(57)【要約】望ましい剤を生物学的ターゲットに送達するためのビヒクルを含有する、ターゲティングされた組成物と同時に、デコイ不活性キャリアー組成物を投与する。この同時投与によって、対象における望ましい位置への、ターゲティングされた組成物の送達が増強される。2007523090.tif 000005
2007523090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるターゲット部位に、望ましい剤を選択的に送達する方法であって、以下を実質的に同時に該対象に投与する工程を含む、方法：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイト(cognate)に特異的に結合するリガンドに結合され、かつ該ビヒクルが、送達しようとする剤を含むか、または該ビヒクル自体が該剤である、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠き、かつ任意で該剤を欠く、微粒子ビヒクルを含む、不活性キャリアー；
ここで、(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の組成物中のビヒクルに対する比は、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である。
【請求項２】
キャリアー(2)中のビヒクルの、(1)の組成物中のビヒクルに対する比が、少なくとも1：1である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
キャリアー(2)中のビヒクルの、(1)の組成物中のビヒクルに対する比が、少なくとも100：1である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ビヒクルが、リポソーム、ミセル、ガスおよび/またはガス前駆体を含有する気泡、リポタンパク質、ハロカーボンおよび/または炭化水素ナノ粒子、ハロカーボンおよび/または炭化水素エマルジョン小滴、中空および/または多孔粒子および/または固体ナノ粒子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
(2)のキャリアー中のビヒクルおよび(1)の組成物中のビヒクルが、同一組成である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
(2)のキャリアー中のビヒクルおよび(1)の組成物中のビヒクルが、同一組成ではない、請求項1記載の方法。
【請求項７】
(2)のキャリアーもしくは(1)の組成物のいずれか、または両方が、同一組成でないビヒクルで構成される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つの剤が、超音波用造影剤；磁気共鳴画像化(MRI)剤；放射性核種；治療剤；およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
コグネイトに結合するリガンドが、抗体もしくはその断片であるか、またはペプチド模倣体である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
部分がαvβ3をターゲットとする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
以下を含む、製剤：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイトに特異的に結合するリガンドに結合され、かつ該ビヒクルが、該ターゲット部位に送達しようとする剤を含むか、該ビヒクル自体が該剤である、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠き、かつ任意で該剤を欠く、微粒子ビヒクルを含む、不活性キャリアー。
【請求項１２】
(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の組成物中のビヒクルに対する比が、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である、請求項11記載の製剤。
【請求項１３】
(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の組成物中のビヒクルに対する比が、少なくとも1：1である、請求項11記載の製剤。
【請求項１４】
(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の組成物中のビヒクルに対する比が、少なくとも100：1である、請求項11記載の製剤。
【請求項１５】
ビヒクルが、リポソーム、ミセル、ガスおよび/またはガス前駆体を含有する気泡、リポタンパク質、ハロカーボンおよび/または炭化水素ナノ粒子、ハロカーボンおよび/または炭化水素エマルジョン小滴、中空および/または多孔粒子および/または固体ナノ粒子を含む、請求項11記載の製剤。
【請求項１６】
(2)のキャリアー中のビヒクルおよび(1)の組成物中のビヒクルが、同一組成である、請求項11記載の製剤。
【請求項１７】
(2)のキャリアー中のビヒクルおよび(1)の組成物中のビヒクルが、同一組成ではない、請求項11記載の製剤。
【請求項１８】
(2)のキャリアーもしくは(1)の組成物のいずれか、または両方が、同一組成でないビヒクルで構成される、請求項11記載の製剤。
【請求項１９】
少なくとも1つの剤が、超音波用造影剤；磁気共鳴画像化(MRI)剤；放射性核種；治療剤；およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項11記載の製剤。
【請求項２０】
コグネイトに結合する部分が、抗体もしくはその断片であるか、またはペプチド模倣体である、請求項11記載の製剤。
【請求項２１】
部分がαvβ3をターゲットとする、請求項20記載の製剤。
【請求項２２】
対象において超音波画像を得る工程を含む、ターゲティング可能な部位の超音波画像を得るための方法であって、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である、(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の活性組成物中のビヒクルに対する比で、以下を実質的に同時に該対象に投与しておく方法：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイトに特異的に結合するリガンドに結合され、かつ超音波造影剤を含む、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠くビヒクルを含む、不活性キャリアー。
【請求項２３】
活性組成物中のビヒクルが、ペルフルオロカーボン・ナノ粒子であり、かつ不活性キャリアー中のビヒクルが油小滴である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
対象におけるターゲット部位のプロトン磁気共鳴画像を得るための方法であって、以下を実質的に同時に投与しておいた対象においてターゲットから該画像を得る工程を含む方法：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイトに特異的に結合するリガンドに結合され、かつ重金属イオンを含有するキレート剤を含む、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠き、かつ任意で該重金属イオンを欠く、ビヒクルを含む、不活性キャリアー；
ここで、(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の活性組成物中のビヒクルに対する比は、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である。
【請求項２５】
キレート剤がDOTAを含み、かつ結合部分がαvβ3に結合する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
対象において光学画像を得る工程を含む、ターゲット部位の光学画像を得るための方法であって、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である、(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の活性組成物中のビヒクルに対する比で、以下を実質的に同時に該対象に投与しておく方法：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイトに特異的に結合するリガンドに結合され、かつ可視標識を含む、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠くビヒクルを含む、不活性キャリアー。
【請求項２７】
可視標識が蛍光であり、かつ不活性キャリアーが該標識を欠く、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
対象においてX線画像を得る工程を含む、ターゲットのX線画像を得るための方法であって、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である、(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の活性組成物中のビヒクルに対する比で、以下を実質的に同時に該対象に投与しておく方法：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイトに特異的に結合するリガンドに結合され、かつ少なくとも1つのX線不透過リガンドを含む、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠くビヒクルを含む、不活性キャリアー。
【請求項２９】
不活性キャリアー中のビヒクルが不透過部分を欠く、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
対象において磁気共鳴画像を得る工程を含む、ターゲットの19F磁気共鳴画像を得るための方法であって、ターゲット部位と活性組成物の会合を増強するのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な投与量を低下させるのに十分である、(2)のキャリアー中のビヒクルの、(1)の活性組成物中のビヒクルに対する比で、以下を実質的に同時に該対象に投与しておく方法：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でそのコグネイトに特異的に結合するリガンドに結合され、かつ19Fを含む、活性組成物；および
(2)該結合性リガンドを欠くビヒクルを含む、不活性キャリアー。
【請求項３１】
活性組成物中のビヒクルが、ペルフルオロカーボン・ナノ粒子であり、かつ不活性キャリアー中のビヒクルが油小滴である、請求項30記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、超音波、X線、放射性画像化、MRI、および/または治療的使用のため、ターゲティングされた剤を送達する方法に関する。特に、本発明は、「デコイ」送達ビヒクルの同時投与によって活性粒子の総投与量を減少させる一方、ターゲティングされた剤の有効性を改善するかまたは維持する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2004年2月10日に出願された米国仮出願第60/543,761号の恩典を主張する。本書類の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
連邦政府が出資した研究下で生じる本発明に対する権利の記述
本発明は、部分的に米国政府の援助で行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
対象における望ましい位置への診断剤および治療剤のターゲティングを成功させ、かつ特異的なものにするのは、困難であった。ターゲティング抱合体が非微粒子である場合、この問題に対する解決策には、クリアランス化剤(clearing agent)の使用が関与した。ターゲット部位に送達しようとする剤のサイズが小さいために腎臓で迅速にクリアランスされる場合の1つのアプローチが、米国特許第4,863,713号に記載される。この例では、送達しようとする剤に抱合体化された結合性リガンドのコグネイトを、ターゲット部位にまず提供し、かつ時間と共にコグネイトがターゲット部位に局在することを可能にする。次いで、循環中の結合性タンパク質と反応して、肝臓および脾臓によって主に操作される細網内皮系(RES)により迅速にクリアランスされ得る凝集体を形成する、クリアランス化剤を投与することによって、循環中の過剰なコグネイトを除去する。次いで、ターゲティング・リガンドおよび送達しようとする剤を含む小分子を投与し、かつ投与された未結合抱合体は、腎臓によって迅速にクリアランスされる一方、ターゲット部位に存在するコグネイトは、そのいくつかを捕捉する。このアプローチで有用な特定の構成要素が、米国特許第5,616,690号に記載される。これは、完全に成功することもまたしないこともあり得る。対象における特定の組織または位置にターゲティングしようとする物質が、細網内皮系(RES)によってクリアランスされるのに十分なサイズである場合には問題が残る。
【０００５】
RES、特に肝臓および脾臓による、粒子(ナノからマイクロ・スケール)の全身クリアランスは、部位特異的、すなわちターゲティングされた造影剤および/または治療剤の有効性を最小限にしてきた。典型的には、全身投与されたこれらの剤の総用量の3分の1またはそれ以上が、治療的有用性を伴わず、かつ不都合な臨床的続発症の可能性を伴い、肝臓および脾臓によってクリアランスされる。これらのRES臓器による微粒子剤の迅速なクリアランスを遅延させるため、多くの試みがなされてきているが、最も際立っているのは、ポリエチレングリコール表面コーティングの利用であり、これによって、多くの微粒子系の循環半減期が延長される。これらの剤は、しばしば、「ステルシー(stealthy)」と称される。
【０００６】
他のアプローチには、微粒子をクリアランスするRESの能力を、非標識キャリアーまたは他の関連物質で飽和させ、その後、活性造影剤および/または治療剤を投与する、2段階の試みが含まれた。例えば、腫瘍を放射性核種で標識する試みでは、腫瘍関連抗原に結合する抗体または断片に、放射性核種を結合しておく。しかしながら、大量の用量を回避するため、対象にまず、非標識抗体を投与しておき、これが次いで、おそらく、肝臓および脾臓を飽和させ、標識抗体がRESによって希釈されることなく、ターゲット領域に進行するのを可能にする。この方法は、微粒子送達系、特に、非常に長い半減期を有する比較的小さい粒子、すなわち100〜200nmの桁の粒子の場合にも適用されてきている。この戦略には深刻な欠点がある。非標識抗体、断片またはペプチドは、典型的には天然のクリアランス機構を飽和させることができず、かつ画像化有効性および/または治療的有効性に寄与することなく、ターゲット部位に関して競合し、かつターゲット部位を遮断し得る。
【０００７】
不快感、吐き気または嘔吐を含む、肝臓または脾臓のうっ滞と関連する症状を誘導せずに、RESは容易に飽和されないようである。したがって、臨床的副作用を伴う、潜在的な有効性減少は、先のアプローチの失敗によるものであるようである。本発明は、確率に基づくアプローチを使用することによって、すなわち類似の物理的特性のターゲティングされない剤とターゲティングされた剤を、同時投与、すなわち同時に投与して、ターゲティングされた複合体によってRES系を回避するのを促進し、望ましい部位での改善された取り込みを提供することによって、この問題を解決する。ターゲットとされる部位での有効性に必要な剤の投与量は、RES系にクリアランスされる量と比較して少量であるため、デコイの使用によって、しばしば、そうでなければRESでの損失を補償するのに必要であろう用量より、活性剤の総用量を低下させることが可能になる。これは、患者の活性剤(すなわち、薬剤、金属、送達ビヒクル構成要素など)へのより低い曝露に直接変換され、かつ投薬あたりの剤のコストが低下する(すなわち投与量が少なくなれば、コストも下がる)。そうでなければ高価な剤を臨床医学において実現性のあるものにするため、ターゲティングされる剤のコストを低下させ、かつその有効性を改善することが必要である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の開示
本発明は、望ましいターゲットに、減少した投与量で、造影剤または標識剤または治療剤を供給し、かつ改善された安全性および健康上の利点を伴って、同等に増強された有効性を生じるための方法における改善に向けられる。該方法は、望ましいターゲットに特異的なターゲティング剤または相補的リガンドにそれ自体結合したナノ微粒子キャリアーに結合した、造影剤もしくは画像生成剤および/または治療剤を、ターゲティングされない過剰なキャリアーの存在下で、同時に投与する工程を含む。望ましい剤のためのキャリアーは、RESを浸す希釈剤として用いる「デコイ」キャリアーと同一である必要はないが、デコイは、標識されターゲティングされたキャリアーの振る舞いを模倣しなければならない。
【０００９】
造影剤および/または治療剤の効力が増加するにつれて、過剰なデコイ剤の、ターゲティングされた剤に対する比が増加し得る。したがって、例えば、シグナル感度を提供する核剤を、非常に過剰なデコイとともに投与することも可能であり、一方、剤の単位あたり、より少ない検出可能なシグナルを提供するMRI剤またはCT剤の製剤を、適度な量のみ、例えば活性組成物量の2〜10倍のデコイとともに投与し得る。同様に、非常に高い効力の治療剤を、デコイの活性剤に対する非常に高い比でデコイと混合し、かつ治療を維持し得る。簡潔には、造影剤および/または治療剤の効力が増加するにつれて、最大の効果のために、剤でターゲットを飽和させる必要性が下がり、かつ逆に、より弱い剤は、適切な有効性を確実にするため、より高い投与量で提供しなければならない。
【００１０】
したがって、1つの局面において、本発明は、対象におけるターゲット位置に、造影剤、標識剤および/または治療剤を提供する方法であって、以下を実質的に同時に該対象に投与する工程を含む方法に向けられる：
(1)ターゲティングされた微粒子ビヒクルの活性組成物であって、該ビヒクルが、ターゲット部位でコグネイトに特異的に結合する結合部分に結合され、かつ任意で、治療剤および/または造影剤もしくはシグナル生成剤である標識構成要素を含む、活性組成物；および
(2)該特異的結合部分を欠き、かつ任意で該標識構成要素および/または治療剤を欠く、デコイ微粒子ビヒクルを含む、組成物；
ここで、(2)のビヒクルの、(1)のビヒクルに対する比は、望ましい部位でターゲティングされたビヒクルの濃度を増加させるのに十分であり、および/またはターゲティングされたビヒクルの必要な有効投与量を低下させるのに十分である。
【００１１】
さらに別の側面において、本発明は、デコイ：ターゲティング剤を含むターゲティングされたビヒクルの望ましい比で、上記の項目(1)および(2)のターゲティングされたビヒクルおよびデコイ・ビヒクルの混合物を含有する、組成物に向けられる。
【００１２】
発明を実施する形態
本発明は、望ましい位置にターゲティングされたビヒクルの存在下で供給された場合、細網内皮系(RES)による取り込みに関して、ターゲティングされたビヒクルと競合する、非常に過剰なターゲティングされない「キャリアー」または「デコイ」ビヒクルの存在に依る。
【００１３】
RESは、通過ごとに、系から一定の量の粒子を取り除くことができ、かつデコイは、ターゲティングされた粒子を取り除くのに有効なその能力を100％妨ぐ。RESに供される粒子の半減期は、用量依存性であり、すなわち、粒子の循環半減期は、投与量が増加するにつれて増加する。より高い投与量ではクリアランスがより遅いことを用いて、総粒子の高い投与量を維持しつつ、ターゲティングされたものの数を減少させることによって、本発明の方法において、利益を得る。したがって、より高い投与量により、すべての粒子の半減期が増加すると、ターゲティングされた粒子のため有益である。所定の用量の二重指数関数モデルおよびβ脱離速度へ焦点を置くことを用いて、この振る舞いをモデリングすることが可能である。
【００１４】
本発明は、ターゲティングされたビヒクルの未成熟なRESクリアランスを減少させるための、ターゲティングされていない「キャリアー」または「デコイ」ビヒクルの同時投与に依る。ターゲティングされたビヒクルの効力に応じて、デコイは、投与される投与量の50％と99.999％より上の間を表し得る。
【００１５】
本発明の方法を使用することによって、ターゲティング部分および可能性のあるさらなる「活性構成要素」を運ぶビヒクルの投与量を減少させることが可能である。一般的に、活性ビヒクルを有する組成物に対する、デコイ不活性キャリアーの比が大きくなるほど、より低い投与量の活性組成物で、画像化または治療がより有効になる。さらに、粒子中の構造変化によって、例えばPEG化、直径の減少、および界面活性剤変化によって、活性組成物中の粒子の半減期が増強され得る。本発明のデコイ・アプローチの上限は、対象に有効に投与可能な組成物の体積の制限に帰する。
【００１６】
本発明の方法を用いて、標識されターゲティングされた組成物の10％の範囲で、ターゲティングの成功を達成することが可能であったが、本発明の方法を用いないと、わずか2％、またはより典型的には、わずか1％もしくはそれより少ないターゲティングされた粒子が、ターゲットに実際に到達する。
【００１７】
本明細書において用いられるように、「ビヒクル」は、望ましい薬剤送達もしくは画像化機能を実行するナノ微粒子もしくはマイクロ微粒子、または一般的にRESによってクリアランスされる粒子を指す。ビヒクルは、例えば、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、リポタンパク質、免疫抱合体デンドリマー、ヒドロゲル、ポリマー系等であり得る。これらはまた、ガスおよび/またはガス前駆体を含有する気泡、炭化水素および/またはハロカーボンを含む微粒子、中空または多孔粒子または固体であり得る。一般的に、微粒子は、さらなる物質でコーティングされ得る固体微粒子であり得、固体もしくは液体外層に囲まれた液体コアであり得、または固体もしくは液体外層に囲まれたガスもしくはガス前駆体を含有することもまた可能である。ビヒクルはエマルジョンの形で供給され得る。活性組成物中の微粒子ビヒクルは、対象における望ましい組織または位置に選択的に結合するターゲティング部分に結合されている。ターゲティング部分は、ターゲットとされる組織に天然に存在するコグネイトに特異的なリガンドであり得、または人工的に供給される部分のコグネイト、例えばビオチン標識されたターゲット組織に結合するであろうアビジンであり得る。
【００１８】
これらのターゲティング部分は、抗体またはその断片、ペプチド模倣体、小分子リガンド、アプタマー等であり得る。これらは、活性組成物中、ビヒクルに共有的または非共有的のいずれかで結合される。
【００１９】
活性組成物の機能に応じて、さらなる構成要素がビヒクル中に存在し得、またはさらなる構成要素が必要でない可能性もある。例えば、ビヒクルを超音波画像化のための組織部位に集中させようとする場合、例えばペルフルオロカーボン・ナノ粒子のようないくつかの粒子を使用すると、さらなる修飾なしに、十分なコントラストが供給され得る。同様に、ビヒクルがX線不透過である場合、さらなる活性構成要素は必要とされない可能性もある。また、MRI画像化でも、粒子中に19F核が存在するため、十分であり得る。しかしながら、放射性画像化を用いて、望ましい位置を画像化することもまた望ましい可能性もあり、またはプロトン・スピンに基づくMRIが望ましい可能性もある。この場合、直接またはリンカーを通じて、ビヒクルはさらに放射性核種またはキレート剤に結合され得、このキレート剤が次に、重金属イオンまたは放射性核種を含み得る。同様に、ビヒクルをターゲティングする目的が、薬剤を送達することである場合、これらのビヒクルはまた、治療的活性剤も含むであろう。一般的に、「活性組成物」は、そこへの特異的結合を通じて、対象における望ましい位置をターゲティングする部分に結合された、微粒子ビヒクルを含み、かつターゲティングの目的と一致するよう、標識剤、造影剤、治療的活性剤、または選択的な位置への送達が望ましい他の構成要素をさらに含むであろうし、こうした剤または「活性構成要素」は、ビヒクルに固有であり得る。
【００２０】
非常に過剰な「不活性キャリアー」と実質的に同時に、「活性組成物」を投与する。「不活性キャリアー」は、活性組成物中のビヒクルと類似の微粒子、または構造が異なるが、活性組成物の振る舞いを模倣する微粒子を含み得る、ターゲティングされない組成物である。例えば、不活性キャリアーは、商業的に入手可能なIntralipid(登録商標)のように、微粒子が油小滴であるエマルジョンを単に含み得る。「不活性キャリアー」または「ターゲティングされないキャリアー」中のデコイは、RESによるクリアランスに関して競合するように、同一機構を介してクリアランスする限り、活性組成物中のビヒクルと構造的に似ていない、ポリマー、ヒドロゲル等であり得る。不活性組成物中の微粒子は、ターゲティング剤を含有せず、かつ任意に、活性組成物に特徴的な標識剤、造影剤または治療剤を含有しない。好ましくは、ターゲティングされないキャリアー中の微粒子は、標識剤/治療剤、すなわち「活性構成要素」を含有しない。
【００２１】
便宜上、用語「活性構成要素」は、望ましい結果を提供する、ターゲティングされたビヒクルに関連するあらゆる特性を指すように作り出されている。活性構成要素は、ビヒクルに結合された部分、例えば放射性核種、薬剤、生物学的剤、重金属を含有するキレート等であり得、その結合は、共有的または非共有的であり得る。しかしながら、「活性構成要素」は、ビヒクル自体に固有であり得、例えば超音波造影剤としてのペルフルオロカーボンに基づくかもしくはガス・気泡に基づく粒子の使用、または19Fに基づくMRIにおけるフッ素化炭化水素粒子の使用であり得る。「活性構成要素」の性質に応じて、それはターゲティングされないキャリアー中に存在することもまたしないことも可能である。
【００２２】
したがって、活性組成物および不活性キャリアーはどちらも微粒子を含み、ここで該微粒子間の本質的な相違は、活性組成物中の微粒子がターゲティング部分を含有し、一方、不活性キャリアー中の微粒子は含有しない点にある。「活性構成要素」は、両方の組成物中に、または活性組成物中にのみ、存在し得る。ある場合には、「活性構成要素」は、ビヒクル自体に固有である。
【００２３】
上述のように、ビヒクル自体、多様な物理的状態のものであり得、固体粒子、液体でコーティングされた固体粒子、液体でコーティングされた液体粒子、および固体または液体でコーティングされたガス粒子が含まれる。本発明で有用な多様なビヒクル、ならびに活性組成物中のそれらのビヒクルにターゲティング構成要素を結合するための手段が当技術分野に記載されてきている。こうしたビヒクルは、例えば、ビヒクルの構造に関して、すべて参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,548,046号；第6,821,506号；第5,149,319号；第5,542,935号；第5,585,112号；第5,149,319号；第5,922,304号；ならびに欧州公報第727,225号に記載される。これらの文書は、単なる例示であり、かつ本発明で有用な微粒子ビヒクルの多様な種類をすべて包括したものではない。本発明で有用なビヒクルは、具体的には、RESによってクリアランスされる粒子であるものとして定義される。
【００２４】
活性組成物と比較した不活性キャリアーの設計は、標準的合理的設計原理に従うであろう。例えば、ターゲティングされた薬剤送達のために活性組成物を設計する場合、不活性キャリアーは、ターゲティング剤を含有せず、かつ任意に、送達しようとする薬剤を含有しないであろう。活性組成物が超音波画像化のために設計され、かつペルフルオロカーボン粒子を含む場合、不活性キャリアーは、好ましくは、超音波画像化に比較的透過性である微粒子、例えば油小滴を含むであろう。放射性標識のために活性組成物を設計する場合、不活性キャリアーは、好ましくは、放射性核種、少なくともターゲットを標識するために設計された種類の放射性核種を欠くであろう。活性組成物が、磁気共鳴画像化を改善することに向けられる場合、活性組成物は、重金属イオンのキレートを含有し得、一方不活性キャリアーは、キレート剤を欠くこともあり得る。したがって、不活性キャリアーは、(a)ターゲット組織に選択的に結合できず、かつ(b)活性組成物のシグナルまたは生物学的活性に実質的に干渉しないかまたはこれらを模倣しないという意味で、「不活性」である。
【００２５】
典型的には、不活性キャリアーの活性組成物に対する比は、1：1〜105：1の範囲である。活性組成物の性質に応じた規模で、中間の比もまた用いられ得る。したがって、2：1、5：1、10：1、50：1、100：1、103：1、104：1、105：1およびこれらの間の値の比のすべてが、本発明の範囲内である。上述のように、活性組成物およびデコイ両方の投与量の上限は超えないため、活性構成要素がより強力であれば、比はより大きくなり得る。放射性核種に関しては、典型的な比は、より高い範囲にあり、一方、MRI剤またはCT剤に関しては、ターゲット部位にとどまらなければならないターゲティングされた物質の量が、より多いため、実用的なレベル内に投与量を維持する一方、より少ないデコイしか許容可能でない。この比は、投与される微粒子の数として決定される。この比は、同様の微粒子を不活性キャリアーおよび活性組成物の両方に用いる場合、容易に決定され；例えば活性組成物がペルフルオロカーボン・ナノ粒子を利用する一方、不活性キャリアーがIntralipid(登録商標)エマルジョンである場合、より精巧な方法が必要とされる。しかしながら、微粒子濃度を測定するための方法は、当技術分野に周知である。
【００２６】
「実質的に同時の」投与によって、活性組成物および不活性キャリアーが最初の生体分布が同一の広がりを持つように投与される、すなわち活性組成物および不活性キャリアーが、互いに5分以内に、好ましくは互いに2分以内に、好ましくは互いに1分以内に、好ましくは互いに30秒以内に、および好ましくは単一の組成物としてまたは2つの組成物の同時投与として、正確に同時に投与されることを意味する。少しでも任意の間隔がある場合、好ましくは、不活性キャリアーが最初に投与される。
【００２７】
活性組成物または不活性キャリアーいずれかに含有される「ビヒクル」は、マイクロ微粒子剤またはナノ微粒子剤、すなわちRESによってクリアランスされる微粒子であり得る。ビヒクルは、RESによってクリアランスされる場合、「微粒子」と見なされる。上述のように、こうした微粒子に含まれるのは、キレート剤、ターゲティング剤等の望ましい部分を粒子に固定するのに有用な、脂質/界面活性剤コーティングで任意にコーティングされた、親油性コアを有するナノ粒子である。
【００２８】
不活性コアは、植物油、動物油、もしくはミネラルオイルであるか、またはペルフルオロ化もしくは別の方法でさらに不活性にされたフルオロカーボン化合物であり得る。ミネラルオイルには、パラフィン油等の石油由来油が含まれる。植物油には、例えば、アマニ油、ベニバナ油、ダイズ油、ヒマシ油、綿実油、パーム油、およびココナツ油が含まれる。動物油には、獣脂、ラード、魚油等が含まれる。多くの油はトリグリセリドである。
【００２９】
フッ素化液体がコアとして含まれる。これらには、直鎖、分枝鎖、および環状炭化水素、好ましくはペルフルオロ化されたものが含まれる。本発明の粒子においてそれ自体有用である、十分にフッ素化された、好ましくはペルフルオロ化された有機化合物のいくつかは、官能基を含有する。ペルフルオロ化された炭化水素が好ましい。ナノ粒子コアは、こうしたフッ素化された物質の混合物を含み得る。典型的には、これらの不活性支持体において、少なくとも50％のフッ素化が望ましい。好ましくは、不活性コアは、20℃を超える、より好ましくは30℃を超える、さらにより好ましくは50℃を超える、かつさらにより好ましくは約90℃を超える沸点を有する。
【００３０】
したがって、本発明の上述のナノ粒子の局面で特に有用なペルフルオロ化合物には、部分的にまたは実質的にまたは完全にフッ素化された化合物が含まれる。塩素化型、臭素化型、またはヨウ素化型もまた使用され得る。
【００３１】
ナノ粒子上の任意のコーティングに関して、比較的不活性なコアに、望ましい部分をナノ粒子自体に固定するように働くであろう、脂質/界面活性剤コーティングが提供される。エマルジョンを形成しようとする場合、コーティングは典型的には界面活性剤を含むはずである。典型的には、コーティングは、極性部分および非極性部分両方、ならびにコレステロールなどのさらなる剤を含有する、レシチン型化合物を含有するであろう。コーティング中の包含のための典型的な物質には、天然または合成リン脂質などの脂質界面活性剤が含まれるが、脂肪酸、コレステロール、リゾ脂質(lysolipid)、スフィンゴミエリン、トコフェロール、糖脂質、ステアリルアミン、カルジオリピン、脂肪酸に連結されたエーテルまたはエステルを有する脂質、重合脂質、およびポリエチレングリコールに抱合体化された脂質が含まれる。他の界面活性剤が商業的に入手可能である。
【００３２】
前述のものを、陰イオン性および陽イオン性界面活性剤と混合し得る。
【００３３】
フルオロ化学界面活性剤もまた、使用され得る。これらには、ペルフルオロ化リン酸アルコールエステルおよびその塩；ペルフルオロ化スルホンアミドリン酸アルコールエステルおよびその塩；ペルフルオロ化アルキルスルホンアミドアルキレン四級アンモニウム塩；N,N-(カルボキシル置換低級アルキル)ペルフルオロ化アルキルスルホンアミド；ならびにそれらの混合物が含まれる。こうした界面活性剤に関して用いるように、用語「ペルフルオロ化」は、界面活性剤が、少なくとも1つのペルフルオロ化アルキル基を含有することを意味する。
【００３４】
典型的には、重量にしてナノ粒子の0.01〜5％、好ましくは重量にして0.1〜2％の総量で、脂質/界面活性剤が用いられる。1つの態様において、界面活性剤層中、粒子表面に核酸物質の付着を促進する陽イオン性脂質を伴って、脂質/界面活性剤被包エマルジョンを製剤化し得る。陽イオン性脂質には、DOTMA、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド；DOTAP、1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン；およびDOTB、1,2-ジオレオイル-3-(4'-トリメチル-アンモニオ)ブタノイル-sn-グリセロールが含まれ、これらが使用され得る。一般的に、脂質/界面活性剤単層中の陽イオン性脂質の非陽イオン性脂質に対するモル比は、例えば、1：1000〜2：1、好ましくは2：1〜1：10の間、より好ましくは1：1〜1：2.5の間の範囲、かつ最も好ましくは1：1(陽イオン性脂質のモル量の非陽イオン性脂質のモル量に対する比、例えばDPPC)であり得る。非常に多様な脂質が、エマルジョン界面活性剤の非陽イオン性脂質構成要素、特に、先に記載したものに加えて、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジル-エタノールアミンまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが含まれ得る。上述のような陽イオン性脂質の代わりに、ポリアミン、例えばスペルミンまたはポリリジンまたはポリアルギニンなどの陽イオン性ポリマーを所持する脂質もまた、脂質界面活性剤に含まれ得、かつエマルジョン粒子の外側への、負に荷電された治療剤、例えば遺伝物質またはその類似体の結合が提供され得る。
【００３５】
本発明の方法を実行する際に、他の微粒子支持体もまた、使用され得る。例えば、粒子は、リポソーム粒子、またはHDL、LDL、およびVLDLなどのリポタンパク質であり得る。多様な種類のリポソームを記載する文献は非常に多く、かつ当業者に周知である。一般的に、リポソームは、1つまたは複数の両親媒性部分、およびコレステロールなどのステロイドからなる。これらは単層、多層であり得、かつ多様なサイズであり得る。これらの親油性の特徴を用いて、不活性コアを有するナノ粒子上のコーティングに関して上述したものに類似の方法で、キレート剤に結合し得；あるいはリポソームの構成要素への共有結合が用いられ得る。ミセルは、類似の物質で構成され、かつ望ましい物質、および特にキレート剤を結合するアプローチはそれらにも同様に適用される。脂質の固体型が用いられ得る。
【００３６】
さらに、タンパク質または他のポリマーを用いて、微粒子キャリアーを形成し得る。これらの物質は親油性コーティングが適用される不活性コアを形成し得、、または例えば微粒子固体支持体にアフィニティー試薬を結合するのに使用される技術によって、キレート剤はポリマー性物質に直接結合され得る。したがって、例えば、タンパク質で形成される粒子は、例えばカルボジイミドによって仲介される脱水反応を通じて、カルボン酸および/またはアミノ基を含有する繋留分子に結合され得る。キレート剤が結合する繋留剤を含有する他の有機分子に、マレイミド連結を通じて、イオウ含有タンパク質が結合され得る。微粒子キャリアーの性質に応じて、キレート剤の歯状部分および粒子の表面の間で埋め合わせが得られるように結合する方法は、当業者に明らかであろう。
【００３７】
さらに、ビヒクルとして用いられる粒子は、ガスの気泡、または使用時にガスの気泡を形成する前駆体を含有し得る。これらの場合、ガスは、液体または固体に基づくコーティング中に含有される。
【００３８】
ターゲティング剤および任意で活性構成要素とともに提供され得るか、またはキャリアー中で使用可能な他の適切なビヒクルには、米国特許第5,536,489号に記載される油および水エマルジョン、米国特許第5,512,294号に記載されるものなどのリポソーム組成物、および米国特許第5,171,737号に記載されるような油および水エマルジョンが含まれる。
【００３９】
したがって、本発明の方法に用いられるビヒクルは、非常に多様なものであり得；本発明の方法の必要条件は、活性組成物中に存在するビヒクルが、RESに関して、不活性キャリアー中に存在するビヒクルと類似の方法で振舞うことである。複数の種類のビヒクルは、活性組成物中もしくは不活性キャリアー中のいずれか、または両方で使用され得る。本考察では、「同一組成の」ビヒクルは、基本的な構造は同一であるが、ターゲティング・リガンドおよび/または活性構成要素との相補性が異なり得るビヒクルを意味するよう定義される。したがって、「同一組成のビヒクル」は、同様に構築されているリポソームであるが、活性組成物に用いられるもののように、そのようなリポソームの1つのセットはターゲティング・リガンドおよび任意で活性構成要素をさらに含有するであろう。「同一組成の」ビヒクルは、別の例として、同じガスおよび全体寸法のマイクロ気泡を含むが、あるものはターゲティング・リガンドを含有し、かつ他のものは含有しない。逆に、「同一組成でない」ビヒクルは、異なる構造の基本粒子、例えばフルオロカーボン・ナノ粒子に対して油小滴、または固体構成要素で被包されたガス・マイクロ気泡に対して液体で被包されたガス・マイクロ気泡である。本発明の方法に関する必要条件は、「同一組成」であるかどうかに関わらず、活性組成物および不活性キャリアーが、RESにおけるそれらのクリアランス特性に関して類似に振舞うビヒクルを含むことである。
【００４０】
活性組成物中のビヒクルは、ターゲティング剤、すなわちターゲット組織中のコグネイトに特異的に結合する部分を含む。典型的には、不活性キャリアー・ビヒクルは、いかなるターゲティング剤も含有しない；理論的には、活性組成物によって示されるもの以外の異なるターゲットに対するターゲティング剤を含有し得る；しかしながら、こうすることに特に意味はないであろう。いずれにせよ、これらは関心対象のターゲットに結合する任意の部分を欠く。ターゲティング剤の選択は、ターゲティングしようとする臓器もしくは組織の性質、または組織の種類に応じるであろう。典型的なターゲットには、フィブリン塊、肝臓、膵臓、神経、腫瘍組織、すなわち特定の細胞表面または他のリガンド結合性部分によって特徴付けられる任意の組織が含まれる。このターゲティングを達成するため、適切なリガンドを直接または間接的に粒子に結合する。間接的な方法は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,690,907号に記載される。この方法において、ナノ粒子の脂質/界面活性剤層をビオチン化し、かつターゲティングされる組織を、ターゲットに特異的に結合するリガンドのビオチン化型に結合させる。次いで、2つのビオチン化構成要素を結合するアビジンの仲介によって、ビオチン化ナノ粒子がそのターゲットに到達する。
【００４１】
または、特異的リガンド自体を、粒子に直接、必須ではないが好ましくは共有的に結合する。したがって、こうした「直接」結合において、意図するターゲットにビオチン化リガンドが存在する間接的結合とは対照的に、望ましい位置に含有されるターゲットの特異的結合パートナーであるリガンドを、それ自体粒子の構成要素に連結する。こうした直接結合は、連結分子を通じて、または表面構成要素との直接相互作用によって達成され得る。ホモ二官能性およびヘテロ二官能性連結分子が商業的に入手可能であり、かつリガンド上に含有される官能基を用いて、共有結合が達成され得る。ターゲティング・リガンド上に存在し得る典型的な官能基には、アミノ基、カルボキシル基、およびスルフィドリル基が含まれる。さらに、グルタルアルデヒドに仲介されるものなどの架橋法が使用され得る。例えば、連結分子または表面構成要素の不飽和部分を通じて、スルフィドリル基を結合することも可能であり；カルボジイミドなどの脱水剤での処理によって、リガンド上のアミノ基、および表面に含有されるカルボキシル基の間で、またはその逆で、アミドが形成され得る。一般に粒子の構成要素、および一つの態様において脂質/界面活性剤コーティングに見られるものなどの構成要素に、リガンドを直接結合するための非常に多様な方法が当技術分野に公知である。
【００４２】
わずかにより詳細には、ターゲティング・リガンドまたは他の有機部分を外層の構成要素に共有結合させることによる結合のため、多様な種類の結合および連結剤が使用され得る。こうした結合を形成するための典型的な方法には、カルボジイミドの使用を伴うアミドの形成、またはマレイミドなどの不飽和構成要素の使用を通じたスルフィド連結の形成が含まれる。他の結合剤には、例えば、グルタルアルデヒド、プロパンジオール(propanedial)またはブタンジオール(butanedial)、2-イミノチオラン塩酸、例えばスベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホンのような二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えばN-(5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシ)スクシンイミド、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、およびスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレートのようなヘテロ二官能性試薬、例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、4,4'-ジイソチオシアノ-2,2'-ジスルホン酸スチルベン、p-フェニレンジイソチオシアネート、カルボニルビス(L-メチオニンp-ニトロフェニルエステル)、4,4'-ジチオビスフェニルアジド、エリスリトールビスカーボネートのようなホモ二官能性試薬、ならびに例えばジメチルアジポイミデート塩酸(dimethyl adipimidate hydrochloride)、スベルイミド酸ジメチル、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート塩酸のような二官能性イミドエステル等が含まれる。連結は、アシル化、スルホン化、還元的アミノ化等によってもまた達成され得る。商業的に入手可能な連結系には、AnorMED、Langley、BCによって市販される、HYNICリンカー技術が含まれる。望ましいリガンドを、外層の1つまたは複数の構成要素に共有的に結合する多様な方法が、当技術分野に周知である。
【００４３】
例えば、直接結合を達成する方法が、これらの方法に関して、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,676,963号に詳細に記載される。
【００４４】
前述の考察は包括的ではない。アプタマーを使用する特定の場合、粒子へのコーティングとして陽イオン性界面活性剤を使用することによって、ナノ粒子にアプタマーを結合することが有利であり得る。
【００４５】
ターゲティング剤自体が、意図するターゲット部位に特異的な任意のリガンドであり得る。ターゲット部位は、ターゲティング剤またはリガンドの「コグネイト」、すなわちターゲティング剤またはリガンドに特異的に結合する部分を含有するであろう。よく知られているコグネイト対には、抗原/抗体、受容体/リガンド、ビオチン/アビジン等が含まれる。一般的に、こうしたリガンドは、抗体またはその一部、問題のターゲットに結合するように設計されたアプタマー、オピオイド受容体結合性リガンドのような特定の受容体に対する公知のリガンド、特定の受容体をターゲティングすることが公知のホルモン、ペプチド模倣体等を含み得る。特定の臓器が、公知のリガンドに結合する表面分子を含むことが知られる；適切なリガンドが未知である場合であっても、標準的技術を用いて抗体が作製および修飾され得、かつこうした結合のためにアプタマーが設計され得る。
【００４６】
ターゲットが天然にまたは設計によってのいずれかで結合する公知のリガンドを有するかどうかに関わらず、実質的に任意のターゲットへ生成されるそれらの能力のため、抗体またはその断片が好ましいターゲティング剤である。モノクローナル抗体の産生を含む、抗体を作製する標準方法は当技術分野に周知であり、本明細書で繰り返す必要はない。抗体の結合部分がその可変領域に存在することは周知であり、したがってFab、Fv、およびscFv部分のような可変領域のみを含有する抗体の断片は「抗体」の定義に含まれる。抗体、および定義に含まれるこれらの断片の組換え体産生もまた、十分確立されている。ヒト対象に対して画像化を行う場合、ターゲティング・リガンドとして働く任意の抗体をヒト化することが好ましい可能性もある。こうしたヒト化のための技術もまた周知である。
【００４７】
ターゲティング剤に加えて、粒子は、生物学的活性剤、標識構成要素、またはその両方をさらに含有し得る。いくつかの場合、超音波またはMRIのための造影剤としてのペルフルオロカーボン粒子の使用のように、粒子がそれ自体が固有に望ましい特性を所持する際、このさらなる剤は不要である。活性組成物が、固有にこの「活性構成要素」を含有する場合、不活性キャリアーがこの特性を欠くビヒクルからなることが好ましいが、不活性組成物中のビヒクルがターゲティング剤を欠くため、これは絶対的な必要条件ではない。プロトンに基づくMRI、放射性核種画像化、および薬剤送達のような他の適用では、さらなる「活性構成要素」が望ましい。
【００４８】
典型的には、大部分のMRI造影剤には、遷移金属が配置されるキレート剤に、ビヒクルが結合される。典型的なキレート剤には、ポルフィリン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸(DTPA)、1,4,10,13-テトラオキサ-7,16-ジアザシクロオクタデカン-7(ODDA)、16-ジアセテート,N-2-(アゾール-1(2)-イル)エチルイミノ二酢酸、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N'N'',N'''-四酢酸(DOTA)、1,7,13-トリアザ-4,10,16-トリオキサシクロ-オクタデカン-N,N',N''-三酢酸(TTTA)、四エチレングリコール、1,5,9-トリアザシクロドデカン-N,N',N''-トリス(メチレンホスホン酸)(DOTRP)、N,N',N''-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、およびそれらの類似体が含まれる。
【００４９】
MRI画像化で使用するための金属キレートが周知である。例えば、金属キレートを伴うリポソーム粒子を記載する、米国特許第5,512,294号および第6,132,764号；常磁性油エマルジョンを記載する米国特許第5,064,636号および第5,120,527号、ならびに血液プール造影剤として親油性ガドリニウムキレートを取り込むエマルジョンを記載する、米国特許第5,614,170号および第5,571,498号を参照されたい。米国特許第5,804,164号は、キレート剤および常磁性金属を含有する水溶性親油性剤を記載する。米国特許第6,010,682号は、リポソーム、ミセルまたは脂質エマルジョンの形で投与される、脂溶性キレート化造影剤を記載する。
【００５０】
適切な常磁性金属には、原子番号58〜70のランタニド元素または原子番号21〜29、42、もしくは44の遷移金属、すなわち、例えば、スカンジウム、チタニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウム、最も好ましくはGd(III)、Mn(II)、鉄、ユーロピウムおよび/またはジスプロシウムが含まれる。
【００５１】
活性組成物中のビヒクルはまた、放射性核種画像化にも使用され得、放射性核種は上述のMRIで使用するために複合体化される金属イオンと類似の方法で、キレート化によって含まれ得、また代替の結合機構が使用され得る。放射性核種は、治療用または診断用のいずれかであり得；こうした核種を用いた診断画像化は周知であり、かつ望ましくない組織に放射性核種をターゲティングすることによって治療的利益を達成することもまた可能である。典型的な診断放射性核種には99mTc、95Tc、111In、62Cu、64Cu、67Ga、および68Gaが含まれ、かつ治療的核種には186Re、188Re、153Sm、166Ho、177Lu、149Pm、90Y、212Bi、103Pd、109Pd、159Gd、140La、198Au、199Au、169Yb、175Yb、165Dy、166Dy、67Cu、105Rh、111Ag、および192Irが含まれる。
【００５２】
多様な方法で、あらかじめ形成されたエマルジョンに核種を提供し得る。例えば、99Tc-ペルテクネート(pertechnate)は過剰な塩化第一スズと混合され、かつナノ粒子のあらかじめ形成されたエマルジョンに取り込まれ得る。オキシン酸スズ(stannous oxinate)は塩化第一スズの代わりに用いられ得る。さらに、商業的に入手可能なキット、例えばNycomed AmershamによってCeretek(登録商標)として市販されるHM-PAO(exametazine)キットが用いられ得る。多様な放射性リガンドを本発明のナノ粒子に付着させる手段が当技術分野に理解される。上述のように、放射性核種が補助物質でなくてもよいが、その代わり、組成物を放射性核種に基づく診断目的または治療目的のためだけに用いる場合、常磁性イオンの代わりに、放射性核種がキレート剤を占有し得る。
【００５３】
標識構成要素に加えて、またはその代わりに、ビヒクルは、治療剤を含有し得る。これらの生物学的活性剤は、タンパク質、核酸、製剤、放射性核種などを含む、非常に多様なものであり得る。したがって、適切な製剤に含まれるのは、抗腫瘍剤、ホルモン、鎮痛剤、麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌剤または抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、インターフェロン、抗糖尿病剤、抗ヒスタミン剤、鎮咳剤、抗凝血剤等である。
【００５４】
上述のように、生物学的活性剤は粒子に受動的に含まれ得るが、ターゲティング剤またはキレート化剤は典型的により堅固に連結される。したがっていくつかの場合、特に薬剤に関しては、「活性構成要素」はその特性が適している場合、界面活性剤層に含まれ得る。例えば、構成要素が高い親油性の部分を含有する場合、脂質/界面活性剤コーティング中に単に包埋され得る。さらに、構成要素がコーティングに直接吸着することが可能である場合、これもまたその結合を達成するであろう。例えば、核酸は負に荷電しているため、陽イオン性界面活性剤に直接吸着する。
【００５５】
要約すると、本発明の方法において活性組成物は、薬剤送達、超音波画像化、X線画像化、放射性核種画像化、磁気共鳴画像化、トモグラフィー、またはシグナル伝達に応じた任意の他の画像化技術に使用され得る。いくつかの例では、例えば蛍光タンパク質、フルオレセイン、またはダンシルを用いた蛍光標識が用いられる。
【００５６】
本発明を限定しないが例示するため、以下の例を提供する。
【００５７】
調製A
αvβ3に特異的な脂質に結合したリガンドの調製
パートA−DSPE-PEG(2000)マレイミド-メルカプト酢酸付加体
2007523090.tif 000003
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)2000]をDMFに溶解し、かつ窒素またはアルゴンを噴霧することによって脱気する。DIEAを用いて酸素不含溶液をpH7〜8に調整し、かつメルカプト酢酸で処理する。分析によって出発物質が完全に消費されたことが示されるまで、周囲温度で攪拌を続ける。以下の反応にこの溶液を直接用いる。
【００５８】
パートB−DSPE-PEG(2000)マレイミド-メルカプト酢酸付加体と2-[({4-[3-(N-{2-[(2R)-2-((2R)-2-アミノ-3-スルホプロピル)-3-スルホプロピル]エチル}カルバモイル)プロポキシ]-2,6-ジメチルフェニル}スルホニル)アミノ](2S)-3-({7-[(イミダゾール-2-イルアミノ)メチル]-1-メチル-4-オキソ(3-ヒドロキノリル)}カルボニルアミノ)プロパン酸の抱合
2007523090.tif 000004
HBTUおよび十分なDIEAを添加してpH8〜9に維持することにより、上記パートAの産物溶液をあらかじめ活性化する。この溶液に、2-[({4-[3-(N-{2-[(2R)-2-((2R)-2-アミノ-3-スルホプロピル)-3-スルホプロピル]エチル}カルバモイル)プロポキシ]-2,6-ジメチルフェニル}スルホニル)アミノ](2S)-3-({7-[(イミダゾール-2-イルアミノ)メチル]-1-メチル-4-オキソ(3-ヒドロキノリル)}カルボニルアミノ)プロパン酸を添加し、かつ溶液を窒素下室温で18時間攪拌する。DMFを真空で除去し、かつ調製用HPLCによって未精製産物を精製し、パートB表題化合物を得る。
【００５９】
調製B
ナノ粒子の調製
Flacke, S.ら, Circulation(2001)104：1280-1285に記載されるように、ナノ粒子を産生した。簡潔には、ナノ微粒子エマルジョンは、40％(v/v)ペルフルオロオクチルブロミド(PFOB)、2％(w/v)の界面活性剤相互混合物、1.7％(w/v)グリセリンおよび均衡に相当する水で構成された。
【００６０】
対照、すなわちターゲティングされないエマルジョンの界面活性剤には、60モル％レシチン(Avanti Polar Lipids, Inc.、Alabaster, AL)、8モル％コレステロール(Sigma Chemical Co.、St.Louis, MO)、および2モル％ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン(DPPE)(Avanti Polar Lipids, Inc.、Alabaster, AL)が含まれた。
【００６１】
60モル％レシチン、αvβ3-インテグリン・ペプチド模倣体アンタゴニスト(Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc.、North Billerica, MA)に共有結合された0.05モル％N-[{w-[4-(p-マレイミドフェニル)-ブタノイル]アミノ}ポリ(エチレングリコール)2000]1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(MPB-PEG-DSPE)、8モル％コレステロール、30モル％Gd-DTPA-BOA、および1.95モル％DPPEを含む界面活性剤相互混合物を用いて、αvβ3ターゲティング常磁性ナノ粒子を上記のように調製した。
【００６２】
各ナノ粒子製剤の構成要素を、M110S Microfluidics乳化機(Microfluidics、Newton, MA)中、20,000PSIで4分間乳化した。完成したエマルジョンをクリンプシール・バイアル中に配置し、かつ窒素で覆った。
【００６３】
レーザー光散乱サブミクロン粒子サイズ分析器(Malvern Instruments、Malvern, Worcestershire, UK)を用いて粒子サイズを37℃で決定し、かつ公称粒子サイズ(すなわち球体の粒子体積)からナノ粒子濃度を計算した。大部分の粒子は400nm未満の直径を有する。
【００６４】
フレームイオン化検出器(モデル6890、Agilent Technologies, Inc.、Wilmington, DE)を用いたガスクロマトグラフィーで、ペルフルオロカーボン濃度を決定する。エタノール中の10％水酸化カリウムと合わせたペルフルオロカーボンエマルジョン1ml、および内部標準(Freon(登録商標)中の0.1％オクタン)2.0mlを、激しくボルテックスし、次いでシェーカー上で30分間連続して攪拌する。シリカゲルカラムを通じて下部抽出層をろ過し、かつ分析まで4〜6℃で保存する。最初のカラム温度は30℃であり、かつ10℃/分で145℃まで上昇させる。
【００６５】
実施例1
不活性キャリアー・デコイの効果
ターゲティング剤としてαvβ3、および標識剤として111Inを用いて、実質的に調製Bに記載したようにナノ粒子を調製した。ナノ粒子は粒子あたり10コピーのInを含有した。
【００６６】
これらの粒子を活性組成物として用い、かつ18日Vx-2腫瘍を有するウサギに、0.5mCi/kgのレベルで投与した。ピンホールコリメータを用いて、Philips Genesys(登録商標)システムで画像化を行った。15分までに優れたコントラストで、有意なターゲティングが見られた。いかなる標識も欠くターゲティングされない粒子の非常に過剰な存在下で、この手順を反復した。2時間の期間に渡る、デコイの存在下および非存在下でのコントラストを図1に示し、この図はコントラスト、すなわちバックグラウンドに対するターゲットからのシグナルの比(CBR)に対する投与後の時間をプロットする。
【００６７】
示すように、デコイの存在下でコントラスト中の有意な改善が達成された。デコイの使用なしでは、循環中の粒子の持続は、有効な量の粒子、すなわち放射性シグナルがターゲット部位に蓄積するのを可能にするには不適切である。デコイを同時投与すると、インジウム標識粒子の循環寿命が延長され、これによってターゲットでの結合およびシグナル濃縮のための時間がより長くなる。デコイなしで、シグナルの同じレベルをターゲットで得るには、RESの損失を補償するため、はるかに多く、おそらく危険なレベルのインジウム標識粒子を注射する必要があるであろう。
【００６８】
より高い標識用量では、非特異的標識を最小限にするため、プロトコルに調整が必要であろう。
【００６９】
実施例2
特異的結合の立証
ターゲティングされている(ターゲティングされていないものではない)が標識されていない粒子を用いた類似の実験で得た結果を、図2の類似のプロットに示し、ここで黒塗りの円はターゲティングされた粒子を単独で投与した場合の結果を示し、かつ黒塗りの四角はターゲティングされているが標識されていない粒子をあらかじめ投与した場合の結果に相当する。標識されずターゲティングされた組み合わせのものと一緒に投与された、標識されターゲティングされた組成物が競合的遮断されることによって、非特異的蓄積ではなく、ターゲティングされた組成物が病変に対して特異的であることが立証される。したがって、特異的結合は、効果、この場合は核シグナルを高めかつ維持する。
【００７０】
実施例3
ビヒクル上の標識密度増加の効果
実施例1の実験を反復したが、ナノ粒子あたりIn原子50対10コピーを所持する、標識αvβ3ターゲティング・ナノ粒子を用いて、0.3mCi/kgを投与した場合に得た結果を比較した。予期されるように、図3に示すとおり、より高密度で標識された粒子は、バックグラウンドに対して増強したコントラストの化合物を提供した。粒子あたりの放射性核種数が増加するにつれて、検出可能なシグナルを生じる各結合粒子の効力が増加する。さらに、放射標識粒子に対するデコイの比が増加する。この例では、10 /ナノ粒子に対して50 In/ナノ粒子の製剤を用いた投与量では、より少ない活性粒子しか必要としないため、デコイの比は5倍増加し、かつターゲット部位でのシグナル自体が改善されるだけでなく、放射能の同じ総用量に関して増強される。
【００７１】
実施例4
デコイ比の影響
図4に示す結果において、ターゲティング剤および標識を欠く、相当のナノ粒子を含有する、あらかじめ測定した量のエマルジョンの存在下で、インジウム標識ナノ粒子を投与した。0.3mCi、1xデコイと表示する曲線では、デコイ・エマルジョン0.3ml/kgと共に、0.3mCiを提供するのに十分な粒子を投与した。
【００７２】
0.15mCi、1xデコイと表示する曲線では、同じ量のデコイ・エマルジョンを投与したが、0.15mCiのみ投与したように、標識されターゲティングされたナノ粒子の量が減少した。予期されるように、より少ない標識のみ投与されたためため、標識活性組成物(標識を含有するターゲティングされたナノ粒子)に対するデコイの比が倍になったにも関わらず、生じたコントラストは減少した。しかしながら、デコイ・エマルジョンの量を0.6ml/kgに増加させた場合、投与する標識レベルが、0.15mCiで低いままでも、コントラスト・シグナルは増強され、0.3mCiで得た曲線に良く似ていた。したがって、0.15mCi、2xデコイと表示する曲線に示す得られた結果は、ターゲティングされたナノ粒子の同じレベルで、デコイの活性組成物に対する比を2倍増加させることが結果を改善することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】111Inを含有するターゲティングされたナノ粒子を単独で投与した場合、およびデコイ不活性キャリアーと共に投与した場合であって投与が同時である場合、放射性核種画像化で得られるコントラストを示す。
【図２】不活性キャリアー・デコイを、ターゲティングされた活性組成物より十分前に投与した場合の、図1と類似の実験の結果を示す。
【図３】粒子あたり、多様な量の放射性核種を含有するナノ粒子を用いた、放射性核種画像化の結果を示す。
【図４】多様な量のデコイ不活性キャリアーの存在下で、標識ナノ粒子を用いた画像化の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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