(57)【要約】  本発明は腫瘍抑制因子として作用するＡＩＭ３の新規用途に関するものであり、より詳しくはＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸を利用して、ＡＴＭまたはＡＴＲを活性化させる方法及びＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患を治療する方法に関するものである。本発明によれば、ＡＩＭ３蛋白質はＡＴＭ／ＡＴＲと直接的に相互作用してＡＴＭ／ＡＴＲ及びこれらにより調節される蛋白質を活性化させ、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３及びそのターゲット遺伝子を上向調節することにより、細胞の増殖を抑制するのみならずアポトーシスを誘導する。
2007534748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３（ARS-interaｊａcting multifunctional protein 3）の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、細胞、組織、または体内で、ＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質から選ばれるいずれか一つを活性化させる方法。
【請求項２】
ＡＩＭ３の結合により媒介される請求項１記載のＡＴＭまたはＡＴＲを活性化させる方法。
【請求項３】
ＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質が、Ｈ２ＡＸ、ｐ５３、ｃｈｋ２、ｃｈｋ１、ＢＲＣＡ１、ｃ−Ａｂ１、ＰＨＡＳ−１、ＲＰＡ、ＲＡＤ９、ＭＤＭ２、ＭＲＥ１１、Ｒａｄ１７、ＷＲＮ、ＰＴＳ、ＣｔＩＰ、ｅＩＦ−４Ｅ結合蛋白質１、ＬＫＢ１、ＦＡＮＣＤ２、ＳＭＣ１、Ｒａｄ１７、Ｎｉｂｒｉｎ、ＮＢＳ、ｐ９５、Ｐｉｎ２／ＴＲＦ１、ＤＮＡ５Ｂ、ＢＲＣＡ２、及びホスファチジルイノシトル３−キナーゼからなる群より選ばれる請求項１項記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質から選ばれるいずれか一つの活性化が、ＤＮＡ修復、細胞周期調節及び／またはアポトーシスと関連したものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、細胞、組織、または体内で、ｐ５３またはそのターゲット遺伝子の発現を誘導する方法。
【請求項６】
ｐ５３のターゲット遺伝子が、ｐ２１、ＰＵＭＡ、ＧＡＤＤ４５、１４−３−３ｓｉｇｍａ、ＷＩＰ１、ｍｄｍ−２、ＥＧＦＲ、ＰＣＮＡ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣｙｃｌｉｎＧ、ＴＧＦα、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＦＡＳ１、Ｆａｓ／ＡＰＯ１、ＦＡＳＬ、ＩＧＦ−ＢＰ３、ＰＡＧ６０８、ＤＲ５／ＫＩＬＬＥＲ、ＧＭＬ、ｐ５３ＡＩＰ１、ｐ５３Ｒ２、Ｐ２ＸＭ、ＴＳＰ−１、ＢＡＬ１、ＣＳＲ、ＰＩＧ３、Ａｐａｆ−１、ｐ５３ＲＤＬ１、Ｓｔａｆ５０、ＣＤ２００、及びＳｎｋ／ＰＩｋ２からなる群より選ばれる請求項５記載の方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を、細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項８】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、細胞、組織、または体内でアポトーシスを促進する方法。
【請求項９】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を治療が必要な個体に投与することを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患を治療または予防する方法。
【請求項１０】
前記疾患が、がんまたは乾癬である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが、乳房がん、大腸がん、肺がん、小細胞肺がん、胃腸がん、肝臓がん、血液がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部がん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門付近がん、結腸がん、喇叭管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、腟がん、陰門がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱がん、腎臓または輸尿管がん、腎臓細胞がん、腎臓骨盤がん、ＣＮＳ腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳間神経膠腫、脳下垂体腺腫のようながん、またはこれらがんの一つ以上の組合せである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）ＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）または前記蛋白質を発現する組み換え細胞を候補物質と共に培養する段階；及び
（ｂ）ＡＩＭ３の活性または細胞内レベル増加に及ぼす候補物質の効果を測定する段階を含むことを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患を治療及び／または予防する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
前記ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患が、がんまたは乾癬である請求項第１２項記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）個体からサンプリングした組織内でＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）の発現レベルを測定する段階；及び
（ｂ）前記組織内のＡＩＭ３レベルと正常ＡＩＭ３レベルを比較する段階を含むことを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患の危険性のある個体を同定する方法。
【請求項１５】
前記ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患が、がんまたは乾癬である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸、その断片、前記核酸またはその断片でコードされるペプチド及び前記ペプチドに対する抗体から選ばれるいずれか一つを含むことを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患の診断用キット。
【請求項１７】
前記ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患が、がんまたは乾癬である請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つを有効成分として含むことを特徴とする、細胞、組織または体内でＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質から選ばれるいずれか一つを活性化させるための薬学的組成物。
【請求項１９】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つを有効成分として含むことを特徴とする、細胞、組織、または体内でｐ５３またはそのターゲット遺伝子の発現を誘導するための薬学的組成物。
【請求項２０】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つを有効成分として含むことを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制するための薬学的組成物。
【請求項２１】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つを有効成分として含むことを特徴とする、細胞、組織、または体内でアポトーシスを促進するための薬学的組成物。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチド（ａ）と少なくとも７０％以上のアミノ酸配列相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つを有効成分として含むことを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド及び（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の配列相同性を有する分離されたポリペプチドからなる群より選ばれる、活性治療成分としての使用のための分離されたポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ３の分離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の配列相同性を有する分離されたポリペプチドをコードする、活性治療成分としての使用のための分離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規の腫瘍抑制因子に関するものにして、より詳しくはＡＴＭまたはＡＴＲを活性化させる新規の腫瘍抑制因子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は多様なフェイルセーフメカニズムを有している。その内の一つは染色体ＤＮＡが損傷された時、細胞分裂を中断してまずその損傷が修復されるようにすることにより、突然変異が確立できないようにすることである。紫外線等によりＤＮＡが損傷された時、それが修復されないまま細胞分裂が継続すると、損傷された状態で染色体ＤＮＡが複製され突然変異が蓄積される。このように突然変異が蓄積されることにより、がん細胞の発生確率も高くなる。従って、細胞はＤＮＡが損傷された時、それを修復する過程と、修復がなされるまで細胞の増殖を中断する細胞内フィードバックメカニズムを作動させ、がんの発生を抑制する。このようなフィードバックメカニズムは細胞分裂各周期の間のチェックポイントにより媒介される。チェックポイントの総体的な機能は損傷または変則的に構成されたＤＮＡを探知し、ＤＮＡ修復と細胞周期進行を調整するものである（Robert T.Genes & development, 15, 2177-2196, 2001；非特許文献１）。典型的には、細胞周期チェックポイントの活性化は上述した通り細胞周期進行を遅延させたりまたは停止させるため、修復メカニズムのための適切な時間が娘細胞の次世代に伝えられる前に遺伝子病変を修正することを可能にする。胸腺細胞のような幾つかの細胞ではチェックポイント蛋白質が破損されたＤＮＡ鎖と連結され、ｐ５３誘導を通じたアポトーシス細胞死が誘導される（Robert T.Genes & development,15, 2177-2196, 2001；非特許文献１）。
【０００３】
ＤＮＡ損傷により開始される細胞周期チェックポイントは主に、ＡＴＭ（ataxia-telangiectasia-mutated）と、ＡＴＲ（ATM-and Rad3-related）により調節される（Shiloh,Y.Curr. Opin. Gent. Dev., 11, 71-77, 2001；非特許文献２、Abraham, R. T. Genes Dev., 15, 2177-2196, 2001；非特許文献１）。これらは細胞周期チェックポイントを通じた初期シグナル伝達において極めて重要な役割をする。ＡＴＭとＡＴＲが欠乏した細胞は放射線に反応して細胞分裂周期を止めるのに欠陥を示した。特にＡＴＭが欠乏した細胞はＧ１、Ｓ、及びＧ２チェックポイント等において深刻な欠陥を示し（Robert T. Genes & development, 15, 2177-2196, 2001；非特許文献１）。ＡＴＲが欠乏した細胞では“二本鎖切断（double strand breaks）”として知られる深刻な損傷が起こった。さらに、ＡＴＭ／ＡＴＲが変異された時、腫瘍発生確率が極めて増加するものと知られている。
【０００４】
ＡＴＭとＡＴＲは相同性が高く同様の基質を有する。しかしながら、これらは他の遺伝毒性ストレスにより活性が増進する面で異なる。ＡＴＭは主に二本鎖のＤＮＡを破壊するＩＲ（ionizing radiation）のような作用因子に対して反応する反面、ＡＴＲはＩＲを初めＤＮＡ上でバルキーな付加物（bulky adducts）を生成させるか、または一本鎖のＤＮＡを生成する製剤に対して反応する。さらに、ＡＴＭとＡＴＲは他の方法で活性化される。ＡＴＭは自己燐酸化を通じて活性化されるものの、ＡＴＭが自己燐酸化されると二量体の形態が崩壊される（Bakkenist, C. J. et al., Nature, 421, 499-506, 2003；非特許文献３）。ＡＴＭの自己燐酸化がどのように起こるかに付いては未だ明らかにされていなかった。ＡＴＲもまた自己燐酸化できるが、それが細胞内で不活性型二量体を形成するのか、活性型単量体を形成するかに付いては明確でない。さらに、ＡＴＭ／ＡＴＲが活性化されるのに他のサブユニットや補助因子が要求されるかについても未だ明確に確認されておらず、ＤＮＡ損傷によりＡＴＭ／ＡＴＲが活性化され作動する信号伝達体系の生化学的な細胞内作用メカニズムもまた完全に確認されていない。
【０００５】
ＡＴＭ／ＡＴＲにより直接燐酸化される標的蛋白質として、ｐ５３、ｃｈｋ１、ｃｈｋ２、ｃ−Ａｂ１、ＲＰＡ等が明らかとなり、その中でｐ５３はＡＴＭ／ＡＴＲによって、セリン１５（serine 15）から燐酸化が起こる。ｐ５３が過発現するとＧ２が停止して、さらに細胞がＧ２からＭに入るために、必要な二つの蛋白質であるＣＤＫ１（cyclin-dependent kinase 1）及びサイクリンＢ１（cyclin B1）の合成が阻害されると報告されたことがある。このようにｐ５３は細胞の非正常的な分裂と増殖を抑制するのみならず、ＤＮＡが損傷された時に細胞周期を停止させ、損傷されたＤＮＡを修復する機能を遂行する。最近ｐ５３遺伝子変異及び欠損はある特定のがんでのみ起こるものではなく、人体の殆ど全てのがんで現れる最もありふれた遺伝子変異の一つの形態として認められている。さらに、ｐ５３はさらに他の腫瘍抑制遺伝子であるｐ２１の転写を増加させ、Ｇ１／Ｓ転写を抑制するのみならず、ｐ５３−依存性アポトーシスを起こす。ｐ５３により発現されるｐ２１はＣＫ１（cyclin-dependent kinase inhibitor）の一種にして、細胞の分裂と増殖を抑制する機能をするものとして知られている。従って、細胞周期調節に関与する因子またはこれらを活性化する物質を利用して新たな抗がん剤を開発しようとする努力が続けられている。
【０００６】
一方、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetases ; ARSs）は蛋白質合成の一番目の段階を触媒する重要な酵素として多様な生物学的機能に関与する多機能蛋白質である（Ko et al., Proteomics, 2, 1304-1310, 2002；非特許文献４）。これらの内ＭＲＳ（methionyl-tRNA synthetase）、ＱＲＳ（glutaminyl-tRNA synthetase）、ＲＲＳ（arginyl-tRNA synthetase）、ＫＲＳ（Lysyl-tRNA synthetase）、ＤＲＳ（aspartyl-tRNA synthetase）等のような多様な哺乳動物のｔＲＮＡ合成酵素はｐ４３、ｐ３８、及びｐ１８と命名された三つの非酵素補助因子と結合して、高分子蛋白質複合体を形成する（Han et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 303, 985-993, 2003；非特許文献５）。ＡＲＳｓが蛋白質合成に必須的な酵素であるため、前記複合体は蛋白質合成を助けるために形成されるものと思われている。
【０００７】
ＡＲＳｓと結合する前記非酵素補助因子の中でｐ４３は免疫反応と血管新生において、サイトカインとして重要な役割をするものと知られている（Ko et al., J. Biol. Chem., 276, 23028-32303, 2001b；非特許文献６、Park et al., J. Biol. Chem., 277, 45234-45248, 2002；非特許文献７）、さらに、ｐ３８は前がん遺伝子であるc-mycをダウンレギュレーションし、肺分化に関与するものと確認された（Kim et al., Nat. Genet., 34, 330-336, 2003；非特許文献８）。最終の補助因子であるｐ１８は伸長因子サブユニット（ＥＦ−１）と配列相同を示すため（Quevillon and Mirande, FEBS Lett., 395, 63-67, 1996；非特許文献９）、蛋白質合成に関与するものと推定されている。しかしながら、ｐ１８の生理学的機能に付いては未だ明確にされておらず、特にｐ１８とがんとの関連性に付いては全く研究されていない。
【０００８】
【非特許文献１】Robert T.Genes & development, 15, 2177-2196, 2001
【非特許文献２】Shiloh,Y.Curr. Opin. Gent. Dev., 11, 71-77, 2001
【非特許文献３】Bakkenist, C. J. et al., Nature, 421, 499-506, 2003
【非特許文献４】Ko et al., Proteomics, 2, 1304-1310, 2002
【非特許文献５】Han et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 303, 985-993, 2003
【非特許文献６】Ko et al., J. Biol. Chem., 276, 23028-32303, 2001b
【非特許文献７】Park et al., J. Biol. Chem., 277, 45234-45248, 2002
【非特許文献８】Kim et al., Nat. Genet., 34, 330-336, 2003
【非特許文献９】Quevillon and Mirande, FEBS Lett., 395, 63-67, 1996
【発明の開示】
【０００９】
従って、本発明の目的はｐ１８（ARS-interacting multifunctional protein 3）蛋白質の新規の用途を提供するものである。
本発明者等はアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetases;ARS）複合体の補助因子として知られたｐ１８を“ＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）”と再命名した。従って、以下でｐ１８をＡＩＭ３と記載した。
【００１０】
前記のような目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３（ARS-interacting multifunctional protein 3）蛋白質の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）ポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に処理することを特徴とする、細胞、組織、または体内でＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質を活性化させる方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３蛋白質の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、細胞、組織、または体内で、ｐ５３またはそのターゲット遺伝子の発現を誘導する方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３蛋白質の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明の他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３蛋白質の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を細胞、組織、または体内に投与することを特徴とする、細胞、組織、または体内でアポトーシスを促進する方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３蛋白質の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を治療を必要とする個体に投与することを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲに関連する疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１５】
併せて、本発明の他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３蛋白質または前記蛋白質を発現する組み換え細胞と候補物質を培養する段階；及び
（ｂ）前記蛋白質の活性または細胞内レベル増加に及ぼす候補物質の効果を測定する段階を含むことを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲに関連する疾患を治療及び／または予防する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）個体からサンプリングした組織内でＡＩＭ３蛋白質の発現レベルを測定する段階；及び
（ｂ）前記組織内ＡＩＭ３蛋白質のレベルと正常ＡＩＭ３蛋白質のレベルを比較する段階を含むことを特徴とする、ＡＴＭまたはＡＴＲに関連する疾患の危険性のある個体を同定する方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、
ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸、その断片、前記核酸またはその断片からコードされるペプチド、及び前記ペプチドに対する抗体からなる群より選ばれるいずれか一つを含むＡＴＭまたはＡＴＲと関係のある疾患の診断用キットを提供する。
【００１８】
ひいては、本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）ＡＩＭ３蛋白質の分離されたポリペプチド；
（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸を有効成分とする薬学的組成物を提供する。
【００１９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明ではアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetases; ARS）複合体の補助因子として知られたＡＩＭ３（ｐ１８）の新たな活性を確認した。本発明で確認されたＡＩＭ３の生理学的活性（機能）は下記の通りである。
第１に、ＡＩＭ３はＤＮＡ合成段階とＤＮＡが損傷された時、核内に移動され高いレベルで誘導される。
第２に、細胞に対して抗増殖活性を示す。
第３に、細胞のアポトーシスを誘導する。
第４に、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３及びこれのターゲット遺伝子の発現を誘導する。
第５に、ＡＴＭ／ＡＴＲと直接的に相互作用してＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質を活性化させる。
第６に、ＡＩＭ３発現レベルの減少は腫瘍形成を誘導し、がん細胞株とがん患者から分離された組織より低いレベルで発現される。
【００２０】
従って、本発明はＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸を利用してＡＴＭ、ＡＴＲ及びＡＴＭまたはＡＴＲにより調節される蛋白質からなる群より選ばれるいずれか一つを活性化させる方法を提供する。
【００２１】
前記において“活性化”とは、蛋白質の燐酸化や蛋白質の構造的及び化学的変異を意味する。ＡＴＭ／ＡＴＲの活性化はＡＩＭ３が結合することにより媒介される。ＡＩＭ３によりＡＴＭ／ＡＴＲが活性化されると、ＡＴＭ／ＡＴＲが関与する細胞内で多様な反応が引起される。前記の細胞内反応はこれに制限はされないものの、ＤＮＡ修復、細胞周期調節及びアポトーシス誘発を含む。従って、ＡＩＭ３によりＡＴＭ／ＡＴＲが活性化すると、ＤＮＡ複製または損傷によるＤＮＡ修復信号伝達経路；各細胞周期のチェックポイント信号伝達経路；及び／またはＤＮＡ損傷によるアポトーシス誘発信号伝達経路に関与するＡＴＭ／ＡＴＲの下流蛋白質が連続的に活性化される。ＡＴＭ／ＡＴＲにより調節された蛋白質とはＡＴＭ／ＡＴＲにより直接的に燐酸化される蛋白質及び前記蛋白質の燐酸化により信号伝達経路で連続的に燐酸化される蛋白質を含む。好ましくは、これに制限はされないものの、Ｈ２ＡＸ（Burma S. et al., J. Biol. Chem., 9, 276(45): 42462-42467, 2001）、ｐ５３（Saito S，et al., J. Biol. Chem., 12, 277(15):12491-12494,2002）、ｃｈｋ２（Matsuoka S，et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 12; 97(19): 10389-10394, 2000）、ｃｈｋ１（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、ＢＲＣＡ１（Xu B，et al., Cancer Res., 15; 62(16): 4588-4591, 2002、Cortez D, et al., Science, 5; 286(5442): 1162-1166, 1999）、ｃ−Ａｂ１（Baskaran R, et al., Nature, 29; 387(6632): 516-519, 1997）、ＰＨＡＳ−１（Chan DW et al., J. Biol. Chem., 17; 275(11): 7803-7810, 2000）、ＲＰＡ（Cham DW et al., J. Biol. Chem., 17; 275(11): 7803-7810, 2000）、ＲＡＤ９（Chen MJ et al., J. Biol. Chem., 11; 276(19): 16580-16586, 2001）、ＭＤＭ２（Maya R,et al., Genes Dev., 1; 15(9): 1067-1077, 2001）,ＭＲＥ１１（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、Ｒａｄ１７（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、ＷＲＮ（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、ＰＴＳ（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、ＣｔＩＰ（Li S, et al., Nature, 13; 406(6792): 210-215, 2000）、ｅＩＦ−４Ｅ結合蛋白質１（Yang DQ，et al., Nat. Cell. Biol., 2(12): 893-898）、ＬＫＢ１（Sapkota GP, et al., Biochem J., 1; 368(Pt2): 507-516, 2002）、ＦＡＮＣＤ２（Taniguchi T，et al., Cell, 17; 109(4): 459-472, 2002）、ＳＭＣ１（Yazdi PT，et al., Genes Dev., 1; 16(5): 571-582, 2002）、Ｒａｄ１７（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、Ｎｉｂｒｉｎ（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、ＮＢＳ（Wu K. et al., Nature, 25; 405(6785): 477-482, 2000）、ｐ９５（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）、Ｐｉｎ２／ＴＲＦ１（Kishi S.et al., J. Biol. Chem., 3; 276(31): 29282-29291, 2001）、ＤＮＡ５Ｂ（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53) :37538-37543, 1999）、ＢＲＣＡ２（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Kim ST et al., J. Biol. Chem., 31; 274(53): 37538-37543, 1999）であってもよい。より好ましくは、Ｈ２ＡＸ、ｐ５３、またはｃｈｋ２であってもよい。
【００２２】
さらに、本発明はＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸を利用して、ｐ５３またはこれのターゲット遺伝子の発現を誘導する方法を提供する。前記において、“ｐ５３のターゲット遺伝子”とは、ｐ５３の下流に位置してｐ５３により発現が誘導される遺伝子を意味する。前記ｐ５３のターゲット遺伝子はｐ５３調節、細胞周期調節、ＤＮＡ修復、アポトーシス、血管新生、細胞のストレス反応及び細胞運命決定からなる群より選ばれる一つ以上のメカニズムに関与する遺伝子であってもよい。好ましくは、これに制限はされないものの、ｐ２１（Fujioka S, et al., J. Biol. Chem., Apr.21, 2004、Nayak BK, et al., Oncogene, 17; 21(47): 7226-7229, 2002）、ＰＵＭＡ（Gu J. et al., Oncogene, 12; 23(6): 1300-1307, 2004、Yu J, et al., Cell, 7(3): 673-682, 2001）、ＧＡＤＤ４５（Nayak BK, et al., Oncogene, 17; 21(47): 7226-7229, 2002、el-Deiry WS., Semin Cancer Biol., 8(5): 345-57）、１４-３-３ ｓｉｇｍａ（el-Deiry WS., Semin Cancer Biol., 8(5):3 45-57）、ＷＩＰ１（Choi J, et al., Genomics., 15; 64(3): 298-306, 2000）、ｍｄｍ−２（Freedman and Levine, Cancer Research, 59: 1-7, 1999）、ＥＧＦＲ（Tokino and Nakamura, Crit. Rev. Onc. Hem., 33: 1-6, 2000）、ＰＣＮＡ（Tokino and Nakamura, Crit. Rev. Onc. Hem., 33: 1-6, 2000）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（Tokino and Nakamura, Crit. Rev. Onc. Hem., 33: 1-6, 2000）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ（Tokino and Nakamura, Crit. Rev. Onc. Hem., 33: 1-6, 2000）、ＴＧＦα（Inoue Y, et al., Hepatology, 36(2): 366-344, 2002）、ＢＡＸ（Gu J, et al., Oncogene, 12; 23(6): 1300-1307, 2004、Nayak BK, et al., Oncogene, 12; 21(47): 7226-7229, 2002）、ＢＡＫ（Gu J, et al., Oncogene, 12; 23(6): 1300-1307, 2004）、ＦＡＳ１（Gu J, et al., Oncogene, 12; 23(6): 1300-1307, 2004）、Ｆａｓ／ＡＰＯ１（el-Deiry WS., Semin Cancer Biol., 8(5): 345-57）、ＦＡＳＬ（Mendoza-Rodriguez CA, et al., Rev. Invest. Clin., 53(3): 266-273, 2001）、ＩＧＦ−ＢＰ３（Mendoza-Rodriguez CA, et al., Rev. Invest. Clin., 53(3): 266-273, 2001）、ＰＡＧ６０８（Higashi Y, et al., J. Biol. Chem., 1; 277(44): 42224-422262, 2002）、ＤＲ５／ＫＩＬＬＥＲ（Takimoto R, et al., Oncogene, 30; 19(14): 1735-1743, 2000）、ＧＭＬ（Higashiyama M, et al., Eur. J. Cancer., 36(4): 489-495, 2000、Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004），ｐ５３ＡＩＰ１（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004）、ＳＴＡＧ１（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004），ｐ５３Ｒ２（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004）、ｐ５３ＲＦＰ（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004）、Ｐ２ＸＭ（Nawa G,et al., Br. J. Cancer., 80(8): 1185-1189, 1999）、ＴＳＰ−１（Harada H, et al., Cancer Lett., 28; 191(1): 109-119, 2003）、ＢＡＬ１（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004）、ＣＳＲ（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004）、ＰＩＧ３（Giampieri S, et al., Oncogene, Apr. 12, 2004、Contente A, et la., Nat Oncogene, Apr. 12, 2004、Contente A,et la., Nat. Genet., 30(3): 315-320, 2002）、Ａｐａｆ−１（Giampieri S, et al., Oncogene, Apr. 12, 2004）、ｐ５３ＲＤＬ１（Nakamura Y., Cancer Sci., 95(1): 7-11, 2004）、Ｓｔａｆ５０（Obad S, et al., Oncogene, 20; 23(3): 4050-4059, 2004）、ＣＤ２００（Rosenblum MD, et al., Blood, 1; 103(7): 2691-2698, 2004）及びＳｎｋ／ＰＩｋ２（Burns TF, et al., Mol. Cell. Biol., 23(16): 5556-5571, 2003）であってもよい。より好ましい遺伝子はｐ２１またはＰＵＭＡであってもよい。 
【００２３】
本発明のＡＩＭ３はＡＴＭ／ＡＴＲが媒介する信号伝達経路を通じて腫瘍細胞の増殖を抑制し、ＤＮＡの損傷によるアポトーシスを促進する。従って、本発明ＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸を利用して腫瘍細胞の増殖を抑制する方法及びアポトーシスを促進する方法を提供する。
【００２４】
上述した全ての方法はＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸の有効量を細胞または組織に投与することを含む。前記において“有効量”とは細胞または組織内でＡＴＭ／ＡＴＲの活性化；ＡＴＭ／ＡＴＲによって調節される蛋白質の燐酸化増加；ｐ５３またはこれのターゲット遺伝子の発現誘導；腫瘍細胞の増殖抑制；及びアポトーシス促進からなる群から選ばれるものに対して効果が認められるＡＩＭ３の量を言う。
【００２５】
本発明に使用されるＡＩＭ３蛋白質は天然型または組み換え型ＡＩＭ３蛋白質、またはこれらと実質的に同等な生理活性を有する蛋白質を含む。前記ＡＩＭ３蛋白質のアミノ酸配列は公知であり、哺乳動物から由来したものが好ましい。前記哺乳動物はヒトを含む。本発明のＡＩＭ３蛋白質は配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するのが好ましい。ＡＩＭ３と実質的に同等な生理活性を有する蛋白質には、天然型／組み換え型ＡＩＭ３蛋白質とその機能的同等物及び機能的誘導体（functional derivative）が含まれる。前記“実質的に同等な生理活性”とは、ＡＴＭ／ＡＴＲまたはこれらにより調節される蛋白質を活性化させるか、またはｐ５３またはそのターゲット遺伝子の発現を誘導するか、または腫瘍細胞の増殖を抑制したり、及び／またはアポトーシスを誘導する活性のことを言う。前記“機能的同等物”には天然型蛋白質アミノ酸の内、一部または全部が置換されるか、またはアミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体として天然型ＡＩＭ３蛋白質と実質的に同等な生理活性を有することを言う。さらに、前記“機能的誘導体”は前記ＡＩＭ３蛋白質の物理／化学的性質を増加または減少させるための変形を加えた蛋白質にして、天然型ＡＩＭ３蛋白質と実質的に同等な生理活性を有することを意味する。ＡＩＭ３と実質的に同等な生理活性を有する蛋白質は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有することが好ましい。本発明に用いられるＡＩＭ３蛋白質は公知の配列から当業界において公知の遺伝工学的方法で製造することができる。
【００２６】
本発明のＡＩＭ３蛋白質を有効成分とする薬学的組成物は、経口的にまたは静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内等に非経口的に人と動物に投与することができる。経口投与は舌下適用も含まれる。非経口的投与は皮下注射、筋肉内注射及び静脈注射のような注射法及び点滴法を含む。この他に前記薬学的組成物は各種の剤形の形態で通用される技法により製造でき、薬学的に許容される担体と混合して各種剤形の形態で製造できる。前記“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容されヒトに投与する際、通常的に胃腸障碍、眩気症等のようなアレルギー反応、またはこれと類似した反応を起こさないことを言う。
【００２７】
薬学的に許容される担体は経口投与の際には結合剤、潤滑剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素及び香料を用いることができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤及び安定化剤を混合して用いることもでき、局所投与用製剤の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤を用いることもできる。このように本発明のＡＩＭ３を含む薬学的組成物の剤形は、上述した通りの薬学的に許容される担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与の際には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、カシェ剤（wafer）等の形態で製造することができ、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは複数回投薬包含剤の形態で製造することができる。
【００２８】
本発明のＡＩＭ３蛋白質の総有効量は、一回投与で患者に投与するか、より長期間において投与される分割治療プロトコルにより複数回投与することができる。本発明のＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸を含む薬学的組成物は疾患の程度により、有効成分の含量を変えることができるが、通常的に１回投与の際１μｇ乃至１０ｍｇの有効容量で１日に複数回繰返して投与することができる。しかしながら、前記ＡＩＭ３蛋白質の濃度は薬の投与経路及び治療回数ばかりでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、及び排泄率等多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるものであることから、このような点を考慮するに、当分野の通常的な知識を有する者であれば、前記ポリペプチドのＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患の治療または予防剤としての特定の用途に伴う適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明に伴うＡＩＭ３蛋白質を含む薬学的組成物は本発明による効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【００２９】
一方、本発明のＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含む。好ましくは、哺乳動物、さらに好ましくはヒトから由来したＡＩＭ３蛋白質をコードするＤＮＡを言う。前記ヒトのＡＩＭ３遺伝子は公知である（GenBank accession No. AB011079）。本発明の核酸は好ましくは配列番号２で示される。さらに、前記核酸はＡＩＭ３蛋白質の機能的同等物をコードする核酸を含む。本発明には前記ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸またはそれに相補的な塩基配列を含む核酸と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の配列相同性を有する核酸が全て用いられる。
【００３０】
前記ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸はプラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクター内に挿入させた後、前記発現ベクターを感染または形質導入等の当業界において公知の方法により発現型で標的細胞内に導入させ、遺伝子治療に用いることができる。
【００３１】
プラスミド発現ベクターを利用した遺伝子伝達方法はヒトの細胞に直接的にプラスミドＤＮＡを伝達する方法にして、ＦＤＡから承認を得たヒトに使用できる方法である（Nabel, E. G., et al., Science, 249: 1285-1288, 1990）。プラスミドＤＮＡはウイルスベクターとは異なり均質に精製できる長所がある。本発明で用いられるプラスミド発現ベクターには、当業界において公知の哺乳動物発現プラスミドを用いることができる。例えば、これに限定はされないものの、ｐＲＫ５（ヨーロッパ特許第307,247号）、ｐＳＶ１６Ｂ（国際特許公開第91/08291号）及びｐＶＬ１３９２（PharMingen）等が代表的である。
【００３２】
本発明に伴う核酸を含むプラスミド発現ベクターは当業界において公知の方法、例えばこれに限定はされないものの、一時的形質導入、微細注射、形質導入、細胞融合、カルシウムホスフェート沈澱法、リポソーム媒介された形質導入、ＤＥＡＥデキストラン媒介された形質導入、ポリブレン媒介された形質導入、電気穿孔法、遺伝子銃及び細胞内にＤＮＡを誘入させるための他の公知の方法により、標的細胞内に導入することができる（Wu et la.,J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992、Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263: 14621-14624, 1988）。
【００３３】
さらに、本発明に伴う核酸を含むウイルス発現ベクターとしてはこれに限定はされないものの、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びアビポックスウイルス等が含まれる。
【００３４】
前記レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子が全て除去されたか、若しくは変更された非ウイルス蛋白質がウイルスベクターにより、感染された細胞内で作れるように作製されたものである。遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターの主な長所は多量の遺伝子を複製細胞内に伝達し、細胞ＤＮＡ内に伝達された遺伝子を正確に統合し、遺伝子形質導入後に連続的な感染が誘発されないことである（Miller, A. D., Nature, 357: 455-460, 1992）。ＦＤＡより認証を得たレトロウイルスベクターはＰＡ３１７アンフォトロフィックレトロウイルスパッケージ細胞を利用して製造したものである（Miller, A. D. and Byttimore, C., Molec. Cell Biol., 6: 2895-2902, 1986）。
【００３５】
非レトロウイルスベクターとしては前記で言及した通り、アデノウイルスがある（Rosenfeld et al., Cell, 68: 143-155, 1992、Jaffe et al., Nature Genetics, 1: 372-378, 1992、Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6482-6486, 1992）。アデノウイルスの主な長所は多量のＤＮＡ断片（３６ｋｂゲノム）を運搬し、極めて高い力価で非複製細胞を感染させる能力があると言うことである。さらに、ハーピスウイルスも人の遺伝子療法のため有用に用いられることもある（Wolfe, J. H., et al., Nature Genetics, 1: 379-384, 1992）。この他にも、公知の適切なウイルスベクターを本発明に用いることもできる。
【００３６】
前記ＡＩＭ３遺伝子を発現できるベクターは公知の方法により投与できる。例えば、局所的に非経口、経口、鼻腔、静脈、筋肉内、皮下、または他の適切な手段により投与することができる。特に、前記ベクターは標的組織の腫瘍細胞を治療するための有効量で標的がんまたは腫瘍細胞内に直接注射することができる。特に、目、胃腸管、泌尿生殖器官、肺、及び気管支の組織ような体腔にあるがんまたは腫瘍の場合には、本発明の薬学的組成物をがんまたは腫瘍により、影響を受ける中空器官内に、針、カテーテルまたは他の種類の輸送チューブを利用して直接注入することができる。この際、Ｘ線、ソノグラム、または光ファイバー画像システムのような映像装置が標的組織の位置確認と針または導管の注入に用いられる。その他に、直接的に到達ができなかったり、分析学的に分離できない腫瘍またはがんの場合には、ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸を含有する薬学的組成物を血液循環系内に投与することができる。
【００３７】
ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸を有効成分として含有する薬学的組成物は薬学的に許容される担体または賦形剤を追加して含ませてもよい。このような担体または賦形剤としては分散剤、湿潤剤、懸濁剤、希釈剤及び促進剤が含まれる。特定の薬学的に許容される担体と本発明の薬学的組成物に含まれる発現ベクターの比率は、組成物の溶解度と化学的性質、特定の投与方式により決定される。本発明のＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸を含む薬学的組成物の治療学的または予防学的有効量は、投与対象、年齢、個人差及び疾病状態によって適切に選択できる。
【００３８】
さらに、本発明はＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸を利用してＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患を治療または予防する方法を提供する。具体的に、本発明は（ａ）ＡＩＭ３蛋白質の分離されたポリペプチド；（ｂ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％以上の相同性を有する分離されたポリペプチド；及び（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする分離された核酸からなる群より選ばれるいずれか一つの有効量を治療が必要な個体に投与することを特徴とするＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患を治療または予防する方法を提供する。前記“個体”とは哺乳動物、特にヒトを含む動物を意味する。前記個体は治療が必要な患者であってもよい。さらに、“ＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患”とは、ＡＴＭ／ＡＴＲの不活性化または活性化の低下により誘発される疾患、つまり、ＡＴＭ／ＡＴＲが不活性化または活性化低下によって、ＡＴＭ／ＡＴＲにより媒介される信号伝達経路に異常が生ずることにより引起される疾患のことを意味する。前記ＡＴＭ／ＡＴＲにより媒介される信号伝達経路はＡＴＭ／ＡＴＲ自体またはこれらにより調節される蛋白質により媒介される信号伝達経路を含む。前記信号伝達経路はＤＮＡ修復、細胞周期調節、アポトーシス、ｐ５３調節、血管新生及び／または細胞内ストレス反応の信号伝達経路であってもよい。前記ＡＴＭ／ＡＴＲと関係した疾患は細胞の過増殖による疾患がんまたは乾癬であってもよい。前記がんはこれに限定はされないものの、乳がん、大腸がん、肺がん、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、血液がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部がん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門付近がん、結腸がん、喇叭管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、腟がん、陰門がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱がん、腎臓または輸尿管がん、腎臓細胞がん、腎臓骨盤がん、ＣＮＳ腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳間神経膠腫、脳下垂体腺腫のようながんまたはこれらがんの一つ以上の組合せであってもよい。特に、本発明の治療／予防方法はｐ５３遺伝子異常によるがんの治療／予防に効果的である。前記方法でＡＩＭ３蛋白質とこれをコードする核酸の投与量（有効量）投与方法は上述の通りである。
【００３９】
本発明のＡＩＭ３はＡＴＭ／ＡＴＲと直接的に相互作用してＡＴＭ／ＡＴＲのみならず、前記ＡＴＭ／ＡＴＲにより調節される多様な蛋白質を活性化させ、ＡＴＭ／ＡＴＲにより調節される蛋白質の中の一つであるｐ５３及びこれのターゲット遺伝子が発現を誘導することにより、ＤＮＡ損傷に付いて細胞のアポトーシスを促進し、腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を示す。このようなＡＩＭ３の特性は、ＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患、特にがんの治療／予防に効果的な物質のスクリーニングに利用することができる。従って、本発明は（ａ）ＡＩＭ３蛋白質または前記蛋白質を発現する組み換え細胞を候補物質と共に培養する段階；及び（ｂ）ＡＩＭ３蛋白質の活性または細胞内レベル増加に及ぼす候補物質の効果を測定する段階を含むことを特徴とするＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患の治療または予防に効果的な物質をスクリーニングする方法を提供する。前記“ＡＩＭ３蛋白質の活性”とは、ＡＴＭ／ＡＴＲとの結合活性、ＡＴＭ／ＡＴＲまたはこれらにより調節される蛋白質の燐酸化を促進する活性及び／またはｐ５３及びそれのターゲット遺伝子の発現を誘導する活性を意味する。さらに、前記“ＡＩＭ３蛋白質の細胞内レベルの増加”とは、ＡＩＭ３遺伝子の発現が増加するかまたはＡＩＭ３蛋白質の分解が抑制され、ＡＩＭ３蛋白質の濃度が増加することを意味する。前記ＡＩＭ３遺伝子発現はＡＩＭ３遺伝子の転写及び蛋白質への翻訳過程を含む。従って、本発明でスクリーニングされる物質はＡＩＭ３とＡＴＭ／ＡＴＲとの結合を促進させるか、またはＡＴＭ／ＡＴＲまたはこれらにより調節される蛋白質を活性化させるか、ｐ５３及びこれのターゲット遺伝子の発現を誘導したり、及び／または細胞内ＡＩＭ３蛋白質のレベルを増加させる特性を有する物質である。前記物質は蛋白質のみならず、天然で分離されたり化学的に合成された化合物または抽出物を含む。
【００４０】
ＡＩＭ３蛋白質活性及び細胞内レベルを測定する方法は、当業界において公知の種々の方法を用いることができる。例えば、これに限定はされないものの、共免疫沈澱法（co-immunoprecipitation）、酵素免疫測定法（enzyme-linked immunosorbentassay）、放射能免疫測定法（RIA）、免疫組織化学測定法、ウェスタンブロット法（Western Blotting）及び蛍光活性化細胞選別測定法（FACS）が含まれる。
【００４１】
さらに、本発明ＡＩＭ３を標的としたスクリーニング方法は高効率スクリーニング（high throughput screening; HTS）を適用できる。ＨＴＳは多数の候補物質を並行試験して、複数の候補物質の生物学的活性に付いて、同時にまたは殆ど同時にスクリーニングする方法である。特定の様態として９６−ウェル微細力価プレートまたは１９２−微細力価プレートで細胞株を培養し、ここに複数個の候補物質を処理した後、免疫化学的方法によりＡＩＭ３蛋白質の発現程度を測定できる。このフォーマットでは、９６回の独立的な試験を９６個の反応ウェルを含有する単一８ｃｍ×１２ｃｍプラスチックプレートの上で同時に行うことができる。前記ウェルは典型的に５０μｌ乃至５００μｌに至る検定容積を必要とする。プレート以外に９６ウェルフォーマットを広範囲な均一界及び不均一界検定に適合ならしめるため、複数の計器、器具、ピペット、ロボット、プレート洗浄器及びプレート判読機が商業的に利用可能である。
【００４２】
一方、個体から収得した生物学的サンプル（例えば、血液、血清、喀啖、尿及び／または腫瘍生検）よりＡＩＭ３遺伝子またはＡＩＭ３蛋白質の発現レベルを正常人と比べて、ＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患の危険性を有する個体を同定（診断）することができる。具体的にはＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸、その断片、それらによってコードされるペプチド及び前記ペプチドに対する抗体で構成される群から選ばれる一つをプライマーまたはプローブ（probe）を利用して、ＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患を同定することができる。従って、本発明は（ａ）個体からサンプリングした組織内でＡＩＭ３の発現レベルを測定する段階；及び（ｂ）前記組織内のＡＩＭ３レベルと正常ＡＩＭ３レベルを比較する段階を含む、ＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患の危険性を有する個体を同定する方法を提供する。前記疾患を同定するための方法は、ＡＩＭ３の発現を転写または翻訳レベルで検出できる方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、免疫学的分析等）を全て含む。前記方法はＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患の中でもがんの診断に極めて効果的である。
【００４３】
さらに、本発明はＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸、その断片、それらによってコードされるペプチド及び前記ペプチドに対する抗体で構成される群から選ばれる一つを含むＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患診断用キットを提供する。ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸及びその断片は公知のＡＩＭ３遺伝子の配列を参考にして合成することができる。前記核酸の断片はＡＩＭ３遺伝子を増幅できるプライマーであることが好ましい。さらに、ＡＩＭ３蛋白質をコードする核酸またはその断片からコードされるペプチドは当分野で公知の技術で合成することができる（Creighton, Protein: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983）。ペプチドは通常の段階的な液体または固体状合成、断片凝縮、Ｆ−ＭＯＣまたはＴ−ＢＯＣ化学法を利用して製造することができる（Williams et al., Eds., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton Florida, 1997、Atherton & Sheppard, Eds., A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England, 1989）。
【００４４】
さらに、前記ペプチドに対する抗体はＡＩＭ３蛋白質またはこれの断片を抗原として免疫学分野で広く知られている通常の方法で製造することができる。前記抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含む。
【００４５】
ポリクローナル抗体は馬、牛、羊、犬、鶏、七面鳥、兎、マウス、またはラットのような多くの温血動物から当該分野の通常的な技術の内で一つを使用できる。つまり、抗原を腹膜内、筋肉内、眼内または皮下注射を通じて動物を免疫させる。前記抗原に対する免疫性は補助剤、例えば、フロイント（Freund）の完全補助剤または不完全補助剤を用いて増加させることができる。ブースタ（booster）免疫処理後、血清の小型サンプルを収集して目的とする抗原に対する反応性を試験する。動物の力価が一応抗原に対するこれの反応性の観点で停滞状態に達すれば、多量のポリクローナル免疫血清を１週間毎に出血または動物を放血させることにより収得することができる。
【００４６】
モノクローナル抗体も公知の技術を用いて生成できる（Kennettm McKearn, and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas;A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980）。モノクローナル抗体はＡＩＭ３蛋白質またはこれの断片を免疫源として動物を免疫化させ、免疫化された動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、ＡＩＭ３蛋白質を選択的に認識するハイブリドーマを選別し、選別したハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養液から抗体を分離することにより製造することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体は前記ハイブリドーマを動物に注入し、注入後一定期間が過ぎた後回収した動物の腹水から分離することにより製造することができる。
【００４７】
本発明の診断用キットに含まれる抗体は、好ましくは固体基質上に固定される。抗体は文献に開示された通りの多様な方法を利用して固定することができる（Antibodies: A Labotory Manual, Harlow & Lane; Cold Spring Hrbor, 1988）。適切な固体基質には、棒、合成ガラス、アガロウスビズ、カップ、フラットパック、またはその他の固体支持体により支持されるか、またはこのようなものに付着された膜やコーティングを有するものが含まれる。その他の別の固体基質としては細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブ、及びポリマー製フィルムが挙げられる。
【００４８】
本発明に伴う診断用キットはＡＩＭ３蛋白質を選択的に認識する抗体と共に、免疫学的分析に用いられる試薬が含まれていてもよい。前記免疫学的分析は本発明抗体に対する抗原の結合を測定できる方法であれば全てが含まれる。このような方法は当分野において公知であり、例えば、免疫細胞化学分析、免疫組織化学分析、放射線免疫分析法（radioimmunoassays）、酵素結合免疫法（ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay）、免疫ブロット（immunoablotting）、ファール分析法（Farr assay）、沈降反応法、比濁法、免疫拡散法、カウンター電流電気泳動法、単一ラジカル免疫拡散法、及び免疫螢光法がある。
【００４９】
免疫学的分析に用いられる試薬には、適切な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、溶解剤、洗浄剤が含まれる。さらに、標識物質が酵素の場合には酵素活性を測定できる基質及び反応停止剤を含めることができる。
【００５０】
適切な担体としてはこれに限定はされないものの、可溶性担体、例えば当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液の内いずれか一種（例えば、ＰＢＳ）または不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋テキストラン、ポリサカライト、ラテックスに金属を鍍金した磁性微粒子のような高分子、その他、紙、ガラス、金属、アガロス、及びこれらの組合せであってもよい。
【００５１】
検出可能な信号を生成できる標識には、酵素、蛍光物質、発光物質、及び放射性物質等が用いられる。酵素には、ファオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、β−Ｄ−カラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、マレアートジハイドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸ジハイドロゲナーゼ、インバターゼ等を用いることができ、蛍光物質としては、フルオロシンイソチオキシアネート、ピコビリプロテイン等を用いることができ、発光物質としては、イソルシノール、ルシゼニン等が、放射線物質としてはＩ131、Ｃ14、Ｈ3等が挙げられる。しかしながら、前記例示されたものの他に、免疫学的分析法に用いられるものであれば、いずれのものでも用いることができる。本発明のキットで診断できるＡＴＭ／ＡＴＲに関連する疾患は前記記載と同じく、好ましくは、肺がん、大腸がん、肝臓がん、リンパ腫、及び白血病であってもよい。
【００５２】
本発明の実施例のひとつでは、ＡＩＭ３の生物学的機能を確認するために、遺伝子トラップ方法を利用してＡＩＭ３遺伝子が欠損されたマウスを製造した。次に、遺伝子トラップベクター挿入により、突然変異が誘発されたゲノミックＤＮＡをマウスの胚性幹細胞に導入して、突然変異型ライブラリを製作した。前記ライブラリから突然変異されたＡＩＭ３遺伝子を含有しているクローンを探索し、これを利用してＡＩＭ３異型接合性突然変異型マウスを製造した。
【００５３】
本発明の他の実施例ではＡＩＭ３突然変異体マウス内にあるＡＩＭ３対立遺伝子の塩基配列を分析した。その結果、遺伝子トラップベクターがＡＩＭ３遺伝子内の一番目のエキソンと二番目のエキソンとの間に挿入されたことを確認した（図１ａ参照）。さらに、ゲノミックＰＣＲとサザンブロット分析を行ってＡＩＭ３突然変異を確認し（図１ｂ及び１ｃ参照）、ＡＩＭ３の発現に対する突然変異の効果をウェスタンブロット分析で確認した（図１ｄ参照）。
【００５４】
さらに、前記ＡＩＭ３異型接合性突然変異型マウス（以下、“ＡＩＭ３+/-マウス”と称す。）を異種交配して得た子孫の出生後、遺伝型及び時間経過に伴う胎児の遺伝型を調査した結果、ＡＩＭ３+/-マウスが野生型同腹子と類似した比率で示されたことを確認した（表１参照）。これはＡＩＭ３+/-マウスの約５０％が出生前段階で致死したことを示すものである。さらに、ＡＩＭ３同型接合性マウス（以下、“ＡＩＭ３-/-マウス”と称す。）は胎生初期に致死したことが確認された（表１及び表２参照）。これよりＡＩＭ３が生体内で重要な機能を果たすものと思われた。特に、ＤＮＡ−損傷反応と修復システムに関与するＲａｄ５１、Ｃｈｋ１／２及びＡＴＲのような蛋白質の遺伝的消失が胎生初期に致死を誘発することから（de Klein et al., Curr. Biol., 10: 479-482, 2000、Lim and Hasty, Mol. Cell Biol., 14: 7133-7143, 1996、Takai et al., Genes Dev., 14: 1439-1447, 2000）、ＡＩＭ３がＤＮＡ−損傷反応と修復システムに関与するものと思われる。
【００５５】
ＡＩＭ３蛋白質が蛋白質合成に関与するマルチ−ｔＲＮＡ合成酵素複合体と関係があるため（Han et al., Biochem. Biophys. Res. Commum., 303: 985-993, 2003）、本発明者等はＡＩＭ３レベルの減少がマウスの全体的な身体成長に影響を及ぼすものと予想した。しかしながら、興味深くもＡＩＭ３+/-マウスの成長率は性別とは関係なく、野生型マウスと類似するかまたは多少高いことが観察された（結果未図示）。これは蛋白質合成がＡＩＭ３レベルの減少により、阻害されないことを示唆するものである。
【００５６】
本発明のさらに他の実施例ではＡＩＭ３遺伝子の機能を調べるために、ＡＩＭ３+/-マウスから分離した組織及び器官の組織学的特性を調査した。その結果、ＡＩＭ３+/-マウス由来の組織と器官で多様な腫瘍が発見され、腫瘍の発生率は出生後１５ヶ月経過後、急激に増加したことが見られた（図２ａ乃至図２ｃ及び表３参照）。特に、ＡＩＭ３+/-マウスではリンパ腫が高い頻度で発生した（表３参照）。これはＤＮＡ修復機能の消失がリンパ腫を起こし得ると言う以前の報告と一致するものである（Bassing et al., Cell, 114: 359-370, 2003、Celeste et al., Cell, 114: 371-383, 2003）。このように、ＡＩＭ３が欠損したマウスにおいて様々な腫瘍が自然に形成されると言う結果は、ＡＩＭ３が腫瘍形成経路に関与する強力な腫瘍抑制因子であることを示す。
【００５７】
早い細胞周期は腫瘍形成の典型的な徴候である（Evan and Vousden, Nature, 411: 342-348,2001）。従って、本発明の他の実施例ではＡＩＭ３が細胞周期調節に関与するか否かを調査した。その結果、ＡＩＭ３が欠損したマウスから由来した細胞は野生型細胞に比べてより早く増殖し、より早い細胞周期を示した（図３ａ及び図３ｂ参照）。または細胞周期と関連してＡＩＭ３の発現をウェスタンブロット分析及び流細胞分析法でそれぞれ調査した結果、ＡＩＭ３がＤＮＡ合成段階で著しく誘導されたことを確認した（図３ｃ及び図３ｄ参照）ＤＮＡ合成段階でＡＩＭ３が誘導される理由を調べるために、成長が止どまった状態と増殖する状態でＡＩＭ３の細胞内の位置を調べた結果、細胞成長が血清欠乏により抑制された時、ＡＩＭ３は主に細胞質で検出されたものの、細胞が増殖する段階では核から検出された（図３ｅ参照）。前記結果はＤＮＡ合成の間にＡＩＭ３が誘導されるのみならず、核内に移動することを示した。このような結果はＡＩＭ３が核内で新規の機能を果たすことを示した。
【００５８】
ＤＮＡ損傷に対する細胞の反応は細胞周期停止、アポトーシス及びＤＮＡ修復ネットワークの直接的な活性化を含む（Zhou BB et al., Cancer Biol. Ther., S(4 Suppl 1): S16-22, 2003）。さらに、このような細胞の反応の一つであるアポトーシスに対する細胞の抵抗性は典型的な腫瘍形成の徴候である（Evan and Vousden, Nature, 411: 342-348, 2001）。従って、ＡＩＭ３がアポトーシス調節にも関与するか否かに付いて調査するために、ＤＮＡ損傷を誘導するアドリアマイシンを利用してＡＩＭ３+/-マウス由来の細胞の反応を調査した。その結果ＡＩＭ３+/-マウス由来の細胞はアポトーシスに対して抵抗性を示した（図４ａ参照）。さらに、野生型細胞はアドリアマイシンにより成長が完全に停止される反面、ＡＩＭ３+/-マウス由来の細胞は成長が若干阻害された（図４ｂ参照）。ＤＮＡ損傷に伴うＡＩＭ３レベルの変化を調査した結果、アドリアマイシン等ＤＮＡ損傷剤の処理により、ＡＩＭ３の発現が転写及び翻訳レベルで全て誘導されることを確認した（図４ｃ参照）。併せてＤＮＡ損傷に伴うＡＩＭ３細胞内の位置を観察した結果、ＵＶが照射された細胞からＡＩＭ３により形成された核焦点（nuclear foci）が著しく増加したものと観察された（図４ｄ参照）。前記結果からＡＩＭ３が遺伝毒性ストレスにより誘導されるＤＮＡ損傷に対する細胞反応に関与し、ＤＮＡ損傷の際核内に移動することを確認することができた。
【００５９】
さらに、本発明の他の実施例ではＡＩＭ３が細胞増殖に関与するか否かを調査した。その結果、ＡＩＭ３が欠損したマウス由来の細胞及び組織が野生型に比べて高い細胞増殖率を示すことを確認した（図５ａ及び図５ｂ参照）。さらに、ＡＩＭ３遺伝子が導入された細胞の増殖が野生型細胞に比べて減少することを確認した（図５ｃ参照）。これはＡＩＭ３が腫瘍細胞に対して抗増殖活性を示すことを意味する。
【００６０】
ＡＩＭ３がＤＮＡ合成段階とＤＮＡが損傷した時、高いレベルに誘導され、他のＤＮＡ修復蛋白質（Falck et al., Nature, 420: 842-847, 2001、Lim et al., Mol. Cell, 7: 683-694, 2000）と同様に抗増殖活性を有するという前記結果は、ＡＩＭ３がＤＮＡ複製またはストレスから引起されるＤＮＡ損傷の修復に反応する信号伝達経路に機能的に関与することを示すものである。
【００６１】
一方、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３は細胞の非正常的な分裂と増殖を抑制するのみならず、細胞ＤＮＡが損傷された時に細胞周期を停止させ損傷されたＤＮＡを修復する機能を果たし、ＤＮＡが無制限的に増幅されることを防止するために、細胞増殖及びアポトーシスの調節に関与することが知られている（Levine, Cell, 88: 323-331, 1997、Vousden, Cell, 103: 691-694, 2000）。従って、本発明者等はＡＩＭ３とｐ５３の機能的関連性を調査した。その結果、ＡＩＭ３遺伝子で形質導入させた細胞からｐ５３のみならず、ｐ５３のターゲット遺伝子であるｐ２１のレベルもまた増加したことを確認できた（図６ａ及び図６ｂ参照）。このような増加はアポトーシスを誘導するアドリアマイシンの処理により、さらに増加した（図６ｃ参照）。さらに、ＡＩＭ３遺伝子で形質導入された細胞の増殖は野生型細胞に比べて減少し、このようなＡＩＭ３の抗増殖活性はｐ５３またはｐ２１が消失されたがん細胞では消滅された（６ｄ参照）。ＵＶまたはアドリアマイシンによるｐ５３の誘導はＡＩＭ３が抑制された時阻害された（６ｅ参照）。これはＡＩＭ３がＤＮＡ損傷により誘導されるｐ５３及びこれのターゲット遺伝子であるｐ２１の発現を上方調節し、これを通じてがん細胞の増殖抑制することを示したものである。
【００６２】
ＤＮＡ損傷により開始される細胞周期チェックポイントで主要な役割をする哺乳動物のＡＴＭとＡＴＲはセリンスレオニンキナーゼとして、他の遺伝毒性ストレスに反応するＤＮＡ修復過程に関与することが知られている（Yang et al., Carcinogenesis, 24: 1571-1580, 2003）。さらに、ＡＴＭとＡＴＲはＤＮＡ損傷に反応してｐ５３を直接的に活性化させるのみならず、ｐ５３を通じて細胞周期を調節する（Abraham,Genes Dev., 15: 2177-2196, 2001）。従って、本発明者等はＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲを通じてｐ５３を調節するか否かを確認するために、ＡＴＭ／ＡＴＲ阻害剤がＡＩＭ３の活性を抑制するか否かを調査した。その結果、ＡＴＭの抗-増殖活性、ＡＩＭ３により誘導されるアポトーシス及びｐ５３のＡＩＭ３依存性発現が、ＡＴＭ／ＡＴＲ阻害剤であるカフェインにより全て抑制されことを確認した（図７ａ〜図７ｃ参照）。さらに、ＡＴＭの活性を特異的に阻害するＡＴＭのキナーゼデッドドメイン（ＫＤ−ＡＴＭ）によってもｐ５３のＡＩＭ３依存性発現が抑制された（図７ｄ参照）。前記結果からＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲを通じて適用することを確認できた。
【００６３】
このような、ＡＩＭ３とＡＴＭ／ＡＴＲの関係をより詳しく調べるために、本発明者等はＡＩＭ３とＡＴＭ／ＡＴＲの相互作用を分析した。その結果、ＵＶ、アドリアマイシン処理等のストレスにより、ＡＩＭ３とＡＴＭ／ＡＴＲ間の相互作用が増加することを確認し、前記相互作用がＡＩＭ３とＡＴＭ／ＡＴＲのＦＡＴドメインに特異的に結合することを通じてなされたことを確認した（図８ａ〜図８ｃ参照）。
【００６４】
次に、本発明者等はＡＴＭ／ＡＴＲの活性がＡＩＭ３との結合により、強化されるか否かを調査した。その結果、ＡＴＭ／ＡＴＲの基質であるＨ２ＡＸの燐酸化レベルが野生型細胞に比べて、ＡＩＭ３+/-マウス由来の細胞から著しく減少したことを確認した（図９ａ参照）。さらに、Ｈ２ＡＸの燐酸化がアンチセンスＡＩＭ３（Ａｓ−ｐ１８）の発現により阻害されことを確認した（図９ｂ参照）。この他にも本発明者等は種々の試験を通じてＡＩＭ３がＡＴＭ自体及びＡＴＭのターゲット蛋白質ｐ５３及びｃｈｋ２）の燐酸化を増加させることを確認した（図９ｃ及び結果未図示）。前記結果からＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲと直接的に相互作用して、これら自体を活性化させるのみならず、ＡＴＭ／ＡＴＲにより調節される蛋白質も活性化させることを確認することができた。
【００６５】
最後に、本発明者等はＡＴＭ／ＡＴＲと関係のある疾患とＡＩＭ３の機能的関連性を確認するために、種々のがん細胞株よりＡＩＭ３の発現レベルを調査した。その結果、ＡＩＭ３の発現レベルが幾つかのがん細胞株で減少したことを確認できた（図１０ａ参照）。その原因をゲノミックＰＣＲ分析で調査した結果、前記細胞株のＡＩＭ３ ＤＮＡの量が少ないことを確認した。これは前記細胞株で一つのＡＩＭ３対立因子が欠損されたことを示した（図１０ｂ参照）。さらに、９人の白血病患者から分離された組織よりＡＩＭ３の発現レベルを調査した結果、３人の患者の組織からＡＩＭ３が低いレベルで発現することが観察された。この場合にはｐ５３のターゲット遺伝子であるｐ２１の発現もまた強く抑制された（図１０ｃ参照）。肝臓がん患者等から分離された正常組織とがん組織からＡＩＭ３のレベルをＲＴ−ＰＣＲ分析で調査した結果、がん組織でＡＩＭ３ががん−特異的に減少されたことを確認した（図１０ｄ参照）。前記結果からＡＩＭ３の低発現が多様ながん細胞株及びがん患者の組織と高い頻度で関連していることが確認できた。
【００６６】
このように本発明ではＡＩＭ３とＡＴＭ／ＡＴＲ及びｐ５３を含む信号伝達経路で作用する腫瘍抑制遺伝子、より具体的には、ハプロ不全の腫瘍抑制遺伝子（haploinsufficient tumor suppressor gene）であることを最初に確認した。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであって本発明の内容がこれに限定されるものではない。
【００６８】
〈実施例１〉ＡＩＭ３遺伝子が欠損された突然変異マウスの製造
本発明者等は遺伝子トラップ方法（Zambrowicz,B.P.et al.,Nature,392:608-611,1998）を利用してＡＩＭ３欠損マウスを製造した。遺伝子トラップベクターが無作為で挿入された１２９／ＳｖＥｖＢｒｄマウスの胚性幹細胞ライブラリ（OmniBank Library,Lexicon Genetics）の中で遺伝子トラップベクターの導入により変異されたＡＩＭ３遺伝子を含むOST377244クローンを探し出した。前記クローンを利用してレキシコンゼネティックス社の勧奨方法により、ＡＩＭ３異型接合性Ｃ５７ＢＬ６／アルビノマウスを製造した。同型接合性の子孫を得るために異型接合性マウスを異種交配させた。
【００６９】
〈実施例２〉ＡＩＭ３遺伝子が欠損された突然変異マウスの遺伝的及び表現形的特性調査
〈2-1〉ＡＩＭ３対立遺伝子内遺伝子トラップベクターが挿入された位置の確認
ＡＩＭ３突然変異型対立遺伝子内で、遺伝子トラップベクターが挿入された位置を確認するために、塩基配列決定分析を行った。この際、塩基配列決定は塩基配列分析会社であるパンゼノミックス（Pangenomics, 大韓民国）に依頼した。その結果、図１ａに示された通り、遺伝子トラップベクターがＡＩＭ３遺伝子の一番目のエキソン（Exon I）と二番目のエキソン（Exon II）との間に挿入されていることが確認できた。
【００７０】
〈2-2〉ゲノミックＰＣＲ分析
前記実施例１で製造した各マウスの尻尾からゲノミックＤＮＡを分離した。次に、ＡＩＭ３遺伝子のエキソンＩ領域を含む約1.5ｋｂ大のＤＮＡ断片を増幅するための、ｐ１８Ｆ−１及びｐ１８Ｒ−１プライマー対（配列番号３及び配列番号４）を利用してＰＣＲを行った（図１ａ参照）。さらに、ＡＩＭ３遺伝子の一部と遺伝子トラップベクターの一部を含む約0.8ｋｂ大のＤＮＡ断片を増幅するために、前記ｐ１８Ｆ−１プライマーとゲノム内に挿入された遺伝子トラップベクター（約5.7ｋｂ）に結合するＬＴＲプライマー（配列番号５）を利用してＰＣＲを行った（図１ａ参照）。この際、ＰＣＲは９４℃で５分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分、５４℃で１分、７２℃で２分を、３０回繰返して行った。
その結果、興味深くも製造された突然変異マウスは全て1.5ｋｂ及び0.8ｋｂ大のＤＮＡ断片を二つとも生産する異型接合性マウス（ＡＩＭ３+/-マウス）であることを示した（図１ｂ参照）。反面、野生型マウス（ＡＩＭ３+/+マウス）では1.5ｋｂ大のバンド一つだけを確認できた。
【００７１】
〈2-3〉サザンブロット分析
各マウスの尻尾からゲノミックＤＮＡを分離し、Sac Iで切断した後、ゲル電気泳動を行い、切断されたＤＮＡ切片を分離した。次に、配列番号６及び配列番号７で示されるｐ１８Ｆ−２及びｐ１８Ｒ−２プライマーにより増幅されたＡＩＭ３遺伝子のエキソン領域を含むＰＣＲ産物を放射性同位元素で表示した後（図１ａ参照）、これをプローブ（probe）として前記切断されたＤＮＡ切片と混成化させた（southerm, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503, 1975）。
その結果、図１ｃで示した通り、野生型マウスでは１２ｋｂ付近で一つのバンドが検出される反面、異型接合性マウスでは約３ｋｂ大のバンドがまた一つ検出された。
【００７２】
〈2-4〉ＡＩＭ３遺伝子欠損による胎生期致死誘発の確認
前記実施例〈2-2〉及び〈2-3〉の分析で同型接合性遺伝型の子孫は見当らなかった。従って、本発明者等はＡＩＭ３遺伝子の欠損が胎生期致死を誘発するか否かを調査するために、出生後マウスの遺伝型及び受精後時間経過に伴う胎児の遺伝型を前記実施例〈2-2〉と同様の方法により、ゲノミックＰＣＲ分析を行い調査した。その結果を下記表１及び表２に示した。
下記表１の通り、生存した総２６２匹のマウスの中で、野生型マウス（＋/＋）が１１４匹、異型接合性マウス（＋/−）が１４８匹と調査された。生存した同型接合性マウス（−/−）は１匹も無いものと確認された。特に、異型接合性マウスは野生型同腹子と類似した比率で表れたものの、これは異型接合性マウスの約５０％が出生前段階で死亡することを意味する。さらに、下記表２の通り、7.5〜9.5日齢に分離された全８３個の胎児の中で同型接合性遺伝型を含有している胎児は8.5日齢でたった一つが検出された。これはＡＩＭ３同型接合性マウスが胎生初期に致死することを示すものである。
【表１】
2007534748.tif 000003
【表２】
2007534748.tif 000004
前記結果からＡＩＭ３遺伝子の欠損によって胎生期致死が誘発されることが確認できた。
【００７３】
〈2-5〉ウェスタンブロット分析
ジアク等の方法（Ziak,M,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.280:363-367,2001）により、多くの器官（小腸、腎臓、心臓及び脾臓）から蛋白質を分離した。次に、パク等の方法（Park S. G., et al., J. Biological Chemistry 274: 16673-16676, 1999）により、多クローンラビット抗ＡＩＭ３抗体（polyclonal rabbit anti-AIM3 antibody）を利用して、ウェスタンブロット分析を実施した。前記抗ＡＩＭ３抗体はキム等の方法（Kim,T.et al.,J.Biol.Chem.,275:21768-21772,2000）により製作した。
その結果、図１ｄに示した通り、各器官によって減少程度が異なったもののＡＩＭ３+/-マウスの器官でのＡＩＭ３発現レベルが、野生型マウスの器官よりは遥かに低いことが確認できた。
【００７４】
〈実施例３〉ＡＩＭ３+/-マウスの組織学的特性調査
本発明者等はＡＩＭ３遺伝子の機能を調べるために、ＡＩＭ３+/-マウスから組織と器官を分離してこれらの組織学的特性を分析した。
まず、時間間隔をおいてマウスから多様な組織を分離し、分離した組織を１０％ホルマリンで固定させた。固定された組織をパラフィンに埋込んだ後、Ｈ＆Ｅ染色をした。さらに、Ｂ細胞転移を確認するために、パラフィンスライドを表面マーカーＢ２２０で免疫組織化学的染色した。キシレンでパラフィンを除去した後、スライドを抗２２０抗体（santacruz biotech）を含むブロッキングバッファー（1:100, 5%BSA及び0.1%ツイン20/PBS）で２時間培養した。
次に、スライドをＰＢＳで洗浄した後、スライドに固定されている組織をアビジン結合２次抗体及びＤＡＢ溶液と共に再び培養した。
その結果、ＡＩＭ３+/-マウスより種々の腫瘍が見出された（表３及び図２ａ参照）。興味深くも腫瘍が発達している１８匹のＡＩＭ３+/-マウスの内、１４匹は脾臓またはリンパ節から由来したリンパ腫が含まれており、５匹のマウスでは複合性腫瘍が発見された。具体的には、１５ヶ月齢のＡＩＭ３+/-マウス（B-63）及び２３ヶ月齢のＡＩＭ３+/-マウス（B-95）の乳房から腺がんが発見された。さらに、１９ヶ月齢ＡＩＭ３+/-マウス（B-103）の精嚢から腺がんが発見され、２２ヶ月齢のＡＩＭ３+/-マウス（B-207）では肝臓がんと由来不明の肉腫が発見された。このような全ての種類のがんは退形成及び侵襲性のような、典型的な悪性表現型を示した。さらに、２２ヶ月齢のＡＩＭ３+/-マウス（B-232）のリンパ節ではリンパ腫が発見され、１７ヶ月齢のＡＩＭ３+/-マウス（B-14）では細気管支上皮組織から高分化型の腺がんが観察された。
幾つかのリンパ腫は肝臓、腎臓、肺臓、及び唾液腺のような他の器官に転移したことがわかった（図２ｂ参照）。このような腫瘍の発生率は出生後１５ヶ月が経過した後に著しく増加した（図２ｃ及び表３参照）。
【表３】
2007534748.tif 000005
上記の結果に示されるように、ＡＩＭ３欠損異型接合性マウスにおいて、様々な腫瘍が自然に形成されることにより、ＡＩＭ３が一般的な腫瘍形成メカニズムに関与する強力な腫瘍抑制因子であると考えられる。
【００７５】
〈実施例４〉細胞周期とＡＩＭ３の関連性の確認
早い細胞周期は腫瘍形成（tumorigenesis）の典型的な徴候である（Evan and Vousden, Nature, 411: 342-348, 2001）。従って、ＡＩＭ３が細胞周期調節に関与するか否かを調査した。
【００７６】
〈4-1〉ＡＩＭ３+/-マウス由来細胞における細胞周期変化調査
まず、本発明者等はＡＩＭ３+/-マウス由来細胞の細胞増殖率を野生型マウスの細胞と比較調査した。このために、４週齢野生型マウスとＡＩＭ３+/-マウスから脾臓細胞と胸腺細胞をそれぞれ分離した後、培養時間に伴う細胞数を測定した。その結果、図３ａに示された通り、ＡＩＭ３+/-マウス由来細胞は野生型マウスの細胞より早い増殖を示した。
次に、ＡＩＭ３+/-マウス由来細胞の細胞周期を調査するためにＦＡＣＳ分析を行った。４週齢野生型マウス及びＡＩＭ３+/-マウスから分離した脾臓細胞を一夜培養した。培養した細胞を１％ＰＦＡ（paraformaldehyde）で固定し、ＰＩ（propidium iodide）で染色した。各サンプル当り20,000個の細胞を対象にＦＡＣＳ分析を行った。その結果、図３ｂに示された通り、ＡＩＭ３+/-マウスから分離した脾臓細胞は野生型マウスの細胞より早い細胞周期を示した。
【００７７】
〈4-2〉細胞周期に伴うＡＩＭ３発現レベル変化調査
次に、細胞周期間のＡＩＭ３の機能を調べるために、ＡＩＭ３が細胞周期に依存して発現するか否かを調査した。ＨＣＴ１１６細胞を無血清培地で２４時間培養した後、さらに、血清含有培地で培養して細胞周期が始まるようにした。このように、細胞周期を終えた細胞を対象に血清欠乏状態と血清を再供給した状態で時間に伴うＡＩＭ３発現レベルを、ウェスタンブロット法で比較分析した。その結果、ＡＩＭ３はＤＮＡ合成段階で著しく誘導された（図３ｃ参照）。
これをさらに確認するために本発明者等はＦＡＣＳ分析を行った。ＨＣＴ１１６細胞（Human colon adenocarcinoma cell line）を１％ＰＦＡで固定して中和させた。次に、細胞を抗ＡＩＭ３モノクローナル抗体と共に培養した。ＦＩＴＣ結合抗マウスヒツジＩｇＧ抗体（Pierce）を添加して再度培養した。次に、ＰＩで細胞を共染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。その結果、ＡＩＭ３はＤＮＡ合成段階で著しく誘導された（図３ｄ参照）。これは前記ウェスタンブロット分析結果と一致する結果である。前記結果からＡＩＭ３がＤＮＡ合成段階で誘導されることが確認できた。
【００７８】
〈4-3〉細胞増殖に伴うＡＩＭ３の細胞内位置調査
本発明者等はＤＮＡ合成段階でＡＩＭ３が誘導される機能的な理由を調べるために、細胞の成長が止どまった状態と、細胞が増殖する状態でＡＩＭ３の細胞内の位置を調査した。このために、ＤＵ１４５細胞（Prostate cancer cell line）１０％血清が含まれているＲＰＭＩ−１６４０培地（complete media; CM）と血清が無い培地（serum free media;SF）でそれぞれ培養した後、１００％ＭｅＯＨで固定させ、抗ＡＩＭ３モノクローナル抗体と反応させた。次に、抗マウスヒツジＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Pierce）と反応させ、ＰＩで染色し蛍光顕微鏡下で細胞内ＡＩＭ３の位置を調査した。
その結果、図３ｅに示した通り、血清欠乏により細胞の成長が抑制された時、ＡＩＭ３は主に細胞質に位置する反面、細胞の成長が再開された時には核に位置することが示された。これにより細胞周期の内、ＤＮＡ合成の間ＡＩＭ３が誘導されるのみならず、核内に移動することが確認できた。前記結果はＡＩＭ３が核内において新たな機能を持ち得ることを示す。
【００７９】
〈実施例５〉ＤＮＡ損傷とＡＩＭ３の関連性の確認
ストレス等によりＤＮＡが損傷されると、一般的にアポトーシスが誘導され細胞周期が停止する（Zhou BB et al., Cancer Biol. Ther., S(4 Supp11): S16-22, 2003）。ここに、本発明者等はストレスにより誘導されるアポトーシスと細胞が成長停止に対する細胞の反応でＡＩＭ３がどのような役割をするのかを調査した。
【００８０】
〈5-1〉アポトーシス調節に対するＡＩＭ３遺伝子欠損による影響の調査
ＤＮＡ損傷を誘導するアドリアマイシンを利用して、プロアポトーシスストレスに対するＡＩＭ３+/-マウス由来脾臓細胞の反応を調査した。
まず、野生型マウスとＡＩＭ３+/-マウスから脾臓細胞を分離した。アポトーシスを誘発するために、前記分離された脾臓細胞に0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシン（Adr,Sigma）を２時間処理した。細胞をＦＩＴＣ結合アネキシンＶ（FITC-conjugated annexin V,Roche）と５分間培養した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＬ−１Ｈ検出器下でＦＡＣＳ分析を行った。分析にはサンプル当り20,000個の細胞を用いた。
その結果、図４ａに示した通り、野生型細胞の場合には、アドリアマイシン処理によりアポトーシスが進行中の細胞が著しく増加したものの、ＡＩＭ３+/-細胞はアドリアマイシンにより誘導されるアポトーシスに対して抵抗性を示した。これはＡＩＭ３がＤＮＡ損傷により誘導されるアポトーシスに対して細胞を敏感にするのに必要であることを示唆する。これにより、ＡＩＭ３がＤＮＡ損傷による細胞のアポトーシスを促進することが確認できた。
【００８１】
〈5-2〉アポトーシス誘導剤に対する細胞成長変化調査
アドリアマイシンによる細胞の成長停止よりＡＩＭ３の重要性を調べるために、流動細胞計測を実施した。まず、野生型マウスとＡＩＭ３+/-マウスから胸腺細胞を分離した後、0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシン（Adr,Sigma）を６時間処理した。次に、前記実施例〈5-1〉と同様の方法によりＦＡＣＳ分析を行った。その結果、図４ｂに示した通り、ＡＩＭ３+/-マウス細胞の成長はアドリアマイシン処理により若干阻害される反面、野生型細胞の成長は停止することが確認できた。
【００８２】
〈5-3〉アポトーシス誘導体によるＡＩＭ３レベル変化調査
ＡＩＭ３のレベルがアドリアマイシン処理により影響を受けるか否かをＲＴ−ＰＣＲ分析及びウェスタンブロット分析で調査した。
ＨＣＴ１１６細胞に0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシンを処理した。次に、時間別に細胞を収得した後、Ｓｏｌ Ｄ溶液（4M guanidine thiocyanate,1% laurosarcosine, 25mM sodium citrate, and 0.1% b-mercaptoenthanol）で細胞を溶解させた。細胞抽出物を酸性フェノール（acidic phenol）と４％イソアミルアルコールを含むクロロホルムで培養した後、撹拌した（vortexed）。混合物を14,000rpmで遠心分離した。収得した上澄み液にイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈澱させた。沈澱されたＲＮＡを１００％エタノールで洗浄し、１μｇのＲＮＡを蒸留水に溶解させ、ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。次に、配列番号８及び配列番号９で示されるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、ＡＩＭ３の発現レベルを定量的に比較するため、ＧＡＤＰＨの発現レベルを共に測定した。
一方、ウェスタンブロット分析のため、アドリアマイシンを処理した細胞を蛋白質分解酵素カクテルを含むＲＩＰＡで溶解させた。14,000rpmで３０分間遠心分離した。抽出された蛋白質２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。次に、パク等の方法（Park S.G.,et l.,J.Biol.,Chem.,274:16673-16676,1999）により、ポリクローナルラビット抗ＡＩＭ３抗体を利用してウェスタンブロットを行った。この際、ＡＩＭ３の発現レベルを定量的に比較するため、チューブリンの発現レベルを共に測定した。
その結果、図４ｃに示した通り、アドリアマイシンに反応してＡＩＭ３の転写及び翻訳が全て誘導された。さらに、ＡＩＭ３の誘導はＵＶ、アクチノマイシンＤ（actinojycin D,Act.D）及びシスプラチン（CDPP）のような他のＤＮＡ損傷剤によっても観察された （結果未図示）。特に、ＡＩＭ３はＵＶやアドリアマイシンに露出後、５分〜１０分以内に誘導された（結果未図示）。前記結果はＡＩＭ３がＤＮＡ複製またはＤＮＡ損傷から引起されるＤＮＡ修復に反応する信号伝達経路に機能的に関連していることを示した。
【００８３】
〈5-4〉ＤＮＡ損傷に伴うＡＩＭ３の細胞内位置調査
ＤＮＡ損傷時ＡＩＭ３の細胞内位置を、大きい核を含むＵ２ＯＳ細胞を利用して調査した。Ｕ２ＯＳ細胞（osteosarcoma cell line）に２５４ｎｍ波長のＵＶ−Ｃ（UV cross linker）で５０Ｊ／ｍ2で処理した。前記細胞を完全培地で３０分間培養した後収集した。次に前記実施例〈4-3〉と同様の方法により実施し、ＡＩＭ３の細胞内位置を免疫蛍光染色法で調査した。その結果、図４ｄに示した通り、ＵＶが照射された細胞でＡＩＭ３により、形成された核焦点（nuclear foci）の著しい増加が観察された。
前記全ての結果はＡＩＭ３が遺伝毒性ストレスにより誘導される、ＤＮＡ損傷に対する反応に関与することを示した。
【００８４】
〈実施例６〉細胞増殖とＡＩＭ３の関連性の確認
本発明者等は前記実施例４を通じてＡＩＭ３の欠損によって細胞周期が早くなり、ＡＩＭ３がＤＮＡ合成過程中、高レベルで誘導されることを確認した。従って、ＡＩＭ３が細胞増殖にも関与するか否かを確認した。
【００８５】
〈6-1〉ＡＩＭ３遺伝子の欠損による細胞増殖率変化調査
ａ．チミジン混入法（thymidine incorporation）
野生型マウス及びＡＩＭ３+/-マウスから分離したマウス胎児線維芽細胞（MEFs,E14.5d）を１μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］チミンを含む培地で培養した。培養された細胞を冷ＰＢＳで洗浄した後、核酸を沈澱させるために１０％ＴＣＡ溶液で３０分間培養した。次に、0.1Ｎ ＮａＯＨで細胞を溶解させた後、沈澱物内に混入された放射性チミジンの量を液体シンチレーションカウンターを利用して定量した。実験を全３回行いその平均値を算出した。
その結果、図５ａに示した通り、ＡＩＭ３+/-マウスから分離されたＭＥＦｓは野生型ＭＥＦｓに比べて一層高い増殖率を示した。
ｂ）in situ 免疫蛍光染色法
ＡＩＭ３+/-マウスから腸、精巣、脾臓、及び胸腺を分離した。次に、前記組織における細胞増殖率を調査するために、細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７を利用してin situ 免疫蛍光染色法を行った（Gerdes J. et al., J. Immunol., 133: 1710-1715, 1984）。
その結果、図５ｂに示した通り、ＡＩＭ３+/-マウス由来の各組織で野生型組織に比べて増加した細胞増殖が観察された。
【００８６】
〈6-2〉ＡＩＭ３の発現増加による細胞増殖率変化調査
本発明者等は前記実施例〈6-1〉を通じてＡＩＭ３の発現減少により、細胞増殖が増加したことを確認した。従って、ＡＩＭ３の発現が増加すると細胞増殖が抑制されるかを調査した。
ＡＩＭ３遺伝子（配列番号２）をｐｃＤＮＡ３（invitrogen）ベクターに挿入してＡＩＭ３発現ベクターを製造した。次に、前記ベクターをＨＣＴ１１６細胞（Human colon adenocarcinoma cell line）に導入させた。形質導入された各細胞の細胞増殖率を前記実施例〈6-1〉のａと同様の方法により調査した。この際、ＡＩＭ３遺伝子を含有していないｐｃＤＮＡ３ベクター（empty vector,EV）で形質導入させたＨＣＴ１１６細胞を対照群として用いた。
その結果、図５ｃに示した通り、ＡＩＭ３遺伝子が導入された細胞で細胞増殖が減少した。これにより、ＡＩＭ３が腫瘍細胞に対して抗増殖活性を示すことを確認できた。
【００８７】
〈実施例７〉ｐ５３の上向調節剤としてのＡＩＭ３の機能の確認
腫瘍抑制蛋白質であるｐ５３はＤＮＡ損傷により、誘導される細胞周期停止とアポトーシスを調節するにおいて主要な役割をする（Levine, Cell, 88: 323-331, 1997、Vousden, Cell, 103: 691-694, 2000）。従って、ＡＩＭ３とｐ５３の機能的関連性について調査した。
【００８８】
〈7-1〉ＡＩＭ３によるｐ５３のレベル測定
ＡＩＭ３+/-マウス及び野生型マウスから分離したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）内でｐ５３及びＡＩＭ３の発現レベルを前記実施例〈5-3〉と同様の方法により、ウェスタンブロットで調査した。さらに、前記実施例〈6-2〉で製造したＡＩＭ３発現ベクターをＨＣＴ１１６細胞に導入し、形質導入されたＨＣＴ１１６細胞でＡＩＭ３及びｐ５３の発現レベルをウェスタンブロットで調査した。
その結果、図６ａに示した通り、ｐ５３の発現レベルは野生型マウスに比べてＡＩＭ３+/-マウスのＭＥＦｓでさらに低かった。一方、ＡＩＭ３遺伝子を導入したＨＣＴ１１６細胞ではＡＩＭ３遺伝子を導入しない対照群細胞に比べてｐ５３のレベルが増加した。これはＡＩＭ３の異所性発現がｐ５３の発現を向上させることを示すものである。
【００８９】
〈7-2〉ＡＩＭ３によるｐ２１のレベル測定
ＡＩＭ３の増加がｐ５３依存性転写を強化させるか否かを調査するために、ｐ５３のターゲット遺伝子として知られているｐ２１のＡＩＭ３依存性転写を調査した。
前記実施例〈7-1〉でＡＩＭ３遺伝子（１μｇ／ｍｌ）で形質導入されたＨＣＴ１１６細胞を２４時間培養した。次に、前記実施例〈5-3〉と同様の方法によりＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。その結果、図６ｂに示した通り、ＡＩＭ３遺伝子を導入したＨＣＴ１１６細胞でｐ２１の発現が増加したことが確認できた。
【００９０】
〈7-3〉ＡＩＭ３とアドリアマイシンによるｐ２１のレベル測定
次に、本発明者等はｐ２１転写において、ＡＩＭ３及び／またはアドリアマイシンの効果を調べるために、ルシフェラーゼ遺伝子と融合されたｐ２１のプロモーターを含むベクターを利用してルシフェラーゼ分析を行った。
ルシフェラーゼ遺伝子がｐ２１プロモーター下で発現されるように操作したｐＧＬ−３ベクター（Promega）とＡＩＭ３遺伝子を含む組み換えＡＩＭ３発現ベクター（1.2μｇ／ｍｌ）でＨＣＴ１１６細胞を共形質導入させた。対照群細胞には前記ｐＧＬ−３ベクターとＡＩＭ３遺伝子を含有していない空ベクターを共導入した。次に、形質導入された各細胞に0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシンを２時間処理した。細胞を溶解した後、ルシフェラーゼ基質を添加し、常温で３０分間培養した。各サンプル５μｌをルミノメータプレート（luminometer plate）に移して、メーカー（Promega）のプロトコルに従ってルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、図６ｃに示した通り、ｐ２１プロモーターにより調節されるルシフェラーゼ活性がＡＩＭ３の形質導入により高レベルで増加され、ここにアドリアマイシンを追加して処理した場合にはその活性が一層増加した。
【００９１】
〈7-4〉ＡＩＭ３の抗-増殖活性とｐ５３及びｐ２１の関連性の確認
前記実施例〈7-1〉及び〈7-2〉を通じてｐ５３とｐ２１の発現がＡＩＭ３に依存することを確認した。従って、ＡＩＭ３がｐ５３とｐ２１を通じて腫瘍細胞の増殖を抑制するか否かを調査した。
前記実施例〈6-2〉で製造したＡＩＭ３発現ベクターまたは空ベクター（２μｇ／ｍｌ）をＨＣＴ１１６細胞（Human colon adenocarcinoma cell line）、ｐ５３遺伝子が欠損されたｐ５３−ｎｕｌｌＨＣＴ１１６細胞及びｐ２１遺伝子が欠損されたｐ２１−ｎｕｌｌＨＣＴ１１６細胞にそれぞれ導入した。次に、形質導入された各細胞の増殖率を前記実施例〈6-1〉のａと同様の方法により調査した。
その結果、図６ｄに示した通り、ＡＩＭ３の抗増殖活性は機能的なｐ５３またはｐ２１の不在により消滅した。これはＡＩＭ３がｐ５３とｐ２１を通じて腫瘍細胞の増殖を抑制することを示した。
【００９２】
〈7-5〉ＡＩＭ３の発現抑制によるｐ５３レベル減少測定
本発明者等はアンチセンスＡＩＭ３（Ａｓ−ＡＩＭ３）を利用してＡＩＭ３の発現を抑制した後、ｐ５３誘導が影響を受けるか否かを調査した。
まず、配列番号１０及び配列番号１１で示されるプライマーを利用して、ＡＴＧを含むＡＩＭ３遺伝子のＮ−末端１７６ｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ3.1ベクターに逆方向に挿入した。アンチセンスＡＩＭ３を含むベクター（２μｇ／ｍｌ）をＨＣＴ１１６細胞に導入した。形質導入された細胞を２４時間培養した。次に、細胞にＵＶ及び0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシンをそれぞれ処理した。次に、抗ＡＩＭ３抗体または抗ｐ５３抗体（Santacruz）を利用して前記実施例〈2-5〉と同様の方法により、ウェスタンブロット分析を行った。この時、ＡＩＭ３及びｐ５３の発現レベルを定量的に比較するために、アクチンの発現レベルを共に測定した。
その結果、図６ｅに示した通り、ｐ５３のレベルはＵＶまたはアドリアマイシン処理により増加する反面、Ａｓ−ＡＩＭ３によるＡＩＭ３の抑制はｐ５３の誘導を阻害した。前記結果からｐ５３の発現を増加させるためにＡＩＭ３が必要であることが示された。さらに、ｐ５３の直接的な初期ターゲット遺伝子であるＰＵＭＡの転写またはＵＶ照射により増加され、その誘導はＡＩＭ３がＡｓ−ＡＩＭ３により抑制された時阻害された（結果未図示）。
前記結果はＡＩＭ３がＤＮＡ損傷によりｐ５３の誘導を媒介するｐ５３の重要な上位調節者であることを示すものである。
【００９３】
〈実施例８〉ＡＩＭ３の作用メカニズムの確認
ＡＴＭ／ＡＴＲはＤＮＡ損傷に反応してｐ５３を直接的に活性化させる物質である（Canman et al., Science, 281: 1677-1679, 1998、Banin S et al., Science, 11; 281(5383): 1674-7, 1998）。従って、本発明者等はＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲを通じて作用するか否かを調査した。
【００９４】
〈8-1〉カフェインによるＡＩＭ３の抗増殖活性消滅分析
ＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲを通じてｐ５３を調節できるとの可能性を確認するために、本発明者等はまず、ＡＴＭ／ＡＴＲの阻害剤として知られているカフェインの存在下でＡＩＭ３の抗増殖活性調査した。ＨＣＴ１１６細胞をＡＩＭ３発現ベクターまたは空ベクター（２μｇ／ｍｌ）で２４時間形質導入させた。次に、２０ｍＭカフェインを添加して４時間培養した。対照群ではＰＢＳを添加した。各細胞の細胞増殖率を前記実施例〈6-1〉のａと同様の方法により調査した。その結果、図７ａに示した通り、ＡＴＭ／ＡＴＲの阻害剤であるカフェインにより、ＡＩＭ３の抗増殖活性が消滅されたことが観察された。これにより、ＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲを通じて抗増殖活性を示すことが確認された。
【００９５】
〈8-2〉カフェインによるＡＩＭ３誘導アポトーシス阻害分析
次に、本発明者等はＡＩＭ３により誘導されるアポトーシスがＡＴＭ／ＡＴＲの阻害剤であるカフェインにより、阻害されるか否かを調査した。ＨＣＴ１１６細胞をＡＩＭ３発現ベクターまたは空ベクター（４μｇ／ｍｌ）で２４時間形質導入させた。次に、２０ｍＭカフェインを添加して１２時間培養した。対照群ではＰＢＳを添加して培養した。次に、ＰＩ染色を行った後、サブＧ１細胞の部分（％）を測定してアポトーシスを調査した。その結果、図７ｂに示した通り、アポトーシスがＡＩＭ３の発現により誘導され、このような効果はカフェイン処理により緩和されたことを確認できた。
【００９６】
〈8-3〉カフェインによるｐ５３のＡＩＭ３依存性誘導阻害分析
次に、本発明者等はＡＩＭ３により誘導されるｐ５３の発現がカフェインにより阻害されるか否かを調査した。まず、ＨＣＴ１１６細胞をＡＩＭ３発現ベクターまたは空ベクター（２μｇ／ｍｌ）で２４時間形質導入させた。次に、２０ｍＭカフェインを添加して１２時間培養した。対照群にはＰＢＳを添加して培養した。その後、ＡＩＭ３とｐ５３のレベルを調査するために、前記実施例〈7-5〉と同様の方法により、ウェスタンブロット分析を行った。この際、ＡＩＭ３及びｐ５３の発現レベルを定量的に比較するために、アクチンの発現レベルを共に測定した。
その結果、図７ｃに示した通り、ＡＩＭ３により誘導されたｐ５３の発現はカフェインにより阻害された。さらに、ｐ５３のターゲット遺伝子であるＰＵＭＡの発現もＡＩＭ３により誘導されたものの、これもまたカフェインにより阻害された（結果未図示）。前記結果等はｐ５３のＡＩＭ３−依存性誘導でＡＴＭ／ＡＴＲが重要な役割をすることが示された。
【００９７】
〈8-4〉ＫＤ−ＡＴＭによるｐ５３のＡＩＭ３−依存性誘導阻害分析
ｐ５３のＡＩＭ３依存性誘導でＡＴＭ／ＡＴＲが重要な役割をすることを、より詳しく確認するため、ＡＴＭのキナーゼデッドドメイン（ＫＤ−ＡＩＭ３）でＨＣＴ１１６細胞を間形質導入させた（Canman et al., Science, 281: 1677-1679, 1998）。前記ＫＤ−ＡＴＭはＡＴＭの活性を特異的に阻害した。
まず、ＫＤ−ＡＴＭドメインまたは野生型ＡＴＭを含むベクター（St. Jude Children's HospitalのMicheal Kastanから提供された）をＡＩＭ３発現ベクター（２μｇ／ｍｌ）と共に、ＨＣＴ１１６細胞にそれぞれ導入した。ＡＩＭ３発現に対する対照群には、前記ベクターをＡＩＭ３遺伝子を含有していない空ベクターと共に、ＨＣＴ１１６細胞にそれぞれ導入させた。次に、形質導入された各細胞におけるｐ５３とＡＩＭ３の発現レベルを前記実施例〈6-5〉と同様の方法によりウェスタンブロット分析で調査した。この時、ＡＩＭ３及びｐ５３の発現レベルを定量的に比較するために、アクチンの発現レベルを共に測定した。
その結果、図７ｄに示した通り、ＡＩＭ３の発現増加によるｐ５３誘導はＫＤ−ＡＴＭにより阻害される反面、野生型ＡＴＭによっては阻害されなかった。これはｐ５３のＡＩＭ３依存性誘導にＡＴＭが必要であることをさらに裏付ける結果である。
前記全ての結果等からＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲを通じて抗増殖活性、アポトーシス誘導活性及びｐ５３上向調節（up-regulation）活性を示すことが確認できた。
【００９８】
〈実施例９〉ＡＩＭ３によるＡＴＭ／ＡＴＲの活性化分析
〈9-1〉ＡＩＭ３とＡＴＭの相互作用分析
ａ．共免疫沈澱法（co-immunoprecipitation）
ＡＩＭ３とＡＴＭ間の相合作用を調査するために、共免疫沈澱法を行った。まず、ＵＶ及び0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシンをそれぞれ処理したＨＣＴ１１６細胞から時間別に蛋白質を抽出した。蛋白質抽出物を正常ＩｇＧと蛋白質Ａ／Ｇアガロス（protein A/G-agarose）と共に２時間培養し、次に、非特異的ＩｇＧ結合蛋白質等を除去するために遠心分離を行った。遠心分離により収得された上澄みに抗ＡＴＭ抗体（Santacruz）２μｇ添加して４℃で２時間振盪培養した。次に、蛋白質Ａ／Ｇアガロスを添加した。冷たいＰＢＳで２回洗浄した後ＰＩＲＡでもう一度洗浄した。沈澱物等をＳＤＳ−サンプルバッファーに溶解させた後、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離された蛋白質をＰＶＤＦ膜に移して抗−ＡＩＭ３単一抗体及び２次抗体（horseradish peroxidase conjugated secondary antibody）とこの順序で反応させた。
その結果、図８ａに示した通り、ＡＩＭ３とＡＴＭの相互作用はＵＶ及びアドリアマイシンと反応して５分以内に増加した。ＡＩＭ３の分解反応速度はアドリアマイシンが処理された細胞においてより遅くなったものの、これはＵＶストレスは細胞に一時的な影響を与える反面、アドリアマイシンは培養する間培地内に継続して存在するためのものと思われる。
ｂ．試験管内プルダウン分析（in vitro pull down assay）
ＡＩＭ３とＡＴＭ間の直接的な相互作用を確認するためにＧＳＴプルダウン分析を行った。
まず、ＡＩＭ３はＧＳＴと融合された形態に変化させ、メーカー（pharmacia）のプロトコルに従って精製した。一方、全体のＡＴＭは大きさが極めて大きく合成が困難であっため、本発明者等はＡＴＭの機能ドメインとＡＩＭ３の相互作用を試験した。このため、ＡＴＭの構造でＦＡＴドメインを含む６１２個のアミノ酸からなる断片を配列番号１２及び配列番号１３で示されるプライマーを利用してＰＣＲで増幅した。さらに、Ｃ−末端ドメインを有する１４５個のアミノ酸からなる断片（対照群）は配列番号１４及び配列番号１５に示されるプライマーを利用してＰＣＲで増幅した。次に、増幅されたＰＣＲ産物を試験管内転写及び翻訳が可能なベクターのｐｃＤＮＡ3.1（Invitrogen）にクローニングした。この際、蛋白質の合成は放射性メチオニンの存在下で試験管内翻訳法（in vitro trnaslation）で行った。合成されたＴＮＴ産物１０μｌをＧＳＴまたはＧＳＴ−融合ＡＩＭ３蛋白質が固定されたグルタチオンセパロスビド上で５分間培養した。次に、結合バッファ（0.2% sarcosine 及び0.2% Triton X100を含むPBS）で６回洗浄し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解した。各ドメインに対するＧＳＴ−融合ＡＩＭ３の結合をオートラジオグラフ法（autoradiography）で分析した。
その結果、図８ｂに示した通り、ＧＳＴ−融合ＡＩＭ３蛋白質はＡＴＭの機能ドメインであるＦＡＴドメインとは結合したものの、ＡＴＭのｃ−末端ドメインとは結合しなかった。これにより、ＡＩＭ３がＡＴＲと直接的に相互作用をすることが確認できた。
【００９９】
〈9-2〉ＡＩＭ３とＡＴＲの相互作用分析
ＦＡＴドメインはＡＴＭのみならずＡＴＲにも存在する（Abraham R,Genes Dev.,15:2177,2001）。従って、ＡＩＭ３とＡＴＲの相互作用を共免疫沈澱法で調査した。
まず、フラグタグを付けたＡＴＲ（Flag-tagged ATR）を含むＡＴＲベクター（ハーバド大学 Elledge S.より提供された）で２９３細胞を形質導入させた。形質導入された２９３細胞にＵＶを処理した後、時間別に蛋白質を抽出した。次に、抗ＡＴＭ抗体の代わりに抗ＦＬＡＧ抗体（Sigma）を用いたことを除いては前記実施例〈9-1〉のａと同様の方法により行った。
その結果、図８ｃに示した通り、ＡＩＭ３はフラグタグを付けたＡＴＲ（Flag-tagged ATR）と共免疫沈澱させ、前記相互作用はＵＶ露出下で一層強化された。これよりＡＩＭ３がＡＴＭに作用したのと同様に、ＡＴＲにも作用することが確認できた。
前記結果等からＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲと直接的な相合作用をすることが確認できた。
【０１００】
〈9-3〉ＡＩＭ３によるＡＴＭ／ＡＴＲの活性化分析
本発明者等はＡＴＭ／ＡＴＲの活性がＡＩＭ３との結合により強化されるか否かを調査した。
ａ．ＡＩＭ３+/-マウス由来の細胞よりＨ２ＡＸの燐酸化レベル測定
ＡＴＭ／ＡＴＲの基質として知られているＨ２ＡＸ（Burma et al., Biol. Chem., 276: 42462-42467, 2001、Ward, I. M. et al., J. Biol. Chem., 276: 47759-47762, 2001、Iren M. Ward. et al., J. Biol. Chem., 279(11): 9677-9680, 2004）を利用してＡＴＭ／ＡＴＲの活性を調査した。
野生型マウスとＡＩＭ３+/-マウスより胸腺細胞と脾臓細胞を分離した後、前記細胞等よりH2AXの燐酸化レベルを前記実施例〈7-5〉と同様の方法により、ウェスタンブロット法で測定したその結果、図９ａに示した通り、Ｈ２ＡＸの燐酸化（p-H2AX）がＡＩＭ３+/-マウス由来の細胞で急激に減少されたことが確認できた。
ｂ．アンチセンスＡＩＭ３によるＨ２ＡＸ燐酸化抑制分析
次に、本発明者等はＤＮＡ損傷剤であるＶＰ１６（Clarke et al., Nature, 362: 849-852,1993）を細胞に処理した後、アンチセンスＡＩＭ３（As-AIM3）の存在下でＨ２ＡＸの燐酸化がＡＩＭ３の抑制により阻害されるか否かを調査した。前記実施例〈7-5〉で製造したアンチセンスＡＩＭ３を含むベクター（２μｇ／ｍｌ）をＨＣＴ１１６細胞に導入した。形質導入された細胞を２４時間培養した後、アポップトシス誘導体であるＶＰ１６（Sigma）を１００μＭの濃度で４時間処理した。次に、抗ｐ５３抗体、抗ＡＩＭ３抗体及び抗ｐＨ２ＡＸ抗体（Cell signaling）をそれぞれ利用して、前記実施例〈7-5〉と同様の方法によりウェスタンブロット分析をした。この時、各蛋白質の発現レベルを定量的に比較するため、アクチンの発現レベルを共に測定した。その結果、図９ｂに示した通り、ＶＰ１６処理によりＨ２ＡＸの燐酸化が強化されたものの、これはアンチセンスＡＩＭ３の発現により阻害された。
ｃ．ＡＴＭ活性化に対するＡＩＭ３の効果分析
ＡＴＭの自己燐酸化に対するＡＩＭ３の効果を調べるため、本発明者等はＡＴＭ及びそのターゲットであるｐ５３とｃｈｋ２の燐酸化をウェスタンブロットで調査した。野生型マウス及びＡＩＭ３+/-マウスから分離した細胞に0.2μｇ／ｍｌアドリアマイシンを処理した。次に、抗燐酸セリンＡＴＭ抗体（anti-phospho-serine antibody of ATM）、抗ｐ５３抗体及び抗ｃｈｋ２の抗体をそれぞれ利用してウェスタンブロットを行った（Bakkenist and Kastan, Nature, 421: 499-506, 2003）。その結果、図９ｃに示した通り、野生型細胞ではＡＴＭ及びこれのターゲット蛋白質等の燐酸化がアドリアマイシン処理により、強化される反面、ＡＩＭ３+/-細胞では前記燐酸化が抑制された。
前記全ての結果はＡＩＭ３がＡＴＭ／ＡＴＲ及びこれらのターゲット蛋白質の活性化に必要であることを表した。
【０１０１】
〈実施例１０〉がんとＡＩＭ３の機能的関連性の確認
〈10-1〉ヒトのがん細胞株からＡＩＭ３の発現レベル測定
ａ．ＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒトのがんとＡＩＭ３の機能的関連性を確認するために、本発明者等は下記表４に記載された多様な種類のがん細胞株内で、ＡＩＭ３レベルをＲＴ−ＰＣＲで調査した。ＲＴ−ＰＣＲは前記実施例〈5-3〉と同様の方法により行った。
【表４】
2007534748.tif 000006
その結果、図１０ａに示した通り、試験された細胞株の内ＨＣＴ１１６、Ａ５４９及びＨ４６０細胞株よりＡＩＭ３の発現が低いものとして示された。より具体的には、活性型ｐ５３を含む細胞株（ｐ５３（＋）細胞：ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、及びＨ４６０）ではＡＩＭ３レベルが低い反面、活性型ｐ５３が不足した細胞（ｐ５３（−）細胞：ＳＷ４６０、Ｈ２３、Ｈ１５７、及びＫ−５６２）では正常であった。さらに、部分的に活性化されたｐ５３を含むＲａｊｉ細胞（Bhatia et al., FASEB J., 7: 951-956, 1993）ではＡＩＭ３がｐ５３（+）細胞とｐ５３（−）細胞間の中間レベルで発現された。前記結果からＡＩＭ３の発現レベルがｐ５３と機能的に関連していることが確認できた。さらに、前記結果はＡＩＭ３とｐ５３の中でいずれか一つだけが異常であっても細胞が変形することがあり、ＡＩＭ３とｐ５３が同一の信号伝達経路で作用する可能性を一層支持するものである。
さらに、前記表４の細胞株の内、肺がん細胞株のみを対象にＡＩＭ３の発現レベルをウェスタンブロットで比較した結果、前記ＲＴ−ＰＣＲ分析結果と一致する結果を得た（結果未図示）。
前記結果はＡＩＭ３の発現レベルが幾つかの細胞株で減少することを示唆する。
ｂ．ゲノミックＰＣＲ分析
幾つかの細胞株よりＡＩＭ３の発現レベルが低い原因を確認するために、本発明者等はＰＣＲ分析を利用してＡＩＭ３遺伝子のＤＮＡの量を比較した。Ｈ１５７、Ｈ４６０、ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、及びＤＵ１４５細胞株を対象に前記実施例〈2-2〉と同様の方法によりゲノミックＰＣＲ分析を行った。対照群としてアクチン遺伝子を利用した。
その結果、図１０ｂに示した通り、Ｈ４６０及びＡ５４９細胞株は他の細胞株よりもさらに少ない量のＡＩＭ３ ＤＮＡを含有していた。これは前記二つの細胞株より一つのＡＩＭ３対立因子が欠損されたことを意味する。
【０１０２】
〈10-2〉がん患者から分離された組織におけるＡＩＭ３及びｐ２１の発現レベル測定
次に、がん患者等から分離された組織よりＡＩＭ３及びｐ２１の発現レベルを調査した。９人の白血病患者（５人：急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）４人：慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の白血球細胞から全ＲＮＡを分離した。次に、前記実施例〈5-3〉と同様の方法によりＲＴ−ＰＣＲを行った。ｐ２１のためのＲＴ−ＰＣＲ分析では配列番号１６及び配列番号１７で示されるプライマーを利用した。
その結果、図１０ｃに示した通り、３人の患者の組織よりＡＩＭ３が低いレベルで発現されることが観察された。この場合にはｐ５３のターゲット遺伝子であるｐ２１の発現も強く抑制されることがわかった。これにより、ｐ５３の調節にＡＩＭ３が機能的に関与することを改めて確認することができた。
【０１０３】
〈10-3〉肝臓がん患者の正常組織とがん組織におけるＡＩＭ３発現レベル比較測定
固形腫瘍はその頻度が極めて低かったものの、ＡＩＭ３+/-マウスでも発見されたので、本発明者等は肝臓がん患者等から分離された正常組織とがん組織でＡＩＭ３のレベルをＲＴ−ＰＣＲ分析で比較した。この時、対照群としてアクチンの発現レベルを共に測定した。２５個の患者サンプルを分析した結果、１２個のサンプルからＡＩＭ３によりがんが特異的に減少されたことが観察された。代表的な８個のサンプルの結果を図１０ｄに示した。
前記全ての結果は低いレベルのＡＩＭ３発現が多様なヒトの細胞株及び患者組織と高頻度で関連していることを示唆する。さらに、前記結果はＡＩＭ３発現レベルを測定してがんを診断できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
以上に記述した通り、本発明ではＡＩＭ３が強力な腫瘍抑制因子として作用することを確認した。ＡＩＭ３蛋白質はＡＴＭ／ＡＴＲのＦＡＴドメインに結合してこれらを活性化させることにより、腫瘍抑制蛋白質であるｐ５３の発現を誘導する。従って、ＡＩＭ３蛋白質またはこれをコードする核酸はがん治療に有用である。さらに、抗がん剤開発のためのターゲット及び多様ながんの診断マーカーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１ａ】ＡＩＭ３遺伝子内に挿入された遺伝子トラップベクターを概略的に示す図面である。
【図１ｂ】遺伝子トラップベクターの挿入を確認するためにゲノミックＰＣＲ分析を行った結果を示す。      Ｍ：分子量マーカー      ＋／＋：野生型マウス      ＋／−：ＡＩＭ３異型接合性マウス
【図１ｃ】遺伝子トラップベクターの挿入を確認するためにサザンブロット分析を行った結果を示す。      ＋／＋：野生型マウス      ＋／−：ＡＩＭ３異型接合性マウス
【図１ｄ】野生型マウス（＋/＋）及びＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）の各器官でＡＩＭ３の発現レベルをウェスタンブロット分析で比較した結果を示す。
【図２ａ】ＡＩＭ３異型接合性マウスより分離した多様な組織と器官を免疫組織化学的染色で観察した結果を示す。
【図２ｂ】リンパ腫細胞が肝臓と肺臓に転移したことを示す抗Ｂ２２０モノクローナル抗体を利用して観察した写真である。
【図２ｃ】野生型マウス（＋/＋）及びＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）の月齢に伴う腫瘍の発生率を調査した結果を示す。      白色棒：検視された野生型マウスの数（＋/＋）      灰色棒：検視されたＡＩＭ３異型接合性マウスの数（＋/−）      黒色部分：腫瘍が発生したマウスの数（tumor＋）
【図３ａ】野生型マウス（＋/＋）及びＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）より分離した脾臓細胞及び胸腺細胞の細胞増殖率を調査するために細胞数を測定した結果を示す。
【図３ｂ】野生型マウス（＋/＋）及ＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）より分離した脾臓細胞の細胞周期を分析した結果を示す。
【図３ｃ】細胞周期の各段階でＡＩＭ３の発現レベルをウェスタンブロットで調査した結果を示す。
【図３ｄ】細胞周期に伴うＡＩＭ３の発現レベルをＦＡＣＳで調査した結果を示す。      左側のパネル：ＤＮＡ含量（Ｙ軸）とＡＩＭ３（Ｘ軸）の発現をＦＡＣＳで分析して細胞の密度を等高線で表示したものである。Ｓで表示された部分はＤＮＡ含量を基準にＤＮＡ合成段階の細胞であって、Ｇ１で表示された部分はＧ１／Ｇ０段階の細胞である。      右側のパネル：左側のパネルでＧ１とＳでそれぞれ表示された部分のＡＩＭ３の発現量をヒストグラムで表示したものであって、Ｘ軸はＡＩＭ３の発現量をＹ軸は細胞数を示す。
【図３ｅ】細胞の増殖条件に伴うＡＩＭ３の細胞内位置を調査した結果を示す。      ＳＦ：細胞を無血清培地で培養した場合、      ＣＭ：細胞を完全培地で培養した場合。
【図４ａ】アドリアマイシン（Ａｄｒ）処理によるＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）由来脾臓細胞のアポトーシス反応を野生型マウス（＋/＋）と比較して調査した流細胞分析結果を示す。      Ｍ１：アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性個体群
【図４ｂ】アドリアマイシン処理に伴う細胞成長停止において野生型マウスとＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）由来の細胞の反応を調査した流細胞分析結果を示す。縦軸はＧ１／Ｇ０段階細胞の数を示すものであって、数字はＧ１／Ｇ０段階細胞の割合である。
【図４ｃ】アドリアマイシン（Ａｄｒ）処理に伴うＡＩＭ３発現レベルの変化を処理時間によって調査したＲＴ−ＰＣＲ分析及びウェスタンブロット分析結果を示す。
【図４ｄ】ＵＶ照射の際、ＡＩＭの細胞内位置を免疫蛍光染色法で調査した結果を示す。
【図５ａ】野生型マウス（＋/＋）及びＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）より分離したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）の細胞増殖率をチミジン混合法で調査した結果を示すグラフである。
【図５ｂ】野生型マウス（＋/＋）及びＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）より分離した多様な組織から細胞の増殖率を抗Ｋｉ６７抗体（緑色）を利用した免疫蛍光染色法で観察した写真である。
【図５ｃ】ＡＩＭ３遺伝子を導入した細胞の増殖率をチミジン混合法で調査した結果を示すグラフである。      ＥＶ：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞、      ＡＩＭ３：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞。
【図６ａ】ｐ５３発現に対するＡＩＭ３の効果をＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）由来のマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）とＡＩＭ３発現ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞を対象として調査したウェスタンブロット分析結果を示す。      ＋／＋：野生型マウス、      ＋／−：ＡＩＭ３異型接合性マウス、      ＥＶ：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞、      ＡＩＭ３：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞。
【図６ｂ】ｐ２１ｐのｐ５３依存性転写に対するＡＩＭ３の効果を調査したＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。      −：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞、      ＋：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞。
【図６ｃ】ｐ２１ｐのｐ５３依存性転写に対するＡＩＭ３の効果をｐ２１プロモーターと融合したルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターを利用したルシフェラーゼ分析で調査した結果を示す。      ＥＶ：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞に何の処理も施していない場合、      ＥＶ＋Ａｄｒ：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞にアドリアマイシンを処理した場合、      ＡＩＭ３：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞に何の処理も施していない場合、      ＡＩＭ３＋Ａｄｒ：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞にアドリアマイシンを処理した場合。
【図６ｄ】野生型ＨＣＴ１１６細胞（ＷＴ）、ｐ５３遺伝子が欠損されたＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３-/-）、及びｐ２１遺伝子が欠損したＨＣＴ１１６細胞（ｐ２１-/-）の増殖に対するＡＩＭ３効果を示すグラフである。      ＥＶ：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞、      ＡＩＭ３：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞。
【図６ｅ】ＵＶ照射及びアドリアマイシン（Ａｄｒ）処理によるｐ５３の誘導に対するＡＩＭ３の効果を調査した結果を示す。      ＥＶ：アンチセンスＡＩＭ３（Ａｓ−ＡＩＭ３）を含まない空ベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞、      Ａｓ−ＡＩＭ３：アンチセンスＡＩＭ３（Ａｓ−ＡＩＭ３）を含むベクターで形質導入したＨＣＴ１１６細胞。
【図７ａ】ＡＩＭ３の抗増殖活性に対するカフェインの効果を調査した結果を示すグラフである。      ＥＶ：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞、      ＡＩＭ３：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞。
【図７ｂ】ＡＩＭ３により誘導されるアポトーシスに対するカフェインの効果を調査した結果を示す。
【図７ｃ】ｐ５３誘導に対するＡＩＭ３の効果を調べるためにＡＴＭの抑制剤であるカフェインを処理した後、ウェスタンブロット分析を行った結果を示す。      −：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞      ＋：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞
【図７ｄ】ｐ５３誘導に対するＡＩＭ３の効果を調べるためにＡＴＭの活性を特異的に阻害するＫＤ−ＡＴＭドメインを細胞に導入した後、ウェスタンブロット分析を行った結果を示す。      −：ＡＩＭ３遺伝子を含まない空ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞      ＋：ＡＩＭ３発現ベクターで形質導入させたＨＣＴ１１６細胞
【図８ａ】ＡＩＭ３とＡＴＭ間の相互作用を確認するために、ＵＶ及びアドリアマイシンを処理した後、共免疫沈澱法を行った結果を示す。
【図８ｂ】ＡＩＭ３とＡＴＭ間の直接的な相互作用を調べるために、試験管内プル−ダウン分析を行った結果を示す。
【図８ｃ】ＡＩＭ３とＡＴＲ間の相互作用を調べるためにＵＶ調査後、共免疫沈澱法を行った結果を示す。
【図９ａ】野生型マウス（＋/＋）及びＡＩＭ３異型接合性マウス（＋/−）から分離した脾臓細胞及び胸腺細胞でＡＴＭの基質であるＨ２ＡＸの燐酸化レベルを測定したウェスタンブロット結果を示す。      ｐ−Ｈ２ＡＸ：燐酸化されたＨ２ＡＸ。
【図９ｂ】ＡＴＭの基質であるＨ２ＡＸの燐酸化に対するＡＩＭ３の効果をアンチセンスＡＩＭ３（Ａｓ−ＡＩＭ３）を利用して分析したウェスタンブロット分析結果を示す。      −：アポトーシス誘導体であるＶＰ１６を処理しない場合、      ＋：アポトーシス誘導体であるＶＰ１６を処理した場合。
【図９ｃ】ＡＴＭ及びこれのターゲット蛋白質（ｐ５３，Ｃｈｋ２）の燐酸化に対するＡＩＭ３の効果を確認するために行ったウェスタンブロット分析結果を示す。      ｐ−ＡＴＭ：燐酸化したＡＴＭ、      ｐ−ｐ５３：燐酸化したｐ５３、      ｐ−Ｃｈｋ２：燐酸化したＣｈｋ２、      アクチン：対照群。
【図１０ａ】多様なヒトがん細胞株よりＡＩＭ３の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す。
【図１０ｂ】多様なヒトがん細胞株よりＡＩＭ３ ＤＮＡの量を調査するためにゲノミックＰＣＲを行った結果を示す。
【図１０ｃ】９人の白血病患者より得た組織からＡＩＭ３とｐ２１の発現レベルをウェスタンブロットで分析した結果を示す。      ＡＰＭＬ：急性前骨髄構成白血病、      ＣＭＬ：慢性骨髄性白血病。
【図１０ｄ】９人の肝臓がん患者から分離した正常組織とがん組織でＡＩＭ３の発現レベルを比較調査したＲＴ−ＰＣＲ分析した結果を示す。      Ｎ：腫瘍隣接部位の正常組織、      Ｔ：肝臓がん組織。
【図１ａ】
2007534748.tif 000007
【図１ｂ】
2007534748.tif 000008
【図１ｃ】
2007534748.tif 000009
【図１ｄ】
2007534748.tif 000010
【図２ａ】
2007534748.tif 000011
【図２ｂ】
2007534748.tif 000012
【図２ｃ】
2007534748.tif 000013
【図３ａ】
2007534748.tif 000014
【図３ｂ】
2007534748.tif 000015
【図３ｃ】
2007534748.tif 000016
【図３ｄ】
2007534748.tif 000017
【図３ｅ】
2007534748.tif 000018
【図４ａ】
2007534748.tif 000019
【図４ｂ】
2007534748.tif 000020
【図４ｃ】
2007534748.tif 000021
【図４ｄ】
2007534748.tif 000022
【図５ａ】
2007534748.tif 000023
【図５ｂ】
2007534748.tif 000024
【図５ｃ】
2007534748.tif 000025
【図６ａ】
2007534748.tif 000026
【図６ｂ】
2007534748.tif 000027
【図６ｃ】
2007534748.tif 000028
【図６ｄ】
2007534748.tif 000029
【図６ｅ】
2007534748.tif 000030
【図７ａ】
2007534748.tif 000031
【図７ｂ】
2007534748.tif 000032
【図７ｃ】
2007534748.tif 000033
【図７ｄ】
2007534748.tif 000034
【図８ａ】
2007534748.tif 000035
【図８ｂ】
2007534748.tif 000036
【図８ｃ】
2007534748.tif 000037
【図９ａ】
2007534748.tif 000038
【図９ｂ】
2007534748.tif 000039
【図９ｃ】
2007534748.tif 000040
【図１０ａ】
2007534748.tif 000041
【図１０ｂ】
2007534748.tif 000042
【図１０ｃ】
2007534748.tif 000043
【図１０ｄ】
2007534748.tif 000044
【配列表】
2007534748000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月9日(2007.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
ｐ５３のターゲット遺伝子が、ｐ２１、ＰＵＭＡ、ＧＡＤＤ４５、１４−３−３ｓｉｇｍａ、ＷＩＰ１、ｍｄｍ−２、ＥＧＦＲ、ＰＣＮＡ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣｙｃｌｉｎＧ、ＴＧＦα、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＦＡＳ１、Ｆａｓ／ＡＰＯ１、ＦＡＳＬ、ＩＧＦ−ＢＰ３、ＰＡＧ６０８、ＤＲ５／ＫＩＬＬＥＲ、ＧＭＬ、ｐ５３ＡＩＰ１、ｐ５３Ｒ２、Ｐ２ＸＭ、ＴＳＰ−１、ＢＡＬ１、ＣＳＲ、ＰＩＧ３、Ａｐａｆ−１、ｐ５３ＲＤＬ１、Ｓｔａｆ５０、ＣＤ２００、Ｓｎｋ／ＰＩｋ２、ＳＴＡＧ１、及びｐ５３ＲＦＰからなる群より選ばれる請求項５記載の方法。
【国際調査報告】
2007534748.tif 000045