(57)【要約】  本発明は、配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むポリペプチド、かかるポリペプチドの使用及びかかるポリペプチドを産生する発現系を特徴とする。配列番号１は完全長Ｓ．アウレウスポリペプチドの切断誘導体である。完全長ポリペプチドは、本明細書では完全長「ＯＲＦ０６５７ｎ」と称する。配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫応答を生じることが判明した。
2007502101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらし、１個以上の追加のポリペプチド領域が存在する場合には前記追加の領域は配列番号２のアミノ酸６０９から６４５を含むカルボキシ末端を与えない、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号３と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むその断片からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号３と少なくとも９４％同一なアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも９４％同一なアミノ酸配列を含むその断片からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号３又は配列番号４２と少なくとも９４％同一なアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号１、３、７、１７、２０又は４２のアミノ酸配列から本質的になる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号１、３、７、１７、２０又は４２のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列とカルボキシ末端又はアミノ末端において前記配列に共有結合した１個以上の追加の領域部分とからなり、各領域又は部分が以下の諸性質、すなわち、免疫応答を増強する性質、精製を容易にする性質、又はポリペプチドの安定性を高める性質のうち少なくとも１つを有する領域又は部分から独立に選択される、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む免疫原。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原の免疫学的有効量と薬剤として許容される担体とを含む、患者において防御免疫応答を誘導することができる組成物。
【請求項９】
前記組成物がさらにアジュバントを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む核酸。
【請求項１１】
前記組換え遺伝子がシグナルペプチドコード配列及び細胞壁局在化シグナル配列の少なくとも実質的にすべてを欠く、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記組換え遺伝子が、酵母発現に対して最適化された１個以上のコドンを含む、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、酵母における発現に対して最適化された少なくとも５０％のコドンである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記核酸が発現ベクターである、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３からなる群から選択される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸が発現ベクターである、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１０から１６のいずれか一項に記載の核酸を含む組換え細胞。
【請求項１８】
（ａ）ポリペプチドが発現される条件下で請求項１７に記載の組換え細胞を増殖させるステップと、および
（ｂ）前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む、防御免疫をもたらすＳ．アウレウスポリペプチドを製造する方法。
【請求項１９】
前記組換え細胞がＳ．セレビシエである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドを含む免疫原の免疫学的有効量を患者に投与するステップを含み、前記ポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらす、患者における防御免疫応答を誘導する方法。
【請求項２１】
前記免疫原が請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者がＳ．アウレウス感染に対して予防的に治療される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法によって製造されるポリペプチドの免疫学的有効量を患者に投与するステップを含む、患者における防御免疫応答を誘導する方法。
【請求項２５】
ポリペプチドを含む免疫原の有効量を患者に投与するステップを含み、前記ポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、及び前記ポリペプチドがＳ．アウレウスに対して防御免疫をもたらす、患者における既往反応を誘導する方法。
【請求項２６】
前記既往反応が、既存の力価に対して少なくとも３倍の増加した幾何級数的に増加する力価（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｔｅｒ）を３日以内にもたらす、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｓ．アウレウス感染に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むその断片をコードする酵母に対して最適化された核酸配列。
【請求項２８】
ＯＲＦ０６５７ｎシグナルペプチドも細胞壁局在化シグナル配列もコードしない、請求項２７に記載の酵母に対して最適化された核酸。
【請求項２９】
（ａ）Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え酵母細胞を前記ポリペプチドが発現される条件下で増殖させるステップ（前記ポリペプチドはＳ．アウレウス感染に対して防御免疫をもたらす完全長ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むその断片である。）と、および
（ｂ）前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドを製造する方法。
【請求項３０】
前記組換え遺伝子が、機能的ＯＲＦ０６５７ｎ細胞壁局在化シグナル配列をコードしない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組換え遺伝子が、機能的ＯＲＦ０６５７ｎ細胞壁局在化シグナル配列もシグナルペプチド配列もコードしない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換え酵母細胞がＳ．セレビシエであり、前記ヌクレオチド配列が配列番号１、３、７、１７又は２０のポリペプチドをコードする、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる２００３年７月２４日に出願された米国仮出願第６０／４８９，８４０号及び２００３年１１月１４日に出願された米国仮出願第６０／５２０，１１５号の利益を主張するものである。
【０００２】
本願を通して引用される参考文献は、本発明の従来技術であることを認めるものではない。
【０００３】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は広範な疾患及び症状の病原体である。Ｓ．アウレウスに起因する疾患及び症状の例としては、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、せつ、よう、膿か疹、水ほう性膿か疹、蜂か織炎、ボトリオミセス症、毒素性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性及び炎症性眼疾患、骨髄炎（ｏｓｔｅｏｍｙｌｅｔｉｔｉｓ）並びに関節及び骨の他の感染症、気道感染症などが挙げられる。（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．  １９９７）。
【０００４】
Ｓ．アウレウス感染及びＳ．アウレウスの伝播を抑えるために、免疫学に基づく戦略を使用することができる。免疫学に基づく戦略としては、受動免疫、能動免疫などが挙げられる。受動免疫は、Ｓ．アウレウスを標的にした免疫グロブリンを使用する。能動免疫では、Ｓ．アウレウスに対する免疫応答が誘導される。
【０００５】
Ｓ．アウレウスワクチン候補は、Ｓ．アウレウス多糖及びポリペプチドを標的にする。ターゲティングは、適切なＳ．アウレウス多糖又はポリペプチドをワクチン成分として使用して実施することができる。多糖ワクチン成分候補の例としては、Ｓ．アウレウス５型及び８型きょう膜多糖が挙げられる。（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ等、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６：４９１〜４９６、２００２）。ワクチン成分候補として使用することができるポリペプチドの例としては、コラーゲン付着因子、フィブリノーゲン結合タンパク質及びクランピング因子が挙げられる。（Ｍａｍｏ等、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：４７〜５４、１９９４、Ｎｉｌｓｓｏｎ等、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：２６４０〜２６４９、１９９８、Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ等、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８４：１５７２〜１５８０、２００１）。
【０００６】
Ｓ．アウレウスポリペプチド配列に関する情報は、Ｓ．アウレウスゲノムの配列を決定することによって得られた。（Ｋｕｒｏｄａ等、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１２２５〜１２４０、２００１、Ｂａｂａ等、Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１８１９〜１８２７、２０００、Ｋｕｎｓｃｈ他、１９９７年７月３０日に公表された欧州特許公報ＥＰ  ０  ７８６  ５１９号）。ゲノム配列決定から得られたポリペプチド配列を特徴づけようとしてバイオインフォマティクスがある程度使用された。（Ｋｕｎｓｃｈ他、１９９７年７月３０日に公表された欧州特許公報ＥＰ  ０  ７８６  ５１９号）。
【０００７】
潜在的抗原をコードする遺伝子を特定するために、ディスプレイ技術などの技術及び感染者の血清を一部使用することができる。（Ｆｏｓｔｅｒ他、２００１年１２月２７日に公表された国際公開第０１／９８４９９号、Ｍｅｉｎｋｅ他、２００２年８月１日に公表された国際公開第０２／０５９１４８号）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むポリペプチド、かかるポリペプチドの使用及びかかるポリペプチドを産生する発現系を特徴とする。配列番号１は完全長Ｓ．アウレウスポリペプチドの切断誘導体である。完全長ポリペプチドは、本明細書では完全長「ＯＲＦ０６５７ｎ」と称する。配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫応答を生じることが判明した。
【０００９】
「防御」免疫又は免疫応答という表記は、Ｓ．アウレウス感染に対する検出可能な防御レベルを指す。この防御レベルは、本明細書に記載されたモデルなどの動物モデルを用いて評価することができる。
【００１０】
したがって、本発明の第１の側面は、配列番号２のアミノ酸６０９から６４５で与えられるカルボキシ末端を含まず、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫を示し、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原である。配列番号２は、アミノ酸６０９から６４５がＬＰＸＴＧモチーフ（本明細書では「細胞ウェル局在化シグナル（ｃｅｌｌ  ｗｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）」と称する）で始まるカルボキシ末端ドメインを与える完全長ＯＲＦ０６５７ｎポリペプチドを与える。
【００１１】
「免疫原」という表記は、防御免疫をもたらす能力を指す。
【００１２】
配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むという表記は、配列番号１に関係する領域が存在し、追加のポリペプチド領域が存在し得ることを指す。追加のポリペプチド領域が存在する場合、このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６０９から６４５によって示されるカルボキシルＬＰＸＴＧモチーフを持たない。
【００１３】
本発明の別の側面は、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫をもたらすアミノ酸配列を含む免疫原である。この免疫原は、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列と、カルボキシ末端又はアミノ末端において共有結合した１個以上の追加の領域又は部分とを含み、各領域又は部分は以下の諸性質、すなわち、免疫応答を増強する性質、精製を容易にする性質又はポリペプチドの安定性を高める性質のうち少なくとも１つを有する領域又は部分から独立に選択される。
【００１４】
「追加の領域又は部分」という表記は、原核生物、真核生物宿主などの生物宿主において産生されるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドとは異なる領域又は部分を指す。例えば、追加の領域又は部分は、追加のポリペプチド領域又は非ポリペプチド領域とすることができる。
【００１５】
本発明の別の側面は、患者においてＳ．アウレウスに対する防御免疫を誘導することができる組成物である。この組成物は、薬剤として許容される担体と、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫をもたらす免疫原の免疫学的有効量とを含む。
【００１６】
免疫学的有効量は、Ｓ．アウレウス感染に対する防御免疫をもたらすのに十分な量である。この量は、Ｓ．アウレウス感染の可能性又は重症度を有意に抑制するのに十分な量とすべきである。
【００１７】
本発明の別の側面は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む核酸である。組換え遺伝子は、適切な転写及びプロセシングのための調節要素（翻訳要素及び翻訳後要素を含むことができる）と一緒にポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。組換え遺伝子は、宿主ゲノムとは無関係に存在することができ、又は宿主ゲノムの一部とすることができる。
【００１８】
組換え核酸は、その配列及び／又は形態のために天然には存在しない核酸である。組換え核酸の例としては、精製核酸、天然に存在するのとは異なる核酸を与える結合された２個以上の核酸領域、及び本来相互に関連する１個以上の核酸領域（例えば、上流又は下流領域）の欠如が挙げられる。
【００１９】
本発明の別の側面は組換え細胞である。この細胞は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
【００２０】
本発明の別の側面は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドを製造する方法である。この方法は、このポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え細胞を増殖させるステップと、このポリペプチドを精製するステップとを含む。
【００２１】
本発明の別の側面は、このポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え細胞を宿主中で増殖させるステップとこのポリペプチドを精製するステップとを含むプロセスによって製造された、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドである。異なる宿主細胞を使用することができる。本発明の一実施態様においては、宿主細胞は酵母細胞である。
【００２２】
本発明の別の側面は、患者においてＳ．アウレウスに対する防御免疫応答を誘導する方法である。この方法は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらす免疫原の免疫学的有効量を患者に投与するステップを含む。
【００２３】
本発明の別の側面は、患者において既往反応を誘導する方法である。この方法は、既往反応をもたらす免疫原の有効量を患者に投与するステップを含む。
【００２４】
本発明の別の側面は、酵母における発現に対して最適化されたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする核酸である。酵母発現に対して１個以上のコドンが最適化される。
【００２５】
本発明の別の側面は、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫をもたらすポリペプチドを組換え酵母細胞中で製造する方法である。この方法は、
（ａ）前記ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え酵母細胞を前記ポリペプチドが発現される条件下で増殖させるステップ（前記ポリペプチドはＳ．アウレウス感染に対して防御免疫をもたらす完全長ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むその断片である。）と、および
（ｂ）このポリペプチドを精製するステップと
を含む。
【００２６】
特定の用語が相容れない場合を除き、「又は」という表記は一方又は両方の可能性を示す。「及び／又は」などの句は、一方又は両方の可能性を強調するために使用されることがある。
【００２７】
「含む」などの非制限的用語の表記では、要素又はステップを追加することができる。「１個以上」などの句は、追加の要素又はステップの可能性を強調するために、非制限的用語と一緒に、又は非制限的用語と別に使用されることがある。
【００２８】
「ａ」又は「ａｎ」などの用語の表記は、特に明示しない限り１に限定されない。例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を排除しない。１個以上などの句は、複数の存在を強調するために使用される。
【００２９】
本発明の他の特徴及び利点は、様々な実施例を含めて本明細書のさらなる説明から明らかである。記載された実施例は、本発明の実施に有用な様々な成分及び方法を説明するものである。実施例は、請求する本発明を限定するものではない。当業者は、本開示に基づいて、本発明の実施に有用な他の成分及び方法を確認し、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
完全長を含むＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド、及びＯＲＦ０６５７ｎＩ領域を含むそれよりも短い誘導体は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすことが動物モデルを用いて見出された。図１ａに、Ｓ．アウレウス感染に対して防御免疫をもたらす様々なＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド領域、及び防御免疫をもたらさなかった領域の位置を示す。図１ａにおいて、ＯＲＦ０６５７ｎは配列番号２に対応する完全長配列を指し、ＯＲＦ０６５７ｎＩは（アミノ末端メチオニンを含まない）配列番号１に対応する領域を指し、ＯＲＦ０６５７ｎＨは（アミノ末端メチオニンを含まない）配列番号３に対応する領域を指す。
【００３１】
ＯＲＦ０６５７ｎ「関連」ポリペプチドは、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ又はその断片に構造的に関係する領域を含む。ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドは、天然ＯＲＦＯ６５７ｎの対応領域と少なくとも約９０％の配列が同一であるポリペプチドである。図１におけるＯＲＦ０６５７ｎとは、Ｓ．アウレウスＣＯＬ由来のＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２）に対応する。
【００３２】
基準配列に対する同一割合は、ポリペプチド配列を基準配列と整列させ、同一アミノ酸数を求めることによって決定される。この数は、基準配列のアミノ酸総数で除算され、次いで１００を掛け、最も近い整数に四捨五入される。
【００３３】
図１ａは、配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むコア領域の重要性を説明するのに役立つ。配列番号１はＯＲＦ０６５７ｎ  ＣＯＬのアミノ酸４２から４８６を含む。配列番号１は、発現を促進するアミノ末端メチオニンも含む。配列番号２アミノ酸４６１から６０９、アミノ酸８２から４８６又はアミノ酸４２から１９６からなるポリペプチド断片は防御性ではなかった。
【００３４】
本願を通して様々なアミノ酸及び核酸配列が参照される。表１は、図１の領域を示すポリペプチド配列の一部及び追加の修飾をまとめたものである。表２は核酸配列の一部をまとめたものである。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
【表２】
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【００３７】
配列番号１関連ポリペプチド
配列番号１に構造的に関係するポリペプチド領域は、配列番号１と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸を含む。配列番号１に構造的に関係する領域を含むポリペプチドは、本明細書の指針に基づいてＳ．アウレウスに対するポリペプチド防御が得られるように設計することができる。
【００３８】
配列番号１を基準のフレームとして用いて、異なる天然ＯＲＦ０６５７ｎポリペプチドのアミノ酸配列、及びアミノ酸の公知の諸性質を考慮して変更を加えることができる。変更としては、１個以上のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換などが挙げられる。特定のポリペプチドの防御免疫をもたらす能力を確認するために、本明細書に記載された技術を用いて様々な変更の全体的効果を評価することができる。
【００３９】
ＯＲＦ０６５７ｎは、病理学的及び分類学的に多様なＳ．アウレウス臨床分離株のコレクション全体にわたって十分に保存されていることが判明した。（下記実施例５参照）。図２は、配列番号１を含む様々な配列のアミノ酸配列比較である。示された配列比較は、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域に対するものである。ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域はより小さな防御ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域を含む。
【００４０】
図２は配列番号１および３から２７の配列比較である。この比較は、配列番号１、３などのＳ．アウレウス関連ポリペプチドに対する変更候補の設計を導くために使用することができるＳ．アウレウス臨床分離株間のアミノ酸の違いを示すものである。また、変更は、アミノ酸の公知の諸性質を考慮して行うことができる。配列番号１、３から６及び８から２６は、位置番号３から始まる天然の配列を示し、位置番号１及び２は、いくつかの配列のアミノ末端へのメチオニン又はメチオニン−グリシンの付加を示す。配列番号１１から２６は異なる臨床分離株から得られた。配列番号７及び２７は、配列番号１のコア領域の外側の領域に５個のアミノ酸置換を含む配列番号４  ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の変異体である。
【００４１】
追加のＯＲＦ０６５７ｎ配列は、変更を導くのに役立てるための配列比較に使用することができる。追加のＳ．アウレウスＯＲＦ０６５７ｎＨ領域配列の例は配列番号５４から６３によって与えられ、配列番号１７及び２０の完全長配列は配列番号１０６及び１０７によって与えられる。
【００４２】
一般に、異なるアミノ酸を置換して活性を維持するためには、諸性質が類似したアミノ酸を交換することが好ましい。アミノ酸置換で考慮することができる要因としては、アミノ酸サイズ、電荷、極性、疎水性などが挙げられる。アミノ酸の諸性質に対する異なるアミノ酸Ｒ基の効果は当分野で周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃを参照されたい）。
【００４３】
アミノ酸を交換して活性を維持するためには、置換アミノ酸は、ほぼ同じ電荷及び／又はサイズ及び／又は極性及び／又は疎水性などの１つ以上の類似の諸性質を有するべきである。例えば、ロイシンをバリンで、リジンをアルギニンで、グルタミンをアスパラギンで置換することは、ポリペプチド機能を変化させない良好な候補である。
【００４４】
特定の目的を達成する変更としては、ポリペプチドの産生又は効力を高めるように設計された変更、コードされた核酸のクローニングなどが挙げられる。ポリペプチド産生は、組換え発現に適切な（例えば、メチオニンをコードする）開始コドンを使用することによって促進することができる。メチオニンは、後で細胞のプロセシング中に除去することができる。クローニングは、例えば、アミノ酸付加又は変化に付随し得る制限酵素切断部位の導入によって促進することができる。
【００４５】
免疫応答を誘導するポリペプチドの効力は、エピトープの増強によって高めることができる。エピトープの増強は、ＭＨＣ分子に対するペプチド親和性を改善するアンカー残基の変更を含む技術、Ｔ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体の親和性を増大させる技術などの異なる技術を用いて実施することができる。（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  １：２０９〜２１９、２００１）。
【００４６】
異なる実施態様においては、配列番号１関連ポリペプチド領域に関して、該領域は、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９４％又は少なくとも９９％が同一であり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５の変更又は最大５０の変更によって配列番号１と異なり、或いは
配列番号１１、１５、１６、１８又は５４のアミノ酸１から４４２、
配列番号６３のアミノ酸１から４４３、
配列番号５７又は５９のアミノ酸１から４４４、
配列番号７、８、９、１０、１２、１３、１４、１７、１９、２０、５５、５６又は５８のアミノ酸１から４４５、
配列番号２３又は２４のアミノ酸１から４４６、
配列番号１又は３のアミノ酸１から４４６又は２から４４６、
配列番号２５又は２６のアミノ酸１から４４７、或いは
配列番号４、５又は２７のアミノ酸１から４４７、２から４４７又は３から４４７、
配列番号６１又は６２のアミノ酸１から４４９、
配列番号６０のアミノ酸１から４５３、及び
配列番号６、２１又は２２のアミノ酸１から４５４
からなる群から選択されるＯＦＲ０６５７ｎＩ関連領域から本質的になる又は該ＯＦＲ０６５７ｎＩ関連領域からなる。
【００４７】
示されたアミノ酸から「本質的になる」という表記は、示されたアミノ酸が存在し、追加のアミノ酸が存在してもよいことを示す。追加のアミノ酸は、カルボキシル又はアミノ末端位とすることができる。異なる実施態様においては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の追加のアミノ酸が存在する。好ましい実施態様においては、メチオニンがアミノ末端に存在し、又はメチオニン−グリシンがアミノ末端に存在する。
【００４８】
本発明の実施態様において、このポリペプチドは、配列番号４２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、又は配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むその断片からなる。異なる実施態様において、配列番号４２に関して、このポリペプチドは、配列番号４２と少なくとも９４％又は少なくとも９９％同一であり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５の変更、最大５０の変更、或いは最大６５の変更によって配列番号４２と異なり、配列番号４２又は
配列番号１１、１５、１６、１８若しくは５４のアミノ酸１から４７７、
配列番号６３のアミノ酸１から４７８、
配列番号５７若しくは５９のアミノ酸１から４７９、
配列番号７、８、９、１０、１２、１３、１４、１７、１９、２０、５５、５６若しくは５８のアミノ酸１から４８０、
配列番号２３若しくは２４のアミノ酸１から４８１、
配列番号１若しくは３のアミノ酸１から４８１若しくは２から４８１、
配列番号２５若しくは２６のアミノ酸１から４８２、
配列番号４、５若しくは２７のアミノ酸１から４８２、２から４８２若しくは３から４８２、
配列番号６１若しくは６２のアミノ酸１から４８４、
配列番号６０のアミノ酸１から４８８、及び
配列番号６、２１若しくは２２のアミノ酸１から４８９
からなる群から選択されるＯＦＲ０６５７ｎＩ＋関連領域から本質的になる或いは配列番号４２又は該ＯＦＲ０６５７ｎＩ＋関連領域からなる。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、このポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、又は配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むその断片からなる。異なる実施態様においては、配列番号３に関して、このポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９４％若しくは少なくとも９９％同一であり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５の変更、最大５０の変更又は最大６５の変更によって配列番号３と異なり、或いは配列番号３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる又は該アミノ酸配列から本質的になる。
【００５０】
さらに別の実施態様において、このポリペプチドは、最初のメチオニンの後にグリシンが挿入されて修飾された配列番号２のポリペプチドからなる又は該ポリペプチドから本質的になり、或いは最初のメチオニンを含まないかかるポリペプチドからなる又は該ポリペプチドから本質的になる。
【００５１】
さらに別の実施態様において、このポリペプチドは精製ポリペプチドである。「精製ポリペプチド」は、それに天然に付随する１個以上の他のポリペプチドを欠く環境中に存在し、および／又は存在する総タンパク質量の少なくとも約１０％に相当する。異なる実施態様において、精製ポリペプチドは、試料又は調製物中の総タンパク質量の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約９５％である。
【００５２】
さらに別の実施態様において、このポリペプチドは「実質的に精製されている」。実質的に精製されたポリペプチドは、このポリペプチドに天然に付随するすべて又は大部分の他のポリペプチドを欠く環境中に存在する。例えば、実質的に精製されたＳ．アウレウスポリペプチドは、すべて又は大部分の他のＳ．アウレウスポリペプチドを欠く環境中に存在する。環境は、例えば、試料又は調製物とすることができる。
【００５３】
「精製された」又は「実質的に精製された」という表記は、ポリペプチドが精製にかけられる必要はなく、例えば、精製されていない化学合成ポリペプチドを含むことができる。
【００５４】
ポリペプチドの安定性は、ポリペプチドカルボキシル又はアミノ末端を修飾することによって高めることができる。可能な修飾の例としては、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニルなどのアミノ末端保護基、及びアミド、メチルアミド、エチルアミドなどのカルボキシ末端保護基が挙げられる。
【００５５】
本発明の実施態様において、防御ポリペプチドは、ポリペプチドと、カルボキシ末端又はアミノ末端においてポリペプチドに共有結合した１個以上の追加の領域又は部分とからなる免疫原の一部である。各領域又は部分は、以下の諸性質、免疫応答を増強する性質、精製を容易にする性質又はポリペプチドの安定性を高める性質、の少なくとも１つを有する領域又は部分から独立に選択されるべきである。このポリペプチドの安定性は、例えば、アミノ又はカルボキシ末端上に存在することができるポリエチレングリコールなどの基を用いて高めることができる。
【００５６】
ポリペプチドの精製は、精製を容易にする基をカルボキシル又はアミノ末端に付加することによって強化することができる。精製を容易にするために使用することができる基の例としては、親和性タグを与えるポリペプチドが挙げられる。親和性タグの例としては、６−ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオン及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。
【００５７】
ポリペプチドの免疫応答生成能力は、免疫応答を一般に高める基を用いて増強することができる。ポリペプチドに対する免疫応答を高めるためにポリペプチドに結合させることができる基の例としては、ＩＬ−２などのサイトカインが挙げられる。（Ｂｕｃｈａｎ等、２０００．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３７：５４５〜５５２）。
【００５８】
ポリペプチド製造
ポリペプチドは、化学合成を含む標準技術及びポリペプチドを産生する細胞からの精製を含む標準技術を含めた標準技術を用いて製造することができる。ポリペプチドの化学合成技術は当分野で周知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ、１９９０を参照されたい）。
【００５９】
細胞からのポリペプチド精製技術を以下の実施例に示す。精製技術の別の例は当分野で周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２を参照されたい）。
【００６０】
細胞からのポリペプチドの取得は、ポリペプチドを生産する組換え核酸技術を用いて促進される。ポリペプチドを生産する組換え核酸技術は、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を細胞中に導入し又は細胞中で生産し、ポリペプチドを発現させることを含む。
【００６１】
組換え遺伝子は、ポリペプチド発現の調節要素と一緒にポリペプチドをコードする核酸を含む。組換え遺伝子は細胞ゲノム中に存在することができ、又は発現ベクターの一部とすることができる。
【００６２】
組換え遺伝子の一部として存在し得る調節要素としては、ポリペプチドコード配列に天然に付随する調節要素、ポリペプチドコード配列に天然には付随しない外来性調節要素などがある。外来性プロモーターなどの外来性調節要素は、特定の宿主において組換え遺伝子を発現させるのに有用であり得、又は発現レベルを増加させるのに有用でがあり得る。一般に、組換え遺伝子中に存在する調節要素としては、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーターなどが挙げられ、場合によってはオペレーターが存在してもよい。真核細胞におけるプロセシングに好ましい要素はポリアデニレーションシグナルである。
【００６３】
組換え遺伝子の細胞中での発現は、発現ベクターを使用することによって促進される。組換え遺伝子に加えて発現ベクターは、宿主細胞において自己複製するための複製開始点、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位及び高複製能力も含むことが好ましい。発現ベクターの例は、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド及びウイルスなどである。
【００６４】
遺伝コードの縮重のために、多数の異なるコード核酸配列を使用して特定のポリペプチドをコードすることができる。遺伝コードの縮重は、ほぼすべてのアミノ酸が３個のヌクレオチド、すなわち「コドン」の異なる組み合わせによってコードされているために発生する。アミノ酸は、コドンによって以下のとおりコードされる。
【００６５】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ
【００６６】
ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの組換え核酸発現に適切な細胞は原核生物及び真核生物である。原核細胞の例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）などのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）などのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）などのラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーが挙げられる。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー（例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ハンゼヌラ（ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のメンバー（例えば、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）又はＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ））及びシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））などの酵母細胞が挙げられる。
【００６７】
組換え遺伝子製造技術、細胞への導入及び組換え遺伝子発現は当分野で周知である。かかる技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９などの参考文献にある。
【００６８】
特定の宿主における発現は、必要に応じて、コドンを最適化することによって促進することができる。コドンの最適化は、より好ましいコドンの使用を含む。様々な宿主におけるコドン最適化技術が当分野で周知である。
【００６９】
ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドは翻訳後修飾、例えば、Ｎ−結合型グリコシル化、Ｏ−結合型グリコシル化又はアセチル化を含むことができる。「ポリペプチド」又はポリペプチドの「アミノ酸」配列という表記は、哺乳動物、昆虫又は酵母宿主細胞などの宿主細胞由来の、翻訳後修飾構造を有する１個以上のアミノ酸を含むポリペプチドも含む。
【００７０】
翻訳後修飾は、化学的に又は適切な宿主を利用して行うことができる。例えば、Ｓ．セレビシエにおいては、最後から２番目のアミノ酸の性質によってＮ末端メチオニンが除去されるかどうかが決まると考えられる。また、最後から２番目のアミノ酸の性質によって、Ｎ末端のアミノ酸がＮα−アセチル化されるかどうかも決まる（Ｈｕａｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：８２４２〜８２４６、１９８７）。別の例としては、分泌性リーダー（例えば、シグナルペプチド）が存在するために分泌の標的となる、Ｎ−結合型又はＯ−結合型グリコシル化によって修飾されたポリペプチドが挙げられる。（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ等、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５６：９１５〜９４４、１９８７）。
【００７１】
酵母発現
ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドは、酵母発現に対して最適化されたコドンを含むコード核酸を用いて好ましくは酵母中で発現される。酵母中での発現は、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドと酵母発現の調節領域とをコードする組換え遺伝子を用いて実施することができる。使用される発現系に応じて、産生されるタンパク質は細胞内に残留することができ、又は細胞外に排出することができる。
【００７２】
組換え遺伝子発現用プロモーターは、酵母ガラクトース遺伝子クラスター由来のプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１Ｏ、ＭＥＬ１などのＧＡＬプロモーター）、酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモーター、アルコール脱水素酵素ＩＩ  ＡＤＨ２プロモーター、銅によって調節されるメタロチオネインＣＵＰ１プロモーターなどの誘導性プロモーターであることが好ましい。使用することができる「構成」プロモーターの例は、ＧＡＰ（ＴＤＨ）、ＰＧＫ又はＴＰ１プロモーターである。（Ｒｏｍａｎｏｓ等、ＹＥＡＳＴ  ８：４２３〜４８８、１９９２）。
【００７３】
組換え発現に使用される酵母宿主細胞は、組換え遺伝子発現を容易にするように選択又は操作することができる。ｍｎｎ９、ｐｒｂ１及び／又はｐｅｐ４変異などの変異が一般に望ましい。ＧＡＬプロモーターからの発現を増加させるために、ＧＡＬ４転写因子の過剰発現を実施することができる（Ｈｏｐｐｅｒ他、米国特許第５，０６８，１８５号）。
【００７４】
特定の宿主に対するコドン最適化は、低使用レベル又は中程度の使用レベルのコドンを高発現レベルのコドンと置換することによって実施される。コード配列中に存在する最適なコドンの割合は変わり得る。異なる実施態様においては、（最初に存在したコドン及び導入されたコドンを含めて）最適なコドンの数は、コドン総数の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９５％又は１００％である。
【００７５】
コドン最適化は以下のとおり実施することができる。
１．  特定のコドンについて、酵母遺伝子による全体的コドン使用頻度と野生型コドンの頻度を比較する。
２．  コドンが、酵母によって一般に使用されるコドンの１つではない場合には、それを酵母細胞における高発現に最適なコドンと置換する。
３．  所望のコドン最適化レベルに達するまで、異なるコドンに対してステップ（１）と（２）を繰り返す。
４．  望ましくない制限酵素部位、スプライス部位、プロモーター、望ましくないパリンドローム構造又は反復配列、転写ターミネーター配列、高頻度のＧＣ塩基対などの生成される望ましくない配列について新しいコード配列を検査する。代替コドンを用いて望ましくない配列を除去する。
【００７６】
代替コドンの使用は、Ｌａｔｈｅ、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．、１８３：１〜１２、１９８５に記載されている。様々な酵母宿主におけるコドンの使用は当分野で周知である。例えば、Ｓｈａｒｐ等、Ｙｅａｓｔ  ７：６５７〜６７８、１９９１は、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における同義コドンの使用を記載している。
【００７７】
図８Ｃから８Ｍに酵母最適化核酸配列を示す。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、メチオニンアミノ末端を含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４から４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【００７８】
酵母発現は、最適化配列、及び酵母発現に対して最適化されていない配列（例えば、配列番号２９のヌクレオチド１から１９３５又は１２４から１４５８或いは配列番号３０のヌクレオチド１から１７１０）を用いて実施することができる。最適化配列及び非最適化配列を用いた酵母発現技術を下記実施例に示す。
【００７９】
ＯＲＦ０６５７ｎは、保存「ＬＰＸＴＧ」モチーフを有する３６アミノ酸Ｃ末端細胞壁局在化シグナルを含む表面タンパク質である。（Ｓｃｈｎｅｅｄｗｉｎｄ等  １９９３、ＥＭＢＯ、１２：４８０３〜４８１１、１９９３）。細胞壁局在化シグナルを含むタンパク質は、膜結合性タンパク質ｓｏｒｔａｓｅによって触媒されるペプチド転移機構によって細胞壁エンベロープに連結される（Ｍａｚｍａｎｉａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：９０６〜９０９、２００１）。連結するためには、表面タンパク質は、分泌性経路に搬出するためのＮ末端シグナルペプチドも含まなければならない。分泌性経路においては、シグナルペプチドが除去され、細胞壁局在化シグナルによって分泌性経路中に保持することが容易になる。次いで、Ｓｏｒｔａｓｅは、ＬＰＸＴＧモチーフのトレオニンとグリシンを切断し、トレオニンのカルボキシル基とペプチドグリカン架橋のアミノ基とのアミド結合の形成を触媒する。
【００８０】
酵母中の発現は、細胞壁局在化配列（ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除去することによってかなり増加することが見出された。異なる実施態様においては、ポリペプチドをコードする構築体は機能的細胞壁局在化コード配列を欠き、より好ましくは機能的細胞壁局在化及びシグナルペプチドコード配列を欠く。対応する好ましいＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドは、機能的細胞壁局在化配列、又は細胞壁局在化配列とシグナルペプチド配列の両方を欠く。
【００８１】
異なる実施態様においては、細胞壁局在化配列又は細胞壁局在化配列とシグナルペプチド配列の両方の少なくとも実質的にすべてが、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸中に存在することはない。異なる実施態様においては、タンパク質発現は、細胞壁局在化配列又は細胞壁局在化配列とシグナルペプチド配列の両方の少なくとも実質的にすべてを除去することによって、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍又は少なくとも約２０倍増加する。より好ましくは、コード用構築体は、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ）発現に最適化された１個以上のコドンも含む。
【００８２】
ＯＲＦ０６５７ｎ細胞壁局在化及びシグナルペプチド配列に近い領域の例を配列番号２に関して説明することができる。アミノ酸１から４２はシグナルペプチド配列を含む。アミノ酸６０９から６４５は細胞壁局在化配列を含む。
【００８３】
アジュバント
アジュバントは、免疫原が免疫応答を生じるのを補助することができる物質である。アジュバントは、抗原の生物学的又は免疫学的半減期の増加、抗原提示細胞への抗原送達の向上、抗原プロセシングの向上及び抗原提示細胞による提示、並びに免疫調節性サイトカインの産生誘導の１つ以上などの異なる機序によって機能することができる。（Ｖｏｇｅｌ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０（ｓｕｐｐｌ．  ３）：Ｓ２６６〜２７０、２０００）。
【００８４】
様々な異なるタイプのアジュバントを使用して免疫応答の生成を補助することができる。特定のアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は他のアルミニウム塩、リン酸カルシウム、ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ、モノホスホリル脂質Ａ、コレラ毒素、Ｅ．コリ熱不安定性毒素、百日咳毒素、ムラミルジペプチド、フロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫賦活性複合体、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチドアナログ、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＳＣＯＭＳが挙げられる。（Ｖｏｇｅｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０（ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２６６〜２７０、２０００、Ｋｌｅｉｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９：３１１〜３２１、２０００、Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ等、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１８０〜１１８７、２００１、Ｋｅｒｓｔｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：９１５〜９２０、２００３、Ｏ’Ｈａｇｅｎ  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｏｒｄ．、１：２７３〜２８６、２００１）。
【００８５】
防御免疫を誘導するための患者
「患者」とは、Ｓ．アウレウスに感染し得る哺乳動物を指す。患者は、予防又は治療上の処置を受けることができる。予防的治療によって、Ｓ．アウレウス感染の可能性又は重症度を抑制するのに十分な防御免疫が得られる。治療上の処置は、Ｓ．アウレウス感染の重症度を軽減するために実施することができる。
【００８６】
予防的治療は、本明細書に記載された免疫原を含むワクチンを用いて実施することができる。かかる治療は好ましくはヒトに対して実施される。ワクチンは一般の人又はＳ．アウレウス感染のリスクが高い人に投与することができる。
【００８７】
アウレウス感染のリスクが高い人としては、医療従事者、病院患者、免疫系の低下した患者、手術中の患者、カテーテル、血管装置などの異物移植片を受けた患者、免疫低下をもたらす治療を受けた患者、火傷又は創傷患者、火傷又は創傷のリスクが高い職業の人などが挙げられる。（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ（ｅｄ．）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．  １９９７）。
【００８８】
Ｓ．アウレウスに感染し得る非ヒト患者としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、マウスなどが挙げられる。非ヒト患者の治療はペット及び家畜の保護並びに特定の治療の効力の評価に有用である。
【００８９】
既往反応
ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドは、アカゲザルにおいて単回投与後に迅速で有効な免疫応答を生じることが見出された。（下記実施例１７参照）。観察された応答は既往反応と一致した。
【００９０】
既往反応の発生は、単回投与によって有効な免疫をもたらすことができ、短期間で有効な免疫をもたらすなどの大きな利点がある。異なる実施態様においては、既往反応によって相乗平均力価が既存の力価の少なくとも３倍、少なくとも５倍又は少なくとも６倍増加し、この増加は３、５、７、９、１４又は２１日以内に生じる。
【００９１】
有効な免疫応答を素早く生じることができることによって、複数回投与ワクチン接種よりも費用を節約し、Ｓ．アウレウス感染のリスクが高い患者のワクチン接種に使用することができる。アウレウス感染のリスクが高い人としては、医療従事者、病院患者、免疫系の低下した患者、手術中の患者、カテーテル、血管装置などの異物移植片を受けた患者、免疫低下をもたらす治療を受けた患者、火傷又は創傷患者、火傷又は創傷のリスクが高い職業の人などが挙げられる。（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．  １９９７）。異なる実施態様においては、患者は、医療処置直後或いは３、５、７、９、１４又は２１日以内にワクチン接種される。
【００９２】
混合ワクチン
防御免疫を与えるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドは、単体で使用し又は他の免疫原と併用して免疫応答を誘導することができる。使用することができる追加の免疫原としては、上記発明の背景に記載のものなどの１個以上の追加のＳ．アウレウス免疫原、Ｓ．エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ワーネリ（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ）、Ｓ．ルグネンシス（Ｓ．ｌｕｇｕｎｅｎｓｉｓ）などの１個以上の他のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）生物を標的とする１個以上の免疫原、他の感染性生物を標的とする１個以上の免疫原などが挙げられる。
【００９３】
動物モデル系
動物モデル系を用いて、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫応答を生じるポリペプチドの効力を評価した。防御動物モデルを設定する際に遭遇した２つの障害は、（１）自然免疫に打ち勝つために必要な投与量が極めて多いこと、及び（２）死亡速度が速すぎて防御応答を検出できないことであった。具体的には、マウスは細菌投与後２４時間以内に感染のために死亡し、感染を分析するための具体的な免疫応答には時間が短かった。用量を減少させると、対照と免疫マウスの両方が感染から生き延びた。
【００９４】
これらの障害は、定常期の細胞から調製され、適切に力価が設定され、静脈内投与されたＳ．アウレウスを含む速度の遅い致死モデルを用いることによって対処された。死亡速度が遅いことによって、細菌感染を撃退する具体的な免疫防御に十分な時間（例えば、２４時間ではなく１０日）が得られる。
【００９５】
定常期のＳ．アウレウス細胞は、固体培地上で増殖された細胞から得ることができる。これは液体からも得ることができるが、固体培地上で増殖された細胞の結果はより再現性があった。細胞は、好都合には、固体培地上で終夜増殖させることができる。例えば、Ｓ．アウレウスは、倍加時間が約２０分から３０分という条件下で約１８から２４時間増殖させることができる。
【００９６】
スタフィロコッカスは、スタフィロコッカスの能力を維持する標準技術を用いて固体培地又は液体培地から単離することができる。単離されたスタフィロコッカスは、例えば、グリセリンを含むリン酸緩衝食塩水中の洗浄された高密度懸濁液（＞１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ）として−７０℃で保存することができる。
【００９７】
スタフィロコッカス投与は、動物モデルにおいて第１日又は第２日から始まり約７日から１０日の期間にわたって約８０％から９０％の死亡をもたらす効力を有するべきである。滴定実験は、保存されたスタフィロコッカス接種材料の効力をモニターするために動物モデルを用いて実施することができる。力価測定実験は、接種実験の約１から２週間前に実施することができる。
【００９８】
力価測定実験の最初の力価は以前の実験をもとにすることができる。動物モデル系統がＢｅｃｋｅｒの場合、適切なＳ．アウレウス投与量は一般に５×１０８から８×１０８ＣＦＵ／ｍＬであった。
【００９９】
投与
免疫原は、当分野で周知の技術と一緒に本明細書の指針を用いて処方し、患者に投与することができる。薬剤投与指針は、一般に、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｅｄｓ．  Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｄ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００；及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｄｓ．  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９０に記載されている。これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
薬剤として許容される担体は、保存及び免疫原の患者への投与を容易にする。薬剤として許容される担体は、緩衝剤、注射用滅菌水、等張食塩水又はリン酸緩衝食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩、ポリソルベートなどの異なる成分を含むことができる。
【０１０１】
免疫原は皮下、筋肉内、粘膜などの異なる経路によって投与することができる。皮下及び筋肉内投与は、例えば、針又は噴射式注射器を用いて実施することができる。
【０１０２】
適切な投薬計画は、患者の年齢、体重、性別及び健康状態、投与経路、所望の効果並びに使用される特定の化合物を含めて当分野で周知の要因を考慮して好ましくは決定される。免疫原は、複数回投与ワクチン形式で使用することができる。１回分は全ポリペプチド１．０μｇから１．０ｍｇからなると予想される。本発明の異なる実施態様においては、この範囲は０．０１ｍｇから１．０ｍｇ及び０．１ｍｇから１．０ｍｇである。
【０１０３】
投与のタイミングは当分野で周知の要因によって決まる。最初の投与後、特定の個体に必要な場合には、続いて抗体価を維持又は増大させるために１回以上の追加量を投与することができる。投薬計画の例は、１日目、１ヶ月、４、６又は１２ヶ月での第３の用量、及び必要に応じ久しく隔たった時間でのさらなる追加量である。
【０１０４】
抗体の産生
防御免疫を誘導することができるＯＲＦ０６５７関連ポリペプチドは、ポリペプチド又はＳ．アウレウスに結合する抗体及び抗体断片を産生するために使用することができる。かかる抗体及び抗体断片は、ポリペプチド精製、Ｓ．アウレウスの識別、或いはＳ．アウレウス感染に対する治療処置又は予防的治療における使用を含めて様々な用途を有する。
【０１０５】
抗体はポリクローナル又はモノクローナルとすることができる。抗体を産生し使用する技術は当分野で周知である。かかる技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜１９９８、Ｈａｒ１ｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８及びＫｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７、１９７５に記載されている。
【０１０６】
（実施例）
本発明の様々な特徴をさらに説明する実施例を以下に示す。これらの実施例は、本発明を実施するために有用な方法も説明する。これらの実施例は、請求する本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０７】
防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ領域の使用
この実施例は、防御免疫をもたらす完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域の能力を示す。
ＯＲＦ０６５７ｎクローニング及び発現
ＰＣＲプライマーは、第１のアスパラギン残基で始まり末端アスパラギン残基の終止コドン前で終わるＯＲＦ０６５７ｎをコードする遺伝子を増幅するように設計された。これらのＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にする追加のＮｃｏＩ（順方向プライマー）及びＸｈｏＩ（逆方向プライマー）部位も有した。
【０１０８】
コードされたタンパク質は、末端Ｈｉｓ残基とベクターによってコードされる終止コドンとを有するｐＥＴ２８ベクターから発現されるように設計された。また、グリシン残基をタンパク質の開始メチオニンの後に添加した。生成した増幅ＤＮＡ配列はカルボキシルＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）をコードする。
【０１０９】
ＰＣＲ増幅配列は、ＰＣＲプライマー中に操作されＥ．コリＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に熱ショックによって導入されたＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位を用いてｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結された。形質転換混合物は、１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天板上で３７℃で終夜増殖された。コロニーが選択され、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ中で増殖され、ＤＮＡミニプレップが作製され（Ｐｒｏｍｅｇａ）、挿入の完全性が制限消化及びＰＣＲによって求められた。正確な挿入サイズの４個のミニプレップを、プライマーＭ１３Ｆ（配列番号６５）、Ｍ１３Ｒ（配列番号６６）、ＯＲＦ０６５７ｎＦ（配列番号６７）及びＯＲＦ０６５７ｎＲ（配列番号６８）を用いて配列決定した。所望の配列からのＤＮＡ変化を含まないクローンを選択した。
【０１１０】
Ｅ．コリＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上で増殖させ、発現試験用に３つのコロニー（ＵｎｋＣ−１、ＵｎｋＣ−２及びＵｎｋＣ−３）を選択した。液体ＬＢ（カナマイシン）培養物をＡ６００が０．６から１．０になるまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、次いで、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで追加することによって誘導し、続いてさらに３時間インキュベートした。４℃で５０００×ｇで５分間遠心分離して培養物を回収した。細胞を５００μＬ溶解緩衝剤（Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ、プロテアーゼ阻害剤を含む、Ｎｏｖａｇｅｎ）中に再懸濁した。（５％最終体積までβ−メルカプトエタノールが補充された）等体積のローディングバッファーを試料に添加し、７０℃で５分間加熱した。抽出物をＮｏｖｅｘ  ４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上に流し、タンパク質を可視化し（クーマシーブルー染色）、ニトロセルロース上にブロットし、抗ＨＩＳ６抗体（Ｚｙｍｅｄ）で精査した。
【０１１１】
ＯＲＦ０６５７ｎ精製
上記小規模手順を作業体積が５０リットルである撹拌発酵槽（７５リットルスケール）に直接スケールアップした。Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（＋カナマイシン）５０ｍＬを含む２５０ｍＬフラスコ中で接種材料を培養し、凍結種培養１ｍＬを接種し、３時間培養した。この種培養１ｍＬを使用して、ＬＢ培地（＋カナマイシン）５００ｍＬを含む２リットルフラスコに接種し、１６時間インキュベートした。大規模発酵槽（７５リットルスケール）をＬＢ培地（＋カナマイシン）５０リットルと一緒に培養した。発酵槽の発酵パラメータは、圧力＝５ｐｓｉｇ（３０ｋＰａ）、撹拌速度＝３００ｒｐｍ、気流＝１５リットル／分及び温度＝３７℃であった。細胞を光学濃度（ＯＤ）０．８光学濃度単位まで波長６００ｎＭでインキュベートし、濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｋ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。ＩＰＴＧによる誘導時間は３時間であった。温度を１５℃に低下させて細胞を収集し、５００ＫＭＷＣＯ中空繊維カートリッジを通して濃縮し、９，０００×重力で４℃で２０分間遠心分離した。上清をデカントし、組換えＥ．コリウェット細胞ペレットを−７０℃で凍結させた。
【０１１２】
組換えＥ．コリ細胞（１９．２ｇウェット細胞重量）を溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭイミダゾール、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）−８０及び６Ｍグアニジン−ＨＣｌ）に８ｍＬ／グラム細胞湿重量で懸濁した。ポリ（ヒスチジン）タグ付きタンパク質（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８４９）と一緒に使用されるプロテアーゼ阻害剤カクテルを懸濁液に０．０５ｍＬ／グラム細胞ペーストで添加した。さらに、リゾチームを１ｍｇ／ｍＬ添加し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（ＥＭ  Ｉｎｄ．）を１μＬ／ｍＬ添加した。細胞溶解は、懸濁液をマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓモデル１１０Ｓ）に１４，０００ＰＳＩ（９６ＭＰａ）で４℃で４回通過させて実施された。細胞片を１１，０００×ｇで４℃で３０分間ペレット化し、上清を保持した。
【０１１３】
Ｈｉｓタグを有するタンパク質を上清から精製した。上清をＮｉ＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）２０ｍＬと４℃で２時間静かに反転させて混合した。混合物をオープンカラム（１．５ｃｍ×２０ｃｍ）にあけ、非結合画分をバルクで収集した。カラムを洗浄緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）−８０）で洗浄した。Ｈｉｓタグ付きＯＲＦ０６５７ｎを３００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）−８０の段階的勾配によって溶出させた。
【０１１４】
ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）を含む画分をクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、貯蔵した。貯蔵画分を０．２ミクロンフィルターを通してろ過して粒子材料を除去し、サイズ排除カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ２６／６０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．１、１５０ｍＭ  ＮａＣｌによって１ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎを含む画分をクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法（ａｎｔｉ−ｔｅｔｒａ  Ｈｉｓ  Ｍａｂ、Ｑｉａｇｅｎ）によって検出した。内毒素をＺｅｔａ−Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｆｉｌｔｅｒ（ＣＵＮＯ）を通してろ過除去した。タンパク質濃度をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。純度をクーマシー染色ゲルの濃度測定によって測定した。
【実施例２】
【０１１５】
Ｓ．アウレウス抗原の調製
Ｓ．アウレウスをＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ＴＳＡ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）プレート上で３７℃で終夜増殖させた。ＰＢＳ５ｍＬをプレートに添加することによってこの細菌をＴＳＡプレートから洗浄し、無菌延展機を用いて細菌を静かに再懸濁した。細菌懸濁液をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１６％グリセリンに再懸濁し、一定分量を−７０℃で凍結保存した。
【０１１６】
使用前に、接種材料を解凍し、適切に希釈し、感染に使用した。各貯蔵物を少なくとも３回滴定して、未処置のマウスにおいて遅い死亡速度をもたらす適切な用量を決定した。（マウスの８０から９０％を死滅させることができる）細菌接種材料の効力を絶えずモニターしてモデルの再現性を確保した。各投与実験の１０日前に、１０匹の（アジュバントのみで免疫された）対照動物群に投与し、モニターした。
【実施例３】
【０１１７】
Ｈｉｓタグ付きＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドを用いた防御試験
２５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、アルミニウムヒドロキシホスフェートアジュバント（４５０μｇ／回）上のＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）２０μｇ／回を３回投与して免疫した。アルミニウムヒドロキシホスフェートアジュバント（ＡＨＰ）は、Ｋｌｅｉｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９、３１１〜３２１、２０００に記載されている。各用量は０、７及び２１日目に２回の５０μＬ筋肉内注射として投与された。２８日目にマウスから採血し、その血清をＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎに対する反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【０１１８】
実験の３５日目に、増殖されたＳ．アウレウスを静脈内注射によって、力価測定実験で決定された約２から７日の致死用量（７．３×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）でマウスに投与した。この遅い死亡速度の致死モデルにおける生存を、ＡＨＰのみで偽免疫されたマウスの対照群に対して評価した。マウスの生存を１４日間モニターした（図３Ａ）。実験の最後には、ＡＨＰ対照群では３匹のマウスが生存したのに対してＯＲＦ０６５７ｎ免疫群では１１匹が生存した。
【０１１９】
図３Ｂ及び３ＣにＯＲＦ０６５７ｎＨ及びＯＲＦ０６５７ｎＩ領域に対応するポリペプチドを用いた防御を示す。図３Ｂに、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４による防御を示す。図３Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号５の結果である。
【実施例４】
【０１２０】
ＯＲＦ０６５７ｎ配列の入手
ＯＲＦ０６５７ｎは、Ｓ．アウレウス鉄取得においてある役割を有することに関与している。（Ａｎｄｒａｄｅ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（９）：４７．１〜４７．５、２００３）。ＯＲＦ０６５７ｎ配列は、その一部は出所が異なり、参考文献によって名称が異なる。（例えば、Ｅｔｚ等、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９９：６５７３〜６５７８、２００２（ＬＰＸＴＧＶＩ）；Ｂａｂａ等、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１８１９〜１８２７、２００２（ＭＷ１０１１）；Ｋｕｒｏｄａ等、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７、１２２５〜１２４０、２００１（ＳＡ０９７６）；Ａｎｄｒａｄｅ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（９）：４７．１〜４７．５、２００３（Ｓ＿ａｕｒ２）；Ｍａｚｍａｎｉａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：９０６〜９０９、２００３（ｉｓｄＢ）；Ｍａｚｍａｎｉａｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：１０４９〜１０５７、２００１（ｓａｓＪ）；及びＴａｙｌｏｒ等、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３：１６０３〜１６１４、２００２（ｓｉｒＨ）を参照されたい。
【０１２１】
ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質配列に対応するポリペプチド配列は、様々な特許公報に記載されているようである。（Ｍｅｉｎｋｅ他、２００２年８月１日に公表された国際公開第０２／０５９１４８号、Ｗａｎｇ他、２００２年１０月３日に公表された国際公開第０２／０７７１８３号、Ｍａｓｉｇｎａｎｉ他、２００２年１１月２８日に公表された国際公開第０２／０９４８６８号、Ｆｏｓｔｅｒ他、２００２年１２月２７日に公表された国際公開第０２／１０２８２９号及びＦｏｓｔｅｒ他、２００３年２月１３日に公表された国際公開第０３／０１１８９９号）。
【０１２２】
ゲノムＤＮＡは異なるＳ．アウレウス臨床分離株から得られた。臨床分離株をＤｉｆｃｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）３ｍＬに添加し、３７℃、１５０ｒｐｍで終夜インキュベートした。終夜培養物を１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ブロスをデカントし、ペレットを５００μＬ再懸濁緩衝剤（２５％スクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）に再懸濁した２ｍｇ／ｍｌリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液の５μＬ一定分量を各再懸濁ペレットに添加した。次いで、懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２３】
インキュベーション期間の最後に２％ＳＤＳ  ２５０μＬを各管に添加し、溶液の粘度が顕著に減少するまでボルテックス撹拌した。フェノール−クロロホルム−イソアミル溶液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）２５０μＬを添加した。混合物を３０秒間ボルテックス撹拌し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上部水相を除去し、界面がほとんど残らなくなるまで沈殿ステップを繰り返した。３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８  ０．１体積を各管に添加し混合した。次いで、イソプロパノール１体積を添加し再度混合した。管を室温で５分間インキュベートし、次いで１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清をデカントし、管を組織上で逆さまにして乾燥させた。ペレットを無菌Ｈ２Ｏ  ５０μＬに再懸濁した。
【０１２４】
単離ＤＮＡをＰＣＲ用テンプレートとして使用した。遺伝子を順方向プライマー（ＯＲＦ０６５７ｎＦ、配列番号６７）及び逆方向プライマー（ＯＲＦ０６５７ｎＲ、配列番号６８）を用いて増幅した。標準Ｂｉｇ  ＤｙｅプロトコルによってＰＣＲ産物の配列を決定した。
【実施例５】
【０１２５】
異なるＳ．アウレウス単離株由来のＯＲＦ０６５７ｎの比較
ＯＲＦ０６５７ｎは、病理学的及び分類学的に多様なＳ．アウレウス臨床分離株のコレクション全体にわたって十分に保存されていることが判明した。表３に、臨床分離株を含めた様々な単離株の同一割合をまとめる。
【０１２６】
【表３】
2007502101.tif 000007
2007502101.tif 000008
【０１２７】
同一性百分率（％ＩＤ）は、ポリペプチド配列を配列番号２と整列させ、同一アミノ酸の数を求めることによって決定された。この数は、（配列番号２の）アミノ酸総数で除算され、次いで１００を掛け、最も近い整数に四捨五入された。
【実施例６】
【０１２８】
異なるＳ．アウレウス臨床分離株に対する防御
様々なＳ．アウレウス臨床分離株に対する免疫原としてのＯＲＦ０６５７ｎの効力を、ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎを免疫原（配列番号２８）として用いて評価した。表３に記載された分類学的に多様な単離株のサブセットを投与接種材料として使用した。これら様々な単離株のＯＲＦ０６５７ｎ配列は、使用されたワクチンＯＦＲ０６５７ｎ配列とは異なった。
【０１２９】
得られた投与系統は、実施例２に記載の技術を用いて調製された。マウスは、実施例３に記載の技術を用いて免疫され投与され、１０日間モニターされた。常法に従ってモデルに使用される投与接種材料は、ヒト感染において一般に遭遇する材料をはるかに凌駕する。
【０１３０】
防御は、メチシリン感受性系統と耐性系統の両方に対して実証された。結果を図４Ａから４Ｈに示す。
【実施例７】
【０１３１】
酵母発現に対する配列番号２８のコドン最適化
配列番号２８のアミノ酸１から６４６をコードする核酸配列のコドンを酵母における発現に対して最適化した。配列番号２８のアミノ酸１から６４６のコドン最適化配列を図８Ｃに示す（配列番号３１）。
【０１３２】
カルボキシルＨｉｓタグコード領域を含まない配列番号２９を最適化の出発構築体として使用した。最適化前のコード配列の全コドン使用頻度については、コドンの２８％（１７９）は高度発現酵母遺伝子によってほとんど稀にしか又はまったく使用されず、２０％（１２６）は控えめにしか使用されなかった。
【０１３３】
配列番号２８のアミノ酸１から６４６をコードする核酸のコドン最適化は、酵母中での発現が低度又は中度のコドンを高度に発現されるコドンで置換して実施された。また、グリシンコドンを第２の位置に付加した。コドン最適化は、ソフトウエアプログラムＭａｃＤＮＡｓｉｓ  Ｐｒｏ  Ｖ３．０を用いて実施された。タンパク質の逆翻訳に使用されたパラメータ表は、高度に発現されるＳ．セレビシエコドンを示している。ＭａｃＤＮＡｓｉｓ  Ｐｒｏにおいて使用された機能は「翻訳＞［タンパク質−−＞ＤＮＡ］」である。出力は「アミノ酸転化」と標題が付けられた。
【０１３４】
所与のアミノ酸に対して高度に発現されるコドンが２個以上あることもある。例えば、セリンは「ＴＣＴ」又は「ＴＣＣ」によってコードされる。これらの場合には、２個の異なるコドンがほぼ等しい数だけ使用された。表４は、高度に発現されるＳ．セレビシエコドンのコドン表である。
【０１３５】
【表４】
2007502101.tif 000009
【０１３６】
配列番号３１の中度に発現される遺伝子中のコドンに換えられた２個のアラニンコドン（ヌクレオチド５０５及び１５４６で始まるＧＣＧ）を除いて、最適でないコドンはすべて、高度に発現される酵母遺伝子中のコドンに換えられた。
【０１３７】
ＯＲＦ０６５７ｎをコードする全配列は、最終の所望の配列をコードするようになされた２５オリゴマー（配列番号６９から９３）のアニーリングと伸長によって調製された。これらのオリゴマーは８５から１１０ｂｐ長であった。これらのオリゴマーは交互のＯＲＦ０６５７ｎコード配列であった。各オリゴマーは、２５から２９ｂｐが隣接オリゴマーと相補的に重複しており、その二重鎖はＴｍが８０から８４℃であった。これはＧＣ塩基対に４℃及びＡＴ塩基対に２℃の値を割り当てることによって手入力で計算された。
【０１３８】
７つの別個の伸長反応が３個又は４個の隣接重複オリゴマー、二重鎖Ｔｍ＝７０から７２℃の長さ（２３から２６）ｎｔのセンス及びアンチセンスＰＣＲプライマーを用いて実施された。未変性Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を以下のとおり「タッチダウン」戦略のＰＣＲ反応に使用した：９５℃、９０秒、１サイクル；９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、６８℃、３分を５サイクル、直後に第２の系列の反応；９５℃、３０秒、５２℃、３０秒、６８℃、３分を２０サイクル。６８℃で７分間インキュベートして反応を完結した。これらのＰＣＲ反応の結果、７個の共直線性遺伝子断片が作製された（本明細書では便宜上１、２、３、４、５、６及び７と呼ぶ）。
【０１３９】
各断片はアガロースゲル電気泳動によって単離され、適切なサイズの産物が切除され、ＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ（登録商標）ＩＩ法（ＱＢＩＯｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて製造者によって推奨されたとおりに精製された。共直線性断片１、２及び３、共直線性断片４と５並びに共直線性断片６と７は、適切なプライマーを用いたその後のＰＣＲ反応で連結されて、それぞれ断片Ａ、Ｂ及びＣが得られた。次いで、断片Ａ、Ｂ及びＣが末端のセンス及びアンチセンスプライマーによって連結される追加のＰＣＲ反応によってＯＲＦ０６５７ｎの完全な遺伝子が構築された。最終ＰＣＲ産物をゲルによって単離し、製造者によって推奨されたとおりにｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローン化した。いくつかの独立クローンのＤＮＡ配列を得て、間違いを確認した。
【０１４０】
間違いは、３個の独立クローンｐＵＣ３、ｐＵＣ４及びｐＵＣ６の異なるセグメントについて、ＱＵＩＫ−ＣＨＡＮＧＥ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて逐次的に、又はＱＵＩＫ−ＣＨＡＮＧＥ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて同時に、製造者の推奨に従って修正された。最終の修正された配列は、３個のクローンからの修復された制限酵素断片を交換することによって得られた。クローンｐＵＣ４の修復された１．１ｋｂ  ＸｍｎＩ断片をｐＵＣ３の対応するＸｍｎＩ断片と交換してｐＵｎｋＣ１３を構築した。ｐＵＣ６の修復された４５６ｂｐ  ＡｃｃＩ断片をｐＵｎｋＣ１３の対応する断片と交換してｐＵｎｋＣＲ１を構築し、ＤＮＡ配列を確認した。
【実施例８】
【０１４１】
組換え遺伝子発現用サッカロミセス  セレビシエ系統の構築
この実施例では、組換え遺伝子発現用サッカロミセス  セレビシエ系統を得るために使用することができる技術を説明する。１２６０及び１３０９と命名された系統の作製を以下に説明する。系統の遺伝的背景は異種タンパク質発現用系統の諸性質に大いに影響し得るので、やはりいくつかの望ましい遺伝マーカー、すなわち、（１）分泌されたタンパク質の過グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を防止するｍｎｎ９変異、（２）タンパク質分解に伴う問題を抑制するｐｒｂ１及び／又はｐｅｐ４プロテアーゼ変異及び（３）ＧＡＬプロモーターからの発現を増大させるためのＧＡＬ４転写因子の過剰発現を含む遺伝的背景が異なる酵母系統を構築することが望ましい。
【０１４２】
１２６０と命名されたＳ．セレビシエ系統の構築
出発Ｓ．セレビシエ系統は以下のように構築された。Ｓ．セレビシエ系統Ｙ３７９−５Ｄ（ＭＡＴα、ｃｙｈ２、ｎｉｂ１、ｒｈｏ−、ｃｉｒ°）（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６：７３〜８４、１９７７）を系統ＤＣ０４（ＭＡＴａ、ａｄｅ１、ａｄｅＸ、ｌｅｕ２−０４、ｃｉｒ°）（Ｂｒｏａｃｈ等、Ｃｅｌｌ  ２１：５０１〜５０８、１９８０）と交雑させた。生成した二倍体系統を胞子にし、四分子を標準手順によって解体した。一倍体胞子の１つは系統２１５０−２−３（ＭＡＴａ、ａｄｅ１、ｌｅｕ２−０４、ｃｉｒ°）を生じた。α交配型Ｓ．セレビシエ系統ＬＢ−３４７−１Ｃ（ＭＡＴα、ｍｎｎ９）は、ｍｎｎ９変異を含むＳ．セレビシエ系統Ｘ２１８０−１Ｂ（ＭＡＴα、ＳＵＣ２、ｍａｌ、ｍｅｌ、ｇａｌ２、ＣＵＰ１；ＡＴＣＣ番号２０４５０４）である。ＬＢ−３４７−１Ｃを、ＹＥＨＤ完全培地寒天板（Ｃａｒｔｙ等、Ｊ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏ  ２：１１７〜１２１、１９８７）上で該系統を混合することによって基準株２１５０−２−３（ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−０４、ａｄｅ１）と交配させた。交配された系統を、二倍体用に選択するために、ロイシンを含まず唯一の炭素源として２％スクロースを含む最少培地上に蒔いてレプリカプレートを作製した。単一コロニーを単離した後、二倍体を胞子にし、子嚢を標準技術によって解体した。ＫＨＹ−１０７系統を単一の一倍体胞子として単離し、（シッフ染色技術によって）ＡＤＥ１、ｌｅｕ２及びｍｎｎ９として特徴づけた。凍結されたグリセリン貯蔵物とし、−７０℃で貯蔵した。
【０１４３】
ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ＋）を−７０℃貯蔵物から増殖させ、ｐＭＢ９  ＤＮＡがｐＢＲ３２２  ＤＮＡで置換された以外は、酵母ＬＥＵ２−ｄ遺伝子を含みｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４〜１０９、１９７８）に関係する酵母ベクターｐＣ１／１で形質転換した。単離された形質転換体を（ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む）選択液体培地上で増殖させ、次いで（１Ｍソルビトールを含む）富栄養培地中で複数回継代増殖させてｐＣ１／１と２μＤＮＡの両方を取り除いた。（ロイシンを欠く培地では増殖することができない）ｐＣ１／１を失ったコロニーをＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成によって２μＤＮＡの有無について検査した。２μＤＮＡを示さない単離クローン、ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ°）−１を選択し、凍結グリセリン貯蔵物（−７０℃）とした。
【０１４４】
ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ°）−１は遺伝子破壊によってｕｒａ３にされた。Ｔｎ９０３由来のＡｐｈ３’Ｉ遺伝子の２つのコピーによって破壊されたＳ．セレビシエＵＲＡ３遺伝子を含むプラスミドが構築された。５’−ＵＲＡ３−Ａｐｈ３’Ｉ−ＵＲＡ３−３’カセットをベクターから切除し、ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ°）−１を形質転換するために使用した。破壊されたｕｒａ３カセットを組み込んだ形質転換体が５−フルオロ−オロチン酸プレート（Ｋａｉｓｅｒ，Ｃ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−１９９４  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；１９９４）  ２１４〜２１５ページ）上で選択され、続いてウラシルを欠く培地上で増殖できないことが示された。１個の単離クローンＫＨＹ−１０７ｕｒａ３（ＰＮ２）を選択し、凍結（−７０℃）グリセリン貯蔵物とした。
【０１４５】
ＫＨＹ−１０７ｕｒａ３（ＰＮ２）を（１Ｍソルビトールを含む）天然培地上で増殖させ、次いでアルギニンの代わりにカナバニンを含む合成培地上に蒔き、カナバニン耐性（ｃａｎＲ）変異体を得た。自発的なｃａｎＲ変異体をアルギニンの代わりにカナバニンを含む固体合成培地上の単離コロニーに対して画線した。単離コロニーは標準の遺伝的相補性試験によってｃａｎ１であることが判明した。１つの単離ｃａｎ１コロニーＤＭＹ１０を選択し、凍結（−７０℃）グリセリン貯蔵物として保存した。
【０１４６】
酵母ＧＡＬ４転写因子を過剰発現させるために、ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４融合遺伝子をＤＭＹ１０のＨＩＳ３遺伝子に組み込んだ。５’−ＨＩＳ３−ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４−ＵＲＡ３−ＨＩＳ３−３’カセットをｐＫＨｉｎｔ−Ｃ（Ｓｃｈｕｌｔｚ等、Ｇｅｎｅ  ６１：１２３〜１３３、１９８７）から切除し、ＤＭＹ１０を形質転換するために使用した。そのカセットを組み込んだ形質転換体が、ウラシルを欠く固体合成培地上で選択され、続いてヒスチジンを欠く培地上で増殖できないことが判明した。ＨＩＳ３部位にのみカセットが組み込まれたことがサザンブロット法によって確認された。１つの単離された要素ＤＭＹ１０ｉｎｔ−３を選択し、凍結（−７０℃）グリセリン貯蔵物とした。この系統はＣＦ５２と命名された。
【０１４７】
Ｓ．セレビシエＰＲＢ１遺伝子を有するプラスミドＦＰ８ΔＨ（Ｍｏｅｈｌｅ等、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５：２５５〜２６３、１９８７）をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ＰＲＢ１遺伝子を有する３．２ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にした。プラスミドｐＵＣ１８をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にした。生成したベクター断片に上記ＰＲＢ１遺伝子断片を連結してプラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を得た。ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドＹＥｐ６（Ｓｔｒｕｈｌ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ７６：１０３５、１９７９）をＢａｍＨＩで消化した。機能的ＨＩＳ３遺伝子を有する、生成した１．７ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ断片をゲル精製し、次いでＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にした。ＰＲＢ１コード配列内で切断しプロテアーゼＢ活性部位及びフランキング配列を除去するＥｃｏＲＶ＋ＮｃｏＩを用いてｐＵＣ１８−ＰＲＢ１ベクターを消化した。ｐＵＣ１８中のＰＲＢ１コード配列の残留５’及び３’部分を有する５．７ｋｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にし、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、上記平滑末端ＨＩＳ３断片を連結した。（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３、ストック＃１２４５と命名された）生成したプラスミドは、上で除去されたＰＲＢ１遺伝子の部分の代わりに機能的ＨＩＳ３遺伝子を含む。
【０１４８】
ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクター（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３）をＳａｃＩ＋ＸｂａＩで消化して、線状ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊カセットを作製し、酢酸リチウム法（Ｉｔｏ等、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３：１６３、１９８３）による系統ＣＦ５２の形質転換に使用した。Ｈｉｓ＋形質転換体をヒスチジンを欠く合成寒天培地上で選択し、クローン単離株用に同じ培地に再画線（ｒｅｓｔｒｅａｋ）した。いくつかの生成したＨｉｓ＋単離株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、次いで０．８％アガロースゲル上で電気泳動させた。サザンブロット分析によって所望のｐｒｂ１Δ：：ＨＩＳ３遺伝子破壊の存在を確認した。
【０１４９】
所望のｐｒｂ１Δ：：Ｈ１Ｓ３破壊を含む単離株の１つをさらに使用するために選択し、系統＃１２６０と命名した。系統＃１２６０の凍結グリセリン貯蔵物を調製し−７０℃で貯蔵した。生成した系統１２６０の遺伝子型は以下のとおりである：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−２，１１２、ｍｎｎ９、ｕｒａ３Δ、ｃａｎ１、ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｐｒｂ１Δ：：ＨＩＳ３、ｃｉｒ°。
【０１５０】
１３０９と命名されたＳ．セレビシエ系統の構築
Ｓ．セレビシエ系統ＢＪ１９９５（ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ１−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｇａｌ２）はすでに記載されている（Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｗ．、Ｔａｃｋｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐｒｏｂｌｅｍ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１）、４２８〜４５３ページ）。内因性２μＤＮＡプラスミドを欠くＢＪ１９９５のｃｉｒ°誘導体を、系統１２６０の構築に対して開示された手順を用いて単離した。生成したｃｉｒ°単離株を系統９１と命名し、凍結グリセリン貯蔵物（−７０℃）として保存した。
【０１５１】
次いで、ＧＡＬプロモーターからの転写を増加させるために、ＧＡＬ４転写因子を過剰産生する系統９１の誘導体を構築した。プラスミドｐＫＨｉｎｔ−Ｃ（Ｓｃｈｕｌｔｚ等、Ｇｅｎｅ  ６１：１２３〜１３３、１９８７）をＢａｍＨＩで消化し、生成した５’−ＨＩＳ３−ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４−ＵＲＡ３−ＨＩＳ３−３’カセットを使用して系統９１を形質転換した。そのカセットを組み込んだ形質転換体が、ウラシルを欠く固体合成培地上で選択され、続いてヒスチジンを欠く培地上で増殖できないことが判明した。カセットがＨＩＳ３部位に所望のとおり組み込まれたことを、酵母ＨＩＳ３遺伝子用プローブを用いたサザンブロット法によって確認した。１つの単離された要素ＢＪ１９９５ｃｉｒ°ｉｎｔ  ＃２２を選択し、凍結（−７０℃）グリセリン貯蔵物とした。この単離株は系統１２８２と命名された。
【０１５２】
次いで、ＭＮＮ９遺伝子の破壊を含む系統１２８２の誘導体を以下の一連のステップにおいて単離した。ＭＮＮ９遺伝子を破壊するためには、遺伝子破壊ベクターを調製する目的でＳ．セレビシエゲノムＤＮＡからＭＮＮ９遺伝子をまずクローン化する必要があった。これは標準ＰＣＲ技術によって実施された。完全長ＭＮＮ９コード配列のＰＣＲ用５’センスプライマー及び３’アンチセンスプライマーは、酵母ＭＮＮ９遺伝子の公表された配列（ＭａｃＫａｙ他、欧州特許ＥＰ０３１４０９６、国際公開日１９８９年５月３日）に基づいて設計された。（下線の）フランキングＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーが使用された。
センスプライマー（配列番号９４）：
【０１５３】
【化１】
2007502101.tif 000010
【０１５４】
アンチセンスプライマー（配列番号９５）：
【０１５５】
【化２】
2007502101.tif 000011
【０１５６】
ＭＮＮ９遺伝子の開始メチオニンコドンを太字で強調表示する。
【０１５７】
テンプレートとしてＳ．セレビシエ由来のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。ＭＮＮ９遺伝子を有する生成した１．２ｋｂｐ  ＰＣＲ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ゲル精製され、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されアルカリ性ホスファターゼで処理されたｐＵＣ１３を用いて連結された。生成したプラスミドはｐ１１８３と命名された。酵母ＴＲＰ１遺伝子は、平滑末端化された０．８５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：１０３５〜１０３９、１９７９）から単離され、次いでｐｌ１８３のＰｍｌＩ部位に挿入された。ＰｍｌＩ部位はＭＮＮ９コード配列の中央にあり、そのためその部位にＴＲＰ１遺伝子が挿入されると遺伝子破壊が起こる。次いで、生成したプラスミドｐＵＣ１３−ｍｎｎ９：：ＴＲＰ１（ｐ１１８８５−２３９−１）はＨｐａＩ＋ＥｃｏＲＩで消化された。５’−ｍｎｎ９−ＴＲＰ１−ｍｎｎ９−３’カセットは、酢酸リチウム法による系統１２８２の形質転換に使用された。（Ｉｔｏ等、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３：１６３、１９８３）。
【０１５８】
Ｔｒｐ＋形質転換体は、トリプトファンを欠く合成培地寒天板上で選択され、単一コロニー単離株用に同じプレート上に再画線された。いくつかの生成したＴｒｐ＋単離株からゲノムＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで０．８％アガロースゲル上で電気泳動させた。サザンブロット分析によって所望のｍｎｎ９：：ＴＲＰ１遺伝子破壊の存在を確認した。所望のｍｎｎ９：：ＴＲＰ１破壊を含むこれらの単離株の１つをさらに使用するために選択し、系統１３０９と命名した。系統１３０９の凍結グリセリン貯蔵物を調製し−７０℃で貯蔵した。系統１３０９の遺伝子型は以下のとおりである：ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｍｎｎ９：：ＴＲＰ１、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｐｒｂ１−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｇａｌ２、ｃｉｒ°。
【実施例９】
【０１５９】
完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域の発現
完全長ＯＲＦ０６５７ｎがＥ．コリ中で発現され（配列番号２８；ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ）、Ｓ．セレビシエ（配列番号２８のアミノ酸１〜６４６）と発現生成物が比較された。
【０１６０】
Ｓ．セレビシエ発現
酵母発現に対して最適化されたコドンによってＯＲＦ０６５７ｎタンパク質をコードするＤＮＡは、フランキングＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を含む以下のセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ、ＵｎｋＣＹ−Ｆ（配列番号；９６）、
【０１６１】
【化３】
2007502101.tif 000012
【０１６２】
及びＵｎｋＣＹ−Ｒ（配列番号９７）、
【０１６３】
【化４】
2007502101.tif 000013
【０１６４】
を用いて最終修正クローンｐＵｎｋＣＲ１（実施例７）から増幅された。センスプライマーは５’非翻訳配列及びＡＴＧコドンを含み、アンチセンスプライマーは終止コドンとしてＴＡＡを含む。生成した１．９ｋｂ産物をゲル単離し、製造者に従ってＴＯＰＯ  ＴＡベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローン化して、プラスミドＵｎｋＣ−Ｂ１を構築した。続いて挿入断片のＤＮＡ配列を確認した。ＢａｍＨＩ断片をゲル単離し、酵母ベクター（ｐＧＡＬ１１０、図５Ａ）に適切な向きでサブクローニングしてｐＲＵｎｋＣ−ｐＧＡＬ１１０を構築した。挿入断片の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１６５】
スフェロプラスト形質転換プロトコル（Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ、７５：１９２９〜３３、１９７８）によって、ｐＲＵｎｋＣ−ｐＧＡＬ１１０由来のプラスミドＤＮＡを使用してｌｅｕ２変異を含むＳ．セレビシエ系統をロイシン原栄養（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）（Ｌｅｕ＋）に形質転換した。系統１２６０及び１３０９の構築は上記実施例８に記載されている。
【０１６６】
形質転換体は、ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む合成寒天培地上で選択された。ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む上部及び下部合成寒天培地は、ＲＥＭＥＬ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ（それぞれ、ｃａｔ＃０９４５９及び９２１５５）から得られた。クローンのＬｅｕ＋単離株は、ＳＤマイナスロイシンプレート（ＫＤ  ＭＥＤＩＣＡＬ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）上の連続成長によって得られた。
【０１６７】
複数の形質転換体をスクリーニングするために、ゆっくり回転する培養管中で産生培養物５．０ｍＬを３０℃で増殖させた。続いて、１２５ｍＬフラスコにおいて２５ｍｌ培養物中の選択された形質転換体の産生を確認した。両方の場合において、４．０％グルコースと０．１Ｍソルビトールを含む５×マイナスロイシン培地中で種培養５ｍＬを３０℃でＯＤ６００が１．５から３．０／ｍＬになるまで１８から２４時間増殖させた。５×マイナスロイシン培地は、１リットル当たり以下の成分を含む：添加アミノ酸も硫酸アンモニウムも含まないＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、８．５ｇ；アデニン、０．４０ｇ；Ｌ−チロシン、０．２５ｇ；ウラシル、０．２０ｇ、コハク酸、１０．０ｇ、硫酸アンモニウム、５．０ｇ及びロイシンマイナス溶液＃３  ５０ｍＬ。ロイシンマイナス溶液＃３は蒸留水１リットル当たり、Ｌ−アルギニン、２ｇ；Ｌ−ヒスチジン、１．０ｇ；Ｌ−イソロイシン、６ｇ；Ｌ−リジン４．０ｇ；Ｌ−メチオニン、１．０ｇ；Ｌ−フェニルアラニン、６．０ｇ；Ｌ−トリプトファン、４．０ｇを含む。培地のｐＨを５０％水酸化ナトリウムで５．３に調節した。
【０１６８】
管中における産生の場合、種培養の０．３ｍＬ一定分量は、２％グルコース、４％ガラクトースを含む５×マイナスロイシン培地又はＹＥＨＤＧ培地５．０ｍＬに最終ＯＤ６００が５から１６．０／ｍＬになるまで７２時間移送された。ＹＥＨＤＧ培地は１リットル当たりＬ−Ｈｙ−大豆ペプトン−Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、１０ｇ；酵母エキス、２０ｇ；Ｌ−デキストロース、１６ｇ；Ｄ（＋）ガラクトース、４０ｇを含む。フラスコ中での産生の場合、種培養１．５ｍＬ一定分量を培地２５ｍＬに移し、上述したように２２０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。
【０１６９】
１０ＯＤ単位／試料を収集した後、細胞ペレットを溶解緩衝剤（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７．２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ）０．３ｍＬ中でガラスビーズで破壊した。溶解物を遠心分離によって回収し、破壊細胞／ビーズを溶解物緩衝剤０．３ｍＬで洗浄し、清浄化された各上清を混合した。タンパク質濃度は、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって製造者の指示に従って測定された。細胞溶解物は、４から２０％勾配Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で、１×Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中、還元及び変性条件下で電気泳動させた後、ＯＲＦ０６５７ｎの発現について免疫ブロット分析によって分析された。試料は全細胞タンパク質２０μｇを含んだ。ゲルは０．４５ミクロンニトロセルロースメンブランフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ製Ｏｐｔｉｔｒａｎ）上に電気ブロットされた。タンパク質サイズを推定するために、６．４から２０３ｋＤａの着色標準（Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を溶解物と平行して泳動させた。
【０１７０】
Ｅ．コリ標準
ＯＲＦ０６５７ｎを産生するように誘導されたＥ．コリ産生用培養物（Ｅ．コリ宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から精製されたＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）及び細胞溶解物を標準として使用した。Ｅ．コリは、ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎを発現する発現ベクターで形質転換された。Ｅ．コリ培養物を３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢブロス中で３７℃で終夜増殖させた。翌日、終夜培養物６０μＬを使用して６．０ｍＬ  ＬＢ＋３０μｇ／ｍＬカナマイシンを接種した。培養物をＯＤ６００が０．４から１．０になるまで３７℃で約３時間増殖させた。発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって３７℃で２時間誘導された。細胞を収集し、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。
【０１７１】
Ｅ．コリ溶解物はＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて製造者の手順に従って調製された。タンパク質は、ＯＲＦ０６５７ｎに対する（「２Ｈ２Ｂ８」と命名された）ネズミモノクローナル抗体を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型全抗体（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を二次抗体として用いたウエスタンブロットによって免疫検出された。Ｍａｂ  ２Ｈ２Ｂ８は、精製Ｅ．コリによって産生された完全長ＯＲＦ０６５７ｎによるマウスの免疫化によって産生された。Ｍａｂ  ２Ｈ２Ｂ８はＥＬＩＳＡによって選択され、ＯＲＦ０６５７ｎに特異的であることが判明した。フィルターは、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔによって処理された。
【０１７２】
Ｅ．コリ及びＳ．セレビシエからの発現産物
酵母形質転換体の初期スクリーニングから、酵母系統１２６０及び１３０９の各１個の形質転換体を完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）の最適産生株として選択した。ＹＥＨＤＧ培地における７２時間の発酵後のそれらの完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域の産生例をＥ．コリにおけるＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号２８）の産生と比較して図６Ａ及び６Ｂに示す。
【０１７３】
ｍＡｂ  ２Ｈ２Ｂ８を用いたウエスタンブロット分析によって検出された主要なタンパク質は、図６Ａ（系統１２６０）及び６Ｂ（系統１３０９）：レーン５及び６に示すように約１０５から１１０ｋＤａであった。約１０５から１１０ｋＤａのタンパク質は、Ｅ．コリ中で産生された精製組換えＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８；レーン２）又は誘導されたＥ．コリＯＲＦ０６５７ｎ産生用培養物の抽出物（後者は図６に示されたゲルには含まれていない）の試料中で検出された最大のタンパク質のサイズに相当した。Ｅ．コリ及びＳ．セレビシエによって産生された１０５から１１０ｋＤａのタンパク質は、本発明者らのゲル電気泳動システムにおける予測サイズよりも高分子量である。Ｅ．コリ対照において検出された優勢種は約９５ｋＤａと小さく、酵母中で産生された少量のタンパク質と共に移動することに留意されたい。約１０５から１１０ｋＤａのタンパク質は、Ｅ．コリとＳ．セレビシエの両方でＥ．コリ分泌性リーダーと共に発現される完全長ＯＲＦ０６５７ｎに対応すると考えられ、９５ｋＤａのタンパク質は分解産物と考えられる。ベクターｐＧＡＬ１１０単体を用いて得られた対照形質転換体の抽出物は検出されなかった（レーン３及び４）。
【０１７４】
１２６０及び１３０９の形質転換体によって産生されるＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）の推定量は約１０マイクログラムＯＲＦ０６５７ｎ／ｍＬ  ＹＥＨＤＧ培地であり、ＯＲＦ０６５７ｎ領域は、精製ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）１００ｎｇを標準として用いた半定量的ウエスタンブロットによって測定して総タンパク質量の約２％を含む。総タンパク質の発現量と％ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）は、両方の系統において４８時間よりも７２時間の方が多かった（データ示さず）。２％グルコース、４％ガラクトースを含む５×ロイシン培地中で１２６０の形質転換体によって産生されたＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）の力価は約８．０μｇ／ｍＬであり、％総タンパク質は２．０であった。
【実施例１０】
【０１７５】
ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域をコードする分泌コドン最適化配列の発現
ベクターｐＫＨ４−３Ｂ（Ｃａｒｔｙ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １２：８７９〜８８４、１９９０）は、酵母アルファ因子（ＭＦα１）プレプロ分泌性リーダーを含む。このリーダーに所望のタンパク質が融合して、Ｓ．セレビシエのシグナルペプチダーゼによってまず切断される翻訳産物を生じる。続いて、Ｋｅｘ２プロテアーゼは、分泌性リーダー及び成熟タンパク質中の「Ｌｙｓ  Ａｒｇ残基」が放出された後に開裂する。Ｓ．セレビシエ誘導性ＧＡＬ１０プロモーターは、タンパク質を発現させるために使用された。
【０１７６】
ベクターｐＫＨ４−３Ｂは、改変された配列番号３をコードするコドン最適化された遺伝子を発現するために使用された。配列番号３は、アミノ末端メチオニンを除去しアミノ末端リーダー配列を付加することによって修飾された。コドン最適化された配列番号３コード領域は、配列番号３２のヌクレオチド４から１７１０によって与えられ、リーダーコード配列は、以下に示すように調製されたベクターｐＫＨ４−３Ｂによって与えられる。
【０１７７】
ｐＫＨ４−３Ｂのアルファ因子プレプロ分泌性リーダーは、配列番号３のＯＲＦ０６５７ｎＨ領域にインフレームで融合された。これは、ベクターｐＫＨ４−３ＢをＳｐｈＩで消化し、続いてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理してＳｐｈＩ−オーバーハングを除去し、リーダーの適切なコドンを用いて５’末端に平滑末端を作製することよって実施された。続いて、ベクターをＢａｍＨＩで消化して３’クローニング部位を作製した。この構築体は、再構築されたＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３２）の第２のコドンに対応する５’平滑末端と終止コドン及びＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を有する３’末端とを含むＰＣＲ産物を必要とする。
【０１７８】
酵母発現に対して最適化されたコドンによってＯＲＦ０６５７ｎＨ領域をコードするＤＮＡは、以下のセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ、ＵＣＫＨＳ２（配列番号９８）、５’ＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣ３’及びＵＣＫＨＡ２、（配列番号９９）
５’ＧＴＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＴＴＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＴＴＣ３’を用いてｐＵｎｋＣＲ１（実施例７）から増幅された。センスプライマーの５’末端ＧＣＴは、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の予測されたＮ末端であるアラニンをコードする。アンチセンスプライマーは、ＴＡＡ終止コドン及びＢａｍＨＩ部位（下線）を含む。生成した１．７ｋｂ  ＰＣＲ産物をゲル単離し、（上述したように調製された）ｐＫＨ４−３Ｂにクローン化してｐＵＳ３８を構築した。挿入断片のＤＮＡ配列全体及びベクターの部分配列を確認し、分泌性リーダーに所望のとおり融合されたことが示された。この構築体から発現される最初のタンパク質がＫｅｘ２ｐによって適切に切断されて、Ｎ末端メチオニンを欠く配列番号３に対応するタンパク質が生成する。
【０１７９】
スフェロプラスト形質転換プロトコル（Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ、７５：１９２９〜３３、１９７８）によって、プラスミドｐＵＳ３８を使用してＳ．セレビシエ系統１２６０及び１３０９をロイシン原栄養（Ｌｅｕ＋）に形質転換した。形質転換体は、ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む合成寒天培地上で選択された。ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む上部及び下部合成寒天培地は、ＲＥＭＥＬ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ（それぞれ、ｃａｔ＃０９４５９及び９２１５５）から得られた。クローンのＬｅｕ＋単離株は、ＳＤマイナスロイシンプレート（ＫＤ  ＭＥＤＩＣＡＬ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）上の連続成長によって得られた。
【０１８０】
複数の形質転換体のスクリーニングでは、４．０％グルコースと０．１Ｍソルビトール培地を含む５×マイナスロイシン培地中で種培養５ｍＬを３０℃でＯＤ６００が１．５から３．０／ｍＬになるまで１８から２４時間増殖させた。５×マイナスロイシン培地は、１リットル当たり以下の成分を含む：アミノ酸も硫酸アンモニウムも含まないＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、８．５ｇ；アデニン、０．４０ｇ；Ｌ−チロシン、０．２５ｇ；ウラシル、０．２０ｇ、コハク酸、１０．０ｇ、硫酸アンモニウム、５．０ｇ及びロイシンマイナス溶液＃３  ５０ｍＬ。ロイシンマイナス溶液＃３は蒸留水１リットル当たり、Ｌ−アルギニン、２ｇ；Ｌ−ヒスチジン、１．０ｇ；Ｌ−イソロイシン、６ｇ；Ｌ−リジン４．０ｇ；Ｌ−メチオニン、１．０ｇ；Ｌ−フェニルアラニン、６．０ｇ；Ｌ−トリプトファン、４．０ｇを含む。培地のｐＨを５０％水酸化ナトリウムで５．３に調節した。２％グルコース＋４％ガラクトースを含む５×マイナスロイシン培地又はＹＥＨＤＧ培地５．０ｍＬに最終ＯＤ６００が１０から２０．０／ｍＬになるまで０．３ｍＬ一定分量を７２時間移送した。ＹＥＨＤＧ培地は１リットル当たりＬ−Ｈｙ−大豆ペプトン−Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、１０ｇ；酵母エキス、２０ｇ；Ｌ−デキストロース、１６ｇ；Ｄ（＋）ガラクトース、４０ｇを含む。
【０１８１】
発酵は、酵母細胞を除去し、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット分析又はクーマシー染色によって上清を直接分析することによって収集された。免疫ブロット分析の場合には、１０から２５マイクロリットルの試料が還元及び変性条件下で１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中の４から１５％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で電気泳動にかけられた。このゲルを０．２ミクロンＰＶＤＦメンブランフィルター上に電気ブロットした。タンパク質は、モノクローナル抗体２Ｈ２Ｂ８を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型全抗体（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を二次抗体として免疫検出された。Ｍａｂ  ２Ｈ２Ｂ８は実施例９に記載されている。フィルターは、ＷＥＳＴＥＲＮ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ（商標）  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）によって処理された。
【０１８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色による組換え酵母ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の発現分析の場合には、試料は還元及び変性条件下で１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中の４から１５％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上で電気泳動にかけられた。ゲルは、製造者（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の手順に従ってＢｉｏ−Ｓａｆｅクーマシー、クーマシーＧ２５０染色で染色された。
【０１８３】
定性標準として、ＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）を産生するＥ．コリ培養物からの細胞溶解物が使用された。Ｅ．コリ発現ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の予測アミノ酸配列は、Ｅ．コリ構築体においてＮ末端メチオニンに続いてグリシンが存在する以外は、Ｓ．セレビシエ内部で発現されたＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の予測アミノ酸配列（配列番号３）と同一である。
【０１８４】
Ｅ．コリ中でＯＲＦ０６５７ｎＨ領域を産生するために、産生用培養物を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢブロス中で３７℃で終夜増殖させた。カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４をコードするｐＥＴ２８を使用してタンパク質を発現させた。翌日、終夜培養物５００μＬを使用して５．０ｍＬ  ＬＢブロス＋５０μｇ／ｍＬカナマイシンを接種した。培養物をＯＤ６００  ０．６まで３７℃で約３時間増殖させた。発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって３７℃で３．５時間誘導された。細胞を収集し、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。Ｅ．コリ溶解物はＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて製造者の手順に従って調製された。
【０１８５】
下記実施例１１に記載され下記実施例１１に示されたとおりに調製された内部ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）を発現するＳ．セレビシエ形質転換体１−１の細胞溶解物由来のタンパク質も標準として入れられた。タンパク質サイズを推定するために、クーマシー染色とウェスタン評価の両方で１０から２５０ｋＤａの着色標準（ＢＩＯ−ＲＡＤ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の試料と平行して泳動させた。
【０１８６】
所望の種は、２％グルコース＋４％ガラクトースを含む５×マイナスロイシン培地中で産生された。両系統１２６０及び１３０９のｐＵＳ３８を含む形質転換体は、酵母内部で発現された（配列番号３をコードする核酸由来の）ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域並びにウェスタン及びクーマシー染色によって検出された（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４をコードする核酸由来の）Ｅ．コリ発現ＯＲＦ０６５７ｎＨと極めて接近して移動する約８０ｋＤａのタンパク質を分泌した。典型的な実験においては、これらの対照溶解物５００ｎｇ及び培地上清２５マイクロリットルが電気泳動にかけられた。検出は特異的であった；８０ｋＤａのタンパク質は、ベクターのみを含む形質転換体の上清中にはウエスタンブロットでもクーマシー染色でも検出されなかった。分泌された約８０ｋＤａのタンパク質は、成熟非グリコシル化ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）に対応する場合もあり、或いは、少数のグリコシル残基を含む場合もあった。上清中のより高分子量の種は、２種類の低分子量タンパク質と同様に、抗体によって検出され、これらはすべてクーマシーブルーで染色された。より高分子量の種は、未加工のリーダーを含み、かつ／又はグリコシル化することができた。低ＭＷ種は分解産物である可能性が高い。
【０１８７】
両系統１２６０及び１３０９の形質転換体によって分泌された８０ｋＤａの種の推定量は約２μｇ／ｍＬ培地であった。これは、８０ｋＤａにおけるウェスタンシグナルをＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）を含む酵母細胞溶解物の試料のそれと比較することによって求められ、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域が総タンパク質量の少なくとも５０％を構成することを示唆している。ＯＲＦ０６５７ｎ領域の残留種の混合力価は約５０μｇ／ｍＬ培地と推定された。
【実施例１１】
【０１８８】
Ｓ．セレビシエにおけるＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の細胞内発現
Ｓ．セレビシエにおける配列番号３の細胞内発現によって、離散的なサイズのタンパク質が極めて高いレベルで産生された。発現は酵母最適化コード核酸配列を用いて実施された。
【０１８９】
酵母発現に対して最適化されたコドンによってＯＲＦ０６５７ｎＨ領域をコードするＤＮＡ（配列番号３２）は、フランキングＢａｍＨＩ制限酵素切断部位（下線）を含む以下のセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ、（配列番号１００）５’ＧＧＧＧ  ＧＧＡＴＣＣ  ＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧ３’及び（配列番号１０１）５’ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＡＴＣＣ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ３’を用いてｐＵｎｋＣＲ１（実施例７）から増幅された。センスプライマーは５’非翻訳リーダー配列及びＡＴＧコドンを含み、アンチセンスプライマーは終止コドンとしてＴＡＡを含む。
【０１９０】
生成した１．７ｋｂ産物をゲル単離し、製造者の指示に従ってＴＯＰＯ  ＴＡベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローン化して、プラスミドｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓを構築した。続いて、挿入断片のＤＮＡ配列が２個の独立クローン、ｐＣＲ＿ｉＵＣＳ２．２及びｐＣＲ＿ｉＵＣＳ−２．４から求められた。挿入断片の各々において各プラスミドの異なるＨｉｎｄＩＩＩ断片上に位置する単一のＰＣＲエラーが見出された。正確な配列を含むプラスミドは、正確な配列を有するｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓ２．２の１．３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓ２．４の対応する断片と交換することによって得られた。
【０１９１】
ｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓ２．２の１．３ｋｂ断片及びｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓ２．４の４．３ｋｂ断片をゲル単離し連結した。所望の断片を含むクローンが選択され、ｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓ、適切な向き及びヌクレオチド配列がＤＮＡ配列決定によって確認された。続いて、１．７ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片をｐＧＡＬ１１０（図５Ａ）にサブクローニングしてｐｉＵＣＳ−Ｓ（−）を構築した。
【０１９２】
スフェロプラスト形質転換プロトコルによって、ｐｉＵＣ−Ｓ（−）由来のプラスミドＤＮＡを使用してＳ．セレビシエ系統１２６０及び１３０９をロイシン原栄養（Ｌｅｕ＋）に形質転換した。（Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ、７５：１９２９〜３３、１９７８）。形質転換体は、ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む合成寒天培地上で選択された。ロイシンを欠き１Ｍソルビトールを含む上部及び下部合成寒天培地は、ＲＥＭＥＬ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ（それぞれ、ｃａｔ＃０９４５９及び９２１５５）から得られた。クローンのＬｅｕ＋単離株はＳＤマイナスロイシンプレート（ＫＤ  ＭＥＤＩＣＡＬ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）上の連続成長によって得られた。
【０１９３】
複数の形質転換体が、実施例９に記載された発酵条件を用いたＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の産生についてスクリーニングされた。細胞溶解物は、ウエスタンブロット分析又はクーマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析によって、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の産生について分析された。
【０１９４】
ウエスタンブロット分析の場合、試料は還元及び変性条件下で１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中の４から１５％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で電気泳動にかけられた。このゲルを０．２ミクロンＰＶＤＦメンブランフィルター上に電気ブロットした。タンパク質は、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）に対するモノクローナル抗体２Ｈ２Ｂ８を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型全抗体（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を二次抗体として用いたウエスタンブロットによって免疫検出された。Ｍａｂ  ２Ｈ２Ｂ８は実施例９に記載された。フィルターは、ＷＥＳＴＥＲＮ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ（商標）  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）によって処理された。
【０１９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色による（配列番号３２によってコードされた）組換え酵母ＯＲＦ０６５７ｎＨの発現分析の場合、試料は還元及び変性条件下で１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中の４から１５％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上で電気泳動にかけられた。ゲルは、製造者の手順に従ってＢｉｏ−Ｓａｆｅクーマシー、クーマシーＧ２５０染色（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で染色された。
【０１９６】
電気泳動にかけられた酵母細胞溶解物の試料は、ウエスタンブロット及びクーマシー染色で全細胞酵母タンパク質のそれぞれ０．５及び１．２５μｇを含んだ。クーマシー染色の定量標準として、精製ＢＳＡ（１００×、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）が使用された。精製Ｅ．コリ完全長組換えＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号２８）はウェスタンの定量標準として使用された。定性標準として、ＯＲＦ０６５７ｎＨを産生するように誘導された、ＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）を産生するＥ．コリ培養物からの細胞溶解物が両方の評価に使用された。
【０１９７】
Ｅ．コリ中でＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグ）を産生するために、産生用培養物を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢブロス中で３７℃で終夜増殖させた。翌日、終夜培養物５００μＬを使用して５．０ｍＬ  ＬＢブロス＋５０μｇ／ｍＬカナマイシンを接種した。培養物をＯＤ６００  ０．６まで３７℃で約３時間増殖させた。発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって３７℃で３．５時間誘導された。細胞を収集し、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。Ｅ．コリ溶解物はＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて製造者の手順に従って調製された。タンパク質サイズを推定するために、１０から２５０ｋＤａの着色標準を溶解物と平行して泳動させた（ＢＩＯ−ＲＡＤ）。
【０１９８】
初期スクリーニングから、１−１と命名された酵母系統１２６０の１個の形質転換体が、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の最適産生株として選択された。振とうフラスコ中の天然培地ＹＥＨＤＧにおける７２時間の発酵後のＯＲＦ０６５７ｎＨ領域の産生例を図７Ａ及び７Ｂに示す。クーマシー染色（Ａ）又は抗体（Ｂ）によって検出された主要なタンパク質は約８５ｋＤａであり（レーン５、６及び７参照）、Ｅ．コリＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４；レーン２）と共に移動した。Ｅ．コリ発現ＯＲＦ０６５７ｎと酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎの両方のＭＷは、本発明者らのゲル電気泳動システムにおける予測サイズよりも大きかった。約８５ｋＤａのタンパク質の検出は特異的であった；ベクターｐＧＡＬ１１０のみを含む形質転換体由来の細胞溶解物中には検出されなかった（レーン３）。完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）よりもかなり多量のＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）が産生された。レーン５、６及び７をレーン４と比較されたい。完全長ＯＲＦ０６５７ｎを含む形質転換体を、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）を含む形質転換体と同時に同一条件下で発酵させた。成熟酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域が分解した証拠はほとんど認められなかった。
【０１９９】
タンパク質の安定性を評価するために、数日間凍結され、続いて解凍されていない形質転換体１−１の細胞溶解物からの試料がゲルに加えられた（図７、レーン７）。この試料の完全性及び量は新しい試料と類似していると判断することができる（レーン５及び６）。ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）が分解せず安定であることは、完全長Ｅ．コリＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）に対するヤギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって確認された（データ示さず）。
【０２００】
ウエスタンブロット及びクーマシーゲルによるＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の推定量は約３６０μｇ／ｍＬ  ＹＥＨＤ培地であり、％総タンパク質は約５０と推定された。特定培地中で産生された量は２２５μｇ／ｍＬ培地であり総タンパク質％はやはり約５０であった。ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の量は、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）の量よりも多く（それぞれ３５０と１０μｇ／ｍＬ）、％総タンパク質も高かった（５０と２．０）。
【実施例１２】
【０２０１】
Ｓ．セレビシエにおけるＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４）の細胞内発現
ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの細胞内発現は、ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４）をコードするＤＮＡ構築体を用いて以下の実施例において評価された。ＯＲＦ０６５７ｎＧ（配列番号４４）は配列番号２の切断型であり、アミノ末端シグナル配列を欠く。配列番号４４は、Ｎ末端メチオニン及び配列番号２のアミノ酸４２から６４５を有する。
【０２０２】
ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４）をコードする酵母最適化ＤＮＡは、ｐＵｎｋＣＲ１（実施例７）から、フランキングＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を有する以下のセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ、５’ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧ３’（配列番号１０２）及び５’ＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧ３’（配列番号１０３）を用いて増幅された。センスプライマーは５’非翻訳リーダー配列及びＡＴＧコドンを含み、アンチセンスプライマーは終止コドンとしてＴＡＡを含む。生成した１．８ｋｂ産物をゲル単離し、製造者（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の指示に従ってＴＯＰＯ  ＴＡベクターｐＣＲ２．１にクローン化して、プラスミドｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｌ４を構築した。ＤＮＡ配列分析によって、単一の欠失が５’末端で起きたことが確認された。
【０２０３】
正確な配列を有するクローンは、正確な配列を含むｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｓ２．２の１．３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（実施例１１参照）をｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｌ４の対応する断片と交換することによって得られた。ｐＣＲ＿ｉＵＣＳ２．２の１．３ｋｂ断片及びｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｌ４の４．４ｋｂ断片をゲル単離し連結した。所望の断片を含むクローンが選択され、ｐＣＲ＿ｉＵＣ−Ｌ、適切な向き及びヌクレオチド配列がＤＮＡ配列決定によって確認された。続いて、１．８ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片をｐＧＡＬ１１０にサブクローニングしてｐｉＵＣ−Ｌ（−）を構築し、ＤＮＡ配列を確認した。
【０２０４】
ｐｉＵＣ−Ｌ（−）からのプラスミドＤＮＡを使用して、実施例９に記載されたようにＳ．セレビシエ系統１２６０をロイシン原栄養（Ｌｅｕ＋）に形質転換した。いくつかの酵母形質転換体が、実施例１１に記載された発酵及び細胞破壊条件を用いてＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４）の細胞内産生についてスクリーニングされた。細胞溶解物タンパク質０．２５から０．５μｇは、実施例１１に記載されたようにＯＲＦ０６５７ｎＧ領域の産生についてウエスタンブロット分析によって分析された。精製Ｅ．コリＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）を定量標準として使用し、ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域を産生するように誘導されたＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４４）を産生するＥ．コリ培養物からの細胞溶解物を定性標準として使用した。試料は還元及び変性条件下で１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中の４から１５％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で電気泳動にかけられた。このゲルを０．２ミクロンＰＶＤＦメンブランフィルター（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上に電気ブロットした。
【０２０５】
タンパク質は、精製Ｅ．コリによって産生された完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）に対するポリクローナル抗体を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型全抗体（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を二次抗体として用いたウエスタンブロットによって免疫検出された。ポリクローナル抗体は、精製Ｅ．コリによって産生された完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号２８）による免疫化によって産生された。フィルターは、ＷＥＳＴＥＲＮ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ（商標）  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）によって処理された。
【０２０６】
比較のために、ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４４）を、実施例１に記載されたようにＥ．コリ発現ベクター中でクローン化し発現させた。Ｅ．コリ中でＯＲＦ０６５７ｎＧ領域を産生するために、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢブロス中で産生用培養物を３７℃で終夜増殖させた。翌日、終夜培養物５００μＬを使用して５．０ｍＬ  ＬＢブロス＋５０μｇ／ｍＬカナマイシンを接種した。培養物をＯＤ６００  ０．６まで３７℃で約３時間増殖させた。発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって３７℃で３．５時間誘導された。細胞を収集し、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。Ｅ．コリ溶解物はＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて製造者（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の手順に従って調製された。タンパク質サイズを推定するために、１０から２５０ｋＤａの着色標準（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を溶解物と平行して泳動させた。
【０２０７】
初期スクリーニングから、ｉＵＣ−Ｌ３と命名された酵母系統１２６０の１個の形質転換体が、実施例１１に記載されたように、培養管における天然培地ＹＥＨＤＧ中の７２時間発酵後にＯＲＦ０６５７ｎＧ領域の良好な産生株として選択された。クーマシー染色又は抗体によって検出された主要なタンパク質は約８５ｋＤａであり、Ｅ．コリ発現ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４４）と共に移動した。Ｅ．コリ発現ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域と酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎＧ領域の両方のＭＷは、本発明者らのゲル電気泳動システムにおける予測サイズよりも大きかった。約８５ｋＤａのタンパク質の検出は特異的であった；ベクターｐＧＡＬ１１０のみを含む形質転換体由来の細胞溶解物中には検出されなかった。３つのウエスタンブロット実験から求められたＯＲＦ０６５７ｎＧの平均力価は３０μｇ／ｍＬ  ＹＥＨＤＧ培地であり、％総タンパク質は１０．０と推定された（下記実施例１３参照）。
【実施例１３】
【０２０８】
細胞壁局在化シグナルを除去すると細胞内発現が増加する
ＯＲＦ０６５７ｎカルボキシル細胞ｓｏｒｔａｓｅ  Ｃ末端コード領域のみの除去及びＮ末端シグナル領域の除去との組み合わせの効果をコドン最適化ＯＲＦ０６５７ｎ遺伝子配列番号３１、３２及び４５を用いて検討した。配列番号３１は完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域をコードする。配列番号３２は、Ｎ末端シグナル配列とＣ末端細胞壁局在化領域の両方を欠くＯＲＦ０６５７ｎＨ領域をコードする。配列番号４５は、シグナルペプチド配列のみを欠くＯＲＦ０６５７ｎＧ領域をコードする。
【０２０９】
完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８；形質転換体ｒＵｎｋＣ１）、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３；形質転換体１−１）及びＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４  形質転換体ｉＵＣ−Ｌ３）を各々発現する１個の形質転換体を発酵させ、実施例１１に記載されたように細胞溶解物を調製し分析した。代表的なウエスタンブロットを図９に示す。異なる形質転換体からゲル上に堆積したタンパク質細胞溶解物の量は、ＯＲＦ０６５７ｎ領域をコードする３個の構築体の異なる発現レベルを補償するために同じではなかった。各場合において、各ＯＲＦ０６５７ｎ含有形質転換体から少なくとも２つの異なる量のタンパク質細胞溶解物が堆積した。
【０２１０】
ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）が完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）又はＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４）よりもかなり良好に発現されることを示す典型的な結果を図９に示す。かなりのシグナルが、レーン１１及び１２に示されるようにＯＲＦ０６５７ｎＨ領域産生株からのわずか５０及び１００ｎｇの細胞溶解物タンパク質で検出された。これに対して、完全長ＯＲＦ０６５７ｎＣ領域産生株の細胞溶解物タンパク質１．０及び２．０μｇ、それぞれレーン７及び８が使用された。良好なシグナルがタンパク質のより少ないＯＲＦ０６５７ｎＧ領域で検出され、タンパク質２５０及び５００ｎｇがレーン１４及び１５に示されるように堆積した。
【０２１１】
表４は、３個のＯＲＦの各々の平均力価及び３つの独立したウエスタンブロットによって求められた％総タンパク質の比較である。細胞溶解物は、各ウエスタンブロットで新たに調製された。平均は、２つの独立した発酵からの結果を含む。特定のＯＲＦ０６５７ｎの量は、精製Ｅ．コリＯＲＦ０６５７ｎＨ（配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグ）標準に対して求められた。
【０２１２】
【表５】
2007502101.tif 000014
【０２１３】
シグナルペプチド配列を除去すると、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）とＯＲＦ０６５７ｎＧ領域（配列番号４４）の発現を比較して求められた％総タンパク質及び力価が２．５から３倍に増加した。シグナルペプチドと細胞壁局在化配列の両方を除去すると、発現がシグナルペプチド配列のみの除去の８から１４倍（ｇとＨ領域の比較）、完全長タンパク質の２０から４２．５倍（ＣとＨ領域）に増加した。細胞壁局在化配列の除去による発現の増加の程度は予想外であった。
【実施例１４】
【０２１４】
Ｓ．セレビシエにおけるＯＲＦ０６５７ｎＩ領域の細胞内発現
酵母発現に対して最適化されたコドンによってＯＲＦ０６５７ｎＩ領域をコードするＤＮＡ（配列番号３３）は、フランキングＢａｍＨＩ制限酵素切断部位（下線）を有する以下のセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ
５’ＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴ３’（配列番号１０４）及び
５’ＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＴＡＧ３’（配列番号１０５）
を用いてｐＵｎｋＣＲ１（実施例７）から増幅された。センスプライマーは５’非翻訳リーダー配列及びＡＴＧコドンを含み、アンチセンスプライマーは終止コドンとしてＴＡＡを含む。生成した１．３ｋｂ産物をゲル単離し、ｐＧＡＬ１１０（図５Ａ）にクローン化してｐｉＵＣ−Ｉ（図５Ｂ）を構築し、ＤＮＡ配列を確認した。
【０２１５】
ｐｉＵＣ−１からのプラスミドＤＮＡを使用して、実施例９に記載されたようにＳ．セレビシエ系統１２６０をロイシン原栄養（Ｌｅｕ＋）に形質転換した。３種類のＬｅｕ＋形質転換体が、実施例９に記載されたように、小規模発酵（５．０ｍＬ培養）条件を用いてＯＲＦ０６５７ｎＩ領域（配列番号１）の細胞内産生についてスクリーニングされた。
【０２１６】
産生は、Ｓ．セレビシエ形質転換体１−１（実施例１１参照）によって産生されたＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）のそれと比較された。細胞溶解物を実施例９に記載されたように調製し、酵母細胞溶解物タンパク質１００及び２００ｎｇをＯＲＦ０６５７ｎＩ及びＯＲＦ０６５７ｎＨの産生について分析実施例１１に記載された半定量的ウエスタンブロットによって分析した。精製Ｅ．コリＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）を定量標準として使用した。試料は還元及び変性条件下で１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝剤（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中の１０から２０％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で電気泳動にかけられた。このゲルを０．２ミクロンＰＶＤＦメンブランフィルター（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上に電気ブロットした。タンパク質は、精製Ｅ．コリ完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）に対するポリクローナル抗体を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型全抗体（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を二次抗体として用いたウエスタンブロットによって免疫検出された。ポリクローナル抗体は、精製Ｅ．コリによって産生された完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）による免疫化によって産生された。フィルターは、ＷＥＳＴＥＲＮ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ（商標）  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）によって処理された。タンパク質サイズを推定するために、１０から２５０ｋＤａの着色標準（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を溶解物と平行して泳動させた。
【０２１７】
図１１は、培養管における複合ＹＥＨＤＧ培地中の７２時間発酵の結果である。レーン５、６、１４、１５、２１及び２２に示すように酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）が大きく検出された。ＯＲＦ０６５７ｎＩ（配列番号１）を発現するように構築された形質転換体中の約６０ｋＤａのタンパク質もレーン７から１２及び１６から２１に示されるように容易に検出された。酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎＩ（配列番号１）は、Ｅ．コリから発現され精製されたＯＲＦ０６５７ｎＩ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号５）と共に移動した（データ示さず）。Ｅ．コリ発現ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域と酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域の両方のＭＷは、本発明者らのゲル電気泳動システムにおける予測サイズよりも大きかった。ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域（配列番号１）を発現するように構築された形質転換体中で検出された６０ｋＤａのタンパク質は特異的であった；ベクター対照形質転換体からの細胞溶解物中にタンパク質は検出されなかった（レーン４及び１３）。
【０２１８】
ゲル上のＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）及びＯＲＦ０６５７ｎＩ領域（配列番号１）の量は、半定量的ウエスタンブロットから既知量の精製ＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）と比較して推定された。力価及び％総タンパク質は、ゲル上の２つの異なる量のタンパク質を含む２つ組の溶解物から求められた平均として計算された。新たな発酵試料及び凍結細胞溶解物から求められたＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）の各体積力価（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｔｅｒ）は約５００と約５５０μｇ／ｍＬ培地で同等であり、１ｍＬ培地当たり３２０μｇのＯＲＦ０６５７ｎＩ領域（配列番号１）が産生された（ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域の力価は形質転換体Ｉ１に対するものである）。総タンパク質の％ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）はそれぞれ７８％及び８０％と推定され、ＯＲＦ０６５７ｎＩ（配列番号１）は総タンパク質の４５％であった。
【０２１９】
したがって、ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域はＳ．セレビシエ中で十分に発現され、力価はＯＲＦ０６５７ｎＨ（配列番号３）の力価の約１／１．５であり、％総タンパク質は約１／１．３であった。酵母中のＯＲＦ０６５７ｎＩ領域の良好な発現は、細胞溶解物を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色によって確認された。ＹＥＤＨＧ培地におけるＯＲＦ０６５７ｎＩ領域の発現は大規模に実現可能であり、１２５ｍＬ又は２Ｌ振とうフラスコにおける産生は培養管における小規模発現と同等であった。
【０２２０】
ＯＲＦ０６５７ｎＩ領域（配列番号１）は特定５×マイナスロイシン培地（実施例９に記載された培地）中でも十分に発現した。力価は、天然培地ＹＥＨＤＧにおける力価の１／１．５倍しか低くなく、％総タンパク質は両方の培地で同等であった。ＯＲＦ０６５７ｎＩの完全性は両方の培地において良好であり、大きな分解は検出されなかった。ＯＲＦ０６５７ｎＩの産生は、振とうフラスコ発酵で試験すると、天然培地と５×マイナスロイシン培地のどちらも９６時間より７２時間の方が多かった。
【実施例１５】
【０２２１】
ＯＲＦ０６５７ｎＨ（配列番号３）を産生する酵母系統の大規模発酵
（プラスミドｐｉＵＣ−Ｓ（−）で形質転換された系統１２６０；実施例１１に記載された）酵母系統１−１の凍結された種貯蔵物を大規模発酵及び精製に使用した。種貯蔵物のバイアルを解凍し、１．０ｍＬを使用して４％グルコースを含みロイシンを含まない選択培地（５×Ｌｅｕ−培地、Ｂａｙｎｅ等、Ｇｅｎｅ  ６６（２）：２３５〜４４、１９８８）５０ｍＬを含む２５０ｍＬ三角フラスコに接種した。フラスコを回転振とう機上２５０ｒｐｍで２８℃でインキュベートした。２４時間後（残留グルコース２３．５ｇ／Ｌ）、培養体積１３ｍＬを同じ培地８７７ｍＬを含む２Ｌフラスコに添加した。フラスコを２８℃で再度インキュベートし、２５０ｒｐｍで撹拌した。２４時間後（残留グルコース４．０４ｇ／Ｌ）、２Ｌフラスコの内容物を使用して、使用された系統に対して最適化された既知組成培地（Ｏｕｒａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．  １６：１１９７、１９７４）を含む２０Ｌ反応器に接種した。この培地は２０ｇ／Ｌグルコースを含み、続いて誘導用の２５ｇ／Ｌガラクトースを含んだ。反応器は２８℃、４．７Ｌ／ｍｉｎ、１５ｐｓｉｇ（１００ｋＰａ）及び３００ｒｐｍで運転された。これらの条件下で、溶存酸素レベルは飽和の３０％を超えて維持された。細胞増殖は、グルコース消費、光学濃度（Ａ６００ｎＭ、１ｃｍキュベット）、乾燥細胞重量、ガラクトース利用及びエタノール産生によってモニターされた。培養は９０時間続けられ、Ａ６００は３３．９に達し、乾燥細胞重量は１７．５ｇ／Ｌに達した。
【０２２２】
培養物をＡＭＩＣＯＮ  ＤＣ−１０収集スキッド（ｈａｒｖｅｓｔ  ｓｋｉｄ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて中空繊維接線流ろ過（ＡＭＩＣＯＮ  Ｈ５ＭＰ０１−４３カートリッジ）によって収集した。透過液を廃棄し、細胞を濃縮し、ＰＢＳで透析ろ過し、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ（ＳＬＡ−３０００ローター）を用いた遠心分離によって８０００ｒｐｍ、４℃で２０分間回収した。細胞を−７０℃で貯蔵した。
【０２２３】
大規模発酵において系統１−１によるＯＲＦ０６５７ｎＨの産生を評価するために、収集された培養物１０  ＯＤ６００単位から細胞溶解物を調製し、実施例１１に詳述されたように評価した（結果示さず）。振とうフラスコ発酵（７２時間、複合ＹＥＨＤＧ培地）からのＯＲＦ０６５７ｎＨの産生も評価された。（実施例１１に記載されたように実施された）ウエスタンブロット分析の結果によれば、大規模発酵から産生されたタンパク質は、振とうフラスコ発酵で産生されたＯＲＦ０６５７ｎＨと共に移動した（結果示さず）。大規模（２０Ｌ）発酵から得られるＯＲＦ０６５７ｎＨの力価は７３９μｇ／ｍＬと推定され、％総タンパク質は５５％と推定され、（実施例１１記載の半定量的ウェスタン方法を用いた）振とうフラスコ発酵の７３２μｇ／ｍＬ及び５８％総タンパク質と比較された。これらの結果によれば、ＯＲＦ０６５７ｎの産生を酵母中でスケールアップできることが確認される。
【実施例１６】
【０２２４】
酵母中で産生されたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの防御免疫
酵母によって産生されるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの防御免疫能力は、配列番号３のポリペプチドを酵母中で発現させることによって評価された。Ｅコリ発現完全長ＯＲＦ０６５７ｎＣ（配列番号２８）、ＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシル末端Ｈｉｓタグを含む配列番号４）、ＯＲＦ０６５７ｎＩ（カルボキシル末端Ｈｉｓタグを含む配列番号５）及びアジュバント単体を対照として使用した。
【０２２５】
配列番号３のＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドが酵母から得られ、動物モデルにおいて防御免疫をもたらすために使用された。配列番号３のポリペプチドは実施例１１に記載されたように発現された。
【０２２６】
ＯＲＦ６５７ｎＨ（配列番号３）を発現する凍結組換えＳ．セレビシエ細胞を０．２Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０中に５ｍＬ／グラムウェット細胞重量でプロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡなし）と一緒に再懸濁した。溶解物は、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｓ）を１４，０００ｐｓｉ（９６ＭＰａ）で４回通過させることによって調製された。溶解物は、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分、２から８℃）、続いて粗ろ過（ガラス繊維プレフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び精密ろ過（ｆｉｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（０．２μｍ酢酸セルロース、Ｗｈａｔｍａｎ）によって浄化された。
【０２２７】
浄化された溶解物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ、移動相：０．２Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０）によって分画された。画分は、クーマシー検出によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び（完全長ＯＲＦ０６５７ｎ、配列番号２８に対する）ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質特異的抗血清を用いたウエスタンブロット法によって分析された  産物を含む画分はプールされた。
【０２２８】
ＳＥＣ生成物は、無菌状態下の０．２μｍ酢酸セルロースを通して無菌ろ過された。無菌ろ過生成物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、≧又はそれよりも高く、９４％であった。無菌ろ過生成物は０．２ｍｇ／ｍｌでＡＨＰ及びチメロサールと一緒に処方された。
【０２２９】
酵母中で産生されたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの防御免疫能力を図１０に示す。酵母発現ＯＲＦ０６５７ｎＨ（配列番号３）は、Ｅ．コリ発現ポリペプチドと同じ防御免疫をもたらした。
【実施例１７】
【０２３０】
非ヒト霊長類における既往反応
３群のアカゲザルが、ＡＨＰと一緒に又はＡＨＰなしで処方された酵母産生ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド（ＯＲＦ０６５７ｎＨ、配列番号３）又はＥコリ発現ＯＲＦ０６５７関連ポリペプチド（完全長ＯＲＦ０６５７ｎ、配列番号２８）を用いて免疫された。ワクチン群のサルは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド５０ｍｃｇを筋肉内経路を介して投与された。
【０２３１】
図１２に示されるように、ワクチン群の動物は、単回投与後、既存の適度な力価の約３から６倍の相乗平均力価で応答し、既往反応が示唆された。これに対し、対照群動物の相乗平均力価は（抗体アッセイのばらつきの範囲内で）一定であった。第２のワクチン投与後、ワクチン群及び対照群における１力価投与後相乗平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ  ｐｏｓｔ−ｄｏｓｅ  ｏｎｅ  ｔｉｔｅｒｓ）は、投与後力価（ｐｏｓｔ−ｄｏｓｅ  ｔｉｔｅｒｓ）とほとんど変わらなかった。
【０２３２】
わずか１用量後の抗体応答の発生を観測するために、酵母発現ＯＲＦ０６５７Ｈ領域（配列番号３）投与群を３ヶ月（試験された最終時点）追跡した。抗体価は９日後上昇し続け、ワクチン２又は３用量後でも越えられないレベルに達した。
【０２３３】
これらの観察によれば、ワクチン１用量は、おそらくはＳ．アウレウスへの環境暴露による免疫系の自然の初回抗原刺激（ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ）の後に、かなりの持続的な抗体応答を誘導することができる。ヒトにおける既存の抗体価の調査によれば、すべての試験試料においてＯＲＦ０６５７ｎに対する適度の抗体価が存在した（データ示さず）。
【０２３４】
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内にある。いくつかの実施態様を示し説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な改変態様を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、動物における防御についてスクリーニングされたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド領域及びいくつかの異なるＯＲＦ０６５７ｎ配列の略図である。図１Ａは、（塗り潰された矩形で示された）試験され防御性であることが判明したポリペプチド、（白抜きの矩形で示された）試験され防御性でないことが判明したポリペプチド、及び試験されなかったポリペプチド（線影の付いた矩形）の略図である。図１Ｂは、図１Ａで参照された完全長配列（配列番号２）である。図１Ｃは配列番号２８である。配列番号２８はカルボキシル「Ｈｉｓタグ」（ＬＥＨＨＨＨＨＨ；配列番号６４）を含む。カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号２８は、本明細書では「ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ」とも称される。図１ＤはＯＲＦ０６５７ｎＩ＋配列である。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、動物における防御についてスクリーニングされたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド領域及びいくつかの異なるＯＲＦ０６５７ｎ配列の略図である。図１Ａは、（塗り潰された矩形で示された）試験され防御性であることが判明したポリペプチド、（白抜きの矩形で示された）試験され防御性でないことが判明したポリペプチド、及び試験されなかったポリペプチド（線影の付いた矩形）の略図である。図１Ｂは、図１Ａで参照された完全長配列（配列番号２）である。図１Ｃは配列番号２８である。配列番号２８はカルボキシル「Ｈｉｓタグ」（ＬＥＨＨＨＨＨＨ；配列番号６４）を含む。カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号２８は、本明細書では「ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ」とも称される。図１ＤはＯＲＦ０６５７ｎＩ＋配列である。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、動物における防御についてスクリーニングされたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド領域及びいくつかの異なるＯＲＦ０６５７ｎ配列の略図である。図１Ａは、（塗り潰された矩形で示された）試験され防御性であることが判明したポリペプチド、（白抜きの矩形で示された）試験され防御性でないことが判明したポリペプチド、及び試験されなかったポリペプチド（線影の付いた矩形）の略図である。図１Ｂは、図１Ａで参照された完全長配列（配列番号２）である。図１Ｃは配列番号２８である。配列番号２８はカルボキシル「Ｈｉｓタグ」（ＬＥＨＨＨＨＨＨ；配列番号６４）を含む。カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号２８は、本明細書では「ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ」とも称される。図１ＤはＯＲＦ０６５７ｎＩ＋配列である。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、動物における防御についてスクリーニングされたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド領域及びいくつかの異なるＯＲＦ０６５７ｎ配列の略図である。図１Ａは、（塗り潰された矩形で示された）試験され防御性であることが判明したポリペプチド、（白抜きの矩形で示された）試験され防御性でないことが判明したポリペプチド、及び試験されなかったポリペプチド（線影の付いた矩形）の略図である。図１Ｂは、図１Ａで参照された完全長配列（配列番号２）である。図１Ｃは配列番号２８である。配列番号２８はカルボキシル「Ｈｉｓタグ」（ＬＥＨＨＨＨＨＨ；配列番号６４）を含む。カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号２８は、本明細書では「ＨｉｓタグＯＲＦ０６５７ｎ」とも称される。図１ＤはＯＲＦ０６５７ｎＩ＋配列である。
【図２Ａ】図２Ａから２Ｅは、異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連配列の配列をＯＲＦ０６５７ｎＨ領域にわたって比較した図である。配列番号を図中の「ＩＤ」によって示す。
【図２Ｂ】図２Ａから２Ｅは、異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連配列の配列をＯＲＦ０６５７ｎＨ領域にわたって比較した図である。配列番号を図中の「ＩＤ」によって示す。
【図２Ｃ】図２Ａから２Ｅは、異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連配列の配列をＯＲＦ０６５７ｎＨ領域にわたって比較した図である。配列番号を図中の「ＩＤ」によって示す。
【図２Ｄ】図２Ａから２Ｅは、異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連配列の配列をＯＲＦ０６５７ｎＨ領域にわたって比較した図である。配列番号を図中の「ＩＤ」によって示す。
【図２Ｅ】図２Ａから２Ｅは、異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連配列の配列をＯＲＦ０６５７ｎＨ領域にわたって比較した図である。配列番号を図中の「ＩＤ」によって示す。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、完全長配列、ＯＦＲ０６５７ｎＨ領域及びＯＲＦ０６５７ｎＩ領域を与えるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの、Ｓ．アウレウスＢｅｃｋｅｒに対する防御免疫をもたらす能力を示すグラフである。これらのポリペプチドは、アルミニウムヒドロキシホスフェートアジュバント（ＡＨＰ）と一緒に使用された。図３Ａは、配列番号２８の結果である。図３Ｂは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４の結果である。図３Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号５の結果である。「カルボキシルＨｉｓタグ」という表記は、Ｈｉｓタグ基ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号６４）がカルボキシ末端に存在することを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、完全長配列、ＯＦＲ０６５７ｎＨ領域及びＯＲＦ０６５７ｎＩ領域を与えるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの、Ｓ．アウレウスＢｅｃｋｅｒに対する防御免疫をもたらす能力を示すグラフである。これらのポリペプチドは、アルミニウムヒドロキシホスフェートアジュバント（ＡＨＰ）と一緒に使用された。図３Ａは、配列番号２８の結果である。図３Ｂは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４の結果である。図３Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号５の結果である。「カルボキシルＨｉｓタグ」という表記は、Ｈｉｓタグ基ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号６４）がカルボキシ末端に存在することを示す。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、完全長配列、ＯＦＲ０６５７ｎＨ領域及びＯＲＦ０６５７ｎＩ領域を与えるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの、Ｓ．アウレウスＢｅｃｋｅｒに対する防御免疫をもたらす能力を示すグラフである。これらのポリペプチドは、アルミニウムヒドロキシホスフェートアジュバント（ＡＨＰ）と一緒に使用された。図３Ａは、配列番号２８の結果である。図３Ｂは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４の結果である。図３Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号５の結果である。「カルボキシルＨｉｓタグ」という表記は、Ｈｉｓタグ基ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号６４）がカルボキシ末端に存在することを示す。
【図４Ａ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｂ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｃ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｄ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｅ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｆ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｇ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図４Ｈ】図４Ａから４Ｈは、様々なＳ．アウレウス暴露に対して防御免疫をもたらすＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの能力を示すグラフである。配列番号２８のポリペプチドが免疫原として使用された。図４Ａは、攻撃株ＣＬ−１０（２．２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｂは、攻撃株ＣＬ−１０（２．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｃは、攻撃株ＣＬ−１３（２．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｄは、攻撃株ＣＬ−１３（２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｅは、攻撃株ＣＬ−３０（３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｆは、攻撃株ＣＬ−３０（３．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。図４Ｇは、攻撃株ＣＬ−１８（１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを用いた結果である。図４Ｈは、攻撃株ＣＬ−２１（１．６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を用いた結果である。
【図５Ａ】図５Ａ及び５Ｂは、Ｓ．セレビシエ発現プラスミドのプラスミド地図である。図５ＡはベクターｐＧＡＬ１１０のプラスミド地図である。図５Ｂは、ｐＧＡＬ１１０のＧＡＬ１プロモーターの制御下でクローン化された酵母コドン最適化配列を示すｐｉＵＣ−１のプラスミド地図である。
【図５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、Ｓ．セレビシエ発現プラスミドのプラスミド地図である。図５ＡはベクターｐＧＡＬ１１０のプラスミド地図である。図５Ｂは、ｐＧＡＬ１１０のＧＡＬ１プロモーターの制御下でクローン化された酵母コドン最適化配列を示すｐｉＵＣ−１のプラスミド地図である。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、配列番号２８のアミノ酸１から６４６を有する完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）の細胞内発現を示すウエスタンブロットである。レーン１、分子サイズ標準；レーン２、精製Ｅ．コリによって産生された組換え完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号２８）、１００ｎｇ；レーン３から６は酵母細胞溶解物２０μｇを含む；レーン３及び４、ベクターｐＧＡＬ１１０のみを含む１２６０（図６Ａ）及び１３０９（図６Ｂ）の形質転換体の２つ組の発酵から得られた細胞溶解物；レーン５及び６、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）を発現するｐＲＵｎｋＣ−ｐＧＡＬ１１０を含む１２６０（図６Ａ）及び１３０９（図６Ｂ）の形質転換体の２つ組の発酵から得られた細胞溶解物。
【図６Ｂ】図６Ａ及び６Ｂは、配列番号２８のアミノ酸１から６４６を有する完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）の細胞内発現を示すウエスタンブロットである。レーン１、分子サイズ標準；レーン２、精製Ｅ．コリによって産生された組換え完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号２８）、１００ｎｇ；レーン３から６は酵母細胞溶解物２０μｇを含む；レーン３及び４、ベクターｐＧＡＬ１１０のみを含む１２６０（図６Ａ）及び１３０９（図６Ｂ）の形質転換体の２つ組の発酵から得られた細胞溶解物；レーン５及び６、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）を発現するｐＲＵｎｋＣ−ｐＧＡＬ１１０を含む１２６０（図６Ａ）及び１３０９（図６Ｂ）の形質転換体の２つ組の発酵から得られた細胞溶解物。
【図７Ａ】図７Ａ及び７Ｂは、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色及びウエスタンブロットであり、Ｓ．セレビシエにおける配列番号３をコードする核酸からの細胞内発現を示している。レーン１、パネルＡ、ＢＳＡ、１．２５μｇ；パネルＢ、精製Ｅ．コリ組換え完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）、１００ｎｇ；レーン２、Ｅ．コリにおけるＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）産生株からの細胞溶解物；パネルＡ、１．２５μｇ、パネルＢ、０．５μｇ。レーン３から７、パネルＡ及びＢは、それぞれ酵母細胞溶解物１．２５及び０．５μｇを含む：レーン３、ベクターｐＧＡＬ１１０のみを含む形質転換体；レーン４、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）を含む形質転換体；レーン５、６及び７、成熟ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）を発現するｐｉＵＣ−Ｓ（−）を含む形質転換体１−１；レーン７は、凍結され続いて解凍された（形質転換体１−１の）細胞溶解物を含む。レーン８は分子サイズ標準を含む。
【図７Ｂ】図７Ａ及び７Ｂは、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色及びウエスタンブロットであり、Ｓ．セレビシエにおける配列番号３をコードする核酸からの細胞内発現を示している。レーン１、パネルＡ、ＢＳＡ、１．２５μｇ；パネルＢ、精製Ｅ．コリ組換え完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号２８）、１００ｎｇ；レーン２、Ｅ．コリにおけるＯＲＦ０６５７ｎＨ（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）産生株からの細胞溶解物；パネルＡ、１．２５μｇ、パネルＢ、０．５μｇ。レーン３から７、パネルＡ及びＢは、それぞれ酵母細胞溶解物１．２５及び０．５μｇを含む：レーン３、ベクターｐＧＡＬ１１０のみを含む形質転換体；レーン４、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ（カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８）を含む形質転換体；レーン５、６及び７、成熟ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）を発現するｐｉＵＣ−Ｓ（−）を含む形質転換体１−１；レーン７は、凍結され続いて解凍された（形質転換体１−１の）細胞溶解物を含む。レーン８は分子サイズ標準を含む。
【図８Ａ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｂ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｃ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｄ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｅ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｆ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｇ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｈ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｉ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｊ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｋ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｌ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｍ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｎ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｏ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｐ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｑ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｒ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｓ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｔ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図８Ｕ】図８Ａから８Ｕは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする異なる核酸配列の例を示す図である。図８Ａは、配列番号２＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号２９）である。図８Ｂは、配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグをコードする核酸配列（配列番号３０）である。図８Ｃは、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３１）である。図８Ｄは、配列番号３をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３２）である。図８Ｅは、配列番号１をコードする酵母最適化核酸（配列番号３３）配列である。図８Ｆから８Ｍは、アミノ末端メチオニンを含む配列番号７をコードする酵母最適化核酸配列（配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）である。図８Ｎから８Ｕは、配列番号１７又は配列番号２０に基づく異なるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドをコードする酵母最適化核酸配列（配列番号４６から５３）である。
【図９】Ｓ．セレビシエにおけるＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの細胞内発現を比較したウエスタンブロットである。レーン１及び１８、ＭＷサイズ標準。レーン２及び３、Ｅ．コリ中で産生される精製ＯＲＦ０６５７ｎＨ（配列番号４＋カルボキシルＨｉｓタグ）のそれぞれ５０及び１００ｎｇ。レーン５は、Ｓ．セレビシエベクター対照形質転換体に由来する細胞溶解物のタンパク質５００ｎｇを含む。レーン７、８及び９は、カルボキシルＨｉｓタグを含まない配列番号２８を生成するＳ．セレビシエ形質転換体由来の細胞溶解物タンパク質１．０、２．０及び４．０μｇである。レーン１１及び１２は、ＯＲＦ０６５７ｎＨ（配列番号３）を生成するＳ．セレビシエ形質転換体に由来する細胞溶解物のタンパク質のそれぞれ５０及び１００ｎｇを含む。レーン１４及び１５は、ＯＲＦ０６５７ｎＧ（配列番号４４）を生成するＳ．セレビシエ形質転換体に由来する細胞溶解物のタンパク質のそれぞれ２５０及び５００ｎｇを含む。レーン１７は、ＯＲＦ０６５７ｎＧ（配列番号４４＋カルボキシルＨｉｓタグ）Ｅ．コリ産生株由来の細胞溶解物タンパク質２５０ｎｇを含む。レーン４、６、１０、１３及び１６は空である。
【図１０】Ｅ．コリ及び酵母において産生されたＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチドの防御免疫データを示すグラフである。「ＯＦＲ０６５７ｎＨ（Ｅ．コリ）」はカルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４に対応する。「ＯＦＲ０６５７ｎＩ（Ｅ．コリ）」はカルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号５に対応する。「ＯＦＲ０６５７ｎＣ（Ｅ．コリ）」は配列番号２８に対応する。「ＯＦＲ０６５７ｎＨ（Ｅ．コリ）」は配列番号３に対応する。
【図１１】Ｓ．セレビシエにおけるＯＲＦ０６５７ｎＩの細胞内発現の例示的なウエスタンブロットである。レーン１及び２５、ＭＷサイズ標準。レーン２、３及び２４：Ｅ．コリ中で産生される精製ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（カルボキシルＨｉｓタグを含む配列番号４）のそれぞれ２５、５０及び１００ｎｇ。レーン４から２３は、酵母形質転換体由来のタンパク質細胞溶解物を含む。レーン１３から２１は、レーン４から１２の溶解物と同じ発酵試料から調製された２つ組の細胞溶解物である。レーン４及び１３は、ｐＧＡＬ１１０を含むベクター対照形質転換体由来のタンパク質２００ｎｇを含む。レーン５及び１４は、ＯＲＦ０６５７ｎＨ領域（配列番号３）を生成する形質転換体１−１由来のタンパク質１００ｎｇを含む。レーン６及び１５は、形質転換体１−１由来のタンパク質２００ｎｇを含む。レーン７及び１６は形質転換体Ｉ１由来のタンパク質１００ｎｇを含み、レーン８及び１７は形質転換体Ｉ１由来のタンパク質２００ｎｇを含む。レーン９及び１８は形質転換体Ｉ２由来のタンパク質１００ｎｇを含み、レーン１０及び１９は形質転換体Ｉ２由来のタンパク質２００ｎｇを含む。レーン１１及び２０は形質転換体Ｉ３由来のタンパク質１００ｎｇを含み、レーン１２及び２１は形質転換体Ｉ３由来のタンパク質２００ｎｇを含む。レーン２２及び２３は、形質転換体１−１の前の発酵からあらかじめ調製されたタンパク質細胞溶解物１００及び２００ｎｇを含む。
【図１２】アカゲザル免疫化データを示す図である。アカゲザルは、ＡＨＰと一緒に又はＡＨＰなしで処方された、酵母産生ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド（ＯＲＦ０６５７ｎＨ、配列番号３）又はＥコリ発現ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド（完全長ＯＲＦ０６５７ｎＣ、配列番号２８）によって免疫された。ワクチン群のサルは、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド５０ｍｃｇを筋肉内経路によって投与された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
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【図８Ｐ】
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【図８Ｑ】
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【図８Ｒ】
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【図８Ｓ】
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【図８Ｔ】
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【図８Ｕ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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