(57)【要約】  一般的なインク顔料と、紙および布帛をはじめとする様々な印刷媒体とに、高親和力で結合するペプチドが同定されている。これらのペプチドを使用して、インクジェット印刷をはじめとするコーティング用途のためのジブロックおよびトリブロック分散剤、および紙ならびに布帛を処理するためのジブロックポリマーを調製した。ジブロック分散剤は、親水性リンカーと共役する顔料結合ペプチド、印刷媒体結合ペプチドと共役する顔料結合ペプチド、または疎水性リンカーと共役する印刷媒体結合ペプチドからなる。ジブロックポリマーは、親水性リンカーまたは恩恵作用物質と共役する印刷媒体結合ペプチドからなる。トリブロック分散剤は、印刷媒体結合ペプチドと共役する親水性リンカーと共役する顔料結合ペプチドからなる。
2007508246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９よりなる群から選択される顔料結合ペプチド。
【請求項２】
配列番号３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、および４０よりなる群から選択される印刷媒体結合ペプチド。
【請求項３】
ａ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
ｂ）（ａ）のライブラリーと顔料とを接触させて、
（ｉ）ペプチド−ポリエステル複合体、
（ｉｉ）非結合ポリエステル、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のペプチド−ポリエステル複合体を単離し、そして、
ｄ）（ｂ）のペプチド複合体から、特異的ポリエステル結合特性を有するペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、ポリエステル結合ペプチド。
【請求項４】
ペプチドが約５〜約２０個のアミノ酸であり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも約２０ｍｏｌ％含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項３に記載のポリエステル結合ペプチド。
【請求項５】
約５〜約２０個のアミノ酸を有し、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも約２０ｍｏｌ％含んでなり、ポリエステル基材に対して２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の結合エネルギーを有する、ポリエステル結合ペプチド。
【請求項６】
一般構造式、
［ＰＢＰ］ｎ−ＨＬ
（式中、
ａ）ＰＢＰは顔料結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＬは親水性リンカーであり、そして、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有する、ジブロック分散剤。
【請求項７】
顔料結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンよりなる群から選択される少なくとも約４０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項６に記載のジブロック分散剤。
【請求項８】
顔料結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと顔料とを接触させて、
（Ａ）ペプチド−顔料複合体、
（Ｂ）非結合顔料、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−顔料複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項６に記載のジブロック分散剤。
【請求項９】
一般構造式、
［ＰＭＢＰ］ｎ−ＨＬ
（式中、
ａ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＬは親水性リンカーであり、そして、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロックポリマー。
【請求項１０】
印刷媒体結合ペプチドが、セルロース結合ペプチドおよびポリエステル結合ペプチドよりなる群から選択される、請求項９に記載のジブロックポリマー。
【請求項１１】
セルロース結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約１４ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項１０に記載のジブロックポリマー。
【請求項１２】
ポリエステル結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約２０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項１０に記載のジブロックポリマー。
【請求項１３】
セルロース結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとセルロースとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−セルロース、
（Ｂ）非結合セルロース、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−セルロース複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項１０に記載のジブロックポリマー。
【請求項１４】
ポリエステル結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとポリエステルとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−ポリエステル、
（Ｂ）非結合ポリエステル、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−ポリエステル複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項１０に記載のジブロックポリマー。
【請求項１５】
一般構造式、
［ＰＢＰ］ｎ−［ＰＭＢＰ］ｎ
ａ）ＰＢＰは顔料結合ペプチドであり、
ｂ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、そして
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有する、ジブロック分散剤。
【請求項１６】
顔料結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンよりなる群から選択される少なくとも約４０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項１５に記載のジブロック分散剤。
【請求項１７】
印刷媒体結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約１４ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有し、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約２０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項１５に記載のジブロック分散剤。
【請求項１８】
顔料結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと顔料とを接触させて、
（Ａ）ペプチド−顔料複合体、
（Ｂ）非結合顔料、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−顔料複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項１５に記載のジブロック分散剤。
【請求項１９】
印刷媒体結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとセルロースまたはポリエステルとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−セルロース複合体またはペプチド−ポリエステル−複合体、
（Ｂ）非結合セルロースまたはポリエステル、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−セルロースまたはペプチド−ポリエステル複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項１５に記載のジブロック分散剤。
【請求項２０】
一般構造式、
［ＰＭＢＰ］ｎ−ＨＰＬ
（式中、
ａ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＰＬは疎水性リンカーであり、そして
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロック分散剤。
【請求項２１】
印刷媒体結合ペプチドが、セルロース結合ペプチドおよびポリエステル結合ペプチドよりなる群から選択される、請求項２０に記載のジブロック分散剤。
【請求項２２】
セルロース結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約１４ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項２１に記載のジブロック分散剤。
【請求項２３】
ポリエステル結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約２０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項２１に記載のジブロック分散剤。
【請求項２４】
セルロース結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとセルロースとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−セルロース、
（Ｂ）非結合セルロース、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−セルロース複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項２２に記載のジブロック分散剤。
【請求項２５】
ポリエステル結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとポリエステルとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−ポリエステル、
（Ｂ）非結合ポリエステル、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−ポリエステル複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項２３に記載のジブロック分散剤。
【請求項２６】
一般構造式、
［ＰＭＢＰ］ｎ−ＢＡ
（式中、
ａ）ＰＭＢＰは配列番号４、３０、３１、３２、３３、３４、３５，３６、３７、３８、および４０よりなる群から選択される印刷媒体結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは恩恵作用物質であり、そして
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロックポリマー。
【請求項２７】
恩恵作用物質が、芳香剤、衛生作用物質、昆虫制御剤、酵素、軟化タンパク質、布帛柔軟剤、防汚剤、漂白剤、染料固定剤、光沢剤、抗菌剤、界面活性剤、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項２６に記載のジブロックポリマー。
【請求項２８】
一般構造式、
［ＰＢＰ］ｎ−ＨＬ−［ＰＭＢＰ］ｎ
（式中、
ａ）ＰＢＰは顔料結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＬは親水性リンカーであり、
ｃ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、そして
ｄ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するトリブロック分散剤。
【請求項２９】
顔料結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約１４ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有し、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約２０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項２８に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３０】
印刷媒体結合ペプチドが、セルロース結合ペプチドおよびポリエステル結合ペプチドよりなる群から選択される、請求項２８に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３１】
セルロース結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約１４ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項３０に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３２】
ポリエステル結合ペプチドが約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸であり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンよりなる群から選択される少なくとも約２０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなり、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有する、請求項３０に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３３】
セルロース結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとセルロースとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−セルロース、
（Ｂ）非結合セルロース、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−セルロース複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項３１に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３４】
ポリエステル結合ペプチドが、
ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーとポリエステルとを接触させて、
（Ａ）ペプチド−ポリエステル、
（Ｂ）非結合ポリエステル、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−ポリエステル複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される、請求項３２に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３５】
顔料結合ペプチドまたは印刷媒体結合ペプチドが約７個のアミノ酸〜約１２個のアミノ酸である、請求項６、１５または２８に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項３６】
顔料結合ペプチドが配列番号５、６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６、１５または２８に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項３７】
印刷媒体結合ペプチドが配列番号４、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、および４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項９、１５、または２０に記載の分散剤またはジブロックポリマー。
【請求項３８】
印刷媒体結合ペプチドが配列番号１〜４、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、および４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載のトリブロック分散剤。
【請求項３９】
親水性リンカーがポリエチレングリコール誘導体、ポリアクリル酸／マレイン酸ポリマー、ポリアクリル酸の誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメチルビニルエーテル、セルロースポリマー、およびその他の多糖類よりなる群から選択される有機ポリマーである、請求項６、９または２８に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４０】
親水性リンカーがアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、プロリン、セリン、スレオニン、およびそれらの混合物よりなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるペプチドである、請求項６、９または２８に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４１】
親水性リンカーが３〜約５０個のアミノ酸の長さを有するペプチドである、請求項４０に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４２】
親水性リンカーがポリプロリン、配列番号４５、および配列番号５６よりなる群から選択されるペプチドである、請求項４０に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４３】
疎水性リンカーがメタクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、およびそれらの共重合体よりなる群から選択される合成有機ポリマーである、請求項２０に記載のジブロック分散剤。
【請求項４４】
疎水性リンカーがアラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、親水性アミノ酸の疎水性誘導体、およびそれらの混合物よりなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるペプチドである、請求項２０に記載のジブロック分散剤。
【請求項４５】
顔料結合ペプチドがシアン、イエロー、レッド、ブルー、オレンジ、マゼンタ、ブラック、グリーン、バイオレット、ライトシアン、およびライトマゼンタよりなる群から選択される有機顔料に対する親和力を有する、請求項６、１５、または２８に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４６】
顔料結合ペプチドがカーボンブラック、クロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔｈａｌ）（登録商標）イエロー、サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ、およびサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルーよりなる群から選択される有機顔料に対する親和力を有する、請求項４５に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４７】
印刷媒体結合ペプチドが綿、ポリエステル／綿、セルロース、およびポリ（エチレンテレフタラート）よりなる群から選択される、紙および編織布に対する親和力を有する、請求項９、１５、または２０に記載の分散剤またはジブロックポリマー。
【請求項４８】
顔料結合ペプチドまたは印刷媒体結合ペプチドが、２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の結合エネルギーを有する、請求項６、１５、または２８に記載の分散剤またはポリマー。
【請求項４９】
ａ）水性キャリア媒体、
ｂ）顔料、および
ｃ）請求項６、１５、または２８に記載の分散剤
を含んでなる、水性インク組成物。
【請求項５０】
組成物が約０．１〜約１５％の顔料、約０．１〜約３０％の分散剤、および約７０〜約９９．８％の水性キャリア媒体を含有する、請求項４９に記載のインク組成物。
【請求項５１】
水性媒体が水、または水と少なくとも１つの有機溶剤との混合物を含んでなる、請求項４９に記載のインク組成物。
【請求項５２】
有機溶剤が多価アルコールである、請求項５１に記載のインク組成物。
【請求項５３】
界面活性剤をさらに含んでなる、請求項５１に記載のインク組成物。
【請求項５４】
界面活性剤がアニオン性、非イオン性、カチオン性、および両性界面活性剤よりなる群から選択される、請求項５３に記載のインク組成物。
【請求項５５】
界面活性剤が約０．０１〜約５％の量で存在する、請求項５３に記載のインク組成物。
【請求項５６】
界面活性剤が約０．２〜約２％の量で存在する、請求項５３に記載のインク組成物。
【請求項５７】
ａ）水性キャリア媒体、
ｂ）顔料、
ｃ）フィルム形成樹脂、および
ｄ）請求項６、１５、または２８に記載の分散剤またはポリマー
を含んでなる水性コーティング組成物。
【請求項５８】
ａ）プラスチック樹脂、
ｂ）顔料、および
ｃ）請求項６、１５、２８に記載の分散剤またはポリマー
を含んでなる、着色可塑性組成物。
【請求項５９】
ａ）配列番号３５、３６、３７、および３８よりなる群から選択されるセルロース結合ペプチド配列を含有する組換えタンパク質を含んでなるサンプルを提供し、
ｂ）サンプルとセルロース担体とを接触させて、
ｃ）サンプルからセルロース担体を分離し、そして、
ｄ）担体を溶出剤で処理して組換えタンパク質を回収する
工程を含んでなる、組換えタンパク質を回収および精製する方法。
【請求項６０】
ａ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９よりなる群から選択される顔料結合ペプチド配列を含有する組換えタンパク質を含んでなるサンプルを提供し、
ｂ）サンプルと顔料とを接触させて、
ｃ）サンプルから顔料を分離し、そして
ｄ）顔料を溶出剤で処理して組換えタンパク質を回収する
工程を含んでなる、組換えタンパク質を回収および精製する方法。
【請求項６１】
ａ）顔料結合ペプチドと印刷媒体結合ペプチドとを有する請求項２８に記載のトリブロック分散剤を提供し、
ｂ）（ａ）のトリブロック分散剤と顔料とを接触させて、顔料が顔料結合ペプチドと複合体を形成して、ペプチド複合トリブロックを形成し、そして
ｃ）ステップ（ｃ）のペプチド複合トリブロックと印刷媒体とを接触させて、印刷媒体が印刷媒体結合ペプチドと複合体を形成し、顔料が印刷媒体に固着される
工程を含んでなる、顔料を印刷媒体に固着する方法。
【請求項６２】
ステップｂ）およびｃ）が逆転される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
トリブロック分散剤がインク組成物、水性コーティング組成物、および着色可塑性組成物よりなる群から選択される組成物の一部として提供される、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本願明細書は、２００３年９月８日に出願された米国特許仮出願第６０／５０１４９７号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、微粒子固形物、特に顔料のための分散剤分野に関する。より具体的には、本発明はジブロックおよびトリブロック分散剤、および特異的ペプチド配列を含んでなるジブロックポリマーに関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリマー分散剤は、塗料および仕上げ剤などのコーティングシステム、およびインクジェット印刷インク中の顔料を安定化するのに広く使用される（非特許文献１、非特許文献２、および非特許文献３）。分散剤は顔料粒子の周囲にシェルを形成する役割を果たし、凝集および凝固を防止する。水性システムでは、顔料分散体は概して非イオン性またはイオン性技術のいずれかによって安定化される。非イオン性技術では、顔料粒子は、水中に伸長してエントロピー的または立体構造的安定化を提供する、水溶性で親水性のセクションを有するポリマーによって安定化される。この目的で有用な代表的なポリマーとしては、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、およびエチレンオキシド変性フェノールが挙げられる。非イオン性技術は、ｐＨ変化またはイオンの混入に対して非感応性ではあるが、それには最終生成物が感水性であるという、多くの用途における大きな不都合がある。したがってインク用途などで使用した場合、湿気に曝されると顔料がこすられて不鮮明になる傾向がある。
【０００４】
イオン性技術では、顔料粒子は、中和されたアクリル酸、マレイン酸、またはビニルスルホン酸などのイオン含有モノマーのポリマーによって安定化される。ポリマーは、それによってイオン性反発が粒子の凝集を妨げる荷電二重層機序を通じて、安定化を提供する。中和構成要素は塗布後に蒸発する傾向があるので、ポリマーは水溶性が低下し、最終生成物は感水性でない。立体化学性およびイオン性安定化の双方を提供するブロックおよびグラフトポリマーなどのポリマー分散剤が、最も強健な顔料分散体を作る（非特許文献３）。
【０００５】
ランダムおよびブロック構造の双方を有するポリマー分散剤が開示されている。例えばオオタ（Ｏｈｔａ）らは、特許文献１で顔料表面に接着するイオン性親水性セグメントおよび芳香族疎水性セグメントを有する、ランダムポリマー分散剤を開示する。マ（Ｍａ）らは特許文献２で、水性インクジェットインクの分散剤としてのＡＢまたはＢＡＢブロック共重合体の使用を開示する。Ａセグメントは顔料粒子に結合する役割をする疎水性ホモポリマーまたは共重合体であり、Ｂセグメントは顔料を水性媒体中に分散する役割をする親水性ポリマーまたはその塩である。マ（Ｍａ）らは特許文献３で、Ａセグメントが顔料の水中の分散を容易にする役割をする親水性ポリマーであり、Ｂセグメントが顔料に結合できるポリマーであり、Ｃセグメントが分散体を安定化する役割をする親水性または疎水性ポリマーである、ＡＢＣトリブロックポリマー分散剤を開示する。ローズ（Ｒｏｓｅ）らが特許文献４で述べるように、ポリマー分散剤の組み合わせを使用してもよい。これらのランダムおよびブロックポリマー分散剤は、分散した顔料に良好な安定性を提供するものの、より高品質のコーティング用途のためにさらなる改善が所望される。例えば顔料とのより強力な相互作用を有する分散剤は、分散体の安定性を改善するであろう。さらにコーティング基材とのより強力な相互作用を有する分散剤は、より耐久性のあるコーティングをもたらすであろう。これは、強化された耐久性が必要とされるテキスタイル印刷で特に重要である。
【０００６】
分散剤としてのタンパク質およびペプチドの使用もまた、技術分野で知られている。例えばブリュックマン（Ｂｒｕｅｃｋｍａｎｎ）らは特許文献５で、着色調合物中での分散剤としてのカゼイン、コラーゲン、アルブミン、およびゼラチンなどの化学的に変性されたタンパク質の使用について述べる。非特許文献４は、無機ミネラル粒子のための分散剤としてのポリアスパラギン酸などのポリアニオン性アミノ酸ペプチドの使用について述べる。しかし技術分野で、ジブロックおよびトリブロック分散剤における特異的結合ペプチド配列の使用の提案はされていない。
【０００７】
セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、およびキチナーゼなどの様々な酵素が、セルロースに特異的に結合する領域を含有することが知られている。これらのセルロース結合領域（ＣＢＤ）はそれらのアミノ酸配列に基づいて、いくつかの異なるファミリーに分類されている（非特許文献５）。ＣＢＤはセルロース表面に結合するためにいくつかの芳香族アミノ酸に依存し、ＣＢＤの大きさは典型的にアミノ酸残基３３〜１６８個の範囲であることが知られている。それらのセルロース結合特性のために、ＣＢＤは、布帛を処理して布帛上への恩恵作用物質の付着を確実にするための組成物中で使用されている。例えばペダーソン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）らは特許文献６で、布帛を処理して漂白された外見を生じるためのＣＢＤ結合フェノール酸化酵素を含有するハイブリッド酵素について述べる。フォンデルオステン（Ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｏｓｔｅｎ）らは特許文献７で、ＣＢＤに結合するアミラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、および酸化還元酵素などの非セルロース分解性酵素を使用して、セルロース布帛から染みを除去または漂白するためのプロセスについて述べる。ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）らは特許文献８で、スメッツ（Ｓｍｅｔｓ）らは特許文献９で、セルロース誘導体布帛を処理するための柔軟剤、芳香剤、抗酸化剤、ポリマー潤滑剤、染料固定剤、および汚れ忌避剤および剥離剤などの恩恵作用物質に結合するＣＢＤを含んでなる組成物について述べる。
【０００８】
３０個以下のアミノ酸の合成ペプチドであり、好ましくは少なくとも３個の芳香族アミノ酸を含有する模擬ＣＢＤについてもまた述べられている（ビョルキスト（Ｂｊｏｒｋｑｕｉｓｔ）らに付与された特許文献１０）。この開示で示される模擬ＣＢＤのための好ましい配列は、配列番号１として示される（ＡＷ）４Ｋ２、および配列番号２として示される（ＷＥ）４Ｋ２である。布帛表面への付着を改善するために、様々な恩恵作用物質に結合する模擬ＣＢＤを含んでなる布帛ケア組成物が、ビョルキスト（Ｂｊｏｒｋｑｕｉｓｔ）らに付与された特許文献１０によって教示される。しかし技術分野において、ジブロックまたはトリブロック分散剤中でのＣＢＤまたは模擬ＣＢＤの使用に関する記述はない。
【０００９】
１９８５年に導入されて以来、ファージディスプレイは、ペプチド、タンパク質、および薬剤標的のための小型分子をはじめとする多様なリガンドを発見するために広く使用されている（非特許文献６）。その用途は、タンパク質の折りたたみ、新しい触媒の活性、新しい特性を有するＤＮＡ結合タンパク質、および組織工学のための新しいペプチドベースの生体材料骨格の研究などのその他の分野に拡大されている（非特許文献７および非特許文献８）。非特許文献９は、無機半導体基材の異なる結晶学的形態に特異的に結合できるペプチド配列を同定するための、ファージディスプレイスクリーニングの使用を開示する。炭素ベースのナノ構造に特異的に結合するペプチドを同定するためのファージディスプレイの使用については、ジャゴタ（Ｊａｇｏｔａ）らに付与された同時係属の特許文献１１および特許文献１２で述べられる。ファージディスプレイにより大きくて多様なペプチドライブラリーを作り出す方法についてはかねて知られているが、改善された分散剤を作るのに使用するための顔料に特異的に結合するペプチドを見つける課題には応用されていない。ノラン（Ｎｏｌａｎ）ら（特許文献１３および非特許文献１０）は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して同定された、フルオレセイン、オレゴングリーン５１４、ローダミンレッド、およびテキサスレッドなどの蛍光性の染料と高い親和力で結合するペプチドを開示する。しかしこれらはコーティング用途において顔料としての役割をしない小型の可溶性染料分子である。
【００１０】
非特許文献１１は、ファージディスプレイ法を使用した、セルロースマトリックスに特異的に結合するペプチドの同定について述べる。これらのセルロース結合ペプチドの推定されるアミノ酸配列は、保存された芳香族残基であるチロシンまたはフェニルアラニンを有し、それらはセルロース結合タンパク質の正常なセルロース結合領域と類似している。配列番号３として示されるアミノ酸配列ＳＷＹＬは、セルロース結合モチーフのための有力候補として同定された。コーティング用途のための新しい分散剤におけるこれらのセルロース結合ペプチドの使用については、その開示では述べられていない。
【００１１】
エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）らは、特許文献１４でペプチドライブラリーと抗標的とを接触させて、抗標的に結合するペプチドを除去し、次に非結合ペプチドと標的とを接触させることを含んでなる、修正ファージディスプレイスクリーニング法について述べる。この方法を使用して、襟の汚れに結合するがポリエステル／綿には結合しないペプチド配列、およびポリウレタンに結合するが綿、ポリエステル、またはポリエステル／綿布帛には結合しないペプチド配列が同定された。布帛に結合するペプチド配列は、この開示では報告されていない。
【００１２】
ノモト（Ｎｏｍｏｔｏ）らは、特許文献１５でファージディスプレイを使用した顔料結合ペプチドの同定について述べる。いくつかのカーボンブラック、銅フタロシアニン、二酸化チタン、および二酸化ケイ素結合ペプチド配列が開示される。この開示では顔料結合ペプチドが使用されて、酵素ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼが顔料粒子上に固定化される。遺伝的工学が使用され、結合ペプチド配列が組換え融合タンパク質に組み込まれる。固定化酵素は顔料粒子上でポリヒドロキシアルカノアートの形成を触媒し、カプセル化された粒子を形成する。ペプチドベースのジブロックおよびトリブロック顔料分散剤については、この開示では述べられていない。
【００１３】
本発明のペプチド結合配列のいくつかについては、その他の目的で報告されている。エングラー（Ｅｎｇｌｅｒ）ら（特許文献１６および非特許文献１２）は、ファージディスプレイスクリーニングによって、ヒトトランスフェリン受容体への結合ペプチドとして同定される、配列番号４で示されるペプチド配列を開示する。非特許文献１３は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、配列番号５として示されるペプチド配列をＤＮＡ結合ペプチドとして同定した。非特許文献１４は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、配列番号６として示されるペプチド配列をカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）由来β−１，２−連結マンノシドを模倣するペプチドとして同定した。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）らは、特許文献１７で配列番号２２として示されるペプチド配列を血管形成阻害タンパク質と結合するペプチドとして同定した。マスダ（Ｍａｓｕｄａ）らは、特許文献１８でファージディスプレイスクリーニングを使用して、レトロウィルスインテグラーゼのＮ−末端領域に特異的に結合するペプチドとして同定される、配列番号３０によって示されるペプチド配列を開示する。非特許文献１５は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、チロシンキナーゼ受容体ＥｐｈＢ２に結合するペプチドとして同定される、配列番号３３によって示されるペプチド配列を開示する。これらの開示のいずれもコーティング用途のための新しい分散剤中におけるこれらのペプチド配列の使用については、教示していない。
【００１４】
上記を鑑みて、分散顔料に改善された安定性を提供し、商業的インクジェットプリンターをはじめとするより先進的な高品質コーティング用途の厳しい要求を満たす分散剤に対する必要性が存在する。様々な印刷媒体、特に編織布に改善された耐久性を提供するインク分散剤に対する必要性も存在する。
【００１５】
出願人は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、高親和力で顔料および様々な印刷媒体に特異的に結合するペプチド配列を同定し、それらを使用して、ペプチドを様々なリンカーブロックにカップリングすることで、ジブロックおよびトリブロック分散剤およびジブロックポリマーをデザインして、既述の必要性を満たした。
【００１６】
【特許文献１】米国特許第４，５９７，７９４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０８５，６９８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５１９，０８５号明細書
【特許文献４】ＧＢ２３４９１５３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１２４，４３８号明細書
【特許文献６】国際公開第９７４０１２７号パンフレット
【特許文献７】米国特許第６０１５７８３号明細書
【特許文献８】国際公開第９８００５００号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／１８８９７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０１３２８４８号パンフレット
【特許文献１１】米国特許出願第１０／４５３４１５号明細書
【特許文献１２】国際公開第０３／１０２０２０号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第００／２３４６３号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第０１／７９４７９号パンフレット
【特許文献１５】ＥＰ１２７５７２８号明細書
【特許文献１６】国際公開第０２／０４４３２９号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第００／０３２６３１号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第００／０７００３５号パンフレット
【非特許文献１】ロイター（Ｒｅｕｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ３７：１６１〜１６７（１９９９）
【非特許文献２】シュミッツ（Ｓｃｈｍｉｔｚ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ３５：１９１〜１９６（１９９９）
【非特許文献３】スピネリ（Ｓｐｉｎｅｌｌｉ）、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１０：１２１５〜１２１８（１９９８）
【非特許文献４】ガリス（Ｇａｒｒｉｓ）ら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ８０：１０３〜１１２（１９９３）
【非特許文献５】リンダー（Ｌｉｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７：１２〜２８（１９９７）
【非特許文献６】ディクシト（Ｄｉｘｉｔ）、Ｊ．ｏｆ  Ｓｃｉ．  ＆  Ｉｎｄ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５７：１７３〜１８３（１９９８）
【非特許文献７】ヘース（Ｈｏｅｓｓ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：３２０５〜３２１８（２００１）
【非特許文献８】ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１６〜２１（２００２）
【非特許文献９】ホエーリー（Ｗｈａｌｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：６６５〜６６８（２０００）
【非特許文献１０】ノラン（Ｎｏｌａｎ）ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：７３１〜７２８（１９９８）
【非特許文献１１】ハン（Ｈａｎ）ら、Ｓｈｅｎｇｗｕ  Ｈｕａｘｕｅ  Ｙｕ  Ｓｈｅｎｇｗｕ  Ｗｕｌｉ  Ｘｕｅｂａｏ  ３０：２６３〜２６６（１９９８）
【非特許文献１２】エングラー（Ｅｎｇｌｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：２００４〜２０１２（２００１）
【非特許文献１３】ウォルケ（Ｗｏｌｃｋｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０：１２３９〜１２４１（２００１）
【非特許文献１４】ジョールト（Ｊｏｕａｕｌｔ）ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：６９３〜７０１（２００１）
【非特許文献１５】ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｓｈｅｎｇｗｕ  Ｈｕａｘｕｅ  Ｙｕ  Ｓｈｅｎｇｗｕ  Ｗｕｌｉ  Ｘｕｅｂａｏ  ３２：４７５〜４７９（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、
様々な顔料および印刷媒体、特にセルロースおよびポリエステルに対して特異的親和力を示す、コンビナトリアルバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）手段によって選択されるいくつかのペプチドを提供する。ペプチドは、場合により多様な親水性および疎水性リンカーと結合する様々なジブロック、トリブロックおよび分散剤形状にアセンブルされる。これらの組成物は、選択的に顔料および染料を印刷媒体に付着させるのに有用である。
【００１８】
したがって本発明は、配列番号７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９よりなる群から選択される顔料結合ペプチドを提供する。
【００１９】
同様に本発明は、配列番号３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、および４０よりなる群から選択される印刷媒体結合ペプチドを提供する。
【００２０】
顔料結合ペプチドは、好ましくは、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと顔料とを接触させて、
（Ａ）ペプチド−顔料複合体、
（Ｂ）非結合顔料、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−顔料複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される。
【００２１】
同様にして、印刷媒体結合ペプチドは、好ましくは、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと顔料とを接触させて、
（Ａ）ペプチド−顔料複合体、
（Ｂ）非結合顔料、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のペプチド−顔料複合体を単離し、そして、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体からペプチドを溶出する
工程を含んでなるプロセスによって選択される。
【００２２】
好ましい一実施態様では、一般構造式、
［ＰＢＰ］ｎ−ＨＬ
（式中、
ａ）ＰＢＰは顔料結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＬは親水性リンカーであり、そして、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロック分散剤が提供される。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様では、一般構造式、
［ＰＭＢＰ］ｎ−ＨＬ
（式中、
ａ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＬは親水性リンカーであり、そして、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロックポリマーが提供される。
【００２４】
代案の実施態様では、本発明は、一般構造式、
［ＰＢＰ］ｎ−［ＰＭＢＰ］ｎ
（式中、
ａ）ＰＢＰは顔料結合ペプチドであり、
ｂ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロック分散剤を提供する。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、一般構造式、
［ＰＭＢＰ］ｎ−ＨＰＬ
（式中、
ａ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＰＬは疎水性リンカーであり、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロック分散剤を提供する。
【００２６】
代案の実施態様では、本発明は、一般構造式、
［ＰＭＢＰ］ｎ−ＢＡ
（式中、
ａ）ＰＭＢＰは配列番号４、３０、３１、３２、３３、３４、３５，３６、３７、３８、および４０よりなる群から選択される印刷媒体結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは恩恵作用物質であり、
ｃ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するジブロックポリマーを提供する。
【００２７】
別の好ましい実施態様では、本発明は、一般構造式、
［ＰＢＰ］ｎ−ＨＬ−［ＰＭＢＰ］ｎ
（式中、
ａ）ＰＢＰは顔料結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＬは親水性リンカーであり、
ｃ）ＰＭＢＰは印刷媒体結合ペプチドであり、そして
ｄ）ｎは１〜約５の範囲である）
を有するトリブロック分散剤を提供する。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）水性キャリア媒体、
ｂ）顔料、および
ｃ）本発明の分散剤
を含んでなる水性インク組成物を提供する。
【００２９】
同様にして本発明は、
ａ）水性キャリア媒体、
ｂ）顔料、
ｃ）フィルム形成樹脂、および
ｄ）本発明の分散剤またはポリマー
を含んでなる、水性コーティング組成物を提供する。
【００３０】
代案としては本発明は
ａ）プラスチック樹脂、
ｂ）顔料、および
ｃ）本発明の分散剤またはポリマー
を含んでなる着色可塑性組成物を提供する。
【００３１】
さらに本発明は、
ａ）配列番号３５、３６、３７、および３８よりなる群から選択されるセルロース結合ペプチド配列を含有する組換えタンパク質を含んでなるサンプルを提供し、
ｂ）サンプルとセルロース担体とを接触させて、
ｃ）セルロース担体をサンプルから分離し、
ｄ）担体を溶出剤で処理して組換えタンパク質を回収する
工程を含んでなる、組換えタンパク質を回収および精製する方法を提供する。
【００３２】
ａ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９よりなる群から選択される顔料結合ペプチド配列を含有する組換えタンパク質を含んでなるサンプルを提供し、
ｂ）サンプルと顔料とを接触させて、
ｃ）顔料をサンプルから分離し、
ｄ）顔料を溶出剤で処理して組換えタンパク質を回収する
工程を含んでなる、組換えタンパク質を回収および精製する方法もまた提供される。
【００３３】
さらに
ａ）顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドを有する本発明のトリブロック分散剤を提供し、
ｂ）（ａ）のトリブロック分散剤と顔料とを接触させることで、顔料が顔料結合ペプチドと複合体を形成して、ペプチド複合体トリブロックを形成し、
ｃ）ステップ（ｂ）のペプチド複合体トリブロックと印刷媒体とを接触させることで、印刷媒体が印刷媒体結合ペプチドと複合体を形成して、顔料が印刷媒体に固着される
工程を含んでなる、顔料を印刷媒体に固着する方法が提供される。
【００３４】
配列説明
本願明細書の部分を形成する以下の詳細な説明、図、および添付の配列説明から、本発明をより完全に理解できる。
【００３５】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００３６】
配列番号１〜３は、模擬ＣＢＤペプチドのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号４は、本発明の紙結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号５は、本発明の顔料結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号６は、本発明のカーボンブラック結合ペプチドおよびセルロース結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号７〜２９は、本発明の顔料結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号３０〜４０は、本発明の印刷媒体結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号４１は、ファージＤＮＡの配列決定に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００４３】
配列番号４２〜４４は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイで対照として使用されるペプチドのアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号４５は、ＳＴ−リンカーとして使用される、植物病原体菌・カビアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のセロビオヒドロラーゼＩ中のドメイン間リンカーのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号４６〜５０は、ＴＢＰ１遺伝子を調製するのに使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００４６】
配列番号５１は、ＴＰＢ１遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号５２は、ＴＰＢ１と称されるトリブロックタンパク質分散剤のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号５３、５４は、ＴＢＰ１断片を増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００４９】
配列番号５５は、６Ｈ−ＴＢＰ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号５６は、ＰＴ−リンカーとして使用される細菌セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）のエンドグルカナーゼＡ中のドメイン間リンカーのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号５７〜６１は、ＴＢＰ２遺伝子を調製するのに使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
配列番号６２は、ＴＰＢ２遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号６３は、ＴＰＢ２と称されるトリブロックタンパク質分散剤のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号６４、６５は、ＴＢＰ２断片を増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００５５】
配列番号６６は、６Ｈ−ＴＢＰ２タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号６７〜１１４は、実施例６のプラスミドを調製するのに使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００５７】
配列番号１１５は、実施例１３のジブロック分散剤を調製するのに使用される綿結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号１１６は、実施例１９で述べられるゲートウェイエントランスプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１０１のコード領域のヌクレオチド配列である。
【００５９】
配列番号１１７は、Ｘａ認識部位を表すテトラ−ペプチドのアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号１１８は、ゲートウェイエントランスプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１０１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号１１９は、実施例１９で述べられるゲートウェイエントランスプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ２０１のコード領域のヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号１２０は、ゲートウェイエントランスプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ２０１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号１２１は、発現プラスミドｐＩＮＫ２５１のヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号１２２は、発現プラスミドｐＩＮＫ２５１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
本発明は、様々な顔料または印刷媒体に特異的に結合するペプチド配列を提供する。さらに本発明は、インクジェット印刷インク、および塗料および仕上げ剤などのその他のコーティングシステムで使用するためのペプチドベースのジブロックおよびトリブロック分散剤を提供する。本発明のジブロック分散剤は、親水性リンカーと共役する特異的顔料結合ペプチド、疎水性リンカーと共役する印刷媒体結合ペプチド、または印刷媒体結合ペプチドと共役する顔料結合ペプチドを含んでなる。本発明のトリブロック分散剤は、特異的印刷媒体結合ペプチドと共役する、親水性リンカーと共役する特異的顔料結合ペプチドを含んでなる。本発明はまた、親水性リンカーまたは恩恵作用物質と共役する印刷媒体結合ペプチドを含んでなるジブロックポリマーも提供し、これは紙または布帛を処理するのに有用である。
【００６６】
ここでは以下の定義が使用され、特許請求の範囲および明細書の解釈において参照されるべきである。
【００６７】
「ＣＢＤ」はセルロース結合領域を意味する。
【００６８】
「ＰＢＰ」は顔料結合ペプチドを意味する。
【００６９】
「ＰＭＢＰ」は印刷媒体結合ペプチドを意味する。
【００７０】
「ＨＬ」は親水性リンカーを意味する。
【００７１】
「ＨＰＬ」は疎水性リンカーを意味する。
【００７２】
「ＢＡ」は恩恵作用物質を意味する。「恩恵作用物質」という用語は、ここでの用法では繊維、布帛または表面に望ましい効果を提供するあらゆる化合物を指す。
【００７３】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または変性ペプチド結合によって互いにつながる２個以上のアミノ酸を指す。ここでの用法では「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、区別なく使用される。
【００７４】
「顔料」という用語は、不溶性の有機または無機着色剤を指す。
【００７５】
「印刷媒体」という用語は、インクジェット印刷に適するあらゆる基材を指す。
【００７６】
「分散剤」という用語は、ここでの用法では、液体媒体中の固形顔料粒子のコロイド溶液の形成を安定化する物質を指す。
【００７７】
「ジブロック分散剤」という用語は、ここでの用法では、それぞれが特定の機能を果たす２つの異なる単位またはブロックからなる顔料分散剤を指す。ペプチドベースの本発明のジブロック分散剤は、親水性リンカーブロックと共役する顔料結合ペプチドブロック、印刷媒体結合ペプチドブロックと共役する顔料結合ペプチドブロック、または印刷媒体結合ペプチドブロックと共役する疎水性リンカーブロックからなる。ジブロック分散剤は、あらゆるペプチドブロックの多重コピーを含有してもよい。
【００７８】
「ジブロックポリマー」という用語は、ここでの用法では、それぞれが特定の機能を果たす２つの異なる単位またはブロックからなる組成物を指す。本発明のペプチドベースのジブロックポリマーは、親水性リンカーブロックと共役する印刷媒体結合ペプチドブロック、または恩恵作用物質と共役する印刷媒体結合ペプチドブロックからなる。ジブロックポリマーは、ペプチドブロックの多重コピー含有してもよい。
【００７９】
「トリブロック分散剤」という用語は、ここでの用法では、それぞれが特定の機能を果たす３個の異なる単位またはブロックからなる顔料分散剤を指す。本発明のペプチドベースのトリブロック分散剤は、顔料結合ペプチドブロック、親水性リンカーブロック、および印刷媒体ペプチドブロックからなる。トリブロック分散剤は、あらゆるペプチドブロックの多重コピーを含有してもよい。
【００８０】
「ストリンジェンシー」という用語は、本発明の顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドの選択に適用される場合、顔料または印刷媒体からペプチドを溶出するのに使用される溶出剤（通常洗剤）の濃度を指す。溶出剤濃度が高いほど、よりストリンジェントな条件が提供される。
【００８１】
「ペプチド−顔料複合体」という用語は、ペプチド上の結合部位を通じて顔料粒子に結合するペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００８２】
「ペプチド−印刷媒体複合体」は、ペプチド上の結合部位を通じて印刷媒体に結合するペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００８３】
「ＭＢ５０」という用語は、実施例６で述べられるように、ＥＬＩＳＡベース結合アッセイで得られる最大シグナル（Ｂｍａｘ）の５０％のシグナルを与える、結合ペプチドの濃度を指す。ＭＢ５０は、複合体構成要素の結合相互作用または親和力強度の指標を提供する。ＭＢ５０の値が低いほど、ペプチドとその対応する基材との相互作用はより強力である。
【００８４】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。具体的なアミノ酸を同定するのに、ここでは以下の略語が使用される。
【００８５】
【表１】
2007508246.tif 000003
【００８６】
「遺伝子」は、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびその後ろの制御配列（３’非コード配列）を含めた特定のタンパクを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、それ自体の制御配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「外来性」遺伝子は、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００８７】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成してもよい。ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アセンブルされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。したがってヌクレオチド配列の最適化に基づいて、遺伝子を最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みの真価を認める。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。
【００８８】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００８９】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００９０】
「発現」という用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００９１】
「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体ゲノム中への核酸断片の転移を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【００９２】
「宿主細胞」という用語は、外来性ポリヌクレオチド配列によって、形質転換または形質移入されている、または形質転換または形質移入が可能な細胞を指す。
【００９３】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外因子を指す。このような因子は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【００９４】
「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染するウィルスを指す。本発明の目的では改変形態を使用してもよい。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３と称される「野生型」ファージから誘導される。Ｍ１３システムは細菌中で生育できるので、感染した細胞を破壊せず、新しいファージを連続的に作らせる。これは一本鎖ＤＮＡファージである。
【００９５】
「ファージディスプレイ」という用語は、バクテリオファージまたはファージミド粒子表面の機能性外来性ペプチドまたは小型タンパク質のディスプレイを指す。遺伝子改変ファージを使用して、ペプチドをそれらの未変性表面タンパク質のセグメントとして提示してもよい。異なる遺伝子配列のファージ集団によって、ペプチドのライブラリーを作り出してもよい。
【００９６】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８９）（以下、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；およびシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【００９７】
本発明は、特異的な顔料および印刷媒体結合ペプチド、およびインクジェットインクおよびその他のコーティング用途のためのジブロックおよびトリブロック分散剤におけるそれらの使用を含んでなる。
【００９８】
顔料
ここでの用法では「顔料」という用語は、不溶性の着色剤を意味する。本発明では、多種多様な有機および無機顔料を単独でまたは組み合わせて使用してもよい。有機顔料の例としては、シアン、イエロー、レッド、ブルー、オレンジ、マゼンタ、ブラック、グリーン、バイオレット、ライトシアン、およびライトマゼンタが挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい有機顔料は、カーボンブラックＦＷ１８などのカーボンブラック、およびクロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔｈａｌ）（登録商標）イエロー１３１ＡＫ（チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ１２２（サンケミカル（Ｓｕｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））およびサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルー１５：３（サンケミカル（Ｓｕｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））などの有色顔料である。無機顔料の例としては、銅、鉄、アルミニウム、およびそれらの合金などの超微粒子金属と、シリカ、アルミナ、およびチタニアなどの金属酸化物とが挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な顔料の追加的な例は、参照によって本書に援用される米国特許第５，０８５，６９８号明細書で、マ（Ｍａ）らによって述べられる。
【００９９】
印刷媒体
「印刷媒体」という用語は、ここでの用法では、インクジェット印刷に適したあらゆる基材を指す。適切な印刷媒体としては、印刷紙と、シートと、フィルムと、不織布と、ポリエステル、ナイロン、ライクラ（登録商標）、絹、綿、綿混紡、レーヨン、亜麻、麻、羊毛、スパンデックス、アセテート、アクリル、モダクリル、アラミドおよびポリオレフィンなどの編織布とが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの印刷媒体は、いくつかの販売元から容易に入手できる。
【０１００】
顔料結合および印刷媒体結合ペプチド
顔料結合ペプチド（ＰＢＰ）および印刷媒体結合ペプチド（ＰＭＢＰ）はここでの定義では、顔料および印刷媒体のそれぞれと高親和力で特異的に結合するペプチド配列である。本発明の顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドは、長さが約５個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、より好ましくは約７個のアミノ酸〜約１２個のアミノ酸である。
【０１０１】
適切な顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチド配列は、技術分野でよく知られている方法を使用して選択してもよい。本発明のペプチドは無作為に作り出され、次に関心のある基材に対するそれらの結合親和力に基づいて、特定の顔料または特定の印刷媒体に対して選択される。ペプチドのランダムライブラリーの作成についてはよく知られており、細菌ディスプレイ（ケンプ（Ｋｅｍｐ）Ｄ．Ｊ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８（７）：４５２０〜４５２４（１９８１）、およびヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０（１）：３１〜３５（１９８３））、酵母ディスプレイ（チェン（Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８８（２１）：９５７８〜８２（１９９１））、コンビナトリアル固体相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、およびファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）をはじめとする多様な技術によって達成されてもよい。このような生物学的ペプチドライブラリーを作り出す技術については、ダニ（Ｄａｎｉ）Ｍ．、Ｊ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＆  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．、２１（４）：４４７〜４６８（２００１）で述べられる。
【０１０２】
ペプチドを無作為に作り出す好ましい方法は、ファージディスプレイによる。ファージディスプレイは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択技術であり、その中ではペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージの外被タンパク質に遺伝的に融合して、ファージビリオンの外面に融合ペプチドのディスプレイをもたらす一方、融合をコードするＤＮＡはビリオン中に存在する。ディスプレイされるペプチドとそれをコードするＤＮＡの間のこの物理的結合により、「バイオパニング」と称される単純な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択手順によって、それぞれが対応するＤＮＡ配列に結合する膨大な数のペプチドの変異体のスクリーニングができるようになる。その最も単純な形態では、バイオパニングは、ファージディスプレイされた変異体のプールをプレートまたはビーズ上に固定化されている関心のある標的と共にインキュベートして、非結合ファージを洗い流し、ファージと標的間の結合相互作用を中断して特異的に結合したファージを溶出して実施される。次に溶出されたファージを生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で増幅し、プロセスを反復してファージプールの段階的な濃縮をもたらし、最も堅固な結合配列が選択される。３回以上の選択／増幅後、個々のクローンがＤＮＡ配列決定によって特性判定される。
【０１０３】
ペプチドの適切なライブラリーを作り出した後、次にそれらを適量の試験基材、具体的には選択された顔料または特定の印刷媒体と接触させる。試験基材を溶液中に懸濁しながら、ペプチドのライブラリーに提示する。好ましい溶液は、界面活性剤を含有する緩衝生理食塩水溶液である。適切な溶液は、０．１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０添加トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）である。ペプチドの顔料または印刷媒体表面への質量移動速度を増大することで、最大結合を得るのに要する時間を短縮するために、溶液をあらゆる手段でさらに撹拌してもよい。
【０１０４】
接触すると、いくつかの無作為に作り出されたペプチドは、顔料または印刷媒体基材と結合してペプチド−基材複合体を形成する。非結合ペプチドは、洗浄によって除去してもよい。あらゆる非結合材料を除去した後、試験基材に対して様々な程度の結合親和性を有するペプチドは、様々なストリンジェンシーを有する緩衝液中での選択洗浄によって分画されてもよい。使用する緩衝液のストリンジェンシーを増大させることは、ペプチド−基材複合体中で要求されるペプチドと基材の間の結合強度を増大させる。
【０１０５】
酸性ｐＨ（１．５〜３．０）、塩基性ｐＨ（１０〜１２．５）、ＭｇＣｌ２（３〜５Ｍ）およびＬｉＣｌ（５〜１０Ｍ）などの高い塩濃度、水、エチレングリコール（２５〜５０％）、ジオキサン（５〜２０％）、チオシアネート（１〜５Ｍ）、グアニジン（２〜５Ｍ）、尿素（２〜８Ｍ）、そしてＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０などの様々な濃度の異なる界面活性剤をはじめとするが、これに限定されるものではないいくつかの物質を使用して、ペプチド選択における緩衝液溶液のストリンジェンシーを変化させてもよく、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０が好ましい。これらの物質は、トリス−ＨＣｌ、トリス−緩衝食塩水、トリス−ホウ酸、トリス−酢酸、トリエチルアミン、リン酸緩衝液、およびグリシン−ＨＣｌをはじめとするが、これに限定されるものではない緩衝液溶液中で調製されてもよく、トリス−緩衝食塩水溶液が好ましい。
【０１０６】
顔料または印刷媒体基材に対して増大する結合親和性を有するペプチドは、増大するストリンジェンシーを有する緩衝液を使用して選択プロセスを反復することで溶出されてもよいものと理解される。溶出されたペプチドは、技術分野で知られているあらゆる手段によって同定および配列決定できる。
【０１０７】
したがって、本発明の目的は
ａ）コンビナトリアルで作り出されたペプチドのライブラリーを提供し、
ｂ）（ａ）のライブラリーと顔料または印刷媒体とを接触させて、
（ｉ）ペプチド−顔料またはペプチド−印刷媒体複合体、
（ｉｉ）非結合顔料または印刷媒体、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のペプチド−顔料またはペプチド−印刷媒体複合体を単離し、そして、
ｄ）（ｂ）のペプチド複合体から特異的結合特性を有するペプチドを溶出する
工程を含んでなる、顔料結合ペプチドまたは印刷媒体結合ペプチドを作り出すためのプロセスを提供することである。
【０１０８】
顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドは、上のプロセスを使用して同定されている。本発明の顔料結合ペプチドは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンである少なくとも約４０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなる。具体的には、顔料カーボンブラックに対する高親和力を有する配列番号６〜９として示される結合ペプチド、クロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔｈａｌ）（登録商標）イエローに対する高親和力を有する配列番号５、１０〜１７として示される結合ペプチド、サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタに対する高親和力を有する配列番号１８〜２０として示される結合ペプチド、およびサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルーに対する高親和力を有する配列番号５、２１〜２９として示される結合ペプチドが単離された。本発明のセルロース結合ペプチドは、セリン、スレオニン、およびチロシンである少なくとも約１４ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなる。セルロース（綿の主要構成要素）に対する高い結合親和力を有する結合ペプチドとしては、配列番号３５〜３９が挙げられる。本発明のポリエステル結合ペプチドは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである、少なくとも約２０ｍｏｌ％のアミノ酸を含んでなる。ポリエステル（ポリ（エチレンテレフタラート））に対する高親和力を有する結合ペプチドとしては、配列番号４０が挙げられる。さらに以下の印刷媒体に対する結合親和力を有する結合ペプチドが単離された。綿に対する配列番号３０〜３１として示される結合ペプチド、ポリエステル／綿に対する配列番号３０および３２として示される結合ペプチド、および印刷紙に対する配列番号４、３０、３３、および３４として示される結合ペプチド。
【０１０９】
ここでモルあたりのキロカロリー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の単位で、結合ペプチドとそれぞれの基材との相互作用に際して放出されるエネルギー量として定義される結合エネルギーは、結合親和力の強度の指標を提供する。本発明の顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドと、それらのそれぞれの基材との相互作用の吸着モル熱を相互作用の結合エネルギーの基準として使用してもよい。本発明の顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドは、フローマイクロ熱量計測による測定で、少なくとも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの水中における吸着の発熱モル熱を有する。吸着のモル熱は、実施例７で詳細に述べるようにマイクロスカル・ロンドン（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｔｄ．）から入手できるようなフローマイクロ熱量計を使用して、標準熱量測定技術を使用して測定してもよい。結合ペプチドとその各基材との吸着のモル熱の測定は、水中に既知の濃度の結合ペプチドを含有する溶液を、フローマイクロ熱量計内の既知量のその各基材上に通過させ、マイクロ熱量計内に含まれるサーミスタの手段によって、結合相互作用の結果として放出される熱量を測定することで達成される。ここで基材の単位面積当たりに吸着される結合ペプチドの量として定義される質量移動値は、フローマイクロ熱量計の下流に位置する屈折計などの質量感応性検出計の手段によって判定してもよい。次にマイクロ熱量計測から得られた吸着熱を質量移動値で割って、吸着のモル熱を計算してもよい。発熱プロセスでは、吸着のモル熱が負の値として示され、プロセスにおいて熱が放出されることを示唆する。
【０１１０】
結合ペプチドの製造
本発明の結合ペプチドは、技術分野でよく知られている標準ペプチド合成法を使用して調製されてもよい（例えばスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら「固体相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ）、１９８４；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８４；およびペニングトン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら「ペプチド合成プロトコル（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、１９９４を参照されたい）。さらに多くの会社が、カスタムペプチド合成サービスを提供している。
【０１１１】
代案としては、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して調製されてもよい。顔料または印刷媒体結合ペプチドをコードする遺伝子は、異種の宿主細胞中、特に微生物の宿主細胞中で生成されてもよい。
【０１１２】
本発明の結合ペプチドの発現に好ましい異種の宿主細胞は、菌・カビまたは細菌ファミリー内に広く存在して、広範な温度、ｐＨ値、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は、細胞原材料とは無関係に同一であるので、細胞生物体量を作り出すのに使用される炭素原材料とは無関係に、機能性遺伝子が発現される。宿主の例としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの菌・カビ性または酵母菌種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ），チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１３】
多様な発現システムを使用して、本発明のペプチドを生成できる。このようなベクターとしては、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、挿入要素由来、酵母エピソーム由来、バキュロウイルスやレトロウィルスなどのウィルス由来のベクターなどの染色体、エピソーム、およびウィルス−由来ベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどのそれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。発現システムコンストラクトは、発現を調節し、ならびに引き起こす調節領域を含有してもよい。一般に、宿主細胞中でポリヌクレオチドまたはポリペプチドを維持、増殖または発現するのに適した、あらゆるシステムまたはベクターをこの関連で発現に使用してもよい。微生物の発現システムおよび発現ベクターは、宿主細胞の生育に比べて外来性タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する。制御配列は当業者によく知られており、例としては、例えば転写促進因子配列などのベクター中の調節要素の存在をはじめとする化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子発現をスイッチオンまたはオフするものが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらのいずれでも、キメラ遺伝子を構築して本発明のあらゆる結合ペプチドを生成するのに使用できる。次に形質転換を通じて、これらのキメラ遺伝子を適切な微生物中に導入して、ペプチドの高レベル発現を提供できる。
【０１１４】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットについては、技術分野でよく知られている。典型的にベクターまたはカセットは、当該遺伝子の転写および翻訳を導く配列、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー、および自律性の複製または染色体の組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を宿す遺伝子の５'領域、および転写終了を制御するＤＮＡ断片の３'領域を含んでなる。双方の制御領域が形質転換宿主細胞の同族遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は必ずしも産生宿主として選択された特定の種に天然の遺伝子から誘導されなくてよいものと理解される。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換宿主細胞の選択のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性などの表現型形質を提供する。
【０１１５】
所望の宿主細胞においてキメラ遺伝子の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみ深い。事実上、遺伝子を駆動できるあらゆるプロモーターが、以下をはじめとするが、これに限定されるものではない、本発明の結合ペプチドを生成するのに適している。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびにバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター。
【０１１６】
終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終了部位は不必要かもしれないが、含まれれば最も好ましい。
【０１１７】
上述のような適切なＤＮＡ配列を含有するベクター、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を用いて、宿主が本発明のペプチドを発現するように、適切な宿主を形質転換してもよい。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用して、このようなペプチドを生成するのに、細胞フリーの翻訳システムもまた用いることができる。場合により、形質転換された宿主の分泌生成物として、本遺伝子産物を生成することが所望されるかもしれない。生育培地中への所望のタンパク質の分泌は、簡易化されたより安価な精製手順という利点を有する。分泌シグナル配列は、細胞膜を超えた発現できるタンパク質の能動輸送を促進するのに有用であることが多いことが、技術分野ではよく知られている。分泌できる形質転換された宿主の創造は、産生宿主において機能性である分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の組み込みによって達成されてもよい。適切なシグナル配列を選択する方法は、技術分野でよく知られている（例えばＥＰ  ５４６０４９号明細書および国際公開第９３２４６３１号パンフレットを参照されたい）。分泌シグナルＤＮＡまたは促進要素は、発現−制御ＤＮＡと本遺伝子または遺伝子断片の間、および後者の同一読み枠内に位置してもよい。
【０１１８】
ジブロック分散剤およびジブロックポリマー
本発明の一実施態様では、ジブロック分散剤は、親水性リンカー（ＨＬ）ブロックと共役する顔料結合ペプチド（ＰＢＰ）ブロックからなる。好ましくはペプチドは、親水性リンカーに共有結合的に付着する。顔料結合ペプチドの機能は、顔料粒子に強力に結合することにより、安定した分散体を形成することである。親水性リンカーは水性相中に伸長し、凝集に対して顔料粒子の立体化学性およびイオン性安定化を提供する。顔料結合ペプチドとしては、配列番号５〜２９によって示されるペプチド、最も好ましくは配列番号５〜７、９、１０、１４〜１８、２０、２１、２５、２６、２８、および２９によって示されるペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
親水性リンカーは、親水性アミノ酸Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、セリン、スレオニン、およびそれらの混合物をはじめとするが、これに限定されるものではないアミノ酸から構成されるペプチドであってもよい。好ましいペプチドリンカーは、アミノ酸Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびそれらの混合物から構成される。ペプチドリンカーは、１個〜約８０個のアミノ酸、好ましくは約３個〜約５０個のアミノ酸であってもよい。当業者は、効果的な分散剤として作用するあらゆる特定のジブロック組み合わせの能力が、添加剤、ｐＨ、およびペプチドリンカーをはじめとするペプチド上の酸または塩基の中和程度をはじめとする全体的な分散体の調合に強く依存することを認識するであろう。したがってあらゆる特定用途に対するペプチドリンカーの最適な長さは、日常的実験によって求めるべきである。これらの単純なジブロック分散剤に加えて、親水性リンカーと共役する複数の顔料結合ペプチドを有して、ペプチドと顔料の間の相互作用を向上させることが望ましいかもしれない。これらの分散剤は、一般構造式、［ＰＢＰ］ｎ−ＨＬ（式中、ｎは１〜約５の範囲であり、より好ましくはｎは１〜約３である）を有する。
【０１２０】
これらのジブロックペプチド分散剤は、技術分野で知られているあらゆる方法を使用して調製してもよい。例えば上述の標準ペプチド合成法を使用して顔料結合ペプチドを調製し、次に顔料結合ペプチドのＮ−末端アミンによる活性化を通じて、所望のアミノ酸のＮ−カルボキシ無水物の原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）重合によって、ペプチドリンカーを添加してもよい。このアプローチは、一級アミンがＮ−カルボキシ無水物の開環重合を触媒する既知の能力に基づく（例えばペンツェック（Ｐｅｎｃｚｅｋ）「開環重合モデル（Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｒｉｎｇ  Ｏｐｅｎｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボーカラトーン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州（ＦＬ）（１９８９）を参照されたい）。さらにカルボジイミドカップリング剤（例えばハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９６））、二酸塩化物、ジイソシアネート、およびペプチドの末端アミンおよび／またはカルボン酸末端基と反応性であるその他の二官能性カップリング試薬を使用して、ペプチドブロックを組み合わてもよい。代案としては、上述の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用してジブロックペプチド分散剤全体を調製してもよい。
【０１２１】
親水性リンカーはまた、有機ポリマーであってもよい。適切な合成有機ポリマーは、顔料結合ペプチドに共有結合できる１つもしくはそれ以上の部分を有することで特徴づけられる。好ましくは、これらの有機ポリマーリンカーは１０，０００未満、より好ましくは約５００と４０００との間の分子量を有する。適切な合成有機ポリマーリンカーとしては、ポリエチレングリコール誘導体、ポリアクリル酸／マレイン酸ポリマー、その塩をはじめとするポリアクリル酸誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメチルビニルエーテル、セルロース誘導体ポリマー、そしてデンプンおよびグリコーゲンなどのその他の多糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば本発明で使用するのに適した多くのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体が市販される。これらのＰＥＧ誘導体の例としては、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびアルデヒドが挙げられる。ポリアクリル酸ポリマーおよび誘導体、マレイン酸ポリマーおよびそれらの混合物は、例えばカルボジイミドカップリングを使用して、顔料結合ペプチド上でアミン基に共有結合的に付着していてもよいカルボン酸部分を有する。ポリビニルアルコールポリマーは、エステル化反応を通じて、顔料結合ペプチド上のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸基に結合していてもよい。適切なセルロース誘導体ポリマーとしては、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシメチルセルロースが挙げられる。これらのセルロース誘導体ポリマーおよびその他の多糖類では、ペプチドへの結合は、セルロース誘導体側鎖上のヒドロキシル基とペプチド上のカルボン酸基を使用したエステル化によるものでも、またはペプチド一級アミン基およびセルロース誘導体ヒドロキシル基を通じたジイソシアネートカップリングによるものでもよい。
【０１２２】
親水性リンカーはまた、上述の方法を使用して調製されてもよい、ペプチドリンカーと合成有機ポリマーの組み合わせであってもよい。
【０１２３】
本発明の別の実施態様では、ジブロックポリマーは、親水性リンカー（ＨＬ）ブロックに共役する印刷媒体結合ペプチド（ＰＭＢＰ）ブロックからなる。好ましくはペプチドは、親水性リンカーに共有結合的に付着する。印刷媒体結合ペプチドの機能は、親水性リンカーが表面を親水性にしながら、印刷媒体表面に強力に結合することである。印刷媒体結合ペプチドとしては、配列番号４、３０〜４０によって示されるペプチド、最も好ましくは配列番号４、３０〜３８および４０によって示されるペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらのＰＭＢＰ−ＨＬジブロックポリマーはコーティング組成物中で有用であり、処理された表面に有益な表面特性を提供する。これらの改善された表面特性としては、ウェッティングおよびシーティング、汚れ除去、汚れ付着抵抗性、および染み抵抗性が挙げられる。
【０１２４】
親水性リンカーは、ＰＢＰ−ＨＬジブロック分散剤について上で述べたように、ペプチド、合成有機ポリマー、またはその混合物であってもよい。ＰＭＢＰ−ＨＬジブロックポリマーは、ＰＢＰ−ＨＬジブロック分散剤について上述した方法を使用して調製してもよい。これらの単純なジブロックポリマーに加えて、親水性リンカーに共役する複数の印刷媒体結合ペプチドを有して、ペプチドと印刷媒体の間の相互作用を向上させることが望ましいかもしれない。これらのジブロックポリマーは、一般構造式、［ＰＭＢＰ］ｎ−ＨＬ（式中、ｎは１〜約５の範囲であり、より好ましくはｎは１〜約３である）を有する。
【０１２５】
さらにＰＭＢＰは、布帛または紙表面に機能的利点を与える作用物質と共役していてもよい。ＰＭＢＰは恩恵作用物質と直接に共役していても、またはカップリングはリンカーを通じていてもよい。上述のあらゆるリンカーを使用してもよい。適切な恩恵作用物質は、技術分野でよく知られている（例えばビョルキスト（Ｂｊｏｒｋｑｕｉｓｔ）ら、国際公開第０１／３２８４８号パンフレット、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、国際公開第９８／００５００号パンフレット、およびスメッツ（Ｓｍｅｔｓ）ら、国際公開第００／１８８９７号パンフレットを参照されたい）。恩恵作用物質の例としては、芳香剤、衛生作用物質、昆虫制御剤、酵素、軟化タンパク質、布帛柔軟剤、防汚剤、漂白剤、染料固定剤、光沢剤、抗菌剤、界面活性剤、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい恩恵作用物質は、香料および抗菌剤である。これらの恩恵作用物質は、上述の方法を使用してＰＭＢＰと共役していてもよい。これらのＰＭＢＰ−恩恵作用物質（ＢＡ）ジブロックポリマーは、一般構造式、［ＰＭＢＰ］ｎ−ＢＡ（式中、ｎは１〜約５の範囲であり、より好ましくはｎは１〜約３である）を有する。
【０１２６】
本発明の別の実施態様では、ジブロック分散剤は、好ましくは共有結合を通じて、印刷媒体結合ペプチドブロックに共役する顔料結合ペプチドブロックからなる。顔料結合ペプチドの機能は、顔料粒子と強力に結合することによって、安定した分散体を形成することである。印刷媒体結合ペプチドの機能は、印刷媒体基材と強力に結合することによって、コーティングの耐久性を向上させることである。これらのＰＢＰ−ＰＭＢＰジブロック分散剤は、上に列挙した顔料結合ペプチドおよび印刷媒体結合ペプチドを使用して、技術分野で知られているあらゆる方法を使用し、それらを一緒にカップリングして調製してもよい。例えば２つのペプチドは、４，４’メチレンビス（フェニルイソシアネート）などの架橋剤を使用して共有結合していてもよい。２つのペプチドはまた、カルボジイミドカップリング剤、二酸塩化物、ジイソシアネート、およびペプチド上の末端アミンおよび／またはカルボン酸末端基と反応性であるその他の二官能性カップリング試薬を使用して結合されていてもよい。代案としてはＰＢＰ−ＰＭＢＰジブロック分散剤は、上述の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して調製してもよい。これらの単純なジブロック分散剤に加えて、複数のＰＭＢＰに共役する複数のＰＢＰを有することが望ましいかもしれない。これらの分散剤は、一般構造式、［ＰＢＰ］ｎ−［ＰＭＢＰ］ｎ（式中、ｎは１〜約５の範囲であり、より好ましくはｎは１〜約３である）を有する。
【０１２７】
本発明のさらに別の実施態様では、ジブロック分散剤は、好ましくは共有結合を通じて、疎水性リンカー（ＨＰＬ）ブロックと共役する印刷媒体結合ペプチドブロックからなる。このジブロック分散剤では、印刷媒体結合ペプチドは具体的には、印刷媒体表面への強力な結合と、親水性リンカーとしての機能との２つの機能を果たして顔料を分散する。疎水性リンカーブロックは、顔料粒子と相互作用する役割をする。印刷媒体結合ペプチドとしては、配列番号４、６、３０〜４０によって示されるペプチド、最も好ましくは配列番号４、３０〜３８、および４０によって示されるペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２８】
疎水性リンカーは、ペプチド、合成有機ポリマー、またはその混合物であってもよい。ペプチドベースの疎水性リンカーは、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、およびそれらの混合物をはじめとするが、これに限定されるものではないアミノ酸から構成されるペプチドであってもよい。さらにペプチドベースの疎水性リンカーは、例えばグルタミン酸ベンジルなどの親水性アミノ酸の疎水性誘導体を含有してもよい。ペプチドリンカーは、１個〜約８０個のアミノ酸、好ましくは約５個〜約３０個のアミノ酸であってもよい。
【０１２９】
疎水性リンカーはまた、疎水性の合成有機ポリマーであってもよい。疎水性リンカーは水不溶性であり、少なくとも約３００の分子量を有する。適切な疎水性の合成有機ポリマーリンカーについては、参照によって本書に援用されるマ（Ｍａ）ら付与された米国特許第５，０８５，６９８号明細書で述べられる。好ましい疎水性の合成有機ポリマーは、メタクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ベンジルメタクリレートから調製されるホモポリマーおよび共重合体、またはメチルメタクリレートとブチルメタクリレートとの共重合体である。
【０１３０】
これらのＰＭＢＰ−ＨＰＬジブロック分散剤は、その他のジブロック分散剤について上で述べた方法によって調製してもよい。これらの単純なジブロック分散剤に加えて、疎水性リンカーと共役する複数のＰＭＢＰを有することが望ましいかもしれない。これらの分散剤は、一般構造式、［ＰＭＢＰ］ｎ−ＨＰＬ（式中、ｎは１〜約５の範囲であり、より好ましくはｎは１〜約３である）を有する。
【０１３１】
トリブロック分散剤
本発明の好ましい実施態様では、分散剤は、印刷媒体結合ペプチドブロックに共役する親水性リンカー（ＨＬ）ブロックに共役する顔料結合ペプチド（ＰＢＰ）ブロックからなるトリブロックである。好ましくは、ブロックは共有結合的に互いに付着する。顔料結合ペプチドの機能は、顔料粒子に強力に結合することにより、安定した分散体を形成することである。親水性リンカーは水性相中に伸長して、凝集に対して顔料粒子の立体化学性およびイオン性安定化を提供し、顔料表面からよりアクセスしやすいＰＭＢＰの提示を提供する。印刷媒体結合ペプチドの機能は、印刷媒体基材に強力に結合することによって、コーティング耐久性を向上させることである。適切な顔料結合ペプチド、親水性リンカー、および印刷媒体結合ペプチドは、ジブロック分散剤について上で述べたものと同一である。さらに配列番号１〜３によって示されるものなどの模擬ＣＢＤを、これらのトリブロック分散剤中でＰＭＢＰとして使用してもよい。単純なトリブロック分散剤に加えて、複数のＰＢＰおよびＰＭＢＰを含有する分散剤を有して、分散剤と顔料粒子および印刷媒体基材との相互作用の強度を向上させることが望ましいかもしれない。これらの分散剤は、一般構造式、［ＰＢＰ］ｎ−ＨＬ−［ＰＭＢＰ］ｎ（式中、ｎは１〜約５の範囲であり、より好ましくはｎは１〜約３である）を有する。
【０１３２】
これらのトリブロック分散剤は、ジブロック分散剤の調製について上で述べた化学的方法を使用して調製してもよい。化学的方法は、親水性リンカーとして合成有機ポリマーを含有する、トリブロック分散剤により適している。親水性リンカーとしてペプチドを含有するトリブロック分散剤では、ペプチド上の多数の官能基のために、様々なブロックが互いに付着する場所を制御することが困難であるので化学的合成は複雑である。したがってこれらの完全にペプチドベースのトリブロック分散剤を調製する好ましい方法は、上述の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用することである。
【０１３３】
分散剤の用途
本発明の分散剤の用途の１つは、インクジェットインクなどの水性インク中である。水性インク調合物については、技術分野でよく知られている。例えば適切な調合物について、どちらも参照によって本書に援用されるマ（Ｍａ）らに付与された米国特許第５，２７２，２０１号明細書、およびマ（Ｍａ）らに付与された米国特許第５，０８５，６９８号明細書で述べられている。水性インク調合物は、典型的に水性キャリア媒体、顔料または顔料混合物、分散剤、および様々なその他の成分を含んでなる。
【０１３４】
水性キャリア媒体は、水または水と少なくとも１つの水溶性有機溶剤との混合物を含んでなる。脱イオン水が一般に使用される。水溶性有機溶剤の代表的な例は、マ（Ｍａ）らに付与された米国特許第５，０８５，６９８号明細書で開示される。適切な水と水溶性有機溶剤との混合物の選択は、所望の表面張力および粘度、選択される顔料、インク乾燥時間、およびインクがその上に印刷される媒体基材タイプなどの特定用途の要件に左右される。例えばジエチレングリコールなどの少なくとも２つのヒドロキシル基、および脱イオン水を有する水溶性多価アルコールの混合物が水性キャリア媒体として好ましく、水は水性キャリア媒体の総重量を基準にして重量で約３０％〜約９５％、好ましくは約６０％〜約９５％を構成する。水性キャリア媒体の量は、インクの総重量を基準にして、有機顔料が選択される場合、約７０％〜約９９．８％、好ましくは約９４％〜約９９．８％の範囲であり、無機顔料が選択される場合、約２５％〜約９９．８％、好ましくは約７０〜約９９．８％の範囲である。
【０１３５】
顔料は、単一顔料または顔料混合物であってもよい。適切な顔料については、マ（Ｍａ）らに付与された米国特許第５，０８５，６９８号明細書で述べられる。インクは、約３０重量％までの顔料を含有してもよく、好ましくは顔料の量は約０．１％〜約１５重量％である。
【０１３６】
本発明のいずれの分散剤もインク調合物中において、単独でまたは組み合わせて使用してもよい。顔料結合ペプチドそれ自体（すなわち親水性リンカーなし）が、それらの親水的性質のために、条件によっては水性分散剤の役割をしてもよいことにも留意すべきである。分散剤は、インク中に約０．１％〜約３０重量％の範囲で存在する。
【０１３７】
特定用途の要件と一致させて、様々なタイプの水性添加剤を使用して、インク組成物の特性を変性できる。本発明の分散剤に加えて、界面活性剤化合物を使用してもよい。これらはアニオン性、カチオン性、非イオン性、または両性界面活性剤であってもよい。特定の界面活性剤が特定のインク組成物と不適合性で、顔料分散体を不安定化するかもしれないことが技術分野で知られている。特定の界面活性剤の選択はまた、印刷される印刷媒体基材のタイプにも高度に依存する。当業者は、特定のインク組成物中で使用される特定の基材のために、適切な界面活性剤を選択できることが予期される。水性インクでは、界面活性剤は、インク総重量を基準にして約０．０１％〜約５％、好ましくは約０．２％〜約２％の量で存在してもよい。インク組成物の浸透および詰まり阻害特性を改善するための補助溶剤を添加してもよく、実際には好ましい。このような補助溶剤は、先行技術でよく知られている。さらにインク組成物中で殺生剤を使用して、微生物の生育を阻害してもよい。またエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属イオン封鎖剤を含めて、重金属不純物の有害な効果を排除してもよい。また保湿剤、粘度変性剤、およびその他のアクリルまたは非アクリルポリマーなどのその他の既知の添加剤を添加して、必要に応じてインク組成物の様々な特性を改善できる。
【０１３８】
本発明のインク組成物は、マ（Ｍａ）らに付与された米国特許５，２７２，２０１号明細書で述べられるようなその他の水性インク組成物と同一の様式で調製される。
【０１３９】
本発明の分散剤はまた、塗料およびカラーフィルムなどの水性コーティング用途で使用する組成物中で、顔料分散剤として使用してもよい。本発明のコーティング組成物は、金属、セラミック、プラスチック、紙または木材表面に塗布してもよい。特定の一用途は、水性自動車コーティング組成物である。着色水性コーティング組成物のための調合物については、技術分野でよく知られている。例えば適切な調合物については、全て参照によって本書に援用される、カーペンター（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）に付与された米国特許第５，３２０，６７３号明細書、バルゾッティ（Ｂａｒｓｏｔｔｉ）に付与された米国特許第５，３７６，７０４号明細書、およびゲーベル（Ｇｏｅｂｅｌ）らに付与された米国特許第６，３５０，８０９号明細書で述べられる。着色、水性コーティング組成物は、水性キャリア媒体、顔料または顔料混合物、分散剤、１つもしくはそれ以上のフィルム形成樹脂、および様々なその他の成分を典型的に含んでなる。
【０１４０】
水性キャリア媒体は、水と１つもしくはそれ以上の水溶性有機溶剤との混合物を含んでなる。適切な水溶性有機溶剤としては、一価または多価アルコール、グリコールエーテルまたはエステル、グリコール、およびケトンが挙げられるが、これに限定されるものではない。典型的に組成物の６０〜７０％が水である。
【０１４１】
適切なフィルム形成樹脂またはバインダーは、水分散性または水溶性のイオン性または非イオン性樹脂である。樹脂は、アクリル、ビニル、ポリウレタン、ポリエステル、アルキド、エポキシ、またはフィルム中で有用なことが知られているその他のポリマーであってもよい。水性コーティング組成物で使用される水分散性ポリマーの例については、全て参照によって本書に援用される、サビーノ（Ｓａｖｉｎｏ）らに付与された米国特許第４，７９４，１４７号明細書、サラティン（Ｓａｌａｔｉｎ）らに付与された米国特許第４，７９１，１６８号明細書、およびクワジマ（Ｋｕｗａｊｉｍａ）らに付与された米国特許第４，５５１８７２４号明細書で述べられる。
【０１４２】
顔料は、単一顔料、または顔料混合物であってもよい。適切な顔料については、参照によって本書に援用される、バデージョ（Ｂａｄｅｊｏ）らに付与された米国特許第６，０６６，２０３号明細書、およびゲーベル（Ｇｏｅｂｅｌ）らに付与された前出の明細書で述べられる。有機顔料は、フィルム形成樹脂および架橋剤、および反応してコーティングのキュアリング中にポリマー網目状組織に組み込まれるあらゆるその他の化合物を含めた固体反応物の総重量を基準にして、約１％〜約２００％の量で使用される。
【０１４３】
本発明のＰＢＰ−ＨＬ、ＰＢＰ−ＰＭＢＰまたはＰＭＢＰ−ＨＰＬジブロック分散剤、またはＰＢＰ−ＨＬ−ＰＭＢＰトリブロック分散剤のいずれもコーティング組成物中で単独でまたは組み合わせて使用してもよい。本発明の水性コーティング組成物はまた、架橋剤、可塑剤、組成物の安定化または塗布を助ける追加的補助溶剤、レオロジー制御剤、紫外線安定剤、抗酸化剤、触媒、殺菌・殺カビ剤などをはじめとするが、これに限定されるものではない、技術分野でよく知られているその他の成分を含有してもよい。
【０１４４】
本発明の分散剤はまた、着色プラスチック組成物中で顔料分散剤として使用してもよい。プラスチックの調製および加工については、技術分野でよく知られている（例えば「ウルマンの工業化学百科（Ｕｌｌｍａｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第６版、２７巻、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ホーボーケ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）（２００３）、およびハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）「プラスチック、エラストマー、および複合材ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｓｔｉｃ，Ｅｌａｓｔｏｍｅｒｓ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）」、第３版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９６）を参照されたい）。プラスチック中での顔料分散剤の使用については、技術分野でよく知られている。実例は、全て参照によって本書に援用されるメイ（Ｍａｙ）らに付与された米国特許第５，６５２，３１６号明細書、ディーツ（Ｄｉｅｔｚ）らに付与された米国特許第５，２６４，０３２号明細書、およびデルフィン（Ｄｅｌｐｈｉｎ）らに付与された米国特許第４，９４８，５４６号明細書で述べられる。
【０１４５】
本発明の分散剤は、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリ−α−メチルスチレン、およびそれらの共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンターポリマー、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、塩素化ゴム、およびフッ化ポリビニリデンをはじめとするが、これに限定されるものではない、広範な標準プラスチック樹脂のための顔料分散剤として使用してもよい。可塑性組成物中で、単一顔料または顔料混合物を使用してもよい。適切な顔料としては、上述の顔料、およびメイ（Ｍａｙ）らに付与された前出の明細書で述べられるものが挙げられる。典型的に顔料は、組成物の総重量に対して約０．５％〜約７０％、好ましくは約１％〜約５０重量％の量で使用される。
【０１４６】
本発明のＰＢＰ−ＨＬ、ＰＢＰ−ＰＭＢＰまたはＰＭＢＰ−ＨＰＬジブロック分散剤またはＰＢＰ−ＨＬ−ＰＭＢＰトリブロック分散剤のいずれも、可塑性組成物中で単独でまたは組み合わせて使用してもよい。プラスチックはまた、界面活性剤、流動学的添加剤、防腐剤、光安定剤などのその他の習慣的な添加剤を含有してもよい。
【０１４７】
さらに別の用途では、組換えタンパク質の回収および精製のために、具体的には配列番号３５〜３９である本発明のセルロース結合ペプチドを親和力タグとして単独でまたは組み合わせて使用してもよい。これらのあらゆる具体的セルロース結合ペプチド配列、またはそれらの組み合わせは、上述の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して、所望の組換えタンパク質に融合させてもよい。所望ならば融合タンパク質は、異種タンパク質からのセルロース結合ペプチドのタンパク分解除去のための部位を含有するようにデザインしてもよい。この用途では、セルロース結合ペプチドがＣＢＤの代わりに使用され、親和力タグとしてのその使用については、トム（Ｔｏｍｍｅ）ら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９９：４１８〜４２４（１９９６）およびＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、７１５：２８３〜２９６（１９９８））によって述べられる。本発明のセルロース結合ペプチドは、サイズが小さいことでＣＢＤに勝る利点を有するので、組換えタンパク質に組み込むことがより容易である。
【０１４８】
親和力タグ付き組換えタンパク質は、タンパク質含有溶液をセルロース担体と接触させて分離および精製してもよい。セルロースは、ビーズ、粉末、繊維、膜、フィルター、およびシートはじめとする多くの異なる形態で、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））をはじめとするいくつかの供給元から市販される。組換えタンパク質含有溶液は、技術分野で知られている様々なやり方でセルロース担体と接触させてもよい。例としては次が挙げられる。バッチ反応器内での接触、膜を通した濾過、またはセルロース充填カラムの通過。次にタンパク質溶液をセルロース担体から分離して、担体を適切な緩衝液で洗浄し非結合材料を除去する。中性ｐＨに近いリン酸塩およびトリス緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、タンパク質と適合性のあらゆる緩衝液を使用してもよい。次に溶出剤とセルロース担体を接触させて、それから親和力タグ付きタンパク質を回収する。溶出剤は、蒸留水、高ｐＨ溶液（ｐＨ＞１０）、低ｐＨ溶液（ｐＨ＜３）、高濃度グアニジン塩酸塩または尿素、またはエチレングリコールであってもよい。好ましい溶出剤は、ｐＨ２．２の０．２Ｍグリシン−ＨＣｌである。
【０１４９】
同様に、具体的には配列番号５〜１０、１４〜２１、および２３〜２９である本発明の顔料結合ペプチドは、セルロース結合ペプチドについて上で述べたように、組換えタンパク質の回収および精製のために、親和力タグとして単独でまたは組み合わせて使用してもよい。顔料結合ペプチド配列は、上述の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して、所望の組換えタンパク質と融合させてもよい。親和力タグ付き組換えタンパク質は、バッチ反応器または顔料充填カラムの通過をはじめとするが、これに限定されるものではない、技術分野で知られている様々なやり方で、タンパク質含有溶液を適切な顔料と接触させて、分離および精製してもよい。次に上述のようにタンパク質溶液を顔料から分離して、顔料を適切な緩衝液で洗浄し非結合材料を除去する。次に溶出剤と顔料を接触させて、親和力タグ付きタンパク質を場合により顔料から回収する。上述のあらゆる溶出剤を使用してもよい。
【０１５０】
さらに生物触媒および親和力用途のために、本発明のセルロース結合ペプチドを使用して、タンパク質をセルロース担体上に固定化してもよい。これらの用途のため、上述のように、セルロース結合ペプチドを所望の組換えタンパク質に融合させてもよく、または上述のペプチドカップリング法を使用して、結合ペプチドを未変性タンパク質と共有結合的に共役させてもよい。セルロース結合ペプチド−タンパク質抱合体を固定化するためには、抱合体を含有する溶液を所望のセルロース担体と単に接触させる。
【実施例】
【０１５１】
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示しながら、例示のみの目的で提示されるものと理解される。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その精神と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更をおよび修正を加えて、それを様々な用途および条件に適合できる。
【０１５２】
使用した略語の意味は次の通り。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍｏｌ」はナノモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「Ｊ」はジュールを意味し、「ｍＪ」はミリジュールを意味し、「ｖ／ｖ」は容積―対−容積比を意味し、「ｐｆｕ」はプラーク形成単位を意味し、「ｋＤＡ」はキロダルトンを意味し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ４０５」は波長４０５ｎｍで測定した光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は波長６００ｎｍで測定した光学濃度を意味し、「Ｐ」は圧力を意味し、「Ｐ０」は等温における液体吸着質の蒸気圧を意味し、「ＴＢＳ」はトリス−緩衝食塩水を意味し、「ＴＢＳＴ−Ｘ」は指定量（Ｘ％）のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を含有するトリス−緩衝食塩水を意味し、「ＨＲＰ」はホースラディシュ・ペルオキシダーゼを意味し、「Ｘｇａｌ」は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、「ＤＰ」は重合程度を意味し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴分光法を意味し、「ＴＢＰ」はトリブロックタンパク質を意味し、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を意味し、「ＭＡＬＤＩ」はマトリックス補助レーザー脱離イオン化質量分析法を意味する。
【０１５３】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）、およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【０１５４】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（ＲａｌｐＨＮ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．：サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）（１９８９）。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ））、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））、マサチューセッツ州ベバリーのニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０１５５】
ファージディスプレイペプチドライブラリー
本発明で使用したファージディスプレイライブラリー、Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２はマサチューセッツ州ベバリーのニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から購入した。これらのライブラリーは、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合したランダムペプチド７−ｍｅｒおよび１２−ｍｅｒのコンビナトリアルライブラリーに基づいている。ディスプレイされたペプチドは、ｐＩＩＩのＮ−末端で発現され、短いスペーサーＧＧＧＳを介してそれに結合する。Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーは、それぞれおよそ２．８×１０９および２．７×１０９個の配列からなる。
【０１５６】
ペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニング
供給元ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）が提供する標準手順を修正して、本出願人らの実験的ニーズに合わせた。この方法の一般的説明は以下の通り。
バイオパニング：試験する適量の基材をマイクロ遠心管または２４−ウェルプレートのウェルに入れた。次に遠心管またはウェルに、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．１ＭのＮａＨＣＯ３をｐＨ８．６で含有するブロック緩衝液を充填し、基材を１時間４℃でインキュベートした。基材および容器をＴＢＳＴ−０．１％（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および０．１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ））で６回洗浄した。次に基材を２×１０１１個のファージ（１０ｍＬのオリジナルライブラリー）および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１ｍＬのＴＢＳＴ−０．１％と共に室温で１０〜２０分間インキュベートした。その後、ＴＢＳＴ−Ｘ（下で具体的実験について述べるように、指定量のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０添加ＴＢＳ）を含有する１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで基材を５回洗浄し、次にＴＢＳＴ−Ｘ単独でさらに５回洗浄した。基材を１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡおよび０．２Ｍグリシン−ＨＣｌをｐＨ２．２で含有する１ｍＬの溶出溶液と共に７ｍｉｎインキュベートして基材結合ファージを溶出した。１５０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を添加して、溶出溶液を即座に中和した。
【０１５７】
滴定および配列決定
溶出されたファージを１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母抽出物、および１％ＮａＣｌ（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節）からなるＬＢ（ルリア−ベルタニ）培地で希釈し、１０１〜１０４の１０倍連続希釈物を調製した。各希釈物の１０μＬのアリコートをＬＢ培地中で生育させた２００μＬの対数増殖期中期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８（ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））と共に２ｍｉｎインキュベートし、次に３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．７％アガロース添加ＬＢ培地）と４５℃で混合した。この混合物をＬＢ培地／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート（１５ｇ／Ｌ寒天、０．０５ｇ／Ｌ  ＩＰＴＧ、および０．０４ｇ／Ｌ  Ｘｇａｌ添加ＬＢ培地）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。青色プラークを数えてファージ力価を計算した。
【０１５８】
基材結合ファージ中の融合ペプチド配列を判定するために、プレートからいくつかの青色プラークを無作為に選んで、２ｍＬの一晩培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８の１００倍ＬＢ希釈物と共に３７℃の振盪機内で５ｈインキュベートした。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からのキアプレップ・スピン（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ）Ｍ１３キットを使用してファージＤＮＡを培養物から精製し、−９６  ｇＩＩＩプライマー、配列番号４１（５’ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＧＧ３’）を使用して、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）配列決定設備内で配列決定した。ＧＧＧＳスペーサー（Ｐｈ．Ｄ．−７ファージでは２１個のヌクレオチド、またはＰｈ．Ｄ．−１２ファージでは３６個のヌクレオチド）コード領域上流のＤＮＡ配列をペプチド配列に翻訳した。
【０１５９】
増幅
候補ペプチド配列を同定するために、異なる条件下で数サイクルのパニングプロセスが、通常必要とされた。この目的で、前のランから溶出されたファージの半量を２０ｍＬの一晩培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８の１００倍ＬＢ希釈物と共に３７℃の振盪機内で４．５ｈインキュベートして増幅した。細菌を１０，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。１／６容積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ−８，０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加してファージを沈殿させ、１０，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。ファージを１ｍＬのＴＢＳ中に懸濁させ、再度ＰＥＧ沈殿させた。増幅されたファージを０．２ｍＬのＴＢＳ中に再懸濁させ、上述のプロトコル従ってその力価を判定した。その結果ファージに次のパニングを実施する準備ができた。これらの実験では、ランの間の唯一の違いは、ＴＢＳＴ−Ｘ洗浄中に適用されるトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０の濃度であった。
【０１６０】
実施例１
顔料結合ペプチドの同定
この実施例の目的は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、一般的なインク顔料に特異的に結合するペプチド配列を同定することであった。
【０１６１】
この試験では４種の市販されるインク顔料を試験基材として使用した。これらの顔料には、ニュージャージー州ピスカタウェイのデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からのカーボンブラックＦＷ−１８、ノースカロライナ州ハイポイントのチバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ、ＮＣ））からのクロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔａｌ）（登録商標）イエロー１３１ＡＫ、ニュージャージー州カールスタッドのサンケミカル（Ｓｕｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｃａｒｓｔａｄｔ、ＮＪ））からのサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ１２２、およびサンケミカル（Ｓｕｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）からのサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルー１５：３が含まれた。Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２スクリーニングライブラリーの双方を使用して顔料結合候補を同定した。
【０１６２】
ペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニングを以下の修正を加えて上述のように行った。カーボンブラックＦＷ−１８の２５０μｇのサンプルをマイクロ遠心管内で試験基材として使用した。ＴＢＳＴ−Ｘ中それぞれ０．１％、０．５％、および１％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０によって、３回のスクリーニングを行い、続いてＴＢＳＴ−Ｘ中の１％および２％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０によって、４回目のスクリーニングを平行して２回行った。Ｐｈ．Ｄ．−１２ライブラリーによるスクリーニングでは、ＴＢＳＴ−Ｘ中２％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０によって、最初の４回のランのみ実施した。
【０１６３】
クロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔａｌ）（登録商標）イエロー１３１ＡＫ、サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ１２２、およびサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルー１５：３顔料を試験基材として使用して、このスクリーニングを反復した。これらの実験では、５００μｇの顔料を使用した。
【０１６４】
ペプチド配列を判定するために、各スクリーニングにおいて１６〜２４個のファージプラークからのＤＮＡを上述のように配列決定した。これらの結果に基づいて、特定のランにおいて高い再出現頻度を有する配列、および／または様々なストリンジェンシー条件下でいくつかのランにおいて、顔料と一貫して相互作用する配列を顔料結合ペプチド候補として同定した。これらの配列を表１に示す。
【０１６５】
【表２】
2007508246.tif 000004
【０１６６】
実施例２
印刷媒体結合ペプチドの同定
この実施例の目的は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、一般的な印刷媒体に特異的に結合するペプチド配列を同定することであった。
【０１６７】
この試験で基材として試験した印刷媒体には、ペンシルベニア州ウェストピストンのテストファブリックス（Ｔｅｓｔｆａｂｉｃｓ（Ｗｅｓｔ  Ｐｉｔｔｓｔｏｎ、ＰＡ））から得られた１００％綿布帛（綿ブロードクロススタイル４１９Ｗ）、テストファブリックス（Ｔｅｓｔｆａｂｉｃｓ）から得られた６５／３５ポリエステル／綿布帛（プリントクロス（６５／３５ＰＣ）７４３６Ｍ）、およびデラウェア州ウィルミントンのファーストステートペーパー（Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｔｅ  Ｐａｐｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））からのハンマーミル（Ｈａｍｍｅｒｍｉｌｌ）（登録商標）タイダルＭＰ紙（Ｔｉｄａｌ  ＭＰ  Ｐａｐｅｒ）が含まれた。上述の手順を使用して、１枚の印刷媒体（７．５ｍｍ×７．５ｍｍ）をＰｈ．Ｄ．−７ライブラリースクリーニングにおいて使用して、印刷媒体結合ペプチド候補を同定した。スクリーニングを２４−ウェルプレート内で実施し、結合に使用したのとは異なるウェル内に結合ファージを溶出した。ＴＢＳＴ−Ｘ中０．５％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０で３回のスクリーニングを行い、続いてそれぞれＴＢＳＴ−Ｘ中１％、３％、３％、および５％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０で、４回の追加的スクリーニングを実施した。ペプチド配列を判定するために、上述のように各ランにおいて１６個のファージプラークからのＤＮＡを配列決定した。
【０１６８】
これらの試験では、ファージと３つの全印刷媒体の間の非特異的相互作用に起因する高いバックグラウンドは、ＴＢＳ−Ｘ中５％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０での６回目のランを含めて全てのランで観察された。このバックグラウンドは印刷媒体と特異的に相互作用するファージの濃縮を妨げたので、スクリーニングを妨害した。しかし配列データの注意深い検討からは、３回の各スクリーニング中の配列の少数が試験された基材との一貫した相互作用を示すことが示唆され、ある程度の濃縮が見られた。表２に列挙したこれらの配列を印刷媒体結合ペプチド候補として同定した。
【０１６９】
【表３】
2007508246.tif 000005
【０１７０】
実施例３
セルロースおよびポリ（エチレンテレフタラート）結合ペプチド候補の同定
この実施例の目的は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して、セルロースおよびポリ（エチレンテレフタラート）に特異的に結合するペプチド配列を同定することであった。高バックグラウンドに起因する、印刷媒体結合ペプチドを明らかに同定する上で遭遇する困難さのために、追加的試験を行って、これらの印刷媒体の２つの主要成分であるセルロースおよびポリ（エチレンテレフタラート）と特異的に相互作用するペプチドを同定した。
【０１７１】
この試験では、Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリースクリーニングにおいて、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））からの繊維サイズが１００〜４００μｍの長い繊維状セルロース２５０μｇを使用した。実施例１で述べた手順に従って、反応をマイクロ遠心管内で実施した。Ｐｈ．Ｄ−７ライブラリースクリーニングではＴＢＳＴ−Ｘ中０．１％、０．５％、１％、２％、および４％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０で、５回のランを行ったが、Ｐｈ．Ｄ．−１２ライブラリースクリーニングでは、最初の４回のランのみ実施した。
【０１７２】
デラウェア州ウィルミントンのデュポン（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））からのサイズおよそ２ｍｍ×２ｍｍ×１ｍｍのポリ（エチレンテレフタラート）ペレットもまた、実施例２で述べるのと同一手順に従ってＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリースクリーニングで使用した。ＴＢＳＴ−Ｘ中０．１％および０．５％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０で２回のランを行い、続いてＴＢＳＴ−Ｘ中０．５％および１％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０で３回目のランを平行して行った。
【０１７３】
この試験の結果からは、３回の各スクリーニング中の少数の配列が、具体的には次のようである基材結合ペプチドの基準を満たすことが示された。特定のラン中での特異的に高い再出現頻度、および／または様々なストリンジェンシー条件下のいくつかのラン中での基材との一貫した相互作用。表３に列挙するこれらの配列をセルロースまたはポリ（エチレンテレフタラート）結合ペプチド候補として同定した。
【０１７４】
【表４】
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【０１７５】
実施例４
ＥＬＩＳＡベース結合アッセイによる基材結合ペプチドの確認
この実施例の目的は、ファージディスプレイスクリーニングを使用して同定された基材結合ペプチド候補をＥＬＩＳＡベース結合アッセイによって確認することであった。
【０１７６】
ペプチドによっては、例えば増幅中の特別なファージの速い生育速度など、基材特異的結合活性以外の理由で、スクリーニングプロセスから選択されるかもしれない。その基材特異的結合活性を確認するために、ペプチド候補を宿すファージを増幅して、ＥＬＩＳＡベース結合アッセイを行った。Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーから得られた２つのファージが、アッセイにおいてそれぞれ７−および１２−アミノ酸−ペプチド候補の対照の役割をした。１つのファージは、Ｃｔｒｌ−７１（配列番号４２）と称される７−アミノ酸−ペプチド配列ＳＮＲＤＬＶＹを有した。もう１つの対照ファージはＣｔｒｌ−１２１（配列番号４３）と称される１２−アミノ酸ペプチド配列ＳＳＮＬＮＬＳＷＶＱＤＴを有した。いくつかの結合アッセイでは、１２−アミノ酸ペプチドＫＦＱＮＭＤＲＨＰＡＳＬ（配列番号４４）を含有する、Ｃｔｒｌ−１２２と称される第３のファージを対照として使用した。
【０１７７】
アッセイを実施するために、上述のように候補ペプチドを宿すファージを精製し増幅して、精製されたファージの８×１０１０個のコピーを使用した。顔料結合ペプチド、印刷媒体結合ペプチド、および印刷媒体成分結合ペプチドについてアッセイを実施した。顔料結合アッセイでは、７５μｇのカーボンブラック、１５０μｇのクロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔａｌ）（登録商標）イエロー、１５０μｇのサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ、または１５０μｇのサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルーを基材として使用した。印刷媒体結合アッセイでは、１００％綿４１９Ｗ布帛および６５／３５ポリエステル／綿７４３６Ｍ布帛から個々の繊維のストリングを引き抜いた。これらの繊維、または１６ｍｍ２ハンマーミル（Ｈａｍｍｅｒｍｉｌｌ）タイダル（Ｔｉｄａｌ）ＭＰ紙の２０ｍｍのセグメントをアッセイで使用した。成分結合アッセイでは、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）からの１５０μｇのタイプ２０シグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）セルロース、または実施例３で述べるペレットをニュージャージー州メタチェンのスペックス・サーティプレップ（ＳＰＥＸ  ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ  Ｉｎｃ（Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ））からのスペックス（ＳＰＥＸ）６７００フリーザーミル内で粉砕して調製した、４５０μｇのポリ（エチレンテレフタラート）粉末を使用した。
【０１７８】
マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ））から得たマルチスクリーン−ＨＶ（０．４５μｍ）９６ウェル濾過プレート内で、ＥＬＩＳＡベースアッセイを行った。アッセイではミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）からの真空マニフォールドを使用して、膜を通した溶液の除去によってウェルを空にした。
【０１７９】
アッセイを次のようにして実施した。上述のように試験する適量の基材を９６ウェル濾過プレートのウェルに入れた。５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６からなる２００μＬのブロック緩衝液を各ウェルに添加し、ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・インストゥルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ））からのオルビマックス（Ｏｒｂｉｍｉｘ）１１０振盪機を使用して室温で１ｈ振盪して、基材およびウェルをブロックした。真空を使用してブロック緩衝液をウェルから除去し、１回量２００μＬのＴＢＳＴ−０．１％（ＴＢＳ＋０．１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０）を使用して、基材を５回洗浄した。１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する２００μＬのＴＢＳＴ−０．１％中のファージ（８×１０１０コピー）の適量を各ウェルに添加した。プレートを室温で１５ｍｉｎ振盪した。真空を使用して、ファージ溶液を除去し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１回量２００μＬのＴＢＳＴ−０．５％を使用して基材を４回洗浄し、１回量２００μＬのＴＢＳＴ−０．５％を使用してさらに４回洗浄した。ＴＢＳを含有する１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで、ニュージャージー州ピスカタウェイのアマーシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））から得られたＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル抗体抱合体を５０００倍に希釈し、各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間振盪した。その後、真空を使用して抱合体溶液を除去し、基材をＴＢＳＴ−０．１％で５回洗浄した。次に２００μＬのＡＢＴＳ基材溶液（０．４ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸、０．０５％のＨ２Ｏ２、および５０ｍＭクエン酸のナトリウム、ｐＨ４．０）を各ウェルに添加して、プレートを室温で２０ｍｉｎ振盪した。得られた着色溶液を真空マニフォールドを使用して通常の９６−ウェルプレートに移し、カリフォルニア州メンロパークのモレキュラーデバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ））から得られた動態学的マイクロプレートリーダーを使用して、溶液の４０５ｎｍにおけるＯＤを測定した。
【０１８０】
各ペプチドを三連でアッセイし、平均ＯＤ４０５値および標準偏差を表４〜６にまとめる。
【０１８１】
【表５】
2007508246.tif 000007
【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
【表８】
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【０１８５】
スクリーニングプロセスから同定されたペプチド候補の大多数が対照よりも顕著に高いＯＤ４０５値を有したので、これらの結果は、確かにそれらが特異的基材結合ペプチドであったことを確認する。ペプチドＣＹ−７２、ＳＢ−７２、ＣＥＬ−７３、ＣＹ−７３、ＣＹ−７４、およびＣＥＬ−１２３は、対照よりも顕著に高いＯＤ４０５値を有さず、それらが擬陽性結合ペプチドであることが示唆される。一般にこれらの結果は、それらのそれぞれの基材について、顔料結合ペプチドが、印刷媒体および印刷媒体成分結合ペプチドよりも高い結合親和力を有することを示すが、顔料粒子の表面積が印刷媒体基材に比べて高いことが、より高いＯＤ４０５値に寄与しているのかもしれない。
【０１８６】
実施例５
直接ファージ計数による基材結合ペプチドの確認
この実施例の目的は、直接ファージ計数を使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を確認することであった。
【０１８７】
実施例４で得られたＯＤ４０５値と、それぞれの基材に対する実際のペプチドの結合親和力の間の相関を確認するために、以下のように直接ファージ計数手順を使用して、各群で最も高いＯＤ４０５値のペプチドを試験した。実施例４で述べるようにして、選択されたペプチドを９６−ウェル濾過プレート内でそれらの特異的基材と相互作用させた。ＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル抗体抱合体を添加する代わりに、２００μＬの溶出溶液（０．２Ｍ  グリシン−ＨＣｌ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ２．２）を各ウェルに添加して、室温で５ｍｉｎ混合して結合したファージを溶出したこと以外は、実施例４で述べた手順に従った。真空マニフォールドを使用してファージ含有溶液をレギュラー９６−ウェルプレートに移し、ｐＨ９．１の３０μＬ  １Ｍトリス−ＨＣｌを添加して即座に中和した。アッセイで基材に結合するファージの数を上述のようにファージ滴定により判定した。
【０１８８】
３回の独立したアッセイからの平均結合ファージ数、および結果の標準偏差を表７〜９に示す。
【０１８９】
【表９】
2007508246.tif 000011
【０１９０】
【表１０】
2007508246.tif 000012
【０１９１】
【表１１】
2007508246.tif 000013
【０１９２】
これらの結果は、顔料に結合したファージ数が対照よりも少なくとも１０倍高いという事実によって示されるように、調べた顔料結合ペプチドのほとんどが、高い特異的結合親和力を有することを実証する。例外は結合ファージ数が対照よりも約５倍高かったＳＭ−７１およびＳＭ−１２１であり、これらのペプチドは中程度の特異的結合親和力を有することが示唆される。印刷媒体および印刷媒体成分結合ペプチドでは、結合ファージ数は対照よりも統計学的に高かったが、１０倍以内であり、中程度の特異的結合親和力が示唆された。１つの例外はＣＥＬ−１２１であり、対照の１００倍を超える結合ファージ数を有した。結合親和力に加えて、顔料、印刷媒体、および印刷媒体成分の表面積もまた、これらの基材と結合するファージ数に寄与する。これらの結果は、実施例４のＥＬＩＳＡベースアッセイ結果で得られたものと一致し、特異的基材結合ペプチド候補が確認される。
【０１９３】
実施例６
結合親和力（ＭＢ５０）および最大結合（Ｂｍａｘ）の測定による結合ペプチド候補の特性判定
実施例４および５では、ペプチド候補を宿すファージの基材特異的結合活性が、ＥＬＩＳＡアッセイおよび直接プラーク計数方法を使用して確認された。しかしこれらの方法にはいくつかの限界がある。それらは具体的に各候補がその対応する基材にどれだけ強力に結合するかを示唆せず、ファージそれ自体が方法で偽陽性を引き起こすかもしれない。これらの限界を克服するために、ファージから結合ペプチド候補を単離して、検出可能なタンパク質パートナーと融合させた。グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）をタンパク質パートナーとして使用した。結合活性の滴定を通じて、選択されたペプチド候補について結合親和力（ＭＢ５０）および最大結合（Ｂｍａｘ）を測定した。
【０１９４】
ｐＧＳＴｆプラスミドの構造：
カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））からのゲートウェイシステムのｐＤＥＳＴ１５プラスミドを修正して、発現プラスミドｐＧＳＴｆを作り出した。修正はｐＤＥＳＴ１５プラスミド上のＧＵＳのＣ−末端配列を単純化し、リンカーをコードする配列および４つのユニークな制限部位（ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＡｓｃＩ）をＧＵＳ遺伝子の停止コドンの直前に追加した。これらのユニークな制限部位のために、結合ペプチドコード配列、および隣接ＳａｃＩおよびＡｓｃＩ相補的付着端を含有する二本鎖ＤＮＡアダプターが、ＳａｃＩおよびＡｓｃＩ部位の間でｐＧＳＴｆプラスミドに挿入された。
【０１９５】
各結合ペプチド候補群からの２つの最良の７−ｍｅｒ配列および２つの最良の１２−ｍｅｒ配列について、ＧＳＴ−ペプチド融合体を構築した。表１０に示すように、オリゴヌクレオチドの組を各ペプチド候補に割り当てた。９５℃で５ｍｉｎ加熱し、次に１分あたり２℃の速度で２４℃に冷却して、各ペプチドのためのオリゴヌクレオチドをアニールした。最後にアニールしたオリゴヌクレオチドをＳａｃＩおよびＡｓｃＩ部位間でｐＧＳＴｆに挿入し、日常的分子遺伝子組換え技術を用いて、発現プラスミドｐＧＳＴ−ペプチドを形成した。ペプチドＣＥＬ−１２１のために使用したオリゴヌクレオチドは、その他のペプチドのために使用したオリゴヌクレオチドとは異なる形態を有した。ＣＥＬ−１２１のためのオリゴヌクレオチドペアは、ＮｃｏＩおよびＡｓｃＩ部位間でｐＧＳＴｆに挿入してプラスミドｐＧＳＴ−ＣＥＬ１２１を形成した。
【０１９６】
【表１２】
2007508246.tif 000014
【０１９７】
【表１３】
2007508246.tif 000015
【０１９８】
【表１４】
2007508246.tif 000016
【０１９９】
【表１５】
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【０２００】
ＧＳＴ−ペプチド融合タンパク質の調製：
ＧＳＴ−ペプチド融合タンパク質を発現するために、これらの新しいｐＧＳＴｆコンストラクトをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１  Ａ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。各ｐＧＳＴｆコンストラクトで、１個の形質転換されたコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＬＢ−Ａｍｐ５０）を含有する２．５ｍＬのＬＢブロス中で一晩３７℃で生育させ、次に５０ｍＬの新鮮なＬＢ−Ａｍｐ５０中で再度生育させた。細胞密度が０．８〜１．０のＯＤ６００値に達したら、０．２％の濃度でＬ−アラビノースを培養物に添加して、３７℃で４ｈタンパク質発現を誘導した。およそ１００μＬの細胞を遠沈して、次に３０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で１０ｍｉｎ沸騰させて溶解した。１０μＬの細胞溶解産物をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でランしてタンパク質発現を調べ、プラスミドが確かに融合タンパク質を生成したことを確認した。イリノイ州ロックフォードのピアス（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））からのＢ−ＰＥＲ  ＧＳＴ融合タンパク質精製キットを使用して、製造業者が提供するプロトコルに従って発現したタンパク質精製した。簡単に述べると、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）および５ｍＭのＥＤＴＡを添加した２．５ｍＬのＢ−ＰＥＲ試薬中で、５０ｍＬの培養物から収集した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を室温で３０ｍｉｎかけて溶解した。細胞デブリを遠心分離によって除去した。可溶性画分（上清）を１ｍＬの５０％固定化グルタチオンスラリーと３０ｍｉｎ混合し、遠心分離して融合タンパク質と結合したグルタチオンゲルを収集した。ゲルを０．２５ｍＬのウォッシュバッファー中に再懸濁して、マイクロフィルタースピンカラムに装填し、遠心分離してウォッシュバッファーを除去した。次に１回当たり０．５ｍＬのウォッシュバッファーを使用して、スラリーを２回洗浄した。０．４５ｍＬの溶出溶液を使用して、融合タンパク質をゲルから２回溶出した。２つの溶出サンプルを合わせて、ＩＥＢ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール）中で透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の質を検査して、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイ試薬を使用してタンパク質濃度を判定した。
【０２０１】
ＭＢ５０およびＢｍａｘの測定：
ＭＢ５０およびＢｍａｘデータを得るために、０．０２５、０．０５、０．１、０．１５、０．２５、０．４、および０．５ｎｍｏｌのタンパク質を添加して、実施例４で述たＥＬＩＳＡベース結合アッセイにおいてＧＳＴ−ペプチド融合タンパク質を滴定した。１つのアッセイ反応では、適量の基材をウェルに入れてウェルをブロッキングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６、５ｍｇ／ｍ  Ｌ  ＢＳＡ）で満たしてブロックした。基材およびウェルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ−０．１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）で３回洗浄し、試験するＧＳＴ−ペプチド融合タンパク質、および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する２００μＬのＴＢＳＴ溶液と室温で１５ｍｉｎ反応させ、最後にＴＢＳＴで５回洗浄した。基材と結合するＧＳＴ−ペプチド融合タンパク質を検出するために、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの抗ＧＳＴ−ＨＲＰ抱合体をＴＢＳＴで２，５００倍に希釈し、ウェルに添加して室温で１ｈインキュベートした。ＴＢＳＴでの５回の洗浄後、２００μＬのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）基材溶液（０．４ｍＭ）、５０ｍＭナトリウムクエン酸、ｐＨ４．０、０．０５％のＨ２Ｏ２）をウェルに添加して、室温で２５ｍｉｎ発色反応を起こさせた。コネチカット州シェルトンのパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ））からのヴィクター（Ｖｉｃｔｏｒ）−３  １４２０マルチ・レベル・カウンターを使用して、ＯＤ４０５値を測定した。
【０２０２】
アッセイでは、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの３７．５μｇのカーボンブラックＦＷ−１８、１５０μｇのクロモフタール（Ｃｒｏｍｏｐｈｔａｌ）（登録商標）イエロー、１５０μｇのサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ、または１５０μｇのサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルーを顔料結合基材として使用した。１００％綿４１９Ｗ布帛および６５／３５ポリエステル／綿７４３６Ｍ布帛から２０ｍｍの繊維ストリングを引き抜いて、１つの反応で布帛結合基材として使用した。１片の１６ｍｍ２ハンマーミル・タイダル（Ｈａｍｍｅｒｍｉｌｌ  Ｔｉｄａｌ）ＭＰ紙を紙結合基材として使用した。シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの６００μｇのシグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）（セルロースタイプ２０）をセルロース結合基材として使用した。１００％ポリエステル布帛から引き抜いた２０ｍｍの繊維ストリングをポリエステル結合基材として使用した。各反応を三連で実施して、ＯＤ４０５値の平均を基材に対するペプチド結合親和力の測定値とした。タンパク質不在下での反応をブランク反応として使用した。
【０２０３】
カリフォルニア州サンディエゴのグラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からのグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）４．０を使用して、各ＧＳＴ−ペプチド融合タンパク質で、タンパク質濃度に対する平均ＯＤ４０５値をプロットした。スキャッチャードプロットを使用して、タンパク質のＭＢ５０およびＢｍａｘ値を判定し、表１１に示す。表ではより小さなＭＢ５０値がより強力な結合親和力を示唆するのに対し、より高いＢｍａｘ値は、より大量のペプチドが基材に付着することを示す。優れたペプチド候補は、ＣＢ−１２２のようにより小さなＭＢ５０と高いＢｍａｘを有するべきである。ＧＳＴそれ自体は試験したいずれの基材に対しても結合活性を示さなかった（データ示さず）ので、このデータは、選択されたペプチド候補が基材特異的結合活性を確かに有し、ペプチドがより大きなタンパク質複合体に組み入れられた後もなおも活性であることを実証する。しかしこのアッセイは、大量の洗浄を使用したために非平衡状態条件下で実施された。したがってこのデータの組を異なる条件下でその他の方法によって得られたものと比較することは、適切でないかもしれない。
【０２０４】
【表１６】
2007508246.tif 000018
【０２０５】
実施例７
フローマイクロ熱量計測を使用したペプチド−基材結合エネルギーの測定
この実施例の目的は、相互作用の強度、具体的には、顔料結合および印刷媒体結合ペプチドの各基材との吸着モル熱をフローマイクロ熱量計測を使用して測定することである。
【０２０６】
結合ペプチドとそれらの各基材との相互作用に関する吸着および脱離熱をマイクロスカル・ロンドン（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌ  Ｌｏｎｄｏｎ，Ｌｔｄ．）からのモデル４０３４フローマイクロ熱量計によって測定した。フローマイクロ熱量計は、ユニット内で一緒になって容積０．１７ｃｍ３のサンプルキャビティーまたはセルを形成する、入り口および出口コネクタを有する定温金属ブロックから構成される。１組の２個のサーミスタが、サンプルキャビティー内の２個のサーミスタの第２の組と共に、金属ブロック内に包埋される。ホイートストーンブリッジ回路の手段によって、マイクロカロリー範囲の熱変化を測定できる。出口チューブには２５ミクロンフィルターが装着され、その上にサンプルベッドが位置し、またキャリブレーションコイルも含まれる。ホイートストーン回路からのアナログデータストリームは１秒間隔でサンプルされてデジタル化され、接続されたコンピューターに保管と引き続く分析のために送られる。あらゆる実験は２４．５±０．５℃で行った。
【０２０７】
マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ））からのウォーターズ・モデル２４１０示差屈折計をフローマイクロ熱量計の下流に置いて、キャリア溶液へのそしてそれからの質量移動をモニターした。第２の吸着／脱離サイクルでは検出可能な質量移動が観察されなかったので、この第２のサイクルを下流検出器のブランクとして使用した。下流検出器を通るブランクとサンプルの間の時間毎の差を積分することで、濃度ピークが得られた。ピーク領域のキャリブレーションは、下流検出器上の既知容積のサンプルループ内に、ペプチド含有溶液を注入することで達成された。
【０２０８】
試験する基材、具体的には、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）からのセルロース繊維またはポリエチレンテレフタレート（ポリエステル）を繊維または微粒子形態で、装置のサンプルセル内に入れた。水をキャリア溶剤として使用した。サンプルセルへのまたはそれからの熱の流れの変化がないことで立証される平衡状態が得られるまで、キャリア溶剤をサンプルセルを通して汲み上げた。平衡状態を得た後、溶剤の流れを既知濃度の特異的結合ペプチドを含有するものの方に切り替えた。ペプチドの基材への吸着は、発熱ピークと、示差屈折率モニターを使用して下流で判定されるように、キャリア溶中のペプチド濃度の低下をもたらした。平衡状態が得られるまで、ペプチド含有溶剤の流れを継続した。次に溶剤の流れを元の純粋な溶剤に切り替え、もしあれば、基材からのペプチドの脱離をモニターした。比較のため同一方法を使用して、その基材への結合について、伝統的アクリルバインダー（ポリメタクリル酸）を試験した。
【０２０９】
基材表面の単位表面積あたりの結合ペプチドの質量移動を計算するために、屈折率モニターにより収集したデータを使用して、これらの試験において使用した印刷媒体基材の表面積を測定した。表面積の判定は、ジョージア州ノークロスのマイクロメリティクス（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ））からのマイクロメリティクス（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ）ＡＳＡＰ（登録商標）モデル２４００／２４０５多孔率計を使用して、７７．３°Ｋで二窒素吸着測定を使用して行った。データ収集に先だって、サンプルを６０℃で一晩脱気した。相対圧力（Ｐ／Ｐ０）０．０５〜０．２０にわたり収集した５点吸着等温線を使用して表面積測定を行い、ブルナウア（Ｂｒｕｎａｕｅｒ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６０：３０９（１９３８））が述べるようなＢＥＴ法で分析した。μｍｏｌ／ｍ２で示される質量移動値は、屈折率モニターで行った測定から判定された、基材上に吸着するサンプル量を基材の表面積で除して計算した。得られた質量移動値を表１２に示す。いずれのサンプルでも脱離ステップ中に濃度の顕著な変化は観察されなかった。結果は不可逆的吸着と一致する。
【０２１０】
マイクロ熱量計測判定からの吸着熱を平方メートル当たりのミリジュール（ｍＪ／ｍ２）単位で表１３に示す。吸着熱を質量移動値で除して、所望の単位を得るのに適した転換因数を使用し、これらの値を表１３でモルあたりのキロカロリー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の単位で示される吸着のモル熱に変換した。表中の吸着熱および吸着のモル熱に関する負の値は、プロセスが発熱であり、すなわち結合の結果として熱が放出されたことを示唆する。表中のデータに見られるように、ペプチドの全ての吸着のモル熱は２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、メタクリレート対照から得られた値と比較できる。いずれのサンプルについても顕著な脱離熱は観察されず、全例において吸着が本質的に不可逆的であることが示唆された。
【０２１１】
この試験の結果は、本発明のペプチドが、結合相互作用の強度の観点から、伝統的アクリルバインダー対照と比べて遜色がないことを示唆する。
【０２１２】
【表１７】
2007508246.tif 000019
【０２１３】
【表１８】
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【０２１４】
実施例８
顔料結合ペプチド／リンカージブロック分散剤の調製
この実施例の目的は、顔料結合ペプチドおよびポリプロリンリンカーからなるジブロック分散剤を調製することであった。ポリプロリンリンカーは、配列番号７として示されるカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−７１のＮ−末端アミンを通じた活性化による、Ｌ−プロリンのＮ−カルボキシ無水物の原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での重合によって合成された。
【０２１５】
Ｌ−プロリンＮ−カルボキシ無水物の合成：
乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でのホスゲン化によってＬ−プロリンから、Ｌ−プロリンのＮ−カルボキシ無水物を合成した。熱電対ウェル付き３，０００ｍＬの丸底四つ口フラスコに、較正済み添加漏斗を装着し、それに小型のドライアイスコールドフィンガーを載せた。第２のより大きなコールドフィンガーもまた、フラスコに装着した。１５００ｍＬの乾燥ＴＨＦおよびミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ））からの２３．０２ｇ（２００ｍｍｏｌ）のＬ−プロリンを装入したフラスコに、磁気撹拌棒を入れた。反応に液体ホスゲン（２８ｍＬ）を２つの１４ｍＬの部分に分けて添加し、透明な溶液が得られるまで反応混合物を撹拌した。次に溶剤を４０℃以下で、約４０ｍＬの容積に真空蒸留した。透明な油が得られ、次に乾燥箱に移して、ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ））からの１００ｍＬのヘキサンを添加した。油を洗浄するために回旋させた後、ヘキサンをデカントして１００ｍＬのＴＨＦを−２０℃で添加した。次にトリエチルアミン（２０．２ｇ）を含有する追加的な１００ｍＬの冷ＴＨＦを添加して、トリエチルアミン塩酸塩の沈殿を引き起こし、それを濾過して除去した。ヘキサン（１５０ｍＬ）を濾液に添加して、溶液を−２０℃の冷蔵庫に２４ｈ入れた。得られた白色結晶（２回の収集）を真空濾過により収集した。得られた収量はそれぞれ１３．３ｇおよび９．１ｇであった。
【０２１６】
カーボンブラック結合ペプチド／ポリプロリンジブロック分散剤の合成：
隔壁および磁気撹拌棒を装着した１００ｍＬ丸底フラスコ内の１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた１グラムのカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−７１（配列番号７）を溶解した。上述のようにして調製されたプロリンＮ−カルボキシ無水物（１．２ｍＬのＤＭＦ中の１．０ｍｍｏｌ／ｍＬ溶液）を室温で迅速に撹拌しながら一度に添加した。反応混合物を室温で２４ｈ撹拌し、その後８ｍＬのＤＭＦを添加して、続いてマサチューセッツ州ホリストンの（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ））からのハーバード（Ｈａｒｖａｒｄ）モデル４４シリンジポンプを使用して、追加的な１０．８ｍＬのプロリンＮ−カルボキシ無水物溶液を４ｈかけて滴下して添加した。反応を一晩撹拌し、次に凍結乾燥機を使用してＤＭＦを除去した。生成物をヘキサンで洗浄し、濾過して収集して４０℃で真空乾燥した。収量は１．６９ｇのベージュ色の粉末であった。ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して生成物を分析し、数平均分子量（Ｍｎ）は２１７０ｇ／ｍｏｌであることが分かった。生成物の理論分子量は１８００ｇ／ｍｏｌである。
【０２１７】
実施例９
顔料結合ペプチド／リンカージブロック分散剤の調製および性能試験
この実施例の目的は、顔料結合ペプチドおよびポリプロリンリンカーからなるジブロック分散剤を調製して、顔料分散剤としてのそれらの性能を試験することであった。ポリプロリンリンカーは、配列番号８として示されるカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−１２１、または配列番号１８として示されるマゼンタ結合ペプチドＳＭ−７１のＮ−末端アミンを通じた活性化によって、Ｌ−プロリンのＮ−カルボキシ無水物の原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での重合によって合成された。
【０２１８】
Ａ．カーボンブラック結合ペプチド／ポリプロリンジブロック分散剤の合成：
隔壁および磁気撹拌棒を装着した１００ｍＬ丸底フラスコ内の１０ｍＬのＤＭＦに、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた１グラムのカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−１２１（配列番号８）を溶解した。実施例８で述べたようにして調製したプロリンＮ−カルボキシ無水物（０．８ｍＬのＤＭＦ中の１ｍｍｏｌ／ｍＬ溶液）を室温で迅速に撹拌しながら一度に添加した。反応混合物を室温で２４ｈ撹拌し、その後１２ｍＬのＤＭＦを添加して、続いてハーバード（Ｈａｒｖａｒｄ）モデル４４シリンジポンプを使用して、追加的な７．２ｍＬのプロリンＮ−カルボキシ無水物溶液を４ｈかけて滴下して添加した。反応を一晩撹拌し、次に減圧下でＤＭＦを除去した。生成物をヘキサンで洗浄し、濾過して収集して４０℃で真空乾燥した。収量は１．３６ｇのベージュ色の粉末であった。ＧＰＣを使用して生成物を分析し、数平均分子量（Ｍｎ）は２８５０ｇ／ｍｏｌであることが分かった。生成物の理論分子量は２２６０ｇ／ｍｏｌである。
【０２１９】
カーボンブラック結合ペプチド／ポリプロリンジブロック分散剤の分散試験：
振盪ボトル試験を使用して、本発明の分散剤の能力の定性試験を実施した。試験は、下で述べるように、関心のある分散剤を顔料、および不活性研磨粒子をはじめとするその他の添加剤と組み合わせることと、混合物を激しく振盪することからなった。振盪後に混合物の粘度および解凝集を調べて、分散剤の有効性を判定した。
【０２２０】
上述のように調製した１グラムのカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−１２１／ポリプロリンジブロック分散剤を０．２７ｇの１０％水性カリウム水酸化物溶液を含有する１８．７３ｇの脱イオン水に懸濁させた。得られた溶液はわずかに濁っていた。２オンスのねじ蓋式バイアルに、８ｇの分散剤溶液、７．５ｇのジルコニアビーズ、オハイオ州アクロンのノプコＮＤＷ（Ｎｏｐｃｏ  ＮＤＷ、（Ａｋｒｏｎ、ＯＨ））からの０．１ｇの脱泡剤、１．０ｇのＦＷ−１８カーボンブラック顔料、および３．５ｇの脱イオン水を装入した。バイアルにしっかり蓋をしてテープで密封し、緩衝材材料で満たされた塗料缶に入れた。次にこのアセンブリーをニュージャージー州ユニオンのレッドデビル（Ｒｅｄ  Ｄｅｖｉｌ（Ｕｎｉｏｎ、ＮＪ））からの塗料ミキサー上で３０ｍｉｎ撹拌した。その後、分散体がバイアルの壁を流下する際に形成される薄膜の特性によって判定して、粘度および凝集の程度について分散体を定性的に調べた。このジブロック分散剤は、カーボンブラック顔料について良好な分散体特性を有すると判定された。液体の粘度が低ければ、そしてガラスバイアルの側面を流下しながら色の大きなパッチまたは溝を形成せずに均一の薄膜を形成すれば、分散体は良好であると判定された。あらゆる特定のポリマーが効果的な分散剤として作用する能力は、添加剤、ｐＨおよびポリマー上の酸または塩基の中和程度をはじめとする、全体的な分散体調合物に強く依存することを強調しておかなくてはならない。
【０２２１】
このカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−１２１／ポリプロリンジブロック分散剤は、顔料結合ペプチドを同定するために使用したＦＷ−１８顔料以外のカーボンブラック顔料、具体的には全てニュージャージー州ピスカタウェイのデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からのデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）９０、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）１５０Ｔ、および２つのロットのＮＩＰｅｘ（登録商標）１８０を使用しても試験した。ＣＢ−１２１／ポリプロリンジブロック分散剤は、これらの別の顔料を分散するのに効果的でなかった。しかし上で述べたのと同様にして調製した別のカーボンブラック結合ペプチド分散剤、具体的にはＣＢ−７１（配列番号７）／ポリプロリン１０、およびＣＢ−７２（配列番号６）／ポリプロリン１０は、これらの別のカーボンブラック顔料のほとんどについて効果的な分散剤として機能した。一般には、調合物中で使用する特定の顔料について顔料結合ペプチドを選択することが一番よい。
【０２２２】
比較のために同一条件で、このカーボンブラック結合ペプチド／ポリプロリン分散剤を顔料サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ１２２のための分散剤として試験した。このジブロックペプチドはサンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）マゼンタ顔料を分散しなかったが、代わりに高度に粘稠な混合物を生じた。この結果は、カーボンブラック結合ペプチド／ポリプロリン分散剤の選択性を実証する。
【０２２３】
Ｂ．マゼンタ結合ペプチド／ポリプロリンジブロック分散剤の合成：
隔壁および磁気撹拌棒を装着した１００ｍＬ丸底フラスコ中の１０ｍＬのＤＭＦに、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた１グラムのマゼンタ結合ペプチドＳＭ−７１（配列番号１８）を溶解した。実施例８で述べたように調製したプロリンＮ−カルボキシ無水物（０．８ｍＬのＤＭＦ中の１ｍｍｏｌ／ｍＬ溶液）を室温で迅速に撹拌しながら一度に添加した。反応混合物を室温で２４ｈ撹拌し、その後８ｍＬのＤＭＦを添加して、続いてハーバード（Ｈａｒｖａｒｄ）モデル４４シリンジポンプを使用して、追加的な１１．２ｍＬのプロリンＮ−カルボキシ無水物溶液を４ｈかけて滴下して添加した。反応を一晩撹拌し、次に減圧下でＤＭＦを除去した。生成物をヘキサンで洗浄し、濾過して収集して４０℃で真空乾燥した。収量は１．７９ｇのベージュ色の粉末であった。ＧＰＣを使用して生成物を分析し、数平均分子量（Ｍｎ）は２４６０ｇ／ｍｏｌであることが分かった。生成物の理論分子量は１７４５ｇ／ｍｏｌである。
【０２２４】
マゼンタ結合ペプチド／ポリプロリンジブロック分散剤の分散試験
２オンスねじ蓋式バイアル中の０．５ｍＬの１０％水性ＫＯＨ溶液を含有する１０ｍＬの脱イオン水に、上述のように調製したマゼンタ結合ペプチド／ポリプロリンジブロック分散剤（０．２５ｇ）を懸濁させた。サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ１２２顔料（０．６２５ｇ）、砂（７．５ｇ）、および脱泡剤（０．１ｇ）を添加して、バイアルに蓋をして上述のように３０ｍｉｎ振盪した。低粘度を示して凝集を示さない、非常に良好な分散体が得られた。比較のために同一条件で、顔料カーボンブラックＦＷ１８のための分散剤として、このマゼンタ結合ペプチド／ポリプロリンペプチド分散剤を試験した。このジブロックペプチドはカーボンブラック顔料を分散せず、その選択性が実証された。
【０２２５】
実施例１０
印刷媒体結合ペプチド／疎水性リンカージブロック分散剤の調製
この実施例の目的は、綿結合ペプチドおよび疎水性ポリγベンジルグルタミン酸リンカーからなるジブロック分散剤を調製することであった。この実施例は、選択された印刷媒体結合ペプチドが、水性分散体のための親水性リンカーと、特異的印刷媒体バインダーの双方の役割を果たす能力を例証する。ポリγベンジルグルタミン酸リンカーは、配列番号３０として示される綿結合ペプチドＣＯＴ−７１のＮ−末端アミンを通じた活性化によって、γベンジルグルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物の原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での重合によって合成された。
【０２２６】
γベンジルグルタミン酸Ｎ−カルボキシ無水物の合成：
γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸を使用して、Ｌ−プロリンＮ−カルボキシ無水物の調製について実施例８で述べたようにして、ホスゲン化によってγベンジルグルタミン酸Ｎ−カルボキシ無水物を調製した。熱電対ウェル付き１，０００ｍＬの丸底四つ口フラスコに、較正済み添加漏斗を装着し、それに小型のドライアイスコールドフィンガーを載せた。第２のより大きなコールドフィンガーもまた、フラスコに装着した。５００ｍＬの乾燥ＴＨＦおよびウィスコンシン州ミルウォーキーのフルカ・ケミカル（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））からの５０ｇ（２００ｍｍｏｌ）のγ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸を装入したフラスコに、磁気撹拌棒を入れた。還流しながら加熱して、反応に液体ホスゲン（２４ｍＬ）を２つの１２ｍＬの部分に分けて添加した。還流しながら透明な溶液が得られるまで反応混合物を撹拌した。次に溶剤を４０℃以下で真空蒸留して乾燥させた。次に白色結晶性生成物を乾燥箱に移して、８００ｍＬのヘキサンを添加した。ヘキサン中で回旋させた後、結晶を濾過して収集した。生成物をＴＨＦ／ヘキサン混合物から再結晶化した。得られた白色結晶（２回の収集）を真空濾過して収集し、５３．２ｇ（収率９５．９％）を得た。
【０２２７】
綿結合ペプチド／ポリγベンジルグルタミン酸ジブロック分散剤の合成：
乾燥箱中で、隔壁および磁気撹拌棒を装着した１００ｍＬの丸底フラスコ内の１０ｍＬの蒸留して乾燥させたＤＭＦに、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた１．０ｇの綿結合ペプチドＣＯＴ−７１（配列番号３０）を溶解した。次に上述のようにして調製した１．２ｍＬのＤＭＦ中のγ−ベンジルＬ−グルタミン酸Ｎ−カルボキシ無水物の１ｍｍｏｌ／ｍＬ溶液を室温で迅速に撹拌しながら一度に添加した。この反応混合物を室温で７２ｈ撹拌した。その後、８ｍＬのＤＭＦを添加して、ハーバード（Ｈａｒｖａｒｄ）モデル４４シリンジポンプを使用して、追加的な１０．８ｍＬのγ−ベンジルＬ−グルタミン酸Ｎ−カルボキシ無水物溶液を４ｈかけて緩慢に添加した。この反応混合物をさらに４８ｈ撹拌した。その後、溶剤を真空下で蒸発させて乾燥した。回収した乾燥生成物をヘキサンで洗浄して風乾させ、次に真空中において４０℃で乾燥させた。収量は２．９９ｇの灰色がかった粉末であった。ＧＰＣを使用して生成物を分析し、数平均分子量（Ｍｎ）が４２３０ｇ／ｍｏｌであることが分かった。生成物の理論分子量は３４８２ｇ／ｍｏｌである。
【０２２８】
実施例１１
カーボンブラック結合ペプチド／印刷媒体結合ペプチドジブロック分散剤の調製
この実施例の目的は、綿結合ペプチドＣＯＴ−７１（配列番号３０）およびカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−７１（配列番号７）からなるジブロック分散剤を調製することであった。
【０２２９】
隔壁および磁気撹拌棒を装着した１００ｍＬ丸底フラスコ内の１０ｍＬのＤＭＦに４，４’メチレンビス（フェニルイソシアネート）（０．３０８ｇ）を溶解した。シリンジポンプを使用して、１０ｍＬのＤＭＦ中の１．０ｇのカーボンブラック結合ペプチドＣＢ−７１（配列番号７）溶液を室温で２ｈかけて滴下して添加し、添加完了後、反応混合物を室温でさらに４ｈ撹拌した。１０ｍＬのＤＭＦ中の綿結合ペプチドＣＯＴ−７１（配列番号３０）（１．０７０ｇ）を迅速に撹拌しながら一度に添加し、得られた溶液を室温で２４ｈ撹拌した。次に溶剤を真空蒸留によって除去し、生成物をヘキサンで洗浄して濾過によって収集した。サンプルを４０℃で真空乾燥させ、２．０２ｇの灰色がかった粉末を得た。生成物をＧＰＣを使用して分析し、数平均分子量（Ｍｎ）は２４３０ｇ／ｍｏｌであることが分かった。生成物の理論分子量は１９６０ｇ／ｍｏｌである。
【０２３０】
実施例１２
綿結合ペプチドの洗濯堅牢度試験
この実施例の目的は、配列番号３０として示される綿結合ペプチドＣＯＴ−７１の綿上における洗濯堅牢耐久性を実証し、それをポリメタクリレート対照と比較することであった。綿結合ペプチドおよびポリメタクリレートのどちらも染料に共役し、分光光度的判定が可能になった。
【０２３１】
４−（２−（４−イソシアナトフェニル）ジアゼニル）ベンゼンアミン（イソシアネート機能性付与分散オレンジ３）の調製：
ホスゲン（２５．４ｍＬ）をトルエンに溶解して、３５重量％溶液を作った。アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から得られた分散オレンジ３（４−（２−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）ベンゼンアミン（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６，４７９−７）、（１４．２５ｇ）をトルエン中に懸濁させ、前もって調製したホスゲン溶液を５分間かけて滴下して添加した。反応物を１００℃に２ｈ加熱して、次に室温に冷却させた。得られた固形物を濾過してトルエンで洗浄し、１１．３３ｇ（８４．５％収率）の所望のイソシアネート誘導体を得た。
【０２３２】
染料結合する綿結合ペプチドの調製：
アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から得られた４−（２−（４−イソシアナトフェニル）ジアゼニル）ベンゼンアミン（Ｃａｔ．Ｎｏ．２５，６４３−９）、（０．７０ｇ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解した。配列番号３０として示される綿結合ペプチドＣＯＴ−７１（１．４５ｇ）を２５ｍＬのＤＭＦに溶解し、室温で激しく撹拌しながら上の溶液に添加した。反応を４日間撹拌した。反応溶液を濾過して未溶解固形物を除去し、濾液をジエチルエーテルで希釈して暗赤褐色粉末を沈殿させ、それを真空乾燥させた（０．５ｇ、収率２３％）。
【０２３３】
染料結合するメタクリル酸オリゴマーの調製：
トリメチルシリルメタクリレートの基移動重合によってポリメタクリル酸オリゴマー（ＤＰ＝１０、２．０ｇ）を調製し、続いてマ（Ｍａ）らに付与された米国特許第５，０８５，６９８号明細書で述べられるのと類似の方法を使用してトリメチルシリル基を除去した。オリゴマーを塩化オキサロイル（４ｍＬ）中に溶解し、混合物を３０ｍｉｎ還流した。過剰な塩化オキサロイルを真空蒸留によって除去した。アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から得られた分散オレンジ３、（４−（２−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）ベンゼンアミン）、（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６，４７９−７）、（１．１５ｇ）を２０ｍＬのＴＨＦに溶解し、この溶液を上の乾燥させた酸塩化物に添加した。酸塩化物が再溶解した後、溶液を加熱して３０ｍｉｎ還流した。次に５ｍＬの水を添加して、混合物を加熱して３０ｍｉｎ還流した。溶液を濾過し、濾液を真空内で濃縮させ、収量２．０１ｇの粗生成物を得た。この固形物を小さな部分に分割し、溶出溶剤として９：１ｖ／ｖクロロホルム／メタノールを使用して、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０２３４】
洗濯堅牢度耐久性試験：
ジメチルホルムアミド中２０％の固形分濃度で、染料結合する綿結合ペプチドおよび染料結合するメタクリル酸オリゴマーの溶液を調製した。これらの溶液を１００％綿布帛スワッチ（１０ｃｍ×１０ｃｍ）上にスプレーして、直径約２．５〜５ｃｍの着色スポットを調製した。次に布帛試験に先だって、布帛サンプルを室温に２４ｈ置いて、または７０℃に１０ｍｉｎ加熱して順応させた。
【０２３５】
加速洗濯試験（米国繊維化学者・色彩技術者協会（ＡＡＴＣＣ）試験方法６１−１９９６）を使用して、洗濯堅牢度耐久性を判定した。布帛の着色スポット領域を光センサー中に入れて、高度計応答を表すＬ＊、ａ＊およびｂ＊パラメーターを計算して、加速洗濯前後の色強度測定を分光光度的に判定した。スポットを付けていない布帛について最初のベースラインＬ＊値を測定し、あらゆる測定は３回の個々の判定の平均であった。ΔＥ値を下の式１
ΔＥ＝（（Ｌ＊１−Ｌ＊２）２＋（ａ１−ａ２）２＋（ｂ１−ｂ２）２）１／２      （１）
（式中、
Ｌ＊＝明度変数であり、ａ＊およびｂ＊は国際照明委員会（ＣＩＥ）によって定義されるＣＩＥＬＡＢ色空間の色度座標である（ミノルタ「正確な色のコミュニケーション−感触から器具使用への色制御（Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ−Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｆｒｏｍ  Ｆｅｅｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」ミノルタカメラ、１９９６））から計算した。ΔＥ値は色の損失と相関するので、より小さい値はより良い洗濯堅牢度耐久性の徴候である。
【０２３６】
結果を表１４に提示する。表中のデータに見られるように、綿結合ペプチドの洗濯堅牢度は、メタクリレート対照よりも良好である。
【０２３７】
【表１９】
2007508246.tif 000021
【０２３８】
実施例１３
綿結合ペプチド／疎水性リンカージブロック分散剤の調製
この実施例の目的は、顔料結合領域の役割をする、綿結合ペプチドおよびポリ（ベンジルメタクリレート）リンカーからなるジブロック分散剤を調製することであった。下の手順に従って、単一ヒドロキシエチルメタクリレート単位で終結するポリ（ベンジルメタクリレート）オリゴマー（ＤＰ＝９）をビス（４−イソシアナトフェニル）メタンによって、末端ヒドロキシル基でキャッピングした。これによって綿結合ペプチドに直接結合する、反応性中間体が提供される。
【０２３９】
イソシアネートキャップドポリ（ベンジルメタクリレート）の調製：
マ（Ｍａ）ら（前出）によって述べられる一般方法を使用して、基移動重合によってポリ（ベンジルメタクリレート／ヒドロキシエチルメタクリレート）を調製し、５０ｍＬのＴＨＦに１０ｇを溶解した。アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から得られたビス（４−イソシアナトフェニル）メタン、（Ｃａｔ．Ｎｏ．２５，６４３−９）、（１２ｇ）もまた５０ｍＬのＴＨＦに溶解し、次に激しく撹拌しながら、ポリアクリレート溶液を数時間かけて滴下して添加した。添加完了後、１０ｍＬの乾燥エチルアミンを添加して、反応物を室温で一晩撹拌した。次にヘキサンの添加によって、注意深い分別沈殿によりイソシアネートキャップド生成物を得た。沈殿したポリマーを収集し、ジエチルエーテルに溶解して、ヘキサンの添加によってもう一度新たに沈殿させた。精製した生成物を乾燥した後、生成物重量は５．８９ｇであった。ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ質量分析法を使用して、精製された生成物のアイデンティティを確認した。
【０２４０】
綿結合ペプチド（ＣＯＴ−７１）／ベンジルメタクリレートジブロック分散剤の合成：
ＣＯＴ−７１綿結合ペプチド配列（配列番号３０）と、テトラプロリンスペーサーによって綿結合領域から隔てられるＮ−末端リジンとを含有する、配列番号１１５として示される合成ペプチドが、上述の固相合成技術を使用してシンプレップ（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって調製された。乾燥箱中で、０．７２ｇの真空乾燥ペプチドを乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した。ゴム隔壁が装着され磁気撹拌棒を含有する４０ｍＬねじ込み栓びんに、上述のイソシアネートキャップドアクリレート（１．０４ｇ）を装入した。ペプチド溶液をびんに一度に添加した。次にびんを撹拌しながら加熱ブロック内に入れて６０℃に６ｈ保ち、その後取り出して反応混合物を室温で一晩撹拌した。次に溶液を１μｍフィルターに通過させ、次に溶剤を真空蒸留によって除去した。生成物をジエチルエーテルで数回洗浄して１．４ｇの精製生成物を得た。
【０２４１】
実施例１４
綿結合ペプチド／疎水性リンカージブロック分散剤を有するカーボンブラックインクの洗濯堅牢度試験
この実施例の目的は、綿結合ペプチド／ポリ（ベンジルメタクリレート）分散剤を有するカーボンブラックインクの洗濯堅牢度耐久性を実証して、それを伝統的アクリレートジブロック共重合体分散剤を有するカーボンブラックインクと比較することであった。
【０２４２】
カーボンブラックインク調合物：
実施例９で述べるびん振盪法を使用して、カーボンブラックインク分散体を調製した。インク調合物の詳細は表１５に述べる。実施例１３で述べる綿結合ペプチド（ＣＯＴ−７１）／ベンジルメタクリレートジブロック分散剤を使用して、ペプチドベースの分散剤調合物を調製した。ベンジルメタクリレート１３／メタクリル酸１０からなるアクリレートジブロック共重合体を使用して、アクリレートベースの分散剤調合物を調製した。ニュージャージー州ピスカタウェイのデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からのＰｒｉｎｔｅｘ  １５０Ｔカーボンブラック顔料を使用して、分散体を作成した。砂（０．５ｇ）を研磨材媒体として全体で使用した。
【０２４３】
【表２０】
2007508246.tif 000022
【０２４４】
カーボンブラックインクの洗濯堅牢度耐久性試験：
金属ローラーを使用してカーボンブラックインクを１０ｃｍ×１０ｃｍ四角い綿布帛に塗布し、一晩乾燥させた。次にＡＡＴＣＣ試験方法６１−１９９６を使用して、洗剤なしの冷水洗浄ステップ後、または加熱プラテン間での１６０℃で２ｍｉｎのヒートセットとそれに続く洗剤なしの冷水洗浄ステップ後に、それらを試験した。ΔＥ値を実施例１２で述べるようにして測定し、表１６に示す。結果は、ペプチドベースの分散剤を有するカーボンブラックインクの洗濯堅牢度耐久性が、アクリレートベースの分散剤を有するインクと比較できることを示唆する。
【０２４５】
【表２１】
2007508246.tif 000023
【０２４６】
実施例１５
カーボンブラック結合ペプチド／ペプチドリンカー／セルロース結合ペプチドトリブロック分散剤の調製
この実施例の目的は、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して、カーボンブラック顔料結合ペプチド、親水性ペプチドリンカー、およびセルロース結合ペプチドからなるトリブロックタンパク質分散剤を調製することであった。
【０２４７】
デザインされたトリブロック分散剤は、ＣＢ−７２（配列番号６）／ＳＴ−リンカー／ＣＥＬ−１２１（配列番号３７）の構造を有する。ＳＴ−リンカーは、配列番号４５によって示される配列を有する、植物病原体菌・カビアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のセロビオヒドロラーゼＩの天然ドメイン間リンカーである。
【０２４８】
ＴＢＰ１遺伝子のデザインおよび合成：
ＴＢＰ１と称される合成遺伝子を製作するために、ＣＢ−７２（配列番号６）／ＳＴ−リンカー／ＣＥＬ−１２１（配列番号３７）トリブロックタンパク質分散剤を生成するために、テキサス州ウッドランドのシグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ））によって表１７に列挙するオリゴヌクレオチドが合成された。
【０２４９】
【表２２】
2007508246.tif 000024
【０２５０】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、各オリゴヌクレオチドをＡＴＰでリン酸化した。得られたオリゴヌクレオチドを混合し、５ｍｉｎ煮沸して、次に緩慢に室温に冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドをＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートして、配列番号５２として示されるＣＢ−７２／ＳＴ−リンカー／ＣＥＬ−１２１トリブロックタンパク質分散剤をコードする、配列番号５１として示される合成ＤＮＡ断片ＴＢＰ１を得た。
【０２５１】
ｐＩＮＫ１発現プラスミドの構築：
タンパク質の過剰発現のために、ＴＢＰ１をカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））からのゲートウェイ（商標）技術システムに組み入れた。第１のステップでは５０μＬのＰＣＲ反応中で、２μＬのＴＢＰ１ライゲーション混合物を使用した。標準ＰＣＲプロトコルに従って、カリフォルニア州ラホヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって反応を触媒した。ＴＢＰ１断片の増幅のために、配列番号５３として示されるプライマー５’ＴＢＰ１（５’−ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  Ｔ−３’）、および配列番号５４として示されるプライマー３’ＴＢＰ１（５’−ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ−３’）を使用した。これらのプライマーのデザインのために、増幅された断片の５’および３’末端に、追加的配列ＣＡＣＣおよび別の停止コドンＴＧＡを付加した。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＥＮＴＲ方向性ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを使用して、増幅したＴＢＰ１をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター内に直接クローンし、ゲートウェイエントリープラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１を得た。このエントリープラスミドをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのワンショット（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ）ＴＯＰＯ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で増殖させた。ＰＣＲ増幅およびクローニングの正確さは、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）配列決定設備でＤＮＡ配列決定によって判定した。最後にエントリープラスミドをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＬＲクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）（商標）によって、ＬＲ遺伝子組換え反応を触媒した。目的プラスミドｐＩＮＫ１を構築し、ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で増殖させた。遺伝子組換え反応の正確さをＤＮＡ配列決定によって判定した。ＬＲ遺伝子組換え反応のためのあらゆる試薬は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のゲートウェイ（商標）技術大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現システムキット中で提供された。上述の全プロセスは、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書に従った。
【０２５２】
目的プラスミドｐＩＮＫ１は、配列番号５５として示される組換えタンパク質６Ｈ−ＴＢＰ１のためのコード領域を含有し、それは１１．６ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質の配列は６ｘＨｉｓタグおよびＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識部位を含む。このＮ−末端配列に続いて、６Ｈ−ＴＢＰ１は、配列番号５２として示される、ＣＢ−７２／ＳＴ−リンカー／ＣＥＬ−１２１の構造を有するトリブロックタンパク質ＴＢＰ１を含有する。ＴＢＰ１は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ処理によって６Ｈ−ＩＮＫ１から放出できる。
【０２５３】
６Ｈ−ＴＢＰ１タンパク質の生成：
発現プラスミドｐＩＮＫ１をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１−ＡＩ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。組換えタンパク質を生成するために、５０ｍＬのＬＢ−カルベニシリンブロス（１０ｇ／Ｌバクト−トリプトン、５ｇ／Ｌバクト−酵母抽出物、１０ｇ／ＬＮａＣｌ、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン、ｐＨ７．０）に、形質転換された細菌の１個のコロニーを接種して、ＯＤ６００が０．６に達するまで培養物を３７℃で振盪した。培養物に０．５ｍＬの２０％Ｌ−アラビノースを添加して振盪をさらに４ｈ継続し、発現を誘導した。培養物を１０，０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心処理して、およそ０．１５ｇの細菌を収集した。
【０２５４】
シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含有するミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ））からの４ｍＬのセリテック（Ｃｅｌｌｙｔｉｃ）Ｂ−細菌細胞溶解／抽出試薬中に、収集した細菌を懸濁させた。室温で３０ｍｉｎのインキュベーション中に、細菌細胞を溶解させた。可溶性および不溶性の画分を４℃で１０，０００×ｇにおいて１５ｍｉｎの遠心分離によって分離した。不溶性の画分を５ｍＬの溶解緩衝液（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解した。可溶性画分および溶解した不溶性画分のアリコート（１３μＬ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、得られたゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０で染色した。電気泳動の結果を図１Ａに示し、ここではレーンＩおよびＳはそれぞ不溶性画分および可溶性画分を示す。これらの結果は、タンパク質６Ｈ−ＴＢＰ１が、不溶性の画分中で発現したことを示唆する（図１ＡのレーンＳおよびＩ参照）。
【０２５５】
組換えタンパク質を精製するために、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）からの１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂を添加して不溶性の画分を溶解し、室温で１ｈ混合した。混合物をカリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））からのガラスエコノ−カラム、０．５ｃｍ×５ｃｍに装入した。液相を重力によりＮｉ−ＮＴＡ樹脂に流してＦＴ画分として収集した。次にカラムをそれぞれ６Ｍ、４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、および０Ｍの尿素を含有する溶解緩衝液の２ｍＬの部分で逐次洗浄した。洗浄プロセス中の尿素濃度の段階的な低下により、組換えタンパク質のいくらかは再生しているかもしれない。したがって２ｍＬの未変性溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を使用して、タンパク質をカラムから溶出し、未変性タンパク質画分として収集した。３ｍＬの変性溶出緩衝液（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．５）を使用して、残る変性組換えタンパク質をカラムから溶出し、変性タンパク質画分として収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して未変性および変性画分の双方を調べ、結果を図１Ａに示し、そこではレーンＲおよびＤがそれぞれ、再生溶出画分および変性溶出画分を示す。これらの結果は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して６Ｈ−ＴＢＰ１が成功裏に精製されたこと、そしてタンパク質画分のいくらかはカラム上で直接に再生されたことを実証する（図１ＡのレーンＲおよびＤ参照）。各溶出画分中のタンパク質濃度は、カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））からのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイ試薬を使用して判定された。計算により本出願人らは、１Ｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物がおよそ５２ｍｇの精製された６Ｈ−ＴＢＰ１を生じることができると結論づけた。
【０２５６】
実施例１６
サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）マゼンタ結合ペプチド／ペプチドリンカー／ポリ（エチレンテレフタラート）結合ペプチドトリブロック分散剤の調製
この実施例の目的は、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して、サンファスト（Ｓｕｎｆａｓｔ）マゼンタ顔料結合ペプチド、親水性ペプチドリンカー、およびポリ（エチレンテレフタラート）結合ペプチドからなるトリブロックタンパク質分散剤を調製することであった。
【０２５７】
デザインされたトリブロック分散剤は、ＳＭ−１２１（配列番号２０）／ＰＴ−リンカー／ＰＥＴ−１２１（配列番号４０）の構造を有する。ＰＴ−リンカーは細菌セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）のエンドグルカナーゼＡ中の天然ドメイン間リンカーであり、配列番号５６によって示される配列を有する。
【０２５８】
ＴＢＰ２遺伝子のデザインおよび合成：
ＴＢＰ２と称される合成遺伝子を作るため、ＳＭ−１２１（配列番号２０）／ＰＴ−リンカー／ＰＥＴ−１２１（配列番号４０）トリブロックタンパク質分散剤を生成するために、表１８に列挙したオリゴヌクレオチドが、テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ））によって合成された。
【０２５９】
【表２３】
2007508246.tif 000025
【０２６０】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、各オリゴヌクレオチドをＡＴＰでリン酸化した。得られたオリゴヌクレオチドを混合し、５ｍｉｎ煮沸して、次に緩慢に室温に冷却した。最後にアニールしたオリゴヌクレオチドをＴ４ＤＮＡリガーゼにライゲートして、配列番号６３として示されるＳＭ−１２１／ＰＴ−リンカー／ＰＥＴ−１２１トリブロックタンパク質分散剤をコードする、配列番号６２として示される合成ＤＮＡ断片ＴＢＰ２を得た。
【０２６１】
ｐＩＮＫ２発現プラスミドの構築：
実施例１５で述べた手順を使用して、ＴＢＰ２をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのタンパク質過剰発現のためのゲートウェイ（商標）技術システム中に組み入れた。配列番号６４として示されるプライマー５’ＴＢＰ１（５’−ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  Ｔ−３’）、および配列番号６５として示されるプライマー３’ＴＢＰ２（５’−ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＴ  ＧＡ−３’）をＴＢＰ２断片増幅のために使用した。これらのプライマーのデザインのために、追加的配列ＣＡＣＣ、および別の停止コドンＴＧＡを増幅させた断片の５’および３’末端に付加した。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＥＮＴＲ方向性ＴＯＰＯクローニングキットを使用して、増幅されたＴＢＰ２をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに直接クローニングして、ゲートウェイエントリープラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ２を得た。このエントリープラスミドをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのワンショット（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ）ＴＯＰＯ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で増殖させた。ＰＣＲ増幅およびクローニングの正確さをＤＮＡ配列決定によって判定した。最後にエントリープラスミドをｐＤＥＳＴ１７と混合した。ＬＲ遺伝子組換え反応は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＬＲクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）（商標）によって触媒した。目的プラスミドｐＩＮＫ２を構築し、ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で増殖させた。遺伝子組換え反応の正確さをＤＮＡ配列決定によって判定した。ＬＲ遺伝子組換え反応のためのあらゆる試薬は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のゲートウェイ（商標）技術大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現システムキット中で提供された。上述の全プロセスは、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書に従った。
【０２６２】
目的プラスミドｐＩＮＫ２は、配列番号６６として示される組換えタンパク質６Ｈ−ＴＢＰ２のためのコード領域を含有し、それは１０．７ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質の配列は、６ｘＨｉｓタグおよびＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識部位を含み、それは実施例１５で述べたように、６Ｈ−ＴＢＰ１認識部位と同一である。このＮ−末端配列に続いて、６Ｈ−ＴＢＰ２は、ＳＭ−１２１／ＰＴ−リンカー／ＰＥＴ−１２１の構造を有するトリブロックタンパク質ＴＢＰ２を含有する。ＴＢＰ２は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ処理によって６Ｈ−ＴＢＰ２から放出できる。
【０２６３】
６Ｈ−ＴＢＰ２タンパク質の生成：
実施例１５で６Ｈ−ＴＢＰ２タンパク質について述べた手順を使用して、発現プラスミドｐＩＮＫ２をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１−ＡＩ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。
【０２６４】
可溶性画分および溶解した不溶性画分のアリコート（１３μＬ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、得られたゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０で染色した。電気泳動の結果を図１Ｂに示し、ここではレーンＩおよびＳはそれぞ不溶性画分および可溶性画分を示す。これらの結果は、タンパク質６Ｈ−ＴＢＰ２が、不溶性の画分中で発現したことを示唆する（図１ＢのレーンＳおよびＩ参照）。
【０２６５】
実施例１５で述べたようにして、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）からののＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂を使用して組換えタンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して未変性および変性画分の双方を調べ、結果を図１Ｂに示し、そこではレーンＲおよびＤがそれぞれ、再生溶出画分および変性溶出画分を示す。これらの結果は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して６Ｈ−ＴＢＰ２が成功裏に精製されたこと、そしてタンパク質画分のいくらかはカラム上で直接に再生されたことを実証する（図１ＢのレーンＲおよびＤ参照）。各溶出画分中のタンパク質濃度は、カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））からのからのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイ試薬を使用して判定された。計算により本出願人らは、１Ｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物がおよそ４０ｍｇの精製された６Ｈ−ＴＢＰ２を生じることができると結論づけた。
【０２６６】
実施例１７
６Ｈ−ＴＢＰ１および６Ｈ−ＴＢＰ２タンパク質の特性決定
溶解緩衝液中における４℃で一晩の透析によって変性画分中の６Ｈ−ＴＢＰ１（配列番号５５）および６Ｈ−ＴＢＰ２（配列番号６６）組換えタンパク質を再生した。透析の過程において、緩衝液中の尿素濃度を徐々に０に低下させた。再生できなかったタンパク質、および形成した沈殿物を遠心分離によって除去した。最後に、全ての再生組換えタンパク質を合わせてＩＮＫ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２０％グリセロール）中で透析した。
【０２６７】
実施例４で述べたＥＬＩＳＡベース結合アッセイを使用して、これらのタンパク質の結合親和力を判定した。ファージ粒子の代わりに、１μｇの６Ｈ−ＴＢＰ１または６Ｈ−ＴＢＰ２をアッセイで使用した。分析直前にタンパク質溶液を遠心分離して、あらゆる沈殿タンパク質を除去した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｑｈＤ遺伝子の翻訳生成物である５μｇの４２ｋＤａのＣ−末端６ＸＨｉｓ−タグ付き組換えタンパク質（Ｃｔｒｌ−６Ｈ）を対照として使用した。同様の分子量のあらゆるＣ−末端−Ｈｉｓタグ付き組換えタンパク質を対照として使用してもよい。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）からのＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｂの１：２，０００希釈物を第１の抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体の１：１，０００希釈物を第２の抗体として使用して、基材と相互作用するタンパク質を検出した。平行する三連の判定の平均および標準偏差として示されるＥＬＩＳＡアッセイの結果を表１９に要約する。表中の結果に見られるように、ＴＢＰ１およびＴＢＰ２トリブロックタンパク質分散剤はどちらもそれぞれの基材に特異的に結合するが、ＴＢＰ１の基材に対する結合親和力は、ＴＢＰ２の基材に対する結合親和力よりも高い。
【０２６８】
【表２４】
2007508246.tif 000026
【０２６９】
実施例１８
トリブロックペプチド分散剤の性能試験
この予言的実施例の目的は、トリブロックペプチド分散剤の試験について述べることである。トリブロック分散剤は、カーボンブラック結合ペプチド（配列番号６）、ＳＴ−リンカー（配列番号４５）、およびセルロース結合ペプチド（配列番号３７）からなる。
【０２７０】
カーボンブラックインク調合物：
実施例１５で述べるようにして配列番号５２として示されるトリブロックペプチド分散剤を調製し、この実施例の全ての調合物で使用する。実施例９で述べるびん振盪法を使用して、カーボンブラックインク分散体を調製する。３つの異なるインク調合物の詳細は表２０で示す。分散体は、ニュージャージー州ピッスカタウェイのデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からのプリンテックス（Ｐｒｉｎｔｅｘ）１５０Ｔカーボンブラック顔料を使用して作られる。砂（０．５ｇ）を研磨材媒体として使用する。
【０２７１】
【表２５】
2007508246.tif 000027
【０２７２】
トリブロックペプチド分散剤の分散体試験：
実施例９で述べる分散体試験を実施する。調合物１および２は、良好な分散体を与えることが予期される一方、調合物３は良好から非常に良好な分散体を与えることが予期される。
【０２７３】
実施例１９
可溶性トリブロックタンパク質分散剤の調製
実施例１５および１６では、トリブロックタンパク質分散剤を調製する方法を実証した。この実施例の目的は、トリブロックタンパク質分散剤を調製する改善された方法を実証することであった。改善された方法では、コンストラクトｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１を修正して、そのトリブロックタンパク質−コード領域の各要素間に適切な制限部位を追加した。この修正によって、単純な「カットアンドペースト」法による各要素の置換が可能になるので、コンストラクトを適用して、あらゆるペプチドおよびリンカー候補の組み合わせを調製して検査できるようになる。さらにＧＳＴ（グルタチオンＳ−転移酵素）タンパク質を融合パートナーとして使用し、水溶性トリブロックタンパク質分散剤を生成して精製した。
【０２７４】
ｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１の修正：
カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのクイックチェンジ（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）キットを使用して、実施例１５で述べたプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１に部位指向性変異誘発を実施し、リンカーコード配列の始めのユニークなＮｇｏＭＩ部位（ＧＣＣＧＧＣ）、および終わりのＫａｓＩ部位（ＧＧＣＧＣＣ）に付加したので、このプラスミド上のＴＢＰ１コード領域内の各要素は、ユニークな制限酵素消化を通じて、その他のもので置き換えることができる。この手順によってＩＥＧＲ（配列番号１１７）／ＣＢ−７２（配列番号６）：：ＳＴ−リンカー（配列番号４５）：：ＣＥＬ−１２１（配列番号３７）をコードする、配列番号１１６として示されるコード配列を有するゲートウェイエントランスプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１０１が得られる。ＩＥＧＲはＸａ認識部位を表す。コードタンパク質の対応するアミノ酸配列は、配列番号１１８として示される。
【０２７５】
さらにｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１０１内のＳＴリンカー配列は、ＰＴリンカー（配列番号５６）によって置換された。その小さなサイズのために、ＰＴリンカー配列は、直接カットアンドペーストできない。その代わりＰＣＲ反応によって、ｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ２（実施例１６参照）からリンカーコード配列および隣接領域を増幅し、ＮｇｏＭＩおよびＫａｓＩで消化した。得られた断片をｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ１０１に挿入して、以前のリンカー配列を置き換えた。この挿入はゲートウェイエントランスプラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ２０１を形成し、それはＩＥＧＲ（配列番号１１７）／ＣＢ−７２（配列番号６）：：ＰＴ−リンカー（配列番号５６）：：ＣＥＬ−１２１（配列番号３７）をコードする、配列番号１１９として示されるコード配列を有する。コードタンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号１２０として示される。
【０２７６】
実施例１５および１６で述べたバクテリオファージλの部位特異的遺伝子組換えを活用して、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのゲートウェイ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現システムに、修正されたエントリープラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＢＰ２０１中のＴＢＰ構造を導入した。簡単に述べると、０．３μｇのエントリープラスミドＤＮＡ、０．３μｇのｐＤＥＳＴ１５目的プラスミドＤＮＡ、４μＬのコロナーゼ緩衝液、および４μＬのＬＲコロナーゼ混合物を含有する２０μＬの反応中で、２５℃で１ｈ遺伝子組換えを行った。次に４μＬのタンパク質分解酵素Ｋを添加して、反応混合物を３７℃で１０ｍｉｎ加熱した。得られた反応混合物（２μＬ）を使用して、５０μＬのライブラリー効率的ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。形質転換された細胞を５００μＬのＳＯＣ媒体内に回収して、ＬＢ−Ａｍｐ５０プレート上で生育させた。プレート上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを選択し、さらにＬＢ−Ａｍｐブロス内で生育させた。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からのキアプレップ・ミニプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを使用して、発現プラスミドＤＮＡを細胞から単離した。ＤＮＡ配列決定によってコンストラクトを確認した。反応は、配列番号１２１として示される発現プラスミドｐＩＮＫ２５１を作り出した。このプラスミドは、配列番号１２２として示されるＧＳＴ−ＴＢＰ２５１（ＧＳＴ−ＣＢ７２：：ＰＴ−リンカー：：ＣＥＬ−１２１）融合タンパク質をコードする。
【０２７７】
ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質の発現および生化学的特性決定：
極小規模の機能性分析を実施するため、発現プラスミドｐＩＮＫ２５１を小規模に発現させてＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質を精製した。ｐＩＮＫ２５１を発現するために、プラスミドをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１Ａ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。１個の形質転換コロニーを１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ５０ブロス内において３７℃で一晩生育させ、次に一晩生育させた細胞を２０倍容積の新鮮なＬＢ−Ａｍｐ５０に接種して、より大きな規模で再度生育させた。細胞密度がＯＤ６００値０．８〜１．０に達したら、Ｌ−アラビノースを濃度０．２％で培養物に添加して、タンパク質発現を３７℃で４ｈ誘導した。およそ１００μＬの細胞を遠沈して、３０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー内で１０ｍｉｎ沸騰させて溶解した。１０μＬの細胞溶解産物をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質の発現を確認した。
【０２７８】
発現タンパク質を精製するために、２００ｍＬの培養物から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を収集し、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの１５μｇのＤＮａｓｅ  Ｉおよび１００μＬのタンパク質分解酵素阻害剤カクテルを含有する、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの５ｍＬのセルリテテイック（ＣｅｌＬｙｔｉｃ）Ｂ細菌細胞溶解抽出試薬中で室温で３０ｍｉｎ溶解させた。可溶性および不溶性の画分を遠心分離によって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーを双方の画分の部分に添加して、それらのタンパク質プロフィールをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。結果はＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質が完全に可溶性であることを示した。溶解産物をシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの１．５ｍＬグルタチオン−アガロースカラムに装入して、１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するカラムを１０ｍＬのＴＢＳで洗浄した。ＦＳＴ溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、および１０ｍＭ還元グルタチオン）の２ｍＬの部分を使用して、ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質をカラムから４回溶出した。各精製ステップ中のタンパク質プロフィールをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べ、その結果から、溶出された画分中に３３．７ｋＤａのＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質の存在が確認された。精製されたタンパク質をＩＥＢ緩衝液に対して透析し、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイ試薬を使用してタンパク質濃度を判定した。
【０２７９】
ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質の結合活性：
ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質のカーボンブラックおよびセルロースに対する結合活性は、実施例６で述べたＥＬＩＳＡベース結合アッセイを実施して特性決定された。カーボンブラック顔料結合活性の判定のためにデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの７５μｇのカーボンブラックＦＷ−１８を使用する一方、セルロース結合活性の判定のためには１５０μｇのシグマ（Ｓｉｇｍａ）からのシグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）（セルロースタイプ２０）を使用した。アッセイでは、タンパク質が存在しない反応をブランク反応として使用し、４μｇ（およそ０．１ｎｍｏｌ）のＧＳＴを含有する反応が負の対照の役割をした。ＥＬＩＳＡ結果を表２１に提示する。結果からは、ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質がカーボンブラックおよびセルロースの双方に対して、結合活性を有することが確認された。
【０２８０】
【表２６】
2007508246.tif 000028
【０２８１】
実施例２０
ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質の性能試験
ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質の二重結合活性を実証した（実施例１９参照）が、結果はタンパク質が必ずしも顔料分散剤または印刷媒体バインダーのどちらかとして機能できることを実証しない。したがってこの実施例の目的は、ＴＢＰ２５１タンパク質が、カーボンブラックのための分散剤として効果的に機能し、それがセルロースに結合することを実証することであった。
【０２８２】
トリブロックタンパク質ＴＢＰ２５１の調製：
ＴＢＰ２５１タンパク質をＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質から次のようにして切断した。開裂反応では、１０ｍｇのＧＳＴ−ＴＢＰ２５１融合タンパク質を含有するタンパク質溶液に、ドイツ国マンハイムのロッシュ（Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））からの１００μｇのビオチン標識制限プロテアーゼ因子Ｘａを添加して、反応混合物を４℃で１８ｈインキュベートした。反応からは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定されるように、ビオチン標識因子Ｘａおよび混合物中のわずかな非切断ＧＳＴ−ＴＢＰ２５１タンパク質と共に、４．８７ｋＤａのＴＢＰ２５１タンパク質および２８．９ｋＤａのＧＳＴ融合パートナーがもたらされた。混合物をグルタチオン−アガロースカラムに２回通過させて、ＴＢＰ２５１タンパク質を反応混合物から精製し、続いてマサチューセッツ州ビルリカのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））からのセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）（登録商標）−３，０００遠心フィルター装置を使用して、分子濾過を行った。
【０２８３】
ＴＢＰ２５１によるカーボンブラック顔料分散体の極小規模アッセイ：
ＴＢＰ２５１タンパク質が、カーボンブラック顔料分散体を安定化することを実証するために、標準分散体試験を模倣する極小規模分散体アッセイを開発した。このアッセイでは、１０μＬのＩＥＢ緩衝液中にデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの５０μｇのカーボンブラックＦＷ−１８および３μｇ（０．６ｎｍｏｌ）のＴＢＰ２５１タンパク質を含んだ、１０μＬの分散体反応混合物を調製した。素早い穏やかな混合後、５μＬの混合物をペンシルベニア州メディアの（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｅｄｉａ、ＰＡ））からの１片のマイクロスライドガラスに滴下した。ガラススライドを２ｍｉｎ静置してから顔料分散を観察した。結果を図２Ａに示す。図に示すように、カーボンブラック顔料は、ＴＢＰ２５１タンパク質を添加すると微細に分散する。比較のために４２μｇ（０．６ｎｍｏｌ）のＢＳＡ、および緩衝液（タンパク質なし）も使用して分散体試験を行った。図２Ａに示すように、これらの混合物はどちらもカーボンブラック顔料の凝集を示した。この実施例で実証した分散体は強い物理的力を必要としないので、ＴＢＰ２５１とカーボンブラックの間の相互作用は、顔料の自己分散を仲介するのに十分強力なようである。これは現行の最先端技術の共重合体ベースの分散剤が提供しない特性である。
【０２８４】
分散体試験はまた、分散体混合物中でＴＢＰ２５１に代えて１８μｇ（０．６ｎｍｏｌ）のＧＳＴを使用して行った。図２Ａに示すように、ＧＳＴはカーボンブラック顔料分散剤としても機能した。ＧＳＴは、カーボンブラック結合ペプチドまたは結合領域を含有しない天然タンパク質であるので、ＧＳＴの分散体機能は、ＴＢＰ２５１と異なる機序を有することが提案された。これを実証するために、カーボンブラック分散体の競合試験を行った。顔料分散体がより簡単に逆転できるように、上述の分散試験と比べて、競合混合物はグリセロールを含有せず、はるかに少ないタンパク質を含有した。したがってデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの６０μｇのカーボンブラックＦＷ−１８を０．４２μｇ（０．１ｎｍｏｌ）のＴＢＰ２５１タンパク質を含有する１３μＬのＩＥＢ緩衝液（グリセロールを含有しない）と穏やかに混合した。混合物（５μＬ）を１片のマイクロスライドガラスに滴下して、それを２ｍｉｎ静置してから顔料分散を観察した。結果は、カーボンブラック顔料を混合物中に分散するために、より少ない量のＴＢＰ２５１タンパク質で十分であることを示唆した。カリフォルニア州のダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた０．６μｇ（０．６６ｎｍｏｌ）の合成ＣＢ−７２ペプチド（配列番号６）もまた混合物に含めると、過剰量の競合ペプチドがＴＢＰ２５１の分散機能をブロックして、混合物中に顔料の凝集がもたらされる（図２Ｂ）。同一レベルの凝集は、０．６μｇ（０．６６ｎｍｏｌ）の合成ＣＢ−７２ペプチドを含有するがＴＢＰ２５１タンパク質を欠く負の対照混合物でも観察された（図２Ｂ）。これらの競合結果は、ＣＢ−７２ペプチド配列のカーボンブラック結合活性が、ＴＢＰ２５１タンパク質の顔料分散機序に直接関与することを実証する。ＴＢＰ２５１の代わりに２．５２μｇ（０．１ｎｍｏｌ）のＧＳＴを使用して同一競合試験を行うと、ＣＢ−７２ペプチドはＧＳＴの分散機能をブロックできなかった（図２Ｃ）。この結果は、ＧＳＴによる顔料分散がＣＢ−７２ペプチドの特異的活性に依存せず、したがって異なる機序を有することを示唆した。競合試験混合物はグリセロールを欠いていたことから、カーボンブラック顔料の凝集（図２Ｂおよび２Ｃ）は、最初の分散試験におけるよりも大きかった（図２Ａ）。
【０２８５】
ＴＢＰ２５１によって媒介される印刷媒体表面への顔料接着性の極小規模アッセイ：
ＴＢＰ２５１タンパク質が、カーボンブラック顔料を印刷媒体表面に付着できることを実証するため、標準洗濯堅牢度耐久性試験を模擬する極小規模アッセイを開発した。このアッセイでは、１２μｇ（２．５ｎｍｏｌ）のＴＢＰ２５１タンパク質を含有する４０μＬのＩＥＢ緩衝液に、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの２００μｇのカーボンブラックＦＷ−１８を添加した。２つの負の対照混合物、７２μｇ（２．５ｎｍｏｌ）のＧＳＴおよび１６８μｇ（２．５ｎｍｏｌ）のＢＳＡをＴＢＰ２５１の代わりに使用した。室温で２０ｍｉｎのインキュベーション後、５μＬの混合物をニュージャージー州クリフトンのワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ（Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ））からの１片のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）５濾紙に滴下した。その優れた水吸収能力のために、紙は水を迅速に吸収してカーボンブラックが表面に残り、紙表面と顔料−タンパク質複合体の間で、直接相互作用できるようになった。次に紙を１０ｍＬのＴＢＳＴに入れて激しく振盪しながら２ｍｉｎ洗浄した。結果は図３Ａに示すように、混合物がＴＢＰ２５１を含む場合、紙表面にカーボンブラックが付着するが、ＧＳＴまたはＢＳＡを使用した場合は付着しないことを示した。印刷媒体として綿１００％布帛を使用して試験を繰りしたところ同一結果が得られた（図３Ｂ）。綿布帛上の繊維間の大きな空間によって、多くの顔料は表面に留まらず透過したためにシグナルはより弱かったが、ＴＢＰ２５１が綿布帛表面への顔料の付着を強化したのに対し、ＧＳＴおよびＢＳＡは強化しなかったことは明らかであった。したがってＴＢＰ２５１は確かに印刷媒体バインダーとして機能し、カーボンブラック顔料をセルロース含有布帛に付着する。
【０２８６】
ＴＢＰ２５１タンパク質のデザインに従って、ＣＢ−７２配列はカーボンブラックと相互作用し、ＣＥＬ−１２１配列はセルロース含有印刷媒体と相互作用する。カーボンブラック結合活性およびセルロース結合活性のどちらもＴＢＰ２５１のバインダーとしての機能に貢献する。これを直接実証するために、紙付着に対する競合試験を開発した。カーボンブラック結合競合試験では、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの５０μｇのカーボンブラックＦＷ−１８を７．５μｇ（８．２ｎｍｏｌ）の合成ＣＢ−７２ペプチドを含有する５μＬのＩＥＢ緩衝液と室温で１０ｍｉｎ混合した。次に３μｇ（０．６１ｎｍｏｌ）のＴＢＰ２５１タンパク質を含有する１０μＬのＩＥＢ緩衝液を混合物に添加した。室温で２０ｍｉｎのインキュベーション後、５μＬの混合物を１片のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）５濾紙に滴下した。紙を１０ｍＬのＴＢＳＴに入れて、激しく振盪しながら２ｍｉｎ洗浄した。カーボンブラックの紙への付着を洗浄前後に観察した。
【０２８７】
印刷媒体結合競合がある試験では、１５μＬのＩＥＢ緩衝液中で、特定の順序に従うのでなく、カーボンブラックを１１μｇ（８．２ｎｍｏｌ）の合成ＣＥＬ−１２１ペプチドおよび３μｇ（０．６１ｎｍｏｌ）のＴＢＰ２５１タンパク質の双方と同時に混合した。
【０２８８】
双方の競合試験の結果を図３Ｃに示す。競合なしの混合物は、対照の役割をする。これらの結果は、遊離ＣＢ−７２およびＣＥＬ−１２１ペプチドが、カーボンブラック顔料のための印刷媒体バインダーとしてのＴＢＰ２５１の機能を少なくとも部分的にブロックできることを実証する。したがってＴＢＰ２５１タンパク質はカーボンブラック−およびセルロース結合活性を有し、カーボンブラック顔料を分散して、顔料をセルロース−含有する印刷媒体に付着する機能をする。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】組換えトリブロックタンパク質分散剤（Ａ）６Ｈ−ＴＢＰ１および（Ｂ）６Ｈ−ＴＢＰ２の精製からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル画像である。
【図２】トリブロックタンパク質ＴＢＰ２５１によるカーボンブラック顔料分散の結果を示す。
【図３】トリブロックタンパク質ＴＢＰ２５１によって媒介される顔料接着性試験の結果を示す。
【図１】
2007508246.tif 000029
【図２】
2007508246.tif 000030
【図３】
2007508246.tif 000031
【配列表】
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【国際調査報告】
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