(57)【要約】  この発明は、悪性新生物及び乳癌の予測、診断、予後予測、予防及び治療のための新規な組成物、方法及び利用を提供する。この発明は、更に、乳癌患者の乳房組織と正常な「健康な」組織とで差次的に発現される遺伝子に関係する。化学療法に応答することがありそうな患者を同定するための差次的に発現される遺伝子も又、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における新生物疾患の状態を特性決定するための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１６５よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該患者由来の生物学的試料において測定し、
(ｉｉ)(ｉ)で測定された発現レベルのパターンを、一つ又は幾つかの発現レベルの参照用パターンと比較し、
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)における比較の結果から該患者における新生物疾患の状態を特性決定する。
【請求項２】
患者における新生物疾患の状態を特性決定するための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０、４７又は６７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該患者由来の生物学的試料において測定し、
(ｉｉ)(ｉ)で測定された発現レベルのパターンを、一つ又は幾つかの発現レベルの参照用パターンと比較し、
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)における比較の結果から該患者における新生物疾患の状態を特性決定する。
【請求項３】
患者における新生物疾患の検出、診断、スクリーニング、監視、及び／又は予後予測のための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１７、１９〜３３、３５〜５０、５２〜６４、６６〜８５、８８〜９１及び９３〜１６５よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０又は４７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該患者由来の生物学的試料において測定し、
(ｉｉ)(ｉ)で測定された発現レベルのパターンを、一つ又は幾つかの発現レベルの参照用パターンと比較し、
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)における比較の結果から該患者における新生物疾患を検出し、診断し、スクリーニングし、監視し、及び／又は予後予測する。
【請求項４】
患者における新生物疾患の検出、診断、スクリーニング、監視、及び／又は予後予測のための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１７、１９〜３３、３５〜５０、５２〜６４、６６〜８５、８８〜９１及び９３〜１６５及び４７２〜４９１よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、４７又は６７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該患者由来の生物学的試料において測定し、
(ｉｉ)(ｉ)で測定された発現レベルのパターンを、一つ又は幾つかの発現レベルの参照用パターンと比較し、
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)における比較の結果から該患者における新生物疾患を検出し、診断し、スクリーニングし、監視し、及び／又は予後予測する。
【請求項５】
前記の方法が、異なる時点における多数の発現レベルのパターンの測定を含み、それにより、前記の患者における前記の新生物疾患の発生を監視することを可能にする、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記の方法が、前記の患者における前記の新生物疾患の所定の治療方法の成功の見込みの評価を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記の方法が、患者が前記の新生物疾患の所定の治療方法に応答することが期待されるか否かの評価を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
予測用アルゴリズムを利用する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
予測用アルゴリズムが、サポート・ベクトル・マシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の所定の治療方法が、
(ｉ)細胞増殖に作用し、及び／又は
(ｉｉ)細胞生存に作用し、及び／又は
(ｉｉｉ)細胞運動性に作用し、及び／又は
(ｉｖ)アントラサイクリンベースの治療方法であり、及び／又は
(ｖ)エピルビシン及び／又はシクロホスファミドの投与を含む
請求項６〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
新生物疾患に悩まされている患者に対する治療方法であって、下記を含む当該治療方法
(ｉ)請求項６又は７に記載の方法を利用して、最も有望な治療方法を同定し、
(ｉｉ)該患者の該新生物疾患を、ステップ(ｉ)で同定した治療方法により治療する。
【請求項１２】
新生物疾患に悩まされている患者をスクリーニングする方法であって、請求項１〜４の何れかに記載の方法を複数の患者に適用する当該方法。
【請求項１３】
新生物疾患に対する治療効果を有する物質及び／又は治療方法をスクリーニングする方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)該新生物疾患に悩まされている患者から生物学的試料を得て、
(ｉｉ)請求項６又は７に記載の方法を利用して、該生物学的試料から、該患者が、該新生物疾患に対する所定の治療方法に応答すると予想されるかどうかを評価し、
(ｉｉｉ)もし、該患者が、該所定の治療方法に応答すると予想されるならば、該生物学的試料を、該治療方法において、該物質とインキュベートし、
(ｉｖ)該治療方法において、該試験物質により開始された該生物学的試料の変化を観察し、
(ｖ)該試験物質及び／又は該治療方法を、(ｉｖ)における該生物学的試料の変化の観察に基づいて、選択し又は拒絶する。
【請求項１４】
新生物疾患に対する治療効果を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)生物学的試料又はそれらの抽出物を試験物質とインキュベートし、
(ｉｉ)SEQ ID NO:１〜１７、１９〜３３、３５〜５０、５２〜６４、６６〜８５、８８〜９１及び９３〜１６５よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０又は４７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該生物学的試料において測定し、
(ｉｉｉ)(ｉｉ)で測定された発現レベルのパターンを一つ又は数個の参照用パターンと比較し、
(ｉｖ)該試験物質を、(ｉｉｉ)で実施した比較に基づいて、選択し又は拒絶する。
【請求項１５】
新生物疾患に対する治療効果を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)生物学的試料又はそれらの抽出物を試験物質とインキュベートし、
(ｉｉ)SEQ ID NO:１〜１７、１９〜３３、３５〜５０、５２〜６４、６６〜８５、８８〜９１及び９３〜１６５及び４７２〜４９１よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、４７又は６７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを測定し、
(ｉｉｉ)(ｉｉ)で測定された発現レベルのパターンを一つ又は数個の参照用パターンと比較し、
(ｉｖ)該試験物質を、(ｉｉｉ)で実施した比較に基づいて、選択し又は拒絶する。
【請求項１６】
前記のマーカー遺伝子が、表２に列記したマーカー遺伝子の群に含まれる、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
下記により発現レベルを測定する、請求項１〜１６の何れかに記載の方法
(ｉ)ハイブリダイゼーションに基づく方法、又は
(ｉｉ)アレイ状に並べたプローブを利用する、ハイブリダイゼーションに基づく方法、又は
(ｉｉｉ)個々の標識プローブを利用する、ハイブリダイゼーションに基づく方法、又は
(ｉｖ)リアルタイムリアルタイムＰＣＲ、又は
(ｖ)ポリペプチド、タンパク質又はそれらの誘導体の発現の評価、又は
(ｖｉ)ポリペプチド、タンパク質又はそれらの誘導体の量の評価。
【請求項１８】
新生物疾患が、乳癌である、請求項１〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
下記よりなるマーカー遺伝子の群に含まれるマーカー遺伝子に適した少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７のプライマー対及びプローブを含むキット
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１６５、又は
(ｉｉ)表２に列記したマーカー遺伝子。
【請求項２０】
下記よりなるマーカー遺伝子の群に含まれるマーカー遺伝子に適した少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０、４７又は６７のプライマー対及びプローブを含むキット
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１６５、及び／又は
(ｉｉ)SEQ ID NO:４７２〜４９１、又は
(ｉｉｉ)表２に列記したマーカー遺伝子。
【請求項２１】
各々、SEQ ID NO:３３１〜４７１よりなる配列の群に含まれる配列を有する少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７の個別に標識したプローブを含むキット。
【請求項２２】
各々、SEQ ID NO:３３１〜４７１及びSEQ ID NO:５１２〜５７１よりなる配列の群に含まれる配列を有する少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０、４７又は６７の個別に標識したプローブを含むキット。
【請求項２３】
各々、SEQ ID NO:３３１〜４７１よりなる配列の群に含まれる配列を有する少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７のアレイ状に並べたプローブを含むキット。
【請求項２４】
各々、SEQ ID NO:３３１〜４７１及びSEQ ID NO:５１２〜５７１よりなる配列の群に含まれる配列を有する少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０、４７又は６７のアレイ状に並べたプローブを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療結果(例えば、治療に対する腫瘍の応答)の予測、新生物疾患の診断、予防及び治療のための方法及び組成物に関係している。癌細胞は、それらの形態的種類、進行状態、ゲノム変化の獲得、臨界的遺伝子例えばゲートキーパー及び腫瘍抑制遺伝子における点突然変異に関連して、或は外的シグナル例えば成長因子、ホルモン又は二次的メッセンジャーに依存して、遺伝子発現の特異的パターンを示す。
【０００２】
この発明は、特に新生物組織において、対応する健康な組織又は所与の化学療法に不応答の他の新生物病変と比較して変化した発現を示す遺伝子を開示する。それらは、診断マーカーとして有用であり、治療標的と考えることもできよう。新生物疾患を予測し、診断し及び予後を予測し並びに予防し及び治療する方法を開示する。この発明に開示した遺伝子は、乳癌において同定されたものであるが、ある治療養生法に対する結果を予言でき、それ故、それらは又、乳房以外の組織における他の種類の癌についても妥当である。
【背景技術】
【０００３】
癌は、米国において、心臓血管病に次ぐ第二の死亡原因である。３人に１人の米国人がその生涯において癌を発症し、４人に１人の米国人が癌で死亡する。一層詳細には、乳癌は、毎年、米国内だけで、約４０，０００人の女性の生命を奪い、約２０万人の女性が乳癌と診断される。癌は、種々のパラメーター例えば腫瘍の大きさ、浸潤状態、リンパ節に含まれるか、転移、病理組織学、免疫組織化学的マーカー及び分子マーカーに基づいて分類される(WHO. International Classification of diseases (1); Sabin and Wittekind, 1997 (2))。遺伝子チップの最近の進歩により、研究者は、ますます、マーカー遺伝子の異なる発現に基づく腫瘍の分類に集中している。Sorlie等、2001 (3): van't Veer等、2002 (4)。
【０００４】
化学療法は、乳癌患者、特に、原発部位から転移した癌を有する者に提供される治療養生法において、頼みの綱であり続けている(Perez, 1999, (5))。乳癌の治療において活性を示した幾つかの化学療法剤があり、最適な薬物及び養生法を決定することを試みる研究が続けられている。しかしながら、異なる患者が、同じ治療養生法に対して異なる応答をする傾向がある。現在、ある治療に対するこれらの個人の応答は、以前の臨床研究のデータに基づいて統計的に評価できるだけである。未だ多数の、全身的化学療法の利益を受けない患者がいる。特に、乳癌は、それらの侵略性及び治療応答において、非常に不均質である。それらは、成長特性及び幾つかの薬物に対する感受性に影響を与える異なる遺伝子変異を含んでいる。各腫瘍の分子フィンガープリントの同定は、それ故、特に侵略的な腫瘍を有する患者又は特異的な利益のある治療で治療する必要のある患者を分離する助けとなりうる。研究が遺伝学及び治療成熟に対する関連応答を含むならば、標準的プラクティスは、確実に、一層個別化され、医師が、腫瘍の遺伝学的プロフィルとマッチした特異的治療養生法を提供して最適な結果を確実にすることを可能にする。
【０００５】
発明の概要
本発明は、新生物病変の変化した臨床挙動を生じる新生物組織において異なって発現される１８５のヒト遺伝子の同定と関係している。これらの１８５遺伝子の異なる発現は、人体のある組織内の特定の新生物病変に限定されない。
【０００６】
この発明の好適具体例において、これらの１８５遺伝子が発現において変化する新生物病変は、ヒトの乳癌である。この癌は、女性に限られず、男性においても診断され分析されうる。
【０００７】
この発明は、乳癌の診断、染色、予後予測、監視及び治療のための、様々な方法、試薬及びキットに関係する。「乳癌」は、ここで用いる場合、癌腫(例えば、イン・シトゥーの癌腫、侵襲的癌腫、転移性癌腫)及び組織学的起源とは無関係の前悪性化状態、新形態変化(例えば、管状、小葉、髄、混合型起源)を包含する。本発明の組成物、方法及びキットは、単数又は複数(例えば、２、５、１０又は５０以上)の遺伝子(以後、「マーカー遺伝子」と呼ぶ。表１ａ及び１ｂに列記。SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１)(それらにコードされたそれぞれのポリペプチドは、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１と数え上げられている。やはり表１ａ及び１ｂ参照)の、患者試料中のｍＲＮＡ発現のレベルを、対照用被験者(例えば、乳癌を有しないヒト被験者)由来の試料におけるマーカー遺伝子の発現の平均レベルと比較することを含む。特異的試験用組成物又はキットを代表するマーカー遺伝子の好適サブセットを、表２に列記してある。
【０００８】
この発明は、更に、所定の乳癌治療に対する臨床的に重要な腫瘍治療応答の予測のための様々な組成物、方法、試薬及びキットに関係する。本発明の組成物、方法及びキットは、単数又は複数(例えば、２、５、１０又は５０以上)の乳癌マーカー遺伝子の、未分類患者試料中のｍＲＮＡ発現のレベルを、施与された乳癌治療に対して異なる強度で応答する患者を含む一団の試料中のマーカー遺伝子の発現の平均レベルと比較することを含む。この発明の好適具体例において、マーカー遺伝子の特異的発現は、アントラサイクリンベース(例えば、エピルビシン又はドキソルビシンによる多重化学療法)の化学療法介入に対する応答者と不応答者の識別のために利用することができる。
【０００９】
更なる好適具体例において、ｍＲＮＡ発現の対照レベルは、何人か(例えば、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０又は５０人)の対照用被験者からの試料におけるマーカー遺伝子の発現の平均レベルである。これらの対照用被験者は、乳癌に冒されてない者であってもよいし、個別の発現プロフィルの測定前に臨床応答により同定・分類された者であってもよい。
【００１０】
以下に詳しく述べるように、患者試料におけるマーカー遺伝子(マーカー遺伝子のセット)の少なくとも一つの発現レベルの、対照レベルと比較しての有意の変化は、患者の乳癌の状態及び化学療法に対する応答性に関する重要な情報を与える。本発明の組成物、方法及びキットにおいて、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子は、周知の乳癌マーカー遺伝子(例えば、ＣＥＡ、マンマグロビン又はＣＡ１５−３)と組み合わせて利用することもできる。
【００１１】
この発明により、これらのマーカー遺伝子及びマーカー遺伝子のセットは、この発明の組成物、方法及びキットの陽性の予測値が、少なくとも約１０％、好ましくは約２５％、一層好ましくは約５０％、最も好ましくは約９０％であるように選択される。この発明の組成物、方法及びキットにおける利用にやはり好ましいのは、正常な乳細胞と比較して、少なくとも最少平均差次的発現因子(表３)により、次の条件の何れかの約２０％、一層好ましくは約５０％及び最も好ましくは約７５％で異なって発現されるマーカー遺伝子及びセットである：ステージ０の乳癌患者、ステージＩの乳癌患者、ステージＩＩの乳癌患者、ステージＩＩＩの乳癌患者、ステージＩＶの乳癌患者、等級Ｉの乳癌患者、等級ＩＩの乳癌患者、等級ＩＩＩの乳癌患者、悪性乳癌患者、乳の原発性癌腫、及び他のすべての種類の乳に関連する癌、悪性疾患及び形質転換を有する患者。
【００１２】
マーカー遺伝子の発現の検出は、乳癌患者の原発病変、二次的病変又は転移性病変に限られず、乳癌細胞に冒されたリンパ節において又は局所的(例えば、骨髄、肝臓、腎臓)に付着し若しくは自由に患者の身体中を流れる最少の残留的な病気細胞も検出されうる。
【００１３】
本発明の組成物、方法及びキットの一具体例において、分析すべき試料は、吸引若しくは穿刺、切開又は他の生検へと導く外科的方法により得られた新生物病変からの組織材料又は切除された細胞材料である。本発明の組成物、方法及びキットの一具体例において、該試料は、患者から得られた細胞を含む。これらの細胞は、例えば、乳頭吸引、腺管洗浄、細針生検により又は刺激若しくは自然乳頭排出によって集められた乳房細胞「スメア」中に見出されうる。他の具体例において、この試料は、体液である。かかる液体は、例えば、血液、リンパ液、腹水液、婦人科液、又は尿を含むが、これらの液体に限られない。
【００１４】
本発明の組成物、方法及びキットによれば、遺伝子発現の測定は、如何なる特定の方法にも又はｍＲＮＡの検出にも限定されない。試料中のマーカー遺伝子の存在及び／又は発現レベルを、例えば、下記を測定し及び／又は定量することにより評価することができる：
１）表１ａ及び１ｂ中のマーカー遺伝子(SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１)によりコードされるタンパク質又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチド又はタンパク質のプロセッシング若しくは分解(例えば、試薬例えばタンパク質又はポリペプチドと特異的に結合する抗体、抗体誘導体、又は抗体断片を利用する)により生じたポリペプチド
２）表１ａ及び１ｂ中のマーカー遺伝子(SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１)によりコードされたタンパク質により又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドによって直接(即ち、触媒されて)又は間接に生成される代謝産物
３）表１ａ及び１ｂ中のマーカー遺伝子によりコードされたＲＮＡ転写物(例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ)、又は該ＲＮＡ転写物の断片(例えば、試料から得られたＲＮＡ転写物の混合物又は転写物から調製されたｃＤＮＡを、選択した位置で固定された表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子の少なくとも一つの配列を含む核酸を有する基材と接触させることによる)。これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現は、例えば、Affymetrix Inc.又は他の製造業者により提供されるＤＮＡ−マイクロアレイによって検出することができる。米国特許第５，５５６，７５２号。更なる具体例において、これらの遺伝子の発現は、例えば、Luminex Inc.により提供されるビーズベースの直接蛍光読出し技術(ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９７／１４０２８)を利用して検出することができる。
【００１５】
一面において、本発明は、患者が乳癌に苦しんでいるかどうかの評価のための組成物、方法及びキットを提供する(例えば、新規な検出又は「スクリーニング」、再発、再生の検出、特に、乳癌発生の増大した危険を有する患者(例えば、乳癌の家族の病歴を有する患者及び変異型癌遺伝子を有すると同定された患者)における試験)。この目的に関して、この組成物、方法及びキットは、下記を比較することを含む：
ａ）患者試料中の単一又は複数のマーカー遺伝子の発現レベル{少なくとも一つ(例えば、２、５、１０又は５０以上)のマーカー遺伝子を、表１ａ及び１ｂのマーカー遺伝子から選択する}
ｂ）乳癌を有しない対照用被験者におけるマーカー遺伝子の正常発現レベル。
【００１６】
患者試料における選択したマーカー遺伝子(例えば、２、５、１０又は５０以上)の発現レベルの、各マーカー遺伝子の正常発現レベルと比較しての有意の増加並びに減少は、その患者が乳癌に苦しんでいることの指示である。
【００１７】
本発明の組成物、方法及びキットは又、悪性新生物形成の進行又は結果の予測にも有用である。この目的に関して、この組成物、方法及びキットは、下記を比較することを含む：
ａ）患者試料中の単一又は複数のマーカー遺伝子の発現レベル{少なくとも一つ(例えば、２、５、１０又は５０以上)のマーカー遺伝子を、表１ａ及び１ｂのマーカー遺伝子から選択する}
ｂ）これらのマーカー遺伝子の対照発現パターン。
【００１８】
本発明の組成物、方法及びキットは、特に、ある種の化学療法に応答するであろう患者を同定するのに有用である。この目的に関して、この組成物、方法及びキットは、下記を比較することを含む
ａ）患者試料における単数又は複数のマーカー遺伝子の発現レベル{少なくとも一つ(例えば、２、５、１０又は５０以上)のマーカー遺伝子を、表１ａ及び１ｂのマーカー遺伝子から選択する}及び
ｂ）対照用被験者におけるマーカー遺伝子の発現レベル。対照用被験者は、乳癌を患っていない者であってもよいし、特定の化学療法に対する臨床応答によって同定・分類された者であってもよい。
【００１９】
他の面において、この発明は、患者における乳癌を阻止するための治療の効力を評価するための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、下記を比較することを含む：
ａ）任意の治療の前の患者から得た第一の試料における単数又は複数のマーカー遺伝子の発現{少なくとも一つのマーカー遺伝子を、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子から選択する}及び
ｂ）少なくとも一回の治療の後に患者から得た第二の試料における当該マーカー遺伝子の発現。
【００２０】
この組成物、方法及びキットにおいて、「治療」は、化学療法、抗ホルモン療法、指向性抗体療法、放射線療法、及び組織例えば乳癌の外科的切除を含む(但し、これらに限られない)乳癌を治療するための任意の治療であってよいということは認められよう。従って、この発明の組成物、方法及びキットを利用して、例えば、患者を、治療前、治療中及び治療後に評価して、腫瘍負荷の減少を評価することができる。
【００２１】
更なる面において、本発明は、患者における乳癌の進行をモニターするための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、下記を含む：
ａ）第一の時点において、患者試料における単一又は複数のマーカー遺伝子の発現を検出し{少なくとも一つのマーカー遺伝子を、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子から選択する}
ｂ）ステップａ）を、その後の時点において繰り返し；そして
ｃ）ステップａ）及びｂ）において検出された各マーカー遺伝子の発現レベルを比較し、それから、患者における乳癌の進行をモニターする。
【００２２】
他の面において、この発明は、患者における乳癌を阻止するための治療養生法(例えば、化学療法剤の種類)のイン・ビトロ選択のための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、次のステップを含む：
ａ）患者から癌細胞を含む試料を得て；
ｂ）その試料のアリコートを、種々の試験組成物の存在下で、別々に維持し；
ｃ）単数又は複数のマーカー遺伝子(表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子から選択)の発現を比較し(各アリコートにおいて)；そして
ｄ）少なくとも一つの試験組成物{その試験組成物を含むアリコートにおいて、他の試験組成物を含むアリコートにおける各マーカー遺伝子の発現レベルと比較して、SEQ ID NO:１１、１７、２２、２５、３１、３６、４８、４９、５７、８３、１０７、１０８、１１２及び１５９からの一層低レベルの遺伝子発現を誘導し且つ／又はSEQ ID NO:２４、４７、５４、５８、５９、６０、６７、７９、８０、８８、１１４、１１８、１３５及び１４１ からの一層高レベルの遺伝子発現を誘導するもの}を選択する
【００２３】
この発明は、更に、ある種の生物学的又は化学的化合物の潜在的発癌性を評価するための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、下記のステップを含む：
ａ）乳房細胞の別々のアリコートを、試験化合物の存在下及び非存在下で維持し；そして
ｂ）各アリコートにおける単一又は複数のマーカー遺伝子の発現を比較し{少なくとも一つの遺伝子を、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子から選択する}、試験化合物の存在下に維持した(又は該化合物に暴露した)アリコートにおけるSEQ ID NO:１９、２３、３６、４５、６２、７４、８１、９６、１０３、１０６、１０７、１１２、１１３及び１３２からの遺伝子発現レベルの有意の増加及び／又はSEQ ID NO:２２、２５、３１、４０、４３、４７、５５、５７、５９、６０、１０８、１１９、１２１、１２４、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０及び１６４からの遺伝子発現レベルの有意の減少{試験化合物の非存在下に維持したアリコートにおける各マーカー遺伝子の発現レベルと比較しての}は、試験化合物が潜在的乳癌発癌性を有することの指示である。
【００２４】
この発明は、更に、乳癌に苦しんでいる患者を治療するための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、患者の細胞に、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子のポリヌクレオチド配列と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを与えることを含む。
【００２５】
この発明は、更に、乳癌が発達する危険にある患者における乳癌細胞を阻止するための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子の発現を阻止することを含む。
【００２６】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する薬剤をスクリーニングするための組成物、方法及びキットを提供する。試験化合物を、特定のポリペプチドと接触させる。試験化合物の該ポリペプチドへの結合を検出する。該ポリペプチドに結合する試験化合物は、それにより、悪性新生物(一層詳細には、乳癌)の治療のための潜在的治療剤として同定される。
【００２７】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する薬剤をスクリーニングするための他の組成物、方法及びキットを提供する。試験化合物を、特定のポリペプチドと接触させる。該ポリペプチドにより媒介される生物学的活性を検出する。該生物学的活性を減少させる試験化合物を、それにより、悪性新生物(特に、乳癌)における特定のポリペプチドの活性を減少させるための潜在的治療剤として同定する。該生物学的活性を増大させる試験化合物は、それにより、悪性新生物(特に、乳癌)における特定のポリペプチドの活性を増大させるための潜在的治療剤として同定される。
【００２８】
従って、この発明は、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリペプチドの一つから選択するポリペプチドであって、例えば、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドの、アゴニスト及びアンタゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アクチベーター、コ−アクチベーター及びインヒビターなどのレギュレーター又はモジュレーターとして作用しうる化合物を同定するために利用することのできる当該ポリペプチドを提供する。従って、この発明は、悪性新生物(特に、乳癌)において、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドを調節するための試薬及び組成物、方法及びキットを提供する。この調節は、アップレギュレーションであっても、ダウンレギュレーションであってもよい。表１ａ及び１ｂに列記したポリヌクレオチド(SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１)の発現、安定性若しくは量又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する試薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体(例えば、ペプチド核酸、ロックされた核酸)又は低分子であってよい。SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１(表１ａ及び１ｂに列記)から選択するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、安定性若しくは量又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１(表１)から選択するポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する組成物、方法及びキットは、遺伝子置換療法、アンチセンス、リボザイム及びトリプレックス核酸によるアプローチであってよい。
【００２９】
この発明は、更に、患者が乳癌を患っているかどうかの評価に有用な抗体を産生する単離されたハイブリドーマの製造のための組成物、方法及びキットを提供する。この組成物、方法及びキットは、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子によりコードされたタンパク質又は該タンパク質のポリペプチド断片を単離すること、その単離したタンパク質又はポリペプチド断片を利用して哺乳動物を免疫化すること、その免疫化した哺乳動物から脾臓細胞を単離すること、それらの単離した脾臓細胞を不滅化した細胞株と融合させてハイブリドーマを形成すること、及び個々のハイブリドーマを、当該タンパク質又はポリペプチド断片と特異的に結合する抗体の産生につきスクリーニングして該ハイブリドーマを単離することを含む。この発明は又、この方法により生成された抗体をも含む。かかる抗体は、悪性新生物(特に、乳癌)の予測、予防、診断、予後予測及び治療における利用のために、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１(表１ａ及び１ｂに列記)から選択するポリペプチドを含む完全長又は部分的ポリペプチドに特異的に結合する。
【００３０】
この発明の更に別の具体例は、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１から選択するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１(表１ａ及び１ｂに列記)から選択するポリペプチドを含むポリペプチドに特異的に結合する試薬の、悪性新生物(特に、乳癌)の治療のための医薬の製造における利用である。
【００３１】
更に別の具体例は、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１(表１ａ及び１ｂ)から選択するポリペプチドを含むポリペプチドの活性若しくは安定性又はSEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１(表１ａ及び１ｂ)から選択するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、量若しくは安定性を調節する試薬の、悪性新生物(特に、乳癌)の治療のための医薬の製造における利用である。
【００３２】
この発明の更に別の具体例は、SEQ ID NO:１〜１６５(表１)から選択するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はSEQ ID NO:１６６〜３００から選択するポリペプチドを含むポリペプチドに特異的に結合する試薬、及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物である。
【００３３】
この発明の更なる具体例は、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１から選択するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド及び表１ａ及び１ｂ又は４中のそれぞれのポリヌクレオチドにつき与えられるのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物である。本発明で有用な医薬組成物は、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１から選択するポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含む融合タンパク質、又はその断片、抗体又は抗体断片を更に含むことができる。
【００３４】
この発明は又、様々なキットをも提供する。かかるキットは、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子から又は表２に列記した遺伝子のサブセットから選択した単一又は複数の遺伝子の発現を評価するための試薬を含む。
一面において、この発明は、患者が乳癌を患っているかどうかを評価するためのキットを提供する。
【００３５】
他の面において、この発明は、複数の化合物の各々の、患者の乳癌を阻止することについての適性を評価するためのキットを提供する。このキットは、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子の発現を評価するための試薬、又は表２に列記した各マーカー遺伝子の発現を評価するための試薬を含む。このキットは又、複数の化合物を含むこともできる。
【００３６】
更なる面において、この発明は、乳癌細胞の存在を評価するためのキットを提供する。このキットは、抗体を含み、該抗体は、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質又は該タンパク質のポリペプチド断片と特異的に結合する。このキットは又、複数の抗体を含むこともでき、該複数の抗体は、表２に列記したマーカー遺伝子セットの各マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的に結合する。
【００３７】
更に別の面において、この発明は、乳癌細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは、核酸プローブを含む。このプローブは、表１ａ及び１ｂに列記したマーカー遺伝子のＲＮＡ転写物又は該転写物のｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする。このキットは又、複数のプローブを含むこともでき、それらのプローブの各々は、表２に列記したマーカー遺伝子の一つの又はマーカー遺伝子セットのＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズする。
【００３８】
本発明の組成物、方法及びキットは又、公知の乳癌マーカー遺伝子を含む公知の癌マーカー遺伝子を含むこともできるということは認められよう。更に、これらの組成物、方法及びキットが、乳癌以外の癌を同定するために利用しうるということは認められよう。
【００３９】
発明の詳細な説明
定義
「差次的発現」又は「発現」は、ここで用いる場合、分化発生、腫瘍細胞の異なる遺伝的背景及び／又は腫瘍の組織環境への反応に依存する遺伝子発現パターンの量的並びに質的差異の両方を指す。差次的に発現される遺伝子は、「マーカー遺伝子」及び／又は「標的遺伝子」を表しうる。ここに開示する差次的に発現される遺伝子の発現パターンは、乳癌の予後予測的又は診断的評価の部分として利用することができる。或は、ここに開示する差次的に発現する遺伝子は、試薬及び化合物を同定する方法において並びにこれらの試薬及び化合物の乳癌の治療のための利用において並びに治療方法において利用することができる。この遺伝子の差次的調節は、特定の癌細胞型又はクローンに限られず、むしろ、癌細胞、筋肉細胞、間質細胞、結合組織細胞、他の上皮細胞、内皮細胞及び血管並びに免疫系細胞(例えば、リンパ球、マクロファージ、キラー細胞)の相互作用を示す。
【００４０】
「生物学的活性」又は「生物活性」又は「活性」又は「生物学的機能」(これらは、交換可能に用いられる)は、ここでは、ポリペプチド(ネイティブな又は変性したコンホメーションのもの)により又はその任意の断片によって、イン・ビボ又はイン・ビトロで、直接又は間接に作動されるエフェクター又は抗原性機能を意味する。生物学的活性は、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質又は分子への結合、酵素活性、シグナル変換、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写レギュレーターとしての活性、ダメージを受けたＤＮＡに結合する能力などを含むが、これらに限られない。生物活性は、主題のポリペプチドに直接影響を与えることによって調節することができる。或は、生物活性は、そのポリペプチドのレベルを調節することにより、例えば対応する遺伝子の発現を調節することによって変えることができる。
【００４１】
用語「マーカー」又は「バイオマーカー」は、生物学的分子例えば核酸、ペプチド、ホルモンなどを指し、これらの存在又は濃度は、既知の条件(例えば、病気)により検出でき、相関されうる。
【００４２】
用語「マーカー遺伝子」は、ここで用いる場合、差次的に発現される遺伝子を指し、該遺伝子の発現パターンは、悪性新生物形成又は乳癌評価における予測、予後予測又は診断プロセスの部分として利用することができ、或は、それは、悪性新生物形成(特に、乳癌)の治療又は予防に有用な化合物を同定するための方法において利用することができる。マーカー遺伝子は又、標的遺伝子の特徴を有することもできる。
【００４３】
「標的遺伝子」は、ここで用いる場合、標的遺伝子の発現レベル又は標的遺伝子産物の活性の調節が、悪性新生物形成(特に、乳癌)の症状を改善するように作用しうる様式で乳癌に関係する差次的に発現される遺伝子を指す。
【００４４】
用語「新生物病変」又は「新生物疾患」又は「新生物」は、癌様組織を指し、これは、癌腫(例えば、イン・シトゥーの癌腫、浸潤性癌腫、転移性癌腫)及び組織学的起源とは無関係の前悪性化状態、新形態変化(例えば、管状、小葉、髄、混合型起源)を包含する。用語「癌」は、冒された組織又は細胞凝集体の如何なる段階、等級、組織形態学的特徴、浸潤性、侵略性又は悪性にも限定されない。特に、ステージ０の乳癌、ステージＩの乳癌、ステージＩＩの乳癌、ステージＩＩＩの乳癌、ステージＩＶの乳癌、等級Ｉの乳癌、等級ＩＩの乳癌、等級ＩＩＩの乳癌、悪性乳癌、乳房の原発性癌腫及び他のすべての型の乳房と関係する癌、悪性疾患及び形質転換が含まれる。用語「新生物病変」又は「新生物疾患」又は「新生物」又は「癌」は、如何なる組織又は細胞型にも限られず、それらは又、癌患者の原発性、二次的又は転移性の病変をも包含し、局所的(例えば、骨髄、肝臓、腎臓)に付着し若しくは自由に患者の身体中を流れる癌細胞又は最少の残留的な病気細胞に冒されたリンパ節をも包含する。
【００４５】
用語「生物学的試料」は、ここで用いる場合、生物から又は生物の構成要素(例えば、細胞)から得られる試料を指す。この試料は、任意の生物学的組織又は液体のものであってよい。しばしば、この試料は、「臨床試料」であり、これは、患者に由来する試料である。かかる試料は、唾液、血液、血液細胞(例えば、白血細胞)、組織又は細針生検試料、細胞含有体液、自由に流れる核酸、尿、腹腔液、及び胸膜腔液、又はそれに由来する細胞を包含するが、これらに限られない。生物学的試料は又、組織の切片例えば組織学的目的のために採った凍結又は固定した切片をも含むことができる。分析すべき生物学的試料は、吸引若しくは穿刺、切開又は他の生検へと導く外科的方法により得られた新生物病変に由来する組織材料又は切除された細胞材料である。かかる生物学的試料は、患者から得られた細胞を含んでよい。これらの細胞は、例えば、乳頭吸引、腺管洗浄、細針生検により又は刺激若しくは自然乳頭排出によって集められた乳房細胞「スメア」中に見出されうる。他の具体例において、この試料は、体液である。かかる液体は、例えば、血液、リンパ液、腹水液、婦人科液、又は尿を含むが、これらの液体に限られない。
【００４６】
用語「治療法」、「治療様式」、「養生法」又は「化学養生法」並びに「治療養生法」は、時間的に順次的又は同時の、抗腫瘍及び／又は免疫刺激性、及び／又は血液細胞増殖性因子、及び／又は放射線療法、及び／又は癌治療のための高温、及び／又は低体温法の施与を指す。これらの施与は、補助剤及び／又は補助剤様式で行なうことができる。かかる「プロトコール」の組成物は、限られた治療用ウインドウ内で、単一薬剤の投与量、適用の時間枠及び施与の頻度を変えることができる。現在、様々な薬物及び／又は物理的方法の様々な組合せ、及び様々な計画が研究されている。
【００４７】
「アレイ」又は「マトリクス」とは、番地付け可能な位置又は「アドレス」のデバイス上の配置を意味する。これらの位置は、二次元のアレイ、三次元のアレイ、又は他のマトリクス形式に配置することができる。位置の数は、数個から少なくとも数十万に及びうる。最も重要なことには、各位置は、全く独立した反応部位を表している。アレイは、核酸アレイ、タンパク質アレイ及び抗体アレイを含むが、これらに限られない。「核酸アレイ」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は遺伝子の一層大きい部分などの核酸プローブを含むアレイを指す。このアレイ上の核酸は、好ましくは、一本鎖である。これらのプローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」又は「オリゴヌクレオチドチップ」と呼ばれる。「マイクロアレイ」は、ここでは、「バイオチップ」又は「バイオロジカルチップ」(少なくとも約１００／ｃｍ2の、好ましくは、少なくとも約１０００／ｃｍ2の分離した領域の密度を有する領域のアレイ)とも呼ぶ。これらのマイクロアレイ中の領域は、約１０〜２５０μｍの範囲の典型的寸法(例えば、直径)を有して、アレイ中の他の領域から凡そ等距離だけ分離されている。「タンパク質アレイ」は、ポリペプチドプローブ又はタンパク質プローブ(ネイティブ形態でも、変性していてもよい)を含むアレイを指す。「抗体アレイ」は、モノクローナル抗体を含む(但し、モノクローナル抗体に限られない)抗体(例えば、マウス由来のもの)、キメラ抗体、ヒト化抗体又はファージ抗体及び一本鎖抗体並びに抗体由来の断片を含むアレイを指す。
【００４８】
用語「アゴニスト」は、ここで用いる場合、タンパク質の生物活性を真似し又はアップレギュレートする(例えば、強化し又は補う)薬剤を指すことを意味する。アゴニストは、野生型タンパク質又は野生型タンパク質の少なくとも一つの生物活性を有するその誘導体であってよい。アゴニストは又、遺伝子の発現をアップレギュレートし又はタンパク質の少なくとも一つの生物活性を増大させる化合物であってもよい。アゴニストは又、ポリペプチドの他の分子(例えば、標的ペプチド又は核酸)との相互作用を増大させる化合物であってもよい。
【００４９】
用語「アンタゴニスト」は、ここで用いる場合、タンパク質の少なくとも一つの生物活性をダウンレギュレートする(例えば、抑制し又は阻害する)薬剤を指すことを意味する。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子(例えば、標的ペプチド、リガンド又は酵素基質)との相互作用を阻害し又は低下させる化合物であってよい。アンタゴニストは又、遺伝子の発現をダウンレギュレートし又は発現されて存在するタンパク質の量を減少させる化合物であってもよい。
【００５０】
「小分子」は、ここで用いる場合、約５ｋＤ以下(最も好ましくは、約４ｋＤ未満)の分子量を有する合成物を指すことを意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質又は他の有機(炭素含有)分子若しくは無機分子であってよい。多くの製薬会社は、生物活性を調節する化合物を同定するために、この発明の何れかのアッセイによってスクリーニングすることのできる化学的及び／又は生物学的混合物の多数のライブラリー(しばしば、カビ、細菌又は藻類抽出物)を有している。
【００５１】
用語「調節された」又は「調節」又は「調節された」又は「調節」及び「異なって調節された」は、ここで用いる場合、アップレギュレーション(即ち、活性化又は刺激(例えば、作動又は強化による))とダウンレギュレーション(即ち、阻害又は抑制(例えば、拮抗、低下又は阻害による))の両方を指す。
【００５２】
「転写調節ユニット」は、制御可能に結合されたタンパク質をコードする配列の転写を誘導し又は制御する開始シグナル、エンハンサー、及びプロモーターなどのＤＮＡ配列を指す。好適具体例において、遺伝子の一つの転写は、発現を意図する一つの細胞型において組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列(又は、他の転写調節配列)の制御下にある。組換え遺伝子は、天然型のポリペプチドの転写を制御する配列と同じ又は異なる転写調節配列の制御下にあってよいということも又理解されよう。
【００５３】
用語「誘導体」は、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の化学的改変を指す。ポリヌクレオチド配列の化学的改変は、例えば、水素の、アルキル、アシル、又はアミノ基による置換を含むことができる。誘導体のポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも一つの生物学的又は免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体のポリペプチドは、それが導かれたポリペプチドの少なくとも一つの生物学的又は免疫学的機能を保持するグリコシル化、ペグ化、又は任意の類似のプロセスにより改変されたものである。
【００５４】
用語「ヌクレオチド類似体」は、少なくとも一つの特長において、天然のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと異なっているが、それぞれの天然のヌクレオチドの機能的特徴(例えば、塩基対合、ハイブリダイゼーション、コード情報)を示すオリゴマー又はポリマー(前記の組成物に利用できるもの)を指す。これらのヌクレオチド類似体は、非天然の塩基又はポリマー主鎖からなってよく、その例は、ＬＮＡ、ＰＮＡ及びモルホリノである。このヌクレオチド類似体は、その天然の対応物又は同等物と異なる少なくとも一つの分子を有する。
【００５５】
「乳癌遺伝子」は、ここで用いる場合、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド(表１ａ及び１ｂに列記)並びにそれらの誘導体、断片、類似体及び同族体、それによりコードされたポリペプチド(SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１、表１参照)並びにそれらの誘導体、断片、類似体及び同族体、そして表１〜５に開示した情報を利用して当分野で周知の標準的技術を用いて誘導し又は同定することのできる対応するゲノム転写ユニットを指す。SEQ ID NO:１〜６５のポリヌクレオチド配列及びSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリペプチドの遺伝子名称、参照配列番号、固有遺伝子識別子、及び遺伝子座リンクＩＤ番号は、表１ａ及び１ｂに見られる(遺伝子記述、遺伝子機能及び細胞内局在性は、表４ａ及び４ｂに与えられている)。
【００５６】
用語「染色体領域」は、ここで用いる場合、細胞遺伝学的又は他の遺伝学的マーカー例えば制限断片長多型(ＲＦＬＰ)、一塩基多型(ＳＮＰ)、発現配列タグ(ＥＳＴ)、配列標識部位(ＳＴＳ)、マイクロサテライト、縦列反復数可変部（ＶＮＴＲ）及び遺伝子により規定されうる染色体上の連続するＤＮＡストレッチを指す。典型的には、染色体領域は、最大で２メガ塩基(ＭＢ)、最大で４ＭＢ、最大で６ＭＢ、最大で８ＭＢ、最大で１０ＭＢ、最大で２０ＭＢ又はそれ以上のＭＢの塩基よりなる。
【００５７】
用語「キット」は、ここで用いる場合、この発明で開示した少なくとも一つのマーカー遺伝子(特に、表２に列記した遺伝子)の発現を特異的に検出するための少なくとも一種の試薬(例えば、プローブ)を含む任意の製品(たとえば、診断または研究用製品)を指し、この製品は、本発明の方法を実施するためのユニットとして販売され、頒布され、そして／又は促進される。表２及び５に列記した遺伝子、プライマー及びプローブ又はそれらの少なくとも２つの任意の組合せは、この発明の目的、方法及び開示に関して、単一の試験として注目する。SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチドを含む、それぞれのマーカー遺伝子産物の存在、安定性、活性、複雑さを検出するための試薬(例えば、イムノアッセイ)も又、キットの成分として注意する。加えて、この発明に開示したような核酸及びタンパク質検出の任意の組合せは、キットとして考えられる。
【００５８】
本発明は、ポリヌクレオチド配列及びそれによりコードされたタンパク質並びにそれらのポリヌクレオチド配列から導かれたプローブ、それらのコードされたタンパク質に向けられた抗体、及び悪性新生物(特に、乳癌)を有する危険のある又は有する個人のための、予測的、予防的、診断的、予後予測的及び治療的利用を提供する。これらの開示する配列は、乳癌由来の試料において異なって発現されることが見出されている。
【００５９】
本発明は、乳癌の臨床的証拠を有する患者の腫瘍生検において異なって制御される(アップ又はダウンレギュレートされる)１８５の遺伝子の同定に基づいている。これらの遺伝子の幾つかの同時発現の特性決定は、乳癌における新たに同定された役割を与える。それらの遺伝子名、データベース受入れ番号(遺伝子名称、参照配列番号、固有遺伝子識別子、及び遺伝子座リンクＩＤ番号)並びにコードされたタンパク質の推定の又は既知の機能及びそれらの細胞内局在性は、表１〜４ａ及び４ｂに与えてある。遺伝子増幅に用いるプライマー配列及びハイブリダイゼーション用プローブは、表５に示してある。
【００６０】
本発明は、下記と関係している：
１．患者における新生物疾患の状態を特性決定する(好ましくは、エキス・ビボで)方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該患者由来の生物学的試料において測定し、
(ｉｉ)(ｉ)で測定された発現レベルのパターンを、一つ又は幾つかの発現レベルの参照用パターンと比較し、
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)における比較の結果から該患者における新生物疾患の状態を特性決定する。
２．患者における新生物疾患の検出、診断、スクリーニング、監視、及び／又は予後予測のための方法(好ましくは、エキス・ビボ)であって、下記を含む当該方法
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１７、１９〜３３、３５〜５０、５２〜６４、６６〜８５、８８〜９１及び９３〜１６５及び４７２〜４９１よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０又は４７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを該患者由来の生物学的試料において測定し、
(ｉｉ)(ｉ)で測定された発現レベルのパターンを、一つ又は幾つかの発現レベルの参照用パターンと比較し、
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)における比較の結果から該患者における新生物疾患を検出し、診断し、スクリーニングし、監視し、及び／又は予後予測する。
【００６１】
発現レベルの測定は、発現レベルの定量及び／又は純粋に定性的な測定を含むことができる。
【００６２】
単一遺伝子の「発現レベルのパターン」は、適当な方法により測定した前記の遺伝子の発現レベルとして理解されるべきである。
【００６３】
この発明の意味の内で、特定のSEQ ID NOにより言及される核酸分子は、元の核酸分子から、ヌクレオチドの欠失、挿入又は転位によって誘導することのできる該核酸分子の変異体も含むものとして理解されるべきである(但し、該変異体は、依然として、元の配列に対して８０、９０、９５又は９９％の配列同一性を有している)。好ましくは、これらの変異体は、依然として、元の分子が有するのと同じ生物学的活性及び／又は機能を有している。
【００６４】
当業者には、ヌクレオチド配列の参照は、該ヌクレオチド配列によりコードされる関連タンパク質配列の参照を含むことを意味するということは明らかである。
【００６５】
第一の配列の第二の配列に対する「同一性％」は、この発明の意味の内において、同一性％を意味し、それは、次のように計算される：先ず、２つの配列の間の最適な大域アラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズム[Thomson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680]、バージョン１．８を用いて測定する(次のコマンドラインシンタクスを適用：./clustalw-infile=./infile.txt  -output=  -outorder=aligned  -pwmatrix=gonnet  -pwdnamatrix=clustalw-pwgapopen=10.0  -pwgapext=0.1  -matrix=gonnet  -gapopen=10.0  -gapext=0.05  -gapdist=8-hgapresidues=GPSNDQERK maxdiv=40)。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ アルゴリズムの実行は、インターネット上の多数のサイト(例えば、http://www.ebi.ac.uk. を含む)で容易に利用可能である。その後、アラインメント中のマッチした数を、整列させた位置における同じヌクレオチド(又は、アミノ酸残基)の数を計数することにより測定する。最後に、マッチの層数を２つの配列の長い方のヌクレオチド(又はアミノ酸残基)数で除して、１００を乗じて、第一の配列の第二の配列に対する同一性％を生成する。
３．異なる時点における多数の発現レベルのパターンの測定を含み、それにより、該患者における該新生物疾患の発生を監視することを可能にする、１又は２の計数方法。
４．該患者における該新生物疾患の治療の所定の方法の成功の見込みの評価を含む、１の計数方法。
５．患者が応答することが期待されるか又は患者が該新生物疾患についての所定の治療方法に応答しないと予想されるかどうかの評価を含む、１の計数方法。
【００６６】
用語「応答する」又は「応答しない」は、定性的及び／又は定量的様式で、理解されるべきである。「応答する」及び「応答しない」は、適当な参照用応答(例えば、ある治療方法に対する「応答者」及び「不応答者」により示される応答)に関して評価されるべきである。
【００６７】
６．予測用アルゴリズムを利用する、４又は５の計数方法。
データ分析の当業者に周知の予測用アルゴリズムは、当分野で公知の任意の種類の予測用アルゴリズムであると理解されるべきである。かかるアルゴリズムの好適な例は、例えば、実施例４で開示するＳＶＭアルゴリズムである。
【００６８】
７．予測用アルゴリズムが、Support Vector Machineである、６の計数方法。
Support Vector Machineは、データ分析の分野の当業者に周知のアルゴリズムである。Support Vector Machineアルゴリズムは、実施例４で開示する。
【００６９】
８．前記の所定の治療方法が、下記である、４〜７の何れかの計数方法
(ｉ)細胞増殖に作用し、及び／又は
(ｉｉ)細胞生存に作用し、及び／又は
(ｉｉｉ)細胞運動性に作用し、及び／又は
(ｉｖ)アントラサイクリンベースの治療方法であり、及び／又は
(ｖ)エピルビシン及び／又はシクロホスファミドの投与を含む。
【００７０】
９．新生物疾患に悩まされている患者に対する治療方法であって、下記を含む当該治療方法
(ｉ)４又は５の計数方法を利用して、有望な治療方法を同定し、
(ｉｉ)該患者の該新生物疾患を、ステップ(ｉ)で同定した治療方法により治療する。
【００７１】
１０．新生物疾患に悩まされている患者をスクリーニングする方法であって、１又は２の計数方法を複数の患者に適用する当該方法。
【００７２】
１１．新生物疾患に対する治療効果を有する物質及び／又は治療方法をスクリーニングする方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)該新生物疾患に悩まされている患者から生物学的試料を得て、
(ｉｉ)４又は５の計数方法を利用して、該生物学的試料から、該患者が、該新生物疾患に対する所定の治療方法に応答すると予想されるかどうかを評価し、
(ｉｉｉ)もし、該患者が、該所定の治療方法に応答すると予想されるならば、該生物学的試料を、該治療方法において、該物質とインキュベートし、
(ｉｖ)該治療方法において、該試験物質により開始された該生物学的試料の変化を観察し、
(ｖ)該試験物質及び／又は該治療方法を、(ｉｖ)における該生物学的試料の変化の観察に基づいて、選択し又は拒絶する。
【００７３】
特定の生物学的試料(例えば、所定の治療に対する良好な応答者であるもの)の選択は、該特定の新生物疾患の治療のための新規な物質及び／又は治療方法の同定の助けとなりうる。
【００７４】
１２．新生物疾患に対する治療効果を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、下記を含む当該方法
(ｉ)生物学的試料又はそれらの抽出物を試験物質とインキュベートし、
(ｉｉ)SEQ ID NO:１〜１７、１９〜３３、３５〜５０、５２〜６４、６６〜８５、８８〜９１及び９３〜１６５及び４７２〜４９１よりなるマーカー遺伝子の群に含まれる少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０又は４７のマーカー遺伝子の発現レベルのパターンを測定し、
(ｉｉｉ)(ｉｉ)で測定された発現レベルのパターンを一つ又は数個の参照用パターンと比較し、
(ｉｖ)該試験物質を、(ｉｉｉ)で実施した比較に基づいて、選択し又は拒絶する。
【００７５】
１３．前記のマーカー遺伝子が、表２に列記したマーカー遺伝子の群に含まれる１〜１２の何れかの計数方法。
表２に列記したマーカー遺伝子は、特に、所与の新生物疾患に対するある治療方法の成功する蓋然性の評価に関して情報を与えるものであることが示されている。表２のマーカー遺伝子は、この発明による好適なマーカー遺伝子である。
【００７６】
１４．下記により発現レベルを測定する、１〜１３の何れかの計数方法。
(ｉ)ハイブリダイゼーションに基づく方法、又は
(ｉｉ)アレイ状に並べたプローブを利用する、ハイブリダイゼーションに基づく方法、又は
(ｉｉｉ)個々の標識プローブを利用する、ハイブリダイゼーションに基づく方法、又は
(ｉｖ)リアルタイムリアルタイムＰＣＲ、又は
(ｖ)ポリペプチド、タンパク質又はそれらの誘導体の発現の評価、又は
(ｖｉ)ポリペプチド、タンパク質又はそれらの誘導体の量の評価。
【００７７】
１５．新生物疾患が、乳癌である、１〜１４の何れかの計数方法。
この発明の方法は、好ましくは、エキス・ビボで行い、この発明の方法は、好ましくは、既に利用可能であるか又は医師若しくは他の医療教育を受けた者の介入なしで得ることのできる試料についてエキス・ビボで行なう。
【００７８】
１６．下記よりなるマーカー遺伝子の群に含まれるマーカー遺伝子に適した少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７のプライマー対及びプローブを含むキット
(ｉ)SEQ ID NO:１〜１６５、又は
(ｉｉ)表２に列記したマーカー遺伝子。
【００７９】
１７．各々、SEQ ID NO:３３１〜４７１よりなる配列の群に含まれる配列を有する少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７セットの個別に標識したプローブを含むキット。
【００８０】
１８．各々、SEQ ID NO:３３１〜４７１よりなる配列の群に含まれる配列を有する少なくとも６、８、１０、１５、２０、３０又は４７セットのアレイ状に並べたプローブを含むキット。
【００８１】
この発明の部分である遺伝子の生物学的妥当性
表１ａ及び１ｂに列記した遺伝子の幾つかは、生物学的、細胞性プロセスを示し、それらは、遺伝子の類似の調節により特徴付けられる。説明のためであり、制限するものではないが、下記の実施例では、表１からの少数の特徴的な遺伝子をあとで一層詳細に記載する：
【００８２】
ＭＡＤ２Ｌ１
細胞分裂後期における染色体分離の開始は、紡錘体構築のチェックポイントにより、中期の染色体−微小管付着の完了とリンクしている。正常な細胞分裂中のＭａｄ２タンパク質の機能を測定するために、マウスにおいて、ノックアウト実験を行なった。これらの細胞は、紡錘体破壊に応答して拘束することができなかった。胎児の６．５日目に、胚盤葉上層の細胞は、急速な細胞分裂を開始し、チェックポイントのないことは、広範囲の染色体のミスエグレゲーション及びアポトーシスを生じた。対照的に、有糸分裂後のトロホブラスト巨大細胞は、Ｍａｄ２なしで生存した。従って、紡錘体構築チェックポイントは、有糸分裂中のマウス細胞における正確な染色体分離及び胎児の生存力に必要とされる(紡錘体損傷がなくても)。
【００８３】
紡錘体チェックポイント変異体における減数分裂Ｉの染色体不分離は、後期の開始を遅延させることによって防ぐことができる。組換え欠損変異体において、このチェックポイントは、後期Ｉの生化学的事象を遅延させ、これは、微小管に付着したが緊張していない染色体は、紡錘体チェックポイントを活性することができることを示唆している。紡錘体チェックポイント変異体は、減数分裂Ｉにおける染色体分離の精度を減数分裂ＩＩにおけるものより遥かに低下させ、これは、チェックポイント欠損が、ダウン症候群に寄与しうること及びおそらくは癌で認められる「無秩序な」倍数性に寄与しうることを示唆している。
【００８４】
ＩＧＦＢＰ４
７つの構造的に異なるインスリン様成長因子結合タンパク質が単離されており、それらのｃＤＮＡがクローン化されている：ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、及びＩＧＦＢＰ７。これらのタンパク質は、強い配列相同性を示し、それは、それらが、密接に関連した遺伝子ファミリーによりコードされていることを示唆している。これらのＩＧＦＢＰは、３つの構造的に異なるドメインを含んでおり、その各々は、分子の約１／３を含んでいる。６つのヒトＩＧＦＢＰのＮ末端ドメイン１及びＣ末端ドメイン３は、中〜高レベルの配列同一性を示しており{ドメイン１及び３中には、１２及び６の不変のシステイン残基をそれぞれ含んでいる(ＩＧＦＢＰ６は、ドメイン１に、１０のシステイン残基を含んでいる)}、ＩＧＦ結合ドメインであると考えられている。ドメイン２は、先ず、６ＩＧＦＢＰ中で配列同一性がないこと及びシステイン残基のないことにより規定される{それは、２つのシステインをＩＧＦＢＰ４中に含むが}。ドメイン３は、チログロブリンＩ型反復ユニットと相同である。研究は、これらのタンパク質の主たる効果がＩＧＦ活性の減衰であること及びそれらがＩＧＦ媒介の細胞成長及び代謝の制御に寄与することを示唆した。
【００８５】
ＤＤＢ２
ヒトの細胞において、紫外線照射により誘発されたＤＮＡ損傷の効率的で広範なゲノム修復は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子を必要とする。ｐ４８遺伝子は、紫外線照射で損傷を受けたＤＮＡに結合する活性の発現に必要とされ、この活性を欠く色素性乾皮症グループＥ細胞のサブセット、ＤＤＢ陰性ＸＰＥにおいて突然変異により破壊される。ｐ４８ｍＲＮＡレベルは、基礎的ｐ５３発現に強く依存しており、ＤＮＡ損傷のずっと後に、ｐ５３に依存する様式で増加する。更に、ｐ５３−／−細胞に似て、色素性乾皮症グループＥの細胞は、広範なゲノム修復が欠損している。これらの結果は、ｐ４８を、ｐ５３とヌクレオチド除去修復装置の結合物として同定した。
【００８６】
ＵＶ損傷したＤＮＡに結合する活性(ＵＶ−ＤＤＢ)は、ゲッ歯類からの細胞系統及び一次組織においては欠損している。ｐ４８のトランスフェクションは、ＵＶ−ＤＤＢをハムスター細胞に与え、シクロブタンピリミジンダイマー(ＣＰＤ)のゲノムＤＮＡ及び発現される遺伝子の非転写鎖からの除去を増進させた。ｐ４８の発現は、非転写鎖から起きるＵＶ誘導性変異を抑制したが、細胞のＵＶ感受性に効果を有しなかった。これらの結果は、ＤＮＡ修復におけるｐ４８の役割を限定し、突然変異誘発におけるＣＰＤの重要性を示し、如何にしてゲッ歯類モデルが、ヒトにおける癌の罹病性をより良く反映するように改善されうるかを示唆した。
【００８７】
ＨＳＰＡ２
幾つかの熱ショックタンパク質遺伝子は、第６染色体上の主要組織適合性複合体中に位置している(例えば、ＨＳＰＡ１)。しかしながら、ＨＳＰＡ２は、１４ｑ２２−ｑ２４上に位置している。(単離された)ＨＳＰＡ２のクローンは、７０，０３０Ｄａの予想分子量を有する６３９アミノ酸のタンパク質をコードする１，９１７塩基対の単一のオープンリーディングフレームにより特徴付けられる。この配列の分析は、ＨＳＰＡ２が、マウスのＨｓｐ７０−２遺伝子のヒト同族体であることを示した(ヌクレオチドコード配列における９１．７％同一性及び対応するアミノ酸配列における９８．２％同一性を有する)。ＨＳＰＡ２は、ヒトＨＳＰ７０遺伝子ファミリーの他のメンバーに対する一層小さいアミノ酸相同性を有する。ＨＳＰＡ２は、殆どの組織において構成的に発現されるが、精巣及び骨格筋においては非常に高レベルで発現される。ＨＳＰＡ２は、筋肉、心臓、食道、及び脳において、豊富に発現され、精巣においては一層低い程度に発現される。Ｈｓｐ７０−２についてホモ接合の雌のノックアウトマウスは、正常な減数分裂を行なって、繁殖力を有している。対照的に、ホモ接合の雄のノックアウトマウスは、後減数期の精細胞及び成熟精子を欠いて繁殖力がなかった。Ｈｓｐ７０−２は、減数分裂時の精母細胞の核において、正常に、接合糸複合体と関係している。雄のノックアウトマウスにおいては、これらの構造は、前期の遅くまでに異常となった。精母細胞アポトーシスの大いなる増加も認めうる。
【００８８】
ポリヌクレオチド
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのコード配列又はコード配列の相補鎖を含む。ヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする縮重したヌクレオチド配列、並びにSEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６又は９８％同一である相同ヌクレオチド配列も又、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、コンピュータープログラム例えば、ギャップオープンペナルティー−１２及びギャップエキステンションペナルティー−２のアフィンギャップサーチを利用してＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用するＡＬＩＧＮを利用して測定される。生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの相補性ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)分子、種同族体、及び変異体も又、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。
【００８９】
ポリヌクレオチドの調製
天然の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、膜成分、タンパク質及び脂質などの他の細胞成分を含まないで単離することができる。ポリヌクレオチドは、細胞により生成させて、標準的核酸精製技術を利用して単離することができ、又は増幅技術例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を利用し又は自動化シンセサイザーを利用することによって合成することができる。ポリヌクレオチドを単離する方法は、日常的であり、当分野で公知である。ポリヌクレオチドを得るための任意のかかる技術を利用して、単離された「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素及びプローブを利用して、「乳癌遺伝子」ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離することができる。単離されたポリヌクレオチドは、他の分子を含まず又は少なくとも７０、８０若しくは９０％含まない調製物中にある。
【００９０】
「乳癌遺伝子」ｃＤＮＡ分子は、「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡをテンプレートとして利用して、標準的な分子生物学技術によって生成することができる。ｍＲＮＡの単離に逆らって選択することのない任意のＲＮＡ単離技術を、かかるＲＮＡ試料の精製に利用することができる。例えば、Sambrook等、1989, (6); 及びAusubel, F.M.等、1989, (7)(これらの両方を参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)を参照されたい。加えて、多数の組織試料は、当業者に周知の技術例えばChomczynski, P.(1989, 米国特許第４，８４３，１５５号)の単一ステップのＲＮＡ単離プロセス(参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)を利用して、容易に処理することができる。
【００９１】
「乳癌遺伝子」ｃＤＮＡ分子は、その後、当分野で公知の及びマニュアル(例えば、Sambrook等、1989, (6))に開示されている分子生物学技術を利用して複製することができる。増幅技術例えばＰＣＲを利用して、ヒトのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡをテンプレートとして、この発明のポリヌクレオチドの更なるコピーを得ることができる。
或は、化学合成技術を利用して、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを合成することができる。この遺伝コードの縮重は、「乳癌遺伝子」ポリペプチド又は生物学的に活性なその変異体をコードする別のヌクレオチド配列を合成することを可能にする。
【００９２】
差次的発現の同定
差次的に発現される遺伝子により生成されるＲＮＡを表す集められたＲＮＡ試料内の転写物は、当業者に周知の様々な方法を利用することによって同定することができる。例えば、差次的スクリーニング[Tedder, T.F.等、1988, (8)]、減法ハイブリダイゼーション[Hedrick, S.M.等、1984, (9); Lee, S.W.等、1984, (10)]、及び好ましくは、差次的ディスプレー(Liang, P.及びPardee, A.B., 1993, 米国特許第５，２６２，３１１号、これを参考として、本明細書中に、そっくりそのまま援用する)を利用して、差次的に発現される遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列を同定することができる。
【００９３】
差次的スクリーニングは、ｃＤＮＡライブラリーの二重スクリーニングを含み、該スクリーニングにおいては、ライブラリーの１コピーを、一細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全細胞ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、他方、このｃＤＮＡライブラリーの複製したコピーを、第二の細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする。例えば、一のｃＤＮＡプローブは、対照用患者に由来する細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応し得て、他方、第二のｃＤＮＡプローブは、実験用患者に由来する同じ細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応しうる。一方のプローブにはハイブリダイズするが他方のプローブにはハイブリダイズしないクローンは、潜在的に、対照用患者と実験用患者における関心ある細胞型において差次的に発現される遺伝子に由来するクローンを表している。
【００９４】
減法ハイブリダイゼーション技術は、一般に、２つの異なる起源(例えば、対照用組織と実験用組織)からのｍＲＮＡの単離、そのｍＲＮＡ又は単離したｍＲＮＡから逆転写した一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、及びハイブリダイズしたすべて(従って、二本鎖配列)の除去を含む。残りの未ハイブリダイズの一本鎖ｃＤＮＡは、潜在的に、２つのｍＲＮＡ起源において差次的に発現される遺伝子に由来するクローンを表している。かかる一本鎖ｃＤＮＡを、次いで、差次的に発現される遺伝子に由来するクローンを含むライブラリー構築のための出発材料として利用する。
【００９５】
差次的ディスプレー技術は、差次的に発現される遺伝子に由来する配列の同定を可能にする周知のポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ；Mullis, K.B., 1987, 米国特許第４，６８３，２０２号に示された実験具体例)を利用する手順を記載している。先ず、単離したＲＮＡを、当業者に周知の標準的技術を利用して、逆転写して一本鎖ｃＤＮＡにする。逆転写反応のためのプライマーは、オリゴｄＴ含有プライマー(好ましくは、後記のリバースプライマー型のオリゴヌクレオチド)を含むことができるが、これらに限られない。次に、この技術は、後記のように、ＰＣＲプライマーの対を利用し、これは、任意所定の細胞に存在するＲＮＡ転写物のランダムなサブセットを表すクローンの増幅を可能にする。異なるプライマー対の利用は、細胞内に存在する各ｍＲＮＡ転写物を増幅することを可能にする。かかる増幅された転写物は、差次的に発現される遺伝子から生成されたものと同定されうる。
【００９６】
プライマー対のリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチドの、好ましくは、ｍＲＮＡのポリ(Ａ)テイルにハイブリダイズし又はｍＲＮＡのポリ(Ａ)テイルから逆転写されたｃＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする５’末端の１１ヌクレオチド長のオリゴｄＴストレッチを含みうる。第二に、リバースプライマーの特異性を増大させるために、プライマーは、少なくとも一つの、好ましくは２つの追加のヌクレオチドを３’末端に含むことができる。特に、統計的に、関心ある試料中に存在するｍＲＮＡ由来の配列の、唯一つのサブセットだけがかかるプライマーにハイブリダイズするので、これらの追加のヌクレオチドは、プライマーが、関心ある試料中に存在するｍＲＮＡ由来の配列の唯一つのサブセットだけを増幅することを可能にする。これは、増幅された配列を表すバンドの各々の一層正確で完全な可視化及び特性表示を可能にする点において好適である。
【００９７】
フォワードプライマーは、統計的に、関心ある組織に由来するｃＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有することが予想されるヌクレオチド配列を含むことができる。このヌクレオチド配列は、任意のものであってよく、このフォワードプライマーの長さは、約９〜１３ヌクレオチドに及んでよいが、約１０ヌクレオチドが好ましい。任意のプライマー配列は、生成される増幅された部分的ｃＤＮＡの長さを可変にし、そうして、標準的な配列決定用の変性ゲル電気泳動の利用により、異なるクローンの分離を可能にする。ＰＣＲ反応条件は、増幅生成物の収率及び特異性を最適化し、更に、標準的ゲル電気泳動技術を利用して分離できる長さの増幅生成物を生成するものを選択すべきである。かかる反応条件は、当業者に周知であり、重要な反応パラメーターは、例えば、上で論じたオリゴヌクレオチドプライマーの長さ及びヌクレオチド配列、及びアニーリング工程及び伸長工程の温度及び反応時間を含む。２つの異なる細胞型のｍＲＮＡの逆転写及び増幅の結果生成したクローンのパターンは、配列決定用ゲル電気泳動により表示されて比較される。２つのバンドパターンにおける差異は、潜在的に、差次的に発現される遺伝子を示す。
【００９８】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする場合、一層大きいｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリーを利用することは好ましい。ランダムにプライムしたライブラリーは、遺伝子の５’領域を含む一層多くの配列を含むであろうという点において好ましい。ランダムにプライムされたライブラリーの利用は、オリゴｄ(Ｔ)ライブラリーが完全長のｃＤＮＡを生成しないという状況に特に好ましい。ゲノムライブラリーは、５’の転写されない調節領域への配列の伸長に有用でありうる。
【００９９】
市販のキャピラリー電気泳動システムを利用して、ＰＣＲ産物又は配列決定用生成物のサイズを分析し又はヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、キャピラリーによる配列決定は、電気泳動分離用の流れうるポリマー、レーザー活性化される４つの異なる蛍光染料(各ヌクレオチド用)、及び放射された波長の電荷結合素子カメラによる検出を利用することができる。出力／光強度を、適当なソフトウェア(例えば、GENOTYPER及びSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer; ABI)を利用して電気シグナルに変換することができ、試料のローディングからコンピューター分析及び電気的データ表示までの全工程をコンピューター制御することができる。キャピラリー電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するであろう小片ＤＮＡの配列決定には、特に好ましい。
【０１００】
一度潜在的に差次的発現される遺伝子配列が、バルク技術(例えば、上記のもの)によって同定されたならば、かかる推定の差次的発現遺伝子の差次的発現を確認すべきである。確証は、例えば、ノーザン分析及び／又はＲＴ−ＰＣＲなどの周知技術によって達成することができる。確証に際して、差次的発現される遺伝子を、更に、特性決定することができ、以下で論じるように、標的及び／又はマーカー遺伝子として同定することができる。
【０１０１】
例えば差次的ディスプレーによって得られた差次的発現される遺伝子の増幅した配列を利用して、対応する遺伝子の完全長クローンを分離することもできる。この遺伝子の完全長のコーディング部分は、過度の実験をせずに、当分野で周知の分子生物学的技術によって容易に単離することができる。例えば、単離された差次的発現される増幅された断片を標識して、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに利用することができる。或は、標識した断片を利用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１０２】
同定された遺伝子により生成されたｍＲＮＡの組織分布の分析を、当業者に周知の標準的技術を利用して行なうことができる。かかる技術には、例えば、ノーザン分析及びＲＴ−ＰＣＲが含まれうる。かかる分析は、同定された遺伝子が乳癌に寄与すると予想される組織において発現されるかどうかに関する情報を与える。かかる分析は又、定常状態のｍＲＮＡ調節に関する量的情報をも与え、同定された遺伝子のどれが、好ましくは、乳癌に寄与すると予想されうる組織において、高レベルの調節を示すかに関するデータを生じる。
【０１０３】
かかる分析は又、所定の組織に由来する特定の細胞型の単離した細胞集団につき行なうこともできる。加えて、標準的イン・シトゥーハイブリダイゼーション技術を利用して、所定の組織中のどの細胞が同定された遺伝子を発現するかに関する情報を与えることができる。かかる分析は、組織内の細胞の一つのサブセットのみが乳癌に関係していると考えられる場合に、同定された遺伝子の乳癌に関する生物学的機能に関する情報を与えることができる。
【０１０４】
ポリヌクレオチドの伸長
かかる完全長遺伝子配列の同定及びクローニングのための手順の一具体例において、標準的手順に続いて、適当な組織又は細胞起源から、ＲＮＡを単離することができる。次いで、逆転写反応を、第一鎖の合成をプライムするための、増幅される遺伝子に対応するｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、そのＲＮＡについて実施することができる。このプライマーは、ｍＲＮＡに対してアンチパラレルであるので、伸長は、ｍＲＮＡの５’末端に向かって進行する。その結果生成したＲＮＡハイブリッドを、次いで、標準的ターミナルトランスフェラーゼ反応を利用してグアニンの「テイル付け」を行なうことができ、このハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化することができ、そしてその後、第二鎖合成を、ポリＣプライマーを用いてプライムすることができる。これらの２つのプライマーを利用して、この遺伝子の５’部分を、ＰＣＲを利用して増幅する。得られた配列を、次いで、単離して、予め単離してある配列と再結合させて、この発明の差次的発現される遺伝子の完全長ｃＤＮＡを生成する。クローニングストラテジー及び組換えＤＮＡ技術の総説については、例えば、Sambrook等、(6); 及びAusubel等、(7)を参照されたい。
【０１０５】
様々なＰＣＲベースの方法を利用して、ここに開示したポリヌクレオチド配列を伸長させて、上流の配列例えばプロモーター及び調節エレメントを検出することができる。例えば、制限部位ＰＣＲは、ユニバーサルプライマーを利用して、既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を回収する[Sarkar, 1993, (11)]。ゲノムＤＮＡを、先ず、リンカー配列に対するプライマーと既知の領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。それらの増幅された配列を、次いで、同じリンカープライマーと第一のものの内側の他の特異的プライマーを利用する第二ラウンドのＰＣＲにかける。各ＰＣＲラウンドの生成物を、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させて、逆転写酵素を利用して配列決定する。
【０１０６】
逆ＰＣＲも又、既知の領域に基づく発散性プライマーを利用して配列を増幅し又は伸長するために利用することができる[Triglia等、1988, (12)]。プライマーを、市販のソフトウェア例えばOLIGO 4.06 Primer Analysis ソフトウェア(National Biosciences Inc., ミネソタ、Plymouth在)を利用して、例えば２２３０ヌクレオチド長で、５０％以上のＧＣ含量を有して、約６８〜７２℃の温度で標的配列とアニールするようにデザインすることができる。この方法は、幾つかの制限酵素を利用して、遺伝子の既知領域内において、適当な断片を生成する。この断片を、次いで、分子内連結により環状化して、ＰＣＲテンプレートとして利用する。
【０１０７】
利用できる他の方法は、捕獲ＰＣＲであり、これは、ヒト及び酵母の人工染色体ＤＮＡ中の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む[Lagerstrom等、1991, (13)]。この方法においては、多数の制限酵素消化及び連結を、遺伝子工学的処理した二本鎖配列を、ＤＮＡ分子の未知の断片中に、ＰＣＲを行なう前に配置するために利用することもできる。
【０１０８】
加えて、ＰＣＲ、ネステッドプライマー、及びPROMOTERFINDERライブラリー(CLONTECH、カリフォルニア、Palo Alto在)も又、ゲノムＤＮＡウォーキングに利用することができる(CLONTECH、カリフォルニア、Palo Alto在)。この方法は、ライブラリーをスクリーニングする必要性を回避するものであり、イントロン／エキソン接合部を発見するのに有用である。
【０１０９】
同定された遺伝子の配列を、標準的技術を利用して、それらの遺伝子を遺伝子マップ(例えば、マウス[Copeland及びJenkins, 1991, (14)]及びヒト遺伝子マップ[Cohen等、1993, (15)])上に配置するために利用することができる。かかるマッピング情報は、例えば、公知の遺伝性乳癌傾向がマップされる遺伝子領域の近くにマップされる遺伝子を同定することによって、ヒトの病気に対する遺伝子の重要性に関する情報を生じうる。
【０１１０】
ポリヌクレオチド変異体及び同族体又はスプライス変異体の同定
上記の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの変異体及び同族体も又、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。典型的には、同族体「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド配列は、当分野で公知のように、候補のポリヌクレオチドの、公知の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドへの、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより同定されうる。例えば、次の洗浄条件：２×ＳＳＣ(０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム(ｐＨ７．０)、０．１％ ＳＤＳ、室温で、各３０分ずつ、２回の洗浄；その後の２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０ＥＣ一回、３０分；その後の、２×ＳＳＣ、室温で、各１０分ずつ、２回の洗浄)を使用して、最大で約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む相同性配列を同定することができる。一層好ましくは、相同性ポリヌクレオチド鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチを含み、尚一層好ましくは、５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【０１１１】
ここに開示した「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの同族体種は又、適当なプローブ又はプローブを作成して、マウス、サル、又は酵母などの他の種からのｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えば、ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。二本鎖ＤＮＡのＴmは、相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃低下するということは周知である[Bonner等、1973, (16)]。それ故、ヒト「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド又は他の種の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの変異体は、推定の相同性「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドをSEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１又はこれらの相補鎖の配列の一つのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて試験ハイブリッドを形成することによって同定することができる。この試験ハイブリッドの融点を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融点と比較して、試験ハイブリッド内の塩基対ミスマッチの数又はパーセントを計算する。
【０１１２】
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も又、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は、当分野で周知であって理解されており、例えば、Sambrook等、(6)に開示されている。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組合せを、研究中のハイブリッドの計算されたＴmより約１２〜２０℃低いものを選択すべきである。SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１の配列の一つ又はその相補鎖のヌクレオチド配列を有する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドと、それらのヌクレオチド配列の一つと少なくとも約５０％好ましくは約７５、９０、９６若しくは９８％同一であるポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴmは、例えば、下記の方程式[Bolton及びMcCarthy, 1962, (17)]を利用して計算することができる：
Ｔm = 81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(G+C%)-0.63(ホルムアミド%)-600/l)
(式中、ｌ＝塩基対中のハイブリッドの長さ)
【０１１３】
ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、６５℃で、４×ＳＳＣ、又は２８℃で、５０％ ホルムアミド、４×ＳＳＣ、又は６５℃で、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む。高度にストリンジェントな洗浄条件は、例えば、６５℃で、０．２×ＳＳＣを含む。
【０１１４】
同定された遺伝子の生物学的機能は、妥当なイン・ビボ及びイン・ビトロシステムを利用することによって、一層直接的に評価することができる。イン・ビボシステムは、自然に乳癌疾病素質を示す動物又はかかる徴候を示すように遺伝子工学処理した動物{発癌遺伝子過剰発現(例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｒａｓ、ｒａｆ、又はＥＧＦＲ)悪性新生物形成マウスを含む}の系を含むことができるが、これらに限られない。
【０１１５】
同じｐｒｅ ｍＲＮＡにコードされる同じゲノム領域に由来するスプライス変異体を、相同性検索に関して上記したハイブリダイゼーション条件によって同定することができる。同じｐｒｅ転写物のスプライス変異体によりコードされる変異体タンパク質の特異的性質は、異なり、開示したようにアッセイすることもできる。SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１の配列の一つ又はその相補鎖のヌクレオチド配列を有する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、それ故、全配列の部分において異なっている。スプライシング事象の予測及びｐｒｅ ｍＲＮＡ中の利用されるアクセプター及びドナー部位の同定は、コンピューター(例えば、ソフトウェアパッケージGRAIL又はGenomeSCAN)によって行なうことができ、当業者によりＰＣＲ法によって確認することができる。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列である。一度細胞に導入されると、相補的なヌクレオチドは、その細胞により生成された天然の配列と結合して複合体を形成し、転写又は翻訳をブロックする。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチド長であるが、少なくとも７、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチド長以上であってよい。一層長い配列も、利用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物にて与えることができ、上記のような細胞に導入して、該細胞中の「乳癌遺伝子」遺伝子産物のレベルを変えることができる。
【０１１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸(ＰＮＡ；米国特許第５，７１４，３３１号に記載)、ロックされた核酸(ＬＮＡ；ＷＯ９９／１２８２６に記載)、又はそれらの組合せであってよい。オリゴヌクレオチドは、手作業でも、自動化シンセサイザーによってでも、一つのヌクレオチドの５’末端に他のヌクレオチドの３’末端を、非ホスホジエステルヌクレオチド間結合例えばアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセタミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、及びホスフェートトリエステルによって、共有結合させることにより合成することができる[Brown, 1944, (55); Sonveaux, 1994, (56)及びUhlmann等、1990, (57)]。
【０１１８】
「乳癌遺伝子」発現の調節は、「乳癌遺伝子」の対照５’又は調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインすることにより得ることができる。転写開始部位例えば位置１０と開始部位から＋１０の間に由来するオリゴヌクレオチドは、好適である。同様に、阻害は、「三重らせん」塩基対形成の方法論を利用して達成することができる。三重らせん対形成は、二重らせんの、ポリメラーゼ、転写因子、又はシャペロンの結合に十分に開く能力の阻害を引き起こすので有用である。三重らせんＤＮＡを利用する治療の進歩は、文献に記載されている[Gee等、1994, (58)]。アンチセンスオリゴヌクレオチドは又、ｍＲＮＡの翻訳を、転写物のリボソームへの結合を防ぐことによってブロックするようにデザインすることもできる。
【０１１９】
正確な相補性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの相補的配列との間の上首尾の複合体形成には必要でない。例えば、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドに正確に相補的である隣接するヌクレオチドの２、３、４又は５以上のストレッチ(隣接する「乳癌遺伝子」ヌクレオチドに対して相補的でない隣接するヌクレオチドにより分離されている)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡに対する十分なターゲティング特異性を与えることができる。好ましくは、相補的な隣接するヌクレオチドの各ストレッチは、少なくとも４、５、６、７又は８以上のヌクレオチド長である。非相補的インタービーニング配列は、好ましくは、１、２、３又は４ヌクレオチド長である。当業者は、容易に、アンチセンス対の計算された融点を利用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド配列との間のミスマッチの程度を決定することができる。
【０１２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力に影響を与えずに改変することができる。これらの改変は、アンチセンス分子の内部であってもよいし、一端又は両端であってもよい。例えば、ヌクレオチド間のリン酸結合は、コレステリル又はジアミン部分を、アミノ基と末端リボソームとの間の炭素残基数を変えて、付加することによって改変することができる。改変した塩基及び／又は糖(例えば、リボースの代りのアラビノース)又は３’、５’置換されたオリゴヌクレオチド(３’水酸基又は５’リン酸基が置換されている)も又、改変アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて利用することができる。これらの改変オリゴヌクレオチドは、当分野で周知の方法によって製造することができる[Agrawal等、1992, (59); Uhlmann等、1987, (57)及びUhlmann等、2000 (60)]。
【０１２１】
リボザイム
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡ分子である[Cech, 1987, (61); Cech, 1990, (62)及びCouture及びStinchcomb, 1996, (63)]。リボザイムを利用して、当分野で周知のように、ＲＮＡ配列を開裂させることにより、遺伝子機能を阻害することができる(例えば、Haseloff等、米国特許第５，６４１，６７３号)。リボザイムの作用の機構は、リボザイム分子の、相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的なハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレアーゼ的開裂を含んでいる。実施例は、特異的且つ効率的に、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレアーゼ的開裂を触媒する遺伝子工学的処理されたハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子を含んでいる。
【０１２２】
「乳癌遺伝子」の転写された配列は、「乳癌遺伝子」ゲノム遺伝子座から転写されたｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを生成するために利用することができる。他のＲＮＡ分子を、高度に配列特異的様式でトランスに開裂することのできるリボザイムをデザインして構築する方法は、開発されており、当分野で記載されている[Haseloff等、1988, (64)]。例えば、リボザイムの開裂活性は、別の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム内に遺伝子工学的に工作することによって、特異的ＲＮＡに対して標的を定めることができる。このハイブリダイゼーション領域は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含み、それ故、標的と特異的にハイブリダイズする[例えば、Gerlach等、EP 0 321201参照]。
【０１２３】
「乳癌遺伝子」ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム開裂部位は、標的分子を、次の配列を含むリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定されうる：ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣ。一度同定されたならば、開裂部位を含む標的ＲＮＡの両域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、標的を活動不能にすることのできる二次構造的特徴について評価することができる。候補の「乳癌遺伝子」ＲＮＡ標的の適性も又、ハイブリダイゼーションへのアクセシビリティーを相補的オリゴヌクレオチドによりリボヌクレアーゼ防護アッセイを利用して試験することにより評価することができる。一層長い相補的配列を利用して、ハイブリダイゼーション配列の標的への親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズして開裂する領域は、標的ＲＮＡへの相補的領域によるハイブリダイズに際してリボザイムの触媒領域が標的を開裂することができるように、一体的に関連しうる。
【０１２４】
リボザイムは、ＤＮＡ構築物の部分として細胞に導入することができる。機械的方法例えばマイクロインジェクション、リポソーム媒介のトランスフェクション、エレクトロポレーション、又はリン酸カルシウム沈殿法を利用して、リボザイム含有ＤＮＡ構築物を、「乳癌遺伝子」発現を減少させることを指向する細胞に導入することができる。或は、細胞が安定にＤＮＡ構築物を維持することが望まれるならば、当分野で公知のように、該構築物を、プラスミドにて供給して別個のエレメントとして維持し又は細胞ゲノム中に組み込むことができる。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、リボザイムの細胞内での転写を制御するための、転写調節エレメント例えばプロモーターエレメント、エンハンサー又はＵＡＳエレメント、及び転写終結シグナルを含むことができる。
【０１２５】
Haseloff等、米国特許第５，６４１，６７３号で教示されたように、リボザイムは、その発現が、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答して起きるように遺伝子工学処理することができる。リボザイムは又、調節の更なるレベルを与えるように遺伝子工学処理して、ｍＲＮＡの破壊が、リボザイムと標的遺伝子の両方が細胞に含まれた場合にのみ起きるようにすることができる。
【０１２６】
ポリペプチド
この発明による「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１から選択するポリペプチド又はSEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチドの何れかによりコードされるポリペプチド又はその誘導体、断片、類似体及び同族体を含む。それ故、この発明の「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、タンパク質、完全長又は融合タンパク質(「乳癌遺伝子」ポリペプチドの全部又は一部を含む)であってよい。
【０１２７】
タンパク質の精製
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」発現構築物をトランスフェクトされた宿主細胞を含む、応答するタンパク質を発現する任意の細胞から精製することができる。精製された「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、細胞中で通常「乳癌遺伝子」ポリペプチドと会合している他の化合物例えばある種のタンパク質、炭水化物、又は脂質から、当分野で周知の方法を利用して、分離されている。かかる方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び調製用ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限られない。精製「乳癌遺伝子」ポリペプチド調製物は、少なくとも純度８０％であり；好ましくは、これらの調製物は、純度９０％、９５％、又は９９％である。これらの調製物の純度は、当分野で公知の任意の手段例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価することができる。
【０１２８】
ポリペプチドの獲得
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、例えば、ヒトの細胞からの精製により、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの発現により、又は直接的化学合成によって得ることができる。
【０１２９】
生物学的に活性な変異体
生物学的に活性な(即ち、「乳癌遺伝子」活性を維持している)「乳癌遺伝子」ポリペプチド変異体も又、「乳癌遺伝子」ポリペプチドとみなすことができる。好ましくは、天然又は非天然の「乳癌遺伝子」ポリペプチド変異体は、SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリペプチド又はSEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチドの何れかによりコードされるポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の何れかと、少なくとも約６０、６５又は７０％、好ましくは約７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６又は９８％同一であるアミノ酸配列を有する。推定の「乳癌遺伝子」ポリペプチド変異体とSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリペプチド又はSEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチドの何れかによりコードされるポリペプチド又はその断片との間の同一性パーセントは、慣用の方法によって測定される[例えば、Altschul等、1986, (19)及びHenikoff及びHenikoff, 1992, (20)参照]。簡単にいえば、２つのアミノ酸配列を、整列させて、ギャップオープニングペナルティー１０、ギャップエキステンションペナルティー１、及びHenikoff及びHenikoff, 1992 (20)の「BLOSUM 62」scoring matrixを利用して、アラインメントスコアを最大にする。
【０１３０】
当業者は、２つのアミノ酸配列を整列させるために利用できる多くの確立されたアルゴリズムがあることを認める。Pearson及びLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、ここに開示したアミノ酸配列と推定の変異体のアミノ酸配列との同一性レベルを調べるための適当なタンパク質アラインメント法である[Pearson及びLipman, 1988, (21), 及びPearson, 1990, (22)]。簡単にいえば、FASTAは、先ず、問合せの配列(例えば、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１)と、最高密度の同一性(ｋｔｕｐ値が１)又は同一性の対(ｋｔｕｐ＝２)を有する試験配列に共有される領域を同定することにより配列類似性を特性決定する(保存的アミノ酸置換、挿入、又は欠失を考慮しない)。最高密度の同一性を有する１０の領域を、次いで、アミノ酸置換マトリクスを利用してすべての対合したアミノ酸の類似性を比較することによって、再採点し、それらの領域の末端を「トリム」して、最高スコアに寄与する残基のみを含むようにする。「カットオフ」値(配列の長さｋｔｕｐ値に基づき予め決めた式により計算)より大きいスコアを有する幾つかの領域があるならば、トリムされた最初の領域を試験して、それらの領域を結合して、ギャップを有する近似的アラインメントを形成することができるかどうかを測定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコア領域を、改変Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム[Needleman及びWunsch, 1970, (23), 及びSellers, 1974, (24)](アミノ酸の挿入及び欠失を許す)を利用して整列させる。FASTA分析に好適なパラメーターは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップエクステンションペナルティー＝１、及び置換マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。これらのパラメーターは、スコアリングマトリクスファイル(「ＳＭＡＴＲＩＸ」)を改変することによって(Pearson,(22)の補遺２に説明されている)、ＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【０１３１】
ＦＡＳＴＡは、上記の比を利用して核酸分子の配列同一性を決定するためにも利用することができる。ヌクレオチド配列の比較のためには、ｋｔｕｐ値は、１〜６(好ましくは３〜６)に及んでよく、最も好ましくは３であってよい(他のパラメーターは、デフォルト値をセット)。
【０１３２】
同一性パーセントの変化は、例えば、アミノ酸の置換、挿入又は欠失のためでありうる。アミノ酸置換は、アミノ酸の置き換えとして定義される。それらは、置換されたアミノ酸が、類似の構造的及び／又は化学的特性を有する場合には、性質において保存的である。保存的置換の例は、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、又はスレオニンのセリンによる置換である。
【０１３３】
アミノ酸の挿入及び欠失は、アミノ酸配列に加えられる変化又は該配列内における変化である。それらは、典型的には、約１〜５アミノ酸の範囲内にある。どのアミノ酸残基が「乳癌遺伝子」ポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を破壊せずに、置換、挿入又は欠失させることができるかの決定についての手引きは、当分野で周知のコンピュータープログラム(例えば、ＤＡＮＳＴＡＲソフトウェア)を利用して見出すことができる。アミノ酸変化が、生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチドを生じるかどうかは、例えば、下記の特定の実施例に記載したように、「乳癌遺伝子」活性について評価することによって、容易に決定することができる。一層大きい挿入又は欠失も又、選択的スプライシングによって引き起こされうる。タンパク質ドメインは、そのタンパク質の主要な活性を変えることなく、挿入又は欠失されうる。
【０１３４】
融合タンパク質
融合タンパク質は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのアミノ酸配列に対する抗体の生成及び様々なアッセイ系における利用のために有用である。例えば、融合タンパク質を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの部分と相互作用するタンパク質を同定することができる。タンパク質アフィニティークロマトグラフィー又はタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーベースのアッセイ例えば酵母のツーハイブリッド系又はファージディスプレー系を、この目的のために利用することができる。かかる方法は、当分野で周知であり、薬物スクリーニングとして利用することもできる。
【０１３５】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合で互いに融合された２つのポリペプチドセグメントを含む。第一のポリペプチドセグメントは、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１の任意のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列又は、上記したもののような生物学的に活性な変異体の少なくとも２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００又は７５０の隣接するアミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントは又、完全長の「乳癌遺伝子」を含むこともできる。
【０１３６】
第二のポリペプチドセグメントは、完全長のタンパク質又はタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の構築において通常利用されるタンパク質には、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、自己蛍光タンパク質(ブルー蛍光タンパク質、ＢＦＰを含む)、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)が含まれる。加えて、ヒスチジン(Ｈｉｓ)タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン(Ｔｒｘ)タグを含むエピトープタグが、融合タンパク質構築に利用される。他の融合タンパク質構築は、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ ＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物及び単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)ＢＰ１６タンパク質融合物を含むことができる。融合タンパク質は又、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを開裂して異質部分から精製することができるように、「乳癌遺伝子」ポリペプチドコード配列と異質タンパク質配列との間に位置した開裂部位を含むように工作されうる。
【０１３７】
融合タンパク質は、当分野で公知のように、化学合成することができる。好ましくは、融合タンパク質は、２つのポリペプチドセグメントを共有結合することにより又は分子生物学の分野における標準的手順によって生成される。組換えＤＮＡ法を利用して、融合タンパク質を、例えば、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド配列の何れかから選択するコード配列を、適当なリーディングフレーム内で、第二のポリペプチドをコードするヌクレオチドと共に含むＤＮＡ構築物を作成し、当分野で公知のように、該ＤＮＡ構築物を宿主細胞中で発現させることによって製造することができる。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、Promega Corporation (ウィスコンシン、Madison在)、Stratagene（カリフォルニア、La Jolla在)、CLONTECH (カリフォルニア、Mountain View在)、Santa Cruz Biotechnology (カリフォルニア、Santa Cruz在)、MBL International Corporation (MIC; マサチューセッツ、Watertown在)、及びQuantum Biotechnologies (カナダ国、Montreal在；1-888-DNA-KITS)などの会社から販売されている。
【０１３８】
種同族体の同定
マウス、サル、又は酵母などの他の種からのｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの同族体をコードするｃＤＮＡを同定して、当分野で公知のｃＤＮＡを発現させるための適当なプローブ又はプライマーを作成するために、ヒトの「乳癌遺伝子」ポリペプチドの種同族体を、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド(下記)を利用して得ることができる。
【０１３９】
ポリヌクレオチドの発現
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを発現させるために、このポリヌクレオチドを、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列及び適当な転写及び翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、イン・ビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びイン・ビボの遺伝子組換えを含む。かかる技術は、例えば、Sambrook等、(6)及びAusubel等、(7)に記載されている。
【０１４０】
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を含有させて、発現させることができる。これらには、微生物例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフォームされた細菌；酵母発現ベクターでトランスフォームされた酵母；ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ)又は細菌発現ベクター(例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド)でトランスフォームした植物細胞系、又は動物細胞系が含まれるが、これらに限られない。
【０１４１】
制御用エレメント又は調節配列は、ベクターのエンハンサー領域、プロモーター領域、５’及び３’非翻訳領域であり、これらは、転写及び翻訳を行なう宿主の細胞性タンパク質と相互作用する。かかるエレメントは、それらの強さ及び特異性を変えることができる。利用するベクター系及び宿主に依って、任意の数の適当な転写及び翻訳用エレメント(構成的及び誘導性プロモーターを含む)を利用することができる。例えば、細菌の系でクローニングする場合、誘導性プロモーター例えばBLUESCRIPTファージミド(Stratagene, カリフォルニア、La Jolla在)又はｐSPORT1(Life Technologies)のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどを利用することができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを、昆虫細胞において利用することができる。植物細胞ゲノム(例えば、熱ショック、RUBISCO、及び貯蔵タンパク質遺伝子)又は植物ウイルス(例えば、ウイルスプロモーター又はリーダー配列)に由来するプロモーター又はエンハンサーを、ベクター中にクローン化することができる。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の多数のコピーを含む細胞系統を生成することが必要であるならば、ＳＶ４０又はＥＢＶに基づくベクターを、適当な選択マーカーと共に利用することができる。
【０１４２】
細菌及び酵母発現系
細菌系において、発現ベクターの数は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドについて意図される用途に応じて選択することができる。例えば、多量の「乳癌遺伝子」ポリペプチドが、抗体の誘導のために必要とされる場合には、容易に精製することのできる融合タンパク質の高レベルの発現を指示するベクターを利用することができる。かかるベクターには、多機能性の大腸菌用クローニング及び発現用ベクター例えばBLUESCRIPT(Stratagene)が含まれるが、これに限られない。BLUESCRIPTベクターにおいては、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列は、ベクターに、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔ及びその後の７残基の配列とフレームを合わせて連結して、ハイブリッドタンパク質が生成されるようにすることができる。ｐＩＮベクター[Van Heeke及びSchuster, (113)]又はｐＧＥＸベクター(Promega, ウィスコンシン、Madison在)も、外来ポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として発現させるために利用することができる。一般に、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、溶解させた細胞から、グルタチオンアガロースビーズに吸着させてから遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することができる。かかる系で生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン又はＸａプロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインして、クローン化した関心あるポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に遊離させることができるようにすることができる。
【０１４３】
酵母サッカロミセス・セレビシエにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性プロモーターを含む多くのベクターを利用することができる。総説としては、Ausubel等、(7)及びGrant等、(114)を参照されたい。
【０１４４】
植物及び昆虫発現系
植物発現ベクターを用いる場合、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターの何れかによって駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、又はＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて利用することができる[Takamatsu, 1987, (25)]。或は、植物プロモーター例えば、RUBISCOの小型サブユニット及び熱ショックプロモーターを利用することができる[Coruzzi等、1984, (26); Broglie等、1984, (27); Winter等、1991, (28)]。これらの構築物は、直接的ＤＮＡトランスフォーメーションにより又は病原体媒介のトランスフェクションによって、植物細胞に導入することができる。かかる技術は、多くの一般に入手可能な総説中に記載されている。
【０１４５】
昆虫系も又、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現させるために利用することができる。例えば、一つのかかる系の内で、オートグラファ・カリフォーニカ・ニュークリア・ポリヘドロシスウイルス(ＡｃＮＰＶ)は、スポドプテラ・フルギペルダ細胞又はトリコプラシア・ラーバエにおいて外来遺伝子を発現させるためのベクターとして利用される。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列は、このウイルスの必須でない領域例えばポリヘドリン遺伝子中にクローン化して、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドの上首尾の挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性化して、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを生成する。次いで、これらの組換えウイルスを利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現することのできるＳ．フルギペルダ細胞又はトリコプラシア・ラーバエに感染させることができる[Engelhard等、1994, (29)]。
【０１４６】
哺乳動物発現系
多くのウイルスベースの発現系を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを、哺乳動物宿主細胞において発現させることができる。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして利用する場合には、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を、アデノウイルスの転写／翻訳複合体中に連結することができる(該複合体は、後期プロモーター及び３つに分かれたリーダー配列を含む)。このウイルスゲノムの必須でないＥ１又はＥ３領域内の挿入を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを感染した宿主細胞において発現することのできる生存力のあるウイルスを得ることができる[Logan及びShenk, 1984, (30)]。所望であれば、転写エンハンサー例えばラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)エンハンサーを利用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることができる。
【０１４７】
ヒトの人工染色体(ＨＡＣ)も又、プラスミドに含有させて発現させることのできるものより一層大きいＤＮＡ断片を送達するために利用することができる。６〜１０ＭのＨＡＣを構築して、慣用の送達方法(例えば、リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、又は小胞)によって、細胞に送達することができる。
【０１４８】
特異的な開始シグナルは又、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列の一層効率的な翻訳を達成するために利用することもできる。かかるシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列が含まれる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、及びその上流配列が、適当な発現ベクターに挿入される場合には、更なる転写又は翻訳の制御用のシグナルは、必要とされないであろう。しかしながら、コード配列又はその断片のみが挿入される場合には、外因性の転写制御シグナル(ＡＴＧ開始コドンを含む)が与えられるべきである。この開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするように、正しいリーディングフレームで存在すべきである。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な起源のものであってよく、天然物及び合成物の何れであってもよい。この発現の効率は、利用する特定の細胞の系に適したエンハンサーを含有させることにより増進させることができる[Scharf等、1994, (31)]。
【０１４９】
宿主細胞
宿主細胞株は、所望の様式で、挿入された配列の発現を調節し、又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドのプロセッシングを行なう能力について選択することができる。かかるポリペプチドの調節には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が含まれるが、これらに限られない。このポリペプチドの「プレプロ」型を開裂させる翻訳後プロセッシングも又、正しい挿入、折り畳み及び／又は機能を容易にするために利用することができる。特定の細胞性機械及び翻訳後活性のために特徴的な機構を有する異なる宿主細胞(例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３及びＷＩ３８)は、American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, バージニア、20110-2209在)から入手可能であり、外来タンパク質の正しい改変及びプロセッシングを確実にするために選択することができる。
【０１５０】
安定な発現は、組換えタンパク質の長期の、高収率の生産に好適である。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを安定に発現する細胞系統を、ウイルス性複製起点及び／又は内因性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を同一ベクター上に又は別々のベクター上に含みうるベクターを利用してトランスフォームすることができる。このベクターの導入後に、細胞を、富化培地で１２日間にわたって成長させてから、選択培地に切り替えることができる。この選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在は、導入された「乳癌遺伝子」配列を上首尾に発現する細胞の成長及び回収を可能にする。安定にトランスフォームされた細胞の耐性クローンを、その細胞型に適した組織培養技術を利用して増殖させることができる[Freshney等、1986, (32)]。
【０１５１】
任意の数の選択システムを利用して、トランスフォームされた細胞系統を回収することができる。これらには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ[Wigler等、1977, (33)]及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ[Lowy等、1980, (34)]遺伝子(これらは、それぞれ、ｔｋ-又はａｐｒｔ-細胞で用いることができる)が含まれるが、これらに限られない。代謝拮抗物質、抗生物質、又は除草剤に対する耐性も又、選択の基礎として利用することができる。例えば、ｄｈｆｒは、メトトレキセートに対する耐性を与え[Wigler等、1980, (35)]、ｎｐｔは、アミノグリコシド、ネオマイシン及びＧ４１８に対する耐性を与え[Colbere-Garapin等、1981, (36)]、そしてａｌｓ及びｐａｔは、クロルスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ与える。更なる選択遺伝子が、記載されている。例えば、ｔｒｐＢは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にし、又はｈｉｓＤは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする[Hartman及びMulligan, 1988, (37)]。可視的マーカー例えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質のＧＵＳ、並びにルシフェラーゼとその基質のルシフェリンを利用して、トランスフォーマントを同定し、特異的ベクターの発現に帰することのできる一過性の又は安定なタンパク質発現の量を定量することができる[Rhodes等、1995, (38)]。
【０１５２】
発現及び遺伝子産物の検出
マーカー遺伝子の発現の存在は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドも存在することを示唆するが、その存在及び発現は、確認する必要がありうる。例えば、もし「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入されたならば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を含むトランスフォームされた細胞は、マーカー遺伝子機能のないことにより同定することができる。或は、マーカー遺伝子は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列と直列に、単一プロモーターの制御下に配置することができる。誘導又は選択に応答してのマーカー遺伝子の発現は、通常、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの発現を示す。
【０１５３】
或は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを含み及び該ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な手順によって同定することができる。これらの手順は、ポリヌクレオチド又はタンパク質の検出及び／又は定量のための、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ技術(膜、溶液又はチップベースの技術を含む)を包含するが、これらに限られない。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプローブ若しくは断片を利用する増幅により検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイには、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを含むトランスフォーマントを検出するための「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列から選択するオリゴヌクレオチドの利用が含まれる。
【０１５４】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドの発現を検出して測定するための、該ポリペプチドに特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体の利用を含む、様々なプロトコールが、当分野では公知である。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、及び蛍光活性化細胞ソーティング(ＦＡＣＳ)が含まれる。「乳癌遺伝子」ポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープと反応性のモノクローナル抗体を利用するツーサイトモノクローナルベースのイムノアッセイを利用することができ、又は競争結合アッセイを利用することができる。これらの及び他のアッセイは、Hampton等、(39)及びMaddox等、(40)に記載されている。
【０１５５】
広範な標識及び結合体化技術が、当業者には公知であり、様々な核酸及びアミノ酸のアッセイにおいて利用することができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブを製造する手段には、オリゴ標識、ニック翻訳、末端標識、又はＰＣＲ増幅(標識されたヌクレオチド使用)が含まれる。或は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためにベクター中にクローン化することができる。かかるベクターは、当分野で公知であり、市販されていて、ＲＮＡプローブを、標識したヌクレオチド及び適当なＲＮＡポリメラーゼ例えばＴ７、Ｔ３又はＳＰ６の添加によりイン・ビトロで合成するために利用することができる。これらの手順は、様々な市販のキット(Amersham Pharmacia Biotech, Promega,及びUS Biochemical)を利用して行なうことができる。検出を容易にするために利用することのできる適当なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素、及び蛍光剤、化学発光剤、又は色素生成剤、並びに基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが含まれる。
【０１５６】
ポリペプチドの発現及び精製
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列でトランスフォームされた宿主細胞を、タンパク質の発現及び回収に適した条件下で培養することができる。トランスフォームされた細胞により生成されたポリペプチドは、配列及び／又は用いたベクターに依って、分泌され得又は細胞内に貯蔵され得る。当業者には理解されるであろうが、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、可溶性「乳癌遺伝子」ポリペプチドの、原核細胞又は真核細胞膜を通過しての分泌を指示し又は膜結合した「乳癌遺伝子」ポリペプチドの膜挿入を指示するシグナル配列を含むようにデザインすることができる。
【０１５７】
上記のように、他の構築物を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に繋ぐことができる。かかる精製促進ドメインには、固定化金属上での精製を可能にする金属キレートペプチド例えばヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティー精製系(Immunex Corp., ワシントン、Seattle在)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限られない。開裂可能なリンカー配列例えば因子Ｘａ又はエンテロキナーゼに特異的な同配列(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego在)の、精製用ドメインと「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの間への含有を利用して、精製を容易にすることもできる。一つのかかる発現ベクターは、「乳癌遺伝子」ポリペプチド及び６つのヒスチジン残基をチオレドキシン又はエンテロキナーゼ開裂部位に先行して含む融合タンパク質の発現を与える。これらのヒスチジン残基は、ＩＭＡＣ(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー[Porath等、1992, (41)])による精製を容易にし、他方、エンテロキナーゼ開裂部位は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの融合タンパク質からの精製のための手段を与える。融合タンパク質を含むベクターは、Kroll等、(42)に開示されている。
【０１５８】
化学合成
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を、当分野で周知の化学的方法を利用して、その全部又は部分を合成することができる(Caruthers等、(43)及びHorn等、(44)参照)。或は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドそれ自身を、アミノ酸配列を合成するための化学的方法を利用して、例えば、固相技術[Merrifield, 1963, (45)及びRoberge等、1995, (46)]を利用する直接的ペプチド合成などによって生成することができる。タンパク質合成を、手動技術を利用して又はオートメーションにより行なうことができる。自動化された合成は、例えば、Applied Biosystems 431A ペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer)を利用して達成することができる。随意に、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの断片を、別々に合成して、化学的方法を利用して結合させて完全長の分子を生成することができる。
【０１５９】
新たに合成したペプチドを、次いで、調製用の高性能液体クロマトグラフィーによって精製することができる[Creighton, 1983, (47)]。合成の「乳癌遺伝子」ポリペプチドの組成を、アミノ酸分析又は配列決定(例えば、エドマン分解法；Creighton, (47)参照)によって確認することができる。加えて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を、直接的合成において変えることができ及び／又は化学的方法を利用して他のタンパク質からの配列と結合して変異体ポリペプチド又は融合タンパク質を生成することができる。
【０１６０】
変化したポリペプチドの生産
当業者には理解されるであろうが、非天然コドンを有する「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成することは、有利でありうる。例えば、特定の原核又は真核生物宿主に好まれるコドンを選択して、タンパク質の発現速度を増大させ、又は望ましい特性を有する(例えば、半減期が、天然の配列から生成された転写物よりも長い)ＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０１６１】
ここに開示したヌクレオチド配列は、様々な理由のために、当分野で一般に知られた方法を利用することにより、工作して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を変えることができる（ポリペプチド又はｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセッシング及び／又は発現を改変する変化を含むが、これらに限られない）。ランダムな断片化並びに遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる再構築によるＤＮＡのシャッフリングを利用して、ヌクレオチド配列を工作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発法を利用して、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先度を変え、スプライス変異体を生成し、突然変異を導入することなどができる。
【０１６２】
予測的、診断的及び予後予測的アッセイ
本発明は、患者が、悪性新生物(特に、乳癌)の発生の危険にあるかどうかを、悪性新生物(特に、乳癌)についての、開示したバイオマーカー即ち、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド配列及び／又はそれによりコードされるポリペプチドマーカー又はSEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリペプチド配列の何れかを含むポリペプチドマーカーの何れかを含む開示したポリヌクレオチドマーカーを検出することにより測定するための、組成物、方法及びキットを提供する。
【０１６３】
臨床的応用において、生物学的試料を、ここで同定したバイオマーカーの存在及び／又は非存在についてスクリーニングすることができる。かかる試料は、例えば、針生検コア、外科的切除試料、又は血清、乳頭吸引液及び尿のような体液である。例えば、これらの方法は、生検を得ることを含み、それは、適宜、低温切片化により分画して、病気の細胞を全細胞集団の約８０％まで富化させる。ある具体例において、これらの試料から抽出されたポリヌクレオチドを、当分野で周知の技術を利用して増幅することができる。検出された選択したマーカーの発現レベルを、病気の又は健康な試料の統計的に有効な群と比較する。
【０１６４】
一具体例において、これらの組成物、方法及びキットは、患者が、開示したマーカーの異常なｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを有するかどうかを、ノーザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)、イン・シトゥーハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロットハイブリダイゼーション又は免疫組織化学などによって決定することを含む。この方法により、細胞を患者から得て、開示したバイオマーカーのレベル(タンパク質又はｍＲＮＡレベル)を測定して、健康な被験者におけるこれらのマーカーのレベルと比較する。バイオマーカーの異常なレベル(ポリペプチド又はｍＲＮＡレベル)が、悪性新生物例えば乳癌を示すことは、ありそうなことである。
【０１６５】
他の具体例において、これらの組成物、方法及びキットは、被験者が、該遺伝子又は該遺伝子座の異常なＤＮＡ含量を有するかどうかを、サザーンブロット分析、ドットブロット分析、蛍光分光法若しくは比色法、イン・シトゥーハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション又は定量的ＰＣＲなどにより測定することを含む。一般に、これらのアッセイは、代表的ゲノム領域からのプローブの使用法を含む。これらのプローブは、少なくとも該ゲノム領域又は該領域に相補的若しくは類似な配列の部分を含む。特に、該遺伝子又はゲノム領域の遺伝子内又は遺伝子間領域。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションにより標的領域に結合できる類似の機能のヌクレオチド配列(例えば、ＰＮＡ、モルホリノオリゴマー)からなってよい。一般に、該患者試料において変化しているゲノム領域を、冒されていない対照用試料(同じ又は異なる患者からの正常組織、周囲の冒されてない組織、末梢血)と比較し又は該変化を有さずそれ故内部対照として役立ちうる同じ試料のゲノム領域と比較する。好適具体例においては、同じ染色体上に位置する領域を利用する。或は、試料中の生殖体部領域及び／又は限られた変化する量の領域を利用する。一好適具体例において、ＤＮＡの含量、構造、組成又は改変は、別のゲノム領域内にあるものと比較される。特に好ましいのは、該試料のＤＮＡ含量を検出する方法であり、該方法において、標的領域の量は、増幅又は欠失により変化する。他の具体例において、標的領域は、該試料中の細胞に臨床面に関して影響を与え又は素因を与える多型(例えば、単一ヌクレオチドの多型又は突然変異)の存在につき分析される(診断的、予後予測的又は治療的価値がある)。好ましくは、配列変化の同定は、該臨床面を有する該試料の特徴的性質を生じるハプロタイプを規定するために利用される。
【０１６６】
一具体例において、悪性新生物(特に、乳癌)の予測、診断又は予後予測のためのこれらの組成物、方法及びキットは、下記：
(ａ)SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチドから選択するポリヌクレオチド；
(ｂ)表１ａ及び１ｂ又は４ａ及び４ｂのそれぞれの配列について特定されたのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする(ａ)で特定されたポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
(ｃ)SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリペプチドについて特定されたのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする遺伝コードの生成のために、配列が、(ａ)及び(ｂ)で特定されたポリヌクレオチドから離れているポリヌクレオチド
(ｄ)表１ａ及び１ｂ又は４ａ及び４ｂのそれぞれの配列について特定されたのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする(ａ)〜(ｃ)で特定されたポリヌクレオチド配列の特異的断片、誘導体又はアレル変異を表すポリヌクレオチド；
の、生物学的試料における検出により行われ、該検出は、(ａ)〜(ｄ)で特定された何れかのポリヌクレオチド又は類似のオリゴマーを生物学的試料のポリヌクレオチド物質にハイブリダイズさせ、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成して；該ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップを含む。
【０１６７】
他の具体例において、悪性新生物の予測、診断又は予後予測のための方法は、正に記載したように行われるが、但し、ハイブリダイゼーション前に、生物学的試料のポリヌクレオチド物質を増幅する。
【０１６８】
他の具体例において、悪性新生物特に乳癌の診断又は予後予測のための方法を、下記の検出により行なう：
(ａ)SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１のポリヌクレオチドから選択するポリヌクレオチド；
(ｂ)表１ａ及び１ｂ又は４ａ及び４ｂのそれぞれの配列について特定されたのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする(ａ)で特定されたポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
(ｃ)表１ａ及び１ｂ又は４ａ及び４ｂのそれぞれの配列について特定されたのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする遺伝コードの生成のために、配列が、(ａ)及び(ｂ)で特定されたポリヌクレオチドから離れているポリヌクレオチド；
(ｄ)表１ａ及び１ｂ又は４ａ及び４ｂのそれぞれの配列について特定されたのと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする(ａ)〜(ｃ)で特定されたポリヌクレオチド配列の特異的断片、誘導体又はアレル変異を表すポリヌクレオチド；
(ｅ)(ａ)〜(ｄ)で特定されたポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド
(ｆ)SEQ ID NO:１６６〜３３０及び４９２〜５１１の任意のポリペプチドを含むポリペプチド
(ｇ)
生物学的試料を、(ａ)〜(ｄ)で特定されたポリヌクレオチド又は(ｅ)で特定されたポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させるステップを含む。
【０１６９】
１．ＤＮＡアレイ技術
一具体例において、本発明は又、ポリヌクレオチドプローブが、組織化されたアレイにＤＮＡチップ上に固定化されている方法をも提供する。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む様々な方法によって、固相支持体に結合させることができる。例えば、一枚のチップは、最大で４１０，０００オリゴヌクレオチドを保持することができる(GeneChip, Affymetrix)。本発明は、単一チップ当たりにポリヌクレオチドマーカーのアレイを提供することによって試験の信頼性を増大させるので、乳癌などの悪性新生物の利用可能な試験を超える重要な利点を提供する。
【０１７０】
この方法は、生物学的試料を得ること(該試料は、冒された人間の生検であってよく、適宜、病気の細胞を全細胞集団の約８０％まで富化させるように低温切片化によって分画される)及び血清又は尿、血清又は細胞含有液体(例えば、細針吸引液由来)などの体液の利用を含む。次いで、ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、増幅し、そしてＤＮＡチップを用いて分析して、マーカーポリヌクレオチド配列の存否を測定する。一具体例において、これらのポリヌクレオチドプローブは、基材上に、二次元のマトリクス又はアレイに配置される。ポリヌクレオチド試料は、標識することができ、次いで、これらのプローブとハイブリダイズされる。二本鎖形成したポリヌクレオチドは、プローブのポリペプチドに結合した標識された試料ポリヌクレオチドを含み、一度試料の未結合部分を荒い去ったならば、検出することができる。
【０１７１】
これらのプローブのポリヌクレオチドは、硝子、ニトロセルロースなどを含む基材上に配置することができる。これらのプローブは、共有結合により又は非特異的相互作用(例えば、疎水相互作用)によって、基材に結合することができる。試料のポリヌクレオチドは、放射性標識、蛍光体、発色団などを利用して標識することができる。アレイを構築する技術及びこれらのアレイの利用方法は、ＥＰ０ ７９９ ８９７；ＷＯ９７／２９２１２；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ０ ７８５ ２８０；ＷＯ９７／０２３５７；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；ＥＰ０ ７２８ ５２０；米国特許第５，５９９，６９５号；ＥＰ０ ７２１ ０１６；米国特許第５，５５６，７５２号；ＷＯ９５／２２０５８；及び米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。更に、アレイを利用して、遺伝子の差次的発現を調べることができ、そして遺伝子機能を測定することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のアレイを利用して、ポリヌクレオチド配列の何れかが、例えば、正常細胞と病気の細胞との間で、異なって発現されるかどうかを測定することができる。病気試料中の特定のメッセージの高発現(対応する正常試料中では認められないもの)は、乳癌特異的なタンパク質を示すことができる。
【０１７２】
従って、一面において、この発明は、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド配列に特異的なプローブ及びプライマーを提供する。
【０１７３】
一具体例において、この組成物、方法及びキットは、ポリヌクレオチドプローブを利用して、患者由来の組織中の悪性の又は乳癌細胞の存在を測定することを含む。特に、その方法は、下記：
１）少なくとも１２ヌクレオチド長の、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの、一層好ましくは２５ヌクレオチドの、最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列、及び最大でコード配列(SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド又はこれらに相補的な配列から選択するポリヌクレオチドのコード配列の一部に相補的)のすべて又は殆どすべてを含むポリヌクレオチドプローブを用意し；
２）組織試料を、悪性新生物を有する患者から得；
３）第二の組織試料を、悪性新生物を有しない患者から用意し；
４）ポリヌクレオチドプローブを、ストリンジェントな条件下で、上記の第一及び第二の組織試料の各々のＲＮＡと接触させ(例えば、ノーザンブロット又はイン・シトゥーハイブリダイゼーションアッセイ)；そして
５）(ａ)プローブの、第一の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量を、(ｂ)プローブの、第二の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較する
ことを含み；
第一の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量の、第二の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較しての、統計的に有意の差異は、第一の組織試料における、悪性新生物(特に、乳癌)を示す。
【０１７４】
２．データ分析方法
少なくとも一つの「乳癌遺伝子」の発現レベルの、参照用発現レベル（例えば、乳癌の病気の細胞におけるか又は正常な対応細胞における発現レベル）との比較は、好ましくは、コンピューターシステムを利用して行なう。一具体例において、発現レベルは、２つの細胞で得られ、これらの発現レベルの２つのセットは、比較のためにコンピューターシステムに導入される。好適具体例において、１セットの発現レベルが、コンピューターシステム中にに既に存在し又はコンピューターで読める形式の中に既に存在していてその後コンピューターシステムに入れられる値との比較のために、コンピューターシステムに入れられる。
【０１７５】
一具体例において、この発明は、この発明の遺伝子発現プロフィルデータの、又は病気の細胞における少なくとも一つの「乳癌遺伝子」の発現レベルに対応する値の、コンピューターで読める形式を提供する。これらの値は、実験例えばマイクロアレイ分析から得られたｍＲＮＡ発現レベルであってよい。これらの値は又、多くの細胞において多くの条件下で発現が一定である参照用遺伝子(例えば、ＧＡＰＤＨ)に対して標準化されたｍＲＮＡレベルであってもよい。他の具体例において、コンピューター中でのこれらの値は、異なる試料における標準化された又はされてないｍＲＮＡレベルの間の比又は差異である。
【０１７６】
遺伝子発現プロフィルデータは、表(例えば、エクセルの表)形式であってよい。このデータは、単独であってもよいし、一層大きいデータベース(例えば、他の発現プロフィルと比較する)の部分であってもよい。例えば、この発明の発現プロフィルデータは、公開されたデータベースの部分であってよい。コンピューターで読める形式は、一つのコンピューター中にあってよい。他の具体例において、この発明は、遺伝子発現プロフィルデータのコンピューターディスプレーを提供する。
【０１７７】
一具体例において、この発明は、第一の細胞例えば患者の細胞における少なくとも一つの「乳癌遺伝子」の発現レベルと第二の細胞におけるそれとの間の類似性を測定するための方法であって、第一の細胞における少なくとも一つの「乳癌遺伝子」の発現レベルを得ること及びこれらの値を、第二の細胞における少なくとも一つの「乳癌遺伝子」の発現レベルに対応する値を含む記録を含むデータベース、及びコンピューターに保存されたデータとの比較目的のための少なくとも一つの値の選択を受けることのできるプロセッサーインストラクション(例えば、ユーザーインターフェース)を含むコンピューターに入れることを含む当該方法を提供する。このコンピューターは、更に、比較データを線図若しくはチャート又は他の出力様式に変換する手段を含むことができる。
【０１７８】
他の具体例において、「乳癌遺伝子」の発現レベルを表す値は、一つより多くの細胞から得られた参照用発現レベルを有する一つ以上のデータベースを含むコンピューターシステムに入れられる。例えば、このコンピューターは、病気の細胞と正常細胞の発現データを含む。インストラクションがコンピューターに与えられ、そのコンピューターは、入れられたデータとコンピューター内のデータとを比較して、入れられたデータが、正常細胞のデータと病気の細胞のデータのどちらと一層類似しているかどうかを決定することができる。
【０１７９】
他の具体例において、コンピューターは、乳癌の異なるステージの患者の細胞における発現レベルの値を含み、そのコンピューターに入れられた発現データを保存してあるデータと比較することができ、そして入れられたものがコンピューター内の発現プロフィルのどれに最も類似しているかを示し、患者の乳癌のステージを決定するなどのための結果を生成する。
【０１８０】
更に別の具体例において、コンピューター中の参照用発現プロフィルは、一人以上の患者の乳癌細胞からの発現プロフィルであり、該細胞は、乳癌治療に用いられる薬物によりイン・ビボ又はイン・ビトロで治療されている。薬物によりイン・ビトロ又はイン・ビボで治療した細胞の発現データを入れる際に、コンピューターは、入れられたデータをコンピューター内のデータと比較して、コンピューターにインプットされた発現データが、薬物に応答性の患者の細胞のデータに一層類似しているか又は薬物に応答性でない患者の細胞のデータに一層類似しているかどうかを表示する結果を与えるように命令される。従って、これらの結果は、患者が該薬物による治療に応答することがありそうか又はありそうにないかを示している。
【０１８１】
一具体例において、この発明は、一つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現データを受けるための手段；該一つ又は複数の遺伝子の各々からの遺伝子発現データを共通の参照用フレームと比較する手段；及び比較の結果を提示する手段を含むシステムを提供する。このシステムは、更に、データをクラスター化する手段を含むことができる。
【０１８２】
他の具体例において、この発明は、遺伝子発現データを分析するためのコンピュータープログラムであって、(ｉ)複数の遺伝子についての遺伝子発現データをインプットとして受ける計算機コード及び(ｉｉ)該複数の遺伝子の各々からの該遺伝子発現データを共通の参照用フレームと比較する計算機コードを含む当該コンピュータープログラムを提供する。
【０１８３】
この発明は又、次のステップを実行するためのプログラムインストラクションを含む機械読取り可能な又はコンピューター読取り可能な媒体をも提供する：(ｉ)問合わせの細胞中の乳癌に特徴的な一つ以上の遺伝子の発現レベルに対応する複数の値を、一つ以上の参照用細胞の参照用発現又は発現プロフィルデータ及び細胞型の注釈を含む記録を含むデータベースと比較して；(ｉｉ)問合わせの細胞が、発現プロフィルの類似性に基づいて、どの細胞に最も類似しているかを示す。これらの参照用細胞は、異なるステージの乳癌患者からの細胞であってよい。これらの参照用細胞は又、特定の薬物治療(適宜、該薬物とイン・ビトロ又はイン・ビボでインキュベート)に応答する又はしない患者からの細胞であってもよい。
【０１８４】
これらの参照用細胞は又、幾つかの異なる治療に応答する又はしない患者からの細胞であってよく、コンピューターシステムは、患者に好適な治療を指示する。従って、この発明は、乳癌を有する患者に対する治療を選択する方法であって、該方法は：(ｉ)患者の病気の細胞の乳癌に特徴的な一つ以上の遺伝子の発現レベルを与え；(ｉｉ)それぞれ治療と関係する複数の参照用プロフィルを与え(患者の発現プロフィル及び各参照用プロフィルは、複数の値を有し、各値は、乳癌に特徴的な遺伝子の発現レベルを表す)；及び(ｉｉｉ)患者の発現プロフィルに最も類似している参照用プロフィルを選択することを含み、それにより、該患者に対する治療を選択する当該方法を提供する。好適具体例において、ステップ（ｉｉｉ）は、コンピューターにより実施する。最も類似している参照用プロフィルは、複数の比較値に、対応する発現データと関連する重み値を利用して重みを付けることによって選択することができる。
【０１８５】
２つの生物学的試料中のｍＲＮＡの相対的発生量は、動揺及びその重大さが測定された(即ち、発生量が、調べたｍＲＮＡの２つの起源で異なる)場合、又は動揺がなかった(即ち、相対的発生量が同じである)ときに、評点することができる。様々な具体例において、倍率が、少なくとも約２５％(一方の起源からのＲＮＡが他方の起源より一方の起源において、２５％以上豊富)、一層普通に約５０％、尚一層頻繁に約２(２倍豊富)、３(３倍豊富)、又は５(５倍豊富)の２つのＲＮＡの起源の間の差異は、動揺として評点される。動揺は、コンピューターによって、計算するために及び発現比較のために利用することができる。
【０１８６】
好ましくは、陽性又は陰性としての動揺の同定に加えて、動揺の等級を測定するのが有利である。これは、上記のように、差次的標識に用いた２つの蛍光体の放出の比を計算することにより、又は当業者には容易に明らかとなる類似の方法によって実施することができる。
【０１８７】
コンピューターで読める媒体は、更に、乳癌のステージの記述子又は乳癌の治療へのポインターを含むことができる。
【０１８８】
運用においては、本発明のシステムのコンテキストにおいて、遺伝子発現データを受ける手段、遺伝子発現データを比較する手段、提示する手段、標準化する手段、及びクラスター化する手段は、ここに記載のそれぞれの機能性(ハードウェア又はハードウェアとソフトウェアにおいて実行される)を有するプログラムされたコンピューター；ここで特異的に同定された操作を実施するプログラムされたコンピューターの論理回路又は他の要素(コンピュータープログラムにより指図される)；又はここに記載した特定の様式でコンピューターを機能させるコンピュータープログラムを表す実行可能な命令で符号化されたコンピューターメモリーを含むことができる。
【０１８９】
当業者は、本発明のシステム及び方法が、ＭＳ−ＤＯＳ又はマイクロソフトウィンドウズが作動するＩＢＭ互換性パーソナルコンピューターを含む様々なシステムに適用可能であることを理解するであろう。
【０１９０】
このコンピューターは、外部要素と結合された内部要素を有することができる。内部要素は、メインメモリーと内部連絡したプロセッサーエレメントを含むことができる。このコンピューターシステムは、２００ＭＨｚ以上のクロック速度で３２ＭＢ以上のメインメモリーのインテルペンティアム(登録商標)ベースのプロセッサーであってよい。外部要素は、大容量記憶装置含むことができ、これは、一つ以上のハードディスクであってよい(典型的には、プロセッサー及びメモリーと一緒にパッケージ化されている)。かかるハードディスクは、典型的には、１ＧＢ以上の記憶容量である。他の外部要素は、ユーザーインターフェースデバイスを含み、これは、入力装置と一緒にしたモニターであってよく、「マウス」又は他のグラフィック入力装置、及び／又はキーボードであってよい。印刷装置も又、このコンピューターに付けることができる。
【０１９１】
典型的には、このコンピューターシステムは又、ネットワークリンクと結合させることもでき、それは、他のローカルなコンピューターシステムへのリンクであるイーサネットの部分、リモートコンピューターシステム、又は広域のコミュニケーションネットワーク例えばインターネットであってよい。このネットワークリンクは、このコンピューターシステムがデータ及び処理タスクを他のコンピューターシステムと共有することを可能にする。
【０１９２】
このシステムの運転中にメモリーにロードされるのは、幾つかのソフトウェアコンポーネントであり、それらは、当分野で標準的なものと本発明のための特殊なものの両方である。これらのソフトウェアコンポーネントは、集合的に、この発明の方法に従って、コンピューターシステムを機能させる。これらのソフトウェアコンポーネントは、典型的には、大容量記憶装置に保存される。一つのソフトウェアコンポーネントは、オペレーティングシステムを表し、これは、コンピューターシステム及びそのネットワークへの連結の管理に責任を有している。このオペレーティングシステムは、例えば、マイクロソフトウィンドウズファミリーのもの例えばウィンドウズ９５、ウィンドウズ９８、又はウィンドウズＮＴであってよい。一つのソフトウェアコンポーネントは、共通の言語及び機能を表し、これらは、このシステム上に便利に存在して、この発明に特異的な方法を実行するプログラムを助ける。多くの高級又は低級コンピューター言語を利用して、この発明の分析方法をプログラムすることができる。命令は、実行時に翻訳するか又はコンパイルすることができる。好適な言語には、Ｃ／Ｃ＋＋、及びＪＡＶＡ(登録商標)が含まれる。最も好ましくは、この発明の方法を、方程式の記号エントリー及び使用すべきアルゴリズムを含む高レベルの処理の仕様を可能にし、それにより、ユーザーを、個々の方程式又はアルゴリズムを手続き的にプログラムする必要性から解放する数学ソフトウェアパッケージにてプログラムする。かかるパッケージには、Mathworks(マサチューセッツ、Natick在)から市販されている Matlab、Wolfram Research(イリノイ、Champaign在)の Mathematica、又はMath Soft(マサチューセッツ、Cambridge在)のS-Plusが含まれる。従って、ソフトウェアコンポーネントは、手続き型言語又は記号パッケージでプログラムされたならば、この発明の分析方法を表す。好適具体例において、このコンピューターシステムは又、乳癌に特徴的な一つ以上の遺伝子の発現レベルを表す値を含むデータベースをも含む。このデータベースは、種々の細胞における乳癌に特徴的な遺伝子の一つ以上の発現レベルを含むことができる。
【０１９３】
典型的な実行において、本発明の方法を実施するために、ユーザーは、発現プロフィルデータをコンピューターシステムにロードする。これらのデータは、モニター及びキーボードからユーザーが直接入れることができ、又はネットワーク接続によりリンクした他のコンピューターシステムから、又は取り外し可能な記憶媒体たとえばＣＤ−ＲＯＭ又はフロッピーディスクから又はネットワークを通して入れることができる。次に、ユーザーは、発現プロフィル分析ソフトウェアを実行させ、該分析ソフトウェアは、比較のステップ及び例えば同時に変化する(co-varying)遺伝子を遺伝子群にクラスター化するステップを実行する。
【０１９４】
他の典型的な実行においては、発現プロフィルを、米国特許第６，２０３，９８７号に記載された方法を利用して比較する。ユーザーは、先ず、発現プロフィルデータを、コンピューターシステムにロードする。遺伝子セットのプロフィルの定義は、記憶媒体から、又はリモートコンピューターから、好ましくは、ダイナミック遺伝子セットデータベースシステムからネットワークを通してメモリーにロードされる。次に、ユーザーは、映像作成ソフトウェアを実行し、これは、発現プロフィルの投影用発現プロフィルへの変換のステップを行なう。この投影用発現プロフィルを、次いで、ディスプレー表示する。
【０１９５】
更に別の典型的な実行においては、ユーザーは、先ず、投影用プロフィルをメモリーに導く。次いで、ユーザーは、参照用プロフィルのメモリーへのローディングを行なう。次に、ユーザーは、比較用ソフロウェアを実行し、これは、これらのプロフィルを客観的に比較するステップを行なう。
【０１９６】
３．変異体ポリヌクレオチド配列の検出
更に別の具体例において、この発明は、患者が、病気を発生する危険にあるかどうか、例えば、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチドの何れかによりコードされるポリペプチドの何れか一つの異所的活性と関係する悪性新生物(例えば、乳癌)を発生する疾病素質かどうかを決定する方法であって、該ポリペプチドの異所的活性が、下記の少なくとも一つにより特徴付けられる遺伝的病変の存否の検出により特徴付けられる当該方法を提供する：
(ｉ)マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化、又は
(ｉｉ)コードするポリヌクレオチドの誤発現。
【０１９７】
説明のために、かかる遺伝的病変は、下記の少なくとも一つの存在を確認することによって検出することができる：
Ｉ．ポリヌクレオチド配列からの一つ以上のヌクレオチドの欠失
ＩＩ．ポリヌクレオチド配列への一つ以上のヌクレオチドの追加
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド配列の一つ以上のヌクレオチドの置換
ＩＶ．ポリヌクレオチド配列の大きい染色体再配列
Ｖ．ポリヌクレオチド配列のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルでの大きい変化
ＶＩ．ポリヌクレオチド配列の異所的改変(例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン)
ＶＩＩ．遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在
ＶＩＩＩ．マーカーポリペプチドの非野生型レベル
ＩＸ．遺伝子のアレル喪失
Ｘ．マーカーポリペプチドの不適当な翻訳後修飾。
【０１９８】
本発明は、コードするポリヌクレオチド配列における突然変異を検出するためのアッセイ技術を提供する。これらの方法は、配列分析、サザーンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを含む方法、及び分析すべきポリヌクレオチドとプローブとの間のヌクレオチド対合の非存在の検出を含む方法を包含するが、これらに限られない。
【０１９９】
特殊な病気例えば遺伝病は、ある遺伝子の多型領域の特異的アレル変異体と関係している(それらは、必ずしも変異型タンパク質をコードしない)。従って、患者の遺伝子の多型領域の特異的アレル変異体の存在は、その患者を、特異的疾患を発症しやすくする。遺伝子中の多型領域は、個人の集団内の遺伝子のヌクレオチド配列を決定することによって同定することができる。もし多型領域が同一であれば、この特定の病気とのリンクは、特定の個人(例えば、特定の病気例えば乳癌を発症した個人)の集団を研究することによって決定することができる。多型領域は、遺伝子の任意の領域例えばエキソン(エキソンのコード領域又は非コード領域)、イントロン及びプロモーター領域に位置しうる。
【０２００】
典型的具体例において、遺伝子のセンス又はアンチセンス配列又はそれらの天然の変異体、又は主題の遺伝子と自然に結合している５’若しくは３’フランキング配列又はイントロン配列又はそれらの天然の変異体にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列の領域を含むポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチド組成物を提供する。細胞のポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションのために接近可能となり、このプローブは、試料のポリヌクレオチドと接触し、そしてプローブの試料ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが検出される。かかる技術を利用して、病変又はアレル変異体を、ゲノム又はｍＲＮＡレベルで検出し(欠失、置換などを含む)、並びにｍＲＮＡ転写物レベルを測定することができる。
【０２０１】
好適な検出方法は、突然変異又は多型部位に重複し且つ該突然変異又は多型領域の周囲に約５、１０、２０、２５、又は３０ヌクレオチドを有するプローブを利用するアレル特異的ハイブリダイゼーションである。この発明の好適具体例においては、アレル変異体に特異的にハイブリダイズすることのできる幾つかのプローブを、固相支持体例えば「チップ」に結合させる。オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップ(「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれる)を利用する変異検出分析は、例えば、Cronin等(48)に記載されている。一具体例において、一つのチップは、一つの遺伝子の少なくとも一つの多型領域の全アレル変異体を含む。この固相支持体を、次いで、試験ポリヌクレオチドと接触させて、特異的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する。従って、少なくとも一つの遺伝子の多くのアレル変異体の正体は、単一のハイブリダイゼーション実験において同定されうる。
【０２０２】
ある具体例において、病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号参照)例えばアンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ ＰＣＲにおける、或はリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)[Landegran等、1988, (49)及び Nakazawa等、1994 (50)]におけるプローブ／プライマーの利用を含む(後者は、遺伝子中の点突然変異の検出に特に有用である；Abravaya等、1995, (51)]。単に説明のための具体例において、この方法は、(ｉ)患者から細胞試料を集め、(ｉｉ)その試料の細胞から、ポリヌクレオチド(例えば、ゲノム性ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ又は両方)を単離し、(ｉｉｉ)このポリヌクレオチド試料を、ポリヌクレオチド(存在するなら)のハイブリダイゼーション及び増幅が起きる条件下でポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする少なくとも一つのプライマーと接触させ、そして(ｉｖ)増幅生成物の存否を検出し、又は増幅生成物のサイズを検出してその長さを対照用試料と比較するステップを含む。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、ここに記載の突然変異の検出に用いられる技術の何れかと共に、予備的増幅ステップとして利用するのが望ましいことは予想される。
【０２０３】
別の増幅方法は、自立配列複製[Guatelli, J.C.等、1990, (52)]、転写増幅システム[Kwoh, D.Y.等、1989, (53)]、Ｑ−Ｂｃｔａレプリカーゼ[Lizardi, P.M.等、1988, (54)]、又は任意の他のポリヌクレオチド増幅方法と、その後の、当業者に周知の技術を利用する増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、特に、ポリヌクレオチド分子が非常に少数存在する場合に、かかる分子の検出に有用である。
【０２０４】
主題のアッセイの好適具体例において、試料細胞からの遺伝子のアレル変異体における突然変異(又は、アレル変異体)は、制限酵素開裂パターンの変化によって同定される。例えば、試料と対照用ＤＮＡを単離して、増幅し(適宜)、一種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化して、断片長サイズをゲル電気泳動により測定する。その上；配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５，４９８，５３１号参照)の利用は、リボザイム開裂部位の発生又は消失による特異的変異の存在についての評点に利用することができる。
【０２０５】
４．イン・シトゥーハイブリダイゼーション
一面において、この方法は、所定のマーカーポリヌクレオチドに由来するプローブを用いるイン・シトゥーハイブリダイゼーションを含み、該ポリヌクレオチドの配列は、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド配列又はそれらと相補的な配列の何れかから選択される。この方法は、標識したハイブリダイゼーションプローブを、潜在的に悪性新生物(特に、乳癌)を有する患者からの所定の種類の組織並びに悪性新生物を有しない人物からの正常組織の試料と接触させること、及びこのプローブが、患者の組織を、正常組織が標識される程度から有意に異なる程度に(例えば、少なくとも倍率２、又は少なくとも倍率５、又は少なくとも倍率２０、又は少なくとも倍率５０だけ)標識するかどうかを測定することを含む。
【０２０６】
ポリペプチドの検出
主題の発明は、更に、患者から得られた細胞試料が、異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する方法であって、(ａ)細胞試料を患者から得、(ｂ)そうして得られた試料中のマーカーポリペプチドの量を定量的に測定し、そして(ｃ)そのように測定したマーカーポリペプチドの量を公知の標準と比較し、それにより、該患者から得られた細胞試料が異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定することを含む当該方法を提供する。かかるマーカーポリペプチドは、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡなどによって検出することができる。
【０２０７】
抗体
当分野で公知の任意の種類の抗体を生成させて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに特異的に結合させることができる。抗体は、ここで用いる場合、完全な免疫グロブリン分子、並びに「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに結合することのできるその断片例えばＦab、Ｆ(ab)2、及びＦｖを包含する。典型的には、一つのエピトープを形成するのに、少なくとも６、８、１０又は１２の隣接するアミノ酸が必要である。しかしながら、非隣接アミノ酸を含むエピトープは、一層多くの例えば少なくとも１５、２５又は５０アミノ酸を必要としうる。
【０２０８】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は、治療に利用できるし、並びに免疫化学的アッセイ例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降法、又は他の当分野で公知の免疫化学的アッセイに利用することができる。様々なイムノアッセイを利用して、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。競争結合アッセイ又はイムノラジオメトリックアッセイについての多くのプロトコールが、当分野では周知である。かかるイムノアッセイは、典型的には、免疫原とその免疫原に特異的に結合する抗体との間での複合体の形成の測定を含む。
【０２０９】
典型的には、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイで用いた場合、他のタンパク質により与えられる検出シグナルよりも少なくとも５、１０、又は２０倍高い検出シグナルを与える。好ましくは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおいて、他のタンパク質を検出せず、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【０２１０】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドを利用して、哺乳動物例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、又はヒトを免疫化して、ポリクローナル抗体を製造することができる。所望であれば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを、キャリアータンパク質例えばウシ血清アルブミン、チログロブリン、及び傘貝ヘモシアニンと結合体化することができる。宿主種に依って、様々なアジュバントを利用して、免疫学的応答を増大させることができる。かかるアジュバントには、フロイントのアジュバント、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、及び表面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、傘貝ヘモシアニン、及びジニトロフェノール)が含まれるが、これらに限られない。ヒトにおいて用いるアジュバントの内では、ＢＣＧ(バチリ・キャルメッテ−グエリン)及びコリネバクテリウムパルバムが、特に有用である。
【０２１１】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、連続的培養細胞系統により抗体分子の生成を与える任意の技術を利用して製造することができる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶハイブリドーマ技術[Kohler等、1985, (65); Kozbor等、1985, (66); Cote等、1983, (67)及び Cole等、1984, (68)]が含まれるが、これらに限られない。
【０２１２】
加えて、キメラ抗体製造のために開発された技術、適当な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子への切継ぎを利用することができる[Morrison等、1984, (69); Neuberger等、1984, (70); Takeda等、1985, (71)]。モノクローナル及びその他の抗体は又、ヒト化して、それを治療に用いた場合に、患者の免疫応答がその抗体に対して高まるのを防ぐことができる。かかる抗体は、治療に直接使用するために、配列において、ヒトの抗体に十分類似しており又は少数の鍵となる残基の変更を必要としてもよい。ゲッ歯類の抗体とヒト配列との間の配列の差異は、ヒト配列と異なる残基を、個々の残基の位置指定突然変異誘発法により又は全相補性決定領域をすりつぶすことにより置き換えることによって最少化することができる。或は、ヒト化抗体を、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載されたような組換え法を利用して製造することができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されたような部分的に又は完全にヒト化された抗原結合部位を含むことができる。
【０２１３】
或は、一本鎖抗体の製造に関して記載された技術は、当分野で公知の方法を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体を製造するために適用することができる。関連特異性を有するが、明確なイディオタイプ組成ではない抗体は、チェーンシャッフリングによって、ランダムなコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから生成することができる[Burton, 1991, (72)]。
【０２１４】
一本鎖抗体は又、ハイブリドーマｃＤＮＡをテンプレートとして利用するＤＮＡ増幅法例えばＰＣＲを利用して構築することもできる[Thirion等、1996, (73)]。一本鎖抗体は、一又は二重特異性であってよく、二価又は四価であってよい。四価の、二重特異性の、一本鎖抗体の構築は、例えば、Coloma及びMorrison, (74)に教示されている。二価の、二重特異性の一本鎖抗体は、Mallender及びVoss, (75)に教示されている。
【０２１５】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手作業による又は自動化ヌクレオチド合成を利用して構築することができ、標準的組換えＤＮＡ法を利用して発現用構築物中にクローン化して、コード配列を発現するための細胞に導入することができる(下記のように)。或は、一本鎖抗体は、例えば、繊維状ファージ技術を利用して、直接製造することができる[Verhaar等、1995, (76); Nicholls等、1993, (77)]。
【０２１６】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は又、リンパ球集団におけるイン・ビボ生産を誘導することにより、又は免疫グロブリンライブラリー又は文献に開示された高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって製造することもできる[Orlandi等、1989, (789)及びWinter等、1991, (79)]。
【０２１７】
他の種類の抗体を構築して、この発明の方法で治療に使うこともできる。例えば、キメラ抗体を、ＷＯ９３／０３１５１に開示されたように構築することができる。免疫グロブリンに由来して、多価で多重特異性である結合タンパク質例えばＷＯ９４／１３８０４に記載された抗体を製造することもできる。
【０２１８】
この発明の抗体は、当分野で周知の方法によって精製することができる。例えば、抗体を、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを結合させたカラムを通過させることによりアフィニティー精製することができる。結合した抗体を、次いで、そのカラムから、高塩濃度を利用して溶出させることができる。
【０２１９】
イムノアッセイは、細胞試料中のタンパク質のレベルを定量するために、普通に用いられ、多くの他のイムノアッセイ技術が、当分野で公知である。この発明は、特定のアッセイ手順に限られず、それ故、均質及び不均質手順の両方を含むことが意図される。この発明により行なわれうる典型的なイムノアッセイには、蛍光分極イムノアッセイ(ＦＰＩＡ)、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ)、酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、比濁阻害イムノアッセイ(ＮＩＡ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、及びラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)が含まれる。指示薬部分又は標識基を、主題の抗体に結合することができ、しばしばアッセイ装置の利用可能性及び適用可能なイムノアッセイ手順により指図されるこの方法の様々な利用の要求を満たすように選択する。上記の様々なイムノアッセイの実施において利用すべき一般的技術は、当業者に公知である。
【０２２０】
特定の試料中の特定のタンパク質、又はタンパク質断片、又は改変タンパク質のレベルを定量するための他の方法は、フローサイトメトリー法に基づくものである。フローサイトメトリーは、細胞表面のタンパク質ならびに細胞内のタンパク質の同定を可能にする(蛍光色素標識されたタンパク質特異的な抗体を利用して又は未標識の抗体を蛍光色素標識した第二抗体と共に利用して)。上記のフローサイトメトリーアッセイの実施において利用すべき一般的技術は、当業者に公知である。同じ原理に基づく特殊な方法は、ミクロスフェアベースのフローサイトメトリー法である。ミクロスフェアビーズは、正確な量の蛍光染料と特定の抗体で標識される。かかる技術は、Luminex Inc.のＷＯ９７／１４０２８によって提供される。他の具体例において、特定のタンパク質又はタンパク質断片、又は改変タンパク質の特定の試料中のレベルは、２Ｄゲル電気泳動法及び／又は質量分析法によって測定することができる。タンパク質の性質、配列、分子量並びに電荷の測定は、一検出ステップで達成することができる。質量分析法は、当業者に公知の方法(ＭＡＬＤＩ，ＴＯＦ)、又はこれらの組合せによって行なうことができる。
【０２２１】
他の具体例においては、コードされた生成物(即ち、SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１のポリヌクレオチド配列又はこれらに相補的な配列の何れかによりコードされた生成物)の、患者の生物学的液体(例えば、血液又は尿)中のレベルを、その患者の細胞におけるマーカーポリヌクレオチド配列の発現レベルをモニターする方法として測定することができる。かかる方法は、患者からの生物学的液体の試料を得るステップ、該試料(又は、該試料からのタンパク質)をコードされたマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させるステップ、及び該抗体による免疫複合体形成の量を測定するステップを含み、免疫複合体形成の量が、マーカーコードされた生成物の試料中のレベルの指示である。この測定は、正常な個人から採った対照用試料中の又は同じ人物から予め又はその後得られた一つ以上の試料中の同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較した場合に、特に教訓的である。
【０２２２】
他の具体例において、この方法を利用して、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を測定することができ、それは、更に、病気の進行(例えば、プラーク形成)と相関しうる。このマーカーポリペプチドのレベルは、細胞試料が、プラーク関連細胞である細胞を又は該細胞になる素因のある細胞を含むかどうかを予想的に評価するために利用することができる。マーカーポリペプチドレベルの観察を、例えば、一層ストリンジェントな治療の利用に関する決定において、利用することができる。
【０２２３】
上記のように、本発明の一つの面は、患者から単離した細胞のコンテキストにおいて、マーカーポリペプチドのレベルが、試料細胞において有意に減じているかどうかを測定するための診断用アッセイに関係する。用語「有意に減じている」は、細胞が、同種の組織起源の正常細胞と比較して、現じた量の細胞内マーカーポリペプチドを有する細胞表現型を指す。例えば、細胞は、正常細胞より、約５０％、２５％、１０％、又は５％少ないマーカーポリペプチドを有してよい。特に、このアッセイは、試験細胞におけるマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは、測定されたレベルを、少なくとも一つの対照用細胞(例えば、正常細胞及び／又はトランスフォームされた公知の表現型の細胞)で検出されたマーカーポリペプチドと比較する。
【０２２４】
主題の発明に特に重要なことは、正常な又は異常なマーカーポリペプチドレベルと関連する細胞の数により測定されるようなマーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。特定のマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数は、次いで、患者の予後と相関されうる。この発明の一具体例において、この病変のマーカーポリペプチド表現型は、異常に高い／低いレベルのマーカーポリペプチドを有することが見出された生検中の細胞のパーセンテージとして測定される。かかる発現は、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡなどによって検出されうる。
【０２２５】
免疫組織化学
組織試料を利用する場合、免疫組織化学的染色を利用して、マーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を測定することができる。かかる染色のためには、生検又は他の組織試料から組織の多数のブロックを採取して、プロテアーゼＫ又はペプシンなどの薬剤を使用するタンパク質加水分解にかける。ある具体例においては、試料細胞から核画分を単離して、その核画分中のマーカーポリペプチドのレベルを検出することは望ましいことであろう。
【０２２６】
これらの組織試料を、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなど試薬での処理により固定する。次いで、これらの試料を、マーカーポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体(好ましくは、モノクローナル抗体)とインキュベートする。この抗体は、後続の結合の検出のために、標識と結合体化することができる。試料を、免疫複合体の形成に十分な時間にわたってインキュベートする。次いで、抗体の結合を、この抗体に結合体化した標識によって検出する。抗体が未標識の場合には、例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のイソタイプに特異的な第二の標識した抗体を使用することができる。使用できる標識の例には、放射性核種、蛍光、化学発光、及び酵素が含まれる。
【０２２７】
酵素を使用する場合には、有色又は蛍光性生成物を与えるように、酵素の基質を試料に加えることができる。結合体における利用のための適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレートデヒドロゲナーゼなどが含まれる。抗体−酵素結合体のように、市販されていない場合には、当業者に公知の技術によって、容易に作成される。
【０２２８】
一具体例において、このアッセイは、ドットブロットアッセイとして行なわれる。このドットブロットアッセイは、予め決めた数の細胞から作成した無細胞抽出物においてマーカーポリペプチドの量を相関させることにより、単一細胞と結合したマーカーポリペプチドの平均量の測定を可能にするので、組織試料を使用する場合に特別の適用を見出している。
【０２２９】
更に別の具体例において、この発明は、この発明のマーカーポリペプチド(SEQ ID NO:１〜１６５及び４７２〜４９１によりコードされる)に対して生成された抗体のパネルを利用することを企図する。かかる抗体のパネルは、乳癌に対する信頼できる診断用プローブとして利用することができる。本発明のアッセイは、細胞(例えば、マクロファージ)を含む生検試料を、コードされた生成物の少なくとも一つに対する抗体のパネルと接触させて、マーカーポリペプチドの存否を決定することを含む。
【０２３０】
この主題の発明の診断方法は又、治療の追跡として使用することもでき、例えば、マーカーポリペプチドのレベルの定量化は、悪性新生物(特に、乳癌)に対して現在又は以前に使用した治療の効力並びにこれらの治療の効果(患者の予後)を示すことができる。
【０２３１】
上記の診断用アッセイは、予後用アッセイとして用いるために適用することもできる。かかる適用は、悪性新生物の症例におけるプラーク生成の進行における特徴的ステージで起きる事象に対するこの発明のアッセイの感度を利用する。例えば、所定のマーカー遺伝子は、非常に早いステージ(おそらく、細胞が、泡沫細胞に発生する前)でアップ又はダウンレギュレートされうるが、他方、他のマーカー遺伝子は、特徴的に、ずっと遅いステージでのみアップ又はダウンレギュレートされうる。かかる方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、悪性新生物の進行の種々のステージの乳癌組織細胞において種々の特徴的なレベルで発現する所定のマーカーポリヌクレオチドから誘導したポリヌクレオチドプローブと接触させるステップ、及び該プローブの該細胞のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの大凡の量を測定するステップを含むことができよう(かかる量は、該細胞における該遺伝子の発現レベルを示し、従って、該細胞の病気進行のステージを示す)；或は、このアッセイを、所定のマーカーポリヌクレオチドの遺伝子産物に特異的な抗体を用いて行なうことができる(試験細胞のタンパク質と接触させる)。一組のかかる試験は、ある種の新生物の存在を明らかにするだけでなく、臨床医がその病気に最も適した治療方法を選択すること及びその治療の成功する見込みを予測することを可能にもするであろう。
【０２３２】
この発明の方法は又、所与の乳癌疾病素質の臨床コースを追跡するために利用することもできる。例えば、この発明のアッセイを、患者からの血液試料に適用することができ；乳癌についての患者の治療後に、別の血液試料を採って、試験を繰り返す。上首尾の治療は、乳癌組織の細胞に特徴的な(おそらく正常レベルに達し、或は超えることすらある)デモンストレート差次的発現の除去を生じる。
【０２３３】
ポリペプチド活性
一具体例において、本発明は、少なくとも一つの「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を調節する潜在的治療剤であって、該ポリペプチドの活性が、悪性新生物(特に、乳癌)を有するか又はその危険にある被験者において「乳癌遺伝子」のアップレギュレーションの結果として増大しているならば、治療用物質は、該ポリペプチドの活性を、悪性新生物(特に、乳癌)を有しないか又はその危険になく、治療剤での治療を受けてない被験者の幾つかのポリペプチドの活性と比較して、減少させるような潜在的治療剤をスクリーニングする方法を提供する。同様に、該ポリペプチドの活性が、「乳癌遺伝子」のダウンレギュレーションの結果として、悪性新生物(特に、乳癌)を有するか又はその危険にある被験者において減少しているならば、治療剤は、該ポリペプチドの活性を、悪性新生物(特に、乳癌)を有しないか又はその危険になく、治療剤での治療を受けてない被験者における、同ポリペプチドの活性と比較して、増大させる。
【０２３４】
表２又は３に示した「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができる(特定のポリペプチドにより達成される活性型については特に)。特定のポリヌクレオチドの活性を測定するために利用することのできる特異的アッセイの例を、以下に示す。
【０２３５】
ａ）Ｇタンパク質共役型レセプター
一具体例において、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、Ｇタンパク質共役型レセプターをコードすることができる。一具体例において、本発明は、Ｇタンパク質共役型レセプターの潜在的モジュレーター(インヒビター又はアクチベーター)を、候補のモジュレーターの存在下での該レセプターの活性の変化を測定することによってスクリーニングする方法を提供する。
【０２３６】
１）Ｇi共役型レセプター
細胞(例えば、ＣＨＯ細胞又は一次細胞)を、適当なレセプター及び誘導可能なＣＲＥ−ルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトする。細胞を、１０％ ＦＢＳを補った５０％ダルベッコ改変イーグル培地／５０％ Ｆ１２(ＤＭＥＭ／Ｆ１２)中で、３７℃で、１０％ＣＯ2を含む加湿大気中で成長させて、日常的に、２〜３日ごとに１：１０の比で分ける。試験培養物を、３８４ウェルプレート中のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中に適当な密度(例えば、２０００細胞／ウェル、３５μｌ細胞培養培地中)で播種して、４８時間にわたって(範囲：細胞系統に依って、〜２４乃至６０時間)成長させる。次いで、成長培地を、０．１％ＢＳＡを含む無血清培地(ＳＦＭ；例えば、ウルトラＣＨＯ)に交換する。ＤＭＳＯに溶解させた試験化合物を、ＳＦＭにて希釈して、試験培養物に移し(最大終濃度１０μモル)、その１０分後に、ＳＦＭ中のフォルスコリン(終濃度、〜１μモル)＋０．１％ＢＳＡを加える。アンタゴニストのスクリーニングの場合には、適当な濃度のアゴニストとフォルスコリンの両方を加える。これらのプレートを、３７℃で、１０％ＣＯ2中で、３時間インキュベートする。次いで、上清を取り出して、細胞を、溶解用試薬(２５ｍモルリン酸緩衝液、ｐＨ７．８、２ｍモルＤＤＴ、１０％グリセロール及び３％トリトンＸ１００含有)で溶解させる。ルシフェラーゼ反応を、基質−緩衝液(例えば、ルシフェラーゼアッセイ試薬、Promega)の添加によって開始させて、発光を、直接測定する(例えば、Berthold ルミノメーター又はHamamatzu カメラシステム)。
【０２３７】
２）Ｇs共役型レセプター
細胞(例えば、ＣＨＯ細胞又は一次細胞)を、適当なレセプター及び誘導可能なＣＲＥ−ルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトする。細胞を、１０％ ＦＢＳを補った５０％ダルベッコ改変イーグル培地／５０％ Ｆ１２(ＤＭＥＭ／Ｆ１２)中で、３７℃で、１０％ＣＯ2を含む加湿大気中で成長させて、日常的に、２〜３日ごとに１：１０の比で分ける。試験培養物を、３８４ウェルプレート中のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中に適当な密度(例えば、１０００又は２０００細胞／ウェル、３５μｌ細胞培養培地中)で播種して、４８時間にわたって(範囲：細胞系統に依って、〜２４乃至６０時間)成長させる。アッセイを、０．１％ＢＳＡを含む無血清培地(ＳＦＭ；例えば、ウルトラＣＨＯ)中の試験化合物の添加により開始する：試験化合物を、ＤＭＳＯに溶解させ、ＳＦＭにて希釈して、試験培養物に移す(最大終濃度１０μモル、ＤＭＳＯ濃度＜０．６％)。アンタゴニストスクリーニングの場合には、適当な濃度のアゴニストを５〜１０分後に加える。これらのプレートを、３７℃で、１０％ＣＯ2中で、３時間インキュベートする。次いで、これらの細胞を、ウェル当たり１０μｌの溶解用試薬(２５ｍモルリン酸緩衝液、ｐＨ７．８、２ｍモルＤＤＴ、１０％グリセロール及び３％トリトンＸ１００含有)で溶解させて、ルシフェラーゼ反応を、ウェル当たり２０μｌの基質−緩衝液(例えば、ルシフェラーゼアッセイ試薬、Promega)の添加によって開始させる。発光の測定を、直ちに開始する(例えば、Berthold ルミノメーター又はHamamatzu カメラシステム)。
【０２３８】
３）Ｇq共役型レセプター
細胞(例えば、ＣＨＯ細胞又は一次細胞)を、適当なレセプターで安定にトランスフェクトする。機能的レセプタータンパク質を発現する細胞を、１０％ ＦＢＳを補った５０％ダルベッコ改変イーグル培地／５０％ Ｆ１２(ＤＭＥＭ／Ｆ１２)中で、３７℃で、５％ＣＯ2を含む加湿大気中で成長させて、日常的に、３〜４日ごとに細胞系統依存の比で分ける。試験培養物を、３８４ウェルプレート中のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中に適当な密度(例えば、２０００細胞／ウェル、３５μｌ細胞培養培地中)で播種して、４８時間にわたって(範囲：細胞系統に依って、〜２４乃至６０時間)成長させる。次いで、成長培地を、生理的塩溶液(例えば、タイロード溶液)に交換する。ＤＭＳＯに溶解させた試験化合物を、０．１％ＢＳＡを含むタイロード溶液にて希釈し、試験培養物に移す(最大終濃度１０μモル)。レセプター特異的アゴニストの添加後に、その結果生成したＧq媒介の細胞内カルシウム増加を、適当な読み出しシステム(例えば、カルシウム感受性染料)を利用して測定する。
【０２３９】
ｂ）イオンチャンネル
イオンチャンネルは、電気的シグナリング、膜貫通シグナル変換、及び電解質と溶質の輸送に関係する完全な膜タンパク質である。膜脂質二重層を通る巨大分子による孔を形成することにより、イオンチャンネルは、透過イオンの電気化学的ポテンシャル勾配により駆動される特異的なイオンの流れの原因となる。単一分子レベルにおいて、個々のチャンネルは、「開」(イオン導通)状態と「閉」(イオン非導通)状態の間で、コンホメーションの変化(「ゲーティング」)を受ける。典型的なシグナルチャンネル開通は、数ミリ秒間続き、１０-9〜１０-12アンペアの範囲の基本膜貫通電流を生じる。チャンネルゲーティングは、様々な化学的及び／又は生物物理学的パラメーター例えば神経伝達物質及び細胞内二次メッセンジャー(「リガンドゲーテッド」チャンネル)又は膜ポテンシャル(「ボルテージゲーテッド」チャンネル)により制御される。イオンチャンネルは、イオン選択性、ゲーティング特性、及びホルモン及び薬理学的因子による調節によって、機能的に、特徴付けられる。シグナリング及び輸送過程におけるそれらの中心的役割の故に、イオンチャンネルは、様々な病態生理学的状況における薬理学的治療剤のための理想的な標的を提供する。
【０２４０】
一具体例において、「乳癌遺伝子」は、イオンチャンネルをコードすることができる。一具体例において、本発明は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのチャンネル活性の潜在的アクチベーター又はインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。イオンチャンネルと相互作用してそれらの活性を阻害し又は促進する化合物のスクリーニングは、生細胞における(１)結合及び(２)機能アッセイに基づいてよい[Hille (112)]。
【０２４１】
１．リガンドゲーテッドチャンネル例えばイオン誘起型神経伝達物質／ホルモンレセプターについて、標的への結合を、化合物と標識リガンドとの間の競争によって検出するアッセイをデザインすることができる。
【０２４２】
２．イオンチャンネル機能を、生細胞内で機能的に試験することができる。標的タンパク質を、適当なレポーター細胞内で内因的に発現させるか又は組換えにより導入する。チャンネル活性を、(２．１)透過イオン(最も顕著なのはＣａ2+イオン)の濃度変化により、(２．２)膜貫通電気的ポテンシャル勾配の変化により、及び(２．３)標的活性により開始され又は調節される細胞応答(例えば、レポーター遺伝子の発現、神経伝達物質の分泌)の測定によってモニターする。
【０２４３】
２．１  チャンネル活性は、膜貫通イオンフラックスを生じる。従って、イオンチャンネルの活性化は、その結果の細胞内イオン濃度の変化を、発光又は蛍光標識を利用することによってモニターすることができる。適当な標識の広いダイナミックレンジと利用可能性の故に、これは、特に、細胞内Ｃａ2+イオン濃度([Ｃａ2+]i)の変化に対して適用される。[Ｃａ2+]iは、例えば、エクオリン発光又は蛍光染料技術(例えば、Ｆｌｕｏ−３、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２使用)によって測定することができる。標的チャンネル自身を通るＣａ2+フラックスを直接測定する場合又は標的チャンネルの調節が膜ポテンシャルに影響してそれにより同時発現されるボルテージゲーテッドＣａ2+チャンネルの活性に影響を与える場合には、細胞アッセイをデザインすることができる。
【０２４４】
２．２  イオンチャンネル電流は、電気的膜ポテンシャル(Ｖm)の変化を生じ、これは、電位差蛍光プローブを利用して直接モニターすることができる。これらの電気的に帯電した標識(例えば、アニオン性オキソノール染料ＤｉＢＡＣ4(３))は、ボルテージ変化に応答して、細胞外コンポーネントと細胞内コンポーネントとの間に再分配される。平衡分布は、ネルンスト方程式により支配される。従って、膜ポテンシャルの変化は、細胞の蛍光の付随する変化を生じる。再び、Ｖmの変化は、標的イオンチャンネルの活性により又は同じ細胞に同時発現されたチャンネルによるシグナルの増幅及び／若しくは延長によって直接的に引き起こされうる。
【０２４５】
２．３  標的チャンネル活性は、細胞Ｃａ2+が直接又は更なるＣａ2+チャンネルの活性化によって入ることを引き起こす(２．１参照)。その結果生成した細胞内Ｃａ2+シグナルは、様々な細胞応答例えば分泌又は遺伝子転写を調節する。それ故、標的チャンネルの調節は、公知のホルモン／伝達物質の、標的発現細胞からの分泌をモニターすることにより、又はＣａ2+応答性プロモーターエレメント(例えば、サイクリックＡＭＰ／Ｃａ2+応答性エレメント；ＣＲＥ)により制御されるレポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ)の発現によって検出することができる。
【０２４６】
ｃ）ＤＮＡ結合性タンパク質及び転写因子
一具体例において、「乳癌遺伝子」は、ＤＮＡ結合性タンパク質又は転写因子をコードすることができる。かかるＤＮＡ結合性タンパク質又は転写因子の活性は、例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質又は転写因子の、特定のプロモーターに結合された試験配列の転写を開始する能力を測るプロモーターアッセイによって測定することができる。一具体例において、本発明は、試験化合物を、かかるＤＮＡ結合性タンパク質又は転写因子の活性を調節する能力について、該転写因子に応答性のプロモーターにより調節される試験遺伝子の発現の変化を測定することによってスクリーニングする方法を提供する。
【０２４７】
プロモーターアッセイ
プロモーターアッセイを、関心ある遺伝子(例えば、甲状腺ホルモン)が制御されるプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を安定にトランスフェクトしたヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を利用して設定した。トランスフェクションに用いたベクター２ｘＩＲＯｌｕｃは、８ｂｐのスペーサーで分離された２つの１２ｂｐの逆向きパリンドロームの甲状腺ホルモン応答性エレメント(ＴＲＥ)を、ｔｋ最小プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子の前に有している。試験培養物を、９６ウェルプレート中の、グルタミン、トリシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、インスリン、セレン、トランスフェリンを補った無血清イーグル最少必須培地中に播種して、１０％ＣＯ2を含む加湿大気中で、３７℃で培養した。インキュベーションの４８時間後に、試験化合物又は参照用化合物(例えば、Ｌ−Ｔ３、Ｌ−Ｔ４)及び、適宜、コスティミュレーター(終濃度１ｎＭ)の連続希釈物を、これらの細胞培養物に加えて、インキュベーションを、最適な時間(例えば、更に４〜７２時間)続けた。これらの細胞を、次いで、トリトンＸ１００とルシフェリンを含む緩衝液の添加により溶解させて、Ｔ３又は他の化合物により誘導されたルシフェラーゼの発光を照度計で測定した。試験化合物の各濃度について、４つの複製物を試験した。各試験化合物についてのＥＣ50値を、Graph Pad Prism Scientific ソフトウェアの利用によって計算した。
【０２４８】
配列決定法
この発明は、「乳癌遺伝子」ポリペプチド又は「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドに結合し又はその活性を調節する試験化合物を配列決定するためのアッセイを提供する。試験化合物は、好ましくは、「乳癌遺伝子」ポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合する。一層好ましくは、試験化合物は、「乳癌遺伝子」活性を、該試験化合物の非存在時と比べて、少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、一層好ましくは約７５、９０、又は１００％減少させ又は増大させる。
【０２４９】
試験化合物
試験化合物は、当分野で既知の薬理学的因子であってよいし、又は以前は如何なる薬理学的活性を有することも知られていなかった化合物であってもよい。これらの化合物は、天然物であっても、研究室でデザインされたものであってもよい。それらは、微生物、動物、又は植物から単離することができ、組換えにより生成することができ、又は当分野で公知の化学的方法によって合成することができる。所望であれば、試験化合物は、当分野で公知の多くのコンビナトリアルライブラリー法の何れかを利用して得ることができ、該方法には、生物学的ライブラリー、空間的に位置付け可能な並行固相又は溶液相ライブラリー、デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法、１ビーズ１化合物ライブラリー、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を利用する合成ライブラリー法が含まれるが、これらに限られない。生物学的ライブラリーによるアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である[総説としては、Lam, 1997, (80)を参照されたい]。
【０２５０】
分子ライブラリーの合成の方法は、当分野で周知である[例えば、DeWitt等、1993, (81)；Erb等、1994, (82)；Zuckermann等、1994, (83)；Cho等、1993, (84)；Carell等、1994, (85)及びGallop等、1994, (86)を参照されたい]。化合物のライブラリーは、溶液[例えば、Houghten, 1992, (87)参照]、又はビーズ上[Lam, 1991, (88)]、ＤＮＡチップ[Fodor, 1993, (89)]、細菌又は胞子(Ladner, 米国特許第５，２２３，４０９号)、プラスミド[Cull等、1992, (901)]、又はファージ[Scott及びSmith, 1990, (91)；Devlin, 1990, (92)；Cwirla等、1990, (93)Felici,1991,(94)]にて提供することができる。
【０２５１】
高スループットスクリーニング
試験化合物を、「乳癌遺伝子」ポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合する能力又は「乳癌遺伝子」活性若しくは「乳癌遺伝子」発現に影響を与える能力について、高スループットスクリーニングを利用してスクリーニングすることができる。高スループットスクリーニングを利用して、多くの別々の化合物を並行して試験して、多数の試験化合物を迅速にスクリーニングすることができる。最も広く確立された技術は、９６ウェル、３８４ウェル又は１５３６ウェルのミクロ滴定プレートを利用する。これらのミクロ滴定プレートのウェルは、典型的には、５〜５００μｌの範囲のアッセイ容積を必要とする。これらのプレートに加えて、多くのミクロウェル形式に適合した機器、材料、ピペッター、ロボット工学、プレート洗浄機、及びプレートリーダーが、市販されている。
【０２５２】
或は、フリーフォーマットアッセイ(即ち、試料間に物理的境界を有しないアッセイ)を利用することもできる。例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーについての単一均質アッセイにおいて色素細胞(メラノサイト)を利用するアッセイが、Jayawickreme等、(95)により記載されている。これらの細胞は、培養ディッシュ中のアガロース下に置かれ、その後、コンビナトリアル化合物を有するビーズを該アガロースの表面に置く。これらのコンビナトリアル化合物は、部分的に、それらの化合物をビーズから放出する。活性な化合物は、それらの化合物がゲルマトリクス中に局所的に拡散する際に、活性な化合物はそれらの細胞に色の変化を引き起こすので、暗い色素領域として見ることができる。
【０２５３】
フリーフォーマットアッセイの他の例は、Chelsky, (96)により記載されている。Chelskyは、単一均質酵素アッセイを、アガロースゲルの内側にカルボニックアンヒドラーゼにつき行なって、ゲル中のこの酵素が、該ゲル中で色の変化を引き起こすようにした。その後、コンビナトリアル化合物をフォトリンカーにより有するビーズを、ゲルの内側に置き、これらの化合物は、ＵＶ光により、部分的に放出された。この酵素を阻害する化合物は、一層少ない色の変化を有する阻害の局所領域として観察された。
【０２５４】
他の例において、コンビナトリアルライブラリーは、寒天中で成長中の癌細胞に対する細胞障害性効果を有する化合物についてスクリーニングされた[Salmon等、1996, (97)]。
【０２５５】
他の高スループットスクリーニング法は、米国特許第５，９７６，８１３号に記載されている。この方法において、試験試料は、多孔性マトリクス中に置かれる。次いで、一種以上のアッセイ用成分が、マトリクス例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、又は他の形態の容易に操作できる固体支持体の内部、頂部、又は底部に置かれる。試料を多孔性マトリクスに導入する場合には、それらは、十分にゆっくりと拡散するので、試験試料が一緒に流れることなく、これらのアッセイを行なうことができる。
【０２５６】
結合アッセイ
結合アッセイのためには、試験化合物は、好ましくは、例えば酵素のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性部位に結合して占領し、正常な生物学的活性が妨げられるようにする小分子である。かかる小分子の例には、小型ペプチド又はペプチド様分子が含まれるが、これらに限られない。
【０２５７】
結合アッセイにおいて、試験化合物又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、検出可能な標識例えば蛍光標識、放射性同位体標識、化学発光標識、又は酵素標識例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼを含むことができる。次いで、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに結合した試験化合物の検出を、例えば、電波放出のシンチレーションカウンティングによる直接的計数により、又は適当な基質の検出可能な生成物への変換を測定することによって達成することができる。
【０２５８】
或は、試験化合物の「乳癌遺伝子」ポリペプチドへの結合は、反応体の何れも標識することなく測定することができる。例えば、マイクロ生理機能測定器を利用して、試験化合物の「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの結合を検出することができる。マイクロ生理機能測定器(例えば、Cytosensor J)は、細胞がその環境を酸性化する速度を、光位置付け可能な電位差センサー(LAPS)を利用して測定する分析用器具である。この酸性化速度の変化は、試験化合物と「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの間の相互作用の指標として利用することができる[McConnell等、1992, (98)]。
【０２５９】
試験化合物の「乳癌遺伝子」ポリペプチドに結合する能力を測定することは又、リアルタイムBimolecular Interaction Analysis (BIA)[Sjolander及びUrbaniczky, 1991, (99)及びSzabo等、1995, (100)]などの技術を利用することによっても達成することができる。ＢＩＡは、二重特異性相互作用を、何れの反応体も標識することなく、リアルタイムで研究するための技術である(例えば、BLAcore(登録商標))。光学的現象の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)における変化は、生物学的分子の間のリアルタイムの反応の指標として利用することができる。
【０２６０】
この発明の更に別の面において、「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、ツーハイブリッドアッセイ又はスリーハイブリッドアッセイにおける「餌タンパク質」として利用して[例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos等、1993, (101)；Madura等、1993, (102)；Bartel等、1993, (1034)；Iwabuchi等、1993, (104)及びBrent ＷＯ９４／１０３００参照]、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合し又は相互作用する他のタンパク質を同定してその活性を調節することができる。
【０２６１】
このツーハイブリッドシステムは、殆どの転写因子の、別々のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインよりなるという分子の性質に基づいている。簡単にいえば、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物においては、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、公知の転写因子(例えば、ＧＡＬ４)のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させることができる。他方の構築物においては、未同定のタンパク質(「餌動物」又は「試料」)をコードするＤＮＡ配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させることができる。もし「餌」及び「餌動物」タンパク質が、イン・ビボで相互作用して、タンパク質依存性複合体を形成することができるならば、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインが、近くにもたらされる。この接近は、該転写因子に応答性の転写調節部位に操作可能に結合されたレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を与える。このレポーター遺伝子の発現は、検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離して、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を得るために利用することができる。
【０２６２】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)又は試験化合物を固定化して、反応体の一方又は両方の、結合型の未結合型からの分離を容易にすることは望ましいであろう。それ故、「乳癌遺伝子」ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)又は試験化合物を、固体支持体に結合することができる。適当な固体支持体には、硝子又はプラスチックスライド、組織培養プレート、ミクロ滴定用ウェル、チューブ、シリコンチップ、又は粒子例えばビーズ(ラテックス、ポリスチレン又は硝子ビーズを含むが、これらに限られない)が含まれるが、これらに限られない。当分野で公知の任意の方法を利用して、「乳癌遺伝子」ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)又は試験化合物を固体支持体に結合することができるが、該方法には、共有結合及び非共有結合、受動的吸着、又は該ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)又は試験化合物と固体支持体とにそれぞれ結合した結合部分の対合の利用が含まれる。試験化合物は、好ましくは、固体支持体に、アレイにて結合され、それにより、個々の試験化合物の位置を追跡することができる。試験化合物の「乳癌遺伝子」ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)への結合は、反応体を含むのに適した任意の容器中で達成することができる。かかる容器の例には、ミクロ滴定プレート、試験管、及びミクロ遠心管が含まれる。
【０２６３】
一具体例において、「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドが固体支持体に結合することを可能にするドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, ミズーリ、St. Louis在)又はグルタチオン誘導体化プレート上に吸着させることができ、これらは、その後、試験化合物と、又は試験化合物及び未吸着の「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合され；該混合物を、次いで、複合体形成に伝導的な条件(例えば、塩及びｐＨについて生理的条件)下でインキュベートする。インキュベーション後に、これらのビーズ又はミクロ滴定プレートのウェルを洗って、任意の未結合成分を除去する。反応体の結合を、上記のように、直接又は間接的に測定することができる。或は、複合体を、固体支持体から解離させてから、結合を測定することもできる。
【０２６４】
タンパク質又はポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するための他の技術を、この発明のスクリーニングアッセイで利用することもできる。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)又は試験化合物を、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化「乳癌遺伝子」ポリペプチド(又はポリヌクレオチド)又は試験化合物は、ビオチンＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド)から、当分野で周知の技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals製 (イリノイ、Rockford在))を利用して製造することができ、ストレプトアビジンでコートした９６ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定化することができる。
【０２６５】
或は、「乳癌遺伝子」ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は試験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位例えばＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性部位を邪魔しない抗体を、プレートのウェルに結合体化することができる。未結合の標的又はタンパク質を、これらのウェル中で、抗体結合によってトラップすることができる。
【０２６６】
かかる複合体を検出する方法には、ＧＳＴ固定化複合体について上記したものに加えて、「乳癌遺伝子」ポリペプチド又は試験化合物に特異的に結合する抗体を利用する複合体の免疫検出、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性の検出に依存する酵素結合アッセイ、及び非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動法が含まれる。
【０２６７】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合する試験化合物のスクリーニングは又、無傷の細胞において行なうこともできる。「乳癌遺伝子」ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む任意の細胞を、細胞ベースのアッセイ系において利用することができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、細胞中に天然に存在しうるものであり又は上記のような技術を利用して導入することもできる。試験化合物の「乳癌遺伝子」ポリペプチド又はポリヌクレオチドへの結合は、上記のように測定される。
【０２６８】
遺伝子発現の調節
他の具体例においては、「乳癌遺伝子」の発現を増大又は減少させる試験化合物を同定する。「乳癌遺伝子」ポリペプチドを、試験化合物と、上記のような適当な発現試験系又は細胞系において接触させて、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのＲＮＡ又はポリペプチド産物を検出する。試験化合物の存在下における適当なｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルを、該試験化合物の非存在下でのｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルと比較する。その試験化合物を、次いで、この比較に基づいて、発現モジュレーターとして同定することができる。例えば、ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下において、非存在下におけるより大きいならば、その試験化合物は、そのｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現のスティミュレーター又はエンハンサーとして同定される。或は、このｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現が、該試験化合物の存在下において、非存在下におけるよりも一層少ないならば、該試験化合物は、該ｍＲＮＡ又はポリペプチド発現のインヒビターとして同定される。
【０２６９】
「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡ又はポリペプチドの細胞における発現のレベルは、ｍＲＮＡ又はポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法によって測定することができる。定性的方法でも定量的方法でも利用することができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えば、当分野で公知の様々な技術を利用して測定することができ、該技術には、免疫化学的方法例えばラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、及び免疫組織化学が含まれる。或は、ポリペプチド合成を、イン・ビボで、細胞培養で、又はイン・ビトロ翻訳系で、標識アミノ酸の「乳癌遺伝子」ポリペプチドへの組込みを検出することによって測定することができる。
【０２７０】
かかるスクリーニングを、無細胞アッセイ系又は無傷の細胞において行なうことができる。「乳癌遺伝子」遺伝子ポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を、細胞ベースのアッセイ系において利用することができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、細胞中に天然に存在するものであってもよいし、又は上記のような技術を利用して導入したものであってもよい。一次培養物又は樹立された細胞株例えばＣＨＯ若しくはヒト胎児腎臓２９３細胞を利用することができる。
【０２７１】
治療の指示及び方法
乳癌の治療は、主として、細胞増殖、細胞成長又は血管形成に介入する有効な化学療法剤に依存している。ゲノム学に駆動される分子標的同定の出現は、悪性新生物患者(特に、乳癌患者)のために、一層安全で、一層効果的な治療を与えるであろう治療介入のための新しい乳癌特異的な標的を同定する可能性を開いた。従って、新たに発見された乳癌関連遺伝子及びそれらの産物は、革新的治療を開発するためのツールとして利用することができる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターキナーゼの同定は、上記のような腫瘍の患者のあるサブセットの治療について刺激的な新しい機会を与えるものである。上で概説した生理学的過程の何れかにおいて重要な役割を演じる遺伝子は、乳癌の標的として特性表示することができる。ゲノム学により同定された遺伝子又は遺伝子断片は、一種以上の異質な発現系において容易に発現されて、機能的な組換えタンパク質を生成する。これらのタンパク質は、イン・ビトロで、それらの生化学的特性について特性決定され、その後、それらの生化学的活性の化学的モジュレーターを同定するための高スループット分子スクリーニングプログラムにおいてツールとして利用される。標的遺伝子の発現又はタンパク質の活性のモジュレーターは、この方法で同定することができ、続いて、細胞及びイン・ビボ疾患モデルにおいて治療活性について試験することができる。リード化合物の、生物学的モデル及び詳細な薬物動力学及び毒物学的分析における反復試験による最適化は、薬物開発及びその後のヒトにおける試験のための基礎を形成する。
【０２７２】
この発明は、更に、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の利用に関係する。従って、適当な動物モデルでここに記載のようにして同定された試験化合物を利用することは、この発明の範囲内にある。例えば、ここに記載のようにして同定された薬剤(例えば、調節剤、アンチセンスポリヌクレオチド分子、特異的抗体、リボザイム、又はヒトの「乳癌遺伝子」ポリペプチド結合性分子)は、動物モデルにおいて、かかる薬剤による治療の効力、毒性、又は副作用を測定するために利用することができる。或は、ここに記載のようにして同定した薬剤は、動物モデルにおいて利用して、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。更に、この発明は、ここに記載した治療のために、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の利用に関係する。
【０２７３】
ヒト「乳癌遺伝子」活性に影響を与える試薬を、ヒト細胞に、イン・ビトロ又はイン・ビボで投与して、ヒト「乳癌遺伝子」活性を減少させ又は増大させることができる。この試薬は、好ましくは、ヒト「乳癌遺伝子」の発現産物に結合する。もし発現産物が、タンパク質であるならば、この試薬は、好ましくは、抗体である。ヒト細胞のエキス・ビボでの治療のためには、抗体を、身体から取り出した幹細胞の調製物に加えることができる。これらの細胞を、次いで、同じ又は別のヒトの身体に戻すことができるが、これは、当分野で公知のように、クローン増殖を伴っても伴わなくてもよい。
【０２７４】
一具体例において、この試薬は、リポソームを利用して送達することができる。好ましくは、このリポソームは、それが投与された動物中で、少なくとも約３０分間にわたって、一層好ましくは少なくとも約１時間にわたって、更に一層好ましくは少なくとも約２４時間にわたって安定である。リポソームは、動物例えばヒトの特定の部位を、試薬特にポリヌクレオチドの標的とすることができる脂質組成物を含む。好ましくは、このリポソームの脂質組成物は、動物の特異的臓器例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的とすることができる。
【０２７５】
本発明で有用なリポソームは、標的細胞に内容物を送達するために該細胞の原形質膜と融合することのできる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は、約１０6個の細胞に送達される１６ｎモルのリポソーム当たり約０．５μｇのＤＮＡであり、一層好ましくは、約１０6個の細胞に送達される１６ｎモルのリポソーム当たり約１．０μｇのＤＮＡであり、尚一層好ましくは、約１０6個の細胞に送達される１６ｎモルのリポソーム当たり約２．０μｇのＤＮＡである。好ましくは、リポソームは、直径が、約１００〜５００ｎｍであり、一層好ましくは、約１５０〜４５０ｎｍであり、尚一層好ましくは、約２００〜４００ｎｍである。
【０２７６】
本発明における使用に適したリポソームには、例えば、当業者に公知の遺伝子送達法に普通に使われるリポソームが含まれる。一層好適なリポソームには、ポリカチオン性脂質組成物を有するリポソーム及び／又はポリエチレングリコールに結合させたコレステロール主鎖を有するリポソームが含まれる。適宜、リポソームは、特定の細胞型をそのリポソームの標的とすることのできる化合物例えばリポソームの外表面に露出された細胞特異的リガンドを含む。
【０２７７】
リポソームを、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの試薬又はリボザイムと複合体化することは、当分野で標準的な方法(例えば、米国特許第５，７０５，１５１号参照)を利用して、達成することができる。好ましくは、約０．１〜１０μｇのポリヌクレオチドを約８ｎモルのリポソームと、一層好ましくは、約０．５〜５μｇのポリヌクレオチドを約８ｎモルのリポソームと、尚一層好ましくは、約１．０μｇのポリヌクレオチドを約８ｎモルのリポソームと結合させる。
【０２７８】
他の具体例において、抗体を、特異的組織に、レセプター媒介による標的を定めた送達を利用して、イン・ビボで、送達することができる。レセプター媒介のＤＮＡ送達技術は、例えば、Findeis等、1993, (105)；Chiou等、1994, (106)；Wu及びWu, 1988, (107)；Wu等、1994, (108)；Zenke等、1990, (109)；Wu等、1991, (110)に教示されている。
【０２７９】
治療上有効な投与量の決定
治療上有効な投与量の決定は、十分に、当業者の能力の内にある。治療上有効な投与量は、ヒト「乳癌遺伝子」活性を、当該治療上有効な投与量の非存在下で生じるヒト「乳癌遺伝子」活性と比べて、増大させ又は減少させる活性成分の量を指す。
【０２８０】
任意の化合物について、治療上有効な投与量は、最初、細胞培養アッセイにおいて又は動物モデル(通常、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタ)において見積もることができる。動物モデルは又、適当な濃度範囲及び投与経路を決定するために利用することもできる。次いで、かかる情報を利用して、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２８１】
治療上の効力及び毒性例えばＥＤ50(集団の５０％において治療上有効である投与量)及びＬＤ50(集団の５０％に対して致死的である投与量)を、標準的製薬手順によって、細胞培養物又は実験動物において測定することができる。毒性の治療効果に対する投与量の比は、治療インデックスであり、比 ＬＤ50／ＥＤ50として表すことができる。
【０２８２】
大きな治療インデックスを示す医薬組成物は、好適である。細胞培養アッセイ及び動物での研究から得られるデータは、ヒトへの利用のための投薬量の範囲を処方する際に利用される。かかる組成物に含まれる投薬量は、好ましくは、ＥＤ50を含むが毒性が殆ど又は全くない循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、この範囲内で、使用する投薬形態、患者の感受性、及び投与経路に依って変化する。
【０２８３】
正確な投薬量は、開業医により、治療を必要とする患者に関する因子を考えて決定される。投薬量及び投与は、十分なレベルの活性成分を与えて、所望の効果を維持するように調節される。考慮されうる因子には、病状の重さ、患者の一般的健康状態、年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応感度、及び治療に対する耐性／応答が含まれる。長期作用性の医薬組成物は、特定の配合物の半減期及びクリアランス速度に依って、３〜４日ごとに、毎週、又は２週間ごとに投与することができる。
【０２８４】
正常な投薬量は、投与経路によって、０．１〜１００，０００マイクログラムで変化しうる(最大で、約１ｇの総投与量)。特定の投薬量及び送達方法に関する指針は、文献に与えられており、当分野の開業医は利用可能である。当業者は、ヌクレオチドについては、タンパク質又はそれらのインヒビターとは異なる配合を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置などに対して特異的なものとなろう。
【０２８５】
もし試薬が一本鎖抗体であるならば、その抗体をコードするポリヌクレオチドを構築して、細胞に導入することが、十分確立された技術を利用して、エキス・ビボ又はイン・ビボででき、該技術には、トランスフェリン−ポリカチオン媒介のＤＮＡトランスファー、裸の又はカプセル封入された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介の細胞融合、ＤＮＡをコートしたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、及びＤＥＡＥ又はリン酸カルシウム媒介のトランスフェクションが含まれるが、これらに限られない。
【０２８６】
イン・ビボの抗体の有効投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約５〜５０μｇ、約５０μｇ〜５ｍｇ、約１００〜５００μｇ、及び約２００〜２５０μｇの範囲にある。一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドの投与のために、有効なイン・ビボ投薬量は、ＤＮＡ約１００〜２００ｎｇ、５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５〜５００μｇ、及び約２０〜１００μｇの範囲にある。
【０２８７】
もし発現産物がｍＲＮＡであるならば、この試薬は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムを発現するポリヌクレオチドを、上記のような様々な方法によって、細胞に導入することができる。
【０２８８】
好ましくは、試薬は、「乳癌遺伝子」遺伝子の発現又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を、該試薬の非存在時と比較して、少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、一層好ましくは約７５、９０、又は１００％減じる。「乳癌遺伝子」遺伝子の発現レベル又は「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を減じるために選択した機構の効力を、当分野で周知の方法例えばヌクレオチドプローブの「乳癌遺伝子」特異的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの免疫学的検出、又は「乳癌遺伝子」活性の測定を利用して、評価することができる。
【０２８９】
上記の具体例の何れかにおいて、この発明の医薬組成物の何れかを、他の適当な治療剤と共に投与することができる。組合せ治療で用いるための適当な薬剤の選択は、慣用の製薬原理に従って、当業者によってなされうる。この治療剤の組合せは、相乗的に作用して、上記の様々な疾患の治療又は予防を達成することができる。このアプローチを利用すれば、各薬剤の一層少ない投薬量で(従って、有害な副作用の可能性を減じて)、治療効果を達成することができる。
【０２９０】
上記の治療方法の何れでも、かかる治療を必要とする任意の患者(例えば、鳥類及び哺乳類例えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、サル、及び最も好ましくはヒト)に適用することができる。
【０２９１】
この開示の中で引用したすべての特許及び特許出願は、参考として、本明細書中にはっきりと援用する。上記の開示は、本発明を、一般的に記載している。一層完全な理解は、下記の特定の実施例を参照することにより得ることができるが、該実施例は、単に例示の目的で与えるものであり、この発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０２９２】
医薬組成物
この発明は又、患者に投与して治療効果を達成することのできる医薬組成物をも提供する。この発明の医薬組成物は、例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチド、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体(「乳癌遺伝子」ポリペプチド又は擬似物に特異的に結合するもの)、「乳癌遺伝子」ポリペプチド活性のアゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビターを含むことができる。これらの組成物は、単独で、又は少なくとも一種の他の薬剤(例えば、安定化化合物)と共に投与することができ、これらは、任意の無菌の、生体適合性の、製薬キャリアー(塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、及び水を含むが、これらに限られない)にて投与することができる。これらの組成物は、患者に、単独で、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと共に投与することができる。
【０２９３】
これらの活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物の医薬使用できる製剤への処理を容易にする適当な製薬上許容しうるキャリアー(賦形剤及び助剤を含む)を含むことができる。この発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、非経口、局所、舌下、又は直腸投与の手段を含む(これらに限られない)経路の幾つかによって投与することができる。経口投与のための医薬組成物は、当分野で周知の製薬上許容しうるキャリアーを利用して、経口投与に適した投薬量で、配合することができる。かかるキャリアーは、これらの医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして配合することを可能にする
【０２９４】
経口投与用の医薬製剤は、活性化合物を、固体の賦形剤と組み合わせ(その結果生成した混合物を適宜粉砕する)、適当な助剤を加えた後に顆粒の混合物を処理する(所望であれば、錠剤又は糖衣剤コアを得る)ことにより得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤(例えば、ラクトース、シュークロース、を含む糖類、マンニトール又はソルビトール；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモその他の植物由来の澱粉；セルロース例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むガム類；及びタンパク質例えばゼラチン及びコラーゲン)である。所望であれば、崩壊剤又は可溶化剤(例えば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウム)を加えることができる。
【０２９５】
糖衣錠コアは、適当な被覆剤(例えば、濃縮糖液)と結合させて利用することができるが、該被覆は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶剤又は溶剤混合物をも含むことができる。染料又は色素を、製品の確認又は活性化合物の量(即ち、投薬量)を表示するために、錠剤又は糖衣錠の被覆剤に加えることができる。
【０２９６】
経口使用できる医薬製剤には、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、並びにゼラチンと被覆剤例えばグリセロール又はソルビトールで作られた軟質の密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、充填剤又は結合剤例えばラクトース又は澱粉、潤滑剤例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム(及び、適宜、安定剤)と混合した活性成分を含むことができる。軟質カプセルにおいては、活性化合物は、適当な液体例えば脂肪油、又は液体ポリエチレングリコールに、安定剤を伴って又は伴わずに、溶解又は懸濁させることができる。
【０２９７】
非経口投与に適した医薬配合物は、水溶液、好ましくは、生理的に適合性の緩衝液例えばハンクス溶液又はリンゲル溶液、又は生理的に緩衝された塩溶液中で配合することができる。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含むことができる。更に、活性化合物の懸濁液は、適当な注射用油性懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒又はビヒクルには、油脂油例えば胡麻油、又は合成の脂肪酸エステル例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド、又はリポソームが含まれる。脂質でないポリカチオン性のアミノ酸ポリマーも又、送達のために利用することができる。適宜、この懸濁液は又、適当な安定剤又は、これらの化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮された溶液の製造を可能にする薬剤をも含むことができる。局所投与又は鼻内投与のためには、透過すべき特定のバリヤーに適した浸透剤を利用することができる。かかる浸透剤は、一般に、当分野で公知である。
【０２９８】
本発明の医薬組成物は、当分野で公知の方法で、例えば、慣用の混合、溶解、粉砕、糖衣錠作成、湿式粉砕、乳化、カプセル封入、捕獲、又は凍結乾燥法の手段によって、製造することができる。この医薬組成物は、塩として提供することができ、それは、多くの酸(塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限られない)を用いて形成することができる。塩は、対応する遊離の塩基形態よりも、水性溶媒又は他のプロトニック溶媒に、一層よく溶解する傾向がある。他の場合には、好適な調製物は、凍結乾燥した粉末であってよく、これは、次の何れか又はすべてを含むことができる：１５０ｍＭ ヒスチジン、０．１％２％ シュークロース、及び２７％ マンニトール(４．５〜５．５のｐＨ範囲)(使用前に、緩衝液と合わせる)。
【０２９９】
配合物及び投与の技術についての更に詳細なことは、最新版のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (111)中に見出すことができる。医薬組成物を製造した後は、それらを、適当な容器に入れて、治療のために、指示された条件を記載したラベルを貼ることができる。かかるラベル表示は、投与の量、頻度、及び方法を含む。
【０３００】
乳癌に関与する遺伝子を同定するための一つのストラテジーは、病気と関係する条件下と病気と関係しない条件下とで、又は治療応答条件のコンテキストにおいて、差次的に発現される遺伝子を検出することである。下記の小区分は、かかる差次的に発現される遺伝子を検出するために利用することのできる幾つかの実験系を記載している。一般に、これらの実験系は、患者又は試料が乳癌と関連した仕方で治療される少なくとも一つの実験条件を、かかる病気関連治療を欠くか又はかかる治療に応答しない少なくとも一つの対照実験条件に加えて、含んでいる。差次的に発現される遺伝子は、下記のように、遺伝子発現のパターンを実験条件と対照用条件との間で比較することによって検出される。
【０３０１】
一度特定の遺伝子が、かかる実験を利用して同定されたならば、更に、その発現パターンを、その発現を異なる実験において研究し、発見を同定技術により確認することによって特性決定することができる。かかる多数の実験の利用は、特定の遺伝子の乳癌及びその治療における役割及び相対的重要性を識別するのに有用でありうる。乳癌患者に由来する細胞における遺伝子発現パターンをイン・ビトロ細胞培養モデルのそれらと比較することを含む組み合せたアプローチは、乳癌の発達及び／又は進行に関与する経路に対するかなりのヒントを与えることができる。それは又、ある種の治療剤(例えば、化学療法剤)に対する耐性又は無反応性の発達におけるかかる遺伝子の役割をもはっきりさせることができる。
【０３０２】
悪性新生物(特に、乳癌)に関与する差次的に発現される遺伝子の同定のために利用されうる実験の内には、シグナル変換に関与する遺伝子を分析するためにデザインされた実験がある。かかる実験は、細胞の増殖に関与する遺伝子を同定するのに役立ちうる。
【０３０３】
下記は、乳癌に関与する遺伝子の同定のために記載された方法である。かかる方法は、乳癌状態において、正常な発現と比較して又は非乳癌状態と比較して、又は臨床的観察に基づく実験操作において、差次的に発現される遺伝子を表す。かかる差次的に発現される遺伝子は、「標的」及び／又は「マーカー」遺伝子を表す。かかる差次的に発現される遺伝子の更なる特性決定のための方法、及びそれらの標的及び／又はマーカー遺伝子としての同定は、以下に与えられる。
【０３０４】
或は、差次的に発現される遺伝子は、調節された発現を有することができ、即ち、発現が、正常対乳癌状態で、又は対照用条件下対実験条件下で、定量的に、増大され又は減少される。正常対乳癌で、又は対照対実験状態で、発現が異なる程度は、標準的な特性決定技術例えば下記の差次的ディスプレー技術によって可視化されるのに十分なだけ大きいことのみが必要とされる。他の発現の差異を可視化することのできる、かかる標準的な特性決定技術には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザン分析(これらは、当業者に周知である)が含まれるが、これらに限られない。
【０３０５】
上記の実験に加えて、下記に、データの評価及び分類並びに、これまで、対照用試料のコンテキストにおいて分類されなかった生物学的試料についての応答の予測に利用することのできるアルゴリズム及び統計解析を記載する。下記の予測用のアルゴリズム及び方程式は、既に、個々の癌を細分類するそれらの力が示されている。
【実施例】
【０３０６】
実施例１
定量的な動力学的ＲＴ−ＰＣＲを利用する発現プロファイリング
遺伝子発現の、定量的ＰＣＲ法による詳細な分析のために、関心あるゲノム領域に隣接するプライマー及び中間にハイブリダイズする蛍光標識したプローブを利用することができる。PE Applied Biosystems (Perkin Elmer, 米国、カリフォルニア、Foster City在)のＰＲＩＳＭ７７００配列決定システムを利用して、蛍光レポーター染料及び消光染料の両方で標識されたオリゴヌクレオチドよりなる蛍光原プローブの技術を用いて、かかる発現の測定を行なうことができる。プローブ特異的生成物の増幅は、そのプローブの開裂を引き起こして、レポーターの蛍光の増大を生じる。プライマー及びプローブは、プライマー発現ソフトウェアを利用して選択し、殆ど、コード配列の３’領域又は３’非翻訳領域に局在した(プライマー及びプローブの配列については、表５を参照されたい)。すべてのプライマー対を、慣用のＰＣＲ反応及びゲル電気泳動により、特異性につきチェックした。試料ＲＮＡの量を標準化するために、ＧＡＰＤＨを基準として選択した(分析した試料中で差次的に調節されないので)。生物学的試料中のかかる遺伝子発現の分析を行なうために、それぞれのプライマー／プローブを、２５μｌの１００μＭ ストック溶液「アッパープライマー」、２５μｌの１００μＭ ストック溶液「ロウアープライマー」及び１２．５μｌの１００μＭ ストック溶液 ＴａｑＭａｎ−プローブ(ＦＡＭ／Ｔａｍｒａ)を混合することによって調製して、アクアデスト(プライマー／プローブ混合物)によって、５００μｌに調節する。各反応のために、患者試料の１．２５μｌのｃＤＮＡを８．７５μｌのヌクレアーゼフリーの水と混合して、９６ウェルのオプチカルリアクションプレート(Applied Biosystems Part No.4306737)の一つのウェルに加えた。次いで、１．５μｌの上記のプライマー／プローブ混合物、１２．５μｌのＴａｑ Ｍａｎ ユニバーサルＰＣＲ混合物(２×)(Applied Biosystems Part No.4318157)及び１μｌの水を加える。これらの９６ウェルプレートを、８Ｃａｐｓ／Ｓｔｒｉｐｓ(Applied Biosystems Part No.4323032)により閉じて、３分間遠心分離する。ＰＣＲ反応の測定を、製造業者の指示に従って、Applied Biosystems (No.20114)のＴａｑＭａｎ７９００ＨＴにより、適当な条件(５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で０．１５分、６０℃で１分間；を４０サイクル)下で行なう。これまでに未分類の生物学的試料の測定の前に、例えば、細胞系統、健康な対照用試料、限られた治療応答の試料による対照用実験を、実験条件の標準化のために利用することができよう。
【０３０７】
ＴａｑＭａｎによる確認実験を行なって、標的と対照の増幅の効率がほぼ等しいことを示したが、これは、当業者に公知の、比較ΔΔＣT法による遺伝子発現の比較定量には、前もって必要なことである。ここでは、ソフトウェアとして、Applied BiosystemsのＳＤＳ ２．０を、それぞれの指示に従って利用することができる。次いで、ＣＴ値を、更に、統計用ソフトウェアパッケージ(ＳＡＳ)の適当なソフトウェア(Microsoft Excel(商標))によって分析する。
【０３０８】
Perkin Elmerにより提供される上記の技術と並び、Roche Inc.のライトサイクラー(商標)又はStratagene Inc.のｉサイクラー(ＲＴ−ＰＣＲ反応のリアルタイム検出が可能)など他の技術手段も利用することができる。
【０３０９】
実施例２
ＤＮＡマイクロアレイを利用する発現プロファイリング
発現プロファイリングを、Affymetrix Array 技術を利用して、行なうことができる。ｍＲＮＡのかかるＤＮＡアレイ又はＤＮＡチップへのハイブリダイゼーションによって、各転写物の発現値を、アレイのある位置におけるシグナル強度によって同定することができる。通常、これらのＤＮＡアレイは、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はサブクローン化ＤＮＡ断片をスポットすることにより製造される。Affymetrix 技術の場合には、約４００，０００の個別のオリゴヌクレオチド配列を、シリコンウエハーの表面上で、識別できる位置で合成された。オリゴヌクレオチドの最小の長さは、１２ヌクレオチド(好ましくは、２５ヌクレオチド)であり、又は問題の転写物の全長である。発現プロファイリングは又、ナイロン又はニトロセルロース膜に結合したＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによっても行なうことができる。ハイブリダイゼーションにより引き出されるシグナルの検出は、比色、蛍光、電気化学、電子工学、光学又は放射能による読み出しの何れかによって得ることができる。アレイ構築の詳細な説明は、上で言及してあり、引用した他の発明で言及されている。染色体領域内の定量的変化及び定性的変化を測定して分析するためには、かかるゲノムの変化を含んでいると疑われる腫瘍組織からのＲＮＡを、全トランスクリプトームについての発現プロファイルに基づいて、良性の組織(例えば、乳房上皮組織、又は顕微解剖した管組織)から抽出したＲＮＡと比較しなければならない。少し改変したが、試料調製プロトコールは、Affymetrix GeneChip Expression Analysis Manual (カリフォルニア、Santa Clara在)に従った。腫瘍又は良性組織、生検、細胞分離株、又は細胞含有体液からの全ＲＮＡ抽出及び単離は、ＴＲＩゾール(Life Technologies, メリーランド、Rockville在)及びOligotex mRNA Midi キット(Qiagen, ドイツ国、Hilden在)を利用して行なうことができ、エタノール沈殿工程は、その濃度を１ｍｇ／ｍｌにするように行なうべきである。二本鎖ｃＤＮＡをSuperScriptシステム(Life Technologies)によって造るための５〜１０ｍｇのｍＲＮＡの利用。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、Ｔ７−(ｄＴ２４)オリゴヌクレオチドを利用してプライムした。このｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルムにより抽出して、エタノールにより沈殿させて、終濃度１ｍｇ／ｍｌにすることができる。この生成したｃＤＮＡから、Ｅｎｚｏイン・ビトロ転写キット(Enzo Diagnostic Inc., ニューヨーク、Farmingdale在)を利用して、ｃＲＮＡを合成することができる。同じ工程内で、このｃＲＮＡを、ビオチンヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰ及びＢｉｏ−１６−ＵＴＰ(Enzo Diagnostics Inc., ニューヨーク、Farmingdale在)で標識することができる。標識及び清浄化(Qiagen, ドイツ国、Hilden在)の後に、ｃＲＮＡを、適当な断片化用緩衝液(例えば、４０ｍＭ トリス−酢酸、ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、９４℃、３５分間)中で断片化すべきである。このAffymetrix プロトコールにより、断片化ｃＲＮＡは、約４０，０００の各プローブド転写物を含むＨＧ＿Ｕ１３３アレイＡ及びＢ上にハイブリダイズさせるべきである(４５℃のハイブリダイゼーション用オーブン中で、６０ｒｐｍで、２４時間)。ハイブリダイゼーション工程後に、チップ表面を洗浄して、ストレプトアビジンフィコエリトリン(SAPE; Molecular Probes, オレゴン、Eugene在)で、Affymetrixフルイディクスステーションにて染色しなければならない。染色を増強するために、第二の標識の工程を導入することができる(これは、推奨されるが、強制的ではない)。ここに、ＳＡＰＥ溶液は、抗ストレプトアビジンビオチン化抗体と共に、２回加えるべきである。プローブアレイに対するハイブリダイゼーションは、蛍光スキャニング(Hewlett Packard Gene Array Scanner; Hewlett Packard Corporation, カリフォルニア、Palo Alto在)によって検出することができる。
【０３１０】
ハイブリダイゼーションとスキャンの後に、マイクロアレイのイメージを、質対照につき分析して、主要なチップの欠損又は異常をハイブリダイゼーションシグナルにて探すことができる。それ故、Affymetrix GeneChip MAS 5.0 ソフトウェア又は他のマイクロアレイイメージ分析用ソフトウェアを利用することができる。一次データ分析は、製造業者により提供されたソフトウェアによって行なうべきである。
【０３１１】
この発明の一具体例における遺伝子分析の場合には、一次データを、更なる生体情報科学用ツール及び更なるフィルター基準によって分析した。この生体情報科学的分析は、以下で詳述する。
【０３１２】
実施例３
発現プロファイリング実験によるデータ分析
Affymetrix 測定技術(Affymetrix GeneChip Expression Analysis Manual, カリフォルニア、Santa Clare在)により、一チップ上での単一遺伝子発現の測定は、差の平均値及び独立した信号を生じる。各チップは、遺伝子又はｃＤＮＡクローン当たり１６〜２０のオリゴヌクレオチドプローブ対を含む。これらのプローブ対は、好ましくは、マッチしたセット及びミスマッチのセットを含み、これらの両方が、平均の差、又は発現値の計算に必要である(各プローブ対の強度の差の測定は、ミスマッチの強度を完全なマッチの強度から減算することによって計算される)。これは、プローブ対の間でのハイブリダイゼーションにおける変動性及び蛍光強度に影響しうる他のハイブリダイゼーションアーティファクトを考慮する。この平均の差は、その遺伝子の発現値を表すと仮定した数値である。この独立した信号は、値「Ａ」(非存在)、「Ｍ」(限界)、又は「Ｐ」(存在)をとることができ、単一ハイブリダイゼーションの質を示す。我々は、平均差により与えられる量的情報と独立の信号により与えられる質的情報の両方を利用して、乳癌を有する個人からの生物学的試料と正常な集団からの生物学的試料とで差次的に発現される遺伝子を同定した。このAffymetrix以外のアルゴリズムを用いて、我々は、比較したときに同じ発現値及び発現の差を表す異なる数値を得た。
【０３１３】
乳癌の群の一つにおける差次的発現Ｅを、正常集団と比較して、下記のように計算する。乳癌の集団におけるｎ個の平均の差の値ｄ1，ｄ2，．．．，ｄn及び正常な個人の集団におけるｍ個の平均の差の値ｃ1，ｃ2，．．．，ｃmが与えられたならば、それは、下記の方程式によって計算される：
【数１】
2007512804.tif 000002
もし、ｉ及びｊの一つ以上の値について、ｄj＜５０又はｃj＜５０であれば、これらの特定の値ｃi及び／又はｄjは、「人為的」発現値５０をセットされる。これらの特定のＥの計算は、ＴａｑＭａｎの結果に対する正しい比較を可能にする。
【０３１４】
遺伝子は、もし、Ｅ≧最少変化因子(表３に与えたもの)であり且つ乳癌の集団において「Ｐ」に等しい独立の信号の数が、ｎ／２より大きいならば、乳癌において、正常に対して、アップレギュレートされたと言われる。表３における因子の最少変化倍率は、所与の化学療法に応答する(ＣＲ)、施与された化学療法に応答しない(ＮＣ)患者集団又は如何なる腫瘍の病理学的兆候も有しない組織(ＮＢ)について与えられている。１より大きい変化倍率は、第一の名称の組織試料における遺伝子発現の第二の組織試料と比較しての増大を指す。この調節倍率は、平均値であり、個々に異なってよく、ここに、表１ａ及び１ｂに列記したすべての１８５の遺伝子の、クラスター分析又は本質成分分析における合わせたプロフィルは、かかる試料についての分類群を示すであろう。
【０３１５】
上記により、遺伝子は、もし、Ｅ≦最少変化倍率(表３)であり且つ乳癌の集団において「Ｐ」に等しい独立の信号の数がｎ／２より大きいならば、乳癌において、正常に対して、ダウンレギュレートされたと言われる。１より小さい値は、所与の遺伝子の減少した発現を記載する。
【０３１６】
表３に与えた最少変化倍率は、腫瘍の存在を示す遺伝子の相対的アップ及びダウンレギュレーションをも示している。これらの遺伝子は、任意の腫瘍組織の正常で健康な対応物(ＮＴ)に対する比較において、最高の増大又は減少倍率を示している(例えば、SEQ ID NO:４３、５５、６５又は１６２)。
【０３１７】
最後の差次的に調節される遺伝子の一覧表は、乳癌を有する個人からの生物学的試料対正常集団からの生物学的試料における、すべてのアップレギュレートされ及びすべてのダウンレギュレートされる遺伝子、又は個々の応答パターンよりなる。この一覧表の、診断又は医薬応用に関係する遺伝子は、最終的に、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認された(実施例１参照)。もし、発現値／転写物の振舞いの間でのよい相関が、両技術を利用して認められたならば、かかる遺伝子は、表１〜５に列記される。
【０３１８】
実施例４
差次的遺伝子発現パターンのサポートベクトルマシンを利用する分析
サポートベクトルマシン(ＳＶＭ)は、２つのクラス又は多数のクラスのパターン認識によく適している(Weston及びWatkins, 1999 (115)；Vapnik, 1995 (116)；Vapnik, 1998 (117)；Burges, 1998 (118))。
【０３１９】
２つのクラスの分類の問題のために(例えば、腫瘍組織対非腫瘍組織、又は治療応答対不応答)、我々は、一組の試料即ち下記の入力ベクトルを有するということを仮定し、
【数２】
2007512804.tif 000003
これは、下記の対応する標識を伴う
【数３】
2007512804.tif 000004
(式中、＋１及び−１は、２つのクラスを示している)。現在の腫瘍の状態又は治療剤に対するありそうな応答を記載するための表１ａ及び１ｂ又は２のマーカー遺伝子の遺伝子発現パターンを分類するために、入力ベクトルの次元は、オリゴヌクレオチドアレイ上に存在する異なるオリゴヌクレオチドの種類又はその部分集合の数と等しく、各入力ベクトルのユニットは、一つの特異的なオリゴヌクレオチドの種類のハイブリダイゼーション値を表している。
【０３２０】
このゴールは、未来の試料の分類を誤る可能性の小さな、利用可能な試料から、二元の分級器を構築すること又は決定関数を引き出すことである。
【０３２１】
ＳＶＭは、下記のアイデアを実行する：それは、入力ベクトル
【数４】
2007512804.tif 000005
を高次元の特徴空間
【数５】
2007512804.tif 000006
の中に写像し、マージン(空間Ｈ内の各クラスの、超平面と最も近いデータ点との間の距離)を最大にする最適な分離用超平面(ＯＳＨ)を構築する。ＯＳＨを、特徴空間内で陽性例を陰性例から分離することのできる多くのものの内から選択することにより、ＳＶＭは、過剰適合(overfitting)の危険を回避するであろう。
【０３２２】
異なる写像は、異なるＳＶＭを構築する。写像
【数６】
2007512804.tif 000007
は、下記の核関数(kernel function)により行なわれ
【数７】
2007512804.tif 000008
これは、空間Ｈにおける内積を定義する。
【０３２３】
ＳＶＭにより実行される決定関数は、次のように記述することができる(Burges, 1998 (118)：
【数８】
2007512804.tif 000009
(式中、係数αiは、下記の、凸二次計画法(ＱＰ)の問題を解くことにより得られる：
【数９】
2007512804.tif 000010
の最大値を求めよ、但し、下記に従うものとする
【数１０】
2007512804.tif 000011
及び
【数１１】
2007512804.tif 000012
)。
【０３２４】
一定不変(regularity)のパラメーターＣ(方程式３)は、マージンと誤分類エラーとの間の交換を制御する。
【数１２】
2007512804.tif 000013
は、対応するαiが正の場合にのみ、サポートベクトルと呼ばれる。
【０３２５】
この例で用いた２つの核関数は、下記の通りである：
【数１３】
2007512804.tif 000014
【数１４】
2007512804.tif 000015
(式中、第一式(方程式４)は、ｄ次の多項式核関数と呼ばれ、ｄ＝１の場合、線形関数となり、後のもの(方程式５)は、基礎動径関数(ＲＢＦ)核と呼ばれる)。
【０３２６】
所与のデータセットについて、唯一つの核関数と一定不変のパラメーターＣが、一つのＳＶＭを特定するように選択されなければならない。ＳＶＭは、多くの魅力的な特徴を有している。例えば、ニューラルネットワークを用いての勾配ベースのトレーニングアルゴリズムは、局所極小を保証するだけであるが、ＱＰ問題の解決は、広域で、最適化される。加えて、ＳＶＭは、大きい特徴空間を扱うことができ、マージンを制御することにより、効果的に過剰適合(上記参照)を回避することができ、情報を与える点(informative point)から出来る小さい部分集合(即ち、サポートベクトル)を自動的に同定することなどができる。
【０３２７】
生物学的試料の分類(及び、その結果の新生物病変の同定並びに遺伝子発現データに基づくかかる病変の治療剤に対する応答)は、多数のクラスの分類問題である。クラス数ｋは、腫瘍の下位分類の数に等しく(例えば、組織学的特徴、ＴＮＭステージ、等級、ホルモン状態)、ある種の治療剤に対する応答サブグループ(例えば、病理学的に確認された完全な緩解、良好な緩解、部分的緩解、又は緩解せず、並びに病気の進行)に等しく、これらは、予測されよう(即ち、これらは、トレーニングデータセット中に存在する)。現在の試料セットにおける異なるクラスの限られた数のために、我々は、多数のクラスの分類を、多元分類を一連の二元分類に還元することによって扱うことを決定した。ｋクラスの分類のためには、ｋ個のＳＶＭを構築する。ｉ番目のＳＶＭは、陽性標識を有するｉ番目のクラス内のすべての試料及び陰性標識を有する他のすべての試料により教育される。最後に、未知試料が、最高の出力値を有するＳＶＭに対応するクラスに分類される。この方法は、表１ａ及び１ｂ並びに２に与えたような差次的に発現されるマーカー遺伝子の遺伝子発現パターンについての予測／分類システムを構築するために利用される。
【０３２８】
マイクロアレイハイブリダイゼーション実験により又はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより生成される各データポイント(実施例１及び２参照)は、分析する試料中に存在するｍＲＮＡのコピー数に対応し、それらにより測定される(即ち、ポリヌクレオチドアレイ上でのｎ種類のオリゴヌクレオチドを用いる実験からは、ｎ個の発現レベル値のシリーズが得られる)。これらのｎ個の値は、典型的には、メトリクスファイルに保存する(該ファイルは、「セルファイル」のAffymetrix(登録商標)Microarray Suite 又は上記のソフトウェアによる分析の結果である)。ｍ個のメトリクスファイルのシリーズからのデータ(ｍ個の発現分析に対応する)は、発現マトリクスを築くために採用され、そこにおいて、ｍ個の列の各々は、単一実験についてのｎエレメントの発現ベクトルよりなる。ｍ個の実験の発現値を標準化するために、我々は、ｘijを、遺伝子ｊ(そのｍＲＮＡは、マイクロアレイ上に存在するｊ’型のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、又は有効なΔΔＣT強度を与える)の発現レベルａijの対数の総和であって、発現ベクトル
【数１５】
2007512804.tif 000016
が、ユークリッド長さ１を有するように標準化したものであると定義する：
【数１６】
2007512804.tif 000017
【０３２９】
初期分析を、実施例１及び２に記載の１５０の実験(トレーニングセット中の１００の実験及び試験セット中の５０の実験)についての２００００エレメントの発現ベクトルのセットを利用して行なう。
【０３３０】
これらの１５０の実験が、３つの異なる応答のクラスと２つの異なる腫瘍状態並びに腫瘍及び非腫瘍組織の情報を表すという知識を利用して、我々は、上記のＳＶＭを、それらの応答クラス及び病気上体を認識するためのトレーニングセットを用いて教育した。この試験セットを利用して、予測精度を評価した。ここに、我々は、「リーブ・ワン・アウト」法を利用するクロス確認を行い、一層厳しい試験のためには、ｎ個の相互作用(ｎ＞１００)で、４〜５倍の確認(２５％リーブ・アウト)を行なった。
【０３３１】
かかるクロス確認及び分類実験においては、表１ａ及び１ｂから選択したマーカー遺伝子の部分集合(例えば、SEQ ID NO:２７、３８、５５、８１、９７、９８)の予測力を試験した。平均のクロス確認エラー率は、下記のように親和性レベルを伴って、８．３３３％であった：
組織試料    真の応答  予測されたＣＲ  予測されたＮＣ
試料＿１    ＣＲ        ０．９１４１  −０．９１４１
試料＿２    ＣＲ          １．２８１    −１．２８１
試料＿３    ＣＲ          １．１４９    −１．１４９
試料＿４    ＣＲ        ０．３９８７  −０．３９８７
試料＿５    ＣＲ        ０．２１８２  −０．２１８２
試料＿６    ＣＲ        ０．７１２７  −０．７１２７
試料＿７    ＮＣ        −１．１２４      １．１２４
試料＿８    ＮＣ        −１．４９２      １．４９２
試料＿９    ＮＣ        −１．８９６      １．８９６
試料＿１０  ＮＣ          ０．４７５    −０．４７５
試料＿１１  ＮＣ        −１．９６２      １．９６２
試料＿１２  ＮＣ      −０．７５５７    ０．７５５７
【０３３２】
一つの試料の誤分類は、表１ａ及び１ｂからの一層多くのマーカー遺伝子の追加によって補正することができる。これらのデータは、予測用アッセイ又はキットのために組み合わせることのできるマーカー遺伝子の最少数を示している。
【０３３３】
実施例５
不応答性腫瘍試料の予測を最適化するために、トレーニング集団に由来するこのクラスを利用して、多重統計試験(グループの比較に適した、ｔ検定又はウィルコクソンなどの試験)を行なうことができる。表６に列記したように、不応答性腫瘍組織において差次的発現を、０．０５より小さい有意レベル(ｐ値)で有する遺伝子を同定することができる。表６においては、低いｐ値及び２つのクラス間での高い発現変化倍率の基準を満たす２０の遺伝子が選択されている。
【０３３４】
表２で最も好適として選択された遺伝子リストを表１ｂからの遺伝子と組み合わせて、これまで未分類であった任意の試料について分類実験を実施して、化学療法に対する応答を予測することができる。
【０３３５】
実施例４に記載のアルゴリズムをある核において実行して、試料を、それらの特異的な遺伝子発現に従って、２つのクラスに分類することができるが、別のアプローチを採用して、ｋ−ＮＮ分類の実行によって、クラス帰属関係を予測することもできる。T.M. Cover及びP.E. Hartにより提案されたｋ−ニアレストネイバー(ｋ−ＮＮ)法は、ノンパラメトリック分類への重要なアプローチであり、極めて容易且つ効率的である。部分的に、完全な数学的理論の故に、ＮＮ法は、幾つかの変法へと発展している。我々の知る限りでは、もし我々が無数に多くの試料点を有するならば、その密度は、実際の密度関数への収束を評価する。この分級器は、大規模な試料が与えられれば、ベイズの分級器となる。しかし、実践において、小さい試料が与えられたならば、ベイズの分級器は、通常、ベイズのエラーを、特に高次元空間において見積もることができない(次元の災難という)。それ故、ｋ−ＮＮ法では、非常に残念なことに、試料空間が十分大きくなければならない。
【０３３６】
ｋ−ニアレストネイバー分類においては、トレーニングデータセットを利用して、「標的」データセットの各メンバーを分類する。このデータの構造は、関心ある一つの分類(範疇)変数(例えば、「応答者」(ＣＲ)又は「非応答者」(ＮＣ))があり、幾つかの追加の予測者変数(遺伝子発現」値)があるというものである。一般的に、このアルゴリズムは、下記の通りである：
１．分類すべきデータセット中の各試料について、トレーニングデータセットのｋニアレストネイバーを配置する。ユークリッド距離の測定を利用して、このトレーニングセットの各メンバーが試験される標的試料にどれだけ近いかを計算する。
２．ｋニアレストネイバーを調べる(それらの殆どは、どの分類に属するか？)。このカテゴリーを試験する試料に割り当てる。
３．この手順を、標的セット中の残りの試料について反復する。
【０３３７】
勿論、計算時間は、ｋが増すにつれて増大するが、長所は、一層大きいｋ値は、トレーニングデータ中のノイズに対する脆弱性を減じる平滑化を与えることである。実際の適用においては、ｋは、典型的には、数百、数千ではなく、数個又は数十個である。
【０３３８】
この「ニアレストネイバー」は、考慮されるベクトル及び距離測定が与えられれば、測定される。ある数の試料についての発現値のトレーニングセットを与えれば、
【数１７】
2007512804.tif 000018
であり、これは、入力ベクトル
【数１８】
2007512804.tif 000019
のクラスを決定する。
【０３３９】
最も特殊なケースは、ｋ＝１の場合のｋ−ＮＮ法であり、これは、正に、一つの隣りのものを探し：
【数１９】
2007512804.tif 000020
であるならば、
【数２０】
2007512804.tif 000021
が、解である。
【０３４０】
この分類のエラー率の評価のために、下記の考察を行なうことができよう：
トレーニングセット
【数２１】
2007512804.tif 000022
は、ｋ−ＮＮ法のエラー率がｄ％(ここに、ｄ％は、独立の実験からの経験エラーである)であるならば、(ｋ，ｄ％)安定と呼ばれる。もしデータのクラスター化が全く異なる(クラスの距離が、分類の決定的基準である)ならば、そのｋは、小さくなければならない。この鍵となるアイデアは、我々は、ｄ％が閾値より大きいの場合に、最小のｋを好むということである。
【０３４１】
このｋ−ＮＮ法は、最も近いｋのものを集めてそれらに投票させて、最も近いクラスを勝ちとする。理論的には、一層近ければ、エラーの起きる率も一層小さくなると我々は考える。一般的なケースは、もう少し複雑である。しかし、想像力によって、
Ｎを固定したならば、ｋが大きいほど、Ｐベイズに漸近する上限が低い
というのは、真である。
【０３４２】
かかるアルゴリズムを利用して、表１ａ及び１ｂ中にこの発明により与えられた遺伝子に基づいて、試料の所与の集団を分類してクロス確認することができる。最も好ましくは、この分類は、表２からの遺伝子と組み合せた表１ｂに与えられた遺伝子の発現レベルに基づいて行なわれる。ｋ＝３且つ＞１００反復の場合、３つのクラス「正常乳房組織」(癌に冒されていない)、不応答性腫瘍(ＮＣ)、及び応答性腫瘍(ＣＲ)の、クロス確認実験のために以下に描いたような分類を得ることができる。親和性は、所与のクラスについて、−１から１に及んでいる。
組織試料    真の  予測された正常な  予測されたＮＣ  予測されたＣＲ  備考
応答  乳房
「正常」組織                      １        −０．５        −０．５
試料＿１      ＣＲ    −０．４９９４        −０．５    ０．９９９４
試料＿２      ＣＲ    −０．４９８８        −０．５    ０．９９８８
試料＿３      ＣＲ    −０．４９８８        −０．５    ０．９９８８
試料＿４      ＣＲ          −０．５        −０．５              １
試料＿５      ＣＲ    −０．４９８８        −０．５    ０．９９８８
試料＿６      ＣＲ          −０．５        −０．５              １
試料＿７      ＣＲ          −０．５  −０．４９８８    ０．９９８８
試料＿８      ＣＲ    −０．４８８３  −０．４６４９    ０．９５３２
試料＿９      ＮＣ      −０．４９７      ０．９９７        −０．５
試料＿１０    ＮＣ    −０．４９６９    ０．９９６９        −０．５
試料＿１１    ＮＣ    −０．４９７５    ０．９９７５        −０．５
試料＿１２    ＮＣ    −０．４９８２    ０．９９８２        −０．５
試料＿１３    ＮＣ                １        −０．５        −０．５  低い腫瘍％
試料＿１４    ＮＣ          −０．５  −０．４９８８    ０．９９８８  偽
試料＿１５    ＮＣ    −０．４９７６    ０．９９７６        −０．５
試料＿１６    ＮＣ    −０．４９７６    ０．９９７６        −０．５
【０３４３】
一つの試料の誤分類は、表１ａからの一層多くのマーカー遺伝子の追加によって補正することができる。これらのデータは、予測用アッセイ又はキットに組み合せることのできるマーカー遺伝子の最少数を示している。
【０３４４】
実施例６
化学療法に対する応答について、表１ａ及び１ｂに列記した遺伝子の発現レベルに基づいて最も正確な予測を得るために、応答性腫瘍(ＣＲ)のクラスに対する最高の親和性を有する第一の個人(腫瘍組織)を同定する段階的分類モデルを実行することができる(例えば、ｋ−ＮＮ分類により)。もしこれまで未分類の腫瘍試料が、ＣＲのクラスに属しなかったならば、第二の分類ステップを、ｋ−ＮＮ分類において、不応答性腫瘍の部分的に応答するものからのより良い分離を与える表１ａからの遺伝子(例えば、SEQ ID NO:２、８、９、２１、２４、３５、５３、５４、５７、６４、８０、８７、８９、９５、９７、１１８及び１４６)の発現レベルを利用して行なうことができる。この第二の分類ステップのためには、予め定めたクラスＮＣ及びＰＲのみを利用すべきである。
【０３４５】
参考文献
引用した特許
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米国特許第５，２６２，３１号          Liang, P.及びPardee, A.B., 1993
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米国特許第５，６３１，７３４号
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米国特許第５，９７６，８１３号        Beutel等
米国特許第５，２８３，３１７号
米国特許第６，２０３，９８７号
【０３４６】
ＷＯ９７／２９２１２
ＷＯ９７／２７３１７
ＷＯ９５／２２０５８
ＷＯ９９／１２８２６
ＷＯ９７／０２３５７
ＷＯ９４／１３８０４
ＷＯ９４／１０３００
ＥＰ０ ７８５ ２８０
ＥＰ０ ７９９ ８９７
ＥＰ０ ７２８ ５２０
ＥＰ０ ７２１ ０１６
ＥＰ０ ３２１ ２０１
ＧＢ２１８８６３８Ｂ
【０３４７】
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【０３４８】
【表１】
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【０３４９】
【表２】
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【０３５０】
【表３】
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【０３５１】
【表４】
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【０３５２】
【表５】
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【０３５３】
【表６】
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【０３５４】
【表７】
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【０３５５】
【表８】
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【０３５６】
【表９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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