任意で、例えば主な画分を濃縮する（例えば、酸の存在下において減圧下で）ことにより、主な画分から不純物の減少したタクロリムスを単離する段階、及び任意で、そのようにして得た産物を回収する段階を含む。上記の通り、得られた産物を更に結晶化し、そして再結晶化する。
【００６２】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで０.５０面積パーセント未満、最も好ましくは０.１６面積パーセント未満の全不純物含有量を有する。
【００６３】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満、最も好ましくは約０.０２面積パーセント未満のアスコマイシンを有する。
【００６４】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.０７面積パーセント未満、最も好ましくは約０.０５面積パーセント未満のジヒドロタクロリムスを有する。
【００６５】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.１９を有する。
【００６６】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満、最も好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.６０を有する。
【００６７】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.１２面積パーセント未満、最も好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ０.８３を有する。
【００６８】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.０８面積パーセント未満、最も好ましくは約０.０２面積パーセント未満の不純物ＲＲＴ１.４５を有する。
【００６９】
好ましくは、得られたタクロリムスは、ＨＰＬＣで約０.０６面積パーセント未満、最も好ましくは約０.０２面積パーセント未満の任意の個々の不純物を有する。
【００７０】
本発明は、上記の方法により得られるタクロリムスを提供する。
【００７１】
【表２】
2007523201.tif 000003
【００７２】
グラジエントの表
【表３】
2007523201.tif 000004
【００７３】
流速：２.３ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ
注入体積：２０μｌ
サンプルの溶媒：アセトニトリル
カラムユニットの温度：６０℃
測定時間：２７分
タクロリムスの保持時間：約１４分
検出限界：０.０１面積パーセント未満
定量限界：０.０２面積パーセント未満
【００７４】
不純物であるアスコマイシン（ＲＲＴ０.９５）、ジヒドロタクロリムス（ＲＲＴ１.２５）及び不純物であるＲＲＴ１.１９の保持時間は、タクロリムスに関連しており、クロマトグラムの全ピークの面積に対する面積パーセントとして表されている。
【００７５】
現在入手可能な典型的なＨＰＬＣ装置の検出限界及び定量限界は、それぞれ０.０１面積パーセント未満及び０.０２面積パーセント未満である。
【実施例】
【００７６】
下記の非制限的な実施例は、本発明の好ましい実施態様の単なる例示であり、本発明を制限するものと解釈されてはならず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により規定される。
【００７７】
実施例１
タクロリムスの出発材料を、クロマトグラフィー及びいくつかの結晶化段階により精製した。純度分析は、上記の「実施例に用いたクロマトグラフィー条件」に記載した分析ＨＰＬＣ法を用いて実施した。出発材料は、０.１６面積パーセントのアスコマイシン、１.５６面積パーセントの不純物ＲＲＴ１.１９、及び０.４６面積パーセントのジヒドロタクロリムスを含んでいた。出発物質の試験は、９５質量パーセントの純度を与えた。本発明の方法を用いた精製に従う場合、最終産物は、０.０２面積パーセントのアスコマイシン、０.０２面積パーセントの不純物ＲＲＴ１.１９、及び０.０５面積パーセントのジヒドロタクロリムスを含んでいた。存在する他の任意の不純物の量は、０.０２面積パーセント以下であり、本発明の方法で得られたタクロリムスの純度は９９.８４面積パーセントであった。
【００７８】
クロマトグラフィー段階
ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０吸着樹脂をクロマトグラフィーに用いた。３つのクロマトグラフィーカラム（直径４０ｃｍ、カラムの高さ１ｍ、およそ１００リットルの湿潤吸着樹脂）を調製した。３８１２ｇ（ここで、３６２３ｇが活性物質であった）の量のタクロリムス出発材料を、３０リットルのアセトンに溶解した。３３リットルの量のＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ１１８０樹脂をタクロリムス溶液に添加した。１８０リットルの量の水を、かき混ぜなから、タクロリムス溶液：樹脂混合物にゆっくりと添加した。水の添加が完了した時、吸着樹脂の充填用試料を濾過により回収した。
【００７９】
回収した充填用試料を、湿潤吸着樹脂のベッドの頂上の層として充填した。全樹脂体積は、およそ１００リットルであった。およそ７００リットルのテトラヒドロフラン／水（３４ｖｏｌ−％ ＴＨＦ）溶離剤を用いて、第一のカラム溶出を行った。第一の溶出の後、第二のカラムを第一のカラムに接続した。およそ１４００リットルのＴＨＦ／水（３４ｖｏｌ−％ ＴＨＦ）溶離剤を用いて、溶出を継続して行った。第一のカラムを第二のカラムから外し、およそ１２００リットルのＴＨＦ／水（３４ｖｏｌ−％ ＴＨＦ）溶離剤を用いて、溶出を継続して行った。それぞれ２０リットルの体積を有する画分を回収した。０.５リットルの量の水を各画分と混合して、画分を希釈した。希釈画分を第三のカラムに通し、タクロリムスを第三のカラムの樹脂に吸着させた。およそ１８００リットルのＴＨＦ／水（３４ｖｏｌ−％ ＴＨＦ）溶離剤を用いて、第三のカラムからタクロリムスを溶出した。それぞれ２０リットルの体積を有する画分を回収し、いくつかの画分を上記の「実施例に用いたクロマトグラフィー条件」に記載したＨＰＬＣ法を用いて分析した。
【００８０】
次に適切な画分を混合した。しかし、画分を混合する前に予備画分（例えば、適切な各画分から１０ｍｌ）を混合し、ＨＰＬＣ分析により分析できることに注意すべきである。予備混合のＨＰＬＣ分析の結果が、アスコマイシン濃度が０.０２面積パーセント超であり、そして／或いはジヒドロタクロリムス濃度が０.０４面積パーセント超である場合は、所望の高い純度を得るために混合した画分の番号を変えるべきである（画分の混合の間に所望の高い純度を得ることが、高い純度の最終生成物を提供するのであろうから）。
【００８１】
混合した主な画分（およそ５００リットル）を、１００ｍｌの８５パーセントリン酸とともに混合し、減圧下で約２００リットルの体積まで濃縮した。濃縮物を周囲温度まで冷却し、５０リットルの水、１００リットルの酢酸エチル、及び２００ｍｌの濃縮アンモニア溶液を濃縮物に添加した。酢酸エチル相（およそ７５リットル）を分離し、減圧下で油性残渣になるまで濃縮した。
【００８２】
主な画分の結晶化
油性残渣を１０リットルの酢酸エチルを用いて希釈し、減圧下で再び濃縮して油性残渣とした。加熱温度はおよそ６０℃であり、推測される沸点温度は２０〜４０℃であった。希釈−濃縮段階を２回繰り返した。
【００８３】
油性残渣の固形分を、減圧下で少量のサンプルの蒸発により確立し、油性残渣については１３２９ｇの固形分となった。油性残渣を酢酸エチルでおよそ２５２５ｇまで希釈し、７９７０ｍｌのシクロヘキサンをこの溶液に添加した。温度循環器を用いて、温度を２５℃に維持した。
【００８４】
１０.６ｍｌの量の溶液に、水を速やかに添加した。１８.６ｍｌの量の水をこの溶液に３時間添加し、結晶化を開始した。４５分間の撹拌の後、結晶を濾過し、１６００ｍｌのシクロヘキサンで洗った。洗った結晶を７０℃で１２時間乾燥させ、１２５０ｇの多量の乾燥結晶を調製した。
【００８５】
再結晶化
１２５０ｇの量のタクロリムスを、７.５リットルの酢酸エチルに溶解した。この溶液を、減圧下で油性残渣になるまで濃縮した。溶解−濃縮段階を２回繰り返した。油性残渣を３７５０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、１２.５ｇの木炭で処理した。木炭処理は、３０℃で３０分間実施した。懸濁液を濾過し、１２５ｍｌの酢酸エチルで濾過ケーキを洗った。濾過した溶液を減圧下で濃縮し、２３７５ｇの酢酸エチルで希釈した。
【００８６】
６.２５リットルの量のシクロヘキサンを、タクロリムス溶液に１.５時間添加した。２７.５ｍｌの量の水を２時間この溶液に添加した。２４６ｍｌの量の水をこの溶液に２時間添加し、結晶化を開始した。
【００８７】
この懸濁液を８℃まで冷却し、１.２５リットルの量のシクロヘキサンを８℃で１時間この懸濁液に添加した。次に懸濁液を、８℃で１２時間撹拌した。結晶を濾過し、シクロヘキサンを用いて２回懸濁した。この懸濁に用いたシクロヘキサンの体積は、２.５リットルであった。
【００８８】
乾燥を減圧下において４０℃で１２時間実施し、そしておよそ２５℃で２４時間実施した。窒素注入を全乾燥工程の間使用した。
【００８９】
結晶化段階は、産物の不純物ＲＲＴ１.１９含有量を効果的に減少させる。最終産物の質量は１１８０ｇであった。得られたタクロリムスの純度は、ＨＰＬＣにより９９.８４面積パーセント、すなわち：全不純物含有量がＨＰＬＣにより０.１６面積パーセントであった。得られた最終産物：ＨＰＬＣで０.０２面積パーセントのアスコマイシン、ＨＰＬＣで０.０５面積パーセントのジヒドロタクロリムス及びＨＰＬＣで０.０２面積パーセントの不純物ＲＲＴ１.１９、ＨＰＬＣで０.０２面積パーセントのＲＲＴ０.８３、ＨＰＬＣで０.０２面積パーセント未満のＲＲＴ０.０６、ＨＰＬＣで０.０２面積パーセント未満のＲＲＴ１.４５、ＨＰＬＣで０.０２面積パーセントのＲＲＴ０.２５及びＨＰＬＣで０.０２面積パーセント未満の任意の個々の不純物。不純物プロファイルを表２に要約する。
【００９０】
【表４】
2007523201.tif 000005
【００９１】
結晶化後に最終産物中の不純物ＲＲＴ１.１９の濃度が所望の濃度を超えている場合は、不純物を取り除くために１又は複数の追加の結晶化段階を実施することができる。
【国際調査報告】
2007523201.tif 000006
2007523201.tif 000007
2007523201.tif 000008