(57)【要約】  単離または精製の工程中、比酵素活性を初期の安定化された活性に比較して５０％以上損失せずに、摂氏−２０〜４度で少なくとも１週間保存可能なように、安定化種の添加により安定化されることが特徴の、単離または精製されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼ。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離または精製の工程中、初期の安定化された活性に比較して比酵素活性が５０％を越えて損失することなく、摂氏−２０〜４度で少なくとも１週間保存可能なように、安定化種の添加により安定化されることを特徴とする、単離または精製されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼ。
【請求項２】
スタフィロコッカス・アウレウスキナーゼである、請求項１に記載のＵＭＰキナーゼ。
【請求項３】
安定化種がＵＴＰもしくはＧＴＰまたはそれらの機能的類似体から選択される、請求項１または請求項２に記載のＵＭＰキナーゼ。
【請求項４】
安定化種が少なくとも１００マイクロモルの濃度で存在し、そしてキナーゼが２００％までの等価濃度で存在する、請求項３に記載のＵＭＰキナーゼ。
【請求項５】
バッファー中で少なくとも２００マイクロモルの濃度で可溶性であるように安定化される、単離または精製されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼ。
【請求項６】
キナーゼのヘキサマーとして特徴付けられる、安定化されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼ。
【請求項７】
ＵＴＰまたはＧＴＰをＵＭＰキナーゼ酵素に添加することを含む、前記酵素を安定化する方法。
【請求項８】
対応する非‐活性化キナーゼの比活性に比較して、少なくとも２倍以上である比活性を有するキナーゼを提供するために、活性化種の添加により活性化されることを特徴とする、単離または精製されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼ。
【請求項９】
ＵＭＰキナーゼが非‐活性化キナーゼの比活性に比較して、少なくとも３倍以上の比活性を有する酵素を提供するために活性化される、請求項８に記載の前記キナーゼ。
【請求項１０】
Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼである、請求項８または９に記載のＵＭＰキナーゼ。
【請求項１１】
活性化種がＧＴＰもしくはＡＴＰまたはそれらの機能的類似体である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＵＭＰキナーゼ。
【請求項１２】
活性化種がＧＴＰまたはその機能的類似体である、請求項８または請求項９に記載のＵＭＰキナーゼ。
【請求項１３】
ＧＴＰまたはＡＴＰが１００〜２０００マイクロモルの濃度で存在し、そしてＵＭＰキナーゼが５０％以下の等価濃度で存在する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の前記キナーゼ。
【請求項１４】
ＵＭＰキナーゼ酵素にＧＴＰまたはＡＴＰを添加することを含む、前記酵素を活性化する方法。
【請求項１５】
１以上のバッファー、ヌクレオチド、グリセロール、および還元剤と一緒に請求項１〜６のいずれか１項に記載のＵＭＰキナーゼを含む貯蔵溶液であって、構成後、比酵素活性が５０％を越えて損失せずに摂氏−２０〜４度で少なくとも１週間保存可能な前記溶液。
【請求項１６】
１以上のバッファー、塩、ヌクレオチド、および界面活性剤と一緒に請求項８〜１３のいずれか１項に記載のＵＭＰキナーゼを含む希釈標準溶液であって、構成後、比酵素活性が５０％を越えて損失せずに摂氏４〜２５度で１２時間保存可能な前記溶液。
【請求項１７】
比酵素活性の損失が２０％以下である、請求項１６に記載の希釈標準溶液。
【請求項１８】
ＡＴＰのγ‐ホスフェートのＵＭＰへの移動を触媒してＡＤＰおよびＵＤＰを産生するための、請求項８〜１３または１６〜１７のいずれか１項に記載の活性化されたＵＭＰキナーゼの使用を含む、薬物発見アッセイ。
【請求項１９】
アッセイのＡＤＰおよびＵＤＰ生成物が直接検出される、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
ピルベートキナーゼ／ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＰＫ／ＬＤＨ）カップリング反応およびＮＡＤＨからＮＡＤ＋への変換の測定を含む、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
ｐＨ７〜８で実施される、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２２】
ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳバッファーまたはＢｒｉｊ‐３５中で実施される、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２３】
摂氏２０〜３０度で実施される、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２４】
ＵＭＰキナーゼ濃度０．１〜３００ｎＭで実施される、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２５】
摂氏−２０度で液相である、請求項１５に記載の保存溶液。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はヌクレオシドモノホスフェートキナーゼ、およびとりわけそれらの精製、安定化およびキナーゼ阻害剤を同定するための薬物スクリーニングにおける使用に関する。
ヌクレオシドモノホスフェートキナーゼは核酸、各種の重要なヌクレオチド中間体の生合成、およびエネルギー代謝において必要とされる。このキナーゼファミリーの一メンバーであるウリジン５′‐モノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼ（ＰｙｒＨ）は、アデノシン５′‐トリホスフェート（ＡＴＰ）のγ‐ホスフェートのＵＭＰへの移動を触媒して、アデノシン５′‐ジホスフェート（ＡＤＰ）およびウリジン５′‐ジホスフェート（ＵＤＰ）を産生し、この機能は細胞生存に必須である。細菌における特有の側面は、それらが別個のＵＭＰおよびシチジン５′‐モノホスフェート（ＣＭＰ）キナーゼを有することであるが、哺乳動物および多くの高等真核生物は両方の機能を果たす単一の酵素を有する。これらの酵素は配列相同性をほとんど共有せず、細菌のＰｙｒＨ酵素は特有の構造および酵素学的特徴を有する。該酵素は遍在し、すべての主要な病原細菌に見出される。この酵素の特質およびその広い分布は、それを抗菌剤による介入のための理想的な標的とする。
【０００２】
ＷＯ‐９９／５５７２９、ＷＯ‐２００１／１２６７８および対応する米国特許第６４０３３３７号は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．アウレウス）由来のｐｙｒＨ遺伝子配列を開示する。
【０００３】
本発明者らはＳ．アウレウスＵＭＰキナーゼ（ＰｙｒＨ）をクローニング、および精製し、アミノ酸配列は以後Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．２と記載する。この遺伝子の公開されたアミノ酸配列と比較した場合、それは第１アミノ酸としてのメチオニンを欠如する。本発明者らは理論に束縛されることを望まないが、たとえば薬物スクリーニングアッセイに使用される場合、このことは該酵素の特性に少しも影響を与えないと考えられる。
【０００４】
本発明者らは、Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼの精製中に、可溶性で安定または活性な酵素を提供するために、精製手順にヌクレオシドまたはヌクレオチドを添加することが必要であることを見出した。とりわけ、本発明者らはウリジン５′‐トリホスフェート（ＵＴＰ）の添加が、高濃度で可溶性の安定な蛋白質を生じることを見出した。また、本発明者らは、グアノシン５′‐トリホスフェート（ＧＴＰ）および他のヌクレオチド、たとえばＡＴＰが酵素を安定化、および／または活性化するために重要であり、そして活性のアロステリック様調節因子として作用することを見出した。
【０００５】
これらの発見は先行技術では予想されていない。米国特許出願２００２／０１１９５０６は、３種のバチルス属、すなわち、Ｂ．サチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（グラム陰性）、Ｍ．ツベルクローシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（抗酸性）およびＨ．インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（グラム陰性）由来のＵＭＰキナーゼのクローニングおよび単離を開示する。該出願はＢ．サチリス酵素のＧＴＰ活性化およびＵＴＰ不活性化を報告する。３種すべてに対するＧＴＰ活性化の程度は、Ｍ．ツベルクローシスでは２倍、Ｈ．インフルエンザでは３倍、そしてＢ．サチリスでは１０〜２０倍変動する。しかし、そのような影響は種特異的であると考えられる、すなわち、他の酵素が著しい活性化を示すという予想はない。とりわけ、グラム陽性スタフィロコッカスＵＭＰキナーゼの性質に関しては何ら示されていない。
【０００６】
したがって、本発明の第１の側面において、本発明者らは、単離または精製の工程中に、該酵素が比酵素活性を初期の安定化された活性に比較して５０％を越えて損失せずに摂氏−２０〜４度で少なくとも１週間保存可能なように、安定化種の添加により安定化されることが特徴の、単離または精製されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼを提供する。
【０００７】
安定化は、好都合には蛋白質を分解、改変または凝集から保護することによりもたらされる。該酵素は、好都合にはＵＴＰもしくはＧＴＰ、またはそれらの機能的類似体のような安定化種の使用により安定化される。
【０００８】
ＵＴＰのような安定化種の濃度は、好都合には少なくとも１００マイクロモルであり、該キナーゼは２００％等価濃度までの濃度で存在する。
さらに高濃度のＵＴＰを使用してもよいが、実用的な目的には５ミリモルを超える必要性はないであろう。理論に限定されることを望まないが、本発明者らは、たとえば基質（ＵＭＰおよびＡＴＰ）結合部位とは異なる結合部位を占有することによってＵＴＰがＵＭＰキナーゼを安定化すると考える。ＵＴＰまたはＧＴＰの“機能的類似体”という語により、本発明者らは同じ結合部位を認識し、結合する種を意味する。そのような種には、限定的でない例として、ヌクレオチド類似体、たとえば２′‐フルオロ‐ウリジン５′‐トリホスフェート、グアノシン５′［ガンマ‐チオ］‐トリホスフェート、および２′/３′‐Ｏ‐（Ｎ‐メチル‐アントラニロイル）‐グアノシン‐５′‐トリホスフェートを挙げることができる。
【０００９】
該酵素はいずれか都合のよいスタフィロコッカス、たとえば、Ｓ．アエロゲネス（ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウリクラリス（ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．アルレッタ（ａｒｌｅｔｔａｅ）、Ｓ．カピチス（ｃａｐｉｔｉｓ）、Ｓ．カピチス亜種ウレオリチクス、Ｓ．カプラ（ｃａｐｒａｅ）、Ｓ．カルノスス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）亜種カルノスス、Ｓ．クロモゲネス（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．コーニイ（ｃｏｈｎｉｉ）亜種コーニイ、Ｓ．コーニイ亜種ウレアリチクム（ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｓ．コンジメンチ（ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ）、Ｓ．デルフィニ（ｄｅｌｐｈｉｎｉ）、Ｓ．エピデルミジス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．エクオルム（ｅｑｕｏｒｕｍ）、Ｓ．フェリス（ｆｅｌｉｓ）、Ｓ．フレウレッチ（ｆｌｅｕｒｅｔｔｉ）、Ｓ．ガリナルム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｓ．ヘモリチクス（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ホミニス（ｈｏｍｉｎｉｓ）亜種ホミニス、Ｓ．ホミニス亜種ノボビオセプチクス（ｎｏｖｏｂｉｏｓｅｐｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ヒイクス（ｈｙｉｃｕｓ）、Ｓ．インテルメジウス（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｓ．クロオシイ（ｋｌｏｏｓｉｉ）、Ｓ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｓ．ルグデュネンシス（ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ルトラ（ｌｕｔｒａｅ）、Ｓ．ムスカ（ｍｕｓｃａｅ）、Ｓ．オビス（ｏｖｉｓ）、Ｓ．パステウリ（ｐａｓｔｅｕｒｉ）、Ｓ．ピスシフェルメンタンス（ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｓ．プルベレリ（ｐｕｌｖｅｒｅｒｉ）、Ｓ．サッカロリチクス（ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．サプロフィチクス（ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．シュレイフェリ（ｓｈｌｅｉｆｅｒｉ）、Ｓ．シュレイフェリ亜種コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｓ．シウリ（ｓｃｉｕｒｉ）亜種カルナチクス（ｃａｒｎａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．シウリ亜種ロデンチウム（ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、Ｓ．シウリ亜種シウリ、Ｓ．シムランス（ｓｉｍｕｌａｎｓ）、Ｓ．スクシヌス（ｓｕｃｃｉｎｕｓ）、Ｓ．ビツルス（ｖｉｔｕｌｕｓ）、Ｓ．ワルネリ（ｗａｒｎｅｒｉ）、Ｓ．キシロスス（ｘｙｌｏｓｕｓ）の中の任意の１種のＵＭＰキナーゼであり、そしてとりわけＳ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来のものである。
【００１０】
本発明者らは“安定化”という語により、比活性がある期間にわたり過度に低下せずに、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおける使用に適切な状態のままであるような形態で、ＵＭＰキナーゼ酵素が提供されることを意味する。とりわけ、それは比酵素活性を初期の安定化された活性に比較して５０％を越えて損失せずに、摂氏−２０〜４度で少なくとも１週間保存可能である。
【００１１】
本発明者らは、Ｓ．アウレウス由来の安定化されたＵＭＰキナーゼ酵素が分子量約１５６０００のヘキサマーであることを認めている。したがって、本発明の別の側面において、本発明者らはキナーゼのヘキサマーであることが特徴の、安定化されたＵＭＰキナーゼを提供する。
【００１２】
安定化された酵素は好都合には、１以上のバッファー、ヌクレオチド、グリセロール、および還元剤から構成される保存溶液として提供される。該溶液は都合のよいバッファー、好ましくはＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくはｐＨ８．０〜８．５を含有してよい。さらに、該溶液は、少なくとも５０％の酵素対ヌクレオチド比に相当する、０．５〜２ミリモルの濃度でヌクレオチド、好ましくはＵＴＰを含有する。また、該溶液はグリセロール（１０％〜５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１００〜２５０ミリモルの塩化ナトリウムまたは類似の塩および１００マイクロモル〜５ミリモルの濃度の還元剤、たとえばジチオスレイトールを含有する。
【００１３】
上記の特性を理解した上で、本発明者らはＵＭＰキナーゼ酵素の阻害剤を同定し、そして特徴を明らかにするアッセイを考案している。そのようなアッセイは、ＵＭＰキナーゼ酵素の活性化された形態を使用する。
【００１４】
したがって、本発明の別の側面において、本発明者らは対応する非‐活性化キナーゼの比活性に比較した場合、少なくとも２倍以上の比活性をもつキナーゼを提供するために、活性化種の添加により活性化されることが特徴の、単離または精製されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼを提供する。
【００１５】
活性化種は、好都合にはＧＴＰまたはＡＴＰであるか、またはいずれかの種の機能的類似体である。ヌクレオシドトリホスフェート（複数のヌクレオシドトリホスフェート）は好都合には、１００〜１０００マイクロモルで存在し、そしてキナーゼは５０％以下の等価濃度で存在する。
【００１６】
該酵素はいずれか都合のよいスタフィロコッカス、たとえば、Ｓ．アエロゲネス（ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウリクラリス（ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．アルレッタ（ａｒｌｅｔｔａｅ）、Ｓ．カピチス（ｃａｐｉｔｉｓ）、Ｓ．カピチス亜種ウレオリチクス、Ｓ．カプラ（ｃａｐｒａｅ）、Ｓ．カルノスス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）亜種カルノスス、Ｓ．クロモゲネス（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．コーニイ（ｃｏｈｎｉｉ）亜種コーニイ、Ｓ．コーニイ亜種ウレアリチクム（ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｓ．コンジメンチ（ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ）、Ｓ．デルフィニ（ｄｅｌｐｈｉｎｉ）、Ｓ．エピデルミジス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．エクオルム（ｅｑｕｏｒｕｍ）、Ｓ．フェリス（ｆｅｌｉｓ）、Ｓ．フレウレッチ（ｆｌｅｕｒｅｔｔｉ）、Ｓ．ガリナルム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｓ．ヘモリチクス（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ホミニス（ｈｏｍｉｎｉｓ）亜種ホミニス、Ｓ．ホミニス亜種ノボビオセプチクス（ｎｏｖｏｂｉｏｓｅｐｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ヒイクス（ｈｙｉｃｕｓ）、Ｓ．インテルメジウス（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｓ．クロオシイ（ｋｌｏｏｓｉｉ）、Ｓ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｓ．ルグデュネンシス（ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ルトラ（ｌｕｔｒａｅ）、Ｓ．ムスカ（ｍｕｓｃａｅ）、Ｓ．オビス（ｏｖｉｓ）、Ｓ．パステウリ（ｐａｓｔｅｕｒｉ）、Ｓ．ピスシフェルメンタンス（ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｓ．プルベレリ（ｐｕｌｖｅｒｅｒｉ）、Ｓ．サッカロリチクス（ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．サプロフィチクス（ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．シュレイフェリ（ｓｈｌｅｉｆｅｒｉ）、Ｓ．シュレイフェリ亜種コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｓ．シウリ（ｓｃｉｕｒｉ）亜種カルナチクス（ｃａｒｎａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．シウリ亜種ロデンチウム（ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、Ｓ．シウリ亜種シウリ、Ｓ．シムランス（ｓｉｍｕｌａｎｓ）、Ｓ．スクシヌス（ｓｕｃｃｉｎｕｓ）、Ｓ．ビツルス（ｖｉｔｕｌｕｓ）、Ｓ．ワルネリ（ｗａｒｎｅｒｉ）、Ｓ．キシロスス（ｘｙｌｏｓｕｓ）の中の任意の１種のＵＭＰキナーゼであり、そしてとりわけＳ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来のものである。
【００１７】
活性化酵素は好都合には希釈標準溶液として提供される。該希釈標準溶液は１以上のバッファー、塩、ヌクレオチド、および界面活性剤を含んでいてよい。希釈標準溶液は、いずれか都合のよいｐＨ（ｐＨ６〜ｐＨ９）、好ましくはｐＨ７〜ｐＨ８で、いずれか都合のよいバッファーＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはグリシン、好ましくはＨＥＰＥＳまたはＰＩＰＥＳバッファーを含んでいてよい。該溶液は１以上の塩、たとえばＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、および／またはＭｇＣｌ２（それらに限定されない）を含んでいてよい。また希釈標準溶液は、界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤、たとえばＢｒｉｊ３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｗｅｅｎ２０を臨界ミセル濃度に近いか、またはそれ以下の濃度で含んでいてよい。さらに、ヌクレオチド、好ましくはＧＴＰおよび／またはＡＴＰが添加され、好都合には１００〜１０００マイクロモルの濃度で存在し、そしてキナーゼは５０％以下の等価濃度で存在する。
【００１８】
本発明の別の側面において、本発明者らは本発明の活性化されたスタフィロコッカスＵＭＰキナーゼを使用する薬物発見アッセイを提供する。
活性化されたＵＭＰキナーゼは、好都合には、たとえば安定化種の置換により、本発明の安定化されたＵＭＰキナーゼから製造することができる。限定的でない例としては、該酵素は５μＭ〜５ｍＭ  ＧＴＰもしくは５μＭ〜５ｍＭ  ＡＴＰ、またはこれらのヌクレオチドの任意の組み合わせを含有する希釈標準溶液に希釈される。これはたとえばＰｙｒＨ酵素より４０００倍〜４，０００，０００倍のモル過剰を提供する。少なくとも８０，０００倍過剰のＧＴＰの使用が好ましい。摂氏−８０〜−３０度における安定化は、保存溶液成分を改変することにより達成することができる。
【００１９】
アッセイは好都合には、ピルベートキナーゼ／ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＰＫ／ＬＤＨ）カップリング反応を含有する。これにより、ピルベートキナーゼはＵＭＰキナーゼ反応の生成物、ＡＤＰおよびＵＤＰを、ホスホエノールピルベートと一緒に、ＡＴＰ、ＵＴＰおよびピルベートに変換する。第２のカップリング酵素、ラクテートデヒドロゲナーゼはピルベートをラクテートに、そしてＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換する。ＮＡＤ＋に変換下際のＮＡＤＨ濃度の低下は、吸光度または蛍光のいずれかによる分光光度測定によりモニターすることができる。１モルのＵＭＰ消費の結果、２モルのＮＡＤ＋が産生される。
【００２０】
アッセイは任意の都合のよいｐＨ（ｐＨ６〜ｐＨ９）で行われ、好ましくはｐＨ７〜８で行われる。
アッセイは任意の都合のよいバッファー、たとえばＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはグリシン中で行われ、好ましくはＨＥＰＥＳまたはＰＩＰＥＳバッファー中で行われる。界面活性剤（Ｂｒｉｊ‐３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｗｅｅｎ２０）が添加され、反応容器またはピペットチップに蛋白質が張り付くのを妨げる。０．０１％ｖ／ｖの濃度のＢｒｉｊ‐３５が好ましい界面活性剤である。
【００２１】
アッセイは任意の都合のよい温度（摂氏１５〜３０度）で行われ、そして好ましくは摂氏２０〜３０度の温度、とりわけ室温（摂氏１８〜２５度、たとえば約摂氏２２度）で行われる。
アッセイは０．１〜３００ｎＭのような任意の都合のよいＵＭＰキナーゼ濃度、たとえば約１．３ｎＭで行われる。
アッセイで使用されるＵＭＰキナーゼは、好都合には５０ｕＭ〜１０ｍＭ  ＧＴＰ、好ましくは５ｍＭ  ＧＴＰの濃度でＧＴＰにより安定化される。
【００２２】
本発明はここで以下の実施例、配列リストおよび図面を参照することによって説明されるが、それらに限定されない。
【００２３】
実施例
Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼ（ｐｙｒＨ）のクローニング
Ｓ．アウレウスｐｙｒＨは菌株６０１０５５からクローニングされた。プライマーＩＮＦ５１７４（５′）およびＩＮＦ５１８３（３′）を使用してＳ．アウレウス６０１０５５の細胞溶解物由来のＳ．アウレウスｐｙｒＨＰＣＲ生成物を得た。
【００２４】
【化１】
2007500512.tif 000003
【００２５】
ＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ精製キットを使用して精製し、ＴＯＰＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎクローニングベクターに連結した。連結生成物は、製造業者が推奨する方法に従ってＴＯＰＯ細胞に形質転換された。形質転換体は推奨方法に従って選択され、プラスミドはＱｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して回収された。適切なサイズのＤＮＡインサートの存在は、ＢａｍＨ１およびＮｄｅ１制限酵素による消化により確認された。Ｓ．アウレウスＰｙｒＨを含有する、適切なサイズのインサートを持つクローンが選択され、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡが調製された。インサートの存在はＢａｍＨ１／Ｎｄｅ１消化により再確認された。インサートは配列決定され、その同一性を確認された。
【００２６】
Ｓ．アウレウスＰｙｒＨインサートは大腸菌ｐＴ７３．３にクローニングされ、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された。これらの細胞はテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中、３０℃で培養され、発現は最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することにより誘導された。誘導された細胞は、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された見かけの分子量２６，０００（そのペプチドに対して予想されるサイズと一致する）を持つ蛋白質を発現した。細胞ペーストは遠心分離により集め、使用するまで−２０℃で保存した。
【００２７】
Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼ（ＰｙｒＨ）の精製
凍結した細胞ペーストは５０ｍｌの溶解バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１プロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）］に懸濁した。１８，０００ｐｓｉで操作されたＦｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓに細胞を２回通過させることにより細胞を破壊し、粗抽出物は２０，０００ｒｐｍ（４５Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）、３０分間、４℃で遠心分離した。上清は、バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＵＴＰ）で予め平衡化した２０ｍｌ  Ｑ−セファロースＨＰ（ＨＲ１６／１０）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流速１．５ｍｌ／分で載せた。その後カラムをバッファーＡで洗浄し、蛋白質をバッファーＡ中、０〜１ＭのＮａＣｌ直線勾配溶出により溶出した。ＰｙｒＨを含有する画分をプールし、固体（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．４ｇ／ｍｌ）を添加してすべての蛋白質を沈殿させ、氷上で１時間混合した。試料は１１，０００ｒｐｍ（ＪＡ１２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）、３０分間、４℃で遠心分離し、ペレットは５ｍｌのバッファーＡに溶解した。５ｍｌの試料は、バッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で予め平衡化した３２０ｍｌ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（ＨＲ２６／６０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流速０．５ｍｌ／分で載せた。ＰｙｒＨを含有する画分をプールし、１Ｌ  貯蔵バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＵＴＰ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２０％  グリセロール）に対して透析した。蛋白質は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析および分析用ＬＣ−ＭＳにより性状を解析した。決定された該蛋白質の質量は、ＤＮＡ配列から予測されたポリペプチドのＮ−末端メチオニンが存在しないことを示唆した
【００２８】
【化２】
2007500512.tif 000004
【００２９】
蛋白質は−８０℃で保存した。
スタフィロコッカス・アウレウスＵＭＰキナーゼ（ＰｙｒＨ）のアッセイ
ＵＭＰキナーゼはＡＴＰのガンマホスフェートのＵＭＰへの移動を触媒し、結果として２種の生成物、ＡＤＰおよびＵＤＰが形成される。この活性は、ピルベートキナーゼ／ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＰＫ／ＬＤＨ）カップリング反応を使用してモニターすることができる。ピルベートキナーゼはＵＭＰキナーゼ反応の生成物、ＡＤＰおよびＵＤＰを、ホスホエノールピルベートと一緒に、ＡＴＰ、ＵＴＰおよびピルベートに変換する。第２のカップリング酵素、ラクテートデヒドロゲナーゼはピルベートをラクテートに、そしてＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換する。ＮＡＤ＋に変換した際のＮＡＤＨ濃度の低下は、吸光度または蛍光のいずれかによる分光光度測定によりモニターすることができる。１モルのＵＭＰ消費の結果、２モルのＮＡＤ＋が生成されることに注意すべきである。
【００３０】
アッセイを実行するために、反応物が最終濃度５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６．６ユニット／ｍＬ  ＰＫ／ＬＤＨ、０．４ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１．２９μＭ  Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼ、０．５ｍＭ  ＧＴＰおよび０．００１％  Ｂｒｉｊ‐３５を含有するように、１．６７Ｘアッセイバッファー保存溶液が調製された。この混合物への添加前に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＧＴＰ、０．０１％  Ｂｒｉｊ‐３５中に１２．９ｎＭのＳ．アウレウスＵＭＰキナーゼ溶液を含有する１０Ｘ  酵素希釈標準溶液を調製し、室温で１５分間インキュベーションした。アッセイプレートは、適切な容量の１．６７Ｘアッセイバッファー保存溶液を反応容器に分注し、化合物ＤＭＳＯ保存溶液を添加し、そして試薬を平衡化させるため、少なくとも１５分間室温でインキュベーションすることにより調製した後、３．３３ＸのＵＭＰ保存溶液により反応を開始した。たとえば、１００μＬの反応容積では、ＤＭＳＯ中の５０Ｘ化合物２μＬを１．６７Ｘバッファー／酵素混合物６０μＬに添加し、回転振とうまたはピペッティングのいずれかにより混合した。適切なインキュベーション時間後、反応は４０μＬの０．６７ｍＭ  ＵＭＰ（最終濃度は０．２ｍＭであった）の添加により開始した。使用した対照は、２％  ＤＭＳＯ（阻害なし）および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（１００％  阻害）であった。アッセイ混合物は、ＵＭＰ添加後、約２０秒間の回転振とうにより混合した。ブランク読み取りが実行され、反応の進行はエンドポイントまたは継続読み取り法のいずれかにより、ある期間にわたりＮＡＤＨ吸光度または蛍光の低下を追跡することによりモニターした。多数の化合物の試験を容易にするために、いくつかの場合、反応は３０分後に１０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により停止し、最終分光光度測定は数時間後まで行った。
【００３１】
アッセイは好ましい反応速度パラメータの制約の範囲内で、最大比活性を得るために最適化された。検討したアッセイパラメータは、酵素操作、基質濃度、塩要求性および効果、ｐＨおよびバッファー選択、温度、ある期間にわたる反応安定性、ある期間にわたる反応直線性、ＤＭＳＯに対するアッセイの反応、カップラー酵素濃度および活性、ならびにアッセイのロバスト性であった。
【００３２】
Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼは、７．０〜８．０の至適ｐＨを有することが見出された。０．５未満のｐＨ変化はアッセイ速度に著しい影響を与えないはずであるため、アッセイのために選択されたｐＨは７．５であった。バッファーの影響は小さいが重要であり、ＴｒｉｓおよびＭＯＰＳでは最低の酵素活性、ＨＥＰＥＳおよびＰＩＰＥＳでは最高の活性が得られた。
【００３３】
Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼの比活性は、１５〜３０℃の温度変化にわたりモニターした。一般に温度上昇に伴って、活性の直線的上昇が認められ、３０℃で４０％の全体的な活性上昇がみられた。
【００３４】
いくつかの塩がアッセイで試験され、それらがＵＭＰキナーゼ活性を促進または低下させるかどうかを調べた。約１００ｍＭまでのＮａＣｌもしくはＮＨ４Ｃｌのいずれか、または３２０ｍＭまでのＫＣｌの濃度に反応した活性の変化はほとんどみられなかった。しかし、硫酸アンモニウムは酵素活性を著しく阻害することが認められた。酵素活性に必要とされる以上の濃度におけるＭｇＣｌ２濃度増大は、アッセイにほとんど影響を与えなかった。
【００３５】
ＮＡＤＨ蛍光（励起／発光波長  ３４０ｎｍ／４６５ｎｍ）は約２００μＭまで直線状であることが認められた。Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａを使用して、３４０ｎｍの吸光度モードにおける約５００μＭまでの直線状範囲の増大を得ることができた。アッセイにおいてモニターされるシグナル変化の直線性を確実にするために、２００μＭのＮＡＤＨアッセイ濃度が選択された。カップリング酵素ＰＫ／ＬＤＨの濃度は、それらの過剰を確実にする濃度が選択された。アッセイは、１５０μＭ  ＵＭＰ、４００μＭ  ＡＴＰおよび０．００００３６ｍｇ／ｍＬ  ＰｙｒＨを含有する反応混合物中、１．３ユニット／ｍＬ以上の濃度で、ＰＫ／ＬＤＨの飽和状態下であることが認められた。
【００３６】
Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼの比活性は、酵素濃度の変化に反応して変化しなかった。このことは、アッセイ速度がＵＭＰキナーゼ依存的であることを確証した。１．３ｎＭ  ＵＭＰキナーゼ濃度により至適活性が得られることが見出された。ＵＭＰおよびＡＴＰのＫｍはそれぞれ、４０μＭ〜５５０μＭの範囲であることが見出された。アッセイでは、２００μＭ  ＵＭＰおよび４００μＭ  ＡＴＰが十分な活性を得るために十分であり、阻害剤の同定を可能にするであろうということが見出された。
【００３７】
蛋白質は−８０℃で数ヶ月保存された場合、安定であることが見出された。使用する場合、酵素は氷上で解凍され、直ちに保存用希釈標準溶液に希釈された。一旦解凍されると、保存溶液は活性を著しく低下せずに、少なくとも７時間氷上で保存可能であった。酵素の安定性および溶解性は、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、またはＵＴＰ）の存在で促進された。ＧＴＰは十分な酵素活性に必要であることが見出された。Ｓ．アウレウスＵＭＰキナーゼの室温における安定性は、アッセイ濃度の１０Ｘの酵素濃度を含有する希釈標準溶液中、ＧＴＰおよびＢｒｉｊ‐３５の種々の濃度条件下で検討された。５ｍＭ  ＧＴＰおよび０．０１〜０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢｒｉｊ‐３５濃度により酵素の最大安定性および最高活性が得られることが見出された。選択された希釈標準溶液条件は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＧＴＰおよび０．０１％  Ｂｒｉｊ‐３５であった。アッセイバッファー中のＳ．アウレウスＵＭＰキナーゼの安定性も検討された。保存用希釈標準溶液のより高いｐＨは、酵素安定性をさらに増した。保存用希釈標準溶液酵素はアッセイバッファーに添加し、６時間まで室温でインキュベーション後、ＵＭＰとの反応を開始した。酵素はアッセイバッファー中で６時間インキュベーション後、＞９０％活性を保持することが見出された。
【００３８】
参考文献
【００３９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＵＭＰキナーゼにより触媒される反応経路を示す。
【図２】ＧＴＰが十分な酵素活性に必要とされることを示す。グラフは種々のＧＴＰ濃度を用いた、酵素プレインキュベーションの効果を示す。
【図３】バッファーとｐＨの特性を示す。グラフは種々のｐＨにおけるバッファーの比較を示す。
【図４】摂氏１５〜３０度の酵素活性の温度依存性を示す。
【図５】酵素活性に対する塩の効果を示す。使用された塩はＮａ＋、ＮＨ４＋、およびＳＯ４２−であった。
【図６】ＭｇＣｌ２濃度の最適化を示す。
【図７】酵素活性に対するＤＭＳＯの効果を示す。
【図８】種々の濃度の酵素活性を示す。
【図９】ＵＭＰキナーゼアッセイにおけるカップラー酵素濃度の最適化を示す。
【図１０】添加されたＧＴＰおよびＢｒｉｊ‐３５による、ある期間にわたる酵素安定性を示す。
【図１１】アッセイバッファー中の酵素安定性を示す。
【図１２ａ】種々の濃度のＵＭＰキナーゼ阻害剤ＥＤＴＡの影響を示す。
【図１２ｂ】種々の濃度のＵＭＰキナーゼ阻害剤ＡＭＰ‐パラニトロフェノールの影響を示す。
【図１３ａ】３８４ウェルプレートにおけるＵＭＰキナーゼアッセイの経時変化を示す。ＮＡＤＨ蛍光は３４０／４６５ｎｍの励起／発光波長対を使用して測定した。
【図１３ｂ】３８４ウェルプレートにおけるＵＭＰキナーゼアッセイの経時変化を示す。吸光度は３４０ｎｍで測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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