(57)【要約】新規zacrp11ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに関連する組成物および方法を開示する。zacrp11タンパク質に対する抗体およびその断片もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:2のアミノ酸残基16〜255を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号:2を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号:2である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
アミノ末端またはカルボキシル末端において、親和性タグ、毒素、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）、酵素、およびフルオロフォアからなる群より選択される部分と共有結合している、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
請求項1記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体または抗体断片。
【請求項６】
ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片、中和抗体、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項5記載の抗体。
【請求項７】
F(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位からなる群より選択される、請求項5記載の抗体断片。
【請求項８】
請求項5記載の抗体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を含む、抗イディオタイプ抗体。
【請求項９】
以下を含む組成物：
配列番号:2のアミノ酸残基16〜255を含む単離されたポリペプチド；および
薬学的に許容される担体。
【請求項１０】
ポリペプチドのオリゴマー化複合体を含む、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
オリゴマー化複合体がポリペプチドの三量体を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
オリゴマー化複合体がポリペプチドの六量体を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１３】
オリゴマー化複合体がポリペプチドの18量体を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１４】
ポリペプチド三量体とポリペプチド六量体の混合物を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１５】
混合物が約90%の六量体および約10%の三量体を含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
第1部分が配列番号:2のアミノ酸残基16〜255を含むポリペプチドを含み、かつ第2部分が別のポリペプチドを含む、ペプチド結合によって結合された第1部分および第2部分を含む、融合タンパク質。
【請求項１７】
第2部分が、少なくとも1つの定常領域を含む免疫グロブリン部分である、請求項16記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
第2部分が別の脂肪細胞補体関連タンパク質である、請求項16記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
50%ホルムアミド、5×SSC（1×SSC：0.15 M塩化ナトリウムおよび15 mMクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、および2% (w/v)ウシ血清アルブミン、10%硫酸デキストラン、ならびに20μg/ml変性剪断サケ精子DNAによる約42℃〜約70℃でのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:1またはその相補物とハイブリダイズし得る単離された核酸分子。
【請求項２０】
配列番号:2のアミノ酸残基16〜255を含む単離されたポリペプチドをコードする、請求項19記載の核酸分子。
【請求項２１】
コードされるポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸残基16〜255からなる、請求項20記載の核酸分子。
【請求項２２】
配列番号:2を含む単離されたポリペプチドをコードする、請求項19記載の核酸分子。
【請求項２３】
コードされるポリペプチドが配列番号:2からなる、請求項22記載の核酸分子。
【請求項２４】
配列番号:1のヌクレオチド59〜778のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２５】
ヌクレオチド配列が配列番号:1のヌクレオチド14〜778を含む、請求項24記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
第1部分が配列番号:2のアミノ酸残基16〜255を含むポリペプチドを含み、かつ第2部分が別のポリペプチドを含む、ペプチド結合によって結合された第1部分および第2部分を含む融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２７】
以下の機能的に連結されたエレメントを含む、発現ベクター：
転写プロモーター；
請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および
転写ターミネーター。
【請求項２８】
請求項27記載の発現ベクターが導入された培養細胞であって、DNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する培養細胞。
【請求項２９】
以下の段階を含む、ポリペプチドを作製する方法：
請求項27記載の発現ベクターが導入された細胞を培養する段階であって、細胞が、DNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、段階；および
発現されたポリペプチドを回収する段階。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
細胞-細胞および細胞-細胞外基質相互作用は、多細胞生物の種々の細胞間での情報交換およびそれらの細胞間での協調を可能にし、ほとんどの生物学的過程の基礎である。これらの相互作用は、受精から死に至るあらゆることにおいて役割を果たす。そのような相互作用は発達および分化の過程において必須であり、生物の機能および防御にとって重要である。例えば、細胞とその環境との間の相互作用は、組織再構築を開始および媒介するために必要である。組織再構築は、物理的損傷、細胞毒性損傷、代謝ストレス、または発達上の刺激を含む多くの因子に応答して開始され得る。病態と治癒（または代謝の最適化）との間の調節は、一つには、刺激を受けた細胞と細胞外基質および局所的溶媒との相互作用により、行われ得る。
【０００２】
脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーは、細胞とそれらの環境との相互作用において役割を果たし、細胞外基質と細胞との界面で作用すると考えられる。これらのタンパク質には、例えば、
2007532092.tif 000002
が含まれる。
【０００３】
これらのタンパク質はすべて、完全なGly-Xaa-Proおよび不完全なGly-Xaa-Xaaコラーゲン反復を含むコラーゲン様ドメイン、およびC1qドメインを共有する。補体因子C1qは3種の関連ポリペプチド（A鎖、B鎖、およびC鎖）の6コピーからなり、各ポリペプチドは、アミノ末端近傍のコラーゲンドメインおよびカルボキシ末端球状領域を有する、約225個アミノ酸長である。6つの三重らせん領域が、6本のA鎖、6本のB鎖、および6本のC鎖のコラーゲンドメインによって形成され、中央領域および6本の軸を形成する。A鎖、B鎖、およびC鎖の球状カルボキシ末端の会合によって、球状頭部部分が形成される。C1qは、6本のコラーゲン様軸を介して中央繊維領域に連結された6個の球状頭部から構成される。Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991。この構造は多くの場合、「花束」と称される。Acrp30は、単一の種類のポリペプチド鎖から形成される類似の花束構造を有する。ACRP30のC1q球状ドメインは、10本のβ鎖「ジェリーロール」形態を有すると決定された（Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8: 335-8, 1998）。折りたたみ構造、保存残基、および類似の三量体界面などの構造要素、ならびにイントロンの位置は腫瘍壊死因子ファミリーと類似しており、これによってTNFファミリーとC1qファミリーとの関連が示唆される。
【０００４】
C1qは、防御機構を促進すること、および組織損傷を引き起こし得る毒性酵素種の生成を誘発することが見い出されている（Tenner, Behring Inst. Mitt. 93:241-53, 1993）。C1q結合部位は血小板上に認められる。さらに、補体およびC1qは炎症において役割を果たす。補体活性化は、C1qの免疫グロブリンへの結合により開始される。
【０００５】
血管への損傷は、損傷を修復し、血管からの血液の放出を制御する一連の事象を推進する。この過程は止血として知られている。血小板は、血管損傷を一時的に修復するために血栓または栓を形成することで、止血において初期の役割を果たす。血小板は通常、血管壁を裏打ちする内皮とは相互作用しないが、偶然によるまたは外科手術の過程での血管への損傷が、内皮細胞を破壊する場合がある。損傷の程度に応じて、コラーゲン、弾性板、または繊維状コラーゲンと結合した平滑筋細胞などの種々の内皮下要素が、血流に曝露されることになる。
【０００６】
血管損傷後に内皮下層が曝露されると、局所血流中で移動している血小板は、コラーゲンを含む曝露された内皮下層基質と相互作用し、速度を落とす。血小板表面上の受容体と曝露されたコラーゲン層とのさらなる相互作用が、血小板の結合および活性化を引き起こし、結果として局部血流が停止する。結合した血小板は活性化され、フィブリノーゲン-血小板間架橋の形成を介して、通過する血流中の血小板と凝集塊を形成する（Moroi and Jung, Frontiers in Bioscience 3:719-28, 1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., eds., Elsevier Science, pp.299-306, 1998、およびBarnes et al., Curr. Opin. Hematol. 5:314-20, 1998）。
【０００７】
止血応答は段階的であり、血管への損傷の程度、曝露される特定の血管構成成分、および損傷領域における血流状態に依存する（Rand et al., Thrombosis and Haemostasis 78:445-50, 1997）。例えば、軽度の血管損傷における内皮下層基質（VI型コラーゲンおよびフォンウィルブランド因子）の曝露は、低血流状態を有する領域において低度の粘着および凝集を促進する。高度の血管外傷をもたらす損傷、ならびに内部弾性板およびエラスチンが結合した微小繊維などのさらなる血管構成成分の曝露は、より強い血小板凝集塊の形成を促進することになる。繊維状コラーゲンを曝露する重度の血管外傷は、血栓性血小板応答を誘発し、これによって犠牲者を血液の過度の喪失から防御する（Rand et al、前記）。
【０００８】
細胞相互作用において役割を担う、転写因子およびホルモンなどのタンパク質は、有用な診断薬および治療薬である。再構築などの特定の相互作用を媒介するタンパク質は、特に有用であると考えられる。さらに、止血の阻害剤は、血管損傷後の血流を早めるのに、およびコラーゲン表面を元の状態に戻すのに有用である。C1qおよび補体経路の阻害剤は、抗炎症用途、補体活性化および血栓活性の阻害にとって有用であると考えられる。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、これらの、および本明細書の教示から当業者に明らかとなるはずの他の用途のための、そのようなポリペプチドを提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
定義
以下の記載においては、多くの用語が頻繁に用いられる。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００１１】
特記しない限り、「1つの」、「その」、および「少なくとも1つの」は互換的に用いられ、1つまたは複数を意味する。
【００１２】
本明細書において用いる「核酸」またはは「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により生成された断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド（例えば、DNAおよびRNA）の単量体、もしくは天然ヌクレオチドの類似体（例えば、天然ヌクレオチドのα-鏡像異性体）、または両者の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分に、および/またはピリミジン塩基もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による1つまたは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、または糖はエーテルまたはエステルとして官能基が付加され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造体と置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはこのような結合の類似結合によって結合され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）、ホスホラミデートなどが含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に結合した天然または修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」もまた含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００１３】
「核酸分子の相補物」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して逆方向である相補的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。例えば、
2007532092.tif 000003
は
2007532092.tif 000004
と相補的である。
【００１４】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
【００１５】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写され、その後そのmRNAが特定のポリペプチドに特有であるアミノ酸配列に翻訳される核酸分子を指す。
【００１６】
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNAに組み込まれていない状態の核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００１７】
「核酸分子構築物」とは、天然には存在しない配置で組み合わせかつ並置された核酸の部分を含むように人間の介入により修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００１８】
「相補的DNA（cDNA）」とは、逆転写酵素によってmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部と相補的なプライマーが、逆転写の開始に用いられる。当業者はまた、このような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指して、「cDNA」という用語を使用する。「cDNA」という用語はまた、RNA鋳型から合成されるcDNA分子のクローンも意味する。
【００１９】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、共通ヌクレオチド配列によって特徴づけられる場合が多い。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7: 511 (1993)）、サイクリックAMP応答エレメント（CRE）、血清応答エレメント（SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、ならびにCRE/ATF（O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)）、AP2（Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994))、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)）、およびオクタマー因子などの他の転写因子の結合部位が含まれる（一般的には、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照のこと）。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質に応じて増大する。これとは対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質による調節を受けない。抑制性プロモーターもまた周知である。
【００２０】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写開始点を含む、プロモーターの機能に不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し得るかまたは組織特異的活性を付与し得る特定の配列の非存在下で、検出可能な活性を有する場合もあれば有さない場合もある。
【００２１】
「エンハンサー」とは、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写効率を増大し得る調節エレメントの一種である。
【００２２】
「異種DNA」とは、所与の宿主細胞内に天然では存在しないDNA分子またはDNA分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外因性DNA）と結合している限りにおいて、宿主細胞種に由来するDNA（すなわち、内因性DNA）を含む場合がある。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNAセグメントに機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であるとみなされる。逆に、異種DNA分子は、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性遺伝子を含み得る。別の説明として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入される場合、異種DNAとみなされる。
【００２３】
「ポリペプチド」とは、天然で産生されようと合成で産生されようと、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは一般に、「ペプチド」と称される。
【００２４】
「タンパク質」とは、1本または複数本のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、糖質基などの非ペプチド成分を含み得る。糖質および他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加され得り、細胞の種類によって変化することになる。タンパク質は、本明細書ではそのアミノ酸骨格構造の観点から定義され；糖質基などの置換基は一般に規定しないが、それにもかかわらず存在する場合がある。
【００２５】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００２６】
「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失うことのない確定した様式で核酸分子の挿入を可能とする、1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択での使用に適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００２７】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子はプロモーターに「機能的に連結された」と言われる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、機能的に連結される。
【００２８】
「組換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本明細書組換え宿主の例は、発現ベクターからzacrp11を産生する細胞である。対照的に、zacrp11は、zacrp11の「天然供給源」であり、発現ベクターを欠く細胞によって産生され得る。
【００２９】
「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば融合タンパク質は、親和性基質と結合するポリペプチドと融合したzacrp11ポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより大量のzacrp11を単離するための手段を提供する。
【００３０】
「受容体」という用語は、「リガンド」と称する生物活性分子と結合する、細胞結合型のタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。受容体は、膜結合型受容体、細胞質受容体、または核内受容体であってよく；単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、βアドレナリン受容体）または多量体（例え、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体、およびIL-6受容体）であってよい。膜結合型受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、および典型的にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造によって特徴づけられる。特定の膜結合型受容体では、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別個のポリペプチド内に位置する。
【００３１】
一般に、リガンドが受容体に結合することで受容体の高次構造が変化し、これによって細胞内でエフェクタードメインと他の分子の相互作用が起こり、次いで
細胞の代謝変化が生じる。受容体-リガンド相互作用と結びつけられることの多い代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP生成の上昇、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【００３２】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介してより大きなポリペプチドを方向づけるペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするヌクレオチド配列を示す。より大きなポリペプチドは通常、分泌経路を介した移行過程において、切断されて分泌ペプチドが除去される。
【００３３】
「単離されたポリペプチド」とは、天然状態でポリペプチドと結合している炭水化物、脂質、または他のタンパク質性不純物などの混入細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に純粋な形態の、すなわち少なくとも約80%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約95%純粋、95%を超えて純粋、または99%を超えて純粋なポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色後の、単一バンドの出現によるものである。しかし「単離された」という用語は、二量体などの別の物理的形態、またはグリコシル化もしくは誘導体化形態での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００３４】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その状況が可能である場合、これらの用語は、近接性または相対位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するとは限らない。
【００３５】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現には、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAから1つまたは複数のポリペプチドへの翻訳が関与する。
【００３６】
「スプライス変種」という用語は、遺伝子から転写される別の形態のRNAを示すために、本明細書において用いられる。スプライス変種は、転写後のRNA分子内の、またはあまり一般的ではないが転写後の別個のRNA分子間の、選択的スプライス部位の使用によって自然に起こり、同じ遺伝子から転写されたいくつかのmRNAを生じ得る。スプライス変種は、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。スプライス変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変種によってコードされるポリペプチドを示すために用いられる。
【００３７】
本明細書で用いる「免疫調節物質」という用語は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、共刺激分子、造血因子、およびこれらの分子の合成類似体を含む。
【００３８】
「相補物/抗相補物対」という用語は、適切な条件下で非共有結合された安定な対を形成する非同一な成分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補物/抗相補物対の典型的なメンバーである。他の例示的な相補物/抗相補物対には、受容体/リガンド対、抗体/抗原（またはハプテンもしくはエピトープ）対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対などが含まれる。相補物/抗相補物対が後に解離されることを所望する場合には、相補物/抗相補物対は109 M-1未満の結合親和性を有することが好ましい。
【００３９】
「抗イディオタイプ抗体」とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書においては、抗イディオタイプ抗体は抗zacrp11抗体の可変領域と結合し、したがって抗イディオタイプ抗体はzacrp11のエピトープを模倣する。
【００４０】
「抗体断片」とは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabなどの抗体の一部である。構造とは無関係に、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば抗zacrp11モノクローナル抗体断片は、zacrp11のエピトープと結合する。
【００４１】
「抗体断片」という用語は、軽鎖の可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「scFvタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位などの、特定の抗原と結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子改変ポリペプチドもまた含む。
【００４２】
「キメラ抗体」とは、げっ歯類抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、抗体分子の残りの部分はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。
【００４３】
「ヒト化抗体」とは、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域から、ヒトの可変ドメインに移行された組換えタンパク質である。
【００４４】
本明細書において用いる「治療薬」とは、抗体部分と結合して治療に有用な複合体を生じる分子または原子である。治療薬の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体などが含まれる
【００４５】
「検出可能な標識」とは、抗体部分と結合して診断に有用な分子を生じ得る分子または原子である。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、または他のマーカー部分が含まれる。
【００４６】
「親和性タグ」という用語は、第2ポリペプチドの精製もしくは検出を提供する、または基質に対する第2のポリペプチドの結合部位を提供するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチド部分を示すために本明細書において使用される。原理的には、抗体または他の特異的な結合剤が利用できる任意のペプチドまたはタンパク質を、親和性タグとして使用することができる。親和性タグには、ポリヒスチジン区域、プロテインA（Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985)；Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)）、Glu-Glu親和性タグ（Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)）、サブスタンスP、FLAGペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)）、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。一般的には、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)を参照されたい。親和性タグをコードする核酸分子は、業者（例えば、Pharmacia Biotech、ジュージャージー州、ピスカタウェイ）から入手することができる。
【００４７】
「裸の抗体」とは、抗体断片とは対照的に、治療薬と結合していない完全な抗体である。裸の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体などの特定の組換え抗体が含まれる。
【００４８】
本明細書で用いる「抗体成分」という用語は、完全な抗体および抗体断片の両方を含む。
【００４９】
「免疫複合体」とは、抗体成分と治療薬または検出可能な標識との複合体である。
【００５０】
本明細書で用いる「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体成分および治療薬を含む組換え分子を指す。そのような融合タンパク質に適した治療薬の例には、免疫調節物質（「抗体-免疫調節物質融合タンパク質」）および毒素（「抗体-毒素融合タンパク質」）が含まれる。
【００５１】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」とは、少なくとも1つのエピトープを含み、腫瘍細胞または感染性病原体抗原を含む細胞などの標的細胞上で発現されるアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対する主要組織適合遺伝子複合体分子により提示されるペプチドエピトープを認識し、典型的には標的細胞を溶解するか、または標的細胞の部位に他の免疫細胞を動員し、それにより標的細胞を死滅させる。
【００５２】
「抗原ペプチド」とは、主要組織適合遺伝子複合体分子と結合して、T細胞によって認識されるMHC-ペプチド複合体を形成し、それによってT細胞への提示に基づいて細胞障害性リンパ球応答を誘導するペプチドである。したがって抗原ペプチドは、適切な主要組織適合遺伝子複合体分子と結合し、細胞溶解、または抗原と結合するかもしくは抗原を発現する標的細胞に対する特定のサイトカインの放出などの細胞障害性T細胞応答を誘導し得る。抗原ペプチドは、抗原提示細胞上でまたは標的細胞上で、クラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体分子に関して結合され得る。
【００５３】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生する。RNA転写産物が特定のmRNAの配列と相補的な配列を有するRNAポリメラーゼII鋳型を含むように、核酸分子を設計することができる。このようなRNA転写産物は「アンチセンスRNA」と称され、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子と結合し、その結果mRNAの翻訳を抑制することができる。
【００５４】
「zacrp11に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」、または「zacrp11アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、(a) zacrp11遺伝子の一部と安定な三本鎖を形成し得る、または(b) zacrp11遺伝子のmRNA転写産物の一部と安定な二本鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００５５】
「リボザイム」とは、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己切断RNA、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と称される。
【００５６】
「外部ガイド配列」とは、内因性リボザイムであるRNase Pを特定の種の細胞内mRNAに導くことで、RNase PによるmRNAの切断を導く核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と称される。
【００５７】
「変種zacrp11遺伝子」という用語は、配列番号:2の修飾物であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を指す。このような変種には、zacrp11遺伝子の天然の多型、ならびに配列番号:2のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子が含まれる。zacrp11遺伝子のさらなる変種形態は、本明細書に記載するヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変種zacrp11遺伝子は、その遺伝子が、配列番号:1のヌクレオチド配列またはその相補物を有する核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかどうかを判定することによって同定することができる。
【００５８】
または、変種zacrp11遺伝子は配列比較によって同定することができる。2つのアミノ酸配列は、2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の一致を求めてアライメントした際に同一である場合、「100%アミノ酸配列同一性」を有する。同様に、2つのヌクレオチド配列は、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大の一致をもとめてアライメントした際に同一である場合、「100%ヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR （ウィスコンシン州、マディソン）製のLASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートに含まれるプログラムのような、標準的なソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。最適なアライメントを決定することによる、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較する他の方法は、当業者には周知である（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)、Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)、およびBishop (ed.) Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法については後述する。
【００５９】
「対立遺伝子変種」という用語は、本明細書において、同じ染色体座を占める遺伝子の2つまたはそれ以上の別の形態のいずれかを示すために用いられる。対立遺伝子の変化は変異によって自然に生じ、集団内で表現型多型を生じ得る。遺伝子変異はサイレントである（コードされたポリペプチドに変化がない）場合もあれば、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。対立遺伝子変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされるタンパク質を示すためにも用いられる。
【００６０】
「オルソログ」という用語は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示す。オルソログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【００６１】
「パラログ」とは、生物によって作製される、異なるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは相互にパラログである。
【００６２】
本発明は、zacrp11遺伝子の機能断片を含む。本明細書では、zacrp11遺伝子の「機能断片」とは、抗zacrp11抗体と特異的に結合するzacrp11ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を指す。例えば、本明細書に記載するzacrp11遺伝子の機能断片は、配列番号:1のヌクレオチド配列の一部を含み、抗zacrp11抗体と特異的に結合するポリペプチドをコードする。
【００６３】
標準的な解析法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは概数値であると理解される。このような値が「約」Xまたは「およそ」Xと表記される場合、Xの記載値は±10%で正確であると理解される。
【００６４】
本発明は、「zacrp11」と称する新規の脂肪細胞補体関連タンパク質を提供する。本発明はまた、「zacrp11」変種ポリペプチドおよび「zacrp11」融合タンパク質、ならびにそのようなポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸分子、さらにこれらの核酸分子およびアミノ酸配列の使用方法を提供する。
【００６５】
1つの局面において、本発明は、配列番号:2の少なくとも一部を含む単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、配列番号:2の少なくとも一部は、1〜15、1〜60、1〜111、1〜255、16〜60、16〜111、16〜255、1〜20、21〜60、21〜111、21〜255、124〜255、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列番号:2のアミノ酸残基を含む。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255および/または21〜255を含み得るか、またはそれらからなり得る。任意には、ポリペプチドは配列番号:2を含み得るか、または配列番号:2からなり得る。別の態様では、本明細書に開示する単離されたポリペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端において、親和性タグ、毒素、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）、酵素、およびフルオロフォアからなる群より選択される部分と共有結合している。別の態様において、本発明の単離されたポリペプチドは、薬学的に許容される賦形剤と併用される。1つの局面において、ポリペプチドは、本発明の少なくとも2つのポリペプチドを含むポリペプチドオリゴマーを形成し得る。ポリペプチドオリゴマーは、1つまたは複数の分子間ジスルフィド結合により結合され得る。オリゴマーは例えば、三量体、六量体、九量体、または18量体であってよい。
【００６６】
別の局面において、本発明は、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255または21〜255と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する単離されたポリペプチドであって、例えば創傷治癒を促進する、腫瘍細胞転移を抑制する、および抗菌活性を有するなどの、本明細書に記載の機能を実行するポリペプチドを提供する。
【００６７】
別の局面において、本発明は、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255または21〜255を含む単離されたポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。組成物は、ポリペプチドのオリゴマー化複合体を含み得る。任意には、オリゴマー化ポリペプチドは三量体、六量体、九量体、または18量体であってよい。組成物は、例えば約90パーセントの六量体および約10パーセントの三量体から構成され得る六量体と三量体の混合物などの、オリゴマー化ポリペプチドの混合物であってもよい。
【００６８】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。1つの態様において、抗体は、ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される。1つの態様において、抗体断片は本明細書に記載する通りであり、F(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位からなる群より選択される。
【００６９】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００７０】
第2の局面において、本発明は、第1部分が、a) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜255；b) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜255；c) 配列番号:2のアミノ酸残基61〜255；d) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜111；e) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜111；f) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜15；およびg) これらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含み；第2部分が別のポリペプチドを含む、ペプチド結合によって結合された第1部分および第2部分を含む融合タンパク質を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリン断片および本明細書に記載のzacrp11ペプチドまたはポリペプチドを含む。そのような融合タンパク質の免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンの少なくとも1つの定常領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリンの一部を示す。融合タンパク質の第2部分は任意には、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの別のメンバーまたは断片を含み得る。
【００７１】
別の局面において、本発明は、a) 配列番号:1の核酸分子；およびb) 配列番号:3の核酸分子からなる群より選択される、単離された核酸分子を提供する。
【００７２】
別の局面において、本発明は、約42℃〜約70℃における50%ホルムアミド、5×SSC（1×SSC：0.15 M塩化ナトリウムおよび15 mMクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液（100×デンハルト溶液：2% (w/v) Ficoll 400、2% (w/v)ポリビニルピロリドン、および2% (w/v)ウシ血清アルブミン）、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAというハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:1またはその相補物とハイブリダイズし得る単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ポリペプチドの少なくとも一部をコードし得る。任意には、核酸分子は、配列番号:2の少なくとも一部をコードし得る。核酸分子はまた、1〜255、16〜255、21〜255、61〜255、1〜111、16〜111、21〜111、1〜15、1〜20、124〜255、およびこれらの組み合わせからなるアミノ酸残基の群より選択される、配列番号:2の少なくとも一部をコードし得る。核酸分子は、配列番号:2によって示されるポリペプチドをコードし得る。
【００７３】
別の局面において、本発明はまた、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255または21〜255と95パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば創傷治癒を促進するなどの、本明細書に記載の機能を実行するポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００７４】
別の局面において、本発明は、a) 配列番号:1の核酸分子；およびb) 配列番号:3の核酸分子からなる群より選択される、単離された核酸分子を提供する。単離された核酸分子は、例えば、14〜778、59〜193、59〜346、59〜778、194〜346、194〜778、383〜778、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、配列番号:1または配列番号:3の連続したヌクレオチドを含み得る。
【００７５】
別の局面において、本発明は、第1部分が、a) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜255；b) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜255；c) 配列番号:2のアミノ酸残基61〜255；d) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜111；e) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜111；f) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜15；およびg) 配列番号:2のアミノ酸残基21〜255からなる群より選択されるポリペプチドを含み；第2部分が別のポリペプチドを含む、ペプチド結合によって結合された第1部分および第2部分を含む融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００７６】
別の局面において、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明の特定の態様において、ポリペプチドは、配列番号:2の20個、30個、40個、50個、100個、またはそれ以上の連続した残基を含む。さらなるポリペプチドは、配列番号:2のそのような領域の少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも70個の連続したアミノ酸を含み得る。このようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブとして使用し得る。
【００７７】
別の局面において、本発明は、以下の機能的に連結されたエレメント：転写プロモーター；本明細書に記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および転写ターミネーターを含む発現ベクターを提供する。
【００７８】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の発現ベクターが導入され、そのようなDNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する培養細胞を提供する。例示的な宿主細胞には、細菌、酵母、菌類、昆虫、哺乳類、および植物細胞が含まれる。発現ベクターを含み、zacrp11タンパク質を産生するそのような組換え宿主細胞を培養し、任意に培養組換え宿主細胞からzacrp11タンパク質を単離することにより、そのような発現ベクターを含む組換え宿主細胞を用いてzacrp11ポリペプチドを産生させることができる。
【００７９】
別の局面において、本発明は、上記に開示する発現ベクターが導入され、そのようなDNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養する段階；および発現されたポリペプチドを回収する段階を含む、ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００８０】
本発明はまた、これらの検出方法を行うためのキットを提供する。例えば、zacrp11遺伝子発現を検出するためのキットは、(a) 配列番号:1のヌクレオチド配列を含む核酸分子、(b) 配列番号:1のヌクレオチド配列の相補物を含む核酸分子、および(c) 配列番号:1またはその相補物の少なくとも15個、30個、45個、または60個の連続したヌクレオチドからなる核酸分子からなる群より選択される核酸分子を含む容器を含み得る。例示的な核酸分子は、配列番号:1のヌクレオチド14〜778、14〜346、59〜778、74〜778、194〜346、194〜778、59〜346、および383〜778、またはその相補物を含む核酸分子を含む。そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第2容器も含み得る。一方、zacrp11タンパク質を検出するためのキットは、配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片を含む容器を含み得る。
【００８１】
本発明は、一部、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーと相同性を有するポリペプチドをコードする新規DNA配列の発見に基づく。zacrp11のヌクレオチド配列を配列番号:1に記載し、その推定アミノ酸配列を配列番号:2に示す。zacrp11ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸残基1（Met）〜アミノ酸残基15（Ser）、配列番号:1のヌクレオチド14〜58を含むシグナル配列を包む。または、シグナル配列は、配列番号:2のアミノ酸残基1（Met）〜アミノ酸残基20（Ala）、配列番号:1のヌクレオチド14〜73を含み得る。成熟ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸16（Ala）〜アミノ酸255（Asp）、配列番号:1のヌクレオチド59〜778にわたる。成熟ポリペプチド内には、配列番号:2のアミノ酸61（Ala）〜111（Asn）、配列番号:1のヌクレオチド194〜346のコラーゲン様ドメインが存在する。コラーゲン様ドメイン内には、17個のコラーゲン反復、すなわち9個の完全Gly-Xaa-Pro反復および8個の不完全Gly-Xaa-Xaa反復が存在する。このドメイン内に見出される、配列番号:2のアミノ酸残基62、69、74、77、78、81、83、84、86、89、96、102、104、105、および108におけるプロリン残基は、ヒドロキシル化され得る。zacrp11ポリペプチドはまた、配列番号:2のアミノ酸124（Val）〜255（Asp）、配列番号:1のヌクレオチド383〜778のカルボキシ末端C1q/TNFドメインを含む。芳香族モチーフF-X(5)-[ND]-X(4)[FYWL]-X(6)-F-X(5)-G-X-Y-X(4)（配列番号：17）もまた、配列番号:2の残基145（Phe）〜175（Tyr）、配列番号:1のヌクレオチド446〜538においてこのドメイン内に見出される。Xは任意のアミノ酸残基を表し、括弧（）内の数字はアミノ酸残基数を示す。括弧［］内に含まれるアミノ酸残基は、特定の位置におけるアミノ酸残基の選択を制限する。適切な折りたたみを可能にするため、C1qドメイン内には相当量の保存構造が存在する。当業者は、これらのドメインの境界がおおよそのものであり、既知タンパク質とのアラインメントおよびタンパク質折りたたみの予測に基づくことを理解すると考えられる。
【００８２】
本発明の別の局面は、zacrp11ポリペプチド断片およびその組み合わせを含む。好ましい断片は、配列番号:2のアミノ酸残基1（Met）、16（Ala）、または21（His）〜アミノ酸残基111（Asn）のzacrp11ポリペプチドのコラーゲン様ドメイン、コラーゲン様ドメインを含むzacrp11ポリペプチドの一部、または二量体化もしくはオリゴマー化し得るコラーゲン様ドメインの一部を含む断片を含む。本明細書において用いる「コラーゲン」または「コラーゲン様ドメイン」という用語は、モチーフGly-Xaa-ProまたはGly-Xaa-Xaa（Xaaは任意のアミノ酸残基である）によって示される「反復」または「コラーゲン反復」を指す。コラーゲン様ドメイン内のコラーゲン反復の数は、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリー内で異なる。そのようなコラーゲン様ドメインを含む断片またはタンパク質は、ホモマー構造体（同じ断片またはタンパク質の二量体、三量体、六量体、またはオリゴマー）を形成し得る。さらに、そのようなコラーゲン様ドメインを含むそのような断片またはタンパク質は、ヘテロマー構造体（異なる断片またはタンパク質の二量体、三量体、六量体、またはオリゴマー）を形成し得る。
【００８３】
これらの断片は、コラーゲンの二量体化もしくはオリゴマー化の研究、または以下でさらに十分に説明する融合タンパク質の形成において特に有用である。(a) ヌクレオチド14、59、194、383〜ヌクレオチド778の配列番号:1に示されるヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド分子；(b) アミノ酸残基16（Ala）〜アミノ酸残基111（Asn）の配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%を超えて同一であるzacrp11ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド分子；(c) (a)または(b)と相補的な分子；および(d) zacrp11ポリペプチドコラーゲン様ドメイン断片をコードする縮重ヌクレオチド配列からなる群を含む、そのような断片をコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。
【００８４】
他の好ましい断片は、例えば、配列番号:2のアミノ酸124（Val）〜アミノ酸255（Asp）およびアミノ酸112（Ala）〜255（Asp）にわたるzacrp11ポリペプチドの球状C1qドメイン、C1qドメインを含むzacrp11ポリペプチドの一部、またはC1qドメインの活性部分を含む。他のC1qドメイン含有タンパク質には、C1qA、B、およびC（Sellar et al.、前記、Reid、前記、およびReid et al., 1982、前記）、シマリス冬眠関連血漿タンパク質HP-20、HP-25、およびHP-27（Takamatsu et al.、前記およびKondo & Kondo、前記）、ヒトプレセレベリン（precerebellin）（Urade et al.、前記）、ヒト内皮細胞マルチメリン（multimerin）（Hayward  et al.、前記）、脊椎動物コラーゲンVIII型およびX型（Muragaki et al.、前記）、脂肪細胞補体関連タンパク質
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が含まれる。
【００８５】
脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーのメンバーは、例えばacrp30（Scherer et al., J. Biol. Chem., 270(45):26746-26749 (1995)）およびzsig37（Sheppard、米国特許第6,265,544号、米国特許第6,518,403号、および米国特許第6,566,499号）など、オリゴマーを形成することが知られている。本発明は、zacrp11ペプチド、zacrp11ポリペプチド、およびzacrp11融合タンパク質のオリゴマーの使用を含む。そのようなオリゴマーは、例えば、三量体、六量体、九量体、および18量体を含む。したがって、本発明のタンパク質および/またはその断片は、ホモマー、または脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの他のメンバーとのヘテロマーを形成し得る。例えば、六量体は、zacrp11のホモ三量体、またはzacrp11とacrp30のヘテロ三量体として形成され得る。
【００８６】
zacrp11の以下の断片は、本明細書に記載の治療用途に有用である：配列番号:2のアミノ酸残基16〜111、配列番号:2のアミノ酸残基61〜255、配列番号:2のアミノ酸残基124〜255、およびこれらの組み合わせ。これらのポリペプチドは、単一鎖として、またはホモ二量体、ホモ三量体、もしくはホモ六量体などのオリゴマーとして、投与することができる。または、ホモ二量体、ホモ三量体、もしくはホモ六量体などのこれらのポリペプチドを、他の脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーメンバーのオリゴマーと共に投与することができる。しかし、zacrp11ポリペプチドを、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの他のメンバーとヘテロマーを形成させてから、投与することもできる。少なくとも1つのシステイン残基がセリン残基で置換されたこれらのポリペプチドの変種もまた、治療化合物として用いることができる。
【００８７】
本発明の治療組成物は、zacrp11アミノ酸配列、acrp30アミノ酸配列（Scherer et al., J. Biol. Chem., 270(45):26746-26749 (1995)）、zacrp2アミノ酸配列（Piddington et al., WO 00/63376）、zacrp7アミノ酸配列（Piddington et al., WO 00/73448）、zsig39アミノ酸配列（Sheppard and Humes、米国特許第6,197,930号および米国特許第6,482,612号）、zacrp3アミノ酸配列（Piddington et al.、米国特許第6,521,233号）、zsig37 アミノ酸配列（Sheppard、米国特許第6,265,544号、米国特許第6,518,403号、および米国特許第6,566,499号）、zacrp5アミノ酸配列（Piddington et al., WO 00/73444）、およびzacrp6アミノ酸配列（Piddington et al., WO 00/73446)の混合物を含む、六量体などのzacrp11へテロマーを含む。
【００８８】
治療組成物はまた、例えば、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255、acrp30アミノ酸配列
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、zacrp2アミノ酸配列
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および
、zacrp7アミノ酸配列
2007532092.tif 000008
および
、zsig39アミノ酸配列
2007532092.tif 000009
、zacrp3アミノ酸配列
2007532092.tif 000010
、zsig37アミノ酸配列
2007532092.tif 000011
、zacrp5アミノ酸配列
2007532092.tif 000012
、およびzacrp6アミノ酸配列
2007532092.tif 000013
などの、zacrp11、acrp30、zacrp2、zacrp7、zsig39、zacrp3、zsig37、zacrp5、およびzacrp6の断片を含み得る。これらの治療化合物は、ホモマーであってもヘテロマーであってもよい。例示的なオリゴマーには、ホモ三量体およびヘテロ三量体、ならびにホモ六量体およびヘテロ六量体が含まれる。
【００８９】
zacrp11のC1qドメインは、Shapiro and Scherer（参照）によって記載される「ジェリーロール」形態を形成する10本のβ鎖（配列番号:2のアミノ酸残基128〜132、147〜150、156〜160、164〜167、169〜180、185〜193、198〜205、210〜219、226〜231、および245〜253）を含む。これらの鎖は、それぞれ「A」、「A'」、「B'」、「B」、「C」、「D」、「E」、「F」、「G」、および「H」と称される（Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8:335-8, 1998）。
【００９０】
これらの断片は、エネルギーバランスまたは神経伝達、特に食事もしくはストレス関連神経伝達、コラーゲン阻害、および補体阻害の研究または調節において特に有用である。そのような断片には、抗菌活性もまた存在し得る。脂肪細胞補体関連タンパク質C1qドメインのTNFタンパク質（Shapiro and Scherer、前記）に対する相同性から、そのような断片が肥満関連インスリン抵抗性、免疫調節、炎症応答、血小板粘着調節、アポトーシス、および破骨細胞成熟において有用であることが示唆される。(a) ヌクレオチド383〜ヌクレオチド778の配列番号:1に示されるヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド分子；(b) アミノ酸残基124（Val）〜アミノ酸残基255（Asp）の配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%を超えて同一であるzacrp11ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド分子；(c) (a)または(b)と相補的な分子；および(d) zacrp11ポリペプチドC1qドメイン断片をコードする縮重ヌクレオチド配列からなる群を含む、そのような断片をコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。
【００９１】
本発明の他のzacrp11ポリペプチド断片は、配列番号:2のアミノ酸残基16（Ala）〜255（Asp）に及ぶコラーゲン様ドメインおよびC1qドメインの両方を含む。(a) ヌクレオチド59〜ヌクレオチド778の配列番号:1に示されるヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド分子；(b) 配列番号:2のアミノ酸残基16（Ala）〜255（Asp）の配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%を超えて同一であるzacrp11ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド分子；(c) (a)または(b)と相補的な分子；および(d) zacrp11ポリペプチドコラーゲン様ドメイン-C1qドメイン断片をコードする縮重ヌクレオチド配列からなる群を含む、そのような断片をコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。
【００９２】
本発明はまた、 (a) 配列番号:1のヌクレオチド配列またはその相補物の一部を含むヌクレオチド配列を有するzacrp11核酸プローブを、(i) 生物試料から単離された試験RNA分子または(ii) 単離されたRNA分子から合成された核酸分子と、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる段階、(b) 核酸プローブと試験RNA分子または合成核酸分子とのハイブリッドの形成を検出する段階を含み、ハイブリッドの存在によって生物試料中のzacrp11 RNAの存在が示される、生物試料中のzacrp11 RNAの存在を検出する方法を意図する。生物試料の例は、生検試料または剖検試料などのヒト生物試料である。
【００９３】
本発明はさらに、(a) 生物試料を、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255または21〜255のアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片と、生物試料への抗体または抗体断片の結合を可能にする条件下で接触させる段階、および(b) 結合した抗体または抗体断片のいずれかを検出する段階を含む、生物試料中のzacrp11ポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。そのような抗体または抗体断片は、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、およびコロイド金からなる群より選択される検出可能な標識をさらに含み得る。例示的な生物試料はヒト生物試料である。
【００９４】
ヒトzacrp11遺伝子の作製
ヒトzacrp11遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号:1に基づいたポリヌクレオチドプローブを使用し、ヒトcDNAライブラリーまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技法は標準的であり、十分に確立されている。例として、ヒトzacrp11遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトcDNAライブラリーから単離することができる。この場合、第1段階は、当業者に周知である方法を用いてcDNAライブラリーを調製することである。一般に、RNA単離技法は、細胞を破壊する方法、RNaseに誘導されるRNA分解を抑制する手段、ならびにDNA、タンパク質、および多糖類混入物からRNAを分離する方法を提供する必要がある。例えば、全RNAは、組織を液体窒素中で凍結し、凍結組織を乳鉢および乳棒で破砕して細胞を溶解し、破砕した組織をフェノール/クロロホルム溶液で抽出してタンパク質を除去し、塩化リチウムによる選択的沈殿により残存する不純物からRNAを分離することによって単離することができる（例えば、Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, pages 4-1〜4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"；Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, pages33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]を参照のこと）または、全RNAは、破砕した組織をグアニジンイソチオシアネートで抽出し、有機溶媒で抽出し、分画遠心法により混入物からRNAを分離することによって単離することができる（例えば、Chirgwin et al., Biochemistry 18:52 (1979)；Ausubel (1995) pages 4-1〜4-6；Wu (1997) pages 33-41を参照のこと）。
【００９５】
cDNAライブラリーを構築するには、全RNA調製物からポリ(A)+ RNAを単離する必要がある。ポリ(A)+ RNAは、オリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィーの標準的な技法を用いて、全RNAから単離することができる（例えば、Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad.Sci. USA 69:1408 (1972)；Ausubel (1995) pages 4-11〜4-12を参照のこと）。
【００９６】
二本鎖cDNA分子は、当業者に周知である技法を用いて、ポリ(A)+ RNAから合成される（例えば、Wu (1997) pages 41-46を参照のこと）。さらに、市販のキットを用いて、二本鎖cDNA分子を合成することができる。例えば、そのようなキットは、Life Technologies, Inc.（メリーランド州、ゲイサーズバーグ）、CLONTECH Laboratories, Inc.（カリフォルニア州、パロアルト）、Promega Corporation（ウィスコンシン州、マディソン）、およびSTRATAGENE（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）から入手できる。
【００９７】
cDNAライブラリーの構築には、種々のクローニングベクターが適している。例えば、cDNAライブラリーは、λgt10ベクターなどのバクテリオファージに由来するベクター中で調製することができる。例えば、Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11", DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49 (IRL Press, 1985)；Wu (1997) pages 47-52を参照されたい。
【００９８】
または、PBLUESCRIPTベクター（STRATAGENE；カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）、LAMDAGEM-4（Promega Corp.）、または他の市販のベクターなどのプラスミドベクター中に、二本鎖cDNA分子を挿入することもできる。適切なクローニングベクターはまた、American Type Culture Collection（バージニア州、マナッサス）から入手できる。
【００９９】
クローン化されたcDNA分子を増幅するには、標準的な技法を用いて、cDNAライブラリーを原核生物宿主中に挿入する。例えば、cDNAライブラリーは、例えばLife Technologies, Inc.（メリーランド州、ゲイサーズバーグ）から得られるコンピテント大腸菌（E. coli）DH5細胞中に導入することができる。
【０１００】
ヒトゲノムライブラリーは、当技術分野において周知である手段によって調製することができる（例えばAusubel (1995) pages 5-1〜5-6；Wu (1997) pages 307-327を参照のこと）。ゲノムDNAは、組織を界面活性剤サルコシルで溶解し、溶解液をプロテイナーゼKによって消化し、遠心分離により溶解液から不溶性残屑を除去し、イソプロパノールを用いて溶解液から核酸を沈殿させ、再懸濁したDNAを塩化セシウム密度勾配上で精製することによって単離することができる。
【０１０１】
ゲノムライブラリーの作製に適したDNA断片は、ゲノムDNAのランダムな剪断により、または制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNAの部分消化により得ることができる。ゲノムDNA断片は、適切な末端を提供するための制限酵素消化の使用、DNA分子の望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理の使用、および適切なリガーゼによる連結などの従来の技法に従って、バクテリオファージまたはコスミドベクターなどのベクター中に挿入することができる。そのような操作のための技法は、当技術分野において周知である（例えば、Ausubel (1995) pages 5-1〜5-6；Wu (1997) pages 307-327を参照のこと）。
【０１０２】
ヒトzacrp11遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書に記載のzacrp11遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことで取得できる。PCRを用いてライブラリーをスクリーニングする一般的な方法は、例えば、Yu et al., "Use of The Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries", Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Application, White (ed.), pages 211-215 (Humana Press, Inc. 1993)によって提供されている。さらに、PCRを用いて関連遺伝子を単離する技法は、例えば、Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993)によって記載されている。
【０１０３】
または、ヒトゲノムライブラリーは、Research Genetics（アラバマ州、ハンツビル）およびAmerican Type Culture Collection（バージニア州、マナッサス）などの商業的供給源から取得することができる。
【０１０４】
cDNAクローンまたはゲノムクローンを含むライブラリーは、標準的な方法により、配列番号:1に基づいた1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることができる（例えば、Ausubel (1995) pages6-1〜6-11を参照のこと）。
【０１０５】
以下に記載するように作製した抗zacrp11抗体を用いて、ヒトzacrp11遺伝子をコードするDNA配列をcDNAライブラリーから単離することもできる。例えば、抗体を用いてλgt11発現ライブラリーをスクリーニングすることもできるし、またはハイブリッドを選択して翻訳させた後に、抗体を免疫スクリーニングに使用することもできる（例えば、Ausubel（1995）pages 6-12〜6-16；Margolis et al., "Screening λ expression libraries with antibody and protein probes", DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.) pages 1-14 (Oxford University Press 1995)を参照のこと）。
【０１０６】
別の方法として、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載のヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することにより、zacrp11遺伝子を得ることができる（例えば、Ausubel (1995) pages 8-8〜8-9を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法により、少なくとも2 kb長のDNA分子を合成する能力が提供される（Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)、Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993)、Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press. Inc. 1993)、およびHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)）。
【０１０７】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミダイト法などの手順を用いて、「遺伝子合成装置」で合成することができる。遺伝子または遺伝子断片の合成などの用途に、化学合成二本鎖DNAが必要とされる場合には、各相補鎖を別々に作製する。短い遺伝子（60〜80塩基対）の作製は技術的に容易であり、相補鎖を合成した後にそれらをアニーリングすることによって達成し得る。しかし、化学的DNA合成過程における各サイクルのカップリング効率が100%であることはめったにないため、より長い遺伝子（＞300塩基対）を作製するには特殊な戦略が必要となる場合がある。この問題を克服するためには、20〜100ヌクレオチド長の一本鎖断片によるモジュラー形式で、合成遺伝子（二本鎖）を構築する。
【０１０８】
合成遺伝子を構築するための1つの方法は、それぞれ20〜60ヌクレオチド長である、1組の重複する相補的オリゴヌクレオチドを最初に作製することを必要とする。アニーリング後に、遺伝子の2つの末端部分が整列して平滑末端を生じるように、鎖の配列を設計する。遺伝子の内部部分はそれぞれ、隣接する部分と正確に塩基対を形成するように設計された相補的3'および5'末端伸長を有する。したがって、遺伝子を組み立てた後、その工程を完了するために残った唯一の要件は、T4 DNAリガーゼを用いて、2本の鎖の骨格に沿ってニックを閉じることである。合成遺伝子は、タンパク質コード配列に加えて、クローニングベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位への挿入を容易にする末端配列を付加して設計することができ、転写および翻訳の正確な開始および終結のためのシグナルを含む他の配列もまた付加されるべきである。
【０１０９】
全長遺伝子を調製するための別の方法は、特定化した一組の重複オリゴヌクレオチド（40〜100ヌクレオチド）を合成することである。3'および5'伸長（6〜10ヌクレオチド）をアニーリングさせた後、大きなギャップが残存するが、塩基対を形成した領域は、構造を全体的に維持するのに十分に長くかつ十分に安定している。二本鎖が完成されたら、大腸菌DNAポリメラーゼIによる酵素DNA合成によってギャップを埋める。この酵素は、複製開始点として3'-ヒドロキシル基、および鋳型として一本鎖領域を使用する。酵素合成が完了した後、T4 DNAリガーゼを用いてニックを閉じる。より大きな遺伝子に関しては、完全な遺伝子配列は通常、4〜6つの重複オリゴヌクレオチド（それぞれ20〜60塩基対）を連結して組み立てた二本鎖断片から構築する。それぞれの合成およびアニーリング段階の後に十分な量の二本鎖断片が存在する場合には、単にそれらを相互に連結する。そうでない場合は、各断片をベクターにクローニングして、利用できるDNA量を増幅させる。いずれの場合にも、二本鎖構築物を相互に順次に連結して、完全な遺伝子配列を形成する。化学合成した遺伝子が正確なヌクレオチド配列を有することを確認するために、DNA配列解析によって各二本鎖断片および完全な配列を特徴づけるべきである。ポリヌクレオチド合成の総説に関しては、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984)、およびClimie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)を参照されたい。
【０１１０】
zacrp11 cDNAまたはzacrp11ゲノム断片の配列は、標準的な方法を用いて決定し得る。本明細書に開示するzacrp11ポリヌクレオチド配列はまた、zacrp11遺伝子の5'非コード領域をクローニングするためのプローブまたはプライマーとして用いることもできる。zacrp11遺伝子のプロモーターエレメントを用いて、例えばトランスジェニック動物または遺伝子治療を受けている患者において、異種遺伝子の発現を導くことができる。zacrp11プロモーターまたは調節エレメントを含むゲノム断片の同定は、欠失解析などの十分に確立された技法により達成し得る（一般的には、Ausubel (1995)を参照のこと）。
【０１１１】
5'隣接配列のクローニングはまた、米国特許第5,641,670号に開示されるような「遺伝子活性化」によるzacrp11タンパク質の産生を促進する。簡潔に説明すると、細胞における内因性zacrp11遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー部位を含むDNA構築物を、zacrp11座位に導入することによって変化を受ける。標的配列は、構築物と内因性zacrp11座位との相同組換えを可能にするzacrp11 5'非コード配列であり、それによって、構築物中の配列が内因性zacrp11コード配列と機能的に連結されるようになる。このようにして、内因性zacrp11プロモーターが他の調節配列により置換されるかまたは補充されて、増強された、組織特異的な、または別の方法で調節された発現が提供される。
【０１１２】
zacrp11遺伝子変種の作製
本発明は、本明細書に開示するzacrp11ポリペプチドをコードするDNAおよびRNAを含む、種々の核酸分子を提供する。当業者は、遺伝暗号の縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間で相当数の配列変化が可能であることを容易に認識すると考えられる。配列番号:3は、配列番号:2のzacrp11ポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者は、TをUに置換することで、配列番号:3の縮重配列がまた、配列番号:2をコードするすべてのRNA配列を提供することを認識すると考えられる。したがって、本発明は、配列番号:1のヌクレオチド14〜778、およびそのRNA同等物を含むzacrp11ポリペプチドコード核酸分子を意図する。
【０１１３】
表1は、縮重ヌクレオチド位置を示すために配列番号:3において使用される1文字コードを示す。「転換（resolution）」はコード文字により示されるヌクレオチドである。「相補物」は、相補ヌクレオチドについてのコードを示す。例えば、コードYはCまたはTを示し、その相補物RはAまたはGを示し、AはTと相補的であり、GはCと相補的である。
【０１１４】
【表１】
2007532092.tif 000014
【０１１５】
所与のアミノ酸に対するあらゆる可能なコドンを包含する、配列番号:3において使用される縮重コドンを表2に記載する。
【０１１６】
【表２】
2007532092.tif 000015
【０１１７】
当業者は、アミノ酸をコードするあらゆる可能なコドンを代表する縮重コドンの決定において、多少のあいまいさが導入されることを理解すると考えられる。例えば、セリン（WSN）の縮重コドンは、状況によってはアルギニン（AGR）をコードし、またアルギニン（MGN）の縮重コドンは、状況によってはセリン（AGY）をコードする。フェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間にも同様の関係が存在する。したがって、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードし得るが、当業者は、配列番号:2のアミノ酸配列を参照することで、そのような変種配列を容易に同定することができる。変種配列は、その機能性について、本明細書に記載する通りに容易に試験することができる。
【０１１８】
様々な種で「優先的コドン使用」が見られる。一般的には、Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8:1893 (1980)、Haas et al., Curr. Biol. 6:315 (1996)、Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981)、Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982)、Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986)、Ikemura., J. Mol. Biol. 158:573 (1982)、Sharp and Matassi., Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994)、Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995)、およびMakrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996)を参照されたい。本明細書で用いる「優先的コドン使用」または「優先的コドン」という用語は、ある種の細胞で最も高い頻度で使用されることによって、各アミノ酸をコードする可能なコドン（表2参照）の中でも1個または少数のコドンが優先されるタンパク質翻訳コドンを示す、当技術分野における用語である。例えば、アミノ酸スレオニン（Thr）はACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされ得るが、哺乳類細胞では通常ACCが使用され；他の種（例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌）では、異なるThrコドンが優先的に使用され得る。当技術分野で周知の様々な方法により、特定の種における優先的なコドンを、本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。例えば、優先的コドン配列を組換えDNAに導入することによって、特定の細胞種または種において、タンパク質の翻訳をより効率的にすることでタンパク質の産生を高めることができる。したがって、配列番号:3に開示する縮重コドン配列は、当技術分野で広く使用され、かつ本明細書に開示された、様々な細胞種または種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型となる。優先的コドンを含む配列を、様々な種における発現について試験し、最適化することが可能であり、また本明細書に開示するようにその機能性について試験することができる。
【０１１９】
本発明はさらに、他の種に由来する対応物（オルソログ）を表す変種ポリペプチドおよび核酸分子を提供する。これらの種には、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆虫類、ならびに他の脊椎動物種および無脊椎動物種が含まれるがこれらに限定されない。特に関心があるのは、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類ポリペプチドを含む、他の哺乳類種に由来するzacrp11ポリペプチドである。zacrp11のそのようなオルソログは、本発明の提供する情報および組成物と従来のクローニング技法を組み合わせて用いることで、クローニングすることができる。例えば、本明細書に開示するzacrp11を発現する組織または細胞種から得られたmRNAを用いて、cDNAをクローニングすることができる。mRNAの適切な供給源は、本明細書に開示する配列を元に設計したプローブでノーザンブロットをプロービングすることにより、同定することができる。次いで、陽性組織または細胞株のmRNAからライブラリーを調製する。
【０１２０】
次いで、完全なもしくは部分的なcDNAで、または開示した配列に基づく1組もしくは複数組の縮重プローブでプロービングするなどの種々の方法で、zacrp11をコードするcDNAを単離することができる。また、本明細書に開示する代表的なzacrp11配列から設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、cDNAをクローニングすることもできる。さらなる方法として、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし得り、関心対象のcDNAの発現をzacrp11ポリペプチドに対する抗体で検出することができる。同様の技法を、ゲノムクローンの単離にも適用することができる。
【０１２１】
当業者は、配列番号:1に開示する配列がヒトzacrp11の1つの対立遺伝子を表すこと、ならびに対立遺伝子の変化および選択的スプライシングが起こると予想されることを理解すると考えられる。この配列の対立遺伝子変種は、異なる個体に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを標準的な手順に従ってプロービングすることで、クローニングすることができる。サイレント変異を含む変種、および変異がアミノ酸配列の変化を生じる変種を含む、配列番号:1に示すヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は本発明の範囲に含まれ、また配列番号:2の対立遺伝子変種であるタンパク質についても同様である。zacrp11ポリペプチドの特徴を保持する、選択的スプライシングを受けたmRNAから生じたcDNA分子は本発明の範囲に含まれ、またこのようなcDNAおよびmRNAによってコードされるポリペプチドについても同様である。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当技術分野で周知の標準的な手順に従って、様々な個体または組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによって、クローニングすることができる。
【０１２２】
本発明の特定の態様では、単離された核酸分子は、本明細書に開示するヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。例えば、このような核酸分子は、ストリンジェントな条件で、配列番号:1のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、配列番号:1のヌクレオチド配列からなる核酸分子と、または配列番号:1と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸分子とハイブリダイズし得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱融点（Tm）より約5℃低く選択される。Tmとは、標的配列の50%が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびpHにおける）温度である。
【０１２３】
DNA-DNA、RNA-RNA、およびDNA-RNAなどの核酸分子の対は、ヌクレオチド配列がある程度の相補性を有する場合にハイブリダイズし得る。ハイブリッドは二重らせん内のミスマッチ塩基対を許容し得るが、ハイブリッドの安定性はミスマッチの程度に影響を受ける。ミスマッチを含むハイブリッドのTmは、1〜1.5%の塩基対ミスマッチにつき1℃低下する。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることで、ハイブリッド中に存在するミスマッチの程度を調節することができる。ストリンジェンシーの程度は、ハイブリダイゼーション温度を上げると、またハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度を下げると上昇する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドのTmより約5℃〜25℃低い温度、および最大1 MのNa+を含むハイブリダイゼーション緩衝液を含む。より低い温度でのより高いストリンジェンシーの程度は、ハイブリッドのTmを緩衝液中の1%ホルムアミドにつき約1℃低下させるホルムアミドを添加することで達成される。一般に、そのようなストリンジェントな条件は、20℃〜70℃という温度、および最大6×SSC、および0〜50%のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を含む。より高い程度のストリンジェンシーは、40℃〜70℃の温度で、最大4×SSCおよび0〜50%のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いることで達成し得る。高度にストリンジェントな条件は典型的には、温度が42℃〜70℃で、ハイブリダイゼーション緩衝液が最大1×SSCおよび0〜50%のホルムアミドを含む。様々な程度のストリンジェンシーをハイブリダイゼーション時および洗浄時に用いることで、標的配列に対して最大限に特異的な結合を達成することができる。典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズした複合体から除去するために、ストリンジェンシーの程度を高めて実施する。
【０１２４】
上記の条件は手引きとして機能することを意図しており、これらの条件を特定のポリペプチドハイブリッドを使用するために適合させることは当業者の能力の範囲内にある。特定の標的配列のTmとは、標的配列の50%が、完全に一致したプローブ配列とハイブリダイズする（既定の条件下での）温度である。Tmに影響する条件には、ポリヌクレオチドプローブの大きさおよび塩基対組成、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、ならびにハイブリダイゼーション溶液中の不安定化薬剤の存在が含まれる。Tmを計算するための数多くの式が当技術分野で周知であり、様々な長さのDNA、RNA、およびDNA-RNAハイブリッド、ならびにポリヌクレオチドプローブの配列に特異的である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987)；Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987)；およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照のこと）。配列解析ソフトウェアおよびインターネット上のサイトは、ユーザー定義の基準に基づいた所与の配列の解析およびTmの計算に利用できるツールである。このようなプログラムは、規定の条件下において所与の配列を解析し、適切なプローブ配列を同定することもできる。典型的には、＞50塩基対という長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、Tm計算値より約20℃〜25℃低い温度で実施する。＜50塩基対の短いプローブの場合には、ハイブリダイゼーションは典型的に、TmまたはTmより5℃〜10℃低い温度で実施する。こうすることでDNA-DNAハイブリッドおよびDNA-RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション速度が最大となる。
【０１２５】
ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度および安定性に影響を及ぼす。＜50塩基対の短いプローブ配列は相補配列と共に速やかに平衡に達する、安定性に劣るハイブリッドを形成し得る。数分〜数時間のインキュベーション時間で、ハイブリッド形成が達成され得る。長いプローブ配列はより緩やかに平衡に達するが、より低温であってもより安定な複合体を形成する。インキュベーションは一晩かまたはそれ以上かけて行う。一般にインキュベーションは、算出したCot時間の3倍に相当する時間をかけて実施する。Cot時間とはポリヌクレオチド配列が再会合するのに要する時間であり、当技術分野で周知の方法により特定の配列に関して算出することができる。
【０１２６】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成は、ハイブリッド複合体の熱安定性に影響を及ぼし、よってハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度の選択に影響する。A-T対は、塩化ナトリウムを含む水溶液中でG-C対よりも安定性に劣る。したがってG-C含量が高いほど、ハイブリッドは安定性を増す。配列内でのG残基およびC残基の均等な分布もまた、ハイブリッドの安定性にプラスに寄与する。さらに、塩基対組成を操作して所与の配列のTmを変えることができる。例えば、デオキシシチジンに代えて5-メチルデオキシシチジンを使用し、またチミジンに代えて5-ブロモデオキシウリジンを使用することで、Tmを上昇させることができ、一方、グアノシンに代えて7-デアザ-2'-デオキシグアノシンを使用することで、Tmに対する依存性を低くすることができる。
【０１２７】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度もまた、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般に、デンハルト液（Sigma Chemical Co.、ミズーリ州、セントルイス）、変性サケ精子DNA、tRNA、粉乳（BLOTTO）、ヘパリン、またはSDSなどのブロッキング剤、およびSSC（1×SSC：0.15 M塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウム）またはSSPE（1×SSPE：1.8 M NaCl、10 mM NaH2PO4、1 mM EDTA、pH 7.7）などのNa+源を含む。緩衝液のイオン濃度を減少させることで、ハイブリッドの安定性が増大する。典型的に、ハイブリダイゼーション緩衝液は10 mM〜1 MのNa+を含む。ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジン陽イオン、またはチオシアン酸陽イオンなどの不安定化剤または変性剤をハイブリダイゼーション溶液に添加すると、ハイブリッドのTmが変化する。典型的には、インキュベーションをより簡便でかつより低い温度で行うことができるように、最大50%の濃度でホルムアミドを使用する。ホルムアミドにはまた、RNAプローブを用いる際に非特異的なバックグラウンドを低減させる作用もある。
【０１２８】
例として、変種zacrp11ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:1のヌクレオチド配列（またはその相補物）を有する核酸分子と、50%ホルムアミド、5×SSC（1×SSC：0.15 M塩化ナトリウムおよび15 mMクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト液（100×デンハルト液：2% (w/v) Ficoll 400、2% (w/v)ポリビニルピロリドン、および2% (w/v)ウシ血清アルブミン）、10%デキストラン硫酸、および20 μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩でハイブリダイズし得る。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件を様々に工夫することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物を、ホルムアミドを含まない溶液中で、より高い温度（約65℃など）でインキュベートすることができる。さらに、予め混合してあるハイブリダイゼーション溶液（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.製のEXPRESSHYB Hybridization Solution）を入手することができ、製造業者の指示書に従ってハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション後に核酸分子を洗浄し、ハイブリダイズしていない核酸分子をストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下で除去することができる。典型的なストリンジェントな洗浄条件には、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.5×〜2×SSCの溶液中での55℃〜65℃における洗浄が含まれる。すなわち、変種zacrp11ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:1のヌクレオチド配列（またはその相補物）を有する核酸分子とハイブリダイズした状態を、55℃〜65℃での0.1% SDSを含む0.5×〜2×SSC（55℃での0.1% SDSを含む0.5×SSC、または65℃での0.1% SDSを含む2×SSCを含む）に相当するストリンジェントな洗浄条件で維持する。当業者は、例えば洗浄液中のSSCをSSPEに代えるなどして、同等の条件を容易に考案することができる。
【０１３０】
典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件には、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.1×〜0.2×SSCの溶液中での50℃〜65℃における洗浄が含まれる。すなわち、変種zacrp11ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:1のヌクレオチド配列（またはその相補物）を有する核酸分子とハイブリダイズした状態を、50℃〜65℃での0.1% SDSを含む0.1×〜0.2×SSC（50℃での0.1% SDSを含む0.1×SSC、または65℃での0.1% SDSを含む0.2×SSCを含む）に相当するストリンジェントな洗浄条件で維持する。
【０１３１】
本発明はまた、配列番号:2のポリペプチドまたはオルソログと実質的に類似した配列同一性を有する、単離されたzacrp11ポリペプチドを提供する。「実質的に類似した配列同一性」という用語は、本明細書において、対応する配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%を超える配列同一性を有するポリペプチドを示すために用いられる。
【０１３２】
本発明はまた、以下の2つの基準を用いて同定され得るzacrp11変種核酸分子も意図する：コードされるポリペプチドと配列番号:2のアミノ酸配列との類似性の決定、および上記のハイブリダイゼーションアッセイ法。そのようなzacrp11変種には、(1) 配列番号:1のヌクレオチド配列（またはその相補物）を有する核酸分子とハイブリダイズした状態を、55℃〜65℃での0.1% SDSを含む0.5×〜2×SSCに相当するストリンジェントな洗浄条件で維持し、かつ(2) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜アミノ酸残基255を含むポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
【０１３３】
または、zacrp11変種は、(1) 配列番号:1のヌクレオチド配列（またはその相補物）を有する核酸分子とハイブリダイズした状態を、50℃〜65℃での0.1% SDSを含む0.1×〜0.2×SSCに相当する高度にストリンジェントな洗浄条件で維持し、かつ(2) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜アミノ酸残基255を含むポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１３４】
本発明はまた、配列番号：1のヌクレオチド配列からなる核酸分子断片またはその相補体である参照核酸分子を用いたハイブリダイゼーション分析により特徴付けられる、特定のzacrp11変種を含む。例えば、このような参照核酸分子には、ヌクレオチド配列（配列番号：1、配列番号：1のヌクレオチド59〜778）からなる核酸分子またはその相補体が含まれる。
【０１３５】
パーセント配列同一性は従来の方法で決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。簡潔に説明すると、2つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティ 10、ギャップエクステンションペナルティ 1、および表3（アミノ酸を標準的な1文字コードで表示）に示すHenikoff and Henikoff（前記）の「BLOSUM62」スコアリング行列を用いて、アライメントスコアが最適になるようにアライメントする。次いで、パーセント同一性を以下のように算出する：（［完全な一致の総数］/［長い方の配列の長さ＋2つの配列をアライメントする目的で長い方の配列に導入されたギャップの数］）(100)。
【０１３６】
【表３】
2007532092.tif 000016
【０１３７】
当業者であれば、2つのアミノ酸配列をアライメントするために利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。PearsonおよびLipmanによる「FASTA」類似性探索アルゴリズムは、本明細書に開示するアミノ酸配列と推定zacrp11変種のアミノ酸配列で共有される同一性レベルを調べるのに適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムについては、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)によって記載されている。簡潔に説明すると、FASTAでは最初に、質問配列（例えば、配列番号:2）と試験配列によって共有される、最も高い同一性密度（ktup変数が1の場合）または同一性対（ktup＝2の場合）を有する領域を、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を考慮することなく同定することで、配列類似性を特徴づける。次いで、同一性密度の最も高い10の領域を、対になったアミノ酸すべての類似性をアミノ酸置換行列で比較することにより再びスコア化し、領域の末端を「切り詰める」ことで、最高のスコアに寄与する残基のみを含めるようにする。「カットオフ」値（配列の長さおよびktup値に基づき、所定の式で算出される）よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合には、切り詰めた当初の領域を調べて、その領域を結合してギャップを含む近似のアラインメントを形成できるかどうかを決定する。最後に、2つのアミノ酸配列の最もスコアの高い領域を、アミノ酸の挿入および欠失を可能とする改良Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)）を用いてアライメントする。FASTA解析の例示的なパラメータは、ktup＝1、ギャップオープニングペナルティ＝10、ギャップエクステンションペナルティ＝1、および置換行列＝BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のAppendix 2に説明されているようにスコアリング行列ファイル（「SMATRIX」）を改良することで、FASTAプログラムに導入することができる。
【０１３８】
FASTAを使用して、上記の比を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列を比較する場合には、他のパラメータセットを上記の通りに設定し、ktup値を1〜6、好ましくは3〜6、最も好ましくは3にし得る。
【０１３９】
本発明は、配列番号:2のアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。すなわち、zacrp11アミノ酸配列中のアルキルアミノ酸がアルキルアミノ酸に置換されているか、zacrp11アミノ酸配列中の芳香族アミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されているか、zacrp11アミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸が硫黄含有アミノ酸に置換されているか、zacrp11アミノ酸配列中の水酸基含有アミノ酸が水酸基含有アミノ酸に置換されているか、zacrp11アミノ酸配列中の酸性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されているか、zacrp11アミノ酸配列中の塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されているか、またはzacrp11アミノ酸配列中の二塩基性一カルボキシル基アミノ酸が二塩基性一カルボキシル基アミノ酸に置換されている、配列番号:2の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む変種を得ることができる。
【０１４０】
一般的なアミノ酸の中で、例えば「保存的アミノ酸置換」は、以下の群のそれぞれの中でのアミノ酸間の置換によって説明される：(1) グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2) フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびスレオニン、(4) アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5) グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6) リジン、アルギニン、およびヒスチジン。
【０１４１】
BLOSUM62表は、500を超える群の関連タンパク質の高度に保存された領域を代表する、タンパク質配列部分の約2,000の局所的多重アライメントに由来するアミノ酸置換行列である（Henikoff and Henikoff、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)）。したがって、BLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を規定することができる。化学的特徴（上記）のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という用語は好ましくは、-1を上回るBLOSUM62値で示される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3のBLOSUM62値で特徴づけられる場合に保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1（例えば、1、2、または3）のBLOSUM62値によって特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2（例えば、2または3）のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【０１４２】
zacrp11の特定の変種は、対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号：2）と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%を超える配列同一性を有し、アミノ酸配列の変化は1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因する。
【０１４３】
zacrp11遺伝子の保存的アミノ酸変化は、配列番号:1に記載のヌクレオチドを別のヌクレオチドと置換することで導入することができる。そのような「保存的アミノ酸」変種は、例えば、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる突然変異誘発などにより得ることができる（Ausubel (1995) pages 8-10〜8-22；およびMcPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)を参照）。
【０１４４】
zacrp11ポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の変化は、生物活性に必須である高次構造の破壊を最小限に抑えるように加えられる。例えば、アミノ酸残基の変化は、高次構造の変化が何らかの重要な機能を弱めるような分子の配置および他の成分を破壊しないように、加えられることになる。アミノ酸配列変化の影響は、例えば上記に開示するようなコンピュータモデリングにより予測することができ、または結晶構造の解析により決定することができる（例えば、Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995を参照のこと）。当技術分野において周知の他の技法では、変種タンパク質の折りたたみを基準分子（例えば、天然タンパク質）と比較する。例えば、変種と基準分子におけるシステインパターンの比較を行うことができる。質量分光法ならびに還元およびアルキル化を用いた化学修飾は、ジスルフィド結合に使われているかまたはそのような結合に使われていないシステイン残基を決定するための方法を提供する（Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992；Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993；およびPatterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994）。修飾を受けた分子が基準分子と同じシステインパターンを有さない場合、折りたたみに影響を受けると一般的に考えられている。折りたたみを測定するための周知でありかつ認められている別の方法は、円二色性（CD）である。修飾分子および基準分子によって生じるCDスペクトルを測定および比較することは、日常的業務である（Johnson, Proteins 7:205-214, 1990）。結晶学は、折りたたみおよび構造を解析するための別の周知の方法である。核磁気共鳴（NMR）、消化ペプチドマッピング、およびエピトープマッピングもまた、折りたたみおよびタンパク質とポリペプチドとの構造的類似性を解析するための周知の方法である（Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992）。
【０１４５】
配列番号:2に示すようなzacrp11タンパク質配列のHopp/Woods親水性プロファイルを作成することができる（Hopp et al., Proc Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981；Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986、およびTriquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998）。このプロファイルは、スライドする6残基領域に基づく。埋もれたG残基、S残基、およびT残基、ならびに露出しているH残、Y残基、およびW残基は無視される。
【０１４６】
当業者は、zacrp11ポリペプチドのアミノ酸配列において修飾を計画する際に、全体的な構造および生物学的プロファイルを破壊しないよう、親水性または疎水性が考慮されるであろうことを認識すると考えられる。置換に関して特に関心があるのは、Val、Leu、およびIleからなる群、またはMet、Gly、Ser、Ala、Tyr、およびTrpからなる群より選択される疎水性残基である。例えば、置換を許容する残基には、配列番号:2に示されるようなVal、Leu、およびIle、またはMet、Gly、Ser、Ala、Tyr、およびTrp残基からなる群が含まれ得る。構造に基づいて変種zacrp11ポリヌクレオチドを同定する別のアプローチでは、上記したように、潜在的変種zacrp11遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズし得るかどうかを決定する。
【０１４７】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を同定する他の方法は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャン突然変異誘発などの、当技術分野において周知の手順である（Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989)、Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991)、Coombs and Gorey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)）。後者の技法においては、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入し、得られる変異分子を、以下に開示する生物活性または生化学的活性について試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。同様に、Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)も参照されたい。
【０１４８】
本発明のタンパク質はまた、非天然のアミノ酸残基も含み得る。非天然のアミノ酸には、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンが含まれるがこれらに限定されない。非天然のアミノ酸残基をタンパク質に導入するいくつかの方法が、当技術分野で周知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑圧するインビトロ系を使用することができる。アミノ酸を合成する方法およびtRNAをアミノアシル化する方法は、当技術分野において周知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳は典型的に、大腸菌S30抽出物、ならびに市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーで精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)、Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)、Chung et al., Science 259:806 (1993)、およびChung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)を参照されたい。
【０１４９】
第2の方法では、変異を含むmRNAおよび化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAをマイクロインジェクションすることにより、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞で翻訳を行う（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)）。第3の方法では、大腸菌細胞を、置換されるべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下、かつ所望の非天然のアミノ酸（例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。非天然アミノ酸は、その天然対応物の代わりにタンパク質中に取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994)を参照されたい。天然のアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾法により非天然種に変換することができる。化学修飾を部位特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡張することができる。（Wynn and Richards, Protein Sci. 2：395 (1993)）。
【０１５０】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号にコードされていないアミノ酸、非天然（non-naturally occurring）アミノ酸、および非天然（unnatural）アミノ酸を、zacrp11のアミノ酸残基と置換することができる。
【０１５１】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャン突然変異誘発などの、当技術分野において周知の手順に従って同定することができる。（Cunningham and Wells., Science 244:1081 (1989)、Bass et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991)、Coombs and Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)）。後者の技法においては、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入し、得られる変異分子を以下に開示する生物活性について試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。同様に、Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)も参照されたい。
【０１５２】
zacrp11活性ドメインの位置はまた、推定接触部位のアミノ酸の変異と併せた、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または光親和性標識などの技法で決定される構造の物理的解析によって、決定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992)を参照されたい。さらに、ビオチンまたはFITCで標識したzacrp11を、zacrp11基質および阻害剤の発現クローニングに用いることができる。
【０１５３】
Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53 (1988)）またはBowie and Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989)）によって開示されているような、既知の突然変異誘発法およびスクリーニング法を用いて、複数のアミノ酸置換を作製して試験することができる。簡潔に説明すると、著者らは、ポリペプチド中の2か所またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能ポリペプチドを選択し、次いで変異が誘発されたポリペプチドの配列を決定することで、各位置における可能な置換の範囲を決定する方法について開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991)、Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Huse, 国際公開公報第92/06204号）、および領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986)、およびNer et al., DNA 7:127, (1988)）が含まれる。
【０１５４】
開示されたzacrp11のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の変種は、Stemmer, Nature 370:389 (1994)、Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)、および国際公開公報第97/20078号に開示されているDNAシャフリングによって作製することができる。簡潔に説明すると、親DNAのランダムな断片化およびこれに続くPCRによる再会合により、ランダムに導入された点変異を得るインビトロ相同組換えによって、変種DNAを作製する。この技法を、対立遺伝子変種または異なる種に由来するDNA分子などの親DNA分子のファミリーを用いて改良することで、この過程にさらなる多様性を導入することができる。所望の活性の選択またはスクリーニングの後に、突然変異誘発およびアッセイをさらに繰り返すことで、所望の変異を選択しつつ同時に有害な変化に対して選択することによる配列の速やかな「進化」が提供される。
【０１５５】
本明細書に開示する突然変異誘発法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせ、宿主細胞内のクローン化変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる。生物活性のあるポリペプチド、または抗zacrp11抗体と結合するポリペプチドをコードする変異誘発DNA分子を宿主細胞から回収し、最新装置を用いて迅速に配列を決定することができる。これらの方法により、関心対象のポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができ、またこれらの方法は未知の構造のポリペプチドにも適用することができる。
【０１５６】
本発明はまた、zacrp11ポリペプチドの「機能断片」、およびそのような機能断片をコードする核酸分子を含む。核酸分子の常用的な欠失解析を行い、zacrp11ポリペプチドをコードする核酸分子の機能断片を得ることができる。例として、配列番号:1のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連の入れ子状態の欠失体を得ることができる。エキソヌクレアーゼ消化に代わる別の方法では、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて、所望の断片の産生を特定化するために欠失または終止コドンを導入する。または、ポリメラーゼ連鎖反応により、zacrp11遺伝子の特定の断片を合成することができる。
【０１５７】
例として、インターフェロンの片側または両側の末端における切断に関する研究が、Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)に要約されている。さらに、タンパク質の機能解析の標準的な技法は、例えば、Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993)、Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff, 1987)、Herschman, "The EGF Receptor", Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985)、Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995)；Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995)；Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)、およびMeisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)により記載されている。
【０１５８】
本発明はまた、配列番号:2のアミノ酸配列と比較してアミノ酸変化を有する、zacrp11遺伝子の機能断片を意図する。変種zacrp11遺伝子は、上記のように、配列番号:1および2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することにより、構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変種遺伝子を同定する別のアプローチでは、上記したように、潜在的変種zacrp11遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズし得るかどうかを決定する。
【０１５９】
本発明はまた、本明細書に記載のzacrp11ポリペプチドのエピトープ含有部分を含むポリペプチド断片またはペプチドを提供する。このような断片またはペプチドは、タンパク質全体を免疫原として使用した場合に抗体応答を誘発するタンパク質の部分である「免疫原性エピトープ」を含み得る。免疫原性エピトープ含有ペプチドは、標準的な方法（例えば、Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81：3998 (1983)を参照のこと）により同定することができる
【０１６０】
対照的に、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合し得るタンパク質分子の領域である「抗原エピトープ」を含み得る。ある種のエピトープはアミノ酸の直線状のまたは連続したひと配列からなり、そのようなエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣し得る比較的短い合成ペプチドを用いて、タンパク質に対する抗体の産生を促進できることは、当技術分野において周知である（例えば、Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)を参照のこと）。したがって、本発明の抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するポリペプチドと結合する抗体の産生に有用である。
【０１６１】
抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは好ましくは、配列番号:2の少なくとも4〜10アミノ酸、少なくとも10〜15アミノ酸、または約15〜約30アミノ酸を含む。このようなエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するように、zacrp11ポリペプチドを断片化するか、または化学的なペプチド合成によって作製することができる。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイにより選択することができる（例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993)、およびCortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)を参照のこと）。エピトープを同定し、エピトープを含む短いペプチドから抗体を作製する標準的な方法は、例えば、Mole, "Epitope Mapping", Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992）、Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.),  pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)、およびColigan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997）によって記載されている。
【０１６２】
変種および融合タンパク質を含む任意のzacrp11ポリペプチドに関して、当業者は、上記の表1および表2に記載の情報を用いて、そのような変種をコードする完全に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に作製することができる。さらに当業者は、標準的なソフトウェアを使用して、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を元にzacrp11変種を考案することもできる。したがって本発明は、配列番号:1、2、または3の少なくとも1つを提供するデータ構造で暗号化されたコンピュータ可読媒体を含む。適切な形態のコンピュータ可読媒体には、磁気媒体および光可読媒体が含まれる。磁気媒体の例には、ハードまたは固定ドライブ、ランダムアクセスメモリ（RAM）チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアテープ（DLT）、ディスクキャッシュ、およびZIPディスクが含まれる。光可読媒体は、コンパクトディスク（例えば、CD-読み出し専用（ROM）、CD-書き換え可能（RW）、およびCD-書き込み可能）、およびデジタル多用途/ビデオディスク（DVD）（例えば、DVD-ROM、DVD-RAM、およびDVD+RW）によって例証される。
【０１６３】
zacrp11融合タンパク質の作製
zacrp11の融合タンパク質を用いて、組換え宿主においてzacrp11を発現させること、および発現されたzacrp11を単離することができる。後述するように、特定のzacrp11融合タンパク質は、診断および治療にも使用できる。
【０１６４】
ある種の融合タンパク質は、組換え宿主細胞からzacrp11ポリペプチドを導くペプチドを含む。zacrp11ポリペプチドを真核生物宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列とも称される）がzacrp11発現ベクター中に提供される。分泌シグナル配列はzacrp11に由来する場合もあるが、適切なシグナル配列は別の分泌タンパク質に由来し得るか、または新規に合成され得る。分泌シグナル配列は、2つの配列が正しい読み枠で連結され、新規に合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くよう配置されるように、zacrp11コード配列に機能的に連結する。分泌シグナル配列は一般に、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'側に配置されるが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象のヌクレオチド配列の別の場所に配置され得る（例えば、Welch et al.、米国特許第5,037,743号；Holland et al.、米国特許第5,143,830号を参照のこと）。
【０１６５】
哺乳類細胞で産生されるzacrp11または他のタンパク質の分泌シグナル配列（例えば、米国特許第5,641,655号に記載されている組織型プラスミノーゲンアクチベーターのシグナル配列）は、組換え哺乳類宿主におけるzacrp11の発現に有用であるが、酵母細胞における発現には酵母のシグナル配列が好ましい。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母接合フェロモンα因子（MFα1遺伝子にコードされる）、インベルターゼ（SUC2遺伝子にコードされる）、または酸性ホスファターゼ（PHO5遺伝子にコードされる）に由来するシグナル配列である。例えば、Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast", DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), pages 123-167 (Oxford University Press 1995）を参照されたい。
【０１６６】
細菌細胞では、発現タンパク質の毒性を低減し、安定性を高め、また回収を増進させるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現させることが望ましい場合がある。例えばzacrp11は、グルタチオンS-トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質として発現させることができる。グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質は典型的に可溶性であり、固定化グルタチオンカラムで大腸菌溶解液から容易に精製することができる。同様のアプローチでは、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むzacrp11融合タンパク質を、アミロース樹脂カラムで単離することができ、また切断型プロテインA遺伝子のC末端を含む融合タンパク質を、IgG-セファロースを用いて精製することができる。異種ポリペプチドを融合タンパク質として細菌細胞中で発現させる確立された技法は、例えば、Williams et al., "Expression of Foreign Proteins in E.coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.).  pages 15-58 (Oxford University Press 1995）に記載されている。さらに、市販の発現系を利用することができる。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム（Promega Corporatiom；ウィスコンシン州、マディソン）は、発現中にビオチン化されるポリペプチドを含む融合タンパク質を、アビジンを含む樹脂によって単離する方法を提供する。
【０１６７】
原核生物または真核細胞で発現される異種ポリペプチドを単離するのに有用なペプチドタグには、ポリヒスチジンタグ（ニッケル-キレート樹脂に対する親和性を有する）、c-mycタグ、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーで単離される）、サブスタンスP、RYIRSタグ（抗RYIRS抗体と結合する）、Glu-Gluタグ、およびFLAGタグ（抗FLAG抗体と結合する）が含まれる。例えば、Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996)、Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996)、およびZheng et al., Gene 186:55 (1997)を参照されたい。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えばSigma-Aldrich Corporation（ミズーリ州、セントルイス）から入手することができる。
【０１６８】
融合タンパク質の別の形態は、zacrp11ポリペプチドおよび免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的に2つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが可変領域を欠くFc断片を含む。例として、Chang et al.、米国特許第5,723,125号では、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンFc断片を含む融合タンパク質について記載しており、インターフェロンのC末端はペプチドリンカー部分によりFc断片のN末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性なT細胞不活性配列を主に含むペプチドである。このような融合タンパク質において、例証となるFc部分は、溶液中で安定であり、かつ補体活性化活性をほとんどもたないヒトγ4鎖である。したがって本発明は、zacrp11部分のC末端がペプチドリンカーを介してFc断片のN末端に結合している、zacrp11部分およびヒトFc断片を含むzacrp11融合タンパク質を意図する。zacrp11部分は、zacrp11分子であってもその断片であってもよい。
【０１６９】
別の変形例では、zacrp11融合タンパク質は、IgG配列、IgG配列のアミノ末端に共有結合したzacrp11部分、およびzacrp11部分のアミノ末端に共有結合したシグナルペプチドを含み、IgG配列は以下の順序で以下のエレメントからなる：ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。したがって、IgG配列はCH1ドメインを欠いている。zacrp11部分は、zacrp11抗体と結合する能力など、本明細書に記載のzacrp11活性を示す。抗体部分と非抗体部分の両方を含む融合タンパク質を作製するこの一般的なアプローチは、LaRochelle et al., EP 742830（WO95/21258）に記載されている。
【０１７０】
zacrp11部分およびFc部分を含む融合タンパク質は、例えばインビトロアッセイ法のツールとして使用することができる。例えば、zacrp11-免疫グロブリン融合タンパク質を用いて生物試料中のzacrp11阻害剤の存在を検出することができ、この場合、zacrp11部分は基質または阻害剤を標的するために用いられ、プロテインAまたは抗Fc抗体などの高分子が、結合した融合タンパク質-受容体複合体を検出するために用いられる。さらに、このような融合タンパク質を用いて、zacrp11と基質の結合を妨げる分子を同定することができる。
【０１７１】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製して、成分を化学的に結合することによって、当技術分野で周知の方法で調製することができる。または、融合タンパク質の両成分を適切な読み枠でコードするポリヌクレオチドを既知の技法で作製して、本明細書に記載する方法で発現させることができる。融合タンパク質の酵素的切断および化学的切断の一般的な方法は、例えば、Ausubel (1995) pages 16-19〜16-25によって記載されている。
【０１７２】
zacrp11類似体およびzacrp11阻害剤
zacrp11類似体の1つの一般的なクラスは、本明細書に開示するアミノ酸配列の変異であるアミノ酸配列を有する変種である。別の一般的なクラスのzacrp11類似体は、後述するような、抗イディオタイプ抗体およびその断片によって提供される。さらに、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体を類似体として使用することができる（例えば、Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)を参照のこと）。抗イディオタイプzacrp11抗体の可変ドメインはzacrp11に似ているため、これらのドメインはzacrp11活性を提供し得る。抗イディオタイプ触媒性抗体を作製する方法は、当業者には周知である（例えば、Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992)、Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994)、およびAvalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)を参照のこと）。
【０１７３】
zacrp11類似体を同定する別のアプローチは、コンビナトリアルライブラリーの使用によって提供される。ファージディスプレイおよび他のコンビナトリアルライブラリーの構築法およびスクリーニング法は、例えば、Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996)、Verdine、米国特許第5,783,384号、Kay et al.、米国特許第5,747,334号、およびKauffman et al.、米国特許第5,723,323号によって提供される。
【０１７４】
溶液インビトロアッセイを用いて、zacrp11基質または阻害剤を同定することができる。また固相系を用いて、zacrp11ポリペプチドの基質または阻害剤を同定することもできる。例えば、zacrp11ポリペプチドまたはzacrp11融合タンパク質を、市販のバイオセンサー装置（BIACORE、Biacore AB；スウェーデン、ウプサラ）の受容体チップの表面に固定化することができる。この装置の使用については、例えば、Karlsson, Immunol. Methods 145:229 (1991)、およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554 (1993)により開示されている。
【０１７５】
簡潔に説明すると、zacrp11ポリペプチドまたは融合タンパク質を、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内で金フィルムに結合しているデキストラン繊維に共有結合させる。次いで、試験試料をセルに通す。zacrp11基質または阻害剤が試料中に存在すれば、それが固定化されたポリペプチドまたは融合タンパク質に結合して、媒体の屈折率に変化をもたらし、この変化が金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系により、結合親和性を計算し得る元となるオン速度およびオフ速度の決定、ならびに結合化学量論およびzacrp11変異の速度効果の評価が可能となる。この系を用いて、抗体-抗原の相互作用、および他の相補物/抗相補物対の相互作用を調べることもできる。
【０１７６】
培養細胞におけるzacrp11ポリペプチドの産生
完全長ポリペプチド、機能断片、および融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って組換え宿主細胞において作製することができる。zacrp11遺伝子を発現させるには、ポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにおいて転写発現を制御する調節配列に機能的に連結し、次いでこれを宿主細胞に導入しなければならない。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、翻訳調節配列、および発現ベクターを有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含み得る。
【０１７７】
真核細胞における外来タンパク質の産生に適した発現ベクターは典型的に、(1) 細菌宿主における発現ベクターの増殖および選択を提供するための細菌の複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードする、原核生物のDNAエレメント；(2) プロモーターなどの、転写の開始を制御する真核生物のDNAエレメント；および（3）転写終結配列/ポリアデニル化配列などの、転写産物のプロセシングを制御するDNAエレメントを含む。上述したように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導く分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、zacrp11発現ベクターは、zacrp11遺伝子、およびzacrp11遺伝子または別の分泌遺伝子に由来する分泌配列を含み得る。
【０１７８】
本発明のzacrp11タンパク質は、哺乳類細胞で発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎細胞（Vero；ATCC CRL 1587）、ヒト胚腎細胞（293-HEK；ATCC CRL 1573）、ベビーハムスター腎細胞（BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314）、イヌ腎細胞（MDCK；ATCC CCL 34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44（Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986））、ラット下垂体細胞（GE1；ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝細胞癌細胞（H-4-II-E；ATCC CRL 1548）、SV40形質転換サル腎細胞（COS-1；ATCC CRL 1650）、およびマウス胚細胞（NIH-3T3；ATCC CRL 1658）が含まれる。
【０１７９】
哺乳類宿主の場合、転写および翻訳の調節シグナルは、調節シグナルが高レベルで発現する特定の遺伝子と関連しているアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどのウイルス供給源に由来し得る。適切な転写および翻訳の調節配列は、アクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネインの遺伝子などの哺乳類遺伝子からも得ることができる。
【０１８０】
転写調節配列は、RNA合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)）、ヘルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight, Cell 31:355 (1982)）、SV40初期プロモーター（Benoist et al., Nature 290:304 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)）、サイトメガロウイルスプロモーター（Foecking et al., Gene 45:101 (1980)）、およびマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（一般的には、Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照のこと）が含まれる。
【０１８１】
または、原核生物プロモーターが真核生物のプロモーターによって調節される場合には、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターなどの原核生物プロモーターを用いて、哺乳類細胞におけるzacrp11遺伝子発現を制御することができる（Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990)、およびKaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)）。
【０１８２】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、微粒子銃を介した送達、エレクトロポレーションなどを含む種々の標準的な技法を用いて、宿主細胞に導入することができる。好ましくは、トランスフェクションされた細胞を選択して増殖させることで、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞が得られる。ベクターを真核細胞に導入する技法および優性選択マーカーを用いてそのような安定形質転換体を選択する技法は、例えば、Ausubel (1995)、およびMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)によって記載されている。
【０１８３】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を提供する遺伝子である。この場合、選択はG-418などのネオマイシン系薬剤の存在下で行われる。選択系を用いて関心対象の遺伝子の発現レベルを増大させることもでき、この過程は「増幅」と称される。増幅は、形質転換体を低レベルの選択薬剤の存在下で培養し、次いで選択薬剤を増量して、導入遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択することで行われる。例示的な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素である。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる。または、緑色蛍光タンパク質または細胞表面タンパク質（例えば、CD4、CD8、クラスI MHC、および胎盤アルカリホスファターゼ）などの、表現型の変化を導入するマーカーを用いて、FACS選別または磁気ビーズ分離技術のような手段により、トランスフェクションされていない細胞からトランスフェクションされた細胞を選別することができる。
【０１８４】
zacrp11ポリペプチドはまた、ウイルス送達系を用いて培養細胞によって産生され得る。この目的における例示的なウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）が含まれる。2本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは、現在最も詳しく研究されている異種核酸送達用の遺伝子移入ベクターである（総説に関しては、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)、およびDouglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)を参照のこと）。アデノウイルス系の利点には、比較的長いDNA挿入物を収容できること、高力価になるまで増殖可能なこと、広範囲の哺乳類細胞種に感染可能なこと、および種々のプロモーターを含む多くの利用可能なベクターとの使用を可能とする柔軟性が含まれる。
【０１８５】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることで、異種DNAのより大きな挿入物（最長7 kb）を収容することができる。これらの挿入物は、直接連結によって、または同時にトランスフェクションしたプラスミドとの相同組換えによって、ウイルスDNAに取り込まれ得る。1つの選択肢はウイルスベクターから必須のE1遺伝子を欠失させることであって、その結果ウイルスベクターは、E1遺伝子が宿主細胞から提供されない限り、複製することができない。例えば、アデノウイルスベクターを感染させたヒト293細胞（ATCC No. CRL-1573、45504、45505）を、接着細胞として、または比較高い密度の懸濁培養で培養し、かなりの量のタンパク質を産生させることができる（Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)を参照のこと）。
【０１８６】
zacrp11遺伝子は、鳥類、真菌、昆虫、酵母、または植物細胞などの他の高等真核細胞で発現させることもできる。バキュロウイルス系は、クローニングされたzacrp11遺伝子を昆虫細胞に導入するための有効な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcMNPV）に基づき、ショウジョウバエ（Drosophila）熱ショックタンパク質（hsp）70プロモーター、Autographa californica核多角体病ウイルスの前初期遺伝子プロモーター（ie-1）および後発型初期39Kプロモーター、バキュロウイルスp10プロモーター、ならびにショウジョウバエメタロチオネインプロモーターなどの既知プロモーターを含む。組換えバキュロウイルスを作製する第2の方法では、Luckow（Luckow  et al., J. Virol. 67:4566 (1993)）によって記載されているトランスポゾンに基づく系を利用する。送達ベクターを利用するこの系は、BAC-to-BACキットとして販売されている（Life Technologies、メリーランド州、ロックビル）。この系では、「バクミド（bacmid）」と称される大型プラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムに、zacrp11ポリペプチドをコードするDNAを移動させるTn7トランスポゾンを含む送達ベクター、PFASTBAC（Life Technologies）を利用する。例えば、Hill-Perkins and Possee., J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (19949、およびChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照されたい。さらに、送達ベクターは、発現されるzacrp11ポリペプチドのC末端またはN末端におけるエピトープタグをコードするDNAとの読み枠の合った融合物を含み得り、タグは例えばGlu-Gluエピトープタグ（Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)）である。当技術分野で周知の技法により、zacrp11遺伝子を含む送達ベクターで大腸菌を形質転換し、組換えバキュロウイルスの指標となる中断されたlacZ遺伝子を含むバクミドのスクリーニングを行う。次いで、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAを、通常の技法で単離する。
【０１８７】
例示的なPFASTBACベクターは、かなりの程度まで改変することができる。例えば、ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現され、分泌タンパク質の発現に有利なことが示されているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター（Pcor、p6.9、またはMPプロモーターとしても知られている）と置換することができる（例えば、Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、およびChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照のこと）。このような送達ベクター構築物では、短いまたは長い種類の塩基性タンパク質プロモーターを使用することができる。さらに、天然のzacrp11分泌シグナル配列を昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列で置換する送達ベクターを構築することができる。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチメリチン（Invitrogen Corporation；カリフォルニア州、カールズバッド）、またはバキュロウイルスgp67（PharMingen：カリフォルニア州、サンディエゴ）に由来する分泌シグナル配列を構築物において使用し、天然のzacrp11分泌シグナル配列を置換することができる。
【０１８８】
組換えウイルスまたはバクミドは、宿主細胞をトランスフェクションするために使用される。適切な昆虫宿主細胞には、Sf9（ATCC CRL 1711）、Sf21AE、およびSf21（Invitrogen Corporation；カリフォルニア州、サンディエゴ）などのヨトウガ（Spodoptera frugiperda）蛹卵巣細胞株IPLB-Sf-21由来細胞株、ならびにショウジョウバエSchneider-2細胞、およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来HIGH FIVEO細胞株（Invitrogen）（米国特許第5,300,435号）が含まれる。市販の無血清培地を使用して、これらの細胞を培養および維持することができる。適切な培地は、Sf9細胞用のSf900 II（商標）（Life Technologies）またはESF 921（商標）（Expression Systems）；およびイラクサギンウワバ細胞用のEx-cellO405（商標）（JRH Biosciences、カンザス州、レネクサ）またはExpress FiveO（商標）（Life Technologies）である。組換えウイルスを使用する場合、細胞は典型的に約2〜5×105細胞の播種密度から1〜2×106細胞の密度まで増殖させ、その時点で組換えウイルス保存液を0.1〜10、より典型的には約3の感染効率（MOI）で添加する。
【０１８９】
バキュロウイルス系で組換えタンパク質を産生させるための確立された技法は、Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 （The Humana Press, Inc. 1991）、Patel et al., "The baculovirus expression system", DNA Cloning 2: Expressions Systems. 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995）、Ausubel (1995) pages 16-37〜16-57, Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995）、およびLucknow, "Insect Cell Expression Technology", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.) pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996）によって提供されている。
【０１９０】
酵母細胞を含む真菌細胞を用いて、本明細書に記載の遺伝子を発現させることもできる。この点において特に関心がある酵母には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）が含まれる。酵母における発現に適したプロモーターには、GAL1（ガラクトース）、PGK（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ADH（アルコール脱水素酵素）、AOX1（アルコールオキシダーゼ）、HIS4（ヒスチジノール脱水素酵素）などのプロモーターが含まれる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手することができる。これらのベクターには、YIpに基づくベクター（YIp5など）、YRpベクター（YRp17など）、YEpベクター（YEp13など）、およびYCpベクター（YCp19など）が含まれる。外因性DNAでS. セレビシエ細胞を形質転換し、それらから組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasaki et al.、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Welch et al.、米国特許第5,037,743号、およびMurray et al.、米国特許第4,845,075号によって開示されている。形質転換細胞は、通常、薬剤耐性かまたは特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で増殖する能力である選択マーカーによって判定される表現型で選択される。サッカロミセス・セレビシエで使用するための例示的なベクター系は、グルコース含有培地中での増殖によって形質転換細胞を選択できる、Kawasaki et al.（米国特許第4,931,373号）によって開示されているPOT1ベクター系である。酵母での使用に適したさらなるプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsman et al、米国特許第4,615,974号、およびBitter、米国特許第4,977,092号を参のこと）およびアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが含まれる。米国特許第号4,990,446号、米国特許第5,063,154号、米国特許第5,139,936号、および米国特許第4,661,454号もまた参照されたい。
【０１９１】
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、黒穂菌（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギリエルモンジイ（Pichia guillermondii）、およびカンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）を含む他の酵母の形質転換系も、当技術分野において周知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986)、およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス属（Aspergillus）細胞は、McKnight et al.、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用することができる。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法は、Sumino et al.、米国特許第5,162,228号によって開示されている。ニューロスポラ属（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号によって開示されている。
【０１９２】
例えば、組換えタンパク質を産生させる宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、Raymond、米国特許第5,716,808号、Raymond、米国特許第5,736,383号、Raymond et al.、Yeast 14:11-23 (1998)、および米国特許第5,955,349号、米国特許第5,888,768号、米国特許第6,001,597号、米国特許第第5,965,389号、米国特許第5,736,383号、米国特許第5,854,039号によって開示されている。P. メタノリカの形質転換に使用するDNA分子は通常、二本鎖の環状プラスミドとして調製され、好ましくは線状化してから形質転換に使用する。P. メタノリカでポリペプチドを産生させる場合、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、P. メタノリカアルコール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）などのP. メタノリカ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターであることが好ましい。他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）遺伝子、ギ酸脱水素酵素（FMD）遺伝子、およびカタラーゼ（CAT）遺伝子のプロモーターが含まれる。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するには、プラスミドの発現セグメント全体が、両末端において宿主DNA配列と隣接していることが好ましい。ピキア・メタノリカで使用するための例示的な選択マーカーは、ホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC；EC 4.1.1.21）をコードし、アデニンの非存在下でade2宿主細胞の増殖を可能とする、P. メタノリカADE2遺伝子である。メタノールの使用を最小限に抑えることが望ましい大規模な産業工程の場合には、両メタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠損している宿主細胞を使用することが好ましい。分泌タンパク質を産生させる場合には、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP4およびPRB1）が欠損している宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションによって、関心対象のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドのP. メタノリカ細胞への導入が促進される。P. メタノリカ細胞は、指数関数的に減衰するパルス電場を用いるエレクトロポレーション（電界強度が2.5〜4.5 kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cm、また時定数（t）が1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒）により形質転換することができる。
【０１９３】
発現ベクターは、植物プロトプラスト、植物体の組織、または単離された植物細胞に導入することもできる。発現ベクターを植物組織に導入する方法には、植物組織のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いた直接感染または共培養、微粒子を介した銃送達、DNA注入、エレクトロポレーションなどが含まれる。例えば、Horsch et al., Science 227:1229 (1985)、Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)、およびMiki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993）を参照されたい。
【０１９４】
または、原核生物宿主細胞においてzacrp11遺伝子を発現させることができる。zacrp11ポリペプチドを原核生物宿主で発現させるために使用できる適切なプロモーターは当業者には周知であり、これには、T4、T3、Sp6、およびT7ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、バクテリオファージλのPRおよびPLプロモーター、大腸菌のtrp、recA、熱ショック、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA、およびlacZプロモーター、枯草菌（B. subtilis）のプロモーター、バシラス属（Bacillus）のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセス属（Streptomyces）プロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターが含まれる。原核生物のプロモーターについては、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987）、およびAusubel et al. (1995)により概説されている。
【０１９５】
有用な原核生物宿主には、大腸菌および枯草菌が含まれる。大腸菌の適切な株には、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF'、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、およびER1647が含まれる（例えば、Brown (ed.),  Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991）を参照のこと）。枯草菌の適切な株には、BR151、YB886、MI119、MI120、およびB170が含まれる（例えば、Hardy, "Bacillus Cloning Methods", DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)を参照のこと）。
【０１９６】
zacrp11ポリペプチドを大腸菌などの細菌で発現させる場合、ポリペプチドは、典型的に不溶性の顆粒として細胞質中に維持され得るか、または細菌の分泌配列によって細胞膜周辺腔に向けられ得る。前者の場合は、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性させる。次いで、尿素、および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析を行い、次に緩衝生理食塩水溶液に対する透析を行うなどして、変性剤を希釈することにより、変性ポリペプチドを再び折りたたんで二量体化することができる。後者の場合は、細胞を（例えば、超音波処理または浸透圧ショックによって）破砕して細胞膜周辺腔の内容物を放出させ、タンパク質を回収することにより、変性および再折りたたみ段階を必要とすることなく、細胞膜周辺腔からポリペプチドを可溶型でかつ機能的形態で回収することができる。
【０１９７】
タンパク質を原核生物宿主で発現させる方法は、当業者には周知である（例えば、Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995）、Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995）、およびGeorgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照のこと）。
【０１９８】
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫、および植物の細胞に導入する標準的な方法は、例えばAusubel (1995)によって提供されている。哺乳類細胞系が産生する外来タンパク質を発現させて回収する一般的な方法は、例えば、Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)によって提供されている。細菌系によって産生されたタンパク質を回収する標準的な技法は、例えば、Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E.coli cells", DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995）によって提供されている。組換えタンパク質をバキュロウイルス系から単離する確立された方法は、Richardson (ed.),  Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)によって記載されている。
【０１９９】
別の方法として、本発明のポリペプチドは、専用の固相合成、部分固相法、断片濃縮、または古典的な溶液合成により合成することができる。これらの合成法は当業者には周知である（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)、Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)、Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)、Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)、Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)、およびLloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。「化学的連結法（native chemical ligation）」および「発現タンパク質連結法」などの、全体的な化学合成戦略の変形もまた標準的である（例えば、Dawson et al., Science 266:776 (1994)、Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997)、Muir et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998)、およびSeverinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)を参照のこと）。
【０２００】
zacrp11ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して少なくとも約80%の純度まで、少なくとも約90%の純度まで、少なくとも約95%の純度まで、または95%を超える純度まで精製することができ、また感染物質および発熱物質を含まない。本発明のポリペプチドはまた、99.9%を超える純度である薬学的に純粋な状態まで精製することもできる。ある種の精製ポリペプチド調製物は、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０２０１】
分画法および/または従来の精製法を用いて、天然源から精製されたzacrp11の調製物、ならびに組換え宿主細胞から精製された組換えzacrp11ポリペプチド、および融合zacrp11ポリペプチドを得ることができる。一般に、試料の分画には、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出が用いられ得る。例示的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC、および逆相高速液体クロマトグラフィーを含み得る。適切なクロマトグラフィー用媒体には、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、専用のシリカなどが含まれる。PEI、DEAE、QAE、およびQの誘導体が好ましい。例示的なクロマトグラフィー用媒体には、Phenyl-Sepharose FF（Pharmacia）、Toyopearl butyl 650（Toso Haas、ペンシルバニア州、モンゴメリービル）、Octyl-Sepharose（Pharmacia）などの、フェニル基、ブチル基、もしくはオクチル基で誘導体化された媒体；またはAmberchrom CG 71（Toso Haas）などのポリアクリル樹脂が含まれる。適切な固相支持体には、使用時の条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などが含まれる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、および/または炭水化物部分でのタンパク質の結合を可能にする反応基で修飾することができる。
【０２０２】
カップリング化学の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル誘導体およびアミノ誘導体が含まれる。これらのおよび他の固体媒体は当技術分野において周知であって、広く使用されており、また業者から入手することができる。ポリペプチドを単離および精製するための特定の方法の選択は、常用的な設計の問題であり、一つには選択した支持体の性質によって決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology、1988）、およびDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照されたい。
【０２０３】
zacrp11の単離および精製のさらなる変形例を当業者は考案することができる。例えば、下記の通りに得られた抗zacrp11抗体を用いて、免疫アフィニティー精製により大量のタンパク質を単離することができる。
【０２０４】
本発明のポリペプチドはまた、特定の性質を利用して単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーにより、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質を含む、ヒスチジンに富んだタンパク質を精製することができる。簡潔に説明すると、最初にゲルに二価金属イオンを充填し、キレートを形成する（Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)）。ヒスチジンに富んだタンパク質は、使用した金属イオンに依存して様々な親和性でこの基質に吸着され、競合溶出、pHの低下、または強力なキレート剤の使用で溶出される。他の精製法には、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が含まれる（M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)）。本発明のさらなる態様では、関心対象のポリペプチドとアフィニティータグ（例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）との融合物を構築することで、精製が促進され得る。
【０２０５】
zacrp11ポリペプチドまたはその断片はまた、上記のように化学合成により調製することもできる。zacrp11ポリペプチドは、単量体の場合もあれば多量体の場合もあり；グリコシル化される場合もあればグリコシル化されない場合もあり；PEG化される場合もあればPEG化されない場合もあり；最初のメチオニンアミノ酸残基を含む場合もあれば含まない場合もある。
【０２０６】
本発明はまた、zacrp11ポリペプチドがポリマーと連結された、化学的に修飾されたzacrp11組成物も意図する。典型的にポリマーは水溶性であり、そのためzacrp11複合体は生理環境などの水性環境で沈殿しない。適切なポリマーの例は、アシル化用の活性エステルまたはアルキル化用のアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾されたポリマーである。このようにすることで、重合の程度を制御することができる。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノ-(C1〜C10)アルコキシ、もしくはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Harris et al.、米国特許第5,252,714号を参照のこと）。このようなポリマーは、分枝状であっても非分枝状であってもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いてzacrp11複合体を作製することができる。
【０２０７】
治療に用いられるzacrp11複合体は、好ましくは薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含むべきである。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1〜C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシPEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマーが含まれる。適切なPEGは、例えば5,000、12,000、20,000、および25,000を含む約600〜約60,000の分子量を有し得る。zacrp11複合体はまた、このような水溶性ポリマーの混合物も含み得る。抗zacrp11抗体または抗イディオタイプ抗体もまた、水溶性ポリマーと結合させることができる。
【０２０８】
本発明は、本明細書に記載のペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を意図する。このような組成物はさらに担体を含み得る。担体は、従来の有機担体または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０２０９】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明の特定の態様において、ポリペプチドは、これらのアミノ酸配列の20、30、40、50、100、またはそれ以上の連続した残基を含む。さらなるポリペプチドは、配列番号:2のそのような領域の少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも40個、または少なくとも50個の連続したアミノ酸を含み得る。そのようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブとして有用である。
【０２１０】
zacrp11タンパク質に対する抗体の産生
zacrp11に対する抗体は、例えばzacrp11発現ベクターの産物、または天然源から単離されたzacrp11を抗原として使用することで得ることができる。特に有用な抗zacrp11抗体は、zacrp11と「特異的に結合する」。抗体は、抗体が以下の2つの特徴の少なくとも1つを示す場合に、特異的に結合するとみなされる：(1) 抗体がzacrp11と結合活性の閾値レベルで結合する、および(2) 抗体がzacrp11に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【０２１１】
第1の特徴に関しては、抗体は、zacrp11ポリペプチド、ペプチド、またはエピトープと106 M-1またはそれ以上、好ましくは107 M-1またはそれ以上、より好ましくは108 M-1またはそれ以上、また最も好ましくは109 M-1またはそれ以上の結合親和性（Ka）で結合する場合に、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード解析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)）によって、当業者により容易に決定することができる。第2の特徴に関しては、抗体は、例えば抗体が標準的なウェスタンブロット解析でzacrp11を検出するが、既知の関連ポリペプチドを検出しない場合に、関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。既知の関連ポリペプチドの例は、オルソログ、およびタンパク質ファミリーのメンバーである同じ種に由来するタンパク質である。
【０２１２】
抗zacrp11抗体は、抗原性zacrp11エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドを用いて作製することができる。本発明の抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2に含まれる少なくとも9個、好ましくは15〜約30個のアミノ酸の配列を含む。しかし、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までを含む任意の長さを含む、本発明のアミノ酸配列のより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチドも、zacrp11と結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ含有ペプチドのアミノ酸配列が、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択されることが望ましい（すなわち、配列は比較的親水性の残基を含み、疎水性残基は好ましくは回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列も抗体産生に望ましい場合がある。
【０２１３】
例として、zacrp11の潜在的な抗原部位は、LASERGENE（DNASTAR；ウィスコンシン州、マディソン）のPROTEANプログラム（バージョン3.14）で実行されるJameson-Wolf法（Jameson and Wolf, CABIOS 4:181 (1988)）によって同定された。この解析では、初期設定パラメータが使用された。
【０２１４】
Jameson-Wolf法では、タンパク質構造予測の6つの主要なサブルーチンを組み合わせることで、潜在的な抗原決定基を推定する。簡潔に説明すると、最初にHopp-Woods法（Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981)）を用いて、局所的親水性が最も高い領域を示すアミノ酸配列を同定する（パラメータ：平均7残基）。第2段階では、Eminiによる方法（Emini et al., J. Virology 55:836 (1985)）で表面確率を計算する（パラメータ：表面決定閾値（0.6）＝1）。第3に、Karplus-Schultz法（Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985)）により主鎖の柔軟性を推定する（パラメータ：柔軟性閾値（0.2）＝1）。解析の第4および第5段階では、Chou-Fasmanの方法（Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), pages 549-586 (Plenum Press 1990）)およびGarnier-Robsonの方法（Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978)）を用いて、二次構造推定をデータに適用する（Chou-Fasmanパラメータ：高次構造表＝64タンパク質；α領域閾値＝103；β領域閾値＝105；Garnier-Robsonパラメータ：αおよびβ決定定数＝0）。第6のサブルーチンでは、柔軟性パラメータと疎水性親水性指標/溶媒近接因子を組み合わせて、「抗原指標」と命名された表面輪郭値を決定する。最後に、内部領域に対する表面領域の運動に由来するさらなる自由エネルギーを説明するために、各ピーク値の20、40、60、または80%を加えることによって、主要な表面ピークを拡張するピーク拡張関数を抗原指標に適用する。しかし、らせん状領域は柔軟性に劣る傾向があるため、この計算はらせん状領域中に存在する任意の主要ピークには適用しない。
【０２１５】
組換えzacrp11タンパク質、または天然源から単離されたzacrp11に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法により調製することができる。抗体はまた、Burrs and McMahon, Exp. Cell. Res. 220:363 (1995)によって記載されている方法と同様の、zacrp11-グルタチオントランスフェラーゼ融合タンパク質を用いても作製することもできる。ポリクローナル抗体を作製する一般的な方法は、例えば、Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)、およびWilliams et al., "Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 15 (Oxford University Press 1995)によって記載されている。
【０２１６】
zacrp11ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを使用することで増大させることができる。免疫化に有用なポリペプチドは、zacrp11またはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合体などの融合ポリペプチドも含む。ポリペプチド免疫原は、完全長分子である場合もあれば、またはその一部である場合もある。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合には、免疫化のためにこのような部分を高分子担体（キーホールリンペットヘモシニアン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、または破傷風トキソイドなど）と有利に結合または連結することができる。
【０２１７】
ポリクローナル抗体は典型的に、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、またはヒツジなどの動物で産生されるが、本発明の抗zacrp11抗体は類人猿の抗体に由来してもよい。診断上および治療上有用な抗体をヒヒで作製する一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.、国際公開公報第91/11465号、およびLosman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)に見い出すことができる。
【０２１８】
または、例えばzacrp11活性を中和するための中和モノクローナル抗体といった、モノクローナル抗zacrp11抗体を作製することができる。特定抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により得ることができる（例えば、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)、Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol.1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991）［"Coligan"］、Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 93 (Oxford University Press 1995)を参照のこと）。
【０２１９】
簡潔に説明すると、zacrp11遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を採取してBリンパ球を取得し、Bリンパ球と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することで、モノクローナル抗体を得ることができる。
【０２２０】
さらに、本発明の抗zacrp11抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来してもよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖の座位のエレメントが、内因性重鎖および軽鎖の座位の標的破壊を含む胚幹細胞株に由来するマウスの系列に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを使用してヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)によって記載されている。
【０２２１】
モノクローナル抗体は、種々の既知の技法により、ハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離法には、プロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる（例えば、Coligan, pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3；Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照のこと）。
【０２２２】
特定の用途に関しては、抗zacrp11抗体の断片を調製することが望ましい場合がある。このような抗体断片は、例えば抗体のタンパク質加水分解によって得ることができる。抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例として、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素切断しF(ab')2と称される5S断片を提供することで、作製され得る。この断片をチオール還元剤でさらに切断することで、3.5S Fab'一価断片を作製することができる。任意に、ジスルフィド結合の切断で生じるスルフヒドリル基に対する保護基を用いて、切断反応を実施することができる。別の方法として、ペプシンによる酵素切断により、2つの一価Fab断片およびFc断片が直接得られる。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960)、Porter, Biochem. J. 73:119 (1959)、Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967)、およびColigan, pages 2.8.1-2.8.10および2.10.-2.10.4によって記載されている。
【０２２３】
断片が、完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいて、重鎖の分離による一価の軽鎖-重鎖断片の形成、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技法などの他の抗体切断法を用いることも可能である。
【０２２４】
例えば、Fv断片はVH鎖とVL鎖の結合を含む。この結合は、Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)によって記載されているように、非共有結合であってよい。または、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され得るか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質により架橋され得る（例えば、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照のこと）。
【０２２５】
Fv断片は、ペプチドリンカーで連結されたVH鎖およびVL鎖を含み得る。この1本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドで連結されたVHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することで調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、この発現ベクターは次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを伴う1本のポリペプチド鎖を合成する。scFvを作製する方法は、例えば、Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)により記載されている（Bird et al., Science 242:423 (1988)、Ladner et al.、米国特許第4,946,778号、Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)、およびSandhu、前記もまた参照のこと）。
【０２２６】
例として、インビトロでリンパ球をzacrp11ポリペプチドに曝露することによって、およびファージベクターまたは類似のベクターの抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって、scFvを得ることができる（例えば、固定化または標識zacrp11タンパク質またはペプチドを使用する）。潜在的なzacrp11ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージディスプレイ）または大腸菌などの細菌上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成などの多くの方法で得られ得る。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、リガンドもしくは受容体などのタンパク質もしくはポリペプチド、生体高分子もしくは合成高分子、または有機物質もしくは無機物質であり得る既知標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする技法は当技術分野で周知であり（Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Ladner et al.、米国特許第4,946,778号、Ladner et al.、米国特許第5,403,484号、Ladner et al.、米国特許第5,571,698号、およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)）、またランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.（カリフォルニア州、パロアルト）、Invitrogen Inc.（カリフォルニア州、サンディエゴ）、New England Biolabs, Inc.（マサチューセッツ州、ベバリー）、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から市販されている。本明細書に開示したzacrp11配列を用いてランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングすることで、zacrp11に結合するタンパク質を同定することができる。
【０２２７】
別の形態の抗体断片は、1つの相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することで得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される（例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991)、Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)、およびWard et al, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照のこと）。
【０２２８】
または、抗zacrp11抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体に由来してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からヒト可変ドメインに移すことによって作製される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基が、マウスの対応物のフレームワーク領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することで、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が回避される。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングする一般的な技法は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技法は、例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986)、Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)、Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993)、Sudhir (ed.),  Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995)、Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)、およびQueen et al.、米国特許第5,693,762号 (1997)によって記載されている。
【０２２９】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準的な技法により、抗zacrp11抗体または抗体断片を動物に免疫化することによって調製され得る。例えば、Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992)を参照されたい。また、Coligan, pages 2.4.1-2.4.7も参照されたい。または、上記の技法において抗zacrp11抗体または抗体断片を免疫原として用いることで、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を調製することもできる。別の方法では、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人猿の抗イディオタイプ抗体を、上記の技法で調製することができる。抗イディオタイプ抗体を作製する方法は、例えば、Irie、米国特許第5,208,146号、Greene et al.、米国特許第5,637,677号；およびVarthakavi and Minocha., J. Gen. Virol. 77:1875 (1996)によって記載されている。
【０２３０】
抗イディオタイプzacrp11抗体およびzacrp11ポリペプチドを用いて、zacrp11基質および阻害剤を同定および単離することができる。例えば、本発明のタンパク質およびペプチドをカラム上に固定化し、カラムに流した生物試料に由来する基質および阻害剤タンパク質を結合させることができる（Hermanson et al., (eds.), Immobilized Affinity Ligand Techniques, pages 195-202 (Academic Press 1992)）。また放射標識または親和標識したzacrp11ポリペプチドを用いて、生物試料中のzacrp11基質および阻害剤を同定すること、またはその位置を特定することができる（例えば、Deutscher (ed.), Methods in Enzymol., vol. 182, pages 721-37 (Academic Press 1990)；Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483 (1993)；Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167 (1984)を参照のこと）。
【０２３１】
zacrp11遺伝子発現を検出するため、およびzacrp11遺伝子構造を試験するためのzacrp11ヌクレオチド配列の使用
核酸分子を用いて、生物試料中のzacrp11遺伝子の発現を検出することができる。そのようなプローブ分子には、配列番号:1のヌクレオチド配列またはその断片を含む2本鎖核酸分子、および配列番号:1のヌクレオチド配列の相補物またはその断片を有する1本鎖核酸分子が含まれる。プローブ分子は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチドなどであってよい。
【０２３２】
基本的なアッセイ法では、1本鎖プローブ分子を、生物試料から単離されたRNAと共に、プローブと標的zacrp11 RNA種との塩基対形成を促進する温度およびイオン強度の条件下でインキュベートする。ハイブリダイズした分子から未結合のプローブを分離した後に、ハイブリッドの量を検出する。
【０２３３】
RNAを検出する確立されたハイブリダイゼーション法には、ノーザン解析およびドット/スロットブロットハイブリダイゼーションが含まれる（例えば、Ausubel (1995) pages 4-1〜4-27、およびWu et al. (eds.), "Analysis of Gene Expression at the RNA Level", Methods in Gene Biotechnology, pages 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。核酸プローブは、32Pまたは35Sなどの放射性同位体で検出可能に標識することができる。または、非放射性ハイブリダイゼーション法でzacrp11 RNAを検出することも可能である（例えば、Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes (Humana Press, Inc. 1993)を参照のこと）。典型的には、非放射性検出は、発色基質または化学発光基質の酵素的変換によって達成される。例示的な非放射性部分には、ビオチン、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンが含まれる。
【０２３４】
zacrp11オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断にも有用である。例として、18F標識オリゴヌクレオチドを対象に投与し、ポジトロン放出断層撮影法により可視化することができる（Tavitian et al., Nature Medicine 4:467 (1998)）。
【０２３５】
数多くの診断手順で、検出法の感度を高めるためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が利用されている。PCRを行う際の標準的な技法は周知である（一般的には、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991)、White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993)、Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996)、Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998)、Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998)、およびMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)を参照のこと）。
【０２３６】
診断アッセイ法に関するPCRの1つの変形例は、逆転写PCR（RT-PCR）である。RT-PCR法では、RNAを生物試料から単離し、cDNAに逆転写し、このcDNAをzacrp11プライマーと共にインキュベートする（例えば、Wu et al. (eds.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR", Methods in Gene Biotechnology, pages 15-28 (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。次いで、標準的な技法でPCRを行って産物を解析する。
【０２３７】
例として、RNAは、上記のグアニジン-チオシアネート細胞溶解法で生物試料から単離する。または、固相法により、細胞溶解液からmRNAを単離することもできる。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、短いdTホモポリマー、またはzacrp11アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたRNAからプライミングされ得る。オリゴdTプライマーには、対照標的配列を提供し得る様々なmRNAヌクレオチド配列が増幅されるという利点がある。zacrp11配列は、典型的に20塩基長である2つの隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
【０２３８】
PCR増幅産物は、様々なアプローチで検出することができる。例えば、PCR産物をゲル電気泳動で分画し、臭化エチジウム染色で可視化することができる。または、分画後のPCR産物をメンブレンに転写し、検出可能に標識されたzacrp11プローブとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィーで調べることができる。さらなる別のアプローチには、ジゴキシゲニン標識デオキシリボ核酸三リン酸の使用による化学発光の検出、およびC-TRAK比色アッセイが含まれる。
【０２３９】
zacrp11発現を検出する別のアプローチは、1本鎖DNA標的が過剰のDNA-RNA-DNAキメラプローブと結合して複合体を形成し、RNA部分がRNAase Hによって切断され、この切断されたキメラプローブの存在を確認するサイクリングプローブ技術（CPT）である（例えば、Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34:2985 (1996)、Bekkaoui et al., Biotechniques 20:240 (1996)を参照のこと）。zacrp11配列を検出する別の方法では、核酸配列に基づいた増幅（NASBA）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（CATCH）、およびリガーゼ連鎖反応（LCR）などのアプローチを利用することができる（例えば、Marshall et al.、米国特許第5,686,272号 (1997)、Dyer et al., J. Virol. Methods 60:161 (1996)、Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358 (1997)、およびChadwick et al., J. Virol. Methods 70:59 (1998)を参照のこと）。他の標準的な方法は当業者には周知である。
【０２４０】
zacrp11プローブおよびプライマーを使用して、組織試料中のzacrp11遺伝子発現を検出すること、およびその位置を特定することも可能である。そのようなインサイチューハイブリダイゼーションの方法は、当業者には周知である（例えば、Choo (ed.), In Situ Hybridization Protocols (Humana Press, Inc. 1994)、Wu et al. (eds.), "Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)", Methods in Gene Biotechnology, pages 259-278 (CRC Press, Inc. 1997)、およびWu et al. (eds.), "Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)", Methods in Gene Biotechnology, pages 279-289 (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。さらなる様々な診断アプローチが、当業者には周知である（例えば、Mathew (ed.),  Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991)、Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996)、およびElles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc., 1996)を参照のこと）。
【０２４１】
zacrp11ヌクレオチド配列を種々の疾患に関する連鎖に基づく試験に使用し、対象の染色体がzacrp11遺伝子に変異を含むかどうかを決定することができる。zacrp11遺伝子座において検出可能な染色体異常には、異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位変化、および再配列が含まれるが、これらに限定されない。特に関心があるのは、zacrp11遺伝子を不活化する遺伝子変化である。zacrp11座位に関連する異常は、本発明の核酸分子を用いて、制限断片長多型（RFLP）解析、PCR法を用いた短いタンデム反復（STR）解析、増幅-抵抗性突然変異システム解析（ARMS）、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）検出、RNase切断法、変性勾配ゲル電気泳動、蛍光支援ミスマッチ解析（FAMA）、および当技術分野において周知の他の遺伝子解析法などの分子遺伝学的技法で検出することができる（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991)、Marian, Chest 108:255 (1995)、Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996)、Elles (ed.) Morecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996)、Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996)、Birren et al., (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Habor Laboratory Press 1998)、Dracopoli et al.,  (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998)、およびRichards and Ward, "Molecular Diagnostic Testing", Principles of Molecular Medicine, pages 83-88 (Humana Presa, Inc. 1998)を参照のこと）。
【０２４２】
タンパク質切断試験もまた、翻訳終了変異がコードされるタンパク質の一部のみを生じる、遺伝子の不活化の検出に有用である（例えば、Stoppa-Lyonnet et al., Blood 91:3920 (1998)を参照のこと）。このアプローチに従って、生物試料からRNAを単離し、cDNAの合成に使用する。次いでPCRによりzacrp11標的配列を増幅し、かつRNAポリメラーゼプロモーター、翻訳開始配列、および読み枠の合ったATGトリプレットを導入する。RNAポリメラーゼを用いてPCR産物を転写し、その転写産物をT7と共役した網状赤血球溶解物系を用いてインビトロで翻訳する。次に、翻訳産物をSDS-PAGEで分画して、翻訳産物の長さを決定する。タンパク質切断試験については、例えば、Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, pages 9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998)によって記載されている。
【０２４３】
本発明は、zacrp11遺伝子発現の診断アッセイを行うため、または対象のzacrp11座位を解析するためのキットも意図する。このようなキットは、配列番号:1のヌクレオチド配列またはその断片を含む2本鎖核酸分子、および配列番号:1のヌクレオチド配列の相補物またはその断片を有する1本鎖核酸分子などの核酸プローブを含む。プローブ分子は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチドなどであってよい。キットは、PCRを行うための核酸プライマーを含み得る。このようなキットは、上記の核酸診断アッセイを行うために必要な要素をすべて含み得る。キットは、zacrp11プローブまたはプライマーを含む少なくとも1つの容器を含む。キットはまた、zacrp11配列の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第2の容器を含み得る。そのような指示薬の例には、放射性標識、蛍光色素、化学発光剤などの検出可能な標識が含まれる。キットはまた、zacrp11プローブおよびプライマーを用いてzacrp11遺伝子発現を検出する旨を使用者に伝える手段を含み得る。例えば、書面による指示書には、同梱された核酸分子を用いて、zacrp11をコードする核酸分子もしくはzacrp11コードヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を検出できること、またはzacrp11座位に関連した染色体配列を解析できることが記載され得る。書記情報は容器に直接記載され得るか、または添付文書の形態で提供され得る。
【０２４４】
本発明はまた、診断用途に役立つ試薬を提供する。例えば、zacrp11遺伝子、zacrp11 DNAもしくはRNAを含むプローブ、またはそれらのサブ配列を用いて、zacrp11遺伝子が第10染色体などのヒト染色体上に存在するかどうか、または遺伝子変異が生じているかどうかを判定することができる。zacrp11ゲノムDNAの一部を含むヒトゲノムDNAの断片の注釈づけによれば、zacrp11は第10染色体のp13領域に位置する。zacrp11遺伝子座位において検出可能な染色体異常には、異数性、遺伝子コピー数変化、ヘテロ接合性欠失（LOH）、転座、挿入、欠失、制限部位変化、および再配列が含まれるが、これらに限定されない。このような異常は、本発明のポリヌクレオチドを用いて、制限断片長多型（RFLP）解析、PCR法を用いた短いタンデム反復（STR）解析、および当技術分野において周知の他の遺伝子連鎖解析法などの分子遺伝学的技法で検出することができる（Sambrook et al.、前記；Ausubel et al.、前記；Marian, Chest 108:255-65, 1995）。
【０２４５】
遺伝子の位置に関する正確な知識は、以下を含む多くの目的に有用であり得る：(1) 配列が既存のコンティグの一部かどうかを判定し、YAC、BAC、またはcDNAクローンなどの様々な形態でさらなる周囲の遺伝子配列を得ること；(2) 同じ染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患の可能性のある候補遺伝子を提供すること；および(3) 特定の遺伝子がどのような機能を有するかを決定するのに役立つ、マウスなどのモデル生物を相互参照すること。
【０２４６】
zacrp11遺伝子は、第10染色体のp13領域に位置する（GenBankアクセッション番号AL353576を参照のこと）。機能が既知であるいくつかの遺伝子が、ヒトの疾患と関連しているこの領域にマップされている。このように、zacrp11遺伝子が染色体p13にマップされることから、本発明のzacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、第10染色体モノソミーおよび他の染色体p13欠失の存在を検出および診断することが可能であり、特に第10染色体モノソミーならびにp13における欠失および染色体異常（欠失、再配列、ならびに染色体の切断および転座を含む）は、腫瘍に関連する場合がある。このように、zacrp11遺伝子がこの重要な領域にマップされることから、本発明のzacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、上記疾患と関連する染色体の欠失、転座、および再配列を検出することができる。Online Mendellian Inheritance of Man（OMIM（商標）、National Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine、メリーランド州、ベテスダ）遺伝子マップ、およびこれに含まれるヒト第10染色体のこの領域に関する参考文献、ならびに公的に利用できるワールドワイドウェブのサーバー上のp13を参照されたい。これらはいずれも、zacrp11遺伝子と同じ染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患の可能性のある候補遺伝子となる。したがって、zacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、これらの欠陥に関連する異常または遺伝子型を検出することができる。
【０２４７】
診断は、疾患の種類および適切な関連療法の決定において、または遺伝カウンセリングの補助において、医師を補助し得る。したがって、本発明の抗zacrp11抗体、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドをzacrp11ポリペプチド、mRNA、または抗zacrp11抗体の検出に使用することで、マーカーとして作用し、また当技術分野で周知の方法および本明細書に記載する方法を用いて本明細書に記載する通りに、遺伝性疾患または癌の検出に直接使用することができる。さらに、zacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、染色体p13の欠失に関連する異常もしくは遺伝子型、第10染色体モノソミー、ならびに上記のようなヒト疾患に関連する転座、または腫瘍の悪性進行に関与する他の転座およびLOH、もしくは悪性腫瘍における染色体再配列；もしくは他の癌との関与が推定される他のp13変異を検出することができる。同様に、zacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、染色体p13トリソミーに関連する異常または遺伝子型、およびヒトの疾患もしくは自然流産に関連する染色体欠損を検出することができる。これらはいずれも、zacrp11遺伝子と同じ染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患の可能性のある候補遺伝子となる。したがって、zacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、これらの欠陥に関連する異常または遺伝子型を検出することができる。
【０２４８】
当業者は、zacrp11ポリヌクレオチドプローブが、ヘテロ接合性欠失（LOH）、染色体の獲得（例えば、トリソミー）、転座、染色体の欠損（モノソミー）、DNA増幅などに関連する第10染色体全体の異常の診断に特に有用であることを理解すると思われる。zacrp11遺伝子が位置する染色体座p13における転座は、ヒトの疾患に関連することが知られている。例えば、p13欠失、モノソミー、および転座は、上記の特定のヒト疾患に関連している。このように、zacrp11遺伝子がこの重要な領域にマップされることから、本発明のzacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、上記のp13の転座、欠失、およびトリソミーなどと関連する異常または遺伝子型を検出することができる。
【０２４９】
上記したように、zacrp11遺伝子それ自体の欠損は、遺伝性のヒトの病態をもたらし得る。本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド、および抗体などの本発明の分子は、zacrp11遺伝子欠損に関連する検出、診断、予防、および治療に役立つ。さらに、zacrp11ポリヌクレオチドプローブを用いて、zacrp11染色体座における罹患個体と非罹患個体間の対立遺伝子の差を検出することができる。したがって、zacrp11配列を、法医学的なDNAプロファイリングの診断として使用することができる。
【０２５０】
一般的に、患者の遺伝子異常を検出するために遺伝子連鎖解析で使用される診断方法は、当技術分野において周知である。解析プローブは一般的には少なくとも20 nt長であるが、幾分短いプローブを用いることも可能である（例えば、14〜17 nt）。PCRプライマーは、少なくとも5 nt長、好ましくは15 ntまたはそれ以上、より好ましくは20〜30 ntである。遺伝子または染色体DNAを全体的に解析するには、zacrp11ポリヌクレオチドプローブはエキソン全体またはそれ以上を含み得る。エキソンは、zacrp11配列（配列番号:1）とzacrp11のゲノムDNAを比較することで、当業者により容易に決定される。一般的に、患者の遺伝子異常を検出するために遺伝子連鎖解析で使用される診断方法は、当技術分野において周知である。大部分の診断方法は以下の段階を含む：(a) 潜在的罹患患者、罹患患者、または劣性疾患対立遺伝子の潜在的非罹患保因者から遺伝子試料を得る段階；(b) RFLP解析などにおいて、遺伝子試料をzacrp11ポリヌクレオチドプローブと共にインキュベートすることにより（ポリヌクレオチドは、相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする）、または適切なPCR反応条件下でのPCR反応において、遺伝子試料をセンスおよびアンチセンスプライマーと共にインキュベートすることにより、第1反応産物を生成する段階；(iii) 電気泳動、および/または第1反応産物をzacrp11ポリヌクレオチドプローブで可視化する（ポリヌクレオチドは、第1反応の相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする）などの他の周知の方法により、第1反応産物を可視化する段階；および(iv) 可視化した第1反応産物を、野生型患者による遺伝子試料の第2対照反応産物と比較する段階。
【０２５１】
第1反応産物と対照反応産物との相違は、罹患もしくは潜在的罹患患者における遺伝子異常、または非罹患患者についてのヘテロ接合性劣性保因者表現型の存在、または罹患患者の腫瘍における遺伝子欠損の存在、または胎児胚もしくは着床前胚における遺伝子異常の存在を示す。例えば、制限断片パターン、PCR産物の長さ、zacrp11遺伝子座における反復配列の長さなどの相違は、遺伝子異常、または正常野生型対照との対立遺伝子の相違を示す。対照は、試験および試料の利用性に応じて、罹患していない家族の一員または血縁関係のない個体に由来し得る。本発明において用いられる遺伝子試料には、患者由来の任意の組織、またはこれらに限定されないが血液、唾液、精液、胚細胞、羊水などの患者由来の他の生物試料から単離されたゲノムDNA、mRNA、およびcDNAが含まれる。ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーはRNAまたはDNAであってよく、配列番号:1の一部、配列番号:1の相補物、またはそれらのRNA同等物を含む。ヒト疾患表現型に対する遺伝子連鎖解析を示すそのような方法は、当技術分野において周知である。診断におけるPCRに基づく方法の参考文献に関しては、一般的に、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991)、White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc, 1993)、 Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996)、Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998)、Lo (ed.), Clinical Application of PCR (Humana Press, Inc. 1998)、およびMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)を参照されたい。
【０２５２】
zacrp11座位に関連する変異は、本発明の核酸分子を用いて、制限断片長多型解析、PCR法を用いた短いタンデム反復解析、増幅-抵抗性突然変異システム解析、一本鎖DNA高次構造多型検出、RNase切断法、変性勾配ゲル電気泳動、蛍光支援ミスマッチ解析、および当技術分野において周知の他の遺伝子解析法などの、標準的な直接変異解析法で検出することができる（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991)、Marian, Chest 108:255 (1995)、Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnositics (Human Press, Inc. 1996)、Elles (ed.) Morecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996)、Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996)、Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Habor Laboratory Press 1998)、Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998)、およびRichards and Ward, "Molecular Diagnostic Testing", Principles of Molecular Medicine, pages 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)を参照のこと）。突然変異に関するzacrp11遺伝子の直接解析は、対象のゲノムDNAを用いて行われ得る。例えば末梢血リンパ球から得られるゲノムDNAを増幅する方法は、当業者には周知である（例えば、Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, page 7.1.6-7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)を参照のこと）。
【０２５３】
zacrp11タンパク質を検出するための抗zacrp11抗体の使用
本発明は、zacrp11の存在に関して生物試料をインビトロでスクリーニングするための抗zacrp11抗体の使用を意図する。ある種のインビトロアッセイ法では、抗zacrp11抗体が液相で使用される。例えば、生物試料中のzacrp11の存在は、zacrp11とその抗体との結合を促進する条件下で、生物試料を微量の標識zacrp11および抗zacrp11抗体と混合することで試験することができる。試料中のzacrp11と抗zacrp11の複合体は、複合体を、Fc抗体またはブドウ球菌（Staphylococcus）プロテインAなどの、抗体と結合する固定化タンパク質と接触させることにより、反応混合物から分離することができる。生物試料中のzacrp11の濃度は、抗体に結合した標識zacrp11の量に反比例し、遊離の標識zacrp11の量に直接関連する。
【０２５４】
または、抗zacrp11抗体が固相担体に結合されているインビトロアッセイ法を行うことができる。例えば、抗体をアミノデキストランなどのポリマーに結合させることで、抗体を、ポリマーでコーティングされたビーズ、プレート、またはチューブなどの不溶性支持体に連結することができる。他の適切なインビトロアッセイ法は、当業者に容易に明らかとなる。
【０２５５】
別のアプローチでは、抗zacrp11抗体を用いて、生検試料から調製した組織切片中のzacrp11を検出することができる。このような免疫化学的検出を用いて、zacrp11の相対量を決定すること、および被験組織におけるzacrp11の分布を決定することができる。一般的な免疫化学的技法は、十分に確立されている（例えば、Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application", Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.),  pages 115-138 (IRL Press 1987)、Coligan, pages 5.8.1-5.8.8、Ausubel (1995) pages 14.6.1-14.6.13 (Wiley Interscience 1990)、およびManson (ed.),  Methods In Molecular Biology, Vol.10: Immunochemical Protocols (The Humana Press, Inc.1992)を参照のこと）。
【０２５６】
免疫化学的検出は、生物試料を抗zacrp11抗体と接触させ、次いでこの生物試料を、検出可能に標識された、抗体と結合する分子と接触させることで行い得る。例えば、検出可能に標識された分子は、抗zacrp11抗体と結合する抗体部分を含み得る。または、抗zacrp11抗体をアビジン/ストレプトアビジン（またはビオチン）と結合させ得り、検出可能に標識された分子はビオチン（またはアビジン/ストレプトアビジン）を含み得る。この基本技術の数多くの変形例が、当技術分野で周知である。
【０２５７】
または、抗zacrp11抗体を検出可能な標識と結合させて、抗zacrp11免疫複合体を形成することも可能である。適切な検出用標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、またはコロイド金が含まれる。このような検出可能に標識された免疫複合体を作製および検出する方法は糖業者には周知であり、以下にさらに詳述する。
【０２５８】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーで検出される放射性同位体であってよい。本発明の目的に特に有用な同位体は、3H、125I、131I、35S、32Pおよび14Cである。
【０２５９】
抗zacrp11免疫複合体は、蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識された抗体の存在は、免疫複合体を適切な波長の光に曝露し、生じる蛍光を検出することで判定される。蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、およびフルオレサミンが含まれる。
【０２６０】
または、抗zacrp11免疫複合体は、抗体成分を化学発光化合物に結合させることで検出可能に標識することができる。化学発光タグ化免疫複合体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することで決定される。化学発光標識化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、芳香性アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、ならびにシュウ酸エステルが含まれる。
【０２６１】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗zacrp11免疫複合体を標識することができる。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系において見られるある種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することで判定される。標識に有用な生物発光化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが含まれる。
【０２６２】
または、抗zacrp11免疫複合体は、抗zacrp11抗体成分を酵素と連結することで、検出可能に標識することができる。抗zacrp11酵素複合体を適切な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度手段、蛍光定量手段、または可視的手段によって検出され得る化合物部分を生じる。多特異的な免疫複合体を検出可能に標識するために用いられ得るな酵素の例には、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる。
【０２６３】
当業者は、本発明に従って使用可能な他の適切な標識を熟知していると考えられる。マーカー部分と抗zacrp11抗体との結合は、当技術分野で周知の標準的な技法により達成し得る。この関連での典型的な方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976)、Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977)、Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990)、Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990)、およびColigan、前記によって記載されている。
【０２６４】
さらに、免疫化学的検出の利便性および汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンと複合体を形成した抗zacrp11抗体を用いることで高めることができる（例えば、Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990)、およびBayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照のこと）。
【０２６５】
免疫測定を実施するための方法は十分に確立されている。例えば、Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 180-208 (Cambridge University Press, 1995)、Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、およびDiamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)を参照されたい。
【０２６６】
関連するアプローチにおいては、ビオチンまたはFTTC標識zacrp11を用いて、zacrp11と結合する細胞を同定し得る。そのような結合は、例えばフローサイトメトリーを用いて検出され得る。
【０２６７】
本発明は、zacrp11遺伝子発現の免疫学的診断アッセイを行うためのキットも意図する。このようなキットは、抗zacrp11抗体または抗体断片を含む少なくとも1個の容器を含む。キットはまた、zacrp11抗体または抗体断片の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第2の容器を含み得る。そのような指示薬の例には、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド金などの検出可能な標識が含まれる。キットはまた、zacrp11抗体または抗体断片を用いてzacrp11タンパク質を検出する旨を使用者に伝える手段を含み得る。例えば、書面による指示書には、同梱された抗体または抗体断片を用いて、zacrp11を検出できることが記載され得る。書記情報は容器に直接記載され得るか、または添付文書の形態で提供され得る。
【０２６８】
zacrp11ポリペプチドおよびポリペプチドの使用
zacrp11ポリペプチド、断片、融合体、アゴニスト、またはアンタゴニストを用いて、哺乳類におけるエネルギーバランスを調節すること、または内皮細胞を損傷から保護することができる。エネルギーバランスの調節に関して、zacrp11ポリペプチドは細胞の代謝反応の調節に役立ち得る。そのような代謝反応には、脂肪生成、糖新生、グリコーゲン分解、脂質生成、グルコース摂取、タンパク質合成、熱発生、酵素利用などが含まれる。zacrp11はまた、抗菌活性について評価され得る。zacrp11ポリペプチドを術前処置に使用して、虚血および/もしくは炎症または同様の過程による損傷を妨げることができる。zacrp11ポリペプチドはまた、神経伝達物質として、または神経伝達の調節物質として役立ち得る。この関連で、zacrp11ポリペプチドは、例えば脳などでの2-デオキシ−グルコース摂取によって実証されるように、栄養摂取の調節に役立ち得る。
【０２６９】
炎症とは、侵入物を回避するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性および体液性メディエータを含むカスケード事象である。一方では、炎症反応の制御は宿主を免疫抑制状態にし得る；しかし抑制されなければ、炎症は、慢性炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患など）、敗血性ショック、およ多臓器不全を含む重篤な合併症を引き起こし得る。重要なことには、これらの多様な病態は共通する炎症性メディエータを共有する。炎症によって特徴づけられる疾患は全体で、ヒトの罹病率および死亡率に大きく影響する。したがって、本明細書に記載するzacrp11ポリペプチド（例えば、ホモ三量体およびヘテロ三量体、六量体、九量体、および18量体、ならびにこれらの混合物を含むzacrp11ポリペプチド）、それらの断片、融合タンパク質、およびそれらに対する抗体などの、抗炎症抗体およびポリペプチドが、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血性ショックにまで及ぶ膨大な数のヒトおよび動物疾患に対して、重大な治療可能性を有することが明らかである。したがって、本発明の抗炎症zacrp11ポリペプチドの使用は、特に関節炎、内毒血症、炎症性腸疾患、乾癬、および関連疾患などの疾患において、例えばzacrp11アゴニスト/アンタゴニストとして治療に使用され得る。
【０２７０】
1. 関節炎
骨関節炎、関節リウマチ、損傷の結果としての関節炎関節などを含む関節炎は、本発明のzacrp11ポリペプチドの治療的使用から恩恵を受ける一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ（RA）は全身に影響を及ぼす全身性疾患であり、関節炎の最も多く見られる形態の1つである。関節リウマチは関節を裏打ちする膜の炎症によって特徴づけられ、これによって疼痛、硬直、発熱、発赤、および腫れが生じる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節内層、滑膜が侵入し、骨および軟骨に損傷を与え得り、いくつかある生理的影響の中でも特に関節変性および激しい痛みをもたらす。病変関節はその形状および配置構造を失い得り、疼痛および運動障害をもたらす。
【０２７１】
関節リウマチ（RA）は、特に、重度の障害および死亡率の上昇を引き起こす、炎症およびそれに続く組織損傷によって特徴づけられる免疫介在性疾患である。リウマチ様関節では、種々のサイトカインが局所的に産生される。2つの原型の炎症促進性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜炎症および進行性関節破壊に関与する機構において重要な役割を果たすことが、多くの研究から実証されている。実際に、RA患者にTNF-αおよびIL-1阻害剤を投与すると、炎症の臨床学的および生物学的徴候の飛躍的な改善、ならびに骨浸食および軟骨破壊の放射線学的徴候の低減が生じた。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、かなりの割合の患者がこれらの薬剤に応答せず、このことから、他のメディエータもまた関節炎の病態生理に関与していることが示唆される（Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002）。そのようなメディエータの1つは、例えば、関節リウマチおよび他の関節疾患における炎症を軽減する、調節する、または抑制するための価値ある治療薬として作用し得るzacrp11である可能性がある。
【０２７２】
当技術分野において周知である関節リウマチの動物モデルがいくつか存在する。例えば、コラーゲン誘導性関節炎（CIA）モデルでは、マウスはヒトの関節リウマチに非常によく似た慢性炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと類似の免疫学的特徴および病理学的特徴を共有するため、CIAモデルは潜在的なヒト抗炎症化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。CIAモデルは、免疫反応および炎症反応の両方に依存して存在する、マウスのよく知られたモデルである。免疫応答は、抗原として与えられ、抗コラーゲン抗体の産生を導くコラーゲンに応答したB細胞とCD4＋ T細胞の相互作用を含む。炎症段階は、マウスの生来のコラーゲンと交差反応し、補体カスケードを活性化するこれらの抗体のいくつかの結果としての、炎症のメディエータによる組織応答の結果である。CIAモデルを用いることの利点は、病因の基本的機構が既知である点である。II型コラーゲン上の関連するT細胞およびB細胞エピトープは同定されており、また免疫介在性関節炎に関連する種々の免疫学的パラメータ（例えば、遅延性型過敏症および抗コラーゲン抗体）および炎症パラメータ（例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解酵素）が決定されており、したがってこれらを用いてCIAモデルにおける試験化合物の有効性を評価することができる（Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999；Williame et al., Immunol. 89:9784-788, 1992；Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997；およびWang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995）。
【０２７３】
本発明のzacrp11含有ポリペプチドをこれらのCIAモデルマウスに投与することで、症状を改善し、疾患経過を変更するためのzacrp11の使用を評価することができる。免疫反応および炎症反応を調節する分子として、zacrp11は関節リウマチの病因に関連するSAAの産生を誘導し得り、zacrp11はインビトロおよびインビボでSAA活性を低下させ得るため、zacrp11含有ポリペプチドの全身投与または局所投与により、RAなどにおける炎症反応を潜在的に抑制することができる。
【０２７４】
2. 内毒血症
内毒血症は、通常、細菌および他の感染病原体などの病原菌、敗血症、毒性ショック症候群に起因するか、または日和見感染などにさらされた免疫不全患者における重症状態である。治療上有用な本発明のzacrp11ポリペプチドは、内毒血症の予防および処置を支援して、ヒトおよび動物における内毒血症の炎症および病理学的影響を低減し得る。
【０２７５】
リポ多糖（LPS）により誘発される内毒血症は、感染症において病理学的影響を生じる多くの炎症促進性メディエータを作動させ、またげっ歯類におけるLPS誘発性内毒血症は広く使用されており、潜在的炎症促進薬または免疫調節薬の薬理学的効果を研究するための許容されるモデルである。グラム陰性菌で産生されるLPSは、敗血性ショックの病因における主要な原因物質である（Glausner et al., Lancet 338:732, 1991）。ショック様状態は実際に、LPSを動物に1回注射することで実験的に誘発され得る。LPSに応答する細胞によって産生される分子は、病原体を直接または間接的に標的化し得る。これらの生物学的応答は侵入する病原体から宿主を保護するが、それらはまた害を及ぼし得る。したがって、重度のグラム陰性菌感染の結果として生じる先天性免疫の大規模な促進により、サイトカインおよび他の分子の過剰な産生、ならびに致死的症状、発熱を特徴とする敗血性ショック症状、低血圧、播種性血管内凝固症候群、および多臓器不全の発症が起こる（Dumitru et al., Cell 103:1071-1083, 2000）。
【０２７６】
LPSのこれらの毒性効果は、主に、複数の炎症性メディエータの放出をもたらすマクロファージ活性化と関連がある。これらのメディエータの中で、TNFは、中和抗TNF抗体の投与によるLPS毒性の予防によって示されるように、重要な役割を担っているようである（Beutler et al., Science 229:869, 1985）。C57Bl/6マウスに大腸菌LPSを1μg注射することで、注射の約2時間後に、循環するIL-6、TNF-α、IL-1、および急性期タンパク質（例えば、SAA）の有意な上昇が起こることは、十分に確立されている。これらのメディエータに対する受動免疫により死亡率が低下し得ることから、LPSの毒性はこれらのサイトカインによって媒介されるようである（Beutler et al., Science 229:869, 1985）。敗血性ショックを予防および/また処置するための潜在的免疫介入方法には、抗TNF mAb、IL-1受容体アンタゴニスト、LIF、IL-10、およびG−CSFが含まれる。LPSは、内毒血症の病理学におそらく寄与する炎症促進因子の産生を誘発するため、zacrp11によるSAAまたは他の炎症促進因子の中和により、内毒性ショックなどで見られる内毒血症の症状を軽減することができる。
【０２７７】
3. 炎症性腸疾患
米国では、約500,000人の人々が、結腸および直腸（潰瘍性大腸炎）、または小腸および大腸の両方（クローン病）に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患（IBD）を患っている。これらの疾患の病因は不明であるが、これらの疾患には罹患組織の慢性炎症が関与している。潜在的治療法には、IBDおよび関連疾患における炎症および病理学的効果を低減するための価値ある治療薬として作用し得る、本発明のzacrp11が含まれる。
【０２７８】
潰瘍性大腸炎（UC）は、結腸の粘膜または最内層の炎症および潰瘍形成により特徴づけられる、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は高い頻度で結腸を空にし、下痢を引き起こす。症状には、下痢および関連する腹部痙攣、発熱、ならびに体重減少が含まれる。UCの正確な原因は未知であるが、最近の研究から、身体の生来の防御機構が、身体が外来性と見なす身体内のタンパク質に対して作用すること（「自己免疫反応」）が示唆されている。おそらくはそれらが腸内の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質が結腸の内層を破壊し始める炎症過程を誘導するかまたは促進する可能性がある。結腸の内層が破壊されるにつれて、潰瘍は粘液、膿、および血液の放出を形成する。この疾患は通常、直腸領域で始まり、最終的に大腸全体に広がり得る。炎症を繰り返して発症することで、腸壁および直腸壁は瘢痕組織を伴い肥厚する。結腸組織の死または販血症は、重篤な疾患を引き起こし得る。潰瘍性大腸炎の症状は重症度が異なり、その発症は段階的である場合もあれば、突発性である場合もある。呼吸器感染またはストレスを含む多くの要因により、発作が誘発され得る。
【０２７９】
現在、UCについての治療法は存在しないが、処置は結腸内層の異常な炎症過程の抑制に重点が置かれている。この疾患を処置するためには、コルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキセ−ト）およびアミノサリチル酸をを含む処置が利用できる。しかし、コルチコステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤の長期使用は、骨の菲薄化、白内障、感染、ならびに腎臓および骨髄への影響を含む重度の副作用をもたらし得る。現在の治療法で良好な結果が得られない患者では、手術が選択の対象となる。手術は結腸および直腸の全摘出を含む。
【０２８０】
慢性潰瘍性大腸炎を部分的に模倣し得る動物モデルがいくつか存在する。最も広く使用されているモデルは、結腸において慢性炎症および潰瘍を誘発する、2,4,6-トリニトロベンスルホン酸/エタノール（TNBS）誘発性大腸炎モデルである。直腸内点滴によりTNBSが感受性マウスの結腸に導入されると、TNBSは結腸粘膜においてT細胞媒介性免疫応答を誘発し、この場合、大腸壁全体にわたるT細胞およびマクロファージの高密度浸潤によって特徴づけられる重度の粘膜炎症を引き起こす。さらに、この組織病理像は、進行性体重減少（消耗）、出血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う（Neurath et al., Intern, Rev. Immunol. 19:51-62, 2000）。
【０２８１】
別の大腸炎モデルでは、出血性下痢、体重減少、結腸短縮、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍を呈する急性大腸炎を誘発するデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を使用する。DSS誘発性大腸炎は、リンパ過形成、局所的陰窩損傷、および上皮潰瘍を伴った、固有層への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴づけられる。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性効果に起因して、また固有層細胞の食作用、ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって生じると考えられている。一般的に使用されているにもかかわらず、ヒト疾患との関連性についてのDSSの機構に関するいくつかの問題点は末解決のままである。DSSは、SCIDマウスなどのT細胞欠損動物においても認められるため、T細胞非依存性モデルと見なされる。
【０２８２】
例えば、ホモ三量体および/またはヘテロ三量体、ホモ六量体および/またはヘテロ六量体、ホモ18量体および/またはヘテロ18量体、およびそれらの混合物などの本発明のzacrp11ポリペプチド、融合タンパク質、およびそれらの断片をTNBSモデルまたはDSSモデルに投与することで、症状を改善し、胃腸疾患の経過を変更するためのzacrp11の使用を評価することができる。zacrp11は大腸炎の炎症反応を中和する役割を果たし得り、zacrp11の投与はIBDおよび他の同様の炎症性疾患の潜在的治療アプローチである。
【０２８３】
4. 乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人が罹患している慢性皮膚疾患である。乾癬は新しい皮膚細胞が異常に増殖する場合に生じ、古い皮膚が十分に素早く脱落しない部位に、炎症性の、肥大した、かつ鱗状の皮膚斑をもたらす。最もよく見られる形態である尋常性乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた炎症性皮膚斑（「病変」）によって特徴づけられる。乾癬は少数の斑に限定される場合もあれば、皮膚の中程度から広範囲の領域を含む場合もあり、頭皮、膝、肘、および体幹に最もよく現れる。乾癬は目立つものの、感染性の疾患ではない。この疾患の病因は、罹患組織の慢性炎症を含む。本発明のzacrp11ポリペプチドは、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜のアレルギー、ならびに関連疾患における炎症および病理学的効果を低減するための価値ある治療薬として作用し得る。乾癬および膿疱性乾癬の処置おける本発明のzacrp11ポリペプチドの有効性を試験するための動物モデルが、Mizutani, H., et al., Arch Dermatol Res 2003 Apr;295 Suppl 1:S67-8、およびPol, A., et al., Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 2002 Jul-Aug;15(4):252-61において論じられている。
【０２８４】
乾癬は、相当な不快感を招き得る、皮膚のT細胞媒介性炎症性疾患である。乾癬は、治療法がなく、あらゆる年齢の人々が罹患する疾患である。ヨーロッパおよび北アメリカの人口の約2%が乾癬に罹患している。軽度の乾癬を有する個体は局所薬により疾患を制御できる場合が多いが、世界中の100万人を超える患者は、紫外線または全身免疫抑制療法を必要とする。不運なことには、紫外線照射の不便性および危険性、ならびに多くの治療法の毒性により、長期使用が制限される。さらに、患者は通常、乾癬を再発し、場合によっては、免疫抑制療法の停止直後に再発を起こす。
【０２８５】
哺乳類のエネルギーバランスは、当技術分野において周知であるかまたは本明細書に記載する他の方法の中でも、特に以下の代謝機能の1つまたは複数をモニターすることによって評価され得る：脂肪生成、糖新生、グリコーゲン分解、脂質生成、グルコース摂取、タンパク質合成、熱発生、酵素利用など。これらの代謝機能は、以下にさらに詳述するように、当業者に周知の技法（アッセイまたは動物モデル）によりモニターされる。例えば、インスリンの糖調節効果は、肝臓、骨格筋、および脂肪組織に優先的に作用する。インスリンはこれら3つの組織においてその細胞受容体に結合し、例えば、グルコース生成の抑制およびグルコース利用の促進をもたらす組織特異的作用を惹起する。肝臓では、インスリンはグルコース摂取を促進し、糖新生およびグリコーゲン分解を抑制する。骨格筋および脂肪細胞では、インスリンは、グルコースの摂取、貯蔵、および利用を促進するよう作用する。
【０２８６】
上記の代謝機能のすべてをモニターするための、技術的に認識されている方法が存在する。したがって、当業者は、代謝調節機能に関してzacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、およびアンタゴニストを評価することができる。例示的な調節法を以下に記載する。
【０２８７】
脂肪生成、糖新生、およびグリコーゲン分解は、哺乳類のエネルギーバランスの相互に関係する成分であり、このバランスは、例えばob/obマウスまたはdb/dbマウスを用いて、周知の技法により評価することができる。ob/obマウスは、ob（肥満）座位における不活性化変異に関してホモ接合性である近交系マウスである。このようなob/obマウスは食欲過剰および低代謝であり、循環OBタンパク質の産生が欠損していると考えられている。db/dbマウスは、db(糖尿病)座位における不活性化変異に関してホモ接合性である近交系マウスである。同様に糖尿病表現型を示すこと以外は、db/dbマウスは、ob/obマウスの表現型と類似の表現型を示す。このようなdb/dbマウスは、循環OBタンパク質の作用に対して抵抗性であると考えられている。同様に、これらのパラメータを評価する種々のインビトロ方法が、当技術分野において周知である。
【０２８８】
インスリン促進性脂質生成は、例えば、トリグリセリドへの14C-酢酸塩の取り込み（Mackall et al., J. Biol. Chem. 251:6462-4, 1976）、またはトリグリセリド蓄積（Kletzien et al., Mol. Pharmacol. 41:393-8, 1992）を測定することによってモニターすることができる。
【０２８９】
グルコース摂取は、例えば、インスリン促進性グルコース輸送に関するアッセイで評価することができる。トランスフェクションしていない、分化したL6筋管（G418の非存在下で維持）を、1 g/lグルコース、0.5ないし1.0% BSA、20 mM Hepes、および2 mM グルタミンを含むDMEM中に添加する。2〜5時間培養した後、培地を、0.5ないし1.0% BSA、20 mM Hepes、1 mMピルビン酸、および2 mMグルタミンを含む新鮮なグルコース非含有DMEMで置換する。適切な濃度のインスリンもしくはIGF-1、または試験物質の一連の希釈溶液を添加し、細胞を20〜30分間インキュベートする。3Hまたは14C標識デオキシグルコースを最終濃度約50 lMとなるように添加し、細胞を約10〜30分間インキュベートする。次に、細胞を冷緩衝液（例えば、PBS）で素早くすすぎ、次いで適切な溶解剤（例えば、1% SDSまたは1 N NaOH）で溶解する。続いて、細胞溶解物を、シンチレーションカウンターでカウントして評価する。グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンbの存在下で細胞をインキュベートすることで決定した非特異的結合を減算した後、細胞に関連する放射活性をグルコース輸送の測定値とする。他の方法には、例えば、Manchester et al., Am. J. Physiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29):E326-E333, 1994によって記載されている方法（インスリン促進性グルコース輸送）が含まれる。
【０２９０】
タンパク質合成は、例えば試験細胞を35S-メチオニンおよび35S-メチオニンおよびタンパク質合成の推定上の調節因子と共にインキュベーションした後、35S-メチオニン標識タンパク質の沈殿を比較することで評価することができる。
【０２９１】
熱発生は、B．Stanley, The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers and C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993, pp. 457-509；C. Billington et al., Am. J. Physiol. 260:R321, 1991；N. Zarjevski et al., Endocrinology 133:1753, 1993；C. Billington et al., Am. J. Physiol. 266:R1765, 1994；Heller et al., Am. J. Physiol. 252(4 Pt 2): R661-7, 1987；およびHeller et al., Am. J. Physiol. 245: R321-8, 1983によって記載されて通りに評価することができる。また、種々の技法により測定され得る代謝速度は、熱発生の間接的測定値である。
【０２９２】
酸素利用は、Heller et al. Pflugers Arch 369: 55-9, 1977によって記載されているように評価され得る。この方法はまた、視床下部温度および代謝熱生成の解析を含んだ。酸素利用および体温調節はまた、Haskell et al., J. Appl. Physiol. 51: 948-54, 1981によって記載されているように、ヒトでも評価されている。
【０２９３】
神経伝達機能は、当技術分野において周知であるかまたは本明細書に記載する方法の中でも、特に脳における2-デオキシ-グルコース摂取をモニターすることで評価され得る。このパラメータは、当業者に周知である技法（アッセイまたは動物モデル）、例えばオートラジオグラフィーによりモニターされる。有用なモニター法は、例えばKilduff et al., J. Neurasci. 10: 2463-75, 1990により記載されており、「冬眠心臓」を評価するために用いられる関連技法は、Gerber et al., Circulation 94: 651-8, 1996、およびFallavollita et al., Circulation 95: 1900-9, 1997により記載されている。
【０２９４】
さらに、zacrp11ポリペプチド、その断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストは、治療上、抗菌用途に有用である可能性がある。例えば、補体成分C1qは、細菌およびウイルスなどの病原菌に対する宿主防御において役割を担う。C1qは、いくつかの特殊化した機能を示すことが知られている。例えば、C1qは、結合した抗体またはC反応性タンパク質（CRP）との相互作用を介して、補体カスケードを誘発する。また、C1qは、特定の細菌、RNAウイルス、マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌内毒素のリピドA成分、およびある種の細胞小器官の膜と直接相互作用する。C1q受容体に対するC1qの結合は、食作用を促進すると考えられている。C1qはまた、宿主防御システムの抗体形成面を増強するようである。例えば、Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12(11): 933-41, 1993を参照されたい。したがって、可溶性C1q様分子は、病原体の溶解または食作用を促進する抗菌剤として有用である可能性がある。
【０２９５】
C1qおよびマクロファージスカベンジャー受容体などのコラーゲンドメインは、LPAなどの酸性リン脂質と結合することが知られている。zacrp11ポリペプチド、断片、融合物質、アゴニスト、またはアンタゴニストとLPAなどの分裂促進アニオンとの相互作用は、当技術分野において周知のアッセイを用いて決定することができ、例えば、Acton et al., 前記を参照されたい。本発明のポリペプチド及び抗体による炎症工程の阻害はまた、創傷部位での感染を妨げることにおいて有用である。
【０２９６】
抗菌保護剤は、直接的または間接的に作用し得る。膜結合または孔形成の作用機構を介して作動するそのような薬剤は、原因微生物に直接結合する。抗菌剤はまた、酵素機構を介して作用し得り、微生物保護物質またはその細胞壁/細胞膜を分解する。微生物の増殖もしくは作用を阻害し得るか、または上記のいずれかの機構により微生物の完全性を破壊し得る抗菌剤は、その抗菌活性に感受性の微生物による細胞培養物の汚染を妨げる方法において有用である。そのような技法は、有効量のzacrp11ポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの存在下で細胞を培養する段階を含む。
【０２９７】
また、zacrp11ポリペプチドまたはそのアゴニストは、細菌、ウイルス、または真菌感染などの外因性微生物感染のインビトロ研究における細胞培養試薬としても用いられ得る。そのような成分はまた、感染のインビボ動物モデルにおいても使用され得る。
【０２９８】
zacrp11断片、およびzacrp11ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、または抗体を、当技術分野において周知の手順に従って、その抗菌特性に関して評価することができる。例えば、Barsum et al., Eur. Respin. J. 8(5): 709-14, 1995；Sandovsky-Losica et al., J. Med. Vet. Mycol. (England) 28(4): 279-87, 1990；Mehentee et al., J. Gen. Microbiol. (England) 135 (Pt. 8): 2181-8, 1989；Segal and Savage, J. Med. Vet. Mycol. 24: 477-9, 1986などを参照されたい。必要に応じて、この関連でのzacrp11の性能を、この関連で機能することが知られている、プロリンリッチタンパク質、リゾチーム、ヒスタチン、ラクトペルオキシダーゼなどのタンパク質と比較することができる。さらに、zacrp11断片、ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、または抗体を、1つまたは複数の抗菌剤と組み合わせて評価し、相乗効果を同定することができる。当業者は、zacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、および抗体の抗菌特性も同様に評価できることを理解すると考えられる。
【０２９９】
神経伝達物質または神経伝達調節物質として、本発明のzacrp11ポリペプチド断片、およびzacrp11ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、または抗体は、カルシウムイオン濃度、筋収縮、ホルモン分泌、DNA合成または細胞増殖、イノシトールリン酸代謝回転、アラキドン酸放出、ホスホリパーゼC活性化、胃内容排出、ヒト好中球活性化またはADCC能、スーパーオキシドアニオン生成なども調節し得る。これらの性質の評価は、本明細書に記載するような周知の方法によって行うことができる。
【０３００】
細胞内カルシウムレベルに対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Dobrzanki et al., Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。筋収縮に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またじゃアンタゴニストの影響は、Smits & Lebebvre, J. Auton. Pharmacol. 14: 383-92, 1994、Belloli et al., J. Vet. Pharmacol. Therap. 17: 379-83, 1994、Maggi et al., Regulatory Peptides 53: 259-74, 1994などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。ホルモン分泌に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Henriksen et al., J. Recep. Sig. Transd. Res. 15(1-4): 529-41, 1995などによって記載されているプロラクチン放出に関する方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。DNA合成または細胞増殖に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Dobrzanki et al., Regulatory Reptides 45: 341-52, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。イノシトールリン酸代謝回転に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。
【０３０１】
また、アラキドン酸放出に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。ホスホリパーゼC活性化に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。胃内容排出に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Varga et al., Eur. J. Pharmacol. 286: 109-112, 1995などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。ヒト好中球活性化およびADCC能に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Wozniak et al., Immunology 78: 629-34, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。スーパーオキシドアニオン生成に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの影響は、Wozniak et al., Immunology 78: 629-34, 1993などによって記載されている方法などの、当技術分野において周知の方法により評価され得る。
【０３０２】
E-セレクチン（内皮性白血球接着分子）、V-CAM（血管細胞接着分子）、およびI-CAM（細胞内接着分子）などの細胞表面接着分子の発現に及ぼすzacrp11の影響は、Ouchi et al.（Circulation 100:2473-7, 1999)に従い、細胞ELISAにおいて微小血管骨髄細胞（TRBMEC）を用いることで測定し得る。この活性は、TNF（腫瘍壊死因子）などの炎症性サイトカインによる刺激と比較することができる。Ouchi et al.（前記）およびCybulsky and Gimbrone（Science 251:788-91, 1991）に準じるTHP-1単球接着アッセイを用いて、zacrp11活性を測定することも可能である。
【０３０３】
コラーゲンは、血小板凝集の潜在的誘導因子である。血小板は損傷した血管壁と相互作用して、血栓を形成する。この応答の程度は、曝露される内皮下層組織および損傷領域における血流によって段階づけられる。これは、血管損傷から回復する患者に危険をもたらす。コラーゲン誘発性血小板凝集の阻害剤は、コラーゲン被覆された表面への血小板の結合の阻止、および付随するコラーゲン誘発性血小板凝集の低下に有用である。C1qは補体経路の成分であり、防御機構を促進すること、および組織損傷を引き起こし得る毒性酸素種の生成を誘発することが見い出されている。（Tenner, Behring Inst. Mitt. 93:241-53, 1993）。C1q結合部位は、血小板上に認められる。免疫結合パートナーに依存しないC1qは、血小板凝集を阻害するが、血小板粘着および形状変化は阻害しないことが見い出されている。C1qのアミノ末端領域は、コラーゲンと相同性を共有する（Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol. 145:2984-88, 1990）。C1qおよび補体経路の阻害は、Suba and Csako, J. Immunol. 117:304-9, 1976によって記載されているような、本明細書において開示する方法または当技術分野において周知の方法により決定され得る。この点で、zacrp11ポリペプチドは、止血の調節、血管損傷を流れる血流の上昇、およびコラーゲン表面の回復において有用であると考えられる。
【０３０４】
コラーゲン媒介性血小板粘着、活性化、および凝集に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの活性は、血小板凝集アッセイ（Chiang et al., Thrombosis Res. 37:605-12, 1985）および血小板粘着アッセイ（Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol. 144:221-25, 1990）などの、本明細書に開示する方法または当技術分野において周知の方法により測定され得る。コラーゲンへの血小板粘着、およびコラーゲン誘導性血小板凝集の阻害に関するアッセイは、Keller et al., J. Biol. Chem. 268:5450-6, 1993；Waxman and Connolly, J. Biol. Chem. 268:5445-9, 1993；Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269:5050-3, 1994、またはDeckmyn et al., Blood 85:712-9, 1995によって記載されている方法を用いて測定され得る。
【０３０５】
粘着して活性化される血小板の数、および血小板凝集塊の大きさを減少させることによって、哺乳類の血管系内の血流を促進する方法において、本発明のzacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストを使用することができる。そのような方法は、治療的有効量のzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストを、そのような処置を必要とする哺乳類に投与する段階を含み、それによりzacrp11は、哺乳類の血管系内の血栓形成活性および補体活性を低下させる。そのような方法に用いられるzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、哺乳類における急性血管損傷の前、間、または後に投与することができる。
【０３０６】
1つのそのような方法において、血管損傷は、血管形成、血管内膜切除、冠動脈バイパス、微小血管修復、または血管移植片の吻合を含むがこれらに限定されない血管再構築によるものである。外傷、脳卒中、または動脈瘤による血管損傷もまた意図する。他の好ましい方法において、血管損傷は、粥腫崩壊、血管系の劣化、糖尿病に伴う合併症、およびアテローム性動脈硬化症に起因する。冠動脈における粥腫崩壊は心臓発作を誘発し、大脳動脈における粥腫崩壊は脳卒中を誘発する。そのような方法におけるzacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの使用は、例えば播種性血管内凝固症候群（DIC）およびSIDなどの、免疫系に関連する血管系全体の疾患を改善するためにも有用である。さらに、補体阻害活性は、アテローム性動脈硬化症などの、非血管系免疫疾患の処置に有用であると考えられる。
【０３０７】
局所的虚血心筋におけるC1qの存在と、冠動脈閉塞および再灌流後の白血球の蓄積との間に、相関関係が見出されている。組織損傷後の細胞成分の放出は補体活性化を誘発し、その結果、心筋損傷の主要原因となり得る毒性酸素産物を生じる（Rossen et al., Circ. Res. 62:572-84, 1998、およびTenner、前記）。補体経路の阻止が、虚血心筋を再灌流傷害から保護することが見い出された（Buerke et al., J. Pharm. Exp. Therp. 286:429-38, 1998）。zacrp11ポリペプチドの補体阻害およびC1q結合活性は、そのような目的のために有用であると考えられる。
【０３０８】
大動脈輪の血管拡張に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストの活性は、Dainty et al., J. Pharmacol. 100:767, 1990、およびRhee et al., Neurotox. 16:179, 1995の方法に従って測定され得る。
【０３０９】
虚血および再灌流傷害に対するzacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、およびアンタゴニストの影響を測定するためには、種々のインビトロモデルおよびインビボモデルが利用できる。例えば、Shandelya et al., Circulation 88:2812-26, 1993；Weisman et al., Science 249:146-151, 1991；Buerke et al., Circulation 91:393-402, 1995；Horstick et al., Circulation 95:701-8, 1997、およびBurke et al., J. Phar. Exp. Therp. 286:429-38, 1998を参照されたい。エクスビボハムスター血小板凝集アッセイは、Deckmyn et al.、前記によって記載されている。ハムスターおよびヒヒにおける出血時間は、Deckmyn et al.、前記によって記載されるモデルを用いて、zacrp11ポリペプチドの注入後に測定され得る。本発明のタンパク質の投与に応答した血栓の形成は、Deckmy et al.、前記により提供されるハムスター大腿静脈血栓症モデルを用いて測定され得る。zacrp11投与後の流動条件下での血小板粘着の変化は、Harsfalvi et al., Blood 85:705-11, 1995に記載される方法を用いて測定され得る。
【０３１０】
zacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの補体阻害および創傷治癒活性は、単独で、または例えばパルジピン（palldipin）、モウバチン（moubatin）、またはカリン（calin）などの、コラーゲン誘発性血小板活性化および凝集の他の既知阻害剤と組み合わせてアッセイされ得る。
【０３１１】
zacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、例えばブタにおける皮層の治癒（Lynch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7696-700, 1987）および遺伝的糖尿病マウスにおける全層皮膚創傷（Greenhalgh et al., Am. J. Pathol. 136: 1235-46, 1990）などの、本明細書に記載の方法または当技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。本発明のポリペプチドは、単独で、または上記の他の既知補体阻害剤と組み合わせてアッセイされ得る。
【０３１２】
コラーゲンと結合するタンパク質は、損傷したコラーゲン組織を回復して、血小板の粘着、活性化、または凝集、および毒性酸素産物の放出をもたらす炎症過程の活性化を妨げるのに有用である。補体活性、血栓活性、および免疫活性化のような過程に対して、曝露された組織を不活性にすることで、zacrp11ポリペプチド、断片、融合物、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、虚血および再灌流の損傷作用を低減するのに有用であると考えられる。特に、そのような損傷には、外傷性傷害虚血、腸紋扼、ならびに血流の確立前および後に関連する損傷が含まれる。zacrp11は、心肺バイパス虚血および蘇生、心筋梗塞、ならびに外傷後血管攣縮、例えば脳卒中または経皮経管的血管形成、および偶発的もしくは手術による血管外傷などの処置において有用であると考えられる。
【０３１３】
zacrp11ポリペプチド、断片、融合物、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、人工生体材料および手術用機器を静めて、補体活性化、血栓活性、または免疫活性化に対して材料の表面を不活性化するのにも有用である。そのような材料には、コラーゲンもしくはコラーゲン断片被覆生体材料、ゼラチン被覆生体材料、フィブリン被覆生体材料、フィブロネクチン被覆生体材料、ヘパリン被覆生体材料、コラーゲンおよびゲル被覆ステント、動脈グラフト、人工心臓弁、人工臓器、または血液に曝露される任意の補装具適用が含まれるがこれらに限定されず、これらは1×108以上でzacrp11と結合することになる。そのような材料の被覆は当技術分野において周知の方法を用いて行うことができ、例えば、Rubens、米国特許第5,272,074号を参照されたい。
【０３１４】
補体およびC1qは、炎症において役割を担っている。補体の活性化は、C1qの免疫グロブリンへの結合によって開始される（Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12:933-41, 1993；Ward and Ghetie, Therap. Immunol. 2:77-94, 1995）。C1qおよび補体の阻害剤は抗炎症剤として有用である。そのような適用により、感染を妨げることができる。さらに、そのような阻害剤を、補体活性化および免疫複合体のC1qへの結合により媒介される炎症を患う個体に投与することができる。zacrp11ポリペプチド、断片、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、創傷治癒の障害を克服することで、創傷修復を媒介する方法、創傷治癒の進行を促進する方法において有用であると考えられる。創傷治癒の進行には、例えば、炎症の縮小、線維芽細胞の動員、創傷の退縮、および感染の低下などの要素が含まれる。
【０３１５】
腫瘍細胞がコラーゲンと結合する能力は、腫瘍の転移に寄与し得る。コラーゲン結合の阻害剤はまた、腫瘍の接着相互作用および転移拡散を媒介するのにも有用である（Noeske-Jungbult et al., 米国特許第5,723,312号）。さらに、細胞とのその細胞外基質との相互作用を媒介する、破壊する、または調節するzacrp11の能力は、腫瘍の転移に寄与し得る。したがって、zacrp11アンタゴニストまたは阻害剤は、腫瘍細胞転移を減じるかまたは妨げ得る。
【０３１６】
さらに、腫瘍の進行および転移に対するzacrp11の活性および効果を、インビボで測定することができる。いくつかの同系マウスモデルが、腫瘍進行に対するポリペプチド、化合物、または他の処置の影響を研究するために開発されている。これらのモデルでは、培養で継代された腫瘍細胞が、腫瘍ドナーと同じ系統のマウスに移植される。細胞はレシピエントマウスにおいて同様の特徴を有する腫瘍となり、いくつかのモデルでは転移も起こる。本発明者らの研究に適した腫瘍モデルには、特に、Lewis肺癌（ATCC No. CRL-1642）およびB16黒色腫（ATCC No. CRL-6323）が含まれる。これらはいずれも、インビトロで容易に培養し操作できる、C57BL6/Jマウスと同質遺伝子的な、一般的に使用される腫瘍株である。これらの細胞株のいずれかの移植によって生じる腫瘍は、C57BL6/Jマウスの肺に転移し得る。Lewis肺癌モデルは、最近では、血管新生の阻害剤を同定するためにマウスで使用された（O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994）。組換えタンパク質、アゴニスト、もしくはアンタゴニストの連日注入、または組換えアデノウイルスの単回注射により、C57BL6/Jマウスを実験薬剤で処置する。この処置の3日後に、105〜106個の細胞を背面皮膚下に移植する。または、タンパク質が全身ではなく腫瘍部位または細胞内で合成され得るよう、移植する前に、zacrp11を発現するような組み換えアデノウイルスで細胞自体を感染させてもよい。マウスは通常、5日以内に明らかな腫瘍を生じる。腫瘍は最長3週間増殖させるが、その間に腫瘍は対照処置群において1500〜1800 mm3の大きさに達し得る。実験期間中は、腫瘍の大きさおよび体重を慎重にモニターする。屠殺時に肺および肝臓と共に腫瘍を摘出し、秤量する。肺重量は、転移腫瘍量と相関することが示されている。さらなる測定値として、肺表面転移を計数する。切除した腫瘍、肺、および肝臓を、当技術分野において周知であり、本明細書に記載の方法を用いて、病理組織学的試験、免疫組織化学、およびインサイチューハイブリダイゼーション用に調製する。このようにして、腫瘍が脈管構造を補充して転移する能力に対する、発現された関心対象のポリペプチド、例えばzacrp11の影響を評価することができる。さらに、アデノウイルスの使用のほかに、移植細胞にzacrp11を一過性にトランスフェクションすることができる。安定なzacrp11トランスフェクタントの使用、およびインビボでzacrp11発現を活性化するための誘導性プロモーターの使用は、当技術分野において周知であり、zacrp11の転移誘導を評価するためにこの系において使用することができる。さらに、精製zacrp11またはzacrp11馴化培地をこのマウスモデルに直接注入し、よってこの系で使用することができる。一般的な参考文献については、O'Reilly MS, et al., Cell 79:315-328, 1994；およびRusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995を参照されたい。
【０３１７】
本発明のzacrp11ポリペプチドおよび/またはzacrp11抗体は腫瘍形成の処置に有用であり、したがって癌の処置に有用であると考えられる。zacrp11は、ケラチノサイト遊走および他の細胞外基質相互作用を促進、増強、および/または亢進し得る。さらに、zacrp11は、免疫系の細胞と結合するかまたは直接もしくは間接的に相互作用して、それらの細胞の活性化を引き起こし得るが、そのような細胞には、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、B細胞、およびT細胞が含まれる。zacrp11による活性化T細胞、単球、およびマクロファージの過剰刺激は、例えば免疫細胞癌または他の癌などのヒト病態を引き起こし得る。したがって、本発明のzacrp11ポリペプチドは診断薬として作用し得り、また腫瘍細胞増殖および/または転移活性のアンタゴニストとして作用し得る。zacrp11ポリペプチドは、従来の化学治療薬およびインターフェロンαなどの免疫調節薬を含む、既に使用されている他の薬剤と組み合わせて投与することができる。α/βインターフェロンは、いくつかの白血病および動物疾患モデルの処置において有効であることが示されており、インターフェロンαおよびzacrp11の増殖阻害効果は相加的である可能性がある。
【０３１８】
血小板粘着、活性化、および凝集は、血小板凝集アッセイ（Chiang et al., Thrombosis Res. 37:605-12, 1985）および血小板粘着アッセイ（Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol. 144:221-25, 1990）などの、本明細書に記載する方法または当技術分野において周知の方法により評価され得る。C1qおよび補体経路の阻害は、Suba and Csako, J. Immunol. 117:304-9, 1976に記載されるような、本明細書に開示するかまたは当技術分野において周知の方法を用いて決定され得る。コラーゲンへの血小板粘着、およびコラーゲン誘発性血小板凝集の阻害に関するアッセイは、Keller et al., J. Biol. Chem. 268:5450-6, 1993；Waxman and Connolly, J. Biol. Chem. 268:5445-9, 1993；Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269:5050-3, 1994、またはDeckmyn et al., Blood 85:712-9, 1995に記載される方法を用いて測定され得る。
【０３１９】
C1qおよびマクロファージスカベンジャー受容体の正に荷電した細胞外三重らせんコラーゲンドメインは、リガンド結合において役割を担うことが決定されており、ポリアニオンに対して広い結合特異性を有することが示されている（Acton et al., J. Biol. Chem. 268:3530-37, 1993）。リゾリン脂質増殖因子（リゾホスファチジン酸、LPA）および他の分裂促進アニオンは、損傷組織の部位に局在し、創傷修復を支援する。LPAは、血小板の活性化および基質構築の上方制御を含む多くの多くの生物学的効果をもたらす。LPAは、他の血液凝集因子と協同して創傷治癒を媒介すると考えられている。
【０３２０】
脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの他のメンバー（例えば、組織壊死因子、acrp30、およびzsig37）と同様に、zacrp11ポリペプチド、断片、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストは、特定の組織が組織再構築を開始するかまたは終了するかの決定をもたらすためにも使用され得る。組織再構築は、物理的損傷、細胞毒性損傷、代謝ストレス、または発生上の刺激を含む多くの要因により開始され得る。組織再構築は組織の生成および破壊を含み、これは例えば、間質コラーゲン、基底膜コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アグリカン、および種々のプロテオグリカンを含む細胞外基質の一定した再編成および再構築を必要とする。Heinegard et al., FASEB J., 3:2042-2051 (1989)；およびWoessner, FASEB J., 5:2145-2154 (1991)。通常の様式の再構築過程には、胚発生、子宮の分娩後退縮、排卵、創傷治癒、ならびに骨および成長板再構築が含まれる。Woessner et al., Steroids, 54 :491-499 (1989)；Weeks et al., Biochim Biophys Acta, 445:205-214 (1976)；Lepage and Gache, EMBO J., 9:3003-3012 (1990)；およびWride et al., Dev-Dyn, 198(3):225-239 (1993)。同様の過程は、リウマチおよび骨関節炎における関節破壊などの病態、歯周組織、ならびに腫瘍細胞転移においても起こる。Thompson et al., J. Bone Joint Surg., 61:407-416 (1979)；Reynolds  et al., Adv-Dent-Res., 8(2):312-319 (1994)。これらの過程の1つの例は、関節リウマチの滑膜組織に見られるような、炎症部位へのマクロファージの遊走である。Cutolo  et al., Clin. and Exper. Rheum., 11:331-339 (1993)。細胞外基質成分は、種々の外因性因子および内因性因子により、正常状態および病理状態のいずれにおいても調節を受ける。病態と正常治癒との間の相違は精巧に調整される過程であるべきであり、一つには、刺激を受けた細胞と細胞外基質環境および局所的溶媒との相互作用により調節され得る。脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーは、細胞外基質と細胞との界面で作用すると考えられ、例えばzsig37は、特定のコラーゲン型およびまた血小板と結合する（Sheppard, P.、米国特許第6,265,544号、米国特許第6,518,403号、および米国特許第6,566,499号；ならびにBishop et al.、米国特許第6,448,221号および米国特許第6,544,946号）。
【０３２１】
多くの自己免疫疾患および再構築関連疾患の表現型の現れは、炎症過程および/または組織再構築過程の大規模な活性化である。その結果は多くの場合、機能器官または器官下組織が、置換された生物学的構造の機能を実施し得ない種々の細胞外基質成分によって置換されることである。理論に制限されることなく、これらの疾患における開始事象は、損傷または最適な生物学的構造調節の初期混乱を含み得る。例えば、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーのメンバーであるacrp30は、活発に増殖している脂肪組織においてのみ発現される。結合組織再構築は、脂肪細胞のこの活性化と密に関連している。したがって、過度の体重の増加（脂肪）と糖尿病との間には明白な関連があり、おそらくacrp30、およびzacrp11を含む脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの他のメンバーは脂肪再構築に関与している。さらに、この脂肪再構築過程はおそらく肥満個体において酷使されている。したがって、制限されるわけではないが、これは、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の発症に寄与する不適当かつ不適切な脂肪貯蔵の影響である。zacrp11が位置するゲノム座位は、II型糖尿病と関連している（Watanabe et al., Am J Hum Genet. 2000 Nov;67(5):1186-1200）。さらなる例は、動脈閉塞を引き起こし得る、動脈硬化および動脈損傷における過度のプラーク形成である。限定されるわけではないが、この血管病態は、過度のおよび/または不適切な動脈再構築に起因し得るか、またはそれにより顕著に影響され得る。zsig37およびおそらくzacrp11による血管損傷（および下層の細胞基質）の処置は、非常に早い段階で血管再構築の過程を変更するようである（Bishop et al.、米国特許第6,448,221号および米国特許第6,544,946号）。限定されるわけではないが、当業者は、zsig37による処置が、損傷後に血小板を比較的静穏な状態に維持し、かつしたがって再構築促進性および炎症促進性のタンパク質および細胞の過度の補充は決して起こらないと仮定することができる。zacrp11などの脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの他のメンバーは、例えば脂肪またはコレステロールの存在により誘導される再構築を、改変しうる。血中の過剰量のコレステロールおよび脂肪は、zacrp11の非存在下で再構築を活性化し得る。
【０３２２】
興味深いことに、細胞内成分は時として、特定の疾患を示す自己抗原として見い出される。理論に制限されないが、これらの細胞内タンパク質への過度の曝露後の免疫系による抗体産生は、おそらく過度のまたは不適切な再構築の結果である。したがって自己抗原は、免疫系を標的化することに加えて、さらに再構築過程を標的化することにより制限され得る。例えば、強皮症の診断となる自己抗原は細胞質タンパク質である。限定されるわけではないが、これらのタンパク質に対する抗体は、少なくとも部分的にzacrp11により媒介される不適切なまたは不完全な局所的組織修復によって誘発される非特異的炎症に応答して産生される。さらなる例は、関節炎に存在する炎症である。関節炎は持続的な自己抗原応答によって起こる可能性が高い。しかし、これはこの病態を引き起こす根本的な起因事象ではない可能性がある。制限されるわけではないが、関節における結合組織または筋肉の損傷に応答した不適切な再構築は、損傷部位における細胞成分の過度の放出に対する過敏性をもたらし、おそらくはこれがこの病態の発症における根本的原因または重要な要因である。
【０３２３】
zacrp11活性を有するポリペプチドの治療的使用
本発明は、zacrp11活性を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド（zacrp11ポリペプチド、抗イディオタイプ抗zacrp11抗体、およびzacrp11融合タンパク質など）の、zacrp11タンパク質を必要とする対象への使用を含む。
【０３２４】
一般に、投与する本発明のzacrp11の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、および既往歴などの要因に応じて変動する。典型的には、約1 pg/kg〜10 mg/kg（薬剤量/患者体重）という範囲の用量のzacrp11ポリペプチドをレシピエントに提供することが望ましいが、状況に応じてこれよりも低用量または高用量が投与される場合もある。当業者は、当技術分野において周知の方法により、そのような用量およびその用量への調整を容易に決定することができる。
【０３２５】
対象に対するzacrp11ポリペプチドの投与は、局所カテーテルを介した潅流によるか、または直接的な病巣内注射による、局所、吸入、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内投与であってよい。注射により治療タンパク質を投与する場合は、投与は持続注入か、または単回もしくは複数回の大量瞬時投与で行うことができる。投与の1つの形態は、血管損傷の部位またはその近傍で行われる。
【０３２６】
さらなる投与経路には、経口、経粘膜、経肺、および経皮が含まれる。経口送達は、ポリエステル微粒子、ゼイン微粒子、プロテイノイド微粒子、ポリシアノアクリレート微粒子、および脂質に基づく系に適している（例えば、DiBase and Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)を参照のこと）。鼻腔内送達の実行可能性は、インスリン投与のような様式で例証される（例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999を参照のこと）。zacrp11を含む乾燥粒子または液状粒子は、乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を用いて調製して吸入させることができる（例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998)；Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)）。このアプローチは、エアロゾル化されたインスリンを肺に送達する携帯式の電動吸入装置の1種である、AERX糖尿病管理システムによって示される。研究の結果、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波数超音波を利用することで皮膚を介して治療濃度で送達されることが示されており、これは経皮投与の実行可能性を示すものである（Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)）。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、zacrp11結合活性を有する分子を投与する別の手段を提供する（Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)）。
【０３２７】
zacrp11結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する周知の方法に従って製剤化することができ、治療タンパク質は薬学的に許容される担体の混合物と混合される。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合に、「薬学的に許容される担体」と表現される。無菌のリン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者には周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)を参照されたい。
【０３２８】
治療目的のために、zacrp11活性を有する分子および薬学的に許容される担体を、治療有効量で患者に投与する。zacrp11活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与量が生理学的に有意な場合に、「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化をもたらすのであれば、生理学的に有意である。例えば、炎症の治療に使用される薬剤は、その存在が炎症反応の少なくとも一部を緩和するのであれば、生理学的に有意である。
【０３２９】
本発明のzacrp11ポリペプチドを含む薬学的組成物は、液状、エアロゾル状、または固体状で提供され得る。液状は、注射溶液、エアロゾル、液滴、トポロジー溶液（topological solution）、および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体状には、カプセル、錠剤、および徐放性形状が含まれる。後者の形状は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される（Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, "Implants in Drug Delivery", Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.) pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.) pages 93-117 (Plenum Press 1997)）。他の固体状には、クリーム、ペースト、他のトポロジー適用（topological application）などが含まれる。
【０３３０】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達する1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である（一般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1)S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照のこと）。リポソームは組成が細胞膜と似ているため、安全に投与することができ、また生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームは0.02μm〜10μm超の範囲の直径で大きさが変動し得る。種々の薬剤をリポソーム中に封入することができる：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される（例えば、Machy et al., "Liposomes In Cell Biology And Pharmacology" (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照のこと）。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることで、封入薬剤の治療利用能を調節することが可能である。
【０３３１】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞に飲食作用で取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される（Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)）。静脈内投与後、小さなリポソーム（0.1〜1.0μm）は典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０３３２】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る（Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)）。さらに、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)）。
【０３３３】
リポソームは、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはリガンドを挿入することにより調製して、特定の細胞または器官を標的することもできる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームが、肝臓を標的するために使用された（Hayakawa et al.、日本国特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)）。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油（HCO-60）を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）とダイズ由来ステリルグルコシド混合物（SG）およびコレステロール（Ch）のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的することが示されている（Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)）。
【０３３４】
または、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的リガンドをリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面で発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的することができる（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)）。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することで阻害され得る（Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)）。ポリアコニチル化（polyaconitylated）ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化する別のアプローチを提供する（Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)）。さらに、Geho et al.、米国特許第4,603,044号では、肝臓の特殊化代謝細胞に付随する肝胆道受容体に対する特異性を有する、肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０３３５】
組織を標的するさらなる一般的アプローチでは、標的細胞を、標的細胞で発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体で前標識する（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)）。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジンを結合させたリポソームを投与する。別のアプローチでは、標的抗体をリポソームに直接結合する（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)）。
【０３３６】
zacrp11活性を有するポリペプチドを、タンパク質の微小カプセル化の標準的ま技法でリポソーム内に封入することができる（例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", Liposome Technology, 2nd Edithion, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照のこと）。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含み得る（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)）。
【０３３７】
治療タンパク質の高度の全身性レベルを維持するために、分解性ポリマー微粒子が設計されている。微粒子は、ポリラクチド・グリコリド共重合体（PLG）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生物分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、タンパク質はこれらのポリマー内に封入される（Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.),  pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)）。ポリエチレングリコール（PEG）で被覆されたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供する（例え、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照のこと）。
【０３３８】
本発明はまた、ポリペプチドが上記のポリマーに連結されている、化学修飾された、zacrp11ポリペプチドなどのzacrp11活性を有するポリペプチド、zacrp11アゴニスト、および抗zacrp11抗体などのzacrp11アンタゴニストも意図する。
【０３３９】
当業者は、例えばAnsel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.),  Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)に示されているように、他の投与剤形を考案することができる。
【０３４０】
例として、薬学的組成物は、zacrp11ポリペプチドまたはzacrp11アンタゴニスト（例えば、zacrp11ポリペプチドと結合する抗体または抗体断片）を含む容器を含むキットとして提供され得る。治療ポリペプチドは、単回用量もしくは複数回用量の注射溶液の形態で、または注射前に再構成される無菌粉末として提供され得る。または、このようなキットは、治療ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を含み得る。このようなキットは、薬学的組成物の効能および用法に関する書記情報をさらに含み得る。さらに、このような情報は、zacrp11組成物が、zacrp11に対して過敏であることがわかっている患者には禁忌であるという記述を含み得る。
【０３４１】
オリゴマーの形態で存在するzacrp11ペプチド、ポリペプチド、または融合タンパク質を含む薬学的組成物で、対象を処置することができる。例示的なオリゴマーには、三量体、六量体、九量体、および18量体が含まれる。薬学的組成物はまた、zacrp11オリゴマーの混合物を含み得る。例えば、薬学的組成物は、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255を含むポリペプチドの三量体と六量体の混合物を含み得る。特定の三量体-六量体混合物において、三量体/六量体の比は、約1/99、2/98、3/97、4/95、5/95、6/94、7/93、8/92、9/91、10/90、11/89、12/88、13/87、14/86、15/85、16/84、17/83、18/82、19/81、20/80、25/75、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、75/25、80/20、81/19、82/18、83/17、84/16、85/15、86/14、87/13、88/12、89/11、90/10、91/9、92/8、93/7、94/6、95/5、96/4、97/3、98/2、または99/1の範囲内であってよい。ある種の薬学的組成物は、三量体/六量体の比が約5/95〜約20/80の範囲にあるオリゴマーの混合物を含む。
【０３４２】
zacrp11ペプチド、ポリペプチド、または融合タンパク質は、場合によってはさらなる治療薬と共に対象に投与することができる。これらの治療薬は、zacrp11ペプチド、ポリペプチド、または融合タンパク質の投与の前、それと同時に、またはその後に投与され得る。
【０３４３】
併用療法により、本明細書に記載の障害および疾患を処置することができる。例えば、zacrp11ペプチド、ポリペプチド、または融合タンパク質と少なくとも1つの他の治療薬との組み合わせを用いて、例えば急性心筋梗塞を処置することができる。
【０３４４】
教育上の使用
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝学および分子生物学、タンパク質化学、ならびに抗体の産生および解析に関連する課程を対象とした実験実習課目のキットに含まれる教育用ツールとして有用である。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列が固有であるため、zacrp11分子を標準物質として、または試験目的の「未知物質」として使用することができる。例として、zacrp11ポリヌクレオチドを、例えば、zacrp11が発現される遺伝子である融合構築物を含む、細菌、ウイルス、または哺乳類発現用の発現構築物の調製法；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の決定法；組織におけるzacrp11ポリヌクレオチドのmRNAおよびDNA局在性の決定法（すなわち、ノーザンブロッティングおよびサザンブロッティング、ならびにポリメラーゼ連鎖反応による）；および関連ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの核酸ハイブリダイゼーションによる同定法を学生に教示するためなどの補助として使用することができる。
【０３４５】
zacrp11ポリペプチドは、抗体の調製法；ウェスタンブロッティングによるタンパク質の同定法；タンパク質の精製法；産生されたzacrp11ポリペプチドの、産生された総タンパク質に対する比としての重量の決定法；ペプチド切断部位の同定法；アミノ末端およびカルボキシル末端タグの結合法；アミノ酸配列解析法、およびこれに限定されないが、天然タンパク質およびタグ化タンパク質の生物活性のインビトロおよびインビボにおけるモニタリング法を教示するための補助として使用することができる。
【０３４６】
zacrp11ポリペプチドはまた、質量分析法、特に4つのαヘリックスの高次構造を決定するため円二色性、原子レベルにおける詳細な三次元構造を決定するためのX線結晶学、溶液中のタンパク質の構造を明らかにするための核磁気共鳴スペクトル法などの分析技術を教示するために使用することもできる。例えば、zacrp11を含むキットを学生に与えて解析させることができる。指導者にはアミノ酸配列が分かっているため、学生の技術を判定するため、または学生の技術向上のために、このタンパク質を試験物質として学生に与え得り、次いで指導者は、学生がポリペプチドを正確に解析したか否かを知ることができる。すべてのポリペプチドは固有であるので、zacrp11の教育的有用性もそれ自体固有となる。
【０３４７】
zacrp11に特異的に結合する抗体は、アフィニティクロマトグラフィーカラムを調製してzacrp11を精製し、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングして配列を決定する方法について学生を指導するための補助教材として、またヒト化抗体の設計法を学生に教えるための実習科目として使用することができる。よって、zacrp11遺伝子、ポリペプチド、または抗体は、学生が分子生物学分野における技術を獲得できるように、試薬業者によって包装され、教育機関に販売され得る。個々の遺伝子およびタンパク質は固有であるため、個々の遺伝子およびタンパク質は、学生にとって実験実習課目における独自の問題および学習経験となる。zacrp11遺伝子、ポリペプチド、または抗体を含むこのような教育用キットは、本発明の範囲内に含まれると見なされる。
【０３４８】
zacrp11ヌクレオチド配列の治療的使用
本発明は、zacrp11をそのような処置を必要とする対象に提供するための、zacrp11ヌクレオチド配列の使用を含む。さらに、アンチセンス分子、リボザイム、または外部ガイド配列分子などといった、zacrp11遺伝子の発現を抑制する治療用発現ベクターが提供され得る。
【０３４９】
zacrp11を発現する組換え宿主細胞の使用、zacrp11をコードする裸の核酸の送達、陽イオン性脂質担体と、zacrp11をコードする核酸分子の使用、およびzacrp11を発現するウイルス（組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えアデノウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルスなど）の使用を含む、zacrp11遺伝子を対象に導入するための数多くのアプローチが存在する（例えば、Mulligan, Science 260:926 (1993)、Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988)、LaSalle et al., Science 259:988 (1993)、Wolff et al., Science 247:1465 (1990)、Breakfield and Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)を参照のこと）。エクスビボアプローチでは、例えば、細胞を対象から単離し、zacrp11遺伝子を発現するベクターをトランスフェクションし、次いでこれを対象にに移植する。
【０３５０】
zacrp11遺伝子を発現させるには、遺伝子の転写を制御するために、zacrp11遺伝子をコードするヌクレオチド配列をコアプロモーターに、また任意には調節エレメントに機能的に連結して、発現ベクターを構築する。発現ベクターの一般的な必要条件は上記の通りである。
【０３５１】
または、zacrp11遺伝子を、例えばアデノウイルスベクター（例えば、Kass-Eisler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993)、Kolls et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:215 (1994)、Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993)、Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993)、およびZabner et al., Cell 75:207 (1993)）、アデノウイルス関連ウイルスベクター（Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10613 (1993)）、セムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスなどのアルファウイルス（Hertz and Huang, J. Vir. 66:857 (1992)、Raju and Huang, J. Vir. 65:2501 (1991)、およびXiong et al., Science 243:1188 (1989)）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第4,769,331号、米国特許第4,859,587号、米国特許第5,288,641号、および米国特許第5,328,688号）、パルボウイルスベクター（Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)）、ポックスウイルスベクター（Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993)、Panicali and Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4927 (l982)）、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスなどのポックスウイルス（Fisher-Hoch et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317 (1989)、およびFlexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)）、およびレトロウイルス（例えば、Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993)、Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993)、Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992)、Vile and Hart, Cancer Res. 53:962 (1993)、Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993)、およびAnderson et al.、米国特許第5,399,346号）を含む組換えウイルスベクターで送達することができる。様々な態様において、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子を、後述する方法および組成物に使用することができる。
【０３５２】
1つの系の例として、2本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは、異種核酸分子を送達するための特徴がはっきりした遺伝子送達ベクターである（総説として、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)；Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)を参照のこと）。アデノウイルス系は、以下を含むいくつかの利点を提供する：(i) 比較的長いDNA挿入物を収容できること、(ii) 高力価になるまで増殖可能なこと、(iii) 広範囲の哺乳類細胞種に感染可能なこと、および(iv) 遍在性プロモーター、組織特異的プロモーター、および調節可能なプロモーターを含む多種多様なプロモーターと共に使用可能なこと。さらに、アデノウイルスは血流中で安定なため、静脈内注射により投与することができる。
【０３５３】
アデノウイルスゲノムの一部が欠失したアデノウイルスベクターを用いることで、直接連結によって、または同時にトランスフェクションしたプラスミドとの相同組換えによって、挿入配列がウイルスDNAに組み込まれる。1つの例示的な系では、必須のE1遺伝子がウイルスベクターから除去され、そのためウイルスは、E1遺伝子が宿主細胞から提供されない限り複製できない。動物体に静脈内投与する場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的とする。E1遺伝子が欠失したアデノウイルス送達系は宿主細胞内で複製できないが、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現してプロセシングを行う。宿主細胞はまた、対応遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合には、異種タンパク質を分泌する。分泌タンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高度に血管新生した肝臓）から血流に入る。
【０３５４】
さらに、ウイルス遺伝子の様々な欠失を含むアデノウイルスベクターを用いて、ベクターに対する免疫応答を低下させるかまたは排除することができる。このようなアデノウイルスはE1が欠失しており、さらにE2AまたはE4の欠失を含む（Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998)；Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998）)。E2bの欠失も、免疫応答を低下させることが報告されている（Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)）。アデノウイルスゲノム全体を欠失させることによって、異種DNAの極めて大きな挿入物を収容することができる。全ウイルス遺伝子を欠失させた、いわゆる「腑抜け（gutless）」アデノウイルスの作製は、異種DNAの大きな挿入物の挿入に特に有利である（総説として、Yeh. and Perricaudet. FASEB J. 11:615 (1997)を参照のこと）。
【０３５５】
治療遺伝子を発現し得る組換えウイルスの高力価保存液は、標準的な方法を用いて、感染哺乳類細胞から得ることができる。例えば、組換えHSVは、Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991)、Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994)、Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991)、Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989)、Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992)、およびBrown and MacLean (eds.),  HSV Virus Protocols (Humana Press 1997)によって記載されているように、Vero細胞から調製することができる。
【０３５６】
または、zacrp11遺伝子を含む発現ベクターを、リポソームを用いたインビボでのリポフェクションによって、対象の細胞に導入することができる。マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームは、合成陽イオン性脂質を用いて調製することができる（Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)；Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)）。特定の臓器に外因性遺伝子を導入するためにインビボでリポフェクションを使用することには、ある種の実用上の利点がある。リポソームを使用して特定の細胞種を直接トランスフェクションすることができ、このことは細胞が不均一な組織（膵臓、肝臓、腎臓、および脳など）において特に有利である。標的化する目的で、脂質を他の分子と化学的に結合させてもよい。標的ペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、タンパク質（抗体など）、または非ペプチド分子を、リポソームに化学的に結合することができる。
【０３５７】
エレクトロポレーションは、zacrp11核酸分子の別の投与様式である。例えば、Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867 (1998)は、筋肉への遺伝子移入を目的としたインビボエレクトロポレーションの使用について実証している。
【０３５８】
遺伝子治療の別のアプローチでは、治療用遺伝子は、zacrp11の発現を抑制するzacrp11アンチセンスRNAをコードし得る。アンチセンス構築物を調製する方法は、当業者には周知である。例えば、Erickson et al., Dev. Genet. 14:274 (1993)［トランスジェニックマウス］、Augustine et al., Dev. Genet. 14:500 (1993)［マウス全胚培養］、およびOlson and Gibo, Exp. Cell Res. 241:134 (1998)［培養細胞］を参照されたい。zacrp11アンチセンス分子の適切な配列は、本明細書に開示するzacrp11のヌクレオチド配列に由来し得る。
【０３５９】
または、リボザイムをコードするヌクレオチド配列に調節エレメントを機能的に連結させた発現ベクターを構築することができる。リボザイムは、mRNA分子中の特定の標的配列に対するエンドヌクレアーゼ活性を発現するように設計することができる（例えば、Draper and Macejak、米国特許第5,496,698号、McSwiggen、米国特許第5,525,468号、Chowrira and McSwiggen、米国特許第5,631,359号、およびRobertson and Goldberg、米国特許第5,225,337号を参照のこと）。本発明では、リボザイムは、zacrp11 mRNAと結合するヌクレオチド配列を含む。
【０３６０】
別のアプローチでは、調節エレメントが、zacrp11遺伝子をコードするmRNA分子のRNase P媒介性切断を促進し得るRNA転写産物の産生を指示する発現ベクターを構築することができる。このアプローチでは、内因性リボザイムであるRNase Pを細胞内mRNAの特定の種に導き、次いでこのmRNAが細胞リボザイムによって切断されるように、外部ガイド配列を構築することができる（例えば、Altman et al.、米国特許第5,168,053号、Yuan et al., Science 263:1269 (1994)、Pace et al.、国際公開公報第96/18733号、George et al.、国際公開公報第96/21731号、およびWerner et al.、国際公開公報第97/33991を参照のこと）。好ましくは、外部ガイド配列は、zacrp11 mRNAに相補的な10〜15ヌクレオチド配列、およびNが好ましくはプリンである3'-NCCAヌクレオチド配列を含む。外部ガイド配列の転写産物は、mRNAと相補的な外部ガイド配列との間で塩基対を形成することで標的mRNA種に結合し、これによって、塩基対形成領域の5'側に位置するヌクレオチドにおけるRNase PによるmRNAの切断を促進する。
【０３６１】
一般に、組換えウイルスなどの、zacrp11ヌクレオチド配列を有する治療用ベクターを含む組成物の用量は、対象の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、および既往歴などの要因に応じて変動する。治療用ベクターの適切な投与経路には、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、および腫瘍を含む空洞への注射が含まれる。
【０３６２】
本発明のウイルスベクター、非ウイルスベクター、またはウイルスベクターと非ウイルスベクターの組み合わせを含む組成物を既知の方法で製剤化して、ベクターまたはウイルスが薬学的に許容される担体と混合された、薬学的に有用な組成物を調製することができる。上記したように、リン酸緩衝食塩水などの組成物は、その投与がレシピエント対象によって許容される場合に、「薬学的に許容される担体」であると表現される。他の適切な担体は、当業者には周知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)、およびGilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed.(MacMillan Publishing Co. 1985)を参照のこと）。
【０３６３】
治療目的で、治療用遺伝子発現ベクター、またはこのようなベクターを含む組換えウイルス、および薬学的に許容される担体が、治療有効量で対象に投与される。発現ベクター（またはウイルス）と薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与量が生理学的に有意であれば、「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在によりレシピエント対象の生理機能に検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意である。
【０３６４】
治療用遺伝子発現ベクターまたは組換えウイルスで処置する対象がヒトである場合、治療は好ましくは体細胞遺伝子治療である。すなわち、治療用遺伝子発現ベクターまたは組換えウイルスを用いた、ヒトを対象とした好ましい処置は、ヒト生殖系列の一部を形成し、後に続く世代に受け継がれ得る核酸分子を細胞に導入すること（すなわち、ヒト生殖系列遺伝子治療）を必要としない。
【０３６５】
1つの局面において、本発明は、配列番号:2の少なくとも一部を含む単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、配列番号:2の少なくとも一部は、1〜15、1〜111、1〜255、16〜111、16〜255、21〜111、21〜255、61〜255、および124〜255、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される配列番号:2のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。別の態様では、本明細書に開示する単離されたポリペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端において、親和性タグ、毒素、放射性ヌクレオチド、酵素、およびフルオロフォアからなる群より選択される部分に共有結合している。別の態様において、本発明の単離されたポリペプチドは、薬学的に許容される賦形剤と併用される。1つの局面において、ポリペプチドは、本発明の少なくとも2つのポリペプチドを含むポリペプチドオリゴマーを形成し得る。ポリペプチドオリゴマーは、1つまたは複数の分子間ジスルフィド結合により結合され得る。オリゴマーは例えば、三量体、六量体、九量体、または18量体であってよい。
【０３６６】
1つの局面において、本発明は、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255または21〜255と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する単離されたポリペプチドであって、例えば創傷治癒を促進するなどの、本明細書に記載の機能を実行するポリペプチドを提供する。
【０３６７】
別の局面において、本発明は、配列番号:2のアミノ酸残基16〜255または21〜255を含む単離されたポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。組成物は、ポリペプチドのオリゴマー化複合体を含み得る。任意には、オリゴマー化ポリペプチドは三量体、六量体、九量体、または18量体であってよい。組成物は、例えば約90パーセントの六量体および約10パーセントの三量体から構成され得る六量体と三量体の混合物などの、オリゴマー化ポリペプチドの混合物であってもよい。
【０３６８】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。1つの態様において、抗体は、ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される。1つの態様において、抗体断片は本明細書に記載する通りであり、F(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位からなる群より選択される。
【０３６９】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０３７０】
第2の局面において、本発明は、第1部分が、a) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜255；b) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜255；c) 配列番号:2のアミノ酸残基21〜255；d) 配列番号:2のアミノ酸残基61〜255；e) 配列番号:2のアミノ酸残基124〜255；f) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜111；g) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜15；およびh) これらの組み合わせからなるより選択されるポリペプチドを含み；第2部分が別のポリペプチドを含む、ペプチド結合によって結合された第1部分および第2部分を含む融合タンパク質を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリン断片および本明細書に記載のzacrp11ペプチドまたはポリペプチドを含む。そのような融合タンパク質の免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンの少なくとも1つの定常領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリンの一部を示す。融合タンパク質の第2部分は任意には、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーの別のメンバーを含み得る。
【０３７１】
別の局面において、本発明は、a) 配列番号:1の核酸分子；およびb) 配列番号:3の核酸分子からなる群より選択される、単離された核酸分子を提供する。
【０３７２】
別の局面において、本発明は、約42℃〜約70℃における50%ホルムアミド、5×SSC（1×SSC：0.15 M塩化ナトリウムおよび15 mMクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液（100×デンハルト溶液：2% (w/v) Ficoll 400、2% (w/v)ポリビニルピロリドン、および2% (w/v)ウシ血清アルブミン）、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAというハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:1またはその相補物とハイブリダイズし得る単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ポリペプチドの少なくとも一部をコードし得る。任意には、核酸分子は、配列番号:2の少なくとも一部をコードし得る。核酸分子はまた、1〜255、16〜255、21〜255、61〜255、1〜111、16〜111、1〜15、および1〜20からなるアミノ酸残基の群より選択される、配列番号:2の少なくとも一部をコードし得る。核酸分子は、配列番号:2によって示されるポリペプチドをコードし得る。
【０３７３】
別の局面において、本発明はまた、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し、ここで、コードされるポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸残基16〜25または21〜255と95パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ例えば創傷治癒を促進するなどの本明細書に記載の機能を実行する。
【０３７４】
別の局面において、本発明は、a) 配列番号:1の核酸分子；およびb) 配列番号:3の核酸分子からなる群より選択される、単離された核酸分子を提供する。単離された核酸分子は、例えば、14〜778、59〜778、74〜778、194〜778、14〜346、および59〜346からなる群より選択される、配列番号:1または配列番号:3の連続したヌクレオチドを含み得る。
【０３７５】
別の局面において、本発明は、第1部分が、a) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜255；b) 配列番号:2のアミノ酸残基16〜255；c) 配列番号:2のアミノ酸残基61〜255；d) 配列番号:2のアミノ酸残基124〜255；e) 配列番号:2のアミノ酸残基61〜255；f) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜15；g) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜20；h) 配列番号:2のアミノ酸残基21〜258；およびi) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜111からなる群より選択されるポリペプチドを含み；第2部分が別のポリペプチドを含む、ペプチド結合によって結合された第1部分および第2部分を含む融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０３７６】
別の局面において、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明の特定の態様において、ポリペプチドは、配列番号:2の20個、30個、40個、50個、100個、またはそれ以上の連続した残基を含む。さらなるポリペプチドは、配列番号:2のそのような領域の少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも70個の連続したアミノ酸を含み得る。このようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブとして有用である。
【０３７７】
別の局面において、本発明は、以下の機能的に連結されたエレメント：転写プロモーター；本明細書に記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および転写ターミネーターを含む発現ベクターを提供する。
【０３７８】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の発現ベクターが導入され、そのようなDNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する培養細胞を提供する。例示的な宿主細胞には、細菌、酵母、菌類、昆虫、哺乳類、および植物細胞が含まれる。発現ベクターを含み、zacrp11タンパク質を産生するそのような組換え宿主細胞を培養し、任意に培養組換え宿主細胞からzacrp11タンパク質を単離することにより、zacrp11ポリペプチドを産生させるために、そのような発現ベクターを含む組換え宿主細胞を使用することができる。
【０３７９】
別の局面において、本発明は、上記に開示する発現ベクターが導入され、そのようなDNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養する段階；および発現されたポリペプチドを回収する段階を含む、ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【０３８０】
本発明はまた、これらの検出方法を行うためのキットを提供する。例えば、zacrp11遺伝子発現を検出するためのキットは、(a) 配列番号:1のヌクレオチド配列を含む核酸分子、(b) 配列番号:1のヌクレオチド配列の相補物を含む核酸分子、(c) 配列番号:1またはその相補物の少なくとも15個、30個、45個、または60個の連続したヌクレオチドからなる核酸分子からなる群より選択される核酸分子を含む容器を含み得る。例示的な核酸分子は、配列番号:1のヌクレオチド14〜778、14〜346、59〜778、59〜346、74〜778、74〜346、194〜778、194〜346、および383〜778、またはその相補物を含む核酸分子を含む。そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第2容器も含み得る。一方、zacrp11タンパク質を検出するためのキットは、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片を含む容器を含み得る。
【０３８１】
トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウスを作製することで、あらゆる組織において、または組織特異的もしくは組織選択的調節エレメントの制御下で、zacrp11遺伝子を過剰発現させることができる。zacrp11を過剰に産生するこれらの個体を用いて、過剰発現に起因する表現型を特徴づけることができ、またトランスジェニック動物は、過剰なzacrp11に起因するヒト疾患のモデルとなり得る。zacrp11を過剰に発現するトランスジェニックマウスはまた、大型動物の乳または血液中にzacrp11を産生するバイオリアクターのモデルを提供する。トランスジェニックマウスを作製する方法は、当業者には周知である（例え、Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995)、およびAbbud and Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)を参照のこと）。
【０３８２】
例えば、zacrp11遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法は、生殖能力がある成体雄（繁殖用雄）（B6C3f1、2〜8月齢、（Taconic Farms、ニューヨーク州、ジャーマンタウン））、精管切除した雄（不能雄）（B6D2f1、2〜8月齢、（Taconic Farms））、性的成熟前の生殖能力のある雌（ドナー）（B6C3f1、4〜5週齢、（Taconic Farms））、および生殖能力がある成体雌（レシピエント）（B6D2f1、2〜4月齢、（Taconic Farms））を対象に開始し得る。ドナーを1週間順化させた後、約8 IU/マウスの妊馬血清ゴナドトロピン（Sigma Chemical Company；ミズーリ州、セントルイス）を腹腔内に注射し、46〜47時間後に、8 IU/マウスのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG（Sigma））を腹腔内に注射して過排卵を誘導する。ホルモン注射後に、ドナーを繁殖用雄と交配させる。排卵は通常、hCG注射の13時間以内に起こる。交尾の成功は、交配後の翌朝における膣栓の存在によって確認される。
【０３８３】
受精卵を外科用顕微鏡下で採取する。卵管を採取し、卵をヒアルロニダーゼ（Sigma）を含む尿検査用スライド上に放出させる。卵をヒアルロニダーゼで1回洗浄し、5% CO2、5% O2、および90% N2で37℃においてインキュベートしたWhitten's W640培地（例えば、Menino and O'Claray、Biol. Reprod. 77:159 (1986)、およびDienhart and Downs, Zygote 4:129 (1996)に記載）で2回洗浄する。次にこの卵を、マイクロインジェクションを行うまで37℃/5% CO2インキュベーター内で保存する。
【０３８４】
zacrp11コード配列を含むプラスミドDNA 10〜20 μgを線状化し、ゲル精製し、マイクロインジェクション用に最終濃度が5〜10 ng/μlとなるよう、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、0.25 mM EDTA (pH 8.0)に再懸濁する。例えば、zacrp11コード配列は、配列番号:2のアミノ酸配列をコードし得る。
【０３８５】
加温したCO2平衡化ミネラルオイルを重層したW640培地の液滴中に含まれる回収卵に、プラスミドDNAをマイクロインジェクションする。DNAを注射針内に引き込み（内径0.75 mm、外径1 mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き抜く）、個々の卵に注入する。個々の卵に注射針を差し込み、一倍体前核の一方または両方まで到達させる。
【０３８６】
数ピコリットルのDNAを前核に注入し、注射針を核小体に接触しないように引き抜く。この手順を、すべての卵への注入が終わるまで繰り返し行う。マイクロインジェクションが成功した卵を、事前にガスを加えておいたW640培地を含む器官組織培養ディッシュに移して、37℃/5% CO2インキュベーター内で一晩保存する。
【０３８７】
翌日、2細胞胚を偽妊娠レシピエントに移す。レシピエントは、精管切除した不能雄との交尾後に交尾栓の存在によって同定する。レシピエントを麻酔して背部の左側を剪毛し、外科用顕微鏡に移す。膝と脾臓との中間の、胸郭、鞍部、および後肢で囲まれた腹部中央の皮膚および筋肉壁を小さく切開する。小さな外科的ドレープ上に生殖器官を露出させる。脂肪塊を外科的ドレープ上で広げ、小型止血小鉗子（Roboz、メリーランド州、ロックビル）を脂肪塊に取り付け、マウスの背中側につるしておき、臓器が滑り込んで戻るのを防ぐ。
【０３８８】
W640と気泡が交互に続くミネラルオイルを含む、細いトランスファーピペットで、前日の注射で得られた12〜17個の健康な2細胞期の胚をレシピエントに移す。卵管膨大部の位置を確認し、膨大部と卵巣嚢との間に卵管を保持し、膨大部および卵巣嚢を断裂させないように、卵管の卵巣嚢の近傍に28ゲージ針で切れ目を入れる。
【０３８９】
ピペットを卵管の切れ目に挿入し、1番目の気泡がピペットから出るように胚を注入する。脂肪塊を緩やかに腹膜へ押しつけ、生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を1回の縫合で閉じ、皮膚を創傷クリップで閉じる。マウスを、37℃のスライドウォーマーで最低4時間かけて回復させる。
【０３９０】
レシピエントをつがいにしてケージに戻し、19〜21日の妊娠期間をおく。出生後は、分娩後19〜21日おいて離乳させる。離乳仔の性別を確認し、性別隔離ケージに収容し、0.5 cmの生検試料（遺伝子型決定用）を清潔なハサミで尾から切り取る。
【０３９１】
ゲノムDNAを尾の切片から、例えばQIAGEN DNEASYキットを用いて製造業者の指示書に従って調製する。zacrp11遺伝子または同じプラスミドに導入された選択マーカー遺伝子を増幅するように設計したプライマーを使用して、ゲノムDNAをPCRで解析する。動物がトランスジェニックであることを確認した後、トランスジェニックの雌と野生型の雄、またはトランスジェニックの雄と1匹もしくは2匹の野生型のメスを一緒にすることで、戻し交配して近交系とする。仔が生まれて離乳したら、性別を分けて、尾から遺伝子型決定用の試料を切断する。
【０３９２】
生体動物における導入遺伝子の発現を調べるために、部分的な肝切除を行う。剣状突起の直下の上腹部で手術の準備を行う。無菌的な手法で胸骨下を小さく1.5cm〜2 cm切開し、肝臓の左側葉を露出させる。4-0シルクを用いて下葉の周囲を結紮し、体腔の外側に固定する。非外傷性クランプを用いて結び目を抑えながら、吸収性Dexon （American Cyanamid；ニュージャージー州、ウェーン）の第2のループを、第1の結び目の近位に配置する。Dexonの結び目から遠位部を切開し、約100 mgの切除肝組織を、滅菌ペトリ皿に入れる。切除肝切片を14 mlポリプロピレン丸底チューブに移し、液体窒素中で瞬間凍結し、その後ドライアイス上で保存する。外科処置部位を縫合および創傷クリップで閉じ、37℃に加熱したパッド上に動物のケージを術後24時間静置する。術後は動物を毎日調べ、創傷クリップを術後7日〜10日目に除去する。RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイまたはポリメラーゼ連鎖反応により、各トランスジェニックマウスについてzacrp11 mRNAの発現レベルを調べる。
【０３９３】
zacrp11を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製に加えて、遺伝子の発現が異常に低いかまたは遺伝子を発現しないトランスジェニックマウスを作製することも有用である。このようなトランスジェニックマウスは、zacrp11の欠損に関連する疾患の有用なモデルを提供する。上述したように、zacrp11遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、または外部ガイド配列遺伝子により抑制され得る。zacrp11遺伝子を低発現するトランスジェニックマウスを作製するためには、このような抑制配列をzacrp11 mRNAに標的化する。特定の遺伝子の発現が異常に低いトランスジェニックマウスを作製する方法は、当業者には周知である（例えば、Wu et al., "Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies", Methods in Gene Biotechnology, pages 205-224 (CRC Press 1997)を参照のこと）。
【０３９４】
zacrp11遺伝子発現がほとんどまたは全くないトランスジェニックマウスを作製する別のアプローチでは、少なくとも一方の正常zacrp11対立遺伝子が非機能的zacrp11遺伝子で置換されたマウスを作製する。非機能的zacrp11遺伝子を設計する1つの方法では、選択マーカー遺伝子などの別の遺伝子を、zacrp11をコードする核酸分子内に挿入する。このようないわゆる「ノックアウトマウス」を作製する標準的な方法は、当業者には周知である（例えば、Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、およびWu et al., "New Strategies for Gene Knockout", Methods in Gene Biotechnologym pages 339-365 (CRC Press 1997)を参照のこと）。
【０３９５】
本明細書で引用するすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な情報（例えば、GenBankアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の寄託）の完全な開示は、参照により組み入れられる。前述の詳細な説明および実例は、理解を明快にする目的でのみ提供されている。そこから不必要な制限はないと理解されるべきである。当業者に明らかな変形例は、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲に含まれるため、本発明は、提示および記載された正確な詳細には制限されない。
【０３９６】
実施例
実施例1
zacrp11のクローニングおよび単離
zacrp11の明白な全長cDNAを得るため、以下のPCR反応を設定した。オリゴZC43822
2007532092.tif 000017
およびZC43820
2007532092.tif 000018
、アニーリング温度53℃、40サイクル、ならびに10% DMSOを添加したKOD Hot Startポリメラーゼを用いるPCR反応を行い、ヒト胎児脳cDNAから0.77 kb断片を取得した。QIAquickゲル抽出キット（Qiagen、カリフォルニア州、サンタクラリタ）を用いて、産物を精製した。次いで、0.77 kb断片を、FAST-LINK DNAライゲーションおよびスクリーニングキット（Epicentre Technologies；ウィスコンシン州、マディソン）を用いてベクターpZMP31に連結した。
【０３９７】
標準的なミニプレップ手順により、zacrp11 cDNAを含むクローンを同定した。2つのクローンを配列決定に供した。これらのクローン間に、塩基配列の相違は検出されなかった。
【０３９８】
実施例2
zacrp11の発現および精製
A. ベビーハムスター腎（BHK）細胞におけるzacrp11の発現
zacrp11のcDNAをPCR増幅して、C末端Glu-Gluタグ、ならびに5'末端および3'末端それぞれにおけるFseI部位およびBgl II部位を付加した。KOD Hot Start DNAポリメラーゼキット（EMD Biosciences、ウィスコンシン州、マディソン）と共にプライマーZC42971
2007532092.tif 000019
およびZC43820
2007532092.tif 000020
を使用し、キットの指示書に従うと共に10% DMSOを添加して、zacrp11 cDNAを増幅した。PCR条件は以下の通りであった：DNA鋳型を94℃で5分間変性した後、90℃で30秒；54℃で20秒；65℃で20秒を18サイクル行い、続いて65℃で10分間を1サイクル行った。PCR反応産物を、TAE緩衝液により1.0%（低融点）SEAPLAQUE GTG（FMC Bioproducts；メイン州、ロックランド）で泳動した。ゲルからzacrp11 PCR産物を切り出し、65℃で融解し、フェノール抽出を2回行い、次いでエタノール沈殿した。次に、PCR産物をFseI-Bgl IIで消化し、フェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、20μl dH2Oで再水和した。
【０３９９】
cDNAをpZMP31のFseI-Bgl II部位にクローニングした。連結は、FAST-LINK DNAライゲーションおよびスクリーニングキット（EPICENTRE TECHNOLOGIES；ウィスコンシン州、マディソン）を用いて行った。zacrp11 cDNAを含むクローンを、標準的なミニプレップ手順により同定した。
【０４００】
zacrp11のcDNAを含むpZMP31プラスミドを、以下の手順によりBHK 570細胞にトランスフェクションした。1.7 mlチューブ中で、16μg DNAを無血清DMEM（Gibco-BRL）で希釈して640μlとした。別の1.7 mlチューブでは、製造業者の指示書に従って、35μlリポフェクタミン（Gibco-BRL）を無血清DMEMで希釈して640μlとした。リポフェクタミン混合物をDNAに添加して緩やかに混合し、室温で15分間保存した。脂質/DNA複合体を5 ml無血清培地と共に、BHK細胞の10 cmディッシュ（50〜60%コンフルエント）に添加した。6時間後、無血清培地を完全増殖培地（DMEM、5% FBS、2 mM GlutaMAX-1、および1 mMピルビン酸ナトリウム（Gibco-BRL）と置換した。24時間後、1 uMメチルトレキセート（methyltrexate）を培地に添加し、トランスフェクションされた細胞を選択した。無血清DMEM培地での馴化培地を回収し、zacrp11を精製した。
【０４０１】
B. 精製
安定な多クローン性のBHK感染細胞集団の順化培養液から、C末端にEEタグ（EYMPME）がタグ化された組換えzacrp11タンパク質を回収した。培養物を回収し、培地を0.20μmフィルターでろ過した。
【０４０２】
抗EE抗体アフィニティーカラムおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより、zacrp11-CEEを馴化培地から精製した。ろ過した培養液を、1.7 ml/分で、20×80 mm（総容積25-ml）抗EYMPME（抗-EE）抗体アフィニティーカラムに直接供した。カラムをまず5カラム容積（cv）の1×PBSで洗浄し、次いで5-cvの5×PBSで洗浄し、続いて結合しているタンパク質を2-cvの0.2 Mグリシン、pH 3で溶出した。zacrp11含有画分をプールし、Biomax-5濃縮器（Millipore）で2〜3 mlになるまで濃縮し、1×PBSで26×60 mm Superdex 200ゲルろ過カラム（Amersham Pharmacia Biotech）にかけた。精製zacrp11-CEEタンパク質を含む5 ml画分をプールし、0.2μmフィルターでろ過し、-80℃で保存した。最終的に精製されたタンパク質の濃度を、BCAアッセイ（Pierce Chemical Co.、イリノイ州、ロックフォード）およびHPLCアミノ酸解析により決定した。
【０４０３】
C. 解析
SDS-PAGE（Bis-Tris Nupage（商標）ゲル、4〜12%；Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド）を行い、銀染色（Fast Silver、Geno Tech、ミズーリ州、セントルイス）することで、および抗EEマウスモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングすることで、組み換えzacrp11-CEEタンパク質を解析した。市販のブロッティング装置（Novex（登録商標）Xcell II（商標）ミニセル；Invitrogen）を用いて馴化培地または精製タンパク質を電気泳動し、ブロットモジュール（Xcell II（商標）；Invitrogen）を用いて、装置の手引書に提供された指示に従って、室温でニトロセルロースフィルター（0.2μm；Invitrogen）に転写した。転写は、25 mM Trisベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含む緩衝液中で、500 mAで1時間行った。次いで、ブロットを、PBSに溶解した10%脱脂粉乳を用いて室温で10分間ブロッキングした。3%脱脂粉乳を含むPBSで1:5000希釈したマウス一次抗体で、ブロットを室温で1時間プロービングした。インキュベーション後、ブロットをPBSでそれぞれ10分間ずつ3回洗浄し、次いで3%脱脂粉乳を含むPBSで1:5000希釈した二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG、Pierce Chemical Co.、イリノイ州、ロックフォード）で標識し、室温で1時間インキュベートした。次に、ブロットをPBSでそれぞれ10分間ずつ3回洗浄した。市販の化学発光基質試薬（1:1で混合したSuperSignal（登録商標）ULTRA試薬1および2；試薬はPierce Chemical Co.、イリノイ州、ロックフォードから入手）を用いてブロットを検出し、市販のソフトウェア（Lumi-Imager（商標） LumiAnalyst 3.0；Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ）を用いて保存した。
【０４０４】
精製したzacrp11-CEEタンパク質は、銀染色したゲルから判定して、変性および非還元条件下で主に二量体として存在した。単量体バンドおよびいくつかの大きなオリゴマーバンドも認められた。二量体タンパク質は非還元条件下では54-kDaで移動し、還元すると32 kDaになった。N末端配列決定データから、A16が主な開始部位であることが明らかになった。
【０４０５】
実施例3
ヒトzacrp11のN末端配列決定
Applied Biosystem製の試薬を用いて、標準的な自動N末端ポリペプチド配列決定（エドマン分解）を行った。N末端配列解析は、Model 494 Protein Sequencer Systems（Applied Biosystems, Inc.、カリフォルニア州、フォスターシティー）で行った。データ解析は、Model 610A Data Analysis System for Protein Sequencing、バージョン2.1a（Applied Biosystems）で行った。
【０４０６】
zacrp11-CEE試料は、プロテインGセファロース/抗EEビーズ上に捕捉し、0.2 Mグリシン緩衝液、pH 3、0.5 M塩化ナトリウムで溶出し、tris緩衝液で中和した後に使用に供した。この試料を還元LDS NuPAGE試料緩衝液（Invitrogen）に添加し、熱湯で加熱してから、Novex SDS PAGEシステム（4〜12% Bis-Tris MES NuPAGE；Invitrogen）により製造業者の指示書に従ってSDS-PAGEで泳動した。ゲルをNovex PVDF膜（Invitrogen）に電気的に転写し、標準的な方法でクマシーブルー染色した（Sigma、ミズーリ州、セントルイス）。対応する抗EEウェスタンブロットを行い、N末端タンパク質配列決定のためのzacrp11バンドを同定した。抗EE IgG HRP結合抗体は、研究室で作製した。
【０４０７】
分泌されたzacrp11ポリペプチドのN末端配列解析から、配列番号:2のアミノ酸残基16（Ala）での成熟開始部位を生じるシグナル配列の予測切断部位が確認された。
【０４０８】
以上のことから、説明を目的として本発明の特定の態様を本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることが理解されると考えられる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に制限される以外に、制限されることはない。
【配列表】
2007532092000001.app
【国際調査報告】
2007532092.tif 000021
2007532092.tif 000022
2007532092.tif 000023
2007532092.tif 000024