(57)【要約】本発明は、他の抗結核薬と組み合わせて使用する結核治療用の薬の製剤のための、毒性の強い結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの細胞壁小片に依存する免疫療法治療剤と、前記免疫療法治療剤を得る方法と、前記免疫療法治療剤を含む製剤処方と、その使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性の強い複合結核菌（Mycobacterium tuberculisis-complex (ＭＴＢ−Ｃ)）からの細胞壁小片を含む免疫療法治療剤を生成する方法において、
（Ａ）  毒性の強い複合結核菌を３週間以上にわたって培養するステップと、
（Ｂ）  前記の細胞の培養物を、非イオン化張力作用性の化合物の存在下で、均質化するステップと
を有する
ことを特徴とする免疫療法治療剤を生成する方法。
【請求項２】
前記培養期間は、３週間から４週間の間である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記非イオン化張力作用性の化合物は、アルキルフェノール・エトキシレート基（alcyphenol ethoxylat group）とエトキシ化ソリビタン・エステル（ethoxylated sorbitan esters）からなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記非イオン化張力作用性の化合物は、オクチルフェノール・エトキシレート化合物（octylphenol ethoxylat compounds）から選択される
ことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記非イオン化張力作用性の化合物は、エチレン酸化物（ethylene oxide）を７−８モル有するオクチルフェノール・エトキシレート（octylphenol ethoxylat）から選択される
ことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記均質化ステップ（Ｂ）は、中性ｐＨの干渉媒体中で実行される
ことを特徴とする請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（Ｃ）  小片化されていない細胞と可溶性化合物とを遠心分離により分離するステップと、
（Ｄ）  残りの毒性の強い複合結核菌細胞を非活性化するために、前記細胞壁小片を有する部分を、化学的あるいは物理的に処理するステップと、
（Ｅ）  凍結乾燥により、前記免疫療法治療剤を乾燥させるステップと
を有する
ことを特徴とする請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかの方法により生成された
ことを特徴とする免疫療法治療剤。
【請求項９】
請求項８の免疫療法治療剤を含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
前記免疫療法治療剤をリポソームの形態で含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
他の抗結核薬と組み合わせた結核の混成治療用の薬剤を用意する
ことを特徴とする免疫療法治療剤の使用法。
【請求項１２】
前記抗結核薬は、イソニアジドとリファンピシンのいずれか、またはその両方である
ことを特徴とする請求項１１記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の抗結核薬と組み合わせて使用する結核治療に有効な免疫療法治療剤に関する。本発明の治療剤は、毒性の強い複合結核菌（Mycobacterium tuberculosis-complex (ＭＴＢ−Ｃ)  bacilli）の細胞壁小片と、本発明の方法により得られた免疫療法治療剤による。
【背景技術】
【０００２】
結核は、複合結核（ＭＴＢ−Ｃ）菌株（菌）より引き起こされる慢性感染症である。このＭＴＢ−Ｃ菌株は、現在次の種を含んでいる。ヒト型結核菌（M. tuberculosis）, ウシ型結核菌（M. bovis）, ネズミ型結核菌（M. microti）, アフリカ型結核菌（M. africanum）である。
【０００３】
世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、８００万人に新たな結核の発症があり、３００万人が毎年そのために死亡している。さらに２０億人が世界中で結核に感染していると言われている。
【０００４】
結核に対し予防的治療として用いられている現在のワクチンは、いわゆるＢＣＧ菌株（Calmette-Guerin bacillus）とさまざまなウシ型結核菌（M. bovis）からのバクテリアに依存している。
【０００５】
特許文献１によれば、ＢＣＧ菌株は、結核に対する免疫療法を導入する現在利用可能な最適のワクチンである。しかし、人体に対するこのワクチンの安全性と薬効は、いくつかの国では論争の的になっている。成人を肺結核から完全には防がないからである。
【０００６】
【特許文献１】国際公開パンフレット第０３／０１８０５３号
【特許文献２】国際公開パンフレット第０３／００４５２０号
【特許文献３】米国特許第４７２４１４４号明細書
【特許文献４】米国特許第６００１３６１号明細書
【０００７】
特許文献２に記載された公知の事実によれば、患者の体内で結核菌に対抗する最も効果的な治療法は、結核を発症している人と発症していない人の両方に、イソニアジド（isoniazid）を含む数種類の抗結核薬を数ヶ月にわたって投与することである。
【０００８】
この長期にわたる治療法は、結核が完治しない時には、これらの抗結核薬に対して耐性を有する微生物（microorganism）の成長を促す。さらにまた、前述の抗結核薬は、結核菌が新陳代謝が活動状態の時（すなわち成長している時）のみ効果があり、非活動状態の時にはそうではない。これは非常に不都合なことである。結核に感染中は、結核菌は、活動代謝相と非活動代謝相の両方の状態で存在するからである。
【０００９】
この問題を解決する１つの可能性としては、特許文献３に記載されているように、死んだウシ型結核菌（dead M. vaccae）細胞に基づいた免疫療法治療剤を結核治療の補助剤／アジュバンド（adjuvant）として、他の抗結核薬（例、リファンピン（rifampicin）、イソニアジド（isoniazid））の投与と共に使用することである。
【００１０】
しかし、特許文献４は、このような補助剤は結核に対する大規模な予防接種には使用できず、またその有効性についてもいい情報はないと記載している。
【００１１】
それ故に、免疫療法治療剤が、これらの抗結核薬に対する共補助剤（coadjuvant）として、結核治療に必要である。この免疫療法治療剤は、薬剤耐性のある微生物（microorganisms）の発生を誘導してはならず、結核菌が活動状態にない時でも有効な免疫反応を生成させなければならない。
【００１２】
本発明者らは、他の抗結核薬と共に使用する結核の混成治療（combined treatment）に有効な新たな免疫療法治療剤を生成する方法を発見した。この免疫療法治療剤は、毒性の強いＭＴＢ−Ｃ菌株の細胞壁小片を含む。この菌株が、代謝が活動状態にない結核に対しても有効な免疫反応を生成し、共に使用される抗結核薬の有効性を増加させる。かくして薬剤耐性のリスクを減らすことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、他の抗結核薬と共に使用する結核の混成治療に有効な毒性の強いＭＴＢ−Ｃ菌株の細胞壁小片を含む免疫療法治療剤を生成する方法を提供することである。
【００１４】
前述の方法を用いて得られた免疫療法治療剤と、他の抗結核薬と共に使用する結核の混成治療用の薬剤を生成するための免疫療法治療剤を使用する方法とが、本発明の目的に含まれる。
【００１５】
さらに本発明の別の目的は、この免疫療法治療剤により生成される薬剤化合物（pharmaceutical compound）である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、毒性の強い複合結核菌株からの細胞壁小片を含む免疫療法治療剤を生成する方法を発見した。本発明の方法は、毒性の強い複合結核菌（ヒト（型）結核菌（Mycobacterium tuberculisis-complex (ＭＴＢ−Ｃ)））からの細胞壁小片を含む免疫療法治療剤を生成する方法において、（Ａ）毒性の強い複合結核菌を３週間以上にわたって培養するステップと、（Ｂ）前記の細胞の培養物を、非イオン化張力作用性の化合物の存在下で、均質化する（homogenize）ステップとを有することを特徴とする。
【００１７】
この毒性の強い菌株は、ＭＴＢ−Ｃ菌株の如何なる菌株でもよい。結核菌は、非常に安定しており、免疫組織化合物（immunorganic compound）内では如何なる変異も示さない。この分野の研究者によって最も頻繁に使用される菌株の１つで基準となる菌株としてみなされるものは、いわゆるＨ３７Ｒｖ菌株である。これは、例えば、英国ロンドンにあるNational Collection of Type Cultures (NCTC) (受託番号ＮＣ００７４１６)から自由に得ることができる。
【００１８】
この毒性菌株は、当業者に公知の培養基容器（culture media well）内で接種することにより培養される。培養基は、固体媒体（例、ミドルブルック（Middlebrook）７Ｈ１０または７Ｈ１１型の寒天）、あるいは液体媒体（例、ソートン（Sauton）あるいはプロスカウアー・ベック（Proskauer-Beck）の培養基）である。
【００１９】
本発明に関しては、培養期間は、３週間以上、好ましくは３週間から４週間の間である。培養時の温度は、３４℃から３８℃の間に維持するのが好ましい。
【００２０】
培養の完了後、培養が固体相で行われた場合には、培養基（寒天）の抽出を避けながらプレートを擦ってコロニー（細胞群体（colonies））を得る。培養が液相で行われた場合には、細胞を、当業者に公知の従来方法を用いて、濃縮（遠心分離）し洗浄する。
【００２１】
菌株の均質化は、中性ｐＨの干渉媒体（buffered media）内で行われる。本発明においては、均質化は、非イオン化（イオン化していない）張力活動化合物（non-ionic tensionactive compound）の存在下で行うことが重要である。これは、細かく分割された細胞壁粒子と、少なくとも部分的にエマルジョン化した不要な脂質部分とを得るのに好ましい。
【００２２】
この均質化方法により、ＭＴＢ−Ｃ細胞は破損し、細胞壁の小片が得られる。
【００２３】
均質化は、超音波による音波処理を用いて実行してもよい。あるいは約１ｍｍの直径の小さなビーズ（例えば、シリカ製またはシリカ−ジルコニウム製）を機械的均質化装置と共に用いて実行してもよい。機械的均質化装置は、例えば、Biospec社のBEADBEATERモデルがある。
【００２４】
干渉媒体は、例えばＰＢＳ（Saline solution of phosphate 燐酸塩の塩水溶液）バッファで形成できる。
【００２５】
使用されるイオン化張力活動化合物の種類は重要ではないが、アルキルフェノール・エトキシレート基（aclyclphenol ethoxylat group）およびエトキシ化ソリビタン・エステル（ethoxylated sorbitan ester）から選択するのが好ましい。より好ましくは、イオン化張力活動化合物は、オクチルフェノール・エトキシレート化合物（octylphenol ethoxylat compound）であり、最も好ましいのは、エチレン酸化物（ethylene oxide）を７−８モル含むオクチルフェノール・エトキシレート（octylphenol ethoxylat）を使用することである。これらは例えば、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４の名称で市販されている。均質化ステップの間のイオン化張力活動化合物の濃度は、均質化された全重量の１％から５％の間である。
【００２６】
好ましい細胞壁小片を含む均質化した物体は、従来と同様の処理を行い、小片化していない細胞と溶解した化合物の両方から、これらの細胞壁小片を分離する。
【００２７】
例えば、シリカまたはシリカ−ジルコニウム製のビーズ（使用されている場合）を、容器の傾斜／デカンテーション（decantation）により分離した後、均質化した生成物を、小片化していない細胞を沈降物として取り除くために、毎分５，０００ｒｐｍ以下の速度でゆっくりと遠心分離する。
【００２８】
その後、かくして得られた表面に浮かぶ上清（supernatant）を、上清の液体中に濃縮していた溶解していた成分を取り除くために、より高速（例、１５，０００ｒｐｍ以上）で遠心分離する。すると、細胞壁小片は沈降物内に濃縮する。従来公知の技術（例、ＰＢＳバッファでの洗浄と遠心分離）を用いて、完全に透明な上清が得られるまで、この方法を数回繰り返す。その後これを捨てる。
【００２９】
かくして得られた細胞壁小片を含む沈降物は、ＰＢＳバッファ内に拡散させ、化学的方法（例、フォルモール（formol）で処理すること）、あるいは物理的方法（例、高圧釜内での処理または低温殺菌）で、小片化プロセスと精製化プロセスの後生育することのあるＭＴＢ−Ｃ細胞の全体的な非活動化を確実にする。
【００３０】
最後に、ＰＢＳバッファ内に細胞壁小片が分散したものを、ガラス瓶に分け、−１５℃から−２５℃の間の温度で、０．１から０．５ｍｂａｒの真空度で凍結乾燥する。
【００３１】
かくして、ＭＴＢ−Ｃの細胞壁小片を有するガラス瓶が得られる。、これが本発明の免疫療法治療剤を形成し、それらを−７０℃で保管する。
【００３２】
本発明の免疫療法治療剤から何種類かの薬剤化合物が得られるが、これもまた本発明の目的の１つである。これらは、水中に浮かぶオイル型エマルジョン（oil-type emulsion in water (O/W)）、あるいはリポソーム（liposome：組織内の水性溶媒中に懸濁された脂質の球状粒子）として形成される。リポソーム型の薬剤組成物が好ましい。
【００３３】
リポソームの形成は、従来公知の技術を用いて行われる。例えば、リポソームは、凍結乾燥した細胞壁小片とリポソームを形成する補助脂質（adjunct lipid）を液状媒体中で混合し、この混合物を標準の方法（例、高速振動機を用いて）均質化することにより得られる。
【００３４】
リポソームを形成する補助脂質は当業者に公知である。一般的にこれらの脂質は、実質的に中性または負にチャージされた燐脂質（phospholipid）とステロールとを含む。
【００３５】
使用される燐脂質は、例えば、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine）、ホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）である。
【００３６】
通常、リポソーム中に最も多く含まれる成分は、ホスファチジルコリンであり、これは、人工合成あるいは自然天然物から分離して製造できる。最も市販されている製品は、大豆レシチン（soybean lecithin）である。
【００３７】
リポソームを生成するために使用されるステロールは、コレステロール（cholesterol）と胆汁塩（bile salt）である。
【００３８】
リポソームは、大豆レシチンとナトリウム・コール酸塩（sodium cholate）の混合物を用いて形成するのが好ましい。
【００３９】
選択的事項として、リポソームは、安定性を改善する添加物（例、ビタミンＥ）を有し、これは脂質酸化防止剤（lipid antioxidant）として機能する。
【００４０】
かくして得られたリポソームはその大きさが変動するが、その９９．９％が、１ミクロンよりも小さい。
【００４１】
リポソームを免疫療法治療剤を得るために凍結乾燥処理する。これが凍結乾燥したリポソームとして本発明の目的物である。
【００４２】
本発明の目的は、他の抗結核薬と組み合わせて結核の混成治療を行うために薬剤を準備するために、免疫療法治療剤を使用することを含む。
【００４３】
好ましくは、他のルートの投与を排除するわけではないが、本発明の目的物たる免疫療法治療剤は、非経口のルートで投与される。
【００４４】
公知の抗結核薬（antituberculosis drug）の中で、本発明の免疫療法治療剤と組み合わせて使用される抗結核薬は、イソニアジドとリファンピンである。
【００４５】
結核の混成治療用に、本発明の免疫療法治療剤と公知の抗結核薬は、同時にあるいは前後して投与してもよい。例えば、抗結核薬と本発明の免疫療法治療剤を同時に投与しても、あるいは抗結核薬を最初にその後本発明の免疫療法治療剤を投与してもよい。
【００４６】
意外なことに、本発明の免疫療法治療剤を抗結核薬と関連付けて投与することによる混成治療は、抗結核薬の効能を増加させる。その理由は、本発明の免疫療法治療剤は、代謝が活動状態にはない結核菌に対する免疫反応を生成し、薬剤耐性が増加するリスクを減らすことができるからである。
【実施例】
【００４７】
実験例１．免疫療法治療剤の生成
ミドルブルック（Middlebrook）７Ｈ１１型の寒天の８０−１００枚のプレートをNational Collection of Type Cultures (NCTC)に保管されているＨ３７Ｒｖ培養体（保管番号ＮＣ００７４１６）で培養した。各プレートで培養されたコロニーを形成するユニット（colony-forming units）の濃度は、１０５−１０６ＵＦＣである。これらのプレートを２１日間（３週間）、３４℃から３８℃の間の温度で培養した。
【００４８】
培養後、コロニーを、培養媒体を剥ぎ取らないようにしながら、寒天のプレートからヘラを用いて取り除く。１５ｇから１８ｇの粗抽出物（crude extract）を得た。
【００４９】
この粗抽出物を、４重量％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４を含む約２０ｍＬのＰＢＳバッファ内に分散させた。１ｍｍの直径を有するシリカ−ジルコニウム製ビーズ３５ｍＬを添加し、その後機械的な均質化プロセスを、Ｂｉｏｓｐｅｃ社製のＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ均質化装置を用いて実行した。
【００５０】
この均質化方法は、Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ技術によるステイニング（staining）の後、１０００倍に拡大して１００個のフィールドを観察し、５個未満の完全な結核菌が検出されるまで、継続した。
【００５１】
この均質化プロセスから得られた生成物を、デカンテーションによりシリカ−ジルコニウム製ビーズから分離した。これらを４重量％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４を含むＰＢＳの干渉液内で洗浄した。別の洗浄からの液体が生成物と共に集められ、かくして約８０−１００ｍＬの全容積を得た。
【００５２】
その後、均質化ステップから得られた生成物と洗浄ステップからの液体を、４℃の冷却機能付き遠心分離機内で、３，０００ｒｐｍで３０分間回転させて遠心分離し、沈降物から小片化していない細胞を取り除いた。
【００５３】
上清（supernatant）はとっておく。
【００５４】
その後、その上清（２７０００ｇに等しい）を、４℃で１５，１００ｒｐｍで６０分間回転させて遠心分離し、細胞壁小片を含む白っぽい沈降物を得た。
【００５５】
沈降物を保管し、黄色っぽい上清を取り除いた。
【００５６】
沈降物をＰＢＳバッファ（３×３ｍＬ）内でまず洗浄する。その後、３ｍＬのバッファ溶液中で再度分散し、ＰＢＳバッファで２０ｍＬにし、その後、４℃で６０分間１５１，１００ｒｐｍで再び遠心分離した。
【００５７】
かくして得られた上清を廃棄する。
【００５８】
洗浄と遠心分離を繰り返し、かくして得られた上清は完全に透明となり、廃棄された。
【００５９】
細胞壁小片を含む沈降物をＰＢＳバッファ（３×３ｍＬ）内で洗浄し、１２ｍＬのＰＢＳバッファ内に再度分散した。
【００６０】
遠心分離と洗浄の後、ＰＢＳバッファ内に細胞壁小片を分散させた物から得られた全容積をコンテナ内に集め、６５℃で１時間処理することにより、低温殺菌を行った。
【００６１】
その後、この混合物を氷の浴槽（ice bath）内で急速に冷却し、細胞壁小片が分散している生成物を、クライオチューブ（低温チューブ）あたり１ｍＬの割合で、クライオチューブ内に分散させた。
【００６２】
分散した細胞壁小片を有するクライオチューブを−７０℃で凍結し、−１５℃から−２２℃の温度で、０．１８０ミリバールから０．４００ミリバールの真空状態で、凍結乾燥させた。
【００６３】
かくして、１ｇから１．５ｇの免疫療法治療剤が得られた。
【００６４】
実験例２−免疫療法治療剤をリポソーム形態で生成する
実験例１で得られた７４０−７７０ｍｇの生成物をビーカーで重りを量る。その後、エタノール中に薬剤品質（pharmacy-quality）の大豆レシチンの２０ｍＬが分散したもの（１リットルの純粋エタノール中に１ｋｇのレシチンをいれたものに相当する）と、水中の薬剤品質のナトリウム・コール酸塩の７ｍＬ溶液（１リットルの２回蒸留水中に２００ｇのナトリウム・コール酸塩をいれたものに相当する）を追加した。
【００６５】
ｐＨが、７．７と８の間の値となるよう、ＨＣｌ０．９９７Ｎの溶液で調整された。
【００６６】
リポソームが、高速振動機を用いた均質化ステップにより、得られた。
【００６７】
かくして得られたリポソーム状の分散物を２回蒸留水で１０％まで薄めた。ｐＨは、７．１と７．３の間の値となるよう、ＨＣｌ０．９９７Ｎの溶液で調整された。
【００６８】
リポソーム状の分散物が、クライオチューブ（チューブあたり０．５ｍＬ）内に分散され、−８０℃で凍結された。
【００６９】
その後、これらを凍結乾燥し、免疫療法治療剤（本発明の目的物）が、リポソーム状で得られた。
【００７０】
実験例３．  抗結核薬による結核治療における補助剤としての免疫療法治療剤の効能
感染モデルにおいて、生後６−８週間の特定の病原体に感染していない、雌のＢＡＬＢ／ｃ、１２９／Ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２のマウスを用意した。
【００７１】
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の毒性の強い菌株を、プロスカウアー・ベック媒体内で、中間対数相（middle logarithmic phase）に達するまで、培養され、１ｍＬに等分して、−７０℃で使用されるまで、保管された。
【００７２】
マウスは、ミドルブルック・エアゾール（Middlebrook aerosol）接種容器中で接種された。その結果、マウスの肺内に約１０−５０個の生きた結核菌が接種された。
【００７３】
結核菌の濃度、すなわち生きた結核菌の数は、ミドルブルック７Ｈ１１型の寒天内で、均質化した左肺と脾臓の一連の拡散の培養（incubation of seriated dilution）により決定される。左肺と脾臓のサンプルは、１ｍＬのＰＢＳバッファの存在下で均質化された。
【００７４】
Ｉ）  イソニアジゾと同時にリポソーム状の免疫療法治療剤を１回投薬することによる治療
【００７５】
感染したＢＡＬＢ／ｃ型のマウスを３つのグループに分けた。
（Ａグループ）−  １日あたり２５ｍｇ／ｋｇのイソニアジドのみの投与を１週間に５日間６週間にわたり行い治療したグループ（対照標準）。
（Ｂグループ）−  １日あたり２５ｍｇ／ｋｇのイソニアジドの投与を１週間に５日間６週間にわたり行い、リポソーム状の免疫療法治療剤１８０μｇを鼻孔を介して投与したことにより治療したグループ（本発明）。
（Ｃグループ）−  １日あたり２５ｍｇ／ｋｇのイソニアジドの投与を１週間に５日間６週間にわたり行い、リポソーム状の免疫療法治療剤１８０μｇを腹膜を介して投与したことにより治療したグループ（本発明）。
【００７６】
抗生イソニアジド（antibiotic isoniazid）での治療を第９週目に開始し、第１５週目まで継続した。
【００７７】
リポソーム状免疫療法治療剤（本発明の目的物）を第１３週目に投与した。
【００７８】
第１５週目にマウスを殺し、左肺と脾臓内の結核菌の濃度を決定した。
【００７９】
結核菌の濃度は、セクションＣの導入部に記載した方法により行われたが、ワクチンを投与したマウスの肺内でははるかに小さく、一方、脾臓内での実験結果は、対照標準のグループと比較して統計的な差はなかった。
【００８０】
実験結果を、ＵＦＣ／ｍＬ単位で、表１に示す。
（表１）
マウスグループ          肺                      脾臓          
Ａ  対照標準      ７．５±２．８９        ０．７５±０．３３
Ｂ  鼻孔経由          ２±０＊以下        ０．４  ±０．２
Ｃ  腹膜経由          ２±０＊以下        ０．５２±０．４４
＊＝対照標準と比較して統計的に意味のある数字  ｐ＜０．０５
【００８１】
上記の表１は、イソニアジドと同時に、リポソーム状免疫療法治療剤を鼻孔経由で投与して治療したマウスと、腹膜経由で投与して治療したマウスは、抗生イソニアジドのみで治療したマウスよりも、肺内の結核菌の数は大幅に少なくなっていることを示している。
【００８２】
確認された結核菌の数は、活動状態にある結核菌と非活動状態にある結核菌の両方を含んでいることを考慮に入れると、リポソーム状の免疫療法治療剤での治療は、抗生イソニアジドでかかる治療時間を減らすことができる。これは、時間の経過と共に活動状態に変化する結核菌の数を大幅に減らすからである。
【００８３】
ｉｉ）  リファンピンとイソニアジドで治療した後、リポソーム状免疫療法治療剤の３回の投与による治療
【００８４】
感染した１２９／Ｓｖ型のマウスを２つのグループに分けた。
（Ａグループ）−  １日あたり２５ｍｇ／ｋｇのイソニアジドを１週間に５日間４週間にわたり投与し、１日あたり１０ｍｇ／ｋｇのリファンピンを１週間に５日間４週間にわたりで投与して治療したグループ（対照標準）。
（Ｂグループ）−  リファンピンとイソニアジドの治療の後、１８０μｇのリポソーム状の免疫療法治療剤を３回皮下経由で投与して治療したグループ（本発明）。
【００８５】
抗生イソニアジドでの治療を第９週目に開始し４週間継続した。第１３週目にリファンピンのよる治療を開始し第１７週目に完了した。
【００８６】
第１７、１９、２１週目にリポソーム状の免疫療法治療剤を３回投与した（本発明）。
【００８７】
第２２週目にマウスを殺し、左肺と脾臓内の結核菌濃度を確定した。
【００８８】
結核菌濃度は、対照標準グループと比較すると、本発明のワクチン投与した動物の肺内では大幅に低いが、一方、対照標準グループのマウスとリポソーム状の免疫療法治療剤で治療したマウスとの間で脾臓内では大きな差は見られなかった。
【００８９】
実験結果を、ｌｏｇ１０ＵＦＣ／ｍＬ単位で、表２に示す。
（表２）
マウスグループ          肺                        脾臓          
Ａ  対照標準      ２．６７±０．８３        ２．３５±１．１８
Ｂ  皮下経由      １．６１±０．５８＊      １．３７±１．０２
＊＝対照標準と比較して統計的に意味のある数字ｐ＜０．０５
【００９０】
抗生イソニアジドとリファンピンで治療した後、皮下経由でリポソーム状の免疫療法治療剤を投与して治療したマウスは、抗生イソニアジドとリファンピンのみで治療したマウスよりも、肺内の結核菌の数は大幅に減ったことが分かる。
【００９１】
セクションＩ）と同一の結論がこのケースにも適用できる。
【００９２】
ＩＩＩ）  イソニアジドと同時にリポソーム状の免疫療法治療剤を３回投与することによる治療。
【００９３】
感染したＣ５７ＢＬ／６型のマウスを２つのグループに分けた。
（Ａグループ）−  １日あたり２５ｍｇ／ｋｇのイソニアジドのみを１週間に５日間８週間にわたり治療したグループ（対照標準）。
（Ｂグループ）−  上記の治療と共に、リポソーム状の免疫療法治療剤を１８０μｇを鼻孔経由で３回投与して治療したグループ（本発明）。
【００９４】
第９週目に抗生イソニアジドの治療を開始し、第１７週目まで継続した。
【００９５】
リポソーム状の免疫療法治療剤を第１３、１５、１７週目に投与した。
【００９６】
第１５週目と第２８週目にマウスを殺し、左肺と脾臓内の結核菌の数を確定した。
【００９７】
結核菌濃度は、対照標準グループと比較すると、１回または３回の投与の後（第１５週目と第２８週目に対応する）は、本発明のワクチン投与したマウスの肺内では大幅に減っていた。
【００９８】
免疫療法治療剤の１回の投与（第１５週目）の後と３回の投与（第２８週目）の後の肺に対し得られた実験結果を、ｌｏｇ１０ＵＦＣ／ｍＬの形で、表３に示す。
（表３）
マウスグループ    第１５週（１回投与）      第２８週（３回投与）        
Ａ  対照標準      ２．３４±０．２４        ３．８６±０．４１
Ｂ  鼻孔経由      １．５９±０．６１＊      ３．４８±０．１８＊
＊＝対照標準と比較して統計的に意味のある数字ｐ＜０．０５
【００９９】
抗生イソニアジドでの治療と同時に、鼻孔経由で投与したリポソーム状の免疫療法治療剤の１回の投与のみで治療したマウスは、抗生イソニアジドでのみ治療したマウスよりも肺内の結核菌の数は大幅に少ない。
【０１００】
セクションＩ）と同一の結論がこの場合にも当てはまる。
【０１０１】
脾臓に関しては、結核菌濃度は、対照標準グループと比較すると、３回の投与の後（第２８週目に対応する）のマウス内では大幅に減っていた。
【０１０２】
脾臓に対する得られた結果を、ｌｏｇ１０ＵＦＣ／ｍＬの形で、表４に示す。
（表４）
マウスグループ    第１５週                  第２８週            
Ａ  対照標準      １．４７±０．４４        ３．８４±０．４８
Ｂ  鼻孔経由      １．４１±０．５８        ３．４３±０．２９＊
＊＝対照標準と比較して統計的に意味のある数字ｐ＜０．０５
【０１０３】
上記の表によれば、抗生イソニアジドと同時にリポソーム状の免疫療法治療剤を鼻孔経由で３回投与して治療したマウスは、抗生イソニアジドのみで治療したマウスよりも肺内の結核菌の数は大幅に少ない。
【０１０４】
セクションＩ）と同一の結論がこの場合にも当てはまる。
【０１０５】
ＩＶ）  抗生イソニアジドの効果と、リポソーム状の免疫療法治療剤の効果と、それらの間の相互作用を研究するための比較実験
【０１０６】
以下の表５に示した条件の下で、２２の累乗のデザインに従った後の、ＤＢＡ／２マウスで数回の実験を行った。
（表５）
実験      抗生イソニアジド    リポソーム状免疫療法治療剤
１        Ｎｏ                Ｎｏ
２        Ｙｅｓ              Ｎｏ
３        Ｎｏ                Ｙｅｓ
４        Ｙｅｓ              Ｙｅｓ
【０１０７】
実験１においては、感染したマウスには、如何なる治療も施さずに放置した。
【０１０８】
実験２においては、感染したマウスは、１日あたり２５ｍｇ／ｋｇの抗生イソニアジドのみを１週間に５日間４週間にわたり投与し、感染後第９週目から、１日あたり１０ｍｇ／ｋｇのリファンピンを１週間に５日間４週間にわたり投与した。
【０１０９】
実験３においては、感染後に第９週目、第１１週目、第１５週目に、リポソーム状免疫療法治療剤のみ１８０μｇを３回にわたって、皮下経由で投与した。
【０１１０】
実験４においては、抗生イソニアジドを第９週目に投与開始し４週間にわたって投与した。第１３週目にリファンピンによる投与を開始し第１７週目で終了した。第１７、１９、２１週目にリポソーム状免疫療法治療剤を３回投与した。
【０１１１】
第２２週目に、全てのマウスを殺し、左肺内の結核菌の濃度を確定した。左肺で得られた実験結果を、ｌｏｇ１０ＵＦＣ／ｍＬの単位で、表６に示す。
（表６）
実験    抗生イアオニジド    リポソーム状の免疫療法治療剤    ｌｏｇ１０ＵＦＣ／ｍＬ
１      Ｎｏ                Ｎｏ                          ５．３７±０．２７
２      Ｙｅｓ              Ｎｏ                          ３．２９±０．８＊
３      Ｎｏ                Ｙｅｓ                        ５．６９±０．２２
４      Ｙｅｓ              Ｙｅｓ                        ０．６９±０＊＊
＊    実験１、３、４に比較して、統計的に意味ある値  ｐ＜０．０５
＊＊  実験１、２、３に比較して、統計的に意味ある値  ｐ＜０．０５
【０１１２】
抗生イソニアジドとリファンピンと本発明のリポソーム状の免疫療法治療剤との混成治療（本発明）による結核菌の減少は、他の２つの場合（抗生物質のみの場合とリポソーム状の免疫療法治療剤のみの場合）のいずれの場合の結核菌の数の減少に比較すると、大幅であることが分かる。
【０１１３】
確定された結核菌の数は、活動状態にあるものと非活動状態にあるものとの両方の全ての結核菌を含んでいることを考慮に入れると、他の抗結核薬と組み合わせたリポソーム状の免疫療法治療剤での本発明の治療は、他の抗結核薬のみによる治療時間を大幅に減らすことができる。これは、時間と共に活動状態に変化する結核菌の数を大幅に減らすからである。
【０１１４】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【国際調査報告】
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2007509910.tif 000003
2007509910.tif 000004
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