(57)【要約】本発明は、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母における、糖タンパク質のグリカン上へのマンノシルリン酸化の除去に関する。マンノシルリン酸化糖タンパク質の除去は、ＰＮＯ１遺伝子、および、新たに単離されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂ遺伝子の破壊の結果として起こる。本発明はさらに、グリカンのマンノシルリン酸化を含まない宿主細胞における、改変されたグリカン構造体の産生方法に関する。本発明はさらに、マンノシルリン酸化糖タンパク質を実質的に含まない、糖タンパク質組成物を提供する。このような糖タンパク質組成物は、治療的用途のために用いられ得る、複合体Ｎグリカンを含む。
2007530014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質のマンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性を欠失するように特徴付けられる、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母。
【請求項２】
請求項１に記載の酵母であって、該酵母は：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓからなる群より選択される、酵母。
【請求項３】
前記酵母はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】
マンノシルリン酸化糖タンパク質、またはそのフラグメントを、正常に産生する真菌宿主であって、ここで該宿主が、マンノシルリン酸残基を欠失する糖タンパク質を産生するように改変される、真菌宿主。
【請求項５】
請求項４に記載の真菌宿主であって、ここで該宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、真菌宿主。
【請求項６】
請求項５に記載の真菌宿主において産生される、単離された糖タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の、単離された糖タンパク質であって、ここで該糖タンパク質は、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターの＃鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子−１、オステオプロテゲリン、＃−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、＃−フェトプロテイン、ＦＳＨ、およびペプチドホルモンからなる群より選択される、単離された糖タンパク質。
【請求項８】
Ｐｉｃｈｉａ属の酵母における糖タンパク質の産生方法であって、ここで該方法が、糖タンパク質のグリカンからマンノシルリン酸残基を除去する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで前記除去する工程が、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸残基の転移に関係する遺伝子の組み合わせを破壊する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記関係する遺伝子の組み合わせが：ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃ、およびＰＮＯ１からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の組み合わせがＭＮＮ４ＢおよびＰＮＯ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記酵母は：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓからなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
前記酵母が、減弱されたマンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２の方法により産生される、単離された糖タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された糖タンパク質であって、ここで該糖タンパク質は、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターの＃鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子−１、オステオプロテゲリン、＃−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、＃−フェトプロテイン、ＦＳＨ、およびペプチドホルモンからなる群より選択される、単離された糖タンパク質。
【請求項１６】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは以下：
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号１の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１とハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）長さが、少なくとも６０個の連続したヌクレオチドである、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、あるいはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは以下
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチド配列；および
（ｃ）長さが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは以下：
（ａ）配列番号３；
（ｂ）配列番号３の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号３とハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）長さが、少なくとも６０個の連続したヌクレオチドである、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、あるいはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは以下
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチド配列；および
（ｃ）長さが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは以下：
（ａ）配列番号５；
（ｂ）配列番号５の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号５とハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）長さが、少なくとも６０個の連続したヌクレオチドである、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、あるいはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは以下
（ａ）配列番号６；
（ｂ）配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチド配列；および
（ｃ）長さが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
改変された宿主細胞であって、ここで該宿主は、請求項１６、請求項１８、もしくは請求項２０に記載のポリヌクレオチドを発現しないか、または発現が減少するか、あるいは該ポリヌクレオチドにおいて、破壊、欠失、または変異を有することを特徴とする、改変された宿主細胞。
【請求項２３】
改変された宿主細胞であって、ここで該宿主は、請求項１７、請求項１９、または請求項２１に記載のポリペプチドによってコードされる、機能性遺伝子産物を産生しないことを特徴とする、改変された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００３年１２月２４日に出願された、米国仮特許出願第６０／５３２，４６１号の優先権を主張するものであり、本明細書中にてその全体が参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府によって後援される研究についての宣言）
本発明は、商務省からの助成金、ＮＩＳＴ−ＡＴＰ協同協定番号（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ  Ｎｕｍｂｅｒ）７０ＮＡＮＢ２Ｈ３０４６の下で、少なくとも一部分の資金を供給された。従って、米国政府は本発明に特定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、糖タンパク質のグリカン上へのマンノシルリン酸転移の除去に関し、そしてさらに、酵母細胞および糸状菌細胞における、グリカン上へのマンノシルリン酸残基の付加を引き起こす遺伝子の除去に関する。特に、本発明は、マンノシルリン酸残基を有さないグリカンを産生する、酵母宿主細胞および糸状菌宿主細胞の操作に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
組換えヒトタンパク質を産生する能力によって、ヒトの健康管理において重要な進歩がもたらされ、そして、薬物の発見は活発な分野であり続ける。多くの治療的タンパク質は、ヒト血清における適切な構造機能活性、およびそれに伴う安定性を確実にするために、そのタンパク質の特定のアスパラギン残基への、共翻訳のグリカンの付加（Ｎ−グリコシル化）を必要とする。ヒトにおける治療的使用のために、糖タンパク質は、ヒト様Ｎ−グリコシル化を必要とする。ヒト様糖タンパク質プロセシングを模倣し得る哺乳動物細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒト網膜細胞）は、低いタンパク質力価、長い発酵時間、不均一な産物、および進行中のウイルス封じ込めの問題を含む、いくつかの欠点を有する。従って、処理がより経済的で、安全性の妨げがより少なく、そしてより強い異種のタンパク質の産生を引き起こす、酵母発現系および糸状菌発現系の使用が、ヒトの治療のための宿主細胞として重点的に研究されている。
【０００５】
酵母および糸状菌において、哺乳動物由来の糖タンパク質のオリゴ糖とは異なるオリゴ糖を有する、糖タンパク質が産生される。具体的に酵母では、外鎖（ｏｕｔｅｒ  ｃｈａｉｎ）オリゴ糖は、高マンノシル化され、３０〜１５０残基のマンノース残基を構成する（非特許文献１）。さらに、酵母にて産生される糖タンパク質のコアおよび糖外鎖（ｏｕｔｅｒ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ）の双方に、マンノシルリン酸がしばしば転移される（非特許文献２）。最も重要なことは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において産生される糖タンパク質由来の、これらのマンノシルリン酸化されたグリカンが、ウサギにおける免疫応答を認めないことを示すことである（非特許文献３）。従って、酵母および糸状菌におけるマンノシルリン酸化の除去は、非免疫原性の治療的糖タンパク質の産生に必須である。
【０００６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、マンノシルリン酸の転移に関与する、少なくとも２つの遺伝子が存在する。これら２つの遺伝子、すなわちＭＮＮ４およびＭＮＮ６はクローン化され、そしてこれらの遺伝子産物の解析からは、これらの遺伝子産物がマンノシルリン酸の転移において機能することが示唆される（総説については、非特許文献４を参照のこと）。ＭＮＮ６は、Ｏ−マンノシル化およびＮ−グルコシル化に関与する、ゴルジ  ａ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼとして特徴付けられた、Ｋｒｅ２ｐ／Ｍｎｔ１ｐタンパク質ファミリーと相同な、ＩＩ型膜タンパク質をコードする（非特許文献５）。Ｄｍｎｎ６変異体は、インビボにおけるコアのグリカンのマンノシルリン酸化においては欠損を示さないが、インビトロにおけるマンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性における減少を示す（非特許文献６）。Ｍｎｎ４ｐはまた、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹｊｒ０６１ｐに３３％同一である、推定上のＩＩ型膜タンパク質である（非特許文献７；非特許文献８）。Ｄｍｎｎ６変異体およびＤｍｎｎ４変異体の双方は、マンノシルリン酸の転移を減少させる。しかし、Ｄｍｎｎ６およびＤｍｎｎ４の二重変異体は、この活性をさらに減少させることはない。これらの知見は、コアのグリカンにマンノシルリン酸を付加する、さらなるマンノシルトランスフェラーゼの存在を示唆する。
【０００７】
従って、ＭＮＮ４の破壊、ＭＮＮ６の破壊、または双方の組み合わせによる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるマンノシルリン酸化の減少にもかかわらず、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性の完全な除去を可能とする証拠は存在しない。マンノシルリン酸のレベルに影響する他の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて同定された。これらの遺伝子としては、ＰＭＲ１、ＶＲＧ４、ＭＮＮ２およびＭＮＮ５が挙げられる。ＰＭＲ１は、ゴルジ体の正常な機能に必要な、ゴルジ局在性Ｃａ２＋／Ｍｎ２＋−ＡＴＰａｓｅをコードし（非特許文献９）；Ｖｒｇ４ｐは、ゴルジ内のヌクレオチド−糖の輸送に関与し（非特許文献１０）、そして、Ｍｎｎ２ｐおよびＭｎｎ５ｐは、Ｎ連結グリカンの外鎖における分枝の開始を引き起こす、ａ１，２−マンノシルトランスフェラーゼである（非特許文献１１）。４つのタンパク質全てについて、Ｎ連結グリカンに連結するマンノシルリン酸基の減少は、マンノシルリン酸基のトランスフェラーゼ活性における特異的な欠損ではなく、むしろゴルジ機能不全の結果、または、Ｎ連結グリカンの大きさの減少であるようである。
【０００８】
メチロトローフ酵母であるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにて発現されるタンパク質は、マンノシルリン酸化グリカンを含む（非特許文献１２）。Ｍｉｕｒａらは、ＰＮＯ１（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）遺伝子の同定を報告し、その破壊は、糖タンパク質のマンノシルリン酸化の減弱化をもたらす（特許文献１；非特許文献１３）。ＰＮＯ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてグリカンへのマンノシルリン酸の転移に関与するタンパク質について、コードする。しかしながら、その具体的な機能は未知である。言及されるように、Ｄｐｎｏ１変異体は、野生型Ｐｎｏ１ｐを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株と比較して、Ｎ−グリカンのマンノシルリン酸化を減少させるが、完全に破壊はしない。
【０００９】
現在、真菌宿主において産生される糖タンパク質上のマンノシルリン酸化を除去する方法は存在しない。糖タンパク質上のマンノシルリン酸化の残存量はなお、免疫原性であり得て、従ってヒトの治療としての使用には望ましくない。
【００１０】
それゆえ、必要とされるのは、マンノシルリン酸化されたグリカンを実質的に含まない糖タンパク質を産生する、酵母または糸状菌に基づく発現系である。
【特許文献１】国際公開第０１／８８１４３号パンフレット
【非特許文献１】Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）５６：９１５−９４４
【非特許文献２】Ｂａｌｌｏｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）  １８５：４４０−４７０
【非特許文献３】ＲｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＢａｌｌｏｕ、ＪＢＣ  （１９７４）  ２４９：２３１９−２３２１
【非特許文献４】ＪｉｇａｍｉおよびＯｄａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  （１９９９）  １４２６：３３３−３４５
【非特許文献５】Ｌｕｓｓｉｅｒら、ＪＢＣ  （１９９７）  ２７２：１５５２７−１５５３１
【非特許文献６】Ｗａｎｇら、ＪＢＣ  （１９９７）  ２７２：１８１１７−１８１２４
【非特許文献７】Ｏｄａｎｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９６）  ６：８０５−８１０
【非特許文献８】ＨｕｎｔｅｒおよびＰｌｏｗｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９７）  ２２：１８−２２
【非特許文献９】ＡｎｔｅｂｉおよびＦｉｎｋ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  （１９９２）  ３：６３３−６５４
【非特許文献１０】Ｄｅａｎら、ＪＢＣ  （１９９７）  ２７２：３１９０８−３１９１４
【非特許文献１１】ＲａｙｎｅｒおよびＭｕｎｒｏ、ＪＢＣ  （１９９８）  ２７３：２３８３６−２３８４３
【非特許文献１２】Ｍｉｅｌｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）  ２：７９−８３
【非特許文献１３】Ｍｉｕｒａら、Ｇｅｎｅ  （２００４）  ３２４：１２９−１３７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、酵母宿主または糸状菌宿主（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸残基を除去する方法を提供する。本発明はまた、マンノシルリン酸化された糖タンパク質、またはそのフラグメントを正常に産生する真菌宿主を提供し、ここで、この真菌宿主は、マンノシルリン酸残基を実質的に含まない糖タンパク質を産生するように、改変される。１つの実施形態において、本発明は、ＭＮＮ４と相同的な１つ以上の遺伝子を欠く、ヌル変異体を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、ｍｎｎ４Ｂおよびｐｎｏ１の破壊、欠失、または変異を含む、Ｐｉｃｈｉａ属の宿主を提供する。得られる宿主株は、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸化を、実質的に含まない。
【００１２】
本発明はさらに、マンノシルリン酸化糖タンパク質を実質的に含まない、糖タンパク質組成物を提供する。このような糖タンパク質組成物は、治療的用途のために用いられ得る、複合体Ｎグリカンを含む。
【００１３】
本発明はまた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、およびＭＮＮＣのコード配列からなる群より選択される核酸配列；これらの配列の縮重改変体である核酸配列；ならびに、関連する核酸配列およびフラグメントを含むか、またはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、およびＭＮＮ４Ｃによってコードされる配列からなる群より選択されるポリペプチド配列；関連するポリペプチド配列、フラグメント、ならびに融合を含むか、またはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチドを提供する。本発明の単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体もまた、提供される。
【００１４】
本発明はまた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、およびＭＮＮＣ遺伝子のコード配列からなる群より選択される核酸配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、およびＭＮＮＣ遺伝子のコード配列の縮重改変体である核酸配列、ならびに関連する核酸配列およびフラグメントの、破壊、欠失、または変異を含む宿主細胞を提供し、ここで、この宿主細胞は、この破壊、欠失、または変異を含まない宿主細胞と比較して、この核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性を減少させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者に広く理解される意味を有する。さらに、文脈から他に要求されない限り、単数形の語は複数形を含み、そして複数形の語は単数形を含む。通常、本明細書中で記載される、生化学、酵素学、分子生物学、および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、およびこれらの技術は、当該分野で周知のものであり、そして当該分野で広く用いられる。本発明の方法および技術は、当該分野で周知である従来の方法に従い、そして、他に示されない限り、本明細書の全体にわたって引用され、考察される種々の一般的な参考文献、およびより詳細な参考文献において記載されるように、一般に実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２に補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第Ｉ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第ＩＩ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
【００１６】
本明細書中で言及される、全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００１７】
以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有するものとして理解される：
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいう。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然のヌクレオチドアナログ、非天然のヌクレオシド間結合、またはその双方を含む、ＤＮＡアナログもしくはＲＮＡアナログを含む。核酸は、任意の形態の構造であり得る。例えば、核酸は、単鎖であっても、二本鎖であっても、三本鎖であっても、四重であっても、部分的に二本鎖であっても、分枝していても、ヘアピンであっても、環状であってもよいか、またはパドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）された高次構造であってもよい。
【００１８】
他に示さない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、核酸の少なくとも一部分が、（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。この２つの間の選択は、文脈から決定される。例えば、核酸がプローブとして用いられる場合、この２つの間の選択は、このプローブが所望の標的と相補的であるという要求によって決定される。
【００１９】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマー）は、天然の宿主細胞において、天然のポリヌクレオチドと天然に付随する、その他の細胞性成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、および、天然に付随されるゲノム配列）から、実質的に分離される核酸またはポリヌクレオチドである。この用語は、（１）天然に存在する環境から取り除かれた核酸またはポリヌクレオチド、（２）ポリヌクレオチドの全体または一部分が付随しない核酸またはポリヌクレオチドであって、ここで「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出され、（３）天然においては連結されないポリヌクレオチドに、作動的に連結された核酸またはポリヌクレオチド、あるいは（４）天然には存在しない核酸またはポリヌクレオチドを包含する。用語「単離された」または「実質的に純粋な」とはまた、組換えＤＮＡ単離体またはクローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、あるいは、異種の系によって生物学的に合成された、ポリヌクレオチドアナログに関して用いられ得る。
【００２０】
しかしながら、「単離された」とは、そのように記載される核酸またはポリヌクレオチド自体が、その天然の環境から物理的に取り出されることを、必ずしも必要としない。例えば、生物体のゲノム内にある内因性の核酸配列は、この内因性の核酸配列の発現が変化するように、異種の配列がこの内因性の核酸配列に隣接して配置される場合、本明細書中において「単離された」と判断される。この状況において、異種の配列は、この異種の配列自体が内因性（同じ宿主細胞、またはその子孫由来）であろうと無かろうと、または外因性（異なる宿主細胞、またはその子孫由来）であろうと無かろうと、この内因性の核酸配列に天然には隣接しない配列である。例えば、プロモーター配列が、宿主細胞のゲノム中にある遺伝子の天然のプロモーターと（例えば、相同組換えによって）置換され得、その結果、この遺伝子は、変化された発現パターンを有する。ここで、この遺伝子は、天然にこの遺伝子と隣接する、配列のうちの少なくともいくつかから分離されるので、この遺伝子は「単離された」こととなる。
【００２１】
核酸はまた、ゲノム中の対応する核酸に対して天然に生じない、任意の改変を含む場合、「単離された」とみなされる。例えば、内因性のコード配列は、例えばヒトの介入によって、人工的に導入された挿入、欠失、または点変異を含む場合、「単離された」とみなされる。「単離された核酸」としてはまた、異種の部位における宿主細胞の染色体の中に組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物が挙げられる。さらに、「単離された核酸」は、その他の細胞性物質を実質的に含まなくてもよいか、または組換え技術によって産生される場合、培地を実質的に含まなくてもよいか、または化学的に合成される場合、化学的な前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、参照の核酸配列の語句「縮重改変体」とは、この参照の核酸配列から翻訳されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を提供するために、標準的な遺伝コードに従って翻訳され得る核酸配列を包含する。用語「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」は、配列上において必ずしも同一ではないが、１つ以上の特定のセグメント内で互いに相同である、標的核酸配列とハイブリダイズし得る、オリゴヌクレオチドを示すために用いられる。
【００２３】
核酸配列の文脈において、用語「パーセント配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「同一の」とは、最大の対応について並べられる場合、同じである２つの配列内の残基をいう。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、普通は少なくとも約２０ヌクレオチド、より普通には、少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には、少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には、少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは、少なくとも約３６以上のヌクレオチドの範囲より長くなり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いられ得る、当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較され得、これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムである。ＦＡＳＴＡは、照会配列と検索配列との間の、最高の重複領域のアラインメント、およびパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（本明細書中にて、その全体が参考として援用される）。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、そのデフォルトのパラメーター（６のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスとしてＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦＡＳＴＡを使って決定され得るか、またはＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１（本明細書中で、参考として援用される）において提供されるようなデフォルトのパラメーターを用いてＧａｐを使って決定され得る。あるいは、配列は、コンピュータープログラムであるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて比較され得る。
【００２４】
核酸またはそのフラグメントを言及する場合、用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、別の核酸（または、その相補的な鎖）と、適切なヌクレオチドの挿入物または欠失物とを最適に並べるとき、上に記載したような、任意の周知の配列同一性のアルゴリズム（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐ）によって測定した場合、少なくとも約５０％、より好ましくは、ヌクレオチド塩基の６０％、普通は、少なくとも約７０％、より普通には、少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約９０％、そしてより好ましくは、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において、ヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。
【００２５】
あるいは、核酸またはそのフラグメントが、別の核酸、別の核酸の１つの鎖、またはその相補鎖と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合、実質的な相同性または実質的な類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」とは、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズ種の塩基組成、相補領域の長さ、および、ハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基のミスマッチの長さのような条件によって影響される。当業者は、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するために、これらのパラメーターをいかに変化させるべきか知っている。
【００２６】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の条件の組において、特異的なＤＮＡのハイブリッドのための温度融解点（Ｔｍ）より低い約２５℃において、行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、特定の条件の組において、特異的なＤＮＡハイブリッドのためのＴｍより低い、約５℃の温度において行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、第９．５１頁（本明細書中で、参考として援用される）を参照のこと。本明細書における目的のための「ストリンジェントな条件」とは、液相ハイブリダイゼーションについては、６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは、３．０ＭのＮａＣｌおよび０．３Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）、１％のＳＤＳ中における６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中における、６５℃で２０分間の２回の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよびパーセント同一性を含む、多数の因子に依存して、異なる速度で起こることが、当業者に理解される。
【００２７】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）としては、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成形態のセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方、ならびに上記の混合ポリマーが挙げられ得る。これらは、当業者に容易に理解されるように、化学的に改変されても、生化学的に改変されてもよいか、または非天然のヌクレオチド塩基を含んでも、誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログによる置換、例えば、電荷を有さない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、電荷を有する連結（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ぶら下がった(ｐｅｎｄｅｎｔ）部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター、アルキレーター（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）、および改変された連結（例えば、αアノマーの核酸など）のようなヌクレオチド間の改変が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して、設計された配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子も挙げられる。このような分子は当該分野で公知であり、そして、例えば、分子の骨格において、ペプチド連結がリン酸結合を置換する分子が挙げられる。他の改変としては、例えば、リボース環が、架橋部分、または「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸に見受けられる改変のような他の構造を含むアナログが挙げられ得る。
【００２８】
用語「変異の」とは、核酸配列に適用される場合、参照の核酸配列と比較して、挿入、欠失、または変化され得る核酸配列におけるヌクレオチドを意味する。単一の変化が、１つの遺伝子座においてなされてもよいか（点変異）、または、複数のヌクレオチドが、単一の遺伝子座において挿入、欠失、もしくは変化されてもよい。さらに、１つの核酸配列内における任意の数の遺伝子座において、１つ以上の変化がなされ得る。核酸配列は、当該分野で公知である、任意の方法によって変異され得、これらの方法としては、「エラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）」（ＰＣＲ産物の全長に沿って、高い割合で点変異が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピーフィデリティーが低い条件下で、ＰＣＲを行う方法；例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１：１１−１５（１９８９）、ならびに、ＣａｌｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２）を参照のこと）；および、「オリゴヌクレオチド指向性変異（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」（目的の任意のクローン化ＤＮＡセグメントのものにおける、部位特異的変異の生成を可能にする方法；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７（１９８８）を参照のこと）のような、変異技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」は、連結される別の核酸を輸送し得る核酸分子をいうことを意図される。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントが結合され得る環状の二重鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムの中に結合され得る（以下でより詳細に考察される）。特定のベクターは、導入された宿主細胞内において、自律的に複製し得る（例えば、宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入に際して、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、そしてそれによって、宿主のゲノムと共に複製され得る。さらに、特定の好ましいベクターは、作動可能に連結される遺伝子の発現を方向付け得る。このようなベクターは、本明細書中で、「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００３０】
用語「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」とは、核酸配列であって、宿主細胞中におけるその配列の存在または非存在について、ポジティブな選抜またはネガティブな選抜のいずれかを可能にする、活性を発現し得る、核酸配列をいう。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子は、この遺伝子を含む細胞の、ウラシルの非存在下における増殖能力によって、その存在が選抜され得るので、マーカー遺伝子である。その存在はまた、この遺伝子を含む細胞の、５−ＦＯＡの存在下における増殖不能性によっても、選抜され得る。マーカー配列またはマーカー遺伝子は、必ずしも、ポジティブな選択可能性およびネガティブな選択可能性の双方を示す必要は無い。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の、マーカー配列またはマーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４、およびＵＲＡ３が挙げられる。
【００３１】
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、目的の遺伝子を制御するために、その発現制御配列が、目的の遺伝子と隣接する連結、および、目的の遺伝子を制御するために、トランスに作用するか、または距離を置いて作用する発現制御配列をいう。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、用語「発現制御配列」とは、ポリヌクレオチド配列であって、このポリヌクレオチド配列が作動可能に連結されたコード配列の発現に影響するために必要な、ポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後の事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルのような、有効なＲＮＡプロセシングのシグナル；細胞質性ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を亢進させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を亢進する配列；ならびに、所望される場合、タンパク質分泌を亢進する配列が挙げられる。このような制御配列の性質は、宿主生物体に依存して異なり；原核生物では、このような制御配列としては一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」とは、少なくとも、その存在が発現にとって必須である全ての構成要素を含むことが意図され、そして、その発現が有利である、付加的な構成要素（例えば、リーダー配列および融合相手の配列）をも含み得る。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換えベクターが導入される細胞をいうことが意図される。このような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことを意図されることが、理解されるべきである。変異または環境的影響のいずれかによって、次世代において特定の改変が起こるので、実際には、このような子孫は、親の細胞と同一ではあり得ないが、本明細書中で用いられる場合、用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。組換え宿主細胞は、単離された細胞であっても、培養液中で増殖された細胞株であってもよく、あるいは、生きている組織または生物体に存在する細胞であってもよい。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド（例えば、代表的には、約５０アミノ酸長未満であり、より代表的には、約３０アミノ酸長未満であるポリペプチド）をいう。本明細書中で用いられる場合、この用語は、構造的に模倣し、従って生物学的機能を模倣する、アナログおよび模倣物を包含する。
【００３５】
用語「ポリペプチド」とは、天然に存在するタンパク質、および天然に存在しないタンパク質の双方、ならびにそのフラグメント、変異体、誘導体、およびアナログを包含する。ポリペプチドは、モノマー性であってもポリマー性であってもよい。さらに、ポリペプチドは、多数の異なるドメインを含み得、そのそれぞれが１つ以上の異なる活性を有する。
【００３６】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、タンパク質またはポリペプチドであって、その起源、または誘導の源の効力によって、（１）その天然の状態において付随している天然に会合する構成要素と会合しない、（２）天然には見受けられない純粋さで存在し、この純粋さは他の細胞性物質の存在について判断される（例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または、（４）天然に存在しない（例えば、天然に見受けられるポリペプチドのフラグメントであるか、もしくは天然に見受けられないアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体、あるいは、標準のペプチド結合以外の連結を含む）タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成されたポリペプチド、または、天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、天然に会合する構成要素から「単離されて」いる。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いた単離によって、天然に会合する構成要素を実質的に含まなくされ得る。このように定義されるので、「単離された」とは、そのように記載されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはオリゴペプチドが、その天然の環境から物理的に取り出されることを、必ずしも必要としない。
【００３７】
本明細書中で用いられる場合、用語「ポリペプチドフラグメント」とは、欠失（例えば、全長ポリペプチドと比較して、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失）を有するポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、ポリペプチドフラグメントは、そのフラグメントのアミノ酸配列が、天然に存在する配列中の対応する部位と同一である隣接した配列である。フラグメントは代表的には、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、または少なくとも１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１６アミノ酸長、または少なくとも１８アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、少なくとも４０アミノ酸長、または少なくとも４５アミノ酸長であり、なおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長、または少なくとも６０アミノ酸長であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。
【００３８】
「改変された誘導体」とは、一次構造配列においては実質的に相同的であるが、例えば、インビボまたはインビトロの化学的改変および生化学的改変を含むか、あるいは、天然のポリペプチドにおいては見受けられないアミノ酸を取り込んだ、ポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。このような改変としては、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性各種による）、および種々の酵素的改変が挙げられ、当業者によって容易に理解される。ポリペプチド標識のための種々の方法、およびこのような目的に有用な種々の置換基または標識は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ）、標識された抗リガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）（例えば、抗体）に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光因子、酵素、および、標識されたリガンドに対する、特異的な対合メンバーとして役に立ち得る、抗リガンドが挙げられる。標識の選択は、所望される感受性、プライマーとの結合体化の容易さ、所望される安定性、および使用可能な器具に依存する。ポリペプチドの標識の方法は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２に補遺）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００３９】
用語「融合タンパク質」とは、異質なアミノ酸配列と連結する、ポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質に由来する、２つ以上の所望の機能的な要素を含むように作製され得るので、有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチドに由来する、少なくとも１０の隣接したアミノ酸、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸または少なくとも３０アミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、または少なくとも６０アミノ酸、さらにより好ましくは、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、または少なくとも１２５アミノ酸を含む。本発明のタンパク質の全体を含む融合は、著しい有用性を有する。本発明の融合タンパク質内に含まれる、異質なポリペプチドは、長さが少なくとも６アミノ酸であり、しばしば、長さが少なくとも８アミノ酸であり、そして有用には、長さが少なくとも１５アミノ酸、２０アミノ酸、および２５アミノ酸である。より大きなポリペプチド（例えば、ＩｇＧＦｃ領域）、およびタンパク質全体（例えば、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質）さえ含む融合は、著しい有用性を有する。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を有し、ポリペプチドまたはそのフラグメントをインフレームでコードする核酸配列を作製する工程、次いでこの融合タンパク質を発現する工程によって、組換えて産生され得る。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、別のタンパク質と架橋することによって、化学的に産生され得る。
【００４０】
用語「非ペプチドアナログ」とは、参照のポリペプチドの性質と類似した性質を有する化合物をいう。非ペプチド化合物はまた、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」とも呼ばれ得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｊｕｎｇ、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９９７）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９３）；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ（Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１９９２）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、８：３９２−３９６（１９８５）；および上記のそれぞれで引用される参考文献を参照のこと。これらは本明細書中で、参考として援用される。このような化合物は、しばしば、コンピューター処理された分子モデリングの助けにより、開発される。本発明の有用なペプチドに、構造的に類似するペプチド模倣物は、相当する効果を生じ、それゆえ、本発明の部分となるように想像されるように、用いられ得る。
【００４１】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）」とは、天然のタンパク質または野生型のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、転位、または置換を含む配列を有するポリペプチドをいう。ムテインは、一つの位置における単一のアミノ酸が、別のアミノ酸と変換される、１つ以上のアミノ酸点置換、天然に存在するタンパク質の配列において、１つ以上のアミノ酸が挿入または欠失される、それぞれ１つ以上の挿入および／または欠失、ならびに／あるいは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかまたは双方における、アミノ酸配列の切断を有し得る。ムテインは、天然に存在するタンパク質と比較して同じ生物学的活性を有し得るが、好ましくは、異なる生物学的活性を有する。
【００４２】
ムテインは、その野生型の対照と、少なくとも５０％の全体的な配列相同性を有する。なおより好ましくは、ムテインは、野生型タンパク質と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の、全体的な配列相同性を有する。なおより好ましい実施形態において、ムテインは、少なくとも９５％の配列同一性を示し、なおより好ましくは、９８％の全体的な配列同一性、なおより好ましくは９９％の全体的な配列同一性、および、なおより好ましくは９９．９％の全体的な配列同一性を示す。配列相同性は、任意の通常の配列解析アルゴリズム（例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ）によって測定され得る。
【００４３】
アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解への感受性を減少させる、（２）酸化への感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性または酵素学的活性を変化させる、そして（５）このようなアナログの、他の物理化学的性質または機能的性質を与える、または改変するようなアミノ酸置換を含み得る。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、２０種の通常のアミノ酸、およびその略語は、通常の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＃  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧｏｌｕｂおよびＧｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、第２版、１９９１）を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される）。２０種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ＃アミノ酸）、異常なアミノ酸（例えば、＃＃、＃＃二置換のアミノ酸）、Ｎ＃アルキルアミノ酸、および他の通常でないアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適切な構成要素であり得る。通常でないアミノ酸の例としては：４＃ヒドロキシプロリン、＃＃カルボキシグルタミン酸、＃＃Ｎ，Ｎ，Ｎ＃トリメチルリジン、＃＃Ｎ＃アセチルリジン、Ｏ＃ホスホセリン、Ｎ＃アセチルセリン、Ｎ＃ホルミルメチオニン、３＃メチルヒスチジン、５＃ヒドロキシリジン、Ｎ＃メチルアルギニン、ならびに、他の類似のアミノ酸、およびイミノ酸（例えば、４＃ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチドの表記法においては、標準の用法および慣習に従って、左末端はアミノ末端に対応し、右末端はカルボキシ＃末端に対応する。
【００４５】
タンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似した配列を有する場合、このタンパク質は第二のタンパク質と、「相同性」を有するか、または「相同」である。あるいは、２つのタンパク質が「類似した」アミノ酸配列を有する場合、このタンパク質は第二のタンパク質と相同性を有する。（従って、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有することを意味するように定義される。）好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質と少なくとも６５％の配列相同性を示すタンパク質であり、より好ましいのは、少なくとも７０％の配列相同性である。なおより好ましいのは、野生型タンパク質と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の配列相同性を示す、相同タンパク質である。さらにより好ましい実施形態において、相同タンパク質は、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または少なくとも９９．９％の配列同一性を示す。本明細書中で用いられる場合、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に、予測される構造的類似性に関する）は、機能における類似性を示ものとして、解釈される。
【００４６】
「相同な」が、タンパク質またはペプチドに関して用いられる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的なアミノ酸置換によって異なるものと認識される。「保存的なアミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、類似した化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する、別のアミノ酸によって置換される、アミノ酸置換である。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を、実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって、互いに異なる場合において、パーセント配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または相同性の度合いは、この置換の保存的な性質について矯正するように、上方に調整され得る。この調整をなすための方法は、当業者にとって周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１、および２５：３６５−８９を参照のこと（本明細書中で、参考として援用される）。
【００４７】
以下の６つの群はそれぞれ、互いにとって保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４８】
ポリペプチドの配列相同性は、パーセント配列同一性としても呼ばれるが、代表的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照のこと。タンパク質解析ソフトウェアは、種々の置換、欠失、および、保存的なアミノ酸置換を含む他の改変に起因する相同性の測定を用いて、類似配列をマッチさせる。例えばＧＣＧは、例えば、異なる生物種に由来する相同なポリペプチド、または野生型タンパク質と、そのムテインの間のような、密接に関連したポリペプチドの間の配列相同性または配列同一性を決定するために、デフォルトのパラメーターを用いて使用され得る、例えば「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照のこと。
【００４９】
特定のポリペプチド配列を、異なる生物体に由来する多数の配列を含むデータベースと比較する場合に、好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴコンピュータープログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））であり、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））である。
【００５０】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメーターは、以下の通りである：
期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開けるためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを広げるためのコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；記載数：１００（デフォルト）；ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。
【００５１】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基であり、普通は、少なくとも約２０残基であり、より普通には、少なくとも約２４残基であり、代表的には、少なくとも約２８残基であり、そして好ましくは、約３５残基より多い。多数の異なる生物体に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は、当該分野で公知であるｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって、測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１に含まれるプログラムである、ＦＡＳＴＡを用いて比較され得る。ＦＡＳＴＡは、照会配列と検索配列との間の最高の重複領域の、アラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（本明細書中で、参考として援用される）。例えば、アミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書中で参考として援用される、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１において提供されるような、デフォルトのパラメーター（ワードサイズは２、そしてＰＡＭ２５０のスコア付けマトリックス）を用いたＦＡＳＴＡを使用して、決定され得る。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、用語「領域」とは、生体分子の一次構造の、物理的に隣接する部分をいう。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分によって定義される。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、用語「ドメイン」とは、生体分子の、公知の機能または疑わしい機能に寄与する、その生体分子の構造をいう。ドメインは、領域またはその部分と同一の広がりを持ち得；ドメインはまた、生体分子の、異なる、隣接しない領域を含み得る。タンパク質ドメインの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質性ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で用いられる場合、用語「分子」とは、任意の化合物を意味し、この化合物としては、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるが、これらに限定されず、そして、このような化合物は天然であっても合成的であってもよい。
【００５５】
マンノシルリン酸化に関して用いられる場合、用語「除去」とは、規定された設定におけるＨＰＬＣを用いて、明らかに検出可能なマンノシルリン酸残基を示さない、マンノシルリン酸化グリカンの検出レベルをいう。
【００５６】
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者に、通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と、類似する、または同質な方法および材料がまた、本発明の実行にあたって用いられ得、そして当業者にとって明らかであるが、例示的な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。相容れない場合、定義を含む本明細書が、対照標準である。材料、方法、および実施例は例示的なものでのみあり、そして限定することを意図しない。
【００５７】
（糖タンパク質上のマンノシルリン酸化を欠く、真菌宿主系統の産生方法）
本発明は、マンノシルリン酸化を有する糖タンパク質を正常に産生する、酵母宿主細胞または糸状菌宿主細胞において、糖タンパク質のグリカンへのマンノシルリン酸の転移を除去する方法を提供する。１つの実施形態において、マンノシルリン酸化を有する糖タンパク質を正常に産生する、酵母宿主細胞または糸状菌宿主細胞が、糖タンパク質上のグリカンにおけるマンノシルリン酸化が実質的に無くなるように、操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）される。別の実施形態において、この真菌宿主は一般的に、マンノシルリン酸トランスフェラーゼに関与するタンパク質をコードする、少なくとも１つの遺伝子を破壊、減弱化、または突然変異するように、改変される。好ましくは、この方法は、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃ、およびＰＮＯ１から選択される１つ以上の遺伝子の破壊、減弱化、または突然変異に関与する。
【００５８】
マンノシルリン酸トランスフェラーゼをコードする公知の遺伝子を用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるマンノシルリン酸トランスフェラーゼをコードする、新規の遺伝子を単離した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＮＮ４遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３６０４４）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に対して、ブラスト検索（ｂｌａｓｔ）した。この検索の結果、ＰＮＯ１遺伝子に加えて、過去には未知であった３つのＯＲＦを同定した。これらの３つのＯＲＦを、ＭＮＮ４Ａ（配列番号１）、ＭＮＮ４Ｂ（配列番号３）、およびＭＮＮ４Ｃ（配列番号１）として名付けた。これらのＯＲＦを増幅し、続いて配列決定して、そしてそれぞれ図１〜図３に示す（実施例１）。ＭＮＮ４Ａ（配列番号２）、ＭＮＮ４Ｂ（配列番号４）、ＭＮＮ４Ｃ（配列番号６）についてコードされたアミノ酸をまた、図１〜図３に示す。
【００５９】
（核酸配列）
１つの局面において、本発明は、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａ遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなる核酸分子を提供する。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性を有し得る。なおより好ましくは、この核酸配列は、配列番号１と、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．９％の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。本発明はまた、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａ遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなるポリペプチドを提供する。このアミノ酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性を有し得る。なおより好ましくは、このアミノ酸配列は、配列番号２と、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．９％の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。
【００６０】
別の実施形態において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂ遺伝子は、酵母菌株における糖タンパク質のグリカンへのマンノシルリン酸転移の除去に、特に有用である。本発明は、配列番号３と少なくとも５０％の同一性を有する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂ遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなる核酸分子を提供する。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性を有し得る。なおより好ましくは、この核酸配列は、配列番号３と、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．９％の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。本発明はまた、配列番号４と少なくとも５０％の同一性を有する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂ遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなるポリペプチドを提供する。このアミノ酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性を有し得る。なおより好ましくは、このアミノ酸配列は、配列番号４と、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．９％の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。
【００６１】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号５と少なくとも５０％の同一性を有する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｃ遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなる核酸分子を提供する。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性を有し得る。なおより好ましくは、この核酸配列は、配列番号５と、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．９％の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。本発明はまた、配列番号６と少なくとも５０％の同一性を有する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｃ遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなるポリペプチドを提供する。このアミノ酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性を有し得る。なおより好ましくは、このアミノ酸配列は、配列番号６と、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．９％の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。
【００６２】
また提供されるのは、本発明の、上記の核酸分子を含む、発現ベクターおよびノックアウトベクターを含む、ベクターである。ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、またはＭＮＮ４Ｃを含むノックアウトベクターは、ＭＮＮ４Ａ遺伝子座、ＭＮＮ４Ｂ遺伝子座、またはＭＮＮ４Ｃ遺伝子座を破壊するために用いられ得る。あるいは、薬物耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーを含む、組み込みベクターが、ＭＮＮ４遺伝子座を破壊するために用いられる。
【００６３】
（マンノシルリン酸化遺伝子のノックアウトの組み合わせ）
３つの新たに同定されたＰ．Ｐａｓｔｏｒｉｓの遺伝子、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃのそれぞれが、マンノシルリン酸化における効果を決定するために、図４に示されるＰＣＲ重複戦略を用いて、破壊される。個々のＤｍｎｎ４Ａ突然変異体、Ｄｍｎｎ４Ｂ突然変異体、およびＤｍｎｎ４Ｃ突然変異体は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）タンパク質のグリカンへの、マンノシルリン酸化転移活性において、有意な減少を示さなかったが、一方で、Ｄｐｎｏ１突然変異体（ＹＳＨ−４９）が、マンノシルリン酸化転移における減弱のみを示したものの（６％までの減少（図５Ｃ））、Ｍｉｕｒａら（国際公開第０１／８８１４３号）において過去に記載されたレベルまでではなかった。異なる糖タンパク質は、同じ宿主細胞内において、異なる度合いおよび型のグリコシル化を示すと、仮定されている（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、１９９８、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１４：１９７−２０７）。本発明の１つの実施形態において、ヌル突然変異の組み合わせが構築され、その１つである、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＤｐｎｏ  Ｄｍｎｎ４ｂの二重突然変異体（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）は、結果として、Ｋ３レポータータンパク質のグリカン上における、検出不可能なレベルのマンノシルリン酸化を生じた（図５Ｄ）。同様に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＤｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４ｂの二重突然変異体によって産生される他の糖タンパク質（例えば、ＣＤ４０およびインベルターゼ）もまた、結果として、マンノシルリン酸化の欠失を生じた。それゆえ、この二重突然変異体は、グリカン上にマンノシルリン酸化を有しない、種々の目的の糖タンパク質を産生する。従って、宿主（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）における糖タンパク質のグリカン上の、マンノシルリン酸残基の転移に関与する遺伝子の組み合わせを破壊する方法が提供される。好ましくは、この組み合わせは、ＭＮＮ４ＢおよびＰＮＯ１の破壊を含む。
【００６４】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂ遺伝子座単独の破壊の場合は、グリカン上のマンノシルリン酸化が除去されないので、マンノシルリン酸化遺伝子の組み合わせが破壊される。好ましい実施形態において、ＭＮＮ４Ｂ遺伝子座の破壊は、少なくとも１つの、マンノシルリン酸転移に関与する第二の遺伝子（例えば、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃ、またはＰＮＯ１）と組み合わせられる。この場合、好ましくは、この第二の遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰＮＯ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＤ１０５４３４）である。当業者は、オリゴ糖合成に関与する任意の遺伝子、またはそのフラグメントを、破壊されたＭＮＮ４Ｂまたは突然変異されたＭＮＮ４Ｂと組み合わせて、破壊しても、突然変異してもよいことが企図され、このことは結果として、他の真菌宿主におけるグリカンへのマンノシルリン酸転移の除去を生じる。
【００６５】
別の実施形態において、マンノシルリン酸転移活性が既に減弱化された宿主（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、ＭＮＮ４Ｂをコードする遺伝子（配列番号３）を破壊するための方法が提供される。さらに、他のＰｉｃｈｉａ種におけるグリカンへのマンノシルリン酸転移の除去が、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃ、またはＰＮＯ１と相同性を有する遺伝子の任意の組み合わせを、破壊することまたは突然変異することに関与することが、企図される。
【００６６】
本発明のさらに別の局面において、新たに同定された、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの３つの遺伝子、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃのそれぞれを、遺伝子ノックアウトの任意の組み合わせが、この突然変異系統において発現される糖タンパク質の、マンノシルリン酸化に効果を有するかどうかを決定するために、実施例３に記載される、融合ノックアウト戦略を用いて、破壊した。ＰＣＲ重複ノックアウト戦略（図４）のように、個々のＤｍｎｎ４Ａ突然変異体、Ｄｍｎｎ４Ｂ突然変異体、およびＤｍｎｎ４Ｃ突然変異体は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）タンパク質のグリカンにおける、マンノシルリン酸化転移活性の減少を示さなかった（データは示さず）。しかしながら、Ｄｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４ｂの二重ヌル突然変異体（ＹＡＳ１７４）において発現されたＫ３レポータータンパク質は、実質的にいかなるマンノシルリン酸化も含まない（図６Ｃ、図６Ａおよび図６Ｂと比較せよ）。２０分〜３０分の間の、マンノシルリン酸化グリカンの非存在に注目されたい。
【００６７】
（異種糖タンパク質発現系）
酵母および糸状菌において、異種糖タンパク質を発現するための、確立された技術を用いて、治療的糖タンパク質をコードする遺伝子が発現される。真菌組換えタンパク質発現系は、代表的には、プロモーター（例えば、ＡＯＸＩ、ＡＯＸ２、または他の誘導性プロモーター）、転写終結因子（例えば、ＣＹＣ）、選択可能なマーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、Ｇ４１８、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４、Ｚｅｏｃｉｎ）、および分泌シグナル（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＃ＭＦ）を含み得る。１つの実施形態において、この発現系は、少なくともｍｎｎ４Ｂ突然変異体であるように、改変される。好ましくは、糖タンパク質は、少なくとも＃ｍｎｎ４Ｂを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生される。
【００６８】
目的の糖タンパク質は、本明細書中に開示される方法の使用を通じる、任意の手段によって産生され得る。糖タンパク質産生は、細胞内区画中の蓄積、または細胞から培養液の上清への分泌を含む、宿主細胞における任意の手段によって提供され得る。本発明の宿主細胞は、当該分野で公知の、または企図される任意の手段を用いて、増殖されても、培養されてもよく、このような手段としては、細菌培養管、フラスコ、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）、振盪フラスコ、または発酵槽内での増殖が挙げられるが、これらに限定されない。糖タンパク質産物の単離および／または精製は、当該分野で公知の、または企図される任意の手段（例えば、分画、イオン交換、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィー）によって行われ得る。糖タンパク質の産生および精製の例は、実施例７に開示される。
【００６９】
本明細書中に記載される方法を用いる、マンノシルリン酸化グリカンを含まずに発現される糖タンパク質としては：エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロン＃ａ、インターフェロン＃ｂ、インターフェロン＃ｇ、インターフェロン＃ｗ、ＴＮＦ−＃、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１ｒａ））、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトタンパク質Ｃ（ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）、アンチトロンビンＩＩＩ、およびトロンボポエチン抗体）；ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびそれらのフラグメント、Ｆｃ領域およびＦａｂ領域、可溶性ＩｇＥレセプターａ−鎖、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン分泌因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）−１、オステオプロテゲリン、＃−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、＃−フェトプロテイン、ならびにグルコセレブロシダーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７０】
（マンノシルリン酸化を欠失した、複合糖タンパク質の産生）
本発明の別の局面において、本発明は、糖タンパク質上のグリカンへのマンノシルリン酸転移の除去工程を包含する、真菌および酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における、複合Ｎ−連結グリカンの産生の方法が提供される。このような方法は、糖タンパク質上に、実質的にマンノシルリン酸残基を含まない、糖タンパク質組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明は、全Ｎ−グリカンの１％未満が、マンノシルリン酸化された、糖タンパク質を提供する。さらに好ましい実施形態において、全Ｎ−グリカンの０．５％未満が、マンノシルリン酸化された、糖タンパク質を提供する。
【００７１】
本発明の別の局面において、この糖タンパク質組成物は、複合Ｎ−グリカン上に実質的にマンノシルリン酸残基を含まない。このようなグリカンを産生する方法は、複合Ｎ−グリカンを発現する宿主系統（例えば、Ｋ３レポータータンパク質を発現する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４）中における、ＰＮＯ１遺伝子およびＭＮＮ４Ｂ遺伝子の破壊に関与する（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：１２４４−１２４６）。ＹＡＳ−１３０として名付けた、ｐｎｏ１  ｍｎｎ４Ｂ破壊を含む、操作された系統は、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸残基を欠失する（実施例５）。ＹＳＨ−４４中のＰＮＯ１遺伝子の遺伝的破壊（ＹＳＨ−４９と名付けた）は、マンノシルリン酸化（酸性画分）を示すグリカンのモル％を減少させるが、マンノシルリン酸残基はなお残る（図５Ｃ）。ＹＳＨ−４４由来のグリカンの、穏やかな酸加水分解での処理、続けてアルカリホスファターゼでの処理は、この酸性画分が、全グリカンの約５％〜約１５％を含むことを示す。このＹＳＨ−４９系統は、約６％の酸性画分を示し、このことは、ＹＳＨ−４４の約９％の酸性画分に対して、好都合に比較する（図５Ｂ）。
【００７２】
対照的に、図５Ｄは、図５Ａのコントロール（Ｈ２Ｏ）、図５Ｂの、約９％のマンノシルリン酸化を有するＹＳＨ−４４、および、図５Ｃの、約６％のマンノシルリン酸化を有するＹＳＨ−４９（Ｄｐｎｏ１）と比較して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１３０（Ｄｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４Ｂ）における、グリカンへのマンノシルリン酸転移の除去を示す。本明細書中で、初めて、マンノシルリン酸化グリカンを実質的に含まないように操作された、酵母系統について記載される。
【００７３】
他の型の酵母および糸状菌が、本明細書中に記載される方法を用いて、マンノシルリン酸転移活性を欠失するように改変され得ることがまた、企図される。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、マンノシルリン酸残基を欠失する、複合Ｎ連結糖タンパク質を産生するために、好ましい宿主菌株であるが、以下の宿主細胞もまた、操作され得る：Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）。
【００７４】
（酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生される、治療的糖タンパク質）
異なる糖タンパク質は、同じ宿主細胞中で、異なる度合いおよび型のグリコシル化を示し得る（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、１９９８）。本発明は、マンノシルリン酸化を実質的に欠失する、組換え酵母系統における、種々の糖タンパク質の酸性方法を提供する。好ましくは、この方法は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｄｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４Ｂにおける、異種糖タンパク質の発現の操作に関与する。このように、本発明は、種々の治療的糖タンパク質上のグリカンからの、マンノシルリン酸化の除去を示す（図７Ａ〜図７Ｅ、図８）。
【００７５】
レポータータンパク質Ｋ３が、単一のＮ連結グリコシル化部位を含む一方で、本明細書中で開示されるレポータータンパク質Ｈｉｓ−エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、３つのＮ連結グリコシル化部位を含み、本明細書中で開示されるレポータータンパク質Ｈｉｓ−ＣＤ４０は、２つのグリコシル化部位を含み、そして本明細書中で開示されるＨｉｓ−インベルターゼタンパク質は、２４個までのグリコシル化部位を含む。Ｈｉｓでタグを付けられたエリスロポエチン（Ｈｉｓ−ＥＰＯ）は、図７Ｂにおいて、マンノシルリン酸化を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統から発現され、そして図７Ｃにおいて、マンノシルリン酸化を欠失する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｄｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４Ｂ系統から発現される。Ｈｉｓでタグを付けられたＣＤ４０（Ｈｉｓ−ＣＤ４０）は、図７Ｄにおいて、マンノシルリン酸化を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統から発現され、そして図７Ｅにおいて、マンノシルリン酸化を欠失する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｄｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４Ｂ系統から発現される。Ｈｉｓでタグを付けられたインベルターゼは、図８において、マンノシルリン酸化を欠失するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統から発現される。これらの糖タンパク質のそれぞれについての、系統構築は、実施例６に記載される。
【００７６】
（ＭＮＮ４ホモログの同定）
本発明の別の局面において、任意の酵母（好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ種）、または糸状菌における、ＭＮＮ４遺伝子のホモログの同定方法が提供される。当業者は、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃ、またはＰＮＯ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＤ１０５４３４）のアミノ酸配列を用いて、任意の酵母（好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ）のゲノムに対して、ＢＬＡＳＴデータベース検索を行い、そしてこれらの遺伝子の任意のものの、ホモログを得ることが出来る。Ｐｉｃｈｉａ酵母における、ＭＮＮ４／ＰＮＯ１ホモログの同定によって、当業者は続いて、これらの相同な遺伝子の任意の組み合わせを、破壊または突然変異し得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）における、ＭＮＮ４／ＰＮＯ１のホモログのアラインメントが、図９に示される。Ｐｉｃｈｉａ宿主から発現されるタンパク質上の、マンノシルリン酸化グリカンの存在についてのスクリーニング（実施例７）に際して、破壊すると、Ｐｉｃｈｉａ宿主から、マンノシルリン酸化を実質的に含まない糖タンパク質を発現させる、遺伝子または遺伝子の組み合わせを、当業者は決定し得る。
【００７７】
上記の破壊された遺伝子、または、糖タンパク質のグリカンへの、マンノシルリン酸の転移に関与するタンパク質についてコードする遺伝子は、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ属に属する酵母系統に由来する。本発明に従う、Ｐｉｃｈｉａ属に属する酵母としては：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中で、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが、好ましくは用いられる。ほかの酵母および糸状菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａが挙げられる。
【００７８】
以下は、本発明の組成物および方法を例示する、実施例である。これらの実施例は、限定するように解釈されるべきではなく、これらの実施例は、例示の目的のみのために含まれる。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃの同定および配列決定（図１〜図３））
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ４タンパク質配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３６０４４）を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノム配列（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に対して、相同性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームについて、ブラスト検索した。この検索から、ＭＮＮ４ｐと相同な領域を有する、３つのＯＲＦを同定した。これらのＯＲＦを、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、およびＭＮＮ４Ｃと名付けた。続いて、これら３つの遺伝子のそれぞれを、配列決定した。ＭＮＮ４Ａ遺伝子は、８６０アミノ酸をコードする、２５８０ヌクレオチド塩基を含む、オープンリーディングフレームを含むように見受けられた（図１）。ＭＮＮ４Ｂ遺伝子は、６５２アミノ酸をコードする、１９５６ヌクレオチド塩基を含む、オープンリーディングフレームを含むように見受けられ（図２）、そして、ＭＮＮ４Ｃ遺伝子は、７６３アミノ酸をコードする、２２８９ヌクレオチド塩基を含む、オープンリーディングフレームを含むように見受けられた（図３）。
【００８０】
（実施例２）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統：ＹＳＨ−４４およびＹＳＨ−１の構築）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４およびＹＳＨ−１を、ＢＫ６４−１（単一のＮ連結グリコシル化部位を有するレポータータンパク質である、Ｋ３を分泌する、Ｄｏｃｈ１欠失突然変異体）から操作した（Ｃｈｏｉら、２００３、ＰＮＡＳ、１００：５０２２−５０２７；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：１２４４−１２４６）。ＹＳＨ−１は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を発現し、そしてＹＳＨ−４４は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を発現する。
【００８１】
（ＹＳＨ−４４系統における、ＰＮＯ１遺伝子の欠失）
ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８：２６０７−２６１５）によって、ＹＳＨ−４４における、ｐｎｏ１欠失対立遺伝子（ｐｎｏ１：：ＨｙｇＲ）を生成した。プライマーＰＮＫ２（
【００８２】
【化１】
2007530014.tif 000003
）（配列番号８）と対になるプライマーＰＮＫ１（
【００８３】
【化２】
2007530014.tif 000004
）（配列番号７）、プライマーＰＮＫ４（
【００８４】
【化３】
2007530014.tif 000005
）（配列番号１０）と対になるプライマーＰＮＫ３（
【００８５】
【化４】
2007530014.tif 000006
）（配列番号９）を、ゲノムＤＮＡ（ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０）から、ＰＮＯ１遺伝子の５’隣接領域および３’隣接領域を増幅するために用いた。プライマーＫＡＮ２（５’−ＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧ−３’）（配列番号１２）と対になるプライマーＫＡＮ１（５’−ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴ−ＴＣＧＴＡＣＧＣＴＧＣ−３’）（配列番号１１）を、ｐＡＧ３２（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｃＣｕｓｋｅｒ、１９９９、Ｙｅａｓｔ、１４：１５４１−１５５３）から、Ｈｙｇ耐性マーカーを増幅するために用いた。次いで、重複産物を生成するために、第一回のＰＣＲ反応に由来する３つの産物全てを用いた、２回目の反応において、プライマーＰＮＫ１およびプライマーＰＮＫ４を用いた。結果として生じる融合ＰＣＲ産物を、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に発現する、操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統である、ＹＳＨ−４４系統に形質転換するために用いた。形質転換体を、２００ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース）培地上で選抜した。欠失対立遺伝子ｐｎｏ１：：ＨｙｇＲの適切な組み込みを、ＰＣＲによって確認した。このＤｐｎｏ１系統を、ＹＳＨ−４９と名付けた。
【００８６】
（実施例３）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４９系統における、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４Ｂノックアウト戦略（図４））
ＹＳＨ−４９におけるＰＣＲ重複によって、ＹＡＳ−１３０（Ｄｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４ｂ）二重突然変異系統を達成した。ＴＡＳ５４プライマー（ＴＴＣＡＡＣＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡ）（配列番号１３）、およびＴＡＳ５１プライマー（
【００８７】
【化５】
2007530014.tif 000007
）（配列番号１４）を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ（ＮＲＲＬ−Ｙ  １１４３０）から、予測される開始コドンの５’側の、５２１ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅するために用いた。ＴＡＳ５１は、薬物耐性マーカー５’末端に相補的な、２２ｂｐの突出部を含む。ＴＡＳ４９（ＴＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＡ）（配列番号１５）、およびＴＡＳ５２（
【００８８】
【化６】
2007530014.tif 000008
）（配列番号１６）を、予測される終止コドンの３’側の、５０３ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅するために用いた。ＴＡＳ５２はまた、薬物耐性マーカーの３’末端に相補的な、２２ｂｐの突出部を含む。薬物耐性マーカーのＰＣＲは、ＤＮＡ源としてｐＡＧ２９（ｐａｔ  ＯＲＦを含む）を用いた（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｃＣｕｓｔｅｒ、１９９９）。この薬物耐性マーカーを、ＴＡＳ５３プライマー（
【００８９】
【化７】
2007530014.tif 000009
）（配列番号１７）、およびＴＡＳ５０プライマー（
【００９０】
【化８】
2007530014.tif 000010
）（配列番号１４）を用いて、増幅した。ＴＡＳ５３は、予測されるＭＮＮ４Ｂの開始コドンの５’側の２２ｂｐと相補的な、２２ｂｐの突出部を有する。ＴＡＳ５０は、予測されるＭＮＮ４Ｂの終止コドンの３’側の２２ｂｐと相補的な、２２ｂｐの突出部を有する。ＭＮＮ４Ｂの５’側フラグメント、ＭＮＮ４Ｂの３’側フラグメント、および、選択可能なマーカーに対する耐性を与える遺伝子を、等モル比率において合わせ、そして、ＰＣＲ重複反応について、テンプレートのＤＮＡとして、ＴＡＳ５４プライマーおよびＴＡＳ４９プライマーと共に、用いた。
【００９１】
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１系統における、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４Ｂノックアウト戦略）
Ｄ  ｏｃｈ１  Ｄｍｎｎ４Ａ  Ｄ  ｐｎｏ１系統であるＹＡＳ１５９を得るために、ＳｆｉＩ消化したｐＪＮ５０３ｂ（Ｄｍｎｎ４Ａ  Ｄｐｎｏ１：：ＵＲＡ３）を、ＹＳＨ−１にエレクトロポレーションにて形質転換した。この系統において、５−ＦＯＡの対抗選択（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって、ＵＲＡ３選択可能マーカーを回収した。結果として生じる系統である、ＹＡＳ１６４（Ｄ  ｏｃｈ１；Ｄｍｎｎ４Ａ  Ｄ  ｐｎｏ１；ｕｒａ３；ｈｉｓ４；ａｄｅ１；ａｒｇ４）に、ＳｆｉＩ消化したｐＡＳ１９（Ｄ  ｍｎｎ４Ｂ：ＵＲＡ３）を形質転換して、Ｄ  ｏｃｈ１  Ｄｍｎｎ４Ａ  Ｄ  ｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４Ｂ系統である、ＹＡＳ１７０を生じさせた。引き続いて、ＹＡＳ１７４系統（Ｄ  ｏｃｈ１  Ｄｍｎｎ４Ａ  Ｄ  ｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４Ｂ；ｕｒａ３；ｈｉｓ４；ａｄｅ１；ａｒｇ４）を得るために、ＹＡＳ１７０系統を５−ＦＯＡにて対抗選択した。従って、ＹＡＳ１７４は、マンノース外鎖形成を欠失し、そしてＮ連結グリカン上のマンノシルリン酸を有さない、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ系統を表す。
【００９２】
（実施例４）
（ＰＣＲ増幅）
全てのＰＣＲ反応について、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒを用いた。ＰＣＲ反応液は、テンプレートＤＮＡ、１２５ｍＭのｄＮＴＰ、それぞれ０．２ｍＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）、ならびにＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼを含んだ。予測されるＭＮＮ４Ｂ  ＯＲＦの５’側のＤＮＡフラグメント、予測されるＭＮＮ４Ｂ  ＯＲＦの３’側のＤＮＡフラグメント、および薬物耐性マーカーを、最初の変性工程が９７℃で２分間、および、最後の伸長工程が７２℃で７分間である、９７℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で９０秒間の３０サイクルによって、増幅した。ＰＣＲサンプルを、アガロースゲル電気泳動にて分離し、そしてＤＮＡバンドを、Ｑｉａｇｅｎから入手したＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、抽出および精製した。全てのＤＮＡ精製物を、ｐＨ８．０である、１０ｍＭのＴｒｉｓに溶出したが、最後のＰＣＲ（３つのフラグメント全ての重複）は、脱イオン化Ｈ２Ｏに溶出した。
【００９３】
（実施例５）
（マンノシルリン酸化解析のための、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける複合グリカンの産生のための、ＤＮＡ形質転換、培養条件）
形質転換のためのＤＮＡを、酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍまで添加することで、調製した。次いで、このＤＮＡサンプルに、１００％の氷冷エタノールを、最終濃度７０％まで添加した。ＤＮＡを遠心分離（１２０００ｇ×１０分間）によってペレット化し、そして、７０％の氷冷エタノールを用いて２回洗浄した。ＤＮＡを乾燥させ、次いでｐＨ８．０である、１０ｍＭのＴｒｉｓ５０ｍｌに再懸濁した。ＢＭＧＹ（緩衝化最小グリセロール：１００ｍＭ、ｐＨ６．０のリン酸カリウム；１．３４％の酵母ニトロゲンベース；４×１０−５％のビオチン；１％のグリセロール）中で酵母培養物を、２〜６のＯ．Ｄ．まで拡大することで、ＹＳＨ−４９およびＹＡＳ−１３０を調製した。これらの酵母を、１Ｍのソルビトールで３回洗浄し、そして約１〜２ｍｌの１Ｍソルビトールに再懸濁することで、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）にした。ＤＮＡ（１〜２ｍｇ）を、１００ｍｌのコンピテント酵母と混合し、そして氷上で１０分間インキュベートした。次いで、以下のパラメーター；１．５ｋＶ、１２９Ω、および２５ｍＦ、を用いるＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００によって、酵母をエレクトロポレートした。このエレクトロポレートされた細胞に、１ｍｌのＹＰＤＳ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース、１Ｍのソルビトール）を添加した。引き続いて、形質転換された酵母を、選択寒天プレートにプレートした。ｈｐｈ抵抗性遺伝子を含むノックアウト構築物を形質転換された細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む、ＹＰＤ  Ｙ＋（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース、１．３４％の、アミノ酸を含まない酵母ニトロゲンベース）寒天プレート上に塗付した。ｐａｔ抵抗性遺伝子を含む構築物を形質転換された細胞を、０．６ｍｇ／ｍｌのグルホシネートを含む、定義された培地（アミノ酸およびＮＨ４ＳＯ４を欠く、１．３４％の酵母ニトロゲンベース、２％のデキストロース、０．１％のＬ−プロリン、４×１０−５％のビオチン）寒天プレート上に塗付した。コロニーを、同じ選択薬剤を含む別のプレート上に、寄せ集めた。この寄せ集めからＤＮＡを単離し、野生型ＭＮＮ４ＢＯＲＦの薬物耐性マーカーによる置換について、ＰＣＲによって解析した。
【００９４】
ノックアウトのスクリーニングを、ノックアウト構築物の５’側部分および３’側部分の双方をＰＣＲ増幅すること（図４）によって行った。ノックアウト構築物の５’側部分をスクリーニングするために、ＴＡＳ８１プライマー（ＴＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＡ−ＡＡＣＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧ）（配列番号１９）、およびＴＡＳ０８プライマー（ＡＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＣ−ＴＧＴＣＡＡＧＧ）（配列番号２０）を用いる一方、ノックアウト構築物の３’側部分をスクリーニングするために、ＴＡＳ８２プライマー（ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＧＧＴＴ）（配列番号２１）、およびＴＡＳ０７プライマー（ＴＣＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＣ）（配列番号２２）を用いた。ＴＡＳ０８プライマーおよびＴＡＳ０７プライマーは、それぞれ、薬物耐性マーカー配列の５’側末端および３’側末端にアニールし、そしてＴＡＳ８１およびＴＡＳ８２は、ノックアウト構築物に用いられるＤＮＡの５’側領域および３’側領域に隣接するゲノムの配列に相補的であるので、双方のスクリーニングにおけるＰＣＲ産物の観察は、ＭＮＮ４Ｂ  ＯＲＦのノックアウトの成功を示す。９６個の形質転換体をスクリーニングし、ＭＮＮ４Ｂノックアウトとして４個が試験的に陽性であった。４つのＤｐｎｏ１  Ｄｍｎｎ４ｂ系統は全て、検出可能なレベルのマンノシルリン酸を有さない、Ｋ３レポータータンパク質を発現した。この一例を、図５Ｄに示す。
【００９５】
（実施例６）
（Ｈｉｓでタグを付けられた、ＥＰＯタンパク質、ＣＤ４０タンパク質、およびインベルターゼタンパク質についての系統構築、図７，８）
Ｈｉｓでタグを付けられたエリスロポエチン（ＥＰＯ）のために、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、ＥＰＯの最初の１６６アミノ酸を増幅して、そしてＣ−末端６Ｈｉｓ  ｐＰＩＣＺＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドの、ＥｃｏＲＩ部位およびＫｐｎＩ部位に挿入した。このプラスミド（ｐＢＫ２９１）を２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統に形質転換し、ＥＰＯ−６Ｈｉｓを発現する、以下の系統を生じた：実施例２、実施例４に記載され、そして示される、ＢＫ２４８ノックアウト（ｕｒａ３、ｈｉｓ４、ａｄｅ１、ａｒｇ４、Ｄ  ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３）およびＢＫ２４４ノックアウト［ｐＢＫ１１６、およびｐｎｏ１ｍｎｎ４ｂ（ｐｎｏ１：：ＨｙｇＲ）を有するｐＢＫ２８４を形質転換されたＹＳＨ４４］（ｍｎｎ４ｂ：：ＫａｎＲ）。ｐＢＫ１１６は、ＮＲＲＬ１１４３０（ＡＴＣＣ）から単離された１５５１ｂｐのＡＯＸ１  ３’ＵＴＲ  ＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＰＩＣ６ＡプラスミドのＡＦｌＩＩＩ部位に挿入し、そしてＮＲＲＬ１１４３０から単離された１９５２ｂｐのＡＯＸ１  ５’ＵＴＲ  ＤＮＡフラグメントを、５７３ｂｐのＰｍｅＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントを除去した、同じｐＰＩＣ６ＡプラスミドのＢｇｌＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位に挿入することの結果として生じる。次いで、このｐＢＫ１１６をＮｏｔＩで消化し、そして、レポーターであるＫ３タンパク質をノックアウトするために、生じたＮｏｔＩフラグメントをＹＳＨ４４に形質転換した。ｐＢＫ２８４は、ＮＲＲＬ１１４３０（ＡＴＣＣ）から、ＡＯＸ１プロモーター配列、ＡＯＸ１  ＯＲＦ配列、およびＡＯＸ１ターミネーター配列を含む３１９６ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯのマルチクローニング部位にクローニングすることの結果として生じる。次いで、カナマイシン遺伝子を消失するために、このプラスミドをＭｓｃＩおよびＢｓｓＨＩで消化した。この結果ｐＢＫ２８４が生じ、これを、ＡＯＸＩプロモーター遺伝子座への組み込みのためにｐＢＫ１１６を形質転換された、ＹＳＨ４４系統への形質転換に先立って、ＰｍｅＩで消化した。ＢＫ２４８およびＢＫ２４４における、ＥＰＯ−６ＨｉｓのＨＰＬＣグリカン解析を、図７Ｂおよび図７Ｃに示す。Ｈｉｓタグを付けられたＣＤ４０のために、ｐｈＣＤ４０／ＧｅｍＴ（Ｐｕｌｌｅｎら、１９９９、ＪＢＣ、２７４：１４２４６−１４２５４）から、ｐＰＩＣＺ  ａＡへのクローニングのための５’ＥｃｏＲＩプライマーおよび３’Ｈｉｓ１０−ＫｐｎＩプライマーを用いて、ヒトＣＤ４０  ＤＮＡを増幅し、結果としてｐＪＣ３３を生じた。ｐＪＣ３３を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＪＣ１２系統（ｕｒａ３、ｈｉｓ４、ａｄｅ１、ａｒｇ４）、およびＹＡＳ２５２−２（ｐＢＫ１１６、ｐＢＫ２８４、および、ガラクトシルトランスフェラーゼを含むｐＲＣＤ４６５（ＵＳＳＮ  ６０／５６２４２４）を形質転換されたＹＡＳ−１３０）内で発現させ、後者は結果としてＹＡＳ２５２を生じた。ＹＪＣ１２およびＹＡＳ２５２内での、ＣＤ４９−６ＨｉｓのＨＰＬＣグリカン解析を、図７Ｄおよび図７Ｅに示す。Ｈｉｓでタグを付���られたインベルターゼのために、インベルターゼ配列の全長を、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから購入した、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡ（ＣＢＳ６８３系統）から、ＰＣＲによって増幅した。このインベルターゼＯＲＦを、ＰｍｌＩ部位におけるｐＰＩＣＺＡプラスミド（Ｃ末端の６Ｈｉｓタグを提供する）への挿入のために、平滑末端の５’プライマーおよび３’プライマーを用いて増幅した。このｐＰＢ１４７を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ２４５−２系統（ｐＢＫ１１６、ｐＢＫ２８４、およびｐＲＣＤ４６５（ＵＳＳＮ  ６０／５６２４２４）を形質転換されたＹＡＳ１３０）に形質転換し、結果としてＹＡＳ２５３を生じた。ＹＡＳ２５３におけるインベルターゼ−６ＨｉｓのＨＰＬＣグリカン解析を、図８に示す。
【００９６】
（実施例７）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるマンノシルリン酸化の決定）
図５〜図８に示す系統における、Ｎ連結グリカンへのマンノシルリン酸の転移の量を、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下において発現される、Ｈｉｓでタグを付けられたレポータータンパク質（図５および図６において、クリングル３タンパク質；図７において、エリスロポエチンタンパク質およびＣＤ４０タンパク質、ならびに、図８においてインベルターゼタンパク質）の分泌によって決定した。手短に言うと、ＢＭＧＹを含む振盪フラスコに、新鮮な酵母培養物（例えば、ＹＡＳ−１３０）を播種し、そして、Ｏ．Ｄ．が約２０になるまで増殖させた。この培養物を遠心分離し、そして細胞ペレットをＢＭＭＹ（緩衝化最小メタノール：１％グリセロールの代わりに０．５％メタノールを含む点を除いて、ＢＭＧＹと同じ）で洗浄した。細胞ペレットを、最初のＢＭＧＹ培養物の１／５の体積までのＢＭＭＹに再懸濁し、そして振盪機に２４時間置いた。分泌されたタンパク質、遠心分離によってバイオマスをペレット化し、そして培養培地を新たなチューブに移すことで、収集した。次いで、Ｈｉｓでタグを付けられたＫ３タンパク質、ＥＰＯタンパク質、ＣＤ４０タンパク質、およびインベルターゼタンパク質を、Ｎｉ−親和性カラム上で精製し、そしてＰＮＧａｓｅ（Ｃｈｏｉら、２００３）で消化した。グリカンをタンパク質から分離し、次いで２−アミノ−ベンズアミド（２−ＡＢ）で標識した。この２−ＡＢで標識されたグリカンを凍結乾燥し、ＨＰＬＣグレードの水に再懸濁し、そしてＧｌｙｃｏＳｅｐ  Ｃカラム（Ｇｌｙｃｏ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を用いたＨＰＬＣに供した。この解析は、中性グリカンと酸性グリカンの分離を可能とする。末端のマンノース基を除いてリン酸を露出させる、穏やかな酸による加水分解を用いる実験によるリン酸化のために、これらのグリカンを決定した。引き続くアルカリホスファターゼ処理によって、末端のリン酸基を切断させて、中性のグリカンを残し得る。一連の実験は、全ての系統におけるリン酸化されたＮ連結グリカン（酸性グリカン）が、２０分〜３０分の間に移動することを示した。ｄＨ２Ｏをブランクとして用いることで、基線条件を評価した。リン酸化の割合を、酸性ピーク面積を中性ピークおよび酸性ピークの和で割ることで計算した。このＨＰＬＣ解析を、以下の条件下で行った。
【００９７】
（ＨＰＬＣ解析）
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：溶媒Ａ（アセトニトリル）、溶媒Ｂ（５００ｍＭの酢酸アンモニウム、５００ｍＭ、ｐＨ４．５）、および溶媒Ｃ（水）。流速は、０．４ｍＬ／分にて５０分間である。１０分間、イソクラティク（２０％  Ａ：８０％  Ｃ）に溶出した後、グリカンを溶出するために、３０分間、線形溶媒勾配（２０％  Ａ：０％  Ｂ：８０％  Ｃ〜２０％  Ａ：５０％  Ｂ：３０％  Ｃ）を用いた。実行の間に、カラムを溶媒（２０％  Ａ：８０％  Ｃ）で２０分間平衡化した。
【００９８】
（配列表テキスト）
【００９９】
【化９】
2007530014.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｃの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、薬物耐性マーカーを用いた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂの、融合ＰＣＲノックアウト戦略を示す。
【図５−１】図５Ａは、サンプルとしてＨ２Ｏを用いる、ネガティブ実験コントロールについての、高速液体クロマトグラムを示す。図５Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。図５Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４９（＃ｐｎｏ１）の上清から精製されたＫ３に由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。
【図５−２】図５Ｄは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１３０（＃ｐｎｏ１＃ｍｎｎ４Ｂ）の上清から精製されたＫ３に由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。２０分〜３０分の間の、マンノシルリン酸化グリカンの非存在に注目されたい。
【図６】図６Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１（Ｄ  ｏｃｈ１）の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。図６Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１６４（Ｄ  ｏｃｈ１  Ｄｍｎｎ４Ａ  Ｄ  ｐｎｏ１）の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。図６Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１７４（Ｄ  ｏｃｈ１  Ｄｍｎｎ４Ａ  ＃ｐｎｏ１＃ｍｎｎ４Ｂ）の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。２０分〜３０分の間の、マンノシルリン酸化グリカンの非存在に注目されたい。
【図７−１】図７Ａは、Ｈ２Ｏを含むネガティブ実験コントロールサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。図７Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＢＫ２４８系統より産生された、ｐＢＫ２９１（Ｈｉｓ−ＥＰＯ）から発現される、エリスロポエチンに由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。図７Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＢＫ２４４系統において産生されるＨｉｓ−Ｅｐｏに由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。
【図７−２】図７Ｄは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＪＣ１２系統において産生される、ｐＪＣ３３（Ｈｉｓ−ＣＤ４０）から発現される、ＣＤ４０に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。図７Ｅは、ＹＡＳ２５２についての高速液体クロマトグラムを示す。注意：マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。
【図８】図８Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ２５２系統において産生されるｐＰＢ１４７から発現される、インベルターゼに由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。
【図９】図９は、ＤＮＡＳｔａｒから提供されるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐｐ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎｃ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｎ）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃａ）、およびＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（Ｐａ）における、ＭＮＮ４／ＰＮＯ１のホモログのアラインメントを示す。
【図１−１】
2007530014.tif 000012
【図１−２】
2007530014.tif 000013
【図１−３】
2007530014.tif 000014
【図２−１】
2007530014.tif 000015
【図２−２】
2007530014.tif 000016
【図２−３】
2007530014.tif 000017
【図３−１】
2007530014.tif 000018
【図３−２】
2007530014.tif 000019
【図４】
2007530014.tif 000020
【図５−１】
2007530014.tif 000021
【図５−２】
2007530014.tif 000022
【図６】
2007530014.tif 000023
【図７−１】
2007530014.tif 000024
【図７−２】
2007530014.tif 000025
【図８】
2007530014.tif 000026
【図９−１】
2007530014.tif 000027
【図９−２】
2007530014.tif 000028
【図９−３】
2007530014.tif 000029
【図９−４】
2007530014.tif 000030
【図９−５】
2007530014.tif 000031
【図９−６】
2007530014.tif 000032
【図９−７】
2007530014.tif 000033
【図９−８】
2007530014.tif 000034
【図９−９】
2007530014.tif 000035
【図９−１０】
2007530014.tif 000036
【図９−１１】
2007530014.tif 000037
【図９−１２】
2007530014.tif 000038
【図９−１３】
2007530014.tif 000039
【配列表】
2007530014000001.xml
【国際調査報告】
2007530014.tif 000084
2007530014.tif 000085
2007530014.tif 000086