(57)【要約】  哺乳類の育毛は、熱ショックタンパク質阻害物質を含む組成物を局所的に適用することによって、低減される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の育毛を低減する方法であって、
育毛の低減が望まれる皮膚の領域を選択すること；及び
育毛を低減するのに有効な量で熱ショックタンパク質阻害物質を含む皮膚科学的に許容可能な組成物を前記皮膚の領域に適用すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記阻害物質がゲルダナマイシンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害物質が、１７−アリルアミノ，１７−デメトキシゲルダナマイシンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害物質がＫＦ２５７０６であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
阻害物質がＫＦ５８３３３であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害物質がＫＦ５８３３２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害物質が、Ｏ−カルバモイル−メチルオキシムであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）阻害物質がゲルダナマイシンベンゾ−１，３−ジオキソールであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害物質がＫＮＦ４３７であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害物質がＫＮＫ４２３であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害物質が、１種または複数種の毛嚢熱ショックタンパク質の活性を特異的に阻害することができる化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害物質が、毛嚢において１種または複数種の熱ショックタンパク質のレベル及び／又は発現を低減することができる化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害物質が、毛嚢において１種または複数種の熱ショックタンパク質ｍＲＮＡの発現を低減することができる化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物における前記阻害物質の濃度が０．１％〜３０％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害物質が、皮膚１平方センチメートル当たり前記阻害物質１０〜３０００マイクログラムの量で皮膚に適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記皮膚の領域がヒトの顔面にあることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該組成物が、剃毛と併せて皮膚の領域に適用されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記皮膚の領域がヒトの脚にあることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記皮膚の領域がヒトの腕にあることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記皮膚の領域がヒトの腋の下にあることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記皮膚の領域がヒトの胴体にあることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
該組成物が、多毛症の女性の皮膚の領域に適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記育毛が、アンドロゲン刺激育毛を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該組成物が、同様に育毛の低減を引き起こす第２の構成成分を更に包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において、特に美容上の目的において育毛を低減することに関する。
【０００２】
哺乳類の毛髪の主要機能は、環境保護の提供である。しかし、その機能はヒトではほとんど失われており、毛髪は本質的に美容上の理由から、身体の様々な部分で維持または除去されている。例えば、頭皮に毛髪を有することは好まれるが、顔面には好まれない。
【０００３】
剃毛、電解、脱毛剤クリーム類またはローション類、ワックス除毛（waxing）、抜き毛（plucking）、及び治療用抗アンドロゲン剤を含む種々の手順が、不必要な毛髪を除去するために使用されてきた。一般にこれらの従来の処置は、伴う欠点を有する。例えば、剃毛は切り傷をもたらすことがあり、発毛の速度が速まる感覚を残すことがありうる。剃毛は、また、望ましくない刈り株を残すことがありうる。一方電解は、処置領域を毛髪がない状態に長期間保つことができるが、高価で痛みを伴い、時には瘢痕を残すことがありうる。脱毛剤クリーム類は非常に有効であるが、典型的には、それらの高い刺激可能性がゆえに頻繁な使用は推奨されない。ワックス除毛及び抜き毛は、痛み、不快感、及び短い毛髪の不十分な除去をもたらすことがありうる。最後に、抗アンドロゲン剤−−女性の多毛症を処置するために使用されてきた該剤は、望ましくない副作用をもたらすことがありうる。
【０００４】
育毛の速度及び性質は特定の酵素の皮膚阻害物質の適用によって変わりうることが、以前に開示されている。これらの阻害物質には、５−αレダクターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、及びトランスグルタミナーゼの阻害物質が挙げられる。例えば、米国特許第４，８８５，２８９号（ブロイヤー（Breuer）ら）；米国特許第４，７２０，４８９号（シャンダー（Shander））；米国特許第５，０９５，００７号（アールワリア（Ahluwalia））；米国特許第５，０９６，９１１号（アールワリアら）；及び米国特許第５，１３２，２９３号（シャンダーら）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、異なる分子量のサブファミリーから構成される、進化的に保存されたタンパク質の既知のスーパーファミリーである。ＨＳＰの例には、ＨＳＰ−２７、ＨＳＰ−７０、及びＨＳＰ−９０が挙げられる。ＨＳＰは、多数の細胞内機能を実行する。これらの合成は、細胞障害性薬剤、熱、及び照射を含む種々のストレスにより刺激されることから、「ストレスタンパク質」とも呼ばれる。ＨＳＰは同様に、生理学的条件下で細胞の恒常性の維持に役割を果たす可能性がある。ＨＳＰの合成は、熱ショック特異的転写因子による応答配列の転写活性化の結果起こり、その阻害は、ＨＳＰレベルの低下をもたらす。ＨＳＰは、クライアントタンパク質に結合してその適した折り畳みを促進し、細胞内区画間でのタンパク質の輸送及び選択を助け、活性／未変性立体構造のスイッチングを制御する、監督分子として作用する。ＨＳＰの基質には、多数のチロシン、セリン／トレオニン、及びサイクリン依存性キナーゼがある。加えて、ＨＳＰ−９０は、ホルモン受容体を通した信号伝達の変調に関与する。ＨＳＰとそれらの依存タンパク質との相互作用は、細胞増殖及び分化の調節が必要となる。細胞周期調節に加えて、ＨＳＰは、多種多様な刺激により誘導される、アポトーシスと呼ばれるプログラム細胞死に対して細胞を保護する可能性がある。ＨＳＰは、相当な抗アポトーシス特性を有する。これらは、異なる細胞内レベルでプログラム細胞死を制御する可能性がある。ＨＳＰの過剰発現は、Ｆａｓ、ＴＮＦ、セラミド、及び細胞障害性薬剤により誘導されるアポトーシスに対して細胞を保護する可能性がある。ＨＳＰは、ミトコンドリア依存性アポトーシス経路に関わり、カスパーゼの活性化を妨げることが示された。ＨＳＰ７０及びＨＳＰ−９０は突然変異体ｐ５３と相互作用して、細胞周期停止／アポトーシスの重要な調節因子である野生型ｐ５３の低減を引き起こす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの態様において本発明は、育毛を低減するのに有効な量で熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）阻害物質を皮膚に適用することによって、哺乳類（好ましくはヒト）の不必要な育毛を低減する方法（典型的には、美容的な方法）を提供する。不必要な育毛は、美容上の観点から望ましくない可能性があるか、または例えば、疾患若しくは異常状態（例えば、多毛症）によりもたらされる可能性がある。
【０００７】
ＨＳＰ阻害物質には、ＨＳＰと強く相互作用することにより１つ以上の毛嚢ＨＳＰの活性を特異的に阻害する化合物；毛嚢において１種または複数種のＨＳＰのレベル及び／または発現を低減する化合物；並びに／或いは毛嚢において１種または複数種のＨＳＰ  ｍＲＮＡの発現を低減する化合物が挙げられる。「強く相互作用する」とは、化合物がＨＳＰと結合する、または優先的に結合することを意味する。
【０００８】
典型的には、上記の方法を実践するにあたり、阻害物質は、皮膚科学的にまたは美容上許容可能なビヒクルと共に局所適用組成物の中に含まれる。それ故に本発明はまた、皮膚科学的にまたは美容上許容可能なビヒクルと、ＨＳＰ阻害物質とを含む局所適用組成物に関する。
【０００９】
加えて、本発明は、育毛を低減する治療的な局所適用組成物の製造のための、ＨＳＰ阻害物質の使用に関する。
【００１０】
特定の化合物には、化合物それ自体と、その化合物の薬理学上許容可能な塩類の両方が挙げられる。
【００１１】
本発明の他の特徴及び利点は、発明を実施するための最良の形態及び請求項から明らかになる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
好ましい組成物には、美容上及び／または皮膚科学的に許容可能なビヒクル中のＨＳＰ阻害物質が挙げられる。組成物は、固体、半固体、または液体であってもよい。組成物は、軟膏、ローション、フォーム、クリーム、ゲル、または溶液の形態の、例えば、美容及び皮膚用製品であってもよい。組成物はまた、剃毛調製物またはアフターシェーブの形態であってもよい。ビヒクルは、それ自体不活性であることができるか、またはそれ自体美容的、生理学的及び／若しくは薬学的利益を有することができる。
【００１３】
既知のＨＳＰ阻害物質の例が表１で提供される。
【００１４】
【表１−１】
2007534700.tif 000002
【００１５】
【表１−２】
2007534700.tif 000003
【００１６】
【表１−３】
2007534700.tif 000004
【００１７】
組成物は、２つ以上のＨＳＰ阻害物質を包含してもよい。加えて、組成物は１つ以上の他の種類の育毛低減剤を含んでもよく、例えば、米国特許第４，８８５，２８９号；米国特許第４，７２０，４８９号；米国特許第５，１３２，２９３号；米国特許第５，０９６，９１１号；米国特許第５．０９５，００７号；米国特許第５，１４３，９２５号；米国特許第５，３２８，６８６号；米国特許第５，４４０，０９０号；米国特許第５，３６４，８８５号；米国特許第５，４１１，９９１号；米国特許第５，６４８，３９４号；米国特許第５，４６８，４７６号；米国特許第５，４７５，７６３号；米国特許第５，５５４，６０８号；米国特許第５，６７４，４７７号；米国特許第５，７２８，７３６号；米国特許第５，６５２，２７３号；ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９４／２７５８６；ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９４／２７５６３；及びＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８／０３１４９で記載されているものであり、これらは全て参考として本明細書に組み込まれる。
【００１８】
組成物中のＨＳＰ阻害物質の濃度は、飽和溶液までの広範囲にわたって変わってもよく、好ましくは０．１重量％から３０重量％まで、更にそれ以上であり、育毛の低減は、皮膚の単位面積当たりに適用される阻害物質の量が増加するほど大きくなる。有効的に適用される最大量は、阻害物質が皮膚に浸透する速さによってのみ限定される。有効量は、例えば、皮膚の１平方センチメートル当たり１０〜３０００マイクログラム以上の範囲であってもよい。
【００１９】
ビヒクルは、不活性であることができるか、またはそれ自体美容的、生理学的及び／または薬学的利益を有することができる。ビヒクルを、液体または固体皮膚軟化剤、溶媒、増粘剤、保湿剤及び／または粉末剤により配合できる。皮膚軟化剤には、ステアリルアルコール、ミンク油、セチルアルコール、オレイルアルコール、イソプロピルラウレート、ポリエチレングリコール、石油ゼリー、パルミチン酸、オレイン酸、及びミリスチルミリステートが挙げられる。溶媒には、エチルアルコール、イソプロパノール、アセトン、ジエチレングリコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００２０】
組成物は任意に、阻害物質の皮膚への及び／または作用部位への浸透を増進させる構成成分を含むことができる。浸透増進剤の例には、尿素、ポリオキシエチレンエーテル類（例えば、ブリジ（Brij）−３０及びラウレス（Laureth）−４）、３−ヒドロキシ−３，７，１１−トリメチル−１，６，１０−ドデカトリエン、テルペン類、シス−脂肪酸類（例えば、オレイン酸、パルミトレイン酸）、アセトン、ラウロカプラム（laurocapram）、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドン、オレイルアルコール、グリセリル−３−ステアレート、プロパン−２−オール、ミリスチン酸イソプロピルエステル、コレステロール及びプロピレングリコールが挙げられる。浸透増進剤は、例えば、０．１重量％〜２０重量％、または０．５重量％〜５重量％の濃度で添加できる。
【００２１】
該組成物は、また、阻害剤の連続的な持続放出を提供するために、皮膚の内部または表面上に容器を提供するように配合できる。該組成物はまた、皮膚からゆっくりと蒸発して、阻害物質が皮膚に浸透するための余分の時間を取れるように配合できる。
【００２２】
ＨＳＰ阻害物質を含有するクリーム系局所適用組成物は、水と全ての水溶性構成成分とを混合容器−Ａで一緒に混合することにより調製される。ｐＨは、約３．５〜８．０の所望の範囲に調整される。成分の完全な溶解を達成するために、容器の温度を４５℃まで上げてもよい。ｐＨ及び温度の選択は、ＨＳＰ阻害物質の安定性により左右される。防腐剤及び芳香剤構成成分を除く油溶性構成成分は、構成成分を溶融及び混合するために、別の容器（Ｂ）で一緒に混合され、７０℃まで加熱される。容器Ｂの加熱された内容物は、水相（容器Ａ）に、勢いよく攪拌しながら注がれる。混合は、約２０分間続けられる。防腐剤構成成分が約４０℃の温度で添加される。８〜１２Ｐａ／ｓ（８，０００〜１２，０００ｃｐｓ）の粘度または所望の粘度の軟質クリームを得るため、温度が約２５℃に達するまで攪拌が続けられる。芳香剤構成成分が、約２５℃〜３０℃で添加されるが、内容物は、まだ混合されており、粘度は所望の範囲まで高まっていなかった。得られるエマルションの粘度を上げることが望まれる場合、従来のホモジナイザー、例えば、角穴高剪断スクリーンを持つシルバーソン（Silverson）Ｌ４Ｒホモジナイザーを使用して、剪断力を適用することができる。局所適用組成物は、上記の製剤調製の際に水相に活性物質を含めることにより作製することができるか、または製剤（ビヒクル）調製が完了した後で加えることができる。活性物質は、ビヒクル調製のいずれかの工程で加えることもできる。クリーム製剤の構成成分は、下記の実施例で記載されている。
【００２３】
【表２】
2007534700.tif 000005
aＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
bポリクオチニウム（Polyquartinium）−５１（コラボレイティブ・ラボ（Collaborative Labs）、ニューヨーク）。
cグリセリン、水、ナトリウムＰＣＡ、尿素、トレハロース、ポリカウタニウム（polyqauternium）−５１、及びヒアルロン酸ナトリウム（コラボレイティブ・ラボ（Collaborative Labs）、ニューヨーク）。
【００２４】
【表３】
2007534700.tif 000006
aＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００２５】
【表４】
2007534700.tif 000007
aＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００２６】
【表５】
2007534700.tif 000008
【００２７】
ＨＳＰ阻害剤は、実施例４の製剤に添加され、可溶化するまで混合される。ＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００２８】
【表６】
2007534700.tif 000009
【００２９】
ＨＳＰ阻害剤は、実施例４の製剤に添加され、可溶化するまで混合される。ＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００３０】
【表７】
2007534700.tif 000010
【００３１】
ＨＳＰ阻害剤は、実施例４の製剤に添加され、可溶化するまで混合される。ＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００３２】
【表８】
2007534700.tif 000011
【００３３】
ＨＳＰ阻害剤は、実施例４の製剤に添加され、可溶化するまで混合される。ＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００３４】
【表９】
2007534700.tif 000012
【００３５】
ＨＳＰ阻害剤は、実施例４の製剤に添加され、可溶化するまで混合される。ＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００３６】
ＨＳＰ阻害剤を含有するヒドロアルコール性製剤は、製剤構成成分を混合容器中で混合することにより調製される。製剤のｐＨは、３．５〜８．０の範囲の所望の値に調整される。このｐＨ調整は、製剤成分の完全な溶解をもたらすためにも実施することができる。加えて、活性物質の安定性に応じて、製剤成分の溶解を達成するために、加熱を４５℃まで、更には７０℃まで適用することができる。幾つかのヒドロアルコール性製剤が下記に示されている。
【００３７】
【表１０】
2007534700.tif 000013
aＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
bカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（アビテック社（Abitec Corp.）、オハイオ州）。
【００３８】
【表１１】
2007534700.tif 000014
aＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００３９】
【表１２】
2007534700.tif 000015
【００４０】
ＨＳＰ阻害剤は、製剤に添加され、可溶化するまで混合される。ＨＳＰ阻害物質は、例えば、表１で提供されたリストから選択できる。
【００４１】
該組成物は、育毛を低減することが望まれる、体の選択された領域に局所的に適用されるべきである。例えば、該組成物は、顔、特に顔の髭領域、すなわち頬、頸、上唇及び顎に適用できる。該組成物は、また、剃毛、ワックス除毛、機械式脱毛、化学的除毛、電解及びレーザー補助脱毛を含む、他の脱毛法の補助剤として使用されてもよい。
【００４２】
該組成物は、また、脚、腕、胴体または腋の下にも適用できる。該組成物は、多毛症または他の状態を有する女性において、不必要な毛髪の発育を低減するのに特に適している。ヒトでは、該組成物は、知覚される育毛の低減を達成するために、１日１回若しくは２回、または更に頻繁に適用されるべきである。育毛の低減の知覚は、早ければ使用後２４時間または４８時間（例えば、通常の剃毛の間隔）で起こることがあるか、または例えば３か月まで続くことがある。育毛の低減は、例えば、育毛の速度が遅くなるとき、除去の必要性が低くなるとき、対象者が処置部位で毛髪が少ないことを感知するとき、または定量的には、除去された毛髪の量（いわゆる毛髪量）が低減するときに実証される。
【００４３】
ヒト毛嚢発育アッセイ
ヒトの皮膚は、美容整形術の副産物として形成外科医から入手した。皮膚試料は一般に、顔の領域から取られた毛髪領域と非毛髪の領域から構成された。除去した直後、皮膚は、抗生物質を含有するウイリアムス（Williams）Ｅ培地の中に置かれ、冷蔵保存された。ウイリアムス（Williams）Ｅ培地は市場から購入され（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）、メリーランド州ゲイサーズバーグ（Gaithersburg））、生体外（in-vitro）環境下で毛嚢の生存能力を維持するのに必須の栄養素が配合された。
【００４４】
発育期（成長期）のヒト毛嚢が、解剖用顕微鏡下でメス及び時計工鉗子を使用して、美容整形組織から単離された。皮膚は、容易に切開できるように、２〜３列の毛嚢を露出する薄片に切断された。毛嚢は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌインスリン、１０ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、１００単位のペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補充した０．５ｍｌのウイリアムス（Williams）Ｅ培地の中に置かれた。毛嚢は、５％ＣＯ2及び９５％空気の環境下で、２４ウエルプレート（１毛嚢／ウエル）中、３７℃でインキュベートされた。毛嚢の画像は、２０Ｘ倍率の解剖用顕微鏡下で、２４ウエルプレート中で取られた。毛嚢の長さは、０日目（毛嚢が培養地の中に置かれた日）に測定され、６〜７日目に再び測定された。この系では、毛嚢は毛髪繊維に完全に分化し、生体内（in vivo）で約０．３ｍｍ／日の率のヒトと同様の速度で長さが伸びるように思われる。熱ショックタンパク質の阻害物質を試験するために、該阻害物質または抗ＨＳＰ抗体が培地に０時間から含有され、実験の間を通じ培地中で保持された。
【００４５】
免疫組織化学アッセイ
毛嚢または急速冷凍皮膚生検からの８ミクロンの凍結切片を調製し、アセトン中、−２０℃で１０分間固定した。ＨＳＰ−２７、ＨＳＰ７０またはＨＳＰ−９０の免疫検出では、チラミド（tyramide）増幅法が使用された。内因性ペルオキシダーゼ及び非特異的アビジン／ビオチン結合をブロックした直後に（アビジン／ビオチンブロックキット、ベクター・ラボ（Vector Lab））、切片は、ＴＮＢ緩衝剤（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５％ブロック試薬、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、マサチューセッツ州ボストン（Boston））で３０分間インキュベートされた。次に、ヒトＨＳＰ−２７、ＨＳＰ７０に対するマウスモノクローナル抗体（カルバイオケム（Calbiochem））、またはヒトＨＳＰ−９０に対するウサギポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology））が一晩適用され（それぞれ１：５００及び１：１０００）、続いてＴＮＢブロック緩衝剤（パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、マサチューセッツ州ボストン（Boston）、１：２００、３０分間）で希釈された、ビオチン化ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ抗血清が適用された。その後、切片はストレプトアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼの中（ＴＮＢ中１：１００、３０分間）でインキュベートされた。ＴＮＴ緩衝剤（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン）による３回の洗浄の後、ＴＲＩＴＣ−チラミド（増幅希釈剤中１：５０、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、マサチューセッツ州ボストン（Boston））の１０分間の適用が続いた。次に、切片は細胞核を確認するためにヘキスト（Hoechst）３３３４２で対比染色され、ベクタシールド（VectaShield）（ベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories））を使用して載せた。
【００４６】
全ての切片は、オリンパス（Olympus）ＢＸ６０蛍光顕微鏡下で検査され、デジタル画像分析システム（クールスナップ（CoolSnap）（商標）冷却ＣＤカメラ、アルファ・イノテック（Alpha Innotech））の助けを借りて写真記録された。
【００４７】
結果
免疫組織化学方法論を使用して、ＨＳＰー２７、ＨＳＰ−７０及びＨＳＰ−９０の存在が生体外（in-vitro）でヒト毛嚢において実証された。ＨＳＰ−２７及びＨＳＰ−７０は、外毛根鞘及び毛嚢の真皮乳頭細胞のような、良好に画定された区画における濾胞性上皮細胞及び間充織細胞で見出された。しかし、他方、毛嚢上皮でより広範囲にわたって発現しているＨＳＰ−９０は、間充織起原の真皮乳頭細胞では不在である。この免疫組織化学方法論は、ＨＳＰ−２７及びＨＳＰ−７０またはＨＳＰ−９０のレベル及び／または発現を特異的に低減させる剤を選択するために使用できる。
【００４８】
追加的な免疫組織化学アッセイが、ＨＳＰ発現の変化及びＨＳＰに結合する剤の特異性を決定するために実施された。ヒト毛嚢発生におけるＨＳＰの役割を検査するために、内因性ＨＳＰ−２７は、抗ＨＳＰ−２７抗体の培地中に加えることによって、中和された。単離されたヒト毛嚢は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＨＳＰ−２７抗体が存在する補充されたウイリアム（William）培地で培養された。４８時間後、ＨＳＰ−２７の免疫組織化学分析が、毛嚢におけるＨＳＰ−２７の発現を決定するために実施された。対照毛嚢の分析は、濾胞性上皮細胞及び間充織細胞でのＨＳＰ２７の強い発現を明らかにした。対照的に、抗ＨＳＰ−２７抗体で処置された毛嚢は、近位毛嚢区画におけるＨＳＰ−２７の発現の完全な阻害を示した。遠位外毛根鞘の単離された細胞は、ＨＳＰ−２７陽性のままであった。モノクローナル抗ＨＳＰ−２７抗体で処置されたヒト毛嚢の結果は、下記を示す：
（１）免疫組織化学分析で決定されているように、ＨＳＰ−２７タンパク質に対する抗体の有意な結合；
（２）タンパク質に対するこの強い結合の結果、抗ＨＳＰ−２７抗体が、内因性ＨＳＰ−２７の活性及び発現を阻害した；
（３）退行期の発生の頻度の増加（抗ＨＳＰ−２７抗体処置毛嚢６７％対対照１６％、データが表２で示されている）；
（４）毛髪繊維発育の有意な低減（データが表２で示されている）；及び
（５）追加のＨＳＰ阻害物質を選択する方法。
【００４９】
【表１３】
2007534700.tif 000016
a育毛は、５日目の毛嚢の全長から０日目の毛嚢の全長を差し引くことにより決定された。阻害％＝１００−（阻害物質で処置された毛嚢の育毛／対照の育毛）×１００。退行期％＝（退行期毛嚢数／全毛嚢数）×１００。
【００５０】
ヒト毛嚢成育の用量依存性低減が、ＨＳＰ−９０特異的阻害物質ゲルダナマイシンで見られた（表３）。阻害物質のマイクロモル以下の用量での育毛の強力な、５０％を超える低減は、最適に機能化されたＨＳＰ活性に対する育毛の依存性を示す。
【００５１】
【表１４】
2007534700.tif 000017
a育毛は、６日目の毛嚢の全長から０日目の毛嚢の全長を差し引くことにより決定された。阻害％＝１００−（阻害物質で処置された毛嚢の育毛／対照の育毛）×１００。
【００５２】
表４は、ＫＮＫ４３７、ベンジリデンラクタム化合物によるヒト毛嚢発育の用量依存性低減を示す。化合物ＫＮＫ４３７は、ｍＲＮＡレベルでＨＳＰの誘発、従ってその発現を阻害することが知られている。
【００５３】
【表１５】
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a育毛は、６日目の毛嚢の全長から０日目の毛嚢の全長を差し引くことにより決定された。低減％＝１００−（阻害物質で処置された毛嚢の育毛／対照の育毛）×１００。
【国際調査報告】
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