(57)【要約】  （＋）鎖および相補的（−）鎖を有するｎ塩基対の二本鎖ポリヌクレオチド配列（マスター配列）の突然変異誘導のための方法であって、（ｉ）マスター配列の（＋）鎖の一本鎖断片のコレクションの作製、ここで、該コレクションのすべてのメンバーは同じ５’末端を有し、かつコレクションがｎ−１、ｎ−２、ｎ−３、・・・（以下続く）ヌクレオチドの鎖長を有する（＋）鎖となるように３’末端において欠失を有する；（ｉｉ）ステップ（ｉ）で作製した（＋）鎖の３’末端での、少なくとも１つの共通または縮重ヌクレオチドの導入；（ｉｉｉ）（−）鎖またはその断片を伸長のための鋳型鎖として用いる、ステップ（ｉｉ）で作製した（＋）鎖のマスター配列全長までの伸長；（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で作製した（＋）鎖を鋳型鎖として用いることによる（−）鎖の合成、これによりマスター配列との比較において、前出の共通または縮重ヌクレオチドの位置で（−）鎖中に突然変異をもたらす、の各ステップを含んでなる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）鎖および相補的（−）鎖を有するｎ塩基対の二本鎖ポリヌクレオチド配列（マスター配列）の突然変異誘導のための方法であって、以下のステップ：
（ｉ）  マスター配列の（＋）鎖の一本鎖断片のコレクションの作製、ここで、該コレクションのすべてのメンバーは同じ５’末端を有し、かつコレクションがｎ−１、ｎ−２、ｎ−３、・・・（以下続く）ヌクレオチドの鎖長を有する（＋）鎖となるように３’末端において欠失を有する；
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）で作製した（＋）鎖の３’末端での、少なくとも１つの共通または縮重ヌクレオチドの導入；
（ｉｉｉ）  （−）鎖またはその断片を伸長のための鋳型鎖として用いる、ステップ（ｉｉ）で作製した（＋）鎖のマスター配列全長までの伸長；
（ｉｖ）  ステップ（ｉｉｉ）で作製した（＋）鎖を鋳型鎖として用いることによる（−）鎖の合成、これによりマスター配列との比較において、前出の共通または縮重ヌクレオチドの位置で（−）鎖中に突然変異をもたらす、
を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｉ）の一本鎖断片のコレクションを、ヌクレオチドアナログの取り込み、およびそれに続くアルカリまたは酸溶液中での切断により作製する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヌクレオチドアナログがα−ホスホチオエートヌクレオチドであり、酸化的切断をホスホチオエート結合においてヨウ素により行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉ）が、ステップ（ｉ）で作製した一本鎖断片のコレクションの、酵素的もしくは化学的方法による共通塩基または縮重塩基を用いた伸長を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを伸長のために用いる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
デオキシイノシン、３−ニトロピロール、５−ニトロインドールまたは無差別な塩基対形成特性を有するヌクレオチドアナログをステップ（ｉｉ）において共通ヌクレオチドとして用いる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン（Ｋ）、Ｎ６−メトキシ−アミノプリン（Ｚ）、ヒドロキシルアミノプリン（ＨＡＰ）、２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｙＴＰ）、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミドール［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ）、Ｎ４−アミノシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン、Ｎ４−メトキシ−２’−デオキシシチジン、８−オキソデオキシ−グアノシン三リン酸（８−ｏｘｏ−Ｇ）または無差別な塩基対形成特性を有するヌクレオチドアナログをステップ（ｉｉ）において縮重ヌクレオチドとして用いる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下の一般式のオリゴヌクレオチド：
ｐ(Ｕ)ａ(Ｎ)ｂ＊(Ｓ)ｃ[ＴＥＲＭ]
（ｐ＝５’−リン酸もしくはヒドロキシル基またはジエステル結合を形成可能ないずれかの化学基
Ｕ＝共通または縮重塩基
ａ＝０〜１００００のうちの任意の整数
Ｎ＝４種類の塩基（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ（標準ヌクレオチド））の混合
ｂ＝０〜１００のうちの任意の整数
＊＝ホスホチオエートヌクレオチド中のホスホチオエート結合のような切断可能な基
Ｓ＝標準ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
ｃ＝０〜１００のうちの任意の整数
[ＴＥＲＭ]＝ダイ・ターミネーターまたはオリゴヌクレオチドの伸長を阻害するいずれかの基
ただし、ａ＋ｂ＞０）
を、ステップ（ｉ）で作製した一本鎖断片のコレクションに対して共通または縮重塩基を導入するためにステップ（ｉｉ）において用いる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
突然変異誘導されたポリヌクレオチド配列のコレクション中に、
（ａ）終止コドンおよび／または
（ｂ）二次構造を乱すアミノ酸
を含めないように前記オリゴヌクレオチドを設計する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
突然変異誘導されたポリヌクレオチド配列のコレクション中に、
（ａ）トランジション変異または
（ｂ）トランスバージョン変異
をもたらすように前記オリゴヌクレオチドを設計する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）で作製した一本鎖断片のうち前記オリゴヌクレオチドとライゲーションしていないものを、エキソヌクレアーゼを用いて除去する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉｉ）での伸長をＰＣＲ反応により行う、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉｉｉ）が、マスター配列の（＋）鎖の下流にアニーリングするプライマーを用いた、マスター配列を有する二本鎖プラスミドからの（−）一本鎖プラスミドポリヌクレオチド配列の合成、ならびに当該（−）ｓｓ−プラスミドポリヌクレオチド配列とステップ（ｉｉ）で作製した（＋）鎖とのアニーリング、および（＋）鎖の伸長、を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉｉ）が、ウラシルおよび標準ヌクレオチドの存在下での、マスター配列の（＋）鎖の下流にアニーリングするプライマーを用いた、マスター配列を有する（−）一本鎖プラスミドの合成、およびステップ（ｉｉ）で作製した（＋）鎖の伸長後に、ウラシルを有する（−）一本鎖プラスミドを、ウラシルグリコシラーゼを用いて消化すること、を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉｉｉ）で作製した（＋）鎖に対して相補的な（−）鎖を合成するために、ステップ（ｉｉｉ）の後にＰＣＲ増幅を用い、それにより突然変異を有する二本鎖マスター配列をもたらす、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列飽和突然変異誘導（ＳｅＳａＭ）の方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
事実上ダーウィンの進化論に触発されて、われわれのニーズに合ったタンパク質を作製するため、および構造−機能連関を明らかにするために、ランダム突然変異導入法が開発されてきた（１）。遺伝子レベルでの差異の作出は、遺伝子シャッフリングの代替ツールであり、なぜならそれが、バイオテクノロジーの方法において自然界とは異なる環境にタンパク質を適合させるための新規な突然変異を導入する機会を作り出すものだからである。完全にランダム化したライブラリーの配列の広がりは、元来、生理的条件下での機能についての前選別により制限されることはない。遺伝子シャッフリング実験で用いる親遺伝子は、生理的条件下での機能について、自然進化により最適化されている。
【０００３】
ランダム突然変異誘導法の中では、遺伝子の不正確な増幅に基づくエラー・プローンＰＣＲ法が、その簡便性および汎用性から、最もよく用いられる。エラー・プローンＰＣＲ法は３つのカテゴリーに分けることができる：Ａ）ヌクレオチド濃度のバランスを崩すことおよび／または塩化マンガンの添加により、ポリメラーゼのフィデリティーを低下させる方法（２〜４）、Ｂ）ヌクレオチドアナログを用いる方法（５、６）、およびＣ）複合法（ＡおよびＢ；（７））である。
【非特許文献１】Arnold, F.H., Wintrode, P.L., Miyazaki, K. および Gershenson, A. (2001) Trends Biochem. Sci., 26, 100-106.
【非特許文献２】Cadwell, R.C. および Joyce, G.F. (1994) PCR Meth. App., 3, 136-140.
【非特許文献３】Lin-Goerke, J.L., Robbins, D.J. および Burczak, J.D. (1997) Biotechniques, 23, 409-412.
【非特許文献４】Cadwell, R.C. および Joyce, G.F. (1992) PCR Meth. Appl., 2, 28-33.
【非特許文献５】Kuipers, O.P. (1996) Meth. Mol. Biol., 57, 351-356.
【非特許文献６】Zaccolo, M., Williams, D.M., Brown, D.M. および Gherardi, E. (1996) J. Mol. Biol., 255, 589-603.
【非特許文献７】Xu, H., Petersen, E.I., Petersen, S.B. および el-Gewely, M.R. (1999) Biotechniques, 27, 1102-1108.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、（＋）鎖および相補的（−）鎖を有するｎ塩基対の二本鎖ポリヌクレオチド配列（マスター配列）の突然変異誘導のための方法であって、以下のステップ：
（ｉ）  マスター配列の（＋）鎖の一本鎖断片のコレクションの作製、ここで、該コレクションのすべてのメンバーは同じ５’末端を有し、かつコレクションがｎ−１、ｎ−２、ｎ−３、・・・（以下続く）ヌクレオチドの鎖長を有する（＋）鎖となるように３’末端において欠失を有する；
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）で作製した（＋）鎖の３’末端での、少なくとも１つの共通ヌクレオチドまたは縮重ヌクレオチドの導入；
（ｉｉｉ）  （−）鎖またはその断片を伸長のための鋳型鎖として用いる、ステップ（ｉｉ）で作製した（＋）鎖のマスター配列全長までの伸長；
（ｉｖ）  ステップ（ｉｉｉ）で作製した（＋）鎖を鋳型鎖として用いることによる（−）鎖の合成、これによりマスター配列との比較において、前出の共通ヌクレオチドまたは縮重ヌクレオチドの位置で（−）鎖中に突然変異をもたらす、
を含んでなる方法に関する。
【０００５】
共通（universal）ヌクレオチドとは、４種類すべての標準ヌクレオチドとペアになることができるヌクレオチドである。例えば、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）は、ポリヌクレオチド鎖中に取り込まれた場合、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンとの塩基対形成が可能である。
【０００６】
好ましい共通ヌクレオチドは、デオキシイノシン、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールである。
【０００７】
縮重（degenerate）ヌクレオチドとは、４種類すべてに満たない標準ヌクレオチドとペアになることができるヌクレオチドである。好ましい縮重ヌクレオチドは、Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン（Ｋ）、Ｎ６−メトキシ−アミノプリン（Ｚ）、ヒドロキシルアミノプリン（ＨＡＰ）、２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｙＴＰ）、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミドール［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ）、Ｎ４−アミノシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン、Ｎ４−メトキシ−２’−デオキシシチジンおよび８−オキソデオキシグアノシン三リン酸（８−ｏｘｏ−Ｇ）である。
【０００８】
無差別な塩基対形成特性を有するヌクレオチドアナログとは、プリンまたはピリミジン構造（例えばＡ，Ｇ、Ｃ、Ｔ）に基づいて、その官能基のうち１以上が修飾されているヌクレオチドが、２種類以上の他のヌクレオチドと（例えば２、３または４種類のヌクレオチドと）塩基対を形成しうることを意味する。また、共通ヌクレオチドおよび縮重ヌクレオチドは、無差別な塩基対形成特性を有するヌクレオチドアナログという語句に包含される。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態は、上記の方法であって、以下の一般式のオリゴヌクレオチド：
ｐ(Ｕ)ａ(Ｎ)ｂ＊(Ｓ)ｃ[ＴＥＲＭ]
（ｐ＝５’−リン酸もしくはヒドロキシル基またはジエステル結合を形成可能ないずれかの化学基
Ｕ＝共通または縮重塩基
ａ＝０〜１００００、好ましくは１〜１００のうちの任意の整数
Ｎ＝４種類の塩基（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ（標準ヌクレオチド））の混合
ｂ＝０〜１００、好ましくは１〜１０のうちの任意の整数
＊＝ホスホチオエートヌクレオチド中のホスホチオエート結合のような切断可能な基
Ｓ＝標準ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
ｃ＝０〜１００、好ましくは１〜１０のうちの任意の整数
[ＴＥＲＭ]＝ダイ・ターミネーターまたはオリゴヌクレオチドの伸長を阻害するいずれかの基
ただし、ａ＋ｂ＞０、好ましくは＞１、より好ましくは＞２）
を、ステップ（ｉ）で作製した一本鎖断片のコレクションに対して共通または縮重塩基を導入するためにステップ（ｉｉ）において用いる方法である。
【００１０】
[ＴＥＲＭ]は上述のオリゴヌクレオチドの伸長を阻害するいずれの基であってもよく、好ましくは水素またはダイ・ターミネーターである。好ましいダイ・ターミネーターは、クマリン、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、フルオレセイン−ｄＴ、ＪＯＥ、オレゴングリーン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはテキサスレッド−Ｘである。
【００１１】
本発明の別の好ましい実施形態は、ステップ（ｉ）に従ったマスター配列の（＋）鎖の一本鎖断片のコレクションの作製であって、α−ホスホチオエートヌクレオチド、好ましくはｄＡＴＰαＳ、ｄＧＴＰαＳ、ｄＴＴＰαＳ、ｄＣＴＰαＳをＰＣＲ産物に取り込ませること、およびそれに続くアルカリ条件下でのヨウ素によるホスホチオエート結合の切断によるものである。
【００１２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態は、ステップ（ｉｉｉ）についての以下のプロセスである：マスター配列を有する二本鎖プラスミドから出発して、マスター配列の（＋）鎖の下流にアニーリングするプライマーを用いて、（−）一本鎖プラスミドポリヌクレオチド配列を合成する。この（−）一本鎖プラスミドポリヌクレオチド配列を、ステップ（ｉｉ）で作製した（＋）鎖とアニーリングさせる。（−）鎖を鋳型として用いて、（＋）鎖をマスター配列の全長まで伸長させる。このプロセスは図３に示してある。
【００１３】
さらなる好ましい実施形態は、特許請求の範囲において開示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ステップ（ｉ）：鎖長分布を有するＤＮＡ断片プールの作製
最初のステップでは、標準ヌクレオチドおよびα−ホスホチオエートヌクレオチドの両者の存在下で、ビオチン化フォワードプライマーおよび非ビオチン化リバースプライマーを用いてＰＣＲを行う。α−ホスホチオエートヌクレオチドは、α−リン酸の酸素原子が硫黄原子に置換されていること以外は通常のヌクレオチドと同様である。ホスホチオエート結合は、アルカリ条件中でのヨウ素切断に感受性である。ＤＮＡ中のホスホチオエートのランダムな分布により、個々のすべての塩基で停止した断片よりなるライブラリーが１回のＰＣＲで作られる。２本の相補鎖間の結合が強ければ、ニックも形成されうる。ビオチン化断片は、ストレプトアビジンでコートした生体磁気ビーズを用いて単離する。ＤＮＡ融解溶液（０．１Ｍ ＮａＯＨ）を、その後、ビオチン化されていない鎖および所望でない断片を除去するのに用いる。ビオチン化断片は、０．１％ＳＤＳ溶液中で煮沸することにより生体磁気ビーズから容易に遊離させることができる。最初のステップの概略図を図１ａに示し、対応する実験データを図１ｂに示す。
【００１５】
ステップ（ｉｉ）：酵素的伸長
共通塩基または縮重塩基を用いてＤＮＡ断片を伸長するために（図２）、２つのアプローチを用いることができる。第１のアプローチでは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを、３’末端にあいまいな塩基（共通塩基または縮重塩基）を取り込ませるために用いる。第２のアプローチでは、ＤＮＡ断片と「特別」オリゴとの間での一本鎖ＤＮＡライゲーションが必要である。ライゲーションを容易にするために、この「特別」オリゴを５’−リン酸化する。これには、分子内および分子間ライゲーションが起こらないようにするため、ならびに取り込みを定量するためにフルオレセインを末端に付す。このオリゴ中には３つの異なる部分がある：１）共通塩基または縮重塩基を有する「変異性部分」、２）３塩基からなる「接着部分」（オリゴ合成で等モル濃度のＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃを用いることにより６４通りすべての可能性を包含する）。この部分は全長遺伝子合成のために用いる次のＰＣＲでのアニーリングを助けることを意図するものである。「余剰部分」は、ホスホチオエート結合（ヨウ素法による切断を可能にする）を介して「接着部分」に連結させる。ｓｓＤＮＡライゲーションは、ＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅ ＲＮＡリガーゼＩＩ（Prokaria）を用いて行うことができる。ＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅ ＲＮＡリガーゼＩＩは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの５’−リン酸と３’−ヒドロキシ末端との間のホスホジエステル結合の、ＡＴＰ依存的な分子内および分子間形成を触媒する。この酵素は、好熱性ユウバクテリア（ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓに感染する好熱性ファージＴＳ２１２６に由来する。この熱安定性酵素は、バクテリオファージＴ４に由来するＲＮＡリガーゼと相同である。これは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼと比較して、ｓｓＤＮＡライゲーションにおいて優れた効率を示す。ライゲーション効率は、フルオレセイン標識オリゴを一本鎖ＤＮＡ鋳型にライゲーションさせることにより測定した。ライゲーション後、「余剰部分」はアルカリ条件中でのヨウ素切断により除去する。
【００１６】
ステップ（ｉｉｉ）：全長遺伝子合成
第３のステップは、伸長した断片を全長までのばすことである（図３）。ここでは、野生型の増幅を回避するために一本鎖鋳型を用いる。一本鎖鋳型はリバースプライマーを用いて合成する。メチル化およびヘミメチル化親遺伝子は、ＤｐｎＩ消化により除去する。この手順は、変異性プライマーのペアでなく片方のみ非変異性プライマーを用いること以外は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘導（Stratagene）と同様である。伸長した断片は、相補性により一本鎖鋳型とアニーリングし、一本鎖を全長までのばす。このＰＣＲ反応中に存在するリバースプライマーは、新規に合成された全長一本鎖にのみアニーリングすることができ、一本鎖鋳型にはアニーリングしない。リバースプライマーの結合後、二本鎖全長遺伝子が合成されるであろう。二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖にヌクレオチドアナログを含み、他方には標準ヌクレオチドを含むであろう。  
一本鎖のものではなく二本鎖の鋳型をこのＰＣＲで用いる場合には、リバースプライマーはその相補的鋳型鎖に結合し、ヌクレオチドアナログを含まない二本鎖ＤＮＡが増幅されるであろう。
【００１７】
ステップ（ｉｖ）：ヌクレオチド置換
最後のＰＣＲでは、ヌクレオチドアナログを標準ヌクレオチドと置換するために、ヌクレオチドアナログ含有鎖を鋳型として用いる（図４）。制限酵素消化後、変異の入った遺伝子を好適な発現ベクターにクローニングし、形質転換して大腸菌中で発現させる。ランダムに選択したクローンを拾い、小さな培養チューブ中で増殖させた（５ｍｌ；ＬＢａｍｐ）。単離したプラスミドＤＮＡを次に配列決定する。１００クローンについての試験的な配列決定の結果は適正な置換を証明し、イノシンに対して予想される偏りを示した（図５および図６）。
【００１８】
ＳｅＳａＭ法を用いた変異体ライブラリーの作製は、１〜２日間以内に完了する。ＳｅＳａＭ法は以下の利点を提供する：
１）  配列中のそれぞれの位置全部を、２０種類すべての可能な天然に存在するアミノ酸で飽和（saturate）させることが可能である。  
２）  完全に共通な塩基を用いれば、変異スペクトルには偏りがない。  
３）  トランジション（塩基転位）好性またはトランスバージョン（塩基転換）好性縮重塩基を用いて変異スペクトルを操作することが可能である。  
４）  適正な特別オリゴを設計することで、突然変異領域の長さが制御可能である。  
５）  Ｓｐ−ｄＡＴＰαＳ／Ｓｐ−ｄＴＴＰαＳ／Ｓｐ−ｄＧＴＰαＳ／Ｓｐ−ｄＣＴＰαＳまたはそれらの組み合わせを用いることにより、断片サイズ分布を制御することができる。
【実施例】
【００１９】
材料および方法
用いたすべての試薬は、分析用試薬グレードまたはより高品質のものであり、Sigma-Aldrich Chemie GmbH(Taufkirchen, Germany)、Applichem GmbH(Darmstadt, Germany)またはCarl Roth GmbH +Co(Karlsruhe, Germany)から購入した。ｐＥＧＦＰプラスミドは、BD Biosciences(Heidelberg, Germany)から購入した。
【００２０】
サーマルサイクラー（Mastercycler gradient; Eppendorf, Hamburg, Germany）および薄壁ＰＣＲチューブ（Multi-Ultraチューブ；０．２ｍｌ；Carl Roth GmbH +Co., Karlsruhe, Germany）をすべてのＰＣＲで用いた。すべてのＰＣＲの反応容量は常に５０μｌとした。
【００２１】
（準備ステップ１）  一本鎖ｐＥＧＦＰ調製：
各ＰＣＲに対して、５ＵのＰｆｕ  Turboポリメラーゼ（Stratagene, Amsterdam, Netherlands）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（New England Biolab, Frankfurt, Germany）、１２．６ｐｍｏｌ  リバースプライマー（５’−ＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧ−３’）および４８．６〜５４．３ｎｇのプラスミドｐＥＧＦＰ（Miniprep, Qiagen, Hilden, Germany）を用いた。ＰＣＲ後（９５℃３０秒間１サイクル、９５℃３０秒間／５５℃１分間／６８℃４分間４０サイクル）、４０ＵのＤｐｎＩを添加し、その後３７℃にて３時間インキュベートした。産物の回収はNucleoSpin Extract（Macherey-Nagel, Duren, Germany；２００μｌのＰＣＲ産物に対して溶出容量３５μｌ）を用いて行った。
【００２２】
（準備ステップ２）  クローニングベクター調製：
２４．３〜２７．１μｇのプラスミドｐＥＧＦＰ（Miniprep；QIAGEN）を、まず１００μｌの反応混合液中で３０ＵのＥｃｏＲＩ（New England Biolab）を用いて消化した。反応混合液を３７℃にて３時間インキュベートした。直線化したプラスミドを、NucleoSpin Extract（Machery-Nagel；１００μｌの反応混合液に対して溶出容量５０μｌ）を用いて精製した。４．９〜５．６μｇの直線化プラスミドｐＥＧＦＰを、５０μｌの反応容量中で２０ＵのＡｇｅＩ（New England Biolab）を用いた第２の消化に供した。３７℃にて３時間のインキュベーション後、二重消化したプラスミドをNucleoSpin Extract（Macherey-Nagel；５０μｌの反応混合液に対して溶出容量３５μｌ）を用いて精製した。二重消化したｐＥＧＦＰを次のクローニングに用いた。
【００２３】
（ステップ１）  ｄＡＴＰαＳを用いたＰＣＲ：
各ＰＣＲ（９４℃３分間１サイクル、９４℃１分間／５９．５℃１分間／７２℃７５秒間３１サイクル、７２℃１０分間１サイクル）に対して、２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（New England Biolab）、０．２ｍＭ  Ｓｐ−ｄＡＴＰαＳ（Biolog Life Science Institute, Bremen, Germany）、１２．６ｐｍｏｌ  ５’−ビオチン化フォワードプライマー（５’−ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣ−３’）、１２．６ｐｍｏｌ  リバースプライマー（５’−ＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧ−３’）および２４２．９〜２７１．４ｎｇのプラスミドｐＥＧＦＰ（Miniprep；Qiagen）を用いた。
【００２４】
（ステップ２）  チオホスホジエステル骨格のヨウ素切断：
ホスホチオエート結合をヨウ素（エタノール中に溶解；ＰＣＲチューブ中の最終濃度２μＭ）を用いて切断した。混合液を室温にて１時間インキュベートした。
【００２５】
（ステップ３）  それぞれ異なる長さを有する一本鎖ＤＮＡ断片の調製：
フォワードプライマーに由来するビオチン化ＤＮＡ断片を、室温にてDynabeads MyOneストレプトアビジン（DYNAL Biotech, Oslo, Norway）を用いて単離した。５０μｌの生体磁気ビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌの２×Ｂ＆Ｗバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；２．０Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて２回洗浄した。洗浄済み生体磁気ビーズを１００μｌの２×Ｂ＆Ｗバッファーに再懸濁し、１００μｌの切断済みＰＣＲ産物を加えた。２０分間インキュベートした後、ビオチン化ＤＮＡ断片を生体磁気ビーズ表面上に固層化し、１００μｌの２×Ｂ＆Ｗバッファーで洗浄することによりヨウ素を除去した。１００μｌのＤＮＡ融解溶液（０．１Ｍ  ＮａＯＨ）中で３７℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌのＤＮＡ融解溶液および１００μｌの１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いたビーズ洗浄ステップを行い、ビオチン化されていないＤＮＡ断片を遊離させた。洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓを、固体支持体からＤＮＡ断片を遊離させるために６０μｌの０．１％ＳＤＳ中で煮沸した。ＤＮＡ断片を含む上清をすぐに別のチューブに移した。
【００２６】
（ステップ４）  溶出した一本鎖ＤＮＡ断片からのＳＤＳ塩の除去：
脱塩はNucleoTrapキット（Macherey-Nagel, Duren, Germany）を用いて行った。４００μｌのバッファーＮＴ２を１００μｌの溶出したＤＮＡに添加し、次に１５μｌのNucleoTrap懸濁液を加えた。混合物を室温にて１０分間インキュベートし、２〜３分毎に穏やかに振り混ぜた。その後サンプルを１００００ｇにて３０秒間遠心し、上清を捨てた後、ビーズを５００μｌのバッファーＮＴ３で洗浄した。後者のステップをもう一度繰り返した。ペレットを３７℃にて１５分間風乾して残ったエタノールを除き、５５μｌのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（５ｍＭ；ｐＨ８．５）中に再懸濁し、そしてＤＮＡ溶出のために５０℃にて５分間インキュベートした。懸濁液をピペットでNucleoSpinマイクロフィルターに移し、ＤＮＡ含有溶液からビーズを分離するために１００００ｇにて３０秒間遠心した。
【００２７】
（ステップ５）  共通塩基を用いたＤＮＡ断片の酵素的伸長：
各伸長反応に対する総反応容量は５０μｌとした。各反応において、５Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（New England Biolabs）、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．４μＭ  ｄＩＴＰ（Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany）、およびステップ４の脱塩ＤＮＡの１８μｌを用いた。伸長反応（３７℃にて３０分間、およびトランスフェラーゼの加熱不活性化７０℃にて１０分間）における共通塩基の取り込み後、産物をQIAquickヌクレオチド除去キット（QIAGEN；５０μｌの反応混合液に対して溶出容量２５μｌ）のプロトコールに従って精製した。
【００２８】
（ステップ６）  全長遺伝子合成：
各ＰＣＲ（９４℃３分間１サイクル、９４℃１分間／５９．５℃＋０．２℃（１サイクル毎に０．２℃の増加）１分間／７２℃３分間３０サイクル、７２℃１０分間１サイクル）に対して、２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（New England Biolab）、１３．３μｌの伸長済みＤＮＡ断片、２０ｐｍｏｌ  リバースプライマー（５’−ＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧ−３’）および０．６６〜０．７６μｇの一本鎖リバース鋳型（準備ステップ１）を用いた。全長遺伝子の合成後、NucleoSpin Extract（Macherey-Nagel；１５０μｌのＰＣＲ産物に対して溶出容量３５μｌ）を用いて精製ステップを行った。
【００２９】
（ステップ７）  共通塩基置換：
各ＰＣＲ（９４℃３分間１サイクル、９４℃１分間／５２．７℃１分間／７２℃７５秒間３０サイクル、７２℃１０分間１サイクル）に対して、２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（New England Biolab）、２０ｐｍｏｌ  フォワードプライマー（５’−ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣ−３’）、２０ｐｍｏｌ  リバースプライマー（５’−ＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧ−３’）および２．５μｌの全長遺伝子（ステップ６）を用いた。ＰＣＲ産物は、NucleoSpin Extract（Macherey-Nagel；１５０μｌのＰＣＲ産物に対して溶出容量５０μｌ）を用いて精製した。
【００３０】
（ステップ８）  ＰＣＲ産物消化：
共通塩基置換の後、４０μｌの精製済みＰＣＲ産物（ステップ７）を３０ＵのＥｃｏＲＩ（New England Biolab）を用いて３７℃にて３時間消化した。その後、２０ＵのＡｇｅＩ（New England Biolab）を消化物に加え、混合液を３７℃にてさらに３時間インキュベートした。消化産物を、NucleoSpin Extract（Macherey-Nagel；溶出容量２５μｌ）を用いて精製した。
【００３１】
（ステップ９）  ライゲーションおよび形質転換：
消化済みＰＣＲ産物（ステップ８）とｐＥＧＦＰクローニングベクター（準備ステップ２）とのライゲーションは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Roche, Mannheim, Germany）を用いて室温にて１時間行い、大腸菌ＸＬ２  Ｂｌｕｅ（Stratagene, Amsterdam, Netherlands）細胞を形質転換した。コンピテント・セルは５０ｍｌ培養物（ＯＤ５７８  ０．４〜０．５）の細胞ペレットを２ｍｌのＴＳＳバッファー（ＰＥＧ６０００  １０ｇ；ＤＭＳＯ  ５ｍｌ；ＭｇＳＯ４  ０．６ｇ；ＬＢ  １００ｍｌ）中に再懸濁することにより調製した。５μｌのライゲーション混合液を２００μｌの細胞アリコートに添加し、氷中にて２０分間インキュベートし、４２℃にて４５秒間の熱ショックを与え、そしてさらに２分間氷冷した。０．８ｍｌのＬＢを加えた後、培養物を３７℃、１７０ｒｐｍにて１時間振盪した。３０００ｇ、室温にて２分間遠心することにより細胞を回収した。９００μｌの上清を捨て、残りの１００μｌの上清中に細胞を穏やかに再懸濁した。そして細胞をＬＢ／Ａｍｐプレート上にまき、３７℃にて一晩インキュベートした。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ａ）ステップ（ｉ）：ランダムな断片サイズ分布を作り出すことを表す概略図である。；ｂ）上段および中段のゲル写真：ヨウ素切断前（左レーン）および後（右レーン）のＰＣＲ産物を示す写真である。下段のゲル写真：異なる濃度（レーンの下側に記載）のＳｐ−ｄＡＴＰαＳに対するＤＮＡ融解および精製後のＤＮＡ断片サイズ分布を示す写真である。
【図２】ａ）ステップ（ｉｉ）：共通または縮重塩基を用いて伸長したＤＮＡ断片を表す概略図である。；ｂ）左下のゲル写真：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより３’末端で異なる濃度のデオキシイノシンを用いて伸長したプライマーでのＰＣＲを示す写真である。右下のゲル写真：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより３’末端で異なる濃度の５−ニトロインドールを用いて伸長したプライマーでのＰＣＲを示す写真である。
【図３】ステップ（ｉｉｉ）：ヌクレオチドアナログを含有する全長遺伝子の合成を表す概略図である。
【図４】ステップ（ｉｖ）：ヌクレオチドアナログを標準ヌクレオチドで置換することを表す概略図である。
【図５】１００個のランダムに拾ったクローンの配列決定の結果を示すグラフである。
【図６】１００個の配列決定されたクローンの突然変異のランダムな分布を表すグラフである。
【図１】
2007507212.tif 000002
【図２】
2007507212.tif 000003
【図３】
2007507212.tif 000004
【図４】
2007507212.tif 000005
【図５】
2007507212.tif 000006
【図６】
2007507212.tif 000007
【国際調査報告】
2007507212.tif 000008
2007507212.tif 000009