(57)【要約】【課題】癌、特に転移癌、及びT細胞由来の癌、並びにEphA2発現細胞が関わる過剰増殖性疾患の治療、管理、又は予防のために設計された方法、及び組成物を提供すること。【解決手段】本発明の方法は、リステリアに基づくEphA2ワクチンの使用を伴う。本発明は、本発明の１以上のリステリアに基づくワクチンを単独で、又は癌治療に有用な１以上の他剤と組み合わせを含む医薬組成物も提供する。本発明のある態様では、前記方法はEphA2及び／又はEphA2発現細胞に対してCD4+及びCD8+のT細胞応答を誘発することを伴う。【選択図】図１Ａ及び１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてEphA2発現細胞に対する免疫応答を誘発する方法であって、EphA2発現細胞に対して免疫応答を誘発するのに有効な量でEphA2抗原ペプチドを発現するリステリア細菌を含む組成物を対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
前記リステリアがリステリアモノサイトゲネスである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リステリアが弱毒化されている、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記EphA2抗原ペプチドをコードする核酸が、前記EphA2抗原ペプチドをコードする配列に有効に結合している分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記対象が癌に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記癌が上皮細胞由来である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記癌がT細胞由来である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記癌が皮膚癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、又は膵臓癌であるか、腎細胞癌、又は黒色腫である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記癌が白血病、又はリンパ腫である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が非腫瘍性の過剰増殖性障害に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記過剰増殖性障害が上皮細胞障害である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記過剰増殖性障害が、喘息、慢性肺閉塞性疾患、肺線維症、気管支応答性亢進、乾癬及び脂漏性皮膚炎である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
EphA2発現細胞の過剰増殖性障害を有するヒト対象を治療する方法であって、EphA2発現細胞の過剰増殖性障害を治療するのに有効な量でEphA2抗原ペプチドを発現するリステリア細菌を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記リステリアがリステリアモノサイトゲネスである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が癌に罹患している、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が上皮細胞由来である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が内皮細胞由来である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記癌がT細胞由来である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が前記癌細胞の組織型を有する非癌化細胞と比較してEphA2を過剰発現する細胞を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が皮膚癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、又は膵臓癌であるか、腎細胞癌、又は黒色腫である、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が白血病、又はリンパ腫である、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が非腫瘍性の過剰増殖性障害に罹患している、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
前記過剰増殖性障害が上皮細胞障害である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記過剰増殖性障害が、喘息、慢性肺閉塞性疾患、肺線維症、気管支応答性亢進、乾癬、及び脂漏性皮膚炎である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記EphA2ポリペプチドが完全長EphA2を含む、請求項１、又は１３記載の方法。
【請求項２６】
前記EphA2ポリペプチドがEphA2の細胞外ドメインを含む請求項１、及び１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記EphA2ポリペプチドが少なくともEphA2の抗原部分、及び第２のポリペプチドを含むキメラポリペプチドである、請求項１、及び１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がEphA2抗原ペプチドを発現する複数のリステリアを含む、請求項１、又は１３記載の方法。
【請求項２９】
前記EphA2抗原ペプチドを発現するリステリアが複数のEphA2抗原ペプチドを発現する、請求項１、又は１３記載の方法。
【請求項３０】
さらに、付加的抗癌療法を適用するステップを含む、請求項１、及び１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記付加的抗癌療法がアゴニストEphA2抗体である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記付加的抗癌療法が抗イディオタイプのアゴニストEphA2抗体である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記付加的抗癌療法が、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、又は手術である、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記投与が粘膜、非経口、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は経口の経路による、請求項１、及び１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記投与がCD4+T細胞応答、CD8+T細胞応答、生得的な免疫応答、抗体応答、又は前述の１つ、又は複数の組合せを誘発する、請求項１、又は１３記載の方法。
【請求項３６】
前記投与がCD4+T細胞応答及びCD8+T細胞応答の両方を誘発する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
異常血管形成と関係する疾患を有するヒト対象を治療する方法であって、異常血管形成と関係する疾患を治療するのに有効な量でEphA2抗原ペプチドを発現するリステリア細菌を含む組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３８】
前記対象が異常血管形成と関係する疾患に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患が、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脈管再狭窄、幼児の血管腫、尋常性疣贅、乾癬、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性ジストロフィー表皮水疱症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身紅斑、乾癬性関節炎、ライター症候群、及びシェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、又は冠状動脈疾患である、請求項３７、又は３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれが参照により完全に組み込まれている2003年10月15日に出願の米国仮出願第60／511919号、2003年10月15日に出願の米国仮出願第60／511719号、2003年12月24日に出願の米国仮出願第60／532666号、2004年3月26日に出願の米国仮出願第60／556631号、2004年10月1日に出願の米国仮出願第          号（整理番号10271-144-888）及び2004年10月7日に出願の米国仮出願第          号（整理番号10271-146-888）の優先権を主張する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、増殖性細胞疾患の治療、管理、又は予防のための方法及び組成物に関する。本発明は、さらに、過剰増殖性細胞に対して免疫応答を誘発するためのリステリアに基づく組成物、及び前記組成物を使用する方法に関する。本発明は、とりわけ、EphA2抗原ペプチドを発現するリステリア含有ワクチン、及びEphA2を発現する過剰増殖性細胞に対して免疫応答を誘発するためのそのようなEphA2ワクチンの投与を含む。本発明は、増殖性障害の治療のために有用な１以上の他剤と組み合わせた本発明の１以上のリステリアに基づく組成物を含むワクチンも提供する。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
（２．１．リステリア）
リステリアモノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（リステリア（Listeria））は、MHCクラスI、及びクラスII抗原提示経路を通して免疫能のあるCD4+／CD8+ T細胞媒介反応を初回刺激するその能力のために抗原特異ワクチンでの使用のために開発されているグラム陽性の通性細胞内細菌であるので、近年、健常健康ボランティアにおけるヒト臨床試験でワクチンベクターとして試験された。
【０００４】
リステリアは、生得的、及び適応性のT細胞依存性抗菌免疫を刺激するためのモデルとして、長年研究されてきた。効果的に細胞免疫を刺激するリステリアの能力は、その細胞内ライフサイクルに基づく。宿主に感染すると、細菌は直ちにマクロファージ及び樹状細胞を含む食細胞によってファゴリソソームコンパートメント内に取り込まれる。大部分の細菌は、その後分解される。感染APCのファゴソーム内の病原体のタンパク質分解から生じるペプチドは、MHCクラスII分子上へ直接ロードされ、これらのMHC IIペプチド複合体は抗体産生を刺激するCD4+「ヘルパー」T細胞を活性化し、次にプロセシングされた抗原はクラスIIエンドソーム経路を通して抗原提示細胞の表面で発現される。酸性のコンパートメント内で、ある種の細菌遺伝子が活性化され、これには、ファゴリソソームを分解して生存するリステリアが増殖する宿主細胞内可溶質コンパートメント内に細菌を放出することのできる、コレステロール依存性細胞溶解素、LLOが含まれる。MHCクラスI経路による異種抗原の効果的な提示のためには、リステリアによる内因性タンパク質のデノボ発現が必要である。抗原提示細胞（APC）内では、リステリアによって合成及び分泌されるタンパク質がプロテオゾームによって採取及び分解される。得られたペプチドはTAPタンパク質によって小胞体に運ばれ、MHCクラスI分子上へロードされる。MHC Iペプチド複合体は細胞表面に運ばれ、十分な同時刺激（シグナル２）とともにコグネイトT細胞受容体を有する細胞傷害T細胞（CTL）を活性化及び刺激して、MHC Iペプチド複合体を拡大し、その後認識する。
【０００５】
（２．２．過剰増殖性疾患）
（２．２．１．癌）
新生物、又は腫瘍は、良性、又は悪性の異常な抑制されていない細胞増殖から生じる腫瘍塊である。良性腫瘍は、一般に、局在化されたままである。悪性腫瘍は、癌と総称される。用語「悪性」は、その腫瘍が隣接する体構造に侵入して破壊し、遠隔部位に広がって死をもたらすことを一般に意味する（レビューについては、Robbins及びAngellの論文、1976, Basic Pathology, 2版, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122を参照）。癌は体の多くの場所で発生することができ、その起源によって異なった振る舞いをする。癌細胞はそれらの起源である体の部分を破壊し、次に体の他の部分に広がってそこで新しい増殖を開始してさらに多くの破壊を引き起こす。
【０００６】
1,200,000人以上の米国人が、毎年癌を発症する。癌は米国の第２の死因であり、この傾向が続くならば、癌は2010年までに第1の死因になることが予想される。肺癌及び前立腺癌は、米国男性の癌死の原因の第1位である。肺癌及び乳癌は、米国女性の癌死の原因の第1位である。米国の男性2人の1人は、生涯の間に癌と診断される。米国の女性3人の1人は、生涯の間に癌と診断される。
癌を治癒する方法は、まだ発見されていない。現在の治療オプション、例えば手術、化学療法及び放射線療法は、効果がないか、重大な副作用を提示することがしばしばある。
【０００７】
（２．２．２．転移）
癌の最も致命的な形態は、しばしば腫瘍細胞の集団が体の異なる遠隔部位に定着する能力を獲得したときに生じる。このような転移細胞は、異なる組織への細胞定住を通常抑制する規制を乗り越えることによって生き残る。例えば、典型的な乳房上皮細胞は、肺に移植しても通常成長も生存もしないが、肺転移は乳癌関連の疾患、及び死亡の主な原因である。最近の証拠は、体内での転移細胞の伝播は原発腫瘍の臨床症状の出現よりずっと前に起こることを示唆している。これらの微小転移細胞は、原発腫瘍の発見、及び除去後何ヵ月、又は何年もの間休眠していることができる。したがって、異質の微小環境での転移細胞の増殖及び生存を可能にするメカニズムを理解することは、転移癌と闘うための治療法ならびに転移の早期発見及び位置特定のための診断法の改善のために重要である。
【０００８】
（２．２．３．癌細胞シグナル伝達）
癌は、異常なシグナル伝達の疾患である。異常な細胞シグナル伝達は、細胞の増殖及び生存に対する足場依存性制約を乗り越える（Rhimらの論文、1997, Crit. Rev. in Oncogenesis 8: 305; Patarca, 1996, Crit. Rev. in Oncogenesis 7: 343; Malikらの論文、1996, Biochimica et Biophysica Acta 1287: 73; Canceらの論文、1995, Breast Cancer Res. Treat. 35: 105）。チロシンキナーゼ活性は細胞外マトリックス（ECM）足場によって誘導され、実際、チロシンキナーゼの発現、又は機能は通常悪性細胞で増大する（Rhimらの論文、1997, Critical Reviews in Oncogenesis 8: 305; Canceらの論文、1995, Breast Cancer Res. Treat. 35: 105; Hunterの論文、1997, Cell 88: 333）。チロシンキナーゼ活性は悪性細胞増殖のために必要であるという証拠に基づいて、チロシンキナーゼは新治療法の標的とされた（Levitzkiらの論文、1995, Science 267: 1782; Kondapakaらの論文、1996, Mol. & Cell. Endocrinol. 117: 53; Fryらの論文、1995, Curr. Opin. in BioTechnology 6: 662）。残念なことに、腫瘍細胞への特異的ターゲッティングと関連する障害が、これらの薬剤の適用をしばしば制限する。特に、チロシンキナーゼ活性は、しばしば良性組織の機能及び生存のために不可欠である（Levitzkiらの論文、1995, Science 267: 1782）。副次的な毒性を最小にするために、腫瘍細胞で選択的に過剰発現するチロシンキナーゼを最初に特定して、次にそれを標的にすることが重要である。
【０００９】
（２．２．４．癌治療法）
抗転移作用物質の開発への障壁は、これらの薬剤を設計、及び評価するために使用されるアッセイ系であった。大部分の従来の癌治療法は、成長の速い細胞を標的にする。しかし、癌細胞は必ずしもより速く成長するというわけではなく、その代わりに正常細胞にとっては許容されない条件下で生存、及び増殖する（Lawrence、及びSteegの論文、1996, World J. Urol. 14: 124-130）。正常細胞及び悪性細胞の振る舞いの間のこれらの基本的な差は、治療的ターゲッティングに機会を提供する。微小転移性腫瘍が既に体中に伝播しているというパラダイムは、異質で三次元的微小環境という中で可能性のある化学療法薬を評価する必要性を強調している。多くの標準的な制癌剤アッセイでは、典型的な細胞培養条件（すなわち単層増殖）の下で、腫瘍細胞の増殖、又は生存を測定する。しかし、二次元アッセイでの細胞行動に基づくin vivoでの腫瘍細胞の振る舞いの予測は、しばしば確実ではない。
【００１０】
現在では、癌治療法としては、患者で腫瘍細胞を根絶するための手術、化学療法、ホルモン療法、及び／又は放射線療法がある（例えば、Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein、及びFederman, eds., ch. 12, sect. IVに所収のStockdaleの論文、「癌患者管理の原理」(1998)を参照）。近年では、癌治療法としては、生物学的治療法、又は免疫療法もある。これらの手法のすべては、患者にとってかなりの欠点をもたらす可能性がある。手術は、例えば、患者の健康のために禁忌であるか、又は患者に受け入れがたいかもしれない。さらに、手術では腫瘍組織を完全に除去することができないかもしれない。放射線療法は腫瘍組織が放射線に対して正常組織より高い感受性を示すときだけ有効であり、また、放射線療法は重大な副作用をしばしば誘発する。ホルモン療法は単剤としてはめったに適用されず、また有効ではあるけれども、しばしば他の治療で大部分の癌細胞を除去した後に癌の再発を予防するか遅らせるために使用される。生物療法／免疫療法は数が制限され、また各療法は通常非常に特異的な型の癌だけに有効である。
【００１１】
化学療法に関しては、癌の治療に利用できる様々な化学療法剤がある。癌化学療法剤のかなりの大多数は、DNA複製、及び付随する細胞分裂を阻止するために直接的に、又はデオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成を妨げることによって間接的にDNA合成を妨げることにより作用する（例えば、Gilmanらの著書「グッドマン及びギルマン薬理書」第８版(1990)、(Pergamom Press, New York)を参照）。これらの剤、例えばニトロソ尿素などのアルキル化剤、代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート、及びヒドロキシ尿素、ならびに他の剤、例えばエトポシド、カンパテシン（campathecin）、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、その他の剤は、細胞周期特異的ではないけれどもそれらのDNA複製に対する影響のためにＳ期の細胞を殺滅する。他の剤、特にコルヒチン及びビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン及びビンクリスチンは、微小管集合に干渉して有糸分裂停止をもたらす。化学療法プロトコルは、治療の効力を増大させるために、一般に化学療法剤の併用投与を含む。
【００１２】
様々な化学療法剤の入手が可能であるにもかかわらず、化学療法は多くの欠点を有する（例えばScientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein、及びFederman, eds., ch. 12, sect. Xに所収のStockdaleの論文「癌患者管理の原理」(1998)を参照）。ほとんどすべての化学療法剤は毒性があり、化学療法は重度の吐き気、骨髄低下、免疫抑制、その他を含むかなりの、またしばしば危険な副作用を起こす。さらに、化学療法剤の併用投与によっても多くの腫瘍細胞は抵抗性であるか、又は化学療法剤に対して抵抗性になる。実際、治療プロトコルで使用される特定の化学療法剤に抵抗性の細胞は、しばしば特定の治療で使用される薬剤の作用機序と異なるメカニズムで作用する他剤に対しても抵抗性であることが判明する。この現象は、多面的薬剤耐性、又は多剤耐性と呼ばれる。したがって、薬剤耐性のため、多くの癌は標準の化学療法治療プロトコルに抗療性であると判明する。
【００１３】
代替の癌治療法、特に標準の癌治療法、例えば手術、放射線療法、化学療法及びホルモン療法に抗療性であることが判明した癌の治療法に対する必要性が高い。さらに、癌が１つの方法だけで治療されることは稀である。したがって、癌の治療のための新しい治療薬、及び癌の治療のための新しい、より有効な併用療法を開発する必要がある。
【００１４】
（２．２．５．他の過剰増殖性障害）
（２．２．５．１．喘息）
喘息は、断続的な気道閉塞を特徴とする障害である。欧米では、小児集団の15％及び大人の集団の7.5％は喘息患者である（Strachanらの論文、1994, Arch. Dis. Child 70: 174-l78）。子供たちや若年成人における喘息のほとんどは、吸入されたアレルゲン、例えばイエダニ、及び猫鱗屑アレルゲンに対するIgE媒介性アレルギー（アトピー）によって誘導される。しかし、すべての喘息患者がアトピーであるというわけではなく、また、大部分のアトピー患者は喘息ではない。したがって、この障害を誘導するのにアトピーの他にも要因が必要である（Fraserら編「胸部疾患の概要」(1994) 635-53 (WB Saunders Company, Philadelphia); Djukanovicらの論文、1990, Am. Rev. Respir. Dis. 142: 434-457）。喘息は家族性の傾向が強く、遺伝的要因及び環境要因の間の相互作用による。遺伝的要因は正常な遺伝子の変異（「多型現象」）であると考えられ、これらはそれらの機能を変化させて喘息の素因となる。
【００１５】
喘息は、再発性の喘鳴及び断続的な気流制限によって特定することができる。喘息の傾向は、ヒスタミン、又はメタコリンのような気管支収縮剤に対する個体の用量反応曲線が構築される気管支の反応亢進の測定によって定量化することができる。この曲線は、通常、気流の20％の低下（PD20）をもたらす用量、又は最初の空気流量測定、及び最後の投与用量の間の曲線の傾斜（傾き）に要約される。
【００１６】
アトピー性の反応では、IgEはアレルゲン刺激に応じてＢ細胞によって産生される。これらの抗体はIgEの高親和性受容体に結合することによって肥満細胞を覆い、細胞膜の不安定化及び炎症伝達物質の放出を導く一連の細胞事象を開始する。この結果、粘膜炎症、喘鳴、咳、くしゃみ及び鼻詰まりが起こる。
アトピーは、（i）一般的なアレルゲンに対する皮膚プリックテストの陽性反応、（ii）アレルゲンに対する特異血清IgEの存在の検出、又は（iii）総血清IgEの上昇の検出によって診断することができる。
【００１７】
（２．２．５．２．COPD）
慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、固定された気道障害の２つの状態、慢性気管支炎及び気腫を記載するために多用される包括用語である。慢性気管支炎、及び気腫は、最も普通には喫煙に起因する。COPD患者の約90％は、現在、又は過去の喫煙者である。喫煙者の約50％は慢性気管支炎を発症するけれども、喫煙者の15％だけが障害性気道閉塞を起こす。ある種の動物、特に馬もCOPDを起こす。
COPDと関連する気道閉塞は進行性であり、気道活動過多を伴うことがあり、また部分的に回復可能である。非特異的気道反応亢進もCOPDの発症において役割を果たしている可能性があり、肺機能低下速度の亢進の前兆となる可能性がある。
【００１８】
COPDは、死亡及び障害の重要な原因である。米国及び欧州では、現在のところ4番目に重要な死因である。治療ガイドラインは、障害による罹患率及び死亡率の低下を促進するために、早期発見及び禁煙計画の実行を提唱している。しかし、早期発見及び診断は、いくつかの理由のために困難であった。COPDの発症には何年もかかり、また急性の気管支炎発症はしばしばCOPDの初期徴候としては一般開業医によって認識されない。多くの患者は１以上の障害（例えば慢性気管支炎、又は喘息性気管支炎）の特徴を示すので、特に障害の初期の病因判定では、正確な診断は困難を伴う。また、多くの患者は低下した肺機能と関連したより重度の症状、例えば呼吸困難、持続する咳及び痰生産を経験するまで、診察を受けない。結果として、大多数の患者はその障害がより進行するまで、診断、及び治療されない。
【００１９】
（２．２．５．３．ムチン）
ムチンは、上皮細胞が分泌する糖タンパク質の仲間で、呼吸管、胃腸管、及び女性の生殖管におけるそれらを含む。ムチンは、粘液の粘弾性を賦与する（Thorntonらの論文、1997, J. Biol. Chem. 272: 9561-9566）。MUC 1、MUC 2、MUC 3、MUC 4、MUC 5AC、MUC 5B、MUC 6、MUC 7、及びMUC 8の9つのムチン遺伝子がヒトで発現することが知られている（Bobekらの論文、1993, J. Biol. Chem. 268: 20563-9; Dusseynらの論文、1997, J. Biol. Chem. 272: 3168-78; Gendlerらの論文、1991, Am. Rev.Resp. Dis. 144: S42-S47; Gumらの論文、1989, J. Biol. Chem. 264: 6480-6487; Gumらの論文、1990, Biochem.Biophys. Res. Comm. 171: 407-415; Lesuffleurらの論文、1995, J. Biol. Chem. 270: 13665-13673; Meerzamanらの論文、1994, J. Biol. Chem. 269: 12932-12939; Porchetらの論文、1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 175: 414-422; Shankarらの論文、1994, Biochem. J. 300: 295-298; Toribaraらの論文、1997, J. Biol. Chem. 272: 16398-403）。多くの気道障害、例えば慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、管支拡張症(bronchietactis)、喘息、嚢胞性線維症及び細菌感染症は、ムチン過剰産生を特徴とする（Prescottらの論文、Eur. Respir. J., 1995, 8: 1333-1338; Kimらの論文、Eur. Respir. J., 1997, 10: 1438; Steigerらの論文、1995, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 12: 307-314）。ムチン過分泌に起因する粘膜繊毛の障害は、慢性感染症、気道閉塞及び時には死を促進する気道粘液閉塞をもたらす。例えば、遅い進行性の不可逆的気流制限を特徴とする障害であるCOPDは、先進国の主要な死因である。呼吸低下は主に、気道壁肥厚による管腔直径の縮小、ならびに杯状細胞過形成症及び過分泌に起因する粘液の増大からなる。上皮細胞増殖因子（EGF）は、上皮細胞増殖及びムチン産生／分泌を上方制御することが知られている（Takeyamaらの論文、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3081-6; Burgelらの論文、2001, J. Immunol. 167: 5948-54）。EGFは、ムチン分泌細胞、例えば杯状細胞を増殖させ、気道上皮内でムチン産生を増大させる（Leeらの論文、2000, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278: 185-92; Takeyamaらの論文、2001, Am. J. Respir. Crit. Care. Mod. 163: 511-6; Burgelらの論文、2000, J. Allergy Clin. Immmol. 106: 705-12）。歴史的に、粘液過分泌は、クリアランスを増大する物理的方法、及び粘液溶解薬の2つの方法で治療されてきた。どちらの手法も、患者に大きな恩恵をもたらさず、また粘液閉塞を減らしもしなかった。したがって、ムチン産生を減少させ、ムチン過分泌と関連する障害を治療する方法を有することが望ましいであろう。
【００２０】
（２．２．５．４．再狭窄）
血管形成術、ステント術、アテレクトミー及び移植術を含む脈管インターベンションは、望ましくない影響がしばしば併発する。患者の体に移植、又は挿入された医療器具への曝露は、身体組織が有害な生理的反応を示す原因になることがある。例えば、ある種のカテーテル、又はステントの挿入、又は体内移植は、血管内での塞栓、又は血餅の形成をもたらす可能性がある。脈管インターベンションによる他の有害反応としては、過形成症、再狭窄、すなわち動脈の再閉塞、血管の閉塞、血小板凝集及び石灰化をもたらす内皮細胞増殖がある。再狭窄の治療では、しばしば第2の血管形成術、又はバイパス手術が含まれる。特に、再狭窄の原因が、再狭窄の治療における脈管インターベンションに起因する内皮細胞傷害であるかもしれない。
【００２１】
血管形成術は、動脈の部分的に閉塞したアテローム硬化型病変部位への、バルーンカテーテルの挿入を含む。バルーンの膨張は、内膜を破裂させて、閉塞を広げることを目的とする。わずか2、3日、又は2、3週間で約20から30％の閉塞は再閉塞を起こす（Eltchamnoffらの論文、1998, J. Am Coll. Cardiol. 32: 980-984）。ステントの使用は再閉塞率を減らすが、相変わらずかなりの割合で再狭窄が起こる。血管形成術の後の再狭窄の率は、プラークの長さを含むいくつかの要因に依存する。狭窄率は、存在する危険因子に従い、10％から35％まで変動する。さらに、１年後の再血管造影で見かけ上正常な内腔を示すのは、処置を受けた血管の約30％だけである。
【００２２】
再狭窄は、アテローム及びバルーンによる傷害、又は臨床血管形成術の後の動脈過形成病変の両方で見られる、平滑筋細胞と結合したコラーゲン、及びプロテオグリカンを含む細胞外マトリックスの蓄積に起因する。平滑筋細胞増殖に関する管腔の狭小化の遅れの一部は、新生内膜平滑筋細胞によるマトリックス物質の継続的な同化の結果であるかもしれない。様々な媒介物質が、in vivoでの平滑筋細胞によるマトリックス合成を変化させることができる。
【００２３】
（２．２．５．５．新生内膜過形成）
新生内膜過形成は、移植片アテローム性動脈硬化症、狭窄症及び大多数の代用血管閉塞の基礎をなす病理学的過程である。新生内膜過形成は様々な形態の血管損傷の後に通常見られ、採取及び高圧動脈の循環内への外科的体内移植に対する静脈移植の反応の主な構成要素である。
血管壁の中間層（すなわち中膜層）の平滑筋細胞は活性化され、分裂し、増殖し、内部層（すなわち内膜層）に移動する。結果として生じる異常な新生内膜細胞は、閉塞性新生内膜疾患及び最終的には移植不全をもたらすカスケード事象をさらに引き起こすサイトカイン、ケモカイン及び接着分子などの炎症誘発性分子を発現する。
【００２４】
平滑筋細胞の増殖は、新生内膜過形成反応の臨界事象である。様々な手法を使用した研究により、平滑筋細胞増殖の阻止は正常な血管の表現型及び機能の維持をもたらし、新生内膜過形成及び移植片不全の減少をもたらすことが証明された。
上で議論された適用のための既存の治療法は不十分である。したがって、上記適用のための改善された治療法が必要である。
【００２５】
（２．３．EphA2）
EphA2は大人の上皮で発現される130kDaの受容体チロシンキナーゼであり、そこでは低濃度で存在し、細胞間接着部位では濃縮される（Zantekらの論文、1999, Cell Growth & Differentiation 10: 629; Lindbergらの論文、1990, Molecular & Cellular Biology 10: 6316）。EphA2は細胞膜に固着するリガンド（エフリンA1からA5として知られる）と結合するので、この細胞下局在化は重要である（Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90: 403; Galeらの論文、1997, Cell & Tissue Research 290: 227）。リガンド結合の第一の帰結は、EphA2自己リン酸化である（Lindbergらの論文、1990, 前掲）。しかし、他の受容体チロシンキナーゼと異なり、EphA2はリガンド結合、又はホスホチロシン含有がない場合も酵素活性を保持する（Zantekらの論文、1999, 前掲）。EphA2は、攻撃的な癌細胞などの多数の過剰増殖性細胞上で上方制御される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
（３．発明の要旨）
EphA2は多くの悪性の癌腫で過剰発現され、機能的に変化させられる。EphA2は腫瘍性タンパク質であり、癌細胞に転移能力を与えるのに十分である。EphA2は他の過剰増殖性細胞とも関係し、細胞過剰増殖に起因する疾患との関係が示唆されている。本発明は、対象へのEphA2抗原ペプチドを発現するリステリアの投与が、EphA2を過剰発現する細胞と関係する過剰増殖性障害に対して有益な治療的及び予防的恩恵を提供するという発明者らの発見に由来する。いかなるメカニズム、又は理論にも拘束されないが、この治療的、及び予防的恩恵は、EphA2抗原ペプチド発現リステリアの投与によって誘発される免疫応答の結果であると思われている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、したがって、リステリアに基づくEphA2ワクチン及びそれらの使用方法を提供する。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、細胞免疫応答、液性免疫応答、又はその両方を誘発することができる。免疫応答が細胞免疫応答である場合は、それはTc、Th1、又はTh2免疫応答でよい。好ましい一実施態様では、免疫応答はTh2細胞免疫応答である。
好ましい一実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、非癌化細胞（すなわち正常な、健全な細胞、又は過剰増殖性でない細胞）と比較して癌細胞上で選択的に露出されるか増大する、EphA2の１以上のエピトープを発現する。一実施態様では、癌は上皮細胞由来である。他の実施態様では、癌は皮膚癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、膀胱癌、又は膵臓癌であるか、腎細胞癌、又は黒色腫である。他の実施態様では、癌はT細胞由来である。他の実施態様では、癌は白血病、又はリンパ腫である。
【００２８】
好ましい一実施態様では、本発明の方法及び組成物は、EphA2を発現する腫瘍転移を予防、治療、又は管理するために使用される。好ましい一実施態様では、免疫応答が求められるEphA2発現細胞（「標的細胞」）は、本明細書で記載されているか当業者に公知のアッセイ（例えばイムノアッセイ、例えばELISAもしくはウェスタンブロット、ノーザンブロット、又はRT-PCR）によって評価されるのと同じタイプの健常細胞と比較して、EphA2を過剰発現させる。好ましい一実施態様では、細胞間接触の減少、細胞下局在化の変化、又はリガンドと比較してのEphA2量の増大の結果として、同じ種類の健常細胞と比較して標的細胞上のより少ないEphA2がリガンドに結合する。他の実施態様では、当技術分野で公知のアッセイ（例えばイムノアッセイ）によって評価されるのと同じ型の健常細胞と比較して、標的細胞上の約10％以下、約15％以下、約20％以下、約25％以下、約30％以下、約35％以下、約40％以下、約45％以下、約50％以下、約55％以下、約60％以下、約65％以下、約70％以下、約75％以下、約80％以下、約85％以下、約90％以下、又は約95％以下より少ない量のEphA2がリガンド（例えばエフリンA1）に結合する。他の実施態様では、当技術分野で公知のアッセイ（例えばイムノアッセイ）によって評価されるのと同じ型の健常細胞と比較して、標的細胞上の1〜10倍、1〜8倍、1〜5倍、1〜4倍、又は1〜2倍、あるいは1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、又は10倍より少ない量のEphA2がリガンド（例えば、エフリンA1）に結合する。
【００２９】
したがって、本発明はEphA2発現細胞に対して免疫応答を誘発するための、個体に対してリステリアに基づくEphA2ワクチンをEphA2発現細胞に対して免疫応答を誘発するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。
本発明は、EphA2発現細胞の過剰増殖性障害を治療、予防、又は管理するための、個体に対してリステリアに基づくEphA2ワクチンを過剰増殖性障害（例えば腫瘍性の過剰増殖性障害、及び非腫瘍性の過剰増殖性障害）の治療、又は予防に有効な量で投与することを含む方法を提供する。本発明は、EphA2発現細胞に対して免疫応答を誘発するために有用な、及び／又はEphA2発現細胞の過剰増殖性障害を治療、予防、又は管理するために有用なリステリアに基づくEphA2ワクチンも提供する。
【００３０】
リステリアに基づくEphA2ワクチンは、EphA2抗原ペプチドの発現媒体として、リステリアを含むことができる。好ましい一実施態様では、EphA2抗原性の発現媒体として対象（好ましくは、ヒト対象）に投与されるリステリア細菌は、弱毒化されている。例えば、対象（好ましくは、ヒト対象）に投与される弱毒化リステリア細菌は、その組織指向性（例えばinlB突然変異体）、又は細胞から細胞に伝播する能力（例えば、actA突然変異体）が弱毒化されてもよい。特定の実施態様において、EphA2抗原性の発現媒体として対象（好ましくは、ヒト対象）に投与される弱毒リステリア細菌は、変異（例えば欠失、付加、又は置換）を１以上のインターナリン（internalin）（例えばinlA及び／又はinlB）に含み、そのような変異はリステリアの弱毒化をもたらすかそれに寄与する。他の実施態様では、EphA2抗原性の発現媒体として対象（好ましくは、ヒト対象）に投与される弱毒化リステリア細菌は、その組織指向性（例えばinlB突然変異体）及び細胞から細胞に伝播する能力（例えば、actA突然変異体）が弱毒化されている。好ましい実施態様において、EphA2抗原性の発現媒体として対象（好ましくは、ヒト対象）に投与される弱毒リステリア細菌は、１つの変異（例えば欠失、付加、又は置換）をインターナリンＢに、１つの変異をactAに含み、そのような変異はリステリアの弱毒化をもたらすかそれに寄与する。
【００３１】
本発明のリステリア（好ましくは、弱毒化リステリア）は、好ましくはリステリアから分泌されるEphA2抗原ペプチドを発現するように工作される。特定の実施態様において、EphA2抗原ペプチドをコードする核酸は、EphA2抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能に結合している、SecA分泌シグナル、又はTatシグナルなどの分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、シグナル配列はリステリアシグナル配列である。他の実施態様では、シグナル配列はリステリアシグナル配列以外の細菌性シグナル配列（すなわち非リステリア細菌のシグナル配列）である。
本発明の方法及び組成物での使用に適当なリステリア細菌の系統には、それには限定されないが、リステリアグライ（Listeria grayi）、リステリアインノキュア（Listeria innocua）、リステリアイバノビイ（Listeria ivanovii）、リステリアモノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリアセエリゲリ（Listeria seeligeri）、及びリステリアウエルシメリ（Listeria welshimeri）が含まれる。本発明の方法及び組成物で用いられるリステリア細菌の好ましい系統は、リステリアモノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）である。
【００３２】
本発明の組成物、及び方法は、過剰増殖性疾患の治療、予防及び／又は管理において有用である。ある実施態様では、過剰増殖性疾患は癌である。ある実施態様では、癌は上皮細胞由来であり、かつ／又は前記癌細胞の組織型を有する非癌化細胞と比較してEphA2を過剰発現する細胞を含む。特定の実施態様では、癌は皮膚、肺、大腸、乳腺、卵巣、食道、前立腺、膀胱、又は膵臓の癌であるか、腎細胞癌、又は黒色腫である。他の実施態様では、癌はT細胞由来である。特定の実施態様では、癌は白血病、又はリンパ腫である。他の実施態様では、過剰増殖性障害は非腫瘍性である。特定の実施態様では、非腫瘍性の過剰増殖性障害は、上皮細胞障害である。例示的な非腫瘍性の過剰増殖性障害は、喘息、慢性肺閉塞性疾患、肺線維症、気管支応答性亢進、乾癬、及び脂漏性皮膚炎である。ある実施態様では、過剰増殖性疾患は、内皮細胞障害である。
【００３３】
本発明の方法及び組成物に従って用いられるEphA2抗原ペプチドは、完全長EphA2、又はその抗原性の断片、類似体、又は誘導体を含むことができる。ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、EphA2の細胞外ドメイン、又はEphA2の細胞内ドメインを含む。ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、EphA2膜貫通領域を欠く。ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドはEphA2の細胞外及び細胞内ドメインを含み、EphA2の膜貫通領域を欠く。ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、EphA2のアミノ酸残基646のメチオニンがリジンに置換された完全長EphA2、又はその断片を含む。ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドはEphA2の細胞外及び細胞内ドメインを含み、EphA2の膜貫通領域を欠き、EphA2のアミノ酸残基646のメチオニンのリジンによる置換を有す。ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、少なくともEphA2の抗原部分、及び第２のポリペプチドを含むキメラポリペプチドである。
【００３４】
EphA2抗原ペプチドを発現するリステリアは、１以上のEphA2抗原ペプチドを発現することができる。特定の実施態様では、EphA2抗原ペプチドを発現するリステリアは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25もしくはそれ以上のEphA2抗原ペプチドを、又は2〜5、2〜10、2〜20、10〜20もしくは15〜25のEphA2抗原ペプチドを発現する。複数のEphA2抗原ペプチドは、単一の発現構築物、又は複数の発現構築物から発現させることができる。発現構築物はエピソームでもよく、リステリアゲノムに組み込んでもよい。例えば、ある実施態様において、リステリアワクチン株のゲノムは１以上の遺伝子発現カセットを含み、これらの組合せはEphA2の細胞内ドメイン及び細胞外ドメインの両方をコードする。特定の実施態様では、１以上の発現カセットが、リステリアゲノムに組み込まれる。
【００３５】
本発明のワクチンは、１以上のEphA2抗原ペプチドを発現するリステリアを有することができる。特定の実施態様では、本発明のワクチンは2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25もしくはそれ以上のEphA2抗原ペプチドを発現するリステリアを、又は2〜5、2〜10、2〜20、10〜20もしくは15〜25のEphA2抗原ペプチドを発現するリステリアを有す。
本発明の方法は、リステリアに基づくEphA2ワクチン、及び１以上のさらなる治療法、例えばさらなる抗癌療法による併用療法を含む。ある実施態様では、さらなる抗癌療法はアゴニストEphA2抗体、すなわちEphA2と結合してEphA2のシグナル伝達及びリン酸化を誘導する抗体である。他の実施態様では、さらなる抗癌療法は抗EphA2抗体の抗イディオタイプである。他の実施態様では、さらなる抗癌療法は化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、又は手術である。
【００３６】
本発明のある態様では、本発明のリステリアに基づくワクチンは、EphA2インターナリゼーションを増加させる療法とともに投与される。特定の実施態様では、この剤はEphA2アゴニスト、例えば抗体、ペプチド（例えばKoolpeらの論文、2002, J. Biol. Chem. 277(49): 46974-46979を参照）、又は小分子である。他の特定の実施態様では、この剤はEphA2を調整するホスファターゼの阻害剤、例えば低分子量のチロシンホスファターゼ（LMW-PTP）である。
本発明のワクチンは、例えば、粘膜、鼻腔内、非経口、筋肉内、静脈内、経口、又は腹腔内の経路で投与することができる。特定の実施態様において本発明のワクチンは、例えば体内移植、又は腫瘍内注射によって、疾患部位に局所投与される。
【００３７】
他の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、細胞過剰増殖と関連する非癌性疾患、又は障害、例えばそれには限定されないが喘息、慢性閉塞性肺疾患、再狭窄（平滑筋及び／又は内皮細胞性）、乾癬、その他の治療、予防及び／又は管理のために使用される。好ましい実施態様では、過剰増殖性細胞は上皮である。好ましい実施態様では、過剰増殖性細胞はEphA2を過剰発現する。他の好ましい実施態様では、EphA2の一部（例えば5％以下、10％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、35％以下、40％以下、45％以下、50％以下、55％以下、60％以下、75％以下、85％以下）は、当技術分野で公知のアッセイ（例えばイムノアッセイ）による評価では、細胞間接触の減少、細胞下局在化の変化、EphA2-リガンドと比較してのEphA2量のいずれかの結果として、リガンドに結合していない。
【００３８】
本発明の他の態様では、リステリアに基づくEphA2ワクチンは、異常血管形成と関連、又は関係している障害の治療、予防及び／又は管理のために使用される。リステリアに基づくEphA2ワクチンは、新脈管構造の上で発現するEphA2に対して免疫応答を誘発するために使用される。したがって、本発明は異常血管形成と関連、又は関係している障害の治療、予防及び／又は管理のための、異常血管形成と関連、又は関係している障害の治療、予防及び／又は管理のために有効な量のEphA2抗原ペプチドを発現するリステリア細菌を含む組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。そのような疾患の例としては、それには限定されないが、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脈管再狭窄、幼児の血管腫、尋常性疣贅、乾癬、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性ジストロフィー表皮水疱症、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身紅斑、乾癬性関節炎、ライター症候群、及びシェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、及び冠状動脈疾患がある。
【００３９】
本発明の方法と組成物は未治療者に役立つだけでなく、現在標準の及び実験段階の癌療法、例えばそれには限定されないが化学療法、ホルモン療法、生物療法、放射線療法、及び／又は手術に対して一部、又は完全に不応性の患者の治療にも役立ち、またそのような治療の効力の向上にも役立つ。特に、EphA2発現はサイトカインIL-6の濃度上昇との関係が示唆され、このことは異なる治療計画、例えば化学療法及びホルモン療法に対する癌細胞の抵抗性の発達と関連づけられている。さらに、EphA2過剰発現はエストロゲン受容体活性の必要性を乗り越えることができ、このようにして乳癌細胞のタモキシフェン抵抗性に寄与している。したがって好ましい一実施態様では、本発明は本発明のリステリアベースのEphA2ワクチンの投与を含むもの以外の療法に抗療性、又は非反応性であることがわかった、又はその可能性がある癌の治療、予防、又は管理のための治療的、及び予防的方法を提供する。特定の実施態様において、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、EphA2に基づかない治療法、特にタモキシフェン治療、又は抵抗性がIL-6レベルの上昇と関連している治療法に対して抗療性であるか非反応性である患者に対し、その患者を非抗療性、又は反応性にするために投与される。患者が以前抗療性、又は非反応性であった治療法は、次に適用されたときに治療効果を示す。
【００４０】
本発明の方法と組成物は未治療者に役立つだけでなく、非腫瘍性過剰増殖性障害及び／又は異常血管形成と関連、又は関係している障害のための現在標準の及び実験段階の療法に対して一部、又は完全に不応性の患者の治療にも役立つ。本発明の方法と組成物は、腫瘍性過剰増殖性障害及び／又は異常血管形成と関連、又は関係している障害（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脈管再狭窄、幼児の血管腫、尋常性疣贅、乾癬、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性ジストロフィー表皮水疱症、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身紅斑、乾癬性関節炎、ライター症候群、及びシェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、及び冠状動脈疾患、喘息、慢性肺閉塞性疾患、肺線維症、気管支応答性亢進、乾癬及び脂漏性皮膚炎）のための現在標準の及び実験段階の療法に対して一部、又は完全に不応性の患者の治療にも役立つ。
本発明は、本発明のワクチン、又はワクチン成分を含むキットも提供する。
【００４１】
（３．１．定義）
本明細書で使用される用語「リステリアに基づくEphA2ワクチン」は、EphA2抗原ペプチドを発現するように作成されたLiseria細菌、又はそのような細菌を含む組成物を指す。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、有効な量で投与されると過剰増殖性細胞上でEphA2に対して免疫応答を誘発する。本発明のワクチンでの使用に適当なリステリア細菌の系統には、それには限定されないが、Listeria grayi、Listeria innocua、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes、Listeria seeligeri、及びListeria welshimeriが含まれる。好ましい一実施態様では、リステリアはリステリアモノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）である。
本明細書で使用される用語「EphA2抗原ペプチド」、及び「EphA2抗原性ポリペプチド」は、EphA2の１以上のB細胞エピトープ、又はT細胞エピトープを含む、好ましくは配列番号２のEphA2ポリペプチド、又はその断片、類似体もしくは誘導体を指す。EphA2ポリペプチドは、いかなる種に由来するものでもよい。ある実施態様では、EphA2ポリペプチドは、EphA2の成熟した、加工された形態を指す。他の実施態様では、EphA2ポリペプチドは、EphA2の未熟な形態を指す。
【００４２】
EphA2ポリペプチドのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は文献、又は公共データベースで見つけることができ、又はこのようなヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は当業者に公知のクローニング及び配列決定技術を使用して決定することができる。例えば、ヒトEphA2のヌクレオチド配列は、GenBankデータベース(例えばアクセッション番号BC037166、M59371及びM36395を参照）で見つけることができる。ヒトEphA2のアミノ酸配列は、GenBankデータベース（例えばアクセッション番号NP_004422、AAH37166及びAAA53375を参照）で見つけることができる。EphA2のアミノ酸配列のさらなるそれには限定されない例は、下の表１で示されている。
【００４３】
【表１】
2007509067.tif 000003
【００４４】
ある実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、以下のペプチドの１以上ではない：TLADFDPRV（配列番号３）；VLLLVLAGV（配列番号４）；VLAGVGFFI（配列番号５）；IMNDMPIYM（配列番号６）；SLLGLKDQV（配列番号７）；WLVPIGQCL（配列番号８）；LLWGCALAA（配列番号９）；GLTRTSVTV（配列番号１０）；NLYYAESDL（配列番号１１）；KLNVEERSV（配列番号１２）；IMGQFSHHN（配列番号１３）；YSVCNVMSG（配列番号１４）；MQNIMNDMP（配列番号１５）；EAGIMGQFSHHNIIR（配列番号１６）；PIYMYSVCNVMSG（配列番号１７）；DLMQNIMNDMPIYMYS（配列番号１８）。ある特定の実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、配列番号３〜１２のいずれでもなく、配列番号１３〜１５ではなく、かつ／又は配列番号１６〜１８ではない。他の特定の実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、配列番号３〜１８ではない。
【００４５】
タンパク性因子（例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は抗体）と関連して本明細書で使用される用語「類似体」は、第２のタンパク性因子（例えばEphA2ポリペプチド）と類似した、又は同一の機能を備えているが、前記第２のタンパク性因子と類似しているか同一のアミノ酸配列、又は構造を必ずしも含むわけではないタンパク性因子を指す。類似したアミノ酸配列を有するタンパク性因子は、以下の少なくとも１つを満たすタンパク性因子を指す：（ａ）第２のタンパク性因子のアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク性因子；（ｂ）少なくとも20のアミノ酸残基、少なくとも30のアミノ酸残基、少なくとも40のアミノ酸残基、少なくとも50のアミノ酸残基、少なくとも60のアミノ酸残基、少なくとも70のアミノ酸残基、少なくとも80のアミノ酸残基、少なくとも90のアミノ酸残基、少なくとも100のアミノ酸残基、少なくとも125のアミノ酸残基、又は少なくとも150のアミノ酸残基の第２のタンパク性因子をコードするヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされたタンパク性因子；及び（ｃ）第２のタンパク性因子をコードするヌクレオチド配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされたタンパク性因子である。第２のタンパク性因子と類似した構造を有すタンパク性因子は、前記第２のタンパク性因子と類似した二次、三次、又は四次構造を有するタンパク性因子を指す。タンパク性因子の構造は当業者に公知の方法で測定することができ、その例としては、それには限定されないが、X線結晶学、核磁気共鳴、及び結晶学的電子顕微鏡法がある。好ましくは、前記タンパク性因子は、EphA2活性を有する。
【００４６】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の一致率を決定するために、それらの配列は最適な比較ができるように整列させられる（例えば、第２のアミノ酸、又は核酸配列との最適な整列のために第１のアミノ酸、又は核酸配列に隙間を導入することができる）。対応しているアミノ酸位置、又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基、又はヌクレオチドが、次に比較される。第１の配列内のある位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基、又はヌクレオチドで占められているときは、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の一致率は両配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、一致率＝同一のオーバーラップ位置／位置総数×100％）。一実施態様では、２つの配列は同じ長さである。
【００４７】
２つの配列間の一致率の決定は、数値計算用アルゴリズムを使用しても達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの好ましい非限定例は、Karlin及びAltschulの論文、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268のアルゴリズムであり、これはKarlin及びAltschulの論文、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877のように修正されている。そのようなアルゴリズムは、Altschulらの論文、1990, J. Mol. Biol. 215: 403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTによるヌクレオチドの検索は、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメータを例えば、スコア＝100、文字長＝12に設定して実施し、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTによるタンパク質の検索は、XBLASTプログラムパラメータを例えば、スコア＝50、文字長＝3に設定して実施し、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップがある整列を得るためには、Altschulらの論文, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402で記載されているように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、分子間の遠い関係を検出する繰り返し検索を実施するために、PSI-BLASTを使用することができる（Id.）。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI-Blastプログラムを利用するときは、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる（例えばNCBIウェブサイトを参照）。配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの他の好ましい非限定例は、Myers及びMillerの論文、1988, CABIOS 4: 11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。ALIGNプログラムをアミノ酸配列の比較のために利用するときは、PAM120ウェートレジデュ（weight residue）表、１２のギャップレングスペナルティ（gap length penalty）、及び４のギャップペナルティ（gap penalty）を使用することができる。
【００４８】
ギャップの有無にかかわらず、２つの配列間の一致率は、上述のものと類似した手法を使用して決定することができる。一致率を計算する際には、一般的に完全な一致だけが数えられる。
非タンパク類似体と関連して本明細書で使用される用語「類似体」は、第１の有機、又は無機の分子と類似、又は同一の機能を備え、また前記第１の有機、又は無機の分子と構造的に類似している第２の有機、又は無機の分子を指す。
本明細書で使用される用語「弱毒化された」及び「弱毒化」は、リステリアの病原性が弱くなるような修飾を指す。弱毒化の最終的な結果は、リステリアが対象に投与されたときに他の副作用と同様に毒性の危険性が減少することである。
【００４９】
タンパク性因子（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び抗体）と関連して本明細書で使用される用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加の導入によって変更されたアミノ酸配列を含むタンパク性因子を指す。本明細書で用いられる用語「誘導体」は、すなわちタンパク性因子へのある種の分子の共有結合的付着によって修飾されたタンパク性因子も指す。例えば、しかし限定するものではないが、タンパク性因子の誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンド、又は他のタンパク質への連結、その他によって生産することができる。タンパク性因子の誘導体は当業者に公知の手法を使用した化学修飾、例えばそれには限定されないが特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成、その他によって生産することもできる。さらに、タンパク性因子の誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。タンパク性因子の誘導体は、それが由来するタンパク性因子と同一の機能を有する。
【００５０】
EphA2タンパク性因子と関連して本明細書で使用される用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、又は付加（すなわち変異）の導入によって変更されたEphA2ポリペプチドのアミノ酸配列、又はEphA2ポリペプチドの断片を含むタンパク性因子を指す。EphA2タンパク性因子と関連して本明細書で使用される用語「誘導体」は、すなわちそのポリペプチドへの任意の種類の分子の共有結合的付着によって修飾された、EphA2ポリペプチド、又はEphA2ポリペプチドの断片を指す。例えば、しかし限定するものではないが、EphA2ポリペプチド、又はEphA2ポリペプチドの断片は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンド、又は他のタンパク質への連結、その他によって修飾することができる。EphA2ポリペプチド、又はEphA2ポリペプチドの断片の誘導体は当業者に公知の手法を使用した化学修飾、例えばそれには限定されないが特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成、その他によって修飾することができる。さらに、EphA2ポリペプチド、又はEphA2ポリペプチドの断片の誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。一実施態様では、ポリペプチド誘導体は、本明細書で記載されているEphA2ポリペプチド、又はEphA2ポリペプチドの断片と類似、又は同一の機能を備えている。他の実施態様では、変更されていないポリペプチドと比較して、EphA2ポリペプチド、又はEphA2ポリペプチドの断片の誘導体は変化した活性を有する。例えば、EphA2ポリペプチド、又はその断片の誘導体は、EphA2ポリペプチド、又はその断片と比較してリン酸化において異なることがある。
【００５１】
非タンパク性因子と関連して本明細書で使用される用語「類似体」は、第１の有機、又は無機の分子の構造に基づいて形成される第２の有機、又は無機の分子を指す。有機分子の誘導体としては、それには限定されないが例えば、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボキシル基、ニトリル基、又はミン基の付加、又は削除によって修飾された分子がある。有機分子は、例えば、エステル化、アルキル化及び／又はリン酸化することもできる。
【００５２】
本明細書で使用される用語「エフリンA1ポリペプチド」はエフリンA1、その類似体、誘導体、又は断片、あるいはエフリンA1、その類似体、誘導体、又は断片を含む融合タンパク質を指す。エフリンA1ポリペプチドはいかなる種からのものでもよい。ある実施態様では、用語「エフリンA1ポリペプチド」は、エフリンA1の成熟した、加工された形態を指す。他の実施態様では、用語「エフリンA1ポリペプチド」は、エフリンA1の未熟な形態を指す。この実施態様によれば、本発明の抗体は、エフリンA1の成熟した加工された形態に対応するエフリンA1の未熟な形態の一部と免疫特異的に結合する。
【００５３】
エフリンA1ポリペプチドのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は文献、又は公共データベースで見つけることができ、又はこのようなヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は当業者に公知のクローニング及び配列決定技術を使用して決定することができる。例えば、ヒトエフリンA1のヌクレオチド配列は、GenBankデータベース（例えばアクセッション番号BC032698を参照）で見つけることができる。ヒトエフリンA1のアミノ酸配列は、GenBankデータベース（例えばアクセッション番号AAH32698を参照）で見つけることができる。エフリンA1のアミノ酸配列のさらなる非限定的な例を、下の表２で示す。
【００５４】
【表２】
2007509067.tif 000004
【００５５】
特定の実施態様において、エフリンA1ポリペプチドは、任意の種からのエフリンA1である。好ましい一実施態様では、エフリンA1ポリペプチドは、ヒトエフリンA1である。
本明細書で使用される用語「有効量」は、障害（例えば癌、非腫瘍性の過剰増殖性細胞障害、又は異常血管形成と関連する障害）、又はその症状の程度及び／又は期間を削減及び／又は改善するのに十分な、前記障害の進行を阻止するのに十分な、前記障害の退行を引き起こすのに十分な、前記障害と関連する１以上の症状の再発、発達、又は開始を阻止するのに十分な、あるいは他の療法（例えば予防薬、又は治療薬）の予防効果、又は治療効果を強化、又は改善するのに十分な療法（例えば予防薬、又は治療薬）の量を指す。
【００５６】
本明細書で使用される用語「B細胞エピトープ」は、動物で、好ましくは哺乳類で、最も好ましくはマウス、又はヒトで抗原性、又は免疫原性の活性を有するEphA2ポリペプチドの部分を指す。免疫原性活性を有しているエピトープは、動物で抗体応答を誘発するEphA2ポリペプチドの一部である。抗原性活性を有しているエピトープは、当業者に公知の任意の方法、例えばイムノアッセイによって測定されるような、抗体が免疫特異的に結合するEphA2ポリペプチドの一部である。抗原エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【００５７】
本明細書で使用される用語「T細胞エピトープ」は、EphA2ポリペプチド、好ましくは配列番号２のEphA2ポリペプチドのT細胞受容体によって認識される少なくとも一部を指す。用語「T細胞エピトープ」は、ヘルパーT細胞（Th）エピトープ及び細胞傷害性T細胞（Tc）エピトープを含む。用語「ヘルパーT細胞エピトープ」は、Th1及びTh2エピトープを含む。
【００５８】
EphA2ポリペプチドと関連して本明細書で使用される用語「断片」は、EphA2ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5つの連続したアミノ酸残基、少なくとも10の連続したアミノ酸残基、少なくとも15の連続したアミノ酸残基、少なくとも20の連続したアミノ酸残基、少なくとも25の連続したアミノ酸残基、少なくとも40の連続したアミノ酸残基、少なくとも50の連続したアミノ酸残基、少なくとも60の連続したアミノ残基、少なくとも70の連続したアミノ酸残基、少なくとも80の連続したアミノ酸残基、少なくとも90の連続したアミノ酸残基、少なくとも100の連続したアミノ酸残基、少なくとも125の連続したアミノ酸残基、少なくとも150の連続したアミノ酸残基、少なくとも175の連続したアミノ酸残基、少なくとも200の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも250の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むEphA2抗原性のペプチド、又はポリペプチドを含む。
【００５９】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は第１のポリペプチド、又はタンパク質あるいはその断片、類似体、又は誘導体のアミノ酸配列、及び異種ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はタンパク質を指す。一実施態様では、融合タンパク質は異種のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに融合している予防薬、又は治療薬を含む。この実施態様によれば、前記異種のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、異なる種類の予防薬、又は治療薬であってもよいしそうでなくてもよい。例えば、免疫調節活性を有する２つの異なるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを融合させて、融合タンパク質を形成することができる。好ましい一実施態様では、融合タンパク質は活性を保持するか、あるいは異種のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに融合される前の元のポリペプチド、又はタンパク質の活性と比較して、向上した活性を有する。
【００６０】
核酸配列（例えば遺伝子）、又はアミノ酸配列（例えばペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）と関連して本明細書で使用される用語「異種」は、自然界では第２の核酸配列、又は第２のアミノ酸配列（例えば異なる種に由来する核酸配列、又はアミノ酸配列）と関連していない核酸配列、又はアミノ酸配列を指す。
【００６１】
本明細書で使用される用語「過剰増殖性細胞障害」、「過剰増殖性細胞障害」、「過剰増殖性障害」及び「過剰増殖性疾患」、ならびに類似の用語は、細胞過剰増殖、又はいかなる形態の過度の細胞蓄積が障害の病理学的状態、又は症状を引き起こすかそれに寄与する障害を指す。一部の実施態様では、過剰増殖性細胞障害は、過剰増殖性上皮細胞を特徴とする。他の実施態様では、過剰増殖性細胞障害は、過剰増殖性内皮細胞を特徴とする。他の実施態様では、過剰増殖性細胞障害は、過剰増殖性線維芽細胞を特徴とする。ある実施態様では、過剰増殖性細胞障害は、腫瘍性ではない。例示的な非腫瘍性の過剰増殖性細胞障害は、喘息、慢性肺閉塞性疾患、線維症（例えば肺、肝臓及び腎臓の線維症）、気管支応答性亢進、乾癬及び脂漏性皮膚炎である。好ましい一実施態様では、過剰増殖性細胞障害は、EphA2を発現（好ましくは、過剰発現）する過剰増殖性細胞を特徴とする。
【００６２】
本明細書で使用される用語「免疫特異的にEphA2と結合する」及び類似の用語は、EphA2受容体、又はその１以上の断片と特異的に結合して他の受容体、又はその断片とは特異的に結合しないペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗体、又はそれらの断片を指す。用語「免疫特異的にエフリンA1と結合する」及び類似の用語は、エフリンA1、又はその１以上の断片と特異的に結合して他のリガンド、又はその断片とは特異的に結合しないペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗体、又はそれらの断片を指す。EphA2、又はエフリンA1、又はその断片と免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は抗体は、例えばイムノアッセイ、又は当技術分野で公知の結合能を検出するための他のアッセイで測定されるように、他のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質とより低い親和性で結合するかもしれない。EphA2、又はエフリンA1と免疫特異的に結合する抗体、又は断片は、関連する抗原と交差反応を起こすことができる。好ましくは、EphA2、又はエフリンA1と免疫特異的に結合する抗体、又はその断片は、例えばイムノアッセイ、又は当業者に公知の他の手法で特定することができる。抗体、又はその断片は、ラジオイムノアッセイ（RIA）、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）などの実験手法を使用して決定されるように、いかなる交差反応性抗原よりも高い親和性でEphA2、又はエフリンA1と結合するとき、EphA2、又はエフリンA1と特異的に結合する。抗体特異性に関する議論に関しては、例えばPaul, ed., 1989, Fundamental Immunology, 2版, Raven Press, New York, pp. 332-336を参照。好ましい一実施態様では、EphA2、又はエフリンA1と免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と結合及び交差反応しない。他の実施態様では、融合タンパク質であるEphA2、又はエフリンA1と結合する抗体は、その融合タンパク質のEphA2、又はエフリンA1である部分と特異的に結合する。
【００６３】
本発明の抗体としては、それには限定されないが例えば、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えで生産された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ（intrabody）、単鎖Fvs（scFv）（例えば、単一特異性及び二重特異性、その他を含む）、Fab断片、F（ab’）断片、ジスルフィド結合Fvs（sdFv）、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、及び上のいずれかのエピトープ結合断片がある。特に、本発明の抗体としては、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわちEphA2抗原、又はエフリンA1抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗EphA2抗体、又は抗エフリンA1抗体の１以上の相補性決定領域（CDR））がある。本発明の抗体は免疫グロブリン分子のいずれの型（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY）、クラス（例えば、IgG１、IgG２、IgG３、IgG４、IgA１及びIgA２）、又はサブクラスでよい。
【００６４】
タンパク性因子、又は核酸以外の有機、又は無機の分子（その分子が小さくても大きくても関係なく）と関連して本明細書で使用される用語「単離された」は、異なる有機、又は無機の分子を実質的に含まない有機、又は無機の分子を指す。好ましくは、有機、又は無機の分子は、第２の異なる有機、又は無機の分子を60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は99％含まない。好ましい一実施態様では、有機及び／又は無機の分子は単離されている。
【００６５】
タンパク性因子（例えばペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、又は抗体）と関連して本明細書で使用される用語「単離された」は、由来源である細胞、又は組織からの細胞物質、又は混在タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成されたときは化学前駆物質、又は他の化学物質を実質的に含まないタンパク性因子を指す。用語「実質的に細胞物質を含まない」は、タンパク性因子が、それがそこから単離されたか組換えで生産された細胞の細胞成分から分離されているタンパク性因子の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まないタンパク性因子としては、異種のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又は抗体（「混在タンパク質」とも称される）を約30％未満、20％未満、10％未満、又は5％未満（乾燥重量ベースで）有するタンパク性因子の調製物がある。タンパク性因子が組換えで生産される場合は、それは好ましくは培地を実質的に含まず、すなわち培地が占めるのはタンパク性因子調製物の体積の約20％未満、10％未満、又は5％未満である。タンパク性因子が化学合成によって生産される場合は、それは好ましくは化学前駆物質、又は他の化学物質を実質的に含まず、すなわちそれは前記タンパク性因子の合成に関与している化学前駆物質、又は他の化学物質から分離されている。したがって、そのようなタンパク性因子調製物は、関心のタンパク性因子以外の化学前駆物質、又は化合物を約30％未満、20％未満、10％未満、5％未満（乾燥重量ベースで）有する。特定の実施態様では、本明細書で開示されているタンパク性因子は単離されている。
【００６６】
核酸分子と関連して本明細書で使用される用語「単離された」は、その核酸分子の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子を指す。さらに、cDNA分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって生産された場合は好ましくは他の細胞物質、又は培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成された場合は化学前駆物質、又は他の化学物質を実質的に含まない。特定の実施態様では、核酸分子は単離される。
本明細書で使用される用語「疾患」及び「障害」はある病態を指すために同義で使用される。
【００６７】
本明細書で使用される用語「組合せ」は、２つ以上の療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）の使用を指す。用語「組合せ」が使用される場合、複数の療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）が過剰増殖性細胞障害、特に癌の対象に投与される順序を制限しない。第１の療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）は、過剰増殖性細胞障害、特に癌を過去発症したか、現在有しているかそれに感受性の対象に対する第２の療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）の投与の（例えば1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間）前に、それと同時に、あるいは（例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間）後に投与することができる。このような療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）は、経時的に、また、その本発明の薬剤が他の薬剤とともに作用してそれらが他の方法で投与されたときよりも恩恵が増大するような時間間隔内に対象に投与される。任意のさらなる療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）を、他のさらなる療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）と任意の順序で投与することができる。
【００６８】
本明細書で使用される用語「低寛容性」は、患者が治療による副作用で苦しみ、その結果副作用のために患者が療法から恩恵を受けずかつ／又は療法を継続できない状態、及び／もしくは副作用による害が治療の利点を上回る状態を指す。
本明細書で使用される用語「管理する」、「管理すること」及び「管理」は、疾患の治癒には至らないが対象が療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）の投与から引き出す有益効果を指す。ある実施態様では、対象は疾患を「管理」してその疾患の進行、又は悪化を阻止するために、１以上の療法（例えば予防薬及び／又は治療薬）が適用される。
【００６９】
本明細書で使用される用語「腫瘍性」は、遠隔部位に転移して非腫瘍性の細胞のそれらと異なる表現型形質、例えば軟寒天のような三次元基質でのコロニーの形成、又は三次元基底膜もしくは細胞間マトリックス調製物、例えばMATRIGEL（商標）での管状ネットワーク、又はクモの巣状のマトリックスの形成を示す能力を有する細胞にかかわる疾患を指す。非腫瘍性の細胞は軟寒天でコロニーを形成せず、三次元基底膜、又は細胞間マトリックス調製物では明瞭な球状構造を形成する。様々なメカニズムによるが、腫瘍細胞はそれらの発達の間、一組の特徴的な機能的能力を獲得する。そのような能力としては、回避アポトーシス、増殖シグナルの自給、抗増殖シグナルへの非感受性、組織侵入／転移、無限複製能力及び持続的血管形成がある。したがって、「非腫瘍性」は、その病態、疾患、又は障害は癌細胞を含まないことを意味する。
【００７０】
本明細書で使用される用語「非反応性／抗療性の」は、１以上の今日利用できる療法（例えば癌療法）、例えば化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法及び／又は生物療法／免疫療法、特に特定の癌のための標準的な療法で治療される患者において、その療法が患者を治療するのに臨床的に十分ではなくこれらの患者がさらなる有効な療法を必要とすること、例えばこれらの患者が療法に非感受性のままであることを記載するために使用される。この用語を用いて、療法に反応するが、副作用が起き、逆戻りし、抵抗性が発達するなどする患者を記載することもできる。様々な実施態様において、「非反応性／抗療性」は、癌細胞の少なくともかなりの部分が死滅しないか、又はそれらの細胞分裂が停止しないことを意味する。癌細胞が「非反応性／抗療性」であるかどうかは、当技術分野で認められている「抗療性」の意味をそのような文脈で使用して、癌細胞に対する治療効果を検定するための当技術分野で公知の任意の方法によってin vivo、又はin vitroで決定することができる。様々な実施態様において、癌細胞の数がかなり減少していないか治療の間に増加した場合は、癌は「非反応性／抗療性」である。
【００７１】
EphA2過剰発現と関連して本明細書で使用される用語「過剰発現する」は、EphA2をコードする遺伝子が、本明細書で記載されているか当業者に公知のアッセイ（例えばイムノアッセイ、例えばELISAもしくはウェスタンブロット、ノーザンブロット、又はRT-PCR）によって評価されるように正常ヒト細胞によって発現されるよりも高いレベルで発現されることを意味する。
本明細書で使用される用語「増強」はその一般的、又は承認された用量における療法の効力の向上を指す。
本明細書で使用される用語「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、対象にある療法（例えば予防薬、又は治療薬）、又は療法の組合せを投与することにより疾患の開始、再発、又は拡散を予防することを指す。
【００７２】
本明細書で使用される用語「予防薬」は、EphA2過剰発現の関連障害、異常血管形成の関連障害及び／又は過剰増殖性細胞障害、特に癌の開始、再発、又は拡大の予防で使用することができる任意の薬剤を指す。ある実施態様では、用語「予防薬」は、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを指す。他のある実施態様では、用語「予防薬」はリステリアに基づくEphA2ワクチン以外の療法、例えば癌化学療法薬、放射線療法、ホルモン療法、生物療法（例えば免疫療法）を指す。他の実施態様では、２つ以上の予防薬を組み合わせて投与することができる。
【００７３】
本明細書で使用される「予防的有効量」はある障害（例えば、異常血管形成と関連する障害及び過剰増殖性細胞障害、好ましくは癌）の開始、再発、又は拡大の予防に十分な療法（例えば予防薬）の量を指す。予防的有効量は、ある対象、例えばそれには限定されないが過剰増殖性細胞障害の素因がある対象、例えば癌に対する遺伝的素因があるか以前発癌物質に曝露した対象においてある障害（例えば、異常血管形成と関連する障害及び過剰増殖性細胞障害、特に癌）の開始、再発、又は拡大を予防するのに十分な療法（例えば予防薬）の量を指すこともある。予防的有効量は、ある障害（例えば、異常血管形成と関連する障害、及び過剰増殖性細胞障害）の予防において予防的恩恵を提供する療法（例えば予防薬）の量を指すこともある。さらに、療法（例えば予防薬）に関して予防的有効量は、単独使用、又は他の療法（例えば薬剤）と併用使用される療法（例えば予防薬）の、ある障害（例えば異常血管形成と関連する障害、及び過剰増殖性細胞障害）の予防において予防的恩恵を提供する量を意味する。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンのある量に関連して使用されると、その用語は全体的な予防を改善するか、他の療法（例えば予防薬）の予防効力、又はそれとの相乗効果を強化する量を含むことができる。
本明細書で使用される「プロトコル」は投薬スケジュール及び投薬計画を含む。
【００７４】
本明細書で使用される用語「副作用」は、予防薬、又は治療薬の、不必要な悪影響を含む。悪影響は常に不必要であるが、不必要な影響は必ずしも有害というわけではない。ある療法（例えば予防薬、又は治療薬）からの悪影響は有害かも、不快かも、又は危険かもしれない。化学療法による副作用としては、それには限定されないが例えば胃腸毒性、例えばそれには限定されないが早期及び後期の下痢、及び鼓腸、吐き気、嘔吐、食欲不振、白血球減少症、貧血症、好中球減少症、無力症、腹部痙攣、熱、疼痛、体重減少、脱水、脱毛症、呼吸困難、不眠症、めまい、粘膜炎、口内乾燥症及び腎不全、ならびに便秘、神経、及び筋肉への影響、腎臓、及び膀胱の一時的、又は恒久的損傷、風邪様症状、体液停留、及び一時的、又は恒久的不妊症がある。放射線療法からの副作用としては、それには限定されないが疲労、口内乾燥症及び食欲不振がある。生物療法／免疫療法からの副作用としては、それには限定されないが投与部位の発疹、又は腫脹、熱、悪寒及び疲労などの風邪様症状、消化管の問題ならびにアレルギー性反応がある。ホルモン療法による副作用としては、それには限定されないが吐き気、生殖の問題、うつ症、食欲不振、目の問題、頭痛及び体重変動がある。患者が一般に経験するさらなる望ましくない影響は非常に多く、当技術分野で公知である。多くは「医師用卓上参考書」(56版, 2002, 57版, 2003、及び58版, 2004)に記載されている。
【００７５】
本明細書で使用される用語「対象」及び「患者」は同義で使用される。本明細書で使用される対象は好ましくは哺乳類、例えば非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、その他）と霊長類（例えばサル及びヒト）、最も好ましくはヒトである。特定の一実施態様では、対象はヒト以外の動物である。他の実施態様では、対象は家畜（例えばウマ、ブタ、子羊、又はウシ）あるいはペット（例えばイヌ、ネコ、ウサギ、又は鳥）である。他の実施態様では、対象は実験動物、又は動物モデル（例えばマウス、ラット、モルモット、又はサル）以外の動物である。好ましい一実施態様では、対象はヒトである。他の好ましい実施態様では、対象は免疫不全状態でも免疫抑制状態でもないヒトである。他の好ましい実施態様では、対象はヒトであって、平均絶対リンパ球カウントが約500細胞／mm３、約600細胞／mm３、約650細胞／mm３、約700細胞／mm３、約750細胞／mm３、約800細胞／mm３、約850細胞／mm３、約900細胞／mm３、約950細胞／mm３、約1000細胞／mm３、約1050細胞／mm３、約1100細胞／mm３、又は約1150細胞／mm３、又は約1200細胞／mm３である。
【００７６】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、ある障害、又はその症状の根絶、減少、又は改善を指し、特に１以上の療法（例えば治療薬）の適用がもたらす原発性、領域性、又は転移性癌組織の根絶、除去、修飾、又は制御を指す。ある実施態様では、そのような用語は、癌を有する対象への１以上の療法（例えば治療薬）の適用がもたらす、癌の広がりの最小化、又は遅延を指す。
【００７７】
本明細書で使用される用語「治療薬」は、ある疾患（例えばEphA2過剰発現の関連障害及び／又は過剰増殖性細胞障害、特に癌）の予防、治療、又は管理で使用することができる任意の薬剤を指す。ある実施態様では、用語「治療薬」は、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを指す。他のある実施態様では、用語「治療薬」はリステリアに基づくEphA2ワクチン以外の療法、例えば癌化学療法薬、放射線療法、ホルモン療法及び／又は生物療法／免疫療法を指す。他の実施態様では、２つ以上の療法（例えば治療薬）を組み合わせて適用することができる。
【００７８】
本明細書で使用される「治療的有効量」はある療法（例えば治療薬）の、ある障害（例えばEphA2過剰発現の関連障害、異常血管形成の関連障害及び／又は過剰増殖性細胞障害）を治療、又は管理するのに十分な量、及び好ましくは、原発性、限局性、又は転移性癌組織を破壊、修飾、制御、又は除去するのに十分な量を指す。治療的有効量はある療法（例えば治療薬）の、ある障害（例えば過剰増殖性細胞障害）の発症を遅延、又は最小化させるのに、例えば癌の広がりを遅延、又は最小化させるのに十分な量を指すこともある。治療的有効量は、ある障害（例えば癌）の治療、又は管理において治療的恩恵を提供する療法（例えば治療薬）の量を指すこともある。さらに、ある療法（例えば治療薬）に関する治療的有効量は、単独使用、又は他の療法と併用使用されるある療法（例えば治療薬）の、ある障害（例えば癌などの過剰増殖性細胞障害）の治療、又は管理において治療的恩恵を提供する量を意味する。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンのある量に関連して使用されると、この用語は全体的な治療を改善するか、不必要な影響を削減、又は回避させるか、あるいは他の療法（例えば治療薬）の治療効力、又はそれとの相乗効果を強化する量を含むことができる。
【００７９】
本明細書で使用される用語「療法」は、ある障害（例えば過剰増殖性細胞障害、異常血管形成の関連障害及び／又は非腫瘍性の過剰増殖性細胞障害）あるいはそれらの症状の予防、治療、又は管理で使用することができる任意のプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。ある実施態様では、用語「複数の療法」、及び「療法」は、ある障害（例えば、過剰増殖性細胞障害及び／又は非腫瘍性の過剰増殖性細胞障害）あるいはその１以上の症状の治療、管理、予防、又は改善において有用な、医療関係者などの当業者に公知の生物療法、支持療法及び／又は他の療法を指す。
【００８０】
本明細書で使用される用語「相乗的」は、任意の２個以上の単独療法（例えば１以上の予防薬、又は治療薬）の相加効果よりも効果的な複数の療法（例えば予防薬、又は治療薬）の組合せを指す。複数の療法の組合せ（例えば予防薬、又は治療薬の組合せ）の相乗効果のために、非腫瘍性の過剰増殖性上皮及び／又は内皮の細胞障害を有する対象に対する、１以上の療法（例えば１以上の予防薬、又は治療薬）のより低い用量での使用及び／又は前記療法のより低い頻度での投与が可能になる。複数の療法（例えば予防薬、又は治療薬）の低用量での使用及び／又は前記療法のより低い頻度での投与が可能になると、ある障害（例えば過剰増殖性細胞障害）の予防、又は治療における前記療法の効力低下を伴わずに、前記療法の対象への投与に伴う毒性が軽減される。さらに、相乗効果は障害（例えば異常血管形成と関連する障害及び過剰増殖性細胞障害）の予防、又は治療において、療法（例えば予防薬、又は治療薬）の効力の改善をもたらすことができる。最後に、複数の療法（例えば予防薬、又は治療薬）の組合せの相乗効果により、いずれか１つの療法の使用に伴う有害、又は不必要な副作用の回避、又は軽減が可能になる。
【００８１】
本明細書で使用される用語「複数のT細胞悪性腫瘍」及び「T細胞悪性腫瘍」は、胸腺、及び後胸腺の悪性腫瘍を含む任意のT細胞リンパ増殖性障害を指す。T細胞悪性腫瘍は、T細胞由来の腫瘍を含む。T細胞悪性腫瘍は、リンパ系の前駆細胞、胸腺細胞、T細胞、NK細胞、又は抗原提示細胞由来の腫瘍を指す。T細胞悪性腫瘍としては、それには限定されないが、白血病、例えば急性リンパ芽球性白血病、胸腺腫、急性リンパ芽球性白血病、ならびにリンパ腫、例えばホジキン病及び非ホジキン病があるが、T細胞悪性腫瘍は皮膚のT細胞悪性腫瘍、特に皮膚細胞リンパ腫ではない。好ましい一実施態様では、T細胞悪性腫瘍は全身性の、皮膚以外のT細胞悪性腫瘍である。
【００８２】
（３．２．配列）
以下は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、添付の配列表中に表す配列の簡単な説明である。
【００８３】
配列番号１
ヒトEphA2のcDNA（完全長）
【００８４】
配列番号２
ヒトEphA2のポリペプチド（完全長）
【００８５】
配列番号３〜１８
ヒトEphA2のペプチド
【００８６】
配列番号１９
コンストラクト：LLOss-PEST-hEphA2
天然型LLOシグナルペプチド＋完全長ヒトEphA2と融合したPEST
コドン最適化せず
エピトープタグなし（例えば、myc、又はFLAGをこのコンストラクト中に使用する）
融合タンパク質コード配列を示す
【００８７】
配列番号２０
コンストラクト：LLOss-PEST-hEphA2
天然型LLOシグナルペプチド＋完全長ヒトEphA2と融合したPEST
コドン最適化せず
エピトープタグなし（例えば、myc、又はFLAGをこのコンストラクト中に使用する）
予想融合タンパク質を示す
【００８８】
配列番号２１
EphA2 EX2ドメイン
天然型ヌクレオチド配列
【００８９】
配列番号２２
EphA2 EX2ドメイン
リステリア中で最適コドンを使用するためのヌクレオチド配列
【００９０】
配列番号２３
EphA2 EX2ドメイン
一次アミノ酸配列
【００９１】
配列番号２４
コンストラクト：LLOss-PEST-EX2_hEphA2
天然型LLOシグナルペプチド＋ヒトEphA2の外部ドメインと融合したPEST
コドン最適化せず
エピトープタグなし（例えば、myc、又はFLAGをこのコンストラクト中に使用する）
【００９２】
配列番号２５
コンストラクト：LLOss-PEST-EX2_hEphA2
天然型LLOシグナルペプチド＋ヒトEphA2の外部ドメインと融合したPEST
コドン最適化せず
エピトープタグなし（例えば、myc、又はFLAGをこのコンストラクト中に使用する）
予想融合タンパク質を示す
【００９３】
配列番号２６
天然型LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp
（天然型L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-EX-2 EphA2-Myc）
ヌクレオチド配列（hlyプロモーター含む）
【００９４】
配列番号２７
天然型LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp
（天然型L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-EX-2EphA2-Myc）
一次アミノ酸配列
【００９５】
配列番号２８
コドン最適化LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-EX-2EphA2-Myc）
ヌクレオチド配列（hlyプロモーター含む）
【００９６】
配列番号２９
コドン最適化LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-EX-2EphA2-Myc）
一次アミノ酸配列
【００９７】
配列番号３０
PhoD-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化B.サブチリスphoD Tatシグナルペプチド-FLAG-EX-2EphA2-Myc）
ヌクレオチド配列（hlyプロモーター含む）
【００９８】
配列番号３１
PhoD-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化B.サブチリスphoD Tatシグナルペプチド-FLAG-EX-2EphA2-Myc）
アミノ酸配列
【００９９】
配列番号３２
EphA2 COドメイン
天然型ヌクレオチド配列
【０１００】
配列番号３３
EphA2 COドメイン
リステリア中で最適コドンを使用するためのヌクレオチド配列
【０１０１】
配列番号３４
EphA2 COドメイン
一次アミノ酸配列
【０１０２】
配列番号３５
コンストラクト：LLOss-PEST-CO-huEphA2
天然型LLOシグナルペプチド＋ヒトEphA2の細胞質ドメインと融合したPEST
コドン最適化せず
エピトープタグなし（例えば、myc、又はFLAGをこのコンストラクト中に使用する）
融合タンパク質コード配列を示す
【０１０３】
配列番号３６
コンストラクト：LLOss-PEST-CO-huEphA2
天然型LLOシグナルペプチド＋ヒトEphA2の細胞質ドメインと融合したPEST
コドン最適化せず
エピトープタグなし（例えば、myc、又はFLAGをこのコンストラクト中に使用する）
予想融合タンパク質を示す
【０１０４】
配列番号３７
天然型LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-コドンOp
（天然型L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-CO_EphA2-Myc）
ヌクレオチド配列（hlyプロモーター含む）
【０１０５】
配列番号３８
天然型LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-コドンOp
（天然型L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-CO_EphA2-Myc）
一次アミノ酸配列
【０１０６】
配列番号３９
コドン最適化LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-CO_EphA2-Myc）
ヌクレオチド配列（hlyプロモーター含む）
【０１０７】
配列番号４０
コドン最適化LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化L.モノサイトゲネスLLOシグナルペプチド＋PEST-コドン最適化-FLAG-CO_EphA2-Myc）
一次アミノ酸配列
【０１０８】
配列番号４１
PhoD-FLAG-CO_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化B.サブチリスphoD Tatシグナルペプチド-FLAG-CO_EphA2-Myc）
ヌクレオチド配列（hlyプロモーター含む）
【０１０９】
配列番号４２
PhoD-FLAG-CO_EphA2-myc-コドンOp
（コドン最適化B.サブチリスphoD Tatシグナルペプチド-FLAG-CO_EphA2-Myc）
アミノ酸配列
【０１１０】
配列番号４３
コンストラクト：pAM401-MCS
pPL2ベクター由来のマルチクローニング部位（MCS）を含むプラスミドpAM401
pAM401中に挿入されたpPL2由来の小さなAatIIMCS断片の挿入体
平滑XbaI部位とNruI部位の間のプラスミド
完全なpAM401-MCSプラスミド配列を示す
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１１】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、EphA2抗原ペプチドを発現するように設計されたリステリアを含むリステリアに基づくワクチンを使用すると、EphA2発現細胞が関与する過剰増殖性疾病に対する治療上及び予防上の恩恵を得られるという、発明者の発見に一部基づいている。
【０１１２】
本発明は、EphA2の過剰発現に関連する疾患、異常血管形性に関連する疾患、及び／又は過剰増殖性細胞障害の予防、治療、抑制、及び管理を行えるようにするための方法及び組成を実現する。本発明の特定の態様は、EphA2発現細胞が関与する過剰増殖性細胞障害を患っている対象に投与したときに、EphA2に対する免疫応答を引き起こすか、又は媒介し、その結果、過剰増殖性細胞障害が関与するEphA2発現細胞の成長阻害を生じさせる、化合物を含む方法及び組成物に関する。本発明は、さらに、上皮細胞由来の癌、特に胸、卵巣、食道、肺、皮膚、前立腺、膀胱、及び膵臓のヒト癌、腎細胞癌、及びメラノーマの転移の治療、抑制、又は管理の方法及び組成物に関する。本発明は、さらに、T細胞由来の癌、特に白血病及びリンパ腫の予防、治療、抑制、又は管理の方法、及び組成物に関する。さらに、本発明の組成物及び方法は、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンと併せた他の種類の活性成分を含む。いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、他の非腫瘍性過剰増殖性細胞障害、例えば、限定はしないが、喘息、乾癬、再狭窄、COPDなどを治療、予防、又は管理するために使用される。
【０１１３】
本発明は、さらに、現在の、又は標準的な治療法（例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び生物療法／免疫療法などの癌療法）では部分的に、又は完全に不応性の癌及び他の過剰増殖性細胞障害の治療、抑制、及び管理の方法に関する。
【０１１４】
（５．１．リステリアに基づくワクチン）
本発明は、EphA2抗原ペプチドを発現するように設計されたリステリア属細菌、及びそのようなリステリアを使用してEphA2の過剰発現及び／又は過剰増殖性細胞障害に関連する疾病を管理、治療、又は予防することを実現する。
リステリアに基づくEphA2ワクチンは、EphA2抗原ペプチドを発現するリステリアの１以上の菌株を含むことができる。他の実施態様では、リステリアに基づくEphA2ワクチンは、１以上のEphA2抗原ペプチドを発現するように設計されているリステリア菌株を含むことができる。
好ましい一実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、リステリアモノサイトゲネス種を含む。
【０１１５】
（５．１．１．弱毒化）
ヒト、及び動物の治療にリステリアを安全に使用できるようにするため、リステリア菌は、疾病を引き起こす病原性を弱毒化されているのが好ましい。最終的な結果は、リステリアを患者に投与したことによる毒素性ショック、又は他の副作用の生じる危険性を減らすことである。このような弱毒化されたリステリアは、様々な手法により分離できる。このような方法は、微生物の抗生物質感受性株の使用、微生物の突然変異誘発、病原因子を欠いた微生物の突然変異体の選択、改変された細胞壁リポ多糖を有する微生物の新株の構成を含む。
【０１１６】
ある実施態様では、リステリアは、例えば相同的組み換え法、及び化学的、又はトランスポゾン突然変異誘発法により、宿主細胞、特にマクロファージ、及び好中球内のリステリアの生存を保証する病原因子についてコードするDNA配列の欠失、又は破壊により弱毒化できる。これらの調査された病毒因子はすべてではないとしてもその多くは、それらの因子がストレス、例えば、酸性化によりマクロファージ内に特に発現するようにマクロファージの存続に関連しているか、又は特定の宿主細胞応答、例えばマクロ飲作用を誘起するために使用される（Fieldsらの論文、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5189-5193）。毒性因子の実施例は、限定はしないが、hly、plcA、plcB、mpl、actA、inlA、及びinlBを含む。Autretらの論文、2001, Infection and Immunity 69: 2054-2065も参照のこと。
【０１１７】
特定の一実施態様では、リステリアは、その組織向性（例えば、inlB突然変異体）及び／又は細胞から細胞へ広がるその能力（例えば、actA突然変異体）を減衰する。他の実施態様では、リステリアは、１以上のインターナリン（internalin）（例えば、inlA及び／又はinlB）における突然変異（例えば、欠失、付加、又は置換）を含む。他の実施態様では、リステリアは、actAにおける突然変異（例えば、欠失、付加、又は置換）を含む。
【０１１８】
弱毒化された表現型を保証し、非弱毒化表現型への逆戻りを回避する方法として、複数の方法、例えば、組織向性に影響を及ぼす突然変異（例えば、inlB突然変異体）及び細胞から細胞へ広がる能力に影響を及ぼす突然変異（例えば、actA突然変異体）で弱毒化されるようにリステリアを設計することができる。好ましい一実施態様では、リステリアは、インターナリンBにおける突然変異（例えば、欠失、付加、又は置換）及びactAにおける突然変異を含む。
【０１１９】
（５．１．２．発現系）
EphA2抗原ペプチドは、非相同遺伝子発現カセットを使用してリステリア内に発現されるのが好ましい。非相同遺伝子発現カセットは、通常、（１）原核生物プロモーター（prokaryotic promoter）、（２）シャインダルガノ配列、（３）分泌シグナル（シグナルペプチド）、及び（４）非相同遺伝子の４つの順序付けられた要素からなる。適宜、非相同遺伝子発現カセットは、さらに、細菌染色体内の安定した組込みのためにコンストラクト内に転写終結配列を含むこともできる。必要ではないが、転写終結配列を非相同遺伝子発現カセットの最終の順序付けられた要素として含むことにより、リードスルー転写による隣接遺伝子の発現の調整に対する極性効果を防止することができる。
【０１２０】
リステリアに基づくEphA2ワクチン内に導入される発現ベクターは、リステリア産生EphA2ペプチド及び状況に応じて第２の腫瘍抗原がリステリアから分泌されるように設計されるのが好ましい。当業では多数の細菌分泌シグナル（bacterial secretion signals）が知られており、本発明の組成物及び方法において使用することができる。以下の５．２．１．４節で説明されているように、リステリアとともに使用できる例示的な分泌シグナルは、SecAである。
【０１２１】
EphA2抗原ペプチドの発現を駆動するプロモーターは、構成的でありペプチドが継続的に発現されるか、誘導的であり、ペプチドが誘導物質分子の存在時のみ発現されるか、細胞型特異性でありペプチド、又は酵素が特定の細胞型でのみ発現されるものとすることができる。
５．２節で説明されているEphA2抗原ペプチドをコードする核酸と併せて使用されるEphA2抗原ペプチド発現系の構成要素の好ましい実施態様について以下で説明する。
【０１２２】
（５．１．２．１．コンストラクトバックボーン（Construct Backbone））
当業者であれば、非相同遺伝子発現カセットの組み立てで使用するのに好適な様々なプラスミドコンストラクトバックボーン（plasmid construct backbones)が利用可能であることを理解するであろう。特定のプラスミドコンストラクトバックボーンの選択は、細菌染色体から、又は染色体外エピソームからの非相同遺伝子発現カセットの発現が望ましいかどうかに基づく。
【０１２３】
限定されない実施例が与えられた場合、非相同遺伝子発現カセットをリステリアモノサイトゲネス（リステリア）の細菌染色体に組み込むことは、リステリア染色体の中へのベクターの配列特異性統合に触媒作用を引き起こすリステリオファージ（listeriophage）インテグラーゼの発現カセットを含む組込み型ベクターとともに行われる。例えば、pPL1及びpPL2と呼ばれる組込み型ベクターは、細菌ゲノムの無害な領域内の異種タンパク質（例えばEphA2抗原ペプチド）発現カセットの安定した単コピー組み込み（single-copy integration）をプログラムするが、これについては、文献で説明されている（Lauerらの論文、2002, J. Bacteriol. 184: 4177-4178）。組込み型ベクターは、大腸菌内のプラスミドとして安定しており、接合を介して所望のリステリアバックグラウンド（Listeria background）内に導入される。それぞれのベクターは、リステリア特有の複製起点を欠いており、またベクターが染色体ファージ付着部位内に挿入された後のみ安定するようにファージインテグラーゼをコードする。所望のプラスミドコンストラクトから始まる、所望のタンパク質を発現する組み換え型リステリア菌株を生み出すプロセスは、約１週間を要する。pPL1及びpPL2組込み型ベクターは、それぞれ、U153及びPSAリステリオファージに基づいている。pPL1ベクターは、comK遺伝子のオープンリーディングフレーム内に組み込まれるが、pPL2は、遺伝子の固有の配列が正常に組み込まれた後復元され、その固有の発現機能がそのまま保たれるようにtRNAArg遺伝子内に組み込まれる。pPL1及びpPL2組込み型ベクターは、異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）発現カセットを含むプラスミドの構成を容易にするため多重クローニング部位配列を含む。
【０１２４】
それとは別に、EphA2抗原ペプチド発現カセットをリステリア染色体に組み込むことは、当業者に知られている、対立遺伝子交換法を介して行うことができる。特に、抗生物質抵抗性タンパク質をコードする遺伝子を、非相同遺伝子発現カセットを含むコンストラクトの一部として組み込まないことが望ましい組成では、対立遺伝子交換方法が望ましい。例えば、pKSV7ベクター（Camilliらの論文、1993, Mol. Microbiol. 8: 143-157）は、リステリア染色体内に組み換えられたpKSV7プラスミドを表す非許容温度の組み換え型クローンについて選択するために利用される温度感性のあるリステリアグラム陽性複製起点を含む。pKSV7対立遺伝子交換プラスミドベクターは、異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）発現カセットを含むプラスミドの構成を容易にするため多重クローニング部位配列、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（chloramphenicol resistance gene）を含む。リステリア染色体内に挿入するために、非相同EphA2抗原ペプチド発現カセットコンストラクトは、所望の組込みの正確な配置に対応する約1kbの染色体DNA配列により最適な形で両脇を挟まれる。pKSV7異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）発現カセットプラスミドは、グラム陽性菌のエレクトロポレーションの標準的な方法に従って、エレクトロポレーションにより所望の菌株内に最適な形で導入される。簡潔に言うと、pKSV7異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）発現カセットプラスミドでエレクトロポレートされた細菌は、クロラムフェニコール（10μg／ml）を含むBHI寒天培地上に塗抹することにより選択され、30℃の許容温度で培養される。細菌染色体への単一交差組込みは、クロラムフェニコールを含む培地内において41℃の非許容温度で複数世代にわたりいくつかの個別コロニーを継代することにより選択される。最後に、プラスミドの切除及び除去処理（二重交差）は、クロラムフェニコールを含まないBHI培地内において30℃の許容温度で複数世代にわたりいくつかの個別コロニーを継代することにより行われる。異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）発現カセットの細菌染色体内への組込みの検証は、定義されている領域を異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）発現カセット内からpKSV7プラスミドベクターコンストラクト内に含まれない配列を標的とする細菌染色体へと増幅するプライマー対を利用して、PCRにより行うことができる。
【０１２５】
他の組成物では、安定しているプラスミドエピソームから異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）を発現することが望ましい場合がある。複数世代にわたる継代を通じてプラスミドエピソームを維持するには、プラスミド含有細菌に対し選択的な利点をもたらすタンパク質の共発現を必要とする。限定しない実施例として、異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）と併せてプラスミドから共発現されたタンパク質は、抗生物質耐性タンパク質、例えば、クロラムフェニコールとすることができるか、又はこれも選択的な利点をもたらしうる細菌タンパク質（野生型細菌の染色体から発現される）とすることができる。細菌タンパク質の限定されない実施例は、プリン、又はミノ酸生合成(関連するアミノ酸、又は他の必要な前駆体高分子を欠いた定められた培地の下での選択)に必要な酵素、又は体外、又は体内に選択的な利点をもたらす遺伝子の発現に必要な転写因子を含む（Gunnらの論文、2001, J. Immuol. 167: 6471-6479）。限定しない実施例として、pAM401は、多様なグラム陽性細菌属における選択された異種タンパク質（例えば、EphA2抗原ペプチド）のエピソーム発現に対する好適なプラスミドである。
【０１２６】
（５．１．２．２．シャインダルガノ配列）
プロモーターの3’端には、非相同遺伝子RNA転写及び翻訳開始に対する30Sリボソームサブユニット（16S rRNAを介した）の活性化に必要な要素である、ポリプリンシャインダルガノ配列が含まれる。シャインダルガノ配列は、通常、以下のコンセンサス配列（配列番号６６）：5’-NAGGAGGU-N5-10-AUG（開始コドン）-3’を有する。ポリプリンシャインダルガノ配列の変種がある。特に、リステロリシン（listerolysin）O（LLO）をコードするリステリアhly遺伝子は、以下のシャインダルガノ配列（配列番号６７）：AAGGAGAGTGAAACCCATGを有する（シャインダルガノ配列には下線が引かれており、翻訳開始コドンは太字である）。
【０１２７】
（５．１．２．３．コドンの最適化）
いくつかの実施態様では、選択された異種タンパク質の最適な翻訳効率に関して、リステリアに都合のよいコドンを利用することが望ましい。細菌発現の好ましいコドン利用は、Nakamuraらの論文、2000, Nucl. Acids Res. 28: 292で説明されているように決定することができる。いくつかの実施態様では、リステリアモノサイトゲネスからのEphA2抗原ペプチドのコドン最適化発現が望ましい。
それぞれのアミノ酸に対しリステリアモノサイトゲネスによって使用される最適なコドンが以下の表３に示されている。
【０１２８】
【表３】
2007509067.tif 000005
【０１２９】
（５．１．２．４．シグナルペプチド）
細菌は、プレタンパクのN末端側に配置された、secA1及びTwin-Arg転座（Tat）を含むタンパク分泌物の多様な経路を利用する。分泌されたタンパク質の大半は、タンパク質が折り畳まれていない立体構造で細菌膜埋め込みタンパク質Secポアを通じて転座するSec経路を利用する。対照的に、Tat経路を使用するタンパク質は、畳まれた立体構造で分泌される。
【０１３０】
これらのタンパク質分泌経路（限定はしないが、５．１節及び２．４節で説明されているシグナルペプチド及び５．２．１節で説明されているシグナル、及びリーダーペプチドを含む）のいずれかに対応するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、所望の異種タンパク質コード配列にインフレームとなるように遺伝子的に融合することができる。シグナルペプチドは、細胞外環境内に正真正銘の望ましいタンパク質を放出するためカルボキシル末端にシグナルペプチドを含むと最適である（Sharkov及びCaiの論文、2002, J. Biol. Chem. 277: 5796-5803、Nielsenらの論文、1997, Protein Engineering 10: 1-6）。シグナルペプチド切断部位は、SignalP3.0などのプログラムを使用して予測することができる（Bendtsenらの論文、2004, J. Mol. Biol. 340: 783-795）。シグナルペプチドは、多様な分泌経路からだけでなく、多様な細菌属からも誘導することができる。シグナルペプチドは、共通の構造機構を有し、帯電したN末端（Nドメイン）、疎水性コア領域（Hドメイン）、及びさらに極性の大きいC末端領域（C領域）があるが、配列保存性を示さない。シグナルペプチドのC領域は、I型シグナルペプチダーゼ（SPase I）切断部位を帯び、切断部位に関して位置-1、及び3のところにコンセンサス配列A-X-Aを有する。Sec経路を介して分泌されるタンパク質は、28個の残基を平均するシグナルペプチドを有する。Tat経路により分泌されるタンパク質に関係するシグナルペプチドは、Secシグナルペプチドに類似したトリパータイト構成を有するが、Nドメイン／Hドメイン境界のところに配置された、RRモティフ（R-R-X-#-#、ただし、#は疎水性残基）を持つことにより特徴付けられる。細菌Ｔシグナルペプチドは、secシグナルペプチドに比べてアミノ酸平均14個分長い。枯草菌セクレトーム（secretome）は、Tat分泌経路を利用する推定69個ほどのタンパク質を含むことができ、そのうち14個は、SPase I切断部位を含む（Jongbloedらの論文、2002, J. Biol. Chem. 277: 44068-44078、Thalsmaらの論文、2000, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 515-547）。以下の表４には、選択された非相同遺伝子を有する融合組成で使用でき、その結果コードされたタンパク質の細菌から分泌が生じる、限定しない実施例が示されている。
【０１３１】
【表４】
2007509067.tif 000006
【０１３２】
多様な細菌属に、Tat経路を介して分泌される様々なタンパク質がある。いくつかの実施態様では、それらのタンパク質に対応する選択されたTagシグナルペプチドは、EphA2抗原ペプチドをコードする所望の配列に対しインフレームとなるように遺伝子的に融合され、それにより、Tat経路を介して機能的に連結されているTatシグナルペプチドEphA2タンパク質キメラの分泌が容易になる。以下に、Tat経路分泌を利用することが予測される枯草菌、及びリステリア（イノキュア及びモノサイトゲネス）からのタンパク質の限定しない実施例が示されている。
【０１３３】
Tatにより分泌される推定枯草菌タンパク質
＞gi｜2635523｜emb｜CAB15017.1｜2-コンポーネントセンサヒスチジンキナーゼに類似（YtsA）（枯草菌）
【０１３４】
＞gi｜2632548｜emb｜CAB12056.1｜ホスホジエステラーゼ／アルカリホスファターゼD（枯草菌）
【０１３５】
＞gi｜2632573｜emb｜CAB12081.1｜仮説的タンパク質に類似（枯草菌）
【０１３６】
＞gi｜2633776｜emb｜CAB13278.1｜仮説的タンパク質に類似（枯草菌）
【０１３７】
＞gi｜2634674｜emb｜CAB14172.1｜メナキノール：シトクロムcオキシドレダクターゼ（鉄（硫黄サブユニット）（枯草菌））
【０１３８】
＞gi｜2635595｜emb｜CAB15089.1｜yubF（枯草菌）
【０１３９】
＞gi｜2636361｜emb｜CAB15852.1｜代替え遺伝子名：ipa（29d-仮説的タンパク質に類似（枯草菌））
【０１４０】
（Tatにより分泌される推定リステリアタンパク質）
【０１４１】
＞gi｜16799463｜ref｜NP_469731.1｜枯草菌YwbNタンパク質に類似の保存された仮説的タンパク質（リステリアイノキュア）
【０１４２】
＞gi｜16801368｜ref｜NP_471636.1｜3-オキソアシル−（アシルキャリアタンパク質）シンターゼ（リステリアイノキュア）
【０１４３】
（リステリアモノサイトゲネスEGD（e））
【０１４４】
＞gi｜16802412｜ref｜NP_463897.1｜枯草菌YwbNタンパク質に類似の保存された仮説的タンパク質（リステリアモノサイトゲネスEGD（e））
【０１４５】
有機体は、コドンバイアスを使用して、特定の内在性遺伝子の発現を調整する。こうして、選択された異種タンパク質の分泌に使用されるシグナルペプチドは、好ましいコドンを使用するコドンを含むことができず、レベルのタンパク質合成が最適でないものとなる。いくつかの実施態様では、選択された異種タンパク質をコードする遺伝子とインフレームとなるように融合されたシグナルペプチド配列は、選択された細菌におけるコドン使用度に関してコドン最適化される。組み換え型リステリアモノサイトゲネスからの発現及び分泌のいくつかの実施態様では、選択されたシグナルペプチドのヌクレオチド配列は、上の表４により、リステリアモノサイトゲネスにおける発現に合わせてコドン最適化される。
【０１４６】
（５．１．２．５．転写終結配列）
いくつかの実施態様では、転写終結配列は、異種タンパク質に関係する翻訳終止コドンのC末端の下流で、異種タンパク質発現カセット内に挿入できる。ロー依存性、又はロー非依存性転写終結を促進する、当業者に知られている適切な配列要素を異種タンパク質発現カセット内に配置することができる。
【０１４７】
（５．２．EphA2抗原ペプチド）
上述のように、本発明は、EphA2抗原ペプチドを発現するように設計されているリステリアの使用に関係する。このようなリステリアは、どのような機構にも束縛されることなく、EphA2の過剰発現が関与する疾病を持つ対象に投与した後、EphA2への免疫応答を引き起こすことができ、内因性EphA2に対する細胞、又は液性免疫応答がもたらされる。
【０１４８】
原理上、本発明の方法及び組成物で使用するためのEphA2抗原ペプチド（「EphA2抗原性ポリペプチド」と呼ばれることもある）は、過剰増殖性疾患が関与するEphA2発現細胞に対し免疫応答を引き起こすことができるEphA2抗原ペプチドであればどのようなものでもよい。したがって、EphA2抗原ペプチドは、EphA2ポリペプチド、好ましくは配列番号２のEphA2ポリペプチド、又は（１）EphA2の抗原性を示す（抗EphA2抗体への結合に関してEphA2と結合、又は競合する能力）、（２）EphA2の免疫原性を示す（EphA2に結合する抗体を産生する能力）、及び／又は（３）EphA2の１以上のT細胞エピトープを含むEphA2ポリペプチドの断片、又は誘導体とすることができる。
いくつかの実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、以下に示されるヌクレオチド配列、又はその断片、又は誘導体によりコードされる配列である。
【０１４９】
GenBankアクセッション番号NM  004431    ヒト
【０１５０】
GenBankアクセッション番号NM  010139    マウス
【０１５１】
GenBankアクセッション番号AB038986      ニワトリ（部分的）
【０１５２】
いくつかの実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、完全長のEphA2（配列番号２）である。
いくつかの実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、EphA2（配列番号２の残基22から554）の細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、EphA2（配列番号２の残基558から976）の細胞内ドメインを含む。
【０１５３】
さらに他の実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、完全長のヒトEphA2の複数のドメインを含む。特定の実施態様において、EphA2抗原ペプチドは、細胞外ドメイン、及び細胞内細胞質ドメインを、一緒に併せて含む。この実施態様では、EphA2の膜貫通ドメインが取り除かれる。
本発明のいくつかの実施態様では、EphA2のチロシンキナーゼ活性は排除される。そのためEphA2は、チロシンキナーゼ活性の排除を引き起こすアミノ酸残基の欠失、付加、又は置換を含むことができる。好ましい一実施態様では、位置646にリジン-メチオン置換が存在する。
好ましい一実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、EphA2の膜貫通ドメインの欠失から生じるEphA2の細胞外、及び細胞質ドメインを含み、位置646にリジン-メチオニン置換を有する。
いくつかの実施態様では、ペプチドは、癌細胞内では露出されているが、非癌細胞内では閉塞されているEphA2エピトープに対応するか、又は含む。好ましい一実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、優先的に、癌細胞上では選択的に露出、又は増大されるが、非癌細胞上ではそうではないEphA2上のエピトープを含む（「露出されたEphA2エピトープペプチド」）。
【０１５４】
本発明は、さらに、本発明の組成物、及び方法において、複数のEphA2抗原ペプチド、例えば、2、3、4、5、6、又はそれ以上のEphA2抗原ペプチドを使用することも含む。
本発明の方法及び組成物で使用されるEphA2の断片は、EphA2遺伝子によりコードされたアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加、又は置換を含むことができる。突然変異は沈黙の変化を引き起こし、それにより、機能上同等のEphA2遺伝子産物を産生することが好ましい。「機能上同等」とは、突然変異したEphA2遺伝子産物が野生型EphA2遺伝子産物と同じ機能を有する、例えば、EphA2の１以上のエピトープを含むことを意味する。
【０１５５】
EphA2抗原ペプチド配列は、ヒトEphA2との少なくとも約65％の配列類似性を示す、より好ましくはヒトEphA2との少なくとも70％の配列類似性を示す、さらに好ましくはヒトEphA2との少なくとも約75％の配列類似性を示すアミノ酸配列を含むのが好ましい。他の実施態様では、EphA2抗原ペプチド配列は、好ましくはヒトEphA2との少なくとも85％の配列類似性を示す、さらに好ましくはヒトEphA2との少なくとも90％の配列類似性を示す、最も好ましくはヒトEphA2との少なくとも約95％の配列類似性を示すアミノ酸配列を含む。
本発明の方法において好適な追加のポリペプチドは、以下の５．２節で説明されている核酸によりコードされるペプチドである。
【０１５６】
２つの配列の間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。２つの配列の近くに使用される数学的アルゴリズムの好ましい、限定しない実施例は、Karlin及びAltschulの論文、1993, Proc Natl Acad Sci. USA 90: 5873-5877で修正されたKarlin及びAltschulの論文、1990, Proc Natl Acad Sci. USA 87: 2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulらの論文、1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、スコア＝100、文字長＝12としてNBLASTプログラムにより実行し、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、スコア＝50、文字長＝3としてXBLASTプログラムにより実行し、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためギャップのある整列を得るのに、Altschulらの論文、1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402で説明されているようにGapped BLASTを利用することができる。それとは別に、PSI-Blastは、分子間の距離的関係を検出する反復検索を実行するために使用できる（Id）。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI-Blastプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）の既定のパラメータを使用できる。
【０１５７】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の好ましい、限定しない実施例は、Myers、及びMillerの論文、1988, Comput Appl Biosci 4: 11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。ALIGNプログラムを使用してアミノ酸配列を比較する場合、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用できる。配列分析のための追加のアルゴリズムは、当業で知られており、Torellis及びRobottiの論文、1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5で説明されているようなADVANCE及びADAM、及びPearson及びLipmanの論文、1988, Proc Natl Acad Sci USA 85: 2444-8で説明されているFASTAを含む。FASTA内では、ktupは検索の感度、及び速度を設定する制御オプションである。ktup＝2の場合、比較される２つの配列内の類似の領域が、整列された残基の対を見ることにより見つかり、ktup＝1の場合、単一の整列されたアミノ酸が調べられる。ktupは、タンパク質配列については２、又は１に、DNA配列については１から６のいずれかに設定することができる。ktupが指定されていない場合の既定値は、タンパク質では２、DNAでは６である。FASTAパラメータの詳細については、http: ／／bioweb.pasteur.fr／docs／man／man／fasta.1.html#sect2を参照のこと。
【０１５８】
２つの配列の間の同一性の割合は、ギャップを許す場合、又は許さない場合について、上で説明されているのと類似の手法を使用して決定することができる。同一性の割合を計算する際に、正確なマッチのみを数える。しかし、本明細書で開示されているEphA2配列との同一性の割合が低い配列を評価する際には同類置換を考慮すべきである。
特定の実施態様において、好ましくは配列番号２のEphA2ポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、75、100、又は200個のアミノ酸を含むEphA2抗原ペプチドが、本発明で使用される。好ましい実施態様においては、好ましくは配列番号２のEphA2ポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、75、100、又は200個の隣接アミノ酸を含むEphA2抗原ペプチドが、本発明で使用される。好ましい一実施態様では、このようなポリペプチドは、配列番号２のEphA2ポリペプチドの細胞外ドメインの全部、又は一部を含む。
【０１５９】
（５．２．１．融合タンパク質）
本発明のいくつかの実施態様では、リステリアに基づくEphA2ワクチンは、融合タンパク質であるEphA2抗原ペプチドを発現する。そのため、本発明は、EphA2抗原ペプチドが、異種成分に、例えば異種ペプチドに作用するように関連付けられているEphA2の全部、又は一断片、又は誘導体を含む融合タンパク質である組成物、及び方法を包含する。異種成分は、限定はしないが、融合タンパク質の分離及び精製を容易にする配列を含むことができる。異種成分は、さらに、EphA2に安定性をもたらす配列をも含むことができる。このような融合パートナーは、当業者に知られている。
【０１６０】
本発明は、EphA2ポリペプチド（例えば、配列番号２のポリペプチド、又はその断片）及び異種ポリペプチド（すなわち、ポリペプチド、又はその断片、好ましくはポリペプチドの少なくとも10個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、又は少なくとも100個の隣接アミノ酸の断片）を含む融合タンパク質の使用を包含する。融合は、直接的であってよいが、リンカー配列を通じて発生しうる。異種ポリペプチドは、EphA2のN末端、又はC末端に融合することができる。それとは別に、異種ポリペプチドは、EphA2ポリペプチド配列で両脇を固めることができる。
【０１６１】
融合タンパク質は、N末端で異種シグナル配列に融合されたEphA2抗原ペプチドを含むことができる。様々なシグナル配列が市販されている。上の５．１．２．４節で説明されているシグナル配列に加えて、本発明の方法で有用な原核生物異種信号配列は、限定はしないが、phoA分泌シグナル（Sambrookら編「分子クローニング: 実験室マニュアル、第２版」（1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY））及びタンパク質Ａ分泌シグナル（ニュージャージー州  ピスカタウェイ、Pharmacia Biotech）を含む。
【０１６２】
EphA2抗原ペプチドは、タグ配列、例えば、ヘキサヒスチジンペプチドに融合することができ、例えば、タグは、特にpQEベクター（カリフォルニア州  チャッツワース、QIAGEN，Inc．）で提供され、その多くは市販されており、本発明の方法で使用できる。Gentzらの論文、1989, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 86: 821-824で説明されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の精製をしやすくする。ペプチドタグの他の実施例は、血球凝集素「HA」タグであり、これは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質（Wilsonらの論文、1984, Cell, 37: 767）及び「フラグ」タグ（Knappikらの論文、1994, Biotechniques, 17 (4): 754-761）から誘導されるエピトープに対応する。これらのタグは、特に、組み換え技術により産生されたEphA2抗原ペプチドの精製に有用である。
【０１６３】
融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に特異的な、又は選択的な抗体を使用することにより容易に精製することができる。例えば、Janknechtらの論文で説明されているシステムでは、ヒトの細胞系内に発現される非変性融合タンパク質を容易に精製することができる（Janknechtらの論文、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972）。このシステムでは、注目する遺伝子は、遺伝子のオープンディーリングフレームが６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端基タグに翻訳しつつ融合されるようにワクチニア組み換えプラスミド内にサブクローニングされる。組み換えワクチニアウイルスに感染した細胞からの抽出物は、Ni２＋ニトリロ酢酸アガロースカラムに充填され、ヒスチジンタグ付きタンパク質は、イミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出される。
【０１６４】
親和性標識は、本発明の方法で使用するために、そのアミノ末端でEphA2抗原ペプチドのカルボキシル末端に融合することもできる。カルボキシル末端の融合が行われる正確な部位は、重要でない。最適な部位は、ルーチン実験で決定することができる。親和性標識は、本発明の方法で使用するために、そのカルボキシル末端でEphA2抗原ペプチドのアミノ末端に融合することもできる。
【０１６５】
限定はしないが、免疫グロブリン定常領域（Pettyの論文「金属キレート親和性クロマトグラフィー」（1996, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubelらの論文、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceも参照）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST、Smithの論文、1993, Methods Mol. Cell Bio. 4: 220-229）、大腸菌麦芽糖結合タンパク質（Guanらの論文、1987, Gene 67: 21-30）、及び様々なセルロース結合ドメイン（米国特許第5,496,934号、5,202,247号、5,137,819号、Tommeらの論文、1994, Protein Eng. 7: 117-123）などの、当業で知られている様々な親和性標識を使用できる。他の親和性標識は、特定の結合パートナーにより認識され、これにより、固体担体上に固定化できる結合パートナーへの親和性結合で分離が容易になる。いくつかの親和性標識では、EphA2抗原ペプチドに多量体を形成する能力などの新規性のある構造特性を与えることができる。これらの親和性標識は、通常はホモポリマーとして存在するタンパク質から誘導される。CD8（Shiueらの論文、1988, J. Exp. Med. 168: 1993-2005）、又はCD28（Leeらの論文、1990, J. Immunol. 145: 344-352）の細胞外ドメイン、又は鎖間ジスルフィド結合の部位を含む免疫グロブリン分子の断片などの親和性標識により、多量体の形成に至る可能性がある。
【０１６６】
当業者であれば理解するように、限定はしないが、DNAクローニング、DNA増幅、及び合成方法を含む、上述の親和性標識のコーディング領域を得るために、多くの方法を使用することができる。検出、及び分離のための親和性標識及び試薬の一部は市販されている。
【０１６７】
当業で知られている様々なリーダー配列は、リステリアなどの細菌細胞からEphA2抗原ペプチドの効率的分泌を行わせるために使用することができる（von Heijneの論文、1985, J. Mol. Biol. 184: 99-105）。上述及び５．１．２．４節のシグナル配列に加えて、細菌細胞内のEphA2抗原ペプチド発現を標的とするのに好適なリーダー配列は、限定はしないが、大腸菌タンパク質OmpA（Hobomらの論文、1995, Dev. Biol. Stand. 84: 255-262）、Pho A（Okaらの論文、1985, Proc. Natl. Acad. Sci 82: 7212-16）、OmpT（Johnsonらの論文、1996, Protein Expression 7: 104-113）、LamB及びOmpF（Hoffman & Wrightの論文、1985, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82: 5107-5111）、β-ラクタマーゼ（Kadonagaらの論文、1984, J. Biol. Chem. 259: 2149-54）、エンテロトキシン（Morioka-Fujimotoらの論文、1991,J. Biol. Chem. 266: 1728-32）、及び黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ（Abrahmsenらの論文、1986, Nucleic Acids Res. 14: 7487-7500）、及び枯草菌エンドグルカナーゼ（Loらの論文、Appl. Environ. Microbiol. 54: 2287-2292）、さらに、人工及び合成シグナル配列（MacIntyreらの論文、1990, Mol. Gen. Genet. 221: 466-74、Kaiserらの論文、1987, Science, 235: 312-317）を含む。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、融合パートナーは、治療上、又は予防上免疫が望ましい細胞型に関連する抗原に対応する非EphA2ポリペプチドを含む。例えば、非EphA2ポリペプチドは、限定はしないが、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、TRP-2、チロシナーゼ、MART-1、β-HCG、CEA、Ras、β-catenin、gp43、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15、β-catenin、BAGE-1、PSA、MUM-1、CDK4、HER-2／neu、ヒト乳頭腫ウイルス-E6、ヒト乳頭腫ウイルス-E7、及びMUC-1、2、3などの腫瘍関連抗原のエピトープを含むことができる。
【０１６９】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標準の遺伝子組み換え技術により産生できる。例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、自動DNA合成装置を含む従来の技術により合成することができる。それとは別に、遺伝子断片のPCR増幅は、後からアニールし、再増幅してキメラ遺伝子配列を精製できる２つの連続する遺伝子断片の間に相補的突出を引き起こすアンカープライマーを使用して実行できる（例えば、Ausubelら編「分子生物学の現在のプロトコル」（John Wiley & Sons, 1992）を参照）。
【０１７０】
融合タンパク質のヌクレオチド配列コードは、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクター内に挿入することができる。融合タンパク質の発現は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は組織選択的プロモーターにより調節することができる。当業者であれば、融合タンパク質は、可溶性及び／又は発現を容易にすることができ、またEphA2抗原ペプチドの体内半減期を高めることができ、そのため、本発明で有用であることを理解するであろう。EphA2抗原ペプチド、又はそのペプチド断片、又は融合タンパク質は、EphA2抗原ペプチドを検出、又は測定する試金分析、又はそのようなアッセイの較正及び標準化で使用することができる。
【０１７１】
本発明の方法は、EphA2ペプチド、又はそのペプチド断片の使用を包含し、これは、当技術分野で周知の手法を使用する遺伝子組み換え技術により産生することができる。そのため、EphA2抗原性遺伝子配列を含む核酸を発現することにより本発明のEphA2抗原ペプチドを調合する方法が本明細書で説明されている。当技術分野で周知の方法は、例えば、EphA2抗原ペプチドコード配列（限定はしないが、配列番号２のポリペプチドの全部、又は抗原性部分をコードする核酸を含む）、及び適切な転写、及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構成するために使用できる。これらの方法は、例えば、体外遺伝子組み換え技術、合成技術、及び体内遺伝子組み換え技術を含む。例えば、上記のSambrookらの論文、1989、及び上記のAusubelらの論文、1989で説明されている手法を参照のこと。それとは別に、例えば、合成装置を使用して、EphA2抗原ペプチド配列をコードすることができるRNAを化学的に合成することができる（例えば、「オリゴヌクレオチド合成」（1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford）で説明されている手法を参照のこと）。
【０１７２】
いくつかの実施態様では、EphA2抗原ペプチドは、細胞核内への摂取を可能にする「タンパク質形質導入ドメイン」とも呼ばれる、インターナリゼーションシグナルペプチド（internalization signal peptide）に機能的に結合される。いくつかの特定の実施態様では、インターナリゼーションシグナルは、アンテナペディア（Prochiantzの論文、1996, Curr. Opin. Neurobiol. 6: 629-634で考察）、Hox A5（Chatelinらの論文、1996, Mech. Dev. 55: 111-117）、HIV TATタンパク質（Vivesらの論文、1997, J. Biol. Chem. 272: 16010-16017）、又はVP22（Phelanらの論文、1998, Nat. Biotechnol. 16: 440-443）のシグナルである。
【０１７３】
（５．２．２．EphA2抗原ペプチドコードするポリヌクレオチド）
本発明は、さらに、本発明のEphA2抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドへの以下で定義されているような高ストリンジェンシー、中、又は低ストリンジェンシーハイブリッド形成条件の下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含むリステリアに基づくワクチンの使用も包含する。
【０１７４】
例として、限定はしないが、90個を超えるヌクレオチドのハイブリッド形成の領域に対する低ストリンジェンシーのそのような条件を使用する手順は以下の通りである（Shilo、及びWeinbergの論文、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792も参照）。DNAを含むフィルタを、35％のホルムアルデヒド、5×SSC、50 mMのTris-HCl（pH7.5）、5mMのEDTA、0.1％のPVP、0.1％のFicoll、1％のBSA、及び500μg／mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、6時間の間、40℃で前処理する。以下の修正を加えてハイブリッド形成を同じ条件で実行する。0.02％のPVP、0.02％のFicoll、0.2％のBSA、100μg／mlのサケ精子DNA、10％（wt／vol）の硫酸デキストラン、及び5〜20×10６cpm３２P標識付きプローブを使用する。フィルタは、40℃で18〜20時間の間ハイブリッド形成混合液中でインキュベートされ、その後、2×SSC、25 mMのTris-HCl（pH 7.4）、5 mMのEDTA、及び0.1％のSDSを含む溶液中で、1.5時間の間55℃で洗浄される。洗浄液を新鮮な溶液で置き換えて、さらに1.5時間かけて60℃の温度でインキュベートする。フィルタは、染色乾燥され、オートラジオグラフィーにかけられる。必要ならば、フィルタを3回目に65〜68℃の温度で洗浄し、フィルムに曝露される。使用できる低ストリンジェンシーの他の条件（例えば、異種間ハイブリッド形成に使用されるような）は当技術分野で周知である。
【０１７５】
さらに、例として、限定はしないが、90個を超えるヌクレオチドのハイブリット形成の領域に対する高ストリンジェンシーのそのような条件を使用する手順は以下の通りである。DNAを含むフィルタの事前ハイブリッド形成を、6×SSC、50 mMのTris-HCl（pH 7.5）、1 mMのEDTA、0.02％のPVP、0.02％のFicoll、0.02％のBSA、及び500μg／mlの変性サケ精子DNAからなる緩衝液中で、8時間から一晩の間、65℃で実行する。フィルタは、100μg／mlの変性サケ精子DNA及び5〜20×10６cpmの３２P標識付きプローブを含む事前ハイブリッド形成混合液内で48時間かけて65℃でハイブリッド形成される。フィルタの洗浄は、2×SSC、0.01％のPVP、0.01％のFicoll、及び0.01％のBSAを含む溶液中で１時間かけて37℃で行われる。この後に、0.1×SSC中で45分間、50℃で洗浄が行われ、その後、オートラジオグラフィーが実行される。
【０１７６】
使用できる高ストリンジェンシーの他の条件は、核酸の性質（例えば、長さ、GC含有量など）、及びハイブリッド形成の目的（欠失、増幅など）に依存し、当技術分野では周知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における相補配列に対する約15〜40個の塩基の核酸の厳しいハイブリッド形成は、50 mMのKClの塩濃度、10 mMのTris-HClの緩衝液濃度、1.5 mMのMg２＋濃度、7〜7.5のpH、及び55〜60℃のアニーリング温度という条件の下で行われる。
中ストリンジェンシーの適切な条件の選択も、当技術分野で周知の（Sambrookら編「分子クローニング: 実験室マニュアル、第２版」（1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照、Ausubelら編、実験法マニュアルの「分子生物学の現在のプロトコル」シリーズ、（著作権）1987-1997、「現在のプロトコル」、（著作権）1994-1997, John Wiley and Sons, Inc.も参照）。
【０１７７】
本発明の方法で有用な核酸は、当業で知られているどのような方法でも作ることができる。例えば、EphA2抗原ペプチドのヌクレオチド配列が知られている場合、ペプチドをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Kutmeierらの論文、1994, BioTechniques 17: 242で説明されているような）から組み立てることができ、簡潔に言うと、ペプチドをコードする配列の部分を含有する重複したオリゴヌクレオチドの合成を行い、それらのオリゴヌクレオチドをアニールし連結し、その後、連結されたオリゴヌクレオチドをPCRで増幅する。
【０１７８】
それとは別に、EphA2抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源からの核酸から産生することができる。特定のペプチドをコードする核酸を含むクローンが利用可能でないが、EphA2抗原ペプチドの配列が知られている場合、配列の3’末端、及び5’末端にハイブリッド形成できる合成プライマーを用いたPCR増幅により、又は同定すべき特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、例えば、ペプチドをコードするcDNAライブラリからのcDNAクローンをクローニングすることにより、適当な供給源（例えば、cDNAライブラリ、又はEphA2を発現する組織、又は細胞から産生されるcDNAライブラリ、又はEphA2を発現する組織、又は細胞から分離された核酸、好ましくはポリA+ RNA）からペプチドをコードする核酸を化学的に合成するか、又は取得することができる。その後、PCRにより産生された増幅核酸は、当技術分野で周知の方法を使用して複製可能なクローニングベクターの中にクローニングすることができる。
【０１７９】
さらに、本発明の方法で有用な核酸は、ヌクレオチド配列の操作について当技術分野で周知の方法、例えば、遺伝子組み換え技術、部位特異的変異誘発、PCRなどを使用して操作することができ（例えば、Sambrookらの論文「分子クローニング、実験室マニュアル（1990, 2版., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）及びAusubelらの論文「分子生物学の現在のプロトコル」（1998, John Wiley & Sons, NY）も参照。これは、両方とも、参照により全体が本明細書に組み込まれている）、例えば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を産生するために、配列番号２で表されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するEphA2抗原ペプチドを産生することができる。
【０１８０】
（５．３．EphA2抗原ペプチドのアッセイ）
本発明では、EphA2抗原ペプチドを発現するように設計されたリステリアに基づく細菌を含むリステリアに基づくEphA2ワクチンを実現する。ペプチドがT細胞エピトープであるか、B細胞エピトープであるかを判定する当業で知られているアッセイを、EphA2ペプチドが本発明の方法及び組成物に適しているかどうかを検査する際に使用することができる。
例えば、ペプチドがT細胞エピトープであるかどうかを判定するために、抗原特異的なCD4+及びCD8+T細胞の列挙及び特徴付けにELISPOTアッセイ及び細胞内サイトカイン染色の方法を使用することができる。Lalvaniらの論文、1997, J. Exp.Med. 186: 859-865、Waldropらの論文、1997, J. Clin Invest. 99: 1739-1750を参照。
【０１８１】
EphA2抗原ペプチドは、EphA2の一部に対応する合成ペプチドをスクリーニングすることにより決定することができる。候補抗原ペプチドは、配列、又は予測される構造に基づいて同定することができる。この目的のために、多くのアルゴリズムが利用可能である。
このようなアッセイの例示的なプロトコルを以下に示す。
【０１８２】
（５．３．１．EphA2の免疫原性を示すペプチド）
哺乳類においてEphA2ペプチドがEphA2特異的抗体応答をもたらしうるかどうかについて、例えば、フロインドの補助で乳化された個々のEphA2ペプチドで動物（例えば、マウス、モルモット、又はウサギ）に免疫を与えることにより調べることができる。
3回注射した後（注射1回につき5から100μgのペプチド）、EphA2に対するペプチド特異的ELISA及び免疫ブロット法によりIgG抗体応答を検査する。
免疫ブロット法でEphA2ペプチド及び認識された完全長EphA2タンパク質と特異的に反応する抗血清を産生するEphA2ペプチドは、EphA2の抗原性を示すといわれる。
【０１８３】
（５．３．２．CD4+ T細胞増殖アッセイ）
例えば、このようなアッセイは、末梢血単核細胞（「PBMC」）がEphA2の過剰発現を伴う疾病を持つ患者の新鮮な血液から得られ、本質的にKruse及びSebaldの論文、1992, EMBO J. 11: 3237-3244で説明されているように、FICOLL-PLAQUE PLUS（スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia)を使用する遠心分離により精製される体外細胞培養アッセイを含む。末梢血単核細胞は、候補EphA2抗原ペプチドとともに7〜10日間、培養される。抗原の処理及び提示のため、アッセイの24から48時間前に抗原提示細胞をその培養に適宜加えることができる。その後、遠心分離により細胞が収穫され、RPMI 1640培地（メリーランド州  ゲーサーズバーグ、GibcoBRL）内で洗浄される。5×10４活性化T細胞／ウェルは、96枚のウェルプレート内で72時間の間37℃の10％のウシ胎仔血清、10 mMのHEPES、ph 7.5、2 mMのLグルタミン、100単位／mlのペニシリンG、及び100μg／mlの硫酸ストレプトマイシンを含むRPMI 1640内に置かれ、6時間の間1μCｉ３Hチミジン（マサチューセッツ州  ボストン、DuPont NEN）／ウェルでパルス処理され、収穫され、TOPCOUNT シンチレーションカウンタで放射性測定される（コネチカット州  メリデン、Packard Instrument Col．）。
【０１８４】
（５．３．３．細胞内サイトカイン染色法（ICS））
T細胞の抗原特異的細胞内サイトカイン応答の測定は、本質的にWaldropらの論文、1997, J. Clin. Invest. 99: 1739-1750、Openshawらの論文、1995,J. Exp. Med. 182: 1357-1367、又はEstcourtらの論文、1997, Clin. Immunol.Immunopathol. 83: 60-67で説明されているように実行することができる。EphA2過剰発現細胞が関与する疾病を持つ患者からの精製されたPBMCは、培養管１本につき1×10６個の細胞の濃度で12×75ミリメートルのポリスチレン組織培養管（ニュージャージー州リンカーンパーク、Becton Dickinson）内に置かれる。0.5ミリリットルのHL-1無血清培地、1ミリリットル当たり100単位のペニシリン、1ミリリットル当たり100単位のストレプトマイシン、2ミリモルのLグルタミン（Gibco BRL）、様々な量の個別のEphA2抗原性候補ペプチド、及び１単位の抗CD28 mAb（ニュージャージー州  リンカーンパーク、Becton-Dickinson）を含有する溶液がそれぞれの培養管に加えられる。抗CD3 mAbは、正の制御として通常のPBMC培養の重複セットに加えられる。培養管は、1時間かけてインキュベートされる。ブレフェルディンAが、1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度で個別の培養管に加えられ、それらの培養管は、さらに17時間かけてインキュベートされる。
【０１８５】
上述のように刺激されるPBMCは、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（dPBS）及び10単位のブレフェルディンＡを含む溶液で細胞を２回洗浄することにより収穫される。これらの洗浄された細胞は、0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド及びdPBSを含む溶液中での10分間のインキュベートにより固定される。細胞は、dPBS及び2％のウシ胎仔血清（FCS）を含む溶液で洗浄される。細胞は、その後、Waldropらの論文、1997,J. Clin. Invest. 99: 1739-1750で説明されているように、細胞内サイトカイン及び表面マーカー染色のため即座に使用されるか、又は寒剤中で3日以内の間凍結される。
【０１８６】
細胞作製物は、37℃の水槽内で急速解凍され、dPBSで1回洗浄された。細胞は、新鮮なものでも凍結されたものでも、0.5ミリリットルの浸透化溶液（カリフォルニア州  サンノゼ、Becton Dickinson Immunocytometry systems）の中で再懸濁され、光を遮りつつ室温で10分間インキュベートされる。浸透化された細胞は、dPBSで2回洗浄され、光を遮りつつ室温で20分間直接結合mAbsでインキュベートされる。標準的な方法に従って、抗体の最適な濃度を事前に決定する。染色後、細胞は洗浄され、dPBS  1％パラホルムアルデヒドを含む溶液中でのインキュベートにより再固定され、フローサイトメトリー分析のため4℃で光から遠ざけて保管される。
【０１８７】
（５．３．４．ELISPOTアッセイ）
ELISPOTアッセイでは、リステリアワクチン接種の後、ネズミ脾細胞内のTh1-サイトカイン特異的な誘導を測定する。ELISPOTアッセイを実行し、内因性抗原ペプチド刺激に応答してTリンパ球の頻度を調べるが、これについては、Geginatetらの論文、2001, J. Immunol. 166: 1877-1884で説明されている通りである。Balb／cマウス（１グループに3匹）に、候補EphA2抗原ペプチドを発現するリステリアモノサイトゲネス、又は対照としてHBSSでワクチン接種する。マウスの脾臓全体を採り、ワクチン接種後5日間プールする。ネズミ脾細胞の単個細胞懸濁液が、37℃のインキュベーター内で一晩中様々な抗原の存在下で塗沫される。
【０１８８】
アッセイは、ラット抗マウスIFN-γ mAbでコーティングされたニトロセルロースをベースとする96ウェルマイクロリッタープレート内で実行される。候補EphA2抗原ペプチドの検査のため、1×10−５Mのペプチド溶液を調合する。丸底型の1ウェル当たり96ウェルマイクロリッタープレートで、135μlの培地（10％のFCS、100μ／mlのペニシリン、100μg／mlのストレプトマイシン、1×10−5のM2-ME、及び2mMのグルタミンを補ったイーグル培地（ドイツ、エッゲンシュタイン、Life Technologies）の修正）内の6×105の分離されていない脾細胞を、1×10−５Mのペプチド溶液の15μlと混合し、最終的なペプチド濃度1×10−６Mを得る。37℃で6時間培養した後、勢いよくピペットで採ることにより細胞を再懸濁し、100μl、又は10μlの細胞懸濁（それぞれ4×10５／ウェル、又は4×10４／ウェル）をAbコーティングされたELISPOTプレートに移し、37℃で一晩インキュベートする。ELISPOTプレート内で、最終的体積を150μlに調整し、細胞の分布が均一になるようにした。
【０１８９】
精製されたCD4+、又はCD8+T細胞を以下のように修正されたアッセイで検査する。15μlの事前希釈ペプチド（1×10−５M）を直接、AbコーティングされたELISPOTプレートに加え、APCとして免疫のない動物から採った4×105の脾細胞と混合して、100μlの最終的体積を得る。37℃でAPCを4時間事前インキュベートした後、リステリアモノサイトゲネス免疫マウスから精製された1×105のCD4+、又はCD8+細胞が50μlの体積内で1ウェル毎に加えられ、プレートは37℃で一晩インキュベートされる。37℃で2時間の間、1×10−６Mのペプチドで、特異的MHCクラス1分子を発現する細胞系の充填後、ELISPOTに基づく生体外MHC限定解析を実行する。その後、非結合ペプチドを洗い落として（4回）、ペプチドが応答者の脾細胞に結合するのを防止する。ELISPOTプレートのウェル毎に、1×105のペプチド充填APCを最終体積150μlの4×10５、又は4×10４の応答者の脾細胞と混合する。37℃で一晩培養した後、ELISPOTプレートは、ビオチン標識されたラット抗マウスIFN-γ mAb、HRPストレプトアビジン結合、及び種となる脾細胞毎にスポットのアミノエチルカルバゾール色素で作製される。ELISPOTアッセイの特異性及び感度は、対照抗原に特異的なIFN-γ分泌CD8 T細胞系で制御される。
【０１９０】
（５．４．予防／治療法）
本発明は、EphA2の過剰発現に関連する疾患及び／又は過剰増殖性細胞障害、好ましくは癌を治療、予防、又は管理する方法を実現し、これは、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを必要としている対象に投与することを含む。
本発明は、過剰増殖性細胞障害に関連するEphA2発現細胞に対し免疫応答を引き起こす方法を包含し、これは、EphA2発現細胞に対する免疫応答を引き起こすのに有効な量だけ本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを対象に投与することを含む。
他の特定の実施態様では、治療、予防、又は管理すべき疾患は、EphA2を過剰発現する細胞に関連する前癌症状である。より具体的な実施態様では、前癌症状は、高悪性度の前立腺上皮内腫瘍（PIN）、乳房の線維腺腫、線維嚢胞性疾患、又は複合母斑である。
【０１９１】
本発明は、EphA2の過剰発現に関連する疾患及び／又は過剰増殖性細胞障害、好ましくは癌を治療、予防、又は管理する方法を実現し、これは、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを必要としている対象に投与すること及び１以上の他の治療法を含む。他の治療法の実施例は、限定はしないが、以下の５．４．３節に示されているものを含む。他の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、EphA2過剰発現に関連する疾患及び／又は癌などの過剰増殖性細胞障害の治療、予防、又は管理で有用な１以上の他の治療法（例えば、予防、又は治療薬剤）と併せて投与することができる。いくつかの実施態様では、１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、癌の治療、又は管理に有用な１以上の他の治療法（例えば、治療薬剤）と同時に、対象、好ましくはヒトに投与される。「同時」という用語は、治療（例えば、予防薬、又は治療薬の投与）を正確に同時に施すことに限定されず、むしろ、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与及び他の治療法を順に、また時間内に対象に施し、リステリアに基づくEphA2ワクチンが他の治療法とともに作用し、他の方法で投与された場合と比べて恩恵が増大するようにできることを意味する。例えば、それぞれの治療法（例えば、予防薬、又は治療薬の投与）を同時に、又は異なる時点において任意の順序で順に、施すことができるが、同時に投与しない場合には、所望の治療、又は予防効果が得られるように十分に短い時間内に投与すべきである。それぞれの治療法（例えば、予防薬、又は治療薬の投与）を別々に、適切な形態で、適当な経路により施すことができる。いくつかの実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、手術前に、手術と同時に、又は手術後に投与される。この手術では、局所腫瘍を完全に除去するか、又は大きな腫瘍の大きさを縮小させることが好ましい。また、手術は、予防処置として、又は痛みを軽減するために行うこともできる。
【０１９２】
様々な実施態様において、治療法（例えば、予防薬、又は治療薬の投与）は、1時間未満間をあけて、約1時間間をあけて、約1時間から約2時間間をあけて、約2時間から約3時間間をあけて、約3時間から約4時間間をあけて、約4時間から約5時間間をあけて、約5時間から約6時間間をあけて、約6時間から約7時間間をあけて、約7時間から約8時間間をあけて、約8時間から約9時間間をあけて、約9時間から約10時間間をあけて、約10時間から約11時間間をあけて、約11時間から約12時間間をあけて、24時間以内間をあけて、又は48時間以内間をあけて施される。好ましい実施態様では、２つ以上の治療法が同じ患者診察において施される。
【０１９３】
本明細書で提示されている投与量及び投与頻度は、治療上有効及び予防上有効という用語により包含される。投与量及び頻度は、さらに、投与される特定の治療を、又は予防薬、癌の重症度及び種類９、投与の経路とともに、患者の年齢、体重、応答、及び既往歴に応じて、それぞれの患者について特異的な因子に従って変わるのがふつうである。当業者であれば、そのような因子を考慮し、例えば、文献で報告されている、また「医師用卓上参考書」（56版, 2002, 57版, 2003、及び58版, 2004）で推奨されている投与量に従うことにより、好適な投薬計画を選択できる。
【０１９４】
（５．４．１．１．患者集団）
本発明は、EphA2の過剰発現に関連する疾患及び／又は過剰増殖性細胞疾病、特に癌を治療、予防、又は管理する方法を実現し、これは、治療上、又は予防状有効な量だけ、又は過剰増殖性疾患に関連するEphA2発現細胞に対する免疫応答を引き起こすのに有効な量だけ本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを対象に投与することを含む。他の実施態様では、本発明の有効な量のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、EphA2過剰発現に関連する疾患及び／又は過剰増殖性細胞障害、特に癌を治療、予防、及び／又は管理するために、有効な量の１以上の他の治療法（例えば、治療薬、又は予防薬の投与）と組み合わせて施される。対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、カニクイザルなどサル及びヒト）などのほ乳類であるのが好ましい。好ましい実施態様では、対象は人である。
【０１９５】
本発明が包含する方法により治療できる癌の特定の例は、限定はしないが、EphA2を過剰発現する癌を含む。一実施態様では、癌は、上皮由来である。このような癌の例は、肺、大腸、前立腺、乳房、及び皮膚の癌である。他の癌は、膀胱及び膵臓の癌及び腎細胞癌及びメラノーマを含む。他の実施態様では、癌は、固形癌である。他の実施態様では、癌は、T細胞由来である。このような癌の例は、白血病、及びリンパ腫である。以下の５．４．１．１節ではさらに癌の一覧を示しているが、限定はしていない。特定の実施態様では、本発明の方法は、原発腫瘍からの転移を治療及び／又は防止するために使用することができる。
【０１９６】
本発明の方法及び組成物は、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、癌を患っている、又は患うと予想される、例えば、特定の種類の癌に対する遺伝的疾病素質を有する、発癌性物質に曝されている、又は特定の癌から寛解している対象／患者に投与することを含む。本明細書で使用されているように、「癌」は、原発腫瘍、又は転移癌を指す。このような患者は、既に癌治療を受けている場合も受けていない場合もある。本発明の方法及び組成物は、一連の癌治療、例えば、１回目の癌治療、２回目の癌治療、又は３回目の癌治療として使用することができる。本発明には、さらに、他の癌治療を受けている患者の治療も含まれ、本発明の方法、及び組成物は、それらの他の癌治療の悪影響、又は不寛容が生じる前に使用することができる。本発明は、さらに、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与し、難治性患者の症状を治療、又は改善する方法も包含する。いくつかの実施態様では、癌が難治性であることは、癌細胞の少なくとも何らかの有意な部分が殺されないか、又はその細胞分裂が停止しないことを意味する。癌細胞が難治性であるかどうかの判定は、そのような文脈で「難治性」の当業で受け入れられている意味を使用して、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当業で知られている方法により体内、又は体外で行われる。様々な実施態様において、癌は、癌細胞の数がなかなか減らないか、又は増大する場合に難治性である。本発明は、さらに、１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与し、癌にかかりやすい体質の患者の癌の発生、又は再発を防止する方法も包含する。
【０１９７】
特定の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、特定のホルモン剤、放射線照射、及び化学療法薬に対する癌細胞の耐性、又は低下した感受性を元に戻し、それにより、これらの薬剤のうちの１つ、又は複数に対して、癌細胞を再び感受性にし、次にそれを投与し（、又は投与を継続して）、転移の予防を含めて癌の治療、又は管理を行うことができる。特定の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、サイトカインIL-6のレベルが増大している患者に投与するが、このような増大は、化学療法及びホルモン療法などの異なる治療計画に対する癌細胞の耐性の発生に関連している。他の特定の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、タモキシフェン治療に対し反応性が低下しているか、又は難治性である乳癌を患う患者に投与される。他の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、サイトカインIL-6のレベルが増大している患者に投与するが、このような増大は、化学療法及びホルモン療法などの異なる治療計画に対する癌細胞の耐性の発生に関連している。
【０１９８】
他の実施態様では、本発明は、他の治療法と組み合わせて本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを患者に投与するか、又は他の治療法に対して難治性であることが判明しているがこれらの治療をもう受けていない患者に投与することを含む、患者の癌の治療、又は管理を行う方法を実現する。いくつかの実施態様では、本発明の方法により治療される患者は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、又は生物療法／免疫療法で既に治療されている患者である。これらの患者のうちには、難治性の患者と既存の癌療法による治療を受けたにもかかわらず癌を有する患者とがいる。他の実施態様では、患者は既に治療されており、疾患活動性がなく、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、癌の再発を防止するために投与される。
【０１９９】
好ましい実施態様では、既存の治療法は、化学療法である。特定の実施態様において、既存の治療法は、限定はしないが、メトトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、デカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタクセル（Pclitaxel）、ドセタクセルなどの投与を含む化学療法を含む。これらの患者には、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は生物療法／免疫療法で治療された患者も含まれる。さらにこれらの患者の中には、癌の治療、又は管理のために手術を受けた患者もいる。
【０２００】
それとは別に、本発明は、放射線療法を受けているか、又は受けたことのある患者を治療、又は管理する方法も包含する。これらの患者には、化学療法、ホルモン療法、及び／又は生物療法／免疫療法で治療されているか、又は以前に治療された患者も含まれる。さらにこれらの患者の中には、癌の治療のために手術を受けた患者もいる。
他の実施態様では、本発明は、ホルモン療法及び／又は生物療法／免疫療法を受けているか、又は受けたことのある患者を治療する方法も包含する。これらの患者の中には、化学療法及び／又は放射線療法で治療されているか、又は治療されたことのある患者もいる。さらにこれらの患者の中には、癌の治療のために手術を受けた患者もいる。
【０２０１】
さらに、本発明は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は生物療法／免疫療法では、毒性が強すぎる、すなわち治療されている対象にとって容認できないか、又は耐え難い副作用をもたらすことが判明しているか、又は判明する可能性がある場合に、これらの療法に代わる手段として癌を治療、又は管理する方法も実現する。本発明の方法で治療されている対象は、どの治療が容認できない、又は耐え難いと判明したかに応じて手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、又は生物療法などの他の癌治療で適宜治療することができる。
他の実施態様では、本発明は、他の癌治療を行わずに、そのような治療に対して難治性であることが判明している人の癌を治療するため、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与を行う。特定の実施態様では、他の癌治療に対し難治性である患者に、癌治療法が存在しない場合に１以上のEphA2ワクチンを投与する。
【０２０２】
他の実施態様では、EphA2を過剰発現する細胞に関連する前癌症状を有する患者に、その疾患を治療し、悪性の癌に進行する可能性を低減するために、本発明のワクチンを投与することができる。特定の実施態様では、前癌症状は、高悪性度の前立腺上皮内腫瘍（PIN）、乳房の線維腺腫、線維嚢胞性疾患、又は複合母斑である。
さらに他の実施態様では、本発明は、限定はしないが、喘息、慢性閉塞性肺疾（COPD）、線維症（例えば、肺、腎臓、心臓、及び肝臓線維症）、再狭窄（平滑筋及び／又は内皮の）、乾癬などを含む、癌以外の過剰増殖性細胞障害、特にEphA2の過剰発現に関連する疾患を治療、予防、及び／又は管理する方法を実現する。これらの方法は、例えば、本発明のEphA2ワクチンの投与、併用治療（例えば、癌以外の過剰増殖性疾患を治療、予防、又は管理するためにEphA2ワクチンと組み合わせて対象に投与する他の治療の実施例については、以下の５．４．３節を参照）、特定の治療に対し難治性の患者への投与などにより、癌を治療し、予防し、管理する上述の方法と類似の方法を含む。
【０２０３】
（５．４．１．２．癌）
本発明の方法、及び組成物により治療、予防、又は管理できる癌及び関連する疾患は、限定はしないが、上皮細胞由来及び／又は内皮由来の癌を含む。そのような癌の例としては、限定はしないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤血球白血球の白血病などの骨髄急性骨髄性白血病などの白血病、限定はしないが、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病、真性赤血球増加症、限定はしないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫、限定はしないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症、良性単クローン性免疫グロブリン血症、重鎖病、限定はしないが、骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫(血管肉腫)、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨組織及び結合組織肉腫、限定はしないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍、限定はしないが、腺管癌、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、乳腺髄様癌、乳房粘液癌、乳房腺管癌、乳頭癌、パジェット病、及び炎症性乳癌を含む乳癌、限定はしないが、クロム親和細胞種及び副腎皮質癌などの副腎癌、限定はしないが、乳頭状、又は濾胞状甲状腺癌、甲状腺髄様癌、及び未分化甲状腺癌などの甲状腺癌、限定はしないが、インスリノーマ、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ビポーマ、ソマトスタチン産生腫瘍、及びカルチノイドなどの膵臓癌、又は島細胞腫、限定はしないが、クッシング病、プロラクチン分泌性腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症などの下垂体癌、限定はしないが、虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマ、及び毛様体メラノーマなどの眼メラノーマ、及び網膜芽細胞腫などの眼癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、及びメラノーマなどの膣癌、扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病などの外陰癌、限定はしないが、扁平上皮細胞癌、及び腺癌などの子宮頚癌、限定はしないが、子宮内膜癌及び子宮肉腫などの子宮癌、限定はしないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、及び間質腫瘍などの卵巣癌、限定はしないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、非上皮性悪性腫瘍、メラノーマ、形質細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌などの食道癌、限定はしないが、腺癌、菌状（ポリープ状）癌、潰瘍性癌、表在拡大型癌、散在拡大型癌、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫などの胃癌、大腸癌、直腸癌、限定はしないが、肝細胞癌及び肝芽腫などの肝臓癌、腺癌などの胆嚢癌、限定はしないが、乳頭状癌、結節性癌、及び散在性癌などの胆管癌、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌などの肺癌、限定はしないが、胚細胞腫瘍、セミノーマ、未分化癌、古典的（定常型）、精母細胞性癌、セミノーマ、非精上皮腫性癌、胎生期癌、奇形腫癌腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、限定はしないが、前立腺上皮内腫瘍、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫などの前立腺癌、陰茎癌、限定はしないが、扁平上皮癌などの口腔癌、基底細胞癌、限定はしないが、腺癌、粘液性類表皮癌、及び腺様嚢胞癌などの唾液腺癌、限定はしないが、扁平上皮癌、及びいぼ状癌などの咽頭部癌、限定はしないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌及びメラノーマ、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子悪性メラノーマ、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌、限定はしないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂及び／又は子宮）などの腎臓癌、ウィルムス腫瘍、限定はしないが、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌を含む。さらに、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、骨液膜種、血管芽細胞腫、上皮癌腫、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、及び乳頭腺癌が含まれる（そのような疾患に関するレビューについては、Fishmanらの論文、1985, Medicine, 2版, J. B. Lippincott Co., Philadelphia、及びMurphyらの論文「情報に基づいた決断：癌診断、治療、及び回復のすべてに関する本」（1997, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America）を参照のこと）。
【０２０４】
本発明の方法及び組成物は、さらに、様々な癌、又は他の異常増殖疾病の治療、又は予防に有用であり、（限定はしないが）扁平上皮癌を含む膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚管、甲状腺、及び皮膚の癌を含む癌腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ系統の造血器腫瘍、急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄細胞系列の造血器腫瘍、線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉細胞由来の腫瘍、メラノーマ、セミノーマ、テトラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、及び神経膠腫を含む他の腫瘍、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉細胞由来の腫瘍、及びメラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍を含む。アポトーシスにおける染色体異常により引き起こされる癌も、本発明の方法及び組成物によって治療されるであろうことも考えられる。そのような癌は、限定はしないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する癌腫、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、及び家族性大腸腺腫症及び骨髄異形成症候群などの前癌性病変を含むことができる。特定の実施態様では、皮膚、肺、大腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、又は子宮における悪性腫瘍、又は増殖性病変（化生、及び異形成など）、又は過剰増殖性疾患が治療されるか、又は予防される。他の特定の実施態様では、肉腫、メラノーマ、又は白血病が治療、又は予防される。
【０２０５】
いくつかの実施態様では、癌は、悪性でありEphA2を過剰発現する。他の実施態様では、治療すべき疾患は、EphA2を過剰発現する細胞に関連する前癌症状である。特定の実施態様では、前癌症状は、高悪性度の前立腺上皮内腫瘍（PIN）、乳房の線維腺腫、線維嚢胞性疾患、又は複合母斑である。
好ましい実施態様では、本発明の方法及び組成物は、乳癌、卵巣癌、食道癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、及び前立腺癌及びメラノーマの治療及び／又は予防に使用され、以下では限定するのではなく例として示す。
他の好ましい実施態様では、本発明の方法及び組成物は、限定はしないが、白血病、及びリンパ腫を含むT細胞由来の癌の治療及び／又は予防に使用される。
【０２０６】
（５．４．１．３．乳癌の治療）
特定の実施態様では、乳癌の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のペプチドは、乳癌治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、限定はしないが、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンとシクロホスファミド（AC）との組合せ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、及び5-フルオロウラシル（CAF）の組合せ、シクロホスファミド、エピルビシン、及び5-フルオロウラシル（CEF）の組合せ、her-2抗体、例えば、ハーセプチン、タモキシフェン、タモキシフェンと細胞毒性化学療法との組合せ、タキサン（ドセタクセル及びパクリタクセルなど）を含む。他の実施態様では、本発明のペプチドは、結節陽性の局所性乳癌の補助治療にタキサンを追加した標準的なドキソルビシン及びシクロホスファミドとともに投与することができる。
【０２０７】
特定の実施態様では、乳房の前癌線維腺腫、又は線維嚢胞性疾病を有する患者に、その疾患を治療し、悪性の乳癌に進行する可能性を低減するために、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与する。他の特定の実施態様では、治療、特にホルモン療法、より具体的にはタモキシフェン療法に対し難治性の患者に、癌を治療し、及び／又は患者の難治性をなくし、応答性を高めるために本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与する。
【０２０８】
（５．４．１．４．大腸癌の治療）
特定の実施態様では、大腸癌の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のペプチドは、大腸癌治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、限定はしないが、AVASTIN（商標）（ベバシズマブ）、5-FUとロイコボリンとの組合せ、5-FUとレバミゾールとの組合せ、イリノテカン（CPT-11）、又はイリノテカン、5-FU、及びロイコボリン（IFL）の組合せを含む。
【０２０９】
（５．４．１．５．前立腺癌の治療）
特定の実施態様では、前立腺癌の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のペプチドは、前立腺癌治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、限定はしないが、外部ビーム放射線療法、放射性同位元素（すなわち、I１２５、パラジウム、イリジウム）の組織間腔皮内移植、ロイプロリド、又は他のLHRHアゴニスト、非ステロイド性抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）、ステロイド性抗アンドロゲン（酢酸シプロテロン）、ロイプロリドとフルタミドとの組合せ、DES、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、抱合卵胞ホルモンU.S.P.、DES二リン酸などのエストロゲン、ストロンチウム89などの放射性同位元素、外部ビーム放射線療法とストロンチウム89との組合せ、アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド離脱、プロゲステロン、及びケトコナゾールなどの第二線ホルモン療法、低投与量プレドニソン、又はドセタクセル、パクリタクセル、エストラムスチン／ドセタクセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、及びエストラムスチン／パクリタクセルを含む、対象の症状の改善及びPSAレベルの低減をもたらすと報告されている他の化学療法を含む。
【０２１０】
特定の実施態様では、前癌状態高悪性度前立腺上皮内腫瘍（PIN）を有する患者に、その疾患を治療し、悪性の前立腺癌に進行する可能性を低減するために、本発明のEphA2ワクチンを投与する。
【０２１１】
（５．４．１．６．メラノーマの治療）
特定の実施態様では、メラノーマの患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のペプチドは、メラノーマ治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、限定はしないが、デカルバジン（DTIC）、カルムスチン（BCNU）及びロムスチン（CCNU）などのニトロソ尿素、ビンカアルカロイド、白金化合物、及びタキサンを含む穏やかな単剤活性を有する薬剤、ダートマス療法（シスプラチン、BCNU、及びDTIC）、インターフェロンアルファ（IFN-α）、及びインターロイキン-2（IL-2）を含む。特定の実施態様では、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）がある場合、又はない場合に、多重脳転移、骨転移、及び脊髄圧迫を患う患者に、本発明の１以上のEphA2ワクチンを有効な量だけ、メルファラン（L-PAM）を用いた分離式四肢温熱灌流（isolated hyperthermic limb perfusion）（ILP）と組み合わせて投与し、放射線療法での症候の軽減及びいくらかの腫瘍の収縮とを実現することができる。
【０２１２】
特定の実施態様では、前癌性複合母斑を有する患者に、その疾患を治療し、悪性のメラノーマに進行する可能性を低減するために、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与する。
【０２１３】
（５．４．１．７．卵巣癌の治療）
特定の実施態様では、卵巣癌の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のペプチドは、卵巣癌治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、限定はしないが、P３２治療などの腹腔内放射線療法、全腹部、及び骨盤の放射線療法、シスプラチン、パクリタクセル（タキソール）、又はドセタクセル（タキソテレ）とシスプラチン、又はカルボプラチンとの組合せ、シクロホスファミドとシスプラチンの組合せ、シクロホスファミドとカルボプラチンとの組合せ、5-FUとロイコボリンとの組合せ、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビン、又はトポテカンを含む。白金難治性疾病の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを有効な量だけタキソール投与と組み合わせて投与することが考えられる。含まれるのは、難治性卵巣癌を有する患者の治療であり、これは、白金難治性である疾病を有する患者へのイホスファミドの投与、シスプラチンに基づく併用療法が失敗した後の救助化学療法としてのヘキサメチルメラミン（HMM）の投与、腫瘍に関して検出可能なレベルの細胞質エストロゲン受容体を有する患者へのタモキシフェンの投与を含む。
【０２１４】
（５．４．１．８．肺癌の治療）
特定の実施態様では、小細胞肺癌の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のペプチドは、肺癌治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、限定はしないが、胸部放射線療法、シスプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びエトポシドの単独、又は併用、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン／エトポシド、及びシスプラチン（CAV／EP）の組合せ、気管支内レーザー療法による局所緩和、気管支内ステント、及び／又は近接照射療法を含む。
【０２１５】
他の特定の実施態様では、非小細胞肺癌の患者に、本発明の有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、肺癌治療に有用な有効な量の１以上の他の薬剤と組み合わせて投与するが、これは、限定はしないが、緩和的放射線療法、シスプラチン、ビンブラスチン、及びマイトマイシンの組合せ、シスプラチンとビノレルビンとの組合せ、パクリタクセル、ドセタクセル、又はゲムシタビン、カルボプラチンとパクリタクセルとの組合せ、気管支内病変に対する組織内照射療法、又は定位的放射線照射療法を含む。
【０２１６】
（５．４．１．９．T細胞悪性腫瘍の治療）
特定の実施態様では、白血病、及びリンパ腫（例えば、セクション５．８．１．１参照）などのT細胞悪性腫瘍の患者に、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2を有効な量だけ投与する。他の実施態様では、本発明のEphA2ワクチンは、癌、特に、T細胞悪性腫瘍、又は１以上のその症状の予防、治療、又は改善に有用な１以上の有効な量の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、前記併用療法は、それを必要としている対象に、本発明の予防上、又は治療上有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与し、化学療法、ホルモン療法、生物療法、免疫療法、又は放射線療法を含む予防上、又は治療上有効な量の１以上の癌治療を施すことを含む。
【０２１７】
他の特定の実施態様では、T細胞悪性腫瘍の患者に、本発明の有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、１以上の癌化学療法薬剤と組み合わせて投与するが、これは、限定はしないが、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、ドセタクセル、及びパクリタクセルなどのタキサン、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ビンブラスチン、ダカルバジン、カルムスチン及びロムスチンなどのニトロソ尿素、ビンカアルカロイド、白金化合物、シスプラチン、マイトマイシン、ビノレルビン、ゲムシタビン、カルボプラチン、ヘキサメチルメラミン、及び／又はトポテカンを含む。そのような方法は、限定はしないが、放射線療法、生物療法、ホルモン療法、及び／又は手術などの他の癌治療法を施すことを適宜さらに含むことができる。
【０２１８】
さらに他の特定の実施態様では、T細胞悪性腫瘍の患者に、本発明の有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、外部ビーム放射線療法、放射性同位元素（I１２５、パラジウム、イリジウム）の組織間腔皮内移植、ストロンチウム89などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内P３２放射線療法、及び／又は全腹部、及び骨盤の放射線療法などの１以上の種類の放射線療法と組み合わせて投与する。そのような方法は、限定はしないが、化学療法、生物療法／免疫療法、ホルモン療法、及び／又は手術などの他の癌治療法を施すことを適宜さらに含むことができる。
【０２１９】
さらに他の特定の実施態様では、T細胞悪性腫瘍の患者に、本発明の有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、タモキシフェン、ロイプロリド、又は他のLHRHアゴニスト、非ステロイド性抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）、ステロイド性抗アンドロゲン（酢酸シプロテロン）、エストロゲン（DES、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、抱合卵胞ホルモンU.S.P.、DES二リン酸）、アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド離脱、プロゲステロン、ケトコナゾールプレドニソン、インターフェロン-α、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子-α、及び／又はメルファランなどの、１以上の生物療法／免疫療法、又はホルモン療法と組み合わせて投与する。含まれる生物療法は、さらに、限定はしないが、アポトーシスを誘発するTRAIL抗癌アゴニスト、ほかではDR4及びDR5（デスドメイン含有受容体4及び5）と呼ばれるTRAIL受容体1及び2に結合するTRAIL抗体、さらにDR4及びDR5などのTNFリガンドファミリーのメンバーなどのサイトカインである。TRAIL及びTRAIL抗体、リガンド、及び受容体は、当業で知られており、米国特許第6,342,363号、第6,284,236号、第6,072,047号、及び第5,763,223号で説明されている。そのような方法は、限定はしないが、放射線療法、化学療法、及び／又は手術などの他の癌治療法を施すことを適宜さらに含むことができる。
【０２２０】
さらに他の特定の実施態様では、T細胞悪性腫瘍の患者に、本発明の有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、T細胞悪性腫瘍の標準的及び実験的療法と組み合わせて投与する。本発明の方法及び組成物で使用できるT細胞悪性腫瘍の標準的及び実験的治療法は、限定はしないが、抗体療法（例えば、Campath（登録商標）、anti-Tac、HuM291（ヒト化ネズミIgG2モノクローナル抗体CD3）、抗体医薬結合（例えば、ミロターグ）、放射性標識化モノクローナル抗体（例えば、ベクザー、ゼバリン、Lym-1））、サイトカイン療法、細胞毒性薬、プリン類似薬、造血幹細胞移植術のある、又はない積極的併用化学療法、及びT細胞媒介療法（例えば、限定はしないが、白血病特異タンパク質（例えば、bcr／abl、PML／RARa、EMV／AML-1）、白血病付随タンパク質（例えば、プロテイナーゼ3、WT-1、h-TERT、hdm-2）を含む標的抗原に対する抗白血病活性のあるCD8+ T細胞）を含む。（Riddellらの論文、2002, Cancer Control, 9 (2): 114-122、Deardenらの論文、2002, Medical Oncology, 19, Suppl. S27-32、Waldmannらの論文、2000, Hematology (Am Soc Hematol Educ Program): 394-408を参照）。
【０２２１】
（５．４．２．異常血管形性に関連する疾患の治療、又は予防）
EphA2は、血管由来の血管の標識であり、血管新生、又は新血管形成において重要な役割を果たす（例えば、Ogawaらの論文、2000, Oncogene. 19 (52): 6043-52、Hessらの論文、2001, Cancer Res. 61 (8): 3250-5を参照）。血管新生は、平滑筋細胞、及び内皮細胞の侵入、移行、増殖により特徴付けられる。新しい血管の成長、すなわち血管新生は、糖尿病性網膜症（Adonisらの論文、1994, Amer. J. Ophthal., 118: 445）、関節リウマチ（Peacockらの論文、1992, J. Exp. Med. 175: 1135）、及び変形性関節症（Ondrickらの論文、1992, Clin.-Podiatr.-Med.-Surg. 9: 185）などの病的状態に関わる。
したがって、本発明のリステリアに基づく組成物を、それを必要とする対象に投与し、異常血管形性に関連する疾患、又は１以上のその症状を予防、管理、治療、又は改善することができる。
【０２２２】
異常血管形性に関連する、又は特徴付けられ、本発明のリステリアに基づく組成物で予防、治療、管理、又は改善できる疾患は、限定はしないが、腫瘍性疾患（限定しない例は、腫瘍、及び白血病の転移である）、眼新血管形成の疾病（限定しない例は、加齢に関係する黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び未熟児網膜症、血管再狭窄である）、皮膚病（限定しない例は、幼児血管腫、尋常性疣贅、乾癬、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、皮膚黒色腫、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水泡症である）、関節炎（限定しない例は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節症、ライター症候群、及びシェーグレン症候群である）、女性生殖器疾患（限定しない実施例は、子宮内膜症、妊娠中の子癇前症、卵巣、子宮内膜、及び子宮頚管の癌腫である）、及び心循環器疾患（限定しない例は、動脈硬化性プラークの形成、粥状動脈硬化症、及び冠動脈疾患である）を含む。
【０２２３】
特定の実施態様では、異常血管形性に関連する、又は特徴付けられ、本発明のリステリアに基づく組成物で予防、治療、管理、又は改善できる疾患は、限定はしないが、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、動脈硬化性プラークにおける毛細血管増殖、さらにEphA2が脈管構造内に発現される癌を含む。このような癌疾患は、例えば、固形癌、腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後腫瘍、線維増殖、血管腫、カポジ肉腫を含むことができる。
いくつかの実施態様では、リステリアに基づく組成物は、他の治療法が関与する併用療法計画で使用される。このような治療法の限定しない実施例は、鎮痛薬、血管形成阻害薬、抗癌治療、及び抗炎症薬、特に鎮痛薬と血管形成阻害薬を含む。
【０２２４】
（５．４．２．１．患者集団）
本発明は、１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与することを含む対象における異常血管形性に関連する疾患、又はその症状を治療、管理、又は予防する方法を包含する。本発明の方法は、１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、異常血管形性に関連する疾患を患っている、又は患うことが予想される患者（例えば、そのような遺伝的疾病素質を有する患者、又は以前に患ったことのある患者）に投与することを含む。そのような患者は、その疾患について以前に治療されている可能性があるか、又は現在治療中である。本発明によれば、リステリアに基づくEphA2ワクチンは、限定はしないが、１回目、２回目、３回目、及び４回目の一連の治療を含む、任意の一連の治療として使用することができる。さらに、本発明によれば、リステリアに基づくEphA2ワクチンは、リステリアに基づくEphA2ワクチン療法の悪影響、又は不寛容が生じる前に使用することができる。本発明は、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与し、異常血管形性に関連する疾患の発生、又は再発を防止する方法も包含する。
【０２２５】
一実施態様では、本発明は、さらに、現在の治療法の代替え手段として異常血管形性に関連する疾患の治療、又は管理を行う方法も実現する。特定の一実施態様では、現在の治療法は、患者に対し毒性が強すぎる（すなわち容認できないか、又は耐え難い副作用をもたらす）ことが判明しているか、又は判明する可能性がある。他の実施態様では、患者は、現在の治療法に対し難治性であることが判明している。そのような実施態様では、本発明は、他の治療法を行わずに、異常血管形性に関連する疾患を治療、又は管理するため、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与を行うことを規定する。いくつかの実施態様では、異常血管形性に関連する疾患を治療、又は管理するために、他の治療法の代わりに、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、それを必要としている患者に投与することができる。
【０２２６】
本発明は、さらに、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを投与して、リステリアに基づくEphA2ワクチンによらない療法に難治性である、又は難治性になった患者において異常血管形性に関連する疾患の症状を治療、又は改善する方法も包含する。それらの症状が難治性であるかどうかの判定は、異常血管形性に関連する疾患における、又はリステリアに基づくEphA2ワクチンによらない療法に難治性であるか、又は難治性であったことがある患者内の影響を受ける細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当業で知られている方法により体内、又は体外で行うことができる。
【０２２７】
（５．４．３．他の治療法）
いくつかの実施態様では、１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与による治療は、限定はしないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は生物学的療法／免疫療法などの１以上の治療法の投与と組み合わせる。予防／治療薬剤は、限定はしないが、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後修飾されたタンパク質、ペプチドなどを含むタンパク質を含むタンパク質性分子、又は小分子（1000ダルトン未満）、無機、又は有機化合物、又は限定はしないが、二本鎖、又は一本鎖のDNA、又は二本鎖、又は一本鎖のRNA、さらに三重らせん核酸分子を含む核酸分子を含む。予防／治療薬剤は、知られている生物（限定はしないが、動物、植物、細菌、菌類、及び原生生物、又はウイルスを含む）、又は合成分子ライブラリから産生することができる。
【０２２８】
特定の一実施態様では、本発明の方法は、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、１以上の予防／治療薬剤と組み合わせて投与することを包含し、これは、限定はしないが、ABL、ACK、AFK、AKT（例えば、AKT-1、AKT-2、及びAKT-3）、ALK、AMP-PK、ATM、オーロラ、オーロラ2、bARK1、bArk2、BLK、BMX、BTK、CAK、CaMキナーゼ、CDC2、CDK、CK、COT、CTD、DNA-PK、EGF-R、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ERK（例えば、ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7）、ERT-PK、FAK、FGR（例えば、FGF1R、FGF2R）、FLT（例えば、FLT-1、FLT-2、FLT-3、FLT-4）、FRK、FYN、GSK（例えば、GSK1、GSK2、GSK3-alpha、GSK3-beta、GSK4、GSK5）、G-タンパク質結合受容体キナーゼ（GRKs）、HCK、HER2、HKII、JAK（例えば、JAK1、JAK2、JAK3、JAK4）、JNK（例えば、JNK1、JNK2、JNK3）、KDR、KIT、IGF-1受容体、IKK-1、IKK-2、INSR（インスリン受容体）、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOK、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、MHCK、MLCK、MLK3、NEU、NIK、PDGF受容体アルファ、PDGF受容体ベータ、PHK、PI-3キナーゼ、PKA、PKB、PKC、PKG、PRK1、PYK2、p38キナーゼ、pl35tyk2、p34cdc2、p42cdc2、p42mapk、p44mpk、RAF、RET、RIP、RIP-2、RK、RON、RSキナーゼ、SRC、SYK、S6K、TAK1-TEC、TIE1、TIE2、TRKA、TXK、TYK2、UL13、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70、及びこれらのキナーゼのすべての特殊型などのキナーゼの阻害剤である、抗体を含む（例えば、Hardie及びHanksの論文「タンパク質キナーゼファクトブック」（(1995) I and II, Academic Press, San Diego, Calif.）を参照）。好ましい実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、Eph受容体キナーゼの阻害剤である１以上の予防／治療薬剤の投与と組み合わせて投与される（例えば、EphA2、Epha4）。最も好ましい実施態様では、本発明のEphA2ワクチンは、EphA2の阻害剤である１以上の予防／治療薬剤の投与と組み合わせて投与される。
【０２２９】
特定の一実施態様では、本発明の方法は、１以上の治療抗体の投与と組み合わせた本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与を包含する。本発明の方法で使用できる治療抗体の実施例は、限定することなく以下のものを含む、すなわちAVASTIN（登録商標）は、抗ＶEGF抗体であり、EphA2に免疫特異的に結合し、シグナル変換を引き起こす抗体（すなわち、EphA2アゴニスティック抗体）であり、エフリンA1に免疫特異的に結合する抗体であり、HERCEPTIN（登録商標）（トラスツズマブ）（Genentech、カリフォルニア州）は、転移性乳癌の患者を治療するためのヒト化抗HER2モノクローナル抗体であり、REOPRO（アブシキシマブ）（Centocor）は、血栓形成を予防するための血小板上の抗糖タンパク質IIb／IIIa受容体であり、ZENAPAX（登録商標）（ダクリズマブ）（Roche Pharmaceuticals、スイス）は、急性腎臓同種移植拒絶反応を予防するための免疫制御、ヒト化抗CD25モノクローナル抗体であり、PANOREX（商標）は、ネズミ抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体（Glaxo Wellcome／Centocor）であり、BEC2は、ネズミ抗イディオタイプ（GD3エピトープ）IgG抗体（ImClone System）であり、IMC-C225は、キメラ抗EGFR IgG抗体（ImClone System）であり、VITAXINT（商標）は、ヒト化抗αｖβ３インテグリン抗体（Applied MolecularEvolution／MedImmune）であり、Campath1H／LDP-03は、ヒト化抗CD52 IgG１抗体（Leukosite）であり、Smart M195は、ヒト化抗CD33 IgG抗体（Protein DesignLab／Kanebo）であり、RITUXAN（商標）は、キメラ抗CD20 IgG1抗体（IDECPharm／Genentech、Roche／Zettyaku）であり、LYMPHOCIDE（商標）は、ヒト化抗CD22 IgG抗体（Immunomedics）であり、LYMPHOCIDE（商標）Y-90（Immunomedics）であり、LymphoScan（Tc-99m-標識付き、放射線画像、Immunomedics）であり、Nuvion（CD3に対抗、Protein Design Labs）であり、CM3は、ヒト化抗ICAM3抗体（ICOS Pharm）であり、IDEC-114は、霊長類化抗CD80抗体（IDEC Pharm／Mitsubishi）であり、ZEVALIN（商標）は、放射性標識化ネズミ抗CD20抗体（IDEC／Schering AG）であり、IDEC-131は、霊長類化抗CD40L抗体（IDEC／Eisai）であり、IDEC-151は、霊長類化抗CD4抗体（IDEC）であり、IDEC-152は、霊長類化抗CD23抗体（IDEC／Seikagaku）であり、SMART抗CD3は、ヒト化抗CD3 IgG（Protein Design Lab）であり、5G1.1は、ヒト化抗補体因子5（C5）抗体（Alexion Pharm）であり、D2E7は、ヒト化抗TNF-α抗体（CAT／BASF）であり、CDP870は、ヒト化抗TNF-α免疫グロブリン断片（Celltech）であり、IDEC-151は、霊長類化抗CD4 IgG1抗体（IDECPharm／SmithKline Beecham）であり、MDX-CD4は、ヒト抗CD4 IgG抗体（Medarex／Eisai／Genmab）であり、CD20-スレプタビジン（＋ビオチン-イットリウム90、NeoRx）であり、CDP571は、ヒト化抗TNF-α IgG4抗体（Celltech）であり、LDP-02は、ヒト化抗αｖβ７抗体（LeukoSite／Genentech）であり、OrthoClone OKT4Aは、ヒト化抗CD4 IgG抗体（Ortho Biotech）であり、ANTOVA（商標）は、ヒト化抗CD40L IgG抗体（Biogen）であり、ANTEGREN（商標）は、ヒト化抗VLA-4 IgG抗体（Elan）であり、CAT-152は、ヒト抗TGF-β２抗体（Cambridge Ab Tech）である。
【０２３０】
他の特定の実施態様では、本発明の方法は、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、血管形成阻害薬である１以上の予防／治療薬剤の投与と組み合わせて投与することを包含し、このような阻害薬は、限定はしないが、アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管形成性アンチトロンビンIII、アンジオザイム、ABT-627、Bay 12-9566、ベネフィン、ベバシズマブ（AVASTIN（商標））、BMS-275291、軟骨由来阻害剤（CDI）、CAI、CD59補体断片、CEP-7055、Col 3、コンブレタスタチンA-4、エンドスタチン（コラーゲンXVIII断片）、フィブロネクチン断片、Gro-ベータ、ハロフジノン、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖断片、HMV833、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、IM-862、インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導タンパク質（IP-10）、インターロイキン-12、クリングル5（プラスミノーゲン断片）、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤（TIMPs）、2-メトキシエストラジオール、MMI 270（CGS 27023A）、MoAb IMC-1C11、ネオバスタット、NM-3、パンゼム、PI-88、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板因子-4（PF4）、プリノマスタット、プロラクチン16kD断片、プロフェリン関連タンパク質（PRP）、PTK 787／ZK 222594、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、テトラヒドロコルチゾール-S、テトラチオモリブデン酸塩、サリドマイド、トロンボスポンジン-1（TSP-1）、TNP-470、トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-β）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）、ZD6126、ZD6474、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）、及びビスホスホン酸塩などがある。
【０２３１】
他の特定の実施態様では、本発明の方法は、本発明のEphA2ワクチンを、抗癌剤である１以上の予防／治療薬剤の投与と組み合わせて投与することを包含し、このような抗癌剤は、限定はしないが、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、二メシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルブビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロランブシル、シロルマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、ダカルバジン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシラート、ジアジクォン、ドセタクセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、可溶性EphrinA1、EphrinA1-Fcポリペプチド、EphA2-Ｆｃポリペプチド、EphA2アンチセンス、EphrinA1アンチセンス、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸ソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキン2（組み換え体のインターロイキン2、すなわちrIL2を含む）、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-n1、インターフェロンアルファ-n3、インターフェロンベータ-I a、インターフェロンガンマ-I b、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲステロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、塩酸ミトザントロン、ミコフェノール酸、ニトロソ尿素、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタクセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、塩酸プロカルバジン、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、トラスツズマブ（HERCEPTIN（商標））、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンなどである。他の抗癌剤は、限定はしないが、20-エピ-1、25ジヒドロキシビタミンD3、5-エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ALL-TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管形成阻害剤、アンタゴニストD、アンタゴニストG、アンタレリクス、抗背方化形態形成タンパク質-1、抗アンゴロゲン、抗エストロゲン薬、アンチネオプラストン、アフィジコリングリシナート、アポトーシス遺伝子変調因子、アポトーシス調節因子、アプリン酸、ara-CDP-DL-PTBA、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン1、アキシナスタチン2、アキシナスタチン3、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール、バチマスタット、BCR／ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータアレシン、ベタクラマイシンB、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンA、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ビチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンC、カンプトテシン誘導体、カナリア痘ウイルスIL-2、カペシタビン、カルボキシアミドアミノトリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN 700、軟骨由来抑制物質、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害薬（ICOS）、カスタノスペルミン、セクロピンB、セトロレリクス、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンA、コリスマイシンB、コンブレタスタチンA4、コンブレタスタチン��似体、コナゲニン、クランベスシジン816、クリスナトール、クリプトフィシン8、クリプトフィシンA誘導体、キュラシンA、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、サイペマイシン、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロダイデムニンB、デスロレリン、デキサメサゾン、デキシホスファミド、デキスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジクォン、ダイデムニンB、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ-5-アザシチジン、ジヒドロタキソール、ジオクサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタクセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、ズオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチニン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチン、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害薬、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセタミド、ハイペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫活性ペプチド、インスリン様増殖因子-1受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、イオドクソルビシン、イポメアノール、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンB、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン-Nトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、レンチナン硫酸、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミソール、リアロゾール、線形ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド7、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ラートテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンA、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリジン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖RNA、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、メトナフィド、マイトトキシン線維芽細胞増殖因子サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリルリピドA＋放線菌���胞壁sk、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多重腫瘍抑制物質１に基づく治療、マスタード抗癌剤、マイカペロキシドB、放線菌細胞壁抽出物、ミリアポロン、N-アセチルジナリン、N-置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスティップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素変調因子、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン、O6-ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘発剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキザウノマイシン、パクリタクセル、パクリタクセル類似体、パクリタクセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンA、プラセチンB、プラスミノーゲン活性化因子抑制因子、白金錯体、白金化合物、白金トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニソン、プロピルビスアクリドン、プロスタグランジンJ2、プロテアソーム阻害剤、プロテインAに基づく免疫変調薬、プロテインキナーゼC阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、微細藻類、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体、rafアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ras阻害剤、ras-GAP阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムRe 186エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、RIIレチナミド、ログレチミド、ロヒツカイン、ロムルチド、ロキニメクス、ルビジノンB1、ルボキシル、サフィンゴール、サイトピン、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、
Sdi 1模倣体、セムスチン、老化由来抑制物質1、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達変調因子、単一鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ボロカプタートナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルホス酸、スピカマイシンD、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン1、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、過活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワンソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タキソール、タラロテン、テコガランナトリウム、テガフル、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポリフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキサイド、テトラゾミン、サリブラスチン、サリドマイド、チオコラリン、チオグアニン、トロンボポイエチン、トロンボポイエチンミメティック、チマルファシン、サイモポイエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、UBC阻害剤、ウベニメクス、泌尿生殖洞由来増殖抑制因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンB、ベクターシステム、赤血球遺伝子療法、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、バイタクシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、及びジノスタチンスチマラマーを含む。好ましい追加の抗癌剤は、5-フルオロウラシル及びロイコボリンである。
【０２３２】
より具体的な実施態様では、本発明は、好ましくは上述のように乳癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、大腸癌、及び肺癌を治療するために、本発明の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、限定はしないが、以下の表５に開示されているような抗癌剤などの１以上の治療法と組み合わせて投与することも含む。
【０２３３】
【表５】
2007509067.tif 000007
2007509067.tif 000008
2007509067.tif 000009
【０２３４】
本発明は、さらに、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンを、X線、ガンマ線、及び他の放射線源を使用して癌細胞を破壊することを含む放射線療法と組み合わせて投与することを包含する。好ましい実施態様では、放射線治療は、放射線が離れた場所にある放射線源から放射される外部ビーム放射線、又は遠隔療法として施される。他の好ましい実施態様では、放射線治療は、内科治療、又は放射性線源が体内の癌細胞、又は腫瘤の近くに置かれる近接照射療法として施される。
【０２３５】
特定の一実施態様では、本発明の方法は、１以上の抗炎症薬剤の投与と組み合わせた本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与を包含する。当業者に周知の炎症疾患の治療に有用な薬剤を含む、抗炎症薬剤は、本発明の組成物、及び方法で使用することができる。抗炎症薬剤の限定しない実施例は、非ステロイド系抗炎症薬剤（NSAID）、ステロイド系抗炎症薬剤、抗コリン剤（例えば、硫酸アトロピン、メチル硝酸アトロピン、及び臭化イプラトロピウム（ATROVENT（商標）））、ベータ2-アゴニスト（例えば、アブテロール（VENTOLIN（商標）、及びPROVENTIL（商標））、ビトルテロール（TORNALATE（商標））、レバルブテロール（XOPONEX（商標））、メタプロテレノール（ALUPENT（商標））、ピルブテロール（MAXAIR（商標））、テルブタリン（BRETHAIRE（商標）及びBRETHINE（商標））、アルブテロール（PROVENTIL（商標）、REPETABS（商標）、及びVOLMAX（商標））、ホルモテロール（FORADIL AEROLIZER（商標））、及びサルメテロール（SEREVENT（商標）及びSEREVENT DISKUS（商標））、及びメチルキサンチン（例えば、テオフィリン（UNIPHYL（商標）、THEO-DUR（商標）、SLO-BID（商標）、及びTEHO-42（商標）））を含む。NSAIDの実施例は、限定はしないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（CELEBREX（商標））、ジクロフェナク（VOLTAREN（商標））、エトドラク（LODINE（商標））、フェノプロフェン（NALFON（商標））、インドメタシン（INDOCIN（商標））、ケトラク（TORADOL（商標））、オキサプロジン（DAYPRO（商標））、ナブメントン（RELAFEN（商標））、スリンダク（CLINORIL（商標））、トルメチン（TOLECTIN（商標））、ロフェコキシブ（VIOXX（商標））、ナプロキセン（ALEVE（商標）、NAPROSYN（商標））、ケトプロフェン（ACTRON（商標））及びナブメトン（RELAFEN（商標））を含む。このようなNSAIDは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、COX-1及び／又はCOX-2）を抑制することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬剤の実施例は、限定はしないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（DECADRON（商標））、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン（MEDROL（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（PREDNISONE（商標）及びDELTASONE（商標））、プレドニゾロン（PRELONE（商標）及びPEDIAPRED（商標））、トリアムシノロン、アザルフィジン、及びエイコサノイドの阻害剤（例えば、プロスタグランジン、トロンボキサン、及びロイコトリエン（ロイコトリエン及びそのような薬剤の典型的な投与量の限定しない実施例については以下の表６を参照））を含む。
【０２３６】
いくつかの実施態様では、抗炎症薬剤は、喘息、又はその１以上の症状の予防、管理、治療、及び／又は改善に有用な薬剤である。そのような薬剤の限定しない実施例は、アドレナリン作動薬（例えば、カテコールアミン（例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、及びイソエタリン）、レゾルシノール（例えば、メタプロテレノール、テルブタリン、及びフェノテロール）、及びサリゲニン（例えば、サルブタモール））、アドレノコルチコイド、ブルココルチコイド、コルチコステロイド（例えば、ベクロメタドンス、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、及びプレドニゾン）、他のステロイド系、ベータ2-アゴニスト（例えば、アルブツエロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリン、ホルモテロール、サルメテロール、及びアルブタモールテルブタリン）、抗コリン作用薬（例えば、臭化イプラトロピウム及び臭化オキソトピウム）、IL-4アンタゴニスト（抗体を含む）、IL-5アンタゴニスト（抗体を含む）、IL-13アンタゴニスト（抗体を含む）、PDE4阻害剤、NF-カッパ−ベータ阻害剤、VLA-4阻害剤、CpG、抗CD23、選択アンタゴニスト（TBC 1269）、肥満細胞タンパク質分解酵素阻害剤（例えば、トリプターゼキナーゼ阻害剤（例えば、GW-45、GW-58、及びゲニステイン）、ホスファチジルイノシチド-3’（PI3）-キナーゼ阻害剤（例えば、カルホスチンC）、及び他のキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）（Temkinらの論文、2002 J Immunol 169(5): 2662-2669、Vossellerらの論文、1997 Mol. Biol. Cell 8(5): 909-922、及びNagaiらの論文、1995 Biochem Biophys Res Commun 208(2): 576-581）、C3受容体アンタゴニスト（抗体を含む）、免疫阻害剤（例えば、メトトレキサート及び金塩）、肥満細胞変調因子（例えば、クロモリンナトリウム（INTAL（商標））、及びネドクロミルナトリウム（TILADE（商標））、及び粘液溶解薬剤（例えば、アセチルシステイン））を含む。特定の実施態様では、抗炎症剤は、ロイコトリエン阻害剤（例えば、モンテルカスト（SINGULAIR（商標））、ザフィルルカスト（ACCOLATE（商標））、プランルカスト（ONON（商標）、又はジレウトン（ZYFLO（商標））（表６を参照））である。
【０２３７】
【表６】
2007509067.tif 000010
【０２３８】
【表７】
2007509067.tif 000011
【０２３９】
癌治療は、癌以外の過剰増殖性細胞障害の治療及びその投与量、投与の経路、及び推奨用法とともに、当業で知られており、「医師用卓上参考書」（56版, 2002, 57版, 2003、及び58版, 2004）などの文献に記載されている。
【０２４０】
（５．５．生物活性）
本発明の予防及び／又は治療上のプロトコルの毒性、及び有効性は、実験動物において、例えばLD５０（母集団の50％にとって致命的な投与量）、及びED５０（母集団の50％に治療上有効な投与量）を測定する標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性効果と治療効果との投与量比は、治療指数であり、比LD５０／ED５０で表すことができる。大きな治療指数を示す予防及び／又は治療薬剤が好ましい。毒副作用を示す予防及び／又は治療薬剤を使用することもできるが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、そのような薬剤の標的が患部組織部位となるように送達システムを設計する際には注意すべきである。
【０２４１】
動物実験から得られたデータは、ヒトに使用する予防及び／又は治療薬剤の投与量の範囲を定式化する際に使用できる。そのような薬剤の投与量は、毒性がほとんど、又はまったくないED５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用される投薬形態、及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化しうる。本発明の方法で使用される薬剤については、治療上有効な投与量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。動物実験で測定されたIC５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状の抑制が最大限度の半分に達するワクチン、又は試験化合物の濃度）を達成するように投与量を動物モデルで定式化できる。このような情報は、ヒトに対する有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２４２】
本発明により使用される治療の抗癌活性も、免疫応答性マウスモデル、例えば、マウスEphA2がヒトEphA2で置き換えられたBalb／c、又はC57／B1／6、又はトランスジェニックマウス、ヒトEphA2を発現するように設計されたネズミ腫瘍細胞株が投与されるマウスモデル、以下の第６節で説明されている動物モデル、当業で知られており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Fiebig及びBurger編「抗癌剤開発における腫瘍モデルの重要性」(1999)、Kargerの論文「腫瘍学への貢献」（1999）、Boven及びWinograd編「腫瘍学研究におけるヌードマウス」(1991)、及びTeicher編「抗癌剤開発ガイド」(1997)に記載されている動物モデル（ハムスター、ウサギなどを含む）などの様々な実験動物モデルを癌研究に使用することにより決定することができる。
【０２４３】
治療で使用される化合物は、限定はしないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなども含めて、ヒトで試験する前に、他の好適な動物モデルシステム、例えば上述の動物モデルで試験することができる。その後、適切な臨床試験でそれらの化合物を使用することができる。
さらに、当業者に知られているアッセイを使用して、癌の治療、又は予防のため本明細書で開示されている併用療法の予防及び／又は治療上の効用を評価することができる。
【０２４４】
（５．６．ワクチンの組成）
本発明の組成物は、非医薬組成物（例えば、不純、又は未殺菌組成物）及び単位投薬形態の調製に使用できる医薬組成物（すなわち、対象、又は患者に投与するのに適している組成物）の製造に有用なバルク薬物組成物を含む。このような組成物は、本明細書で開示されている予防、又は治療上有効な量の予防及び／又は治療薬剤、又はそれらの薬剤の組合せ及び薬剤として許容される担体を含む。好ましくは、本発明の組成物は、本発明の予防、又は治療上有効な量の１以上のリステリアに基づくEphA2ワクチンを含む。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンは、１以上のEphA2抗原ペプチド発現リステリア及び薬剤として許容される担体を含むことができる。
特定の一実施態様では、本発明の組成物は、リステリアに基づくEphA2ワクチン、及び追加の予防、又は治療薬剤、例えば、抗癌剤を含む。この実施態様によれば、組成物は、さらに、薬剤として許容される担体を含むことができる。
【０２４５】
特定の一実施態様では、「薬剤として許容される」という言い回しは、動物での使用、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府、又は州政府の監督官庁により承認されているか、又は米国薬局方、又は他の広く認知されている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬がそれとともに投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全、又は不完全な）、又はより好ましくは、カリフォルニア州  エメリービルのChironが販売しているMF59C.1アジュバント）、賦形剤、又は媒体を指す。このような薬剤担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など、石油由来、動物由来、植物由来、又は合成のものを含む、水及び油などの無菌液体とすることができる。水は、薬剤組成物が静脈内に投与される場合に好ましい担体である。食塩水、及びブドウ糖水、及びグリセリン溶液も、液体担体として、特に注射液用に使用することができる。好適な製剤賦形剤は、デンプン、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、必要ならば、少量の湿潤剤、又は乳化剤、又はpH緩衝剤も含有できる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【０２４６】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば、活性薬の量を示しているアンプル、又はサシェなどの密封容器に入れた凍結乾燥粉末、又は無水濃縮物として、別々に、又は単位投薬形態で混ぜ合わせて供給される。組成物を注入により投与する場合、殺菌薬剤グレードの水、又は塩水を入れた輸液ビンで分注できる。組成物を注射により投与する場合、注射用の滅菌水、又は塩水のアンプルを用意し、投与前に成分が混合されるようにできる。
本発明の産生物は、中性型、又は塩型として処方できる。薬剤として許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなど陰イオンにより形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど陽イオンにより形成される塩を含む。
【０２４７】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、EphA2抗原ペプチドを発現できる組み換え型細胞、受容体を介した飲食作用（例えば、Wu、及びWuの論文、1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432を参照）、レトロウイルス、又は他のベクターの一部としての核酸の構築などの、様々な送達システムが知られており、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又は本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンと癌を予防、又は治療するために有用な予防薬剤、又は治療薬剤の組合せを投与するために使用できる。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又はリステリアに基づくEphA2ワクチンと予防、又は治療薬剤との組合せを投与する方法としては、非経口的投与（例えば、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、及び皮下投与)、硬膜外投与、及び粘膜投与(例えば、鼻孔内経路、吸入経路、及び経口経路)があるが、これらに限られるわけではない。特定の一実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又は本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンと予防、又は治療薬剤との組合せは、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与する。本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又は本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンと予防、又は治療薬剤との組合せは、都合のよい経路、例えば、注入、又は静ボーラス注入、上皮細胞層、又は皮膚粘膜細胞層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）を介した吸収により投与することができ、また他の生物活性薬剤とともに投与することもできる。投与は、全身投与でも局所投与でもよい。
【０２４８】
特定の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又は本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンと本発明の予防、又は治療薬剤との組合せの治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいが、これは、例えば、限定はしないが、局所注入、注射、又はインプラントを使って実現でき、前記インプラントはシアラスチック膜などの膜、又は繊維を含む、多孔物質、無孔物質、又はゼラチン様物質である。
【０２４９】
さらに他の実施態様では、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又は本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンと予防、又は治療薬剤との組合せは、制御放出、又は徐放性システムで送達できる。一実施態様では、制御放出、又は徐放を実現するためにポンプを使用することができる（Langerの論文（同上）、Seftonの論文、1987,CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20、Buchwaldらの論文、1980, Surgery 88: 507、Saudekらの論文、1989, N.Engl. J. Med. 321: 574を参照）。他の実施態様では、本発明のEphA2抗原ペプチド発現リステリアの制御放出、又は徐放性を実現するために、ポリマー材料を使用することができる（例えば、Langer及びWise編「制御放出の医療用途」（CRC Pres., Boca Raton, FL （1974））、Smolen及びBall編「調節薬生体利用性、医薬品製剤設計、及び性能」（Wiley, New York（1984））、Ranger、及びPeppasの論文、1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61を参照のこと。Levyetらの論文、1985, Science 228: 190、Duringらの論文、1989, Ann. Neurol. 25: 35、Howardらの論文、1989, J. Neurosurg. 71: 105、米国特許第5,679,377号、第5,916,597号、第5,912,015号、第5,989,463号、第5,128,326号、国際公開第99／15154号及び第99／20253号も参照のこと）。徐放性製剤で使用されるポリマーの実施例は、限定はしないが、ポリ（2-ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン-co-酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（PLA）、ポリ（ラクチド-co-グリコリド）（PLGA）、及びポリオルトエステルを含む。好ましい一実施態様では、徐放性製剤で使用されるポリマーは、不活性であり、滲出しうる不純物を含まず、貯蔵の際に安定しており、無菌であり、生物分解性を有する。さらに他の実施態様では、制御放出、又は持続放出システムは、予防、又は治療標的の近くに置くことができ、そのため、全身投与量のうちのわずかな部分で済む（例えば、Goodsonらの論文、「制御放出の医療用途」前掲、第２巻、115-138(1984)を参照のこと。）
【０２５０】
制御放出システムについては、Langerによる総説(1990, Science 249: 1527-1533)で説明されている。当業者に知られている手法を使用して、本発明の１以上の治療薬剤を含む徐放性製剤を作ることができる。例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,526,938号、国際公開第91／05548号及び第96／20698号、Ningらの論文、1996, Radiotherapy & Oncology 39: 179-189、Songらの論文、1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397、Cleekらの論文、1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854、及びLamらの論文、1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760を参照のこと。
【０２５１】
（５．６．１．製剤）
本発明により使用される薬剤組成物は、１以上の生理的に許容される担体、又は賦形剤を使用して従来の方法で製剤することができる。
そのため、本発明のEphA2抗原ペプチド発現リステリア及びその生理的に許容される塩及び溶媒和物は、吸入、又は吹送（口、又は鼻のいずれかを通して）、又は経口、非経口、又は粘膜（口腔、膣、直腸、舌下など）投与により投与するように製剤できる。好ましい一実施態様では、局所、又は全身非経口的投与が使用される。
【０２５２】
経口投与では、リステリアに基づくEphA2ワクチンは、例えば、結合剤（アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ）、錠剤分解物質（例えば、イモデンプン、又はグリコール酸デンプンナトリウム）、又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬剤として許容される賦形剤とともに従来の手段により調製された錠剤、又はカプセルの形態をとりうる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態をとることができるか、又は乾燥製剤として提供し、使用前に水、又は他の適当な媒体と合わせることができる。このような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化された食用脂）、乳化剤（例えば、レシチン、又はアカシア）、非水溶性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、又は分留された植物油）、及び保存料（例えば、メチル、又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート、又はソルビン酸）などの薬剤として許容される添加物とともに従来の方法で製剤できる。製剤は、さらに、緩衝塩、香料、着色料、及び甘味料を適宜入れることができる。
【０２５３】
経口投与用の製剤は、活性化合物の制御放出を行うように適宜調製することができる。
口腔投与では、組成物は、従来の方法で製剤された錠剤、又はトローチ剤の形態をとりうる。
吸入による投与では、本発明により使用するための予防、又は治療薬剤は、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適なガスを使用し、加圧パック、又はネブライザーからのエアゾールスプレー噴霧の形態で送達することができて都合がよい。加圧型エアゾールの場合、投薬単位は、計った量を送達するため弁を備えることにより決定することができる。吸入器、又は吹送器で使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤でき、これは、化合物と乳糖、又はデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合を含む。
【０２５４】
リステリアに基づくEphA2ワクチンは、注射、例えばボーラス注入、又は連続注入による非経口的投与用に製剤できる。注射用の製剤は、単位投薬形態、保存料を加えて、例えば、アンプル、又は複数投薬容器に用意することができる。組成物は、油性、又は水性媒体の懸濁液、溶液、又はエマルジョンなどの形態をとることができ、また懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含むことができる。それとは別に、活性成分は粉末形態をとり、使用する前に適当な媒体、例えば、発熱物質なしの滅菌水と合わせることができる。
本発明のワクチンは、さらに、ココアバター、又は他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む、座薬、又は保持浣腸剤などの直腸組成物で製剤できる。
【０２５５】
前記の製剤に加えて、予防、又は治療薬剤は、デポー製剤として調合することもできる。このような長時間効果のある製剤は、インプラント（例えば、皮下、又は筋肉）、又は筋肉注射により投与することができる。したがって、例えば、予防、又は治療薬剤は、好適なポリマー、又は疎水性物質（例えば、許容できる油内のエマルジョンとして）、又はイオン交換樹脂とともに、又はやや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として、製剤できる。
本発明は、さらに、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンが数量を示すアンプル、又はサシェなどの密封容器にパッケージされることも規定している。一実施態様では、ワクチンは、乾燥滅菌凍結粉末、又は無水濃縮物として密封容器内に入れて供給され、例えば、対象に投与するために適切な濃度になるまで水、又は塩水を加えて戻すことができる。
【０２５６】
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のワクチンと組み合わせて使用する様々な化学療法、生物学的／免疫療法、及びホルモン療法薬剤の製剤及び投与は、当業では知られており、「医師用卓上参考書」（56版, 2002）に記載されていることが多い。例えば、本発明のいくつかの特定の実施態様では、これらの薬剤は、表３に記載されている通りに製剤し、供給することができる。
本発明の他の実施態様では、放射性同位体などの放射線療法薬剤は、カプセルに入れた液体として、又は飲料として、経口で与えられる。放射性同位体は、静脈注射用に製剤することもできる。熟練癌専門医であれば、好ましい製剤、及び投与経路を決定することができる。
【０２５７】
いくつかの実施態様では、本発明のEphA2抗原ペプチド発現リステリアは、静脈注射用に1 mg／ml、5 mg／ml、10 mg／ml、及び25 mg／mlで製剤され、反復皮下投与及び筋肉注射用に5 mg／ml、10 mg／ml、及び80 mg／mlで製剤される。他の実施態様では、本発明のEphA2抗原ペプチド発現リステリアは、約1×10２CFU／mlから約1×10１２CFU／mlの範囲の量、例えば、1×10２CFU／ml、5×10２CFU／ml、1×10３CFU／ml、5×10３CFU／ml、1×10４CFU／ml、5×10４CFU／ml、1×10５CFU／ml、5×10５CFU／ml、1×10６CFU／ml、5×10６CFU／ml、1×10７CFU／ml、5×10７CFU／ml、1×10８CFU／ml、5×10８CFU／ml、1×10９CFU／ml、5×10９CFU／ml、1×10１０CFU／ml、5×10１０CFU／ml、1×10１１CFU／ml、5×10１１CFU／ml、又は1×10１２CFU／mlで製剤される。
【０２５８】
組成物は、必要ならば、活性成分を含む１以上の単位投薬形態を含むことができるパック、又は分注器装置で提供することができる。パックは、例えば、ブリスター包装などの金属、又はプラスチックホイルを含むことができる。パック、又は分注器装置には、投与方法説明書を添付することができる。
【０２５９】
（５．６．２．投与量）
癌の治療、予防、又は管理に有効な本発明の組成物の量は、標準的な研究技術により決定することができる。例えば、癌の治療、予防、又は管理に有効な本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの投与量は、例えば、本明細書に開示されている、又は当業者に知られている動物モデルなどの動物モデルに組成物を投与することにより決定することができる。さらに、最適な投与量範囲を識別しやすくするために体外アッセイを適宜使用することもできる。
【０２６０】
好ましい有効な投与量の選択は、通常の当業者に知られる複数の要因を考慮することに基づいて当業者が決定することができる（例えば、臨床試験を介して）。このような要因は、治療、又は予防すべき疾病、関与する症状、患者の身体質量、患者の免疫状態、及び投与された薬剤組成の正確さ反映する当業者に知られている他の要因を含む。
製剤で使用される正確な投与量は、投薬の経路、及び癌の深刻度にも左右され、医者の判断、及び患者のそれぞれの状況に応じて決定されなければならない。有効な投与量は、体外、又は動物モデル試験システムで求めた投与量−応答曲線から外挿で推定することができる。
【０２６１】
本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン内のリステリアの投与量に関して、投与量は、コロニー形成単位（c.f.u）の量に基づく。一般に、様々な実施態様において、投与量の範囲は、約1.0 c.f.u.／kgから約1×10１０c.f.u.／kg、約1.0 c.f.u.／kgから約1×10８c.f.u.／kg、約1×10２c.f.u.／kgから約1×10８c.f.u.／kg、及び約1×10４c.f.u.／kgから約1×10８c.f.u.／kgである。有効な投与量は、動物モデル試験システムで求めた投与量−応答曲線から外挿で推定することができる。いくつかの例示的な実施態様では、投与量範囲は、ネズミLD50の0.001倍から10,000倍、ネズミLD50の0.01倍から1,000倍、ネズミLD50の0.1倍から500倍、ネズミLD50の0.5倍から250倍、ネズミLD50の1倍から100倍、及びネズミLD50の5倍から50倍である。いくつかの特定の実施態様では、投与量範囲は、ネズミLD50の0.00.1倍、0.01倍、0.1倍、0.5倍、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、5,000倍、又は10,000倍である。
【０２６２】
患者に投与される他の癌治療薬剤について、当業で知られている様々な癌治療の典型的な投与量は、表３に示されている。本発明を利用する場合、いくつかの好ましい実施態様は、単一薬剤の投与について推奨される投与量よりも少ない、併用治療計画における投与量の投与を包含する。
本発明では、癌の予防、治療、管理、又は改善に有効と以前に考えられている投与量に比べて少ない、知られている予防、又は治療薬剤の投与量を投与する方法を規定する。知られている抗癌治療の少ない投与量を、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの少ない投与量と組み合わせて投与するのが好ましい。
【０２６３】
（５．７．キット）
本発明は、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチン、又は本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの成分を充填された１以上の容器を含むパック、又はキットを提供する。さらに、癌、又は他の過剰増殖性疾患の治療に有用な１以上の他の予防、又は治療薬剤も、このパニック、又はキットに含めることができる。このような（複数の）容器には、医薬品、又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定されている書式で、ヒトへの投与のため製造、使用、又は販売が政府機関により承認されたことを示す通知を適宜関連付けることができる。
【０２６４】
本発明は、上記の方法で使用できるキットを提供する。一実施態様では、キットは、本発明のリステリアに基づくEphA2ワクチンの１つ、又は複数を含む。他の実施態様では、キットは、さらに、癌、又は他の過剰増殖性疾患の治療に有用な１以上の他の予防、又は治療薬剤を１以上の容器に入れて備える。他の実施態様では、予防、又は治療薬剤は、生物療法、又はホルモン療法である。
【実施例】
【０２６５】
(６．実施例：リステリアに基づくEphA2ワクチンは、EphA2発現癌に対する治療、及び予防利点を与える)
受容体チロシンキナーゼEphA2は、様々な悪性細胞型及び腫瘍中で選択的に過剰発現される。さらに最近の研究は、EphA2を認識する患者由来のＴリンパ球を同定している。このように、EphA2は活性免疫療法の非常に必要とされる標的を与える。ここで我々は、グラム陽性通性細胞内細菌リステリアモノサイトゲネス（リステリア）中のヒトEphA2の異所発現は、予防接種済み動物において抗原特異的抗腫瘍応答性を与える可能性があることを示す。リステリアは重要な抗原提示細胞に感染し、それによってコードされている抗原に対する強力かつ確かなCD4+、及びCD8+T細胞応答を誘導するその能力に基づいて、癌療法剤としての有効性をもたらす。野生型菌の抗原送達能力を有し、マウス中で約10,000倍病原性が低い弱毒化リステリア突然変異菌株を使用した。リステリアに基づくEphA2ワクチンの有効性を実証するために、リステリアactA-菌株を工学処理して、ヒトEphA2の細胞外（ECD）、又は細胞内（ICD）ドメイン（actA-hEphA2-ECD、又はactA-hEphA2-ICD）を発現させた。リステリア由来のhEphA2-EX及びCOの発現、及び分泌は、ウェスタンブロット分析によって確認した。actA-hEphA2EXを用いた防御免疫処置は、完全長hEphA2を発現するCT26細胞の皮下増殖を有意に阻害した（p＝0.0037）。対照として、親actA菌株を予防接種したマウスは、賦形剤治療対照マウスと匹敵した腫瘍を発症した。actA-hEphA2 COを用いた防御免疫処置は、RenCA-hEphA2で攻撃したマウスにおいて生存率を有意に増大させた。その後、actA-hEphA2-ECD、又はactA-hEphA2-ICDの治療有効性を、実験CT26-hEphA2肺腫瘍モデルを使用して評価した。腫瘍細胞の静脈内移植の後に、actA、actA-hEphA2EX、又はactA-hEphA2-ICDでBalb／cマウスを免疫処置した。actA-hEphA2-ECD、又はactA-hEphA2-ICDを用いた免疫処置は、対応対照と比較して（賦形剤、又はactAの平均生存期間は、それぞれ19日、及び20日であった）、生存を有意に延長させた（平均生存＞43日、p＝0.0035）。重要なことに、腫瘍移植の後に、huEphA2免疫処置マウスの80％が第43日まで生存した。併せてこれらのデータは、EphA2腫瘍抗原を標的とするリステリア仲介型予防接種は、様々な悪性腫瘍に対する予防及び治療有効性を与えることができることを実証する。
【０２６６】
（６．１．実施例１：リステリアの生活環）
エンドサイトーシス、ファゴリソソーム溶解、及び細胞間の転移のステップを含むリステリアモノサイトゲネスの生活環を、図１Ａ〜１Ｂ中に示す。
【０２６７】
（６．２．実施例２：EphA2発現及び制御リステリア菌株の構築）
（６．２．１．背景）
MHCクラスI経路を介してリステリアが異種抗原の提示を行う機構を考慮すると、異種遺伝子の発現、及び細菌から感染した（抗原提示）細胞の細胞質への新たに合成されたタンパク質の分泌の有効性は、CD8+T細胞初回刺激及び／又は活性化の効力と直接関係がある。Ag特異的T細胞初回刺激のレベルはワクチン有効性と直接関係があるので、異種タンパク質の発現、及び分泌の有効性はワクチン効力と直接関係がある。したがって、EphA2の発現及び分泌の有効性を最適化して、コードされているEphA2タンパク質に特異的なCD8+T細胞応答の初回刺激及び／又は活性化に関して、リステリアに基づくワクチンの効力を最大にした。
【０２６８】
（６．２．２．突然変異リステリア菌株の調製）
リステリア菌株は10403Sに由来した(Bishopらの論文、J. Immunol. 139: 2005 (1987))。示した遺伝子のインフレーム欠失を有するリステリア菌株は、確立している方法を用いたSOE-PCR及び対立遺伝子交換によって作製した(Camilliらの論文、Mol. Microbiol. 8: 143 (1993))。突然変異菌株LLO L461T（DP-L4017）は、参照により本明細書に組み込まれているGlomskiらの論文、J. Cell. Biol. 156: 1029 (2002)中に記載された。actA−突然変異体（DP-L4029）は、そのプロファージを解明した参照によりその全容が本明細書に組み込まれている、Skobleらの論文、J. of Cell Biology、150: 527-537 (2000)中に記載されたDP-L3078菌株である。（プロファージの解明は(Lauerらの論文、J. Bacteriol. 184: 4177 (2002)); 米国特許公報第2003／0203472号中に記載されている)。
【０２６９】
いくつかのワクチンでは、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている、インターナリンＢに関して欠失があるリステリアの突然変異菌株（Genbank受託番号AL591975（リステリアモノサイトゲネス菌株EGD、完全ゲノム、セグメント3／12；inlB遺伝子領域：nts.97008〜98963）、及び／又は、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている、Genbank受託番号NC_003210（リステリアモノサイトゲネス菌株EGD、完全ゲノム、inlB遺伝子領域：nts.457008〜458963）として列挙した配列を使用する。１つの特定のactA−inlB−菌株（DP-L4029inlB）が、2003年10月3日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、受託番号PTA-5562で表された。
【０２７０】
（６．２．３．クローニングベクター）
選択した異種抗原発現カセット分子コンストラクトをpPL2(Lauerらの論文J. Bacteriol. 2002)、又はpAM401(Wirthらの論文、J. Bacteriol. 165: 831-836)中に挿入し、改変してpPL2の多数のクローニング配列（AatII小断片、171bp）を含ませ、テトラサイクリン耐性遺伝子内の平滑XbaI認識部位とNruI認識部位の間に挿入した（pAM401-MCS）。一般に、hlyプロモーター及び（選択した）シグナルペプチド配列を、pPL2、又はpAM401-MCSプラスミドベクター中の特有のKpnI部位とBamHI部位の間に挿入した。選択したEphA2遺伝子（時折改変してN末端及びC末端エピトープタグを含ませた；以下の記載参照）は、これらのコンストラクト中、特有のBamHI部位とSacI部位の間に後にクローニングした。pAM401-MCSプラスミドベクターに基づく分子コンストラクトを、エレクトロポレーションによって選択したリステリアモノサイトゲネス菌株中に導入し、当業者に一般的な方法を使用してリゾチームを用いてさらに処理した。リステリア−トランスフェクタント中の予想プラスミド構造は、制限酵素分析によりクロラムフェニコール含有BHI寒天プレート（10μg／ml）上に形成されたコロニーから、DNAを単離することによって確認した。様々なpAM401-MCS系異種タンパク質発現カセットコンストラクトを用いて形質転換した組換えリステリアを使用して、以下に記載したように異種タンパク質発現、及び分泌を測定した。
【０２７１】
pPL2系異種タンパク質発現カセットコンストラクトを、前に記載されたのと同様の方法(Lauerらの論文、2002, J. Bacteriol. 184: 4177-4186)に従い、選択したリステリア菌株のゲノム中のtRNAArg遺伝子中に組み込んだ。簡潔に言うと、pPL2異種タンパク質発現カセットコンストラクトプラスミドを、エレクトロポレーション、又は化学的手段によって、大腸菌宿主菌株SM10中に最初に導入した(Simonらの論文、1983, Bio／Technology 1: 784-791)。その後pPL2系プラスミドを、形質転換したSM10から選択したリステリア菌株に接合によって移した。記載したのと同様の1 ml当たり7.5μgのクロラムフェニコール、及び1 ml当たり200μgのストレプトマイシンを含む薬剤選択BHI寒天プレート上でのインキュベーションの後、同じ組成でプレート上において３回継代することによって、選択したコロニーを精製する。ファージ結合部位におけるpPL2ベクターの組込みを確認するために、個々のコロニーを採取し、正方向プライマーNC16（5’-gtcaaaacatacgctcttatc-3’）（配列番号４７）と逆方向プライマーPL95（5’-acataatcagtccaaagtagatgc-3’）（配列番号４８）のプライマー対を使用して、PCRによってスクリーニングする。選択したリステリア菌株のゲノム中のtRNAArg遺伝子に組み込まれたpPL2系プラスミドを有する選択したコロニーは、499 bpの診断用DNAアンプリコンを生成した。
【０２７２】
（６．２．４．プロモーター）
リステリオリシンO（LLO）をコードする遺伝子の転写を誘導し、感染細胞のミクロ環境内で活性化される、prfA依存性hlyプロモーターを含む異種タンパク質発現カセット。ヌクレオチド205586〜206000（414bp）を、以下に示すプライマー対を使用してリステリアモノサイトゲネス、菌株DP-L4056からPCRによって増幅させた。この増幅領域はhlyプロモーター、及びsecA1シグナルペプチド（上記）、及びPESTドメインを含むLLOの最初の２８アミノ酸も含む。リステリアモノサイトゲネス、菌株EGDに関するこの領域の予想配列は、GenBankにおいて見ることができる（受託番号：gi｜16802048｜ref｜NC_003210.1｜［16802048］）。
【０２７３】
プライマー対
【０２７４】
正方向（KpnI-LLO nts.1257-1276）：
【０２７５】
5’-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC（配列番号４９）
【０２７６】
逆方向（BamHI-LLO nts.X-x）：
【０２７７】
5’-CTCTGGATCCATCCGCGTGTTTCTTTTCG（配列番号５０）
【０２７８】
（制限エンドヌクレアーゼ認識部位に下線）
【０２７９】
422 bpのPCRアンプリコンを、製造者の仕様書に従いプラスミドベクターpCR-XL-TOPO（カリフォルニア州  カールスバード、Invitrogen）にクローニングした。pCR-XL-TOPO-hlyプロモータープラスミドクローン中の、リステリア特異的塩基のヌクレオチド配列を決定した。リステリアモノサイトゲネス菌株DP-L4056は、EGD菌株と比較して、hlyプロモーター中prfAボックス側面の8個のヌクレオチド塩基の変化を含んでいた。リステリアモノサイトゲネスDP-L4056及びEGD菌株に関するhlyプロモーター配列を、以下の図中に示す（それぞれ配列番号６８及び６９）。
【０２８０】
【化１】
2007509067.tif 000012
【０２８１】
hlyプロモーター及びsecA1 LLOシグナルペプチドに対応する422 bpのDNAを、KpnI及びBamHIを用いた消化によってpCR-XL-TOPO-hlyプロモータープラスミドクローンから遊離させ、当業者によく知られている従来の方法に従いpPL2プラスミドベクターにクローニングした(Lauerらの論文、2002, J. Bact.)。このプラスミドはpPL2−hlyP（天然型）として知られている。
【０２８２】
（６．２．５．選択した組換えリステリアモノサイトゲネス菌株中での発現のための、EphA2のpPL2ベクターへのクローニング及び挿入）
EphA2膜貫通ヘリックスの側面に位置するEphA2の外部（EX2）及び細胞質（CO）ドメインを、様々なpPL2-シグナルペプチド発現コンストラクトへの挿入用に別々にクローニングした。天然型の哺乳動物配列、又はリステリアモノサイトゲネス中でのEphA2 EX2、及びCOドメインの発現用のコドン最適化配列に対応する遺伝子を使用した。20個のアミノ酸それぞれに関するリステリア中の最適コドン（表参照、上記）を、コドン最適化EphA2 EX2及びEphA2 COに使用した。コドン最適化EphA2 EX2及びCOドメインは、当業者に一般的な技法を使用して、重複オリゴヌクレオチドを延長させることによって合成した。すべての合成EphA2コンストラクトの予想配列は、ヌクレオチドの塩基配列決定によって確認した。
【０２８３】
配列番号２３、２１、及び２２は、EphA2のEX2ドメインに関する一次アミノ酸配列、ならびに天然型及びコドン最適化ヌクレオチド配列をそれぞれ表す。
配列番号３４、３２、及び３３は、EphA2のCOドメインに関する一次アミノ酸配列、ならびに天然型及びコドン最適化ヌクレオチド配列をそれぞれ表す。
【０２８４】
さらに、FLAG（カリフォルニア州  ラホーヤ、Stratagene）及びmycエピトープタグを、FLAG、又はタンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析によって発現及び分泌したEphA2を検出するために、合成EphA2 EX2及びCO遺伝子のアミノ末端及びカルボキシ末端にインフレームでそれぞれ挿入した。したがって、発現タンパク質は以下の規則配列要素：NH２-シグナルペプチド-FLAG-EphA2-myc-CO２を有していた。以下に示すのは、FLAG及びmycエピトープタグアミノ酸及びコドン最適化ヌクレオチド配列である。
【０２８５】
FLAG
【０２８６】
5’-GATTATAAAGATGATGATGATAAA（配列番号５１）
【０２８７】
NH２-DYKDDDDK-CO２（配列番号５２）
【０２８８】
Myc
【０２８９】
5’-GAACAAAAATTAATTAGTGAAGAAGATTTA（配列番号５３）
【０２９０】
NH２-EQKLISEEDL-CO２（配列番号５４）
【０２９１】
（６．２．６．ウェスタンブロット分析による合成及び分泌された異種タンパク質の検出）
EphA2タンパク質の合成、及び様々な選択した組換えリステリア-EphA2菌株からの分泌を、トリクロロ酢酸（TCA）沈殿させた細菌培養物流体のウェスタンブロット分析によって測定した。簡潔に言うと、BHI培地中で増殖させた対数中期のリステリアの培養物を50 mLの円錐形遠心分離チューブ中に回収し、細菌をペレット状にし、氷冷TCAを最終［6％］濃度まで細菌培養物の上清に加え、氷上で最低90分あるいは一晩インキュベートした。TCA沈殿タンパク質は、4℃における20分間2400×gでの遠心分離によって回収した。次いでペレットを、15μg／mlのフェノールレッドを含む300〜600μl体積のTE、pH 8.0中に再懸濁させた。攪拌によってサンプルの溶解を容易にした。必要な場合は色がピンクになるまでNH４OHを加えることによって、サンプルのpHを調整した。100μlの4×SDSローディングバッファーを加えることによって、電気泳動用にすべてのサンプルを調製し、90℃で10分間インキュベートした。次いでサンプルをミクロ遠心分離機中において14,000 rpmで5分から遠心分離を施し、上清を回収し-20℃に保存した。ウェスタンブロット分析用に、20μlの調製分画（1〜4×10９個の細菌由来の培養流体の相当物）を4〜12％のSDS-PAGEゲル上に載せ、電気泳動を施し、当業者によって使用される一般的な方法に従いタンパク質をPDDF膜に移した。攪拌しながら室温で２時間の5％乾燥乳を溶かしたPBS中でのインキュベーションによる、抗体とのインキュベーション用に移動膜を調製した。PBSTバッファー（0.1％Tween20、PBS中）中に以下の希釈で抗体を使用した：（１）1：10,000でウサギ抗Mycポリクローナル抗体（ICL研究室、Newberg、Oregon）；（２）1：2,000でネズミ抗FLAGモノクローナル抗体（Stratagene、上記）；及び、（３）ウサギ抗EphA2（カルボキシ末端特異的）ポリクローナル抗体（sc-924、カリフォルニア州  サンタクルーズ、Santa Cruz Biotechnology,Inc.）。抗体とタンパク質標的の特異的結合は、ホースラッディッシュペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギ、又は抗マウス抗体との二次インキュベーションによって評価し、ECL化学発光アッセイキット（Amersham）を用いて検出し、フィルムに曝した。
【０２９２】
（６．２．７．様々な形のEphA2をコードする組換えリステリアによるEphA2タンパク質の分泌）
（６．２．７．１．リステリア：［菌株DP-L4029（actA）、又はDP-L4017（LLOL461T）］）
【０２９３】
発現カセットコンストラクト：LLOss-PEST-CO-EphA2（配列番号３５）
【０２９４】
EphA2 COドメインの天然型配列を天然型secA1 LLO配列と遺伝子工学により融合させて、異種抗原発現カセットをリステリアhlyプロモーターの制御下で、記載したのと同様に（上記）pPL2プラスミド中、KpnI部位とSacI部位の間に挿入した。pPL2-EphA2プラスミドコンストラクトを、記載したのと同様に（上記）リステリア菌株DP-L4029（actA）及びDP-L4017（L461T LLO）への接合によって導入した。図２は、4029-EphA2 CO及び4017-EphA2 COのTCA沈殿させた細菌培養物流体の、ウェスタンブロット分析の結果を示す。この分析は、secA1、及びEphA2 CO融合タンパク質に対応する天然型配列から構成される異種タンパク質発現カセットを含むように工学処理した組換えリステリアは、52 kDaの予想分子量より小さい多数のEphA2特異的断片を分泌したことを実証し、発現カセットの修飾に関する必要性を実証した。
【０２９５】
（６．２．７．２．リステリア：［DP-L4029（actA）］）
発現カセットコンストラクト：
天然型LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-コドンOp（配列番号２６）
（コドンOp）LLOss-PEST-（コドンOp）FLAG-EX2_EphA2-myc（配列番号２８）
【０２９６】
天然型secA1 LLOシグナルペプチド配列、又はリステリア中での発現用にコドン最適化したsecA1 LLOシグナルペプチド配列を、リステリア中での発現用にコドン最適化したEphA2 EX2ドメイン配列と遺伝子工学により融合させて、異種抗原発現カセットをリステリアhlyプロモーターの制御下で、記載したのと同様に（上記）pPL2プラスミド中、KpnI部位とSacI部位の間に挿入した。pPL2-EphA2プラスミドコンストラクトを、記載したのと同様に（上記）リステリア菌株DP-L4029（actA）への接合によって導入した。図３は、コドン最適化EphA2 EX2ドメインと融合した天然型、又はコドン最適化secA1 LLOシグナルペプチドをコードするリステリアactAのTCA沈殿させた細菌培養物流体の、ウェスタンブロット分析の結果を示す。この分析は、リステリアモノサイトゲネス中での好ましいコドンの使用のために最適化した、シグナルペプチド及び異種タンパク質の配列を組み合わせて使用することによって、予想した完全長EphA2 EX2ドメインタンパク質の発現がもたらされたことを実証した。完全長EphA2 EX2ドメインタンパク質の発現は、EphA2コード配列のみのコドン最適化に関して乏しかった。異種タンパク質発現（断片、又は完全長）のレベルは、リステリアモノサイトゲネス中での発現用にコドン最適化したリステリアモノサイトゲネスLLOsecA1シグナルペプチドを使用したとき最高であった。
【０２９７】
（６．２．７．３．リステリア：［DP-L4029（actA）］）
発現カセットコンストラクト：
天然型LLOss-PEST-（コドンOp）FLAG-EphA2_CO-myc（配列番号３７）
コドンOpLLOss-PEST-（コドンOp）FLAG-EphA2_CO-myc（配列番号３９）
コドンOpPhoD-（コドンOp）FLAG-EphA2_CO-myc（配列番号４１）
【０２９８】
天然型secA1 LLOシグナルペプチド配列、又はリステリア中での発現用にコドン最適化したsecA1 LLOシグナルペプチド配列、あるいは代替的に、リステリア中での発現用にコドン最適化したバシラスサブチリス由来のphoD遺伝子のTatシグナルペプチドを、リステリア中での発現用にコドン最適化したEphA2 COドメイン配列と遺伝子工学により融合させて、異種抗原発現カセットをリステリアhlyプロモーターの制御下で、記載したのと同様に（上記）pAM401-MCSプラスミド中、KpnI部位とSacI部位の間に挿入した。pAM401-EphA2プラスミドコンストラクトは、記載したのと同様に（上記）リステリア菌株DP-L4029（actA）へのエレクトロポレーションによって導入した。図４は、天然型、又はコドン最適化secA1 LLOシグナルペプチド、又はコドン最適化EphA2 COドメインと融合したコドン最適化バシラスサブチリスphoD TatシグナルペプチドをコードするリステリアactAのTCA沈殿させた細菌培養物流体の、ウェスタンブロット分析の結果を示す。この分析は、リステリアモノサイトゲネス中での好ましいコドンの使用のために最適化した、シグナルペプチド及び異種タンパク質の配列を組み合わせて使用することによって、予想した完全長EphA2 COドメインタンパク質の発現がもたらされたことを再度実証した。さらに、コドン最適化EphA2 COドメインと融合したコドン最適化バシラスサブチリスphoD Tatシグナルペプチドをコードする組換えリステリアから生じた、予想した完全長EphA2 COドメインタンパク質の発現及び分泌。この結果は、異なる細菌種由来のシグナルペプチドを使用して、組換えリステリアからの異種タンパク質の分泌を行うことができるという、新規かつ予想外の発見を実証する。完全長EphA2 COドメインタンパク質の発現は、EphA2配列のみのコドン最適化に関して乏しかった。異種タンパク質発現のレベルは、リステリアモノサイトゲネス中での発現用にコドン最適化したシグナルペプチドを使用したとき最高であった。
【０２９９】
（６．２．８．AH1／OVA、又はAH1-A5／OVAを発現するリステリア菌株の構築）
切断形のモデル抗原卵白アルブミン（OVA）を発現する突然変異リステリア菌株、AH1（SPSYVYHQF）（配列番号５５）として知られるマウス結腸直腸癌（CT26）由来の免疫優性エピトープ、及び改変型エピトープAH1-A5（SPSYAYHQF（配列番号５６）；Slanskyらの論文、2000, Immunity, 13: 529-538）を調製した。pPL2組込みベクター(Lauerらの論文、J. Bacteriol.184: 4177 (2002); 米国特許公報第2003／0203472号)を使用して、リステリアゲノムの無毒部位に組み込まれた１つのコピーを含む、OVA、及びAH1-A5／OVA組換えリステリア菌株を誘導した。
【０３００】
（６．２．９．OVA発現リステリア（DP-L4056）の構築）
切断型OVAと融合しpPL2組込みベクター（pPL2／LLO−OVA）中に含まれる、溶血素欠失LLOからなる抗原発現カセットを最初に調製する。リステリアOVAワクチン菌株は、PSA（ScottA由来ファージ）結合部位tRNAＡｒｇ-attBB’にファージ治療L.モノサイトゲネス菌株DP-L4056中にpPL2／LLO−OVAを導入することによって誘導する。
【０３０１】
以下の鋳型、及びプライマーを使用することによって、PCRを使用して溶血素欠失LLOを増幅させる。
供給源：DP-L4056ゲノムDNA
プライマー：
正方向（KpnI-LLO nts.1257〜1276）：
5’-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC（配列番号５７）
（Tｍ：LLO-spec：52℃  全体：80℃）
逆方向（BamHI-XhoI-LLO nts.2811〜2792）：
5’-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC（配列番号５８）
（Tｍ：LLO-spec：52℃  全体：102℃）
【０３０２】
以下の鋳型及びプライマーを使用することによって、PCRを使用して切断型OVAも増幅させる。
供給源：DP-E3616大腸菌由来のpDP3616プラスミドDNA(Higginsらの論文、Mol. Molbiol. 31: 1631-1641 (1999))。
プライマー：
正方向（XhoI-NcoIOVA cDNA nts.174〜186）：
5’-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC（配列番号５９）
（Tｍ：OVA-spec：60℃  全体：88℃）
逆方向（XhoI-NotI-HindIII）：
5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT（配列番号６０）
（Tｍ：全体：82℃）
【０３０３】
構築法を実施するための１つのプロトコルは、KpnI及びBamHIを用いてLLOアンプリコンを最初に切断すること、及びKpnI／BamHIベクターをpPL2ベクター（pPL2-LLO）中に挿入することを含む。次いでOVAアンプリコンをXhoI及びNotIで切断し、XhoI／NotIで切断したpPL2-LLO中に挿入する。（注：pPL2ベクターはいかなるXhoI部位も含まず；pDP-3616は１つのXhoI部位を含み、これはOVA逆方向プライマーの設計において利用する）コンストラクトpPL2／LLO−OVAは、制限酵素分析（KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI）、及び塩基配列決定によって確認する。プラスミドpPL2／LLO−OVAは形質転換によって大腸菌中に導入し、次にLauerらの論文に記載されたのとまったく同様に（あるいは他の望ましいリステリア菌株中に）、接合によってリステリア（DP-L4056）中に導入し組み込む。
【０３０４】
（６．２．１０．AH1／OVA、又はAH1-A5／OVAを発現するリステリア菌株の構築）
AH1／OVA、又はAH1-A5／OVA抗原配列のいずれかを発現するリステリアを調製するために、その抗原を有する挿入体をオリゴヌクレオチドから最初に調製し、次いでベクターpPL2-LLO-OVA（前に記載したのと同様に調製したもの）に連結させる。
【０３０５】
以下のオリゴヌクレオチドを、AH1、又はAH1-A5挿入体の調製において使用する。
AH1エピトープ挿入体（ClaI-PstI適合端）：
上部鎖オリゴ（AH1上部）：
5’-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA（配列番号６１）
底部鎖オリゴ（AH1底部）：
5’-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT（配列番号６２）
AH1-A5エピトープ挿入体（ClaI-AvaII適合端）：
【０３０６】
AH1-A5エピトープの配列は、SPSYAYHQF（配列番号５６）（5’-AGT CCA AGT Tat GCA Tat CAT CAA TTT-3’）（配列番号６３）である。
上部：5’-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC（配列番号６４）
底部：5’-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT（配列番号６５）
【０３０７】
所与のエピトープのオリゴヌクレオチド対を等モル比で１つに混合し、5分間95℃で加熱する。次いでオリゴヌクレオチド混合物を、ゆっくりと冷却する。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対は、関連制限酵素を用いた消化によって作製したpPL2−LLO／OVAプラスミドと、200対1のモル比で次いで連結させる。新しいコンストラクトの同一性は、制限酵素分析及び／又は塩基配列決定によって確認することができる。
次いでプラスミドは形質転換によって大腸菌中に導入し、次にLauerらの論文によって記載されたのとまったく同様に接合によりリステリア（DP-L4056）中、あるいはactA−突然変異菌株（DP-L0429）、LLO L461T菌株（DP-L4017）、又はactA-／inlB-菌株（DP-L4029inlB）などの他の望ましいリステリア菌株中に導入し組み込むことができる。
【０３０８】
（６．３．実施例３：ヒトEphA2を発現するネズミ腫瘍細胞系の作製）
（６．３．１．背景）
マウス免疫療法モデルを、本発明のリステリアに基づくワクチンを試験するために作製した。３つのネズミ腫瘍細胞系、CT26ネズミ結腸癌細胞系、B16F10ネズミメラノーマ細胞系、及びRenCaネズミ腎細胞癌細胞系を作製して、高レベルのhuEphA2タンパク質を発現させた。FACS細胞選別アッセイを行って、高レベルのhuEphA2を発現するCT26、B16F10、及びRenCa腫瘍細胞を同定し、これらを集めてウェスタンブロット分析によって分析した。FACS細胞選別によりクローンをさらに集めて、高レベルのhuEphA2を発現するサブクローンを作製した。
【０３０９】
（６．３．２．高レベルのhuEphA2を発現するCT26ネズミ結腸癌細胞の選択）
（６．３．２．１．Lipofectamine（商標）を用いるトランスフェクションアッセイ）
製造者の指示書に従い標準的なトランスフェクション技法及び市販のLipofectamine（商標）を使用して、huEphA2を含むコンストラクトを用いてCT26細胞を形質移入した。
【０３１０】
（６．３．２．２．フローサイトメトリー（FACS）分析）
単細胞FACS選別アッセイを標準的技法によって行って、高レベルのヒトEphA2を発現するCT26ネズミ癌腫瘍細胞を同定した。
図５は、EphA2-3クローンが最高レベルのヒトEphA2タンパク質を発現したことを示す、例示的実験を示す。
【０３１１】
（６．３．２．３．高レベルのhuEphA2を発現する、集めた個体群のウェスタンブロット）
標準的技法を使用してウェスタンブロットも行って、huEphA2遺伝子を含む様々なコンストラクトを用いて形質移入した細胞の集めた個体群のFACS選別の後に、CT26細胞中でのヒトEphA2タンパク質発現のレベルを測定した。図６は、例示的実験の結果を示す。試験した様々なクローンと比較すると、huEphA2-3クローンが最高レベルのヒトEphA2タンパク質を発現し、以下に記載したin vivoでの有効性試験用に選択した。細胞をさらに集めて、高レベルのhuEphA2を発現するサブクローンを作製した。
【０３１２】
（６．３．３．高レベルのhuEphA2を発現するB16F10ネズミメラノーマ細胞の選択）
（６．３．３．１．レトロウイルス形質導入）
ヒトEphA2を、レトロウイルス形質導入法によりB16F10ネズミメラノーマ細胞中に導入して、高レベルのタンパク質を発現するクローンを作製した。
【０３１３】
（６．３．３．２．フローサイトメトリー（FACS）分析）
CT26細胞に行ったのと同様に、単細胞FACS選別アッセイを、標準的技法によってhuEphA2を発現するB16F10細胞に行って、高レベルのhuEphA2を発現するクローンを作製した。最高レベルのhuEphA2を発現するクローンを集め、ウェスタンブロット分析によってさらに調べた。例示的なFACS実験を図７中に示し、高レベルのhuEphA2を発現するB16F10サブクローンが示される。
【０３１４】
（６．３．３．３．高レベルのhuEphA2を発現する、集めた個体群のウェスタンブロット）
前に記載したのと同様にウェスタンブロットも行って、レトロウイルス形質導入によって導入されたhuEphA2遺伝子を含む細胞の集めた個体群のFACS選別の後に、B16F10細胞中でのhuEphA2タンパク質発現のレベルを測定した。細胞をさらに集めて、高レベルのhuEphA2を発現するサブクローンを作製した。
【０３１５】
（６．３．４．高レベルのhuEphA2を発現するRenCaネズミ腎細胞癌細胞の選択）
（６．３．４．１．Lipofectamine（商標）を用いるトランスフェクションアッセイ）
製造者の指示書に従い標準的なトランスフェクション技法及び市販のLipofectamine（商標）を使用して、huEphA2を含むコンストラクトを用いてRenCa細胞を形質移入した。
【０３１６】
（６．３．４．２．フローサイトメトリー（FACS）分析）
単細胞FACS選別アッセイを標準的技法によって行って、高レベルのヒトEphA2を発現するRenCa腎細胞癌腫瘍細胞を同定した。
【０３１７】
（６．３．４．３．高レベルのhuEphA2を発現する、集めた個体群のウェスタンブロット）
標準的技法を使用してウェスタンブロットも行って、huEphA2遺伝子を含む様々なコンストラクトを用いて形質移入した細胞の集めた個体群のFACS選別の後に、RenCa細胞中でのヒトEphA2タンパク質発現のレベルを測定した。細胞をさらに集めて、高レベルのhuEphA2を発現するサブクローンを作製した。
【０３１８】
（６．３．５．完全長EphA2をコードするpCDNA4プラスミドを用いた293細胞のトランスフェクション）
【０３１９】
発現カセットコンストラクト：
【０３２０】
pCDNA4-EphA2
【０３２１】
天然型完全長EphA2遺伝子を、真核生物CMVプロモーター系発現プラスミドpCDNA4（カリフォルニア州  カールスバード、Invitrogen）にクローニングした。図８は、pCDNA4-EphA2プラスミドを用いて形質移入した293細胞から調製した溶解物のウェスタンブロット分析の結果を示し、哺乳動物細胞中での完全長EphA2タンパク質の多量の発現を実証する。
【０３２２】
（６．４．実施例４：予防接種後の抗原特異的免疫応答の評価）
本発明のワクチンは、様々なin vitro、及びin vivo法を使用して評価することができる。いくつかのアッセイは、予防接種したマウスの脾臓由来の抗原特異的T細胞の分析を含む。例えばC57B1／6、又はBalb／cは、OVA（又は他の適切な抗原）を発現するリステリア菌株の0.1 LD50の静脈内注射によって予防接種する。予防接種後第7日で、脾臓を氷冷RPMI 1640培地中に置き、そこから単細胞懸濁液を調製することによって、マウスの脾細胞を採取する（典型的には一群当たり3匹のマウス）。代替法として、マウスのリンパ節を同様に採取し、単細胞懸濁液として調製し、以下に記載するアッセイにおいて脾細胞の代わりとすることができると思われる。典型的には、脾細胞はワクチンの静脈内、又は腹膜内投与用に評価し、一方脾細胞、及びリンパ節由来の細胞はワクチンの筋肉内、皮下、又は皮内投与用に評価する。
他に示さない限り、これらの実験で使用したすべての抗体は、カリフォルニア州サンディエゴ、Pharmingenから入手することができる。
【０３２３】
（６．４．１．ELISPOTアッセイ）
一例としてOVA抗原を有するリステリア菌株を使用して、マウスモデルにおける免疫処置によって生じた抗原特異的T細胞の定量頻度を、ELISPOTアッセイを使用して評価する。評価した抗原特異的T細胞は、OVA特異的CD8+、又はLLO特異的CD8+、又はCD4+T細胞である。このOVA抗原モデルは、ワクチンに挿入した異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、当該の任意の抗原に置き換わることができると思われる。LLO抗原はリステリアに特異的である。特異的T細胞は、特異的抗原の認識によるサイトカイン放出（例えばIFN-γ）を検出することによって評価する。PVDF系96ウェルプレート（カリフォルニア州サンノゼ、BD Biosciences）を、抗ネズミIFN-γモノクローナル抗体（mAbR4；5μg／ml）で4℃において一晩コーティングする。プレートは洗浄し、200μLの完全RPMIを用いて室温で２時間ブロッキングする。予防接種済みマウス（又は非予防接種対照マウス）由来の脾細胞をウェル当たり2×10５個の細胞で加え、0.01〜10μMの範囲の様々な濃度のペプチドの存在下で37℃において20〜22時間インキュベートする。OVA及びLLO用に使用するペプチドは、SL8、OVAのMHCクラスIエピトープ、LLO１９０（NEKYAQAYPNVS、Invitrogen）、リステリオシンOのMHCクラスIIエピトープ（リステリア抗原）、LLO２９６（VAYGRQVYL）、リステリオシンOのMHCクラスIエピトープ、又はLLO９１（GYKDGNEYI）、リステリオシンOのMHCクラスIエピトープのいずれかである。LLO１９０及びLLO２９６はC57B1／6モデルにおいて使用し、一方LLO９１はBalb／cモデルにおいて使用する。洗浄後、0.5μg／mlまでPBSに希釈したIFN-γ（XMG 1.2）に特異的な二次ビオチン化抗体とともに、プレートをインキュベートする。2時間の室温でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、1％ BSAを含むPBSに希釈した1 nmの金ヤギ抗ビオチン複合体（GAB-1；1：200希釈；カリフォルニア州レディング、Ted Pella）とともに、37℃において1時間インキュベートする。完全に洗浄した後、スポットを増大させるために基質（Silver Enhancingキット；30 ml／ウェル；Ted Pella）とともに、2〜10分間室温でプレートをインキュベートする。次いでプレートを蒸留水ですすぎ、基質反応を停止させる。プレートを空気乾燥させた後、それぞれのウェル中のスポットを、自動ELISPOTプレートリーダー（オハイオ州  クリーブランド、CTL）を使用して数える。サイトカイン応答は、OVA特異的T細胞、又はリステリア特異的T細胞のいずれかに関する、2×105の脾細胞当たりのIFN-γスポット形成細胞（SFC）の数として表す。
【０３２４】
（６．４．２．細胞内サイトカイン染色アッセイ（ICS）：）
抗原特異的CD8+、又はCD4+T細胞の数をさらに評価し、その結果とELISPOTアッセイから得た結果を関連付けるために、ICSを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。予防接種及び対照群のマウス由来の脾細胞を、Brefeldin A(Pharmingen）の存在下で5時間、SL8（OVA特異的CD8+細胞を刺激する）、又はLLO１９０（LLO特異的CD4+細胞を刺激する）とともにインキュベートする。Brefeldin Aは、T細胞を刺激することによって生成するサイトカインの分泌を阻害する。無関係なMHCクラスIペプチドとともにインキュベートした脾細胞は、対照として使用する。PMA（ホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート、Sigma）20 ng／ml及びイノマイシン（Sigma）2μg／mlで刺激した脾細胞は、IFN-γ、及びTNF-α細胞内サイトカイン染色の陽性対照として使用する。細胞質サイトカイン発現を検出するために、細胞はFITC抗CD4 mAb（RM4-5）及びPerCP抗CD8 mAb（53-6.7）で染色し、Cytofix／CytoPerm溶液（Pharmingen）で固定及び浸透処理し、氷上で30分間ＰＥ複合抗TNF-α mAb（MP6-XT22）、及びAPC複合抗IFN-γ mAb（XMG 1.2）で染色する。細胞内IFN-γ及び／又はTNF-αを発現する細胞の割合は、フローサイトメトリー（FACScalibur、カリフォルニア州マウンテンビュー、Becton Dickinson）によって測定し、CELLQuestソフトウェア（Becton Dickinson Immunocytometry Systeｍ）を使用してデータを分析した。様々な抗体上の蛍光標識は、いずれもFACScaliburによって区別することができるので、抗IFN-γ、又は抗TNF-αの片方、又は両方で染色したCD8+及びCD4+の進入によって、適切な細胞を同定する。
【０３２５】
（６．４．３．刺激した脾細胞のサイトカイン発現）
マウスの脾細胞によるサイトカイン分泌のレベルは、対照、及び予防接種C57B1／6マウスに関して評価することもできる。脾細胞は、SL8、又はLLO１９０で24時間刺激する。無関係なペプチドHSV-gB２（Invitrogen、SSIEFARL）による刺激は、対照として使用する。刺激した細胞の上清を回収し、Tヘルパー1及びTヘルパー2サイトカインのレベルは、ELISAアッセイ（eBiosciences、CO）、又はCytometric Bead Arrayキット（Pharmingen）を使用して測定する。
【０３２６】
（６．４．４．サイトカインT細胞の活性の評価）
OVA特異的CD8+T細胞は、in vitroあるいは直接in vivoでのC57B1／6マウス中での、それらの細胞毒性活性を評価することによってさらに評価することができる。CD8+T細胞は、抗原特異的な方法でそのそれぞれの標的細胞を認識し溶解させる。In vitroでの細胞毒性は、クロム放出アッセイを使用して測定する。非投薬及びリステリアOVA（内標準）予防接種マウスの脾細胞は、放射線照射EG7.OVA細胞（OVAを発現させるために形質移入したEL-4腫瘍細胞系、バージニア州  マナサス、ATCC）、又は100 nMのSL8を用いて10：1の割合で刺激して、脾細胞個体群中のOVA特異的T細胞を増殖させる。培養７日後に、エフェクター細胞の細胞毒性活性を、EG7.OVA、又はSL8刺激EL-4細胞（バージニア州マナサス、ATCC）を標的細胞として、及び陰性対照としてEL-4細胞のみを使用して、標準的な4時間の５１Cr-放出アッセイにおいて測定する。YAC-1細胞系（バージニア州  マナサス、ATCC）は標的として使用して、NK細胞の活性を測定し、T細胞による活性とNK細胞による活性を区別する。特異的な細胞毒性の比率は、100×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）として計算する。自発的放出は、エフェクター細胞なしで標的細胞をインキュベートすることによって測定する。最大放出は、0.1％のTriton X-100を用いて細胞を溶かすことによって測定する。自発的放出が最大放出の20％未満である場合、分析に関して実験は有効であるとみなす。
【０３２７】
in vivoでのOVA特異的CD8+T細胞の細胞毒性活性を評価するために、非投薬C57B1／6マウス由来の脾細胞を2つの均等な等分試料に分ける。それぞれの群は特異的ペプチド、37℃において90分間0.5μg／mlで、標的（SL8）、又は対照（HSV-gB２）を用いて刺激する。次いで細胞は培地中で3回洗浄し、PBS+0.1％BSA中で2回洗浄する。カルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジルエステル（CFSE、オレゴン州  ユージーン、Molecular Probes）で標識するために、温かいPBS+0.1％BSA（10 ml以下）中に1 ml当たり1×10７で細胞を再懸濁させる。標的細胞の懸濁液に、1.25μLの5 mMのCFSEストックを加え、攪拌によってサンプルを混合する。対照細胞の懸濁液に、10倍希釈のCFSEストックを加え、攪拌によってサンプルを混合する。細胞は37℃で10分間インキュベートする。多量（＞40 ml）の氷冷PBSを加えることによって、染色を停止させる。細胞はPBSを用いて室温で２回洗浄し、次いで再懸濁させ計数する。それぞれの細胞懸濁液は50×10６／mlに希釈し、100μLのそれぞれの群は混合させ、非投薬、又は予防接種マウスの尾部静脈を介して注射する。12〜24時間後、脾臓を採取し、合計5×10６個の細胞をフローサイトメトリーによって分析する。高い（標的）及び低い（対照）蛍光ピークを列挙し、その２つの比を使用して、標的細胞溶解の比率を確定する。in vivo細胞毒性アッセイによって、in vitroでの再刺激の必要なしで抗原特異的T細胞の溶解活性を評価することができる。さらに、このアッセイはその天然環境におけるT細胞の機能を評価する。
【０３２８】
（６．５．実施例５：in vivoでのEphA2の有効性試験）
（６．５．１．背景）
ヒトEphA2の細胞外ドメイン（ED）を発現するCT26腫瘍細胞を接種したマウスにおいて有効性試験を行って、huEphA2の抗腫瘍効果を特徴付けした。測定した終点は、腫瘍接種後のマウスの腫瘍体積、及び生存率であった。接種経路は皮下（s.c.）、及び静脈内（i.v.）であった。HBSS及びリステリアを、対照として投与した。
【０３２９】
（６．５．２．AH1-A5発現リステリアを用いた対照の予防接種）
Balb／cマウス（n＝5）を、1×10５個のCT26細胞の静脈内注射後3日間0.1 LD５０リステリアで免疫処置した。図９Ａは、AH1-A5を発現するリステリアを用いた治療免疫処置は、接種動物の生存率を増大させることを実証する。図９Ｂは、実験用マウスの肺を細胞接種後第19日に採取し固定した、別個ではあるが他は等しい実験の結果を示す。肺結節の全体的評価も行って、リステリア対照を与えた対照動物と比較して、リステリア-AH1／A5を与えた試験動物の肺中に腫瘍が存在しないことを実証した。
【０３３０】
（６．５．３．予防的なEphA2の予防接種）
６．５．３．１．huEphA2のECDを発現するリステリアを用いた免疫処置の、CT26-hEphA2腫瘍の増殖及び生存に対する影響
前に記載した単細胞FACSアッセイによって生成させた、huEphA2を発現する一群のCT26細胞を使用して、予防試験を行った。ヒトEphA2で形質移入したCT26結腸癌細胞（「CT26-hEphA2」）を、一群当たり10匹のBalb／cマウスである群には皮下接種し、一群当たり5匹のBalb／cマウスである群には静脈内接種した。0.1 LD５０リステリア対照、又は200μlのボーラス中でhEphA2のECDを発現するリステリアを用いて、マウスを免疫処置した。CD26の皮下接種に関する試験用に、AH1／A5リステリアを陽性対照として使用した。CT26-hEphA2腫瘍攻撃前14日及び4日に、免疫処置を行った。腫瘍体積の測定値は試験の行程中1週間に2回得て、予防接種の抗腫瘍効果を測定した。
【０３３１】
図１０Ａは、陰性対照（＊p＝0.0012）と比較した、huEphA2発現CT26細胞の皮下接種に対するhEphA2のECDを発現するリステリアの抗腫瘍有効性を実証する。そのデータは以下の表８中に要約する。
【０３３２】
【表８】
2007509067.tif 000013
【０３３３】
図１０Ｂは、陰性対照（＊p＝0.0017）と比較した、huEphA2発現CT26細胞の静脈内接種に対するhEphA2のECDを発現するリステリアの抗腫瘍有効性を実証する。そのデータは以下の表９中に要約する。
【０３３４】
【表９】
2007509067.tif 000014
【０３３５】
以下に記載したスケジュールに従い、予防試験を行った。これらの試験は、前に記載した単細胞FACSアッセイによって生成させた、huEphA2を発現する一群のCT26細胞を使用した。
群：一群当たり10匹のマウスの8群。以下の表１０に示すように、ヒトEphA2で形質移入したCT26結腸癌細胞を、群1〜4には皮下接種し、群5〜8には静脈内接種した。
【０３３６】
【表１０】
2007509067.tif 000015
【０３３７】
スケジュール：動物には第0日及び第10日に200μlのボーラスで前に列挙した物質を静脈内投与した。第14日には動物に、ヒトEphA2で形質移入したCT26結腸癌細胞（L4029EphA2-exFlag）、リステリア対照（L4029）、又はAH1タンパク質を含むリステリア陽性対照（L4029-AH1）（100μl体積中に5×10５個の細胞）を、皮下、又は静脈内（実験的肺転移モデル）接種した。腫瘍体積は隔週で測定し（皮下接種のみ）、動物の重量は１週間単位で測定した。2000 mm３より大きい腫瘍を有するか、あるいは罹患の徴候（曲がった姿勢、乱れた呼吸、運動性の低下、20％を超える体重の損失など）を示す任意の動物を、人道的に安楽死させた。実験スケジュールを下記表１１中に要約する。
【０３３８】
【表１１】
2007509067.tif 000016
【０３３９】
この試験では、リステリアhuEphA2 exFlagを用いた予防接種は、皮下、及び実験的肺転移モデル（静脈内）において有意な抗腫瘍効果を示した。皮下モデルでは、腫瘍増殖の有意な低下を得て、３匹のマウスは腫瘍がない状態であった。対照リステリア及び賦形剤治療動物と比較して、この応答も特異的であった。実験的肺転移モデルでは、リステリアhuEphA2 exFlagを用いた予防接種は、賦形剤治療群と比較して有効性も示した。
【０３４０】
図１１Ａ〜１１Ｄは、予防実験の結果を示す。図１１Ａは、第21日で開始し接種後第32日まで続けると、huEphA2のECDを発現するCT26細胞を接種したマウスの腫瘍体積は、賦形剤（HBSS）、リステリア（L4029）及びリステリア陽性（L4029-AH1）対照と比較すると有意に減少したことを示す。図１１Ｂも予防実験の結果を示し、第21日で開始し接種後第32日まで続けると、huEphA2のECDを発現するCT26細胞（L4029-EphA2exFlag）を接種したマウスの腫瘍体積は、リステリア（L4029）対照と比較すると有意に減少したことを再度示す。図１１Ｃは、CT26腫瘍細胞接種後のマウスの生存率を測定した、皮下モデルにおける予防実験の結果を示す。全対照群と比較すると、L4029-EphA2exFlag群は最も有意な生存率を有していた（三角形によって示す）。図１１Ｄは、腫瘍細胞接種後のマウスの生存率を測定した、肺転移モデルにおける予防実験の結果を示す。全対照群と比較すると、L4029-EphA2exFlag群は最も有意な生存率を有していた。
前述のデータは、huEphA2のECDを発現するリステリアを用いた予防免疫処置はCT26-hEphA2腫瘍の増殖を抑制し、生存率を増大させることを実証する。
【０３４１】
（６．５．３．２．huEphA2のICDを発現するリステリアを用いた免疫処置の、RenCa-hEphA2を接種したマウスの生存に対する影響）
前に記載した方法によって生成させスクリーニングした、huEphA2を発現する一群のRenCa細胞（バージニア州  マナサス、American Type Culture Collection）を使用して、予防試験を行った。一群当たり10匹のBalb／cマウスである群には、ヒトEphA2を発現するRenCa腎臓細胞癌細胞（「RenCahEphA2細胞」）を皮下接種した。0.1LD50リステリア対照、又は200 mlのボーラス中でhEphA2のICDを発現するリステリアを用いて、マウスを免疫処置した。RenCa-hEphA2細胞の腫瘍攻撃前18日及び4日に、免疫処置を行った。腫瘍体積の測定値は試験の行程中１週間に2回得て、予防接種の抗腫瘍効果を測定した。
【０３４２】
図１２は、陰性対照と比較した、huEphA2発現RenCA細胞の皮下接種に対するhEphA2のICDを発現するリステリアの抗腫瘍有効性を実証する。カプラン−マイヤー分析による増大した生存率によって評価した有意な抗腫瘍応答は、リステリアのみを予防接種した動物と比較して（＊p＝0.0079）、hEphA2のICDを発現するリステリアを予防接種した動物において観察した。
【０３４３】
（６．５．４．治療的なEphA2の予防接種）
前に記載した単細胞FACSアッセイによって生成させた、huEphA2を発現する一群のCT26細胞を使用して、治療試験を行った。
例示的な治療試験を以下のように行った。
群：一群当たり10匹のマウスの6群。以下の表１２に示すように、CT26ネズミ結腸癌細胞を、群1〜3には皮下接種し、群4〜6には静脈内接種した。
【０３４４】
【表１２】
2007509067.tif 000017
【０３４５】
スケジュール：ヒトEphA2で形質移入したCT26結腸癌細胞（L4029-EphA2exFlag）、リステリア対照（L4029）、又は賦形剤（HBSS）（100μl体積中に5×10５個の細胞）を、動物に皮下、又は静脈内（実験的肺転移モデル）接種した。細胞接種後３日間、200 mlのボーラスで前に列挙した物質を動物に静脈内投与した。最初の投与後２週間、動物に追加抗原刺激による予防接種をした。腫瘍体積は隔週で測定し（皮下接種のみ）、動物の重量は１週間単位で測定した。2000 mm３より大きい腫瘍を有するか、あるいは罹患の徴候（曲がった姿勢、乱れた呼吸、運動性の低下、20％を超える体重の損失など）を示す任意の動物を、人道的に安楽死させた。スケジュールは以下の表１３中に要約する。
【０３４６】
【表１３】
2007509067.tif 000018
【０３４７】
図１３Ａ〜１３Ｃは、典型的な治療試験の結果を示す。図１３Ａでは、接種後数回の間隔で腫瘍体積を測定した。HBSS及びリステリア対照と比較すると、huEphA2のECDを発現するCT26細胞を接種したマウスは、第14日後有意に少ない腫瘍体積を有しており、第28日まで続いた。図１３Ｂは、リステリア対照、又はhuEphA2を含むCT26細胞を接種したマウスの平均腫瘍体積を示す。対照と比較すると、huEphA2を発現するCT26細胞を接種したマウスは、減少した平均腫瘍体積を有していた。図１３Ｃは、HBSS、又はリステリア対照、あるいはhuEphA2のECDを発現するリステリアとともにCT26細胞を接種した後のマウスの生存率を測定した、肺転移モデルを使用した治療試験の結果を示す。huEphA2のECDを発現するCT26細胞を接種した動物（三角形によって示す）は、対照と比較して高い生存率を示した。
【０３４８】
他の試験では、一群当たり10匹のBalb／cマウスの群に、ヒトEphA2で形質移入したCT26結腸癌細胞（「CT26-hEphA2」）を皮下、又は静脈内接種した。0.1 LD５０actAリステリア対照、又は200μlのボーラス中でhEphA2のICDを発現するリステリアを用いて、マウスを免疫処置した。１つの養生法では、皮下CT26-hEphA2腫瘍接種後第6日及び第14日に免疫処置を行った。他の養生法では、静脈内CT26-hEphA2腫瘍接種後第3日及び第14日に免疫処置を行った。抗腫瘍有効性は、1週間に2回の腫瘍測定、及び生存率から決定した。
有意な抗腫瘍有効性を、リステリア-hEphA2接種動物において観察した（p＝0.0035）。
図１４Ａは、免疫処置した動物の腫瘍測定値を示す。このデータは以下の表１４中に要約する。
【０３４９】
【表１４】
2007509067.tif 000019
【０３５０】
図１４Ｂは、免疫処置した動物の生存期間を示す。このデータは以下の表１５中に要約する。
【０３５１】
【表１５】
2007509067.tif 000020
【０３５２】
OVA.AH1（MMTVgp70免疫優性エピトープ）、又はOVA.AH1-A5（MMTVgp70免疫優性エピトープ、増大したT細胞受容体結合に関する不規則変化あり）をコードする組換えリステリアを用いた、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの免疫処置は、長期の生存をもたらす（図１４Ｃ）。
EphA2 COドメインは免疫原性が強く、コドン最適化、又は天然型EphA2 COドメイン配列をコードする組換えリステリアを用いて免疫処置すると、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの有意な長期の生存率の増大を観察した（図１４Ｄ）。
【０３５３】
EphA2 EX2ドメインは免疫原性が乏しく、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの増大した生存率は、コドン最適化EphA2 EX2ドメイン配列と融合したコドン最適化secA1シグナルペプチドをコードする組換えリステリアを用いて免疫処置したときのみ観察した。コドン最適化EphA2 EX2ドメイン配列と融合した天然型secA1シグナルペプチドをコードする組換えリステリアを用いて免疫処置したときは、マウスにおいて治療有効性は観察されなかった（図１４Ｅ）。コドン最適化secA1シグナルペプチド及びEphA2 EX2ドメイン配列を使用することの望ましさは、以下の表中に示すように、統計上有意な治療上の抗腫瘍有効性によって支持された。
図１４Ｅ中に示す生存曲線の対数順位検定による比較を、以下の表１６中に要約する。
【０３５４】
【表１６】
2007509067.tif 000021
【０３５５】
重要なことに、pCDNA4-EphA2プラスミドで形質移入した293細胞が、非常に高レベルのタンパク質発現を生じても、pCDNA4-EphA2プラスミドを用いたCT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの免疫処置は、治療的抗腫瘍有効性のいかなる観察結果ももたらさなかった（図１４Ｆ）。
【０３５６】
治療in vivo腫瘍試験用に、メスBalb／Cマウスに、EphA2を安定して発現する5×10５個のCT26細胞を静脈内接種した。3日後、マウスを無作為に抽出し、EphA2をコードする様々な組換えリステリア菌株を静脈内に予防接種した。（図中に示した）いくつかの場合、100μgのpCDNA4プラスミド、又はpCDNA4-EphA2プラスミドを、マウスの前頚骨筋に予防接種した。陽性対照として、OVA.AHI、又はOVA.AH1-A5タンパク質キメラをコードする組換えリステリア菌株を、マウスに静脈内予防接種した。腫瘍細胞接種後に、第3日及び第14日にマウスに予防接種した。ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）バッファー、又は非改変型リステリアを注射したマウスは、陰性対照として働いた。全実験のコホートは、5匹のマウスを含んでいた。生存試験用に、それらが何らかのストレス、又は乱れた呼吸の徴候を示し始めたときにマウスを殺傷した。
前述のデータは、huEphA2を発現するリステリアを用いた治療免疫処置は確かなCT26-hEphA2腫瘍の増殖を抑制し、生存率を増大させることを実証する。
【０３５７】
（６．６．実施例６：再攻撃によるCT26-hEphA2腫瘍増殖の長期の抑制）
攻撃するCT26-hEphA2腫瘍に対してhEphA2のICD、又はECDを発現するリステリアを用いた予防免疫処置後に、腫瘍を形成しなかったBalb／cマウスを、最初の腫瘍攻撃後第56日及び最後の免疫処置後第60日に、反対側腹部をCT26親細胞系とCT26-hEphA2細胞の両方で再攻撃した（皮下）。年齢対応マウスを、この実験において対照として使用した。
親CT26細胞を用いた再攻撃によって、群間の統計上有意な腫瘍増殖の違いが示されることはなかった（データ示さず）。しかしながら、図１５中に示したように、hEphA2のICD、又はECDを発現するリステリアを予防接種した両群は、再攻撃によって腫瘍増殖の有意な抑制を示した（＊p＜0.041）。
【０３５８】
（６．７．実施例７：hEphA2を発現するリステリアを用いた免疫処置は、EphA2特異的CD8+T細胞応答を誘導する）
Balb／cマウス（n＝3）を、hEphA2の細胞内ドメイン（hEphA2-ICD）を発現するリステリアL461T、又はhEphA2のコドン最適化細胞外ドメイン（hEphA2-ECD）を発現するΔactAを用いて2週間間隔で免疫処置した。マウスは安楽死させ、脾臓を採取し、最後の免疫処置後第6日で集めた。ELISPOTアッセイ用に、完全長hEphA2を発現するP815細胞、又はこれらの細胞から調製した細胞溶解物を用いて、in vitroで細胞を再刺激した。親P815細胞、又は細胞溶解物は、陰性対照として働いた。細胞は組換えhEphA2Fc融合タンパク質でも刺激した。IFN-γ陽性スポット形成コロニー（SFC）は、96ウェルスポットリーダーを使用して測定した。
【０３５９】
図１６中に示すように、増大したIFN-γ SFCを、リステリア-hEphA2を予防接種したマウス由来の脾細胞に関して観察した。hEphA2発現細胞、又は細胞溶解物による刺激はIFN-γ SFCの増大をもたらし、これはEphA2特異的CD8+及びCD4+T細胞応答を示唆する。親リステリア対照を予防接種したマウス由来の脾細胞は、IFN-γ SFCの増大を示さなかった。
【０３６０】
（６．８．実施例８：CD4+T細胞応答とCD8+T細胞応答の両方が、最大のhEphA2対象抗腫瘍有効性に必要とされる）
Balb／cマウス（n＝10）に、第0日に2×10５個のCT26-hEphA2を静脈内接種した。CD4+細胞、及びCD8+T細胞は、第1日、及び第3日に、200μgの抗CD4（ATCCハイブリドーマGK1.5）、又は抗CD8（ATCCハイブリドーマ2.4-3）を注射することによって枯渇させ、これはFACS分析によって確認した（データ示さず）。第4日に0.1 LD50のhEphA2 ICDを発現するリステリアL461Tを、次いでマウスの静脈内に予防注射し、生存を調べた。
図１７中に示すように、CD4+及びCD8+枯渇群は、非T細胞枯渇型動物中で見られた一定の抗腫瘍応答を示さなかった。データは以下の表１７中に要約する。
【０３６１】
【表１７】
2007509067.tif 000022
【０３６２】
前述のデータは、腫瘍増殖の最適な抑制におけるCD4+及びCD8+T細胞の必要性を示す。
【０３６３】
（６．９．実施例９：ヒトEphA2 ICDを発現するリステリアを用いる治療予防接種は、CD45+腫瘍浸潤を増大させる）
Balb／cマウス（n＝3）は、皮下CT26-hEphA2腫瘍接種後第6日に、0.1 LD50のactA-リステリア対照、又はhEphA2のECD、又はICDを発現するリステリアを用いて免疫処置した。予防接種後第9日に、腫瘍を採取し、10％中性緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、4μmで切片にした。腫瘍切片から顕微鏡用スライドを作製した。スライド上の組織は脱パラフィン処理し、以下のようにして再水和状態にした：それぞれ5分間キシレンを用いて4回変更；それぞれ5分間無水アルコールを用いて2回変更；5分間95％アルコールを用いて1回変更；5分間70％アルコールを用いて1回変更；及び蒸留水を用いて2回変更。
【０３６４】
蒸気を用いた抗原検索を、製造者のプロトコルの変形を使用して、標的抗原検索用（TAR）溶液（カリフォルニア州  カーピンテリア、DakoCytomation）を使用することにより、Black and Decker Rice スチーマー中で行った。正確に沸点温度未満まで予め加熱したTAR溶液中にスライドを置き、20分間インキュベートした。次いでスライドをTAR溶液から除去し、20分で室温に冷却し、TBSアッセイバッファー中で2回すすいだ。
【０３６５】
ビオチン化抗体を用いたスライドの染色は、以下のように行った。
内因性ペルオキシダーゼは、3％過酸化水素をメタノールに溶かした溶液中にスライドを10分間浸し、次にそれぞれ5分間蒸留水を用いた2回の変更によって阻害した。タンパク質は、5％のウシ血清アルブミン（BSA）を1×Tris緩衝生理食塩水、及び0.01％のTween20（TBST）に溶かした溶液中に、少なくとも30分間スライドを浸すことによって阻害した。
スライドから過剰なBSA溶液をふき取った後、組織中心に集まった「プール」を作製し、スライドは湿気チャンバー中に平らに敷き、1％BSA／TBST溶液に1：100に希釈したビオチン化ラット抗マウスCD45／B220（Pharmingen）を施した。注意を払いながら室温で一晩、湿気チャンバー中においてスライドをインキュベートして、組織切片の乾燥を防いだ。
【０３６６】
翌朝、TBSTの2回の変更とともにスライドを洗浄し、第2回目は10分間続けた。HRP、又はAPのいずれかと結合したストレプトアビジンを施し、室温で30分間インキュベートした。TBSTの２回の変更とともにスライドを洗浄し、適切な基質色原体を用いて目に見える状態にする（Strep-HRP用には、DABを使用する）。蒸留水中での洗浄後、2分間色素中にスライドを浸すことによって、マイヤーヘマトキシリンを用いてスライドを対比染色する。次いで水が透明になるまで流水中でスライドを洗浄し、青みづけ剤に30秒間浸し（Scottsが水道水の代わりとなる）、水道水で再度洗浄する。スライドは脱水させ、以下の洗浄：95％アルコールで1分間、それぞれ1分間無水アルコールを用いた3回の変更、及びそれぞれ1分間キシレンを用いた4回の変更により、キシレン（又はキシレン代用品）によって等級アルコール中で清掃する。
【０３６７】
封入媒体をカバーガラスに施し（キシレン用に、DPX封入物質を使用する）、目に見える状態にする前にスライドを一晩乾燥させる。
Nikon Eclipse E400上で切片を目に見える状態にして、Nikon DXM1200デジタルカメラを用いて画像を捉えた（図１８Ａ）。データはさらに腫瘍体積に正規化した（図１８Ｂ）。
これらの結果は、治療予防接種の後に腫瘍関連浸潤リンパ球が増大することを実証する。
【０３６８】
（７．均等物）
等業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施態様に対する多数の均等物を理解し、あるいは常例的実験を超える実験を使用して確認することができよう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
本明細書で言及した刊行物、特許、及び特許出願のすべてを、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願を具体的かつ個別的に参照により組み込むものと示されているのと同程度に、参照により本明細書中に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０３６９】
（４．図面の簡単な説明）
【図１】リステリアの細胞内生活環、抗原提示細胞の活性化、及び抗原提示の図である。
【図２】天然型EphA2 COドメイン配列をコードする組換えリステリアから分泌されたタンパク質の、ウェスタンブロット分析の図である。
【図３】コドン最適化EphA2 EX2ドメイン配列シグナルペプチドと融合した、天然型、又はコドン最適化LLO secA1シグナルペプチドをコードする組換えリステリアから分泌されたタンパク質の、ウェスタンブロット分析の図である。
【図４】コドン最適化EphA2 COドメイン配列と融合した、天然型、又はコドン最適化LLO secA2シグナルペプチド、又はコドン最適化Tatシグナルペプチドをコードする組換えリステリアから分泌されたタンパク質の、ウェスタンブロット分析の図である。
【０３７０】
【図５】CT2ネズミ癌細胞中でのヒトEphA2発現の、フローサイトメトリー分析の図である。単細胞FACS選別アッセイを標準的技法により行って、高レベルのヒトEphA2を発現するCT26細胞クローンを同定した。
【図６】高レベルのヒトEphA2タンパク質を発現する、集めた個体群CT26ネズミ結腸癌細胞の、ウェスタンブロット分析の図である。
【図７】huEphA2を発現するB16F10細胞の、フローサイトメトリーの図である。
【図８】完全長である天然型EphA2配列をコードするpCDNA4プラスミドDNAを用いたトランスフェクション後48時間の、293細胞由来の溶解物のウェスタンブロット分析の図である。
【０３７１】
【図９Ａ】CT26腫瘍モデルにおける、AH1-A5を発現する陽性対照リステリアを用いた治療免疫処置の図である。
【図９Ｂ】CT26腫瘍モデルにおける、AH1-A5を発現する陽性対照リステリアを用いた治療免疫処置の図である。
【図１０Ａ】hEphA2のECDを発現するリステリアを用いた予防免疫処置は、CT26-hEphA2腫瘍の増殖を抑制することを示す図である。
【図１０Ｂ】hEphA2のECDを発現するリステリアを用いた予防免疫処置は、生存率を増大させることを示す図である。
【０３７２】
【図１１】L4029EphA2-exFlag、リステリア対照（L4029）の静脈内投与、又はAH1タンパク質を含むリステリア陽性対照（L4029-AH1）（5×10５個の細胞、100μl体積中）皮下、又は静脈内投与の後の、予防試験の図である。
【図１１Ａ】huEphA2のECDを発現するCT26細胞、賦形剤（HBSS）、リステリア（L4029）、又はリステリア陽性（L4029-AH1）対照を接種したマウスの、腫瘍体積を示す図である。
【図１１Ｂ】リステリア（L4029）対照と比較した、huEphA2のECDを発現するCT26細胞（L4029-EphA2 exFlag）を接種したマウスの、平均腫瘍体積を示す図である。
【図１１Ｃ】CT26腫瘍細胞接種の後にマウスの生存率を測定した、皮下モデルにおける予防試験の結果を示す図である。
【図１１Ｄ】腫瘍細胞接種の後にマウスの生存率を測定した、肺転移モデルにおける予防試験の結果を示す図である。
【０３７３】
【図１２】hEphA2のECDを発現するリステリアを用いた予防免疫処置によって、RenCa-hEphA2腫瘍攻撃の後の生存率が増大することを示す図である。
【図１３】ヒトEphA2で形質移入したCT26ネズミ結腸癌細胞（L4029-EphA2 exFlag）、リステリア対照（L4029対照）、又は賦形剤（HBSS）を接種した動物の典型的な治療試験の結果を示す図である。
【図１３Ａ】接種後数回の間隔で、腫瘍体積を測定したことを示す図である。
【図１３Ｂ】リステリア対照、又はhuEphA2のECDを含むCT26細胞を接種したマウスの、平均腫瘍体積を示す図である。
【図１３Ｃ】CT26細胞にHBSS、又はリステリア対照、あるいはhuEphA2のECDを発現するリステリアを接種した後にマウスの生存率を測定した、肺転移モデルを使用する治療試験の結果を示す図である。
【０３７４】
【図１４Ａ】hEphA2のICDを発現するリステリアを用いたBalb／Cマウスにおける治療免疫処置は、安定したCT26-hEphA2腫瘍の増殖を抑制することを示す図である。
【図１４Ｂ】EphA2 COドメインをコードする組換えリステリアを用いた、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの免疫処置は、長期の生存をもたらすことを示す図である。
【図１４Ｃ】OVA.AH1、又はOVA.AH1-A5をコードする組換えリステリアを用いて免疫処置した、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの長期の生存を示す図である。
【図１４Ｄ】コドン最適化、又は天然型EphA2 COドメイン配列をコードする組換えリステリアを用いて免疫処置したときの、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの増大した生存率を示す図である。
【図１４Ｅ】コドン最適化EphA2 EX2ドメイン配列と融合したコドン最適化secA1シグナルペプチドをコードする、組換えリステリアを用いて免疫処置したときの、CT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの増大した生存率を示す図である。
【図１４Ｆ】完全長EphA2をコードするプラスミドDNAではなく、EphA2 COドメインをコードする組換えリステリアを用いたCT26.24（huEphA2+）肺腫瘍を有するBalb／Cマウスの免疫処置が、長期の生存をもたらすことを示す図である。
【０３７５】
【図１５】再攻撃によるCT26-hEphA2腫瘍増殖の長期の抑制を示す図である。
【図１６】hEphA2を発現するリステリアを用いた免疫処置が、特異的なCD8+T細胞応答を誘導することを示す図である。
【図１７】CD4+T細胞応答とCD8+T細胞応答の両方が、最適hEphA2対象型の抗腫瘍有効性に必要とされることを示す図である。
【図１８】（Ａ〜Ｂ）ヒトEphA2 ICDを発現するリステリアを用いた治療予防接種によって、CD45+腫瘍の浸潤が増大することを示す図である。
【図１８Ａ】ビオチン化ラット抗マウスCD45／B200で染色した腫瘍切片の画像を示す図である。
【図１８Ｂ】画像データを腫瘍体積に正規化した棒グラフである。
【図１Ａ】
2007509067.tif 000023
【図１Ｂ】
2007509067.tif 000024
【図２】
2007509067.tif 000025
【図３】
2007509067.tif 000026
【図４】
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【図５】
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【図６】
2007509067.tif 000029
【図７】
2007509067.tif 000030
【図８】
2007509067.tif 000031
【図９Ａ】
2007509067.tif 000032
【図９Ｂ】
2007509067.tif 000033
【図１０Ａ】
2007509067.tif 000034
【図１０Ｂ】
2007509067.tif 000035
【図１１Ａ】
2007509067.tif 000036
【図１１Ｂ】
2007509067.tif 000037
【図１１Ｃ】
2007509067.tif 000038
【図１１Ｄ】
2007509067.tif 000039
【図１２】
2007509067.tif 000040
【図１３Ａ】
2007509067.tif 000041
【図１３Ｂ】
2007509067.tif 000042
【図１３Ｃ】
2007509067.tif 000043
【図１４Ａ】
2007509067.tif 000044
【図１４Ｂ】
2007509067.tif 000045
【図１４Ｃ】
2007509067.tif 000046
【図１４Ｄ】
2007509067.tif 000047
【図１４Ｅ】
2007509067.tif 000048
【図１４Ｆ】
2007509067.tif 000049
【図１５】
2007509067.tif 000050
【図１６】
2007509067.tif 000051
【図１７】
2007509067.tif 000052
【図１８Ａ】
2007509067.tif 000053
【図１８Ｂ】
2007509067.tif 000054
【配列表】
2007509067000001.app
【国際調査報告】
2007509067.tif 000055