(57)【要約】  本発明は、悪性腫瘍、特に乳癌、の予測、診断、予後予測、予防、および処置のための新規組成物、方法、および使用を提供する。健常人と比較して乳癌患者の乳組織に特異的に発現する遺伝子が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのマーカーを検出することによる癌の処置に対する応答の予測のための方法であって、該マーカーが悪性腫瘍において変化した１つの染色体領域に位置する遺伝子およびその断片またはゲノム核酸配列であることを特徴とする方法。
【請求項２】
処置が、抗体療法、抗ホルモン療法、抗成長因子療法、タキソールに基づく処置、アントラサイクリンに基づく処置、または白金塩に基づく処置である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
処置が、ハーセプチン（商標）、トラスツヅマブ、または２Ｃ４抗体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該マーカーが、
ａ）悪性腫瘍において変化した１以上の染色体領域に位置する遺伝子；および
ｂ）
ｉ）レセプターおよびリガンド；または
ｉｉ）同一シグナル伝達経路のメンバー；または
ｉｉｉ）相乗的シグナル伝達経路のメンバー；または
ｉｖ）拮抗的シグナル伝達経路のメンバー；または
ｖ）転写因子および転写因子結合部位；または
ｖｉ）ヘテロマー複合体に不可欠な成分
であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
悪性腫瘍が、乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、食道癌、間葉性癌、膀胱癌、または非小細胞肺癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの染色体領域が以下の細胞遺伝学的領域であると規定される、請求項１から５のいずれかに記載の方法：１ｐ１３、１ｑ３２、３ｐ２１−ｐ２４、５ｐ１３−ｐ１４、８ｑ２３−ｑ２４、１１ｑ１３、１２ｑ１３，１７ｑ１２−ｑ２４、１７ｑ１１．２−２１．３または２０ｑ１３。
【請求項７】
少なくとも１つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための方法であって、以下から選択されるマーカーを検出することを特徴とする方法：
ａ）配列番号３１９〜３８９の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定されるのと同じ生物学的機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｃ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｅ）（ａ）から（ｅ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ配列によりコードされる精製ポリペプチド；
ｆ）配列番号３９７〜４６７の配列の少なくとも１つを含む精製ポリペプチド。
【請求項８】
以下から選択されるマーカーを検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７６、または３１５〜３８９の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｅ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ配列によりコードされる精製ポリペプチド；
ｆ）配列番号２７〜５２、または７６〜９８、または３９３〜４６７の配列を少なくとも１つ含む精製ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１から８の方法を実施するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、腫瘍性疾患の予測、診断、予後予測、予防および処置のための方法および組成物に関する。特に興味深いのは、各種治療計画に対する腫瘍性病変の応答予測である。腫瘍性疾患は、再配列された遺伝子の過剰または過小発現につながる染色体再配列により起こることが多い。本発明は、腫瘍組織において過剰発現し診断マーカーおよび処置の標的として有用である遺伝子を開示する。腫瘍性疾患の予測、診断および予後予測ならびに予防および処置のための方法が開示される。
［背景技術］
【０００２】
染色体異常（増幅、欠失、反転、挿入、転座および／またはウイルス組み込み）は、それぞれの領域の脱調節の原因となるので、癌および腫瘍病巣の発生に重要である。成長特性、分化、侵襲性または治療的介入に対する耐性について重要な遺伝子が位置するゲノム領域の増幅が記載されている。染色体異常を有するこれらの領域の一つは、乳癌患者において増幅されているＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子を有する領域である。乳癌患者の約２５％において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が、遺伝子増幅のために過剰発現している。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現は、予後不良（再発、全体的生存率、治療法に対する感受性）と相関する。疾患進行の予後予測に関するＨＥＲ−２／ｎｅｕの重要性は記載されている［Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎら、１９９２，（１）］。ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して生じる遺伝子特異的抗体（ハーセプチン（商標））は各癌患者を処置するために作られてきた。しかしながら、ハーセプチンでの抗体処置からは患者のわずか約５０％しか恩恵を享受せず、ほとんどの場合化学療法計画と組み合わせられる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍（同様の程度までＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する）の治療法に対する反応性に関しての不一致から、各腫瘍組織の成長およびアポトーシス特性に関与するさらなる因子または遺伝子が存在する可能性があることが示唆される。成長因子レセプターＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現と治療成果の間には一因的な関係は無いようである。これと一致して、通常用いられる腫瘍マーカー、たとえば、エストロジェンレセプター、プロゲステロンレセプター、ｐ５３およびＫｉ−６７の測定は、特定の治療的決定の臨床的成果に関して非常に限られた情報しか提供しない。従って、患者の向上された治療決定および生存率の予測を可能にするために、さらに詳細な腫瘍の診断および兆候の分類が非常に必要とされている。本発明は、その発現が腫瘍において脱調節され、かつ臨床的成果と相関する遺伝子を提供することにより、さらなるマーカーの必要性に対応する。一つの点は、特定の染色体領域に存在する遺伝子および疾患発症および薬剤応答性におけるその相互作用の脱調節である。
【０００３】
腫瘍性疾患のＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび他のマーカーは通常、診断法、たとえば、免疫組織学（ＩＣＨ）（たとえば、ＤＡＫＯ  Ｉｎｃから得られるＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標））および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（たとえば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびトポイソメラーゼＩＩアルファのＶＹＳＩＳから得られる蛍光インサイチュハイブリダイゼーションキットでの定量的測定）で分析される。さらに、ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、血清におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ断片をＥＬＩＳＡ試験（ＢＡＹＥＲ  Ｃｏｒｐ．）またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子増幅を検出するために非増幅対照遺伝子の量とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子の量を比較する定量的ＰＣＲキット（ＲＯＣＨＥ）で検出することにより分析できる。しかしながら、これらの方法は、感度、特異性、技術および人員労力、費用、時間、実験室間の再現性に関していくつかの欠点を示す。これらの方法はまた、一つの患者サンプル内の複数のパラメーターの測定に関して制限される（「マルチプレクシング」）。通常、組織スライドあたりわずかに約３から４のパラメータ（たとえば、遺伝子または遺伝子産物）しか検出できない。従って、一つのサンプルにおいて複数のパラメータを同時に測定するための迅速で簡単な試験法の開発が必要とされる。本発明は、複数の診断および予後予測マーカーを同時に検出できる迅速で簡単な高分解法に対する必要性に関する。
【０００４】
［発明の概要］
本発明は、癌組織における染色体変化がその変化した染色体領域によりコードされる遺伝子の発現における変化につながり得るという発見に基づく。乳癌組織から得られる腫瘍病巣において共に増幅されている例示的な４３ヒト遺伝子が同定され、これらの遺伝子のいくつかにおいては結果として発現が変化している（表１から４）。これらの４３遺伝子は、正常、すなわち非乳癌状態におけるその発現と比較して、乳癌状態において差次的に発現する。本発明は、これらの遺伝子の誘導体、断片、アナログおよびホモログおよびその使用または使用法に関する。
【０００５】
本発明はさらに、悪性腫瘍、特に乳癌の新規な予防、予測、診断、予後予測および治療用組成物および使用にも関する。特に細胞外ドメインを含む膜結合マーカー遺伝子産物は処置方法並びに診断および臨床的モニター法の標的として特に有用であり得る。
【０００６】
これらの遺伝子のいくつかが、その遺伝子産物が互いに直接的または間接的に影響を及ぼすことによりシグナリングカスケードにおいて機能的に相互作用することを特徴とするということは、本発明により見いだされた。この相互作用は、非腫瘍組織（たとえば、脳または神経組織）の通常の生理機能において重要である。しかしながら、通常異なるレベルの活性を示すかまたは活性でないこれらの遺伝子が腫瘍病巣において脱調節される結果、病気になり、疾患関連組織の特性に影響を及ぼす。
【０００７】
本発明はさらに、悪性腫瘍におけるこれらの脱調節をＤＮＡおよびｍＲＮＡレベルで検出する方法にも関する。
【０００８】
本発明はさらに、変化した染色体領域において位置する遺伝子によりコードされる個々のｍＲＮＡの相対量を検出することを特徴とする染色体変化の検出方法にも関する。
【０００９】
本発明はさらに、定量的ＰＣＲまたはＤＮＡアレイおよびＤＮＡシーケンシングによりＤＮＡコピー数を測定することにより、特定の染色体変化の隣接切断点を検出する方法にも関する。
【００１０】
記載されたゲノム切断点に隣接するか、またはその内部に位置するＤＮＡ配列の検出により悪性腫瘍を予測、診断または予後予測する方法。
【００１１】
本発明はさらに、変化した染色体領域内に位置する１以上のゲノム核酸配列のコピー数を定量的ＰＣＲ技術（たとえば、ＴａｑＭａｎ（商標）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）およびｉＣｙｃｌｅｒ（商標））により検出することを特徴とする染色体変化の検出方法にも関する。
【００１２】
本発明はさらに、少なくとも２つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断または予後予測の方法であって、該マーカーが悪性腫瘍、特に乳癌において変化した一つの染色体領域上に位置する遺伝子およびその断片またはゲノム核酸配列である方法にも関する。
【００１３】
本発明はさらに、少なくとも２つのマーカーの検出により悪性腫瘍を予測、診断または予後予測する方法であって、該マーカーが悪性腫瘍、特に乳癌において変化した１以上の染色体領域上に位置し、かつ（ｉ）レセプターおよびリガンドまたは（ｉｉ）同じシグナル伝達経路のメンバーまたは（ｉｉｉ）相乗的シグナル伝達経路のメンバーまたは（ｉｖ）拮抗的シグナル伝達経路のメンバーまたは（ｖ）転写因子および転写因子結合部位として相互作用する方法を開示する。
【００１４】
また、少なくとも１つのマーカーの検出により悪性腫瘍を予測、診断または予後予測する方法であって、該マーカーが増幅のために悪性腫瘍において変化した１つの染色体領域上に位置するＶＮＴＲ、ＳＮＰ、ＲＦＬＰまたはＳＴＳであり、かつ同じ個体から得られる（ａ）癌および（ｂ）非癌組織または生物学的サンプルにおいて検出される方法が開示される。好ましい態様は、表６の少なくとも１つのＶＮＴＲマーカーまたは表４の少なくとも１つのＳＮＰマーカーまたはその組み合わせの検出である。かかる多型マーカーの検出、定量およびサイズ決定が（ａ）ＰＣＲ増幅およびそれに続くキャピラリー電気泳動による比較測定、（ｂ）ゲル電気泳動（たとえば、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ）、リアルタイムキネティックＰＣＲ、ダイレクトＤＮＡシーケンシング、ピロシーケンシング、質量特異的対立遺伝子識別またはＤＮＡアレイ技術による再配列化による配列決定および対立遺伝子識別、（ｃ）特定の制限酵素切断パターンの測定およびそれに続く電気泳動による分離および（ｄ）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（たとえばＡＳＯ）による対立遺伝子識別の方法により達成されるのもさらに好ましい。ヘテロ接合ＶＮＴＲ、ＳＮＰ、ＲＦＬＰまたはＳＡＴＳのさらに好ましい検出は、様々な標識されたプライマー（たとえば、蛍光、放射性、生物活性）および適当なキャピラリー電気泳動（ＣＥ）電気泳動システムを用いて多様な方法において行われる。
【００１５】
別の態様において、これらの遺伝子の発現は、ＷＯ９７２７３１７およびＵＳ６３７９８９５に記載されているようなＤＮＡアレイで検出できる。
【００１６】
さらに別の態様において、これらの遺伝子の発現は、ＷＯ９７１４０２８およびＷＯ９９５２７０８において記載されているようなビーズに基づく直接蛍光リードアウト技術で検出することができる。
【００１７】
ある態様において、本発明は、配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９または２１〜２６または５３〜７５を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの、正常または未処置細胞と比較して、差次的発現を検出することを含む、細胞または組織の表現型を決定する方法に関し、ここで、ポリヌクレオチドは少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍または少なくとも約３倍、差次的に発現する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９または２１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチドの一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、各ポリヌクレオチドに関して表２または３において示す生物学的機能と同じ機能を示すポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの、正常または未処置細胞と比較しての差次的発現を検出することを含む、細胞または組織の表現型を決定する方法に関し、ここで該ポリヌクレオチドは少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍または少なくとも約３倍、差次的に発現する。
【００１９】
本発明の別の態様において、配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９または２１〜２６または５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むか、または配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５または４７〜５２または７６〜９８を有するポリペプチドの一つをコードするポリヌクレオチドは、乳癌に罹患しやすい表現型または罹患した表現型を示す個体における細胞または組織を同定するために用いることができ、これにより（ａ）個体が発症の危険にあるかどうかを予測し、または（ｂ）個体が罹患しているかどうかを診断し、または（ｃ）悪性腫瘍および特に乳癌の進行または処置の成果を予後予測することができる。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は染色体レベルで変化し、かつ機能により連関し、悪性腫瘍および特に乳癌において差次的に発現する遺伝子をコードするゲノム領域を同定する方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、悪性腫瘍および乳癌の予測、診断および予後予測ならびに予防および処置において用いられるゲノム領域１７ｑ２１、３ｐ２１および１２ｑ１３を提供する。特に、前記染色体領域の遺伝子内領域だけでなく遺伝子間領域、疑似遺伝子または非転写遺伝子も、診断、予測、予後予測および予防および治療用組成物および方法に用いることができる。それゆえ、本発明に記載されるコード領域または非コード領域の配列は、例示であって限定ではない。この一局面として、この記載されるゲノム配列の間のゲノム配列も同じ目的で使用可能である。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるか、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。試験化合物を、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる。試験化合物のポリペプチドとの結合が検出される。ポリペプチドと結合する試験化合物は、それにより悪性腫瘍、さらに詳細には乳癌の処置のための有効な治療薬と同定される。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性を調節する物質をスクリーニングするもう一つの方法を提供する。試験化合物を、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる。ポリペプチドにより媒介される生物学的活性を検出する。生物学的活性を減少させる試験化合物は、これにより、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドによりコードされるポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性を、悪性腫瘍、特に乳癌において減少させるための有効な治療薬と同定される。生物学的活性を増大させる試験化合物は、これにより、配列番号２７〜５２および７６〜９８を有するポリペプチドの一つから選択されるポリペプチドによりコードされるポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性を悪性腫瘍、特に乳癌において上昇させる有効な治療薬と同定される。
【００２４】
別の態様において、本発明は、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの活性を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。試験化合物を、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと接触させる。配列番号１〜２６および５３〜７５から選択させるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとの試験化合物の結合が検出される。ポリヌクレオチドと結合する試験化合物は、これにより、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの活性を悪性腫瘍、特に乳癌において調節する有効な治療薬と同定される。
【００２５】
本発明は従って、配列番号２７〜５２および７６〜９８を有するポリペプチドの一つから選択されるポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、たとえば、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドまたは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのレギュレーターまたはモジュレーター、たとえば、アゴニストおよびアンタゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、アクチベーター、コアクチベーターおよびインヒビターとして作用し得る化合物を同定するために用いることができる。従って、本発明は、悪性腫瘍、特に乳癌において配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドまたは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを調節するための試薬および方法を提供する。調節は、上方調節または下方調節であり得る。配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、安定性または量、あるいは配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドまたは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性を調節する試薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、核酸アナログ（たとえば、ペプチド核酸、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸）または小分子であり得る。配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、安定性または量、あるいは配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドまたは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性を調節する方法は、遺伝子置換療法、アンチセンス、リボザイムおよびトリプレックス核酸法であり得る。
【００２６】
本発明のある態様において、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドもしくは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされる完全長または部分ポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと特異的に結合する、悪性腫瘍、特に乳癌の予測、予防、診断、予後予測および処置において使用される抗体を提供する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドもしくは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと特異的に結合する試薬の、悪性腫瘍、特に乳癌を処置するための医薬の調製における使用である。
【００２８】
さらに別の態様は、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドまたは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性または安定性、あるいは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、量または安定性を調節する試薬の、悪性腫瘍、特に乳癌を処置するための医薬の調製における使用である。
【００２９】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１〜２６、５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または配列番号２７〜５２、７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドもしくは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと特異的に結合する試薬および医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物である。
【００３１】
ある態様において、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらと相補的な配列を含むポリヌクレオチドの、細胞における発現のレベルを変化させる試薬は、細胞を提供し、該細胞に試験試薬を処置し、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらと相補的な配列を含むポリヌクレオチドの、細胞における発現のレベルを測定し、そして処置された細胞におけるポリヌクレオチドの発現のレベルを未処置細胞におけるポリヌクレオチドの発現のレベルと比較することにより同定され、ここで未処置細胞におけるポリヌクレオチドの発現のレベルと比較して処置された細胞におけるポリヌクレオチドの発現のレベルにおける変化は、細胞におけるポリヌクレオチドの発現のレベルを変化させる物質を示す。
【００３２】
本発明はさらに、この方法により同定される試薬を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
本発明のもう一つの態様は、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドまたは配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む医薬組成物である。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１〜２６および５３〜７５から選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれのポリヌクレオチドについて示される生物学的機能と同じ機能を示すポリペプチド、または配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物である。本発明において有用な医薬組成物は、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリヌクレオチド、またはその断片、抗体、または抗体断片を含むポリペプチドを含む融合タンパク質をさらに含みうる。
【００３５】
［図面の簡単な説明］
図１は、Ｇ−バンディングパターンおよび細胞遺伝学的位置を伴う染色体１７のスケッチを示す。図面の下の部分での吹き出しにおいて、染色体１７の長腕（１７ｑ１２−２１．１）の染色体部分の詳細図を示す。中間の灰色で示すそれぞれの上下の長方形は、各位置の上下で標識された遺伝子を表す。この図において示される遺伝子の順序は、過剰発現の増幅を探求する実験および公に入手可能なデータ（たとえば、ＵＣＳＣ、ＮＣＢＩまたはＥｎｓｅｍｂｌｅ）から推測した。
図２は、図１においてすでに示したのと同じ領域およびＤＮＡ−チップハイブリダイゼーションにより測定された個々の発現値のクラスター図を示す。遺伝子を表す正方形は点線により示される。クラスター図の上部において、４つの腫瘍細胞株（その内の２つが公知のＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現（ＳＫＢＲ３およびＡＵ５６５）を有する）を各発現特性に関して図示する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子だけでなく、本発明により提供されるその周辺のいくつかの他の遺伝子も明らかな過剰発現を示す。クラスター図の中間部に、免疫組織化学的に特徴づけられた腫瘍サンプルから得られる発現データを示す。図示されたプローブの内の２つは白い長方形により印を付けた遺伝子の明らかな過剰発現を示す。さらなる情報および比較のために、何人かの非罹患ヒト組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から入手したＲＮＡ）の発現特性を示す。ヒト脳および神経組織がＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍の発現特性と最も近い関係を示す。
図３は、ｑＰＣＲ（たとえば、ＴａｑＭａｎ）によるＤＮＡ増幅測定から得られるデータを示す。データは、いくつかの分析された乳癌において、細胞株が前述の領域（ＡＲＣＨＥＯＮ）に位置する遺伝子の増幅を有することを示す。データは、ｘ−軸上に各遺伝子、ｙ−軸に４０−Ｃｔについて示した。データは、カラムの第一群においてみられるＧＡＰＤＨの発現レベルに対して標準化した。
図４は、増幅された領域についての概略図を示し、各増幅の長さおよび分析された腫瘍細胞株における過剰発現についての情報を提供する。増幅の長さおよび遺伝子の構成は、他の場所でも記載するように、癌細胞の性質およびある種の薬剤に対する反応性に対して著しい影響を及ぼす。
【００３６】
［発明の詳しい説明］
定義
本明細書において用いられる「差次的発現」とは、異なる発生および／または腫瘍増殖による遺伝子の発現パターンにおける量ならびに質的な差の両方を意味する。差次的に発現する遺伝子は、「マーカー遺伝子」および／または「標的遺伝子」を表しうる。本明細書において開示される差次的に発現する遺伝子の発現パターンは、予後または診断的乳癌の評価の一部として用いることができる。別法として、本発明において開示される差次的に発現する遺伝子は、試薬および化合物を同定するための方法、これらの試薬および化合物の乳癌の処置における使用並びに処置方法において用いることができる。
【００３７】
「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的機能」は、本明細書において交換可能に用いられ、ポリペプチド（その本来のまたは変性後のコンフォメーションのいずれにおいても）、またはその任意の断片により、インビボまたはインビトロで、直接または間接的に発揮されるエフェクター機能または抗原性機能を意味する。生物学的活性としては、これらに限定されないが、ポリペプチドとの結合、他のタンパク質または分子との結合、酵素活性、シグナル伝達、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写レギュレーターとしての活性、損傷したＤＮＡと結合する能力などが挙げられる。生物活性は、対象のポリペプチドに直接影響を及ぼすことにより調節できる。別法として、生物活性は、ポリペプチドのレベルを調節すること、たとえば、対応する遺伝子の発現を調節することにより変化させることができる。
【００３８】
「マーカー」または「バイオマーカー」なる用語は、その存在または濃度が検出可能であり、かつ既知の状態、たとえば疾患状態と関連する生物学的分子、たとえば、核酸、ペプチド、ホルモンなどを意味する。
【００３９】
本明細書において用いられる「マーカー遺伝子」とは、その発現パターンを、悪性腫瘍または乳癌の予測、予後予測または診断の評価の一部として利用できるか、または別法として悪性腫瘍、特に乳癌の処置または予防に有用な化合物を同定する方法において用いることができる、差次的に発現する遺伝子を意味する。マーカー遺伝子は、標的遺伝子の特徴を有していてもよい。
【００４０】
本明細書において用いられる「標的遺伝子」とは、標的遺伝子発現または標的遺伝子産物の活性のレベルの調節が悪性腫瘍、特に乳癌の症状を緩和するように作用し得るように乳癌に関与する差次的に発現する遺伝子を意味する。標的遺伝子は、マーカー遺伝子の特徴を有していてもよい。
【００４１】
本明細書において用いられる「生物学的サンプル」なる用語は、生物または生物の成分（たとえば、細胞）から得られるサンプルを意味する。サンプルは、いずれの生物組織または体液であってもよい。サンプルは患者から得られる「臨床」サンプルであることが多い。かかるサンプルとしては、これらに限定されないが、喀痰、血液、血液細胞（たとえば、白血球）、組織または微細穿針生検、細胞含有体液、浮動性核酸、尿、腹水、および胸水、またはこれから得られる細胞が挙げられる。生物サンプルは、組織の部分、たとえば、組織学的目的のために採取された凍結切片を含んでもよい。
【００４２】
「アレイ」または「マトリックス」とは、装置上のアドレス可能な位置または「アドレス」の配置を意味する。その位置は、二次元アレイ、三次元アレイ、または他のマトリックスフォーマットにおいて配列させることができる。位置の数は、２、３から少なくとも１００，０００の範囲まで可能である。最も重要なことには、各位置は、完全に独立した反応部位を表す。アレイには、これらに限定されないが、核酸アレイ、タンパク質アレイおよび抗体アレイが包含される。「核酸アレイ」は、核酸プローブ、たとえば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは遺伝子のさらに大きな部分を含むアレイを意味する。アレイ上の核酸は、好ましくは一本鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」と呼ばれる。本明細書において「マイクロアレイ」とは、「バイオチップ」または「生物学的チップ」を意味し、それは独立した領域の密度が少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２である領域のアレイを意味する。マイクロアレイにおける領域は、典型的な寸法、例えば約１０〜２５０μｍの間の範囲の直径を有し、ほぼ同じ間隔でアレイ中の他の領域と隔てられている。「タンパク質アレイ」とは、本来の形態または変性後でありうるポリペプチドプローブまたはタンパク質プローブを含むアレイを意味する。「抗体アレイ」とは、抗体、例えばこれらに限定されないが、モノクローナル抗体（たとえば、マウス由来）、キメラ抗体、ヒト化抗体またはファージ抗体、および一本鎖抗体、ならびに抗体から得られる断片、を含むアレイを意味する。
【００４３】
本明細書において用いられる「アゴニスト」なる用語は、タンパク質の生物活性を模倣するかまたは上方調節する（例えば、増強する、または補足する）物質を意味する。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体である。アゴニストは、遺伝子の発現を上方調節するか、またはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる化合物であってよい。アゴニストは、ポリペプチドともう一つ別の分子、たとえば、標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増大させる化合物であってもよい。
【００４４】
本明細書において用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、タンパク質の少なくとも１つの生物活性を下方調節（たとえば、抑制または阻害）する物質を意味する。アンタゴニストは、タンパク質ともう一つの分子、たとえば標的ペプチド、リガンドまたは酵素基質との間の相互作用を阻害または減少させる化合物である。アンタゴニストは、遺伝子の発現を下方調節するか、または存在する発現タンパク質の量を減少させる化合物であってよい。
【００４５】
本明細書において用いられる「小分子」とは、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）または無機分子であり得る。多くの製薬会社が化学および／または生物学的混合物、多くは真菌、細菌、または藻類抽出物の大規模なライブラリーを有しており、これは、生物活性を調節する化合物を同定するために本発明のいずれの分析方法によってもスクリーニングできる。
【００４６】
本明細書において用いられる「調節された」または「調節」あるいは「調整された」または「調整」および「差次的に調整された」なる用語は、上方調節［すなわち、活性化または刺激（たとえば、アゴナイジングまたは増強による）］および下方調節［すなわち、阻害また抑制（たとえば、アンタゴナイズ、減少または阻害による）］の両方を意味する。
【００４７】
「転写調節単位」とは、それらが作動可能に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列、たとえば、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーター、を意味する。好ましい態様において、ある遺伝子の転写は、発現が意図される細胞タイプにおける組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にある。組換え遺伝子は、天然に存在する形態のポリペプチドの転写を制御する配列と同じ転写調節配列の制御下にあっても、異なる転写調節配列の制御下にあってもよい。
【００４８】
「誘導体」なる用語は、ポリペプチド配列、またはポリヌクレオチド配列の化学的修飾物を意味する。ポリヌクレオチド配列の化学的修飾には、たとえば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換が含まれる。誘導体ポリヌクレオチドは、天然の分子の少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、あるいはそれが由来するポリペプチドの少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持する任意の同様のプロセスにより修飾されたものである。
【００４９】
「ヌクレオチドアナログ」なる用語は、少なくとも１つの性質において天然に存在するヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと異なるが、それぞれの天然に存在するヌクレオチドの機能的特徴（たとえば、塩基対形成、ハイブリダイゼーション、コード情報）を示し、前記組成物に使用可能なオリゴマーまたはポリマーを意味する。ヌクレオチドアナログは、天然に存在しない塩基またはポリマー骨格を含んでもよく、その例は、ＬＮＡ、ＰＮＡおよびモルホリノである。ヌクレオチドアナログは、その天然に存在する対応物または等価物と異なる少なくとも１つの分子を有する。
【００５０】
本明細書において用いられる「乳癌遺伝子」とは、配列番号１〜２６および５３〜７５のポリヌクレオチド、並びにその誘導体、断片、アナログおよびホモログ、これらによりコードされるポリペプチド、配列番号２７〜５２および７６〜９８のポリペプチド、その誘導体、断片、アナログおよびホモログ、ならびに表１から５および図１から４において開示される情報を用いて当該分野において周知の標準的技術により誘導または同定できる対応するゲノム転写単位を意味する。配列番号１〜２６および５３〜７５のポリヌクレオチド配列および配列番号２７〜５２および７６〜９８のポリペプチドのＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ  ＩＤおよびＵｎｉＧｅｎｅアクセション番号を表１に示し、遺伝子種類、遺伝子機能および細胞内の局在を表２および３に示す。
【００５１】
本明細書において用いられる「染色体領域」なる用語は、制限酵素ＤＮＡ断片長多型（ＲＦＬＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、配列タグ部位（ＳＴＳ）、マイクロサテライト、タンデムリピート反復数（ＶＮＴＲ）および遺伝子などの細胞遺伝学的マーカーまたは他の遺伝子マーカーにより定義できる染色体上の連続ＤＮＡ鎖を意味する。典型的には、染色体領域は、２メガベース（ＭＢ）まで、４ＭＢまで、６ＭＢまで、８ＭＢまで、１０ＭＢまで、２０ＭＢまでまたはさらに大きなＭＢからなる。
【００５２】
「変化した染色体領域」または「異常な染色体領域」なる用語は、染色体構成およびＤＮＡ配列の構造的変化を意味し、これは次の事象により起こり得る：増幅、欠失、反転、挿入、転座および／またはウイルス組み込み。所定の細胞が染色体の２以上のコピーを有するトリソミーは、染色体または染色体領域の「増幅」なる用語の意味に含まれる。
【００５３】
本発明は、ポリヌクレオチド配列およびこれによりコードされるタンパク質、並びにポリヌクレオチド配列に由来するプローブ、コードされたタンパク質に向けられる抗体、および悪性腫瘍、特に乳癌の危険性があるかまたは罹患している個人についての予測、予防、診断、予後予測および治療的使用を提供する。本発明において開示される配列は、乳癌から得られるサンプルにおいて差次的に発現することが見いだされている。
【００５４】
本発明は、乳癌の臨床的徴候を示す患者の腫瘍生検において特異的に調節（上方または下方調節）される４３の遺伝子の同定に基づく。乳癌状態において差次的に調節される４３のヒト遺伝子の同定およびその疾患についての重要性は本明細書の実施例に記載する。これらの遺伝子の共発現の特徴決定により、乳癌における役割が新たに確認された。遺伝子の名前、データベースアクセション番号（ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＧｅｎｅ）並びにコードされたタンパク質の推定または既知の機能およびそのタンパク質の細胞内局在を表１から４に示す。遺伝子増幅に用いられるプライマー配列を表５に示す。
【００５５】
いずれかの状況において、正常な発現と比較して過剰または低いレベルのこれらの遺伝子の発現を検出することにより、悪性腫瘍および乳癌の診断の基礎が提供される。さらに、臨床試験中の化合物の有効性の試験において、これらの遺伝子の発現レベルの減少は、疾患状態から正常な状態へ戻ることに相当し、従って化合物の正の効果を示す。
【００５６】
本発明のもう一つの局面は、所定のゲノム領域内の隣接する遺伝子は互いに直接または間接的に機能的に相互作用し、影響を及ぼしあうという観察に基づく。腫瘍病巣において共増幅され、共発現する機能的に相互作用する遺伝子をコードするゲノム領域は、「ＡＲＣＨＥＯＮ」と定義されている。（ＡＲＣＨＥＯＮ＝Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｎｇｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ）。染色体の変化は１以上の遺伝子に影響を及ぼすことが多い。これは、増幅、複製、挿入、組み込み、反転、転座、および欠失に関して当てはまる。これらの変化は、一つまたは複数の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼし得る。癌診断および処置の分野において最も一般的には、発現レベルの変化は、一つの推定関連標的遺伝子、たとえば、ＭＬＶＩ２（５ｐ１４）、ＮＲＡＳＬ３（６ｐ１２）、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２３）、サイクリン  Ｄ１（１１ｑ１３）、ＩＧＦ１Ｒ（１５ｑ２５）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（１７ｑ２１）、ＰＣＮＡ（２０ｑ１２）について調査されている。ところが、１つのゲノム領域中の多数の（つまり２つより多い）遺伝子の発現レベルおよび相互作用の変化については未だ検討されていない。ＡＲＣＨＥＯＮの遺伝子は、組織特異的発現パターンを有する遺伝子クラスターを形成する。ＡＲＣＨＥＯＮを表すと推定されるかかる遺伝子クラスター内の個々の遺伝子の相互作用の様式は、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸相互作用のいずれかであり、これは以下の例により説明されるが、限定されない：ＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子相互作用は、同じシグナル伝達経路内であっても、リガンドに対するレセプターの結合、レセプターキナーゼとＳＨ２またはＳＨ３の結合、プロモーターに対する転写因子の結合、転写因子に対する核ホルモンレセプターの結合、リン酸基供与（たとえば、キナーゼ）および受容（たとえば、リンタンパク質）、ｍＲＮＡ安定化タンパク質結合および転写プロセスであってもよい。ある遺伝子対および／またはこれによりコードされるタンパク質またはそのより高次の群の個々の活性および特異性は、当業者により公共のデータベース内で公開または登録されている論文から容易に推論できる。しかしながら、ＡＲＣＨＥＯＮに関連して、ＡＲＣＨＥＯＮの一部であるメンバーの相互作用は、その個別の機能を増強、悪化または減少させる。この相互作用は、それらが通常共発現する所定の正常な組織において重要である。従ってこれらのクラスターは進化中に共通して保存される。しかしながら、腫瘍病巣におけるこれらのＡＲＣＨＥＯＮのメンバーの異常な発現は、（特にこれらが通常発現しない組織において）腫瘍特性、たとえば、増殖、侵襲性および薬剤反応性に対して影響を及ぼす。これらの隣接する遺伝子の相互作用のために、脱調節事象に関与するＡＲＣＨＥＯＮのメンバーを決定することが重要である。この点に関して、腫瘍病巣における増幅および欠失事象は、特に興味深い。
【００５７】
本発明は、定量的ＰＣＲにより（ａ）各ｍＲＮＡ種の相対的ｍＲＮＡ量を測定するか、または（ｂ）１以上の染色体領域のコピー数を測定することにより、染色体変化を検出する方法に関する。ある態様において、ゲノム構成および染色体領域の空間的調節に関する情報は、ヒトゲノムの配列情報（ＵＣＳＣ、ＮＣＢＩ）の生物情報分析により評価され、次いでＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ＤＮＡアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）から得られるＲＮＡ発現データおよび／またはＲＮＡサンプルまたはゲノムＤＮＡから得られる定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）と組み合わせられる。
【００５８】
さらに別の態様において、変化（増殖または欠失）した染色体領域上に位置する遺伝子の機能的関係が確立された。この変化した染色体領域は、該領域上に位置する遺伝子が機能的に相互作用するならば、ＡＲＣＨＥＯＮと定義される。
【００５９】
１７ｑ２１座を、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子を有する一モデル型として調査した。高分解能分析を確立して隣接する遺伝子における増幅事象を検出することにより、乳癌細胞株および患者サンプルにおいて一般に共増幅される４３遺伝子を同定した。遺伝子アレイ技術および免疫学的方法により、腫瘍サンプルにおけるその共過剰発現を証明した。驚くべきことに、組織サンプルをＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍サンプルとクラスター化することにより、この大きなゲノム領域（４３遺伝子を含む）の発現パターンは、対照の脳組織と非常に類似していることがわかった。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陰性乳癌組織は、類似した発現パターンを示さなかった。実際、これらのクラスター内の遺伝子の一部はマウスモデル系において神経発生に重要であるか（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＨＲＡ）、または神経細胞において発現する（ＮｅｕｒｏＤ２）ことが記載されている。さらに、ヒトおよび齧歯類ゲノムにおいて類似する遺伝子の組み合わせを探すことにより、３ｐ２１および１２ｑ１３上に各遺伝子のいくつかのアイソフォームを有するさらなる相同染色体領域（下記参照）が見つかった。４３の候補遺伝子、例えば同じ経路の一部である遺伝子（ＨＥＲ−２、ｎｅｕ、ＧＲＢ７、ＣｒｋＲＳ、ＣＤＣ６）、互いの発現に影響を及ぼす遺伝子（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＨＲＡ、ＲＡＲＡ）、互いに相互作用する遺伝子（ＰＰＡＲＧＢＰ、ＴＨＲＡ、ＲＡＲＡ、ＮＲ１Ｄ１またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＧＲＢ７）、あるいは所定の組織において発現する遺伝子（ＣＡＣＮＢ１、ＰＰＡＲＧＢＰ等）の間の複数の相互作用についての強力な証拠があった。興味深いことに、同定されたＡＲＣＨＥＯＮのゲノム領域はＨＥＲ−２／ｎｅｕ陰性細胞（ＭＣＦ７）（通常タモキシフェン処置に対して感受性）の獲得タモキシフェン耐性において増幅される［Ａｃｈｕｔｈａｎら、２００１、（２）］。
【００６０】
さらに、これらのＡＲＣＨＥＯＮ内の遺伝子の変化により処置に対する反応性が変化することが観察された。驚くべきことに、ＡＲＣＨＥＯＮ内の遺伝子は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕホモログの不在下でさえも重要である。ＡＲＣＨＥＯＮ内の遺伝子のいくつかは、予後予測のマーカー遺伝子として役立つだけでなく、治療介入の標的としてすでに知られている。たとえば、ＴＯＰ２アルファはアントラサイクリンの標的である。ＴＨＲＡおよびＲＡＲＡはホルモンおよびホルモンアナログ（たとえば、Ｔ３、ｒＴ３、ＲＡ）により標的とされ得る。その高い親和結合部位および利用可能なスクリーニング分析（その転写能力に基づくリポーター分析）から、腫瘍病原生理学と関連することが本明細書においてはじめて示されたホルモンレセプターは、薬剤スクリーニングおよび悪性腫瘍、特に乳癌の処置についての理想的な標的である。この点に関して、ＡＲＣＨＥＯＮのどのメンバーが腫瘍病巣において変化しているかを知ることは本質的である。特に、ＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子の増幅または欠失の性質、数および程度を知ることが重要である。ＡＲＣＨＥＯＮは類似した内因性レトロウイルス（たとえば、ＨＥＲＶ−Ｋ＝「ヒト内因性レトロウイルス」）と隣接しており、そのいくつかは乳癌において活性化される。これらのウイルスはＡＲＣＨＥＯＮの進化複製に関与する。
【００６１】
１７ｑ２１領域の分析により、ＩＨＣにより得られたデータが証明され、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子と共に共増幅されるいくつかのさらなる遺伝子が同定された。腫瘍細胞株から得られるＲＮＡに基づく定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）をＤＮＡに基づくｑＰＣＲと比較分析することにより、同じ増幅された領域が同定された。１７ｑ１１．２〜２１領域の遺伝子を制限のためではなく例示のために示す。前記染色体領域の図を図１に示す。
【００６２】
１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮの一部である遺伝子の生物学的関連性
ＭＬＮ５０
乳癌由来の転移性腋窩リンパ節のｃＤＮＡのディファレンシャル（差次的）スクリーニングにより、乳癌において過剰発現するＴＲＡＦ４および３つの他の新規遺伝子（ＭＬＮ５１、ＭＬＮ６２、ＭＬＮ６４）が同定された［Ｔｏｍａｓｅｔｔｏら、１９９５，（３）］。ＭＬＮ５０と表されるある遺伝子を、放射性インサイチュハイブリダイゼーションにより１７ｑ１１−ｑ２１．３にマップした。乳癌細胞株において、４ｋｂ  ＭＬＮ５０ｍＲＮＡの過剰発現は、その遺伝子の増幅ならびに同じ領域にマップされるＥＲＢＢ２の増幅および過剰発現と相関した。筆者らはこの２つ遺伝子が同じアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）に属すると示唆している。染色体領域１７ｑ１１−ｑ２１の増幅は、ヒト乳癌において起こる最も一般的な事象である。予想される２６１アミノ酸ＭＮＬ５０タンパク質はＮ末端ＬＩＭドメインおよびＣ末端ＳＨ３ドメインを含む。彼らはそのタンパク質を「ＬＩＭ  ａｎｄ  ＳＨ３Ｐｒｏｔｅｉｎ」からＬＡＳＰ１と新たに名付けた。ノザンブロット分析により、ＬＡＳＰ１ｍＲＮＡは試験された全ての正常な組織において基底レベルで発現し、原発乳癌の８％において過剰発現することがわかった。これらの癌のほとんどにおいて、ＬＡＳＰ１およびＥＲＢＢ２は共に過剰発現した。
【００６３】
ＭＬＬＴ６
ＭＬＬＴ６（ＡＦ１７）遺伝子は、融合点の３’に位置するロイシン−ジッパー二量化モチーフおよび末端のシステインリッチドメインを含む。ＡＦ１７は、転写抑制または活性化に関与するドメインと結合することが以前に示されているアミノ酸鎖を含むことが見いだされた。
【００６４】
バンド１１ｑ２３が関与する染色体転座は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者のほぼ１０％および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者の５％以上と関連する。転座に関与する１１ｑ２３の遺伝子は、ＡＬＬ１、ＨＲＸ、ＭＬＬ、およびＴＲＸ１とさまざまに表される。これらまれな転座の一つ、ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）におけるパートナー遺伝子が、１７ｑ１２上のＭＬＬＴ６と表される。
【００６５】
ＺＮＦ１４４（Ｍｅｌ１８）
Ｍｅｌ１８ｃＤＮＡは新規なシステインリッチなジンクフィンガーモチーフをコードする。該遺伝子は、ほとんどの腫瘍細胞株において強く発現するが、その正常組織における発現は、神経起源の細胞に限定され、胎児神経細胞において特に豊富であった。これは、ＢＭＩ１を含むＲＩＮＧ−フィンガーモチーフファミリーに属する。ＭＥＬ１８／ＢＭＩ１遺伝子ファミリーは、ショウジョウバエ「ポリコーム（ｐｏｌｙｃｏｍｂ）」遺伝子群の哺乳動物ホモログの代表であり、重要な調節因子、たとえば、マウスＰｃ−Ｇ遺伝子の代表例として、Ｈｏｘ遺伝子、Ｂｍｉｌ、Ｍｅｌ１８およびＭ２２遺伝子の発現パターンの維持に関与する記憶メカニズムに属する。これらの遺伝子のそれぞれのノックアウトマウス突然変異体において観察される共通の表現型は、Ｈｏｘ遺伝子発現および中軸骨格発生の調節のみならず、造血細胞株の増殖および生存の制御におけるＰｃ−Ｇ遺伝子の重要な役割を示す。これは、リンパ芽球性白血病において観察される増殖脱調節の一致する。ＭＥＬ１８遺伝子は、脊椎動物間で保存されている。そのｍＲＮＡは胎盤、肺、および腎臓において高レベルで発現し、肝臓、膵臓、および骨格筋において低レベルで発現する。興味深いことに、子宮頸管および腰仙のＨＯＸ遺伝子発現は、正常乳房組織に対して幾つかの原発乳癌において変化しており、ＨｏｘＢ遺伝子クラスターが１７ｑ２１座に対して遠位の１７ｑ上に存在する。さらに、増殖細胞の持続巣を伴う分化の遅れが、ＨＯＸＢ７導入ＳｋＢｒ３細胞とともに共培養された内皮細胞において見いだされ、これは１７ｑ２１増殖を示す。これらの細胞の発癌性はインビボで評価されている。無胸腺ヌードマウスにおける異種移植により、ＳｋＢｒ３／ＨＯＸＢ７細胞が、照射されていてもいなくても、血管数が増加した腫瘍を発達させ、一方、親ＳｋＢｒ３細胞はマウスが実質的に照射されなければ何ら腫瘍を発生させないことが示された。本発明の一部として、本発明者らは、ＭＥＬ１８がＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子増幅を有する腫瘍において特異的に過剰発現することを見いだし、これはＨｏｘ発現について重要でありうる。
【００６６】
ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート５−キナーゼＩＩ型ベータ；ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ
ホスホイノシチドキナーゼはシグナル伝達において中心的な役割を果たす。ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）はホスファチジルイノシトール−４−ホスフェートをリン酸化し、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェートを生じる。ＰＩＰ５Ｋ酵素は、様々な免疫反応性、速度特性、および分子量を有する多数のアイソフォームとして存在する。これらは、他のホスファチジルイノシトール、タンパク質、および脂質キナーゼに存在するキナーゼモチーフとほとんど相同性を有さないという点でユニークである。ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをＰＩＰ５Ｋ２Ｂ  ＥＳＴでスクリーニングすることにより、完全長遺伝子が単離できた。推測される４１６アミノ酸タンパク質はＰＩＰ５Ｋ２Ａと７８％同一である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、著者らは細菌により発現させたＰＩＰ５Ｋ２Ｂは４７ｋＤの分子量を有すると推定した。ノザンブロット分析は、いくつかのヒト組織において豊富に発現する６．３ｋｂ  ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ転写物を検出した。ＰＩＰ５Ｋ２Ｂはｐ５５ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ１）の膜近接領域と特異的に相互作用し、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ活性はＴＮＦ−アルファでの処置により哺乳動物において増大する。膜結合基質とＡＴＰとの複合体モデルは、どのようにしてホスホイノシチドキナーゼが膜界面でインサイチュにてその基質をリン酸化できるかを示す。基質結合部位は一方が開放されており、これホスファチジルイノシトール３−および５−ホスフェートに対する二重特異性と一致する。ＰＩＰ５Ｋ２Ａのアミノ酸配列は公知キナーゼと同一性を示さないが、組換えＰＩＰ５Ｋ２Ａはキナーゼ活性を示した。ＰＩＰ５Ｋ２Ａは推定Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメイン結合配列を含む。ＣＯＳ７細胞におけるマウスＰＩＰ５Ｋ１Ｂの過剰発現は、短いアクチンファイバーの増大およびアクチンストレスファイバーの減少を誘発した。
【００６７】
ＴＥＭ７
遺伝子発現の連続的な分析（ＳＡＧＥ）を用いて、腫瘍血管新生中に発現上昇するいくつかの腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）に対応する部分的ｃＤＮＡを同定できた。同定された遺伝子にはＴＥＭ７があった。データベース検索と５’ＲＡＣＥを用いて、５００アミノ酸のタイプＩ膜貫通タンパク質をコードするＴＥＭ７コード領域全体が示された。ＴＥＭ７の細胞外領域はプレキシン様ドメインを含み、ＥＣＭタンパク質Ｎｉｄｏｇｅｎに対して弱い相同性を有する。分泌された細胞外マトリックス分子において通常見いだされるこれらのドメインの機能は未知である。Ｎｉｄｏｇｅｎ自身はエンタクチンタンパク質ファミリーに属し、周辺から縦方向への移動に切り替えることにより遊走軸策の経路を決定する助けとなる。エンタクチンは、ＲＧＤ認識部位により媒介されるメカニズムによりトロホブラストの成長を促進するので、細胞遊走に関与し、かつ着床に際して子宮内基底膜の侵入時に重要な役割を果たす。エンタクチンは胸腺細胞接着を促進するが、胸腺遊走には少ししか影響を及ぼさないので、Ｔ細胞発生時の胸腺細胞局在化に関与することが示唆される。
【００６８】
ヒト結腸直腸癌のインサイチュハイブリダイゼーション分析により、ＴＥＭ７が腫瘍ストロマの内皮細胞において明らかに発現するが、正常な結腸組織の内皮細胞においては発現しないことが明らかになった。インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、様々な正常成体マウス組織における発現を分析し、ＴＥＭ７がマウス組織または腫瘍ではほとんど検出できないが、マウス脳においては豊富に発現することが観察された。
【００６９】
ＺＮＦＮ１Ａ３
Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーをマウスＡｉｏｌｏｓのＮ末端ｃＤＮＡプローブでスクリーニングすることにより、ヒトＡｉｏｌｏｓ、またはＺＮＦＮ１Ａ３をコードするｃＤＮＡが得られた。そのマウス対応物と８６％の配列同一性を有する推定５０９アミン酸のタンパク質は、そのＮ末端に４つのＤＮＡ結合ジンクフィンガー、そのＣ末端にタンパク質二量化を媒介する２つのジンクフィンガーを有する。これらドメインは、それぞれマウスタンパク質における対応する領域に対して１００％および９６％の相同性を有する。ノザンブロット分析により、末梢血白血球、脾臓、および胸腺において主な１１．０ｋｂとわずかの４．４ｋｂのＺＮＦＮ１Ａ３転写物の強い発現が明らかになり、肝臓、小腸、および肺では発現は低かった。
【００７０】
造血ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質であるＩｋａｒｏｓ（ＺＮＦＮ１Ａ１）は、リンパ球分化の主な調節因子であり、白血病発生に関与する。Ｉｋａｒｏｓの正常な機能を実行するためには、配列特性ＤＮＡ結合、トランスアクチベーション、および二量化ドメインが必要である。関連するジンクフィンガータンパク質Ａｉｏｌｏｓに突然変異を有するマウスは、Ｂ細胞リンパ腫に罹患しやすい。化学的に誘発されたマウスリンパ腫において、Ｚｎｆｎ１ａ１遺伝子を取り巻くマーカー上の対立遺伝子欠損が、分析された腫瘍の２７％において検出された。さらに、特異的Ｉｋａｒｏｓ発現は、主にマウスホルモン産生下垂体前葉細胞でみられ、それ自体が多数のエンドクリン細胞のホルモンおよび増殖特性に関与する繊維芽細胞成長因子レセプター４（ＦＧＦＲ４）発現に重要であり、ＦＧＦＲ４は正常および腫瘍性下垂体において差次的に発現する。さらに、Ｉｋａｒｏｓは、ポリコーム機能に拮抗するＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質を含むクロマチンリモデリング複合体と結合する。興味深いことに、開示されたＡＲＣＨＥＯＮのテロメリック末端に、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体メンバーのＳＭＡＲＣＥ１（＝クロマチンのＳＷＩ／ＳＮＦ関連、マトリックス関連、アクチン依存性レギュレーター）があり、これが記載される増幅の一部である。Ｉｋａｒｏｓとパリンドローム結合タンパク質（ＰＢＰ）の関連する結合特異性のために、ＺＮＦＮ１Ａ３はＨｅｒ２／ｎｅｕエンハンサーを調節することができることが示唆される。
【００７１】
ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ
中脳ドーパミン作動性ニューロンは多数の脳機能において重要な役割を果たし、ドーパミン作動性経路による異常なシグナリングはいくつかの主要な神経および精神障害に関与する。ドーパミンの作用について一つのよく研究された標的は、ＤＡＲＰＰ３２である。密にドーパミンおよびグルタミン酸で刺激されたラット尾状核−皮殻において、ＤＡＲＰＰ３２は、ドーパミンＤ１レセプターを発現する中程度のサイズのとげ状ニューロンにおいて発現する。ＤＡＲＰＰ３２の機能は、レセプター刺激により調節されるようである。ドーパミン作動性レセプター刺激とグルタミン酸作動性（ＮＭＤＡ）レセプター刺激はいずれもＤＡＲＰＰ３２リン酸化の程度を調節するが、それらは反対方向である。
【００７２】
ヒトＤＡＲＰＰ３２は、線条体ｃＤＮＡライブラリーから単離された。２０４アミノ酸のＤＡＲＰＰ３２タンパク質は、ウシおよびラットＤＡＲＰＰ３２タンパク質とそれぞれ８８％と８５％の配列同一性を共有する。ＤＡＲＰＰ３２配列は、タンパク質の活性部分にあたるＮ末端が特に保存されている。ノザンブロット分析により、２．１ｋｂのＤＡＲＰＰ３２ｍＲＮＡがヒト尾状核において皮質におけるよりも高度に発現することが証明された。死後のヒト脳に対するインサイチュハイブリダイゼーションにより、ＤＡＲＰＰ３２発現レベルは大脳新皮質層全てにおいて低く、ハイブリダイゼーションは表面層において最強であることが示された。ＣＤＫ５はインビトロおよびインタクトな脳細胞においてＤＡＲＰＰ３２をリン酸化した。Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ３２は競合的メカニズムによりＰＫＡをインビトロで抑制する。線条体細胞において、ＣＤＫ５特異的インヒビターによって、または遺伝子組換えマウスを使用することによって、Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ３２を減少させると、結果としてＰＫＡのドーパミン誘発性リン酸化が増大し、電圧依存性カルシウム電流ピークが増大した。このように、ＤＡＲＰＰ３２は、別個のメカニズムによりセリン／トレオニンキナーゼおよびセリン／トレオニンホスファターゼを制御する、二機能性シグナル伝達分子である。
【００７３】
ＤＡＲＰＰ３２およびｔ−ＤＡＲＰＰは胃癌において過剰発現する。これらの２つのタンパク質の胃癌における過剰発現は、腫瘍細胞に対して重要な生存のために有利な条件を提供し得ることが示唆される。Ｄａｒｐｐ３２は、メスラットおよびマウスにおいてプロゲステロンにより促進される性的受容性において必須の中間体である。メスラットにおける性的受容性に対するプロゲステロンの促進効果は、Ｄａｒｐｐ３２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによりブロックされる。Ｄａｒｐｐ３２遺伝子に対して無発現変異のホモ接合マウスは、野生型同腹子と比較した場合、プロゲステロンにより促進される性的受容性が最低レベルであり、プロゲステロンは視床下部ｃＡＭＰレベルおよびｃＡＭＰ−依存性タンパクキナーゼ活性を著しく増大させた。
【００７４】
ＣＡＣＮＢ１
１９９１年、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーからウサギ骨格筋ジヒドロピリジン感受性カルシウムチャンネルベータサブユニットと高い相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡがクローニングされた［Ｐｒａｇｎｅｌｌら、（１９９１）、（４）］。このラット脳ベータサブユニットｃＤＮＡは、大脳半球と海馬において高レベルで発現するが小脳においてはずっと低いレベルで発現する、３．４ｋｂのメッセージにハイブリダイズした。そのオープンリーディングフレームは、骨格筋ベータサブユニットと８２％の相同性を有する、予想分子量６５６７９Ｄａの５９７アミノ酸をコードする。対応するヒトベータサブユニット遺伝子は、体細胞ハイブリッドの分析により染色体１７に局在化していた。著者らは、コードされた脳ベータサブユニットは、骨格筋におけるそのアイソフォームと非常に類似する一次構造を有し、神経細胞のカルシウムチャンネルの不可欠な調節成分として類似するｓ役割を有し得ることを示唆した。
【００７５】
ＲＰＬ１９
リボソームは、原核生物と真核生物間で保存される唯一の細胞小器官である。真核細胞において、この細胞小器官は６０Ｓラージサブユニットと４０Ｓスモールサブユニットから成る。哺乳動物リボソームは、４種のＲＮＡと約８０の異なるリボソームタンパク質を含み、そのほとんどは等モル量で存在するようである。哺乳動物細胞において、リボソームタンパク質は最大で全細胞タンパク質の１５％を占め、また全細胞ｍＲＮＡの７から９％を占め得る相異なるリボソームタンパク質遺伝子の発現はタンパク質合成のための細胞の様々な要件にあうように協同的に調節される。哺乳動物リボソームタンパク質遺伝子は多重遺伝子ファミリーのメンバーであり、そのほとんどが多数のプロセシング済偽遺伝子と単一の機能的イントロン含有遺伝子からなる。多数の偽遺伝子の存在は、機能的リボソームタンパク質遺伝子の研究の妨げであった。体細胞ハイブリッドの研究により、６つの哺乳動物リボソームタンパク質ｃＤＮＡと相補的なＤＮＡ配列は、染色体５、８および１７に割り当てられることが解明された。１０の断片が３つの染色体にマップされた［Ｎａｋａｍｉｃｈｉら、１９８６、（５）］。これらはおそらくは機能性（発現）遺伝子と偽遺伝子の混合物である。５ｑ２３−ｑ３３に位置するものは、種間ハイブリッドにおけるチャイニーズハムスターエメチン耐性突然変異を回復し、つまり転写的に活性なＲＰＳ１４遺伝子である。１９８９年に、多数の偽遺伝子の存在下でイントロン含有遺伝子を検出するためのＰＣＲに基づく方法が記載された。この技術を用いて、７つのヒトリボソームタンパク質遺伝子のイントロン含有ＰＣＲ産物が同定され、ヒト／齧歯類体細胞ハイブリッドに対するハイブリダイゼーションによりその染色体位置がマップされた［Ｆｅｏら、１９９２、（６）］。７つのリボソームタンパク質遺伝子はすべて、相異なる染色体上にあることが見いだされた：ＲＰＬ１９は１７ｐ１２−ｑ１１上；ＲＰＬ３０は８上；ＲＰＬ３５Ａは１８上；ＲＰＬ３６Ａは１４上；ＲＰＳ６は９ｐｅｔｅｒ−ｐ１３上；ＲＰＳ１１は１９ｃｅｎ−ｑｔｅｒ上；ＲＰＳ１７は１１ｐｔｅｒ−ｐ１３上。これらは、すでにマップされたリボソームタンパク質遺伝子（染色体５上のＳ１４、ＸｑおよびＹｐ上のＳ４、および９ｑ３−ｑ３４上のＲＰ１１７Ａ）の染色体位置と異なる部位でもある。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより、ＲＰＬ１９遺伝子の位置が１７ｑ１１にマップされた［Ｄａｖｉｅｓら、１９８９、（７）］。
【００７６】
ＰＰＡＲＢＰ、ＰＢＰ、ＣＲＳＰ１、ＣＲＳＰ２００、ＴＲＩＰ２、ＴＲＡＰ２２０、ＲＢ１８Ａ、ＤＲＩＰ２３０
甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）は、様々な特異的標的遺伝子の発現を調節するホルモン依存性転写因子である。これらは、そのはじめの翻訳および核移行からレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）とのヘテロ二量化、他の転写因子および基本的転写装置との機能的相互作用、および最後に分解へと進行する際に、多くのタンパク質と特異的に相互作用する。ＴＲの転写効果および他の潜在的機能の基礎となるメカニズムの解明を助けるために、酵母相互作用トラップ、酵母ツーハイブリッドシステムのあるバージョンを用いて、ＴＲ−ベータ−１（ＴＨＲＡＢ）のリガンド結合領域と特異的に相互作用するタンパク質が同定された［Ｌｅｅら、１９９５、（８）］。著者らは、ＴＲＩＰ２を含むいくつかの異なるＴＲ相互作用タンパク質（ＴＲＩＰ）をコードするＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを単離した。ＴＲＩＰ２は甲状腺ホルモンの存在下のみでラットＴｈｒｂと相互作用した。これは、ＲＸＲ−アルファとのリガンド非依存的相互作用を示すが、どのような条件下でもグルココルチコイドレセプター（ＮＲ３Ｃ１）とは相互作用しなかった。ヒトＢリンパ腫細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、抗ｐ５３モノクローナル抗体ＰＡｂ１８０１を用いてイムノスクリーニングすることにより、ＰＰＡＲＢＰが同定され、これを「Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＰＡｂ１８０１  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」としてＲＢ１８Ａと呼んだ［Ｄｒａｎｅら、１９９７、（９）］。予想される１５６６アミノ酸のＲＢ１８Ａタンパク質はいくつかの可能性ある核局在化シグナル、１３の可能性あるＮ−グリコシル化部位、および多数の可能性あるリン酸化部位を含む。ｐ５３と共通の抗原性決定因子を共有するにもかかわらず、ＲＢ１８Ａはｐ５３と有意なヌクレオチドまたはアミノ酸配列類似性を示さない。ＲＢ１８Ａの分子量の計算値は１６６ｋＤであるが、組換えＲＢ１８Ａの見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると２０５ｋＤであった。著者らは、ＲＢ１８Ａはｐ５３と、ＤＮＡ結合、ｐ５３結合、および自己オリゴマー化を含む機能的特性を共有することを示した。さらに、ＲＢ１８Ａは、ｐ５３のＤＮＡに対する配列特異的結合を活性化でき、これは両タンパク質間の不安定な相互作用により誘発された。ヒト組織のノザンブロット分析により、腎臓をのぞく試験されたすべての組織において８．５ｋｂのＲＢ１８Ａ転写物が検出され、心臓において最も発現が高かった。さらに、マウスＰｐａｒｂｐは、「Ｐｐａｒ−Ｂｉｎｄｉｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」としてＰｂｐとよばれるが、酵母ツーハイブリッドシステムにおいてＰｐａｒ−ガンマ（ＰＰＡＲＧ）リガンド結合ドメインと相互作用するタンパク質として同定された［Ｚｈｕら、１９９７、（１０）］。本発明者らは、Ｐｂｐは、ＰＰＡＲ−アルファ（ＰＰＡＲＡ）、ＲＡＲ−アルファ（ＲＡＲＡ）、ＲＸＲ、およびＴＲ−ベータ−１とインビトロで結合することも見いだした。Ｐｂｐのこれらのレセプターとの結合は、特定のリガンドの存在下で増大した。ＰＰＡＲ−ガンマのＣ末端から最後の１２アミノ酸を欠失させると、ＰｂｐとＰＰＡＲ−ガンマ間の相互作用がなくなった。Ｐｂｐは適度にＰＰＡＲ−ガンマの転写活性を増大させ、切断型Ｐｂｐ��ドミナントネガティブリプレッサーとして作用し、このことは、ＰｂｐがＰＰＡＲの真の転写コアクチベーターであることを示唆する。予想される１５６０アミノ酸Ｐｂｐタンパク質は２つのＬＸＸＬＬモチーフを含み、これは核レセプターに対するいくつかのコアクチベーターの結合に必要であり、かつ十分であると考えられる。ノザンブロット分析により、試験されたすべてのマウス組織においてＰｂｐ発現が検出され、肝臓、腎臓、肺、および精巣において高レベルであった。インサイチュハイブリダイゼーションにより、マウス個体発生中にＰｂｐが発現することが示され、このことは、Ｐｂｐの細胞増殖および分化における可能性ある役割を示唆する。成体マウスにおいて、インサイチュハイブリダイゼーションにより、肝臓、肺の気管支上皮、腸粘膜、腎皮質、胸腺皮質、脾臓小胞、および精巣の精上皮においてＰｂｐ発現が検出された。ＴＲＡＰ２２０とよばれるラテロン（ｌａｔｅｒｏｎ）ＰＰＡＲＢＰが、免疫精製されたＴＲ−アルファ（ＴＨＲＡ）−ＴＲＡＰ複合体から同定された［Ｙｕａｎら、１９９８、（１１）］。著者らは、ＴＲＡＰ２２０をコードするＪｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡをクローニングした。予想される１５８１アミノ酸のＴＲＡＰ２２０タンパク質は、他の核レセプター相互作用タンパク質に見られるＬＸＸＬＬ領域を含む。ＴＲＡＰ２２０はほとんどＲＢ１８Ａと同一であり、これらのタンパク質は主にＴＲＡＰ２２０の延長されたＮ末端において異なる。ＴＲ−アルファの非存在下で、ＴＲＡＰ２２０は他のＴＲＡＰとの一つの複合体中に存在するようである。ＴＲＡＰ２２０はＴＲ−アルファと直接的リガンド依存性相互作用を示し、これはＴＲ−アルファのＣ末端と、少なくとも部分的にＴＲＡＰ２２０のＬＸＸＬＬドメインにより媒介された。ＴＲＡＰ２２０はまた、ビタミンＤレセプター、ＲＡＲＡ、ＲＸＲＡ、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＧ、およびエストロゲンレセプター−アルファ（ＥＳＲ１；１３３４３０）を含む他の核レセプターと、リガンド依存的に相互作用した。ＴＲＡＰ２２０は、トランスフェクト細胞においてヒトＴＲ−アルファにより媒介される転写を適度に刺激し、一方ＬＸＸＬＬモチーフを含む断片は、トランスフェクト細胞および無細胞転写システムの両方において核レセプター媒介性転写のドミナントネガティブなインヒビターとして作用した。さらなる研究により、ＴＲＡＰ２２０はＴＲ−アルファ−ＴＲＡＰ複合体の機能時に他のＴＲＡＰをＴＲ−アルファに固定する際に主要な役割を果たすこと、およびＴＲＡＰ２２０が核レセプタースーパーファミリーの包括的なコアクチベーターであり得ることが示された。核レセプターコアクチベーターであるＰＢＰは、エストロゲンの非存在下でエストロゲンレセプター−アルファ（ＥＳＲ１）と相互作用する。この相互作用は、エストロゲンの存在下で増強されるが、抗エストロゲンタモキシフェンの存在下で低減される。ＰＢＰの培養細胞中へのトランスフェクションの結果、エストロゲン依存性転写が増強され、このことはＰＢＰがエストロゲンレセプターシグナリングにおいてコアクチベーターとしての働きをすることを示す。ＰＢＰの過剰発現が、エストロゲンレセプターシグナリングにおけ��そのコアクチベーター機能のために乳癌において役割を果たすかどうかを調べるために、乳房腫瘍におけるＰＢＰ発現のレベルを測定した［Ｚｈｕ  ら、１９９９、（１２）］。リボヌクレアーゼ保護分析、インサイチュハイブリダイゼーション、およびイムノペルオキシダーゼ染色により、ほぼ５０％の原発乳癌および乳癌細胞株において高いレベルのＰＢＰ発現が検出された。ＦＩＳＨを使用することにより、著者らはＰＢＰ遺伝子を一部の乳癌において増幅される領域である１７ｑ１２にマップした。約２４％（２５のうち６）の乳房腫瘍および約３０％（６のうち２）の乳癌細胞株においてＰＢＰ遺伝子増幅が見いだされ、これはＰＢＰ遺伝子過剰発現が遺伝子の増幅と関係なく起こり得ることを意味する。ＰＢＰ遺伝子は全部で３７ｋｂ以上におよぶ１７のエキソンを含むことが確認された。この知見、特にＰＢＰ遺伝子増幅は、ＰＢＰがそのエストロゲンレセプター−アルファコアクチベーターとして機能する能力により乳房上皮分化および乳房発癌性に関与し得ることを示唆した。
【００７７】
ＮＥＵＲＯＤ２
塩基性へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質は、発生中に細胞のタイプを決定することに関与する転写因子である。１９９５年に、神経発生時に機能するｂＨＬＨタンパク質が記述され、ＮｅｕｒｏＤ（「Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」）と命名された［Ｌｅｅら、１９９５、（１３）］。ヒトＮＥＵＲＯＤ遺伝子は染色体２ｑ３２にマップされる。２つのさらなるＮＥＵＲＯＤ遺伝子、ＮＥＵＲＯＤ２およびＮＥＵＲＯＤ３のクローニングおよびキャラクタライゼーションは１９９６年に記載された［ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、１９９６，（１４）］。マウスおよびヒトホモログの配列が提示された。ＮＥＵＲＯＤ２はＮＥＵＲＯＤのｂＨＬＨ領域と高度の相同性を示すが、ＮＥＵＲＯＤ３は関連性が低い。著者らは、マウスｎｅｕｒｏＤ２はまず胎生１１日目に発現し、成体神経系においても発現が存続することを見いだした。ｎｅｕｒｏＤと同様に、ｎｅｕｒｏＤ２もニューロン分化を媒介するようである。ヒトＮＥＵＲＯＤ２は蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより１７ｑ１２にマップされ、マウスホモログは染色体１１にマップされた［Ｔａｍｉｍｉら、１９９７、（１５）］。
【００７８】
テレソニン
テレソニン（ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ）は、もっぱら横紋筋および心筋においてみられる１９ｋＤのサルコメアタンパク質である。これは成人骨格筋および培養筋細胞のＺディスクに局在化するようである。テレソニンは、他のサルコメアタンパク質に空間的に規定された結合部位を提供することによりサルコメアの組み立てについての分子の「定規」として作用するチチン（ｔｉｔｉｎ）の基質である。早期分化筋細胞において、リン酸化およびカルシウム／カルモジュリン結合による活性化の後、チチンはテレソニンのＣ−末端領域をリン酸化する。テレソニン遺伝子はフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子に隣接する１７ｑ１２にマップされている［Ｖａｌｌｅら、１９９７、（１６）］。
【００７９】
ＰＥＮＴ、ＰＮＭＴ
フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼは、カテコールアミンの生合成の最終段階である、ノルエピネフリンからのエピネフリンの合成を触媒する。ｃＤＮＡクローンは、１９９８年に最初に、ウシの酵素から得られるトリプシンペプチドの部分アミノ酸配列に基づき合成された混合オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを用いて、ウシ副腎髄質ＰＮＭＴについて単離され［Ｋａｎｅｄａら、１９８８、（１７）］。ウシｃＤＮＡをプローブとして使用して、著者らはヒト褐色細胞腫ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、約１．０ｋｂのインサートを有するｃＤＮＡクローンを単離し、これはこの酵素の完全コード領域を含んでいた。ヒト褐色細胞腫のポリアデニル化されたＲＮＡをこのｃＤＮＡインサートをプローブとして用いてノーザンブロット分析したところ、約１０００ヌクレオチドの一つのＲＮＡ種が明らかになり、このクローンは完全長ｃＤＮＡであることが示唆された。そのヌクレオチド配列により、ヒトＰＮＭＴは、予想分子量が３０８５３の、最初のメチオニンを含めて２８２アミノ酸残基を有することを示した。そのアミノ酸配列はウシ酵素と８８％の相同性を有した。ＰＮＭＴ遺伝子は約２１００塩基対に及び、３つのエキソンと２つのイントロンからなることが見いだされた。この遺伝子はトランスジェニックマウスにおいて副腎髄質および網膜において発現することが示された。サルウイルス４０初期領域と融合した２ｋｂのＰＮＭＴの５’隣接領域を含むハイブリッド遺伝子もまた、結果として副腎および眼における腫瘍抗原ｍＲＮＡ発現をもたらした；さらに、免疫細胞化学により、この腫瘍抗原が副腎髄質細胞の核および網膜の内部顆粒層の細胞（両方ともエピネフリン合成の顕著な部位）に局在化していることが示された。この結果は、これらの細胞タイプにおける遺伝子の適当な発現のエンハンサーは、２ｋｂの遺伝子の５’隣接領域にあることを示す。
【００８０】
Ｋａｎｅｄａら、１９８８（１７）は、マウス−ヒト体細胞ハイブリッドからのＤＮＡのサザンブロット分析によりヒトＰＮＭＴ遺伝子を染色体１７に割り当てた。１９９２年に、ＰＮＭＴ遺伝子に関連するＲＦＬＰおよびいくつかの１７ｑＤＮＡマーカーを用いた連鎖解析により、この局在化は１７ｑ２１−２２に絞られた［Ｈｏｅｃｈｅら、１９９２，（１８）］。この知見は、ラット染色体１０上のヒト染色体１７ｑ２２−ｑ２４に対応する保存された連鎖シンテニーグループにおける卒中の傾向のある自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ−ＳＰ）における血圧調節と関連する遺伝子座の説明の点で興味深い。
【００８１】
ＭＧＣ９７５３
この遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑによると染色体１７上、１７ｑ１２にマップされる。これは非常に高レベルで発現する。これは、複数のｃＤＮＡクローンにより定義され、選択的スプライシングにより７つの異なる転写物が得られ（配列番号６０〜６６および８３〜８９、表１）、これらが一緒になって７つの異なるタンパク質アイソフォームをコードする。特に興味深いのは、２．５５ｋｂのｍＲＮＡによりコードされる推定分泌型アイソフォームである。そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９４ｋｂをカバーする。これは非常に長い３’ＵＴＲを有する。タンパク質（２６６ａａ、ＭＷ２４．６ｋＤａ、ｐＩ８．５）はＰｆａｍモチーフを含まない。ＭＧＣ９７５３遺伝子は、選択的スプライシングにより、７つの異なるタンパク質をコードすることが予想される７種の転写物を産生する。これには１３の確認されたイントロンが含まれ、そのうち１０が選択的である。ゲノム配列との比較により、１１のイントロンは共感性（ｃｏｎｓｅｎｓｕａｌ）［ｇｔ−ａｇ］則に従うことが示され、１は非典型的だが良好に支持される［ｔｇ  ｃｇ］。６つの最も豊富なアイソフォームは、ａ）からｉ）により表され、以下のタンパク質をコードする：
ａ）このｍＲＮＡは３．０３ｋｂの長さであり、そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９５ｋｂをカバーする。これは非常に長い３’ＵＴＲを有する。タンパク質（１９０ａａ、ＭＷ２１．５ｋＤａ、ｐＩ７．２）はＰｆａｍモチーフを含まない。これは小胞体において局在化することが予想される。
ｃ）このｍＲＮＡは１．１７ｋｂの長さであり、そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９３ｋｂをカバーする。これはＮ末端が不完全である。タンパク質（３６８ａａ、ＭＷ４１．５ｋＤａ、ｐＩ７．３）はＰｆａｍモチーフを含まない。
ｄ）このｍＲＮＡは３．１７ｋｂの長さであり、そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９４ｋｂをカバーする。これは非常に長い３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲを有する。タンパク質（１９０ａａ、ＭＷ２１．５ｋＤａ、ｐＩ７．２）はＰｆａｍモチーフを含まない。これは小胞体において局在化することが予想される。
ｇ）このｍＲＮＡは２．５５ｋｂの長さであり、そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９４ｋｂをカバーする。これは非常に長い３’ＵＴＲを有する。タンパク質（２２６ａａ、ＭＷ２４．６ｋＤａ、ｐＩ８．５）はＰｆａｍモチーフを含まない。これは分泌されることが予想される。
ｈ）このｍＲＮＡは２．６８ｋｂの長さであり、そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９４ｋｂをカバーする。これは非常に長い３’ＵＴＲを有する。タンパク質（３２０ａａ、ＭＷ３６．５ｋＤａ、ｐＩ６．８）はＰｆａｍモチーフを含まない。これは小胞体において局在化することが予想される。
ｉ）このｍＲＮＡは２．３４ｋｂの長さであり、そのプレメッセンジャーはゲノム上の１６．９４ｋｂをカバーする。これはＮ末端が不完全な可能性がある。タンパク質（２１７ａａ、ＭＷ２４．４ｋＤａ、ｐＩ５．９）はＰｆａｍモチーフを含まない。
【００８２】
ＭＣＧ９７５３遺伝子は染色体１７ｑ１２上に位置するＣＡＢ２遺伝子のホモログである。ＤＮＡ二本鎖切断を修復するために必要な酵母ＣＯＳ１６のヒトホモログであるＣＡＢ２をクローニングした。そのＧＦＰ融合タンパク質でトランスフェクトされた細胞の自己蛍光分析により、ＣＡＢ２が小胞中に移動することが示され、これは、ＣＡＢ２の過剰発現は、酵母と同様に、小胞中に蓄積することにより細胞内Ｍｎ−（２＋）を減少できることを示唆する。
【００８３】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＮＧＬ、ＴＫＲ１
当初ＮＥＵと呼ばれたこの腫瘍遺伝子はラット神経／神経膠芽細胞腫細胞株由来であった。これは血清学的に表皮成長因子レセプターＥＧＦＲに関連する腫瘍抗原ｐ１８５をコードする。ＥＧＦＲは染色体７にマップされる。１９８５年に、ＮＧＬ（ノイラミニダーゼとの混同を避けるためにＮＧＬと表すが、ＮＥＵとも表す）と表されるヒトホモログが、インサイチュハイブリダイゼーションにより１７ｑ１２−ｑ２２に、および体細胞ハイブリッドにおいて１７ｑ２１−ｑｔｅｒにマップされることがわかった［Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇら、１９８５、（１９）］。従って、そのＳＲＯは１７ｑ２１−ｑ２２である。さらに、１９８５年に、チロシンキナーゼ遺伝子ファミリーの可能性ある細胞表面レセプターが同定され、遺伝子をクローニングすることにより特徴決定された［Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９８５、（２０）］。その一次配列は、ヒト表皮成長因子レセプターと非常に類似している。ヒトＥＧＦレセプターに対する外観上の密接な関連性のため、著者らはこの遺伝子をＨＥＲ２と呼んだ。体細胞ハイブリッドＤＮＡのサザンブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーションにより、この遺伝子は１７ｑ１２−ｑ２２に割り当てられた。この遺伝子の染色体位置は、ＮＥＵ腫瘍遺伝子と一致し、このことは、これら二つの遺伝子が実際は同じであることを示唆する；事実、配列決定によりこれらが同一であることが示唆された。１９８８年に、ＮＥＵタンパク質の過剰発現と大細胞面皰成長タイプの管癌の間の相関が見いだされた［ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら、１９８８、（２１）］。しかしながら、著者らはリンパ節状態または腫瘍再発との相関は見いださなかった。乳癌および卵巣癌におけるＨＥＲ２／ＮＥＵの役割は、１９８９年に記載され、これらをまとめると、女性における全ての癌の１／３および女性における癌関連死の１／４が説明される［Ｓｌａｍｏｎら、１９８９、（２２）］。
【００８４】
ＥＲＢＢ１と呼ばれるＥＲＢＢ遺伝子と別個のＥＲＢＢ関連遺伝子が１９８５年に見いだされた。ＥＲＢＢ２は陰門癌細胞においてＥＧＦＲ増幅に伴っては増幅されず、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡと反応しなかった。約３０倍のＥＲＢＢ２の増幅がヒトの唾液腺腺癌において観察された。速度沈降およびサザンハイブリダイゼーションと組み合わせた染色体選別により、ＥＲＢＢ２遺伝子は染色体１７に割り当てられた［Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら、１９８６、（２３）］。選別された染色体および中期染色体にゲノムプローブをハイブリダイゼーションさせることにより、ＥＲＢＢ２座が１７ｑ２１にマップされた。これは急性前骨髄細胞性白血病（ＡＰＬ）における染色体１７の切断点である。さらに、胃癌細胞株においてＥＲＢＢ２遺伝子の増幅および発現の上昇が観察された。ＥＲＡＢＡＢ２ヌクレオチド配列から推測されるタンパク質のＣＯＯＨ末端の１４アミノ酸残基に対応する合成ペプチドに対する抗体が、１９８６年に樹立された。これらの抗体により、腺癌細胞から得られるＥＲＢＢ２遺伝子産物が沈殿し、チロシンキナーゼ活性を有する１８５ｋＤの糖タンパク質であることが示された。ＥＲＢＢ２に対するｃＤＮＡプローブおよび１５；１７染色体転座を有するＡＰＬ細胞に対するインサイチュハイブリダイゼーションにより、この遺伝子はこの切断点の近位側に位置することが確認された［Ｋａｎｅｋｏら、１９８７、（２４）］。著者らは、この遺伝子と切断点の両方ともバンド１７ｑ２１．１に位置し、さらにＥＲＢＢ２遺伝子が白血病発症に関与することを見いだした。１９８７年に、実験によりＮＥＵおよびＨＥＲ２はいずれもＥＲＢＢ２と同一であることが示された［Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅら、１９８７、（２５）］。著者らは、過剰発現のみにより正常な成長因子レセプターの遺伝子、すなわちＥＲＢＢ２を腫瘍遺伝子に変換できることを示した。ＥＲＢＢ２はインサイチュハイブリダイゼーションにより１７ｑ１１−ｑ２１にマップされた［Ｐｏｐｅｓｃｕら、１９８９、（２６）］。１５と１７の間に構造上の転座を有する繊維芽細胞由来の染色体に対するインサイチュハイブリダイゼーションにより、ＥＲＢＢ２遺伝子は誘導染色体１５に移転されることが示された；従ってこの遺伝子は、１７ｑ１２−ｑ２１．３２に局在化されうる。１７ｑ１２−ｑ２１領域における多数のＤＮＡマーカーを用いたファミリー連鎖研究により、ＥＲＢＢ２遺伝子はこの領域の遺伝子マップ上に配置された。
【００８５】
インターロイキン−６は、はじめ免疫および炎症応答のレギュレーターとして認識されたサイトカインであるが、前立腺癌を含む多くの腫瘍細胞の成長も調節する。ＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３の過剰発現は、前立腺癌の腫瘍形質転換に関与する。前立腺癌細胞株をＩＬ６で処置すると、ＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３のチロシンリン酸化が誘発されたが、ＥＲＢＢ１／ＥＧＦＲでは誘発されなかった。ＥＲＢＢ２はＩＬ６依存性にＩＬ６レセプターのｇｐ１３０サブユニットと複合体を形成する。ＥＲＢＢ２活性の阻害の結果、ＩＬ６誘発ＭＡＰＫ活性化が中止されるので、この関連は重要である。従って、ＥＲＢＢ２はＭＡＰキナーゼ経路によるＩＬ６シグナリングの重要な成分である［Ｑｉｕら、１９９８、（２７）］。これらの発見により、成長因子レセプターキナーゼと協働することにより、サイトカインレセプターがどのようにそのシグナリング経路を多様化させることができるかが示された。
【００８６】
ＥＲＢＢ２の過剰発現は、乳癌にタキソール（Ｔａｘｏｌ）耐性を付与する。ＥＲＢＢ２の過剰発現は、タキソール誘発アポトーシスを抑制する［Ｙｕら、１９９８、（２８）］。タキソールはＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞においてＣＤＣ２キナーゼを活性化し、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期を停止し、その後アポトーシスをもたらす。ＣＤＣ２の化学的インヒビターおよびＣＤＣ２のドミナント−ネガティブ突然変異体は、これらの細胞においてタキソール誘発アポトーシスをブロックした。トランスフェクションによるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＥＲＢＢ２の過剰発現は、ＣＤＣ２と関連するＣＤＫＮ１Ａを上方調節し、タキソール媒介ＣＤＣ２活性化を阻害し、細胞がＧ２／Ｍ期へ入るのを遅らせ、これによりタキソール誘発アポトーシスを阻害する。ＣＤＫＮ１Ａにおいて、アンチセンスをトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞またはｐ２１−／−ＭＥＦ細胞において、ＥＲＢＢ２はタキソール誘発アポトーシスを阻害できなかった。従って、ＣＤＫＮ１Ａは、ＥＲＢＢ２過剰発現乳癌細胞におけるタキソール誘発アポトーシスに対する耐性に貢献するＧ２／Ｍチェックポイントの調節に関与する。
【００８７】
ヘルスタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）と呼ばれる約６８ｋＤの分泌タンパク質が、イントロン８を保持する選択的ＥＲＢＢ２転写物の産物として記載された［Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９９、（２９）］。この選択的転写物は、ｐ１８５ＥＲＢＢ２の細胞外ドメイン由来のサブドメインＩおよびＩＩと同一の３４０残基、およびその後に続くイントロン８によりコードされる７９アミノ酸の独特なＣ末端配列を特徴とする。選択的転写物の組換え産物はＥＲＢＢ２をトランスフェクトされた細胞と特異的に結合して、ｐ１８５ＥＲＢＢ２と化学的に架橋し、一方そのイントロンでコードされる配列は単独でトランスフェクトされた細胞と高い親和性で結合して、細胞抽出物から可溶化されるｐ１８５と結合した。ヘルスタチンｍＲＮＡは正常なヒト胎児腎臓および肝臓において発現していたが、増幅されたＥＲＢＢ２遺伝子を含む癌細胞におけるｐ１８５ＥＲＢＢ２のｍＲＮＡと比べて低いレベルであった。ヘルスタチンは、二量体を分裂させ、ｐ１８５のチロシンリン酸化を減少させ、ＥＲＢＢ２を過剰発現する形質転換細胞の足場依存的な成長を阻害するので、ｐ１８５ＥＲＡＢＢ２のインヒビターであると思われる。ＨＥＲ２遺伝子は増幅され、ＨＥＲ２は乳癌の２５〜３０％において過剰発現し、腫瘍の攻撃性を増大させる。最後に、ＨＥＲ２に対する組換えモノクローナル抗体は、ＨＥＲを過剰発現する転移性乳癌において第１選択の化学療法の臨床的利益を増大させた［Ｓｌａｍｏｎら、２００１、（３０）］。
【００８８】
ＧＲＢ７
成長因子レセプターチロシンキナーゼ（ＧＦ−ＲＴＫ）は細胞周期の活性化に関与する。ＧＦ−ＲＴＫのいくつかの基質はＳｒｃ−相同性２（ＳＨ２）およびＳＨ３ドメインを含む。ＳＨ２ドメイン含有タンパク質はチロシンキナーゼシグナリングにおいて重要な多様な分子群である。高発現マウスライブラリーをスクリーニングするためのＣＯＲＴ（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ）法を用いて、５３５アミノ酸のタンパク質をコードするマウスＧｒｂ７の遺伝子を単離した［Ｍａｒｇｏｌｉｓら、１９９２、（３１）］。ＧＲＢ７はｒａｓ−ＧＡＰ（ｒａｓ−ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質）と相同性を有する。これはＳＨ２ドメインを含み、肝臓および腎臓において高度に発現する。この遺伝子は、ＧＲＢ７ファミリーを規定し、そのメンバーにはマウス遺伝子Ｇｒｂ１０とヒト遺伝子ＧＲＢ１４が含まれる。
【００８９】
推定ＧＲＢシグナル伝達分子および侵襲性ヒト食道癌由来のＧＲＢ７Ｖ新規スプライス変異体が単離された［Ｔａｎａｋａら、１９９８、（３２）］。両ＧＲＢ７アイソフォームは線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）のＭｉｇ−１０細胞遊走遺伝子と相同性を共有するが、ＧＲＢ７ＶアイソフォームはＣ末端において８８塩基対が欠失していた；その結果生じるフレームシフトにより１つのＳＨ２ドメインが短い疎水性配列で置換された。野生型ＧＲＢ７タンパク質は食道癌細胞においてＥＧＦ刺激に応答して迅速にチロシルリン酸化されたが、ＧＲＢ７Ｖアイソフォームはチロシルリン酸化されなかった。ヒト食道腫瘍細胞および転移を有する所属リンパ節の分析により、ＧＲＢ７Ｖは４０％のＧＲＢ７陽性食道癌において発現することが明らかになった。ＧＲＢ７Ｖ発現は、もとの腫瘍組織と比較して、転移がリンパ節に広がった後に上昇した。アンチセンスＧＲＢ７ＲＮＡ発現構築物のトランスフェクションは内因性ＧＲＢ７タンパク質レベルを低下させ、食道癌細胞により示される侵襲性表現型を抑制した。これらの発見により、ＧＲＢ７アイソフォームは細胞侵襲およびヒト食道癌の転移進行に関与することが示唆された。配列分析により、ＧＲＢ７遺伝子はトポイソメラーゼ２遺伝子の近くの、染色体１７ｑ２１−ｑ２２にマップされた［Ｄｏｎｇら、１９９７、（３３）］。ＧＲＢ−７はＨＥＲ２と協調していくつかの乳癌細胞株において過剰発現し、このＧＲＢ−７は細胞株および乳房腫瘍の両者において過剰発現する。ＳＫＢＲ−３細胞におけるチロシンリン酸化ＨＥＲ２の大きなフラクションがＧＲＢ−７と結合するように、ＧＲＢ−７はそのＳＨ２ドメインによりＨＥＲ２としっかりと結合する。［Ｓｔｅｉｎら、１９９４、（３４）］。
【００９０】
ＧＣＳＦ、ＣＳＦ３
顆粒球コロニー刺激因子（またはコロニー刺激因子−３）は顆粒球の前駆細胞の増殖および分化を特異的に刺激する。精製ＧＣＳＦタンパク質の部分的アミノ酸配列を決定し、プローブとしてオリゴヌクレオチドを用いて、いくつかのＧＣＳＦｃＤＮＡクローンがヒト扁平上皮癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーから単離された［Ｎａｇａｔａら、１９８６、（３５）］。ヒトＧＣＳＦｃＤＮＡのクローニングは、一つの遺伝子が分子量１９６００の１７７または１８０アミノ酸の成熟タンパク質をコードすることを示す。著者らは、ＧＣＳＦ遺伝子が４つのイントロンを有し、ｍＲＮＡの相異なるスプライシングにより２の異なるポリペプチドが同じ遺伝子から合成されることを見いだした。この２つのポリペプチドは３アミノ酸の存在または不在の点で異なる。発現の研究により、両者は真性なＧＣＳＦ活性を有することが示される。膀胱細胞株により産生されるＧＣＳＦと生物学的および生化学的に区別できない神経膠芽細胞腫多形細胞株からの刺激活性が、１９８７年に見いだされた。体細胞ハイブリダイゼーションおよびインサイチュ染色体ハイブリダイゼーションにより、ＧＣＳＦ遺伝子は１７ｑ１１に急性前骨髄細胞性白血病に特徴的な１５；１７転座における切断点の領域においてマップされた［Ｌｅ  Ｂｅａｕら、１９８７，（３６）］。さらなる研究により、この遺伝子は前記切断点に近接し、再配列された染色体１７上に残存することが示された。公知のパルスフィールド電気泳動法を用いたサザンブロット分析により、再配列された制限酵素切断片は示されなかった。完全長ｃＤＮＡクローンをヒト−マウス体細胞ハイブリッドおよびフロー分別されたヒト染色体においてハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、ＧＣＳＦの遺伝子は１７ｑ２１−ｑ２２ラテロンにマップされた。
【００９１】
ＴＨＲＡ、ＴＨＲＡ１、ＥＲＢＡ、ＥＡＲ７、ＥＲＢＡ２、ＥＲＢＡ３
ヒトおよびマウスＤＮＡはいずれも２つの関連性の少ないクラスのＥＲＢＡ遺伝子を有し、またこのクラスのうちの１つのコピーがヒトゲノムに多数存在することが証明された［Ｊａｎｓｓｏｎら、１９８３、（３７）］。ｃＤＮＡはヒト甲状腺レセプター遺伝子に対する相同性に基づいてラット脳メッセンジャーＲＮＡから単離された［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８７、（３８）］。このｃＤＮＡを発現させると、甲状腺ホルモンの高親和性結合タンパク質が産生された。この遺伝子から得られるメッセンジャーＲＮＡは組織特異的様式で発現し、中枢神経系で最高レベルであり、肝臓においては発現しなかった。多数の甲状腺ホルモンレセプターの存在を示す証拠が増えつつある。著者らは、５つの異なる、しかし関連する座があることを示唆した。多くの臨床および生理学的研究により、多数のレセプターの存在が示唆された。たとえば、家族性の甲状腺ホルモン耐性を有する患者が同定され、そこではニューロンの機能は維持されているが甲状腺ホルモンに対する末梢応答が失われるかまたは減少していた。甲状腺学者は、神経系が非常に影響を受けるクレチン病の一形態と甲状腺ホルモンの末梢機能がさらに多大な影響を受けるもう一つの形態を認識している。
【００９２】
ヒト肝臓、腎臓、胎盤、および脳に発現する甲状腺ホルモンレセプターの特定の形態をコードするｃＤＮＡが単離された［Ｎａｋａｉら、１９８８、（３９）］。同じクローンがヒト胎盤において見いだされた。ｃＤＮＡは４９０アミノ鎖および分子量５４８２４のタンパク質をコードする。甲状腺ホルモンレセプターアルファ−２型（ＴＨＲＡ２）と表されるこのタンパク質は、肝臓および腎臓において異なるサイズのｍＲＮＡにより表され、これは一次転写物の組織特異的プロセシングを表しうる。
【００９３】
ＴＨＲＡ遺伝子は１０のエキソンを含み、２７ｋｂのＤＮＡに及ぶ。この遺伝子の最後の２つのエキソンは、選択的にスプライシングされる。５ｋｂのＴＨＲＡ１ｍＲＮＡは推定の４１０アミノ酸タンパク質をコードする；２．７ｋｂＴＨＲＡ２ｍＲＮＡは４９０アミノ酸のタンパク質をコードする。第三のアイソフォーム、ＴＲ−アルファ−３は選択的スプライシングにより得られる。ＴＨ−アルファ−２特異的配列の近位３９アミノ酸がＴＲ−アルファ−３において欠失している。第二の遺伝子、染色体３上のＴＨＲＢは、選択的スプライシングによりＴＲ−ベータの２つのアイソフォームをコードする。１９８９年に、ＥＡＲ１およびＥＡＲ７遺伝子の構造および機能が解明され、両方とも１７ｑ２１上にあった［Ｍｉｙａｊｉｍａら、１９８９、（４０）］。著者らは、ＥＡＲ７コード配列におけるエキソンの一つはＥＡＲ１のエキソンと重複し、これら２つの遺伝子が相対するＤＮＡ鎖から転写されることを確認した。加えて、ＥＡＲ７ｍＲＮＡは、２つの選択的スプライシングされたアイソフォーム（ＥＡＲ７１およびＥＡＲ７２と称する）を生じ、そのうち、ＥＡＲ７１タンパク質はトリｃ−ｅｒｂＡタンパク質のヒト対応物である。
【００９４】
甲状腺ホルモンレセプター、ベータ、アルファ−１，およびアルファ−２  ３のｍＲＮＡは、調べた全ての組織において発現し、３つのｍＲＮＡの相対量はおよそ類似していた。３つのｍＲＮＡのうちのいずれも、主な甲状腺ホルモン−応答器官であるの肝臓においては豊富にない。これにより、もう一つの甲状腺ホルモンレセプターが肝臓に存在する可能性があるという仮説が導かれる。ＥＲＢＢを増強するＥＲＢＡは、他の公知の腫瘍細胞産物と異なり、炭酸脱水酵素と関連するアミノ酸配列を有することが見いだされた［Ｄｅｂｕｉｒｅら、１９８４、（４１）］。ＥＲＢＡは未分化期の赤芽細胞の分化をブロックすることによりＥＲＢＢを増強する。炭酸脱水酵素は赤血球における二酸化炭素の輸送に関与する。１９８６年に、ＥＲＢＡタンパク質は甲状腺ホルモンの高親和性レセプターであることが示された。ｃＤＮＡ配列はステロイドホルモンレセプターとの関連性を示し、結合研究により、甲状腺ホルモンのレセプターであることが示される。これは核に位置し、ここでＤＮＡと結合し、転写を活性化する。
【００９５】
母体の甲状腺ホルモンは妊娠早期に胎児に移され、脳発生を調節すると仮定されている。９つの第一期胎児脳におけるＴＲアイソフォームおよび関連するスプライス変異体の個体発生は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により調べられた。ＴＲ−ベータ−１、ＴＲ−アルファ−１、およびＴＲ−アルファ−２アイソフォームの発現は、妊娠８．１週から検出された。さらなる切断型種がＴＲ−アルファ−２プライマーセットにより検出され、ラットにおいて記載されているＴＲ−アルファ−３スプライス変異体と一致した。ＴＲ−アルファ−由来の転写物はすべて協調的に発現し、妊娠８．１週と１３．９週間の間で約８倍増大した。より複雑な個体発生パターンがＴＲ−ベータ−１について観察され、これは妊娠８．４週と１２．０週間の最下点を示唆する。著者らは、これらの発見が、第一期胎児脳発生時に母体の甲状腺ホルモン作用を媒介する際のＴＲ−アルファ−１アイソフォームの重要な役割を示すと結論づけた。
【００９６】
いくつかのタイプの甲状腺ホルモンレセプターの同定により、様々な器官の甲状腺ホルモン応答性における正常なバリエーションおよび甲状腺ホルモン耐性症候群においてみられる選択的組織異常を説明できる。甲状腺ホルモン作用に対して耐性の兄弟姉妹のメンバーは、成長が遅く、先天性難聴、および骨の異常があったが、知能および性的成熟は正常であり、心血管活性は増強されていた。この家族において、血球および繊維芽細胞中の異常なＴ３核レセプターが示された。様々な甲状腺ホルモンレセプターをコードするｃＤＮＡが利用可能であることは、この家族における根元的な遺伝子欠損を決定するのに有用であると考えられた。
【００９７】
ＥＲＢＡ腫瘍遺伝子は、染色体１７に割り当てられた。ＥＲＢＡ座は急性前骨髄細胞性白血病（ＡＰＬ）のｔ（１５；１７）転座において染色体１７上に残存する。チミジンキナーゼ座はおそらくは染色体１５に転座される；ｔ（１７；２１）および見かけ上同一の切断点を有する白血病の研究により、ＴＫは２１ｑ＋上にあることが示された。未培養精母細胞から得られる減数分裂パキテン期鎖に対するｃ−ｅｒｂ−Ａのクローン化ＤＮＡプローブのインサイチュハイブリダイゼーションにより、ＥＲＢＡは１７ｑ２１．３３−１７ｑ２２に、ＡＰＬにおいてみられるｔ（１５；１７）を生じる切断点と同じ領域において、位置すると結論づけられた。ほとんどの粒状物は１７ｑ２２においてみられるので、ＥＲＢＡはおそらくは１７ｑ２２に近い領域または１７ｑ２２と１７ｑ２１．３３の接合点にあることが示唆された。インサイチュハイブリダイゼーションにより、ＥＲＢＡはＡＰＬにおいて１７ｑ１１−ｑ１２に残存し、一方、１７ｑ２１−ｑ２２のＴＰ５３は染色体１５に転座されることが示された。このように、ＥＲＢＡは、１７ｑ１１．２において、ＡＰＬ転座における切断点のすぐ近位で、かつ構造転座における切断点からすぐ遠位に存在しなければならない。
【００９８】
非機能性下垂体腫瘍における異常なＴＨＲＡ発現は、レセプターコード配列および調節配列における突然変異を反映すると仮説が立てられている。ＴＨＲＡ  ｍＲＮＡおよびＴＨＲＢ応答エレメントおよびリガンド結合ドメインの配列異常についてスクリーニングされた。２３の腫瘍から得られるＴＨＲＡｍＲＮＡのＲＮＡｓｅミスマッチによるスクリーニングおよび候補断片の配列決定により、１つのサイレントな突然変異および３つのミスセンス突然変異が確認され、このうち２つは共通のＴＨＲＡ領域にあり、１つはアルファ−２アイソフォームについて特異的であった。ＴＨＲＢ応答エレメントの相違は１４の非機能性腫瘍において検出されず、ＴＨＲＢリガンド結合ドメインの相違は２３の非機能性腫瘍において検出されなかった。従って、新規甲状腺レセプター突然変異は甲状腺レセプター作用の点で機能的に重要であり、さらにその機能的特性を規定すると、下垂体細胞における成長制御における甲状腺レセプターの役割が解明されることが示唆される。
【００９９】
ＲＡＲ−アルファ
高親和性でレチノイン酸と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡがクローニングされた［Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈら、１９８７、（４２）］。そのタンパク質はステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、およびビタミンＤ３のレセプターに対して相同性を有することが判明し、レチノイン酸誘導性トランス作用性エンハンサー因子であると思われた。従って、胚発生、分化、および腫瘍細胞成長に対するビタミンＡの効果の分子メカニズムは、この核レセプターファミリーの他のメンバーについて記述されたもの類似する可能性がある。一般に、ＤＮＡ結合ドメインは、２つのレセプターグループ（ステロイドと甲状腺）の中およびその間で高度に保存される；ｃＤＮＡプローブを使用して、ＲＡＲ−アルファ遺伝子は、インサイチュハイブリダイゼーションにより１７ｑ２１にマップされた［Ｍａｔｔｅｉら、１９８８、（４３）］。それぞれ染色体１７ｑ２１．１および３ｐ２４にマップされる２つのレチノイン酸レセプター、ＲＡＲ−アルファおよびＲＡＲ−ベータの存在についての証拠が提示されている。ＲＡＲのアルファおよびベータ型は、核レセプターファミリーのほかのどのメンバーよりも、それぞれ１７ｑ１１．２および３ｐ２５−ｐ２１に位置する２つの密接に関連する甲状腺ホルモンレセプターアルファおよびベータとより相同性を有することが見いだされた。これらの観測は、甲状腺ホルモンとレチノイン酸レセプターが、そのファミリーのステロイドレセプター群の共通の祖先から進化のかなり早期に分岐した、共通の祖先からの遺伝子複製、おそらく染色体複製により発達したことを示唆する。ヒトＲＡＲＡおよびＲＡＲＢ遺伝子の対応物がマウスとニワトリの両方に存在していることが指摘された。ＡＰＬ切断点におけるＲＡＲＡの関与は、急性骨髄性白血病の処置における治療用分化剤としてのレチノイン酸の使用がなぜＡＰＬに限定されているかを説明できる。ほとんどすべてのＡＰＬ患者が染色体転座ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）を有している。分子の研究により、この転座は染色体１５上のＰＭＬ遺伝子と染色体１７上のＲＡＲＡ遺伝子の間の融合によるキメラ遺伝子をもたらすことが明らかになる。ホルモン依存性の核レセプターＲＡＲＡおよびＲＸＲＡのＣＬＯＣＫおよびＭＯＰ４との相互作用が提示されている。
【０１００】
ＣＤＣ１８  Ｌ、ＣＤＣ６
酵母において、Ｃｄｃ６（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））とＣｄｃ１８（シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））は、起点認識複合体（ＯＲＣ）タンパク質と結合し、細胞にＤＮＡ複製能を与える。従って、Ｃｄｃ６は酵母においてｃＤＮＡ複製の開始おいて重要な調節の役割を果たす。酵母ＣＤＣ６のツメガエル属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびヒトホモログをコードするｃＤＮＡが単離されている［Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９７、（４４）］。彼らは、そのヒトおよびツメガエル属タンパク質をｐ６２（ｃｄｃ６）と表した。それは別に、ＰＣＮＡをベイトとして用いた酵母ツーハイブリッド分析で、ヒトＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８ホモログをコードするｃＤＮＡが単離された［Ｓａｈａら、１９９８、（４５）］。これらの著者は推定の５６０アミノ酸のヒトタンパク質がこれら２つの酵母菌タンパク質と約３３％の配列同一性を共有すると報告した。ＨｅＬａ細胞抽出物のウェスタンブロット上では、ヒトＣＤＣ６／ｃｄｃ１８は６６ｋＤタンパク質として移動する。ノザンブロットは、ＨｅＬａ細胞においてＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８ｍＲＮＡレベルがＳ期の開始でピークに達し有糸分裂の開始で減少することを示したが、この著者らは全ＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８タンパク質レベルが細胞周期全体を通じて変化しないことを見いだした。エピトープタグ付加されたタンパク質の免疫蛍光分析により、ヒトＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８は、Ｇ１期細胞には核に、Ｓ期細胞には細胞質に存在することが明らかになり、これはＤＮＡ複製が核と細胞質の間のこのタンパク質の移動あるいは核におけるこのタンパク質の選択的な分解により制御されることを示唆する。免疫沈降研究は、ヒトＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８がインビボでサイクリンＡ、ＣＤＫ２、およびＯＲＣ１と結合することを示した。このサイクリン−ＣＤＫ２とＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８の結合は有糸分裂細胞抽出物に存在する因子により特異的に阻害された。従って、ＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８とＳ期促進因子のサイクリン−ＣＤＫ２との間の相互作用がＤＮＡ複製の開始に必須であるならば、この相互作用に対する有糸分裂インヒビターは、Ｇ１における適当な時期まで未熟な相互作用を防止できることが示唆された。Ｃｄｃ６は、培地および未処置動物の組織内のいずれにおいても、増殖中の哺乳動物細胞では発現するが、静止細胞では発現しない［Ｙａｎら、１９９８、（４６）］。ヒトＣｄｃ６プロモーターの機能分析により、また内因性Ｃｄｃ６遺伝子を刺激する外因的に発現させたＥ２Ｆタンパク質の能力により明らかになるように、成長阻止された状態から増殖状態への遷移中、哺乳動物Ｃｄｃ６の転写はＥ２Ｆタンパク質により制御される。抗Ｃｄｃ６抗体の微量注入によるＣｄｃ６の免疫枯渇は、ヒト腫瘍細胞株におけるＤＮＡ複製の開始をブロックした。著者は、Ｅ２Ｆタンパク質を含む転写制御メカニズムによりヒトＣｄｃ６の発現が有糸分裂促進シグナルに応答して調節されること、およびＣｄｃ６は哺乳動物細胞におけるＤＮＡ複製に必要であることを結論づけた。
【０１０１】
酵母ツーハイブリッドシステム、組換えタンパク質の同時精製および免疫沈降により、ＣＤＣ６のＮ末端セグメントであるラテロンが、タンパクホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の調節サブユニットであるＰＲ４８と特異的に結合することが示された。著者らは、Ｒ４８または関連Ｂ’’（−ダブルプライム）タンパク質との特異的相互作用により媒介されるＰＰ２ＡによるＣＤＣ６の脱リン酸化は哺乳動物細胞におけるＤＮＡ複製の開始を制御する調節事象であると仮定した。体細胞ハイブリッドの分析および蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより、ヒトｐ６２（ｃｄｃ６）遺伝子は１７ｑ２１．３にあることがわかった。
【０１０２】
ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２、ＴＯＰ２アルファ
ＤＮＡトポイソメラーゼは原核生物と真核生物の両方においてＤＮＡのトポロジー状態を制御し、変化させる酵素である。真核細胞から得られるトポイソメラーゼＩＩは高次コイルＤＮＡ分子の弛緩、カートネーション（ｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）、デカートネーション（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）、環状ＤＮＡのノッティングおよびアンノッティングを触媒する。これより、トポイソメラーゼＩＩにより触媒される反応は２つのＤＮＡセグメントの交差を含むと思われる。１つのＨｅＬａ細胞株につき、核抽出物の約０．１％にあたる、約１００，０００の分子のトポイソメラーゼＩＩがあると推定された。毛細血管拡張性運動失調症の異常な特性のいくつかはＤＮＡプロセシングにおける欠陥によると考えられ、５ＡＴ細胞株においてこれらの酵素活性についてスクリーニングが行なわれた［Ｓｉｎｇｈら、１９８８、（４７）］。対照と比較して、Ｐ４期ＤＮＡのアンノッティングにより決定されるＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのレベルはこれらの細胞株のうち４つにおいて実質的に５分の１に減少した。高次コイルＤＮＡの弛緩により分析されたＤＮＡトポイソメラーゼＩは正常なレベルで存在することが判明した。
【０１０３】
ヒトＴＯＰ２遺伝子の全コード配列は決定されている［Ｔｓａｉ−Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒら、１９８８、（４８）］。
【０１０４】
加えて、ショウジョウバエＴｏｐｏＩＩｃＤＮＡを用いてメクロレタミン耐性バーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ−ＨＮ２）由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離されたヒトｃＤＮＡｓはすでに配列決定されている［Ｃｈｕｎｇら、１９８９、（４９）］。著者らは２つのＴＯＰ２アイソザイムを表す２つの配列クラスを同定し、これをＴＯＰ２ＡおよびＴＯＰ２Ｂと命名した。ＴＯＰ２ＡｃＤＮＡの一つの配列はＴｓａｉ−Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒら、１９８８（４８）により単離されたＴＯＰ２ｃＤＮＡの内部断片と同一である。サザンブロット分析は、ＴＯＰ２ＡとＴＯＰ２ＢのｃＤＮＡが別の遺伝子から得られることを示した。ＴＯＰ２Ａ特異的プローブを用いたノザンブロット分析により、ヒト細胞株Ｕ９３７において６．５ｋｂの転写物が検出された。ＴＯＰ２Ａペプチドに対する抗体はＵ９３７細胞溶解物で１７０ｋＤのタンパク質を認識した。従って、このデータが２つのＴＯＰ２アイソザイムの遺伝的、免疫化学的証拠を提供すると結論された。ＴＯＰ２ＡおよびＴＯＰ２Ｂ遺伝子の完全な構造が報告されている［Ｌａｎｇら、１９９８、（５０）］。ＴＯＰ２Ａ遺伝子は約３０ｋｂにおよび、３５のエキソンを含む。
【０１０５】
Ｔｓａｉ−Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒら、１９８８（４８）は、中期染色体に対するクローン化断片のインサイチュハイブリダイゼーションの組み合わせにより、また一連のマウス−ヒトハイブリッド細胞株についてのサザンハイブリダイゼーション分析により、そのヒト酵素が１７ｑ２１−ｑ２２にマップされた一つのコピーの遺伝子によってコードされるということを示した。染色体１７への割り当ては、体細胞ハイブリッドの研究に確認されている。腺癌細胞株における共増幅のために、ＴＯＰ２ＡおよびＥＲＢＢ２遺伝子は染色体１７と密接に関連し得ると結論づけられた［Ｋｅｉｔｈら、１９９２、（５１）］。ＴＯＰ２ＡおよびＴＯＰ２Ｂの座の両方でＲＦＬＰを検出するプローブを使って、示されたヘテロ接合性は、アルファおよびベータ座についてそれぞれ０．１７および０．３７の頻度であった。マウスホモログは染色体１１にマップされた［Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅら、１９９３、（５２）］。ＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼの構造および機能は総説に記載されている［Ｗａｔｔら、１９９４、（５３）］。ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ−アルファはｐｏｌＩＩホロ酵素と結合し、クロマチン依存性コアクチベーションに必要とされる成分である。トポイソメラーゼＩＩの特異的インヒビターはクロマチン鋳型上の転写をブロックしたが、裸の鋳型上の転写には影響を及ぼさなかった。精製トポイソメラーゼＩＩ−アルファの添加により、コアｐｏｌＩＩとの反応におけるクロマチン依存性活性化活性が再構築された。従って、クロマチン鋳型上の転写は結果として高次コイル張力の蓄積をもたらし、トポイソメラーゼＩＩの弛緩活性がヌクレオソームＤＮＡ上での生産的ＲＮＡ合成に必須となるようである。
【０１０６】
ＩＧＦＢＰ４
６つの構造的に異なるインシュリン様成長因子結合タンパク質が単離され、ｃＤＮＡがクローニングされた：ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５およびＩＧＦＢＰ６。これらタンパク質は強い配列相同性を示し、このことはこれらは密接に関連する遺伝子ファミリーによりコードされることを示唆する。ＩＧＦＢＰは３つの構造的に異なるドメインを含み、それらはそれぞれその分子のおよそ３分の１を構成している。６つのヒトＩＧＦＢＰのＮ末端ドメイン１とＣ末端ドメイン３は、それぞれ１２個と６個の不変のシステイン残基を含む（ＩＧＦＢＰ６はドメイン１において１０のシステイン残基を含む）など、中〜高程度の配列同一性を示しており、そこがＩＧＦ結合ドメインと考えられる。ドメイン２は、６つのＩＧＦＢＰの間の配列同一性の欠失により、またシステイン残基の欠失により主に定義されるが、ＩＧＦＢＰ４においては２のシステインを含む。ドメイン３はチログロブリンタイプＩ繰り返しユニットに対して相同性を有する。組換えヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質４、５、および６は、ユビキチンとの融合タンパク質としての酵母における発現により特徴づけられる［Ｋｉｅｆｅｒら、１９９２、（５４）］。研究の結果から、著者らはこれら３つのタンパク質の主な効果はＩＧＦ活性の減弱であること、およびこれらはＩＧＦにより媒介される細胞成長および代謝の制御に寄与することを示唆した。さらに、ＩＧＦＢＰは、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕが媒介するシグナルに影響する。ＩＧＦＢＰをＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現細胞へ添加すると、少なくとも一部において、それぞれの細胞の成長および生存特性が阻害される。
【０１０７】
精製インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）のペプチド配列に基づいて、ＰＣＲを用いることによりラットＩＧＦＢＰ４がクローニングされた［Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、１９９０、（５５）］。彼らはラットｃＤＮＡを用いて肝臓ｃＤＮＡライブラリーからヒトオルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をクローニングした。ヒトＩＧＦＢＰ４は２１アミノ酸のシグナル配列を含む２５８アミノ酸のポリペプチドをコードする。タンパク質は非常に親水性が高く、これは血液中でのＩＧＦのキャリアタンパク質としての能力を促進し得る。ラット組織のノザンブロット分析により、すべての試験された組織において発現が明らかにとなり、肝臓において最高の発現が得られた。ＩＧＦＢＰ４がＩＧＦ誘発骨細胞増殖のインヒビターとしての働きをすることが述べられている。そのゲノム領域は、ＩＧＦＢＰ遺伝子を含む。約１５ｋｂのゲノムＤＮＡに及ぶ４のエキソンからなる遺伝子が調べられた［Ｚａｚｚｉら、１９９８、（５６）］。その遺伝子の上流領域はＴＡＴＡボックスおよびｃＡＭＰ感受性プロモーターを含む。
【０１０８】
インサイチュハイブリダイゼーションにより、ＩＧＦＢＰ４遺伝子は１７ｑ１２−ｑ２１にマップされた［Ｂａｊａｌｉｃａら、１９９２、（５７）］。遺伝的乳癌−卵巣癌遺伝子のＢＲＣＡ１が同じ領域にマップされていたので、２２のＢＲＣＡ１ファミリーの結合分析によりＩＧＦＢＰ４が候補遺伝子であるかどうかを調べた；遺伝子組換えの発見は、これがＢＲＣＡ１遺伝子でないことを示唆した［Ｔｏｎｉｎら、１９９３、（５８）］。
【０１０９】
ＥＢＩ１、ＣＣＲ７、ＣＭＫＢＲ７
縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを使用して、Ｇタンパク質結合レセプターファミリーのリンパ球特異的メンバーが同定され、ヒト／マウス体細胞ハイブリッドＤＮＡの解析と蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより１７ｑ１２−ｑ２１．２にマップされた。このレセプターは独立にエプスタイン−バー誘発性ｃＤＮＡ（記号ＥＢＩＩ）として同定されていたことが示された［Ｂｉｒｋｅｎｂａｃｈら、１９９３、（５９）］。ＥＢＩ１は正常なリンパ組織およびいくつかのＢ−およびＴ−リンパ球細胞株において発現する。ＥＢＩ１の機能およびリガンドは不明であるが、その配列と遺伝子構造はそれがインターロイキン−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ５ａ、およびｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅのような化学誘引物質を認識するレセプターと関連することを示唆する。化学誘引物質レセプターと同様、ＥＢＩ１はその５’末端付近に介在配列を含んでいる；しかしながら、そのイントロンの両方ともが最初の細胞外ドメインのコード領域を中断するという点で、ＥＢＩ１はユニークである。マウスＥｂｉ１  ｃＤＮＡは単離されており、ヒトホモログと８６％の同一性を有するタンパク質をコードすることが判明した。
【０１１０】
マウスＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットは養子移入後に脾臓の相異なる領域に局在化する。ＣＣＲ７を発現するナイーブなＴヘルパー−１（ＴＨ１）細胞は、動脈周辺リンパ鞘に向かい、一方、ＣＣＲ７を欠く活性化ＴＨ２細胞は、Ｂ細胞小胞付近のＴ細胞ゾーンの周囲において環を形成する。ＴＨ２細胞へのＣＣＲ７のレトロウイルス形質導入は、これらをＴＨ１様パターンで局在化させ、インビボでのＢ細胞の補助への参加を阻害するが、インビトロでは阻害しないことが判明した。ケモカインレセプターの差次的発現の結果、有効な免疫反応のために重要な独自の細胞移動パターンが得られるようである。
【０１１１】
ＣＣＲ７発現は、ヒト記憶Ｔ細胞を２つの機能的に別個のサブセットに分ける。ＣＣＲ７記憶細胞は炎症組織への移動のためレセプターを発現し、即時的エフェクター機能を示す。対照的に、ＣＣＲ７＋記憶細胞はリンパ節（ｈｏｍｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現し、即時エフェクター機能を欠くが、効率的に樹状細胞を刺激して、二次刺激によりＣＣＲ７−エフェクター細胞に分化する。それぞれ中心記憶Ｔ細胞（Ｔ−ＣＭ）およびエフェクター記憶Ｔ細胞（Ｔ−ＥＭ）と呼ばれるＣＣＲ７＋Ｔ細胞およびＣＣＲ７−Ｔ細胞は、段階的にナイーブＴ細胞から分化し、免疫後数年にわたって存続し、記憶レスポンスにおいて分業を許容する。
【０１１２】
ＨＩＶおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）四量体に対する記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答におけるＣＣＲ７発現が評価された。ほとんどの記憶Ｔリンパ球がＣＤ４５ＲＯを発現するが、一部はその代わりにＣＤ４５ＲＡマーカーを発現する。マーカー発現および細胞分裂のフローサイトメトリー分析により、系列分化パターンを表すＨＩＶ−およびＣＭＶ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４つのサブセットが同定された：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋（ダブルポジティブ）；ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋；ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−（ダブルネガティブ）；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−。５−（および６−）カルボキシル−フルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、およびＫｉ６７核抗原についての細胞内染色により測定される細胞分裂能は、主にＣＣＲ７＋サブセットに限定され、ＣＤ４５ＲＡ＋でもある細胞ではより急速に起こった。ダブルネガティブ細胞は刺激後に分裂または増殖しなかったが、これらはＣＤ４５ＲＡまたはＣＣＲ７またはその両方についてポジティブに戻った。最終分化細胞と考えられるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−細胞は、分裂しないが、インターフェロン−ガンマを産生し、高いレベルのパーフォリンを発現する。ＣＭＶおよびＨＩＶについて特異的なサブセットの代表は区別可能である。ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の約７０％はダブルネガティブであるか、または最終分化前であるのに対して、ＣＭＶ特異的細胞では４０％である。ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞のおよそ５０％が最終分化状態であるのに対して、ＨＩＶ特異的細胞は１０％以下である。最終分化ＣＭＶ特異的細胞は迅速に介入できる状態だが、ダブルポジティブ前駆細胞はエフェクター細胞プールの増殖と補充のために残存することが示唆される。さらに、高い抗原耐性とＨＩＶ特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性の減少は、ＨＩＶ特異的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を、最終エフェクター状態に分化できないダブルネガティブ期に保持し得る。Ｂリンパ球は、二次リンパ系器官におけるＢ細胞が豊富な区画（小胞あるいはＢゾーン）間で再循環し、抗原を探す。抗原結合後、Ｂ細胞はＴ−ヘルパー細胞と相互に作用するためにＢとＴゾーンの境界に移動する。さらに、抗原結合Ｂ細胞は、Ｔ−ゾーンケモカインＣＣＬ１９（ＥＬＣともいう）およびＣＣＬ２１のレセプターであるＣＣＲ７の発現を増大させ、両化学誘引物質に対して応答性が増大することが証明された。リンパ球ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１ケモカインが欠失しているか、またはＣＣＲ７が欠失したＢ細胞を有するマウスにおいては、抗原結合によりＴゾーンへの移動が起こらない。レトロウイルス媒介遺伝子移入を用いて、著者らは、ＣＣＲ７発現の上昇がＢ細胞をＴゾーンへ向かわせるのに十分であることを示した。相互的に、Ｂ−ゾーンケモカインＣＸＣＬ１３のレセプターであるＣＸＣＲ５の過剰発現は、抗原により誘発されるＢ細胞のＴゾーンへの移動を克服するために十分である。これは、抗原に応答したＢ細胞再局在化のメカニズムの証拠になり、インビボでの細胞位置は、隣接する分離ゾーンで作られる化学誘引物質の応答のバランスによって決定されることができることを確認した。
【０１１３】
ＢＡＦ５７、ＳＭＡＲＣＥ  １
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とショウジョウバエにおけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、クロマチンが媒介する転写抑制と拮抗することにより、特定遺伝子の転写活性を促進すると考えられている。この複合体は、転写因子の結合の増強につながり得るＡＴＰ依存性ヌクレオソーム分解活性を含む。哺乳動物におけるＢＲＧ１／ｂｒｍ関連因子（すなわちＢＡＦ）複合体は、機能的にＳＷＩ／ＳＮＦと関連し、９から１２のサブユニットから成り、このうちのいくつかはＳＷＩ／ＳＮＦサブユニットと相同性を有する。５７ｋＤのＢＡＦサブユニット、ＢＡＦ５７は、酵母菌には存在せず、より高等な真核生物に存在している。部分的なコード配列は、ヒト細胞株の抽出物由来の精製ＢＡＦ５７から得られた［Ｗａｎｇら、１９９８、（６０）］。ペプチド配列に基づいて、ＢＡＦ５７をコードするｃＤＮＡを同定した。推定の４１１アミノ酸タンパク質はキネシン様領域に隣接するＨＭＧドメインを含む。組換えＢＡＦ５７および全ＢＡＦ複合体はいずれも、ヌクレオソームに入るかまたは出る際にＤＮＡのトポロジーを模倣すると考えられる４ウェイジャンクション（４ＷＪ）ＤＮＡと結合する。ＢＡＦ５７のＤＮＡ結合活性は、他のＨＭＧタンパク質と類似した特性を有する。ＢＡＦ５７のＨＭＧドメインに突然変異を有する複合体は、そのＤＮＡ結合およびヌクレオソーム分解活性を保持することが判明した。哺乳動物ＳＷＩ／ＳＮＦ様複合体がクロマチンと相互作用するメカニズムには、２またはそれ以上のＤＮＡ結合ドメインによる高次クロマチン構造の認識が関与することが示唆された。ＲＮａｓｅプロテクション研究およびウェスタンブロット分析により、ＢＡＦ５７は遍在的に発現することが明らかになった。いくつかの証拠が癌発生におけるＳＷＩ／ＳＮＦ因子の関与を指摘する［Ｋｌｏｃｈｅｎｄｌｅｒ−Ｙｅｉｖｉｎら、２００２、（６１）］。さらに、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連遺伝子はしばしばヒト癌における体細胞再配列に関与する染色体領域に割り当てられる［Ｒｉｎｇら、１９９８、（６２）］。この点に関して、ＳＷＩ／ＳＮＦファミリーメンバーの一部（すなわち、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＡＲＣＤ１およびＳＭＡＲＣＤ２２）が、我々が同定した真核細胞ＡＲＣＨＥＯＮのうちの３つ（すなわちそれぞれ３ｐ２１−ｐ２４、１２ｑ１３−ｑ１４および１７ｑ）に隣接することは興味深く、これは本発明の一部をなす。本発明において、本発明者らは、ＰＣＲ核形分析によりＳＭＡＲＣＥ１／ＢＡＦ５７も１７ｑ１２領域にマップすることができた。
【０１１４】
ＫＲＴ  １０、  Ｋ１０
ケラチン１０は酸性のタイプＩファミリーに属する中間径フィラメント（ＩＦ）鎖であり、最終分化表皮細胞に発現する。表皮細胞はほとんど常にタイプＩおよびタイプＩＩケラチンのペアを共発現し、この共発現するペアは所定の表皮組織に非常に特徴的である。例えば、ヒト表皮において、３つの異なるケラチンペアが発現する：基底または増殖細胞に特徴的なケラチン５（タイプＩＩ）および１４（タイプＩ）；超基底最終分化細胞に特徴的なケラチン１（タイプＩＩ）および１０（タイプＩ）；ならびに疾患または障害により過剰増殖が誘導された細胞、および細胞培養による表皮細胞に特徴的なケラチン６（タイプＩＩ）および１６（タイプＩ）（およびケラチン１７［タイプＩ］）。ヒト表皮ケラチン１０（５６．５のｋＤ）をコードする１７００ｂｐｃＤＮＡのヌクレオチド配列［Ｄａｒｍｏｎら、１９８７、（６３）］、およびヒトケラチン１０の完全アミノ酸配列［Ｚｈｏｕら、１９８８、（６４）］は、同様に開示されている。Ｃ末端ドメインにおいてグリシン−ループモチーフを形成するグリシンリッチ準ペプチドリピートの挿入および欠失に限定されるＫＲＴ１０遺伝子の多型がよく記載されている［Ｋｏｒｇｅら、１９９２、（６５）］。
【０１１５】
特異的ｃＤＮＡクローンを体細胞ハイブリッド分析およびインサイチュハイブリダイゼーションと組み合わせて使用することにより、ＫＲＴ１０遺伝子が、１７ｑ１２−ｑ２１に、ある形態の急性白血病と関連するｔ（１７；２１）（ｑ２１；ｑ２２）転座に関与する１７ｑ２１の切断点に近位の領域においてマップされた。ＫＲＴ１０は同じ領域にマップされる３つの他の座：ＣＳＦ３、ＥＲＢＡ１およびＨＥＲ２に対してテロメリックであるようであった［Ｌｅｓｓｉｎら、１９８８、（６６）］。ＮＧＦＲおよびＨＯＸ２はＫ９に対して遠位である。ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１３、およびＫＲＴ１５遺伝子は同じラージパルスフィールドゲル電気泳動断片中に位置する［Ｒｏｍａｎｏら、１９９１、（６７）］。３つの遺伝子の割り当ての相関関係から１７ｑ２１−ｑ２２がそのクラスターの位置と思われる。突然変異ケラチン１０遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは表皮剥離性角化症の表現型を有し、したがってこのヒト障害についての遺伝的基礎は超基底ケラチンＫＲＴ１またはＫＲＴ１０をコードする遺伝子における突然変異にあることが示唆される［Ｆｕｃｈｓら、１９９２、（６８）］。著者らはまた、基底細胞増殖の刺激が超基底細胞における欠陥に起因すること、および核形状のひずみまたは細胞質分裂における変化は、中間径フィラメントネットワークが乱れたときに起こりうることを示した。自然発生または軽い機械的または熱的ストレスに応答しての水疱がなく、かつ手のひらおよび足裏以外の体の部分および皮膚に影響のない掌蹠角化症の家族において、ＫＲＴ１０遺伝子のＣ末端コード領域の挿入−欠失多型と密接な連鎖（シータ＝０．００での極大ロッドスコア＝８．３６）が見いだされた［Ｒｏｇａｅｖら、１９９３、（６９）］。この障害に関して分離されたのはＫＲＴ１０多型を有するまれな高分子量対立遺伝子であったことは注目すべきである。この対立遺伝子は非罹患コーカサス人から得られた９６の別個の染色体において観察された。ＫＲＴ１０多型は、コード領域中の不完全な（ＣＣＧ）ｎリピートの挿入／欠失に起因し、ケラチン１０タンパク質のＣ末端にさまざまなグリシンループモチーフを生じさせた。不完全なトリヌクレオチドリピートの増幅に発病的役割がある可能性がある。
【０１１６】
ＫＲＴ１２、Ｋ１２
ケラチンは上皮細胞における１０ナノメートルの中間径フィラメントを形成する水不溶性タンパクのグループである。およそ３０の異なったケラチン分子が同定されている。これらはそれぞれ相対的な電荷、免疫反応性およびタイプＩおよびＩＩウールケラチンに対する配列相同性によって、酸性および塩基性−中性サブファミリーに分類することができる。インビボで、塩基性ケラチンは通常特定の酸性ケラチンと共発現し、「ペア」になって、ヘテロダイマーを形成する。種々のケラチンペアの発現は組織特異性であり、分化作用依存性で、発達を促進するように調節される。特異的ケラチンペアの存在は、上皮の完全性の維持に欠くことができない。例えば、ヒトＫ１４／Ｋ５ペアとＫ１０／Ｋ１ペアにおける突然変異は、それぞれ皮膚病、単純型先天性表皮水疱症および表皮剥離性角質増殖症の根底にある。Ｋ３およびＫ１２ケラチンペアの発現は、ヒト、マウスおよびニワトリを含む多数の種の角膜において見いだされており、角膜タイプの上皮分化のマーカーと見なされる。マウスＫｒｔ１２（Ｋｒｔ１．１２）遺伝子とその発現は角膜上皮細胞特異性であり、分化依存性であり、発達を促進するように調節される［Ｌｉｕら、１９９３、（７０）］。ケラチン１２遺伝子発現の角膜特異性は、ケラチン１２が正常な角膜の上皮機能の維持において独自の役割を果たすことを示す。にもかかわらず、ケラチン１２の厳密な機能は不明であり、遺伝的なヒト角膜の上皮障害でケラチン１２遺伝子における突然変異と直接関連づけられるものはなかった。ヒト角膜上皮細胞の発現特性の研究の一部として、オープンリーディングフレームが角膜特異的マウスケラチン１２遺伝子と高度に相同性を有するｃＤＮＡが単離された［Ｎｉｓｈｉｄａら、１９９６、（７１）］。ケラチン１２の機能を説明するために、Ｋｒｔ１．１２遺伝子を欠くノックアウトマウスが遺伝子標的技術によって作られた。ヘテロ接合マウスは正常であるように見えた。ホモ接合マウスは正常に発育し、軽い角膜上皮びらんにかかっていた。角膜上皮は脆弱で、目を軽くこするかまたはなでることにより除去することができた。免疫組織化学、エピトープ特異的抗ケラチン１２抗体を用いたウェスタンブロット分析、ノザンハイブリダイゼーション、およびアンチセンスケラチン１２リボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより判断されるように、ホモ接合体の角膜上皮はケラチン１２を発現しなかった。ＫＲＴ１２遺伝子は放射線ハイブリッドの研究により１７ｑにマップされ、Ｄ１７Ｓ８００とＤ１７Ｓ９３０（１７ｑ１２−ｑ２１）の間におけるタイプＩケラチンクラスターに局在化された［Ｎｉｓｈｉｄａら、１９９７、（７２）］。著者らは、ＫＲＴ１２遺伝子のエキソン−イントロン境界構造を提示し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによりその遺伝子を１７ｑ１２にマップした。その遺伝子は、コード配列をカバーする８つのエキソンを規定する７つのイントロンを含む。このエキソンとイントロンは一緒になって約６ｋｂのゲノムＤＮＡに及ぶ。
【０１１７】
Ｍｅｅｓｍａｎｎ角膜ジストロフィーは、角膜特異的ケラチンＫ３およびＫ１２が発現する前角膜上皮の易損性を起こす常染色体優性障害である。これらのケラチンにおけるドミナントネガティブな突然変異は、Ｍｅｅｓｍａｎｎ角膜ジストロフィーの原因である可能性がある。実際、Ｋ１２座とその障害との関連性が、シータ＝０．０においてＺ（最大）＝７．５３を有するＭｅｅｓｍａｎｎのオリジナルのドイツ人家系において見いだされた［ＭｅｅｓｍａｎｎおよびＷｉｌｋｅ、１９３９、（７３）］。北アイルランドからの２家系において、この障害が、一方の家系ではＫ１２と、他方の家系でがＫ３と一緒に分離されることが判明した。各家族において、Ｋ３またはＫ１２におけるヘテロ接合ミスセンス突然変異（Ｒ１３５Ｔ、Ｖ１４３Ｌ）が確認された。これらすべての突然変異は高度に保存されたケラチンへリックス境界モチーフにおいて生じ、他のケラチンにおける優性突然変異は細胞骨格機能をひどく損ない、ケラチノサイト易損性つながることが判明した。
【０１１８】
ヒトＫＲＴ１２遺伝子の領域は配列決定され、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して全てのエキソンについて突然変異検出が可能になった［Ｃｏｒｄｅｎら、２０００、（７４）］。著者らは、ヒトゲノム配列が５，９１９ｂｐに及び、８つのエキソンからなることを見いだした。マイクロサテライトジヌクレオチドリピートがイントロン３内で同定され、これは高度に多型であり、遺伝子型分析に用いるため開発された。加えて、Ｋ１２のヘリックス開始モチーフでの２つの突然変異がＭｅｅｓｍａｎｎ角膜ジストロフィーを有する家系において見いだされた。アメリカ人家系において、ミスセンスＭ１２９Ｔ突然変異がＫＲＴ１２遺伝子において見いだされた。ＫＲＴ１２遺伝子において合計８つの突然変異が報告されていたということであった。
【０１１９】
ＡＲＣＨＥＯＮの中の遺伝子の相互作用
ゲノム変化（増幅、挿入、転座、欠失など）に関与する遺伝子はその発現パターンにおいて変化を示す。特に興味深いのは、細胞あたりの遺伝子コピー数が２より多いことの原因である遺伝子増幅、または細胞あたりの遺伝子コピー数が２より少ないことの原因である欠失である。それぞれの遺伝子の遺伝子コピー数と遺伝子発現は必ずしも相関しない。転写的過剰発現は、その染色体の座の調節領域（プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサー）により決定されるインタクトな転写状況および有効な組み合わせで存在する十分な量の転写レギュレーターを必要とする。これはゲノム領域について特に当てはまり、その発現は特定の組織において、または特定の発達段階の間に厳しく調節される。ＡＲＣＨＥＯＮは、直接隣接するかまたは染色体の順番で最大１０、好ましくは７、より好ましくは５または少なくとも１つの遺伝子が散在する２以上の遺伝子の遺伝子クラスターにより特定される。散在遺伝子も共増幅されるが、直接ＡＲＣＨＥＯＮと相互作用しない。このようなＡＲＣＨＥＯＮは最大２０、より好ましくは１０または少なくとも６つのメガベースの染色体領域上に広がりうる。ＡＲＣＨＥＯＮの性質は特定の組織、細胞タイプ、細胞または発達状態あるいは時点に含まれる遺伝子の共増幅および／または欠失およびそれに相関する発現（すなわちそれぞれ上方調節または下方調節）により特徴づけられる。このようなＡＲＣＨＥＯＮは、細胞発生中に重要な役割をするので、進化中に通常保存される。これらのＡＲＣＨＥＯＮの場合、異常な生物学的環境でも遺伝子発現および／または生物学的エフェクター機能を安定化させる自己調節フィードバックループを有するか、または非常に類似した転写因子の組み合わせにより調節されるため、増幅により遺伝子クラスター全体が過剰発現し、ある発達段階での特定の組織におけるその同時に起こる機能を反映する。したがって、遺伝子コピー数は、特にＡＲＣＨＥＯＮとして機能する遺伝子クラスターにおける遺伝子については、発現レベルと相関する。腫瘍病巣における異常な遺伝子発現の場合、自己調節フィードバックループがＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子メンバーの生物学的活性を決めるので、それが保存されるかどうかを知ることは非常に重要である。
【０１２０】
限定ではなく例示として、ＡＲＣＨＥＯＮにおける遺伝子間の強い相互作用を１７ｑ１２ＡＲＣＨＥＯＮ（図１）について記載する。ある態様において、乳癌細胞株について例示されるように、別のゲノム領域中の遺伝子の変化の存在または不在は互いに相関する（図３および図４）。これにより、所定の染色体位置の前記遺伝子産物の複数の相互作用がおこること、異常な組織におけるそのそれぞれの変化は予測、診断、予後予測及び／または予防および治療的価値があることという本発明の発見が得られる。これらの相互作用は、それぞれの遺伝子が、相互につながった、または独立したシグナリングネットワークの一部であるか、または細胞挙動（分化状態、増殖及び／またはアポトーシス能、侵襲性、薬剤反応性、免疫調節活性）を相乗的、拮抗的または独立した様式にて調節するという事実により、直接または間接的に媒介される。ＡＲＣＨＥＯＮ内の機能上重要な遺伝子の順序は進化中に保存される（例えばヒト染色体１７ｑ２１上のＡＲＣＨＥＯＮはマウス染色体１１上に存在している）。さらに、１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮは、ヒト染色体３ｐ２１と１２ｑ１３上にも存在し、いずれも増幅事象および腫瘍発生に関与することが判明している。おそらくこれらの相同ＡＲＣＨＥＯＮは脊椎動物進化中に重複と再配列により形成された。相同なＡＲＣＨＥＯＮは、特定の遺伝子ファミリーの相同遺伝子および／またはアイソフォームからなる（例えばＲＡＲＡまたはＲＡＲＢまたはＲＡＲＧ、ＴＨＲＡまたはＴＨＲＢ、ＴＯＰ２ＡまたはＴＯＰ２Ｂ、ＲＡＢ５ＡまたはＲＡＢ５Ｂ、ＢＡＦ１７０またはＢＡＦ１５５、ＢＡＦ６０ＡまたはＢＡＦ６０Ｂ、ＷＮＴ５ＡまたはＷＮＴ５Ｂ、ＩＧＦＢＰ４またはＩＧＦＢＰ６）。さらにこれらの領域は相同な染色体遺伝子クラスター（例えばＣＡＣＮ、ＳＣＹＡ、ＨＯＸ、ケラチン）に隣接している。これらのＡＲＣＨＥＯＮは別の組織においてそのそれぞれの機能を満たすために進化中に分かれた（例えば、１７ｑ１２ＡＲＣＨＥＯＮは中枢神経系においてその主な機能の１つを有する）。その組織特異性機能のために、大規模な調節ループがそれぞれのＡＲＣＨＥＯＮのメンバーの発現を制御する。腫瘍発生中、これらの制御は、分化、増殖、薬剤反応性、侵襲性に関する異常組織の特性に重要になる。ＡＲＣＨＥＯＮ内の遺伝子の共増幅は、それぞれの遺伝子産物の共発現につながり得ることが見いだされた。前記遺伝子のいくつかはまた、これらのＡＲＣＨＥＯＮの発癌性に重要であるさらなる突然変異あるいは特定パターンの多型を示した。これはこのようなアンプリコンの重要な特徴の１つであり、ＡＲＣＨＥＯＮのメンバーは腫瘍形成中（たとえば増幅及び欠失事象中）に保存され、これによりこれら遺伝子が診断標識遺伝子と定義される。さらに、ＡＲＣＨＥＯＮ内のある遺伝子の発現は、ＡＲＣＨＥＯＮの他のメンバーによって影響され、これによりこれらの調節遺伝子および調節される遺伝子が治療的介入のための標的遺伝子と定義される。ＡＲＣＨＥＯＮのある特定のメンバー（例えばＴＯＰＯ２アルファ、ＲＡＲＡ、ＴＨＲＡ、ＨＥＲ−２）の発現が、薬物療法に感受性であることも観察され、これによりこれらの遺伝子が「マーカー遺伝子」と定義される。さらにいくつかの他の遺伝子は、抗体（ＣＡＣＮＢ１、ＥＢＩ１）、リガンド（ＣＡＣＮＢ１）または薬剤、たとえばキナーゼインヒビター（ＣｒｋＲＳ、ＣＤＣ６）による治療的介入に適している。ＡＲＣＨＥＯＮのメンバーの間の相互作用の次の例は、限定のためではなく例示のために提示される。
【０１２１】
ＥＢＩ１／ＣＣＲ７はＧタンパク質結合レセプターファミリーのリンパ球特異的メンバーである。ＥＢＩ１はインターロイキン−８、ＳＣＹＡ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｃ５ａ、およびｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅなどの化学誘引物質を認識する。細胞分裂の能力はリンパ球中の主としてＣＣＲ７＋サブセットに限定される。ダブルネガティブ細胞は刺激後に分裂または膨張しなかった。末梢で分化すると考えられるＣＣＲ７−細胞は、分裂しないが、インターフェロンガンマを産生し、高レベルのパーフォリンを発現する。ＥＢＩ１はエプスタイン−バー−ウイルスのようなウイルス活性により誘導される。従って、ＥＢＩ１はリンパ球における形質転換事象と関連づけられる。非リンパ組織における腫瘍形成中のＥＢＩ１の機能的役割を本発明において調べた。興味深いことに、同じゲノム領域に位置するＥＲＢＡおよびＥＲＢＢもリンパ球形質転換と関連する。さらに、そのレセプターのリガンド（すなわちＳＣＹＡ５／Ｒａｎｔｅｓ）は１７ｑゲノム上で近接する。リンパおよび非リンパ組織におけるこれら因子の両方の異常な発現は、自己調節フィードバックループを確立し、それぞれの細胞内でシグナリング事象を誘導する。リンパ系因子の発現は免疫細胞に影響を及ぼし、細胞挙動を調節する。これはリンパ球が浸潤する異常な乳房組織に関して特に興味深い。これと一致して、もう１つの免疫調節および増殖因子が１７ｑ２１上の近くに位置する。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ３）は顆粒球の先祖細胞の増殖および分化を特異的に刺激する。また、多形性グリア芽細胞腫細胞株から、膀胱細胞株から産生されたＧＣＳＦと生物学的および生化学的に識別できない刺激活性が見いだされた。コロニー刺激因子は単に免疫細胞に影響を与えるだけではなく、非免疫細胞の細胞応答も誘発し、このことから異常な発現に際して腫瘍発生に関与する可能性があることが示される。加えて、１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮのいくつかの他の遺伝子、例えばＭＬＬＴ６、ＺＮＦ１４４およびＺＮＦＮ１Ａ３が免疫細胞および／またはリンパ芽球性リンパ腫の増殖、生存、分化に関与し、このこともまた特定の細胞タイプ内の交互につながった重要なプロセスにおける遺伝子産物の関連した機能が示される。非免疫細胞における１以上のこれらの遺伝子の異常な発現は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の過剰発現のみから生じる腫瘍形成活性に寄与するシグナリング活性を構成する。
【０１２２】
ＰＰＡＲＢＰはｐ５３ファミリーの腫瘍サプレッサー遺伝子との複合体において見いだされた。さらに、ＰＰＡＲＢＰはＰＰＡＲ−アルファ（ＰＰＡＲＡ）、ＲＡＲ−アルファ（ＲＡＲＡ）、ＲＸＲ、ＴＨＲＡおよびＴＲ−ベータ−１とも結合する。甲状腺ホルモンレセプターと結合する能力により、これはＴＲＩＰ２およびＴＲＡＰ２２０と命名された。この複合体において、ＰＰＡＲＢＰは遺伝子調節活性に影響を与える。興味深いことに、ＰＰＡＲＢＰはその相互作用パートナーＴＨＲＡおよびＲＡＲＡにゲノム上で近接した位置にある。本発明者らは、腫瘍組織においてＰＰＡＲＢＰはＴＨＲＡおよびＲＡＲＡと共増幅されることを見いだした。ＴＨＲＡはＥＲＢＢとともに鳥類の赤芽球症ウイルスから単離され、従ってＥＲＢＡと命名された。ＥＲＢＡは、未熟な段階での赤芽球の分化をブロックすることにより、ＥＲＢＢを増強する。ＥＲＢＡはＥＲＢＢ発現に影響を与えることが示された。この状況において、ＴＨＲＡ遺伝子産物のＣ末端部の欠失は影響力がある。異常なＴＨＲＡ発現は非機能性脳下垂体腫瘍においても見いだされ、これはレセプターコード配列および調節配列における突然変異を反映すると仮定された。調節遺伝子の遺伝子発現を調節することにより、また代謝活性（例えば、リンゴ酸酵素などの腫瘍における代替代謝経路の重要な酵素および脂質生成に重要な遺伝子）に影響を与えることによって、ＴＨＲＡ機能は腫瘍細胞発生を促進する。観察された核レセプターの活性は、そのトランス活性化能を反映するだけではなく、リガンドの存在下または不在下での転写後活性によるものである。ＴＨＲＡ／ＥＲＢＡおよびＥＲＢＢの共増幅が示されたが、過剰発現が乳癌において示されなかったので、その腫瘍発生に対する影響は疑われている［ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら、１９８７、（７５）］。ＴＨＲＡとＲＡＲＡはその機能がモノマー、ホモダイマーあるいはヘテロダイマーとして媒介されうる核レセプターファミリーの一部である。ＲＡＲＡは広範囲の細胞の分化を調節する。ホルモンのＥＲＢＢとの相互作用が調査されている。ＲＡＲＡのリガンドは乳癌において増幅されたＥＲＢＢ遺伝子の発現を抑制することができる［Ｏｆｆｔｅｒｄｉｎｇｅｒら、１９９８、（７６）］。本発明の一部として、ＴＨＲＡとＲＡＲＡの共増幅及び共発現を示すことができる。甲状腺ホルモンレセプターおよびレチノイン酸レセプターファミリーのメンバーにより調節される多数の遺伝子は、ゲノム変化（増幅、突然変異、欠失）に対応して、腫瘍サンプルにおいて差次的に発現することが見いだされた。これらのホルモンレセプター遺伝子およびそれぞれの標的遺伝子は臨床特性に関して患者サンプルを区別するために有用である。
【０１２３】
多数の正常な組織、腫瘍サンプルおよび腫瘍細胞株の発現分析とその後に続く１７ｑ２１領域のクラスター化により、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍細胞および腫瘍サンプルの発現プロファイルは、中枢神経系由来組織の発現パターンと類似性を示すことがわかった（図２）。これは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＴＨＲＡノックアウトマウスの中枢神経系で観察された奇形と一致する。さらに、神経発生に関与する核因子であるＮＥＵＲＯＤ２は、それぞれのサンプルに共通して発現することが判明した。これにより１７ｑ２１座が「ＡＲＣＨＥＯＮ」であるとして定義され、その正常な臓器発達における本来の機能は中枢神経系に対して規定される。驚くべきことに、ＮＥＵＲＯＤ２の発現は治療の介入によって影響を受けた。極めて印象的なことには、ＺＮＦ１４４、ＴＥＭ７、ＰＩＰ５ＫおよびＰＰＰ１Ｒ１Ｂは神経細胞において発現し、多様な組織特異的機能を示す。
【０１２４】
加えて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、腫瘍の侵襲性に関与するシグナリングカスケードの下流のメンバーであるＧＲＢ７と共にしばしば共増幅される。驚くべきことに、本発明者らは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕシグナリングカスケードの別のメンバー（ＴＯＢ１（＝「ＥＲＢＢシグナリングのトランスデューサー」）が原発乳癌で過剰発現することを明らかにした。ＴＯＢ１の強力な過剰発現は、それより弱いＨｅｒ−２／ｎｅｕの過剰発現（すでに発癌性に関与することが示されている）と相関する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの増幅は、そのシグナリングカスケードの同定された下流成分（例えばＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫ）のために、増殖能増強の原因とされている。この点に関して、細胞周期依存性キナーゼであるいくつかのｃｄｃ遺伝子がこのアンプリコンの一部であり、その発現の変化が細胞周期進行に大きな影響を与えることは驚くべきことであった。
【０１２５】
１７ｑ２１と１２ｑ１３上のＡＲＣＨＥＯＮは、特定の遺伝子のアイソフォーム（例えば、ＣＡＣＮＢ１  ｖｓ．  ＣＡＣＮＢ３、ＥＲＢＢ２  ｖｓ．  ＥＲＢＢ３、ＲＡＲＡ  ｖｓ．  ＲＡＲＧ、以下参照）を有するだけでなく、ある遺伝子ファミリーの複数のアイソフォームが直列に位置して構成される完全な遺伝子クラスター、例えばケラチンおよびＨＯＸ遺伝子クラスター、に隣接することから、非常に密接に関係している。これに関して、個々のケラチンの発現はＥＧＦＲシグナリング経路によって非常に厳密に制御されていることから、ケラチンとＥＧＦＲファミリーのレセプター（すなわちＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）およびＥＲＢＢ３（Ｈｅｒ−３）が同時に存在することが特に興味深い。
【０１２６】
ケラチンは、上皮細胞において１０ｎｍの中間径フィラメントを形成する不水溶性タンパク質の群である。約３０の相異なるケラチン分子が同定されている。それらは、その相対電荷、免疫反応性、およびタイプＩおよびタイプＩＩそれぞれのウール・ケラチンに対する配列相同性にしたがい、酸性および塩基性−中性サブファミリーに分類することができる。インビボにおいて、塩基性ケラチンは通常、特定の酸性ケラチンと共発現し、ペアとなって、ヘテロダイマーを形成する。各種ケラチンペアの発現は、組織特異的であり、分化に依存し、かつ発達上調節される。特異的ケラチンペアの存在は、上皮の完全性の維持に不可欠である。腫瘍上皮においてケラチンの発現の変化が観察されており、近接する正常組織と比較して腫瘍細胞において異常なケラチン発現パターンが見られる。ヒトＫ１４／Ｋ５ペアおよびＫ１０／Ｋ１ペアにおける突然変異は、単純型表皮水疱症および表皮剥離性角質増殖症のような皮膚疾患の原因である。皮膚におけるこれらケラチンおよび他のケラチンの発現は、厳密に調節されている。例えば、Ｋ１４／Ｋ５ペアの発現は皮膚の基底細胞層に限定され、基底層直上にしか発現していないＫ１０／Ｋ１ペアとは重複しない。遺伝子発現は、レセプターチロシンキナーゼおよびセリンスレオニンキナーゼが関与する複数のシグナルリングカスケード、例えば、ＥＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ソニックヘッジホッグ、およびｗｎｔシグナリング、の相互作用により、非常に厳密にコントロールされている。さらに、翻訳後修飾、例えばセリン／スレオニンおよび／またはチロシンリン酸化事象、がケラチン機能に影響し、レセプターチロシンキナーゼシグナリングやＭＡＰＫおよびＥＲＫ活性に寄与しうる。ケラチンの翻訳後修飾は、ケラチンの溶解性を変化させるだけでなく、核機能およびシグナルリング機能にも影響する（例えば、１４−３−３タンパク質との結合後）。さらに、我々は、ケラチン発現パターンを乱す、ケラチン遺伝子クラスターのゲノム変化を観察した。
【０１２７】
さらに、異なる染色体のＡＲＣＨＥＯＮに位置し、かつ別個の分化状態におけるその細胞タイプ特異的発現が同じＡＲＣＨＥＯＮのメンバーにより調節されているケラチンの物理的相互作用は、ＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子の遺伝子相互作用の見事な例である。１２ｑ１３ＡＲＣＨＥＯＮと１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮの間の厳密な相互作用の例は、ケラチン５（塩基性ケラチン  タイプＩＩ、１２ｑ１３に位置）およびケラチン１４（酸性ケラチン  タイプＩ、１７ｑ２１に位置）の皮膚の基底層における発現および物理的相互作用であり、これは基底層直上では遮断され、ケラチン１（塩基性ケラチン  タイプＩＩ、１２ｑ１３に位置）およびケラチン１０（酸性ケラチン  タイプＩ、１７ｑ２１に位置）の発現および物理的相互作用により補填されている。多様な制御機構がこの独占的な発現を提供し、それには染色体位置決定および成長因子シグナリング活性が含まれる。興味深いことに、重要なケラチンは、様々なケラチンペアおよび特定の組織において、関連するがしかし独占的な機能を反映する秩序ある様式で染色体上に存在し、それは同じ染色体上のｈｏｘ遺伝子クラスターの構造と機能の関係と似ている。さらに、その突然変異が特定の皮膚障害をもたらすケラチン（例えば、Ｋ５およびＫ１４の突然変異は手足症候群をもたらす）は、染色体１７ｑ２１および１２ｑ１３のＡＲＣＨＥＯＮ内の良く似た位置に存在する。これら遺伝子は、皮膚組織においても増殖、分化、およびアポトーシス事象を調節する、シグナリング事象に関与する遺伝子（例えば、ＥＲＢＢおよびＲＡＲ）と近接する。例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは皮膚の基底層に特異的に発現し、そこでは、成人幹細胞またはその初期前駆細胞の非対称細胞分裂により、基底層に存在し続ける未分化娘細胞と、次第に基底直上区画に移動する分化娘細胞が生じる。この非対称細胞分裂により、皮膚組織の自己再生および細胞恒常性が保証される。これは、皮膚の生物学的機能、例えば感染性物質を含む環境ストレスに対するバリア機能に重要である。皮膚内のシグナル活性が乱れると、特定のケラチン遺伝子の突然変異を反映する遺伝病とよく似た疾患がおこる。臨床研究において、抗体処置（例えばセチュキマブ）やレセプターチロシンキナーゼを標的とする小分子阻害剤（例えばイレッサ）によりＥＧＦＲシグナル伝達を阻害すると、グレードＩ、ＩＩ、またはＩＩＩの皮膚疾患（例えば、ニキビ様発疹）となりうることが示された。本発明の一部としては、これら皮膚疾患はそれぞれの処置の副作用を反映するだけでなく治療計画の結果生じる全身性変化を例示するものであり、それにより治療物質に対する体内のシグナリングネットワークの感受性を示唆する。副作用の発生により通常治療計画は中止されるか、あるいは低減されるため、この観察は結果として治療の決定をもたらしうる。しかしながら、副作用（例えば、抗成長因子処置のもと生じる皮膚疾患）は処置に対する応答（例えば、腫瘍縮小）を示唆するので、たとえ「望ましくない」薬物応答が生じてもその処置を継続すべきであり、副作用は別途その症状を緩和する物質によって処置すべきである。発疹および手足症候群のような皮膚疾患は、所定の処置（すなわち、抗腫瘍治療）のもと���じる所定の副作用の単なる例であり、応答の相関づけに使用可能である。
【０１２８】
レセプター分子自体を阻害するのと同様にこれらシグナルカスケードの下流のメンバーを阻害すると、主に皮膚疾患（例えば、手足症候群）が起こる。驚いたことに我々は、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ−２／ｎｅｕシグナルリングを阻害する物質（例えば、セテュキマブ、イレッサ、ハーセプチン、ＲＡＦキナーゼ阻害剤など）で腫瘍細胞を処置すると、本発明に記載のＡＲＣＨＥＯＮの一部である特定のケラチンの発現が変化することを観察した。さらに、患者の腫瘍細胞におけるケラチン発現の変化は、その同じ患者の皮膚のケラチノサイトにおけるケラチン発現の変化と平行する。皮膚組織におけるケラチン発現および転写後修飾の乱れは、それぞれの処置に対する体内の成長因子シグナル伝達経路の感受性を象徴するようである。それゆえ、結果として生じる皮膚疾患は、少なくともある程度、その治療計画に対する腫瘍の応答性を示唆する。成長因子シグナルリングを標的とする物質に対する体内の応答性はまた、本発明に記載のＡＲＣＨＥＯＮ内に存在する多型および遺伝子変化（例えば、突然変異）から説明されうる。この点で特に興味深いのは、ケラチン遺伝子に存在する多型である。しかしながら、ケラチン、ケラチン関連遺伝子、および／またはケラチン基盤細胞骨格と機能的に関連する遺伝子（必ずしも記載のＡＲＣＨＥＯＮ内に存在する必要はない）における多型もまた、個々の遺伝子産物（例えば、ＩＴＧＢ４）とのそれらの物理的相互作用を考慮すれば重要である。本発明の一部としては、成長因子を標的とする処置に対する所定の腫瘍の応答性は、正常組織、例えば皮膚組織におけるシグナル伝達経路のメンバー、および増殖、分化、およびアポトーシスのマーカーである標的遺伝子の遺伝的素因と関係し、それにはケラチンおよび関連遺伝子が含まれる。この知見は、上記の遺伝子および／または遺伝子産物を含む代用組織（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅ）、例えば皮膚、血液、および他のいずれかの正常組織、の特徴決定に基づき腫瘍の応答性を予測するのに使用可能である。例えばイレッサ、ＲＡＦ−キナーゼ阻害剤、およびＥＧＦＲやＨｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗体に基づく治療に対する応答性は、皮膚のパンチ生検から（好ましくは処置前と処置後のサンプルを比較することにより）、あるいは血液サンプルから個々の患者のケラチンまたはケラチン関連遺伝子の発現パターンまたは遺伝的特徴を決定することにより、説明できる。さらに、それゆえ、このような代用組織の応答性は、腫瘍表現型および個々の処置に対する腫瘍の応答性と相関し得、それにより治療結果を予測することができる。代用組織の例は例示であり、これら限定されない。
【０１２９】
本発明のさらに別の態様として、心毒性のような望ましくない薬物応答もまた、記載されるＡＲＣＨＥＯＮの特徴から推測可能である。特に興味深いのは、１７ｑ１２−２４、１２ｑ１３、および３ｑ２１−２６に存在するＡＲＣＥＯＮである。アントラサイクリンに基づく抗癌療法は、例えばＬＶＥＦ測定により予測されうるような心毒性（例えば、拡張心筋症）をもたらすことが知られている。さらに、アントラサイクリンを事前に処置された患者は、その後のハーセプチン（商標）に基づく治療の際の心毒性事象が顕著に増加する。興味深いことに、本発明に記載のＡＲＣＨＥＯＮは、これら治療の一次標的（すなわちトポイソメラーゼおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕ）だけでなく、心筋機能を含む筋機能に重要な構造遺伝子および機能遺伝子（テレソニン（Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ）、ＰＮＭＴ、ＣＡＣＮＢ１、ＰＰＡＲＢＰ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ４）を有する。これら遺伝子は、心筋機能の中心的プロセス、例えばチロシンリン酸化、セリン／スレオニンリン酸化、カルシウム流入、調節（例えばチチン（ｔｉｔｉｎ）のような中心的構造タンパク質の調節）に関与する。さらに、これら遺伝子は、心筋に共に局在し、この組織において機能的相互作用を発揮しうる。マウスモデルにおいて、テレソニンの誤った局在化とＨｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ４、およびニューレグリンの遺伝子不活性化は、各種の抗癌剤で処置された癌患者に見られうる表現型とよく似た表現型をもたらす。望ましくない相乗的薬物応答効果が、アントラサイクリンとハーセプチン（商標）の組み合わせ療法で見られる。個々の遺伝子、ゲノム領域、および／またはＡＲＣＨＥＯＮ構造の多型およびハプロタイプの説明は、抗癌剤処置の際に心毒性を患う感受性の指標となる。先に行われた治療によりその後の処置の選択の余地がなくなるため、これは治療決定および癌治療の管理に重要である。例えば、アントラサイクリンに基づき先の処置を行った場合、心毒性（例えば拡張心筋症）が起こる可能性が排除できなければ、その後のハーセプチン（商標）の処置を除外するか、あるいは投与量を減少しうる。
【０１３０】
上記の観察により、限定ではなく例示として、以下の３ｑ２１−２６の遺伝子の例を提示する。
⇒ＷＮＴ５Ａ、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＴＨＲＢ、ＲＡＲＢ、ＴＯＰ２Ｂ、ＲＡＢ５Ｂ、ＳＭＡＲＣＣ１（ＢＡＦ１５５）、ＲＡＦ、ＷＮＴ７Ａ
１２ｑ１３の遺伝子の次の例は、限定ではなく例示のために提示される。
⇒ＣＡＣＮＢ３、ケラチン、ＥＲＢＢ３，ＮＲ４Ａ１、ＲＡＢ５／１３、ＲＡＲＧ、ＳＴＡＴ６、ＷＮＴ１０Ｂ、（ＧＣＮ５）、（ＳＡＳ：肉腫増幅配列）、ＳＭＡＲＣＣ２（ＢＡＦ１７０）、ＳＭＡＲＣＤ１（ＢＡＦ６０Ａ）、（ＧＡＳ４１：神経膠腫増幅配列）、（ＣＨＯＰ）、Ｈｅｒ３、ＫＲＴＨＢ、ＨＯＸＣ、ＩＧＦＢＰ６、ＷＮＴ５Ｂ
【０１３１】
上記の増幅されたＡＲＣＨＥＯＮ間にはクロストークがあり、いくつかの他の高度に増幅されたゲノム領域がおよそ１ｐ１３、１ｑ３２、２ｐ１６、２ｑ２１、３ｐ１２、５ｐ１３、６ｐ１２、７ｐ１２、７ｑ２１、８ｑ２３、１１ｑ１３、１３ｑ１２、１９ｑ１３、２０ｑ１３および２１ｑ１１の位置にある。増幅された領域はこれらの染色体位置で更に大きいおよび／または重複した位置におよぶので、前記染色体領域は限定ではなく例示である。
【０１３２】
前記染色体位置の非転写遺伝子、偽遺伝子または遺伝子間領域のさらなる変化は、悪性腫瘍、特に乳癌の予測、診断、予後予測、予防および処置のために測定することができる。これら遺伝子あるいはゲノム領域のいくつかはＡＲＣＨＥＯＮのメンバーまたは別の染色体領域の中の遺伝子に直接影響しないが、それでも染色体上で機能的に重要な遺伝子の近傍に位置することから、マーカー遺伝子機能を保持する（例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子に隣接しているテレソニン）。
【０１３３】
１７ｑ２１Ａｒｃｈｅｏｎの一部である遺伝子とハーセプチン処置に対する応答との臨床的関連
ハーセプチン、ドセタキセル、パクリタキセル、タキソテール、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ビノレルビン、タモキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、タモキシフェン、エピルビシン、ドキソルビシンおよびＣＭＦを処置された患者の臨床サンプルを得た。ネオアジュバント療法およびアジュバント療法をうけた患者から原発腫瘍組織とリンパ節組織を得た。さらに、一部の患者において一次療法および二次療法の生検物を転移性病変より得た。これらサンプルには、各患者の原発腫瘍および転移病巣から得たホルマリン固定パラフィン包埋物または新鮮組織が含まれた。さらに、全血、血清、および血漿サンプルが解析に含まれた。
【０１３４】
化学療法（例えば、ドセタキセル、タキソテール、パクリタキセル、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン）または以下に記載する他の治療と組み合わせたハーセプチンに対する応答について、臨床情報、例えば組織学的パラメーター（ＴＮＭステージ、ＡＪＣＣグレード）、標準的分子マーカー（エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するＩＨＣ染色）および超音波または放射線評価（例えば、ＣＴ）に基づき、マルチパラメトリックな臨床評価を行った。組み合わせ療法に加えて、単剤療法から得たサンプルも評価した。処置に対する応答は、国際的基準にしたがい評価した。ＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルで解析した。ＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子は、染色体内または染色体外の参照遺伝子（例えば以下の実施例３参照）により、あるいは様々な発現レベルのハウスキーピング遺伝子により標準化した。
【０１３５】
ＡＲＣＨＥＯＮの特定の領域は、ハーセプチンに基づく治療に対する応答に有用な情報を与えると言うことができた。以下に記載するように、ＡＲＣＨＥＯＮの中心に位置する遺伝子（例えば、１７ｑ２１  ＡＲＣＨＥＯＮにおけるＨｅｒ−２／ｎｅｕ）との関係において個々の染色体のセントロメアまたはテロメア方向に位置する遺伝子を、以下それぞれ「セントロメリック（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）」および「テロメリック（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）」と呼ぶ。ハーセプチンに基づく処置に対する応答に関し特に興味深いのは、１７ｑ２１上のＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子座からセントロメリックな遺伝子である。このセントロメリックなＡＲＣＨＥＯＮ領域の完全性は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍の表現型に重要である。ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＦＬＪ２０２９１、ＭＬＮ５０、ＴＥＭ７、ＣＡＣＮＢ１、ＲＰＬ１９、ＭＧＣ１５４８２、ＰＰＡＲＢＰ、ＣｒｋＲＳの染色体領域における遺伝子変化は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性乳癌の臨床成績に重要である。特に興味深いのは、遺伝子ＴＥＭ７、ＣＡＣＮＢ１、ＣｒｋＲＳ、およびＰＰＡＲＢＰに近接する、１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮのセントロメリックな切断点領域である。他のＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍および／または正常組織対照と比較してＴＥＭ７、ＣＡＣＮＢ１、ＣｒｋＲＳ、およびＰＰＡＲＢＰの遺伝子コピー数が上昇したＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍は、臨床成績がより悪く、ハーセプチンに基づく処置に対する応答が弱い。この領域内の遺伝子は、細胞生存メカニズムの基礎をなすカルシウムおよびイノシトールシグナリングに関与する（例えば、ＣＡＣＮＢ１、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、およびＰＩＰ５Ｋ２Ｂ）。ＣｒｋＲＳの過剰発現は、そのキナーゼ活性がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体を調節するので、腫瘍の表現型に重要である。特に、Ｃ末ドメインおよびその結合成分のリン酸化は、酵素複合体の全体的活性に影響するだけでなく、腫瘍細胞増殖についての重要性が示されている遺伝子産物に影響し、その遺伝子産物の幾つかはＡＲＣＨＥＯＮの一部である（例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦの成分であるＳＭＡＲＣ、例えばＳＭＡＲＣＣ２は、ＲＢ仲介腫瘍抑制に重要である）。ＳＭＡＲＣのリン酸化は、細胞周期進行中厳密に調節されており、ＳＭＡＲＣの生物学的機能に影響する（活性、安定性および細胞内局在に対する影響）。ＣｒｋＲＳによるＲＮＡポリメラーゼホロ酵素複合体のリン酸化の変化は、それゆえ、細胞周期進行に影響する可能性が高い。さらに、ＴＥＭはもともと腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ；上記参照）として同定されたものだが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍のサブクラスにおいて上昇していることが明らかとなったその発現異常は、腫瘍と内皮細胞の間の強力な相互作用を指摘するものであり、そのような相互作用は血管内侵入または血管外遊出のような転移過程における個々の腫瘍細胞のより攻撃的な挙動をもたらす。驚いたことに、この領域の遺伝子、すなわちＺＮＦ１４４、ＴＥＭ７、ＰＩＰ５Ｋ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、およびＣＡＣＮＢ１は全て、中枢神経系において生理機能を有する。それゆえ我々は、「神経的環境」がこれら遺伝子を過剰発現する腫瘍細胞にとって好ましく、これら特定の腫瘍細胞の増殖および生存に���利に働くと強く推測する。このことと一致して、ハーセプチン抵抗性転移が脳で頻繁に生じることが観察される。これまで議論されている限りでは、この観察から血液脳関門に関する医薬のバイオアベイラビィリティのような毒物学的問題が言及されている。本発明の一部として、通常神経細胞に発現する遺伝子が、染色体１７ｑ２１上のＡＲＣＨＥＯＮのセントロメリックな遺伝子クラスターに不可欠な部分であり、かつハーセプチンに基づく処置に対する新規かつ後天的な抵抗性に関与する。個々の増幅単位および／または染色体切断によるこのセントロメリックなクラスターの特異な遺伝子の欠失は、このゲノム領域の持続および抵抗機能の妨げとなる。それゆえ、増幅単位の連続性は、治療に対する応答または非応答に関する別の重要な特徴である。注目すべきは、このゲノム領域に特定の遺伝子だけでなく調節エレメントも存在することが前述の生物学的表現型に寄与するということである。それゆえ、ＡＲＣＨＥＯＮのセントロメリックな部分内の調節エレメントの喪失または獲得もまた抗癌処置に対する抵抗性に重要であり、したがって本発明の一部である。
【０１３６】
セントロメリックなＡＲＣＨＥＯＮ領域の変化に加えて、テロメリックな領域に関するＡＲＣＨＥＯＮの全長および増幅遺伝子の相対的な遺伝子コピー数が重要である。特に、ＴＯＰ２α遺伝子およびその周辺遺伝子ＴＨＲＡ、ＮＲ１Ｄ１、ＭＬＮ５１、ＷＩＲＥ、ＨｓＣＤＣ６、ＲＡＲＡ、ＣＴＥＮ、ＩＧＦＢＰ４、ＥＢＩ１およびＳＭＡＲＣＥ１を有するゲノム領域の完全性は興味深い。これら遺伝子少なくとも一部が欠失しているＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍は、ハーセプチンに基づく化学療法に対する応答が悪化している。このことは、この領域がアントラサイクリンに基づく治療に対する予後予測的価値を有するだけでなく、タキソール関連物質および白金塩による化学療法に対する予後予測的価値を有することを示す。このテロメリックな領域の増幅、欠失またはサイレンシングは、上記の化学療法薬に対する感受性の変化を伴う。これは、（１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮの遺伝子発現および／または増幅に関して）変化を有する腫瘍の一般的特徴であり、乳癌だけにあてはまるものではない。このことと一致して、我々は、１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮに変化を有する卵巣腫瘍を解析し、上記と同様に評価した臨床成績を白金塩に基づく治療に対して相関させた。驚いたことに、このテロメリックな領域内に明確な遺伝子パターンを有する腫瘍は、この化学療法計画に抵抗性を示さなかった。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕとＴＯＰ２αの共増幅だけを検出することは、詳細な特徴決定としての応答予測およびその後のＴＨＲＡ、ＮＲ１Ｄ１、ＭＬＮ５１、ＷＩＲＥ、ＨｓＣＤＣ６、およびＲＡＲＡ遺伝子の領域との応答の相関づけに関して有益でなかった。本発明の一部として、腫瘍の増殖状態はＡＲＣＨＥＯＮ領域内の遺伝子に影響される。１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮは、少なくともある程度、腫瘍細胞の増殖速度を決定する。興味深いことに、テロメリックな領域の幾つかの遺伝子（すなわちＴＯＰ２α、ＨｓＣＤＣ６）を除きレベルが上昇している遺伝子の数がより限られているＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍は、増殖速度が比較的遅く、このことが増殖細胞を標的とする化学療法薬の効果を減少させ、その物質に対するこれら腫瘍の抵抗性の理由の１つとなっている。そのかわり、これら腫瘍は侵襲性に関する能力が高く、さらにアポトーシス速度が減少しており、このことから、ＧＲＢ７およびＡＫＴキナーゼをそれぞれ介するＨｅｒ−２／ｎｅｕシグナル伝達（イノシトールおよびカルシウムによっても影響される、前述）がある程度言及される。ＡＲＣＨＥＯＮのテロメリックな領域内の幾つかの遺伝子は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕシグナリング、例えばＲＡＲＡ、ＴＨＲＡ、ＩＧＦＢＰ４に影響し、増殖状態を含む細胞の個々の特徴を変化させる。
【０１３７】
本発明の一部であるＡＲＣＨＥＯＮは、ＥＧＦＲシグナリングおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕシグナリングに対する抗体（例えば、ハーセプチン、２Ｃ４、またはセテュキマブ療法）に基づく治療や化学療法薬に対する腫瘍の臨床応答に重要なだけでなく、様々な抗ホルモン療法（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、ファスロデックス（ｆａｓｌｏｄｅｘ））の方法にも重要である。特に、ＰＰＡＲＢＰ遺伝子およびタンパク質のレベルの増加、およびＴＨＲＡ、ＮＲ１Ｄ１、およびＲＡＲＡを有する１７ｑ２１ＡＲＣＨＥＯＮのテロメリックなホルモンレセプター領域、あるいは他のＡＲＣＨＥＯＮ上の関連領域の完全性は、これら治療計画に重要である。タモキシフェンによる乳癌のアジュバント療法について上記の臨床パラメーターを評価する遡及的臨床研究において、我々は、ＰＰＡＲＢＰの過剰発現がこの治療を受けている患者の全体的生存率に影響することを観察した。ＰＰＡＲＢＰの過剰発現は、エストロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプターを結合リガンドによらず活性化することができる。それゆえ、ＰＰＡＲＢＰの脱調節は、ホルモンの非存在下において、さらに抗ホルモン物質の存在下においてさえも、これらホルモンレセプターの活性化をもたらし、それにより抗ホルモン療法の抗腫瘍効果を損ない、結果としてＰＰＡＲＢＰ過剰発現細胞が抵抗性となる。さらに、腫瘍細胞におけるエストロゲンレセプター以外のホルモンレセプターの過剰発現は、エストロゲンの活性に、あるいはＲＸＲのような二量体化パートナーまたはＣＢＰまたはＮＣＯＲのような転写アクチベーターまたはリプレッサー遺伝子と競合する個々の抗ホルモン物質の活性に影響する。タモキシフェン療法に関しては、タモキシフェンの古典的作用様式により核内の転写補助因子のプールが減少するので、明らかに抗ホルモン物質効果が減少する。
【０１３８】
本発明はさらに：
Ａ）配列番号１〜２６または５３〜７５の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチド；
Ｂ）表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を示すポリペプチドをコードする（ａ）で特定したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
Ｃ）表２または３のそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を示すポリペプチドをコードする遺伝コードが生成するように（遺伝コードの縮重により）、その配列が（ａ）および（ｂ）で特定されるポリヌクレオチドから逸脱しているポリヌクレオチド；
Ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチド；
Ｅ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列の１つを特異的に標的とするアンチセンス分子；
Ｆ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドによりコードされる精製ポリペプチド；
Ｇ）配列番号２７〜５２または７６〜９８の配列の少なくとも１つを含む精製ポリペプチド；
Ｈ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたは（ｆ）および（ｇ）において特定されるポリペプチドの一つと結合できる抗体；
Ｉ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたは（ｆ）および（ｇ）において特定されるポリペプチドの量または活性を調節する請求項１４から１６の方法のいずれかにより同定される試薬
の、悪性腫瘍、特に乳癌の予防、予測、診断、予後予測のための組成物または処置のための医薬の調製における使用に関する。
【０１３９】
ポリヌクレオチド
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのコード配列またはそのコード配列の相補体を含む。ヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに配列番号１〜２６または５３〜７５のヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％の同一性を有する相同なヌクレオチド配列も、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドの配列間の配列同一性（％）は、ギャップオープンペナルティー−１２で、ギャップエクステンションペナルティー−２のアフィンギャップ検索を用いて、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するＡＬＩＧＮなどのコンピューター・プログラムを用いて決定される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、相同な種、および生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの変異体も「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。
【０１４０】
ポリヌクレオチドの調製
天然に存在する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、他の細胞成分、たとえば、膜成分、タンパク質、および脂質を含まないで単離できる。ポリヌクレオチドは細胞に作らせて、標準的核酸精製技術を使って単離するか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を使って、または自動合成器を用いて合成することができる。ポリヌクレオチドを単離するための方法は慣例どおりであって、当該分野において公知である。ポリヌクレオチドを得るためのこのような技術いずれも、単離「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを得るために用いることができる。例えば、制限酵素およびプローブを「乳癌遺伝子」ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離するために用いることができる。単離ポリヌクレオチドは、他の分子を全く、または少なくとも７０、８０、または９０％含まない。
【０１４１】
「乳癌遺伝子」ｃＤＮＡ分子は、「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡを鋳型として使用して、標準的分子生物学的技術で作ることができる。ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術をこのようなＲＮＡサンプルの精製のために用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、（７７）；およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ・Ｍ．ら、１９８９、（７８）（両方ともが出典明示により本発明の一部とされる）参照。さらに、たとえばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５）（出典明示によりその全体を本発明の一部とする）のシングルステップＲＮＡ単離法などの当業者に周知の技術を用いて多数の組織サンプルを処理できる。
【０１４２】
「乳癌遺伝子」ｃＤＮＡ分子はその後当該分野において知られる、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（７７）などのマニュアルに開示されている分子生物学的技術を使って複製できる。ＰＣＲなどの増幅技術を用いて、ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して、本発明のポリヌクレオチドのさらなるコピーを得ることができる。
【０１４３】
別法として、合成化学技術を、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを合成するために用いることができる。遺伝コードの縮重により、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはその生物学的に活性なその変異体をコードする別のヌクレオチド配列を合成することが可能になる。
【０１４４】
差次的発現の同定
当業者らによく知られている様々な方法を利用することにより、差次的に発現した遺伝子により産生されたＲＮＡにあたる収集ＲＮＡサンプル中の転写物を同定できる。例えば、ディファレンシャルスクリーニング［Ｔｅｄｄｅｒ、Ｔ・Ｆ．ら、１９８８、（７９）］、サブトラクティブハイブリダイゼーション［Ｈｅｄｒｉｃｋ、Ｓ・Ｍ．ら、１９８４、（８０）；Ｌｅｅ、Ｓ・Ｗ．ら、１９８４、（８１）］、および好ましくは、ディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ、Ｐ．およびＰａｒｄｅｅ、Ａ・Ｂ．、１９９３、米国特許第５，２６２，３１１号、その全体を出典明示により本発明の一部とする）を差次的に発現する遺伝子から得られるポリヌクレオチド同定を識別するために利用できる。
【０１４５】
ディファレンシャルスクリーニングは、ｃＤＮＡライブラリーの複製スクリーニングを含み、そこではライブラリーの１コピーをある細胞タイプのｍＲＮＡ集団に対応する全細胞ｃＤＮＡプローブについてスクリーニングし、一方、そのｃＤＮＡライブラリーの複製コピーを第二の細胞タイプのｍＲＮＡ集団に対応する全ｃＤＮＡプローブに関してスクリーニングする。例えば、一方のｃＤＮＡプローブは対照から得られる細胞タイプの全細胞ｃＤＮＡプローブに対応し、第二のｃＤＮＡプローブは実験対象から得られる同じ細胞タイプの全細胞ｃＤＮＡプローブに対応する。一方のプローブにハイブリダイズするが他方とはハイブリダイズしないクローンは、興味のある細胞タイプにおける遺伝子から得られる実験対象と対照の間で差次的に発現するクローンの代表である。
【０１４６】
サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は一般に２つの異なった供給源、たとえば対照および実験組織、からのｍＲＮＡの単離、ｍＲＮＡまたは単離ｍＲＮＡから逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、および全てのハイブリッドの除去、つまり二本鎖になった配列の除去を含む。残存するハイブリダイズされていない一本鎖ｃＤＮＡは、２つのｍＲＮＡ供給源において差次的に発現する遺伝子から得られるクローンを表す。このような一本鎖ｃＤＮＡは、次いで、差次的に発現する遺伝子から得られるクローンを含むライブラリーの構築用出発物質として用いられる。
【０１４７】
ディファレンシャルディスプレイ技術は、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ．Ｂ．、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載された実施例）を用いる方法であり、差次的に発現する遺伝子から得られる配列の同定を可能にする。最初に、単離ＲＮＡを当業者に周知の標準的技術を用いて一本鎖ｃＤＮＡ中に逆転写する。逆転写酵素反応のプライマーは、これらに限定されるわけではないが、オリゴｄＴ含有プライマー、好ましくは後述のリバースプライマータイプのオリゴヌクレオチドを包含する。次に、後述するように、この技術はＰＣＲプライマーペアを使い、これによりいずれかの所定の細胞内に存在するＲＮＡ転写物のランダムなサブセットを代表するクローンの増幅が可能になる。このような増幅された転写物のうち、差次的に発現する遺伝子から産生されるものを同定することができる。
【０１４８】
プライマーペアのリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端に、好ましくは１１ヌクレオチド長の、ヌクレオチドのオリゴｄＴ鎖を含んでもよく、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールまたはｍＲＮＡポリ（Ａ）テールから逆転写されたｃＤＮＡ相補体にハイブリダイズする。第二に、リバースプライマーの特異性を増大させるために、プライマーは１以上、好ましくは２つのさらなるヌクレオチドをその３’末端に含んでもよい。統計的に、対象とするサンプル中に存在するｍＲＮＡ由来の配列のあるサブセットのみがこのようなプライマーにハイブリダイズするので、さらなるヌクレオチドにより、プライマーは対象とするサンプルに存在するｍＲＮＡ由来の配列のサブセットのみを増幅させる。これにより増幅された配列を表す各バンドの更に正確で完全な可視化とキャラクタライゼーションが可能になる点で、これは好ましい。
【０１４９】
フォワードプライマーは、対象とする組織から得られるｃＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有すると統計学的に考えられるヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は任意のものであってよく、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーの長さは約９から約１３ヌクレオチドの範囲であり、約１０ヌクレオチドが好ましい。任意のプライマー配列に産生される増幅された部分的ｃＤＮＡの長さが多様となり、標準的変性シーケンシングゲル電気泳動を用いることにより相異なるクローンを分離できる。増幅産物の収率および特異性を最適にするＰＣＲ反応条件を選択し、さらに標準的ゲル電気泳動技術を用いて解析できる長さの増幅産物を産生する。このような反応条件は当業者らにはよく知られており、重要な反応パラメータには、たとえば、前記のオリゴヌクレオチドプライマーの長さとヌクレオチド配列、およびアニーリングおよび延長段階温度および反応時間が含まれる。２つの異なる細胞タイプのｍＲＮＡの逆転写および増幅から得られるクローンのパターンは、シーケンシングゲル電気泳動により表示され、比較される。２つのバンドパターンは、差次的に発現する可能性のある遺伝子を示す。
【０１５０】
標準的な長さの完全長ｃＤＮＡについてスクリーニングする場合、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリーを用いるのが好ましい。ランダムにプライムされたライブラリーは、遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含む点で好ましい。ランダムにプライムされたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーから完全長ｃＤＮＡが生じない場合に特に好ましい。ゲノムライブラリーは５’非転写調節領域へと配列を伸長するために有用である。
【０１５１】
商業的に入手可能なキャピラリー電気泳動システムを、大きさを分析するか、またはＰＣＲまたはシークエンス産物のヌクレオチド配列を確認するために用いることができる。例えば、キャピラリーシーケンシングは、電気泳動分離用の流動可能なポリマー、レーザーで活性化される４つの異なる蛍光色素（それぞれのヌクレオチドについて一つ）、および電荷結合素子カメラによる発光波長の検出を用いることができる。アウトプット／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲとＳｅｑｕｅｎｃｅＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；ＡＢＩ）、を用いて電気信号に変換でき、サンプルのローディングからコンピューター分析までの全プロセスおよび電子データ表示はコンピューター制御できる。キャピラリー電気泳動は、特定のサンプル中に限られた量しか存在しないＤＮＡの小片のシーケンシングに特に好ましい。
【０１５２】
差次的に発現する可能性のある遺伝子配列を、例えば、前記のもののようなバルク技術により同定したら、その後このような推定上の差次的発現遺伝子を確認すべきである。確認は、例えばノザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲのようなよく知られている技術によって達成することができる。確認の際、差次的に発現する遺伝子をさらに特徴決定し、後述する標的および／またはマーカー遺伝子として同定することができる。
【０１５３】
また、例えばディファレンシャルディスプレイにより得られる差次的発現遺伝子の増幅された配列は、対応する遺伝子の完全長クローンを単離するために用いることができる。遺伝子の完全長コード部分は当該分野においてよく知られた分子生物学的技術により過度の実験を行うことなく容易に単離できる。例えば、単離された差次的発現増幅断片を標識し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。別法として、標識された断片を、ゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。
【０１５４】
同定された遺伝子により産生されたｍＲＮＡの組織分布の分析は、当業者に周知の標準的技術を用いて行うことができる。このような技術には、例えば、ノザン分析およびＲＴ−ＰＣＲが含まれる。このような分析は、同定された遺伝子が乳癌に寄与すると予想される組織において発現するかどうかについての情報を提供する。このような分析はまた、定常状態のｍＲＮＡ調節に関する定量的情報を提供し、どの同定された遺伝子が、好ましくは乳癌に寄与することを予想される組織において、高レベルの調節を示すかに関するデータを生み出す。
【０１５５】
このような分析は、所定の組織から得られる特定の細胞タイプの単離細胞集団に対して行うことができる。加えて、所定の組織内のどの細胞が同定された遺伝子を発現するかに関する情報を提供するために、標準的インサイチュハイブリダイゼーション技術を用いることができる。このような分析は、組織内のある細胞サブセットのみが乳癌に関連すると考えられる場合に、乳癌に対する同定された遺伝子の生物学的機能に関する情報を提供する。
【０１５６】
共増幅された遺伝子の同定
ゲノム変化（増幅、挿入、転座、欠失など）に関与する遺伝子がデータベース分析と組み合わせたＰＣＲに基づく染色体分析によって同定される。特に興味深いのは、細胞あたりの遺伝子コピー数が２より多いことを説明する遺伝子増幅である。それぞれの遺伝子の遺伝子コピー数と遺伝子発現はしばしば相関する。したがって、遺伝子増幅のために共に過剰発現する遺伝子のクラスターを、ＤＮＡチップ技術または定量的ＲＴＰＣＲによる発現分析によって同定することができる。例えば、遺伝子コピー数の増大または減少により変化した遺伝子の発現は、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘからのＧｅｎｅＡｒｒａｙ（商標）技術またはＴａｑＭａｎまたはｉＣｙｃｌｅｒシステムを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。さらにＲＮＡのＤＮＡとの組み合わせ解析により、組織または単一細胞サンプルにおいて様々な長さの多数のゲノム領域を高度に平行化および自動化して、高解像度にて特徴決定することが可能である。さらに、これら分析は標的遺伝子の遺伝子コピー数に対する遺伝子転写の相関を可能にする。必ずしも発現レベルと遺伝子コピー数が線形相関関係にあるわけではなく、またある特定の遺伝子クラスターにおいては相乗的または拮抗的効果があるので、ＲＮＡレベルの同定がより容易であり、特に腫瘍組織における変化の生物学的結果に関してより適切であろう。
【０１５７】
悪性腫瘍における共増幅された遺伝子の検出
染色体の変化は一般にＦＩＳＨ（＝蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）およびＣＧＨ（＝比較ゲノムハイブリダイゼーション）により検出される。ゲノム領域の定量化のために遺伝子または遺伝子間領域を使用することができる。このような定量化により、多数の遺伝子の相互の相対的存在量が測定される（例えば標的遺伝子とセントロメリックな領域またはハウスキーピング遺伝子）。相対的存在量の変化は、パラフィン包埋物質において、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの抽出後でも検出できる。ゲノムＤＮＡの測定は、ＤＮＡの安定性のためＲＮＡ分析と比較して有利であり、これが遡及的研究の可能性を説明でき、多数の内部対照（変化、増幅、または欠失していない遺伝子）を提供する。さらに、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は、遺伝子間の非常に可変的な領域またはＳＮＰ（＝一塩基多型）、ＲＦＬＰ、ＶＮＴＲおよびＳＴＲ（一般的な多型マーカー）の組み合わせを調査するのに有利である。所定のゲノム領域内のＳＮＰまたは多型マーカーの決定（例えば「Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）」によるＳＮＰ分析）はゲノム変化による表現型に影響を与える。例えば、増幅された対立遺伝子の一部である遺伝子の生物学的能力を特徴決定するために多型またはハプロタイプの組み合わせを決定することは有利である。遺伝子の切断点領域、コード領域または調節領域あるいは遺伝子間領域における多型マーカーが特に重要である。所定の生物学的または臨床結果について予測されるハプロタイプを決定することにより、患者からの非腫瘍サンプルを用いて診断および予後予測分析を確立することが可能である。好ましくは１つの対立遺伝子または両対立遺伝子が同程度まで増幅（＝線形または非線形増幅）されるかどうかによってハプロタイプを決定できる。例えばある患者の正常組織、体液または生物学的サンプルから単離された核酸におけるヘテロ接合性多型マーカーの組み合わせは、そのちょうど同じ患者の腫瘍組織ではホモ接合性になるので、遺伝子増幅を有する細胞または組織における特定の多型マーカー組み合わせの過剰発現は、ハプロタイプ決定を容易にする。この「ホモ接合性の獲得」は、増幅事象により変化したゲノム領域の測定に対応し、例えば発癌性または成長促進活性をもたらすような腫瘍における「機能獲得」的変化の同定に適している。対照的に、「ヘテロ接合性の喪失」の検出は、発癌性を抑制して、細胞の成長プロセスを下方調節する癌抑制遺伝子、ゲートキーパー遺伝子またはチェックポイント遺伝子の同定に用いられる。この内在的相違は、腫瘍発生のためのそれぞれのゲノム領域の影響に明らかに反し、本発明において開示された「ホモ接合性の獲得」測定の重要性を強調する。ＳＮＰに関する分析に加えて、ＶＮＴＲ検出に基づく血液白血球ＤＮＡと腫瘍ＤＮＡの比較法により、前述のＡＲＣＨＥＯＮの存在を解明できる。１７ｑ１１−２１のＡＲＣＨＥＯＮの検出に最も適したＳＮＰおよびＶＮＴＲ配列およびプライマーセットを表４および表６に記載する。このような多型マーカーの検出、定量化およびサイズ決定は当業者らに公知の方法によって達成できる。本発明のある態様において、本発明者はＰＣＲ増幅とキャピラリー電気泳動による記載されたＶＮＴＲ（表６）のいずれかの量と大きさの比較を開示する。ＰＣＲは、標準的プロトコルによって線形増幅範囲（少ないサイクル数）において有利に実行でき、ＣＥによる検出は供給元プロトコル（例えばＡｇｉｌｅｎｔ）によって実行されるべきである。さらに有利には、表６に記載されるＶＮＴＲの検出は、さまざまな標識されたプライマー（例えば、蛍光、放射性、生物活性）および適当なＣＥ検出システム（例えばＡＢＩ３１０）を利用して多様な方法で実行できる。しかしながら、検出は、単色ＤＮＡ染色を用いる高度に濃縮されたアガロースまたはポリアクリルアミドからなるスラブゲル上でも行うことができる。解像度の向上は、適当なプライマーデザインおよび長さの多様性により達成でき、多重ＰＣＲにおいて最良の結果が得られる。
【０１５８】
遺伝子の転写活性に対して影響を与える、変化したゲノム領域内でＤＮＡの共有結合修飾（例えばメチル化）または関連クロマチンの共有結合修飾（例えば関連タンパクのアセチル化またはメチル化）を決定することも重要である。一般に、これらの技術は、多数の短い配列（６０−３００ｂｐ）を測定することにより、ＦＩＳＨ分析法のような従来の方法（２−１００のｋｂ）によって得ることができない標的領域の高分解能分析が可能になる。さらにＰＣＲに基づくＤＮＡ分析技術は、感度、特異性、多重性、時間消費量と必要とされる患者サンプルの量が少ないことに関して利点を提供する。これらの技術は分析のためにさらに純粋な出発物質を得るための顕微手術またはマクロ解剖と組み合わせることにより最適化できる。
【０１５９】
ポリヌクレオチドの伸長
完全長遺伝子配列の同定およびクローニングのためのこのような手順のある態様において、ＲＮＡは、適当な組織または細胞供給源から標準的手順に従って単離できる。次いで、第一鎖合成のプライミングのために、増幅された断片に対応するｍＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＮＡに関して逆転写反応を行えばよい。プライマーはｍＲＮＡに対して逆平行性であるので、伸長はｍＲＮＡの５’末端へ向かって進行する。結果として得られるＲＮＡハイブリッドに、次いで標準的末端トランスフエラーゼ反応を使用して末端にグアニンを付加し、ハイブリッドをＲＮＡ分解酵素Ｈで消化し、次いで第二鎖合成をポリＣプライマーで開始させることができる。これら２つのプライマーを使うと、遺伝子の５’部分がＰＣＲにより増幅される。得られた配列を次いで単離し、あらかじめ単離された配列と再結合させて、本発明の差次的発現遺伝子の完全長ｃＤＮＡを生じさせる。クローニング法および組換えＤＮＡ技術の論評については、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（７７）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（７８）参照。
【０１６０】
種々のＰＣＲに基づく方法を使用し、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列を拡張して、プロモーターや調節エレメントなどの上流配列を検出することができる。例えば、制限酵素切断部位ＰＣＲは、公知の遺伝子座［Ｓａｒｋａｒ、１９９３、（８２）］に隣接する未知の配列を修復するためにユニバーサルプライマーを使用する。ゲノムＤＮＡをまずリンカー配列に対するプライマーおよび公知領域に対して特異的なプライマーの存在下で増幅させる。増幅された配列を次いで同じリンカープライマーおよびはじめのプライマーより内側の別の特異的プライマーを用いるＰＣＲの第二ラウンドに供する。ＰＣＲの各ラウンドの生成物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
【０１６１】
インバースＰＣＲを、公知領域に基づく多種多様なプライマーを使って配列を増幅または延長することができる［Ｔｒｉｇｌｉａら、１９８８、（８３）］。プライマーは、ＯＬＩＧＯ４．０６Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、Ｍｉｎｎ．）のような、商業的に入手可能なソフトウェアを使って、例えば２２３０ヌクレオチドの長さであり、５０％以上のＧＣ含有率を有し、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニールするように設計できる。この方法は遺伝子の公知領域において適当な断片を生成するためにいくつかの制限酵素を使う。断片は次に分子内ライゲーションによって環状化されて、ＰＣＲ鋳型として使用される。
【０１６２】
使用できるもう１つの方法はキャプチャーＰＣＲであり、これはヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡにおいて既知の配列に隣接しているＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む［Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、１９９１、（８４）］。この方法において、多数の制限酵素消化およびライゲーションはまた、ＰＣＲを行なう前にＤＮＡ分子の未知の断片中に二本鎖配列を組み込むために使用できる。
【０１６３】
加えて、ＰＣＲ、ネステッドプライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使ってゲノムＤＮＡ上を歩行することができる（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要を回避し、イントロン／エキソンジャンクションを見いだすことにおいて有用である。
【０１６４】
同定された遺伝子の配列は、標準的技術を利用して、遺伝子マップ、たとえばマウス［Ｃｏｐｅｌａｎｄ＆Ｊｅｎｋｉｎｓ、１９９１、（８５）］およびヒト遺伝子マップ［コーエンら、１９９３、（８６）］上に遺伝子を配置するために用いることができる。このようなマッピング情報は、例えば、既知の乳癌遺伝傾向がマップされる遺伝子領域の近くにマップされる遺伝子を同定することにより、ヒトの疾患に対する遺伝子の重要性に関する情報をもたらす。
【０１６５】
ポリヌクレオチド変異体およびホモログまたはスプライス変異体の同定
前記の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの変異体およびホモログもまた、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。典型的には、相同な「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下における公知「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドとの候補ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより同定できる。例えば、次の洗浄条件：２ＸＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％のＳＤＳ、室温で２回、それぞれ３０分；次いで２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０ＥＣ、３０分；次いで２ＸＳＳＣ、室温で２回、１０分、を使用して、最大で約２５〜３０％塩基対ミスマッチを含むそれぞれの相同配列を同定することができる。さらに好ましくは、相同なポリヌクレオチド鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを含み、さらにいっそう好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含んでいる。
【０１６６】
適当なプローブまたはプライマーを作成し、マウス、サル、または酵母菌などの他の種からのｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明において開示される「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのホモログを同定できる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのヒト変異体は、たとえば、ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％減少するのに対して１〜１．５℃低下することはよく知られている［Ｂｏｎｎｅｒら、１９７３、（８７）］。ヒト「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド変異体または他の種の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、推定の相同「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを配列番号１〜２６または５３〜７５の配列またはその相補体のいずれかのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズさせて、テストハイブリッドを形成することにより同定できる。テストハイブリッドの融点は、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融点と比較され、テストハイブリッドの中の塩基対のミスマッチの数またはパーセントが計算される。
【０１６７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件の後に、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当該分野において周知であり、かつ理解され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（７７）において開示されている。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件について、温度と塩濃度の組み合わせを選択しなければならず、すなわち、研究対象のハイブリッドのＴｍ計算値の約１２−２０℃下である。配列番号１〜２６または５３〜７５の配列の一つのヌクレオチド配列またはその相補体を有する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドとこれらのヌクレオチド配列の一つと少なくとも約５０、好ましくは７５、９０、９６、または９８％の同一性を有するポリヌクレオチド配列間のハイブリッドのＴｍは、たとえば、下記の式を用いて計算できる［ＢｏｌｔｏｎとＭｃＣａｒｔｈｙ、１９６２、（８８）：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）
（式中、ｌ＝ハイブリッドの長さ（塩基対）である。）
【０１６８】
ストリンジェントな洗浄条件は、たとえば、６５℃で４×ＳＳＣ、または５０％ホルムアミド、２８℃で４×ＳＳＣ、または６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。非常にストリンジェントな洗浄条件は、たとえば、６５℃で０．２×ＳＳＣを含む。
【０１６９】
適当なインビボおよびインビトロシステムを用いることにより、同定された遺伝子の生物学的機能をさらに直接的に評価できる。インビボシステムには、これらに限定されないが、天然に乳癌素因を示すか、またはこのような症状を示すように操作された動物系が含まれ、限定されないが、ａｐｏＥ−欠損悪性腫瘍マウスモデル［Ｐｌｕｍｐら、１９９２、（８９）］が包含される。
【０１７０】
相同性検索についてすでに記載したハイブリダイゼーション条件により、同じプレｍＲＮＡによりコードされる同じゲノム領域から得られるスプライス変異体を同定することができる。同じプレ転写物のスプライス変異体によりコードされる変異タンパク質の特異的性質は異なり、開示のようにして分析できる。配列番号１〜２６または５３〜７５の配列のいずれかのヌクレオチド配列またはその相補体を有する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、したがって、配列番号６０に示される全配列の一部とは異なり、コードされるスプライス変異体は配列番号６１〜６６である。これらは配列番号８３〜８９の個々のタンパク質にあたる。スプライシング事象の予想および使用されるプレｍＲＮＡ内のアクセプターおよびドナー部位の同定はコンピューターで計算でき（例えばソフトウェアパッケージＧＲＡＩＬまたはＧｅｎｏｍｅＳＣＡＮ）、当業者によりＰＣＲ法により検証できる。
【０１７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されると、相補的なヌクレオチドは細胞により産生される天然の配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかをブロックする。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さにおいて少なくとも６つのヌクレオチドであるが、少なくとも７、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってよい。より長い配列も使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は細胞の「乳癌遺伝子」遺伝子産物のレベルを減少させるために前記のようにＤＮＡ構築物として供給し、細胞中に導入することができる。
【０１７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ；米国特許第５，７１４，３３１号に記載）、ロックド核酸（ＬＮＡ；ＷＯ９９／１２８２６に記載）、またはその組み合わせでありうる。オリゴヌクレオチドは、手作業でまたは自動化合成器により、一方のヌクレオチドの５’末端を別のヌクレオチドの３’末端と非ホスホジエステルヌクレオチド間結合によって、例えばアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カーバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、炭酸エステルおよびリン酸トリエステルによって、共有結合させることにより合成することができる［Ｂｒｏｗｎ、１９９４、（１２６）；Ｓｏｎｖｅａｕｘ、１９９４、（１２７）およびＵｈｌｍａｎｎら、１９９０、（１２８）］。
【０１７３】
「乳癌遺伝子」の制御領域、５’領域、または調節領域に対して二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインすることにより、「乳癌遺伝子」発現の修飾を達成することができる。転写開始部位から得られるオリゴヌクレオチド、たとえば１０位と開始部位から＋１０位の間が好ましい。同様に、「三本鎖」塩基対合法を用いて抑制を達成できる。三本鎖対合は、二本鎖がポリメラーゼ、転写因子、またはシャペロンの結合のために十分開くための能力を抑制するので有用である。三本鎖ＤＮＡを使用した治療の進歩が文献において記載されている［Ｇｅｅら、１９９４、（１２９）］。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、転写物がリボソームと結合するのを防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するようデザインすることができる。
【０１７４】
正確な相補性はアンチセンスオリゴヌクレオチドと「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの相補配列間に複合体を形成するために必要とされない。例えば、隣接する「乳癌遺伝子」ヌクレオチドと相補的でない連続ヌクレオチド鎖により分離された、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドと正確に相補的である２、３、４、または５またはそれ以上の連続したヌクレオチド鎖を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡに対する十分な標的特異性を提供することができる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドのそれぞれの鎖は長さにおいて少なくとも４、５、６、７、または８かそれ以上のヌクレオチドである。非相補的介在配列は好ましくは長さにおいて１、２、３、または４のヌクレオチドである。当業者にとって、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド配列の間に許容されるミスマッチの程度を決定するためにアンチセンス−センスペアの融点の計算値を用いることは容易である。
【０１７５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドにハイブリダイズするその能力に影響を与えないで修飾できる。これらの修飾はアンチセンス分子の内部であるか、その分子の一端または両端であり得る。例えば、ヌクレオシド間リン酸結合は、アミノ基と末端リボースの間の炭素残基の数がさまざまであるコレステリルナまたはジアミン部分を加えることにより修飾できる。修飾された塩基および／または糖、たとえばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシル基または５’リン酸基が置換されている３’，５’置換オリゴヌクレオチドも、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて使用できる。これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは当該分野において周知の方法により調製できる［Ａｇｒａｗａｌら、１９９２、（１３０）；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９８７、（１３１）およびＵｈｌｍａｎｎら、（１２８）］。
【０１７６】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である［Ｃｅｃｈ、１９８７、（１３２）；Ｃｅｃｈ、１９９０、（１３３）およびＣｏｕｔｕｒｅ＆Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、１９９６、（１３４）］。リボザイムは、当該分野において公知のように、ＲＮＡ配列を切断することにより遺伝子機能を抑制するために用いることができる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号）。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーション、続いてエンドヌクレアーゼ的切断を含む。その例には、特定のヌクレオチド配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ有効に触媒することできる人工ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。
【０１７７】
「乳癌遺伝子」の転写された配列は、「乳癌遺伝子」ゲノム座から転写されたｍＲＮＡと特異的に結合するリボザイムを生成するために使用できる。高度に配列特異的な方法でトランスにて他のＲＮＡ分子を切断させることができるリボザイムをデザインおよび構築する方法が開発されて、当該分野において記載されている［Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９８８、（１３５）］。例えば、リボザイム中に別々の「ハイブリダイゼーション」領域を作ることにより、リボザイムの切断活性を特定のＲＮＡに向けることができる。ハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含み、したがって標的と特異的にハイブリダイズする［例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、ＥＰ０３２１２０１］。
【０１７８】
次の配列を含むリボザイム切断部位について標的分子を調べることにより、「乳癌遺伝子」ＲＮＡ標的中の特定のリボザイム切断部位を同定できる：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ。同定後、切断部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する１５から２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、標的を作動不能にし得る二次構造特性について評価することができる。候補「乳癌遺伝子」ＲＮＡ標的の適合性もまたリボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いる相補的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションの実施容易性を試験することにより評価できる。より長い相補配列を使用して、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。相補的領域により標的ＲＮＡにハイブリダイズする際に、リボザイムの触媒領域が標的を切断させることができるように、リボザイムのハイブリダイズおよび切断領域は一体的に関連し得る。
【０１７９】
リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞に導入できる。微量注入法、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈降のような機械的方法を使用して、「乳癌遺伝子」発現を減少させることが望ましい細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。別法として、もし細胞が安定してそのＤＮＡ構築物を保持することが望ましいならば、当該分野において知られているように構築物をプラスミド上で提供し、別個の要素として維持するか、または、細胞のゲノム中に統合できる。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、細胞におけるリボザイムの転写を制御するために、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメントおよび転写ターミネーターシグナルのような転写調節エレメントを含むことができる。
【０１８０】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号により示唆されるように、リボザイム発現が標的遺伝子の発現を誘発する因子に応えて起こるように、リボザイムを設計することができる。リボザイムと標的遺伝子の両方が細胞において誘導されるときだけｍＲＮＡの破壊が起こるようなさらなるレベルの調節が提供されるようリボザイムを操作することができる。
【０１８１】
ポリペプチド
本発明の「乳癌遺伝子」ポリペプチドには、配列番号２７〜５２および７６〜９８から選択されるポリペプチド、または配列番号１〜２６および５３〜７５のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、またはその誘導体、断片、アナログ、およびホモログが含まれる。本発明の「乳癌遺伝子」ポリペプチドはしたがって、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのすべてまたは一部を構成する部分、完全長、または融合タンパク質であり得る。
【０１８２】
タンパク質精製
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、その酵素を発現するすべての細胞から精製することができ、それには「乳癌遺伝子」発現構築物でトランスフェクトされた宿主細胞が含まれる。乳房組織は「乳癌遺伝子」ポリペプチドの特に有用な供給源である。精製「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、当該分野においてよく知られている方法を使用して、通常細胞において「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合する他の化合物、例えばある種のタンパク質、炭水化物、または脂質、から分離される。このような方法には、これらに限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび分取ゲル電気泳動が含まれる。精製「乳癌遺伝子」ポリペプチドの調製物は、少なくとも８０％の純度であり；好ましくは、調製物は９０％、９５％、または９９％の純度である。調製物の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法のような、当該分野において公知の手段により評価することができる。
【０１８３】
ポリペプチドの取得
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、例えば、ヒト細胞から精製するか、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの発現によるか、または直接の化学合成により、得ることができる。
【０１８４】
生物学的に活性な変異体
生物学的に活性な、すなわち「乳癌遺伝子」活性を保持する「乳癌遺伝子」ポリペプチド変異体も、「乳癌遺伝子」ポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然の「乳癌遺伝子」ポリペプチド変異体は、配列番号２７〜５２または７６〜９８のポリペプチドまたは配列番号１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチドのいずれかによりコードされるペプチドまたはその断片のアミノ酸配列と少なくとも約６０、６５、または７０、好ましくは約７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、または９８％の同一性を有する。推定「乳癌遺伝子」ポリペプチド変異体と配列番号２７〜５２または７６〜９８のポリペプチドまたは配列番号１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチドのいずれかによりコードされるポリペプチドまたはその断片の間の同一性（％）は慣用の方法によりに決定される［例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９８６、（９０）およびＨｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、（９１）参照］。簡単にいうと、２つのアミノ酸配列を整列させ、１０のギャップオープニングペナルティー、１のギャップエクステンションペナルティー、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆの「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いてアラインメントスコアを最適化する。
【０１８５】
当業者らは２つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されたアミノ酸配列および推定変異体のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質整列方法である［Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、１９８８、（９２）とＰｅａｒｓｏｎ、１９９０、（９３）］。簡単にいうと、ＦＡＳＴＡはまず、クエリー配列（例えば、配列番号１〜２６または５３〜７５まで）および最高の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）または同一性の対（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有するテスト配列により共有される領域を同定することによって、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮せずに、配列類似性を特徴づける。アミノ酸置換マトリックスを用いてすべての対にされたアミノ酸の類似性を比較することにより、最高の同一性を有する１０の領域を次に再び採点し、領域の末端を、最高得点に寄与する残基のみを含むために「切り取る」。もし「カットオフ」値よりも高い得点を有するいくつかの領域があるならば（配列の長さに基づいてあらかじめ決められた式により計算、ｋｔｕｐ値）、切り取られた初期領域を次いで調べて、この領域が結合してギャップを有する適当なアラインメントを形成できるかどうかを決定する。最終的に、２つのアミノ酸配列の最高得点領域はＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｔｓアルゴリズム［Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０、（９４）、およびＳｅｌｌｅｒｓ、１９７４、（９５）］を用いて整列され、これによりアミノ酸挿入および欠失が可能になる。ＦＡＳＴＡ分析の望ましいパラメータは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップエクステンションペナルティー＝１、置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。Ｐｅａｒｓｏｎ、（９３）の補遺２において説明するように、これらのパラメータは、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによって、ＦＡＳＴＡプログラム中に導入することができる。
【０１８６】
ＦＡＳＴＡはまた、前記の比を用いて核酸分子の配列同一性を決定するために使用できる。ヌクレオチド配列比較について、ｋｔｕｐ値は１から６の範囲、好ましくは３から６、最も好ましく３であり、他のパラメータはデフォルトにセットする。
【０１８７】
同一性の変動（％）は、たとえば、アミノ酸置換、挿入、または欠失に帰せられ得る。アミノ酸置換は１対１アミノ酸置換と定義される。置換されたアミノ酸が類似した構造的および／または化学的特性を有しているとき、これらは性質において保存的である。保存的な置換の例は、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸塩をグルタミン酸塩で、またはトレオニンのセリンでの置換である。
【０１８８】
アミノ酸の挿入または欠失は、アミノ酸配列に対するかまたはアミノ酸配列内の変化である。これらは典型的に約１から５のアミノ酸の範囲にある。「乳癌遺伝子」ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を廃することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失できるか決定することにおいての手引きは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアなどの当該分野においてよく知られているコンピュータープログラムを用いて見いだすことができる。アミノ酸変化の結果、生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチドが得られるかどうかは、例えば、以下の実施例において記述されるように、「乳癌遺伝子」活性について分析することによって容易に決定できる。より大きな挿入または欠失も、選択的スプライシングによって引き起こすことができる。タンパク質の主な活性を変えないで、タンパク質ドメインを挿入または欠失させることができる。
【０１８９】
融合タンパク質
融合タンパク質は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の生成のため、および様々な分析システムにおける使用のために有用である。例えば、融合タンパク質は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの部分と相互作用するタンパク質を同定するために使用できる。タンパク質アフィニティークロマトグラフィーまたはタンパク−タンパク相互作用についてのライブラリーに基づく分析、たとえば、酵母ツーハイブリッドまたはファージディスプレーシステムをこの目的のために用いることができる。このような方法は当該分野においてよく知られていて、同じく薬剤スクリーニングとしても使用できる。
【０１９０】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により融合され一緒になった２つのポリペプチドセグメントを含む。第一のポリペプチド部分は、配列番号１〜２６または５３〜７５の任意のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列または生物学的に活性な変異体、たとえば前述の変異体の、少なくとも２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００の連続したアミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントは完全長の「乳癌遺伝子」も含むことができる。
【０１９１】
第二のポリペプチドセグメントは完全長のタンパク質またはタンパク質断片であり得る。融合タンパク質構築において一般的に用いられるタンパク質には、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質、グルタチオン−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が含まれる。さらに、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含むエピトープタグを融合タンパク質構築において用いることができる。他の融合構築物には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、ＬｅｘＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が含まれうる。融合タンパク質は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドコード配列と異種性のタンパク質配列の間に切断部位を含むようにすることができ、それにより「乳癌遺伝子」ポリペプチドを切断し、異種性のの部分から精製することができる。
【０１９２】
当該分野で知られているように、融合タンパク質は化学的に合成できる。好ましくは、融合タンパク質は２つのポリペプチドセグメントを共有結合させるかまたは分子生物学の分野における標準的手順を用いることにより産生される。組換えＤＮＡ法を用いて融合タンパク質を調製することができ、たとえば、当該分野において公知のように、第二のポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチドと適切なリーディングフレーム中にある配列番号１〜２６および５３〜７５のポリヌクレオチド配列から選択されるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作り、宿主細胞においてそのＤＮＡ構築物を発現させることにより調製する。融合タンパクを構築するための多くのキットがＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ；１−８８８の−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）から入手可能である。
【０１９３】
ホモログの同定
ヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチドのホモログは、当業界にて知られるように、（後述の）「乳癌遺伝子」ポリペプチドポリヌクレオチドを用いて、マウス、サル、または酵母などの他の種由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのホモログをコードするｃＤＮＡを同定し、そのｃＤＮＡを発現させることにより得られる。
【０１９４】
ポリヌクレオチドの発現
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを発現するために、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクター中にポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者らによく知られている方法を、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法はインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（７７）およびＡｕｓｕｂｅｌら、（７８）において記載されている。
【０１９５】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を含ませ、発現させるために、いろいろな発現ベクター／宿主システムを利用することができる。これらは組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母菌、ウイルス発現ベクターに感染している昆虫細胞株（例えば、バクロウイルス）、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞、あるいは動物細胞株を包含するが、これらに限定されるわけではない。
【０１９６】
制御エレメントまたは調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターエンハンサー、プロモーター、５’および３’未翻訳領域の領域である。このようなエレメントはその強度と特異性の点で異なる。使用されるベクター系および宿主によって、構成的および誘導性プロモーターを含む任意の数の適当な転写および翻訳エレメントを用いることができる。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導性プロモーターが使用できる。バクロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において用いることができる。植物細胞（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク遺伝子）または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）のゲノムから得られるプロモーターまたはエンハンサーをベクター中にクローン化することができる。哺乳動物細胞株においては、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスからのプロモーターが好ましい。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の多数のコピーを含む細胞株を生成する必要があるならば、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択可能なマーカーとともに用いることができる。
【０１９７】
細菌および酵母菌発現系
細菌系において、「乳癌遺伝子」ポリペプチドについて意図された用途により、多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、大量の「乳癌遺伝子」ポリペプチドが抗体の誘導に必要な場合、精製が容易な融合タンパクの高レベルの発現を行うベクターを使用できる。このようなベクターは、これらに限定されないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの多機能的な大腸菌クローニングベクターおよび発現ベクターを含む。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいて、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、アミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列とインフレームにてベクター中に「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列をライゲーションできる。ｐＩＮベクター［Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、（１７）］またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）もグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパクとして外来ポリペプチドを発現するために使用できる。一般に、このような融合タンパクは可溶性であって、グルタチオンアガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解した細胞から精製することができる。対象とするクローン化ポリペプチドが随意にＧＳＴ部分から放出され得るように、このような系において作られたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、またはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むよう意図されることができる。
【０１９８】
酵母菌サッカロミセス・セレビシエにおいて、多くの構成的または誘導性プロモーター、たとえば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨを含む多くのベクターを用いることができる。論評については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（４）およびＧｒａｎｔら、（１８）参照。
【０１９９】
植物と昆虫発現系
もし植物発現ベクターが使われるなら、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれによってでも駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独またはＴＭＶからのオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる［Ｔａｋａｍａｔｓｕ、１９８７、（９６）］。別法として、植物プロモーター、たとえば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを使用できる［Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４、（９７）；Ｂｒｏｇｌｉｅら、１９８４、（９８）；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、（９９）］。これらの構築物は直接的ＤＮＡ形質転換により、または病原体により媒介されるトランスフェクションにより植物細胞に導入できる。このような技術は多くの一般に利用可能な論評において記述されている。
【０２００】
昆虫システムも「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現するために使用できる。例えば、そのようなシステムの１つにおいて、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、ハスモンヨトウ近似種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼生において外来遺伝子を発現するためにベクターとして使われる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドの挿入の成功により、ポリヘドリン遺伝子は不活性にされ、外殼タンパク質がない組換型ウイルスが産生される。組換ウイルスは次いで「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現できるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼生に感染するために使用できる［Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、１９９４、（１００）］。
【０２０１】
哺乳動物の発現システム
多くのウイルスに基づく発現システムは哺乳動物の宿主細胞において「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現するために用いることができる。例えば、もしアデノウイルスが発現ベクターとして使用されるなら、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三連リーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションすることができる。ウイルスのゲノムの必須でないＥ１またはＥ３領域中へ挿入して、感染させた宿主細胞において「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現することができる生存可能なウイルスを得ることができる［Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、１９８４、（１０１）］。もし望ましいなら、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーは、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させるために用いることができる。
【０２０２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）も、プラスミドに含ませ、発現できるより大きいＤＮＡの断片を送達するために用いることができる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣが構築され、従来の送達方法によって細胞に送達される（例えば、リポソーム、多カチオン性アミノフェノールポリマー、または小胞）。
【０２０３】
特定の開始シグナルも「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列のいっそう効率的な翻訳を達成するために用いることができる。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドンと隣接した配列を含む。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流の配列が適切な発現ベクターに挿入される場合において、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要とされない場合もある。しかしながら、コード配列、またはその断片のみが挿入される場合においては、外因性翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始シグナルを含む）が提供されるべきである。開始コドンはインサート全体の翻訳を保証するために正しいリーディングフレーム中にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは種々の起源のものであり、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞株について適切なエンハンサーを含めることによって向上させることができる［Ｓｃｈａｒｆら、１９９４、（１０２）］。
【０２０４】
宿主細胞
宿主細胞種は、挿入された配列の発現を調整するか、または望ましい方法で発現した「乳癌遺伝子」ポリペプチドを処理するその能力のために選択することができる。このようなポリペプチドの修飾は、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、糖鎖形成、リン酸化反応、脂質化、およびアシル化を包含する。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進するために用いることができる。翻訳後活性（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）についての特定の細胞機構および特有のメカニズムを有する異なる宿主細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０−２２０９）から入手可能であり、正しい修飾および外来タンパクのプロセッシングを保証するように選択することができる。
【０２０５】
安定した発現が、組換タンパクの長期の、高収率の生産のために好ましい。例えば、安定して「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現する細胞株は、同一または別のベクター上にウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる発現ベクターを使って形質転換することができる。ベクターの導入の後に、選択培地に切り替える前に、強化培地中にて１２日間細胞を成長させてもよい。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、導入された「乳癌遺伝子」配列の発現が成功した細胞の成長と回復が許容される。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる［Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、１９８６、（１０３）］。
【０２０６】
形質転換された細胞株を回収するために、いくつの選択システムを用いてもよい。これらは、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ［Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、（１０４）］およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［Ｌｏｗｙら、１９８０、（１０５）］遺伝子を含むが、これらに制限されるわけではない。また、代謝アンタゴニスト、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基礎として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を付与し［Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、（１０６）］、ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与し［Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、（１０７）］、ａｌｓとおよびｐａｔはそれぞれクロロスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらなる選択可能な遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは、細胞がトリプトファンのかわりにインドールを利用することを許容し、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを許容する［Ｈａｒｔｍａｎ＆Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９８８、（１０８）］。アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどの可視マーカーは、形質転換体を同定し、特定のベクターシステムに起因する一時的または安定したタンパク質発現の量を定量化するために用いることができる［Ｔｈｏｄｅｓら、１９９５、（１０９）］。
【０２０７】
発現および遺伝子産物の検出
マーカー遺伝子発現の存在は、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドも存在していることを示唆するが、その存在および発現は確認される必要があるかもしれない。例えば、もし「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列中に挿入されるなら、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を含む形質転換された細胞はマーカー遺伝子機能の欠如により同定することができる。別法として、マーカー遺伝子は、一つのプロモーターの制御下で、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列と一列に配置することができる。誘発または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの発現を示す。
【０２０８】
別法として、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを含み、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者らに公知のいろいろな方法によって同定することができる。これらの方法は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の検出および／または定量化のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイあるいはイムノアッセイを包含するが、これらに限定されるわけではない。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは断片を使用して、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。核酸増幅に基づく分析は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列から選択されたオリゴヌクレオチドの、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための使用を含む。
【０２０９】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、そのポリペプチドの発現を検出し測定するためのいろいろなプロトコルが当該分野において公知である。その例には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が含まれる。「乳癌遺伝子」ポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる二部位モノクローナルに基づくイムノアッセイを用いることができるか、または競合結合測定法を用いることができる。これらおよび他の分析法は、Ｈａｍｐｔｏｎら、（１１０）およびＭａｄｄｏｘら、１１１において記載されている。
【０２１０】
多種多様な標識と結合技術が当業者らによって知られていて、種々の核酸とアミノ酸分析において用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生するための手段は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法として、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためにベクターの中にクローニングすることができる。このようなベクターは当該分野で公知であり、商業的に入手可能であって、標識ヌクレオチドおよびＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼの添加によってインビトロでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。これらの手順はいろいろな商業的に入手可能なキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＰｒｏｍｅｇａおよびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使って行なうことができる。検出を容易にするために用いることができる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素および蛍光、化学発光法、または、色素産生剤、ならびに基質、補助因子、阻害剤、磁気粒子などが含まれる。
【０２１１】
ポリペプチドの発現と精製
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養できる。形質転換された細胞により産生されたポリペプチドは、使用した配列および／またはベクターによって、分泌されるかあるいは分子内で貯蔵されうる。当業者らによって理解されるように、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞膜を通して可溶性「乳癌遺伝子」ポリペプチドを分泌させるか、または膜結合「乳癌遺伝子」ポリペプチドの膜挿入を行うシグナル配列を含むようにデザインすることができる。
【０２１２】
前記のように、他の構築物を用いて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を可溶性タンパクの精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結することができる。このような精製促進ドメインは、これらに限定されないが、固定化金属上の精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化イムノグロブリン上の精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，シアトル、Ｗａｈ．）において利用されるドメインを含む。精製ドメインと「乳癌遺伝子」ポリペプチド間に切断可能なリンカー配列、例えばファクターＸａまたはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）に対して特異的な配列を含めて、精製を促進することができる。１つのこのような発現ベクターは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前にある６のヒスチジン残基を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基はＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー［Ｐｏｒａｔｈら、１９９２、（１１２）］による精製を促進し、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質から「乳癌遺伝子」ポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパクを含むベクターが、Ｋｒｏｌｌら、（１１３）において開示されている。
【０２１３】
化学合成
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列は、当該分野でよく知られている化学的方法を使って全部または部分的に合成される（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、（１１４）とＨｏｒｎら、（１１５）参照）。別法として、「乳癌遺伝子」ポリペプチドそれ自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いた直接的ペプチド合成［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、（１１６）およびＲｏｂｅｒｇｅら、１９９５、（１１７）］、を使って生産することができる。タンパク合成は、手動の技術を使用するか、または自動化により行なうことができる。自動化された合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１ペプチド合成器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使って達成することができる。所望により、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの断片を別に合成して、化学的方法を用いて組み合わせて、完全長分子を産生することができる。
【０２１４】
新たに合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーによって実質的に精製することができる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、（１１８）］。合成の「乳癌遺伝子」ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認できる（例えば、Ｅｄｍａｎ分解法；およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１１８）参照）。さらに、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を直接合成の間に変化させ、および／または他のタンパク質からの配列を化学的方法を用いて組み合わせ、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を得ることができる。
【０２１５】
変化したポリペプチドの産生
当業者らにより理解されるように、天然に存在しないコドンを有する「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を産生することが有利でありうる。例えば、特定の原核生物または真核生物宿主により好まれるコドンを、タンパク質発現の速度を増大させるため、または天然に存在する配列から生じる転写物よりも長い半減期などの望ましい性質を有するＲＮＡ転写物を産生するために選択することができる。
【０２１６】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を、様々な理由による変化、例えば、限定はされないが、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセッシング、および／または発現を修飾する変化のため、当該分野において一般的に公知の方法を用いて本発明において開示されたヌクレオチド配列を操作することができる。遺伝子断片および合成のオリゴヌクレオチドのランダム断片化およびＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリングを用いてヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、新しい制限酵素切断部位を挿入し、糖鎖形成パターンを変化させ、コドン選択を変化させ、スプライス変異体を産生し、突然変異を導入するなどするために、部位指向性突然変異を用いることができる。
【０２１７】
予測、診断および予後予測
本発明は、悪性腫瘍、特に乳癌に関して、配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９または２１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチド配列のいずれかを含むポリヌクレオチドマーカーおよび／またはこれによりコードされるポリペプチドマーカーまたは配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５または４７〜５２または７６〜９８のポリペプチド配列のいずれかを含むポリペプチドマーカー、または配列番号１〜２６および５３〜７５から選択される少なくとも２つの開示されたポリヌクレオチドまたは配列番号２８〜３２および７６〜９８から選択される少なくとも２つの開示されたポリペプチドの一つを検出することにより、患者が悪性腫瘍、特に乳癌を発症する危険にあるかどうかを決定するための方法を提供する。
【０２１８】
臨床用途において、生物学的サンプルを、本発明において同定されたバイオマーカーの存在および／または不在に関してスクリーニングすることができる。このようなサンプルは例えば針生検コア、外科切除サンプル、または血清、細針ニップル吸引物および尿のような体液である。例えば、これらの方法には生検を得ることが含まれ、その生検は所望によりクリオスタット切断により細分され細胞集団全体のおよそ８０％に疾患細胞が濃縮される。ある態様において、これらのサンプルから抽出されるポリヌクレオチドは当該分野でよく知られている技術を使って増幅できる。検出された選択マーカーの発現レベルは、統計的に有効な疾患および健康なサンプル群と比較される。
【０２１９】
ある態様において、診断方法は、たとえば、ノザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学により、患者が開示されたマーカーの異常なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを有するかどうかを決定することを含む。この方法によれば、細胞を被験体から得て、開示されたバイオマーカーのレベル、タンパク質またはｍＲＮＡレベルを測定し、健康な被験体におけるこれらのマーカーのレベルと比較する。異常なレベルのバイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルは乳癌などの悪性腫瘍を示している可能性が高い。
【０２２０】
別の態様において、診断方法は、例えば、サザンブロット分析、ドットブロット分析、蛍光または比色インサイチュハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＶＮＴＲ、ＳＴＳ−ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲによる遺伝子型決定により、被験体の前記遺伝子または前記ゲノム座のＤＮＡ含有量が異常かどうか決定することを含む。一般に、これらの分析は、代表的なゲノム領域由来のプローブの使用を含む。プローブは前記ゲノム領域または前記領域に対して相補的または類似の配列の少なくとも一部を含む。特に、前記遺伝子またはゲノム領域の遺伝子間または遺伝子内領域である。プローブは、ハイブリダイゼーションによって標的領域に結合することができるヌクレオチド配列または類似した機能を有する配列（例えばＰＮＡ、Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏオリゴマー）からなる。一般に、前記患者サンプルにおいて変化したゲノム領域は、非罹患対照サンプル（同一または異なる患者から得られる正常な組織、周囲の非罹患組織、末梢血）または前記変化を有さず、したがって内部対照としての働きをすることができる同じサンプルのゲノム領域と比較される。好ましい態様において、同じ染色体上に位置する領域が使用される。別法として、ゴノソーム領域および／またはサンプル中の所定の様々な量の領域が使用される。ある好ましい態様において、ＤＮＡ含量、構造、組成または修飾を、別のゲノム領域内にあるものと比較する。特に好ましいのは、標的領域の量が増幅およびまたは欠失により変化した前記サンプルのＤＮＡ含量を検出する方法である。別の態様において、診断、予後予測または治療的価値がある、臨床面に関して前記サンプル中の細胞を罹患させるかまたは罹患しやすくする多型（例えば、一塩基多型または突然変異）の存在について標的領域を分析する。好ましくは、配列変異の同定は、前記臨床面を有する前記サンプルの特徴的挙動をもたらすハプロタイプを定義するために使われる。
【０２２１】
１７ｑ１２−２１．２における遺伝子の次の例は、制限のためではなく、例示のために提示する。
【０２２２】
本発明のある態様は、少なくとも１０、少なくとも５、または少なくとも４、または少なくとも３、さらに好ましくは少なくとも２つのマーカーの検出による悪性腫瘍の予測、診断または予後予測の方法であって、該マーカーが悪性腫瘍において変化した一つの染色体領域上に位置する遺伝子およびその断片および／またはゲノム核酸配列である方法である。
【０２２３】
本発明のさらに別の態様は、少なくとも１０、少なくとも５、または少なくとも４、または少なくとも３、さらに好ましくは少なくとも２つのマーカーの検出による悪性腫瘍の予測、診断または予後予測の方法であって、該マーカーが、（ａ）悪性腫瘍において変化した１以上の染色体領域上に位置する遺伝子およびその断片および／またはゲノム核酸配列であり、かつ（ｂ）（ｉ）レセプターおよびリガンドまたは（ｉｉ）同じシグナル伝達経路のメンバーまたは（ｉｉｉ）相乗的シグナル伝達経路のメンバーまたは（ｉｖ）拮抗的シグナル伝達経路のメンバーまたは（ｖ）転写因子および転写因子結合部位として機能的に相互作用する方法である。
【０２２４】
ある態様において、悪性腫瘍、特に乳癌の予測、診断または予後予測の方法は、生物学的サンプルにおいて：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチド；
ｂ）表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を示すポリペプチドをコードする（ａ）において特定されたポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体または対立遺伝子変異体を表すポリヌクレオチド
を検出することにより行われ、次の工程を含む：（ａ）から（ｄ）において特定されたいずれかのポリヌクレオチドまたは類似のオリゴマーを生物学的サンプル由来のポリヌクレオチド物質にハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する工程、および該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
【０２２５】
別の態様において、悪性腫瘍の予測、診断または予後予測の方法は、記載のとおりであるが、生物学的サンプルのポリヌクレオチド物質がハイブリダイゼーション前に増幅される方法である。
【０２２６】
別の態様において、悪性腫瘍、特に乳癌の診断または予後予測の方法は：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチド；
ｂ）表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を示すポリペプチドをコードする（ａ）において特定されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体または対立遺伝子変異体を表すポリヌクレオチド；
（ｅ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５、４７〜５２または７６〜９８の任意のポリペプチドを含むポリペプチド
を検出することにより行われ、生物学的サンプルを（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたは（ｅ）において特定されるポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程を含む。
【０２２７】
ＤＮＡアレイ技術
ある態様において、本発明は、その上にポリヌクレオチドプローブが整列され固定化されたＤＮＡチップを用いる方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む様々な方法により固体支持体に結合させることができる。例えばチップは最高４１００００のオリゴヌクレオチドを保持できる（ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。一つのチップにポリヌクレオチドマーカーのアレイを供することにより試験の信頼性が増大するので、本発明は、乳癌などの悪性腫瘍に現在利用可能な試験を超える顕著な利点を提供する。
【０２２８】
この方法は、罹患者の生検を得ること（これは所望によりクリオスタットで切断することによって細分されて、罹患細胞集団が全細胞集団の約８０％となるように濃縮される）、および体液、たとえば、血清または尿、液体を含む血清または細胞（例えば、細針吸飲物から得られる）の使用を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡを次に抽出し、増幅し、ＤＮＡチップを用いて分析して、マーカーポリヌクレオチド配列の存在または不在を決定する。ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは、２次元マトリックスまたはアレイにおいて基体上にスポットする。ポリヌクレオチドサンプルは、標識し、次いでプローブにハイブリダイズさせることができる。プローブヌクレオチドと結合した標識されたサンプルポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドは、サンプルの未結合部分を洗い流すと検出できる。
【０２２９】
プローブポリヌクレオチドは、ガラス、ニトロセルロースなどを包含する基体上にスポットすることができる。プローブは共有結合または疎水性相互作用などの非特異的相互作用のいずれかにより基体に結合させることができる。サンプルポリヌクレオチドは放射性ラベル、蛍光体、発色団などを用いて標識することができる。アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを使用する方法は、ＥＰ０７９９８９７；ＷＯ９７／２９２１２；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ０７８５２８０；ＷＯ９７／０２３５７；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；ＥＰ０７２８５２０；米国特許第５，５９９，６９５号；ＥＰ０７２１０１６；米国特許第５，５５６，７５２号；ＷＯ９５／２２０５８；米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。さらにアレイは、遺伝子の差次的発現を調べるために使用でき、遺伝子機能を決定するために使用できる。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のアレイは、いずれのポリヌクレオチド配列が正常細胞と罹患細胞間で差次的に発現するかを決定するために用いることができる。対応する正常なサンプルにおいて観察されない罹患サンプルにおける特別のメッセージの高い発現が乳癌特異的タンパク質を示すことができる。
【０２３０】
したがって、ある局面において、本発明は、本明細書において開示する独特なポリヌクレオチドマーカーに特異的なプローブおよびプライマーを提供する。
【０２３１】
ある態様において、本発明の方法は、患者から得られる組織において悪性、特に乳癌の細胞の存在を確認するためにポリヌクレオチドプローブを使用することを含む。特に、この方法は：
１）配列番号１〜２６および５３〜７５のポリヌクレオチドまたはこれに相補的な配列から選択されるポリヌクレオチドのコード配列の一部と相補的なコード配列の、少なくとも１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、いっそう好ましくは２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、最大で全てまたはほとんど全てを含むポリヌクレオチドプローブを提供すること、ここで該配列は乳癌などの悪性腫瘍において差次的に発現している；
３）悪性腫瘍を有する患者から組織サンプルを得ること；
４）悪性腫瘍がない患者から第二の組織サンプルを提供すること；
５）該ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントな条件下で該第一および第二の組織サンプルと接触させること（例えば、ノザンブロットまたはインサイチュハイブリダイゼーション分析において）；
６）（ａ）プローブと第一の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）プローブと第二の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較すること
を含み、ここで、第二の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較した第一の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量における統計学的に有意な差は、第一の組織サンプルにおける悪性腫瘍、特に乳癌を示す。
【０２３２】
データ分析法
１つ以上の「乳癌遺伝子」の発現レベルと参照発現レベルとの比較、例えば、乳癌罹患細胞または正常な対応細胞における発現レベルの比較は、好ましくはコンピューターシステムを使って行なわれる。ある態様において、発現レベルは２つの細胞で得られ、これらの２つの発現レベルのセットは比較のためにコンピューターシステムに導入される。望ましい態様において、１セットの発現レベルは、すでにコンピューターシステム内に存在する値、または後にコンピューターシステムに入力されるコンピューター読みとり可能な形態にて存在する値と比較するためにコンピューターシステムに入力される。
【０２３３】
ある態様において、本発明は、コンピューター読みとり可能な形態の、本発明の遺伝子発現特性データ、または罹患細胞における少なくとも１つの「乳癌遺伝子」の発現のレベルに対応する値を提供する。値は、実験、例えば、マイクロアレイ分析から得られるｍＲＮＡ発現レベルであり得る。値はまた、その発現が多数の条件下で多数の細胞において一定である参照遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ、に関して標準化されたｍＲＮＡレベルであり得る。他のある態様において、コンピューターにおける値は、異なるサンプルにおける標準化または非標準化ｍＲＮＡレベルの比または差である。
【０２３４】
遺伝子発現特性データは表の形態、たとえばエクセルの表であり得る。データは単独であるか、または例えば他の発現特性を含むより大きなデータベースの一部であり得る。例えば、本発明の発現特性データは公共のデータベースの一部であり得る。コンピューター読みとり可能な形態はコンピューター内にあってもよい。別の態様において、本発明は遺伝子発現特性データを表示するコンピューターを提供する。
【０２３５】
ある態様において、本発明は、第一の細胞、例えば、被験体の細胞における１以上の「乳癌遺伝子」の発現レベルと、第二の細胞における発現レベルの間の類似性を決定する方法であって、第一の細胞における１以上の「乳癌遺伝子」の発現レベルを得ること、およびこれらの値を、第二の細胞における１以上の「乳癌遺伝子」の発現レベルに対応する値を含む記録を含むデータベースを含むコンピューターであって、該コンピューター中に記憶されているデータとの比較ための１以上の値の選択を受容できるユーザーインターフェースなどのプロセッサインストラクションを含むコンピューターに入力することを含む。コンピューターはさらに比較データをダイアグラムまたはチャートまたは他の種類の出力に変換する手段を含むことができる。
【０２３６】
さらに別の態様において、「乳癌遺伝子」の発現レベルを表す値は、１以上の細胞から得られた参照発現レベルについての１つ以上のデータベースを含むコンピューターシステムに入力される。例えば、コンピューターは罹患細胞および正常細胞の発現データを含む。インストラクションがコンピューターに提供され、コンピューターは入力されたデータが正常細胞または罹患細胞のいずれに類似するかを決定するためにコンピューター中のデータと入力されたデータとを比較することができる。
【０２３７】
さらに別の態様において、コンピューターは、異なる段階の乳癌の被験体の細胞における発現レベルの値を含み、該コンピューターは、コンピューター中に入力された発現データを保存されたデータと比較でき、例えば被験体における乳癌の段階を決定するために、コンピューター中の発現特性のどれに入力されたものが最も類似しているかを示す結果をもたらす。
【０２３８】
さら別の態様において、コンピューターにおける参照発現特性は１以上の被験体の乳癌細胞由来の発現特性であり、その細胞は乳癌の治療のために用いられる薬でインビボまたはインビトロで処置されている。インビトロまたはインビボにおいて薬で処置された被験体の細胞の発現データを入力すると、コンピューターは、コンピューター中のデータを入力されたデータと比較し、コンピューターへの発現データ入力が薬に反応する患者の細胞のものとより類似しているか、または薬に反応しない患者の細胞のものにより類似しているかを示す結果を提供するよう指示される。かくして、その結果は、被験体が薬での処置に反応しやすいか、反応しにくいかを示す。
【０２３９】
ある態様において、本発明は、１または複数の遺伝子の遺伝子発現データを受け取るための手段；前記の１または複数の遺伝子それぞれから得られる遺伝子発現データを一般的参照フレームと比較する手段；および比較の結果を提示するための手段を含むシステムを提供する。このシステムはさらにデータをクラスター化するための手段を含むことができる。
【０２４０】
さらに別の態様において、本発明は（ｉ）複数の遺伝子についての遺伝子発現データを入力として受け取るコンピューターコードおよび（ｉｉ）前記の複数の遺伝子のそれぞれから得られる前記遺伝子発現データを一般的参照フレームと比較するコンピューターコードを含む遺伝子発現データを分析するためのコンピュータープログラムを提供する。
【０２４１】
本発明はまた、次の工程を実行するためのプログラムインストラクションを含む機械読みとり可能またはコンピューター読みとり可能な媒体を提供する：（ｉ）問題の細胞における乳癌に特徴的な１以上の遺伝子の発現レベルに対応する複数の値を、１以上の参照細胞の参照発現または発現特性データおよび細胞の種類の注釈を含む記録を含むデータベースと比較する；（ｉｉ）発現特性の類似性に基づいてどの細胞と問題の細胞が最も類似しているかを示す。参照細胞は、異なる段階の乳癌の被験体から得られる細胞であってもよい。参照細胞はまた、特定の薬物療法に反応する、または反応しない被験体から得られ、その薬とともにインビトロまたはインビボでインキュベートされた細胞であってもよい。
【０２４２】
参照細胞はまた、いくつかの異なった処置に反応するかまたは反応しない被験体から得られる細胞であってもよく、コンピューターシステムは被験体に対する好ましい処置を示す。したがって、本発明は乳癌の患者のための治療法を選択する方法であって：（ｉ）患者の罹患細胞における乳癌に特徴的な１以上の遺伝子の発現レベルを提供する；（ｉｉ）それぞれが治療と関連する複数の参照特性を提供する、ここで被験体の発現特性および各参照特性は複数の値を有し、各値は乳癌に特徴的な遺伝子の発現レベルを表す）；（ｉｉｉ）被験体の発現特性に最も類似する参照特性を選択して、これにより前記患者のための治療を選択することを含む方法を提供する。好ましい態様において、工程（ｉｉｉ）はコンピューターによって行なわれる。対応する発現データと関連する重量値を使って複数の値の考察することにより最も類似した参照特性を選択することができる。
【０２４３】
２つの生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの相対量は、乱れ（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）および測定された乱れの大きさ（すなわち、存在量は試験したｍＲＮＡの２つの供給源で異なっている）、または乱れなし（すなわち、相対的存在量は同じである）としてスコア付けできる。種々の態様において、２つのＲＮＡ源の間の差が、少なくとも約２５％（一方の供給源から得られるＲＮＡが他方の供給源よりもその一方の供給源において２５％多い）、より一般的には約５０％、さらに一層頻繁には約２倍（２倍豊富）、３倍（３倍豊富）、または５倍（５倍豊富）になる場合に、乱れとしてスコアされる。乱れは、計算と発現比較のためのコンピューターによって使用されうる。
【０２４４】
好ましくは、乱れをプラスまたはマイナスと判断することに加えて、乱れの大きさを決定することは有利である。これは、前記のように、差次的標識に用いられる２つの蛍光体の発光比を計算することにより、実行することができる。
【０２４５】
コンピューター読み取り可能な媒体は、乳癌の段階の記述または乳癌に対する処置の指針をさらに含むことができる。
【０２４６】
操作において、本発明のシステムとの関連で、遺伝子発現データを受け取るための手段、遺伝子発現データを比較するための手段、提示するための手段、標準化するための手段、およびクラスター化するための手段は、ハードウェアまたはハードウェアおよびソフトウェアにおいて実行される本明細書に記載するそれぞれの機能についてプログラムされたコンピューター；コンピュータープログラムにより支持される、本明細書において特に特定される操作を実行するプログラムされたコンピューターの論理回路または他の成分；または本明細書において記述される特定の方法でコンピューターを機能させることができる実行可能な命令がコード化された内部記憶装置を含んでもよい。
【０２４７】
当業者らは本発明のシステムおよび方法が、ＭＳ−ＤＯＳまたはマイクロソフトウインドウズを実行させるＩＢＭコンパチブルのパーソナルコンピューターを含むさまざまなシステムに適用できることを理解するであろう。
【０２４８】
コンピューターは外部成分に結合した内部成分を有していてもよい。内部成分はメイン記憶装置と相互に連結したプロセッサ要素を含んでもよい。コンピューターシステムは２００ＭＨｚまたはそれ以上のクロックレイトを有し、３２ＭＢ以上のメイン記憶装置を有しているインテルＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）に基づくプロセッサであり得る。外部成分は、大容量記憶装置を包含し得、それは（典型的にはプロセッサおよび記憶装置と共に典型的にパッケージされる）１つ以上のハードディスクであってよい。このようなハードディスクは典型的には１ＧＢ以上の容量である。他の外部成分には、ユーザインタフェースデバイス、例えばモニター、入力装置、例えば「マウス」または他のグラフィック入力装置、および／またはキーボードが含まれる。印刷装置もコンピューターに取り付けることができる。
【０２４９】
典型的には、コンピューターシステムはネットワークリンクにリンクされ、それは他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステム、またはインターネットなどの広域通信網ネットワークへのイーサネットリンクの一部であり得る。このネットワークリンクはコンピューターシステムが他のコンピューターシステムとデータと処理タスクを共有することを可能にする。
【０２５０】
このシステムの操作中にいくつかのソフトウェアコンポーネントが記憶装置にロードされ、これには当該分野で標準的なものも本発明に特別なものもある。これらのソフトウェアコンポーネントは集合的にコンピューターシステムを本発明の方法に従って作用させる。これらのソフトウェアコンポーネントは典型的には大容量記憶装置に記憶される。ソフトウェアコンポーネントはコンピューターシステムとそのネットワーク相互接続の管理に重要なオペレーティングシステムを表す。このオペレーティングシステムは、例えば、マイクロソフトのＷｉｎｄｏｗｓのファミリーの、Ｗｉｎｄｏｗｓ９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ９８、またはＷｉｎｄｏｗｓＮＴなどであり得る。ソフトウェアコンポーネントは、本発明に特殊な方法を実行するプログラムを支援するためにこのシステムに好都合に存在する共通言語および機能を表す。多くの高または低レベルのコンピューター言語を、本発明の分析法をプログラムするために用いることができる。インストラクションをランタイムの間に解釈するかまたはコンパイルすることができる。望ましい言語はＣ／Ｃ＋＋とＪＡＶＡ（登録商標）を含む。最も好ましくは、本発明の方法は、使用されるアルゴリズムを含む式の記号入力および高レベル仕様のプロセッシングを可能にする数学的のソフトウェアパッケージにおいてプログラムされ、これにより使用者は手続き上個別の方程式またはアルゴリズムをプログラムする必要がなくなる。このようなパッケージには、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓから得られるＭａｔｌａｂ（Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．）、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られるＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ）、または  Ｍａｔｈ  Ｓｏｆｔから得られるＳ−Ｐｌｕｓ（Ｃａｍｂｒｉｇｅ、Ｍａｓｓ．）が含まれる。このように、ソフトウェアコンポーネントは、手続き型言語またはシンボルパッケージでプログラムされるので、本発明の解析方法を表す。好ましい態様において、コンピューターシステムはまた、乳癌に特徴的な１以上の遺伝子の発現のレベルを表す値を含むデータベースも含んでいる。このデータベースは、異なる細胞における乳癌に特徴的な１以上の遺伝子の発現特性を含んでもよい。
【０２５１】
実行の例において、本発明の方法を実施するためには、使用者は最初にコンピューターシステムに発現特性データをロードする。これらのデータはモニターとキーボードから、またはネットワーク接続によってリンクされた他のコンピューターシステムから、あるいはＣＤ−ＲＯＭまたはフロッピーディスクのような取外し可能な記憶装置媒体上に、またはネットワークを通して、直接使用者が入力することができる。次に使用者は、比較工程と、例えば、共に変化する遺伝子を遺伝子の群にまとめる工程を行なう発現特性分析ソフトウェアを実行する。
【０２５２】
もう１つの実行例において、発現特性は米国特許第Ｎｏ．６，２０３，９８７号において記述される方法を使って比較される。使用者は最初にコンピューターシステムに発現特性データをロードする。Ｇｅｎｅｓｅｔ特性定義が保存媒体またはリモートコンピューターから、好ましくはダイナミックなｇｅｎｅｓｅｔデータベースシステムから、ネットワークを通して記憶装置にロードされる。次に使用者は、発現特性を予測発現特性に変換する工程を実行するプロジェクションソフトウェアを実行する。その後、予測発現特性が示される。
【０２５３】
さらに別の実行例において、使用者は最初に記憶装置中に予測特性を導入する。使用者は次いで記憶装置の中に参照特性をロードする。次に、使用者は客観的に特性を比較する工程を実行する比較ソフトウェアを実行する。
【０２５４】
変異体ポリヌクレオチド配列の検出
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチドのいずれかによりコードされるいずれかのポリペプチドの異常な活性と関連する、悪性腫瘍、例えば乳癌を発症する傾向などの、被験体が病気を発症する危険にあるかどうかを決定する方法であって、該ポリペプチドの異常な活性が、以下の少なくとも１つを特徴とする遺伝子の損傷の存在または不在を検出することにより特徴決定される方法を提供する：
（ｉ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化、または
（ｉｉ）コードされるポリヌクレオチドの誤発現。
【０２５５】
説明のために、このような遺伝子損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確かめることにより検出することができる：
Ｉ．ポリヌクレオチド配列からの１以上のヌクレオチドの欠失
ＩＩ．ポリヌクレオチド配列に対する１以上のヌクレオチドの付加
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド配列の１以上のヌクレオチドの置換
ＩＶ．ポリヌクレオチド配列の全体的な染色体再配列
Ｖ．ポリヌクレオチド配列のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルにおける全体的な変化
ＶＩ．ゲノムＤＮＡのメチル化パターンなどのポリヌクレオチド配列の異常な修飾
ＶＩＩ．遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在
ＶＩＩＩ．マーカーポリペプチドの非野生型レベル
ＩＸ．遺伝子の対立遺伝子喪失
Ｘ．遺伝子の対立遺伝子獲得
ＸＩ．マーカーポリペプチドの不適当な翻訳後修飾
【０２５６】
本発明は、コードされるポリヌクレオチド配列において突然変異を検出するための分析技術を提供する。これらの方法は、これらに限定されないが、配列分析を含む方法、サザンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位のマッピングおよび分析されるポリヌクレオチドとプローブの間のヌクレオチド対の欠如の検出を含む方法を包含する。
【０２５７】
特定の病気または障害、例えば遺伝病または障害は、ある特定の遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体と関連付けられるが、それは必ず突然変異したタンパク質をコードするわけではない。このように、被験体における遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体の存在は、被験体が特異的疾患または障害を発症しやすくすることがある。個人の集団における遺伝子のヌクレオチド配列を決定することによって、遺伝子における多型領域を同定できる。もし多型領域が同定されるなら、特定の疾患とのつながりは、個人、例えば乳癌などの特定の疾患を発症した個人の特定の集団を研究することにより決定することができる。多型領域は、エキソン、エキソンのコード領域および非コード領域、イントロン、およびプロモーター領域など、いずれの遺伝子領域にしてもよい。
【０２５８】
ある態様において、遺伝子またはその天然に存在する変異体のセンスまたはアンチセンス配列、５’または３’フランキング配列あるいは対象の遺伝子と天然に関連するイントロン配列またはその天然に存在する変異体にハイブリダイズできるヌクレオチド配列の領域を含むポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。細胞のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションに利用可能にされ、プローブがサンプルのポリヌクレオチドと接触され、サンプルポリヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションが検出される。このような技術は、欠失、置換などを含むゲノムまたはｍＲＮＡレベルのいずれかで損傷または対立遺伝子変異体を検出し、ｍＲＮＡ転写レベルを決定するために用いることができる。
【０２５９】
好ましい検出方法は、突然変異または多型部位と重複し、突然変異または多型領域付近のおよそ５、１０、２０、２５、または３０のヌクレオチドを有するプローブを用いた対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の望ましい態様において、対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイズすることができるいくつかのプローブを固相支持体、例えば、「チップ」に取り付ける。「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれるオリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを用いた突然変異検出分析は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、（１１９）において記載されている。ある態様において、チップは遺伝子の少なくとも１つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含む。そして固相支持体を試験ポリヌクレオチドと接触させ、特定のプローブに対するハイブリダイゼーションを検出する。つまり、１以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同定は、単純なハイブリダイゼーション実験で検出することができる。
【０２６０】
ある態様において、損傷の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５４号、第６８３，２０２号参照）、例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ、あるいは別法としてリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））［Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、１９８８、（１２０）とＮａｋａｚａｗａら、１９９４（１２１）］においてプローブ／プライマーを利用することが含まれ、後者は遺伝子における点突然変異の検出に特に有用であり得る［Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５、（１２２）］。単なる例であるが、方法は、（ｉ）患者から細胞のサンプルを集める工程、（ｉｉ）サンプルの細胞からポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離する工程、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドサンプルを、（もし存在するなら）ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でそのポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させる工程、（ｉｖ）増幅産物の存在または不在を検出するか、または増幅産物の大きさを検出し、対照サンプルに対して長さを比較する工程を含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載される突然変異を検出するために使用されるいずれかの技術とともに、予備的増幅工程として使用するのが望ましいと予想される。
【０２６１】
別の増幅方法には：自己支持配列複製［Ｇｕａｔｅｌｌｉ、Ｊ．Ｃ．ら、１９９０、（１２３）］、転写増幅システム［Ｋｗｏｈ、Ｄ．Ｙ．ら、１９８９、（１２４）］、Ｑ−ベータレプリカーゼ［Ｌｉｚａｒｄｉ、Ｐ．Ｍ．ら、１９８８、（１２５）］、または任意の他のポリヌクレオチド増幅方法が含まれ、その後当業者らに一般的な技術を用いる増幅された分子の検出を行う。もしポリヌクレオチド分子が非常に少ない数で存在しているなら、これらの検出スキームは特にそのような分子の検出に有用である。
【０２６２】
対象分析の好ましい態様において、制限酵素切断パターンにおける変化により、サンプル細胞から得られる遺伝子の突然変異、または対立遺伝子変異体が同定される。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡが単離され、増幅され（任意）、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、断片の長さがゲル電気泳動によって決定される。さらに、配列特異的なリボザイムを使用して（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号参照）、リボザイム切断サイトの発生または喪失により特定の突然変異の存在について採点することができる。
【０２６３】
インサイチュハイブリダイゼーション
ある局面において、本発明の方法は、所定のマーカーポリヌクレオチドから得られるプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションを含み、該配列は、配列番号１〜９、または１１〜１９または２１〜２６および５３〜７５のポリヌクレオチド配列のいずれかまたはこれに相補的な配列から選択される。該方法は、悪性腫瘍、特に乳癌を有する可能性のある患者から得られる所定のタイプの組織、および悪性腫瘍がない個人から得られる正常な組織のサンプルを標識されたハイブリダイゼーションプローブと接触させ、プローブが正常な組織が標識される程度よりも有意に異なる程度（例えば、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍）に患者の組織を標識するかどうかを決定することを含む。
【０２６４】
ポリペプチド検出
本発明はさらに、被験体から得られる細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する方法であって、（ａ）被験体から細胞サンプルを得ること、（ｂ）この得られたサンプルにおけるマーカーポリペプチドの量を定量すること、（ｃ）この決定されたマーカーポリペプチドの量を既知の標準と比較して、被験体から得られる細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定すること、を含む方法を提供する。このようなマーカーポリペプチドは、免疫組織化学的分析、ドット−ブロット分析、ＥＬＩＳＡなどにより検出できる。
【０２６５】
抗体
当該分野で知られているいずれのタイプの抗体も、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープと特異的に結合するよう生成させることができる。本明細書において用いられる抗体は、インタクトのイムノグロブリン分子、ならびにその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖを含み、これらは「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、少なくとも６、８、１０、または１２の連続したアミノ酸がエピトープを形成するために必要とされる。しかしながら、非連続的アミノ酸を含むエピトープはさらに多く、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかもしれない。
【０２６６】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体は、治療的に、ならびに免疫化学的分析、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学分析、免疫沈降、または当該分野において公知の他の免疫化学的分析において用いることができる。種々の免疫学的検定を、望ましい特異性を有する抗体を同定するために用いることができる。競合的結合または免疫放射線検定法のための多くのプロトコルは当該分野において周知である。このような免疫学的検定は典型的には、免疫原と特異的に結合する抗体と免疫原との間の複合体形成の測定を含む。
【０２６７】
典型的には、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的分析において用いられる場合、他のタンパク質に関して提供される検出シグナルよりも少なくとも５倍、１０倍、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、免疫化学的分析において他のタンパク質を検出せず、溶液から「乳癌遺伝子」ポリペプチドを免疫沈降させる。
【０２６８】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、ポリクロナール抗体を産生するために、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトなどの哺乳類を免疫するのに用いることができる。もし望ましいならば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン、チログロブリンおよびキーホールリンペットヘモシアニンと接合させることができる。宿主種によって、免疫応答を増やすために種々のアジュバントを用いることができる。このようなアジュバントは、これらに限定されないが、フロインドアジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および界面活性剤（例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含する。ヒトにおいて使用されるアジュバントのなかで、ＢＣＧ（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブムは特に有用である。
【０２６９】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培地における連続継代細胞株による抗体分子の生産のための任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術［Ｋｏｈｌｅｒら、１９８５、（１３６）；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８５、（１３７）；Ｃｏｔｅら、１９８３、（１３８）およびＣｏｌｅら、１９８４、（１３９）］が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２７０】
加えて、キメラ抗体の産生のために開発された技術、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングを用いることができる［Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、（１４０）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、（１４１）；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、（１４２）］。モノクローナル抗体および他の抗体は、治療的に用いられる場合に、患者が抗体に対して免疫反応を起こすのを防止するためにヒト化することもできる。このような抗体は、治療において直接使用するためにヒト抗体に対して配列が十分類似している場合、または少数の重要な残基の変化を必要とする場合がある。個々の残基の部位指向性突然変異誘発によるか、または全体的な相補決性定領域のグレーティング（ｇｒａｔｉｎｇ）により、ヒト配列と異なる残基を置換することにより、齧歯類抗体とヒト配列との間の配列の違いを最小限に抑えることができる。別法として、ＧＢ２１８８６３８Ｂにおいて記載されるように、組換え法を使ってヒト化抗体を産生することができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号において開示されるように、部分的にまたは完全のいずれかでヒト化される抗原結合部を含むことができる。
【０２７１】
別法として、一本鎖抗体の生産について記載された技術を適応して、当該分野で知られる方法により「乳癌遺伝子」ポリペプチドと特異的に結合する一本鎖抗体を産生するためにことができる。関連した特異性を有しているが、別のイディオタイプ組成を有する抗体は、ランダムコンビナトリアルイムノグロブリンライブラリーから鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）により生成することができる［Ｂｕｒｔｏｎ、１９９１、（１４３）］。
【０２７２】
一本鎖抗体はまた、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法を用いて構築することができる［Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６、（１４４）］。一本鎖抗体は一重または二重特異性であり、二価または三価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１４５）において示唆されている。二価二重特異性一本鎖抗体の構築はＭａｌｌｅｎｄｅｒ＆Ｖｏｓｓ、（１４６）において示唆される。
【０２７３】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、後述のように、手動または自動化されたヌクレオチド合成を用いて構築され、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物中にクローニングされ、コード配列を発現させるために細胞中に導入することができる。別法として、一本鎖抗体は、例えば、繊維状ファージ技術［Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５、（１４７）；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３、（１４８）］を使って直接産生することができる。
【０２７４】
リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導することによって、あるいは、イムノグロブリンライブラリーまたは文献［Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、（１４９）とＷｉｎｔｅｒら、１９９１、（１５０）］において開示されている高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生することができる。
【０２７５】
他のタイプの抗体を構築し、本発明の方法において治療的に用いることができる。例えば、ＷＯで９３／０３１５１において開示されるようにキメラ抗体を構築することができる。免疫グロブリンから得られ、ＷＯ９４／１３８０４で記述される抗体のように、多価、多重特異的である結合タンパク質も調製することができる。
【０２７６】
本発明の抗体は、当該分野でよく知られている方法によって精製することができる。例えば、抗体は「乳癌遺伝子」ポリペプチドが結合するカラム上に通すことにより、アフィニティー精製することができる。結合した抗体は次に高い塩濃度を有する緩衝液を使ってカラムから溶出させることができる。
【０２７７】
免疫学的検定が通常、細胞サンプルにおけるタンパク質のレベルを定量するために用いられ、多くの他の免疫測定法技術が当該分野で知られている。本発明は特定の分析法に限定されず、従って、同種および異種の両方の方法を含むことを意図される。本発明に従って実施できる免疫学的検定の例は、蛍光極性化免疫測定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、比濁阻害免疫測定法（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、および放射免疫定量法（ＲＩＡ）を包含する。インジケーター部分、または標識基を対象抗体に結合させることができ、分析装置および適合性免疫学的検定法の利用可能性により決まることが多い様々な方法の使用の要件にあうように選択される。前記の様々な免疫学的検定の実施において用いられる一般的技術は当業者には知られている。
【０２７８】
別の態様において、患者の生物学的液体（例えば、血液または尿）中の配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９または２１〜２６または５３〜７５のポリヌクレオチド配列のいずれかによりコードされる少なくとも１つの産物、または配列番号１〜２６および５３〜７５またはその相補的配列から選択されるポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも２つの産物のレベルは、該患者の細胞におけるマーカーポリヌクレオチド配列の発現のレベルをモニターすることにより定量できる。このような方法は、患者から得られる生物学的液体のサンプルを得ること、コードされるマーカーポリペプチドに特異的な抗体とサンプル（またはサンプル由来のタンパク）を接触させること、抗体による免疫複合体形成の量を定量することを含み、免疫複合体形成量はサンプル中のマーカーのコードする産物のレベルを示す。この定量法は、正常な個体から得られる対照サンプルまたは同じ個人から事前にまたは後に得た１以上のサンプルにおける同じ抗体による免疫複合体の量と比較する場合、特に有益である。
【０２７９】
別の態様において、本発明の方法は、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を定量するために用いることができ、これは次にプラーク形成などの障害の進行と相関させることができる。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞のサンプルが、プラーク関連細胞であるか、またはそのような細胞になりやすい細胞を含むかどうかを予測的に評価するために用いることができる。マーカーポリペプチドレベルの観察は、さらに厳しい治療の使用などに関する決断において用いることができる。
【０２８０】
前記のように、本発明のある局面は、患者から単離された細胞に関して、マーカーポリペプチドのレベルがそのサンプル細胞において著しく低下しているかどうかを決めるための診断分析に関する。「著しく低下」なる用語は、細胞が類似した組織起源の正常細胞に対して低下した細胞量のマーカーポリペプチドを有する細胞表現型を意味する。例えば、細胞は、正常な対照細胞よりも約５０％以下、２５％、１０％、または５％のマーカーポリペプチドを有する。特に、分析は、試験細胞中のマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは測定されたレベルを少なくとも１つの対照細胞、例えば正常細胞および／または既知の表現型の形質転換細胞において検出されるマーカーポリペプチドと比較する。
【０２８１】
本発明について特に重要なのは、正常または異常なマーカーポリペプチドレベルに関連する細胞の数により決められるマーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。特定のマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数は、次に患者予後と相関させることができる。本発明のある態様において、病変のマーカーポリペプチド表現型は、異常に高い／低いマーカーポリペプチドを有することが見いだされる細胞の生検における割合として定量される。このような発現がは免疫組織化学的分析法、ドットブロット分析、ＥＬＩＳＡなどにより検出できる。
【０２８２】
免疫組織化学
組織サンプルが使用される場合、そのマーカーポリペプチド発現型を有する細胞の数を定量するために、免疫組織化学染色を用いることができる。このような染色に関して、
組織のマルチブロックを生検または他の組織サンプルから得、プロテアーゼＫまたはペプシンなどの物質を利用して、タンパク質加水分解に供する。ある態様において、核フラクションをサンプル細胞から単離して、核フラクション中のマーカーポリペプチドのレベルを検出することは望ましい。
【０２８３】
組織サンプルはホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなどの試薬での処理によって固定される。サンプルは次にマーカーポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体と共にインキュベートされる。この抗体は、その後の結合の検出のために標識と結合させることができる。このサンプルを免疫複合体の形成に十分な時間インキュベートする。次に抗体の結合をこの抗体に結合した標識により検出する。抗体が標識されていない場合、第二の標識された抗体、例えば抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプについて特異的な抗体を使用することができる。使用される標識の例には、放射性核種、蛍光、化学ルミネセンス、および酵素が含まれる。
【０２８４】
酵素が利用されている場合、酵素の基質をサンプルに添加して、着色または蛍光性産物を得ることができる。結合体においての使用に適当な酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが含まれる。商業的に入手可能でない場合は、このような抗体酵素接合体は容易に当業者らに公知の技術により容易に産生される。
【０２８５】
ある態様において、分析はドットブロットとして行なわれる。ドットブロット分析は、あらかじめ決められた数の細胞から産生される無細胞抽出物におけるマーカーポリペプチドの量を相関させることにより一つの細胞と関連するマーカーポリペプチドの平均量の定量を可能にするので、組織サンプルが使用される場合に特に有用である。
【０２８６】
さらに別の態様において、本発明は、１以上の本発明のマーカーポリペプチドに対して生成される１以上の抗体を使用することを包含し、該ポリペプチドは配列番号１〜２６または５３〜７５までのいずれかのポリヌクレオチド配列によってコードされる。このような抗体のパネルは、乳癌について信頼性が高い診断プローブとして使用できる。本発明の分析法は、細胞、例えばマクロファージを含む生検サンプルを、１以上のコードされた産物に対する抗体のパネルと接触させて、マーカーポリペプチドの存在または不在を決定することを含む。
【０２８７】
本発明の診断法はまた、処置の追跡としても用いることができ、例えばマーカーペプチドのレベルの定量は、悪性腫瘍、特に乳癌について現在または以前に用いられた治療の有効性、および患者の予後予測に際してのこれらの治療の効果を示す。
【０２８８】
診断は、予後予測法として使用するためにも採用できる。このような用途は、悪性腫瘍の場合にプラーク生成の進行において特徴的な段階で起こる事象に対して本発明の分析法の感度を利用する。例えば、所定のマーカー遺伝子が、非常に早い段階で、おそらくは細胞が泡沫細胞に進化する前に上方または下方調節され、一方、もう一つのマーカー遺伝子はずっと後の段階でのみ特徴的に上方または下方調節される場合がある。このような方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、悪性腫瘍進行の異なる段階の乳癌組織細胞において相異なる特徴的なレベルで発現する所定のマーカーポリペプチドに由来するポリヌクレオチドプローブと接触させる工程、および細胞のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションのおよその量を定量する工程を含み、このような量は細胞における遺伝子の発現のレベルを示すものであり、したがって細胞の疾患の進行の段階を示すものである；別法として、分析は、所定のマーカーポリヌクレオチドの遺伝子産物について特異的な抗体を試験細胞のタンパク質と接触させて行うことができる。このような一連の試験は、ある種の動脈硬化斑の存在を明らかにするだけでなく、医師が疾患について最も適切な処置方法を選択し、処置の成功率を予測できるようにする。
【０２８９】
本発明の方法はまた、所定の乳癌素因の臨床的経過を追跡するためにも用いることができる。例えば、本発明の分析法は、患者からの血液サンプルについて適用することができ；乳癌についての患者を処置した後、別の血液サンプルを採取し、試験を繰り返す。処置が成功すると、乳癌組織細胞に特徴的な明らかな異なる発現が除かれ、おそらくは正常なレベルに近づくか、または正常なレベルを越える。
【０２９０】
ポリペプチド活性
ある態様において、本発明は、１以上の「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を調節する可能性ある治療物質をスクリーニングする方法であって、悪性腫瘍または特に乳癌を有するかまたはその危険性がある被験体における「乳癌遺伝子」の上方調節の結果ポリペプチドの活性が上昇する場合、その治療物質が、悪性腫瘍、特に乳癌を有さないかまたはその危険性がなくその治療薬を処置されていない被験体におけるそのポリペプチドの活性と比較して、ポリペプチドの活性を減少させる方法、を提供する。同様に、「乳癌遺伝子」の下方調節の結果ポリペプチドの活性が悪性腫瘍、特に乳癌を有するかまたはその危険性のある被験体において減少する場合、その治療物質は、悪性腫瘍または特に乳癌を有さないかまたはその危険性がなくその治療薬を処置されていない被験体における同じペプチドの活性と比較してポリペプチドの活性を増大させるであろう。
【０２９１】
表２または３に示す「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性は、当業者らに公知の、特定のポリペプチドにより示される活性の種類について特別な任意の手段により測定できる。特定のポリヌクレオチドの活性を測定するために用いることができる特定の分析法の例を以下に示す：
【０２９２】
ａ）Ｇタンパク質結合レセプター
ある態様において、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドはＧタンパク質結合レセプターをコードできる。ある態様において、本発明は、候補モジュレーターの存在下でレセプターの活性における変化を測定することにより、Ｇタンパク質結合レセプターである可能性のあるモジュレーター（インヒビターまたはアクチベーター）をスクリーニングする方法を提供する。
【０２９３】
１、Ｇｉ結合レセプター
細胞（ＣＨＯ細胞または初代培養細胞など）を適切なレセプターおよび誘導可能なＣＲＥ−−ルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトする。細胞は、５０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修飾イーグル培地／５０％Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（１０％ＦＢＳ添加）（３７℃、１０％のＣＯ２を含む加湿大気中）中で成長させ、２または３日ごとに定期的に１：１０に比で分割する。試験培養は、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２とで適切な濃度（例えば３５μｌの細胞培養培地中１ウェルあたり２０００個の細胞）で３８４−ウェルプレート中に播種し、４８時間（細胞株によって〜２４から６０時間の範囲）成長させる。成長培地を次に、０，１％ＢＳＡを含む無血清培地（ＳＦＭ；例えばＵｌｔｒａ−ＣＨＯ）に交換する。ＤＭＳＯ中に溶解された試験化合物をＳＦＭで希釈し、試験培地（最大最終濃度１０μＭ）へ移し、つづいて１０分後にＳＦＭ＋０，１％ＢＳＡ中フォルスコリン（〜１μＭ、最終濃度）を添加する。アンタゴニストをスクリーニングする場合、適当な濃度のアゴニスト、およびフォルスコリンの両方を添加する。プレートを１０％ＣＯ２中、３７℃で３時間インキュベートする。次に、上清を除去し、細胞を溶解試薬（２５ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８、２ｍＭＤＤＴ、１０％グリセロールおよび３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む）で溶解させる。ルシフェラーゼ反応は基質−緩衝液（例えばルシフェラーゼ分析試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によって開始され、発光をすぐに定量する（例えばＢｅｒｔｈｏｌｄ照度計またはＨａｍａｍａｔｚｕカメラシステム）。
【０２９４】
２．Ｇｓ結合レセプター
細胞（ＣＨＯ細胞または初代培養細胞など）を適切なレセプターおよび誘導可能なＣＲＥ−−ルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトする。細胞は、５０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修飾イーグル培地／５０％Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（１０％ＦＢＳ添加）（３７℃、１０％のＣＯ２を含む加湿大気中）中で成長させ、２または３日ごとに定期的に１：１０に比で分割する。試験培養は、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で適切な濃度（例えば３５μｌの細胞培養培地中１ウェルあたり１０００または２０００個の細胞）で３８４−ウェルプレート中に播種し、４８時間（細胞株によって〜２４から６０時間の範囲）成長させる。０，１％ＢＳＡを含む無血清培地（ＳＦＭ；例えばＵｌｔｒａ−ＣＨＯ）に試験化合物を添加することにより分析を開始する：試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解させ、ＳＦＭで希釈し、試験培地（最大最終濃度１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度＜０．６％）へ移す。プレートを１０％ＣＯ２中、３７℃で３時間インキュベートする。次に、１ウェルあたり１０μｌの試薬（２５ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８、２ｍＭＤＤＴ、１０％グリセロールおよび３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む）で溶解させる。ルシフェラーゼ反応は１ウェルあたり２０μｌ基質−緩衝液（例えばルシフェラーゼ分析試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によって開始される。発光の定量をすぐに開始する（例えばＢｅｒｔｈｏｌｄ照度計またはＨａｍａｍａｔｚｕカメラシステム）。
【０２９５】
３．Ｇｑ結合レセプター
細胞（ＣＨＯ細胞または一次細胞など）を適切なレセプターで安定にトランスフェクトする。細胞は、５０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修飾イーグル培地／５０％Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（１０％ＦＢＳ添加）（３７℃、５％のＣＯ２を含む加湿大気中）中で成長させ、３または４日ごとに定期的に１：１０に比で分割する。試験培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＦＢＳ中で適切な濃度（例えば３５μｌの細胞培養培地中１ウェルあたり２０００個の細胞）で３８４−ウェルプレート中に播種され、４８時間（細胞株によって〜２４から６０時間の範囲）成長させる。成長培地を次に生理学的塩溶液（例えば、Ｔｙｒｏｄｅ溶液）に対して交換する。ＤＭＳＯ中に溶解させた試験化合物を、０．１％ＢＳＡを含むＴｙｒｏｄｅ溶液で希釈し、試験培地（最大最終濃度１０μＭ）へ移す。レセプター特異性アゴニストの添加後、結果として得られるＧｑにより媒介される細胞内カルシウム増加を、適当な読みとりシステム（例えば、カルシウム感受性色素）を用いて測定する。
【０２９６】
ｂ）イオンチャンネル
イオンチャンネルは電気信号、膜貫通シグナル伝達、ならびに電解質および溶質輸送に関与する膜内在性タンパク質である。膜脂質二重層を貫通する巨大分子ポアを形成することにより、イオンチャンネルはイオンの浸透のための電気化学ポテンシャル勾配により促進させられる特定のイオン種の流れを引き起こす。一つの分子レベルで、個々のチャンネルは、「開」状態（イオンを運ぶ）と「閉」状態（運ばない）の間の構造的移行（「ゲーティング」）を経験する。典型的な一つのチャンネル開放は数ミリ秒の間続いて、１０−９−１０−１２アンペアの範囲で基礎膜電流をもたらす。チャンネルゲーティングは神経伝達物質および細胞内のセカンドメッセンジャー（「リガンド依存性」チャンネル）または膜電位（「電位依存性」チャンネル）などの種々の化学的および／または生物物理学的パラメータにより制御される。イオンチャンネルは、そのイオン選択性、ゲーティング特性、およびホルモンおよび薬剤による調節により機能的に特徴づけられる。シグナリングおよび輸送プロセスにおけるその中心的な役割のために、イオンチャンネルは種々の病態生理学的状況において薬理学的療法のための理想的な標的を提示する。
【０２９７】
ある態様において、「乳癌遺伝子」はイオンチャンネルをコードしうる。ある態様において、本発明は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのチャンネル活性の、可能性あるアクチベーターまたはインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。その活性を抑制するかまたは促進するかのいずれかのためのイオンチャンネルと相互作用する化合物のスクリーニングは、生体細胞における（１）結合および（２）機能分析に基づく［Ｈｉｌｌｅ（１８３）］。
【０２９８】
１．リガンド依存性チャンネル、例えば向イオン性神経伝達物質／ホルモンレセプターについて、化合物と標識リガンド間の競合により標的との結合を検出する分析をデザインすることができる。
【０２９９】
２．イオンチャンネル機能を生細胞において機能的に試験することができる。標的タンパクは、内因的に適切なリポーター細胞において発現するかまたは組換えにより導入される。チャンネル活性は、（２．１）イオン透過（最も顕著には、Ｃａ２＋イオン）の濃度変化、（２．２）膜電位勾配における変化、および（２．３）標的活性により誘発または調節される細胞応答（例えば、リポーター遺伝子の発現、神経伝達物質の分泌）の測定によりモニターすることができる。
【０３００】
２．１  チャンネル活性の結果、膜貫通流動が生じる。したがって、イオンチャンネルの活性化は、発光または蛍光インジケーターを用いて、結果として得られる細胞内イオン濃度の変化によりモニターすることができる。その広いダイナミックレンジと適当なインジケーターの利用可能性のために、これは特に細胞内Ｃａ２＋イオン濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の変化に適用される。［Ｃａ２＋］ｉは、例えば、エクオリン発光または蛍光色素技術（例えばＦｌｕｏ−３、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２を使用）により測定できる。標的チャンネル自体を通るＣａ２＋流を直接測定するか、または標的チャンネルの調節が膜電位に影響を及ぼし、それにより共発現する電位依存性Ｃａ２＋チャンネルの活性が影響される細胞分析を設計することができる。
【０３０１】
２．２  イオンチャンネル電流は、電位差蛍光プローブを用いて直接モニターできる膜電位（Ｖｍ）の変化をもたらす。これらの荷電インジケーター（例えばアニオン性オキソノール色素ＤｉＢＡＣ４（３））は電圧の変化に対応して細胞外および細胞内区画の間に再分配する。平衡分配はネルンストの式に支配される。したがって膜電位の変化は、細胞の蛍光に同時に変化をもたらす。ここでも、Ｖｍの変化は、標的イオンチャンネルの活性により直接おこるか、または同じ細胞において共発現するチャンネルによるシグナルの増幅および／または延長により引き起こされる。
【０３０２】
２．３  標的チャンネル活性は、直接的に、またはさらなるＣａ２＋チャンネルの活性化により、細胞Ｃａ２＋流入を引き起こすことができる（２．１参照）。結果として得られる細胞内Ｃａ２＋シグナルは、様々な細胞応答、例えば、分泌または細胞転写、を調節する。従って、標的チャンネルの調節は、標的発現細胞からの公知のホルモン／伝達物質の分泌をモニターするか、またはＣａ２＋感受性プロモーターエレメント（例えば、環状ＡＭＰ／Ｃａ２＋−感受性エレメント；ＣＲＥ）により制御されるリポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の発現により検出できる。
【０３０３】
ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質と転写因子
ある態様において、「乳癌遺伝子」はＤＮＡ結合タンパク質または転写因子をコードしうる。このようなＤＮＡ結合タンパク質または転写因子の活性は、例えば、特定のプロモーターと結合した試験配列の転写を開始するためのＤＮＡ結合タンパク質または転写因子の能力を測定するプロモーター分析により測定することができる。ある態様において、本発明は、転写因子応答性のプロモーターにより調節される試験遺伝子の発現における変化を測定することにより、このようなＤＮＡ結合タンパク質または転写因子の活性を調節する能力について試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０３０４】
ｄ）プロモーター分析
プロモーター分析は、対象とする遺伝子（例えば、甲状腺ホルモン）に調節されるプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子で安定にトランスフェクトされたヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２を用いて構築された。トランスフェクションのために使用されたベクター２ｘＩＲＯｌｕｃは、ｔｋ最小プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子の前に、８ｂｐのスペーサーで分離された２つの１２ｂｐ逆パリンドローム配列の甲状腺ホルモン反応性エレメント（ＴＲＥ）を有する。試験培養物は、無血清イーグル最小基本培地（グルタミン、トリシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、インシュリン、セレン、トランスフェリンを添加）中、９６ウェルプレート中に播種し、１０％ＣＯ２、３７℃で加湿された大気中、培養した。４８時間インキュベーションした後、試験化合物または参照化合物（例えば、ＬＴ３、Ｌ−Ｔ４）および適当ならば共刺激因子（最終濃度１ｎＭ）の連続希釈を細胞培養物に添加し、最適時間（例えばさらに４−７２時間）インキュベーションを続けた。細胞を次に、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびルシフェリンを含む緩衝液の添加により溶解させ、Ｔ３または他の化合物によって誘発されたルシフェラーゼの発光を照度計で測定した。試験化合物のそれぞれの濃度について、４回の反復試験を行った。各試験化合物についてのＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｉｅｎｔｆｉｃソフトウェアの使用により計算した。
【０３０５】
スクリーニング法
本発明は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたは「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドと結合するかまたはその活性を調整する試験化合物をスクリーニングする分析法を提供する。試験化合物は、好ましくは「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する。さらに好ましくは、試験化合物は、試験化合物なしの場合と比較して、「乳癌遺伝子」活性を少なくとも約１０％、好ましくは約５０、いっそう好ましくは約７５、９０、または１００％減少または増大させる。
【０３０６】
試験化合物
試験化合物は当該分野ですでに知られている薬理学的物質であるか、または何らかの薬理学的活性を有することが以前に知られていない化合物である。化合物は天然に存在するか、または研究室で設計することができる。これらは微生物、動物、または植物から単離でき、組換えにより産生することができ、または当該分野で知られている化学的方法により合成することができる。もし望ましいなら、試験化合物を当該分野で公知の、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行した固相または溶液相ライブラリー、デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とする合成ライブラリー法、１ビーズ１化合物ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含むが、これらに限定されない多数のコンビナトリアルライブラリー法のいずれを用いても得ることができる。生物学的ライブラリー法は、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法はポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。［総説については、Ｌａｍ、１９９７、（１５１）参照］。
【０３０７】
分子のライブラリーの合成法は当該分野において一般的である［例えば、ＤｅＷｉｔｔら、１９９３、（１５２）；Ｅｒｂら、１９９４、（１５３）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４、（１５４）；Ｃｈｏら、１９９３、（１５５）；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４、（１５６）とＧａｌｌｏｐら、１９９４、（１５７）参照］。化合物のライブラリーは溶液中［例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２、（１５８）参照］、またはビーズ上［Ｌａｍ、１９９１、（１５９）］、ＤＮＡチップ［Ｆｏｄｏｒ、１９９３、（１６０）］、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド［Ｃｕｌｌら、１９９２、（１６１）］、またはファージ［スコット＆スミス、１９９０、（１６２）；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０、（１６３）；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０、（１６４）；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１、（１６５）］で提示できる。
【０３０８】
ハイスループットスクリーニング
試験化合物は、ハイスループットスクリーニングを使って、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する能力、または「乳癌遺伝子」活性または「乳癌遺伝子」発現に影響を与える能力についてスクリーニングすることができる。ハイスループットスクリーニングを使って、多数の試験化合物を速くスクリーニングできるように、多くの別々の化合物を平行して試験することができる。最も広く確立された技術は９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタプレートを利用する。マイクロタイタプレートのウェルは典型的には５から５００μｌの範囲の分析容積を必要とする。プレートに加えて、マイクロウェルフォーマットに装着する多くの器具、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄装置およびプレートリーダーは商業的に入手可能である。
【０３０９】
別法として、自由なフォーマット分析、またはサンプル間に物理的障壁がない分析を用いることができる。例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーの単純な同種分析において色素細胞（メラニン細胞）を用いる分析法が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、（１６６）により記載されている。細胞を培養皿中アガロースの下に配置し、次いでコンビナトリアル化合物を有するビーズをアガロースの表面上に置く。コンビナトリアル化合物はビーズから部分的に化合物を放出する。活性化合物は、ゲルマトリックス中に局所的に拡散すると細胞の色を変化させるので、暗色色素領域として可視化することができる。
【０３１０】
別の自由なフォーマット分析の例は、Ｃｈｅｌｓｋｙ、（１６７）によって記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、炭酸脱水酵素についての単純な同種酵素分析をアガロースゲルの内部に設置して、ゲル中の酵素がゲル全体にわたって色の変化を引き起こすようにした。その後、フォトリンカーによりコンビナトリアル化合物を有するビーズをゲル内部に置き、化合物をＵＶ光により部分的に放出させた。酵素を阻害する化合物は、色の変化が少ない阻害部分として観察された。
【０３１１】
別の例において、コンビナトリアルライブラリーは、寒天中で成長する癌細胞に細胞毒性効果を及ぼす化合物についてスクリーニングされた［Ｓａｌｍｏｎら、１９９６、（１６８）］。
【０３１２】
別のハイスループットスクリーニング法は、Ｂｅｕｔｅｌら、米国特許第５，９７６，８１３号において記載されている。この方法において、試験サンプルは多孔性マトリックス中に設置される。１以上の分析成分を次に、例えば、ゲル、プラスチックシート、フィルターまたはその他の形態の操作が容易な固体支持体などのマトリックス内、マトリックス上、またはマトリックスの底部に置く。サンプルが多孔性マトリックスに導入されると、これらは、試験サンプルが混合しないで分析を行うことができるように十分ゆっくりと拡散する。
【０３１３】
結合分析
結合分析について、試験化合物は、好ましくは、通常の生物学的な活性が妨げられるように、例えば、酵素のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位または「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性部位と結合し、占拠する小分子である。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
結合分析において、試験化合物または「乳癌遺伝子」ポリペプチドのいずれかは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼなどの蛍光性、放射性同位元素、化学発光性、または酵素標識などの検出可能な標識を含むことができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合する試験化合物の検出は、例えば、放射性発光の直接計測、シンチレーションカウンティング、または検出可能な生成物への適当な基質の変換を測定することにより達成することができる。
【０３１５】
別法として、「乳癌遺伝子」ポリペプチドへの試験化合物の結合は、いずれの相互作用体も標識することなく測定することができる。例えば、ミクロフィジオメーターは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの試験化合物の結合を検出するために用いることができる。ミクロフィジオメーター（例えば、ＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＪ）は、光走査型化学顕微鏡（ＬＡＰＳ）を用いて細胞がその環境を酸性化させる速度を測定する分析機器である。この酸性化速度における変化を、試験化合物と「乳癌遺伝子」ポリペプチド間の相互作用の指標として用いることができる［ＭｃＣｏｎｎｅｌら、１９９２、（１６９）］。
【０３１６】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合する試験化合物の能力を決定することは、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）［Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ＆Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ、１９９１、（１７０）およびＳｚａｂｏら、１９９５、（１７１）］などの技術を使っても達成できる。ＢＩＡ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）は、いずれの相互作用体も標識することなく、リアルタイムの生物特異的相互作用を研究するための技術である。光学現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）における変化は、生体分子の間のリアルタイム反応の指標として使用できる。
【０３１７】
本発明のさらに別の態様において、「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合または相互作用してその活性を調整する他のタンパクを同定するために、ツーハイブリッド分析またはスリーハイブリッド分析において「ベイトタンパク質」として用いることができる［例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３、（１７２）；Ｍａｄｕｒａら、１９９３、（１７３）；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、（１７４）；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３、（１７５）およびＢｒｅｎｔＷＯ９４／１０３００参照］。
【０３１８】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる通常の転写因子のモジュラー性に基づく。簡単にいうと、この分析は２つの異なったＤＮＡ構築物を利用する。例えば、１つの構築物において、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが周知の転写因子（例えば、ＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合されうる。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列を、周知の転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させることができる。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、タンパク質依存性複合体を形成できるならば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは近接させられる。この近接により、その転写因子に応答する転写調節部位と作動可能に結合されたリポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。リポーター遺伝子の発現を検出し、機能的な転写因子を含む細胞コロニーを単離し、それを用いて「乳癌遺伝子」ポリペプチドと相互に作用するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。
【０３１９】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかは、未結合形態の相互作用体の一方または双方を結合形態から分離することを促進するため、また分析の自動化に適応させるために、固定化するのが望ましい。したがって、「乳癌遺伝子」ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。適当な固体支持体は、これらに限定されないが、ガラスまたはプラスチックのスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、またはビーズなどの粒子（ラッテクス、ポリスチレン、またはガラスビーズを含むが、これに限定されない）を包含する。当該分野で知られる任意の方法を、「乳癌遺伝子」ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物を固体支持体に結合させるために用いることができ、それには共有結合および非共有結合、受動的吸収、またはポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物とそれぞれ連結する結合部分のペアおよび固体支持体の使用が含まれる。試験化合物は、好ましくは、個々の試験化合物の位置を追跡できるように固体支持体上に整列させ結合させる。試験化合物の「乳癌遺伝子」ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）との結合は、反応物質を入れるのに適した任意の容器中で行うことができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管を包含する。
【０３２０】
ある態様において、「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドが固体支持体と結合することを可能にするドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、これを次に試験化合物または試験化合物と非吸着「乳癌遺伝子」ポリペプチドと組み合わせ；次に該混合物を複合体形成を行うことができる条件下（例えば、塩およびｐＨについて生理学的な条件下）でインキュベートする。インキュベーション後ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して未結合成分を除去する。相互作用体の結合は、前記のように直接または間接的に定量することができる。別法として、結合を測定する前に、その複合体を固体支持体から分離することができる。
【０３２１】
タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するための他の技術も本発明のスクリーニング分析において用いることができる。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を用いて固定化することができる。ビオチニル化された「乳癌遺伝子」ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物は、当該分野において一般的な技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロックフォード、Ｉｌｌ．）を使ってビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンでコートされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化することができる。別法として、「乳癌遺伝子」ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または試験化合物に特異的に結合するが、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位または「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性部位などの望ましい結合部位と干渉しない抗体を、プレートのウェルに誘導化することができる。未結合標的またはタンパク質は、抗体結合によってウェル中にトラップすることができる。
【０３２２】
このような複合体の検出法は、ＧＳＴ固定化複合体についてすでに記載したものに加えて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたは試験化合物と特異的に結合する抗体を用いた複合体の免疫検出、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を検出することに依存する酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動を包含する。
【０３２３】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する試験化合物のスクリーニングは、インタクトな細胞において行うこともできる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞はいずれも、細胞に基づく分析システムにおいて用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは細胞において天然に発生するものであってもよく、または前記のような技術を用いて導入したものであってもよい。「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの試験化合物の結合は、前記のように定量される。
【０３２４】
遺伝子発現の調整
別の態様において、「乳癌遺伝子」発現を増大させるか、または減少させる試験化合物が同定される。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを試験化合物と接触させ、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのＲＮＡまたはポリペプチド産物の発現を定量する。試験化合物の存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現のレベルを、試験化合物比存在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現のレベルと比較する。そして試験化合物はこの比較に基づいて発現のモジュレーターとして同定される。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下で、非存在下よりも大きい場合、試験化合物はｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質またはエンハンサーであると認知される。別法として、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下で、非存在下よりも少ない場合は、試験化合物はｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターであると認知される。
【０３２５】
ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルのための当該分野で周知の方法により測定することができる。定性的または定量的方法のいずれも用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、および免疫組織化学などの免疫化学的方法を含む当該分野で公知のさまざまな技術を用いて定量できる。別法として、「乳癌遺伝子」ポリペプチド中への標識アミノ酸の組み込みを検出することによって、ポリペプチド合成を、インビボ、細胞培養物中、またはインビトロ翻訳システムにおいて定量することができる。
【０３２６】
このようなスクリーニングは、無細胞分析またはインタクトな細胞のいずれかにおいて実行することができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を細胞に基づく分析システムにおいて用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは細胞において自然に発生し得るか、または前記のような技術を用いて導入することができる。初代培養または、確立された細胞株、例えば、ＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞を用いることができる。
【０３２７】
治療の指標と方法
乳癌の治療法は、主に細胞増殖、細胞成長または血管新生について介入する有効な化学療法剤に依存する。ゲノムによる分子標的同定の出現は、悪性腫瘍患者、特に乳癌患者により安全でより有効な処置を提供する治療的介入のための新規乳癌特異的標的を同定する可能性を開いた。かくして、新たに発見された乳癌関連遺伝子およびその産物は、革新的な処置を開発するための手段として用いることができる。前記のように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターキナーゼの同定は、ある腫瘍患者のサブセットの処置に刺激的な新しい機会を提供する。前述の生理学的プロセスのいずれかにおいて重要な役割を演じる遺伝子を乳癌標的として特徴づけることができる。ゲノミクスにより同定された遺伝子または遺伝子断片は、１以上の異種発現システムにおいて容易に発現させ、機能的組換えタンパク質を産生させることができる。これらのタンパクは、その生化学的特性によりインビボで特徴づけられ、次にその生化学的活性の化学的モジュレーターを同定するハイスループット分子スクリーニングプログラムにおいてツールとして使用される。標的遺伝子発現またはタンパク質活性のモジュレーターをこの方法で同定し、続いて治療活性について細胞およびインビボ疾患モデルにおいて試験することができる。生物学的モデルにおけるリード化合物の反復試験での最適化および詳細な薬物速度論および毒物学分析は、薬剤開発およびその後のヒトにおける試験の基礎を形成する。
【０３２８】
本発明はさらに前記のスクリーニング分析により同定される新規物質の使用に関する。したがって、適当な動物モデルにおいて本明細書において記載されるように同定された試験化合物を使用することは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、本明細書に記載のように同定された物質（例えば、調節物質、アンチセンスポリヌクレオチド分子、特異的抗体、リボザイム、またはヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチド結合分子）を、かかる物質での処置の有効性、有毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて用いることができる。別法として、本明細書において記載されるように同定された物質を、かかる物質の作用のメカニズムを決定するために動物モデルにおいて使用することができる。さらに、本発明は本明細書に記載される処置のための前記スクリーニング分析により同定される新規物質の使用に関する。
【０３２９】
ヒト「乳癌遺伝子」活性に影響を与える試薬を、インビトロまたはインビボのいずれかでヒト細胞に投与して、ヒト「乳癌遺伝子」活性を増大させるかまたは減少させることができる。試薬は好ましくはヒト「乳癌遺伝子」の発現産物と結合する。もし発現産物がタンパク質であるなら、試薬は好ましくは抗体である。ヒト細胞のエクスビボでの処置のために、抗体を、身体から取り出された幹細胞の調製物に添加することができる。次にその細胞を当該分野で知られているように、クローンの増殖の有無にかかわらず、同一または別の人体において置換することができる。
【０３３０】
ある態様において、試薬はリポソームを使って送達される。好ましくは、リポソームは少なくとも約３０分、さらに好ましくは少なくとも約１時間、さらにいっそう好ましくは少なくとも約２４時間、投与された動物において安定である。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドに、ヒトなどの動物における特定の部位を標的とさせることができる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームの脂質組成物は、肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節、および皮膚などの動物の特定の器官を標的とすることができる。
【０３３１】
本発明において有用なリポソームには、その内容物を細胞に送達するために標的細胞の原形質膜と融合することができる脂質組成物が含まれる。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は、約１０６の細胞に送達される１６ナノモルのリポソームにつき０．５μｇのＤＮＡであり、さらに好ましくは約１０６の細胞に配達される１６ナノモルのリポソームにつき約１．０μｇのＤＮＡであり、さらに一層好ましくは約１０６の細胞に送達される１６ナノモルのリポソーム当たり約２．０μｇのＤＮＡである。好ましくは、リポソームは直径が約１００から５００ｎｍの間であり、さらに好ましくは約１５０から４５０ｎｍの間であり、さらにいっそう好ましくは約２００から４００ｎｍの間である。
【０３３２】
本発明における使用に適当なリポソームには、例えば、当業者らに公知の遺伝子送達法において通常用いられるリポソームが含まれる。さらに好ましいリポソームは、多カチオン性脂質組成物および／またはポリエチレングリコールと結合したコレステロール主鎖を有するリポソームを有するリポソームを包含する。所望により、リポソームは、リポソームを特定の細胞タイプ、例えばリポソームの外部表面上に露出された細胞特異的リガンドを標的とすることができる化合物を含む。
【０３３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムなどの試薬とのリポソームの複合体形成は、当該分野において標準的な方法を用いて達成できる（例えば、米国特許第５，７０５，１５１号参照）。好ましくは、約０．１μｇから約１０μｇのポリヌクレオチドを約８ナノモルのリポソーム、さらに好ましくは約０．５μｇから約５μｇのポリヌクレオチドを約８ナノモルのリポソームと組み合わせ、いっそうさらに好ましくは、約１．０μｇのポリヌクレオチドを約８ナノモルのリポソームと組み合わせる。
【０３３４】
別の態様において、レセプターにより媒介される標的化送達を用いて抗体をインビボで特定の組織に送達できる。レセプターにより媒介されるＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、１９９３、（１７６）；Ｃｈｉｏｕら、１９９４、（１７７）；Ｗｕ＆Ｗｕ、１９８８、（１７８）；Ｗｕら、１９９４、（１７９）；Ｚｅｎｋｅら、１９９０、（１８０）；Ｗｕら、１９９１、（１８１）に記載される。
【０３３５】
治療上有効な投与量の決定
治療上有効な量の決定は当業者らの能力範囲内である。治療上有効な投与量は、治療上有効な投与量が存在しない場合に起こるヒト「乳癌遺伝子」活性と比較してヒト「乳癌遺伝子」活性を増大または減少させる活性成分の量を意味する。
【０３３６】
いずれの化合物についても、治療上有効な投与量は、はじめに細胞培養分析または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタにおいて評価できる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために用いることができる。このような情報は次にヒトにおいて有用な投与量および投与経路を決定するために用いることができる。
【０３３７】
治療の有効性と毒性、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な投与量）は、細胞培養または実験動物において標準的製薬手順により決定することができる。毒性と治療効果の投与量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。
【０３３８】
高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養分析および動物研究から得られるデータは、ヒトの使用のための投与量範囲の設定において用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路によってこの範囲内で変化する。
【０３３９】
正確な投与量は、処置を必要とする被験体に関連するファクターを考慮に入れて担当医により決定されるであろう。投与量と投与は、活性成分の十分なレベルを提供するため、または望ましい効果を維持するために調整される。考慮される因子は、病状の重さ、被験体の全体的な健康状態、被験体の年齢、体重、および性、食餌、投与の時間および頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する寛容性／応答を包含する。長期間作用性の医薬組成物は、特定の剤型の半減期およびクリアランス率によって、３から４日ごと、毎週、または２週ごとに投与することができる。
【０３４０】
標準的な投与量は、投与経路によって、約０．１ｇ〜１０００００μｇから最大で約１ｇの投与量まで変化し得る。特定の投与量および送達法についての手引きは、文献に記載され、当該分野における当業者により一般に利用可能である。当業者らは、タンパク質またはそのインヒビターと異なる製剤をヌクレオチドに用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置に特異的である。
【０３４１】
もし試薬が一本鎖抗体であるなら、その抗体をコードするポリヌクレオチドを組み立て、これらに限定されないが、トランスフェリン−ポリカチオンにより媒介されるＤＮＡトランスファー、裸のまたは封入された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡでコートされたラテックスビーズの細胞内輸送、原形質体融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、およびＤＥＡＥまたはリン酸カルシウム媒介トランスフェクションを含むよく確立された技術を用いて、エクスビボまたはインビボのいずれかで細胞中に導入することができる。
【０３４２】
抗体の有効なインビボ投与量は、患者の体重１ｋｇあたり約５μｇから約５０μｇ、約５０μｇから約５ｍｇ、約１００μｇから約５００μｇ、および約２００から約２５０μｇの範囲である。一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドの投与について、有効なインビボ投与量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０３４３】
もし発現産物がｍＲＮＡであるなら、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、前記のようにいろいろな方法によって細胞に導入することができる。
【０３４４】
好ましくは、試薬は、「乳癌遺伝子」遺伝子の発現または「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を試薬が存在しない場合と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、いっそう好ましくは約７５、９０、または１００％減少させる。「乳癌遺伝子」遺伝子の発現または「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性のレベルを減少させるために選択されたメカニズムの有効性は、ヌクレオチドプローブの「乳癌遺伝子」特異的なｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの免疫学的検出、または「乳癌遺伝子」活性の測定などの当該分野において周知の方法を用いて算定することができる。
【０３４５】
前記の任意の態様において、本発明の医薬組成物はいずれも、他の適切な治療物質との組み合わせにて投与することができる。当業者は、従来の製薬の原理にしたがい、組み合わせ療法における使用に適切な薬剤の選択を行うことができる。治療物質の組み合わせは、前記の種々の障害の処置または予防を行うために相乗的に作用することができる。この方法を使って、低用量の各薬剤で治療効果を達成することができ、有害な副作用の可能性を減らすことができる。
【０３４６】
前記の治療法はいずれも、このような治療を必要としている被験体、例えば、トリおよび哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、サル、最も好ましくは、ヒトを含む任意の被験体に適用することができる。
【０３４７】
本開示において引用されるすべての特許および特許出願は引用により明示的に本発明に含まれる。前記開示は一般的に現在の発明を説明する。例示のみの目的で提供されて本発明の範囲を制限することが意図されない次の具体的な実施例を参照することにより、さらによく理解できる。
【０３４８】
医薬組成物
本発明はまた治療効果を達成するために患者に投与することができる医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチド、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体、または模倣物、「乳癌遺伝子」ポリペプチド活性のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターを含むことができる。組成物は単独でまたは少なくとも１つの他の物質、例えば安定剤との組み合わせにおいて投与することができ、これは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含む（これらに限定されない）滅菌生体適合性医薬担体中で投与することができる。組成物は単独で、または他の物質、医薬またはホルモンと組み合わせて患者に投与することができる。
【０３４９】
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬上用いることができる調製物中の活性化合物の処理を容易にする賦形剤および助剤などの適当な医薬上許容される担体を含むことができる。本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹膜組織内、鼻内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を含むが、これらに限定されない多くの経路により投与することができる。経口投与用医薬組成物は、経口投与に適した投与量にて、当該分野で一般的な、医薬上許容される担体を用いて処方することができる。このような担体により、患者が摂取するために、医薬組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして処方することが可能になる。
【０３５０】
経口用医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、所望により得られる混合物を粉砕し、適当な助剤を添加した後、顆粒混合物を加工することにより、望ましいならば錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質フィラー、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。もし望ましいなら、崩壊剤または可溶化剤、たとえば架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを添加することができる。
【０３５１】
糖衣錠コアは、適当なコーティング、例えば、濃縮糖溶液と組み合わせて用いることができ、このコーティングまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶剤または溶剤混合物を含むことができる。製品の識別または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴づけるために、色素または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【０３５２】
経口で用いることができる医薬調製物には、ゼラチンでできたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびコーティング、例えば、グリセロールまたはソルビトールからできたソフトシールドカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、フィラーまたはバインダー、例えば、ラクトースまたはデンプン、滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および所望により安定剤と混合した活性成分を含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、適当な液体、例えば、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール（安定剤を含むかまたは含まない）中に溶解または懸濁させることができる。
【０３５３】
非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的緩衝塩溶液などの生体適合性緩衝液中で製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含むことができる。加えて、活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶剤またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーに用いることができる。所望により、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増大させる適当な安定剤または物質も含むことができる。局所または経鼻投与のために、浸透させようとする特定のバリヤに適当な浸透剤を製剤中に用いることができる。このような浸透剤は当該分野において一般的に知られている。
【０３５４】
本発明の医薬組成物は、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスにより、当該分野において公知の方法で製造することができる。医薬組成物は、塩として提供することができ、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多くの酸を用いて形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性または他のプロトン性溶剤中により可溶性である傾向がある。他の場合においては、好ましい製剤は：１５０ｍＭのヒスチジン、０．１％２％のスクロース、および２７％のマンニトール（４．５から５．５までのｐＨ範囲）のうちのいずれかまたは全部を含むことができる凍結乾燥粉末であり、これは使用の前に緩衝液と組み合わせられる。
【０３５５】
製剤および投与のための技術に関しての詳細は、レミントンの製薬の科学（１８２）の最新版において記載されている。医薬組成物は調製された後、適切な容器中に入れ、適応症の処置のためにラベルをはることができる。このようなラベルには、投与量、投与頻度および投与方法が含まれる。
【０３５６】
材料および方法
乳癌に関与している遺伝子を同定するための一つの方法は、疾患関連状態と非疾患状態の下で差次的に発現する遺伝子を検出することである。以下のサブセクションは、このような差次的に発現する遺伝子を検出するために用いることができる多くの実験的システムを記載する。一般に、これらの実験的なシステムは、被験体またはサンプルが乳癌と関連する方法において処置される少なくとも１つの実験条件、およびそれに加えてこのような疾患に関連する処置を欠く少なくとも１つの実験対照条件を含む。後述されるように、差次的に発現した遺伝子は、実験および対照条件間で遺伝子発現のパターンを比較することにより検出される。
【０３５７】
特定の遺伝子が１つのこのような実験の使用により同定されると、その発現パターンは、別の実験においてその発現を研究することによってさらに特徴づけることができ、その知見は独立した技術によって実証できる。乳癌における特定の遺伝子の役割と相対的な重要性を見分ける際、このような多数の実験の使用は有用である。乳癌患者から得られる細胞における遺伝子発現パターンを、インビトロ細胞培養モデルにおけるパターンと比較する複合法により、乳癌の発生および／または進行に関連する経路についての重要なヒントが得られる。
【０３５８】
悪性腫瘍および乳癌に関与する差次的に発現した遺伝子の同定のために利用できる実験には、たとえばシグナル伝達に関与する遺伝子を分析するために設計された実験がある。このような実験は細胞の増殖に関与する遺伝子を同定するのに役立つ。
【０３５９】
乳癌に関与する遺伝子の同定のための方法を以下に記載する。これは、正常、または非乳癌状態または臨床観察に基づく実験的操作後の発現と比較して、乳癌状態において差次的に発現する遺伝子を表す。このような差次的に発現する遺伝子は、「標的」および／または「マーカー」遺伝子を表す。このような差次的に発現する遺伝子のさらなる特徴決定のための方法、および標的および／またはマーカー遺伝子としての同定のための方法を以下に記載する。
【０３６０】
別法として、差次的に発現する遺伝子は、正常状態と乳癌状態、または対照条件と実験条件下で、調節された、すなわち、量的に増大または減少した発現を有する。発現が正常と乳癌または対照状態と実験状態において異なる程度は、標準的特徴決定技術、例えば、後述のディファレンシャルディスプレー技術により可視化するのに十分な大きさであればよい。発現の差を可視化できる他のこのような標準的特徴決定技術は、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびノザン分析を含むが、これに限定されるわけではなく、これらは当業者には一般的である。
【０３６１】
本発明の一部として方法を記載するが、これは例示であって限定ではなく、以下の局面の一部を表す：
１．少なくとも２つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための方法であって、該マーカーが悪性腫瘍において変化した１つの染色体領域に位置する遺伝子およびその断片またはゲノム核酸配列であることを特徴とする方法。
２．少なくとも２つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための方法であって、該マーカーが、
ａ）悪性腫瘍において変化した１以上の染色体領域に位置する遺伝子；および
ｂ）
ｉ）レセプターおよびリガンド；または
ｉｉ）同一シグナル伝達経路のメンバー；または
ｉｉｉ）相乗的シグナル伝達経路のメンバー；または
ｉｖ）拮抗的シグナル伝達経路のメンバー；または
ｖ）転写因子および転写因子結合部位
であることを特徴とする方法：
３．悪性腫瘍が、乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、食道癌、間葉性癌、膀胱癌、または非小細胞肺癌である、局面１または２の方法。
４．少なくとも１つの染色体領域が以下の細胞遺伝学的領域と規定される、局面１または２に記載の方法：１ｐ１３、１ｑ３２、３ｐ２１−ｐ２４、５ｐ１３−ｐ１４、８ｑ２３−ｑ２４、１１ｑ１３、１２ｑ１３，１７ｑ１２−ｑ２４、または２０ｑ１３。
５．少なくとも１つの染色体領域が細胞遺伝学的領域１７ｑ１１．２−２１．３と規定され、かつ悪性腫瘍が、乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、食道癌、間葉性癌、膀胱癌、または非小細胞肺癌である、局面１または２の方法。
６．少なくとも１つの染色体領域が細胞遺伝学的領域３ｐ２１−２４と規定され、かつ悪性腫瘍が、乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、食道癌、間葉性癌、膀胱癌、または非小細胞肺癌である、局面１または２の方法。
７．少なくとも１つの染色体領域が細胞遺伝学的領域１２ｑ１３と規定され、かつ悪性腫瘍が、乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、食道癌、間葉性癌、膀胱癌、または非小細胞肺癌である、局面１または２の方法。
８．ＶＮＴＲ、ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、またはＳＴＳである少なくとも１つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための方法であって、該マーカーが悪性腫瘍において増幅のため変化した１つの染色体領域上に位置し、かつ該マーカーを同じ個体の癌性および非癌性の組織または生物学的サンプルにおいて検出する方法。
９．マーカーが以下のＶＮＴＲからなる群より選択される、局面８の方法：
Ｄ１７Ｓ９４６、Ｄ１７Ｓ１１８１、Ｄ１７Ｓ２０２６、Ｄ１７Ｓ８３８、Ｄ１７Ｓ２５０、Ｄ１７Ｓ１８１８、Ｄ１７Ｓ６１４、Ｄ１７Ｓ２０１９、Ｄ１７Ｓ６０８、Ｄ１７Ｓ１６５５、Ｄ１７Ｓ２１４７、Ｄ１７Ｓ７５４、Ｄ１７Ｓ１８１４、Ｄ１７Ｓ２００７、Ｄ１７Ｓ１２４６、Ｄ１７Ｓ１９７９、Ｄ１７Ｓ１９８４、Ｄ１７Ｓ１９８４、Ｄ１７Ｓ１８６７、Ｄ１７Ｓ１７８８、Ｄ１７Ｓ１８３６、Ｄ１７Ｓ１７８７、Ｄ１７Ｓ１６６０、Ｄ１７Ｓ２１５４、Ｄ１７Ｓ１９５５、Ｄ１７Ｓ２０９８、Ｄ１７Ｓ５１８、Ｄ１７Ｓ１８５１、Ｄ１１Ｓ４３５８、Ｄ１７Ｓ９６４、Ｄ１９Ｓ１０９１、Ｄ１７Ｓ１１７９、Ｄ１０Ｓ２１６０、Ｄ１７Ｓ１２３０、Ｄ１７Ｓ１３３８、Ｄ１７Ｓ２０１１、Ｄ１７Ｓ１２３７、Ｄ１７Ｓ２０３８、Ｄ１７Ｓ２０９１、Ｄ１７Ｓ６４９、Ｄ１７Ｓ１１９０、およびＭ８７５０６。
１０．マーカーが以下のＳＮＰからなる群より選択される、局面８の方法：
ｒｓ２２３０６９８、ｒｓ２２３０７００、ｒｓ１０５８８０８、ｒｓ１８０１２００、ｒｓ９０３５０６、ｒｓ２３１３１７０、ｒｓ１１３６２０１、ｒｓ２９３４９６８、ｒｓ２１７２８２６、ｒｓ１８１０１３２、ｒｓ１８０１２０１、ｒｓ２２３０７０２、ｒｓ２２３０７０１、ｒｓ１１２６５０３、ｒｓ３４７１、ｒｓ１３６９５、ｒｓ４７１６９２、ｒｓ５５８０６８、ｒｓ１０６４２８８、ｒｓ１０６１６９２、ｒｓ５２０６３０、ｒｓ７８２７７４、ｒｓ５６５１２１、ｒｓ２５８６１１２、ｒｓ５３２２９９、ｒｓ２７３２７８６、ｒｓ１８０４５３９、ｒｓ１８０４５３８、ｒｓ１８０４５３７、ｒｓ１１４１３６４、ｒｓ１２２３１、ｒｓ１１３２２５９、ｒｓ１１３２２５７、ｒｓ１１３２２５６、ｒｓ１１３２２５５、ｒｓ１１３２２５４、ｒｓ１１３２２５２、ｒｓ１１３２２６８、およびｒｓ１１３２２５８。
１１．少なくとも１つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための方法であって、以下から選択されるマーカーを検出することを特徴とする方法：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７６、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｃ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｅ）（ａ）から（ｅ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ配列によりコードされる精製ポリペプチド；
ｆ）配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５、４７〜５２、７６〜９８、または３９３〜３９６の配列の少なくとも１つを含む精製ポリペプチド。
１２．少なくとも２つのマーカーを検出することによる悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための方法であって、以下から選択される少なくとも２つのマーカーを検出することを特徴とする方法：
ａ）配列番号１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ
ｅ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ配列によりコードされる精製ポリペプチド；
ｆ）配列番号２７〜５２、または７６〜９８、または３９３〜３９６の配列を少なくとも１つ含む精製ポリペプチド。
１３．検出方法がＰＣＲ、アレイ、またはビーズの使用を含む、局面１から１２のいずれかの方法。
１４．局面１から１３のいずれかの方法を実施するための説明書を含む診断キット。
１５．以下を含む、悪性腫瘍の予測、診断、または予後予測のための組成物：
ａ）以下のための検出用物質（ａｇｅｎｔ）：
ｉ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｉｉ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｉｖ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ
ｖ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ配列によりコードされるポリペプチド、
ｖｉ）配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５、４７〜５２、７６〜９８、または３９３〜３９６の配列の少なくとも１つを含むポリペプチド、
または、
ｂ）以下から選択される少なくとも２つのマーカーのための少なくとも２つの検出用物質：
ｉ）配列番号１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチド；
ｉｉ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉｖ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチド
ｖ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
ｖｉ）配列番号２７〜５２、７６〜９８、または３９３〜３９６の配列の少なくとも１つを含むポリペプチド。
１６．複数のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含むアレイであって、以下から選択される各ポリヌクレオチドが固体支持体に結合しているアレイ：
ａ）配列番号１〜２６、または５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ。
１７．以下：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログによりコードされるポリペプチドの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）試験化合物を（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも１つのポリペプチドと接触させる工程；および
ｉｉ）該試験化合物の該ポリペプチドに対する結合を検出する工程、ここで該ポリペプチドに結合する試験化合物は、悪性腫瘍の予防または処置を目的として該ポリペプチドの活性を調節するための可能性ある治療用物質として同定される。
１８．以下：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログによりコードされるポリペプチドの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）試験化合物を（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも１つのポリペプチドと接触させる工程；および
ｉｉ）表２または３においてそれぞれの配列について特定されるポリペプチドの活性を検出する工程、ここで、該活性を増大させる試験化合物は悪性腫瘍において該ポリペプチドの活性を増大させるための可能性ある予防また治療物質として同定され、該活性を減少させる試験化合物は悪性腫瘍において該ポリペプチドの活性を減少させるための可能性ある予防また治療物質として同定される。
１９．以下：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）試験化合物を（ａ）から（ｄ）において特定される少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログと接触させる工程；および
ｉｉ）該試験化合物の該ポリヌクレオチドに対する結合を検出する工程、ここで該ポリヌクレオチドに結合する試験化合物は、悪性腫瘍において該ポリヌクレオチドの活性を調節するための可能性ある予防または治療物質として同定される。
２０．悪性腫瘍の予防、予測、診断、予後予測のための組成物または悪性腫瘍を処置するための医薬の調製における、以下のいずれかの使用：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ、
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｅ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列の１つを特異的に標的とするアンチセンス分子；
ｆ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ配列によりコードされる精製ポリペプチド；
ｇ）配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５、４７〜５２、７６〜９８または３９３〜３９６の配列の少なくとも１つを含む精製ポリペプチド；
ｈ）（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチドまたは（ｆ）および（ｇ）において特定されるポリペプチドのいずれかと結合することができる抗体；
ｉ）局面１７から１９のいずれかの方法により同定される、（ａ）から（ｄ）において特定されるポリヌクレオチド配列または（ｆ）および（ｇ）において特定されるポリペプチドの量または活性を調節する試薬。
２１．疾患が乳癌である、局面２０の使用。
２２．局面１７から１９のいずれかの方法により同定される、以下からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調節する試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログによりコードされるポリペプチド、
ｂ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログによりコードされるポリペプチド；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログよりコードされるポリペプチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログによりコードされるポリペプチド；または
ｅ）配列番号２８〜３２、３４、３５、３７〜４２、４４、４５、４７〜５２、７６〜９８、または３９３〜３９６の配列の少なくとも１つを含むポリペプチド。
２３．局面１７から１９のいずれかの方法により同定される、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログの活性を調節する試薬：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｂ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｃ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｄ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ。
２４．以下：
ａ）以下からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含む発現ベクター：
ｉ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｉｉ）（ａ）において特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により（ａ）および（ｂ）において特定されるポリヌクレオチドとは異なる配列を有し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
ｉｖ）（ａ）から（ｃ）において特定されるポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表し、かつ表２または３においてそれぞれの配列について特定される生物学的機能と同じ機能を発揮するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ；
または局面２２または２３の試薬および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
２５．悪性腫瘍の危険性のある被験体または悪性腫瘍を有する被験体由来の細胞における以下の値を含む、コンピューター読み取り可能媒体：
ａ）配列番号２〜６、８、９、１１〜１６、１８、１９、２１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の発現レベルを表す少なくとも１つのデジタルコード値、
ｂ）配列番号１〜２６、５３〜７５、または３１５〜３１８から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチド配列の発現レベルを表す少なくとも２つのデジタルコード値。
２６．変化した染色体領域に位置する遺伝子によりコードされる個々のｍＲＮＡの相対量を検出することを特徴とする、染色体変化の検出方法。
２７．１以上の染色体領域のコピー数を定量的ＰＣＲにより検出することを特徴とする、染色体変化の検出方法。
【０３６２】
実施例１
発現のプロファイリング
ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現のプロファイリング
定量的ＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、興味のあるゲノム領域を挟むプライマーおよびその間にハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用する。ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、フォスターシティー、ＣＡ、ＵＳＡ）のＰＲＩＳＭ７７００配列検出システムと蛍光リポーター色素およびクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる蛍光原プローブの技術を用いて、このような発現測定を行なうことができる。プローブ特異的産物の増幅はプローブの切断を引き起こし、リポーター蛍光の増加を生み出す。プライマーおよびプローブは、プライマーエクスプレスソフトウェアを使って選択されて、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ９５Ａ−ＥまたはＨＧ−Ｕ１３３ＡＢＤＮＡチップの構築のために用いられるプローブ配列の相対的位置に従ってコード配列の３’領域または３’非翻訳領域にほとんど局在化していた（プライマーおよびプローブの配列については表５参照）。すべてのプライマーペアは慣用のＰＣＲ反応により特異性についてチェックした。ＧＡＰＤＨは分析したサンプルにおいて差次的に調節されていないので、サンプルＲＮＡの量を標準化するためにＧＡＰＤＨを参照として選択した。ＴａｑＭａｎ確認実験を行い、標的および対照の増幅の効率はほぼ等しいことを示したが、このことは当業者に公知の比較ΔΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的定量化のために必須条件である。
【０３６３】
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒにより提供される技術と同様に、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．から得られるＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．から得られるｉＣｙｃｌｅｒのような他の技術を用いることができる。
【０３６４】
ｂ）ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現プロファイリング
発現プロファイリングは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて行うことができる。ｍＲＮＡのこのようなＤＮＡアレイまたはＤＮＡチップとのハイブリダイゼーションによって、アレイのある特定の位置でのシグナルの強さによりそれぞれの転写物の発現値を同定することが可能である。通常、これらのＤＮＡアレイはｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはサブクローニングしたＤＮＡ断片のスポッティングにより得られる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術の場合、約４００．０００の個々のオリゴヌクレオチド配列が別個の位置においてシリコンウエハー表面上で合成された。オリゴマーの最小の長さは１２ヌクレオチド、好ましくは２５ヌクレオチド、または問題となる転写物の完全長である。発現のプロファイリングは、ナイロンまたはニトロセルロース膜に結合したＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。ハイブリダイゼーションから得られるシグナルの検出は、比色性、蛍光性、電気化学的、電子的、光学的または放射性読み取りのいずれによっても得ることができる。アレイ構築の詳細な説明は前述され、また引用した他の特許に記載されている。分析すべき染色体領域における量的および質的な変化を決定するために、このようなゲノム変化を含んでいると思われる腫瘍組織から得られるＲＮＡを、良性組織（例えば上皮乳房組織、または顕微解剖された管組織）から抽出したＲＮＡと、全トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の発現プロファイリングに基づいて比較しなければならない。サンプル調製プロトコルは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析マニュアル（サンタクララ、ＣＡ）をわずかに改変して用いた。良性組織、生検、細胞単離物または細胞含有体液からの全ＲＮＡの抽出および単離は、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、ロックビル、ＭＤ）およびＯｌｉｇｏｔｅｘｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使って行うことができ、濃度を１ｍｇ／ｍｌにするためにエタノール沈降工程を行うべきである。５−１０ｍｇのｍＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により二本鎖ＤＮＡを作成した。第一のストランドｃＤＮＡ合成はＴ７−（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドを用いて開始した。ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させて、最終濃度１ｍｇ／ｍｌにすることができる。生成したｃＤＮＡから、Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）インビトロ転写キットを使ってｃＲＮＡを合成することができる。同じ工程の中で、ｃＲＮＡはビオチンヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）で標識することができる。標識およびクリーンアップ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ（ドイツ））後、ｃＲＮＡを次に適当な断片化用緩衝液（例えば、４０ミリのＴｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、３０ｍＭのＭｇＯＡｃ、９４℃で３５分間）中で断片化する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルのように、断片化されたｃＲＮＡを、それぞれ約４０．０００のプローブされた転写物を含むＨＧ＿Ｕ１３３アレイ上で、２４時間、６０ｒｐｍで、４５℃のハイブリダイゼーションオーブン中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション工程後、チップ表面を洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルイディクスステーションにおいてストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色しなければならない。染色を増幅するために、第二の標識工程を導入することができ、これは推奨されるが強制ではない。抗ストレプトアビジンビオチニル化抗体をＳＡＰＥ溶液に２回添加する。プローブアレイへのハイブリダイゼーションは、蛍光分析スキャニング（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ遺伝子アレイスキャナー；Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、パロアルト、ＣＡ）により検出できる。
【０３６５】
ハイブリダイゼーションとスキャニングの後に、マイクロアレイ像を品質管理のために解析し、ハイブリダイゼーションシグナルにおける主要なチップ欠陥または異常を探すことができる。そのためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＭＡＳ  ５．０ソフトウェアまたは他のマイクロアレイ画像解析ソフトウェアを利用することができる。一次データ分析は製造業者により提供されたソフトウェアによって実行されるべきである。
【０３６６】
遺伝子分析の場合、本発明のある態様において、一次データは別のバイオインフォマティクスツールおよびさらなるフィルター基準によって分析された。生物情報分析は以下に詳細に記述される。
【０３６７】
ｃ）データ解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ測定技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ、サンタクララ、ＣＡ）に従って、１つのチップ上での一つの遺伝子の発現測定により平均差分値（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｖａｌｕｅ）と絶対的コール（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｃａｌｌ）が得られる。それぞれのチップは、遺伝子またはｃＤＮＡクローンにつき１６から２０のオリゴヌクレオチドプローブペアを含む。これらのプローブペアには完全にマッチするセットおよびミスマッチするセットが含まれ、その双方が、完全なマッチの強度からミスマッチの強度を引くことにより計算される各プローブペアの強度の差の尺度である、差平均（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）または発現値の計算に必要である。これは、蛍光強度に影響を与えうるプローブペアおよび他のハイブリダイゼーション人為要素間でのハイブリダイゼーションにおける変動性を考慮に入れる。差平均は該遺伝子の発現値を表すと思われる数値である。絶対的コールは値「Ａ」（不在）、「Ｍ」（ほとんどなし）、または「Ｐ」（存在）をとることができて、一つのハイブリダイゼーションの質を示す。本発明者らは差平均によって与えられる量的情報と絶対的コールによって与えられる質的情報の両方を用いて、正常集団由来の生物学的サンプルに対して乳癌を有する個人由来の生物学的サンプルにおいて差次的に発現する遺伝子を同定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ以外のアルゴリズムを用いて、本発明者らは同じ発現値と比較による発現差を表す別の数値を得た。
【０３６８】
正常な集団と比較した乳癌グループの１つにおける差次的発現Ｅは次のようにして計算される：乳癌集団におけるｎ個の平均差分値ｄ１、ｄ２、・・・、ｄｎと正常集団におけるｍ個の平均差分値ｃ１、ｃ２、・・・、ｃｍが与えられると、次式によりコンピューターで計算される：
【数１】
2007512807.tif 000002
もしｉとｊの１つ以上の値についてｄｊ＜５０またはｃｉ＜５０であるならば、これらの特定の値ｃｉおよび／またはｄｊは「人工の」発現値５０にセットされる。これらのＥの特定の計算によりＴａｑＭａｎ結果を正しく比較できる。
【０３６９】
もしＥ＞１．５であるなら、またもし乳癌集団における「Ｐ」に等しい絶対的コールの数がｎ／２より大きいなら、遺伝子は乳癌対正常において上方調節されるとよばれる。
【０３７０】
もしＥ＜１．５であるなら、またもし正常集団における「Ｐ」に等しい絶対的コールの数がｍ／２より大きいなら、遺伝子は正常に対して乳癌において下方調節されているといわれる。
【０３７１】
差次的に調節された遺伝子の最終のリストは、正常な集団から得られる生物学的サンプルに対して乳癌を有する個人から得られる生物学的サンプルにおいて上方調節および下方調節されたすべての遺伝子からなる。製薬用途にとって興味深いこのリストの遺伝子は、最終的にＴａｑＭａｎによって実証された。転写物の発現値／挙動の間の良好な相関関係が両方の技術で観察できた場合、そのような遺伝子は表１から３に記載する。
【０３７２】
同定されたＡＲＣＨＥＯＮの中の単一の遺伝子の差別的な発現についての情報だけでなく、いくつかのメンバーの共調節に関する情報もまた、予測、診断、予防および治療目的のために重要であるので、本発明者らは、所定の腫瘍サンプルの全トランスクリプトーム像を明らかにするために、発現データを公共の利用可能なデータベースから得た染色体の位置（例えばゴールデンパス）についての情報と組み合わせた。この技術により、ゲノムの既知の領域または予想される領域を調査できるだけでなく、さらに価値のある、染色体連鎖を伴う新規な脱調節領域を同定できる。これは他のタイプの腫瘍またはウイルスの組み込みおよび染色体再配列において価値がある。ＳＱＬに基づくデータベース検索によって、発現、測定の質的な値（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマス５．０ソフトウェアによって示される）、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション以外の他の技術から得られる発現値および染色体連鎖に関する情報を得ることができる。
【０３７３】
実施例２
ＡＲＣＨＥＯＮの同定
ａ）遺伝子または遺伝子プローブ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイＨＧ−Ｕ９５Ａ−ＥまたはＨＧ−Ｕ１３３Ａ−Ｂに関するいわゆるプローブセットに代表される）の、ヒトゲノム上のその染色体構成および順序の同定および局在化
より大きな染色体の変化または異常の同定のために、上記の詳細な記述のように、十分な数の遺伝子、転写物またはＤＮＡ断片が必要とされる。染色体領域をカバーするプローブの密度は、アレイに基づくＣＧＨを使用する場合には、必ずしも転写される遺伝子に限定されないが、ＲＮＡをプローブ材料として利用することによって、その密度は染色体上に遺伝子の距離によって与えられる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．により提供されるＤＮＡマイクロアレイは従来の公知ヒトゲノムから得られるすべての転写物を含み、これは４０．０００〜６０．０００のプローブセットにより表される。カリフォルニアの大学（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはＮＣＢＩから入手可能ないわゆる「ゴールデンパス」により表されるヒトゲノムの公共の利用可能な配列に対するこれらの短いＤＮＡオリゴマーの配列のＢＬＡＳＴマッピングおよびソーティングにより、組織標本の全トランスクリプトームの染色体表示が得られる。個々の染色体領域の図形的表示および表される転写物の上または下のカラーコーディングにより、参照トランスクリプトーム領域をＤＮＡに関して比較して、獲得および欠損を確定できる。
【０３７４】
ｂ）ＩＨＣおよび定量的ＰＣＲ（ＰＣＲ核型分析）の組み合わせまたは直接的定量的ＰＣＲによる遺伝子コピー数の定量化
通常、５μｍの厚さの１から３のパラフィン包埋組織切片を用いて、サンプルからゲノムＤＮＡを得る。組織切片を、疾患関連細胞を含む領域を同定するために、脱パラフィンの後に比色ＩＨＣによって染色する。染色された領域をメスで顕微解剖し、ミクロ遠心分離管中に移す。これらの単離された組織切片のゲノムＤＮＡを、適当な緩衝液を用いて抽出する。単離されたＤＮＡを次いで適当なプライマーおよびプローブを用いて定量的ＰＣＲのために用いる。所望により、ＩＨＣ染色は省略することができ、ゲノムＤＮＡは適切な緩衝液を用いた事前の脱パラフィンの有無にかかわらず直接単離することができる。当業者らは同等の結果を得るために以下に記載される条件および緩衝液を変えてもよい。
【０３７５】
ＤＡＫＯ（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔコード番号Ｋ５２０４）およびＴａＫａＲａ（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＣａｔ．：９０９１）から得られる試薬は、製造元プロトコルに従って使用した。
染色前に、次の試薬を準備するのが都合良い：
溶液Ｎｏ．７
エピトープ回収溶液（クエン酸緩衝液＋抗菌剤）（１０ｘｃｏｎｃ）
２００ｍｌの蒸留水に対して２０ｍｌ（２−８℃で１ヶ月安定）
溶液Ｎｏ．８
洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋抗菌剤）（１０ｘｃｏｎｃ）
３００ｍｌの蒸留水に対して３０ｍｌ（２−８℃で１ヶ月安定）
染色溶液：ＤＡＢ
１０のスライドについて１ｍｌの溶液で十分である。溶液は使用直前に調製した。
【０３７６】
１ｍｌのＤＡＢ緩衝液（基質緩衝液、ｐＨ７．５、Ｈ２Ｏ２、安定剤、エンハンサーおよび抗菌剤を含む）＋１滴（２５−３μｌ）ＤＡＢ−クロモゲン（（３，３’−ジアミノベンジジンクロモゲン溶液）。この溶液は２−８℃で最高５日の間安定である。沈殿物は染色結果に影響を与えない。さらに次のものが必要である：２ｘ約１００ｍｌのキシロール、２ｘ約１００ｍｌのエタノール１００％、２ｘエタノール９５％、蒸留水。これらの溶液は、４０回までの染色に用いることができる。エピトープ回収工程のために水浴が必要である。
【０３７７】
染色法：
すべての試薬は免疫染色の前に室温（２０−２５℃）に前もって暖められる。同様に、すべてのインキュベーションは室温において行なわれた。９５℃の水浴中で行なわれるエピトープ回収は除く。ステップ間で過剰の液体をリントレスティッシュ（Ｋｉｍ  Ｗｉｐｅ）を用いてスライドから取り除く。
【０３７８】
脱パラフィン
スライドをキシレン浴中に入れ、５分間インキュベートする。浴を換え、その工程をもう１回繰り返す。過剰の液体を取り除き、スライドを無水エタノール中に３分間入れる。浴を換え、その工程をもう１度繰り返す。過剰の液体を取り除き、スライドを９５％エタノールに３分間入れる。浴を換え、その工程をもう１度繰り返す。過剰の液体を取り除き、スライドを蒸留水中に最低３０秒間入れる。
【０３７９】
エピトープ回収
染色ジャーを希釈エピトープ回収溶液で満たし、水浴中、９５℃で予熱する。脱パラフィン切片を予熱した液体中に浸し、９５℃で４０分間インキュベートする。ジャー全体を水浴から取り出し、室温で２０分間冷却させる。エピトープ回収溶液をデカントし、切片を蒸留水ですすぎ、最終的に５分間洗浄緩衝液中に浸漬する。
【０３８０】
ペルオキシダーゼブロッキング：
過剰の緩衝液を除去し、組織切片をＤＡＫＯｐｅｎで取り囲む。標本を３滴（１００μｌ）のペルオキシダーゼ−ブロッキング溶液でカバーし、５分間インキュベートする。スライドを蒸留水ですすぎ、新しい洗浄緩衝液浴中に入れる。
【０３８１】
抗体インキュベーション
過剰の液体を除去し、標本を３滴（１００μｌ）の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ試薬（０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．２のＮａＮ３（安定化タンパク質含有）中ウサギ抗ヒトＨｅｒタンパク質）または陰性対照試薬（＝Ｈｅｒ２  Ａｂとタンパク質濃度の等しい標準的ウサギ血清のＩＧＧフラクション）でカバーする。３０分のインキュベーションの後、スライドを水中ですすぎ、新しい水浴中に入れる。
【０３８２】
可視化
過剰の液体を除去し、標本をｓ３滴（１００μｌ）の可視化試薬でカバーする。３０分のインキュベーションの後、スライドを水中ですすぎ、新しい水浴中に入れる。過剰の液体を除去し、標本を３滴（１００μｌ）の基質−クロモゲン溶液（ＤＡＢ）で１０分間カバーする。標本を蒸留水ですすいだ後、通常のオリンパス電子顕微鏡で写真を撮影し、標本内の染色強度および腫瘍領域を示す。所望により、ヘマトキシリンを用いて対比染色が行なわれた。
【０３８３】
ＤＮＡ抽出
全標本または解剖した小区画をミクロ遠心分離管に移す。所望により、少量（１０μｌ）の予熱ＴａＫａＲａ溶液（ＤＥＸＰＡＴ（商標））を予熱し、標本上において、メスを用いてサンプルの移動を促進する。選択された組織サンプルの大きさによって、５０から１５０μｌのＴａＫａＲａ溶液をサンプルに添加した。サンプルを１００℃で１０分間ブロックヒーター中でインキュベートし、続いて１２，０００ｒｐｍでミクロ遠心分離器中で遠心分離する。ミクロペットを用いて上清を集め、別のミクロ遠心分離管に入れる。脱パラフィン工程を行っていない場合、確実に組織デブリスおよび樹脂を抽出しないようにしなければならない。樹脂不含ＴａＫａＲａ緩衝液を添加し、さらに加熱し、遠心分離して、ペレット中に残るゲノムＤＮＡを回収することができる。サンプルは、−２０℃で貯蔵する。
【０３８４】
別の腫瘍細胞株（ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３、ＡＵ−５６５、ＵＡＣＣ−８１２、ＵＡＣＣ−８９３、ＨＣＣ−１００８、ＨＣＣ−２１５７、ＨＣＣ−１９５４、ＨＣＣ−２２１８、ＨＣＣ−１９３７、ＨＣＣ１５９９、ＳＷ４８０）またはリンパ球由来のゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔまたはＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔにより製造元のプロトコールにしたがい調製する。通常、１反応につき１ｎｇから最大１μｇのＤＮＡを使用する。
【０３８５】
定量的ＰＣＲ
患者サンプル中の遺伝子の遺伝子コピー数を測定するために、それぞれのプライマー／プローブ（以下の表参照）を、２５μｌの１００μＭストック溶液「アッパープライマー」、２５μｌの１００μＭストック溶液「ローアープライマー」を１２．５μｌの１００μＭストック溶液Ｔａｑ  Ｍａｎプローブ（ＱｕｅｎｃｈｅｒＴａｍｒａ）と混合し、蒸留水で５００μｌに調整して準備する。各反応について、１．２５μｌの患者サンプルのＤＮＡ抽出物または１．２５μｌの細胞株から得られるＤＮＡを８．７５μｌのヌクレアーゼ不含水と混合し、９６ウェルＯｐｔｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３０６７３７）の１つのウェルに添加した。１．５μｌのプライマー／プローブミックス、１２μｌのＴａｑ  Ｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ＰＣＲミックス（２ｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３１８１５７）および１μｌの水を次に添加した。９６ウェルプレートを８キャップ／ストリップ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３２３０３２）で閉じ、３分間遠心分離機にかける。ＰＣＲ反応の測定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られるＴａｑＭａｎ７９００ＨＴ（Ｎｏ．２０１１４）を用いて、製造業者の説明にしたがい、適切な条件下（２分５０℃、１０分９５℃、０．１５分９５℃、１分６０℃；４０サイクル）で行う。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｒｔｅｍｓからのＳｏｆｔｗａｒｅＳＤＳ２．０をそれぞれの支持に従って用いる。ＣＴ値を、適切なソフトウェア（Ｍｉｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標））でさらに分析する。
【０３８６】
実施例３
ハーセプチンおよび二次療法としての化学療法薬（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル，タキソテール、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ビノレルビン）を処置された患者の臨床サンプルを得た。これらサンプルには、それぞれの患者の原発腫瘍および転移病巣に由来するホルマリン固定パラフィン包埋物が含まれた。しかしながら、本発明に開示されるＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子の決定は、別のネオアジュバント療法における新鮮組織からの核酸抽出後にも行った。さらに、全血、血清、および血漿サンプルを多くの患者から入手した。
【０３８７】
化学療法薬（例えば、ドセタキセル、タキソテール、パクリタキセル、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン）または下記の他の治療と組み合わせたハーセプチンに対する応答についてマルチパラメトリックな臨床評価を行った。臨床情報には、組織学的パラメーター（ＴＮＭ−ステージ、ＡＪＣＣグレード）、標準分子マーカー（エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するＩＨＣ染色）、および超音波または放射線評価（例えば、ＣＴ）が含まれた。処置に対する応答は、国際的基準、すなわち改訂版ＷＨＯ基準およびＲＥＣＩＳＴ基準によって評価した。疾患の経過中の各々の癌評価を記録した（方法および評価日、臓器、解剖学的説明、可測性、病変の大きさ（最長直径）、最大垂直直径、腫瘍領域）。さらに、アントラサイクリン（ドキソルビシンまたはエピルビシン）および／またはＣＭＦによる先の化学療法を含む各々の全身性抗癌治療およびそれに対する応答を評価した（薬物、目的、期間、スケジュール、サイクル数、累積投与量）。ハーセプチンおよび二次療法としての化学療法薬による組み合わせ療法に対する転移性乳癌患者の応答には、改訂版ＷＨＯ基準を用いた。さらに、はじめの無病生存率、応答期間、および進行までの時間を考慮した。処置応答を規定するため、標準的基準を用いた：「完全応答」（「ＣＲ」＝臨床的に検出可能な残存病変のない１００％の腫瘍縮小）、「部分応答」（「ＰＲ」＝標的病変の少なくとも５０％の腫瘍縮小）、「疾患安定」（「ＳＤ」＝５０％未満の腫瘍縮小または変化なし）および「疾患進行」（「ＰＤ」＝腫瘍増殖または新規腫瘍病変）。
【０３８８】
実施例２に開示の方法にしたがい、ＩＨＣおよび定量的ＰＣＲを組み合わせて、あるいはホルマリン固定パラフィン包埋組織スライドからの核酸抽出後の定量的ＰＣＲにより直接的に、７０を超える遺伝子を解析した。結果は、別々の方法論（ＶＮＴＲおよびＳＮＰ検出）により再確認した。４３のＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子の変化を、同じ染色体に位置する参照遺伝子（＝染色体内対照）または別の染色体位置する参照遺伝子（＝染色体外対照）との比較により決定した。染色体内参照遺伝子には、ＭＭＰ２８、ｈＫａ３、およびＫ２０が含まれた。染色体外参照遺伝子には、染色体１２に対するＧＡＰＤＨが含まれた。しかしながら、本発明に開示されるＡＲＣＨＥＯＮに含まれない他の遺伝子はいずれも、ＡＲＣＨＥＯＮの特徴決定のための参照遺伝子として使用可能である。参照遺伝子は、腫瘍性病変において生じるＡＲＣＨＥＯＮの変化から独立していなければならず、また増幅や欠失のような染色体変化による影響をうけてはならない。非増幅遺伝子の遺伝子コピー数は、腫瘍性病変における異数性や倍数性のようなゲノム不均衡（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｍｂａｌａｎｃｅ）により増加しうるので、ＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子についての各測定を複数の参照遺伝子と相関させ、相対的コピー数計算に対するゲノム不均衡の影響を最小化する。さらに、個々のプライマー／プローブペアのパフォーマンスの相違により生じる軽微なシステムエラーは、プライマー／プローブのパフォーマンスを対照組織（すなわち健常人対照由来の非腫瘍性組織）および正倍数性対照細胞株（例えば、ＨＳ６８、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６３５）において決定することにより最小化する。さらに、ある１つの染色体について異数性を示す、十分に特徴決定された対照細胞株（すなわちＤｅｔｒｏｉｔ、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−５４；トリソミー２１）を使用した。Ｘ染色体に位置する遺伝子（例えば、ＳＲＹ）、Ｙ染色体に位置する遺伝子（例えば、Ｘｉｓｔ）、および染色体２１に位置する遺伝子を測定することにより、１、２、３つの遺伝子の規定のコピー数を各ラン中の標準化のための内部対照として測定することができた。さらに、標準化すべき遺伝子のＰＣＲフォワードプライマーおよびリバースプライマーの標的領域からなるが、その間がその標準化すべき標的遺伝子の元のプローブ領域とは異なる合成プローブハイブリダイゼーション領域からなる合成標的を一部の反応に混ぜた。これにより、マルチプレックスＰＣＲによる個々のｑＰＣＲ反応の内部標準化が可能となった。計算したパフォーマンスの相違は、標的組織内における測定のフィルターとして使用した、すなわち、対照細胞および組織において示される個々の遺伝子のプライマー／プローブの相違を標的組織において行った個々の遺伝子測定から差し引いた。その後、フィルタリング後の個々のＣＴ値を参照遺伝子に対して標準化した。プライマー／プローブのパフォーマンスの相違のフィルタリング後に残ったＡＲＣＨＥＯＮ遺伝子と参照遺伝子の定量的ＰＣＲ反応のＣＴ値の差を決定し、「細胞あたりのコピー数」に変換した。これは、標的遺伝子のＣＴ値を参照遺伝子のＣＴ値から差し引くことによって行った。次に、得られたΔＣＴ値を、以下の式により参照遺伝子のΔＣＴ値（ΔＣＴ＝０）を「細胞あたり２コピー」と規定して、遺伝子コピー数に変換した：２＊（２∧（ΔＣＴ＊（−１）））。計算は全て、標準的ソフトウェアを用いて行った（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標）。
【０３８９】
引例
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【０３９０】
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【０３９１】
【表１−１】
2007512807.tif 000003
【表１−２】
2007512807.tif 000004
【表１−３】
2007512807.tif 000005
【表１−４】
2007512807.tif 000006
【表１−５】
2007512807.tif 000007
【表２−１】
2007512807.tif 000008
【表２−２】
2007512807.tif 000009
【表２−３】
2007512807.tif 000010
【表２−４】
2007512807.tif 000011
【表２−５】
2007512807.tif 000012
【表２−６】
2007512807.tif 000013
【表３−１】
2007512807.tif 000014
【表３−２】
2007512807.tif 000015
【表３−３】
2007512807.tif 000016
【表３−４】
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【表３−５】
2007512807.tif 000018
【表３−６】
2007512807.tif 000019
【表４−１】
2007512807.tif 000020
【表４−２】
2007512807.tif 000021
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表６−１】
2007512807.tif 000029
【表６−２】
2007512807.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【０３９２】
【図１】Ｇ−バンディングパターンおよび細胞遺伝学的位置を有する染色体１７のスケッチを示す。
【図２】図１においてすでに示したのと同じ領域およびＤＮＡ−チップハイブリダイゼーションにより測定された個々の発現値のクラスター図を示す。
【図３】ｑＰＣＲ（たとえば、ＴａｑＭａｎ）によるＤＮＡ増幅測定から得られるデータを示す。
【図４】増幅された領域についての概略図を示し、各増幅の長さおよび分析された腫瘍細胞株における過剰発現についての情報を提供する。
【図１】
2007512807.tif 000031
【図２】
2007512807.tif 000032
【図３】
2007512807.tif 000033
【図４】
2007512807.tif 000034
【配列表】
2007512807000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月27日(2006.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007512807000001.app
【国際調査報告】
2007512807.tif 000323
2007512807.tif 000324
2007512807.tif 000325
2007512807.tif 000326
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2007512807.tif 000328
2007512807.tif 000329