(57)【要約】前立腺癌、特にアンドロゲン非依存性前立腺癌を処置および予防するための方法。本方法は、哺乳動物に式（Ｉ）を有するベンゾチオフェンまたはその薬学的に受容可能な塩またはそのプロドラッグを投与する工程を包含する。ＲおよびＲ１は、独立に水素、−ＣＯＲ２、−ＣＯＲ３およびＲ４からなる群より選択され；Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３クロロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３フルオロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、クロロ、フルオロ、トリクロロメチルおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される少なくとも一置換基を有するフェニルであり；Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキルおよびベンジルからなる群より選択され；Ｒ５は、酸素および−Ｃ＝Ｏからなる群より選択される。2007513865.tif 000020
2007513865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の以下の式
【化１】
2007513865.tif 000012
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する方法であって、
ここで、ＲおよびＲ１は、それぞれ独立して、水素、−ＣＯＲ２、−ＣＯＲ３、およびＲ４からなる群より選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３クロロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３フルオロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、およびフェニルからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、クロロ、フルオロ、トリクロロメチル、およびトリフルオロメチルからなる群より選択される、少なくとも１つの置換基を有するフェニルであり、
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、およびベンジルからなる群より選択され、そして
Ｒ５は、酸素および−Ｃ＝Ｏからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約６０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり約６０ｍｇの量での該化合物による処置に対して前記哺乳動物が応答しない後のみ、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記方法は、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効量で、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記エストロゲン低下薬は、前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを約３０ｐｇ／ｍｌ以下の量まで低めるために有効量で投与される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、経口投与される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ＲおよびＲ１は、ともに水素である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、Ｒ５は酸素である、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、Ｒ５は、−Ｃ＝Ｏである、方法。
【請求項１２】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の以下の式
【化２】
2007513865.tif 000013
を有するプロドラッグまたはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する方法であって、
ここで、Ｒ５は、酸素および−Ｃ＝Ｏからなる群より選択され、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、および−ＯＲ８からなる群より選択され、
Ｒ８は、ヒドロキシ保護基であり、そして、
Ｒ６およびＲ７うちの少なくとも一つは、該プロドラッグの投与後、該哺乳動物によって代謝的に処理されて、該プロドラッグをアンドロゲン非依存性前立腺癌の処置に有効な薬学的化合物に変える、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約６０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり約６０ｍｇの量での該化合物による処置に対して前記哺乳動物が応答しない後のみ、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効な量で、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記エストロゲン低下薬は、前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを約３０ｐｇ／ｍｌ以下の量まで低めるために有効量で投与される、方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の方法であって、前記化合物は、経口投与される、方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法であって、Ｒ６およびＲ７は、該プロドラッグの投与後、ともに該哺乳動物によって代謝的に処理され、その結果、該代謝過程に続いて、第一のヒドロキシル基は、該代謝過程前にＲ６によって占められていた部位に残り、そして、第二のヒドロキシル基は、該代謝過程前にＲ７によって占められていた部位に残る、方法。
【請求項２１】
請求項１２に記載の方法であって、Ｒ５は酸素である、方法。
【請求項２２】
請求項１２に記載の方法であって、Ｒ５は、−Ｃ＝Ｏである、方法。
【請求項２３】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の、以下の式
【化３】
2007513865.tif 000014
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効な量でエストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の、以下の式
【化４】
2007513865.tif 000015
の化合物のプロドラッグまたはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効量の、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の、以下の式
【化５】
2007513865.tif 000016
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効な量で、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の、以下の式
【化６】
2007513865.tif 000017
の化合物のプロドラッグまたはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効な量で、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の、以下の式
【化７】
2007513865.tif 000018
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩の有効量を投与する工程を包含する方法であって、
ここで、ＲおよびＲ１は、それぞれ独立して、水素、−ＣＯＲ２、−ＣＯＲ３、およびＲ４からなる群より選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３クロロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３フルオロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、およびフェニルからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、クロロ、フルオロ、トリクロロメチル、およびトリフルオロメチルからなる群より選択される、少なくとも１つの置換基を有するフェニルであり、
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、およびベンジルからなる群より選択され、そして
Ｒ５は、酸素および−Ｃ＝Ｏからなる群より選択される、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約６０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり約６０ｍｇの量での該化合物による処置に対して前記哺乳動物が応答しない後のみ、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項４０】
請求項３５に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効な量で、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記エストロゲン低下薬は、前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを約３０ｐｇ／ｍｌ以下の量まで低めるために有効な量で投与される、方法。
【請求項４２】
請求項３５に記載の方法であって、前記化合物は、経口投与される、方法。
【請求項４３】
請求項３５に記載の方法であって、ＲおよびＲ１は、ともに水素である、方法。
【請求項４４】
請求項３５に記載の方法であって、Ｒ５は酸素である、方法。
【請求項４５】
請求項３５に記載の方法であって、Ｒ５は、−Ｃ＝Ｏである、方法。
【請求項４６】
アンドロゲン依存性前立腺癌を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、有効量の、以下の式
【化８】
2007513865.tif 000019
を有するプロドラッグまたはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する方法であって、
ここで、Ｒ５は、酸素および−Ｃ＝Ｏからなる群より選択され、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、および−ＯＲ８からなる群より選択され、
Ｒ８は、ヒドロキシ保護基であり、そして、
Ｒ６およびＲ７うちの少なくとも一つは、該プロドラッグの投与後、該哺乳動物によって代謝的に処理されて、該プロドラッグをアンドロゲン依存性前立腺癌の処置に有効な薬学的化合物に変える、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１０ｍｇと３００ｍｇとの間の有効量で投与される、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約６０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記化合物は、１日あたり約６０ｍｇの量での該化合物による処置に対して前記哺乳動物が応答しない後のみ、１日あたり、約１８０ｍｇの有効量で投与される、方法。
【請求項５１】
請求項４６に記載の方法であって、
前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを低めるために有効な量で、エストロゲン低下薬を該哺乳動物に投与する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記エストロゲン低下薬は、前記哺乳動物におけるエストラジオールの血清レベルを約３０ｐｇ／ｍｌ以下の量まで低めるために有効な量で投与される、方法。
【請求項５３】
請求項４６に記載の方法であって、前記化合物は、経口投与される、方法。
【請求項５４】
請求項４６に記載の方法であって、Ｒ６およびＲ７は、該プロドラッグの投与後、ともに該哺乳動物によって代謝的に処理され、その結果、該代謝過程に続いては、第一のヒドロキシル基は、該代謝過程前にＲ６によって占められていた部位に残り、そして、第二のヒドロキシル基は、該代謝過程前にＲ７によって占められた部位に残る、方法。
【請求項５５】
請求項４６に記載の方法であって、Ｒ５は酸素である、方法。
【請求項５６】
請求項４６に記載の方法であって、Ｒ５は、−Ｃ＝Ｏである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第１０／４１２，０８７号（２００２年５月９日出願）の一部継続出願であり、その内容は、本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明の実施形態は、患者に、ベンゾチオフェン（ｂｅｎｚｉｏｔｈｉｏｐｅｎｅ）（例えば、ラロキシフェンまたはアルゾキシフェン（ａｒｚｏｘｉｆｅｎｅ））を投与することによって、前立腺癌、特にアンドロゲン非依存性前立腺癌を処置および予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
いくつかの型の癌（腺癌、肉腫、扁平上皮癌、および腺管移行性癌を含む）が、前立腺に影響を与え得る。腺癌は、これらのうち最も一般的な癌であり、５０代を過ぎた男性において最も一般的な悪性疾患のうちの１つである。米国において、２００，０００名を超える男性が、毎年、この型の癌であると診断されている。
【０００３】
前立腺の癌の大部分は、アンドロゲンレセプターを有する。それら癌は、それら癌の増殖がテストステロンおよび他のアンドロゲンに依存する。ホルモン除去療法  （Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｌａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）（アンドロゲンまたはアンドロゲンを生成する器官を化学的に妨害する治療）は、従って、前立腺癌の処置における標準である。このような治療は、前立腺癌を有する男性の生存を、３年から５年、またはそれ以上、長期化し得る。
【０００４】
化学的ホルモン除去療法は、アンドロゲン合成をもたらすホルモン経路をブロックする薬物の投与を包含する。男性において、視床下部は、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）を分泌し、ゴナドトロピン放出ホルモンは、下垂体を刺激して、黄体形成ホルモン（「ＬＨ」）を分泌させる；続いて、ＬＨは、精巣を  刺激して、テストステロンを生成させる。従って、ＧｎＲＨおよびＬＨの合成アナログは、体内を循環するアンドロゲンのレベルを低下させるために投与される。これらアナログは、ＧｎｒＨレセプターへの結合について天然の対応物と競合し、それにより、レセプターをダウンレギュレートし、テストステロン生成回路を妨害する。エストロゲンもまた、アンドロゲン生成をブロックするが、心血管の健康状態を損ない得るので、滅多に使用されない。抗アンドロゲン薬物（例えば、フルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、またはニルタミド）もまた、利用可能である。これらは、前立腺癌  細胞上のアンドロゲンレセプターに結合し、それらの活性化を妨げ、それにより、天然のアンドロゲンの作用を制限する。
【０００５】
外科的ホルモン除去療法は、男性におけるテストステロン生成器官である、片方または両方の精巣の外科的除去（精巣摘除術）を包含する。この処置の有効性は、抗アンドロゲンと組み合わせることによりなおさらに増大し得る。
【０００６】
アンドロゲン非依存性前立腺癌（ホルモン難治性（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）前立腺癌ともいわれる）は、その増殖がアンドロゲンに依存しない；結果として、ホルモン除去療法は、アンドロゲン非依存性前立腺癌に対してはほとんど効果がない。アンドロゲン依存性癌を処置する際に非常に有効な治療でさえ、アンドロゲン非依存性癌を有する患者に適用した場合、効果がないことが示されている。
【０００７】
アンドロゲン非依存性癌は、処置することが困難である。癌と関連する前立腺炎症のサイズが、例えば、コルチコステロイドおよび他の抗炎症薬剤によって、減少され得るが、このような処置  は、癌自体に対する効果はない。この理由のために、基本的な医学書はなお、「ホルモン難治性前立腺癌に対する標準的治療法はない」（Ｍ．Ｈ．ＢｅｅｒｓおよびＲ．Ｂｅｒｋｏｗ（編），Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１６５８（１９９９））と教示している。この医学書によれば、細胞傷害性薬剤および生物学的薬剤は、「研究中」であるが、「コルチコステロイド単独に対するその優位性は、証明されていない」。
【０００８】
従って、当該分野では、アンドロゲン非依存性前立腺癌の満足いく処置への大きな必要性が存在する。このような処置は、前立腺癌がよく起こる高齢男性の健康状態に対して劇的な影響を有し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の目的は、前立腺癌の処置のための治療、特に、ホルモン除去療法にあまり応答しないかまたはそのような治療に全く応答しない前立腺癌の処置のための治療を提供することである。言い換えると、本発明の目的は、最後の望み、すなわち、患者が長期間生存する望みが未だにほとんどない症例において、前立腺癌の処置のための治療を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
アンドロゲン非依存性前立腺癌を処置する際に驚くほど有効な、数ヶ月しか生存できないと以前に診断された患者において、疾患の進行を劇的に逆転させる前立腺癌を処置する方法が、本明細書中に開示される。この方法は、患者に、有効量の、以下の式
【００１１】
【化９】
2007513865.tif 000003
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、その化合物は、ラロキシフェン（ＲおよびＲ１が、ともに水素であり、Ｒ５が、−Ｃ＝Ｏである式Ｉの化合物）である。別の好ましい実施形態において、その化合物は、アルゾキシフェン（ＲおよびＲ１はがともに水素であり、Ｒ５が酸素である式Ｉの化合物）である。エストロゲン低下薬（薬）が、本発明の化合物（特に、患者が約３０ｐｇ／ｍｌ以上の血清エストラジオールレベルを示す例）に加えて投与され得る。
【００１２】
本願のファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも一つ含む。カラー図面を有する本特許のコピーは、要求および必要な料金の支払いがあればすぐに、米国特許商標庁により提供される。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、患者に、有効量の、以下の式：
【００１４】
【化１０】
2007513865.tif 000004
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含し、ここで、ＲおよびＲ１は、それぞれ独立して、水素、−ＣＯＲ２、−ＣＯＲ３、およびＲ４からなる群より選択され；Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３クロロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３フルオロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、およびフェニルからなる群より選択され；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、クロロ、フルオロ、トリクロロメチル、およびトリフルオロメチルからなる群より選択される、少なくとも１つの置換基を有するフェニルであり；Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、およびベンジルからなる群より選択され；そしてＲ５は、酸素および−Ｃ＝Ｏからなる群より選択される。このような化合物、およびこの化合物を調製する方法は、米国特許第４，４１８，０６８号（「‘０６８特許」）に詳細に記載され、その開示は、本明細書中に参考として援用される。この‘０６８特許は、このような化合物が、それらの抗エストロゲン特性および抗アンドロゲン特性のために有用であることを述べている。
【００１５】
本発明者は、式Ｉの化合物（基本的に、それらの抗エストロゲン特性については公知）が、アンドロゲン非依存性前立腺癌を処置するために使用され得る；すなわち、このような化合物が、アンドロゲンレセプターを欠いているか、さもなければ癌の増殖がアンドロゲンに依存しない癌を処置するために使用され得るという驚くべき発見をした。この発見は、同様の抗エストロゲン、最も明白にはタモキシフェン（クエン酸タモキシフェンは、商標ＮＯＬＶＡＤＥＸのもとで、ＡｓｔｒａＺｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＬＰ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手可能である）が、臨床試験におけるアンドロゲン非依存性前立腺癌に効果を示さないという以前のいくつかの証拠の観点から、特に驚くべきことである。しかし、本発明の方法は、アンドロゲン依存性前立腺癌の処置においてもまた使用され得る。
【００１６】
本発明者は、前立腺癌細胞が、エストロゲンレセプターのβアイソフォームを発現することを実証し、式Ｉの化合物の作用機構が、そのエストロゲンレセプターのβアイソフォームを通じてシグナル伝達しているという仮説を立てた。従って、本発明の好ましい化合物は、エストロゲンレセプターのβアイソフォームをブロックする際に有効な式Ｉの化合物である。タモキシフェンは、上記エストロゲンレセプターのα型アイソフォームと優先的に相互作用することが公知である。
【００１７】
本発明の方法で使用するための特に好ましい化合物は、ラロキシフェン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより、商標品名ＥＶＩＳＴＡのもとで入手可能である）、すなわち、式
【００１８】
【化１１】
2007513865.tif 000005
を有するベンゾチオフェン、およびその薬学的に受容可能な塩である。塩酸ラロキシフェン（ラロキシフェンＨＣｌ）は、式ＩＩの化合物の好ましい塩である。
【００１９】
本発明の方法で使用するための別の特に好ましい化合物は、アルゾキシフェン、すなわち、式
【００２０】
【化１２】
2007513865.tif 000006
を有するベンゾチオフェン、およびその薬学的に受容可能な塩である。塩酸アルゾキシフェン（アルゾキシフェンＨＣｌ）は、式ＩＩＩの化合物の好ましい塩である。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、式Ｉの化合物のプロドラッグ、または好ましくは、式ＩＩもしくは式ＩＩＩの化合物のプロドラッグが、哺乳動物に投与される。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「プロドラッグ」とは、体内での代謝プロセスにより活性なベンゾチオフェンに変換される任意の化合物をいう。式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物自体よりむしろ、式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物のプロドラッグを投与することが、なぜ望ましいことであり得るかということには、種々の理由がある。使用される特定の化合物（またはその塩）に依存して、プロドラッグは、可溶性、吸収性、安定性、放出、毒性、および患者の受容性が考慮される限り、優れた特徴を有し得る。本発明の任意の化合物のプロドラッグをどのように生成し得るかは、当業者に容易に明らかであるはずである。そのために多くのストラテジーがある。
【００２３】
本発明のプロドラッグとしては、式
【００２４】
【化１３】
2007513865.tif 000007
を有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩が挙げられる。Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素（このようなプロドラッグは、インビボで、酵素的ヒドロキシル化により活性なベンゾチオフェンへと転換される）、ヒドロキシおよび−ＯＲ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ８は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩに関して上で記載されているように、体内で代謝的に切断されて本発明の対応する化合物を生成する任意の適切なヒドロキシ保護基である。ヒドロキシ保護基は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９９１の第２章に記載されている。１例として、簡単なエーテル基および簡単なエステル基は、本発明の実施形態に従う適切なヒドロキシ保護基として使用され得る。一連の適切な保護基は、当業者にとって容易に明らかになるが、Ｒ８は、代表的な保護基（Ｃ１〜Ｃ４アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ４アルコキシもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ４アルコキシ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル、ＳＯ２−（Ｃ４〜Ｃ６アルキル）および−（ＣＯ）Ａｒが挙げられるが、これらに決して限定されない）よりさらに選択され得、ここで、Ａｒは、ベンジルまたは置換されたフェニル（すなわち、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード、トリクロロメチルおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される１個以上の置換基を有するフェニル基）である。本発明の方法に関連して使用された化合物の例示的な化合物の調製は、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ  ９８／４５２８８において記載されており、この文献の開示は、本明細書中で参考として援用される。この刊行物は、アンドロゲン依存性前立腺癌の処置における本発明の化合物に関連する化合物の使用を記載する。
【００２５】
式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＩＶの化合物（これらの塩およびこれらの式のプロドラッグを包含する）の投与は、単一の薬剤療法として、または確立された治療（例えば、化学療法、外科手術、またはアンドロゲン非依存性の前立腺癌を処置するための当該分野で公知の任意の他の治療）の補助として、使用され得る。
【００２６】
本発明の化合物の適切な投薬量は、処置される個体の年齢および体重、この化合物が、単一薬剤としてまたは補助治療として使用されているか否か、アンドロゲン非依存性癌の型（例えば、腺癌、肉腫、扁平上皮癌、移行性腺管癌、または他の前立腺癌であるか否か）、癌の進行（例えば、癌が転移性か、局在性か）、そのサイズ、位置、および腫瘍学分野の当業者に周知の他の要因に依存する。一般に、１０ｍｇ〜３００ｍｇ／日の用量が使用され得る。一日当たり６０ｍｇの投薬量は、幾人かの患者において、臨床的に十分な結果を生み出すのに（すなわち、根本的な疾患状態を処置するか、または、単に根本的な疾患状態の悪化を防ぐために）十分であるが、患者が一日当たり６０ｍｇの投薬量に反応しない場合、より高投薬量が、望ましくあり得る。この患者は、このレベルの処置に対して耐性であり得るか、またはそうでなければ非反応性である。一日当たり約１８０ｍｇの、より高い投薬量は、このような場合に好ましくあり得るが、患者は、増加した投薬量が有効または適切になるために、低投薬量に対する耐性または非反応性を最初に示す必要はない。一日当たり６０ｍｇまたは１８０ｍｇの単回用量での、ラロキシフェンＨＣｌ、アルゾキシフェンＨＣｌ、またはこれらのプロドラッグのいずれかの投与は、本発明の種々の実施形態において特に好ましい。
【００２７】
任意の特定の理論に縛られることなく、本発明の化合物は、内因性エストロゲンと競合的にβアイソフォームのエストロゲンレセプター（ＥＲ−β）に結合すると考えられている。従って、本発明のさらなる実施形態では、エストロゲン低下薬が、処置レジメンにおいてかまたは薬学的生成物と組み合わせてのいずれかで、本発明の化合物に加えて投与され得る。適切なエストロゲン低下薬は、すぐに当業者により認識される。適切なエストロゲン低下薬としては、１例として、アロマターゼインヒビターとして公知の化合物のクラスが挙げられ得る。エストロゲン低下薬のさらなる投与は、患者が約３０ｐｇ／ｍｌよりも大きい血清エストラジオールレベルを示す場合（正常な男性は、約５０ｐｇ／ｍｌ〜７０ｐｇ／ｍｌのエストラジオールの血清レベルを有する）、特に望ましくあり得る。後の実施例においてより詳細に記載されている前臨床研究は、エストラジオールの非存在下または低レベルのエストラジオール（例えば、約３０ｐｇ／ｍｌ未満）の存在下においてのみ、ＥＲ−β標的化療法の有効性を示した。エストラジオールが全く存在しないことは、本明細書中に記載されているベンゾチオフェン化合物を用いた本発明の方法を達成するために必要とされているわけではないが、血清エストラジオールレベルの減少（すなわち、約３０ｐｇ／ｍｌ以下）のおかげで、抗腫瘍特性を達成するためのベンゾチオフェン化合物の著しく優れた性能が得られると考えられている。
【００２８】
本発明の化合物を経口投与するのが好ましいが、静脈内注射および筋肉内注射によっても本発明の化合物は投与され得る。特に好ましい実施形態では、ラロキシフェンＨＣｌは、６０ｍｇのラロキシフェンＨＣｌおよび賦形剤を含有する固形錠剤または１８０ｍｇのラロキシフェンＨＣｌおよび賦形剤を含有する固形錠剤として投与される。特に好ましい別の実施形態では、アルゾキシフェンＨＣｌは、６０ｍｇのアルゾキシフェンＨＣｌおよび賦形剤を含有する固形錠剤または１８０ｍｇのアルゾキシフェンＨＣｌおよび賦形剤を含有する固形錠剤として投与される。
【００２９】
本発明の化合物は、一般的に、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＩＶの化合物を、薬学的に受容可能な液体キャリア、微細に分割した固体キャリア、またはその両方と均一に合わせ、次いで、必要であればこの生成物を成形することにより調製される。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、処方物の他の成分と適合性であり、かつ投与される被験体に害を与えないキャリアをいう。そのような適切なキャリアとしては、例えば、水、アルコール、天然油もしくは硬化油および蝋、炭酸カルシウムおよび炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、カオリン、タルク、ならびに乳糖が挙げられる。
【００３０】
本発明に従う処方物は、好ましくは、１種以上の賦形剤（例えば、以下：防腐剤（例えば、エチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート）；懸濁剤（例えば、メチルセルロース、トラガカント、およびアルギン酸ナトリウム）；湿潤剤（例えば、レシチン、ポリオキシエチレンステアレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）；造粒剤および崩壊剤（例えば、デンプンおよびアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、およびアカシアガム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルク）；矯味矯臭剤および着色剤、ならびに薬学的処方物に従来から添加されている任意の他の賦形剤）と合わせられる。
【００３１】
経口投与のために適切な本発明の処方物は、以下の形態：カプセル剤、カシェ剤、または錠剤などの別個の単位（各々が、活性成分の所定の量を含有する）；散剤もしくは顆粒剤；水溶性液体もしくは非水溶性液体中の溶液もしくは懸濁液；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型エマルジョン、および経口投与に適切な任意の他の形態、のいずれかにおいて提示され得る。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例は、本発明の方法に従って、アンドロゲン非依存性前立腺癌に罹患している患者を処置するために使用され得る手順、またはこのような患者を処置するために使用され得る本発明の化合物の効率を評価するために使用され得る手順を代表する。これら実施例の改変は、本明細書中に記載される状態とは異なる状態の患者を処置しようとしている当業者に容易に明らかである。
【００３３】
（実施例１）
（アンドロゲン非依存性前立腺癌を有する男性患者の処置）
３名の男性患者を、前立腺癌の確立された診断に基づいて、処置するために選択した。３名の患者は全て、標準的なアンドロゲン除去療法に失敗していた。処置開始時の各患者についての平均的な前立腺癌特異的抗原（「ＰＳＡ」）レベルは、約２０〜３０ｎｇ／ｍｌであった。ホルモン除去療法は、３６ヶ月程度の期間積極的に投与したいくつかの症例においては、失敗し、各患者においてＰＳＡレベルが明らかに上昇し続けた。このような治療に対する応答がないことは、各患者における前立腺癌が、アンドロゲン非依存性（またはアンドロゲン非依存性になった）ことを示した。各患者は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（「ＬＨＲＨ」）−アゴニスト療法を行っても腫瘍が増殖しているにもかかわらず、この治療を受け続けた。これは、標準的な治療法と考えられる。なぜなら、これらの患者においてテストステロンのレベルが正常に回帰した場合、腫瘍の増殖は、より積極的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）になる可能性があるからである。
【００３４】
各患者に、６０ｍｇのラロキシフェンＨＣｌを１日に１回、最低３０日間にわたり経口的に与えた。各患者のＰＳＡレベルは、この期間の後の各患者において５０％未満に低下した。このことは、ラロキシフェンＨＣｌが、アンドロゲン非依存性前立腺癌に罹患した患者において劇的に有益な結果を生じ得ることを実証する。本出願の出願当時、最長期間処置した患者は、治療の開始から１７ヶ月であり、ＰＳＡは、０．４ｎｇ／ｍｌ未満である状態が続いており、この患者の骨のスキャンにおいて改善がみられている。ラロキシフェンで処置された患者の大部分において、腫瘍の安定化が起こり（非進行）、これは、前に上昇した血清ＰＳＡのレベルが安定化したことによって明らかになった。
【００３５】
（実施例２）
（アンドロゲン非依存性異種移植片モデルにおける腫瘍増殖の阻害）
本発明者は、ヒト前立腺腫瘍細胞（ＣＷＲ２２Ｒ）のアンドロゲン非依存性異種移植片モデルを使用して、雄のヌードマウスおよび雌のヌードマウスにおいて腫瘍を作った。腫瘍は、２〜３週間の期間で触知可能な塊にまで成長した。１０匹のマウスを、処置群に無作為に割り当て、そして１０匹のマウスをコントロール群に割り当てた。
【００３６】
０．８５ｍｇ／ｋｇのラロキシフェンＨＣｌを、上記処置群の各マウスに皮下注射にて毎日投与した。コントロール群のマウスには、生理食塩水の注射を与えた。３０日後、生存マウスからの腫瘍を外科手術により取り出し、目視検査した。腫瘍サイズは、コントロール群のマウスおよび雌の宿主と比較して、処置群のマウスにおいて６０％減少した。
【００３７】
（実施例３）
（臨床研究用の動物被験体の準備）
異種移植片研究を、Ｄ．Ｂ．Ａｇｕｓら、「Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ａｎｔｉ−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（１９）：４７６１〜４７６４（１９９９）において記載されているように行った。精巣摘除された７週齢〜８週齢のヌード胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から得、そして病原体の存在しない条件で維持した。マウスに、細かく刻んだ腫瘍組織を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ再構成基底膜（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｈｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ：Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）と一緒に皮下接種（「ｓ．ｃ．」）した。このＭＡＴＲＩＧＥＬ再構成基底膜は、アンドロゲン非依存性（「ＡＩ」）と立証されたＭＳＫＰＣ９異種移植片細胞株由来であった；細胞株は、Ｍ．Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎら、「ＣＷＲ２２：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｏｆｔ  ａｇａｒ」Ｃａｎｃｅｒ，Ｒｅｓ．５６（１３）３０４２〜３０４６（１９９６）、およびＤ．Ｂ．Ａｇｕｓら、「Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９１（２１）：１８６９〜７６（１９９９）に記載されている。
【００３８】
少なくとも１００ｍｍ３の容積の確立した腫瘍を有する動物を、処置群と名付けた。この処置は、同一の用量計画にて、０．２％のＴＷＥＥＮ−２０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手）を含む１．５％のカルボキシメチルセルロース中のラロキシフェン（経口強制栄養法（「ｐ．ｏ．」）により、４０ｍｇ／ｋｇ  ５×／ｗｋ）またはビヒクル単独のいずれかから構成された。腫瘍を、ノギスで週に２回測定し、そして腫瘍の容積を、式（π／６）×（より大きな直径）×（より小さな直径）２により計算した。この式は、Ｍ．Ｆ．Ｐｒｅｓｓら、「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１５（８）：２８９４〜２９０４（１９９７）に記載されている。動物を、腫瘍接種後２５日目に屠殺し、そして腫瘍組織を、分析のために、素早く凍結させ、またはパラフィン中に固定した。結果を、図１に例示する。図１は、ラロキシフェンで処理した動物では、腫瘍がより小さかったことを示す。
【００３９】
（実施例４）
（血清ＰＳＡレベルの決定）
移植した動物の血液中のＰＳＡレベルを、酵素免疫アッセイキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ；Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡより入手）を使用して決定した。血液サンプルを、血清分離チューブ（ｓｅｒｕｍ−ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ｔｕｂｅ）を使用してまたは５０μｌの血液を回収するための背側の尾の静脈の小切開により屠殺時の心臓の摘出（ｃａｒｄｉａｃ  ｄｒａｗ）を介して、処置前に得た。これらのアッセイの結果を図３に示す。図３は、ラロキシフェンで処置された動物における上昇したＰＳＡレベルを示す。
【００４０】
（実施例５）
（免疫ブロットアッセイ）
タンパク質を、タンパク質抽出緩衝液（放射性免疫沈降（「ＲＩＰＡ」）緩衝液、５μｌ／ｍｌ  ＮａＦ、５μｌ／ｍｌ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｌ／ｍｌ  プロテアーゼインヒビターカクテルおよび５μｌ／ｍｌフッ化フェニルメチルスルホニル（「ＰＭＳＦ」））中で、凍結腫瘍組織をホモジナイズして短時間超音波破砕することにより、その組織から抽出した。ＬＮＣａＰ細胞およびＭＣＦ−７細胞を回収し、同じタンパク質抽出緩衝液中に溶解した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定した。そのサンプルを、５分間煮沸し、各レーンにおいて全量５０μｇのタンパク質を使用して、ゲル電気泳動を実施した。電気泳動後、タンパク質を０．４５μｍ  ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩより入手）に移した。
【００４１】
移した後、非特異的結合部位を、１×ＴＢＳＴ（すなわち、ＴＷＥＥＮを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）の５％ミルク中で１時間インキュベートすることによりブロックした。その後、膜を、適切な抗体（アンドロゲンレセプター（「ＡＲ」）１：１０００、ＥＲ−α  １：２５０、ＥＲ−β  １：２５０、β−アクチン  １：１０，０００；全ての抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；以下、「Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」より入手した）を含む１×ＴＢＳＴ中の５％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）と一晩４℃にてインキュベートした。１×ＴＢＳＴで洗浄した後、膜を、ウサギ２次抗体（ＥＲ−α、もしくはＥＲ−β）、またはマウス２次抗体（ＡＲ、β−アクチン）の存在下で、１：１０，０００の希釈で１時間インキュベートし、次いでＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫより入手）を使用して測定した。
【００４２】
（実施例６）
（ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手可能）を使用して前立腺腫瘍より抽出した。ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸより入手）を使用して反応に干渉する任意の抽出ＤＮＡのサンプルを除去した。収量を、分光光度的に定量した。全量ＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲを、同じ反応においてＴＡＱＭＡＮ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；以下「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」より入手）を使用することにより、実施した。プローブを、その５’末端に対して６−ＦＡＭで、そして３’末端に対してＴＡＭＲＡで標識した。β−アクチンを、内因性コントロールおよび正規化群として使用した。使用したプライマー対を、以下のように表１に示す。
【００４３】
【表１】
2007513865.tif 000008
ＰＣＲサイクル条件を、全てのサンプルについて以下のとおりに実施した：ＲＴ工程について４８℃にて３０分間；ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手可能）活性化について９５℃にて１０分間；そして融解工程（９５℃で１５秒間）およびアニーリング／伸長工程（６０℃で１分間）について４０サイクル。各テンプレートについてのＰＣＲ反応を、サンプルあたり全量１μｇのｍＲＮＡを使用してトリプリケートで行った。各々の遺伝子特異的プライマー対を、標準３８４ウェルプレート上で試験した。標準カーブを、基準ＣＷＲ２２Ｒ腫瘍株より調製された全量１０〜１０００ｎｇのｍＲＮＡを使用して構築した。全ての実験をトリプリケートの反応からの閾値サイクル（「Ｃｔ」）が１サイクル数よりも広がらないように最適化した。
【００４４】
比較Ｃｔ法（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、β−アクチンコントロールと比較した各遺伝子についての遺伝子発現の相対量を決定した。この方法は、ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｍ．Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ．（１９９９）に記載される。まず、β−アクチン反応からのＣｔ値を、各々の３工程について平均した。次に、目的の遺伝子の反応からのＣｔ値を、平均した。全量ＲＮＡの可変性を考慮するために、目的の遺伝子の平均をβ−アクチンの平均で除算した。最終的に、ラロキシフェン処理された腫瘍についての遺伝子発現の値を、いかなる化合物も投与されていない動物由来の腫瘍からの値と比較した。
【００４５】
（実施例７）
（組織病理学）
ヒト組織および異種移植片組織を１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして５μｍの切片を、ＤＡＫＯ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｈｉｇｈ  ｐＨ（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ；以下「Ｄａｋｏ」より入手）中で２０分間インキュベートし、１：１００  マウス抗ヒトＡＲ（Ｄａｋｏより入手）、ウサギ抗ＥＲ−α抗体（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡより入手）またはウサギ抗ＥＲ−β抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手）で染色した。次いで、スライドを、ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ  Ｍｏｕｓｅ  またはＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ  Ｒａｂｂｉｔ（Ｄａｋｏより入手）で３０分間インキュベートし、ＤＡＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡより入手）にさらした。陽性の領域を、異なる領域で５００より多い細胞の数を数えることにより評点付けした。データを、染色された細胞のパーセンテージとして連続して記録し、染色の強度を、以下のとおりに等級付けした：０、検出されない；１＋、中程度の染色；２＋、強力な検出。細胞の少なくとも１０％以上が核染色を有する場合、標本を、「陽性」結果と見なした。本実施例および上述の実施例に従って得られたデータを、図４〜図７に示した。
【００４６】
（実施例８）
（臨床研究のための患者の選別）
以下の実施例で実施されるプロトコールを、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより改良した。この研究において登録された全ての患者には、任意の研究手順を実施する前に、書面のインフォームドコンセントを提供した。
【００４７】
２００１年８月と２００２年７月の間で、２１人の患者を、  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣａｒｉｆｏｒｎｉａのＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＰｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおける研究に登録した。この研究に適格な患者は、組織学的に前立腺癌が確認され、ホルモン治療後、疾患の進行が確認された男性であった。患者は、抗アンドロゲン治療の中止後に、ＣＴスキャンにより証明される疾患の進行を有すること、すなわち２回の連続した測定においてＰＳＡが上昇していることが必要とされた。さらに、その最後の治療形態としてアンドロゲンレセプターブロッキング剤を投与される患者は、投薬中止後に疾患の進行が確認されなければならなかった。非外科的に去勢された患者は、研究に対して去勢レベルの血清テストステロンを維持する間、ＬＨＲＨアゴニストを連続して受容した。
【００４８】
骨スキャンまたはＣＴスキャンのどちらかにより測定可能な疾患を有する患者、およびＰＳＡの上昇により証明される評価可能な疾患を有する患者の両方が、この研究に含まれる。疾患進行の証明がＰＳＡの上昇のみである患者は、少なくとも２週間間隔で測定された任意の２つの定量値に対し、基準値からの２０％より多くの増加を有しているＰＳＡを有さなければならなかった。他の適格な判断基準としては、以下が挙げられた：カルノフスキーパフォーマンスステータス＞７０％；寿命＞１２週（主要な外科手術または放射線治療より少なくとも４週間）；およびストロンチウム−８９、レニウム、またはサマリウム−１５３を用いた処置に対して少なくとも１２週間。必要とされる研究の値としては、３０００／μＬより多い白血球細胞（「ＷＢＣ」）数、１，５００／μＬより多い顆粒球、１００，０００／μＬより多い血小板、９．０ｇ／ｄＬより多いヘモグロビン、正常体の上限（「ＵＬＮ」）の１．５倍未満のクレアチニン、ＵＮＬの２倍未満のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（「ＡＳＴ」）、およびアラニントランスアミナーゼ（「ＡＬＴ」）、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１４８ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウム、３．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．２ｍｍｏｌ／Ｌのカリウム、９０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩素、ならびに８．０ｍｇ／ｄＬ〜１０．５ｍｇ／ｄＬの間のカルシウムが挙げられた。制御されない心血管疾患、または重篤な心血管疾患の病歴（例えば、不適切な制御されない高血圧、うっ血性心不全、アンギナ、または前年内の心筋梗塞）、血栓塞栓症の病歴、胆石仙痛、または未処置の胆石症の病歴を有する患者は、除外した。脳転移、脳が関与する疾患または軟髄膜疾患（ｌｅｐｔｏｍｅｎｉｇｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）の臨床サイン、痴呆症、精神病、または他の精神状態の著しい障害を有する患者は、除外した。過去５年の間に別の悪性疾患（非黒色腫性皮膚癌または、インサイチュ段階のＴ１ａ膀胱癌以外）の病歴を有する患者、抗生物質を必要とする活性な感染症を有する患者、または同時に販売段階もしくは研究段階の抗腫瘍性治療を受けている患者は、除外した。プロステートパルメットまたはソーパルメット（ｐｒｏｓｔａｔａ  ｏｒ  ｓａｗ  ｐｌａｍｅｔｔｏ）の同時使用は、許可しなかった。
【００４９】
（実施例９）
（応答の判断基準）
治療に対する応答を、治療の最初の２ヵ月後、次いでそれ以降毎月評価した。毒性を、各研究の来診において毎月評価した。完全寛解（「ＣＲ」）は、少なくとも１ヶ月間の間、疾患の全ての徴候の消散を必要とした（すなわち、ＰＳＡの正規化；物理試験または新しい病変の出現を伴わないＸ線研究による全ての指標病変（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｌｅｓｉｏｎ）の消散；前立腺を切除した患者における０．１ｎｇ／ｍｌ未満の血清ＰＳＡの減少および前立腺の放射線治療を行った患者における０．５ｍｇ／ｍｌ未満の血清ＰＳＡの減少；全ての異常な生物化学的パラメータが、正常に戻り、そしてこの期間の間、体重、パフォーマンスステータスまたは症状において癌関連の悪化が存在すべきでない）。部分的寛解（「ＰＲ」）は、全ての測定可能な病変について少なくとも１ヶ月間続く直行する直径の積和の縮小、新しい病変が出現しないこと、および少なくとも１ヶ月あいた２回の連続した機会に対する＞５０％の血清ＰＳＡの＞５０％の減少を必要とした。骨転移により評価されている患者について、ＰＲは、少なくとも１ヶ月間離れた、２回の連続した機会に対する＞５０％の血清ＰＳＡの減少、骨スキャンにおける改善（１つ以上の転移性の病巣の強度または大きさの減少、および単純Ｘ線、ＣＴスキャン、またはＭＲＩスキャンにおいて実証された破骨治癒（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｉｃ  ｈｅａｌｉｎｇ）に起因しない限り、放射性核種を取り込む新しい病巣がないこと）を必要とした。この期間の間、体重、パフォーマンスステータスまたは症状において癌関連の悪化がみられなかった。進行（「ＰＤ」）は、以下のいずれかにより規定した：（１）１次元的に測定可能な病変の横行する直径の合計における、２次元的に測定可能な病巣の垂行する直径の積和の２５％を超える増加；（２）新しい病巣の出現；および（３）２８日よりはなれた２回の連続した測定で実証されたような、基準線を超えて５０％よりも大きい血清ＰＳＡの増加。骨転移を有する患者について、ＰＲはまた、基準の骨スキャンで以前見られた病巣の放射性核種の取り込みの大きさおよび強度に対する増加、または異常な取り込みの２つ以上の新しい病巣の出現（上記のような破骨治療に起因しない限り）、あるいは患者がラロキシフェンを用いた処置を開始した後、骨領域に対する放射性治療についてのいずれかの指標より規定され得た。ＰＳＡ判定基準のみにより評点付けされたＰＤについて、確証的なＰＳＡ決定が必要であり、そしてその値が５０％より大きい増加を示した２週間後に得られた。１つの目的のパラメータにおける改善がみられる一方、別のパラメータにより、ＰＤについての判定基準を満たす患者は、ＰＤを有するとして評点付けした。寛解を経験しないかまたはＰＤを示さない患者は、その患者が少なくとも３ヶ月間臨床的に安定したままであった場合、不変（「ＳＤ」）として評点付けした。
【００５０】
（実施例１０）
（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ疼痛簡便質問表（Ｂｒｉｅｆ  Ｐａｉｎ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ））
基準において、各々の患者を、前立腺癌に関する骨疼痛を有するかどうかを質問した。肯定的に答えた患者に、基準、およびその後の毎月の追跡来診においてＷｉｓｃｏｎｓｉｎ簡便質問表を記入するように要求した。
【００５１】
（実施例１１）
（処置）
処置は、毎日の６０ｍｇの経口ラロキシフェン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手）で構成した。処置を、毎月の研究室への訪問（ｌａｂ  ｄｒａｗ）および、医師による追跡来診（ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｖｉｓｉｔ）でほどこした。ラロキシフェンのエストロゲン特性が与える深刻な静脈血栓症の危険性の増加を回避するために、患者に、低用量のＣＯＵＭＡＤＩＮ（ワルファリンナトリウム；ＤｕＰｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥより入手可能）レジメンをほどこした。患者は、毎日１ｍｇの経口ＣＯＵＭＡＤＩＮを受容した（または、患者がすでにアスピリンを摂取している場合、毎日０．５ｍｇの経口ＣＯＵＭＡＤＩＮを受容した）。
【００５２】
（実施例１２）
（臨床研究における患者の特徴付け）
患者の特徴付けを表２に列挙する。前立腺癌に罹患した、平均年齢７３歳の全２１人の患者を、この研究に登録した。患者は、平均９０％（範囲、７０％〜１００％）のカルノフスキーパフォーマンスステータスを有した。１５／２１人（７１％）の患者は、骨疾患の証拠を有した。６人（２８．６％）の患者は、測定可能な疾患の証拠を有し、９人（４２．８％）の患者は、骨転移を含む評価可能測定不可能な疾患を有し、そして６人（２８．６％）の患者は、ＰＳＡレベルが上昇しただけであった。患者の大部分（６７％）は、生検時に、グリーソン腫瘍分類８〜１０を有した。前立腺の検体は、生検材料（１４．６７％）、または前立腺切除（７．３３％）のどちらか由来であった。前立腺癌の診断から患者を研究するまでの平均時間は、８３．３ヶ月（範囲、１６．６〜２０９．５ヶ月）であった。
【００５３】
【表２】
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前処置を、表３に列挙する。全ての患者は、組み合わされたアンドロゲン遮断を使用して前処地を受けた。１９人（９５％）が、２回のホルモン治療を受け、１３人（６２％）の患者は、研究前に２回よりも多くホルモン治療を受けた。以前の非ホルモン処置には、局所的な外科手術（５７％）、局所的な放射線照射（３８％）、および化学療法（３３％）が含まれた。患者は、平均４．０（範囲、１〜９）の全身の前処置を受けた。この研究において登録された全ての患者は、前処置に失敗し、そしてＡＩＰＣを有することが決定された。
【００５４】
【表３】
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（実施例１３）
（毒性）
以前の臨床研究は、ラロキシフェンには、十分に耐性であり、報告された最も共通の有害な事象は、のぼせおよび脚部の痙攣であったことを示している（ＥＶＩＳＴＡ添付文書；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）。同様に、本発明者らは、ラロキシフェンが、適度であると報告されたほとんどの薬物関連毒性に関して十分に耐性であったことを観察した（等級１〜２）。毒性を、表４に列挙する。報告された尿路感染症（「ＵＴＩ」）（１）および血尿（１）は、患者の基礎疾患（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）に関すると考えられた。２つの等級３の事象を報告した：患者の最近の損傷に関すると考えられる等級３の関節痛／筋痛、および患者の疾患の進行に寄与した等級３の上昇クレアチニン。しかし、等級４の高血糖については、患者が、処置の開始前に等級３と実証された高血糖を有したことが報告された；従って、高血糖は、この薬物の研究に寄与しない。
【００５５】
【表４】
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（実施例１４）
（患者の応答および生存）
登録された２１人の患者のうち、１７人（８１％）の患者が、最初の評価時点に到達し、そして効力分析に含まれた。４人の患者は、評価時点に到達しなかった；２人は、情動性副作用（１）、および医療の変化（１）に起因して本人達の希望でこの研究から除外された。３番目の患者は、ノンコンプライアンス（１）に起因してこの研究から除外され、そして４番目の患者は、その患者が、疼痛緩和のための骨領域に対する放射線照射を希望したことから、除外された（ただし、この４番目の患者は、効力分析には含まれ、そして疾患が進行しているとみなされた）。
【００５６】
第一の評価の時点において、１８人の患者のうち１３人は疾患の進行を有し、この研究を中止したが、１８人の患者のうち５人は、疾患の安定を有し、ラロキシフェンを続行した。疾患の進行を、ＰＳＡの上昇（１２）、および骨領域に対する放射線照射の必要性（１）として規定した。軟組織疾患または骨疾患の進行は、観察されなかった。疾患の安定を有する５人の患者のうち、４人の患者は、第２の評価において疾患の進行（すなわち、ＰＳＡの上昇）に起因して中止した。他の患者は、疾患が安定したまま、研究を維持した。軟組織または骨疾患における改善は、観察されなかった。
【００５７】
ラロキシフェンに関する疾患の進行時間の中央値は、８．３週間（範囲、２．９〜２４．７１）であった。分析の時点（２００２年１１月）において、見込まれる経過観察時間（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆｆ  ｓｔｕｄｙ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｔｉｍｅ）の中央値は、９．０ヶ月であった。生存期間の中央値は、１０．５ヶ月であった。２００３年７月において、２１人中１９人（９０％）が、生存している。
【００５８】
（実施例１５）
（組織病理学）
この研究において登録された２１人の患者のうち、１３人は、ＥＲ−α、ＥＲ−β、ＡＲ発現の分析に利用できる現存する前立腺組織を有した。ＥＲ−βおよびＡＲの強力な発現に対する緩和は、全ての場合（１００％、１３／１３）において検出された。ＥＲ−α核染色のほとんど完全な消失が、１３人の患者のうち２人（１５％）を除いて全てに見られた。周囲の間質組織のうち５０％が、全ての患者において、両エストロゲンレセプターについて、陽性で染色された。利用可能な標本数が少ないことに起因して、処置の第一の周期の間に疾患が進行した患者の群と、疾患の安定を示した患者の群との間に、有意な差は検出されなかった。
【００５９】
上記は、本発明の特定の実施形態に言及するが、多くの改変が本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に容易に理解されるべきである。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内に含まれるような改変を網羅すると意図される。従って、本開示の実施形態は、あらゆる観点において，上述の記載ではなく、添付の特許請求範囲により示される本発明の範囲の例示と見なされるべきであり、それを限定するものとして見なされるべきではない。特許請求の範囲の意義およびその等価な範囲に含まれる全ての改変は、特許請求の範囲内に包含されると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従うラロキシフェンによる、アンドロゲン非依存性ＭＳＫＰＣ９腫瘍異種移植片の増殖の阻害を示す。図１Ａは、ラロキシフェンで処理された腫瘍についての、コントロール群の平均腫瘍体積と比較した平均腫瘍体積の減少を図示する。同様に、図１Ｂは、ラロキシフェンで処理された腫瘍についての、コントロール群の平均腫瘍重量と比べた平均腫瘍重量の減少を図示する。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従って、ラロキシフェンで処理された腫瘍およびコントロールの腫瘍における、ＭＳＫＰＣ９腫瘍異種移植片におけるタンパク質の発現を示す。ＥＲ−αタンパク質の発現は、処置群において観察されず、そしてアンドロゲンレセプター（「ＡＲ」）においてもＥＲ−β  ｍＲＮＡにおいても、処置群の間で相違点は、観察されなかった。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従って、ＭＳＫＰＣ９腫瘍異種移植片におけるラロキシフェン処理と共に増加するＰＳＡ（腫瘍体積あたり）を示す。
【図４】図４は、カラーで作成され、そしてラロキシフェンの臨床研究の過程の間に進行した疾患を有する代表的な患者の染色を示し、これは、本発明の実施形態に従って、本明細書中で議論される後の実施例において、より詳細に記載される。代表的な患者は、ＥＲ−β（図４Ａ；９０％（１＋）および１０％（２＋））およびＡＲ（図４Ｃ；８０％（１＋）、１２％（２＋）、８％（０））の、中程度〜強度の発現を示したが、ＥＲ−αに対する核染色は、ほぼ完全に存在しなかった（図４Ｂ；９９％（０））。
【図５】図５は、カラーで作成され、そしてラロキシフェンの臨床研究の過程の間に安定な疾患を有する代表的な患者の染色を示し、これは、本発明の実施形態に従って、本明細書中で議論される後の実施例において、より詳細に記載される。図５Ａは、上記患者のＥＲ−βの発現（５０％（１＋）および５０％（２＋））を図示し；図５Ｂは、上記患者のＥＲ−αの発現（２６％（１＋）、１５％（２％＋）、５９％（０））を図示し；そして図５Ｃは、上記患者のＡＲの発現（４２％（１＋）、１６％（２＋）、４３％（０））を図示する。
【図６】図６は、カラーで作成され、そして本発明の実施形態に従うポジティブコントロール関する免疫組織化学を示す。図６Ａは、染色していない腫瘍組織を図示し；図６Ｂは、ＥＲ−αを発現している腫瘍組織を図示し；そして図６Ｃは、ＥＲ−βを発現している腫瘍組織を図示する。
【図７】図７は、カラーで作成され、そして本発明の実施形態に従う、ＭＳＫＰＣ９異種移植片腫瘍についての免疫組織化学を示す。図７Ａは、ＥＲ−βに対する染色を図示し；図７Ｂは、ＥＲ−αに対する染色を図示し；そして図７Ｃは、ＡＲに対する染色を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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