(57)【要約】  本発明によれば、動物においてプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）種の乳酸菌株が提供される。また、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサムの使用方法及び該菌を含む組成物も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られる、ビフィドバクテリウム・グロボーサム菌株。
【請求項２】
コンパニオンアニマルの胃腸管で生存してコロニーを形成する能力を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
０．５％胆汁酸塩の存在下で培養したときに少なくとも３３％増殖する、請求項１又は請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
ｐＨ２．５において１時間置かれた後で生存能力を維持することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項５】
配列番号１で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項６】
前記菌株が、ビフィドバクテリウム・グロボーサム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９８又はそれらの突然変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項７】
前記突然変異体が、自然突然変異体、遺伝子操作された突然変異体又は誘発突然変異体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項８】
コンパニオンアニマルがイヌ又はネコである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項９】
コンパニオンアニマルにおける健康を維持又は改善する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管からの単離によって得られる、ビフィドバクテリウム・グロボーサム菌株。
【請求項１０】
前記菌株が、コンパニオンアニマルの胃腸管で生存してコロニーを形成する能力で選択されるものである、請求項９に記載の菌株。
【請求項１１】
前記菌株が、０．５％胆汁酸塩の存在下で培養したときに少なくとも３３％増殖する、請求項９又は１０に記載の菌株。
【請求項１２】
前記菌株が、ｐＨ２．５において１時間置かれた後で生存能力を維持することができる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１３】
前記菌株が、配列番号１で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有するものである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１４】
前記菌株が、ビフィドバクテリウム・グロボーサム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９８又はその突然変異体若しくは変異型である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１５】
前記突然変異体が、自然突然変異体、遺伝子操作された突然変異体又は誘発突然変異体である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１６】
コンパニオンアニマルにおける免疫系の調節、コンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、コンパニオンアニマルにおける老化の影響の改善又は低減、コンパニオンアニマルにおける感染中及び感染後の体重減少の予防、コンパニオンアニマルにおける胃腸の感染症の治療又は予防あるいはコンパニオンアニマルにおける尿路疾患の治療又は予防から選択される状態の処置のための、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１７】
コンパニオンアニマルにおける自己免疫疾患の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける炎症の治療又は予防あるいはこれらの組み合わせを含む、コンパニオンアニマルの免疫系の調節のための、請求項１６に記載の菌株。
【請求項１８】
コンパニオンアニマルにおけるアトピー性皮膚疾患の治療又は予防を含む、コンパニオンアニマルの皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善のための、請求項１６に記載の菌株。
【請求項１９】
コンパニオンアニマルにおける微生物生態系の改善、コンパニオンアニマルの糞便中の病原菌レベルの低減又はこれらの組み合わせを含む、コンパニオンアニマルにおける胃腸の感染症の治療又は予防のための、請求項１６に記載の菌株。
【請求項２０】
前記病原菌が、クロストリジウム属、エシェリキア属、サルモネラ属又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の菌株。
【請求項２１】
前記コンパニオンアニマルにおける尿路疾患の治療又は予防のための請求項１６に記載の菌株であって、前記尿路疾患が、尿路感染症、腎臓結石又はこれらの組み合わせを含む、菌株。
【請求項２２】
前記プロバイオティク・ビフィドバクテリア・グロボーサムが、インビトロにてシュウ酸の分解を増進する、請求項２１に記載の菌株。
【請求項２３】
前記コンパニオンアニマルにおける繊維消化が増進される、請求項９に記載の菌株。
【請求項２４】
前記コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルが低下する、請求項９に記載の菌株。
【請求項２５】
前記ストレスレベルが、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるストレスホルモンのレベルを決定することによって測定される、請求項１４に記載の菌株。
【請求項２６】
前記菌株が、１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／動物／日のいずれかの量で動物に与えられる、請求項９〜２５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項２７】
前記コンパニオンアニマルがイヌ又はネコである、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項２８】
プロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィドバクテリウム・グロボーサム菌株と、キャリアとを含む、組成物。
【請求項２９】
前記菌株が、コンパニオンアニマルの胃腸管で生存してコロニーを形成する能力で選択されるものである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記菌株が、０．５％胆汁酸塩の存在下で培養したときに少なくとも３３％増殖する、請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ｐＨ２．５において１時間置かれた後で生存能力を維持することができる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記菌株が、配列番号１で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有するものである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記菌株が、ビフィドバクテリウム・グロボーサム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９８又はそれらの突然変異体である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記突然変異体が、自然突然変異体、遺伝子操作された突然変異体又は誘発突然変異体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記コンパニオンアニマルがイヌ又はネコである、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、コンパニオンアニマル用フード、好ましくはキャットフード又はドッグフードである、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物が湿式アニマルフード又は乾燥アニマルフードである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、粗挽き、噛み物、ビスケット、コンパニオンアニマル用フードサプリメント、肉汁、乳製品、カプセル、錠剤又は丸剤の形態である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
約１．０Ｅ＋０４ＣＦＵ／ｇ〜約１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／ｇの前記乳酸菌を少なくとも０．００１％含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ビフィドバクテリウム・グロボーサム菌が、生存細胞、非生存細胞又はそれらの構成する活性画分の形態である、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティク微生物の分野に関し、より詳細にはイヌ科動物のプロバイオティク乳酸菌及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の胃腸（ＧＩ：gastrointestinal）管を病原菌のコロニー形成から守るための防御機構は、きわめて複雑である。ほとんどの哺乳類のＧＩ管には、自然の微生物相と侵入性病原微生物とがコロニーを形成している。健康な個体では、これらの競合する微生物相は、平衡状態にある。腸の微生物相平衡状態が変化すると、ヒトでも、ネコ、イヌ、及びウサギを含めたコンパニオンアニマルのような他の哺乳類種でも、多くのＧＩ疾患が引き起こされたり、あるいは予防されたりする場合がある。コンパニオンアニマルの幸福は、それらの摂食及びＧＩの健康とが密接に関係しており、これらの動物における腸内微生物相の平衡の維持が、ペットの健康の改善をもたらす場合がある。
【０００３】
腸の微生物相の数及び組成は、安定する傾向にあるが、年齢及び食餌によって変化することもある。ヒト及び他の様々な哺乳類の小腸における細菌相の調節において重要と考えられている因子は、胃の酸性度、胆汁、腸の蠕動運動、及び局所免疫である。イヌ科動物及びネコ科動物で見られるものを含め、ペットのＧＩ疾患は、細菌の異常増殖及び病原菌による腸毒素の産生と関連していることが多い。これらの因子は、腸の微生物相平衡を乱し、炎症及び異常な免疫反応を促進させる虞がある。
【０００４】
ここ数年の間に、研究によって、幾つかの有益な細菌株及びそれらのプロバイオティク剤としての利用可能性が強調され始めている。プロバイオティクは、ＧＩ管内の自然の微生物相を保護及び助長し、並びに異常な免疫反応に対する正常な制御を強化することによって哺乳類の健康を促進する、生菌若しくは死菌の、タンパク質若しくは炭水化物のような細菌の構成成分の、又は細菌発酵の精製画分の、調合物（preparations）と見なされる。一部では、プロバイオティク菌は、処置の対象である個体種から、又はその近縁種から得られるときに、より効果的になると考えられている。したがって、ヒトに由来するものとは異なる、コンパニオンアニマルに使用されるコンパニオンアニマル由来のプロバイオティク菌株が必要とされている。
【０００５】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０１／９０３１１は、プロバイオティク活性を有する、ネコ及びイヌから得られた糞便試料から単離されたプロバイオティク微生物を開示している。しかし、これらの細菌は、糞便試料から得られたものであり、ＧＩ管の上部に存在する自然の腸内微生物相の一部を成すことができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、プロバイオティク特性及びプロセスを生存能力で選択した、コンパニオンアニマルに特に適合したＧＩ管の上部に存在する自然の腸内微生物相からの単離によって得られる細菌株を提供すること、並びにこれらの菌株を使用に好適な組成物に組み込むことが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、動物においてプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）種の乳酸菌株が提供される。
【０００８】
好ましい実施形態では、該乳酸菌株は、配列番号１と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓスペーサ領域ＤＮＡ配列を有するビフィドバクテリア・グロボーサムである。
【０００９】
他の好ましい実施形態では、該乳酸菌株は、ビフィドバクテリア・グロボーサムＡＨＣＦ（ＮＣＩＭＢ４１１９８）である。
【００１０】
さらに、本発明は、ペットの健康を維持且つ改善する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィドバクテリア・グロボーサム菌の使用を提供すること、並びに該乳酸菌を含む組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、並びに利点は、本開示を解釈することにより当業者には明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（配列）
配列番号１  −  ビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）ＡＨＣＦ由来の１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサヌクレオチド配列（ＮＣＩＭＢ４１１９８）。
配列番号２  −  配列分析用の１６ｓ−２３ｓ左ＰＣＲプライマー配列。
配列番号３  −  配列分析用の１６ｓ−２３ｓ右ＰＣＲプライマー配列。
【００１３】
（細菌寄託番号）
以下の表は、本発明の一例であるビフィドバクテリア・グロボーサム菌株を示す。細菌株は、英国工業・食品・海洋細菌収集機関（ＮＣＩＭＢ：National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria）（英国アバディーン（Aberdeen））に寄託される。
【表１】
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【００１４】
指定がない限り、本明細書の重量、測定値、及び濃度は、すべて組成物全体に関して２５℃で測定される。
【００１５】
指示がない限り、本明細書で言及する組成物の百分率は、すべて重量百分率であり、比率は、すべて重量比である。
【００１６】
指示がない限り、分子量は、すべて重量平均分子量である。
【００１７】
指示がない限り、本文内で参照する文献の出典すべての内容全体を、本明細書に参考として組み込む。
【００１８】
実際に測定された値の具体例を提示する場合を除き、本明細書で言及する数値は、「約」という言葉で修飾されていると考えるべきである。
【００１９】
以下の説明では、略語ＣＦＵ（「コロニー形成単位：colony-forming unit」）は、当該技術分野において一般に理解されるように、寒天プレート上の微生物数によって示される細菌性細胞の数を示す。
【００２０】
本明細書で使用する時、用語「それらの突然変異体」には、参照された菌株の１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９３％の相同性、好ましくは少なくとも９６％の相同性、より好ましくは９８％の相同性を有するが、他の部分は細菌ゲノムの他のＤＮＡ配列にＤＮＡ突然変異を含む、派生細菌株が含まれる。
【００２１】
本明細書で使用する時、用語「ＤＮＡ突然変異」には、欠失、挿入、トランスバージョン、及び当業者に既知の他のＤＮＡ操作、例えば、親配列に対して少なくとも５０％の相同性を維持しながら親ヌクレオチド若しくはアミノ酸配列に遺伝子操作を導入することを含め、少なくとも単一の塩基変化を含む自然突然変異又は誘発突然変異が含まれる。好ましくは、（１若しくは複数の）ＤＮＡ突然変異を含む配列は、親配列と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは８５％の相同性を有する。本明細書で使用する時、配列「相同性」は、当業者に既知の標準法を使用して決定することができる。例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で公的に入手可能なオンライン相同性アルゴリズム「ＢＬＡＳＴ」プログラムを使用して、相同性を決定してもよい。
【００２２】
本明細書で使用する時、「遺伝子操作」には、生物のゲノムへの挿入によって、又は当業者に既知であるプラスミドＤＮＡ若しくはバクテリオファージを含めたベクターによって、前記生物のゲノムに外来性及び／又は内在性ＤＮＡ配列を導入することが含まれており、前記ＤＮＡ配列の長さは、少なくとも２つのデオキシリボ核酸塩基分である。
【００２３】
本明細書で使用する時、「コンパニオンアニマル」は、家畜を意味する。好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、家庭で飼われるイヌ科動物、ネコ科動物、ウサギ、白イタチ、ウマ、ウシなどを意味する。より好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、家庭で飼われるイヌ科動物又はネコ科動物を意味する。
【００２４】
（ビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）菌株）
本発明の第１の態様は、動物においてプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィドバクテリア・グロボーサム株を含む。プロバイオティクは、宿主に有益な作用を及ぼす、生存微生物若しくは死んだ微生物、微生物の加工組成物、タンパク質若しくは炭水化物のようなそれらの構成成分、又は細菌発酵の精製画分である。プロバイオティク菌は、一般に生存細胞の形態で使用される。ただし、プロバイオティク菌が発現する有益な因子を含有する、死滅した培養物又は組成物のような非生存細胞にも拡張することができる。これには、熱で死滅する微生物、又は、ｐＨ変化に曝されることによって、若しくは圧力を受けることによって死滅する微生物を含めることができる。本発明の目的では、「プロバイオティク」は、さらに、別途示されていなければ、本発明の微生物によって発酵時に産生される代謝産物を包含するものとする。これらの代謝産物は、発酵の媒質に放出されることがあり、又は微生物内に蓄えられていることがある。本明細書で使用する時、「プロバイオティク」は、また、治療的用量で与えられたときに宿主動物に有益な機能を果たす、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌抽出物、細菌発酵上清、及びこれらの混合物も包含する。
【００２５】
切除及び洗浄された哺乳類のＧＩ管からの直接単離によって得られるビフィドバクテリア・グロボーサム菌株が、生菌細胞の摂食後にＧＩ管に付着し、またさらに、生存形態、非生存形態、又は断片化形態で動物に与えたときに大きな免疫調節性をもつことが判明している。理論に束縛されるものではないが、切除及び洗浄されたＧＩ管からの単離によって得られるビフィドバクテリア・グロボーサムは、腸粘膜組織と密接に関連していると考えられている。さらに理論に束縛されるものではないが、このことは、プロバイオティク作用をもたらす代替的な宿主反応を生み出す本発明のプロバイオティク・ビフィドバクテリア・グロボーサムをもたらすと考えられている。切除及び洗浄されたＧＩ管からの単離によって得られるプロバイオティク細菌は、粘膜上皮及び宿主の免疫細胞との直接相互作用を介して宿主の免疫系を調節できることが判明している。この免疫修飾は、プロバイオティク菌に関連した従来の作用機序、すなわち、閉鎖（occlusion）による腸への病原体付着の防止、及び栄養競合と相まって、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサムをプロバイオティク生物としてきわめて有効なものにする。
【００２６】
切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管からの単離によって得られる本発明のビフィドバクテリア・グロボーサムは、抑制域又は当業者に既知の細菌増殖抑制アッセイによって測定される、多数の病原菌株／種に対するインビトロ抗菌活性を有する。理論に束縛されるものではないが、このインビトロ抗菌活性は、動物、好ましくはイヌ科動物及びネコ科動物のようなコンパニオンアニマルにおいて、インビボで潜在的プロバイオティク活性を示すと考えられている。本発明の乳酸菌は、好ましくは、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、又は大腸菌（Eschericia coli）、より好ましくはこれらの株の組み合わせ、さらになお好ましくはこれらの株すべてに対して、インビトロ抗菌活性を有する。
【００２７】
理論に束縛されるものではないが、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌の抗菌活性は、本明細書のビフィドバクテリア・グロボーサム菌による多種多様な作用に起因する可能性があると考えられている。これまで、当該技術分野では、糞便試料から単離された幾つかの細菌株が、経口消費後に、閉鎖（occlusion）によって腸粘膜への病原生物の付着を防止することにより、ＧＩ管でそのプロバイオティク効果を及ぼすことが示唆されてきた。これには、腸内に細菌のコロニーを形成させるために、「生きている」又は生菌細胞の経口消費が必要である。しかし、切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管からの単離によって得られる本発明のビフィドバクテリア・グロボーサムは、生存可能形態で与えられれば閉鎖（occlusion）による何らかのプロバイオティク効果を及ぼすが、インビトロでは発酵時に、病原微生物の増殖を阻害する、若しくは病原微生物を死滅させる、及び／又は宿主動物の免疫能力を変化させる（１若しくは複数の）物質を産生するので、生存可能形態でも非生存可能形態でも大きなプロバイオティク効果をもたらす可能性があると考えられている。この形態のプロバイオティク活性は、本発明の細菌を生存可能若しくは非生存可能な培養物又は精製発酵産物として与えることができ、それでもなお宿主動物に有益な治療効果をもたらすので、望ましい。
【００２８】
好ましくは、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌は、ＧＩ管を通過後に生存能力を維持することができる。このことは、生きた培養菌を経口摂取し、且つ食道及び胃を通過後に小腸及び大腸内でのコロニー形成のために望ましい。本発明の乳酸菌による小腸及び大腸でのコロニーを形成は、宿主に長期にわたるプロバイオティク利益をもたらすのに望ましい。非生存細胞又はその精製単離物の経口服用は、一時的な利益をもたらすが、細菌は、生存可能ではないので、増殖してその場で継続的にプロバイオティク効果をもたらすことができない。結果として、これには、健康上の利益を維持するために宿主に定期的に服用させることが必要になる可能性がある。それに対し、生存可能形態で胃を通過して生き残ることができ、その後腸粘膜に付着して腸粘膜上で増殖することによってコロニーを形成する生存細胞は、その場で継続的にプロバイオティク効果をもたらすことが可能である。
【００２９】
したがって、本発明の乳酸菌が、ｐＨ２．５の培地に１時間懸濁させた後で生存能力を維持することが好ましい。本明細書で使用する時、「生存能力を維持する」は、当業者に既知の平板計数法を使用して、初めに試験培地に懸濁させた細菌の少なくとも２５％が生存可能であることを意味する。好ましくは、「生存能力を維持する」は、初めに懸濁させた細菌の少なくとも５０％が生存可能であることを意味する。本発明の乳酸菌が低いｐＨに曝された後で生存能力を維持することが望ましく、これは、経口消費後に動物においてインビボで胃及び腸上部で胃液に曝される状況を模しているからである。
【００３０】
さらに、本発明の乳酸菌が、少なくとも０．５％のブタ胆汁酸塩の存在下にあるときに少なくとも３３％増殖することが好ましい。本明細書で使用する、増殖（growth）については、実施例３でさらに詳細に説明する。より好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも１％のブタ胆汁酸塩の存在下にあるときに少なくとも３３％増殖する。理論に束縛されるものではないが、少なくとも０．５％のブタ胆汁酸塩の存在下で増殖可能な本発明の乳酸菌は、腸内に存在する条件で生存することが可能と考えられている。これは、培養培地にブタ胆汁を加えて腸の条件を模した結果と考えられる。
【００３１】
さらに、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌が、インビトロにて腸上皮細胞に対して大きな付着力を有することが好ましい。本明細書で使用する時、「大きな付着力」は、上皮細胞と共にインキュベートされた乳酸菌の総数の少なくとも４％がインビトロにて該上皮細胞に付着することを意味する。より好ましくは、共にインキュベートされた細菌細胞の少なくとも６％がインビトロにて上皮細胞に付着する。理論に束縛されるものではないが、インビトロでの腸上皮細胞への付着は、該乳酸菌がインビボで動物のＧＩ管にコロニーを形成できることを示すと考えられている。
【００３２】
１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、当業者には、様々な細菌種及び細菌株を識別するために使用できる細菌ゲノム内のＤＮＡ配列として知られている。この遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、以下の実施例４で詳述する方法によって決定することができる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、ビフィドバクテリア・グロボーサムの菌株は、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９９％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明による乳酸菌株は、配列番号１で表される１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。さらに好ましくは、本発明による乳酸菌株は、ビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）株ＮＣＩＭＢ４１１９８（ＡＨＣＦ）又はそれらの突然変異体である。
【００３４】
切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィドバクテリア・グロボーサム属の乳酸菌株を使用して、動物、好ましくはコンパニオンアニマル又はヒトにおいて、経口消費後のプロバイオティク利益を与えることができる。このプロバイオティク利益は、一般に、動物の全般的な健康を維持し、改善する。病気の症状の治療的緩和、又は予防による病気の防止において利益となる、動物の健康及び生理機能の非限定的な要素としては、炎症性疾患、免疫不全症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、癌（特に胃腸及び免疫系の癌）、下痢性疾患、抗生物質起因性の下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、アミロイド症、リウマチ様関節炎、関節炎、関節可動性（joint mobility）、真性糖尿病、インスリン耐性、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、歯周病、泌尿生殖器疾患、外科手術による外傷、外科手術によって誘発される転移性疾患、敗血症、体重減少、体重増加、過度の脂肪組織蓄積、拒食症、発熱の抑制（fever control）、悪液質、創傷治癒、潰瘍、腸バリア感染症、アレルギー、喘息、呼吸器疾患、循環器疾患、冠状動脈性心疾患、貧血、血液凝固系の疾患、腎疾患、中枢神経系疾患、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗鬆症、内分泌疾患、及び表皮疾患が挙げられる。好ましいのは、下痢の治療若しくは予防を含めた胃腸管の処置；免疫系の調節、好ましくは自己免疫疾患及び炎症の治療又は予防；皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、好ましくはアトピー性皮膚疾患の治療若しくは予防；精神的認識及び活動レベルを含めた老化の影響の治療若しくは予防；並びに感染中及び感染後の体重減少の予防である。
【００３５】
以上で開示した疾患の処置は、当業者に既知の技術を使用して判断することができる。例えば、自己免疫疾患及び炎症を含めた炎症性疾患は、リンパ球幼若化現象、ナチュラルキラー細胞活性、ワクチンに対する抗体反応、遅延型過敏症、及びこれらの組み合わせなど、インビボ免疫機能試験を使用して検出且つ監視することができる。本明細書でこのような方法について簡単に説明するが、これらは当業者には周知である。
１．リンパ球幼若化現象：このアッセイは、様々なマイトジェンに対する試験動物及び対照動物の新鮮な全血から単離されたリンパ球のインビトロ増殖反応を評価し、総合的なＴ細胞及びＢ細胞の機能の指標となる。簡潔に言えば、当業者に既知のフィコール・ハイパーク密度遠心分離法（Ficoll-Hypaque density centrifugation methods）によって、全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononucleocytes）を単離する。単離したＰＢＭＣを、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０細胞培地で２回洗浄する。洗浄した細胞を、ＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁させ、計数し、細胞密度を適切に調節する。２×１０５個の細胞を、１０％ウシ胎児血清（シグマ（Sigma））を用い、３７℃・５％ＣＯ２で７２時間にわたって、トリプリケート（triplicate）で、様々なマイトジェンの一連の濃度（０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）に曝す：その例を幾つか挙げれば、ポークウィードマイトジェン（ギブコ（Gibco））、フィトヘマグルチニン（ギブコ（Gibco））、及びコンカナバリンＡ（シグマ（Sigma））がある。５４時間経過後に、細胞を１μＣｉ３Ｈ−チミジンでパルスし、細胞を集め、７２時間後にトップカウントＮＸＴ（TopCount NXT）でシンチレーションカウントを読み取る。
２．ナチュラルキラー細胞活性：ＵＳ６，３１０，０９０に記載されているように、このアッセイは、試験動物及び対照動物の新鮮な全血から単離されたナチュラルキラー細胞のインビトロエフェクター活性を評価する。ナチュラルキラー細胞は、哺乳類の先天性免疫機能の構成成分である。ＮＫ細胞の細胞毒性を評価する際のターゲット細胞として、イヌ科動物の甲状腺癌細胞を使用した。この細胞株は、既に、イヌ科動物のＮＫ細胞によって死滅しやすいことが示されていた。ターゲット細胞を、Ｔ７５フラスコ内で、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ：fetal calf serum）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた、２０ｍＬの最小必須培地（ＭＥＭ；シグマ・ケミカル社（Sigma Chem.Co.）、ミズーリ州セントルイス）によって培養した。コンフルエントになったら、ターゲット細胞をトリプシン処理し、３回洗浄して、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）中に細胞数５×１０５個／ｍＬに再懸濁させた。トリプリケートで、ターゲット細胞の１００μＬアリコートをピペットで９６ウェルＵ底プレート（コスタール（Costar）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）内に移し、８時間インキュベートして細胞接着させた。次いで、フィコール・ハイパーク（Ficoll-Hypaque）分離（前述）によって単離されたリンパ球（エフェクター細胞；１００μＬ）をターゲット細胞に加えて、エフェクター／ターゲット細胞（Ｅ：Ｔ）比を１０：１にした。３７℃で１０時間インキュベートした後、５μｇの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を含有する基質２０μＬを加えた。代謝されていないＭＴＴを吸引によって除去した後、混合物を３７℃で４時間インキュベートした。２００μＬの９５％エタノールを加えることによってホルマザン結晶を溶解させた。マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで光学密度を測定した。ＮＫ細胞特異的溶解の百分率を次のように計算した：
特異的細胞毒性（％）＝１００×｛１−［（ターゲット細胞及びエフェクター細胞のＯＤ−エフェクター細胞のＯＤ）／（ターゲット細胞のＯＤ）］｝
３．ワクチンに対する抗体反応：少なくとも１２週間プロバイオティク餌又は対照餌を与えた後、被験体にワクチンのアレイ（最大５まで）を与える。ワクチンは、新規ワクチンと余剰ワクチンの混合物であってよい。使用してよいワクチンアレイの非限定例としては、フォートダッジアニマルヘルス（Fort Dodge Animal Health）によって調製されたワクチンの混合物が挙げられる。本明細書に用いるのに好適なワクチンの非限定例としては、イヌジステンパー、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザ、及びパルボウイルスが挙げられる。被験体のワクチン歴が、使用すべきワクチンを決定することになる。所与のワクチンに対する特異的抗体を、血液中で３週間にわたって測定し、対照餌群及びプロバイオティク餌群における反応の長さ及び強度を比較する。
４．遅延型過敏症：免疫系の状態を評価するインビボの非侵襲的方法。この試験は、多クローン性マイトジェンであるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ：Phytohemmaglutinin）と、ヒツジ赤血球、多価ワクチン、ヒスタミン（１００μＬの０．０２７５ｇ／Ｌリン酸ヒスタミン；グリア（Greer）、ノースカロライナ州ルノワール（Lenoir））、又はＰＢＳ（１００μＬの８．５ｇ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水；シグマ（Sigma））とを組み合わせた、皮内注射を含む。注射後０、２４、４８、及び７２時間の時間間隔でキャリパーを使用した皮下脂肪の厚さとして、抗原に対する免疫反応を記録する。皮下脂肪の厚さの増加は、本発明の細菌による処置によって減少するはずの過敏性反応が大きいことを示す。
【００３６】
本発明のビフィズス菌の効果を決定する他の方法は、ＵＳ６，１３３，３２３及びＵＳ６，３１０，０９０に記載されている。
【００３７】
さらに、体脂肪量、除脂肪量、及び骨塩量を含め、身体組成を測定するデュアルＸ線吸収法（dual x-ray absorptometry）又はＣＴスキャンを使用して、老化の影響の改善を判定することができる。同様に、この方法を使用して、感染後の被験体における体重減少又は骨密度のような解剖学的変化を判定することができる。
【００３８】
また、本発明のビフィズス菌は、コンパニオンアニマルにおいてストレスレベルを低下させる方法でも使用することができる。エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、コルチゾール、及びＣ反応性タンパク質を含めた血中ストレスホルモンの濃度を測定して、ストレスレベル及びそれらの低下又は維持を判定することができる。これらのホルモンは、認識されているストレスのバイオマーカーであり、当業者に既知の技術を使用して容易に測定することができる。
【００３９】
さらに、訓練を受けた２人によって行われる皮膚及び被毛評価を用いて、アトピー性皮膚疾患を含め、コンパニオンアニマルの皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善を判断することができる。このような評価の際に調査される基準の例としては、次が挙げられる：
ａ）脱毛指数（Shedding index）： 標準ブラッシングセッションの間に生じた毛を収集することによって、各被験体に脱毛指数を割り当てる。毛を保管して計量し、対照と被験体とを比較する。
ｂ）皮膚／被毛の主観的評価：訓練を受けた官能試験員が、脱毛、ふけ、光沢、均一性、柔軟性、及び密度を評価することによって、皮膚及び被毛の状態を主観的に評価する。
ｃ）皮膚機能評価： アセトンを染み込ませたガーゼで皮膚表面を拭うことによって、皮膚のバリア機能を評価することができる。この手法は、単一の細胞層及び関連した角質層の脂質画分を除去することによって皮膚バリアを効果的に破壊する。当業者に既知の方法を使用して、経表皮水分損失（ＴＥＷＬ：transepidermal water loss）の増加及び被術部位の赤色度を測定することによって、バリアの破壊を定量化する。前述のカメラ及び照明システムを使用して、発赤（紅斑）スコアを得る。破壊の直前及び直後、並びに５時間及び２４時間エンドポイントにおいて、ＴＥＷＬの読み値及び発赤スコアを獲得して、皮膚の保護及び治癒特性を評価する。
【００４０】
コンパニオンアニマルにおける、下痢を含めた胃腸感染症の治療又は予防は、大便スコアを使用して判断することができる。大便スコアは、以下の指針に従って毎日記録することができ、本発明による細菌の給餌前及び給餌後に対照群と試験群とを比較する。
スコア：５  非常に乾燥している
この大便は、硬く、表面にくっつかない。大便は、押されると転がる。大便を拾い上げたときに、くぼみができない。大便は、完全な単一体ではなく、個別の大便の集団として排泄されることが多い。大便は、収集後に元の形状を維持している。
スコア：４  硬い（理想的な大便）
この大便は、硬く、形が良く、円筒状である。この大便は、拾い上げたときに容易にはばらばらにならない。この大便は、表面及び手袋に残留物を残すことがある。この大便は、単一体として排泄されることが多い。大便は、収集後に元の形状を維持している。
スコア：３  柔らかく、形がある
この大便は、柔らかいが、明確な形がある。この大便は、容易にばらばらになり、表面及び手袋に確実に残留物を残す。大便は、収集後に元の形状を失うことが多い。この大便は、しばしば別のスコアと共に存在するが、大便試料丸ごとを含むことができる。
スコア：２  柔らかく、形がない
この大便は、柔らかく、円筒状の形をもたない。「２」にしばしば関連した形状は、「牛肉パティ（cow patty）」形である。この大便は、収集されると元の形状を失い、表面及び手袋に確実に残留物を残す。この大便スコアは、しばしば別のスコアと共に存在するが、大便試料丸ごとを含むことができる。この大便試料は、数インチ（５〜１５センチ）の面積に広げることができる。
スコア：１  液体
この大便スコアは、常に液体様であり、粒子状物質が存在することもしないこともある。この大便は、完全な単一体ではなく、集合体（groups of piles）として排泄されることが多い。この大便試料と共に粘液が存在することが多い。この大便試料は、収集が非常に困難であり、常に表面及び手袋に残留物が残る。この大便試料は、数インチ（５〜１５センチ）の面積に広げることができる。
【００４１】
またさらに、血便、大便中の異物、又は大便中の粘液を含め、他の観察結果も記録される。
【００４２】
さらに、コンパニオンアニマルにおける胃腸感染症の処置は、コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善を含んでもよい。コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善は、好ましくは、コンパニオンアニマルの糞便中の病原菌レベルの低減を含む。コンパニオンアニマルの糞便中に存在する病原菌のレベルは、当業者に既知の標準的な平板計数法を使用して数えることができる。より好ましくは、病原菌は、クロストリジウム属（Clostridia）、エシェリキア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、バクテリオイド属（bacteriodes）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。好適な病原菌株の非限定例としては、ウェルシュ菌（C.perfringens）、クロストリジウム・ディフィシレ（C.difficile）、大腸菌（Eschericia coli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４３】
本発明の細菌の使用方法には、また、哺乳類、好ましくはコンパニオンアニマルの尿路の予防的又は治療的処置も含めることができる。尿路の処置の非限定例としては、尿路感染症の治療又は予防、腎臓結石を含めた腎疾患の治療又は予防、膀胱感染症の治療又は予防などが挙げられる。理論に束縛されるものではないが、本発明のビフィズス菌は、インビトロにて実証されているように、シュウ酸を分解する能力の結果として、これらの病気を防止する際に有用と考えられている。シュウ酸は、腎臓、膀胱、及び他の尿路感染症を引き起こす不溶性沈殿物を形成する虞のある、尿代謝の副産物である。シュウ酸を分解し、その結果尿路でのシュウ酸の沈殿及び蓄積を潜在的に防止することによって、本発明の細菌は、尿路の感染症及び他の病気を治療且つ予防することができる。シュウ酸の分解は、ベーリンガー・マンハイム／Ｒ−バイオファーム（Boehringer Mannheim/R-Biopharm）から市販されているシュウ酸試験キット・カタログ番号７５５６９９を使用して、インビトロにて判断することができる。
【００４４】
本発明のビフィドバクテリア・グロボーサムは、繊維消化の改善を含む、コンパニオンアニマルの健康を改善又は維持する方法で使用することができる。繊維消化の改善は、前記プロバイオティク細菌並びに有益な内在性微生物相の増殖を促進し、それがある種の潜在的病原菌の抑制に役立つので望ましい。さらに、ヒトにおける腸内発酵に起因した毒性代謝産物及び有害酵素の量の減少が文書化されている（トモマツ，Ｈ．（Tomomatsu,H.）、「オリゴ糖の健康効果（Health effects of oligosaccharides）」、（１９９４）食品技術（Food Technol）、４８、６１〜６５）。希釈糞便試料を使用する植菌の代わりに各実験が関心細菌株の純粋培養を使用した点を別として、ヴィッカーズ（Vickers）ら（２００１）「選択されたフラクトオリゴ糖とイヌ結腸微生物相による他の繊維基質との発酵の比較（Comparison of fermentation of selected fructooligosaccharides and othe rfiber substrates by canine colonic microflora）」、アメリカ獣医学研究雑誌（Am.J.Vet.Res.）６１（４）、６０９〜６１５に記載されている方法を使用して繊維消化を判定することができる。
【００４５】
本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌の使用方法は、通常、動物による経口消費を伴う。経口消費は、通常の食餌摂取の一部として、又はその補助（supplement）として行われてよい。経口消費は、通常、少なくとも月に１回、好ましくは少なくとも週に１回、より好ましくは少なくとも１日に１回行われる。本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌は、動物、好ましくはコンパニオンアニマルの健康を維持又は改善するための治療的に有効な量で、該動物に与えられてよい。本明細書で使用する時、乳酸菌に関する用語「治療的に有効な量」は、処置が必要な宿主動物に所望の効果若しくは利益を提供するのに十分であるが、毒性、刺激、若しくはアレルギー反応のような悪影響を回避するために十分に少ない、本発明の方式で使用したときに適当な利益／危険比に相応する量を意味する。具体的な「治療的に有効な量」は、処置されている特定の条件、ユーザーの身体条件、処置期間、併用療法（もしあれば）の性質、使用されることになる具体的な剤形、採用されるキャリア、服用形態の溶解度、及び特定の服用レジメンのような因子によって異なる。
【００４６】
好ましくは、乳酸菌は、１日当たり１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１４ＣＦＵ、より好ましくは１日当たり１．０Ｅ＋０６〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵの分量でコンパニオンアニマルに与えられる。組成物は、好ましくは、切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管からの単離によって得られる１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／ｇのビフィドバクテリア・グロボーサムを少なくとも０．００１％含有してよい。ビフィドバクテリア・グロボーサム菌は、生存可能な形態で、若しくは死菌細胞として、又は本発明の乳酸菌の発酵産物の留出物、単離物、若しくは他の画分、あるいはこれらのいずれかの組み合わせとして動物に与えることができる。
【００４７】
好ましくは、ビフィドバクテリア・グロボーサム菌、又はその精製若しくは単離画分を使用して、動物の健康を維持又は改善することを目的とした組成物が調製される。前述のように、組成物は、通常の食餌摂取の一部であってよく、又はサプリメントであってよい。組成物が通常の食餌摂取の一部を成す場合、該組成物は、ビスケット若しくは粗挽き（kibbles）のような乾燥アニマルフード、加工粒餌、湿式アニマルフード、ヨーグルト、肉汁（gravies）、噛み物（chews）、トリーツ（treats）などの形態であってよい。
【００４８】
このような組成物は、さらなる構成成分を含んでよい。他の構成成分は、本明細書で使用される組成物に含めるのに有益であるが、本発明の目的には任意である。例えば、フード組成物は、好ましくは栄養的にバランスが取れている。一実施形態では、フード組成物は、乾燥物質基準で、該フード組成物の約２０重量％〜約５０重量％の粗タンパク質、好ましくは約２２重量％〜約４０重量％の粗タンパク質を含んでよい。粗タンパク質材料は、少なくとも約１５重量％のタンパク質含有量を有するいずれの材料を含んでもよく、その非限定例としては、大豆、綿実、及び落花生のような植物性タンパク質、カゼイン、アルブミン、及び肉組織のような動物性タンパク質が挙げられる。本明細書で有用な肉組織の非限定例としては、新鮮な肉、並びに、魚粉、家禽粉、肉粉、骨粉などの乾燥又は精製ミールが挙げられる。他の種類の好適な粗タンパク質源としては、小麦グルテン若しくはトウモロコシグルテン、並びに酵母のような微生物源から抽出されたタンパク質が挙げられる。
【００４９】
さらに、フード組成物は、乾燥物質基準で、該フード組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、好ましくは約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。さらに、本発明の乳酸菌を含むフード組成物は、また、約４％〜約２５％の総食物繊維も含んでよい。該組成物は、また、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／５１１０８に記載の多重デンプン源（multiple starch source）も含んでよい。
【００５０】
本発明の組成物は、炭水化物源をさらに含んでよい。米、トウモロコシ、ミロ、サトウモロコシ、大麦、アルファルファ、小麦などのグレイン又は穀物が、供給源の例である。さらに、該組成物は、また、乾燥乳清及び他の乳製品副産物のような他の材料も含有してよい。
【００５１】
本発明の細菌を含む組成物は、また、プレバイオティクも含んでよい。「プレバイオティク」には、ペットの腸内細菌相によって発酵される、したがって病原菌を犠牲にしてペットの胃腸管内で乳酸菌の増殖及び発達を促進する物質又は化合物が含まれる。この発酵の結果は、結腸での脂肪酸、特に短鎖脂肪酸の放出である。これは、結腸においてｐＨ値を低下させる効果を有する。好適なプレバイオティクの非限定例としては、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、又はデンプンのオリゴ誘導体として一般に知られている、イヌリン及びその加水分解生成物のようなオリゴ糖が挙げられる。プレバイオティクは、いずれか好適な形態で提供されてよい。例えば、プレバイオティクは、繊維を含有する植物材料の形態で提供されてよい。好適な植物材料としては、アスパラガス、アーティチョーク、玉ねぎ、小麦、若しくはチコリー、又はこれらの植物材料の残渣が挙げられる。別法として、プレバイオティク繊維は、イヌリン抽出物として提供されてもよく、例えば、チコリーからの抽出物が好適である。好適なイヌリン抽出物は、オラフティＳＡ（Orafti SA）（ベルギー、チルレモン（Tirlemont）３３００）から商標「ラフティライン（Raftiline）」として得ることができる。例えば、イヌリンは、約９０〜約９４重量％のイヌリン、最高約４重量％までのグルコース及びフルクトース、並びに約４〜９重量％のスクロースを含有する白色微粉末であるラフティライン（Raftiline）（ｇ）ＳＴの形態で提供されてもよい。別法として、繊維は、オラフティＳＡ（Orafti SA）（ベルギー、チルレモン（Tirlemont）３３００）から商標「ラフティルーズ（Raftilose）」として得られるようなフラクトオリゴ糖の形態であってもよい。例えば、イヌリンは、ラフティルーズ（Raftilose）（ｇ）Ｐ９５の形態で提供されてよい。さもなければ、フラクトオリゴ糖は、イヌリンの加水分解によって、酵素法によって、又は微生物を用いて得られてもよい。
【００５２】
乾燥ペットフードの場合、好適なプロセスは、押出調理（extrusion cooking）であるが、ベーキング及び他の好適なプロセスを使用してもよい。押出調理されるときには、乾燥ペットフードは、通常、キブルの形態で提供される。プレバイオティクが使用される場合、該プレバイオティクは、プロセス処理前に乾燥ペットフードの他の成分と混合されてよい。好適なプロセスは、欧州特許出願第０８５０５６９号に記載されている。プロバイオティク微生物が使用される場合、該微生物を乾燥ペットフード上にコーティングする、又は乾燥ペットフードに詰め込むべきである。好適なプロセスは、欧州特許公開第ＥＰ０８６２８６３号に記載されている。
【００５３】
湿式フードの場合、米国特許第４，７８１，９３９号及び同第５，１３２，１３７号に記載されているプロセスを使用して、擬似肉製品を作り出してよい。また、チャンク型製品を作り出す他の手順、例えば、スチームオーブンでの調理を使用してもよい。別法として、好適な肉材料を乳化させて肉エマルションを作り出し、好適なゲル化剤を添加し、該肉エマルションを加熱してから缶又は他の容器に詰めることによって、ローフ型の製品を作り出してもよい。典型的な湿式フード組成物は、約５％〜約１５％のタンパク質、約１％〜約１０％の脂肪、及び約１％〜約７％の繊維を含んでよい。湿式フード組成物で使用してよい非限定的な成分としては、鶏肉、シチメンチョウ肉、牛肉、ホワイトフィッシュ、チキンブロス、ターキーブロス、ビーフブロス、鶏の肝臓、発酵用米、コーングリッツ、魚粉、卵、ビートパルプ、塩化物、フラックスミール、子羊肉、牛肉副産物、鶏肉副産物、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５４】
他の実施形態では、ビスケット、チューズ、及び他のトリーツのようなサプリメント組成物は、乾燥物質基準で、該サプリメント組成物の約２０重量％〜約６０重量％のタンパク質、又は約２２重量％〜約４０重量％のタンパク質を含んでよい。他の例として、サプリメント組成物は、乾燥物質基準で、該サプリメント組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、又は約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。イヌ科動物又はネコ科動物による使用が意図されたフード及びサプリメント組成物は、当該技術分野において一般的に知られている。
【００５５】
ペットフードは、長鎖脂肪酸及び亜鉛のような他の活性剤を含有してよい。好適な長鎖脂肪酸としては、α−リノール酸、γ−リノレン酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸が挙げられる。魚油は、好適なエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸源である。
【００５６】
ルリチシャ油、ブラックカレント種子油、及びマツヨイグサ油は、好適なγリノレン酸源である。ベニバナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、及び大豆油は、好適なリノール酸源である。また、これらの油を、以上で言及したコーティング基材で使用してもよい。亜鉛は、様々な好適な形態で、例えば、硫酸亜鉛又は酸化亜鉛として提供されてよい。さらに、ペットフードで一般的に使用される多くの成分は、脂肪酸及び亜鉛源である。プレバイオティク源として、チコリーとリノール酸が豊富な大豆油のような油とを組み合わせると、相乗効果を示唆する、予期せぬ利益がもたらされることが観察されている。
【００５７】
組成物がグレイビーの形態の場合、該組成物は、好ましくは少なくとも１０％のブロス又はストックを含んでおり、その非限定例としては、野菜ビーフ、チキン、又はハムストックが挙げられる。典型的なグレイビー組成物は、約０．５％〜約５％の粗タンパク質、約２％〜約５％の粗脂肪、及び約１％〜約５％の繊維を含んでよい。
【００５８】
本明細書に用いるのに好適なサプリメントの他の非限定例としては、粉末、油懸濁液、ミルクベース懸濁液チーズ、及び丸薬若しくはカプセルが挙げられる。組成物が丸薬の形態の場合、丸薬を固体の圧縮形態に維持するために、好適な結合剤が必要である。好適な結合剤の非限定例としては、キサンタンガム、ペクチン、レシチン、アルギネート、及び当業者に既知の他のものなど、天然ガムが挙げられる。組成物がカプセルの形態の場合、該組成物は、好ましくは当業者に既知の技術を使用して封入される。好適な封入材料の非限定例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルギネート、及びゼラチンが挙げられる。ヨーグルトベースの組成物は、約１％〜約５％のタンパク質、約１０％〜約２０％の炭水化物、約１％〜約５％の繊維、約１％〜約５％の脂肪、及び約５０％〜約９０％のミルクのような液体キャリアを含んでよい。
【実施例】
【００５９】
以下の諸実施例は、本発明を例示するために提供するものであり、いかなる形でも本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００６０】
実施例１：イヌ科動物のＧＩ管からのビフィドバクテリア・グロボーサム菌の単離
飼い主主導による承認済みの安楽死のために地域の獣医のところにいる健康なイヌから、イヌ腸試料を得た。すべての動物が健康で無病であった。各イヌの結腸、中間結腸（mid-colon）、盲腸、及び回腸を切開して粘膜を露出させた。
【００６１】
粘膜組織を攪拌し（１分間ボルテックス処理）、組織を機械的に均質化した後、上清を除去した。各上清を、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ：Reinforced Clostridia Agar）又はＭＲＳプラス０．０５％システイン・プラス・ムピロシン上で平板培養した。アネロカルト・ガスパック（Anerocult GasPak）システムを使用して、これらを３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートした。プレートから単離したコロニーを、ＭＲＳ又はＲＣＡのいずれかの上に再画線接種し（re-streaked）、再び同一条件下で嫌気的に増殖させた。単離したコロニーをさらに４回、再画線接種して、単一の菌株を精製した。コロニーのモルホロジー（morphology）及び顕微鏡像を評価した。好適な単離株を、グラム反応及びカタラーゼ活性について試験した。ＡＰＩ試験（ＡＰＩ  ５０ＣＨＬ、ビオメリュー（BioMerieux））を使用して、グラム陽性・カタラーゼ陰性桿菌の同定を実施した。採集した細胞を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）及びシステイン−ＨＣｌ（５００ｍｇ／Ｌ）で２回洗浄した後、音波処理を実施した。遠心分離を行って、細胞破片を除去した。上清をＮａＦ（６ｍｇ／ｍＬ）及びヨード酢酸Ｎａ（１０ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。室温で１０分間にわたって塩酸ヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）でインキュベートすることによって、反応を停止させた。ＨＣｌ（４Ｍ）、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ（５％（ｗ／ｖ）、０．１ＭのＨＣｌ中）、及びフルクトース−６−ホスフェート（Ｎａ塩）の添加後、発色（colour development）を観察した。フルクトース−６−ホスフェートからのアセチルリン酸の形成が、そのヒドロキシメート（hydroxymate）の第二鉄キレートによって形成される赤みを帯びた色によって明示された。
【００６２】
切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から５８個の乳酸菌株が単離され、そのうちの６個がビフィズス菌属であり、１個がＢ．グロボーサム（B.globosum）菌株であることが判明した。
【００６３】
実施例２：抗菌活性についてのスクリーニング
単離したビフィドバクテリア・グロボーサム菌株を、ＴＰＹ培地中で嫌気的にインキュベートした。各培養物２μＬを、ＴＰＹ寒天プレート上にスポット接種して、一晩嫌気的にインキュベートした。サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、及び大腸菌（Eschericia coli）０１５７Ｈ４５を、予め一晩増殖させて、１００μＬを融解寒天（molten agar）（１％、ｖ／ｖ）中に播種した。このインジケータ培養物を、播種したＭＲＳ又はＴＰＹプレートの表面上に注いだ。一晩インキュベートした後、プロバイオティク・コロニーの周りの抑制域を評価した。すべての実験を、別個の３つの状況でデュプリケート（duplicate）で実施した。さらに、緩衝剤である２％β−グリセロホスフェートを寒天に組み込むことで、インビトロで観察された病原体抑制に対して酸の産生が果たした寄与を評価することができた。
【００６４】
図１、２、３、及び４に提示したデータは、切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管からの単離によって得られる本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌株が、潜在的なプロバイオティク活性を示す、インビトロでの抗菌活性を有することを明示している。
【００６５】
実施例３：生存及びコロニー形成のインビトロ指標
（ｐＨ耐性）
一晩培養したものから細菌細胞を採集し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で２回洗浄し、１ＭのＨＣｌでｐＨ２．５に調節したＴＰＹ培地中に再懸濁させた。細胞を３７℃で嫌気的にインキュベートし、当業者に既知の平板計数法を使用して０、３０、６０、１２０、２４０、及び３６０分の間隔で細胞の生存を評価した。
【００６６】
図５は、５つの菌株が１時間にわたってｐＨ２．５に対する耐性を示したことを明示している。表２は、このデータを菌株ごとにまとめている。
【表２】
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【００６７】
（胆汁耐性）
ブタ胆汁（シグマ（Sigma））を０．５％、１％、及び５％（ｗ／ｖ）で加えたＴＰＹ寒天上に、細菌株を画線接種した。プレートを嫌気条件下で３７℃でインキュベートし、２４時間後に増殖を記録した。経験豊富な観察者が増殖を対照プレートと比較し、コロニーの増殖を次のように記述した：
陰性（０）  −  増殖なし；
＋（１）  −  濁りを帯びた半透明状の増殖（＜胆汁０％の対照プレートの３３％）；
＋＋（２）  −  対照ほどではないが明確な増殖（＞３３％、ただし＜６６％）；
＋＋＋（３）  −  対照と同等の増殖（＞６６％）。
【００６８】
胆汁酸塩の存在下でのコロニーの増殖を対照と比較した後、増殖記述子に数値０、１、２、又は３（それぞれ、−、＋、＋＋、＋＋＋）を与え、次いでパーセンテージとして表す（３が１００％を表す）。
【００６９】
図６は、本発明のビフィズス菌が明らかに胆汁酸塩に対する耐性を示し、したがって０．５％胆汁酸塩に曝されたときに少なくとも３３％のレベルで増殖してコロニーを形成可能であることを明示している。
【００７０】
（腸上皮細胞の付着）
ヒトの上皮細胞系ＨＴ−２９を使用して、選択された菌株の付着特性を評価した。５％ＣＯ２を含有する３７℃の加湿雰囲気中、７５ｃｍ２組織培養フラスコで、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ：foetal calf serum）、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、及びファンギゾンを含有するダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ：Dulbecco’s Minimal Essential Media）中で上皮細胞を単層としてルーチン的に培養した。実験目的で、上皮細胞を、６ウェル培養プレート（ザルスタット（Sarstedt））中にウェル当たり細胞５×１０５個／ｍＬ（総体積３ｍＬ）の濃度で播種した。７日間インキュベートした後、分化させるために、上皮の単層を、１０％ＦＣＳを含有する抗生物質フリーの培地で洗浄した。抗生物質フリーのＤＭＥＭに加えた細胞懸濁液又は抗生物質フリーのＤＭＥＭ中の細胞懸濁液を各ウェルに加え、細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート後、単層をＰＢＳで３回洗浄した。上皮細胞を脱イオンＨ２Ｏに溶解させ、当業者に既知の平板計数法を使用して付着細菌数を数えた。付着を、最初に平板培養した細菌数のパーセンテージとして表した。
【００７１】
図７からわかるように、ＮＣＩＭＢに寄託番号ＮＣＩＭＢ４１１９８で寄託されたビフィドバクテリア・グロボーサム菌株は、ＨＴ−２９腸上皮細胞に少なくとも４％のレベルで付着した。
【００７２】
実施例４：１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチドの配列決定
ビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）のコロニーを寒天プレートから釣菌し、ＩＸ  ＰＣＲ緩衝剤に再懸濁させ、９６℃で５分間加熱し、−７０℃で５分〜１０分間凍結させ、解凍して、アリコートをＰＣＲエッペンドルフチューブに加えた。遺伝子間スペーサ（ＩＧＳ）プライマーであるＩＧＳ  Ｌ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ−３’及びＩＧＳ  Ｒ：５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡ−３’を使用して、ＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９６℃で１分間（１サイクル）、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒（２８サイクル）とした。ＰＣＲ反応は、５μＬのＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝剤（バイオライン（Bioline）、英国）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（ロシュ（Roche）、英国）、０．４μＭのＩＧＳ  Ｌ及びＲプライマー（１５０ｎｇ／５０μＬ）（ＭＷＧバイオテック（MWG Biotech）、ドイツ）、及びバイオラインＴａｑ（Bioline Taq）ポリメラーゼ（０．６単位）を含有した。ハイベイド（Hybaid）サーモサイクラーでＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物（８μＬ）を、ＴＡＥ中２％アガロースＥｔＢｒ染色ゲル上で分子量マーカー（φＸ１７４ＨａｅＩＩＩ、プロメガ（Promega））と並べて分析して、それらのＩＧＳプロファイルを決定した。以上と同一のプライマーを使用して、当業者に既知の方法を用いて遺伝子間スペーサ（ＩＧＳ）ＤＮＡを２つのイヌ・ビフィドバクテリア・グロボーサム（Bifidobacteria globosum）菌株について配列決定した。
【００７３】
配列決定後、４つの寄託株について得られた配列を、他の寄託細菌１６ｓ−２３ｓ配列との相同性について、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能なオンライン配列データベース「ＢＬＡＳＴ」と比較した。ＡＨＣＦについて最も近いマッチは、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）ＡＴＣＣ２５５２６であり、相同性スコア９２％であった。ただし、これらの菌株間及び互いの間には幾つか相違が存在する。
【００７４】
実施例５：組成物の例
実施例１〜４は、本発明のプロバイオティク・ビフィドバクテリア・グロボーサムを含む乾燥キブル組成物の例である。
【表３】
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【００７５】
実施例５〜７は、本発明のプロバイオティク・ビフィドバクテリア・グロボーサムを含む湿式ペットフード組成物の例である。
【表４】
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【００７６】
実施例８〜１０は、本発明のプロバイオティク・ビフィドバクテリア・グロボーサムを含むヨーグルトサプリメント組成物の例である。
【表５】
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【００７７】
本発明の特定の実施形態を例示し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例２で述べた方法による、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌によるサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）のインビトロでの増殖抑制を示す図。
【図２】実施例２で述べた方法による、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌によるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のインビトロでの増殖抑制を示す図。
【図３】実施例２で述べた方法による、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌によるリステリア・イノキュア（Listeria innocua）のインビトロでの増殖抑制を示す図。
【図４】実施例２で述べた方法による、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌による大腸菌（Escherichia coli）０１５７Ｈ４５のインビトロでの増殖抑制を示す図。
【図５】実施例３で述べた方法による、本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌のインビトロでの酸安定性を示す図。
【図６】０．５％、１％、及び５％ブタ胆汁酸塩の存在下での本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌の増殖特性を示す図。
【図７】本発明のビフィドバクテリア・グロボーサム菌がインビトロにてＨＴ−２９腸上皮細胞に付着する能力を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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