(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の新規の変異体の配列、および、患者のサンプル中で、核酸、抗原、およびそれに向けられた抗体を検出する方法に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１４と少なくとも７８％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）０〜１０個のアミノ酸が、配列番号１４と比較して置換、欠失または挿入されているアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１２の構成的な配列（配列番号１２の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む）であるアミノ酸配列、ここにおいて、該構成的な配列は、配列番号１２の５４位、６１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７８位、８５位、８７位および９４位の少なくとも１つを含む；または、
（ｄ）Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原のフラグメント、ここにおいて、該フラグメントは少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、該ＨＢｓ抗原は９６位のアラニン、１０３位のイソロイシン、１１４位のアラニン、１１５位のイソロイシン、１１６位のアスパラギン、１１７位のアスパラギン、１１８位のアルギニン、１２０位のグルタミン、１２７位のトレオニン、１２９位のヒスチジン、および／または、１３６位のチロシンを有し、該フラグメントは、９６位のアラニン、１０３位のイソロイシン、１１４位のアラニン、１１５位のイソロイシン、１１６位のアスパラギン、１１７位のアスパラギン、１１８位のアルギニン、１２０位のグルタミン、１２７位のトレオニン、１２９位のヒスチジン、および／または、１３６位のチロシンを含む、
を含む、オリゴペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２】
Ｂ型肝炎変異体ＨＤＢ１１に感染している個体由来の血清と反応することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）配列番号３と少なくとも９１％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）０〜１３個のヌクレオチドが、配列番号３と比較して置換、欠失または付加されているヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１の構成的な配列であるヌクレオチド配列（配列番号１の少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む）、ここにおいて、該構成的な配列は、配列番号１の１６１位、１８３位、２１３位、２１４位、２１８位、２２１位、２２４位、２２７位、２３３位、２３４位、２３９位、２５３位、２６１位、２８１位、２９４位、３０６位、３１２位、３８７位、４０５位および４０８位の少なくとも１つを含む；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１の配列に相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または、
（ｅ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
を含む、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、または、それらに相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項６】
１０〜３０個のヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、請求項４に記載のオリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、ベクターまたはプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターまたはプラスミドで形質転換またはトランスフェクションされた細胞。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、または、請求項７に記載のベクターまたはプラスミドを含む細胞。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを製造する方法であって、該オリゴペプチドまたはポリペプチドが発現するのに適切な条件下で請求項８または９に記載の細胞を培養することを含む、該方法。
【請求項１１】
オリゴペプチドまたはポリペプチドは、細胞から単離され、その他のオリゴペプチドまたはポリペプチドから分離されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むＨＢｓ抗原に結合するが、遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ２、Ｂ型肝炎ウィルスに属するＨＢｓ抗原に結合しないか、または、著しく弱くしか結合しないことを特徴とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を提示する抗イディオタイプ抗体。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチド；
（ii）請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；および／または、
（iii）請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗体、
を含む、Ｂ型肝炎ウィルスを検出するための試験キット。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドの１つまたはそれ以上を、その／それら単独で、または、既知のＨＢＶ免疫原と組み合わせて含む、免疫原性ペプチドまたは免疫原性ペプチドの混合物。
【請求項１７】
（ａ）サンプルを、請求項１２または１３に記載の抗体と、抗原−抗体複合体の形成が可能な条件下でインキュベートすること；および、
（ｂ）抗体を含む抗原−抗体複合体を検出すること、
を特徴とする、Ｂ型肝炎抗原を検出する方法。
【請求項１８】
（ａ）サンプルを、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドと、抗原−抗体複合体の形成が可能な条件下でインキュベートすること；および、
（ｂ）オリゴペプチドまたはポリペプチドを含む抗体−抗原複合体を検出すること、
を特徴とする、Ｂ型肝炎抗原に対して向けられた抗体を検出する方法。
【請求項１９】
（ａ）サンプル中でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎の核酸との選択的なハイブリダイゼーションが可能な条件下で、該サンプルを、請求項４〜６のいずれか一項に記載の該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとインキュベートする；および、
（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド二重鎖が形成されているかどうかを測定すること、
を特徴とする、Ｂ型肝炎の核酸を検出する方法。
【請求項２０】
（ａ）サンプル中でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎の核酸との選択的なハイブリダイゼーションが可能な条件下で、該サンプルを、請求項４〜６のいずれか一項に記載の該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１種とインキュベートすること；
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと；および、
（ｃ）核酸が増幅されているかどうかを測定すること、
を特徴とする、Ｂ型肝炎の核酸を検出する方法。
【請求項２１】
プライマーとしての、請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
プローブとしての、請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
配列番号１２と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＢｓ抗原を有する、単離されたＢ型肝炎ウィルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の新規の変異体の配列、および、このゲノム変異体およびタンパク質変異体を検出する方法、同様に、それに対して向けられた患者サンプル中の抗体に関する。
【０００２】
この新規の配列は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に、すなわち表面抗原のアミノ酸配列のアミノ酸９６〜１３６位に、従来技術でまだ開示されていない１１個のアミノ酸置換を生じさせ、そのうち、１０個の置換は、決定基領域に位置している（ａａ１０１〜ａａ１８０）。
【０００３】
本発明はまた、この新規のＨＢＶ変異体と、既知の変異体／サブタイプとを同時に検出するための免疫化学検出法、同様に、ＨＢＶ特異的抗体を同時に検出するための、新規の配列と、既知の配列とを組み合わせた使用に関する。抗原または抗体の決定はそれぞれ、別々の、または一つの試験分析で行うことができる。
【０００４】
最終的に、本発明はまた、それに対応する核酸の、適切なプライマーを用いた核酸試験（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）を用いた検出に関し、同様に、ワクチンを生産するための、新規のアミノ酸配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
知られているように、Ｂ型肝炎ウィルスは、穏やかな不顕性感染から、ウイルス感染によって引き起こされる肝臓の炎症（ウイルス性肝炎）にわたる多数の病気の経過に関与する媒介物であり、ウイルス性肝炎は、慢性的に活性で劇症の経過を引き起こす。
【０００６】
推定４億人の人が罹患している点で、慢性的なＨＢＶ感染は、地球規模の健康問題を構成している（Ｌｅｅ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７；１７３３〜１７４５（１９９７年））。
【０００７】
世界的に頻繁に遭遇する可能性のあるＨＢＶ感染の最も適切な予防法としては、能動免疫法（抗原を投与することによって抗体反応を刺激すること）と、受身免疫法（予め形成された抗体を注入することによって生じる）が考えられている。
【０００８】
ＨＢＶは、ヘパドナウイルスに属し、コアとエンベロープからなる４２ｎｍの直径を有するウイルス粒子を構成する。このウイルスのゲノムは、約３２００個のヌクレオチドからなる二本鎖の環状ＤＮＡ配列であって、この配列は、少なくとも６種の異なるウイルス遺伝子をコードする（Ｔｉｏｌｌａｉｓ等，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４８９〜４９５（１９８５年））。ウイルスタンパク質を形成するのに、４つのオープンリーディングフレームが利用される。
【０００９】
ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、スモールタンパク質（Ｓ）とも呼ばれており、それに関する情報は、Ｓ遺伝子に含まれている。加えて、それより大きい形態もあり、これらは、ラージタンパク質（Ｌ）、および、ミドルタンパク質（Ｍ）と命名されている。
【００１０】
３種全てのタンパク質は、２２６個のアミノ酸を含む共通のＳ−ＨＢｓＡｇ配列に存在する（Ｇｅｒｌｉｃｈ等，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｗｉｌｌｉａｍ−Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ｐａｇｅｓ  １２１〜１３４（１９９１年））。
【００１１】
スモールＨＢｓ（ｓｍａｌｌ ＨＢｓ）上流のタンパク質領域は、プレ−Ｓ１およびプレ−Ｓ２とも呼ばれており、それぞれ１０８個および５５個のアミノ酸を含み、いずれもＬタンパク質（３８９個のアミノ酸）に存在し、一方で、Ｍタンパク質はＳ抗原（２８１個のアミノ酸）と共にプレ−Ｓ２のみを含む。プレ−Ｓタンパク質は、様々な程度のグリコシル化を示し、肝細胞を認識する受容体を有する。特に他の指定がない限り、本願におけるアミノ酸位置は、プレ−Ｓ１領域とプレ−Ｓ２領域を含まないＳ−抗原（２２６ａａ）を意味する。
【００１２】
Ｃ遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質のＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）に関する情報を有する。このタンパク質の翻訳は、早くもプレ−Ｃ領域で開始させることができ、それにより、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の形成が起こる。ＨＢｅＡｇのフォールディングおよび免疫原性は、ＨＢｃＡｇのそれとは異なる。ＨＢｃＡｇに対して、ＨＢｅＡｇは、血清中で遊離の形態で生じ、陽性検出については、ＨＢｃＡｇの形成、その結果として感染性のウイルス粒子の形成の指標とみなされる。
【００１３】
ウイルス粒子に存在する逆転写ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐ遺伝子によってコードされており、トランスアクチベーターＸ遺伝子が、ＨＢＶ関連の初期肝細胞癌の発達において原因的な役割を有する可能性が討論されている。
【００１４】
ＨＢＶウイルスの複製サイクルには、細胞内プレゲノムＲＮＡが含まれ、このＲＮＡは、ウイルスのヌクレオカプシドでＤＮＡに逆転写される。ＨＢＶに特有の逆転写酵素ＤＮＡポリメラーゼには、まったく校正能力がないため、不正確なヌクレオチドが比較的高い頻度で含まれる。結果として、ＨＢＶは、感染年数あたり、塩基１００００個につきヌクレオチド約１個の変異率を示し、これは、その他のＤＮＡウイルスが示す速度の約１０倍に相当する（Ｂｌｕｍ，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ５６：８５〜９５（１９９５年）；Ｏｋａｍｏｔｏ等，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５７：２３１〜２３６（１９８７年））。
加えて、欠失および挿入もまた極めて頻繁に起こる（Ｃａｒｍａｎ等，Ｌａｎｃｅｔ ３４１：３４９〜３５３（１９９３年））。
【００１５】
生じたＨＢＶの変異性は、特に、９種の血清学的に識別されたサブタイプの出現（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ等，Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ４２：１（１９７６）、および、総計で少なくとも６種の異なる遺伝子型で示され、これらの遺伝子型はＡ〜Ｆと命名され（図１）、地理的に分散している。（Ｎｏｒｄｅｒ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３１４１〜３１４５（１９９２年），Ｎｏｒｄｅｒ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４８９〜５０３（１９９４年））。
加えて、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失または付加された多数の突然変異体が説明されている。
【００１６】
自然に生じる突然変異に加えて（Ｃｏｏｒｅｍａｎ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３０：１２８７〜１２９２（１９９９年））、ＨＢＶ免疫グロブリンの投与、および／または、抗ウイルス治療（例えば、ラミブジンを用いた）により選択圧を働かせることができ、それにより、いわゆるエスケープ突然変異体の出現の増加が生じ、ＨＢＶ突然変異体が出現する確率が著しく高くなる（Ｔｅｒｒａｕｌｔ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２８：５５５〜５６１（１９９８年）；Ｔｉｌｌｍａｎｎ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３０：２４４〜２５６（１９９９年）；Ｈｕｎｔ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１：１０３７〜１０４４（２０００年））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
全てのＨＢＶ突然変異が複製可能なウイルスを生じるというわけではなく、生きていないウイルスと複製可能なウイルスが頻繁に共存しており、このような状況はまた、単離されたＤＮＡの配列解析の精度も制限してしまい、または、さらに改変された配列を認識するためのＰＣＲ、クローニング法およびそれに続く配列解析の失敗をもたらすこともあり、後者の場合、定量的にいえば総ＤＮＡの１０％未満になる（Ｃｏｏｒｅｍａｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．８：２３７〜２４７（２００１年））。
【００１８】
従って、突然変異体を単離し、それに続き個々の突然変異体を同定および特徴付け、場合によっては改善されたワクチンおよび診断薬を開発することは有利である。
【００１９】
ＨＢＶに感染した後、免疫反応は、主として、全てのＢ型肝炎ウィルスに共通のＳタンパク質領域としての決定基と呼ばれるものに対して向けられ、この領域は、ウイルス粒子表面上に位置しており（Ｇｅｒｌｉｃｈ等，上記参照）、Ｓ遺伝子のＢ細胞エピトープの最もヘテロジニアスな部分を構成している。
【００２０】
知見の現状に鑑み、アミノ酸１０１位〜１８０位間の決定基上で総計で少なくとも５種の部分的にオーバーラップするエピトープが、抗体の結合部位と推測されており（図１および２）、これは、モノクローナル抗体を用いることによって実証されている（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：９２０〜９２７（１９８４年））。
【００２１】
これらのエピトープは、主として、数個のジスルフィド架橋によって安定化されている複合的な立体配座のエピトープである。また、合成で製造された環状ペプチド構造を用いて生産可能ないくつかの配列のエピトープも存在する。
【００２２】
ＨＢＶでの自然感染後に血清中に循環するいわゆる「防御抗体」の９９％は、ＨＢＶの極めて免疫原性の決定基に対して向けられている（Ｊｉｌｇ，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：６５〜６８（１９９８年））。ヒト血清から単離されたワクチンまたは組換えによって製造されたワクチンのいずれかを用いた免疫化の広範囲の使用、および、ヒトＨＢＶ特異的抗体を含むＢ型肝炎免疫グロブリンの投与は、この事実に基づく。いずれの予防対策も、「ループエピトープ」に結合した後にＨＢｓ特異的抗体が提示する中和作用に基づく（Ｃａｒｍａｎ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２４：４８９〜４９３（１９９６年），Ｍｕｌｌｅｒ等，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１３：９０〜９６（１９９１年）、および、Ｓａｍｕｅｌ等，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：１８４２〜１８４７（１９９３年））。
【００２３】
類似した様式で、現在広く用いられている診断薬は、決定基の決定基特異的な抗体がエピトープに結合することに基づく。
【００２４】
従って、献血分野で世界的に用いられている免疫化学的測定方法を用いてＨＢｓＡｇを決定する場合において、ドナーの血清中に循環するＨＢＶ表面抗原が、決定基に対して向けられている抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を用いて検出され、結果が陽性の場合、ＨＢＶ汚染血液による医原性のＨＢＶ感染を予防するために、それに関連する献血された血液は廃棄される。ＨＢｓＡｇの測定のその他の適用例は、現存の急性ＨＢＶ感染を検出することにある。
【００２５】
逆に言えば、被験体の血液中のＨＢｓ特異的抗体（抗ＨＢｓ）を測定する際の陽性の結果は、自然感染がその過程を経るか、または、実施されたワクチン接種がうまくいったかのいずれかを示している。
【００２６】
最後に、核酸試験（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）も、ＨＢＶヌクレオチドに特異的なプライマーの使用に基づく。
【００２７】
能動免疫法（ＨＢＶ抗原でのワクチン接種）、受動免疫法（ＨＢＶ特異的免疫グロブリンによる防御）、ワクチン接種の成功または発症したＨＢＶ感染の検出（いずれも、ＨＢｓＡｇ特異的抗体、すなわち抗ＨＢｓを測定することによる）、および、最終的に、献血分野における安全性（ＨＢｓＡｇ測定、および、ＰＣＲ）において決定基が果たす中心的な役割により、突然変異体、さらには新しい変異体の出現が、専門家の世界で大いに注目を集めることが理解できる。
【００２８】
その結果として、予防と診断の両方に関して、ＨＢＶの決定基において改変されているが複製可能な新規の突然変異体および／または変異体が関心の対象となり得る（Ｂｒｉｎｄ等，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２６：２２８〜２３５（１９９７年），Ｆｉｓｃｈｅｒ等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３１：４９２〜４９３（１９９９年），Ｇｈａｎｙ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：２１３〜２２２（１９９８年），Ｐｒｏｔｚｅｒ−Ｋｎｏｌｌｅ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：２５４〜２６３（１９９８年），Ｃａｒｍａｎ等，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０２：７１１〜７１９（１９９２年）、および、Ｃｏｌｅｍａｎ等，ＷＯ ０２／０７９２１７Ａ１，（２００２年））。
【００２９】
ＨＢＶの変異体および突然変異体に著しい差異はないが、それに関する提案が広くなされている（Ｃａｒｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．４（ｓｕｐｐｌ．１）：１１〜２０（１９９７年））。この提案に従って、「変異体」という用語は、選択圧（抗ウイルス治療、および／または、免疫グロブリン投与）によるあらゆる既知の障害がなくして出現した、地理的な分散パターンを示す天然に存在するサブタイプに用いることとする。
【００３０】
サブタイプの特徴付け、および、それに続く分類は、モノクローナル抗体を用いて行われ、１個または２個〜３個のアミノ酸が置換されたことによる反応パターンの変化に基づく。分類の基準は、最も普遍的なＨＢＶ配列のアミノ酸１２２位および１６０位：ａａ１２２、および、ａａ１６０＝リシン、Ｋによって構成される。
【００３１】
全ての血清型は、グループに特異的な決定基を含み、一方で、ａａ１２２、それに加えて、１３３および１３４は、ｄまたはｒサブタイプを決定し、ａａ１６０は、ｗまたはｒサブタイプの一員であることを決定する。これに基づき、ＨＢＶサブタイプは、おおまかにａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒおよびａｙｗに分類でき、これらのサブタイプは、少なくとも９種のさらに下位のサブタイプ：ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗｒ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ＋、および、ａｄｒｑ−にさらに分類できる（Ｓｗｅｎｓｏｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．３３：２７〜２８（１９９１年），Ｂｌｉｔｚ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：６４８〜６５１，Ａｓｈｔｏｎ−Ｒｉｃｋａｒｄｔ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２０４〜２１４（１９８９年））。
【００３２】
この分類は血清学的反応に基づいているため、全ての型別がアミノ酸レベルでの変異性を示す必要はなく、その理由としては、Ｓ遺伝子レベルでの遺伝子型解析で示されることが好ましいためである（Ｏｈｂａ等，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３９：２５〜３４（１９９５年））。
【００３３】
まだ知られていない理由により、サブタイプは特定の地理的および民族的なパターンを表す。
【００３４】
Ｃａｒｍａｎに従って、「突然変異」という用語は、ワクチン接種または抗ウイルス治療のような選択圧下で選択的に発生する変異体に用いられることとする。多くの突然変異がすでに説明されているが、それらの多くは、診断上不正確な所見を引き起こす（Ｃａｒｍａｎ等，Ｌａｎｃｅｔ ３４５：１４０６〜１４０７）；これらの突然変異の例として
、以下に示すａａ置換を引用する：
コンセンサス：   ａａ位置          突然変異体：
Ｉ           １１０               Ｖ
Ｐ           １１１               Ｔ
Ｔ           １１４               Ｓ
Ｔ           １１６               Ｓ
Ｐ           １２０             Ｔ／Ｓ
Ｔ           １２３             Ａ／Ｎ
Ｉ／Ｔ         １２６             Ａ／Ｓ
Ｑ           １２９             Ｈ／Ｒ
Ｋ／Ｍ         １３３               Ｌ
Ｔ           １４３             Ｍ／Ｌ
Ｄ           １４４           Ｈ／Ａ／Ｅ
Ｇ           １４５             Ｒ／Ａ
Ａ           １５７               Ｒ
加えて、ａａ１０７位、１２４位、１３７位、１４７位および１４９位に
おけるシステイン置換。
（Ｃｏｌｅｍａｎ，上記参照；Ｏｋａｍｏｔｏ等，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．３２：２６４〜２６８（１９９２年）；Ｚｈａｎｇ等，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８：９〜１５（１９９６年）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等，Ｌａｎｃｅｔ ３４３：７３７〜７３８（１９９４年））。
【００３５】
驚くべきことに、肝炎マーカーの不規則な反応パターンが、萎縮肝の炎症を有するエジプト人の患者から採取されたサンプルに見出された（内部番号：１１８２３４、２００２年１０月２日に回収）。
【００３６】
このような感染に典型的な肝臓値の増加を含む臨床像に加えて、検出されるＩｇＭクラス肝炎コア抗体もまた急性ＨＢＶ感染を示したが、承認された高性能のＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡを用いたところ、ＨＢｓＡｇは検出されなかった。
【００３７】
驚くべきことに、ＰＣＲを行ったところ陽性の結果が得られ、配列解析したところ、まったく意外なことに、図３および４に示すヌクレオチド配列、および、図５および６に示すアミノ酸配列が得られた。
【００３８】
これらの配列から、ａａ９６〜１８０の領域における総数ｎ＝１１個のアミノ酸が、Ｄ遺伝子型と比較して置換されていることから、まったく意外なことに、点突然変異、すなわち２〜３個のヌクレオチドの置換の問題ではなく、おそらく血清学的に特徴付けることが可能なサブタイプのいずれの問題でもないことは明らかである。アミノ酸置換の頻度の観点で、まったく意外なことに、上記結果は、新しい野生型の問題であるか、または、上記突然変異は、その結果から、新しい変異体（以下に示すようなＨＤＢ１１変異体と命名される）であると説明される可能性が高いことを言明していることが考えられる。
【００３９】
決定基のアミノ酸配列と既知の配列との最良の一致を解析したところ、遺伝子型Ｄ（図１）、サブタイプａｙｗ２（図２）が示されるが、驚くべきことに、新しい変異体は、それらとさらに１１個のａａ位置が異なる。最も顕著な特徴は、図１、５および６によれば、ａａ１０３〜１３６の間の領域における１０個の置換で構成される。
【００４０】
新しいＨＤＢ１１変異体と既知の野生型とが共存する可能性を考慮したとしても、アミノ酸領域ａａ１１４〜１２０における特徴および新規の配列は、６個の新規のアミノ酸配列／置換として記載することができ（図１）、これらは驚くべき特徴を有している。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
従って、本発明は、配列番号１４と少なくとも７８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドに関する。配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、Ｂ型肝炎のＳ抗原のアミノ酸９３〜１４０位に対応し、上記抗原は、総長２２６個のアミノ酸を有する。好ましい実施形態は、配列番号１４と、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドに関する。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１２と、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドに関する。配列番号１２に示されるアミノ酸配列は、Ｂ型肝炎ウィルスのＳ抗原のアミノ酸４３〜１９６位に対応し、上記抗原は、２２６個のアミノ酸の長さを有する。
【００４３】
当業者であれば本来、２つのアミノ酸配列間の同一性を決定する方法に精通しており、この方法は、一般的なコンピュータープログラムを用いて実行することができる。同一性は、好ましくは、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，マディソン，ウィスコンシン州）製の「Ｂｅｓｔｆｉｔ」コンピュータープログラムを用いて決定される。パラメーターは、標準（デフォルト）設定で用いられる。本願の優先日において最新のプログラムバージョンを用いることが好ましい。高いパーセンテージの同一性は、２つの配列が、高度の一致、同一性または等価性を示すことを意味する。
【００４４】
本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドはまた、配列番号１４と比較して、０〜１０個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されているアミノ酸配列を含んでいてもよい。上記アミノ酸配列において、配列番号１４と比較して、０〜９個、０〜８個、０〜７個、０〜６個、０〜５個、０〜４個、０〜３個、０〜２個のアミノ酸、または、１個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されていてもよい。置換はまた、ＨＢＶのＳ抗原の９６位、１０３位、１１４〜１１８位、１２０位、１２７位、１２９位および１３６位に対応するアミノ酸位置に影響を与えることもできる。
【００４５】
本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドはまた、配列番号１２と比較して、０〜１０個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されているアミノ酸配列を含んでいてもよい。上記アミノ酸配列において、配列番号１２と比較して、０〜９個、０〜８個、０〜７個、０〜６個、０〜５個、０〜４個、０〜３個、０〜２個のアミノ酸、または、１個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されていてもよい。
【００４６】
本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドはまた、配列番号１６と比較して、０〜９個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されているアミノ酸配列を含んでいてもよい。上記アミノ酸配列において、配列番号１６と比較して、０〜８個、０〜７個、０〜６個、０〜５個、０〜４個、０〜３個、０〜２個のアミノ酸、または、１個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されていてもよい。
【００４７】
本発明のオリゴペプチドまたはポリペプチドはまた、配列番号１２の構成的な配列（配列番号１２の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む）であるアミノ酸配列を含んでい
てもよく、ここにおいて、上記構成的な配列は、少なくとも、配列番号１２の５４位、６１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７８位、８５位、８７位および９４位のいずれか一つを含む。これらのアミノ酸位置は、ＨＢＶのＳ抗原の９６位、１０３位、１１４〜１１８位、１２０位、１２７位、１２９位および１３６位に対応する。上記構成的な配列は、好ましくは、配列番号１２に示されるアミノ配列の、少なくとも６個、より好ましくは少なくとも７個、最も好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸を含む。その他の実施形態において、上記構成的な配列は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列の、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、または、少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。
【００４８】
上記構成的な配列は、好ましくは、配列番号１２の５４位、６１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７８位、８５位、８７位および９４位のうち、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個全てを含む。
【００４９】
本発明に係るポリペプチドはまた、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原のフラグメントを含んでいてもよく、ここにおいて、前記フラグメントは、少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、前記ＨＢｓ抗原は、９６位のアラニン、１０３位のイソロイシン、１１４位のアラニン、１１５位のイソロイシン、１１６位のアスパラギン、１１７位のアスパラギン、１１８位のアルギニン、１２０位のグルタミン、１２７位のトレオニン、１２９位のヒスチジン、および／または、１３６位のチロシンを有し、前記フラグメントは、９６位のアラニン、１０３位のイソロイシン、１１４位のアラニン、１１５位のイソロイシン、１１６位のアスパラギン、１１７位のアスパラギン、１１８位のアルギニン、１２０位のグルタミン、１２７位のトレオニン、１２９位のヒスチジン、および／または、１３６位のチロシンを含む。本オリゴペプチドまたはポリペプチドは、これらの特異的アミノ酸残基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドの最も短い長さは、５個、好ましくは６個、より好ましくは７個、最も好ましくは８個のアミノ酸である。本オリゴペプチドまたはポリペプチドの総長は、一般的に、５〜１０００個のアミノ酸、好ましくは６〜５００個のアミノ酸、より好ましくは７〜３００個のアミノ酸、最も好ましくは８〜２００個のアミノ酸である。本オリゴペプチドまたはポリペプチドはまた、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムによってコードされない異種アミノ酸を含んでいてもよい。従って、固相へのカップリングを容易にする、または、標識物質へのカップリングを可能にするアミノ酸を存在させることもできる。クローニングの結果として発生する、および、組換え発現に付随して発現されるアミノ酸を存在させることもできる。最終的に、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドは、ＨＢＶ由来のアミノ酸に加えて、融合のパートナー、例えば精製を容易にするタグ配列、または、溶解性および／または組換え発現に関する収率を高めるタンパク質成分を含む融合タンパク質であってもよい。この性質を有する融合のパートナーは本来、当業者既知である。
【００５１】
その他の実施形態において、本オリゴペプチドまたはポリペプチドは、ＨＢＶのゲノムによってコードされていないいかなる異種アミノ酸も含まない。それに相応して、これらのオリゴペプチドまたはポリペプチドは、上述された、および／または、請求項に記載のアミノ酸配列のいずれか一つで構成される。
【００５２】
本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは免疫原性であり、すなわち、哺乳動物において抗体反応を誘導することができる。本オリゴペプチドまたはポリペプチドは通常、少なくとも１つの抗原決定基、または、少なくとも１つのエピトープを含む。特定の実施形態において、本オリゴペプチドまたはポリペプチドは、他のＨＢＶ変異体に存在しないエピトープ、例えばサブタイプａｙｗ２に存在しないエピトープを含む。
【００５３】
本オリゴペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および、配列番号３０のアミノ酸配列のいずれか一つを含む。
【００５４】
本発明のその他の形態は、本願で説明されているオリゴペプチドまたはポリペプチドの１種またはそれ以上を含む、免疫原性ペプチド、または、免疫原性ペプチドの混合物である。この免疫原性ペプチドまたは免疫原性の混合物は、本オリゴペプチドまたはポリペプチドを、その／それら単独で、または、既知のＨＢＶ免疫原と組み合わせて含んでいてもよい。
【００５５】
本発明はまた、新規のＨＢＶ変異体ＨＤＢ１１またはそれらの突然変異体のゲノムから誘導された核酸分子、特に、ＨＳｂＡｇをコードする遺伝子から誘導された核酸分子に関する。
【００５６】
それゆえに、本発明は、例えば、配列番号３と少なくとも９１％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。配列番号３のヌクレオチド配列は、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする。好ましい実施形態は、配列番号３と少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。
【００５７】
本発明はまた、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。配列番号１のヌクレオチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする。
【００５８】
この場合、同一性は、２種のＤＮＡセグメントの２つの鎖の間の同一性の程度と定義される。同一性は、比較される２つの配列において同一の塩基の数を、短いほうの配列の長さで割って、１００をかけたパーセンテージとして表現される（Ｓｍｉｔｈ等，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈｅｍ．２：４８２〜４８９（１９８１年））。
【００５９】
当業者であれば、２つのアミノ酸配列間の同一性を決定する方法に精通しており、この方法は、一般的なコンピュータープログラムを用いて実行することができる。同一性は、好ましくは、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，マディソン，ウィスコンシン州）製の「Ｂｅｓｔｆｉｔ」コンピュータープログラムを用いて決定される。パラメーターは、標準（デフォルト）設定で用いられる。本願の優先日において最新のプログラムバージョンを用いることが好ましい。高いパーセンテージの同一性は、２つの配列が、高度の一致、同一性または等価性を示すことを意味する。
【００６０】
この評価はまた、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列にも適用できる（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ.，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ.Ｃ.，ＵＳＡ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６６７６３（１９８６年））。
【００６１】
その上、本発明は、０〜１３個のヌクレオチドが、配列番号３と比較して置換、欠失または付加されているヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。また、上記ヌクレオチド配列において、配列番号３と比較して、０〜１２個、０〜１１個、０〜１０個、０〜９個、０〜８個、０〜７個、０〜６個、０〜５個、０〜４個、０〜３個、０〜２個のヌクレオチド、または、１個のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されていてもよい。
【００６２】
本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、配列番号１の構成的な配列であるヌクレオチド配列（配列番号１の少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む）を含んでいてもよく、ここにおいて、上記構成的な配列は、配列番号１の１６１位、１８３位、２１３位、２１４位、２１８位、２２１位、２２４位、２２７位、２３３位、２３４位、２３９位、２５３位、２６１位、２８１位、２９４位、３０６位、３１２位、３８７位、４０５位および４０８位の少なくとも１つを含む。上記構成的な配列は、好ましくは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の、少なくとも９個、より好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。その他の実施形態において、上記構成的な配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２０個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、または、少なくとも３００個の連続したヌクレオチドを含む。
【００６３】
上記構成的な配列は、好ましくは、配列番号１の１６１位、１８３位、２１３位、２１４位、２１８位、２２１位、２２４位、２２７位、２３３位、２３４位、２３９位、２５３位、２６１位、２８１位、２９４位、３０６位、３１２位、３８７位、４０５位および４０８位のうち、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個全てを含む。
【００６４】
その他の実施形態において、本オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、好ましくは特異的に、配列番号１の配列に相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。さらにその他の実施形態において、本オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、好ましくは特異的に、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および／または、配列番号１１の配列に相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。当業者であれば本来、所定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、その他のポリヌクレオチドとハイブリダイズするかどうかを決定する方法に精通している。以下の条件は、「ストリンジェントな条件」の特定の例を構成する：ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および、変性断片化サケ精子ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌを含む溶液中での、４２℃で１６時間のインキュベート；ｂ）それに続く、０.１×ＳＳＣ中での、約６５℃での洗浄。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は本来、当業者既知であり、一例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（１９８９年）に明記されている。ヌクレオチド配列が所定のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする場合、そのヌクレオチド配列は、他のヌクレオチド配列とハイブリダイズしない、または、それよりかなり弱くしか他のヌクレオチド配列とハイブリダイズしない。本発明の場合、これは、上記ヌクレオチド配列は、従来のＨＢＶ変異体（例えば、遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ２）由来のＨＢｓＡｇをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズしない、または、弱くしかハイブリダイズしないことを意味するといえる。
【００６５】
本発明はまた、本願で説明されているような、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。 本発明のその他の形態は、上述のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。
【００６６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最も短い長さは、６個、好ましくは８個、より好ましくは１０個、最も好ましくは１２個のヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの総長は、一般的に、６〜３０００個のヌクレオチド、好ましくは６〜１５００個のヌクレオチド、より好ましくは８〜９００個のヌクレオチド、最も好ましくは８〜６００個のヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムから誘導されたものではないヌクレオチドを含んでもよい。従って、上述のような望ましい機能を満たすことを目的とする特定のアミノ酸をコードするヌクレオチドが存在していてもよい。例えば特定の切断部位を挿入するために、クローニングのために発生するヌクレオチドが存在していてもよい。最終的に、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＨＢＶ由来のアミノ酸に加えて、融合のパートナー、例えば精製を容易にするタグ配列、または、溶解性および／または組換え発現に関する収率を高めるタンパク質成分を含む融合タンパク質をコードすることができる。この性質を有する融合のパートナー、および、それらをコードするＤＮＡは本来、当業者既知である。
【００６７】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および、配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、例えば蛍光標識または放射標識によって標識されていてもよい。この性質を有するポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において有利に用いることができる。
【００６９】
本発明はまた、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。このようなプラスミドは、例えば宿主細胞中で核酸を複製する、または、特定の制限切断部位を利用可能にするのに用いられるクローニングベクターが可能である。発現ベクターは、クローニングした核酸を宿主細胞で発現させることを可能にするベクターのことである。様々な原核性のまたは真核細胞が、宿主細胞であり得る。原核性の宿主細胞の例としては、細菌細胞が挙げられ、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞である。本発明に係る発現ベクターは、特に、プロモーターまたは抑制因子結合部位のような要素を制御することができる。その他の実施形態において、発現ベクターは、融合タンパク質の一部をコードする核酸のセグメントを含む。
【００７０】
本発明は、同様に、本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係るプラスミド、または、本発明に係るベクターを包含する細胞、例えば宿主細胞に関する。このような宿主細胞は、存在する核酸の転写、およびそれに続く翻訳を起こすのに適切な条件下で培養することができる。本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法に関し、本方法において、本発明のポリヌクレオチド、プラスミドまたは発現ベクターを宿主細胞に導入し、その宿主細胞をポリペプチドが発現されるような条件下で培養する。必要に応じて、その後、上記ポリペプチドを宿主細胞から単離することもできる。上記ポリペプチドは、好ましくは、細菌中で、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞中で製造される。培養に適した手段および条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９３年）“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”で説明されている。発現されたポリペプチドは、本来当業者既知の方法を用いて単離される。様々なタンパク質精製方法は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．（１９９４年）“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”（第三版）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇで説明されている。
【００７１】
しかしながら、本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、固相合成のような既知の方法を用いて化学的に製造することもできる。同様に、本発明に係るポリヌクレオチドは、既知の化学合成法を用いて製造することができる。次に、化学合成により得られたポリヌクレオチドフラグメントはまた、リガーゼを用いて酵素的に連結させることもできる。本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、既知の配列から、点突然変異が特定の位置に挿入される部位特異的変異誘発によって製造することもでき。この性質を有する方法は本来、当業者既知である。
【００７２】
本発明のその他の形態は、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドに結合する抗体である。これらの抗体は、本発明のオリゴペプチドまたはポリペプチド、例えば配列番号１２〜３０の配列のいずれか一つを有するペプチドまたはそれらのフラグメントのいずれかを用いる既知の様式で製造することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；コールドスプリングハーバーラボラトリー）。上記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。上記抗体は、好ましくは、新規のＨＢＶ変異体のＨＢｓＡｇに対して向けられているが、他のＨＢＶ変異体由来のＨＢｓＡｇ（例えば遺伝子型Ｄサブタイプａｙｗ２）を認識しない特異的抗体である。これらの抗体は、新規のＨＢｓＡｇと既知の種由来のＨＢｓＡｇとのアミノ酸配列の比較に基づき、新規のＨＢｓＡｇに特異的なペプチドを同定すること、および、これらのペプチドを用いて抗体を製造することにより得ることができる。また、ポリクローナル抗体の混合物を製造し、この混合物を、既知のＨＢｓＡｇとをインキュベートすることによって枯渇させることも可能である。その他の実施形態において、上記抗体は、既知のＨＢｓＡｇ変異体、同様に、新規のＨＢｓＡｇを認識する。これは、異なるＨＢｓＡｇ変異体を同時に検出することを可能にする。
【００７３】
本発明の抗体は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および、配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列で構成されるオリゴペプチドまたはポリペプチドに結合させることができる。上記抗体は、特に好ましくは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および、配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列で構成されるオリゴペプチドまたはポリペプチドに結合する。特定の実施形態において、上記抗体は、既知のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ
の決定基に結合しない（図１を参照）。特定の実施形態において、上記抗体は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ２の決定基に結合しない。
【００７４】
その上、本発明は、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を示す抗イディオタイプ抗体に関する。抗イディオタイプ抗体を製造する方法は本来、当業者既知である。
【００７５】
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウィルスを検出するための試験キットに関し、本キットは、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチド、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび／または本発明に係る抗体を含む。
【００７６】
本発明はまた、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドの１種またはそれ以上を、その／それら単独で、または、既知のＨＢＶ免疫原と組み合わせて含む免疫原性ペプチド、または、免疫原性ペプチドの混合物に関する。
【００７７】
本発明のその他の形態は、（ａ）サンプルを、本発明に係る抗体と、抗原−抗体複合体の形成が可能な条件下でインキュベートすること；および、（ｂ）前記抗体を含む抗原−抗体複合体を検出すること、を特徴とする、Ｂ型肝炎抗原を検出する方法である。
【００７８】
実験サンプル（ＨＤＢ１１変異体のＨＢｓＡｇ）中で、新規のＨＢＶ変異体のエピトープと反応し、本発明に係るＨＢＶ変異体の決定基を、ポリペプチド配列全体またはそれらの部分の形態で測定するモノクローナルまたはポリクローナル抗体（または、それらの混合物もしくはフラグメントまたはフラグメントの混合物）を使用することができる。
【００７９】
当業者であれば、ＨＢＶの決定基変異体に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（または、それらの混合物もしくはフラグメントまたはフラグメントの混合物）の１種またはそれ以上を用いて、免疫複合体を形成する、または、それらの形成を阻害する多数の測定方法に精通している。
【００８０】
特定の実施形態は、酵素免疫検査法であり、その考えられる試験の原理を一例として以下に説明するが、本発明の観念がこの原理に限定されることはない：
極めて広範囲に用いられているサンドイッチの原理においては、固定化抗体またはそれらのフラグメントは、適切な支持体（例えば、マイクロパーティクルまたはマイクロタイトレーションプレート中のウェル表面）上の試験中のサンプルとインキュベートされる。過量のサンプルが除去された後に、抗体に結合したＨＢｓＡｇは、プローブと共に提供される抗ＨＢｓ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル、または、フラグメントもしくはこれらのフラグメントの混合物）とさらにインキュベートすることによって検出される。用いられるプローブは、多くの場合、適切な基質が触媒的に変換される（過量の試薬を除去した後に）ことにより色の反応を引き起こす酵素であり、その色の反応は光度的に測定され、その強度はサンプル中に存在するＨＢｓＡｇ量に比例する。
【００８１】
この特定の実施形態に加えて、いかなるプローブもまったく必要とせずに実行される実質的に均一な（すなわちあらゆる結合／解離を別々にする必要がない）方法（例えば凝集法）、肉眼で評価できる方法（例えば放射免疫拡散）、または、その他のプローブ（例えば、放射性同位体または化学発光）または数種のプローブ（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン系）を使用する方法も既知である。
【００８２】
これら全ての実施形態は、本発明の場合において、「新規のＨＢＶ変異体のＨＢｓＡｇを測定すること」は、それそのもので新規の変異体のＨＢｓＡｇが測定されるかどうか、または、その領域において新規の変異体のＨＢｓＡｇが既知の決定基および／または既知の突然変異のＨＢｓＡｇと共に測定されるかどうかにかかわりなく、新規のＨＢＶ変異体のポリペプチド配列または抗原を検出するのに適切なあらゆる方法を意味するものと理解される点で従来技術に対応する。
【００８３】
同様に、経済的な理由で、ＨＢｓＡｇの測定と、その他の分析物を検出する方法（例えば、ＨＩＶ抗原、または、ＨＢＶ変異体ＨＢｓＡｇ、および、それに対して向けられた特異的な抗体の同時測定）とを、１つの試験分析（これは、区別してもよいし、区別されていなくてもよい）に統合することも可能である。
【００８４】
本発明はまた、（ａ）サンプルを、本発明に係るオリゴペプチドまたはポリペプチドと、抗原−抗体複合体の形成が可能な条件下でインキュベートすること；および、（ｂ）前記オリゴペプチドまたはポリペプチドを含む抗体−抗原複合体を検出すること、を特徴とする、Ｂ型肝炎抗原に対して向けられた抗体を検出する方法に関する。
【００８５】
特定の実施形態は、酵素免疫検査法であり、その考えられる試験の原理を一例として以下に説明するが、本発明の観念がこの原理に限定されることはない：
極めて広範囲に用いられているサンドイッチの原理においては、固定されたエピトープを有するポリペプチドまたはタンパク質配列を、適切な支持体（例えば、マイクロパーティクルまたはマイクロタイトレーションプレート中のウェル表面）上の調査中のサンプルとインキュベートする。過量のサンプルが除去された後に、エピトープに結合した抗体は、プローブと共に提供されるエピトープを有するポリペプチドまたはタンパク質配列とさらにインキュベートすることによって検出される。用いられるプローブは、多くの場合、適切な基質が触媒的に変換される（過量の試薬を除去した後に）ことにより色の反応を引き起こす酵素であり、その色の反応は光度的に測定され、その強度は、サンプル中に存在する抗体の量に比例する。
【００８６】
この特定の実施形態に加えて、実質的に均一な（すなわち、いかなる方法結合／解離の分離も必要としない）方法、プローブをまったく必要とせずに実行される方法（例えば凝集法）、肉眼で評価できる方法（例えば、放射免疫拡散）、または、その他のプローブ（例えば、放射性同位体または化学発光）または数種のプローブを使用する方法（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン系）も既知である。
【００８７】
同様に、ＨＢＶ変異体のポリペプチド構造を、抗イディオタイプ抗体、または、適切な試験の原理を選択することによって示すことも可能であり、抗ＨＢｓ抗体を測定する（競合的な試験様式において）ために変異体に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いることも可能である。同様に、試験の原理を選択することによって、免疫グロブリンのクラスを識別することも可能なことがわかっている［例えば、あらゆるプローブを有する第二のクラスに特異的な抗体（例えば、ＩｇＭ−またはＩｇＧ特異的な）を用いた、または、いわゆる抗μ原理（ＩｇＭに特異的な）を用いた「間接的な」方法によって］。当然ながら、方法と材料（例えば、プローブおよびポリペプチド配列など）は、所定の目的に適合させなければならない。
【００８８】
これら全ての実施形態は、従来技術に対応しており、すなわち、本発明の場合において、「新規のＨＢＤ１１変異体の決定基に特異的な抗体を測定すること」は、新規のＨＢＶ変異体に対して向けられた免疫グロブリン、および／または、免疫グロブリンのクラスを検出するのに適切なあらゆる方法と理解され、ここにおいて、ある領域において、新規の変異体に対して向けられた抗体が、それ単独で、または、既知の決定基および／または既知の突然変異に対して向けられた抗体と組み合わせて探索されるかどうかは問われない。
【００８９】
その他の方法において、Ｂ型肝炎の核酸を検出することができる。この方法は、以下を特徴とする：
（ａ）サンプル中で前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎の核酸との選択的なハイブリダイゼーションが可能な条件下で、サンプルを、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとインキュベートすること；および、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド二重鎖が形成されているかどうかを測定すること。
【００９０】
また、Ｂ型肝炎の核酸を、（ａ）サンプル中で前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎の核酸との選択的なハイブリダイゼーションが可能な条件下で、サンプルを、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１種とインキュベートすること；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと；および、（ｃ）核酸が増幅されているかどうかを測定することによって検出することもできる。
【００９１】
本発明はまた、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、プライマーおよび／またはプローブとしての使用に関する。本発明のヌクレオチド配列は、プライマーおよび／または遺伝子プローブを製造するのに用いることができ、そのために、試験中のサンプル中で、ＨＢＶ変異体に特異的な核酸を検出するためのプライマーおよび／またはプローブを、それ単独で、または、既知のＨＢＶヌクレオチド配列と組み合わせてのいずれかで含むキットも同様に本発明の主題の一部である。
【００９２】
本発明のヌクレオチド配列に基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いることができるプライマーを開発することが可能である。ＰＣＲは、核酸または核酸混合物の望ましいヌクレオチド配列を増幅するための方法である。この方法において、プライマーは、それぞれの場合において、リーディングフレームとして、望ましい核酸を用いて、ポリメラーゼによって特異的に伸長する。もとの鎖から解離した後、新しいプライマーがハイブリダイズし、再度ポリメラーゼによって伸長する。これらのサイクルの反復によって、検索後の標的配列分子が濃縮される。
【００９３】
核酸試験（ＮＡＴ）に関して、ウイルス変異体を保持する可能性のある個体、または、例えば、献血分野で貯蔵血液を変異体ゲノムの存在に関してスクリーニングするために、選択的に、または、既知のＨＢＶ変異体、および／または、ＨＢＶ突然変異体のヌクレオチド配列を検出することと組み合わせて、説明されているＨＢＶ変異体のウイルスのゲノムを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適した６〜８個またはそれ以上のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴマーを製造するのに、本発明のヌクレオチド配列を使用することが可能である。
【００９４】
同様に、発見された新規のＨＢＶ変異体のヌクレオチド配列に基づき、それに対応する新規の変異体に特異的なプライマー、または、新規の変異体と従来技術において既知の変異体の両方を検出することができるプライマーを開発することも可能である。
【００９５】
その上、本発明は、配列番号１２と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＢｓ抗原を有する単離されたＢ型肝炎ウィルスに関する。本発明に係るウイルスのＨＢｓ抗原は、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。最終的に、本発明はまた、本発明に係るＨＢＶ変異体に感染している組織の細胞の培養物、同様に、単離されたＨＢＶ変異体それ自体も包含する。弱力化または不活性化したＨＢＶのＨＤＢ１１変異体を含む免疫原性の調製物もまた、本発明の主題の一部である。
【００９６】
本発明はまた、ＨＢＶ感染を治療もしくは予防するための製薬を製造するための、本発明に係るオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの使用、または、本発明に係るオリゴペプチドもしくはポリペプチドの使用に関する。特に、本発明に係るオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、または、オリゴペプチドもしくはポリペプチドは、ＨＢＶに対するワクチンの生産に用いることができる。
【００９７】
加えて、本発明はまた、本発明のポリペプチドと、一般的なアジュバント（例えば、フロインドアジュバント、リン酸緩衝食塩水など）とを含むワクチンも含む。この性質を有するワクチンは、哺乳動物において抗体形成を刺激するのに用いることができる。同様に、本発明は、本発明に係るＨＢＶ変異体に特異的なエピトープを含むポリペプチドと、粒子形成を誘導する、変異体に特異的ではないアミノ酸配列とを一緒に含む粒子を包含する。
【００９８】
本発明のヌクレオチド配列はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド（必要に応じて治療目的の）を製造するのに用いることもできる。
【００９９】
本発明のさらなる形態は、以下の主題の項目（１）〜（２１）で構成される：
（１）配列番号１〜配列番号１１からなる群より選択される配列のいずれか一つを有する単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：
【化１】
2007534296.tif 000003
【０１００】
（２）それぞれの場合において、配列番号１〜配列番号１１からなる群より選択される配列のいずれか一つと、少なくとも６５％、または、６６％、または、６７％、または、６８％、または、６９％、または、７０％、または、７１％、または、７２％、または、７３％、または、７４％、または、７５％、または、７６％、または、７７％、または、７８％、または、７９％、または、８０％、または、８１％、または、８２％、または、８３％、または、８４％、または、８５％、または、８６％、または、８７％、または、８８％、または、８９％、または、９０％、または、９１％、または、９２％、または、９３％、または、９４％、または、９５％、または、９６％、または、９７％、または、９８％、または、９９％同一な、（１）に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【０１０１】
（３）ストリンジェントな条件下で、配列番号１〜配列番号１１からなる群より選択される配列のいずれか一つに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズする、（１）または（２）に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【０１０２】
（４）Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原をコードし、（１）、（２）または（３）に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【０１０３】
（５）（１）、（２）または（３）に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原をコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのフラグメント。
【０１０４】
（６）Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原の決定基をコードし、（１）、（２）または（３）に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【０１０５】
（７）（１）〜（６）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに特異的なプライマー。
【０１０６】
（８）（１）〜（５）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１種を含むベクター。
【０１０７】
（９）（８）に記載のベクターを包含する宿主細胞。
【０１０８】
（１０）（１）〜（５）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによってコードされている、オリゴペプチドまたはポリペプチド。
【０１０９】
（１１）配列番号１２〜配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたオリゴペプチドまたはポリペプチド：
【化２】
2007534296.tif 000004
【０１１０】
【化３】
2007534296.tif 000005
【０１１１】
（１２）それぞれの場合において、配列番号１２〜配列番号３０からなる群より選択される配列のいずれか一つと、少なくとも６５％、または、６６％、または、６７％、または、６８％、または、６９％、または、７０％、または、７１％、または、７２％、または、７３％、または、７４％、または、７５％、または、７６％、または、７７％、または、７８％、または、７９％、または、８０％、または、８１％、または、８２％、または、８３％、または、８４％、または、８５％、または、８６％、または、８７％、または、８８％、または、８９％、または、９０％、または、９１％、または、９２％、または、９３％、または、９４％、または、９５％、または、９６％、または、９７％、または、９８％、または、９９％同一な、（１０）または（１１）に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチド。
【０１１２】
（１３）（１０）〜（１２）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原の配列に相当する単離されたポリペプチド。
【０１１３】
（１４）（１０）〜（１２）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原の配列に相当するポリペプチドのフラグメント。
【０１１４】
（１５）（１０）〜（１２）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原の決定基をコードする単離されたポリペプチド。
【０１１５】
（１６）（１０）〜（１５）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むＨＢｓ抗原に結合するが、Ｂ型肝炎の野生型ウイルスに属するＨＢｓ抗原には結合しないか、または、少なくとも著しく弱くしか結合しない、モノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【０１１６】
（１７）（１０）〜（１５）に記載の項目のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を示す抗イディオタイプ抗体。
【０１１７】
（１８）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の項目に記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１つを用いるハイブリダイゼーション反応によって、Ｂ型肝炎ウィルスの変異体または突然変異体に特異的な核酸を検出または測定するための試験キット。
【０１１８】
（１９）（１６）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の少なくとも１つを用いて、Ｂ型肝炎ウィルスの変異体または突然変異体に特異的な抗原を免疫化学的に検出する、または、免疫化学的に測定するための試験キット。
【０１１９】
（２０）（１０）〜（１５）に記載の項目のいずれか一項に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つを用いて、Ｂ型肝炎ウィルスの変異体または突然変異体に対して向けられた抗体を免疫化学的に検出する、または、免疫化学的に測定するための試験キット。
【０１２０】
（２１）主題の項目（３）および（４）の１またはそれ以上に記載のオリゴペプチドまたはポリペプチドの１つまたはそれ以上を、それ単独で、または、既知のＨＢＶ免疫原と組み合わせて含む、免疫原性ペプチドまたは免疫原性ペプチドの混合物。
【０１２１】
本発明は、配列番号１〜１１の相補物と特異的にハイブリダイズする、配列番号１、または、図３および４に示されたこの配列のフラグメントと少なくとも６５％同一な単離されたヌクレオチド配列を包含する。
【０１２２】
加えて、本発明は、ａａ１０１と１８０との間のアミノ酸位置で、本発明に係るＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の決定基の変異体をコードする単離されたヌクレオチド配列、または、ａａ配列が、図５および６に示す配列番号１２または配列番号１３〜３０に記載のそれらのフラグメントと少なくとも６５％の一致を示すペプチド産物を生産する単離されたヌクレオチド配列を包含する。
【０１２３】
その上、本発明は、前記ヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上を含むベクター、同様に、このベクターを包含する宿主細胞、および、決定基から対応するポリペプチドを製造する方法に関し、本方法は、前記ポリペプチドを発現させるのに必要な期間および条件下で、上記の宿主細胞をインキュベートすることを含む。
【０１２４】
本発明はまた、配列番号１２〜３０に記載の決定基と反応する抗体に関し、ここにおいて、結合は、好ましくは、アミノ酸領域ａａ１０１〜１５０で起こる。このような抗体は、ポリクローナルでも、またはモノクローナルでもよいし、動物由来でも、またはヒト由来でもよい。
【０１２５】
本発明は、同様に、単離されたＨＢＶ変異体に関し、前記ウイルスは、少なくとも１０１〜１２０位、および／または、ａａ１２１〜１４０のａａ配列に対応する決定基、理想的には、前記領域の両方（１０１〜１４０）に対応する決定基を有する。
【０１２６】
本発明はまた、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生産するための免疫原性の混合物に関し、前記混合物は、上述の単離したＨＢＶ、または、上述のポリペプチドの１つまたはそれ以上を含む。
【０１２７】
本発明はまた、アミノ酸の置換によって、上述の新規のＨＢＶ変異体のａａ配列と同一な、または、それと少なくとも６５％一致する改変された決定基が生産されるＨＢＶゲノム配列を含むポリヌクレオチドプローブも包含する。
【０１２８】
本発明はまた、前記プローブを用いてＨＢＶ変異体のポリヌクレオチドを検出するためのキット、同様に、変異体のＨＢｓＡｇまたはそれらの個々のエピトープを検出するためのキット、および、それらの変異体またはエピトープに特異的な抗体、同様に、ポリヌクレオチド、抗原および抗体を検出する方法に関し、前記方法は、当業者既知の適切な方法を用いて、対応する複合体を形成するためにインキュベートすること、および、これらの複合体を検出することを含む。
【０１２９】
これらのキットおよび検出方法の実施形態は、ＨＢＶ変異体のヌクレオチドおよび抗原、または、それらに対して向けられた抗体を特異的に単独で検出するように設計することもできるし、または、それに加えて、すなわち、現在既知のＨＢＶヌクレオチド、抗原または抗体に加えて、本発明に係る変異体分析物を検出することも可能である。
【０１３０】
類似の様式において、  本発明に係るポリペプチド配列の免疫原性の混合物はまた、例えばワクチンの有効性を改善するために、既知の抗原と組み合わせて用いることができる。
【０１３１】
本発明は、以下のＳ−ＨＢｓＡｇ配列のａａ位置でのアミノ酸置換の結果として、まったく新規の決定基を有するＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の新規の変異体を記載する。アミノ酸を記載するのに、一文字コードが用いられる：
ＨＤＢ１１のａａ      ａａ位置        ａｙｗ２／遺伝子型Ｄのａａ
Ｉ              １０３                    Ｍ
Ａ              １１４                    Ｓ
Ｉ              １１５                    Ｔ
Ｎ              １１６                    Ｔ
Ｎ              １１７                    Ｓ
Ｒ              １１８                    Ｔ
Ｑ              １２０                    Ｐ
Ｔ              １２７                    Ｐ
Ｈ              １２９                    Ｑ
Ｙ              １３６                    Ｓ
加えて、アラニン（Ａ）は、ＨＤＢ１１のａａ９６位におけるバリン（Ｖ）の位置に存在する：
Ａ               ９６                     Ｖ
【０１３２】
これらのａａ置換は、対応するコドンにおける対応するヌクレオチド置換による可能性がある。
【０１３３】
本発明は、上記ウイルスの決定基をコードする単離されたヌクレオチド配列に関する（図３、さらに、配列番号１）。
【０１３４】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列、または、それらのフラグメント、同様に、それらに相補的な配列と、少なくとも６５％一致する、好ましくは少なくとも７５％一致する、特に好ましくは少なくとも９０％一致する、ヌクレオチドも包含する。
【０１３５】
本発明はまた、上述のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド、特に、ＨＢｓＡｇの決定基を決定するアミノ酸配列、および、これらの配列と、少なくとも６
５％、好ましくは７５％、さらにより好ましくは９５％の類似性を示すポリペプチドも包含する。
【０１３６】
本発明を説明するために、ヌクレオチドフラグメントは、新規のＨＢＶ変異体のヌクレオチド配列由来のヌクレオチドの、少なくとも８または９、好ましくは９〜１５、特に、好ましくは１５〜２１、極めて特に好ましくは２１〜６０個の連続した配列と理解され、これらのヌクレオチドフラグメントの混合物もまた包含される。
【０１３７】
ポリペプチドフラグメントは、新規のＨＢＶ変異体の決定基由来の、少なくとも３、好ましくは３〜５、特に、好ましくは５〜７、極めて特に好ましくは７〜２０個のアミノ酸からなる配列と理解され、また、このようなポリペプチドフラグメントの混合物も本発明に包含される。
【０１３８】
本発明はまた、新規のＨＢＶ変異体のＨＢｓＡｇまたは新規のＨＢＶ変異体の決定基の一部のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列、それらに相補的なヌクレオチド配列、または、サブタイプまたは突然変異としてＨＤＢ１１を検出することができるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それらを得ることができる、単離されたヌクレオチド配列も包含する。
【０１３９】
当業者であれば、従来技術に係る方法を用いて  それを単離した後に、ヌクレオチド配列を、原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）または酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）に、ベクターまたはコンストラクトを用いて導入でき（トランスフェクション、形質転換またはエレクトロポレーションのような当業者既知の方法を用いて：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，１〜３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９年））、ここにおいて、一過性のまたは永続的な培養が使用できることに精通している。
【０１４０】
その結果として、本発明は、新規のＨＢＶ変異体の決定基の単離されたヌクレオチド配列、これらのヌクレオチドによってコードされているポリペプチド、新規のＨＢＶ変異体の決定基のヌクレオチド配列を含むベクター、さらに、ベクターが導入された宿主細胞を包含する。ポリペプチドを（組換えによって）生産する発現系を用いることに加えて、当業者であれば、また、類似のポリペプチド構造を、合成で、またはウイルス変異体から精製することによって直接的に製造することも可能であることに精通している。
【０１４１】
新規のＨＢＶ変異体の決定基の結合部位（エピトープ）に免疫学的に結合するモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を生産するのに、新規のＨＢＶ変異体のポリペプチドまたはタンパク質を使用することができる。抗体の生産方法は当業者既知である（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ ２５６〜４９５（１９７５年）、Ｍｉｍｍｓ等，Ｖｉ．１７６：６０４〜６１９（１９９０年）。
【０１４２】
その上、ＨＢＶ変異体に対して向けられている抗体（抗ＨＢｓ抗体）（上記参照）を測定するために、本発明に係るＨＤＢ１１変異体の決定基を、ポリペプチド配列全体またはそれらの部分の形態で使用することが可能である。
【０１４３】
当業者であれば、動物またはヒト由来のＨＢＶの決定基変異体および抗体由来のポリペプチドを用いて、免疫複合体を形成する、または、それらの形成を阻害する多数の測定方法に精通している。
【０１４４】
最終的に、新規のＨＢＶ変異体のエピトープと反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体（または、それらの混合物もしくはフラグメントまたはフラグメントの混合物）を使用することが可能であり、それにより、試験中のサンプル中で、本発明に係るＨＢＶ変異体の決定基（ＨＤＢ１１変異体のＨＢｓＡｇ）を、ポリペプチド配列全体またはそれらの一部の形態で測定することができる。
【０１４５】
当業者であれば、ＨＢＶの決定基変異体に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（または、それらの混合物もしくはフラグメントまたはフラグメントの混合物）の１つまたはそれ以上を用いて、免疫複合体を形成する、または、それらの形成を阻害する多数の測定方法に精通している。
【０１４６】
同様に、発見された新規のＨＢＶ変異体のヌクレオチド配列に基づき、対応するプライマーを開発することも可能である。
【０１４７】
最終的に、本発明はまた、上述の方法に基づき、ＨＢＶ変異体に特異的な抗原（ＨＢｓＡｇ）またはそれに対して向けられた抗体（抗ＨＢｓ）の検出が可能なキットとしての診断用の試薬に関し、前記検出は、単一の測定であってもよいし、または、互いに組み合わせてもよいし、または、上記抗体またはまったく異なる分析物と特異的に反応するその他の既知のＨＢＶ抗原または抗体と組み合わせてもよい。
加えて、本発明は、特許請求の範囲で説明される。
【０１４８】
図面の説明：
図１は、ＨＤＢ１１と比較した、６種の上述のＨＢＶ遺伝子型の決定基のアミノ酸配列の概要を示す。
図２は、決定基のヌクレオチドおよびアミノ酸配、同様に、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ２のすぐ隣の領域を示す。
図３は、ＨＤＢ１１のヌクレオチド配列と比較した、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのサブタイプａｙｗ２に関するＨＢＶの決定基表面抗原のヌクレオチド配列を示す。
図４は、ＨＤＢ１１のヌクレオチド配列における翻訳に関連する差を要約する。
図５は、決定基領域におけるＨＤＢ１１のヌクレオチド配列、同様に、対応するアミノ酸配列を示す。決定基は、全てのスモールＨＢｓＡｇ（ｓｍａｌｌ，Ｓ）のアミノ酸番号１０１および１８０に位置する。
図６は、ＨＤＢ１１の決定基の対応するポリペプチド配列を示し、このポリペプチド配列は、図５で説明されているヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１４９】
以下の実施例で、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、説明されている実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【０１５０】
実施例１：ＨＢｓＡｇを測定するための酵素免疫検査法、ＥＩＡの使用
デイド・ベーリング社（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，マールブルク，ドイツ）製の酵素免疫検査法Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ（登録商標）ＨＢｓＡｇ５.０を、エジプト人の患者の血液中のＨＢＶ表面抗原、すなわちＨＢｓＡｇを決定するのに用いた。
【０１５１】
これは、欧州で承認された高性能の試験であり、同封の情報冊子中の説明書に従って使用される。
【０１５２】
基礎となる試験の原理は、マイクロタイタープレート様式のサンドイッチ試験である：
試験しようとするサンプル１００μｌを、一段階法で、２５μｌの抱合体１（ビオチンで共有結合により標識されたマウスモノクローナルＨＢｓＡｇ特異的抗体）、および、固定されたヒツジポリクローナルＨＢｓＡｇ特異的抗体と接触させた。３７℃で６０分間インキュベートし、プレートのウェルを４回洗浄することにより過量の成分を除去した後、プローブの酵素ペルオキシダーゼが共有結合したストレプトアビジンからなる抱合体２（１００μｌ）を添加した。３７℃で３０分間インキュベートし、プレートのウェルを４回洗浄することによって過量の成分を除去した後に、クロモゲン緩衝液／基質溶液７５μｌを添加し、これに続いて、室温で３０分間インキュベートした。青いテトラメチルベンジジン色素の発色を、ストップ溶液（硫酸）７５μｌを添加することによって止め、色素を４５０ｎｍで光度的に測定した。
【０１５３】
光学密度（Ｏ.Ｄ．）で測定された発色した色の強さは、調査されたサンプル中のＨＢｓＡｇの量に直接的に比例しており、閾値未満のＯ.Ｄ．値は、ＨＢｓＡｇ非含有と評価した。この閾値は、平行して試験されたネガティブコントロール（試験キットに含まれる）のＯ.Ｄ．の平均値に、０.０５ Ｏ.Ｄ．の一定値を加えた値と定義される。
【０１５４】
試験に用いられたバッチ（＃３２８７４）の検出限界は、図形での補間法によって決定され、その際、ポール・エーリッヒ研究所（Ｐａｕｌ Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ランゲン，ドイツ）製の国際的に容認された標準標品を、それぞれ０.０１２ｎｇのａｄサブタイプ／ｍｌと、０.０１５ｎｇのａｙサブタイプ／ｍｌを、標準標品のＨＢｓＡｇ非含有血清の希釈液の試験による実験的な分析と平行して用いた。
【０１５５】
サンプル＃１１８２３４の解析（２００２年１０月２日に回収されたものであり、それからＤＮＡも単離されている）により、異なる２日でなされた２回の独立した実験で、０.０４、および、０.０５ Ｏ.Ｄ．の結果が得られ、この結果を、ＨＢｓＡｇ非含有の試験を基準にして解釈した。一方で、付随して分析されたポジティブコントロール（試験キットに含まれる）は、上記のａｄおよびａｙ標準標品と同様に陽性であった（確認基準を満たす）。
【０１５６】
実施例２：サンプル＃１１８２３４からのＨＤＢ１１のＤＮＡの単離
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）製のＱＩＡ ａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ血液ミニキットを用いて、エジプト人のサンプルのアリコート（２００μｌ）からＤＮＡを単離した。これを行う際、全ての工程上の段階は同封の情報冊子の説明に従い、溶出は、容積５０μｌで行った。
【０１５７】
実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ
３.１  ＨＢＶプライマー
以下に列挙する４種のＨＢＶプライマーを用いた：
５’から３’への配列を有するプライマー１：
ＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＣ（配列番号３１）
５’から３’への配列を有するプライマー２：
ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧ（配列番号３２）
５’から３’への配列を有するプライマー３：
ＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣ（配列番号３３）
５’から３’への配列を有するプライマー４：
ＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＴＡＣＣ（配列番号３４）。
【０１５８】
３.２  ＰＣＲ増幅
パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット、同様に、パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）製のサーモサイクラーのＧｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００を用いて、表面抗原のネステッドＰＣＲ増幅を行った。
上記ヌクレオチドは、アマシャム・バイオサイエンス（イギリス）から入手した。
【０１５９】
第一の増幅サイクルで、単離されたＤＮＡ（５μｌ）を、上述のプライマー１および２、および、以下の条件を用いて増幅した：
ＰＣＲ１ｒｘｎ
プライマー１（１０μＭ）                                    １μｌ
プライマー２（１０μＭ）                                    １μｌ
１０倍濃度の緩衝液（１５μＭのＭｇＣｌ2を含む）             ５μｌ
ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）                                  １μｌ
蒸留水                                                    ３６.７５μｌ
Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                             ０.２５μｌ
チューブあたり総容積                                  ４５μｌ
上記に加えて、単離されたＤＮＡ                          ５μｌ
反応容積                                              ５０μｌ
【０１６０】
分析物（５０μｌ）を、上述のサーモサイクラーを以下の条件下で用いて増幅した：
９４℃で１分間／９４℃で２８秒〜５５℃で２８秒〜７２℃で３８秒（３５サイクル）／７２℃で５分間／８℃で浸漬。
【０１６１】
第二回の増幅で、第一のＰＣＲ産物５μｌを、ＨＢＶプライマー３および４、および、以下の条件を用いてさらに増幅した：
ＰＣＲ２ｒｘｎ
プライマー３（１０μＭ）                                    １μｌ
プライマー４（１０μＭ）                                    １μｌ
１０倍濃度の緩衝液                                          ５μｌ
ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）                                  １μｌ
蒸留水                                                    ３６.７５μｌ
Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                             ０.２５μｌ 
チューブあたり総容積                                ４５μｌ
上記に加えて、ＰＣＲ産物ｖ.ｒｘｎ                     ５μｌ
反応容積                                            ５０μｌ
【０１６２】
このＰＣＲ２分析物を、上述のサーモサイクラーを用いて  、以下の条件を用いて増幅した：
９４℃、１分間／９４℃で２８秒、−５５℃、２８秒、−７２℃、３８秒（３５サイクル）／７２℃、５分間／８℃で浸漬。
【０１６３】
すなわち、ＰＣＲ２産物を、電気泳動（適切な分子量マーカーを含む１.５％アガロース）で分画した。約５２０塩基対を含むバンドを切り出し、キアゲン（ヒルデン，ドイツ）製のＱＩＡクイック（ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キットを用いて単離した。
【０１６４】
実施例４：ＨＤＢ１１の配列解析
精製したＰＣＲ産物を、メディジェノミクス（Ｍｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘ，マルティンスリート，ドイツ）によって、ＡＢＩ ３７００カピラールシステム（Ｋａｐｉｌｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ）をＡＢＩビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）ターミネーター・ケミストリー・バージョン１.１とＡＢＩ配列解析ソフトウェア・バージョン３．６と組み合わせて用いて、実施例３で説明されているプライマー３および４を用いて配列解析した。
【０１６５】
配列解析の結果
サンプル中で、ＨＢｓＡＧの配列領域内のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ２と最良の一致を示した一方で、決定基領域における総計１０個のアミノ酸置換が存在したことが示された（図２および５も参照）：
ＨＤＢ１１：                Ｄ，ａｙｗ２：
１．）  Ｉｌｅ（Ｉ）   １０３Ｍｅｔ（Ｍ）に置換された
２．）  Ａｌａ（Ａ）   １１４Ｓｅｒ（Ｓ）に置換された
３．）  Ｉｌｅ（Ｉ）   １１５Ｔｈｒ（Ｔ）に置換された
４．）  Ａｓｎ（Ｎ）   １１６Ｔｈｒ（Ｔ）に置換された
５．）  Ａｓｎ（Ｎ）   １１７Ｓｅｒ（Ｓ）に置換された
６．）  Ａｒｇ（Ｒ）   １１８Ｔｈｒ（Ｔ）に置換された
７．）  Ｇｌｎ（Ｑ）   １２０Ｐｒｏ（Ｐ）に置換された
８．）  Ｔｈｒ（Ｔ）   １２７Ｐｒｏ（Ｐ）に置換された
９．）  Ｈｉｓ（Ｈ）   １２９Ｇｌｎ（Ｑ）に置換された
１０．）Ｔｙｒ（Ｙ）   １３６Ｓｅｒ（Ｓ）に置換された
加えて、位置＃９６でのアミノ酸置換がある：
１１．）Ａｌａ（Ａ）   ９６Ｖａｌ（Ｖ）に置換された
【０１６６】
２００２年１０月２日に採取された最初の血液サンプルの異なる試験管で行われた数回の独立した実験で、これらの結果は、同じ配列解析結果で再現された。
【０１６７】
ただし、ａａ位置＃１２２は、第二の解析ではＬｙｓ（Ｉ）である場合が多かったのに対し、第一の解析ではＡｒｇ（Ｒ）と読み取られたことだけを除く。
【０１６８】
ヌクレオチドの特徴から、異なるサブタイプ（ａｄ、特にａｙ）の２種のＢ型肝炎ウィルスが共存する可能性があるという示唆も可能だが、アミノ酸配列は変化しないということ、または、上述のアミノ酸置換を含む新規の変異体が存在するという結論の両方の解釈が可能である。この結論は、特に陰性のＥＩＡ結果から得られるが、なぜなら、いずれの場合においても、用いられたＥＩＡ決定方法の極めて優れた検出限界という観点で、循環している既知の構造のＨＢｓＡｇが多量に存在し得るために、陽性のＥＩＡ結果が生じるためである。
【０１６９】
それゆえに、位置１２２に対応するアミノ酸は、配列番号１２の配列、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および、配列番号３０において、ＫまたはＲのいずれかであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】ＨＤＢ１１と比較した、６種の上述のＨＢＶ遺伝子型の決定基のアミノ酸配列の概要を示す。
【図２】決定基のヌクレオチドおよびアミノ酸配、同様に、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ２のすぐ隣の領域を示す。
【図３】ＨＤＢ１１のヌクレオチド配列と比較した、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのサブタイプａｙｗ２に関するＨＢＶの決定基表面抗原のヌクレオチド配列を示す。
【図４】ＨＤＢ１１のヌクレオチド配列における翻訳に関連する差を要約する。
【図５】決定基領域におけるＨＤＢ１１のヌクレオチド配列、同様に、対応するアミノ酸配列を示す。
【図６】ＨＤＢ１１の決定基の対応するポリペプチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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