(57)【要約】【解決手段】  分娩後組織由来細胞と軟骨形成または骨形成表現型の細胞への分化を単離、誘導する方法が本発明によって提供される。本発明では、さらに分娩後由来細胞の培養と組成、およびそれに関連する製剤を提供する。本発明の分娩後由来細胞とそれに関連する製剤は多く使用され、これだけに限らないが、例えば骨および軟骨疾患の治療における研究、診断、治療応用を含む。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に血液を含まないヒト分娩後組織に由来する細胞を有する分娩後由来細胞であって、前記細胞は培養において自己複製及び増殖することができ、骨形成または軟骨形成表現型の細胞に分化する能力を有し、前記細胞は増殖にＬ−バリンを必要とし、前記細胞は約５％〜２０％の酸素で増殖することができ、前記細胞はさらに、以下の特徴、
（ａ）顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）、レチキュロン１、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＧＲＯ−αまたは酸化低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの生産の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連して、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つで上昇し、または線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、ｏｖｅｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １でダウンレギュレートされた仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇することと、
（ｆ）線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、少なくとも以下の１つで減少し、これが低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒ
ｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１（抗増殖性）、コレステロール２５−水酸化酵素、ｒｕｎｔ関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックス蛋白質５、ヘファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過カルシウム活性化チャネル（サブファミリーＮ、メンバー４）、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス５、仮想的蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク５、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用蛋白質３様、ＡＥ結合蛋白質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種・腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合蛋白質２（３６ｋＤａ）である場合と、
（ｇ）単球走化性タンパク質−１、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、顆粒球走化性タンパク質−２、肝細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮成長因子、脳由来神経栄養因子、トロンボポエチン、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１の少なくとも１つの分泌と、
（ｈ）ＥＬＩＳＡで検出されるとおり、トランスフォーミング成長因子−β２、アンジオポエチン−２、血小板由来増殖因子−ｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、マクロファージ由来ケモカイン、血管内皮増殖因子の少なくとも１つの分泌の欠如、および
（ｉ）培養で少なくとも４０回倍加を受ける能力、
の特徴のうち少なくとも１つを有することを特徴とする前記細胞。
【請求項２】
請求項１の細胞であって、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロン酸を消化する粘液溶解酵素の少なくとも１つを用いた酵素解離により、分娩後の胎盤またはその断片から単離された細胞。
【請求項３】
請求項１の分娩後由来細胞の分化を軟骨形成表現型に誘導する方法であって、前記細胞を１若しくはそれ以上の軟骨形成分化誘導因子に曝露する工程を有する方法。
【請求項４】
請求項３の方法において、
前記軟骨形成分化誘導因子は、トランスフォーミング成長因子−β３（ＴＧＦβ３）、および、増殖および分化因子−５（ＧＤＦ−５）、の少なくとも１つを有するものである。
【請求項５】
請求項３の方法であって、さらに軟骨形成培地で前記細胞を培養する工程を有する方法。
【請求項６】
請求項５の方法において、
前記軟骨形成培地は、ダルベッコ改変イーグル培地、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−プロリン、デキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、抗生剤を有するものである。
【請求項７】
請求項６の方法において、
前記軟骨形成培地は、さらにコラーゲンと水酸化ナトリウムの少なくとも１つを有するものである。
【請求項８】
請求項３の方法であって、さらに、
ペレット培養アッセイにより前記細胞の分化を評価する工程を有する方法。
【請求項９】
請求項３の方法であって、さらに、
グリコサミノグリカンまたはコラーゲンの有無を検出することで、前記細胞の分化を評価する工程を有する方法。
【請求項１０】
請求項９の方法において、
前記評価する工程は、サフラニン−Ｏまたはヘマトキシリン／エオシンを用いて前記細胞を染色する工程を有するものである。
【請求項１１】
請求項３の方法によって生産される、前記細胞。
【請求項１２】
請求項１の分娩後由来細胞の分化を骨形成表現型に誘導する方法であって、前記細胞を１若しくはそれ以上の骨形成分化誘導因子に曝露する工程を有するものである。
【請求項１３】
請求項１２の方法において、
前記分化誘導因子は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、トランスフォーミング成長因子−β１の少なくとも１つを有するものである。
【請求項１４】
請求項１２の方法であって、さらに、
骨形成培地で前記細胞を培養する工程を有する方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、
前記骨形成培地は、低グルコースダルベッコ改変イーグル培地、血清、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸リン酸塩、および少なくとも１種類の抗生物質または抗真菌剤を有するものである。
【請求項１６】
請求項１２の方法であって、さらに、
骨形成細胞系譜特異的マーカーを検出することで、前記分化を評価する工程を有する方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法において、
前記マーカーは、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、またはアルカリホスファターゼである。
【請求項１８】
請求項１２の方法であって、さらに、
石灰化を測定することで、前記分化を検出する工程を有する方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法において、
前記検出段階は、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を有するものである。
【請求項２０】
請求項１２の方法によって生産される前記細胞。
【請求項２１】
請求項１の前記分娩後由来細胞を有する細胞集団。
【請求項２２】
請求項２１の細胞集団において、前記細胞集団は実質的に均一である。
【請求項２３】
請求項２１の細胞集団において、前記細胞集団は不均一である。
【請求項２４】
請求項２３の細胞集団であって、さらに、
骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞前駆細胞、または幹細胞の少なくとも１細胞タイプを有する細胞集団。
【請求項２５】
請求項１２の前記分娩後由来細胞を有する細胞集団。
【請求項２６】
請求項２５の細胞集団において、前記細胞集団は実質的に均一である。
【請求項２７】
請求項２５の細胞集団において、前記細胞集団は不均一である。
【請求項２８】
請求項２７の細胞集団であって、さらに、
骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞前駆細胞、幹細胞、または他の多能性または多分化能細胞の少なくとも１細胞タイプを有する細胞集団。
【請求項２９】
請求項２０の前記分娩後由来細胞を有する細胞集団。
【請求項３０】
請求項２９の細胞集団において、前記細胞集団は実質的に均一である。
【請求項３１】
請求項２９の細胞集団において、前記細胞集団は不均一である。
【請求項３２】
請求項３１の細胞集団であって、さらに、
骨髄細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、幹細胞、または他の多能性または多分化能細胞の少なくとも１細胞タイプを有する細胞集団。
【請求項３３】
請求項２１の前記細胞集団から調製された細胞溶解物。
【請求項３４】
請求項３３の前記細胞溶解物から調製された可溶性細胞画分。
【請求項３５】
請求項２５の前記細胞集団から調製された細胞溶解物。
【請求項３６】
請求項３５の前記細胞溶解物から調製された可溶性細胞画分。
【請求項３７】
請求項２９の前記細胞集団から調製された細胞溶解物。
【請求項３８】
請求項３７の前記細胞溶解物から調製された可溶性細胞画分。
【請求項３９】
請求項２１の前記細胞集団の細胞外基質。
【請求項４０】
請求項２５の前記細胞集団の細胞外基質。
【請求項４１】
請求項２９の前記細胞集団の細胞外基質。
【請求項４２】
請求項２１の前記細胞集団と、１若しくはそれ以上の生理活性因子を有する組成物。
【請求項４３】
請求項２５の前記細胞集団と、１若しくはそれ以上の生理活性因子を有する組成物。
【請求項４４】
請求項２９の前記細胞集団と、１若しくはそれ以上の生理活性因子を有する組成物。
【請求項４５】
請求項４２の前記組成物において、
前記生理活性因子は、軟骨形成分化誘導因子である。
【請求項４６】
請求項４２の前記組成物において、
前記生理活性因子は、骨形成分化誘導因子である。
【請求項４７】
請求項１の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項４８】
請求項１１の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項４９】
請求項２０の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５０】
請求項３９の細胞外基質と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５１】
請求項４０の細胞外基質と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５２】
請求項４１の細胞外基質と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５３】
請求項３３の溶解物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５４】
請求項３５の溶解物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５５】
請求項３７の溶解物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５６】
培地において請求項１の少なくとも１つの細胞を有する細胞培養。
【請求項５７】
請求項５６の細胞培養において、
前記培養培地は、軟骨形成培地または骨形成培地を有するものである。
【請求項５８】
請求項５６の細胞培養であって、さらに、
軟骨形成分化誘導因子の少なくとも１つを有する細胞培養。
【請求項５９】
請求項５８の細胞培養において、
前記軟骨形成分化誘導因子は、トランスフォーミング成長因子−β３および増殖および分化因子−５の少なくとも１つである。
【請求項６０】
請求項５６の細胞培養であって、さらに、
骨形成分化誘導因子の少なくとも１つを有する細胞培養。
【請求項６１】
請求項６０の細胞培養において、
前記骨形成分化誘導因子は、トランスフォーミング成長因子−β１、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、またはＢＭＰ４の少なくとも１つである。
【請求項６２】
請求項２１の細胞集団を有する基質。
【請求項６３】
請求項２５の細胞集団を有する基質。
【請求項６４】
請求項２９の細胞集団を有する基質。
【請求項６５】
請求項６２の基質において、
前記基質は、３次元骨格を有するものである。
【請求項６６】
請求項６３の基質において、
前記基質は、３次元骨格を有するものである。
【請求項６７】
請求項６４の基質において、
前記基質は、３次元骨格を有するものである。
【請求項６８】
患者の疾患を治療する方法であって、前記患者に１若しくはそれ以上の請求項１の分娩後由来細胞を投与する工程を有する方法。
【請求項６９】
請求項６８の方法において、
前記疾患は、骨疾患または軟骨疾患である。
【請求項７０】
請求項６９の方法において、
前記骨疾患または前記軟骨疾患は、先天性な骨または軟骨の欠陥、半月板の損傷または欠陥、骨／脊髄変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症または脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯骨の喪失、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、脊椎固定術、椎間板の再構築または除去、骨パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症、または外傷または外科的損傷である。
【請求項７１】
請求項６８の方法において、
前記分娩後由来細胞は、少なくとも１種類の他細胞タイプと共に投与されるものである。
【請求項７２】
請求項７１の方法において、
前記少なくとも１つの他細胞タイプは、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞前駆細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、幹細胞、または多能性または多分化能細胞である。
【請求項７３】
請求項６８の方法において、
前記分娩後由来細胞は、基質上に接種されるものである。
【請求項７４】
請求項７３の方法において、
前記基質は、前記患者に移植されるものである。
【請求項７５】
請求項６８の方法において、
前記分娩後由来細胞は、前記投与する工程の前に、軟骨形成または骨形成表現型に分化するように誘導されるものである。
【請求項７６】
請求項６８の方法において、
前記分娩後由来細胞は、少なくとも１種類の生理活性因子が同時に投与されるものである。
【請求項７７】
請求項６８の方法において、
前記細胞は、前記患者の骨に投与されるものである。
【請求項７８】
請求項６８の方法において、
前記細胞は、前記患者の軟骨に投与されるものである。
【請求項７９】
組織の再生を必要とする患者で前記組織を再生する方法であって、請求項２１の細胞集団を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項８０】
請求項７９の方法において、
前記組織は、骨または軟骨である。
【請求項８１】
組織の再生を必要とする患者で前記組織を再生する方法であって、請求項２５の細胞集団を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項８２】
請求項８１の方法において、
前記組織は、骨または軟骨である。
【請求項８３】
組織の再生を必要とする患者で前記組織を再生する方法であって、前記請求項２９の細胞集団を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項８４】
請求項８３の方法において、
前記組織は、骨または軟骨である。
【請求項８５】
請求項６８の方法において、
前記細胞は、前記患者に移植されるものである。
【請求項８６】
請求項５６の培養を増殖させることで生成した条件培地。
【請求項８７】
分娩後由来細胞の軟骨形成を刺激する化合物を同定する方法であって、請求項１の細胞と前記化合物とを接触させ、前記細胞の軟骨形成マーカーをモニタリングする工程を有する方法。
【請求項８８】
分娩後由来細胞の骨形成を刺激する化合物を同定する方法であって、請求項１の細胞と前記化合物を接触させ、前記細胞の骨形成マーカーをモニタリングする工程を有する方法。
【請求項８９】
請求項１の分娩後由来細胞に対して毒性がある化合物を同定する方法であって、前記細胞に前記化合物を接触させ、前記細胞の生存をモニタリングする工程を有する方法。
【請求項９０】
請求項１の少なくとも１つの細胞と、さらに基質、水和剤、細胞培養基質、分化誘導剤、および細胞培地の少なくとも１つの成分とを有するキット。
【請求項９１】
請求項９０のキットにおいて、
前記基質は、３次元骨格である。
【請求項９２】
請求項９１のキットにおいて、
前記細胞は、前記骨格に播種されるものである。
【請求項９３】
請求項９０のキットにおいて、
前記分化誘導剤は、骨形成分化誘導剤または軟骨形成分化誘導剤である。
【請求項９４】
骨疾患または軟骨疾患を有する患者を治療する方法であって、前記請求項１の細胞の細胞外基質を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項９５】
骨疾患または軟骨疾患を有する患者を治療する方法であって、前記請求項３３の細胞溶解物を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項９６】
骨疾患または軟骨疾患を有する患者を治療する方法であって、前記請求項８６の条件培地を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項９７】
請求項４７の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞を有するものである。
【請求項９８】
請求項４８の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞を有するものである。
【請求項９９】
請求項４９の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞を有するものである。
【請求項１００】
請求項５０の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項１０１】
請求項５１の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項１０２】
請求項５２の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項１０３】
請求項５３の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項１０４】
請求項５４の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項１０５】
請求項５５の薬学的組成物において、
前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項１０６】
請求項４７の薬学的組成物であって、さらに、
幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、他の骨または軟骨前駆細胞の他の細胞タイプの少なくとも１種類を有する方法。
【請求項１０７】
請求項４８の薬学的組成物であって、さらに、
幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、他の骨または軟骨前駆細胞の他の細胞タイプの少なくとも１種類を有する方法。
【請求項１０８】
請求項４９の薬学的組成物であって、さらに、
幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、他の骨または軟骨前駆細胞の他の細胞タイプの少なくとも１種類を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願書類の相互参照
本書は、２００３年６月２７日に提出された米国仮出願番号第６０／４８３，２６４号に対する優先権を主張するものであって、その全内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。他の関連出願には、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ１］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ２］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ３］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ４］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ５］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ７］号、２００４年３月２４日に提出された米国仮出願番号第６０／５５５，９０８［ＥＴＨ  ５１２７］号、２００４年３月２４日に提出された第［ＥＴＨ  ５１２７］号の同一出願人による同時係属出願を含み、そのそれぞれの内容全体はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、哺乳類細胞の生物学と細胞培養の分野に関するものである。特に、本発明は軟骨形成および骨形成細胞系譜に分化する能力を有する分娩後組織由来細胞と、骨および軟骨の疾患に対する細胞療法を含む、分娩後組織由来細胞の調製法と利用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
骨および軟骨の疾患と状態は、人口の大部分に影響する。哺乳類には３種類の軟骨が存在し、硝子軟骨、線維軟骨、弾性軟骨を含む。硝子軟骨は、堅い弾性を有する軟骨質の塊から成り、半透明で色は真珠のような青である。硝子軟骨は関節の関節表面に主に認められる。硝子軟骨は骨端板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨、鼻軟骨にも認められる。線維軟骨は、前記軟骨に引っ張り強度を加えるＩ型コラーゲンの原線維を含むこと以外は、硝子軟骨と本質的に同一である。前記膠原線維は束となって配列され、前記軟骨細胞は前記束の間にある。線維軟骨は、前記椎間板の線維輪、腱と靱帯の挿入、半月板、前記恥骨結合、関節包の挿入に多く認められる。弾性軟骨もエラスチン線維を含むこと以外は、硝子軟骨と同等である。これは硝子軟骨よりも不透明で、柔軟性が高く、曲げやすい。これらの特徴は、前記軟骨組織に埋め込まれた前記弾性線維によって部分的に定義される。典型的には、弾性線維は前記耳の耳介、前記喉頭蓋、前記喉頭に存在する。
【０００４】
哺乳類関節の関節骨の表面は関節軟骨で覆われている。前記関節軟骨が前記反対の骨表面と直接接触しないようにし、前記関節骨が互いにほぼ摩擦なく動くようにする。哺乳類では一般に２種類の関節軟骨欠陥が認められ、全層および部分層の欠陥を含む。前記２種類の欠陥の違いは物理的損傷の程度だけではなく、各種類の病変が発現させる修復反応の性質である。
【０００５】
全層の関節軟骨欠陥には、前記関節軟骨と、前記基礎軟骨下骨組織と、前記関節軟骨と軟骨下骨の間にある前記軟骨の石灰化層との損傷を含む。全層の欠陥は、典型的には前記関節の重度外傷または変形性関節疾患、の後期（例えば変形性関節症中）に生じる。前記軟骨下骨組織はいずれも神経支配および血管新生化され、この組織の障害は痛みを伴うことが多い。前記軟骨下骨に対する障害によって誘導される修復反応は、通常、前記全層欠陥の部位で線維軟骨を形成する。しかし、線維軟骨には関節軟骨の生体力学的特徴がなく、長期的に前記関節を持続することはできない。
【０００６】
部分層の関節軟骨欠陥は、前記軟骨組織自体に限定される。これらの欠陥は、通常、前記軟骨の関節表面に亀裂または裂溝を含む。部分層欠陥は前記関節の機械的配置によって生じ、次にそのような配置は前記関節内で軟骨組織の消耗を誘導する。神経支配と脈管構造がない場合、部分層欠陥は修復反応を誘導しないため、治癒しない傾向がある。痛みはないが、部分層欠陥は全層欠陥に退化することが多い。
【０００７】
軟骨は異常に発達することがあり、関節リウマチや変形性関節症などの疾患によって、または外傷によって損傷される場合があり、そのそれぞれが肉体的奇形および衰弱につながる可能性がある。Ｈｏｗｅｌｌら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，第２版（フィラデルフィア、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９０）およびＫｅｌｌｅｙら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，第３版（フィラデルフィア、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９８９）でレビューされているとおり、軟骨が外傷損傷であっても、または先天性奇形であっても、その臨床的再生の成功は良くても貧弱なものである。
【０００８】
骨疾患も広範囲に及ぶ。例えば、一般に骨疾患は２種類あり、骨折、骨／脊髄の変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症、脊柱側弯症などの非代謝性骨疾患と、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、骨パジェット病などの代謝性骨疾患である。代謝性骨疾患である骨粗鬆症は、骨の脆弱性と破砕性が上昇することで特徴付けられる全身性疾患であり、その主な臨床症状には、骨量低下と細部にわたる骨組織構造の変化、脊柱後弯症、背腰骨、脊柱中心、大腿骨頚、橈骨下部、肋骨、上腕骨上端、その他の骨折を含む。骨組織では、骨吸収による骨の形成と破壊が絶えず生じている。骨吸収による骨の形成と骨の破壊のバランスが悪化すると、骨の量的減少が起こる。従来、エストロゲン、カルシトニン、ビスフォスフォネートなどの骨吸収抑制剤は、主に骨粗鬆症の治療に利用されてきた。
【０００９】
骨移植は骨疾患の治療に利用されることが多い。実際、先進国では、年間１４０万件以上の骨移植手術が行われている。これらの手術の多くは、関節置換術後または外傷再建手術中に行われる。骨移植の成功または失敗は、前記移植部位の生命力、移植処理、前記移植した組織の免疫適合性を含む多数の因子に依存する。
【００１０】
骨および軟骨疾患の有病率を考慮し、治療、診断、研究で利用する骨および軟骨組織の新しい供給源の需要は高い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一般に、培養において自己複製及び増殖することができ、骨細胞または軟骨細胞の表現型を持つ細胞に分化する能力を有する、実質的に血液を含まない分娩後組織由来の分娩後由来細胞に関するものである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、実質的に血液を含まないヒト分娩後組織から由来された細胞を提供し、このような細胞は、培養において自己複製及び増殖することができ、骨形成または軟骨形成の表現型を持った細胞に分化する能力を有し、増殖にＬ−バリンを必要とし、また約５％〜約２０％の酸素で増殖でき、さらに以下の特徴、
ＧＣＰ−２、組織因子、ビメチン、α−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生と、
フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＮＯＧＯ−Ａ、ＧＲＯ−αまたは酸化低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの生産がないことと、
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生と、
フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生がないことと、
線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜（ｉｌｅａｃ  ｃｒｅｓｔ）の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つで上昇すること、または線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌でダウンレギュレートされる遺伝子１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇することと、
線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１（抗増殖性）、コレステロール２５−水酸化酵素、ｒｕｎｔ関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型α１、テネイシンＣ、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックス蛋白質５、ヘファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過カルシウム活性化チャネル（サブファミリーＮ、メンバー４）、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス  ５、仮想的蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用蛋白質３様、ＡＥ結合蛋白質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種・腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合蛋白質２（３６ｋＤａ）における少なくとも１つの遺伝子で減少している、
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌と、
ＥＬＩＳＡで検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如と、
培養で少なくとも４０集団倍加を受ける能力、
の少なくとも１つを有するものである。
【００１３】
特定の実施形態では、前記分娩後由来細胞は、臍帯由来細胞である。他の実施形態では、これが胎盤由来細胞である。具体的な実施形態では、前記細胞が細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７４）、細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７５）、細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７９）、細胞タイプＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）、または細胞タイプＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６８）のいずれか１つの識別特徴をすべて有する。前記発明の分娩後由来細胞は好ましくはヒト細胞である。
【００１４】
前記細胞は骨形成または軟骨形成性表現型に分化するように誘導されてもよい。本発明の分娩後由来細胞の分化を誘導する方法が検討されている。例えば、前記細胞は骨形成または軟骨形成性表現型を有する細胞に分化するように誘導されてもよい。本発明の前記細胞の分化を誘導する方法には、好ましくは前記細胞を１若しくはそれ以上の分化誘導剤に曝露させる方法が関与する。本発明の骨形成誘導剤には、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β１、その組み合わせを含む。本発明の軟骨形成誘導剤には、ＴＧＦ−β３、ＧＤＦ−５、その組み合わせを含む。本発明には、前記分化誘導細胞および集団、その組成および産物を含む。骨形成細胞系譜の分化誘導細胞は、好ましくは少なくとも１種類の骨形成細胞系譜マーカー（例えば、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、アルカリホスファターゼ）を発現している。骨形成細胞系譜へのＰＰＤＣの分化は、例えば、これだけに限らないが、石灰化の測定（例えばｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色）など、当該分野で既知の方法により評価されてもよい。軟骨形成性細胞系譜の分化誘導細胞は、好ましくは少なくとも１種類の軟骨形成性細胞系譜マーカー（例えば、グルコサミノグリカン、ＩＩ型コラーゲン）を発現している。軟骨形成性細胞系譜へのＰＰＤＣの分化は、例えば、これだけに限らないが、サフラニン−Ｏまたはヘマトキシリン／エオシン染色など、当該分野で既知の方法により評価されてもよい。
【００１５】
ＰＰＤＣ集団は本発明によって提供される。前記ＰＰＤＣは分化誘導されるか、未分化であってもよい。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞集団が別の細胞集団と混合される。いくつかの実施形態では、前記細胞集団が不均一である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明の未分化または分化誘導ＰＰＤＣの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有してもよい。本発明の不均一細胞集団は、さらに骨髄細胞、幹細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、または他の骨または軟骨細胞前駆体を有してもよい。本発明の細胞集団は実質的に均一であり、つまり実質的にＰＰＤＣのみを有してもよい（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上のＰＰＤＣ）。本発明の前記均一細胞集団は、臍帯または胎盤由来細胞を有してもよい。胎盤由来細胞の均一な集団は新生児または母体の細胞系譜であってもよい。細胞集団の均一性は、例えば細胞ソーティング（フローサイトメトリーなど）、ビーズ分離、またはクローン増殖などの当該分野で既知の方法により達成されてもよい。
【００１６】
本発明では、本発明の未分化または分化誘導分娩後由来細胞を含む、不均一および均一な細胞培養も提供する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の１若しくはそれ以上の分娩後由来細胞が播種された移植用基質、またはその細胞溶解物、条件培地、または細胞外基質を含む移植用基質を患者に提供する。前記ＰＰＤＣは分化誘導されるか、未分化であってもよい。前記基質は、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣剤、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）を含む、１若しくはそれ以上の生理活性因子を含むか、処理されてもよい。
【００１８】
また、本発明の範囲に網羅されるものは、ＰＰＤＣの細胞外基質、ＰＰＤＣの細胞溶解物（例えば可溶性細胞分画）、ＰＰＤＣ条件培地を含む、ＰＰＤＣ産物である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＰＤＣ組成、および、例えばこれだけに限らないが、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣剤、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）を含む、増殖因子、軟骨形成または骨形成分化誘導因子などの１若しくはそれ以上の生理活性因子を提供する。
【００２０】
前記分娩後由来細胞の薬学的組成物、それによって生産された細胞外基質、その細胞溶解物、ＰＰＤＣ条件培地が本発明の範囲に含まれる。前記薬学的組成物は、好ましくは医薬品として認められる担体または賦形剤を含む。前記医薬品は、好ましくはここで定義された骨または軟骨疾患の治療用である。
【００２１】
本発明では、さらにいくつかの観点において、本発明の細胞、基質、またはＰＰＤＣ産物を患者に投与することで、それを必要とする患者の骨または軟骨組織を再生させる方法を提供する。
【００２２】
さらに本発明で提供されているのは、１若しくはそれ以上の分娩後由来細胞、ＰＰＤＣ集団、基質、細胞溶解物、細胞溶解物と細胞外基質の組み合わせ、条件培地、または本発明の組成を投与することで、患者の骨または軟骨疾患などの疾患を治療する方法である。分化または未分化の前記ＰＰＤＣ、またはその組み合わせ、それによって生産される細胞外基質、その細胞溶解物、細胞溶解物と細胞外基質の組み合わせ、基質（例えば骨格）、条件培地、および、本発明の組成は、骨または軟骨組織の疾患、例えばこれだけに限らないが、先天性欠損、骨折、半月板の損傷または欠陥、骨／脊髄の変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症および脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯の骨量減少、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、脊椎の癒着、椎間板再健術または欠落、骨パジェット病、半月板の損傷、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨または骨の外傷性または外科的損傷に利用されてもよい。
【００２３】
また本発明で提供されるものは、本発明の前記分娩後由来細胞、ＰＰＤＣ条件培地、溶解物、および／または細胞外基質を有するキットである。本発明の前記キットは、さらに基質、２番目の細胞タイプ、水和剤、細胞培養基質、分化誘導剤、細胞培地、例えば前記細胞の培養または前記細胞および／または細胞産物の投与などに関する使用説明書の少なくとも１要素を含んでもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明が分娩後由来細胞の軟骨形成または骨形成を調節する化合物を同定する方法を提供し、本発明の細胞と前記化合物を接触させる方法と、細胞の軟骨形成または骨形成マーカーをモニターする方法を有する。また、前記細胞に前記化合物を接触させ、前記細胞の生存をモニタリングすることで、本発明の分娩後由来細胞に毒性の化合物を同定する方法も提供する。
【００２５】
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な説明と例から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
定義
本明細書と請求項で使用される様々な用語は、以下に説明するとおりに定義される。
【００２７】
「幹細胞」は、前記単細胞レベルで、その自己複製複製および分化し、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、最終分化細胞を含む後代細胞を生成する能力により定義される未分化細胞である。幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）の様々な細胞系譜の機能的細胞に分化し、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞に注入後、すべてでないとしてもほとんどの組織に実質的に貢献する能力でも特徴付けられる。
【００２８】
幹細胞は、（１）「全能性」−すべての胚細胞および胚体外細胞タイプを
生じさせることができる、（２）「多能性」−すべての胚細胞タイプを生じさせることができる、（３）「多分化能」−細胞系譜のサブセットを生じさせることができ、特定の組織、臓器、または生理学的システム内のすべてを生じさせる（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＨＳＣ（自己複製）、血液細胞限定的な低能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞、および前記血液の正常な成分であるすべての細胞タイプと要素（例えば血小板）を含む後代を生成することができる）、（４）「低能性」−多分化能幹細胞よりも限定的な細胞系譜のサブセットを生じさせることができる、（５）「単能性」−単細胞系譜（例えば精子形成幹細胞）を生じさせることができる、として発達の可能性により分類される。
【００２９】
幹細胞はまた、得られる供給源を元に分類される。「成熟幹細胞」は一般に、複数の分化細胞タイプを有する組織に見られる多分化能の未分化細胞である。前記成熟幹細胞はそれ自体を複製し、標準的な環境でそれが由来する組織の特殊細胞タイプと、可能性として他の組織タイプを生じるように分化することができる。「胚幹細胞」は、胚盤胞の段階にある胚の内細胞塊からの多分化能細胞である。「胎児」幹細胞は胎児の組織または膜に由来する幹細胞である。「分娩後幹細胞」は、分娩後に得られる胚外組織、すなわち前記胎盤と前記臍帯、に実質的に由来する多分化能または多能性細胞である。これらの細胞は、急速な増殖および多数の細胞系譜に分化する可能性を含む、多能性幹細胞に特徴的な特性を有することが分かった。分娩後幹細胞は血液由来（例えば臍帯血から得られるものなど）または非血液由来（例えば臍帯血および胎盤の非血液組織から得られるなど）としてもよい。
【００３０】
「胚組織」は、典型的には（ヒトでは受精から発達の約第６週までの期間を指す）胚に由来する組織として定義される。「胎児組織」は、胎児に由来する組織を指し、胎児は、ヒトでは発達の約第６週から分娩までの期間を指す。「胚体外組織」は前記胚または胎児に随伴するが、これらに由来しない組織である。胚体外組織は胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、尿膜）、臍帯、および胎盤（これ自体は前記絨毛膜と前記母体脱落膜）を含む。
【００３１】
「分化」は、未分化（「コミットしていない」）またはあまり分化していない細胞が、例えば神経細胞または筋肉細胞などの分化細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化した」または「分化誘導された」細胞は、前記細胞系譜内でより分化した（「コミットした」）状態を獲得した細胞である。分化プロセスに適用される場合、「コミットした」という用語は、標準的な状況下で、特定の細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットに分化し続け、標準的な状況下で、異なる細胞タイプに分化することができないか、あまり分化していない細胞タイプに戻ることができない点まで、前記分化経路に進んだ細胞を指す。脱分化は、細胞が前記細胞系譜内であまり分化していない（またはコミットしていない）状態に戻るプロセスを指す。ここで用いるとおり、前記「細胞系譜」とは、前記細胞の遺伝、つまりどの細胞に由来し、どの細胞を生じるかを定義する。前記細胞系譜では、発達および分化の遺伝スキーム内に前記細胞を置く。「細胞系譜特異的マーカー」は、対象細胞系譜の細胞表現型に特異的にに関連した特徴を指し、関心のある細胞系譜への、コミットしていない細胞の分化を評価するために用いることができる。
【００３２】
広い意味では、「前駆細胞」は、それ自体よりも分化した後代を作る能力を有するが、後代の予備体を補給する能力を保有する細胞である。この定義によれば、幹細胞自体も前駆細胞であり、最終分化細胞へのより直前の前駆の細胞も前駆細胞である。本発明の細胞を指す場合、以下にさらに詳細を説明するとおり、この前駆細胞の広義の定義が利用されてもよい。狭い意味では、前駆細胞が前記分化経路の中間体である細胞として定義されることが多く、つまりこれは幹細胞から生じ、成熟細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットの産生における中間体である。このタイプの前駆細胞は一般に自己複製することができない。従って、このタイプの細胞がここで示される場合は、「非複製前駆細胞」または「中間前駆体または中間前駆細胞」として示される。
【００３３】
ここで用いるとおり、「中胚葉、外胚葉、または内胚葉細胞系譜に分化する」という言い回しは、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉、または内胚葉細胞系譜にコミットした細胞を指す。中胚葉細胞系譜に分化するか、特定の中胚葉細胞を生じる細胞の例には、脂肪生成、軟骨形成、心原性、皮膚原性、造血性、血管形成性（ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）、筋原性、腎発生、泌尿生殖器原性（ｕｒｏｇｅｎｉｔｏｇｅｎｉｃ）、骨形成、心膜原性（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）、または間質性細胞を含むが、これだけに限らない。外胚葉細胞系譜に分化する細胞の例には、上皮細胞、神経細胞、神経膠細胞を含むが、これだけに限らない。内胚葉細胞系譜に分化する細胞の例には、胸膜細胞および肝性細胞、前記腸上皮を生じる細胞、膵原性（ｐａｎｃｒｅｏｇｅｎｉｃ）細胞および内臓原性（ｓｐｌａｎｃｈｏｇｅｎｉｃ）細胞を生じる細胞を含むが、これだけに限らない。
【００３４】
本発明の細胞は、ここで「分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）」と呼ばれる。本発明の細胞サブセットは、「胎盤由来細胞（ＰＤＣ）」または「臍帯血由来細胞（ＵＤＣ）」と呼ばれる。本発明のＰＰＤＣには未分化および分化誘導細胞を含む。さらに、前記細胞は幹細胞または前駆細胞として説明されてもよく、前駆細胞は広い意味で使用される。「由来する」という用語は、前記細胞が生物源から入手され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖されるか、またはそうでない場合は操作される（例えば増殖培地で培養され、前記個体群を増殖する、および／または細胞株を生産する）細胞を示すために使用される。本発明の分娩後由来細胞と分娩後由来細胞固有の特徴のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作について、以下に詳細に説明されている。
【００３５】
培養中の細胞を説明するため、様々な用語が使用されている。「細胞培養」とは、一般に生体から採取され、制御された条件で（「培養内で」）増殖される細胞を指す。「初代細胞培養」は、生物から直接採取され、最初の継代培養前の細胞、組織、または臓器の培養である。細胞は細胞増殖および／または分裂を促す条件で増殖培地に入れられた場合、培養で「増殖」され、より多数の前記細胞となる。細胞が培養内で増殖される場合、細胞の増殖率は時に前記細胞数が倍加するために必要な時間で測定される。これは「倍加時間」と呼ばれる。
【００３６】
「細胞株」は、初代細胞培養の、１若しくはそれ以上の継代培養で形成される細胞集団である。継代培養の各回は継代と呼ばれる。細胞が継代培養される場合、その細胞は継代されると呼ばれる。細胞の特定集団または細胞株は、時に継代された時間で言及されるか、特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、Ｐ１０培養と呼ばれてもよい。前記初代培養、つまり組織からの細胞単離後の初代培養は、Ｐ０に指定される。前記初代培養後、前記細胞は二次培養（Ｐ１または継代１）と記述される。前記二次培養後、前記細胞は三次培養（Ｐ２または継代２）などとなる。継代中に多くの集団が倍加する可能性があることは当業者に理解されるであろう。したがって培養の集団倍加数は継代数よりも多い。継代と継代の間の細胞の増殖（つまり集団倍加数）は多くの因子に依存し、播種密度、基質、培地、継代間時間を含むが、これだけに限らない。
【００３７】
「条件培地」は、特定細胞または細胞集団が培養され、次に除去された培地である。前記細胞は前記培地で培養される間、他の細胞の栄養支持を提供することができる細胞因子を分泌する。そのような栄養因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外基質（ＥＣＭ）、蛋白質、小胞、抗体、顆粒を含むが、これだけに限らない。前記細胞因子を含む培地が前記条件培地である。
【００３８】
一般に、「栄養因子」は細胞の生存、成長、増殖、成熟、分化、および／または維持を促し、または細胞の活性亢進を刺激する物質として定義される。
【００３９】
培養された脊椎動物細胞を指す場合、「老化」という用語（「複製老化」または「細胞老化」ともいう）は、限定された細胞培養に起因する特性、つまり限定された集団倍加数を超えて増殖する能力を指す（時にＨａｙｆｌｉｃｋの限界と呼ばれる）。細胞老化は最初、線維芽細胞様細胞を用いて説明されたが、培養で増殖を成功させることができるほとんどの正常ヒト細胞タイプは、細胞の老化を受ける。異なる細胞タイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの寿命は異なるが、最高寿命は典型的には１００集団倍加よりも少ない（これは、前記培養ですべての前記細胞の倍加数であり、老化するため、分化できない培養を与える）。老化は年代時間に依存しないが、むしろ細胞分裂の数、または集団倍加により測定され、前記培養が行われた。従って、重要な増殖因子を除去することで休止させた細胞は、前記増殖因子を再導入した場合に増殖と分裂を再開することができ、その後、同等の細胞が継続して増殖されるのと同じ倍加数を行う。同様に、様々な集団倍加数後に液体窒素で細胞が凍結され、その後解凍、培養された場合、培養中で細胞が凍結されずに維持されている場合と実質的に同等の倍加数となる。老化細胞は死亡した細胞または死につつある細胞ではなく、実際はプログラムされた細胞死（アポトーシス）に耐性があり、３年間分裂しない状態で管理された。これらの細胞は非常に活動的で、代謝的に活動的であるが、分裂しない。老化細胞の前記非分裂状態は、生物因子、化学因子、またはウイルス因子によって可逆的であることはまだ分かっていない。
【００４０】
ここで用いるとおり、「増殖培地」という用語は分娩後由来細胞の増殖に十分な培地を指す。増殖培地の培養液は、好ましくはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。より好ましくは、増殖培地にグルコースを含む。増殖培地は、好ましくはＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）を含む。増殖培地は、好ましくは約１５％（ｖ／ｖ）の血清（例えば、ウシ胎仔血清、ディファインドウシ血清）を含む。増殖培地は、好ましくは少なくとも１種類の抗生物質および／または抗真菌薬（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチン、好ましくは、５０単位／ミリリットルのペニシリンＧナトリウムおよび５０マイクログラム／ミリリットルの硫酸ストレプトマイシン）を含む。増殖培地は好ましくは２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）を含む。より好ましくは、増殖培地がＤＭＥＭ−低グルコース、血清、２−メルカプトエタノール、および抗生物質を含む。
【００４１】
ここで用いるとおり、「標準的な増殖条件」は、約５％ＣＯ２、約３５〜３９℃、より好ましくは３７℃の温度、相対湿度約１００％を有する標準的な大気条件を指す。
【００４２】
「単離された」という用語は、自然環境から除去された細胞、細胞成分、または分子を指す。
【００４３】
「約」という用語は、±１０％の範囲で述べられた値の近似値を指す。
【００４４】
「骨の疾患（または障害または疾患）」は、急性および慢性、および、代謝性および非代謝性の疾患、疾患、または骨疾患を含む包括的な用語である。前記用語は、通常発達する前記組織の疾患または外傷または不全により引き起こされる状態を有する。骨の疾患の例には、これだけに限らないが、先天性骨形成不全、骨折、半月板の損傷または血管、骨／脊髄の変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症および脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯の骨量減少、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、脊椎の癒着、椎間板の再構築または欠落、骨ページェット病を含む。
【００４５】
「軟組織の疾患（または障害または疾患）」は、軟組織の急性および慢性疾患、疾患、または疾病を含む総称である。前記用語は先天的欠陥、半月板の損傷、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨の外傷性または外科的損傷を含む。
【００４６】
「骨または軟骨の疾患を治療する（またはその治療）」という用語は、ここで定義した骨または軟骨の疾患の作用を改善し、その進行を遅延、停止、または回復させ、その発症を遅延または予防することを指す。
【００４７】
「有効量」という用語は、ここで用いるとおり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖および／または分化、または骨または軟骨状態の治療を含む、意図した結果を生み出すために効果的な増殖因子、分化試薬、栄養因子、細胞集団または他の因子などの試薬または医薬品の濃度を指す。増殖因子については、有効量が約１ナノグラム／ミリリットルから約１マイクログラム／ミリリットルの範囲であってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与されるＰＰＤＣについては、有効量は数百以下から数百万以上までの範囲であってもよい。特定の実施形態では、有効量が１０３〜１０１１の範囲であってもよい。投与される細胞数は、医薬生物学者によく知られた他の因子の中で、これだけに限らないが、投与されるサイズまたは総量／表面積を含む、治療される疾患の詳述、および治療される領域への投与部位の近傍によって変化することを理解されたい。
【００４８】
「有効量（または時間）」および「有効条件」という用語は、意図した結果を達成する試薬または医薬品に必要であるか、好ましい時間または他の制御可能な条件（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の温度、湿度）を指す。
【００４９】
「患者」または「被験者」という用語は、前記医薬品で治療されるか、ここで示された方法に従って治療される、哺乳類、好ましくはヒト、を含む、動物を指す。
【００５０】
「基質」という用語はここで用いるとおり、例えば骨格（例えば、ＶＩＣＲＹＬ、ＰＣＬ／ＰＧＡ、またはＲＡＤ１６）または支持培地（例えば、ヒドロゲル、細胞外膜蛋白質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））などの本発明のＰＰＤＣ支持材を指す。
【００５１】
「薬学的に許容可能な担体（または培地）」という用語は、「生物学的に適合した担体または培地」と同義的に使用することができ、適切な医学的判断の範囲で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応や、妥当な効果／リスク比に釣り合った他の合併症を引き起こさずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した試薬、細胞、化合物、物質、組成、および／または剤型を指す。ここにより詳細を示すとおり、本発明で使用される薬学的に許容可能な担体には、液体、半固体（ゲルなど）、固体物質（細胞骨格）を含む。ここで用いるとおり、「生分解性」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解（分解、腐食、溶解）される物質の能力を示す。前記用語には前記身体からの除去（再吸収など）の有無によらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解を含む。半固体および固体物質は、前記身体内の分解に抵抗するようにデザインされてもよく（非生分解性）、または前記身体内で分解するようにデザインされてもよい（生分解性、生腐食性）。生分解物質はさらに「生再吸収性または生吸収性」であってもよく、つまり他の物質への変換または自然経路からの分解と除去により、体液に溶解および吸収されてもよく（水溶性インプラントが１例である）、または前記身体から分解および最終的に除去されてもよい。
【００５２】
細胞置換療法について、いくつかの用語がここで使用されている。自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）などの用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントでもある治療を指す。同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）などの用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントと同種である治療を指すが、同じ個人ではないことを指す。前記ドナー細胞がレシピエントと組織化学的にマッチした細胞移植は、時に「同系移植」と呼ばれる。異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）などの用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントと異なる種である治療を指す。
【００５３】
以下の略語がここで用いられる：
ＡＮＧ２（またはＡｎｇ２）はアンジオポエチン２、
ＡＰＣは抗原提示細胞、
ＢＤＮＦは脳由来神経栄養因子、
ｂＦＧＦは塩基性線維芽細胞増殖因子、
ｂｉｄ（ＢＩＤ）は「１日２回」、
ＢＳＰは骨シアロ蛋白質、
ＣＫ１８はサイトケラチン１８、
ＣＸＣリガンド３はケモカイン受容体リガンド３、
ＤＡＰＩは４'−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−２ＨＣｌ、
ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地、
ＤＭＥＭ：ｌｇ（またはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）は低グルコースＤＭＥＭ、
ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸、
ＥＧＦ（またはＥ）は上皮増殖因子、
ＥＰＯはエリスロポエチン、
ＦＡＣＳは蛍光活性化細胞選別装置、
ＦＢＳはウシ胎仔血清、
ＦＧＦ（またはＦ）は線維芽細胞増殖因子、
ＧＣＰ−２は顆粒球走化性蛋白質−２、
ＧＤＦ−５は増殖および分化因子５、
ＧＦＡＰはグリア線維酸性蛋白質、
ＨＢ−ＥＧＦはヘパリン結合上皮増殖因子、
ＨＣＡＥＣはヒト冠動脈内皮細胞、
ＨＧＦは肝細胞増殖因子、
ｈＭＳＣはヒト間葉幹細胞、
ＨＮＦ−１αは、肝細胞特異的転写因子、
ＨＵＶＥＣはヒト臍静脈内皮細胞、
Ｉ３０９はケモカインで前記ＣＣＲ８受容体のリガンドであり、ＴＨ２型Ｔ細胞の化学親和性に関与する、
ＩＧＦはインスリン様増殖因子、
ＩＬ−６はインターロイキン−６、
ＩＬ−８はインターロイキン８、
Ｋ１９はケラチン１９、
Ｋ８はケラチン８、
ＫＧＦは角化細胞増殖因子、
ＭＣＰ−１は単球走化性蛋白質１、
ＭＤＣはマクロファージ由来ケモカイン、
ＭＩＰ１αはマクロファージ炎症性蛋白質１α、
ＭＩＰ１βはマクロファージ炎症性蛋白質１β、
ＭＭＰはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、
ＭＳＣは間葉幹細胞、
ＮＨＤＦは正常ヒト皮膚線維芽細胞、
ＮＰＥは神経前駆細胞増殖培地、
ＯｘＬＤＬＲは酸化低密度リポ蛋白質受容体、
ＰＢＭＣは末梢血単核球、
ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水、
ＰＤＣは胎盤由来細胞、
ＰＤＧＦｂｂは血小板由来増殖因子、
ＰＤＧＦｒ−αは血小板由来増殖因子受容体α、
ＰＤ−Ｌ２はプログラム死リガンド２、
ＰＥはフィコエリトイン、
ＰＯは「経口」、
ＰＰＤＣは分娩後由来細胞、
Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）は、活性化で制御され、正常Ｔ細胞が発現および分泌（regulated on activation, normal T cell expressed and secreted）の遺伝子、
ｒｂはウサギ、
ｒｈは組み換えヒト、
ＳＣは皮下、
ＳＣＩＤは重度複合免疫不全、
ＳＤＦ−１αは間質由来因子１α、
ＳＨＨはソニック・ヘッジホッグ、
ＳＭＡは平滑筋アクチン、
ＳＯＰは標準操作手順、
ＴＡＲＣは胸腺および活性化制御ケモカイン、
ＴＣＰは組織培養プラスチック、
ＴＧＦβ２はトランスフォーミング増殖因子β２、
ＴＧＦβ３はトランスフォーミング増殖因子β３、
ＴＩＭＰ１は組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１、
ＴＰＯはトロンボポエチン、
ＴｕＪ１はＢＩＩＩチューブリン、
ＵＤＣは臍帯由来細胞、
ＶＥＧＦは血管内皮増殖因子、
ｖＷＦはフォンウィレブランド因子、
αＦＰはαフェトプロテインである。
【００５４】
説明
様々な特許および他の公開はここで、本明細書中に引用され、それぞれは、ここで参照することによってその全体参照することにより本書に盛り込まれる。
【００５５】
１つの観点では、本発明は、実質的に血液がない分娩後組織に由来する分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）を提供する。前記ＰＰＤＣは、これだけに限らないが、ヒトを含む哺乳類の胎盤に由来してもよい。前記細胞は、培養中で自己複製および増殖が可能である。前記分娩後由来細胞は、他の表現型の細胞に分化する可能性を有する。本発明は、臍帯血に対するものとして、いくつかの観点の１つにおいて、臍帯に由来する細胞を提供する。本発明は、いくつかの観点の１つにおいて、胎盤組織に由来する細胞も提供する。
【００５６】
前記細胞は、細胞的、遺伝的、免疫学的、生化学的特徴のいくつかについて特徴付けられた。例えば、前記細胞はその増殖、その細胞表面マーカー、その遺伝子発現、その特定の生化学的栄養因子生産能力、その免疫学的特徴により特徴付けられた。
【００５７】
分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）の由来および増殖
ここで説明された方法によれば、哺乳類の胎盤と臍帯は、満期産または早期産のいずれかを終了時またはその直後、例えば出産後の娩出後に回復される。分娩後組織は、経膣的、または他の方法、例えば帝王切開を用いるかによらず、完了した妊娠、満期または満期前すべてから得られる可能性がある。前記分娩後組織は前記出産施設から実験室に、フラスコ、ビーカー、培養皿、またはバッグなどの無菌容器で輸送されてもよい。前記容器は、これだけに限らないが、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの塩溶液を含む溶媒または培地、またはウィスコンシン大学溶液またはペルフルオロ化合物溶液など、移植に使用される臓器の輸送に使用するすべての溶液を有してもよい。これだけに限らないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなど、１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤が培地または緩衝液に追加されてもよい。前記分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液で洗い流してもよい。ＰＰＤＣの抽出前に約４〜１０℃で前記組織を保持することが好ましい。前記組織はＰＰＤＣの抽出前に凍結されないことがさらに好ましい。
【００５８】
ＰＰＤＣの単離は、無菌環境で行われることが好ましい。血液および壊死組織片は、ＰＰＤＣの単離前に前記分娩後組織から除去されることが好ましい。例えば、前記分娩後組織は、これだけに限らないが、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶液で洗浄されてもよい。前記洗浄緩衝液も、これだけに限らないがペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなど、１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤を有してもよい。
【００５９】
本発明のいくつかの観点では、前記分娩後組織にある異なる細胞タイプが、亜集団に分画され、そのような亜集団からＰＰＤＣが単離され得る。これは、これだけに限らないが、分娩後組織をその成分細胞に分離する酵素処理を含む細胞分離法を用い、その後、クローニングおよび特定の細胞タイプの選択が行われるが、このような選択には、これだけに限らないが、例えば形態学的および／または生化学的マーカーに基づく選択、望ましい細胞の選択的増殖（正の選択）、望まない細胞の選択的破壊（負の選択）、混合集団で差別的細胞被凝集性による分離（例えば大豆凝集素を用いて）、凍結−解凍法、前記混合集団中の細胞の差別的接着性、ろ過、従来の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心傾瀉（傾瀉遠心分離）、単位重力分離、対向流分布、電気泳動、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーなど、特定の細胞タイプをクローニングおよび選択することで達成されてもよい。
【００６０】
好適な実施形態では、胎盤全体またはその断片または切片を有する分娩後組織は、機械力（刻みまたは剪断力）、マトリックスメタロプロテアーゼおよび／または例えばコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）、ヒアルロニダーゼ、および／またはペプシン、または機械的、酵素的方法の組み合わせなど中性プロテアーゼなど、蛋白質分解酵素単独またはその組み合わせを用いた酵素消化により脱凝集される。例えば、前記分娩後組織の細胞成分は、コラゲナーゼを介した解離を用いた方法により脱凝集されてもよい。酵素消化法は、好ましくはマトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組み合わせなどの酵素の組み合わせを利用している。前記マトリックスメタロプロテアーゼは、好ましくはコラゼナーゼである。前記中性プロテアーゼは、好ましくはサーモリシンまたはディスパーゼであり、最も好ましくはディスパーゼである。より好ましくは、分娩後組織の酵素消化がコラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼまたはＬＩＢＥＲＡＳＥ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）とヒアルロニダーゼの組み合わせなど、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロン酸を消化する粘液溶解酵素の組み合わせを利用している。コラゲナーゼは１、２、３、または４型であってもよい。細胞単離の分野で既知の他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなどのセリンプロテアーゼを含み、これらはマトリックスメタロプロテアーゼ、粘液溶解酵素、中性プロテアーゼなど他の酵素単独またはその組み合わせで使用されてもよい。セリンプロテアーゼは、好ましくは他の酵素使用後に引き続いて使用される。前記温度と組織または細胞がセリンプロテアーゼと接触している時間は特に重要である。セリンプロテアーゼは血清中α２ミクログロブリンで阻害される可能性があるため、前記消化に用いる培地は通常血清を含まない。ＥＤＴＡおよびＤＮＡアーゼは一般的に酵素消化法に利用され、細胞回復の効率を上昇させる。前記消化の希釈度は、細胞が前記粘性消化液中で捕捉される可能性があるため、前記細胞収率にも大きく影響する可能性がある。前記ＬＩＢＥＲＡＳＥ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）のＢｌｅｎｄｚｙｍｅ（ロッシュ社）シリーズの酵素の組み合わせは非常に有用であり、前記簡便な方法で利用されてもよい。他の酵素源も既知であり、当業者は自然供給源から直接そのような酵素を入手してもよい。当業者は、本発明の前記細胞の単離に利用するため、新規、または追加の酵素または酵素の組み合わせを評価する設備も十分備えている。好ましい酵素処理は０．５、１、１．５、または２時間若しくはそれ以上である。より好ましい実施形態では、前記分解段階の酵素処理中、前記組織が３７℃でインキュベートされる。
【００６１】
前記臍帯および胎盤を有する分娩後組織は、分離せずに使用されてもよい。代わりに、前記臍帯は当業者に周知の方法で前記胎盤から分離されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、分娩後組織が臍帯および胎盤などの２若しくはそれ以上の部分に分離される。本発明のいくつかの実施形態では、胎盤組織が２若しくはそれ以上の部分に分離され、各部分が主に新生児、新生児と母体、母体側のいずれかを有する。前記分離部分は次に、ここに示された方法に従い、機械的および／または酵素的分離によって分離される。新生児または母体細胞系譜の細胞は、例えば角化細胞分析またはＹ染色体のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、当該分野で既知の方法により同定されてもよい。核型分析も、正常核型の細胞を同定するために利用されてもよい。
【００６２】
ＰＰＤＣが増殖する単離細胞または分娩後組織は、細胞培養の開始または播種に利用されてもよい。細胞は、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、細胞外膜蛋白質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））などの細胞外基質またはリガンドでコーティングされていないか、コーティングされている滅菌組織培養容器に移される。ＰＰＤＣは、これだけに限らないが、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞基本培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、アドバンストＤＭＥＭ（ギブコ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（シグマ）、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥなどの細胞増殖を維持することができる培地で培養される。前記培地は、例えば血清（例えば好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（ＥＳ）、ヒト血清（ＨＳ））、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１若しくはそれ以上の増殖因子、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含むアミノ酸、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンの単独または併用など、微生物汚染を制御するための１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌薬を含む、１若しくはそれ以上の成分が補充されてもよい。前記培地は、好ましくは増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、血清、ＢＭＥ、抗真菌剤、抗生物質）を有する。
【００６３】
前記細胞は一定の密度で培養容器に播種され、細胞増殖を可能とする。好適な実施形態では、前記細胞が空気中のＣＯ２容積約０〜約５パーセントで培養される。いくつかの好適な実施形態では、前記細胞が空気中のＯ２約２〜約２５パーセント、好ましくは空気中のＯ２約５〜約２０パーセントで培養される。前記細胞は好ましくは約２５〜約４０℃、より好ましくは約３５℃〜約３９℃で培養され、さらに好ましくは３７℃で培養される。前記細胞は好ましくはインキュベーターで培養される。前記培養容器の培地は、例えばバイオリアクターで静止または攪拌されてもよい。ＰＰＤＣは好ましくは低酸化的ストレス下で培養される（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインを追加する）。ここで用いられる「低酸化的ストレス」は、前記培養細胞にフリーラジカルの障害が全くないか、最小限の状態を指す。
【００６４】
最も適切な培地、培地の調整、細胞培養法の選択法は当該分野で周知であり、参照することにより本書に盛り込まれるＤｏｙｌｅら、（編集），１９９５，ＣＥＬＬ  &  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒおよびＨｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （編集），１９９１，ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（ボストン）を含む様々な出典で説明されている。
【００６５】
例えばピペットなどで培養皿から培地を慎重に吸引し、新しい培地で補充することにより、前記培地は必要に応じて変更される。インキュベーションは、前記培養皿に十分な数または密度の細胞が蓄積するまで継続される。前記最初の移植組織片は除去されてもよく、前記残りの細胞は標準的な方法または細胞スクレーパーを用いてトリプシン処理されてもよい。トリプシン処理後、前記の通り前記細胞は回収され、新しい培地に除去され、インキュベートされる。いくつかの実施形態では、前記培地はトリプシン処理後、約２４時間で少なくとも１回変更され、すべての浮遊細胞を除去する。培養中に残った前記細胞はＰＰＤＣであると考えられる。
【００６６】
十分な時間、前記細胞または組織断片を培養後、ＰＰＤＣは分娩後組織からの移動または細胞分裂、またはその両方の結果として増殖する。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＰＤＣが最初に用いたものと同じまたは異なるタイプの新鮮培地を含む別の培養容器に継代または除去され、前記細胞集団は有糸分裂により増殖されうる。ＰＰＤＣは好ましくはおよそ１００％のコンフルエントまで、より好ましくは約７０〜８５％コンフルエントまで継代させる。継代のコンフルエントの下限は、当業者に理解される。前記本発明の胎盤由来細胞は、第１継代培養（継代０）から老化まで利用されてもよい。前記好適な継代数は、特定の適用に十分な細胞数を生じる継代数である。特定の実施形態では、前記細胞が２〜２５倍、好ましくは４〜２０倍、より好ましくは８〜１５倍、より好ましくは１０〜１１倍、最も好ましくは１１倍に継代される。クローン細胞集団が単離されたことを確認するため、クローニングおよび／またはサブクローニングが実施されてもよい。
【００６７】
本発明の細胞は凍結保存され、および／または使用前に保存されてもよい。
【００６８】
ＰＰＤＣの特性解析
ＰＰＤＣは例えば増殖特性（例えば集団倍加能、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば正常な核型、母体または新生児の細胞系譜）、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えばこれだけに限らないが、ビメチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、ＮＯＧＯ−Ａを含むエピトープの検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来のＰＣＲ））、蛋白質配列、蛋白質の分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＰＤＣ条件培地の分析により、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による）、抗体分析（例えばＥＬＩＳＡ、これだけに限らないが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦｒ−α）、ＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）、ＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）、Ｂ７−Ｈ２、ＰＤ−Ｌ２を含む細胞表面マーカーの抗体染色）、混合リンパ球反応（例えば、同種ＰＢＭＣ刺激の指標として）、および／または他の当該分野に既知の方法で特徴付けられてもよい。
【００６９】
ＰＰＤＣは培養で少なくとも４０集団倍加を行う可能性がある。集団倍加は［ｌｎ（最終的細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ２］として計算されうる。倍加時間は（培養時間（ｈ）／集団倍加）として計算されてもよい。
【００７０】
未分化のＰＰＤＣは、好ましくは少なくともＮＯＧＯ−Ａ、ＧＣＰ−２、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンの１つを生産し、より好ましくはＧＣＰ−２、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンのそれぞれを生産する細胞である。いくつかの実施形態では、これらの因子の２、３、４、５種類が前記ＰＰＤＣにより生産される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＰＰＤＣにＮＯＧＯ−Ａ、ＧＲＯ−α、または酸化低密度リポ蛋白質受容体の少なくとも１つの生産がない。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣにこれらの因子の少なくとも２種類または３種類の生産がない。
【００７２】
ＰＰＤＣがＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つ細胞表面マーカーを有してもよい。ＰＰＤＣは好ましくはこれらの表面マーカーそれぞれを生産する。ＰＰＤＣはフローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生がないことで特徴付けられてもよい。ＰＰＤＣは好ましくはこれらの表面マーカーそれぞれを生産しない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣが、線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関して発現を示し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α誘導蛋白質３の少なくとも１つ、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌でダウンレギュレートされた遺伝子１、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇する。好適なＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関して、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α誘導蛋白質３のレベルが上昇し、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌でダウンレギュレートされた遺伝子１、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３のレベルが上昇した発現を示す。線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関した発現が、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α誘導蛋白質３の少なくとも１つで上昇するＰＰＤＣでは、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌でダウンレギュレートされた遺伝子１、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで相対的レベルが上昇しないことが好ましい。線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関した発現が、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌でダウンレギュレートされた遺伝子１、、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇するＰＰＤＣでは、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α誘導蛋白質３の少なくとも１つの相対的レベルが上昇しないことが好ましい。
【００７４】
ＰＰＤＣが線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関した発現が、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１（抗増殖性）、コレステロール２５−水酸化酵素、ｒｕｎｔ関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型α１、テネイシンＣ、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックス蛋白質５、ヘファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過カルシウム活性化チャネル（サブファミリーＮ、メンバー４）、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス５、仮想的蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク５、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用蛋白質３様、ＡＥ結合蛋白質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種・腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合蛋白質２（３６ｋＤａ）の少なくとも１つで減少している。
【００７５】
当業者は、前記様々な遺伝子の発現が、遺伝子アレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ、で都合よく特徴付けられることを理解するであろう。
【００７６】
ＰＰＤＣは、増殖因子、ケモカイン、サイトカインなど、様々な生化学的に活性な因子を分泌することができる。好適な細胞はＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１つを分泌する。ＰＰＤＣはＥＬＩＳＡで検出されるとおり、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌がないことで特徴付けられてもよい。前記細胞を同定し、特徴付けるため、また当該分野で既知のその他の細胞と本発明の細胞を区別するため、これらの特徴を利用できる。
【００７７】
好適な実施形態では、前記細胞が前記特徴の２若しくはそれ以上を有する。より好ましくは、前記特徴の３、４、または５若しくはそれ以上を有する細胞である。さらに好ましくは、前記特徴の６、７、または８若しくはそれ以上の特徴を有する分娩後由来細胞である。さらに好ましくは、現在、前記請求された特徴９つすべてを有する細胞である。
【００７８】
また現在好ましくは、ＧＣＰ−２、ＮＯＧＯ−Ａ、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンの少なくとも２つを生産する細胞である。より好ましくは、前記蛋白質の３、４、または５種類を生産する細胞である。
【００７９】
当業者は、細胞マーカーが非常に異なる増殖条件でやや変化しやすく、一般にここで説明されているものは増殖培地、またはその変化物での特徴であることを理解されたい。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１、２、３、４種類を産生する分娩後由来細胞が好ましい。より好ましくは、これらの細胞表面マーカーの５、６、または７種類を生産する細胞である。さらに好ましくは、前記細胞表面マーカー蛋白質の８、９、または１０種類を生産することができる分娩後由来細胞である。
【００８０】
フローサイトメトリーで検出されるとおり、蛋白質ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１、２、３、または４種類が産生されないＰＰＤＣが好ましい。これらのマーカーの少なくとも５、６、７、または８種類若しくはそれ以上が生産されないＰＰＤＣが好ましい。より好ましくは、前記細胞表面マーカーの少なくとも９または１０種類が生産されない細胞である。最も好ましくは、前記同定蛋白質の１１、１２、または１３種類の生産がない細胞である。
【００８１】
フローサイトメトリーで検出されるとおり、現在の好ましい細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを生産し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかを生産しない。
【００８２】
分娩後由来細胞が、線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関して、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α誘導蛋白質３の少なくとも１、２、または３種類が増加した遺伝子の発現を示し、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌ダウンレギュレートされた遺伝子１、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１、２、または３種類のうちの少なくとも１つが増加した遺伝子の発現を示すことが好ましい。より好ましくは、４または５種類の相対的発現上昇を示す細胞であり、さらに好ましくは前記それぞれの遺伝子セットの遺伝子のうち６、７、または８種類の相対的発現を上昇させることができる細胞である。より好ましくは、前記細胞が、線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α誘導蛋白質３の組み合わせで増加した遺伝子の発現を示し、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌でダウンレギュレートされた遺伝子１、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の組み合わせで増加した遺伝子の発現を示す。
【００８３】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１（抗増殖性）、コレステロール２５−水酸化酵素、ｒｕｎｔ関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型α１、テネイシンＣ、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックス蛋白質５、ヘファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過カルシウム活性化チャネル（サブファミリーＮ、メンバー４）、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス５、仮想的蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク５、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用蛋白質３様、ＡＥ結合蛋白質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種・腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合蛋白質２（３６ｋＤａ）に対応する遺伝子の少なくとも１つで発現が減少した細胞が好適である。より好ましくは、ヒト線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞に関して、上記に対応する少なくとも５、１０、１５、または２０遺伝子の発現が低下した細胞である。現在、より好ましくは、前記配列に対応する遺伝子の少なくとも２５、３０、または３５種類の発現が低下した細胞である。またより好ましくは、ヒト維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞に関して、前記配列の３５若しくはそれ以上、４０若しくはそれ以上、またはすべてに対応する遺伝子が低下した発現を有する分娩後由来細胞である。
【００８４】
特定の増殖因子および他の細胞蛋白質の分泌は、特に有用な本発明の細胞を作る可能性がある。好適な分娩後由来細胞はＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１、２、３、または４種類を分泌する。前記蛋白質の５、６、７、または８種類を分泌する細胞も好ましい。前記因子の少なくとも９、１０、１１若しくはそれ以上を分泌することができる細胞がより好ましく、前記リストで前記蛋白質の１２若しくはそれ以上、またはさらに１３種類すべてを分泌できる細胞が好ましい。
【００８５】
そのような因子の分泌は有用であるが、ＰＰＤＣはまた、前記培地に因子を分泌できないことでも特徴付けられる。ＥＬＩＳＡで検出されるとおり、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１、２、３、または４種類の分泌がない分娩後由来細胞が現在、使用に好ましい。前記蛋白質の５または６種類の分泌がないことで特徴付けられる細胞は、より好ましい。前記因子の７種類すべての分泌がない細胞も好ましい。
【００８６】
本発明の分娩後由来細胞の実施例は、（１）株表示ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）は２００４年６月１５日に預けられ、受入番号ＰＴＡ−６０７４が割り当てられ、（２）株表示ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）は２００４年６月１５日に預けられ、受入番号ＰＴＡ−６０７５が割り当てられ、（３）株表示ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）２００４年６月１５日に預けられ、受入番号ＰＴＡ−６０７９が割り当てられるように、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）で預けられ、ＡＴＣＣ受入番号を割り当てられた。
【００８７】
本発明の臍帯由来細胞の例は、（１）株表示ＵＭＢ  ０２２８０３  （Ｐ７）には受入番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ、（２）株表示ＵＭＢ  ０２２８０３  （Ｐ１７）には受入番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられるように、２００４年６月１０日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）が預けられ、ＡＴＣＣ受入番号が割り当てられた。
【００８８】
ＰＰＤＣは単離されうる。前記発明はＰＰＤＣの集団を含むＰＰＤＣの組成も提供する。いくつかの実施形態では、前記細胞集団が不均一である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明のＰＰＤＣの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有してもよい。いくつかの実施形態では、前記本発明の不均一な細胞集団は、さらに骨髄細胞、幹細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、および／または前駆細胞を有してもよい。いくつかの実施形態では、前記本発明の不均一な細胞集団は、さらに骨髄細胞、幹細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞および／または前駆細胞を有してもよい。いくつかの実施形態では、前記集団が実質的に均一であり、つまり実質的にＰＰＤＣのみを有する（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上のＰＰＤＣ）。前記本発明の均一細胞集団は、臍帯または胎盤由来細胞を有してもよい。臍帯由来細胞の均一集団は、母体細胞系譜の細胞がないと考えられる。胎盤由来細胞の均一な集団は新生児または母体の細胞系譜であってもよい。細胞集団の均一性は、例えば細胞ソーティング（フローサイトメトリーなど）、ビーズ分離、またはクローン増殖などの当該分野で既知の方法により達成されてもよい。
【００８９】
本発明の方法は、さらに培養中の本発明の細胞を増殖することにより、分娩後由来細胞の集団を作る方法を有する。前記本発明の分娩後由来細胞は、好ましくは酸素約５％〜約２０％がある状態で増殖する。前記本発明の分娩後由来細胞は、好ましくはこれだけに限らないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、間葉幹細胞増殖培地、アドバンスドＤＭＥＭ（ギブコ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（シグマ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥ、アドバンスドＤＭＥＭ（ギブコ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（シグマ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、イスコブ改変ダルベッコ培地、またはイーグル基本培地などの培地で増殖される。前記培地は、好ましくは低または高グルコース、約２％〜１５％（ｖ／ｖ）血清、βメルカプトエタノール、抗生物質を含む。前記培地は、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、表皮増殖因子の少なくとも１つを有してもよい。本発明の前記細胞はコーティングされていないか、コーティングされた表面上で増殖されてもよい。前記細胞の増殖した表面は、例えばゼラチン、コラーゲン（例えば未変性または変性）、フィブロネクチン、ラミニン、オルニチン、ビトロネクチン、または細胞外膜蛋白質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ）でコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞集団が別の細胞集団と混合される。
【００９０】
軟骨形成培地におけるＰＰＤＣの培養
ＰＰＤＣは分化が誘導される細胞培養条件とすることで、軟骨形成細胞系譜に分化するように誘導されてもよい。ＰＰＤＣは、アスコルビン酸の有無にかかわらず、例えば１若しくはそれ以上のＧＤＦ−５またはトランスフォーミング成長因子β３（ＴＧＦ−β３）など、特定の外因性軟骨形成増殖因子（例えば、培養中）を有する軟骨形成培地で培養されてもよい。
【００９１】
好ましい軟骨形成培地には、抗生物質、プロリン、グルタミンを含むアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、デキサメタゾン、アスコルビン酸、インスリン／トランスフェリン／セレニウムが添加される。軟骨形成培地には、好ましくは水酸化ナトリウムおよび／またはコラーゲンが添加される。最も好ましくは、軟骨形成培地にコラーゲンが添加される。前記細胞は高密度または低密度で培養されてもよい。細胞は血清がない状態で培養されることが好ましい。
【００９２】
骨形成培地におけるＰＰＤＣの培養
ＰＰＤＣは分化を誘導する細胞培養条件とすることで、骨形成細胞系譜に分化するように誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、これだけに限らないが、約１０−７モルおよび約１０−９モルのデキサメタゾンを含む培地（例えば低グルコースＤＭＥＭ）と約１０マイクロモル〜約５０マイクロモルのアスコルビン酸リン酸塩（例えばアスコルビン酸−２−リン酸）および約１０ナノモル〜約１０ミリモルのβ−グリセロリン酸との組み合わせなど、ＰＰＤＣが骨形成培地で培養される。前記培地は好ましくは血清（例えばウシ血清、ウマ血清）を含む。骨形成培地も１若しくはそれ以上の抗生物質／抗真菌薬を有してもよい。前記骨形成培地には、好ましくはトランスフォーミング成長因子−β（例えば、ＴＧＦ−β１）および／または骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、またはその組み合わせ、最も好ましくはＢＭＰ−４）が添加される。
【００９３】
分化の評価
ＰＰＤＣは、外胚葉、内胚葉、または中胚葉細胞系譜に分化するように誘導されてもよい。本発明のＰＰＤＣから発達する分化細胞を特徴付ける方法には、これだけに限らないが組織学的、形態的、生化学的、免疫組織化学的方法を含み、または前記分化細胞による因子を同定することで、また前記分化ＰＰＤＣの誘導性により、遺伝的または分子的に細胞表面マーカーを用いる。
【００９４】
軟骨形成分化は、例えばグリコサミノグリカンの発現についてはサフラニン−Ｏ染色により、前記細胞またはヘマトキシリン／エオシン染色により、または前記培養またより好ましくは前記細胞自体の軟骨形成細胞系譜マーカー（例えば、硫酸グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカン、ケラチン、コンドロイチン、ＩＩ型コラーゲン）の検出により評価されてもよい。
【００９５】
ＰＰＤＣでは、前記培養中、またより好ましくは前記細胞自体で、当分野で既知の方法、例えばｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色、またはオステオカルシン、骨シアロタンパク質、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、オステオポンチン、Ｉ型コラーゲン、骨形態形成タンパク質、および／または核結合因子ａ１などの骨形成マーカーの検出により、骨形成表現型が分析されてもよい。
【００９６】
ＰＰＤＣまたはその成分または製剤の利用方法
ＰＰＤＣの遺伝子工学
本発明の前記細胞は設計され、これだけに限らないが、組み込み型ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター、非組み込み型複製ベクター、例えばパピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター、または複製欠陥ウイルスベクターを含む様々なベクターのいずれかを利用することができる。細胞にＤＮＡを導入する他の方法には、リポソーム、電気穿孔法、パーティクルガンの利用を含み、または直接ＤＮＡ注入法による。
【００９７】
宿主細胞は、特にプロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など、１若しくはそれ以上の適切な発現制御因子により制御されるか、その操作と関連したＤＮＡ、および選択可能なマーカーにより変換または形質移入されることが好ましい。
【００９８】
前記外来ＤＮＡの導入後、設計された細胞は強化培地で増殖することができ、次に選択的培地に交換されてもよい。前記外来ＤＮＡの選択的マーカーは前記選択に抵抗性を与え、例えばプラスミド上でその染色体に対し、細胞に安定して前記外来ＤＮＡを組み込み、順に細胞株にクローン化され、増殖されうる増殖巣を形成するように増殖させることができる。
【００９９】
この方法は、前記遺伝子産物を発現する細胞株を設計するため、有利に利用されてもよい。
【０１００】
前記挿入遺伝子の発現を誘導するため、いずれのプロモーターを使用してもよい。例えば、ウイルスプロモーターにはこれだけに限らないが、前記ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ  ４０、パピローマウイルス、ＥＢウイルスまたはエラスチン遺伝子プロモーターを含む。好ましくは、対照遺伝子の発現を制御するために用いた前記制御要素は、前記遺伝子の制御された発現を可能とし、前記産物はｉｎ  ｖｉｖｏで必要なときにだけ合成されるようにする。一時的な発現が望ましい場合、構成プロモーターが非組み込み型および／または非複製ベクターに用いられる。代わりに、誘導性プロモーターを用い、必要に応じて前記挿入遺伝子の発現を誘導することができる。
【０１０１】
誘導プロモーターは、メタロチオネインおよび熱ショック蛋白質と関連するものを含むが、これだけに限らない。
【０１０２】
本発明の前記細胞は遺伝的に設計され、前記移植部位で炎症または拒絶を促す因子を「ノックアウト」または「ノックダウン」発現させうる。標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させる、負の調節法が以下に考察されている。「負の調節」はここで用いるとおり、前記修飾的治療を行わない状態で、前記標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性に関して、標的遺伝子産物の前記レベルおよび／または活性が低下することを指す。軟骨細胞または骨細胞への未変性遺伝子の発現は、例えば前記相同性組み換え技術を用い、前記遺伝子を完全に不活化することで（一般的には「ノックアウト」と呼ばれる）発現を抑制するなど多数の方法により、低下されるか、ノックアウトされることが可能性である。通常は、前記蛋白質の重要な領域をコードするエキソン（またはその領域に５’のエキソン）は、例えばｎｅｏなどの正の選択的マーカーにより妨害され、前記標的遺伝子の正常ｍＲＮＡの生産を阻害し、前記遺伝子が不活化される。遺伝子は、遺伝子の一部を欠失させるか、遺伝子全体を欠失させることで不活化されうる。前記ゲノムから離れた前記標的遺伝子に相同的な２領域がある作成物を用いることで、前記２領域の間の配列は欠失されうる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４）。
【０１０３】
前記標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、およびリボザイム分子は、本発明に従って用いられ、標的遺伝子活性のレベルを低下させてもよい。例えば、主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応に対して最も多目的に使えることが示された。またさらに、三重らせん分子は標的遺伝子活性のレベルを低下させるために使用されることができる。
【０１０４】
これらの技術はＬ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら、（編集），１９９４，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  &  Ｌａｎｇｅ（コネチカット州ノーウォーク）で詳細に説明され、参照することにより本書に盛り込まれる。
【０１０５】
ＩＬ−１は、軟骨の再吸収と軟骨細胞による炎症メディエーターの生産を司る強力な刺激物質である（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：１２３８）。前記方法のいずれかを用い、ＩＬ−１の発現が本発明の細胞でノックアウトまたはノックダウンされ、本発明の細胞により、移植した軟骨の再吸収リスクが低下し、炎症性メディエーターの産生が減少する可能性がある。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、前記移植組織が拒絶されるリスクを低下させるため、ノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。
【０１０６】
本発明の前記細胞が一度遺伝子操作されると、前記患者に直接移植され、例えばリウマチ様または関節疾患などの骨または軟骨の疾患を治療することが可能となるか、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、または他の炎症性サイトカインの中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチドなど、抗炎症性遺伝子産物を生産してもよい。
【０１０７】
代わりに、前記遺伝子設計された細胞が使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで新しい組織を産生してもよく、ここで述べられているとおり、この組織が前記被験者に移植される。
【０１０８】
栄養因子の分泌
ＰＰＤＣによる増殖因子の分泌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで第２の細胞タイプの栄養支持を提供してもよい。ＰＰＤＣは例えば少なくとも単球走化性蛋白質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＧＣＰ−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、ＲＡＮＴＥＳ、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）の少なくとも１つを分泌してもよく、既知組成培地における前記細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養を含め、様々な方法により増大される可能性がある。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＰＤＣ集団が、胚幹細胞などの幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、その混合物を含む細胞の生存、増殖、成長、維持、成熟、分化、活性上昇を支持する。本発明のいくつかの観点では、ＰＰＤＣの集団が胚幹細胞などの幹細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、その混合物を含む細胞を支持する。本発明のいくつかの観点では、ＰＰＤＣの集団が胚幹細胞などの幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、その混合物を含む細胞を支持する。他の実施形態では、前記集団が実質的に均一であり、つまり実質的にＰＰＤＣのみを有する（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上のＰＰＤＣ）。
【０１１０】
ＰＰＤＣは共培養で他の細胞タイプの生存、増殖、分化を支持する能力を有する。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣがｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養され、これだけに限らないが、幹細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、および／または骨髄細胞、またはその組み合わせを含む、他の細胞に栄養支援を提供する。共培養では、前記ＰＰＤＣと前記望みの他細胞が前記２つの細胞タイプが接触している条件で共培養されることが望ましいと考えられる。これは例えば、培地または適当な培養基質での細胞の不均一集団として、前記細胞を播種することにより達成される可能性がある。代わりに、前記ＰＰＤＣはまずコンフルエントまで増殖され、培養で第２の望みの細胞タイプの基質として利用される可能性がある。この後者の実施形態では、前記細胞がさらに膜または同様の装置によって物理的に分離されてもよく、前記共培養期間後、前記他の細胞タイプが除去、別に使用されてもよい。他の実施形態では、前記望みの他細胞が前記ＰＰＤＣの条件培地、細胞外基質、および／または細胞溶解物と接触して培養される。他の細胞タイプの増殖と分化を促す共培養でＰＰＤＣを使用することで、研究および臨床／治療分野における適用性を見出すことができる。例えば、ＰＰＤＣの共培養が利用され、例えば、薬物スクリーニングアッセイでの基本的な研究目的として、または利用するため、例えば軟骨細胞または骨細胞の培養で、特定表現型の細胞の増殖と分化を促してもよい。後者の治療目的の投与で、骨形成または軟骨形成表現型の細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで増殖する際に、ＰＰＤＣ共培養が利用されてもよい。例えば、細胞は個体から採取され、ＰＰＤＣを用いた共培養でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され、次に個体（自己移植）または別の個体（同系移植または同種移植）に戻されてもよい。これらの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖後、前記ＰＰＤＣを有する細胞の混合集団が、例えばここで示される骨または軟骨疾患の治療を必要とする患者に投与される可能性があることは理解されるであろう。代わりに、自己移植が適切であるか、望ましい状態では、前記共培養された細胞集団が培養で物理的に分離され、前記患者の投与で前記自己細胞の除去を可能としてもよい。
【０１１１】
ＰＰＤＣの条件培地
本発明の別の実施形態では、軟骨形成または骨形成細胞系譜への分化を刺激する条件でインキュベートされた未分化ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣから、条件培地の生産にＰＰＤＣを使用することを特徴としている。そのような条件培地は、例えば、これだけに限らないが骨髄細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞を含む幹細胞または前駆細胞などの細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ培養で、または例えばＰＰＤＣおよび／または幹細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨髄細胞などの均一または不均一な集団を有する移植細胞を支援するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために検討される。
【０１１２】
ＰＰＤＣの治療応用
本発明のＰＰＤＣが利用され、前記組織の疾患または外傷または前記組織が正常に発達できないため、軟骨または骨組織の修復または置換を必要とする患者を治療するか、顔または身体の他の特徴を増大するなどの美容機能を提供してもよい。治療では、本発明の前記細胞を利用し、新しい軟骨組織または骨組織を生産してもよい。例えば、本発明の未分化または軟骨形成分化誘導細胞が利用され、例えば関節リウマチまたは変形性関節症または軟骨の外傷や外科的障害などの軟組織疾患を治療してもよい。別の例としては、本発明の未分化または骨形成分化誘導細胞が利用され、代謝性および非代謝性骨疾患を含む骨疾患を治療してもよい。骨疾患の例には、半月板の断裂、脊椎の癒着、椎間板の欠落、脊髄の再構築、骨折、骨／脊髄の変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症、脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯の骨量減少、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、骨パジェット病を含む。
【０１１３】
本発明の細胞は、単独でまたは他の細胞との混合して投与されてもよい。ＰＰＤＣと同時に投与されうる細胞には、これだけに限らないが、他の多分化能または多能性細胞または軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、幹細胞、または骨髄細胞を含む。異なるタイプの細胞が投与直前または少し前にＰＰＤＣと混合されてもよく、または投与前に一定期間一緒に共培養されてもよい。
【０１１４】
前記ＰＰＤＣは他の有益な薬物または生体分子（増殖因子、栄養因子）を投与されてもよい。ＰＰＤＣが他の薬物とともに投与される場合、他の因子と同時に、または順番に（他の薬物の投与前後で）単一の医薬品または別の医薬品中に一緒に投与されてもよい。同時に投与されうる生理活性因子には、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣剤、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）などのカルシニュリン阻害薬、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、および局所麻酔薬を含む。別の例として、参照することにより本書に盛り込まれる米国特許番号５，８２７，７３５で述べられているとおり、前記細胞は瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１１５】
１つの実施形態では、ＰＰＤＣは未分化細胞として、つまり増殖培地で培養されたものとして投与される。代わりに、ＰＰＤＣは望みの表現型、例えば軟骨形成または骨形成表現型などへの分化を刺激する疾患に対し、培養での曝露後に投与されてもよい。
【０１１６】
本発明の前記細胞は、（例えばカテーテルまたはシリンジにより）外科的に移植、注入、送達されてもよく、またそうでなければ修復または増大を必要とする部位に直接または間接的に投与されてもよい。前記細胞は基質（例えば三次元骨格）により投与されてもよい。前記細胞は従来薬学的に許容可能な担体が投与されてもよい。本発明の細胞またはその組成または成分（例えばＥＣＭ、細胞溶解物、条件培地）の投与経路には、筋肉内、眼、非経口（静脈内を含む）、動脈内、皮下、経口、経鼻投与を含む。特定の非経口投与経路には、これだけに限らないが、筋肉内、皮下、腹腔内、脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、髄腔内、および／または脊髄周囲の投与経路を含む。
【０１１７】
細胞が半固体または固体装置で投与される場合、前記身体の正確な位置への外科的移植が典型的に望ましい投与方法である。しかし、液体または液体医薬品はより全身的な部位に（例えば、散在した患部中に）投与されてもよく、そこから例えば化学シグナルに応答することで、特定の部位へ移動する。
【０１１８】
他の実施形態には、ＰＰＤＣ細胞成分（例えば細胞溶解物またはその成分）または産物（例えば細胞外基質、他のＰＰＤＣにより天然で生産されるか、遺伝子組み換えによる栄養および他の生物学的因子、ＰＰＤＣ培養の条件培地）を有する医薬品を投与することによる治療法も含む。またこれらの方法には、さらに参照することにより本書に盛り込まれる米国特許番号５，８２７，７３５で説明されているとおり、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣剤、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、局所麻酔薬、瘢痕抑制因子など、他の生理活性因子を投与する方法を含む。
【０１１９】
ＰＰＤＣまたはここで説明された他の医薬品のいずれかを投与する剤型と投与法は、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に沿って開発され、個々の患者の条件、例えば治療される前記状態の性質と程度、年齢、性別、体重、全身の疾患、医師に既知の他の要因に沿って投与する。従って、患者に投与される医薬品の有効量は、当該分野で既知のこれらの条件により決定される。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＰＤＣを用いた細胞療法の開始前に患者の免疫反応を抑制することが必要または望ましくないこともある。さらに、ＰＰＤＣは混合リンパ球反応で同種ＰＢＭＣを刺激しないことが示された。従って、同種またはさらに異種のＰＰＤＣを用いた移植が、場合によって耐性があると考えられる。
【０１２１】
従って、その他の場合、細胞療法を開始する前に患者の免疫反応を薬理学的に抑制することが望ましいか適切であると考えられる。これは、全身または局所免疫抑制剤を使用することで達成されてもよく、またはカプセル装置で前記細胞を投与することで達成されてもよい。ＰＰＤＣは、前記細胞と治療因子が必要とする栄養物および酸素に透過性のカプセルで覆われていてもよく、前記細胞はまだ免疫ホルモン因子と細胞に不透過性である。好ましくは、前記カプセルの材料は低刺激性で、標的組織に容易に安定して置かれ、前記移植構造に追加保護を提供する。前記移植細胞に対する免疫反応を軽減または除去するこれらの方法は、当該分野で知られている。代わりに、ＰＰＤＣは遺伝的に修飾され、その免疫原性を低下させてもよい。
【０１２２】
生存患者における移植ＰＰＤＣの生存は、様々なスキャン方法、例えばコンピューター断層写真（ＣＡＴまたはＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを利用することで決定される可能性がある。前記標的組織を除去することで、視覚的または顕微鏡により検討することで、移植生存率の決定は死後行われる可能性がある。代わりに、細胞に、特定細胞系譜の細胞特異的なスタチンが投与される可能性がある。ローダミンまたはフルオレセイン標識ミクロスフィア、ファーストブルー、ビスベンズアミド、第二鉄微粒子、またはβ−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼなどの遺伝的に導入されたレポーター遺伝子産物などのトレーサー色素を事前に組み入れることで、移植細胞が同定される可能性もある。
【０１２３】
障害または疾患があった前記機能の回復、例えば関節または骨機能の回復、または機能の増大を検討することで、移植ＰＰＤＣの被験者への機能的統合は評価される可能性がある。
【０１２４】
組成と医薬品
例えば医薬品を含む、ＰＰＤＣと関連製剤の組成（例えば細胞外基質、溶解物、可溶性細胞分画、条件培地）は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の組成には、例えばこれだけに限らないが、増殖因子、分化誘導因子、カスパーゼ阻害薬などの細胞生存因子、ｐ３８キナーゼ阻害薬などの抗炎症性因子、またはＶＥＧＦまたはｂＦＧＦなどの血管形成因子など、１若しくはそれ以上の生理活性因子を含んでもよい。生理活性因子のいくつかの例には、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＬＩＦを含む。いくつかの実施形態では、未分化または分化誘導ＰＤＰＣが前記生理活性因子と接触して培養される。いくつかの実施形態では、未分化ＰＰＤＣは、前記生理活性因子と接触した時点でまだ未分化のままである。他の実施形態では、前記生理活性因子が前記ＰＰＤＣの分化を誘導する。
【０１２５】
本発明の医薬品は、薬学的に許容可能な担体中に、ＰＰＤＣ、その細胞外基質または細胞溶解物、またはその条件培地の均一または不均一な集団を有してもよい。本発明の前記細胞の薬学的に許容可能な担体は、本発明の前記細胞またはその組成または成分と有害な反応を生じない、適した有機または無機の担体物質を含む。生体適合性となる程度まで、適切な薬学的に許容可能な担体には水、（リンガー液などの）塩溶液、アルコール、オイル、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはでんぷんなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジンを含む。そのような製剤は消毒されることができ、望ましい場合は潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤潤滑剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、着色剤などの補助試薬と混合されることができる。本発明での使用に適した医薬品担体は当該分野で知られており、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン）およびＷＯ  ９６／０５３０９で説明され、そのそれぞれが参照することにより本書に盛り込まれる。
【０１２６】
本発明の前記医薬品の用量（例えば投与される細胞数）および投与頻度が、これだけに限らないが治療される状態の性質、前記状態の症状の程度、前記患者の特徴（例えば年齢、サイズ、性別、健康状態）を含む多数の要因に依存している。
【０１２７】
例えばこれだけに限らないが、ＰＰＤＣ、その細胞外基質または細胞溶解物、条件培地、組成、本発明に沿って生産される組成が、障害または破壊された軟組織の修復または置換、既存の軟組織の増大、新規または変化した組織の導入、義肢の修正、または生物組織または構造の接合に利用されてもよい。例えば、本発明のいくつかの実施形態には、（ｉ）三次元培養で増殖された置換軟骨組織作成物でコーティングされた人工股関節、（ｉｉ）軟骨組織作成物を用いた膝の再構築、（ｉｉｉ）関節軟骨の再構築および／または置換を必要とする他の人工関節、（ｉｖ）軟骨組織作成物を用いた美容的再構築を含む。
【０１２８】
例えば、前記膝、股関節、肘、足首、および前記肩甲上腕関節の関節軟骨の関節内障の評価は、関節鏡検査法により実施されてもよい。いくつかの実施形態では、例えば関節鏡視下手術により、軟骨組織の障害があるか、劣化した部分が除去された後、軟骨移植が行われる。軟骨組織作成物は、異なるタイプの関節で再建手術に利用されてもよい。詳細な方法は、Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｎｉｗａｙａｍａ，Ｇ．，（編集），１９８８，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２ｄ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．で説明され、参照することにより本書に盛り込まれる。
【０１２９】
障害のある軟骨の修復または置換は、修復部位に移植細胞および／または軟骨組織を固定することで強化されてもよい。前記新規細胞および／または軟骨組織を所定の位置に固定するため、前記部位に置くことが可能な、生体適合性組織由来の傷当て、生分解性縫合糸またはピン、留め金、びょう、ネジなどの他の留め具、縫合糸、ピン、びょう、ネジなどの非吸収性固定装置、粘着剤を含む様々な方法が利用される可能性がある。
【０１３０】
別の例として、これだけに限らないが、ＰＰＤＣ、その細胞外基質または細胞溶解物、条件培地、本発明に沿って生産される骨組織が、障害または破壊された骨組織の修復または置換、既存の骨組織の増大、新規または変化した組織の導入、または義肢の修正、に利用されてもよい。本発明の前記細胞は、医薬品として認められる担体で単独で投与されるか、ここで説明される基質に播種されてもよい。
【０１３１】
移植用ＰＰＤＣの使用
本題の発明の治療法には、それを必要とする患者にＰＰＤＣ、または分化転換した細胞の移植が関与する。本発明の細胞は同種または自家としてもよく、治療が必要な部位または前記部位の「ホーム」に送達されてもよい。
【０１３２】
本発明の前記細胞は、患者での移植前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化では、生理活性因子の制御された適用が可能となる。
【０１３３】
本発明の前記細胞はｉｎ  ｓｉｔｕで分化が誘導されてもよく、または内因性細胞に栄養支援を提供するためｉｎ  ｖｉｖｏで導入されてもよい。ヒトにおける適切な細胞移植投与量は、骨または軟組織の置換に関する、細胞活性または細胞密度に関する既存の情報から決定されうる。この情報も移植物質の適切な量を計算する上で有用である。さらに、追加移植が行われるか、移植物質がそれによって低下するか否かを決定するため、前記患者がモニターされる可能性がある。
【０１３４】
移植細胞の分化、生存、または活性を強化するため、増殖因子、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣剤、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、局所麻酔薬を含む追加生理活性因子が追加されてもよい。移植骨組織の血管新生および生存を亢進するため、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦなどの血管形成因子が単独または内皮細胞またはＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞を含むその前駆細胞との組み合わせで追加される可能性がある。
【０１３５】
代わりに、投与されるＰＰＤＣは遺伝子操作され、そのような増殖因子、抗酸化剤、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、または血管形成因子を発現してもよい。
【０１３６】
ＰＰＤＣは、骨または軟骨の疾患または状態を治療するため、または骨または軟骨を増強または置換するために利用されうる。治療される疾患または状態には、これだけに限らないが、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、軟骨軟化症による変形、歯科または口腔疾患（例えば、歯の骨折および欠落）、関節置換、先天性の異常、骨折、腫瘍（良性および悪性）を含む。
【０１３７】
１若しくはそれ以上の他の成分は、当該分野で既知の１若しくはそれ以上のコラーゲンタイプ、および／または増殖因子、血小板が豊富な血漿、および薬物など、選択された細胞外基質成分を含む移植細胞に追加されてもよい。代わりに、本発明の前記細胞は遺伝子操作され、増殖因子を発現および生産してもよい。本発明の前記細胞の遺伝子操作に関する詳細は下に提供される。前記細胞製剤に有用に組み込まれうる生理活性因子には、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣剤、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、および局所麻酔薬を含む。例えば、参照することにより本書に盛り込まれる米国特許番号５，８２７，７３５で述べられているとおり、前記細胞は瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１３８】
移植用ＰＰＤＣ製剤
限定しない実施形態では、本発明の前記細胞を有する製剤が、新規軟骨または骨組織の生産が望ましい部位に直接投与するために調製される。例えば、限定されないが、本発明の前記細胞は注射用ヒドロゲル溶液で懸濁されてもよい。本発明で使用されるために適切なヒドロゲルの例には、ＲＡＤ１６などの自己組織化ペプチドを含む。代わりに、前記細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば鋳型内に固形化することができ、移植前にそこに分散される細胞を有する基質を形成してもよい。または一度前記基質が固まると、前記細胞が移植前に有糸分裂により増殖されるように、前記細胞構造が培養されてもよい。前記ヒドロゲルは、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋結合され、水分子を包括してゲルを形成する三次元開放型格子構造を形成する、有機ポリマー（天然型または合成型）である。ヒドロゲルを形成するために用いられる可能性がある物質の例には、アルギン酸とその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、ポリアクリル酸を含み、これらはイオンにより架橋結合され、また、ポリエチレン・オキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーを含み、それぞれ温度またはｐＨにより架橋結合される。いくつかの実施形態では、本発明のＰＰＤＣの支持体が生分解性である。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施形態では、前記製剤が例えば米国特許出願公報２００２／００２２６７６、Ａｎｓｅｔｈら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１−３）：１９９−２０９  （２００２）、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９−８０  （２００３）で説明されるとおり、ｉｎ  ｓｉｔｕで重合可能なゲルを有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記ポリマーが少なくとも部分的に、水、緩衝塩溶液、またはアルコール水溶液などの水溶液に溶解性であり、荷電した側鎖、またはその一価イオン塩を有する。陽イオンと反応されうる酸性側鎖を持つポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、スルホン化ポリスチレンなどのホスホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリン酸およびビニルエーテルモノマーの反応により生成する、酸性側鎖を有するコポリマーも利用される可能性がある。酸性基の例はカルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ化）アルコール基、フェノールＯＨ基、酸性ＯＨ基である。
【０１４１】
アニオンと反応されうる塩基性側鎖があるポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、一部のイミノ置換ポリホスファゼンである。前記ポリマーのアンモニウム塩または第４級塩は、前記バックボーン窒素またはペンダントイミノ基からも形成されうる。塩基性側鎖の例はアミノ基およびイミノ基である。
【０１４２】
アルギン酸塩は、水中、室温で二価陽イオンでイオン的に架橋結合され、ヒドロゲル基質を形成する可能性がある。これらの軽度の条件のため、例えばＬｉｍの米国特許番号４，３５２，８８３で説明されているとおり、アルギン酸塩がハイブリドーマ細胞カプセル化に最も一般的に使用されるポリマーであった。前記Ｌｉｍ手順では、カプセル化される生体物質を含む水溶液が水溶性ポリマー溶液で懸濁され、前記懸濁液は液滴となり、これが多価陽イオンと接触することで個別のマイクロカプセルに設定され、次に前記マイクロカプセルの表面がポリアミノ酸で架橋結合され、前記カプセル化物質周囲に半透膜を形成する。
【０１４３】
ポリホスファゼンは、交互の単結合と二重結合により分離された窒素およびリンから成るバックボーンを持つポリマーである。各リン原子は２つの側鎖に共有結合されている。
【０１４４】
架橋結合に適したポリホスファゼンの側鎖の大部分は、酸性で、二価または三価陽イオンによる塩橋を形成することができる。好適な酸性側鎖の例は、カルボン酸基とスルホン酸基である。加水分解に安定なポリホスファゼンは、Ｃａ２＋またはＡ１３＋などの二価または三価陽イオンで架橋されるカルボン酸側鎖を有するモノマーで形成される。イミダゾール、アミノ酸エステル、またはグリセロール側鎖を有するモノマーを組み込むことで、加水分解により分解するポリマーが合成される可能性がある。例えば、ポリアニオン系ポリ［ビス（カルボキシラトフェノキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）が合成される可能性があり、室温またはそれ以下で水性培地中に多価陽イオンを溶解して架橋され、ヒドロゲル基質を形成する。
【０１４５】
生分解性ポリホスファゼンは少なくとも２種類の側鎖タイプを有し、それらは、多価陽イオンで塩橋を形成することができる酸性側鎖、および、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件で加水分解する側鎖、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロール、およびグルコシルなど、である。
【０１４６】
前記側鎖の加水分解では、前記ポリマーが侵食する。加水分解側鎖の例は、前記基がアミノ結合を介してリン原子に結合した未置換および置換イミダゾールとアミノ酸エステルである（いずれのＲ基もこのように接合したポリホスファゼンポリマーがポリアミノホスファゼンとして知られている）。ポリイミダゾールホスファゼンとしては、ポリホスファゼンバックボーンの前記「Ｒ」基の一部がイミダゾール環であり、環の窒素原子によりバックボーン中のリンに結合している。他の「Ｒ」基は、メチルフェノキシ基または科学論文Ａｌｌｃｏｃｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  １０：８２４  （１９７７）に示されている他の基など、加水分解に参加しない有機残基であり得る。前記ヒドロゲル物質の合成法とそのようなヒドロゲルを調整する方法は、当該分野で既知である。
【０１４７】
他の成分が前記製剤に含まれてもよく、以下のいずれかに限定される訳ではないが、（１）適当なｐＨと等張性を提供する緩衝液、（２）潤滑油、（３）例えばアルギン酸塩、寒天、植物ゴムを含む、投与部位またはその付近に細胞を保持する粘稠性の物質、（４）例えば、組織形成向上または修飾、またはその物理化学的特徴、または前記細胞の活性度の支持として、または炎症または拒絶の抑制など、投与部位で望みの効果を生じることができる他の細胞タイプを含む。前記細胞は、適切な創傷を覆うことでカバーされてもよく、細胞に前記部位を残さないようにする。そのような創傷被覆剤は当業者に周知である。
【０１４８】
軟骨または骨組織パッチ製剤
事前に形成されたウェルでのＰＰＤＣの培養または共培養は、事前に定められた厚さと容積の組織パッチの製造を可能とする。前記で得られた組織パッチの容積は、前記ウェルの容積と前記ウェル中のＰＰＤＣ数に依存する。最適な事前に決定された容積の組織は、前記パラメーターのいずれかまたは両方を変化させることで、ルーティンな実験により調整されてもよい。
【０１４９】
前記ウェルの表面と接触する細胞は、表面に接触する細胞とＰＰＤＣとを接着させないようにする分子でコーティングされてもよい。好適なコーティング剤には、シリコンを基本とした試薬、つまりジクロロジメチルシランまたはポリテトラフルオロエチレンを基本とした試薬、つまりテフロン（登録商標）を含む。シリコンを基本とした試薬、特にジクロロジメチルシランを用いたコーティング物質の処置は、当該分野で周知である。例えば、参照することによってその開示が盛り込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。前記ウェル表面への細胞の付着を予防する他の生体適合性試薬は、本発明の履行において有用と考えられることが理解される。
【０１５０】
代わりに、前記ウェルは、それ自体が細胞を接着させない、柔軟または鋳造できる生体適合性物質から鋳造されると考えられる。そのような細胞接着を予防する好適な物質には、これだけに限らないが、アガロース、ガラス、未処理細胞培養プラスチック、ポリテトラフルオロエチレン、つまりテフロン（登録商標）を含む。未処理の細胞培養プラスチック、つまり帯電を有する物質で処理されていないか、この物質から作られたプラスチックが市販されており、例えばＦａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージー州リンカーンパーク）から購入されてもよい。しかし、前記物質は制限することを意図していない。本質的にＰＰＤＣを接合させない、他のいずれかの柔軟であるか、鋳造できる生体適合性物質は、本発明の履行において有用と考えられることは理解されることとする。
【０１５１】
前記ウェルのサイズと形は、修復される前記組織の欠陥のサイズと形により決定されてもよい。例えば、前記ウェルが２５ｃｍ２の断面表面積を有してもよいことが意図される。これは、成人のヒト大腿軟骨（ｆｅｍｏｒａｌ  ｃｈｏｎｄｙｌｅ）の平均的な断面表面積である。従って、大腿軟骨全体を蘇生させるため、小さな軟骨片が本発明に沿って調製され得ることが期待される。前記ウェルの深さは好ましくは約０．３ｃｍ以上、また好ましくは深さ約０．６ｃｍである。成人関節の自然な関節軟骨の厚さは、通常約０．３ｃｍである。従って、前記ウェルの深さは、約０．３ｃｍの軟骨パッチを作成するために十分である必要がある。前記ウェルは、培地を含み、これが前記組織パッチと重なるように十分深い必要がある。
【０１５２】
本発明に沿って調整される組織パッチは、前記傷害された組織の外科的修復を実施する外科医により、事前に選択されたサイズおよび形に「切り取られ」てもよいことが意図される。切り取りは、当該分野で周知の方法により、鋭利な切断器具、すなわち、外科用メス、はさみ、または切断縁に合致した関節鏡検査装置を使用すること行われてもよい。
【０１５３】
前記事前に形作られたウェルは、無菌状態でアガロース・ゲルのブロックに鋳造されてもよい。アガロースは、急速および容易に事前に形作られたウェルを鋳造するために利用されうる経済的、生体適合性、柔軟で鋳造できる物質である。前述の通り、前記ウェルの次元は、望みの得られた組織プラグのサイズに依存してもよい。
【０１５４】
事前に形作られたウェルは、溶解ＬＴアガロース（バイオラッド、カリフォルニア州リッチモンド）の温溶液を、１つのシリンダーを含む組織培養皿に注ぐことで調製され、前記シリンダーは前記ウェルが形成される形と同じ寸法を有する。前記ウェルのサイズと形は職人により選択され、修復される前記組織の欠陥の形により決定されてもよい。前記アガロースが前記シリンダーの周囲で冷却、凝固し、前記シリンダーは鉗子により慎重に除去される。前記シリンダーの除去により曝露される前記組織培養皿の表面は、溶融アガロースでカバーされる。これは前記ウェルの底辺を密閉し、前記ウェルの基底部で細胞接着表面を提供する。前記新たに追加された溶融ＬＴアガロースが冷却し、凝固すると、前記で得られた事前に形作られたウェルが培養とＰＰＤＣの分化誘導に適するようになる。ただし、代わりの方法を利用して、本発明の履行において有用な事前に形作られたウェルを調製してもよいことは理解されることとする。
【０１５５】
懸濁液中のＰＰＤＣは、前記事前に形作られたウェルに播種され、培養されてもよい。前記ＰＰＤＣが前記ウェルの培養で軟骨形成または骨形成表現型に分化するように誘導されるか、前記ウェルの播種前に分化するように誘導されてもよい。前記細胞は、１ミリリットル当たり約１×１０５から１×１０９  ＰＰＤＣの細胞密度で培地を追加することで希釈されてもよい。
【０１５６】
前記細胞は細胞の結合フラグを形成してもよい。前記細胞の凝集プラグは、前記ウェルから除去され、前記組織の欠陥に外科的に移植されてもよい。未分化ＰＰＤＣがｉｎ  ｓｉｔｕで分化し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏで組織を形成し得ることが期待される。
【０１５７】
軟骨と骨の欠陥は、コンピューター支援断層撮影（ＣＡＴスキャン）、Ｘ線検査、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、滑液または血清マーカーの分析を利用することで、または当該分野で既知の他の方法により推理して同定されてもよい。哺乳類の欠陥も、関節鏡検査または関節の観血療法中に視覚的に容易に同定される。前記欠陥の治療は、前記方法およびここで開示された組成を用い、関節鏡検査のまたは観血療法中に達成される可能性がある。
【０１５８】
従って、前記欠陥が同定されると、前記欠陥が（１）事前に決定された部位において、ここで説明された方法により調製された組織パッチを外科移植する、および（２）前記組織パッチを事前に決定された部位に組み込めるようにする、段階によって治療されてもよい。
【０１５９】
前記組織パッチは最適には一定のサイズと形を有し、前記パッチが前記欠陥に移植されるようにし、前記移植組織の端が前記欠陥の端と直接接触する。さらに、前記組織パッチは外科手術中に固定されてもよい。これは生物分解性縫合糸を用いた欠陥に前記パッチを外科的に固定する、および／または前記パッチおよび前記欠陥の接触領域に生体粘着剤を適用することで、履行されうる。
【０１６０】
いくつかの例では、前記組織パッチを移植する前に、障害された組織が外科的に切除されうる。
【０１６１】
骨格を用いたＰＰＤＣの移植
本発明またはその共培養の細胞は、三次元骨格に播種され、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植されてもよく、そこで、前記播種細胞は前記構造物で増殖し、前記患者の細胞と共にｉｎ  ｖｉｖｏで置換軟骨または骨組織を形成する。
【０１６２】
本発明のいくつかの観点では、前記基質がＰＰＤＣの細胞外基質、細胞溶解物（例えば溶解性細胞分画）、またはその組み合わせなど、脱細胞化組織（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）を有する。いくつかの実施形態では、前記基質は生分解性である。本発明のいくつかの観点では、前記基質が天然または合成ポリマーを有する。本発明の基質には、生体分解性か否か、液体か固体かによらず、生体適合性骨格、格子、自己組織化構造などを含む。そのような基質は、細胞に基づく治療、外科的修復、組織工学、創傷治癒の分野で既知である。好ましくは、前記基質が本発明の前記細胞、細胞外基質、条件培地、細胞溶解物、その組み合わせで事前に処理（例えば、播種、接種、接触）される。より好ましくは、前記基質に、前記基質またはその空間に密接に随伴して細胞がある。本発明のいくつかの観点では、前記細胞が前記基質に接着する。いくつかの実施形態では、前記細胞が前記基質内に含まれるか、前記基質の間質腔を架橋する。最も好ましくはこれらの播種された基質であり、ここでは前記細胞が前記基質と密接に関連し、治療に利用されると前記患者の細胞および／または適切な血管新生の内植を誘導または支持する。前記播種された基質は、移植、注入、外科的結合、他の組織の移植、注入などを含む、当該分野で既知のいずれかの方法で患者の体内に導入されうる。本発明の前記基質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織または臓器の前記形および／またはサイズに設定されてもよい。
【０１６３】
例えば、これだけに限らないが、前記骨格構造が（１）前記播種細胞を支持し、その後分解されない、（２）播種の時点から、前記組織の移植物が前記宿主組織によってリモデリングされるまで前記細胞を支持し、（２）前記播種細胞を接着、増殖、発達させ、それ自体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで支持できるだけの十分な機械的完全性を有する組織構造にさせ、その時点で前記骨格が分解されるように、前記骨格がデザインされてもよい。骨格デザインのレビューは、Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，１２（１）：１０７−１２４  （２００１）によって提供されている。
【０１６４】
本発明の骨格は、組織形成を刺激し、またそうでなければ本発明の履行を促進または改善するような、増殖因子、細胞、例えば幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、またはその前駆体、薬物、または上述の他の成分の１若しくはそれ以上を併用して投与されうる。前記骨格に播種されるＰＰＤＣは、遺伝子操作され、増殖因子または薬物を発現してもよい。
【０１６５】
本発明の細胞が使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで新しい細胞を生産してもよく、患者の組織修復、置換、または増大を必要とする部位に埋め込み、移植、またそ別の方法で挿入されうる。
【０１６６】
制限のない実施形態では、本発明の前記細胞が利用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで三次元組織作成物を生産し、これが次にｉｎ  ｖｉｖｏで移植される。三次元組織作成物の生産の例として、参照することにより本書に盛り込まれる米国特許４，９６３，４８９を参照。例えば、本発明の前記細胞は三次元骨格に接種または「播種」され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植されうる生組織を形成してもよい。
【０１６７】
本発明の前記細胞は、サブコンフルエントまたはコンフルエントまで培養容器で自由に増殖されることができ、前記培養から取り上げられ、三次元骨格に播種され得る。例えば約１０６〜５×１０７個／ミリリットルの高濃度細胞を用いた前記三次元骨格の播種は、比較的短期間で前記三次元支持体を確立する。
【０１６８】
本発明で利用されてもよい骨格の例には、不織マット、多孔質発泡体、または自己組織化ペプチドを含む。不織マットは、例えば商品名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州サマービル）で販売されているグリコールおよび乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維を使用して形成されてもよい。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成り、米国特許番号６，３５５，６９９で説明されている通りに、凍結乾燥などのプロセスにより形成されるか、凍結乾燥される発泡体も、可能性のある骨格である。自己組織化ペプチドなどのヒドロゲル（例えばＲＡＤ１６）が利用されてもよい。これらの物質は組織の増殖を支持する物として利用されることが多い。
【０１６９】
前記三次元骨格は、これだけに限らないが、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、α第三リン酸カルシウム、β第三リン酸カルシウム、リン酸テトラカルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウムカルシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（フロリダ大学、フロリダ州ゲーンズビル）などの生物活性ガラス、その混合物を含むセラミック材料で作られていてもよい。ＳＵＲＧＩＢＯＮ（Ｕｎｉｌａｂ  Ｓｕｒｇｉｂｏｎｅ，Ｉｎｃ．、カナダ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス）、ＣＥＲＯＳ（Ｍａｔｈｙｓ，Ａ．Ｇ．、スイス、ベトラッハ）、ＩＮＴＥＲＰＯＲＥ（Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ、米国カリフォルニア州アービン）、ＨＥＡＬＯＳ（Ｏｒｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マウンテンビュー）、ＶＩＴＯＳＳ、ＲＨＡＫＯＳＳ、ＣＯＲＴＯＳＳ（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ、ペンシルバニア州マルヴァーン）などの石灰化コラーゲン骨移植製剤など、現在市販されている多数の適切な多孔質生体適合性セラミック材料がある。前記骨格は、天然および／または合成材料の混合物、混和物、複合材料としてもよい。いくつかの実施形態では、前記骨格がケージ型である。好適な実施形態では、前記骨格がコラーゲンでコーティングされている。
【０１７０】
好適な実施形態によれば、前記骨格はフェルトであり、これは例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーまたは混合物、またはヒアルロン酸など、生体吸収性材料で作られた多繊維の糸から成る可能性がある。前記糸は、クリンピング、切断、梳綿、穿刺から成る標準的な繊維処理技術を用いて作られる。
【０１７１】
別の好適な実施形態では、本発明の前記細胞が複合構造としてもよい発泡体骨格に播種される。
【０１７２】
さらに、前記身体の耳、骨、関節、または他の特定構造の外部位置が修復、置換、増大されるなど、前記三次元骨格は有用な形に作られてもよい。
【０１７３】
別の好適な実施形態では、参照することにより本書に盛り込まれる米国特許番号６，２００，６０６で報告されているとおり、本発明の細胞が、患者に移植するため人工器官を有する構造物に播種される。ここで述べられているとおり、骨および軟骨移植法で使用するための、様々な臨床的に有用な人工器具が開発されてきた。（例えば、Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ．Ｅｄ．Ｍ．Ｂ．Ｈａｂａｌ  &  Ａ．Ｈ．Ｒｅｄｄｉ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９２を参照）。例えば、効果的な膝および股関節置換装置は、臨床環境で広く使用されてきたと同時に、これからも使用され続ける。これらの装置の多くは、低免疫原性活性を有する様々な無機物質を用いて組み立てられ、前記身体で安全に機能する。試験、証明された合成物質の例には、チタン合金、リン酸カルシウム、セラミックヒドロキシアパタイト、様々なステンレス鋼、コバルト・クロム合金を含む。これらの物質は構造支持を提供し、骨格を形成することができ、宿主の血管新生と細胞移動が行われる可能性がある。本発明では、そのような人工器官に「播種する」ために用いてもよい細胞供給源を提供する。前記好適な実施形態では、装置に適用する前に、ＰＰＤＣがまず担体材料と混合される。当業者に周知の適切な担体には、これだけに限らないが、ゼラチン、フィブリン、コラーゲン、デンプン、多糖類、糖類、プロテオグリカン、合成ポリマー、リン酸カルシウム、またはセラミックを含む。
【０１７４】
細胞接着を向上させるため、前記骨格は本発明の細胞が播種される前に処理されてもよい。例えば、本発明の前記細胞を用いた播種前に、ナイロン製基質が０．１モル酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲンに播種され、前記ナイロンをコーティングし得る。硫酸を用いてポリスチレンが同時に処理され得る。
【０１７５】
さらに、前記三次元構造物の外表面が修正され、前記構造物をコーティングする血漿または１若しくはそれ以上のタンパク質（例えばコラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞基質、および／またはこれだけに限らないが、中でもゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、植物ガムなどの他の物質の追加などにより、細胞接着または細胞増殖と組織の分化を改善してもよい。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、前記骨格が非血栓形成性を与える物質から成り、これが投与される。これらの治療と物質は、内皮増殖、移動、細胞外基質の堆積を促し、維持する可能性がある。これらの物質と治療の例は、これだけに限らないが、ラミニンとＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、ｅＰＴＦＥなどの合成物質、ＰＵＲＳＰＡＮ（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークリー）などのセグメント化ポリウレタンウレアシリコンなどの天然物質を含む。これらの物質がさらに投与され、前記骨格の非血栓形成性を与えることができる。そのような治療は、ヘパリンなどの抗血栓薬、血漿コーティングなどの前記物質の表面荷電を変化させる治療を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、前記骨格表面はテクスチャード加工される。例えば、本発明のいくつかの観点では、前記骨格に溝と隆線パターンが提供される。前記溝は好ましくは約５００ミクロン未満、より好ましくは約１００ミクロン未満、最も好ましくは約１０ナノメーター〜１０ミクロンである。そのような「マイクログローブ」は、前記細胞を前記表面の溝で誘導し、一列に並べる、および／または移動することができる。例えば、Ｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２００１；８９（１）：２−１１を参照。前記テクスチャード加工の骨格は、歯科移植物として利用されてもよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、培養においてｉｎ  ｖｉｖｏで見つけられる前記細胞の微小環境を再作成することが重要であり、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの移植またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用前に増殖される程度が変化する可能性がある。さらに、増殖因子、軟骨形成分化誘導因子、骨形成誘導因子、血管形成因子は、前記細胞の播種前、播種中、または播種後に前記培地に追加され、前記ＰＰＤＣまたはその共培養により分化と組織形成を誘導してもよい。
【０１７９】
前記三次元構造物が修飾され、前記細胞増殖とその組織生産が向上するか、または前記移植の拒絶リスクが低下してもよい。従って、これだけに限らないが、抗炎症薬、免疫抑制剤または増殖因子を含む、１若しくはそれ以上の生理活性化合物が前記構造物に追加されてもよい。
【０１８０】
ＰＰＤＣに由来する細胞外基質または細胞溶解物の治療上の使用
本発明の前記細胞を移植する、またはそこから生産される生組織の代わりとして、組織修復、置換、または増大を必要とする被験者に、前記細胞外基質（ＥＣＭ）またはこれらの細胞によって生産される細胞溶解物など、ＰＰＤＣの成分または生産物の投与から利益が生じ得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、例えばここで説明された三次元骨格系を用いるなど、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された後、ＥＣＭの望みの量が前記骨格に分泌されていた。前記構造物にＥＣＭが分泌されると、前記細胞が除去されてもよい。前記ＥＣＭが例えば注入製剤として、さらに使用するために処理されてもよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、前記細胞が殺生され、細胞片（例えば細胞膜）が前記構造物から除去される。このプロセスは多数の異なる方法で実行されてもよい。例えば、前記生組織が凍結保存剤なしで液体窒素中に急速冷凍されうるか、前記組織が滅菌蒸留水中に浸され、浸透圧に反応して前記細胞が破裂するようにする。前記細胞が死滅すると、前記細胞膜が分裂し、細胞片がＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、または双性イオン洗剤などの中性洗剤リンスで処理することで除去される。中性洗剤リンスを用いる利点は、しばしば抗原性が高い膜結合タンパク質を可溶化することである。
【０１８３】
代わりに、前記組織が細胞膜を破壊する洗剤で酵素的に消化および／または抽出されうる。そのような酵素の例には、これだけに限らないが、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ）を含む。洗剤の例には、例えばアルキルアリルポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）  Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノール（ローム・アンド・ハース社、ペンシルバニア州フィラデルフィア）、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（アトラスケミカル社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０（登録商標））、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（ローム・アンド・ハース社、）、ポリエチレンラウリルエーテル（ローム・アンド・ハース社）、分岐鎖、または非分岐鎖に７〜２２炭素原子を含む、例えばドデシル硫酸ナトリウム、硫酸高級脂肪族アルコール、スルホン化アルカンおよびスルホン化アルキルアレンなどのイオン洗剤など、非イオン洗剤を含む。
【０１８４】
前述の通り、ＥＣｍを有する骨格が治療に用いられてもよい。代わりに、ＥＣＭが前記骨格から収集されうる。例えば、前記骨格が生物分解性または非生物分解性であるか否かにより、様々な方法で前記ＥＣＭの回収が達成されうる。例えば、前記構造物が非生物分解性である場合、前記ＥＣＭが前記構造物に超音波処理、高圧水ジェット、機械的スクレーピング、または洗剤または酵素を用いた中性処理、または前記いずれかの組み合わせを適用することで除去されうる。
【０１８５】
前記構造物が生物分解性である場合、例えば、前記構造物を溶液中で分解または溶解させることにより、前記ＥＣＭが回収されうる。代わりに、前記生物分解性の構造物が前記ＥＣＭによりそれ自体が注入され得る物質から成る場合、前記構造物と前記ＥＣＭが全体としてその後の注入に処理される可能性がある。代わりに、非生物分解性構造物からＥＣＭを回収するため、前記方法のいずれかにより、前記ＥＣＭが前記生物分解性構造物から除去される可能性がある。すべての回収プロセスは好ましくは、本発明の前記細胞により生産された前記ＥＣＭまたは細胞溶解物を変性させないようにデザインされている。
【０１８６】
前記ＥＣＭが回収された後、これはさらに加工されてもよい。前記ＥＣＭがホモジナイズされ、例えば超音波処理など、当該分野で周知の技術を用いて細かい粒子にホモジナイズされてもよく、その結果、これらは手術用の針を通過し得る。ＥＣＭ成分は望ましい場合、ガンマ照射により架橋結合されうる。好ましくは、前記ＥＣＭが０．２５〜２メガラジアンの間で照射され、前記ＥＣＭを殺菌、架橋結合することができる。グルタルアルデヒドなどの毒性試薬を用いた化学的架橋は可能であるが、一般には好ましくない。
【０１８７】
前記分娩後由来細胞の集団から調製した細胞溶解物にも、多くの効用がある。１つの実施形態では、例えばその後細胞分画を分離せずに細胞を分離することで、細胞溶解物全体が調製される。別の実施形態では、細胞膜分画が、例えば遠心分離、ろ過、または同様の方法で当該分野に既知のルーティンな方法により、前記細胞の可溶性分画から分離される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの溶解性細胞分画の使用により、拒絶または有害反応を誘導せずに、前記有益な細胞内環境を患者で利用することができる。細胞を溶解する方法は当該分野で周知であり、機械的分裂、酵素的分裂、または化学的分裂、またはその組み合わせの様々な方法を含む。そのような細胞溶解物はその増殖培地で直接細胞から調製されてもよく、そのため分泌された増殖因子などを含むか、例えばＰＢＳなどの溶液中で培地を洗い流した細胞から調製されてもよい。洗い流した細胞は、好ましい場合は最初の個体群密度よりも高い濃度で再懸濁されてもよい。分娩後由来細胞の集団から調整される細胞溶解物はそのまま使用してもよく、さらに例えば限外ろ過または凍結乾燥により濃縮、またはさらに乾燥、部分的に精製、当該分野で知られた薬学的に許容可能な担体または希釈液と混合、または例えば医薬品として有用なタンパク質組成など、生物学的製剤などの他の化合物と組み合わせてもよい。細胞溶解物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独または例えば細胞と使用されてもよい。前記細胞溶解物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入された場合、治療部位で局所的に、または遠隔で導入され、例えば患者に必要な細胞増殖因子を提供してもよい。
【０１８８】
タンパク質の量および／または比は、本発明の前記細胞から生産される前記ＥＣＭまたは細胞溶解物と１若しくはそれ以上の他の細胞タイプのＥＣＭまたは細胞溶解物とを混合することで調節されうる。さらに、タンパク質、増殖因子、および／または薬物などの生物学的に活性な物質は、前記ＥＣＭまたは細胞溶解物製剤に組み込まれてもよい。典型的な生物活性物質は抗炎症剤および増殖因子を含み、治癒と組織修復を促す。細胞は本発明の前記ＥＣＭまたは細胞溶解物と同時に投与されてもよい。ＥＣＭまたはＰＰＤＣの細胞溶解物は、ＰＰＤＣで前記に示したとおり、投与用に調製されてもよい。
【０１８９】
注入用ＥＣＭまたは細胞溶解物を調製する前記に示されたプロセスは、好ましくは無菌条件で無菌物質を用いて実施される。薬学的に許容可能な担体中の前記処理されたＥＣＭまたは細胞溶解物は、皮内または皮下に注入され、例えば組織を増大するか、奇形、後天性欠陥、または美容的欠陥を修復または治療することで、骨または軟骨疾患を治療することができる。
【０１９０】
薬物効果または毒性のＩｎ  Ｖｉｔｒｏスクリーニングに対するＰＰＤＣの使用
本発明の細胞と組織はｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用され、医薬品の効果と細胞毒性、増殖／制御因子、抗炎症薬について、広範な化合物をスクリーニングしてもよい。このため、本発明の細胞、または前記組織培養はｉｎ  ｖｉｔｒｏで管理され、検査すべき化合物に曝露される。細胞毒性化合物の活性は、培養で細胞を障害または死滅させる能力により測定されうる。これは生体染色法により容易に評価されうる。増殖／制御因子の効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生細胞数を分析することにより、例えば細胞総量と異なる細胞数により評価されうる。これは、タイプ特異的な細胞抗原を定義する抗体を利用した免疫細胞化学的方法を利用するなど、標準的な細胞学的および／または組織学的方法を用いて達成されてもよい。懸濁培養または前述の三次元系における、本発明の細胞に対する様々な薬物の効果が取り上げられてもよい。
【０１９１】
本発明の細胞と組織は、生理的または病的状態の研究にモデル系として利用されうる。例えば、動かなくなった関節は、多数の点で比較的早く害される。軟骨細胞の代謝活性は、プロテオグリカンの損失として影響されるように見え、水分含有量の増加がすぐに観察される。前記正常な白色に輝く軟骨の性状は、鈍い青みがかった色に変化し、前記軟骨の厚さは減少する。しかし、栄養不足が原因のこの変化量と、ストレス依存性の代謝恒常性の混乱による量との関係は明らかではない。本発明の細胞と組織が利用され、断続的加圧を行うなど異なる物理的条件下、前記軟骨作成物に培養液をポンプで出し入れすることで、軟骨の栄養要件を決定してもよい。これは、加齢または障害に関連した引っ張り強さの減少、例えば弱くなった軟骨が外傷を受けやすくなる膝の関節軟骨などの基礎原因を研究する上で、特に有用と考えられる。
【０１９２】
また、本発明の細胞と組織はサイトカイン、増殖因子、炎症伝達物質、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、プロスタグランジンなどの作用機序を研究するために用いられてもよい。さらに、軟骨または骨の吸収を軽減または予防する、またそうでなければそのバランスの取れた増殖を亢進させるなど、特定の患者に最も有効なものを検討するため、細胞障害性および／または医薬品がスクリーニングされる可能性がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効であることの証明となる薬物は、前記患者を治療するために用いることができる。
【０１９３】
生物学的分子を産生するＰＰＤＣの使用
さらなる実施形態では、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、高収率で生物学的製剤を産生することができる。例えば、そのような細胞は、特定の対象生物学的製剤（例えば増殖因子、制御因子、またはペプチドホルモン）を自然に生産するか、または生物学的製剤を産生するため遺伝子操作され、例えば上述の三次元培養系を用いてクローン技術により増殖することができる。前記細胞が前記栄養培地に生物学的製剤を分泌する場合、前記製剤が前記使用済みまたは条件培地から、分別タンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどの標準的な分離法を利用し、容易に単離されうる。「バイオリアクター」は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元培養など、栄養補給を行うためのフロー法を活用するために利用されうる。
【０１９４】
基本的に、前述の通り、新鮮培地が前記三次元培養を通過すると、前記生物学的製剤が前記培養液から洗い流され、次に前記流出物から単離され得る。
【０１９５】
代わりに、対象の生物学的製剤が前記細胞内に残り、そのため、その回収では前記細胞が溶解されることが必要となることがある。１若しくはそれ以上の前記方法のいずれかを用い、前記生物学的製剤が次に精製されてもよい。
【０１９６】
キット
前記ＰＰＤＣとその成分および製剤は、例えば培養または移植用キットの一部として都合よく利用されうる。従って、本発明は前記ＰＰＤＣと、基質（例えば骨格）、水和剤（例えば、生理的に適合する食塩水、調製細胞培養培地）、細胞培養基質（例えば、培養皿、シャーレ、バイアルなど）、細胞培地（液体または粉末形）、抗生物質、ホルモンなどの追加成分を含むキットを提供する。前記キットはそのような成分のいずれかを含むが、好ましくはその意図した使用に必要なすべての成分を含む。望ましい場合は、前記キットが（典型的には凍結保存された）細胞を含む可能性があり、ここで述べられているとおり、前記格子に播種される可能性がある。
【０１９７】
別の観点では、本発明が、前記増大、再生、修復を行う様々な方法で、ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ個体群、ＰＰＤＣの成分と製剤を利用したキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットが少なくともＰＰＤＣおよび薬学的に許容可能な担体（液体、半固体、または固体）を含む１若しくはそれ以上の細胞集団を含んでもよい。前記キットは、状況に応じて、例えば注入により前記細胞を投与する方法を含んでもよい。前記キットはさらに前記細胞の使用説明書を含んでもよい。軍事行為に使用するなど、野外病院で使用するために準備されたキットは、組織骨格、外科縫合などの処置全体の供給品を含んでもよく、前記細胞が急性障害の治療と連動して使用される。ここで説明されるとおり、アッセイとｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に用いるキットには、１若しくはそれ以上の（１）ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣの成分または製剤、（２）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実行するための試薬、（３）適宜、他の細胞または細胞製剤、（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を行うための取扱説明書を含んでもよい。
【０１９８】
凍結保存とＰＰＤＣの貯蔵
本発明のＰＰＤＣは凍結保存され、「細胞バンク」に維持または保存されてもよい。本発明の細胞の凍結保存は、既知の方法に沿って実行されうる。例えばこれだけに限らないが、５〜１０％のグリセロールがある場合とない場合で、例えば約０．５〜１０×１０６細胞／ミリリットルの密度で、例えばさらに０〜９５％のＦＢＳ、０〜１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を有する培地など、「凍結培地」で細胞が懸濁されてもよい。前記凍結保存培地は、これだけに限らないがメチルセルロースを含む凍結保存剤を有してもよい。前記細胞は、次に制御された冷凍率の冷凍庫に密閉および移動された、ガラスまたはプラスチックアンプルに分配される。最適な冷凍率は経験的に決定されてもよい。例えばプログラム可能な冷凍率の冷凍庫は、毎分−１〜−１０℃の温度で変化させることができる。前記好ましい凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃であり、さらに好ましくは約−９０℃〜約−１６０℃、最も好ましくは約−１２５〜約−１４０℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、好ましくは液体窒素に移動される。いくつかの実施例では、例えば前記アンプルが約−９０℃に達した後、液体窒素の保存域に移動される。凍結保存された細胞は数年間保存されうる。
【０１９９】
本発明の凍結保存された細胞は細胞バンクを構成し、その一部が解凍することで「回収され」、次に必要に応じて使用されうる。例えば、液体窒素から３７℃の水浴にアンプルを移動することなど、解凍は一般に急速に行われるべきである。前記アンプルの解凍内容物は、１０％ＦＢＳで調整されたＤＭＥＭなど、適切な培地を含む培養容器に、滅菌条件下で直ちに移動される必要がある。
【０２００】
さらに別の観点では、本発明は、本発明の組織、細胞、細胞成分、細胞集団の貯蔵も提供する。前述の通り、前記細胞は容易に凍結保存される。従って、本発明はバンクに前記細胞を凍結保存する方法を提供し、前記細胞は凍結保存され、前記細胞の免疫学的、生化学的、遺伝的性質に基づき、前記細胞の完全な特徴付けが付随される。そのように凍結された細胞は、前記処置の要件、前記患者の必要性に応じて、自己、同系、または同種治療に使用されうる。好ましくは、各凍結保存サンプルの情報がコンピューターに保存され、これは前記外科医、処置、患者の要件をもとに検索可能であり、前記細胞または集団の特徴をもとに適切にマッチされる。好ましくは、本発明の細胞が望みの細胞量に増殖され、基質または支持の有無によらず、治療用細胞の組成が個別に、または共培養として調製される。いくつかの応用では、調製されたばかりの細胞を使用することが好ましい場合もあるが、それ以外では、前記細胞を凍結し、前記情報をコンピューターに入力することで凍結保存、貯蔵され、前記サンプルと前記コンピューター入力情報を関連付けることができる。免疫学的目的で、そのような細胞のレシピエントと供給源またはドナーをマッチさせる必要がある場合でも、例えば、前記バンクシステムが、前記治療の必要性に対して前記貯蔵細胞の望みの生化学的または遺伝的性質を容易にマッチさせる。貯蔵サンプルの望みの特徴をマッチさせることで、前記サンプルが検索され、治療用に用意される。ここで説明されるとおりに調整された細胞溶解物または成分は、本発明に沿って保存され（例えば凍結保存、凍結乾燥）、貯蔵されうる。
【０２０１】
以下の実施例では、本発明の実施形態のいくつかの観点について、詳細を説明している。これらの実施例は、本発明を例証することを意図しており、本発明を限定するものではない。  
実施例
【実施例１】
【０２０２】
分娩後組織からの細胞誘導
本研究の目的は、胎盤および臍帯組織の細胞集団に由来するものであった。満期または早期妊娠いずれかの出産で、分娩後臍帯および胎盤が入手された。細胞は、臍帯および胎盤組織の５人の別のドナーから採取された。１）異なる表現型を有する細胞に分化する能力、または２）他の細胞および組織に対して有用な、重大な栄養因子を提供する能力、がある細胞を得る能力について、様々な細胞単離法が検討された。
【０２０３】
方法と材料
臍帯細胞の誘導。臍帯は国立疾病研究互助組織（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ、ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から入手された。前記組織は正常出産後に入手された。前記細胞単離プロトコールは、層流フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記臍帯が抗真菌剤および抗生物質（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド））存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄された。５０ミリリットルの培地（低グルコースＤＭＥＭまたは高グルコースＤＭＥＭ、インビトロジェン）の存在下、前記組織が細いパルプに切断されるまで、前記組織が１５０ｃｍ２の組織培養皿で機械的に分離された。前記細かく切断された組織は、５０ミリリットルのコニカルチューブ（１本当たり約５グラムの組織）に移動された。前記組織は、次に抗真菌剤と抗生物質（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン））および消化酵素をそれぞれ含む低グルコースＤＭＥＭ培地または高グルコースＤＭＥＭ培地で、消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ」、低グルコースＤＭＥＭ培地中、コラゲナーゼ（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ（インビトロジェン）、５０単位／ミリリットル）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（低グルコースＤＭＥＭ中コラゲナーゼ５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ５０単位／ミリリットル、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ミリリットル）。前記組織、培地、消化酵素を含むコニカルチューブが、３７℃、オービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ニューヨーク州ブルックリン）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートされた。
【０２０４】
消化後、前記組織が１５０×ｇで５分間遠心分離され、前記上清が吸引された。前記ペレットは２０ミリリットルの増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ディファインドウシ血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５、ハイクローン社、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ）、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）で再懸濁された。前記細胞懸濁液は、７０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）でろ過された。増殖培地を有するさらに５ミリリットルのリンスが、前記セルスオレーナーを通過された。前記細胞懸濁液は次に４０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通過させられ、さらに５ミリリットルの増殖培地のリンスで流された。
【０２０５】
前記ろ液は増殖培地に再懸濁され（総量５０ミリリットル）、１５０×ｇで５分間遠心分離された。前記上清は吸引され、前記細胞は５０ミリリットルの新鮮増殖培地で再懸濁された。このプロセスは２回以上繰り返された。
【０２０６】
前記最終遠心分離の段階で上清が吸引され、前記細胞ペレットが５ミリリットルの新鮮増殖培地中に再懸濁された。生存可能な細胞数はトリパンブルー染色により決定された。細胞は標準的な条件下で培養された。
【０２０７】
臍帯細胞から単離された細胞は、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、１５％（ｖ／ｖ）のディファインドウシ血清（ハイクローン社、ユタ州ローガン、ロット番号ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ）、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン社））中、ゼラチンコーティングしたＴ−７５ｃｍ２のフラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）に、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。約２〜４日後、使用済み培地は前記フラスコから吸引された。細胞はＰＢＳで３回洗浄され、残渣と血液由来細胞を除去した。次に細胞に増殖培地が補充され、コンフルエントまで増殖させた（約１０日間、継代０から継代１）。その後の継代では（継代１から２など）、細胞は４〜５日でサブコンフルエントに達した（７５〜８５％コンフルエント）。これらのその後の継代では、細胞が５０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、５％二酸化炭素と２０％酸素を用い、３７℃、加湿インキュベーターで増殖された。
【０２０８】
胎盤細胞の単離。胎盤組織がＮＤＲＩ（ペンシルバニア州フィラデルフィア）から入手された。前記組織は妊娠中のもので、通常の外科的出産時に入手された。臍帯細胞の単離で説明されるとおり、胎盤細胞が単離された。
【０２０９】
以下の例は、胎盤組織の母体由来細胞、新生児由来細胞の個別集団の単離に適用される。
【０２１０】
前記細胞単離プロトコールは、層流フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記胎盤組織が抗真菌剤および抗生物質（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、インビトロジェン）存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄された。次に、前記胎盤組織が上線（新生児側）、中線（混合細胞単離の新生児および母体または絨毛領域）、下線（母体側）の３切片に解剖された。
【０２１１】
前記分離した切片はＰＢＳ中で数回個別に洗浄され、抗生物質／抗真菌剤でさらに血液および残渣を除去した。各切片は、５０ミリリットルの低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン）存在下、細かいパルプに１５０ｃｍ２の組織培養皿で機械的に分離された。前記パルプは５０ミリリットルのコニカルチューブに移動された。各チューブには約５グラムの組織を含んでいた。前記組織は、抗真菌剤と抗生物質（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン））および消化酵素を含む、低グルコースＤＭＥＭ培地または高グルコースＤＭＥＭ培地で、消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）が使用され、ＤＭＥＭ低グルコース培地中、コラゲナーゼ（シグマ、ミズーリー州セントルイス）５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ（インビトロジェン）５０単位／ミリリットルを含む。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（低グルコースＤＭＥＭ中コラゲナーゼ５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ５０単位／ミリリットル、ヒアルロニダーゼ（シグマ）、５単位／ミリリットル）。前記組織、培地、消化酵素を含むコニカルチューブが、３７℃、オービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ニューヨーク州ブルックリン）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートされた。
【０２１２】
消化後、前記組織が１５０×ｇで５分間遠心分離され、前記で得られた上清が吸引された。前記ペレットは２０ミリリットルの増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ディファインドウシ血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５、ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、抗生物質／抗真菌剤（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン））で再懸濁された。前記細胞懸濁液は、７０マイクロメーターのナイロン製セルストレーアー（ＢＤバイオサイエンス）を通過させられた後、さらに５ミリリットルの増殖培地のリンスした。前記総細胞懸濁液は、４０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス）を通過させられ、次にさらに５ミリリットルの増殖培地で洗い流された。
【０２１３】
前記ろ液は増殖培地に再懸濁され（総量５０ミリリットル）、１５０×ｇで５分間遠心分離された。前記上清は吸引され、前記細胞ペレットは５０ミリリットルの新鮮増殖培地で再懸濁された。このプロセスは２回以上繰り返された。前記最終遠心分離の後で上清が吸引され、前記細胞ペレットが５ミリリットルの新鮮増殖培地中に再懸濁された。トリパンブルー排除試験により細胞数が決定された。次に細胞が標準的な条件下で培養された。
【０２１４】
リベラーゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）による細胞単離。細胞は、リベラーゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）（２．５ミリグラム／ミリリットル、ブレンザイム３、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナ州インディアナポリス）、ヒアルロニダーゼ（５単位／ミリリットル、シグマ）を用い、低グルコースＤＭＥＭ培地で臍帯から単離された。前記組織の消化と前記細胞の単離は、前記Ｃ：ＤまたはＣ：Ｄ：Ｈ酵素の混合物の代わりに、リベラーゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）／ヒアルロニダーゼ混合物を用い、他のプロテアーゼ消化で説明されたとおりであった。リベラーゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）を用いた組織消化では、容易に増殖される分娩後組織から細胞集団を単離した。
【０２１５】
他の酵素の組み合わせを用いた細胞単離。異なる酵素の組み合わせを用い、前記臍帯から細胞を単離する処置が比較された。消化を比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ；Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、ｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を含めた。これらの異なる酵素消化条件を利用した細胞単離の差が観察された（表１−１）。
【０２１６】
前記臍帯中の残留血液からの細胞単離。異なるアプローチにより、臍帯から細胞プールを単離する試みがなされた。一例では、臍帯がスライスされ、増殖培地で洗浄され、血餅とゲル状物質を除去した。血液、ゲル状物質、増殖培地の混合物が１５０×ｇで回収され、遠心分離された。前記ペレットが増殖培地中に再懸濁され、ゼラチンコーティングフラスコに播種された。これらの実験から、容易に増殖される細胞集団が単離された。
【０２１７】
臍帯血からの細胞単離。ＮＤＲＩから得られた臍帯血サンプルからも、細胞が単離された。ここで用いた単離プロトコールは、Ｈｏらの国際特許出願ＷＯ０２／２９９７１のものであった。臍帯血（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）のサンプル（それぞれ５０ミリリットルと１０．５ミリリットル）が溶解緩衝液（フィルターで殺菌された１５５ミリモル塩化アンモニウム、１０ミリモルの炭酸水素カリウム、ｐＨ  ７．２に緩衝化された０．１ミリモルのＥＤＴＡ（全成分は、シグマ、ミズーリー州セントルイスから取得））と混合された。臍帯と溶解緩衝液が１：２０の比で細胞が溶解される。前記で得られた細胞懸濁液は５秒間ボルテックスされ、周囲温度で２分間インキュベートされた。前記可溶性細胞分画は遠心分離された（２００×ｇで１０分間）。前記細胞ペレットは、１０％の胎仔ウシ血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）、４ミリモルのグルタミン（メディアテック、バージニア州ハーンドン）、１００ミリリットル当たり１００単位のペニシリン、１００ミリリットル当たり１００マイクログラムのストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む最小限の完全基本培地（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）に再懸濁された。前記再懸濁細胞は遠心分離され（２００×ｇで１０分間）、前記上清は吸引され、前記細胞ペレットは完全培地で洗浄された。Ｔ７５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州）、Ｔ７５ラミニンでコーティングしたフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンでコーティングしたフラスコ（いずれもベクトン・ディッキンソン社、マサチューセッツ州ベッドフォード）に直接細胞が播種される。
【０２１８】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた分娩後由来細胞の単離。細胞集団が異なる条件で単離され、単離直後に様々な条件で増殖される可能性があるか否かを判断するため、上述の方法に沿ってＣ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合わせを用い、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）の有無にかかわらず、細胞が増殖培地で消化された。そのように単離された胎盤由来細胞が、様々な条件で播種された。ペニシリン／ストレプトマイシン存在下で、すべての細胞が増殖された。（表１−２）。
【０２１９】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた分娩後由来細胞の単離。すべての条件で、細胞が継代０と１の間で接着され、増殖される（表１−２）。条件５〜８と１３〜１６の細胞は、接種後４継代まで十分増殖することが実証され、この時点で凍結保存された。すべての細胞が貯蔵された。
【０２２０】
結果
異なる酵素の組み合わせを用いた細胞単離。Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせが単離後の最高細胞収率を提供し、前記他の条件よりも培養でより多くの世代を増殖させた細胞を生成した（表１−１）。増殖させた細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼのみを用いて達成されなかった。この結果が検討された前記コラーゲンに特異的であるか否かを決定する試みは行われなかった。
【０２２１】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた分娩後由来細胞の単離。酵素の消化と増殖を検討するすべての条件において、継代０〜１で細胞は十分接着、増殖した（表１−２）。実験条件５〜８と１３〜１６の細胞は、接種後４継代まで十分増殖し、この時点で凍結保存された。すべての細胞が貯蔵された。
【０２２２】
前記臍帯中の残留血液からの細胞単離。有核細胞は急速に接着、増殖した。これらの細胞はフローサイトメトリーで分析され、酵素消化によって得られる細胞と類似であった。
【０２２３】
臍帯血からの細胞単離。前記製剤には赤血球細胞と血小板を含んでいた。前記最初の３週間で接着および分裂した有核細胞はなかった。前記培地は播種後３週間で変化し、接着および増殖した細胞は観察されなかった。
【０２２４】
要約。細胞集団は前記酵素の組み合わせであるコラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用い、臍帯および胎盤組織から最も効率的に単離されうる。Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅであるリベラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社、インディアナ州インディアナポリス）が使用されてもよい。本研究では、コラゲナーゼ（４  Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）とサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）であるＢｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３がヒアルロニダーゼと一緒に使用され、細胞を単離した。これらの細胞はゼラチンコーティングしたプラスチックに載せた増殖培地で培養した場合、多数の継代を容易に増殖した。
【０２２５】
分娩後由来細胞は前記臍帯で残留血液から単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用される前記条件下で接着し、増殖する前記組織から洗い流される血餅中の細胞の有無は、前記解剖プロセス中に放出された細胞によると考えられる。
【０２２６】
【表１】
2007528706.tif 000002
【０２２７】
【表２】
2007528706.tif 000003
【０２２８】
参考文献
1.ＨＯ，Ｔｏｎｙ，Ｗ．；ＫＯＰＥＮ，Ｇｅｎｅ，Ｃ．；ＲＩＧＨＴＥＲ，Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｆ．；ＲＵＴＫＯＷＳＫＩ，Ｊ．，Ｌｙｎｎ  ；ＨＥＲＲＩＮＧ，Ｗ．，Ｊｏｓｅｐｈ  ；ＲＡＧＡＧＬＩＡ，Ｖａｎｅｓｓａ  ；ＷＡＧＮＥＲ，Ｊｏｓｅｐｈ  ＷＯ２００３０２５１４９  Ａ２  ＣＥＬＬ  ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＷＨＩＣＨ  ＣＯ−ＥＸＰＲＥＳＳ  ＣＤ４９Ｃ  ＡＮＤ  ＣＤ９０，ＮＥＵＲＯＮＹＸ，ＩＮＣ．出願番号ＵＳ０２２９９７１  ＵＳ、提出日２００２０９２０、Ａ２発表日２００３０３２７、Ａ３発表日２００３１２１８。
【実施例２】
【０２２９】
分娩後由来細胞の増殖培地の評価
いくつかの細胞培地で、胎盤由来細胞の増殖を支持する能力が評価された。正常（２０％）および低（５％）酸素状態での胎盤由来細胞の増殖が、前記ＭＴＳ比色測定法を用いて３日後に評価された。
【０２３０】
方法と材料
継代８（Ｐ８）における胎盤由来細胞は、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ番号  ＳＨ３００７０．０３、ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ））中、９６ウェルのプレート、１×１０３細胞／ウェルで播種された。８時間後、表２−１で説明されたとおりに前記培地が変更され、細胞は３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間、正常（２０％、ｖ／ｖ）または低（５％、ｖ／ｖ）酸素状態でインキュベートされた。ＭＴＳは３時間前記培地（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ一溶液細胞増殖アッセイ、プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）に追加され、前記吸光度は４９０ナノメーターで測定された（モレキュラーデバイス、カリフォルニア州サニーベール）。
【０２３１】
【表３】
2007528706.tif 000004
【０２３２】
結果
前記ＭＴＳアッセイの標準曲線は、吸光度の上昇と細胞数の上昇の間で線形相関を確立した。得られた吸光度の値は推定細胞数に変換され、前記最初の播種に対する変化（％）が計算された。
【０２３３】
血清の作用。正常な酸素状態で培地に血清を追加することで、吸光度に再現性のある用量依存性の上昇が得られ、そのため前記生存可能な細胞数が上昇した。完全なＭＳＣＧＭに血清を追加することで、吸光度が用量依存的に低下した。追加する血清がない前記培地では、細胞がＣｅｌｌｇｒｏ、ハムＦ１０、ＤＭＥＭ培地で増殖した。
【０２３４】
酸素の効果。低下した酸素は、増殖培地、ハムＦ１０、ＭＳＣＧＭで細胞の増殖率を上昇させるように思われた。
【０２３５】
増殖が抑制される順では、前記細胞の最適な増殖が得られる前記培地は、増殖培地>ＭＳＣＧＭ>イスコブの＋１０％ＦＢＳ＝ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳ＝ハムＦ１２＋１０％ＦＢＳ＝ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであった。
【０２３６】
要約。分娩後由来細胞は、正常酸素または低酸素状態で様々な培地で増殖されうる。胎盤由来細胞の短期的増殖は、５％または２０％Ｏ２で０、２、１０％（ｖ／ｖ）血清を持つ１２種類の基本培地で測定された。一般的に胎盤由来細胞は無血清の条件で増殖しなかったが、ハムＦ１０、Ｃｅｌｌｇｒｏ−ｆｒｅｅの培地は例外であり、これらはタンパク質を含まない。これらの無血清培地での増殖は、１５％の血清を含む増殖培地で観察される最高増殖の約２５〜３３％であった。この研究は、胎盤由来細胞が無血清状態で増殖することを実証し、また増殖培地は胎盤由来細胞の増殖に利用されうるいくつかの培地の１つである（イスコブ、ＲＰＭＩ、またはハムＦ１２培地に１０％の血清）ことを実証している。
【０２３７】
最も有望な無血清培地は、ホルモンまたは増殖因子を含まず、血清およびタンパク質のない培地であるＣＥＬＬＧＲＯ−ＦＲＥＥであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞の増殖用にデザインされている（メディアテック製品情報）。
【０２３８】
無血清培地用に開発された完全無血清培地は、前記胎盤由来細胞の増殖を支持する効果がなかった。完全無血清培地は、メディアテックによって開発され、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の５０／５０混合物に基づき、より少ない割合のＲＰＭＩ  １６４０とＭａｃｏｙ５Ａを含んでいた。この培地も選択された微量要素と高分子量の炭水化物、余分のビタミン、非動物性タンパク質源、少量のＢＳＡ（１グラム／リットル）を含む。これにはインスリン、トランスフェリン、コレステロール、または増殖または接着因子を含まない。これは５％ＣＯ２を使用し、重炭酸で緩衝化されている。これは当初ハイブリドーマと懸濁細胞株用にデザインされ、いくつかの接着依存性細胞株に適していると考えられる。
【実施例３】
【０２３９】
Ｄ−バリンを含む培地中の分娩後由来細胞の増殖
通常のＬ−バリンイソ型の代わりにＤ−バリンを含む培地が利用され、培地で線維芽細胞様の細胞増殖を選択的に抑制させることが報告された（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、２０００；Ｓｏｒｄｉｌｌｏら、１９８８）。Ｌ−バリンがない状態でＤ−バリンを含む培地において、分娩後由来細胞の増殖が評価された。
【０２４０】
方法と材料
ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ中、５×１０３細胞／ｃｍ２で胎盤由来細胞（Ｐ３）、線維芽細胞（Ｐ９）、臍帯由来細胞（Ｐ５）が播種された（コーニング、ニューヨーク州コーニング）。２４時間後、前記培地が除去され、前記細胞がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ、ニューヨーク州コーニング）で洗い流され、残りの培地を除去した。前記培地が改変増殖培地（Ｄ−バリン（特注、ギブコ）、１５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎児血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ）を用いたＤＭＥＭ）で置換された。
【０２４１】
結果
透析された血清を含む増殖培地に播種された細胞と異なり、Ｄ−バリン含有培地に播種される胎盤由来細胞、臍帯由来細胞、線維芽細胞は増殖しなかった。線維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが増加し、形が変化した。前記細胞のすべてが死滅し、最終的に４週間後、フラスコ表面から剥離した。
【０２４２】
要約。分娩後由来細胞は、細胞増殖と長期的生存可能性のため、Ｌ−バリンを必要とする。Ｌ−バリンは、分娩後由来細胞で前記増殖培地から除去されないことが好ましい。
【０２４３】
参考文献
Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ  Ｊ．（２０００）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄ−ｖａｌｉｎｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．２４：１−７．
Ｓｏｒｄｉｌｌｏ  ＬＭ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＳＰ，Ａｋｅｒｓ  ＲＭ．（１９８８）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｄ−ｖａｌｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  Ｒｅｐ．１２：３５５−６４．
【実施例４】
【０２４４】
分娩後由来細胞の凍結保存培地
本研究の目的は、分娩後由来細胞の凍結保存用に適した凍結保存培地を決定することであった。
【０２４５】
方法と材料
ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３、ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ））で増殖された分娩後由来細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ギブコ）で洗浄され、１ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ）を用いてトリプシン処理された。前記トリプシン処理は１０ミリリットルの増殖培地を追加することで停止された。前記細胞は１５０×ｇで遠心分離され、上清が除去され、前記細胞ペレットは１ミリリットルの増殖培地に再懸濁された。一定分量の細胞懸濁液６０マイクロリットルが除去され、６０マイクロリットルのトリパンブルー（シグマ）に追加された。血球計数板を用い、生細胞数が推定された。前記細胞懸濁液がそれぞれ８８×１０４細胞を含む４等分量に分割された。前記細胞懸濁液が各培地１ミリリットル未満に遠心分離、再懸濁され、Ｃｒｙｏｖｉａｌｓ（ナルゲン）に移された。
【０２４６】
１．）増殖培地＋１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ、シグマ、ミズーリー州セントルイス）
２．）細胞凍結培地、ＤＭＳＯとメチルセルロースを含む、無血清（Ｃ６２９５、シグマ、ミズーリー州セントルイス）
３．）細胞凍結培地、無血清（Ｃ２６３９、シグマ、ミズーリー州セントルイス）
４．）細胞凍結培地、グリセロールを含む（Ｃ６０３９、シグマ、ミズーリー州セントルイス）
【０２４７】
前記細胞は、前記製造業者の使用説明書に沿って、「Ｍｒ  Ｆｒｏｓｔｙ」冷凍庫を用い、約１℃／分で一晩、−８０℃の冷凍庫で冷却した（ナルゲン、ニューヨーク州ロチェスター）。細胞のバイアルは、３７℃の水浴で急速解凍する前に、２日間液体窒素に移動された。前記細胞は１０ミリリットルの増殖培地に追加され、遠心分離された後、従来通り前記細胞数と生存度が推定された。細胞は５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングしたフラスコ上に播種され、前記細胞が接着および増殖されるか否かを決定した。
【０２４８】
結果
凍結乾燥される前記細胞の最初の生存可能性は、トリパンブルー染色で１００％と評価された。
【０２４９】
細胞溶解によりＣ６２９５の生存可能性がある細胞数が相応に減少した。４種類すべての溶液で凍結保存された前記生存可能な細胞が、３日以内に接着、分裂し、コンフルエント単層を生産した。推定増殖率に認識できる差はなかった。
【０２５０】
要約。細胞の凍結保存は、細胞バンクまたは細胞生産物の調製に利用できる１つの手順である。４つの凍結保存混合物が、凍害からヒト胎盤由来細胞を保護する能力に関して比較された。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、胎盤由来細胞の凍結保存を比較するために好ましい培地である。
【実施例５】
【０２５１】
分娩後由来細胞の増殖の特徴
単離された幹細胞の他の集団と、分娩後由来細胞の細胞増殖の能力が比較された。老化に対する細胞増殖の方法は、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限度として引用される（Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．２２（１）：１−１２，１９７４；Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ  １４（１）：３７−４５），１９７４）。分娩後由来細胞は十分な細胞数に容易に増殖されうるため、治療用として非常に適している。
【０２５２】
材料と方法
ゼラチンコーティングフラスコ。組織培養プラスチック製フラスコは、室温で２０分間、２０ミリリットルの２％（ｗ／ｖ）ブタゼラチン（タイプＢ：２２５ブルーム、シグマ、ミズーリー州セントルイス）をＴ７５フラスコ（コーニング、ニューヨーク州コーニング）に追加することでコーティングされた。前記ゼラチン溶液を除去した後、１０ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）が追加され、次に吸引された。
【０２５３】
他の細胞集団に対する分娩後由来細胞が増殖する可能性の比較。増殖の可能性を比較するため、ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；ケンブレックス、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許番号６，５５５，３７４  Ｂ１、米国特許出願番号ＵＳ２００４／００５８４１２）、ｉｉｉ）正常皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号  ９Ｆ０８４４；ケンブレックス、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｖ）臍帯由来細胞、ｖ）胎盤由来細胞の細胞集団を利用した。低グルコースＤＭＥＭ増殖培地（（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ディファインドウシ血清（ハイクローン、ユタ州ローガン、ロット番号  ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド使用）において、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で細胞を最初に播種した。その後の継代では、細胞培養が以下のように処理された。トリプシン処理後、生存可能な細胞がトリパンブルー染色後に計数された。細胞懸濁液（５０マイクロリットル）がトリパンブルー（５０マイクロリットル、シグマ、ミズーリー州セントルイス）と混合された。血球計数板を用い、生存可能細胞数が推定された。
【０２５４】
計数後、細胞が新鮮増殖培地２５ミリリットルの５，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコに播種された。標準的な大気下、５％二酸化炭素を用い、３７℃で細胞が増殖された。前記増殖培地は週２回変更された。細胞が約８５％コンフルエントに達したときにこれが継代され、このプロセスは前記細胞が老化に達するまで繰り返された。
【０２５５】
各継代で細胞がトリプシン処理され、計数された。前記生存可能な細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加時間）が計算された。最適な細胞増殖を決定する目的として、継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終的細胞数／初期細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０２５６】
低密度での細胞バンクの増殖可能性。継代１０で貯蔵した細胞の増殖の可能性も検討された。異なる条件セットが利用された。正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号  ９Ｆ０８４４；ケンブレックス、メリーランド州ウォーカーズビル）、臍帯由来細胞、胎盤由来細胞が検討された。これらの細胞集団はこれまで継代１０で貯蔵され、５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、その時点まで各継代でコンフルエントまで増殖された。継代１０で細胞解凍後、前記細胞集団で細胞密度の効果が決定された。細胞は標準的な条件で解凍され、トリパンブルー染色により計数された。次に、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）と、１５％（ｖ／ｖ）ディファインドウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、ロット番号  ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、抗生物質／抗真菌剤（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド使用））において、１，０００細胞／ｃｍ２で解凍細胞が播種された。細胞は標準的な大気条件下、３７℃で増殖された。増殖培地は週２回変更され、細胞は約８５％コンフルエントに達するまで継代された。その後細胞は老化まで、つまりそれ以上増殖できなくなるまで継代された。細胞はトリプシン処理され、各継代で計数された。前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加時間）が計算された。継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終的細胞数／初期細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０２５７】
最初の細胞播種から低密度での分娩後由来細胞の増殖。低細胞播種条件で単離直後の分娩後由来細胞の増殖の可能性が、別の実験で検討された。ここで説明されるとおり、臍帯と胎盤由来細胞が単離された。細胞は１０００細胞／ｃｍ２で播種され、老化まで前述の通り継代された。細胞は標準的な大気条件下、３７℃で増殖された。増殖培地は週２回変更された。細胞は約８５％コンフルエントに達するまで継代された。各継代で細胞がトリプシン処理され、トリパンブルー染色で計数された。各継代で前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加時間）が計算された。継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終的細胞数／初期細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。細胞はゼラチンコーティングフラスコと非ゼラチンコーティングフラスコで増殖された。
【０２５８】
クローン新生児または母体の胎盤由来細胞の増殖。胎盤組織からの新生児または母体細胞集団の増殖を成功させるため、クローニングが利用されてもよい。前記胎盤から３種類の細胞集団が単離された後（新生児側、母体側、絨毛領域）、これらの細胞集団は標準的な増殖条件下で増殖された後、核型が判定され、前記単離細胞集団の識別情報が明らかとなる。男児を出産した母親からの細胞を単離することで、中期染色体伸展を行うことで、男性と女性の染色体を区別することが可能である。これらの実験が利用され、上部の細胞は新生児表現型が陽性の核型であり、正中部の細胞は新生児および母体表現型両方が陽性の核型であり、下部の細胞は母体細胞が陽性の核型である。
【０２５９】
低酸素培養条件での細胞増殖。低Ｏ２細胞培養条件が特定の条件で細胞増殖を改善する可能性があることが証明された（Ｃｓｅｔｅ，Ｍａｒｉｅ；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；Ｗｏｌｄ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ．Ｌｏｗ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．ＵＳ２００４０００５７０４）。分娩後由来細胞の細胞増殖は細胞増殖条件を変化させることで改善されるか否かを決定するため、臍帯由来細胞の培養が低酸素条件で増殖された。ゼラチンコーティングフラスコで増殖培地に、５，０００細胞／ｃｍ２で細胞が播種された。細胞は最初に標準的な大気条件下、継代５まで培養され、この時点で細胞は低酸素（５％  Ｏ２）培養条件まで移動された。
【０２６０】
他の増殖条件の評価。他の実験では、分娩後由来細胞が非コーティング、コラーゲンコーティング、フィブロネクチンコーティング、ラミニンコーティング、細胞外膜タンパク質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））コーティングプレートで増殖された。培養はこれらの異なる基質で十分増殖することが証明された。
【０２６１】
結果
分娩後由来細胞の増殖の可能性と他の幹細胞および非幹細胞集団の比較。臍帯由来および胎盤由来細胞のいずれも、４０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１Ｅ１７細胞となった。対照的に、ＭＳＣと線維芽細胞はそれぞれ２５日未満、６０日未満経てから老化した。脂肪由来および大網細胞のいずれもほぼ６０日間増殖したが、これらの細胞の総細胞収率はそれぞれ４．５Ｅ１２および４．２４Ｅ１３となった。したがって、利用される前記実験条件下、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された場合、分娩後由来細胞は同じ条件で増殖される他の細胞タイプよりもはるかに増殖した（表５−１）。
【０２６２】
低密度での細胞銀行の増殖可能性。臍帯由来細胞、胎盤由来細胞、線維芽細胞は、１０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１Ｅ１７細胞となった（表５−２）。これらの条件下で６０日後、前記線維芽細胞は老化したが、前記臍帯由来および胎盤由来細胞集団は８０日後に老化し、それぞれ５０超、４０超の集団倍加を完了した。
【０２６３】
最初の細胞播種から低密度での分娩後由来細胞の増殖。低密度（１，０００細胞／ｃｍ２）でゼラチンコーティングおよびコーティングしていないプレートまたはフラスコに分娩後由来細胞が播種された。これらの条件下でこれらの細胞の増殖可能性は良好であった。前記細胞では対数増殖期の増殖が容易に増大した。分娩後由来細胞がゼラチンコーティングフラスコの増殖培地で、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された場合、細胞増殖率は観察されたものと同様であった。コーティングされていないフラスコまたはゼラチンコーティングされたフラスコでの培養では、細胞増殖の可能性に差は観察されなかった。しかし、細胞は表現型ではゼラチンコーティングフラスコ上ではるかに小さく見え、コーティングされていないフラスコではより大きな細胞表現型がより多く観察された。
【０２６４】
クローン新生児または母体の胎盤由来細胞の増殖。新生児または母体のクローン細胞集団が、それぞれ前記胎盤の新生児側または母体側から単離された胎盤由来細胞から増殖されうる。９６ウェルのゼラチンコーティングされたプレートに１細胞／ウェルで増殖させるため、細胞は連続的に希釈され、次に増殖培地のゼラチンコーティングされたプレートに播種される。この最初のクローニングからは、増幅クローンが同定され、トリプシン処理され、増殖培地の１２ウェルのゼラチンコーティングされたプレートに再播種され、次に増殖培地において５，０００細胞／ｃｍ２でＴ２５ゼラチンコーティングフラスコに継代される。細胞のクローン集団が同定されたことを確認するため、サブクローニングが行われる。サブクローニングの実験では、細胞がトリプシン処理され、０．５細胞／ウェルで再播種される。十分増殖するサブクローンは、５，０００細胞ｃｍ２／フラスコでゼラチンコーティングされたＴ２５フラスコ中で増殖される。細胞は５，０００細胞ｃｍ２／Ｔ７５フラスコで継代される。細胞増殖を証明するため、クローン増殖の特徴はプロットされてもよい。核型分析では、前記クローンが新生児または母体であることを確認できる。
【０２６５】
低酸素培養条件での細胞増殖。分娩後由来細胞は低酸素条件で十分増殖した。低酸素条件下での培養は、分娩後由来細胞で細胞増殖に有意な効果を有するようには見えない。標準的な大気条件は、十分な細胞数に増殖するため、すでに成功することが証明され、低酸素培地は分娩後由来細胞の増殖に必要ない。
【０２６６】
要約。前記治療を必要とする患者に治療を提供するため、市販の生存可能な細胞製剤は十分な量で生産できる必要がある。分娩後由来細胞はそのような目的で、培養で増殖されうる。間葉幹細胞を含む他の細胞集団と、培養中の分娩後由来細胞の増殖で比較が行われた。ここで開発されるとおり、分娩後由来細胞株は増殖し、４０回以上倍加することができ、例えば前臨床用バンクに十分な細胞数を提供することを前記データは証明した。さらに、これらの分娩後由来細胞集団は、低密度または高密度で十分増殖されうる。この研究では、一方で間葉幹細胞が増殖され、大量の細胞を入手することはできないことが示された。
【０２６７】
標準的な大気中の酸素下、ゼラチンコーティングするか、コーティングされていないフラスコで、増殖培地中約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で単離された分娩後由来細胞を増殖させる現在の細胞増殖条件は、継代１１で多数の細胞を発生させるために十分である。さらに、前記データは、低密度培養条件（例えば１，０００細胞／ｃｍ２）を用いて容易に増殖されうることを示している。低酸素状態での分娩後由来細胞の増殖は細胞増殖を促すが、これらの増殖条件を利用する場合、細胞増殖の可能性で改善の増分はまだ観察されなかった。現在、標準的な大気条件下で分娩後由来細胞の培養が細胞の大量プールを発生させるために好まれている。しかし、前記培養条件を変化させると、分娩後由来細胞の増殖は同様に変化される可能性がある。この戦略は、これらの細胞集団の増殖性および分化能を向上させるために利用されうる。
【０２６８】
利用された前記条件下では、ＭＳＣと脂肪由来細胞の増殖の能力は限定されるが、分娩後由来細胞は容易に多数増殖する。
【０２６９】
参考文献
１）Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｓｏｃ．１９７４  Ｊａｎ；２２（１）：１−１２．
２）Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ．１９７４  Ｆｅｂ；１４（１）：３７−４５．
３）米国特許番号２００４００５８４１２
４）米国特許番号２００４００４８３７２
６）Ｃｓｅｔｅ，Ｍａｒｉｅ；（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）  ；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；（Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）  ；Ｗｏｌｄ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．；（Ｓａｎ  Ｍａｒｉｎｏ，ＣＡ）  ；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）  ；Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ；（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）．Ｌｏｗ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．ＵＳ２００４０００５７０４．
【０２７０】
【表４】
2007528706.tif 000005
【０２７１】
【表５】
2007528706.tif 000006
【実施例６】
【０２７２】
ＰＰＤＣの核型分析
細胞療法で利用される細胞株は好ましくは均一であり、混在細胞タイプはない。細胞療法で利用されるヒト細胞は、正常な染色体数（４６）と構造を有する必要がある。均一で非分娩後組織由来の分娩後由来胎盤および臍帯細胞株を同定するため、細胞サンプルの核型が分析された。
【０２７３】
材料と方法
男性新生児の分娩後組織のＰＰＤＣは、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド））で培養された。男性新生児（Ｘ，Ｙ）の分娩後組織は、新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）を区別できるように選択された。細胞はＴ２５フラスコ（コーニング、ニューヨーク州コーニング）で増殖培地に５，０００細胞／平方センチメートルで播種され、約８０％コンフルエントに増殖された。細胞を含むＴ２５フラスコは、増殖培地で首の部分まで充填された。サンプルは宅配業者によって臨床細胞遺伝学研究室に配達された（研究室から研究室への推定移動時間は１時間）。染色体分析は、ニュージャージー州ニューアーク、ニュージャージー医科歯科大学医学部のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  &  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって実施された。前記染色体の可視化が最も良い中期に、細胞が分析された。計数された中期の２０個の細胞のうち、５個で正常な均一核型数（２）が分析された。２個の核型が観察された場合、細胞サンプルは均一なものとして特徴付けられた。２個以上の核型が観察された場合、細胞サンプルは不均一なものとして特徴付けられた。不均一な核型数（４）が同定されると、追加中期細胞数が計数、分析された。
【０２７４】
結果
染色体分析に送られたすべての細胞サンプルは、細胞遺伝学研究室のスタッフにより正常な形態を示すと解釈された。分析された細胞株１６種類のうち３種類は均一な表現型を示し（ＸＸおよびＸＹ）、新生児および母体由来の細胞の存在を示した（表６−１）。組織胎盤−Ｎ由来細胞は、胎盤の新生児側から単離された。継代０では、この細胞株がＸＹで均一であるように見えた。しかし、継代９では、細胞株が不均一であり（ＸＸ／ＸＹ）、母体由来細胞でこれまで未検出の細胞の存在を示していた。
【０２７５】
【表６】
2007528706.tif 000007
【０２７６】
要約。染色体分析では、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されるとおり、核型が正常に見える胎盤と臍帯由来ＰＰＤＣを同定した。均一の核型で決定されるとおり、核型分析でも母体細胞がない細胞株を同定した。
【実施例７】
【０２７７】
フローサイトメトリーによるヒト分娩後由来細胞表面マーカーの評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴は、細胞株の同定を決定するために利用されうる。発現の一貫性は、複数のドナーから、また異なる処理と培養条件に曝露された細胞で、決定される可能性がある。前記胎盤および臍帯から単離した分娩後由来細胞株はフローサイトメトリーで特徴付けられ、それにより本発明の前記細胞を同定するため、プロフィールを提供した。
【０２７８】
材料と方法
培地。１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む低グルコースＤＭＥＭの増殖培地（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）で細胞が培養された。
【０２７９】
培養容器。細胞は血漿で処理されたＴ７５、Ｔ１５０、Ｔ２２５組織培養フラスコ（コーニング、ニューヨーク州コーニング）でコンフルエントまで培養された。前記フラスコの増殖表面は、室温で２０分間２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（シグマ、ミズーリー州セントルイス）をインキュベートすることで、ゼラチンコーティングされた。
【０２８０】
抗体染色。フラスコ中の接着細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。前記製造業者の仕様書に沿って、対象の前記細胞表面マーカー抗体（表７−１）が１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、前記混合物は４℃で３０分間、暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、非結合性抗体を除去した。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。
【０２８１】
フローサイトメトリー分析。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（ベクトン・ディッキンソン、カリフォルニア州サンホセ）でフローサイトメトリー分析が実施された。
【０２８２】
細胞表面マーカー抗体。以下の細胞表面マーカー抗体が使用された。
【０２８３】
【表７】
2007528706.tif 000008
【０２８４】
胎盤および臍帯由来細胞の比較。胎盤由来細胞は継代８で臍帯由来細胞と比較された。
【０２８５】
継代別の比較。胎盤および臍帯細胞は継代８、１５、２０で分析された。
【０２８６】
ドナー別の比較。ドナーの違いを比較するため、異なるドナーの胎盤由来細胞がそれぞれ比較され、異なるドナーの臍帯由来細胞がそれぞれ比較された。
【０２８７】
表面コーティングの比較。ゼラチンコーティングフラスコで培養された胎盤由来細胞は、コーティングされていないフラスコで培養された胎盤由来細胞と比較された。ゼラチンコーティングフラスコで培養された臍帯由来細胞は、コーティングされていないフラスコで培養された臍帯由来細胞と比較された。
【０２８８】
消化酵素の比較。細胞の単離と調整に用いた４種類の治療を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを処理することで、分娩後組織由来細胞が比較された。
【０２８９】
胎盤層比較。胎盤組織の母体側から単離された細胞は、胎盤組織の絨毛領域から単離された細胞、および胎盤の新生胎児側から単離された細胞と比較された。
【０２９０】
結果
胎盤由来細胞は臍帯由来細胞と比較された。フローサイトメトリーで分析された胎盤および臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産で陽性であることが示されたが、これは前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示された。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現が陰性であり、これは、前記ＩｇＧコントロールと同程度の蛍光値が示された。陽性曲線の蛍光値の変化は説明が付けられた。前記陽性曲線の平均（つまりＣＤ１３）と範囲（つまりＣＤ９０）はやや変化を示したが、前記曲線は正常に見え、均一な集団であることが確認された。いずれの曲線も、それぞれＩｇＧコントロール以上の値を示した。
【０２９１】
胎盤由来細胞の継代別の比較。前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析された継代８、１５、２０の胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産ですべて陽性あった。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致した。
【０２９２】
臍帯由来細胞の継代別の比較。前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析された継代８、１５、２０の胎盤由来細胞は、すべてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性であり、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値によって示された。
【０２９３】
胎盤由来細胞のドナー別の比較。フローサイトメトリーで分析された別のドナーから単離された胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇した。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２９４】
臍帯由来細胞のドナー別の比較。前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、別のドナーから単離された胎盤由来細胞では、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産がそれぞれ陽性であることが示された。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致した。
【０２９５】
胎盤由来細胞に対するゼラチンを用いた表面コーティングの効果。前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、ゼラチンコーティングされたかコーティングされていないフラスコで増殖された胎盤由来細胞は、すべてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２９６】
臍帯由来細胞に対するゼラチンを用いた表面コーティングの効果。フローサイトメトリーで分析され、ゼラチンコーティングされたフラスコおよびコーティングされていないフラスコで増殖された臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産がすべて陽性であり、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇した。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致した。
【０２９７】
前記細胞表面マーカーのプロフィールで前記細胞の調製と単離に使用される酵素消化法の作用評価。前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析された様々な消化酵素により単離された胎盤由来細胞は、すべてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２９８】
胎盤層比較。前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析された、前記胎盤の母体、絨毛、新生児層由来の細胞はそれぞれＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産が陽性であることが示された。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２９９】
要約。フローサイトメトリーによる胎盤と臍帯由来分娩後細胞の分析は、これらの細胞株の識別性を確立した。胎盤と臍帯由来分娩後細胞ではＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃが陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性である。前記ドナー、継代、培養容器の表面コーティング、消化酵素、胎盤層を含む変数の変動によらず、この識別性は一致した。個々の蛍光値のヒストグラム曲線の平均と幅にやや変化が観察されたが、すべての検討された条件下ですべての陽性曲線が正常であり、前記ＩｇＧコントロールよりも大きな蛍光値を発現していたため、前記細胞が均一な集団を有し、前記マーカーの陽性発現を有することを確認した。
【実施例８】
【０３００】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイによる分娩後組織由来細胞の分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイが使用され、臍帯と胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールを線維芽細胞、ヒト間質幹細胞、ヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析では前記分娩後由来細胞の特徴を提供し、これらの細胞に独特の分子マーカーを同定した。
【０３０１】
材料と方法
細胞の単離と培養
分娩後組織由来細胞。ヒトの臍帯と胎盤は、患者の同意を得て、正常な満期出産において国立疾病研究互助組織（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から得られた。例１で説明されたとおり、前記組織が受理され、細胞が単離された。ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコにおいて、増殖培地（１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）を用いたダルベッコ改変の基本培地（低グルコースＤＭＥＭ、インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド））で細胞が培養された。標準的な大気で前記培養が３７℃でインキュベートされた。
【０３０２】
線維芽細胞。ヒト皮膚線維芽細胞はケンブレックス社（メリーランド州ウォーカーズビル、ロット番号９Ｆ０８４４）から購入され、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から入手された。いずれの系も１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ハイクローン）と１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（インビトロジェン）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）で培養された。前記細胞は標準組織で処理されたプラスチックで増殖された。
【０３０３】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）。ｈＭＳＣはケンブレックス社（メリーランド州ウォーカーズビル、ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、２Ｆ１６５７）から購入され、ＭＳＣＧＭ培地（ケンブレックス）の製造業者の仕様書に沿って培養された。前記細胞は、５％ＣＯ２を用い、３７℃で標準的な組織培養プラスチックに増殖された。
【０３０４】
ヒト回腸稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）。ヒト回腸稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受理された。前記骨髄はＨｏらが概要を示した方法に沿って処理された（ＷＯ０３／０２５１４９）。前記骨髄は、２０パーツの溶解緩衝液に対して１パーツの骨髄の比で、溶解緩衝液（１５５マイクロモルのＮＨ４Ｃｌ、１０マイクロモルのＫＨＣＯ３、０．１マイクロモルのＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２）と混合された。前記細胞懸濁液はボルテックスされ、大気温度で２分間インキュベートされ、５００×ｇで１０分間遠心分離された。前記上清は廃棄され、前記細胞ペレットは、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清と４マイクロモルのグルタミンが補充された最小必須培地−α（インビトロジェン）で再懸濁された。前記細胞は再び遠心分離され、前記細胞ペレットは新鮮培地に再懸濁された。前記生存可能な単核細胞は、トリパンブルー排除（シグマ、ミズーリー州セントルイス）を用いて計数された。前記単核細胞は、５×１０４細胞／ｃｍ２で組織培養プラスチックフラスコに播種された。前記細胞は、標準的な大気Ｏ２または５％Ｏ２で５％ＣＯ２を用い、３７℃でインキュベートされた。細胞は培地を取り替えずに、５日間培養された。培地と非接着細胞は５日間の培養後に除去された。前記接着細胞は培地で管理された。
【０３０５】
ｍＲＮＡと遺伝子チップ分析の単離。細胞の活性増殖培地は、セルスクレーパーを用い、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で前記フラスコから除去された。前記細胞は３００×ｇで５分間遠心分離された。前記上清は除去され、前記細胞は新鮮ＰＢＳ中で再懸濁され、再度遠心分離された。前記上清は除去され、前記細胞ペレットは−８０℃で直ちに冷却、保存された。細胞ｍＲＮＡはｃＤＮＡに抽出、転写された。ｃＤＮＡは次にｃＲＮＡに転写され、ビオチン標識された。前記ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ（アフィメトリクス、カリフォルニア州サンタクララ）を用いてハイブリダイズされた。前記ハイブリッド形成とデータ収集は、前記製造業者の仕様書に沿って実施された。「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（スタンフォード大学、ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ；Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５１１６−５１２１）を用いて分析が実行された。
【０３０６】
結果
この研究では、１４種類の異なる細胞集団が分析された。継代情報、培養基質、培地に沿った細胞は表８−１に掲載された。
【０３０７】
【表８】
2007528706.tif 000009
【０３０８】
前記データは主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）で評価され、前記細胞で異なって発現された前記２９０遺伝子を分析した。この分析は、前記集団の類似性を相対的に比較することができる。表８−２は、前記細胞ペアの比較を計算したユークリッド距離を示す。前記ユークリッド距離は前記細胞の比較に基づき、前記細胞タイプの間で異なって発現された２９０種類の遺伝子に基づいていた。前記ユークリッド距離は、前記２９０遺伝子の発現の類似性に反比例している。
【０３０９】
【表９】
2007528706.tif 000010
【０３１０】
表８−３、８−４、８−５は、胎盤由来細胞画が増加した遺伝子の発現（表８−３）、臍帯由来細胞が増加した遺伝子の発現（表８−４）、臍帯と胎盤由来細胞が減少した遺伝子の発現（表８−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と表題をつけたカラムは、前記チップの特定部位に位置したいくつかのオリゴヌクレオチドプローブセットの製造業者識別コードを指し、これは前記名称を付けた遺伝子とハイブリッド形成し（カラム「遺伝子名」）、前記特定の受入番号（カラム「ＮＣＢＩ受入番号」）でＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内に見ることができる配列を有する。
【０３１１】
【表１０】
2007528706.tif 000011
【０３１２】
【表１１】
2007528706.tif 000012
【０３１３】
【表１２−１】
2007528706.tif 000013
【０３１４】
【表１２−２】
2007528706.tif 000014
【０３１５】
【表１２−３】
2007528706.tif 000015
【０３１６】
表８−６、８−７、８−８は、ヒト線維芽細胞（表８−６）、ＩＣＢＭ細胞（表８−７）、ＭＳＣ（表８−８）で上昇した遺伝子の発現を示す。
【０３１７】
【表１３】
2007528706.tif 000016
【０３１８】
【表１４】
2007528706.tif 000017
【０３１９】
【表１５】
2007528706.tif 000018
【０３２０】
要約。前記ＧＥＮＥＣＨＩＰ分析が実施され、臍帯と胎盤に由来する前記分娩後細胞の分子の特徴を提供した。この分析には３種類の臍帯と３種類の胎盤に由来する細胞を含めた。この研究はまた、２種類の皮膚線維芽細胞株、３種類の間葉幹細胞株、３種類の回腸稜骨髄細胞株も含めた。これらの細胞によって発現された前記ｍＲＮＡは、２２，０００遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを含んだアフィメトリクス社のＧＥＮＥＣＨＩＰにより分析された。
【０３２１】
結果は、これらの５種類の細胞タイプで、２９０種類の遺伝子が異なって発現されることを示した。これらの遺伝子には、前記胎盤由来細胞で特異的に上昇する１０種類の遺伝子と、前記臍帯由来細胞で特異的に上昇する７種類の遺伝子を含む。５４種類の遺伝子では、胎盤と臍帯で特異的に発現レベルが低下することが分かった。
【０３２２】
選択された遺伝子の発現は、実施例９でＰＣＲにより確認された。これらの結果は、前記分娩後由来細胞が、例えば骨髄由来細胞および線維芽細胞と比較し、明らかに異なる遺伝子発現プロフィールを有することを示している。
【０３２３】
参考文献
Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，１４（１３）：１６７５−１６８０．
【実施例９】
【０３２４】
分娩後由来細胞の細胞マーカー
前記ヒト胎盤と前記ヒト臍帯に由来する細胞の類似性と違いは、（アフィメトリクスＧＥＮＥＣＨＩＰアレイを用い、）その遺伝子発現プロフィールと他の供給源由来の細胞を比較することで評価された。同定された６種類の「シグネチャー」遺伝子は、酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン−８、レニン、レチキュロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）であった。これらの「シグネチャー」遺伝子は、分娩後由来細胞で比較的高レベルで発現された。
【０３２５】
前記マイクロアレイのデータの妥当性を確認し、遺伝子とタンパク質との発現で一致／不一致を同定するため、また胎盤および臍帯由来細胞に特異的な識別子を検出するため、一連の信頼できるアッセイを確立するために本研究は実施された。
【０３２６】
方法と材料
細胞。胎盤由来細胞（核型分析により同定されるとおり、主に新生児の１種類の単離株を含む３種類の単離株）、臍帯由来細胞（４種類の単離株）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、新生児および成人）が、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコの増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３；ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）で増殖された。間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉幹細胞の増殖培地一括キット（ＭＳＣＧＭ；ケンブレックス、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖された。
【０３２７】
前記ＩＬ−８分泌実験では、細胞が液体窒素から解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングされたフラスコに播種され、増殖培地で４８時間増殖され、次にさらに８時間、１０ミリリットルの血清飢餓培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ、ミズーリー州セントルイス））で増殖された。この処理後、ＲＮＡは抽出され、前記上清が１５０×ｇで５分間遠心分離され、細胞残渣が除去された。ＥＬＩＳＡ分析のために−８０℃で上清が凍結された。
【０３２８】
ＥＬＩＳＡアッセイの細胞培養。胎盤と臍帯由来の分娩後細胞、およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞が、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地で培養された。細胞は継代１１で液体窒素中に凍結された。細胞は解凍され、１５ミリリットルの遠心分離管に移動された。５分間、１５０×ｇで遠心分離後、前記上清は廃棄された。細胞は４ミリリットルの培地に再懸濁され、計数された。細胞は、３７５，０００細胞／フラスコで２４時間、１５ミリリットルの増殖培地を含む７５ｃｍ２のフラスコで増殖された。前記培地は８時間、血清飢餓培地に変更された。血清飢餓培地はインキュベーションの最後に回収され、１４，０００×ｇで５分間遠心分離され、−２０℃で保存された。
【０３２９】
各フラスコで細胞数を推定するため、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）が各フラスコに追加された。細胞が前記フラスコから取り出された後、トリプシン活性が８ミリリットルの増殖培地で中和された。細胞は１５ミリリットルの遠心分離管に移され、１５０×ｇで５分間、遠心分離された。上清は除去され、１ミリリットルの増殖培地が各管に追加され、前記細胞を再懸濁した。血球計数板を用い、細胞数が推定された。
【０３３０】
ＥＬＩＳＡアッセイ。前記細胞により血清飢餓培地に分泌されたＩＬ−８の量はＥＬＩＳＡアッセイで分析された（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。すべての分析は、前記製造業者によって提供された使用説明書に沿って検査された。
【０３３１】
総ＲＮＡ単離。ＲＮＡは、コンフルエント分娩後由来細胞と線維芽細胞から抽出されるか、ＩＬ−８の発現では前述の通り処理された細胞から抽出された。細胞は、製造業者の指示（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）に沿って、β−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）を含む３５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解された。ＲＮＡは製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）に沿って抽出され、ＤＮＡアーゼが処理された（２．７Ｕ／サンプル）（シグマ、ミズーリー州セントルイス）。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保存された。ＲＮＡはヒト胎盤と臍帯から抽出された。β−メルカプトエタノールを含む７００マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴに組織（３０ミリグラム）が懸濁された。サンプルは機械的にホモジナイズされ、前記ＲＮＡ抽出は製造業者の使用説明書に沿って処理された。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保存された。
【０３３２】
逆転写。ＲＮＡは２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたランダム六量体を用い、逆転写された。サンプルは−２０℃で保存された。
【０３３３】
分娩後由来細胞でユニークに調節される、ｃＤＮＡマイクロアレイで同定された遺伝子（シグネチャー遺伝子−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン、レチキュロンを含む）は、さらにリアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲで検討された。
【０３３４】
リアルタイムＰＣＲ。ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物：酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）を用いてｃＤＮＡサンプルで実施され、ＧＡＰＤＨは前記製造業者の使用説明書（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）に沿って、７０００配列の検出システムにより、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用い、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造業者の使用説明書（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、アプライドバイオシステムズのユーザー用公報Ｎｏ．２）に沿って分析された。
【０３３５】
従来のＰＣＲ。従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの結果を確認するため、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  （パーキンエルマー・バイオシステムズ、マサチューセッツ州ボストン）を用いて実施された。ＰＣＲは２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＴＡＱポリメラーゼ（商品名ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）と、９４℃、５分で最初の変性を利用して実施された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、レチキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル）、レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３８サイクル）、酸化ＬＤＬ受容体とＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３３サイクル）について、増幅は各プライマーセットで最適化された。増幅に用いられたプライマーは表１に掲載されている。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、０．５マイクロモルのＧＡＰＤＨを除き、１マイクロモルであった。前記製造業者のＴａｑＭａｎプローブが前記最終ＰＣＲ反応に追加されなかった場合を除き、ＧＡＰＤＨプライマーはリアルタイムＰＣＲと同じであった。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでサンプルが実行され、臭化エチジウムで染色された（シグマ、ミズーリー州セントルイス）。画像は焦点距離ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲインターナショナル、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用い、６６７ユニバーサル・ツイナパックフィルム（ＶＷＲインターナショナル、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて捕獲された。
【０３３６】
【表１６】
2007528706.tif 000019
【０３３７】
免疫蛍光検査。分娩後由来細胞は、冷却した４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（シグマ−アルドリッチ、ミズーリー州セントルイス）で１０分間、室温で固定された。継代０（Ｐ０）（単離直後）と継代１１（Ｐ１１）（胎盤由来細胞の単離株２種類、臍帯由来細胞の単離株２種類）の臍帯および胎盤由来細胞それぞれの単離株１種類および線維芽細胞（Ｐ１１）が使用された。ビメンチン（１：５００、シグマ、ミズーリー州セントルイス）、デスミン（１：１５０、シグマ−ウサギに対して作成、または１：３００、ケミコン、カリフォルニア州テメキュラ−マウスに対して作成）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；シグマ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；シグマ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；シグマ）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カーピンテリア）のエピトープに対する抗体を用い、免疫細胞化学検査が実施された。さらに、継代１１の分娩後由来細胞で抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；サンタクルーズ・バイオテック、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；サンタクルーズ・バイオテック）、抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；サンタクルーズ・バイオテック）のマーカーが検討された。
【０３３８】
培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（ケミコン、カリフォルニア州テメキュラ）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；シグマ、ミズーリー州セントルイス）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が省略された。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記プロセスを介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用された。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；モレキュラープローブズ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；モレキュラープローブズ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，サンタクルーズ・バイオテック）とともにブロッキング溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、前記一次抗体溶液は除去され、前記培地がＰＢＳで洗浄された。次に培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラープローブズ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３３９】
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルビル）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光が可視化された。すべてのケースで、対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった（コントロールでは１次抗体なし）。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス、カリフォルニア州カールズバッド）を用い、代表的な画像が捕らえられた。３回染色したサンプルでは、１度に１回の励起フィルターのみを用い、各画像が取られた。次に、アドビ  フォトショップソフトウェア（アドビ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて層状のモンタージュが用意された。
【０３４０】
ＦＡＣＳ分析での細胞の調整。フラスコ中の接着細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。１００マイクロリットルの分量がコニカルチューブに移された。細胞内抗原で染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤファーミンゲン、カリフォルニア州サンディエゴ）で透過処理された。抗体は製造業者の使用説明書により一定分量に追加され、前記細胞が３０分間４℃において暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、過剰な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞は１００マイクロモルの３％  ＦＢＳに再懸濁された。二次抗体は製造業者の使用説明書により追加され、前記細胞が３０分間４℃において暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、過剰な二次抗体を除去した。洗浄された細胞は０．５マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤファーミンゲン、マサチューセッツ州ベッドフォード）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；シグマ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）の抗体が使用された。
【０３４１】
ＦＡＣＳ分析。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン、カリフォルニア州サンホセ）でフローサイトメトリー分析が実施された。
【０３４２】
結果
ヒト胎盤由来細胞、成人および新生児の線維芽細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）のｃＤＮＡに実施された、選択された「シグネチャー」遺伝子のリアルタイムＰＣＲの結果は、他の細胞と比べ、前記胎盤由来細胞で酸化ＬＤＬ受容体およびレニンが高レベルで発現されたことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、前記ΔΔＣＴ法によって分析され、対数スケールで表現された。レチキュロンと酸化ＬＤＬ受容体の発現レベルは、他の細胞と比べて臍帯由来細胞で高かった。分娩後由来細胞と対照では、ＣＸＣリガンド３とＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は認められなかった（データは示されていない）。ＣＸＣ−リガンド３は非常に低レベルで発現された。ＧＣＰ−２はヒト成人および新生児の線維芽細胞と同等のレベルで発現された。リアルタイムＰＣＲの結果は従来のＰＣＲで確認された。ＰＣＲ産物の配列決定は、さらにこれらの観察の妥当性を確認した。表９−１に掲載された従来のＰＣＲ  ＣＸＣリガンド３プライマーを用い、分娩後由来細胞と対照との間でＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意な差は認められなかった。
【０３４３】
分娩後由来細胞の前記サイトカインＩＬ−８の発現は、増殖培地で培養されたか、血清飢餓分娩後由来細胞で上昇された。すべてのリアルタイムＰＣＲデータは、従来のＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定で妥当性が確認された。
【０３４４】
無血清培地で増殖された細胞の上清でＩＬ−８の有無が検討された場合、臍帯由来細胞由来の培地と胎盤由来細胞の単離株の一部で最も多い量が検出された（表９−２）。ヒト皮膚線維芽細胞由来の培地でＩＬ−８が検出されなかった。
【０３４５】
【表１７】
2007528706.tif 000020
【０３４６】
胎盤由来細胞はＦＡＣＳ分析により、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、ＧＲＯαの発現が検討された。細胞の検査ではＧＣＰ−２が陽性であった。酸化ＬＤＬ受容体とＧＲＯがこの方法で検出されなかった。
【０３４７】
胎盤由来細胞は、免疫細胞化学的分析により、選択されたタンパク質の生産についても検討された。単離直後（継代０）、前記ヒト胎盤由来の細胞が４％パラホルムアルデヒドで固定され、フォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、ビメンチンの６種類のタンパク質の抗体に曝露された。細胞染色では、α−平滑筋アクチンとビメンチン両方で陽性であった。このパターンは継代１１まで保存された。継代０の少数の細胞（<５％）は、サイトケラチン１８で陽性に染色された。
【０３４８】
継代０の前記ヒト臍帯由来細胞は、免疫細胞化学的分析により選択されたタンパク質の生産がプローブされた。単離直後（継代０）、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定され、フォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、ビメンチンの６種類のタンパク質の抗体に曝露された。臍帯由来細胞ではα−平滑筋アクチン、ビメンチンが陽性であり、前記染色パターンは継代１１まで一致した。
【０３４９】
継代１１の胎盤由来細胞も、ＧＲＯαとＧＣＰ−２の生産で免疫細胞化学的分析により検討された。胎盤由来細胞はＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの生産はこの方法では検出されなかった。
【０３５０】
免疫細胞化学により、継代１１での臍帯由来細胞でＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬ受容体１、レチキュロン（ＮＯＧＯ−Ａ）の生産が検討された。臍帯由来細胞はＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの生産はこの方法では検出されなかった。さらに、細胞がＮＯＧＯ−Ａ陽性であった。
【０３５１】
要約。マイクロアレイと（リアルタイムおよび従来の）ＰＣＲにより測定された遺伝子発現レベル間の一致は、酸化ＬＤＬ受容体１、レニン、レチキュロン、ＩＬ−８の４遺伝子で確立された。これらの遺伝子の発現は、分娩後由来細胞で前記ｍＲＮＡレベルが異なって制御され、ＩＬ−８では前記タンパク質レベルでも異なって制御された。酸化ＬＤＬ受容体の有無は、前記胎盤由来細胞でＦＡＣＳ分析によりタンパク質レベルで検出されなかった。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の異なる発現が前記ｍＲＮＡレベルで確認されなかったが、ＧＣＰ−２は前記胎盤由来細胞のＦＡＣＳ分析により前記タンパク質レベルで検出された。この結果は前記マイクロアレイ実験から当初入手されたデータを支持していないが、これは前記方法論の感受性に差があるためと考えられる。
【０３５２】
単離直後（継代０）では、前記ヒト胎盤由来細胞が染色され、α−平滑筋アクチンとビメンチンが陽性であった。このパターンは継代１１の細胞でも観察された。これらの結果は、少なくともここで使用された増殖培地で、ビメンチンとα−平滑筋アクチンの発現が継代により細胞に保たれ得ることを示唆している。
【０３５３】
継代０におけるヒト臍帯由来細胞では、α−平滑筋アクチンとビメンチンの発現がプローブされ、いずれも陽性であった。この染色パターンは継代１１まで保存された。
【０３５４】
結論として、前記完全なｍＲＮＡデータは、少なくとも部分的に前記マイクロアレイ実験から入手されるデータの妥当性を確認する。
【実施例１０】
【０３５５】
ＰＰＤＣ表現型の免疫組織化学的特徴
ヒト分娩後組織、つまり臍帯と胎盤内に認められる細胞の表現型が、免疫組織化学的に分析された。
【０３５６】
方法と物質
組織標本。ヒト臍帯および胎盤組織が採取され、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中、一晩４℃で浸漬固定された。ビメンチン（１：５００、シグマ、ミズーリー州セントルイス）、デスミン（１：１５０、ウサギに対して作成、シグマ、または１：３００、マウスに対して作成、ケミコン、カリフォルニア州テメキュラ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；シグマ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；シグマ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；シグマ）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ダコサイトメーション、カリフォルニア州カーピンテリア）のエピトープに対する抗体を用い、免疫組織化学検査が実施された。さらに、抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；サンタクルーズ・バイオテック、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；サンタクルーズ・バイオテック）、抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；サンタクルーズ・バイオテック）のマーカーが検討された。固定された標本が外科用メスで削られ、エタノールを含むドライアイス浴でＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ、カリフォルニア州トランス）内に入れられた。次に標準的なクライオスタット（ライカマイクロシステムズ）を用い、冷凍ブロックが切片にされ（厚さ１０ミクロン）、染色用ガラススライドに載せられた。
【０３５７】
【表１８】
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【０３５８】
免疫組織化学。免疫組織化学がこれまでの研究と同様に実施された（例えばＭｅｓｓｉｎａら、（２００３）  Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：８１６−８２９）。組織切片はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（ケミコン、カリフォルニア州テメキュラ）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；シグマ）を含むタンパク質ブロッキング溶液に１時間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でｔｒｉｔｏｎが省略された。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記処置を介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された一次抗体は、次に室温で４時間前記切片に適用された。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；モレキュラープローブズ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；モレキュラープローブズ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；サンタクルーズ・バイオテック）とともにブロッキング溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液は除去され、培地がＰＢＳで洗浄された。培養物が洗浄され、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラープローブズ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３５９】
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルビル）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光が可視化された。陽性染色は対照染色を上回る蛍光シグナルにより表された。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス、カリフォルニア州カールズバッド）を用い、代表的な画像が捕らえられた。３回染色したサンプルでは、１度に１回の励起フィルターのみを用い、各画像が取られた。次に、アドビ・フォトショップソフトウェア（アドビ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて層状のモンタージュが用意された。
【０３６０】
結果
臍帯の特徴。ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４マーカーは、臍帯に認められる細胞のサブセットで発現された（データは示されていない）。特に、ｖＷＦとＣＤ３４の発現は前記臍帯に含まれる血管に制限された。ＣＤ３４＋細胞は最も内側の層（内腔側）にあった。ビメンチンの発現は、前記臍帯の基質と血管から認められた。ＳＭＡは前記動脈および静脈の基質と外壁に限定されていたが、前記血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８とデスミンは前記血管内のみに観察され、デスミンは前記中間層と外層に限定されていた。
【０３６１】
胎盤の特徴。ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４はすべて前記胎盤内に観察され、局所的に特異的であった。
【０３６２】
ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ組織発現。臍帯または胎盤組織内にこれらのマーカーは観察されなかった（データは示されていない）。
【０３６３】
要約。ヒト臍帯および胎盤内の細胞で、ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４が発現された。ビメンチンとα−平滑筋アクチンのみが発現されることを示したｉｎ  ｖｉｔｒｏの特徴研究をもとに、前記データは、現在の分娩後由来細胞の単離プロセスが細胞の部分集団を取り入れるか、または前記単離細胞がマーカーの発現を変化させ、ビメンチンとα−平滑筋アクチンを発現することを示唆している。
【実施例１１】
【０３６４】
分娩後由来細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏ免疫学
分娩後由来細胞株が、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植の際に誘発するであろう前記免疫学的反応を予測する試みとして、これらの細胞の免疫学的特徴がｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価された。分娩後由来細胞株がＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現について、フローサイトメトリーによりアッセイされた。これらのタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の直接刺激が必要とされる（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第５版（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７１ページ）。前記細胞株も、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第５版（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７１ページ）、ＣＤ  １７８（Ｃｏｕｍａｎｓら、（１９９９）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５−１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第５版（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７１ページ；Ｂｒｏｗｎら、（２００３）  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０，１２５７−１２６６）の発現でフローサイトメトリーにより分析された。胎盤組織に存在する細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫に特別の状態を媒介すると考えられる。分娩後胎盤および臍帯由来細胞株がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を誘発する程度を予測するため、前記細胞株は一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で検査される。
【０３６５】
材料と方法
細胞培養。２％ゼラチン（シグマ、ミズーリー州セントルイス）でコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）において、コンフルエントまで、細胞が増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド））で培養された。
【０３６６】
抗体染色。細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。製造業者の仕様書により抗体（表１１−１）は１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、４℃で３０分間、暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、非結合性抗体を除去した。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳで再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ベクトン・ディッキンソン、カリフォルニア州サンホセ）を用い、フローサイトメトリーにより分析された。
【０３６７】
【表１９】
2007528706.tif 000022
【０３６８】
混合リンパ球反応。細胞株Ａと標識された継代１０の臍帯由来ＰＰＤＣと、細胞株Ｂと標識された継代１１の胎盤由来ＰＰＤＣの凍結保存したバイアルは、ＣＴＢＲ（ケベック州Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ）にドライアイスに載せて送付され、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いた混合リンパ球反応を実施した。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）が、複数の男性と女性ボランティアドナーから回収された。刺激物（ドナー）同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、分娩後由来細胞株がマイトマイシンＣで処理された。自家およびマイトマイシンＣ処理刺激細胞が、応答する（レシピエント）ＰＢＭＣに追加され、４日間培養された。インキュベーション後、［３Ｈ］チミジンが各サンプルに追加され、１８時間培養された。前記細胞の採取後、放射標識したＤＮＡが抽出され、［３Ｈ］−チミジンの取り込みがシンチレーションカウンターで測定された。
【０３６９】
前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理済み同種ドナーを足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、同種ドナーの刺激指数（ＳＩＡＤ）は計算された。前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理分娩後由来細胞株を足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、分娩後由来細胞の刺激指数が計算された。
【０３７０】
結果
混合リンパ球反応−胎盤。７つのヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされ、他の６つの血液ドナーを用いた混合リンパ球反応において、強固な増殖反応を示す単一の同種ドナーを同定した。このドナーは、前記同種ポジティブコントロールドナーとして選択された。前記残りの６つの血液ドナーはレシピエントとして選択された。前記同種ポジティブコントロールドナーと胎盤由来細胞株がマイトマイシンＣで処理され、前記６つの個別同種レシーバーを用いた混合リンパ球反応で培養された。１プレート当たり３つのレシーバーを用いた２細胞培養プレートを用い、反応は３回繰り返された（表１１−２）。前記平均刺激指数は１．３（プレート２）から３（プレート１）の範囲であり、前記同種ドナーのポジティブコントロールは４６．２５（プレート２）から２７９（プレート１）の範囲であった（表１１−３）。
【０３７１】
【表２０−１】
2007528706.tif 000023
【０３７２】
【表２０−２】
2007528706.tif 000024
【０３７３】
【表２１】
2007528706.tif 000025
【０３７４】
混合リンパ球反応−臍帯。６つのヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされ、他の５つの血液ドナーを用いた混合リンパ球反応において、強固な増殖反応を示す単一の同種ドナーを同定した。このドナーは、前記同種ポジティブコントロールドナーとして選択された。前記残りの５つの血液ドナーはレシピエントとして選択された。前記同種ポジティブコントロールドナーと胎盤由来細胞株がマイトマイシンＣで処理され、前記５つの個別同種レシーバーを用いた混合リンパ球反応で培養された。１プレート当たり３つのレシーバーを用いた２細胞培養プレートを用い、反応は３回繰り返された（表１１−２）。前記平均刺激指数は６．５（プレート１）から９（プレート２）の範囲であり、前記同種ドナーのポジティブコントロールは４２．７５（プレート２）から７０（プレート１）の範囲であった（表１１−５）。
【０３７５】
【表２２−１】
2007528706.tif 000026
【０３７６】
【表２２−２】
2007528706.tif 000027
【０３７７】
【表２３】
2007528706.tif 000028
【０３７８】
抗原提示細胞マーカー−胎盤。フローサイトメトリーで分析される胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値に認められるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現が陰性であることを示し、胎盤由来細胞株には同種ＰＢＭＣ（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞）を直接刺激するために必要な前記細胞表面分子がないことを示している。
【０３７９】
免疫調節マーカー−胎盤由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値の上昇に認められるとおりＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値で認められるとおりＣＤ１７８とＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す（データは示されていない）。
【０３８０】
抗原提示細胞マーカー−臍帯由来細胞。フローサイトメトリーで分析される臍帯由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値に認められるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現が陰性であることを示し、臍帯由来細胞株には同種ＰＢＭＣ（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞）を直接刺激するために必要な前記細胞表面分子がないことを示している。
【０３８１】
免疫調節マーカー−臍帯由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値の上昇に認められるとおりＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値で認められるとおりＣＤ１７８とＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
【０３８２】
要約。胎盤由来細胞株を用いて実施された前記混合リンパ球反応では、前記平均刺激指数が１．３〜３の範囲であり、前記同種ポジティブコントロールの指数は４６．２５〜２７９の範囲であった。胎盤由来細胞株を用いて実施された前記混合リンパ球反応では、前記平均刺激指数が６．５〜９の範囲であり、前記同種ポジティブコントロールの指数は４２．７５〜７０の範囲であった。フローサイトメトリーにより測定されると、胎盤および臍帯由来細胞株が、前記刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現で陰性であった。胎盤および臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーで測定されると、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現が陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現が陽性であった。同種ドナーＰＢＭＣはＨＬＡ−ＤＰ、ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２を発現した抗原提示細胞を含み、それによって同種ＰＢＭＣ（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞）の刺激を可能とする。同種ＰＢＭＣ（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞）の直接刺激と免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２の存在に必要な、胎盤および臍帯由来細胞に抗原提示細胞の表面分子がないことは、同種対照と比べてＭＬＲのこれらの細胞により前記低刺激指数の原因となっている可能性がある。
【０３８３】
参考文献
Ｂｒｕｄｅｒ  ＳＰ  ら、米国特許６，３５５，２３９  Ｂ１  （２００２）
Ａｂｂａｓ，ＡＫ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＡＨ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第５版．（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７１ページ
Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ  Ｐ．Ｌｅら、（２００３）  Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２４；Ｓ１０−Ｓ１５
Ｃｏｕｍａｎｓ  Ｂ  ら、（１９９９）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５−１９６］
Ｂｒｏｗｎ，Ｊｕｌｉａら、（２００３）  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０，１２５７−１２６６
【実施例１２】
【０３８４】
分娩後由来細胞による栄養因子の分泌
胎盤および臍帯由来ＰＰＤＣから選択された栄養因子の分泌が測定された。血管形成活性（つまり、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら、（１９９７）  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５−２６）、単球走化性因子１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら、（２０００）  Ｂｌｏｏｄ  ９６；３４−４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（  Ｌｉら、（２００３）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９−７６）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら、（２００４）  Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２−８）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１ａ（ＳＤＦ−１ａ））、神経栄養性／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら、（２００３）  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９−３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２））、またはケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性制御、正常Ｔ細胞の発現と分泌）、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）を有する因子が選択された。
【０３８５】
方法と材料
細胞培養。胎盤と臍帯由来のＰＰＤＣ、およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞は、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコで増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＳＨ３００７０．０３；ハイクローン、ユタ州ローガン）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ））に培養された。細胞は継代１１で凍結保存され、液体窒素に保存された。前記細胞を解凍後、増殖培地が前記細胞に追加された後、１５ミリリットルの遠心分離管に移し、１５０×ｇで５分間、前記細胞を遠心分離した。前記上清は廃棄された。前記細胞ペレットは４ミリリットルの増殖培地に再懸濁され、細胞が計数された。細胞は増殖培地１５ミリリットルを含むＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、２４時間培養された。前記培地は８時間、無血清培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（シグマ）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ））に変更された。無血清の条件培地はインキュベーションの最後に回収され、１４，０００×ｇで５分間遠心分離され、０℃で保存された。各フラスコの細胞数を推定するため、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ）を用いて分離された。トリプシン活性は８ミリリットルの増殖培地を加えることで抑制された。細胞は１５０×ｇで５分間遠心分離された。上清は除去され、細胞は１ミリリットルの増殖培地に再懸濁された。血球計数板を用い、細胞数が推定された。
【０３８６】
ＥＬＩＳＡアッセイ。細胞は３７℃で５％二酸化炭素と大気酸素中で増殖された。胎盤由来ＰＰＤＣ（１０１５０３）も、５％酸素またはβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で増殖された。各細胞サンプルで生産されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１ａ、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β２の量は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定された（Ｒ&Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）。すべてのアッセイは前記製造業者の使用説明書に沿って実施された。値はピコグラム／ミリリットル／１００万細胞（ｎ＝２、標準誤差）で示している。
【０３８７】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＥＬＩＳＡアッセイ。ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、血管形成因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔプロテオームアレイ（ピアス・バイオテクノロジー社）を用いて測定された。前記プロテオームアレイは、１ウェル当たり１６タンパク質に対して２つの定量測定を行うマルチプレックスのサンドイッチＥＬＩＳＡである。前記アレイは、９６ウェルプレートの各ウェルに４〜１６種類の捕捉抗体の２×２、３×３、または４×４パターンをスポットすることで作成された。サンドイッチＥＬＩＳＡ法後、前記プレートの各ウェル内の各スポットで発生した化学蛍光シグナルを捕捉するため、前記プレート全体が画像化される。各スポットで発生したシグナルの量は、前記最初の標準またはサンプルにおいて、標的タンパク質の量と比例する。
【０３８８】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、胎盤および臍帯由来ＰＰＤＣと皮膚線維芽細胞により分泌された（表１２−１）。臍帯由来細胞は、他の細胞集団よりも少なくとも１０倍多い量のＭＣＰ−１とＩＬ６を分泌した。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍帯由来ＰＰＤＣにより多く発現された。ＴＧＦ−β２は検出されなかった。ＶＥＧＦは線維芽細胞培地で検出された。
【０３８９】
臍帯由来細胞から分泌されたＨＧＦ、ＦＧＦ、ＢＤＮＦの量は、線維芽細胞と胎盤由来細胞よりも著しく高かった（表１２−２および１２−３）。同様に、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＨＢＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＴＡＲＣ、ＩＬ−８は他の細胞集団よりも臍帯由来細胞で高かった（表１２−３）。ＡＮＧ２またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。
【０３９０】
【表２４】
2007528706.tif 000029
【０３９１】
【表２５】
2007528706.tif 000030
【０３９２】
【表２６】
2007528706.tif 000031
【０３９３】
要約。臍帯細胞は、胎盤由来細胞と線維芽細胞よりも有意に多量の栄養因子を分泌した。これらの栄養因子の一部、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などは、血管形成に重要な役割を果たしている。ＢＤＮＦおよびＩＬ−６などの他の栄養因子は、神経の再生に重要な役割を果たしている。これらの条件下で、いくつかの因子の発現がＭＩＰ１ｂ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＦＧＦなど、臍帯由来細胞に限局された。
【０３９４】
参考文献
Ｌｅ  Ｂｅｌｌｅ  ＪＥ，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  ＣＮ．（２００２）  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｗｈｅｒｅ  ｃａｎ  ｗｅ  ｇｏ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｅ？  ＢｉｏＤｒｕｇｓ．１６；３８９−４０１
Ｒｏｓｅｎ  ＥＭ，Ｌａｍｓｚｕｓ  Ｋ，Ｌａｔｅｒｒａ  Ｊ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ，Ｒｕｂｉｎ  ＪＳ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＩＤ．（１９９７）  ＨＧＦ／ＳＦ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．２１２；２１５−２６，．
Ｓａｌｃｅｄｏ  Ｒ，Ｐｏｎｃｅ  ＭＬ，Ｙｏｕｎｇ  ＨＡ，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  Ｋ，Ｗａｒｄ  ＪＭ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＪＪ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＷＪ．（２０００）  Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＣＣＲ２  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ＭＣＰ−１：ｄｉｒｅｃｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＭＣＰ−１  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．９６；３４−４０．
Ｌｉ  Ａ，Ｄｕｂｅｙ  Ｓ，Ｖａｒｎｅｙ  ＭＬ，Ｄａｖｅ  ＢＪ，Ｓｉｎｇｈ  ＲＫ  （２００３）  ＩＬ−８  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０；３３６９−７６．
Ｈｕｇｈｅｓ  ＧＣ，Ｂｉｓｗａｓ  ＳＳ，Ｙｉｎ  Ｂ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＲＥ，ＤｅＧｒａｄｏ  ＴＲ，Ｌａｎｄｏｌｆｏ  ＣＫ，Ｌｏｗｅ  ＪＥ，Ａｎｎｅｘ  ＢＨ，Ｌａｎｄｏｌｆｏ  ＫＰ．（２００４）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．７７；８１２−８．
Ｃｈｅｎｇ  Ａ，Ｗａｎｇ  Ｓ，Ｃａｉ  Ｊ，Ｒａｏ  ＭＳ，Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ  （２００３）  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｃｔｓ  ｉｎ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ  ｗｉｔｈ  ＢＤＮＦ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２５８；３１９−３３．
Ｓｅｂｉｒｅ  Ｇ，Ｅｍｉｌｉｅ  Ｄ，Ｗａｌｌｏｎ  Ｃ，Ｈｅｒｙ  Ｃ，Ｄｅｖｅｒｇｎｅ  Ｏ，Ｄｅｌｆｒａｉｓｓｙ  ＪＦ，Ｇａｌａｎａｕｄ  Ｐ，Ｔａｒｄｉｅｕ  Ｍ．（１９９３）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６，ＩＬ−１  ｂｅｔａ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０；１５１７−２３．
【実施例１３】
【０３９５】
血漿凝固アッセイ
細胞が前記作用部位を標的とすることができる特定の応用について、細胞療法は全身に注入されてもよい。注入された細胞が、致死的と考えられる血栓症を引き起こさないことが重要である。組織因子、つまり膜結合凝血促進性糖タンパク質は外因性凝固カスケードのイニシエーターであり、これはｉｎ  ｖｉｖｏで主な凝固経路である。組織因子も、例えば、前記原始的血管壁の形成において、胚血管形成に重要な役割を果たす（Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２９９−３０６）。最初の凝固に対してＰＰＤＣの可能性を決定するため、臍帯と胎盤由来ＰＰＤＣで組織因子の発現とその能力が評価され、血漿凝固を開始した。
【０３９６】
方法と材料
ヒト組織因子。ヒト組織因子のＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋａｉｌｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ノースカロライナ州ダラム）は、２０ミリリットルの蒸留水でもどされた。前記原液は８本のチューブに順に希釈された（１：２）。正常なヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ、カンザス州オーバーランドパーク）が水浴中３７℃で解凍され、使用前に氷中に保存された。９６ウェルプレートの各ウェルに、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０マイクロリットルの希釈Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）（ブランクのウェルを除く）、３０マイクロリットルの０．１モル塩化カルシウム、１００マイクロリットルの正常ヒト血漿が追加された。前記プレートは直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置され、吸光度は４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分測定した。
【０３９７】
Ｊ−８２および分娩後由来細胞。Ｊ−８２細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ハイクローン、ユタ州ローガン）、１マイクロモルのピルビン酸ナトリウム（シグマ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリー州セントルイス）、２ミリモルのＬ−グルタミン（メディアテック、バージニア州ハーンドン）、１×非必須アミノ酸（メディアテック、バージニア州ハーンドン）を含むイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）で増殖された。７０％コンフルエントでは、細胞が１００，０００、５０，０００、２５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートのウェルに移された。胎盤および臍帯の分娩後由来細胞は、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ（コーニング、ニューヨーク州コーニング）中、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ）、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ）、０．００１％βメルカプトエタノール（シグマ））で培養された。継代５の胎盤由来細胞と継代５および１１の臍帯由来細胞が５０，０００細胞／ウェルでウェルに移された。１５０×ｇで５分間遠心分離後、培地は各ウェルから除去された。細胞はカルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳに懸濁された。抗組織因子抗体細胞を用いてインキュベートされた細胞は、３０分間、２０マイクログラム／ミリリットルのＣＮＴＯ  ８５９（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルバニア州マルヴァーン）でインキュベートされた。塩化カルシウム（３０マイクロリットル）が各ウェルに追加された。前記プレートは直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置され、吸光度は４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分測定された。
【０３９８】
抗体染色。細胞はＰＢＳ中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いたフラスコから分離された。細胞は採取、遠心分離され、１ミリリットル当たり１ｘ１０７の細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳに再懸濁された。抗体は前記製造業者の仕様書の通り、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、前記細胞は暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、１５０×ｇで５分間遠心分離され、結合していない抗体を除去した。前記製造業者の使用説明書の通り、細胞は１００マイクロリットルの３％ＦＢＳに再懸濁され、二次抗体が追加された。細胞は暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、結合していない二次抗体を除去するため、細胞はＰＢＳで洗浄され、遠心分離された。洗浄された細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリーにより分析された。
【０３９９】
フローサイトメトリー分析。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ベクトン・ディッキンソン、カリフォルニア州サンホセ）で実施された。
【０４００】
結果
フローサイトメトリー分析では、胎盤および臍帯由来分娩後細胞のいずれも組織因子を発現していることが明らかとなった。血漿凝固アッセイは、組織因子が活性であることを証明した。胎盤および臍帯由来細胞のいずれにおいても、半値吸光度までの時間（Ｔ１/２から最大までの時間、表１３−１）で示されるとおり、凝固速度が上昇した。凝固は初期（Ｐ５）および後期（Ｐ１８）細胞の両方で観察された。前記Ｔ１/２から最大までの時間はＪ８２細胞の数値と反比例している。組織因子に対する抗体であるＣＮＴＯ  ８５９を用いた臍帯細胞のプレインキュベーションは前記凝固反応を抑制し、それによって組織因子が前記凝固の原因となっていることを示した。
【０４０１】
【表２７】
2007528706.tif 000032
【０４０２】
要約。胎盤および臍帯由来ＰＰＤＣは組織因子を発現し、これは凝固を誘導することができる。組織因子に対する抗体を追加すると、組織因子を抑制することができる。組織因子は通常、細胞内で不活性な高次構造で見つけられるが、機械的または化学的（例えばＬＰＳ）ストレスにより活性化される（Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎら、（２００１）  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１０４：１４９−７４；Ｅｎｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：１５８５−９７）。従って、ＰＰＤＣの調製プロセス中におけるストレスの最小化は、組織因子の活性化を予防することができる。血栓形成活性に加え、組織因子は血管形成活性と関連していた。従って、組織因子の活性は臍帯または胎盤由来ＰＰＤＣが組織に移植される場合に有益と考えられるが、ＰＰＤＣが静脈内に注入される場合に抑制される必要がある。
【０４０３】
参考文献
Ｄｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍａｒｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，３０：Ｓ２４１−Ｓ２５０  （２００２）
Ｍｏｌｌ  ａｎｄ  Ｏｒｔｅｌ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１２７：１７７−１８５  （１９９７）
【実施例１４】
【０４０４】
ＰＰＤＣの骨形成表現型への分化
骨髄由来間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、アルカリホスファターゼを石灰化および発現する骨芽細胞様細胞に分化することができる。骨芽細胞様細胞への分化を証明するため、オステオカルシンと骨シアロタンパク質など、骨芽細胞で発現される追加マーカーが使用された。骨形成培地で、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２（Ｒｉｃｋａｒｄら、１９９４）または−４およびトランスフォーミング増殖因子β１の存在下で培養することで、分娩後由来細胞も骨形成表現型に分化することができるか否かについて判定した。
【０４０５】
方法と材料
細胞培養。骨形成開始前に、間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉幹細胞の増殖培地一括キット（ＭＳＣＧＭ；ケンブレックス、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖された。ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３、ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ））で他の細胞が培養された。
【０４０６】
骨芽細胞（９Ｆ１７２１；ケンブレックス）は骨芽細胞増殖培地（ケンブレックス）で増殖され、ＲＮＡは以下のとおり抽出された。
【０４０７】
骨形成
プロトコール１。胎盤由来細胞単離株１、Ｐ３、胎盤由来細胞単離株２、Ｐ４（事前に核型が判定され、主に新生児由来細胞であることが示された）、臍帯由来細胞単離株１、Ｐ４、およびＰ３のＭＳＣが増殖培地中、２４ウェルプレートと６ウェル培養皿で５×１０３細胞／ｃｍ２にて播種され、一晩インキュベートされた。前記培地は除去され、骨形成培地（低グルコースＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１０ミリモルのβグリセロリン酸（シグマ）、１００ナノモルのデキサメタゾン（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０マイクロモルのアスコルビン酸リン酸塩（シグマ）、ファンギゾン（ギブコ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ギブコ））で置換された。骨形成培地に２０ナノグラム／ミリリットルのｈＴＧＦ−β１（シグマ）、４０ナノグラム／ミリリットルのｈｒＢＭＰ−２（シグマ）、または４０ナノグラム／ミリリットルのｈｒＢＭＰ−４（シグマ）が補充された。合計１４、２１、２８日間培養が処理され、培地は３〜４日ごとに取り替えられた。
【０４０８】
プロトコール２。分娩後由来細胞は、骨形成表現型に分化することができるかを検討された。臍帯由来細胞（単離株１、Ｐ３および単離株２、Ｐ４）および胎盤由来細胞（単離株１、Ｐ４および単離株２、Ｐ４）が増殖培地中、６ウェル、ゼラチンコーティングしたプレートで３０，０００細胞／ウェルにて播種された。間葉幹細胞（ＭＳＣ）（単離株１、Ｐ３および単離株２、Ｐ４）、線維芽細胞（１Ｆ１８５３、Ｐ１１）、回腸稜骨髄細胞（０７０２０３；Ｐ３；ＷＯ２００３０２５１４９）は、３０，０００細胞／ウェルで播種され、６ウェルのゼラチンコーティングされたプレート（ゼラチンコーティング）で、それぞれ間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ、ケンブレックス）および増殖培地でも播種された。
【０４０９】
骨形成誘導は、前記最初の播種培地（２４時間）を除去し、骨形成誘導培地（低グルコースＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、１０ミリモルのβグリセロリン酸（シグマ）、１００ナノモルのデキサメタゾン（シグマ）、５０マイクロモルアスコルビン酸リン酸塩（シグマ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ギブコ））と置き換えることで開始された。場合によっては、骨形成培地にｈｒＢＭＰ−２（２０ナノグラム／ミリリットル）（シグマ）、ｈｒＢＭＰ−４（シグマ）、またはｈｒＢＭＰ−２（２０ナノグラム／ミリリットル）およびｈｒＢＭＰ−４（２０ナノグラム／ミリリットル）（シグマ）の両方が補充された。合計２８日間培養が処理され、培地は３〜４日ごとに取り替えられた。
【０４１０】
ＲＮＡの抽出と逆転写。細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）に沿って、β−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）を含む３５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解され、−８０℃で保存された。細胞溶解物が解凍され、ＲＮＡは製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）に沿って抽出され、２．７Ｕ／サンプルのＤＮＡアーゼが処理された（シグマ、ミズーリー州セントルイス）。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保存された。ＲＮＡは２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたランダム六量体を用い、逆転写された。サンプルは−２０℃で保存された。
【０４１１】
ポリメラーゼ連鎖反応。ＰＣＲは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）遺伝子発現産物の骨シアロタンパク質（Ｈｓ００１７３７２０）、オステオカルシン（Ｈｓ００６０９４５２）ＧＡＰＤＨ（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）、およびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスを用い、７０００  ＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）により、７０００配列検出系を用いた製造業者の使用説明書（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）に沿って、ｃＤＮＡサンプルについて実施された。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルとした。
【０４１２】
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色。細胞は、１０％中性緩衝化ホルマリン（リチャード−アラン、ミシガン州カラマズー）で固定された。固定後、前記細胞は脱イオン水で洗浄され、５％（ｗ／ｖ）硝酸銀（アルドリッチ・ケミカルカンパニー、ウィスコンシン州ミルウォーキー）で１時間、直射日光に当ててインキュベートした。次に細胞は脱イオン化水で洗浄され、５％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ギブスタウン）で５分間インキュベートされた。細胞は蒸留水で洗浄され、光学顕微鏡で検討された。
【０４１３】
結果
プロトコール１。オステオカルシンと骨シアロタンパク質のリアルタイム遺伝子発現におけるポジティブコントロールとして、骨芽細胞から抽出されたＲＮＡが使用された。オステオカルシンとＢＳＰの増殖培地で増殖された胎盤由来細胞に対する骨芽細胞の発現レベルは、それぞれ２．５倍、８０００倍であった。２８日間、骨形成培地で増殖されたＭＳＣは石灰化され、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は陽性であった。主に新生児由来細胞である１種類の胎盤単離株で、広範な石灰化が観察された。また、１種類の胎盤単離株は、骨形成培地でＢＳＰ発現レベルの誘導と、低レベルのオステオカルシン誘導を示している。
【０４１４】
オステオカルシンとＢＳＰのＭＳＣ発現は、２１日の時点で骨形成培地において有意に増加した。ＢＭＰ−２および−４の追加はＢＳＰ発現を増加したが、オステオカルシン発現に影響はなかった。ＴＧＦ−β１は、骨形成培地の作用を増大しなかった。ＢＭＰ−４およびＴＧＦ−β１は、いずれも胎盤単離株により、オステオカルシンの発現を増加させた。
【０４１５】
プロトコール２。石灰化に対するｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色陽性により示される骨形成分化は、胎盤由来細胞Ｐ４およびＩＣＢＭ（０７０２０３）で観察され、Ｐ３はＢＭＰ２または４が補充された骨形成培地でインキュベートされ、ＭＳＣ（０９２９０３）Ｐ３はＢＭＰ  ４が補充された骨形成培地でインキュベートされた（表１４−１）。他の細胞は前記骨形成表現型に分化し、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色された。ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は前記細胞と関連しており、前記細胞外基質とは関連していないことを確認するため、細胞は核ファーストレッドで対比染色された。一部のＭＳＣでは、大きな脂肪滴が観察され、脂肪細胞の表現型と一致した。これは、ＭＳＣがこれらの条件で骨形成表現型に特異的に分化しないことを示している。さらに、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のいずれかを補充した骨形成培地でＭＳＣがインキュベートされると、脂肪形成は増加した。
【０４１６】
【表２８】
2007528706.tif 000033
【０４１７】
要約。骨髄由来ＭＳＣ（Ｋａｄｉｙａｌａら、１９９７）および脂肪などの他の組織由来の細胞（Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら、２００１）は、骨芽細胞様細胞に分化することが示された。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体タイプＩＢおよびＩＡの役割が異なるため、ＭＳＣはＢＭＰ（Ｃｈｅｎら、１９９８）に反応し、脂肪細胞または骨芽細胞に分化することが示された。
【０４１８】
新生児由来胎盤由来細胞とＭＳＣは、石灰化、およびオステオカルシンと骨シアロタンパク質の誘導を示した。利用された条件下、臍帯由来細胞は骨芽細胞遺伝子の石灰化または誘導を示さなかった。母体胎盤由来細胞は、石灰化するため、前記骨形成培地にＢＭＰ−４またはＴＧＦを追加する必要があると考えられる。前記サンプルの妊娠期間は、分娩後組織由来細胞が分化する能力に関与する因子でもあると考えられる。
【０４１９】
参考文献：
Ｋａｄｉｙａｌａ  Ｓ，Ｙｏｕｎｇ  ＲＧ，Ｔｈｉｅｄｅ  ＭＡ，Ｂｒｕｄｅｒ  ＳＰ．（１９９７）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．６：１２５−３４．
Ｃｈｅｎ  Ｄ，Ｊｉ  Ｘ，Ｈａｒｒｉｓ  ＭＡ，Ｆｅｎｇ  ＪＱ，Ｋａｒｓｅｎｔｙ  Ｇ，Ｃｅｌｅｓｔｅ  ＡＪ，Ｒｏｓｅｎ  Ｖ，Ｍｕｎｄｙ  ＧＲ，Ｈａｒｒｉｓ  ＳＥ．（１９９８）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＢＭＰ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＢ  ａｎｄ  ＩＡ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ａｎｄ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４２：２９５−３０５
Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ＹＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｄ，Ｂｏｎｄ  ＡＬ，Ｈｉｔｔ  ＤＣ，Ａｕｃｈｔｅｒ  Ｃ，Ｂｏｓｋｅｙ  ＡＬ，Ｐａｓｃｈａｌｉｓ  ＥＰ，Ｗｉｌｋｉｓｏｎ  ＷＯ，Ｇｉｍｂｌｅ  ＪＭ  （２００１）  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７：７２９−４１．
Ｒｉｃｈａｒｄ  ＤＪら、（１９９４）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ａｎｄ  ＢＭＰ−２．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６１，：２１８−２２８
ＷＯ２００３０２５１４９  Ａ２  ＨＯ，Ｔｏｎｙ，Ｗ．；ＫＯＰＥＮ，Ｇｅｎｅ，Ｃ．；ＲＩＧＨＴＥＲ，Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｆ．；ＲＵＴＫＯＷＳＫＩ，Ｊ．，Ｌｙｎｎ  ；ＨＥＲＲＩＮＧ，Ｗ．，Ｊｏｓｅｐｈ  ；ＲＡＧＡＧＬＩＡ，Ｖａｎｅｓｓａ  ；ＷＡＧＮＥＲ，Ｊｏｓｅｐｈ  ＣＥＬＬ  ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＷＨＩＣＨ  ＣＯ−ＥＸＰＲＥＳＳ  ＣＤ４９Ｃ  ＡＮＤ  ＣＤ９０，ＮＥＵＲＯＮＹＸ，ＩＮＣ．出願番号ＵＳ０２２９９７１  ＵＳ、提出日２００２０９２０、Ａ２発表日２００３０３２７、Ａ３発表日２００３１２１８．
【実施例１５】
【０４２０】
分娩後由来細胞の軟骨形成分化
軟骨の障害と欠陥のため、米国のみで毎年約６００，０００件の手術が行われている（１）。これらの疾患を治療するために多数の戦略が開発されたが、その成功は限られていた。１つのアプローチであるＣａｒｔｅｃｅｌ（ジェンザイム）は、患者から回収され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、次に前記患者に移植された自己軟骨細胞を利用している（１）。このアプローチは、健康な軟骨を回収し、前記培養細胞を移植する２回目の処置が必要となるという欠点を有する。１つの新しい可能性は、幹細胞療法であり、その治療では、細胞が、前記欠陥部位、またはその付近に挿入され、直接に前記障害部位を置換する。細胞は前記適用前に軟骨細胞に分化されうるか、生体内で分化することができる前駆細胞が利用されてもよい。そのような移植細胞は、前記欠陥部で失われた軟骨細胞を置きかわる。
【０４２１】
この適応症の候補細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化する能力が評価される必要がある。細胞の能力を検討するために多数のプロトコールが開発され、軟骨細胞マーカー遺伝子に分化、発現する細胞の能力が検討された。２種類のアッセイシステム、つまり前記ペレットアッセイ培養系とコラーゲンゲル培養で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化する能力について、分娩後由来細胞が検討された。前記ペレット培養系は、ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の特定ロットと使用することで成功した。このアッセイで増殖され、トランスフォーミング増殖因子−β３を処理したＭＳＣは、軟骨細胞に分化することが示された（２）。前記コラーゲンゲル系が使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞を培養した（３）。これらの条件下で培養された軟骨細胞は、軟骨様構造を形成する。
【０４２２】
材料と方法
細胞培養
分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯および胎盤が受理され、細胞は前記説明どおりに単離された。ゼラチンコーティングした組織培養プラスチックフラスコで、増殖培地（ダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）、ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス））中、細胞が培養された。前記培地は３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートされた。実験に使用する細胞は継代４〜１２とした。
【０４２３】
ヒト関節軟骨細胞。ヒト関節軟骨細胞はケンブレックス（メリーランド州フォーカーズビル）から購入され、前記分娩後由来細胞と同じ培地で培養された。前記実験の２４時間前に、前記培地が１％  ＦＢＳを含む培地に変更された。
【０４２４】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）。ＭＳＣはケンブレックス（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入され、ＭＳＣＧＭ（ケンブレックス）に培養された。実験に使用された細胞は、継代２〜４であった。
【０４２５】
コラーゲンゲルアッセイ。培養細胞がトリプシン処理され、培養プレートから除去された。無血清ＤＭＥＭにおいて、３００×ｇで５分間、２回遠心分離することで細胞を洗浄し、計数した。細胞は、掲載された最終濃度で以下の成分により混合された。ラット尾のコラーゲン（１ミリグラム／ミリリットル、ＢＤ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、０．０１Ｎ  ＮａＯＨおよび軟骨形成培地（ＤＭＥＭ、１００Ｕ／１００マイクログラムのペニシリン／ストレプトマイシン、２ミリモルのＬ−グルタミン、１ミリモルのピルビン酸ナトリウム、０．３５ミリモルのＬ−プロリン、１００ナノモルのデキサメタゾン、０．１７ミリモルのＬ−アスコルビン酸、１％（ｖ／ｖ）ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン）（すべての成分は、シグマ・ケミカルカンパニーから取得））。前記細胞は前記培地とゆっくり混合され、前記サンプルは２×１０５／ウェルまたは５×１０５／ウェルの濃度で、２４ウェルの超低クラスタープレート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）の各ウェルに等分された。インキュベーターで培養し、２４〜４８時間放置された。培地が２４〜４８時間おきに、適切な増殖培地が補充された新鮮軟骨形成培地で置換された。サンプルは２８日間培養することが可能であり、この時点で除去、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン（ＶＷＲサイエンティフィック、ペンシルバニア州ウェストチェスター）で固定され、組織学的検討が処理された。サンプルはサフラニンＯまたはヘマトキシリン／エオシンで染色、評価された。
【０４２６】
ペレット培養アッセイ。培養細胞がトリプシン処理され、培養プレートから除去された。無血清ＤＭＥＭにおいて、３００×ｇで５分間、２回遠心分離することで細胞を洗浄し、計数した。細胞は新鮮軟骨形成培地（前述）中、５×１０５細胞／ミリリットルの濃度で再懸濁された。細胞は、試験管１本当たり２．５×１０５細胞で新しいポリプロピレン管に等分された。前記適切なサンプルは次にＴＧＦ−β３（１０ナノグラム／ミリリットル、シグマ）またはＧＤＦ−５（１００ナノグラム／ミリリットル、Ｒ&Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）で処理された。細胞は１５０×ｇで３分間遠心分離された。次に試験管が前記インキュベーターに移され、３７℃および５％  ＣＯ２で２４〜４８時間放置された。適宜、２〜３日ごとに培地は新鮮軟骨細胞培地および増殖因子と置換された。サンプルは２８日まで培養され、この時点で前述のとおり除去、固定、染色された。
【０４２７】
結果
ペレットが調製、培養され、「方法」に説明された。ペレットは培地（対照）で増殖されるか、ＴＧＦ−β３（１０ナノグラム／ミリリットル）またはＧＤＦ−５（１００ナノグラム／ミリリットル）で補充され、これは２〜３日ごとに置換された。２１日間の培養後にペレットが回収され、グリコサミノグリカンの有無を検討するため、サフラニンＯで染色された。ＴＧＦβ３およびＧＤＦ−５で処理されたペレットは、対照細胞と比べ、陽性サフラニンＯ染色を示した。前記臍帯細胞の形態は、やや限定的な軟骨細胞様の形態を示した。
【０４２８】
胎盤細胞の細胞ペレットのサフラニンＯ染色は、前記臍帯細胞と比べ、同様のグリコサミノグリカン発現を示した。前記細胞の形態は、やや限定的な軟骨細胞様の形態を示した。
【０４２９】
要約。本発明の研究結果は、前記ペレット培地および前記コラーゲンゲルアッセイ系で、前記分娩後由来細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞に部分的に分化したことを示している。前記分娩後由来細胞は、前記細胞によるグリコサミノグリカンの発現の徴候をやや示していた。形態は軟骨組織に限られた類似性を示していた。
【０４３０】
参考文献
１．Ｕ．Ｓ．Ｍａｒｋｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．  Ｍｅｄｔｅｃｈ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．２００２
２．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｂ，Ｔ．Ｍ．Ｈｅｒｉｎｇ，Ａ．Ｉ．Ｃａｐｌａｎ，Ｖ．Ｍ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｕ．Ｙｏｏ．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．１９９８．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３８：２６５−２７２．
３．Ｇｏｓｉｅｗｓｋａ，Ａ．，Ａ．Ｒｅｚａｎｉａ，Ｓ．Ｄｈａｎａｒａｊ，Ｍ．Ｖｙａｋａｒｎａｍ，Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｂｕｒｔｉｓ，Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｋｏｎｇ，Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｇｅｅｓｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．２００１  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７：２６７−２７７．
【実施例１６】
【０４３１】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏペレット培養アッセイの分娩後組織に由来する細胞の軟骨形成の能力評価
この実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏペレット培養アッセイにより、胎盤または臍帯組織由来細胞の軟骨形成の能力評価について説明している。初期の継代（Ｐ３）と後半の継代（Ｐ１２）の臍帯および胎盤の細胞が利用された。トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ−３）、ＧＤＦ−５（組み換え型ヒト増殖および分化因子５）、またはその組み合わせが補充された培地において、軟骨形成誘導条件下、ペレット培養アッセイで前記細胞の軟骨形成の能力が評価された。
【０４３２】
方法と材料
試薬。ダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンがインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドから入手された。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）はハイクローン（ユタ州ローガン）から入手された。間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）およびｈＭＳＣ軟骨形成分化一括キットはバイオウィッタカー、メリーランド州ウォーカーズビルから入手された。ＴＧＦβ−３は、オンコジーン・リサーチプロダクツ、（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手された。ＧＤＦ−５はバイオファーム（ドイツ、ハイデルベルク）（ＷＯ９６０１３１６  Ａ１，ＵＳ５９９４０９４  Ａ）から入手された。
【０４３３】
細胞。ヒト間葉幹細胞（ロット番号２Ｆ１６５６）はバイオウィッタカー（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手され、製造業者の使用説明書に沿ってＭＳＣＧＭで培養された。このロットは事前に検査され、前記軟骨形成アッセイで陽性であることが示された。ヒト成人および新生児の線維芽細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナッサス）から入手され、ゼラチンコーティングした組織培養プラスチックフラスコで、増殖培地（ダルベッコ改変基本培地に１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／１００ミリグラム）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）に培養された。事前のサンプルで説明されたとおり、ヒト臍帯（ロット番号０２２７０３Ｕｍｂ）および胎盤（ロット番号０７１００３Ｐｌａｃ）から単離された分娩後組織由来細胞が利用された。線維芽細胞と同様の増殖培地で細胞が培養された。前記細胞培地は３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートされた。実験に使用された細胞は、継代３〜１２であった。
【０４３４】
ペレット培養アッセイ。ペレット培地では、０．２５×１０６細胞が１５ミリリットルのコニカルチューブに入れられ、室温で１５０×ｇで遠心分離され、バイオウィッタカーの軟骨形成アッセイのプロトコールに沿って、球状ペレットを形成した。ＴＧＦβ−３（１０ナノグラム／ミリリットル）、ＧＤＦ−５（５００ナノグラム／ミリリットル）、またはＴＧＦβ（１０ナノグラム／ミリリットル）とＧＤＦ−５（５００ナノグラム／ミリリットル）の組み合わせを含む軟骨形成誘導培地で、ペレットが３週間培養された。未処理の対照が増殖培地で培養された。培養中、１日おきにペレットに新鮮培地が再添加された。治療群には以下のものを含む：
【０４３５】
治療群
Ａ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）＋ＧＤＦ−５
Ｂ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）＋ＧＤＦ−５
Ｃ．臍帯由来細胞初期継代（Ｕ  ＥＰ）＋ＧＤＦ−５
Ｄ．臍帯由来細胞後期継代（Ｕ  ＬＰ）＋ＧＤＦ−５、ｎ＝２
Ｅ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ＧＤＦ−５
Ｆ．ヒト成人線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ＧＤＦ−５
Ｇ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）＋ＴＧＦβ−５
Ｈ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）＋ＴＧＦβ−３
Ｉ．臍帯由来細胞初期継代（Ｕ  ＥＰ）＋ＴＧＦβ−３
Ｊ．臍帯由来細胞後期継代（Ｕ  ＬＰ）＋ＴＧＦβ−３、ｎ＝２
Ｋ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ＴＧＦβ−３
Ｌ．ヒト成人線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ＴＧＦβ−３
Ｍ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３、ｎ＝１
Ｎ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｏ．臍帯由来細胞初期継代（Ｕ  ＥＰ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｐ．臍帯由来細胞後期継代（Ｕ  ＬＰ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３、ｎ＝２
Ｑ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｒ．ヒト成人線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｓ．ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）＋ＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｔ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）
Ｕ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）
Ｖ．臍帯由来細胞初期継代（Ｕ  ＥＰ）
Ｗ．臍帯由来細胞後期継代（Ｕ  ＬＰ）
Ｘ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）
Ｙ．ヒト成人線維芽細胞（ＨＡＦ）
【０４３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルの組織学。前記培養期間の最後に、ペレットは１０％緩衝化ホルマリンで固定され、パラフィン包埋、切片法、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）を用いた染色とサフラニンＯ（ＳＯ）染色を行うため、ＭＰＩリサーチ（ミシガン州マタワン）に郵送された。
【０４３７】
結果
異なる増殖因子を含む軟骨形成誘導培地で、胎盤および臍帯由来細胞、ＭＳＣ、線維芽細胞が細胞ペレットを形成した。培養期間の最後での前記ペレットのサイズは、細胞タイプによって異なっていた。胎盤由来細胞で形成したペレットはサイズが同様で、ＭＳＣおよび線維芽細胞で形成したペレットよりもわずかに大きかった。前記臍帯由来細胞で形成されたペレットは、他の群よりも大きく、ゆるい傾向があった。すべての細胞タイプで形成され、対照培地で培養されたペレットは、軟骨形成誘導培地で培養されたペレットよりも小さかった。
【０４３８】
ヘマトキシリン／エオシンおよびサフラニン−Ｏで染色されたペレットの断面を検査すると、初期継代の臍帯由来細胞は軟骨形成分化を行う能力を有することが示された。細胞凝縮、細胞形態、基質のサフラニンＯ陽性染色で評価された軟骨形成が、ＴＧＦβ−３、ＧＤＦ−５、またはその両方が補充された軟骨形成誘導培地で培養された、前記臍帯細胞ペレットに観察された。ペレットの軟骨形成はＴＧＦβ−３、ＧＤＦ−５、その併用処理で同様であった。増殖培地で培養された対照ペレットは、軟骨形成の兆候を示していなかった。臍帯由来細胞の軟骨形成の可能性は、バイオウィッタカーから入手された前記ＭＳＣで観察された可能性よりもわずかに低かった。
【０４３９】
後半の継代の臍帯由来細胞と胎盤由来細胞は、初期継代の臍帯由来細胞と同様、軟骨形成の能力を明確には示さなかった。しかし、これは軟骨形成誘導状態がＭＳＣで最適化され、分娩後由来細胞では最適化されなかったという事実のためである可能性がある。それにもかかわらず、先端または中心に位置する両方の継代で、胎盤由来細胞で明確な細胞集団が観察された。一部の細胞凝縮は線維芽細胞で観察されたが、サフラニンＯ染色とは関連していなかった。
【実施例１７】
【０４４０】
血管内皮網形成アッセイ
血管形成、または新しい脈管構造の形成は、新しい組織の増殖に必要である。血管形成の誘導は、多くの病的状態で重要な治療目的である。本研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで前記分娩後由来細胞の血管形成活性能力を同定することを目的としていた。前記研究は、基底膜抽出物であるＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングした培養皿に内皮細胞を播種する、十分に確立された方法に従った（Ｎｉｃｏｓｉａ  ａｎｄ  Ｏｔｔｉｎｅｔｔｉ  （１９９０）  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６（２）：１１９−２８）。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）上で内皮細胞を血管形成因子で処理すると、前記細胞が刺激され、毛細管と同様のネットワークを形成する。これは、血管形成の刺激物質と阻害物質を検討する一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである（Ｉｔｏら、（１９９６）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７（１）：１４８−５２）。本研究では共培養系を利用し、前記分娩後由来細胞を培養ウェルインサートに播種した。これらの透過性インサートは、前記内皮および前記分娩後由来細胞の培地成分を受動的に交換させる。
【０４４１】
材料と方法
細胞培地。分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯および胎盤が受理され、細胞はこれまでの説明どおり単離された（例１）。ゼラチンコーティングした組織培養プラスチックフラスコで、増殖培地（ダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（インビトロジェン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス））中、細胞が培養された。前記培地は３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートされた。実験に使用された細胞は、継代４〜１２であった。
【０４４２】
活発に増殖する分娩後由来細胞は、トリプシン処理され、計数され、１インサート当たり１５，０００細胞でＣＯＳＴＡＲ  ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ直径６．５ミリメーターの組織培養インサート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）に播種された。細胞は標準的な増殖条件下で、３７℃で、増殖培地中で、４８〜７２時間前記インサート上で培養された。
【０４４３】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）。ｈＭＳＣはケンブレックス（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入され、ＭＳＣＧＭ（ケンブレックス）に培養された。前記培養物は標準的な増殖条件下でインキュベートされた。
【０４４４】
活発に増殖するＭＳＣは、トリプシン処理され、計数され、１インサート当たり１５，０００細胞でＣＯＳＴＡＲ  ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ直径６．５ミリメーターの組織培養インサート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）に播種された。細胞は、標準的な増殖条件下で、増殖培地中で、４８〜７２時間前記インサート上で培養された。
【０４４５】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。ＨＵＶＥＣはケンブレックス（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手された。細胞はＥＢＭまたはＥＧＭの内皮細胞培地いずれか（ケンブレックス）において、別の培養で増殖された。標準的な増殖条件下で、標準的な組織培養プラスチック上で細胞が増殖された。前記アッセイに使用された細胞は、継代４〜１０であった。
【０４４６】
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）。ＨＣＡＥＣはケンブレックス社（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手された。これらの細胞も、ＥＢＭまたはＥＧＭの培地処方のいずれかで、別の培地で管理された。標準的な増殖条件下、標準的な組織培養プラスチックで細胞が増殖された。実験に使用された細胞は、継代４〜８であった。
【０４４７】
血管内皮網形成（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）アッセイ。製造業者の仕様書に沿って、培養プレートはＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングされた。つまり、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）は４℃で解凍され、約２５０マイクロリットルが冷却された２４ウェル培養プレート（コーニング）の各ウェルに均等に分割、分配された。前記プレートは３７℃で３０分間インキュベートされ、前記物質を凝固させた。活発に増殖している内皮細胞の培養は、トリプシン処理され、計数された。細胞は、２％  ＦＢＳを用いた増殖培地中で、前記上清の遠心分離、懸濁、吸引により２回洗浄された。約０．５ミリリットルの増殖培地で２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを用い、２０，０００細胞／ウェルのコーティングしたウェルに細胞が播種された。次に、細胞を定着させるため、細胞は約３０分間インキュベートされた。
【０４４８】
次に、内皮細胞反応のポジティブコントロールとするため、内皮細胞増殖は１０ナノモルのヒトｂＦＧＦ（ペプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）または１０ナノモルのヒトＶＥＧＦ（ペプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）で処理された。分娩後由来細胞が播種されたトランスウェルインサートは、前記インサートチャンバーに２％ＦＢＳを用いた増殖培地で適切なウェルに追加された。培養は、約２４時間、５％ＣＯ２により３７℃でインキュベートされた。前記ウェルプレートは前記インキュベーターから除去され、前記内皮細胞培地の画像が、オリンパス倒立顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルビル）を用いて収集された。
【０４４９】
結果
胎盤由来細胞または臍帯由来細胞を用いた共培養系で、ＨＵＶＥＣは細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。ＨＵＶＥＣ細胞は、ｈＭＳＣおよび１０ナノモルのｂＦＧＦを用い、共培養実験で限定された細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。いずれの処置を受けなかったＨＵＶＥＣ細胞で示されたネットワークの形成は、非常に少ないか、全くなかった（データは示されていない）。これらの結果は、前記分娩後由来細胞が前記ＨＵＶＥＣを刺激する血管形成因子を放出することを示唆している。
【０４５０】
胎盤由来細胞または臍帯由来細胞を用いた共培養系で、ＣＡＥＣが細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。
【０４５１】
表１７−１は、増殖培地で前記分娩後由来細胞により放出される、既知の血管由来因子のレベルを示している。上述の通り、分娩後由来細胞はインサートに播種された。前記細胞は前記インサートに４８時間、大気中の酸素下、３７℃で培養され、次に２％ＦＢＳ培地に切り替え、３７℃で２４時間戻された。培地は除去され、直ちに凍結、−８０℃で保存され、前記ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ピアスケミカルカンパニー、イリノイ州ロックフォード）で分析された。示された結果は繰り返し測定の平均である。前記結果は、前記分娩後由来細胞が、検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合表皮性増殖因子（ＨＢＥＧＦ）を放出しないことを示している。前記細胞は、メタロプロテアーゼ組織インヒビター−１（ＴＩＭＰ−１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の測定可能量を放出する。
【０４５２】
【表２９】
2007528706.tif 000034
【０４５３】
表１７−２は、前記分娩後由来細胞により放出される、既知の血管形成因子のレベルを示している。上述の通り、分娩後由来細胞はインサート上に播種された。前記細胞は前記インサートに４８時間、５％の酸素、増殖培地で培養され、次に２％ＦＢＳ培地に切り替え、５％Ｏ２インキュベーションに２４時間戻された。培地は除去され、直ちに凍結、−８０℃で保存され、前記ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ピアスケミカルカンパニー、イリノイ州ロックフォード）で分析された。示された結果は繰り返し測定の平均である。前記結果は、前記分娩後由来細胞が、検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合表皮性増殖因子（ＨＢＥＧＦ）は放出しないことを示している。前記細胞は、メタロプロテアーゼ組織インヒビター−１（ＴＩＭＰ−１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の測定可能量を放出する。
【０４５４】
【表３０】
2007528706.tif 000035
【０４５５】
要約。本研究の結果は、分娩後由来細胞がヒト臍静脈と冠動脈内皮細胞の両方を刺激し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）アッセイでネットワークを形成できることを示している。この効果は、このアッセイ系で既知の血管形成因子で見られた効果と同様である。これらの結果は、前記分娩後由来細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を刺激するために有用であることを示唆している。
【実施例１８】
【０４５６】
ＰＰＤＣの移植
前記分娩後臍帯と胎盤由来の細胞は、再生治療に有用である。生分解性物質を用い、ＳＣＩＤマウスに移植した分娩後由来細胞で作られた組織が評価された。評価された物質は、ＶＩＣＲＹＬ不織布、３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、ＲＡＤ  １６自己組織化ペプチドヒドロゲルであった。
【０４５７】
方法と材料
細胞培養。胎盤由来細胞と臍帯由来細胞は、ゼラチンコーティングしたフラスコ中、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３；ハイクローン、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（ギブコ））で増殖された。
【０４５８】
基質の調製。下記に説明された、従来の針穿刺法により不織布の骨格が調製された。商品名ＶＩＣＲＹＬで販売されている、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維はＥｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州サマービル）から入手された。前記繊維は直径約２０ミクロンのフィラメントであった。前記繊維は次に切断され、圧着されて、２インチの一定の長さにされ、２インチの短繊維を形成した。前記ＶＩＣＲＹＬ短繊維を用い、乾燥した状態の針穿刺不織基質が次に調製された。前記短繊維は標準的な不織機械で開かれ、けば立てられた。前記で得られたマットは、クモの巣状の短繊維の形であった。前記クモの巣状の短繊維は針穿刺され、乾燥した状態の針穿刺不織骨格を形成した。前記不織骨格は水中ですすがれ、次にエタノール中にインキュベーションされ、前記製造工程中に使用された残留化学物質または処理用の酸を除去した。
【０４５９】
３５／６５ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成る発泡体は、米国特許番号６，３５５，６９９で説明されているとおり、凍結乾燥処理により形成された。
【０４６０】
サンプル調製。１００万個の生細胞は、５ミリリットルの直径で１５マイクロリットルの増殖培地、２．２５ミリリットルの厚さのＶＩＣＲＹＬ不織骨格（６４．３３ミリグラム／立方センチメートル；ロット番号  ３５４７−４７−１）、または直径５ミリリットルの３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡの発泡体（ロット番号  ３４１５−５３）に播種された。細胞は接着するように２時間おかれ、その後、前記骨格をカバーするためにさらに増殖培地を追加された。細胞は一晩、骨格上で増殖された。細胞のない骨格も培地にインキュベートされた。
【０４６１】
ＲＡＤ１６自己組織化ペプチド（３Ｄマトリックス、マサチューセッツ州ケンブリッジ、物質移動同意書に基づく）は、滅菌１％（ｗ／ｖ）水溶液として入手され、これは使用直前に、ダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ；ギブコ）中、１０％（ｗ／ｖ）スクロース（シグマ、ミズーリー州セントルイス）、１０マイクロモルＨＥＰＥＳで１×１０６個の細胞で１：１に混合された。ＲＡＤ１６ヒドロゲル中、細胞の最終濃度は１×１０６細胞／１００マイクロリットルであった。
【０４６２】
試験物質（Ｎ＝４／Ｒｘ）
１．ＶＩＣＲＹＬ不織布＋１×１０６臍帯由来細胞
２．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０６臍帯由来細胞
３．ＲＡＤ  １６自己組織化ペプチド＋１×１０６臍帯由来細胞
４．ＶＩＣＲＹＬ不織布＋１×１０６臍帯由来細胞
５．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０６胎盤由来細胞
６．ＲＡＤ  １６自己組織化ペプチド＋１×１０６胎盤由来細胞
７．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
８．ＶＩＣＲＹＬ不織布
【０４６３】
動物の準備。動物保護法の現在の要件に従って、本研究で利用される動物が処理され、維持された。前記動物保護規定（９  ＣＦＲ）に順守し、実験動物の治療および使用に関するガイド第７版（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，第７版）で公表されている前記現行の基準に従うことで、前記公法の順守が達成された。
【０４６４】
マウス（Ｍｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／フォックスチェースＳＣＩＤ／雄（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、インディアナ州インディアナポリス）、５週齢。前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは個別に体重を量り、６０ミリグラム／キログラムのＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン，Ａｖｅｃｏ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、アイオア州フォートドッジ）および１０ミリグラム／キログラムＲＯＭＰＵＮ（キシラジン，Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ．、カンザス州シャウニー）および生理食塩水の混合液の腹腔内注射で麻酔された。麻酔誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、動物用電気バリカンで体毛が刈り込まれた。前記部位は次に二酢酸クロルヘキシジンで磨かれ、アルコールで洗い流され、乾燥、１％の有効ヨウ素溶液のヨードフォア水溶液が塗布された。前記眼に眼軟膏が適用され、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。
【０４６５】
皮下移植法。前記マウスの背側で、それぞれ約１．０ｃｍ長の４箇所の皮膚切開が作成された。２箇所の上方部位は脊柱の左側に１箇所、右側に１箇所で、背側外側胸部にわたり、前記肩甲骨の触診された下縁から約５ｍｍ尾側に横に位置していた。別の２箇所は、触診された腸骨稜から約５ｍｍ尾側のところで、正中線の各側に１つずつ、尾側仙腰レベルで殿筋部にかけて横に位置していた。インプラントはこれらの部位に無作為に置かれた。前記皮膚は下層の結合組織から分離され、小さなポケットを作り、前記切開部に向かって約１ｃｍのところに前記インプラントを配置した（またはＲＡＤ１６を注入した）。前記適切な試験物質は前記皮下腔に埋め込まれた。前記皮膚切開は金属クリップで閉じられた。
【０４６６】
動物の飼育。マウスは個別に温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で研究経過中、マイクロアイソレーターケージで飼育され、約１２時間／１２時間の明暗サイクルで管理された。前記温度と相対湿度は、最大限可能な限り、前記に述べられた範囲内に維持された。餌は放射線照射されたＰｉｃｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ  ５０５８  （ピューリナ）から成り、水は自由に摂取させた。
【０４６７】
マウスは二酸化炭素を吸入させることで、指定された期間後に安楽死された。覆っている皮膚を用いた皮下移植部位は、組織学のために切除され、凍結された。
【０４６８】
組織学。インプラントで切除された皮膚は、１０％中性緩衝化ホルマリン（リチャード−アラン、ミシガン州カラマズー）で固定された。覆っている、隣接した組織を用いたサンプルは、ルーティンな方法により中心で二等分され、パラフィン処理され、切除した表面に包埋された。マイクロトームにより５ミクロンの組織切片が得られ、ルーティンな方法によりヘマトキシリンとエオシン（ポリ・サイエンティフィック、ニューヨーク州ベイショア）で染色された。
【０４６９】
結果
３０日後、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された発泡体への組織の成長は最小限であった（データは示されていない）。対照的に、臍帯由来細胞または胎盤由来細胞が移植された発泡体には広範な組織の充填があった（データは示されていない）。
【０４７０】
ＶＩＣＲＹＬ不織骨格で一部組織が増殖していた。臍帯または胎盤由来細胞が播種された不織骨格は、基質沈着と成熟した血管が増加していることが示された（データは示されていない）。
【０４７１】
要約。本研究の目的は、免疫不全マウス内の骨格において、ヒト臍帯または胎盤由来の細胞で形成された組織タイプを決定することであった。合成吸収性不織布／発泡体ディスク（直径５．０ミリメーター×厚さ１．０ミリメーター）または自己組織化ペプチドヒドロゲルにヒト臍帯または胎盤由来細胞が播種され、ＳＣＩＤマウスの背側脊柱領域で両側性に皮下移植された。本研究では、分娩後由来細胞が生分解性骨格で良質の組織形成を劇的に増加させることができることを証明している。
【実施例１９】
【０４７２】
ＳＣＩＤマウスの移植における分娩後由来細胞の軟骨形成および骨形成の能力
臍帯または胎盤組織由来細胞が、生体再吸収性で、増殖因子を充填した骨格に播種され、ＳＣＩＤマウスに移植された後、軟骨形成の能力が評価された。
【０４７３】
方法と材料
試薬。ダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンがインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドから入手された。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）はハイクローン（ユタ州ローガン）から入手された。間葉幹細胞の増殖培地（ＭＳＣＧＭ）は、バイオウィッタカー（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手された。ＴＧＦβ−３は、オンコジーンリサーチプロダクツ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手された。ＧＤＦ−５はバイオファーム（ドイツ、ハイデンベルク）から入手された（国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１６  Ａ１、米国特許番号５，９９４，０９４Ａ）。軟骨細胞増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ミリモルのＨＥＰＥＳ、０．１ミリモルの非必須アミノ酸、２０マイクログラム／ミリリットルのＬ−プロリン、５０マイクログラム／ミリリットルのアスコルビン酸、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢが補充された高グルコースＤＭＥＭから成る。ウシフィブリノーゲンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手された。
【０４７４】
細胞。ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ、ロット番号  ２Ｆ１６５６）はバイオウィッタカー（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手され、前記製造業者の使用説明書に沿ってＭＳＣＧＭで培養された。このロットはｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で事前に研究室で検討され、軟骨形成アッセイで陽性であることが示された。ヒト成人線維芽細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナッサスから入手され、ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコで増殖培地中に培養された。事前に説明されたとおり、ヒト臍帯（ロット番号０２２７０３Ｕｍｂ）および胎盤（ロット番号０７１００３Ｐｌａｃ）から単離された分娩後由来細胞が利用された。ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコにおいて、細胞は増殖培地で培養された。前記細胞培養物は標準的な増殖条件下でインキュベートされた。実験に使用された細胞は、継代５〜１４であった。
【０４７５】
骨格。ポリジオキサノン（ＰＤＳ）メッシュ（ＰＧＡ／ＰＣＬ発泡体−ＰＤＳメッシュ）で強化された６５／３５ポリグリコール酸（ＰＧＡ）／ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）発泡体骨格［４ｘ５センチメートル、厚さ１ミリメートル、エチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌済み］は、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＢＡＴ、ニュージャージー州サマービル）から入手された。骨格から作られたパンチ（ｐｕｎｃｈｅｓ）（３．５ミリメートル）にはＧＤＦ−５（３．４マイクログラム／骨格）、ＴＧＦβ−３（１０ナノグラム／骨格）、ＧＤＦ−５およびＴＧＦβ−３の組み合わせ、または対照培地が充填され、凍結乾燥された。
【０４７６】
骨格への細胞播種。胎盤および臍帯由来細胞はトリプシン処理され、細胞数と生存能力が決定された。０．７５×１０６細胞は増殖培地１５マイクロリットルに再懸濁され、細胞培養皿で３．５ミリメーターの骨格パンチに播種された。細胞が播種された前記骨格は５％ＣＯ２を用いた標準的な空気中、３７℃で２時間、細胞培養インキュベーターでインキュベートされ、その後軟骨移植片リングの内側に入れられた。
【０４７７】
ウシ軟骨外植片。直径５ミリメートルの軟骨外植片は、若年のウシの肩から得られた軟骨から作られた。前記外植片の中心からパンチ（３ミリメートル）が切除され、細胞で播種された、３．５ミリメートルの再吸収性の骨格で置換された。フィブリンのり（６０マイクロリットルのウシフィブリノーゲン、３ミリグラム／ミリリットル）を用い、細胞を含む骨格が前記外植片内に維持された。サンプルは軟骨細胞増殖培地中に一晩維持され、次の日にリン酸緩衝生理食塩水にリンスされ、ＳＣＩＤマウスに移植された。
【０４７８】
動物。ＳＣＩＤマウス（（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／フォックスチェースＳＣＩＤ／雄）、５週齢はＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（インディアナ州インディアナポリス）およびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ミシガン州ポーテジ）から入手された。本研究で使用された動物は、明らかな組織的バイアスがないように選択された。前記受入番号、移植技術、動物番号、種／系統、手術日、ｉｎ  ｖｉｖｏ期間、安楽死日を掲載した各個別動物のケージにタグが付けられた。消えないインクマーカーで耳にマークされた連番により前記動物が同定された。
【０４７９】
実験デザイン。合計４２匹のマウスが検査された。以下に説明するように各マウスで２つの骨格が皮下移植された。すなわち、皮下移植が４２匹、治療が２８で、各治療でｎ値を３とした。前記研究はＩＡＣＵＣ承認番号：Ｓｋｉｌｌｍａｎ  ＩＡＣＵＣ  ０１−０３７に相当する。前記研究は６週間継続した。
【０４８０】
ＳＣＩＤ移植
Ａ．体重
麻酔される前、剖検時に各動物の体重を測定した。
【０４８１】
Ｂ．麻酔と手術の用意：
前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。マウスの体重が個別に測定され、ＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン［６０ミリグラム／キログラム］）、ＲＯＭＰＵＮ（キシラジン［１０ミリグラム／キログラム］）、生理食塩水の混合物を腹腔内注射で麻酔された。
【０４８２】
麻酔誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、動物用電気バリカンで体毛が刈り込まれた。前記部位は二酢酸クロルヘキシジンで磨かれ、アルコールで洗い流され、乾燥、１％の有効ヨウ素溶液のヨードフォア水溶液が塗布された。前記眼に眼軟膏が適用され、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。前記麻酔され、外科的に準備された動物が望みの横臥位に配置された。
【０４８３】
Ｃ．皮下移植法：
脊柱と平行な胸椎のちょうど外側に、約２ｃｍの皮膚切開が行われた。前記皮膚は、鈍的切開で下にある結合組織から分離された。各ＳＣＩＤマウスに２回の治療を行い、これは１回の皮膚切開により、各半胸郭に鈍的切開により作られた皮下ポケットに行われた。５−０  ＥＴＨＩＢＯＮＤ  ＥＸＣＥＬ（ポリエステル）の仮縫い用縫合糸が利用され、各骨格の周囲の筋肉組織に前記皮膚をつなぎ、皮下移動を予防した。骨格は６週間移植された後、取り出された。前記実験デザインは表１９−１に要点がまとめられている。
【０４８４】
【表３１】
2007528706.tif 000036
【０４８５】
Ｄ．剖検と組織学的準備
前記研究の経過中に死亡したか、瀕死の状態で安楽死された動物で肉眼的検査が行われた。選択された組織は、試験責任者および／または病理学者の自由裁量で保存された。
【０４８６】
マウスは指定された期間でＣＯ２を吸入させることにより安楽死された。前記移植部位の肉眼的観察が記録された。覆っている皮膚を用いた皮下移植部位のサンプルが切除され、１０％緩衝化ホルマリンで固定された。各インプラントは二等分され、半分はＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ミシガン州マタワン）に郵送され、パラフィン包埋、セクショニング、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ&Ｅ）およびサフラニンＯ（ＳＯ）を用いた染色を行った。
【０４８７】
本研究で得られたデータは統計学的に分析されなかった。
【０４８８】
結果
増殖因子が充填され、細胞が播種された骨格、細胞が播種されたコントロール骨格、増殖因子のみを充填した骨格を含むサンプルの大部分で、新しい軟骨および骨形成が観察された。新しい軟骨と骨形成の程度は、前記治療群と対照群の中で変化した。
【０４８９】
骨格に播種された初期および後期継代の胎盤由来細胞は、前記骨格内で新しい軟骨および骨形成を示した。異なる増殖因子で充填された、細胞で播種された骨格尾、細胞のみを播種した骨格の間で、新しい軟骨および骨形成に明らかな差は観察されなかった。対照骨格と比べ（増殖因子なし、細胞なし）、増殖因子がある場合とない場合の両方の場合の細胞で播種された骨格、および、増殖因子が充填された骨格のみで、新しい軟骨形成の程度は大きかったように見える。胎盤由来細胞を播種した骨格を用いた新しい軟骨の形成は、ＭＳＣおよび線維芽細胞で播種された骨格と同様であった。
【０４９０】
初期および後期継代の臍帯由来細胞を播種した、増殖因子処理骨格と対照骨格において、新しい軟骨と骨形成が観察された。軟骨形成の程度は、胎盤由来細胞で見られた程度よりも低いように見えた。前記胎盤由来細胞で認められた広範な軟骨形成を示したサンプルはなかった。ＴＧＦβ−３およびｒｈＧＤＦ−５の両方を含む骨格で臍帯由来細胞を播種した骨格では、骨形成が多いように見えた。
【０４９１】
ｈＭＳＣで充填された骨格も新しい軟骨と骨形成を示した。新しい軟骨と骨形成の程度は、すべてのｈＭＳＣ投与群で同等であった。ヒト成人線維芽細胞を播種した骨格も、新しい軟骨と骨形成を示していた。結果は胎盤由来細胞とｈＭＳＣで得られた結果と同等であった。
【０４９２】
増殖因子で充填された骨格または骨格のみを軟骨リングに入れ、移植した前記対照群でも、新しい軟骨および骨形成が観察された。驚くことではないが、新しい軟骨形成の程度は増殖因子を用いた骨格で、増殖因子を用いない骨格よりも大きかった。前記２種類の検討された増殖因子の組み合わせにより、骨形成の増加が前記対照に見られた。
【０４９３】
前記骨格内と同様に、軟骨移植リングと隣接して、新しい軟骨形成が観察された。前記軟骨リングと隣接した前記骨格内の新しい軟骨形成は、軟骨細胞の移動の結果であった可能性がある。前記骨格内で島状として認められる軟骨形成は、前記骨格内の軟骨細胞の移動、播種された細胞の分化、または内因性マウス前駆細胞の分化の結果と考えられる。この観察は、細胞が播種されていない対照の増殖因子で充填された骨格で、島状の軟骨形成が観察された、という事実に基づいている。前記骨格内では、新しい骨形成が独立に観察され、軟骨細胞とも随伴していた。骨形成は骨芽細胞の分化、および軟骨内骨化から生じた可能性がある。
【０４９４】
新しい軟骨と骨形成が、移動した軟骨細胞に関連するか、起こった可能性のある、播種細胞の軟骨形成および骨形成分化に由来するか、分別することは難しい。特定のヒト抗体を用いた切片の染色は、前記播種細胞と前記観察された軟骨形成および骨形成の寄与を区別する可能性がある。胎盤由来細胞と臍帯由来細胞が軟骨細胞の移動を刺激した可能性もある。
【０４９５】
胎盤由来細胞と臍帯由来細胞を充填した骨格を用い、豊富な新しい血管が観察された。骨形成がある部分では、血管は十分にあった。新しい骨形成に伴いｈＭＳＣおよび線維芽細胞を播種した骨格内に、新しい血管も観察された。
【０４９６】
隣接した前記骨格（増殖因子（ＧＦ）あり）が、前記対照骨格（ＧＦなし、細胞なし）に、新しい軟骨と骨形成を促すような全身的作用は除外できない。骨格中の新しい軟骨と骨形成の分析で、ＳＣＩＤマウスで前記骨格がそれと隣接して移植されたことを考慮したが、前記隣接骨格からの増殖因子の明確な全身的作用パターンは示されなかった。
【０４９７】
要約。結果は、新しい軟骨および骨形成が、胎盤および臍帯由来細胞で播種された、増殖因子および対照の骨格で観察されたことを示した。胎盤由来細胞を用いた結果は、ヒト間葉幹細胞で認められたものと同様であったが、新しい軟骨様組織形成の程度は臍帯由来細胞でわずかに顕著ではなかった。細胞なしで移植された、増殖因子で充填された骨格も、新しい軟骨と骨形成を示していた。これらのデータは、前記骨格内の新しい軟骨形成は、前記ウシ外植片、内因性前駆細胞の軟骨形成分化、播種細胞の軟骨形成分化から移動した軟骨細胞から生じる可能性があることを示している。
【０４９８】
これらの結果は、胎盤および臍帯由来細胞が軟骨形成および骨形成分化を受けることを示唆している。これらの結果はまた、胎盤および臍帯由来細胞が前記軟骨外植片から前記骨格への軟骨細胞の移動を促す可能性があることを示唆している。特に新しい骨形成に伴う骨格では、十分な新しい血管も観察された。
【０４９９】
本発明は特に現在の好適な実施形態と関連して示され、説明されたが、本発明は、特に開示され、ここに実証された実施形態に限られないことを理解されたい。本発明の好適な実施形態には多数の変化と修正を行うことができ、そのような変化と修正は、添付の請求項に示さた本発明の範囲と精神から離れることなく行うことが可能である。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月23日(2007.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に血液を含まない分娩後胎盤又は分娩後臍帯から単離された細胞、又は培養中において、分娩後胎盤又は分娩後臍帯から単離された細胞から培養中に伸長した細胞を含む細胞組成物であって、この細胞組成物は、
骨疾患又は軟骨疾患に罹患したを患者を治療するためのものである、細胞組成物。
【請求項２】
請求項１の細胞組成物において、前記単離された細胞は、実質的に血液を含まないヒト分娩後組織から単離されるものであって、前記単離された細胞及び前記培養中に伸長した細胞は培養において自己複製及び伸長することができ、骨形成または軟骨形成表現型の細胞に分化する能力を有し、増殖にＬ−バリンを必要とし、約５％〜約２０％の酸素で増殖することができ、前記細胞はさらに、以下の特徴の少なくとも１つを含み、その特徴は
（ａ）顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）、レチキュロン１、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーで検出した場合、ＧＲＯ−αまたは酸化低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの生産の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーで検出した場合、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連して、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つで上昇し、または線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、ｏｖｅｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １でダウンレギュレートされた仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇することと、
（ｆ）線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、少なくとも以下の１つで減少し、これが低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒ
ｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１（抗増殖性）、コレステロール２５−水酸化酵素、ｒｕｎｔ関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックス蛋白質５、ヘファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過カルシウム活性化チャネル（サブファミリーＮ、メンバー４）、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス５、仮想的蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク５、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用蛋白質３様、ＡＥ結合蛋白質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種・腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合蛋白質２（３６ｋＤａ）である場合と、
（ｇ）単球走化性タンパク質−１、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、顆粒球走化性タンパク質−２、肝細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮成長因子、脳由来神経栄養因子、トロンボポエチン、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１の少なくとも１つの分泌と、
（ｈ）ＥＬＩＳＡで検出した場合、トランスフォーミング成長因子−β２、アンジオポエチン−２、血小板由来増殖因子−ｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、マクロファージ由来ケモカイン、血管内皮増殖因子の少なくとも１つの分泌の欠如、および
（ｉ）培養で少なくとも４０回倍加を受ける能力、
である、細胞組成物。
【請求項３】
請求項１記載の細胞組成物であって、この組成物は、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロン酸を消化する粘液溶解酵素の少なくとも１つを用いた酵素解離により、分娩後の胎盤またはその断片から単離されたものである。
【請求項４】
分娩後由来細胞の分化を軟骨形成表現型に誘導する方法であって、前記分娩後細胞は、実質的に血液を含まない分娩後胎盤又は分娩後臍帯から単離されたものであって、この方法は、前記細胞を１若しくはそれ以上の軟骨形成分化誘導剤に曝露する工程を有するものである、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記軟骨形成分化誘導因子は、トランスフォーミング成長因子−β３（ＴＧＦβ３）、および、増殖および分化因子−５（ＧＤＦ−５）、の少なくとも１つを有するものである。
【請求項６】
請求項４記載の方法であって、この方法は、さらに、
さらに軟骨形成培地で前記細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記軟骨形成培地は、ダルベッコ改変イーグル培地、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−プロリン、デキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、抗生剤を有するものである。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記軟骨形成培地は、さらにコラーゲンと水酸化ナトリウムの少なくとも１つを有するものである。
【請求項９】
請求項４記載の方法であって、この方法は、さらに、
ペレット培養アッセイにより前記細胞の分化を評価する工程を有するものである。
【請求項１０】
請求項４記載の方法であって、この方法は、さらに、
グリコサミノグリカンまたはコラーゲンの有無を検出することで、前記細胞の分化を評価する工程を有するものである。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記評価する工程は、サフラニン−Ｏまたはヘマトキシリン／エオシンを用いて前記細胞を染色する工程を有するものである。
【請求項１２】
請求項４の方法によって産生される細胞。
【請求項１３】
分娩後由来細胞の分化を骨形成表現型に誘導する方法であって、前記分娩後細胞は、実質的に血液のない分娩後胎盤又は分娩後臍帯から単離されるものであり、この方法は、前記細胞を１若しくはそれ以上の骨形成分化誘導剤に曝露する工程を有するものである。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記分化誘導剤は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、トランスフォーミング成長因子−β１の少なくとも１つを有するものである。
【請求項１５】
請求項１３記載の方法であって、この方法は、さらに、
前記細胞を骨形成培地で培養する工程を有するものである。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、前記骨形成培地は、低グルコースダルベッコ改変イーグル培地、血清、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸リン酸塩、および少なくとも１種類の抗生物質または抗真菌剤を有するものである。
【請求項１７】
請求項１３記載の方法であって、この方法は、さらに、
骨形成細胞系譜特異的マーカーを検出することで、前記分化を評価する工程を有するものである。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記マーカーは、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、またはアルカリホスファターゼである。
【請求項１９】
請求項１３記載の方法であって、この方法は、さらに、
石灰化を測定することで、前記分化を検出する工程を有するものである。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、前記検出する工程は、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色工程を有するものである。
【請求項２１】
請求項１３記載の方法によって産生される細胞。
【請求項２２】
請求項１記載の細胞組成物を有する細胞集団。
【請求項２３】
請求項２２記載の細胞集団において、前記細胞集団は実質的に均一である。
【請求項２４】
請求項２２記載の細胞集団において、前記細胞集団は不均一である。
【請求項２５】
請求項２４記載の細胞集団であって、この細胞集団は、さらに、
骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞前駆細胞、または幹細胞の少なくとも１細胞タイプを有するものである。
【請求項２６】
請求項１２記載の細胞を有する細胞集団。
【請求項２７】
請求項２６記載の細胞集団において、前記細胞集団は実質的に均一である。
【請求項２８】
請求項２６記載の細胞集団において、前記細胞集団は不均一である。
【請求項２９】
請求項２８記載の細胞集団であって、この細胞集団は、さらに、
骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞前駆細胞、幹細胞、または他の多能性または多分化能細胞の少なくとも１細胞タイプを有するものである。
【請求項３０】
請求項２１記載の細胞を有する細胞集団。
【請求項３１】
請求項３０記載の細胞集団において、前記細胞集団は実質的に均一である。
【請求項３２】
請求項３０記載の細胞集団において、前記細胞集団は不均一である。
【請求項３３】
請求項３２記載の細胞集団であって、この細胞集団は、さらに、
骨髄細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、幹細胞、または他の多能性または多分化能細胞の少なくとも１細胞タイプを有するものである。
【請求項３４】
請求項１記載の細胞集団から調製された細胞溶解物。
【請求項３５】
請求項３４記載の細胞溶解物から調製された可溶性細胞画分。
【請求項３６】
請求項２６記載の細胞集団から調製された細胞溶解物。
【請求項３７】
請求項３６記載の細胞溶解物から調製された可溶性細胞画分。
【請求項３８】
請求項３０記載の細胞集団から調製された細胞溶解物。
【請求項３９】
請求項３８記載の細胞溶解物から調製された可溶性細胞画分。
【請求項４０】
請求項２２記載の細胞集団の細胞外基質。
【請求項４１】
請求項２６記載の細胞集団の細胞外基質。
【請求項４２】
請求項３０記載の細胞集団の細胞外基質。
【請求項４３】
請求項２２記載の細胞集団と、１若しくはそれ以上の生理活性因子とを有する組成物。
【請求項４４】
請求項２６記載の細胞集団と、１若しくはそれ以上の生理活性因子とを有する組成物。
【請求項４５】
請求項３０記載の細胞集団と、１若しくはそれ以上の生理活性因子とを有する組成物。
【請求項４６】
請求項４３記載の組成物において、前記生理活性因子は、軟骨形成分化誘導因子である。
【請求項４７】
請求項４３記載の組成物において、前記生理活性因子は、骨形成分化誘導因子である。
【請求項４８】
請求項１記載の細胞組成物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項４９】
請求項１２記載の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５０】
請求項２１記載の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５１】
請求項４０記載の細胞外基質と、薬学的に許容可能な担体とを有する、薬学的組成物。
【請求項５２】
請求項４１記載の細胞外基質と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５３】
請求項４２記載の細胞外基質と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５４】
請求項３４記載の溶解物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５５】
請求項３６記載の溶解物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５６】
請求項３８記載の溶解物と、薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物。
【請求項５７】
培地において請求項２記載の少なくとも１つの細胞を有する細胞培養物。
【請求項５８】
請求項５７記載の細胞培養物において、前記培地は、軟骨形成培地または骨形成培地を有するものである。
【請求項５９】
請求項５７記載の細胞培養物であって、この細胞培養物は、さらに、
軟骨形成分化誘導因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項６０】
請求項５９記載の細胞培養物において、前記軟骨形成分化誘導因子は、形質転換成長因子−β３および増殖および分化因子−５の少なくとも１つである。
【請求項６１】
請求項５７記載の細胞培養物であって、この細胞培養物は、さらに、
骨形成分化誘導因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項６２】
請求項６１記載の細胞培養物において、
前記骨形成分化誘導因子は、トランスフォーミング成長因子−β１、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、またはＢＭＰ４の少なくとも１つである。
【請求項６３】
請求項２２記載の細胞集団を有する基質。
【請求項６４】
請求項２６記載の細胞集団を有する基質。
【請求項６５】
請求項３０記載の細胞集団を有する基質。
【請求項６６】
請求項６３記載の基質において、前記基質は、３次元骨格を有するものである。
【請求項６７】
請求項６４記載の基質において、前記基質は、３次元足場を有するものである。
【請求項６８】
請求項６５記載の基質において、前記基質は、３次元足場を有するものである。
【請求項６９】
請求項１記載の細胞組成物において、前記骨疾患または前記軟骨疾患は、先天性な骨または軟骨の欠陥、半月板の損傷または欠陥、骨／脊髄変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症または脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯骨の喪失、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、脊椎固定術、椎間板の再構築または除去、骨パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症、または外傷または外科的損傷である。
【請求項７０】
請求項１記載の細胞組成物において、前記細胞は、少なくとも１種類の他細胞タイプと共に投与されるものである。
【請求項７１】
請求項１記載の細胞組成物において、前記細胞は、基質上に接種されるものである。
【請求項７２】
請求項７１記載の細胞組成物において、前記基質は、前記患者に移植されるものである。
【請求項７３】
請求項１記載の細胞組成物において、前記分娩後由来細胞は、投与する工程の前に、軟骨形成または骨形成表現型に分化するように誘導されるものである。
【請求項７４】
請求項１記載の細胞組成物において、前記細胞は、少なくとも１種類の生理活性因子と同時に投与されるものである。
【請求項７５】
請求項１記載の細胞組成物において、前記細胞は、前記患者の骨に投与されるものである。
【請求項７６】
請求項１記載の細胞組成物において、前記細胞は、前記患者の軟骨に投与されるものである。
【請求項７７】
組織の再生を必要とする患者において前記組織を再生するための請求項２２の細胞集団。
【請求項７８】
請求項７７の方法において、前記組織は、骨または軟骨である。
【請求項７９】
組織の再生を必要とする患者において前記組織を再生する方法ための請求項２６の細胞集団。
【請求項８０】
請求項８１の方法において、前記組織は、骨または軟骨である。
【請求項８１】
組織の再生を必要とする患者において前記組織を再生するための前記請求項３０の細胞集団。
【請求項８２】
請求項８１の細胞集団において、前記組織は、骨または軟骨である。
【請求項８３】
請求項１の細胞組成物において、前記細胞は、前記患者に移植されるものである。
【請求項８４】
請求項５７記載の培養物を増殖させることにより生成された条件培地。
【請求項８５】
分娩後由来細胞の軟骨形成を刺激する化合物を同定する方法であって、請求項１記載の細胞組成物と前記化合物とを接触させ、前記細胞の軟骨形成マーカーをモニタリングする工程を有する、方法。
【請求項８６】
分娩後由来細胞の骨形成を刺激する化合物を同定する方法であって、請求項１記載の細胞組成物と前記化合物とを接触させ、前記細胞の骨形成マーカーをモニタリングする工程を有する、方法。
【請求項８７】
請求項１記載の細胞組成物に対して毒性がある化合物を同定する方法であって、前記細胞と前記化合物とを接触させ、前記細胞の生存をモニタリングする工程を有する、方法。
【請求項８８】
請求項１記載の少なくとも１つの細胞と、さらに基質、水和剤、細胞培養基質、分化誘導剤、および細胞培地の少なくとも１つの成分とを有するキット。
【請求項８９】
請求項８８記載のキットにおいて、前記基質は、３次元足場である。
【請求項９０】
請求項８９記載のキットにおいて、前記細胞は、前記足場に播種されるものである。
【請求項９１】
請求項８８記載のキットにおいて、前記分化誘導剤は、骨形成分化誘導剤または軟骨形成分化誘導剤である。
【請求項９２】
骨疾患または軟骨疾患を有する患者を治療するための請求項１記載の細胞組成物。
【請求項９３】
骨疾患または軟骨疾患を有する患者を治療するための請求項３４の細胞溶解物。
【請求項９４】
骨疾患または軟骨疾患を有する患者を治療するための請求項８４の条件培地。
【請求項９５】
請求項４８記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞組成物を有するものである。
【請求項９６】
請求項４９記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞組成物を有するものである。
【請求項９７】
請求項５０記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞組成物を有するものである。
【請求項９８】
請求項５１記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項９９】
請求項５２記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項１００】
請求項５３記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項１０１】
請求項５４記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項１０２】
請求項５５記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項１０３】
請求項５６記載の薬学的組成物において、前記組成物は、骨疾患または軟骨疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項１０４】
請求項４８記載の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、他の骨または軟骨前駆細胞の他の細胞タイプの少なくとも１種類を有するものである。
【請求項１０５】
請求項４９記載の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、他の骨または軟骨前駆細胞の他の細胞タイプの少なくとも１種類を有するものである。
【請求項１０６】
請求項５０の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞、他の骨または軟骨前駆細胞の他の細胞タイプの少なくとも１種類を有するものである。
【国際調査報告】
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