(57)【要約】  アテローム性動脈硬化症、例えば一次または二次アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病または神経変性疾患、例えばアルツハイマー病の予防または処置を目的とする医薬の製造のための、式（Ｉ）（式中、Ｒは−Ｈを表す）を有する少なくとも１種の化合物またはその薬学的に許容され得る塩と組み合わせた、少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩の使用に関する。
2007534731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症、特に一次または二次アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病または神経変性疾患、特にアルツハイマー病の予防または処置を目的とする医薬の製造のための、
・下記式（Ｉ）：
【化１】
2007534731.tif 000018
（式中、Ｒは−Ｈ、
【化２】
2007534731.tif 000019
を表す）
の少なくとも１種の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、と組み合わせた、
・  少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩、
の使用。
【請求項２】
スタチンが、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンを含む群から選ばれる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物がＬ−異性体に相当する、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
Ｒが
【化３】
2007534731.tif 000020
を表し、そうすると式（Ｉ）の化合物は、アルギニン、特にＬ−アルギニンに相当する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
約５mg／日〜約８０mg／日の用量を個体に投与するために適当な量のスタチン、特にアトルバスタチンの、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
約１ｇ／日〜約３０ｇ／日、特に約５ｇ／日〜約３０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当な量の式（Ｉ）の化合物、特にＬ−アルギニンの、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
少なくとも約１０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当な量のＬ−アルギニンの、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
アテローム性動脈硬化症、特に一次または二次アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病または神経変性疾患、特にアルツハイマー病の処置の枠内で同時的使用または別々の使用または所定の時間に及ぶ使用のための組合せプロダクトとしての、
・少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩、および
・少なくとも１種の下記式（Ｉ）：
【化４】
2007534731.tif 000021
（式中、Ｒは、−Ｈ、
【化５】
2007534731.tif 000022
を表す）
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、
を含有するプロダクト。
【請求項１０】
スタチンが、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチンを含む群から選ばれる、請求項９に記載のプロダクト。
【請求項１１】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項９または１０に記載のプロダクト。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物がＬ−異性体に相当する、請求項９〜１１のいずれかに記載のプロダクト。
【請求項１３】
Ｒが
【化６】
2007534731.tif 000023
を表し、その場合に式（Ｉ）の化合物は、アルギニン、特にＬ−アルギニンに相当する、請求項９〜１２のいずれかに記載のプロダクト。
【請求項１４】
スタチン、特にアトルバスタチン約５mg／日〜約８０mg／日の用量を個体に投与するために適当な、請求項９〜１３のいずれかに記載のプロダクト。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物、特にＬ−アルギニン約１ｇ／日〜約３０ｇ／日、特に約５ｇ／日〜約３０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当な、請求項９〜１４のいずれかに記載のプロダクト。
【請求項１６】
少なくとも約１０ｇ／日のＬ−アルギニンの用量を個体に投与するために適当な、請求項１５に記載のプロダクト。
【請求項１７】
有効成分として、
・少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩、および
・Ｌ−アルギニンまたはその薬学的に許容され得る塩、
を含み、スタチン約５mg／日〜約８０mg／日およびＬ−アルギニン約５ｇ／日〜約３０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当な医薬組成物。
【請求項１８】
スタチンが、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンを含む群から選ばれる、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
少なくとも約１０ｇ／日のＬ−アルギニンの用量を個体に投与するために適当な、請求項１７〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
経口経路による投与のために適当な、請求項１７〜２０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
希釈されるべき散剤、丸剤、薬袋剤、錠剤、カプセル剤の形態においてまたは任意の他の許容され得るガレヌス剤形において与えられることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にアテローム性動脈硬化症と戦うという枠内での新規な医薬組成物およびその使用に関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、２０％より高い死亡を伴う、工業化国における死亡率の第１の原因である（Murray JL, Lopez AD. Mortality by cause for eight regions of the world: global burden of disease study. Lancet 1997; 349:1269-76）。ＷＨＯ（1954）によれば、アテローム性動脈硬化症は、アテローム性のプラークの形成、即ち、脂質、複合炭水化物、血液および血液産物、繊維組織および石灰質の付着物の局所的蓄積を含む大動脈および中等級動脈の内膜に対する変化の可変的組合せであり；すべて媒体の変性により伴われる。この病理は、それ自体数年のサブ・クリニカルな進展の後にのみ現れる。従って、その予防は、その処置よりも最高に重要である。
【０００３】
プラークの形成は、一連の５つの段階である（Tedgui A, Mallat Z. Formation de la plaque d'atherosclerosis. Rev Prat 1999; 49:2081-2086）：
−内膜におけるＬＤＬ（低密度リポタンパク質）の蓄積、
内皮細胞、平滑筋細胞（ＳＭＣｓ）またはマクロファージとの接触による壁におけるＬＤＬ酸化（ＬＤＬｏｘ）、
−酸化されたＬＤＬｓにより引き起こされるＶＣＡＭ１またはＩＣＡＭ１などの接着分子の誘導による循環している単球の動員、
−スカベンジャー受容体によるマクロファージによるＬＤＬｏｘ捕捉；従ってマクロファージにおいてコレステロールが蓄積する、
−平滑筋細胞と細胞外マトリックスからのタンパク質により構成される安定化繊維筋性キャップ（stabilizing fibromuscular cap）の形成。
【０００４】
植物および動物タンパク質中に存在する塩基性アミノ酸、Ｌ−アルギニンは、組織タンパク質の合成に必須である。異なる動物の研究で、食餌にＬ−アルギニンを補充すると（飲料水中２％、血漿アルギニン濃度を倍増することを可能とする用量）、Ｌ−アルギニンは抗アテローム効果を有する傾向があると思われる。この処理は、血管反応性に対する効果も有すると思われる。Boeger等（Boeger RH, Bode-Boeger SM, Brandes RP, Phivthong-ngam L, Boehme M, Nafe R, et al. Dietary L-Arginine reduces the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. Circulation 1997; 96: 1282-1290)、およびBehr-Roussel 等 (Behr-Roussel D, Rupin A, Simonet S, Bonhomme E, Coumailleau S, Cordi A, et al. Effect of chronic treatment with the inducible nitric oxide synthase inhibitor N-iminoethyl-L-lysine or with L-arginine on progression of coronary and aortic atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation 2000; 102: 1033-1038）は１２〜１６週間にわたる強化された食餌によるアテローム性プラーク面積の安定化を証明する。
【０００５】
スタチンは、強力なコレステロール合成阻害剤である。それらの主要な適用は、心臓虚血発作の一次または二次予防における血漿ＬＤＬ−コレステロールの減少である（Vaughan CJ, Murphy MB, Buckley BM. Statins do more than just lower cholesterol. Lancet 1996; 348: 1079-1082）。
【０００６】
スタチンは、酵素の活性部位のための基質ＨＭＧ−ＣｏＡとの可逆的競合によりＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害する。従って、それらはメバロナートおよびコレステロールを含むその誘導体の合成の減少をもたらす。従って、スタチンはアテローム性動脈硬化症の処置に適用される。
【０００７】
しかしながら、現在では、上記した処置のどれもアテローム性動脈硬化症を完全に予防および／または処置することを可能としない。
【０００８】
従って、本発明の目的は、アテローム性動脈硬化症の予防および／または処置のためのより有効な方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、特に、アテローム性動脈硬化症の予防および／または処置の枠内でスタチンおよびＬ−アルギニンの組合せの予想外の相乗効果の証明から生じる。
【００１０】
従って、本発明は、アテローム性動脈硬化症、特に一次または二次アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病または神経変性疾患、特にアルツハイマー病の予防または処置を目的とする医薬の製造のための、
・下記式（Ｉ）：
【化７】
2007534731.tif 000003
（式中、Ｒは−Ｈ、
【化８】
2007534731.tif 000004
を表す）
の少なくとも１種の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、と組み合わせた、
・  少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩
の使用に関する。
ＲがＨを表すとき、式（Ｉ）の化合物はオルニチンに相当する。
Ｒが
【化９】
2007534731.tif 000005
を表すとき、式（Ｉ）の化合物はアルギニンに相当する。
Ｒが
【化１０】
2007534731.tif 000006
を表すとき、式（Ｉ）の化合物はシトルリンに相当する。
【００１１】
これらの３つのアミノ酸は、生物における共通の代謝を有する。
【００１２】
高血圧、糖尿病および神経変性疾患、特にアルツハイマー病は、本発明に従う式（Ｉ）の化合物とスタチンとの相乗的組合せ、特にアルギニン−スタチン相乗的組合せにより補償されうる内皮機能不全に関連した血管成分を有する。
【００１３】
表現「組み合わせて、組み合わせた、組合せにおける、（in combination）」は、スタチンと式（Ｉ）の化合物が両方共本発明に従う医薬中に独立に存在しており、その場合にそれらは例えば塩を形成するための静電気的相互作用などの弱い結合または共有結合などの強い結合のいずれかによって相互に連結されていないことを意味する。  
【００１４】
本明細書で意味する用語「スタチン」は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤のクラスに属する化合物を意味する。特に、用語「スタチン」は、ペプスタチンに起因しそしてレニン阻害性を有するアミノ酸誘導体に相当しない。
【００１５】
さらに有利には、一般式（Ｉ）の化合物、特にアルギニンは、アテローム性動脈硬化症、特に一次または二次アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病または神経変性疾患、特にアルツハイマー病の予防または処置を目的とした医薬の製造の枠内でスタチンの効果を増加させるために佐剤として使用される。
【００１６】
本発明の好ましい態様に従えば、スタチンは下記の群：
アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチンを含む群から選ばれる。
【化１１】
2007534731.tif 000007
2007534731.tif 000008
【００１７】
このリストは、限定するものではなく、当業者に知られているすべての他のスタチンも本発明に従って使用することができる。
【００１８】
本発明の特に好ましい態様に従えば、スタチンはアトルバスタチンである。
【００１９】
本発明の他の好ましい態様に従えば、式（Ｉ）の化合物はＬ−異性体に相当する。
【００２０】
本発明のなお他の好ましい態様に従えば、Ｒは
【化１２】
2007534731.tif 000009
を表し、そうすると式（Ｉ）の化合物は、アルギニン、特にＬ−アルギニンに相当する。
【００２１】
本発明は、さらに詳しくは、約５mg／日〜約８０mg／日の用量を個体に投与するために適当な量のスタチン、特にアトルバスタチンの上記した使用に関する。
【００２２】
本発明は、さらに詳しくは、約１ｇ／日〜約３０ｇ／日、特に約５ｇ／日〜約３０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当な量の式（Ｉ）の化合物、特にＬ−アルギニンの上記した使用にも関する。
【００２３】
有利には、５ｇ／日未満のＬ−アルギニンの用量は特に子供のために適当である。
【００２４】
本発明は、極めて特定的には、少なくとも約１０ｇ／日の用量を個体に投与するのに適当な量のＬ−アルギニンの上記した使用にも関する。
【００２５】
特定の態様では、本発明は、約０．１５ｇ／kg／日の用量、即ち問題の個体の体重kg当たりＬ−アルギニン０．１５ｇ／日の用量を個体に投与するために適当な量のＬ−アルギニンの上記した使用に関する。
【００２６】
上記した使用の他の特定の態様に従えば、この医薬は、スタチン約５mg〜約８０mgおよびＬ−アルギニン約５ｇ〜約３０ｇ、特に約１０ｇの単一用量を個体に投与するめに適当である。
【００２７】
本発明は、アテローム性動脈硬化症、特に一次または二次アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病または神経変性疾患、特にアルツハイマー病の処置の枠内で同時的使用または別々の使用または所定の時間に及ぶ使用のための組合せプロダクトとしての、
・少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩、および
・少なくとも１種の下記式（Ｉ）：
【化１３】
2007534731.tif 000010
（式中、Ｒは、−Ｈ、
【化１４】
2007534731.tif 000011
を表す）
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、
を含有するプロダクトにも関する。
【００２８】
表現「組合せプロダクト」は、スタチンと式（Ｉ）の化合物が両方共本発明に従うプロダクト中に独立に存在しており、その場合にそれらは例えば塩を形成するための静電気的相互作用などの弱い結合または共有結合などの強い結合のいずれかによって相互に連結されていないことを意味する。
【００２９】
本発明の好ましい態様に従えば、スタチンは、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチンを含む群から選ばれる。
【００３０】
特に好ましい態様に従えば、スタチンはアトルバスタチンである。
【００３１】
本発明の他の好ましい態様に従えば、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ−異性体に相当する。
【００３２】
本発明のなお他の好ましい態様に従えば、Ｒは
【化１５】
2007534731.tif 000012
を表し、その場合に式（Ｉ）の化合物は、アルギニン、特にＬ−アルギニンに相当する。
【００３３】
本発明の他の特に好ましい態様に従えば、該プロダクトは、スタチン、特にアトルバスタチン約５mg／日〜約８０mg／日の用量を個体に投与するために適当である。
【００３４】
本発明の他の特に好ましい態様に従えば、該プロダクトは、式（Ｉ）の化合物、特にＬ−アルギニン  約１ｇ／日〜約３０ｇ／日、特に約５ｇ／日〜約３０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当である。
【００３５】
有利には、５ｇ／日未満のＬ−アルギニンの用量は子供のために特に適当である。
【００３６】
本発明の他の特に好ましい態様に従えば、該プロダクトは、少なくとも約１０ｇ／日のＬ−アルギニンの用量を個体に投与するために適当である。
【００３７】
特定の態様では、該プロダクトは、約０．１５ｇ／kg／日のＬ−アルギニンの用量を個体に投与するために適当である。
【００３８】
上記したプロダクトの他の特定の態様に従えば、該プロダクトは、スタチン約５mg〜約８０mgおよびＬ−アルギニン約５ｇ〜約３０ｇ、特に約１０ｇの単一用量を個体に投与するために適当である。
【００３９】
本発明は、有効成分として、
・少なくとも１種のスタチンまたはその薬学的に許容され得る塩、および
・下記式（Ｉ）：
【化１６】
2007534731.tif 000013
（式中、Ｒは−Ｈ、
【化１７】
2007534731.tif 000014
を表す）
の少なくとも１種の化合物またはその薬学的に許容され得る塩を、
薬学的に許容され得るビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物にも関する。
【００４０】
Ｒが−Ｈを表すとき、式（Ｉ）の化合物は、オルニチンに相当する。
【００４１】
Ｒが
【化１８】
2007534731.tif 000015
を表すとき、式（Ｉ）の化合物は、アルギニンに相当する。
【００４２】
Ｒが
【化１９】
2007534731.tif 000016
を表すとき、式（Ｉ）の化合物は、シトルリンに相当する。
これらの３つのアミノ酸は生物において共通の代謝を有する。
【００４３】
本明細書で意味するスタチンおよび式（Ｉ）の化合物は、両方共本発明に従う医薬組成物中に独立に存在し、その場合にそれらは例えば塩を形成するための静電気的相互作用などの弱い結合または共有結合などの強い結合のいずれかによって相互に連結されていない。
【００４４】
本発明の好ましい態様に従えば、スタチンは、下記の群：  
アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチンを含む群から選ばれる。
【００４５】
このリストは限定するものではなく、当業者に知られているすべてのスタチンも本発明に従って使用することができる。
【００４６】
本発明の特に好ましい態様に従えば、スタチンはアトルバスタチンである。
【００４７】
本発明の他の好ましい態様に従えば、式（Ｉ）の化合物はＬ−異性体に相当する。
【００４８】
生物において見出される天然のアミノ酸は、本質的にＬ型である。
【００４９】
本発明のなお他の好ましい態様に従えば、Ｒは
【化２０】
2007534731.tif 000017
を表し、そうすると式（Ｉ）の化合物は、アルギニン、特にＬ−アルギニンに相当する。
【００５０】
本発明の他の好ましい態様に従えば、本発明に従う医薬組成物は、スタチン、特にアトルバスタチン約５mg／日〜約８０mg／日の用量を個体に投与するために適当である。
【００５１】
本発明のなお他の好ましい態様に従えば、本発明に従う医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物、特にＬ−アルギニン約１ｇ／日〜約３０ｇ／日、特に約５ｇ／日〜約３０ｇ／日の用量を個体に投与するために適当である。
【００５２】
有利には、５ｇ／日未満のＬ−アルギニンの用量は、特に子供のために適当である。
【００５３】
特に好ましい態様に従えば、本発明に従う医薬組成物は、少なくとも約１０ｇ／日のＬ−アルギニンの用量を個体に投与するために適当である。
【００５４】
特定の態様では、上記した医薬組成物は、約０．１５ｇ／kg／日のＬ−アルギニンの用量を個体に投与するために適当である。
【００５５】
上記した医薬組成物の他の特定の態様に従えば、医薬組成物は、スタチン約５mg〜約８０mgおよびＬ−アルギニン約５ｇ〜約３０ｇ、特に約１０ｇの単一用量を個体に投与するために適当である。
【００５６】
本発明の他の好ましい態様に従えば、本発明に従う医薬組成物は、経口経路による投与のために適当である。
【００５７】
本発明のなお他の好ましい態様に従えば、本発明に従う医薬組成物は、それが、希釈されるべき散剤、丸剤、薬袋剤（sachets）、錠剤、カプセル剤の形態でまたは任意の他の許容され得るガレヌス剤形（galenic form）において与えられることを特徴とする。
【００５８】
実施例
材料および方法
１．動物および実験プロトコール
遺伝的ＬＤＬ−受容体（ＬＤＬ−Ｒ）欠失により高脂血症であり、ホモ接合体でありそして６週齢の２４匹のWatanabeウサギ（Centre de Production Animale, Olivet, France）を使用する。各動物を個々の檻に入れそして２００ｇ〜２５０ｇ／日の食餌割当量を取らせる。７日間の動物ハウスへの順応の後、６匹のウサギの４つのグループを形成する：
・対照グループは、タンパク質１６％、脂質３．２％および炭水化物４９．３％を含有する通常のウサギ食餌（EXT C15, Dietex, St Gratien, France）を取る。
・第２グループ、いわゆる「アルギニン」グループのウサギは、Ｌ−アルギニンで強化された食餌を取って、このアミノ酸の血漿濃度を倍増する。Ｌ−アルギニン（Sigma, St Quentin Fallavier, France）を１５ｇ／kg食餌の割合で食餌と混合して、アルギニン１ｇ／kg生体重量／日の摂取を生じる。
・第３グループ、いわゆる「スタチン」グループは２．５mg／kg／日の割合で飲料水中にスタチン（Atorvastatin, Tabor（登録商標）１０mg、Godeche-Pfizer, Germany）を有する食餌を取る（Maeso R, Aragoncillo P et al. Effect of Atorvastatin on endothelium-dependant constrictor factors in dyslipidemic rabbits. Gen Pharma. 2000;34:263-272）。
・そして最後に第４グループ、いわゆる「スタチン／アルギニングループ」は、アルギニンで強化された食餌を取りそしてやはり２．５mg／kg／日のアトルバスタチンによる処理を受ける。
【００５９】
強化された食餌中のＬ−アルギニンの摂取は、ヒトにおける約０．１５ｇ／kg／日のＬ−アルギニン摂取に相当するようなものである。
【００６０】
食物摂取を毎日測定しそして動物を１週間に１回体重測定する。血漿サンプルを耳縁静脈から１５日毎に採取する。ヘパリン管に集めた血液を遠心する（４℃、２０００ｇ、１５分）。血漿の一部をスルホサリチル酸の溶液（３０％）により脱タンパクし、次いでアミノ酸のアッセイの目的でアリクォート画分に分ける。血漿の残りを約２００μｌのいくつかの画分にアリクォートとしそして−８０℃で保存する。
【００６１】
８週間の後に、血清のサンプリング（約１ml）を行い、次いで動物をヘパリンを加えたペントバルビタールの注射により麻酔しそして最後に殺す。
【００６２】
全体の研究を動物実験に関する最近の規則に従って行う。
【００６３】
２．生物学的分析
脂質プロフィル、即ち、コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）およびＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステロールを通常の方法によりHitachi 911で決定する。コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを使用し、次いでペルオキシダーゼとの反応による酵素比色試験に従ってコレステロールをアッセイする。ペルオキシダーゼは過酸化水素と反応しそして赤色誘導体を放出し、この染色強度（５５０nMと７００nM間で測定する）はコレステロール濃度に直接比例する。トリグリセリドアッセイも、グリセロールを放出するリパーゼおよび、過酸化水素と反応しそして赤色化合物を形成するペルオキシダーゼを使用するこの原理に基づいている。ＨＤＬコレステロールを２段階の酵素比色試験によりアッセイする。第１段階は硫酸デキストランによって異なる脂質画分を選ぶ。第２段階は、コレステロールアッセイと同様であり、ポリエチレングリコールにより修飾されたコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ、ならびに青紫色誘導体を放出するペルオキシダーゼを使用する。結果をミリモル／ｌで表す。すべてのこれらのアッセイに必要なキットは、ＲＡＮＤＯＸ（Montpellier, France）により供給される。Friedewaldの式を使用して総コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドからＬＤＬｓを計算する（Friedewald et al. (1972) Clin. Chem. 18: 499-502）。
【００６４】
血漿アルギニン、オルニチンおよびシトルリン濃度をＪＥＯＬ（Tokyo, Japan）アミノ酸分析機で決定する。アミノ酸をカチオン交換クロマトグラフィーにより分離する。カラムを去ると、それらはニンヒドリン染色反応により展開される。得られる反応を、５７０および４４０nmでの光度測定法により定量する。結果をμモル／ｌで示す。
【００６５】
３．形態学的研究および組織学的研究
殺した日に、麻酔の後、できるだけ短時間で動物を頚胸領域の全長に沿って切開する。大動脈をできるだけ浅く切開する。曲がった鋏を使用して、大動脈を、大動脈弓から脊柱に続く腸骨分岐（iliac bifurcation）のレベルまで除去する。大動脈を最初に生理学的血清中で清浄しそして脂肪細胞をその外膜から除去する。それを２％パラホルムアルデヒド−２％グルタルアルデヒド混合物中で２０分間固定し、次いでその長さに沿って切開する。次いでそれを再び同じ固定剤中に２４時間浸漬し、その後大動脈を７０％エタノール中ですすぎ、次いでSoudanIVで１５分間染色する。それをもう一度８０％エタノール中で２０分間すすぎ次いで流水下に１時間すすぐ（２２）。次いで大動脈をNikon 995デジタルカメラで平坦写真撮影する。病変の表面を決定することを可能とする面積測定法ソフトウエア（Scion Image）によって像を分析する。最後に、大動脈を微視的研究の目的で同じ固定剤中で固定する。
【００６６】
光学顕微鏡法のために、大動脈を４つのセグメントに切断する：
−大動脈弓の開始部のセグメントおよび大動脈弓の末端部のセグメント、
−大動脈の中間部のセグメントおよび大動脈の末端部のセグメント。
【００６７】
隣接断片を電子顕微鏡法のためにサンプリングする。
【００６８】
サンプルを１００％エタノールまでエタノール中で進行的に脱水し、次いでパラフィンで処理する。このようにしてパラフィンを含浸させた切片は、横断面を有することを可能とする配向した封入（oriented inclusion）に従って封入される（included）。５μm切片を作成し、これをスライド上に張り付け、次いでＨＥＳ（ヘマラム（haemalum）／エリスロシン／サフロン）で染色する。
【００６９】
４．統計的解析
StatViewソフトウエア、バージョン５．０をデータの統計的解析のために使用する。すべての値は、平均±ＳＥＭとして与えられる。グループの比較を、クラスカル−ウオリスの検定により行う。この検定は、順位付け係数（ranking factor）による分散分析のノンパラメトリックバージョンである。２つのグループ間の比較をマン−ホイットニーの検定により行う。この検定は、独立シリーズに関するｔ検定のノンパラメトリックバージョンである。ｐ≦０．０５についての有意な値を考える。量的変数間の相関の有意性をスピアマン検定により評価する。
【００７０】
結果
８週間にわたり処理を行った（処理の開始時のＴ０からＴ８まで）。
【００７１】
１．  動物および一般的パラメータ
１．１動物の監視：体重および食餌摂取
実験期間中、４つのグループの動物が同じ成長曲線を有する（図１）。動物ハウスに到着時には、対照グループおよびアルギニングループの動物はより小さくそしてスタチングループおよびスタチン／アルギニングループからのこの差は、処理の開始時（Ｔ０）とは明瞭性がより少なくなる。
【００７２】
平均食餌摂取（図２）は期間Ｔ０〜Ｔ４間に増加し、次いでＴ８まで一定（regular）である傾向がある。Ｔ５の後のスタチングループの食餌摂取の減少は、２匹の病気の動物の存在に関連している。さらに、アルギニングループの２匹の動物は、プロトコールが終わる前に死亡しそして研究には含ませなかった。
【００７３】
体重および毎日の食餌摂取の測定は、グループがなんであれ、これらのパラメータに関して動物の均等性を反映する。１０週齢（Ｔ４）で、それらの体重は１．９〜２．１kg間に含まれ、これは文献に見られるデータに相当する（Murakami S, Kondo Y, Sakurai T, Kitajima H, Nagate T. Taurine suppresses development of atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbits. Atherosclerosis. 2002; 163: 79-87）。食餌摂取は年齢の関数として増加し（例えば対照グループでは９７．６ｇ／日から１３９．５ｇ／日）そしてＴ３の後相対的に一定のままである。
【００７４】
１．２．脂質プロフィル
アトルバスタチンおよびアトルバスタチン＋アルギニンによる処理は、血漿コレステロールに対する有利な効果を有する（図３）。血漿コレステロールは処理期間中減少する。この減少は、時間Ｔ８で対照に対して２つのループについて有意である。アルギニン食餌はコレステロールに対する効果を持たない。
【００７５】
血漿トリグリセリド濃度（図４）は、対照グループおよびアルギニングループにおいて年齢と共に増加する。有意なポジティブな効果は、Ｔ８で（対照に対して）アトルバスタチンのみで処理した動物に見られ：トリグリセリド濃度は増加しない。この効果はスタチン／アルギニングループでも観察される（有意ではない）。
【００７６】
異なるグループにおけるＨＤＬ濃度（図５）は、プロトコール期間中トリグリセリドと同様に進展する。
【００７７】
同様に、ＬＤＬ濃度（図６）は、コレステロールのラインと同じラインに従う。アトルバスタチンによる処理は、アトルバスタチン＋アルギニン処理の場合と同様に、この濃度の減少を誘導する。
【００７８】
他方、脂質プロフィルは、文献と合致しており：研究の開始時における我々の動物（６週齢）は、２０．４ミリモル／ｌ（対照グループ）と２５．４ミリモル／ｌ（スタチン／アルギニングループ）の間の高コレステロール血症を有し、２１．９±１．５ミリモル／ｌの平均値を報告しているＣｌｕｂｂ等の研究と合致している（Clubb FJ, Cerny JL, Deferrari DA, Butler-Aucoin MM, Willerson JT, Buja LM. Development of atherosclerotic plaque with endothelial disruption in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit aortas. Cardiovasc Pathol 2001; 10: 1-11）。他方、Dowell等（Dowell FJ, Hamilton CA, Lindop GB, Reid JL. Development and progression of atherosclerosis in aorta from heterozygous and homozygous WHHL rabbits. Effects of simvastatin treatment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995; 15: 1152-60）は、ヘテロ接合性Watanabeウサギとホモ接合性Watanabeウサギとの比較研究を行い、そしてホモ接合性ウサギを１０ミリモル／ｌより高いレベルのコレステロールを有するものとして定義した。これは実際我々の動物で当てはまる。
【００７９】
Ｔ０とＴ８との間で、対照グループおよびアルギニングループにおいて、それぞれ２０％および３０％の血漿コレステロール濃度の増加が年齢と共に観察されるが（図３）、これに対してスタチンおよびスタチン／アルギニン処理では、この濃度は２つのグループで２７％減少する。かくして我々の結果に従えば、アトルバスタチンは、ホモ接合性動物におけるコレステロール低下効果を有する：それはコレステロールの肝臓での合成のレベルでコレステロールを減少させることにより作用することができる。同様な結果が文献でしかし異なるモデルで見出される：ニュージーランド白色ウサギを含む１６週間におよぶロバスタチンによる研究（Boeger RH, Bode-Boeger SM, Brandes RP, Phivthong-ngam L, Boehme M, Nafe R, et al. Dietary L-Arginine reduces the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. Circulation 1997; 96: 1282-1290）は、コレステロールの３２％減少を示す。さらに、１６週にわたりWatanabeウサギを使用しそしてピタバスタチンを使用する最近の研究（Suzuki H, Kobayashi H, Sato F, Yonemitsu Y, Nakashima Y, Sueishi K. Plaque-Stabilizing Effect of Pitavastatin in Watanabe Heritable Hyperlipidemic(WHHL) Rabbits. J Atheroscler Thromb. 2003; 10: 109-16）は、血漿コレステロールの２８．６％減少を示す。コレステロール血症の減少は、与えられた結果（スタチングループで２７．１％減少およびスタチン／アルギニングループで２４．５％）により示されるとおりＬＤＬ画分に主として関係しており、データはSuzuki et alによる研究でも見出される。
【００８０】
トリグリセリドに関して、対照グループおよびアルギニングループで同じプロフィルが観察される：トリグリセリドはプロトコール期間中（Ｔ０とＴ８の間）半分より多く増加する。対照的に、スタチンで処理された動物（スタチングループおよびスタチン／アルギニングループ）は、Ｔ０とＴ８間で実質的に一定の濃度を有し、これは高トリグリセリド血症に対するアトルバスタチンのポジティブな効果を示唆する。
【００８１】
アルギニン単独は、この脂質プロフィルに対して認めることができる効果を有しないようであり、これは多数の研究と合致している（Boeger RH, Bode-Boeger SM, Brandes RP, Phivthong-ngam L, Boehme M, Nafe R, et al. Dietary L-Arginine reduces the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. Circulation 1997; 96: 1282-1290; Brandes RP, Brandes S, Boeger RH, Bode-Boeger SM, Mugge A. L-Arginine supplementation in hypercholesterolemic rabbits normalizes meukocyte adhesion to non-endothelial matrix. Life Sci 2000; 66: 1519-1524; Singer AH, Tsao PS, Wang BY, Bloch DA, Cooke JP. Discordant effects of dietary L-arginine on vascular structure and reactivity in hypercholesterolemic rabbits. J Cardiovasc Pharmacol 1995; 25: 710-716）。
【００８２】
１．３  アルギニン、オルニチンおよびシトルリンの濃度
血漿アルギニン濃度（図７）は、対照グループおよびスタチングループで同じである。該濃度はＴ４でアルギニングループにおいて倍増するが（対照に対して有意）、Ｔ８では低下する。スタチン／アルギニングループにおけるアルギニン濃度の増加は、規則的であるが、アルギニングループで観察される増加よりははるかに低い。
【００８３】
オルニチンプロフィル（図８）は、アルギニンのプロフィルと同様である。
【００８４】
スタチン／アルギニングループでの血漿シトルリン濃度（図９）は多かれ少なかれアルギニン濃度に追従する。
【００８５】
一般に、Ｌ−アルギニン濃度（このパラメータは、時間Ｔ０、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ６およびＴ８でアッセイされたが、データは示されていない）は処理されたグループ、即ち、アルギニングループおよびスタチン／アルギニングループにおいて倍増した。
【００８６】
３．動脈病変の形態学的および組織学的研究
３．１．大動脈の巨視的研究
面積測定法による病変の表面積の評価（図１０）は、該表面積がアルギニン単独ではより小さくそしてアルギニン／スタチンでも（対照に対して）有意により小さいことを示す。他方、対照グループとスタチン単独で処理されたグループとでは差は観察されない。したがって、驚くべきことに、スタチン／アルギニン組合せは病変の表面の減少に対する相乗的効果を示す。
【００８７】
大動脈の遠位半部に関心が限定されるならば、結果は非常に有意であり（図１１）：アトルバスタチン／アルギニン処理では、病変の表面積は有意に減少する。アトルバスタチンおよびアルギニンの投与の組合せは、アテローム性動脈硬化症病変の減少に対する予想外の相乗効果を示す。何故ならば、アトルバスタチン単独およびアルギニン単独による処理は効果を示さないからである。
【００８８】
３．２  動脈壁の微視的研究
スライドの観察は、スタチングループと比較してスタチン／アルギニングループの病変のより少ない厚さを示す。より大きい病変は、２つの最初の切片で（大動脈弓の開始部および末端部で）見いだされ：最後の２つの切片（大動脈の中央部および末端部）で、病変は頻度がより低い。それらの組成（composition）に関しては、病変の大部分は細胞性（cellular）であるよりは繊維性である（泡状のそしていくらかの多核マクロファージを含む）。グループ間で病変の組成に関して特定の傾向はない。
【００８９】
巨視的レベルでは、病変表面は、対照グループに対してスタチングループにおいて変わらないが、これに対して多数の研究、特にKroon 等の研究は反対の意見である（Aliev G, Burnstock G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: a model of atherosclerosis. Histol Histopathol. 1998; 13: 797-817）。９ヶ月間４０mg／kg／日の割合でプラバスタチンの投与の後、それは病変の発生の５３〜８０％の減少を示す。同様に、Maeso等は、アトルバスタチン２．５mg／kg／日で処理されたニュージーランド白色ウサギにおける病変のサイズの減少を示す（Maeso R, Aragoncillo P et al. Effect of Atorvastatin on endothelium-dependant constrictor factors in dyslipidemic rabbits. Gen Pharma. 2000; 34: 263-272）。Boeger(Boeger RH, Bode-Boeger SM, Brandes RP, Phivthong-ngam L, Boehme M, Nafe R, et al. Dietary L-Arginine reduces the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. Circulation 1997; 96: 1282-1290）も、ロバスタチンがニュージーランド白色ウサギにおけるプラーク進行を遅くすることを示した。
【００９０】
さらに、アルギニングループは、１．３の係数だけ対照より小さい病変表面を有し、そしてスタチン／アルギニン処理は、対照グループでの１３．７％と比較して８．８％病変を有する最も小さい病変表面を示す。
【００９１】
さらに、総病変表面とアルギニン濃度との有意な逆相関がプロトコール全体にわたり見出される。この相関はオルニチンでも見出される。
【００９２】
最後に、微視的レベルでは、スタチン／アルギニングループでは、病変は他のグループの場合より厚さが少ないと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、対照グループ（第１ヒストグラム）、アルギニングループ（第２ヒストグラム）、スタチングループ（第３ヒストグラム）およびスタチン＋アルギニングループ（第４ヒストグラム）について、動物の到着から、次いで処置の開始（Ｔ０）から処置の終わりまで（週Ｔ１〜Ｔ８）、時間（ｘ軸）の関数として動物の重量（キログラムで、ｙ軸）の増加を表す。
【図２】図２は、対照グループ（第１ヒストグラム）、アルギニングループ（第２ヒストグラム）、スタチングループ（第３ヒストグラム）およびスタチン＋アルギニングループ（第４ヒストグラム）について、処置の開始（Ｔ０）から処置の終わりまで（週Ｔ１〜Ｔ８）、時間（ｘ軸）の関数として動物の平均食餌摂取（グラム／日、ｙ軸）を表す。
【図３】図３は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、平均コレステロール血症（average cholesterolaemia）（ミリモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図４】図４は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、平均高トリグリセリド血症（triglyceridaemia）（ミリモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図５】図５は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、平均血漿ＨＤＬ濃度（ミリモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図６】図６は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、フリードバルトの式に従って計算された平均血漿ＬＤＬ濃度（ミリモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図７】図７は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、平均血漿アルギニン濃度（μモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図８】図８は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、平均血漿オルニチン濃度（μモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図９】図９は、時間（ｘ軸）Ｔ０（第１ヒストグラム）、Ｔ４（第２ヒストグラム）、Ｔ８（殺す）（第３ヒストグラム）における、対照グループ、アルギニングループ、スタチングループおよびスタチン＋アルギニングループについて、血漿シトルリン濃度（μモル／ｌ、ｙ軸）を表す。
【図１０】図１０は、殺した時点（Ｔ８）で異なるグループ（ｘ軸）における病変の表面積の百分率（ｙ軸）を表す。
【図１１】図１１は、殺した時点（Ｔ８）で異なるグループ（ｘ軸）における大動脈の遠位レベルにおける病変の表面積の百分率（ｙ軸）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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