(57)【要約】  本発明は、以下の：１）全煙送達を低減するが、従来の紙巻たばこよりもより効率的に満足のいく量のニコチンを喫煙者が得ることを可能にし、それにより従来の低量紙巻たばこに伴う喫煙者の「埋め合わせ」を減らす、低タール対ニコチン比の紙巻たばこの製造と、２）遺伝子手段による、且つタバコからニコチンを抽出してそれを遺伝子改変ニコチン低減タバコと組み合わせることによる、タバコ製品中の有害なタバコ特有のニトロソアミンの低減と、３）遺伝子改変ニコチン増量タバコを利用する、改善された膨脹タバコの製造と、４）以下の任意の組合せ：遺伝子改変ニコチン増量タバコ、遺伝子改変ニコチン低減タバコ、タバコ葉画分、及び新たに収穫された凍結乾燥タバコを含む再生タバコの製造とを包含する消費者に受け入れられ得るＰＲＥＰの開発及び製造のための、遺伝子改変（ＧＭ）タバコの利用を含む方法論を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分を含む紙巻たばこであって、
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜８のタール対ニコチン量比である紙巻たばこ。
【請求項２】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、ニコチン増量を示す、請求項１に記載の紙巻たばこ。
【請求項３】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分は、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を示す、請求項１に記載の紙巻たばこ。
【請求項４】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項３に記載の紙巻たばこ。
【請求項５】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項１に記載の紙巻たばこ。
【請求項６】
前記量が、約１ｍｇのタールおよび約０．１２ｍｇ〜約０．３４ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項７】
前記量が、約２ｍｇのタールおよび約０．２５ｍｇ〜約０．６８ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項８】
前記量が、約３ｍｇのタールおよび約０．３６ｍｇ〜約１．０ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項９】
前記量が、約４ｍｇのタールおよび約０．５０ｍｇ〜約１．３６ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１０】
前記量が、約５ｍｇのタールおよび約０．６２ｍｇ〜約１．７０ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１１】
前記量が、約６ｍｇのタールおよび約０．７５ｍｇ〜約２．０ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１２】
前記量が、約７ｍｇのタールおよび約０．８７ｍｇ〜約２．３３ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１３】
前記量が、約８ｍｇのタールおよび約１．０ｍｇ〜約２．６６ｍｇのニコチンである、請求項５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１４】
前記量比が、約３より大きく、約５未満である、請求項１に記載の紙巻たばこ。
【請求項１５】
トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分を含む、紙巻たばこ。
【請求項１６】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、ニコチン増加を示す、請求項１５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１７】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を
示す、請求項１５に記載の紙巻たばこ。
【請求項１８】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項１７に記載の紙巻たばこ。
【請求項１９】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである請求項１５に記載の紙巻たばこ。
【請求項２０】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、アルカロイドが増加したトランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該植物をニコチアナ・タバカム種の植物と交雑して、ニコチン増加表現型を有する子孫植物を創出すること、および
該子孫植物を含み、かつ、ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比を有する紙巻たばこを製造すること
を含む紙巻たばこを製造する方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の紙巻たばこ。
【請求項２２】
前記トランスジェニック植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項２１に記載の紙巻たばこ。
【請求項２３】
ニコチアナ・タバカム種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが低減したトランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該ニコチンが低減した植物をニコチアナ・ラスチカと交雑して、子孫のトランスジェニック植物または植物部分を得ること、および
該子孫植物または植物部分を含む紙巻たばこを製造すること
を含む紙巻たばこを製造する方法。
【請求項２４】
前記子孫植物または植物部分が、前記ニコチン低減植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記子孫植物または植物部分が、前記植物種ニコチアナ・ラスチカと比較して、減少したニコチンを含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の紙巻たばこ。
【請求項２７】
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比を有する、請求項２６に記載の紙巻たばこ。
【請求項２８】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該植物または植物部分におけるニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該植物または植物部分から再生タバコを製造すること、および
該再生タバコを含む紙巻たばこを製造すること
を含む紙巻たばこを製造する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の紙巻たばこ。
【請求項３０】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項２９に記載の紙巻たばこ。
【請求項３１】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分は、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を示す、請求項２９に記載の紙巻たばこ。
【請求項３２】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシル
アントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項３１に記載の紙巻たばこ。
【請求項３３】
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比を有する、請求項２９に記載の紙巻たばこ。
【請求項３４】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該植物または植物部分から膨脹したタバコを生産すること、および
該膨脹したタバコを含む紙巻たばこを製造すること
を含む紙巻たばこを製造する方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の紙巻たばこ。
【請求項３６】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項３５に記載の紙巻たばこ。
【請求項３７】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を示す、請求項３５に記載の紙巻たばこ。
【請求項３８】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項３７に記載の紙巻たばこ。
【請求項３９】
トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して増加したニコチンを示す、ニコチアナ属の種のトランスジェニック植物または植物部分であって、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、植物または植物部分を含む紙巻たばこであって、
該非形質転換親植物または植物部分を含む対照紙巻たばこと比較した場合よりもタール対ニコチン量比が低い、紙巻たばこ。
【請求項４０】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、該非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして該非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を示す、請求項３９に記載の紙巻たばこ。
【請求項４１】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項４０に記載の紙巻たばこ。
【請求項４２】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである請求項３９に記載の紙巻たばこ。
【請求項４３】
前記量比が約３より大きく、約５未満である、請求項３９に記載の紙巻たばこ。
【請求項４４】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該トランスジェニック植物または植物部分からニコチンを抽出すること、
ニコチアナ属の種の植物または植物部分を提供すること、
該種に該抽出されたニコチンを添加し、ニコチン増量植物材料を形成すること、
該ニコチン増量植物材料を含む紙巻たばこを製造すること、
を含む紙巻たばこを作製する方法。
【請求項４５】
前記ニコチンがニコチン有機酸塩である、請求項４４に記載の紙巻たばこ。
【請求項４６】
請求項４４に記載の紙巻たばこ。
【請求項４７】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項４６に記載の紙巻たばこ。
【請求項４８】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を示す、請求項４６に記載の紙巻たばこ。
【請求項４９】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項４８に記載の紙巻たばこ。
【請求項５０】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項４６に記載の紙巻たばこ。
【請求項５１】
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比を有する請求項４６に記載の紙巻たばこ。
【請求項５２】
前記量が、約１ｍｇのタールおよび約０．１２ｍｇ〜約０．３４ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５３】
前記量が、約２ｍｇのタールおよび約０．２５ｍｇ〜約０．６８ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５４】
前記量が、約３ｍｇのタールおよび約０．３６ｍｇ〜約１．０ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５５】
前記量が、約４ｍｇのタールおよび約０．５０ｍｇ〜約１．３６ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５６】
前記量が、約５ｍｇのタールおよび約０．６２ｍｇ〜約１．７０ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５７】
前記量が、約６ｍｇのタールおよび約０．７５ｍｇ〜約２．０ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５８】
前記量が、約７ｍｇのタールおよび約０．８７ｍｇ〜約２．３３ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項５９】
前記量が、約８ｍｇのタールおよび約１．０ｍｇ〜約２．６６ｍｇのニコチンである、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項６０】
前記量比が、約３より大きく、約５未満である、請求項５１に記載の紙巻たばこ。
【請求項６１】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニ
コチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該トランスジェニック植物または植物部分からニコチンを抽出すること、
ニコチアナ属の種の第２の植物または植物部分を提供すること、
該第２の植物または植物部分に該抽出されたニコチンを添加して、増加したニコチン植物材料を形成すること、
該ニコチン増量植物材料を含み、かつ、該抽出されたニコチンを添加されない、該第２の植物または植物部分を含む対照紙巻たばこと比較して、低いタール対ニコチン量比を有する、紙巻たばこを製造すること、
を含む紙巻たばこを製造する方法。
【請求項６２】
前記ニコチンがニコチン有機酸塩である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の紙巻たばこ。
【請求項６４】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項６３に記載の紙巻たばこ。
【請求項６５】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチン含量を示す、請求項６３に記載の紙巻たばこ。
【請求項６６】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項６５に記載の紙巻たばこ。
【請求項６７】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項６３に記載の紙巻たばこ。
【請求項６８】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが低減したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をダウンレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該トランスジェニック植物または植物部分から紙巻たばこ用タバコを生産すること、
該紙巻たばこ用タバコにニコチンを添加すること、
該紙巻たばこ用タバコを含み、かつ、タバコ１ｇ当たり約０．５ｍｇ未満のタバコ特有ニトロサミンを有する、紙巻たばこを製造すること、
を含む紙巻たばこを製造する方法。
【請求項６９】
前記ニコチンが、ニコチン有機酸塩、ニコチン類似体または合成ニコチンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項６８に記載の紙巻たばこ。
【請求項７１】
前記ニコチン低減トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される親植物または植物部分と比較して、減少したニコチンを示す、請求項７０に記載の紙巻たばこ。
【請求項７２】
前記ニコチン低減トランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、減少したレベルの該酵素、そして非形質転換対
照植物または植物部分と比較して、減少したニコチン含量を示す、請求項７０に記載の紙巻たばこ。
【請求項７３】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項７２に記載の紙巻たばこ。
【請求項７４】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項７０に記載の紙巻たばこ。
【請求項７５】
前記タバコ特有ニトロソアミンレベルが、タバコ１ｇ当たり約０．０５μｇ（５０ｐｐｂ）未満である、請求項７０に記載の紙巻たばこ。
【請求項７６】
約３〜約８のタール対ニコチン量比を有する、請求項７０に記載の紙巻たばこ。
【請求項７７】
トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、減少したニコチンを示す、ニコチアナ属の種のトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をダウンレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該トランスジェニック植物または植物部分からタバコを製造すること、
該タバコにニコチンを添加すること、および
該タバコを含み、かつ、該非形質転換親植物または植物部分を含む対照製品と比較して、低いタバコ特有ニトロソアミンレベルを有する、製品を製造すること、
を含むタバコ製品を製造する方法。
【請求項７８】
前記ニコチンがニコチン有機酸塩または合成ニコチンである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項７７に記載のタバコ製品。
【請求項８０】
前記ニコチン低減トランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して減少したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して減少したニコチン含量を示す、請求項７９に記載のタバコ製品。
【請求項８１】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項８０に記載のタバコ製品。
【請求項８２】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項７９に記載のタバコ製品。
【請求項８３】
前記タバコ特有ニトロソアミンレベルが、１ｇ当たり約１μｇ（１ｐｐｍ）未満である、請求項７９に記載のタバコ製品。
【請求項８４】
前記タバコ製品が、葉タバコ、細断タバコおよび切断タバコからなる群より選択される形態である、請求項７９に記載のタバコ製品。
【請求項８５】
前記タバコ製品が、かぎたばこ、パイプタバコ、葉巻タバコ、噛みタバコ、及び紙巻たばこからなる群より選択される、請求項７９に記載のタバコ製品。
【請求項８６】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチアナ属の種の、ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、
該トランスジェニック植物または植物部分からタバコを製造すること、および
該タバコを膨脹すること、
を含む膨脹タバコを製造する方法。
【請求項８７】
請求項８６に記載の膨脹タバコ。
【請求項８８】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項８７に記載の膨脹タバコ。
【請求項８９】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したニコチン含量を示す、請求項８７に記載の膨脹タバコ。
【請求項９０】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項８９に記載の膨脹タバコ。
【請求項９１】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項８７に記載の紙巻たばこ。
【請求項９２】
（ａ）ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、増加したニコチントランスジェニック植物または植物部分であって、該トランスジェニック植物または植物部分および紙巻たばこにおけるニコチンの生産をアップレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、植物または植物部分、（ｂ）ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、減少したニコチンのトランスジェニック植物または植物部分であって、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をダウンレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、植物または植物部分、（ｃ）脱タンパク質タバコ繊維、および（ｄ）凍結乾燥タバコを提供すること、ならびに、
該植物材料を再生すること
を含む再生タバコを製造する方法。
【請求項９３】
請求項９２に記載の再生タバコ。
【請求項９４】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが減少したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をダウンレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、および
該トランスジェニック植物または植物部分を再生すること
を含む再生タバコを製造する方法。
【請求項９５】
請求項９４に記載の再生タバコ。
【請求項９６】
前記ニコチン低減トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される親植物または植物部分と比較して、減少したニコチンを示す、請求項９５に記載の再生タバコ。
【請求項９７】
前記ニコチン低減トランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して減少したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して減少したニコチン含量を示す、請求項９５に記載の再生タバコ。
【請求項９８】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵
素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項９７に記載の再生タバコ。
【請求項９９】
前記植物種がニコチアナ・タバカムおよびニコチアナ・ラスチカからなる群より選択される、請求項９５に記載の再生タバコ。
【請求項１００】
再生された脱タンパク質タバコ繊維を更に含む、請求項９５に記載の再生タバコ。
【請求項１０１】
前記非形質転換親植物または植物部分を含む対照紙巻たばこと比較して、減少した量のタバコ特有ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）を有する、請求項９５に記載の再生タバコを含む紙巻たばこ。
【請求項１０２】
前記ＴＳＮＡが、Ｎ'-ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４-（Ｎ-ニトロソメチルアミノ）-１-（３-ピリジル）-１-ブタン-オン（ＮＮＫ）、Ｎ'-ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、Ｎ'-ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）からなる群より選択される、請求項１０１に記載の紙巻たばこ。
【請求項１０３】
前記非形質転換親植物または植物部分を含む対照紙巻たばこと比較して、減少した量の、ベンゾ（ａ）ピレン、フェノール、およびカテコールからなる群より選択される化合物を有する、請求項１０１に記載の紙巻たばこ。
【請求項１０４】
ニコチアナ属の種の、非形質転換対照植物または植物部分と比較して、ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分であって、該植物または植物部分は、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をダウンレギュレートする少なくとも１つの異種核酸を発現する、トランスジェニック植物または植物部分を提供すること、および
該植物または植物部分を再生すること
を含む再生タバコを製造する方法。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の再生タバコ。
【請求項１０６】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項１０５に記載の再生タバコ。
【請求項１０７】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したニコチン含量を示す、請求項１０５に記載の再生タバコ。
【請求項１０８】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項１０７に記載の再生タバコ。
【請求項１０９】
前記植物種がニコチアナ・タバカムである、請求項１０５に記載の再生タバコ。
【請求項１１０】
前記トランスジェニック植物または植物部分を収穫後に凍結乾燥することを更に含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
形質が導入遺伝子によって付与される、高ニコチン形質および高乾燥還元糖含量によって特徴付けられるタバコ変種。
【請求項１１２】
前記変種が、前記高ニコチン形質および前記糖含量の少なくとも１つについてのトゥルーブリーディングである、請求項１１１に記載のタバコ変種。
【請求項１１３】
前記糖含量が約１４％〜約３０％である、請求項１１１に記載のタバコ変種。
【請求項１１４】
前記形質が導入遺伝子によって付与される、高ニコチン形質および高脂肪酸含量によって特徴付けられるタバコ変種。
【請求項１１５】
前記変種が、前記高ニコチン形質および前記脂肪酸含量の少なくとも１つについてのトゥルーブリーディングである、請求項１１４に記載のタバコ変種。
【請求項１１６】
上昇した乾燥還元糖含量を有する植物を、ニコチン増量表現型を付与する導入遺伝子で形質転換すること、
該形質転換された植物から子孫植物を再生すること、および
増加したニコチンおよび乾燥還元糖含量を有する子孫植物を選択すること
を含む植物中のニコチンおよび乾燥還元糖含量を増加する方法。
【請求項１１７】
上昇した脂肪酸合成を有する植物を、ニコチン増量表現型を付与する導入遺伝子で形質転換すること、
該形質移入された植物から子孫植物を再生すること、および
増加したニコチンおよび脂肪酸レベルを有する子孫植物を選択すること
を含む、植物中のニコチンを増加させる方法。
【請求項１１８】
高ニコチン形質および少なくとも１５％の乾燥還元糖含量によって特徴付けられるタバコ変種であって、該形質が導入遺伝子によって付与されるタバコ変種。
【請求項１１９】
前記変種が、前記形質および前記乾燥還元糖含量の少なくとも１つについてトゥルーブリーディングである、請求項１１８に記載のタバコ変種。
【請求項１２０】
前記変種が、３．５％を超える全アルカロイド含量を有する、請求項１１１に記載のタバコ変種。
【請求項１２１】
３．３％を超える高ニコチン含量および高乾燥還元糖形質によって特徴付けられるタバコ変種であって、該形質が導入遺伝子によって付与されるタバコ変種。
【請求項１２２】
前記変種が、前記糖形質および前記ニコチン含量の少なくとも１つについてトゥルーブリーディングである、請求項１２１に記載のタバコ変種。
【請求項１２３】
前記変種の前記乾燥還元糖含量が１５％を超える、請求項１２１に記載のタバコ変種。
【請求項１２４】
ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分、
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比、および
約３．５を超える糖対ニコチン比を有する充填材
を含む紙巻たばこ。
【請求項１２５】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項１２４に記載の紙巻たばこ。
【請求項１２６】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする異種核酸を含有および発現する、請求項１２４に記載の紙巻たばこ。
【請求項１２７】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したニコチン含量を示す、請求項１２４に記載の紙巻たばこ。
【請求項１２８】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項１２７に記載の紙巻たばこ。
【請求項１２９】
ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物または植物部
分、
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比、および
約６を超えるｐＨを有する紙巻たばこ煙
を含む紙巻たばこ。
【請求項１３０】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項１２９に記載の紙巻たばこ。
【請求項１３１】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分においてニコチンの生産をアップレギュレートする異種核酸を含有および発現する、請求項１３０に記載の紙巻たばこ。
【請求項１３２】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したニコチン含量を示す、請求項１２９に記載の紙巻たばこ。
【請求項１３３】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項１３２に記載の紙巻たばこ。
【請求項１３４】
ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分、
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比、
約６を超えるｐＨを有する紙巻たばこ煙、および
約３．５を超える糖対ニコチン比を有する充填材
を含む紙巻たばこ。
【請求項１３５】
第１のアルカロイドの量または相対量が増加する植物または植物細胞培養物を作製する方法であって、
キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）およびプトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）からなる群より選択される第１の酵素の発現を、ＱＰＴまたはＰＭＴをコードする核酸を植物細胞に導入することによって増加させること、
核酸を第２の植物細胞に導入することによって、第２のアルカロイドまたはその前駆体の第２のアルカロイド生合成または代謝に関与する少なくとも１つのさらなる酵素の発現を、増加または減少することによって変更すること、および
第１の細胞および該第２の細胞を含む植物または植物細胞培養物を製造することを含み、
該第１のアルカロイドの量または該第２のアルカロイドと比較した第１のアルカロイドの相対量は、未改変植物細胞または該第１の酵素の発現のみが増加する植物細胞由来の植物もしくは植物細胞培養物におけるよりも、該植物または植物細胞培養物において、より大きいことを特徴とする方法。
【請求項１３６】
前記第１のアルカロイドおよび前記第２のアルカロイドが、ニコチン、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、アナタビン、ニコチン−ｎ−オキシド、Ｎ−メチルアナタビン、Ｎ−メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジルからなる群より選択される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記さらなる酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオ
ニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記第１のアルカロイドがニコチンであり、前記第１の酵素がＰＭＴであり、前記さらなる酵素が減少したＱＰＴであり、そして前記第２のアルカロイドがアナバシンである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第１のアルカロイドがニコチンであり、前記第１の酵素がＰＭＴであり、前記さらなる酵素が減少したＱＰＴであり、そして前記第２のアルカロイドがアナバシンである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第１のアルカロイドがニコチンであり、前記第１の酵素がＰＭＴであり、前記さらなる酵素が減少したＱＰＴであり、そして前記第２のアルカロイドがノルニコチンである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４１】
請求項１３８、１３９、または１４０に記載のタバコ植物。
【請求項１４２】
未改変タバコ先祖植物と比較して減少したＴＳＮＡを含む、請求項１４１に記載のタバコ。
【請求項１４３】
請求項１４２に記載のタバコを含む紙巻たばこ。
【請求項１４４】
植物または植物部分におけるニコチンの生産が、該植物もしくは植物部分または先祖植物への合成または組換え核酸の導入の結果としてアップレギュレートされる、ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分、および
ＦＴＣまたはＩＳＯ法によって測定される場合、約３〜約８のタール対ニコチン量比、を含む紙巻たばこ。
【請求項１４５】
前記ニコチン増量トランスジェニック植物または植物部分が、該トランスジェニック植物または植物部分が創出される非形質転換親植物または植物部分と比較して、増加したニコチンを示す、請求項１４４に記載の紙巻たばこ。
【請求項１４６】
非形質転換対照植物または植物部分と比較して、前記ニコチンが増加したトランスジェニック植物または植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に要求される少なくとも１つの酵素セグメントをコードする異種ＤＮＡを含み、かつ、これを発現し、該トランスジェニック植物または植物部分が、非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したレベルの該酵素、そして非形質転換対照植物または植物部分と比較して増加したニコチン含量を示す、請求項１４４に記載の紙巻たばこ。
【請求項１４７】
前記酵素が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴａｓｅ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴａｓｅ）、Ｓ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、及びホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、からなる群より選択される、請求項１４６に記載の紙巻たばこ。
【請求項１４８】
脱タンパク質タバコを提供すること、
該タバコを膨脹すること、および
該タバコを含む紙巻たばこを製造すること
を含む膨脹タバコを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［仮出願の利益］
本特許出願は、２００３年８月１９日出願の米国仮出願第６０／４９６，２９０号の利益を主張する。その内容全体は、本明細書中に参照により援用される。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、紙巻たばこに限定されないがこれを始めとする、遺伝子改変されたタバコを含む紙巻たばこを含むがこれに限定されない曝露低減タバコ製品及びこのような紙巻たばこの製造方法の分野に関連する。
【背景技術】
【０００３】
［背景］
タバコの使用は、米国における主な病気及び死亡の予防可能な原因であると考えられる（米国保健福祉省(U. S. DHHS), January 2000, Healthy People 2010）。過去数十年の間に、公衆衛生団体（community）は繰り返し紙巻たばこ喫煙の健康影響を強調してきた。喫煙に起因する心血管疾患、呼吸疾患、及び癌は、最新の公衆衛生総監報告書 (「喫煙の健康影響（The Health Consequences of Smoking）」, Surgeon General's Report, 2004)によって明らかなように、広範かつ増加している。疾患管理センターは、米国において１年当たり４４０，０００を超える早期死亡が紙巻たばこ喫煙に起因すると見積もっている（疾病管理センター、「タバコの使用を標的とする（Targeting Tobacco Use）」, 2004）。
【０００４】
先進国での喫煙率はここ３０年間にわたり横ばいであり、いくつかの国においては減少さえしているが、発展途上国での喫煙率及び紙巻たばこ消費量（rates）は同時期の間に増加しており、予期し得る将来についてもこのような動向が続くと思われる。最近の予測では、タバコの世界的普及が変わらないままであるなら世界規模での喫煙者数が現在の１３億人から２０２５年には１７億人より多くなるだろう（部分的には世界人口の増加に起因する）ということが示されている（世界保健機構, 2004）。
【０００５】
世界規模での全紙巻たばこ消費は増加し続けている。量にすると、紙巻たばこの全世界消費は、１９９５年から１９９９年の間に４兆７６３０億個の紙巻たばこから４兆９５３０億個の紙巻たばこへ、４％増加した。製造されたタバコ製品市場は、主に紙巻たばこが占めており、これは世界市場価額の９６％を占める（「タバコ製品の世界市場（The World Market for Tobacco Products）」, Euromonitor International出版, 2000年版, p.2）。２００２年には、世界規模で市場が紙巻たばこ５兆３２２０億個に成長した（「喫煙と健康への対応（Action on Smoking and Health）」, Factsheet No: 18; January, 2004）。
【０００６】
これらの数字の大きさ及び成長率を考慮すると、人々が遠い未来まで紙巻たばこを喫煙するだろうということが明らかである。紙巻たばこ喫煙が２１世紀の終わりまでに世界規模で上限１０億人の早期死亡を引き起こす恐れがあると予測されている。現在の統計は、３００万個の紙巻たばこの消費につき約１人の肺癌死があることを示している(Nature Cancer Reviews, Oct. 2001)。
【０００７】
このヘルスケアのジレンマの理想的な解決策は、全ての紙巻たばこ喫煙者が喫煙を止めることである。しかしながら、このような解決策は非現実的に見える。タバコ製品の世界規模での消費増加から、反タバコ圧力団体からの反タバコ方針賛成論者は大部分で成功し
ていない。西側諸国では、これらの方針が最も広まっているが、過去２０年間にわたって喫煙率をほとんど減少させなかった。かなりの割合の紙巻たばこ喫煙者が喫煙をやめたいと思っていない。米国だけで数千万人が、その多くは多くの形態のニコチン代替療法（ＮＲＴ）の出現前に、喫煙をやめているものの、喫煙者の一部はやめようとして失敗している。これら２つの群について、紙巻たばこ喫煙の悪影響を減少させる有効な戦略が不十分であった。
【０００８】
米国食品医薬品局の要望で国立科学アカデミーの医学研究所（ＩＯＭ）がまとめた最近の報告は、現在の行き詰まりに対する可能性のある療法の基礎を築いている。「喫煙の一掃：タバコの害の低減についての科学的根拠の評価（Clearing the Smoke : Assessing The Science Base For Tobacco Harm Reduction）」 (IOM Report)、と題する６５６ページの報告結果は、切迫した公衆衛生が特に紙巻たばこについて潜在的曝露低減製品（「ＰＲＥＰ」）を必要としていることを示している(Institute of Medicine, Washington, DC: National Academy Press, 2001)。
【０００９】
IOM Reportの最初の結論は、「タバコ使用に起因する多くの疾患について、タバコ毒物への曝露を低減させることによる疾患の危険性の低減が実行可能である。この結論は、多くの疾患について、完全な禁煙が最大の利益をもたらすと同時に、タバコの煙への曝露を低減させることが疾患発生率の減少をもたらし得ることを示す研究に基づく」ということである。(IOM Report Executive Summary, pg.4)。
【００１０】
従って、ＰＲＥＰは全ての経済的及び政治的力学を考慮した場合に公衆衛生の方策の必需品である。科学に基づくＰＲＥＰの市場開発及び調節はタバコにおけるどのような完全な公益戦略でも一部分として含まれる必要がある。理にかなったタバコ市場開発の成人への制限、子供への販売及び市場開発の厳格な施行、及び喫煙の有害な影響についての教育を含む、タバコの使用を減少させる全体的なゴールは、社会に与えるタバコの全体的な損害を減少させるために、消費者のＰＲＥＰの利用可能性と同調して進むべきである。
【００１１】
紙巻たばこの煙は、２相からなる。一般に「タール」と呼ばれる粒子相又は全体が粒子状の物質、及び気体と半揮発性化合物とを含有する蒸気相である。「タール」の一般的な定義は、「ニコチンを含まない乾性煙」又は「ニコチンを含まない乾性粒子状物質」（ＮＦＤＰＭ）である。より詳細には、「タール」は、煙から単離される全粒子状物質で、水及びニコチンに限定されないがこれを始めとするアルカロイド化合物を含まない。タバコの煙の重さの約４／５が周辺空気からなり、これには一酸化炭素、二酸化炭素、水、水素、メタン、窒素、及び酸素が含まれる。残りの１／５は、粒子相及び半揮発性化合物を含む。タールは紙巻たばこの煙の重さの１０％未満を占める。しかし最も有害な化合物の大部分を含有しているのはタール構成成分である。
【００１２】
紙巻たばこの煙は化学化合物の非常に複雑な混合物である。紙巻たばこの煙の化学分析は長年かけて６，０００種を超えた構成成分（タール＋気体）を示してきた。約４，８００種の化合物が紙巻たばこの煙のタール部分で同定されている(Green and Rodgman, 「タバコ科学の最近の進歩（Recent Advances in Tobacco Science）」, 22: 131-304,1996)。高感度な生物学的アッセイと組み合わせた分析法により、タバコの煙中の６９種の発癌物質が同定された（「変化する紙巻たばこ：化学的研究及びバイオアッセイ(The Changing Cigarette: Chemical Studies and Bioassays)」, Dietrich and Ilse Hoffman, Chapter 5, Smoking and Tobacco Control Monograph No. 13, NIH Pub. No. 02-5074, October 2001）。
【００１３】
しかしながら、紙巻たばこの煙の全ての構成成分が等しい毒性を有するのではないことが、研究者に明らかになってきた。注目すべきは、１９６４年の喫煙に関する最初の‘米
国公衆衛生総監報告書が、喫煙者に対する主要な薬理学的診査料は直ちに心配することではないという意味合いを含めて、ニコチンは喫煙者により吸入されるレベルではおそらく毒性ではないという結論に達したことである(Gori, p. 3, 「実質的に安全な紙巻たばこ−一度は無惨にも否定されたチャンスの復活（Virtually Safe Cigarettes -Reviving an
Opportunity Once Tragically Rejected）」,2000)。事実、公衆衛生総監報告書は、「ニコチンへの長期曝露が客観的性質の危険な機能変化又は変性疾患のいずれかを引き起こすことの納得できる証拠はない」と示した（U. S. Surgeon General Report 1964, pg.74）。実際、米国食品医薬品局は現在、喫煙中止手段（devices）としてのニコチンパッチ及びチューインガムの販売を許可しているが、これらは箱に入った紙巻たばこよりも多くのニコチンを含み得る。
【００１４】
「アルカロイド類」は、植物で天然に生じる複雑な窒素含有化合物であり、ヒト及び動物に薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、商品化された紙巻たばこ用タバコの主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に含まれるアルカロイド含量の約９０％を占める。タバコ中の他の主なアルカロイド類として、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、及びアナタビンが挙げられる（J. C. Leffingwell,「第８章葉の化学、タバコ：産生、化学、及び技術（Chapter 8 Leaf
Chemistry, Tobacco: Production, Chemistry and Technology）」, pg.275,1999）。マイナーなタバコアルカロイド類として、ニコチン−ｎ−オキシド、Ｎ−メチルアナタビン、Ｎ−メチルアナバシン、シュードオキシニコチン（pseudooxynicotine）、２，３ジピリジル、及び他のものが挙げられる（「タバコアルカロイド類の生合成及び代謝（Biosynthesis and Metabolism of the Tobacco Alkaloids）」, Edward Leete in Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives, Volume I, S. William Pelletier, Ed. 1983）。ニコチンに共通するヒトへの効果のいくつかとして、血圧及び心拍数の増加、ならびに集中力及び短時間記憶の改善がある。ニコチン類似体及びニコチン化合物は、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの数種の疾患を治療する際に見込みがあるので、最近の研究の多くで研究対象となっている。他のタバコアルカロイド類はニコチンと比較して、似てはいるがそれより少ない活性を有する。
【００１５】
紙巻たばこの煙の送達の最も一般的な測定は、タール及びニコチンとして報告される。紙巻たばこのタール量及びニコチン量は、米国及び多数の他国で、全ての紙巻たばこ消費者広告（advertisements）に示される。多くの国で、タール、ニコチン、及び一酸化炭素についてさえも、それらの量（紙巻たばこ当たり）が紙巻たばこの包装に印刷されることを要求される。過去数十年の間、紙巻たばこ設計の革新は、米国公衆衛生総監及び公衆衛生団体により受け入れられる、「少ないほど良いはず」という信念に基づいて、大きくはタール量及びニコチン量の低減に焦点を当ててきた（図１を参照）。
【００１６】
米国では、タール量、ニコチン量、及び一酸化炭素量は、連邦取引委員会（ＦＴＣ）喫煙機械検査法を用いて得られ、この方法はタールの測定を、紙巻たばこを機械で喫煙した場合にケンブリッジパッド（Cambridge pad）に捕獲される物質（material）−ニコチン及び水として定義する（Pillsbury, et al. , 1969,「紙巻たばこの煙中のタール及びニコチン（Tar and nicotine in cigarette smoke）」. J. Assoc. Off. Analytical Chem., 52,458-62）。具体的には、ＦＴＣ紙巻たばこ検査法は、フィルターの通気孔（もしあれば）をどれも塞がずに、燃焼線がチップペーパー＋２ｍｍに、又はフィルターなしの紙巻たばこの終わりから２３ｍｍのところに引いた線に達するまで、５８秒ごとに２秒間、一服体積３５ｍｌの紙巻たばこの煙を模擬することにより、煙試料を収集する。このＦＴＣ喫煙機械検査法は、タール及びニコチンについて紙巻たばこの煙の量を測定するために１９６７年から米国で用いられている。紙巻たばこの煙中の一酸化炭素量の測定は１９８０年にこの方法に付け加えられた。
【００１７】
１９６７年、ＦＴＣがその検査法を導入したとき、ＦＴＣは新聞発表を行い、検査の目的が「任意のヒトの喫煙者により吸入されるタール及びニコチンの量を決定することではなく、むしろあらかじめ定められた方法で紙巻たばこが機械で喫煙された場合に発生するタール及びニコチンの量を決定すること」であると説明した。それでもなお、この方法は、タール量、ニコチン量、及び一酸化炭素量に従って紙巻たばこを等級付け及び比較する正確な方法を提供するのに重要な役割を果たす。
【００１８】
国際標準化機構（ＩＳＯ）は、紙巻たばこのタール量、ニコチン量、及び一酸化炭素量について非常によく似た喫煙機械検査法を開発した（ISO, 1991「紙巻たばこ−ルーチン分析喫煙機械を用いる全粒子状物質及びニコチンを含まない乾燥粒子状物質の測定（Cigarettes-determination of total and nicotine-free dry particulate matter using a routine analytical smoking machine）」ISO: 4387: 1991）。
【００１９】
ＦＴＣ及びＩＳＯの喫煙法は、以下の８つの領域で異なっている。
・ＦＴＣ法は、平衡化及び検査の両方について、７５°Ｆ±１°Ｆ（２３℃±１℃）及び相対湿度６０％±２％の研究室環境条件を指定（specify)する。平衡化の時間は最短で２４時間及び最長で１４日間である。これをＩＳＯ規格と比較すると、ＩＳＯは平衡化について２２℃±１℃及び相対湿度６０％±２％、検査については２２℃±２℃及び相対湿度６０％±５％である。平衡化時間は最短で４８時間及び最長で１０日間である。
・ＦＴＣは、紙巻たばこの吸いさし長を最長で２３ｍｍ又はチップペーパー＋３ｍｍのどちらか長い方と定義する。ＩＳＯは、吸いさし長を最短で２３ｍｍ又はチップペーパー＋３ｍｍ又はフィルター＋８ｍｍと定義する。フィルターなしの紙巻たばこについては両方法が吸いさし長を２３ｍｍと指定する。
・ＩＳＯは、灰皿の位置を、喫煙機械の紙巻たばこから２０〜６０ｍｍより下と定義する。ＦＴＣは位置を指定しない。
・ＩＳＯは、再使用できるフィルターホルダーと合わせて２ピースの留め金を指定する。このフィルターホルダーは、ケンブリッジパッドを含有し、紙巻たばこの吸いさし部分を部分的に遮るための合成ゴム多孔ワッシャーを用いる。ＦＴＣ法は、ケンブリッジフィルターパッドの使用を定義するが、フィルターパッドホルダー装置を指定しない。
・ＩＳＯ法は、紙巻たばこレベルで紙巻たばこを通る気流を指定する。ＦＴＣは、気流を調整するためのモニター用紙巻たばこの使用を指定する。
・ＩＳＯの手順は、用いたフィルターホルダーから出た過剰な全粒子状物質（ＴＰＭ）を拭き取るプロセスを定義する。フィルターホルダーの内側表面は未使用の調整済みフィルターパッドの別個の１／４片２つで拭く。ＦＴＣ法はフィルターホルダーの内側表面を拭くのに裏側（捕捉されたＴＰＭと反対側）を用いる。
・ＩＳＯは、ＴＰＭ中のニコチン及び水を分析するのにケンブリッジパッド当たり２０ｍｌの抽出溶液を用いることを指定する。ＦＴＣの手順は、ケンブリッジパッド当たり１０ｍｌを定義する。
・ＩＳＯは、ニコチン及び水のガスクロマトグラフィーによる測定について内部標準を定義する。ＦＴＣの手順は、内部標準を指定しない。
【００２０】
これらの違いにより、代表的に、ＦＴＣ法に対してＩＳＯ法でわずかに低い測定結果（deliveries：送達）がもたらされる。ＦＴＣ法とＩＳＯ法の間の測定値は、検査の検出限界内であるか、約１０ｍｇを超える量がある紙巻たばこで約０．４ｍｇ未満のタール及び約０．０４ｍｇニコチンである。
【００２１】
ＦＴＣ／ＩＳＯ喫煙機械検査法（「ＦＴＣ／ＩＳＯ法」又は「ＦＴＣもしくはＩＳＯ法」）に対する主な批判は、特定の紙巻たばこの喫煙による個々の喫煙者のタール、ニコチン、又は一酸化炭素への曝露レベルを正確に予測していないということである（National
Cancer Institute Smoking and Tobacco Control Monograph 13, 「機械測定でタール及
びニコチンが低量であった紙巻たばこの喫煙に伴う危険性（Risks Associated with Smoking Cigarettes with Low Machine-measured Yields of Tar and Nicotine）」）。これらの方法は、標準化された条件下で検査結果をもたらす。しかしながら、個々の喫煙挙動は、多くの場合そうであるが、これらの標準化機械が紙巻たばこを喫煙する仕方により大幅に異なる可能性がある。
【００２２】
ヒト喫煙者は、ＦＴＣ／ＩＳＯ法に由来する値と比較して、喫煙者の一服動作の頻度及びこのような一服動作の吸入体積、煙を吸い込んでから吐くまでの長さ、特定の期間内に喫煙する紙巻たばこ数、及び喫煙した紙巻たばこの割合（紙巻たばこがどの程度まで喫煙されたか）を始めとする様々な要因に依存して、紙巻たばこ当たり非常に異なるレベルのタール、ニコチン、及び一酸化炭素に曝露される可能性がある（全く同じブランドスタイルの紙巻たばこについて）。
【００２３】
全く同じブランドスタイルの紙巻たばこを毎日紙巻たばこ同数喫煙する２人は、必ずしも、同じレベルのタール、ニコチン、及び一酸化炭素に曝露されるとは限らないかもしれない。そのうえさらに、個々の喫煙者は、異なる時間で、紙巻たばこ当たり異なるレベルのタール、ニコチン、及び一酸化炭素に曝露される。例えば、喫煙者が大西洋横断飛行していて８時間紙巻たばこを吸っていなかった場合、彼又は彼女は、きっと次に吸う紙巻たばこを非常に激しく喫煙し、紙巻たばこ当たり彼又は彼女の平均より高いレベルでタール、ニコチン、及び一酸化炭素に曝露されるだろう。一方で、喫煙者が短時間の間にいつもよりも多くの紙巻たばこを吸った場合、次に吸う紙巻たばこはそれほど激しくは喫煙せず、それにより喫煙者は、喫煙者の平均よりも少ないタール、ニコチン、及び一酸化炭素（紙巻たばこ当たりに基づいて）に曝露されるかもしれない。ストレスを始めとする他の要因は、ヒトがどのくらい頻繁に及びどのくらい激しく喫煙するかに影響を及ぼす。ストレスは一般に、喫煙者のニコチン消費量を増加させる(IOM Report p.254)。
【００２４】
フィルター付き紙巻たばこは、ＦＴＣ／ＩＳＯ法に従ってタール、ニコチン、及び一酸化炭素量を減らすように、設計され得る。これは、一服当たりのこれらの煙画分の量を減らすことにより完遂され得る。以下の改変のいずれか１つ又は複数を組み込むことにより、より少ないタール、より少ないニコチン、及びより少ない一酸化炭素の紙巻たばこを得ることが可能であることが既知である（「紙巻たばこ設計（Cigarette Design）」, Lynn
T. Kozlowski, et al., NCI Monograph 13, Chapter 2, pg.15）：
・フィルターが煙をより多くろ過するように、フィルターをより効果的にすること、
・より多孔率の高い紙巻たばこ紙を用いること、
・喫煙者が紙巻たばこを吸うときにより多くの空気が煙混合物中に入るように、フィルターチップ材料の周りに通気孔を置くか又はその数を増やし（それらのサイズを大きくすることを含む）、それにより吸入される煙の量を希釈すること、
・紙巻たばこ紙又は充填材に化学添加物を用いて紙巻たばこの燃焼率を上げること、
・タバコの茎及びくずを含むタバコ廃棄物でできた再生タバコシートをより高い割合で用いること、
・より少ない量の全葉タバコが紙巻たばこロッドを充填しているので紙巻たばこ当たりより少ないタール及びニコチンを生成する、膨脹（expanded)タバコを用いること、
・紙巻たばこの直径を減らし、これにより充填材の重量を減らすこと、及び
・吸いさし長を変えるチップペーパー長を増やすこと。
図１は、歴史的観点からこれらの方法を並べたものであり、その結果のタール量及びニコチン量の減少を示す。
【００２５】
「再生(reconstituted)タバコ」（「レコン（ｒｅｃｏｎ）」）は、タバコくず及び他のタバコ廃棄材料でできたタバコ充填材の重要部分であり、シート型に加工されてタバコに似せた細片に切断される。再生タバコは、製造費が抑えられるだけではなく、アンモニ
アと糖との間の反応を用いて香りの発生を処理する点から、紙巻たばこの風味への寄与に非常に重要である。
【００２６】
「膨脹タバコ」は、タバコが減少した密度とより大きな充填容量をもたらして「吹かれる(puffed)」ように、適したガスでの膨脹を通じて加工処理されたタバコ充填材の別の重要部分である。これは、紙巻たばこに用いられるタバコの重量を減少させる。有利なことに、膨脹タバコは、タール、ニコチン、及び一酸化炭素の送達を低減し、例えば、低タール、低ニコチン、及び低一酸化炭素送達紙巻たばこの作成に用途を見いだす。
【００２７】
紙巻たばこ喫煙が生成するニコチン含量、及びより少ない度合いでのタールレベルは、紙巻たばこの製造に用いられたタバコの種類及び多様さにも依存する。アメリカブランドの紙巻たばこに一般に用いられる３種類のタバコは、黄色種（flue-cured）、バレー種（burley）、及び東洋種（oriental）である。これらの混合により、「アメリカブレンド」の紙巻たばこと称されてきたものが製造される。一般に、バレー種のニコチンレベルが最も高く、黄色種、東洋種がこれに続く。水分１５％の乾燥タバコのほとんどの種類（varieties）が、約１〜３重量％のニコチンを含有する。完成した紙巻たばこのアルカロイド含量は、紙巻たばこを作るのに用いられた新鮮な収穫されたタバコ葉中の量よりも少ない。なぜなら、乾燥、貯蔵、及び製造プロセスの間に損失が生じるからである。
【００２８】
「乾燥(curing)」は、水分を減らし、クロロフィル（タバコ葉に金色を与え、またこれによりデンプンを糖に転換する）の破壊をもたらす加齢プロセスである。したがって、乾燥タバコは収穫された緑の葉と比較して還元糖の含量が高くデンプン含量が低い。「火力乾燥(flue-cured)タバコ」は、換気した小屋で熱を用いてタバコ植物を乾燥させる方法を指し、独特の色、高い還元糖含量、本体が中量〜重い、及び並外れて滑らかな喫煙性質を特徴とする（Bacon, E. W., Wenger, R. & Bullock, J. F. (1952),「火力乾燥中のタバコの化学的変化（Chemical changes in tobacco during flue-curing）」, Ind. Eng. Chem., 44,292）。
【００２９】
紙巻たばこロッドの構成成分のいずれかの設計を変更することにより、上記に記載されるとおり、事実上全ての商品化されたタバコ充填材について、ＦＴＣ／ＩＳＯ法により測定されるタールレベル及びニコチンレベルが、フィルター付き紙巻たばこで約１ｍｇのタール及び０．０５ｍｇのニコチンから約２０ｍｇのタール及び１．８ｍｇのニコチンまで変化し得ることが既知である。
【００３０】
紙巻たばこが「より軽い」ように設計される場合、タールレベル、ニコチンレベル、及び一酸化炭素レベルは、ＦＴＣ／ＩＳＯ法で測定すると、わずかに異なる率で低減している。それにもかかわらず、タール及び一酸化炭素のレベルは、ニコチンレベルにほぼ同じ割合で相当する減少がない限りどのような大きさの割合でも減少せず、その逆もまた同様である。過去５０年間でＦＴＣ／ＩＳＯ法当たりのタール量及びニコチン量が低減してきたものの、紙巻たばこの「タール対ニコチン量比（yield ratio)」（「ＴＮＲ」）は、図１及び図２に示されるとおり、ほぼ一定のままであった。
【００３１】
本明細書中に使用される場合、「紙巻たばこ」という用語は、「ロッド」＋「充填材」として定義される。紙巻たばこの「ロッド」には、紙巻たばこ紙、フィルター、フィルター巻取り紙（plug wrap）（フィルター濾過材料を含有するのに用いられる）、紙巻たばこ紙（充填材を含む）をフィルターに固定するチップペーパー、及びこれらの構成成分をまとめて固定する全ての糊が含まれる。「フィルターなしの紙巻たばこ」のロッドの構成成分は、紙巻たばこ紙及びそれを密閉する糊だけである。「充填材」は、（１）再生タバコ及び膨脹タバコに限定されないがこれらを含む全てのタバコ、（２）非タバコ代替物（薬草、非タバコ植物材料及び紙巻たばこ紙内に巻かれるタバコに付随し得る他の薬味が挙
げられるがこれらに限定されない）、（３）包装材、（４）香味剤、ならびに（５）その他全ての添加物（これらはタバコ及び代替物中に混合されて紙巻たばこ内に巻かれる）を含む。本明細書中に使用される場合、「紙巻たばこ」という用語はまた、（Ａ）紙又はタバコを含有しない任意の他の物質でくるまれた任意のタバコ巻物、及び（Ｂ）タバコを含有する任意の物質でくるまれた任意のタバコ巻物、これはその外観、充填材に用いられるタバコの種類、又はその包装及びラベルのおかげで副段落（Ａ）に記載される紙巻たばことして消費者に販売しやすい、又は消費者が購入しやすいものとして定義される（1967 Federal Cigarette Labeling And Advertising Act, U. S. FTC）
【００３２】
本明細書中に使用される場合、「フィルターなしロッド」、「フルフレーバーロッド」、「軽いロッド」、及び「非常に軽いロッド」という用語は、それぞれ、フィルターなし紙巻たばこ−その充填材、フルフレーバー紙巻たばこ−その充填材、軽い紙巻たばこ−その充填材、及び非常に軽い紙巻たばこ−その充填材として定義される。
【００３３】
本明細書中に使用される場合、紙巻たばこの「タール対ニコチン量比」、すなわち「ＴＮＲ」は、タール量をニコチン量で割ることで計算され、このような量はどちらも、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定される。
【００３４】
米国及び世界中の大部分における紙巻たばこブランドは、フルフレーバー、軽い、及び非常に軽いなどの分類で差別化される。これらの表示は、通常、紙巻たばこの包装及び広告に見られる。このような分類は、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定されるタール及びニコチンのレベルの関数である紙巻たばこの強さを伝える。風味の強い、又はフルフレーバー紙巻たばこはタール量及びニコチン量がより多い。ＦＴＣ法により米国で一般に認識される紙巻たばこの分類又は「強さ」の分類は、以下の通りである。
・「フルフレーバー紙巻たばこ（紙巻たばこ当たり１５ｍｇ又はそれより多いタール）
・「軽い紙巻たばこ」（紙巻たばこ当たり７〜１４ｍｇのタール）
・「非常に軽い紙巻たばこ」（紙巻たばこ当たり６ｍｇ又はそれより少ないタール）。
【００３５】
ＦＴＣ／ＩＳＯ法に由来するタールレベル及びニコチンレベルにのみ基づいてフルフレーバー紙巻たばこと軽い紙巻たばこのどちらを喫煙するかを消費者が決定することは問題がある（「低量製品を喫煙する危険性及び理由についての国民の理解（Public Understanding of Risk and Reasons for Smoking Low-Yield Products）」, Neil Weinstein, NCI
Monograph 13, Chapter 6）。なぜなら、ヒトと喫煙機械は紙巻たばこを異なるように喫煙するからであり、タール量が少ないと報告される紙巻たばこに高い期待を持つ可能性がある（「紙巻たばこ量についての消費者の認識：メッセージは適切なのか（Consumer Perception of Cigarette Yields: Is the Message Relevant?）」, Gio Gori, Regulatory Toxicology and Pharmacology volume 12,64-68 1990）。喫煙者は、フルフレーバー紙巻たばこ（Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標）フルフレーバーは１５ｍｇのタール及び１．１ｍｇのニコチンを生成する）から軽い紙巻たばこ（Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標）ライトは、１１ｍｇのタール及び０．８ｍｇのニコチンを生じる）への切り替えが必ずしも喫煙に伴う危険性を減少させると間違って信じてはならない。
【００３６】
軽い紙巻たばこ喫煙者をフルフレーバー紙巻たばこ喫煙者と比較した場合（ならびに軽い喫煙者と比較した非常に軽い喫煙者、及びフルフレーバー喫煙者と比較した非常に軽い喫煙者）、並びに／又は通常はフルフレーバー又は軽い紙巻たばこを喫煙する個々の喫煙者がより軽い型の紙巻たばこに切り替える、もしくは時々より軽い型の紙巻たばこを喫煙する場合、以下の喫煙挙動のうちのいくつか又は全てがある程度起こる可能性がある：
・紙巻たばこ当たりより多くの一服動作を取る、
・個々の一服動作又は一服動作容量が大きくなる（例えば、３５ｍｌだったのに対して５５ｍｌの煙が消費され得る）、
・個々の一服動作の間隔の変化（例えば、４秒対２秒）、それによりコーン温度がより高くなり、これは煙の突然変異誘発性に関連している＊
・煙を吐き出すまでより長い間肺にとどめる、
・肺により深く吸入する、
・軽い紙巻たばこ喫煙者は、指及び唇でフィルター通気孔を塞ぐ可能性がある、及び
・所定の時間で、より多くの紙巻たばこを喫煙する。
＊（「タバコの煙凝縮物の突然変異原性に対する熱分解温度の効果（Effect of pyrolysis temperature on the mutagenicity of tobacco smoke condensate）」, White, J. L.,
et al. , Food and Chemical Toxicology 39, pg.499-505 (2001) ）。 IOM Reportに記載されるように、「ニコチンの所望の摂取を維持するために、低量製品に変えた多くの喫煙者は、先に述べたような様式で彼らの喫煙方法も変えた。したがって、彼らのタバコ毒物への曝露は、標準化アッセイで予想されてきたよりも高くなり、これらの製品を使い続けた人々は、それらに切り替えたことでかれらの疾患の危険性を明らかに減少させてはいなかった」(IOM Report p. 2)。
【００３７】
フルフレーバー、軽い、及び非常に軽い紙巻たばこ喫煙者の間で観測される喫煙挙動の違いは、まとめて「埋め合わせ」と呼ばれてきた（「低量紙巻たばこの埋め合わせ的喫煙（Compensatory Smoking of Low Yield Cigarettes）」, Neal Benowitz, NCI Monograph
13）。「埋め合わせ」では、タバコの煙に存在するニコチンが減っているために、より集中して喫煙する。喫煙者は、彼らが所望する、重要な知覚特性であるニコチン効果及び煙の口腔感覚を得るために、低量紙巻たばこを（高量紙巻たばこに対して）より激しく喫煙することにより埋め合わせする（Jed E. Rose, 「喫煙における上気道刺激の役割（The
role of upper airway stimulation in smoking）」, Nicotine Replacement: A Critical Evaluation, p95-106, 1988）。
【００３８】
Wilcoxのグループは、低タール及びニコチンの紙巻たばこに切り替えた喫煙者が、対照群と比較して、１日当たりの彼らの紙巻たばこ消費を増やすことにより埋め合わせをするという結論に達した。別の大きなコホート研究でそうであったように（Sidney et al., 1993）、４つのコホートから集められたデータは、肺癌の危険性という点で、異なるレベルの喫煙間であってさえ（Tang et al., 1995b）、低タールの紙巻たばこに統計的に有意な有益性を示すことができなかった。Lee及びGarfinkelは、肺癌の危険性と喫煙される紙巻たばこの種類のまとめを提出したが(Lee and Garfinkel, 1981)、タール含量に基づいた危険性の有意な減少を実証することができなかった(IOM Report p.401)。最近の、喫煙者の下気道での腺癌の増加は、いわゆる低量製品の喫煙埋め合わせによるものであるとの仮説が立てられている。これらの製品の喫煙者は、彼らのニコチン用量を増やすためにより深く吸入する(IOM Report p.285)。
【００３９】
したがって、ここ３０年間の消費者の「より軽い」紙巻たばこへの傾向は、喫煙者の健康に有益ではなかった可能性がある。一般に、埋め合わせにより、軽い紙巻たばこ喫煙者は、フルフレーバー型喫煙者と全く同じだけのタール及びニコチンを吸入する。もちろん、軽い紙巻たばこはフルフレーバー紙巻たばことは違うようにして風味を出し、これらの風味の違いが、通常、大部分の喫煙者がそうするブランドスタイルを選ぶ理由である。しかしながら、米国に限れば、現在、より高量の紙巻たばこから切り替えた、軽い紙巻たばこ及び非常に軽い紙巻たばこ喫煙者が数百万人いる。
【００４０】
図２は、いくつかのアメリカブランドスタイルについて、ＦＴＣ法によるタール量及びニコチン量を示す。「ブランドスタイル（単数又は複数）」は、あるブランドファミリー内の紙巻たばこの異なるバージョン又はスタイルである（例えば、Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標）ウルトラライトキングフィルターボックス）。図２はまた、このようなブランドスタイルで得られるＴＮＲを示す。ブランドスタイルが、キングサイズ（通常長さが８５
ｍｍ）、１００'ｓ（長さ１００ｍｍ）、フルフレーバー、ライト、又はウルトラライトのいずれにかかわらず、それらで得られるＴＮＲは値が比較的近い。ウルトラライトは、幾分低いＴＮＲを有する傾向があるが、これは主にこのような紙巻たばこの設計における余剰の通気がニコチンよりもわずかに高い率でタール量を低下させるという事実による（ＦＴＣ／ＩＳＯ法により）。図２の単純平均ＴＮＲは１４．２２である。
【００４１】
１９９８年版FTC reportについて、タール量及びニコチン量の売り上げ重量平均は、１２．０ｍｇのタール及び０．８８ｍｇのニコチンであったが、これにより１３．６４のＴＮＲが得られる。図１は、１９５０年において、平均ＴＮＲが約１４．４４（約３９ｍｇのタール／約２．７ｍｇのニコチン）であったことを示す。これらの数字は、アメリカの紙巻たばこの平均ＴＮＲがおよそ１９５０年から現在までかなり一貫していることを示す。
【００４２】
１９９８年版FTC Reportは、２０００年に公開されたが、１９９８年の紙巻たばこブランドを取り上げており、ＦＴＣが紙巻たばこからのタール量、ニコチン量、及び一酸化炭素量を公式に発表することを選択した最後の年であった。評価された１，２９４個の紙巻たばこブランドスタイルのうち、わずか３つだけが計算による８未満のＴＮＲを有する。事実、全部で８つのブランドスタイルのみが、計算による１０未満のＴＮＲを有する。これらは、１つのＲｏｔｈｍａｎｓ（登録商標）、３つのＣａｎａｄｉａｎ  Ｐｌａｙｅｒｓ（登録商標）、２つのＯｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）、１つのＮｏｗ（登録商標）、及び１つのＣａｒｌｔｏｎ（登録商標）である。報告書にはタール、ニコチン、及び一酸化炭素の数値のみが記載されたが、ＴＮＲは、タール量をニコチン量で割ることにより、これらの数字から容易に計算できる。他の２つのＣａｒｌｔｏｎ（登録商標）ブランドスタイルは、＜０．５のタール量及び０．１のニコチン量を有する。タール量の実際の生の数字は求めることができないため、こうしたレベルで概数にすることによる影響が莫大なため、これらの２つのブランドスタイルについての数字は先行技術を反映していないようである。
【００４３】
８未満のＴＮＲを有する３つのブランドスタイルのうち２つ（Ｃａｒｌｔｏｎ（登録商標）１００フィルターソフトパック及びＮｏｗ（登録商標）キングフィルターソフトパック）は、１９９８年版FTC Reportで、１ｍｇのタール及び０．２ｍｇのニコチンを生じると報告されており、したがってＴＮＲ５を有する。しかしながら、これら２つのブランドスタイルのＴＮＲは、主に小さい数字を概数にする(rounding)ことの性質によるものである。１９９８年版FTC Reportより、「タール率及び一酸化炭素率は、最も近いミリグラム（ｍｇ）の概数にする：０．５ｍｇ又はそれより大きいものは切り上げ、０．４ｍｇ又はそれより小さいものは切り下げる。ニコチンの数字は、最も近い１／１０ミリグラムの概数にする。０．０５ｍｇ又はそれより大きいものは切り上げ、０．０４ｍｇ又はそれより小さいものは切り下げる。」したがって、１．４ｍｇのタール及び０．１５ｍｇのニコチンを送達する非常に軽い紙巻たばこは、たとえ実際のＴＮＲが９．３３に等しいとしても１ｍｇのタール及び０．２ｍｇのニコチン（ＴＮＲ５）として報告される。１ｍｇのタール及び０．１ｍｇのニコチンを送達する紙巻たばこは、煙の薄さ（風味の欠如）ゆえに消費者に受け入れられにくく、非常に抵抗を招く。２０００年には、ＦＴＣ法に準じて１〜３ｍｇのタールを生じる紙巻たばこブランドスタイルの市場占有率は米国市場占有率の１．３％にすぎなかった。３ｍｇのタール又はそれより少ないタールを生じるブランドスタイルの９２％が、それらの包装にそれらのＦＴＣタール率及びニコチン率を印刷した。このことは、１２ｍｇ又はそれより多いタールを生じるブランドスタイルと対照的であり、これらの中では、１％の０．０１だけがその包装にそれらのＦＴＣタール率及びニコチン率を印刷した（FTC Cigarette Report for 2000, 2002, p. 15）。
【００４４】
１９９８年版FTC ReportでＦＴＣの概数にする手順がこれら２つのブランドスタイルの
ＴＮＲを５にした原因であり、先行技術を正確に反映してないと思われることのさらなる証拠は、Ｃａｒｌｔｏｎ（登録商標）１００フィルターソフトパックというブランドスタイルのハードパック版が１ｍｇのタール及び０．１ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１０）という率を記載していることである。ソフトパック版について「０．２」ｍｇのニコチンの概数は実際には手を加えていない数値では０．１５ｍｇのニコチンに近かったということが予想され得る。同様に、Ｎｏｗ（登録商標）キングフィルターソフトパックのメントール版は１ｍｇのタール及び０．１のニコチンという率で記載されているが、これもまた非メントール版について「０．２」のニコチンの概数は手を加えていない数値ではおそらく０．１５ｍｇのニコチンに近かったことを意味する。同じく、２０００年、２００１年、及び２００２年版FTC reportに記載される正確なＣａｒｌｔｏｎ（登録商標）（１００フィルターソフトパック）ブランドスタイルは、１９９８年版FTC reportに記載されるとおりの１ｍｇのタール及び０．２ｍｇのニコチン（ＴＮＲ５）ではなく、１ｍｇのタール及び０．１ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１０）を生じる。
【００４５】
１ｍｇのタールを生じる１２のブランドスタイルのうちの１０（全部で１，２９４のうち）は、０．１ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１０）も生じる。残りの２つは、上記で記載している（Ｃａｒｌｔｏｎ（登録商標）１００フィルターソフトパック及びＮｏｗ（登録商標）キングフィルターソフトパック）。タール側におけるＦＴＣの概数にする手順は、これら２つの非常に低量のブランドスタイルのＴＮＲを下げることに寄与している可能性があり、おそらくそうである。製造元は、これらの１ｍｇタールのブランドスタイルについて、ブランドの包装に１ｍｇのタールレベルと載せることができることと紙巻たばこが実際に（概数にすることなく）１ｍｇ又はそれより少ないタールを生じることの負の風味条件とが釣り合う、約１．４ｍｇのタール及び０．１４ｍｇのニコチンの量を標的としているようである。このことが、おそらく、非常に類似したブランドスタイル（ソフトパックに対してハードパック、及び非メントールに対してメントール）が、概数にすることによって１つの結果か別の結果になってしまう（ＴＮＲ１０に対して５を有する）理由である。このように、これら２つのブランドスタイルは、先行技術を反映していないようである。
【００４６】
１９９８年版FTC reportで８未満のＴＮＲを有した第３のブランドスタイルは、Ｏｌｄ
Ｇｏｌｄ（登録商標）フィルターなしハードパックであり、これは５．５５というＴＮＲを有する（１０ｍｇのタール及び１．８ｍｇのニコチン）。フィルターなしブランドスタイルについてのこの記載は誤りのように見える。１９９８年版FTC reportには７２個のフィルターなしブランドスタイルが記載されている。これらのうち、Ｏｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）フィルターなしハードパックに次ぐ最も低いＴＮＲは、Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｏｖａｌｓ（登録商標）フィルターなしハードパックであり、これは１３というＴＮＲ（２６ｍｇのタール及び２．０ｍｇのニコチン）を有する。実際、フィルターなし群の７２個のうち、Ｏｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）フィルターなしハードパック以外で、最も低いタール量は、Ｐｉｃａｙｕｎｅ（登録商標）レギュラーフィルターなしソフトパックフルフレーバーである。このブランドスタイルの量は、１８ｍｇのタール及び１．２ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１５）である。
【００４７】
ＦＴＣへの情報公開請求の自由により、２００３年１０月にＦＴＣは、１９９９年〜２００２年について同様な報告を公表した。Ｏｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）フィルターなしハードパックブランドスタイルは、この４年分についてのFTC's reportのいずれか１つにも、又は１９９７年版FTC Reportにも含まれていなかった。これら５つのFTC Report（１９９７年、１９９９年、２０００年、２００１年、及び２００２年）に記載される唯一のＯｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）フィルターなしブランドスタイルは、Ｏｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）フィルターなしソフトパックで、これは１９９７年版では２５ｍｇのタール及び１．８ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１３．８）を生じ、１９９９年版では２６ｍｇのタール及び１．９ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１３．６８）を生じ、２０００年版では２７ｍｇのタ
ール及び１．９ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１４．２）を生じ、２００１年版では２７ｍｇのタール及び２．０ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１３．５）を生じている。ソフトパックフィルターなしブランドスタイルがハードパックブランドスタイルと実質的に（または無視できるぐらいでさえ）異なるレベルのタールを生じる理由はない。２００２年版FTC ReportにはＯｌｄ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ブランドスタイルは記載されなかった。
【００４８】
２００２年版FTC Reportに関して、１，２５０個のブランドスタイルのうち、以下の４つだけが、計算して８未満のＴＮＲを有する：
・Ｍｅｒｉｔ（登録商標）キングフィルターウルティマ：１ｍｇのタール、０．２ニコチン（ＴＮＲ５）
・Ｎｏｗ（登録商標）キングフィルターメントールソフトパック、ウルトラライト：１ｍｇのタール、０．２ニコチン（ＴＮＲ５）
・Ｎｏｗ（登録商標）キングフィルターソフトパック、ウルトラライト：１ｍｇのタール、０．２ニコチン（ＴＮＲ５）
・Ｎｏｗ（登録商標）１００フィルターソフトパック、ウルトラライト：２ｍｇのタール、０．３ニコチン（ＴＮＲ６．６６）。
【００４９】
Ｍｅｒｉｔキングフィルターウルティマとして別の全く同じブランドスタイルもまた記載されているが、しかしこれは１ｍｇのタール及び０．１ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１０）を生じる。これらのブランドスタイルでＴＮＲが低いのは、１９９８年版FTC reportに記載されたのと同じような理由であり、先行技術を正確に反映しているとは思えないと考えられる。２００２年版FTC report中、全部で５つのブランドスタイルのみ（１，２５０個のうち）が、計算して８より大きく１０未満のＴＮＲを有する。これらは、３つのＣａｎａｄｉａｎ  Ｐｌａｙｅｒｓ（登録商標）、１つのＣａｒｌｔｏｎ（登録商標）、及び１つの他のＭｅｒｉｔ（登録商標）である。
【００５０】
紙巻たばこＰＲＥＰの最近の傾向はタバコの煙の選択された発癌物質を低減させている。米国に最近導入された２つの紙巻たばこＰＲＥＰ：Brown & Williamson Tobacco Company製のＡｄｖａｎｃｅ（登録商標）、及びVector Tobacco, Inc製のＯｍｎｉ（登録商標）。Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）は、特殊化フィルター濾過技法と併用して、特許取得（米国特許第５，８０３，０８１号、第５，８４５，６４７号、第６，１３５，１２１号、第６，２０２，６４９号、第６，３１１，６９５号、第６，３３８，３４８号、第６，３５０，４７９号、第６，４２５，４０１号、ＲＥ第３８，１２３号、及び第６，５６９，４７０号を参照）及び特許出願係属中（米国公開番号第２００２０１７４８７４号及び２００３００１８９９７号を参照）のタバコ葉乾燥技法を用いてタバコ特有のニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の低減を達成している。
【００５１】
Ｏｍｎｉ（登録商標）は、充填材及び活性炭フィルター濾過に加えてパラジウム触媒系（米国公開番号第２００３００００５３８号を参照）を用いることにより、多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、ＴＳＮＡ、及びカテコールを低減させる。Ｏｍｎｉ（登録商標）キングサイズフルフレーバーは、１５ｍｇのタール及び１．０ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１５）を有する。Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）ライトキングボックスは、１０ｍｇのタール及び０．８ｍｇのニコチン（ＴＮＲ１２．５）を有する。
【００５２】
ＰＲＥＰの設計における主なジレンマは、従来の紙巻たばこと比較してＰＲＥＰの、もしあれば、低減された危険性を理解するために何年もの臨床研究が必要になるかもしれないということである。このことは、タバコの煙送達全てを低減してはいないがタバコの煙中のある化学化合物のみ低減しているＡｄｖａｎｃｅ（登録商標）及びＯｍｎｉ（登録商標）と同様なＰＲＥＰに特に当てはまる。
【００５３】
多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）は、タバコで天然に見いだされる脂質及びテルペン類の不完全燃焼の結果物である。科学界は、これらの化合物がタバコの煙中の強力な発癌物質であると考えている。タバコに特有のニトロソアミンは、タバコ乾燥プロセス中、及び喫煙中に形成される（Hoffman, D., Dong, M., & Hecht, S. S. (1977),「タバコの煙中の、タバコ特有の発癌物質であるＮ−ニトロソノルニコチンの起源（Origin in tobacco smoke of N-nitrosonornicotine, a tobacco-specific carcinogen）」、Brief communication, J. Natl. Cancer Inst., 58, 1841-4）。これらもまた強力な発癌物質と考えられる。ＴＳＮＡは、ニトロソ化（nitrosating）剤とタバコで天然に見いだされるアルカロイドとの間の反応により形成され、これもまたタバコの煙中の発癌物質である。（米国公開番号第２００４０１４４３９７号）。
【００５４】
これらの強力な発癌物質を低減したとしても、タバコの煙中には多くの他の発癌物質が依然として存在し、それらの技法はこれらを扱っていない（address)。同じく、癌を引き起こさないだろうが、ヒトの健康の他の態様（心血管疾患及び呼吸疾患など）に有害な多くの他の化合物が低減されていない。
【００５５】
Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）及びＡｃｃｏｒｄ（登録商標）は、従来の紙巻たばこの喫煙に可能な限り近づけた、ただしタバコの燃焼（熱分解）が最小限又はない喫煙経験を提供する。これらの製品で意図される利点は、従来の紙巻たばこでタバコの燃焼から生じる化合物の形成の明らかな減少である。これらの化合物は、一般に、喫煙者に有害であると認められる。これらの２つのブランドは従来の紙巻たばこのように喫煙しないので、市場にそれほど受け入れられていない。
【００５６】
これら製品の両方における喫煙経験は、以下の概念に依存する。どちらの製品も煙のエーロゾルは、タバコを燃焼させることよりも、高含量でグリセリンを含有するタバコ材料を加熱することにより形成される。グリセリンが加熱されると、すぐに気化して、紙巻たばこの煙と外観及び感触が非常に類似した吸入可能なエーロゾルを形成する。さらに、これら製品に含有されるタバコ材料の加熱は、タバコに特有の揮発性風味ならびにニコチンを放出するだろう。任意の添加されたタバコ揮発性香味剤が同様に煙エーロゾル中に放出され得る。
【００５７】
Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）及びＡｃｃｏｒｄ（登録商標）は、これら製品のそれぞれに含有されるタバコ材料に熱をかけるのに異なった方法を用いる。Ａｃｃｏｒｄ（登録商標）は、ライターとして既知である、電池、回路、及びヒーターを備えるデバイスに依存し、これがデバイスに挿入された紙巻たばこに熱をかける。Ａｃｃｏｒｄ（登録商標）は、デバイスに挿入された紙巻たばこ当たり６回の一服動作を送達するような様式で設計される。適切な性能のためには、このデバイス用に特別に製造された紙巻たばこが用いられなければならない。
【００５８】
Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）は、燃焼性炭素チップに依存し、これが、点火されると、製品に含有されるタバコ材料から煙エーロゾルを形成するための熱源を提供する。Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）製品は、従来の紙巻たばこと比較すると燃えて灰にならないことを除けば、従来の紙巻たばこと類似した外観を有する。
【００５９】
これら製品の両方がＦＴＣ法を介してタール及びニコチン送達を決定しようと試みたときに難問を提起する。吸いさし長の決定は、どちらの製品も一服動作を行う際に消費されないので無意味である。各製品での一服動作回数はそれらの設計の性質により限定される。Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）では、一服動作回数は炭素熱源により調節される。Ａｃｃｏｒｄ（登録商標）は、６回の一服動作に電子的に限定される。最後に、Ａｃｃｏｒｄ（登録商標）は、ＦＴＣ法で規定されるようには「点火」されない。
【００６０】
遺伝的に改変されることなくニコチン含量が高いニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）をニコチアナ・タバカムと交雑させて新規植物を創出することが可能であることは既知である（Wernsman, E. A. , et al., 「栽培品種開発の原則（Principles of Cultivar Development）」, Volume 2, Crop Species, Ed. W. R. Fehr, Macmillan, New York 1987）。Ｙ−１タバコは、米国農務省により最初に、部分的に開発されたが、この交雑の例である。しかしながら、このような変種では、トランスジェニック手段によるニコチン増加タバコよりも、作り出すのに多くの年数がかかる。植物交雑技法に対してトランスジェニック手段でニコチン増加タバコを作り出すことの他の利点は、任意の種類の商品化タバコ（黄色種、バレー種、及び東洋種）又はタバコの品種（もしくは変種）でトランスジェニックプロセスを行い、それにより、遺伝的改変の前にタバコ親株の形質の大部分を維持することができる。Ｎ．タバカム変種の望ましい商品特徴はＮ．ルスチカと交雑させた場合に負の影響を受ける。
【００６１】
図３は、米国で喫煙に関連した死亡全てのうち３６．４％だけが癌によるものであることを示すが、国民の認識では、癌が喫煙の最大の有害な健康影響である。実際には、心血管疾患が４２．４％の、呼吸疾患が２１．２％のこのような死亡を引き起こしている。疫学的研究は、吸入した煙の合計量が減少すると危険性が実質的に低下することを示す（U.S. Surgeon General, 1964,1979, 1989）。多くの毒素のうちどれが特別有害な影響を引き起こすのかは現在未知であるため、単に発癌物質である煙成分が少量なだけではなく効果的なＰＲＥＰを作り出して喫煙者へのタバコの煙の全送達を低減することが有益である。
【００６２】
IOM reportは、「ニコチンがタバコ製品の成功を決定づける要因の１つである」と結論づけている。（p.29）。したがって、タバコのより毒性のある構成成分を減らしながらもニコチンの満足なレベルを維持することは、害悪減少の別の総合戦略であろう（IOM Report p.29）。紙巻たばこ当たり吸入されるタバコの全煙の用量を減少させることにより、且つ／又は１日当たり喫煙する紙巻たばこ数を減らすことにより、全ての発癌物質及び有害なガスは同様な割合で減少する。タバコの煙の全送達の低減を完遂する最も有効な方法は、喫煙者の埋め合わせ傾向を考えると、紙巻たばこのＴＮＲを低減することである。ＴＮＲ低減紙巻たばこでは、タール及び一酸化炭素を含む喫煙者が吸引するタバコの全煙の一服動作当たりのレベルは、喫煙者の要求するニコチンレベルを維持しながら、多くの場合、減少する。
【００６３】
疫学的証拠より、危険性は、喫煙した紙巻たばこの量と線形に関連する。用量の減少の証拠は、有害性の低い紙巻たばこの規定の基盤となるはずである（Gori, 2002 Coresta Congress）。「用量応答関係」は、疾患危険性回帰と曝露回帰との間の関係として定義される（例えば、用量が多いほど、疾患の発生率が高い）。「現在入手可能なデータは、有害性減少可能性の評価のためにモニタリング可能である、タバコの全煙への曝露と主要な疾患との間の用量応答関係の、見積もりを、たとえ不正確であるにしろ、可能にする」（p.9, IOM Report）。用量応答関係は現在タバコの全煙に関して存在するため、喫煙者へのタバコの全煙送達を低減し得る低ＴＮＲ紙巻たばこの有益性は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの公衆衛生監督機関により迅速に評価及び承認され得る。
【００６４】
図２において、１５ｍｇというＦＴＣ法によるＭａｒｌｂｏｒｏ（登録商標）フルフレーバーキングのタール量を１１ｍｇというＦＴＣ法によるＭａｒｌｂｏｒｏ（登録商標）ライトキングのタール量と比較すると、４ｍｇのタール低減が観測される。このことは、表面的には、軽い製品に切り替えることにより喫煙者が４ｍｇ少ないタールを吸入するということを示すかもしれない。しかしながら、それぞれ１３．６４及び１３．７５のＴＮＲ値は、紙巻たばこ当たりのニコチン１ｍｇ当たり吸引されるタール量という点で、切り
替えによる改善がないことを示す。フルフレーバー紙巻たばこから軽い又は非常に軽い紙巻たばこへ、及び軽い紙巻たばこから非常に軽い紙巻たばこへ切り替えた場合埋め合わせが起こる可能性があるため、ＴＮＲ値は、ヒトの喫煙挙動に関して紙巻たばこブランドの真の煙送達のより正確な表示を提供し得る。
【００６５】
喫煙者の動機は、風味、美的、及び行動誘因などの多様な要因にまで及び、ニコチンの薬理学的報酬が群を抜いて最も顕著であることが既知である。極度に低量の紙巻たばこを除いて、喫煙者は、一般に、標準ＦＴＣ喫煙機械での機械収量に関わらず、どのブランドの紙巻たばこからでも平均で約１ｍｇのニコチン（紙巻たばこ当たり）を利用しようとする（Gori, pg.3, 「事実上安全な紙巻たばこ−一度無惨にも却下されたものの機会を復活させる（Virtually Safe Cigarettes-Reviving an Opportunity Once Tragically Rejected）」, 2000）。「喫煙者がどのくらいのニコチンを吸入できるかの限界は紙巻たばこ当たり約２ｍｇである。紙巻たばこ当たりの一服動作回数は平均して８回前後である。したがって、一服動作当たり２５０μｇのトップ送達で、ピーク需要を満足させるのに十分であるだろうが、通常喫煙者はこの最大送達未満で抽出及び吸引をするだろう」（Gori, Gio,「有害性の低い紙巻たばこ（Less Hazardous Cigarettes)」, Tobacco Reporter, p.31, June, 2004）。
【００６６】
British Medical Journal article (BMJ, 1976 volume 1, pp.1430-1433)において、及び1980 Banbury Report (#3 A Safe Cigarette, pp.297-310)においても再び、Michael Russellは、当時市場で入手可能な紙巻たばこのより安全な代替物として、低タール、中ニコチン、かつ低一酸化炭素の紙巻たばこを推奨した。ドイツタバコ産業のインターネット文書調査の総説は、科学者等が安全な紙巻たばこほどニコチン対タール比が大きい（ＴＮＲが低い）と考えていたことを示した（Tobacco Control 2000; 9: 242-248, pg.4）。
【００６７】
望ましい曝露低減紙巻たばこは、受け入れられる風味を維持しながら、可能な限り清浄かつ効率的に、紙巻たばこ当たり喫煙者の所望するレベルのニコチンを送達するはずである。事実、喫煙者は満足できる量のニコチンを得ながらもより少ないタバコの全煙を吸引するので、「逆の埋め合わせ」が低ＴＮＲ紙巻たばこを用いた多くの状況で生じる可能性がある。「逆の埋め合わせ」は、タバコの煙中のニコチンの存在の増加による、より集中していない喫煙として定義される。
【００６８】
低ＴＮＲ紙巻たばこは非喫煙者にも有益であるだろう。喫煙者へニコチンをより効率的に送達することにより、１日当たりより少ない紙巻たばこが喫煙される可能性があり、各紙巻たばこの喫煙がより少なくなる可能性があり、このことはより少ない副流煙（火のついた紙巻たばこの先から上るもの、ほとんどは一服動作と一服動作の間）及びより少ないタバコの環境煙（空気中に存在する煙、吐き出された主流煙及び副流煙からなる）をもたらす。主流煙（タバコの全煙の主流）は、（喫煙者の）「口」又は一服動作された紙巻たばこの吸いさし(フィルターチップ（filter tip））から出現するものである (IOM Report p.283)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００６９】
したがって、同じだけの有害なタール及びガスなしに、ニコチンの薬理学的効果をより効率的に送達し得る低ＴＮＲ紙巻たばこの必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００７０】
［発明の概要］
本発明は、ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物又は植物部分を含み、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比（ＴＮＲ
）を有する紙巻たばこを提供する。ニコチン増量トランスジェニック植物又は植物部分は、トランスジェニック植物もしくは植物部分を産生する形質転換されていない親植物又は親植物部分と比較して増加したニコチンを示し、トランスジェニック植物又は植物部分でのニコチン産生をアップレギュレートする異種核酸を少なくとも１つ含有して発現する。ニコチン増量トランスジェニック植物又は植物部分は、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して、タバコにおけるニコチン生合成に要求される酵素の少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含有して発現し、トランスジェニック植物又は植物部分は、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して増加したレベルの酵素、及び形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して増加したニコチン含量を示す。
【００７１】
酵素は、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）からなる群より選択されてもよい。植物種はニコチアナ・タバカムであってもよい。
【００７２】
紙巻たばこは、約１ｍｇのタール及び約０．１２ｍｇと約０．３４ｍｇとの間のニコチン、約２ｍｇのタール及び約０．２５ｍｇと約０．６８ｍｇとの間のニコチン、約３ｍｇのタール及び約０．３６ｍｇと約１．０ｍｇとの間のニコチン、約４ｍｇのタール及び約０．５ｍｇと約１．３６ｍｇとの間のニコチン、約５ｍｇのタール及び約０．６２ｍｇと約１．７ｍｇとの間のニコチン、約６ｍｇのタール及び約０．７５ｍｇと約２．０ｍｇとの間のニコチン、約７ｍｇのタール及び約０．８７ｍｇと約２．３３ｍｇとの間のニコチン、又は約８ｍｇのタール及び約１．０ｍｇと約２．６６ｍｇとの間のニコチンを生じることができる。本発明はまた、ニコチアナ属の種のニコチン増量トランスジェニック植物又は植物部分を含む紙巻たばこを含む。
【００７３】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して、アルカロイドの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、この植物をニコチアナ・タバカム種の植物と交雑させて子孫植物を得ることと、この子孫植物を含む紙巻たばこを製造することとを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。紙巻たばこは、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比を有することができる。
【００７４】
本発明はまた、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチン含量の減少したニコチン低減トランスジェニックニコチアナ・タバカム植物又は植物部分を提供することと、このニコチン低減植物をニコチアナ・ルスチカ植物と交雑させて子孫植物を得ることと、この子孫植物を含む紙巻たばこを製造することとを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。子孫植物又は植物部分は、トランスジェニック植物又は植物部分を産生したニコチアナ・タバカム植物と比較して、増加したニコチンを示す。子孫植物は、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比を有する紙巻たばこに用いることができる。
【００７５】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチンの増加した、遺伝子組換え植物又は植物部分を提供することと、この植物又は植物部分から再生タバコを生成することと、この再生タバコを含む紙巻たばこを製造することとを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。紙巻たばこは、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比を有することができる。
【００７６】
本発明はまた、ニコチアナ属の中の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分
と比較してニコチンの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、この植物又は植物部分から膨脹されたタバコを生成することと、この膨脹タバコを含む紙巻たばこを製造することを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。紙巻たばこは、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比を有することができる。
【００７７】
本発明はまた、トランスジェニック植物又は植物部分を産生した形質転換されていない親植物又は植物部分と比較して増加したニコチン、及び形質転換されていない親植物又は植物部分を含む対照紙巻たばこと比較してより低いタール対ニコチン量比を示す、ニコチアナ属の種のトランスジェニック植物又は植物部分を含む紙巻たばこを含む。
【００７８】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して、ニコチンの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、このトランスジェニック植物又は植物部分からニコチンを抽出することと、ニコチアナ属の種の植物又は植物部分を提供することと、抽出したニコチンをこの種に加えてニコチン増量植物材料を形成することと、ニコチン増量植物材料を含む紙巻たばこを製造することとを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。ニコチンは、ニコチン有機酸塩（nicotine
salts of organic acids)であってもよい。
【００７９】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して、ニコチンの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、トランスジェニック植物又は植物部分からニコチンを抽出することと、ニコチアナ属の種の第二の植物又は植物部分を提供することと、抽出したニコチンを第二の植物又は植物部分に加えてニコチン増量植物材料を形成することと、ニコチン増量植物材料を含み、かつ抽出ニコチンを添加していない第二の植物又は植物部分を含む対照紙巻たばこと比較してより低いタール対ニコチン量比を示す紙巻たばこを製造することとを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。
【００８０】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して、ニコチンの減少した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、トランスジェニック植物又は植物部分から紙巻たばこ用タバコを製造することと、ニコチンを紙巻たばこ用タバコに加えることと、１グラム当たり約０．５μｇ未満のタバコ特有のニトロソアミンレベルを有する紙巻たばこ用タバコを含む紙巻たばこを製造することとを含む、紙巻たばこを製造する方法を含む。ニコチンは、ニコチン有機酸塩であっても合成ニコチンであってもよい。タバコ特有のニトロソアミンレベルは、タバコ１グラム当たり約０．０５μｇ（５０ｐｐｂ）未満が可能であり、紙巻たばこは約３と約８との間のタール対ニコチン量を有することができる。
【００８１】
本発明はまた、トランスジェニック植物又は植物部分を産生する形質転換されていない親植物又は植物部分と比較して減少したニコチンを示す、ニコチアナ属の種のトランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、このトランスジェニック植物又は植物部分からタバコを製造することと、ニコチンをタバコに加えることと、タバコを含み形質転換されていない親植物又は植物部分を含む対照製品と比較して低いタバコ特有のニトロソアミンレベルを有するタバコ製品を製造することを含む、タバコ製品の製法を含む。ニコチン低減トランスジェニック植物又は植物部分は、形質転換されていない対照植物又は部分と比較して、トランスジェニック植物又は植物部分におけるニコチン産生をダウンレギュレートする異種核酸を少なくとも１つ含有して発現することが可能である。ニコチン低減トランスジェニック植物又は植物部分は、タバコにおけるニコチン生合成に要求される酵素の少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含有して発現することができ、このトランスジェニック植物又は植物部分は、形質転換されていない対照植物又は植物
部分と比較して減少した酵素レベル、及び形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して減少したニコチン含量を示す。タバコ特有のニトロソアミンレベルは、１グラム当たり約１μｇ（１ｐｐｍ）未満が可能である。タバコ製品は、葉タバコ、細断されたタバコ、及び切ったタバコからなる群より選択される形であってもよく、かぎたばこ、パイプタバコ、葉巻タバコ、噛みタバコ、及び紙巻たばこのタバコからなる群より選択されてもよい。
【００８２】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチンの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、このトランスジェニック植物又は植物部分からタバコを製造することと、タバコを膨脹することとを含む、膨脹タバコを製造する方法を含む。
【００８３】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチンの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチンの減少した、トランスジェニック植物又は植物部分、除タンパクタバコ繊維、及び凍結乾燥タバコからなる群より選択される植物材料を提供することと、植物材料を再生することとを含む、再生タバコを製造する方法を含む。
【００８４】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチンの減少した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供すること、及びこのトランスジェニック植物又は植物部分を再生することを含む、再生タバコを製造する方法を含む。植物種は、ニコチアナ・タバカム及びニコチアナ・ルスチカからなる群より選択されてもよい。再生タバコは、さらに再生除タンパクタバコ繊維を含んでもよい。本発明はまた、このような再生タバコを含み、かつ形質転換されていない親植物又は植物部分を含む対照紙巻たばこと比較して減少したＴＳＮＡ量を有する紙巻たばこを含む。本明細書中に使用される場合、ＴＳＮＡは、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴ、及びＮＡＢからなる群より選択されることができ、紙巻たばこは、このような形質転換されていない親植物又は植物部分を含む対照紙巻たばこと比較して減少した収量の、ベンゾ（ａ）ピレン、フェノール類、及びカテコール類からなる群より選択される化合物を有し得る。
【００８５】
本発明はまた、ニコチアナ属の種の、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してニコチンの増加した、トランスジェニック植物又は植物部分を提供すること、及びこのトランスジェニック植物又は植物部分を再生することを含む、再生タバコを製造する方法を含む。この方法は、トランスジェニック植物又は植物部分の収穫後それを凍結乾燥することをさらに含んでもよい。
【００８６】
本発明はまた、低ＴＮＲ紙巻たばこが、消費者に受け入れられ得る製品を製造するのにより助けとなるように、低ＴＮＲ紙巻たばこに用いる新規タバコ変種を作成及び製造する方法を含む。このような変種は、トランスジェニック高ニコチン形質を高還元糖のバックグラウンド及びトランスジェニック高糖形質と組み合わせることを含む。低ＴＮＲ紙巻たばこの消費者受容性を増加させるための他の新規変種は、トランスジェニック高ニコチン形質をトランスジェニック高脂肪酸形質と組み合わせることを含む。このような方法は、低ＴＮＲ紙巻たばこの煙のｐＨを下げる。
【００８７】
本発明はまた、糖、脂肪酸、クエン酸、乳酸、及びリンゴ酸をタバコ又は低ＴＮＲ紙巻たばこの充填材に加えてこのような紙巻たばこの煙のｐＨを減少させることにより、より消費者に受け入れられ得る製品を製造する方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
本発明のいくつかの態様では、喫煙者の満足を維持するために適切な量のニコチンを提供しながらも喫煙者へのタール送達を制限することにより、紙巻たばこのタール対ニコチン量比（ＴＮＲ）を低下させる。その結果、紙巻たばこは好ましくはより有害なタール及びガスとともに満足のいく量のニコチンを喫煙者に効果的に提供する。現在の市販の軽い紙巻たばこ及び非常に軽い紙巻たばこが喫煙者に満足のいくレベルのニコチンを効率的に送達することに失敗していることは、埋め合わせと呼ばれる激しい喫煙挙動をもたらし、これは喫煙者により大きな害をもたらす可能性がある。このような紙巻たばこはタール量とニコチン量を同時に、ほぼ同じ率で低減していることがその理由である。
【００８９】
本発明は、様々なレベルのフィルター濾過及び／又は煙希釈と組み合わせて、紙巻たばこ充填材のニコチン含量を、タバコ植物内で遺伝的に、又は充填材にニコチンを加えるかのいずれかで増加させ、それにより紙巻たばこのタール送達を好ましく低減しながらも紙巻たばこの喫煙者へのニコチン送達を維持するのを可能にすることを提供する。
【００９０】
本明細書中に使用される場合、「ニコチン増量トランスジェニック植物」は、トランスジェニック植物を産生する非トランスジェニック「親」（又は未改変「対照」）植物よりも高いニコチン含量を含む組換え（すなわち「トランスジェニック」）タバコ植物を意味する。
【００９１】
本明細書中に使用される場合、「アルカロイド増量トランスジェニック植物」は、トランスジェニック植物を産生する非トランスジェニック「親」（又は未改変「対照」）植物よりも高い総アルカロイド含量を含む組換え（すなわち「トランスジェニック」）タバコ植物を意味する。
【００９２】
本明細書中に使用される場合、「ニコチン低減トランスジェニック植物」は、トランスジェニック植物を産生する非トランスジェニック「親」（又は未改変「対照」）植物の半分未満、好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満又は１０％未満のニコチン含量を含む組換え（すなわち「トランスジェニック」）タバコ植物を意味する。対応する未改変対照植物と比較して少なくとも１％又は５％のオーダーである小さいレベルでの残留ニコチンが、本発明を実行するのに用いられるこのようなトランスジェニック植物に残存してもよいことが理解されるだろう。
【００９３】
本明細書中に使用される場合、「ニコチン」（Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２）には、ニコチンの類似体（全アルカロイド（単数又は複数）として示されないかぎり）、ニコチンの２種の異性体、合成ニコチン、及びニコチン有機酸塩が含まれる。
【００９４】
本方法に用いられる植物は、ニコチアナ属の種、すなわちタバコであり、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ルスチカ、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・クレベランジ（Nicotiana clevelandii）、及びニコチアナ・アテニュアタ（Nicotiana
attenuata）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に使用される場合、「タバコ」は、ニコチアナ属の任意の植物、種、交雑種、又はハイブリッドを意味し、それらを包含する。タバコの任意の株又は変種が用いられてもよい。このようなタバコ植物は、目的に応じて、ニコチン含量を増加又は低減するように遺伝的に改変され、それらは以下でより詳細に記載される。「植物」という用語は、植物部分、及び植物抽出物、加水分解物などの、それらの物理的部分及び化学的部分を含む。
【００９５】
本明細書中に使用される場合、本発明の「低ＴＮＲ紙巻たばこ」又は「低タール対ニコチン量比紙巻たばこ」は、ニコチン増量組替えタバコ植物又は植物部分を含有する紙巻た
ばこを意味し、このような植物又は植物部分由来のニコチンを含むがそれらに限定されない。
【００９６】
１．低ＴＮＲ紙巻たばこ（ニコチン増量トランスジェニックタバコを用いて）；新規タバコ変種の産生；及びより受け入れられ得る低ＴＮＲ紙巻たばこ
本発明の第一の態様を実行するのに用いられるニコチン増量トランスジェニックタバコ植物は、一般に、異種ヌクレオチドを含有し発現する組換えタバコ植物であり、異種ヌクレオチドの発現は、植物中で酵素（アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ−メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）など）をアップレギュレートし、それにより植物中のニコチン産生を増加させる。適した組換え植物は、M. Conkling et al., ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９８／５６９２３号（１９９８年１２月１７日公開）及びM. Timko, ＰＣＴ出願第ＷＯ  ００／６７５５８号（２０００年１１月１６日公開）に開示されている。一般に、異種ヌクレオチドは、アップレギュレートされるべき酵素をコードする核酸の少なくとも一つのセグメントを含む。
【００９７】
この実施形態において、ニコチン増量タバコは紙巻たばこの充填材に組み込まれて所望の低ＴＮＲ紙巻たばこを達成する。フルフレーバーロッド、好ましくは軽いロッド、より好ましくは非常に軽いロッドの組合せで、ニコチン増量タバコ（従来のタバコの混合物を含んでもよい）紙巻たばこは、より少ないタール及び有害ガスを送達しながらも紙巻たばこ当たり喫煙者の所望量のニコチンを今度は効率的に送達することができる。本発明の低ＴＮＲ紙巻たばこはまた、フィルターなしロッドを用いることで達成可能でもある。なぜなら、フィルターなし紙巻たばこの喫煙者は、依然増加して存在するニコチンを有するだろうし、場合によってはタール及び有害ガスの吸入が減少するからである。したがって、ＴＮＲ低減紙巻たばこは、本発明のＰＲＥＰの主なゴールである。
【００９８】
１つの具体的な実施形態は、形質転換されていない対照植物に対して増加したキノラートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＲＴアーゼ）の発現を有するニコチン増量組換え植物を用い、このような組換え植物は、５'から３'方向へ、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物キノラートホスホリボシル転移酵素ｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡ構築物を含有する組換え植物細胞を含み、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合し、このような植物は、形質転換されていない対照植物と比較して増加したＱＰＲＴアーゼの発現及び形質転換されていない対照植物と比較して増加したニコチン含量を示す。
【００９９】
別の実施形態は、形質転換されていない対照植物に対して増加したプトレスシンＮ-メチル転移酵素（ＰＭＴアーゼ）発現を有するニコチン増量組換え植物を用いて実行されてもよく、このような組換え植物は、５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物ＰＭＴ  ｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡ構築物を含有する組換え植物細胞を含み、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合し、かつこのような異種ＤＮＡはセンス方向又はアンチセンス方向であり、このような植物は、形質転換されていない対照植物と比較して増加したＰＭＴ発現及び形質転換されていない対照植物と比較して増加したニコチン含量を示す。
【０１００】
さらに他の実施形態を、上記に記載される他の酵素を用いて同様に実行することができる。
【０１０１】
上記に記載される核酸構築物は、例えば、Thompson et al.に対する米国特許第６，１００，４４８号、及び同第６，０３７，５２５号に記載されるように、上記に記載される構築物の上流（５'側）及び／又は下流（３'側）にインスレーター成分（insulator element）を含んでもよい。また、上記に記載されるような構築物は、（例えば、）Thompson et al.に対する米国特許第５，７７３，６９５号及び第５，７７３，６８９号に記載されるように、上記に記載される構築物の上流及び／又は下流に、マトリクス（又は足場）付着領域を含んでもよい。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、用いられる植物は、ニコチン合成経路で複数の酵素をアップレギュレートする複数の組換え核酸を含んでもよい。したがって、少なくとも１つの組換え核酸を保持するとして記載された植物は、これら複数を含有するものを包含することができる。１つより多い組換え核酸を利用することの有益性は、（このような核酸が１つだけ用いられた場合に対して）ニコチン又は他のアルカロイドレベルをより大きなレベルに増加させることができ、もし所望であれば、所望の異なるアルカロイド比（例えば、ニコチン対全アルカロイドの比）に適応され得ることである。
【０１０３】
別の実施形態において、同じ植物又は細胞は、ニコチン又はアルカロイド合成経路で酵素をダウンレギュレートする少なくとも１つの組換え核酸を含有するが、ニコチン又はアルカロイド合成経路で酵素をアップレギュレートする少なくとも１つの組換え核酸を含有してもよい。例として、ＰＭＴがアップレギュレートされてＱＰＴがダウンレギュレートされる場合、ニコチン対全アルカロイド比は増加する。この比は好ましくは、ＮＡＴ、ＮＡＢそしておそらくは他のＴＳＮＡの形成を防ぐのに有利であるものにできるだけ近い。図５及び図６を参照。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明は、形質転換されていない対照植物に対して増加したＱＰＲＴ発現及び増加したＰＭＴ発現の両方を有するニコチン増量組換え植物を用い、このような組換え植物は、（ｉ）５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物キノレートホスホリボシル転移酵素ｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む第一の外来ＤＮＡ構築物、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合する、及び（ｉｉ）５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物ＰＭＴ  ｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む第二の外来ＤＮＡ構築物、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合する、を含有する組換え植物細胞を含み、このような植物は、形質転換されていない対照植物と比較して増加したＱＰＲＴ発現及び増加したＰＭＴ発現ならびに形質転換されていない対照植物と比較して増加したニコチン含量を示す。本明細書中に使用される場合、ＱＰＴ、ＱＰＲＴ、及びＱＰＲＴａｓｅは、相互交換可能に用いられる。ＰＭＴ及びＰＭＴアーゼもまた、相互交換可能に用いられる。
【０１０５】
これらの実施形態を実行するのに用いられ得る組換え植物の例として、タバコキノレートホスホリボシル転移酵素遺伝子（ＮｔＱＰＴ１）をコードするＤＮＡ（例えば、Conkling et al.によるＰＣＴ出願第ＷＯ  ９８／５５５６９２３号を参照）、タバコプトレスシンＮ-メチル転移酵素（ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、及びＰＭＴ４など）をコードするＤＮＡ、タバコアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ１及びＡＤＣ２など）をコードするＤＮＡ、タバコオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードするＤＮＡ、タバコＳ-アデノシルメチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）をコードするＤＮＡ、タバコＮＡＤＨ脱水素酵素をコードするＤＮＡ、及びタバコホスホリボシルアントラニレート異性化酵素（ＰＲＡＩ）をコードするＤＮＡで形質転換された既知の植物が挙げられるが、これらに限定されない（これらは既知であり、M.Timko et al.によるＰＣＴ出願第ＷＯ  ００／６７５５８号に記載される）。
【０１０６】
米国特許第６，４２３，５２０号、同第６，５８６，６６１号、同第５，２６０，２０５号、同第５，３６９，０２３号、同第５，６６８，２９５号、及び米国特許出願公開第２００３００１８９９７号もまた、ニコチン生合成経路においてＱＰＲＴ又はＰＭＴのいずれかを遺伝子的に改変することによりタバコ植物のニコチン含量を変える方法を記載する。
【０１０７】
上記の方法それぞれで形質転換された個々のニコチン増量タバコ植物のニコチン含量は様々である。したがって、約６．２％のニコチン含量（乾燥重量基準で）を有するタバコ植物株が望まれる場合、このようなニコチン含量を有するホモ接合型植物を得るために、当業者にとって理にかなった数の遺伝的植物形質転換が行われる。
【０１０８】
単一の導入遺伝子座を含有する一次形質転換体の自家受粉による種子は３つの異なる遺伝子型を有する。なぜなら導入遺伝子（それが高ニコチンを授ける）は１：２：１に分離し、２５％は導入遺伝子を保有せず、５０％は導入遺伝子についてヘテロ接合性になり、そして２５％が導入遺伝子についてホモ接合性になるからである。ヘテロ接合性クラスの種子の子孫も再び１：２：１に分離する。ホモ接合性クラスの種子がさらなる繁殖に最も有用である。なぜならそれらの子孫全ての１００％が導入遺伝子を保有する（植物が自家受粉する場合は２つのコピー、そしてホモ接合性トランスジェニック植物が非トランスジェニック親と交雑する場合は１つのコピー）からである。ホモ接合性子孫の自家受粉による種子が実地で栽培された場合、それらは同様な気候、土壌、及び栽培条件下で成長した親植物と非常に類似した、増加したニコチン含量を含有する。
【０１０９】
ニコチン増量タバコを産生するこのような遺伝的実施形態は、市販のニコチン増量タバコ製品で実施するのに、ニコチン又はニコチン有機酸塩を加工されたタバコに直接加えるよりも経済的である。同様に、トランスジェニックニコチン増量タバコもまた、合成ニコチン又はニコチン類似体を加えるよりも経済的である。労働力、時間、及び様々な他の資源が節約される。なぜならニコチン抽出用のさらなるタバコの育成、ニコチンの抽出、そしてこのようなニコチンを加工されたタバコに加えることを行う必要がないからである。いったん形質転換植物が作られると、それらは要求されるさらなるニコチンを非常に効率的に内部産生し、さらなる追加コストがかからない。
【０１１０】
ニコチン及びニコチン有機酸塩をタバコ製品に加えること（米国特許第４，８３０，０２８号、同第４，８３６，２２４号、及び同第５，０３１，６４６号に提案されるような）は、米国を始めとする多くの国で、現在禁止されている。多くの国で、ニコチン及びニコチン有機酸塩はタバコ製品用に許可された添加物の一覧に載っていない。本明細書中用いられる「タバコ製品」という用語は、紙巻たばこ、葉巻、紙巻たばこタバコ、パイプタバコ、噛みタバコ、嗅ぎたばこ、ロゼンジ及びニコチン代替療法に用いられるニコチン代替製品ではない任意の他のニコチン送達手段を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
上記の低ＴＮＲ紙巻たばこ実施形態の別の利点は、ニコチン増量タバコが、ニコチン源からニコチンを機械抽出し、それを輸送し、そしてそれを加工中のタバコに加えることよりも安全であるということである。なぜならニコチンはその純粋な形態では毒性が高い。ニコチンは容易に酸化されるためその純粋な形態に維持することが難しい。純粋なニコチンの貯蔵はコストと危険性を増す。
【０１１２】
上記方法の起こり得る不利点は、高レベルのアルカロイドから産生される、ニトロソアミン前駆体であるＴＳＮＡの増加であり得る。これは、ＴＳＮＡが含まれる全煙の送達の低減により相殺される。ＴＳＮＡは、タバコの煙中の複数の発癌物質のうちの１つのクラスにすぎない。適切な乾燥法は、低ＴＮＲ紙巻たばことともに、この起こり得る不利点を受容可能なレベルに下げる (Peele, D. M.,他、「黄色種タバコにおけるタバコ特有ニト
ロソアミンの形成（Formation of Tobacco Specific Nitrosamines in Flue-Cured Tobacco）」, CORESTA 1999 AGRO-PHYTO Proceedings, Suzhou, China 1999)。
【０１１３】
低ＴＮＲ紙巻たばこが喫煙者への全煙（タール及び有害なガスを含む）送達において、従来の平均的な軽い又は非常に軽い紙巻たばこと比較して３５％の低減をもたらす場合、そのＴＳＮＡの量はわずかにそれより高いものの、この実施形態が顕著な危険性低減の利点を有することを疫学的研究が最終的に証明すると仮定することができる。
【０１１４】
この実施形態の低ＴＮＲ紙巻たばこは、好ましくは、上記で記載されるように導入遺伝子を欠く変種又は栽培品種と比較して増加したニコチンレベル、及び乾燥による、広く市販化されている変種及び栽培品種により示される糖含量（content value）の範囲に対して非常に高い還元糖含量を特徴とする表現型を有するトランスジェニックニコチアナ・タバカム変種又は栽培品種由来のタバコ材料を用いる。タバコ変種の還元糖含量の好ましい範囲は、約１１％〜約２０％、又はより好ましくは２０％超である。このような糖含量の非常に高いＮ．タバカム変種の例は、Ｋ３９４、ＮＣ２３２６、及びＧＬ９３９であり、これらは、３年平均で、乾燥後、それぞれ１５．７％、１５．５％、及び１５．２％の還元糖含量を有する(2000 Official Flue-Cured Variety Test at the University of Georgia, Tifton)。
【０１１５】
これに関して、「栽培品種」及び「変種」という用語は、Ｎ．タバカム種内の植物群を示すのに同義的に用いられ、それらは、この種内の代表形態から、及び他の可能な変種から、それらを区別するある一定の特徴を共有する。少なくとも１つの独自な形質を保持しながらも、変種はまた、後継の世代の子孫の間の形質のメンデルの法則に従った分離に主に基づいて、変種内の個体間で相当な量の全体のバリエーションにより特徴づけることができる。「変種」から識別される「系統」は、一般に（排他的ではないが）、数世代の自家受粉によって個体間で現れるバリエーションが少ない植物群を示す。また、「系統」は、本発明の目的にとって、組織培養技法を用いて単一の親植物から無性で繁殖した植物群を含むように、十分に広く定義される。新規ハイブリッドを開発するためのこのような系統の使用は、米国特許第４，３２６，３５８号、及び同第４，３８１，６２４号に記載される。
【０１１６】
「ニコチン緩衝液」は、紙巻たばこの煙のｐＨを維持する助けとなる。ニコチンは紙巻たばこの煙に存在する主な揮発性塩基であるので、煙のｐＨは知覚において重要な役割を与える。糖はニコチン緩衝液として作用し、増加したニコチンからいかなるきつさ（harshness）も低減する。それゆえ、高い糖含量は、糖がタバコ植物に天然のものであるかタバコ加工中に添加されたもの（例えば、高フルクトースコーンシロップ、スクロース、転化糖、甘草抽出物、カロブ豆及び抽出物、ならびにカカオ及びカカオ抽出物）であるかに関わらず、タバコ植物にとって有益である。
【０１１７】
「還元糖（単数又は複数）」は、遊離の又は遊離する可能性があるアルデヒド又はケトン基を有する任意の糖（単糖類又は多糖類）である。グルコース及びフルクトースは、煙のｐＨを減少させ、「遊離した」非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することにより、紙巻たばこの煙中のニコチン緩衝液として作用する。還元糖は、例えば、ニコチン及び他のタバコアルカロイドの知覚的影響を改変することにより、煙の風味の釣り合いをとる。一般に、糖含量とアルカロイド含量の間には、タバコ変種にわたって同じ変種内で、及び同じ植物系統内で、栽培条件により引き起こされる逆相関が存在する。例えば、タバコの土壌中の窒素が低いほど、ニコチンレベルは低くなるが糖レベルは高くなる。雨が多いと、ニコチンレベルの低下と糖レベルの上昇をもたらす。
【０１１８】
低ＴＮＲの紙巻たばこは、特に喉及び鼻の刺激に関して、きつくて刺激性の煙を出す可
能性がある。このきつさの源は、一般に、煙中の「遊離した」又は「揮発性」非プロトン化ニコチンの量に起因する。一般に、煙のｐＨが５．４で、ニコチンは１００％プロトン化される。煙のｐＨが５．４より増加すると、より多くの「遊離した」ニコチンが煙中に存在し、これがきつさの原因である。紙巻たばこの煙のｐＨは、タバコ充填材の糖及びアルカロイド含量により優先的に決定される。糖の燃焼は、酸性の副生成物を生成し、これがｐＨを下げてきつさを低減する助けとなる。例えば、含有する全てが黄色種タバコである紙巻たばこ（一般に、紙巻たばこが黄色種タバコとバレー種タバコの両方を含有する場合よりも高い糖含量を有する）は、約５．０〜約６．０の煙ｐＨを有し、これは０〜１％の非プロトン化ニコチンを産生すると計算される。
【０１１９】
バレー種（これは一般に黄色種よりも低い含量で糖を含有する）などのニコチンがより高いタバコは、一般に、より高い煙ｐＨを有する煙を生成する。アメリカブレンドの紙巻たばこ（バレー種及びおそらくは東洋種と混合された黄色種タバコ）は、約５．５〜約６．５の煙ｐＨを有し、これは０．３〜３％の非プロトン化ニコチンを生成すると計算される(Morie, G. P., (1972), 「様々なｐＨ値でのタバコの煙中のプロトン化及び非プロトン化ニコチンの画分（Fraction of protonated and  unprotonated nicotine in tobacco
smoke at various pH values）」, Tob. Sci., 16,167.)。したがって、約９未満のＴＮＲを持つトランスジェニック高ニコチンタバコから製造された紙巻たばこは、通常、６．５よりも大きいｐＨを有し、充填材中に十分な糖又は他のニコチン緩衝液が存在しない限り、喫煙者にきついと判断されるかもしれない。糖の非常に多いタバコを用いるか充填材に十分な糖を加えることにより、ｐＨが減少し、低ＴＮＲ紙巻たばこは許容可能な風味を有する。このｐＨ低減は、以下に記載されるとおり、充填材の脂肪酸含量を増加させることによっても完遂され得る。
【０１２０】
本発明の別の実施形態は、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較してアルカロイドの増加した、ニコチアナ属の種のトランスジェニック植物又は植物部分を提供することと、この植物をニコチアナ・タバカム種の植物と交雑して子孫植物を得ることと、そして子孫植物を含む紙巻たばこを製造することを含み、ここで紙巻たばこはＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比を有する、紙巻たばこの製法を提供する。この新規植物の利点は、様々なニコチアナ種のニコチン以外の様々なアルカロイドの増加（独自のニコチン対全アルカロイド比を含む）が、ニコチアナ・タバカムの所望の形質と組合せられることである。例えば、ニコチアナ・グラウカ中の主なアルカロイドはアナバシンである。米国特許第６，５３４，５２７号は、Ｎ．グラウカを、ニコチン渇望を緩和するのに有用であると記載する。
【０１２１】
本発明の別の実施形態は、形質転換されていない対照植物又は植物部分と比較して減少したニコチン含量を有するニコチン低減トランスジェニックニコチアナ・タバカム植物又は植物部分を提供することと、ニコチン低減植物をニコチアナ・ルスチカ植物と交雑して子孫植物を得ることと、そして子孫植物を含む紙巻たばこを製造し、ここで子孫植物又は植物部分は、トランスジェニック植物又は植物部分を産生したニコチアナ・タバカム植物と比較して増加したニコチンを現すことを含む、紙巻たばこの製法を提供する。そして、子孫植物は、ＦＴＣ法又はＩＳＯ法で測定して約３と約８との間のタール対ニコチン量比を有する紙巻たばこを製造するのに用いられる。この新規植物の利点は、これもまた、独自のニコチン対全アルカロイド比を得ることができるということである。
【０１２２】
Wernsman, et al.により、「栽培品種開発の２つの原則：作物種（2 PRINCIPLES OF CURTIVAR DEVELOPMENT: CROP SPECIES）」(Macmillan 1997)に記載されるような従来の繁殖技法に従って、安定な導入遺伝子を含有するタバコ材料から再生された安定な形質転換体を用いて、高ニコチン形質を商業的に許容可能な遺伝子バックグラウンドに遺伝子移入し(introgress)、それにより高いニコチンレベルを、例えば、約１４％〜約２０％、より好
ましくは２０％〜３０％、そしてより好ましくは３０％を超えさえする範囲の非常に高い糖含量と組み合わせたタバコ栽培品種又は変種を得る。この実施形態の目的に関して任意の高糖タバコバックグラウンドが用いられ得るものの、そのようにして得られた栽培品種又は変種は好ましくは黄色種である。交雑及び選択の連続した過程（round）に続いて、高ニコチン及び高糖含量の両方を有する子孫が選択される。
【０１２３】
タバコは遺伝子研究にとって扱いやすいため、植物分子生物学で既知の技法及び方法を用いて、任意の導入遺伝子が、適したタバコバックグラウンドに導入され得る。Miki et al.により「植物分子生物学及び生物工学における方法（METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY）」 (CRC Press 1993)に記載されるとおり、導入遺伝子を任意の遺伝子バックグラウンド中に導入するのに、形質移入、感染、形質転換、自然の取り込み、エレクトロポレーション、及び遺伝子銃の任意のものが用いられる。例として、本実施形態に従って、高糖表現型を与える遺伝子が宿主タバコ植物細胞に導入され、それにより、上昇した糖含量を発現する植物を産生する。例えば、タバコ細胞は、グルコース及びフルクトースのレベル上昇を与える遺伝子などの、糖合成をアップレギュレートする酵素又は転写因子をコードする遺伝子で形質転換される。連続する選択に続いて、糖含量の上昇した子孫植物が選択される。
【０１２４】
本発明の例として、高ニコチン表現型を与える導入遺伝子が、高糖タバコバックグラウンドに導入され得る。ニコチン生合成の増加を与える生成物をコードする任意の遺伝子又は遺伝子の一部が形質転換に用いられ得る。これに関する例は、それぞれアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、メチルプトレスシン酸化酵素（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニレート異性化酵素（ＰＲＡＩ）、プトレスシンＮ-メチル転移酵素（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）、及びＳ-アデノシル-メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）をコードする遺伝子である。高ニコチン表現型を与える導入遺伝子がいったん高糖タバコ植物に導入されると、高ニコチン及び高糖含量の両方について同時分離する（co-segregates）タバコ株を同定及び選択するために、従来の様式で、選択の連続する過程が活用される。ニコチン及び糖含量は、標準方法で分析される。
【０１２５】
別の実施形態において、高ニコチン表現型を与える遺伝子が、上昇した脂肪酸合成を発現する植物中に導入される。既知の植物分子生物学技法を用いて、脂肪酸合成の増加を与える任意の遺伝子又は遺伝子の一部が、形質転換に用いられる。これに関する例は、ステアリン酸及びパルミチン酸をコードする遺伝子などの、飽和脂肪酸合成をコードする及び／又は調節する遺伝子である。子孫植物は、ＰＣＲ、ノーザンブロット分析（northern analysis）及びクロマトグラフィー分析などの当該技術分野で既知である方法を用いて上昇した脂肪酸合成についてアッセイされる。上昇した脂肪酸合成を有する安定系統の同定及び選択に続いて、高ニコチン表現型を与える導入遺伝子がこの脂肪酸合成上昇系統に導入される。高ニコチン及び上昇した脂肪酸含量の両方について同時分離するタバコ系統を同定及び選択するために、従来の様式で、選択の連続する過程が活用される。ニコチンレベル及び脂肪酸レベルは、標準方法で分析される。
【０１２６】
変種又は栽培品種を自家受粉させた場合に、子孫の中で特定の形質の顕著な量の独立した分離が観測されない程度まで、その変種又は栽培品種が特定の形質について遺伝的にホモ接合型であるなら、その変種又は栽培品種は、その特定の形質について「トゥルーブリーディング（true-breeding）」と判断される。この文脈において材料のトゥルーブリーディングの特徴を評価するのに、タバコ品種改良の当業者は、それぞれの作物が同一レベルの日光にさらされないため、タバコ葉の糖レベルが同一系統の植物の中で変化することを理解する。糖レベルの変動性は単一植物内にさえも存在する。つまり、下の方の葉は、通常上にある葉により陰となり、同時に列の端にある植物は、列の中央にある植物よりも
多くの日光を受ける傾向がある。これらの理由のため、糖レベルは一般に、植物で茎の部分を下から上へ上がるにつれて増加する。普通の実験を通じて、当業者（skilled breeder）は、本発明の１つの実施形態に従って、高ニコチンレベル及び非常に高い糖含量についてトゥルーブリーディングである栽培品種又は変種を開発する場合に、これら及び他の条件を考慮に入れる。
【０１２７】
別の実施形態において、本発明から生成される煙中のニコチンの増加に由来するいかなる起こり得るきつさも、タバコ充填材に適量の還元糖を加えることを通じて減少する。代表的には、これらの還元糖は、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、又は甘草の形でタバコ包装に加えられる。乾燥重量に基づいて３．３部前後の糖対１部のニコチンというタバコ充填材の糖対ニコチン比について、最適な結果が一般的に得られる（Status update of sugar/nicotine balance technology assessment (1992) RJ Reynolds documents, Bates 512842551/2）。
【０１２８】
しかしながら、この比は、喫煙者の風味嗜好性に従って、糖／ニコチン比の範囲が約３〜約５の間であるように、調整され得る。先に記載したとおり、糖添加物を調整する場合、低ＴＮＲ紙巻たばこの煙のｐＨ及びその充填材の還元糖含量を検討しなければならない。この分析については、タバコ中のニコチン含量は、抽出及びガスクロマトグラフィーによる分析で決定される。天然のタバコ糖レベルは、抽出及び高速液体クロマトグラフィーによる分析で決定される。乾燥重量に基づいて天然のニコチン及び糖の量を得ることで、所望の比を得るための糖の追加量が決定される。
【０１２９】
別の実施形態において、脂肪酸をニコチン緩衝液として用いてもよい。例えば、ミリスチン酸及びパルミチン酸をタバコ充填材に加えてニコチン緩衝液として機能させてもよい。同様に、高乳脂肪カカオ又はココナッツ油で見いだされるものなどの脂肪酸をタバコ包装に加えてもよい。あるいは、タバコ植物は、タバコ葉組織で脂肪酸の産生を上昇させるように遺伝的に改変されてもよい。
【０１３０】
本発明のタバコ植物が、ＤＮＡ修復又は組み換えを誘導する核酸の導入(Beetham他、 1999; Zhu et al., 2002, WO 03/013226)、又は本明細書中に記載される「ニコチン増量トランスジェニック植物」、「ニコチン低減トランスジェニック植物」、「糖増量トランスジェニック植物」、及び脂肪酸増量トランスジェニック植物と同様な結末をもたらし得る改変ウイルスの導入による特定の核酸配列の標的化変異誘発を通じて、植物又は植物細胞を産生することによりニコチン、糖、又は脂肪酸のレベルが改変されているものの、「トランスジェニック」でなくてもよい、すなわち他の生物由来の核酸配列をそのゲノムに組み込んで含有していなくてもよいことが理解される。標的種又は性的に適合性の種に由来する核酸配列のみが標的植物のゲノムに導入される「正確な品種改良（Precise Breeding）」法（米国特許公開番号第２００４０１０７４５５号）を用いて、本明細書中に記載される「ニコチン増量植物」、「ニコチン低減植物」、「糖増量植物」、及び脂肪酸増量植物を産生することができる。
【０１３１】
２．低ＴＮＲ紙巻たばこ（トランスジェニックニコチン増量植物由来のニコチンの添加による）
本発明の第二の態様は、上記で記載されるとおりのニコチン増量トランスジェニック植物から抽出されたニコチン又はニコチン含有画分を、要求されるレベルで従来のタバコ又はニコチン低減タバコに添加する方法である。
【０１３２】
米国特許第４，８３０，０２８号、同第４，８３６，２２４号、及び同第５，０３１，６４６号は、ニコチン有機酸塩の添加による紙巻たばこ充填材の改変を記載する。詳細には、これらは、タール対ニコチン量比を下げるための、この様式でのニコチンの添加を扱
う。Journal of the American Medical Associationでの Brown and Williamson Tobacco
Companyによる総説(volume 274, No. 3, p. 228,1995)は、米国特許第３、２５８、０１５号、及び同第３、３５６、０９４号（Battelle）の包括範囲であるＰｒｏｊｅｃｔ  Ａｒｉｅｌを記載する。これらの特許は、本発明の紙巻たばこのタール対ニコチン量比を従来の紙巻たばこのものの１／４に低減し得るような様式でニコチンを添加したエーロゾルを記載する。
【０１３３】
ニコチン増量トランスジェニック植物から得られたニコチン含有画分、ニコチン、又はニコチン有機酸塩は、溶解用のプロピレングリコール又は任意の他の溶媒、あるいは水の有無に関わらず、全葉又は切断タバコ片に噴霧するか、又はタバコ加工及び添加物応用の当業者にとって任意の他の方法を用いることにより、従来のタバコ又はニコチン低減トランスジェニック植物に添加される。低ＴＮＲ紙巻たばこの設計において、添加しなければならないニコチン量は以下のものの関数となる：（１）用いられるタバコ混合物のニコチン含量及び種類-アメリカの切断タバコ片混合物は一般に約２〜２．５％のニコチンを含有する、（２）通気性又は多孔性を考慮に入れた紙巻たばこロッドの仕様、（３）紙巻たばこの所望のＴＮＲ、及び（４）所望の具体的なタール収量。
【０１３４】
例えば、紙巻たばこ製造元が、ＦＴＣ／ＩＳＯ法で８ｍｇのタール、及びそこのフルフレーバー（full flavor）ブランドスタイルの量と同じ１．２ｍｇのニコチンを生じる低ＴＮＲ紙巻たばこを作りたいと仮定しよう。そこのフルフレーバーブランドスタイルは１６ｍｇのタールを生じるので、新規ブランドスタイルのＴＮＲについて目標はフルフレーバーブランドスタイルのものの半分である。同じ充填材を用い、そしてニコチンを添加して低ＴＮＲ紙巻たばこを作ることもまた望ましい。
【０１３５】
８ｍｇのタール及び１．２ｍｇのニコチンを生じるために製品開発の間に製造元が最初に添加するニコチン量は、そのフルフレーバーブランドについての充填材のニコチン含量の約２倍もの多さである。軽いロッドの割増しの通気がニコチン量よりもわずかに高い率でタール量を低減するので、充填材のニコチンを２倍にすることはわずかに過剰であるかもしれないことは当業者に理解される。しかしながら、ニコチンは一部、タバコ加工及び紙巻たばこ製造プロセスの間に失われる可能性があるので、ニコチンを２倍にすることは理にかなっているとも言える。このようなタバコがニコチンを添加されてから紙巻たばこ製造まで貯蔵される期間の影響も、評価されなければならない。これらのプロセスの規模及び様式は、各製造元によって異なっているので、試行錯誤が幾分必要になるかもしれないことが理解される。
【０１３６】
通常、紙巻たばこあたり８ｍｇのタールを生じる軽いロッドが、製造者によって最初に選択され得る。望まれる結果は、８ｍｇのタール及び１．２ｍｇのニコチンを生じ、それによりニコチン量を大部分のフルフレーバー紙巻たばこと同じに保ちながら半分より多いタールを削減する紙巻たばこである。
【０１３７】
ニコチン、又はニコチン有機酸塩の添加後のタバコを、約１３％の水分で、選択した量で紙巻たばこ製造機のホッパーに入れる。次いで、紙巻たばこ製造機は、巻いた紙巻たばこを別の機械に送り、それがフィルターの付いてない巻いた紙巻たばこにフィルターをつける。この工程は、フィルターなし紙巻たばこを製造する場合には飛ばされる。
【０１３８】
次いで、完成した紙巻たばこは、ＦＴＣ／ＩＳＯ法を用いて試験されて、最終結果の評価が可能となる。紙巻たばこが８ｍｇのタール及び１．２ｍｇのニコチン（ＴＮＲ６．６６）を生じ、かつ上記の重要な点全てが考慮されているなら、開発は完成されている。紙巻たばこが余剰ニコチンのためフォーカスグループできついと評定されるなら、問題を緩和するのを助けるために添加物を充填材に添加するべきである。
【０１３９】
製造された紙巻たばこが所望の量よりも多く又は少なく生じる場合、小さな調節がなされ得る。これには、紙巻たばこロッドの構成成分のうち１つを変更することを含む。フィルター、紙巻たばこ用紙、フィルター巻取り紙(plug wrap)、チップペーパー（これは紙巻たばこロッドをフィルターに固定する）、通気孔の種類、及び組合せたそれらの対応するバリエーション（variation）を変えることによりロッド構成成分のいくつかを改変してもよい。例えば、紙巻たばこが９ｍｇのタール及び１．３ｍｇのニコチンを生じている場合、フィルター濾過及び／又は希釈をわずかに増加させて、非常によく似た割合でタール量及びニコチン量の両方を低減する。これは、通常、所望量を達成するように通気孔の大きさ及び数ならびにフィルター巻取り紙の多孔性を指定（specify）することにより、達成される。タール量は的中しているがニコチン量が所望するより高いもしくは低い場合、添加されるニコチンのレベルがそれ相応に調節され得る。
【０１４０】
紙巻たばこの大部分のブランドは、充填材の必要部分ではないものの、高級ブランドには約１０％から格安ブランドには約３０％まで、紙巻たばこの充填材に再生タバコを用いている。本発明の別の実施形態は、紙巻たばこにより低いＴＮＲを与える目的で、紙巻たばこ充填材の再生部分にニコチンを添加することである。低ＴＮＲ紙巻たばこに添加するニコチン量の調節は、製造元によって完遂され得る別の変量（variable）である。したがって、充填材のニコチン含量は、充填材中の、タバコのニコチン含量＋任意の再生タバコ（ニコチン増量レコン及び／又はニコチン低減レコン又はその両方を含む）のニコチン含量の関数である。３種の任意の組合せが用いられ得る。
【０１４１】
Philip Morris Document Websiteからの１９７５年の論文 (Bates 2056140416, 表題「低送達紙巻きたばことニコチン／タール比の増加、複製（Low  Delivery Cigarettes and
Increased Nicotine/Tar Ratios, A Replication）」)は、ニコチン／タール比の増加した紙巻たばこの風味パネル調査の結果を記載する。１０ｍｇのタール送達及び０．０９のニコチン／タール比（ＴＮＲ１１に相当）を有する紙巻たばこは、１６．６６のＴＮＲと同等である対照のＭａｒｌｂｏｒｏ（登録商標）フルフレーバー（full flavor）（そのとき、１８ｍｇのタール、１．０３ｍｇのニコチン、０．０６のニコチン／タール比）と受け入れやすさ及び強さにおいて等しかったことが見いだされた。
【０１４２】
上記の実施形態について、ニコチン増量組換えタバコからニコチンを抽出することは、十分量のニコチンを得るために栽培及び加工しなければならない植物がより少ないので、従来のタバコでそうするよりも経済的且つ効率的であることは、当業者に理解される。
【０１４３】
３．タバコ製品中の有害なタバコ特有ニトロソアミンの低減
タバコ産業において、一般にタバコの発癌物質と示されるタバコ特有ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）がタバコの乾燥中に優先的に形成されることは既知である。タバコには他のＴＳＮＡも存在するものの、最も有害であるということで一般に同意される４種は以下のものである：Ｎ'-ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４-（Ｎ-ニトロソメチルアミノ）-１-（３-ピリジル）-１-ブタン-オン（ＮＮＫ）、Ｎ'-ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、Ｎ'-ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）。タバコの乾燥においてＴＳＮＡは、微量アルカロイド前駆体から形成される（Wiernik,他、1995,「タバコの化学組成における空気乾燥の効果（Effect of air-curing on the chemical composition of tobacco）」, Recent Advances in Tobacco Science, 21, 39-80）。本明細書中に使用される場合、タバコ特有ニトロソアミン、すなわちＴＳＮＡは、以下、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴ、及びＮＡＢの群から選択される。
【０１４４】
ＴＳＮＡは、溶媒抽出に続いて化学発光検出を用いたガスクロマトグラフィーで主に分析される（Charles Risner, et al.,「タバコ中のタバコ特有ニトロソアミンの定量（Qua
ntification of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco）」, Tobacco Science, 38
(1- 6), 1994.）。分離及び分析の別の方法は、超臨界流体抽出をガスクロマトグラフィー／質量分析検出とともに用いる（Siqing Song, et al.,「紙巻たばこ中のタバコ特有ニトロソアミンの分析のための超臨界流体抽出及びＧＣ／ＭＳ（Supercritical fluid extraction and GC/MS for the analysis of tobacco-specific nitrosamines in cigarettes）」, Analytical Chemistry, 1999,71, 1303-1308）。さらに最近では、酢酸アンモニウム抽出に続いて質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いた液体クロマトグラフィーを用いる迅速な手順が提案されている（Karl Wagner, et al.,「陽イオンエレクトロスプレーを用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる、全タバコ及び主流煙中のタバコ特有ニトロソアミンの迅速な定量分析（The rapid and quantitative analysis of tobacco specific nitrosamines in whole tobacco and mainstream smoke using LC/MS/MS with positive ion electrospray）」, 55th Tobacco Science Research Conference 2001）。
【０１４５】
ニトロソアミンのレベルは、アルカロイドが通常ニコチン含量に比例して存在するため、一般にニコチン含量と正の相関がある。一般に、ニコチアナ・タバカムの大部分の変種について、ニコチンは植物の全アルカロイド含量の約９０％を占める。それゆえ、本発明の別の実施形態は、従来量のニコチンを生じながら実質的にニトロソアミンを含まないか微量アルカロイドを含む紙巻たばこ又は他のタバコ製品を製造する目的で、ニコチン低減トランスジェニックタバコを用いて、遊離塩基で又は有機酸と組み合わせて、抽出ニコチン、有機酸由来のニコチン塩（従来のタバコ又は遺伝子改変したニコチン増量タバコに由来する）、又は合成ニコチンを添加することである。この方法は、ＦＴＣ／ＩＳＯ法で従来の紙巻たばこと同じ量（例えば紙巻たばこあたり０．０５〜１．５ｍｇ）を提供するのに十分なニコチンのみを添加することにより、遺伝子改変したニコチン低減タバコとともに用いられる。
【０１４６】
タバコ中のアルカロイド含量を遺伝的に変更することは、キノレートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＴ）及びプトレスシンメチル転移酵素（ＰＭＴ）を変更することにより実行されている。図４は、バレー種の変種においてＱＰＲＴａｓｅを低減して、ベクター２１-４１と名付けられた低アルカロイドトランスジェニック変種を作り出すことにより、ノルニコチンを始めとするアルカロイドがどのように減少しているかを示す。このタバコ変種は、非常に低レベルのＴＳＮＡを含有する。ベクター２１-４１変種は、品種保護審査室（Plant Variety Protection Office）によって保護されており、その品種保護番号（Plant Variety Protection Number）は２００１０００３９である。
【０１４７】
「対照と比較して、ニコチン含量の付随する減少とともにＰＭＴ活性の著しい減少を含む形質転換根系統（root lines）が産生された」（Transformed root lines were produced that contained markedly reduced PMT activity, with a concomitant reduction in
nicotine content compared to controls）（Yupynn Chintapakorn and John D. Hamill, Plant Molecular Biology 53: 87-105, 2003. （著作権） 2003 Kluwer Academic Publishers. 87）。微量アルカロイドのうちの１つである、ノルニコチンは、タバコの品質及び紙巻たばこの風味と負の相関がある（「天然のタバコ香料（Natural Tobacco Flavor）」, Roberts, D. L., Recent Advances in Tobacco Science, 14, pg.49-81, 1988）。唯一のアルカロイドとしてのニコチンとともに製造された紙巻たばこ製品は、これにのみ基づけば非常に受け入れやすいはずである。
【０１４８】
本発明を実行するのに用いられるニコチン低減タバコ植物は、一般に、異種ヌクレオチドを含有しこれを発現する組換えタバコ植物であり、この異種ヌクレオチドの発現が植物中のキノレートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＲＴａｓｅ）、プトレスシンメチル転移酵素（ＰＭＴアーゼ）、アルギニン脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素、Ｓ-アデノシルメチオニン合成酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、又はホスホリボシルアントラニレート異性化酵
素（ＰＲＡＩ）などの酵素をダウンレギュレートし、それにより植物中のニコチン産生を低減する。適した組換え植物は、M. Conkling他、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９８／５６９２３号（１９９８年１２月１７日公開）及びM. Timko, ＰＣＴ出願第ＷＯ  ００／６７５５８号（２０００年１１月１６日公開）に開示される。一般に、異種ヌクレオチドは、センス方向又はアンチセンス方向で、ダウンレギュレートされるべき酵素をコードする核酸の少なくとも一つのセグメントを含む。
【０１４９】
好ましくは、ニコチン低減タバコはまた、相当するニコチン減少のない植物で見いだされると思われるものと比較して、減少した（例えば、少なくとも９０、９５、又は９９重量％又はそれより多く）レベルのタバコ特有ニトロソアミンを含有する。
【０１５０】
本発明の別の実施形態は、形質転換されていない対照植物に対してキノレートホスホリボシル転移酵素（ＱＰＲＴａｓｅ）発現が減少したニコチン低減組換え植物を利用し、このような組換え植物は、５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物キノレートホスホリボシル転移酵素ｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む外来ＤＮＡ構築物を含有する組換え植物細胞を含み、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合し、且つこのような異種ＤＮＡはセンス方向又はアンチセンス方向であり、このような植物は、形質転換されていない対照植物と比較して減少したＱＰＲＴａｓｅ発現及び形質転換されていない対照植物と比較して減少したニコチン含量を現す。
【０１５１】
本発明の別の実施形態は、形質転換されていない対照植物に対してプトレスシンＮ-メチル転移酵素（ＰＭＴアーゼ）発現が減少したニコチン低減組換え植物で実行することも可能であり、このような組換え植物は、５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物ＰＭＴｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む外来ＤＮＡ構築物を含有する組換え植物細胞を含み、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合し、且つこのような異種ＤＮＡはセンス方向又はアンチセンス方向であり、このような植物は、形質転換されていない対照植物と比較して減少したＰＭＴ発現及び形質転換されていない対照植物と比較して減少したニコチン含量を現す。さらに他の実施形態を、上記に記載される他の酵素を用いて同様に実行することができる。
【０１５２】
上記に記載されるような核酸構築物は、（例えば、）Thompson他に対する米国特許第６，１００，４４８号及び同第６，０３７，５２５号に記載されるように、上記に記載される構築物の上流（５'側）及び／又は下流（３'側）にインスレーター成分を含んでもよい。また、上記に記載されるような構築物は、（例えば、）Thompson他に対する米国特許第５，７７３，６９５号及び同第５，７７３，６８９号に記載されるように、上記に記載される構築物の上流及び／又は下流に、マトリクス（又は足場）付着領域を含んでもよい。
【０１５３】
本発明の別の実施形態において、用いられる植物は、ニコチン合成経路で複数の酵素をダウンレギュレートする複数の組換え核酸を含んでもよい。１つより多い組換え核酸を利用することの有益性は、ニコチンレベルをより大きな程度に、場合によっては０に低減する（このような核酸が１つだけ用いられた場合に対して）ことができ、且つ、もし好ましければ、所望の異なるアルカロイド比（例えば、ニコチン対全アルカロイドの比）を順応することができることである。
【０１５４】
したがって、本発明の別の実施形態は、形質転換されていない対照植物に対して減少したＱＰＲＴａｓｅ発現及び減少したＰＭＴアーゼ発現の両方を有するニコチン低減組換え植物を用い、このような組換え植物は、（ｉ）５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物キノレートホスホリボシル転移酵素ｍＲＮＡの少なくとも一つ
のセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む第一の外来ＤＮＡ構築物、このような異種ＤＮＡはこのようなプロモーターに操作可能に結合する、及び（ｉｉ）５'→３'方向で、組換え植物細胞で操作可能なプロモーター及び植物ＰＭＴｍＲＮＡの少なくとも一つのセグメントをコードする異種ＤＮＡを含む第二の外来ＤＮＡ構築物、このような異種ＤＮＡはそのプロモーターに操作可能に結合し、且つこのような異種ＤＮＡはセンス方向又はアンチセンス方向である、を含有する組換え植物細胞を含み、このような植物は、形質転換されていない対照植物と比較して減少したＰＭＴ発現及び形質転換されていない対照植物と比較して減少したニコチン含量を示す。センス及びアンチセンスダウンレギュレーションが本明細書中に記載されるが、遺伝子サイレンシングを誘導するｄｓＲＮＡを産生する逆方向反復、リボザイム、又は干渉相補ｍＲＮＡの使用などの他の技法が用いられてもよいことが理解される。１つより多い酵素の活性を下げるために単一のＤＮＡを用いることが可能であることも理解される。例えば、ＱＰＲＴａｓｅ及びＰＭＴアーゼの両方を下げるために１つのＤＮＡ構築物を用いることができる。
【０１５５】
本発明を実行するのに用いることが可能な核酸配列の例として、タバコキノレートホスホリボシル転移酵素遺伝子（ＮｔＱＰＴ１）をコードする既知ＤＮＡ（例えば、Conkling他に対するＰＣＴ出願第ＷＯ  ９８／５５５６９２３号を参照）、タバコプトレスシンＮ-メチル転移酵素（ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、及びＰＭＴ４など）をコードするＤＮＡ、タバコアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ１及びＡＤＣ２など）をコードするＤＮＡ、タバコオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードするＤＮＡ、タバコＳ-アデノシルメチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）をコードするＤＮＡ、タバコＮＡＤＨ脱水素酵素をコードするＤＮＡ、及びタバコホスホリボシルアントラニレート異性化酵素（ＰＲＡＩ）をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない（これらは既知であり、M.Timko他に対するＰＣＴ出願第ＷＯ  ００／６７５５８号に記載される）。
【０１５６】
上記で記載されるような所望の酵素活性を有するタンパク質の発現をコードする他のＤＮＡ配列が、上記で記載されるようなＤＮＡと、又は上記に与えられるような酵素タンパク質をコードする他のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることを許容する条件は、決まりきったやり方で決定され得る。例えば、このような配列のハイブリダイゼーションは、減少したストリンジェンシー条件下、又はストリンジェントな条件であってさえも、実行され得る（例えば、標準ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおいて、上記に与えられるタンパク質をコードするＤＮＡに対して、６０℃又は７０℃でさえもある温度で、０．３ＭのＮａＣＩ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件。J. Sambrook 他「分子クローニング、実験室手引書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」 (2d Ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照)。一般に、このような配列は、上記に与えられる配列、又は上記に与えられるタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、少なくとも６５％類似、７５％類似、８０％類似、８５％類似、９０％類似、又は９５％類似でさえある。（配列類似性の決定は、最大限適合するように整列させた２つの配列を用いてなされる；適合させた２つの配列のいずれかにおけるギャップは適合の最大化に許される。１０以下のギャップ長が好ましく、５以下のギャップ長がより好ましく、そして２以下のギャップ長がさらにより好ましい。）
【０１５７】
本発明の方法で利用される異種配列は、酵素配列をコードする全メッセージ又はその一部に相補的なＲＮＡ産物を産生するように選択することが可能である。配列は、天然のメッセンジャーＲＮＡの任意の隣接配列と相補的であってもよい、すなわち、それは、５'末端又はキャップ形成部位と近位、キャップ形成部位の下流、キャップ形成部位と開始コドンとの間の内在性ｍＲＮＡ配列と相補的であってもよく、そして非コード領域の全て又は一部のみを包含してもよく、非コード領域とコード領域とを架橋してもよく、コード領域の全て又は一部と相補的か、コード領域の３'末端と相補的か、ｍＲＮＡの３'非翻訳領
域と相補的であってもよい。適したアンチセンス配列は、少なくとも約１２、１４、又は１５〜約１５、２５、又は３５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、又はそれより多くてもよい。また、配列は、その３'末端又は５'末端で延長又は短縮されてもよい（例えば、１〜４又は８個のさらなる核酸残基の付加により）。アンチセンス産物は、天然に生じる標的ＲＮＡのコード領域部分又は非コード領域部分（あるいはその両方）と相補的であってもよい。特定のアンチセンス配列及びアンチセンス配列の長さは、所望の阻害の程度、アンチセンス配列の安定性などに応じて変化する。当業者は、適切な酵素アンチセンス配列の選択に、当該技術分野で利用可能な技法及び本明細書中提供される情報を用いて誘導される。
【０１５８】
上記に示されるとおり、本発明は、ニコチン産生のセンスコサプレッション(co-suppression)を実施する植物でも実行することが可能である。本発明を実行するのに用いられるセンスＤＮＡは、植物細胞で発現した場合に、その植物細胞で本明細書中に記載されるように植物酵素の自然な発現を抑制するのに十分な長さのものである。このようなセンスＤＮＡは、基本的に、酵素又はそのフラグメントをコードする全ゲノムＤＮＡ又は相補的ＤＮＡであってもよく、このようなフラグメントは代表的には長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。細胞中の本来の遺伝子の発現抑制をもたらすセンスＤＮＡの長さを確認する方法は、当業者に利用可能である。本発明はまた、発現した場合にそれらの配列を含む内在性遺伝子を抑制又はサイレンシングすることができる、相補的なアンチセンス配列及びセンス配列を含む二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する植物でも実行することが可能である。適した相補的領域は、少なくとも約２０〜２５ヌクレオチドであってもよく、そして少なくとも約５ヌクレオチド離れていてもよい。
【０１５９】
本発明のさらに別の実施形態において、ニコチアナ植物細胞は、酵素的ＲＮＡ分子（例えば、「リボザイム」）をコードするＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ構築物で形質転換され、この酵素的ＲＮＡ分子は、本明細書中に記載されるような植物酵素をコードするＤＮＡのｍＲＮＡ転写物に対する（例えば、開裂する）ものである。リボザイムは、標的ｍＲＮＡの到達可能な領域に結合する基質結合ドメイン、ならびにＲＮＡの開裂を触媒するドメインを含有し、翻訳及びタンパク質産生を防ぐ。結合ドメインは、標的ｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス配列を含んでもよい。触媒モチーフは、ハンマーヘッド型モチーフモチーフ又はヘアピンモチーフなどの他のモチーフであってもよい。ＲＮＡ標的内のリボザイム開裂部位は、リボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより最初に同定することが可能である（例えば、ＧＵＡ、ＧＵＵ、又はＧＵＣ配列）。いったん同定されると、開裂部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する１５、２０、３０、又はそれより多いリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、予想される構造的特徴について評価されることが可能である。標的候補の適切性は当該技術分野で既知であるリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのしやすさを検査することによっても評価することが可能である。酵素的ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、既知の技法に従って産生され得る。例えば、T. Cech他 の米国特許第４，９８７，０７１号、Donson他の米国特許第５，５８９，３６７号、Torrence他の米国特許第５，５８３，０３２号、Joyceの米国特許第５，５８０，９６７号、Wagner他の米国特許第５，５９１，６０１号、及び米国特許第５，６２２，８５４号を参照。植物細胞でのこのような酵素的ＲＮＡ分子の産生、及び酵素タンパク質産生の破壊は、アンチセンスＲＮＡ分子産生と基本的に同様な様式で、すなわち酵素を産生する細胞中のｍＲＮＡの翻訳を破壊することにより、植物細胞中の酵素活性を下げる。「リボザイム」という用語は、本明細書中、酵素として機能するＲＮＡ含有核酸（エンドリボヌクレアーゼなど）を記載するのに用いられ、そして「酵素的ＲＮＡ分子」と相互交換的に用いられてもよい。
【０１６０】
本発明のさらに別の実施形態において、ニコチン産生のダウンレギュレーションは、米国特許第５，２７２，０６５号に記載されるように、干渉相補的ｍＲＮＡを用いるｍＲＮＡの翻訳阻害を用いることにより達成されてもよい。
【０１６１】
低下した酵素レベルを有する、したがって形質転換されていない対照タバコ植物よりもニコチン含量の減少したタバコ植物を産生するために、タバコ細胞は、適切に操作可能に連結した制御配列又は上記で記載されるとおりのリボザイムをコードする配列とともに、センス方向又はアンチセンス方向で、部分的酵素核酸配列、全長酵素核酸配列を含む外来性転写単位で形質転換され得る。適した制御配列は、形質転換される植物で操作可能な転写開始配列（「プロモーター」）、及びポリアデニル化／転写終結配列を含む。次いで、制限酵素地図、サザンブロットハイブリダイゼーション、及びヌクレオチド配列分析などの標準技法を用いて、アンチセンス方向で、制御配列に操作可能に連結した酵素配列を保有するクローンを同定する。ついで、タバコ植物は、うまく形質転換した細胞から再生される。用いられるアンチセンス配列が内在性配列と相補的であることが最も好ましいが、外来性配列及び内在性配列におけるわずかなバリエーションは許容され得る。アンチセンスＤＮＡ配列は、以下で記載されるように、ストリンジェントな条件下、調節されるべき細胞の内在性配列に結合する能力のある十分な配列類似性のあるものであることが好ましい。組換えタバコ植物を産生する具体的な技法は、当業者に既知であり、そして上記に記載される、M. Conkling 他ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９８／５６９２３号（１９９８年１２月１７日公開）及びM. Timko,ＰＣＴ出願第ＷＯ  ００／６７５５８号（２０００年１１月１６日公開）に、より長く説明される。
【０１６２】
ニコチン低減タバコ変種である、ベクターバレー種２１-４１は、米国特許第６，５８６，６６１号に記載されるように、バレー種２１ＬＡを遺伝的に改変して開発された。バレー種２１ＬＡは、バレー種２１と比較して顕著に減少したレベルのニコチンを有する、バレー種２１の変種である（例えば、バレー種２１ＬＡはバレー種２１のニコチンレベルの８％を有する、Legg et al., (1971) Can. J. Genet. Cytol. 13: 287-91; Legg他 (1969) J. Hered.60.213-17を参照）。ベクターバレー種２１-４１は、親変種であるバレー種２１ＬＡと最も類似する。一般に、ベクターバレー種２１-４１は、アルカロイド含量（例えば、ニコチン及びノルニコチン）を除いて、評価された特徴すべてにおいてバレー種２１ＬＡに似ている。ベクターバレー種２１-４１は、実質的に減少した含量のニコチン、ノルニコチン及び全アルカロイドにより、親バレー種２１ＬＡと区別され得る。
【０１６３】
図４に示されるとおり、ベクター２１-４１中の総アルカロイド濃度は、親バレー種２１ＬＡのレベルの約１０％まで減少している。ニコチン及びノルニコチン濃度は、バレー種２１ＬＡと比較して、ベクターバレー種２１-４１中それぞれ、約６．７％及び３２％未満である。ＱＰＲＴａｓｅレベルは、ニコチンならびにアナバシン及びアナタビン（これらは順に、ＮＡＢ及びＮＡＴを産生する）を含む他のタバコアルカロイドと正の相関がある。図５を参照。
【０１６４】
本発明のさらに別の実施形態は、ニコチン低減タバコに（従来のタバコと比較して）等量のニコチン、ニコチン有機酸塩、及びニコチン類似体を添加してＴＮＳＡの減少したタバコ製品を作ることである。タバコ添加物及び風味剤の使用を始めとするタバコ加工の当業者にとって従来の方法が、このようなタバコ製品へニコチンを添加するのに用いられる。
【０１６５】
本発明の別の実施形態は、ニコチン低減タバコに（従来のタバコと比較して）それより多くさえある量のニコチンを添加して低ＴＮＲ紙巻たばこを作ることである。この方法の主な利点は、タバコを乾燥させるときにニコチン又は微量アルカロイドが存在しないために、タバコから実質的にニトロソアミンが形成されないことである。この方法により製造
された紙巻たばこは低ＴＮＲ紙巻たばこの利点を有するのみでなく、ＱＰＲＴが低減又は削除された場合は実質的にニトロソアミンも微量アルカロイドも含有しない。本発明の別の実施形態は、ニコチン低減タバコを利用し、そして以下の製品について従来量のニコチンが存在するようにニコチンを添加することである：葉巻充填材又はラッパー、紙巻たばこ用の手巻きタバコ、パイプタバコ、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、再生タバコ、及び無煙タバコの全ての他の種類。これらの製品であることの利点は、ＴＳＮＡ及び／又は微量タバコアルカロイドが極度に少ないことである。
【０１６６】
４．ニコチン増量トランスジェニックタバコを用いた、改善された膨脹タバコ又はパフド（puffed）タバコの製造
タバコの膨脹に関して１５０件より多い特許が発行されている（例えば、米国特許第３，９９１，７７２号）。膨脹プロセスはタバコにより大きな充填力を与えるので、紙巻たばこに用いられるタバコの重量が少なくなる。膨脹タバコを用いることによる利点は、タール送達の減少である。膨脹タバコは、低タール送達紙巻たばこを作るのに特に有用である。Ｃａｒｌｔｏｎ（登録商標）紙巻たばこは、それが最も低タール且つ低ニコチン送達紙巻たばこであることを宣伝文句としてきたが、伝えられるところによれば、非常に大きな割合の膨脹タバコで作られている。しかしながら、膨脹タバコの使用はまた、ニコチン送達の低下ももたらし、これは埋め合わせ（compensation）を引き起こす可能性がある。
【０１６７】
膨脹ニコチン増量トランスジェニックタバコの主な有益性は、このようなタバコがニコチン送達をほぼ維持しながらタール送達の低下を提供し、タール送達の低下且つＴＮＲの低下した紙巻たばこをもたらすことである。例えば、トランスジェニックタバコ由来の増量されたニコチンを組み込まれたタバコブレンドは、１６ｍｇのタール及び２．０ｍｇのニコチンを送達し得る。このタバコを１００％膨脹することで、未膨脹タバコの約半分の重量だが、紙巻たばこ中同体積を占めるタバコ充填材が得られるだろう。この紙巻たばこの煙送達は、フィルター通気なしで、８ｍｇ前後のタール及び１．０ｍｇのニコチンでＴＮＲが８となる。
【０１６８】
当該技術分野で既知のタバコを膨脹する任意の方法が、本発明で用いられてもよい。今日用いられる最も一般的な方法は、液体二酸化炭素を組み入れている（米国特許第４，３４０，０７３号及び同第４，３３６，８１４号）。欧州では主に、液化プロパンが市販の紙巻たばこを作るのに用いられてきた（米国特許第４，５３１，５２９号）。液化プロパンは、２００％の範囲で、より高い度合いの膨脹が可能であるため、二酸化炭素に勝る利点を提供する。加圧下で、液体二酸化炭素（又は液化プロパン）はタバコ細胞構造に浸透する。タバコを急速に加熱すると、二酸化炭素（又は液化プロパン）は膨脹して細胞をその乾燥前の大きさに戻す。
【０１６９】
ニコチン増量トランスジェニックタバコ、好ましくは高糖及び／又は高脂肪酸バックグラウンドから作られたタバコを利用すること、及びこのようなトランスジェニックタバコから膨脹タバコを作って、低ＴＮＲ紙巻たばこを製造することが、本発明の別の実施形態である。
【０１７０】
好ましくはニコチン低減トランスジェニックタバコから抽出された除タンパク質タバコを利用すること、及びこのような除タンパク質タバコから膨脹タバコを作ることが、別の実施形態である。除タンパク質膨脹タバコ及びニコチン増量トランスジェニックタバコを含有する紙巻たばこが製造される。
【０１７１】
５．再生タバコの製造
上記１〜３の先の発明、除タンパク質タバコ繊維、及び凍結乾燥タバコを任意の組合せで、及び再生タバコと併せて利用することで、曝露低減タバコ製品（これは低ＴＮＲ紙巻
たばこも含んでもよい）を製造することが本発明の別の実施形態である。
【０１７２】
再生タバコ（「レコン」）のシートを製造するプロセスは、１９５０年代に始まった。このようなプロセスを記載する米国特許として、第３，４９９，４５４号、第４，１８２，３４９号、第４，９６２，７７４号、及び第６，７６１，１７５号が挙げられる。レコンは、伝統的にはタバコの茎及び／又は小さい葉の小片から製造され、それは代表的な製紙プロセスと非常に類似している。再生タバコのタール量及びニコチン量は、同等量の全タバコ葉由来のものよりも少ない。このプロセスは、レコンになるべき様々なタバコ部分の加工を必要とする。レコンシートは、製造された後、全葉タバコから作られた切断ラグタバコと類似した大きさ及び形に切断される。次いで、この切断レコンは切断ラグタバコと混合されて、すぐに紙巻たばこ作成に使える。
【０１７３】
紙巻たばこは、全部レコンから、又はレコンなしで、あるいはその任意の組合せで製造され得る。大部分の主要ブランドが、充填材に少なくとも１０％のレコンを入れている。
【０１７４】
レコンに用いられるニコチン増量トランスジェニックタバコの主な有益性は、このようなタバコが、ニコチン量（yield）をほぼ維持しながらも、紙巻たばこのタール量（yield）を低減するだろうということである。
【０１７５】
ニコチン又はニコチン塩を添加してレコンを製造することが、本発明の別の実施形態であり、レコンは、このような再生シートが燃焼したときに、十分量のニコチンが存在しながら、従来の紙巻たばこから生成するタバコ特有ニトロソアミン及び他の発癌物質が実質的に少なく生じるように、ニコチン低減トランスジェニックタバコ又は任意の非タバコ植物材料（ハーブブレンドを始めとするがそれらに限定されない）で出来ている。
【０１７６】
ニコチン増量トランスジェニックタバコ、好ましくは高糖及び／又は高脂肪酸バックグラウンドから作られたこのようなタバコを利用すること、及びこのようなトランスジェニックタバコからレコンを作って低ＴＮＲ紙巻たばこを製造することが、本発明の別の実施形態である。別の実施形態は、加工中にレコンの糖含量、脂肪酸含量、又はその両方を増加させる。
【０１７７】
タバコ繊維由来のレコン
タバコからタンパク質を除去し、それにより「除タンパク質タバコ繊維」を作るプロセスを記載する特許は、米国特許第４，２８９，１４７号及び第４，３４７，３２４号に記載される。タバコ繊維は、タンパク質を除去した後の主な副生成物である。除タンパク質タバコ由来の繊維性残骸は、再生タバコの成分として任意の％で含まれ得る。除タンパク質タバコで出来た紙巻たばこは従来の紙巻たばこと異なる風味を有する。しかしながら、香味剤及びニコチンを含む添加物を適量で加えることにより、この風味の欠乏を緩和する助けとなり得る。
【０１７８】
除タンパク質タバコを含有する紙巻たばこは、発癌物質及び有害な燃焼生成物を低下したレベルで生成することから、従来の紙巻たばこに勝る顕著な利点を有する。「黄色種タバコシートのタンパク質含量を７１％下げることにより」、熱分解性縮合物の「ＴＡ９８エイムス変異原性の８１％低下をもたらした」(Clapp, W. L.,他「タバコタンパク質除去による紙巻きたばこ主流煙凝縮物のエイムスサルモネラ変異原性の低下（Reduction in Ames Salmonella mutagenicity of cigarette mainstream smoke condensate by tobacco protein removal）」, Mutation Research, 446, pg 167-174,1999)。この分野における先の研究は、タバコ葉タンパク質がタバコ煙凝縮物中の変異誘発物質の主要な前駆体であり得ると決定している(Matsumoto,他、「ペプチド及びタンパク質の熱分解の突然変異原性（Mutagenicities of the pyrolysis of peptides and proteins）」, Mutation Resea
rch, 56, pg 281-288, 1978)。
【０１７９】
ニトロソアミンを検出可能なレベルで形成するためには、比較的高濃度のニコチン及び他のアルカロイドが要求されるため、遺伝子改変したニコチン低減タバコ（例えば、ベクター２１-４１）からタバコ繊維を抽出することは、このようなタバコから実質的に全ての発癌性ＴＳＮＡを効果的に排除する。図４を参照。
【０１８０】
したがって、さらにニトロソアミンを低減するためには、曝露低減紙巻たばこ又は他のタバコ製品にニコチン低減タバコを用いることが有利である。ニコチンは除外されるかプロセス中後半で導入されるかのいずれかであり、それはニコチン塩の形態であることも可能である。
【０１８１】
多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）は、アミノ酸、糖類、パラフィン、テルペン、植物ステロール、セルロース、及びタバコの他の構成成分の高温熱分解から形成される。これらの構成成分の大部分は、タバコ繊維では大きく減少しており、ＰＡＨの形成を有効的に低下させる。可溶性糖はタバコ繊維中低レベルで存在するので、紙巻たばこの煙中の発癌性補因子と認識されるカテコール及びフェノールもまた減少している。
【０１８２】
タバコ繊維のみを含有する紙巻たばこを喫煙した場合、全葉タバコで出来た紙巻たばこと比較して、シアン化水素、酸化窒素、及び一酸化炭素などの有害な気相化合物もまた減少する。シアン化水素は、タンパク質及びクロロフィルの燃焼から形成される。酸化窒素は、可溶性タンパク質、クロロフィル、硝酸塩、及びアルカロイドの燃焼から形成される。これらの構成成分は、除タンパク質タバコ中は、有意な量では存在しないだろう。タバコ繊維は、約８５％少ないデンプン及びセルロース材料を有し、したがって一酸化炭素の主な熱分解前駆体を低減する。
【０１８３】
従来のタバコ、ニコチン低減トランスジェニックタバコ、又はニコチン増量トランスジェニックタバコに由来する膨脹タバコ繊維を含む再生タバコを製造することが、本発明の別の実施形態である。
【０１８４】
凍結乾燥タバコ由来のレコン
タバコ乾燥プロセスが回避される場合、従来の乾燥プロセスが排除されるので、紙巻たばこ、葉巻充填材又はラッパー、紙巻たばこ用の手巻きタバコ、パイプタバコ、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、再生タバコ、及び実質的にＴＳＮＡを含有しない凍結乾燥タバコで出来た他の調製物などの従来のタバコ製品には、実質的にＴＳＮＡが存在しないだろう。
【０１８５】
本発明の別の実施形態は、新鮮な収穫したタバコを凍結乾燥を用いて加工することを介したＴＳＮＡの実質的な除去である。これは、新鮮な収穫したタバコをタバコ農場の近くに位置する凍結乾燥ユニットを通して加工することにより完遂される。この様式で加工されるタバコは、従来の様式で植物の間隔を空けて、又はバイオマス環境で育てられてもよい。乾燥プロセスに関連するコストの排除という経済的利点に加えて、このタバコは今や、１エーカーあたり数十万ポンドの新鮮なタバコを作ることが可能なバイオマス様式で育てることができる。
【０１８６】
バイオマス環境でタバコを育て、紙巻たばこ、手巻きタバコ、パイプタバコ、葉巻充填材又はラッパー、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、及び他の種類（versions）の無煙タバコ用に新鮮なタバコを直ちに凍結乾燥することにより、各植物をビニールハウスから露地へ移植することを省くだけでなく、タバコの従来の収穫及び乾燥も省くことにより労働力を削減する。同じく、この目的のために必要とされる農地も大幅に削減される。バイオマスで育てられたタバコの１エーカーからのタバコ収量は、従来様式で育てられた約１００エーカ
ーのタバコに等しい。
【０１８７】
「タバコバイオマス」は、１エーカーの土地に大量のタバコ種子を場内に互いが数インチ内にあるように直接播くことにより達成される。従来の間隔で植えられたタバコと異なり、タバコがバイオマス様式で植えられる場合、個々の植物はもはや区別化されない。１エーカーのタバコバイオマスは、連続した、密集した、緑の絨毯の外観を有する。米国特許出願第２００２０１９７６８８号は、このような方法を記載する。
【０１８８】
凍結乾燥は、新鮮な収穫したタバコバイオマスの重さから水の大部分（約８０％）を除去する。その結果が、凍結乾燥タバコ（「ＦＤＴ」）である。ＦＤＴは、容易に粉砕されて、再生タバコシート（レコン）に加工するのに適した微粒子にされる。このレコンは、切断されて、紙巻たばこ用充填材、手巻きタバコ、パイプタバコ、葉巻充填材又はラッパー、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、及び他の形態の無煙タバコなどの任意の型のタバコ製品にすることが可能である。糖類を始めとする香味剤及び添加物が、レコンプロセスに組み込まれ得る。
【０１８９】
このようなレコンは、１００％ＦＤＴから、又は消費者が好む任意の割合のＦＤＴで作られ得る。凍結乾燥プロセスは、このようなタバコ製品の風味に悪影響を有する可能性がある。それゆえ、混合物が再生タバコになり得るように、ＦＤＴは従来の粉砕乾燥したタバコと任意の割合で混合させることさえできる。あるいは、ＦＤＴは、巨大市場の味覚を満足させるために、紙巻たばこ、手巻きタバコ、パイプタバコ、及び葉巻充填材又はラッパー、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、及び他の種類（versions）の無煙タバコを製造する助けとなる従来のタバコの任意の形のものと、任意の割合で混合され得る。
【０１９０】
本発明の別の実施形態は、上記で記載されるようにＴＳＮＡを低減するために遺伝子改変したニコチン低減タバコを使用することであり、それにより、このような紙巻たばこ、手巻きタバコ、パイプタバコ、葉巻充填材又はラッパー、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、及び他の種類の無煙タバコが、無添加であり、且つどのようなニトロソアミンも含まないというさらなる有益性を作り出す。
【０１９１】
所望の生理学的応答を送達する量でニコチンを添加し、紙巻たばこ、葉巻充填材又はラッパー、紙巻たばこ用手巻きタバコ、パイプタバコ、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、及び他の種類の無煙タバコに用いるＦＤＴにもどし、これらが実質的にＴＳＮＡを含有しないことが、本発明の別の実施形態である。ＴＳＮＡは乾燥タバコで圧倒的に見いだされるので、緑葉から得られたタバコ繊維から製造された紙巻たばこはさらに低減したＴＳＮＡさえ有する。
【０１９２】
本発明の別の実施形態において、ニコチアナ・ルスチカ及び／又はニコチン増量トランスジェニックニコチアナ・タバカムは、収穫後、凍結乾燥されてレコンに組み込まれる。その有益性は、高アルカロイド含量が低ＴＮＲ紙巻たばこに残されること、及びタバコ乾燥工程が省かれることである。また、高アルカロイドのタバコに関連するＴＳＮＡの増加は、実現しないだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】１９５０年〜１９９５年の間のアメリカの紙巻たばこの平均タール量（yield）及びニコチン量（yield）を示すグラフである。
【図２】ある紙巻たばこブランドのタール量（yield）及びニコチン量（yield）の（２００３年の段階の）比較及びそれらから得られるＴＮＲを示す表である。
【図３】１９９０年〜１９９４年の米国での喫煙関連死亡の原因を示す円グラフである。
【図４】ニコチン低減トランスジェニック植物株の植物特性を示す表である。
【図５】あるタバコアルカロイド及びＴＳＮＡの経路の概略図である。
【図６】ニコチアナにおけるピリジンアルカロイド生合成の概略図である（トランスジェニックニコチアナ・タバカムＬ．におけるプトレスシンＮ-メチル転移酵素活性のアンチセンス媒介（Antisense-mediated）ダウンレギュレーションは、ニコチンを使ってアナタビンのレベル上昇を導き得る；Yupynn Chintapakorn and John D. Hamill; Plant Molecular Biology 53: 87-105, 2003）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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