(57)【要約】  本発明は、エンドソーム/リソソーム細胞間分解(degradation)経路、及び、エキソサイトーシス経路を組合せた方法を利用(exploiting)することによって細胞外空間由来の治療標的の継続的な除去を許容する選択(Culling)融合タンパク質(CFPs)と呼ばれる新規治療分子を提供する。細胞のエンドサイトーシス及びエキソサイトーシスメカニズムを適宜利用することによる本発明の生産物は、細胞により複数回再利用され、所望されない分子を除去することができる。従って、かかる治療分子は低濃度で投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) ヒト細胞表面受容体と結合することが可能であり、且つエキソサイトーシスドメイン及びエンドサイトーシスドメインにより形成される再利用ドメイン；並びに
b) 細胞外治療標的と結合するタンパク質ドメイン；
を含んで成るキメラタンパク質。
【請求項２】
前記ヒト細胞表面受容体がヒトトランスフェリン受容体であり、且つ前記エンドサイトーシスドメインがヒトHFEタンパク質、又はヒトデルタN-ラクトフェリンのαl-α2ドメインである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記エキソサイトーシスドメインがヒトHFEタンパク質のα3ドメインである、請求項２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、又はSEQ ID NO：7を含んで成る、請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質ドメインが：サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、免疫グロブリン、糖脂質、グリコサミノグリカン、核酸、ウィルス性タンパク質、バクテリア性タンパク質、又は合成有機分子から選定される、細胞外治療標的と結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記細胞外治療標的を結合しているタンパク質ドメインが、細胞外領域の膜-結合タンパク質、分泌タンパク質、ウィルス性タンパク質、抗体の抗原結合ドメイン、又は１つ以上のかかるタンパク質配列の選定されたドメイン：から選定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記エキソサイトーシスドメイン、前記エンドサイトーシスドメイン、及び前記細胞外治療標的を結合しているタンパク質ドメインを含むタンパク質中に含まれるもの以外に、非相同性タンパク質配列に属しているアミノ酸配列を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
非相同性シグナルペプチドを更に含む請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
細胞外治療標的及び対応している任意のSEQID NO：11-14配列として、VEGFを結合しているタンパク質ドメインを有する請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
細胞外治療標的及び対応している任意のSEQID NO：16-19配列として、TNFαを結合しているタンパク質ドメインを有する請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
細胞外治療標的及び対応している任意のSEQID NO：21-24配列として、IL-18を結合しているタンパク質ドメインを有する請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記エキソサイトーシスドメイン、前記エンドサイトーシスドメイン、及び細胞外治療標的を結合しているタンパク質ドメインが対応の天然配列の活性突然変異体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質が活性フラクション、前駆体、塩、誘導体、接合体、又は複合体の形態にある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
請求項1から12に記載のキメラタンパク質をコードするDNA配列を含んで成るDNA分子であって、実質的に同一のヌクレオチド配列を含んで成るDNA分子。
【請求項１５】
前記DNAの発現がプロモーターの制御下にある、請求項１４に記載のDNA分子を含んで成る、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１７】
請求項16に記載の形質転換細胞を培養すること、及び前記発現したタンパク質を収集することを含んで成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の調製方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の精製方法。
【請求項１９】
活性成分として請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、又は請求項１６に記載の細胞を含んで成る医薬組成物。
【請求項２０】
医薬としての請求項1〜12のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、又は請求項１６に記載の細胞の使用。
【請求項２１】
疾患の治療又は予防のための医薬組成物中の活性成分として、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、又は請求項１６に記載の細胞の使用。
【請求項２２】
疾患の治療又は予防のための方法であって、有効量の請求項1〜12のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、又は請求項１６に記載の細胞を投与することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規治療タンパク質、組成物、及びかかるタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換治療タンパク質は、一般的に循環中又は細胞膜上へ置かれ、生物学系への応答を誘発する治療標的へ、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する。特に細胞外治療標的(以下、ETTs)の排出は、組換体治療（例えば可溶性又はdecoy受容体、抗体、又は他の結合タンパク質）を結合することによって達成することができ、疾患経路を遮断する結果となり、ここでのETTは重要な役割を果たす。実施例は、免疫接着、融合タンパク質（ヒト免疫グロブリンのFc部位へ連鎖するタンパク質のETT結合部位を含む）(WO 91/08298, WO 98/02540)。
【０００３】
かかるアンタゴニストは、期待される臨床結果を達成するために、外因性又は内因性起源の循環治療標的を除去することにより、しばしば高濃度で投与される。高用量投与の結果として生じる副作用は、しばしば臨床開発における候補薬物分子の不成功を導く。従って、中和反応方法のためにETTsを分解(degrade)することができ、且つ多数のターンオーバーを保有することができる分子は、治療に高く必要とされる。
【０００４】
中和分子の第一のカテゴリーは、細胞外空間において治療標的を修飾及び/又は分解(degrading)し、それらを不活性化することができる酵素、例えばプロテアーゼによって表される。いくつかの細胞外プロテアーゼの分類は、基質特異性に観点から、例えばMMPs(マトリックスメタロプロテイナーゼ；McCawleyLJ and Matrisian LM, 2001)又はADAMs(A Disintegrin And Metalloprotease；Blobel CP, 2002)によって特徴付けられたが、それらの活性を特異的ETTへ正確且つ容易に導くことができない。
【０００５】
可能な代替は、細胞外流体、例えば血液又はリンパ、からのETTsを、細胞内区画へ再度導き、エンドリソソーム系を形成することである。ここでのETTsは細胞内プロテアーゼにより分解され得る。エンドリソソーム系は一連の膜-結合細胞内区画を含む。ここでの細胞外マテリアル流動は、一連の小胞-様細胞小器官、早期のエンドソーム、エンドソーム運搬小胞、後期のエンドソーム及びリソソームである主なものを通してベクトル的に進行する。エンドリソソーム系の様々な成分は、特異的なタンパク質分解活性のための成分であり、そして全プロセスは、小胞内部のカルシウム濃度及びｐHに高く依存する(Pillay CS etal., 2002; Sachse M et al., 2002)。
【０００６】
細胞外マテリアルは、エンドサイトーシス又はファゴサイトーシスによりエンドリソソーム系に入ることができる。エンドサイトーシスは細胞表面分子及び受容体の発現の調節における本質的なプロセスを構成し、そして受容体-仲介エンドサイトーシスは、シグナル経路を調節するために、いくつかの代謝産物及び/又は結合分子の分解を導入するために特異的な細胞外分子が入ることを可能にする唯一の細胞メカニズムである。細胞外リガンド及び表面に露出した受容体により形成される複合体は、エンドリソソーム系に入ることができ、且つ早期又は後期エンドソーム中で以下の３つの経路内の一つへと分類することができる：
(i)全リガンド-受容体複合体は原形質膜へ戻り再利用され得る；
(ii)リガンド-受容体複合体は、細胞表面で再利用される受容体と共に分離され、そして更にリガンドは経路に従って誘導される；或いは
(iii)全リガンド-受容体複合体は当該経路の後期段階を標的とすることができる。
【０００７】
受容体-仲介輸送メカニズムは、細胞中(エンドサイトーシス)、細胞外(エキソサイトーシス)、及び細胞間(トランスサイトーシス)への、細胞外巨大分子の輸送のための経路を提供する。
【０００８】
特に多様な受容体-仲介輸送メカニズムは、細胞内ターゲッティング及び薬物運搬のために近年同定され(Swaan PW,1998)、トランスフェリン受容体-仲介エンドサイトーシス経路は、最も研究されているものの一つであり(Qian ZM etal.,2002)、そして多くの分子はこの範囲、例えばトランスフェリン-放射活性アイソトープ接合(conjugates)、トランスフェリン-毒性接合(conjugates)、並びにトランスフェリン-DNA接合(conjugates)のために作製された。
【０００９】
トランスフェリン受容体(TfR)は血清トランスフェリンと結合する２量体の膜受容体である。pH 7.4で、細胞表面上の鉄トランスフェリン(Tf-Fe；鉄とのキレート)はTfRへ結合し、そして当該複合体は受容体-仲介エンドサイトーシスを経由して内在化する(Richardson DR and Ponka P,1997)。Tf-Fe-TfR複合体は、被覆ピットと呼ばれる領域において結集し、そしてクラスリン-被覆小胞の形成を通してそれらを内在化させてエンドソームを形成する。ATP-駆動プロトンポンプはエンドソームの内側を酸性化し、且つ当該鉄イオンは、Tfの立体配座の変化を通すようにTfから放出される。アポ-トランスフェリン(鉄は存在しない)はpH 5.6で、TfRと密着結合し、そして早期エンドソーム及びエキソサイトーシス経路の発芽を経由して原形質膜へ再度導かれる。従ってアポ-トランスフェリン(Apo Tf)及び鉄のトランスフェリン(Tf-Fe)はTfRへの多様な結合特徴を有する。一度、Tf/TfR複合体が細胞表面に到達した場合、TfRは立体配座の変化を行い、そして当該結合からアポ-トランスフェリンを放出する。当該サイクルはトランスフェリンの循環への放出により完了する。
【００１０】
トランスフェリン受容体は、トランスフェリンファミリーのタンパク質のメンバーである他のタンパク質（Fe3+輸送(血清トランスフェリン)、特にラクトフェリン及び遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質に関与する）により認識され得る。
【００１１】
ラクトフェリン(Lf)は、感染及び重篤な炎症に対する宿主防御に従事して鉄-結合タンパク質を幅広く発現する。更にラクトフェリンは細胞表面受容体に結合し、鉄を細胞中へ輸送するが、Tf-TfR複合体とは違って、ラクトフェリンはエキソサイトーシスされない。しかしながら、小腸へ鉄を運搬することができるアポ-及び鉄ラクトフェリンは、共に特異的に結合することができ、そしてエンドサイトーシスされる(McAbee DD etal., 1993)。ラクトフェリンは、3次元構造及び鉄結合サイトにおいてトランスフェリンと非常に類似している。ラクトフェリンは、その鉄放出活性においてトランスフェリンと区別され(ｐH２から４の間で、そしてトランスフェリンに関するｐH6から4ではない)、そして付加的な活性においてトランスフェリンと区別される（例えばタンパク質分解、細胞成長促進、及び抗微生物活性(Baker EN etal., 2002)。ラクトフェリンの受容体-仲介細胞輸送は多様なモデル（例えば、培養し分化したウシ脳毛細管内皮細胞(Fillebeen C etal., 1999)、又はラットの肝臓(Meilinger M etal., 1995)）中で実証された。
【００１２】
遺伝的ヘモクロマトーシスタンパク質(HFE)は、遺伝的な鉄過剰負荷における遺伝子欠陥の生産物として同定された。HFEは、調節メカニズムが明確でないにもかかわらず、鉄取り込みの調節因子として特徴付けられた。HFEタンパク質はpH 7.4でTfRと密着結合するが、pH 6.0では結合せず、そしてトランスフェリン受容体により、細胞内区画へ輸送される(Lebron JA etal., 1998; Davies PS etal., 2003)。本タンパク質の可溶性ドメインはTfRにより共-結晶化した。構造解析では、HFEのα1-α2ドメインがTfRへ結合することが解明された(Bennett MJ etal., 2000)。TfRにおけるその調節機能のメカニズムは未知のままであるが、HFEが低いpHのためにエンドソーム中でTfRから放出されることが示唆されている。HFEタンパク質のα3ドメインは、ジスルフィド結合を経由してβ2マクログロブリンと相互作用し、そしてこの相互作用は、HFEタンパク質の細胞表面へのエキソサイトーシスのために要求される(Feder JN etal., 1998)。
【００１３】
多くの構造-機能研究はトランスフェリンファミリーに属するタンパク質において行われてきた。例えば、キメラタンパク質はヒトラクトフェリン及びウシトランスフェリンから由来するセグメントから成り、多様なバクテリア受容体にヒトラクトフェリン領域を結合させることを具体化するために生み出された(Wong H and Schryvers AB, 1998)。或いは、トランスフェリン融合タンパク質は、治療分子、例えば神経成長因子(NGF)を血液脳関門を通して、中枢神経系へ運搬するためにデザインされた(Park E etal., 1998)。
【００１４】
未変化の受容体結合領域以外を変化させたラクトフェリン変異体、pH-依存性鉄結合及び放出は公知である(WO 97/45136)。他のラクトフェリン突然変異体は、減少した糖鎖形成及び増加した血清半減期、更に減少した鉄のための受容体結合、そして治療タンパク質又はペプチドと融合することができることを示す(WO 03/20746)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞中への治療的トランスフェリンを含む二重特異性キメラタンパク質(WO 91/12023, WO 96/39510)、ペプチド(WO 02/44329)又はHFEのα1-α3ドメイン(WO 02/24929)の選択的輸送は開示されているが、エキソサイトーシスを促進するための活性を意味するものではなく、ゆえに本明細書においてキメラ分子の再利用を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
本発明は、HFEタンパク質（エンドソーム/リソソーム細胞間分解(degradation)経路、及び、エキソサイトーシス経路を組合せた方法を利用(exploiting)することによって細胞外空間由来の治療標的の継続的な除去を許容する）の特異的ドメインに基づく選択(Culling)融合タンパク質(CFPs)と呼ばれる新規治療分子を提供する。細胞のエンドサイトーシス及びエキソサイトーシスメカニズムを適宜利用することによる本発明の生産物は、細胞により複数回再利用され、所望されない分子を除去することができる。従って、かかる治療分子は低濃度で投与することができる。
【００１７】
本発明の他の目的は、HFE基づくキメラタンパク質をコードするDNA、それらを発現する細胞、及び生産、単離、アッセイ、及びかかるタンパク質の使用方法に関する。更に本発明の特徴及び利点、例えば医薬組成物及び疾患の治療方法は、以下の詳細な説明から明白にされるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の主な目的はキメラタンパク質であり、以下：
a)ヒト細胞表面受容体を結合することができ、且つエキソサイトーシスドメインとエンドサイトーシスドメインにより形成される再利用ドメイン；並びに
b)細胞外治療標的を結合するタンパク質ドメイン、
を含んで成る。
【００１９】
少なくとも３つの成分を含む選択(Culling)融合タンパク質(CFPs)と呼ばれる、本発明のキメラタンパク質は、程度を異にして：選択(Culling)ドメイン(CD)、エキソサイトーシスドメイン(ExDO)及びエンドサイトーシスドメイン(EnDO)を集合させることができる。選択(Culling)ドメインは、ETTを結合しているポリペプチド配列を含む。エキソサイトーシスドメインは、１つ以上の体細胞のタイプ上で発現した細胞表面受容体を結合しているポリペプチド配列を含む。エンドサイトーシスドメインは、ポリペプチド配列（細胞外空間中で細胞受容体及びETTから解離した後、CFPを細胞表面へルーティングすることを可能にする）を含む（図１）。
【００２０】
受容体-仲介エンドサイトーシスによるエンドソーム-リソソーム形成は、天然の経路であり、血流分子（EGF、インスリン、コレラ毒、ウィルス粒子、及びLDLを含む）を過度に分解する。本発明はこの分解経路を利用して、治療標的を無力化する。かかる触媒分解は、繰り返し使用できるものとして、薬物分子の投与を最小化することができ、そして中和抗体及び/又は副作用の増加を軽減し得る。
【００２１】
上記文献の観点では、ヒトトランスフェリン受容体はヒト細胞受容体であり、本発明のキメラタンパク質を再利用するために使用され得る。従って、好適な再利用ドメインを形成するエンドサイトーシス及びエキソサイトーシスドメインは、ヒトトランスフェリン系と相互作用すべきである。
【００２２】
本明細書における、エンドサイトーシスドメインの例は、とりわけヒトHFEのα1-α2ドメイン(SWISSPROT Acc. No. Q30201；SEQ ID NO：1のフラグメント23-205)及びヒトδN-ラクトフェリン(SWISSPROT Acc. No. P02788；SEQ ID NO：2のフラグメント51-711)の配列等から選定できる。これらのエンドサイトーシスドメインはヒトトランスフェリン受容体と相互作用し、そしてヒトHFEタンパク質のα3ドメイン(SWISSPROT Acc. No. Q30201；SEQID NO：3のフラグメント206-297)により形成されたエキソサイトーシスドメインへ融合することができる。この後者の配列は、エンドソームの酸性pHで、例えばβ2-ミクログロブリン等の膜タンパク質へ結合するCFPを許容し、エキソサイトーシスのために細胞表面へもたらされる。
【００２３】
ヒトラクトフェリン及びHFE変異体は、融合分子の改善された血清半減期、in vitroでの溶液安定性、又はバイオアベイラビリティーに制限した治療特徴を示すことが文献に開示された。本発明は非常に多様な方法（即ち、細胞外空間において分解及び再利用するために、細胞外治療標的を細胞区画内へ輸送するシャトル分子として作用することができる）における融合分子作用の発生を発表する。
【００２４】
上記述べたエキソサイトーシス及びエンドサイトーシスドメインは、任意の順序で再利用ドメイン中に集合することができる。ラクトフェリン/HFE-に基づく再利用ドメインRC1(SEQ ID NO：4)及びRC2(SEQ ID NO：5)は、エキソサイトーシスドメインへのエンドサイトーシスドメインN-末端を有する。ラクトフェリン/HFE-に基づく再利用ドメインRC3(SEQ ID NO：6)及びRC4 (SEQ ID NO：7)はエンドサイトーシスドメインへのエキソサイトーシスドメインN-末端を有する。
【００２５】
選択(Culling)ドメイン(CD)はCFPタンパク質ドメインであり、特定の場合において、細胞外空間からのCFP-ETT複合体の細胞間エンドソーム系への、トランスフェリン受容体を介する内在化を許容するために十分な親和性を有し、細胞外治療標的(ETT)を結合することができる。そのためにETTは細胞中で、維持される場所で放出され得る。そして、場合によっては、CFPsにより認識される細胞受容体が存在している肝細胞又は任意に他の細胞タイプの中で分解され得る。
【００２６】
ETTは、任意の内因的に又は外因的に産生された、細胞外流体中（例えば血液又はリンパ等）で循環している天然又は合成分子であり、疾患に関連していることが見出されたサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、免疫グロブリン、糖脂質、グリコサミノグリカン、核酸、ウィルス性タンパク質、細菌性タンパク質、又は合成有機分子であり得る。
【００２７】
CDは再利用ドメイン（図2A）のN-又はC-末端で融合され得る。そして：膜結合タンパク質の細胞外領域、分泌タンパク質、ウィルス性タンパク質、抗体の抗原結合ドメイン、又はかかるタンパク質配列の１つ以上の選定されたドメインから選定されたタンパク質配列であり得る。
【００２８】
ETTs、及び天然にETTを結合しそれによって対応のCDを含有しているヒトタンパク質の例を、表Ｉに示す。或いはCDタンパク質配列は、一価抗体の可変領域、ファージにディスプレイされた配列、又は任意に他のタンパク質配列ライブラリー（ETTsによるスクリーニング、及びベクター中でサブクローンできる）で同定することができる(Pi ni A and Bracci L, 2000)。代替溶液はヒトサイトカイン及びケモカインと相互作用することが知られているウィルス性タンパク質により提供される(Beisser PS etal., 2002)。
【００２９】
本発明のキメラタンパク質は、エキソサイトーシスドメイン、エンドサイトーシスドメイン、及び細胞外治療標的を結合しているタンパク質ドメインを含むタンパク質において含まれるもの以外の、非相同タンパク質配列に属するアミノ酸配列を更に含んでよい。この非相同配列は、有意に拮抗性"選択(culling)"活性を損傷することなしに、更なる特性を提供することを意図したものである。
【００３０】
かかる付加的な特性の例は、より簡単な精製手順(例えば、アフィニティー精製を可能にするヒスチジンタグの使用)、体液中でのより長い半減期、又は細胞外局在化である。後者の特徴は、上記定義中に含まれる、キメラタンパク質の特定の群を定義するために特に重要である。これらのペプチドの単離及び精製を促進させる場所だけでなく、CFPs、ETTs及び天然で相互作用する細胞受容体のある場所でもCFPsを空間中に位置させることを可能にするからである。従ってCD及び再利用ドメインの順序が、任意の天然に存在するシグナル配列をN-末端に置くことを許容しない場合、CFPsは非相同のシグナルペプチド、例えばマウスlgのκ鎖V-III (SWISSPROT Acc. NO. P01658；SEQID NO：8のフラグメント1-21)、又は対応のヒト配列(SWISSPROT Acc. NO.P18136；SEQ ID NO：9のフラグメント1-21)の一つを含んでよい。
【００３１】
用語"非相同"とは、本明細書において使用する場合、CFP中に含まれる特異的ドメインを有する任意のもの以外のタンパク質に属している任意のポリペプチドを指定するために意図したものである。
【００３２】
可溶性融合タンパク質中のN-又はC-末端のいずれかに含まれ得る非相同性配列の例は、以下の：膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン不変領域(Fc 領域)、多重合ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、排出(export)配列、又はアフィニティークロマトグラフィーにより精製可能な配列である。
【００３３】
これらの非相同性配列の多くは、発現プラスミド中で商業的に入手できる。なぜならこれらの配列は、付加的な特性を提供するための融合タンパク質中に通常含まれるからである(2003)。かかる追加の特性の例は、体液中でのより長い半減期、細胞外局在化、又は"ヒスチジンタグ"(Gentz etal., 1989)と呼ばれる、又は”HA”タグ、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープ(Wilson etal., 1994)によるヒスチジン形成を伸長させることを許容するより簡単な精製手順である。仮に必要ならば、非相同性配列は、タンパク質分解的切断、により除去することができる。例えば可溶性タンパク質及び非相同性配列の間にタンパク質分解的切断サイトを挿入し、そして適宜プロテアーゼに精製した可溶性融合タンパク質を暴露する。これらの特徴は、可溶性融合タンパク質のために特に重要である。なぜなら、これらの特徴は医薬組成物の調製においてそれらの生産及び使用を促進させるからである。
【００３４】
当該可溶性融合タンパク質が免疫グロブリン領域に含まれる場合、当該融合は直接的であっても、又は1〜３個のアミノ酸残基長、又はそれより長い、例えば13個のアミノ酸残基長であり得る短リンカーペプチドを経由してもよい。前記リンカーは、配列E-F-M(Glu-Phe-Met)のトリペプチドであってよく、又は例えば本発明の物質の配列と免疫グロブリン配列の間に導入されたGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを含む13-アミノ酸リンカー配列であってよい。得られた融合タンパク質は、特性、例えば体液中で延長された滞留時間(半減期)を改善し、特異的活性を増加させ、発現レベルを増加させ、又は融合タンパク質の精製を促進させた。
【００３５】
好適な態様では、当該可溶性タンパク質はIg分子の不変領域へ融合する。好適には、重鎖領域、例えばヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインのような重鎖領域へ融合する。またIg分子の他のアイソフォーム（例えばアイソフォームIgG2又はIgG4、或いは他のIgクラス、例えばIgM又はIgA）は、本発明に係る融合タンパク質の産生に適している。融合タンパク質は単量又は多量、ヘテロ-又はホモ多量体であってよい。
【００３６】
更なる好適な態様では、官能的誘導体は、アミノ酸残基上で１つ以上の側鎖として発生する１つ以上の官能基と結合する少なくとも１つの部分を含む。好適には当該部分はポリエチレン(PEG)部分である。PEG化は公知の方法、例えばW099/55377に発表されたものによって実行され得る。
【００３７】
上記提示されたタンパク質エレメントを基礎として、一連の模範的なCFPsをデザインした(図2B)。
【００３８】
第一の群のCFPsはVEGF(血管内皮成長因子)、内皮細胞の増殖促進分子、腫瘍発達誘因メカニズムに対して向けられる。VEGF受容体の細胞外領域は、７つの免疫グロブリン相同性ドメインにより形成され、ここでの第二及び第三はリガンド結合のために重要であり、そして第一の３つのドメインは全結合親和性の確立のために必要である(Jussila L and Alitalo K.,2002)。ヒトVEGFR-1の３つのN-末端の免疫グロブリン相同性ドメイン(SWISSPROT Acc. No.P17948；SEQ ID NO：10のフラグメント27-327)により形成されたCDは再利用ドメインRC1又はRC2のC-末端で融合し、CFP-RC1(n)VEGF(SEQ ID NO：11)又はCFP-RC2(n)VEGF(SEQ ID NO：12)を形成することができる。或いはこのCDは、CFP-RC1(c)VEGF (SEQ ID NO：13)又はCFP-RC2(c)VEGF(SEQ ID NO：14)を形成している再利用ドメインRC1又はRC2のN末端に位置することもできる。
【００３９】
第二の群のCFPsは多くの自己免疫性疾患の原因である分子のTNFα(腫瘍壊死因子α)に対するものである。腫瘍壊死因子結合タンパク質と呼ばれるTNF受容体の可溶性部分は、循環しているTNFαを結合するために、且つ膜結合受容体との相互作用を遮断するために使用することができる(Lorenz HM and Kalden JR, 2002)。腫瘍壊死因子結合タンパク質1(SWISSPROT Acc. No. P19438; SEQ ID NO：15のフラグメント41-291)により形成されるCDを、CFP-RC1 (n) TNF (SEQ ID NO：16)又はCFP-RC2 (n) TNF (SEQ ID NO：17)を形成する再利用ドメインRC1又はRC2のC-末端で融合することができる。或いは当該CDを、CFP-RC1(c) TNF (SEQ ID NO：18)又はCFP-RC2 (c) TNF (SEQ ID NO：19)を形成する再利用ドメインRC1又はRC2のN-末端に置くこともできる。
【００４０】
第三の群のCFPsは、IL-18(インターロイキン18)、強力な炎症性のサイトカインに対するものであり、いくつかの炎症症状において病態生理学的役割を有する。IL-18結合タンパク質(IL-18bp)と呼ばれるタンパク質はIL-18に結合することができ、そしてその活性を遮断することができる(Nakanishi K etal., 2001)。IL-18bp（SWISSPROT Acc. No. 095998; SEQ ID NO：20のフラグメント29-197）により形成されるCDを、CFP-RC1 (n)IL18 (SEQ ID NO：21)又はCFP- RC2(n)IL18 (SEQ ID NO：22)を形成する再利用ドメインRC1又はRC2のC-末端で融合することができる。或いは当該CDをCFP-RC1(c)IL18 (SEQ ID NO：23)又はCFP-RC2 (c)IL18 (SEQ ID NO：24)を形成する再利用ドメインRC1又はRC2のN-末端に置くことができる。
【００４１】
更にエキソサイトーシスドメイン、エンドサイトシーシスドメイン、及びCFPを形成する細胞外治療標的を結合しているタンパク質ドメインは、対応の天然配列の活性突然変異体であり得る。本発明のキメラタンパク質の特性は、これらの得られた活性突然変異体中で維持されるべきであり、又は更に強力であるべきである。当該分子のカテゴリーは前記配列の天然又は人工のアナログを含み、ここで１つ以上のアミノ酸残基を付加、欠失又は置換した。但しそれらは、本発明で限定したものと同等レベル又はより高いレベルで、且つ当業界において公知な手段及び以下の実施例で開示した手段によって測定されたものと同一の生化学的活性を示す。例えば、その活性を発揮するために必要とされるタンパク質配列を最小化するためにネスト化した欠失は、CFPのエレメントにおいて産生し、その結果としてCFPの大きさを減じることができる。
【００４２】
本発明によれば、これらの活性突然変異体の好適な変化は、通常"保存的"又は"安全"な置換として公知である。保存的なアミノ酸置換は、分子の構造及び生物学的機能を保存するために十分に類似する化学的特性を有するアミノ酸によるものである。アミノ酸の挿入及び欠失は、それらの機能を変化させることなく、詳細には仮に挿入又は欠失が数個のアミノ酸（例えば10個、及び好適には３個未満）に関与するだけの場合、且つアミノ酸（タンパク質又はペプチドの機能的な立体構造に重要な意味を持つ）を除去せず、又は置き換えることなく、上記定義した配列中でも作製し得ることは明確である。
【００４３】
文献は、天然タンパク質の配列及び／又は構造の統計及び理化学試験に基づき実施することができる保存的アミノ酸置換の選定の多くのモデルを提供する(Rogov SI and Nekrasov AN, 2001)。タンパク質デザイン実験は、アミノ酸の特定の部分集団の使用が、折り畳み可能であり、且つ活性なタンパク質（アミノ酸"同義(synonymous)"置換を助長する（タンパク質構造中でより簡単に適合でき、そして機能的及び構造的ホモログ及びパラログを検出するために使用できる）を生産できることを示した(Murphy LR etal., 2000)。当該同義アミノ酸群、及びより好適な同義群は表IIに定義する。
【００４４】
更に同様の化合物は、慣用のコード化DNAの突然変異誘発技術から、コード化DNA配列(例えばDNAシャフリング、ファージディスプレイ/選定)のレベルでのコンビナトリアル技術から、コンピューター補助されたデザイン試験から、或いは非天然アミノ酸導入から、従来技術及び以下の実施例において発表されたような所望される活性のバリデーションを行うことにより得てもよい。
【００４５】
或いは、機能のために本質的である本発明の可溶性タンパク質中のアミノ酸は、当業界における公知方法、例えば突然変異誘発又はアラニン-スキャンニング突然変異誘発を指示するサイトの方法によって同定することもできる(Cunningham etal., 1989)。特に重要なのは、他を付加することにより変化させたアミノ酸、又は中性アミノ酸の置換であり、高く所望される改良特質、例えばより少ない凝集、を有するタンパク質を生み出すことができる。凝集は活性を減少させるだけでなく、医薬又は生理学的に許容され得る製剤を調製する場合にも問題になり得る。なぜなら凝集は免疫原性であるからである(Cleland etal., 1993)。
【００４６】
トランスフェリン系と相互作用する再利用ドメインの特定の場合において、HFE及びラクトフェリンに存在する天然イオン結合サイトは、細胞性鉄代謝と相互作用しない分子を生産するために突然変異させることができる。
【００４７】
或いは、活性突然変異は、哺乳動物に投与する場合、前記可溶性タンパク質の免疫原性を減少させる配列変化をもたらし得る。文献は、当該適用範囲でデザイン及び導入され得るそれらの配列変化、或いは他の機能の最適化（特に非-ヒト、非-哺乳動物、又は非-天然タンパク質である場合の治療タンパク質の安全且つ有効な投与を許容する）のための多くの実施例を提供する(Vasserot AP etal., 2003; Marshall SA etal., 2003;Schellekens H, 2002; Gendel SM, 2002; Graddis TJ etal., 2002; WO 03/104263; WO 03/006047; WO 02/98454; WO 02/96454; WO 02/79415 ; WO 02/79232; WO 02/66514 ; WO 01/40281; WO 98/52976; WO 96/40792 ; WO 94/11028)。
【００４８】
本発明のキメラタンパク質は所望される使用及び/又は生産の方法（例えば活性フラクション、前駆物質、塩、誘導体、接合体、又は複合体の形態）に従うことが好適である代替形態であり得る。
【００４９】
用語"活性"とは、かかる代替CFPs形態が、天然配列を含む本発明のCFPsの機能的特徴を保持すべきことを意味する。そして実施例にある任意のアッセイによれば、同程度の活性、又はより増加した活性を有する。最終的にCFPsは、医薬的に許容され、且つ有用であるべきである。
【００５０】
"同程度"である活性とは、可溶性タンパク質の変異体のために発表された任意のアッセイにおいて測定された活性が、本発明により定義されたような対応のCFPを用いて測定された活性と少なくとも同程度の規模であり、そして好適には75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％、及び多くても101％、102％、103％、104％、105％、110％、115％、120％又は125％の活性であることを意味する。
【００５１】
"増加した"活性とは、可溶性タンパク質の変異体のために発表された任意のアッセイにおいて測定された活性が、本発明により定義されたような対応のCFPを用いて測定された活性の少なくとも125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、450％、又は500％であることを意味する。
【００５２】
用語"フラクション"とは、正常では主要配列を変化させない修飾を生じる分子を言う。例えばin vivo又はin vitroでのペプチドの化学的誘導化(アセチル化又はカルボキシル化)であり、リン酸化反応(ホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニン残基の導入)、グリコシル化(糖鎖形成、例えば、哺乳動物の糖鎖付加又は脱糖鎖付加酵素へ影響する酵素へペプチドを曝すことによる)、アセチル化、アミド化、及び/又はミリストイル化のパターンを修飾することにより作製される。
【００５３】
"前駆物質"とは、細胞又は身体へ投与される前又は後に、代謝及び酵素的プロセシングにより本発明の化合物へ変換させることができる化合物である。
【００５４】
本明細書における用語"塩類"とは、本発明のカルボキシル基の塩類及びペプチド、ポリペプチド、又はそれらのアナログの酸付加塩の両方を言う。カルボキシル基の塩類は公知の方法により形成されてよく、そして無機酸、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛の塩類等、並びに有機塩基との塩類（例えば、アミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカイン等と共に形成されるような塩類）を含む。酸付加塩は、例えば、無機酸、例えば、塩酸又は硫酸による塩類、及び例えば、酢酸又はシュウ酸等の有機酸との塩類を含む。任意のかかる塩類は、本発明のペプチド及びポリペプチド、又はそれらのアナログと実質的に同様の活性を有する。
【００５５】
本明細書において使用される用語"誘導体"とは、アミノ酸部分の側鎖上又はN-/又はC-末端基上に存在する官能基から公知の方法により調製することができる誘導体を言う。かかる誘導体は、例えば、カルボキシル基及びN-アシル誘導体の遊離アミノ酸基、又は0-アシル誘導体の遊離ヒドロキシル基のエステル又は脂肪族アミドを含み、そしてアシル-基と共に、例えばアルカノイル-又はアロイル-基として形成される。
【００５６】
本発明のキメラタンパク質の有用な接合体又は複合体は、当業界において公知の分子及び方法（例えば、タンパク質検出のため(放射活性又は蛍光ラベル、ビオチン)又は薬物運搬のため（例えばポリエチレングリコール及び他の天然又は合成のポリマー））を用いて作製できる(Pillai0 and Panchagnula R, 2001)。
【００５７】
ポリマーは任意の分子量であってよく、そして分岐していても分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールのための好適な分子量は、取り扱い及び製造を容易にするために、約1kDaから約100kDaである(用語"約"は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子が既に述べた分子量よりもより重く、あるものはより軽いであろうということを示す）。他のサイズは、所望される治療プロファイル(例えば、所望される徐放の持続時間、効果、任意の生物学的活性の場合、取り扱い易さ、抗原性の欠乏の程度、及びポリエチレングリコールの治療タンパク質又はアナログへの他の公知の効果)に依存して使用してよい。
【００５８】
ポリエチレングリコール分子(又は他の化学部分)はポリペプチドの機能または抗原性ドメインへの効果を考慮するとポリペプチドへ結合する。当業者に公知の利用できる結合方法が数多く存在する（例えばEP401384）。
【００５９】
タンパク質分解へのCFP抵抗性は、-CONH-ペプチド結合を１つ以上の以下の：(CH2NH)還元(reduced)結合；(NHCO) retro inverso 結合；(CH2-0)メチレン-オキシ結合；(CH2-S)チオメチレン結合；(CH2CH2) carba結合；(CO-CH2)cetomethylene結合；(CHOH-CH2)ヒドロキシエチレン結合；(N-N)結合；E-alcene結合；又は-CH=CH-結合により置き換えることによって作り出すことができる。従って、本発明は更に可溶性CD164又はそれらの変異体を含み、ここでの少なくとも１つのペプチド結合は上記発表の通りに修飾された。更にアミノ酸はL又はD体のキラリティーを有す。いくつかの態様では、体内での半減期を延長させるためにアミノ酸のキラリティーを変化させることは好ましい。従っていくつかの態様では、１つ以上のアミノ酸は、L立体配座にあるのが好適である。他の態様では、１つ以上のアミノ酸は、D立体配座にあるのが好適である。
【００６０】
本発明の化合物は、上記発表した組換DNA-関連技術、及び化学合成技術を含む当業界において任意の周知手順によって調製してよい。
【００６１】
本発明の他の目的は、本発明のキメラタンパク質のためのDNA配列を含むDNA分子であり、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
"ヌクレオチド配列実質的に同一"とは、遺伝子コードの縮重の利点による全ての他の核酸配列を含み、更に所定のアミノ酸配列をコードする。
【００６３】
本発明は更に上記定義したDNA分子を含む発現ベクターを含み、ここでの前記DNAの発現はプロモーターの制御下にある。同様に宿主細胞は、かかるベクターにより形質転換され、そして本発明のキメラタンパク質の調製工程は、適宜培養培地中で形質転換した細胞を培養すること、及び発現タンパク質を収集することを含む。
【００６４】
CFPsを形成する異なるエレメントをコードするDNA配列は、制限酵素を用いて改良されたPCR法によって、そして適宜プラスミド中へ挿入して結紮して作製することができる。当該コード化配列は、選定された発現宿主（例えばE coli）に最適であるコドン利用法を有するために選定された(Kane JF, 1995)。
【００６５】
一度形成した発現ベクターを、適切な宿主細胞に導入し、その後ベクターを発現させて、所望のタンパク質を産する。本明細書において述べた本発明の任意の組換タンパク質の発現は、適宜発現ベクターを用いて、真核細胞(例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞)又は原核細胞中で効果を発揮することができる。当業界において公知の任意の方法を使用することができる。
【００６６】
例えば任意の上記方法によって得られたタンパク質をコードするDNA分子は、当業界における周知技術によって適宜構築された発現バクター中に挿入される。二重らせんのcDNAは、ホモポリマーテイリングにより又は合成的DNAリンカー又は平滑末端結紮技術の使用に関与する制限結合によりプラスミドベクターと結合し：DNAリガーゼはDNA分子を結紮するために使用され、そして所望されない結合はアルカリホスファターゼによる処理によって回避される。
【００６７】
所望されるタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターは、かかる方法において遺伝子発現及びタンパク質の生産を許容するような所望されるキメラタンパク質をコードするDNAへ結合する転写及び翻訳調節情報を含む特異的ヌクレオチド配列も含むべきである。転写されるために、当該遺伝子（ここに酵素が結合する）をRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターより前に置き、それによって転写工程を開始する。使用においては多様なかかるプロモーターが存在し、多様な効果(強い、及び弱いプロモーター)で作用する。
【００６８】
真核生物宿主のための多様な転写及び翻訳調節配列は、天然宿主に依存して使用してよい。それらはウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウィルス等から由来してよく、ここでの調節シグナルは高いレベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。それらの例は、ヘルペスウィルス、SV40早期プロモーター、酵母gal4遺伝子プロモーター等のTKプロモーターである。転写開始調節シグナルは、抑制及び活性化のために選定することができ、そのために遺伝子の発現を調節することができる。
【００６９】
本発明のタンパク質のためにコードされるヌクレオチド配列を含むDNA分子は、作用可能式に連鎖される転写的及び翻訳的調節シグナルを有するベクター中に挿入され、宿主細胞中に所望される遺伝子配列を統合することを可能にする。
【００７０】
導入されたDNAによって安定に形質転換された細胞は、更に１つ以上のマーカーを導入することにより選定することができ、発現ベクターを含む宿主細胞の選定を可能にする。当該マーカーは光合成栄養のためにも、成長刺激(auxo tropic)宿主、殺生剤抵抗性（例えば、抗体、又は重金属（例えば銅等)）へ提供してもよい。選定し得るマーカー遺伝子は、発現されるDNA遺伝子配列へ直接連鎖するか、又は共-トランスフェクションにより同一の細胞中へ導入されるかのいずれかが可能である。
【００７１】
発現ベクターは、当業界において公知の任意の哺乳動物、酵母、昆虫又はバクテリア発現系である。商業的に入手し得るベクター及び発現系は、Genetics Institute (Cambridge, MA)、Stratagene (La Jolla, California)、Promega (Madison, Wisconsin)、及びInvitrogen (San Diego, California)を含む様々な業者から入手できる。所望されるならば、発現を増強するため、及び適宜タンパク質フォールディングを促進するための、配列のコドン状況及び配列のコドン組合せは、導入される発現ベクター中で特に発現器官のために最適化することができる(米国特許 No. 5,082,767; Gustafsson C etal., 2004)。
【００７２】
特定のプラスミド又はウィルスベクターを選定するための追加の重要な因子は：ベクターを含む受容細胞が、ベクターを含まないそれらの受容細胞から容易に認識され、そして選定されることができ；ベクターのコピーの数が特定の宿主において所望され；そして異なる種間の宿主細胞の"シャトル"ベクターを可能にすることが所望されるか否かを含む。本発明に係る組換えベクターは制限されずに、YAC(酵母人工染色体)、BAC (細菌人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド、又は更に直線DNA 分子を含んで成り、染色体、非-染色体、半-合成又は合成DNAから成ってよい。
【００７３】
一般的に、組換発現ベクターは複製起点、宿主細胞の形質転換を許容する選択マーカー、及び下流の構造配列の直接的転写を導く高く発現する遺伝子から由来するプロモーターを含むであろう。非相同性構造配列は、翻訳開始及び終結配列、そして好適には、翻訳されたタンパク質を、ペリプラズム空間中、又は細胞外媒質中に直接分泌することを可能にするリーダー配列を有する適宜相において集合させる。特定の態様では、ここでのベクターは、哺乳動物宿主細胞中の所望される配列をトランスフェクト及び発現するために適用され、好適なベクターは、所望される宿主中に複製起点、適宜プロモーター及びエンハンサーを含み、そして更に任意に必要なリボソーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプライスドナー、及びアクセプターサイト、翻訳終結配列、及び5'-隣接非-転写配列を含むであろう。SV40ウィルスゲノム由来DNA配列は、例えばSV40起源、早期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化サイトは要求される非-転写遺伝子エレメントを提供するために使用してよい。
【００７４】
一度、構成(construct)を含むベクター又はDNA配列を調製した場合、当該ベクターを適宜宿主細胞中に、任意の多様な適した手段：形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、カルシウムホスフェート-沈殿、直接的なマイクロインジェクション等によって導入することができる。
【００７５】
宿主細胞は原核又は真核生物のいずれかであってよい。好適には真核性宿主である。例えば哺乳動物細胞、例えばヒト、サル、ブタ、マウス、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、マウス又はラットである。当該細胞は一次細胞、又は二次細胞、不死化細胞、培養細胞株であってよい。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のような細胞は、タンパク質分子に後-翻訳修飾（正確なフォールディング又は正確なサイトでのグリコシル化を含む）を提供するからである。更にヒト細胞発現CFPsは直接使用することができる。更に酵母細胞は後-翻訳ペプチド修飾（グリコシル化を含む）を実行することができる。多くの組換DNA戦略は強力なプロモーター配列及びプラスミドの高度な複製数を利用することであり、酵母中での所望されるタンパク質の生産のために利用することができる。酵母はクローン化した哺乳動物遺伝子上のリーダー配列を認識し、リーダー配列が担持するペプチドを生産及び分泌する(即ち、プレ-ペプチド)。
【００７６】
ベクター導入後、宿主細胞は、ベクターを含む細胞の成長により選択される選択培地の中で成長する。クローン化遺伝子配列の発現は所望されるタンパク質の生産において得られる。
【００７７】
本発明のこれらの目的は、CFPsの本特許出願によって提供される開示を、通常の分子生物学的技術の知識と組合せることにより達成することができる。多くの検討(Makrides SC, 1999)及び書籍は、ベクター及び原核又は真核宿主細胞）を用いて組換タンパク質のクローン及び生産の仕方を教示するために提供されている。例えばいくつかのタイトルはオックスフォード大学プレスにより発行された"A Practical Approach"シリーズ("DNA Cloning 2：Expression Systems"、1995;"DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996;"Protein Expression", 1999;"Protein Purification Techniques", 2001)である。
【００７８】
化学合成技術の例は、固相合成及び液相合成である。例えば、固相合成として合成されるC-末端のペプチドに対応しているアミノ酸は、有機溶媒中で溶解しない支持体と結合し、そして繰り返しの反応を交互に行うことによって、適宜保護基により保護されたそれらのアミノ基及び側鎖官能基を有する一つのここでのアミノ酸は、C-末端からN-末端へ順番に一つずつ、一つが縮合され、そして樹脂又はペプチドのアミノ基の保護基に結合したアミノ酸の存在するところの一つは放出されることによる方法において、ペプチド鎖は拡張される。固相合成方法は、使用される保護基のタイプに依存しているtBoc方法及びFmoc方法により大きく分類される。典型的に使用される保護基は、アミノ基のためにはtBoc (t-ブトキシカルボニル)、CI-Z(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、Br-Z(2-ブロモベンジルオキシカルボニル)、Bzl(ベンジル)、Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)、Mbh(4,4'-ジメトキシジベンゾヒドリル)、Mtr(4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル)、Trt(トリチル)、Tos(トシル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)及びC12-Bzl (2,6-ジクロロベンジル)；グアニジノ基のためには、N02(ニトロ)及びPmc(2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル)；並びに、ヒドロキシル基のためにはtBu(t-ブチル)を含む。所望されるペプチド合成後、それを脱-保護反応にかけ、そして固体支持体から切り離す。かかるペプチド切断反応は、Boc法のためのフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸、及びFmoc法のためのTFAで実施してよい。
【００７９】
本発明の組換又は合成的キメラタンパク質の精製は、本目的のために任意の一つの公知方法（即ち、任意の抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動法等を含む慣用方法）によって実施することができる。本発明のタンパク質を精製するために好適に使用されるであろう更なる精製手順は、標的タンパク質に結合し、そしてカラム中に含まれるゲルマトリックス上で生産及び固定化されるモノクローナル抗体又は親和性基を用いたアフィニティークロマトグラフィーである。タンパク質を含む不純物精製はカラムを通して通過させる。タンパク質はヘパリン又は特異的抗体によってカラムへ結合する。一方、不純物は通り抜ける。洗浄後、タンパク質はpH又はイオン強度を変化させることによりゲルから溶出される。或いは、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いることができる。当該溶出は、通常タンパク質精製に使用される水-アセトニトリルに基づく溶媒を用いて実施することができる。最終的に、組換又は合成キメラタンパク質の同定は、任意の適宜技術、例えばマススペクトルにより検証され得る。
【００８０】
或いはCFPsは、文献において開示された任意の方法を適用して、CFPsを発現するトランスジェニック動物のミルクから単離することができる(Protein Purification Applications, A Practical Approach (New Edition), Edited by Simon Roe, AEA Technology Products and Systems, Biosciences, 50；米国特許Nos. 6,140, 552)。
【００８１】
本発明は本発明のキメラタンパク質の調製物を精製することを含む。本明細書において使用されるような精製調製物は、調製物と言い、本発明の化合物の乾燥重量が少なくとも1％、好適には少なくとも5％である。
【００８２】
本発明の更なる目的は、活性成分としての本発明のキメラタンパク質を含む医薬組成物、或いは本発明のキメラタンパク質を発現する細胞である。本発明の他の目的は、所望されないETTの活性に関する疾患を治療又は予防するための医薬としての本発明のキメラタンパク質の使用であり、又は本発明のキメラタンパク質を発現する細胞の使用であり、そして特に医薬組成物中での活性成分としての使用である(及び医薬的に許容され得る担体、賦形剤、安定化剤、又は希釈剤との組合せへの製剤化)。
【００８３】
CFPsはETTのアンタゴニストとして作用し、そこへ導かれる。所定のETTsの大型変種は、本発明のキメラタンパク質により標的にされ得る。TNFα-誘導CFPsの変わりに取り入れられる上記例示したVEGF-誘導CFPsを使用する疾患は、癌、又は自己免疫性又は炎症性疾患であり得る。
【００８４】
免疫系の主要な機能は、例えば微生物のような外来浸入物に対して個体を保護することであり、当該免疫系は個体自身の組織を攻撃し、自己免疫性疾患として公知である病理学状態を導き、それはしばしば炎症性疾患時に関与する場合に起こり得る。適切なCFPは、それらのプロセスを誘発するETTを排除し得る。
【００８５】
CFPを含む医薬品又は医薬組成物の場合の制限的でない疾患リストは：多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、変形性関節炎、脊椎性関節症(spondylarthropathies)、炎症性腸疾患、内毒素血症、クローン病、Still's疾患ブドウ膜炎、Wegener'sgranulomatosis、ベージェット病、強皮症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、壊疽性膿皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、心筋炎、乾癬、全身性硬化症、C型肝炎、アレルギー、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、腸間膜梗塞、発作、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、気管支喘息、腸間膜梗塞、発作、繊維症、筋肉、腎臓及び心臓中の後-虚血性炎症、皮膚炎症、糸球体腎炎、若年性タイプＩ糖尿病、過敏性疾患、癌、ウィルス性又は急性肝疾患、アルコール性肝不全、結核症、敗血症ショック、HIV-感染、移植片対宿主病(GVHD)及びアテローム性動脈硬化症を含む。
【００８６】
従って、本発明の他の目的は、本発明のキメラタンパク質の有効量、又は本発明のキメラタンパク質を発現している細胞の投与を含んで成る疾患の治療又は予防方法である。
【００８７】
当該医薬組成物は、CFPに加えて、適した医薬的に教許容され得る担体、生物学的に互換性のあるビヒクル及び動物への投与に適した添加剤(例えば、生理食塩水)を含んでよく、そして最終的には、医薬的に使用され得る調製物中への活性化合物の処理を促進するような助剤(賦形剤、安定化剤又は希釈剤等)を含む。かかる組成物は本発明のキメラタンパク質に相乗的に作用する他の治療組成物と、又は本発明のキメラタンパク質との協調的な方法において最終的に組合すことができる。或いは、他の組成物は特異的な疾患(例えば、多発性硬化症のためのIFNβ)に対して治療的に活性である公知の化合物までにすることができる。これらの組成物は、追加の免疫抑制剤、又は抗-炎症性物質を更に含むことができる。或いは、可溶性物質を含む医薬組成物は、多様な治療計画において使用するための"カクテル"中に組合せることができる。
【００８８】
医薬組成物は、必要な投与形態に合致するように任意の許容され得る方法において、製剤化してよい。例えば、薬物運搬のための生体材料及び他のポリマーの使用、更に特殊な投与形態を検証するための多様な技術及びモデルは、文献に開示されている(Luo B and Prestwich GD, 2001; Cleland JL etal., 2001)。
【００８９】
"有効量"とは、疾患の経過及び重篤性に影響を及ぼすために（かかる病状の軽減又は緩和を導くために）十分である活性成分の量を言う。当該有効量は、投与経路及び患者の症状に依存するであろう。
【００９０】
"医薬的に許容され得る"とは、活性成分の生物学的活性の効果を干渉せず、そして投与される宿主に対して毒性がない、任意の担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与のための上記活性成分は、ビヒクル（例えば生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンカー溶液）中での注射のための単位投与形態で製剤化され得る。
【００９１】
任意の許容される投与形態は、当業者によって使用及び決定され、所望される活性成分の血液レベルが確立される。例えば、投与は多様な非経口経路によりされてよい（例えば皮下、静脈内、硬膜外、局所、皮内、髄腔内、直接心室内(direct intraventricular)、腹腔内、経皮(例えば徐放製剤)、筋肉内、鼻腔内、肺内(吸入)、眼球内、経口、又はバッカル経路）。
【００９２】
他の特に好適な投与経路はエアロゾル及びデボー製剤である。発明された医薬の徐放製剤、特にデポーは、明確に意図されたものである。
【００９３】
非経口投与は、時間をかけたボーラス注入又は段階的なかん流により可能である。非経口投与のための調製剤は、殺菌の水性又は非水性溶液、懸濁物、及び乳濁物を含み、当業界において公知の補助剤、又は賦形剤を含んでよく、通常方法によって調製することができる。更に、適宜油性注入懸濁物としての活性化合物の懸濁物を投与してよい。適切な脂溶性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレイン酸エステル又はトリグリセリドを含む。懸濁物の粘性を増加させる物質を含み得る水性注入懸濁物は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び/又はデキストランを含む。
【００９４】
更に任意に当該懸濁物は、安定化剤を含んでよい。医薬組成物は、注入による投与のための適宜溶液を含み、そして賦形剤と共に約0.01から99パーセント、好適には約20から75パーセントの活性化合物を含む。直腸内に投与することができる組成物は坐薬を含む。
【００９５】
非経口のための(例えば、静脈内、皮下、筋肉内)投与、活性タンパク質は、医薬的に許容され得る非経口ビヒクル(例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液)及び等張性を維持する付加物(例えばマンニトール)又は化学安定性(例えば保存剤及び緩衝剤)に関連する溶液、懸濁物、乳濁物、又は凍結乾燥したパウダーとして製剤化することができる。製剤化は通常使用される技術により殺菌される。経粘膜投与のために適切に浸透されるバリアへの浸透剤は、製剤中で使用される。かかる浸透剤は一般的に当業界において公知である。
【００９６】
経口摂取できる医薬又は生理学的に許容され得る調製物は、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、及びゼラチンで作られたソフト、シールカプセル、並びに可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールを含む。プッシュフィットカプセルは、充填物、例えばラクトース、結合剤、例えばスターチ、及び/又は潤滑剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム及び、任意に安定化剤との混合物に活性成分を含むことができる。ソフトカプセル中では、活性化合物は適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール中で溶解又は懸獨させてよい。更に安定化剤を付加してよい。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与に適した投与量であるべきである。
【００９７】
バッカル投与のための組成物は、慣用方法において製剤化される錠剤又はロゼンジの剤型を採ってよい。本発明に従い使用する吸入投与の化合物は、適したガスの発射（例えば二酸化炭素）を使用することにより、圧力を保たれたパック又はネブライザーとして存在しているエアロゾルスプレーの形態において都合よく運搬される。圧力を保たれたエアロゾルの場合、投与単位は計量した量を運搬するための数値を提供することによって決定され得る。例えばゲラチンのカプセル及びカートリッジは吸入器中で使用するために、当該化合物の粉体混合物及びラクトース又はスターチ等に基づく適宜粉体を含んで製剤化してよい。
【００９８】
当該化合物は注入、例えばボーラス又は継続的な注入によって非経口投与するために製剤化され得る。注入のための製剤は、保存剤を付加した単位投与形態、例えばアンプル中又はマルチ投与コンテナ中に存在してよい。当該組成物は、水性ビヒクル中の懸濁物、溶液又は乳濁物のような形態を採ってよく、そして例えば懸濁している、安定している、及び/又は分散している試薬等の製剤試薬を含んでよい。或いは、使用前は、適切なビヒクル、例えば水が存在しない殺菌ピロゲン-不存在水との組成のために、活性成分は粉体又は凍結乾燥形態にあってよい。
【００９９】
上記発表した製剤に加えて、当該組成物はデポー製剤としても製剤化され得る。かかる長期作用製剤は、移植(例えば、皮下又は筋肉内)又は筋肉内注射により投与してよい。従って、当該化合物は、例えば適宜ポリマー又は疎水性材料 (例えば、許容され得るオイル中での乳濁物として)、又はイオン変換樹脂、又はかろうじて溶解できる誘導体、例えば、かろうじて溶解できる塩等により製剤化され得る。更に、当該化合物は徐放システム、例えば治療剤を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスを用いて、運搬させてよい。多様な徐放材料が既に確立されており、当業者には周知である。徐放カプセルは、それらの化学的特質に依存して、数週間、最大 100日又は1年を通して当該化合物を放出し得る。
【０１００】
投与量は、服用者の年齢、性別、健康状態、及び体重、同時治療の種類、もしあるならば、処置頻度、及び所望される効果の特質に依存するであろうと理解される。投与量は、当業者によって理解され、決定されるものとして、個々の対象への特注となるだろう。それぞれの処置で求められる総投与量は、複数回投与又は単回投与で投与してよい。本発明の医薬組成物は、単独でも他の症状、又は他の症状の徴候への治療との組合せで投与してもよい。通常、活性成分の1日投与量は、体重の0.01から100 ミリグラム／キログラムを含む。大抵は、有効である1日1から40ミリグラム／キログラムを分割投与量で、又は徐放形態で投与して、所望される結果を得る。第二、又はその後の投与は、当該個体への最初又は以前の投与と同一量、より少量、又はより多量で投与を行うことができる。本発明によれば、本発明の物質を、他の治療計画又は薬剤(例えば多剤投与計画)より前に、同時に、又は順番に個体へ、治療有効量を予防的に又は治療的に投与することができる。他の治療剤と同時に投与される活性薬剤は、同じ又は異なる組成物中で投与され得る。
【０１０１】
本発明の方法において使用される任意の化合物のための、治療的に有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイから確立され得る。例えば、循環濃度範囲に到達するために動物モデルにおいて処方され得る投与量は、in vitro系での減少したサイトカイン発現を示す濃度ポイント又は範囲を含み、又は包含する。かかる情報はヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用できる。治療有効量とは、患者における徴候の改善をもたらす化合物の量を言う。かかる化合物の毒性及び治療効果は、標準的な医薬手順によって、細胞培養中で、又は実験動物中で決定され得る（例えば、LD50(試験群の50％の致死量)及びED50(個体群の50％の投与治療効果)を決定する）。毒性及び治療効果間の投与率は治療指標あり、そしてLD50及びED50間の比率として表すことができる。高い治療指標を示す化合物は、好適である。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための範囲を処方するために使用することができる。かかる化合物の投与量は、好適には毒性が殆どないか、無毒性のED50を含む循環濃度の範囲内にある。当該投与量は、採用される投与量、及び使用される投与経路に応じて本範囲中で変化させてよい。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の症状の観点から個々の医師によって選定できる。
【０１０２】
本明細書において使用される用語"処置する"とは、臨床徴候が始まった後に化合物を投与することを言う。
【０１０３】
本明細書において使用される用語"予防する"とは、臨床徴候が始まる前に化合物を投与することを言う。
【０１０４】
本発明の文脈の中での用語"予防"とは、疾患又は１つ以上の疾患の徴候の完全な予防だけを意味するのではなく、疾患前又は疾患の早期始まりでの影響の任意の部分的又は十分な予防、弱化(attenuation)、減弱(reduction)、減少(decrease)又は減退(diminishing)も意味する。
【０１０５】
本発明の明細書中での用語"治療"とは、疾患の始まり後の病理学的発達の弱化(attenuation)、減弱(reduction)、減少(decrease)又は減退(diminishing)を含む疾患の経過への任意の有益な影響を言う。
【０１０６】
本発明は、特定の態様に対して参照により発表したが、その発表の内容は、全ての修飾及び置換（特許請求の範囲の意味及び目的を超えて拡張されずに当業者によってもたらし得る）を含む。
【０１０７】
本発明は、本発明を制限するような任意の方法として構成されるべきでない以下の実施例によってここに発表される。実施例は以下に特定した図を参照する。
【実施例１】
【０１０８】
選択(Culling)融合タンパク質(CFPs)の生産
それぞれの選択(culling)癒合タンパク質は、エンドサイトーシスドメイン、エキソサイトーシスドメイン、及び選択(culling)ドメインを含む(図2A)。エキソサイトーシスドメイン(ExDo)、エンドサイトーシスドメイン(EnDo)、及び選択(Culling)ドメイン(CD、例えば、治療標的へ結合でき、そして中和する可溶性受容体又は一価抗体)をコードするDNAフラグメントは、標準的な分子生物学的技術によって適宜発現ベクター中で発生し、そして制御され得る(PCR突然変異誘発及び増幅、DNA配列化、制限消化)。発現ベクターはクローニング工程の間にE.coli株中で保持できるが、CFPsは任意の種類の宿主細胞(他のバクテリア、酵母、及び昆虫、植物又は哺乳類細胞)中で発現させてよい。
【０１０９】
CFPsの作製を促進するための、CFP-専用ベクターは、選択(Culling)ドメイン(CD)がフレーム生成機能CFPsにおいて容易にクローン及び発現できるようにエキソサイトーシスドメイン(ExDo)及びエンドサイトーシスドメイン(EnDo)をコードする配列の3'及び/又は5'末端で多くのクローニングサイトを含むべきである。
【０１１０】
分泌経路を通してCFPsを導くためのこれらのベクターは、非相同性分泌シグナルも提供することができ、CFPsのN-末端で融合される。
【０１１１】
一度発現したCFPsは、タンパク質を精製するための任意の公知技術を用いて細胞培養から単離することができる(例えば、ゲルろ過、液体/アフィニティークロマトグラフィー)。
【０１１２】
VEGF(SEQ ID NO：11-14)、TNFα(SEQ ID NO：16-19)、及びIL-18(SEQID NO：21-24)に対して導かれるCFPsのタンパク質配列の例を提供する(図2B)。
【実施例２】
【０１１３】
in vitroでのCFPsの特徴化
CFPsの構造、発現、及び精製での、それらのin vitroでの特徴化はエンドサイトーシス、エキソサイトーシス、及び標的-結合ドメインがそれらのそれぞれの結合活性(即ち、CFPsのエンドサイトーシス／エキソサイトーシスを誘発する膜-結合タンパク質、及び治療標的のための活性)を保持するか否かをチェックするための予備的研究を含む。
【０１１４】
これらの研究は、潜在的にCFPsと相互作用する組換え体又は精製した試験タンパク質の使用を可能にすることができ、任意の適した方法により検出することができる複合体を形成する。この領域での任意の技術は、試験タンパク質とCFPsとを一緒に使用できる少なくとも定性的に信頼できるタンパク質間での相互作用の決定を可能にする。
【０１１５】
選定された方法によれば、試験タンパク質及びCFPsは、膜又は抗体と複合化され、検出ラベルにより修飾され、及び/又は支持体上で固定化されるようにして使用してよい。例えば、CFPsは、製造業者の指示(分子プローブ)に従い、放射活性の形態において、市販のキット(IODO-GEN；Pierce)により、CFPsをヨウ化することにより、又は蛍光形態においてフルオレセインイソチオシアネート(FITC)によりCFPsを修飾することにより、調製することができる。
【０１１６】
タンパク質マイクロアレイ、マス/NMR分光法、アフィニティークロマトグラフィー、蛍光を基礎とする、そして抗体を基礎とする技術(例えばウェスタンブロット)は適応可能ないくつかの方法の例である。かかる試験は、コントロールタンパク質(例えば、トランスフェリン受容体、非関連/関連ETT)を含むべきであり、多様な条件間での比較は(例えば、酸性及び中性ｐHでの結合活性)、CFPsの結合パラメーターの定量的評価を可能にする（例えば多様なタンパク質の解離定数）。
【０１１７】
標準的な生物化学的方法、例えば、免疫沈降法、又はELISA法は、CFPsとETT間の相互作用、又波細胞成分を確認するために使用できる。例えば、トランスフェリン受容体の細胞外領域は、発表されたように生産することができ(Lawrence CM etal., 1999)、そしてモノクローナル抗体のような検出試薬は、商業的に入手できる(Research Diagnostics Inc)。VEGF(SEQ ID NO：11-14)、TNFα(SEQ ID NO：16-19)、及びIL-18 (SEQ ID NO：21-24)に対するCFPsは、商業的に入手し得る検出試薬及びキットを用いて試験及び比較することができる(R & D Systems, Assay DesignsInc.)。
【実施例３】
【０１１８】
細胞を基礎とするアッセイ：
CFPsは、最小限の情報を含むようにデザイン及び構築され、-ETT結合、-細胞受容体への結合、及び-受容体を仲介したエンドサイトーシス及びエキソサイトーシスを経由した再利用を可能にする。
【０１１９】
前段落で発表した本明細書におけるin vitroアッセイは、CFPsの細胞結合アッセイへの予備的なものであり、固定化CFPsを測定できるように、ラベル化CFPsを含む均衡結合アッセイとしてデザインすることができ、細胞培養へ付加される。適宜修飾された本アッセイは、分化した肝細胞又はヒト結腸癌細胞HT-29c1. 19A(Sitaram MP and McAbee D, 1997)を発表されたように実施することができる。
【０１２０】
細胞上に固定化されたCFPsの量は、例えば、多様な濃度のヨウ化CFPs（リンガーHEPES緩衝剤及び競合剤の存在中）、非-ラベル化分子(例えば0.2％の血清トランスフェリン)、又は任意に他の適宜制御分子(例えばETT)と混合され得るHT-29c1.19A細胞成長フィルターディスクにより測定することができる。
【０１２１】
細胞は注意深く洗浄され、そして細胞に関連した放射活性を測定することができ、そのために結合した及び結合していない放射活性を定量することにより、そしてスキャッチャード分析を実施することにより、細胞のCFPsの特異性を飽和結合結果から決定することができる。
【０１２２】
或いは、CFPsの細胞結合特性の定性的指標は、例えば、蛍光的に-又は放射活性的に-ラベル化CFPsを培養することにより、適宜緩衝液（50 mM Na-MOPS, pH 7.4, 94 mM NaCI, 7.4mM KCI, 0.74 mMMgCl2, 1.4 mMCaCl2）中の二重チャンバー(Costar)に明確に挿入された、ヒトCaco細胞成長により、得ることができる。60分後、37℃で、ラベル化CFPsと共に、細胞を冷却生理食塩水緩衝液で洗浄することができ、そして引き続き3％のグルタルアルデヒド中に固定できる。内部及び表面に結合したCFPsは、共焦点顕微鏡により、又はフィルムへ細胞を暴露することにより、細胞中の蛍光を測定することによって決定することができる。ラベル化又は非ラベル化分子、例えばETTに対するモノクローナル抗体又は細胞受容体は、ネガティブコントロールとして使用できる。
【０１２３】
CFPsの検証への更なる工程は、CFPsが、特異的な細胞培養プレート中で培養された細胞の単層を通したエンド−及びエキソサイトーシスを仲介した受容体を経由して、活発に輸送されることを実証するアッセイにより表される(図3)。
【０１２４】
単層を通してタンパク質のトラフィッキングを示すかかるアッセイ、及びトランスサイトーシスと呼ばれるアッセイは、"挿入(Insert)"側に更なる非ラベル化CFPs -/ラベル化CFPs(治療標的、又は任意の他の制御分子の有無を問わず)を細胞培養培地に含む。仮にCFPsが、治療標的を放出した後にエンドサイトーシス及びエキソサイトーシスをする場合、CFPsを付加した少なくとも重要なフラクションは(治療標的の重要なフラクションではなく)、任意の適宜分析方法によって"ウェル"側に検出されるべきである。
【０１２５】
トランスフェリン受容体を発現し、密着結合により単層を形成する(単層を通す分子の自由な通行を阻害する)、純粋又は混合した細胞培養に関与するトランスサイトーシスアッセイ、及びラベル化タンパク質は、多様な細胞タイプのための文献において公知である(Mikogami T etal., 1994; Fillebeen C etal., 1999; Megias L etal., 2000)。
【０１２６】
文献公知のCFPsのトランスサイトーシスを検査するためにデザインされた実験において(Shah D and Shen WC,1996;Nunez MT etal., 1997)、トランスフェリン受容体を発現し、そして微小孔フィルター上で分極膜(polarized membrane)として成長するCaco-2細胞(ATCC番号：HTB-37)は、挿入物の表面積の1/7を超えない密度で、多孔性の平底を含む、細胞培養挿入部中(例えば、Falcon細胞培養挿入部)に播種され、規則的な24ウェル組織培養皿中で培養した。Caco-2細胞は、Dulbecco's Minimal Essential Medium(DMEM)中で成長させることができ、10％のウシ胎仔血清(FBS)が追加される。一度細胞単層が融合し始め(10-15日後)、密着結合が正確に形成されるが、この特徴は、少なくとも250 Ohm/cm2のVolt-Ohm-meterで、経上皮電気抵抗(TEER)を測定することによって検査することができる。
【０１２７】
広範囲に渡って細胞をDMEMで洗浄した後（FBSなしで）、トランスサイトーシス実験は、ヨウ化CFPs（100-倍過剰の非ラベル化CFPs又は任意の他の制御分子の存在又は不存在中において先端側での緩衝剤である）を付加することにより開始する。多様な時間で(0-6 時間)、収集した基底外側での媒体、及び同容量の収集したサンプルは、補充のために戻される。多量の非ラベル化トランスフェリンは基底外側に付加することができ、往来するCFPsの逆トランスサイトーシスを妨げる。収集したサンプル中での放射活性タンパク質は、TCA沈殿にかけられ、そして沈殿中での放射活性レベルは、ガンマカウンターで測定することができる。往来するCFPの相互作用は、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーにより分析できる。特異的トランスサイトーシスは、非特異的制御を減じた後の単層を通過するCFPの量であり、100-倍過剰の非ラベル化トランスフェリンの存在中において往来をカウントすることにより測定される。
【０１２８】
ETTの除去におけるCFPsの影響は、関連の動物モデル中で試験することもでき、ここでのETT又はETT-誘導化合物は当該動物、又はトランスジェニックマウス(例えば、ETTを構成的に過剰に発現する)に投与される。循環液体中で実施されるELISA又は他の抗体に基づくアッセイは、CFPsの投与、又はネガティブ制御物質により循環中に残っているCFPの濃度及び/又はETTの濃度を決定することを可能にするであろう。同様のモデルはいくつかのETTsの文献において周知である。そして特にその一つは(VEGF,IL-18,TNFα)であり、本出願(SEQID NO：11-14,16-19,及び 21-24)において開示したCFPsに対して、それらの所望されない効果(例えば、VEGFのための内皮細胞の成長における活性を促進させる)を中和させるために導かれる。文献は、拮抗性、治療性、及び薬物動態活性、特に様々なCFPs又は、CFPと公知のETTアンタゴニスト間を比較するための多くの異なるアプローチを示す(例えば、VEGF-を導くCFPと比較した抗-VEGF抗体)。更に本発明において発表されたCFPsの生物学的及び治療的活性の特徴は、多様な分子生物学的技術、例えば、２次元ゲル電気泳動又はRNA干渉を適用することにより得ることができる。
【０１２９】
【表１】
2007508806.tif 000002
【表２】
2007508806.tif 000003
【０１３０】
参考文献
Baker EN etal., Biochem Cell Biol, 80: 27-34,2002.
Beisser PS etal., CurrTop Microbiol Immunol, 269: 203-34,2002.
Bennett MJ etal., Nature 403: 46-53,2000.
Blobel CP, Inflamm Res, 51: 83-84,2002.
Cleland etal., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 10: 307-77,1993.
Cleland JL etal., Curr OpinBiotechnol, 12: 212-219,2001.
Cunningham, etal., Science, 244: 1081-5,1989.
Davies PS etal., Biochem J, 373: 145-153,2003.
Ehrlich R and Lemonnier FA, Immunity, 13: 585-538,2000.
Feder JN etal., Nature Genetics, 13: 399-408,1996.
Feder JN, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1472-1477,1998.
Fillebeen C et al., J Biol Chem, 274: 7011-7017,1999.
Gendel SM, Ann NY Acad SCI, 964: 87-98,2002.
Gentz etal., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 821-4,1989.
Graddis TJ etal., Curr Pharm Biotechnol, 3: 285-97,2002.
Gustafsson C etal., TrendsBiotechnol, 22: 346-53,2004.
Kane JF, Curr Opin Biotechnol, 6: 494-500,1995.
Jussila L and Alitalo K. , Physiol Rev, 82: 673-700,2002.
Lebron JA et al., Cell, 93: 111-123,1998.
Lawrence CM etal., Science, 286: 779-782,1999.
Lorenz HM and Kalden JR, Arthritis Res, 4 Suppl 3:S17-24, 2002.
Luo B and Prestwich GD, Exp Opin Ther Patents, 11: 1395-1410,2001.
Makrides SC, Protein Expr Purif, 17: 183-202,1999.
Marshal SA etal., Drug Disc Today,8 : 212-221,2003.
McAbee DD etal., Biochemistry 32: 13749-13760,1993.
McCawley LJ and Matrisian LM, Curr Opin Cell Biol, 13: 534-40,2001.
Megias L etal., Int J DevBiol, 44: 209-221,2000.
Meilinger M et al., FEBS Lett, 360: 70-74,1995.
Mikogami T et al., Am J Physio, 267: G308-315,1994.
Murphy LR et al., Protein Eng, 13: 149-152,2000.
Nakanishi K etal., Ann Rev Immun, 19: 423-474,2001.
Nunez MT etal., J Biol Chem, 272: 19425-19428,1997.
Park E etal., J Drug Targ, 6: 53-64,1998.
Pillai 0 andPanchagnula R, Cur Opin Chem Biol, 5: 447-451,2001.
Pillay CS et al., Biochem J, 363: 417-429,2002.
Pini A and Bracci L, Curr Protein Pept Sci, 1: 155-169,2000.
Qian ZM etal., Pharmacol Rev, 54: 561-587,2002.
RichardsonDR and Ponka P,Biochim Biophys Acta, 1331: 1-40,1997.
Rogov SI and Nekrasov AN, Protein Eng, 14:459-463, 2001.
Sachse M etal., Histochem Cell Biol, 117: 91-104,2002.
Schellekens H, Nat Rev Drug Disc, 1: 457-462,2002.
Shah D. , and Shen WC, J Pharm Sci, 85: 1306-1311,1996.
Sitaram MP and McAbee D, Biochem. J, 323: 815-822,1997.
Swaan PW, Pharm Res, 15: 826-834,1998.
Terpe K, Appl Microbiol Biotechnol, 60: 523-33,2003.
Vasserot AP etal., Drug Disc Today, 8: 118-126,2003.
Wilson etal., Cell, 37: 767-78,1994.
Wong H andSchryvers AB, Adv Exp Med Biol, 443: 101-106,1998.
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】選択(Culling)融合タンパク質(CFPs)が細胞外空間からの標的分子(ETT)の除去を可能にし、そしてリソソームを通してそれらを分解するメカニズムを示す。その後CFP及び細胞膜受容体は細胞表面へ輸送され、次回の選択(culling)サイクルで利用される。
【０１３２】
【図２】(A)細胞外治療標的及びいわゆる選択(culling)ドメイン(CD)へ結合しているタンパク質ドメイン並びにエキソサイトーシスドメイン(ExDO)及びエンドサイトーシスドメイン(EnDO)から成る再利用ドメインから成るCFPsの概略構造である。 (B)本発明を例証しているCFPs の概略構造であり、ヒトデルタN-ラクトフェリン(dN-Lf)、ヒトHFE(HFE-a3)のα3ドメイン、又はヒトHFE(HFE-a1a2)のα1-α2ドメインを含む再利用ドメインに基づく。VEGFのための選択(Culling)ドメインはVEGFR-1(VEGFR-1d1-3)のIg-様ドメイン1-3により形成される。TNFのための選択(Culling)ドメインは、TNF結合タンパク質I(TNFbp-1)と呼ばれるTNF受容体Iの可溶性部分により形成される。IL-18のための選択（Culling)ドメインは、IL-18結合タンパク質I(IL18bp)により形成される。黒塗り部分はマウスIgκ鎖V-IIIの非相同性シグナル配列を示す。
【０１３３】
【図３】二重(bicameral)チャンバー中に含まれた多孔性支持体上に播種した細胞中のCFPsのトランスサイトーシスを実証することによる細胞を基礎としたCFPsを検証するアッセイのための実験的デザインの例である。
【図１】
2007508806.tif 000004
【図２】
2007508806.tif 000005
【図３】
2007508806.tif 000006
【配列表】
2007508806000001.app
【国際調査報告】
2007508806.tif 000007
2007508806.tif 000008
2007508806.tif 000009