(57)【要約】  本発明は、より生物学的に同等である人工角膜を作成するための、バイオポリマーから合成した実質の内皮側にヒト角膜内皮培養細胞単層を付着および増殖させる方法を開示する。このアプローチは、付着および増殖促進物質、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、RGDS、IV型コラーゲン、ポリカルボフィルと結合したbFGF、およびポリカルボフィルと結合したEGFの使用を含む。本願はまた、半層デバイスまたは全層ボタン交換（button repalacement）のいずれかとしての角膜移植のためのヒト角膜内皮培養細胞の付着および増殖を支持する接着分子および増殖因子を含む自律ポリマーを作る方法を記載する。本発明は加齢黄斑変性症(ARMD)の治療のための網膜下空間への網膜色素上皮(RPE)培養細胞の移植アプローチを開示する。この方法により、単層細胞のシートへの移植RPEの送達が可能となり、その生理機能の発揮により好適となる。
2007509643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGFおよびポリカルボフィルと結合したEGFを含む付着混合物によって、角膜内皮細胞がバイオポリマーに付着し、その上で増殖するのに十分な時間、基盤バイオポリマーを被覆することを含む、内皮細胞付着および増殖を促進するためのバイオポリマーの改変方法。
【請求項２】
以下を含む人工角膜の作成方法:
a)基盤バイオポリマー;
b)該バイオポリマーの所望の形状への成形;
c)ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGFおよびポリカルボフィルと結合したEGFを含む付着混合物による該バイオポリマーの被覆;
d)角膜内皮細胞の接着を向上させるのに十分な時間のおよそ4℃での該バイオポリマーと該混合物とのインキュベーション;
e) 該付着混合物の除去;および、
f) 該バイオポリマー上への角膜内皮細胞の播種。
【請求項３】
バイオポリマーがIV型コラーゲンから構成される請求項2の方法。
【請求項４】
播種が高密度である請求項2の方法。
【請求項５】
以下を含む人工角膜の作成方法:
a)基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーの所望の形状への成形;
c)以下の工程を含むBCE-ECM 被覆物によるバイオポリマーの被覆:
1)増殖に好適な培地において低密度でウシ角膜内皮 (BCE) 細胞集団をバイオポリマー上へ播種する工程;
2)BCE 細胞を集密まで増殖させる工程;および、
3)培地を吸引し、細胞の除去に十分な時間バイオポリマーを水酸化アンモニウムで処理する工程;
d)バイオポリマーの好適なバッファーでの洗浄;および、
e) バイオポリマー上への角膜内皮細胞の播種および集密までの該細胞の増殖。
【請求項６】
以下を含む人工角膜の作成方法:
a)基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーの所望の形状への成形;
c)好適な方法を用いるダイヤモンド状炭素によるバイオポリマーの被覆;
d)バイオポリマーの好適なバッファーによる洗浄;および、
e)バイオポリマー上への角膜内皮細胞の播種および集密までの該細胞の増殖。
【請求項７】
以下を含む、角膜における使用に好適な内皮細胞を増殖させる方法:
a)基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーの所望の形状への成形;
c)十分な量のラミニン、フィブロネクチン、RGDSおよびIV型コラーゲンを好適な生物学的バッファー中に含む接着因子混合物によるバイオポリマーの被覆;
d)バイオポリマーの角膜ボタンへの適用;および、
e) バイオポリマー上への角膜内皮細胞の播種および集密までの該細胞の増殖。
【請求項８】
以下を含む、角膜における使用に好適な内皮細胞を増殖させる方法:
a)好適な生物学的バッファー中に十分な量のラミニン、フィブロネクチン、RGDSおよびIV型コラーゲンを含む接着因子混合物ならびに好適な生物学的バッファー中に十分な量のbFGF、EGFおよびポリカルボフィルを含む増殖因子混合物と接触している基盤バイオポリマーの作成;
b)バイオポリマーの角膜形状への成形;
c)バイオポリマーの角膜ボタンへの適用;および、
d) バイオポリマー上への角膜内皮細胞の播種および集密までの該細胞の増殖。
【請求項９】
インビトロで角膜内皮細胞の増殖を可能とするのに十分な濃度にてラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGFおよびポリカルボフィルと結合したEGFを含む付着混合物。
【請求項１０】
以下を含む付着混合物:
a) PBS中10 μg〜 500 μg/mlのフィブロネクチン;
b) PBS中10μg/ml〜500 μg/mlのラミニン;
c) PBS中1 μg/ml〜100 μg/mlのRGDS;
d) 0.1 M 酢酸中10 μg〜1000 μgのIV型コラーゲン;
e) PBS中1 ng/ml〜500 ng/mlのb-FGF;および、
f) PBS中1 ng/ml〜500 ng/mlのEGF。
【請求項１１】
以下を含む人工全層角膜移植支持材:
a)およそ平均的な角膜の厚さを有する基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーへのその合成の際の以下の１以上を含む付着剤の組込み: ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGF、ポリカルボフィルと結合したEGFおよびヘパリン硫酸;および、 
c)所望の形状の角膜へのバイオポリマーの成形。
【請求項１２】
バイオポリマーがIV型コラーゲンから構成される請求項11の組成物。
【請求項１３】
以下を含む人工全層角膜移植片:
a)およそ平均的な角膜の厚さを有する基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーへのその合成の際の以下の１以上を含む付着剤の組込み: ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGF、ポリカルボフィルと結合したEGFおよびヘパリン硫酸; 
c) バイオポリマーの角膜形状への成形;
d)バイオポリマー上へのHCECの播種および該細胞の集密までの増殖。
【請求項１４】
以下を含む人工半層角膜移植支持材:
a)角膜の平均のおよそ半分の厚さを有する基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーへのその合成の際の以下の１以上を含む付着剤の組込み: ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGF、ポリカルボフィルと結合したEGFおよびヘパリン硫酸;および、
c)バイオポリマーの角膜形状への成形。
【請求項１５】
以下を含む人工半層角膜移植片:
a) 角膜の平均のおよそ半分の厚さを有する基盤バイオポリマー;
b)バイオポリマーへのその合成の際の以下の１以上を含む付着剤の組込み: ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGF、ポリカルボフィルと結合したEGF、およびヘパリン硫酸; 
c)バイオポリマーの角膜形状への成形;
d) バイオポリマー上へのHCECの播種および該細胞の集密までの増殖。
【請求項１６】
バイオポリマーが IV型コラーゲンである請求項15の人工角膜。
【請求項１７】
バイオポリマーが培地の存在下で膨潤しない請求項1の人工角膜。
【請求項１８】
以下の工程を含む損傷角膜を修復する方法:
a) HCECを播種し、集密となるのに十分な期間増殖せしめた人工全層角膜を得る工程;
b)工程a)の人工全層角膜を損傷角膜に移植する工程；
c)該角膜を手術またはその他の手段により固定する工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む損傷角膜を修復する方法:
a)人工全層角膜を得る工程;
b)該角膜表面上に、その上に集密 HCECを有するバイオポリマーを層置する工程;
c)工程a）の人工全層角膜を損傷角膜上に移植する工程;
d)該角膜を手術またはその他の手段により固定する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む損傷角膜を修復する方法:
a) HCECを播種し、集密となるのに十分な期間増殖せしめた人工半層角膜を得る工程;
b) 工程a）の人工半層角膜を損傷角膜上に移植する工程;
c)該角膜を手術またはその他の手段により固定する工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む損傷角膜を修復する方法:
a)人工半層角膜を得る工程;
b) 該角膜表面上に、その上に集密 HCECを有するバイオポリマーを層置する工程;
c)工程a）の人工半層角膜を損傷角膜上に移植する工程;
d)該角膜を手術またはその他の手段により固定する工程。
【請求項２２】
以下の工程を含む、網膜内に移植するのに好適な網膜色素上皮 (RPE) 細胞を作成する方法:
a)上面および底面を有し、厚さが約 10〜100 μmであるバイオポリマーを得る工程;
b) インビトロでRPE 細胞の増殖に好適な培地中に該バイオポリマーを置く工程;
c) RPE 細胞を該バイオポリマーシートの上面に特定の密度で播種し、該RPE 細胞を集密するまで増殖させる工程;および、
d)該シートを取り出し、所望のサイズに切断する工程。
【請求項２３】
バイオポリマーが生分解性である請求項22の方法。
【請求項２４】
バイオポリマーに以下の１以上を含む付着剤が埋め込まれるか、またはその合成の際に該付着剤が組み込まれている請求項22の方法: ラミニン、フィブロネクチン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGF、ポリカルボフィルと結合したEGF、およびヘパリン硫酸。
【請求項２５】
請求項22の方法を用いて作られる網膜への移植に好適な網膜色素上皮 (RPE)細胞を含む組成物。
【請求項２６】
以下の工程を含むインビボで網膜を修復する方法:
a) 修復すべき網膜の損傷領域を同定する工程;
b)損傷網膜領域から残っているRPE 細胞を吸引する工程;
c)請求項1、2または3のいずれかの方法により作られる網膜への移植に好適な網膜色素上皮 (RPE) 細胞を得る工程;
d)その上側にRPEを有するバイオポリマーをカニューレまたはその他の好適な吸引手段で吸引する工程;
e) 修復すべき網膜の損傷領域に好適なサイズの気泡を注入する工程;
f) その上側にRPEを有するバイオポリマーをその細胞が上側となるように損傷領域に配置する工程;および、
g)網膜空間における気泡を吸引する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、2003年10月10日出願の米国特許出願第60/510359号; 2003年10月10日出願の第60/510350号;および2003年10月10日出願の第60/510349号からの優先権を主張し、これらはその内容が開示されているかのように引用により本明細書にすべて含める。
【０００２】
発明の背景
1.発明の分野
本出願は、細胞外マトリックス上のヒト角膜内皮および網膜色素上皮細胞の純粋培養物の解離(dessecting)、播種およびその後の増殖の改良された方法、そして人工角膜移植片を作成するための組成物および方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
2.従来技術の説明
様々な理由によって、眼の角膜部分は外科的に修復または置換する必要がある場合がある。例えば、角膜は傷ついたり、損傷したり、あるいは物理的なダメージを受け、ひどく視覚が衰えることがある。角膜はまた、様々な変性疾患の作用を受けやすく、患者が正常または正常に近い視力を回復しようとする場合、置換が必要となる。
【０００４】
ヒトの眼の角膜は、実質的に平行な比較的圧縮された組織の層からできた特殊化した構造をもつ。角膜の最外層またはもっとも表面の層は上皮層である。これは損傷を受けた場合には再生する組織の保護層である。眼の内側に進むとボウマン膜として知られている上皮層の基底表面(base surface)がある。ボウマン膜の直近には角膜の実質(storoma)があり、これは細胞外コラーゲン構築マトリックスであり、角膜実質細胞が散在している。実質層は角質とそのもっとも深いレベルで結合しており、この細胞膜はデスメ膜と称され、次いで、特殊化した（specialized）内皮細胞の単一の細胞の厚さの単層があり、これは角膜の後面を形成する。内皮層は再生せず、それが冒され、傷つき、あるいは損傷を受けると、置換しなければならない。
【０００５】
ヒトを含むいくつかの動物種において、角膜内皮は通常、インビボで複製して損傷または加齢により欠損した細胞を置換することはない(Murphy C、et al.、Invest. Ophthalmology Vis. Sci. 1984; 25:312-322; Laing R A、et al.、Exp. Eye Res. 1976; 22:587-594)。しかし、ヒト角膜細胞は通常の組織培養条件下でインビトロで増殖因子が濃縮された（enriched）ウシ胎児血清含有培地で培養することが出来る(Baum JL、et al.、Arch. Ophthalmol. 97:1136-1140、1979; Engelmann K、et al.、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29:1656-1662、1998; Engelmann K、and Friedl P; In Vitro Cell Develop. Biol. 25:1065-1072、1989)。培養細胞を角膜内皮細胞の欠損の置換に用いることが出来れば、ヒト角膜のドナープールを大幅に増やすことになる。内皮細胞数が不十分であるために移植術に現在供することができないドナー角膜を増補できるためこれは重要である(Gospodarowicz D、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:464-468、1979; Gospodarowicz D、et al.、Arch. Ophthalmol. 97:2163-2169、1979)。この角膜プール[細胞数が少ないために供することが出来なかったもの？]は年間に提供される角膜の全数の30%をも構成する(National Eye Institute: Summary report on the corneas task force. Invest Ophthalmol Vis Sci 12:391-397、1973)。さらに、低い出発密度からヒト角膜内皮細胞を培養する方法、および、インビトロで増殖した細胞を剥離(denuded)角膜ボタン（buttons）に再び植えることが可能になると、レシピエント独自の損傷のない実質を非自己細胞および自己実質型の移植のために使用することが可能となるであろう (Insler MS、and Lopez JG、Cornea 10:136-148、1991)。
【０００６】
組織培養技術は、組織および器官等価物(equivalent)の開発における使用に成功している。これら技術の基礎はコラーゲンマトリックス構造を伴い、これらは、生細胞、栄養素および培養条件の適切な組合せを用いることにより機能的な組織および器官に再構築することが出来る。組織等価物は多くの特許に記載されており、例えば、米国特許第4485096号;第4485097号;第4539716号;第4546500号;第4604346号;第4837379号;および第5827641号が挙げられ、これらはすべて引用により本出願に含まれる。組織等価物の適用の一つの成功例は生きている皮膚の等価物であり、それは実際のヒトの皮膚と類似の形態を有する。生きている皮膚の等価物は２層から構成される:上部は分化した層をなすヒト表皮角化細胞から構成され、これはより厚い、より下層のコラーゲンマトリックス中のヒト皮膚線維芽細胞の層を被覆する(Bell、et al.、J. of Biochemical Engineering、113:113-19 (1991))。
【０００７】
角膜上皮および内皮細胞の培養についての研究がなされている(Xie、et al.、In Vitro Cell. Develop. Biol.、25:20-22 (1989) and Simmons、et al.、Tox. App. Pharmacol.、88:13-23 (1987))。
【０００８】
ヒト角膜のドナーが慢性的に世界的に不足しているため、角膜の内皮および上皮の疾患を有する患者、および、事故において角膜が外傷性破裂した全角膜置換を必要とする患者における移植用の人工角膜実質の作成に興味が向けられている。
【０００９】
現在、代替（substitute）角膜実質の作成の殆どの試みは、天然源からの、またはポリマーにおけるタンパク質部分の架橋による合成的組合せの、ポリマーゲルの使用に依存している。ポリマーゲルのほとんどは全体積の80%までが水相であるため、それらは人工角膜実質が房水と接触するよう配置されると膨潤する。この場合、移植された人工角膜実質は外側の眼房（exterior chamber）の水性環境に常に供されることになる。その結果のポリマーゲルの膨潤はポリマーゲルにおける濁り（haziness）、および、人工実質の厚さが増すことによる視覚の歪みをもたらす。それゆえ人工実質の内側にヒト培養内皮細胞層を配置し、液体浸透の障壁として作用させ、常に基底側から頭頂側へと液体をくみ出すことにより（これは、人工実質を薄く保ち、高度の透明性を維持する）、実質を適当な厚さに保たせることが望ましい。
【００１０】
角膜移植のための人工実質を作成する際に、その合成中に細胞のバイオポリマーへの付着と増殖を誘導し維持する剤を含めるのが有利である。３種類の細胞タイプ、即ち、凸面側の角膜上皮細胞、内側の角膜実質細胞、および凹面側の角膜内皮細胞、を支持しうる人工角膜が、単なる装置というよりは、より類似した角膜等価物(equivalent)として作用しうる。角膜内皮層は液体を外側に常にくみ出す液体障壁として作用する。創傷部から増殖し、移植された人工角膜を適所にアンカーする角膜実質細胞により、角膜代替物（substitute）は正常のインタクトな角膜により維持される相対的に脱水された状態に達し得、これは、それを透明に保ち(deturgence)、移植術の後の安定性を維持することができる。
【００１１】
角膜外傷に加えて、加齢黄斑変性症が老齢疾患として自然にヒトにおいて起こる(Gartner S、and Henkind P.、Br. J. Ophthalmol. 1981 Jan;65(1):23-8; J Marshall et al.、Br. J. Ophthalmol. 1979、Vol 63、181-187)。網膜色素上皮(RPE)は、持続性の細胞活性、例えば、桿状体の外側部の食作用および毒性因子への累積曝露(Dorey CK.、et al.、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1989 Aug; 30(8):1691-9; Hogan MJ、Trans. Am. Acad. Ophthal. - mol Otolaryngol 1972; 7:6480)によりもたらされる高いストレスの結果としての生物および生理機能のその欠失により、変性疾患に大きく関わっていると示唆されている。RPE 細胞移植術は、ヒト変性斑状疾患および周辺部網膜疾患の可能性のある治療として提案されている(Li、L. and Turner、JE.、Exper. Eye Res. 47:911 (1988); Lane、C.、et al.、Eye. 1989;3 (Pt 1):27-32)。かかる提案の結果、外科の現場では、細胞移植術の際にヒトRPE 細胞を網膜下空間へ送達する必要性が生じている。RPE 細胞移植方法としてのRPE 細胞懸濁液の網膜下空間への直接注入は、注入された細胞が単層として定着するのではなく凝集して集団を形成してしまうため、期待される臨床転帰には不十分である。単層として定着することが細胞が適切に機能するのに必要な条件である(Gouras PG.、et al.、Curr. Eye Res. 1985; 4: 253-265; Lopez R.、et al.、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1987; 28: 1131-1137)。生分解性ポリマー膜のシート上に培養RPE 細胞を単層として移植することにより問題は解決されるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明に至るまで、ヒト角膜内皮細胞 (HCEC)の従来の培養方法は種々の問題に遭遇しており、例えば、HCEC 細胞が高細胞密度 (2000-5000 細胞/mm２)でしか播種できず、それゆえ少ない試料から初代培養を開始する可能性が制限されていたという問題、および、HCEC 細胞は低播種密度 (50-100 細胞/mm２)では連続的に継代することが出来ず、それによってHCEC ストックを貯蔵および将来の使用のために拡張させる可能性が制限されていたという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、培養角膜内皮細胞のバイオポリマー上への付着、およびそれに続く増殖を促進するバイオポリマー表面の改変方法を提供する。具体的には、培養細胞はバイオポリマー表面に付着した状態を保ち、その生理機能を発揮することが可能となる。例えば、機能としては、望ましくない膨潤をもたらす液体のバイオポリマーへの侵入を防ぐ密着結合を形成すること、および基底側から頂端側への能動Na/K ポンプ活性を発揮し、バイオポリマーから過剰の液体を除き、 代替角膜実質 (バイオポリマー)の清浄度(deturgence)および透明度を維持することである。
【００１４】
本発明のアプローチは、付着タンパク質、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、RGDS、IV型コラーゲン、ポリカルボフィルと結合したbFGF、およびポリカルボフィルと結合したEGFの使用を伴う。ポリカルボフィルは軽度に架橋したポリマーである。架橋剤はジビニルグリコールである。ポリカルボフィルはまた、その負の電荷の源である複数のカルボキシルラジカルを含む弱いポリ酸でもある。これらの酸ラジカルにより、細胞表面との水素結合が可能となる。ポリカルボフィルは水中で自重の40〜60倍を吸着する能力をムチンと共有しており、市販の下剤として一般に用いられている(Equalactin、Konsyl Fiber、Mitrolan、Polycarb)(Park H、et al.、J. Control Release 1985; 2:47-57)。ポリカルボフィルは非常に巨大な分子であり、それゆえ、吸収されない。それはまた非免疫原性であり、実験室においてもそのポリマーに対する抗体を作ることができていない。
【００１５】
本発明の一つの態様において、合成の際に付着混合物が埋め込まれたかあるいは組み込まれたバイオポリマーである自律ポリマーを開示する。付着混合物は以下の１以上を含む:フィブロネクチン、ラミニン、RGDS、ポリカルボフィルと結合したbFGF、ポリカルボフィルと結合したEGF、およびヘパリン硫酸。バイオポリマーは所望の形状に成形することが出来、角膜の形状が好ましく、ヒト角膜内皮培養細胞をその凹面表面に播種し、集密まで増殖させる。
【００１６】
本発明は、正常ヒト角膜の半層に成形することが出来、深層角膜手術 (DLEK) と称される方法における半層移植のためにヒト角膜内皮培養細胞で被覆されうる自律バイオポリマーを開示する (Terry、M.A.、Eye. 2003 Nov;17(8):982-8; Loewenstein A、and Lazar M.、Br. J. Ophthalmol. 1993; 77:538)。
【００１７】
別の態様において、自律バイオポリマーは、全層または半層の角膜の形状に成形することが出来、穿孔によって11 mm の直径のボタン(button)が切り出された後、ヒト角膜内皮培養細胞が人工実質の凹面側に播種される。
【００１８】
炭素のダイヤモンド状被覆を有するバイオポリマー表面を提供すること、および角膜内皮細胞のインビトロでの増殖に好適なバイオポリマー表面を生じるよう付着混合物により該被覆表面を処理することも本発明の目的である。
【００１９】
本発明の別の態様は加齢黄斑変性症(ARMD)の治療のための眼の網膜下空間への網膜色素上皮 (RPE) 細胞移植術のための担体としての薄い (10-100μmの厚さ) バイオポリマーシートの使用を含む。あるいは、薄い生分解性ポリマーのシートは、移植術のための培養RPE 細胞の担体として使用しうる。生分解性システムを使用する利点はポリマーが分解するとすぐにRPE 細胞がブルッフ膜およびその下にある血管系と接触でき、より速くその輸送および食作用機能を実行できることである。
【００２０】
これらおよびその他の本発明の目的、ならびにそれによる利点は好適な態様の以下の詳細な説明を参照するとより容易に理解できるであろう。
【００２１】
［詳細な説明および好適な態様］
本発明の好適な態様の記載において、特有の用語を明確性のために使う。しかし、本発明は選択された特定の用語に限定されるわけではなく、特定の用語はそれぞれ同様の目的を達成するために同様に機能するすべての技術的等価物を含むことを理解されたい。
【００２２】
以前の研究により、ヒト角膜内皮細胞(HCEC)はポリマー表面で増殖できることが示されている (T. Mimura et al.、2004 Invest. Ophthal. Vis. Sci. Vol. 45. No.9 2992-2997; F. Li et al.、2003 Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol 100. 15346-15351)。しかし、これら細胞は最大で12〜14週間しかポリマービーズへの付着を維持できない (M.S. Insler and J.G. Lopez、1989 Curr. Eye Res. Vol. 9:23-30)。
【００２３】
本発明は人工実質の内皮側を改変する方法を記載する。これは、培養HCECの長期付着および人工角膜の完全性および清浄性（detergence）を維持する重要な生理機能を発揮するその能力によって可能となる。この目的のため、本発明は、所定の付着タンパク質および増殖因子の混合物(付着混合物)を開示し、この混合物は、フィブロネクチンをPBS中濃度範囲 0.1 μg〜500 μg/ml、ラミニンをPBS中濃度範囲0.1 μg〜500 μg/ml、RGDSをPBS中濃度範囲0.1 μg〜200μg/ml、IV型コラーゲンを0.01M 酢酸中濃度範囲 1μg〜1000μg/ml 、I型コラーゲンを0.01M 酢酸中濃度範囲1 μg〜1000 μg/ml、ポリカルボフィル (0.01 μg/ml)と結合したbFGFをPBS中濃度範囲1ng〜500ng/mlおよびポリカルボフィルと結合したESFをPBS 中濃度範囲1ng〜500ng/mlにて含む。
【００２４】
所定の付着混合物を角膜の形状に成形したポリマーゲルの凹面側に添加する。ポリマーゲルを次いで20分〜24時間の範囲の時間4℃でインキュベートする。その後残りの付着混合物を除去すると、角膜は培養角膜内皮細胞の播種のために準備が整う。別の態様において、ネイティブな培養ウシ内皮細胞由来細胞外マトリックスをポリマーに直接沈着させてもよい。
【００２５】
ウシ起源の角膜内皮細胞を角膜形状のポリマーゲルの内皮側に播種する。デバイスは35mm 培養ディッシュにおいて凹面側を上にし、播種した細胞をウェル空間に配置し、10% CO2 インキュベーター中37℃で2時間インキュベートする。およそ2 mlの培地 (10% ウシ血清、5% ウシ胎児血清、および2% w/v デキストラン (MV 40,000)を追加）を人工角膜を完全に浸すように添加する。ウシ内皮細胞を集密まで7日間増殖させる。次いで内皮細胞層を蒸留水中の20 mM 水酸化アンモニウム溶液で5分間処理し、PBS で10回すすぐと、人工角膜実質は、培養ヒト角膜内皮細胞により被覆するための準備が整う。別の態様において真空環境中において、人工角膜実質をプラズマ銃を用いてダイヤモンド状炭素 (DLC)で被覆して角膜形状のポリマーに炭素の薄い層を沈着させてもよい。
【００２６】
一つの選択的態様において、内皮層を形成するのに用いる角膜内皮細胞は様々な哺乳類の源に由来するものでよい。ヒツジ、ウサギ、およびウシ由来の非形質転換角膜内皮細胞が用いられている。マウス角膜内皮細胞がSV40ラージT抗原で形質転換された(Muragaki、Y.、et al.、Eur. J. Biochem. 207(3):895-902 (1992)）。用いることが出来る非ヒト細胞タイプには、形質転換マウス角膜内皮細胞株、またはヒツジまたはウサギ由来の正常角膜内皮細胞が挙げられる。正常ウサギ内皮細胞は酵素によって分離された角膜内皮または角膜外植片由来であり得、50 μg/mL ヘパリンおよび0.4 μg/mL ヘパリン結合性増殖因子-1 (MSBME)の追加により改変されたMSBM 培地で連続的に培養される(Johnson、W.E. et al.、In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A:429-435 (1992))。
【００２７】
さらに別の態様において、非角膜起源由来の内皮細胞を本発明に用いてもよい。本発明に用いられる非角膜起源内皮細胞としては、ヒツジおよびイヌ血管およびヒト臍帯静脈内皮細胞が挙げられる。内皮細胞はSV40ラージT抗原を含む組換えレトロウイルスで形質転換するとよい(Muragaki、et al.、1992、前掲)。形質転換細胞は角膜等価物において増殖し続け、それらは接触阻害がないために、無細胞層の最上部に隆起(mound)を形成する。非形質転換細胞は実質細胞-コラーゲン層の下に単層を形成する。あるいは、正常内皮細胞を上記のようにトランスフェクトしてもよいが、熱感受性遺伝子を発現する組換えコンストラクトを加えてトランスフェクトする。これら形質転換細胞は低温で連続培養にて増殖する。集密内皮細胞層が確立した後、温度を上げて形質転換遺伝子を不活化させることができ、これにより細胞がその正常な調節を再開し、接触阻害を示し、非形質転換細胞と類似の内皮細胞単層を形成することが可能となる。ほとんどのペプチドは熱感受性であり(熱ショックタンパク質は例外である）、したがって培養温度を上げることにより不活化しうるペプチドは様々に選択することが出来る。このように行われる形質転換はまた、取得および培養が困難な細胞タイプ、例えば、ヒト角膜内皮細胞の使用を促進する。
【００２８】
本発明の自律ポリマーは、バイオポリマーにその合成の際に、以下の１以上を含む付着および/または増殖促進剤を埋め込むか、または組み入れることによって作成される: フィブロネクチン、濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg〜500 μg/ml；ラミニン、濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg〜500 μg/ml；RGDS、濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg〜100μg/ml；ポリカルボフィルと結合したbFGF、濃度範囲ポリマーゲルの1ng〜500ng/ml；ポリカルボフィルと結合したEGF、濃度範囲ポリマーゲルの10ng〜1000ng/ml；およびヘパリン硫酸、濃度範囲ポリマーゲルの1 μg〜500 μg/ml。この強化バイオポリマーを次いで全層角膜代替物(ヒト角膜の正常の厚さ)または半層角膜代替物(正常ヒト角膜の半分までの厚さ)のいずれかとして角膜の形状に成形する。ヒト角膜内皮培養細胞を低密度(約 2000〜150,000  細胞/ml、好ましくは 20,000 細胞/ml)で人工実質の凹面側に播種し、培養物を7〜10日間37℃で10% CO2 インキュベーター中で増殖させる。
【００２９】
倒立顕微鏡下で観察して判定して角膜内皮細胞が集密に達すると、角膜代替物をPBSで３回すすぎ、そうするとすぐに移植に使用可能である。
【００３０】
別の態様において、全層または半層のいずれかの形態の人工実質に、細胞を飽和密度 (約 0.5 x 105〜1 x 107  細胞/ml、好ましくは 106  細胞/ml)で11mm 冠状のこぎりで切り出したボタン上に播くことにより、ヒト角膜内皮培養細胞の集密層を播種してもよい。200μlの細胞のアリコットをボタンに添加し、サンプルを37℃、10% CO2で2時間〜24 時間インキュベートする。角膜代替物をPBSで３回すすぐとすぐに角膜移植に使用可能である。
【００３１】
網膜色素上皮細胞を増殖させるために、その組成と合成が当業者に知られている生体適合性バイオポリマーを、均一な、厚さ1〜1000 μm、好ましくは10〜100 μmの薄いシートに成形する。RPE 細胞を集密するまで膜上で増殖させるか、または膜表面の95%以上を被覆するよう高播種密度で膜上に被覆する。このRPEに被覆されたポリマーシートは眼底への設置の担体システムとして機能する。
【００３２】
本発明によるこの手順を行うために、RPEに被覆されたシートをブルッフ膜上の損傷RPE領域を覆うのに十分な所望のサイズに切断する。この断片をRPE 細胞が上となるように配置しカニューレに吸引する。シートはRPE 細胞が内側に位置するようにたたまれる。網膜下空間に移植のための手術部位を準備するために、気泡を宿主RPE 細胞損傷が同定された網膜下空間に注入する。この領域を吸引針で既存の損傷RPE 細胞を吸引することによって洗浄する。空間を緩衝塩類溶液 (BSS)で１回すすぎ、折りたたまれたRPEに被覆されたポリマーのシートを所定の位置に沈着させる。網膜が正常形態に戻るように気泡を吸引し、こうしてRPE シートを所定の位置に保持させる。
【００３３】
別の態様において、担体シートはその組成および合成が当業者に周知の生分解性ポリマーによって合成できる。培養RPE 細胞を集密するまで増殖させるか、または高播種密度で沈着させてポリマーシートの全表面を被覆する。次いでシートを所望の大きさに切断し、先に記載したように眼の網膜下空間に移植する。
【００３４】
本発明に関して、バイオポリマーまたは生分解性形態のバイオポリマーは、合成工程の際に、以下の１以上を含む付着剤に埋め込むか、または組み込むことが出来る:フィブロネクチン、ラミニン、RGDS、IV型コラーゲン、ポリカルボフィルと結合したbFGF、およびポリカルボフィルと結合したEGF、およびヘパリン硫酸。培養RPE 細胞をかかるポリマーシート上で集密するまで増殖させてもよいし、その全表面を被覆するように高播種密度で沈着させてもよい。RPE 細胞が載ったシートを所望の寸法に切断し、先に記載したように網膜下空間に移植する。
【実施例】
【００３５】
実施例 1:一次ヒト角膜内皮細胞の非酵素的解離(dissection)
ヒトドナーからの角膜縁(中央部が移植のためにすでに除かれている)またはドナー全角膜を大容量 (50 ml)のリン酸緩衝食塩水 (PBS)ですすぐ。それをホルダーに内皮側を上にして置く。小柱網および虹彩の残部を顕微解剖により注意深く除く。先鋭な宝石加工用ピンセットを用いて、内皮細胞層およびデスメ膜を、下にある実質組織を含まないように気をつけて非常に注意深く剥がす。この工程は解離したデスメ膜を倒立顕微鏡で、片側に角膜内皮細胞のみがあり、逆側には何もないこと観察することによって確認する。組織の断片をECM で被覆した 35 mm 組織培養ディッシュまたは同様の好適な容器に入れ、およそ0.5 mlの培地 (b-FGFを250 ng/ml追加した15% ウシ胎児血清を含有するDME-H16)で満たす。ディッシュを37℃で10% CO2 インキュベーター中で24 時間インキュベートし、さらに1 mlの培地を追加する。サンプルを約 7日間静かにインキュベートして、角膜内皮細胞のコロニーが組織サンプルから外側へ遊走するのを確認し、その時点で(サンプルを培地に入れてから7〜14日後)、細胞数が200-500 細胞となるまで培地を一日おきに交換する。
【００３６】
実施例 2:高分割比でのヒト角膜内皮細胞培養
組織サンプル培養物からの一次細胞数が200〜500に達すると、細胞をSTV溶液 (生理食塩水中、0.05% トリプシン、0.02% EDTA)によりディッシュから取り出す。STV溶液は細胞が丸くなっているが培養ディッシュに付着している時に除く。残っているSTVは15% ウシ胎児血清含有培地によって不活性化されるので遠心分離工程は必要ではない。角膜細胞を60-mmのECMで被覆したディッシュ (約 500 細胞/ディッシュ)に入れる。培地を一日おきに交換し、濃度250 ng/ml のb-FGFを培地交換時に添加する。集密に達すると(プレーティングの約7〜10日後)、細胞を同じ分割比(1:16〜1:64)で再度継代するか、または10% DMSO、15% FCS、106細胞/ml/アンプルの密度で冷凍し、液体窒素中でさらに使用するまで保存する。継代は細胞機能または形態学的完全性を失うことなく8回まで行うことが出来る。
【００３７】
HCEC ストックの凍結
収集したHCEC各5 mlについて、細胞懸濁液に0.5 mlのDMSOを添加した。各1.1 mlの混合物を1.5 ml 凍結保存チューブに分注し、終濃度およそ100万 細胞/バイアルとした。バイアルを発泡スチロールの箱に入れ、-80℃冷凍機に24 時間入れて置いた。1日後、アンプルを長期保存のために液体窒素中に移した。
【００３８】
実施例 3: 角膜ボタンの剥皮(denudation)
ヒトドナー角膜ボタン(button)をアイバンクから得る。これら角膜ボタンは内皮細胞数が不十分であるため移植には不適であるとみなされるが、その他は健康であり、疾患を有さず、アイバンクガイドラインにしたがって得られたものである。
【００３９】
角膜ボタンをホルダーに内皮側を上にして置き、PBSで３回すすぐ。次いで濃度10 mM〜200 mM の水酸化アンモニウム溶液を注意深く、上端からこぼれないように角膜ボタンに添加する。角膜を温度約 10℃〜25℃に5分間〜2時間維持する。次いで水酸化アンモニウムを除き、角膜ボタンの内側をおよそ10回PBSですすぐ。消毒綿を内皮表面にそって穏やかに滑らせ、残余の細胞骨格または残骸を除く。角膜ボタンを再びPBSで３回すすぎ、11 mm 冠状のこぎりで切り出すと、すぐにヒト角膜内皮培養細胞による被覆に用いることが出来る。
【００４０】
あるいは、ネイティブな角膜内皮は、5分間〜2時間10℃に維持した蒸留水中の濃度 0.5〜5%のTriton-X100の添加により取り出すことが出来、次いで先に記載したように処理する。さらに角膜内皮を蒸留水で20 分間〜2時間、温度範囲4℃〜25℃で処理してもよい。次いで消毒綿を内皮表面にそって穏やかに滑らせ、残余の細胞骨格または残骸を除く。角膜を11mm 穿孔する。
【００４１】
実施例 4:付着タンパク質および増殖因子による剥皮(denuded)角膜の処理
穿孔の後、剥皮(denuded)角膜ボタンを内皮側を上にして再びホルダーに入れる。フィブロネクチン（PBS中濃度範囲 10 μg〜 500 μg/ml）、ラミニン (PBS中10 μg〜 500 μg/ml)、RGDS (PBS中1 μg〜100 μg/ml)、IV型コラーゲン (0.1 M 酢酸中10 μg〜1000 μg)、b-FGF (PBS中1〜 500 ng/ml)、EGF (PBS 中1 ng〜500 ng/ml)を含む付着タンパク質(付着混合物) 溶液を注意深く剥皮角膜ボタン上に添加する。検体を5 分間〜2時間4℃でインキュベートし、その最後に混合物を除き、角膜をPBS で3回すすぐ。
【００４２】
実施例 5:付着剤および増殖因子の混合物によるポリマーの被覆と高密度細胞播種
人工実質の特徴を満たすバイオポリマーまたはポリマーゲルを角膜の形状に成形する。この人工実質を凹面側を上にして置き、PBSで湿らせる。付着混合物 (以下を含有：フィブロネクチン、PBS中濃度範囲 0.1 μg〜500 μg/ml、ラミニン、PBS中濃度範囲0.1 μg〜500 μg/ml、RGDS、PBS中濃度範囲0.1 μg〜200 μg/ml、IV型コラーゲン、0.01 M 酢酸中濃度範囲1μg〜1000 μg/ml、I型コラーゲン、0.01M 酢酸中濃度範囲1μg〜1000 μg/ml、ポリカルボフィル (0.01 μg/ml)と結合したbFGF、PBS中濃度範囲1ng〜500ng/mlおよびポリカルボフィルと結合したESF、PBS中濃度範囲 1ng〜500ng/ml)の約 0.5 - 0.8  mlのアリコットを角膜形状ポリマーの凹面表面に滴下し、次いでサンプルを4℃〜25℃で10 分間〜2時間インキュベートする。付着混合物を除く;人工ポリマー角膜実質をPBSで３回すすぐと、ヒト角膜内皮培養細胞の播種の準備が整う。STV溶液 (生理食塩水中0.05% トリプシン、0.02% EDTA)の入ったディッシュから培養角膜内皮細胞を剥がす。内皮細胞を2000 rpmで5 分間遠心分離し、細胞ペレットを濃度範囲0.1%〜5%のウシ胎児血清を追加したDME-H16 培地1 mlに再懸濁する。細胞数をCoulter Particle Counterで計測し、約 106 細胞/mlに調整する。人工角膜を11 mm 冠状のこぎりで穿孔し、200 mlのアリコット(2000〜2 x 106 細胞、好ましくは150,000〜250,000 細胞を含有)を角膜形状実質に、表面積の95%を被覆するよう播種する。
【００４３】
人工角膜を移植に用いる前に20分〜24時間インキュベートする。1% ヒアルロン酸ナトリウム (Healon（登録商標） Advanced Medical Optics、Santa Ana、CA)の約 0.2  0.5 mlの層を、保護剤として作用するよう細胞層の上に層置する。
【００４４】
実施例 6:ヒト角膜内皮培養細胞の低密度播種のための付着剤および増殖因子によるバイオポリマーの被覆
別の態様において、バイオポリマーを角膜の形状に成形する。十分な量の付着混合物を人工実質の凹面表面を被覆するよう実施例 5に記載したように添加する。4℃でのインキュベーションの最後に、付着混合物を除き、ポリマー角膜をPBSで３回すすぐ。35mm 組織培養ディッシュ中でPBSで湿らせたままで、ポリマー角膜を11 mm 冠状のこぎりで穿孔する。ヒト角膜内皮培養細胞を先に記載したように培養ディッシュから剥がす。内皮細胞を2000 rpmで遠心して沈降させ、15% ウシ胎児血清を追加した培地5 mlに再懸濁する。細胞量をCoulter Particle Counterで測定し、細胞密度を約 100,000 細胞/ mlに調整する。およそ20,000 細胞を含有する約 100 μlの細胞懸濁液のアリコットを人工角膜上に播種し、37℃で10% CO2 インキュベーターでインキュベートする。2時間後、2 mlの培地 (15% ウシ胎児血清および 250 ng/ml bFGFを追加したDME-H16)をディッシュに添加し、ポリマー角膜および細胞を完全に浸す。ヒト角膜内皮細胞はポリマー角膜の全表面積の約 10%を最初被覆する。細胞を7日間増殖させ、その間、培地を一日おきに交換し、250 ng/ml のbFGFを培地交換時に添加する。細胞は6-7日間で100% 集密に到達し、その時点で人工角膜は移植の準備が整う。
【００４５】
実施例 7:ヒト培養内皮細胞の高密度細胞播種のための、ウシ角膜内皮細胞由来細胞外マトリックスの沈着によるポリマーの被覆
別の態様において、バイオポリマーをまず角膜形状に成形する。次いでサンプルを11 mm 冠状のこぎりで切断し、凹面側を上にして35mm 組織培養ディッシュに入れる。培養ウシ角膜内皮細胞を培養ディッシュから剥がし、結果として得られる細胞懸濁液を密度20,000 細胞/ mlに調整する。約 200 μlの細胞懸濁液のアリコットをポリマー角膜に添加し、サンプルを37℃、10% CO2で、2時間インキュベートする。次いで10% ウシ血清、5% ウシ胎児血清、2% デキストラン (40000 MV)および 50ng/ml bFGFを追加したDME-H16を含有する培地約 2 mlを25 mmディッシュに添加し、人工角膜を完全に浸す。ウシ内皮細胞を7日間増殖させ、濃度50ng/mlのbFGFを培地に一日おきに添加する。7日目に培地を除き、2 mlの水酸化アンモニウム(蒸留水中20 mM)を添加し、5 分間25℃で放置する。人工角膜を次いで2 mlのPBS/ディッシュにより10回洗浄する。
【００４６】
先に記載したようにして調製したヒト角膜内皮培養細胞懸濁液を、最終細胞密度100,000細胞/mlとなるよう調整する。200 μlのヒト細胞懸濁液のアリコットを表面積の95%より多く被覆するために十分な細胞数にて人工角膜に添加する。約 0.2  0.5 mlの1% ヒアルロン酸ナトリウム (Healon（登録商標） Advanced Medical Optics、Santa Ana、CA)の層を細胞層上に層置し、保護剤として機能させ、人工角膜を37℃、10% CO2 で20分〜24時間インキュベートする。ポリマー角膜はこうして移植の準備が整う。
【００４７】
実施例 8:ヒト角膜内皮培養細胞の低密度細胞播種のためのウシ角膜内皮細胞から生じた細胞外マトリックスによるポリマーの被覆
実施例 7に記載したようにウシ内皮細胞によって沈着した細胞外マトリックスでバイオポリマー角膜を被覆する。人工角膜は11 mm 冠状のこぎりで穿孔し、凹面側を上にして35mm 組織培養ディッシュに入れる。ヒト角膜内皮培養細胞を上記のように調製し、細胞懸濁液とする。この細胞懸濁液の最終密度を20,000 細胞/ mlに調整する。200 μlのアリコット(4000細胞含有)の細胞を細胞外マトリックスで被覆したポリマー角膜に添加する。サンプルを37℃、10% CO2でインキュベートし、その間、培地を一日おきに交換する。7日目にヒト角膜内皮細胞は増殖して表面積の100%を被覆するようになる。人工角膜をついで3回PBSですすぐと、移植への準備が整う。
【００４８】
実施例 9:ヒト角膜内皮培養細胞の高密度播種のためのダイヤモンド状炭素 (DLC)によるバイオポリマーの被覆
バイオポリマーを角膜形状に成形する。ポリマー角膜を次に炭素プラズマ沈着の工程に供する。プラズマ装置は関係する高電気出力および熱負荷を最小にするように繰り返しパルスモードにて作動する真空アークプラズマ銃 (Lawrence Berkeley National Laboratory、Berkeley、CA)からなる。炭素陰極が装着されると、プラズマ銃は、方向性ストリーミングエネルギー(a directed streaming energy) 約 10 eVの純粋炭素プラズマの高密度プルームを形成する。プラズマを陰極からの粒子状物質をすべて除くように90° 磁性フィルター (ベント・ソレノイド)に注入し、放射プラズマプロファイルを平らにするよう作用する大きな永久磁石多極配置（multipore configuration）を通過させる; このようにして、炭素プラズマ沈着を大きな沈着領域にわたって空間的に均一にする。フィルムの均一性をさらに増強させるために、DLC被覆すべき基体をゆっくりと回転する円板に載せることにより、方位角不均一性を排除する。プラズマ銃、真空槽、および回転円板の集合体を用いて約 20〜4000オングストロームの厚さ、好ましくは 200-400オングストローム の厚さのDLCフィルムを形成した。プラズマ銃は培養ディッシュ、スライド、ブロック、ビーズ、マイクロキャリア、凹面および凸面表面人工角膜、およびポリマーシートを被覆するのに利用できる。
【００４９】
DLC沈着後、人工角膜を11 mm 冠状のこぎりで穿孔し、3回PBSですすぐ。ヒト角膜内皮培養細胞懸濁液を以前に記載したように調製し、最終細胞密度を約 106 細胞/ mlに調整する。200 μlの200,000 細胞を含有する細胞懸濁液のアリコットを、人工実質の被覆された凹面側に添加し、十分な細胞により表面積の95%以上を被覆する。サンプルを37℃、10% CO2で20分〜24時間インキュベートする。人工角膜は移植の準備が整う。
【００５０】
実施例 10:ヒト角膜内皮細胞の低密度集団の播種用のダイヤモンド状炭素 (DLC)によるバイオポリマーの被覆
バイオポリマーを角膜形状に成形し、実施例 9に記載のように炭素プラズマ (DLC)を凹面表面に沈着させる。約200 μl アリコットのヒト角膜内皮培養細胞（最終濃度20,000 細胞/ ml）を人工実質に添加し、それを35mm 組織培養ディッシュに入れる。サンプルを2時間37℃、10% CO2中に放置する。次いで、10% ウシ胎児血清および250 ng/ml bFGFを追加したDME-H16を含有する培地2 mlを添加する。ヒト角膜内皮細胞を7日間実施例 5に記載のように増殖させる。細胞が人工角膜の表面積の100%を7日目に被覆すると、ポリマー角膜をPBSで３回すすぎ、移植の準備が整う。
【００５１】
実施例 11:付着または増殖促進剤が埋め込まれ、および凹面表面に低密度ヒト角膜内皮細胞培養物が播種された人工全層角膜代替物
この態様において、バイオポリマーに、付着混合物が埋め込まれるか、その合成の際にその組成に組み込まれる：付着混合物は以下の１以上を含む: フィブロネクチン、濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg〜500 μg/ml、ラミニン、濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg〜500 μg/ml、RGDS、 濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg〜100 μg/ml、ポリカルボフィルと結合したbFGF、濃度範囲ポリマーゲルの1ng〜500ng/ml、ポリカルボフィルと結合したEGF、濃度範囲ポリマーゲルの 10ng〜1000ng/mlおよびヘパリン硫酸、濃度範囲ポリマーゲルの1 μg〜500 μg/ml。バイオポリマーを所望の角膜形状に成形し、その厚さは正常健康ヒト角膜の厚さ約 0.4〜0.8 mmと同じ厚さとするが、必要に応じてより厚くても薄くてもよい。
【００５２】
密度約 2000〜2 x 106細胞/ml、好ましくは 約 20,000  細胞/mlのヒト角膜内皮培養細胞を角膜代替物の凹面表面に導入する。十分な体積のDME-H16含有培地(15% ウシ胎児血清および250ng/ml bFGFを追加、細胞密度20,000  細胞/ml)を25 mm 培養ディッシュの内側にある人工実質の凹面側に添加する。約 2時間、37℃、10% CO2でのインキュベーションの後、2 mlの同じ培地を培養ディッシュに添加して角膜等価物を完全に浸す。培地は一日おきに交換し、250 ng/ml bFGFを培地交換毎に添加する。7〜10日目に、ヒト角膜内皮細胞は人工角膜上で集密状態に達する。人工角膜をPBSで3回すすぐと、移植の準備が整う。
【００５３】
患者の治療のために、本発明では、レシピエント患者から公知の外科技術を用いて損傷角膜を除き、人工全層角膜を移植し、手術その他の手段で該角膜を固定する必要がある。
【００５４】
実施例 12:付着または増殖促進剤が埋め込まれ、および凹面表面上に角膜内皮細胞の低密度培養物が播種された人工半層角膜代替物
この態様において、バイオポリマーにその合成の際に実施例 1に記載の付着混合物を埋め込むか、またはその組成に組み込んだ。バイオポリマーを所望の形状の角膜に成形し、その厚さは正常健康ヒト角膜の厚さである約 0.4〜0.8 mmの半分までとするが、必要に応じてより厚くても薄くてもよい。約 2000〜 2 x 106  細胞/ml、好ましくは 約 20,000  細胞/mlの低密度のヒト角膜内皮培養細胞を人工実質の凹面表面に播種し、細胞を集密に達するまでおよそ7〜10日間増殖させる。人工半層角膜をPBSで3回すすぐと、移植の準備が整う。
【００５５】
この態様における外科手順は、損傷または疾患内皮と薄板状に結合したレシピエント実質の内側半分を取り出し、凹面側に培養ヒト角膜上皮細胞が増殖した半層人工実質に取り替え、手術またはその他の手段で固定することを含む。
【００５６】
実施例 13:付着および/または増殖促進剤が埋め込まれ、凹面表面に飽和密度のヒト角膜内皮培養細胞が播種された人工全層角膜代替物
この態様において、バイオポリマーにその合成の際に実施例 1に記載の付着混合物を埋め込むか、またはその組成に付着混合物を組み込んだ。バイオポリマーを所望の形状の角膜に成形し、その厚さは正常健康ヒト角膜の厚さと等しくする。高密度 (104〜5x106細胞/ml) (106細胞/ml)のヒト角膜内皮培養細胞懸濁液を1- 5% ウシ胎児血清を追加したDME-H16含有培地中に調製する。人工角膜実質に11 mm 冠状のこぎりで穿孔する。約200 μlの細胞懸濁液のアリコットを直径11 mmのボタンの凹面側に添加する。サンプルを37℃、10% CO2で20分〜24時間インキュベートする。人工角膜を次いでPBSで3回すすぐと、移植の準備が整う。
【００５７】
角膜基体の準備が整うと、損傷した角膜ボタンのレシピエントからの除去を公知の外科技術により行い、次いでそれを人工角膜と置換し、手術またはその他の手段によって固定する。
【００５８】
実施例 14:付着および/または増殖促進剤が埋め込まれ、凹面表面に飽和密度のヒト角膜内皮培養細胞が播種された人工半層角膜代替物
この別の態様において、バイオポリマーに実施例 1に記載のように付着混合物を埋め込むか、またはその組成にその合成の際に組み込んだ。バイオポリマーを所望の形状の角膜に成形し、その厚さは正常健康ヒト角膜の厚さの半分までとする。約 104〜5x106  細胞/ml、好ましくは 106細胞/mlの高密度ヒト角膜内皮培養細胞懸濁液を用いて実施例 3に記載したように 直径11 mmの穿孔されたボタンに播種する。インキュベーション期間の後に、角膜代替物をPBS中で３回すすぐと移植の準備が整う。
【００５９】
外科手順は、損傷または疾患内皮に薄板状に結合しているレシピエント実質の内側半分のみを患者から取り出し、それを凹面側に培養ヒト角膜上皮細胞が増殖している半層人工実質によって置換し、新規角膜移植片を手術またはその他の手段により固定することを含む。
【００６０】
実施例 15: RPE 細胞移植術のために眼の網膜下空間に送達すべき培養RPE 細胞の付着のための基盤としての均一な厚さ10〜100 μmのバイオポリマーシート
均一な厚さ範囲約 1〜1000 μm、好ましくは約 10-100 μmの生体適合性ポリマーの薄いシートをRPE 細胞の培養物で被覆する。この工程を達成するために、様々な動物種またはヒト起源の培養RPE 細胞をSTV溶液 (生理食塩水中、0.05% トリプシン、0.02% EDTA)を含む培養ディッシュから剥がす。ほとんどのSTをRPE 細胞が丸くなっているがプレートにまだ付着している間にできるだけ早く除く。STVの薄い膜が未だに残っている培養物を37℃で10% CO2で2-3 分間インキュベートする。RPE 細胞を5 mlの培地 (15% ウシ胎児血清を追加したDME-H16)の添加および1 ml ピペットマンによる穏やかな洗浄により取り出す。細胞懸濁液を密度約 2000〜2 x 106細胞/ml、好ましくは 約 20,000細胞/mlに調整する。25 mm 培養ディッシュの内側にメニスカスが形成されるのに十分な量をバイオポリマーシートの表面に添加する。サンプルを37℃10% CO2で2時間放置する。次いで2 mlの培地 (15% ウシ胎児血清および100 ng/ml bFGFを追加)をディッシュに添加してRPE 細胞が付着したポリマーシートを完全に浸す。シートは培地中に浮遊させておいてよいが、接着剤により底に付着させることも可能である。培地を一日おきに交換し、bFGF 100 ng/mlを培地交換毎に添加する。RPE 細胞は7  10日間で集密に達し、それは倒立顕微鏡による観察により確認できる。シートを網膜下空間における目的の移植物をカバーするよう所望の寸法に切断する。RPE 細胞で被覆されたシートはカニューレにより吸引される。それはシートの上側にあるRPE 細胞とともに折りたたまれる。移植部位を先に記載したように調製した後、シートは損傷領域に沈着する。
【００６１】
別の態様において、培養RPE 細胞はポリマーシート上に高播種密度 (2x106細胞/ml)で沈着し、サンプルは37℃で10% CO2中 2〜24 時間インキュベートする。シートを次いで大容量のBSS (洗浄毎に10 ml)で徹底的に洗浄し(3〜5回)、単層に組み込まれていない過剰の細胞を除く。シートを次いで切断して所望の寸法とし、先に記載したように移植する。
【００６２】
実施例 16:眼の網膜下空間への移植のための培養RPE 細胞の均一な厚さ10〜100 μmによる生分解性バイオポリマーの被覆
均一な厚さ10  100 μmの生分解性ポリマーシートを35mm 培養ディッシュに入れる。培養RPE 細胞を細胞密度約 2000 〜 2 x 106細胞/ml、好ましくは 約 20,000細胞/mlの懸濁液中に先に記載したように調製する。シートがメニスカスを形成するのに十分な体積の細胞懸濁液を添加する。37℃、10% CO2での約 2時間のインキュベーション後、15% ウシ胎児血清および100 ng/ml bFGFを追加したDME-H16含有培地2 mlを添加する。RPE 層を実施例 15に記載したように集密まで増殖させ、RPE 移植を行う。あるいは、生分解性ポリマーシートに、37℃、10% CO2環境中2〜24 時間放置した飽和密度の培養RPE 細胞を沈着させてもよい。インキュベーション後、それを10 mlのBSSで徹底的に洗浄し(5  10回)、実施例 15に記載したように移植する。
【００６３】
実施例 17: 眼の網膜下空間への移植の目的での、付着および増殖促進剤が埋め込まれるか、またはその合成の際に付着および増殖促進剤が組み込まれたバイオポリマーの、培養RPE 細胞による被覆
この態様において、均一な厚さ約 1〜1000 μm、好ましくは約 10 〜100 μmのバイオポリマーに付着および増殖促進剤を埋め込むか、その合成の際に付着および増殖促進剤を組み込む：付着および増殖促進剤は以下の１以上を含む: フィブロネクチン、濃度範囲、ポリマーゲルの1 μg〜200 μg/ml、ラミニン、濃度範囲、ポリマーゲルの1 μg〜200 μg/ml、RGDS、濃度範囲、ポリマーゲルの0.1 μg〜50 μg/ml、ポリカルボフィルと結合したbFGF、 濃度範囲、ポリマーゲルの40ng〜500 ng/ml、ポリカルボフィルと結合したEGF、濃度範囲、ポリマーゲルの100 ng〜1000 ng/mlおよびヘパリン硫酸、濃度範囲、ポリマーゲルの0.1 μg〜100 μg/ml。次いで先に記載したように、培養RPE 細胞を低播種密度で(約 104 〜 5 x 105細胞/ml、好ましくは 約 200,000細胞/ml)ポリマーシート上で先に記載したように7日間増殖させるか、または飽和密度で(約 2x106  細胞/ml)ポリマーシートに沈着させる。次いで移植手順を実施例 15に眼の網膜下空間へのRPE 移植について記載したようにして行う。
【００６４】
実施例 18: 眼の網膜下空間への移植の目的での、付着および増殖促進剤が埋め込まれるか、またはその合成の際に付着および増殖促進剤が組み込まれたバイオポリマーの培養RPE 細胞による被覆 
さらに考えられる別の態様において、約 1〜1000 μm、好ましくは約 10 〜 100 μmの均一な厚さのバイオポリマーに付着および増殖促進剤を埋め込むか、またはその合成の際に付着および増殖促進剤を組み込んでおく：付着および増殖促進剤は以下の１以上を含む: フィブロネクチン、濃度範囲ポリマーゲルの1 μg〜200 μg/ml、ラミニン、濃度範囲 ポリマーゲルの1 μg〜200 μg/ml、RGDS、濃度範囲 ポリマーゲルの0.1 μg〜50 μg/ml、ポリカルボフィルと結合したbFGF、 濃度範囲ポリマーゲルの40ng〜500 ng/ml、ポリカルボフィルと結合したEGF、濃度範囲ポリマーゲルの100 ng〜1000 ng/mlおよびヘパリン硫酸、濃度範囲ポリマーゲルの0.1 μg 〜 100 μg/ml。培養RPEを実施例 15に記載のように低播種密度約 2000〜2 x 106細胞/ml、好ましくは 約 20,000細胞/mlから出発して７日間該生分解性ポリマーシート上で増殖させるか、またはRPE 細胞を飽和密度で(約 2x106細胞/ml)、これもまた実施例 15に記載のように生分解性ポリマーシート上に沈着させる。移植手順を先に記載したように行って、眼の網膜下空間におけるRPEに被覆されたポリマーシートの挿入を達成する。
【００６５】
本発明に記載したように、本発明への多くの改変は、添付の特許請求の範囲に規定の本発明の精神から逸脱することなく当業者に明らかである。
【００６６】
米国特許、特許出願およびその他の上記引用文献の開示は引用によりこの明細書にその全体が開示されているかのように含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図 1は、様々な基体上でのヒト培養内皮細胞の長期連続増殖についての世代曲線を示す。
【図２】図 2は、bFGFの存在下または不在下でのヒト角膜内皮培養細胞の増殖に対する様々な付着因子の効果を示す。
【図３】図 3は、付着剤で被覆された剥皮ヒト角膜ボタン(button)上へのヒト角膜内皮培養細胞の付着の時間曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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