(57)【要約】本発明は、NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の発現をモジュレートすることによる、植物の生育特性を改善する方法に関する。本発明はまた、NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現がモジュレートされている、改善された生育特性を有するトランスジェニック植物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型植物と比較して植物の生育特性を改善する方法であって、該植物に遺伝子改変を導入すること、及び該植物におけるNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の発現のモジュレーションについて選別することを含む、上記方法。
【請求項２】
前記発現のモジュレーションが発現の増加である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子改変を、部位特異的突然変異誘発、相同的組換え、TILLING、T-DNA活性化及びDNAシャッフリングの1つによって達成する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子改変がNAP1-様タンパク質をコードする単離された核酸配列を植物に導入することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が植物、好ましくは双子葉植物、より好ましくはアブラナ科（Brassicaceae）、最も好ましくはシロイヌナズナ由来である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸配列及び前記タンパク質が、
(i)好ましくは配列番号１で表されるNAP1-様タンパク質をコードする核酸、又は配列番号2で表されるNAP1-様タンパク質をコードする核酸；
(ii)NAP1-様タンパク質又はスプライス変異体によってコードされるNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライス変異体；
(iii)NAP1-様タンパク質又はアレル変異体によってコードされるNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列のアレル変異体；
(iv)NAP1-様コード核酸と、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な配列；
(v)NAP1-様タンパク質；
(vi)配列番号2で表されるNAP1-様タンパク質；
(vii)NAP1-様タンパク質の、好ましくは配列番号2で提示されるNAP1-様タンパク質の、ホモログ及び誘導体；
から選択される変異体を含み、その際、該NAP1-様タンパク質がNAPドメインと酸性C-末端とを含み、かつPP2aホスファターゼ阻害活性を有する、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
前記生育特性の改善が収量の増加、好ましくは種子収量の増加である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記種子収量の増加が、それぞれ対応する野生型植物と比較して、増加した充填種子数、増加した種子の総重量又は増加した収穫指数の1つ以上を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記NAP1-様タンパク質をコードする核酸が、構成的プロモーター、好ましくはGOS2プロモーターに機能的に連結されるものである、請求項4〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
収量が増加したトランスジェニック植物を作製する方法であって、
(i)植物細胞にNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列を導入すること；
(ii)トランスジェニック植物細胞から植物を再生及び/又は生育すること、
を含む上記方法。
【請求項１１】
収穫可能な部分、珠芽、種子又はその子孫を含む、及びその直接的に由来する産物を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法によって取得可能な収量が増加した植物。
【請求項１２】
(i)NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列；
(ii)植物において(i)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列；及び場合により、
(iii)転写終結配列、
を含む、植物における発現のための遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記NAP1-様タンパク質をコードする核酸が、
(i)配列番号1によって表される核酸配列又はその相補鎖；
(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸配列；
(iii)上記(i)又は(ii)の核酸配列と、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であり、好ましくはNAP1-様タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列；
(iv)遺伝子コードの結果として縮重した、上記(i)〜(iii)の核酸配列；
(v)(i)〜(iii)の核酸配列に対するアレル変異体である核酸配列；
(vi)(i)〜(iii)の核酸配列に対する選択的スプライス変異体である核酸配列；
を含む群から選択され、その際、該NAP1-様タンパク質がNAPドメインと酸性C末端とを含み、かつPP2aホスファターゼ阻害活性を有する、請求項12に記載の構築物。
【請求項１４】
前記制御配列が少なくとも構成的プロモーター、好ましくはGOS2プロモーターを含む、請求項12又は13に記載の構築物。
【請求項１５】
前記NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列が、前記制御配列に対してセンス方向に配向するものである、請求項12〜14のいずれか1項に記載の構築物。
【請求項１６】
配列番号3に本質的に類似する発現カセットを含む構築物。
【請求項１７】
収量の増加について選別されていることを特徴とする、NAP1-様タンパク質をコードする単離された核酸配列を含むトランスジェニック植物。
【請求項１８】
NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現の増加について選別された、請求項17に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
前記NAP1-様タンパク質をコードする単離された核酸が、配列番号2で表されるタンパク質をコードする、請求項17又は18に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
前記植物が、ダイズ、ヒマワリ、ナタネ、アルファルファ、ナタネ種子又はワタを含む作物であり、好ましくは植物がサトウキビ等の単子葉植物、最も好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、アワ、オオムギ、オートムギ、モロコシ等の穀類である、請求項17〜19のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
請求項17〜20のいずれか1項に記載の植物の、収穫可能な部分、珠芽、種子又はトランスジェニック子孫、及びその直接的に由来する産物を含む、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物又はトランスジェニック植物の一部分。
【請求項２２】
NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列、若しくはその一部分又はこれらにハイブリダイズする配列の、植物の収量を増加するための使用。
【請求項２３】
NAP1-様タンパク質及び/又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片の、植物の収量を増加するための使用。
【請求項２４】
前記収量の増加が種子収量の増加である、請求項22又は23に記載の使用。
【請求項２５】
前記種子収量の増加が、種子の総重量、充填種子の数及び収穫指数の1つ以上を含む、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
前記NAP1-様タンパク質をコードする核酸又はNAP1-様タンパク質自体の配列が配列番号1又は2で表されるものである、請求項22〜25のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２７】
NAP1-様タンパク質及び/又はNAP1-様タンパク質をコードする核酸を含む、植物の収量を増加するための組成物。
【請求項２８】
配列番号2で表されるタンパク質又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片を含む、植物の収量を増加するための組成物。
【請求項２９】
配列番号1若しくはその一部分又はこれらとハイブリダイズする配列によって表されるか、又は配列番号2で表されるタンパク質をコードする核酸を含む、植物の収量を増加するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生育特性を改善する方法、及び特に、植物の収量を増加する方法に関する。より具体的には、本発明は、植物においてヌクレオソームアセンブリータンパク質１（NAP1-様タンパク質）と相同なタンパク質をコードする核酸の発現をモジュレートすることによって収量を増加する方法に関する。本発明はまた、NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現がモジュレートされた植物に関し、該植物は対応する野生型植物と比較して増加した収量を有する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口が増え続け、農業に利用可能な土地の面積が次第に減少すると仮定すれば、主要な目的は農業の効率を改善し、園芸における植物の多様性を増加させることに帰する。作物及び園芸改善のための従来の手段は、所望の特徴を有する植物を同定するために選抜育種技術を利用する。しかし、係る選抜育種技術は様々な欠点、すなわちこれらの技術は典型的には大きな労働力を要し、親植物から継承されている所望の特質を常には生じ得ない異種遺伝的相補を頻繁に含む植物を生じるという欠点を有する。分子生物学の進歩により、人類が動物及び植物の生殖質を操作することが可能になった。植物の遺伝子操作は、遺伝物質（典型的にはDNA又はRNAの形態）の単離及び操作並びにその後の遺伝物質の植物への導入を要する。係る技術は改善された様々な経済的、農業的又は園芸的形質を有する植物の開発へと導いてきた。特に経済的関心のある形質は、高い収量等の生育特性である。
【０００３】
NAPタンパク質は関連タンパク質のファミリーを形成する。これは動物で公知であり、かつクロマチン関連活性に関与することが報告されている。NAPタンパク質のファミリーは、NAPドメインとして知られる保存された配列の存在によって特徴付けられる。NAPドメインはPfam（登録PF00956）及びInterproデータベース（登録IPR002164）に記述されている。NAPはヌクレオソームへのDNAパッケージングを仲介する多因子複合体の一成分である（Krude, T.及びKeller, C. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58, 665-672）。真核細胞分裂周期のS期の間に、新たに複製されたDNAは迅速にクロマチンへアセンブルされる。このプロセスは様々な因子の協調した作用を要する。初期段階で、CAF1（クロマチンアセンブリー因子１）がヒストンタンパク質H3及びH4に結合し、PCNA結合を介してこれらを複製フォークへ導く。ヒストンタンパク質H2A及びH2Bのその後の沈着がNAP1タンパク質によって仲介される。NAP1は最初にHeLA細胞で記載され（von Lindernら. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3346-3355）、その後、全ての真核細胞で保存されていることが見出された。さらに、NAPタンパク質は遺伝子の転写を調節し、細胞分化及び発生に影響し得ると考えられている。
【０００４】
SETタンパク質はNAPタンパク質とかなり近縁であり、ヒトにおける様々な細胞プロセスで役割を果たす。ヒト細胞では、SETは細胞周期の調節の間（G2/M移行等）に様々なCDK-サイクリン複合体と会合することが示されている。SETは様々なシグナリング経路に関与するプロテインホスファターゼ2A（PP2A）の強力な阻害物質である。SETの阻害活性は、酸性C末端ドメインに起因し得る（Canelaら. (2003) J. Biol. Chem. 278, 1158-1164）。他の報告はDNAの修復及び転写にSETが関与することを示す。SETはクロマチン関連タンパク質であるHMG2によって仲介されるDNA結合及びベンディング活性を有する複合体の一部分である。HMG2はDNAのベンディング及びルーピングによって、又は損傷（underwound）DNAを安定化することによって核タンパク質の高次構造のアセンブルを促進する。HMG2はSETと共沈殿する（Fanら. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 2810-2820）。SETはまた、活性DNAの脱メチル化を阻害することが報告されている(Cervoniら. (2002) J. Biol. Chem. 277, 25026-25031）。ヒストンのアセチル化の阻害に関与する癌タンパク質Set/TAF-1も、遺伝子サイレンシングを生じる異所的にメチル化されたDNAの脱メチル化を阻害する。Set/TAF-1は、遺伝子調節において後成的状態のヒストンとDNAとを統合する際に役割を果たすことが示唆されている。
【０００５】
NAP1タンパク質の活性は一部にはリン酸化によって調節される。ショウジョウバエ（Drosophila）におけるNAP1の細胞内局在はそのリン酸化状態（これはカゼインキナーゼIIによって制御し得る（Rodriguezら(2000) J. Mol. Biol. 298, 225-238））に左右されることが示された。哺乳類が数種のNAP1タンパク質を保有することが報告されているが、酵母ではわずかに1種の既知のNAP1タンパク質が存在する。
【０００６】
植物のNAP1オーソログは大部分は未知のままであるが、NAP1タンパク質はダイズ（Yoonら(1995) Mol. Gen. Genet. 249, 465-473）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、タバコ、トウモロコシ及びイネ（Dongら. (2003) Planta 216, 561-570）から報告された。植物のNAP1-様遺伝子の系統的分析は、2つのサブグループ（一方はNAP1に関連し、他方はSETタンパク質に関連する）が存在することを明らかにしている（図1）。2つのシロイヌナズナ配列、2つのトウモロコシ配列及び2つのタバコ配列は、共により最近の遺伝子重複効果を示すように群形成（cluster）しているので、おそらく配列分岐は最近生じたかもしれない。出芽酵母のゲノムは、NAP1及びSETサブグループの両方の機能的性質を併せ持つ唯一のNAPコード遺伝子を含む。同様に、NAP1のホモログである鋳型活性化因子１（TAF-1）は、PP2a阻害活性（Saitoら, Biochem. Biophys. Res. Comm. 259, 471-475, 1999）及びクロマチンリモデリング活性（Kawaseら, Genes Cells 1, 1045-1056, 1996）を併せ持つ。したがって、植物のNAP/SETファミリーのタンパク質は、特にNAPグループと比較して低度の分岐が観察されるSETタンパク質グループにおいて、主に機能が重複すると思われる。さらに、NAP及びSETタンパク質はC末端酸性領域の前にNAPドメインを共有するため、これらが同じファミリーに属するという構造上の証拠が存在する。
【０００７】
植物中でのNAP1-様タンパク質の機能についてはほとんど知られていないが、有糸分裂及び細胞質分裂における役割が提起されている（Dongら2003）。植物のNAP1タンパク質のオーソログは、おそらく動物におけるこれらの対応物よりも異なる役割を果たすと考えられる。その核局在化及び哺乳類SETタンパク質との配列類似性に基づいて、クロマチンリモデリングにおける役割を植物タンパク質で予測し得る。さらに、植物のNAP/SETタンパク質群は植物におけるPP2Aの調節に関与することができた。PP2Aは、転写因子及びプロテインキナーゼにかなりの程度で作用する植物中の主要なホスファターゼの1つであり、細胞周期（Ayaydinら. (2000) Plant J. 23, 85-96）、ABAに仲介される気孔の運動、発芽（Kwakら. (2002) Plant Cell 14, 2849-2861）、又はオーキシン輸送等のホルモン作用、及び根の発達（Garbersら 1996 EMBO J. 15, 2115-2124）を含む、様々な細胞プロセスに関与するタンパク質の活性を調節することが提起された。PP2Aはさらに、光合成及び光シグナリング（Sheen (1993) EMBO J. 12, 3497-3505）並びに窒素同化（Hirose及びYamaya (1999) Plant Physiology 121, 805-812）に関与することが報告された。
【発明の開示】
【０００８】
今まで、植物においてNAP1-様タンパク質の発現をモジュレートする際の農業形質に対する効果は記載されていない。現在では、驚くべきことに、植物においてNAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現をモジュレートすることにより、対応する野生型植物と比較する際に、生育及び発達が改善された、特に収量が増加された、より詳細には種子収量が増加された植物を生じることが見出されている。したがって、本発明の第1の実施形態によれば、植物の生育及び発達を改善する方法であって、植物に遺伝子改変を導入すること及びこの植物におけるNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の発現のモジュレーションについて選別することを含む、上記方法が提供される。特に、生育及び発達の改善は、植物の収量の増加、より詳細には種子収量の増加であり、発現のモジュレーションは発現の増加である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書で定義されるNAP1-様タンパク質という用語は、NAPドメイン及び酸性C末端領域を含み、かつPP2aホスファターゼ阻害活性を有する任意のタンパク質を指す。本明細書で使用される「NAPドメイン」という用語は、Pfamデータベースにより登録番号PF00956（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/;例えばBatemanら, Nucleic Acids Research 30(1):276-280 (2002)、表1参照）で定義されるものである。本発明に有用なNAP1-様タンパク質配列が、(T/S)FF(T/N/S/E/D)(W/F)(L/F)識別特性及び/又は配列番号33で表される保存されたアミノ酸配列を含むNAPドメインを有することが好ましい。NAPドメインが配列番号32によって表されるものであることがより好ましい。本明細書で使用される「酸性C末端領域」又は「酸性C末端」という用語は、約20〜25アミノ酸の長さであり、その少なくとも13個の残基がグルタミン酸及び/又はアスパラギン酸である、タンパク質のカルボキシル末端を指す。
【表１】
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【００１０】
場合により、本発明の方法に有用なNAP1-様タンパク質は、PP2aホスファターゼの阻害物質であることに加えて、クロマチンリモデリング活性をも有する。PP2aホスファターゼの阻害を測定する方法は当該技術分野で公知であり、例えば市販の色素標識化基質若しくは蛍光標識化基質に基づくアッセイ、又は[32P]標識したヒストンH1のPP2aホスファターゼとの処理後にTCA可溶性画分中で放射活性を測定すること（Saitoら.(1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 259, 471-475）、若しくは標識したミエリン塩基性タンパク質から放出される放射活性を測定すること（Liら, J. Biol. Chem. 271, 11059-11062, 1996）、に基づくアッセイを含む。NAP1-様タンパク質活性を測定するための代替的方法は実施例6で説明され、これはUlloaらによって記載された方法（FEBS Letters 330, 85-89, 1993）を基礎とする。クロマチンリモデリング活性は、ゲル・リターデーション・アッセイにおけるDNA結合活性の測定（Fanら、2002）又はELISAを用いたヒストン結合活性の測定（Rodriguezら. (1997) Genomics 44, 253-265）等の様々な手法でアッセイし得る。DNAベンディング活性は、リガーゼ仲介環状化アッセイ（ligase-mediated circularization assay）（Fanら、2002）又はスーパーコイリングアッセイ（Fujii-Nakataら.(1992) J. Biol. Chem. 267, 20980-20986; Yoonら. (1995), Mol. Gen. Gen. 249, 465-473）で測定し得る。
【００１１】
上述されるようにNAPドメインと酸性C末端領域とを含むNAP1-様タンパク質が植物起源であることが好ましい。NAP1-様タンパク質が双子葉植物、好ましくはアブラナ科（Brassicaceae）、より好ましくはシロイヌナズナ由来であることが好ましく、NAP1-様タンパク質が配列番号2で表されるタンパク質又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片であることが最も好ましい。このホモログ、誘導体又は活性断片は上述されるようにNAPドメインと酸性C末端とを含み、かつ該ホモログ、誘導体又は活性断片はPP2A阻害活性をさらに有する。NAP1-様タンパク質が配列番号1で表される核酸又はこれにハイブリダイズ可能な核酸によってコードされることが好ましい。
【００１２】
「NAP1-様タンパク質」という用語は、配列番号2で提示されるタンパク質と相同なタンパク質を含む。本発明の方法で使用されるべき好適なホモログは、上述されるようにNAPドメインと酸性C末端とを含む。ホモログが、(T/S)FF(T/N/S/E/D)(W/F)(L/F)識別特性及び/又は配列番号33の保存配列を含むNAPドメインと、少なくとも13個のアスパラギン酸及び/又はグルタミン酸残基を含む20〜25残基の酸性C末端とを有することが好ましい。さらにNAP1ホモログは、上述のように測定できるPP2a阻害活性を有し、かつ場合によりクロマチンリモデリング活性も持つ。
【００１３】
配列番号2のホモログは様々な真核生物で見出し得る。最も近縁のホモログは一般的には植物界で見出される。本発明の方法に適当な配列番号2のホモログは、2つのタバコタンパク質（配列番号7及び9）、1つのトマトタンパク質（配列番号23）、1つのアルファルファタンパク質（配列番号11）、配列番号21で表されるシロイヌナズナタンパク質を含む。本発明による方法を実施するのに適当な他のホモログは、例えばズィー・メイス（Zea mays）ホモログnfa104（登録番号AF384036、配列番号13）及びnfa103（登録番号AF384035、配列番号19）又はイネ（Oryza sativa）ホモログ（配列番号15及び17）を含む。
【００１４】
NAP1-様ホモログの検索及び同定方法は十分に当業者の技術範囲内である。係る方法は、コンピューター読取り可能な形式で、配列番号1又は2によって表される配列の、公開データベース（MIPS (http://mips.gsf.de/)、GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)又はEMBLヌクレオチド配列データベース(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)等）で利用可能な配列との、配列のアライメント又は比較のための当該技術分野で周知のアルゴリズム（GAP(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))、BESTFIT(Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Advances in Applied Mathematics 2; 482-489 (1981))を用いる)、BLAST (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、FASTA及びTFASTA(W. R. Pearson及びD. J. Lipman Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444-2448 (1988)）を用いた比較を含む。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公共的に利用可能である。上述のホモログはBlastのデフォルトのパラメーター（BLOSUM62行列、ギャップオープニングペナルティ11、及びギャップ伸長ペナルティ1）を用いて同定された。全長配列が分析に使用されることが好ましい。あるいは、NAP1ドメインはこのタンパク質の主要部分を含むため、このドメインのみを比較に使用してもよい。
【００１５】
NAP1-様タンパク質の「ホモログ」は、問題の未改変タンパク質に対してアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を有し、かつそれらの由来する未改変タンパク質と類似した生物学的活性及び機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。係るホモログを作製するために、このタンパク質のアミノ酸を類似の性質（類似の疎水性、親水性、抗原性、αへリックス構造若しくはβシート構造を形成又は破壊する性向等）を有する他のアミノ酸で置換し得る。同類置換表は当該技術分野で周知である（例えばCreighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company参照）。
【００１６】
本発明の方法に有用なホモログは、配列番号2（GenBank登録NP_177596）で表されるタンパク質配列に対して少なくとも50％の配列同一性又は類似性（機能的同一性）を有し、あるいは配列番号2に対して少なくとも60％又は70％の配列同一性を有する。典型的にホモログは、配列番号2に対して少なくとも80％の配列同一性又は類似性、好ましくは少なくとも85％の配列同一性又は類似性、より好ましくは少なくとも90％の配列同一性又は類似性、最も好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性又は類似性を有する。
【００１７】
あるいは、本発明の方法に有用なホモログは、GenBank登録NP_568844（配列番号29）で表されるタンパク質配列に対して少なくとも40％の配列同一性又は類似性（機能的同一性）を有し、あるいは配列番号29に対して少なくとも50％、60％又は70％の配列同一性又は類似性を有する。典型的にホモログは、配列番号29に対して少なくとも80％の配列同一性又は類似性を有し、好ましくは配列番号29に対して少なくとも85％の配列同一性又は類似性、さらに好ましくは少なくとも90％の配列同一性又は類似性、最も好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性又は類似性を有する。
【００１８】
同一性％は、全長タンパク質配列又は係る配列の特定の（好ましくは保存）領域から、Needleman及びWunschアルゴリズム（GAP等）を基礎とするアライメントプログラムを用いて、BLOSUM62行列、10のギャップオープンペナルティ及び0.5のギャップ伸長ペナルティを用いて計算し得る。例えば配列番号32で与えられるNAPドメインを問い合わせとして使用し得る。タンパク質配列中の係るドメインの同定は十分に当業者の技術範囲内であり、本発明の方法に使用される核酸のコンピューター読取り可能な形式、アライメントソフトウェアプログラムの使用、並びにタンパク質ドメイン、保存モチーフ及びボックスに関する公然利用可能な情報の使用が含まれよう。総合検索は、タンパク質ファミリー、ドメイン及び機能的部位に関する様々なデータベース(PRODOM(Servantら,(2002)Briefings in Bioinformatics 3, 246-251, http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/2002.1/html/home. php)、PIR (Huangら. (2003) Nucl. Acids Res. 31, 390-392, http://pir.georgetown.edu/)又はPfam (Batemanら. (2002) Nucl. Acids Res. 30, 276-280, http://pfam.wustl.edu/)データベース等）を組合わせるINTERPROデータベース（Mulderら, (2003) Nucl. Acids Res. 31, 315-318, http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）を用いて行い得る。モチーフ検索用に設計された配列分析プログラムが、上述されるような保存された断片、領域及びドメインを同定するために使用し得る。適当なコンピュータープログラムには、例えばMEME (Bailey及びElkan (1994) Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, http://meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html)が含まれる。
【００１９】
相同タンパク質は「タンパク質ファミリー」にグループ分けし得る。タンパク質ファミリーは機能的分析及び配列類似性分析（例えばClustal W等）によって規定し得る。NAP1-様に相同なタンパク質の近隣結合系統樹は、Clustal Wプログラムによって作成することもでき、これはその構造的関係及び祖先関係の良好な概要を与える。本発明の特定の実施形態では、NAP1-様ホモログは配列番号2に対応するタンパク質と同一のタンパク質ファミリーに属する。
【００２０】
シロイヌナズナゲノムにおいて、NAP1-様タンパク質の2つのファミリーメンバーが同定された（NM_177596 (配列番号2)、NP_564063 (配列番号21)）。NAP1-様タンパク質のファミリーメンバーは、イネ又は他の植物（他の単子葉植物等）においても同定し得る。これらのファミリーメンバーも本発明の方法に有用であることが有利である。
【００２１】
相同性の2つの特別な形態であるオーソロガス及びパラロガスは、遺伝子の祖先関係を記述するために使用される進化概念である。「パラロガス」という用語は、ある種のゲノム内での1以上の遺伝子重複から生じる相同遺伝子に関する。「オーソロガス」という用語は、これらの遺伝子の祖先関係に起因する、異なる生物中の相同遺伝子に関する。本明細書で使用される「ホモログ」という用語も、本発明の方法に有用なタンパク質のパラログ及びオーソログを包含する。
【００２２】
オーソロガス遺伝子は、1つ以上の遺伝子データベースを、例えばBLASTプログラムを用いて、目的の問い合わせ配列で問い合わせることによって同定し得る。次いで、検索から生じる最高順位の対象遺伝子が再度BLAST分析に供され、問い合わせ遺伝子と再び適合する対象遺伝子のみが真のオーソロガス遺伝子として保持される。例えば、シロイヌナズナ遺伝子のイネオーソログを見出すために、イネデータベース（(これに限定されるものではないが)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)で利用可能なイネ・日本晴（Oryza sativa Nipponbare）データベース又はイネ(インディカ種又はジャポニカ種)のゲノム配列）でBLASTN又はTBLASTX分析を実施し得る。次のステップで、取得したイネ配列がシロイヌナズナデータベースを用いた逆BLAST分析で使用される。この結果は、生じた配列がClustalWで分析され、近接結合系統樹で視覚化される際にさらに精緻化し得る。この方法は多くの異なる種からオーソログを同定するのに使用し得る。
【００２３】
NAP1-様の「ホモログ」は、問題の未改変タンパク質に対してアミノ酸置換、挿入及び/又は欠失を有するタンパク質を包含する。タンパク質の「置換変異体」は、アミノ酸配列中の少なくとも1つの残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸置換は典型的には一残基であるが、ポリペプチドに設定された機能的制約条件に応じてクラスタ化することもできる、すなわち挿入は通常は約1〜10アミノ酸残基の序列（order）であり、欠失は約1〜20残基の範囲であろう。アミノ酸置換が同類アミノ酸置換を含むことが好ましい。タンパク質の「挿入変異体」は、1以上のアミノ酸残基がタンパク質中の規定部位に導入されているものである。挿入は単一の又は複数のアミノ酸の配列内導入だけでなく、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端融合を含み得る。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ末端又はカルボキシ末端融合よりも小さいであろう。アミノ末端若しくはカルボキシ末端融合タンパク質又はペプチドの例は、酵母ツーハイブリッドシステムで使用されるような転写アクチベーターの結合ドメイン又はアクチベーションドメイン、ファージ外皮タンパク質、（ヒスチジン）6-タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ-タグ、プロテインA、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Tag 100エピトープ、c-mycエピトープ、FLAG（登録商標）-エピトープ、lacZ、CMP（カルモジュリン結合ペプチド）、HAエピトープ、プロテインCエピトープ及びVSVエピトープを含む。タンパク質の「欠失変異体」は、タンパク質からの1以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。タンパク質のアミノ酸変異体は、当該技術分野で周知の、固相ペプチド合成等のペプチド合成技術を用いて、又は組換えDNA操作によって容易に作製し得る。タンパク質の置換、挿入又は欠失変異体を作製するためのDNA配列の操作方法は当該技術分野で周知である。例えば、DNA中の規定部位で置換突然変異を作製する技術は当業者に周知であり、これにはM13突然変異誘発、T7-Gen in vitro突然変異誘発（USB, Cleveland, OH）、QuickChange Site Directed突然変異誘発（Stratagene, San Diego, CA）、PCR仲介部位特異的突然変異誘発又は他の部位特異的突然変異誘発プロトコールが含まれる。
【００２４】
NAP1-様タンパク質の「誘導体」という用語は、天然形態のNAP1-様タンパク質（配列番号2で提示されるタンパク質等）のアミノ酸配列と比較して、天然の及び非天然のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を指す。タンパク質の「誘導体」は、天然形態のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、天然の改変された、グリコシル化された、アシル化された又は非天然のアミノ酸残基を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。誘導体は、その由来するアミノ酸配列と比較して、1以上の非アミノ酸置換、例えばアミノ酸配列に共有又は非共有結合したレポーター分子又は他のリガンド（例えば、その欠失を促進するために結合されるレポーター分子及び天然タンパク質のアミノ酸配列に対する非天然アミノ酸残基等）を含み得る。
【００２５】
NAP1-様タンパク質の「活性断片」は、少なくとも天然のタンパク質と比較して類似した生物学的及び/又は機能的活性を保持するのに十分なアミノ酸残基の量を包含する。NAP1-様タンパク質の好適な活性断片は、上述されるように少なくともNAPドメイン（Pfam 00956）並びにD及び/又はE残基で富化された酸性C末端ドメインを含み、より好適な活性断片はさらに配列番号33の保存配列を含む。
【００２６】
本明細書で定義されるNAP1-様核酸/遺伝子という用語は、上で定義されるNAP1-様タンパク質をコードする任意の核酸又はその相補体を指す。この核酸は、植物で発現される際に、この核酸がNAP1-様核酸/遺伝子の発現のモジュレーション又はNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルのモジュレーションをもたらすという条件で、あらゆる供給源から（直接的又は間接的に（その後改変される場合））誘導し得る。この核酸は、酵母若しくは真菌等の真核生物源、植物（藻類を含む）又は動物（ヒトを含む）から単離し得る。この核酸は、意図的なヒトの操作を通じて組成及び/又はゲノム環境をその天然形態から実質的に改変し得る。この核酸配列は相同核酸配列、すなわち好ましくは（同一の植物種由来であろうと異なる植物種由来であろうと）植物から取得された、配列番号2に構造的に及び/又は機能的に関連したタンパク質をコードする核酸配列であることが好ましい。この核酸が配列番号1若しくはその一部分又はこれらにハイブリダイズ可能な核酸配列によって表されることが好ましい。このハイブリダイズする配列は、上述されるようにNAP1-様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするか、又は配列番号2で表されるアミノ酸をコードするか又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸である。この用語はまた、遺伝子コードの縮重に起因してNAP1-様タンパク質をコードする核酸の変異体、アレル変異体及びNAP1-様タンパク質をコードする核酸の異なるスプライス変異体（1以上の介入配列によって分断される変異体を含む）を包含する。
【００２７】
本発明による方法はまた、上述されるようにNAP1-様タンパク質（配列番号1によってコードされるNAP1-様タンパク質等）をコードする核酸配列の一部分を用いて、又は上述されるようにNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列（配列番号1等）と好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列（このハイブリダイズする配列はNAP1-様活性を有するタンパク質をコードする）を用いることによって、又はNAP1-様タンパク質（配列番号2によって表されるもの等）のホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸を用いることによっても実施し得ることが有利である。
【００２８】
DNA配列の一部分とは、本来の（より大きな）DNA分子から誘導又は調製され、植物で発現される際に生育特性が改善された植物を生じるDNAの断片を指す。好ましくは、生育特性の改善は収量の増加、より好ましくは種子収量の増加であり、種子収量の増加が収穫指数の増加、種子の総重量の増加及び充填種子数の増加の1つ以上を含むことが最も好ましい。この一部分は、追加の制御要素を含む若しくは含まない多くの遺伝子を含んでもよいし、又は単にスペーサー配列等を含んでもよい。
【００２９】
本発明はまた、NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズ可能な核酸配列をも包含し、この核酸配列も本発明の方法を実施する際に有用であり得る。本明細書で定義される「ハイブリダイゼーション」という用語は、実質的に相同な相補ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスを言う。ハイブリダイゼーションプロセスは専ら溶液中で生じ得る（すなわち相補的核酸はいずれも溶液中に存在する）。係るプロセスに依存する分子生物学におけるツールには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR及びこれを基礎とする全ての方法）、サブストラクティブハイブリダイゼーション、ランダムプライマー伸長、ヌクレアーゼS1マッピング、プライマー伸長、逆転写、cDNA合成、RNAの差次的発現、およびDNA配列決定が含まれる。ハイブリダイゼーションプロセスは、磁性ビーズ、セファロースビーズ又は他の任意の樹脂等のマトリックスに固定化された相補的核酸の1つによっても生じ得る。係るプロセスに依存する分子生物学におけるツールには、ポリ(A＋)mRNAの単離が含まれる。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、ニトロセルロース若しくはナイロンメンブレン等の固体支持体に固定化された、又は例えばケイ酸含有支持体への例えばフォトリソグラフィーによって固定化された、相補的核酸の1つによっても生じ得る（後者は核酸アレイ若しくはマイクロアレイ又は核酸チップとして知られる）。係るプロセスに依存する分子生物学におけるツールには、RNA及びDNAゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション及びマイクロアレイハイブリダイゼーションが含まれる。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、核酸分子は一般的に熱的に又は化学的に変性されて、二本鎖を2つの一本鎖に分解する及び/又は一本鎖核酸からヘアピン若しくは他の二次構造を除去する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは温度、塩濃度及びハイブリダイゼーションバッファーの組成等の条件に影響される。
【００３０】
高い選択性を要求する用途のために、典型的には比較的ストリンジェントな条件を採用してハイブリッドを形成させることが望ましいであろう。例えば、比較的低い塩及び/又は高い温度条件（例えば約0.02M〜約0.15M NaClで約50℃〜約70℃の温度によって提供される）を選択するだろう。
【００３１】
したがって、ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェントな条件は、高温及び/又は低塩濃度（塩はNaCl及びクエン酸ナトリウムを含む）を含むが、ハイブリダイゼーションバッファー中にホルムアミドを含ませること及び/又はハイブリダイゼーションバッファー中の化合物（SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）等）の濃度を低くすること及び/又はハイブリダイゼーションバッファーから化合物（硫酸デキストラン又はポリエチレングリコール（分子密集を促進する）等）を排除することによっても影響し得る。十分に低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上で規定される本発明の方法に有用なDNA配列に相同な核酸の単離に特に好ましい。相同性に寄与する要素は、対立性、遺伝子コードの縮重及び好適なコドン使用頻度の差異を含む。ハイブリダイゼーション溶液中の一価陽イオンの存在により、2つの核酸鎖間の静電反発力を低減し、その結果、ハイブリッド形成を促進する。この効果は最大0.4Mのナトリウム濃度で可視化される。ホルムアミドはホルムアミド1％当たりDNA-DNA及びDNA-RNA二本鎖の融解温度を0.6〜0.7℃低減し、そして50％ホルムアミドの添加により30〜45℃でのハイブリダイゼーションを可能にするが、ハイブリダイゼーション率は低下するだろう。塩基対のミスマッチはハイブリダイゼーション率及び二本鎖の熱安定性を低減する。平均的なプローブ及び大きなプローブに関しては、Tm（標的配列の50％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする、規定のイオン強度及びpH下の温度）は塩基ミスマッチ％当たり約1℃減少する。
【００３２】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の関連で、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、かつ異なる環境パラメーター下で異なる。例えば、より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。特異性は典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の機能である。かかる洗浄の重大な要因には、最後の洗浄溶液のイオン強度及び温度が含まれる。
【００３３】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHにおける特定の配列についての熱融点（Tm）よりも低い約50℃となるよう選択される。Tmは溶液条件及びプローブの塩基組成に左右され、そして以下の式を用いて計算し得る：
Tm＝79.8℃＋(18.5xlog[Na＋])＋(58.4℃x％[G+C])−(820x(二本鎖中の塩基数)-1)−(0.5xホルムアミド％)
【００３４】
ハイブリッドのタイプに応じた代替的な式は当該技術分野で公知であり、例えば：
DNA-DNAハイブリッド(Meinkoth及びWahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm＝81.5℃＋16.6xlog[Na+]a＋0.41x％[G/Cb]−500x[Lc]-1−0.61xホルムアミド％
DNA-RNA又はRNA-RNAハイブリッド:
Tm＝79.8＋18.5(log10[Na+]a)＋0.58(G/Cb％)＋11.8(G/Cb％)2−820/Lc
オリゴ-DNA又はオリゴ-RNAdハイブリッド:
＜20ヌクレオチドに関して:Tm＝2(ln)
20−35ヌクレオチドに関して:Tm＝22＋1.46(ln)
a又は他の一価陽イオンに関して（但し、正確には0.01〜0.4Mの範囲）
bGC％に関して正確には30％〜75％の範囲
cL＝塩基対中の二本鎖の長さ
dオリゴ、オリゴヌクレオチド;ln、プライマーの効果的な長さ＝2×(G/C数)＋(A/T数)
注：1％ホルムアミド毎に、Tmは約0.6〜0.7℃減少するが、6M尿素の存在によりTmは約30℃減少する
【００３５】
より好適なストリンジェントな条件は温度がTmよりも20℃低い場合であり、最も好ましいストリンジェントな条件は温度がTmよりも10℃低い場合である。非特異的な結合は、多くの既知の方法（例えば、膜をタンパク質含有溶液でブロックすること、ハイブリダイゼーションバッファーへの異種RNA、DNA及びSDSの添加、及びRNアーゼによる処理等）のいずれか1つを用いることによっても制御し得る。
【００３６】
洗浄条件は典型的にはハイブリダイゼーションストリンジェンシーで又はこれ未満で実施される。一般的に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ又は遺伝子増幅検出手順に適当なストリンジェントな条件は上で記載されるものである。いくらかストリンジェントな条件も選択し得る。
【００３７】
ストリンジェンシーのレベルを規定するために、Sambrookら(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual,第3版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)を便利に参照することができる。低ストリンジェンシー条件の一例は、4〜6xSSC/0.1〜0.5％w/v SDS（37〜45℃で2〜3時間）である。ハイブリダイゼーションに関与する核酸の供給源及び濃度に応じて、代替的なストリンジェンシー条件（中ストリンジェント条件等）を採用し得る。中ストリンジェント条件の例には1〜4xSSC/0.25％ w/v SDS（45℃以上で2〜3時間）が含まれる。高ストリンジェンシー条件の一例には、0.1〜1xSSC/0.1％ w/v SDS（60℃で1〜3時間）が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の間に改変し得る様々なパラメーター（ストリンジェンシー条件を維持又は変更する）を知っている。例えば、他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、4×SSC、65℃でのハイブリダイゼーション、その後の0.1×SSC中65℃で約1時間の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の代替的な例は、50％ホルムアミド、4×SSC中、42℃である。ストリンジェントな条件のさらに別の例には、6×SSC、0.05xBLOTTO中、62℃でのハイブリダイゼーション及び2×SSC、0.1％ SDS(w/v)で、62℃での洗浄が含まれる。
【００３８】
本発明による方法は、NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライス変異体を用いて実施することもできる。本明細書で使用される「選択的スプライス変異体」という用語は、選択されたイントロン及び/又はエクソンが削除され、置換され又は添加されている核酸配列の変異体を包含する。係る変異体は、タンパク質の生物学的活性が影響されていないものであり、これはタンパク質の機能的セグメントを選択的に維持することによって達成することができる。係るスプライス変異体は天然に見出し得るし又は人工的であり得る。係るスプライス変異体を作製する方法は当該技術分野で周知である。したがって、本発明の別の態様によれば、植物の生育特性を改善する方法であって、植物においてNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライス変異体の発現をモジュレートすることを含む、並びに/又は選択的スプライス変異体によってコードされるNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルをモジュレートすることによる、上記方法が提供される。スプライス変異体が配列番号1で表される配列のスプライス変異体であることが好ましい。好ましくは改善された生育特性は収量の増加であり、より好ましくは種子収量の増加であり、種子収量の増加が収穫指数の増加、充填種子数の増加及び/又は種子の総重量の増加を含むことが最も好ましい。
【００３９】
本発明による方法が、さらにNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列のアレル変異体、好ましくは配列番号1で表される配列のアレル変異体を用いて実施できることが有利である。アレル変異体は天然に存在し、これらの天然のアレルの使用も本発明の方法の範囲に包含される。アレル変異体は一塩基多型（SNP）、並びに小さな挿入/欠失多型（INDEL）を包含する。INDELのサイズは通常は100bp未満である。SNP及びINDELは、大部分の生物の天然の多型株において最大のNAP1-様配列の変異体を形成する。これらは遺伝子のマッピング並びに遺伝子及び遺伝子機能の発見に有用である。これらはさらに、遺伝子座、例えば生育速度、植物のサイズ及び植物収量等のプロセス、植物の生長力、疾患耐性、ストレス耐性等の決定に関与する植物遺伝子の同定に有用である。
【００４０】
NAP1-様タンパク質又はそのホモログの活性は、遺伝子改変を（好ましくはNAP1-様遺伝子の遺伝子座に）導入することによってモジュレート（増加又は減少）し得る。本明細書で規定される遺伝子の遺伝子座は、目的の遺伝子及びコード領域の10KB上流又は下流を含むゲノム領域を指すべく使用される。「遺伝子改変」という用語は、ヒトの介入による、野生型細胞と比較した細胞の遺伝物質における変更を指し、これには遺伝子操作、育種又は突然変異誘発などの技術を含む。遺伝物質の変更はゲノムの改変を含み、エピソームのみならず植物細胞の染色体中の遺伝物質の付加、欠失及び置換を含む。この用語はまた、植物細胞への染色体外情報の付加も包含する。遺伝子改変がNAP1-様核酸の発現のモジュレート、より好ましくはNAP-1核酸の発現の増加を生じさせることが好ましい。
【００４１】
遺伝子改変は、例えば以下の方法のいずれか1つ（以上）によって導入し得る：TDNA活性化、TILLING、部位特異的突然変異誘発、相同的組換え、又はNAP1-様タンパク質若しくはそのホモログをコードする核酸を植物細胞中に導入しかつ発現させること。遺伝子改変の導入後、NAP1-様タンパク質の活性のモジュレートについて選別するステップが続く。NAP1-様タンパク質の活性のモジュレートが活性の増加であり、この活性の増加が生育特性が改善（種子収量の増加等）された植物を生じることが好ましい。選別ステップは、生育特性の改善の存在若しくは不在をモニタリングすること、又は導入された目的の核酸に結合した選択可能な若しくは走査可能なマーカー遺伝子の存在若しくは不在をモニタリングすることを基礎とし得る。
【００４２】
T-DNA活性化タギング（Hayashiら. Science (1992) 1350-1353）は、通常はプロモーター（さらに翻訳エンハンサー又はイントロンであり得る）を含むT-DNAを、立体配置中の遺伝子のコード領域の10KB上流若しくは下流又は目的の遺伝子のゲノム領域に、プロモーターが標的化遺伝子の発現を指示するように挿入することを含む。典型的には、その天然のプロモーターによる標的化遺伝子の発現の調節が破壊され、遺伝子は新たに導入されたプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは典型的にはT-DNAに組み込まれる。このT-DNAは、例えばアグロバクテリウム感染を介して、植物ゲノム中に無作為に挿入され、挿入されたT-DNAに近接する遺伝子の過剰発現を導く。生じたトランスジェニック植物は導入されたプロモーターに近接する遺伝子の過剰発現に起因して優性表現型を示す。導入されるべきプロモーターは、所望の生物（この場合は植物）において遺伝子の発現を指示可能な任意のプロモーターであり得る。例えば、構成的、組織優先、細胞型優先および誘導性プロモーターは全てT-DNA活性化における使用に適当である。
【００４３】
遺伝子改変は、TILLING（Targeted Induced Local Lesions IN Genomes）の技術を用いて、NAP1-様遺伝子の遺伝子座に導入してもよい。これはNAP1-様活性を示すことが可能なポリペプチドをコードするNAP1-様核酸の突然変異誘発型変異体を作製する及び/又は同定する、並びに実質的に単離するのに有用な突然変異誘発技術である。TILLINGも上記突然変異体を保有する植物の選別を可能にする。これらの突然変異体は、その天然形態の遺伝子によって示されるものよりもさらに高いNAP1-様活性を示し得る。TILLINGはまた、高密度突然変異誘発を高スループットスクリーニング法と組合せる。典型的にTILLINGに従うこのステップは、(a)EMS突然変異誘発（Redei及びKoncz, 1992; Feldmannら, 1994; Lightner及びCaspar, 1998）；(b)DNAの調製及び個体のプーリング；(c)目的の領域のPCR増幅；(d)ヘテロ二本鎖の形成を可能にするための変性及びアニーリング；(e)DHPLC（プール中のヘテロ二本鎖の存在がクロマトグラム中の過剰ピークとして検出される場合）；(f)突然変異個体の同定；及び(g)突然変異PCR産物の配列決定である。TILLINGのための方法は当該技術分野で周知である（Stemple 2004 (TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics. Nat Rev Genet. 2004 Feb;5(2):145-50.)に概説される、McCallum Nat Biotechnol. 2000 Apr; 18(4):455-7）。
【００４４】
部位特異的突然変異誘発はNAP1-様核酸の変異体又はその一部分を作製するために使用し得る。様々な方法（最も一般的にはPCRベースの方法）が部位特異的突然変異誘発を成すために利用される（current protocols in molecular biology. Wiley編.  http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html）。
【００４５】
TDNA活性化、TILLING及び部位特異的突然変異誘発が、新規アレル及びNAP1-様変異体の作製を可能にする技術の例である。
【００４６】
相同的組換えは、規定の選択した位置で選択した核酸のゲノムの導入を可能にする。相同的組換えは、下等動物（酵母又は蘚類フィスコミトレラ（Physcomitrella）等）について生物科学で常用される標準的技術である。植物において相同的組換えを実施する方法は、モデル生物についてのみならず（Offringaら.  Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation. 1990 EMBO J. 1990 Oct; 9(10):3077-84）、作物、例えばイネについても（Terada R, Urawa H, Inagaki Y, Tsugane K, Iida S. Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat Biotechnol. 2002. Iida及びTerada: A tale of two integrations, transgene and T-DNA: gene targeting by homologous recombination in rice.  Curr Opin Biotechnol. 2004 Apr; 15(2):132-8）記述されている。標的化されるべき核酸（これは本明細書下記で定義されるようにNAP1-様核酸又はその変異体であり得る）は、NAP1-様遺伝子の遺伝子座に標的化される必要はないが、例えば高発現の領域に導入してもよい。標的化されるべき核酸は、内因性遺伝子を置換するために使用される改良型アレルであってもよいし、内因性遺伝子に加えて導入してもよい。
【００４７】
NAP1-様タンパク質は、NAPドメイン、これに続く酸性C-末端領域からなる典型的なドメイン構成を有する。したがって、NAP1-様タンパク質の活性が維持されるか又は改変されるようなNAP1-様タンパク質のドメインの操作が、本発明の方法の実施に有用であることが想定される。変異体の好適なタイプは、生じるNAP1-様タンパク質がNAPドメイン並びに少なくとも13個のグルタミン酸及び/又はアスパラギン酸残基を含む20〜25アミノ酸の酸性C末端領域を含むことを条件として、ドメインの欠失、スタッキング又はDNAシャッフリング（例えばHeら, Science 288, 2360-2363, 2000;又は米国特許第5,811,238号及び6,395,547号参照）によって作製されるものを含む。方向性進化（directed evolution）もNAP1-様タンパク質をコードする核酸の変異体を作製するために使用し得る。これはDNAシャッフリング、その後の適当なスクリーニング及び/又は選択の反復からなり、NAP1-様核酸の変異体、又はNAP1-様ポリペプチドをコードするその一部分、又は改善した生物学的活性を有するそのホモログ若しくは一部分を作製する（Castleら, (2004) Science 304(5674): 1151-4; 米国特許第5,811,238号及び6,395,547号）。
【００４８】
したがって、本発明の別の態様として、対応する野生型植物と比較した際に植物の生育及び発達を改善する方法、好ましくは植物の収量を増加する方法、より好ましくは植物の種子収量を増加する方法であって、発現をモジュレートすること、好ましくは植物においてNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の発現を増加させること並びに/又は植物においてNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルをモジュレートすること、好ましくはNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルを増加させることを含み、その際、この核酸配列及びタンパク質が、
(i)好ましくは配列番号1で表される、NAP1-様タンパク質をコードする核酸、又は配列番号2で表されるNAP1-様タンパク質をコードする核酸；
(ii)NAP1-様タンパク質又はスプライス変異体によってコードされるNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライス変異体；
(iii)NAP1-様タンパク質又はアレル変異体によってコードされるNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列のアレル変異体；
(iv)NAP1-様コード核酸と、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な配列；
(v)NAP1-様タンパク質；
(vi)配列番号2で表されるNAP1-様タンパク質；
(vii)NAP1-様タンパク質、好ましくは配列番号2で提示されるNAP1-様タンパク質の、ホモログ及び誘導体、
から選択される変異体を含み、その際、該NAP1-様タンパク質がNAPドメインと酸性C末端とを含み、PP2aホスファターゼ阻害活性を有する、上記方法が提供される。
【００４９】
種子収量の増加が、収穫指数の増加、充填種子数の増加及び/又は種子の総重量の増加の1つ以上を含むことが好ましい。
【００５０】
本発明の方法では、核酸の、発現のモジュレーション及び特に発現の増加が想定される。NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現のモジュレーション（発現の増加若しくは減少）又はNAP1-様タンパク質自体の活性及び/若しくはレベルのモジュレーションは、特定の細胞又は組織における、遺伝子の発現の改変並びに/又は遺伝子産物（すなわちポリペプチド）の活性及び/若しくはレベルの改変を包含する。遺伝子発現の改変（増加若しくは減少）並びに/又は遺伝子産物の活性及び/若しくはレベルの改変（増加若しくは減少）は、例えば化学的手段及び/又は組換え手段によって達成し得る。遺伝子の発現及び/若しくは遺伝子産物のレベルのモジュレーション並びに/又は遺伝子産物の活性のモジュレーションは、NAP1-様コード遺伝子の発現のモジュレーションを通じて直接的に、並びに/又はNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルのモジュレーションを通じて直接的に、達成し得る。発現のモジュレーションは、内因性NAP1-様遺伝子の発現レベルの改変から生じ得るし、及び/又は予め植物に導入されたNAP1-様コード核酸の発現のモジュレーションからも生じ得る。同様に、NAP1-様タンパク質のレベル及び/又は活性のモジュレーションは、内因性NAP1-様遺伝子の発現レベルの改変の結果であり得るし、及び/又は予め植物に導入されたNAP1-様コード核酸の発現の改変からも生じ得る。加えて又は代替的に、上述される発現のモジュレーションは間接的な手法で達成され、例えばこれは、NAP1-様遺伝子の発現を制御するか、又はNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルに影響する因子のレベル及び/若しくは活性の減少若しくは増加の結果として達成し得る。
【００５１】
本発明の好適な実施形態に従って、NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現のモジュレーション並びに/又はNAP1-様タンパク質自体の活性及び/若しくはレベルのモジュレーションは、組換え手段によって達成される。係る組換え手段は、核酸の発現をモジュレートするための、並びに/又はタンパク質の活性及び/若しくはレベルをモジュレートするための、直接的及び/又は間接的アプローチを含み得る。
【００５２】
NAP1-様遺伝子の発現をモジュレートするための又はNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルをモジュレートするための直接的かつ好適なアプローチは、NAP1-様タンパク質又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする単離された核酸配列を植物に導入することを含む。核酸は、例えば形質転換によって植物に導入し得る。したがって、本発明の好適な態様に従って、植物の生育及び発達を改善する方法、特に植物の収量を増加する方法であって、植物の遺伝子改変を含み、遺伝子改変がNAP1-様コード核酸を植物に導入することを含む、上記方法が提供される。好ましくは、植物収量の増加は種子収量の増加であり、より好ましくは収穫指数の増加、充填種子数の増加又は種子の総重量の増加の1つ以上を含む。
【００５３】
本発明の好適な態様に従って、核酸の発現の増強又は増加が想定される。遺伝子若しくは遺伝子産物の発現を増強又は増加するための方法は当該技術分野で十分に文書化されており、例えば、適当な（好ましくは強力な）プロモーターによって駆動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用を含む。本明細書で使用される過剰発現という用語は、本来の野生型発現レベルに付加的な発現の任意形態を指す。植物に導入されるべき核酸及び/又は植物中で過剰発現されるべき核酸が、機能的に連結されるプロモーターに対してセンス方向であることが好ましい。好ましくは、過剰発現されるべき核酸はNAP1-様タンパク質をコードし、さらに好ましくはNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列は（好ましくはアブラナ科の）双子葉植物から単離され、さらに好ましくはこの配列はシロイヌナズナから単離され、最も好ましくはこの核酸配列は配列番号1若しくはその一部分によって表されるものであるか、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする。あるいは、NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号20（GenBank登録番号NM_101738）で表されるものであるか若しくはその一部分であり、あるいは配列番号21（GenBank登録番号NP_564063）で表されるアミノ酸配列又はそのホモログ、誘導体又は活性断片をコードする。本発明の適用性は、配列番号1で表される核酸の使用、及び配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列の使用に依存せず、配列番号2のホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする他の核酸配列、又は配列番号1の一部分、又は配列番号1とハイブリダイズする配列を本発明の方法に使用し得ることに注意すべきである。特に、タバコ（配列番号7若しくは9）、トウモロコシ（配列番号13若しくは19）、アルファルファ（Medicago sativa）（配列番号11）、トマト（配列番号23）又はイネ（配列番号15若しくは17）等の他の種由来のホモログも本発明の方法に有用である。
【００５４】
本発明は、植物の生育特性を改善する方法又は生育特性が改善した植物を作製する方法であって、生育特性が、分蘖枝（tiller）数の増加、第1円錐花序（最も高い円錐花序及び垂直に整列させる際に最も高い円錐花序と重複する全ての円錐花序）数の増加、第2円錐花序数の増加、種子の総数の増加、充填種子数の増加、植物当たりの種子総重量の増加、収穫指数の増加、千粒重の増加のいずれか1つ以上を含む、収量の増加を含む、上記方法に関する。本発明はまた、上記生育特性の一つを、他の生育特性の一つに不利益を生じることなく改善する（例えば円錐花序当たり同一数の小穂を維持しながら充填種子数を増加させる）方法を提供する。
【００５５】
「収量の増加」という用語は、植物の1つ以上の部分のバイオマスが、野生型植物の対応する部分と相対して増加することを包含する。この用語は、それぞれ対応する野生型植物と相対した、種子のバイオマス（種子重量）の増加並びに/又は（充填）種子数及び/若しくは種子のサイズの増加並びに/又は種子体積の増加を含む、種子の収量の増加を含む。作物に応じて、当該植物の一部分は地上バイオマス（例えばトウモロコシ、貯蔵飼料として使用される場合はサトウキビ）、根（例えば砂糖大根）、果実（例えばトマト）、ワタ繊維又は経済的価値のある植物の他の任意の一部分であり得る。イネを一例にとると、収量の増加は以下の1つ以上の増加によって明らかにされる：特に、植物当たりの円錐花序数、円錐花序当たりの小穂数、円錐花序当たりの花の数、種子の充填率の増加、千粒重の増加。トウモロコシに関して、種子収量の増加は、例えば穂当たりの（種子の）列の増加及び/又は列当たりの穀粒数の増加に反映され得る。種子のサイズ及び/又は体積の増加も種子の組成に影響し得る。種子収量の増加は花の数及び/又はサイズの増加に起因し得る。収量の増加は、合計バイオマスにわたる収穫可能な部分（種子等）の収量の比率として表現される収穫指数、又は千粒重も増加し得る。収量の増加はまた、より高い密度（1ヘクタール又は1エーカー当たりの植物数）で作付けする能力も包含する。
【００５６】
改変した細胞分裂も収量の増加に寄与し得る。「改変した細胞分裂」という用語は、細胞分裂若しくは異常な細胞分裂/細胞質分裂の増加又は減少、改変した分裂面、改変した細胞極性、改変した細胞分化を包含する。この用語はまた、核内有糸分裂、アサイトキネシス（acytokinesis）、染色体倍化、多糸性及び核内倍化も含む。
【００５７】
収量が増加した植物が、対応する野生型植物と比較した際に、改変した生育速度をさらに示すことを想定することができる。本明細書で使用される「改変した生育速度」という用語は、これに限定されるものではないが、植物の生活環における1以上の段階での、植物の1以上の部分（種子を含む）のより急速な生育速度を包含する。生育が改善された植物は改変した生長曲線を示し得るし、そのTmid又はT90（対応する各野生型植物と相対して、それぞれその最大サイズの半分又は最大サイズの90％に達するのに要する時間）について改変した値を有し得る。「生育の改善」という用語は、生長力の増加、早期開花、サイクル時間の改変を包含する。
【００５８】
本発明の好適な特徴に従って、本発明の方法の実施により、収量が増加した植物、特に種子収量が増加した植物を生じる。種子収量の増加が、少なくとも、対照植物と相対した充填種子数、種子の総重量及び収穫指数のいずれか1つ以上の増加を含むことが好ましい。したがって、本発明によれば、植物の収量を増加する方法であって、該方法が植物においてNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の発現をモジュレートすること及び/又はNAP1-様タンパク質自体の活性をモジュレートすることを含む、上記方法が提供され、その際、NAP1-様タンパク質が配列番号1で表される核酸配列若しくはその一部分によってコードされるか、又はこれらとハイブリダイズ可能な配列によってコードされるか、あるいはNAP1-様タンパク質が配列番号2で表されるか又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片であることが好ましい。あるいは、NAP1-様タンパク質は、配列番号20（GenBank登録番号NM_101738）、配列番号6、8、10、12、14、16、18若しくは22で表される核酸配列又はその一部分、又はこれらとハイブリダイズ可能な配列によってコードされてもよいし、あるいはNAP1-様タンパク質は配列番号21（GenBank登録番号NP_564063）、配列番号7、9、11、13、15、17、19、23で表されるものであってもよいし、又はそれらの任意のホモログ、誘導体若しくは活性断片であってもよい。
【００５９】
本発明の方法は作物へ適用することが有利であり、というのも本発明の方法は、植物の、種子の総重量、充填種子数及び収穫指数の1つ以上を増加するために使用されるからである。したがって、本発明の方法は、その種子を目的として栽培される作物（穀類、ヒマワリ、ダイズ、エンドウ、アマ、ルピナス、カノーラ等）に特に有用である。したがって、本発明の特定の実施形態は、穀類の種子収量を増加する（種子の総重量を増加する、充填種子数を増加する及び/又は収穫指数を増加する）方法に関する。
【００６０】
本発明の別の実施形態に従って、本発明の方法に有用なヌクレオチド配列の導入及び/又は発現を促進するための遺伝子構築物及びベクターが提供される。したがって、本発明の第2の実施形態によって、植物における発現用の遺伝子構築物であって、
(i)NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列；
(ii)植物中で(i)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列；及び場合により、
(iii)転写終結配列、
を含む、上記構築物が提供される。
【００６１】
本発明の方法に有用な構築物は、当業者に周知の組換えDNA技術を用いて作製し得る。この遺伝子構築物は、植物へ形質転換するのに適当であり、かつ形質転換した細胞中での目的の遺伝子の発現に適当なベクター（市販のものであり得る）に挿入し得る。遺伝子構築物は、核酸配列が原核及び/又は真核宿主細胞中での発現を可能にする1以上の制御配列に機能的に連結されている発現ベクターであり得る。
【００６２】
本発明の好適な実施形態によれば、遺伝子構築物は核酸配列を過剰発現するよう設計された発現ベクターである。NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現及び/又はNAP1-様タンパク質自体の活性をモジュレート可能な核酸配列は、NAP1-様タンパク質又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸（本明細書下記に記載される任意の核酸配列等）であり得る。好適な核酸配列は配列番号1で表される配列若しくはその一部分又はこれらとハイブリダイズ可能な配列、あるいは配列番号2で表されるタンパク質又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸配列である。この核酸が機能的に連結される制御配列に対してセンス配向でクローニングされることが好ましい。
【００６３】
植物は、1以上の制御配列（少なくともプロモーター）と機能的に連結された目的の配列（すなわち、NAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現をモジュレート可能な核酸配列）を含むベクターで形質転換される。「調節要素」、「制御配列」及び「プロモーター」という用語は全て本明細書中で交換可能に使用され、一般的な文脈中で、これらが連結される配列の発現を達成することが可能な調節核酸配列を指すべく使用されるものとする。古典的な真核細胞ゲノム遺伝子に由来する転写調節配列（CCAATボックス配列を含むか又は含まない、正確な転写開始に必要なTATAボックスを含む）、及び発生刺激（developmental stimuli）及び/又は外部刺激に応じて、又は組織特異的な様式で遺伝子発現を改変する追加の調節要素（すなわち上流活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）が上記用語に含まれる。古典的な原核細胞遺伝子の転写調節配列もこの用語に含まれ、この場合は-35ボックス配列及び/又は-10ボックス転写調節配列をも含み得る。「調節要素」という用語は、細胞、組織又は器官での核酸分子の発現を与える、活性化する又は増強する、合成融合分子又は誘導体をも包含する。本明細書で使用される「機能的に連結された」という用語は、プロモーター配列が目的の遺伝子の転写を開始できるような、プロモーター配列と目的の遺伝子との機能的な結合を指す。
【００６４】
所望の結果に応じてあらゆるタイプのプロモーターが核酸配列の発現を駆動するために使用し得ることが有利である。NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列が構成的プロモーターに機能的に連結されることが好ましい。本明細書で規定される「構成的」という用語は、少なくとも1つの組織又は器官で顕著に、及び植物の任意のライフステージで顕著に発現されるプロモーターを指す。プロモーターが植物全体にわたって顕著に発現されることが好ましい。構成性プロモーターがイネ由来のGOS2プロモーター、又はこれと類似の強さのプロモーター及び/若しくはこれと類似の発現パターンを有するプロモーターであることが好ましい。あるいは、組織特異的プロモーターを使用してもよい。例えば、種子収量の増加が想定される場合には、種子優先、花優先、分裂組織優先プロモーター又は分裂組織で活性のプロモーターの使用を企図することができる。プロモーターの強度及び/又は発現パターンは、例えばレポーター遺伝子へプロモーターをカップリングすること、及び植物の様々な組織中でのレポーター遺伝子の発現をアッセイすることによって分析し得る。当業者に周知の適当なレポーター遺伝子の一つはβ-グルクロニダーゼである。
【００６５】
それぞれの発現パターンを有する代替的なプロモーターの例は表2に提示される。これらのプロモーター又はその誘導体は本発明の方法に有用であり得る。
【表２】
2007530063.tif 000004
2007530063.tif 000005
2007530063.tif 000006
【００６６】
場合により、1以上のターミネーター配列も植物に導入される構築物中で使用し得る。「ターミネーター」という用語は、一次転写産物の3'プロセシング及びポリアデニル化並びに転写の終結を合図する制御配列（転写ユニットの末端のDNA配列である）を包含する。更なる制御要素は翻訳エンハンサーだけでなく転写エンハンサーも含み得る。当業者は本発明の実施の際の使用に適当であり得るターミネーター及びエンハンサー配列に気付くであろう。係る配列は当業者により知られるか又は容易に取得され得る。
【００６７】
本発明の遺伝子構築物は、特定の細胞型の維持及び/又は複製に必要な複製配列の起点をさらに含み得る。遺伝子構築物がエピソームの遺伝子要素（例えば、プラスミド又はコスミド分子）として細菌細胞中で維持される必要がある場合がその一例である。好適な複製起点は、これに限定されるものではないがf1-ori及びcolE1を含む。
【００６８】
遺伝子構築物は、場合により選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。本明細書で使用されるように、「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含み、これは本発明の核酸構築物でトランスフェクト又は形質転換される細胞の同定及び/又は選別を容易にするために該細胞中で発現される。適当なマーカーは、抗生物質又は除草剤耐性を付与するマーカーから選別してもよく、これらは新規代謝的特性を導入するか又は視覚的選別を可能にする。選択可能なマーカー遺伝子の例には、抗生物質（ネオマイシン及びカナマイシンをリン酸化するnptlI、又はハイグロマイシンをリン酸化するhpt等）、除草剤（例えばBastaに対する耐性を与えるbar；グリホサートに対する耐性を与えるaroA又はgox）に対する耐性を付与する遺伝子、又は代謝特性を与える遺伝子（植物に単一炭素源としてのマンノースの使用を可能にするmanA等）が含まれる。視覚マーカー遺伝子は色（例えばβ-グルクロニダーゼ、GUS）、発光（ルシフェラーゼ等）又は蛍光（緑色蛍光タンパク質（GFP）及びその誘導体）の形成をもたらす。
【００６９】
好適な実施形態では、上記遺伝子構築物は、好ましくは構成的プロモーターである、プロモーター（イネGOS2プロモーター等）にセンス配向で結合されたNAP1-様遺伝子を含む。したがって、本発明の別の態様は、イネGOS2プロモーター、シロイヌナズナNAP1-様遺伝子及びT-ゼイン＋T-ルビスコΔGA転写ターミネーター配列を含む、配列番号3に本質的に類似する発現カセットを有するベクター構築物である。配列番号3に本質的に類似する配列は、配列番号2と相同なタンパク質をコードする核酸又は配列番号1にハイブリダイズする核酸を包含し、該核酸はイネGOS2プロモーター又はこれと類似の発現パターンを有するプロモーターと機能的に連結され、及び/又は該核酸は転写終結配列と連結される。
【００７０】
したがって、本発明の別の態様によって、
(i)配列番号1で表される核酸配列又はその相補鎖；
(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸配列；
(iii)上記(i)又は(ii)の核酸配列と（好ましくはストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズ可能な核酸配列（ここでハイブリダイズする配列がNAP1-様タンパク質活性を有するタンパク質をコードすることが好ましい）；
(iv)遺伝子コードの結果として縮重された上記(i)〜(iii)の核酸配列；
(v)(i)〜(iii)の核酸配列に対するアレル変異体である核酸配列；
(vi)(i)〜(iii)の核酸配列に対する選択的スプライス変異体である核酸配列；
を含む群から選択される、NAP1-様タンパク質をコードする核酸配列を保持する発現カセットを含む、遺伝子構築物が提供される。
【００７１】
本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な植物をも包含する。したがって、本発明は、本発明の方法によって取得可能な植物であって、収量が増加されており、NAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルがモジュレートされている、並びに/又はNAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現がモジュレートされている、上記植物を提供する。この植物がNAP1-様タンパク質をコードする単離された核酸配列を含むトランスジェニック植物であり、該トランスジェニック植物が収量の増加について選択されている点で特徴付けられることが好ましい。このトランスジェニック植物がNAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現のモジュレーションに関して選択されていることがさらに好ましい。このトランスジェニック植物が配列番号2で表されるNAP1-様タンパク質をコードする核酸の発現のモジュレーションに関して選択されていることがより一層好ましい。
【００７２】
本発明の第3の実施形態に従って、生育特性が改善されたトランスジェニック植物の製造方法であって、植物での、上述されるNAP1-様タンパク質をコードする核酸の導入及び発現を含む、上記方法が提供される。好ましくは生育特性の改善は収量の増加、より好ましくは種子収量の増加を含み、最も好ましくは充填種子数の増加、収穫指数の増加又は種子の総重量の増加の1つ以上を含む。
【００７３】
より具体的には、本発明は収量が増加したトランスジェニック植物の作製方法であって、
(i)植物細胞にNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列を導入すること；
(ii)トランスジェニック植物細胞から植物を再生及び/又は生育すること、
を含む、上記方法を提供する。
【００７４】
NAP1-様タンパク質自体及び/又はNAP1-様核酸自体は、植物細胞又は植物自体に直接的に導入し得る（植物の組織、器官又他の任意の部分への導入を含む）。本発明の好適な特徴に従って、核酸が形質転換によって植物に導入されることが好ましい。この核酸が配列番号1若しくはその一部分又はこれらとハイブリダイズ可能な配列によって表されるものであることが好ましく、あるいは該核酸は配列番号2で表されるアミノ酸配列又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片をコードする核酸である。あるいは、前記核酸配列は、配列番号20（GenBank登録番号NM_101738）、配列番号6、8、10、12、14、16、18、22で提示されるもの、若しくはその一部分、又は上記配列のいずれかとハイブリダイズ可能な配列である。あるいは、前記アミノ酸配列は配列番号21（GenBank登録番号NP_564063）、配列番号7、9、11、13、15、17、19、23で提示される配列又はそのホモログ、誘導体若しくは活性断片であり得る。
【００７５】
本明細書で言及される「形質転換」という用語は、移入に使用される方法に関りなく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの移入を包含する。器官形成によるか又は胚形成によるかに関らず、その後のクローン増殖が可能な植物組織は、本発明の遺伝子構築物で形質転換することができ、これから全植物（whole plant）を再生し得る。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種で利用可能かつ最も適当なクローン増殖システムに応じて変化するだろう。例示的な組織標的には、リーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大型配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽及び根分裂組織）、及び誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織及び胚軸分裂組織）が含まれる。ポリヌクレオチドは宿主細胞に一過的に又は安定的に導入してもよいし、例えばプラスミドのように組み込まれずに維持されてもよい。あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。生じる形質転換型植物細胞は、その後、当業者に公知の様式で形質転換型植物を再生するために使用することができる。
【００７６】
現在では、植物種の形質転換は極めて慣用的な技術である。種々の形質転換法のいずれかを用いて目的の遺伝子を適当な祖先細胞に導入し得ることが有利である。形質転換法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離DNAの取り込みを増加する化学物質、植物への直接的なDNAの注入、粒子銃衝突、ウイルス又は花粉を用いた形質転換、及びマイクロインジェクションが含まれる。方法は原形質体用のカルシウム/ポリエチレングリコール法（Krens, F.A.ら, 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu Iら, June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373）；原形質体のエレクトロポレーション（Shillito R.D.ら, 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102）；植物材料へのマイクロインジェクション（Crossway A.ら, 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185）；DNA又はRNA被覆粒子衝突（Klein T.M.ら, 1987, Nature 327, 70）；（非統合）ウイルスの感染等から選択し得る。NAP1-様遺伝子を発現するトランスジェニックイネ植物が、イネの形質転換のための周知方法のいずれかを用いて、アグロバクテリウム仲介形質転換を介して作製されることが好ましく、これは例えば以下のいずれかに記載される：ヨーロッパ特許出願EP 1198985 A1、Aldemita及びHodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chanら. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hieiら. (Plant J. 6 (2) 271-282, 1994)（その開示は参照により本明細書に完全に記載されているかのごとく組み込まれる）。トウモロコシの形質転換の場合、好適な方法はIshidaら(Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50)又はFrameら(Plant Physiol. 2002 May; 129(1): 13-22)(その開示は参照により本明細書に完全に記載されているかのごとく組み込まれる）のいずれかに記載されるものである。
【００７７】
一般的には形質転換後に、植物細胞又は細胞集団が、目的の遺伝子と共に共移入された植物で発現可能な遺伝子によってコードされる1以上のマーカーの存在について選別され、その後、形質転換された物質が全植物へ再生される。
【００７８】
DNA移入及び再生後、形質転換されたと推定される植物を、例えばサザン分析を用いて、目的の遺伝子の存在、コピー数及び/又はゲノム構成について評価し得る。あるいは又は加えて、新たに導入されたDNAの発現レベルは、ノーザン及び/又はウエスタン分析（いずれの技術も当業者に周知である）を用いてモニターし得る。
【００７９】
作製された形質転換植物は、種々の手段、例えばクローン増殖又は古典的な育種技術によって繁殖し得る。例えば、第1世代（又はT1）の形質転換植物は、自家受粉されてホモ接合の第2世代（又はT2）形質転換体を生じ、T2植物は古典的な育種技術を通じてさらに繁殖し得る。
【００８０】
作製された形質転換生物は様々な形態を採り得る。例えば、これらは形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ；クローン性形質転換体（clonal transformant）(例えば、全ての細胞が、形質転換されて発現カセットを含む)；形質転換組織と非形質転換組織との移植体（例えば、植物において、非形質転換移植片に移植された形質転換根茎）であり得る。
【００８１】
本発明は本明細書に記載される方法のいずれかによって作製される任意の植物細胞又は植物、及びその全ての植物部位および珠芽まで明確に拡張される。本発明は上述の方法のいずれかによって作製されている一次形質転換体若しくはトランスフェクト細胞、組織、器官又は全植物の、後代をさらに包含するよう拡張され、これは後代が本発明の方法によって親で生じたものと同一の遺伝子型及び/又は表現型特性を示すことを唯一の条件とする。本発明はNAP1-様タンパク質のレベル及び/又は活性をモジュレート可能なタンパク質をコードする単離された核酸分子を含む宿主細胞をさらに含み、その際、該タンパク質がNAP1-様タンパク質であることが好ましい。本発明の好適な宿主細胞は植物細胞である。したがって、本発明は、宿主細胞又はトランスジェニック植物がNAP1-様タンパク質をコードする核酸配列の発現をモジュレートする並びに/又はNAP1-様タンパク質の活性及び/若しくはレベルをモジュレートする点で特徴付けられる、生育特性が改変された宿主細胞又はトランスジェニック植物をさらに包含する。改変された生育特性が収量の増加、より好ましくは種子収量の増加を含むことが好ましい。
【００８２】
本発明は植物の収穫可能な部分（これに限定されるものではないが、種子、葉、果実、花、茎又は茎培養物、根茎、根、塊茎及び球根等）までさらに拡張される。本発明はさらに、係る植物の収穫可能な部分に直接由来する産物（乾燥ペレット若しくは粉末、油、脂肪及び脂肪酸、デンプン又はタンパク質等）に関する。
【００８３】
本明細書で使用される「植物」という用語は、全植物、この植物及び植物部位の祖先及び後代、植物細胞、組織並びに器官を包含する。したがって、「植物」という用語は、浮遊培養物、胚、分裂領域、カルス組織、葉、花、果実、種子、根（根茎及び塊茎を含む）、シュート、球根、茎、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子をさらに包含する。本発明の方法に特に有用な植物は、藻類、シダ類、並びに緑色植物上科、特に単子葉植物及び双子葉植物に属する全ての植物を含み、飼料用（fodder又はforage）マメ科植物、観賞用植物、作物、樹木、又は特にアベルモスクス・エスピーピー（Abelmoschus spp.）、エイサー・エスピーピー（Acer spp.）、アクチニディア・エスピーピー（Actinidia spp.）、アグロピロン・エスピーピー（Agropyron spp.）、アリウム・エスピーピー（Allium spp.）、アマランサス・エスピーピー（Amaranthus spp.）、アナナス・コモサス（Ananas comosus）、アンノナ・エスピーピー（Annona spp.）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、アラキス・エスピーピー（Arachis spp）、アルトカルプス・エスピーピー（Artocarpus spp.）、アスパラガス・オフィシナリス（Asparagus officinalis）、アベナ・サティバ（Avena sativa）、アベロア・カランボラ（Averrhoa carambola）、ベニンカサ・ヒスピダ（Benincasa hispida）、ベルソレティア・エクセルセア（Bertholletia excelsea）、ベタ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ブラッシカ・エスピーピー（Brassica spp.）、カダバ・ファリノーサ（Cadaba farinosa）、カメリア・シネンシス（Camellia sinensis）、カンナ・インディカ（Canna indica）、カプシカム・エスピーピー（Capsicum spp.）カリカ・パパヤ（Carica papaya）、カリッサ・マクロカルパ（Carissa macrocarpa）、カルタムス・ティンクトリウス（Carthamus tinctorius）、カリヤ・エスピーピー（Carya spp.）、カスタネア・エスピーピー（Castanea spp.）、チコリウム・エンダイブ（Cichorium endivia）、キンナモムム・エスピーピー（Cinnamomum spp.）、キトルルス・ラナツス（Citrullus lanatus）、キトルス・エスピーピー（Citrus spp.）、ココス・エスピーピー（Cocos spp.）、コーヒー・エスピーピー（Coffea spp.）、コーラ・エスピーピー（Cola spp.）、コロカシア・エスクレンタ（Colocasia esculenta）、コーリルス・エスピーピー（Corylus spp.）、クラタエグス・エスピーピー（Crataegus spp.）、ククミス・エスピーピー（Cucumis spp.）、ククルビタ・エスピーピー（Cucurbita spp.）、キナラ・エスピーピー（Cynara spp.）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デスモディウム・エスピーピー（Desmodium spp.）、ジモカルプス・ロンガン（Dimocarpus longan）、ジオスコレア・エスピーピー（Dioscorea spp.）、ジオスピロス・エスピーピー（Diospyros spp.）、エキノクロア・エスピーピー（Echinochloa spp.）、エレウシネ・コラカナ（Eleusine coracana）、エリオボティラ・ジャポニカ（Eriobotrya japonica）、ユーグレナ・ユニフロラ（Eugenia uniflora）、ファゴフィーラム・エスピーピー（Fagopyrum spp.）、ファグス・エスピーピー（Fagus spp.）、フィクス・カリカ（Ficus carica）、フォーチュネラ・エスピーピー（Fortunella spp.）、フラガリア・エスピーピー（Fragaria spp.）、ギンクゴ・ビロバ（Ginkgo biloba）、グリシン・エスピーピー（Glycine spp.）、ゴシッピウム・ヒルスーツム（Gossypium hirsutum）、ヘリアンサス・エスピーピー（Helianthus spp.）、ハイビスカス・エスピーピー（Hibiscus spp.）、ホルデウム・エスピーピー（Hordeum spp.）、イポモエア・バタタス（Ipomoea batatas）、ジュグランス・エスピーピー（Juglans spp.）、ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）、ラチラス・エスピーピー（Lathyrus spp.）、レムナ・エスピーピー（Lemna spp.）、レンス・カリナリス（Lens culinaris）、リヌム・ウシタティッシムム（Linum usitatissimum）、レイシ・チネンシス（Litchi chinensis）、ローツス・エスピーピー（Lotus spp.）、ルファ・アクタングラ（Luffa acutangula）、ルピヌス・エスピーピー（Lupinus spp.）、マクロチロマ・エスピーピー（Macrotyloma spp.）、マルピギア・エマルギナータ（Malpighia emarginata）、マルス・エスピーピー（Malus spp.）、マンメア・アメリカーナ（Mammea americana）、マンギフェラ・インディカ（Mangifera indica）、マニホット・エスピーピー（Manihot spp.）、マニルカラ・ザポタ（Manilkara zapota）、メディカゴ・サティバ（Medicago sativa）、メリロツス・エスピーピー（Melilotus spp.）、メンサ・エスピーピー（Mentha spp.）、モモルディカ・エスピーピー（Momordica spp.）、モルス・ニグラ（Morus nigra）、ムサ・エスピーピー（Musa spp.）、ニコチアナ・エスピーピー（Nicotiana spp.）、オレア・エスピーピー（Olea spp.）、オプンティア・エスピーピー（Opuntia spp.）、オルニトプス・エスピーピー（Ornithopus spp.）、オリザ・エスピーピー（Oryza spp.）、パニキュム・ミリアセウム（Panicum miliaceum）、パッシフロラ・エデュリス（Passiflora edulis）、パスティナカ・サティバ（Pastinaca sativa）、ペルセア・エスピーピー（Persea spp.）、ペトロセリヌム・クリスプム（Petroselinum crispum）、ファセオルス・エスピーピー（Phaseolus spp.）、フェニックス・エスピーピー（Phoenix spp.）、フィサリス・エスピーピー（Physalis spp.）、ピヌス・エスピーピー（Pinus spp.）、ピスタキア・ベラ（Pistacia vera）、ピスム・エスピーピー（Pisum spp.）、ポア・エスピーピー（Poa spp.）、ポプルス・エスピーピー（Populus spp.）、プロソピス・エスピーピー（Prosopis spp.）、プルヌス・エスピーピー（Prunus spp.）、プシディウム・エスピーピー（Psidium spp.）、プニカ・グラナツム（Punica granatum）、ピルス・コミュニス（Pyrus communis）、クエルクス・エスピーピー（Quercus spp.）、ラファヌス・サティブス（Raphanus sativus）、レウム・ラバーバルム（Rheum rhabarbarum）、リベス・エスピーピー（Ribes spp.）、ルブス・エスピーピー（Rubus spp.）、サッカルム・エスピーピー（Saccharum spp.）、サンブクス・エスピーピー（Sambucus spp.）、セカレ・セレアレ（Secale cereale）、セサムム・エスピーピー（Sesamum spp.）、ソレヌム・エスピーピー（Solanum spp.）、ソルガム・ビコロル（Sorghum bicolor）、スピナシア・エスピーピー（Spinacia spp.）、シジギウム・エスピーピー（Syzygium spp.）、タマリンダス・インディカ（Tamarindus indica）、テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao）、トリフォリウム・エスピーピー（Trifolium spp.）、トリチコセケール・リンパウイ（Triticosecale rimpaui）、トリティクム・エスピーピー（Triticum spp.）、ワクシニウム・エスピーピー（Vaccinium spp.）、ビシア・エスピーピー（Vicia spp.）、ビグナ・エスピーピー（Vigna spp.）、ビティス・エスピーピー（Vitis spp.）、ジー・メイス（Zea mays）、ジザニア・パルストリス（Zizania palustris）、ジジフス・エ���ピーピー（Ziziphus spp.）を含むリストから選択される低木を含む。
【００８４】
本発明の好適な特徴によれば、植物はダイズ、ヒマワリ、カノーラ、アルファルファ、アブラナ種子又はワタを含む作物である。さらに好ましくは、本発明による植物は、サトウキビ等の単子葉植物であり、最も好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、キビ、オオムギ、オートムギ、モロコシ等の穀類である。
【００８５】
本発明は、NAP1-様タンパク質をコードする核酸、その一部分又は変異体の使用、及びNAP1-様ポリペプチド、そのホモログ又は誘導体の使用をさらに包含する。
【００８６】
係る使用の一つは、植物の生育特性の改善に関連し、特に収量、とりわけ種子収量の改善に関する。種子収量は以下の1以上を含み得る：特に、種子数の増加、充填種子数の増加、種子の総重量の増加、収穫指数の増加、千粒重の増加、種子充填率。好ましくは、NAP1-様タンパク質又はNAP1-様タンパク質をコードする核酸が植物起源であり、より好ましくは双子葉植物由来であり、さらに好ましくはアブラナ科由来であり、最も好ましくはNAP1-様タンパク質は配列番号1でコードされるか又は配列番号2で表されるものである。
【００８７】
NAP1-様核酸若しくはその変異体又はNAP1-様ポリペプチド若しくはそのホモログは、NAP1-様遺伝子又はその変異体と遺伝子的に結合し得るDNAマーカーを同定する育種プログラムにおける使用を見出し得る。NAP1-様遺伝子若しくはその変異体又はNAP1-様タンパク質若しくはそのホモログは、分子マーカーを規定するために使用し得る。このDNA又はタンパク質マーカーは、その後、育種プログラムにおいて生育特性が改善された植物を選別するために使用し得る。NAP1-様遺伝子又はその変異体は、例えば、配列番号1で表される核酸又は上述のホモログのいずれかをコードする核酸であり得る。
【００８８】
NAP1-様タンパク質をコードする遺伝子のアレル変異体も、マーカー利用（marker-assisted）育種プログラムにおける使用を見出し得る。係る育種プログラムはしばしば植物の突然変異誘発処理（例えばEMS突然変異誘発を用いる）によるアレル変異体の導入を要する。あるいは、このプログラムは非意図的に生じるいわゆる「天然」起源のアレル変異体の収集から開始し得る。次いで、アレル変異体の同定が、例えばPCRによって行われる。これに植物で生育特性の改善（種子収量の増加等）を生じる問題の配列の優れたアレル変異体を選択するための選択ステップが続く。選択は、典型的には問題の配列の異なるアレル変異体（例えば配列番号1の、又は上述した植物のホモログのいずれかをコードする核酸の、異なるアレル変異体）を含む植物の生育能をモニタリングすることによって実施される。生育能は温室又は畑でモニターし得る。別の任意ステップとして、種子収量の増加を生じる優れたアレル変異体が同定された植物を、他の植物と交配させることを含む。これは、例えば関心のある表現型特性の組合せを作製するために使用することができる。
【００８９】
NAP1-様核酸又はその変異体はまた、遺伝子を遺伝子的かつ物理的にマッピングするためのプローブ（これらは該遺伝子の一部である）として、並びにこれらの遺伝子と連関する形質に対するマーカーとしても使用し得る。係る情報は所望の表現型を有する系統を開発するための植物育種において有用であり得る。NAP1-様核酸又はその変異体の上記使用は、少なくとも10ヌクレオチドの長さの核酸配列のみを要する。NAP1-様核酸又はその変異体は制限断片長多型（RFLP）マーカーとして使用し得る。制限消化した植物のゲノムDNAのサザンブロットは、NAP1-様核酸又はその変異体で精査し得る。その後、遺伝子マップを構築するために、生じたバンドパターンをMapMaker（Landerら(1987) Genomics 1, 174-181）等のコンピュータープログラムを用いた遺伝子分析に供することもできる。さらに、この核酸は、規定の遺伝子交雑の親及び後代を表す個体のセットの、制限エンドヌクレアーゼ処理したゲノムDNAを含むサザンブロットを精査するために使用し得る。DNA多型の分離は、この集団を用いて予め取得された遺伝子マップにおける、NAP1-様核酸又はその変異体の位置を推定すべく注目及び使用される（Botsteinら(1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331）。
【００９０】
遺伝子マッピングにおいて使用するための、植物遺伝子由来のプローブの作製及び使用は、Bematzky及びTanksley（Plant Mol. Biol. Reporter 4, 37-41, 1986）に記載されている。非常に多くの刊行物が、上で概説した方法論又はその変形法を用いた特定のcDNAクローンの遺伝子マッピングを記載している。例えば、F2異系交配集団、戻し交配集団、ランダムに交配させた集団、準同質遺伝子系統、及び他の個体のセットがマッピングに使用し得る。係る方法論は当業者に周知である。
【００９１】
核酸プローブは物理的マッピング（すなわち、物理的マップへの配列の位置付け；Hoheiselら: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346、及びその中で引用される参考文献を参照）にも使用し得る。
【００９２】
別の実施形態では、核酸プローブはin situハイブリダイゼーション（FISH）マッピング（Trask (1991) Trends Genet. 7, 149-154）における直接的蛍光に使用し得る。現在のFISHマッピング法は巨大なクローン（数〜数百kb；Laanら(1995) Genome Res. 5, 13-20参照）の使用を好むが、感度の改善により、より短いプローブを用いたFISHマッピングの使用を許容し得る。
【００９３】
遺伝子マッピング及び物理的マッピングにおける様々な核酸増幅ベースの方法を、この核酸を用いて実施し得る。例として、アレル特異的増幅（Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11, 95-96）、PCR増幅断片多型（CAPS；Sheffieldら(1993) Genomics 16, 325-332）、アレル特異的連結（Landegrenら(1988) Science 241, 1077-1080）、ヌクレオチド伸長反応（Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18, 3671）、Radiation Hybrid Mapping（Walterら (1997) Nat. Genet. 7, 22-28）及びHappy Mapping（Dear及びCook (1989) Nucleic Acid Res. 17, 6795-6807）を含む。これらの方法のために、この核酸の配列が増幅反応又は一次伸長反応に使用するためのプライマー対を設計及び作製するために使用される。係るプライマーの設計は当業者に周知である。PCRベースの遺伝子マッピングを採用する方法では、問題の(instant)核酸配列に対応する領域における、マッピング交差(mapping cross)の親間のDNA配列の差異を同定することが必要かもしれない。しかし、これは一般的にはマッピング方法に必要ではない。
【００９４】
このように、生育特性の改善を示す、改変したNAP1-様活性を有する改変型植物の作製、同定及び/又は単離を実施することができる。
【００９５】
NAP1-様核酸若しくはその変異体又はNAP1-様ポリペプチド若しくはそのホモログは増殖調節因子としての使用も見出し得る。これらの分子は植物の生育特性を改善する際に有用であることが示されているので、これらは有用な増殖調節因子（除草剤又は増殖因子等）であろう。したがって、本発明は、増殖調節因子、好ましくは成長促進物質として使用するための、より好ましくは収量を増加するための、NAP1-様核酸若しくはその変異体又はNAP1-様ポリペプチド若しくはそのホモログを、適当な担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む組成物を提供する。
【００９６】
本発明の方法により、上記のように生育特性が改善した植物を生じる。これらの有利な生育特性は、更なる収量の増強特性、様々なストレスに対する耐性、様々な構造上の特徴並びに/又は生化学的及び/若しくは生理学的特徴を改変する特性等の、他の経済的に有利な特性と組合せることもできる。したがって、本発明の方法はいわゆる「遺伝子スタッキング」手順でも使用し得る。
【００９７】
図面の説明
本発明は下記の図面を参照しながら記載される。
【００９８】
図１．酵母、ヒト及び植物由来のNAP及びSETタンパク質間の関係を表す系統樹。この系統樹は、VNTI Suite 5.5（Informax, http://www.informaxinc.com/）のAlign Xプログラムによって確立した。複数のアライメントを作成するために使用される行列はBlosum62であり、アライメントパラメーターは以下を使用した：ギャップオープンペナルティ、10；ギャップ伸長ペナルティ、0.5；ギャップ分離ペナルティ、8；アライメントディレイ（alignment delay）対する同一性％、40。系統樹はSaitou及びNeiの近隣結合法を用いて確立される。アライメントに使用される配列のGenBank及びMIPS（シロイヌナズナに関する）の登録番号がこの系統樹中に示される。At:シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、Gm:ダイズ（Glycine max）、Nt：タバコ（Nicotiana tabacum）（WO 03/085115からの配列）、Os：イネ（Oryza sativa）、Ps:エンドウ（Pisum sativum）、Zm：トウモロコシ（Zea mays）、Hs:ヒト（Homo sapiens）、Sc：出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
【００９９】
図２．pDONR201骨格にGateway（登録商標）クローニングするためにAttL1及びAttL2部位内にCDS0406を含む、エントリークローンp68の略図。CDS0406はシロイヌナズナ（Arabidopsis）のNAP1-様コード配列のための内部コードである。このベクターは細菌のカナマイシン耐性カセット及び細菌の複製起点をさらに含む。
【０１００】
図３．イネ（Oryza sativa）で、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のNAP1-様遺伝子（CDS0406）をGos2プロモーター（PRO0129）の制御下で発現させるためのバイナリーベクター。このベクターは、左縁（LB反復、LB Ti C58）及び右縁（RB反復、RB Ti C58）で限定される、Tiプラスミド由来のT-DNAを含む。左縁から右縁にかけてこのT-DNAは、形質転換植物の抗生物質選択のためのカセット、形質転換植物の視覚的スクリーニングのための選択可能なマーカーカセット、並びにシロイヌナズナのNAP1-様遺伝子の発現のためのPRO0129-CDS0406-ゼイン及びrbcS-ΔGA二重ターミネーターカセットを含む。このベクターは、細菌の複製のためのpBR322由来の複製起点と、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンによる細菌の選択のための選択可能なマーカー（Spe/SmeR）とをさらに含む。
【０１０１】
図４．アルファルファ（Medicago）のNAP1-様タンパク質を大腸菌で発現させ、これを親和性クロマトグラフィーによって粗細胞抽出物から6XHIS-タグを介して精製した。34kDタンパク質のニッケル-アガロース樹脂からの異なるイミダゾール濃度での溶出を、抗-6xHIS抗体（Sigma, St Louis, USA）を用いたウエスタンブロッティングによって視覚化した。
【０１０２】
図５．Needleman及びWunschアルゴリズムを用いた、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のNAP1-様タンパク質（AtNAP1-様）及びアルファルファ（Medicago sativa）のNAP1-様タンパク質（MsNAP1-様）のアライメント。ギャップオープンペナルティを10に設定し、ギャップ伸長ペナルティを0.5に設定した。これらの設定により、配列同一性は71.2％、配列相同性は84.5％であった。
【０１０３】
図６．NAP1-様タンパク質は植物において核に局在化する。A)アルファルファ（Medicago）のNAP1-様タンパク質は、精製したタンパク質に対して生じた抗体を用いた間接的な免疫蛍光法によって、培養したアルファルファ細胞の核に局在化することが示されている（パネルAの左の写真）。核局在化を確認するために、平行して核を蛍光ダイDAPIで染色した（パネルAの右の写真）。挿入写真において、矢印は中期細胞を示す。弱い蛍光は核分画のない中期細胞中の染色体付近のNAP1-様タンパク質が少量であることを示す。B)GFPが融合した、一過的に発現したシロイヌナズナのNAP1-様タンパク質は、遺伝子構築物の原形質体へのPEG仲介型取り込み後にシロイヌナズナ細胞中の核に局在化する。
【０１０４】
図７．精製したアルファルファ（Medicago）のNAP1-様タンパク質は（ウサギの骨格筋から精製した）PP2Aのin vitroホスホ-ヒストンH2B脱リン酸化活性を阻害するが、この酵素によるグリコーゲンホスホリラーゼの脱リン酸化に影響しない。
【０１０５】
図８．本発明の方法を実施する際に有用な配列の例。
【実施例】
【０１０６】
実施例
本発明は説明のみを目的とする以下の実施例を参照しながら記載される。
【０１０７】
特に明記しない限り、組換えDNA技術は、Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 第3版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York又はAusubelらCurrent Protocols in Molecular Biologyの第1巻及び第2巻に記載される標準的なプロトコールに従って実施される。植物の分子的研究のための標準的な材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)及びBlackwell Scientific Publications (UK)によって発行されたR.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfase (1993)に記載されている。
【０１０８】
実施例1：遺伝子クローニング
シロイヌナズナ（Arabidopsis）のNAP1-様（内部参照CDS0406）を、シロイヌナズナの実生cDNAライブラリー（Invitrogen, Paisley, UK）を鋳型として用いたPCRによって増幅した。実生から抽出したRNAの逆転写後、cDNAをpCMV Sport 6.0にクローニングした。このバンク（bank）の平均インサートサイズは1.5kbであり、最初のクローン数は1.59x107cfuであった。最初の力価は9.6x105cfu/mlと測定され、最初の増幅後は6x1011cfu/mlと測定された。プラスミド抽出後、200ngの鋳型を50μlのPCRミックス中で用いた。Gateway組換えのためにAttB部位を含むプライマーprm1505（配列番号4）及びprm1506（配列番号5）をPCR増幅に用いた。PCRは標準的な条件でHifi Taq DNAポリメラーゼを用いて実施した。771bpのPCR断片も標準的な方法を用いて増幅及び精製した。その後、Gateway手順の第1ステップであるBP反応を、PCR断片がpDONR201プラスミドとin vivoで再結合して「エントリークローン」（Gateway用語）p68を生じる間に実施した（図2）。プラスミドpDONR201は、Gateway（登録商標）技術の一部としてInvitrogenから購入した。
【０１０９】
実施例2：ベクターの構築
その後、エントリークローンp68をイネ（Oryza sativa）の形質転換に使用するデスティネーションベクターp0640と共にLR反応で用いた。このベクターは機能的要素としてT-DNA境界内に植物の選択可能なマーカー、視覚的マーカー発現カセット、及びエントリークローンに既にクローニングされている目的の配列とのLR in vivo組換えを目的とするGatewayカセットを含む。構成的発現のためのGOS2プロモーター（PRO0129）はこのGatewayカセットの上流に位置する。LR組換えステップ後、生じた発現ベクターp73（図3）はアグロバクテリウム株LBA4404、及びその後、イネ植物に形質転換することができる。
【０１１０】
実施例3：イネの形質転換
イネジャポニカ（Oryza sativa japonica）の日本晴品種の成熟乾燥種子の外皮をむいた。種子を70％エタノール中で1分、その後0.2％HgCl2中で30分インキュベートし、滅菌蒸留水で15分間、6回洗浄することによって滅菌した。次いで、滅菌種子を2,4-Dを含む培地（カルス誘導培地）上で発芽させた。暗下で4週間インキュベートした後、胚形成はい盤誘導化カルス（embryogenic scutellum-derived calli）を摘出し、同じ培地上で増殖させた。2週間後、このカルスを同一の培地上でさらに2週間二次培養することによって繁殖又は増殖させた。共培養の3日前に、胚形成カルスの一部を新鮮な培地上で二次培養して細胞分裂活性を高めた。バイナリーベクターp73を保有するアグロバクテリウム株LBA4404を共培養に用いた。アグロバクテリウム株を適当な抗生物質を含むAB培地上で、28℃で3日間培養した。次いで、この細菌を収集し、液体共培養培地中、約1のOD600で懸濁した。この懸濁液をペトリ皿に移し、カルスを15分間懸濁液に浸した。次に、カルス組織をろ紙上で吸水乾燥させ（blotted dry）、固体化共培養培地に移し、暗下、25℃で3日間インキュベートした。その後、共培養したカルスを、適当な濃度の選択剤の存在下、2,4-D含有培地上で、4週間、暗下、28℃で増殖させた。この期間中に迅速に増殖する耐性カルスの孤立集団（island）が発生した。この物質の再生培地への転移時及び明所でのインキュベート時に、胚形成能を解除し、シュートが次の4〜5週間で発達した。シュートをカルスから摘出し、オーキシン含有培地上で2〜3週間インキュベートした（その後、土壌へ移される）。硬化したシュートを温室中、高湿度かつ短日下で増殖させた。最後に種子を移植後3〜5週間で収穫した。この方法は50％を越える割合で単一遺伝子座の形質転換体を生じた（Aldemita及びHodges, Planta 199, 612-617, 1996; Chanら, Plant Mol. Biol. 22(3), 491-506, 1993; Hieiら, Plant J. 6(2), 271-282, 1994）。
【０１１１】
実施例４：形質転換体の評価：栄養増殖の測定
約15〜20種の独立のT0形質転換体を作製した。一次形質転換体を、T1種子の生育及び収穫のために組織培養室から温室へ移した。トランス遺伝子の存在/不在について3:1で分離したT1子孫の5事象を維持した。これらの事象のそれぞれに関して、トランス遺伝子を含む10個のT1実生（ヘテロ及びホモ接合体）、及びトランス遺伝子を欠く10個のT1実生（ヌル接合体（nullizygote））を視覚マーカースクリーニングによって選別した。選別したT1植物を温室に移した。各植物は表現型データを対応する植物に明確に関連付ける固有のバーコード標識を受け取った。選択したT1植物は、以下の環境設定下で、直径10cmのポット中の土壌で生育させた：光周期＝11.5h、日光強度＝30,000ルクス以上、日中温度＝28℃以上、夜間温度＝22℃、相対湿度＝60〜70％。トランスジェニック植物及びこれに対応するヌル接合体を無作為な位置に並べて生育させた。播種する段階から成熟する段階まで、植物はデジタル画像キャビネットを数回通過した。各時点で、デジタル画像（2048x1536ピクセル、千6百万色）を各植物について少なくとも異なる6方向から撮影した。
【０１１２】
成熟した第1円錐花序を収穫し、袋に入れ、バーコード標識し、その後オーブン中37℃で3日間乾燥させた。その後、円錐花序を脱穀し、全ての種子を収集した。充填外皮（filled husk）を送風装置を用いて空のものから分離した。分離後、いずれの種子ロットも市販の計数機を用いてカウントした。中身のない外皮を廃棄した。充填外皮を分析天秤で計量し、種子の断面の面積をデジタル画像を用いて測定した。この手順により下記に記載される種子関連パラメーターのセットを生じた。
【０１１３】
これらのパラメーターは、画像分析ソフトウェアを用いて、デジタル画像から自動化手法で導き出し、統計分析した。不均衡な設計を矯正する2要因ANOVA(分散分析)を、植物の表現型特性を全体的に評価するための統計モデルとして使用した。上記遺伝子で形質転換された全ての事象における全ての植物の、測定された全てのパラメーターでF-検定を実施した。F-検定は全ての形質転換事象にわたる遺伝子の効果を調査し、かつ該遺伝子の全体的な効果（本明細書で「大域遺伝子効果（global gene effect）」と称される）を検証するために実施した。F検定の値がデータが有意であることを示す場合、「遺伝子」効果が存在すると結論付けられ、これは遺伝子の存在又は位置のみがこの効果を引き起こすのではないことを意味する。真の大域遺伝子効果に関する有意性の閾値は、F検定については5％確率に設定される。
【０１１４】
ある事象における遺伝子の効果、すなわち系統特異的効果を調査するために、トランスジェニック植物及びこれに対応するヌル植物からのデータセットを用いて、各事象においてt検定を行った。「ヌル植物」又は「ヌル分離体」又は「ヌル接合体」は、トランスジェニック植物と同様に処理される植物であるが、分離されるトランス遺伝子がこれに由来するものである。ヌル植物は形質転換されていない同型接合の植物としても記載することができる。T-検定の有意性の閾値は、10％確率性レベルに設定される。幾つかの事象についての結果は、この閾値より上か又は下であり得る。これは、遺伝子がゲノム中の特定の位置においてのみ効果を有し得、この位置依存的な効果の発生が異常でないという仮説を基礎とする。この種類の遺伝子効果は、本明細書で「この遺伝子の系統効果(line effect)」とも称される。p値はt値とt分布とを比較することによって、あるいはF値とF分布とを比較することによって取得される。次いで、p値はヌル仮説（すなわち、トランス遺伝子の効果が存在しないこと）が正しい確率を与える。
【０１１５】
栄養増殖及び種子収量は上述の方法に従って測定した。驚くべきことに、本発明者らは、NAP1-様遺伝子を含まない対照植物と比較した際に、種子の総重量、充填種子数及び収穫指数がNAP1-様遺伝子で形質転換されたイネ植物で増加したことを見出した。
【０１１６】
最初の実験で取得したデータは、T2植物を用いた第2実験で確認した。正確な発現パターンを有した4つの系統を更なる分析のために選別した。T1の陽性植物（ヘテロ及びホモ接合体の両方）からのシードバッチはマーカー発現をモニタリングすることによって選別した。次いで、選別した各事象に関して、ヘテロ接合体シードバッチはT2評価のために維持した。各シードバッチ内で同数の陽性及び陰性植物を評価のために温室で生育させた。
【０１１７】
総数160個体のNAP1-様形質転換植物（すなわち、トランス遺伝子について20個体が陽性であり、20個体が陰性である、事象当たり40個体の植物）はT2世代で評価した。
【０１１８】
実施例5：形質転換体の評価：種子関連パラメーターの測定
上述されるように、種子の分析時に、本発明者らはNAP1-様遺伝子構築物で形質転換された植物が、NAP1-様トランス遺伝子を欠く植物と比較して、高い充填種子数、高い種子総重量を有し、かつ収穫指数が増加したことを見出した。T1世代の植物で取得した肯定的な結果を再度T2世代で取得した。個々のトランスジェニック系統が対応するヌル接合体対照系統よりも有意に優れたスコアを得るだけでなく、試験した全てのT2事象における全ての植物を評価した際に、有意に肯定的な全体的効果も存在し、これは大域遺伝子効果を強く示唆する。このデータの概要は表3で表される。
【表３】
2007530063.tif 000007
【０１１９】
充填種子数
充填種子数は、分離ステップ後に維持された充填外皮数を数えることによって測定した。試験した5系統の内の4系統は、充填種子数の増加を示し、最大で37％まで増加した。対応するヌル分離体に対してトランスジェニック植物によって産生される充填種子数は全体で17％増加し、この増加は統計的に有意である（p値0.0352）。T2世代では、試験した全系統については14〜46％の範囲で増加した。T2系統の平均の増加は28％であり、この平均の増加も統計的に有意であった（0.0013のp値）。T1及びT2データの併合分析も、大域遺伝子効果が非常に有意であることを確認した（0.0003のp値）。
【０１２０】
種子の合計収量
植物当たりの種子の合計収量は、植物から収穫した全ての充填外皮を計量することによって測定した。全てのトランスジェニックT1系統は、種子の総重量の増加を示し、これは8〜43％で変化した。平均して、種子収量の増加は24％であり、種子収量に対するこのトランス遺伝子の存在による全体的な効果は、0.0076のF検定のP値によって証明されるように有意であった。これらの結果はT2世代でも観察された。試験した4系統は、14〜48％の収量の増加を有した（平均は28％）。この平均の増加は統計的に有意であり（0.0013のp値）、T1及びT2植物の併合分析は大域遺伝子効果が存在することを示した（0.0006のp値）。
【０１２１】
収穫指数
本発明における収穫指数は、106の計数を乗じた種子の総収量と上記敷地面積(mm2)との比率として定義される。試験した5系統の内の4系統は、9〜48％の範囲の収穫指数の増加を示した。収穫指数に対する有意な全体的遺伝子効果（トランス遺伝子の存在に関連する効果）（15％の全体的増加）が存在した（F検定で0.085の統計的に有意なp値）。同様の結果をT2植物で取得した。個々の系統に関する収穫指数は12〜34％で増加した（17％の有意平均）(0.0025のp値)。ここでまた、T1及びT2データの併合分析は大域遺伝子効果を示した（p値0.003）。
【０１２２】
植物におけるトランス遺伝子の発現及び係るトランス遺伝子の発現に起因する表現型効果が、独立に取得された異なるトランスジェニック系統及びその子孫間で異なり得ることは当業者に公知である。独立に取得した異なるトランスジェニック植物に存在するトランス遺伝子は、染色体の挿入遺伝子座、並びにその遺伝子座に挿入されたトランス遺伝子コピー数及びその遺伝子座におけるこれらのトランス遺伝子コピーの配置が互いに異なる。発現レベルの差異は、トランス遺伝子の染色体の前後関係（chromosomal context）（いわゆる位置効果）又は特定のトランス遺伝子配置によって誘発される機構をサイレンシングすること（例えば、トランス遺伝子のインワーズ・フェイシング・タンデム・インサーション（inwards facing tandem insertion）は転写時又は翻訳後レベルでのサイレンシングをする傾向がある）からの影響であるとみなし得る。これらの考え得る変異の原因にも関わらず、このデータは、NAP1-様遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、それぞれ対応する非トランスジェニック植物と相対して、一貫してより多数の充填種子、より高い種子総重量、並びに収穫指数の増加を生じたことを示す。観察された増加はT1及びT2世代のいずれにおいても有意であり、これは併合分析のp値によって立証されるように大域遺伝子効果についての強力な論拠である。
【０１２３】
実施例６：アルファルファ（Medicago sativa）NAP1-様タンパク質の特徴付け：
材料と方法
推定アルファルファPP2Aインヒビターの全長cDNAクローンの単離
アルファルファ（Medicago sativa）の推定NAP1-様タンパク質の一部をコードする単離されたcDNA断片は、アルファルファの根粒λ-ZAPファージcDNAライブラリー（Savoureら. Plant Mol. Biol. 27, 1059-1070; 1995）から製造業者（Stratagene）によって記載される標準的なスクリーニング手順を用いて全長クローンを単離するために用いられてきた。400000個のプラークをスクリーニングし、20クローンを維持し、その内の18クローンは第2ハイブリダイゼーションスクリーンで陽性であった。これらのクローンの内の8クローンを更なる研究のために選別し、個々のファージからのファージミドへ変換した。4クローンを配列決定し、その内の2クローンは推定NAP1-様タンパク質の全長cDNAクローンであることが証明された。このクローンの一つ（Ms10.1）を更なる研究に使用した（配列番号11のタンパク質をコードする配列番号10）。
【０１２４】
アルファルファ（Medicago）NAP1-様タンパク質の産生及び精製
アルファルファ（Medicago sativa）のNAP1-様タンパク質をコードするcDNA配列をpENTRY4 GATEWAY（登録商標）ベクター(Invitrogen)のNcoI/XhoI部位に挿入し、その後、pDEST17細菌発現ベクターに導入した。pDEST17ベクターはBL21大腸菌細胞中で6xHIS標識化タンパク質としてのNAP1-様タンパク質の発現を可能にした。34kDaのNAP1-様タンパク質は、ニッケルアガロース樹脂（Sigma）を用いた親和性クロマトグラフィーによって精製した（図4）。
【０１２５】
ホスファターゼ活性の測定
アルファルファ（Meidicago sativa）のNAP1-様タンパク質の潜在的なホスファターゼ阻害活性は、ウサギの骨格菌から精製したタンパク質ホスファターゼ2A（PP2A）触媒サブユニットで、Ulloaら（1993）による基質として32P同位体標識化グリコーゲンホスホリラーゼ及びヒストンH2Aタンパク質を用いてin vitroで試験した。
【０１２６】
MsNAP1-様及びAtNAP1-様タンパク質の細胞内局在
精製した6xHIS-標識化タンパク質に対するポリクローナル抗-MsNAP1-様抗体を、標準的な免疫処理プロトコールを用いてウサギで生じさせた。
【０１２７】
原形質体は浮遊の培養アルファルファ細胞から単離し、6％ホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞をポリL-リシンでコートしたスライドガラスに付着させ、抗MsNAP1-様抗血清（PBS中で200x希釈）に曝露し、洗浄し、そしてFITCコンジュゲート型ヤギ抗ウサギ二次抗体（SIGMA、100x希釈）へ曝露した。平行して、核をDAPI（0.02mg/ml）で染色し、Nikon TE300蛍光顕微鏡及びSPOT IIカラーCCDカメラで撮影した。
【０１２８】
アルファルファのNAP1-様タンパク質のシロイヌナズナオーソログのコード領域（配列番号1）を緑色蛍光タンパク質（GFP）と共にインフレームでGATEWAY（登録商標）適合性植物発現ベクター（pK7WGF2）へ挿入した。原形質体を単離し、精製したプラスミドDNAを標準的な手順を用いてトランスフェクトした。一過的発現をトランスフェクション後1日又は2日で蛍光顕微鏡によって記録した。
【０１２９】
結果
シロイヌナズナ及びアルファルファNAP1-様タンパク質は核に局在化する
アルファルファのNAP1-様タンパク質はシロイヌナズナのNAP1-様タンパク質と非常に相同であった。配列同一性は71.2％であり、配列類似性は84.5％であった（図５）。抗MsNAP1-様抗体を用いた間接的免疫蛍光法は、この抗体が浮遊の培養アルファルファ細胞の核に局在化するタンパク質を認識したことを示した。この局在化は核染色法（DAPI）によって確認した。わずかな蛍光は中期細胞の染色体に関連した（図6A、挿入図）。
【０１３０】
GFP標識したシロイヌナズナNAP1-様タンパク質も専ら浮遊の培養シロイヌナズナ細胞の核に局在化した（図6B）。
【０１３１】
2）アルファルファNAP1-様タンパク質はホスホ-ヒストン基質のPP2Aホスファターゼ活性をin vitroで阻害する
精製したアルファルファNAP1-様タンパク質を、ウサギの骨格筋PP2Aの触媒サブユニットと、基質としてリン酸化ヒストンH2A又はグリコーゲンホスホリラーゼとを含む反応混合物に、様々な濃度で添加した。NAP1-様タンパク質は500mM濃度でさえグリコーゲンホスホリラーゼの脱リン酸化に影響しなかったが、NAP1-様タンパク質は既に2.5mM濃度でホスホ-ヒストンH2A基質のPP2A活性を効果的に阻害した（活性の50％減少）ことが観察された（図7）。
【０１３２】
結論
アルファルファとシロイヌナズナのNAP1-様タンパク質は、構造的及び機能的類似点のいずれをも示す。植物のNAP1-様タンパク質はヒストン基質のホスファターゼ（PP2A）活性をin vitroで阻害し、これはクロマチン編成及び遺伝子転写における可能なin vivoでの役割を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、酵母、ヒト及び植物由来のNAP及びSETタンパク質間の関係を表す系統樹を示す。
【図２】図2は、pDONR201骨格におけるGateway（登録商標）クローニングのための、AttL1及びAttL2部位内にCDS0406を含む、エントリークローンp68の略図を示す。
【図３】図3は、イネ（Oryza sativa）中、Gos2プロモーター（PRO0129）の制御下で、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のNAP1-様遺伝子(CDS0406)を発現させるためのバイナリーベクターを示す。
【図４】図4はアルファルファ由来のNAP1-様タンパク質のウエスタンブロッティングを示す。
【図５】図5は、Needleman及びWunschアルゴリズムを用いた、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のNAP1-様タンパク質（AtNAP1-様）及びアルファルファ（Medicago sativa）のNAP1-様タンパク質（MsNAP1-様）のアライメントを示す。
【図６】図6は、NAP1-様タンパク質が植物の核に局在化することを示す。A:アルファルファ。B：シロイヌナズナ。
【図７】図7は、精製したアルファルファ（Medicago）のNAP1-様タンパク質はPP2Aのin vitroホスホ-ヒストンH2B脱リン酸化活性を阻害するが、この酵素によるグリコーゲンホスホリラーゼの脱リン酸化に影響しないことを示す。
【図８−１】図8-1は本発明の方法の実施に有用な配列の例を示す。
【図８−２】図8-1の続き。
【図８−３】図8-2の続き。
【図８−４】図8-3の続き。
【図８−５】図8-4の続き。
【図８−６】図8-5の続き。
【図８−７】図8-6の続き。
【図８−８】図8-7の続き。
【図８−９】図8-8の続き。
【図８−１０】図8-9の続き。
【図８−１１】図8-10の続き。
【図８−１２】図8-11の続き。
【図８−１３】図8-12の続き。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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