(57)【要約】  本発明は、貴金属層を含む電極を備えた検知デバイスであって、その貴金属層上にニトロレダクターゼ活性を有する生物材料が位置する検知デバイスを提供する。さらに本発明は、（ａ）本発明の第１の態様の検知デバイスおよび参照電極を提供する工程、（ｂ）電極間に電位を印加する工程、（ｃ）電流を測定する工程、（ｄ）検知デバイスと試験する基質物質のサンプルを接触させる工程、および（ｅ）電流の変化を測定する工程を含む、ニトロ基含有化合物を検出する方法を提供する。
2007513622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
貴金属層を含む電極を備えた検知デバイスであって、該貴金属層上にニトロレダクターゼ活性を有する生物材料が位置する検知デバイス。
【請求項２】
前記貴金属層が金、銀、プラチナ、パラジウム、イリジウム、レニウム、ルテニウムおよびオスミウム、またはこれらの合金もしくは混合物からなる群から選択される貴金属からなる、請求項１に記載の検知デバイス。
【請求項３】
前記生物材料が前記貴金属層上に固定されている、請求項１または２に記載の検知デバイス。
【請求項４】
前記生物材料が好ましくは前記貴金属層上に層として存在する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の検知デバイス。
【請求項５】
前記生物材料が複数のイオウ含有官能基を含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の検知デバイス。
【請求項６】
前記生物材料がタンパク質である、請求項１乃至５のいずれかに記載の検知デバイス。
【請求項７】
前記生物材料がニトロレダクターゼ酵素である、請求項６に記載の検知デバイス。
【請求項８】
前記ニトロレダクターゼが、配列番号１または配列番号２に実質的に示す核酸配列によってコードされている、請求項７に記載の検知デバイス。
【請求項９】
前記生物材料が流体透過性のカバー層によって覆われている、請求項１乃至８のいずれかに記載の検知デバイス。
【請求項１０】
前記カバー層がポリカーボネートまたはポリアクリレート材料からなる、請求項９に記載の検知デバイス。
【請求項１１】
前記貴金属層が絶縁性基板上に装着されている、請求項１乃至１０のいずれかに記載の検知デバイス。
【請求項１２】
前記貴金属層が前記生物材料を含まない表面上で１つまたは複数の導電材料、半導体材料または絶縁性材料の層と結合している、請求項１乃至１１のいずれかに記載の検知デバイス。
【請求項１３】
金の層と、その上に自己集合した、酵素活性を実質的に干渉しない前記酵素上の位置に複数のシステイン残基を含むように改変されたニトロレダクターゼ酵素の層とを含む、請求項１乃至１２のいずれかに記載の検知デバイス。
【請求項１４】
前記ニトロレダクターゼ酵素が配列番号３または配列番号５に示す核酸配列の発現産物を実質的に含む、請求項１３に記載の検知デバイス。
【請求項１５】
前記ニトロレダクターゼ酵素が配列番号４または配列番号６に実質的に示すポリペプチド配列を含む、請求項１４に記載の検知デバイス。
【請求項１６】
前記ニトロレダクターゼが電子メディエーターと動作可能に結合している、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の検知デバイス。
【請求項１７】
電気化学セル中に装着された、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の検知デバイスを含む検知システム。
【請求項１８】
前記電気化学セルが前記検知デバイス以外に参照電極を含む、請求項１７に記載の検知システム。
【請求項１９】
前記電気化学セルが対向電極をさらに含む、請求項１８に記載の検知システム。
【請求項２０】
（ａ）請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の検知デバイスおよび参照電極を提供する工程、
（ｂ）該電極間に電位を印加する工程、
（ｃ）電流を測定する工程、
（ｄ）前記検知デバイスと試験する基質物質のサンプルを接触させる工程、および
（ｅ）電流の変化を測定する工程
からなる、ニトロ基含有化合物を検出する方法。
【請求項２１】
工程（ｅ）で得た値からブランク電極を用いて測定した電流の変化を引く工程（ｆ）をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）と（ｂ）の間に測定溶液中に前記検知デバイスを配置する工程をさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
天然酵素中に存在しないシステイン残基であって、酵素の構造中に組み込まれる複数のシステイン残基を含むように改変されたニトロレダクターゼ酵素を含むタンパク質。
【請求項２４】
システイン残基に関する複数のコドンを加えることによって改変されたニトロレダクターゼ遺伝子を含む、単離核酸配列。
【請求項２５】
配列番号１または配列番号２に本質的に示す核酸配列によってコードされた、請求項２３に記載のニトロレダクターゼ酵素。
【請求項２６】
（ａ）ニトロレダクターゼ遺伝子を発現させるためのプロモータ、
（ｂ）システイン残基に関する複数のコドン、および
（ｃ）ニトロレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列
を含む、核酸構築体。
【請求項２７】
配列番号３または配列番号５に示す核酸配列、前記配列の逆相補配列、前記配列の相補配列、前記配列の逆配列、または前記配列のいずれか１つの核酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２６に記載の核酸構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、ニトロ化合物を検知する方法および改変酵素自体に関する。排他的にではないが詳細には、本発明は、爆発性物質を検出する際に有用なバイオセンサ、ニトロ化合物を検出する方法および改変酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にバイオセンサは、サンプル中の所望の化合物（分析物）を認識し、解析してサンプル中の化合物の濃度を測定することが可能であるシグナルを生成する１群のデバイスからなる。大部分のバイオセンサは、特異的な分析物、すなわち限られた範囲の分析物を、分離または単離を必要とせず識別するそれらの能力に基づくものである。例えば、血液または水サンプル中の特異的な化合物の存在を直接検出することが可能であり、したがって対象の分析物を回収するための冗長または複雑な精製工程の必要性のないバイオセンサが知られている。
【０００３】
多くのバイオセンサは、認識システムと電気化学変換器または光変換器との組み合わせを利用して、その認識システムが分析物を認識すると、電気化学信号もしくは光信号またはインパルスを生成し、次いでそれを分析物の濃度測定において使用する。バイオセンサで使用される電気化学的変換器には、電位差測定変換器機構および電流測定変換器機構がある。光学系変換器機構には、蛍光、リン光および単色変化がある。
【０００４】
電位差測定バイオセンサでは、電極の表面上における電荷密度の蓄積を測定し、これはバイオセンサに曝される分析物の濃度を表す。電流測定センサでは、生物系と電極の間で交換される電子が電流を生成し、この電流をモニターすることによりそれらのサンプル中の分析物の濃度を測定することができる。電流測定センサは、血中グルコースおよびエタノール用のセンサ、ならびに生物学的に重要な化合物を調べる他のデバイスにおいて一般に使用されている。多くのバイオセンサでは、生物学的認識分子がセンサの一部となる。生物学的認識分子は、核酸配列、ＲＮＡ、あるいはさらに一般的に酵素または抗体などのタンパク質であってよい。生物学的認識分子は特異的な分析物、すなわち限られた範囲の分析物と結合し、したがって特異的な分析物の選択的な検出に理想的に適合する。
【０００５】
電荷の移動は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨなどの低分子量の酸化還元コファクターによって、あるいはタンパク質の酸化還元中心の直接的な相互作用によって、行われる。両方のタイプの生化学的な電荷移動反応が、酸化還元電極と以前から組み合わされてきている。電気化学は、酵素に関係する酸化還元化学を試験するための有用なツールを与える。酵素と電極の間の電子の移動を評価するために使用することができる方法は、電子伝達のコファクターとして働く小さな酸化還元分子を使用する間接的な方法である。電子伝達共役のスキームは図１に示した。ここでは、基質の酸化（または還元）に関する酵素（Ｅ０／ＥＲ）反応は、最終的な電子受容体（または供与体）としての電極によるコファクター（Ｃ０／ＣＲ）の電気化学的還元（または酸化）と関係している。基質の酵素触媒型の電気化学的酸化（または還元）は、生物電気触媒反応と呼ばれる。
【０００６】
酵素電極は、任意の電気化学的プローブ（電流測定、電圧測定または電気伝導度測定）と固定化酵素の薄層（１０〜２００μｍ）との組み合わせである。これらのデバイスでは、酵素の機能は、特定の基質分子に対するその生物学的親和性により選択性を与えることである。
【０００７】
しかしながら、多くの生物学的認識分子をバイオセンサに取り付ける際には、幾つか
の問題がある。酵素および抗体などの多くの生物学的認識分子には、分析物を生物学的認識分子と結合させるために分析物に対して提示しなければならない「活性部位」がある。多くの生物学的認識分子に関して、バイオセンサへの取り付けは、活性部位を覆い隠すかあるいは妨げる可能性があり、したがって生物学的認識分子の有効性を低下させ、あるいは場合によっては、不活性化させることがある。
【０００８】
多くの爆発性物質および化学肥料などの爆発性物質の前駆体中に存在するニトロ化合物の検出に対する関心が高まっている。
以前の戦争からの埋れた弾薬の検出に関してのみ関心が高まっているのではなく、人間の身体、人間の所有物、乗り物および建造物における爆発性物質の検出にも関心が高まっている。
【０００９】
埋れている弾薬または不発弾に関しては、爆発性物質が埋れている領域にいる公共建設事業のメンバーは、爆発性物質が存在することに全く気付かずに、不発弾を掘り起こしたり、踏んだりする大きな危険が存在する。
【００１０】
埋れている爆発性物質を含むと考えられる地面に、爆発性物質を検出するために利用可能なシュードモナス種またはバチルス種の改変型生物を噴霧する、幾つかの検知システムが現在存在しており、これらは例えば特許文献１に記載されたシステムを含む。土壌中の爆発性蒸気の濃度を増大させるために、地面を軽く照射してから、生物を地面に噴霧する。このシステムは比較的高価であり、作物噴霧航空機、噴霧用デバイスおよび照射用デバイスの形の機器を必要とする。さらに、検出可能なシグナルを得るには、地面は、相当量の改変型生物が表面に噴霧されることを必要とする。
【００１１】
特許文献２および特許文献３では、ニトロレダクターゼ酵素自体を精製し、これを使用して、あるいは他の場合は熱量測定法によって、土壌サンプル中の硝酸塩を検出する。これらの特許で使用されているニトロレダクターゼは、ＰＥＴＮのみに特異的なペンタエリトリトールテトラニトロレダクターゼである。さらに、検出することが可能である硝酸塩の濃度レベルは比較的高く、検出を行うためには、土壌サンプルを地面から取り出さなければならず、比較的時間のかかる複雑なアッセイ手順で取り出さなければならない。
【００１２】
したがって、土壌または他の地面の物質中、あるいは物質のサンプル中で、ｉｎ  ｓｉｔｕで爆発性物質を検出することができる、バイオセンサを提供することが有利であると思われる。
【００１３】
さらに、少なくともナノモル、しかしながらさらに好ましくはピコモル濃度範囲を検出することができる、爆発性物質および化学肥料中に一般に存在するニトロ化合物のための、非常に感度の良い検出システムを提供することが有利であると思われる。
【特許文献１】米国特許第５９７２６３８号
【特許文献２】ＷＯ第９７／０３２０１号
【特許文献３】イギリス国特許第２３０３１３６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本明細書で明確に開示するものであろうとなかろうと、従来技術の少なくとも１つの問題を克服または軽減することが、本発明の好ましい実施形態の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、貴金属層を含む電極を備えた検知デバイスであって、その貴金属層上にニトロレダクターゼ活性を有する生物材料が位置する検知デバイスを提供
する。
【００１６】
貴金属層は金、銀、プラチナ、パラジウム、イリジウム、レニウム、ルテニウムおよびオスミウム、またはこれらの合金もしくは混合物からなる群から選択される貴金属を含むことが好ましい。貴金属は金、プラチナ、あるいはこれらの合金もしくは混合物であることがより好ましいが、金であることが最も好ましい。
【００１７】
貴金属層は少なくとも１つの上部表面および底部表面を含むことが好ましく、生物材料は、上部表面および底部表面の１つに位置することが適切である。
生物材料は、貴金属層上に固定されていることが好ましい。生物材料は、貴金属層上に層として存在することが好ましい。生物材料の層は、自己集合層であることが好ましい。
【００１８】
生物材料は複数のイオウ含有官能基、好ましくはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含むことが適切である。
生物材料はタンパク質であることが適切である。タンパク質は酵素、抗体、受容体、抗体断片、または結合タンパク質から選択されることが適切であるが、酵素であることが最も好ましい。
【００１９】
酵素はニトロレダクターゼであることが好ましい。
ニトロレダクターゼは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のｎｆｎＢ遺伝子（配列番号１）、またはＰｓｅｕｄａｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｐｎｒＡ遺伝子（配列番号２）よってコードされることが適切である（天然酵素は本明細書では以後それぞれ「ｎｆｎＢ」および「ｐｎｒＡ」と呼ぶ）。ニトロレダクターゼは、配列番号１または配列番号２に実質的に示す核酸配列によってコードされていることが適切である。
【００２０】
生物材料は、好ましくは膜の形態の流体透過性カバー層によって覆うことが可能である。カバー層はポリカーボネートまたはポリアクリレート材料を含むことが可能であり、好ましくは１μｍと１００μｍの間の厚さ、より好ましくは５μｍと５０μｍの間、さらにより好ましくは８μｍと３０μｍの間、および最も好ましくは１０μｍと２０μｍの間である。
【００２１】
貴金属層は、絶縁性基板上に装着されていることが好ましい。絶縁性基板はガラス、石英、シリコン、絶縁性ポリマー、プラスチック、およびこれらの混合物から選択することが可能である。
【００２２】
貴金属層は、生物材料を含まない表面上で導電材料、半導体材料または絶縁性材料の１つまたは複数の層と結合することが可能である。導電材料または半導体材料には、金属、合金、カーボン・ペースト、グラファイト、および導電ポリマー、例えばポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリピリミジンなどがある。存在するとき、１つまたは複数の他の層が、貴金属層と絶縁性基板の間に位置することが可能である。
【００２３】
特に好ましい例では、検知デバイスは、金の層と、その上に自己集合した、酵素活性を実質的に干渉しない酵素上の位置に複数のシステイン残基を含むように改変されたニトロレダクターゼ酵素の層とからなる。
【００２４】
ニトロレダクターゼは、６個のシステイン残基（「Ｃｙｓ6」タグ）がＮ末端に挿入さ
れている、大腸菌  Ｋ１２  ｎｆｎＢ遺伝子を含むｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドのＴ７プロモータとＴ７ターミネータの間のヌクレオチド配列を含む、配列番号３に示す核酸配列の発現産物を実質的に含み得る。
【００２５】
他の好ましいニトロレダクターゼは、Ｃｙｓ6タグがＮ末端に挿入されている、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＪＬＲ１１  ｐｎｒＡ遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）のＴ７プロモータとＴ７ターミネータの間の核酸配列である、配列番号５に示す核酸配列の発現産物を実質的に含む。
【００２６】
配列番号３および配列番号５のアミノ酸翻訳産物を、それぞれ配列番号４および配列番号６に示す。改変ニトロレダクターゼは、配列番号４または配列番号６に実質的に示すポリペプチド配列を含むことが適切である。
【００２７】
ニトロレダクターゼは、例えばフェロセン、フタロシアネートなどの電子メディエーターと動作可能に結合させてもよい。
本発明の第２の態様によれば、電気化学セル中に装着された本発明の第１の態様の検知デバイスを含む検知システムが提供される。
【００２８】
電気化学セルは、検知デバイス以外に参照電極を含むことが好ましい。電気化学セルは、参照電極と対向電極の両方を含むことがより好ましい。
参照電極は、カロメル電極（標準カロメル電極（ＳＣＥ））、Ｈｇ／Ｈｇ２Ｃｌ２電極および／またはＡｇ／ＡｇＣｌ電極、または任意のこれらの組み合わせを含み得る。例えばディスク、ワイヤー、ロッド層などの、さまざまな形で製造することが可能であるため、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が好ましい。
【００２９】
電気化学セルは、例えばガラス、ポリスチレンなどから構築されるハウジングを含み得る。
検知システムは、例えばボルタメーター、アンペアメーター、サイクリック・ボルタメーターなどの、測定装置と動作可能に結合することが可能である。
【００３０】
本発明の第３の態様によれば、
（ａ）本発明の第１の態様の検知デバイスおよび参照電極を提供する工程、
（ｂ）電極間に電位を印加する工程、
（ｃ）電流を測定する工程、
（ｄ）検知デバイスと試験する基質物質のサンプルを接触させる工程、および
（ｅ）電流の変化を測定する工程を含む、ニトロ基含有化合物を検出する方法を提供する。
【００３１】
この方法は、工程（ｅ）で得た値からブランク電極を用いて測定した電流の変化を引くさらなる工程（ｆ）を含むことが可能である。ブランク電極は、生物材料を含まないかあるいは不活化した生物材料を含む、本発明の第１の態様の検知デバイスであってよい。
【００３２】
本発明の第１の態様の検知デバイスの物理的な形に応じて、工程（ａ）と（ｂ）の間に測定溶液中に検知デバイスを配置する工程が存在してよい。この場合、工程（ｄ）は、試験する材料のサンプルを測定溶液に加えることを含んでもよい。
【００３３】
本発明の第４の態様によれば、酵素の構造中に組み込まれる複数のシステイン残基を含むように改変されたニトロレダクターゼ酵素を含むタンパク質を提供する。
本発明の第５の態様によれば、システイン残基に関する複数のコドンを加えることによって改変されたニトロレダクターゼ遺伝子を含む、単離核酸配列を提供する。
【００３４】
ニトロレダクターゼ遺伝子は、大腸菌Ｋ１２  ｎｆｎＢ遺伝子およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＪＬＲ１１  ｐｒｎＡ遺伝子から選択されることが適切である。ｎｆｎＢおよびｐｎｒＡ遺伝子に関する核酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号
２として示し、ニトロレダクターゼ遺伝子は、配列番号１および配列番号２に実質的に示す核酸配列によってコードされることが好ましい。システインのコドンは、核酸の３’端の領域、あるいはその中に組み込まれることが適切である。
【００３５】
本発明の第６の態様によれば、
（ａ）ニトロレダクターゼ遺伝子を発現させるためのプロモータ、
（ｂ）Ｃｙｓ残基に関する複数のコドン、および
（ｃ）ニトロレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列
を含む、核酸構築体を提供する。
【００３６】
ニトロレダクターゼ・プロモータは、ｐＥＴ−２８ａ（＋）由来のＴ７プロモータであることが適切である。
構築体はｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドを含むことが適切である。
【００３７】
構築体は、配列番号３または配列番号５に示す核酸配列、前記配列の逆相補配列、前記配列の相補配列、前記配列の逆配列、または前述の配列のいずれか１つの核酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を実質的に含むベクターであることが好ましい。
【００３８】
用語「少なくとも６０％の同一性」を使用することによって、したがって、本発明は特定の例示的なヌクレオチド配列を超える使用を含むと理解される。以下のいずれかを生じさせる、配列中の欠失、挿入、または置換などの配列に対する改変：
ａ）タンパク質分子の機能性には実質的に影響を与えない「サイレント」変化。例えば、遺伝コードの縮重を表すか、あるいは所与の部位に化学的に均等なアミノ酸の生成をもたらす、ヌクレオチド配列の変化が企図されるか、または：
ｂ）活性の改善または基質特異性の改変の助長することも企図される。
【００３９】
配列番号１または２の８０％を超える、好ましくは８５％を超える、より好ましくは９０％を超える、最も好ましくは９５％を超える同一性を有する、ヌクレオチド配列の改変が想定される。
【００４０】
ニトロレダクターゼ中へのシステイン残基の組み込みは、貴金属電極上へのニトロレダクターゼの効率の良い組み込みを可能にし、これがピコモル濃度範囲までのニトロ化合物検出の感度をもたらすことが、驚くことに見出されている。最もよく知られているニトロ化合物検出システムは、ナノモル範囲のみまでの検出しか可能にせず、システイン結合を介してニトロレダクターゼと貴金属電極を結合させることによって、電極上の酵素の最適な配向が可能となり、増大した感度をもたらすと考えられる。酵素に導入したシステイン残基を介した、貴金属電極上へのニトロレダクターゼの固定も、比較的安価で簡単である。生成する検知デバイスは多数回再使用することが可能であり、ｉｎ  ｓｉｔｕ、または現場で使用して、地面に埋れた爆発性物質、または疑いのある爆発性物質を含む物質から採取したサンプル中に埋れた爆発性物質を検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明をよりよく理解するため、およびどのようにして同じ実施形態を実施することが可能であるかを示すために、ここで本発明を、添付の図面を参照することによって例としてのみ記載する。
【００４２】
（実施例１）
大腸菌Ｋ１２由来の改変ｎｆｎＢ遺伝子を含むプラスミドの調製。Ｃｙｓ6タグに関す
るコドンを加えることによって改変した大腸菌Ｋ１２由来のｎｆｎＢ遺伝子を含むプラスミドを以下の方法で調製した。
１．１  元のＤＮＡ鋳型を得るための手順
ＤＮＡ鋳型は、エッペンドルフ・チューブ中のＴＥバッファーｐＨ７．５（トリス−Ｃｌ、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））（１００μｌ、１％）の溶液中に、大腸菌Ｋ１２細胞を導入することによって調製した。生成した懸濁液を完全に混合し、５分間沸騰させて細胞構造を破壊し、溶液中にＤＮＡを放出させ、次いで氷上で冷却し、２分間遠心分離した。他に述べない限り、１４０００ｒｐｍで作動するように遠心分離を設定した。
【００４３】
１．２  ニトロレダクターゼＤＮＡ用のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコル
このＰＣＲプロトコルは、製造者の教示書に従い標準的な市販のキット（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ（商標）、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、英国）を使用する。
【００４４】
鋳型ＤＮＡ（大腸菌Ｋ１２）（１μｌ）を、配列番号７（５μｌ）、および配列番号８（５μｌ）に一致するプライマーを用い、標準的手順を使用するＰＣＲによって増幅させた。
【００４５】
以下の形式で進行するようにＰＣＲ系をプログラムした。この系は５分間９５℃に保ち、ＤＮＡポリメラーゼを活性化させた。その後の温度周期は、ＤＮＡ鎖を分離させるために９４℃で３０秒間、プライマーを用いてアニーリングするために６２℃で１分間、二本鎖ＤＮＡを複製させるために７４℃で２分間からなっていた。
【００４６】
この順序を３５サイクル繰り返し、その後温度を７４℃に保って、あらゆる不完全な二本鎖を完全な状態にすることを可能にした。次いで、溶液の等分試料を、臭化エチジウムを含む１×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー、ｐＨ８．２中１％アガロース・ゲルにかけた。臭化エチジウムは、同じゲル中にかけた分子サイズが既知のＤＮＡ断片を含むサンプルと比較することによって、ＤＮＡの分子量および精度を決定することを可能にする染色色素として働く。以下の他の酵素反応混合物の調製において、ＰＣＲ由来の残りのＤＮＡを精製して、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および塩を除去した。
【００４７】
１．４  ニトロレダクターゼ遺伝子のクローニング
連結反応は、プラスミド中へのＤＮＡの組み込みである。プラスミドと挿入ＤＮＡの両方が、一本鎖の粘着末端を切り離す２つの異なる制限酵素によって切断される場合に、プラスミド中への外来性ＤＮＡの連結反応の優れた効率を得ることが可能である。したがって、ＤＮＡは、ただ１つの所定の方向に連結する。
【００４８】
ＰＣＲ産物（５μｌ）を、適切な制限酵素（それぞれ２μｌ）、精製水（２μｌ）、および１０×の適切な制限バッファー溶液（１μｌ）と混合した。分離溶液は、発現プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）（５μｌ）（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、英国；図２および３）で構成されていた。Ｔ７プロモータとＴ７ターミネータの間の領域を図３に示す。これを同じ２つの制限酵素（それぞれ１μｌ）および第３の制限酵素ＥｃｏＲＩ（１μｌ）、精製水（１μｌ）、および１０×のバッファー溶液（１μｌ）と混合した。ＥｃｏＲＩによる消化によって、ｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドは挿入体無しには再連結しないことが確実になる。それぞれの溶液を３７℃で１時間インキュベートして、制限酵素による消化を行わせて、その後それぞれをセクション１．３に従い浄化した。いずれも真空下で乾燥させ、精製水（４μｌ）に再溶解させた。
【００４９】
次いで、この２つの溶液を混合し、ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）、およびリガーゼ１０×バッファー溶液（１μｌ）を加えた。次いで、この溶液を、連結反応工程用に一晩１６℃に保った。ｐＥＴ−２８（ａ）（＋）のＴ７プロモータとＴ７ターミネータの間のＰＣＲ
産物の連結反応が成功したかどうかを調べるために、連結反応混合物の等分試料を、前記と同様に適切な制限酵素（それぞれ１μｌ）で消化し、アガロース・ゲル電気泳動にかけた。
【００５０】
残りの連結反応混合物は、プラスミド維持に有効な大腸菌菌株であるコンピテント大腸菌ＤＨ５αの細胞（２００μｌ）と混合させた。組換えプラスミドをコンピテント細胞に形質転換するために、混合物を氷上に３０分間放置し、次いで正確に５０秒間４２℃に加熱し、次いで２分間氷に戻した。得られた培養物をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地（５００μｌ）に加え、３７℃で４５分間インキュベートし、次いでペトリ皿に施した。
【００５１】
１．５  コロニーの増殖
固体培地は、抗生物質カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天からなっていた。カナマイシン耐性遺伝子がｐＥＴ２８ａ（＋）の必須部分であるため、この培地は組換えプラスミドを有する細菌のみを増殖させる。形質転換した大腸菌の培養物を、異なる濃度の範囲でプレート上に広げた。増殖させた単コロニーは、次いでカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む液体ＬＢ培地（５ｍｌ）に移し、３７℃で一晩増殖させた。
【００５２】
遠心分離後、ペレットとして細胞を分離した後に、組換えプラスミドを一晩培養物から単離した。標準的なＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、英国）を使用して、製造者の教示書に従いプラスミドを精製した。
【００５３】
１．７  Ｃｙｓ6配列の組み込みに関するＰＣＲプロトコル
鋳型ＤＮＡとして精製ｐＣＤＧ１を使用することによって、ＰＣＲに関するプロトコルを、配列番号９および配列番号８に適合させた設計プライマーを使用して繰り返した。これらは、遺伝子が発現されると、Ｃｙｓ6のアミノ酸配列がタンパク質のＮ末端、ｐＥＴ
２８ａ（＋）によって決定したＨｉｓ6−タグとニトロレダクターゼの開始コドンの間に
加えられるように、ニトロレダクターゼの３’端にＣｙｓに関する６個の隣接コドンを含む。改変遺伝子をクローニングするため、それを大腸菌ＤＨ５αに形質転換するため、およびそれを精製するために、前記と同じプロトコルを使用した。生成したプラスミドはｐＭＫＳ２と名付けた。
【００５４】
（実施例２）
実施例１で調製したプラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）中に位置する改変ｎｆｎＢ遺伝子によってコードされる、セクション１．７で調製したＣｙｓ6改変ニトロレダクターゼ酵
素の発現
２．１  酵素の発現
セクション１．４のプロトコルを使用して、実施例１で調製したプラスミド（２μｌ）を、異種遺伝子を発現させるのに有効な細菌である、大腸菌のＲｏｓｓｅｔｔａ菌株のコンピテント細胞（２００μｌ）に形質転換した。
プラスミドを含む細菌を、０．６の光学濃度（Ｏ．Ｄ．6００ｎｍ）が得られるまで、
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を加えた５００ｍｌのＬＢ中において３７℃で一晩増殖させた。クローニング遺伝子の発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（２ｍｌ、０．１Ｍ：０．４ｍＭ（最終））を加えることによって誘導し、３７℃でさらに４時間増殖させた。
【００５５】
次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を採取し、生成したペレットは氷上に置き、蒸留水を用いて５０ｍｌにしたリン酸バッファー（ｐＨ７．４、６．２５ｍｌ、０．１Ｍ）、およびイミダゾール（２Ｍ、０．２５ｍｌ）からなるイミダゾール溶液（１０ｍＭ、１０ｍｌ）に再懸濁させた。次いで生成した懸濁液を３０秒間４回で超音波処理して、溶液の過熱を避けながら細胞を破壊した。次いで溶液を遠心分離した（３
５０００ｒｐｍ、５℃、４５分間）。生成する溶液はニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）を含み、ペレットは細胞残骸を含む。次いで溶液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に施して、タンパク質が過剰生成され、その分子量が予想通りであったかどうかを調べた。
【００５６】
２．２  酵素精製プロトコル
工学設計したタンパク質はそのＮ末端にＨｉｓ6タグを有し、ニッケル−アガロース・
カラムを介して溶液を溶出することによってタンパク質を精製するのが容易になり、この場合、ヒスチジン残基は樹脂に埋め込まれたＮｉ２＋と結合する。Ｈｉｓタグをつけた標的タンパク質は、したがってニッケル−アガロース・カラム上で選択的に保持され、Ｎｉ結合部位に関して競合しタンパク質を排除するイミダゾールを用いて溶出することが可能である（競合によって除去することが可能である）。
【００５７】
カラムからの溶出用に、イミダゾール溶液（８ｍｌ）を、滅菌濾過済み蒸留水中に５０ｍＭ〜１．０Ｍの高濃度で調製した。
細胞の抽出物を、１０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸バッファーを溶かしたカラムに加えた。段階的な量で増大するイミダゾール濃度を使用して、製造者の教示書（アメルシャム  バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国）に従い溶出を行った。それぞれの溶出物は１ｍｌサンプル（それぞれの濃度に関して５個）中に回収して、希釈は避けた。最後に、カラムを残りの結合バッファー（４ｍｌ）で洗浄し、再使用のために５℃未満に保存した。２ｍｌのそれぞれの溶出物を、サンプルの流過液および誘導未精製サンプルと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに施した。
【００５８】
２．３  タンパク質からのイミダゾールの除去
溶出段階からのイミダゾールは、酵素溶液中に残っている。以下に述べるようにそれを除去し、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）を、電極表面上で使用するために用意したトリスバッファーｐＨ７．２に再懸濁させた。脱塩およびバッファー交換のために使用する５ｃｍの床高を有し８．５ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５  Ｍｅｄｉｕｍを含む比重作動ポリプロピレン・カラムである、ＰＤ−１０脱塩カラム（アメルシャム  バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国）を、製造者の教示書に従い使用した。
【００５９】
（実施例３）
酵素活性の特徴付け。実施例１で調製した改変ニトロレダクターゼ酵素の活性は、以下のように好ましかった：
３．１  ニトロレダクターゼ・アッセイ
ＵＶアッセイおよび関連スペクトル測定を、２５℃において蒸留水を用いて１ｍｌにした、バッファー、トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４（５０ｍＭ、５００μｌ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ、１００μｌ）、芳香族ニトロ化合物（基質、さまざまな濃度）、およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）（１ｍＭ、５μｌ）を有するキュベット中で、セクション２．３の最後で得たＮＴＲ溶液（＝約１．０μＭ（最終）、１０μｌ）について行った。
スペクトルは、１分のスキャンを生じさせる５００ｎｍ間、２２０〜５００ｎｍ／分のスキャン率で回収し、アッセイはＵｖｉｋｏｎ９４３複光束型分光光度計を使用して、それぞれ２分間３４０ｎｍで行った。スペクトルおよびアッセイのパラメータは、他に述べない限り前述したものと同様である。他に述べない限り、全てのスペクトル測定は、前に詳細に述べたアッセイ溶液からなるがニトロレダクターゼを欠くブランクに対して行い、全てのアッセイ測定は、基質を欠くアッセイ溶液からなるブランクに対して行った。
【００６０】
（実施例４）
実施例２の改変ニトロレダクターゼを使用する酵素バイオセンサの調製
４．１  紫外可視分光測定用の金シートの調製
改変酵素はチオール基を介して金基板に固定することが可能であり、固定後に活性状態に保つことが可能であるという概念を証明するために金を使用した。金のシートは、濃硫酸と濃硝酸の５０：５０混合物中で一晩洗浄した。脱塩および非脱塩形のＣｙｓタグをつけたＮＴＲ酵素を、それぞれ／別々に３ｍｍ×５ｍｍのスライド上に吸着させた。金シートはニトロレダクターゼ溶液中に２４時間放置し、次いでバッファー（ｐＨ７）に浸して、残留タンパク質を除去した。
４．２  電気化学的手順
Ａｕｔｏｌａｂ  ＰＧｓｔａｔ３を使用して電気化学的測定を行った。飽和カロメル参照電極（ＳＣＥ）およびプラチナ・メッシュ対向電極を使用する３電極セルを用いて分析を行った。全てのガラス製品は濃Ｈ２ＳＯ４：ＨＮＯ３の５０：５０混合物を使用して洗浄し、次に精製水ですすぎ、蒸気浴中で洗浄し、オーブン中で乾燥させた。作用電極は、適切な酵素の自己集合層を有する金スライドであった。
【００６１】
このセルは、コファクターであるフェロセンジカルボン酸（５０μＭ）と混合したリン酸ナトリウム・バッファーｐＨ７．１（２０ｍｌ、０．１Ｍ）を含んでいた。基質の添加は、セルの上部を介して所望量および濃度をピペット処理することによって行った。
【００６２】
４．３  電気化学的測定用の金コーティングしたガラススライドの調製
Ｇｏｌｄ  Ａｒｒａｎｄｅｅ（商標）／Ａｕ（１１１）から得た金コーティングしたガラススライドは、厚さ１．１＋／−０．１ｍｍ、ガラススライドの大きさ１１×１１＋／−０．２ｍｍである、ホウ珪酸ガラス（ＡＦ４５）基板を使用する。この特別なガラス基板は、火炎焼きなまし手順に非常に適しており、これを使用してＡｕ（１１１）テラスを得る。クロムの薄い（２．５＋／−１．５ｎｍ）接着層を、ガラス表面に施す。この層は、金の層とガラスの最適な接着を保証する。この薄いクロム層の上部に、２５０＋／−５０ｎｍの厚さである最終的な金の層を施す。
【００６３】
使用前に、金コーティングしたガラススライドに、それらが赤い熱を得るまで数回、ブンゼン・バーナー中で火炎焼きなましを施した。短時間空気中で冷却した後、ガラススライドは超純水中で冷却した。次いでガラススライドを５℃において２４時間酵素含有溶液中に浸して、酵素の層を自己集合させた。次いでそれぞれのガラススライドを、電気化学セルに移す前にトリス−バッファー中で洗浄した。
【００６４】
５．１  アッセイ結果
４−ニトロ安息香酸（６２５μＭ）を含むバッファー溶液に対するニトロレダクターゼの影響を、紫外可視分光測定を使用して評価した。ニトロレダクターゼ（１０μｌ）は施行２の前にキュベットに入れた。結果は図４に示す。
【００６５】
これらのスキャンは、第２回目のスキャンにおける３４０ｎｍでの吸光度の強度の低下、次に後のスキャンにおける−０．２９吸光度単位（ａ．ｕ．）までの吸光度の低下を示す。３００ｎｍでのピーク（４−ニトロ安息香酸）は、ニトロレダクターゼの導入および対応する吸光度のために第２回目のスキャンにおける強度を増大し、次いで後のスキャンにおける強度を減少させた。多量のニトロレダクターゼを使用することによって、対応するＮＡＤＰＨ転換の増大がもたらされ、ニトロレダクターゼがＮＡＤＰＨの酸化を担うことが示された。
【００６６】
基質として、４−ニトロトルエン、２，４−ジニトロトルエン、硝酸２−エチルヘキシルおよびニトロベンゼンは良い基質であり、一方で４−ニトロ安息香酸、１，２−ジニトロベンゼンおよび２，４−ジニトロエチルベンゼンは優れた基質であった（図５）。
【００６７】
本明細書で前に調製したようにシステインタグを有する、脱塩および非脱塩形のタンパク質ＮｆｎＢ−ｃｙｓ１ニトロレダクターゼを金スライド上に吸着させ、２，４−ジニトロエチルベンゼン（ＤＮＥＢ）（６２０μｍｏｌｅ）に対する活性のスキャンを評価した。それらの結果は図６Ａおよび６Ｂに示し、それらは脱塩酵素による有効な触媒を明らかに示す（図６Ａ）。
【００６８】
酵素触媒反応において生成される酸化した形のＮＡＤＰ＋は、電気化学的に生物活性がある形のＮＡＤＰＨには立体化学的に還元し得ないため、ＮＡＤＰＨは電気化学セルにおける有効なコファクターではない。この理由のため、フェロセンジカルボン酸（１μｍ）を使用してこの問題を排除した。何故ならフェロセンジカルボン酸は、優れた電気化学的可逆性を示すからである。これらの結果は、３００μｍのＤＮＥＢおよびニトロレダクターゼを使用して図７に示す。
【００６９】
フェロセンジカルボン酸の酸化は、２８０ｎｍでの経時的に低下した吸光度において見ることができ、フェロセン誘導体は酵素反応によって酸化され、したがってニトロレダクターゼのコファクターとして使用することが可能であることを示す。
【００７０】
５．２  ニトロレダクターゼの特異的活性
ニトロレダクターゼの特異的活性を、異なるニトロレダクターゼ濃度と関係がある異なる濃度の基質における割合を計算することによって評価した。大腸菌由来のＨｉｓタグづけしたニトロレダクターゼ（ＮｆｎＢ−ｈｉｓ１）およびさらなるＣｙｓタグづけした改変酵素（ＮｆｎＢ−ｃｙｓ１）用に使用した好ましい基質は、２，４−ジニトロエチルベンゼン（３１μＭ）であった。タンパク質濃度は、３つのキュベット、対照、標準（５００ｍｇ／ｌ）、およびニトロレダクターゼのサンプル中にミクロ・タンパク質ＰＲ（商標）試薬（１ｍｌ）を置くことによって計算した。手順に従い６００ｎｍにおいてＵＶ測定値を得た。未精製タンパク質を精製タンパク質と比較した。それぞれ５、１０、１５、および２０μｌの体積のタンパク質に関して４回実施した。
【００７１】
精製前の酵素ＮｆｎＢ−ｈｉｓ１に関する活性は０．２２μモル／分／ｍｇであり、これは精製後に４．６５μモル／分／ｍｇに上昇した。したがって、精製によっておよそ平均２０倍の活性の増大を得て、酵素は未精製溶液のわずか７．６％を占めていた。関連する特異的活性は、表１に表す。
【００７２】
【表１】
2007513622.tif 000003
Ｃｙｓ6タグ（ＮｆｎＢ−ｃｙｓ１）を有するタンパク質は、Ｃｙｓ残基を挿入するこ
とによって平均約３７％まで活性が低下したことを示した。Ｃｙｓタグを含むタンパク質溶液からイミダゾールを除去した後、タンパク質はその本来の活性の約８６％を保持していた。
【００７３】
５．３  ニトロレダクターゼのＫｍおよびＶmax  ＫｍおよびＶmax値を計算するために、図８に示したように濃度が増大する基質に対する□□分／ｍｇの活性のプロットを構築した。
【００７４】
得られたデータを使用して、酵素反応速度論および実践ソフトウェア・パッケージ（Ｅｎｚｐａｃｋ）によって直接線形法からＫｍおよびＶmax値を計算した。生じたデータを
平均し、これは以下の表２に示すように６８％の信頼水準で得られた。
【００７５】
【表２】
2007513622.tif 000004
ＫｍおよびＶmaxの値はそれぞれの酵素に特異的であるが、比Ｖmax／Ｋｍを使用して、表２中に示した酵素の有効性を比較することが可能である。酵素の有効性は基質と酵素の分散比によって、および酵素の活性部位で起こる化学的事象によって最終的に制限される。
【００７６】
代謝回転数（Ｋcat）として知られる、単位時間当たりで生成物に転換される基質のモ
ル数によっても、酵素間の比較が可能である。代謝回転数は、以下の等式から計算することが可能である：
Ｖmax＝Ｋcat［ＥＴｏｔ］  ２つの改変ＮｆｎＢに関する基質の平均Ｋcatは、６．４
×１０２ｍｏｌ／分／モルの酵素であった。
【００７７】
５．４  バイオセンサの評価；電圧測定の結果
サイクリック・ボルタモグラムを、非改変型金電極および脱塩酵素溶液を用いて改変した金電極に関して得た；作用電極と電解質溶液の間に、０．６ｃｍ２の幾何面積を画定するｏ−リングを有するシールを作製した。電極の改変は、酵素溶液（０．１Ｍのリン酸バッファー、ｐＨ７．１）中に２４時間、ここでは作用電極である金スライドを浸し、次いでリン酸ナトリウム・バッファーで完全に洗浄することによって行った。これらの結果は図９に示す。
【００７８】
＋３５０ｍＶにおける酸化ピーク（金表面の酸化）の低下は、電極表面を遮断する酵素の層の形成によって引き起こされる。層の存在は、−４００ｍＶにおける水素放出反応と関係がある電流の大幅な低下によっても示される。反応（芳香族ニトロ化合物の還元）を進行させるために、コファクターを溶液中に導入する必要がある。０．１Ｍのリン酸バッファー、ｐＨ７．１中のコファクター、フェロセンジカルボン酸（３５μｍ）のボルタモグラム測定を行って、フェロセンジカルボン酸が酵素反応中に酸化された後に還元され得るように、電流測定センサを保持するのに適切な電位を評価した。これらの結果は図１０に示す。
【００７９】
図１１は、ｐＭＫＳ２から発現されたＮｆｎＢ−ｃｙｓ１酵素に関するバイオセンサの電流測定による応答を示し、その応答は０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．１）中において＋１００ｍＶの固定電位で評価し、コファクターはフェロセンジカルボン酸（１０ｍＭ、２００μモル）であった。作用電極は、ＮｆｎＢ−ｃｙｓ１を用いて改変した金スライドであり、電位の値はいずれもＳＣＥに対して引用する。ＤＮＥＢ（セル中で２ｎＭの濃度をもたらす２０μｌのＤＮＥＢの２μＭ溶液）を注射する前に、安定状態の電流に達するまで、電流を７３０秒間安定させた。ＤＮＥＢサンプルを加えた後に、基質の導入によって引き起こされる対流によるものであると考えられる、電流のわずかな増大を観察した。
【００８０】
最初の上昇後、電流は約１０ｎＡ低下する。この低下は、酸化形のニトロレダクターゼによるフェロセンジカルボン酸の酸化の結果として形成されたフェロセニウムジカルボン酸の還元によって引き起こされた。次いで電流は最初の基準値に近い値に減衰し始め、したがって連続的な読み取り値を得るのが可能となる。さらに電流測定を、それぞれ０．５ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、２．５ｎＭに対応する１０、３０、４０および５０ｐモルのＤＮＥＢで行った。系に導入するＤＮＥＢの量が多いほど、低下は大きくなる。電流の大きさと分析物の濃度の間には直線関係が見られ、したがって電流測定センサ用の基準を与える。これらの結果は図１２Ａおよび１２Ｂに示す。分析物の溶液中にＤＮＥＢが存在しないとき、応答は得られなかった。
【００８１】
図１２Ａは、０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．１）中における＋１００ｍＶの電位での、４つの異なる濃度のＤＮＥＢに関する電流測定データを示し、作用電極はＮｆｎＢ−ｃｙｓ１を用いて改変した金スライドであった。電位を印加した後にＤＮＥＢサンプルを１００秒間注入し；コファクターはフェロセンジカルボン酸（１０ｍＭ、２００μモル）であった。図１２Ｂは、ＤＮＥＢの濃度に対する図１２Ａ中のデータから、ＤＮＥＢ注入の７０秒後に得た電流低下の程度のプロットを示す。このプロットは直線のプロット
であり、電流の大きさと分析物の濃度の間の直線関係を示す。
【００８２】
この例で調べた最低濃度は、１兆分率（ｐｐｔ）範囲でＤＮＥＢの濃度に対応する。
（実施例６）
セクション１．１から５．４までの前述のプロトコルおよび試験は、配列番号４中に示す発現配列を含むｐＥＴ−２８ａ（＋）発現ベクター中の配列番号２に適合させた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのＪＬＲ１１  ｐｒｎＡ遺伝子を使用して行った。これらの結果は、ピコモル範囲の優れた感度が、結果として生じたバイオセンサによって示されたことを再度示した。
【００８３】
結論
これらの結果は、Ｎ末端にシステインタグを導入することによって、電流測定による測定に（悪影響を与える／妨げる）ように活性が低下することはなく、活性を失わずに酵素を金表面に固定する際にこれらのタグは成功であったことを示す。金表面上でのニトロレダクターゼの凝集に関する証拠は、ＦＴＩＲ、紫外可視分光測定、およびサイクリック・ボルタモグラム測定によって得た。
【００８４】
ニトロレダクターゼは、ある範囲の芳香族ニトロ化合物およびニトロエステル、すなわち硝酸２−エチルヘキシルに関して活性があることが示され、それぞれの基質に関して異なる反応速度を与えた。酵素に関する最適ｐＨ（ｐＨ７．１）および温度（＜４０℃）は、ＫM、Ｖmaxとおよび代謝回転数（Ｋcat）と共に確定した。
【００８５】
電流測定センサの応答はナノアンペア範囲であり、検出は予想外に１兆分率領域に低下した。電流の低下（および低下率）は、溶液中の芳香族ニトロ化合物の濃度に正比例することが見出され、このシステムは、それぞれのサンプル採取後に、連続的なサンプル採取を可能にした回収の形跡を示した。さらに、２週間冷蔵庫に保っても、酵素は活性状態のままであった。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】電子伝達の仲介を示す、改良型電極の一般モデルを示す図。
【図２】ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドを示す図。
【図３】Ｔ７プロモータからＴ７ターミネータ領域までの、ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドの一部分のヌクレオチド配列を示す図。
【図４】Ｃｙｓ6タグづけしたｎｆｎＢニトロレダクターゼの４−ニトロ安息香酸を含むバッファー溶液およびその紫外可視吸光度スペクトルに対する影響を示すグラフ。
【図５】さまざまな基質に対するＣｙｓ6タグづけしたｎｆｎＢニトロレダクターゼの活性を示す棒グラフを示す図。
【図６Ａ】２，４−ジニトロエチルベンゼンの分解を触媒する際の、脱塩および非脱塩形のＣｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼの活性を示す図。
【図６Ｂ】２，４−ジニトロエチルベンゼンの分解を触媒する際の、脱塩および非脱塩形のＣｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼの活性を示す図。
【図７】コファクターとしてフェロセンジカルボン酸を使用する、Ｃｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼの活性を示す図。
【図８】濃度が増大するＣｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼの基質に対する、活性のプロットを示す図。
【図９】金スライド上に固定したＣｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼおよび結合酵素を含まない対照の金スライドの、サイクリック・ボルタモグラムを示す図。
【図１０】コファクターとしてフェロセンジカルボン酸を使用する、Ｃｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼのサイクリック・ボルタモグラムを示す図。
【図１１】＋１００ｍＶの固定電位で構築体から発現されたｎｆｎＢＣｙｓ6改変酵素を使用する、バイオセンサの電流測定による応答を示す図。
【図１２Ａ】１０、３０、４０および５０ｐｍｏｌｅの２，４ジニトロエチルベンゼンを含むＣｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼの、バイオセンサを用いた電流測定による測定値を示す図。
【図１２Ｂ】１０、３０、４０および５０ｐｍｏｌｅの２，４ジニトロエチルベンゼンを含むＣｙｓ6改変ｎｆｎＢニトロレダクターゼの、バイオセンサを用いた電流測定による測定値を示す図。
【図１】
2007513622.tif 000005
【図２】
2007513622.tif 000006
【図３】
2007513622.tif 000007
【図４】
2007513622.tif 000008
【図５】
2007513622.tif 000009
【図６Ａ】
2007513622.tif 000010
【図６Ｂ】
2007513622.tif 000011
【図７】
2007513622.tif 000012
【図８】
2007513622.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2007513622.tif 000015
【図１１】
2007513622.tif 000016
【図１２Ａ】
2007513622.tif 000017
【図１２Ｂ】
2007513622.tif 000018
【配列表】
2007513622000001.app
【国際調査報告】
2007513622.tif 000019
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