(57)【要約】  本発明は、組み換えヒト・アルファＩ−アンチトリプシン（ｒＡＡＴ）乾燥粉末状組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えヒト・アルファ１−抗トリプシン（ｒＡＡＴ）を含む乾燥粉末状組成物。
【請求項２】
ウイルス不活性化を受けていない、請求項１に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項３】
前記組成物の蛋白質含有量が１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満のα１−抗キモトリプシンである、請求項１又は２に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項４】
前記組成物の蛋白質含有量が１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満のアルブミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項５】
前記組成物の蛋白質含有量が１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満のヒト蛋白質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項６】
前記組成物の蛋白質含有量が９０％超のｒＡＡＴである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項７】
前記組成物の蛋白質含有量が９５％超のｒＡＡＴである、請求項６に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項８】
前記組成物の蛋白質含有量が９９％超のｒＡＡＴである、請求項６に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項９】
ｒＡＡＴの１００ｍｇ当り１〜２０００ミリグラム当量、より好ましくは５０〜５００ミリグラム当量、最も好ましくは１００〜２００ミリグラム当量の塩をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１０】
糖を含有しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１１】
１％未満の水を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１２】
０．５％未満の水を含有する、請求項１１に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１３】
５０℃で３ヶ月間又はこれに等価な条件下での保存の間、初期のｒＡＡＴ活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％超を保持する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１４】
５０℃で３ヶ月間又はこれに等価な条件下での保存の間、少なくとも８０％の単量体のｒＡＡＴ、好ましくは＞９５％の単量体を保持する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１５】
グルタチオン、システイン、ジチオスレイトール又はＮ−アセチルシステインの如き還元剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１６】
アスコルビン酸又はＬ−メチオニンの如き抗酸化物質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１７】
ヒスチジン、リン酸塩又はクエン酸塩の如き、バッファーをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１８】
前記バッファーは、水中の前記組成物の再構成の間、当該再構成された溶液が、約６〜９、より好ましくは６．５〜８、さらにより好ましくは６．８〜７．０のｐＨをもつようなバッファーである、請求項１７に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項１９】
ＥＤＴＡ又はクエン酸塩の如き、キレート剤をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項２０】
ポリオキシエチレン・ソルビタン・オレアートの如き、界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。
【請求項２１】
ｒＡＡＴ、並びに請求項９、１５、１６、１７、１９、及び２０に記載の成分のみから本質的に成る、請求項１に記載の乾燥粉末状組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥蛋白質製剤に関し、そして特にアルファ１−抗トリプシン（ＡＡＴ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＡＴ及び組換えアルファ１−抗トリプシン（ｒＡＡＴ）は、多数の臨床適応症のための有効な治療剤である。ｒＡＡＴは、４４ｋＤの３９５アミノ酸蛋白質であって、非グリコシル化蛋白質であり、そしてアミノ末端のＮ−アセチルメチオニンを除いてヒト血漿タンパク質（ＡＡＴ）と一致するアミノ酸配列を有する。ＡＡＴ又はｒＡＡＴの乾燥、安定製剤であって、すぐに水中で再構成状態になって、即時使用できることが望まれる。
【０００３】
賦形剤は、主に、バッファー、糖類、及び界面活性剤を含む、乾燥した蛋白質製剤において、典型的に、使用した（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１０９−１３３，２００２を参照のこと）。他の有効な安定化賦形剤は、充填剤、キレート剤、酸化防止剤、還元剤、及びアミノ酸を含む。
【０００４】
米国特許第５７８００１Ａ号は、吸入による投与のための、ＡＡＴの乾燥粉末状製剤を記載する。様々な乾燥技術が提示される。
【０００５】
プロラスチン（Ｂａｙｅｒ）は、ヒト血漿由来、グリコシル化ＡＡＴの凍結乾燥製剤である。滅菌水４０ｍＬに当り１ｇのアルファ１−抗トリプシン機能活性体で、指示通りに元に戻すとき、当該液体組成は、＞２０ｍｇ／ｍｌのＡＡＴ、１００〜２１０ｍＥｑ／ＬのＮａ、６０〜１８０ｍＥｑ／ＬのＣｌ、１５〜２５μＭのリン酸ナトリウム、＜５ｐｐｍのＰＥＧ、及び＜０．１％のスクロースを含む。当該凍結乾燥製剤は、冷凍下で保存すべきである。
【０００６】
Ｖｅｍｕｒｉ  ｅｔ  ａｌは、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇｓ：Ｃａｓｅ  Ｈｉｓｔｏｒｉｅｓ，ｅｄ．Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）の９章において、ｒＡＡＴの製剤、主に液体型を記載する。安定性は、例えばｐＨ７．５で、その塩類含有量の増加により促進される。しかしながら、塩は、そのガラス転移温度が下がるため、凍結乾燥製剤に不適当と一般的に考えられる。
【０００７】
ｒＡＡＴの安定化は、天然蛋白質と比較して、特定の問題がある。Ｔｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：４３８４−４３８９，１９８５）は、酵母由来のｒＡＡＴと天然血漿由来のＡＡＴの熱安定性の比較を記載する。当該非グリコシル化ｒＡＡＴの半減期であって、その熱ストレス応答活性に対するものは、その天然グリコシル化対応物の半減期よりかなり短くなる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の要約
本発明は、ｒＡＡＴの乾燥製剤の発見に基づき、ここで当該ｒＡＡＴは、ｒＡＡＴ及び塩の定義済みの濃度を有し、もし凍結乾燥しなくとも（すなわち、５℃又はそれ未満）、最長２年又はそれ以上の優れた安定性を有する。これは、他の所望の特性であって、例えば、素早い再構成及び不要なものを含まない合成溶液といったことを損なうことなく、達成可能である。賦形剤含有量、特に潜在的に微生物の増殖を促進し得る当該量は、最小化され、そして、未承認又は非公定書の薬品は避けられ得る。当該製剤は、嫌な匂いや味はない。その製剤は、便利な凍結乾燥のために修正可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に関する乾燥製剤は、少なくともｒＡＡＴ及び塩を含む。当該組成物の安定性に関する影響は相対的に小さいけれども、他の慣習的な成分は、含まれ得る。そのような成分は、還元剤であって、例えば、ジチオスレイトール、システイン、グルタチオン、又はＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を、例えば再構成上１０ｍＭまでの量において、含む。当該組成物は、抗酸化物質であって、例えば、アスコルビン酸又はＬ−Ｍｅｔを、例えば、再構成上１０ｍＭまでの量において、及び／又はバッファーであって、例えば、リン酸塩、クエン酸塩又はヒスチジンを、例えば、再構成上５〜５０ｍＭの量、好ましくは１０〜２０ｍＭにおいて、も含む。当該バッファーの量は、水中での当該組成物の再構成に関して、当該再構成溶液が、ｐＨ約６〜９、より好ましくは６．５〜８、さらにより好ましくは６．８〜７．０となるような量である。
【００１０】
他の典型的な組成物は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はクエン酸塩）、及び界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタン）である。これらの組成物及びいずれかの他の組成物は、任意の組み合わせにおいて存在し得る。これらの追加成分は任意であり、そして、当該新規製剤は、必要なこれらの追加成分をほとんど含まないことが好ましい。
【００１１】
本発明の乾燥粉末状組成物は、ウイルス不活性化を受けることを要しない。それは、典型的に、６０℃又は６５℃で加熱することにより実施される。
【００１２】
本発明の乾燥粉末状組成物は、１０％未満の、より好ましくは５％未満の、最も好ましくは１％未満の蛋白質含有量のα１−抗キモトリプシンを、典型的に有する。当該組成物は、１０％未満の、より好ましくは５％未満の、最も好ましくは１％未満の蛋白質含有量のアルブミンも典型的に有する。より一般的には、蛋白質含有量は、通常１０％未満の、より好ましくは５％未満の、最も好ましくは１％未満のヒト蛋白質である。蛋白質含有量は、通常、９０％超、好ましくは９５％超のｒＡＡＴ、及び最も好ましくは９９％超のｒＡＡＴである。
【００１３】
当該乾燥粉末状組成物は、ｒＡＡＴの１００ｍｇあたり１〜２０００ミリグラム当量、より好ましくは５０〜５００ミリグラム当量、最も好ましくは１００〜２００ミリグラム当量の塩をさらに含む。使用される塩は、典型的に、ＮａＣｌになるであろう。しかしながら、カチオンが異なっても（例えば、ＫＣｌ）又はアニオンが異なっても（例えば、ＮａＢｒ）又は両方異なっても、他の塩が、同じ効果を有し得ることは、いわゆる当業者により容易に理解されるであろう。
【００１４】
本発明の乾燥粉末状組成物は、糖を含有しないものとなり得る。それは、１％未満、及び好ましくは０．５％未満の水を通常含有する。
【００１５】
本発明の乾燥粉末状組成物は、５０℃で３ヶ月間又はそれに等価な条件下での保存の間、初期のｒＡＡＴ活性の少なくとも８０％、好ましくは＞９０％保持できる。当該組成物は、３ヶ月間、５０℃又はそれに等価な条件下での保存の間、少なくとも８０％の単量体ｒＡＡＴ、好ましくは＞９５％単量体で保持し得る。
【００１６】
安定性基準（保持活性）及び変性は、本分野における、いわゆる当業者にしられた試験により実証される。活性試験は、Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，３９３１ページ，１９８０により記載されるブタ膵エラスターゼ阻害試験に基づく。変性は、分子篩いクロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ法における、凝集体形成、及び単量体の％として報告される非変性ｒＡＡＴの評価により調査される。与えられた条件と等価なことは、本分野における、いわゆる当業者により理解され得るであろう、すなわちアレニウスの式に基づく。
【００１７】
本発明の製剤を製造するために、所望の成分を含む溶液又は他の組成物を乾燥した。乾燥の好適な方法は、凍結乾燥、スプレー乾燥、スプレー凍結乾燥、流動層技術、及び超臨界流体乾燥を非制限的に含む。
【００１８】
好ましい乾燥手順は、凍結乾燥及びスプレー乾燥である。両手順共に、本分野における、いわゆる当業者にしられる標準的技術により実施され得る。例えば、スプレー乾燥は、乾燥粒子形成をもたらす３つのステップ手順からなる。当該プロセスは、液体の原材料を霧化し、圧縮空気を使用して微細な滴のスプレーとすることにより始まり、そしてその後、当該滴からなる霧を蒸発させることにより当該滴を乾燥するために、媒質を加熱する。乾燥粉末の形成における最終的な粒子は、製品として収集される。当該気体及び余分な細塵は、除去される。これらのステップは、３つの構成部品：ノズル形状の噴霧器；乾燥室；及びサイクロンとポットとして知られる収集システム、を使用して実施される。
【００１９】
乾燥製剤又は、再構成後の液体組成物は、それを必要している患者への投与に適する。投与の好適な経路は、吸入、局所、皮下、そして静脈内デリバリーを非制限的に含む。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例は、本発明を例証したものである。
【００２１】
以下の略語（前に未だ説明していないもの）：
・ＮａＰｉ：リン酸カルシウム
・Ｔｗ８０：Ｔｗｅｅｎ８０（Ｔｗｅｅｎは登録商標である。）
・ＦＴＩＲ：フーリエ変換赤外線
を使用する。
【００２２】
実施例１  凍結乾燥
表１に示した製剤を製造した。
【表１】
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【００２３】
乾燥状態中のｒＡＡＴの構造的安定性を評価するために、ＦＴＩＲスペクトルをこれらの製剤に関して収集した。固形における天然構造の保持力は、乾燥蛋白質の長期保存性を予測され得ることが示されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００２，ｓｕｐｒａ）。図１は、９１７−１製剤における液体及び固体のｒＡＡＴのＦＴＩＲを示す。ここで留意すべきは、アミドＩ領域（１７００〜１６００ｃｍ-1）は、二次構造における変化に敏感であること、及び二次導関数スペクトルにおける全ピークは、負であることである。アミドＩ領域における各ピークは、異なる二次構造型に相当する。凍結乾燥の前と後のｒＡＡＴの立体構造に明らかな摂動がある。１６５５ｃｍ-1付近のピークは、αへリックス構造に相当し、１６３５ｃｍ-1付近のバンドは、βシート構造に相当し、そして１６８８ｃｍ-1のピークは、拡張βストランド構造又はβシートに起因する。ランダムコイル構造は、１６４４ｃｍ-1付近のバンドに割り当てられる。
【００２４】
天然の構造を表す液体サンプルは、βシート及びαへリックス構造のかなりの量を示す。凍結乾燥に関して、もし安定剤がなければ（９１７−１１製剤）、図２に示すように重要な構造的摂動がある。当該αへリックスバンドは、ほぼ完全に消滅し、一方、１６８０ｃｍ-1超のバンドにおいて、著しい増加があり、拡張及びループ構造に相当する。図３は、固形状態におけるｒＡＡＴに関する塩の影響を示す。９１７−１、−３及び−４製剤は、それぞれ、１７５ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭのＮａＣｌを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸塩、２．５ｍＭのＮＡＣ、及び３ｍＭのＬ−Ｍｅｔに加えて含む。
【００２５】
より低い塩濃度である製剤３及び４は、構造的摂動の最も大きな度合いを有しているように見え、そして、全ての３つの製剤は、安定剤が無いときよりも、少ない摂動である。結局、凍結乾燥は、天然構造と比較されるいくつかの構造的摂動を引き起こすように思われる。変化の度合いは、塩を含む賦形剤の追加により最小化される。５０ｍＭ超のＮａＣｌ濃度は、より天然様構造を引き起こすように思われ、５０〜１００ｍＭが最適条件である。当該結果は、予期しないものであり、というのは、糖は、乾燥状態における天然蛋白質構造を維持するために、通常、要求され又は使用されるからである。これらの製剤の構造安定性が、乾燥状態中でのｒＡＡＴ構造間の微妙な差を明らかとするために、ＦＴＩＲにより評価された。図４は、糖ベース製剤（１００８−１）及び塩ベース製剤（１００８−２）において処方されたｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトルを示す。これら両製剤におけるｒＡＡＴの二次構造は、重ね合わせることができる。塩が高濃度で蛋白質と同程度の安定性を達成できる事実は、注目すべきであり、自明ではない。再構成の間、当該元々のｒＡＡＴ二次構造は、図５に示すように保持されている。
【００２６】
高濃度のＮａＣｌを含む冷凍乾燥されたｒＡＡＴ製剤の驚くべき観察に基づいて、安定性分析を、凍結乾燥蛋白質製剤中の共通の安定剤の追加が、ｒＡＡＴの構造安定性及び急性安定性（６０℃で３ヶ月）を促進するかどうか体系的に評価するために行った。糖は、恐らくは、凍結乾燥の間、当該蛋白質周辺の水分子の、水素結合の置換、その後の除去により当該分子を安定するために、蛋白質製剤において共通に使用される。糖は、乾燥状態における非結晶質環境であって、当該蛋白質の構造的安定性を促進することも提示し、そして、乾燥する間、除去される水和反応の水を効果的に置換する。界面活性剤もまた、蛋白製剤に、しばしば使用され、当該蛋白質を損傷し得る表面吸着を低減させる。ｒＡＡＴの可能な投与経路は、エアロゾル化を経る肺のデリバリーなので、界面活性剤の効果は、特に着目すべきである。それ故、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレン・ソルビタンの役割は、様々な濃度で、評価もされる。これらの製剤を表ＩＩに示す。
【００２７】
【表２】
2007534633.tif 000003
【００２８】
凍結乾燥製剤について、６０℃での促進保存条件下、短期の安定性（１及び３ヶ月間）を評価した。この保存温度は、蛋白質の安定性を評価するためには特に厳しく、そして、特に高いガラス転移温度（Ｔg）を有するトレハロース・ベース製剤に対する結果に影響を及ぼし得る。この温度を選択した論理的根拠は、より短い枠でｒＡＡＴの安定性を評価した先の安定性試験に基づいた。再構成された活性及び単量体パーセンテージを、６０℃で最大３ヶ月間の保存に渡って測定し、表ＩＩＩ及び表ＩＶにそれぞれ示した。
【００２９】
【表３】
2007534633.tif 000004
【００３０】
【表４】
2007534633.tif 000005
【００３１】
１ヵ月後試験した製剤のいずれにおいても、重大な違いは観察されず、糖含有、及び糖を含有しない製剤の双方共に同程度の安定性を示すことが提示された。６０℃で３ヵ月間の保存後の安定性データは、より広範な結果を示した。糖及び塩の双方を含む製剤は、糖又は塩のどちらか一方を含む場合より、より安定する分析結果となった。これらのデータは、これらの製剤の型における二次構造の保持の高い程度を示すＦＴＩＲ試験と一致する。１００８−２製剤において見られた低い特異的活性は、当該製剤における含水率に起因し得、他の選択された製剤において測定された場合より約１％高い含水率であった。この事は、安定した凍結乾燥ｒＡＡＴ製剤は、好ましくは、１％未満の含水率を有すべきであることを提示する。
【００３２】
これらの結果により、ｒＡＡＴは、相対的に安定した蛋白質であり、凍結乾燥状態中の安定化のために糖を必要としないようであることが提示される。
【００３３】
実施例２  スプレー乾燥
組換えアルファ１−抗トリプシン（ｒＡＡＴ）を、様々な配合及び条件においてスプレー乾燥させた。結果物である乾燥粉末の活性を、乾燥後のｒＡＡＴ有効性を評価するために試験した。表ＶＩＩに配合を、表ＶＩＩＩにこれらの試験のデータを示す。
【００３４】
【表５】
2007534633.tif 000006
【００３５】
【表６】
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【００３６】
上記の特徴は、網羅的なものではなかった。他の態様は、本発明の範囲に含まれる。
【００３７】
前述の参考資料を本願明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明の製剤における液体及び固体ｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトル走査である。
【図２】図２は、液体及び固体状態中の製剤されていないｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトル走査である。
【図３】図３は、塩の異なる濃度を含む製剤中のｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトル走査である。
【図４】図４は、本発明の糖ベースの製剤及び塩ベースの製剤中のｒＡＡＴの二次構造を示す。
【図５】図５は、１００ｍＭのＮａＣｌ製剤中の凍結乾燥された蛋白質の再構成の間、その元々の構造へのｒＡＡＴの二次構造の可逆性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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