(57)【要約】【解決手段】  分娩後胎盤から由来した細胞、及びそれらを単離する方法が本発明によって提供される。本発明はさらに、前記胎盤由来細胞の培養及び組成物も提供する。本発明の胎盤由来細胞は、これに限定されるものではないが、研究、診断、及び治療用適用を含む多血症に対する使用を含むものである。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に血液を含まないヒト分娩後胎盤組織から由来した細胞を有する、胎盤由来細胞であって、
前記細胞は培養において自己複製及び増殖し、前記細胞は多能性であり、前記細胞は、増殖のためにＬ−バリンを必要とし、前記細胞は、約５％〜約２０％の酸素において増殖し、前記細胞はさらに、以下の特徴、
（ａ）組織因子、ビメンチン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、及びアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＧＲＯ−アルファ、及び酸化型低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの産生の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つに対して増加した発現、
（ｆ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンα（アルファ）Ｂ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α（アルファ）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα（アルファ）１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ（ベータ）８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα（アルファ）７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）の少なくとも１つに対して減少した発現、
（ｇ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１ａ
）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１つの分泌、
（ｈ）ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の少なくとも１つの分泌の欠如、
（ｉ）培養において、少なくとも４０継代を経る能力、
の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、組織因子、ビメンチン、顆粒球走化性タンパク質−（ＧＣＰ−２）、及びアルファ−平滑筋アクチンを産生するものである。
【請求項３】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、フローサイトメトリーによって検出されたように、ＧＲＯ−アルファ及び酸化型低密度リポタンパク質受容体の産生が欠如しているものである。
【請求項４】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを産生するものである。
【請求項５】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの産生が欠如しているものである。
【請求項６】
請求項１の細胞において、
前記発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３に対して増加しているものである。
【請求項７】
請求項１の細胞において、
前記発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンα（アルファ）Ｂ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α（アルファ）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα（アルファ）１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ（ベータ）８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα（アルファ）７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）に対して減少しているものである。
【請求項８】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンを分泌するものである。
【請求項９】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の分泌を欠如するものである。
【請求項１０】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、培養において少なくとも４０継代を経る能力を有するものである。
【請求項１１】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、以下の特徴、
（ａ）組織因子、ビメンチン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、及びアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＧＲＯ−アルファ、及び酸化型低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの産生の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つに対して増加した発現、
（ｆ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンα（アルファ）Ｂ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α（アルファ）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα（アルファ）１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ（ベータ）８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα（アルファ）７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）の少なくとも１つに対して減少した発現、
（ｇ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１つの分泌、
（ｈ）ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の少なくとも１つの分泌の欠如、
（ｉ）培養において、少なくとも４０継代を経る能力、
を有するものである。
【請求項１２】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、
（ａ）組織因子、ビメンチン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、及びアルファ−平滑筋アクチンを産生する、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＧＲＯ−アルファ、及び酸化型低密度リポタンパク質受容体の産生が欠如している、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを産生する、
（ｄ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの産生が欠如している、
（ｅ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３が増加したレベルで発現している、
（ｆ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンα（アルファ）Ｂ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α（アルファ）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα（アルファ）１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ（ベータ）８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα（アルファ）７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）が減少したレベルで発現している、
（ｇ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンを分泌する、
（ｈ）ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の分泌が欠如している、及び
（ｉ）培養において、少なくとも４０継代を経る能力を有するものである。
【請求項１３】
分娩後胎盤或いはそれらの断片から、酵素的解離によって単離された、請求項１の胎盤由来細胞。
【請求項１４】
請求項１３の胎盤由来細胞において、
前記細胞は、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びヒアルロン酸を消化するムコ多糖類溶解性酵素での酵素的解離によって単離されるものである。
【請求項１５】
請求項１４の胎盤由来細胞において、
前記マトリックスメタロプロテアーゼは、コラゲナーゼである。
【請求項１６】
請求項１４の胎盤由来細胞において、
前記中性プロテアーゼは、ディスパーゼである。
【請求項１７】
請求項１４の胎盤由来細胞において、
前記ムコ多糖類溶解性酵素は、ヒアルロニダーゼである。
【請求項１８】
請求項１の胎盤由来細胞において、
前記細胞は、０〜２５回継代されるものである。
【請求項１９】
請求項１の胎盤由来細胞において、
前記細胞は、新生児株のものである。
【請求項２０】
請求項ｂ１の胎盤由来細胞において、
前記細胞は、母性株のものである。
【請求項２１】
ダルベッコ変法イーグル培養液（ＤＭＥＭ）−低グルコース、ＤＭＥＭ−高グルコース、間葉系幹細胞成長培養液、ＲＰＭＩ１６４０、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥ、改変ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培養液、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ変法ダルベッコ培養液、或いはイーグル基礎培養液を有する培養液において増殖する、請求項１の胎盤由来細胞。
【請求項２２】
請求項２１の胎盤由来細胞において、
前記培養液は、２％〜１５％（ｖ／ｖ）血清を有するものである。
【請求項２３】
請求項２１の胎盤由来細胞において、
前記培養液は、ベータメルカプトエタノールを有するものである。
【請求項２４】
請求項２１の胎盤由来細胞において、
前記培養液は、少なくとも１つの抗生物質を有するものである。
【請求項２５】
請求項２１の胎盤由来細胞において、
前記細胞は、増殖のために、以下の培養液：成長培地>ＭＳＣＧＭ>Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ＋１０％血清＝ＤＭＥＭ−高グルコース＋１０％血清＝ハムズＦ１２＋１０％血清＝ＲＰＭＩ１６４０＋１０％血清において増殖するものである。
【請求項２６】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、タンパク質を含まない培養液において増殖するものである。
【請求項２７】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、無血清培養液において増殖するものである。
【請求項２８】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、Ｌ−バリンの非存在下では増殖できないものである。
【請求項２９】
請求項２１の細胞において、
前記細胞は、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管内皮細胞増殖因子、及び上皮細胞成長因子の少なくとも１つの存在下で増殖するものである。
【請求項３０】
請求項２１の細胞において、
前記細胞は、非コーティングされた表面上で増殖するものである。
【請求項３１】
請求項２１の細胞において、
前記細胞は、コラーゲン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、オルニチン、ラミニン、或いは細胞外膜タンパク質でコーティングされた表面上で増殖するものである。
【請求項３２】
請求項１の細胞を有する、均一な細胞集団。
【請求項３３】
請求項１の細胞を有する、不均一な細胞集団。
【請求項３４】
請求項３３の細胞集団において、
前記集団は、少なくとも約１０％の請求項１の細胞を有するものである。
【請求項３５】
請求項３４の集団であって、さらに、
中胚葉、外胚葉、或いは内胚葉表現型へ分化する能力を有する幹細胞或いは前駆細胞の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３６】
請求項３２の細胞集団であって、さらに、
血小板由来成長因子−ｂｂ、上皮細胞成長因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞成長因子、或いは白血病抑制因子の少なくとも１つの成長因子を有するものである。
【請求項３７】
少なくとも１つの請求項１の細胞を有する細胞培養。
【請求項３８】
請求項３７の細胞培養であって、さらに、
血小板由来成長因子−ｂｂ、上皮細胞成長因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞成長因子、或いは白血病抑制因子の少なくとも１つの成長因子を有するものである。
【請求項３９】
培養において少なくとも４０継代を経ることができる、請求項３７の培養。
【請求項４０】
請求項１の細胞によって産生された細胞外マトリックス。
【請求項４１】
請求項１の細胞の細胞溶解液。
【請求項４２】
請求項１の細胞を有する基質。
【請求項４３】
請求項４２の基質において、
前記基質は、３次元足場である。
【請求項４４】
ＶＩＣＲＹＬ不織足場、３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合可能ゲル、或いは自己集合性ペプチドハイドロゲルを有する、請求項４３の基質。
【請求項４５】
分娩後人胎盤或いはそれらの断片から胎盤由来細胞を単離する方法であって、
マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びヒアルロン酸を消化するムコ多糖類加水分解酵素を用いて、前記胎盤或いは断片から前記細胞を解離する工程を有する方法。
【請求項４６】
請求項４５の方法において、
前記マトリックスメタロプロテアーゼは、コラゲナーゼを有するものである。
【請求項４７】
請求項４５の方法において、
前記中性プロテアーゼは、ディスパーゼを有するものである。
【請求項４８】
請求項４５の方法において、
前記ムコ多糖類加水分解酵素は、ヒアルロニダーゼを有するものである。
【請求項４９】
請求項４５の方法であって、さらに、
前記解離する工程の前に、前記胎盤或いは断片を機械的に解離する工程を有するものである。
【請求項５０】
請求項４５の方法にであって、さらに、
培養液において前記細胞を増殖する工程を有するものである。
【請求項５１】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、ＲＰＭＩ６４０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培養液、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、間葉系幹細胞成長培地、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ変法ダルベッコ培養液、ダルベッコ変法イーグルス培養液（ＤＭＥＭ）、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、改変ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、或いはイーグルス基礎培養液を有するものである。
【請求項５２】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）血清を有するものである。
【請求項５３】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、ベータ−メルカプトエタノールを有するものである。
【請求項５４】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、少なくとも１つの抗生物質を有するものである。
【請求項５５】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、グルコースを有するものである。
【請求項５６】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、Ｌ−バリンを有するものである。
【請求項５７】
請求項５０の方法において、
前記培養液は、ＤＭＥＭ−低グルコース、ベータ−メルカプトエタノール、血清、及び抗生物質を有するものである。
【請求項５８】
請求項４５の方法において、
前記胎盤の前記断片は、胎盤の新生児側の断片である。
【請求項５９】
請求項４５の方法において、
前記胎盤の前記断片は、胎盤の母性側の断片である。
【請求項６０】
請求項４５の方法であって、さらに、
前記胎盤由来細胞を凍結保存する工程を有するものである。
【請求項６１】
請求項４５の方法であって、さらに、
前記胎盤由来細胞を保存する工程を有するものである。
【請求項６２】
請求項４５の方法であって、さらに、
前記選択された細胞を非コーティングされた表面上で増殖させる工程を有するものである。
【請求項６３】
請求項４５の方法であって、さらに、
前記選択された細胞をコーティングされた表面上で増殖させる工程を有するものである。
【請求項６４】
請求項６３の方法において、
前記表面は、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、或いは細胞外膜タンパク質の少なくとも１つでコーティングされるものである。
【請求項６５】
請求項４９の細胞外マトリックスを有する基質。
【請求項６６】
請求項６５の基質において、
前記基質は、３次元足場である。
【請求項６７】
ＶＩＣＲＹＬ不織足場、３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合可能ゲル、或いは自己集合性ペプチドハイドロゲルを有する、請求項６６の基質。
【請求項６８】
請求項４１の細胞溶解液を有する基質。
【請求項６９】
請求項６８の基質において、
前記基質は、３次元足場である。
【請求項７０】
ＶＩＣＲＹＬ不織足場、３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合可能ゲル、或いは自己集合性ペプチドハイドロゲルを有する、請求項６９の基質。
【請求項７１】
培養において請求項１の細胞を増殖させることによって、胎盤由来細胞の集団を産生する方法。
【請求項７２】
請求項７１の方法において、
前記細胞を増殖させる工程は、ＲＰＭＩ６４０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培養液、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、間葉系幹細胞成長培地、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ変法ダルベッコ培養液、ダルベッコ変法イーグルス培養液（ＤＭＥＭ）−高グルコース、ＤＭＥＭ−低グルコース、改変ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、或いはイーグルス基礎培養液において前記細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項７３】
請求項７１の方法において、
前記増殖させる工程は、ＤＭＥＭ−低グルコース、血清、ベータ−メルカプトエタノール、及び抗生物質を有する培養液において前記細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項７４】
請求項３７の培養の増殖によって産生された、条件培養液。
【請求項７５】
インターロイキン８（ＩＬ８）、組織因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１ａ）、単球化学誘引物質（ＭＣＰ−１）、Ｒｎａｔｅｓ（活性を制御された、発現及び分泌された正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１つを有する、請求項７４の条件培養液。
【請求項７６】
請求項７５の条件培養液、及び、インターロイキン８（ＩＬ８）、組織因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン−結合性上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１ａ）、単球化学誘引物質（ＭＣＰ−１）、Ｒｎａｔｅｓ（活性を制御された、発現及び分泌された正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１つを必要とする哺乳類細胞を有する、細胞培養。
【請求項７７】
請求項７６の細胞培養において、
前記哺乳類細胞は、幹細胞或いは前駆細胞である。
【請求項７８】
請求項１の胎盤由来細胞において、
前記特徴は、前記細胞の継代でも安定である。
【請求項７９】
請求項１の少なくとも１つの細胞、及び足場、水和性因子、細胞培養基質、及び細胞培養液の少なくとも１つの付加的構成成分を有する、キット。
【請求項８０】
請求項７９のキットにおいて、
前記細胞は、凍結乾燥されているものである。
【請求項８１】
請求項７９のキットにおいて、
前記細胞は、前記足場上に播種されるものである。
【請求項８２】
目的のタンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照  
本出願は、２００３年６月２７日に出願された米国仮出願番号第６０／４８３，２６４号に対して優先権を主張しており、この全体の内容はこの参照によって本明細書に組み込まれる。他の関連出願は、以下の同一出願人による同時係属出願：２００４年６月２５日に出願された米国特許番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ１］号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ３］号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ４］号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ５］号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ７］号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ８］号、及び２００４年３月２４日に出願された米国仮出願番号第６０／５５５，９０８号を含み、これらそれぞれの全体の内容はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、哺乳類の細胞生物学と細胞培養の分野に関するものである。特に、本発明は複数の系譜に分化する能力を有する分娩後胎盤組織に由来した培養細胞と、胎盤組織由来細胞を調整する方法とその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
細胞からの器官及び組織発生は、多くの病態に対する将来性のある治療を提供し、それにより作成される幹細胞は、多くの領域における中心的な研究焦点となっている。ヒト幹細胞は、様々な成熟ヒト細胞系譜を作成することができる。そのような細胞の移植は、標的組織を再構成することによって、生理学的および解剖学的機能を修復するための臨床的手段として利用され得る。幹細胞技術の応用は広範で、組織工学と遺伝子治療デリバリ、及び悪性腫瘍、先天性代謝異常症、異常血色素症、及び免疫不全を含む障害に対する細胞治療を含む。
【０００４】
幹細胞技術の治療での治療可能性を現実化するための１つの障害は、十分な数のヒト幹細胞を取得する困難さにあった。幹細胞の１つの源は、胚組織または胎児組織である。胚性幹細胞および前駆細胞は、ヒトを含めた、いくつかの哺乳類から単離された。しかしながら、胚性または胎児性の源から幹細胞を取得することについては、多くの倫理上かつ道徳上の問題が挙げられている。
【０００５】
幹細胞は、成体組織からも単離された。成体源からの幹細胞を単離する方法は、しばしば限られた量の細胞のみ、及び／若しくは限られた分化能力を有する細胞が得られる。
【０００６】
分娩後組織は、ヒト幹細胞に対する代わりの源として関心をもたれている。例えば、胎盤を灌流することによって、または臍帯血から回収することによって、幹細胞を回復させる方法が記載されている。これらの方法からの幹細胞の獲得の限界は、得られる臍帯血の量や細胞数が不十分であることである。
【０００７】
従って、たくさんの細胞系譜へ分化する能力を有する細胞を十分に供給する代わりの源には、凍結乾燥及び／若しくは臨床適用における使用に対する大きな要求がまだ残されている。そのような細胞は、凍結乾燥及び／若しくは保存、診断及び治療適用に対する薬剤スクリーニングアッセイにおいて使用される。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、分娩後胎盤から由来した細胞に関するものである。本発明の細胞は、細胞表面マーカーの存在或いは非存在、胎盤組織からの抽出方法、遺伝子発現特性、タンパク質産生特性、因子の分泌、成長特徴、及びそれら特徴のあらゆる組み合わせの１若しくはそれ以上によって特徴付けられるものである。
【０００９】
本発明は、実質的に血液を含まないヒト分娩後胎盤組織から由来した細胞を含むものである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、培養において自己複製及び増殖できるものである。本発明のいくつかの観点において、前記細胞は、別の表現型の細胞へ分化する能力を有するものである。いくつかの実施形態において、前記胎盤由来細胞は、増殖に対してＬ−バリンを要求するものである。本発明の胎盤由来細胞は、約５％〜約２０％の酸素において増殖することができる。本発明のいくつかの実施形態において、前記胎盤由来細胞は、少なくとも１つの以下の特徴：
【００１０】
（ａ）組織因子、ビメンチン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、及びアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＧＲＯ−アルファ、及び酸化低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの産生の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、及びＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポタンパク質受容体１、プロテインキナーゼＣゼータ、クローンＩＭＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つに対して増加した発現、
（ｆ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）の少なくとも１つに対して減少した発現、
（ｇ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１つの分泌、
（ｈ）ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の少なくとも１つの分泌の欠如、
（ｉ）培養において、少なくとも４０継代を経る能力、
を有するものである。
【００１１】
特定の実施形態において、前記細胞は、細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０７４）、細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０７５）、及び細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０７９）いずれか１つの同定された特徴を有するものである。本発明の前記胎盤由来細胞は、好ましくはヒト細胞である。本発明の細胞は、新生児系譜、母性系譜、或いはそれらの組み合わせである。
【００１２】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテアーゼ及び中性プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ及びヒアルロン酸を消化するムコ多糖類加水分解酵素による酵素解離を用いて、分娩後胎盤或いはそれらの断片から単離された胎盤由来細胞も提供する。好ましいマトリックスメタロプロテアーゼは、コラゲナーゼを含む。前記中性プロテアーゼは、好ましくはサーモリシン、或いはディスパーゼであり、最も好ましいのはディスパーゼである。ヒアルロン酸を消化する前記ムコ多糖類加水分解酵素は、ヒアルロニダーゼである。ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）シリーズの酵素の組み合わせは、非常に有用であり、即時的な方法においては使用される。酵素の他の供給源は、既知であり、当業者はそのような酵素を、天然源から直接得ることができる。当業者は、本発明の細胞を単離する際に有用な新規或いは付加的酵素、若しくは酵素の組み合わせを評価するために十分な知識も有するものである。好ましい酵素処理は、０．５、１、１．５、或いは２時間、若しくはそれ以上である。より好ましい実施形態において、前記組織は、分解工程の酵素処理の間、３７℃でインキュベートされるものである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態において、前記胎盤組織は、前記細胞の大部分が新生児或いは母性由来であるように、細胞抽出の前に画分へ分離されているものである。本発明のいくつかの観点において、胎盤組織は、酵素解離の工程の前に機械的に解離されているものである。いくつかの実施形態において、本発明の細胞を単離する方法はさらに、培養液において前記細胞を増殖させる工程を有するものである。前記培養液は、好ましくは、ＲＰＭＩ６４０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培養液、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、間葉系幹細胞成長培地、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ変法ダルベッコ培養液、ダルベッコ変法イーグルス培養液（ＤＭＥＭ）、改変ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、或いはイーグルス基礎培養液である。本発明のいくつかの観点において、前記培養液は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）血清、ベータ−メルカプトエタノール、グルコース、及び／若しくは抗生物質及び抗真菌薬を添加されるものである。前記培養液は好ましくは、ＤＭＥＭ、グルコース、ベータ−メルカプトエタノール、血清、及び抗生物質を有する成長培地である。前記培養液は、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管内皮細胞増殖因子、上皮細胞成長因子、及び白血病抑制因子の少なくとも１つを含むものである。本発明の細胞は、非コーティングされた、或いはコーティングされた表面上で増殖させるものである。前記細胞が増殖するための表面は、例えば、ゼラチン、コラーゲン（例えば、自然或いは未変性）、フィブロネクチン、ラミニン、オルニチン、ビトロネクチン、或いは細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州））などでコーティングされるものである。
【００１４】
本発明は、これに限定されるものではないが、約１，０００〜約５，０００細胞／ｃｍ２での播種から、約６０日で約１０１７以上を産生する、などの増殖特徴によって特徴付けられる胎盤由来細胞も、その範囲内に含む。いくつかの実施形態において、本発明の胎盤由来細胞は、培養において約８０日で少なくとも４０継代を経る能力を有するものである。
【００１５】
本発明の胎盤由来細胞は、第１の継代培養（継代０）から老化まで使用される。好ましい継代数は、所定の提供に十分な細胞数を産生する数である。特定の実施形態において、前記細胞は、２〜２５回継代され、好ましくは４〜２０回、より好ましくは８〜１５回、より好ましくは１０〜１１回、及び最も好ましくは１１回継代されるものである。
【００１６】
本発明の胎盤由来細胞の分化を誘導する方法も考慮される。本発明のいくつかの実施形態において、胎盤由来細胞は、中胚葉、外胚葉、或いは内胚葉系譜を誘導される。例えば、前記細胞は、脂肪生成、軟骨形成、骨原性、神経原性、眼球原性、膵臓原性、心筋原性、或いは肝原性系譜への分化を誘導される。本発明の細胞の分化を誘導する方法は、好ましくは前記細胞を１若しくはそれ以上の分化誘導因子へ接触させる、或いは曝す工程を含む。いくつかの実施形態において、そのように接触させる及び曝すことは、培養において生じるものである。本発明は、そのように誘導された細胞を含む。
【００１７】
本発明の細胞は、目的の遺伝子を発現するように、或いはこれに限定されるものではないが、治療用タンパク質としての目的のタンパク質を産生するように、遺伝的に操作されているものである。例えば、ＰＤＣｓは、抗炎症性化合物、或いは抗アポトーシス薬剤を発現するように、遺伝的に操作されているものである。
【００１８】
本発明の方法はさらに、培養において本発明の細胞或いは細胞群を増殖することによって、胎盤由来細胞の集団を産生する方法を含むものである。前記ＰＤＣｓは、分化誘導されるか、未分化であってもよい。いくつかの実施形態においては、胎盤由来細胞の集団は、別の細胞の集団と混合される。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、不均一である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明の未分化または分化誘導されたＰＤＣｓの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、或いは９５％を有しているものである。本発明の不均一な細胞集団はさらに、幹細胞、若しくは中胚葉、内胚葉、或いは外胚葉系譜の細胞を有するものである。本発明の細胞集団は、不均一である。胎盤由来細胞の不均一な集団は、新生児或いは母性系譜の細胞である。細胞集団の均一性は、本分野では知られたあらゆる方法、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）、或いはクローン増殖によって達成されるものである。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、患者への移植用に１若しくはそれ以上の本発明の胎盤由来細胞を組織基質上或いはそこへ播種することによって、患者に移植するための組織基質を製造する方法が提供される。前記ＰＤＣｓは、分化或いは未分化である。前記基質は、薬剤、抗アポトーシス薬剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ擬態（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、抗炎症性化合物（例えば、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６、ＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤＳ）（ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、及びＳＵＰＲＯＦＥＮなどの））、さらには局所麻酔薬、及び成長因子を含む１若しくはそれ以上の因子を含む。本発明のいくつかの観点において、前記基質は、ＰＤＣｓの細胞外マトリックス或いは細胞溶解液などの、脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）組織を有するものである。いくつかの実施形態において、前記基質は生分解性である。本発明のいくつかの観点において、前記基質は、天然或いは合成ポリマーを有している。本発明の基質は、生分解性或いは非分解性、液体或いは固体は問わず、生体適合性足場、格子、自己集合性構造、及びそれらの同等物を含む。そのような基質は、細胞ベース治療、手術的修復、組織光学、及び創傷治癒の分野において既知である。好ましい基質は、本発明の細胞、細胞外マトリックス、条件培養液、細胞溶解液、或いはそれらの組み合わせで前処理（例えば、播種、接種、接触させる）されるものである。より好ましくは、前記基質は、前記細胞と前記基質或いはそのスペースへ密接な結合で集合されている。本発明のいくつかの観点において、前記細胞は、前記基質へ接着している。最も好ましくは、前記細胞は、前記細胞が前記基質と密接に結合しており、治療用に使用した場合、患者の細胞及び／若しくは適切な血管新生を誘導する、若しくはそれらの内植を支持するような基質に播種されるものである。播種された基質は、これに限定するものではないが、移植、注入、外科的接着、他の組織との移植、注射、及びそれらと同等なものを含む、本分野では既知であるやり方によって、患者の体内へ導入することができる。本発明において使用される足場の例としては、不織マット、多孔性発泡体、或いは自己集合性ペプチドを含む。不織マットは、例えば、商品名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）で販売されている、グリコール酸及び乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る線維を用いて形成されるものである。発泡体は、例えば、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成り、これは、米国特許番号第６，３５５，６９９号（可能な足場も共に）に記載されているように、フリーズドライ、或いは凍結乾燥などの過程によって形成されるものである。自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのハイドロゲルも、使用される。こ���らの材料は、組織の増殖を支持するために頻繁に使用される。本発明の基質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組織或いは器官の形及び／若しくはサイズに対して形成される。本発明の足場は、平ら或いは管状である、或いはそれらの切片である。本発明の足場は、多層である。ＰＤＣｓを有する器官及び組織、それらの細胞外マトリックス、或いは細胞溶解液も提供される。
【００２０】
ＰＤＣｓの細胞外基質、ＰＤＣｓの細胞画分（例えば、可溶性細胞画分）、及びＰＤＣ条件培養液も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＤＣｓ、及び例えば、これに限定されるものではないが、成長因子、抗アポトーシス因子、抗炎症性因子及び／若しくは分化誘導因子などの生理活性因子の１若しくはそれ以上の組成物を提供する。
【００２２】
本発明の細胞、基質、組織、及び組成物は、凍結保存される。凍結保存された本発明の細胞及び組成物は、保存或いは貯蔵される、本発明の分娩後由来細胞を凍結保存及び／若しくは貯蔵する方法も、考慮される。
【００２３】
ＰＤＣｓの組成物、及び例えば薬学的組成物を含む関連産物は、本発明の範囲内に含まれる。ＰＤＣｓの組成物は、分化誘導因子、カスパーゼ阻害剤などの細胞生存因子、ｐ３８キナーゼ阻害剤などの抗炎症性因子、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、ＩＧＦ−１あるいはＶＥＧＦなどの成長因子、或いはＶＥＧＦ或いはｂＦＧＦなどの血管新生因子の１若しくはそれ以上を含む。胎盤由来細胞の薬学的組成物、それらによって産生された細胞外マトリックス、それらの細胞溶解液、及びＰＤＣ−条件培養液は、本発明の範囲内に含まれる。前記薬学的組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な担体或いは賦形剤を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、胎盤由来細胞或いは基質を移植する方法、及び、本発明の細胞或いは基質を患者へ移植することによって、それを必要とする患者において組織或いは基質を再生する方法が提供される。
【００２５】
さらに、本発明によって、１若しくはそれ以上の本発明の胎盤由来細胞、ＰＤＣ集団、基質、細胞溶解液、条件培養液、或いは組成物を投与することによって、患者の病気或いは障害を治療する方法が提供される。
【００２６】
本発明は、本発明の胎盤由来細胞の細胞培養も含まれる。本発明の培養は、好ましくは、最初の播種から少なくとも４０集団倍加することができるものである。
【００２７】
本発明の細胞及び組成物は、例えば、病状の治療或いは組織の修復において使用される。本発明のいくつかの実施形態において、前記治療される病状は、軟部組織（例えば、皮膚、筋肉、脈管構造、腱、靭帯、膀胱、筋膜、骨盤底）、骨、膵臓、腎臓、肝臓、神経系、目、心臓、或いは軟骨の病状である。
【００２８】
本発明の方法はさらに、培養において本発明の細胞を増殖することによって、胎盤由来細胞の集団を産生する方法も含む。
【００２９】
本発明の他の特性及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例より明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
定義
本明細書と請求項で使用される様々な用語は、以下に説明するとおりに定義される。
【００３１】
「幹細胞」は、前記単細胞レベルで、その自己複製および分化し、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、最終分化細胞を含む後代細胞を生成する能力により定義される未分化細胞である。幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）の様々な細胞系譜の機能的細胞に分化し、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞に注入後、すべてでないとしてもほとんどの組織に実質的に貢献する能力でも特徴付けられる。
【００３２】
幹細胞は、（１）「全能性」−すべての胚細胞および胚体外細胞タイプになることができる、（２）「多能性」−すべての胚細胞タイプになることができる、（３）「多分化能」−細胞系譜のサブセットになることができるが、すべて特定の組織、臓器、または生理学的システム（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＨＳＣ（自己再生）、血液細胞限定的な低能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞、および前記血液の正常な成分であるすべての細胞タイプと要素（例えば血小板）を含む後代を産生
することができる）の中とする、（４）「低能性」−多分化能幹細胞よりも限定的な細胞系譜のサブセットとなることができる、（５）「単能性」−単細胞系譜（例えば精子形成幹細胞）になることができるとして発達の可能性により分類される。
【００３３】
幹細胞も得られる供給源を元に分類される。「成熟幹細胞」は一般に、複数の分化細胞タイプを有する組織に見られる多分化能の未分化細胞である。前記成熟幹細胞はそれ自体、標準的な環境で再生し、それが由来する組織の特殊細胞タイプと、可能性としては他の組織タイプを生じるように分化することができる。「胚幹細胞」は、胚盤胞の段階にある胚の内細胞塊の多分化能細胞である。「胎児」幹細胞は胎児の組織または膜に由来する幹細胞である。「分娩後幹細胞」は、実質的に分娩後に得られる胚外組織、すなわち前記胎盤と前記臍帯に由来する多分化能または多能性細胞である。これらの細胞は、急速な増殖および多数の細胞系譜に分化する可能性を含む、多能性幹細胞に特徴的な特性を有することが分かった。分娩後幹細胞は血液由来（例えば臍帯血から得られるものなど）または非血液由来（例えば臍帯血および胎盤の非血液組織から得られるなど）としてもよい。
【００３４】
「胚組織」は、典型的には（ヒトでは受精から発達の約第６週までの期間を指す）胚に由来する組織として定義される。「胎児組織」は、ヒトでは発達の約第６週から分娩までの期間を指す、胎児に由来する組織を指す。「胚体外組織」は前記胚または胎児と関連するが、これらに由来しない組織である。胚体外組織は胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、尿膜）、臍帯、および胎盤（これ自体は前記絨毛膜と前記母体脱落膜）を含む。
【００３５】
「分化」は、未分化（「中立」）またはあまり分化していない細胞が、例えば神経細胞または筋肉細胞などの分化細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化」または「分化誘導細胞」は、前記細胞系譜内でより分化した（「傾倒した」）状態を獲得した細胞である。分化プロセスが適用される場合、「傾倒した」という用語は、標準的な状況下で、特定の細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットに分化するまで継続し、標準的な状況下で、異なる細胞タイプに分化することができないか、あまり分化していない細胞タイプに戻ることができない点まで、前記分化経路に進んだ細胞を指す。脱分化は、細胞が前記細胞系譜内であまり分化していない（または傾倒していない）状態に戻るプロセスを指す。ここで用いるとおり、前記細胞系譜とは、前記細胞の遺伝、つまりどの細胞に由来し、どの細胞を生じるかを定義する。前記細胞系譜では、発達および分化の遺伝スキーム内に前記細胞を置く。「細胞系譜特異的マーカー」は、対象細胞系譜の細胞表現型と特に関連した特徴を指し、中立細胞の前記対象細胞系譜への分化を評価するために用いることができる。
【００３６】
広い意味では、「前駆細胞」はそれ自体よりも分化した後代を作る能力を有するが、前駆細胞のプールに活力を与える能力を保有する細胞である。この定義によれば、幹細胞自体も最終分化細胞へのより直前の前駆細胞であるため、前駆細胞である。本発明の細胞を指す場合、以下にさらに詳細を説明するとおり、この前駆細胞の広義の定義が利用されてもよい。狭い意味では、前駆細胞が前記分化経路の中間体である細胞として定義されることが多く、つまりこれは幹細胞から生じ、成熟細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットの産生における中間体である。このタイプの前駆細胞は一般に自己複製することができない。従って、このタイプの細胞がここで示される場合は、「非再生前駆細胞」または「中間前駆体または前駆細胞」として示される。
【００３７】
ここで用いるとおり、「中胚葉、外胚葉、または内胚葉細胞系譜に分化する」という言い回しは、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉、または内胚葉細胞系譜に傾倒する細胞を指す。中胚葉細胞系譜に分化する、或いは特定の中胚葉細胞を生じる細胞の例には、これに限定されるものではないが、脂肪生成、軟骨形成、心原性、皮膚原性、造血性、血液血管性、筋原性、腎発生、泌尿生殖器原性（ｕｒｏｇｅｎｉｔｏｇｅｎｉｃ）、骨原性、心膜原性（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）、または間質性細胞を含む。外胚葉細胞系譜に分化する細胞の例には、これに限定されるものではないが、上皮細胞、神経細胞、神経膠細胞を含む。内胚葉細胞系譜に分化する細胞の例には、これに限定されるものではないが、胸膜細胞および肝性細胞、前記腸上皮を生じる細胞、膵原性（ｐａｎｃｒｅｏｇｅｎｉｃ）細胞および内臓原性（ｓｐｌａｎｃｈｏｇｅｎｉｃ）細胞を生じる細胞を含む。
【００３８】
本発明の細胞は、好ましくは、「胎盤由来細胞（ＰＤＣｓ）」として言及される。それらはしばしば、「分娩後由来細胞」或いは「分娩後細胞（ＰＰＤＣｓ）」としても本明細書に言及される。さらに、前記細胞は幹細胞または前駆細胞として説明されてもよく、前駆細胞は広い意味で使用される。「由来する」という用語は、前記細胞が生物源から入手され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖またはそうでない場合は操作される（例えば増殖培地で培養され、前記個体群を増殖する、および／または細胞株を産生する）細胞を示すために使用される。本発明の胎盤由来細胞と胎盤由来細胞固有の特徴のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作について以下に詳細に説明されている。
【００３９】
培養中の細胞を説明するため、様々な用語が使用されている。「細胞培養」とは、一般に生体から採取され、制御された条件で（「培養で」）増殖された細胞を指す。「初代細胞培養」は、生物から直接採取される、最初の継代培養前の細胞、組織、または臓器の培養である。細胞は細胞増殖および／または分裂を促す条件で増殖培地に入れられた場合、培養で増殖され、前記細胞群はより大きくなる。細胞が培養で増殖される場合、細胞の増殖率は時に前記細胞数が倍加するために必要な時間で測定される。これは「倍加時間」と呼ばれる。
【００４０】
「細胞株」は、１つ若しくはそれ以上の初代細胞培養の継代培養で形成される細胞群である。継代培養の各回は「継代」と呼ばれる。細胞が継代培養される場合、その細胞は継代されると呼ばれる。細胞または細胞株の特定集団は、時に継代された時間で言及されるか、特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞群は、「Ｐ１０」培養と呼ばれてもよい。前記初代培養、つまり組織からの細胞単離後の初代培養は、Ｐ０に指定される。前記初代培養後、前記細胞は二次培養（Ｐ１または継代１）と説明される。前記二次培養後、前記細胞は三次培養（Ｐ２または継代２）などとなる。継代中に多くの集団が倍加する可能性があることは当業者に理解されるため、培養の集団倍加数は継代数よりも多い。継代と継代の間の細胞の増殖（つまり集団倍加数）は多くの因子に依存し、播種密度、基質、培地、継代間時間を含むが、これだけに限らない。
【００４１】
「条件培地」は、特定細胞または細胞群が培養され、次に除去された培地である。前記細胞は前記培地で培養される間、他の細胞の栄養支持を提供することができる細胞因子を分泌する。そのような栄養因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外基質（ＥＣＭ）、蛋白質、小胞、抗体、顆粒を含むが、これだけに限らない。前記細胞因子を含む培地が前記条件培地である。
【００４２】
一般的に、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖、維持、分化、及び／若しくは成熟を促進する物質として、若しくは細胞の活性を増加するように刺激する物質として定義される。
【００４３】
培養された脊椎動物細胞を指す場合、「老化」という用語（「複製老化」または「細胞老化」ともいう）は、限定された細胞培養に起因する特性、つまり限定された集団倍加数を超えて増殖する能力を指す（時にＨａｙｆｌｉｃｋの限界と呼ばれる）。細胞老化は線維芽細胞様細胞を用いて初めて説明されたが、培養で増殖を成功させることができるほとんどの正常ヒト細胞タイプは、細胞の老化を受ける。異なる細胞タイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの寿命は異なるが、最高寿命は典型的には１００集団倍加よりも少ない（これは、前記培養ですべての前記細胞の倍加数であり、老化し分割できない培養を与える）。老化は年代時間に依存しないが、むしろ細胞分裂の数、または集団倍加により測定され、前記培養が行われる。従って、重要な増殖因子を除去することで休止させた細胞は、前記増殖因子を再導入した場合に増殖と分裂を再開することができ、その後、同等の細胞が継続して増殖するにつれ、同じ倍加数を実行する。同様に、様々な集団倍加数後に液体窒素で細胞が凍結され、その後解凍、培養された場合、培養中で細胞が凍結されずに維持されている場合と実質的に同等の倍加数となる。老化細胞は死亡しているまたは死亡細胞ではなく、実際はプログラムされた細胞死（アポトーシス）に耐性があり、３年間もの間、分裂しない状態で管理された。これらの細胞は非常に活動的で、代謝的に活動的であるが、分裂しない。老化細胞の前記非分裂状態は、生物因子、化学因子、またはウイルス因子によって可逆的であることはまだ分かっていない。
【００４４】
ここで用いるとおり、「増殖培地」という用語は胎盤由来細胞の増殖に十分な培地を指す。増殖培地の培養液は、好ましくはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。より好ましくは、増殖培地にグルコースを含む。増殖培地は、好ましくはＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を含む。増殖培地は、好ましくは約１５％（ｖ／ｖ）の血清（例えば、ウシ胎仔血清、規定化ウシ血清）を含む。増殖培地は、好ましくは少なくとも１種類の抗生物質および／または抗真菌薬（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチン、好ましくは、５０ユニット／ミリリットルのペニシリンＧナトリウムおよび５０マイクログラム／ミリリットルの硫酸ストレプトマイシン）を含む。増殖培地は好ましくは２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州、セントルイス）を含む。より好ましくは、増殖培地がＤＭＥＭ−低グルコース、血清、２−メルカプトエタノール、抗生物質、及び抗真菌薬を含む。
【００４５】
ここで用いられたように、「標準増殖条件」とは、５％ＣＯ２及び３５℃〜３９℃の範囲、より好ましくは３７℃の温度、及び約１００％の相対湿度を有する標準雰囲気条件を言及している。
【００４６】
「単離された」という用語は、その天然環境から除去された細胞、細胞性構成成分、或いは分子を意味する。例えば、ＰＤＣｓは、本発明のいくつかの実施形態において単離される。
【００４７】
「約」という用語は、規定値の±１０％の範囲内の近似値を意味する。
【００４８】
「病状を治療する（或いは病状の治療）」という用語は、効果を回復させる、若しくは、これに限定されるものではないが、先天性異常、病気、或いは障害などの病状の進行を遅らせる、停止する、または逆転させる、或いは開始を遅らせる或いは阻止することを意味する。
【００４９】
ここで用いられたように、「有効量」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖及び／若しくは分化、または病状の治療を含む、意図した結果を生み出すために効果的な、増殖因子、分化試薬、栄養因子、細胞集団または他の因子などの試薬または薬学的組成物の濃度を指す。増殖因子については、有効量が約１ナノグラム／ミリリットルから約１マイクログラム／ミリリットルの範囲であってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与されるＰＤＣｓについては、有効量は数百以下から数百万以上まで幅があってもよい。特定の実施形態では、有効量が１０３〜１０１１の範囲であってもよい。投与される細胞数は、医薬品生物学者によく知られた他の因子の中で、これだけに限らないが、投与されるサイズまたは総量／表面積を含む、治療される疾患の詳述、および治療される領域への投与部位の近傍によって変化することは理解されるものである。
【００５０】
「有効期間（または時間）」および「有効条件」という用語は、意図した結果を達成する試薬または薬学的組成物に必要であるか、好ましい時間または他の制御可能な条件（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の温度、湿度）を指す。
【００５１】
「患者」または「対象」という用語は、前記薬学的組成物を投与したか、ここで示された方法に供された哺乳類、好ましくはヒトを含む動物を指す。
【００５２】
ここで用いられたように、「基質」という用語は、本発明のＰＰＤＣｓの支持体を意味しており、例えば、足場（例えば、ＶＩＣＲＹＬ、ＰＣＬ／ＰＧＡ、或いはＲＡＤ１６）、或いは支持培養液（例えば、ハイドロゲル、細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）））などである。
【００５３】
「薬学的に許容可能な担体（または培地）」という用語は、「生物学的に適合した担体または培地」と同義的に使用することができ、適切な医学的判断の範囲で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応や、妥当な効果／リスク比に釣り合った他の合併症を引き起こさずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した試薬、細胞、化合物、物質、組成物、および／または剤型を指す。ここにより詳細を示されるように、本発明で使用される医薬品として認められた基材には、液体、半固体（ゲルなど）、固体物質（細胞骨格）を含む。ここで用いられるように、「生物分解性」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解（分解、腐食、溶解）される物質の能力を示す。前記用語には前記身体からの除去（再吸収など）の有無によらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解を含む。半固体および固体物質は、前記身体内の分解に抵抗するように設計されてもよく（非生分解性）、または前記身体内で分解するように設計されてもよい（生物分解性、生腐食性）。生物分解性物質はさらに「生再吸収性または生吸収性」であってもよく、つまり他の物質への変換または自然経路からの除去により、体液に溶解および吸収されてもよく（例としては、水溶性インプラント）、または前記身体から分解および最終的に除去されてもよい。
【００５４】
細胞置換療法について、いくつかの用語がここで使用されている。「自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」及びそれと同等な用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントでもあることを指す。「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）」及びそれと同等な用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントと同種である治療を指すが、同じ個人ではないことを指す。前記ドナー細胞がレシピエントと組織化学的にマッチした細胞移植は、時に「同系移植」と呼ばれる。「異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）」及びそれと同等な用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントと異なる種である治療を指す。
【００５５】
以下の略語がここで用いられる：
ＡＮＧ２（またはＡｎｇ２）は、アンジオポエチン２、
ＡＰＣは、抗原提示細胞、
ＢＤＮＦは、脳由来神経栄養因子、
ｂＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子、
ｂｉｄ（ＢＩＤ）は、「１日２回」、
ＢＳＰは、骨シアロ蛋白質、
ＣＫ１８は、サイトケラチン１８、
ＣＸＣリガンド３は、ケモカイン受容体リガンド３、
ＤＡＰＩは、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−２ＨＣｌ、
ＤＭＥＭは、ダルベッコ変法イーグル培地、
ＤＭＥＭ：ｌｇ（またはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）は、ＤＭＥＭと低グルコース、
ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸、
ＥＧＦ（またはＥ）は、上皮細胞増殖因子、
ＥＰＯは、エリスロポエチン、
ＦＡＣＳは、蛍光活性細胞分類
ＦＢＳは、ウシ胎仔血清、
ＦＧＦ（またはＦ）は、線維芽細胞増殖因子、
ＧＣＰ−２は、顆粒球走化性蛋白質−２、
ＧＤＦ−５は、増殖および分化因子５、
ＧＦＡＰは、グリア線維酸性蛋白質、
ＨＢ−ＥＧＦは、ヘパリン−結合上皮成長因子、
ＨＣＡＥＣは、ヒト冠動脈内皮細胞、
ＨＧＦは、肝細胞増殖因子、
ｈＭＳＣは、ヒト間葉系幹細胞、
ＨＮＦ−１αは、肝細胞特異的転写因子、
ＨＵＶＥＣは、ヒト臍静脈内皮細胞、
Ｉ３０９はケモカインであって、前記ＣＣＲ８受容体に対するリガンドであり、ＴＨ２型Ｔ細胞の化学親和性の原因である、
ＩＧＦは、インスリン様増殖因子、
ＩＬ−６は、インターロイキン−６、
ＩＬ−８は、インターロイキン８、
Ｋ１９は、ケラチン１９、
Ｋ８は、ケラチン８、
ＫＧＦは、ケラチノサイト増殖因子、
ＭＣＰ−１は、単球走化性タンパク質１、
ＭＤＣは、マクロファージ由来ケモカイン、
ＭＩＰ１アルファ（α）は、マクロファージ炎症性タンパク質１α、
ＭＩＰ１ベータ（β）は、マクロファージ炎症性タンパク質１β、
ＭＭＰは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、
ＭＳＣは、間葉系幹細胞、
ＮＨＤＦは、正常ヒト皮膚線維芽細胞、
ＮＰＥは、神経前駆細胞増殖培地、
ＯｘＬＤＬＲは、酸化低密度リポタンパク質受容体、
ＰＢＭＣは、末梢血単核球、
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水、
ＰＤＣは、胎盤由来細胞、
ＰＤＧＦｂｂは、血小板由来増殖因子、
ＰＤＧＦｒ−アルファ（α）は、血小板由来増殖因子受容体α、
ＰＤ−Ｌ２は、プログラム死リガンド２、
ＰＥは、フィコエリトイン、
ＰＯは、「経口」、
ＰＰＤＣは、分娩後由来細胞、
Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）は、活性化を調節された、発現および分泌された正常Ｔ細胞、
ｒｂは、ウサギ、
ｒｈは組み換え、
ＳＣは、皮下、
ＳＣＩＤは、重度複合免疫不全、
ＳＤＦ−１アルファ（α）は、間質由来因子1α、
ＳＨＨは、ソニック・ヘッジホッグ、
ＳＭＡは、平滑筋アクチン、
ＳＯＰは、標準操作手順書、
ＴＡＲＣは、胸腺および活性化制御ケモカイン、
ＴＣＰは、組織培養プラスチック、
ＴＧＦベータ（β）２は、トランスフォーミング増殖因子β２、
ＴＧＦベータ（β）−３は、トランスフォーミング増殖因子β−３、
ＴＩＭＰ１は、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１、
ＴＰＯは、トロンボポエチン、
ＴｕＪ１は、ＢＩＩＩチューブリン、
ＵＤＣは、臍帯由来細胞、
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞増殖因子、
ｖＷＦは、フォン・ウィルブランド因子、
アルファ（α）ＦＰは、αフェトプロテインである。
【００５６】
説明
様々な特許及び他の刊行物は、本明細書全体に引用され、これらの全体はこの参考により本明細書に組み込まれている。
【００５７】
１観点において、本発明は、実質的に血液を含まないように洗浄された胎盤組織から由来した胎盤由来細胞（ＰＤＣｓ）を提供する。前記ＰＤＣｓは、これに限定されるものではないが、ヒトを含む哺乳類の胎盤から由来されるものである。前記細胞が由来した胎盤は。分娩後胎盤である。前記細胞は、培養において自己複製及び増殖することができる。前記胎盤由来細胞は、他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。好ましい実施形態において、前記細胞は、外胚葉、中胚葉、或いは内胚葉由来の細胞へ分化することができる。本発明は、いくつかの観点の１つにおいて、胎盤血を含まないように、胎盤組織から単離された細胞を提供する。
【００５８】
前記細胞は、細胞的、遺伝的、免疫学的、生化学的特徴のいくつかについて特徴付けられた。例えば、前記細胞は、その増殖、その細胞表面マーカー、その遺伝子発現、その特定の生化学的栄養因子の生産能力、その免疫学的特徴により特徴付けられた。
【００５９】
胎盤由来細胞（ＰＤＣｓ）の派生および増殖
ここで説明された方法によれば、哺乳類の胎盤は、満期産または早期産のいずれかの終結点のその直後、例えば出産後の娩出後に回復される。胎盤組織は、経膣的、または他の方法、例えば帝王切開を用いるかによらず、完了した妊娠から満期または満期前のすべてから得られる可能性がある。前記胎盤組織は前記出産施設から実験室に、フラスコ、ビーカー、培養皿、またはバッグなどの無菌容器で輸送されてもよい。前記容器は、これだけに限らないが、例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの塩溶液を含む溶媒または培地、またはウィスコンシン大学溶液またはペルフルオロ化合物溶液など、移植に使用される臓器の輸送に使用するすべての溶液を有してもよい。これだけに限らないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなど、１つ若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤が培地または緩衝液に追加されてもよい。前記分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液で洗い流してもよい。ＰＤＣｓの抽出前に約４〜１０℃で前記組織を保持することが好ましい。前記組織はＰＤＣｓの抽出前に凍結されないことがさらに好ましい。
【００６０】
ＰＤｃｓの単離は、好ましくは無菌的環境でなされるものである。臍帯は、本分野で既知の手段によって、胎盤から除去される。胎盤組織は、ＰＤＣｓを派生させる前に、実質的に血液や残骸を含まないように洗浄した。例えば、前記胎盤組織は、これだけに限らないが、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶液で洗浄されてもよい。前記洗浄緩衝液は、これだけに限らないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなどの１若しくはそれ以上の抗生物質及び／若しくは抗真菌剤を有してもよい。
【００６１】
本発明のいくつかの観点では、分娩後組織に存在する異なる細胞タイプは、ＰＤＣｓが単離される可能性がある亜集団に分割される。これは、これに限られるものではないが、酵素治療を含む細胞分離法を用いて、分娩後細胞をその構成細胞へ解離し、その後、これだけに限らないが、例えば形態学的および／または生化学的マーカーに基づく選択、すなわち、望みの細胞の選択的増殖（ポジティブセレクション）、望まない細胞の選択的破壊（ネガティブセレクション）、例えば大豆凝集素を用いた混合集団における差別的細胞被凝集性に基づいた分離、凍結−解凍法、前記混合集団中の細胞の差別的接着性、ろ過、従来の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心傾瀉（傾瀉遠心分離）、単位重力分離、対向流分布、電気泳動、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーなどの特定の細胞タイプをクローニングおよび選択することで達成されてもよい。
【００６２】
好ましい実施形態では、胎盤全体またはその断片、またはそれらの切片を有する胎盤組織は、機械力（刻みまたは剪断力）、マトリックスメタロプロテアーゼ、及び／若しくは例えばコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州、インディアナポリス）、ヒアルロニダーゼ、および／またはペプシンなどの中性プロテアーゼ、または機械的及び酵素的方法の組み合わせなど、タンパク質分解酵素単独またはその組み合わせを用いた酵素消化により脱凝集される。例えば、前記胎盤組織の細胞性構成成分は、コラゲナーゼ仲介性解離を用いた方法により脱凝集されてもよい。コラゲナーゼは、タイプ１、２、３、或いは４である。酵素的消化方法は、好ましくは、例えばコラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼなどの、マトリックスメタロプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの組み合わせといった、酵素の組み合わせを用いる。より好ましくは、胎盤組織の酵素的消化は、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びヒアルロン酸を消化するためのムコ多糖類加水分解酵素の組み合わせ、例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの組み合わせ、或いはＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州、インディアナポリス）とヒアルロニダーゼの組み合わせなどを用いる。細胞単離の分野で既知の他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなどのセリンプロテアーゼを含み、これらは、単独、若しくはマトリックスメタロプロテアーゼ、ムコ多糖類加水分解酵素、中性プロテアーゼなどの他の酵素との組み合わせで使用されてもよい。セリンプロテアーゼは、好ましくは他の酵素の使用後に使用されるものである。組織または細胞がセリンプロテアーゼと接触している温度と時間は特に重要である。セリンプロテアーゼは、血清中でアルファ（α）２ミクログロブリンで阻害され、そのため前記消化に用いる培地は、通常血清を含まない。ＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅは、一般的に酵素消化法に利用され、細胞回復の効率を上昇させる。前記消化の希釈度は、細胞が前記粘性消化中で捕捉される際、前記細胞収率にも大きく影響する可能性がある。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態では、胎盤組織は、２若しくはそれ以上の切片に分離され、各切片は、それぞれ新生児、新生児と母性、母性側のいずれかを有する。前記分離された切片は次に、ここに示された方法に従って、機械的及び／若しくは酵素的解離によって分離される。新生児または母性系譜の細胞は、例えば、核型分析、或いはＹ染色体に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの本分野で既知の方法によって同定される。核型分析は、正常核型の細胞を同定するためにも利用されてもよい。
【００６４】
増殖したＰＤＣｓから単離された細胞、或いは胎盤組織は、細胞培養の開始または播種に利用されてもよい。細胞は、非コーティングされた、若しくはラミニン、コラーゲン（例えば、自然或いは未変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード））などの細胞外マトリックス或いはリガンドでコーティングされた滅菌組織培養容器に移される。ＰＤＣｓは、これだけに限らないが、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、イーグル基本培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地（Ｆ１０）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｖｏｖｅ’ｓ（イスコブ）変法ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、Ｌｉｅｂｏｖｉｔ’ｓ  Ｌ−１５培養液、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、改変ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、及びＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥなどの細胞増殖を維持することができる培地で培養される。前記培地は、例えば、血清（例えば、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（ＥＳ）、ヒト血清（ＨＳ））、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１若しくはそれ以上の増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含むアミノ酸、例えばペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなどの単独または併用による、微生物汚染を制御するための１若しくはそれ以上の抗生物質及び／若しくは抗真菌薬を含む、１若しくはそれ以上の構成成分が補充されてもよい。前記培地は、好ましくは、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース）、血清、ＢＭＥ、抗真菌剤、及び抗生物質を有する。
【００６５】
前記細胞は、細胞増殖が可能な密度で培養容器に播種される。例えば、前記細胞は、低密度（例えば、約１，０００〜約５，０００細胞／ｃｍ２）から、高密度（例えば、約５０，０００細胞／ｃｍ２以上）で播種される。好ましい実施形態において、前記細胞は、空気中のＣＯ２容積約０〜約５パーセントで培養される。いくつかの好適な実施例では、前記細胞が空気中のＯ２が約２〜約２５パーセント、好ましくは空気中のＯ２が約５〜約２０パーセントで培養される。前記細胞は好ましくは約２５〜約４０℃、より好ましくは約３５℃〜約３９℃で培養され、最も好ましくは３７℃で培養される。前記細胞は、好ましくはインキュベーターで培養される。前記培養容器の培地は、例えばバイオリアクターで静止または攪拌されてもよい。ＰＤＣｓは、好ましくは低酸素ストレス下で培養される（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインを追加する）。ここで用いられる「低酸素ストレス」とは、前記培養細胞にフリーラジカルの障害が全くないか、最小限の状態を指す。
【００６６】
最も適切な培地、培地の調整、細胞培養法を選択する方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，ＣＥＬＬ&ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、およびＨｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），１９９１，ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎを含む様々な出典において記載されており、それぞれは、この参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
前記培地は、例えばピペットなどを用いて、培養皿から培地を慎重に吸引し、新しい培地で補充することにより、必要に応じて交換される。インキュベーションは、前記培養皿に十分な数または密度の細胞が蓄積するまで継続される。前記最初の移植組織片は除去されてもよく、前記残りの細胞は、標準的な方法または細胞スクレーパーを用いてトリプシン処理されてもよい。トリプシン処理後、前述したように細胞は回収され、新しい培地へ移動し、インキュベートされる。いくつかの実施形態では、前記培地は、トリプシン処理後、約２４時間で少なくとも１回交換され、すべての浮遊細胞を除去する。培養中に残った前記細胞は、ＰＤＣｓであると考えられる。
【００６８】
十分な時間で細胞または組織断片を培養後、ＰＤＣｓは、胎盤組織からの遊走または細胞分裂、或いはその両方の結果として増殖する。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＣｓは、最初に用いたものと同じまたは異なるタイプの新鮮培地を含む別の培養容器に継代または除去され、前記細胞の集団は、有糸分裂により増殖されうる。ＰＤＣｓは、好ましくは約１００％のコンフルエントまで、より好ましくは約７０〜８５％コンフルエントまで継代させる。播種に対するコンフルエントの下限は、当業者に理解される。本発明の前記細胞は、継代０から老化の間のあらゆる点で使用される。前記細胞は、好ましくは、約３〜約２５回の間継代される、より好ましくは約４〜約１２回の間継代される、好ましくは１０或いは１１回継代されるものである。クローン細胞集団が単離されたことを確認するため、クローニングおよび／またはサブクローニングが実施されてもよい。
【００６９】
本発明の細胞は、凍結保存される。ＰＤＣｓは、好ましくは、凍結保存培養液、例えばこれに限定されるものではないが成長培地を含む培養液、或いは、例えばこれに限定されるものではないが、Ｃ２６９５（Ｓｉｇｍａ）、Ｃ２６３９（Ｓｉｇｍａ）、或いはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）などの商業的に利用可能な細胞凍結培養液などの細胞凍結培養液において、凍結保存される。前記凍結保存培養液は、好ましくは、約１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を有する。前記凍結保存培養液は、これに限定されるものではないが、メチルセルロース及び／若しくはグリセロールを含む、付加的な凍結保存因子を有するものである。前記細胞は、好ましくは約１℃／分で冷凍される。好ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃であり、より好ましくは、約−９０℃〜約−１６０℃であり、最も好ましくは、約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存された細胞は、好ましくは、使用するために解凍される前に、液体窒素へ移される。いくつかの実施形態において、例えば、アンプルが約―９０℃に到達した際、それらは液体窒素保存エリアに移される。凍結保存された細胞は、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、より好ましくは約３５℃〜約３９℃、最も好ましくは約３７℃で解凍されるものである。
【００７０】
ＰＤＣｓの特性解析
ＰＤＣｓは、例えば増殖特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば、母性または新生児の細胞系譜）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、これだけに限らないが、ビメチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化低密度リポタンパク質受容体１、ＮＯＧＯ−Ａを含むエピトープの検出）、遺伝子発現特性（例えば、遺伝子チップアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来のＰＣＲ））、タンパク質配列、タンパク質の分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＤＣｓ条件培地の分析により、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による）、抗体分析（例えばＥＬＩＳＡ、これだけに限らないが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦｒ−α）、ＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）、ＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）、Ｂ７−Ｈ２、ＰＤ−Ｌ２を含む細胞表面マーカーの抗体染色）、混合リンパ球反応（例えば、同種末梢血単球細胞（ＰＢＭＣｓ）、同種間リンパ球（例えば、未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞）の刺激の指標として）、若しくは本分野で既知の他の方法で特徴付けられてもよい。
【００７１】
本発明の胎盤由来細胞は、好ましくは、実質的に血液を含まないヒト分娩後胎盤組織から由来するものである。ＰＤＣｓは、培養において自己複製及び増殖し、別の表現型の細胞へ分化する能力を有している。ＰＤＣｓは、増殖のためにＬ−バリンを要求する。ＰＤＣｓは好ましくは、約５％〜約２０％の酸素において増殖できるものである。ＰＤＣｓは、好ましくは以下の特徴、
（ａ）組織因子、ビメンチン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、及びアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＧＲＯ−アルファ、及び酸化型低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの産生の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つに対して増加した発現、
（ｆ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンα（アルファ）Ｂ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α（アルファ）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα（アルファ）１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ（ベータ）８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα（アルファ）７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）の少なくとも１つに対して減少した発現、
（ｇ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１つの分泌、
（ｈ）ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の少なくとも１つの分泌の欠如、
（ｉ）培養において、少なくとも４０継代を経る能力、
の少なくとも１つを有するものである。
【００７２】
集団倍加は［ｌｎ（最後の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］として計算されうる。倍加時間は（培養時間（ｈ）／集団倍加）として計算されてもよい。
【００７３】
好ましい実施形態において、前記細胞は、前記特徴の２つ若しくはそれ以上を有する。より好ましくは、前記特徴の３、４、または５つ、若しくはそれ以上を有する細胞である。さらに好ましくは、前記特徴の６、７、または８つ若しくはそれ以上の特徴を有する分娩後由来細胞である。さらに好ましくは、前記請求された特徴９つすべてを有する細胞である。
【００７４】
また、現在好ましくは、ＧＣＰ−２、組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンの少なくとも２つを産生する細胞である。より好ましくは、前記タンパク質であるＧＣＰ−２、組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンの３、或いは４種類を生産する細胞である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、ＦＡＣＳ分析によって検出されたように、酸化低密度リポタンパク質受容体、或いはＧＲＯ−αの少なくとも１つを産生しないものである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ＦＡＣＳ分析によって検出されたように、両タンパク質を産生しないものである。
【００７６】
当業者は、細胞マーカーが非常に異なる増殖条件でやや変化しやすく、一般にここで説明されているものは成長培地、またはその変更体においての特徴であることを理解するものとする。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１、２、３、或いは４種類を産生する分娩後由来細胞が好ましい。より好ましくは、これらの細胞表面マーカーの５、６、または７種類を産生する細胞である。さらに好ましくは、前記細胞表面マーカータンパク質の８種類全てを産生することができる分娩後由来細胞である。
【００７７】
フローサイトメトリーで検出されたように、タンパク質ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１、２、３、または４種類の産生が欠如したＰＰＤＣｓが好ましい。これらのマーカーの少なくとも５、６、７、または８種類若しくはそれ以上の産生が欠如したＰＰＤＣｓが好ましい。より好ましくは、前記細胞表面マーカーの少なくとも９または１０種類の産生が欠如した細胞である。最も好ましくは、前記同定されたタンパク質の１１、１２、または１３種類の産生が欠如した細胞である。
【００７８】
フローサイトメトリーで検出されたように、現在の好ましい細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれを産生し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかを産生しないものである。
【００７９】
前記分娩後由来細胞は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、仮定上タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、及びクローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１、２或いは３種類に対して増加した発現を示すものが好ましい。より好ましくは、４、５、６或いは７種類に対して増加した発現を示す細胞であり、さらに好ましくは前記それぞれの遺伝子のうち８、９或いは１０種類に対して増加した発現を示す細胞である。
【００８０】
いくつかの好ましい実施形態において、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンα（アルファ）Ｂ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮定上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α（アルファ）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮定上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα（アルファ）１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ（ベータ）８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα（アルファ）７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮定上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）に対応する少なくとも１つ��対して減少した発現を有する細胞が好ましい。より好ましい細胞は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、上述したものに対応する少なくとも５、１０、１５、或いは２０種類の遺伝子の発現が減少しているものである。さらに好ましい分娩後由来細胞は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、上記したものの３５以上、４０以上、或いは全てに対応する遺伝子の発現が減少しているものである。
【００８１】
特定の成長因子、及び他の細胞性タンパク質の分泌は、本発明の細胞を特に有用にする。好ましい胎盤由来細胞は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、間葉由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン−結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化を調節された、発現し分泌した正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、及びエオタキシンの少なくとも１、２、３、或いは４種類を分泌するものである。上述したタンパク質の５、６、７或いは８以上を分泌する細胞は、有用であり好ましい。前記因子の９、１０、１１、或いはそれ以上を分泌できる細胞はより好ましく、前述したタンパク質の１２、１３、或いは１４、或いは全てを分泌できる細胞は好ましい。
【００８２】
そのような因子の分泌が有用である一方、ＰＤＣｓは、前記培地に因子の分泌の欠如によっても特徴付けられる。ＥＬＩＳＡによって検出されたように、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トランスフォーミング成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、Ｉ３０９，及びマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の少なくとも１、２、３、或いは４の分泌が欠如した分娩後由来細胞は、使用に対して好ましい。前記タンパク質の５、６、或いは７種類の分泌が欠如することで特徴付けられる細胞は、より好ましい。前記因子のすべての分泌が欠如した細胞も好ましい。
【００８３】
本発明の分娩後由来細胞の例は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナッサス）に委託され、以下のＡＴＣＣアクセッション番号が割り当てられた：（１）系統命名ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）は２００４年６月１５日に委託され、アクセッション番号ＰＴＡ−６０７４が割り当てられた、（２）系統命名ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）は２００４年６月１５日に委託され、アクセッション番号ＰＴＡ−６０７５が割り当てられた、（３）系統命名ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）は２００４年６月１５日に委託され、サクセッション番号ＰＴＡ−６０７９が割り当てられるようた。
【００８４】
本発明の臍帯由来細胞の例は、ＡＴＣＣ（バージニア州、マナッサス）に２００４年６月１０日に寄託され、以下のＡＴＣＣアクセッション番号を割り当てられたものである：（１）系統命名ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）にはアクセッション番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられた、（２）系統命名ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）にはアクセッション番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられた。
【００８５】
本発明のＰＤＣｓは、単離されうる。本発明は、ＰＤＣｓの集団を含むＰＤＣｓの組成物も提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は、不均一である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明のＰＤＣｓの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、或いは９５％を有してもよい。本発明の不均一な細胞集団はさらに、幹細胞或いは前駆細胞を有する。いくつかの実施形態において、前記集団は実質的に均一である、すなわち、実質的にＰＰＤＣｓのみ（好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、或いはそれ以上のＰＰＤＣｓ）を有するものである。本発明の均一な細胞集団は、新生児胎盤由来細胞、或いは母性胎盤由来細胞を有するものである。細胞集団の均一性は、本分野では知られたあらゆる方法、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）、ビーズに分離、或いはクローン増殖によって達成されるものである。
【００８６】
本発明の細胞は、中胚葉、外胚葉、或いは内胚葉表現型或いは系譜の細胞への分化を誘導され得る。
【００８７】
軟骨形成培養液におけるＰＤＣｓの培養
ＰＤＣｓは、分化誘導性細胞培養条件にそれらを曝すことによって、軟骨形成系譜への分化を誘導される。いくつかの実施形態において、ＰＤＣｓは、例えばＰＤＣｓを、例えばアスコルビン酸あり或いはなしで、ＧＤＦ−５或いはトランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦ−ベータ３）の１若しくはそれ以上などの特異的外因性成長因子（例えば、培養において）に接触することによって、軟骨系譜への分化を誘導される。
【００８８】
好ましい軟骨形成培養液は、抗生物質、プロリン及びグルタミンを含むアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、デキサメタゾン、アスコルビン酸、及びインスリン／トランスフェリン／セレニウムが添加されている。軟骨形成培養液は、好ましくは、水酸化ナトリウム及び／若しくはコラーゲンが添加されている。最も好ましくは、軟骨形成培養液は、コラーゲンが添加されている。前記細胞は、高密度或いは低密度で培養される、細胞は好ましくは、血清の非存在下で培養される。
【００８９】
軟骨形成分化は、例えば、グリコサミノグリカン発現に対するサフラニン−Ｏ染色、或いはヘマトキシリン／エオシン染色によって評価される。
【００９０】
脂肪生成培養液におけるＰＤＣｓの培養
ＰＤＣｓは、分化誘導性細胞培養条件にそれらを曝すことによって、脂肪生成系譜への分化を誘導される。いくつかの実施形態において、ＰＤＣｓは、脂肪生成系譜への分化を誘導するための規定培養液において培養される。脂肪生成培養液の例としては、これに限定されるものではないが、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン、インドメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン）、インスリン、ｃＡＭＰの細胞内レベルを上昇する化合物（例えば、ジブチリル−ｃＡＭＰ、８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰ（８−（４）クロロフェニルチオ）−アデノシン，３’，５’環状モノリン酸）、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジオクタノイル−ｃＡＭＰ、フォルスコリン）及び／若しくはｃＡＭＰの分解を阻害する化合物（例えば、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、メチルイソブチルキサンチン、チオフィリン、カフェイン、インドメタシンなどのホスホジエステラーゼ阻害剤）、及び血清などを含む。
【００９１】
脂肪生成は、脂肪滴形成の存在を確認するためのオイル−レッド−Ｏ（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ）染色によって、或いはＰＰＡＲガンマ及びレプチンの発現を検出することによって評価される。
【００９２】
骨芽形成培養液におけるＰＤＣｓの培養
ＰＤＣは、分化誘導性細胞培養条件にそれらを曝すことによって、骨芽形成系譜表現型への分化を誘導される。いくつかの実施形態において、ＰＤＣｓは、これに限定されるものではないが、約１０マイクロモル〜約５０マイクロモルのアスコルビン酸リン酸塩（例えば、アスコルビン酸−２−リン酸）、及び約１０ナノモル〜約１０ミリモルのベータ−グリセロリン酸との組み合わせにおける約１０−７モル〜約１０−９モルのデキサメタゾンを含有する培養液（例えば、ＤＭＥＭ−低グルコース）などの骨芽形成培養液いおいて培養される。前記培養液は、好ましくは、血清（例えば、ウシ血清、ウマ血清）を含む。骨芽形成培養液は、１若しくはそれ以上の抗生物質／抗真菌薬も有するものである。前記骨芽形成培養液は、好ましくは、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（例えば、ＴＧＦ−ベータ１）、及び／若しくは骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、或いはそれらの組み合わせ、最も好ましくはＢＭＰ−４）を添加されている。
【００９３】
細胞は、本分野で既知のあらゆる方法、例えば、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって、或いは、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、或いはアルカリンホスファターゼなどの骨芽形成マーカーの検出によって、骨芽形成表現型が分析される。
【００９４】
神経原性培養液におけるＰＤＣｓの培養
ＰＤＣは、分化誘導性細胞培養条件にそれらを曝すことによって、神経系譜表現型への分化を誘導される。これは、本分野では既知である１若しくはそれ以上の方法によって達成される。例えば、実施例としてここに記載されたように、ＰＤＣｓは、ブチル化ヒドロキサニゾール、塩化カリウム、インスリン、フォルスコリン、バルプロ酸、及びヒドロコルチゾンを含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２組成物などの神経原性培養液において培養される。
【００９５】
或いは、ＰＤＣｓは、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）中において、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培養液としてここに言及された培養液との組み合わせにおいて、ラミニンでコーティングされたフラスコ上にプレーティングされる。ＮＰＥ培養液は、さらに、ｂＦＧＦ及び／若しくはＥＧＦが添加されている。
【００９６】
或いは、ＰＤＣｓは、（１）ＰＤＣｓを神経前駆細胞と共培養する、或いは（２）神経前駆細胞条件培養液においてＰＤＣｓを増殖させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化を誘導させる。
【００９７】
神経系譜へのＰＤＣｓの分化は、増殖過程において双極性細胞形態によってしめされる。前記誘導された細胞集団は、ネスチンの存在に対する染色に陽性にである。分化したＰＤＣｓは、ネスチン、ＴｕＪ１（ＢＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｏ４、ＧＡＢＡ、及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の検出によって評価される。いくつかの実施例において、ＰＤＣｓは、ニューロスフェアーの神経性幹細胞形成の３次元体特徴を形成する能力を有する。
【００９８】
分化の評価
ＰＤＣｓは、外胚葉、内胚葉、或いは中胚葉系譜への分化を誘導される。本発明のＰＤＣｓから発生した分化細胞を特徴付ける方法には、これだけに限らないが、組織学的、形態学的、生化学的、及び免疫組織化学的方法を含み、または前記分化細胞によって分泌された因子を同定することによって、或いは前記分化ＰＤＣｓの誘導性質によって、遺伝的または分子的に細胞表面マーカーを用いることを含む。
【００９９】
ＰＤＣｓ或いはその構成成分、またはそれらの産物を利用する方法
ＰＤＣｓの遺伝子工学
本発明の細胞は、これだけに限らないが、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターなどの組み込み型ウイルスベクター、例えばパピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクターなどの非組み込み型複製ベクター、または複製欠陥ウイルスベクターなどを含む様々なベクターのいずれかを利用して、治療用タンパク質を発現するように設計される。細胞にＤＮＡを導入する他の方法には、リポソーム、電気穿孔法、粒子ガムの利用を含み、または直接ＤＮＡ注入法によってもなされる。
【０１００】
宿主細胞は、特にプロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの１若しくはそれ以上の適切な発現制御因子、及び選択可能なマーカーによって制御されている、或いは作動的に関連しているＤＮＡによって変換または形質移入されることが好ましい。
【０１０１】
前記外来ＤＮＡの導入後、設計された細胞は、濃縮培地で増殖させ、次に選択的培地に交換される。前記外来ＤＮＡの選択的マーカーは、前記選択に抵抗性を与え、例えばプラスミド上でその染色体に対して、細胞に前記外来ＤＮＡを安定して組み込み、次に細胞株
へとクローニングおよび増殖されうるｆｏｃｉ（病巣）を形成するように増殖させることができる。
【０１０２】
この方法は、遺伝子産物を発現する細胞株を設計するために有利に利用されてもよい。
【０１０３】
前記挿入遺伝子の発現を誘導するため、いずれのプロモーターを使用してもよい。例えば、ウイルスプロモーターには、これだけに限らないが、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ  ４０、パピローマウイルス、ＥＢウイルスまたはエラスチン遺伝子プロモーターを含む。好ましくは、目的の遺伝子の発現を制御するために用いた制御要素は、前記産物がｉｎ  ｖｉｖｏで必要なときにだけ合成されるように、前記遺伝子の発現を制御することを可能とするものである。一時的な発現が望ましい場合には、構成プロモーターは、非組み込み型及び／若しくは複製欠陥ベクターにおいて用いられる。代わりに、誘導性プロモーターは、必要に応じて前記挿入遺伝子の発現を誘導するために用いられ得る。
【０１０４】
誘導プロモーターは、これに限られるものではないが、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質と関連するものを含む。
【０１０５】
記載され、使用され得る組織特異性を示す転写調節領域の例としては、これに限定されるものではないが、膵臓腺房細胞において活性を有するエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５）、膵臓ベータ細胞において活性を有するインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５）、脳のオリゴデンドロサイトにおいて活性を有する細胞ミエリン塩基タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０８）、骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓｈａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３）、及び視床下部において活性を有する性腺刺激ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４；１３７２）が含まれる。
【０１０６】
本発明の細胞は、前記移植部位で炎症または拒絶を促す因子の発現を「ノックアウト」または「ノックダウン」するように、遺伝的に設計される。標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させるためのネガティブ調節技術は、以下に説明されている。「ネガティブ調節」は、ここで用いられたように、修飾的処理の非存在下で、前記標的遺伝子産物のレベル及び／若しくは活性に対する、標的遺伝子産物のレベル及び／若しくは活性における減少を指す。細胞に対して未変性の遺伝子の発現は、例えば相同性組み換え技術を用い、前記遺伝子を完全に不活化することで（一般的には「ノックアウト」と呼ばれる）発現を抑制するなど、多数の方法により減少されるか、ノックアウトされる。通常は、前記タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（またはその領域のエキソン５’）は、例えばｎｅｏなどのポジティブ選択的マーカーにより阻害され、前記標的遺伝子の正常ｍＲＮＡの産生を阻害し、前記遺伝子が不活化される。遺伝子は、遺伝子の一部を欠失させるか、遺伝子全体を欠失させることで不活化されうる。前記ゲノムから離れた前記標的遺伝子に相同的な２つの領域からなるコンストラクトを用いることで、前記２つの領域に介入する配列は欠失されうる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４）。
【０１０７】
前記標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス、ＤＮＡｚｙｍｅ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、およびリボザイム分子は、前記発明に従って用いられ、標的遺伝子活性のレベルを減少させる。例えば、主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応に対して最も多目的に使えることが示された。またさらに、三重らせん分子は標的遺伝子活性のレベルを低下させるために使用される可能性がある。
【０１０８】
これらの技術はＬ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９４，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  &  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．で詳細に説明され、この参照によりここに組み込まれる。
【０１０９】
前記方法のいずれかを用い、例えばＩＬ−１の発現が本発明の細胞でノックアウトまたはノックダウンされ、本発明の細胞により炎症性メディエーターの産生が減少する可能性がある。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、前記移植組織が拒絶されるリスクを低下させるため、ノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。
【０１１０】
本発明の細胞が遺伝的に操作された場合、それらは患者へ直接移植される。
【０１１１】
或いは、遺伝的に操作された細胞は、対象に移植されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで新しい組織を産生するために使用される。
【０１１２】
ＰＤＣｓによる栄養因子の産生
ＰＤＣｓによる成長因子の分泌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｉｎｖｉｖｏで第２の細胞タイプに対する栄養補助を提供する。ＰＤＣｓは、細胞の実質的に均一な集団において、例えば、インターロイキン８（ＩＬ８）、組織因子、幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン−結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１ａ）、単球化学誘引物質（ＭＣＰ−１）、Ｒｎａｔｅｓ（活性を制御された、発現及び分泌された正常Ｔ細胞）、胸腺及び活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１．ＳＣＦ、ＡＭＰＳ、或いはシステイン−Ｃを分泌し、それらは化学的な規定培養液における細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養を含む様々な技術によって増強され得る。
【０１１３】
本発明のいくつかの観点において、ＰＤＣｓの集団は、神経幹細胞（ＮＳＣ）、造血性幹細胞（ＨＰＣ、特にＣＤ３４＋幹細胞）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及びそれらの混合物などの幹細胞を含む前記細胞の生存、増殖、成長、維持、成熟、分化、或いは活性の増加を支持する。他の実施形態において、ＰＤＣｓによって支持される集団は、実質的に均一である、すなわち、実質的にＰＤＣｓのみで成る（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％或いはそれ以上のＰＤＣｓ）。
【０１１４】
ＰＤＣｓの条件培養液
本発明の別の実施形態は、未分化ＰＤＣｓからの、或いは所定の系譜への分化を刺激する条件下でインキュベートされたＰＤＣｓからの条件培養液を産生するためのＰＤＣｓの使用を特徴とする。そのような条件培養液は、例えば幹細胞や前駆細胞などの細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｅｘ  ｖｉｖｏ培養における使用、或いは移植された細胞（例えば、ＰＤＣｓの均一或いは不均一な集団）を支持するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用も考慮される。
【０１１５】
他の細胞タイプとＰＤＣｓの共培養
ＰＤＣｓは、共培養で他の細胞タイプの生存、増殖、及び分化を支持する能力を有する。従って、別の実施例では、ＰＤＣｓは、他の細胞に対して栄養支持を提供するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養される。共培養では、前記ＰＤＣｓと望みの他の細胞が、前記２つの細胞タイプが接触している条件で共培養されることが望ましい。これは、例えば、培地または適当な培養基質での細胞の不均一な集団として、前記細胞を播種することにより達成される。代わりに、前記ＰＤＣｓは、まずコンフルエントまで増殖され、培養で第２の望みの細胞タイプの基質として利用される。この後者の実施形態では、前記細胞は、さらに膜または同様の装置によって、物理的に分離されてもよく、前記共培養期間後、前記他の細胞タイプが除去、別に使用されてもよい。他の細胞タイプの増殖と分化を促す共培養においてＰＤＣｓを使用することで、研究及び臨床／治療分野における適用性を見出すことができる。例えば、ＰＤＣｓの共培養は、例えば、基礎的な研究目的または薬物スクリーニングアッセイにおける使用として、例えば軟組織表現型の細胞培養で、特定表現型の細胞の増殖と分化を促進するために利用される。後者の治療目的の投与で、所定の表現型の細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖に対して、ＰＤＣｓ共培養が利用されてもよい。例えば、細胞は個体から採取され、ＰＤＣｓを用いた共培養でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され、次に個体（自家移植）または別の個体（同系または同種移植）に戻されてもよい。これらの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖後、前記ＰＤＣｓを有する細胞の混合集団は、
治療を必要とする患者に投与される可能性があることは理解されるものである。代わりに、自家移植が適切であるか望ましい状態では、前記共培養された細胞集団は培養で物理的に分離され、前記患者の投与に対する自家細胞の除去を可能としてもよい。
【０１１６】
細胞療法
ここに示されたように、ＰＤＣｓは、身体へ有効的に移植され、ヒトにおける有効性の予測に対して適用される動物モデルにおいて失われた機能を補充することが示された。これらの結果は、本発明の好ましい実施形態を支持し、ＰＤＣｓは病状、損傷、或いは病気を治療するための細胞療法において使用されるものである。例えば、本発明のＰＤＣｓは、病気或いは外傷、或いは組織が正常に発生しなかった結果生じた組織或いは器官の修復或いは置換を必要とする患者を治療するために、或いは身体の特徴を増強するような美容機能を提供するために使用される。身体の標的位置に移植された場合、ＰＤＣｓは、１若しくはそれ以上の表現型へ分化する、或いは他の細胞タイプへｉｎ  ｖｉｖｏで栄養支持を提供する、若しくはそれらの方法の両方において有益な影響を発揮するものである。
【０１１７】
ＰＤＣｓは、単独で投与される（例えば、実質的に均一な集団として）、或いは他の細胞との混合物として投与される。ＰＤｓは、基質或いは従来の薬学的に許容可能な担体を有する薬剤において処方されたものとして投与される。ＰＤＣｓは他の細胞と共に投与される場合、それらは、他の細胞と同時に或いは経時的に（他の細胞の前或いは後）投与される。ＰＤＣｓと共役的に投与される細胞は、これに限定されるものではないが、他の多分化能或いは多能性細胞を含む。異なるタイプの細胞は、すぐに或いは投与する少し前にＰＤＣｓと混合される、或いはそれらは投与の前の期間、一緒に共培養される。
【０１１８】
前記ＰＤＣｓは、他の有益な薬物または生体分子（成長因子、栄養因子）と共に投与されてもよい。ＰＤＣｓが他の薬物とともに投与される場合、他の生理活性因子と同時にまたは経時時に（他の薬物の投与前後で）単一の医薬品または別の医薬品中に一緒に投与されてもよい。生理活性因子の例としては、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）などのカルシニュリン阻害薬、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）などの抗体）、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、及び抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）を含む。別の例として、米国特許番号第５，８２７，７３５号（この参照によって本明細書に組み込まれる）で述べられているとおり、前記細胞は瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１１９】
１実施形態において、ＰＤＣｓは、未分化細胞、すなわち、成長培地において培養された細胞として投与される。或いは、ＰＤＣｓは、望ましい表現型への分化を刺激する条件へ培養において曝した後、投与される。
【０１２０】
本発明の細胞は、外科的に移植、注入、運搬(例えば、カテーテル或いはシリンジによって)される、若しくは修復或いは増強を必要とする部位へ直接的或いは間接的に投与される。本発明の細胞或いはそれらの組成物の投与経路は、これに限定されるものではないが、ポンプ装置を有する或いは有さない頭内或いは椎骨内針及び／若しくはカテーテルを介した運搬によって、経口、鼻、動脈内、非経口的、静脈内、眼、筋肉内、皮下、腹腔内、脳内、血管内、脳室内、くも膜下腔内、嚢内、脊髄内及び／若しくは脊髄周辺経路の投与を含む。
【０１２１】
細胞が半固体または固体装置で投与される場合、身体の正確な位置への外科的移植は、典型的に望ましい投与方法である。しかし、液体または液体医薬品は、より全身的な部位に（例えば、散在した患部中に）投与されてもよく、そこから例えば化学シグナルに応答することで、特定の部位へ移動する。
【０１２２】
他の実施例には、ＰＤＣｓ細胞構成成分（例えば細胞溶解液またはその構成成分）或いは産物（例えば、細胞外マトリックス、ＰＤＣｓにより天然で産生されるか、遺伝子組み換えによって産生された栄養因子及び他の生物学的因子、ＰＤＣｓ培養からの条件培地）を有する薬学的組成物を投与することによる治療法も含む。またこれらの方法は、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）などの抗体、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、局所麻酔薬、及び米国特許番号第５，８２７，７３５号（この参照によってここに組み込まれる）に記載されているような瘢痕抑制因子などの生理活性因子を投与する工程を含む。
【０１２３】
ＰＤＣｓ或いはここに記載された他の薬学的組成物のいずれかを投与する剤型と投与処方は、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に沿って開発され、個々の患者の条件、例えば治療される状態の性質と程度、年齢、性別、体重、全身の病状、医師に既知の他の要因に沿って投与する。従って、患者に投与される薬学的組成物の有効量は、本分野で既知であるこれらの考察により決定される。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態においては、ＰＤＣｓを用いた細胞療法の開始前に患者の免疫反応を抑制することが必要または望ましくないこともある。さらに、ＰＤＣｓは、混合リンパ球反応で同種間ＰＢＭＣｓ（例えば、未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞などの同種間リンパ球）を刺激しないことが示された。従って、同種またはさらに異種の移植において、場合によってＰＤＣｓは耐性があると考えられる。
【０１２５】
しかしながら、その他の場合、細胞療法を開始する前に患者の免疫反応を薬理学的に抑制することが望ましい或いは適切であると考えられる。これは、全身または局所免疫抑制剤を使用することで達成されてもよく、またはカプセル装置で前記細胞を投与することで達成されてもよい。ＰＤＣｓは、前記細胞と治療因子によって必要とされる栄養物及び酸素に対して透過性の被膜で覆われていてもよく、前記細胞はまだ免疫ホルモン因子と細胞に対して不透過性である。好ましくは、前記カプセルは低刺激性で、標的組織に容易に安定して置かれ、前記移植構造に追加保護を提供するものである。前記移植細胞に対する免疫反応を軽減または除去するこれらと他の手段は、本分野で知られている。代わりに、ＰＤＣｓは、その免疫原性が減少するように遺伝的に修飾されてもよい。
【０１２６】
生存患者における移植ＰＤＣｓの生存は、様々なスキャン方法、例えばコンピューター断層写真（ＣＡＴまたはＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを利用することで決定される可能性がある。前記標的組織を除去することで、視覚的または顕微鏡により検討することで、移植生存率の決定は死後行われる可能性がある。代わりに、細胞に、特定細胞系譜の細胞特異的なスタチンが投与される可能性もある。ローダミンまたはフルオレセイン標識ミクロスフィア、ファーストブルー、ビスベンズアミド、第二鉄微粒子、またはβ−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼなどの遺伝的に導入されたレポーター遺伝子などのトレーサー色素を事前に組み入れる前に、移植細胞が同定される可能性もある。
【０１２７】
移植ＰＰＤＣの対象への機能的統合は、障害または疾患があった前記機能の回復、または機能の増大を検討することで、評価される可能性がある。
【０１２８】
組成物及び薬学的組成物
ＰＤＣｓの組成物及び、例えば薬学的組成物を含む関連産物（例えば、細胞外マトリックス、溶解液、細胞溶解液、条件培地）は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の組成物には、これだけに限られるものではないが、例えば、成長因子、分化誘導因子、カスパーゼ阻害剤などの細胞生存因子、ｐ３８キナーゼ阻害剤などの抗炎症性因子、或いはＶＥＧＦまたはｂＦＧＦなどの血管新生因子などの１若しくはそれ以上の生理活性因子を含んでもよい。生理活性因子のいくつかの例には、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、及びＬＩＦを含む。いくつかの実施形態では、未分化または分化誘導ＰＤＣｓは、前記生理活性因子と接触して培養される。いくつかの実施形態では、未分化ＰＤＣｓは、前記生理活性因子と接触した時点でまだ未分化である。他の実施形態では、生理活性因子は、前記ＰＤＣｓの分化を誘導する。
【０１２９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に教養可能な担体において、分化および／または未分化ＰＰＤＣの均一若しくは不均一な集団、それらの培養、それらの細胞溶解液、そこから産生された細胞外マトリックス、或いはそれらから由来した条件培養液を有する。
【０１３０】
本発明の細胞に対する薬学的に許容可能な担体は、本発明の細胞或いは組成物、若しくはそれらの成分と有害な反応を生じない、有機または無機担体物質を含む。生体適合性となる程度まで適切な薬学的に許容可能な担体には、水、（リンガー液など）塩溶液、アルコール、オイル、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジンを含む。そのような製剤は、消毒され、望ましい場合は、潤滑剤、保存剤、安定剤、潤滑剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩類、緩衝液、着色剤などの補助試薬と混合される。本発明での使用に適した薬学的に許容可能な担体は、本分野で知られており、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ペンシルバニア州、イーストン）、及び国際特許番号第ＷＯ  ９６／０５３０９号で説明されており、それらはこの参考によって本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
投与量（例えば、投与される細胞数）及び投与頻度は、これに限定されるものではないが、治療される病状の性質、前記病状の程度、前記患者の特徴（例えば年齢、サイズ、性別、健康状態）を含む多数の要因に依存している。
【０１３２】
移植に対するＰＤＣｓの使用
本発明の治療法は、それを必要とする患者へのＰＤＣｓの移植に関するものである。本発明の細胞は、治療が必要な部位又は前記部位の「ホーム」に送達されてもよい。
【０１３３】
本発明の細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化する、或いは内因性細胞への栄養支持を提供するものである。ヒトにおける適切な細胞移植の用量は、例えば、前記細胞の活性などに関する既存の情報から決定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養およびｉｎ  ｖｉｖｏでの動物実験から、産生された因子の量が定量される。この情報は、移植される物質の適切な量を計算する上で有用である。さらに、患者は、追加移植が行われるか或いは移植された物質がそれによって減少するかどうかを決定するためにモニターされる。
【０１３４】
前記移植された細胞の血管新生および生存を亢進するために、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦなどの血管新生因子は、単独、或いは内皮細胞或いはＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞を含むその前駆細胞との組み合わせで添加される。
【０１３５】
本分野で既知の１若しくはそれ以上のコラーゲンのタイプ、及び／若しくは成長因子、血小板が濃縮された血漿、及び薬物などの選択された細胞外マトリックス成分を含む１若しくはそれ以上の他の構成成分は、移植細胞に追加されてもよい。或いは、本発明の細胞は、成長因子を発現および産生するように遺伝的に設計される。前記細胞製剤に有用に組み込まれうる生理活性因子には、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、および局所麻酔薬を含む。別の実施例として、前記細胞は、米国特許番号第５，８２７，７３５号（この参考によってここに組み込まれる。）で記載された瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１３６】
移植用のＰＤＣｓの調整
限定しない実施形態において、本発明の細胞を有する製剤は、新規組織の産生が望ましい部位に直接投与するために調整される。例えば、これに限定されないが、本発明の細胞は、注入用にヒドロゲル溶液に懸濁されてもよい。本発明で使用されるのに適切なヒドロゲルの例には、ＲＡＤ１６などの自己集合性ペプチドを含む。或いは、前記細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば鋳型などに固めることができ、移植前にそこに分散される細胞を有する基質を形成してもよい。または前記基質が固まった際、前記細胞が移植前に有糸分裂により増殖されるように、前記細胞組成物は培養されてもよい。前記ヒドロゲルは、共有、イオン、または水素結合を介して交差結合され、水分子を包括してゲルを形成する三次元開放型格子構造を形成する有機ポリマー（天然型または合成型）である。ヒドロゲルを形成するために用いられる可能性がある物質の例には、アルギン酸とその塩類、ペプチド、ポリホスファジン、ポリアクリル酸塩などの多糖類を含み、イオンにより架橋されるか、ポリエチレン・オキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのポリマーを遮断し、それぞれ温度またはｐＨにより架橋される。いくつかの実施形態において、本発明のＰＤＣｓの支持体は、生物分解性である。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態において、前記製剤は、例えば米国特許出願番号第２００２／００２２６７６号公報：Ａｎｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１〜３）：１９９〜２０９（２００２）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９〜８０（２００３）に記載されたような、ｉｎ  ｓｉｔｕで重合可能なゲルを有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、前記ポリマーは、少なくとも部分的に、水、緩衝塩溶液、またはアルコール水溶液などの水溶液に溶解性であり、荷電した側鎖、またはその一価イオン塩を有する。陽イオンと反応されうる酸性側鎖を持つポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、スルホン化ポリスチレンなどのホスホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリン酸およびビニルエーテルモノマーの反応により形成される酸性側鎖を有するコポリマーも、利用される可能性がある。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ化）アルコール基、フェノールＯＨ基、酸性ＯＨ基である。
【０１３９】
アニオンと反応されうる塩基性側鎖があるポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、一部のイミノ置換ポリホスファゼンである。前記ポリマーのアンモニウムまたは第４級塩は、前記中心窒素またはペンダントイミノ基からも形成されうる。塩基性側鎖の例はアミノ基およびイミノ基である。
【０１４０】
アルギン酸塩は、水中、室温において二価陽イオンでイオン的に架橋され、ヒドロゲル基質を形成する。これらの穏やかな条件のため、例えば米国特許番号第４，３５２，８８３号でリム（Ｌｉｍ）に対して説明されているとおり、アルギン酸塩は、ハイブリドーマ細胞カプセル化に最も一般的に使用されるポリマーであった。前記リムプロセスでは、カプセル化される生体物質を含む水溶液が水溶性ポリマー溶液で懸濁され、前記懸濁液は液滴となり、これが多価陽イオンと接触することで個別のマイクロカプセルに設定され、次に前記マイクロカプセルの表面がポリアミノ酸で架橋され、前記カプセル化物質周囲に半透膜を形成する。
【０１４１】
ポリホスファゼンは、交互の単結合と二重結合により分離された窒素およびリンから成る基幹を持つポリマーである。各リン原子は２つの側鎖に共有結合されている。
【０１４２】
架橋結合に適したポリホスファゼンは側鎖の大部分であり、二価または三価陽イオンによる塩橋を形成することができる。好ましい酸性側鎖の例は、カルボン酸基とスルホン酸基である。加水分解に安定なポリホスファゼンは、Ｃａ２＋またはＡ１３＋などの二価または三価陽イオンで架橋されるカルボン酸側鎖を有するモノマーで形成される。ポリマーが合成され、イミダゾール、アミノ酸エステル、またはグリセロール側鎖を有するモノマーを組み込むことで、加水分解により分解する可能性がある。例えば、ポリアニオン系ポリ［ビス（カルボキシラトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）は合成される可能性があり、室温またはそれ以下で水性培地中に多価陽イオンを溶解して架橋され、ヒドロゲル基質を形成する。
【０１４３】
生物分解性ポリホスファゼンは少なくとも２種類の側鎖タイプ、多価陽イオンで塩橋を形成することができる酸性側鎖、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロール、およびグルコシルなど、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件で加水分解する側鎖を有する。
【０１４４】
前記側鎖の加水分解では、前記ポリマーが腐食する。加水分解側鎖の例は、前記基がアミノ結合を介してリン原子に結合した未置換および置換イミダゾールとアミノ酸エステルである（いずれのＲ基もこのように接合したポリホスファゼンポリマーがポリアミノホスファゼンとして知られている）。ポリイミダゾールホスファゼンとしては、ポリホスファゼン骨格の前記「Ｒ」基の一部がイミダゾール環であり、環の窒素原子により骨格中のリンに結合している。他の「Ｒ」基は、メチルフェノキシ基、または学術論文Ａｌｌｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  １０：８２４（１９７７）に示されている他の基など、加水分解に関与しない有機残基である。前記ヒドロゲル物質の合成法とそのようなヒドロゲルを調整する方法は、本分野で既知である。
【０１４５】
他の成分が前記製剤に含まれてもよく、これらに限定される訳ではないが、以下のいずれか、（１）適当なｐＨと等張性を提供する緩衝液、（２）潤滑油、（３）例えばアルギン酸塩、寒天、植物ゴムを含む、投与部位またはその付近に細胞を保持する粘稠性の物質、（４）例えば、組織またはその物理化学的特徴の形成増大または修飾、または前記細胞の活性度の支持として、または炎症または拒絶の抑制など、投与部位で望みの効果を生じることができる他の細胞タイプを含む。前記細胞は、適切な創傷を覆うことでカバーされてもよく、細胞に前記部位を残さないようにする。そのような創傷被覆剤は当業者に周知である。
【０１４６】
足場を用いたＰＤＣｓの移植
本発明の細胞、或いはそれらの共培養は、３次元フレームワーク或いは足場上に播種され、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植され、前記播種された細胞は、前記フレームワークの表面上で増殖し、対象の細胞と連結するようにｉｎ  ｖｉｖｏで置換組織を形成する。そのようなフレームワークは、組織形成を刺激する、或いは本発明の実施を増強或いは改善する、上述された１若しくはそれ以上の成長因子、細胞、薬剤、或いは他の構成成分との組み合わせで移植され得る。
【０１４７】
本発明の細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで新しい組織を産生するために使用され、次に移植（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ、及びｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）される、或いは対象において組織修復、置換或いは増強を必要とする部位へ挿入される。
【０１４８】
限定されない実施形態において、本発明の細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３次元組織コンストラクトを産生するために使用され、次にｉｎ  ｖｉｖｏで移植される。３次元組織コンストラクトの産生の例としては、米国特許番号第４，９６３，４８９号を参照のこと（これはこの参照によってここに組み込まれる）。例えば、本発明の細胞は、３次元フレームワーク或いは足場へ接種或いは「播種」され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖或いは成長され、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植され得る生組織を形成する。
【０１４９】
本発明の細胞は、サブコンフルエント或いはコンフルエントまで培養容器で自由に増殖され、前記培養から採取し、３次元フレームワークに接種される。例えば、約１０５〜１０７細胞／ミリリットルの高濃度の細胞を有する前記３次元フレームワークの接種は、比較的短期間で前記３次元支持体を確立する。
【０１５０】
本発明で利用される足場の例には、不織マット、多孔性発泡体、または自己集合性ペプチドを含む。不織マットは、例えば、商品名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州、サマビル）で販売されている、グリコールおよび乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維を使用して形成されてもよい。例えば、米国特許番号第６，３５５，６９９号に記載されたように、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成り、フリーズドライ或いは凍結乾燥などのプロセスにより形成される発泡体は、可能な足場である。自己集合性ペプチドなどのヒドロゲル（例えばＲＡＤ１６）も利用される。これらの物質は、組織の増殖に対する支持体として利用されることが多い。
【０１５１】
３次元フレームワークは、これに限定されるものではないが、モノ−、ジ−、トリ−、アルファ−トリ−、ベータ−トリ−、及びテトラ−リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウムカルシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、フロリダ州）などの生物活性ガラス、及びそれらの混合物を含むセラミック物質からも製造される。多くの適切な多孔性生体適合性セラミック物質は、ＳＵＲＧＩＢＯＮ（Ｕｎｉｌａｂ  Ｓｕｒｇｉｂｏｎｅ，Ｉｎｃ．，カナダ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス）、ＣＥＲＯＳ（Ｍａｔｈｙｓ，Ａ．Ｇ．，Ｂｅｔｔｌａｃｈ、スイス）、及びＩＮＴＥＲＰＯＲＥ（Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ，Ｉｒｖｉｎｅ，カリフォルニア州、米国）などの商業市場で現在利用可能であり、ＨＥＡＬＯＳ（Ｏｒｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）及びＶＩＴＯＳＳ、ＲＨＡＫＯＳＳ、ＣＯＲＴＯＳＳ（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ，Ｍａｌｖｅｒｎ、ペンシルバニア州）などのコラーゲン骨移植片産物を石灰化することによっても利用可能である。前記フレームワークは、天然及び／合成物質の混合物、ブレンド、或いは複合体である。
【０１５２】
好ましい実施形態によれば、前記足場はフェルトであり、これは、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマー、またはブレンドなどの生体吸収材料、またはヒアルロン酸で作られた多繊維の糸から構成され得る。前記糸は、折目、切断、梳綿、穿刺から成る標準的な繊維処理技術を用いて作られる。
【０１５３】
別の好ましい実施形態において、本発明の前記細胞は、複合構造である発泡体足場に播種される。さらに、前記３次元フレームワークは、修復、置換或いは増強される耳の外形或いは身体の特定構造などの有用な形に作られてもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、前記足場は、細胞接着を向上させるために、本発明の細胞が播種される前に処理されてもよい。例えば、本発明の細胞の播種前に、ナイロン基質は、０．１モル酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、及び／若しくはコラーゲンとインキュベートされ、前記ナイロンをコーティングする。ポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理される。
【０１５５】
さらに、前記３次元フレームワークの外表面は、前記フレームワークをコーティングする血漿、若しくは１若しくはそれ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞基質、及び／若しくは、これだけに限らないが、ゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、及び植物ガムなどの他の物質の追加により、細胞接着または増殖、及び組織の分化を改善するように修正される。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、前記足場は、非血管形成性を与える物質から成る、若しくはこれで処理される。これらの処理と物質は、内皮増殖、遊走、及び細胞外マトリックスの堆積を促し、維持する。これらの物質と処理の例は、これだけに限られるものではないが、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、ｅＰＴＦＥなどの合成物質、及びＰＵＲＳＰＡＮ（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、バークリー）などの断片化ポリウレタンウレアシリコンなどの天然物質を含む。これらの物質はさらに、前記足場の非血栓形成性を与えるように処理され得る。そのような処理は、ヘパリンなどの抗血栓薬、血漿コーティングなどの前記物質の表面荷電を変化させる処理を含む。
【０１５７】
本発明のいくつかの観点において、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる前記細胞微小環境が培養において再構築されることが重要であり、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏの移植或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用の前に増殖する程度は変わるものである。さらに、成長因子は、細胞の接種の前、間、或いはその後に前記培養液へ添加され、ＰＤＣｓによる分化及び組織形成の引き金となる。
【０１５８】
前記３次元フレームワークは、細胞の増殖及びそれによる組織の産生が増強されるように、若しくは、前記移植の拒絶のリスクが軽減されるように、修飾される。従って、これに限定されるものではないが、抗炎症剤、免疫抑制剤、或いは増殖因子を含む１若しくはそれ以上の生物活性化合物は、前記フレームワークへ添加される。
【０１５９】
ＰＤＣｓからの細胞外マトリックス及び細胞溶解液の治療的使用
本発明の細胞を移植するための、或いはそこから産生される生組織の代替物として、組織修復、置換、または増強を必要とする対象に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）或いはこれらの細胞によって産生される細胞溶解液などのＰＤＣｓの構成成分または産生物の投与から利益が生じてもよい。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、例えば、ここで説明された３次元足場システムを用いるなど、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された後、望ましい量のＥＣＭが前記フレームワークに分泌された。前記足場にＥＣＭが分泌されると、前記細胞は除去される。前記ＥＣＭは、例えば、注入可能な製剤としてなどさらなる使用のために処理される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、前記細胞は死滅し、細胞片（例えば、細胞膜）は、前記フレームワークから除去される。このプロセスは、多数の異なる方法で実行される。例えば、前記生組織は、凍結保存剤なしで液体窒素中に急速冷凍される、或いは前記組織は、滅菌蒸留水中に浸され、浸透圧に反応して前記細胞が破裂される。前記細胞が死滅すると、前記細胞膜が破裂し、細胞片は、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、または双性イオン洗剤などの中性洗剤リンスで処理することで除去される。中性洗剤リンスを用いる利点は、膜に結合したタンパク質を可溶化すること、そしてしばしば高い抗原性である所にある。
【０１６２】
代わりに、前記組織は、細胞膜を破壊する洗剤で酵素的に消化及び／若しくは抽出され得る。そのような酵素の例には、これだけに限定されないが、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ）を含む。洗剤の例には、例えばアルキルアリルポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノール（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０（登録商標））、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、ポリエチレンラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、分岐或いは非分岐鎖に７〜２２炭素原子を含む、例えばドデシル硫酸ナトリウム、硫酸高級脂肪族アルコール、スルホン化アルカンおよびスルホン化アルキルアレンなどのイオン洗剤など、非イオン洗剤を含む。
【０１６３】
前述の通り、前記ＥＣＭを有する足場は、治療に用いられてもよい。或いは、ＥＣＭは前記足場から回収される。ＥＣＭの回収は、例えば、前記フレームワークが生物分解性か或いは非生物分解性であるかなどに依存した様々な方法で達成され得る。例えば、前記フレームワークが非生物分解性である場合、前記ＥＣＭは、前記フレームワークに超音波処理、高圧水ジェット、機械的スクレーピング、または洗剤または酵素を用いた中性処理、若しくは前記いずれかの組み合わせを適用することで除去されうる。
【０１６４】
前記フレームワークが生物分解性である場合、前記ＥＣＭは、例えば、前記フレームワークを溶液中で分解または溶解させることにより、回収され得る。或いは、前記生物分解性のフレームワークが、前記ＥＣＭとともにそれ自体が注入される可能性がある物質からなる場合、前記フレームワーク及び前記ＥＣＭは、その後の注入に対して全体として処理される。或いは、前記ＥＣＭは、ＥＣＭを非生物分解性フレームワークの回収に対する上述された方法のいずれかにより、前記生物分解性足場から除去され得る。全ての回収プロセスは、好ましくは、本発明の細胞により産生されたＥＣＭを変性させないように設計
される。
【０１６５】
前記ＥＣＭが回収された後、これはさらに加工される。前記ＥＣＭは、ホモジナイズされ、例えば超音波処理などの本分野で周知の技術を用いて細かい粒子にされ、外科的針により貫通することができる。ＥＣＭ構成成分は、望ましい場合、ガンマ照射により架橋される。好ましくは、前記ＥＣＭは、０．２５〜２メガラドの間で照射され、前記ＥＣＭを殺菌、架橋することができる。グルタルアルデヒドなどの毒性試薬を用いた化学的架橋は可能であるが、一般には好ましくない。
【０１６６】
分娩後由来細胞の集団から調整した細胞溶解物にも、多くの効用がある。１つの実施形態において、例えばその後細胞分画を分離せずに細胞を分離することで、細胞溶解物全体が調整される。別の実施形態において、細胞膜分画は、例えば遠心分離、ろ過、または同様の方法で本分野に既知のルーティンな方法により、前記細胞の可溶性分画から分離される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの溶解性細胞分画の使用により、拒絶または有害反応を誘導せずに、有益な細胞内環境を患者において利用することができる。細胞を溶解する方法は、本分野で周知であり、機械的分裂、酵素的分裂、または化学的分裂、またはその組み合わせの様々な方法を含む。そのような細胞溶解物は、その増殖培地で直接細胞から調整されてもよく、そのため分泌された増殖因子などを含む、或いは、例えばＰＢＳなどの溶液中で培地を洗い流した細胞から調整されてもよい。洗い流された細胞は、好ましい場合は最初の個体群密度よりも高い濃度で再懸濁されてもよい。分娩後由来細胞の集団から調整される細胞溶解物は、そのまま使用してもよく、さらに例えば限外ろ過または凍結乾燥により濃縮、またはさらに乾燥、部分的に精製、本分野で知られた薬学的に許容可能な担体または希釈液と混合、または例えば医薬品として有用なタンパク質組成物など、生物学的製剤などの他の化合物と組み合わせてもよい。細胞溶解物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独または例えば細胞と使用されてもよい。前記細胞溶解物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入された場合、治療部位で局所的に、または遠隔で導入され、例えば患者に必要な細胞増殖因子を提供してもよい。
【０１６７】
前記タンパク質の量及び／若しくは比は、本発明の細胞から産生される前記ＥＣＭ或いは細胞溶解液と１若しくはそれ以上の他の細胞タイプのＥＣＭ或いは細胞溶解物とを混合することで調節され得る。さらに、タンパク質、成長因子、及び／若しくは薬物などの生物活性物質は、前記ＥＣＭ或いは細胞溶解液製剤に組み込まれてもよい。典型的な生物活性物質の例としては、治癒と組織修復を促す抗炎症剤及び成長因子を含む。細胞は、本発明のＥＣＭ或いは細胞溶解液と同時に投与されてもよい。ＥＣＭまたはＰＤＣｓの細胞溶解液は、ＰＤＣｓに対して前記で示したように、投与用に処方されてもよい。
【０１６８】
薬剤有効性或いは毒性のＩｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに対するＰＤＣｓの使用
本発明の細胞及び組織は、薬剤の効果及び細胞毒性、増殖／制御因子、抗炎症薬について、広範な化合物をスクリーニングするためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用される。このため、本発明の細胞、或いは組織培養は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持され、テストされる化合物に曝される。細胞毒性化合物の活性は、培養における細胞を障害または死滅させる能力により測定されうる。これは重要な染色法により容易に評価されうる。増殖／制御因子の効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生細胞数を分析することにより、例えば、細胞総量及び異なる細胞数により評価される。これは、タイプ特異的な細胞抗原を定義する抗体を利用した免疫細胞化学的方法を利用するなど、標準的な細胞学的及び／若しくは組織学的方法を用いて達成されてもよい。懸濁培養または前述の３次元システムにおける、本発明の細胞に対する様々な薬物の効果は、評価される。
【０１６９】
本発明の細胞及び組織は、生理的或いは病理学条件の研究に対するモデルシステムとして利用されうる。本発明の細胞及び組織は、サイトカイン、成長因子、炎症伝達物質、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、プロスタグランジンなどの作用機序を研究するために用いられてもよい。さらに、細胞毒性及び／若しくは医薬品は、特定の患者で最も有効なものであるものがスクリーニングされ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効であることが証明された薬物は、患者を治療するために用いることができる。
【０１７０】
生物分子を産生するＰＤＣｓの使用
さらなる実施形態において、本発明の細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、高収率で生物産物を産生することができる。例えば、そのような細胞は、目的の特定生物産物（例えば、成長因子、制御因子、或いはペプチドホルモン）を自然に産生する、若しくは生物産物を産生するように遺伝的に操作されており、例えば、上述の３次元培養系を用いてクローン技術により増殖することができる。前記細胞が栄養培地に前記生物産物を分泌する場合、前記産物は、ディファレンシャルタンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動、高性能液体クロマトグラフィーなどの標準的な分離法を利用し、前記使用済みまたは条件培地から容易に単離されうる。「バイオリアクター」は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ３次元培養などの栄養補給を行うための流出法を活用するために利用されうる。
【０１７１】
基本的に、新鮮培地が前記３次元培養を通過すると、前記生物産物は、前記培養液から洗い流され、次に上述したように流出物から単離されてもよい。
【０１７２】
或いは、目的の生物産物は、前記細胞内に残り、そのためその回収では前記細胞が溶解されることが必要となることがある。前記生物産物は次に、前記方法の１若しくはそれ以上を用い精製されてもよい。
【０１７３】
キット
前記ＰＤＣｓ、及び構成成分、さらにそれらの産物は、例えば培養または移植用キットの一部として好都合に利用され得る。従って、本発明は前記ＰＤＣｓと、基質（例えば、足場）、水和剤（例えば、生理的に適合する食塩水、調整細胞培地）、細胞培養基質（例えば、培養皿、シャーレ、バイアルなど）、細胞培地（液体または粉末形）、抗生物質、ホルモンなどの追加構成成分を含むキットを提供する。前記キットは、そのような成分のいずれかを含むが、好ましくはその意図した使用に必要な全ての構成成分を含む。望ましい場合は、前記キットは、（典型的には凍結保存された）細胞を含み、ここで述べられたように、前記格子に播種される。
【０１７４】
別の観点においては、本発明は、上述されたように、増強、再生及び修復に対する様々な方法において、ＰＤＣｓ、ＰＤＣｓ集団、ＰＤＣｓの構成成分及び産物を利用したキットを提供する。いくつかの実施形態においては、前記キットは、少なくともＰＤＣｓを含む１若しくはそれ以上の細胞集団、及び薬学的に許容可能な担体（液体、半固体、または固体）を含む。前記キットは、状況に応じて、例えば注入により前記細胞を投与する手段を含んでもよい。前記キットはさらに、前記細胞の使用説明書を含んでもよい。軍事行為に使用するような医療現場で使用するために調整されたキットは、組織足場、外科的縫合、及びそれらと同等物を全体の処置供給品を含んでもよく、前記細胞は急性障害の修復と関連して使用される。ここで説明されたように、アッセイとｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に用いるキットには、（１）ＰＤＣｓまたはＰＤＣｓの構成成分、或いは産物、（２）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実行するための試薬、（３）適宜、他の細胞または細胞集団、及び（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を行うための取扱説明書の１つ若しくはそれ以上を含む。
【０１７５】
ＰＤＣｓの凍結保存及び貯蔵
本発明のＰＤＣｓは、凍結保存され、「細胞バンク」に維持或いは保存される。本発明の細胞の凍結保存は、既知の方法に沿って実行される。例えば、これだけに限らないが、５〜１０％のグリセロールを含む或いは含まず、例えば約０．５〜１０×１０６細胞／ミリリットルの密度で、例えばさらに０〜９５％のＦＢＳ、０〜１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を有する培地などの「凍結培地」で細胞が懸濁される。前記凍結保存培地は、これだけに限らないが、メチルセルロースを含む凍結保存剤を有する。前記細胞は次に、制御された割合の冷凍庫に密閉および移動されたガラスまたはプラスチックアンプルに分配される。最適な冷凍率は、経験的に決定されてもよい。例えば、プログラム可能な割合の冷凍庫は、毎分−１〜−１０℃の温度で変化させることができる。前記好ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃であり、さらに好ましくは約−９０℃〜約−１６０℃、最も好ましくは約−１２５〜約−１４０℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、好ましくは液体窒素に移動される。いくつかの実施形態においては、例えば、アンプルが約−９０℃に達した後、液体窒素の保存領域に移動される。凍結保存された細胞は、数年間保存されうる。
【０１７６】
本発明の凍結保存された細胞は、細胞のバンクを構成し、その一部を解凍することで「回収され」、次に必要に応じて使用される。例えば、液体窒素から３７℃の水浴にアンプルを移動することで、解凍は、一般に急速に実行される必要がある。前記アンプルの解凍内容物は、１０％ＦＢＳで調整したＤＭＥＭなど、適切な培地を含む培養容器に、滅菌条件下で直ちに移動される必要がある。
【０１７７】
さらに別の観点では、本発明が、本発明の組織、細胞、細胞構成成分、細胞集団を貯蔵する工程も提供する。前述の通り、前記細胞は容易に凍結保存される。従って、本発明はバンクにおける前記細胞を凍結保存する方法を提供し、ここにおいて前記細胞は、凍結保存され、前記細胞の免疫学的、生化学的、遺伝的性質に基づき前記細胞の完全な特徴と関連している。そのように凍結された細胞は、前記手順の要件及び前記患者の必要性に応じて、自家、同系、或いは同種間治療に使用される。好ましくは、各凍結保存サンプルの情報がコンピューターに保存され、これは前記外科医、手順、及び患者の要件を元に検索可能であり、前記細胞または集団の特徴を元に適切に整合されているものである。好ましくは、本発明の細胞は望みの細胞量に増殖され、基質または支持体の有無によらず、治療用細胞の組成物が個別にまたは共培養として調整される。いくつかの応用では、調整されたばかりの細胞を使用することが好ましい場合もあるが、それ以外では、前記細胞を凍結し、前記情報をコンピューターに入力することで凍結保存、貯蔵され、前記サンプルと前記コンピューター入力情報を関連付けることができる。免疫学的目的で、そのような細胞のレシピエントと供給源またはドナーを整合させる必要がある場合でも、例えば、前記バンクシステムが、治療の必要性に対して前記貯蔵された細胞の望ましい生化学的または遺伝的性質を容易に整合させる。貯蔵サンプルの望ましい特徴を整合させることで、前記サンプルが検索され、治療用に用意される。ここで説明されるとおりに調整された細胞溶解液或いは構成成分は、本発明に沿って保存され（例えば凍結保存、凍結乾燥）、貯蔵される。
【０１７８】
以下の実施例は、本発明の実施形態のいくつかの観点を詳細に記載するものである。これらの実施例は、これに限定されるものではないが、ここに記載された本発明の観点の更なる説明を提供するものである。  
【実施例１】
【０１７９】
分娩後胎盤組織からの細胞誘導
満期または早期妊娠いずれかの出産で、分娩後胎盤が入手された。細胞は、胎盤組織の５種類のドナーから採取された。１）異なる表現型の細胞に分化する可能性、または２）他の細胞および組織に対して有用な、重大な栄養因子を提供する可能性がある細胞を得る能力について、様々な細胞単離法が検討された。
【０１８０】
方法と物質
胎盤からの組織の単離：胎盤組織は国立疾病研究互助組織（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ、ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州、フィラデルフィア）から入手された。前記組織は正常外科的出産の時に妊娠から入手された。胎盤細胞は、層流フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記組織が、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄された。５０ミリリットルの培地（ＤＭＥＭ低グルコースまたはＤＭＥＭ高グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、前記組織が細いパルプに切断されるまで、前記組織が１５０ｃｍ２の組織培養皿で機械的に分離された。前記細かく切断された組織は、５０ミリリットルの円錐管（１本当たり約５グラムの組織）に移動された。
【０１８１】
前記組織は、次に１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および消化酵素をそれぞれ含むＤＭＥＭ低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地で、消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ」、ＤＭＥＭ低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ユニット／ミリリットル）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（ＤＭＥＭ低グルコース中コラゲナーゼ５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ５０ユニット／ミリリットル、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５ユニット／ミリリットル）。前記組織、培地、消化酵素を含む円錐管が、３７℃、環状シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ニューヨーク州ブルックリン）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートされた。
【０１８２】
消化後、前記組織が１５０ｘｇで５分間遠心分離され、前記上清が吸引された。前記ペレットは２０ミリリットルの増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、確定ウシ血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で再懸濁された。前記細胞懸濁液は、７０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でろ過された。増殖培地を有するさらに５ミリリットルのリンスが、前記ろ過器を通過された。前記細胞懸濁液は次に４０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させられ、さらに５ミリリットルの増殖培地のリンスで流された。
【０１８３】
前記ろ液は増殖培地に再懸濁され（総量５０ミリリットル）、１５０ｘｇで５分間遠心分離された。前記上清は吸引され、前記細胞は５０ミリリットルの新鮮増殖培地で再懸濁された。このプロセス（すなわち再懸濁、遠心分離、および吸引）は２回以上繰り返された。
【０１８４】
前記最終遠心分離の段階の後上清が吸引され、前記細胞ペレットが５ミリリットルの新鮮増殖培地中に再懸濁された。生存可能な細胞数はＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色により決定された。細胞は標準的な条件下で培養された。
【０１８５】
胎盤から単離された細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）の確定ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、ロット番号ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中、ゼラチンでコーティングしたＴ−７５ｃｍ２のフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州コーニング）に、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。約２〜４日後、使用済み培地は前記フラスコから吸引された。細胞はＰＢＳで３回洗浄され、壊死組織片と血液由来細胞を除去した。次に細胞に増殖培地が補充され、コフルエントまで増殖させた（約１０日間、継代０から継代１）。その後の継代では（継代１から２など）、細胞が４〜５日でサブコフルエントに達した（７５〜８５％コフルエント）。これらのその後の継代では、細胞が５０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、５％二酸化炭素と２０％酸素を用い、３７℃、加湿インキュベーターで増殖された。
【０１８６】
胎盤からの母性由来細胞および新生児由来細胞の集団の単離
前記細胞単離プロトコールは、層流フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記胎盤組織が抗真菌剤および抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄された。次に、前記胎盤組織が上線（新生児側）、中線（混合細胞単離の新生児および母体または絨毛領域）、下線（母体側）の３切片に解剖された。
【０１８７】
前記分離した切片はＰＢＳ中で数回個別に洗浄され、抗生物質／抗真菌剤でさらに血液および壊死組織片を除去した。各切片は、５０ミリリットルのＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、細かいパルプに１５０ｃｍ２の組織培養皿で機械的に分離された。前記パルプは５０ミリリットルの円錐管に移動された。各管には約５グラムの組織を含んでいた。前記組織は、ＰＢＳの１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシン  および消化酵素を含む、ＤＭＥＭ低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地で、消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）が使用され、ＤＭＥＭ低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０ユニット／ミリリットルを含む。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（ＤＭＥＭ低グルコース中コラゲナーゼ５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ５０ユニット／ミリリットル、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５ユニット／ミリリットル）。前記組織、培地、消化酵素を含む円錐管が、３７℃、環状シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ニューヨーク州ブルックリン）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートされた。
【０１８８】
消化後、前記組織が１５０ｘｇで５分間遠心分離され、前記で得られた上清が吸引された。前記ペレットは２０ミリリットルの増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、確定ウシ血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁された。前記細胞懸濁液は、次に７０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させられ、さらに５ミリリットルの増殖培地のリンスで追跡された。前記総細胞懸濁液は、４０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させられ、次にさらに５ミリリットルの増殖培地で洗い流された。
【０１８９】
前記ろ液は増殖培地に再懸濁され（総量５０ミリリットル）、１５０ｘｇで５分間遠心分離された。前記上清は吸引され、前記細胞は５０ミリリットルの新鮮増殖培地で再懸濁された。このプロセス（すなわち再懸濁、遠心分離、および吸引）は２回以上繰り返された。
【０１９０】
前記最終遠心分離の後で上清が吸引され、前記細胞ペレットが５ミリリットルの新鮮増殖培地中に再懸濁された。トリパンブルー排除試験により細胞数が決定された。次に細胞が標準的な条件下で培養された。
【０１９１】
異なる増殖条件を用いたＰＤＣｓの単離：胎盤由来細胞は、上記に提供された手順に従って、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する或いはしない成長因子において、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素組み合わせを用いて消化させた。そのように単離された胎盤由来細胞は、表１−１に説明された条件下で播種し、ペニシリン／ストレプトマイシン存在下で増殖させた。細胞は、播種後４回継代し、凍結保存した。凍結保存された細胞は、貯蔵しておいた。
【０１９２】
【表１】
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【０１９３】
結果
異なる増殖条件を用いたＰＤＣの単離：表１−１に説明された全ての条件において、細胞は、継代０及び１の愛代でよく接着し増殖した。条件５〜８、及び１３〜１６の細胞は、播種後少なくとも４継代までよく増殖することを示した。
【０１９４】
異なる酵素組み合わせを用いた胎盤からの細胞の単離：コラゲナーゼ：ディスパーゼ：及びコラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼでの組織消化は、素早く増殖した胎盤組織からの細胞集団の単離を生じた。
【０１９５】
要約：ＰＤＣｓは、マトリックスメタロプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの組み合わせ、例えばこれに限定されるものではないが、コラゲナーゼ及びディスパーゼの組み合わせを用いて単離され得る。ＰＤＣｓは、好ましくは、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びヒアルロン酸を消化するムコ多糖性加水分解酵素を組み合わせた酵素を用いて単離され、これに限定されるものではないが、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼ、或いはＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，イリノイ州）及びヒアルロニダーゼの組み合わせなどである。コラゲナーゼ（４  Ｗｕｎｓｃｈユニット／ｇ）及びサーモリシン（１７１４カゼインユニット／ｇ）であるＢｌｅｎｄｚｙｍｅ３は、細胞を単離するためにヒアルロニダーゼと共に使用される。  
【実施例２】
【０１９６】
胎盤由来細胞の増殖培地の評価
いくつかの細胞培地で、胎盤由来細胞の増殖を支持する能力が評価された。正常（２０％）および低（５％）酸素状態での胎盤由来細胞の増殖は、前記ＭＴＳ比色測定法を用いて３日後に評価された。
【０１９７】
方法と物質
継代８（Ｐ８）における胎盤由来細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州、カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））中、９６ウェルのプレート、１×１０３細胞／ウェルで播種された。８時間後、表２−１で説明されたとおりに前記培地が変化され、細胞は３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間、正常（２０％、ｖ／ｖ）または低（５％、ｖ／ｖ）酸素状態でインキュベートされた。ＭＴＳは３時間前記培地（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ一溶液細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に追加され、前記吸光度は４９０ナノメーターで測定された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）。
【０１９８】
【表２】
2007528702.tif 000003
【０１９９】
結果
前記ＭＴＳアッセイの標準曲線は、吸光度の上昇と細胞数の上昇の間で線形相関を確立した。得られた吸光度の値は推定細胞数に変換され、前記最初の播種に対する変化（％）が計算された。
【０２００】
正常な酸素状態で培地に血清を追加することで、吸光度に再現性のある用量依存性の上昇が得られ、そのため（外挿された）前記生存可能な細胞数が上昇した。完全なＭＳＣＧＭに血清を追加することで、吸光度が用量依存的に低下した。追加する血清がない前記培地では、細胞がＣｅｌｌｇｒｏ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０、ＤＭＥＭ培地でのみ増殖した。
【０２０１】
低酸素は、成長培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０及びＭＳＣＧＭにおける細胞の増殖率を増加した。
【０２０２】
増殖が抑制される順では、前記ＰＣＤｓの最適な増殖が得られる前記培地は、増殖培地>ＭＳＣＧＭ>イスコブの＋１０％ＦＢＳ＝ＤＭＥＭ−高グルコース＋１０％ＦＢＳ＝ハムのＦ１２＋１０％ＦＢＳ＝ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであった。
【０２０３】
要約：胎盤由来細胞は、正常或いは低酸素における様々な培養液において増殖される。ＰＤＣｓは、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０及びＣｅｌｌｇｒｏ−ｆｒｅｅなどのタンパク質を含まない条件においても増殖した。低酸素は、成長培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０及びＭＳＣＧＭにおける細胞の増殖率を増加した。
【０２０４】
参考文献
米国特許番号第２００４０００５７０４号公報
【実施例３】
【０２０５】
Ｄ−バリンを含む培地中の分娩後細胞の増殖
通常のＬ−バリンアイソフォームの代わりにＤ−バリンを含有する培地が利用され、培養において線維芽細胞様細胞の増殖を選択的に抑制させることが報告された（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、２０００；  Ｓｏｒｄｉｌｌｏら、１９８８）。臍帯由来細胞がＤ−バリン含有培地において増殖できるかどうかを決定するために実験を行なった。
【０２０６】
方法と物質
ゼラチンでコーティングしたＴ７５フラスコ中、５×１０３細胞／ｃｍ２で胎盤由来細胞（Ｐ３）および線維芽細胞（Ｐ９）が播種された（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）。２４時間後、前記培地が除去され、前記細胞がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州コーニング）で洗い流され、残りの培地を除去した。前記培地が修正増殖培地（Ｄ−バリン（特注、Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いたＤＭＥＭ）で置換された。
【０２０７】
結果
透析された血清を含む増殖培地に播種された細胞と異なり、Ｄ−バリン含有培地に播種される胎盤由来細胞および線維芽細胞は増殖しなかった。線維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが増加し、形が変化した。前記細胞のすべてが死滅し、最終的に４週間後、フラスコ表面から剥離した。
【０２０８】
要約：ＰＤＣｓは、細胞増殖、及び長期生存を維持するために、Ｌ−バリンを必要とすると結論付けられた。  
【実施例４】
【０２０９】
胎盤由来細胞の凍結保存培地
本研究の目的は、胎盤由来細胞の凍結保存用に適切な凍結保存培地を決定することであった。
【０２１０】
方法と物質
ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｔ．＃ＳＨ３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））で増殖された分娩後由来細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で洗浄され、１ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてトリプシン処理された。前記トリプシン処理は１０ミリリットルの増殖培地を追加することで停止された。前記細胞は１５０ｘｇで遠心分離され、上清が除去され、前記細胞ペレットは１ミリリットルの増殖培地に再懸濁された。一定分量の細胞懸濁液６０マイクロリットルが除去され、６０マイクロリットルのトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）に追加された。血球計数板を用い、前記生存能力のある細胞数が推定された。前記細胞懸濁液がそれぞれ８８×１０４細胞を含む４等分量に分割された。前記細胞懸濁液が以下の各培地１ミリリットル未満に遠心分離、再懸濁され、Ｃｒｙｏｖｉａｌｓ（Ｎａｌｇｅｎｅ）に移された。
【０２１１】
１．）増殖培地＋１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
２．）細胞凍結培地ｗ／ＤＭＳＯ、ｗ／メチルセルロース、血清なし（Ｃ６２９５、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
３．）細胞凍結培地、血清なし（Ｃ２６３９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
４．）細胞凍結培地、ｗ／グリセロール（Ｃ６０３９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
前記細胞は、前記製造業者の使用説明書に沿って、「Ｍｒ  Ｆｒｏｓｔｙ」冷凍庫を用い、約１℃／分で一晩、−８０℃の冷凍庫で冷却した（Ｎａｌｇｅｎｅ、ニューヨーク州ロチェスター）。細胞のバイアルは、３７℃の水浴で急速解凍する前に、２日間液体窒素に移動した。前記細胞は１０ミリリットルの増殖培地に追加され、遠心分離された後、以前に前記細胞数と生存度が推定された。細胞は５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングしたフラスコ上に播種され、前記細胞が接着および増殖されるか否かを決定した。
【０２１２】
結果
凍結乾燥される前記細胞の最初の生存可能性は、トリパンブルー染色で１００％と評価された。
【０２１３】
細胞溶解によりＣ６２９５の生存可能性がある細胞数が相応に減少した。４種類すべての溶液で凍結保存された前記生存可能な細胞が、３日以内にコフルエント単層を接着、分割、生産した。推定増殖率に認識できる差はなかった。
【０２１４】
要約：細胞の凍結保存は、細胞バンクまたは細胞生産物の調整に利用できる１つの手順である。４つの凍結保存混合物では、凍害からヒト胎盤由来細胞を保護する能力が比較された。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、胎盤由来細胞の凍結保存を比較するために好ましい培地である。  
【実施例５】
【０２１５】
胎盤由来細胞の増殖の特徴
単離された幹細胞の他の集団と、胎盤由来細胞の細胞増殖の可能性が比較された。老化に対する細胞増殖のプロセスは、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限度として引用される（Ｈａｙｆｌｉｃｋ（１９７４）Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．２２：１〜１２；Ｈａｙｆｌｉｃｋ（１９７４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ  １４：３７〜４５）。
【０２１６】
材料と方法
ゼラチンコーティングフラスコ：組織培養プラスチック製フラスコは、室温で２０分間、２０ミリリットルの２％（ｗ／ｖ）ブタゼラチン（Ｔｙｐｅ  Ｂ：  ２２５  Ｂｌｏｏｍ；Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）に追加することでコーティングされた。前記ゼラチン溶液を除去した後、１０ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）が追加され、次に吸引された。
【０２１７】
他の細胞集団と胎盤由来細胞との増殖可能性の比較：増殖の可能性を比較するため、ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許番号第６，５５５，３７４  Ｂ１号、米国特許出願番号第ＵＳ２００４００５８４１２号）、ｉｉｉ）正常皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ｌｏｔ  ＃  ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｖ）胎盤由来細胞の細胞集団を利用した。ＤＭＥＭ−低グルコース（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）確定ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、Ｌｏｔ＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド使用）において、ゼラチンでコーティングしたＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で細胞を最初に播種した。その後の継代では、細胞培養が以下のように処理された。トリプシン処理後、生存可能な細胞がトリパンブルー染色後に計数され、（すなわち、細胞懸濁液（５０マイクロリットル）がトリパンブルー（５０マイクロリットル、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）と混合されて）。血球計数板を用い、生存可能細胞数が推定された。
【０２１８】
計数後、細胞が新鮮増殖培地２５ミリリットルの５，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコに播種された。標準的な大気下、５％二酸化炭素を用い、３７℃で細胞が増殖された。前記増殖培地は週２回変更された。細胞が約８５％コフルエントに達したときにこれが継代され、このプロセスは前記細胞が老化に達するまで繰り返された。
【０２１９】
各継代で細胞がトリプシン処理され、計数された。前記生存可能な細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）が計算された。最適な細胞増殖を決定する目的として、継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０２２０】
低密度での細胞バンクの増殖可能性：継代１０で貯蔵した細胞の増殖の可能性が検討された。正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット＃  ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）、胎盤由来細胞が検討された。これらの細胞集団はこれまで継代１０で貯蔵され、５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、その時点まで各継代でコフルエントまで増殖された。継代１０で細胞解凍後、前記細胞集団で細胞密度の効果が決定された。細胞は標準的な条件で解凍され、トリパンブルー染色により計数された。次に、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース増殖培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）と、１５％（ｖ／ｖ）確定ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、Ｌｏｔ＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド使用）において、１，０００細胞／ｃｍ２で解凍細胞が播種された。細胞は標準的な大気条件下、３７℃で増殖された。増殖培地は週２回変更され、細胞は約８５％コフルエントに達するまで継代された。その後細胞は老化まで継代された。細胞はトリプシン処理され、各継代に関して計数された。前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）が計算された。継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０２２１】
最初の細胞播種から低密度での胎盤由来細胞の増殖：低細胞播種条件で単離直後の胎盤由来細胞の増殖の可能性が、別の実験で検討された。例１で説明されるとおり、胎盤由来細胞が単離された。細胞は１，０００細胞／ｃｍ２で播種され、老化まで前述の通り継代された。細胞は標準的な大気条件下、３７℃で増殖された。増殖培地は週２回変更された。細胞は約８５％コフルエントに達するまで継代された。各継代で細胞がトリプシン処理され、トリパンブルー染色で計数された。各継代で前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）が計算された。継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。細胞はゼラチンと非ゼラチンコーティングフラスコで増殖された。
【０２２２】
クローン新生児または母体の胎盤由来細胞の増殖：胎盤組織からの新生児または母体細胞集団の増殖を成功させるため、クローニングが利用されてもよい。前記胎盤から３種類の細胞集団が単離された後（新生児側、母体側、絨毛領域）、これらの細胞集団は標準的な増殖条件下で増殖された後、核型が判定され、前記単離細胞集団の識別情報が明らかとなる。男児を出産した母親の細胞を単離することで、中期に拡散させることで、男性と女性の染色体を区別することが可能である。これらの実験が利用され、上線細胞は新生児表現型が陽性の核型であり、中線細胞は新生児および母体表現型両方が陽性の核型であり、下線細胞は母体細胞が陽性の核型である。
【０２２３】
他の増殖条件：他の実験では、細胞が非コーティング、コラーゲンコーティング、フィブロネクチンコーティング、ラミニンコーティング、または細胞外膜タンパク質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））コーティングプレートのいずれかで増殖された。培養はこれらの異なる基質で十分増殖することが証明された。
【０２２４】
結果
胎盤由来細胞の増殖の可能性と他の幹細胞および非幹細胞集団の比較：胎盤由来細胞は、４０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１×１０１７細胞となった。対照的に、ＭＳＣと線維芽細胞はそれぞれ２５日未満、６０日未満後に老化した。脂肪由来および大網細胞のいずれもほぼ６０日間増殖したが、これらの細胞の総細胞収率はそれぞれ４．５×１０１２および４．２４×１０１３となった。したがって、利用される前記実験条件下、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された場合、ＰＤＣｓは同じ条件で増殖される他の細胞タイプよりもはるかに増殖した（表５−１）。
【０２２５】
【表３】
2007528702.tif 000004
【０２２６】
低密度での細胞バンクの増殖可能性：胎盤由来細胞および線維芽細胞は、１０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１×１０１１細胞となった（表５−２）。これらの条件下で６０日後、前記胎盤由来細胞は老化したが、前記線維芽細胞集団は８０日後に老化し、４０集団倍加が完了した。
【０２２７】
【表４】
2007528702.tif 000005
【０２２８】
最初の細胞播種から低密度での胎盤由来細胞の増殖：低密度（１，０００細胞／ｃｍ２）でゼラチンコーティングおよびコーティングしていないプレートまたはフラスコに胎盤由来細胞が増殖された。これらの条件下でこれらの細胞の増殖可能性は良好であった。前記細胞では対数増殖期の増殖が容易に増大した。胎盤由来細胞がゼラチンコーティングフラスコの増殖培地で、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された場合、細胞増殖率は観察されたものと同様であった。コーティングされていないフラスコまたはゼラチンコーティングされたフラスコでの培養では、細胞増殖の可能性に差は観察されなかった。ゼラチンコーティングフラスコで増殖した細胞は、コーティングされていないフラスコで増殖した細胞より表現型では小さく見えた。
【０２２９】
クローン新生児または母体の胎盤由来細胞の増殖：クローン新生児または母体の細胞集団は、それぞれ前記胎盤の新生児側または母体側から単離された胎盤由来細胞から増殖されうる。細胞は連続的に希釈され、次に９６ウェルのゼラチンコーティングされたプレート、１細胞／ウェルで増殖させるため、増殖培地のゼラチンコーティングされたプレートに播種される。この最初のクローニングからは、増殖培地の１２ウェルのゼラチンコーティングされたプレートで膨張性クローンが同定、トリプシン処理、再播種され、次に増殖培地において５，０００細胞／ｃｍ２でＴ２５ゼラチンコーティングフラスコに継代される。細胞のクローン集団が同定されたことを確認するため、サブクローニングが行われる。サブクローニングの実験では、０．５細胞／ウェルで細胞がトリプシン処理、再播種される。十分増殖するサブクローンは、５，０００細胞ｃｍ２／フラスコでゼラチンコーティングされたＴ２５フラスコ中で増殖される。細胞は５，０００細胞ｃｍ２／Ｔ７５フラスコで継代される。細胞増殖を証明するため、最良のクローン増殖の特徴はプロットされる。核型分析では、前記クローンが新生児または母性であることを確認できる。
【０２３０】
要約：約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、成長培地のゼラチンコーティング或いは非コーティングされたフラスコ上で、標準雰囲気酸素下で単離されたＰＤＣｓの増殖の細胞増殖条件は、継代１１での大量の細胞を産生するのに十分であった。ＰＤＣｓは、低密度培養条件（例えば、約１，０００細胞／ｃｍ２）を用いて容易に増殖され得る。胎盤由来細胞は、標準雰囲気条件下で、細胞の大きなプールを作成するように培養されることが好ましい。培養条件は、胎盤由来細胞の増殖及び／若しくは分化能力を達成するために変更される。
【０２３１】
用いられた条件下で、ＭＳＣｓ及び脂肪由来細胞の増殖能力は限られていたが、胎盤由来細胞は、素早く大量に増殖した。このデータは、ここで開発されたように、胎盤由来細胞株は、４０倍加以上増殖でき、例えば細胞バンクなどに対して十分な細胞数を提供するが、間葉系幹細胞は増殖できず大量の細胞を得られなかったことを示していた。
【０２３２】
参考文献
Ｈａｙｆｌｉｃｋ(１９７４)Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．２２(１)：１〜１２
【実施例６】
【０２３３】
胎盤由来細胞の核型分析
細胞療法で利用される細胞系は好ましくは均一であり、汚染細胞タイプはない。細胞療法で利用されるヒト細胞は、正常な染色体数（４６）と構造を有する必要がある。均一で非胎盤組織由来の胎盤由来細胞系を同定するため、細胞サンプルの核型が分析された。
【０２３４】
材料と方法
男性新生児の分娩後組織のＰＤＣsは、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド））で培養された。男性新生児（Ｘ，Ｙ）の分娩後組織は、新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）を区別できるように選択された。細胞はＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）で増殖培地に５，０００細胞／平方センチメートルで播種され、約８０％コフルエントに増殖された。細胞を含むＴ２５フラスコは、増殖培地で頸部が充填された。サンプルは宅配業者によって臨床細胞遺伝学研究室に配達された（研究室から研究室への推定移動時間は１時間）。染色体分析は、ニュージャージー州ニューヨーク、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  &  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって実施された。前記染色体は最も可視化される際、中期で細胞が分析された。計数された中期の２０個の細胞のうち、５個で正常な均一核型数（２）が分析された。２個の核型が観察された場合、細胞サンプルは均一なものとして特徴付けられた。２個以上の核型が観察された場合、細胞サンプルは不均一なものとして特徴付けられた。不均一な核型数（４）が同定されると、追加中期細胞数が計数、分析された。
【０２３５】
結果
染色体分析に送られたすべての細胞サンプルは、正常な形態を示すと解釈された。分析された細胞系１３種類のうち３種類は均一な表現型を示し（ＸＸおよびＸＹ）、新生児および母体由来の細胞の存在を示した（表６−１）。組織胎盤−Ｎ由来の細胞は、胎盤の新生児側から単離された。継代０では、この細胞系がＸＹで均一であるように見えた。しかし、継代９では、細胞系が不均一であり（ＸＸ／ＸＹ）、母体由来細胞でこれまで未検出の細胞の存在を示している。
【０２３６】
【表５】
2007528702.tif 000006
【０２３７】
要約：染色体分析では、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されるとおり、核型が正常に見える胎盤由来細胞を同定した。均一の核型で決定されるとおり、核型分析でも母体細胞がない細胞系を同定した。  
【実施例７】
【０２３８】
フローサイトメトリーによるヒト胎盤由来細胞表面マーカーの評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴は、細胞系の同定を決定するために利用されうる。発現の一貫性は複数のドナーから、異なる処理と培養条件に曝露された細胞で決定される可能性がある。前記胎盤から由来した分娩後細胞系は（フローサイトメトリーで特徴付けられ）、それによりこれらの細胞系同定するため、プロフィールを提供した。
【０２３９】
材料と方法
培地：１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド））で細胞が培養された。
【０２４０】
培養容器：細胞は血漿で処理されたＴ７５、Ｔ１５０、Ｔ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）でコフルエントまで培養された。前記フラスコの増殖表面は、室温で２０分間２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）をインキュベートすることで、ゼラチンによりコーティングされた。
【０２４１】
抗体染色：フラスコ中の接着細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。前記製造業者の仕様書に沿って、対象の前記細胞表面マーカー抗体（表７−１）が１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、前記混合物は４℃で３０分間、暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、非結合性抗体を除去した。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。
【０２４２】
フローサイトメトリー分析：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）でフローサイトメトリー分析が実施された。
【０２４３】
細胞表面マーカー抗体：以下の細胞表面マーカー抗体が使用された。
【０２４４】
【表６】
2007528702.tif 000007
【０２４５】
継代と継代の比較：胎盤は継代８、１５、２０で分析された。
【０２４６】
ドナーとドナーの比較：ドナーの違いを比較するため、異なるドナーの胎盤細胞がそれぞれ比較され、異なるドナーの臍帯由来細胞がそれぞれ比較された。
【０２４７】
表面コーティングの比較：ゼラチンコーティングフラスコで培養された胎盤由来細胞は、コーティングされていないフラスコで培養された胎盤由来細胞と比較された。ゼラチンコーティングフラスコで培養された臍帯由来細胞は、コーティングされていないフラスコで培養された臍帯由来細胞と比較された。
【０２４８】
消化酵素の比較：細胞の単離と調整に用いた４種類の治療を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを処理することで、胎盤から単離された細胞が比較された。
【０２４９】
胎盤層比較：胎盤組織の母体側から単離された細胞は、胎盤組織の絨毛領域から単離された細胞、および胎盤の新生胎児側から単離された細胞と比較された。
【０２５０】
結果
胎盤由来細胞の特徴：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産で陽性であることが示されたフローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞は、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示された。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な生産が陰性であり、前記ＩｇＧコントロールと比較可能な蛍光値が示された。陽性曲線の蛍光値の変化が説明された。前記陽性曲線の平均（つまりＣＤ１３）と範囲（つまりＣＤ９０）はやや変化を示したが、前記曲線は正常に見え、均一な集団であることが確認され、ＩｇＧコントロール以上の蛍光値を示した。
【０２５１】
継代と継代の比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析された継代８、１５、２０の胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産で陽性あった。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致することにより示された。
【０２５２】
ドナーとドナーの比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、別のドナーから単離された胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２５３】
ゼラチンを用いた表面コーティングの効果：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、ゼラチンでコーティングされたかコーティングされていないフラスコで増殖された胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２５４】
前記細胞表面マーカーのプロフィールでの酵素消化法の作用：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析された様々な消化酵素により単離された胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２５５】
胎盤層比較：それぞれＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの生産で陽性であることが示されたフローサイトメトリーで分析された、前記胎盤の母体、絨毛、新生児層から単離された細胞は、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示された。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの生産が陰性であった。
【０２５６】
要約：フローサイトメトリーによる胎盤由来細胞の分析は、これらの細胞系の同定に有用なプロファイルを確立した。胎盤由来細胞ではＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃが陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性である。前記ドナー、継代、培養容器の表面コーティング、消化酵素、胎盤層を含む変数の変動によらず、この同一性は一致した。個々の蛍光値のヒストグラム曲線の平均と幅におけるいくつかの変化が観察されたが、すべての検討された条件下ですべての陽性曲線が正常であり、前記ＩｇＧコントロールよりも大きな蛍光値を発現していたため、前記細胞が均一な集団を有し、前記マーカーの陽性発現を有することを確認した。  
【実施例８】
【０２５７】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイによる胎盤由来細胞の分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイが使用され、胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールをヒト骨髄由来の臍帯由来細胞、線維芽細胞、ヒト間質幹細胞、別の細胞系と比較した。この分析では前記分娩後由来細胞の特徴を提供し、これらの細胞に独特の分子マーカーを同定した。
【０２５８】
材料と方法
細胞の単離と培養
分娩後組織由来細胞：ヒトの臍帯と胎盤は、患者の同意を得て、正常な満期出産において国立疾病研究互助組織（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から得られた。例１で説明されたとおり、前記組織が受理され、細胞が単離された。ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコにおいて、増殖培地（１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州、セントルイス）を用いたダルベッコ変法の基本培地（ＤＭＥＭ低グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド））で細胞が培養された。前記培養が標準的な増殖条件でインキュベートされた。
【０２５９】
線維芽細胞：ヒト皮膚線維芽細胞はＣａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウォーカーズビル、ロット番号９Ｆ０８４４）から購入され、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から入手された。いずれの系も１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で培養された。前記細胞は標準組織で処理されたプラスチックで増殖された。
【０２６０】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）：ｈＭＳＣはＣａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウォーカーズビル、ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、２Ｆ１６５７）から購入され、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）の製造業者の仕様書に沿って培養された。前記細胞は、５％ＣＯ２を用い、３７℃で標準的な大気で増殖された。
【０２６１】
ヒト回腸稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）：ヒト回腸稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受理された。前記骨髄はＨｏらが概要を示した方法に沿って処理された（国際ＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０２５１４９号）。前記骨髄は、２０パーツの溶解緩衝液に対して１パーツの骨髄の比で、溶解緩衝液（１５５マイクロモルのＮＨ４Ｃｌ、１０マイクロモルのＫＨＣＯ３、０．１マイクロモルのＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２）と混合された。細胞懸濁液はボルテックスされ、大気温度で２分間インキュベートされ、５００ｘｇで１０分間遠心分離された。前記上清は廃棄され、前記細胞ペレットは、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清と４マイクロモルのグルタミンが補充されたＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁された。前記細胞は遠心分離され、前記細胞ペレットは新鮮培地に再懸濁された。前記生存可能な単核細胞は、トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を用いて計数された。前記単核細胞は、５×１０４細胞／ｃｍ２で組織培養プラスチックフラスコに播種された。前記細胞は、標準的な大気Ｏ２または５％Ｏ２で５％ＣＯ２を用い、３７℃でインキュベートされた。細胞は培地を取り替えずに、５日間培養された。培地と非接着細胞は５日間の培養後に除去された。前記接着細胞は培地で管理された。
【０２６２】
ｍＲＮＡと遺伝子チップ分析の単離：細胞の活性増殖培地は、細胞スクレーパーを用い、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で前記フラスコから除去された。前記細胞は３００ｘｇで５分間遠心分離された。前記上清は除去され、前記細胞は新鮮ＰＢＳ中で再懸濁され、再度遠心分離された。前記上清は除去され、前記細胞ペレットは−８０℃で直ちに冷却、保存された。細胞ｍＲＮＡはｃＤＮＡに抽出、転写された。ｃＤＮＡは次にｃＲＮＡに転写され、ビオチン標識された。前記ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いてハイブリダイズされた。前記ハイブリッド形成とデータ収集は、前記製造業者の仕様書に沿って実施された。データ解析は、"Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピュータソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の（ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ／；Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５１１６〜５１２１）を用いて実行した。
【０２６３】
結果
この研究では、１４種類の異なる細胞集団が分析された。継代情報、培養基質、培地に沿った細胞は表８−１に掲載された。
【０２６４】
【表７】
2007528702.tif 000008
【０２６５】
前記データはＰｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓで評価され、前記細胞で異なって発現された前記２９０遺伝子を分析した。この分析は、前記集団の類似性を相対的に比較することができる。表８−２は、前記細胞ペアの比較を計算したユークリッド距離を示す。前記ユークリッド距離は前記細胞の比較に基づき、前記細胞タイプの間で異なって発現された２９０種類の遺伝子に基づいていた。前記ユークリッド距離は、前記２９０遺伝子の発現の類似性に反比例している。
【０２６６】
【表８】
2007528702.tif 000009
【０２６７】
表８−３、８−４、８−５は、胎盤由来細胞画が増加した遺伝子の発現（表８−３）、臍帯由来細胞が増加した遺伝子の発現（表８−４）、臍帯と胎盤由来細胞が減少した遺伝子の発現（表８−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と表題をつけたカラムは、前記チップの特定部位に位置したいくつかのオリゴヌクレオチドプローブセットの製造業者識別コードを指し、これは前記名称を付けた遺伝子とハイブリッド形成し（カラム「遺伝子名」）、前記特定の受入番号（カラム「ＮＣＢＩ受入番号」）でＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内に見ることができる配列を有する。
【０２６８】
【表９】
2007528702.tif 000010
【０２６９】
【表１０】
2007528702.tif 000011
【０２７０】
【表１１−１】
2007528702.tif 000012
【０２７１】
【表１１−２】
2007528702.tif 000013
【０２７２】
【表１１−３】
2007528702.tif 000014
【０２７３】
表８−６、８−７、８−８は、ヒト線維芽細胞（表８−６）、ＩＣＢＭ細胞（表８−７）、ＭＳＣ（表８−８）で上昇した遺伝子の発現を示す。
【０２７４】
【表１２】
2007528702.tif 000015
【０２７５】
【表１３】
2007528702.tif 000016
【０２７６】
【表１４】
2007528702.tif 000017
【０２７７】
要約：前記ＧＥＮＥＣＨＩＰ分析が実施され、胎盤に由来する前記分娩後細胞の分子の特徴を提供した。この分析には３種類の胎盤に由来する細胞を含めた。この研究でも、３種類の臍帯系、２種類の皮膚線維芽細胞系、３種類の間葉幹細胞、３種類の回腸稜骨髄細胞を含めた。これらの細胞によって発現された前記ｍＲＮＡは、２２，０００遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを含んだＡｆｆｙＭｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰにより分析された。
【０２７８】
結果は、これらの５種類の細胞タイプで、２９０種類の遺伝子が異なって発現されることを示した。これらの遺伝子には、前記胎盤由来細胞で特異的に上昇する１０種類の遺伝子を含む。５４種類の遺伝子では、胎盤で特異的に発現レベルが低下することが分かった。
【０２７９】
選択された遺伝子の発現は、例９でＰＣＲにより確認された。これらの結果は、前記胎盤由来細胞が、例えば骨髄由来細胞および線維芽細胞と比較し、明らかに異なる遺伝子発現プロフィールを有することを示している。  
【実施例９】
【０２８０】
胎盤由来細胞の細胞マーカー
前記ヒト胎盤から由来する細胞と他の供給源から由来する細胞の間の遺伝子発現の類似性と違いは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐアレイを用い、それらの遺伝子発現プロフィールを比較することで評価された。同定された６種類の「サイン」遺伝子は、酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン−８、レニン、レチキュロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）であった。これらの「サイン」遺伝子は、胎盤由来細胞で比較的高レベルで発現された。前記マイクロアレイデータの妥当性を確認し、遺伝子とタンパク質との発現で一致／相違を発見するため、また胎盤由来細胞に特異的な識別子を検出するため、一連の信頼できるアッセイを確立するために本分析は実施された。
【０２８１】
方法と物質
細胞：胎盤由来細胞（核型分析により同定されるとおり、主に新生児の１種類の分離菌を含む３種類の単離株）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、新生児および成人）が、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコの増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で増殖された。間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉幹細胞の増殖培地一括キット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖された。
【０２８２】
前記ＩＬ−８実験では、細胞が液体窒素から解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングされたフラスコに播種され、増殖培地で４８時間増殖され、次に８時間、１０ミリリットルの血清飢餓培地［（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス））で増殖された。この処理後、ＲＮＡは抽出され、前記上清が１５０ｘｇで５分間遠心分離され、細胞片が除去された。
【０２８３】
ＥＬＩＳＡアッセイの細胞培養：胎盤由来細胞およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞が、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地で培養された。細胞は継代１１で液体窒素中に凍結された。細胞は１５ミリリットルの遠心分離管に解凍、移動された。５分間、１５０ｘｇで遠心分離後、前記上清は廃棄された。細胞は４ミリリットルの培地に再懸濁され、計数された。細胞は、３７５，０００細胞／フラスコで２４時間、１５ミリリットルの増殖培地を含む７５ｃｍ２のフラスコで増殖された。前記培地は８時間、血清飢餓培地に変更された。血清飢餓培地はインキュベーションの最後に回収され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離され、−２０℃で保存された。
【０２８４】
各フラスコで細胞数を推定するため、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）が各フラスコに追加された。細胞が前記フラスコから分離された後、トリプシン活性が８ミリリットルの増殖培地で中和された。細胞は１５ミリリットルの遠心分離管に移され、１５０ｘｇで５分間、遠心分離された。上清は除去され、１ミリリットルの増殖培地が各管に追加され、前記細胞を再懸濁した。血球計数板を用い、細胞数が推定された。
【０２８５】
ＥＬＩＳＡアッセイ：前記細胞により血清飢餓培地に分泌されたＩＬ−８の量はＥＬＩＳＡアッセイで分析された（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。すべての分析は、前記製造業者によって提供された使用説明書に沿って検査された。
【０２８６】
総ＲＮＡ単離：ＲＮＡは、コフルエント胎盤由来細胞と線維芽細胞から抽出されるか、ＩＬ−８の発現では前述の通り処理された細胞から抽出された。細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に沿って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を含む３５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解された。ＲＮＡは製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に沿って抽出され、ＤＮＡアーゼが処理された（２．７Ｕ／サンプル）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保存された。ＲＮＡはヒト胎盤から抽出された。β−メルカプトエタノールを含む７００マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴに組織（３０ミリグラム）が懸濁された。サンプルは機械的にホモジナイズされ、前記ＲＮＡ抽出は製造業者の使用説明書に沿って処理された。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保存された。
【０２８７】
逆転写：ＲＮＡは２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたランダム六量体を用い、逆転写された。サンプルは−２０℃で保存された。
【０２８８】
分娩後細胞（"サイン遺伝子"は酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン、レチキュロンを含む）で独自に制御されるとおり、ｃＤＮＡマイクロアレイで同定された遺伝子は、さらにリアルタイムおよび従来のＰＣＲで検討された。
【０２８９】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物：酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）を用いてｃＤＮＡサンプルで実施され、ＧＡＰＤＨは前記製造業者の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）に沿って、７０００配列の検出システムにより、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用い、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターと混合された。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造業者の使用説明書（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのユーザー掲示板＃２）に沿って分析された。
【０２９０】
従来のＰＣＲ：従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの結果を確認するため、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ボストン）を用いて実施された。ＰＣＲは２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＴＡＱポリメラーゼ（商品名ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）と、９４℃、５分で最初の変性を利用して実施された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、レチキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル）、レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３８サイクル）、酸化ＬＤＬ受容体とＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３３サイクル）について、増幅は各プライマーセットで最適化された。増幅に用いられたプライマーは表１に掲載されている。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、０．５マイクロモルのＧＡＰＤＨを除き、１マイクロモルであった。前記製造業者のＴａｑＭａｎプローブが前記最終ＰＣＲ反応に追加されなかった場合を除き、ＧＡＰＤＨプライマーはリアルタイムＰＣＲと同じであった。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでサンプルが実行され、臭化エチジウムで染色された（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）。画像は焦点距離ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用い、６６７  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｗｉｎｐａｃｋフィルム（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて捕獲された。
【０２９１】
【表１５】
2007528702.tif 000018
【０２９２】
免疫蛍光検査：細胞は、冷却した４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリー州セントルイス）で１０分間、室温で固定された。継代０（Ｐ０）（単離直後）と継代１１（Ｐ１１）（胎盤由来細胞の分離株２種類、臍帯由来細胞の分離株２種類）の胎盤由来細胞および線維芽細胞（Ｐ１１）が使用された。ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、デスミン（１：１５０、Ｓｉｇｍａ−ウサギに対して作成、または１：３００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ−マウスに対して作成）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カーピンテリア）のエピトープに対する抗体を用い、免疫細胞化学検査が実施されたさらに、継代１１の胎盤由来細胞で抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；ａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）のマーカーが検討された。
【０２９３】
培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が省略された。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記プロセスを介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に塗布された。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにブロックを含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、前記一次抗体溶液は除去され、前記培地がＰＢＳで洗浄された。培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０２９４】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光が可視化された。すべてのケースで、対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用い、代表的な画像が捕らえられた。３回染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像が取られた。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて層状のモンタージュが用意された。
【０２９５】
ＦＡＣＳ分析での細胞の調整：フラスコ中の接着細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。１００マイクロリットルの分量が円錐管に移された。細胞内抗原で染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）で透過された。抗体は製造業者の使用説明書により一定分量に追加され、前記細胞が３０分間４℃において暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、過剰な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞は１００マイクロモルの３％ＦＢＳに再懸濁された。二次抗体は製造業者の使用説明書により追加され、前記細胞が３０分間４℃において暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、過剰な二次抗体を除去した。洗浄された細胞は０．５マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）の抗体が使用された。
【０２９６】
ＦＡＣＳ分析：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）でフローサイトメトリー分析が実施された。
【０２９７】
結果
ヒト胎盤由来細胞のｃＤＮＡ、成人および新生児の線維芽細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）について実施された選択された「サイン」遺伝子のリアルタイムＰＣＲの結果は、他の細胞と比べ、前記胎盤由来細胞が高レベルで、酸化ＬＤＬ受容体およびレニンが発現されたことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、前記ΔΔＣＴ法によって分析され、対数スケールで表現された。胎盤由来細胞と対照では、ＣＸＣリガンド３とＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は認められなかった。ＣＸＣ−リガンド３は非常に低レベルで発現された。ＧＣＰ−２はヒト成人および新生児の線維芽細胞と同等のレベルで発現された。リアルタイムＰＣＲの結果は従来のＰＣＲで確認された。ＰＣＲ製品の配列決定は、さらにこれらの観察の妥当性を確認した。表９−１に掲載された従来のＰＣＲ  ＣＸＣリガンド３プライマーを用い、分娩後由来細胞と対照との間でＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意な差は認められなかった。
【０２９８】
分娩後由来細胞の前記サイトカインＩＬ−８の発現は、増殖培地で培養されたか、血清飢餓分娩後細胞で上昇された。すべてのリアルタイムＰＣＲデータは、従来のＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定で妥当性が確認された。
【０２９９】
血清のない培地で増殖された細胞の上清でＩＬ−８の有無が検討された場合、臍帯由来細胞由来の培地と胎盤由来細胞の分離株の一部で最も多い量が検出された（表９−２）。ヒト皮膚線維芽細胞由来の培地でＩＬ−８が検出された。
【０３００】
【表１６】
2007528702.tif 000019
【０３０１】
胎盤由来細胞はＦＡＣＳ分析により、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、ＧＲＯαの産生が検討された。細胞の検査ではＧＣＰ−２が陽性であった。酸化ＬＤＬ受容体とＧＲＯαがこの方法で検出された。
【０３０２】
免疫細胞化学的分析により、選択されたタンパク質の産生について胎盤由来細胞が検討された。単離直後（継代０）、前記ヒト胎盤由来の細胞が４％パラホルムアルデヒドで固定され、フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、ビメンチンの６種類のタンパク質の抗体に曝露された。細胞染色では、α−平滑筋アクチンとビメンチン両方で陽性であった。このパターンは継代１１から保存された。継代０のわずかな細胞（<５％）の染色では、サイトケラチン１８が陽性であった。
【０３０３】
継代０のヒト臍帯由来の細胞では、免疫細胞化学的分析により選択されたタンパク質の発現がプローブされた。単離直後（継代０）、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定され、フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、ビメンチンの６種類のタンパク質の抗体に曝露された。臍帯由来細胞ではα−平滑筋アクチン、ビメンチンが陽性であり、前記染色パターンは継代１１まで一致した。
【０３０４】
継代１１の胎盤由来細胞も、ＧＲＯαとＧＣＰ−２の産生で免疫細胞化学的分析により検討された。胎盤由来細胞はＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの産生発現はこの方法では検出されなかった。
【０３０５】
要約：マイクロアレイと（リアルタイムおよび従来の）ＰＣＲにより測定された遺伝子発現レベル間の一致は、酸化ＬＤＬ受容体１、レニン、レチキュロン、ＩＬ−８の４遺伝子で確立された。これらの遺伝子の発現は、胎盤由来細胞で前記ｍＲＮＡレベルが異なって制御され、ＩＬ−８も前記タンパク質レベルが異なって制御された。酸化ＬＤＬ受容体の有無は、前記胎盤由来細胞でＦＡＣＳ分析によりタンパク質レベルで検出されなかった。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の異なる発現が前記ｍＲＮＡレベルで確認されなかったが、ＧＣＰ−２は前記胎盤由来細胞のＦＡＣＳ分析により前記タンパク質レベルで検出された。この結果は前記マイクロアレイ実験から入手されたデータと十分には一致しないかもしれないが、これは前記方法論の感受性に差があるためであると考えられる。
【０３０６】
単離直後（継代０）では、前記ヒト胎盤由来細胞でα−平滑筋アクチンとビメンチンが陽性と染色された。このパターンも継代１１で細胞に観察された。これらの結果は、少なくともここで使用された増殖培地で、ビメンチンとα−平滑筋アクチンの産生が継代により細胞に保存されてもよいことを示唆している。  
【実施例１０】
【０３０７】
ＰＤＣ表現型の免疫組織化学的特徴
ヒト胎盤組織内に認められる細胞の表現型は、免疫組織化学的に分析された。
【０３０８】
方法と物質
組織標本：ヒト胎盤組織が採取され、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中、一晩４℃で浸漬固定された。ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、デスミン（１：１５０、ウサギに対して作成、Ｓｉｇｍａ、または１：３００、マウスに対して作成、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カーピンテリア）のエピトープに対する抗体を用い、免疫組織化学検査が実施された。さらに、抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；ａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）のマーカーが検討された。固定された標本が外科用メスで削られ、エタノールを含むドライアイス浴でＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ、カリフォルニア州トランス）内に入れられた。次に標準的な低温保持装置（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、冷凍ブロックが切片にされ（厚さ１０ミクロン）、染色用ガラススライドに載せられた。
【０３０９】
【表１７】
2007528702.tif 000020
【０３１０】
免疫組織化学：免疫組織化学がこれまでの研究と同様に実施された（例えばＭｅｓｓｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：  ８１６−８２９）。組織切片はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でｔｒｉｔｏｎが省略された。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記処置を介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された一次抗体は、次に室温で４時間前記切片に塗布された。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにブロックを含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液は除去され、培地がＰＢＳで洗浄された。培養物が洗浄され、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３１１】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光が可視化された。陽性染色は対照染色を上回る蛍光シグナルにより表された。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用い、代表的な画像が捕らえられた。３回染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像が取られた。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて層状のモンタージュが用意された。
【０３１２】
結果
臍帯の特徴：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４マーカーは、臍帯に認められる細胞のサブセットで表現された（データは示されていない）。特に、ｖＷＦとＣＤ３４の発現は前記臍帯に含まれる血管に制限された。ＣＤ３４＋細胞は最内の層（内腔側）にあった。ビメンチンの発現は、前記臍帯の基質と血管から認められた。ＳＭＡは前記動脈および静脈の基質と外壁に限定されていたが、それ自体は前記血管に含まれなかった。ＣＫ１８とデスミンは前記血管内のみに観察され、デスミンは前記中間層と外層に限定されていた。
【０３１３】
胎盤の特徴：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４はすべて前記胎盤内に観察され、局所的に特異的であった。
【０３１４】
ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ組織発現。胎盤組織内にこれらのマーカーは観察されなかった。
【０３１５】
要約：ヒト胎盤内の細胞で、ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４が発現された。  
【実施例１１】
【０３１６】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ免疫学
これらの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ移植で誘発する前記免疫学的反応を予測するため、分娩後細胞系はその免疫学的特徴がｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価された。分娩後由胞系がＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の産生について、フローサイトメトリーによりアッセイされた。これらのタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により産生され、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の直接刺激が必要とされる（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）。前記細胞系も、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）、ＣＤ  １７８（Ｃｏｕｍａｎｓ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５〜１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０，１２５７〜１２６６）の発現がフローサイトメトリーにより分析された。胎盤組織に存在する細胞によるこれらのタンパク質の産生は、子宮内の胎盤組織の免疫に特別の状態を媒介すると考えられる。胎盤由来細胞系がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を誘発する程度を予測するため、前記細胞系は一方の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で検査される。
【０３１７】
材料と方法
細胞培養：２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）でコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）で、コフルエントまで増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド））で細胞が培養された。
【０３１８】
抗体染色：細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。製造業者の仕様書により抗体（表１１−１）は１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、４℃で３０分間、暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、非結合性抗体を除去した。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳで再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）を用い、フローサイトメトリーにより分析された。
【０３１９】
【表１８】
2007528702.tif 000021
【０３２０】
混合リンパ球反応：細胞系Ｂと標識された継代１１の胎盤由来ＰＤＣｓの凍結保存したバイアルは、ＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ、ケベック）にドライアイスに載せて送付され、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いた混合リンパ球反応を実施した。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）が、複数の男性と女性ボランティアドナーから回収された。刺激物（ドナー）の同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、胎盤由来細胞系がマイトマイシンＣで処理された。自家およびマイトマイシンＣ処理刺激細胞は応答する（レシピエント）ＰＢＭＣに追加され、４日間培養された。インキュベーション後、［３Ｈ］チミジンが各サンプルに追加され、１８時間培養された。前記細胞の採取後、放射標識したＤＮＡが抽出され、［３Ｈ］−チミジンの取り込みがシンチレーションカウンターで測定された。
【０３２１】
前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理同種ドナーを足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、同種ドナーの刺激指数（ＳＩＡＤ）は計算された。前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理胎盤由来細胞系を足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、胎盤由来細胞の刺激指数が計算された。
【０３２２】
結果
混合リンパ球反応−胎盤：７種類のヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされ、他の６種類の血液ドナーを用いた混合リンパ球反応において、強固な増殖反応を示す単一の同種ドナーを同定した。このドナーは、前記同種ポジティブコントロールドナーとして選択された。前記残りの６種類の血液ドナーはレシピエントとして選択された。前記同種ポジティブコントロールドナーと胎盤細胞系がマイトマイシンＣで処理され、前記６種類の個別同種レシーバーを用いた混合リンパ球反応で培養された。１プレート当たり３種類のレシーバーを用いた２種類の細胞培養プレートを用い、反応は３回行われた（表１１−２）。前記平均刺激指数は１．３（プレート２）から３（プレート１）の範囲で、前記同種ドナーのポジティブコントロールは４６．２５（プレート２）から２７９（プレート１）の範囲であった（表１１−３）。
【０３２３】
【表１９】
2007528702.tif 000022
【０３２４】
【表２０】
2007528702.tif 000023
【０３２５】
【表２１】
2007528702.tif 000024
【０３２６】
抗原提示細胞マーカー−胎盤：フローサイトメトリーで分析される胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値に認められるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の産生が陰性であることを示し、胎盤細胞系には同種ＰＢＭＣを直接刺激するために必要な前記細胞表面分子がないことを示している（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞）。
【０３２７】
免疫調節マーカー−胎盤：フローサイトメトリーにより分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値の上昇に認められるとおりＰＤ−Ｌ２の産生が陽性を示し、ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値で認められるとおりＣＤ１７８とＨＬＡ−Ｇの産生が陰性を示す。
【０３２８】
要約：胎盤由来細胞系を用いて実施された前記混合リンパ球反応では、前記平均刺激指数が１．３〜３の範囲であり、前記同種ポジティブコントロールの指数は４６．２５〜２７９の範囲であった。フローサイトメトリーにより測定されると、胎盤由来細胞系が、前記刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の産生で陰性であった。胎盤由来細胞系は、フローサイトメトリーで測定されると、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の産生が陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現が陽性であった。同種ドナーＰＢＭＣはＨＬＡ−ＤＰ、ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２を発現した抗原提示細胞を含み、それによって同種ＰＢＭＣの刺激を可能とする（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞）。同種ＰＢＭＣの直接刺激（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞）と免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２の存在に必要な、胎盤由来細胞に抗原提示細胞の表面分子がないことは、同種対照と比べてＭＬＲのこれらの細胞により前記低刺激指数の原因となっている可能性がある。  
【実施例１２】
【０３２９】
胎盤由来細胞による栄養因子の分泌
ＰＤＣｓから選択された栄養因子の分泌が測定された。血管由来活性（つまり、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５−２６）、単球走化性因子１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６；３４−４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９−７６）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２−８）、マトリックスメタロプロテアーゼ組織インヒビター１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α））、神経栄養性／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９−３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２））、またはケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球遊走因子−１α（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性制御、正常Ｔ細胞の発現と分泌）、Ｉ３０９、ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＴＡＲＣ）、Ｅｏｔａｘｉｎ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）を有する因子が選択された。
【０３３０】
方法と物質
細胞培養：胎盤由来のＰＤＣｓおよびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞は、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコで増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に培養された。細胞は継代１１で凍結保存され、液体窒素に保存された。前記細胞を解凍後、増殖培地が前記細胞に追加された後、１５ミリリットルの遠心分離管に移し、１５０ｘｇで５分間、前記細胞を遠心分離した。前記上清は廃棄された。前記細胞ペレットは４ミリリットルの増殖培地に再懸濁され、細胞が計数された。細胞は増殖培地１５ミリリットルを含むＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、２４時間培養された。前記培地は８時間、血清のない培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ミリリットルのストレプトマイシン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に変更された。血清のない条件培地はインキュベーションの最後に回収され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離され、−０℃で保存された。各フラスコの細胞数を推定するため、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて分離された。トリプシン活性は８ミリリットルの増殖培地を加えることで抑制された。細胞は１５０ｘｇで５分間遠心分離された。上清は除去され、細胞は１ミリリットルの増殖培地に再懸濁された。血球計数板を用い、細胞数が推定された。
【０３３１】
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞は３７℃で５％二酸化炭素と大気酸素中で増殖された。ＰＤＣｓ（分離３）も、５％酸素またはβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で増殖された。各細胞サンプルで生産されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β２の量は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定された（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。すべてのアッセイは前記製造業者の使用説明書に沿って実施された。値はピコグラム／ミリリットル／１００万細胞（ｎ＝２、ｓｅｍ）で示している。
【０３３２】
ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＥＬＩＳＡアッセイ：ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて測定された。前記プロテオームアレイは、１ウェル当たり１６タンパク質に対して２つの定量測定を行う多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。前記アレイは、１６ウェルプレートの各ウェルに４〜１６種類の捕捉抗体の２×２、３×３、または４×４パターンをスポットすることで作成された。サンドイッチＥＬＩＳＡ法後、前記プレートの各ウェル内の各スポットで発生した化学蛍光シグナルを捕捉するため、前記プレート全体が画像化される。各スポットで発生したシグナルの量は、前記最初の標準またはサンプルにおいて、標的タンパク質の量と比例する。
【０３３３】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、胎盤由来ＰＤＣｓおよび皮膚繊維芽細胞によって分泌されていた（表１２−１）。ＳＤＦ−１αは、５％Ｏ２で培養された胎盤由来細胞、および繊維芽細胞によって分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、ＢＭＥまたは５％のＯ２の存在下で培養された胎盤由来細胞によって、分泌されていた。ＧＣＰ−２はまた、ヒト繊維芽細胞によって分泌されていた。ＴＧＦ−ベータ２はＥＬＩＳＡアッセイによって検出されなかった。
【０３３４】
【表２２】
2007528702.tif 000025
【０３３５】
サーチライト（ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ）マルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイ：ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８が、胎盤由来細胞から分泌されていた（表１２−２および１２−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。
【０３３６】
【表２３】
2007528702.tif 000026
【０３３７】
【表２４】
2007528702.tif 000027
【０３３８】
要約：胎盤由来細胞はいくつかの栄養因子を分泌していた。これらの栄養因子のいくつか、例えば、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８、は血管形成で重要な複数の役割を果たしている。他の栄養因子類、例えば、ＩＬ−６は神経再生で重要な複数の役割を果たしている。  
【実施例１３】
【０３３９】
血漿凝固アッセイ
細胞が前記作用部位を標的とすることができる特定の応用について、細胞療法は全身に注入されてもよい。注入された細胞が、致死的と考えられる血栓症を引き起こさないことが重要である。組織因子、つまり膜結合凝血促進性糖タンパク質は外因性凝固カスケードのイニシエーターであり、これはｉｎ  ｖｉｖｏで主な凝固経路である。組織因子も、例えば、前記原始的血管壁の形成において、胚血管形成に重要な役割を果たす（Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２９９−３０６）。最初の凝固に対してＰＰＤＣｓの可能性を決定するため、胎盤由来ＰＰＤＣで組織因子の産生とその能力が評価され、血漿凝固を開始した。
【０３４０】
方法と物質
ヒト組織因子：ヒト組織因子のＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋａｉｌｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ノースカロライナ州ダラム）は、２０ミリリットルの蒸留水でもどされた。前記原液は８本の管で連続的に蒸留された（１：２）。正常なヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ、カンザス州オーバーランドパーク）が水浴中３７℃で解凍され、使用前に氷中に保存された。９６ウェルプレートの各ウェルに、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０マイクロリットルの希釈ＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ（登録商標）（ブランクのウェルを除く）、３０マイクロリットルの０．１モル塩化カルシウム、１００マイクロリットルの正常ヒト血漿が追加された。前記プレートは直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置され、吸光度は４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分測定した。
【０３４１】
Ｊ−８２および胎盤由来細胞：Ｊ−８２細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、１マイクロモルのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリー州セントルイス）、２ミリリットルのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）、１×非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）を含むイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で増殖された。７０％コフルエントでは、細胞が１００，０００、５０，０００、２５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートのウェルに移された。胎盤由来細胞は、ゼラチンでコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）中、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．００１％βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ））で培養された。継代５の胎盤由来細胞が５０，０００細胞／ウェルでウェルに移された。１５０ｘｇで５分間遠心分離後、培地は各ウェルから除去された。細胞はカルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳに懸濁された。
【０３４２】
組織因子阻害：組織因子に対する抗体であるＣＮＴＯ８５９と細胞との前インキュベーションによる凝固反応の阻害は、組織因子が凝固の原因であることが示された。抗組織因子抗体細胞を用いてインキュベートされた細胞は、３０分間、２０マイクログラム／ミリリットルのＣＮＴＯ  ８５９（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルバニア州マルヴァーン）でインキュベートされる。塩化カルシウム（３０マイクロリットル）が各ウェルに追加された。前記プレートは直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置され、吸光度は４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分測定される。細胞はＰＢＳ中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いたフラスコから分離される。細胞は採取、遠心分離され、１ミリリットル当たり１ｘ１０７の細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳに再懸濁される。抗体は前記製造業者の仕様書の通り、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、前記細胞は暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、１５０ｘｇで５分間遠心分離され、結合していない抗体を除去する。細胞は１００マイクロリットルの３％ＦＢＳに再懸濁し、二次抗体が前記製造業者の使用説明書の通り追加される。細胞は暗所で３０分間、４℃でインキュベートされる。インキュベーション後、結合していない二次抗体を除去するため、細胞はＰＢＳで洗浄され、遠心分離される。洗浄された細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリーにより分析される。
【０３４３】
結果
フローサイトメトリー分析では、胎盤由来細胞が組織因子を表現していることが明らかとなった。胎盤由来細胞のいずれにおいても、半値吸光度までの時間（Ｔ１／２  ｔｏ  ｍａｘ、表１３−１）で示されるとおり、凝固率が上昇した。凝固は初期（Ｐ５）および後期（Ｐ１８）細胞の両方で観察された。前記Ｔ１／２  ｔｏ  ｍａｘはＪ８２細胞数と反比例している。
【０３４４】
【表２６】
2007528702.tif 000028
【０３４５】
要約：胎盤由来細胞は組織因子を発現する。組織因子に対する抗体を追加すると、組織因子を抑制することができる。組織因子は通常、不活性な高次構造で細胞に認められるが、機械的または化学的（例えばＬＰＳ）ストレスにより活性化される（Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１０４：１４９−７４；Ｅｎｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：１５８５−９７）。従って、ＰＤＣｓの調整プロセス中におけるストレスの最小化は、組織因子の活性化を予防することができる。血栓形成活性に加え、組織因子は血管由来活性と関連していた。従って、組織因子の活性は胎盤由来細胞が組織に移植される場合に有益と考えられるが、ＰＤＣｓが静脈内に注入される場合に抑制される必要がある。  
【実施例１４】
【０３４６】
胎盤由来細胞の肝細胞への分化
胎盤由来細胞の肝細胞への分化に対する基礎培養液および成長因子の適切な組み合わせを決定するために、様々な条件を検討した。ＨＮＦ−１アルファ、肝細胞特異的転写因子、ケラチン１９（Ｋ１９）、ケラチン８（Ｋ８）、及びサイトケラチン１８（ＣＫ１８）（これらは上皮細胞のマーカーである）などの細胞質中間体フィラメントタンパク質、及び２つの肝臓特異的分泌タンパク質であるアルファ−フェトタンパク質（アルファＦＰ）、及びアルブミンは、肝細胞分化に対するマーカーとして選択した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１０）：１２９１〜１３０２；Ｏｋｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０４（４）：６９１〜６９５；Ｃｈａｒｇｒａｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１（８）：２９７３〜２９８２）。
【０３４７】
方法と物質
実施例１の方法に記載された方法で単離された胎盤由来細胞、さらに新生児或いは成人正常ヒト上皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア）、１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．０１％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））中のゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコにおいて増殖させた。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、オンコスタチンＭ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州）から購入した。血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）は、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）から購入した。
【０３４８】
以下の条件をテストした。
【０３４９】
方法１
胎盤由来細胞（Ｐ２）（核型によって分析された優性的な新生児）、新生児及び成人正常ヒト上皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）：細胞は、無血清培地（１ｘインスリン／トランスフェリン／セレニウム、４．７マイクログラム／ミリリットルのリノール酸、１ミリグラム／ミリリットルのウシ血清アルブミン、１０ナノモルのデキサメタゾン、１００マイクロモルのリン酸アスコルビン酸（全てＳｉｇｍａより）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００ユニット／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、及び１０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢを添加した、６０％（ｖ／ｖ）低グルコースＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−ＬＧ；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、４０％（ｖ／ｖ）ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州））中で、１％ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）上に、２２．５ｘ１０３細胞／ｃｍ２でプレーティングした。８〜１２時間後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、上述した培養液でＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有しないが、２０ナノグラム／ミリリットルのＨＧＦ及び／若しくは１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−４（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１０）：１２９１〜１３０２）を添加した培養液で培養した。
【０３５０】
方法２
胎盤由来細胞（Ｐ２）（核型によって分析された優性的な新生児）、新生児及び成人ＮＨＤＦ：細胞は、２２，５００細胞／ｃｍ２で、ゼラチンでコーティングした２４ウェルプレートに播種し、上述したように増殖させた。
【０３５１】
方法３
胎盤由来細胞（Ｐ１０）、成人ＮＨＤＦ、胎盤由来細胞（Ｐ３）：細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７添加物（Ｇｉｂｃｏ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、２０ナノグラム／ミリリットルのＨＧＦ及び／若しくは１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−４において増殖させた。細胞は、これらの条件で４週間増殖させた。
【０３５２】
方法４
胎盤由来細胞（Ｐ３）、胎盤由来細胞（Ｐ１５）、胎盤由来細胞（Ｐ２）（核型によって分析された優性的な新生児）、胎盤由来細胞（Ｐ５）（核型によって分析された優性的な新生児）、胎盤由来細胞（Ｐ５）（核型によって分析された優性的な新生児）、及び成人ＮＨＤＦ：細胞は５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、Ｃｈａｎｇ  Ｃ培養液（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、カリフォルニア州）中、Ｔ２５フラスコにおいて、フィブロネクチン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州）上、或いはゼラチン（Ｓｉｇｍａ）上に播種し、コンフルエンスまで２継代増殖させた。細胞は次に、１，０００細胞／ｃｍ２で、２４ウェルＴＣＰＳプレートに播種し、それらが約４０〜６０％コンフルエンスに到達するまで上述したように増殖させた。
【０３５３】
方法５
胎盤由来細胞（Ｐ２）（核型によって分析された優性的な新生児）、及び成人ＮＨＤＦ：細胞は、２４ウェルプレートのゼラチン上に、１ナノグラム／ミリリットル或いは１０ナノグラム／ミリリットルのオンコスタチンＭ（Ｃｈａｒｇｒａｃｕｉ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１（８）：２９７３〜２９８２）を添加した成長培地にプレーティングした。細胞は、これらの条件で４週間増殖させた。
【０３５４】
方法６
胎盤由来細胞（Ｐ２）（核型によって分析された優性的な新生児）及び成人ＮＨＤＦ：細胞は、２４ウェルプレートのゼラチン上に、１０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ、１０ナノグラム／ミリリットルのＨＧＦ、１０ナノグラム／ミリリットルのＳＣＦを添加した成長培地にプレーティングした。細胞は、これらの条件で４週間増殖させた（Ｏｋｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０４（４）：６９１〜６９５）。
【０３５５】
総ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡは、各プロトコールにおいて記載されたように増殖させた胎盤由来細胞及び線維芽細胞から抽出した。細胞は、ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する３５０マイクロリットルの緩衝ＲＬＴで、取り扱い説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って溶解し、ＲＮＡを、２．７ユニット／サンプルのＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ）で、取扱い説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って抽出した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルＤＥＰＣ−処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０３５６】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、アルブミン（Ｈｓ００６０９４１１）、シトクロムｐ４５０  ２Ｂ６（Ｈｓ００１６７９３７）、ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）に対するＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産生物を用いて、及び、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを取り扱い説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）に従って、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）で７０００配列検出システムを用いて、ｃＤＮＡサンプルに対して実行し実行した。熱サイクル条件は、最初５０℃で２分間、９５℃で１０分間とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。ＰＣＲデータは、製造業者の使用説明書（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのユーザー掲示板＃２）に沿って分析した。
【０３５７】
免疫蛍光検査：細胞培養は、冷却４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで、室温、１０分間固定した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対して作られた抗体を用いて実行した：ケラチン８（Ｋ８；１：４００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州）、ケラチン１９（Ｋ１９；１：４００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、細胞質ケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ）、デスミン（１：１５０；Ｓｉｇｍａ）、アルブミン（１：２００；Ｓｉｇｍａ）、ｃ−ｍｅｔ（１：４００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）、及びＨＮＦ−１アルファ（１：４００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。一般には、培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（例えばｃ−ｍｅｔ）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎを省略した。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用させた。Ｋ８、Ｋ１９、ＣＫ１８、ビメンチン、及びアルブミンに対してはヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）、デスミン及びｃ−ｍｅｔに対してはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、またはＨＮＦ−１アルファ染色に対してはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにブロック溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液を除去し、培養をＰＢＳで洗浄した。培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３５８】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化させた。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０３５９】
結果
胎盤由来細胞が上皮細胞性マーカーを発現できるかどうかを検討するために、細胞は、Ｃｈａｎｇ  Ｃ培養液において培養した。胎盤由来細胞（Ｐ４）、（Ｐ３）、及び（Ｐ８）は、Ｃｈａｎｇ  Ｃ培養液で１１日間増殖させた。胎盤由来細胞は、免疫細胞化学分析によって、サイトケラチン１８に対する染色は陽性であった。いずれのサンプルも、ケラチン８に対して陽性ではなかった。成長培地で増殖させたサンプルは、両方のマーカーに対して陰性であった。
【０３６０】
初期及び後期継代の影響、さらにゼラチン及びフィブロネクチン基質の影響を検討した。細胞は、Ｃｈａｎｇ  Ｃ培養液において１１日間増殖させた。上皮細胞性／肝細胞特異的タンパク質のＲＮＡ及びタンパク質発現を分析した。サイトケラチン１８、ケラチン８、ケラチン１９、ｃ−ｍｅｔ、アルブミン、デスミン、及びＨＮＦ−１アルファに対する免疫細胞化学染色は、全ての条件において陰性であった。細胞は、ビメンチン染色に対して陽性であった。ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーによる検出より、アルブミン及びシトクロムｐ４５０  ２Ｂ６両者の発現は、ヒトＨｅｐＧ２細胞の発現よりも低いレベルであった。アルブミン及びシトクロムｐ４５０  ２Ｂ６発現は、成長培地で増殖させた細胞においても検出された。
【０３６１】
胎盤由来細胞は、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１０）：１２９１〜１３０２．）によって開発されたプロトコールに従った方法１に記載されたように処理した。アルブミン及びシトクロムｐ４５０  ２Ｂ６の両者は、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーを用いて、ＨｅｐＧ２ポジティブコントロールよりも低いレベルで検出された。適用された条件と遺伝子発現レベルとの間に明らかなパターンは見られず、すなわち、アルブミン及びシトクロムｐ４５０２Ｂ６発現はそれぞれコントロールサンプルにおいても検出された。アルブミン及びシトクロムｐ４５０  ２Ｂ６の発現は、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーによっていくらか検出されたが、そのレベルはヒトＨｅｐＧ２細胞において観察されたレベルより有意に低かった。
【０３６２】
１ナノグラム／ミリリットルの低濃度でのオンコスタチンＭは、ゼラチンコーティングしたフラスコ上で、成長培地において増殖させた胎盤由来細胞シトクロムｐ４５０  ２Ｂ６の発現レベルを増加させた。ＦＧＦ−４及びＨＧＦ処理は、ほとんど影響せず、アルブミン及びシトクロムｐ４５  ２Ｂ６の発現を減少させた。
【０３６３】
要約：胎盤由来細胞の肝細胞表現型への分化を誘導する能力を、いくつかの異なるプロトコールでテストした。肝細胞特異的マーカー、例えばアルブミンやシトクロムｐ４５０  ２Ｂ６の発現が検出され、それによって、前記細胞は肝細胞へのいくらかの分化を経ることが示された。Ｃｈａｎｇ  Ｃ培養液で培養された胎盤由来細胞は、下部或いは膵臓管における上皮細胞のマーカーである、サイトケラチン１８を発現した。  
【実施例１５】
【０３６４】
胎盤由来細胞の骨形成表現型への分化
骨髄から由来した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、アルカリ性ホスファターゼを石灰化し発現する骨芽細胞様細胞へ再現性よく分化することが示された。オステオカルシン及び骨シアロタンパク質などの骨芽細胞によって発現された付加的なマーカーは、骨芽細胞様細胞への分化を示すために使用された。胎盤由来細胞の骨芽形成表現型への分化の能力は、骨芽形成培養液、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２（Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６１，：２１８〜２２８）、或いは−４、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ１の添加において増殖することによって評価した。
【０３６５】
方法と物質
細胞培養：骨形成開始前に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉系幹細胞の増殖培地一括キット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖された。ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｔ．＃ＳＨ３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルペニシリン、５０ミクログラム／ミリリットルストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））で他の細胞が培養され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄された。
【０３６６】
骨芽細胞（９Ｆ１７２１；Ｃａｍｂｒｅｘ）は骨芽細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）で増殖され、ＲＮＡは以下の通り抽出された。
【０３６７】
骨形成
プロトコール１：胎盤由来細胞（Ｐ３）および（Ｐ４）（事前に核型が判定され、主に新生児由来細胞であることが示された）、およびＭＳＣｓ（Ｐ３）が増殖培地中、２４ウェルプレートと６ウェル培養皿で５×１０３細胞／ｃｍ２にて播種され、一晩インキュベートされた。前記培地は除去され、骨形成培地（ＤＭＥＭ低グルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１０ミリモルのβグリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ）、１００ナノモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州、セントルイス）、５０マイクロモルのアスコルビン酸リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、ファンギゾン（Ｇｉｂｃｏ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））で置換された。骨形成培地に２０ナノグラム／ミリリットルのＴＧＦ−β１（Ｓｉｇｍａ）、４０ナノグラム／ミリリットルのｈｒＢＭＰ−２（Ｓｉｇｍａ）、または４０ナノグラム／ミリリットルのｈｒＢＭＰ−４（Ｓｉｇｍａ）が補充された。合計１４、２１、２８日間培養が処理され、培地は３〜４日ごとに取り替えられた。
【０３６８】
プロトコール２：胎盤由来細胞は、骨形成表現型に分化することができるかを検討された。胎盤由来細胞（Ｐ４）が増殖培地中、６ウェルプレート（ゼラチンコーティング）の３０，０００細胞／ウェルにて播種された。間葉幹細胞（ＭＳＣ）（Ｐ３およびＰ４）、線維芽細胞（Ｐ１１）、回腸稜骨髄細胞（Ｐ３；国際ＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０２５１４９号）は、３０，０００細胞／ウェルで播種され、６ウェルプレート（ゼラチンコーティング）で、それぞれ間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ）および増殖培地でも播種された。
【０３６９】
骨形成誘導は、前記最初の播種培地（２４時間）を除去し、骨形成誘導培地：ＤＭＥＭ−低グルコース、１０％ウシ胎仔血清、１０ミリモルのβグリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ）、１００ナノモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、５０マイクロモルアスコルビン酸リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ミリリットルペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と置き換えることで開始された。場合によっては、骨形成培地にヒト組み換え（ｈｒ）ＢＭＰ−２（２０ナノグラム／ミリリットル）（Ｓｉｇｍａ）、ｈｒＢＭＰ−４（Ｓｉｇｍａ）、またはｈｒＢＭＰ−２（２０ナノグラム／ミリリットル）およびｈｒＢＭＰ−４（２０ナノグラム／ミリリットル）（Ｓｉｇｍａ）の両方が補充された。合計２８日間培養が処理され、培地は３〜４日ごとに取り替えられた。
【０３７０】
ＲＮＡの抽出と逆転写：細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に沿って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を含む３５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解され、−８０℃で保存された。細胞溶解物が解凍され、ＲＮＡは製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に沿って抽出され、２．７ユニット／サンプルのＤＮＡアーゼが処理された（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保存された。ＲＮＡは２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたランダム六量体を用い、逆転写された。サンプルは−２０℃で保存された。
【０３７１】
ＰＣＲ：ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ（登録商標）遺伝子発現産物骨シアロタンパク質（Ｈｓ００１７３７２０）、オステオカルシン（Ｈｓ００６０９４５２）ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）、およびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスを用い、７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）により、７０００配列検出系を用いた製造業者の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）に沿って、ｃＤＮＡサンプルについて実施された。熱サイクル条件は、最初５０℃で２分間、９５℃で１０分間とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルとした。
【０３７２】
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色：細胞は、１０％中性緩衝化ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で固定された。固定後、前記細胞は脱イオン水で洗浄され、５％（ｗ／ｖ）硝酸銀（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）で１時間、直射日光に当ててインキュベートした。細胞は脱イオン水で洗浄され、５％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ギブスタウン）で５分間インキュベートされた。次に細胞は蒸留水で洗浄され、光学顕微鏡で検討された。
【０３７３】
結果
プロトコール１：オステオカルシンと骨シアロタンパク質のリアルタイム遺伝子発現におけるポジティブコントロールとして、骨芽細胞から抽出されたＲＮＡが使用された。の増殖培地で増殖された胎盤由来細胞に対するオステオカルシンとＢＳＰ骨芽細胞の発現レベルは、それぞれ２．５倍、８０００倍であった。骨形成培地で増殖されたＭＳＣは石灰化され、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は陽性であった。主に新生児由来細胞である１種類の胎盤分離株で、広範な石灰化が観察された。オステオカルシンとＢＳＰのＭＳＣ発現は、２１日の時点で骨形成培地において有意に増加した。ＢＭＰ−２および−４の追加はＢＳＰ発現を増加したが、オステオカルシン発現に影響はなかった。ＴＧＦ−β１は、骨形成培地の作用を増強しなかった。広範囲な石灰化は、優性的な新生児由来細胞である１つの胎盤サンプル（Ｐ４）で観察された。胎盤由来細胞（Ｐ３）は、骨芽形成培養液におけるＢＳＰ発現レベルの誘導、及びオステオカルシン誘導の低レベルを示した。ＢＭＰ−４及びＴＧＦ−ベータ１は、胎盤由来細胞（Ｐ３）によるオステオカルシン発現を増加した。
【０３７４】
プロトコール２：石灰化に対するｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色陽性により示される骨形成分化は、胎盤由来細胞（Ｐ４）およびＩＣＢＭで観察され、Ｐ３はＢＭＰ２または４が補充された骨形成培地でインキュベートされ、ＭＳＣｓ（Ｐ３）はＢＭＰ  ４が補充された骨形成培地でインキュベートされた（表１５−１）。他の細胞は前記骨形成表現型に分化し、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色された。ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は前記細胞と関連しており、前記細胞外基質とは関連していないことを確認するため、細胞は核ファーストレッドで対比染色された。この一部のＭＳＣに示された大きなの条件で骨形成表現型に特異的に分化しないことを示している。さらに、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のいずれかを補充した骨形成培地でＭＳＣがインキュベートされると、脂肪形成のレベルの増加が観察された。
【０３７５】
【表２７】
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【０３７６】
要約：骨髄由来ＭＳＣｓ（Ｋａｄｉｙａｌａ ｅｔ  ａｌ．(１９９７)Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．６：１２５〜３４）、及び脂質（Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．(２００１)Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７：７２９〜４１）などの他の組織から由来した細胞は、骨芽細胞様細胞へ分化することが示された。ＭＳＣｓは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体タイプＩＢ及びＩＡの分化における役割に起因して、ＢＭＰｓに反応して脂肪細胞或いは骨芽細胞へ分化することが示された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．(１９９８)Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４２：２９５〜３０５）。胎盤由来細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）で以前観察されたように、デキサメタゾン、Ｂ−グリセロホスフェート、及びアスコルビン酸を含有する骨芽形成培地に置かれた場合、骨芽細胞様表現型を発現することもできる。いくつかの実験を異なる単離体で実行し、前記培養された細胞の石灰化があるかどうかをｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色、骨芽細胞において発現される骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）及びオステオカルシンの発現によって決定した。骨芽形成の誘導に続き、ＭＳＣｓは、石灰化を示し、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａによって染色され、リアルタイム相対定量を用いて骨シアロタンパク質及びオステオカルシン発現のｍＲＮＡレベルも増加したことが示された。多くのＭＳＣｓは、脂肪細胞と同様に細胞質において脂肪滴も形成した。胎盤由来細胞（優性的に新生児細胞）は、広範囲の石灰化、及び骨芽形成培地においてＢＳＰやオステオカルシンの誘導を示し、これはＢＭＰ−２或いは−４を用いて２１日目で増強された。  
【実施例１６】
【０３７７】
胎盤由来細胞の軟骨形成分化
この適応症の候補細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化する能力が評価される必要がある。細胞の能力を検討するために多数のプロトコールが開発され、軟骨細胞マーカー遺伝子に分化、発現する細胞の能力が検討された。２種類のアッセイシステム、つまり前記ペレットアッセイ培養系とコラーゲンゲル培養で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化する能力について、胎盤由来細胞が検討された。前記ペレット培養系は、ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の特定ロットと使用することで成功した。このアッセイで増殖され、トランスフォーミング増殖因子−β３を処理したＭＳＣは、軟骨細胞に分化することが示された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３８：２６５〜２７２）。前記コラーゲンゲル系が使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞を培養した（Ｇｏｓｉｅｗｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７：２６７〜２７７）。これらの条件下で培養された軟骨細胞は、軟骨様構造を形成する。
【０３７８】
材料と方法
細胞培養
ヒト胎盤が受理され、細胞は前記説明どおりに単離された（例１）。ゼラチンコーティングした組織培養プラスチックフラスコで、増殖培地（ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、５０ユニット／ミリリットルペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス））中、細胞が培養された。前記培地は３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートされた。実験に使用する細胞は継代４〜１２とした。
【０３７９】
ヒト関節軟骨細胞はＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州フォーカーズビル）から購入され、前記胎盤由来細胞と同じ培地で培養された。前記実験の２４時間前に、前記培地が１％  ＦＢＳを含む培地に変更された。
【０３８０】
ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）：ＭＳＣはＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入され、ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）に培養された。実験に使用された細胞は、継代２〜４であった。
【０３８１】
コラーゲンゲルアッセイ：培養細胞がトリプシン処理され、培養プレートから除去された。血清のないＤＭＥＭにおいて、３００ｘｇで５分間、２回遠心分離することで細胞を洗浄し、計数した。細胞は、掲載された最終濃度で以下の成分により混合された。ラット尾のコラーゲン（１ミリグラム／ミリリットル、ＢＤ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、０．０１Ｎ  ＮａＯＨおよび軟骨形成培地（ＤＭＥＭ、１００ユニット／ミリリットルペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルストレプトマイシン、２ミリモルのＬ−グルタミン、１ミリモルのピルビン酸ナトリウム、０．３５ミリモルのＬ−プロリン、１００ナノモルのデキサメタゾン、０．１７ミリモルのＬ−アスコルビン酸、１％（ｖ／ｖ）ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン）（すべてＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙの成分））。前記細胞は前記培地とゆっくり混合され、さらに前記サンプルは２×１０５／ウェルまたは５×１０５／ウェルの濃度で、２４ウェルの超低クラスタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）の各ウェルに等分された。インキュベーターで培養し、２４〜４８時間放置された。培地が２４〜４８時間おきに、適切な増殖培地が補充された新鮮軟骨形成培地で置換された。サンプルは２８日間培養することが可能であり、この時点で除去、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州ウェストチェスター）で固定され、組織学的検討が処理された。サンプルはサフラニンＯまたはヘマトキシリン／エオシンで染色、評価された。
【０３８２】
ペレット培養アッセイ：培養細胞がトリプシン処理され、培養プレートから除去された。血清のないＤＭＥＭにおいて、３００ｘｇで５分間、２回遠心分離することで細胞を洗浄し、計数した。細胞は新鮮な軟骨形成培地（前述）中、５×１０５細胞／ミリリットルの濃度で再懸濁された。細胞は、試験管１本当たり２．５×１０５細胞で新しいポリプロピレン管に等分された。前記適切なサンプルは次に増殖因子としてＴＧＦ−β３（１０ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）またはＧＤＦ−５（１００ナノグラム／ミリリットル、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）のいずれかで処理された。細胞は１５０ｘｇで３分間遠心分離された。次に試験管が前記インキュベーターに移され、３７℃および５％  ＣＯ２の標準の大気で２４〜４８時間放置された。適宜、２〜３日ごとに培地は新鮮軟骨細胞培地および増殖因子と置換された。サンプルは２８日まで培養され、この時点で前述のとおり除去、固定、染色された。
【０３８３】
結果
ＴＧＦ−ベータ３及びＧＤＦ−５で処理した胎盤由来細胞の細胞ペレットのサフラニンＯ染色は、コントロール細胞と比較して、サフラニンＯ染色に対して陽性（グルコサミノグリカンを意味する）を示した。胎盤由来細胞は、軟骨細胞様形態も示した。
【０３８４】
要約：本研究の結果により、グルコサミノグリカン発現及び軟骨組織に対する細胞形態の類似性によって証拠付けられるように、胎盤由来細胞は特に、ペレット培養及びコラーゲンゲルアッセイシステムにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞へ分化することが示された。  
【実施例１７】
【０３８５】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏペレット培養アッセイの胎盤由来細胞の軟骨形成の可能性評価
この実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏペレット培養アッセイにより、胎盤組織由来細胞の軟骨形成の可能性評価について説明している。初期継代（Ｐ３）と後期継代（Ｐ１２）での胎盤由来細胞が利用された。トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ−３）、ｒｈＧＤＦ−５（組換え型ヒト増殖及び分化因子５）、またはその組み合わせが添加された培地において、軟骨形成誘導条件下、ペレット培養アッセイで前記細胞の軟骨形成の可能性が評価された。
【０３８６】
方法と物質
試薬：ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッドから入手された。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）はＨｙＣｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）から入手された。間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）およびｈＭＳＣ軟骨形成分化一括キットはＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビルから入手された。ＴＧＦβ−３は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ研究製剤、カリフォルニア州サンディエゴから入手された。ｒｈＧＤＦ−５はＢｉｏｐｈａｒｍ、ドイツ、ハイデルベルク（国際特許番号第ＷＯ９６０１３１６  Ａ１号、米国特許番号第ＵＳ５９９４０９４  Ａ号）から入手された。
【０３８７】
細胞：ヒト間葉幹細胞（ロット番号２Ｆ１６５６）はＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビルから入手され、製造業者の使用説明書に沿ってＭＳＣＧＭで培養された。このロットは事前に検査され、前記軟骨形成アッセイで陽性であることが示された。ヒト成人および新生児の線維芽細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナッサスから入手され、ゼラチンコーティングした組織培養プラスチックフラスコで、増殖培地（ダルベッコ変法基本培地に１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１００ユニット／ミリリットルペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルストレプトマイシン、および０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）に培養された。胎盤由来細胞（ロット番号０７１００３Ｐｌａｃ）が利用された。線維芽細胞と同様の増殖培地で細胞が培養された。前記細胞培地は３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートされた。実験に使用された細胞は、継代３〜１２であった。
【０３８８】
ペレット培養アッセイ：ペレット培地では、０．２５×１０６細胞が１５ミリリットルの円錐管に入れられ、室温で１５０ｘｇで遠心分離され、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒの軟骨形成アッセイのプロトコールに沿って、球状ペレットを形成した。ＴＧＦβ−３（１０ナノグラム／ミリリットル）、ｒｈＧＤＦ−５（５００ナノグラム／ミリリットル）、またはＴＧＦβ（１０ナノグラム／ミリリットル）とｒｈＧＤＦ−５（５００ナノグラム／ミリリットル）の組み合わせを含む軟骨形成誘導培地で、ペレットが３週間培養された。未処理の対照が増殖培地で培養された。培養中、１日おきにペレットに新鮮培地が再添加された。治療には以下のものを含む：
【０３８９】
処理群
Ａ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）＋ｒｈＧＤＰ−５
Ｂ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）＋ｒｈＧＤＰ−５、ｎ＝２
Ｃ．ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ｒｈＧＤＰ−５
Ｄ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ｒｈＧＤＰ−５
Ｅ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｆ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｇ．ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｈ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｉ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦベータ−３、ｎ＝１
Ｊ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）＋ｒｈＧＤＰ−５＋ＴＧＦベータ−３
Ｋ．ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ｒｈＧＤＦ＋５＋ＴＧＦベータ−３
Ｌ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ｒｈＧＤＦ＋５＋ＴＧＦベータ−３
Ｍ．ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）＋ｒｈＧＤＦ＋５＋ＴＧＦベータ−３
Ｎ．胎盤由来細胞初期継代（Ｐ  ＥＰ）
Ｏ．胎盤由来細胞後期継代（Ｐ  ＬＰ）
Ｐ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）
Ｑ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）
【０３９０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルの組織像：前記培養期間の最後に、ペレットは１０％緩衝ホルマリンで固定され、パラフィン包埋、セクショニング、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）を用いた染色とサフラニンＯ（ＳＯ）染色を行うため、ＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ミシガン州マタワン）に郵送された。
【０３９１】
結果
軟骨形成誘導培地中、異なる増殖因子を用いて胎盤由来細胞、ＭＳＣ、線維芽細胞が細胞ペレットを形成した。培養期間の最後での前記ペレットのサイズは、細胞タイプによって異なっていた。胎盤細胞で形成したペレットはサイズが同様で、ＭＳＣおよび線維芽細胞で形成したペレットよりもわずかに大きかった。全ての細胞タイプで形成され、対照培地で培養されたペレットは、軟骨形成誘導培地で培養されたペレットよりも小さかった。
【０３９２】
Ｈ／Ｅ及びサフラニンＯで染色されたペレットの断面の試験より、初期及び後期継代での胎盤由来細胞は、軟骨形成分化を経る能力を有していることを示すいくつかの指標を示した。細胞凝縮、細胞形態、及び基質のサフラニンＯ陽性染色によって評価されたように、軟骨形成は、ＴＧＦベータ−３、ｒｈＧＤＦ−５、或いはその両者を添加した軟骨形成誘導培養液において培養された胎盤由来細胞ペレットにおいて観察された。しかしながら、これは、軟骨形成誘導条件はＭＳＣｓに対して最適化され、分娩後由来細胞に対しては最適化されないという事実に起因するものであり、成長培地において培養されたコントロールペレットは、軟骨形成の証拠を何も示さなかったことに注意すべきである。さらに、異なる細胞集団は、頂端或いは中心に位置した両継代での胎盤由来細胞において観察された。いくつかの細胞凝縮が、線維芽細胞で観察されたが、サフラニンＯ染色に付随するものではなかった。  
【実施例１８】
【０３９３】
胎盤由来細胞の脂肪生成分化
幹細胞の間質集団は、脂肪生成表現型へ分化することが示されていた（Ｊａｎｄｅｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．１１（１）：６５〜７４；Ｚａｎｇａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６４（２）：９１〜１０１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（４）：３２５〜４０）。脂肪生成表現型へ分化する胎盤由来細胞の能力を評価した。
【０３９４】
方法と物質
脂肪分化：胎盤由来細胞（Ｐ３）は、１ウェル当たり２００，０００細胞で、６ウェル培養処理プレート上に成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１５％（ｖ／ｖ）規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州：ロット＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））において播種した。間葉系幹細胞（Ｐ３、ＩＦ２１５５）、骨芽細胞（Ｐ５、ＣＣ２５３８、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）、大網細胞（Ｐ６）（実施例１における胎盤由来細胞単離に使用したプロトコールに従って、ＮＤＲＩからの大網組織より単離された（米国特許番号第６，５５５，３７４  Ｂ１号））、脂肪由来細胞（ＵＳ６５５５３７４  Ｂ１）（Ｐ６）、及び線維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９）（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）も、同条件下で播種した。脂肪生成を開始する前に、間葉系幹細胞は間葉系幹細胞成長培地Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）において増殖させた。２日後、浪費された培養液を吸引除去し、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次に培養液を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、１ミリリットル当たり０．０２ミリグラム／ミリリットルのインスリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、及び１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、１ミリリットル当たり０．２５ミリグラムのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を含有するダルベッコ最小必須培養液−高グルコース（ＤＭＥＭ−Ｈｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へ切り替えた。一度細胞をコンフルエンスまで到達させ、浪費した培養液を除去した。細胞は次に、１０％規定化胎児ウシ血清（（ｖ／ｖ）、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．０２ミリグラム／ミリリットルのインスリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、1ミリリットル当たり０．２５マイクログラムのアンホテリシンＢ、５マイクロモルのイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、１００マイクロモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、及び２．５マイクロモルのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）を含有する脂肪分化培養液（ＤＭＥＭ−Ｈｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））において、４週間まで培養した。細胞は、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ）で染色し、脂肪滴形成の存在を決定した。
【０３９５】
オイルレッドＯ染色：細胞は、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で固定した。固定後、細胞は脱イオン化水で洗浄し、プロピレングリコール（無水；Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で２分間インキュベートした。プロピレングリコールを吸引によって除去し、サンプルはオイルレッドＯ（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で１時間インキュベートした。染色溶液を吸引によって除去し、染色したサンプルは８５％（ｖ／ｖ）プロピレングルコール溶液（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で１分間インキュベートした。染色したサンプルは、脱イオン化水で２回洗浄した。染色されたサンプルは、Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で逆染色（ｃｏｕｎｔｅｒ‐ｓｔａｉｎｅｄ）し、光学顕微鏡で検討した。画像は、２０ｘ拡大率で得た。
【０３９６】
レプチンアッセイ：脂肪由来細胞及び胎盤由来細胞は、２００，０００細胞／ウェルで、６ウェル組織培養処理プレートに播種した。細胞はまず成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１５％（ｖ／ｖ）規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州：ロット＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）において播種し、１マイクロモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、０．２マイクロモルのインドメタゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、０．０１ミリグラム／マイクロリットルのインスリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、０．５ミリモルのイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、1ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、及び１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する脂肪生成分化培養液（ＤＭＥＭ−Ｈｇ培養液；Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へ切り替えた。アッセイの最後に、前記条件培地を回収し、レプチンレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，  Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）を用いて測定した。
【０３９７】
結果
脂肪分化：形態学的に、このアッセイの５日目で、ＭＳＣｓ及び脂肪由来細胞（Ａｒｔｅｃｅｌ；米国特許番号第６，５５５，３７４号）において脂肪滴形成を観察した。大量の脂肪滴形成が、培養の１５日目でこれらの培養において観察された。骨芽細胞の培養でも、培養の１０日後にこれらの条件下で大量の脂肪滴の蓄積があり、１５日目では広範囲であった。脂肪滴形成は、培養の１５日後で胎盤由来細胞及び大網細胞培養において観察された。低レベルの脂肪滴形成は、脂肪生成誘導性条件における２０日後の線維芽細胞培養において観察された。
【０３９８】
レプチン：レプチンは、胎盤由来細胞条件培地におけるＥＬＩＳＡによっては検出されなかった。
【０３９９】
要約：胎盤由来細胞の脂肪細胞表現型へ分化する能力を評価した。データより、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、或いは骨芽細胞の培養と比較して、胎盤由来細胞は、脂肪細胞表現型への低レベルの分化を経ることが明らかに示された。レプチンは、使用された脂肪生成分化後のＥＬＩＳＡによって、臍帯由来細胞において検出されなかった。  
【実施例１９】
【０４００】
胎盤由来細胞のベータ細胞への分化
膵臓は、ランゲルハンスの島を形成する内分泌細胞を含み、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）を産生する。胎盤由来細胞のインスリン産生表現型を有する細胞へ分化する能力を、８つの異なる誘導プロトコールでテストした。
【０４０１】
方法と物質
胎盤由来細胞、さらに新生児或いは成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコで、成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ血清（カタログ＃３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．００１％のベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン）において増殖させ、さらに異なるベータ細胞促進性分化条件においても増殖させた。フラスコは、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）を用いて、室温で２０分間コーティングした。ゼラチン溶液は、吸引除去し、フラスコはＰＢＳで洗浄した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦベータ）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ニュージャージー州）から購入した。ＧＬＰ−１はＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリー州）から購入した。
【０４０２】
プロトコール１：
胎盤由来細胞（単離体１；Ｐ２）、脂肪誘導細胞（米国特許番号第ＵＳ６，５５５，３７４号）及び胎盤由来細胞（単離体２；Ｐ４）（核型決定によって解析された優性的な新生児−データは示さず）、及び成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（Ｐ１０）：細胞は、正常或いは５％Ｏ２条件下で維持した。細胞は、低密度（５，０００細胞／ｃｍ２）で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコのゼラチン上に播種し、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ、カリフォルニア州）、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、及び２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて、コンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス細胞は、トリプシン処理し、５０，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチン或いはコラーゲンコーティングあり或いはなしの２４ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州）プレートにプレーティングした。細胞はＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ、及び１５ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）において、３週間まで増殖させた。
【０４０３】
プロトコール２：
胎盤由来細胞（単離体３：Ｐ３）、及び胎盤由来細胞（単離体２：Ｐ３）（核型決定によって解析された優性的な新生児）：細胞は、低密度（５０００細胞／ｃｍ２）、Ｔ７５フラスコのゼラチン上に播種し、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、１０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいてコンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス細胞は、トリプシン処理し、５０，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコーティングされた或いはされていない２４ウェルＴＣＰプレートへプレーティングした。細胞は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓｍ１５ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）において３週間増殖させた。
【０４０４】
プロトコール３：
胎盤由来細胞（単離体１：Ｐ１０）、成人ＮＨＤＦ  Ｐ１０、及び胎盤由来細胞（単離体２：Ｐ３）：細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培養液、Ｂ−２７添加物（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、２０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ、４０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて増殖させた。球状クラスターは、約４〜６日で産生した。この期間後、前記球状クラスターを回収し、遠心分離し、ラミニンコーティングした２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）上へ置き、１０ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）を含有するが他の成長因子を含まない（すなわちｂＦＧＦ及びＥＧＦなし）Ｂ−２７添加培養液において３週間まで培養した。
【０４０５】
プロトコール４：
胎盤由来細胞（単離体１：Ｐ１０）、成人ＮＨＤＦ  Ｐ１０、及び胎盤由来細胞（単離体２：Ｐ３）：細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培養液、Ｂ−２７添加物、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、２０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ、４０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて増殖させた。球状クラスターは、約４〜６日で産生した。この期間後、前記球状クラスターを回収し、遠心分離し、ラミニンコーティングした２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）上へ置き、１０ナノモルのＧＬＰ−１（１〜３７アイソフォーム）を含有するが他の成長因子を含まない（すなわちｂＦＧＦ及びＥＧＦなし）Ｂ−２７添加培養液において３週間まで培養した。
【０４０６】
プロトコール５：
成人ＮＨＤＦ（Ｐ１５）及び胎盤由来細胞（単離体１；Ｐ１５）：細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培養液、Ｂ−２７添加物、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−１０、及び／若しくは４０ナノグラム／ミリリットルのＴＧＦベータにおいて、２週間以上増殖させた。
【０４０７】
プロトコール６：
成人ＮＨＤＦ（Ｐ１５）及び胎盤由来細胞（単離体１；Ｐ１５）：細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＥＢＭ−２培養液、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−１０、及び／若しくは４０ナノグラム／ミリリットルのＴＧＦベータにおいて、２週間以上増殖させた。
【０４０８】
プロトコール７：
胎盤由来細胞（単離体３；Ｐ３）は、低密度（５，０００細胞／ｃｍ２）で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコのゼラチン上に播種し、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、及び２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて、コンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス細胞は、トリプシン処理し、５０，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチン或いはコラーゲンコーティングあり或いはなしの２４ウェル組織培養ポリスチレンプレートにプレーティングした。３種類の基礎培養液を３週間まで使用した：
ベータＩ培養液：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％ＦＢＳ、１０ミリモルのニコチンアミド、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、２５ミリモルのグルコース；
ベータＩＩ培養液：同等量のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％ＦＢＳ、１０ミリモルのニコチンアミド、２５ミリモルのグルコース；
内皮細胞基礎培養液（ＥＢＭ）、（ｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ，カリフォルニア州）。
【０４０９】
以下の成長因子が各培養液に添加された：１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ、１０ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）。
【０４１０】
プロトコール８：
胎盤由来細胞（単離体２；Ｐ２）（核型分析によって同定されたように、優性的な新生児）、胎盤由来細胞（単離体２；Ｐ１）クローン＃２２：細胞は、低密度（５，０００細胞／ｃｍ２）で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコのゼラチン上に播種し、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシンにおいて、コンフルエンスまで増殖させた。
【０４１１】
総ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡは、各プロトコールにおいて記載されたように増殖させた胎盤由来細胞及び線維芽細胞から抽出した。細胞は、ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する３５０マイクロリットルの緩衝ＲＬＴで、取り扱い説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って溶解し、ＲＮＡを、２．７ユニット／サンプルのＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ）で、取扱い説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って抽出した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルＤＥＰＣ−処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０４１２】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物を用いて、ｃＤＮＡサンプルで実行した。ＰＤＸ−１（Ｈｓ００４２６２１６）、前インスリン（ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｈｓ００３５５７７３）、Ｎｇｎ−３（Ｈｓ００３６０７００）及びＧｌｕｔ−２（Ｈｓ００１６５７７５）、ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘは、取り扱い説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）に従って、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）で７０００配列検出システムを用いた。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。加えて、ＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３に対するイン−ハウス設計したプライマーの別のセットもテストした。表１９−１は、プライマー配列を示している。これらのプライマーを用いたＰＣＲを、上述したように実行した。膵臓総ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を、対照として使用した。ＰＣＲデータは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１）が推薦するΔΔＣＴ方法に従って、分析した。
【０４１３】
【表２８】
2007528702.tif 000030
【０４１４】
結果
プロトコール１〜８に従って処理した胎盤由来細胞に対して、膵臓特異的マーカーの発現は、プロトコール７の細胞において低レベルのＮｇｎ−３が検出された以外は、リアルタイムＰＣＲ及びＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーを用いて検出されなかった。同じプライマーは、膵臓組織ＲＮＡから由来したｃＤＮＡでポジティブな結果を示した。ヒト膵臓から由来したｃＤＮＡサンプルに対するＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３に対するリアルタイムＰＣＲは、プロトコール１に従って増殖させた脂肪由来細胞に対する結果を比較した。ＰＣＲは、インハウス設計プライマー（表１９−１）を用いても実行した。ヒト膵臓から由来したｃＤＮＡサンプルに対するＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３に対するこれらのプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲの結果は、脂肪由来細胞からの結果と比較した。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ方法によって解析し（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのユーザー掲示板＃２）、ログ対数スケールで示した。
【０４１５】
プロトコール３及び８における実験条件は、胎盤由来細胞に適用されたが、膵臓上皮細胞の細胞集合体に類似する構造を島へ産生する線維芽細胞へは行わなかった。これらの構造は、前記プロトコールの移植後約３〜５日で現れた。膵臓特異的マーカーであるＰＤＸ−１．Ｍｇｎ３ｍＧｌｕｔ−２及びプロ−インスリンの発現は、リアルタイムＰＣＲでは検出されなかった。
【０４１６】
要約：ＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３の限られた発現は、様々な実験プロトコールで処理した胎盤由来細胞において観察された。インハウスで設計したプライマーと商業的に利用可能なプライマーとの間では結果に違いがあった。例えば、プロトコール番号１は、インハウスで設計したプライマーを用いた場合、ＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３に対してはポジティブデータが示されたが、同じ遺伝子に対するＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーでは、ネガティブデータが示された。結果は、免疫学的技術によって直接は変更されなかった。そのような違いにも関わらず、いくつかの膵臓マーカーの発現が観察され、これは胎盤由来細胞の膵臓表現型へ分化する能力を示唆するものであった。  
【実施例２０】
【０４１７】
心筋細胞表現型への胎盤由来細胞の分化
虚血性疾患及びうっ血性心不全などの心臓疾患の進行及び／若しくは治療を示す治療が、極めて必要とされている。不整脈なしで患者の心筋へ完全に結合できる心筋細胞へ分化できる細胞が、非常に望まれている。５−アザシチジンで処理したげっ歯類間葉系幹細胞は、心筋細胞のマーカーを発現すると示された（Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌ．３２５：１０２７〜３８）。これは、成人ヒト幹細胞では示されていなかった。低酸素（Ｓｔｏｒｃｈ  （１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０５５：１２６〜９）、レチノイン酸（Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２９：１５２５〜３９）、ＤＭＳＯ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１：５０１〜８）、及び細胞質から原形質膜へのＰＫＣの転位に影響し、ＰＫＣ活性化の阻害剤である、塩化ケレリトリン（国際特許番号第ＷＯ０３／０２５１４９号公報）を含む付加的な因子は、幹細胞分化を促進するために使用した。この実施例において、胎盤由来細胞は、５−アザシチジン単独、若しくはＤＭＳＯ或いは塩化ケレリトリンとの組み合わせで処理し、心筋細胞のマーカーをリアルタイムＰＣＲで測定した。
【０４１８】
方法と物質
細胞：凍結保存された胎盤由来細胞（Ｐ２４）は、ゼラチンコーティングされたフラスコにおいて成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ血清（カタログ＃３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．００１％のベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン）中で増殖させた。細胞は、２４時間、９６ウェルプレートに成長培地中で５ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。培養液は、０、３、１０、及び３０μＭの５−アザシチジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）単独で、或いは５マイクロモルの塩化ケレリトリン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ）、或いは１マイクロモルのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）を含む、ＭＥＭ−アルファ（Ｓｉｇｍａ）、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウム（ＩＴＳ；Ｓｉｇｍａ）、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン及び５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシンに交換し、前記細胞は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）Ｏ２で４８〜７２時間インキュベートした。前記培養液は、ＭＥＭ−アルファ、インスリン、トランスフェリン及びセレニウム、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、及び５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシンへ交換し、細胞は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）Ｏ２で１４日間インキュベートした。
【０４１９】
ＲＮＡ抽出及び逆転写：細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；  Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）に沿って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含む１５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解し、−８０℃で保存した。細胞溶解液を解凍し、取扱説明書（ＲＮｅａｓｙ  ９６  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）に従って、２．７ユニット／サンプルのＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルのＤＥＰＣ−処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０４２０】
ＰＣＲ：ＰＣＲは、ｃＤＮＡサンプルに対してＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物心臓性ミオシン（Ｈｓ００１６５２７６  ｍｌ）、骨格ミオシン（Ｈｓ００４２８６００）、ＧＡＴＡ  ４（Ｈｓ００１７１４０３  ｍｌ）、ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及び取り扱い説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）に従って、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有する７０００配列検出システムを用いたＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを用いて実行した。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。心筋及び骨格筋からのｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）は、コントロールとして使用した。
【０４２１】
結果
心筋からのコントロールＲＮＡは、心臓性ミオシン及びＧＡＴＡ  ４の発現が見られ、骨格筋ＲＮＡは、骨格ミオシン及び心臓性ミオシンを示したが、ＧＡＴＡ  ４発現は見られなかった。７２時間因子で処理し、さらに１４日間培養した胎盤由来細胞（Ｐ２４）は、ＧＡＴＡ  ４を発現したが、骨格ミオシン及び心臓性ミオシンは発現していなかった。分析された胎盤からの付加的なサンプルでも、ＧＡＴＡ  ４の発現が見られた。
【０４２２】
要約：未処理胎盤由来細胞は、心筋細胞、セリトル細胞、及び幹細胞における核転写因子である、ＧＡＴＡ  ４を構成的に発現した。  
【実施例２１】
【０４２３】
胎盤由来細胞のプロゲステロン及びｃＡＭＰでの処理
胎盤は、新生児及び母性細胞の両方で構成されている。前記母性細胞は、移植の過程の間に子宮壁から由来される。子宮の子宮内膜細胞は、ステロイドホルモン、及び細胞の形態、表現型、及び機能を変化する胚性シグナルによって促進さあれる受胎の後で、脱落膜化と呼ばれる過程を経る。前記細胞の形態は、線維芽細胞から多角形へ変化する。アルファ−平滑筋細胞アクチンの発現が減少し、細胞は、デスミン、プロラクチン、及びインスリン成長因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ−１）を発現し始める（Ｆａｚｅａｂａｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｋｏｖａ(２００２)Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ．Ｅｎｄｏ．１８６：１４３〜１４７）。本研究において、プロゲステロン、及びｃＡＭＰ類似体である８−ブロモアデノシン３’，５’−環状一リン酸の影響を検討した。これらの化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで子宮内膜脱落膜化を促進すると以前に示されていた（Ｇｅｌｌｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｓｅｎｓ(２００３)Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７８：３５７〜３７２）。線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び胎盤由来細胞は、プロゲステロン及びｃＡＭＰ類似体で３〜６日間処理し、脱落膜化のマーカーであるデスミン、及び間葉系幹細胞に対するビメンチンに対して染色した。
【０４２４】
物質&方法
間葉系幹細胞（Ｐ３）（Ｃａｍｂｒｅｘ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，メリーランド州）、胎盤由来細胞（Ｐ３）（母性核型）、及び皮膚線維芽細胞（Ｐ１０）（Ｃａｍｂｒｅｘ）は、ゼラチンコーティングされたＬａｂＴｅｋＩＩチェンバースライド（Ｎａｌｇｅｎｅ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク州）上へ、１０，０００細胞／ウェルで、成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．００１％のベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））においてへ播種した。細胞は、４日でコンフルエンスになり、前記培養液は、１）コントロール塩基性培養液（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清チャコール／デキストラン処理（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、フンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ；Ｇｉｂｃｏ））、或いは２）６３．５マイクロモルのプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）及び０．７６ミリモルの８−ブロモアデノシン３’，５’−環状一リン酸（Ｓｉｇｍａ）を含有する塩基性培養液で交換した。細胞は、３日目に培養を交換し、３或いは６日間インキュベートされた。細胞は、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で２０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水において４℃で保存した。
【０４２５】
免疫細胞化学は、ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、及びデスミン（１：１５０、Ｓｉｇｍａ）の発現を評価するために実施した。簡潔には、固定した培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）、及び０．３％のＴｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質ブロッキング溶液へ３０分間曝した。一次抗体溶液を、ブロッキング溶液プラスビメンチン抗体（１：５００）及びデスミン（１：５００）を含むサンプルに１時間、室温で適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、サンプルは、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）を有するブロッキング溶液を含有する二次抗体溶液（１時間、室温）に適用する前に、ＰＢＳで洗浄した。サンプルは、洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に１０分間適用し、細胞核を視覚化した。
【０４２６】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）上で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０４２７】
結果
コントロール培地におけるＭＳＣｓを除く全ての細胞は、３日或いは６日目でビメンチン或いはデスミン染色を示さなかった。３日或いは６日目での母性胎盤由来細胞は、プロゲステロン及び８−ブロモアデノシン３’，５’−環状一リン酸で処理した場合、形態における変化を示した。胎盤由来細胞は、位相差で明るい特徴（ｐｈａｓｅ  ｂｒｉｇｈｔ）、低密度培養に起因して著しく減少した増殖率を有していた。胎盤由来細胞は、プロゲステロン及び８−ブロモアデノシン３’，５’−環状一リン酸で３或いは６日間処理した場合、ビメンチンに対して強く染色される唯一の細胞であった。ＭＳＣｓは、３或いは６日での両条件下でビメンチンに対して弱い陽性染色を示した。
【０４２８】
要約：１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ−低グルコースにおいて増殖された胎盤由来細胞及び線維芽細胞は、通常ビメンチンを発現する。この分析において、細胞が１０％チャコール／デキストラン処理ウシ胎児血清において３日以下増殖された場合、ビメンチンに対する染色は見られなかった。母性胎盤由来細胞は、形態、及びプロゲステロン及び８−ブロモアデノシン３’，５’−環状一リン酸で処理したビメンチン発現の変化を示した。デスミンの発現は検出されなかった。
【０４２９】
遺伝子チップ解析によって、テストした細胞においてプロゲステロン受容体の発現は少し或いはないことが明らかになった。推定上のステロイド受容体であるプロゲステロン膜構成成分１及び２（Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：９０７〜１１）の発現は検出された。  
【実施例２２】
【０４３０】
短期間における胎盤由来細胞の神経分化
胎盤由来細胞が神経系統細胞に分化する能力について、検査された。
【０４３１】
物質&方法
胎盤細胞の単離および増殖：胎盤由来組織からのＰＰＤＣは、実施例１に記載されたように、単離され、増殖された。
【０４３２】
変法Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール  
（Ａ）このアッセイは、骨髄間質細胞の神経系誘導能力を検査するために本来行われたアッセイ（１）を適応した。臍帯由来細胞（Ｐ３）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖させた。細胞は、次にトリプシン処理し、ＴｉｔｒｅｔｅｋＩＩスライドグラス（ＶＷＲインターナショナル、ブリストル、コネチカット州）の各ウェルごとに６，０００細胞で播種した。コントロールとして、間葉系幹細胞（Ｐ３、１Ｆ２１５５、Ｃａｍｂｒｅｘ、ウオーカーズビル、メリーランド州）、骨芽細胞（Ｐ５、ＣＣ２５３８、Ｃａｍｂｒｅｘ）、大網細胞（Ｐ６（０４１００３））、アーテセル細胞（ＵＳ６５５５３７４  Ｂ１）（Ｐ６、ドナー２）、およびヒト新生児皮膚線維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９、Ｃａｍｂｒｅｘ）もまた、同一の条件下で播種された。
【０４３３】
すべての細胞はまず、１５％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロックヒル、ニュージャージー州）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、及び５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）において４日間増殖させた。４日後、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、次にＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋５０マイクログラム／ミリリットルのペニシリン＋５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２４時間培養させた。２４時間後、細胞は、ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞は、２００ミリモルのブチル化ヒドロキシアニソール、１０マイクロモルの塩化カリウム、５ミリグラム／ミリリットルのインスリン、１０ナノモルのホルスコリン、４ナノモルのバルプロ酸、および２ナノモルのヒドロコルチゾン（全ての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州から購入）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）から成る、誘導培養液中で１〜６時間培養させた。その後、細胞は、−２０℃の１００％メタノールで固定し、ヒトネスチンタンパク質の発現を測定するために、免疫細胞化学（方法は以下を参照のこと）を実行した。
【０４３４】
（Ｂ）胎盤由来細胞（Ｐ１１）およびヒト成人皮膚線維芽細胞（１Ｆ１８５３、Ｐ１１）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖させた。細胞はその後、トリプシン処理し、（Ａ）と同様の密度で播種したが、これらは、（１）２４ウェル組織培養用処理プレート（ＴＣＰ、Ｆａｌｃｏｎ  ｂｒａｎｄ、ＶＷＲインターナショナル）、（２）ＴＣＰウェル＋２％（ｗ／ｖ）ゼラチンで、室温で１時間吸着処理した、または（３）ＴＣＰウェル＋２０ナノグラム／ミリリットルのマウスラミニンで吸着処理した（３７℃で最低２時間吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ播種した。
【０４３５】
（Ａ）の場合と同様に、細胞はまず、前述のタイムフレームで増殖させ、培養液を交換した。１組目の培養を、５日目に固定し、また６時間で、４℃の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間固定した。２組目の培養は、培養液を除去し、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（４ミリモル）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、及び５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成る神経前駆細胞増殖培養液（ＮＰＥ）に切り替えた。ＮＰＥ培養液にはさらに、レチノイン酸（ＲＡ、１マイクロモル、Ｓｉｇｍａ）を添加した。この培養液は、４日後に除去し、培養は、４℃の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１０分間固定し、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質発現に関して染色した（表２２−１を参照）。
【０４３６】
【表２９】
2007528702.tif 000031
【０４３７】
二段階分化プロトコール：胎盤由来細胞（Ｐ１１）、ヒト成人皮膚線維芽細胞（Ｐ１１、１Ｆ１８５３、Ｃａｍｂｒｅｘ）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖させた。その後、細胞をトリプシン処理し、２，０００細胞群／ｃｍ２で播種したが、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロックヒル、ニュージャージー州）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＮＰＥ培養液（この全培養液組成は、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅと言及する）の存在下で、ラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ、フランクリンレーク、ニュージャージー州）でコーティングされた２４ウェルプレートに播種した。同時に、海馬から単離されたラット成体神経前駆細胞（Ｐ４、（０６２６０３）、実施例２３を参照）もまた、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培養液内で、ラミニンコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングした。すべての培養群は、６日間、そのような条件下で維持し（細胞は、その期間中１回栄養補給した。）、その時点で、培地を表２２−２に挙げた分化条件下に切り替え、さらに７日間維持した。培養は、氷冷した（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１０分間固定し、ヒトまたはラットのネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質発現に対して染色した。
【０４３８】
【表３０】
2007528702.tif 000032
【０４３９】
神経前駆細胞の共培養プロトコール
成体ラット海馬前駆細胞（０６２６０３）は、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、ラミニンコーティングされた２４ウェルのシャーレ（ＢＤバイオサイエンスズ社）に、ニューロスフェアとして、または単一の細胞（１０，０００細胞／ウェル）としてプレーティングした。
【０４４０】
別に、胎盤由来細胞（０２２８０３）Ｐ１１が解凍され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）に、５，０００細胞／ｃｍ２で、４８時間の期間中、増殖された。その後、細胞はトリプシン処理され、神経前駆細胞が存在する培養の上に２，５００細胞／ウェルで播種された。その時に、存在する培地は新鮮な培地に交換された。４日後に、培養は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で室温で１０分間固定され、ヒトの核タンパク（ｈＮｕｃ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（上記の表２２−１）で染色して、ＰＰＤＣｓを同定した。
【０４４１】
免疫細胞化学
免疫細胞化学は、表２２−１にリストされた前記抗体を使用して行った。培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州、テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質ブロッキング溶液に３０分に供し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液で希釈した１次抗体は、室温で１時間、前記培養に適用させた。次に、１次抗体溶液を除去し、前記培養をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州、ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を有するブロッキング溶液を含有する２次抗体溶液を適用した（室温、１時間）。培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に１０分間適用し、細胞核を視覚化した。
【０４４２】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）上で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。コントロール染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０４４３】
結果
変法Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール  
（Ａ）この神経誘導性組成内でインキュベートすると、全ての細胞タイプは、双極性の形態及び伸長した突起を有する細胞に形質転換した。他の大きな非双極性の形態も観察された。さらに、誘導された細胞集団は、多分化能神経幹細胞および前駆細胞のマーカーであるネスチンに対して陽性に染色された。
【０４４４】
（Ｂ）組織培養用プラスチック（ＴＣＰ）ディシュ上で繰返し行われた時、ラミニンが培養表面に前もって吸着されていない場合は、ネスチン発現は観察されなかった。さらに、ネスチンを発現する細胞群が、成熟したニューロンを発生させ得るかどうかを評価するために、ＰＰＤＣｓおよび線維芽細胞を、ＮＰＥ＋ＲＡ（１マイクロモル）（神経幹細胞及び前駆細胞のそのような細胞への分化を誘導すると知られている培養液組成（２、３、４））にさらした。細胞は、未成熟ニューロンおよび成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪ１、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、および神経前駆体を示すマーカーであるネスチンに対して染色した。いかなるテスト条件下でも、ＴｕＪ１発現は検出されず、神経性の形態を有する細胞も観察されず、これはニューロンが前記短期間では発生されなかったことを示唆するものである。さらに、ネスチンおよびＧＦＡＰ発現は、ラミニンコーティングされた基質上のＰＰＤＣｓ及び線維芽細胞では見られたが、これらの条件下では産生されていなかった。
【０４４５】
二段階分化結果：胎盤由来細胞単離（さらにヒト線維芽細胞群及びげっ歯類神経前駆細胞（それぞれネガティブおよびポジティブコントロール細胞タイプとして））を、ラミニン（神経促進）コーティングされたディシュにプレーティングし、神経前駆細胞をニューロンおよびアストロサイトに分化するように促進すると知られている１３の異なる成長条件（および２つのコントロール条件）にさらした。さらに、ＰＰＤＣｓの分化に対するＧＤＦ５およびＢＭＰ７の影響を検証するために、２つの条件を加えた。一般的に、２段階分化アプローチを実行し、細胞はまず６日間、神経前駆細胞増殖条件に置き、その後７日間、完全な分化条件に置いた。形態的には、胎盤由来細胞は、この手順の期間を通じて、細胞形態で根本的な変化を示した。しかしながら、神経細胞またはアストロサイト形の細胞は、神経前駆細胞をプレーティングした条件であるコントロールを除いては観察されなかった。ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対して陰性であった免疫細胞化学では、これら形態学的観察が確認された。
【０４４６】
神経前駆細胞およびＰＰＤＣの共培養手順：胎盤由来細胞が、神経増殖条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）において２日前に播種されたラットの神経前駆細胞の培養の上にプレーティングした。プレーティングされた胎盤由来細胞の肉眼の確認は、これらの細胞が単一の細胞としてプレーティングされたことを立証したが、プレーティング後４日目（合計６日間曝した）に行ったヒトに特異的な核染色（ｈＮｕｃ）は、胎盤由来細胞が丸くなりがちで、前記神経前駆細胞と接触を避ける傾向があったことを示していた。さらに、胎盤細胞が接着している場合は、これらの細胞は伸展し、ラット由来である分化したニューロンによって神経支配されているようであり、これは、前記胎盤細胞が筋細胞に分化した可能性があることを示唆するものであった。この観察は、位相差顕微鏡下の形態に基づいていた。別の観察では、大きな細胞体（神経前駆細胞より大きい）は通常、神経前駆細胞に似た形態を有しており、複数の方向に細い突起が出ていた。ＨＮｕｃ染色（前記細胞の核の半分に見られた）は、いくつかの場合には、これらのヒト細胞はラット前駆細胞と融合し、前記ラット前駆細胞の表現型を示していた可能性があったことを示唆していた。神経前駆細胞を含むコントロールウェルでは、胎盤細胞を含む共培養のウェルに比べて、前駆細胞および明らかに分化した細胞の合計が僅かに少なかったが、これは、胎盤由来細胞が、ケモカインおよびサイトカインの放出によって、または接触を仲介とする効果によって、神経前駆細胞の分化および振る舞いに影響を与えたことを示す。
【０４４７】
要約：胎盤由来ＰＰＤＣｓに対して、神経系譜細胞に分化する短期間の能力を決定するために、複数のプロトコールを行った。これらには、多分化能神経幹細胞および前駆細胞、未成熟ニューロンおよび成熟ニューロン、およびアストロサイトのそれぞれに関連するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対する免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相差画像法が含まれた。これらの短期間プロトコールのいくつかの場合に、神経分化が起こったことを示唆する証拠が観察された。
【０４４８】
神経前駆細胞とのＰＰＤＣｓの共培養で、いくつかの顕著な観察結果が得られた。ヒトＰＰＤＣｓを異種細胞タイプと共に使用するこのアプローチによって、これらの培養で各細胞の由来の絶対的な決定が可能であることが示された。まず、いくつかの細胞がこれらの培養で観察されたが、それらの細胞質は増大し、神経様突起が前記細胞体から伸展したが、前記細胞体の半分のみがｈＮｕｃタンパク質で標識された。それらの細胞は、神経系譜細胞に分化したヒトＰＰＤＣｓである可能性があり、または前記細胞は、ラット由来の神経前駆細胞と融合したＰＰＤＣｓである可能性もある。第２に、神経前記細胞は、ある程度、ＰＰＤＣに突起を伸長していたようであり、これは、前記神経前駆細胞がニューロンに分化し、前記ＰＰＤＣを神経支配したことを示すものである。第３に、神経前駆細胞及びＰＰＤＣの培養は、ラット由来の細胞がより多くあり、神経前駆細胞のみのコントロール培養より分化の量が多かった。これは、プレーティングされたＰＰＤＣが、水溶性因子を提供する、及び／若しくは、神経前駆細胞の生存性、増殖、及び／若しくは分化を刺激させる接触依存性の機構を提供することを示していた。
【０４４９】
実施例２２の参考文献
（１）Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１（４）：  ３６４〜７０．
（２）Ｊａｎｇ，Ｙ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７５（４）：５７３〜８４．
（３）Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  Ｂｉｏｌ．３（１２）：２２７１〜９．
（４）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５．  
【実施例２３】
【０４５０】
神経前駆細胞の支持のための胎盤由来細胞
非接触依存性（栄養性）のメカニズムを介して、胎盤由来細胞が、成体の神経幹細胞及び神経前駆細胞の生存性及び分化に及ぼす影響を検討した。
【０４５１】
物質および方法
成体の神経幹細胞および神経前駆細胞の単離：Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４成体ネズミは、ＣＯ２で窒息させ、その後、頚椎脱臼させて屠殺した。骨鉗子を用いて脳全体を無傷で除き、海馬組織を、脳の運動領域および体性感覚領域の後方の冠状切開（ｃｏｒｏｎａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎｓ）に基づいて解離させた（１）。組織は、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）とＬ−グルタミン（４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（この組み合わせは、本明細書においては神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と呼ばれる）で洗浄した。ＮＰＥ培地はさらに、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州、ロッキーヒル）及びＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州、ロッキーヒル）を添加した（本明細書においては「ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ」と言及される）。
【０４５２】
洗浄後、覆っている髄膜を除去し、前記組織を外科用メスを用いて刻んだ。刻まれた組織を回収し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を全容量の７５％添加した。デオキシリボヌクレアーゼ（８ミリリットルの全容量につき１００マイクロリットル、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）も添加した。次に、前記組織／培地を順に、１８ゲージ注射針、２０ゲージ注射針、最後に２５ゲージ注射針にそれぞれ一回づつ通した（すべての注射針は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州、フランクリンレークスから購入した）。前記混合液は、２５０ｘｇで３分間遠心分離し、その上清を除去し、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦを添加し、そのペレットを再懸濁した。その結果得られる細胞懸濁液は、４０マイクロメーターのセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通し、ラミニンコーティングされたＴ７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、または低クラスター２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にプレーティングし、概説したテストのために十分な細胞数が得られるまでＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で増殖させた。
【０４５３】
胎盤細胞由来プレーティング：成長培地において以前に増殖させた胎盤由来細胞（Ｐ１２）は、５，０００細胞／トランスウェル（２４ウェルプレート用のサイズ）にプレーティングし、インサート内で、成長培地において１週間の期間増殖させ、コンフルエントを達成した。
【０４５４】
成体の神経前駆細胞のプレーティング：ニューロスフェアとして、或いは単一の細胞として増殖させた神経前駆細胞は、約２，０００細胞／ウェルの密度で、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦにおいて、ラミニンコーティングされた２４ウェルプレート上に、１日の期間播種し、細胞の接着を促進させた。１日後、胎盤由来細胞を含むトランスウェルインサートは、以下のスキームで添加した。
【０４５５】
（１）トランスウェル（成長培地（２００マイクロリットル）における胎盤）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（２）トランスウェル（成長培地（２００マイクロリットル）における成人ヒト皮膚線維芽細胞［１Ｆ１８５３；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州］Ｐ１２）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（３）コントロール：神経前駆細胞のみ（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（４）コントロール：神経前駆細胞のみ（ＮＰＥのみ、１ミリリットル）
免疫細胞化学：共培養で７日後、全ての条件は、氷冷した４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間固定した。免疫細胞化学は、表２３−１にリストされた前記抗体を使用して行った。簡潔には、培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州、テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質ブロッキング溶液に３０分に供し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液で希釈した１次抗体は、室温で１時間、前記培養に適用させた。次に、１次抗体溶液を除去し、前記培養をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州、ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を有するブロッキング溶液を含有する２次抗体溶液を適用した（室温、１時間）。培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に１０分間適用し、細胞核を視覚化した。
【０４５６】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）上で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。コントロール染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０４５７】
【表３１】
2007528702.tif 000033
【０４５８】
神経前駆細胞分化の定量的分析：海馬の神経前駆細胞分化の定量的分析を検討した。各条件につき、最小１０００の細胞を計数し、それより少ない場合は、その条件で観察された全細胞数を計数した。所定の染色に対し陽性の細胞のパーセンテージは、陽性の細胞数をＤＡＰＩ（核）染色で決定された全細胞数で割って評価された。
【０４５９】
質量分析法及び２Ｄゲル電気泳動：共培養の結果としてのユニークな分泌因子を同定するために、培養固定の前に取られた条件培養液サンプルを−８０℃で一晩冷凍した。その後、サンプルは、限外濾過回転装置（名目上の分子量カットオフ：３０ｋＤ）に供した。保持液を、免疫親和性クロマトグラフィー（抗ヒトアルブミン、ＩｇＹ）に供した（免疫親和性は、前記サンプルからアルブミンを除去しなかった）。濾液は、ＭＡＬＤＬ−ＴＯＦＦによって解析した。溶出液は、シバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅ）親和性クロマトグラフィーに共した。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動によって解析した。
【０４６０】
結果
胎盤共培養は、成体神経前駆体分化を刺激する：胎盤由来細胞との培養後、成体ラット海馬から由来した共培養神経前駆細胞は、中枢神経系の３種類の全ての主要系統に沿った有意な分化を示した。この効果は、共培養の５日後にはっきりと観察され、多くの細胞は複雑な突起を伸ばし、分裂する前駆細胞の特徴である位相差で明るい特徴を失っていた。逆に、ｂＦＧＦ及びＥＧＦの非存在下で単独に増殖させた神経前駆細胞は、健康的でないように見え、生存率も限定されていた。
【０４６１】
前記手順の終了後に、培養は、未分化幹細胞及び前駆細胞を示すマーカー（ネスチン）、未成熟ニューロン及び成熟ニューロンを示すマーカー（ＴｕＪ１）、アストロサイトを示すマーカー（ＧＦＡＰ）、及び成熟オリゴデンドロサイトを示すマーカー（ＭＢＰ）に対して染色した。３種類の全ての系統に沿った分化が確認されたが、コントロール条件では、大多数の細胞でのネスチン陽性染色の保持によって明らかなように、有意な分化を示さなかった。分化はまた、ヒト成人繊維芽細胞によって影響を受けるように見えたが、そのような細胞は、成熟したオリゴデンドロサイトの分化を促進することができず、また大量なニューロンを発生することもできなかった。定量化はされなかったが、繊維芽細胞は神経前駆細胞の生存性を向上するようであり、それらの子孫は胎盤由来分娩後細胞に関する発見と似ている。
【０４６２】
ユニークな化合物の同定：臍帯テスト条件からの条件培養液は、適切なコントロールと（ＮＰＥ培養液±１．７％血清、線維芽細胞との共培養からの培養液）と共に、それらの差異について検討した。潜在的にユニークな化合物が同定され、それら個々の２Ｄゲルから切り取られた。
【０４６３】
要約：胎盤由来分娩後細胞との成人神経前駆細胞の共培養によって、これらの細胞の分化を生じた。前記ＰＰＤＣｓ及び前記神経前駆細胞の間で接触がなかったことから考えると、この結果は、前記ＰＰＤＣｓから放出された水溶性因子の機能であると考えられる（栄養作用）。
【０４６４】
いくつかの他の観察結果が見られた。第１に、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを除去した場合のコントロールでは非常に少数の細胞しか見られなかった。ほとんどの細胞が死亡し、平均で各ウェルに約１００或いはそれ以下の細胞が見られた。第２に、ＥＧＦ及びｂＦＧＦが培養の間ずっと培養液に保持されたコントロール条件では、通常の成長培地であるため、分化がほとんどないと予想されている。約７０％の細胞がその前駆細胞の状態（ネスチン＋）を保持していることが観察されたが、約３０％はＧＦＡＰ＋（アストロサイトの徴候）であった。これは、そのような著しい増殖が一連のこの手順の間を通じて起こったため、前駆細胞の間での接触がこの分化を誘導した可能性がある。同様な発見は、参考文献（２）に報告されていた。
【０４６５】
実施例２３の参考文献
（１）Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．&Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．（１９９７）．Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．
（２）Ｓｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ．４１７（６８８４）：２９〜３２．
【実施例２４】
【０４６６】
血管内皮ネットワーク形成アッセイ
血管形成、または新しい脈管構造の形成は、新しい組織の増殖に必要である。血管形成の誘導は、多くの病的状態に重要な治療目的である。本研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける前記胎盤由来細胞に考えられる血管由来活性を同定することを目的としている。前記研究の後、基底膜抽出物であるＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード）でコーティングされた培養ディッシュに内皮細胞を播種するという十分に確立された方法を行った（Ｎｉｃｏｓｉａ  ａｎｄ  Ｏｔｔｉｎｅｔｔｉ（１９９０）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６（２）：１１９〜２８）。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード）で内皮細胞に血管形成因子を処理すると前記細胞を刺激し、毛細管現象と同様のネットワークを形成する。これは、血管形成の刺激物質及び阻害物質をテストするための一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７（１）：１４８〜５２）。この実施例で使用されているプロトコールでは、培養ウェルインサートに播種された前記胎盤由来細胞を用いた共培養系を利用した。これらの透過性インサートは、前記内皮及び前記胎盤由来培養液の培地構成成分を受動的に交換することが可能である。
【０４６７】
物質と方法
細胞培地
胎盤由来細胞：胎盤を受けとり、細胞はこれまでの説明ように単離した（実施例１）。ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコで、成長培地（ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州、セントルイス））において、細胞を培養した。前記培養は、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。実験に使用した細胞は、継代４〜１２であった。
【０４６８】
積極的に増殖する胎盤由来細胞は、１インサート当たり１５，０００細胞で、ＣＯＳＴＡＲ  ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（直径６．５ミリメーター）の組織培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州、コーニング）においてトリプシン処理し、計数、播種した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２の標準的雰囲気下で４８〜７２時間、前記インサートで培養させた。
【０４６９】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）：ｈＭＳＣは、Ｃａｍｂｒｅｘ（メリーランド州、ウォーカーズビル）から購入し、ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養させた。前記培養は、標準的な増殖条件下でインキュベートした。
【０４７０】
積極的に増殖するＭＳＣは、１インサート当たり１５，０００細胞で、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）（直径６．５ミリメーター）の組織培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州、コーニング）においてトリプシン処理し、計数、播種させた。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の標準的雰囲気下で４８〜７２時間、成長培地中で前記インサートで培養させた。
【０４７１】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）：ＨＵＶＥＣは、Ｃａｍｂｒｅｘ（メリーランド州、ウォーカーズビル）から入手した。細胞は、ＥＢＭ或いはＥＧＭの内皮細胞培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）において、別の培養で増殖させた。３７℃で５％ＣＯ２の標準的雰囲気下で標準的な組織培養プラスチックにおいて細胞を増殖させた。前記アッセイに使用された細胞は、継代４〜１０であった。
【０４７２】
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）：ＨＣＡＥＣは、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州、ウォーカーズビル）から入手した。これらの細胞も、ＥＢＭ或いはＥＧＭの培地処方において別の培地で維持された。３７℃で５％ＣＯ２の標準的雰囲気下で標準的な組織培養プラスチックにおいて細胞を増殖させた。実験に使用された細胞は、継代４〜８であった。
【０４７３】
血管内皮網形成（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）アッセイ：製造業者の仕様書に沿って、培養プレートをＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングした。簡潔には、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード）を４℃で解凍し、約２５０マイクロリットルを冷却された２４ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに均等に分配した。前記プレートは、３７℃で３０分間インキュベートし、前記物質を凝固させた。積極的に増殖した内皮細胞培養は、トリプシン処理し、計数した。細胞は、２％ＦＢＳを用いた成長培地で２回洗浄し、その後遠心分離、再懸濁、及び上清の吸引を行なった。約０．５ミリリットルの成長培地、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを用い、２０，０００細胞／ウェルで、コーティングされたウェルに細胞を播種した。次に、細胞を定着させるため、細胞は約３０分間インキュベートした。
【０４７４】
次に、内皮細胞反応のポジティブコントロールとするため、内皮細胞培養は、１０ナノモルのヒトｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州、ロッキーヒル）或いは１０ナノモルのヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州、ロッキーヒル）で処理した。胎盤由来細胞が播種されたトランスウェルインサートは、前記インサートチャンバーに、２％ＦＢＳを含有する成長培地で適切なウェルに添加した。培養は、約２４時間、５％ＣＯ２により３７℃の標準的雰囲気下でインキュベートさせた。前記ウェルプレートは、前記インキュベーターから取り出し、前記内皮細胞培養の画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）を用いて収集した。
【０４７５】
結果
胎盤由来細胞の共培養システムにおいて、ＨＵＶＥＣは細胞ネットワークを形成する。ＨＵＶＥＣ細胞は、ｈＭＳＣおよび１０ナノモルのｂＦＧＦを用い、共培養実験で限定された細胞ネットワークを形成する。処理を行わないＨＵＶＥＣ細胞で示されたネットワークの形成は、非常に少ないか、全くなかった。これらの結果は、前記胎盤由来細胞が前記ＨＵＶＥＣを刺激する血管形成因子を放出することを示唆している。
【０４７６】
胎盤由来細胞の共培養システムにおいて、ＣＡＥＣｓは、細胞ネットワークを形成する。
【０４７７】
表２４−１は、成長培地においてＰＤＣｓにより放出される、既知の血管新生因子のレベルを示している。上述の通り、胎盤由来細胞はインサートに播種した。前記細胞は、前記インサートに４８時間、大気中の酸素下、３７℃で培養し、次に２％ＦＢＳ培地に交換し、３７℃で２４時間戻した。培地は除去し、直ちに凍結、−８０℃で保存し、前記ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）で分析した。示した結果は、二つ組測定の平均値である。この結果は、前記胎盤由来細胞が、検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢＥＧＦ）を放出しないことを示している。前記細胞は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質−１（ＴＩＭＰ−１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の測定可能な量を放出しない。
【０４７８】
【表３２】
2007528702.tif 000034
【０４７９】
表２４−２は、ＰＤＣｓにより放出される、既知の血管新生因子のレベルを示している。上述の通り、ＰＤＣｓは、インサートに播種した。前記細胞は、前記インサートに４８時間、５％の酸素で成長培地において培養し、次に２％ＦＢＳ培地に交換し、５％Ｏ２インキュベーションに２４時間戻した。培地は除去し、直ちに凍結、−８０℃で保存し、前記ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）で分析した。示された結果は、二つ組測定の平均値である。前記結果は、前記胎盤由来細胞が、検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢＥＧＦ）は放出しないことを示している。前記細胞は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質−１（ＴＩＭＰ−１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の測定可能な量を放出しない。
【０４８０】
【表３３】
2007528702.tif 000035
【０４８１】
要約：これらの結果は、胎盤由来細胞がヒト臍帯静脈と冠動脈内皮細胞の両方を刺激し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード）アッセイでネットワークを形成することを示している。この効果は、このアッセイ系で既知の血管由来因子で認められたものと同様である。これらの結果は、ＰＤＣｓがｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を刺激するために有用であることを示唆している。  
【実施例２５】
【０４８２】
腎臓被膜下への胎盤由来細胞の移植
腎臓被膜への膵島の移植は、糖尿病の治療に対する移植方法論を評価するために日常的に実行した（Ｒｅｆａｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、Ｔｒａｎｓ．Ｐｒｏｃ．３０：４００〜４０３）。膵島に加えて、他の細胞は、血液グルコース恒常性を保つことができるインスリン分泌細胞へと分化させた。この研究の目的は、ヒト胎盤から由来した細胞が免疫欠損マウスにおける腎臓被膜下に移植された場合に生存できるかを決定することである。さらに、胎盤由来細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ動態化ＣＤ３４＋細胞と混合され、これらの細胞が血管形成及び前記胎盤由来細胞の生存を促進できるか検討した。
【０４８３】
方法と物質
細胞培地：凍結保存した胎盤由来細胞（単離１、Ｐ１０）は、液体窒素から除去し、成長培地において（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州、カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州、セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）コーティングＴ２５５（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）フラスコ上でコンフルエンスまで増殖させた。
【０４８４】
２つのフラスコからの細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、単一の細胞懸濁液を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて得た。凍結保存されたＧＭ−ＣＳＦ動員性ＣＤ３４＋細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）（ロット  １Ｆ０１７４ドナー７９５６）から購入した。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＤＭＥＭ培養液で洗浄した。
【０４８５】
前記細胞懸濁液は、ＤＭＥＭで２回洗浄した。細胞数及び生存率は、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）染色後、血球計数器を用いて推定した。〜３００，０００生存細胞を含有する一定量の前記細胞懸濁液を、１５０ｘｇで遠心分離し、前記細胞を約６マイクロリットルのＤＭＥＭに再懸濁し、１ミリリットルシリンジをつけた２０マイクロリットルピペットチップで吸い込んだ。前記細胞を含むピペットチップは、ｓｍａｌｌ  Ｌｉｇａｃｌｉｐ(Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｅｎｄｏｓｕｒｇｅｒｙ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州)を用いて挟んだ（クランプ）。
【０４８６】
動物調整：マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／フォックスチェイスＳＣＩＤ／雄（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、インディアナポリス、インディアナ州）は８週齢のものであった。前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは個別に体重を量り、６０ミリグラム／キログラムのＫＥＴＡＳＥＴ（ｋｅｔａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，  Ａｖｅｃｏ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．、アイオア州フォートドッジ）、１０ミリグラム／キログラムＲＯＭＰＵＮ（ｘｙｌａｚｉｎｅ，  Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ．、カンザス州シャウニー）および生理食塩水の混合物の腹腔内注射で麻酔させた。麻酔誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、電気大ばさみで体毛が刈り込まれた。前記部位は、二酢酸クロルヘキシジンで洗浄し、アルコールで洗い流し、乾燥させ、１％の利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液を塗布した。眼に眼軟膏を適用し、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。麻酔され外科的に調整された動物は、好ましい横臥ポジションに置いた。左腹腔上に尾側から胸郭にかけて約２センチメートル横行切開を作った。腎臓をさらし、２６−ゲージ針で被膜に穴を開けた。被膜ランス（改変ガラスピペットチップ）を用いて、腎臓被膜の真下に、細胞を導入するようにスペースを作った。前記細胞を、取り付けられたマイクロピペットチップを用いてシリンジから注入した。ポケットは、開口部上を眼科焼灼ペン(Ａａｒｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，フロリダ)を通過させることによって閉じた（腎臓には触れない）。腎臓を正確な解剖学的位置に戻し、筋肉層を縫合して閉じた。前記皮膚を創傷クリップで閉じた。
【０４８７】
実験設計としては、各マウスに対して１つの細胞を移植し（表２５−１）、ｎ値を４（１処理当たり）で４つの処理を行い、３点（１、１４及び３０日）で実験した。
【０４８８】
マウスは、二酸化炭素を吸入させることで、指定された間隔で安楽死させた。腎臓移植部位を切除し、組織像を作成するために冷凍した。
【０４８９】
免疫組織化学：凍結された腎臓移植部位は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォルニア州）における縁部上に包埋した。腎臓組織は、凍結切片処理によって切り取り、移植部位で組織に隣接した５ミクロン切片を得た。得られた切片は、リン酸緩衝食塩水（Ｇｉｂｃｏ）中で新鮮に調整された４％パラホルムアルデヒド(ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ニュージャージー州)で、１５分間固定した。切片は、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳブロッキング溶液中の３％ヤギ血清において、１時間インキュベートした。ブロッキング溶液は穏やかな吸引によって除去した。切片は、ブロッキング溶液中で１：１００で希釈された抗ヒト核抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）に、１時間インキュベートした。切片はＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液中で１：２００で希釈された蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州)において、暗室で３０分間インキュベートした。切片は、ＰＢＳで洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）において５分間インキュベートした。切片はＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡観察によって評価した。
【０４９０】
トリ−クロム染色：凍結された腎臓移植部位は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォルニア州）における縁部上に包埋した。腎臓組織は、凍結切片処理によって切り取り、移植部位で組織に隣接した５ミクロン切片を得た。得られた切片は、１０％中性緩衝ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ミシガン州）において１５分固定した。製造者の方法を用いて、切片をトリ−クロム（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ，ニューヨーク州）染色した。
【０４９１】
【表３４】
2007528702.tif 000036
【０４９２】
処理：
１．胎盤からの３ｘ１０３細胞
２．胎盤からの３ｘ１０３細胞＋３ｘ１０３  ＣＤ３４＋細胞
対照として動物＃２５〜２７を加えた（細胞なし）。
【０４９３】
結果 
胎盤由来細胞の生存率は、〜７５％であり、ＣＤ３４＋細胞の生存率は、９５％であった。１ｘ１０６生存細胞を移植する初期試験は、腎臓被膜が前記細胞を収納するのに十分なほど大きくなかったため、不成功であった。細胞は、トリプシン処理の３時間以内に移植した。腎臓被膜下の胎盤由来細胞の局在は、顕微鏡観察で確認した。ＣＤ３４＋を有する胎盤由来細胞と有さない臍帯由来細胞の数と分布には有意な違いは見られなかった。長期間では細胞数が著しく減少した。
【０４９４】
腎臓被膜の下の細胞の染色は、移植された細胞の保持を示していた。ヒト細胞は、ヒト核抗原を用いて検出した。全ての細胞（ヒト及びマウス）は、ＤＡＰＩを用いて検出した。
【０４９５】
要約：腎臓被膜への細胞の移植は成功であった。成長因子で前処理した、３ｘ１０３ＧＭ−ＣＳＦ動態化ＣＤ３４＋細胞を有する或いは有さない未分化胎盤由来細胞（３ｘ１０３）は、腎臓の被膜の下に移植した。動物は、細胞移植後１、１４、及び３０日目に屠殺した。３０日目で細胞数が明らかに減少したが、細胞は１、１４及び３０日目でも生存していた。ＧＭ−ＣＳＦ動態化ＣＤ３４＋細胞の存在は、胎盤由来細胞の生存には影響を及ぼさなかった。この研究によって、胎盤由来細胞は、腎臓被膜へ移植可能であることが示された。  
【実施例２６】
【０４９６】
胎盤由来細胞の移植
前記分娩後胎盤由来の細胞は、再生治療に有用である。生分解性物質を用い、ＳＣＩＤマウスに移植した胎盤由来細胞で作られた組織が評価された。評価された物質は、ＶＩＣＲＹＬ不織、３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、ＲＡＤ  １６自己集合性ペプチドヒドロゲルであった。
【０４９７】
方法と物質
細胞培地：胎盤由来細胞は、ゼラチンコーティングされたフラスコ中、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州、カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州、セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））において増殖させた。
【０４９８】
マトリックスの調整：下記に説明された、従来の針穿刺法により不織足場を調整した。商品名ＶＩＣＲＹＬで販売されている、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維は、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（サマービル、ニュージャージー州）から入手した。前記繊維は、直径約２０ミクロンのフィラメントであった。前記繊維を切断され、実質的に均一な２インチの長さに圧着し、２インチの短繊維を形成した。前記ＶＩＣＲＹＬ短繊維を用い、乾燥した状態の針穿刺不織基質を調整した。前記短繊維を開口し、標準的な不織機械にかけた。前記で得られたマットは、クモの巣状の短繊維の形であった。前記クモの巣状の短繊維に針穿刺し、乾燥した状態の針穿刺不織足場を作製した。前記不織足場を水ですすぎ、次にエタノール中、別のインキュベーションを行い、前記製造工程中、残留化学物質または処理した酸を除去した。
【０４９９】
３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成る発泡体は、米国特許番号第６，３５５，６９９号で説明されているとおり、凍結乾燥処理により形成した。
【０５００】
サンプル調整：１、０００，０００個の生存可能な細胞は、１５マイクロリットルの成長培地中で、５ミリメーター、２．２５ミリメーター厚の不織足場（６４．３３ミリグラム／ｃｃ）へ；或いは直径５ミリメーターの３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体ディスクへ播種した。前記足場をカバーするために、さらに成長培地を添加する前に、２時間細胞を接着させた。細胞は、一晩、足場上で増殖させた。細胞のないコントロール足場も培地中でインキュベートさせた。
【０５０１】
ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド（３Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、物質移動同意書に基づく）は、滅菌１％（ｗ／ｖ）水溶液として入手し、これは使用直後、ダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中、１０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１０マイクロモルのＨＥＰＥＳで１×１０６個の細胞で１：１に混合された。ＲＡＤ１６ヒドロゲル中の細胞の最終濃度は、１×１０６細胞／１００マイクロリットルであった。
【０５０２】
試験物質（Ｎ＝４／条件）
１．ＶＩＣＲＹＬ  不織＋１ｘ１０６胎盤由来細胞
２．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０６胎盤由来細胞
３．ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド＋１ｘ１０６胎盤由来細胞
４．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
５．ＶＩＣＲＹＬ不織
【０５０３】
動物調整：本研究で利用される動物は、動物保護法の現在の要件に従って取扱い、維持した。前記動物保護規定（９  Ｃ．Ｆ．Ｒ）に順守し、実験動物の治療および使用に関するガイド第７版（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，  ７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）で公表されている前記現行の基準に従うことで、前記一般法を用いたコンプライアンスが達成された。
【０５０４】
雄マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（フォックスチェイスＳＣＩＤ、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，  Ｉｎｃ．、インディアナポリス、インディアナ州）、５週齢：前記ＳＣＩＤマウスの全ての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは、個別に体重を量り、６０ミリグラム／キログラムのＫＥＴＡＳＥＴ（ｋｅｔａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ａｖｅｃｏ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．、フォートドッジ、アイオア州）、１０ミリグラム／キログラムのＲＯＭＰＵＮ（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ．、シャウニー、カンザス州）および生理食塩水の混合物の腹腔内注射で麻酔させた。麻酔誘導後、背側頚部から背側腰仙部への前記動物の背部において、動物用電気大ばさみで体毛を刈り込んだ。前記部位は次に二酢酸クロルヘキシジンで洗浄し、アルコールで洗い流し、乾燥させ、１％の利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液を塗布した。眼に眼軟膏を適用し、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。
【０５０５】
皮下移植法：前記マウスの背側に、４箇所の皮膚切開をそれぞれ約１ｃｍ長で作成した。脊柱左右に各１つの２箇所の頭側移植部位は、尾側から検診された肩甲骨の下縁に向かって約５ミリメータ、皮膚側面胸部領域の横方向に位置した。２箇所の付加的なインプラントは、触診された腸骨稜に向かって約５ミリメーターのところで、正中線の各側に１つずつ、尾側仙腰レベルで殿筋部にかけて横に位置させた。インプラントは、これらの部位でランダムに位置させた。前記皮膚は、下層の結合組織から分離させ、小さなポケットを作り、前記切開部に向かって約１ｃｍのところに前記インプラントを配置した（またはＲＡＤ１６の場合は注入した）。前記適切な試験物質を前記皮下腔に埋め込んだ。前記皮膚切開を金属クリップで閉じた。
【０５０６】
動物の飼育：動物は、個別に温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で研究経過中、マイクロアイソレーターケージで飼育し、約１２時間（明）／１２時間（暗）の明暗サイクルで管理した。前記温度と相対湿度は、前記に述べられた、考えられる最も大きな範囲内に管理された。食事は、Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｐｉｃｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ  ５０５８（Ｐｕｒｉｎａ  Ｃｏ．）から成り、水は自由に摂取させた。
【０５０７】
組織像：インプラントと共に切除された皮膚は、１０％中性緩衝化ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で固定した。覆っていて隣接している組織を用いたサンプルは、ルーティンな方法により中心で二等分し、パラフィン処理し、切除した表面を包埋させた。マイクロトームにより包埋させた組織の切片を作製し、ルーティンな方法によりヘマトキシリンとエオシン（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で染色した。
【０５０８】
結果 
３０日後、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された発泡体への組織の最小限内殖が見られた。対照的に、胎盤由来細胞とともに移植された発泡体へ満たされた組織の伸長が見られた。
【０５０９】
ＶＩＣＲＹＬ不織足場で一部の組織の内植が見られた。臍帯由来細胞を播種した不織足場は、基質沈着と成熟した血管が増加していることが示された。
【０５１０】
ＲＡＤ１６および細胞の注入点を同定するのは不可能だった。
【０５１１】
要約：本研究の目的は、免疫欠損マウスの足場において、ヒト胎盤由来の細胞で形成された細胞タイプを決定することであった。合成吸収性不織／発泡体ディスク（直径５．０ミリメーター×厚さ１．０ミリメーター）または自己集合性ペプチドヒドロゲルには、ヒト胎盤由来細胞を播種し、ＳＣＩＤマウスの背背側脊柱領域の両側に皮下移植した。本研究では、胎盤由来細胞が生分解性足場で良質の組織形成を劇的に増加させることができることが実証された。  
【実施例２７】
【０５１２】
げっ歯類冠動脈結紮（ライゲーション）モデルにおける心血管治療に対する臍帯由来細胞の評価
心臓内ヒト胎盤由来細胞治療の有効性は、冠動脈閉塞後１５分で投与された場合、心筋虚血／梗塞のげっ歯類モデルにおいて評価した。
【０５１３】
方法&材料
Ｔｈｅ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ（マサチューセッツ州）テスト施設は、米国実験動物管理認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって正式許可を受けており、実験動物における研究を行うために米国農務省から認可されている。テストする全ての条件は、動物保護法（９ＣＦＲ）及びその修正案に従った。プロトコールは、研究を開始する前に、研究機関内の動物の管理および使用に関する委員会（ＩＡＣＵＣ）によって再検討され許可された。
【０５１４】
表２７−１に特定された特徴を有する動物は、マイクロ−隔離飼育器の高圧滅菌されたベッド上に個々に収容した。飼育器は、実験動物の管理および使用に対するガイドにおいて説明されている標準に従った。
【０５１５】
【表３５】
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【０５１６】
Ｐｕｒｉｎａ認定食餌（照射された）は、適宜動物に提供した。この食餌は、栄養成分及び環境混入物に対して製造業者によって日常的に分析された。製造業者の分析の結果は、テスト施設で記録した。高圧滅菌し濾過された水道水は、適宜提供した、濾過された水のサンプルは、溶解固体、硬度、特定の微生物含有量、及び選択された環境混入物の総量を分析した。これらの分析の結果は、テスト施設で記録した。
【０５１７】
環境的コントロールは、１８〜２６℃（６４〜７９°Ｆ）の温度、相対湿度３０％〜７０％で維持するように設定した。１２：１２時間の明：暗サイクルを維持した。1時間に１０回以上の動物室の空気交換を維持した。レセプト及び研究での使用の前に、前記動物は、「実験動物のテスト施設標準操作手順、レセプト、条件、及び検疫（ｔｈｅ  Ｔｅｓｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，  Ｒｅｃｅｉｐｔ，  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」に記載されているテスト施設製造供給元マネージメントプログラム（ｔｈｅ  Ｔｅｓｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｖｅｎｄｏｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）に従った条件で最低４日間保持した。
【０５１８】
各動物は、耳パンチ（穿孔）によって示された独特な数によって特定した。動物は、個々の体重が平均体重±２０％を超えないようにした体重順分配によって、ランダムにグループに割り当てた。
【０５１９】
前記動物は、ペントバルビタールナトリウム（４０ミリグラム／キログラム）、及びブプレノルフィン（０．０５ミリグラム／キログラム）を単一カクテルとしたもので、筋肉内（ＩＭ）に麻酔した。麻酔が達成された後、動物は、１８〜１６ゲージ、２インチ長血管カテーテル、或いは適切なサイズの血管カテーテルを用いて挿管し、大気呼吸（酸素を添加した）、及び陽圧換気を手術の間維持した。必要であれば、付加的な麻酔を徐々に増加するように与えた。手術前抗生剤治療（ベンザチン／プロカインペニシリンＧ、４０，０００ユニット／キログラムでＩＭ）も施した。付加的な抗生剤治療は、４８時間毎に施した。
【０５２０】
電極パッドを、動物の足へ適切に配置し、使用可能な心電図（ＥＣＧ）シグナルを受信した。動物は、加熱パッド上に置かれ、手術中の体温の維持を補助した。直腸温度プローブを動物に挿入し、体温をモニタリングした。眼科軟膏を各眼に投与した。外科的部位（胸部領域）は、余計な毛を除去することによって無菌的な手術に対して準備し、７０％イソプロピルアルコールに浸したスポンジでその領域を穏やかに拭き、乾燥させた。次に、ＭｅｄｉＳｅｅｐｓ（登録商標）或いはその類似溶液をその領域に適用し、乾燥させた。前記領域は、厳密な無菌手術のために適切にドレープした。
【０５２１】
外科的切開を、第４番目の肋間スペースを覆う皮膚上に作った。筋肉層を通る鈍的切開は、胸腔にアクセスするために使用した。開創器を、第４番目の肋間スペースへ注意深く挿入し、開き、胸腔へのアクセスを可能にした。無菌生理食塩水で湿らせたコットンスワブを穏やかに挿入することによって心膜を注意深く開いた。湿ったコットンスワブは、心臓の手術のための、長さが６−０シルクの縫合が心筋へ付けられた場所へ、心尖を穏やかに押すために使用した。停止後、心臓を回復させ、心尖に置かれた縫合は、胸腔から心臓と取り出すことを容易にし、十分な張力を心臓に与え、心臓上部や冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）へのアクセスを可能にするために使用した。別の長さの６−０シルク縫合は、ＬＡＤを取り囲むように心筋へ配置した。尖端縫合への圧力を放出させ、心臓を胸腔の内部へ戻した。
【０５２２】
心拍数及びＥＣＧがベースライン値に戻った時点で、ＬＡＤの周りの結紮を縛り、ＬＡＤを閉塞させた。これは、縛られた縫合と切り揃えられた末端とを有する持続的な結紮である。結紮を縛った後、外科医は、結紮の成功を意味する以下の特徴：結紮の真下の心臓の領域の白色／灰色への色の変化（白色は、前記領域への血流の終結、及びＬＡＤの閉塞に対応するＥＧＤの有意な変化の結果である。）を調査した。不整脈は、結紮の最初の１０分間以内で発現した。ラットは、蘇生が必要である事象の期間の間、精密にモニタリングした。重症な不整脈、及び補助なしでの正常洞リズムの変換におけるラットの不全では、心臓マッサージを介して補助した。ＬＡＤ結紮の開始後、約１５分で、左心室の領域が虚血になり、虚血心筋への直接注入によって、溶媒或いはテスト物質で処理した。処置は、心筋の虚血領域への３〜１０回の心筋内注入（１００マイクロリットル／注入）によって構成されている。
【０５２３】
ヒト細胞は、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア）、１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．０１％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））のゼラチンコーティングされたＴ３００フラスコ上に増殖させた。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いてトリプシン処理した。トリプシン処理は、成長培地を添加することによって停止させた。前記細胞は、１５０ｘｇで遠心分離し、上清を除去し、前記細胞ペレットは１００万細胞当たり約１ミリリットルの成長培地で再懸濁した。一定量の再増を除去し、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を添加した。生存細胞数を、血球計数器を用いて推定した。前記細胞懸濁液は、遠心分離し、５００万細胞当たり１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する１ミリリットルの成長培地に再懸濁し、クリオバイアル（Ｃｒｙｏｖｉａｌｓ：Ｎａｌｇｅｎｅ）へ移した。前記細胞は、「Ｍｒ  Ｆｒｏｓｔｙ」冷凍庫を用い、約１℃／分で一晩、−８０℃の冷凍庫で冷却した（Ｎａｌｇｅｎｅ、ニューヨーク州、ロチェスター）。細胞のバイアルは、液体窒素へ移した。バイアルは、ドライアイス上においてＣＢＡＴ（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）からＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州）へ送付され、−８０℃で保存された。動物への細胞の注入前約１〜２時間、細胞のバイアルは３７℃水浴において素早く解凍させた。ＢＳＬ２バイオセーフティーキャビネットにおける無菌条件下で、細胞は、マグネシウム及びカルシウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含む４０マイクロリットルのＰＢＳへ添加し、前記細胞ペレットを１０ミリリットルＰＢＳに再懸濁する前に１５０ｘｇで５分間遠心分離した。細胞数及び生存率は、上述したように推定した。細胞は、１５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに最終濃度が１０６生細胞／１００マイクロリットルになるように再懸濁した。前記細胞懸濁液を、３０Ｇ注射針を有する１ミリリットルのシリンジに入れ、氷上に置いた。生存率を、再び５時間まで氷上で評価した。
【０５２４】
治療の投与（表２７−２）及び心臓の安定化の後、外科医は外科的切開を閉じ始めた。開創器は除去した。肺は３〜４呼吸過剰膨張させ、それらは完全に再膨張しているかを確認できるまで可視的に視察した。これは、回復後の気胸症を予防するために必要な負圧を作るものである。腔を閉じた後の胸腔からの体液及び過剰な空気を排除するために、静脈内カテーテル（すなわち、２０ゲージ、長さ２ミリメーター）は、皮膚及び筋肉層を通じて、チップが胸腔に残るように設置した。前記チップが肺或いは心臓を突き刺さないように気をつけた。分離させた肋骨及び付随する筋肉は、適切な縫合と共に縫合した。筋肉の上層は、単純な連続性パターンを用いて縫合した。皮膚は、水平マットレスパターンを用いて４−０シルクで閉じた。１０ミリリットルシリンジは、胸腔に以前設置した静脈内カテーテルへ接着させ、プランジャーをゆっくりと引き、胸腔からの体液と空気を取り除いた。同時に、前記カテーテルを侵入部位からゆっくり取り除き、それによって周囲の筋肉塊及び皮膚によって穿刺が密封された。外科的ドレープを除去し、体液（すなわち、乳酸加リンガー溶液、２５ミリリットル／キログラム、皮下（ＳＣ）或いは腹腔内（ＩＰ））を与えた。
【０５２５】
【表３６】
2007528702.tif 000038
【０５２６】
各ラットをテスト物質での処理を受けさせ、切開を縫合した後すぐ、動物は心エコー図検査（ＥＣＧ）試験を受けさせた。エコー試験の完了まで麻酔を維持した。エコー試験が完了したら、換気を中止し、ラットを回復エリアへ戻し、加熱し酸素化した回復ケージにおいて回復させた。
【０５２７】
終了する前に、各生存動物の第２のエコー試験を研究の最後（処理後約２８日）に完了した。第２の試験の間、動物は以前に記載したように麻酔した。
【０５２８】
各エコー試験に対して、左胸部領域を剪毛し、温め、トランスデューサーの接触を増強するために超音波ゲルを皮膚に適用した。電極パッドは、適切な四肢の周囲に配置し、ＥＣＧシグナルを受信した。短軸及び長軸を含む心エコー画像は、心室腔寸法、収縮力、脈管構造を通る血流量、及び壁の厚さの決定を可能にする。これらの画像は、さらなる分析のために光ディスクに保存した。試験後、ガーゼ或いはペーパータオルを用いて皮膚からゲルを除去した。ラットは換気装置からはずし、動くまで温められた回復ケージへ置いた。
【０５２９】
外科的手順の終了時、呼吸換気装置を切った。動物の足反射を観察した。その後、直腸プローブ及びＥＣＧ電極を除去し、動物から抜管し、温められ酸素化された回復ケージへ置いた。麻酔からの完全な回復後、動物にブプレノルフィン（０．０５ミリグラム／キログラム、ＳＣ）を与えた。動物が完全な動きをしめし、食物と水に興味を示すまで、観察を定期的に行った。次に動物は清潔な飼育ケージに置き、動物飼育質に戻した。動物は、手術後１日に２回、外科的切開整合をモニターリングした。
【０５３０】
鎮痛薬（すなわち、ブプレノルフィン、０．０５ミリグラム／キログラム、ＳＣ）を手術後、１日２回を４日間、その後は必要に応じて投与した。手術後の痛みの視覚的指標としては、正常体位及び動きの欠如（例えば、動物が背中を丸める位置を維持するなど）、反感（ａｎｔｉｐａｔｈｙ）、摂食／飲水の欠如、毛づくろいの欠如などを含む。
【０５３１】
体重は、処理開始前、処理後１週間に１回、及び剖検の日に記録した。死んだ動物は、体重を測定し、剖検した。
【０５３２】
心臓を回収するために、各ラットを手術で行ったように麻酔した。頸静脈をカニューレ処置した。頸静脈カニューレを介して注入した塩化カリウムを用いて、弛緩期で心臓を停止させた。次に心臓を胸腔から除去した。次に、心臓を１０％中性緩衝ホルマリンに置いた後、限られた剖検を心臓に行った。各屠殺体の残部は、さらなる評価をせずに破棄した。
【０５３３】
死んだことが確認された、或いは安楽死させて瀕死である全ての動物の心臓は、評価するまで４％パラホルムアルデヒドに置いた。各屠殺体の残部はさらなる評価をせずに破棄した。
【０５３４】
組織学及び画像分析：固定組織は、ステンレススチール冠状心臓マトリックス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）を用いて切片化し、４つの２ミリメートル厚の連続組織切片を得た。切片を加工し、日常的な方法を用いて連続的にパラフィンに包埋した。５ミクロン切片をミクロトームによって得て、取扱説明書を用いて、結合性組織に対するＭａｓｓｏｎ’ｓトリ−クロム（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で染色した。電子顕微鏡写真を記録し、Ｐｈａｓｅ  ３  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｌｅｎ  Ｍｉｌｌｓ、ペンシルバニア州）によって開発された画像解析法を用いて分析した。トリ−クロム染色された切片の顕微鏡写真は、電気的に比色分析を行い、心室及び自由壁の全領域、及び異なって染色された領域を決定した。
【０５３５】
結果
氷上で放置されていた時、溶媒において５時間以上、細胞の初期生存率における欠損はなかった。細胞は、１〜３の注射針の挿入点、及び注射針配向の方向における複数の変更を用いて梗塞へ注入した。
【０５３６】
心電図測定は、梗塞処理ラットで行った。溶媒処理動物の短縮率は、４７．７％±８．３％（０日目）〜２３．５％±３０．２％（２８日目）（ｐ<０．０５）と有意に減少した。胎盤由来細胞で処理された動物は、０日目と２８日目の短縮率の違いは小さく、ほとんど有意差はなかった。０日目での処理群間の短縮率の違いはほとんどなかった。核群は、開始時８匹だったが、本実験で何匹かは生きられなかった。線維芽処理した動物は、ＰＤＣｓで処理された動物より死亡率が高かった。
【０５３７】
本研究で回収された心臓は、研究の終了時、組織学的解析に供した。心臓は弛緩期に停止し、固定した。結果は、アルゴリズムから計算し、梗塞を形成する総心臓領域のパーセンテージを推定した。溶媒処理した動物における梗塞サイズは、心臓領域の２２．９％±６．７％であったが、胎盤由来細胞の２つの異なる単離体で処理した心臓における梗塞細部は、１３．９％±３．７％、及び１２．９％±３．４％であり、線維芽細胞では１９．３％±８．０％であった。溶媒処理した動物に対する細胞処理した動物の梗塞サイズの違いは、ｔ−テスト／ＡＮＯＶＡによって決定されたように、統計学的に有意ではなかった。
【０５３８】
要約：本研究の結果により、胎盤由来細胞は、ラットにおける外科的に誘導された心筋梗塞の損傷を軽減することにおいていくつかの利点を有していることが示唆された。溶媒処理した動物は、短縮率によって測定されたように、０日目と比較して２８日目での心機能における有意な減少を示したが、胎盤由来細胞処理した動物は、２８日間の研究において最小限の変化を示した。線維芽細胞処理した動物は、最小限の変化を示したが、２個体の動物のみが本研究で生存した。梗塞サイズの評価によって、中程度であるが統計学的には有意ではない軽減が、２８日目での溶媒コントロールと比較して、胎盤由来細胞処理した動物における梗塞サイズで見られたことが示された。総合すると、これらのデータは、心筋梗塞からの損傷を軽減する胎盤由来細胞の効果を支持するものである。  
【実施例２８】
【０５３９】
網膜色素変性症の治療における胎盤由来細胞の使用
現在、網膜における細胞の変性から生じる失明障害に対する実質的な治療は存在しない。アポトーシスや２次変性の結果としての光受容体の損失は、視覚の進行性変質、さらに最終的には失明を引き起こす。これらを生じる疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び網膜色素変性症（ＲＰ）を含む。通常、ＲＰは、光受容体細胞死を引き起こす、１つの遺伝子変異に関連している。
【０５４０】
網膜光受容体及び隣接する網膜色素上皮細胞は、機能的ユニットを形成している。英国外科医師会（ＲＣＳ）ラットによって、チロシン受容体キナーゼ（Ｍｅｒｋｔ）欠損は、外側色素食作用に影響を及ぼし、光受容体細胞死を導くことが示された（Ｄ’Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９（４）：６４５〜５１）。
【０５４１】
網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）細胞のＲＣＳラットの網膜下スペースへの移植によって、光受容体損失の進行が限定され、視覚機能の維持が観察された（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ（１９８８）Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．４７（６）：９１１〜７）。本実施例では、臍帯由来細胞は、ＲＣＳモデルにおける光受容体の救出を促進するために使用され得ることを説明する。
【０５４２】
方法と物質
細胞移植：ヒト成人胎盤及び成人線維芽細胞（継代１０）は、１継代増殖させた。全ての細胞は、まず、成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１５％（ｖ／ｖ）規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州：ロット＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））中に５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングＴ７５フラスコ上に播種した。その後の継代では、全ての細胞が以下のように処理された。トリプシン処理後、生存可能な細胞をトリパンブルー染色後に計数した。簡潔には、５０マイクロリットルの細胞懸濁液を、５０マイクロリットルの０．０４％  ｗ／ｖトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）と混合し、生存細胞数は血球計数器を用いて推定した。細胞はトリプシン処理し、添加物を含まないＤＭＥＭ：低グルコース培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で３回洗浄した。ヒト胎盤及び線維芽細胞（継代１１）の培養は、トリプシン処理し、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で２回洗浄した。移植手順として、異栄養性ＲＣＳラットをキシラジン−ケタミン（１ミリグラム／キログラム、腹腔内（ｉ．ｐ．）、以下の混合物：２．５ミリリットルのキシラジン（２０ミリグラム／ミリリットル）、５ミリリットルのケタミン（１００ミリグラム／ミリリットル）、及び０．５ミリリットルの蒸留水のｉ．ｐ．）で麻酔し、それらの頭をノーズバーによって固定した。血清を欠いた細胞は、２マイクロリットルのＬｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ｌ−１５培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）において再懸濁（２ｘ１０５細胞／注入）し、微細なガラスピペット（内径７５〜１５０ミクロン）を用いてトランス−強膜的に（ｔｒａｎｓ‐ｓｃｅｒａｌｌｙ）移植した。
【０５４３】
細胞は、麻酔された３週齢異栄養性色素性ＲＣＳラットの背側−側頭網膜下スペースへ供給した（総Ｎ＝１０／細胞タイプ）。細胞は右眼へ一側性に注入し、左眼は担体培養液のみを注入した（ニセコントロール：Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培養液）。残存移植細胞の生存率は、移植セッションの最後でのトリパンブルー排除によって評価されたように、９５％以上を保持していた。細胞注入を実行した後、動物には、移植後１０日間、デキサメタゾン（２ミリグラム／キログラム）を注入した。研究の期間の間、動物は、移植前２日目から研究が終わる時まで、経口シクロスポリンＡ（２１０ミリグラム／リットルの飲料水：結果生じる血中濃度：２５０〜３００マイクログラム／リットル）（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、オハイオ州）を続けた。食物及び水は適宜利用可能にした。動物は、手術後６０或いは９０日で屠殺し、何匹かの動物は、細胞移植に伴う短期間変化での組織学的評価のためにより早い時期に屠殺した。
【０５４４】
ＥＲＧ記録：一晩の暗順応の後、動物は、以前に記載したように（Ｓａｕｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ；４４（１）：９〜１８）、薄暗い赤色光の下でＥＲＧ記録のために調整した。簡潔には、麻酔（１５０ミリグラム／キログラム、ｉ．ｐ．ケタミン、及び１０ミリグラム／キログラムｉ．ｐ．キシラジンの混合物を用いて）下で、頭を定位固定頭保持器を用いて固定し、体温を直腸温度計を通じてモニタリングし、恒温性毛布を用いて３８℃で維持した。瞳孔を、等量の局所的２．５％フェニレフリン及び１％トロピカミドを用いて拡張させた。０．７５％ブピバカインによる局所麻酔を、角膜反射を予防するために使用し、０．９％の生理食塩水の滴下を、脱水を防ぐために角膜へ頻繁に適用し、記録電極（金ワイヤーループ）との電気的接触を可能にするために適用した。２５−ゲージ注射針を、２つの目の間の頭皮の下へ挿入し、これは参考電極として働くものである。増幅（１〜１，０００Ｈｚブランドパス、Ｖ字型フィルタリングなし）、刺激提示、及びデータ獲得は、ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）からのＵＴＡＳ−３０００システムによって提供される。ＥＲＧｓは、６０日目で記録した。
【０５４５】
混合ａ−波及びｂ−波記録：暗順応ｂ−波の定量化のために、単一フラッシュ提示（１０マイクロ秒期間）から構成される記録を、３〜５回繰り返し、反応信頼度を変更し、信号対雑音比を必要であれば改善した。刺激は、−３．６〜１．４ｌｏｇ  ｃａｎｄｉｌａ／ｍ２まで変わる１つのｌｏｇユニットステップにおいて６つの増加した強度で提示した。桿体の潜在的な脱色を最小限にするために、最低刺激強度の１０秒から最高刺激強度の２分目まで刺激輝度が上昇するにつれて、内部刺激間隔を増加させた。最大ｂ−波振幅は、刺激強度は関係なく、フラッシュ強度系列から得られたように定義した。Ｎａｋａ−Ｒｕｓｈｔｏｎ曲線を用いたデータの補正からの真実Ｖｍａｘは、異栄養性動物における輝度レベルが高くなるにつれてＥＲＧ反応がしばしば不安定になり、０．４及び１．４ｌｏｇ  ｃａｎｄｉｌａ／ｍ２周辺で反応が抑制される傾向を示すので、使用しなかった。ＥＲＧ構成要素が得られたか損失した年齢を決定するために、判定基準振幅：ａ‐波及びｂ−波に対しては２０マイクロボルト、及びＳＴＲ−様反応に対しては１０マイクロボルトを用いた。ｂ−波の振幅は、ａ‐波ネガティブピークからｂ−波ポジティブ尖までで測定し、ｂ−波尖部を超える周期的変動のピークまででは測定しなかった（Ｎｕｓｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４０（１２）：２８４８〜５８）。
【０５４６】
桿体及び錐体反応の分離：二倍フラッシュプロトコールは、桿体及び錐体反応の分離を決定するために用いた（Ｎｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２９（３）：１９３〜６）。プローブフラッシュは、較正全体野を有するＵＴＡＳ−３０００システム（ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、調整フラッシュの後１秒提示し、これは使用された条件下での刺激装置の完全な再充電を確実にするものである。この手順における調整フラッシュの役割は、桿体を一時的に飽和し、プローブフラッシュへ無応答性にするものである。桿体由来ｂ−波は、混合反応（プローブフラッシュのみの提示の後で得られる、すなわち調整フラッシュによって優先されない）から錐体由来反応を引くことによって得られた。
【０５４７】
組織像：動物は、ウレタンを過剰投与（１２．５グラム／キログラム）することによって屠殺した。目の配向は、脱核する前に、上直筋を通って６．０縫合を置くことによって維持した。角膜切開を作った後、目は、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２．５％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．０１％ピクリン酸を用いて固定した。固定後、角膜及びレンズは、毛様体の周りを切ることによって除去した。上直筋の除去の前、配向の維持を補助するために、後網膜の末梢に小さな切れ目を作った。次に、網膜は、１％四酸化オスミウムで１時間、後固定した。アルコールからエポキシプロピレンへの連続による脱水の後、網膜はＴＡＡＢ包埋樹脂（ＴＡＡＢ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｄｅｍａｒｓｔｏｎ、イギリス）に包埋した。セミ（半）薄切片は、１％ホウ酸緩衝液中の１％トルイジンブルーで染色し、ウルトラ（超）薄切片は、ウラニル酢酸及びリードクエン酸で対照させた。
【０５４８】
結果
ＥＲＧ記録：移植後６０日で、胎盤由来細胞注入を受けた動物（ｎ＝４）は、ニセコントロール（０）と比較してａ−波における改善が見られなかった（２０±２０）が、混合ｂ−波においてはニセコントロール（１．５±２）と比較して、改善が見られ（８１±７２）、錐体−ｂ−波においてはニセコントロール（７±７）と比較して非常によい改善（５０±１９）が見られ、桿体寄与においては、ニセコントロール（０）と比較して非常によい改善（３０％）が見られた。これらの結果は、ニセコントロールと比較した場合、視覚反応における改善を意味している。胎盤由来細胞の移植と比べて、線維芽細胞移植は、テストされたいずれのパラメーターにおいても改善は見られなかった。
【０５４９】
【表３７】
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【０５５０】
組織像：移植後、炎症性反応の組織学的証拠はなく、浸潤性免疫細胞は、胎盤細胞群のニッセル染色切片において観察されなかった。しかしながら、線維芽細胞移植は、動物の死を生じ（ｎ＝７）、初期段階炎症性反応を示していた。
【０５５１】
参考文献
Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１７）：９９４２〜７．
【実施例２９】
【０５５２】
ＳＣＩＤマウスの移植における分娩後由来細胞の軟骨形成の可能性
生体再吸収可能な増殖因子を充填した足場に播種し、ＳＣＩＤマウスに移植した後、臍帯または胎盤組織由来細胞の軟骨形成の可能性が評価された。
【０５５３】
方法と物質
試薬：ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリン及びストレプトマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッドから購入した。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）は、ＨｙＣｌｏｎｅ（ユタ州、ローガン）から入手した。間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（メリーランド州、ウォーカーズビル）から入手した。ＴＧＦβ−３は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。ＧＤＦ−５は、Ｂｉｏｐｈａｒｍ（ドイツ、ハイデンベルク）から入手した（国際特許番号ＷＯ９６／０１３１６  Ａ１号公報、米国特許番号第５，９９４，０９４Ａ号）。軟骨細胞増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ミリモルのＨＥＰＥＳ、０．１ミリモルの非必須アミノ酸、２０マイクログラム／ミリリットルのＬ−プロリン、５０マイクログラム／ミリリットルのアスコルビン酸、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢが補充されたＤＭＥＭ−高グルコースから成る。ウシフィブリノーゲンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。
【０５５４】
細胞：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ロット＃  ２Ｆ１６５６）は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（メリーランド州、ウォーカーズビル）から入手し、製造業者の使用説明書に沿ってＭＳＣＧＭで培養した。このロットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において事前に研究室で検討しており、軟骨形成アッセイで陽性であることが示されている。ヒト成人線維芽細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；バージニア州、マナッサス）から入手し、ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコで成長培地中で培養させた。事前に説明されたように、ヒト臍帯（ロット番号０２２７０３Ｕｍｂ）及び胎盤（ロット番号０７１００３Ｐｌａｃ）から単離された分娩後由来細胞を利用した。ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコにおいて、細胞は成長培地で培養させた。前記細胞培養は、標準的な増殖条件下でインキュベートした。実験に使用された細胞は、継代５〜１４であった。
【０５５５】
足場：ポリジオキサノン（ＰＤＳ）メッシュ（ＰＧＡ／ＰＣＬ発泡体−ＰＤＳメッシュ）で強化された６５／３５ポリグリコール酸（ＰＧＡ）／ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）発泡体足場［４ｘ５センチメートル、厚さ１ミリメートル、エチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌済み］は、生体物質及び応用技術センター（ＣＢＡＴ、ニュージャージー州、サマービル）から入手した。足場から作られたパンチ（３．５ミリメートル）には、ＧＤＦ−５（３．４マイクログラム／足場）、ＴＧＦβ−３（１０ナノグラム／足場）、ＧＤＦ−５およびＴＧＦβ−３の組み合わせ、またはコントロール培地を充填し、凍結乾燥した。
【０５５６】
足場への細胞播種：胎盤および臍帯由来細胞は、トリプシン処理し、細胞数と生存可能性を決定した。０．７５×１０６細胞は、成長培地１５マイクロリットルに再懸濁し、細胞培養ディッシュで３．５ミリメーターの骨格パンチに播種した。前記細胞播種足場は、５％ＣＯ２を用いた標準的な空気中、３７℃で２時間、細胞培養インキュベーターでインキュベートし、その後、軟骨移植片リングの内側に入れた。
【０５５７】
ウシ軟骨移植片：直径５ミリメートルの軟骨移植片は、若年のウシの肩から得られた軟骨から作った。前記移植片の中心からパンチ（３ミリメートル）を切除し、３．５ミリメートルの再吸収可能な足場が播種された細胞に置いた。フィブリングルー（６０マイクロリットルのウシフィブリノーゲン、３ミリグラム／ミリリットル）を用い、細胞を有する足場は、前記移植片内に維持させた。サンプルは、軟骨細胞増殖培地中に一晩維持し、次の日にリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、ＳＣＩＤマウスに移植した。
【０５５８】
動物：ＳＣＩＤマウス（（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ／雄）、５週齢は、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（インディアナ州、インディアナポリス）及びＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ミシガン州、ポーテジ）から入手しれた。本研究で使用された動物は、一見、体系的な偏りなく選択された。アクセッション番号、移植技術、動物番号、種／系統、手術日、ｉｎ  ｖｉｖｏ期間、安楽死日を掲載したタグを各個別動物のケージに付けた。消えないインクマーカーで耳にマークされたナンバーにより前記動物が同定された。
【０５５９】
実験設計：合計４２匹のマウスでテストした。２つの足場は、以下に記載したように、各マウスにおいて皮下的に移植した；皮下的移植の４２匹のマウス；１処理当たり３つのｎ−値を有する２８処理。この研究は、ＩＡＣＵＣ許可番号：Ｓｋｉｌｌｍａｎ  ＩＡＣＵＣ  ０１−０３７と一致する。この研究は６週間続けた。
【０５６０】
ＳＣＩＤ移植
Ａ．体重
各動物は、麻酔をする前と、剖検時に体重測定をした。
【０５６１】
Ｂ．麻酔及び手術準備
前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは、個々に体重測定し、ＫＥＴＡＳＥＴ（ケタミン塩酸塩（６０ミリグラム／キログラム））、ＲＯＭＰＵＮ（キシラジン（１０ミリグラム／キログラム））、及び生理食塩水の混合物を腹腔内に注入することによって麻酔した。
【０５６２】
麻酔の誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、動物用電気大ばさみで体毛が刈り込まれた。前記部位は、二酢酸クロルヘキシジンで洗浄し、アルコールで洗い流し、乾燥させ、１％の利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液を塗布した。眼に眼軟膏を適用し、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。麻酔され外科的に調整された動物は、好ましい横臥ポジションに置いた。
【０５６３】
Ｃ．皮下移植法：約２センチメートルの皮膚切開を、脊柱に平行して胸椎に対する側面に作成した。皮膚は、下にある結合性組織から鈍的切開を解して分離した。各ＳＣＩＤマウスは、１つの皮膚切開を通って各半胸部における鈍的切開によって作られた皮下ポケットに置かれた２つの処理を受けた。５−０ＥＴＨＩＢＯＮＤ  ＥＸＣＥＬ（ポリエステル）（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）による仮縫い縫合は、各足場周辺の筋系へ皮膚を仮縫いするために使用し、皮下転位を予防した。足場は、６週間移植し、回収した。実験設計は、表２９−１に概説した。
【０５６４】
【表３８】
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【０５６５】
Ｄ．安楽死及び組織学的調整
肉眼実験は、一連の研究の間に死んだ、或いは瀕死条件において安楽死させたそれぞれの動物に実行した。選択した組織は、研究指導者及び／若しくは病理学者の判断で保存した。
【０５６６】
マウスは、ＣＯ２を吸入させることで、指定された間隔で安楽死させた。移植部位の肉眼観察を記録した。覆っている皮膚の皮下移植部位のサンプルは、切除し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。各移植は、半分に二分し、半分は、パラフィン包埋、切片化、及びマトキシリン&エオシン（Ｈ&Ｅ）及びサフラニンＯ（ＳＯ）染色のために、ＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｔａｗａｎ、ミシガン州）へ送付した。
【０５６７】
この研究より得られたデータは、統計的には分析されなかった。
【０５６８】
結果
新しい軟骨及び骨形成は、成長因子を添加し細胞を播種した足場、細胞を播種したコントロール足場、及び成長因子のみを添加した足場を含むサンプルの大部分で観察された。新しい軟骨及び骨形成の程度は、処理及びコントロール群内で変わった。
【０５６９】
足場に播種された初期及び後期継代の胎盤由来細胞は、足場内に新しい軟骨及び骨形成を示した。異なる成長因子を添加し細胞を播種した足場と、細胞のみを播種した足場との間で、新しい軟骨及び骨形成における明らかな違いは観察されなかった。コントロール足場（成長因子なし及び細胞なし）と比較して、成長因子を有する及び有さない、細胞を播種した足場において、及び生長因子が添加された足場単独において、新しい軟骨形成の程度は、より大きいように見えた。胎盤由来細胞を播種した足場での新しい軟骨形成は、ＭＳＣを播種した足場、及び線維芽細胞を播種した足場と類似していた。
【０５７０】
初期及び後期継代の臍帯由来細胞を播種した、成長因子処理及びコントロール足場において、新しい軟骨及び骨形成が観察された。軟骨形成の程度は、胎盤由来細胞で見られた程度より少ないように見られた。胎盤由来細胞で見られたような大規模な軟骨形成は、どのサンプルにおいても見られなかった。骨形成は、ＴＧＦベータ−３及びｒｈＧＤＦ−５の両方を含有する足場上に臍帯由来細胞を播種した足場においてより高く現れた。
【０５７１】
ｈＭＳＣを添加した足場も、新しい軟骨及び骨形成を示した。新しい軟骨及び骨形成の程度は、全てのｈＭＳＣ処理群と類似していた。ヒト成人線維芽細胞を播種した足場でも、新しい軟骨及び骨形成が観察された。結果は、胎盤由来細胞及びｈＭＳＣで得られたものと類似していた。
【０５７２】
成長因子を添加した足場、或いは足場のみが軟骨リング内に置かれ、移植されたコントロール群においても、新しい軟骨及び骨形成が観察された。予想通り、新しい軟骨形成の程度は、成長因子を含む足場においての方が、成長因子を含まない足場より大きかった。骨形成の増加は、テストされた２つの成長因子の組み合わせを含むコントロールにおいて見られた。
【０５７３】
新しい軟骨形成は、足場内と同様に、軟骨外移植片リングの隣接部でも観察された。軟骨リングに隣接した足場内の新しい軟骨形成は、軟骨細胞の遊走の結果である可能性がある。足場内の島として見られた軟骨形成は、及び播種した細胞が分化する、若しくは内在性マウス前駆細胞が分化して、足場内で軟骨細胞が遊走した結果である可能性がある。この観察は、コントロールの播種された細胞を有さない成長因子を添加した足場において、軟骨形成文化の島が観察された事実に基づいている。新しい骨形成は、独立して足場内に観察され、軟骨細胞にも関連していた。骨形成は、骨芽細胞分化、及び軟骨内骨化から生じている可能性がある。
【０５７４】
遊走した軟骨細胞、対（ｖｅｒｓｕｓ）播種した細胞の軟骨形成及び骨芽細胞分化から生じた軟骨細胞に関して、新しい軟骨及び骨形成を分離するのは困難である。特異的なヒト抗体で切片を染色すると、観察された軟骨形成及び骨芽細胞形勢への播種された細胞の寄与を区別することができる。胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞が軟骨細胞遊走を刺激することも可能である。
【０５７５】
大量な新しい血管は、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞と添加された足場で観察された。血管は、骨形成の領域では豊富にある。新しい血管は、新しい骨形成と関連して、ｈＭＳＣを播種した足場、及び線維芽細胞を播種した足場内でも観察された。
【０５７６】
コントロール足場（ＧＦなし、細胞なし）と比べた隣接足場（成長因子（ＧＦ）あり）の新しい軟骨及び骨形成の促進に対する全身性効果は、考慮からはずすことはできない。ＳＣＩＤマウスにおいてそれに隣接して移植された足場を考慮に入れると、足場内の新しい軟骨及び骨形成の分析によって、隣接した足場からの成長因子の全身性効果の明らかなパターンは見られなかった。
【０５７７】
要約：結果は、新しい軟骨及び骨形成が、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞を播種した、成長因子及びコントロール足場において観察されたことを示していた。胎盤由来細胞での結果は、ヒト間葉系幹細胞で観察されたものと類似していたが、新しい軟骨様組織形成の程度は、臍帯由来細胞において宣告されたものよりわずかに少なかった。細胞なしで移植された成長因子を添加した足場でも、新しい軟骨及び骨形成を示した。これらのデータは、足場内での新しい軟骨形成は、ウシ外移植片から遊走した軟骨細胞から、内在性前駆細胞の軟骨形成分化から、及び播種した細胞の軟骨形成分化から生じる可能性はあることを示唆していた。
【０５７８】
これらの結果は、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞が、軟骨形成及び骨芽細胞形成分化を受けることを示唆していた。これらの結果は、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞は、軟骨外移植片から足場への軟骨細胞の遊走を促進することも示唆していた。大量な新しい血管も、足場内、特に新しい骨形成に関連した足場で観察された。  
【実施例３０】
【０５７９】
分娩後由来細胞の神経修復での使用
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）病変が、哺乳類成体ＣＮＳでの種々の修復の方策のモデルとして広範に使用されている。げっ歯類成体のＲＧＣの軸索の球後部分が、不成功の発芽（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ、１９９５）および親細胞集団の進行的死亡（Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ、１９９３）に至ることが実証されている。多くの研究は、軸索切断されたＲＧＣの生存性およびそれらの軸索の再生への種々の外因性因子類および内因性因子の刺激的効果類を実証している（Ｙｉｐ  ａｎｄ  Ｓｏ，２０００、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２００１）。さらに、他の複数の研究は、細胞移植が、切断された神経軸索の再生に用いられて得ることを実証している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００３、Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ、２０００）。このように、これらの研究および他の研究は、脊髄、末梢神経、陰部神経、視神経、または、神経損傷が起こり得る損傷による他の疾患類／外傷を治療するために、細胞に基づく治療が利用されうることを実証している。
【０５８０】
自己集合性ペプチド（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）、米国特許番号第５，６７０，４８３号および第５，９５５，３４３号、米国特許出願第ＵＳ２００２／０１６０４７１号公報、国際特許第ＷＯ０２／０６２９６９号公報）は、細胞を３次元で封入するための、２次元コーティング内に細胞をプレーティングするための、細胞接着用の足場として、または、懸濁培養でのマイクロキャリアとして、働くように開発されている。３次元細胞培養は、天然の再現性および細胞のシグナルの問題を有する動物由来の物質（マウスの肉腫抽出物）、若しくは天然のＥＣＭの物理学的ナノメートルスケール及び化学的特性を模倣しない、より大きな合成足場を必要とする。ＲＡＤ１６（ＮＨ２−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＯＨ）およびＫＬＤ（ＮＨ２−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ＣＯＯＨ）は、小さい（ＲＡＤは５ナノメートルである）オリゴペプチド断片で合成され、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に類似の或るスケールでナノファイバーに自己集合する（３Ｄマトリックス社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）。前記自己集合は、培養培地内に見つけられる一価陽イオンまたは二価陽イオンによって、または生理学的環境によって、開始される。この実施例に記載されたプロトコールでは、ＲＡＤ１６は、分娩後細胞の眼の異常への移植用のマイクロキャリアとして使用された。この実施例では、分娩後由来細胞（ＰＰＤＣｓ）の移植が、或る成体ラットの視神経の軸索再生モデルで効力を提供し得ることが実証される。
【０５８１】
方法および物質
細胞：ヒト成人のＰＰＤＣｓ（臍帯及び胎盤）、及び繊維芽細胞（継代１０）の培養は、１回の継代で増殖させた。全ての細胞は、まず、成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン；ロット＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド））内で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコにおいて、５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。継代１１で、細胞をトリプシン処理し、生存率をトリパンブルー染色によって決定した。簡潔には、５０マイクロリットルの細胞懸濁液を、５０マイクロリットルの０．０４％（ｗ／ｖ）トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）と混合し、血球計算板を用いて生細胞数を推定した。その後、細胞は、添加物を含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）で３回洗浄した。その後、細胞は、製造会社の推奨の通り、緩衝化され等張化された２５マイクロリットルのＲＡＤ−１６（３ＤＭ社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）において、２００，０００細胞の濃度で懸濁した。１００マイクロリットルの添加物を含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地は、前記細胞／基質懸濁液に添加し、使用までそれを湿った状態に保った。これらの細胞／基質培養は、移植が行われるまで標準の大気条件に維持された。移植の時点で、過剰な培地が除かれた。
【０５８２】
動物および外科処置：Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓの雌ラット（２２０〜２４０グラムの体重）を使用した。腹腔内へのトリブロモエタノールの麻酔下（２０ミリグラム／１００グラムの体重）で、視神経を露出させ、視神経髄を視神経円板から約２ミリメートルの所で眼窩内で切開し、前記神経を前記髄から持ち上げ、細いはさみで完全に横に切断した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００３）。切断の完全性は、近位断端および遠位断端の完全な分離を視覚的に観察することで確認された。コントロール群は、移植されなかった障害ラットから成る。移植ラットでは、１つのマイクロピンセットを用いて、ＲＡＤ−１６に播種された培養分娩後細胞は、前記近位断端および前記遠位断端の間に挿入した。ＲＡＤ−１６中の約７５，０００細胞は、切断された視神経に移植した。１つの細いマイクロピンセットを用いて、細胞／基質を前記切断部に塗布した。切断された視神経の髄は、１０／０ブラックモノフィラメントナイロン（ＥＴＨＩＣＯＮ、英国、エジンバラ）で閉じられた。従って、ギャップは、前記神経の前記切断近位端および前記切断遠位端が互いに近づくように引っ張って閉じた。
【０５８３】
細胞の注入が行われた後、動物は、移植後１０日間の間、デキサメタゾン（２ミリグラム／キログラム）を注入した。この研究の期間中、動物は、移植の２日前から前記研究の終了時まで、経口的にシクロスポリンＡ（２１０ミリグラム／リットル、結果生じる血液内濃度：２５０〜３００マイクログラム／リットル）（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｓ，オハイオ州、ベッドフォード）で維持された。食物と水は無制限に摂取させた。動物は、移植後３０日目或いは６０日目に屠殺した。
【０５８４】
ＣＴＢ適用：動物を屠殺する３日前に、麻酔下で、３０〜５０ミリメートルの先端を有するガラスマイクロピペットを、前記レンズの後ろに前記強膜を通して接線方向に挿入し、１％逆行性トレーサー−コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）水溶液（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ、カリフォルニア州、カンベル）の２つの４〜５マイクロリットル一定量をガラス体に注入した。動物は、固定液で灌流し、視神経を同一の固定液中で１時間、回収した。前記視神経は、一晩スクロース中に移した。２０マイクロメートルの凍結切片は、０．１モルのグリシンに３０分間インキュベートし、２．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ、マンハイム）及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）を含むＰＢＳ溶液でブロックし、次に２％の正常ウサギ血清（ＮＲＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）、２．５％ＢＳＡ、及び２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）を含むＰＢＳ中に１：４０００で希釈されたヤギ抗ＣＴＢ抗体（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ、カリフォルニア州、カンベル）を含有する溶液でブロックし、ＰＢＳ中の２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において１：２００で希釈されたビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、バーリンガム）で、室温、２時間インキュベートさせた。これは、その後ＰＢＳにおいて１：２００希釈のストレプトアビジン・グリーン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４３８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州、ユージーン）中で、室温で２時間、染色した。染色された切片は、その後、ＰＢＳで洗浄し、共焦点顕微鏡のためにプロピジウムアイオダイドで対比染色した。
【０５８５】
組織学用調製：簡潔には、ＣＴＢ注射の５日後、ラットは４％ホルムアルデヒドで灌流した。ラットは、４立方センチメートルのウレタンが与えられ、次にＰＢＳ（０．１モル）で灌流し、その後４％パラホルムアルデヒドで灌流した。脊髄を切断し、頭から骨を除去し、小隆起を露出させた。前記小隆起を取り除き、４％パラホルムアルデヒド中に置いた。前記眼の外側に沿ってできるだけ後方まで切断して、前記眼を取り除いた。前記眼の下側に横たわる前記視神経を切断しないように注意が払われた。前記眼を取り除き、筋肉を切断し、前記視神経を露出された。その後、これは４％パラホルムアルデヒド中に置いた。
【０５８６】
結果
病変部のみ：前記視神経の管後方（ｒｅｔｒｏｔｕｂｕｌａｒ）の切断の１ヶ月後に、いくつかのＣＴＢ標識した軸索が、前記網膜に付着した神経部分に同定された。前記切断部の近くの２００マイクロメートル内に、軸索が主軸に直角にいくつかの副軸索を出し、前記切断面に神経腫様（ｎｅｕｒｏｍａｔｏｕｓ）として末端化していることが発見された。前記近位断端および前記遠位断端の間のこの切断部では、前記間隙は、２〜３ミリメートル断片の血管新生化した結合組織によって進行的に架橋されていることが観察されたが、軸索がこの架橋部分に進行するのは見られなかった。従って、病変のみを受けた動物では、軸索成長が前記遠位断端に到達することは観察されなかった。
【０５８７】
ＲＡＤ−１６移植：前記切断部へのＲＡＤ−１６の移植後、血管新生化した結合組織の内部への可視的な成長が観察された。しかし、前記近位断端及び前記遠位断端の間で、軸索の内部への成長は観察されなかった。ＲＡＤ−１６の適用のみは、この状況での軸索再生を誘導するには不十分であることが、前記結果から実証された。
【０５８８】
分娩後由来細胞の移植：分娩後由来細胞の前記切断視神経への移植は、視神経の成長を刺激した。繊維芽細胞が移植された条件では、いくつかの再成長が観察されたが、前記移植胎盤由来細胞で観察された前記再成長に比較すると、これは最小限であった。視神経の再成長は、胎盤由来細胞で移植された動物の４／５で観察され、成人皮膚繊維芽細胞で移植された動物の３／６で観察され、臍帯由来細胞で移植された動物の１／４で観察された。再成長が観察された条件では、ＣＴＢ標識によって、網膜神経節細胞の軸索の再生が確認された。これらの軸索は前記移植部分を貫通していることが実証された。グリア瘢痕のレベルを決定するために、ＧＦＡＰ標識も行った。ＧＦＡＰ発現は、前記近位断端で高く、前記の再神経化された移植片内にある程度の免疫染色が観察された。
【０５８９】
要約：これらの結果は、移植されたヒト成人の分娩後由来細胞が、切断された網膜神経節細胞軸索の再生を刺激して、導くことができることを実証する。
【０５９０】
参考文献
１）Ｚｅｎｇ  ＢＹ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＮ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｇ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＡＲ．１９９５．Ｊ．Ａｎａｔ．１８６：４９５〜５０８．
２）Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚ  ＭＰ，Ｖｉｄａｌ−Ｓａｎｚ  Ｍ，Ｂｒａｙ  ＧＭ，Ａｇｕａｙｏ  ＡＪ．１９８８．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６５〜８０．
３）Ｙｉｐ  ＨＫ，Ｓｏ  ＫＦ．２０００．Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９：５５９〜７５．
４）Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，Ｈｅｉｄｕｓｃｈｋａ  Ｐ，Ｔｈａｎｏｓ  Ｓ．２００１．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１７２：２５７〜７２．
５）Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏ  Ａ，Ｃｏｒｄｅｒｏ  ＭＩ，Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｉｔｏ  ＦＦ，Ａｖｉｌａ  Ｊ．２０００．Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：４２５〜３５．
【０５９１】
本発明は、特に現在の好適な実施例と関連して示され、説明されたが、本発明は、特に開示され、ここに実証された実施例に限られないことは理解されることとする。本発明の好適な実施例には多数の変化と修正を行うことができ、そのような変化と修正は、添付の請求項に示されたような、本発明の範囲と要旨から逸脱することなくなされるものである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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