(57)【要約】  本出願は、有効量のＣＤ２０に結合する抗体を用いて哺乳動物の多発性軟骨炎又は多発性単神経炎を治療する方法に関し、場合によってはこれらの疾患を治療するために有効な量の他の薬剤を用いる方法に関する。
2007532680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０を結合する抗体の有効量を哺乳動物に投与されることを含む、哺乳動物の多発性軟骨炎又は多発性単神経炎の治療方法。
【請求項２】
前記抗体は他の分子とコンジュゲートしていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体は他の分子とコンジュゲートしている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記他の分子が細胞障害性薬剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞障害性薬剤が放射性化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞障害性薬剤がＹ２Ｂ８又は１３１Ｉ-Ｂ１を含有する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がリツキシマブを含有する、請求項１ないし６の何れか一に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がヒト化２Ｈ７を含有する、請求項１ないし６の何れか一に記載の方法。
【請求項９】
およそ２０ｍｇ／ｍ２からおよそ２５０ｍｇ／ｍ２の用量の抗体を哺乳動物が投与されることを含む、請求項１ないし８の何れか一に記載の方法。
【請求項１０】
前記用量がおよそ５０ｍｇ／ｍ２からおよそ２００ｍｇ／ｍ２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
初期用量の後に持続用量の抗体を投与することを含み、その抗体のｍｇ／ｍ２持続用量が抗体のｍｇ／ｍ２初期用量を超えるものである、請求項１ないし１０の何れか一に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１ないし１１の何れか一に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が静脈内に投与される、請求項１ないし１２の何れか一に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が皮下に投与される、請求項１ないし１２の何れか一に記載の方法。
【請求項１５】
更に、免疫抑制剤、抗疼痛剤又は化学療法剤の有効量が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１ないし１４の何れか一に記載の方法。
【請求項１６】
多発性軟骨炎が治療される、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法。
【請求項１７】
更に、非ステロイド系抗炎症薬、ステロイド、メトトレキセート、シクロホスファミド、ダプソン、アザチオプリン、ペニシラミン又はシクロスポリンの有効量が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多発性単神経炎が治療される、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法。
【請求項１９】
更に、抗疼痛剤、ステロイド、メトトレキセート、シクロホスファミド、血漿交換、静脈免疫グロブリン、シクロスポリン又はミコフェノール酸モフェチルの有効量が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
容器と、容器内に収容されるＣＤ２０を結合する抗体を含んでなる組成物とを含んでなる製造品であり、更に、該組成物の使用者に哺乳動物の多発性軟骨炎あるいは多発性単神経炎の治療について指示するパッケージ挿入物を含んでなる製造品。
【請求項２１】
更に、治療のための抗体以外の薬剤を含有する容器を含んでなり、更に、この薬剤で哺乳動物が治療されることについての指示書を含む、請求項２０に記載の製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法１１９条の下に、２００４年４月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／５６３，２２７号及び２００４年４月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／５６５，０９８号の優先権を主張し、この仮出願全体を出典明記により本明細書に包含する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＣＤ１９又はＣＤ２０などのＢ細胞表面上マーカーに結合するアンタゴニスト、例えばＣＤ２０に結合する抗体を用いた疾患の治療方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
リンパ球は、造血過程の間に骨髄において生産される多種ある白血球のうちの１つである。リンパ球の２つの主な分類は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）とＴリンパ球（Ｔ細胞）である。ここで特に対象とするリンパ球はＢ細胞である。
Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、その細胞表面上に抗原結合抗体を発現する骨髄を放出する。天然のＢ細胞がその膜結合性抗体に特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分離し、その子孫はメモリーＢ細胞と「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞は長い寿命を持ち、本来の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現する代わりに、分泌型抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
【０００４】
ＣＤ２０抗原（ヒトＢリンパ球制限分化抗原、Ｂｐ３５とも呼ばれる）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量の疎水性膜貫通型タンパク質である（Valentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)；及びEinfeldら, EMBO J. 7(3):711-717(1988)）。該抗原はまたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に発現されるが（Anderson等, Blood 63(6):1424-1433 (1984)）、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない（Tedder等, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)）。ＣＤ２０は分化及び細胞周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し（上掲のTedderら）、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能する（Tedder等, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)）。
【０００５】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫の「標的とする（ターゲティング）」ための候補となりうる。基本的に標的とするとは以下のことを言う：Ｂ細胞のＣＤ２０表面上抗原特異的な抗体を患者に投与する。これらの抗ＣＤ２０抗体は、正常及び悪性の何れのＢ細胞（表面上）のＣＤ２０抗原にも特異的に結合する；ＣＤ２０表面上抗原に結合する抗体は、腫瘍性Ｂ細胞を破壊及び減少に至らしめることができる。さらに、腫瘍を破壊する可能性を有する化学薬品または放射性標識は抗ＣＤ２０抗体に結合させて、作用剤が腫瘍性Ｂ細胞特異的に「運ばれる」ようにすることができる。方法にかかわりなく、主たる目的は、腫瘍を破壊することである；特定の方法は、使用する特定の抗ＣＤ２０抗体により測定することができ、ゆえに、ＣＤ２０抗原を標的とする有用な方法はかなり異なる。
【０００６】
ＣＤ１９は、Ｂ細胞系の表面上に発現するもう一つの抗原である。ＣＤ２０のように、ＣＤ１９は、幹細胞段階からプラズマ細胞へ終末分化するまでの系統分化の間ずっと、細胞上にみられる。(Nadler, L. Lymphocyte Typing II 2: 3-37及びAppendix, Renling等, 編集,  (1986), Springer Verlag)。しかしながらＣＤ２０とは異なり、ＣＤ１９に結合する抗体によって、ＣＤ１９抗原の内部移行が生じる。ＣＤ１９抗原は、例えばＨＤ２３７-ＣＤ１９抗体（「ＡＢ４」抗体とも呼称される）によって同定される(Kiesel等 Leukemia Research II, 12: 1119 (1987))。ＣＤ１９抗原は、末梢血単核細胞の４−８％及び末梢血、脾臓、リンパ節又は扁桃腺から単離したＢ細胞の９０％以上に存在する。ＣＤ１９は、末梢血Ｔ細胞、単球又は顆粒球上には検出されない。実質的に、全ての非Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びＢ細胞リンパ腫は、抗体Ｂ４によって検出可能なＣＤ１９を発現する(Nadler等 J. Immunol. 131:244 (1983)；及びNadler等 Progress in Hematology Vol. XII 187-206頁. Brown, E.編集. (1981), Grune & Stratton, Inc)。
【０００７】
Ｂ細胞系統の細胞で発現される分化段階特有の抗原を認識する更なる抗体が同定された。それらの中には、ＣＤ２１抗原に対するＢ２抗体；ＣＤ２２抗原に対するＢ３抗体；及びＣＤ１０抗原（ＣＡＬＬＡとも呼称）に対するＪ５抗体がある 。例として１９９７年１月２１日発行の米国特許第５５９５７２１号(Kaminski等)を参照。
リツキシマブ(rituximab)（リツキサン(RITUXAN)(登録商標)）抗体は、一般的にＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行の米国特許第５７３６１３７号（Anderson等）において「ＡＣ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。リツキサン(登録商標)は、再発性または低抵抗性の（refractory low-grade）または濾胞性の（follicular）、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療のためのものである(Maloney等 Blood 82 (Suppl 1): 445a (1993)；Maloney 等 Proc Am Soc Clin Oncol 13: 993 (1994))。インビトロの作用機序の研究は、リツキサン(登録商標)がヒト補体に結合し補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を通してリンパＢ細胞系を溶解することを実証している（Reff等, Blood 83(2):435-445 (1994)）。加えて、その抗体は抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）のアッセイにおいて有意な活性を有している。更に近年、リツキサン（登録商標）は、他の抗ＣＤ１９抗体や抗ＣＤ２０抗体にはない、トリチウム化したチミジン取り込みアッセイにおける抗増殖性効果を持つこと及び直接的にアポトーシスを誘導することが示唆されている(Maloney等 Blood 88(10):637a (1996))。また、リツキサン（登録商標）及び化学療法及び毒素間の相乗効果は、実験的に観察された。特に、リツキサン（登録商標）は、ドキソルビシン、CDDP、VP-16、ジフテリア毒素及びリシンの細胞障害性効果に対するヒトＢ細胞リンパ腫細胞系の薬物抵抗性の感度を高める(Demidem等 Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)；Demidem A 等 FASEB J 9:A206 (1995))。インビボ前臨床研究では、リツキサン（登録商標）が、おそらく補足及び細胞媒介過程において、カニクイザルの末梢血、リンパ節及び骨髄からのＢ細胞を減少させることを示した (Reff 等, 上掲)。
【０００８】
また、リツキシマブは様々な非悪性腫瘍性自己免疫疾患において研究されており、そこでＢ細胞と自己抗体は疾患病理学上の役割があるようである。Edwards 等, Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)。リツキシマブは、例えば、関節リウマチ(RA) (Leandro 等, Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002)；Edwards 等, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002)；Stahl 等, Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003)；Emery 等, Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003))、ループス(Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003)；Leandro 等 Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002)；Gorman 等, Lupus, 13: 312-316 (2004))、免疫性血小板減少性紫斑病(D’Arena 等, Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003)；Stasi 等, Blood, 98: 952-957 (2001)；Saleh 等, Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000)；Zaia 等, Haematolgica, 87: 189-195 (2002)；Ratanatharathorn 等, Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000))、 赤芽球ろう (Auner 等, Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002))；自己免疫性貧血(Zaja 等, Haematologica 87:189-195 (2002) (Haematologica 87:336 (2002)に誤植あり)、寒冷凝集素症 (Layios 等, Leukemia, 15: 187-8 (2001)；Berentsen 等, Blood, 103: 2925-2928 (2004)；Berentsen 等, Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001)；Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001)；Damiani 等, Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001))、重症インスリン耐性のタイプＢ症候群(Coll 等, N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004)、混合クリオグロブリン血症(DeVita 等, Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002))、重症筋無力症(Zaja 等, Neurology, 55: 1062-63 (2000)；Wylam 等, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003))、ウェゲナー肉芽腫症(Specks 等, Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001))、難治性尋常性天疱瘡(Dupuy 等, Arch Dermatol., 140:91-96 (2004))、皮膚筋炎(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002))、シェーグレン症候群(Somer 等, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003))、急性タイプＩＩ混合クリオグロブリン血症(Zaja 等, Blood, 101: 3827-3834 (2003))、尋常性天疱瘡(Dupay 等, Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004))、自己免疫性ニューロパチー(Pestronk 等, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003))、腫瘍随伴性眼球クローヌス-筋クローヌス症候群(Pranzatelli 等 Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003))、及び再発性多発性硬化症(RRMS)の徴候及び症状を潜在的に軽減することが報告されている。Cross 等 (abstract) 「Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS」 Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003)。
【０００９】
第ＩＩ相研究（ＷＡ16291）を関節リウマチ（ＲＡ）患者で行い、リツキシマブの安全性及び有効性に関する４８週フォローアップデータを得ている。Emery 等 Arthritis Rheum 48(9): S439 (2003)；Szczepanski 等 Arthritis Rheum 48(9): S121 (2003)。合計１６１人の患者は、４つの治療アームについて均等にランダム化した：メトトレキセート、リツキシマブ単独、リツキシマブとメトトレキセート、及びリツキシマブとシクロホスファミド（ＣＴＸ）。リツキシマブの治療投薬計画は、第１日目と第１５日目に１ｇを静脈内に投与された。ほとんどのＲＡ患者はリツキシマブを注入すると、十分な耐性となり、初めの注入の間でさえ少なくとも一の有害症状を経験するものは３６％に上る（これに対してプラシーボ投与患者は３０％）。概して、大多数の有害症状は、重症度が軽度から中程度のものであると考えられ、すべての治療群全体で等しかった。４８週間の４アーム全体の中に合計１９の重症有害症状があった。それはリツキシマブ／ＣＴＸ群においてわずかに頻度が多かった。感染の発病は、すべての群全体で等しかった。このＲＡ患者集団の深刻な感染の平均率は年間１００患者につき４．６６であった。それは地域に密着した疫学研究で報告されたＲＡ患者の入院を必要とする感染率より低い（年間１００患者につき９．５７）。Doran 等, Arthritis Rheum. 46:2287-2293 (2002)。
少数の自己免疫神経障害(Pestronk等, 上掲)、眼球クローヌス-筋クローヌス症候群(Pranzatelli 等, 上掲)及びＲＲＭＳ (Cross 等, 上掲)）を含む神経病患者におけるリツキシマブの報告された安全特性は、腫瘍学又はＲＡにおいて報告されたものと同じであった。ＲＲＭＳ患者においてインターフェロンβ（ＩＦＮ-β）又は酢酸グラチラマー(glatiramer acetate)と組み合わせたリツキシマブの現行の研究者主導試験(investigator-sponsored trial, IST)（Cross 等, 上掲）では、１０人の治療された患者のうちの１人はリツキシマブの第一注入の後に中程度の熱と悪寒を経験し、一晩観察のために病院に入院したが、その他の９人の患者は有害症状を報告することなく４の注入投薬計画を終えた。
【００１０】
ＣＤ２０抗体及びＣＤ２０結合分子に関する特許及び特許文献には、米国特許第 5,776,456号、同第5,736,137号、同第5,843,439号、同第6,399,061号及び同第6,682,734号、並びに米国公開特許2002/0197255、米国公開特許2003/0021781、米国公開特許2003/0082172、米国公開特許2003/0095963、米国公開特許2003/0147885 (Anderson 等)；米国特許第 6,455,043号及び国際公報2000/09160 (Grillo-Lopez, A.)；国際公報2000/27428 (Grillo-Lopez及びWhite)；国際公報2000/27433 (Grillo-Lopez及びLeonard)；国際公報2000/44788 (Braslawsky 等)；国際公報2001/10462 (Rastetter, W.)；国際公報01/10461 (Rastetter及びWhite)；国際公報2001/10460 (White及びGrillo-Lopez)；米国公開特許2001/0018041、米国公開特許2003/0180292、国際公報2001/34194 (Hanna及びHariharan)；米国公開特許2002/0006404及び国際公報2002/04021 (Hanna及びHariharan)；米国公開特許2002/0012665及び国際公報2001/74388 (Hanna, N.)；米国公開特許2002/0058029 (Hanna, N.)；米国公開特許2003/0103971 (Hariharan及びHanna)；米国公開特許2002/0009444及び国際公報2001/80884 (Grillo-Lopez, A.)；国際公報2001/97858 (White, C.)；米国公開特許2002/0128488及び国際公報2002/34790 (Reff, M.)；国際公報2002/060955 (Braslawsky 等)；国際公報2002/096948 (Braslawsky 等);国際公報2002/079255 (Reff及びDavies)；米国特許第 6,171,586号及び国際公報1998/56418 (Lam 等)；国際公報1998/58964 (Raju, S.)；国際公報1999/22764 (Raju, S.)；国際公報1999/51642、米国特許第 6,194,551号、米国特許第 6,242,195号、米国特許第 6,528,624号及び米国特許第 6,538,124 号(Idusogie 等)；国際公報2000/42072 (Presta, L.)；国際公報2000/67796 (Curd 等)；国際公報2001/03734 (Grillo-Lopez 等)；米国公開特許2002/0004587及び国際公報2001/77342 (Miller及びPresta)；米国公開特許2002/0197256 (Grewal, I.)；米国公開特許2003/0157108 (Presta, L.)；米国特許第 6,565,827号、同第6,090,365号、同第6,287,537号、同第6,015,542号、同第5,843,398号、及び同第5,595,721号、(Kaminski 等)；米国特許第 5,500,362号、同第5,677,180号、同第5,721,108号、同第6,120,767号、及び同第6,652,852号 (Robinson 等)；米国特許第6,410,391号 (Raubitschek 等)；米国特許第 6,224,866号及び国際公報00/20864 (Barbera-Guillem, E.)；国際公報2001/13945 (Barbera-Guillem, E.)；国際公報2000/67795 (Goldenberg)；米国公開特許2003/0133930及び国際公報2000/74718 (Goldenberg及びHansen)；米国公開特許2003/0219433及び国際公報2003/68821 (Hansen 等)；国際公報2004/058298 (Goldenberg及びHansen)；国際公報2000/76542 (Golay 等)；国際公報2001/72333 (Wolin及びRosenblatt)；米国特許第 6,368,596 号(Ghetie 等)；米国特許第 6,306,393号及び米国公開特許2002/0041847 (Goldenberg, D.)；米国公開特許2003/0026801 (Weiner及びHartmann)；国際公報2002/102312 (Engleman, E.)；米国公開特許2003/0068664 (Albitar 等)；国際公報2003/002607 (Leung, S.)；国際公報2003/049694、米国公開特許2002/0009427、及び米国公開特許2003/0185796 (Wolin 等)；国際公報2003/061694 (Sing及びSiegall)；米国公開特許2003/0219818 (Bohen 等)；米国公開特許2003/0219433及び国際公報2003/068821 (Hansen 等)；米国公開特許2003/0219818 (Bohen 等)；米国公開特許2002/0136719 (Shenoy 等)；国際公報2004/032828 (Wahl 等)；及び国際公報2002/56910 (Hayden-Ledbetter)が含まれる。また、米国特許第 5,849,898号及び欧州特許第330,191号 (Seed 等)；欧州特許第332,865号A2 (Meyer及びWeiss)；米国特許第 4,861,579号 (Meyer 等)； 米国公開特許2001/0056066 (Bugelski 等)；国際公報1995/03770 (Bhat 等)；米国公開特許2003/0219433 A1 (Hansen 等)；国際公報2004/035607 (Teeling 等)；国際公報2004/056312 (Lowman 等)；米国公開特許2004/0093621 (Shitara 等)；国際公報2004/103404 (Watkins 等)；国際公報2005/000901 (Tedder 等)；米国公開特許2005/0025764 (Watkins 等)；国際公報2005/016969 (Carr 等)；及び米国公開特許2005/0069545 (Carr 等)が含まれる。国際公報2004/032828 は抗ＣＤ２０抗体で治療する免疫疾患の一つとして再発性多発性軟骨炎を挙げている。
【００１１】
リツキシマブを用いた治療に関する文献には、Perotta及びAbuel, 「Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab」 Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)；Perotta 等, 「Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)」, Blood, 94: 49 (abstract) (1999)；Matthews, R., 「Medical Heretics」 New Scientist (7 April, 2001)；Leandro 等, 「Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion」 Ann Rheum Dis, 上掲；Leandro 等, 「Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response」  Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro 等, 「An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus」, Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)、この中では2週間の期間に各患者はリツキシマブ500mgの2回投与、シクロフォスファミド750mgの2回投与、及び高用量経口副腎皮質ステロイドを受け、この治療患者のうち2人はそれぞれ7か月目と8か月目に再発し、異なるプロトコールで再治療されている；「Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy」 Weide 等, Lupus, 12: 779-782 (2003)、この中ではある患者はリツキシマブ（375mg/m2×4回、1週間間隔で繰り返す）で治療を受け、更に5〜6か月ごとにリツキシマブを適用し、次いで維持療法として3か月ごとに375mg/m2のリツキシマブ投与をした、他方、難治性ＳＬＥ患者はリツキシマブで成功裏に治療され、維持療法を3か月ごとに受けている、両患者はリツキシマブ療法によく応答している；Edwards及びCambridge, 「Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes」 Rheumatology 40:205-211 (2001)；Cambridge 等, 「B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters」 Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002)；Edwards 等, 「B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders」 Biochem Soc. Trans., 上掲；Edwards 等, 「Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Edwards 等, 「Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis」 N Engl. J. Med. 350:2572-82 (2004)；Pavelka 等, Ann. Rheum. Dis. 63: (S1):289-90 (2004)；Emery 等, Arthritis Rheum. 50 (S9):S659 (2004)；Levine及びPestronk, 「IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab」 Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita 等, 「Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)；Hidashida 等 「Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab.」  the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002に公開；Tuscano, J. 「Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab」 the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002に公開；「Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic」 Martin and Chan, Immunity 20:517-527 (2004)；Silverman及びWeisman, 「Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy」, Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003)；Kazkaz及びIsenberg, 「Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases」, Current opinion in pharmacology, 4: 398-402 (2004)；Virgolini and Vanda, 「Rituximab in autoimmune diseases」, Biomedicine & pharmacotherapy, 58: 299-309(2004)； Klemmer 等, 「Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab」, Arthritis And Rheumatism , 48: (9) 9,S (SEP), page: S624-S624 (2003)；Kneitz 等, 「Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases」, Immunobiology, 206: 519-527 (2002)；Arzoo 等, 「Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab)」Annals of the Rheumatic Diseases,  61 (10), p922-4 (2002) Comment in Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002)；「Future Strategies in Immunotherapy」 Lake及びDionne, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley & Sons, Inc.)Article Online Posting Date: January 15, 2003 (Chapter 2 「 Antibody-Directed Immunotherapy」)；Liang and Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target, 文献オンライン登記日: 2002年1月15日 表題「CD20」；「Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens」と題するAppendix 4A  Stockinger 等, 編集: Coligan 等, in Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley & Sons, Inc) オンライン登記日: 2003年3月；印刷物出版日: 2003年2月；Penichet及びMorrison, 「CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering」 Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies; オンライン登記 2002年1月15日；Specks 等 「Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy」 Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001)；online abstract submission and invitation Koegh 等, 「Rituximab for Remission Induction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients」, American College of Rheumatology, Session Number: 28-100, Session Title: Vasculitis, Session Type: ACR Concurrent Session, Primary Category: 28 Vasculitis, Session 10/18/2004 (<www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp>)；Eriksson, 「Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab」, Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003)；Jayne 等, 「B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis」 Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003)；Jayne, poster 88 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), 2003 American Society of Nephrology；Stone及びSpecks, 「Rituximab Therapy for the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis」, the 2002-2003 Immune Tolerance Networkのthe Clinical Trial Research Summary, <www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html>が含まれる。また、Leandro 等, 「B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus」 Arthritis Rheum., 48 (Suppl  9): S1160 (2003)も参照。
【００１２】
Sarwal 等 N. Eng. J. Med. 349(2): 125-138（2003年7月10日）は、ＤＮＡマイクロアレイプロファイリングによって同定された急性の腎臓同種異系移植片拒絶反応の分子不均一性を報告している。
再発性多発軟骨炎は、身体の様々な組織の軟骨に炎症が再発するという特徴を有するまれな軟骨の慢性疾患である。炎症を起こしうる軟骨を含有する組織には、耳、鼻、関節、脊椎及び気管（気管）などがある。また、軟骨と類似の生化学的構成である眼、心臓及び血管も影響を受けうる。
再発性多発軟骨炎の原因は知られていない。この症状は、身体の免疫系（通常身体への侵入物、特に感染を退けるもの）が誤って引き起こされる免疫系疾患（自己免疫）によって生じると思われる。この結果、身体の様々な組織に炎症が生じる。消炎剤及び様々なステロイドによって軽減されうる。
多発性単神経炎は、少なくとも２の異なる神経域への隔たれた損傷を伴う運動末梢性神経障害及び痛みを有する非対称性非同期感覚である。身体のランダムな領域にある複数の神経が影響を受けうる。症状が悪化するにつれて、多病巣性でなくなり、より対称性になる。これは多発性神経炎に似ている。多発性単神経炎症候群は、身体全体にわたって、両側性、遠位及び近位に分布しうる。神経への損傷は軸索（すなわち導線の銅部分に類似する神経細胞の一部）の破壊を伴うため、損傷の位置で神経伝導が妨げられる。一般的な原因は、糖尿病と、複数の神経圧縮、並びに減少した血流や血管の炎症によって生じる酸素欠乏などがある。症例の約１／３は原因不明である。複数の特定の疾患は、限定するものではないが、結節性多発動脈炎及び他の脈管炎疾患などの血管疾患、糖尿病、及び結合織病、例えば関節リウマチや全身性エリテマトーデスを含む、多発性単神経炎と関係している。結合織病は子どもでは最も一般的な原因である。一般性の低い原因には以下のものがある：シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、血管の炎症を引き起こす過敏症（アレルギー性反応）、ハンセン病、サルコイドーシス、アミロイドーシス、糖尿病性神経障害の多病巣性型、及び血液の疾患（例えば過好酸球増加症及びクリオグロブリン血症）。例としてHattori 等 Brain 122(3): 427-439 (1999)を参照のこと、この中では、２８人のチャーグ-ストラウス症候群と関係する末梢性神経障害患者の臨床病理学的特徴が評価されており、感覚器及び運動器の関与により四肢に制限された非対称性の多発性神経炎に進行する初期段階の多発性単神経炎のパターンをほぼ示した。ＣＤ２０陽性Ｂリンパ球は時々だけ観察された。
【００１３】
神経障害の治療はその原因に依存し、多くの神経障害は根本的な原因（例えばビタミン欠乏症）を調べることによって治療されうる。発症を予防されうることもある。例えば、コントロール中の糖尿病では、糖尿病性神経障害が予防されうる。腫瘍又は椎間板ヘルニアが原因である場合、腫瘍を取り除くか椎間板ヘルニアを修復するための外科的手術を治療と共に施されてもよい。包括法又は圧縮神経障害治療法では、治療は尺骨あるいは正中神経の副木固定又は外科的減圧法から成ってもよい。腓骨及び放射状加圧神経障害は加圧の回避を必要とするかもしれない。理学療法及び／又は副木は、拘縮（関節のまわりのもろくなった筋肉によって異常や時には関節の痛みが生じる症状）の予防に有用でありうる。免疫疾患と関係している神経障害は、免疫系の異常な特徴に対する治療で改善されうる。このような治療には、静脈免疫グロブリン、血漿交換及び免疫抑制療法などがある(Cook 等 Neurology 40:212-214 (1990)；Dyck 等 N. Engl. J. Med 325:1482-1486 (1991)；Ernerudh 等 J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:930-934 (1992)；Blume 等 Neurology 45:1577-1580 (1995)；Pestronk 等 Neurology 44:2027-2031 (1994))。これらはごく小さい機能的な改善をなし得る。さらに、治療にはお金と時間がかかりうる。
Ｂ細胞表面膜マーカーに対する抗体誘導性治療の文献は、極めて少ない。Levine及びPestronkは、リツキシマブで治療された、神経障害とＧＭ１又はＭＡＧに対する免疫グロブリンＭ抗体を有する５人の患者について記載している。３〜６か月の治療の範囲内で、５人は機能が改善され、血清抗体の力価が低減した(Levine及びPestornk Am. J. Neurol. 52:1701-1704 (1999))。
特定の治療が有効でない場合、神経障害の疼痛は通常、鎮痛剤、疼痛薬物、三環系抗鬱薬、抗発作薬物又は神経遮断剤を用いてコントロールされうる。
【００１４】
Sutton及びWiner Current Opinion in Pharmacology 2/3: 291-295（２００２年６月１日）は、血漿交換、静脈免疫グロブリン及び副腎皮質ホルモンが炎症性神経障害の治療の中心として寄与することを提唱している。最近の実験により、これらの治療の組み合わせが単一薬剤治療より有意に効果的でないことが示されている。新規の免疫療法及び細胞障害性薬剤の有用性は、少数の患者治療の非盲検試験であるために確認するのが困難である。
Lee 等 Bone Marrow Transplantation 30/1: 53-56 (2002)は、高用量化学療法及び自己由来の末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）移植が、重症で進行性の治療抵抗性モノクローナル免疫グロブリン異常症の不明徴候（ＭＧＵＳ）の二次的な末梢性神経障害の治療に役立ちうることを提唱している。Latov 等 Neurology 52: A551 (1999)は、リツキサン(登録商標)が抗ＭＡＧ抗体活性とＩｇＭモノクローナル免疫グロブリン異常症を伴う２人の神経障害患者の治療で安全性と有効性を示したことを開示している。Canavan 等 Neurology 58/7 (Suppl. 3): A233（２００２年４月）は、リツキサン(登録商標)がＩｇＭ自己抗体随伴多発性神経炎を示すほとんどの治療患者の持続的臨床改善と関係があったことを開示していた。
抗ＣＤ２０抗体を用いたインターフェロンαに抵抗性の混合クリオグロブリン血症のモノクローナル抗体治療に関して、Sansonno 等 Blood 101(10): 3818-3826（２００３年５月１５日）は、リツキサンを用いた末梢性神経障害の治療を開示している。
Hattori 等 Brain 122/3: 427-439 (1999)はチャーグ-ストラウス症候群を伴う末梢性神経障害患者の臨床病理学的特徴を評価して、ＣＤ２０陽性Ｂリンパ球がごくたまに観察されたことを述べた。
【００１５】
Zaja 等 Blood 101(10): 3827-3834（２００３年５月１５日）は、リツキサン(登録商標)がタイプＩＩ混合クリオグロブリン血症（ＭＣ）において標準的な免疫抑制に代わって安全性と有効性を表しうることを開示した。リツキサン(登録商標)は、皮膚脈管炎徴候（潰瘍、紫斑病又は蕁麻疹）、末梢性神経障害の自覚症状、軽度のＢ細胞リンパ腫、関節痛及び熱に効果を示した。Zaidi 等 Leukemia and Lymphoma 45/4: 777-780 (2004)は、肺、肝臓、中枢及び末梢神経系に併発し、初年度で６０％近い死亡率を有する稀なリンパ増殖性疾患であるリンパ腫肉芽腫症（ＬＹＧ）の症例がリツキサン(登録商標)で成功裏に治療されることを開示した。しかしながら、Trojan 等 Annals of Oncology 13/5: 802-805 (2002)は、リツキサン(登録商標)が神経リンパ腫症による末梢性神経障害に罹患している患者に有効性を示さないことを開示した。インラインＰＥＴ-ＣＴ系で行われる融合ＰＥＴ-ＣＴ画像診断により、形質転換したＢ細胞非ホジキンリンパ腫の早期再発に応答して末梢神経に沿って伸びている複数の小結節性の病変が示された。
Binstadt 等 Journal of Pediatrics 143/5: 598-604（２００３年１１月）は、リツキサン(登録商標)が、各々中枢神経系（ＣＮＳ）を併発している、従来の免疫抑制薬物に抵抗性の４人の多系統自己免疫性疾患小児患者において安全性と有効性があると結論付けた。自己免疫性血球減少及び自己免疫ＣＮＳ及び末梢神経系疾患のある患者は、血球減少の解決能を有して、神経症状の改善を示した；患者は現在のところ免疫抑制薬物を投与されていないことを報告する。リンパ形質細胞様大腸炎、肺小結節及びＣＮＳ疾患を有する半数の同胞子は症状が改善された。一次抗リン脂質抗体症候群の二次症状である舞踏病及び発作を有する第４の患者は、良好な全体の運動機能の改善を示し、発作頻度が減少した。Saito 等 Lupus 12/10: 798-800 (2003)は、リツキサン(登録商標)が高活性Ｂリンパ球を伴う全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のＣＮＳ併発及び難治性ループス腎炎患者の治療に有用であったことを開示する。
様々な徴候、例として多発性軟骨炎及び多発性単神経炎を治療するための付加的な薬剤が当分野では必要である。
【００１６】
（発明の概要）
したがって、本発明は請求の範囲の通りである。特に、本発明は、第一の態様において、ＣＤ２０を結合する抗体の有効量を哺乳動物に投与されることを含む、哺乳動物の多発性軟骨炎又は多発性単神経炎の治療方法を提供する。
前記方法の一実施態様では、抗体は他の分子とコンジュゲートしていない。他の実施態様では、抗体は他の分子、例えば放射性化合物、例えばＹ２Ｂ８又は１３１Ｉ-Ｂ１などの細胞障害性薬剤とコンジュゲートしている。他の実施態様では、前記抗体がリツキシマブ又はヒト化２Ｈ７を含有する。一実施態様のヒト化２Ｈ７は配列番号２及び８の可変ドメイン配列を含有する。他の実施態様では、ヒト化２Ｈ７は配列番号８内に変異Ｎ１００Ａ又はＤ５６Ａ、Ｎ１００Ａを有する可変重鎖ドメインと、配列番号２内に変異Ｍ３２Ｌ、Ｓ９２Ａ又はＭ３２Ｌ、Ｓ９２Ａを有する可変軽鎖ドメインを含有する。更なる実施態様では、ヒト化２Ｈ７は配列番号３０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と配列番号８の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含有してなり、更に抗体がＶＨ-ＣＤＲ２内にＤ５６Ａのアミノ酸置換を含有し、ＶＨ-ＣＤＲ３内のＮ１００がＹ又はＷで置換されているものであり、より好ましくは抗体が配列番号３１のｖ５１１軽鎖配列と配列番号３２のｖ５１１重鎖配列を含有する。
前記抗体はおよそ２０ｍｇ／ｍ２からおよそ２５０ｍｇ／ｍ２の用量で哺乳動物に投与されることが好ましく、より好ましくはおよそ５０ｍｇ／ｍ２からおよそ２００ｍｇ／ｍ２である。他の好適な実施態様では、前記方法は初期用量の後に持続用量の抗体を投与することを含み、その抗体のｍｇ／ｍ２持続用量が抗体のｍｇ／ｍ２初期用量を超えるものである。
【００１７】
さらに他の好適な実施態様では、哺乳動物はヒトである。抗体は、静脈内又は皮下に投与されるのが好ましい。
好適な実施態様では、前記方法は有効量の抗体が哺乳動物に投与されることを基本的に含む。
他の好適な実施態様では、前記方法は更に、免疫抑制剤、抗疼痛剤又は化学療法剤の有効量が哺乳動物に投与されることを含む。
更なる実施態様では、多発性軟骨炎が治療される場合、前記方法は更に、非ステロイド系抗炎症薬、ステロイド、又は免疫抑制薬、例としてメトトレキセート、シクロホスファミド、ダプソン、アザチオプリン、ペニシラミン又はシクロスポリンの有効量が哺乳動物に投与されることを含む。多発性単神経炎が治療される場合、前記方法は更に、抗疼痛剤、ステロイド、メトトレキセート、シクロホスファミド、血漿交換、静脈免疫グロブリン、シクロスポリン又はミコフェノール酸モフェチルの有効量が哺乳動物に投与されることを含む。
更なる態様では、本発明は容器と、容器内に収容されるＣＤ２０を結合する抗体を含んでなる組成物とを含んでなる製造品であり、更に、哺乳動物の多発性軟骨炎あるいは多発性単神経炎の治療について指示するパッケージ挿入物を含んでなる製造品に関する。好適な実施態様では、製造品は更に、治療のための抗体以外の薬剤を含有する容器を含んでなり、更に、この薬剤で哺乳動物が治療されることについての指示書を含む。
【００１８】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで「Ｂ細胞表面上マーカー」又は「Ｂ細胞表面上抗原」とは、Ｂ細胞の表面上に発現する抗原であり、それに結合するアンタゴニストの標的となることができる。例示的Ｂ細胞表面上マーカーには、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５及びＣＤ８６白血球表面上マーカーが含まれる。(詳しくは、The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, 編集. Barclay 等 Academic Press, Harcourt Brace & Co., New Yorkを参照)。他のＢ細胞表面上マーカーには、RP105、FcRH2、CD79A、C79B、B細胞CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA、及び239287_atなどがある。特に対象とするＢ細胞表面上マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比較してＢ細胞上に優先的に発現しており、Ｂ細胞前駆細胞及び成熟Ｂ細胞の両方の細胞上に発現していてもよい。本明細書中で好適なＢ細胞表面上マーカーはＣＤ２０及びＣＤ２２である。
【００１９】
「ＣＤ２０」抗原又は「ＣＤ２０」は、末梢血又はリンパ系器官に由来するＢ細胞の９０％以上の表面にみられるおよそ３５ｋＤａの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞だけでなく悪性のＢ細胞上にも存在し、幹細胞には発現しない。ＣＤ２０を意味する文献中での他の名称には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」などがある。ＣＤ２０抗原は、例としてClark等 PNAS (USA) 82:1766 (1985)に記載されている。
ＢＬ-ＣＡＭ又はＬｙｂ８としても知られる「ＣＤ２２」抗原又は「ＣＤ２２」は、およそ１３０ｋＤ（還元型）から１４０ｋＤ（非還元型）の分子量を有するタイプ１完全膜糖タンパク質である。それはＢリンパ球の細胞質及び細胞膜に発現される。ＣＤ２２抗原は、Ｂ細胞リンパ球分化の初めにＣＤ１９抗原とおよそ同じ段階で現れる。他のＢ細胞マーカーと異なり、ＣＤ２２膜発現は成熟Ｂ細胞（ＣＤ２２＋）とプラズマ細胞（ＣＤ２２−）の間の後期分化段階に限定される。ＣＤ２２抗原は、例えば、Wilson 等 J. Exp. Med. 173: 137 (1991)及びWilson 等 J. Immunol. 150:5013 (1993)において記述されている。
【００２０】
本明細書中の「非悪性疾患」は多発性軟骨炎又は多発性単神経炎であり、好ましくは多発性単神経炎である。あるいは、脊柱-眼の多発性硬化症；尋常性天疱瘡；チャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群（ＣＳＳ）；ループス脳炎；ループス腎炎；皮膚全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；喘息以外のＩｇＥ媒介性疾患、特にアレルギー性鼻炎、アナフィラキシー又は過敏性皮膚炎；慢性神経障害；眼球クローヌス-筋硬直症候群；肺胞タンパク症；強膜炎；微細な多発性血管炎；腫瘍随伴症候群、この症候群は低血糖又は貧血症、Lambert-Eatonを含まない高カルシウム血症など、腫瘍によって生じる遠隔的な影響である；ラスマッセン脳炎；中枢神経系（ＣＮＳ）脈管炎；チャネル病、この疾患はイオンチャネル機能不全、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病（ＣＮＳ炎症性疾患を含まない）と関係している多様な性質を有するものである；自閉症；又は、神経障害、筋疾患あるいはＣＮＳサルコイドーシスでもよい。
本願明細書において用いられる「多発性軟骨炎」は任意の多発性軟骨炎を意味し、再発性多発軟骨炎、Von Meyenburg疾患、Meyenburg疾患又は症候群、Meyenburg Altherr Uehlinger症候群、多発性軟骨疾患、Askenazy、Jaksch Wartenhorst、Meyenburg又はVon Jaksch Wartenhorst症候群、軟骨溶解性、広汎性又は再発性の軟骨膜炎、軟骨軟化関節炎又は汎軟骨炎などがある。
本願明細書において用いられる「多発性単神経炎」は、身体の関連性のない部分にあるいくつかの神経によって引き起こされる炎症、すなわち神経損傷が少なくとも２つの隔たれた神経領域に別々の損傷を伴うことに特徴がある症状を表す。悪化するにつれ、より広汎性となり、特定領域に集中しなくなる。これは多発性神経炎に似ている。この種の疾患の症状には、麻痺、虚弱、焼けるような疼痛（特に夜間）及び反射の欠損などがある。疼痛は重症で動けないほどでありうる。
【００２１】
「アンタゴニスト」とは、Ｂ細胞表面上マーカーに結合することによって哺乳動物のＢ細胞を破壊又は枯渇させる、及び／又は一以上のＢ細胞機能を妨げる、例えば、Ｂ細胞に誘導される体液性反応を低減又は阻害する分子である。好ましくは、アンタゴニストは、それによって治療する哺乳動物のＢ細胞を枯渇する（すなわち、循環中のＢ細胞レベルを下げる）ことができる。そのような枯渇は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ、Ｂ細胞増殖の阻害及び／又はＢ細胞死の誘導（例えば、アポトーシスを介する）等の多様な機能を介して達成されるであろう。本発明の範囲に包含されるアンタゴニストには、場合によって細胞障害性剤を抱合する又は細胞障害性剤と融合している、Ｂ細胞マーカーに結合する抗体、合成又は天然配列のペプチド及び小分子アンタゴニストが含まれる。好適なアンタゴニストは抗体、すなわちＢ細胞表面上マーカーに結合する抗体を含む。
【００２２】
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
【００２３】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含め、他のＦｃＲもここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
【００２４】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。補体活性化経路は補体系（Ｃｌｑ）の第１補体が、同族抗原と結合した分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「成長阻害」アンタゴニストは、アンタゴニストが結合する抗原を発現している細胞の増殖を阻害又は低減するものである。例えば、アンタゴニストはインビトロ及び／又はインビボでのＢ細胞の増殖を阻害又は低減しうる。
「アポトーシスを誘導する」アンタゴニストとは、標準的なアポトーシスアッセイにより測定できるようなＢ細胞などのプログラム細胞死、例えば、アネキシンＶの結合、ＤＮＡ断片化、細胞収縮、小胞体の肥大、細胞断片化、及び／又は膜小嚢の形成（アポトーシス体と呼称）を誘導するものである。
【００２５】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成した多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
本明細書中の目的では、「完全な抗体」とは重鎖と軽鎖の可変ドメイン並びにＦｃ領域を含有してなるものである。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２６】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣへの抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００２７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００２８】
任意の脊椎動物種からの抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。完全な抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス（イソ型）に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００２９】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００３０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
【００３１】
ここで言うモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似する重鎖および／または軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似するものである（米国特許第4,816,567号；およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００３２】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン（免疫グロブリン）に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがＦＲのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００３３】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
目的の抗原、例えば、Ｂ細胞表面上マーカーに「結合する」アンタゴニストとは、アンタゴニストが抗原発現細胞を標的とした治療剤として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ＣＤ１９抗原に結合する抗体の例には、抗-ＣＤ１９抗体（Hekman等 Cancer Immunol. Immunother. 32:364-372 (1991) 及び Vlasveld等 Cancer Immunol. Immunother. 40:37-47 (1995)）；及びＢ４抗体（Kiesel等 Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)）が含まれる。
【００３４】
「ＣＤ２０を結合する抗体」とは、ＣＤ２０抗原を発現あるいは過剰発現する細胞を標的とする治療薬剤として有用な抗体となるのに十分な程度に親和性及び／又は結合力を有してＣＤ２０抗原に結合する抗体を意味する。このような抗体の例には以下のものが含まれる：現在では「リツキシマブ」（「リツキサン（登録商標）」）と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第５，７３６，１３７号）；「Ｙ２Ｂ８」又は「Ibritumomab Tiuxetan」ゼバリン(登録商標)と命名されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体(米国特許第５，７３６，１３７号)；場合によっては「１３１Ｉ-Ｂ１」抗体(ヨードＩ131 Tositumomab、BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識した「Tositumomab」とも呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第５，５９５，７２１号)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及び「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(国際公報０３／００２６０７, Leung, S); ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第５，６７７，１８０号)；ヒト化２Ｈ７；；ｈｕＭａｘ-ＣＤ２０(Genmab, Denmark)；ＡＭＥ-１３３(Applied Molecular Evolution)；及びInternational Leukocyte Typing Workshopより入手のモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael, 編集, 440頁, Oxford University Press (1987))。
ここで言う「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、一般的にＣＤ２０抗原に対する遺伝学的に操作したキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、米国特許第５，７３６，１３７号では「Ｃ２Ｂ８」と命名されるものであり、ＣＤ２０を結合する能力を保持する該抗体の断片を含みうる。
【００３５】
単に本願明細書中の目的のために、「ヒト化２Ｈ７」は、ヒトＣＤ２０を結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片を意味し、該抗体がインビボで霊長類のＢ細胞を枯渇させる効果を有し、該抗体はＨ鎖可変領域（ＶＨ）に抗ヒトＣＤ２０抗体由来の配列番号：１２（図１Ｂ）に記載の少なくとも１のＣＤＲ３配列と実質的にヒト重鎖サブグループIII（ＶＨIII）のヒトコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基を有するものである。好ましい実施態様では、更に、この抗体は配列番号：１０のＨ鎖ＣＤＲ１配列及び配列番号：１１のＣＤＲ２配列を含んでなるもの、より好ましくは更に、配列番号：４のＬ鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：５のＬ鎖ＣＤＲ２配列、配列番号：６のＬ鎖ＣＤＲ３配列及び実質的にヒト軽鎖κサブグループI（ＶκI）のヒトコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基を含有してなるものであり、この抗体のＶＨ領域はヒトＩｇＧ鎖定常領域に結合されていてもよく、該領域は、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ３であってもよい。好ましい実施態様では、このような抗体は配列番号：８のＶＨ配列（図１Ｂのｖ１６）を含有するもの、場合によってはまた、配列番号：２のＶＬ配列（図１Ａのｖ１６）を含有するものであり、それはＨ鎖内にＤ５６Ａ及びＮ１００Ａのアミノ酸置換とＬ鎖内にＳ９２Ａのアミノ酸置換を含有してもよい（ｖ.９６）。より好適なこのような抗体は、図６Ｂ及び図７Ｂのそれぞれに示す配列番号：２４及び配列番号：２６の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を有する２Ｈ７.ｖ１６である。他の好ましい実施態様は、抗体が、図６Ｂ及び図８Ｂのそれぞれに示す配列番号：２４及び配列番号：２８の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を有する２Ｈ７.ｖ３１である。本願明細書中の抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性が改良される、少なくとも１のアミノ酸置換をＦｃ領域内に含有するものであり、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａのアミノ酸置換を有するものであり、より好ましくは、配列番号：２８（図８Ｂに示す）の重鎖アミノ酸配列を有する2Ｈ7.ｖ３１でもよい。これらの抗体の何れかは更に、ＣＤＣ活性を低減するようにＦｃ領域内に少なくとも１のアミノ酸置換を含有し、例えば少なくとも置換Ｋ３２２Ａを少なくとも含む。このような抗体は、好ましくはリツキサン(登録商標)と比較して少なくとも１０倍改良されたＡＤＣＣ活性を有する２Ｈ７.ｖ１１４又は２Ｈ７.ｖ１１５である。
【００３６】
好適なヒト化２Ｈ７は可変軽鎖配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (配列番号:2)；
と、可変重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号:8)
を含有する完全な抗体ないしは抗体断片である。
【００３７】
ヒト化２Ｈ７が完全な抗体である場合、軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号:24)；
と、重鎖アミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号:26) 
又は、重鎖アミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号:28)
を含有するのが好ましい。
【００３８】
「単離された」アンタゴニストは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、アンタゴニストの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、アンタゴニストは、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、アンタゴニストが９５重量％より多くなるまで、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。アンタゴニストの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたアンタゴニストには、組換え細胞内のインサイツのアンタゴニストが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたアンタゴニストは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３９】
治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭又は農場用動物、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。治療の必要があるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患又は疾病が予防されるべきものが含まれる。従って、哺乳動物は、疾患又は疾病を有すると診断されてもよく、あるいは疾患又は疾病に罹りやすい又は敏感であると診断されていてもよい。
「有効量」という用語は、疑われる自己免疫疾患を予防、寛解又は治療するのに効果的なアンタゴニストの量を意味する。
【００４０】
ここで治療補助剤として用いる「免疫抑制剤」という用語は、本明細書中で治療される哺乳動物の免疫系を抑制する又は遮断するように働く物質を表す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御または抑制する、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例として、2-アミノ-6-アリル-5-代替ピリミジン(米国特許第４，６６５，０７７号参照)；CELLCEPT(登録商標)などのミコフェノール酸モフェチル；アザチオプリン(IMURAN(登録商標)、AZASAN(登録商標)／6-メルカプトプリン)；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド (米国特許第４，１２０，６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドや糖質ステロイドなどのステロイド、例として、プレドニゾン、PEDIAPRED(登録商標)(リン酸プレドニゾロン・ナトリウム)やORAPRED(登録商標)(リン酸プレドニゾロン・ナトリウム経口溶液)などのプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾン；メトトレキサート（経口又は皮下）(RHEUMATREX(登録商標), TREXALLTM)；ヒドロキシクロロキン／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン（ENBREL(登録商標)、エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗-Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ポリクローナル又はｐａｎ-Ｔ抗体、あるいは、モノクローナル抗-ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公報９０／０８１８７)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohen等, 米国特許第５，１１４，７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner 等, Science 251:430-432 (1991)；国際公報９０／１１２９４；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公報 91/01133)；Ｔ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０，１０９号)；シクロフォスファミド(CYTOXAN(登録商標))；ダプソン；ペニシラミン(CUPRIMINE(登録商標))；血漿交換；又は、静脈内免疫グロブリン(IVIG)を含む。これらは単独又は互いに併用してもよく、特にステロイドと他の免疫抑制剤の併用あるいはその併用の後に維持用量の非ステロイド薬剤を投与してステロイドの使用を減らしてもよい。
【００４１】
「抗疼痛薬」は疼痛を妨げる又は抑制する働きを有する薬剤、例えば神経痛をコントロールするための処方箋なしの鎮痛薬又は処方された疼痛薬、例えば非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、例としてイブプロフェン(MOTRIN(登録商標))、ナプロキセン(NAPROSYN(登録商標))、並びに生じうる刺すような疼痛を軽減するために使用される様々な他の医薬、例として抗痙攣薬（ガバペンチン、フェニトイン、カルバマゼピン）又は三環系抗鬱薬を表す。具体的には、アセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン(ELAVIL(登録商標))、カルバマゼピン(TEGRETOL(登録商標))、フェニトイン(DILANTIN(登録商標))、ガバペンチン(NEURONTIN(登録商標))、(Ｅ)-Ｎ-バニリル-８-メチル-６-ノンアミド(CAPSAICIN(登録商標))又は神経遮断剤がある。
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害又は阻止、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を表す。この用語は、放射性同位体（例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことを意図する。
【００４２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；ミトキサントン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダ��レキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００４３】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON*トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、FEMARA(登録商標)レトロゾールおよびARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター（例えばANGIOZYME(登録商標)リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン）などのワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)rmRH並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００４４】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β、及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
「ホルモン」なる用語は通常管を有する腺性器官によって分泌されるポリペプチドホルモンを表す。そのようなホルモンには、例えば、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；ミュラー阻害物質；及びトロンボポエチンなどがある。
【００４５】
「成長因子」なる用語は成長を促進するタンパク質を表し、例えば、肝成長因子；線維芽細胞成長因子；血管内皮成長因子；神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子；トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)、例えばＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β；インスリン様増殖因子-I及び-II；エリトロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び-γ；及び、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)、顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)などがある。
「インテグリン」なる用語は、細胞の細胞外基質への結合と応答の両方をさせるレセプタータンパク質であり、創傷治癒、細胞分化、腫瘍細胞のホーミング及びアポトーシスなどの様々な細胞性機能に関与するものを表す。これらは細胞-細胞外基質及び細胞間相互作用に関与する細胞接着レセプターの大きなファミリーの一部である。機能的なインテグリンは、α及びβと称する２つの膜貫通性グリコプロテインサブユニットから成り、非共有的に結合している。βサブユニットのように、αサブユニットはすべて互いにいくらかの相同性がある。レセプターは常に１のα鎖及び１のβ鎖を含有する。例えば、α６β１、α３β１及びα７β１がある。
【００４６】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等（編）, 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
「リポソーム」とは、薬剤（例として、ここで開示したアンタゴニスト及び場合によっては化学療法剤）の哺乳動物への運搬に有用な多種の脂質、リン脂質及び／又は界面活性物質から構成される小胞体である。一般にリポソームの構成成分は、脂質の生物学的膜の配列に類似して、二層を形成している。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
【００４７】
ＩＩ．アンタゴニストの製造
本発明の方法及び製造品は、Ｂ細胞表面上のマーカーに結合するアンタゴニストを使用又は取り込む。したがって、該アンタゴニストの製造方法をここに記載する。
アンタゴニストの製造又はスクリーニングのために用いるＢ細胞表面上のマーカーは、例として抗原又はその所望のエピトープを含む一部の可溶性形態であってもよい。あるいは又は更に、Ｂ細胞表面上のマーカーを細胞表面上に発現する細胞をアンタゴニストの製造又はスクリーニングに用いることができる。アンタゴニストの製造に有用なＢ細胞表面上のマーカーの他の形態は当業者に明らかである。好ましくは、Ｂ細胞表面上のマーカーはＣＤ１９又はＣＤ２０抗原である。
【００４８】
好ましいアンタゴニストが抗体の場合、抗体以外のアンタゴニストがここに取り込まれる。例えば、アンタゴニストは、場合によっては細胞障害性剤（例えば、ここに記載のもの）と融合又は結合（抱合）した小分子アンタゴニストを含んでもよい。抗原に結合する小分子を同定するために、ここで対象とするＢ細胞表面上のマーカーについて小分子ライブラリーをスクリーニングしてもよい。更に、小分子をその拮抗的特性及び／又は細胞障害性剤との結合についてスクリーニングしてもよい。
また、アンタゴニストは理論的な設計またはファージディスプレイにより製造したペプチドでもよい(例として１９９８年８月１３日公開のＷＯ９８／３５０３６を参照)。一実施態様では、選択した分子が、抗体のＣＤＲに基づいて設計した「ＣＤＲ模倣体」又は抗体類似体でもよい。該ペプチドはそれ自体で拮抗作用を持つが、場合によってはペプチドはその拮抗的性質を付加又は亢進するために細胞障害性剤に融合してもよい。
以下は、本発明に従って用いた抗体アンタゴニストの製造の例示的技術として記載する。
【００４９】
(i)  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００５０】
(ii)  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００５１】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Manassas, Virginia USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００５２】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-SEPHAROSETMアガロースクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
また、モノクローナル抗体は組み換えを行って産生してもよい。モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【００５３】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００５４】
(iii)  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５５】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００５６】
（iv）ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,591,669号、同5,589,369号及び同5,545,807号を参照されたい。
【００５７】
別に、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号及び同５，５７３，９０５号を参照のこと。
またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５，５６７，６１０号及び同５，２２９，２７５号を参照)。
【００５８】
(v)  抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【００５９】
(vi)  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面上のマーカーの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では一方のＢ細胞表面上マーカーと更に他方のＢ細胞表面上のマーカーが結合しうる。あるいは、抗Ｂ細胞表面上マーカー結合アームは、Ｂ細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＢ細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＢ細胞表面上マーカー結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００６０】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公報９３／８８２９及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００６１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００６２】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（国際公報９１／００３６０、国際公報９２／２００３７３及び欧州特許第０３０８９号）等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号などに記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００６３】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００６４】
ＩＩＩ．アンタゴニストのコンジュゲート（結合）と他の修飾
ここでの方法に用いる又は製造品に内包されるアンタゴニストは場合によって細胞障害性剤と結合させる。
そのようなアンタゴニスト-細胞障害性剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は前述している。
また、アンタゴニストと一つ以上の小分子毒素のコンジュゲート、例えばカリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号）、トリコテン(trichothene）及びＣＣ１０６５もここにおいて考慮される。本発明の一実施態様では、アンタゴニストは、一つ以上のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子）と共役している。マイタンシンは、例えばＭａｙ-ＳＨ３へ還元されるＭａｙ-ＳＳ-Ｍｅへ変換され、修飾アンタゴニスト(Chariら，Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してマイタンシノイド(maytansinoids)−アンタゴニストコンジュゲートを生じる。
【００６５】
あるいは、アンタゴニストは、一つ以上のカリケアマイシン(calicheamicin)分子を包含する。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチルγ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58:2925-2928(1998)）を含む。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開９３／２１２３２を参照のこと。
【００６６】
本発明は、更に、抗体と核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素）を有する化合物との間に形成される免疫コンジュゲートについて考慮する。
種々の放射性核種が放射性コンジュゲートアンタゴニストの生成に利用できる。具体例にはＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射線各種が含まれる。
アンタゴニストと細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシインミジル１-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸性の易動性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari 等 Cancer Research 52: 127-131 (1992))を用いてもよい。
あるいは、アンタゴニスト及び細胞障害性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。
【００６７】
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)にアンタゴニストがコンジュゲートされ得、ここで、アンタゴニスト-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
また、本発明のアンタゴニストを、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公報８１／０１１４５を参照）を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせてもよい。例えば国際公報８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
そのようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【００６８】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。アンタゴニスト-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００６９】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、アンタゴニストに共有的に結合させることができる。あるいは、本発明のアンタゴニストの少なくとも結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312:604-608(1984)参照。
抗体の他の修飾がここで検討される。例えば、アンタゴニストは、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合させてもよい。
また、ここで開示するアンタゴニストはリポソームとして製剤化してもよい。アンタゴニストを含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；U.S. Pat. Nos. 4,485,045及び4,544,545；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公報９７／３８７３１等に記載されているような当分野において公知の方法によって調製する。循環時間が長いリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導体ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。所望の直径を有するリポソームを回収するために、リポソームを規定のサイズの孔のフィルターに通す。本発明の抗体のＦａｂ’断片を、ジスルフィド相互反応を介してMartin等 J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載のようにリポソームと抱合させることができる。場合によっては、化学療法剤をリポソーム内に内包させる。Gabizon等 J. National Cancer Inst.81(19)1484 (1989)を参照。
【００７０】
ここで記載のタンパク質又はペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、アンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化をアンタゴニスト核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アンタゴニストの翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にあるアンタゴニストの残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたアンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００７１】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つアンタゴニスト又は細胞障害ポリペプチドに融合したアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、アンタゴニストの血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチドのアンタゴニストのＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、アンタゴニスト分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。抗体アンタゴニストの置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００７２】
表１
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【００７３】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
（２）中性の親水性：cys、ser、thr、
（３）酸性：asp、glu；
（４）塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
（６）芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
アンタゴニストの適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、アンタゴニストにシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特にここでのアンタゴニストは抗体断片、例としてＦｖ断片である）。
【００７４】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
アンタゴニストのアミノ酸変異の他の型は、アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、アンタゴニストに見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又はアンタゴニストに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００７５】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元のアンタゴニストの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製されたアンタゴニストの変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【００７６】
エフェクター機能、例えばアンタゴニストのＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを向上させるために、本発明のアンタゴニストを修飾することが望ましい。このことは、抗体アンタゴニストのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞障害およびＡＤＣＣを増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
アンタゴニストの血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているようにアンタゴニスト（特に抗体断片）内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを表す。
【００７７】
ＩＶ．治療的剤形
本発明に関連して使用されるアンタゴニストの治療的剤形は、所望の純度を有するアンタゴニストを選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形または液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７８】
例示的抗ＣＤ２０抗体の剤形は国際公報９８／５６４１８に記載されている。この公報は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように、リツキシマブ４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、及び０．０２％POLYSORBATETM２０(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート), ｐＨ５．０を含む液状複数回用量の剤形である。目的の他の抗ＣＤ２０剤形は、リツキシマブ１０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム二水和物７．３５ｍｇ／ｍＬ、POLYSORBATETM８０(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)０．７ｍｇ／ｍＬ、および注入用の滅菌水を含むｐＨ  ６．５のものである。
凍結乾燥剤形は国際公報９７／０４８０１に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
また、ここでの剤形は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤（例として、シクロスポリンまたはＴ細胞結合抗体、例としてＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの）を提供することが望まれる。そのような他剤の有効量は剤形に存在するアンタゴニスト量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の１〜９９％量で用いられる。
【００７９】
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム（例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第３７７３９１９号), L-グルタミン酸およびエチルＬグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリD-(-)-3ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる剤形は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
【００８０】
Ｖ．アンタゴニストを用いた治療 
Ｂ細胞表面上抗原に結合するアンタゴニストを含んでなる組成物は、調製され、調薬されて、良好な臨床に合う様式で投与される。この文脈における考慮のための要素には、治療される特定の疾患又は疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患又は疾患の原因、薬剤を運搬する部位、投与の方法、投与の日程計画、及び開業医の知りうる他の因子が含まれる。投与されるアンタゴニストの治療上の有効量は、このようなことを考慮して調整される。
一般的な計画として、用量当たりの非経口的に投与されるアンタゴニストの治療上の有効量は、患者の体重量にして１日当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、アンタゴニストの一般的初期投与範囲は約２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
好適なアンタゴニストは、細胞障害性剤を抱合していない抗体、例としてリツキサン(登録商標)などの抗体である。非抱合の抗体の好適な用量は、例えば、約２０ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。一実施態様では、抗体の用量はリツキサン(登録商標)に対して推奨されている用量とは異なる。例えば、約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲、例えば約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量である場合に、抗体を実質的に３７５ｍｇ／ｍ２より少ない用量で一回以上患者に投与してもよい。
【００８１】
更に、一以上の抗体の初期投与に続いて、初期投与の抗体用量（ｍｇ／ｍ２）を超える抗体の継続投与量（ｍｇ／ｍ２）で一回以上投与してもよい。例えば、初期用量が、約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲（例として、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２）であり、継続用量が約２５０ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。
しかしながら、上記したようなアンタゴニストの提案した量は、多くの治療的選択に従う。上記のように、適切な用量及び日程計画を選択する際の鍵となる要素は、得られた結果である。例えば、相対的により高い用量は、まず最初に進行中の及び急性疾患の治療に必要とされるかもしれない。最も効果的な結果を得るために、疾病又は疾患に応じて、できるだけ疾病又は疾患の最初の徴候、診断、出現または発症に近づくように、又は疾病又は疾患の緩解期となるようにアンタゴニストを投与する。
アンタゴニストは、非経口的、皮下、腹膜内、吸入、髄膜下、関節内及び鼻腔内、必要であれば局所の免疫抑制性治療のため、病巣内投与を含む好適な方法で投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与を含む。加えて、アンタゴニストは、例えばアンタゴニストの用量を減少させたパルス注入によって、好適に投与してもよい。好ましくは、投薬は、短期間の投与か長期間の投与かによって、注入、最も好ましくは静脈内又は皮下注入により行われる。
【００８２】
一又は複数の他の化合物、例えば本願明細書中のアンタゴニストと、細胞障害性薬剤、化学療法剤、免疫抑制剤、抗疼痛薬剤、ホルモン剤、インテグリン、成長因子及び／又はサイトカインを投与してもよく、あるいは当分野で公知の様々な他の治療を応用してもよい。例えば、効能の種類、徴候の程度又は重症度、及び、アンタゴニストの種類に応じて、投与される他の化合物は、免疫抑制剤、抗疼痛薬剤又は化学療法剤であるのが好ましい。
再発性多発軟骨炎などの多発性軟骨炎が治療される場合、症状が重症でなければ、他の化合物は炎症をコントロールするために非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、例としてイブプロフェン(MOTRIN(登録商標))、ナプロキセン(NAPROSYN(登録商標))又はスリンダク(CLINORIL(登録商標))であるのが好ましい。しかしながら通常、コルチゾン関連の薬物には例えばプレドニソン及びプレドニソロンなどのステロイドが必要である。特に眼又は呼吸気道に併発する場合、高用量ステロイドがまず最初に用いられることが多い。さらに、ほとんどの患者はステロイドの長期服用を必要とする。
多発性軟骨炎の治療のためにアンタゴニストと併用されうる他の好適な化合物はメトトレキセート(RHEUMATREX(登録商標)、TREXALLTM)である。これはステロイドと併用すると再発性多発性軟骨炎の治療が促進するだけでなく、治療が維持される。研究により、メトトレキセートがステロイドの必要性を低減するように働くことが示されている。他の好適な化合物には、シクロスファミド(CYTOXAN(登録商標))、ダプソン、アザチオプリン(IMURAN(登録商標), AZASAN(登録商標))、ペニシラミン(CUPRIMINE(登録商標))、シクロスポリン(NEORAL(登録商標), SANDIMMUNE(登録商標))、及びステロイドとのこれらの薬剤の併用などがある。
【００８３】
他の薬剤を使用した多発性単神経炎の治療に関して、特定の治療が有用でない場合、通常、神経障害の疼痛がコントロールされうる。最も単純な治療は、処方箋の必要のない鎮痛薬、例えばアセトアミノフェン(TYLENOL(登録商標))、上記のようなイブプロフェンなどのＮＳＡＩＤ、又はアスピリンであり、その後、処方薬である。三環系抗鬱薬、例えばアミトリプチリン(ELAVIL(登録商標))及び抗発作薬物、例えばカルバマゼピン(TEGRETOL(登録商標))、フェニルトイン(DILANTIN(登録商標))又はガバペンチン(NEURONTIN(登録商標))が神経障害の疼痛の軽減に用いられている。辛い唐辛子の化学的主成分である、CAPSAICIN(登録商標)((Ｅ)-Ｎ-バニリル-８-メチル６-ノンアミド)は、末梢性神経障害の疼痛を軽減する働きのクリームとして用いられる。加えて、神経ブロッカーは疼痛を軽減する効果がありうる。末梢性神経障害の治療に好適な他の化合物には、自己由来の末梢血幹細胞移植、ステロイド、例えばそのパルス療法を含む副腎皮質ホルモン、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びそのパルス療法を含むメチルプレドニゾロン、メトトレキセート、静脈内シクロフォスファミドパルス療法を含むシクロスファミド(例えばCYTOXAN(登録商標))、血漿交換又は血漿分離交換法、静脈免疫グロブリン、シクロスポリンＡなどのシクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル(例えばCELLCEPT(登録商標))又はＩｇＭ濃度を下げるものを含む化学療法剤(高用量のものも含む)、例えばFLUDARA(登録商標)(フルダラビンリン酸塩)又はLEUKERAN(登録商標)(クロランブシル)などがある。特にこの効能に好適な他の化合物は、抗疼痛薬剤、ステロイド、メトトレキセート、シクロホスファミド、血漿交換、静脈免疫グロブリン、シクロスポリン又はミコフェノール酸モフェチルである。
【００８４】
併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬製剤を使用して、同時投与、及び、何れの順序での連続的な投与を含み、好ましくは、両方の（または全ての）活性剤が同時に生物学的活性を示す期間があるものである。
タンパク質アンタゴニストの患者への投与を除いて、本出願は、遺伝子治療によるアンタゴニストの投与を熟慮する。アンタゴニストをコード化する核酸のこのような投与は、「アンタゴニストの治療上の有効量を投与する」という発現によって包含される。細胞内抗体を生成することを目的とした遺伝子治療の使用に関する１９９６年３月１４日公開の国際公報９６／０７３２１を参照。
核酸（場合によって、ベクターに含まれる）を患者の細胞に入れるには主に2つのアプローチがある;インビボ及びエクスビボである。インビボ運搬のために、通常アンタゴニストが必要である部位に、直接核酸を注入する。エクスビボ治療のために、患者の細胞を取り出し、核酸を単離した細胞に導入し、変更された細胞を直接患者に投与する、又は例えば、患者の体内に埋め込まれる多孔性の膜に被包する（例として米国特許第4,892,538号及び同第5,283,187号を参照）。核酸を生きた細胞に導入するための有用な多種の技術がある。技術は、核酸がインビトロ培養された細胞に移入するか、又は意図した宿主のインビボ細胞に移入するかどうかによって、異なる。インビトロの哺乳動物細胞への核酸の移入に適切な技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などの使用を含む。遺伝子のエクスビボ運搬のための一般的に用いられるベクターは、レトロウイルスである。
【００８５】
現在好適なインビボでの核酸移入技術は、ウイルスベクター(例として、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質介在移入のために有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ，ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)による形質移入を含む。ある状況では、核酸供給源に標的細胞を標的とする作用物質、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどを与えることが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスと関連している細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、循環内で内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的として細胞内半減期を延長するタンパク質をターゲティング及び／又は取り込み促進のために用いてもよい。例として、Wu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)；及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に、レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術が記載されている。現在知られている遺伝子作製及び遺伝子治療のプロトコールの考察には、Anderson等, Science 256:808-813 (1992)を参照。また、国際公報９３／２５６７３及びここに挙げた文献も参照のこと。
【００８６】
本発明の他の実施態様では、前述した疾患又は疾病の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器と、容器に貼付されるか添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、ガラス瓶、シリンジ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成されうる。容器は選択した疾患又は疾病の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はガラス瓶であってよい)。組成物中の少なくとも１つの活性剤はＢ細胞表面上マーカーに結合するアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物には、組成物が、自己免疫疾患、例えば本明細書に挙げるものに罹患しているか素因がある患者の治療に使用されることが示されている。更に、製造品は、製薬的に許容可能な希釈用バッファー、例えば、注入のための静菌性水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
更に、以下の限定的でない実施例により本発明を詳述する。本明細書中のすべての引例に開示されていることは出典明記によりここに組み込まれる。
【実施例】
【００８７】
実施例１
２Ｈ７抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体の２Ｈ７（ここではマウスをｍとしてｍ２Ｈ７とも呼ぶ）のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス２Ｈ７抗体可変領域配列とマウスＶとヒトＣのキメラ２Ｈ７は開示されており、例えば米国特許第５８４６８１８号及び同第６２０４０２３号を参照のこと。２Ｈ７のＣＤＲ残基は、マウス２Ｈ７可変ドメインのアミノ酸配列（米国特許第５８４６８１８号に開示）を既知の抗体の配列と比較することにより同定された（Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。軽鎖と重鎖のＣＤＲ領域は配列高頻度可変性（上掲のKabat等）に基づいて定まり、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド（表２）を用いて、部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)）を使用して、プラスミドｐＶＸ４に含まれるコンセンサス配列ＶｋＩ,ＶＨＩＩＩ（ＶＬカッパサブグループＩ，ＶＨサブグループＩＩＩ）に対応する完全ヒトＦａｂフレームワーク中に６つ全てのマウス２Ｈ７ＣＤＲ領域を導入した（図２）。
ファージミドｐＶＸ４（図２）を突然変異誘発並びに大腸菌中でのＦ(ａｂ)の発現に使用した。ｐＢ０４７５の誘導体（Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989)）であるファージミドｐｂ０７２０に基づいて、ｐＶＸ４は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループＩ軽鎖（ＶＬκＩ-ＣＬ）とヒト化コンセンサスＩＩＩ重鎖（ＶＨＩＩＩ-ＣＨ１）抗ＩＦＮ-α（インターフェロンα）抗体をコードするＤＮＡ断片を含む。ｐＶＸ４はまた共に別の過去に開示されたｐＵＣ１１９ベースのプラスミドｐＡＫ２（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)）から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のＳｐｅｌ制限部位をＦ(ａｂ)軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ間に導入した。抗ＩＦＮ-α重鎖及び軽鎖双方の最初の２３のアミノ酸はＳｔＩＩ分泌シグナル配列である（Chang等, Gene 55: 189-196 (1987)）。  
【００８８】
２Ｈ７のＣＤＲスワップバージョン（２Ｈ７.ｖ２）を構築するために、部位特異的突然変異誘発をｐＶＸ４のデオキシウリジン含有鋳型で実施した；抗ＩＦＮ-αの６つ全てのＣＤＲがマウス２Ｈ７ＣＤＲに変化した。得られた分子をヒト化２Ｈ７バージョン（２Ｈ７.ｖ２）又は２Ｈ７の「ＣＤＲスワップバージョン」と呼ぶ；これは図１Ａ及び１Ｂに示されるコンセンサスヒトＦＲ残基を有するｍ２Ｈ７ＣＤＲ残基を有する。ヒト化２Ｈ７.ｖ２は更なるヒト化に用いた。
表２はＨ及びＬ鎖においてマウス２Ｈ７（ｍ２Ｈ７）ＣＤＲのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、ＣＤＲ-Ｈ１オリゴヌクレオチドを使用してｍ２Ｈ７のＨ鎖を再作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３はＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ意味する；同様に、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３はＬ鎖ＣＤＲのそれぞれを意味する。ＣＤＲ-Ｈ２における置換はＣＤＲ-Ｈ２ＡとＣＤＲ-Ｈ２Ｂの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表２．ｐＶＸ４のヒトフレームワーク中へのマウス２Ｈ７ＣＤＲのＣＤＲスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
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【００８９】
ヒト化コンストラクトとの比較のために、キメラ２Ｈ７Ｆａｂ（マウスＶＬ及びＶＨドメイン、及びヒトＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む）を発現するプラスミドを、２Ｈ７.ｖ２中にマウスフレームワーク残基を導入するために合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然変異誘発（上掲のKunkel）によって構築した。２Ｈ７.ｖ６.８として知られているキメラＦａｂを発現させるための得られたプラスミドコンストラクトの配列を図３に示す。Ｆａｂの各コード鎖は上にｐＶＸ４（図２）について記載された２３のアミノ酸のＳｔＩＩ分泌シグナル配列を有している。
ヒトＶｋＩ,ＶＨＩＩＩコンセンサスフレームワーク（図１Ａ及び１Ｂ）及び過去のヒト化抗体（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)）とのマウス２Ｈ７フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって２Ｈ７.ｖ２Ｆａｂコンストラクト中に導入した。これらの変異により、ＣＤＲコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス２Ｈ７フレームワークに見出されたものに変化した。バージョン３はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）を、バージョン４はＶＨ（Ｒ７１Ｖ）を、バージョン５はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）を、バージョン６はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ，Ｌ４７Ｗ）を含んでいた。
【００９０】
ｍ２Ｈ７抗体のヒト化及びキメラＦａｂ型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの調製のためにプラスミドを大腸菌株ＸＬ-１ブルー（Stratagene, San Diego, CA）中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法（SEQUENASE(登録商標)標識プライマーサイクル配列決定法、Sequenase, U.S. Biochemical Corp.）を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、ＭＭ２９４の誘導体である大腸菌株１６Ｃ９に形質転換し、５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを３７℃で５−８時間、５ｍｌのＬＢ-１００μｇ／ｍｌカルベニシリン中で成長させた。５ｍｌの培養物を５００ｍｌのＡＰ５-１００μｇ／ｍｌカルベニシリンに添加して、３７℃で４Ｌの邪魔板振盪フラスコ中で１６時間成長させた。ＡＰ５培地は１．５ｇのグルコース、１１．０のHYCASE SFTM(カゼイン加水分解物)、０．６ｇの酵母エキス（保証付き）、０．１９ｇの無水ＭｇＳＯ４、１．０７ｇのＮＨ４Ｃｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、１．２ｇのＮａＣｌ、１２０ｍｌの１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ７．４からなり、１Ｌの水に加えた後、０．１μｍのSEAKLEEN(登録商標)殺生剤フィルターを通して滅菌濾過した。
細胞を、３０００×ｇにて１Lの遠心分離瓶（Nalgene）で遠心分離によって収集し、上清を除去した。１時間の凍結後、ペレットを２５ｍｌの非放射性１０ｍＭ ＭＥＳ-１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０（バッファーＡ）中に再懸濁させた。２５０μｌの０．１Ｍ フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)(Sigma)を添加してタンパク質分解を阻止し、３．５ｍｌの原液１０ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵の白色リゾチーム(Sigma)を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で１時間、穏やかに振盪した後、試料を４００００×ｇで１５分、遠心分離した。上清をバッファーＡを用いて５０ｍｌにし、バッファーＡで平衡にした２ｍｌのＤＥＡＥカラムに充填した。ついで、バッファーＡで平衡にしたプロテインＧセファロースＣＬ-４ＢＴＭアガロース(Pharmacia)クロマトグラフィカラム（０．５ｍｌ床容積）に流通させた。カラムを１０ｍｌのバッファーＡで洗浄し、１．２５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０に入れた３ｍｌの０．３Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。ついで、Ｆ(ａｂ)をセントリコン-３０(登録商標)遠心フィルター装置(Amicon)を使用してリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中にバッファー交換し、０．５ｍｌの最終容積まで濃縮した。全てのＦ(ａｂ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
【００９１】
細胞ベースのＥＬＩＳＡ結合アッセイ（以下に記載）においては、キメラ２Ｈ７Ｆａｂを含むＦａｂのＣＤ２０への結合は検出が難しかった。従って、２Ｈ７Ｆａｂバージョンをアッセイと更なる突然変異誘発のために完全長ＩｇＧ１抗体として再形態化した。
完全長ＩｇＧの発現のためのプラスミドは、キメラ２Ｈ７（ｖ６.８）ＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにヒト化Ｆａｂバージョンないし６を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたｐＲＫベクター（Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)）中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各ＦａｂコンストラクトをＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩを用いて消化させてＶＬ断片を切除し、これを、完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ１（図４）のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。また、各ＦａｂコンストラクトをＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで消化させてＶＨ断片を切除し、これを、完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ２（図５）のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位中にクローニングした。各ＩｇＧ変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)）中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、２９３細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖ＤＮＡと、続いてPADVANTAGETMDNA（Promega, Madison, WI）を添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し４日後に収集した。抗体を、プロテインＡ-セファロースＣＬ-４ＢＴＭアガロースクロマトグラフィを使用して培養上清から精製した後、バッファーを１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、CENTRICON-10(登録商標)遠心フィルター装置(Amicon)を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
【００９２】
ＣＤ２０抗原に対する相対的結合親和性を測定するために、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイ法を開発した。ヒトＢリンパ芽球腫ＷＩＬ２-Ｓ細胞（ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Manassas, VA）を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、２ｍＭのＬ-グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２及び１０％の熱不活化仔ウシ血清を補填したＲＰＭＩ１６４０中で成長させた。細胞を、１％胎仔ウシ血清(ＦＢＳ)含有ＰＢＳ（アッセイバッファー）で洗浄し、９６ウェルの丸底プレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中で２５０−３０００００細胞／ウェルにて播種した。アッセイバッファー中、２倍の連続希釈標準（１５．６−１０００ｎｇ／ｍｌの２Ｈ７ｖ６.８キメラＩｇＧ）と３倍の連続希釈試料（２．７−２０００ｎｇ／ｍｌ）をプレートに添加した。プレートを氷中に埋設し、４５分間、インキュベートした。未結合抗体を除くために、ウェルに０．１ｍＬのアッセイバッファーを添加した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞を０．２ｍＬのアッセイバッファーでもう２回洗浄した。プレートに結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）をプレートに添加することによって検出した。４５分のインキュベーション後、細胞を前に記載したようにして洗浄した。ＴＭＢ基質（３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン；Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）をプレートに添加した。１Ｍのリン酸を加えて反応を停止させた。滴定曲線を４変数非線形回帰曲線フィッティングプログラム（KALEIDAGRAPHTM, KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA）を用いてフィッティングさせた。滴定曲線の中点の吸光度（中央-ＯＤ）とその対応する標準濃度を決定した。ついで、この中央-ＯＤでの各変異体の濃度を決定し、標準の濃度を各変異体の濃度で割った。よって、値は、標準に対する各変異体の結合比である。相対親和性の標準偏差（等価濃度）は一般に実験値の＋／−１０％であった。
【００９３】
表３に示されるように、ＣＤＲ-スワップ変異体（ｖ.２）の結合はキメラ２Ｈ７（ｖ.６.８）と比較すると極めて低減していた。しかしながら、バージョン３ないし６は改善された結合性を示した。キメラ２Ｈ７のものに対する結合親和性を回復させるのに必要とされるかも知れない変異の最小数を決定するために、更なる変異及び変異の組み合わせを部位特異的突然変異誘発によって構築して、表４に示される変異体７から１７を産生した。特に、これらはＶＨ変異Ａ４９Ｇ、Ｆ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ｎ７３Ｋ、及びＬ７８Ａ；及びＶＬ変異Ｍ４Ｌ、Ｍ３３Ｉ、及びＦ７１Ｙを含んでいた。バージョン１６及び１７は、キメラバージョンの２倍内の、最良の相対的結合親和性を示し、２者間に有意差はなかった（標準偏差＝＋／−１０％）。よって、変異の数を最小にするために、マウスフレームワーク残基に対してヒトフレームワーク残基の４の変異のみを有するバージョン１６（表４）を、更なる特徴付けのためのヒト化型として選択した。
【００９４】
表３．細胞ベースＥＬＩＳＡを使用してキメラ２Ｈ７と比較したＣＤ２０に対するヒト化２Ｈ７ＩｇＧ変異体の相対的結合親和性。相対的結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対するキメラ２Ｈ７の濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従ったＣＤＲ-スワップバージョンに対するものである。
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表４．ヒト化２Ｈ７バージョン１６（２Ｈ７.ｖ１６）における変異ＶＨ（Ａ４９Ｇ、Ｒ７１Ｖ、Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）の構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。下線のコドンは示されたアミノ酸置換をコードする。ＶＨ（Ｒ７１Ｖ、Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）に対して、オリゴヌクレオチドは、Ｆａｂ鋳型での突然変異誘発に使用されたので、センス鎖として示される一方、ＶＨ（Ａ４９Ｇ）に対して、オリゴヌクレオチドは、ｐＲＫ（ＩｇＧ重鎖）鋳型と共に使用されたので、アンチセンス鎖として示される。バージョン１６のタンパク質配列は図６及び図７に示す。
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【００９５】
実施例２
２Ｈ７の抗原結合決定基（パラトープ）
ＣＤ２０への結合における抗体の個々の側鎖の寄与を試験するために２Ｈ７.ｖ１６又は２Ｈ７.ｖ１７においてアラニン置換（(Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)）を行った。ＩｇＧ変異体をｐＤＲ１及びｐＤＲ２ベクターから２９３細胞中で発現させ、精製し、上述の相対的結合親和性についてアッセイした。幾つかのアラニン置換は、ＷＩＬ-２Ｓ細胞上のＣＤ２０への相対結合性を有意に減少させた（表５）。
【００９６】
表５．細胞ベースＥＬＩＳＡ（ＷＩＬ-２Ｓ細胞）を使用して測定したヒト化２Ｈ７.ｖ１６のＣＤＲ領域におけるアラニン置換の効果。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６親の濃度として表す；よって、比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。ＮＢＤは検出可能な結合がないことを意味する。バージョン４５の二つの数値は別の実験のものである。
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【００９７】
実施例３
２Ｈ７ＣＤＲ領域内の更なる変異
Ａｌａスキャニングによって重要であると同定されたＣＤＲ位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にｖ.９６はｖ.１６よりもより強固に結合したようであった。
【００９８】
表６．細胞ベースＥＬＩＳＡ（ＷＩＬ-２Ｓ細胞）を使用して測定したヒト化２Ｈ７.ｖ１６のＣＤＲ領域における変異と非アラニン置換の組み合わせの効果。ＣＤ２０に対する相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６親の濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す；比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。
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【００９９】
実施例４
フレームワークヒト化置換の部位における変異
ヒト化の間に変化したフレームワーク位置の更なる残基の置換をまた２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドで試験した。特に、マウス２Ｈ７親にもヒトコンセンサスフレームワークの何れにも見出されなかった選択的フレームワーク置換をＶＬ（Ｐ４６）及びＶＨ（Ｇ４９、Ｖ７１、及びＫ７３）において行った。
これらの置換は一般的に相対的結合性の変化をあまりもたらさず（表７）、これらの位置のフレームワーク残基にある程度の自由度があることを示している。
【０１００】
表７．フレームワーク置換の細胞ベース（ＷＩＬ-２Ｓ）アッセイにおける相対結合性。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示す。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す；比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。
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（*）標準コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６でアッセイされた変異体；相対値はキメラの値に対して正規化してある。
【０１０１】
実施例５
亢進したエフェクター機能を持つヒト化２Ｈ７変異体
２Ｈ７はＣＤＣとＡＤＣＣの双方を介してＢ細胞の溶解を媒介しうるので、改善されたＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を持つヒト化２Ｈ７.ｖ１６の変異体を調べた。補体成分Ｃ１ｑへの向上した結合性を介してＣＤＣを改善するために、他の抗体のＦｃ領域内でのある種の残基の変異は記載されている（Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)）。活性化ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合性の向上と阻害性ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合性の向上によってＡＤＣＣを改善するための変異もまた記載されている（Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)）。特に、記載されているようにして（上掲のIdusogie等 (2001)；上掲のShields等）３の変異がＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の改善のために同定されている：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ここでは、三重Ａｌａ変異又は変異体とも呼ぶ；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付け法による；上掲のKabat等）。
【０１０２】
２Ｈ７のＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を向上させるために、２Ｈ７Ｆｃの三重Ａｌａ変異体を構築した。抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５のヒト化変異体は、変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａで産生されており、４Ｄ５Ｆｃ１１０として知られている（つまり、抗ｐ１８５ＨＥＲ２ＩｇＧ１（Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ）；上掲のShields等）。プラスミドである抗体４Ｄ５Ｆｃ１１０をコードするｐ４Ｄ５Ｆｃ１１０（上掲のShields等）をＡｐａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、Ｆｃ断片（変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含む）を２Ｈ７重鎖ベクターｐＤＲ２-ｖ１６のＡｐａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させ、ｐＤＲ２-ｖ３１を産生した。バージョン３１の完全Ｈ鎖のアミノ酸配列は図８に示す。Ｌ鎖はｖ１６のものと同じである。
ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在している（Lefranc及びLefranc, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib編, Pergammon Press, Oxford (1990)に概説）。
【０１０３】
表８．ＣＤ２０結合性に対するＦｃ領域中の置換の効果。ＣＤ２０への相対結合性は、フレームワーク置換の細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイで測定した。Ｆｃ変異（*）はＥＵ番号付け法（上掲のKabat）により、２Ｈ７.ｖ１６親に対するものである。ｖ.３１のＦｃ領域の３つのＡｌａ変化の組み合わせは「Ｆｃ１１０」と記載される。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。
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【０１０４】
実施例６
向上した安定性を持つヒト化２Ｈ７変異体
治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。２Ｈ７.ｖ１６では、幾つかの残基が不安定性の原因として同定された：ＶＬ（Ｍ３２）及びＶＨ（Ｍ３４、Ｎ１００）。従って、ｖ１６との比較でこれらの部位に変異を導入した。
【０１０５】
表９．細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイにおけるＣＤ２０に対する、安定性及び／又はエフェクター機能の向上のために設計された２Ｈ７変異体の相対結合性。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインにおけるフレームワーク置換はＫａｂａｔの番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものであり、Ｆｃ変異（*）はＥＵ番号付けによって示される（上掲のKabat等）。
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（**）コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６で測定された変異体；
相対的な結合値はキメラの値に対して正規化してある。
【０１０６】
更なるＦｃ変異が過去に報告された変異（Idusogie等 (2000); Idusogie等 (2001); Shields等 (2001)）に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。実施例５に記載したようにこれらの変異にはＳ２９８、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａが含まれ；ＣＤＣ活性の低減のためのＫ３２２Ａ；ＡＤＣＣ活性の低減のためのＤ２６５Ａ；ＣＤＣ活性の亢進のためのＫ３２６Ａ又はＫ３２６Ｗ；及びＦｃ領域内のアロタイプ変異の効果の試験のためのＥ３５６Ｄ／Ｍ３５８Ｌが含まれる。これらの変異の何れもＣＤ２０結合親和性に有意な差異を生じなかった。
タンパク質の分解速度に対する安定性変異の効果を試験するために、２Ｈ７.ｖ１６と２Ｈ７.ｖ７３を１０ｍＭのヒスチジン、６％のスクロース、０．０２％のポリソルベート２０ＴＭ乳化剤、ｐＨ５．８中１２−１４ｍｇ／ｍＬで処方し、４０℃で１６日間インキュベートした。ついで、インキュベートした試料につき、イオン交換クロマトグラフィーによって荷電変異体における変化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集と断片化を、細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイでの試験によって相対結合性をアッセイした。
結果は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、２Ｈ７.ｖ７３が２Ｈ７.ｖ１６と比較して大なる安定性を有していることを示している。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。
【０１０７】
実施例７
ＷＩＬ２-Ｓ細胞上のＣＤ２０への抗体結合のスキャッチャード分析
平衡解離定数（Ｋｄ）を、放射標識２Ｈ７ＩｇＧを使用してＷＩＬ２-Ｓ細胞へ結合している２Ｈ７ＩｇＧ変異体について定量した。ＩｇＧ変異体はＣＨＯ細胞中で産生させた。リツキサン(RITUXAN)(登録商標)（全実験での入手源はジェネンテック、S. San Francisco, CA）とマウス２Ｈ７（BD PharMingen, San Diego, CA）をヒト化変異体との比較に使用した。マウス２Ｈ７抗体はまた例えばeBioscience及びCalbiochem（共にSan Diego, CA）、Accurate Chemical & Scientific Corp.(Westbury, NY)、Ancell (Bayport, MN)、及びVinci-Biochem (Vinci, Italy)から入手可能である。希釈は全て結合アッセイバッファー（１％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、及び０．０１％のアジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地）で実施した。０．８ｎＭの濃度の１２５Ｉ-２Ｈ７.ｖ１６（ラクトペルオキシダーゼでヨウ素化）のアリコート（０．０２５ｍＬ）をＶ底の９６ウェルマイクロアッセイプレートのウェル中に分配し、非放射性抗体の連続希釈物（０．０５ｍＬ）を加えて混合した。ついで、ＷＩＬ２-Ｓ細胞（０．０２５ｍＬ中６００００細胞）を加えた。プレートをシールし、室温で２４時間インキュベートした後、３５００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。ついで、上清を吸引し、細胞ペレットを洗浄し遠心分離した。上清を再び吸引し、ペレットを１ＮのＮａＯＨに溶解し、ガンマ計数のためチューブに移した。データを、プログラムLigand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))を使用するスキャッチャード分析 (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)) に使用した。表１０に示す結果は、ヒト化２Ｈ７変異体がマウス２Ｈ７と比較して類似のＣＤ２０結合親和性を、リツキサン(登録商標)と類似の結合親和性を有していたことを示している。２Ｈ７.ｖ３１は上の表８に示した結合性に基づくとｖ.１６に非常に類似したＫｄを有していると予想される。
【０１０８】
表１０．スキャッチャード分析による２Ｈ７変異体の均衡結合親和性
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【０１０９】
実施例８
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
２Ｈ７ＩｇＧ変異体について、本質的に開示されている（Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)）ＣＤ２０発現リンパ芽球腫Ｂ細胞株のＷＩＬ２-Ｓ細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を０．１ｍｇ／ｍＬ原液から１：３で連続希釈した。各希釈物の０．０５ｍＬのアリコートを、０．０５ｍＬの正常なヒト補体溶液（Quidel, San Diego, CA）を含んだ９６ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、０．０５ｍＬ容積で５００００ＷＩＬ２-Ｓ細胞を加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、０．０５ｍＬのALAMAR BLUETM resazurin（Accumed International, Westlake, OH）の溶液を加え、３７℃で更に１８時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて１５分振盪した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を５３０ｎｍ励起フィルター及び５９０ｎｍ発光フィルターを使用して読み取った。KALEIDAGRAPHTMソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてＲＦＵをフィッティングさせることによってＥＣ５０を計算した。
結果（表１１）は、ヒト化２Ｈ７抗体によるＣＤＣの驚くべき改善を示しており、ｖ.７３に対してはリツキサン(登録商標)と同様の相対作用強度で、ｖ.７５に対してはリツキサン(登録商標)より３倍強く、ｖ.１６に対してはリツキサン(登録商標)より３倍弱い。
【０１１０】
表１１．リツキサンと比較した２Ｈ７抗体のＣＤＣ活性。＞１の数はリツキサン(登録商標)より弱いＣＤＣ活性を示しており、＜１の数はリツキサン(登録商標)より強い活性を示している。抗体は、（*）によって示したものが一過性に産生された以外は、安定なＣＨＯ株から産生された。
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【０１１１】
実施例９
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
２Ｈ７ＩｇＧ変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）読み取りを使用して、本質的に開示されている（Shields等, J.  Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)）ＣＤ２０発現リンパ芽球腫Ｂ細胞株のＷＩＬ２-Ｓ細胞のＮＫ細胞溶解を媒介するその能力をアッセイした。ＮＫ細胞を、ＣＤ１６としても知られている（Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997)）ＦｃγＲＩＩＩに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた１００ｍＬのＰＢＳで希釈した１００ｍＬのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、ＮＫ細胞はＣＤ１６（Ｆ１５８／Ｖ１５８）に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を１５ｍＬのリンパ球分離培地（ICN Biochemical, Aurora, Ohio）上に層状にし２０００ＲＰＭで２０分間、遠心分離した。層間界面の白血球を４本の清浄な５０ｍＬチューブに分配し、それに１５％の胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地を満たした。チューブを１４００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをＭＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、ビーズ（ＮＫ細胞単離キット，１３０-０４６-５０２）を製造者のプロトコール（Miltenyi Biotech）に従って使用してＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳバッファーで２×１０６細胞／ｍＬまで希釈した。
アッセイ培地（グリシンなしのＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０、１ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．２、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）、グルタミン、及び１％熱不活化仔ウシ血清）中の抗体の連続希釈物（０．０５ｍＬ）を、９６ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。ＷＩＬ２-Ｓ細胞をアッセイバッファーで４ｘ１０５／ｍＬの濃度まで希釈した。ＷＩＬ２-Ｓ細胞（ウェル当たり０．０５ｍＬ）を９６ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で３０分間、インキュベートしてＣＤ２０への抗体の結合を可能にした（オプソニン作用）。
【０１１２】
各ウェルに０．１ｍＬのＮＫ細胞を添加してＡＤＣＣ反応を開始させた。コントロールウェルでは、２％のTRITON(登録商標)Ｘ-１００アルキルアリルポリエーテルアルコールを添加した。ついで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。放出されたＬＤＨのレベルを、細胞傷害性（ＬＤＨ）検出キット（キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana）を製造者のプロトコールに従って使用して測定した。０．１ｍＬのＬＤＨ展開液を各ウェルに加えた後、１０秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で１５分暗室でインキュベートした。ついで、４９０ｎｍでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全ＬＤＨで割ることによって溶解％を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、４変数曲線フィッティング（KALEIDAGRAPHTMソフトウェア）を用いてＥＣ５０濃度を決定した。
結果は、ヒト化２Ｈ７抗体がＡＤＣＣに活性があり、ｖ.３１に対してはリツキサン(登録商標)の２０倍強い相対作用強度で、ｖ.１６に対してはリツキサン(登録商標)より５倍強く、ｖ.７３に対してはリツキサン(登録商標)よりほぼ４倍強い。
【０１１３】
表１２．ｎ回の実験に基づいて２Ｈ７.ｖ１６と比較したＷＩＬ２-Ｓ細胞に対する２Ｈ７抗体のＡＤＣＣ活性。（＞１の値は２Ｈ７.ｖ１６より低い作用強度を示し、＜１の値はより大なる強度を示す。）
2007532680.tif 000016
更なるＡＤＣＣアッセイを実施してリツキサン(登録商標)と２Ｈ７の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、２Ｈ７.ｖ１１４及び２Ｈ７.ｖ１１５がリツキサン(登録商標)と比較して＞１０倍の改善されたＡＤＣＣ作用強度を有することを示している（表１３）。
【０１１４】
表１３．ｎ回の実験に基づいてリツキサン(登録商標)と比較したＷＩＬ２-Ｓ細胞に対する２Ｈ７抗体のＡＤＣＣ活性（＞１の値はリツキサン(登録商標)より低い作用強度を示し、＜１の値はより大なる強度を示す）。
2007532680.tif 000017
【０１１５】
実施例１０
カニクイザルにおけるパイロット試験での２Ｈ７変異体のインビボ効果
ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって産生下２Ｈ７変異体を、そのインビボ活性を評価するために正常な雄カニクイ(Macaca fascicularis)ザルにおいて試験した。Ｃ２Ｂ８（リツキサン(登録商標)）のような他の抗ＣＤ２０抗体は、正常な霊長類においてＢ細胞を枯渇させる能力が証明されている（Reff等, Blood 83: 435-445 (1994)）。
一試験では、ヒト化２Ｈ７変異体を比較した。平行した試験では、リツキサン(登録商標)もまたカニクイザルにおいて試験された。４匹のサルを５つの用量群のそれぞれに使用した：（１）ビヒクル、（２）０．０５ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ１６、（３）１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ１６、（４）０．０５ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ３１、及び（５）１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ３１。抗体は、試験の１日目に一用量と８日目にもう一用量の全二用量に対して、０、０．２、又は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与した。投薬の最初の日を１日目とし、その前の日を−１日と標記する；回復の最初の日（各群２匹の動物に対して）は１１日と標記する。血液試料を−１９、−１２、１（投薬前）日、及び最初の投薬後６時間、２４時間、及び７２時間で収集した。更なる試料を８日目（投薬前）、１０日目（２動物／群の屠殺前）、及び３６日及び６７日目（回復動物に対して）に採取した。
末梢Ｂ細胞濃度を、ＣＤ３−／ＣＤ４０＋細胞を計数するＦＡＣＳ法によって定量した。サル試料中における全リンパ球のＣＤ３−ＣＤ４０＋細胞の割合（パーセント）を次のゲーティング方法によって得た。前方散乱／側方散乱散乱図上にリンパ球集団をマークして領域１（Ｒ１）を決めた。Ｒ１での事象を使用して、ＣＤ４０及びＣＤ３マーカーに対して蛍光強度ドットプロットを表示した。蛍光的に標識した同位元素コントロールを用いて、ＣＤ４０及びＣＤ３陽性の各カットオフ点を決定した。
【０１１６】
結果は、２Ｈ７.ｖ１６と２Ｈ７.ｖ３１の双方が１０ｍｇ／ｋｇ用量で完全な末梢Ｂ細胞枯渇を、また０．０５ｍｇ／ｋｇ用量で部分的な末梢Ｂ細胞枯渇を生じさせることができたことを示している。投薬の最初の７２時間の間に測定されたＢ細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体に対して同様であった。回復動物の続く分析は、２Ｈ７.ｖ３１で処置した動物が２Ｈ７.ｖ１６を投薬したものと比較してＢ細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、１０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ７.ｖ１６で処置した回復動物は１０日目と３６日目の間のある時に実質的なＢ細胞回復を示した。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ７.ｖ３１で処置した回復動物では、３６日目と６７日目の間のある時にならないとＢ細胞は回復を示さなかった。これは、２Ｈ７.ｖ１６と比較して２ｈ７.Ｖ３１の場合に約一ヶ月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。
低又は高用量でサルの試験では毒性は観察されず、全体的な症状は正常であった。他の試験では、ｖ１６はこれらのサルで２週間あけて２用量を静脈内投与した後（１００ｍｇ／ｋｇｘ２＝１２００ｍｇ／ｍ２ｘ２）の最も高い用量まで耐容性が良好であった。
２Ｈ７.ｖ１６対リツキサン(登録商標)のカニクイザルにおけるデータは、ＣＤＣ活性の５倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なＡＤＣＣ活性を持つが減少したＣＤＣ活性の抗体は、大なるＣＤＣ活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性状を有しうる。
【０１１７】
実施例１１
亢進したエフェクター機能を持つフコース欠損２Ｈ７変異体抗体
正常なＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞はＩｇＧオリゴ糖に高度に（９７−９８％）フコースを添加する。血清からのＩｇＧがまた高度にフコシル化される。
フコシル化適格性であるジヒドロ葉酸レダクターゼマイナス（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株のＤＰ１２と、タンパク質フコシル化に欠損がある細胞株のＬｅｃ１３を用いてこの試験の抗体を産生した。ＣＨＯ細胞株Ｐｒｏ-Ｌｅｃ１３.６ａ（Ｌｅｃ１３）を、イェシーバ大学のアルバートアインシュタイン医科カレッジのパメラ・スタンレー教授から取得した。親株はＰｒｏ−（プロリン栄養要求株）及びＧａｔ−（グリシン、アデノシン、チミジン栄養要求株）である。ＣＨＯ-ＤＰ１２細胞株はＣＨＯ-Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ-６１）の誘導体であり、これはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損であり、インスリンに対する要求は低い。細胞株は、SUPERFECTTM形質移入試薬法(Qiagen, Valencia, CA)を使用してｃＤＮＡを形質移入した。形質移入した抗体を発現するＬｅｃ１３細胞の選択は、１０％の不活化ＦＢＳ(GIBCO)、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１Ｘのペニシリン／ストレプトマイシン(GIBCO)を補填したＬ-グルタミン、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を含むＭＥＭアルファ培地を含む成長培地中１０μｇ／ｍｌで、ピューロマイシン二塩酸塩(Calbiochem, San Diego, CA) を使用して実施した。ＣＨＯ細胞を同様に、５％のＦＢＳ(GIBCO)、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ-グルタミン、１ＸのＧＨＴ（グリシン、ヒポキサンチン、チミジン）、及び１Ｘのペニシリン／ストレプトマイシンを補填したＮａＨＣＯ３を伴いグリシンを伴わない低グルコースＤＭＥＭを含むＧＨＴなしのハムＦ１２を含む成長培地で選択された。
【０１１８】
コロニーは２ないし３週間以内に形成され、増殖とタンパク質発現のためにプールした。細胞プールを、小バッチタンパク質発現のために３×１０６細胞／１０ｃｍプレートで最初に播種した。細胞は、それらが９０−９５％の集密度まで成長したところで無血清培地に転換し、３−５日後に細胞の上清を収集し、ＦｃＩｇＧ-及び無傷ＩｇＧ-ＥＬＩＳＡで試験してタンパク質の発現レベルを推定した。１０ｍｇ／Ｌの組換えヒトインスリン及び１ｍｇ／Ｌの微量元素を補填したＰＳ２４生産培地への転換の一日前に約８×１０６細胞／１５ｃｍプレートでＬｅｃ１３及びＣＨＯ細胞を播種した。
Ｌｅｃ１３細胞及びＤＰ１２細胞は３−５日間、無血清生産培地に残したままとした。上清を収集し、１５０ｍｌのコニカルチューブで遠心分離によって透明にし、細胞及び細胞片を除去した。プロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦとアプロチニン（Sigma, St. Louis, MO）を添加し、上清を、プロテインＧクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を使用する即座の精製の前にＭＷＣＯ３０ＴＭフィルター（Amicon, Beverly, MA）を用いて撹拌細胞で５倍に濃縮した。全てのタンパク質を、CENTRIPREP-30TM濃縮器(Amicon)を使用してＰＢＳにバッファー交換し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。タンパク質濃度はＡ２８０吸光度値を使用して定量し、アミノ酸組成分析を使用して証明した。
【０１１９】
ＣＨＯ細胞を、ヒト化２Ｈ７ｖ１６，２Ｈ７ｖ.３１を発現するベクターでトランスフェクトし、記載されたようにして選択した。２Ｈ７ｖ.１６抗体は野生型Ｆｃ領域を保持する一方、ｖ．３１（実施例５、上の表８を参照）は、３のアミノ酸変化がなされた（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）Ｆｃ領域を有しており、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに対して高い親和性を生じる(Shields等 J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001))。トランスフェクションと選択に続いて、個々の細胞コロニーを単離し、タンパク質の発現レベルの評価をし、最も高い発現体をネトトレキセートでの選択にかけて、プラスミドコピー数を増大させ、高レベルの抗体を産生した細胞を選択した。細胞を成長させ、７日の期間、無血清培地に移した後、培地を収集し、プロテインＡカラムに充填し、標準的な方法を使用して抗体を溶出させた。抗体の最終濃度を、完全な抗体を測定するＥｌｉｓａを使用して定量した。全てのタンパク質を、CENTRIPREP-30TM濃縮器(Amicon)を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。
【０１２０】
アスパラギン結合オリゴ糖のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法
Ｎ結合オリゴ糖は、Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)の方法を使用して組換え糖タンパク質から放出された。簡単に説明すると、９６ウェルポリビニリジンジフルオリドＰＶＤＦ-裏打ちマイクロタイタープレート（Millipore, Bedford, MA）を、Millipore MULTISCREENTM真空マニフォールドに真空を適用することによってＰＤＶＦ膜を通して吸引した１００μｌメタノールで条件化した。条件化ＰＶＤＦ膜を３Ｘ２５０μｌ水で洗浄した。全ての洗浄工程間に、ウェルを、マニフォールドに穏やかな真空をかけることによって完全に液抜きした。膜を、６Ｍ塩酸グアニジン、３６０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．６からなる還元及びカルボキシメチル化バッファー（ＲＣＭ）で洗浄した。糖タンパク質試料（５０μｇ）を個々のウェルに適用し、穏やかな真空をかけてＰＶＤＦ膜を通して再び吸引し、ウェルを２×５０μｌのＲＣＭバッファーで洗浄した。固定化した試料を、各ウェルに５０μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液に添加し、３７℃で１時間マイクロタイタープレートをインキュベートすることにより還元した。ＤＴＴを真空で除去し、ウェルを４×２５０μｌ水で洗浄した。
システイン残基を、１ＭのＮａＯＨで新しく調製しＲＣＭバッファーで０．１Ｍまで希釈した５０μｌの０．１Ｍのヨード酢酸（ＩＡＡ）を添加してカルボキシメチル化した。カルボキシメチル化は雰囲気温度で暗室にて３０分間インキュベーションを行うことによって達成した。真空をプレートにかけてＩＡＡ溶液を除去し、ウェルを４ｘ２５０μｌの純水で洗浄した。ＰＶＤＦ膜を、１００μｌの１％ＰＶＰ３６０（ポリビニルピロリドン、分子量３６００００）(Sigma)溶液を添加し、雰囲気温度で１時間インキュベーションすることによりブロックした。ＰＶＰ-３６０溶液を穏やかな真空で除去し、ウェルを４×２５０μｌの水で洗浄した。１０ｍＭトリスアセテート、ｐＨ８．４中２５μｌの２５単位／ｍｌ溶液のPNGASE FTMアミダーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）消化液を各ウェルに加え、３７℃で３時間、消化を進めた。消化後、試料を５００μｌのエッペンドルフチューブに移し、各試料に２．５μｌＬの１．５Ｍ酢酸溶液を加えた。酸性化試料を雰囲気温度で３時間インキュベートし、オリゴ糖をグリコシルアミンからヒドロキシル形態に転換した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル分析の前に、放出されたオリゴ糖を、コンパクトな反応チューブ（US Biochemical, Cleveland, OH）中に充填したスラリー化された陽イオン交換樹脂（水素形態のＡＧ５０Ｗ-Ｘ８ＴＭ樹脂）（Bio-Rad, Hercules, CA）の０．７ｍｌ床を使用して脱塩した。
【０１２１】
ポジティブモードでの試料のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル分析では、脱塩オリゴ糖（０．５μｌアリコート）を、１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウム１：１（ｖ／ｖ）中で２ｍｇの２,５ジヒドロキシ安息香酸を０．１ｍｇの５-メトキシスリサイリック(methoxyslicyic)酸で溶解することによって調製した０．５μｌの２,５ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（ｓＤＨＢ）と共に染色なしの標的に適用した。試料／マトリックス混合物を真空乾燥した。ネガティブモードでの分析のために、脱塩Ｎ結合オリゴ糖（０．５μｌアリコート）を、１：３（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１３．３ｍＭクエン酸アンモニウムバッファー中で調製した０．５μｌの２',４',６'-トリヒドロキシアセトフェノンマトリックス（ＴＨＡＰ）と共に染色なしの標的に適用した。試料／マトリックス混合物を真空乾燥した後、分析前に大気水分を吸収させた。放出されたオリゴ糖をPERSEPTIVE BIOSYSTEMSTM VOYAGER-DETM質量分析計でのＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによって分析した。質量分析計を線形構成のポジティブ又はネガティブモードの何れかで遅延型抽出を使用して２０ｋＶで操作した。データは、信号雑音比を改善するためにデータ加算モード（２４０スキャン）で１３００のレーザー出力を用いて獲得した。機器を標準オリゴ糖の混合物を用いて較正し、質量をあてがう前に１９点のＳａｖｉｔｓｋｙ-Ｇｏｌａｙアルゴリズムを使用して平滑化した。質量スペクトルデータの積分をCaesar7.0TMデータ解析ソフトパッケージ（SciBridge Software）を使用して達成した。
【０１２２】
ＮＫ細胞ＡＤＣＣ
ＡＤＣＣアッセイは実施例９に記載されたようにして実施した。標識細胞（ＷＩＬ２-Ｓ）に対するＮＫ比は１対４であり、アッセイを４時間実施し、毒性をラクトースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して前のようにして測定した。標的細胞を、ＮＫ細胞の添加の前に３０分間、示した抗体濃度でオプソニン化した。使用したリツキサン(登録商標)抗体はジェネンテック（S. San Francisco, CA）からのものであった。
結果は、低フコシル化抗体が、フコースの完全な補体を持つ抗体よりもより効果的にＮＫ細胞標的細胞死滅を媒介することを示している。低フコシル化抗体２Ｈ７ｖ.３１が標的細胞死滅の媒介に最も効果的である。この抗体は低濃度で効果的であり、他の抗体より高い濃度で、より大なる割合の標的細胞の死滅を媒介することができる。抗体の活性は次の通りである：Ｌｅｃ１３誘導２Ｈ７ｖ３１＞Ｌｅｃ１３誘導２Ｈ７ｖ１６＞Ｄｐ１２誘導２Ｈ７ｖ３１＞Ｄｐ１２誘導２Ｈ７ｖ１６＞又は＝リツキサン(登録商標)。タンパク質及び糖鎖改変が相加的である。Ｌｅｃ１３産生及びＣＨＯ産生ＩｇＧから天然ＩｇＧに見出された糖鎖の比較では、ガラクトシル化の度合いに有意な差異を示しておらず、よってこの結果はフコースの存在／不存在のみに帰する可能性がある。
【０１２３】
実施例１２
カニクイザルＣＤ２０のクローニング及び抗体結合
カニクイザル(Macaca fascicularis)のＣＤ２０  ＤＮＡ配列は、カニクイザル脾臓ｃＤＮＡライブラリからＣＤ２０をコードするｃＤＮＡの単離によって決定した。ｃＤＮＡ合成とプラスミドクローニングのためのSUPERSCRIPTTM プラスミドシステム (Cat#18248-013, Invitrogen, Carlsbad, CA)を少し変更して用いて、ライブラリを構築した。ｃＤＮＡライブラリを、制限酵素部位ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＲＫ５Ｅベクターにライゲーションした。ｍＲＮＡは脾臓組織から単離した(California Regional Research Primate Center, Davis, CA)。ＣＤ２０をコードするｃＤＮＡを増幅するためのプライマーを、ヒトＣＤ２０の非コード配列に基づいて設定した。Ｎ末端領域プライマー5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3'（配列番号：４１）及びＣ末端領域プライマー5'-AAGCTATGAACACTAATG-3'（配列番号：４２）を用いて、カニクイザルＣＤ２０をコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。ＰＣＲ反応は、製造業者が推奨する通りに(Gibco, Rockville, MD)、PLATINUM TAQ DNA POLYMERASE HIGH FIDELITYTMシステムを用いて行った。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ(登録商標)２.１-ＴＯＰＯ(登録商標)ベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＸＬ-１ブルー大腸菌(Stratagene. La Jolla, CA)内に形質移入した。ライゲーションしたＰＣＲ産物を含有するプラスミドＤＮＡを各々のクローンから単離して、配列決定した。
カニクイザルＣＤ２０のアミノ酸配列を図１９に示す。図２０はカニクイザル及びヒトＣＤ２０の比較を示す。カニクイザルＣＤ２０はヒトＣＤ２０と８つの相違を有して９７．３％類似である。細胞外ドメインはＶ１５７Ａに１つの変異を有し、細胞質又は膜貫通領域に残りの７残基がみられた。
【０１２４】
ヒトＣＤ２０に対する抗体は、ＣＤ２０を発現するカニクイザル細胞への結合能及びＦＩＴＣコンジュゲートマウス２Ｈ７結合に代替する能力について検定された。２匹のカニクイザル(California Regional Research Primate Center, Davis, CA)から２０ｍｌの血液を採血してナトリウムヘパリンに注ぎ、Genentech, Inc.に直接輸送した。同じ日に、血液サンプルをプールして、４０ｍｌのＰＢＳを加えて１：１に希釈した。２０ｍｌの希釈した血液を、５０ｍｌの円錐形のチューブ(Cat#352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ)中の４×２０ｍｌのFICOLL-PAQUETMPLUS (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)の上に重ね、SORVALTM７遠心機(Dupont, Newtown, CT)にて室温で、３０分、１３００回転数／分で遠心分離した。ＰＢＭＣ層を単離して、ＰＢＳで洗浄した。赤血球を０．２％のＮａＣｌ溶液に溶解して、等量の１．６％のＮａＣｌ溶液にて等張性に戻し、１０００回転数／分で１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣペレットを５％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０ (Gibco, Rockville, MD)に再懸濁し、３７℃で１時間、１０ｃｍの組織培養ディッシュに分配した。付着しなかったＢ-及びＴ-細胞集団を吸引によって除去し、遠心分離して、計数した。合計２．４の×１０７の細胞が回収された。再懸濁されたＰＢＭＣを、各チューブに０．２５ｍｌ容量で１×１０６細胞を含有するように、２０本の１２×７５ｍｍの培養チューブ(Cat#352053, Falcon)に分注した。チューブを５本ずつの４セットに分けた。各セットに、いずれかの培地（ＲＰＭ１６４０、５％ＦＢＳ）を添加し、対照ヒトＩｇＧ１抗体、リツキサン(登録商標)、２Ｈ７.ｖ１６又は２Ｈ７.ｖ３１の量を滴定した。各々の抗体の終濃度は、３０、１０、３．３及び１．１ｎＭであった。加えて、各々チューブにフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ２０ (Cat#555622, BD Biosciences, San Diego, CA)を２０μｌずつ加えた。細胞をゆっくりと混合し、氷上で１時間インキュベートし、次いで、冷たいＰＢＳで２回洗浄した。細胞表面染色をEPIC XL-MCLTM流動血球計算器(Coulter, Miami, FL)で分析して、相乗平均を求めて、抗体濃度に対してプロットした(KALEIDAGRAPHTM, Synergy Software, Reading, PA)。
データは、２Ｈ７ｖ.１６及び２Ｈ７ｖ.３１がカニクイザル細胞へのＦＩＴＣ-マウス ２Ｈ７結合を競合的に置き換えたことを示した。さらにまた、リツキサン(登録商標)はＦＩＴＣマウス２Ｈ７結合を置き換えた。このことから、２Ｈ７及びリツキサン(登録商標)の両方がＣＤ２０上の重複エピトープに結合することが示唆された。加えて、データにより、２Ｈ７ｖ.１６、２Ｈ７ｖ.３１及びリツキサン(登録商標)のＩＣ５０値が類似しており、４−６ｎＭの範囲内であることが示された。
【０１２５】
実施例１３
中等度から重度の関節リウマチにおけるｒｈｕＭＡｂ ２Ｈ７（２Ｈ７.ｖ１６）の第I相／第II相試験
手順概要
同時メトトレキセート（ＭＴＸ）を永続的に服用している中等度から重度の関節リウマチ患者における、ＰＲＯ７０７６９（ｒｈｕＭＡｂ ２Ｈ７）の漸増用量の安全性についてのランダム化、プラセボ対照、多中心、盲目第I相／第II相試験。
目的
この試験の最初の目的は、中等度から重度の関節リウマチ（ＲＡ）患者におけるＰＲＯ７０７６９（ｒｈｕＭＡｂ ２Ｈ７）の静脈内(ＩＶ)漸増用量の安全性及び耐容性を評価することである。
【０１２６】
試験の設定
中等度から重度の関節リウマチ（ＲＡ）患者におけるＭＴＸと併用したＰＲＯ７０７６９の漸増用量の安全性のランダム化、プラセボ対照、多中心、盲目第I相／第II相、研究者及び被検者盲目試験である。この研究は用量漸増の段階と大量の被検者の登録を有する第二の段階からなる。実施者は処置の分類を分けたままにした。
１〜５の疾患の状態を変えうる抗リウマチ剤に失敗した中等度から重度のＲＡ患者又はＭＴＸを用いた治療に満足した臨床効果を現段階で示さない患者を登録した。
患者は、試験開始前の少なくとも１２週間に１０−２５ｍｇ／週の範囲のＭＴＸ投与と、少なくとも４週間の永続用量の投与を必要とし、その後、初期用量の試験薬剤（ＰＲＯ７０７６９又はプラセボ）を投与した。また、患者は、経口副腎皮質ホルモン（最高１０ｍｇ／日又はプレドニゾン当量）の永続用量と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の永続用量を投与してもよい。患者は、以下の用量-漸増計画に従って、第１日目と第１５日目に示された用量のＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量の２回の静脈内注入を行った。
特定の基準に従い、体内安全性データ検討委員会による安全性データと各コホートで処理された最後の患者の２回目の注入後７２時間の急性毒性を考慮して用量の漸増を行った。用量-漸増期の間に服用レベルに耐性がみられた場合には、用量-漸増の後、４０の追加患者（活性薬剤３２及びプラセボ８）を各々以下の服用レベルにランダム化した：２×５０ｍｇ、２×２００ｍｇ、２×５００ｍｇ及び２×１０００ｍｇ。およそ２０５の患者が研究に寄与された。
Ｂ細胞数を計測して記録された。Ｂ細胞数は、６ヵ月の有効性評価後の４８週フォローアップ期間にフローサイトメトリを用いて測定した。Ｂ細胞枯渇は用量制限毒性（ＤＬＣ）でなく、むしろＰＲＯ７０７６９治療の予想される薬力学的結果と考えた。
好適な付随的研究として、血清及びＲＮＡ分析のための血液、並びに尿試料を様々な時期に患者から採取した。これらの試料を用いて、中等度から重度のＲＡ患者におけるＰＲＯ７０７６９治療に対する応答を示唆しうるバイオマーカーを同定した。
【０１２７】
結果計測
この研究の一次結果計測は、中等度から重度のＲＡ患者におけるＰＲＯ７０７６９の安全性及び耐容性である。
試験処置
患者集団には、以下の漸増計画に従って第１日目と第１５日目に示された用量のＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量の２回の静脈内注入がされた：
−１０ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量：活性薬剤４患者、対照１患者
−５０ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量：活性薬剤８患者、対照２患者
−２００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量：活性薬剤８患者、対照２患者
−５００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量：活性薬剤８患者、対照２患者
−１０００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量：活性薬剤８患者、対照２患者
有効性
ＰＲＯ７０７６９の有効性はＡＣＲ応答により測定した。ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０及びＡＣＲ７０応答に至った患者の割合は治療群ごとにまとめ、各群について９５％の信頼区間を確保した。これらの応答の内容と基準からの変化を処置と観察ごとにまとめた。
【０１２８】
実施例１−１３の結論
上記のデータは、ヒト化ＣＤ２０結合抗体、特に、生物学的特性を有し、さらにはその特性を亢進した２Ｈ７抗体変異形の産生が成功したことを示した。マウスのドナーと類似の親和性でＣＤ２０結合した本発明のヒト化２Ｈ７抗体とキメラ２Ｈ７抗体は、霊長類のＢ細胞殺傷に有効性を示し、Ｂ細胞枯渇を引き起こした。特定の変異形は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するために現在用いられるキメラ抗ＣＤ２０抗体のより亢進したＡＤＣＣを示し、患者の治療的抗体の低用量化に有利に働く。さらに、マウスＦＲ残基を有するキメラ抗体が完全なＢ細胞枯渇に至るために有効な量で投与されて抗体応答が取り除かれることが必要である一方で、本発明のヒト化抗体は、特定の疾患及び患者に望ましいような部分的又は完全なＢ細胞枯渇に至る用量と、異なる継続期間で投与されうる。さらに、これらの抗体は溶液中で安定性を示した。ヒト化２Ｈ７抗体の特性によりＣＤ２０陽性自己免疫疾患の治療において免疫療法薬剤として使用することが考えられた；これらの抗体はヒト患者において免疫原性となることが予測されず、少なくとも完全なマウスあるいはキメラの抗ＣＤ２０抗体よりも免疫原性が低い。
【０１２９】
実施例１４
更なるヒト化抗体の調整
それぞれ配列番号：２４及び２８の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含有してなる抗体２Ｈ７.ｖ３１はさらに、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するように、Ｆｃ領域内に少なくとも１のアミノ酸置換、例えばＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａのアミノ酸置換を含んでもよく、より好ましくは２Ｈ７.ｖ３１は配列番号：２８の重鎖アミノ酸配列を有する。抗体は、それぞれ図１０及び１１に示すような配列番号：２９及び３０の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含有してなる２Ｈ７.ｖ１３８でもよく、それは２Ｈ７.ｖ１６の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列に対応する配列の配置であった。あるいは、このような好適な完全なヒト化２Ｈ７抗体は２Ｈ７.ｖ４７７であり、それはＮ４３４Ｗのアミノ酸置換を除いて２Ｈ７.ｖ１３８の軽鎖及び重鎖配列を有する。これら抗体の何れかはさらに、ＣＤＣ活性を低減するように、Ｆｃ領域内に少なくとも１のアミノ酸置換を含有してもよく、例えば少なくとも置換Ｋ３２２Ａを含有してなる。米国特許第6,528,624号B1(Idusogie 等)を参照。
いくつかの好適なヒト化２Ｈ７変異形は配列番号：２の可変軽鎖ドメインと、配列番号：８の可変重鎖ドメインを有するものである、すなわちＦｃ領域内に置換を有するものないしは有しないものであり、配列番号：８内にＮ１００ＡあるいはＤ５６ＡとＮ１００Ａの置換を有する可変重鎖ドメインと、配列番号：２内にＭ３２Ｌ又はＳ９２ＡあるいはＭ３２ＬとＳ９２Ａの置換を有する可変軽鎖ドメインを有するものであり、すなわちＦｃ領域内に置換を有するものないしは有しないものである。置換がＦｃ領域内にある場合、それらは以下の表に記載されるものの一つであることが好ましい。
【０１３０】
いくつかの様々な本発明の好ましい実施例の概要において、２Ｈ７バージョン１６をベースとした変異形のＶ領域は、以下の表に示すアミノ酸置換の位置を除いて、ｖ１６のアミノ酸配列を有する。特に明記しない限り、２Ｈ７変異形はｖ１６と同じＬ鎖を有する。
2007532680.tif 000018
【０１３１】
上記の変異形に加えて、完全なヒト化２Ｈ７抗体はバージョン１３８でもよく、それは軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号:29)
と、重鎖アミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号:30)
を有する。
【０１３２】
他の実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は、配列番号：４３の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と配列番号：８の重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよく、この抗体は更にＶＨ-ＣＤＲ２内にＤ５６Ａのアミノ酸置換を含有し、ＶＨ-ＣＤＲ３内のＮ１００はＹ又はＷで置換されており、配列番号：４３は配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (配列番号:43)
を有する。
この一番最後のヒト化２Ｈ７抗体の一実施態様では、Ｎ１００はＹによって置換される。他の実施態様では、Ｎ１００はＷによって置換される。さらに他の実施態様では、抗体はＶＨ−ＣＤＲ３内に置換Ｓ１００ａＲを含んでおり、好ましくは、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するような、Ｆｃ領域内に少なくとも一つのアミノ酸置換を含有してなるものであり、例としてアミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３２６Ａを含有するＩｇＧ１ Ｆｃを含んでなるものである。あるいは、抗体はＶＨ-ＣＤＲ３内に置換Ｓ１００ａＲを含んでおり、好ましくは更にＡＤＣＣ活性を改善するがＣＤＣ活性を低減するような、Ｆｃ領域内に少なくとも１のアミノ酸置換を含有してなるものであり、例として少なくともアミノ酸置換Ｋ３２２Ａを含有するもの、並びに更にアミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａを含有するものである。
【０１３３】
特に好ましい実施態様では、抗体はバージョン５１１であり、２Ｈ７.ｖ５１１軽鎖配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC   (配列番号:44)
と、２Ｈ７.ｖ５１１重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY
NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号:45)
を含有してなる。
【０１３４】
実施例１５
多発性軟骨炎におけるリツキシマブの臨床研究
多発性軟骨炎と診断された患者がリツキサン(登録商標)抗体で治療された。治療された患者はＢ細胞悪性腫瘍を持っていなかった。
リツキサン(登録商標)は以下の何れかの服用計画に従って患者に静脈内(ＩＶ)投与された。
(Ａ)  第１日目  ５０ｍｇ／ｍ２ＩＶ
第８、第１５及び第２２日目  １５０ｍｇ／ｍ２ＩＶ
(Ｂ)  第１日目  １５０ｍｇ／ｍ２ＩＶ
第８、第１５及び第２２日目  ３７５ｍｇ／ｍ２ＩＶ
(Ｃ)  第１、第８、第１５及び第２２日目  ３７５ｍｇ／ｍ２ＩＶ
更なる補助療法（例えば上記の免疫抑制剤）をリツキサン(登録商標)療法に組み合わせてもよいが、好ましくは患者は治療過程を通して単剤としてリツキサン(登録商標)で治療される。
全体の応答の割合は、標準物質化学パラメータによって定まる軟骨性組織の炎症の減退に基づいて測定した。リツキサン(登録商標)の投与により、上記のように治療された患者の多発性軟骨炎の一又は複数の症状を改善した。
【０１３５】
実施例１６
多発性単神経炎のリツキシマブの臨床研究
本明細書中に定義したような多発性単神経炎と臨床診断された患者が、場合によってはステロイド療法と組み合わせたリツキシマブ（リツキサン(登録商標)）抗体で治療された。治療される患者は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有しない。疾患の原因を可能な限り決定する際には、詳細で完全な病歴聴取が絶対に重要である。疼痛は腰又は臀部で発生して、一側性の大腿及び膝まで広がることが多い。通常、疼痛は、夜に最もひどく、層を成して突くような深い痛みに特徴がある。糖尿病患者は、一般に、一側性の重症大腿部疼痛の直後に前側大腿筋の虚弱と萎縮及び膝反射の損失が起こる急性の発作を有する。患者から報告される他の起こりうる症状には以下のものがある：麻痺、うずき、知覚異常、焼けるような疼痛−感覚異常、体部移動困難 − 麻痺、体動制御の損失。感覚及び運動の損失は特定の神経の機能不全と関係しうる。試験により、より多く影響を受けている領域以外の反射及び良好な強度の保存が明らかにされた。多発性単神経炎のいくつかの共通した調査結果は以下のようなものがある（頻度の順ではない）：坐骨神経機能不全、大腿神経機能不全、共通のひ骨神経機能不全、腋部(auxillary)神経機能不全、とう骨神経機能不全、正中神経機能不全、尺骨神経機能不全及び自律機能不全、すなわち非自発的な身体の機能、例えば腺及び心臓を制御する神経系の一部。
この分散量を考察するための以下の４つのパラメータのうちの２つの改善を、治療に対する陽性応答とし、該パラメーターは、糖尿病性神経障害における以前の治療研究に基づく(Jaradeh 等 Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 67:607-612 (1999))。患者は、電気生理学試験で測定可能な神経障害を有するはずである。明らかな糖尿病又は遺伝性神経障害患者は除外された。
【０１３６】
患者は以下の基準で測定される十分な器官機能を有していなければいけない（値は、登録前の２か月以内に得なければいけない）：肝：ＡＳＴ＜３×lab正常の上限及びビリルビン＜ ２．０ｍｇ／ｄｌ。腎臓：クレアチニン＜  ３．０ｍｇ／ｄｌ。
リツキシマブは通院患者に静脈内投与された。インラインフィルタは必要でない。初速は初めの１時間は５０ｍｇ／時である。毒性が見られない場合、速度は３０分間隔で５０ｍｇ／時ずつ段階的に最大４００ｍｇ／時まで増加してもよい。第一の服用に十分に耐容性がある場合、継続用量の初速は１００ｍｇ／時とし、３０分間隔で１００ｍｇ／時ずつ段階的に増加し、４００ｍｇ／時を上回らないものとした。患者が熱及び硬直を経験した場合、抗体注入を停止した。副作用の重症度を評価した。症状が改善された場合、注入は最初は以前の速度の半分で続けた。抗体注入後、静脈内ラインは、必要に応じて薬物のために維持した。１時間の観察の後、合併症がなければ、静脈内ラインは中断してもよい。
この研究に登録されたすべての患者は、週に１回のリツキシマブを連続した４週間の間、投与された。用量は実際の表面積に基づく。投与計画は、リツキシマブ：第１、８、１５、及び２２日目に３７５ｍｇ／ｍ２／週、ＩＶ注入とした。すべての患者には６５０ｍｇのTYLENOL(登録商標)鎮痛剤と、ＩＶ又はＰＯによる５０ｍｇのBENADRYL(登録商標)アレルギー性薬物が前投与され、処置前の３０−６０分の副作用が軽減された。過敏性反応の治療のための薬剤、例えばエピネフリン、抗ヒスタミン剤及び副腎皮質ホルモンを、投与中の反応の出現の際にすぐに使えるようにしておくべきである。加えて、抗疼痛薬剤、例えばアセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン(ELAVIL(登録商標))、カルバマゼピン(TEGRETOL(登録商標))、フェニトイン(DILANTIN(登録商標))、ガバペンチン(NEURONTIN(登録商標))、(Ｅ)-Ｎ-バニリル-８-メチル-６-ノンアミド(CAPSAICIN(登録商標))、又は、神経ブロッカーが、リツキシマブと共に使用されてもよい
【０１３７】
神経障害はいくつかの異なるパラメータによって評価される：１）ＥＭＧ／ＮＣＳ、２）量的感覚試験、３）神経障害欠損スコア、４）神経障害症状と変化の質問表。
ＥＭＧ／ＮＣＳ：筋電図記録法及び神経伝達速度測定は、同じ筋電図記録装置と同じ技術者によってリツキシマブの注入後、３、６及び１２か月後に実行された。各々の試験からの概略データを用いて、平均知覚神経活動電位（腓腹、正中、尺骨）、平均化合物運動神経活動電位（前頸骨の腓骨、脛骨、尺骨及び正中）及び、平均運動神経の伝導速度などの初期値を比較した。また、平均Ｆ波刺激潜伏性及び近位性から遠位性の運動振幅率が算出された。目的とする応答は基準からの１０％より大きいものとした。安定した疾患は神経障害の有意な変化を示さない（+/->１０）。進行性の疾患は神経障害の悪化を示す（基準から１０％より大きい）。
定量的感覚検査：振動検出閾値（ＶＤＴ）、冷却検出閾値（ＣＤＴ）、及び足及び手の背側の熱痛覚閾値（ＨＰＴ）を有する定量的感覚検査、並びに遠位性足及び手の発汗刺激性の軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）を、同じ技術者よってリツキシマブの注入後３、６及び１２か月目に行った。これらの試験の異常は、標準偏差と比較してパーセンタイル値をベースとした点数に置き換えた。事前調査測定値から２パーセンタイルの変化を示すものを有意とした。
神経障害欠陥スコア（ＮＩＳ）：この試験は、反射、感覚及び筋力を測定するものである。足指での歩行、踵及び跪いた位置から生じる下肢の機能評価を行った。試験中、リツキシマブの注入後３、６及び１２か月目に同じ神経科医によってスコア化した。ＮＩＳにおいて５点以上低減したものを改善と定義した(Dyck 「Quantitating severity of neuropathy」 : Dyck 等 Eds. Peripheral Neuropathy. Philadelphia: WB Saunders, 686-697 (1993))。
【０１３８】
神経障害症状及び変化質問表（ＮＳＣ）：この質問表は正しいか誤りかの様式で答えられる３８項目から成る。それは、時間の経過につれての神経障害症状、それらの重症度及び変化の有無を評価するものである。それは、試験の全体を通して各々の患者に対して同じ神経科医が行った。基準スコアから１０％の変化を示すものを有意とした。
試験の一次結果の値は患者改善であった。患者が上記に挙げた４つのパラメータのうちの２つに有意な改善を示す一方で他の測定値の何れもが低下していない場合に、患者を改善と分類した。この応答分類法に従って、二項算出に基づく応答率の正確な９５％信頼区間を計算した。１４の患者について、この区間の幅は、正応答率が３０−７０％の間であればおよそ５０％、７０−９０％の間ないしは１０−３０％の間であればおよそ４０％、９０％より大きいないしは１０％より小さければおよそ３０％未満であった。
正確な二項間隔を用いて各々のパラメータ上の成功した結果を有する患者の割合について、推定値と９５％信頼区間を計算した。各々の連続した又は序数の測定値について、Tukey間隔及びHodges-Lehmann統計学による基準からの変化について、正確な９５％信頼区間を計算した（Hollender及びWolfe Nonparametric Statistical Methods 2nd Edition, Wiley, New York, 1999 p51-56を参照）。計算は、STATEXACTTM (Cytel)統計的ソフトウェアパッケージを用いて行った。
【０１３９】
神経障害欠損スコア試験により、神経障害欠損の単一のスコアと、脳神経機能、筋肉虚弱、反射及び感覚に関するサブセットスコアが得られた。身長、体重及び身体適応度を考慮して年齢及び性別毎の患者と比較して、分析者が欠損をスコア化した。筋肉の虚弱を、正常であるならば０、２５％弱いならば１、５０％弱いならば２、７５％弱いならば３、筋肉が重力に反して動く場合を３．２５、重力がない場合に動く場合を３．５、動かずにけいれんする場合を３．７５、そして、全麻痺がある場合を４として、スコア化した。これは、脳神経III、VI、VII、X及びXIIに対応する。筋力について試験した個々の筋肉群は、呼吸、首屈曲、肩外転、Ｌ型曲り屈曲、上腕橈側、Ｌ型曲り伸展、手首屈曲及び伸展、指屈曲及び伸展、親指外転、腰屈曲及び伸展、膝屈曲及び伸展、足関節背屈、足関節足底屈曲足指伸筋及び屈筋の合計２４項目を含む。各々の群は右側及び左側で試験した。
反射は、０＝正常、１＝低減、２＝欠損としてスコア化した。繊維-腱反射は、二頭筋、三頭筋、上腕橈側、四頭筋及び三頭筋腓腹の各々の側面を調べた。６０歳以上の患者については、足関節反射の減少を０と分類し、足関節反射の欠損を１と分類した。
感覚試験は、指及び第１趾の背側について行った。触覚圧は、長い脱脂綿を用いて測定した。まっすぐなピンでの刺し跡を評価した。振動感覚は１６５Ｈｚの音叉で試験し、人さし指及び第１趾の末端指節骨を動かすことによって関節位置を試験した。試験を各末端で行い、０＝正常、１＝低減及び２＝欠損とスコア化した。
上記のように、リツキシマブ又はヒト化２Ｈ７は、対照（抗体なしのもの）と比べて患者の改善を示すため、多発性単神経炎を治療することが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ】マウス２Ｈ７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（配列番号１）、ヒト化２Ｈ７．ｖ１６変異形の軽鎖可変ドメイン（配列番号２）、及びヒトκ軽鎖サブグループＩの軽鎖可変ドメイン（配列番号３）のアミノ酸配列を比較した配列。２Ｈ７及びｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）、及びＣＤＲ３（配列番号６）。それぞれの鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は示すように大括弧で囲っており、フレームワーク領域、ＦＲ１-ＦＲ４に隣接している。２Ｈ７はマウス２Ｈ７抗体を示す。２配列間にあるアステリスクは２配列間で異なる箇所を示す。 Kabat ら, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従って残基番号を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅで挿入を示す。
【図１Ｂ】マウス２Ｈ７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（配列番号７）、ヒト化２Ｈ７．ｖ１６変異形の重鎖可変ドメイン（配列番号８）、及び重鎖サブグループＩＩＩのヒトコンセンサス配列の重鎖可変ドメイン（配列番号９）のアミノ酸配列を比較した配列。２Ｈ７及びｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＨのＣＤＲは以下の通りである。ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）。それぞれの鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は示すように大括弧で囲っており、フレームワーク領域、ＦＲ１-ＦＲ４に隣接している。２Ｈ７はマウス２Ｈ７抗体を示す。２配列間にあるアステリスクは２配列間で異なる箇所を示す。 Kabat ら, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従って残基番号を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅで挿入を示す。
【図２Ａ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３｛５'配列｝及び配列番号１４｛３'相補配列｝）のヌクレオチド配列、並びにＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＦａｂのＬ鎖（配列番号１５）及びＨ鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３｛５'配列｝及び配列番号１４｛３'相補配列｝）のヌクレオチド配列、並びにＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＦａｂのＬ鎖（配列番号１５）及びＨ鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３｛５'配列｝及び配列番号１４｛３'相補配列｝）のヌクレオチド配列、並びにＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＦａｂのＬ鎖（配列番号１５）及びＨ鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｄ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３｛５'配列｝及び配列番号１４｛３'相補配列｝）のヌクレオチド配列、並びにＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＦａｂのＬ鎖（配列番号１５）及びＨ鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｅ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３｛５'配列｝及び配列番号１４｛３'相補配列｝）のヌクレオチド配列、並びにＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＦａｂのＬ鎖（配列番号１５）及びＨ鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７｛５'配列｝及び配列番号１８｛３'相補配列｝）を示す。Ｌ鎖（配列番号１９）及びＨ鎖（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７｛５'配列｝及び配列番号１８｛３'相補配列｝）を示す。Ｌ鎖（配列番号１９）及びＨ鎖（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７｛５'配列｝及び配列番号１８｛３'相補配列｝）を示す。Ｌ鎖（配列番号１９）及びＨ鎖（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｄ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７｛５'配列｝及び配列番号１８｛３'相補配列｝）を示す。Ｌ鎖（配列番号１９）及びＨ鎖（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｅ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７｛５'配列｝及び配列番号１８｛３'相補配列｝）を示す。Ｌ鎖（配列番号１９）及びＨ鎖（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】実施例１に示すように免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１（配列番号２１；５３９１ｂｐ）のヌクレオチド配列を示す。ｐＤＲ１は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖(Shalabyら, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))をコードする配列を含み、太字及び下線で開始コドンと終止コドンを示す。
【図４Ｂ】実施例１に示すように免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１（配列番号２１；５３９１ｂｐ）のヌクレオチド配列を示す。ｐＤＲ１は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖(Shalabyら, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))をコードする配列を含み、太字及び下線で開始コドンと終止コドンを示す。
【図５Ａ】実施例１に記載した免疫グロブリン重鎖を発現するためのプラスミドｐＤＲ２（配列番号２２、６１３５ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ２は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖(Shalabyら、上述)をコードする配列を含み、開始コドン及び終止コドンを太字及び下線で示す。
【図５Ｂ】実施例１に記載した免疫グロブリン重鎖を発現するためのプラスミドｐＤＲ２（配列番号２２、６１３５ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ２は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖(Shalabyら、上述)をコードする配列を含み、開始コドン及び終止コドンを太字及び下線で示す。
【図６Ａ】２Ｈ７．ｖ１６Ｌ鎖のアミノ酸配列を示す。成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列であるＤＩＱより前の初めの１９アミノ酸を含有する完全なＬ鎖（配列番号２３）を示す。
【図６Ｂ】２Ｈ７．ｖ１６Ｌ鎖のアミノ酸配列を示す。成熟ポリペプチドＬ鎖（配列番号２４）を示す。
【図７Ａ】２Ｈ７．ｖ１６Ｈ鎖のアミノ酸配列を示す。成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列であるＥＶＱより前の初めの１９アミノ酸を含有する完全なＨ鎖（配列番号２５）を示す。完全なＨ鎖配列と図１ＢのＶＨ配列（配列番号８）を比較すると、ヒトγ１定常領域は配列番号２５のアミノ酸位置１１４−４７１由来である。
【図７Ｂ】２Ｈ７．ｖ１６Ｈ鎖のアミノ酸配列を示す。成熟ポリペプチドＨ鎖（配列番号２６）を示す。完全なＨ鎖配列と図１ＢのＶＨ配列（配列番号８）を比較すると、ヒトγ１定常領域は配列番号２５のアミノ酸位置１１４−４７１由来である。
【図８Ａ】２Ｈ７．ｖ３１Ｈ鎖のアミノ酸配列を示す。成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列であるＥＶＱより前の初めの１９アミノ酸を含有する完全なＨ鎖（配列番号２７）を示す。Ｌ鎖は２Ｈ７．ｖ１６と同じである（図６参照）。
【図８Ｂ】２Ｈ７．ｖ３１Ｈ鎖のアミノ酸配列を示す。成熟ポリペプチドＨ鎖（配列番号２８）を示す。Ｌ鎖は２Ｈ７．ｖ１６と同じである（図６参照）。
【図９】マウス２Ｈ７からｖ７５までのヒト化バージョンのサブセットへのアミノ酸変異の概略のフローチャートである。
【図１０】ヒト化２Ｈ７.ｖ１６変異形の軽鎖（配列番号２）及びヒト化２Ｈ７.ｖ１３８変異形の軽鎖（配列番号２９）のアミノ酸配列を比較する配列。
【図１１】ヒト化２Ｈ７.ｖ１６変異形の重鎖（配列番号８）及びヒト化２Ｈ７.ｖ１３８変異形の重鎖（配列番号３０）のアミノ酸配列を比較する配列。
【図１Ａ】
2007532680.tif 000019
【図１Ｂ】
2007532680.tif 000020
【図２Ａ】
2007532680.tif 000021
【図２Ｂ】
2007532680.tif 000022
【図２Ｃ】
2007532680.tif 000023
【図２Ｄ】
2007532680.tif 000024
【図２Ｅ】
2007532680.tif 000025
【図３Ａ】
2007532680.tif 000026
【図３Ｂ】
2007532680.tif 000027
【図３Ｃ】
2007532680.tif 000028
【図３Ｄ】
2007532680.tif 000029
【図３Ｅ】
2007532680.tif 000030
【図４Ａ】
2007532680.tif 000031
【図４Ｂ】
2007532680.tif 000032
【図５Ａ】
2007532680.tif 000033
【図５Ｂ】
2007532680.tif 000034
【図６Ａ】
2007532680.tif 000035
【図６Ｂ】
2007532680.tif 000036
【図７Ａ】
2007532680.tif 000037
【図７Ｂ】
2007532680.tif 000038
【図８Ａ】
2007532680.tif 000039
【図８Ｂ】
2007532680.tif 000040
【図９】
2007532680.tif 000041
【図１０】
2007532680.tif 000042
【図１１】
2007532680.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
また、リツキシマブは様々な非悪性腫瘍性自己免疫疾患において研究されており、そこでＢ細胞と自己抗体は疾患病理学上の役割があるようである。Edwards 等, Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)。リツキシマブは、例えば、関節リウマチ(RA) (Leandro 等, Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002)；Edwards 等, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002)；Stahl 等, Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003)；Emery 等, Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003))、ループス(Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003)；Leandro 等 Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002)；Gorman 等, Lupus, 13: 312-316 (2004))、免疫性血小板減少性紫斑病(D’Arena 等, Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003)；Stasi 等, Blood, 98: 952-957 (2001)；Saleh 等, Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000)；Zaja 等, "B-cell depletion with rituximab as treatment for immune hemolytic anemia and chronic thrombocytopenia" Haematologica 87(2):189-195 (2002)；Ratanatharathorn 等, Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000))、 赤芽球ろう (Auner 等, Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002))；自己免疫性貧血(Zaja 等, Haematologica 87:189-195 (2002) (Haematologica 87:336 (2002)に誤植あり)、寒冷凝集素症 (Layios 等, Leukemia, 15: 187-8 (2001)；Berentsen 等, Blood, 103: 2925-2928 (2004)；Berentsen 等, Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001)；Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001)；Zaja 等, British Journal of Haematology 115: 232-233 (2001))、重症インスリン耐性のタイプＢ症候群(Coll 等, N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004)、混合クリオグロブリン血症(DeVita 等, Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002))、重症筋無力症(Zaja 等, Neurology, 55: 1062-63 (2000)；Wylam 等, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003))、ウェゲナー肉芽腫症(Specks 等, Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001))、難治性尋常性天疱瘡(Dupuy 等, Arch Dermatol., 140:91-96 (2004))、皮膚筋炎(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002))、シェーグレン症候群(Somer 等, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003))、急性タイプＩＩ混合クリオグロブリン血症(Zaja 等, Blood, 101: 3827-3834 (2003))、尋常性天疱瘡(Dupay 等, Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004))、自己免疫性ニューロパチー(Pestronk 等, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003))、腫瘍随伴性眼球クローヌス-筋クローヌス症候群(Pranzatelli 等 Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003))、及び再発性多発性硬化症(RRMS)の徴候及び症状を潜在的に軽減することが報告されている。Cross 等 (abstract) 「Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS」 Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
ＣＤ２０抗体及びＣＤ２０結合分子に関する特許及び特許文献には、米国特許第 5,776,456号、同第5,736,137号、同第5,843,439号、同第6,399,061号及び同第6,682,734号、並びに米国公開特許2002/0197255、米国公開特許2003/0021781、米国公開特許2003/0082172、米国公開特許2003/0095963、米国公開特許2003/0147885 (Anderson 等)；米国特許第 6,455,043号及び国際公報2000/09160 (Grillo-Lopez, A.)；国際公報2000/27428 (Grillo-Lopez及びWhite)；国際公報2000/27433 (Grillo-Lopez及びLeonard)；国際公報2000/44788 (Braslawsky 等)；国際公報2001/10462 (Rastetter, W.)；国際公報01/10461 (Rastetter及びWhite)；国際公報2001/10460 (White及びGrillo-Lopez)；米国公開特許2001/0018041、米国公開特許2003/0180292、国際公報2001/34194 (Hanna及びHariharan)；米国公開特許2002/0006404及び国際公報2002/04021 (Hanna及びHariharan)；米国公開特許2002/0012665及び国際公報2001/74388 (Hanna, N.)；米国公開特許2002/0058029 (Hanna, N.)；米国公開特許2003/0103971 (Hariharan及びHanna)；米国公開特許2002/0009444及び国際公報2001/80884 (Grillo-Lopez, A.)；国際公報2001/97858 (White, C.)；米国公開特許2002/0128488及び国際公報2002/34790 (Reff, M.)；国際公報2002/060955 (Braslawsky 等)；国際公報2002/096948 (Braslawsky 等);国際公報2002/079255 (Reff及びDavies)；米国特許第 6,171,586号及び国際公報1998/56418 (Lam 等)；国際公報1998/58964 (Raju, S.)；国際公報1999/22764 (Raju, S.)；国際公報1999/51642、米国特許第 6,194,551号、米国特許第 6,242,195号、米国特許第 6,528,624号及び米国特許第 6,538,124 号(Idusogie 等)；国際公報2000/42072 (Presta, L.)；国際公報2000/67796 (Curd 等)；国際公報2001/03734 (Grillo-Lopez 等)；米国公開特許2002/0004587及び国際公報2001/77342 (Miller及びPresta)；米国公開特許2002/0197256 (Grewal, I.)；米国公開特許2003/0157108 (Presta, L.)；米国特許第 6,565,827号、同第6,090,365号、同第6,287,537号、同第6,015,542号、同第5,843,398号、及び同第5,595,721号、(Kaminski 等)；米国特許第 5,500,362号、同第5,677,180号、同第5,721,108号、同第6,120,767号、及び同第6,652,852号 (Robinson 等)；米国特許第6,410,391号 (Zelsacher)；米国特許第 6,224,866号及び国際公報00/20864 (Barbera-Guillem, E.)；国際公報2001/13945 (Barbera-Guillem, E.)；国際公報2000/67795 (Goldenberg)；米国公開特許2003/0133930及び国際公報2000/74718 (Goldenberg及びHansen)；米国公開特許2003/0219433及び国際公報2003/68821 (Hansen 等)；国際公報2004/058298 (Goldenberg及びHansen)；国際公報2000/76542 (Golay 等)；国際公報2001/72333 (Wolin及びRosenblatt)；米国特許第 6,368,596 号(Ghetie 等)；米国特許第 6,306,393号及び米国公開特許2002/0041847 (Goldenberg, D.)；米国公開特許2003/0026801 (Weiner及びHartmann)；国際公報2002/102312 (Engleman, E.)；米国公開特許2003/0068664 (Albitar 等)；国際公報2003/002607 (Leung, S.)；国際公報2003/049694、米国公開特許2002/0009427、及び米国公開特許2003/0185796 (Wolin 等)；国際公報2003/061694 (Sing及びSiegall)；米国公開特許2003/0219818 (Bohen 等)；米国公開特許2003/0219433及び国際公報2003/068821 (Hansen 等)；米国公開特許2003/0219818 (Bohen 等)；米国公開特許2002/0136719 (Shenoy 等)；国際公報2004/032828 (Wahl 等)；及び国際公報2002/56910 (Hayden-Ledbetter)が含まれる。また、米国特許第 5,849,898号及び欧州特許第330,191号 (Seed 等)；欧州特許第332,865号A2 (Meyer及びWeiss)；米国特許第 4,861,579号 (Meyer 等)； 米国公開特許2001/0056066 (Bugelski 等)；国際公報1995/03770 (Bhat 等)；米国公開特許2003/0219433 A1 (Hansen 等)；国際公報2004/035607 (Teeling 等)；国際公報2004/056312 (Lowman 等)；米国公開特許2004/0093621 (Shitara 等)；国際公報2004/103404 (Watkins 等)；国際公報2005/000901 (Tedder 等)；米国公開特許2005/0025764 (Watkins 等)；国際公報2005/016969 (Carr 等)；及び米国公開特許2005/0069545 (Carr 等)が含まれる。国際公報2004/032828 は抗ＣＤ２０抗体で治療する免疫疾患の一つとして再発性多発性軟骨炎を挙げている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
リツキシマブを用いた治療に関する文献には、Perotta及びAbuel, 「Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab」 Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)；Perotta 等, 「Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)」, Blood, 94: 49 (abstract) (1999)；Matthews, R., 「Medical Heretics」 New Scientist (7 April, 2001)；Leandro 等, 「Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion」 Ann Rheum Dis, 上掲；Leandro 等, 「Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response」  Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro 等, 「An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus」, Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)、この中では2週間の期間に各患者はリツキシマブ500mgの2回投与、シクロフォスファミド750mgの2回投与、及び高用量経口副腎皮質ステロイドを受け、この治療患者のうち2人はそれぞれ7か月目と8か月目に再発し、異なるプロトコールで再治療されている；「Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy」 Weide 等, Lupus, 12: 779-782 (2003)、この中ではある患者はリツキシマブ（375mg/m2×4回、1週間間隔で繰り返す）で治療を受け、更に5〜6か月ごとにリツキシマブを適用し、次いで維持療法として3か月ごとに375mg/m2のリツキシマブ投与をした、他方、難治性ＳＬＥ患者はリツキシマブで成功裏に治療され、維持療法を3か月ごとに受けている、両患者はリツキシマブ療法によく応答している；Edwards及びCambridge, 「Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes」 Rheumatology 40:205-211 (2001)；Cambridge 等, 「B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters」 Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002)；Edwards 等, 「B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders」 Biochem Soc. Trans., 上掲；Edwards 等, 「Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Edwards 等, 「Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis」 N Engl. J. Med. 350:2572-82 (2004)；Pavelka 等, Ann. Rheum. Dis. 63: (S1):289-90 (2004)；Emery 等, Arthritis Rheum. 50 (S9):S659 (2004)；Levine及びPestronk, 「IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab」 Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita 等, 「Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)；Higashida 等 「Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab.」  the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology (Abstract #LB11), New Orleans, LA 2002；Tuscano, J. 「Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab」 the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002に公開；「Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic」 Martin and Chan, Immunity 20:517-527 (2004)；Silverman及びWeisman, 「Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy」, Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003)；Kazkaz及びIsenberg, 「Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases」, Current opinion in pharmacology, 4: 398-402 (2004)；Virgolini and Vanda, 「Rituximab in autoimmune diseases」, Biomedicine & pharmacotherapy, 58: 299-309(2004)； Klemmer 等, 「Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab」, Arthritis And Rheumatism , 48: (9) 9,S (SEP), page: S624-S624 (2003)；Kneitz 等, 「Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases」, Immunobiology, 206: 519-527 (2002)；Arzoo 等, 「Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab)」Annals of the Rheumatic Diseases,  61 (10), p922-4 (2002) Comment in Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002)；「Future Strategies in Immunotherapy」 Lake及びDionne, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley & Sons, Inc.)Article Online Posting Date: January 15, 2003 (Chapter 2 「 Antibody-Directed Immunotherapy」)；Liang and Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target, 文献オンライン登記日: 2002年1月15日 表題「CD20」；「Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens」と題するAppendix 4A  Stockinger 等, 編集: Coligan 等, in Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley & Sons, Inc) オンライン登記日: 2003年3月；印刷物出版日: 2003年2月；Penichet及びMorrison, 「CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering」 Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies; オンライン登記 2002年1月15日；Specks 等 「Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy」 Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001)；online abstract submission and invitation Koegh 等, 「Rituximab for Remission Induction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients」, American College of Rheumatology, Session Number: 28-100, Session Title: Vasculitis, Session Type: ACR Concurrent Session, Primary Category: 28 Vasculitis, Session 10/18/2004 (<www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp>)；Eriksson, 「Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab」, Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003)；Jayne 等, 「B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis」 Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003)；Smith and Jayne, “A Prospective, Open Label Trial of B-cell Depletion with Rituximab in Refractory Systemic Vasculitis” poster 998 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), American Society of Nephrology, J. Am. Soc. Nephrol., 14: p. 755A (2003)；Stone及びSpecks, 「Rituximab Therapy for the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis」, the 2002-2003 Immune Tolerance Networkのthe Clinical Trial Research Summary, <www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html>が含まれる。また、Leandro 等, 「B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus」 Arthritis Rheum., 48 (Suppl  9): S1160 (2003)も参照。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
神経障害の治療はその原因に依存し、多くの神経障害は根本的な原因（例えばビタミン欠乏症）を調べることによって治療されうる。発症を予防されうることもある。例えば、コントロール中の糖尿病では、糖尿病性神経障害が予防されうる。腫瘍又は椎間板ヘルニアが原因である場合、腫瘍を取り除くか椎間板ヘルニアを修復するための外科的手術を治療と共に施されてもよい。包括法又は圧縮神経障害治療法では、治療は尺骨あるいは正中神経の副木固定又は外科的減圧法から成ってもよい。腓骨及び放射状加圧神経障害は加圧の回避を必要とするかもしれない。理学療法及び／又は副木は、拘縮（関節のまわりのもろくなった筋肉によって異常や時には関節の痛みが生じる症状）の予防に有用でありうる。免疫疾患と関係している神経障害は、免疫系の異常な特徴に対する治療で改善されうる。このような治療には、静脈免疫グロブリン、血漿交換及び免疫抑制療法などがある(Cook 等 Neurology 40:212-214 (1990)；Dyck 等 N. Engl. J. Med 325:1482-1486 (1991)；Ernerudh 等 J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:930-934 (1992)；Blume 等 Neurology 45:1577-1580 (1995)；Pestronk 等 Neurology 44:2027-2031 (1994))。これらはごく小さい機能的な改善をなし得る。さらに、治療にはお金と時間がかかりうる。
Ｂ細胞表面膜マーカーに対する抗体誘導性治療の文献は、極めて少ない。Levine及びPestronkは、リツキシマブで治療された、神経障害とＧＭ１又はＭＡＧに対する免疫グロブリンＭ抗体を有する５人の患者について記載している。３〜６か月の治療の範囲内で、５人は機能が改善され、血清抗体の力価が低減した(Levine及びPestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52(8):1701-1704 (1999))。
特定の治療が有効でない場合、神経障害の疼痛は通常、鎮痛剤、疼痛薬物、三環系抗鬱薬、抗発作薬物又は神経遮断剤を用いてコントロールされうる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（発明の概要）
したがって、本発明は請求の範囲の通りである。特に、本発明は、第一の態様において、ＣＤ２０を結合する抗体の有効量を哺乳動物に投与されることを含む、哺乳動物の多発性軟骨炎又は多発性単神経炎の治療方法を提供する。
前記方法の一実施態様では、抗体は他の分子とコンジュゲートしていない。他の実施態様では、抗体は他の分子、例えば放射性化合物、例えばＹ２Ｂ８又は１３１Ｉ-Ｂ１などの細胞障害性薬剤とコンジュゲートしている。他の実施態様では、前記抗体がリツキシマブ又はヒト化２Ｈ７を含有する。一実施態様のヒト化２Ｈ７は配列番号２及び８の可変ドメイン配列を含有する。他の実施態様では、ヒト化２Ｈ７は配列番号８内に変異Ｎ１００Ａ又はＤ５６Ａ、Ｎ１００Ａを有する可変重鎖ドメインと、配列番号２内に変異Ｍ３２Ｌ、Ｓ９２Ａ又はＭ３２Ｌ、Ｓ９２Ａを有する可変軽鎖ドメインを含有する。更なる実施態様では、ヒト化２Ｈ７は配列番号３０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と配列番号８の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含有してなり、更に抗体がＶＨ-ＣＤＲ２内にＤ５６Ａのアミノ酸置換を含有し、ＶＨ-ＣＤＲ３内のＮ１００がＹ又はＷで置換されているものであり、より好ましくは抗体が配列番号４４のｖ５１１軽鎖配列と配列番号４５のｖ５１１重鎖配列を含有する。
前記抗体はおよそ２０ｍｇ／ｍ２からおよそ２５０ｍｇ／ｍ２の用量で哺乳動物に投与されることが好ましく、より好ましくはおよそ５０ｍｇ／ｍ２からおよそ２００ｍｇ／ｍ２である。他の好適な実施態様では、前記方法は初期用量の後に持続用量の抗体を投与することを含み、その抗体のｍｇ／ｍ２持続用量が抗体のｍｇ／ｍ２初期用量を超えるものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含め、他のＦｃＲもここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKim J-K; Tsen M-F; Ghetie V; Ward 「Localization of the site of the murine IgG1 molecule that is involved in binding to the murine intestinal Fc receptor」ES European Journal of Immunology ( EUR. J. IMMUNOL.), Germany, 24(10): 2429-2434 (1994))。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHolligerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
ここで治療補助剤として用いる「免疫抑制剤」という用語は、本明細書中で治療される哺乳動物の免疫系を抑制する又は遮断するように働く物質を表す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御または抑制する、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例として、2-アミノ-6-アリル-5-代替ピリミジン(米国特許第４，６６５，０７７号参照)；CELLCEPT(登録商標)などのミコフェノール酸モフェチル；アザチオプリン(IMURAN(登録商標)、AZASAN(登録商標)／6-メルカプトプリン)；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド (米国特許第４，１２０，６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドや糖質ステロイドなどのステロイド、例として、プレドニゾン、PEDIAPRED(登録商標)(リン酸プレドニゾロン・ナトリウム)やORAPRED(登録商標)(リン酸プレドニゾロン・ナトリウム経口溶液)などのプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾン；メトトレキサート（経口又は皮下）(RHEUMATREX(登録商標), TREXALLTM)；ヒドロキシクロロキン／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン（ENBREL(登録商標)、エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗-Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ポリクローナル又はｐａｎ-Ｔ抗体、あるいは、モノクローナル抗-ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公報９０／０８１８７)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohen等, 米国特許第５，１１４，７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner 等, Science 251:430-432 (1991)；国際公報９０／１１２９４；Janeway 等, "Autoimmune disease: immunotherapy by peptides ?" Nature, 341: 482-483 (1989年10月12日)；及び国際公報 91/01133)；Ｔ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０，１０９号)；シクロフォスファミド(CYTOXAN(登録商標))；ダプソン；ペニシラミン(CUPRIMINE(登録商標))；血漿交換；又は、静脈内免疫グロブリン(IVIG)を含む。これらは単独又は互いに併用してもよく、特にステロイドと他の免疫抑制剤の併用あるいはその併用の後に維持用量の非ステロイド薬剤を投与してステロイドの使用を減らしてもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Nicolaou 等, "Calicheamicin 121 : A Rationally Designed Molecule with Extremely Potent and Selective DNA Cleaving Properties and Apoptosis Inducing Activity" Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33(2)：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガ���マイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；ミトキサントン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（国際公報９１／００３６０、国際公報９２／０２０３７３及び欧州特許第０３０８９号）等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号などに記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月24日(2007.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０を結合する抗体の有効量を含有してなる、哺乳動物の多発性軟骨炎又は多発性単神経炎の治療のための医薬。
【請求項２】
前記抗体は他の分子とコンジュゲートしていない、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記抗体は他の分子とコンジュゲートしている、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記他の分子が細胞障害性薬剤である、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
前記細胞障害性薬剤が放射性化合物である、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記細胞障害性薬剤がＹ２Ｂ８又は１３１Ｉ-Ｂ１を含有する、請求項４又は５に記載の医薬。
【請求項７】
前記抗体がリツキシマブを含有する、請求項１ないし６の何れか一に記載の医薬。
【請求項８】
前記抗体がヒト化２Ｈ７を含有する、請求項１ないし６の何れか一に記載の医薬。
【請求項９】
およそ２０ｍｇ／ｍ２からおよそ２５０ｍｇ／ｍ２の用量の抗体が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１ないし８の何れか一に記載の医薬。
【請求項１０】
前記用量がおよそ５０ｍｇ／ｍ２からおよそ２００ｍｇ／ｍ２である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
初回用量の後に持続用量の抗体を投与することを含み、その抗体のｍｇ／ｍ２持続用量が抗体のｍｇ／ｍ２初回用量を超えるものである、請求項１ないし１０の何れか一に記載の医薬。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１ないし１１の何れか一に記載の医薬。
【請求項１３】
前記抗体が静脈内に投与される、請求項１ないし１２の何れか一に記載の医薬。
【請求項１４】
前記抗体が皮下に投与される、請求項１ないし１２の何れか一に記載の医薬。
【請求項１５】
更に、免疫抑制剤、抗疼痛剤又は化学療法剤の有効量が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１ないし１４の何れか一に記載の医薬。
【請求項１６】
多発性軟骨炎が治療される、請求項１ないし１５の何れか一に記載の医薬。
【請求項１７】
更に、非ステロイド系抗炎症薬、ステロイド、メトトレキセート、シクロホスファミド、ダプソン、アザチオプリン、ペニシラミン又はシクロスポリンの有効量が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１８】
多発性単神経炎が治療される、請求項１ないし１５の何れか一に記載の医薬。
【請求項１９】
更に、抗疼痛剤、ステロイド、メトトレキセート、シクロホスファミド、血漿交換、静脈免疫グロブリン、シクロスポリン又はミコフェノール酸モフェチルの有効量が哺乳動物に投与されることを含む、請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
容器と、容器内に収容されるＣＤ２０を結合する抗体を含んでなる組成物とを含んでなる製造品であり、更に、該組成物の使用者に哺乳動物の多発性軟骨炎あるいは多発性単神経炎の治療について指示するパッケージ挿入物を含んでなる製造品。
【請求項２１】
更に、治療のための抗体以外の薬剤を含有する容器を含んでなり、更に、この薬剤で哺乳動物が治療されることについての指示書を含む、請求項２０に記載の製造品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（発明の概要）
したがって、本発明は請求の範囲の通りである。特に、本発明は、第一の態様において、ＣＤ２０を結合する抗体の有効量を哺乳動物に投与されることを含む、哺乳動物の多発性軟骨炎又は多発性単神経炎の治療方法を提供する。
前記方法の一実施態様では、抗体は他の分子とコンジュゲートしていない。他の実施態様では、抗体は他の分子、例えば放射性化合物、例えばＹ２Ｂ８又は１３１Ｉ-Ｂ１などの細胞障害性薬剤とコンジュゲートしている。他の実施態様では、前記抗体がリツキシマブ又はヒト化２Ｈ７を含有する。一実施態様のヒト化２Ｈ７は配列番号２及び８の可変ドメイン配列を含有する。他の実施態様では、ヒト化２Ｈ７は配列番号８内に変異Ｎ１００Ａ又はＤ５６Ａ、Ｎ１００Ａを有する可変重鎖ドメインと、配列番号２内に変異Ｍ３２Ｌ、Ｓ９２Ａ又はＭ３２Ｌ、Ｓ９２Ａを有する可変軽鎖ドメインを含有する。更なる実施態様では、ヒト化２Ｈ７は配列番号３０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と配列番号８の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含有してなり、更に抗体がＶＨ-ＣＤＲ２内にＤ５６Ａのアミノ酸置換を含有し、ＶＨ-ＣＤＲ３内のＮ１００がＹ又はＷで置換されているものであり、より好ましくは抗体が配列番号４４のｖ５１１軽鎖配列と配列番号４５のｖ５１１重鎖配列を含有する。
前記抗体はおよそ２０ｍｇ／ｍ２からおよそ２５０ｍｇ／ｍ２の用量で哺乳動物に投与されることが好ましく、より好ましくはおよそ５０ｍｇ／ｍ２からおよそ２００ｍｇ／ｍ２である。他の好適な実施態様では、前記方法は初回用量の後に持続用量の抗体を投与することを含み、その抗体のｍｇ／ｍ２持続用量が抗体のｍｇ／ｍ２初回用量を超えるものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
Ｖ．アンタゴニストを用いた治療 
Ｂ細胞表面上抗原に結合するアンタゴニストを含んでなる組成物は、調製され、調薬されて、良好な臨床に合う様式で投与される。この文脈における考慮のための要素には、治療される特定の疾患又は疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患又は疾患の原因、薬剤を運搬する部位、投与の方法、投与の日程計画、及び開業医の知りうる他の因子が含まれる。投与されるアンタゴニストの治療上の有効量は、このようなことを考慮して調整される。
一般的な計画として、用量当たりの非経口的に投与されるアンタゴニストの治療上の有効量は、患者の体重量にして１日当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、アンタゴニストの一般的初回投与範囲は約２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
好適なアンタゴニストは、細胞障害性剤を抱合していない抗体、例としてリツキサン(登録商標)などの抗体である。非抱合の抗体の好適な用量は、例えば、約２０ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。一実施態様では、抗体の用量はリツキサン(登録商標)に対して推奨されている用量とは異なる。例えば、約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲、例えば約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量である場合に、抗体を実質的に３７５ｍｇ／ｍ２より少ない用量で一回以上患者に投与してもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
更に、一以上の抗体の初回投与に続いて、初回投与の抗体用量（ｍｇ／ｍ２）を超える抗体の継続投与量（ｍｇ／ｍ２）で一回以上投与してもよい。例えば、初回用量が、約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲（例として、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２）であり、継続用量が約２５０ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。
しかしながら、上記したようなアンタゴニストの提案した量は、多くの治療的選択に従う。上記のように、適切な用量及び日程計画を選択する際の鍵となる要素は、得られた結果である。例えば、相対的により高い用量は、まず最初に進行中の及び急性疾患の治療に必要とされるかもしれない。最も効果的な結果を得るために、疾病又は疾患に応じて、できるだけ疾病又は疾患の最初の徴候、診断、出現または発症に近づくように、又は疾病又は疾患の緩解期となるようにアンタゴニストを投与する。
アンタゴニストは、非経口的、皮下、腹膜内、吸入、髄膜下、関節内及び鼻腔内、必要であれば局所の免疫抑制性治療のため、病巣内投与を含む好適な方法で投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与を含む。加えて、アンタゴニストは、例えばアンタゴニストの用量を減少させたパルス注入によって、好適に投与してもよい。好ましくは、投薬は、短期間の投与か長期間の投与かによって、注入、最も好ましくは静脈内又は皮下注入により行われる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
試験の設定
中等度から重度の関節リウマチ（ＲＡ）患者におけるＭＴＸと併用したＰＲＯ７０７６９の漸増用量の安全性のランダム化、プラセボ対照、多中心、盲目第I相／第II相、研究者及び被検者盲目試験である。この研究は用量漸増の段階と大量の被検者の登録を有する第二の段階からなる。実施者は処置の分類を分けたままにした。
１〜５の疾患の状態を変えうる抗リウマチ剤に失敗した中等度から重度のＲＡ患者又はＭＴＸを用いた治療に満足した臨床効果を現段階で示さない患者を登録した。
患者は、試験開始前の少なくとも１２週間に１０−２５ｍｇ／週の範囲のＭＴＸ投与と、少なくとも４週間の永続用量の投与を必要とし、その後、初回用量の試験薬剤（ＰＲＯ７０７６９又はプラセボ）を投与した。また、患者は、経口副腎皮質ホルモン（最高１０ｍｇ／日又はプレドニゾン当量）の永続用量と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の永続用量を投与してもよい。患者は、以下の用量-漸増計画に従って、第１日目と第１５日目に示された用量のＰＲＯ７０７６９又はプラセボ当量の２回の静脈内注入を行った。
特定の基準に従い、体内安全性データ検討委員会による安全性データと各コホートで処理された最後の患者の２回目の注入後７２時間の急性毒性を考慮して用量の漸増を行った。用量-漸増期の間に服用レベルに耐性がみられた場合には、用量-漸増の後、４０の追加患者（活性薬剤３２及びプラセボ８）を各々以下の服用レベルにランダム化した：２×５０ｍｇ、２×２００ｍｇ、２×５００ｍｇ及び２×１０００ｍｇ。およそ２０５の患者が研究に寄与された。
Ｂ細胞数を計測して記録された。Ｂ細胞数は、６ヵ月の有効性評価後の４８週フォローアップ期間にフローサイトメトリを用いて測定した。Ｂ細胞枯渇は用量制限毒性（ＤＬＣ）でなく、むしろＰＲＯ７０７６９治療の予想される薬力学的結果と考えた。
好適な付随的研究として、血清及びＲＮＡ分析のための血液、並びに尿試料を様々な時期に患者から採取した。これらの試料を用いて、中等度から重度のＲＡ患者におけるＰＲＯ７０７６９治療に対する応答を示唆しうるバイオマーカーを同定した。
【国際調査報告】
2007532680.tif 000044
2007532680.tif 000045
2007532680.tif 000046
2007532680.tif 000047