(57)【要約】  本発明は、単離された真菌プロモーターＤＮＡ配列、ＤＮＡ構築物、ベクター、およびポリペプチドをコードするコード配列と作動可能に会合されるこれらのプロモーターを含む真菌宿主細胞に関する。本発明はまた、単離された新規のプロモーターを使用して遺伝子を発現させるおよび／またはポリペプチドを産生させるための方法に関する。本発明はまた、本発明の新規のプロモーターを使用して、転写レベルおよび／または内因性遺伝子の調節を改変するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に少なくとも５０％相同であるＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの変異体、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかのサブ配列、
からなる群から選択されるプロモーターＤＮＡ配列。
【請求項２】
コード配列がプロモーターＤＮＡ配列の制御下で発現され得るように、請求項１に記載のプロモーターＤＮＡ配列および前記プロモーターＤＮＡ配列と作動可能に会合されるコード配列を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物を含む、宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）または麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）種である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）請求項２に記載のＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ構築物で適切な宿主細胞を形質転換すること、および
（ｃ）前記プロモーターＤＮＡ配列の制御下で遺伝子を発現させること、
を含む、宿主細胞における遺伝子の発現のための方法。
【請求項７】
（ａ）ポリペプチドをコードするコード配列を含む請求項２に記載のＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ構築物で適切な宿主細胞を形質転換すること、
（ｅ）ポリペプチドの発現をもたらす培養条件下で適切な宿主を培養すること、および
（ｆ）培養ブロスからポリペプチドを回収すること、
を含む、適切な宿主におけるポリペプチドの産生のための方法。
【請求項８】
（ａ）二次代謝物の産生に関与する酵素をコードするコード配列を含む、請求項２に記載のＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ構築物で適切な宿主細胞を形質転換すること、
（ｃ）二次代謝物の産生をもたらす培養条件下で適切な宿主を培養すること、および
（ｄ）培養ブロスから二次代謝物を回収すること、
を含む、適切な宿主における二次代謝物の産生のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ配列、特に、単離された真菌プロモーター、およびＤＮＡ構築物、ベクター、ならびにポリペプチドをコードするコード配列と作動可能に会合されるこれらのプロモーターを含む真菌宿主細胞に関する。本発明はまた、遺伝子を発現させるおよび／またはポリペプチドを産生させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌宿主細胞における組換えポリペプチドの産生は、ポリペプチドをコードするＤＮＡが、宿主細胞に適切なプロモーターの発現制御下に配置される発現カセットを構築することによって、通常達成される。発現カセットは、プラスミドまたはベクターによって仲介される形質転換により、宿主細胞に導入することができる。次いで、ポリペプチドの産生は、発現カセットに含有されるプロモーターの適切な機能化に必要な誘導条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって、達成することができる。
【０００３】
各真菌宿主細胞について、形質転換によって真菌宿主に導入されているコード配列の発現およびこのコード配列によってコードされる組換えポリペプチドの産生には、機能的プロモーターが利用可能であることが必要である。多数のプロモーターが、真菌宿主細胞において機能的であることが既に公知である。プロモーターの異種間使用の例が存在する。すなわち、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））において機能的であることが公知である（Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１年１月；１７（１）：１９−３３．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｇｐｄＡ  ｇｅｎｅ．プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、ゼガー  ＮＤ（Ｚｅｇｅｒｓ  ＮＤ）、ブッチャー  Ｍ（Ｂｕｓｓｃｈｅｒ  Ｍ）、ポウウェルズ  ＰＨ（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ＰＨ）、バンデンホンデル  ＣＡ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ））。もう１つの例は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）において使用されるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）β−キシロシダーゼｘｌｎＤプロモーター「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」、ヴァンペイジ，ＮＮＭＥ（ｖａｎ  Ｐｅｉｊ，ＮＮＭＥ）博士−ｔｈｅｓｉｓ  Ｌａｎｄｂｏｕｗｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、蘭国、ＩＳＢＮ９０−５８０８−１５４−０ならびにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびクラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ、１９８９年３月；１５（３）：１７７−８０：ロバーツ  ＩＮ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＩＮ）、オリバー  ＲＰ（Ｏｌｉｖｅｒ  ＲＰ）、プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、バンデンホンデル  ＣＡ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ」において記載される）である。
【０００４】
しかし、誘導される遺伝子の発現制御するため、内因性遺伝子の発現のレベルを制御するため、内因性遺伝子の発現の調節を制御するためかもしくは内因性遺伝子の不活化を仲介するため、またはポリペプチドを産生させるため、あるいは先のアプリケーションの組み合わせのための改善されたプロモーターに必要性がなお存在する。これらの改善されたプロモーターは、例えば、これまでの公知のプロモーターよりも強力であり得る。それらはまた、特異的な簡便な基質または化合物によって誘導可能であり得る。単一の真菌宿主において多用な遺伝子を同時に過剰発現させようと考える場合、いくらかの機能的プロモーターについて知ることもまた有利である。スケルチング（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）（特定の転写因子のタイトレーション）を防止するためには、複数の個別のプロモーター（発現させようとする１つの遺伝子に対してそれぞれ１つの特異的プロモーター）を使用することが好適である。
【発明の詳細な説明】
【０００５】
本発明は、以下からなる群から選択されるプロモーターＤＮＡ配列に関する。すなわち、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に少なくとも５０％相同であるＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの変異体、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかのサブ配列。
【０００６】
本発明に関して、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列と作動可能に会合される場合、このプロモーターＤＮＡ配列は、このコード配列の発現を制御することが可能なＤＮＡ配列である。用語「作動可能に会合」は、本明細書において、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列によってコードされるポリペプチドの産生を指令するようなコード配列に対する位置に、プロモーターＤＮＡ配列が適切に配置される配置形態として規定される。
【０００７】
用語「コード配列」は、本明細書において、適切な制御配列の制御下に配置される場合、ポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡに転写される核酸配列として規定される。コード配列の境界は、一般に、通常、ｍＲＮＡの５’末端におけるオープンリーディングフレームの開始部であるＡＴＧ開始コドン、およびｍＲＮＡの３’末端におけるオープンリーディングフレームの直ぐ下流に位置する転写ターミネーター配列によって決定される。コード配列としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、および組換え核酸配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０００８】
より具体的には、用語「プロモーター」は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始するポリペプチドをコードするコード配列の正確な下流の転写開始部位にポリメラーゼを指向するＤＮＡ配列として規定される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの集成を効果的に触媒する。用語「プロモーター」はまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための（プロモーターと転写開始部との間の）５’非コード領域、エンハンサーなどのシス作用性転写制御エレメント、および転写因子と相互作用することが可能な他のヌクレオチド配列を含むことが理解されよう。
【０００９】
好適な実施態様では、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載の配列である。
【００１０】
別の好適な実施態様に従えば、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５にハイブリダイズすることが可能であり、なおプロモーター活性を保持するＤＮＡ配列である。
【００１１】
プロモーター活性は、好ましくは、プロモーターと作動可能に会合されるコード配列によってコードされるタンパク質の濃度を測定することによって、決定される。あるいは、プロモーター活性は、プロモーターと作動可能に会合されるコード配列によってコードされるタンパク質の酵素活性を測定することによって、決定される。好適な実施態様に従えば、プロモーター活性（およびその強度）は、ｌａｃＺレポーター遺伝子のコード配列の発現を測定することによって決定される（ルオ（Ｌｕｏ）（Ｇｅｎｅ  １６３（１９９５年）１２７−１３１）。別の好適な実施態様に従えば、プロモーター活性は、コード配列として緑色蛍光タンパク質を使用することによって決定される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９９年３月；１４５（Ｐｔ３）：７２９−３４、サンテリレ  アンリクセンＡＬ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ  ＡＬ）、エヴェン  Ｓ（Ｅｖｅｎ  Ｓ）、マラー  Ｃ（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ）、プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、バンデンホンデル  ＣＡ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ）、ニールセン  Ｊ．スタディ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｊ．Ｓｔｕｄｙ））。
【００１２】
さらに、プロモーター活性は、プロモーターの制御下で作製される転写物のｍＲＮＡレベルを測定することによって、決定することができる。ｍＲＮＡレベルは、例えば、ノーザンブロットを介して測定することができる（Ｊ．サンブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアツス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州）。
【００１３】
本発明は、極めて低いストリンジェンシー条件、好ましくは低いストリンジェンシー条件、より好ましくは中等度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中等度〜高いストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは高いストリンジェンシー条件、および最も好ましくは極めて高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のヌクレオチド１〜２０００、好ましくはヌクレオチド１００〜１９９０、より好ましくは２００〜１９８０、さらにより好ましくは３００〜１９７０、さらにより好ましくは３５０〜１９５０および最も好ましくは３６０〜１９００に対応するか、（ｉｉ）（ｉ）のサブ配列であるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖である核酸プローブにハイブリダイズする（単離された）プロモーターＤＮＡ配列を包含する（Ｊ．サンブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアティス（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州）。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のサブ配列は、少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであり得る。
【００１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の核酸配列またはそのサブ配列を使用して、核酸プローブを設計し、当該分野において周知の方法に従って、異なる属あるいは種の株からＤＮＡプロモーターを同定およびクローニングしてもよい。特に、そのようなプローブは、本明細書に記載の対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング手順に従って、目的の属または種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用することができる。そのようなプローブは、全配列よりもかなり短くあり得るが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、およびより好ましくは少なくとも３５ヌクレオチド長であるべきである。さらに、そのようなプローブを使用して、ＰＣＲを介してＤＮＡプロモーターを増幅することができる。ＰＣＲを介してプロモーターをクローニングする例については、本明細書に記載されている（実施例１．３を参照のこと）。また、より長いプローブを使用することもできる。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを使用することもできる。プローブは、典型的に、対応する遺伝子を、（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、もしくはアビジンまたは蛍光マーカーで）検出するために標識される。かかるプローブも本発明に包含される。
【００１５】
従って、そのような他の生物体から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを、上記のプローブにハイブリダイズし、ポリペプチドをコードするＤＮＡを対象にスクリーニングしてもよい。そのような他の生物体由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または他の分離技術によって分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡまたは分離されたＤＮＡを、ニトロセルロースまたは他の適切なキャリア材料に移して固定化してもよい。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５、またはそのサブ配列に相同であるクローンあるいはＤＮＡを同定するために、キャリア材料を、サザンブロットにおいて使用してもよい。
【００１６】
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、核酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５に示される核酸配列、その相補鎖、またはそのサブ配列に対応する標識核酸プローブに、極めて低い〜極めて高いストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズすることを示す。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムを使用して、検出される。また、検出のために蛍光ならびに支持体としてガラススライド（ｇｌａｓｓ  ｓｉｄｅｓ）および／またはＤＮＡマイクロアレイを使用する技術などの他のハイブリダイゼーション技術を使用することもできる。ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション検出の例は、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２００３年１２月；４（３）：２５９−６９（ダラン−ラプジャデ  Ｐ（Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ  Ｐ）、ダラン  ＪＭ（Ｄａｒａｎ  ＪＭ）、コッテル  Ｐ（Ｋｏｔｔｅｒ  Ｐ）、ペティット  Ｔ（Ｐｅｔｉｔ  Ｔ）、パイパー  ＭＤ（Ｐｉｐｅｒ  ＭＤ）、プランク  ＪＴ（Ｐｒｏｎｋ  ＪＴ）．「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒａｉｎｓ  Ｓ２８８Ｃ  ａｎｄ  ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」）に認められる。さらに、ハイブリダイゼーションのためのＰＮＡマイクロアレイの使用については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３年１０月１日；３１（１９）：ｅ１１９（ブラント  Ｏ（Ｂｒａｎｄｔ  Ｏ）、フェルトナー  Ｊ（Ｆｅｌｄｎｅｒ  Ｊ）、シュテファン  Ａ（Ｓｔｅｐｈａｎ  Ａ）、シュレーダー  Ｍ（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｍ）、シュノルザー  Ｍ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  Ｍ）、アーリンハウス  ＨＦ（Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ  ＨＦ）、ホヘイセル  ＪＤ（Ｈｏｈｅｉｓｅｌ  ＪＤ）、ヤコブ  Ａ（Ｊａｃｏｂ  Ａ）．ＰＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｌａｂｅｌｌｅｄ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ．）に記載されている。
【００１７】
好適な実施態様では、核酸プローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５の核酸配列である。好適な別の実施態様では、核酸プローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド２０〜１９８０、より好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド５００〜１９５０、さらにより好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド８００〜１９２０、および最も好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド９００〜１９００を有する配列である。別の好適なプローブは、転写部位の前のＤＮＡ配列の部分である。
【００１８】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブでは、極めて低い〜極めて高いストリンジェンシー条件は、標準的なサザンブロッティング手順に従う５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００．ｍｕ．ｇ／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、ならびに極めて低いおよび低いストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中等度および中等度〜高いストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、または高いおよび極めて高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミドのいずれかにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして規定される。
【００１９】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブでは、キャリア材料は、それぞれ、１５分間、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して、好ましくは少なくとも４５℃（極めて低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中等度のストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中等度〜高いストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（高いストリンジェンシー）、および最も好ましくは少なくとも７０℃（極めて高いストリンジェンシー）で、最終的に３回洗浄する。
【００２０】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブでは、ストリンジェンシー条件は、標準的なサザンブロッティング手順に従う、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、および１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡにおいて、ボールトン（Ｂｏｌｔｏｎ）およびマッカーシー（ＭｃＣａｒｔｈｙ）（１９６２年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ４８：１３９０）に従う計算を使用して算出されるＴｍより５℃〜１０℃低い温度でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーション後洗浄として規定される。
【００２１】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブでは、キャリア材料は、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ中、１５分間で１回、算出されたＴｍより５℃〜１０℃低い温度で６×ＳＳＣを使用して、それぞれ１５分間、２回洗浄される。
【００２２】
別の好適な実施態様に従えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５を最初に使用して、それと作動可能に会合される生来の遺伝子、コード配列もしくはその一部をクローニングする。これは、先に規定されるような配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５、またはそのサブ配列のいずれかから開始し、プローブとしてこの配列を使用して、行うことができる。プローブは、ｃＤＮＡまたは所定の宿主、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）かもしくは本出願において規定される他の任意の真菌宿主のいずれかのゲノムライブラリーにハイブリダイズされる。一旦、生来の遺伝子またはその一部がクローニングされれば、続いて、それ自体をプローブとして使用して、本明細書に記載のハイブリダイゼーション実験によって、他の真菌から誘導されるその相同遺伝子をクローニングすることができる。
【００２３】
本発明に関して、相同遺伝子とは、生来の遺伝子に対して少なくとも５０％相同（同一）である遺伝子を意味する。好ましくは、相同遺伝子は、生来の遺伝子に対して、少なくとも５５％相同、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％、および最も好ましくは約９７％相同である。
【００２４】
相同遺伝子のコード配列の上流の配列は、本発明に包含されるプロモーターである。あるいは、本発明のプロモーターに作動可能に会合される生来の遺伝子の配列、コード配列またはその一部を、先に規定されるような配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５またはそのサブ配列を使用して同定し、例えば、本明細書に記載のアラインメントまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ゲノムデータベースを検索することができる。続いて、この同定される配列を使用して、本出願において規定される他の任意の真菌宿主において、オーソログまたは相同遺伝子を同定することができる。同定されるオーソログまたは相同遺伝子のコード配列の上流の配列は、本発明に包含されるプロモーターである。
【００２５】
別の好適な実施態様に従えば、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５に少なくとも５０％相同（同一）である単離されたＤＮＡ配列である。好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５に対して、少なくとも５５％相同、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％、および最も好ましくは約９７％相同である。
【００２６】
本発明の目的のために、２つの核酸配列間の相同性（同一性）の程度は、好ましくは、ＢＬＡＳＴプログラムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９年）を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００２７】
好適な別の実施態様では、プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のサブ配列であり、該サブ配列はなお、プロモーター活性を有する。サブ配列は、好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも約３００ヌクレオチドを含有する。
【００２８】
好適な別の実施態様では、サブ配列は、５’および／または３’末端からの１もしくはそれ以上のヌクレオチドが欠失されていることを除いて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５に包含される核酸配列であり、前記ＤＮＡ配列はなおプロモーター活性を有する。
【００２９】
好適な別の実施態様では、プロモーターサブ配列は、「トリミングした」のサブ配列、即ち、翻訳開始部および／または転写開始部より上流にある配列フラグメントである。プロモーターをトリミングし、それについて機能的に分析する例は、Ｇｅｎｅ．１９９４年８月５日；１４５（２）：１７９−８７：ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ．ベルダズ  ＪＣ（Ｖｅｒｄｏｅｓ  ＪＣ）、プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、ストウサメル  ＡＨ（Ｓｔｏｕｔｈａｍｅｒ  ＡＨ）、バンデンホンデル  ＣＡ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ））に記載されている。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、プロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５の変異体である。
【００３１】
用語「変異体」または「変異体プロモーター」は、本明細書において、親プロモーターの１もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含むヌクレオチド配列を有するプロモーターとして規定され、ここで、変異体プロモーターは、対応する親プロモーターよりも高いまたは低いプロモーター活性を有する。用語「変異体プロモーター」は、天然の変異体ならびに古典的な変異誘発、部位特異的変異誘発、およびＤＮＡシャフリングなどの当該分野において周知の方法を使用して入手されるインビトロで作製される変異体を包含する。変異体プロモーターは、１つもしくはそれ以上の変種を有してもよい。各変種は、ヌクレオチドの独立した置換、欠失、および／または挿入である。
【００３２】
好適な実施態様に従えば、変異体プロモーターは、最初に同定されたプロモーター配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５）と比較して少なくとも修飾された調節部位を有するプロモーターである。そのような調節部位は、その全体を取り出すかまたは上記で説明されるように特異的に変異することができる。従って、かかるプロモーター変異体の調節は、例えば、それがもはやグルコースによって誘導されないように修飾される。かかるプロモーター変異体およびそれらを入手する仕方に関する技術の例は、ＥＰ６７３４２９号明細書または国際公開第９４／０４６７３号パンフレットに記載されている。これらの特許は、参照により本明細書に援用される。
【００３３】
プロモーター変異体は対立遺伝子変異体であり得る。対立遺伝子変異体は、同じ染色体の遺伝子座を占有する遺伝子の２つもしくはそれ以上の代替的形態のいずれかを示す。対立遺伝子の変異体は変異を介して自然に生じ、集団内において多型を生じ得る。変異体プロモーターは、（ａ）ＤＮＡを、極めて低い、低い、中等度、中等度〜高い、高い、もしくは極めて高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５、（ｉｉ）（ｉ）のサブ配列あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズさせること、および（ｂ）ＤＮＡから変異体プロモーターを単離することによって、入手することができる。ストリンジェンシーおよび洗浄条件は、本明細書において規定されるとおりである。
【００３４】
本発明のプロモーターは、その配列が、プロモーター配列と、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を誘導する目的のためのリンカーを伴って提供され得るプロモーターであり得る。
【００３５】
本明細書において提供される配列情報は、誤って同定される塩基の夾在を要するようにし、あまりに限られた範囲で解釈すべきではない。本発明において開示される特定の配列は、糸状菌、特に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の本来のＤＮＡ配列を単離するために容易に使用することができ、さらなる配列解析に供し、それによって、シークエンシングエラーを同定することができる。
【００３６】
他で示さない限り、本明細書においてＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサーを使用して決定した。従って、この自動化アプローチによって決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知であるように、本明細書において決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含有してもよい。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には、少なくとも約９０％同一、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。
【００３７】
当業者は、そのように誤って同定される塩基を同定することが可能であり、そのようなエラーを補正する仕方を知っている。
【００３８】
本発明は、本発明が係わるプロモーターの生物学的機能を改変しない変異を典型的に含有する機能的プロモーター等価物を包含する。用語「機能的等価物」はまた、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＤＮＡ配列のオーソログを包含する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＤＮＡ配列のオーソログは、他の株または種から単離することができ、類似または同一の生物学的活性を所有するＤＮＡ配列である。
【００３９】
本発明のプロモーター配列は、任意の属の微生物から入手してもよい。本発明の目的のために、所定の供給源に関して本明細書において使用する用語「から入手する」は、ポリペプチドが、供給源または供給源由来の遺伝子が挿入されている細胞によって産生されることを意味すべきである。
【００４０】
プロモーター配列は、真菌供給源、好ましくは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株などの酵母株、より好ましくは、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ダグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロミセス・オヴィフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）株から入手することができる。
【００４１】
好適な別の実施態様では、プロモーター配列は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トイポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株などの糸状菌株、より好ましくは、アスペルギルス・アクレアータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パルロゼラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギプラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｉｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株から入手される。
【００４２】
好適な別の実施態様では、プロモーター配列は、フザリウム・バクトリディオデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェルエンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコチロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルプレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルローサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ヴェネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）株から入手される。
【００４３】
上記の種について、本発明は、完全および不完全な状態、ならびに名称が公知である種であるかどうかに係わらず、他の分類学的等価物、例えば、アナモルフを包含することが理解される。当業者であれば、適切な等価物の同一性を容易に認識する。これらの種の株は、米国菌培養収集所（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、および農業研究サービス機関（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）などの多くの培養コレクションにおいて、公的に容易に利用可能である。
【００４４】
さらに、本発明に従うプロモーター配列は、上記のプローブを使用して、自然（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離される微生物を含む他の供給源から同定および入手することができる。天然の生育地から微生物を単離するための技術は、当該分野において周知である。次いで、核酸配列は、別の微生物のゲノムＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることによって、誘導することができる。一旦、プロモーターをコードする核酸配列がプローブで検出されたら、当業者に公知である技術を利用することによって、配列を単離またはクローニングすることができる（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、上掲を参照のこと）。
【００４５】
本発明では、プロモーターＤＮＡ配列はまた、本発明の１つもしくはそれ以上のプロモーターの一部；本発明のプロモーターの一部および別の既知のプロモーターの一部、例えば、一方のプロモーターのリーダー配列および他方のプロモーターの転写開始部位；または本発明の１つもしくはそれ以上のプロモーターの一部および１つもしくはそれ以上の他のプロモーターの一部を含むハイブリッドプロモーターであってもよい。他のプロモーターは、変異体、短縮型、ハイブリッドプロモーターを含む、好適な真菌宿主細胞において転写活性を示す任意のプロモーター配列であってもよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から入手してもよい。他のプロモーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に生来または外来性であってもよく、細胞に対して生来または外来性であってもよい。
【００４６】
好適な実施態様として、同定されるプロモーターの重要な調節サブ配列を、他の「基本」プロモーターに融合して、それらのプロモーター活性を増強することができる（例えば、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４年５月；１２（３）：４７９−９０．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘｙｌａｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｘｌｎＡ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ．デグラフ  ＬＨ（ｄｅ  Ｇｒａａｆｆ  ＬＨ）、ファンデンブルック  ＨＣ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ  ＨＣ）、ファンオオイジェン  ＡＪ（ｖａｎ  Ｏｏｉｊｅｎ  ＡＪ）、ヴィセル  Ｊ（Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊ）に記載される）。
【００４７】
本発明のプロモーターとのハイブリッドプロモーターの構築において有用な他方のプロモーターの他の例として、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｐｄＡ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼｇｏｘＣ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）の遺伝子から入手されるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼおよび麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ならびにその変種、短縮型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターについては、ローマノス（Ｒｏｍａｎｏｓｅｔ）ら、１９９２年、Ｙｅａｓｔ８：４２３−４８８に記載されている。
【００４８】
本発明では、プロモーターＤＮＡ配列はまた、「タンデムプロモーター」であってもよい。「タンデムプロモーター」は、本明細書において、２つもしくはそれ以上のプロモーター配列として規定され、それらのそれぞれが、コード配列と作動可能に会合され、コード配列からｍＲＮＡへの転写を仲介する。
【００４９】
タンデムプロモーターは、本発明の２つもしくはそれ以上のプロモーター、あるいは本発明の１つもしくはそれ以上のプロモーターおよびハイブリッドプロモーターの構築に有用な上記で例示されるような１つもしくはそれ以上の他の既知のプロモーターを含む。タンデムプロモーターの２つもしくはそれ以上のプロモーター配列は、核酸配列の転写を同時に促進することができる。あるいは、タンデムプロモーターのプロモーター配列のうちの１つもしくはそれ以上は、細胞の成長の異なる段階または菌糸体の形態学的に異なる部分での核酸配列の転写を促進することができる。
【００５０】
本発明では、プロモーターは、目的のポリペプチドをコードするコード配列および／または真菌宿主細胞に対して外来性であってもよい。野生型プロモーターがコード配列または真菌宿主細胞に対して生来である場合であっても、本発明の変異体、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、ポリペプチドをコードするコード配列に対して外来性であることが理解される。
【００５１】
本発明の変異体、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５を有するプロモーターのプロモーター活性の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％、さらにより好ましくは少なくとも約２００％、最も好ましくは少なくとも約３００％、およびさらに最も好ましくは少なくとも約４００％を有する。
【００５２】
本発明は、コード配列が、所定の真菌宿主細胞においてプロモーターＤＮＡ配列の制御下で発現され得るように、上記のように規定される少なくとも１つのプロモーターＤＮＡ配列、および前記プロモーターＤＮＡ配列と作動可能に会合されるコード配列を含むＤＮＡ構築物にさらに関する。
【００５３】
コード配列は、目的の真菌宿主細胞に対して生来または異種であり得るポリペプチドをコードする。
【００５４】
用語「ポリペプチド」は、本明細書においては、特定の長さのコードされた産物を指すことを意図するのではなく、従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。用語「異種ポリペプチド」は、本明細書において、真菌細胞に対して生来ではないポリペプチド、生来の配列を改変するために修飾が施されている生来のポリペプチド、または発現が、組換えＤＮＡ技術による真菌細胞の操作の結果として量的に改変される生来のポリペプチドとして規定される。例えば、生来のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする配列を本発明のプロモーターの制御下に配置して、ポリペプチドの発現を増強し、シグナル配列の使用によって、目的の生来のポリペプチドの細胞外への輸送を促進し、細胞によって通常産生されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加することによって、組換え的に産生され得る。真菌細胞は、ポリペプチドをコードする１コピーもしくはそれ以上のコード配列を含有してもよい。
【００５５】
好ましくは、コード配列は、ペプチドホルモンもしくはその変異体、酵素、細胞内タンパク質、分泌プロセスに関与するタンパク質、ホールディングプロセスに関与するタンパク質、チャペロン、ペプチドアミノ酸トランスポーター、グリコシル化因子、転写因子、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはレポータータンパク質をコードする。
【００５６】
好適な実施態様では、ポリペプチドは細胞外に分泌される。
【００５７】
より好適な実施態様では、ポリペプチドは酵素である。酵素の例には、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはβ−グルコシダーゼ；ヘミセルラーゼまたはペクチン分解酵素、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ；デンプン分解酵素；ホスファターゼ、例えば、フィターゼ、エステラーゼ、例えば、リパーゼ、タンパク質分解酵素、例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、酸化還元酵素、例えば、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼがある。
【００５８】
あるいは、コード配列は、例えば、チャペロンまたは転写因子などの細胞内タンパク質をコードしてもよい。この例は、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年１０月；５０（４）：４４７−５４（「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｂｉｐＡ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｃｋ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ．」プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、バンゲメレン  ＩＡ（ｖａｎ  Ｇｅｍｅｒｅｎ  ＩＡ）、ドリント−クイジュヴェンホヴェン  Ｊ（Ｄｒｉｎｔ−Ｋｕｉｊｖｅｎｈｏｖｅｎ  Ｊ）、ヘッシング  ＪＧ（Ｈｅｓｓｉｎｇ  ＪＧ）、バンムイジュゥ−ハートベルト  ＧＭ（ｖａｎ  Ｍｕｉｊｌｗｉｊｋ−Ｈａｒｔｅｖｅｌｄ  ＧＭ）、ベイジェルスベルゲン  Ａ（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ  Ａ）、ヴェリップス  ＣＴ（Ｖｅｒｒｉｐｓ  ＣＴ）、バンデンホンデル  ＣＡ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ））に記載されている。チャペロンまたは転写因子などのこのコード配列が、タンパク質産生の制限要因であることが公知であった場合、これを使用して、例えば、タンパク質生産者としての宿主細胞の効率を改善することができる。
【００５９】
コード配列はまた、有機酸、カロテノイド、（β−ラクタム）抗生物質、ビタミンなどの一次または二次代謝物の合成に関与する酵素をコードしてもよい。
【００６０】
目的のポリペプチドをコードするコード配列は、任意の原核生物、真核生物、または他の供給源から入手することができる。
【００６１】
あるいは、コード配列は、アンチセンスＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）構築物の発現をコードし得る。アンチセンス−ＲＮＡを発現させる例については、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年２月；６６（２）：７７５−８２．（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｌｄａｓｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ａ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．ンギアム  Ｃ（Ｎｇｉａｍ  Ｃ）、ジーネス  ＤＪ（Ｊｅｅｎｅｓ  ＤＪ）、プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、バンデンホンデル  ＣＡ（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ）、アーチャー  ＤＢ（Ａｒｃｈｅｒ  ＤＢ））または（ズレンナー  Ｒ（Ｚｒｅｎｎｅｒ  Ｒ）、ウィルミツァー  Ｌ（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ  Ｌ）、ゾンネバルト  Ｕ（Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ  Ｕ）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ．Ｐｌａｎｔａ．（１９９３年）；１９０（２）：２４７−５２．）に認められる。遺伝子の発現の完全な不活化は、例えば、（β−ラクタム）抗生物質またはカロテノイドなどの特定の二次代謝物の産生を増加するための、例えば、代謝経路の所望されない側枝を制御する遺伝子の不活化に有用である。完全な不活化はまた、毒性または所望されない化合物の産生を減少するのに有用である（ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）におけるクリソゲニン（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｉｎ）；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるアフラトキシン（Ａｆｌａｔｏｘｉｎ）：マクドナルド  ＫＤ（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＫＤ）ら：ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６３年）３３：３７５−８３）。完全な不活化はまた、発酵プロセスおよび下流プロセッシングが改善されるような方法で生物体の形態学を改変するのに有用である。
【００６２】
本発明の別の実施態様は、真菌細胞の広範な代謝再プログラミングまたは操作に関する。完全な新規の経路の導入および／または所望されない経路の修飾は、タンパク質もしくは代謝物などの特定の化合物の産生に特異的に適応された細胞を提供する。
【００６３】
本発明の方法では、コード配列がポリペプチドをコードする場合、前記ポリペプチドもまた、別のポリペプチドがポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末端もしくはＣ末端で融合される融合されたあるいはハイブリッドポリペプチドを含み得る。融合されたポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）を別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）に融合させることによって、産生される。融合ポリペプチドを産生させるための技術は当該分野において公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、それらがフレーム内にあって、融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように連結することを含む。ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから入手される部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含み得、ここで、１つもしくはそれ以上は、真菌細胞に対して異種であってもよい。
【００６４】
ＤＮＡ構築物は、プロモーターＤＮＡ配列に加えて、制御配列に適合する条件下で、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を指令する１つもしくはそれ以上の制御配列を含み得る。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むがこれらに限定されないポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むことが理解される。１つもしくはそれ以上の制御配列は、コード配列または宿主に対して生来であってもよい。あるいは、１つもしくはそれ以上の制御配列は、宿主細胞におけるコード配列の発現を改善するために、核酸配列に対して外来性の１つもしくはそれ以上の制御配列で置換されていてもよい。
【００６５】
「ＤＮＡ構築物」は、本明細書において、天然に存在する遺伝子から単離されるかまたはそうでなければ天然には存在しない様式で組み合わされ、並置される核酸のセグメントを含有するように修飾されている一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの核酸分子として規定される。ＤＮＡ構築物という用語は、ＤＮＡ構築物がコード配列およびコード配列の発現に要求されるすべての制御配列を含有する場合、発現カセットという用語と同義である。
【００６６】
用語「制御配列」は、本明細書において、コード配列の発現に必要または有利であるすべての成分を含むように規定され、本発明のプロモーターを含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に生来または外来性であってもよい。かかる制御配列として、リーダー、（コザク（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載のような）至適翻訳開始配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、上流活性化配列、変異体、フラグメント、ならびにそれから誘導されるハイブリッドおよびタンデムプロモーターを含む本発明のプロモーターならびに転写ターミネーターが挙げられるが、それらに限定されない。少なくとも、制御配列は、転写および翻訳停止シグナルならびに本発明のプロモーター（の一部）を含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を誘導する目的のためのリンカーを伴って提供され得る。
【００６７】
制御配列は、適切な転写ターミネーター配列、即ち、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするコード配列の３’末端と作動可能に会合される。好適な宿主細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。
【００６８】
糸状真菌宿主細胞のための好適なターミネーターは、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から入手される。
【００６９】
酵母宿主細胞のための好適なターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド（ｇｌｙｃｅｒａｉｄｅｈｙｄｅ）−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から入手される。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターについては、ローマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、上掲に記載されている。
【００７０】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、即ち、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの５’非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端と作動可能に会合される。好適な宿主細胞において機能的であるいずれのリーダー配列も本発明において使用することができる。
【００７１】
糸状真菌宿主細胞のための好適なリーダーは、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡの遺伝子から入手される。
【００７２】
酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から入手される。
【００７３】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、核酸配列の３’末端と作動可能に会合され、転写される場合、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を添加するためのシグナルとして宿主細胞に認識される配列であってもよい。好適な宿主細胞において機能的であるいずれのポリアデニル化配列も本発明において使用することができる。
【００７４】
糸状真菌宿主細胞のための好適なポリアデニル化配列は、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼの遺伝子から入手される。
【００７５】
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列については、クオ（Ｇｕｏ）およびシャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）、１９９５年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００７６】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に指向するシグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを伴う翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本来的に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来性のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然には含有しない場合に要求され得る。あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域と単純に置き換わってもよい。しかし、発現されるポリペプチドを好適な宿主細胞の分泌経路に指向するいずれのシグナルペプチドコード領域も本発明において使用することができる。
【００７７】
糸状真菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、Ａ．フィクウム（Ａ．ｆｉｃｕｕｍ）フィターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）エンドキシラナーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、およびフミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの遺伝子から入手されるシグナルペプチドコード領域である。
【００７８】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から入手される。他の有用なシグナルペプチドコード領域については、ローマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、上掲により記載されている。
【００７９】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素もしくはプロポリペプチド（または場合によりチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟した活性なポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）エンドキシラナーゼ（ｅｎｄｏ１）の遺伝子から入手することができる。
【００８０】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【００８１】
宿主細胞の増殖に関するポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を添加することもまた所望され得る。調節系の例は、遺伝子の発現を、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答してオンもしくはオフに転向させる調節システムである。原核生物系における調節系としては、ｌａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用することができる。糸状菌では、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーター、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーター、Ａ．ツビンゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）エンドキシラナーゼ（ｘ／ｎＡ）プロモーター、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）プロモーター、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼプロモーターおよびＡ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アルコールおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（それぞれａｌｃＡおよびａｌｄＡ）プロモーター（米国特許第５，５０３，９９１号明細書に記載される）を調節配列として使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする調節配列である。真核生物系では、これらは、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は調節配列と作動可能に会合される。
【００８２】
ｃｒｅＡ結合部位の取り出し（ＥＰ６７３４２９号明細書において先に記載されているような炭素カタボライト抑制）、ｐａｃＣおよびａｒｅＡの変更（ｐＨおよび窒素調節のため）は重要であり得る。
【００８３】
本発明はまた、本発明のプロモーター、ポリペプチドをコードするコード配列、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。上記の多様なコードおよび制御配列を共に接続して、１つもしくはそれ以上の簡便な制限部位を含んで、そのような部位における、プロモーターおよび／またはポリペプチドをコードするコード配列の挿入もしくは置換を可能にし得る組換え発現ベクターを産生させてもよい。あるいは、コード配列とプロモーターとの融合は、例えば、ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を使用する配列、重複伸長（Ｇｅｎｅ．１９８９年４月１５日；７７（１）：５１−９．ホウ  ＳＮ（Ｈｏ  ＳＮ）、ハント  ＨＤ（Ｈｕｎｔ  ＨＤ）、ホートン  ＲＭ（Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ）、プーレン  ＪＫ（Ｐｕｌｌｅｎ  ＪＫ）、ピーズ  ＬＲ（Ｐｅａｓｅ  ＬＲ）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」に記載される）によってかまたはＧａｔｅｗａｙＴＭクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングによって、行うことができる。あるいは、コード配列は、コード配列あるいはプロモーターおよび／またはコード配列を含むＤＮＡ構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって、発現させてもよい。発現ベクターを作製する際に、コード配列が本発明のプロモーターおよび発現のための１つもしくはそれ以上の適切な制御配列と作動可能に会合されるように、コード配列がベクターに位置される。
【００８４】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、コード配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする宿主細胞との適合可能性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。
【００８５】
ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。自律複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞において、ベクターが自立的に複製することを可能にする複製開始点を含み得る。酵母宿主細胞において使用される複製開始点の例として、２マイクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合わせがある。複製開始点は、その機能性を宿主細胞において温度感受性にする変異を有するものであってもよい（例えば、エールリヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、１９７８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ７５：１４３３を参照のこと）。糸状真菌において自律的に維持されるクローニングベクターの例は、ＡＭＡ１配列を含むクローニングベクターである。ＡＭＡ１は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）における自律的維持が可能であるＡ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）から単離される６．０−ｋｂゲノムＤＮＡフラグメントである（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照のこと）。
【００８６】
あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つもしくはそれ以上のベクターまたはプラスミド、あるいはトランスポゾンを使用してもよい。
【００８７】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つもしくはそれ以上の選択マーカーを含有する。宿主は、少なくとも２つのベクター（一方は選択マーカーを含む）で同時形質転換してもよい。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に栄養非要求性、などを提供する遺伝子である。酵母宿主細胞に適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとして、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの等価物が挙げられるが、それらに限定されない。また、例えば、フレオマイシン、ハイグロマイシンＢまたはＧ４１８に対する耐性を付与するマーカーを使用することもできる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用には、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）または麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）の遺伝子が好適である。ａｍｄＳマーカー遺伝子は、好ましくは、ＥＰ６３５５７４号明細書または国際公開第９７／０６２６号パンフレットに記載の技術を適用して、使用される。好適な選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターに融合されたＡ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である（ＥＰ６３５５７４号明細書）。他の糸状真菌由来のＡｍｄＳ遺伝子を使用してもよい（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【００８８】
宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、プロモーター配列および／またはポリペプチドをコードするコード配列あるいは相同もしくは非相同組換えによるゲノムへのベクターの安定な組込みのためのベクターの他の任意のエレメントに依存し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指令するためのさらなる核酸配列を含有してもよい。さらなる核酸配列は、染色体上の正確な位置で宿主細胞ゲノムにベクターを組込むことを可能にする。正確な位置での組込みの可能性を高めるために、組込みエレメントは、好ましくは、充分な数の核酸、例えば、１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、より好ましくは８００〜１，５００塩基対、および最も好ましくは少なくとも２ｋｂを含有すべきであり、これは対応する標的配列と高度に相同であり、相同組換えの確率を増強する。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同である任意の配列であってもよい。さらに、組込みエレメントは、非コードまたはコード核酸配列であり得る。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。
【００８９】
好ましくは、標的遺伝子座に相同であるクローニングベクターにおける組込みエレメントが、高度に発現される遺伝子座から誘導され、これは、それらが、真菌宿主細胞において高い発現レベルが可能である遺伝子から誘導されることを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、即ち、高度に発現される遺伝子は、本明細書において、例えば、誘導条件下で、そのｍＲＮＡが少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを構成し得る遺伝子、あるいは、その遺伝子産物が少なくとも１％（ｗ／ｗ）の全細胞性タンパク質を構成し得るか、または、分泌される遺伝子産物の場合、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌され得る遺伝子として規定される（欧州特許第３５７１２７Ｂ１号明細書に記載される）。多くの好適な高度に発現される真菌遺伝子は、次の例によって示される。すなわち、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼもしくはセロビオヒドロラーゼ遺伝子。これらの目的のための最も好適な高度に発現される遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の遺伝子座、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子座、またはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ遺伝子である。
【００９０】
一方、ベクターは、非相同組換えによって、宿主細胞のゲノムに組込むことができる。
【００９１】
ポリペプチドをコードする１コピーを超える核酸配列を宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増加させてもよい。これは、好ましくは、ＤＮＡ配列のそのゲノムコピーに組込むことによって、より好ましくは、高度に発現される遺伝子座、好ましくはグルコアミラーゼ遺伝子座または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の遺伝子座でＤＮＡ配列の組込みを標的化することによって、行うことができる。あるいは、これは、核酸配列を伴う増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって行うことができ、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれによる核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞を、適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養することによって、選択することができる。過剰発現させようとするＤＮＡ配列のコピー数をさらにより増加するために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載の遺伝子変換技術を使用してもよい。
【００９２】
上記のエレメントを連結して、本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、上掲を参照のこと）。
【００９３】
本発明はまた、ポリペプチドをコードするコード配列と作動可能に会合される本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含む組換え宿主細胞に関し、これは、ポリペプチドの産生において有利に使用される。ポリペプチドをコードするコード配列と作動可能に会合される本発明のプロモーターを含むベクターは、ベクターが染色体組込み体としてかまたは先に記載のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に生じる変異のため親細胞とは同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に大きな程度で依存する。
【００９４】
本発明はまた、２つ以上の本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含む組換え宿主細胞に関し、それぞれのプロモーターは、ポリペプチドをコードするコード配列と作動可能に会合される。かかる宿主細胞は、少なくとも１つのポリペプチドの組換え産生において有利に使用することができる。好ましくは少なくとも１つのプロモーターおよびその会合されるコード配列は、ベクター上に存在する。ベクターは、それが、染色体組込み体としておよび／または先に記載のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。
【００９５】
別の好適な実施態様に従えば、宿主細胞は、（β−ラクタム）抗生物質、ビタミンもしくはカロテノイドなどの特定の一次または二次代謝物の産生のために使用される。
【００９６】
宿主細胞は、本発明の方法において有用ないずれの真菌細胞であってもよい。本明細書において使用する「真菌」としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ、第８版、１９９５年、ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国により記載される）ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、上掲、１７１頁において引用される）およびすべての栄養胞子形成菌（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ  ｆｕｎｇｉ）（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、上掲）が挙げられる。
【００９７】
好適な実施態様では、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において使用する「酵母」としては、有子嚢胞子（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母（エンドミセタレス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子形成（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  ｌｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母が挙げられる。酵母の分類は将来変化し得るため、本発明の目的のために、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（スキナー，Ｆ．Ａ．（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．）、パスモア，Ｓ．Ｍ．（Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．）、およびダベンポート，Ｒ．Ｒ．（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．）編、Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第９回シンポジウム、１９８０年）において記載のように規定されるべきである。
【００９８】
より好適な実施態様では、酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００９９】
最も好適な実施態様では、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ダグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロミセス・オヴィフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も好適な実施態様では、酵母宿主細胞は、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好適な実施態様では、酵母宿主細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
【０１００】
別の好適な実施態様では、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。「糸状菌」は、亜門の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべての糸状形態を含む（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、上掲により規定される）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖からなる菌糸体の壁によって特徴付けられる。栄養生長は菌糸伸長により、炭素の異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養生長は単細胞葉状体の出芽により、炭素の異化は発酵性であり得る。
【０１０１】
より好適な実施態様では、糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トイポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種の細胞であるが、これらに限定されない。
【０１０２】
最も好適な実施態様では、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）または麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）細胞である。最も好適な別の実施態様では、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリディオデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェルエンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｎ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコチロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルプレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルローサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、またはフザリウム・ヴェネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）細胞である。最も好適な別の実施態様では、糸状真菌宿主細胞は、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パルロゼラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、シーラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギプラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
【０１０３】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、およびそれ自体公知の様式での細胞壁の再生を包含するプロセスによって形質転換することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換に適切な手順については、ＥＰ２３８０２３号明細書およびエルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、１９８４年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４に記載されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）および他の糸状真菌宿主細胞の形質転換に適切な手順については、例えば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年９月；１６（９）：８３９−４２．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８年１１月；１６（１１）：１０７４に掲載の訂正表．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ、デグルート  ＭＪ（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＭＪ）、バンドドック  Ｐ（Ｂｕｎｄｏｃｋ  Ｐ）、フーカス  ＰＪ（Ｈｏｏｙｋａａｓ  ＰＪ）、ベイエルスベルゲン  ＡＧ（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ  ＡＧ）．Ｕｎｉｌｅｖｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，オランダに記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換するための適切な方法については、メーラディール（Ｍａｌａｒｄｉｅｒ）ら、１９８９年、Ｇｅｎｅ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより記載されている。酵母は、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）およびグアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）、編者：エイブルソン，Ｊ．Ｎ．（Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．）およびシモン，Ｍ．Ｉ．（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、１８２−１８７頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク；イトウら、１９８３年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１５３：１６３；ならびにヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、１９７８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ７５：１９２０に記載の手順を使用して、形質転換してもよい。
【０１０４】
本発明は、宿主細胞におけるコード配列の発現のための方法にさらに関する。方法は、以下の工程を含む。すなわち、
（ａ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列および上記のコード配列を含むＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ構築物で適切な宿主細胞を形質転換すること、および
（ｃ）前記プロモーターＤＮＡ配列の制御下でコード配列を発現させること。
【０１０５】
本発明はまた、適切な真菌宿主において本発明のプロモーターの制御下にあるコード配列によってコードされるポリペプチドの産生のための方法に関する。方法は、以下の工程を含む。すなわち、
（ａ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列および上記のポリペプチドをコードするコード配列を含むＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ構築物で適切な真菌宿主細胞を形質転換すること、
（ｃ）ポリペプチドの発現をもたらす適切な培養条件下で適切な真菌宿主を培養すること、
（ｄ）培養ブロスからポリペプチドを回収すること。
【０１０６】
本発明はまた、以下を含む、適切な宿主における二次代謝物の産生のための方法に関する。すなわち、
（ａ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列および上記の二次代謝物の産生に関与する酵素をコードするコード配列を含むＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ構築物で適切な宿主細胞を形質転換すること、
（ｃ）二次代謝物の産生をもたらす適切な培養条件下で適切な真菌宿主を培養すること、および
（ｄ）培養ブロスから二次代謝物を回収すること。
【０１０７】
本発明の産生方法では、当該分野において既知の方法を使用して、細胞は、ポリペプチドまたは代謝物の産生に適切な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、適切な培地において、ならびにコード配列を発現させるおよび／またはポリペプチドを単離することが可能な条件下で、実験室あるいは産業発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、流加、もしくは固体発酵を含む）によって、培養することができる。培養は、当該分野において既知の手順を使用して、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地において行われる。適切な培地は販売者から入手可能であり、または（例えば、米国菌培養収集所（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにおいて）公開された組成に従って、調製してもよい。ポリペプチドまたは代謝物が栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドまたは代謝物は、培地から直接回収することができる。ポリペプチドまたは代謝物が分泌されない場合、それは、細胞溶解物から回収することができる。
【０１０８】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的である当該分野において既知の方法を使用して、検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、または酵素基質の消失を含み得る。
【０１０９】
得られるポリペプチドまたは代謝物は、当該分野において既知の方法によって回収することができる。例えば、ポリペプチドまたは代謝物は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、栄養培地から回収することができる。
【０１１０】
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、差分溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、編者：Ｊ．−Ｃ．ヤンソン（Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ）およびラーズ・ライデン（Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ）、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９８９年を参照のこと）を含むが、これらに限定されない当該技術分野で既知の様々な手順によって、精製することができる。
【０１１１】
本発明はまた、真菌宿主細胞に対して内因性であるポリペプチドをコードするコード配列の発現を改変するためのＤＮＡ構築物に関する。構築物は、内因性遺伝子の発現を改変するのに必要な最小数の成分を含有し得る。
【０１１２】
１つの実施態様では、核酸構築物は、好ましくは、（ａ）ターゲティング配列、（ｂ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）スプライスドナー部位を含有する。核酸構築物の細胞への導入時に、構築物は、相同組換えによって、内因性遺伝子部位で細胞ゲノムに組込む。ターゲティング配列は、エレメント（ｂ）〜（ｄ）が内因性遺伝子と作動可能に会合されるように、エレメント（ａ）〜（ｄ）の内因性遺伝子への組込みを指令する。
【０１１３】
別の実施態様では、核酸構築物は、（ａ）ターゲティング配列、（ｂ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位を含有し、ここで、ターゲティング配列は、エレメント（ｂ）〜（ｆ）が内因性遺伝子と作動可能に会合されるように、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指令する。しかし、構築物は、選択マーカーなどのさらなる成分を含有してもよい。使用することができる選択マーカーについては、先に記載された。
【０１１４】
両方の実施態様において、これらの成分の導入は、内因性遺伝子の発現が改変される新たな転写単位の生成を生じる。本質的に、新たな転写単位は、ターゲティング構築物によって誘導される配列と内因性遺伝子との融合産物である。内因性遺伝子が改変される１つの実施態様では、遺伝子が活性化される。本実施態様では、相同組換えを使用して、対応する親細胞において認められるレベルよりも高いレベルで遺伝子を発現させる調節配列の挿入を介して、親細胞の内因性遺伝子に、通常会合される調節領域を置換、破壊、または不能にする。
【０１１５】
ターゲティング配列は、内因性遺伝子内にあるか、遺伝子の直ぐ隣にあるか、上流の遺伝子内にあるか、または内因性遺伝子の上流かつ離れた場所にあり得る。１つもしくはそれ以上のターゲティング配列を使用することもできる。例えば、環状プラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、好ましくは、単一のターゲティング配列を用いる一方、線状プラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、好ましくは、２つのターゲティング配列を用いる。
【０１１６】
構築物は、内因性遺伝子の１つもしくはそれ以上のエキソンをさらに含有する。エキソンは、エキソン配列が内因性遺伝子のコード領域を伴うフレーム内に存在するように、ＲＮＡにコピーされ、成熟ｍＲＮＡ分子に存在するＤＮＡ配列として規定される。エキソンは、場合により、１つもしくはそれ以上のアミノ酸をコードするおよび／またはアミノ酸を部分的にコードするＤＮＡを含有し得る。あるいは、エキソンは、５’非コード領域に対応するＤＮＡを含有する。外因性エキソンが１つもしくはそれ以上のアミノ酸および／またはアミノ酸の部分をコードする場合、第２のエキソンから誘導されるｍＲＮＡの部分の適切なリーディングフレームが変更されないように、転写およびスプライシング時に、リーディングフレームが、内因性遺伝子のコード領域を伴うフレーム内にあるように、核酸構築物が設計される。構築物のスプライスドナー部位は、１つのエキソンの別のエキソンへのスプライシングを指令する。典型的に、第１のエキソンは第２のエキソンの５’にあり、第１のエキソンの３’側に重複および隣接するスプライスドナー部位は、第２のエキソンの５’側で第２のエキソンに隣接するスプライスアクセプター部位を認識する。スプライスアクセプター部位は、スプライスドナー部位と同様に、１つのエキソンの別のエキソンへのスプライシングを指令する配列である。スプライシング装置は、スプライスドナー部位と協働して作用し、スプライスアクセプター部位を使用して、イントロンの取り出しを生じさせる。
【０１１７】
所定のＤＮＡ配列の発現を改変するための好適なストラテジーは、所定のＤＮＡ配列の欠失および／または本発明のプロモーターなどの修飾されたプロモーターＤＮＡ配列による所定のＤＮＡ配列の内因性プロモーター配列の置換を含む。欠失および置換は、好ましくは、ＥＰ０３５７１２７号明細書に記載の遺伝子置換技術によって実施される。遺伝子および／またはプロモーター配列の特異的欠失は、好ましくは、ＥＰ６３５５７４号明細書に記載のように、ａｍｄＳ遺伝子を選択マーカー遺伝子として使用して実施される。ＥＰ６３５５７４号明細書に記載のようなフルオロアセトアミド（ｆｌｕｏｒａｃｅｔａｍｉｄｅ）培地に対する対抗選択によって、得られる株は、選択マーカーを含まず、さらなる遺伝子修飾に使用することができる。
【０１１８】
あるいは、他の言及した技術との組み合わせで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコスミドのインビボ組換えに基づく技術を使用することができ、これについては：Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（２０００年）チャベロチェ，Ｍ−Ｋ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ，Ｍ−Ｋ）、チコ，Ｊ−Ｍ．（Ｇｈｉｃｏ，Ｊ−Ｍ．）およびダンフェール  Ｃ（ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ  Ｃ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２８巻、２２号に記載されている。この技術は、例えば、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のような他の糸状菌にも適用可能である。本明細書において開示される特定の実施態様は、本発明のいくつかの態様の例示として意図されるため、本明細書において説明および特許請求される本発明は、これらの実施態様によってその範囲が限定されるべきではない。任意の等価な実施態様は、本発明の範囲内にあることが意図される。実際、本明細書において示しかつ説明される改変の他にも、本発明の多様な改変が存在することは、先の記載から当業者には明らかであろう。かかる改変もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。抵触する場合については、定義を含む本発明の開示内容が優先される。
【０１１９】
本明細書において言及した特許および刊行物において開示されるすべての配列および方法を含むすべての特許および刊行物は、参照により明確に援用される。これらの特許および刊行物には次のものが含まれる。すなわち、ＥＰ３５７１２７号明細書、ＥＰ６７３４２９号明細書、ＥＰ６３５５７４号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９４／０４６７３号パンフレット。
【実施例】
【０１２０】
実験の情報
株
ＷＴ１：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を野生型株として使用する。この株は、寄託番号ＣＢＳ５１３．８８でＣＢＳ研究所（ＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に寄託される。
【０１２１】
ＷＴ２：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、グルコアミラーゼをコードする遺伝子（ｇｌａＡ）の欠失を含むＷＴ１株である。ＷＴ２は、ＥＰ０６３５５７４号明細書に記載のように、「マーカー遺伝子を含まない（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ）」アプローチを使用して、構築した。本特許では、ＣＢＳ５１３．８８のゲノムにおけるｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列を欠失する仕方について、広範に説明する。該手順により、最終的に外来性のＤＮＡ配列を全く所有しない、マーカーを含まない（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ）（？）ｇｌａＡ組換えＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８株が得られた。
【０１２２】
グルコアミラーゼ活性アッセイ
国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載のように、ｐ−ニトロフェニルａ−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用して、グルコアミラーゼ活性を決定した。
【０１２３】
実施例１
コード配列と作動可能に会合される本発明のプロモーターを含むＤＮＡ構築物の構築
本実施例では、本発明のプロモーターの制御下にある発現構築物の構築について説明する。ここで使用するコード配列またはレポーター構築物は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ酵素をコードするｇｌａＡ遺伝子である。グルコアミラーゼは、本発明のプロモーターの活性を測定することが可能であるレポーター酵素として使用する。
【０１２４】
１．１  集成的グルコアミラーゼ発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ）の説明
グルコアミラーゼプロモーターおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の遺伝子ｇｌａＡをコードするグルコアミラーゼを、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載の発現ベクターｐＧＢＴＯＰ−８にクローニングした。既知の原理および日常的なクローニング技術に従って、クローニングを実施し、プラスミドｐＧＢＴＯＰＧＬＡ（図１を参照のこと）を得た。本質的に、この発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターにおける３’および３’’ｇｌａＡターゲティング部位に隣接されるグルコアミラーゼプロモーター、コード配列およびターミネーター領域を含む。
【０１２５】
１．２  複数のクローニング部位ＭＣＳを伴う集成的グルコアミラーゼ発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２）の構築
テンプレートとして、オリゴヌクレオチド５’−ＡＴｇＣｇｇＣＣｇＣＣＴＣｇＡｇＴＴＡＡＴＴＡＡｇｇＣＣＡｇｇＣＣｇｇＣＣｇｇＣｇＣｇＣＣＴＣＡｇＣＡＡＴｇＴＣｇＴＴＣＣｇＡ−３’（配列番号６として同定される）および５’−ＡＧＣＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号７として同定される）および１ｎｇのベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡを使用して、ｇｌａＡコード配列の部分を含有するＰＣＲフラグメントを作製した。このフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ消化したベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡに導入し、ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２（図２を参照のこと）を得た。ＭＣＳおよびｇｌａＡコード配列の一部を含む導入されたＰＣＲフラグメントの配列を、配列解析によって確認した。
【０１２６】
１．３  グルコアミラーゼコード配列と作動可能に会合される本発明のプロモーターを伴う集成的発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−３）の構築
株ＣＢＳ５１３．８８のゲノムＤＮＡを配列決定し、解析した。表において（オリゴ配列番号）以下のように同定されるオリゴヌクレオチドの組み合わせおよび株ＣＢＳ５１３．８８のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲ増幅により、適切な制限部位を本発明のプロモーターに付着させた。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５において同定される配列は、以下の表において同定されるように、約２ｋｂの得られるフラグメントの配列を含む。すべての５つの得られるフラグメントを、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ消化したベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２に導入し、表（ベクターの名称）において同定されるように、ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−４、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−５、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−７、ＧＢＴＯＰＧＬＡ−９またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１０を得た。図３では、５つのすべてのベクターのレイアウトを例示する図を見出すことができる。本発明のプロモーターを含む多様な導入されたＰＣＲフラグメントの配列を、配列解析によって確認した。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
実施例２．ＤＮＡ構築物で形質転換された真菌宿主細胞
ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−４、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−５、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−７、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−９またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１０ベクターをＷＴ２に導入するために、形質転換およびその後の形質転換体選択を、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載のとおりに行った。原則として、ＮｏｔＩによる消化後、すべてのベクターの線状ＤＮＡを単離し、ｐＧＢＡＡＳ−１で示されるａｍｄＳ選択マーカー遺伝子含有ベクターで同時形質転換した（ＥＰ６３５５７４号明細書に記載のとおりに構築した）。両方のベクターは、ＷＴ２における短縮型ｇｌａＡ遺伝子座への標的化を指令するためのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主株のｇｌａＡ遺伝子座に相同な２つのＤＮＡドメインを含む。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的手順に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロアセトアミド培地上に配置し、ａｍｄＳマーカーを消失した株を選択した。増殖中のコロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座での組込みおよびコピー数について診断した。類似の予想されるコピー数を伴うｐＧＢＴＯＰＧＬＡ、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−４、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−５、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−７、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−９またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１０の形質転換体を選択した。好ましくは、単一コピーを伴う若干の形質転換体（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）およびおそらく、複数コピーを伴う１つの形質転換体（２Ａ）を選択した。
【０１２９】
さらに、選択マーカー遺伝子および本発明のプロモーターによって制御される目的の遺伝子は１つの構築物上に存在している。この例を図４に示す。
【０１３０】
実施例３．真菌宿主細胞における本発明のプロモーターの制御下でｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの産生
多くの選択された上記のようなＷＴ２の形質転換体、および両方の５つの株ＷＴ１およびＷＴ２を使用し、５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコを使用する恒温振盪器において、ＥＰ６３５５７４号明細書に記載のような１００ｍｌの培地中、３４℃および１７０ｒｐｍで、振盪フラスコ実験を実施した。発酵の４および５日後、サンプルを採取し、上記のようにグルコアミラーゼ活性を決定した。グルコアミラーゼ活性を、４日目のＷＴ１の活性に対して正規化した。ＷＴ１、ＷＴ２、ならびにｐＧＢＴＯＰＧＬＡ、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−５、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−７、およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１０について多くの選択された形質転換体の正規化された活性を図５に示す。
【０１３１】
グルコアミラーゼレポーターの測定される活性から結論し得るように、本発明は、真菌細胞において、目的の遺伝子の高い発現のための強力なプロモーターを提供する。従って、本発明のプロモーターは、真菌細胞において、目的の遺伝子の高い発現のための代替的およびさらなるプロモーターを提供する。
【０１３２】
実施例４．本発明のプロモーターを含むプロモーター置換構築物ｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡの構築
宿主細胞における所定の遺伝子の発現レベルを改変するために、本発明のプロモーターは、前記所定の遺伝子の内因性プロモーターと置き換わることができる。本実験では、本発明のプロモーターは、真菌宿主細胞においてｇｌａＡ遺伝子をコードするグルコアミラーゼのプロモーターと置き換わる。実施例４、５および６では、このプロセスにおける多くの異なる工程について説明している。
【０１３３】
グルコアミラーゼプロモーターのための置換ベクターを、既知の原理に従って設計し、日常的なクローニング手順に従って構築した（図６を参照のこと）。本質的に、ｇｌａＡプロモーター置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡは、予め定められた遺伝子座での相同組換えを介して本発明のプロモーター（配列番号４に含まれる）によって置換されるべきｇｌａＡプロモーター配列の約１０００ｂｐフランキング領域を含む。ここで使用されるフランキング領域（図６を参照のこと）は、ｇｌａＡプロモーターの５’上流領域であり、ｇｌａＡコード配列の部分である。さらに、置換ベクターは、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）両方向性ａｍｄＳ選択マーカーを中間的なダイレクトリピートで含有する。本実施例で使用されるダイレクトリピートは、ｇｌａＡコード配列の部分である。これらの欠失ベクターの一般的な設計については、ＥＰ６３５５７４号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットにおいて先に記載された。
【０１３４】
実施例５．真菌宿主細胞における本発明のプロモーターによるｇｌａＡプロモーターの置換
ＮｏｔＩ消化した欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡの線状ＤＮＡを単離し、ＷＴ１（ＣＢＳ５１３．８８）を形質転換するために使用した。この線状ＤＮＡは、ｇｌａＡ遺伝子座でゲノムに組込むことができ、従って、ｇｌａＡプロモーター領域をａｍｄＳおよび本発明のプロモーターを含有する構築物で置換する（図７を参照のこと）。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的手順に従ってコロニーを精製した。増殖中のコロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座での組込みについて、ＰＣＲによって診断した。ｇｌａＡプロモーターの欠失は、本発明のプロモーターに特異的なサイズを伴うバンドの増幅、およびｇｌａＡプロモーターに特異的なバンドの消失によって、検出した。胞子をフルオロアセトアミド培地上に配置し、ａｍｄＳマーカーを消失した株を選択した。候補株を、グルコアミラーゼプロモーターの適切な欠失および配列番号４に含まれる本発明のプロモーターによる置換について、サザン分析を使用して試験した。株ｄＰＧＬＡＡを、ｇｌａＡプロモーターが本発明のプロモーターによって置換され、回復された機能的ｇｌａＡコード配列を有する代表的株として選択した（図７を参照のこと）。
【０１３５】
実施例６．真菌宿主細胞における本発明の置換されたプロモーターの制御下でｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの産生
選択されたｄＰＧＬＡＡ株（実施例５において単離されたＷＴ１の適切なｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡ形質転換体）および株ＷＴ１を使用して、５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコを使用する恒温振盪器において、欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書に記載のような１００ｍｌの培地中、３４℃および１７０ｒｐｍで、振盪フラスコ実験を実施した。さらなる条件および活性測定は、実施例３に記載のとおりであった。ＷＴ１の選択されたｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡ形質転換体におけるグルコアミラーゼ活性は、発酵の両方の日にＷＴ１について測定した活性と比較して増加していた（データ示さず）。
【０１３６】
実施例７．真菌宿主細胞における本発明のプロモーターの制御下におけるさらなるｇｌａＡ遺伝子の付加
宿主細胞において所定の遺伝子の発現レベルを改変するために、本発明のプロモーターに作動可能に連結された複数のさらなるコピーの前記遺伝子を、内因的に付与された遺伝子に付加することができる。本実施例では、配列番号４に含まれ、ｇｌａＡコード配列に作動可能に連結される本発明のプロモーターを、真菌宿主細胞において内因的に存在するｇｌａＡ遺伝子をコードするグルコアミラーゼの隣に導入する。実施例７、および８では、このプロセスにおける多くの異なる工程について説明している。
【０１３７】
図８に示される環状構築物を単離し、ＷＴ１（ＣＢＳ５１３．８８）を形質転換するために使用した。この線状ＤＮＡは、ｇｌａＡコード配列においてゲノムに組込むことができ、従って、本発明のプロモーターの制御下の第２のｇｌａＡ遺伝子を、選択マーカーａｍｄＳの隣に付加することができる（図８を参照のこと）。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的手順に従ってコロニーを精製した。増殖中のコロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座での組込みについて、ＰＣＲによって診断した。ｇｌａＡ遺伝子座の組込みを、ＰＣＲおよびサザン分析によって検出した。株Ｐ２ＧＬＡＡを、ｇｌａＡ遺伝子座で組込まれる本発明のプロモーターの制御下にある少なくとも第２のｇｌａＡ遺伝子を伴う代表的株として選択した。
【０１３８】
実施例８．真菌宿主細胞における本発明のプロモーターおよび内因性ｇｌａＡプロモーターの制御下でｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの産生
実施例７において単離された選択されたＰ２ＧＬＡＡ株、および株ＷＴ１を使用して、実施例３に記載のように、１００ｍｌの培地において、振盪フラスコ実験を実施した。発酵の４および６日後、サンプルを採取し、グルコアミラーゼ活性を決定した。ＷＴ１の選択されたＰ２ＧＬＡＡ形質転換体におけるグルコアミラーゼ活性は、発酵の４または５日後のいずれかで、ＷＴ１について測定した活性と比較して増加した。グルコアミラーゼレポーターの活性の増加は、本発明のプロモーターが、真菌細胞において強力なプロモーター下で既に発現されている目的の遺伝子の発現をさらに増加する手段を提供することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】集成的グルコアミラーゼ発現ベクターであるｐＧＢＴＯＰＧＬＡのプラスミドマップを表す。
【図２】複数のクローニング部位を伴う集成的グルコアミラーゼ発現ベクターであるｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２のプラスミドマップを表す。
【図３】グルコアミラーゼコード配列と作動可能に会合される本発明のプロモーターを含有する集成的発現ベクターであるｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−３のプラスミドマップを表す。
【図４】単一の相同組換えを介する組み込みの略図を表す。
【図５】ＷＴ１、ＷＴ２および多様なｐＧＢＴＯＰＧＬＡベクターの形質転換体のグルコアミラーゼ活性。４日目のＷＴ１の活性を１００％と設定した場合の正規化された活性を示す。
【図６】置換ベクターであるｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＧＬＡＡのプラスミドマップを表す。
【図７】プロモーター置換の略図を表す。
【図８】相同組換えを介する組み込みの略図を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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