(57)【要約】黄色ブドウ球菌株から由来する又は得られるサンプル核酸を型特定する方法であって、複数の核酸分子を含むアレイを用意すること、ここで前記複数の核酸分子は黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の第１の組から由来する、前記アレイを黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の第２の組から得られる又は由来する少なくとも２つの異なる参照核酸とハイブリダイゼーションすることによって、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを用意すること、ここで前記第２の組における黄色ブドウ球菌の前記株は少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づいて少なくとも２つのグループに分離可能である、外的基準のない多変量解析によって前記参照ハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化することによって、参照ハイブリダイゼーションパターンの少なくとも２つの異なるクラスタを作成すること、前記参照ハイブリダイゼーションパターンを用意するために使用されたのと同じアレイをサンプル核酸とハイブリダイゼーションして、サンプルハイブリダイゼーションパターンを得ること、そして、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、参照ハイブリダイゼーションパターンの前記少なくとも２つの異なるクラスタの１つに割り当てることを含む方法。【選択図】なし
2007534333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌株から由来する又は得られるサンプル核酸を型特定する方法であって、
複数の核酸分子を含むアレイを用意すること、ここで前記複数の核酸分子は黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の第１の組から由来する、
前記アレイを黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の第２の組から得られる又は由来する少なくとも２つの異なる参照核酸とハイブリダイゼーションすることによって、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを用意すること、ここで前記第２の組における黄色ブドウ球菌の前記株は少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づいて少なくとも２つのグループに分離可能である、
外的基準のない多変量解析によって前記参照ハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化することによって、参照ハイブリダイゼーションパターンの少なくとも２つの異なるクラスタを作成すること、
前記参照ハイブリダイゼーションパターンを用意するために使用されたのと同じアレイをサンプル核酸とハイブリダイゼーションして、サンプルハイブリダイゼーションパターンを得ること、そして、
前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、参照ハイブリダイゼーションパターンの前記少なくとも２つの異なるクラスタの１つに割り当てること
を含む方法。
【請求項２】
前記サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズが、約50〜5,000の間のヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の核酸分子における前記分子の平均サイズが、約200〜5,000の間のヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アレイが、黄色ブドウ球菌の前記少なくとも２つの異なる株の断片化されたゲノムＤＮＡのフラグメントから無作為に選択された約1,500〜5,000の間の核酸分子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル核酸が黄色ブドウ球菌の純粋培養から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の核酸分子が、黄色ブドウ球菌の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも８つの異なる株から得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０の異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを含む参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタと比較することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記表現型パラメータが前記株の伝染性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記比較が、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンと一緒の前記参照ハイブリダイゼーションパターンの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を含み、及びその値が前記参照ハイブリダイゼーションパターンについて知られているところの少なくとも１つの表現型パラメータ（該情報は、ＰＬＳ−ＤＡ分析を監督するために使用される）が、前記サンプル核酸又はそれが得られる起源についてさらに決定され又は推定される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析に基づきハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
本質的に全ての参照ハイブリダイゼーションパターンが、黄色ブドウ球菌株の核酸によって生成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記型特定が、前記サンプル核酸における黄色ブドウ球菌が、伝染性株から由来する株かどうかを決定することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の前記第２の組が前記第１の組からの株を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
パーツのキットであって、前記キットは、請求項１〜１３のいずれか一項に定義された少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターン又は参照核酸と一緒に、請求項１〜１３のいずれか一項に定義されたアレイの組み合わせを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌のための診断学の分野、より特には、黄色ブドウ球菌株を型特定する方法に基づくアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は入院患者の世話において主要な問題である。多くの種々の黄色ブドウ球菌株があり、そのうちの幾つかは広範囲の抗生物質に対して耐性である。多くの異なる黄色ブドウ球菌株があり、そのうちの幾つかは広範囲の抗生物質に対して耐性である。黄色ブドウ球菌の種々の株は、それらの伝染性に関して異なるように振る舞う。幾つかの株は患者から患者に迅速に蔓延し、一方他の株はそれを容易に蔓延しない。特定の株が早く蔓延する株（伝染性株）であるか又はそうでないかを迅速に決定することは以前に可能でなかった。従って、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に感染した患者に直面する病院は最も厳しいは感染者にこのように直面する病院は、最も厳格な隔離及び衛生規則を強化する以外ない。
【０００３】
アレイ技術は、生物学及び医学に関連付けられる様々な分野において重要な手法となっている。アレイの幾つかのタイプが、数年をかけて開発されてきている。小型化及びオートメーションの出現で、ますます多くの情報がアレイ内に入ってきている。アレイ技術における現在の傾向は、アレイ上にますます多くの情報を運ぶ、ずっと大きなアレイを生成することである。
【０００４】
アレイに基づく診断法では、ハイブリダイゼーションパターン、すなわちアレイ上の様々なスポットがサンプル核酸とハイブリダイゼーションするところの強度のパターンが、他のサンプル核酸のそれと比較されるべきであるところのデータを含む。慣用のアレイでは、１スポット当たりのヌクレオチドの数は好ましくは、経済性及び正確性の理由でできるだけ低く維持されている。
【０００５】
アレイ上に含まれるより高いレベルの情報は、核酸サンプルのより詳細な分析を提供するために、すなわち比較されるべきである２つのそのようなサンプル間の些細な差を可視化し又は明らかにするために主に使用される。例えば、ヒトの診断法において、アレイは、同じ疾病を有しているが、異なる予後を有している患者のグループを分類し、そしてその結果、予後におけるこの違いの原因である遺伝子を明らかにするために使用される。そのような実験は、発現アレイに基づいてほとんど行われる。なぜならば、ある遺伝子の発現のレベルのみが２つのグループの患者間を識別するために、すなわちそれらの間で十分な識別力を提供するために必要な解決を提供すると信じられている。
【０００６】
発現プロファイリングとして知られているこれらの診断方法において、アレイを調査するために使用される核酸（すなわち、発現されたｍＲＮＡ）が、複雑な核酸を提供する。特に、複雑な核酸がアレイを調査するために使用される場合、アレイ内のより多くの数のヌクレオチドの導入が今、他の困難性をもたらす。発現プロファイリングの状況において、多くの数のスポットは、スポットにおける核酸の全てが核酸を調査するためにハイブリダーゼーションされるとは限らないという事実を示す値０及び１の間のシグナルを有し、それは、関与する遺伝子の発現のレベルを決定し又は数値化するために使用される特徴である。
【０００７】
結局、異なるハイブリダイゼーションパターンを比較する際に、アレイのどのシグナルが分析に含められ及びどれが除かれるかの決定がされなければならない。通常、これは、あるスポットの強度における最も顕著な又は最大の変化を含める方向へ分析にバイアスをかけるために導入された切り捨て値に基づいて生じる。参照パターン、試験物質又はサンプル核酸を用いて生成されたパターンが比較されるところのパターンがこのプロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。先行技術の方法に関する問題は今、核酸の発現は有機体がいる状態を表わし、それは同じ有機体が状況に依存して異なる発現パターンを有しうることを意味するということである。従って、先行技術方法は、それら代謝状態に関係なく有機体の型特定を提供するためにあまり適していない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、そのような高い識別力を提供する参照ハイブリダイゼーションパターンを作成する方法であって、該方法が、サンプル核酸の型特定のあるレベル（驚くほどに詳述される）を可能にするところの方法を今見つけた。例えば、本発明者らは、異なる細菌株のサンプル核酸が伝染性としてそのような詳述された表現型パラメータの該レベルで型特定されることを可能にする型特定方法を今見つけた。一方、型特定それ自体は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づき生じる。そのような全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーション手法では、アレイ上の核酸分子及びサンプル核酸の両方が、（ランダム）ゲノムＤＮＡフラグメントからなる。黄色ブドウ球菌の株の間で、伝染性及び非伝染性のサブタイプ間で識別することがゲノムＤＮＡの組成に基づいて可能であろうことを当業者が予測しない以上、詳述のこのレベルが達成されることは驚くべきことである。
【０００９】
１つの観点では、本発明は、ＭＲＳＡ株が伝染性かそうでないかを迅速に決定することを可能にするところの手段及び方法を提供する。本発明はまた、特定の黄色ブドウ球菌株の他の特徴を決定するために適している。この目的のために、本発明は黄色ブドウ球菌の様々な株間で識別することが可能であり且つさらに重要なことにはアレイ上で生成されたハイブリダイゼーションパターンが既に以前に生成されたハイブリダイゼーションパターンと同一でない環境下でさえ、特定の黄色ブドウ球菌株の特徴を推定するための特定のアレイを提供する。
【００１０】
従って、１つの観点において、本発明は、黄色ブドウ球菌株から由来する又は得られるサンプル核酸を型特定する方法であって、
複数の核酸分子を含むアレイを用意すること、ここで前記複数の核酸分子は黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の第１の組から由来する、
前記アレイを黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株の第２の組から得られる又は由来する少なくとも２つの異なる参照核酸とハイブリダイゼーションすることによって、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを用意すること、ここで前記第２の組における黄色ブドウ球菌の前記株は少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づいて少なくとも２つのグループに分離可能である、
外的基準のない多変量解析（unsupervised multivariate analysis）によって前記参照ハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化することによって、参照ハイブリダイゼーションパターンの少なくとも２つの異なるクラスタを作成すること、
前記参照ハイブリダイゼーションパターンを用意するために使用されたのと同じアレイをサンプル核酸とハイブリダイゼーションして、サンプルハイブリダイゼーションパターンを得ること、そして、
前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、参照ハイブリダイゼーションパターンの前記少なくとも２つの異なるクラスタの１つに割り当てること
を含む方法を提供する。
【００１１】
１つの好ましい実施態様では、前記サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズが、約50〜5,000の間のヌクレオチドである。
【００１２】
他の好ましい実施態様では、前記複数の核酸分子における前記分子の平均サイズが、約200〜5,000の間のヌクレオチドである。
【００１３】
さらに他の好ましい実施態様では、該アレイが、黄色ブドウ球菌の前記少なくとも２つの異なる株の断片化されたゲノムＤＮＡのフラグメントから無作為に選択された約1,500〜5,000の間の核酸分子を含む。
【００１４】
さらに他の好ましい実施態様では、前記サンプル核酸が黄色ブドウ球菌の純粋培養から得られる。
【００１５】
さらに他の好ましい実施態様では、前記複数の核酸分子が、黄色ブドウ球菌の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも８つの異なる株から得られる。
【００１６】
さらに他の好ましい実施態様では、該方法が、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０の異なる参照ハイブリダイゼーションパターンと比較することを含む。
【００１７】
さらに他の好ましい実施態様では、前記表現型パラメータが前記株の伝染性である。
【００１８】
さらに他の好ましい実施態様では、該比較が、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンと一緒の前記参照ハイブリダイゼーションパターンの部分最小二乗法判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を含み、及びその値が前記参照ハイブリダイゼーションパターンについて知られているところの少なくとも１つの表現型パラメータ（該情報は、ＰＬＳ−ＤＡ分析を監督（supervise）するために使用される）が、前記サンプル核酸又はそれが由来する起源についてさらに決定され又は推定される。
【００１９】
さらに他の好ましい実施態様では、該方法は、外的基準のある（supervised）ＰＬＳ−ＤＡ分析に基づきハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化することをさらに含む。
【００２０】
さらに他の好ましい実施態様では、該方法は、クラスタにおける存在又は不存在に基づいて前記サンプル核酸を型特定することをさらに含む。
【００２１】
さらに他の好ましい実施態様では、本質的に全ての参照ハイブリダイゼーションパターンが、黄色ブドウ球菌株の核酸によって生成される。
【００２２】
さらに他の好ましい実施態様では、該型特定が、前記サンプル核酸における黄色ブドウ球菌が、伝染性株から由来するかどうかを決定することを含む。
【００２３】
他の観点では、本発明はパーツのキットであって、前記キットは、本明細書の上記に記載されるアレイの組み合わせを含み、前記キットは、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターン又は本明細書の上記に記載された黄色ブドウ球菌の株から由来の参照核酸を含むキットを提供する。
【００２４】
図１は、黄色ブドウ球菌株及びそれらの伝染性特徴のリストを示す。各ＭＲＳＡ株は、固有のＴＮＯ型集団番号（ＴＴＣ番号、第１カラム）によって識別される。各株は、RiboPrint分類によって黄色ブドウ球菌株として特徴付けられた（第２カラム）。伝染性特徴が、日常の病院実務から決定された（第３カラム）。
【００２５】
図２は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、ＭＲＳＡ株の伝染性のためのクラスタ化を示す。１９個の異なるＭＲＳＡ株のCy-ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、黄色ブドウ球菌ゲノムの表現を含むアレイとハイブリダイゼーションされた。黄色ブドウ球菌株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを示す）は、各ＭＲＳＡ株の既知の伝染性特徴に基づき、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いて解析された。下のＰＬＳ−ＤＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す（テキストを伴う小円は図１における株TTC.03番号を示す）。２回ハイブリダイゼーションされた株は、太字テキストで示される。データセットの特定部分に基づき、ＰＬＳ−ＤＡ分析は、株の既知の伝染性に従い、２つの別々のクラスタ（手動で置かれた楕円、E=伝染性及びN=非伝染性を示す）における株をクラスタ化しうる。注：Cy5/Cy3比は、切り捨て0.5によって０及び１データセットに変換された。ＰＬＳ−ＤＡスケーリングは、平均中央である。非伝染性株”236”は、ＰＬＳ−ＤＡによってE-及びN-クラスタ間内に置かれた。データセットの番号は、図１において示される株番号をいう。
【００２６】
図３は、部分最小二乗法（ＰＬＳ）分析方法の項における、本明細書の下記に記載されたモデル複雑性の観点を強調する。
【００２７】
図４は、主成分判別分析（ＰＣ−ＤＡ）の項における、本明細書の下記に記載された判別分析の観点を示す。この図において、Ｄは判別式軸であり、Ｐは投射線であり、Ｘ１及びＸ２は２つの変数であり、及びｘ及びｏは２つの異なるグループからのサンプルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
サンプル核酸と参照核酸との間の遺伝子比較と一緒に（例えば、同時に、前に又は後に）、少なくとも１つの表現型パラメータ（例えば伝染性）が参照核酸の各起源について決定されること、従って該表現型パラメータがデータの統計的分類において使用されることが本発明の特徴である。
【００２９】
本発明は、一般にサンプル核酸を分類するためにディファレンシャルハイブリダイゼーションを使用し、そして有機体を分類するために全ゲノムディファレンシャルハイブリダイゼーションを特に使用する。１つの実施態様において本発明は、臨床的に関連する特徴（例えば、抗生物質耐性、伝染性、毒性、病原性など）に従い黄色ブドウ球菌の「新しい」株を分類するために黄色ブドウ球菌の異なる株のプールから複数のランダムゲノムＤＮＡフラグメントのアレイを用いる方法に関する。
【００３０】
従って、本発明は、黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株が、関心のある少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づき少なくとも２つのグループに分けられなければならいことを規定する場合に、本発明の方法は、好ましい実施態様において、伝染性及び非伝染性サブタイプの間での識別を可能にする。
【００３１】
少なくとも１つの表現型特徴についての情報を黄色ブドウ球菌の参照株に提供する追加的ステップが、本発明の１つの観点において、黄色ブドウ球菌の異なる株からなるグループからの例えばゲノムＤＮＡフラグメントの非特異的集団を使用して、例えば該グループ内又は外の未知のメンバーのｇＤＮＡとともに得られるハイブリダイゼーションパターンを類似性に従いクラスタ化しそして分類する方法、及び少なくとも１つの表現型特徴に基づきそれらのクラスタをさらに識別し又は分離しうる方法を提供する。
【００３２】
語  非特異的は、意識的に使用される。なぜならば、本発明のアレイは、アレイ上にスポットされた黄色ブドウ球菌の異なる株のそれに関連する黄色ブドウ球菌の株の核酸の分析のために必ずして適していない分析ツールを提供するが、アレイ上の核酸から分類学的に除去される又は関係しないゲノムの分析を可能にするための基本的に十分な識別力を提供するからである。さらに、アレイの複数の核酸分子のための核酸を、サンプル核酸が非常に関連するように（すなわち、そのハイブリダイゼーションは参照パターン間で又はとともにクラスタ化される）選択する際に、最良の結果及び最高の識別力が達成される。
【００３３】
アレイ上の複数の核酸分子は、黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株から得られ、好ましくは該複数の核酸分子は、黄色ブドウ球菌の少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも５つ、そしてさらにより好ましくは少なくとも８つの異なる株から得られる。
【００３４】
アレイ核酸分子は、典型的に、黄色ブドウ球菌の株の（通常、一重鎖）ゲノムＤＮＡフラグメントである。
【００３５】
本発明の方法において、参照ハイブリダイゼーションパターンの作成のために使用される黄色ブドウ球菌の異なる株は、表現型特徴又はパラメータ（本明細書では、関心のある少なくとも１つの表現型パラメータの値とも名付けられる）に基づき少なくとも２つのグループ内に分離できる。語「値」は、量的な及び質的な値の両方を含む。従って、例えば、アレイは黄色ブドウ球菌の伝染性株からのゲノムＤＮＡフラグメント並びに非伝染性株からのゲノムＤＮＡフラグメントを含む。この方法は、黄色ブドウ球菌の異なる株の迅速な且つ正確な型特定のために結局のところ適していることが今見つけられた。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の場合、非伝染の株から伝染の株を区別することがさらに可能である。
【００３６】
それ故に、本発明の特に好ましい観点では、黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株から得られる又は由来する核酸が、参照ハイブリダイゼーションパターンを生成するために使用される。好ましくは、少なくとも５以上、より好ましくは少なくとも５０の参照ハイブリダイゼーションパターンが、異なる黄色ブドウ球菌株から得られる又は由来する核酸によって生成される。特に好ましい実施態様では、本質的に全ての参照ハイブリダイゼーションパターンが、黄色ブドウ球菌株の核酸によって生成される。
【００３７】
この特に好ましい実施態様は好ましくは、参照及びサンプルハイブリダイゼーションパターンを比較するために統計解析と組み合わされる。このように、黄色ブドウ球菌株が、黄色ブドウ球菌の全てではないが幾つかの株の或る表現型特徴又は遺伝子型の関連性を含む可能性を決定することが可能である。該核酸はＲＮＡから得られうるが、好ましくはＤＮＡから由来する又は得られる（すなわちゲノムから得られる）。従って、本発明の好ましい実施態様では、核酸分子はＤＮＡから得られる。
【００３８】
参照ハイブリダイゼーションパターンは、本発明のアレイを参照有機体とハイブリダイゼーションすることによって典型的に得られ、典型的に黄色ブドウ球菌の１つの株は、１つの参照ハイブリダイゼーションパターンを生じる。もちろん、株間の関係を決定するために、該少なくとも２つの異なる参照核酸及びサンプル核酸が、黄色ブドウ球菌の異なる株から得られる。１つの実施態様において、本発明は、黄色ブドウ球菌の株を分類する方法であって、黄色ブドウ球菌の試験株のＤＮＡを無作為に選択された多くのゲノムＤＮＡフラグメントを含む本発明のＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションすることを含み、該ゲノムＤＮＡフラグメントは、前記参照有機体間で試験有機体のゲノムＤＮＡを分類するために、黄色ブドウ球菌の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも８つの異なる株の混合物から得られるところの方法に関する。
【００３９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡアレイは、約1,000〜約10,000、好ましくは約1,500〜約5,000、最も好ましくは約1,800〜約2,400、さらにより好ましくは約1,900〜約2,200の無作為に選ばれたゲノムＤＮＡフラグメントを含む。
【００４０】
好ましい実施態様では、無作為に選ばれたゲノムＤＮＡフラグメントは、約500〜約5,000、より好ましくは約1,000〜約2,000、より好ましくは約1,300〜約1,800、より好ましくは約1,400〜約1,600ヌクレオチドの長さを有する。従って、最も好ましい実施態様では、本発明の方法において使用されるＤＮＡアレイは、約３メガ塩基を含む。
【００４１】
他の実施態様では、本発明は、微生物を分類する方法に関する。該方法は、多くの数（約1,000〜約10,000、好ましくは約1,500〜約5,000、最も好ましくは約1,800〜約2,400、さらにより好ましくは約1,900〜約2,200）の無作為に選択されたゲノムＤＮＡフラグメント（好ましくは、約500〜約5,000、より好ましくは約1,000〜約2,000、より好ましくは約1,300〜約1,800、より好ましくは約1,400〜約1,600ヌクレオチドの長さを有する）を含むＤＮＡアレイを使用し、該ゲノムＤＮＡフラグメントは、微生物のゲノムＤＮＡを分類するために、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、例えば５、６又は７、さらにより好ましくは少なくとも８つの異なる微生物の混合物から得られる。該混合物は、黄色ブドウ球菌の異なる株のｇＤＮＡプールを適切に表しうる。
【００４２】
本発明の方法は好ましくは、ハイブリダイゼーションによって、黄色ブドウ球菌の他の株における比較の（すなわち相補的な）ＤＮＡ領域の存在又は不存在を調査する又は決定するために全ゲノムアレイを使用する。先行技術方法と対照的に、本発明は好ましくは、アレイ上の核酸分子として所謂オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）プローブを使用しない。そのようなプローブは、特定の遺伝子のフラグメント、又は黄色ブドウ球菌のｇＤＮＡフラグメントから得られ、そしてそれのみを検出する。代わりに、本発明は好ましくは、二重鎖ｇＤＮＡフラグメントを得るために、消化されたゲノムＤＮＡを使用し、次に該フラグメントは好ましくは、本発明のアレイの構築のために適切な複数の核酸分子において形成されうる一重鎖ランダムｇＤＮＡプローブとして役立つために変性される。黄色ブドウ球菌ＤＮＡを型特定するための本発明の方法の他の好ましい実施態様では、先行技術方法を超える更なる改良が、様々な及び異なる株の黄色ブドウ球菌のｇＤＮＡプールから得られるランダムゲノムＤＮＡフラグメントのアレイを提供することによって実現される。単一の実験又はアッセイを用いて、該関係が、試験有機体と、定義された表現型特徴を有する参照有機体のグループとの間で確立されうることが、有利点を有する。
【００４３】
本発明は、黄色ブドウ球菌における多重遺伝子特徴の研究を今、結局のところ可能にする。従って、本明細書で記載された手法は、黄色ブドウ球菌の（例えば、それらの遺伝的基礎にかかわらず試験有機体の抗生物質耐性のような）表現型特徴の分類の取り込みを支援し又は可能にする。従って、本方法を黄色ブドウ球菌の分類に適用し、且つ前記黄色ブドウ球菌株のための少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータ（例えば、抗生物質耐性又は伝染性）を含む場合、それは、２つの間の任意の原因となる関係に関係なく、株を分類する遺伝的特徴のみだけでなく、その株の組み合わされた遺伝的及び表現型特徴である。
【００４４】
アレイ上に存在する配列の詳細な知識を有することは必要でない。本発明において、パターンが互いに比較される。
【００４５】
少なくとも２つの異なる黄色ブドウ球菌株のゲノム幅表現を含むアレイを構築するために、少なくとも２つの株の混合されたゲノムライブラリーが前記少なくとも２つの株のｇＤＮＡを混合することによって作成されうる。好ましくは、株は、表現型パラメータ（例えば、抗生物質の広いセットに対する耐性の異なるプロファイル、好ましくは抗生物質耐性のほとんどの型を一緒にカバーする）の異なる値を夫々示す株が選択される。好ましくは、有機体は、それらの単離されたｇＤＮＡのアガロースゲル分析において有意なプラスミドバンドを含まない。次に、該ｇＤＮＡ混合物は断片化されることができ（例えば、音波処理によってばらばらにされる）、そして該フラグメントは例えばアガロースゲルにおいて分離されうる。次に、適切なサイズ（好ましくは、約1〜3kb）のＤＮＡフラグメントが、（例えば、ゲルから切除され、そして固体担体（例えば、ガラスミルク）への結合によって）単離されうる。ｇＤＮＡフラグメントの適切な数はgＤＮＡ混合物から無作為に回収され、そしてこの数は、約1,000〜約10,000、好ましくは約1,500〜約5,000、最も好ましくは約1,800〜約2,400、さらにより好ましくは約1,900〜約2,200の無作為に選択されたゲノムＤＮＡフラグメントの範囲でありうる。多数の株のｇＤＮＡ混合物の効果は、そこからＤＮＡフラグメントを単離すると、様々な株からのフラグメントのランダムプールが得られ、それは該アレイを構築するために使用されるということである。
【００４６】
無作為に選択された単離されたフラグメントは好ましくは、材料の適切な在庫を用意するためにさらに増加される。フラグメントの増加は例えば、下記実施例１に記載されたように、クローニング及び核酸増幅技術の組み合わせによって実行されうる。次に、二重鎖ｇＤＮＡフラグメントは、例えばＰＣＲ増幅反応（ここで、プライマーの１つ又は両方は、Ｃ６−リンカーを介して該プライマーの５’末端に結合された遊離のNH2基を含む）を実行することによって、アレイ表面上にそれらを固定化することを可能にするために末端修飾されうる。
【００４７】
次に、無作為に選択された単離された及び任意的に増幅されたgＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡマイクロアレイを提供するために、表面上にスポットされうる。フラグメントのカップリングを容易にするためにアレイの表面（例えばスライド、その表面は、なかんずくガラス、金などでありうる）が修飾されうる。スポッティングは、利用可能な任意の方法によって、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）マイクロアレイプリンティングを使用することによって生じうる。該フラグメントのスポッティング後、該スライス表面は、核酸の更なる付着を防ぐために、例えばホルムアルデヒド修飾されたガラススライド表面の場合、ボロ無水物（boro-anhydride）での処理によって、ブロックされうる。
【００４８】
個々の株の元のｇＤＮＡ材料の一部は、アレイとハイブリダイゼーションされうる材料を提供するために、すなわち参照核酸を提供するために使用される。成功したハイブリダイゼーションの検知を容易にするために、該ｇＤＮＡは、好ましくは蛍光的に（例えば、Ｃｙ（商標）ラベル[Amersham Pharmacia Biotech]を使用することによって）、適切にラベル付けされる。蛍光ラベル付けキットは、様々な製造者から商業的に入手可能である。
【００４９】
サンプル核酸の平均サイズは、アレイ上でのシグナル分布に対する影響を有する。より大きいサンプル分子はより大きい情報を含み、従って、スポットのより多くにおいて適切なハイブリダイゼーションパートナーを見つける可能性がありそうである。サンプル核酸の平均サイズを減少することは、この現象を減少しうる。他方、サンプル核酸があまりにも小さい場合、サンプルにおける核酸フラグメントは、あまりにも小さな遺伝子情報を含み及びまた多くのスポットにおいて適切なハイブリダイゼーションパートナーを見つける。サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズは好ましくは、約50〜5,000の間のヌクレオチドである。より好ましくは、サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズは、約50〜1,000の間のヌクレオチド、より好ましくは約50〜500の間のヌクレオチドのサイズを含む。
【００５０】
サンプル核酸は好ましくは、全サンプルゲノムを表わす。アレイ上のサンプル核酸を用いて得られたハイブリダイゼーションパターンは、参照ハイブリダイゼーションパターンと比較される。参照ハイブリダイゼーションパターンは、例えば参照サンプルの核酸組成の知識（例えば、黄色ブドウ球菌株のゲノム配列が知られているところの黄色ブドウ球菌株のゲノム配列）を使用することを介して人工的に生成されうる。しかしながら、好ましい実施態様では、参照ハイブリダイゼーションパターンは、参照核酸をアレイとハイブリダイゼーションすることによって生成される。サンプルハイブリダイゼーションパターンの該参照との比較は、サンプル核酸が参照核酸と同じ又は類似であるかどうかを決定するために少なくとも使用されうる。当業者が例えばサンプル核酸が特定の黄色ブドウ球菌株を含むかどうかを決定するために必要とされる場合に、これは有用である。この設定では、参照ハイブリダイゼーションパターンは特定の黄色ブドウ球菌株の核酸を用いて生成され、及びサンプルハイブリダイゼーションパターンが参照ハイブリダイゼーションパターンと基本的に同じである場合に、該サンプルは特定の黄色ブドウ球菌株を含むとして識別される。好ましい実施態様では、本発明の方法は、サンプルハイブリダイゼーションパターンを少なくとも１つの他の参照ハイブリダイゼーションパターンと比較することをさらに含む。このように、該サンプルは、少なくとも２つの異なる参照核酸と比較されうる。もちろん、アレイの継続的使用をすると、ますます多くの黄色ブドウ球菌ハイブリダイゼーションパターンが生成され、そしてこれらの全ては、サンプル核酸と比較するために使用されうる。したがって、一旦ハイブリダイゼーションパターンがサンプル核酸を用いて生成されれば、このハイブリダイゼーションパターンは後の実験において、参照ハイブリダイゼーションパターンとして使用されうる。従って、好ましい実施態様では、本発明の方法は、ハイブリダイゼーションパターンを、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、そしてより好ましくは少なくとも５０の参照ハイブリダイゼーションパターン、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００の参照ハイブリダイゼーションパターンと比較することをさらに含む。
【００５１】
サンプルハイブリダイゼーションパターン及び参照ハイブリダイゼーションパターンは、アレイから得られたシグナルのサブセットでありうる。ハイブリダイゼーションパターンは1つのシグナルからなりうる；好ましくは、該ハイブリダイゼーションパターンは、アレイへの下記ハイブリダイゼーションから得られたシグナルの少なくとも２０％からなる。より好ましくは、該ハイブリダイゼーションパターンは、アレイからのシグナルの少なくとも５０％からなる。特に好ましい実施態様では、該ハイブリダイゼーションパターンは、アレイのシグナルの少なくとも８０％を含む。
【００５２】
本発明の方法は、黄色ブドウ球菌サンプル核酸が特定の黄色ブドウ球菌参照核酸と同じであるかどうかを決定するためにのみ使用されえない。サンプルハイブリダイゼーションパターンは、任意の参照ハイブリダイゼーションパターンとたまたま異なりうる。本発明の方法及びアレイの特に有用な特徴は、またこの場合、本発明の方法が有用な情報を提供しうるということである。サンプル核酸がそれから由来する又は得られるところの黄色ブドウ球菌株と関連付けられる表現型特徴は、多数の異なる配列及び／又は遺伝子の相互作用の結果で非常にしばしばありうる。これらの状況において、１以上のスポットにおいて得られたシグナルに基づいて特定のサンプルを型特定することは可能でない。それどころか、非常に多くの異なるスポットのシグナルが比較される必要がある。本発明の方法及びアレイは、この種の分析のために特に適している。この目的のために、参照ハイブリダイゼーションパターン及びサンプルハイブリダイゼーションパターンが、統計ソフトウェアを使用して解析される。１つの実施態様では、本発明の方法は、黄色ブドウ球菌サンプル核酸によって生成されたパターンと一緒に、黄色ブドウ球菌参照ハイブリダイゼーションパターンの外的基準のない多変量解析（例えば、主成分分析、ＰＣＡ）をさらに含む。この解析に基づいて、ハイブリダイゼーションパターンがｎ次元値（ｎは、２と解析に含まれるデータポイントの総数との間を表す）を与えられ、それはその好ましくは２の基本的な成分に減少されることができる。これら成分は、多次元視覚化において、好ましくは２次元視覚化において視覚化されうる。成分の該次元値は全てのハイブリダイゼーションパターンのためにプロットされることができ、それは、ハイブリダイゼーションパターンの好ましくは２次元値のグループ化又はクラスタ化が調べられうるとところの解析に含まれる。好ましい実施態様では、サンプルハイブリダイゼーションパターンの二次元値は、参照ハイブリダイゼーションパターンの全ての二次元値と比較される。このように、該含まれる参照と比較して、サンプル核酸がそれから得られる又は由来する黄色ブドウ球菌株の関連性の統計的推定を提供することが可能である。
【００５３】
好ましい実施態様では、参照ハイブリダイゼーションパターンの二次元値がクラスタ化される。このクラスタリングは好ましくは、関連性に基づいて行われる。この型特定は典型的に、分類についての誤差の統計的マージン、すなわちサンプル核酸が参照株の特定の（クラスタ）に関連付けられているとして間違って分類される機会に関連付けられている。従って、本発明の方法は好ましくは、クラスタにおける存在又は不存在に基づき前記サンプル核酸を生成するために使用される黄色ブドウ球菌の関係を型特定することをさらに含む。
本発明の方法は好ましくは、クラスタにおける存在又は不存在に基づき前記サンプル核酸を型特定することをさらに含む。
【００５４】
語「クラスタ化」は、同じ又は類似の特徴をクラスタ又はクラスタ項目内に集めること（collecting）、結集すること（assembling）、又は結合すること（uniting）の活動をいい、「クラスタ」は、集められた又は互いに近くで生じる同じ又は類似の項目のグループ又は数をいう。「クラスタ化された」は、項目がクラスタ化に付されたことを示す。本発明の方法において使用されるクラスタ化の過程は、測定可能なパラメータからのデータを通じて、手によって又は眼によって又は特徴、属性、特性、質、効果などにおける類似性のための項目を比較するために知られた何らかの（数学的）過程によって行われうる。統計解析が使用されうる。
【００５５】
主成分分析（ＰＣＡ）は、選択されたスケーリング方法として平均中央を用いて実行されうる。同等の結果が、他のスケーリング方法を使用して得られうる。好ましい実施態様では平均中央スケーリング方法が使用された。主成分分析の概要について、Joliffe IT. 1986年. Principal Component Analysis. New York: Springer-Verlagが参照される。
【００５６】
ハイブリダイゼーションパターンが参照及び／又はサンプル核酸がそこから得られる又は由来するところの黄色ブドウ球菌株上のさらなる情報を用いて拡張されることが本発明の特徴である。例えば、ハイブリダイゼーションパターンは、核酸ハイブリダイゼーションと異なる方法において決定されるパラメータを用いて拡張されうる。黄色ブドウ球菌株について、該株の抗生物質耐性表現型を知ることはしばしば重要である。この耐性パラメータは、統計解析に追加されうる。このパラメータの値（耐性若しくは感受性、又は更なる微調整）は、該ハイブリダイゼーションパターンに又は該ハイブリダイゼーションパターンの統計解析に追加されうる。引き続き、クラスタ化はこの追加のパラメータに基づきうる。従って、本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つの非核酸に基づくパラメータが、参照ハイブリダイゼーションパターンの起源であった有機体について決定される。引き続き、統計解析が、サンプル核酸の起源であった黄色ブドウ球菌のこのパラメータの値を決定するために又は推定するためにに使用されうる。この実施態様では、本発明の方法は、サンプル核酸によって生成されたハイブリダイゼーションパターンと一緒に参照ハイブリダイゼーションパターンの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）をさらに含み、その値が参照ハイブリダイゼーションパターンについて知られていることろの少なくとも１つのパラメータがＰＬＳ−ＤＡ分析を監督するために使用される。
【００５７】
部分最小二乗法（ＰＬＳ）
部分最小二乗法（ＰＬＳ）は、文献（P. Geladi and B. R. Kowalski, Partial Least Squares Regression: A Tutorial, Analytica Chimica Acta, 第185巻, 1986年, 第1-17頁、H. Martens and T. Naes, Multivariate Calibration, John Wiley & Sons, Chichester, 1989年）において広く記載されている。主成分分析（ＰＣＡ）モデルは記述的性質を有する一方、ＰＬＳモデルは予測的性質を有する。ＰＬＳでは、スコア×ローディング対（潜在的変数（ＬＶ）とも呼ばれる）が予測するデータセットにおいて、説明された変数を最大化するためだけでなく、予測されるべきデータを有する共分散を最大化するためにまた計算されない。ＰＬＳモデルは、式（１）及び式（２）によって数学的に要約されうる。
【００５８】
2007534333.tif 000003
2007534333.tif 000004
【００５９】
行列Ｘ（Ｘ−ブロックとも呼ばれる）は独立変数のｎ×ｐ行列（例えば、クロマトグラムあたりのｐリテンション時間を有するｎクロマトグラム）を表し、行列Ｙ（Ｙ−ブロックとも呼ばれる）は従属変数（例えば、濃度）を含むｎ×ｑマトリックスであり；ＰＴ及びＱＴは、夫々従属及び独立変数ローディングを含む、Ｓ×ｐ及びＳ×ｑ転置行列であり；Ｔは、Ｓ潜在スコアのｎ×Ｓ行列であり、ＢはＹ−データのスコア上でＸ行列のスコアの回帰を表すＳ×Ｓ行列であり；Ｅ及びＦは、夫々独立及び従属変数の残余を含むｎ×ｐ及びｎ×ｑ行列である。
【００６０】
Ａ  ＬＶを抽出後、標準誤差（ＳＥＶ）が、式（３）から計算される。
【００６１】
2007534333.tif 000005
ここで、Ｉｃは検量サンプルの数であり、yi,jはオブジェクトiにおける成分ｊの濃度の真の値であり；Yj,iはyijのＰＬＳ予測値であり；qはＹ−変数の数である。ＬＶの抽出は、ＳＥＶが有意に改善される限り続けられる。
【００６２】
選択されたＬＶの数は、関心のある変数の最適な予測を生じなければならない。しかしながら、変数と偏り（又は適合）との間のペイオフがある：あまりにも複雑なモデルは十分に適合するが、非常に貧弱に予測しうる。これは、最適なモデル複雑性の概念をもたらす：適合と変数との間の最適なバランスが得られる。これは図３において図解で示され、該モデルの増加された複雑性がデータにおけるより多くの特徴を適合しうるが、推定されたパラメータの変数が上昇し、そして全結果が最適なモデル複雑性で最小値を達成する。
【００６３】
ＸとＹとの間の純粋な線形関係は、通常２〜５のＬＶを有する単純なモデルをもたらすだろう。複雑な非線形の関係がまた、モデル化されうる。しかしながら、これらは、ＹをＸに関連付けるために有意により多くのＬＶを取り上げるだろう。
【００６４】
部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）
ＰＬＳ−ＤＡにおいて、クラス（予め定められたグループ）は、従属変数として使用される。Ｙ−ブロックＹは、クラスのn×数の行列である。Ｙ−ブロックは、０及び１で満たされる。
【００６５】
例:
2007534333.tif 000006
【００６６】
各サンプルがＰＬＳに属するクラス上に依存する０及び１で満たされるＰＬＳにおけるＹ−ブロックを使用することは、ＰＬＳを判別分析に変える。
【００６７】
主成分判別分析（ＰＣ−ＤＡ）
関心がサンプルのグループ間の相違に合わされた場合、判別分析（ＤＡ） [D. L. Massart, B.G.M. Vandeginste, L. M.C. Buydens, S.De Jong, P. J. Lewi and J. Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part A, Elsevier, Amsterdam, 1997年; B.G.M. Vandeginste, D.L. Massart, L.M.C. Buydens, S. De Jong, P.J. Lewi and J. Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part B, Elsevier, Amsterdam, 1998年]が適用される。該技術は、同じグループのサンプルが他のグループのサンプルと比較して、より類似しているという仮定に基づく。ＤＡの目的は、グループ手段において大きな違いを示す元のデータにおける構造を見つけ且つ識別することである。このプロセスは、そのサンプルが類似するところの演繹的な知識を含む。それ故に、ＤＡは外的基準のある（supervised）分析技術であるといわれる。これは、それを、サンプルについて演繹的な知識を要求しない他の外的基準のない技術（例えば、主成分分析（ＰＣＡ））と区別する。
【００６８】
ＤＡにおける第一歩は、これらの新しい変数の最小数によって測られたスペースにおける元のサンプルの投射がグループ手段間の相違を最大化するように、元の変数を相互に独立した新しい変数のセットに結合することである。この原理は図４において示される。サンプルの２つのグループが、２つの変数Ｘ１及びＸ２で測定される。主成分（ＰＣ）最大分散基準を使用して、これらのサンプルが、図４において線Ｐによって示されるサンプルを介して線上に投射されるべきである。サンプルの異なるクラスタ間を区別するために、これは最適な解決法でない。しかしながら、線Ｄ上のサンプルの投射は、２つのクラスタ間の完全な分離を示す。計算された係数は、判別式軸すなわちＤ軸と呼ばれる。他のすべての投射は、サブの最適な解決法を与える。これは、Ｄ線上のサンプルの投射をＸ１又はＸ２軸上のそれと比較することによって、図４において示される。
【００６９】
ＤＡは、サンプルのグループ間の相違を最も効率的に記述する。しかしながら、変数の数は、サンプルの数と比較してしばしば大きい。これは、解決法を悪化させることを生じうる。例えば、３つのサンプルは、それらの類似性の独立した２つの変数によって常に分離されうる。より多くのサンプルが含まれる場合、この悪化効果は消えるだろう。一般的な経験則は、サンプルの数が変数の数の少なくとも４倍であるべきということである。例えば、この規則は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルの試験において問題をもたらしうる。天然物の分析では、ＮＭＲスペクトル当たりのピークの数（変数）が、ほぼ数百程度で一般にある。正常な環境下で、これは、当業者が少なくとも400〜800のサンプルを測定すべきであることを意味するだろう。実際上、これは決して生じない。これに基づき、天然物のＮＭＲスペクトル上でＤＡを行なうことが不可能であろう。しかしながら、この問題に対する解決法がある。Hoogerbrugge等[R. Hoogerbrugge, S. J. Willig and P.G. Kistemaker, Discriminant Analysis by Double Stage Principal Component Analysis, Analytical Chemistry, 第55巻, 1983年, 第1710-1712頁]は、変数の数が最初にＰＣＡ、次に第１ＰＣ軸上のサンプルのスコア上のＤＡによって減少されるところのスキームを開発した。この技術は、主成分判別分析（ＰＣ−ＤＡ）と呼ばれる。含めるべきＰＣの正確な数を決定することは困難である。該数は、あまりにも小さくないべきである。なぜならば、最初の少数だけを含むことは、多くのグループ間情報の損失を生じうるからである。該数はまた、あまりにも大きすぎないべきである。なぜならば、それは、４によって割られたサンプルの数の規則を超過するだろう。それ故に、４で割られたサンプルの数の最大まで有意な量の分散（例えば、元の分散の１％より上である）を説明する全てのＰＣを含むことが望ましく見える。これらＰＣによって説明された分散の総量が非常に低い場合、次に該数は常に増加されうる。しかしながら、説明された分散が低い場合、元の分散間の相関性がまた低いだろう。結果として、ＤＡが元の問題と同様に複雑である結果を生成するだろう。
【００７０】
ＰＬＳ−ＤＡ分析において使用されるパラメータは好ましくは、表現型パラメータである。語「表現型パラメータ」は、黄色ブドウ球菌又はその機能的部分によって示される又は発現される何らかの特性を記述する任意のパラメータを定義するために本明細書において使用される。この分析に基づき、ハイブリダイゼーションパターンが、好ましくは２次元視覚化において表現型パラメータとの最適な相関のためのその（好ましくは２つの）主要成分に減少されうるｎ次元値（ｎは２と分析において含まれるデータポイントを識別するための総数とのあいだの値を表す）を与えられる。ハイブリダイゼーションパターンの好ましくは２次元値のグループ化又はクラスタ化が調べられうると、この好ましい二次元値が、全てのハイブリダイゼーションパターンについてプロットされうる。好ましい実施態様では、サンプルハイブリダイゼーションパターンの二次元値は、参照ハイブリダイゼーションパターンの全ての二次元値と比較される。このように、サンプル核酸が得られる又は由来する黄色ブドウ球菌株が或る表現型特徴を含むかどうかという可能性の統計的推定を提供することを可能にする。この表現型パラメータは、参照核酸がそれから得られる又は由来するところの黄色ブドウ球菌株について知られていることを、これは勿論必要とする。好ましい実施態様では、参照ハイブリダイゼーションパターンの二次元値が、外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析に基づきクラスタ化される。
【００７１】
クラスタ化は好ましくは、サンプルハイブリダイゼーションパターンがそのために調査される表現型パラメータに基づいて行われる。クラスタ化は好ましくは２つのクラスタをもたらし、１つのクラスタはある表現型を有し及び他は有していず、違うようにいうと、２つの異なる参照核酸の起源は、１つの表現型パラメータの値に基づいて２つのクラスタ内に分離可能である。従って、サンプルハイブリダイゼーションパターンは、ある表現型を有しているか又は有していないかとして容易に識別されうる。本発明の方法は好ましくは、クラスタにおける存在又は不存在に基づき前記サンプル核酸を型特定することをさらに含む。この型特定が典型的に、分類についての誤差の統計的マージン、すなわちサンプル核酸が或る表現型特徴を有している又は有していないとして誤って分類される統計的機会に関連付けられている。該クラスタの境界は、誤差のより小さい又はより大きい統計的機会を提供するために設定されうる。従って、本発明の方法は好ましくは、クラスタにおける存在又は不存在に基づき前記サンプル核酸を型特定することをさらに含む。好ましい実施態様では、該パラメータは伝染性を含む。好ましくは、該ハイブリダイゼーションパターンは、それらの伝染性表現型、すなわち病院設定における他の他の患者への株の蔓延の可能性に基づきクラスタ化又はグループ化される。
【００７２】
好ましい実施態様では、パラメータは伝染性を含む。上記されたように、参照ハイブリダイゼーションパターンが好ましくは、天然の黄色ブドウ球菌起源から得られる又は由来する核酸から生成される。好ましくは、少なくとも５、そしてより好ましくは少なくとも５０の参照ハイブリダイゼーションパターンが、異なる黄色ブドウ球菌株から得られる又は由来する核酸によって生成される。特に好ましい実施態様では、本質的に全ての参照ハイブリダイゼーションパターンが、黄色ブドウ球菌株の核酸によって生成される。このようにして、得られた核酸のそれへの存在のためにサンプルを型特定することを可能にし、ある株又は黄色ブドウ球菌の株として類似の表現型パラメータ含む。この特に好ましい実施態様は好ましくは、参照及びサンプルハイブリダイゼーションパターンの統計解析と組み合わされる。このように、サンプルにおける黄色ブドウ球菌が、黄色ブドウ球菌株の全てではないが幾つかのによって共有される或る表現型特徴を含む可能性を決定することが可能である。黄色ブドウ球菌核酸はＲＮＡから得られうるが、好ましくは黄色ブドウ球菌ＤＮＡから由来する又は得られる（すなわちゲノムから得られる）。従って、本発明の好ましい実施態様では、複数の核酸分子は、黄色ブドウ球菌ＤＮＡから得られる。
【００７３】
本発明の方法の重要な利点は今、有機体が最初に分類学的に分類され（例えば識別され）、次に識別された種に属する臨床的に関連するパラメータが、例えば既知の参照株に対するデータのリストとの比較に基づき決定されうることが必要ないことである。従って、種決定が、例えばある抗生物質に対する試験有機体の感受性（若しくは耐性）の存在又は何らかの他の臨床的に関連するパラメータを決定するために要求されないことが本発明の有利点である。これは、そのような情報がアレイの複数の核酸分子”内”に今用意されるという事実によって達成される。
【００７４】
ハイブリダイゼーションパターンを生成するために使用されるサンプル及び／又は参照核酸は、それが由来する又は得られる黄色ブドウ球菌の核酸のサブセットを含みうる。しかしながら、好ましくは、選択が実行されない。どんな場合も、選択は好ましくは、サンプル及び参照核酸について同じ又は類似である。これは、参照及びサンプルハイブリダイゼーションパターンの容易な比較を可能にする。
【００７５】
語「から得られる又は由来する核酸」では、アレイ上にハイブリダイゼーションするために使用される核酸が起源から直接的に得られることが必須でないことが意味される。それは、ハイブリダイゼーションのための使用の前に、クローニング、選択及び他の操作を経験したかもしれない。サンプル核酸及び参照核酸は例えば、クローニングされたライブラリー、例えば発現又はゲノムライブラリーから得られうる。代替的に、サンプル及び参照核酸は、例えば進行中のゲノム効果の結果として、データベースにおける核酸情報に基づき、スクラッチから生成されうる。しかしながら、好ましくは、サンプル及び参照核酸は、天然の黄色ブドウ球菌起源から直接的に又は増幅を介して得られる。好ましくは、サンプルハイブリダイゼーションパターンは、黄色ブドウ球菌株の単培養から開始して生成される。このように、１つの黄色ブドウ球菌のみがアレイ上で分析され、及び同時に、生成されたパターンが黄色ブドウ球菌株から生成されたハイブリダイゼーションパターンであることが保証される。
【００７６】
１つの観点では、本発明は、複数の黄色ブドウ球菌核酸分子を含むアレイを提供し、該核酸分子は約200〜5,000の間の平均サイズのヌクレオチドを含む。本発明のアレイは好ましくは、その上に少なくとも500,000のヌクレオチドを含む。好ましくは、該アレイは、その上にさらに多くのヌクレオチドを運ぶ。好ましい実施態様では、該アレイは少なくとも１メガ塩基（106ヌクレオチド）を含む。好ましくは、それらは少なくとも２メガ塩基を含む。慣用のアレイとは反対に、１スポット当たりの塩基の数は高い（すなわち200〜5,000の間のヌクレオチド）。好ましくは、前記複数の核酸分子は、天然の黄色ブドウ球菌起源から得られる。好ましくは、前記複数の核酸分子は、黄色ブドウ球菌ＤＮＡから得られる。それにもかかわらず黄色ブドウ球菌の異なる株（一方、同じ種に属する）は、それが運ぶＤＮＡの量及び種類において非常に変わりうることが見つけられた。従って、好ましい実施態様では、本発明のアレイは、黄色ブドウ球菌の少なくとも２つの異なる株から得られる複数の核酸分子を含む。好ましくは、該アレイにおける複数の核酸分子は、黄色ブドウ球菌株のゲノムの少なくとも表現を含む。これは好ましくは、黄色ブドウ球菌の少なくとも１つの他の株から得られる核酸に拡張される。このように、該アレイは、黄色ブドウ球菌種の全遺伝的多様性のより多くの代表である。特に好ましい実施態様では、該アレイは、黄色ブドウ球菌の少なくとも３つの異なる株から得られる複数の核酸分子を含む。該アレイにおける複数の核酸を生成するために黄色ブドウ球菌株の数を増加させることによって、該アレイは、黄色ブドウ球菌種の完全な遺伝的潜在性をますます模倣し、従って型特定がますます特異的になる。従って、好ましい実施態様では、該アレイは、黄色ブドウ球菌種の遺伝的多様性の表現を含む複数の核酸分子を含む。これは、異なる黄色ブドウ球菌株の減少された数を運ぶアレイを用いて型特定することが有効な有効な手法でないことを意味しない；それは、予測及び推定がより正確且つ完全になることを単に意味する。
【００７７】
実施例
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＣＡ−ＤＡ分析による、伝染性及び非伝染性黄色ブドウ球菌間の区別に基づくクラスタ化
31個の異なる黄色ブドウ球菌株の一組の蛍光的にラベル付けされたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が、８個の異なる黄色ブドウ球菌株の混合物の無作為的に選択されたｇＤＮＡフラグメント（ほぼ2100個のフラグメント／アレイ、ほぼ1500 bp／フラグメント）を用いて覆われたアレイと別々にハイブリダイゼーションされた。各試験された株についてゲノムＤＮＡフラグメント当たりハイブリダイゼーションシグナルのリストを生じた蛍光ハイブリダイゼーションパターンが、数値化された。より詳細には、各アレイは２個のラベル付けされたｇＤＮＡと同時にハイブリダイゼーションされた：１つは、調査下の特定の黄色ブドウ球菌株に関し（Cy5でラベル付けされた）、及び他は、全ての個々のスライド上で作成されたハイブリダイゼーションを正規化するための参照として役立つアレイを作成するために使用された８個の黄色ブドウ球菌の標準混合物に関する（Cy3でラベル付けされた）。引き続き、データ分析は、データのフィルタリング、正規化、そして切り捨て処理、引き続き主成分分析（ＰＣＡ）を含んだ。これは、全ゲノムディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく類似の黄色ブドウ球菌株のクラスタ化をもたらす。再現性が、幾つかの株について２回のハイブリダイゼーションによって示された。
【００７８】
異なる細菌株の組
19個の多重耐性黄色ブドウ球菌株の一組が、実施例３のために使用された（図５）。該組は、19個の病院単離物からなる。すべての株について、それらの伝染性特徴が、日々の病院実務から取り出された（図１）。これらの株についてマイクロアレイ結果の生成のために使用された全ての実験手順が、実施例１における記載に従った。
【００７９】
黄色ブドウ球菌株の成長及びｇＤＮＡ単離
黄色ブドウ球菌単離物は、ＴＳＡ−寒天プレート及び／又はＴＳＡ培地（一晩、３７℃）上で（単一コロニーを介して）成長され、そしてグリセロール培養物として保管された（−80℃）。ｇＤＮＡ単離のために、プレート成長した細菌（例えば、10〜20のコロニーの量）が、2 mlバイアル中の400μｌ TE-バッファ（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5）内に再懸濁された。該細胞は400μl水洗された0.1 mmジルコニウムガラスビーズ懸濁液（Biospec Products（商標））を添加することによって溶解され、氷上で予め冷やされ、細胞破壊機（minibeadbeater 8, Biospec Products（商標））において、120秒間、中レベルで振とうされ、そして氷上で冷却された。遠心分離（5分、14 krpm、4℃）後、ｇＤＮＡが、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出（室温）、クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出（室温）によって標準手順（Sambrook、1989年）に従い透明な溶解物から単離され、エタノール／酢酸ナトリウムを用いて沈殿し（−20℃、４℃で回転）、70％エタノールを用いて洗浄し（−20℃、４℃で回転）、乾燥し（真空）、RNAseA（１〜100μg/ml）を有する100μl TE-バッファ内にペレットを溶解し、そして0.6％アガロースエチジウムブロミド染色されたゲル上のｇＤＮＡ量（例えば、１〜5μｌ調製物／スロット）を半数値化した。
【００８０】
黄色ブドウ球菌ｇＤＮＡアレイ（スライド）の構築
種  黄色ブドウ球菌のゲノム全体に渡る表現を含むアレイを作るために、有機体の混合ゲノムライブラリーが、８つの黄色ブドウ球菌株のｇＤＮＡを混合することによって作られた（株選択のために、図３を参照）。（ａ）（抗生物質耐性のほとんどの型を一緒にカバーする）抗生物質の広いセットに対する各異なるプロファイルを示した株、及び（ｂ）それらの単離されたｇＤＮＡのアガロース−ゲル分析において有意なプラスミドバンドを含まなかった株が選択された。ｇＤＮＡ混合物は、音波処理（Branson sonifier 450）によって剪断され、そして0.8％のアガロースゲルのいくつかのレーンにおいて単離された。ＤＮＡフラグメント（およそ1〜3kb）が、ガラスミルク（Bio101-kit）への結合を介して切り取られ、そして単離された。該単離されたフラグメントは、細菌プラスミド（pSmartHCkan vector, CloneSmart Blunt Cloning Kit, Lucigen）内への効率的な（平滑な）クローニングを容易にするために、DNA-terminator End-repair kit（Lucigen Corp.）を用いて前処理された。ライゲーション混合物の一部（1μl）が、エレクトロポレーション（0.1cm-ギャップキュベット、Eurogentec、BioRad Pulser、25μF、200オーム、1.6 kV）によって、25μl大腸菌細胞（E. kloni 10G supreme electrocompetent cells, Lucigen）に形質転換され、TB-培地において再生され、そして30μｇ/mlカナマイシンを有するTYプレート上に置かれ、一晩、37℃で成長された。爪楊枝を使用して、コロニーが96穴マイクロタイタープレート（32プレート、穴当たり150μlの30μg/mlカナマイシンを含むTY培地）内に移された。37℃で一晩成長後、グリセロールが添加され（最終濃度15％）、そして該グリセロールストックが−80℃で保存された。
【００８１】
穴プレートにおける各クローンからのゲノム挿入物が、96穴ＰＣＲプレート（22プレート）においてＰＣＲ増幅を使用して増加された。ＰＣＲ反応物は、1×SuperTaqバッファ、0.2mMの各dNTP（Roche Diagnostics）、0.4μMプライマーL1（5'-cag tcc agt tac gct gga gtc-3'）及び0.4μMプライマーR1（5'-ctt tct gct atg gag gtc agg tat g-3'）、1.5U  SuperTaq-DNA-ポリメラーゼ、及びｇＤＮＡバンクの対応する穴からの１μlグリセロールストックを有する50μl反応混合物／穴を含んだ。両方のプライマーが、プライマーの5'末端にC6-リンカーを介して結合された遊離NH2基を含む。下記ＰＣＲプログラムが使用された：4分94℃、30回（30秒94℃、30秒50℃、3分72℃）、10分72℃、そして4℃で浸す。増幅に引き続き、50μlのＰＣＲ生成物が96穴丸底プレートに移され、そして150μl酢酸ナトリウム／イソプロパノール混合物（夫々、0.2M 酢酸ナトリウム、67％イソプロパノール最終濃度）を添加することによって沈殿され、１時間、−80℃でインキュベーション、回転（１時間、2.5 krpm、4℃）、上清の除去、そして100μlの70％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットが50μl水／穴中に再懸濁され、384穴プレートに移され、乾燥され（スピード真空）、そして穴当たり10μlの3xSSCバッファ中に再懸濁された。およそ2100個のＰＣＲ生成物を含む6個の生じた384穴プレートは、マイクロアレイをスポットするために使用された。該ＰＣＲ生成物は、24個のTeleChem Stealth micro spotting quill-pins（ほぼ100μm直径）と一緒に、ESIマイクロアレイプリンターを使用して、一連の最大75個の「アルデヒド」コーティングされたスライド（Cell Associates）上でスポットされた。スポット後に、スライド表面が、室温でボロ無水物での処理（0.2％ SDS中2x 5分、水中2x 5分、ボロ無水物バッファ（510 ml PBS-バッファ及び170 mlの100％エタノール中1.7g NaBH4）中10分、0.2％ SDS中3x 5分、水中3x 5分、100℃水中2秒、窒素フローでの乾燥）によってブロックされた。PBS（リン酸緩衝生理食塩水）は、6.75 mM Na2HP04、1.5 mM K2HP04、140 mM NaCl及び2.7 mM KCl、pH 7.0（リットル当たり、1.2 g Na2HP04、0.2 g K2HP04、8.0 g NaCl、0.2 g KCl、pH 7.0）である。
【００８２】
ｇＤＮＡのラベル付け
ｇＤＮＡの蛍光ラベル付けが、BioPrime（商標）DNA Labeling System（Invitrogen、カタログ番号：18094-011）に基づき、25μl反応物において、1.5時間の間、37℃で、0.5〜2μgの単離された黄色ブドウ球菌ｇＤＮＡ上で実行された。該反応物は、1x Random Primer溶液（50mM Tris-HCI pH 6.8、5 mM MgCl2、30μg/mlランダムオクタマー、Bioprime（商標））、lxlowT dNTP混合物(0.25 mM dATP、0.25 mM dGTP、0.25 mM dCTP、O.l mM dTTP)、0.06 mM Cy-dUTP（Cy= Cy5又はCy3のいずれか、1μ1の1 mMストック、Amersham Biosciences)及び20ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（Klenowフラグメント；0.5μlの40U/μlストック、Bioprime（商標））を含んだ（最終濃度）。反応後、塩類、取り込まれなかった（ラベル付けされた）ヌクレオチド及びプライマーが、Autoseq G50カラム(Amersham Biosciences)を介する精製によって除去された。精製後、ラベル付けされた物質の１０分の１部が、ＤＮＡ(A260nm)及びCy5(A649nm)又はCy5(A550nm)の量を決定するために分光学的分析のために使用された。ラベル付けされた物質の残りが、アレイハイブリダイゼーションのために使用された。
【００８３】
アレイの（プレ）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの調製において、スライドが、ペトリ皿において、20 mlのプレハイブリダイゼーション溶液（1％BSA、5xSSC、0.1％SDS、0.45μmフィルターを通じて濾過された、42℃）中に置かれ、そして45分間、42℃で、（緩やかな回転によって）穏やかに振とうされた。次に、該スライドは、（40mlのキャップされたチューブ中）40 mlの水において２回洗浄され、そしてN2銃を使用して迅速に乾燥された。
【００８４】
Cy5-dUTP及びCy3-dUTPでラベル付けさられた適切なｇＤＮＡサンプルは、4μｌの酵母ｔＲＮＡ（25μｇ／μｌ）と一緒にされ、乾燥され（SpeedVacを使用）、40μｌEasyHyb溶液 (Roche Applied Science, Roche Diagnostics Nederland B.V.、アルメレ、オランダ)、変性され（1.5分、95℃）、簡単に遠沈され（1秒、10 krpm）、予め温められた（42℃金属プレート）乾燥プレハイブリダイゼーションアレイ上にピペットで置かれ、プラスチックカバースリップ（Hybrislip, Molecular Probes）で覆われ、水−蒸気飽和された予め温められた（42℃）ハイブリダイゼーションチャンバー（Corning）内に挿入され、そして42℃の水浴中で一晩ハイブリダイゼーションされた。試験株からの各ハイブリダイゼーションｇＤＮＡはCy5-dUTPでラベル付けされ、一方参照プール（アレイ構築のために使用された株からのｇＤＮＡの混合物）がCy3-dUTPでラベル付けされた。ハイブリダイゼーション後、該アレイはキャップされた40 mlチューブにおいて40 mlの（異なる）バッファ中で４回スライドを振とうすることによって洗浄された（洗浄バッファ１：１x SSC、0.2％SDS、37℃、5〜10秒；洗浄バッファ２：0.5x SSC、37℃、5〜10秒；洗浄バッファ３及び４：0.2x SSC、20℃、夫々10分）。
【００８５】
スキャンニング及び画像分析
洗浄後、スライドが、（Cy蛍光の消失を防ぐために）暗所中に保存され、又はスキャンニング装置（Packard BioscienceからのScanalyzeソフトウェアを備えた、PerkinElmerからのScanArray 4000)を用いて蛍光Cy染料をスキャンするために直接的に使用された。クイックスキャン（解像度30μm/ピクセル）が、低シグナル又は飽和されたシグナルの過剰を防ぐために、最適なレーザー（強度）及び検出（光電子増倍管）設定を選択するために実行された。スライドが、Cy5-及びCy3-蛍光のために２回走査された。ディジタル走査は、ImaGeneソフトウェア（BioDiscovery Inc., バージョン4.2）を用いて数値化され、スポット識別、並びにアレイ上の各スポットについてCy5及びCy3の両方のシグナル（Ｓ）及びバックグラウンド（Ｂ）値をもたらした。該データは電子ファイルに格納され、そして更なるデータ処理のために使用された。
【００８６】
データ前処理
表計算ソフトウェア（エクセル、マイクロソフト）を使用することによって、下記計算が各スポットについて行われた：Cy3とCy5のためのS-B値、及びCy5/Cy3比の[R=Cy5(S-B)]/[(Cy3(S-B)]。低品質データが除去された（例えば、S<2Bを有するCy3データを有するスポット）。次に、正規化係数Nが、スライド上の全てのスポットについて平均Cy5-及びCy3-シグナルに基づき、各スライドについて計算された（N=[平均Cy5(S-B)/[平均Cy3(S-B)]）。次に、正規化された比(Rn)が、全てのアレイ上の各スポット(Rn=R/N)について計算された。多くのスライド（スライドは黄色ブドウ球菌株に関連する）について、スポット当たりの正規化された比の行列（データセット）が、更なるデータ前処理のために使用された。
【００８７】
Cy3シグナルがほとんどのスポットについて一般的に存在し（8つの株のCy3ラベル付けされた参照ｇＤＮＡプールが全てのスライドにハイブリダイゼーションされた）、及びCy5シグナルは変化しうる（異なる株のCy5ラベル付けされたｇＤＮＡは単一のスライドと夫々ハイブリダイゼーションされた）故に、ｇＤＮＡフラグメントがCy5試験株において夫々存在する又は存在しない場合に、Cy5/Cy3比が、理論的に２つの値（１又は０）を有しうる。しかしながら、実際上、これらの値は１及び０あたりを変化する。それ故に、０及び１についての多くの分析切り捨て値は、更なる分析の前に比データセット上に適用された（例えば、Rn<0.5及びRn>0.5が０及び１に夫々置換され、又はRn<0.3及びRn>0.7が０及び１に夫々置換され、一方0.3及び0.5の間のRn値を維持する）。これら「切り捨てデータセット」が、最終データ分析に使用された。
【００８８】
結果
19個の異なる黄色ブドウ球菌単離物の一組が、全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＬＳ−ＤＡ分析のために処理された（図２）。
【００８９】
ＰＬＳ−ＤＡ分析が、黄色ブドウ球菌株の既知の伝染性特徴に従い、該黄色ブドウ球菌株び有意なクラスタ化をもたらした（E=伝染性、N=非伝染性）。
【００９０】
これは、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの一部が知られていない黄色ブドウ球菌株の伝染性を予測するために使用されうる予測情報を含むことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】黄色ブドウ球菌（S. aureus）株及びそれらの伝染性特徴のリストを示す表である。
【図２】全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、ＭＲＳＡ株の伝染性のためのクラスタ化を示す図である。
【図３】部分最小二乗法（ＰＬＳ） 分析方法の項におけるモデル複雑性の観点を強調する図である。
【図４】主成分判別分析（ＰＣ−ＤＡ）の項における判別分析の観点を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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