(57)【要約】本発明は、MUC1発現細胞をMUC1アンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む、MUC1発現細胞においてデスレセプター誘導アポトーシスを増強する方法に関する。2007523214.tif 000005
2007523214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MUC1発現細胞をMUC1アンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む、MUC1発現細胞においてデスレセプター誘導アポトーシスを増強する方法。
【請求項２】
MUC1発現細胞がMUC1発現癌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
デスレセプター誘導アポトーシスがFas誘導アポトーシスである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
デスレセプター誘導アポトーシスがTRAILレセプター誘導アポトーシスである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
MUC1アンタゴニストが、アンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAポリヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
MUC1アンタゴニストがMUC1リガンド捕捉分子である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
MUC1アンタゴニストがPDZドメインへのMUC1の結合を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
MUC1発現細胞が、MUC1発現細胞のデスレセプター誘導アポトーシス細胞死の誘導を含む治療の必要性がある患者の内部にある、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、恩典が細胞死リガンド誘導アポトーシスに由来する、癌および他の治療法の分野に関する。より具体的に、本発明は、デスレセプターリガンド誘導アポトーシスを増強するためのMUC1アンタゴニストの使用に関する。
【０００２】
本発明は、2004年2月23日に出願された米国仮出願第60/547,010号に対する優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
背景
細胞のアポトーシス反応は、システインプロテアーゼのカスパーゼファミリーを活性化する、外因性および内因性経路によって誘導される。外因性アポトーシス経路は、腫瘍壊死因子のリガンド刺激によって活性化される。細胞のアポトーシス反応は、システインプロテアーゼのカスパーゼファミリーを活性化する、外因性および内因性経路によって誘導される。外因性アポトーシス経路は、デスレセプターの腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのリガンド刺激によって活性化される。デスレセプターシグナル伝達によるカスパーゼ-8の活性化により、プロカスパーゼ-3の切断がもたらされる(Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Stennicke et al., 1998)。カスパーゼ-8はまた、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバーであるBidを切断し、それによりミトコンドリアチトクロムcの細胞質への放出を刺激する(Li et al., 1998; Luo et al., 1998)。多様なBid非依存性ストレスシグナルによる内因性経路の活性化もまた、ミトコンドリアのチトクロムcの放出を伴う(Kluck et al., 1997; Liu et al., 1996; Yang et al., 1997)。細胞質内で、チトクロムcはApaf-1と共に複合体を形成し、カスパーゼ-9を活性化する(Li et al., 1997; Srinivasula et al., 1998)。カスパーゼ-8と同様に、カスパーゼ-9は直接カスパーゼ-3を活性化することができる(Li et al., 1997)。順々に、カスパーゼ-3は複数のタンパク質を切断し、このことは、切断により不活性化または活性化される場合にアポトーシスの誘導に寄与する。プロテインキナーゼCd(PKCd)は、触媒活性のある断片に切断される、ひとつのそのようなカスパーゼ-3基質であり、その発現はアポトーシスを誘導するのに十分である(Emoto et al., 1995)。多くの遺伝毒性のある抗癌薬は、内因性経路の活性化によってアポトーシスを誘導する(HerrおよびDebatin、2001; KroemerおよびReed、2000)。さらに、細胞傷害性のある抗癌剤に対する抵抗性は、多くの場合、内因性経路における欠陥と関連している(Bunz、2001; Datta et al., 1995)。
【０００４】
ヒトDF3/MUC1膜貫通型糖タンパク質は、正常の分泌上皮細胞の頂端部境界上に発現している(Kufe et al., 1984)。一方、上皮から癌腫への形質転換は、細胞膜全体にわたる、MUC1の著しい過剰発現を伴う(Kufe et al., 1984)。MUC1は、一つのMUC1ポリペプチドの切断に続いて安定な複合体を形成するN末端(N-ter)およびC末端(C-ter)サブユニットからなる、細胞表面ヘテロダイマーとして発現する(Ligtenberg et al., 1992)。＞250 kDaのN-ter外部ドメインは、O-結合型グリカンにより広範に修飾されている可変数の20アミノ酸タンデム反復を含む(Gendler et al., 1988; Siddiqui et al., 1998)。N-terを細胞表面に固定する〜20-25kDaのC末端は、58アミノ酸の細胞外領域、28アミノ酸の膜貫通ドメイン、および72アミノ酸の細胞質ドメイン(CD)からなる。MUC1-CDは、Y-46において、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、c-Src(Li et al., 2001; Li et al., 2001a)、およびLyn(Li et al., 2003)によりリン酸化される。MUC1-CDは、S-44においてグリコーゲン合成酵素キナーゼ3b(GSK3b)(Li et al., 1998b)により、およびT-41においてPKCd(Ren et al., 2002)によりリン酸化されることが、他の研究により示されている。Y-46およびT-41におけるリン酸化は、Wntエフェクターであるb-カテニンとのMUC1-CDの結合を誘導する(Li et al., 2001; Li et al., 2001a; Ren et al., 2002)。逆に、GSK3b媒介性のS-44リン酸化は、MUC1-CDとb-カテニンとの相互作用を減少させる(Li et al., 1998b)。これらの所見により、MUC1-CDが、EGFR経路およびWnt経路からのシグナルを統合して機能することが示された。
【０００５】
MUC1の過剰発現は、足場非依存的増殖ならびに齧歯類繊維芽細胞およびヒト上皮細胞の腫瘍形成能を付与する(Li et al., 2003c;Ren et al., 2002)。細胞膜における局在に加え、MUC1 C-terは核複合体中でb-カテニンと共に発現することが、他の研究により示された(Li et al., 2003a; Li et al., 2003b; Li et al., 2003c)。さらに、ErbB2-4を活性化するヘレグリン(HRG)による細胞の処理は、g-カテニンと複合して、MUC1 C-terの核小体への標的化を伴う(Li et al., 2003a)。これらの観察により、形質転換タンパク質としてのMUC1の機能は、遺伝子発現を制御することにより媒介され得ることが示された。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、デスレセプター誘導アポトーシスの対象となるMUC1発現細胞をMUC1アンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む、MUC1発現細胞においてデスレセプター誘導アポトーシスを増強する方法に関する。いくつかの態様において、MUC1発現細胞はMUC1発現癌細胞である。いくつかの態様において、デスレセプター誘導アポトーシスは、Fas誘導アポトーシスまたはTRAILレセプター誘導アポトーシスである。
【０００７】
いくつかの態様において、MUC1アンタゴニストは、アンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAポリヌクレオチドまたはMUC1リガンド捕捉分子、またはPDZドメインへのMUC1の結合の阻害剤である。
【０００８】
本発明の一つの局面において、本発明の方法の対象となるMUC1発現細胞は、MUC1発現細胞のデスレセプター誘導アポトーシス細胞死の誘導を含む治療の必要性のある患者の内部にある。
【０００９】
詳細な説明
I．デスレセプターリガンド誘導アポトーシスのMUC1ダウンレギュレーション
MUC1は、DNA損傷剤に対するアポトーシス反応を減弱させ、遺伝毒性のある抗癌剤に対して抵抗性を与える腫瘍性タンパク質である(2004年2月13日に出願された米国特許出願、KufeおよびOhno、「MUC1 Extracellular Domain and Cancer Treatment Compositions and Methods Derived Therefrom」、参照により本明細書に組み入れられる)。内因性アポトーシス経路の活性化阻止に加え、MUC1の発現はTRAIL誘導アポトーシスを減弱させる。従って、MUC1発現は、デスレセプターリガンド誘導アポトーシスもまたダウンレギュレーションする。MUC1アンタゴニストの有効量を用いたMUC1発現細胞の処理により、デスレセプターリガンド誘導アポトーシスのダウンレギュレーションを軽減するためのメカニズムが提供される。デスレセプター経路に付随するアポトーシスを刺激することが望ましいMUC1発現細胞の処理において、これは有益である。
【００１０】
II．内因性および外因性アポトーシスのメカニズム
哺乳動物細胞において、二つの主要なシグナル伝達経路がアポトーシスプログラムを開始させる。細胞-外因性経路は、それらのリガンドによるデスレセプターの会合に反応してアポトーシスを誘発する。細胞表面デスレセプターのリガンド誘導活性化により、死滅誘導シグナル伝達複合体(DISC)の迅速な構築ならびにアポトーシス開始プロテアーゼであるカスパーゼ-8およびカスパーゼ-10の活性化が導かれる。これらのカスパーゼは、カスパーゼ-3、-6、および-7を順に活性化するカスパーゼ-9を活性化する。外因性細胞経路は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘発するために、NKおよび傷害性Tリンパ球によって使用されるメカニズムである。
【００１１】
細胞内因性経路は、DNA損傷、欠損細胞周期、低酸素、生存因子の欠如、および細胞ストレスの他の型に反応してアポトーシスを誘発する。この経路は、ミトコンドリアに会合してチトクロムcおよびSMAC/DIABLOなどアポトーシス刺激性因子(apoptogenic factor)の細胞質への放出を引き起こす、BCL2遺伝子ファミリーのアポトーシス促進性アーム(arm)の活性化に関係している(Adams et al., 1998; Hunt & Evans、2001)。細胞質内において、チトクロムcはアダプターAPAF1と結合し、外因性経路の場合と同様に、カスパーゼ-3、-6、および-7を順に活性化するカスパーゼ-9を活性化するアポトソームを形成する。SMAC/DIBALOはアポトーシスタンパク質の阻害因子に結合し、これらの因子がカスパーゼ活性化を減弱するのを阻止することによって、アポトーシスを促進させる(Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000)。ほとんどの化学療法剤および照射は、細胞傷害誘因の間接的結果として、細胞-内因性経路を介した腫瘍細胞アポトーシスを誘発する。
【００１２】
二つのアポトーシス経路は相互連関している。頂端(apical)アポトーシス促進性BCL2ファミリーのメンバーであるBIDのカスパーゼ-8媒介性切断により、デスレセプターは内因性経路を活性化することができる(Li et al., 1998; Luo et al., 1998; Gross et al., 1999)。BIDは、ミトコンドリアチトクロムcおよびSMAC/DIABLOの放出を引き起こすアポトーシス促進性BCL2の類縁体である、BAXおよびBAKと相互作用し、カスパーゼ-9およびカスパーゼ-3を活性化する。これにより、内因性経路を介したアポトーシス誘導が増幅される。いくつかの細胞型においては、アポトーシスへのコミットメントは、内因性経路によるデスレセプターシグナルの増幅を必要とする(Scaffidi et al., 1999)。
【００１３】
III．デスリガンドおよびレセプター
腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのサブセットは、TNFレセプター(TNFR)ファミリーの適切なメンバーに結合した後に、細胞死シグナル伝達カスケードを開始するのに関わっており、後者は「デスレセプターファミリー」と呼ばれる。デスレセプターリガンドには、FasL(APO1LまたはCD95L)およびTNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAILまたはAPO2L)が含まれる。
【００１４】
TRAILは、様々な腫瘍細胞および形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導するが、たいていの正常細胞のアポトーシスを誘導せず、したがって癌治療のための有望な物質として強い関心を集めている(Wang & El-Deiry、2003)。TRAILは、免疫系の異なる細胞上に発現し、T-細胞およびナチュラルキラー細胞の両細胞-媒介性の腫瘍監視ならびに腫瘍転移抑制の抑制において、役割を担っている。二つのデスレセプターDR4(TRAIL-R1)およびDR5(TRAIL-R2)、ならびに二つのデコイレセプターDcR1(TRAIL-R3)およびDcR2(TRAIL-R4)の四つのTRAILレセプターが同定されている(Pan et al., 1997; Pan et al., 1997a; Walczak et al., 1997; Marsters et al., 1997)。ほとんどの他のTNFファミリーメンバーと同様に、TRAILは、サブユニットの二つの間の界面でそれぞれ三つのレセプター分子が結合するホモ三量体を形成する(Hymowits et al., 1999)。三量体リガンド内のシスチンによって結合した亜鉛原子は、三量体の安定性および最適な生物活性のために不可欠である(Bodmer et al., 2000)。インビボのマウスおよび霊長類モデルにおけるTRAILの投与により、全身毒性を伴わず腫瘍の退縮が誘導される(Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999)。TRAILはまた、p53の状態にかかわらず、様々な癌細胞株においてもアポトーシスを誘導する。いくつかのミスマッチ修復欠損腫瘍は、TRAIL誘導アポトーシスを回避し、異なるメカニズムを介してTRAIL抵抗性を獲得する。BAXは、恐らくSMAC/DIABLOの放出を可能にすることにより、特定の癌細胞株のTRAIL誘導アポトーシスに必要であり(Deng et al., 2002)、MMR欠損腫瘍におけるBaxの不活性化が、TRAILに対する抵抗性を引き起こし得ることが見出されている(Burns & El Deiry、2001; LeBlanc et al., 2002)。化学療法または放射線療法と組み合わせたTRAIL治療は、TRAIL感受性を増強するか、または下流のエフェクターを制御することによりTRAIL抵抗性を覆す(Wang & El-Deiry、2003)。ミトコンドリアのアポトーシス経路の増強は、TRAILに対する感受性を増大させる方法を提供する。
【００１５】
ヒトTRAILの多様な組換えバージョンが作成されている。一つのバージョンは、アミノ末端のポリヒスチジンタグに融合したTRAILのアミノ酸残基114-281を含む(Pitti et al., 1996)。別の変異体は、リガンドの三量体形成を促進する改変酵母Gal4ロイシンジッパーに、アミノ末端を介して融合させたアミノ酸95-281を含む(Walczak et al., 1999)。また別のバージョンは、アミノ末端の「Flag」タグに融合した残基95-281を含む。このタグ化タンパク質の抗Flag抗体を用いたクロスリンクは、Jurkat T白血病など特定の細胞株に対して、その活性を増強する(Bodmer et al., 2000)。いかなる外来配列も追加されていないヒトTRAILの残基114-261のさらに別の組換えバージョンが、臨床応用にとって現在最も好ましい型であり得る(Ashkenazi & Dixit、1999)。このバージョンは、ヒトの患者において、最も免疫原性が少なそうである。そのような可溶性組換えTRAILタンパク質は、大抵の正常細胞を殺さないが、多くの形質転換細胞を殺す分子の数少ない例の一つとなるため、癌治療にとって関心対象である(Ashkenazi & Dixit、1998)。
【００１６】
タンパク分解性に切断され生物活性三量体を形成することができるII型膜タンパク質であるFasLによって、Fas媒介アポトーシスは誘発される(Kayagaki et al., 1995; Mariani et al., 1995)。FasLが結合した後、Fasは二つの特異的タンパク質であるFas関連デスドメイン(FADD)およびカスパーゼ-8と会合し、死滅誘導シグナル複合体(DISC)を形成する(Kischkel、1995)。FasLは腫瘍に対する免疫性監視に重要だと考えられ、NK細胞および細胞傷害性T細胞は、Fas発現腫瘍細胞の標的を誘導するのにFasを用いることができる(Nagata、1997; French & Tschopp、1999)。しかしながら、Fas機能の喪失は、ヒト腫瘍の進行の間に頻繁に生じ、Fas遺伝子の転写ダウンレギュレーション、選択的スプライシングされた可溶性Fas型の選択的な産生、またはBCL2、BCL-xL、FAP-1、もしくはFLIPの結果としてのFasシグナル伝達の喪失を反映し得る(Jattela et al., 1995; Srinivasan et al., 1998a; Sato et al., 1995; Irmler et al., 1997; Kataoka et al., 1998)。多くのそのような腫瘍はまた、免疫特権を媒介し、かつFas陽性エフェクターTリンパ球のアポトーシスを介した末梢性寛容を誘導し得る恒常的なFasL発現を示すようである(Griffith et al., 1996; Bellgrau et al., 1995; Milik et al., 1997)。
【００１７】
抗Fas抗体、FasL発現細胞および組換え型Fasは、移植された固形腫瘍の増殖を減少させることが、マウスモデルにおけるインビボ実験により示された。残念ながら、これらの物質はマウス肝臓に重篤な傷害も引き起こす(Timmer et al., 2002)。しかしながら、抗腫瘍ワクチンおよびまた従来の化学療法剤の使用を伴う補助的療法として、内因性Fas誘導性アポトーシスの増強は有用であり得る。FasLは、DNA損傷性化学療法剤により誘導される、アポトーシスのオートクリン/パラクリン媒介物質として機能し得る(Poulaki et al., 2001)。
【００１８】
IV．MUC1アンタゴニスト
MUC1アンタゴニストは、MUC1の発現を低下させるか、またはMUC1の膜貫通シグナル伝達および/もしくは細胞内シグナル伝達を阻害する物質または化合物である。MUC1アンタゴニストは、以下の物質または化合物を含むがこれらに限定されない。
【００１９】
1．小分子
MUC1の発現をダウンレギュレーションする小分子には、イソクマリンNM-3(2-(8-ヒドロキシ-6-メトキシ-1-オキソ-1 H-2-ベンゾピラン-3-イル)プロピオン酸)が含まれる。MUC1/ECDの発現をダウンレギュレーションするのに適した、NM-3および他の3-イル-イソクマリンは、米国特許第6,020,363号に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。他の適した化合物には、2-メトキシエストラジオールおよび2-ヒドロキシエストラジオールなどの2-置換エストラジオール化合物が含まれる。これらの、および他の適したエストラジオール誘導体は、米国特許第6,239,123号に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。MUC1/ECD発現をダウンレギュレーションするのに適した他の化合物には、エラナ(oelanae)トリテルペノイド2-シアノ-3,12-ジオキソオレアン-1.9-ジエン-28-オイック(oic)(CDDO)、CDDOメチルエステル(CDDO-Me)、イミダゾール(imadzole)CDDO(CDDO-Im)および2-プロピル-イミダゾール(CDDP-Pr-Im)が含まれる。小分子によるMUC1のダウンレギュレーションの測定に関連する方法は、2003年5月29日にKufe et alにより出願された米国特許出願第10/447,839号において提供されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２０】
2．アンチセンスおよびsiRNA
MUC1の発現は、アンチセンスによって、またはsiRNAの使用によってダウンレギュレーションされ得る。適した化合物および方法は、2003年5月29日にKufe et alにより出願された米国特許出願第10/447,839号において開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２１】
3．抗体
MUC1膜貫通シグナル伝達は、MUC1/ECDに対する抗体の使用により阻害され得る。適した抗体の詳細は、2003年5月29日にKufe et alにより出願された米国特許出願第10/447,839号によって提供されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２２】
4．リガンド捕捉
野生型MUC1リガンドにはダームシジン(dermcidin)が含まれる。ダームシジン捕捉など野生型MUC1リガンド捕捉に関連する方法および組成物、ならびに野生型MUC1リガンド-MUC1相互作用を阻害する他の様式は、2003年11月12日にKharbanda et alにより出願された米国仮特許出願第60/519,822号において提供されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
5．PDZリガンド結合阻害剤
MUC1/CDはPDZ結合モチーフを含み、PDZリガンドとして作用し、かつそのような相互作用はMUC1/CDによる細胞内シグナル伝達を促進させる。MUC1-PDZ結合阻害剤に関連する組成物および方法は、2003年9月11日にJecminek et alにより出願された米国仮特許出願第60/502,111号によって提供されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２４】
実施例
実施例1．ミトコンドリアに局在するMUC1 C-ter
細胞培養
ヒトHCT116結腸癌細胞(ATCC, Manassas, VA)を、10%の熱失活させたウシ胎仔血清、100 ユニット/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを有する、ダルベッコ改変イーグル培地/F12中で培養した。細胞を、EGF(10 ng/ml;Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA)、HRG(20 ng/ml; Calbiochem-Novabiochem)、シスプラチン(CDDP; Sigma)、エトポシド(Sigma)、rhTNF-a(Promega, Madison, WI)、CHX(Sigma)、またはrhTRAIL(100 ng/ml;Calbiochem-Novabiochem)により処理した。
【００２５】
細胞のトランスフェクション
記載のように(Li et al., 2001a)、pIRES-puro2、pIRESpuro2-MUC1またはpIRES-puro2-MUC1(Y46F)を用いて、HCT116細胞をトランスフェクションした。SW480細胞を、pIRES-puro2またはpIRES-puro2-MUC1を用いてトランスフェクションした。安定トランスフェクタントを、0.4 mg/mlピューロマイシン(Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA)の存在下で選択した。各ベクターについて、二回の独立トランスフェクションを実施した。単独の細胞クローンを限外希釈により単離し、解析のために拡大させた。他の研究においては、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする配列の下流にMUC1 C-terをクローニングしたpEGFP-C1ベクター(Clontech)を用いて、HCT116細胞を一過性にトランスフェクションした。
【００２６】
免疫ブロット解析
記載のように(Li et al., 2001a)、サブコンフルエントの細胞から溶解産物を調製した。タンパク質の等量をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。抗MUC1 N-ter(DF3)(Kufe et al., 1984)、抗MUC1 C-ter(Ab5; Neomarkers, Fremont, CA)、抗MUC1 C-ter(ウサギポリクローナルDF3E)(Li et al., 2001)、抗MUC1 C-ter(ヒトモノクローナルECD1)、抗b-actin(Sigma)、抗HSP60(Stressgen Biotechnologies; Victoria, BC, Canada)、抗PCNA(Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA)、抗IkBa(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、抗カルレティキュリン(Stressgen Biotechnologies, Victoria, BC, Canada)、抗PDGFR(Santa Cruz Biotechnology)、抗チトクロムc(BD PharMingen, San Diego, CA)、抗カスパーゼ-3(BD PharMingen)、抗PKCd(Santa Cruz Biotechnology)、抗Smac/DIABLO(Medical & Biological Laboratories, Ltd, Japan)、または抗AIP(Santa Cruz Biotechnology)を用いて、免疫ブロットをプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体および増強化学発光(ECL, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)を用いて、免疫複合体を検出した。シグナルの強度を、デンシトメトリー走査によって検出した。
【００２７】
フローサイトメトリー
細胞を、抗MUC1 N-terまたは対照マウスIgGと共に4℃で1時間インキュベーションし、洗浄し、ヤギ抗マウスIgフルオレセイン結合抗体(Jackson Immunoresearch laboratories, West Grove, PA)と共にインキュベーションし、その後2%ホルムアルデヒト/PBS中で固定した。反応性を、FACScanにより検出した。
【００２８】
共焦点顕微鏡観察
カバースリップ上で培養した細胞を、100 nM MitoTracker Red CMXRos (Molecuar Probes, Eugene, OR)を含むダルベッコ改変イーグル/F12培地中で、37℃で20分間培養した。染色後、細胞を新鮮な増殖培地で洗浄し、3.7%ホルムアルデヒド/増殖培地中、37℃で15分間前固定し、PBSで洗浄し、0.2%Triton X-100を含むPBS中、25℃で5分間透過化処理し、PBSで洗浄し、その後3.7%ホルムアルデヒド/PBS中、25℃で5分間後固定した。PBSを用いて数回洗浄後、10%ヤギ血清を用いて25℃で1時間、細胞をブロッキングし、抗MUC1 C-ter抗体を用いて25℃で1.5時間染色し、PBSで洗浄し、FITC結合二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)と共に25℃で40分間インキュベーションし、PBSで洗浄し、2 mM TO-PRO3(Molecuar Probes)と共に25℃で10分間インキュベーションした。カバースリップを封入後、LSM510共焦点顕微鏡(ZEISS)を用いて、1024x1024ピクセル解像度にて画像を捕らえた。FITC、MitoTracker Red、およびTO-PRO3のための励起波長は、それぞれ488 nm、543 nm、および633 nmであった。505-nmから530-nmのバンドパスフィルターを通して、フルオレセイン蛍光を捕らえた。560-nmから615-nmのバンドパスフフィルターを通して、MitoTracker Red CMXRos 蛍光を収集した。650-nmロングパスフィルターを通してTO-PRO3染色を可視化した。
【００２９】
細胞下分画
精製したミトコンドリア溶解産物および細胞質溶解産物を、記載のように(Kumar et al., 2003)調製した。記載のように(Kharbanda et al., 1996)、核およびミトコンドリアの沈降後、上清から細胞膜を精製した。
【００３０】
結果
空ベクター、MUC1、またはMUC1(Y46F)変異体を安定に発現させるように、MUC1-陰性HCT116細胞をトランスフェクションした。それぞれの二つのクローン(AおよびB)を別個のトランスフェクションから選択した。抗MUC1抗体を用いた免疫ブロット解析により、ベクタートランスフェクタント中には、MUC1-N-terまたはC-terサブユニットの発現を検出できないことが示された。対して、MUC1またはMUC1(Y46F)を用いてトランスフェクションした細胞において、MUC1 N-ter発現は類似していた。類似のレベルのMUC1 C-terもまた、MUC1およびMUC1(Y46F)トランスフェクタント中に見出された。MUC1が細胞膜において発現しているかどうかを評価するため、抗MUC1 N-ter抗体を用いたフローサイトメトリーによりトランスフェクタントを解析した。HCT116/ベクター細胞と比較して、MUC1またはMUC1(Y46F)を発現するHCT116細胞の表面上で、MUC1は検出可能であった。MUC1の分布をさらに限定するため、MUC1 N-terおよびC-terに対する抗体を用いて共焦点顕微鏡観察を実行した。両方のサブユニットがMUC1トランスフェクタントの細胞膜において検出可能であった。しかしながら、予想に反して、MUC1 C-terはミトコンドリア局在を示唆するパターンでも発現していたが、N-terはそうではなかった。実際に、MUC1 C-terとMitoTrackerの共局在が、MUC1 C-terのミトコンドリアへの標的化を支持した。対して、MUC1(Y46F)C-terのミトコンドリア局在は実質上少なかった。単一のHCT116/MUC1細胞内において、画像をより高倍率かつ高度に焦点合わせすることにより、MUC1 C-terの明らかな細胞膜局在およびミトコンドリアネットワーク全範囲にわたるMitoTrackerとの共局在が示された。とりわけ、細胞膜におけるMUC1 C-terの検出は、ミトコンドリアの共焦点顕微鏡観察に焦点を合わせた場合には明らかでない。これらの所見を確認するために、トランスフェクタントからのミトコンドリア溶解産物を、抗MUC1 C-terを用いた免疫ブロット解析に供した。C-terはHCT116/MUC1からのミトコンドリア分画中に検出可能であるが、HCT116/ベクター細胞からは検出されないことが結果により示されている(図1)。さらに、共焦点データと合致して、MUC1(Y46F)C-terにおけるミトコンドリア局在は、MUC1 C-terに関して見出されるよりも相当少なかった(図1)。ミトコンドリア溶解産物の等量添加は、ミトコンドリアHSP60タンパク質についての免疫ブロットにより確認された。ミトコンドリア分画が細胞膜で汚染されていないことは、N-terの非存在により示された。細胞質IκBα、核PCNA、および小胞体関連カルレティキュリンタンパク質に対する抗体を用いたミトコンドリア溶解産物の免疫ブロット解析により、ミトコンドリアがこれらの細胞下分画でほとんど汚染されていないことがさらに示された。
【００３１】
細胞膜におけるMUC1 C-ter発現と、ミトコンドリアにおける発現を比較するため、これらの分画由来の溶解産物を細胞外ドメイン(ECD)および細胞質ドメイン(CD)に対して向けられた抗体を用いた免疫ブロット解析に供した。MUC1 CDのC末端17アミノ酸に反応するAb5抗体を用いて得られた結果は、細胞膜において、およびミトコンドリア内において発現するMUC1 C-terに関して同様のパターンを示した。Ab5との反応性は主に20-25kDaにおいて観察された。反応性バンドは約17kDaおよび15kDaにおいても観察された。参照により本明細書に組み入れられる、2003年5月29日に出願されたKufe et alによる米国特許出願第10/447,839号に記載のとおり、VETQFNYKTEAASモチーフに対して作成されたDF3抗体を用いた免疫ブロットは、細胞膜およびミトコンドリア両方由来の溶解産物に活性を示した。とりわけ、20-25kDa MUC1 C-terおよび17kDa断片のみとのDF3E抗体の反応性は、Ab5を用いて検出された15kDa断片がDF3Eエピトープを含まないことを示した。ECD1と命名されたもうひとつの抗MUC1 ECD抗体は、細胞膜およびミトコンドリアの両方において、主に20-25kDa MUC1 C-terと反応した。これらの結果により、17kDa断片および15kDa断片がECD内部における切断を表していることが示唆された。対照として、MUC1 N-ter発現は細胞膜分画中にのみ検出可能であり、HSP60発現はミトコンドリア分画に限定されていた。さらに、IkBa、PCNA、またはカルレティキュリンによるミトコンドリア分画の汚染は検出されなかった。
【００３２】
これらの所見を伸展させるため、N末端におけるGFPタグと共にMUC1 C-terを発現させ、ミトコンドリア局在を評価した。抗GFPおよび抗MUC1 C-terを用いたミトコンドリア溶解産物の免疫ブロット解析により、GFP-タグMUC1 C-ter融合タンパク質のミトコンドリア標的化が確認された。対照として、血小板由来増殖因子レセプター(PDGFR)およびHSP60の発現は、それぞれ細胞膜およびミトコンドリア分画に限定されていた。共焦点研究の結果もまた、GFP-MUC1 C-terのMitoTrackerとの共局在を示している。HCT116細胞のトランスフェクション効率は、これらの実験状件下では〜25%である(Ren et al., 2002)。対照として、GFPのみ発現する場合には、ミトコンドリア局在の顕著なパターンは明らかでなかった。これらの所見を合わせると、MUC1 C-terがミトコンドリアに局在することを示している。MUC1 C-terは、EGFで刺激された細胞内においてはβ-カテニンと共に核に標的化される(Li et al., 2001a; Li et al., 2003a)。EGFによるHCT116/MUC1細胞またはHCT116/MUC1(Y46F)細胞の刺激は、しかしながら、MUC1 C-terのミトコンドリア標的化にはほとんど影響しなかった。EGFとは対照的に、HRGは、上皮細胞のストレスに対する反応においてErbB2を活性化し(Vermeer et al., 2003)、MUC1 C-terを核小体に標的化する(Li et al., 2003)。有意に、0.5時間のHRG処理は、MUC1 C-terのミトコンドリアへの局在を2.3倍増大し、この反応は3時間持続した(図2)。さらに、HRGは、MUC1(Y46F)C-terのミトコンドリア局在にほとんど影響しなかった(図2)。3回の別個の実験において同様の結果が得られた。加えて、対照細胞またはHRG刺激細胞由来のミトコンドリア分画中に、検出可能なβ-カテニンまたはγ-カテニンは認められなかった。MUC1のミトコンドリアへの標的化が少なくとも一部はHRG誘導シグナル伝達により制御されており、Y46F変異がこの反応を減弱させることを、これらの所見は示している。
【００３３】
実施例2．チトクロムc放出およびカスパーゼ-3活性化を減弱させるMUC1
方法
実験手順および方法は実施例1に記載のとおりであった。
【００３４】
結果
DNA損傷剤による細胞の処理は、ミトコンドリアチトクロムcの放出および内因性アポトーシス経路の活性化を伴う。MUC1 C-terのミトコンドリア局在が、チトクロムc放出に影響を与えるかどうかを決定するために、HCT116トランスフェクタントをシスプラチン(CDDP)で処理した。HCT116/ベクター細胞のCDDPによる処理は、細胞質チトクロムcのレベル増大を伴った。とりわけ、MUC1の発現はチトクロムcの放出を有意に減弱させた。対して、MUC1(Y46F)の発現は、CDDP誘導チトクロムc放出の阻止に関して無効であった。他の別個に単離したBクローンにおいて、同様の結果が得られた。遺伝毒性ストレスに反応したチトクロムcの放出は、カスパーゼ-3の活性化およびPKCδの切断を伴う(Emoto et al., 1995)。カスパーゼ-3活性化に対するMUC1の影響を評価するため、プロカスパーゼ-3の切断に関して、CDDP処理した細胞を解析した。HCT116/ベクター細胞と比較して、MUC1はカスパーゼ-3のCDDP誘導活性化を減弱させることが、結果により示されている。CDDP処理したHCT116/MUC1(Y46F)細胞におけるプロカスパーゼ-3の切断は、HCT116/ベクター細胞におけるそれと同様であった。これらの結果を合わせると、HCT116/ベクター細胞およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞と比較して、CDDP処理したHCT116/MUC1細胞においてPKCδのカスパーゼ-3媒介切断は減弱した。Smac/DIABLOは、アポトーシスタンパク質の阻害剤(IAPs)と相互作用し、それらのカスパーゼ阻害活性を阻止することによりカスパーゼ依存性細胞死を誘導するミトコンドリアタンパク質である(Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000)。MUC1がSmac/DIABLOの放出を減弱するかどうか決定するため、HCT116/ベクター細胞、HCT116/MUC1細胞、およびHCT116/MUC(Y46F)細胞を、24、48、および72時間CDDPで処理し、細胞質溶解産物を免疫ブロット解析に供した。チトクロムcと同様、Smac/DIABLOの放出はHCT116/ベクター細胞およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞と比較して、HCT116/MUC1において減弱することが結果により示されている。加えて、MUC1は、ミトコンドリアのカスパーゼ非依存性デスエフェクターであるアポトーシス誘導因子(AIF)の放出を、ベクターまたはMUC1(Y46F)を発現する細胞における場合と比較して減弱させた(Susin et al., 1999)。72時間のHCT116/ベクター細胞およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞のCDDP処理は、＞90％の細胞死および負荷に対する対照として使用したβ-アクチンシグナルの減少を伴った。対して、CDDPによる72時間のHCT116/MUC1細胞の処理は、細胞増殖の休止および＜30%の細胞死を伴った。これらの所見は、MUC1 C-terのミトコンドリア局在が、DNA損傷誘導性の内因性アポトーシス経路の活性化を減弱させることを示している。
【００３５】
実施例3．DNA損傷-およびTRAIL-誘導アポトーシスを阻止するMUC1
方法
サブG1 DNAおよびTUNEL染色の解析によりアポトーシス細胞を定量化した。サブG1 DNA含量を評価するため、細胞を回収し、PBSで洗浄し、80%エタノールで固定し、20 ng/ml RNase(Rosch)を含むPBS中、37℃で60分間、インキュベーションした。その後、40 mg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma)を用いて、暗所内、室温で30分間、細胞を染色した。DNA含量をフローサイトメトリー(EPICS XL-MCL, Coulter Corp.)により解析した。DNA断片化を伴うアポトーシス細胞を、インサイチュー細胞死検出キット(TUNEL; Roche Applied Science)を用いた染色により検出し、共焦点顕微鏡(ZEISS LSM510)により可視化した。染色後、フローサイトメトリーにより細胞を解析した。他の実験手順および方法は、実施例1に記載のとおりであった。
【００３６】
結果
MUC1がCDDPによるアポトーシス誘導に影響を与えるかどうかを判定するため、サブG1 DNA含量について細胞を解析した。CDDPによる24時間のHCT116/ベクター細胞の処理は、約40%のアポトーシスを伴った(図3)。有意に、CDDP誘導アポトーシスはHCT116/MUC1細胞において減弱したが、HCT116/MUC1(Y46F)細胞においては減弱しなかった(図3)。サブG1 DNA含量を伴う細胞によって判定されたように、MUC1によるアポトーシスの減弱は、別の方法としてTUNEL染色を用いた場合に確認された。加えて、別個に単離したHCT116細胞クローンを用いた複数回の実験において、同様の結果が得られた(図4)。野生型MUC1の発現は、遺伝毒性物質であるエトポシドにより誘導されるアポトーシスも阻止したが、MUC1(Y46F)変異体では阻止しなかった(図5)。TNF-αまたはTNF関連アポトーシス誘導因子TRAILによる細胞表面デスレセプターの刺激は、外因性アポトーシス経路の活性化を伴う。MUC1がデスレセプター誘導アポトーシスに影響を与えるかどうかを判定するため、HCT116細胞をTNF-αで処理した。以前の研究(Tsuchida et al., 1995)と合致して、TNF-α単独ではHCT116/ベクター細胞のアポトーシスを誘導できなかった。しかしながら、シクロヘキシミド(CHX)存在下でのTNF-αによる処理は、HCT116/ベクター細胞のアポトーシス誘導を伴った(図6)。HCT116/MUC1細胞およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞をTNF-αおよびCHXにより処理した場合に同様の結果が得られ(図6)、これはTNF-α+CHX誘導アポトーシスに対してMUC1が影響しないことを示している。対して、HCT116/ベクター細胞のアポトーシスをCHXを添加せずに誘導する際にTRAILは有効であり、重要なことに、MUC1はこの反応を減弱させたが、MUC1(Y46F)は減弱させなかった(図7)。さらに、HCT116/MUC1細胞をTRAIL+CHXで処理した場合、MUC1はTRAIL誘導アポトーシスを減弱するのに無効であった(図7)。CHXがMUC1 C-terの発現に明確な影響がなかったことに留意されたい。これらの所見は、i)MUC1のミトコンドリア局在が、内因性経路の活性化により誘導されるアポトーシスを減弱させること、およびii)短命タンパク質により媒介され得るメカニズムにより、MUC1がTRAIL誘導アポトーシスを減弱させることを示している。
【００３７】
参考文献
2007523214.tif 000003
2007523214.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３８】
次の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれる。本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の一つまたは複数を参照することにより、本発明はより良く理解され得る。
【図１】HCT116/ベクター-A細胞、HCT116/MUC1-A細胞、およびHCT116/MUC1(Y46F)-A細胞由来のミトコンドリア分画のSDS-PAGEおよび表示の抗体を用いた免疫ブロッティングの説明図を示す。
【図２】へレグリン(HRG)により表示時間処理されたHCT116/MUC1-A細胞およびHCT116/MUC1(Y46F)-A細胞由来のミトコンドリア分画のSDS-PAGEおよび表示の抗体を用いた免疫ブロッティングの説明図を示す。
【図３】100μM CDDPで24 hrインキュベート後、サブ-G1 DNAについて解析した、HCT116/ベクター-A細胞、HCT116/MUC1-A細胞、およびHCT116/MUC1(Y46F)-A細胞における、シスプラチン(CDDP)誘導アポトーシスの概要を示す。
【図４】100μM CDDPで24 hr処理された(黒棒)または未処理(白棒)の場合のHCT116/ベクター細胞、HCT116/MUC1細胞、およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞のAクローンおよびBクローン両方において誘導されたアポトーシスの概要を示す。結果は、サブ-G1 DNAの解析により決定されたように、アポトーシスの百分率(三回の独立した実験の平均値±SD)として示されている。
【図５】70μM エトプシドで48 hr処理された(黒棒)または未処理(白棒)の場合のHCT116/ベクター細胞、HCT116/MUC1細胞、およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞のAクローンおよびBクローン両方において誘導されたアポトーシスの概要を示す。結果は、サブ-G1 DNAの解析により決定されたように、アポトーシスの百分率(三回の独立した実験の平均値±SD)として示されている。
【図６】20 ng/ml TNF-αおよび10 ng/mlシクロヘキシミド(CXH)で12 hr処理された(黒棒)または未処理(白棒)の場合のHCT116/ベクター細胞、HCT116/MUC1細胞、およびHCT116/MUC1(Y46F)細胞のAクローンおよびBクローン両方において誘導されたアポトーシスの概要を示す。結果は、サブ-G1 DNAの解析により決定されたように、アポトーシスの百分率(三回の独立した実験の平均値±SD)として示されている。
【図７】100 ng/ml TRAILで14 hr処理された(黒棒)または未処理(白棒)の場合のHCT116/ベクター-A細胞、HCT116/MUC1-A細胞、およびHCT116/MUC1(Y46F)-A細胞において誘導されたアポトーシスの概要を左パネル内に示す。表記のとおり100 ng/ml TRAILおよび/または10μM CXHで14 hr処理された場合のHCT116/MUC1(Y46F)-A細胞において誘導されたアポトーシスの概要を右パネル内に示す。結果は、サブ-G1 DNAの解析により決定されたように、アポトーシスの百分率(三回の独立した実験の平均値±SD)として示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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