(57)【要約】  反芻動物のルーメン発酵に影響を及ぼし、かつエネルギーおよび窒素源のアベイラビリティを増大させる、スイカズラ、ゲンチアナ・アスクレピデア、キバナリンドウ、クローブバッド、ヒナギク、オリーブ、ヒレハリソウ、ヒメヒレアザミ、シャクヤク、ヤマナラシ、サクランボ、バッコヤナギ、セイタカダイオウ、ハンニチバナ、クマコケモモ、インディアンルバーブ、エゾアカバナ、クナウチア・アルベンシス、レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）およびネトルおよびそれらの抽出物、およびβ−ミルセンから選択される植物材料、植物抽出物、または天然同一成分の使用。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物のルーメン発酵に影響を及ぼし、かつエネルギーおよび窒素源のアベイラビリティを増大させる１つもしくはそれ以上の植物材料、植物抽出物、または天然同一成分を含有する添加物の使用であって、
前記成分がスイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ゲンチアナ・アスクレピデア（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ａｓｃｌｅｐｉｄｅａ）、キバナリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｌｕｔｅａ）、クローブバッド（Ｅｕｇｅｎｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｔａ）、ヒナギク（Ｂｅｌｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、ヒメヒレアザミ（Ｃａｒｄｕｕｓ  ｐｙｃｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａｅ  ａｌｂａ  ｒａｄｉｘ）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）、サクランボ（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ）、バッコヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｃａｐｒｅａ）、セイタカダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｎｏｂｉｌｅ）、ハンニチバナ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｅｍｕｍ  ｃａｎｕｍ）、クマコケモモ（Ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｓ  ｕｖａ−ｕｒｓｉ）、インディアンルバーブ（Ｐｅｌｔｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｐｅｌｔａｔｕｍ）、エゾアカバナ（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ｍｏｎｔａｎｕｍ）、クナウチア・アルベンシス（Ｋｎａｕｔｉａ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）、レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）およびネトル（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ）およびそれらの抽出物、およびβ−ミルセンからなる群から選択される植物材料であることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記選択される成分が、ルーメン消化のタンパク質分解活性を減少させる、ハンニチバナ、クマコケモモ、エゾアカバナ、クナウチア・アルベンシス、およびインディアンルバーブおよびそれらの抽出物からの植物材料からなる亜群からの１つもしくはそれ以上の成分を含有することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記選択される成分が、原虫の活性を抑制する、スイカズラ、ゲンチアナ・アスクレピデア、クローブバッド、ヒナギク、オリーブ、ヒレハリソウおよびそれらの抽出物、およびβ−ミルセンからの植物材料からなる群からの１つもしくはそれ以上の成分を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記選択される成分が、前記ルーメン消化のメタン生成活性を減少させる、ヒメヒレアザミ、シャクヤク、ヤマナラシ、サクランボ、バッコヤナギ、およびセイタカダイオウおよびそれらの抽出物からなる群からの１つもしくはそれ以上の成分を含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記選択される成分が、乳酸の産生を減少させる、レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）およびネトルおよびそれらの抽出物からの植物材料からなる群からの１つもしくは２つの成分を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記添加物が請求項２〜５に記載の亜群の少なくとも２つからの成分を含有することを特徴とする請求項２〜５に記載の使用。
【請求項７】
前記添加物が請求項２〜５に記載の全亜群からの成分を含有することを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記成分の少なくとも１つが、
ｉ）クナウチア・アルベンシス、クマコケモモ、およびハンニチバナおよびそれらの抽出物からの植物材料からなり、
ｉｉ）ヒナギク、クローブバッド、オリーブ、スイカズラおよびヒレハリソウおよびそれらの抽出物からの植物材料からなり、
ｉｉｉ）ヒメヒレアザミ、ヤマナラシ、およびセイタカダイオウ、およびそれらの抽出物からの植物材料からなり、かつ
ｉｖ）レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）およびネトルおよびそれらの抽出物からの植物材料からなる
群の各々から選択されることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記群ｉ）〜ｉｖ）に属する前記成分の総量が、本発明により存在する前記成分の総量の２０〜１００重量％であることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
投与される前記成分の総量が、１日当り、かつ前記反芻動物のｋｇ体重当り０．０２ｍｇ〜２０ｇであることを特徴とする請求項１〜７に記載の使用。
【請求項１１】
前記添加物が、０．２〜９０重量％の請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記成分、および１０〜７５重量％の成長改善剤、香味料、吸収担体、および／または他の飼料成分を含有することを特徴とする添加物。
【請求項１２】
前記添加物が、
ａ）０〜８０乾燥重量％の穀類と、
ｂ）０〜３０乾燥重量％の油脂と、
ｃ）穀類以外の種類の栄養物を含有する０〜８５乾燥重量％のタンパク質と、
ｄ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の１０ｐｐｍ〜４０乾燥重量％の成分とを含有し、ａ）〜ｄ）の総量が少なくとも５０乾燥重量％であることを特徴とする動物飼料。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１〜９９乾燥重量％の前記成分と、１〜９９乾燥重量％の他の成分とを含有する動物の飲料水サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルーメン発酵のエネルギーおよび窒素保持を改善するための、または乳酸アシドーシスを減少させるための、植物材料、植物抽出物、または天然同一精油化合物からの１つもしくはそれ以上の成分を含有する添加物の使用に関する。この化合物は、動物の飼料または飲料水によって反芻動物に適切に経口投与される。
【背景技術】
【０００２】
ルーメンは、ウシ、ヒツジ、およびヤギなど反芻動物の第一胃である。その構造上および栄養上の意義は、ハンゲート（Ｈｕｎｇａｔｅ）（１９６６年）によって記載されている。ルーメンは、これらの動物が大部分の非反芻動物に不適切な高繊維植物材料を消化することを可能にする。ルーメンは、乳牛における１５０ｋｇを超える消化物を含有する巨大な臓器であり、ここで消化のすべては微生物によって行われる。ルーメンは、動物が微生物の繊維消化活動から恩恵を受けるようにして発達した。最終生成物である、揮発性脂肪酸は、ルーメン壁にわたって吸収され、エネルギーおよびタンパク質合成に使用される。後腸発酵と比べルーメン前腸発酵の主な利点は、発酵中に形成される微生物細胞が第４胃に移動し、そこでそれらは消化され、アミノ酸が吸収されることである。したがって、後腸発酵とは違って、微生物アミノ酸は宿主動物に利用可能となる。したがって、ルーメンは、乏しい牧草地で自給する草食動物の進化との関連できわめて効率的な臓器である。
【０００３】
ルーメン発酵はいくつかの欠点ももたらす。メタンは嫌気性発酵の自然の結果として生成される（ハンゲート（Ｈｕｎｇａｔｅ）、１９６６年）。メタンの放出は動物からのエネルギーの損失も表す。さらに、メタンは強力な温室効果ガスであり、したがってこの意味で、反芻動物は環境に損害を与える（レング（Ｌｅｎｇ）、１９９２年）。反芻動物はまた、食事タンパク質の利用において他の種よりも効率的でない。反芻動物からの窒素損失は、特に草食動物において例外的に高い（ノラン（Ｎｏｌａｎ）、１９７５年）。これは、窒素豊富な糞尿の環境に対する影響のため環境問題であると同時に経済問題である。さらに、障害のあるルーメン微生物発酵の直接の結果として生じる反芻動物に特有の消化系障害がある。
【０００４】
化学的および抗生物質の飼料添加物は過去においてこれらの問題の一部を緩和するために使用されている。食物連鎖におけるかかる材料の存在は、規制当局および消費者にはますます受入れられなくなっている。したがって、反芻動物の家畜生産の問題解決は自然かつ持続可能でなければならない。
【０００５】
ルーメンに入る食事タンパク質は明らかに非制御的に分解され、結果としてアンモニア形成およびその後の尿中窒素の損失がもたらされる（ノラン（Ｎｏｌａｎ）、１９７５年）。主な経済的損失を表す窒素保持の低い効率は、動物における代謝性侵襲を引き起こし、かつ窒素豊富な廃棄物によって環境への負担ともなる。分解過程が減少されれば、これらの問題が減少されるであろう。
【０００６】
さらに、ルーメンにおけるタンパク質保持を改善するために存在する第２の可能性は、ルーメン繊毛原虫の集団の抑制である。原虫はルーメンにおける大量の細菌を消費し、それらの分解は結果として５０％までのルーメン発酵からの微生物タンパク質の正味収量の減少をもたらしうる（ウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、１９９７年）。原虫が抑制されうる場合は、アンモニア形成が少なくなり、かつ食事タンパク質の補給の必要が少なくなる。
【０００７】
乳酸は通常、ルーメン発酵の微量生成物にすぎない。しかし、迅速分解飼料があまりに急速に導入される場合、または濃縮物が高い割合の食事を形成する場合、揮発性脂肪酸産生がルーメンの緩衝能力を超える。これはルーメンにおけるきわめて低いｐＨ値をもたらすため、乳酸産生細菌のみが増殖しうる（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）とヒノ（Ｈｉｎｏ）、１９８５年）。
【０００８】
乳酸が揮発性脂肪酸よりも強い酸であると、ｐＨはさらに低下し、正常な発酵の回復は不可能になり、そして動物は死亡する。しかし、より一般的には、高濃度の食事の状態にある反芻動物は無症状のアシドーシスにかかるが、これは苦難を伴い、生命にかかわることはないものの生産効率を減少させる。化学バッファーはこの状態を食い止めることができるが、乳酸産生細菌の増殖が抑制されればより良いであろう。
【０００９】
公報国際公開第０３／０９４６２８号パンフレットは、リモネン、オイゲノール、サリチル酸塩、キノリン、バニラ、チモール、およびクレゾールからなる群から選択される１つもしくはそれ以上の精油化合物の添加によって反芻動物の消化活動から発するメタン産生を削減する試みを記載している。同時にルーメンにおける微生物の活動および揮発性脂肪酸、例えばプロピオン酸の産生が許容可能レベルで維持されうる。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明の目的は、全体として、かつ一括してルーメンにおける消化系障害に取組み、かつ反芻動物の成長に利用可能なエネルギーおよび窒素源の利用を促進することである。この目的は、ルーメン壁にわたって吸収され、エネルギーおよびタンパク質合成に使用される揮発性脂肪酸の形成を助けることによって、かつ食事タンパク質および微生物タンパク質の分解を減少させることによって達成されうる。他の方法は、メタン生成を制限し、乳酸産生細菌を制御または抑制することである。
【００１１】
本発明によれば、前記目的は、スイカズラ、ゲンチアナ・アスクレピデア、キバナリンドウ、クローブバッド、ヒナギク、オリーブ、ヒレハリソウ、ヒメヒレアザミ、シャクヤク、ヤマナラシ、サクランボ、バッコヤナギ、セイタカダイオウ、ハンニチバナ、クマコケモモ、インディアンルバーブ、エゾアカバナ、クナウチア・アルベンシス、レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、およびネトルおよびそれらの抽出物、およびβ−ミルセンからなる群から選択される植物材料の１つもしくはそれ以上の成分を含有する添加物を動物飼料または飲料水によって適切に経口投与することによって達成されうる。動物に投与される成分の総量は、1日およびｋｇ体重当り０．０２ｍｇ〜２０ｇであることが適切である。
【００１２】
本発明の成分はすべて、考慮すべき欠点なしにルーメンにおける発酵の効率に実質的に寄与することが証明されている。成分の一部は原虫の活性を抑制し、その他はタンパク質分解活性、メタン生成活性、または乳酸の産生を減少させる。
【００１３】
本発明は、１つもしくはそれ以上の規定された成分を含有する添加物および飼料組成物にも関する。
【００１４】
成分は発酵に対して多様に影響を有するため、本発明の目的に記載の発酵を最適化する特定の化合物を組み合わせることが有利である。
【００１５】
大規模な試験では、ハンニチバナ、クマコケモモ、エゾアカバナ、クナウチア・アルベンシス、およびインディアンルバーブ、およびそれらの抽出物からの植物材料からなる亜群の成分はルーメンのタンパク質分解を大幅に削減することが示された。また、これらの成分のすべては原虫の活性を阻害し、その大部分は、メタン産生、揮発性脂肪酸の量、消化率、微生物バイオマス、および／または発酵効率など、他の必須の発酵パラメータに対する有利な効果も有する。最も適切な成分は、クマコケモモ、クナウチア・アルベンシス、およびハンニチバナ、およびそれらの抽出物からの植物材料である。最も好ましい成分は、クナウチア・アルベンシスおよびその抽出物、特にメタノール抽出物からの植物材料である。
【００１６】
スイカズラ、ゲンチアナ・アスクレピデア、キバナリンドウ、クローブバッド、ヒナギク、オリーブおよびヒレハリソウおよびそれらの抽出物およびβ−ミルセンからの植物材料は、その成分がルーメン液中の繊毛原虫の細菌溶解活性を抑制する別の亜群を形成する。クローブバッドも微生物バイオマスを増大させ、メタン産生を削減する。ヒナギクはメタン産生の小さな削減を示し、発酵効率および微生物バイオマス産生を改善もするが、ヒレハリソウは発酵効率を増大させ、アシドーシス効果を削減する。β−ミルセンは原虫活性に対する中程度の阻害効果を有するが、メタン産生を減少させるためにも使用される。スイカズラの花から調製される抽出物が繊毛原虫の細菌分解活性を無効にした。スイカズラの種子調製物も原虫活性を抑制したが、これは約６０％にすぎない。この亜群からの好ましい成分は、ヒナギク、クローブバッド、オリーブおよびヒレハリソウおよびそれらの抽出物、特にメタノール、およびヒナギクおよびゲンチアナ・アスクレピデアの水抽出物からの植物材料である。
【００１７】
ヒメヒレアザミ、シャクヤク、ヤマナラシ、サクランボ、バッコヤナギおよびセイタカダイオウおよびそれらの抽出物からの植物材料は、その成分がルーメン消化物中のメタン生成活性を減少させるために適切に使用される第３の亜群を形成する。これらの成分には重要な有害な効果が他の発酵パラメータでは確認されていない。好ましい成分は、ヒメヒレアザミ、ヤマナラシ、およびセイタカダイオウおよびそれらの抽出物であり、特に好ましいのは、ヒメヒレアザミおよびセイタカダイオウからの植物材料である。
【００１８】
最後に、第４の亜群が、レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）およびネトルおよびそれらの抽出物からの植物材料によって形成される。これらの成分は乳酸の活性および／または形成を低下させる。レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）は、ワイルドレタス（Ｌａｔｕｃａ  ｖｉｒｏｓａ）と呼ばれることもあり、これもメタン産生および原虫活性を減少させ、揮発性脂肪酸の形成を増大させる。ネトルは追加の効果を有し、タンパク質分解および原虫活性を阻害し、かつ揮発性脂肪酸の形成を助ける。
【００１９】
本発明の適切な実施形態において、添加物は、上記規定された亜群の１つ以上成分を含有し、添加物は４つの亜群すべてからの成分を含有することが有利でありうる。有利には、添加物は、
ｉ）クナウチア・アルベンシス、クマコケモモ、およびハンニチバナおよびそれらの抽出物からの植物材料と、
ｉｉ）ヒナギク、クローブバッド、オリーブ、スイカズラおよびヒレハリソウおよびそれらの抽出物からの植物材料と、
ｉｉｉ）ヒメヒレアザミ、ヤマナラシ、およびセイタカダイオウおよびそれらの抽出物からの植物材料と、
ｉｖ）レタス（Ｌａｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）およびネトルおよびそれらの抽出物からの植物材料と
からなる群の各々から選択される少なくとも１つの成分を含有する。
ｉ）〜ｉｖ）の群に属する成分の総量は適切には２０〜１００重量％であり、好ましくは本発明により存在する成分の総量の４０〜１００重量％である。
【００２０】
本発明による植物材料の抽出物としては、凝結物、精油、樹脂状物質、チンキ剤、遊離物および純油が挙げられるがこれらに限定されない。植物または植物部位の抽出物の生成に際しては、水、有機溶媒、およびそれらの混合物が従来の方法に従って使用されうるが、乾燥蒸留も適用されうる。適切な有機溶媒の例は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、メチルエチルエーテル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼン、トルエン、石油エーテル、およびアセトンである。
【００２１】
動物に投与される成分の総量は、その成分が精油化合物、植物材料の抽出物、または植物材料であるかどうかによって決まる。成分がすべてβ−ミルセン、および／または抽出物である場合には、投与量は通常、１日およびｋｇ体重当り０．１〜５０ｍｇであるが、成分が植物材料のみからなる場合、投与される量は通常、１日およびｋｇ体重当り０．０２〜１０ｇである。
【００２２】
本発明の添加物は、本発明の成分以外の成分を含有しうる。適切には、添加物は、０．１〜１００重量％、好ましくは、０．２〜９０重量％の成分、および成長改善剤、香味料、吸収担体および／または他の飼料成分を含有する。好ましくは、成長改善剤、香味料、吸収担体および／または他の飼料成分の総量は、１０〜７５重量％の添加物である。成分が植物材料である場合、それらは適切には乾燥され、もしあれば、添加物中で他の成分と混合される前に粒子または粉末に粉砕される。
【００２３】
適切な成長改善添加物および香味料の例は、クレゾール、アネトール、デカ−、ウンデカ−および／またはドデカ−ラクトン、イオノン、イロン、ジンジェロール、ピペリジン、プロピリデンファタライド（ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ  ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、ブチリデンファタライド（ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅ  ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、カプサイシンおよび／またはタンニンである。担体は、例えば、４０〜５０重量％の木質繊維、８〜１０重量％のステアリン、４〜５重量％のクルクマ粉末、４〜５重量％のローズマリー粉末、２２〜２８重量％の石灰石、１〜３重量％のアラビアゴムなどゴム、５〜５０重量％の砂糖および／またはでんぷん、および５〜１５重量％の水を含有しうる。他の飼料成分は、適切にはビタミン、酵素、鉱塩、粉砕穀類、タンパク質含有成分、炭水化物含有成分、ミドリング粉および／またはふすまからなる群から選択される。添加物は適切に、飼料が通常、０．４ｐｐｍ〜８０重量％の成分を含有するような量で本発明による飼料組成物に添加される。
【００２４】
本発明による飼料組成物は通常、飼料の乾燥重量で計算され、以下の成分を含有する。
ａ）０〜８０乾燥重量％の穀類、
ｂ）０〜３０乾燥重量％の油脂、
ｃ）０〜８５乾燥重量％の穀類以外の種類のタンパク質含有栄養物、および
ｄ）１０ｐｐｍ〜４０乾燥重量％の本発明の成分。
ａ）〜ｄ）の総量は、好ましくは、少なくとも５０乾燥重量％である。
【００２５】
飼料組成物を調製する場合、添加物は、粉砕または破砕されたコムギ、オートムギ、オオムギ、トウモロコシ、およびコメなどの穀類、例えば、ナタネ、ダイズ、およびヒマワリの種に基づく植物性タンパク質源、動物性タンパク質源、糖蜜、およびさまざまな粉ミルクやホエー粉末など乳製品からなる乾燥成分と混合されうる。乾燥成分すべてを混合した後、液体成分、および加熱後に液体になる成分が添加されうる。液体成分は、場合により加熱によって液体化される油脂、例えば植物性油脂などの脂質、および／または脂肪酸などのカルボン酸からなりうる。完全な混合後、成分の粉砕度によって、粉状または粒子状の稠度が得られる。貯蔵中の分離を阻止するには、動物飼料に水を添加することが好ましく、次いで従来のペレット化、膨張、押出し工程にかけられる。余分な水は乾燥によって除去されうる。必要に応じて、結果として生じる粒状の動物飼料も破砕され、より小さな粒径にすることができる。記載された飼料組成物は通常、乾燥生草および／またはサイレージといっしょに投与される。
【００２６】
飲料水サプリメントは少なくとも１乾燥重量％、適切には１〜９９乾燥重量％、好ましくは１０〜５０乾燥重量％の成分を含有うる。１つもしくはそれ以上の成分のほかに、サプリメントは１〜９９乾燥重量％の数多くの他の成分をも含有しうる。他の成分の適切な例は、鉱塩、ビタミン、健康および成長強化添加物、香味料、水溶性または水分散性担体、例えば砂糖、粉ミルク、乳副産物およびセルロース誘導体、分散剤および安定剤、例えば水溶性または水分散性ポリマー、およびそれらの混合物である。飲料水を調製する場合、サプリメントは通常、成分の濃度が１ｐｐｍ〜１０重量％になるような量で水に添加される。
【００２７】
本発明の範囲内では、飼料組成物の懸濁液を生成することも可能である。これは、飼料が即時消費用に調製される場合に特に便利である。
【００２８】
本発明をこれから以下の実施例によってさらに例示する。
【実施例】
【００２９】
本実施例において多くの試験が植物材料、植物材料の抽出物、および精油化合物の試料で実行された。植物材料の試料は凍結乾燥され、粉砕され、１ｍｍの篩に通された。試料は以下の通りであった。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
本発明による試料１〜２２のルーメン消化物に対する効果を、ルーメン繊毛原虫の細菌分解活性、ルーメン消化物のタンパク質分解活性、ルーメン消化によって引き起こされるメタン形成、乳酸アシドーシス、および揮発性脂肪酸の形成のほか、発酵に対する他の効果に関して試験した。試験においては以下の方法を適用した。
【００３２】
ルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性
［１４Ｃ］ロイシン標識セレノモナス・ルミナンチューム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）（Ｓ．ルミナンチューム）の分解速度を、以前に記載されているように（ウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）とマックフェルソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、１９８７年）、５ｍＭ非標識Ｌ−ロイシンの存在下に標識Ｓ．ルミナンチュームで染色ルーメン液をインビトロでインキュベートすることによって測定した。これらの条件下、大多数の細菌タンパク質分解は繊毛原虫による細菌の摂取および消化によって引き起こされる。試料は、他に記述がない限り、５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加された。ヒツジには混合干草、すなわち濃縮食を与えた（フルムホルツ（Ｆｒｕｍｈｏｌｔｚ）ら、１９８９年）。
【００３３】
抗原虫活性の継続
試料をコールマンバッファー、ルーメン液、または水とともに２４時間、プレインキュベーションにかけ、次いでその後に上述した細菌分解アッセイで新鮮ルーメン液でインキュベートした。
【００３４】
ルーメン消化物のタンパク質分解活性
方法１．同じヒツジからの染色ルーメン液を使用し、ウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ（１９８３年）の１４Ｃ−カゼイン法を使用してタンパク質分解活性を測定した。試料を２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、１時間のインキュベーション時間を使用した。
【００３５】
方法２．ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら（２００３ａ、ｂ）に基づく。典型的な乳牛食が与えられた瘻孔形成泌乳期ホルスタイン乳牛５頭をドナー動物として使用した。ルーメン液を朝の給餌前に給餌マットから手動で回収した。ルーメン液を１００μｍナイロンネットにろ過し、１０％（ｖ／ｖ）のインキュベーションバッファーと混合した。７５ｍｌ体積中緩衝化ルーメン液を、トウモロコシサイレージ４５０ｍｇ、オオムギ粒２２５ｍｇ（両方とも１ｍｍ篩に通るように粉砕）、および脱脂した未加工のダイズミール１５０ｍｇとウシ血清アルブミン１０ｍｇからなるタンパク質サプリメントの基質混合物を含有する（ＲＰＴ）インキュベーション瓶に分注した。試験植物が添加されていないこの基質を陰性対照としてインキュベートした。試験植物を添加した場合、それらはサイレージに置き換えた。陽性対照として使用したモネンシンをエタノール（１４ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、この保存溶液１１．２５μｌを３μＭモネンシンの最終濃度まで充填直後に各フラスコへ注入した。すべてのフラスコを３９℃下、１２時間までインキュベートした。各処置の２つの複製を一定の間隔でサンプリングすると同時に、第３の補助複製をガスリーディングのために用意した。各サンプリング時間で、２×９００μｌを強く攪拌しながらインキュベーション瓶から回収し、ＳＣＦＡ、アンモニア、およびタンパク質濃度の測定のために調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）法によって行い、総タンパク質定量をホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら（２００２年）によるドットブロットによって行った。
【００３６】
ルーメン発酵に対する一般的効果
発酵に対する一般的効果のホーエンハイム法
実験計画法：
インキュベーション系：リーディング・プレッシャー・テクニック（ＲＰＴ）、７５ｍｌ、総実行時間２４時間
ドナー動物：非分泌乳期ホルスタイン乳牛３頭
基礎基質：牧草サイレージ０．７５０g（対照）
試験植物の含有レベル：１０％（置換サイレージ）
ガスリーディング：２、４、６、８、１０、１２、１６、２４時間
サンプリング：ＳＣＦＡおよびＴＤには２４時間（ナイロンバッグ中ＮＤＳ処置）
ＳＣＦＡ（９００μｌ）およびＲＮＡ（３００μｌ、分析最大値）には６、８、１０時間
平行：２通りで３つの独立した実行（３種類のドナー動物）
【００３７】
【表２】
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【００３８】
方法の詳細な説明：
インビトロインキュベーション
８：００時および１６：００時に２つの同じ分量で給餌される維持において牧草サイレージ干草混合物を与えられた挿管乳牛からルーメン液を採取した。ルーメン液を魔法瓶に供給する前に採取し、１００μｍナイロンネットにろ過し、還元バッファー鉱液に添加した。すべてのステップを３９℃でＣＯ２下に行い、嫌気性状態を維持した。
【００３９】
基質を１０ｍｇ／ｍｌ培地の割合でインキュベートし、すなわち、基質７５０ｍｇをろ過ルーメン液７．５ｍｌ（１０％ｖ／ｖルーメン液）を含有する緩衝化ルーメン液７５ｍｌでインキュベートした。
【００４０】
ガス量または圧力をインキュベーションの２、４、６、８、１０、１２、１６、および２４時間の時点で頻繁に記録し、試料を６、８、１０、および２４時間後に採取した。
【００４１】
分析
ガス圧はＲＰＴ系の血清瓶で記録され、実験的に測定された較正曲線を使用して体積へ変換される。各々の測定後、ガスは血清瓶から放出される。インビトロの真の消化率は、インキュベーション内容物を予め秤量したポリエステルバッグ（アンコム（Ａｎｋｏｍ）５１μｍ孔径）に移すことによって測定された。バッグは熱シールされ、中性清浄液中で１時間煮沸され、１０５℃で一夜乾燥され、これを消化率の測定のために秤量した。ＳＣＦＡは、ＧＰ１０％ＳＰ１０００  １％Ｈ３ＰＯ４、クロモソブ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｂ）ＷＡＷ（サペルコ社（Ｓｕｐｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．）、Ｂｅｌｌａｆｏｎｔｅ、ペンシルベニア（ＰＡ））でパックされたステンレス鋼カラムを使用するガスクロマトグラフィーによって測定された。インキュベーション上清０．９ｍｌに内部基準（１％メチルブトリル（Ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｒｙｒｉｃ）酸）を含有するギ酸０．１ｍｌを添加した。タンパク質を４℃で一夜沈殿させた。試料を遠心分離し（３０，０００ｇ、１０分、４℃）、上清を適切なＧＣバイアルへ分析のために採取した。
【００４２】
ＲＮＡを改良型フェノールクロロホルムプロトコールに従って抽出した。ｐＨ５．１フェノール６００μｌ、ｐＨ５．１バッファー２７０μｌ、ＳＤＳ  ３０μｌ（２０％ｗ／ｖ）、およびジルコニウムビーズ１．０ｇを試料（３００μｌ）に添加した。試料を２×２分間、６０℃で１０分のインキュベーションで中断されるビーズビーター（５０Ｈｚ）中で攪拌することによって細胞を溶解した。試料を氷上で１０分間冷却し、クロロホルム３００μｌを添加した。強く、さらに１０分間、室温（ＲＴ）下に振盪した後、試料を遠心分離し（１０，０００ｇ、５分、４℃）、水相および有機相を分離した。水相を量的に除去し、ＮＨ４酢酸３００μｌ（７．５Ｍ）およびイソプロパノール９００μｌを含有するバイアルに移した。試料を一夜、−２０℃でインキュベートし、遠心分離（１６，０００ｇ、１０分、４℃）によって核酸を沈殿させた。上清を廃棄し、試料を１回、８０％エタノール中で洗浄した。核酸をアガロースゲルに装填し、臭化エチジウムで染色した後、較正曲線に対して濃度測定的に定量化した（２５〜３００ｎｇ／μｌ）。
【００４３】
発酵に対する一般的効果のリーディング法
一連の１３連続発酵を毎週１回、リーディング・プレッシャー・テクニック［ＲＰＴ］を使用して行い、発酵に対するこれら試験材料を含めることからの潜在的な効果、および基礎試料［トウモロコシサイレージ］の分解特性を確認した。β−ミルセン［含有レベル１０および４０ｍｇ  ｇ−１］を除く全試料を３通に、２つの含有レベル［１００および４００ｍｇ  ｇ−１ＤＭ基質］で検査した。トウモロコシサイレージを予備乾燥し、２ｍｍ篩に通るように粉砕した。全部で１．０ｇの混合基質［サイレージ＋基質］を各々の発酵フラスコに配置した。次いで、緩衝化インキュベーション培地［９０ｍｌ］を添加し、フラスコを密閉し、一夜室温下に保存した。調製ルーメン液での接種前に、フラスコ内容物を３９℃に上昇させた。トウモロコシ／牧草サイレージを濃縮物［６０：４０］の割当量で自由に与えた泌乳期乳牛２頭から給餌前［０７：００時］にルーメン液を手動で［用手圧搾内容物］得た。液体を２層のモスリンにろ過し、ＣＯ２下に３９℃で使用するまで保持した。調製液１０ｍｌを各々のフラスコに添加し、これらを試験期間中３９℃でインキュベートした。６つの陰性対照［緩衝化培地＋ルーメン液のみ］を各々の実行に含め、直接のルーメン液効果に対するガス値および分解残留物を補正した。また、非補充トウモロコシサイレージ［１．０ｇフラスコ−１］をすべての実行に含めた［実行当りフラスコ６個］。試験内の結果を陽性対照値に対して表した。
【００４４】
ヘッドスペースガス圧リーディングを接種後２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２１、および２４時間に得た。最後の測定後、発酵培地約３．０ｍｌを各々のフラスコからサンプリングし、試験材料／含有レベルによってバルク化し、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）３６００ＧＣを使用するＶＦＡ組成物のその後の分析まで［−２０℃］で凍結保存した。発酵残留物をフラスコ内容物を６０ｍｌグーチろ過器［空隙率１、１００〜１６０μｍ］を通じて軽真空下にろ過することによって回収した。次いで、残留物を乾燥し［２４時間１００℃］、秤量し、灰化し［一夜５００℃］、再秤量した。測定された乾物［ＤＭ］および有機物［ＯＭ］の量を使用してｉＤＭＤおよびｉＯＭＤ［それぞれ、インビトロＤＭおよびＯＭ分解］を評価した。発酵ガス放出の程度［インキュベートされたｍｌガス  ｇ−１ＯＭ］および速度［ｍｌ  ｈ−１］を以前に導出された二次関数を使用して生成し、圧力を体積に変換した。飼料発酵効率［ＦＥ］を接種後２４時間でのｉＤＭＤ［ｇ  ｋｇ−１］／累積ガス［ｍｌ］放出として推定した。処置手段と陽性対照［トウモロコシサイレージのみ］との間の統計的差異をスチューデントＴ検定を使用して評価し、Ｐ＞０．０５を有意とした。
【００４５】
発酵に対する一般的効果のレオン法
７５％アルファルファ干草および２５％オオムギからなる飼料で給餌されるルーメン挿管ヒツジ（ビタミン−ミネラルサプリメントおよび水を自由に与える）をルーメン液のドナーとして使用した。ルーメン液を朝食直前に採取した。
【００４６】
５０％アルファルファ干草、４０％牧草の干草、および１０％オオムギ粒からなるバッチ培養に使用された基質を１ｍｍ篩のハンマーミルで粉砕した。使用された基質の量は５００ｍｇであり、試験植物の含有率は１０％（約５０ｍｇ）であった。両方を秤量して血清瓶へ入れ、ここでろ過ルーメン液１０ｍｌおよびゲーリング（Ｇｏｅｒｉｎｇ）とファン・ゼースト（Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ）、１９７０年）によって記載された培地４０ｍｌを含有する緩衝化ルーメン液５０ｍｌを好気的に分散させた。これらの瓶を密閉し、３９℃下にインキュベートした。インキュベーションの２４時間後、確実な測定値を記録した。すなわち、
−総ガス生産（ｍｌ）、圧力トランスデューサを使用し、ガスを目盛付き注射器に収集。
−インキュベーション培地中のｐＨ。
−インキュベーション倍地中の揮発性脂肪酸濃度、ＧＣによる（ＶＦＡも接種時に測定し、２４時間後のＶＦＡ産生を計算する）。
−ＤＭインキュベーション残留物、焼結つぼ中で瓶内容物をろ過し、乾燥後の残留物を秤量することによって。その後、残留物の中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）内容物を測定し、非分解ＤＮＦの量を計算した。これからＤＭおよびＮＤＦの消失を推定した。
【００４７】
植物ごとに３つの複製をインキュベートし、ブランク（基質なし植物なし）および対照（植物なし基質５００ｍｇ、および植物なし基質５５０ｍｇ）を使用した。
【００４８】
ルーメン消化物によるメタン形成
レオンの一般法によって行われたインキュベーションをメタン形成について分析した。生産されたガスの代表的な試料をその後の分析のために採取した。サンプリングは、試料の固定および貯蔵を可能にする弁を装着した特殊なガス気密注射器を使用して行われた。試料は、ストッパーの中隔を通じて針の挿入後にヘッドスペースから直接採取され、試料を注射器に取り、弁を閉じた。この試料を総ガス生産の測定後に採取し、ガス組成物が放出されたガス中およびヘッドスペース中の残留物中で同じであると想定した。
【００４９】
生産されたガス中のメタン濃度をガスクロマトグラフィーによって測定した。ガス試料（３００〜５００μｌ）をガス気密注射器から直接、対応するポートへ注入した。分析に使用されたＧＣパラメータ設定値は以下の通りであった。
器具：炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたシマズ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＧＣ−１４Ｂ
カラム：６０／８０メッシュカルボキセン（Ｃａｒｂｏｘｅｎ）１０００固定相でパックした長さ２．３メートル×内径２．１ｍｍステンレス鋼カラム
搬送ガス：ヘリウム、流量（１００ｋＰａ）、一定流モード
温度：
検出器：ＦＩＤ。温度２００℃、合成空気流量（５０ｋＰａ）、Ｈ２流量（５０ｋＰａ）
インジェクタ：温度２００℃
カラムオーブン：１７０℃（定温）
【００５０】
較正に使用される標準は純粋メタン（９９．９％）であった。標準曲線は、メタンの注射された標準量に対してピーク面積の線形回帰をプロットすることによって確立され、反応因子を得た。
【００５１】
アシドーシスアッセイ
４８時間の発酵期間にわたって対照に対して、インキュベーション培地ｐＨおよび産生される乳酸の濃度の減少が、潜在的なアシドーシス効果を消失する試験基質の能力の指標を示すモデルを使用した。本試験では粉砕コムギ［２ｍｍ］を基礎基質として使用し、試験材料を１００ｍｇ  ｇ−１ＤＭ［または１０ｍｇ  ｇ−１ＤＭ  β−ミルセン］で含めた。前述同様に、総基質１．０ｇを各々のフラスコに添加した。乳酸産生を強化するために、調製したバッファー溶液を５０％希釈した。これはインキュベーション培地の緩衝能力が上回り、結果として生じるｐＨの減少が乳酸菌および他の乳酸産生細菌の成長を促進することを確実にするためであった。ルーメン液は、使用された２頭の乳牛が高レベルの粗い粉砕コムギで早期泌乳割当量が与えられたこと除き既述されているように得られ、調製された。液体のｐＨ測定は、接種後１時間［開始ｐＨ］、次いでさらに２３および４７時間後にｐＨ電極を直接各々のフラスコへ挿入することによって行った。最後の測定の直後、液体約３．０ｍｌを各々のフラスコから採取し、試料によってバルク化し、Ｌ［＋］乳酸について酵素的に分析されるまで−２０℃下に凍結保存した。
【００５２】
結果は対照に対する絶対差として示されている。アシドーシスの好ましい効果が、２４時間までのｐＨ低下の低下率、高い終点ｐＨ、および低い乳酸濃度として確認された。
【００５３】
結果
発酵活性の測定から得られた結果は、以下の表２ａ、２ｂ、および２ｃに示されている。
【００５４】
原虫アッセイ、方法１によるタンパク質分解アッセイ、およびメタン形成において得られた結果が同じ表に示されている。
【００５５】
異なる含有率での選択された植物／植物抽出物の原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの影響は図１〜図７に示されている。原虫の細菌溶解活性の継続率は、特にＧ．アスクレピアダ（Ｇ．ａｓｃｌｅｐｉａｄｅａ）でバッファーまたは水においてよりもルーメン液において高かった（表１）。Ｋ．アルベンシス（Ｋ．ａｒｖｅｎｓｉｓ）の影響は図８に示されている。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
【表６】
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【００６０】
引用文献
ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ＥＭ、モイツェル（Ｍｅｕｔｚｅｌ）Ｓ、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）Ｋ（２００２年）、Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｏｔ−ｂｌｏｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔａｎｎｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｎｎｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｆｅｅｄｓ、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８７：４２１−４２６頁
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ゲンチアナ・アスクレピデアの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図２】スイカズラの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図３】クローブバッドの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図４】ヒナギクの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図５】オリーブの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図６】ヒレハリソウの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図７】β−ミルセンの異なる含有率（μｇ／ｍｌ）でのルーメン繊毛原虫の細菌溶解活性に対するインビトロでの効果。
【図８】ドットブロットアッセイによるタンパク質分解の定量により、Ｋ．アルベンシスの２種類の受入によるタンパク質分解の阻害が確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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