(57)【要約】  本出願は、ＴＧＦβのII型受容体のｓｉＲＮＡに基づいたサイレンシングを対象とする。この受容体を標的とするｓｉＲＮＡは、受容体タンパク質および転写を破棄し、ＴＧＦβフィブロネクチンの集合および細胞移動などのＴＧＦβ介在過程も阻害し、本発明の分子がマトリクス沈着を低減させるのに有効であった。これらの発見は、ＳｉＲＮＡがＴＧＦβII型受容体レベルを調整し、創傷反応を調節するために、in vitroおよびin vivo両方で送達に成功し得ることを示している。本発明の発見を利用する方法および組成物は、目から全身の他の器官および組織の障害の処置に及ぶ多岐にわたる適用があるだろう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβII型受容体の発現を低減させるｓｉＲＮＡ分子であって、１９〜２５塩基対の長さである前記分子。
【請求項２】
４０％〜５０％の範囲のグアニン−シトシン含量を有し、４つの同一の連続した塩基を有しない、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号５の核酸配列、配列番号６の核酸配列、配列番号７の核酸配列、配列番号８の核酸配列、配列番号９の核酸配列、配列番号１０の核酸配列、配列番号１１の核酸配列、配列番号１２の核酸配列、配列番号１４の核酸配列、配列番号１５の核酸配列、配列番号１７の核酸配列、配列番号１８の核酸配列、配列番号２０の核酸配列、配列番号２１の核酸配列、配列番号２３の核酸配列、配列番号２４の核酸配列、配列番号２６の核酸配列、配列番号２７の核酸配列、配列番号２９の核酸配列、配列番号３０の核酸配列、配列番号３２の核酸配列、配列番号３３の核酸配列、配列番号３５の核酸配列、配列番号３６の核酸配列、配列番号３８の核酸配列、配列番号３９の核酸配列、配列番号４１の核酸配列、配列番号４２の核酸配列、配列番号４４の核酸配列、配列番号４５の核酸配列、配列番号４７の核酸配列、配列番号４８の核酸配列、配列番号５０の核酸配列、配列番号５１の核酸配列、配列番号５３の核酸配列、配列番号５４の核酸配列、配列番号５６の核酸配列、配列番号５７の核酸配列、配列番号５８の核酸配列、配列番号５９の核酸配列、配列番号６１の核酸配列、配列番号６２の核酸配列、配列番号６４の核酸配列、配列番号６５の核酸配列、配列番号６７の核酸配列、配列番号６８の核酸配列、配列番号７０の核酸配列、配列番号７１の核酸配列、配列番号７３の核酸配列、配列番号７４の核酸配列、配列番号７６の核酸配列、配列番号７７の核酸配列、配列番号７９の核酸配列、配列番号８０の核酸配列、配列番号８１の核酸配列配列番号８２の核酸配列、配列番号８４の核酸配列、配列番号８５の核酸配列、配列番号８７の核酸配列、配列番号８８の核酸配列、配列番号９０の核酸配列、配列番号９１の核酸配列、配列番号９３の核酸配列、配列番号９４の核酸配列、配列番号９６の核酸配列、配列番号９７の核酸配列、配列番号９９の核酸配列、配列番号１００の核酸配列、配列番号１０１の核酸配列、配列番号１０２の核酸配列、配列番号１０４の核酸配列、配列番号１０５の核酸配列、配列番号１０７の核酸配列、配列番号１０８の核酸配列、配列番号１１０の核酸配列、配列番号１１１の核酸配列、配列番号１１３の核酸配列、配列番号１１４の核酸配列、配列番号１１６の核酸配列、配列番号１１７の核酸配列、配列番号１１９の核酸配列、配列番号１２０の核酸配列、配列番号１２２の核酸配列、配列番号１２３の核酸配列、配列番号１２５の核酸配列、配列番号１２６の核酸配列、配列番号１２８の核酸配列、配列番号１２９の核酸配列、配列番号１３１の核酸配列、配列番号１３２の核酸配列、配列番号１３４の核酸配列、配列番号１３５の核酸配列、配列番号１３７の核酸配列、配列番号１３８の核酸配列、配列番号１４０の核酸配列、配列番号１４１の核酸配列、配列番号１４３の核酸配列、配列番号１４４の核酸配列、配列番号１４６の核酸配列、配列番号１４７の核酸配列、配列番号１４９の核酸配列、配列番号１５０の核酸配列、配列番号１５２の核酸配列、配列番号１５３の核酸配列、配列番号１５５の核酸配列、および配列番号１５６の核酸配列からなる群から選択された核酸配列を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ分子および薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項５】
付加的な創傷治癒剤をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
治療効果のある量の請求項３または４に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における創傷治癒を促進する方法。
【請求項７】
治療効果のある量の請求項４または５に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における線維症を阻害する方法。
【請求項８】
治療効果のある量の請求項４または５に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における血管形成を阻害する方法。
【請求項９】
必要としている哺乳動物が、緑内障、黄斑変性、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、角膜の瘢痕または結膜の瘢痕を患っている、請求項６、７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物における緑内障を予防する方法であり、前記哺乳動物に、ＴＧＦβII型受容体の発現を低減させるｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を投与することを含み、該分子は、１９〜２５塩基対の長さである、前記方法。
【請求項１１】
哺乳動物における再狭窄を予防する方法であり、前記哺乳動物に、ＴＧＦβII型受容体の発現を低減させるｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を投与することを含み、該分子は、１９〜２５塩基対の長さである、前記方法。
【請求項１２】
哺乳動物における瘢痕を予防するまたは処置する方法であり、前記哺乳動物に、ＴＧＦβII型受容体の発現を低減させるｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を投与することを含み、該分子は、１９〜２５塩基対の長さである、前記方法。
【請求項１３】
瘢痕が冠状血管瘢痕である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トランスフォーミング成長因子ベータII型受容体（ＴＧＦβＲII）の発現をサイレンシングさせるための方法および組成物を対象とする。
さらに特に本発明は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を使用してかかる発現を低減させるための方法および組成物について説明する。
【０００２】
発明の背景
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、一群の構造的に関係がある多機能性サイトカインを含む。それらは、広範にわたる生物学的作用を有し、細胞増殖、分化、アポトーシス、線維成長および血管形成を含む（Massague et al., Cancer Surv. 12, 81-103, (1992), Piek et al., FASEB J. 13, 2105-2124, (1999), Border & Noble N. Engl. J. Med. 331, 1286-1292 (1994); Govinda and Bhoola, Pharmacol. Ther. 98: 257-265 (2003); Cusiefen et al., Cornea 19: 526-533; Sakimoto et al., Gene Therapy 7: 1915-1924 (2000)）。ＴＧＦβは典型的に、生物学的に潜在した形で分泌される。それは、タンパク分解活性および潜在サブユニットタンパク質の解離の複合過程を通じて活性化される（Massague, Annu. Rev. Biochem. 67, 753-791 (1998)）。
【０００３】
ＴＧＦβの作用機序は、ＴＧＦβ受容体、I、IIおよびIII型として知られている受容体への結合により調節されている。受容体IおよびIIは、５５および７０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であり、シグナル伝達において重要であることが示されている。これらの受容体のためのＴＧＦβリガンド結合部位は、細胞外である。シグナリングが達成されると考えられる機構は、Ｓｍａｄｓとして知られる転写因子のリン酸化反応の活性化を介する（Massague & Wotton, EMBO J. 19, 1745-1754 (1999)）。
【０００４】
ＴＧＦβは、損傷への線維形成反応の重要な要素として浮上し、目、肝臓および皮膚などの組織における多くの異なる種類の創傷治癒中に上方に調節される（Border & Noble, N. Engl. J. Med. 331, 1286-1292 (1994), Connor et al., J. Clin. Invest. 83, 1661-1666 (1989), McCormick et al., J. Immunol. 163, 5693-5699 (1999), Shah et al., J Cell Sci. 108, 985-1002 (1995)）。目において、３種のヒトのイソ型（ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）のうち、ＴＧＦβ２が優勢なものである（Lutty et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 477-487 (1993), Pasquale et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 23-30 (1993)）。ＴＧＦβは、増殖性硝子体網膜症（Kon et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 705-712 (1999)）、白内障形成（Hales et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 1709-1713 (1989)）、角膜混濁（Chen et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 4108-4116 (2000)）および結膜創傷治癒（Cordeiro, Clin. Sci. 104, 181-187 (2003)）、特に主要な失明病である、緑内障の濾過手術後に生じるものを含む、いくつかの瘢痕形成過程に関与する。
【０００５】
加えて、ＴＧＦβは結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）と併せて、血管形成において重要な役割を担う（Abreu et al., Nature Cell Biol. 4: 599-604 (2002)）。さらに、最近の研究では、ＴＧＦは実は、原発性開放隅角緑内障の発症に関わるかもしれないことが示された（Inatani et al., Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 239 (2): 109-13, 2001; Ochiai et al., Jap. J. Ophthalmol. 46 (3): 249-53, 2002; Gattanka et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (1): 153-8, 2004)。
【０００６】
緑内障濾過手術において、創傷部位での過度の術後瘢痕は、手術の成功率を著しく低減させる（Migdal et al, Ophthalmology 101, 1651-1656 (1994), Addicks et al., Ophthalmol. 101, 795-798 (1983)）。マイトマイシン−Ｃおよび５−フルオロウラシルなどの抗瘢痕(anti-scarring)剤は、手術後の瘢痕を防止し、緑内障手術結果の改善を助け得る（Khaw et al., Arch. Ophthalmol. 111, 263-267 (1993), Cordeiro et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 1975-1982 (1999)）にもかかわらず、それらは、広範囲にわたる線維芽細胞の死をもたらすことによるものであり、重症なおよび失明の可能性がある合併症に関係する（Crowston et al. 449-454 (1998), Stamper et al., Am. J. Ophthalmol. 114, 544-553 (1992)）。創傷修復過程におけるＴＧＦβの役割を踏まえて、ＴＧＦβに対する抗体（Cordeior et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2225-2234 (1999), Mead et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3394-3401 (2003)）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（Cordeior、et al., Gene Therapy 10, 59-70 (2003)）などの代替戦略（Codeiro, Prog Retin. Eye Res. 21, 75-89 (2002)）を、ＴＧＦβ作用を阻止するために使用してきた。
【０００７】
しかしながら、これらの技術は、多くの緑内障において生じる衰弱性乱切(debilitating scarification)の処置のためには依然不十分である。例えば、アンチセンス治療の使用は、様々な障害を処置するのに効果的ではない。なぜなら、アンチセンス分子は、患者内のインターフェロン反応を誘導するからである。抗体ベースの治療の使用は、ある抗原の特定のエピトープに対する特異抗体を生み出す必要性により減る。したがって、過剰発現またはさらにＴＧＦβII型受容体の存在からもらたされる障害に介入する新しい方法を、依然確認する必要がある。
【０００８】
発明の概要
本発明は、哺乳動物において、ＴＧＦβII型受容体（ＴＧＦβＲII）レベルを調整し、創傷反応および血管形成を調節するための、in vitroおよびin vivo両方でのｓｉＲＮＡの使用を対象とする。本発明のＲＮＡ干渉に基づいた方法は、目から全身の他の器官および組織に及ぶ多岐にわたる適用がある。
【０００９】
ある態様において、本発明は、ＴＧＦβのII型受容体を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物における創傷治癒を促進するための、線維症を低減させるためのおよび／または血管形成を低減させるための方法および組成物を対象とする。
【００１０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、治療効果のある量を、創傷部位に局所的に送達してもよく、または代わりに全身的に投与してもよい。ある態様において、治療上効果的なｓｉＲＮＡ組成物を、単独で投与してもよく、または代わりに、ｓｉＲＮＡ分子ベースの治療組成物を、他の創傷治癒組成物を含む治療規制の一部として投与してもよい。
【００１１】
特に好ましい態様において、本発明のｓｉＲＮＡベースの治療組成物により処置される障害は、緑内障である。しかしながら、本発明のｓｉＲＮＡ組成物を、ＴＧＦβII型受容体を通したシグナリングが関与するいかなる障害の処置にも使用してもよいことを理解すべきである。緑内障濾過手術に加えて、本発明の組成物を、いずれの他の眼科手術の瘢痕の低減を伴う治癒を促進するために使用してもよく、水晶体交換ありまたはなしの水晶体摘出；ウィルス感染を処置するための角膜移植、または全層角膜移植（ＰＫＰ）；および放射状角膜切除術および屈折を補正するための他の種類の手術を含んでもよいが、それらに限定されない。また、本発明の組成物および方法は、例えば、網膜剥離および裂傷、網膜血管障害、網膜新血管形成、糖尿病性網膜症などの網膜創傷、角膜上皮創傷、角膜新血管形成、角膜潰瘍、黄斑円孔、黄斑変性、後発白内障、角膜疾患、ドライアイ／シェーグレン症候群およびブドウ膜炎などの角膜創傷などの眼障害の処置のために使用してもよい。これらの障害は、目に生じる創傷治癒障害、増殖性障害、抗変性(anti-degenerative)障害および抗血管形成(anti-angiogenesis)障害を含む。
【００１２】
上記方法のそれぞれにおいて、方法は、哺乳動物にある量のｓｉＲＮＡ組成物を、視覚を安定させるまたは改善するために効果的な量で投与することを伴う。結合組織または線維組織の増加により特徴付けられる網膜障害もまた、目から硝子体液を除去する；網膜上膜存在する場合にそれを目から除去する；および処置を必要とする網膜の部分のすぐ上に治療組成物を配するために、カニューレにより本発明のｓｉＲＮＡ組成物を含む組成物を投与する、というステップを含む方法を使用して処置してもよい。
【００１３】
ある他の態様において、ｓｉＲＮ組成物を、眼内注射によりまたは角膜への適用により投与してもよい。かかる角膜への適用を、点眼薬または盲管(cul de sac)に配される持続放出カプセルを使用することにより達成してもよい。
【００１４】
別の態様において、眼の新血管形成について哺乳動物を処置する方法を提供し、前記方法は、哺乳動物に効果的な量の本発明のｓｉＲＮＡ組成物を投与することを含む。
【００１５】
本発明のｓｉＲＮＡに基づいた方法を使用して処置してもよい他の眼以外の(non-ocular)障害は、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、増殖性硝子体網膜症、肝硬変、胆管線維症，および骨髄線維症、放射線照射後の(post-radiation)線維症からなる群から選択されたものなどの線維増殖性障害を含むが、それらに限定されない。関節リウマチ、強皮症、骨髄線維症、ならびに肝線維症および肺線維症などの結合組織障害もまた、処置してもよい。トリパノソーマ感染などのＴ細胞反応の欠損またはヒト免疫抑制ウィルス、ヒトＴ細胞白血球ウィルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルスおよび肝炎などのウィルス感染を伴う障害を、処置してもよい。ｓｉＲＮＡ方法を、前立腺癌、卵巣癌、形質細胞腫および膠芽細胞腫の患者を含む、癌患者の処置のために使用してもよい。ｓｉＲＮＡを、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、多発性筋炎、皮膚筋炎および全身性エリテマトーデスなどの膠原血管病患者の処置のために使用してもよい。
【００１６】
加えて、ｓｉＲＮＡに基づいた方法を、眼外傷、障害または手術により誘導されたもの以外の創傷の処置のために使用してもよい。外科的切開は一般的に、外傷誘導裂傷、放射線治療による線維症および腹膜に関する創傷を、処置してもよい。血管の再狭窄により生じる瘢痕、肥厚性瘢痕およびケロイドもまた、ｓｉＲＮＡ方法により処置してもよい。
【００１７】
特に好ましいｓｉＲＮＡ分子は、２１〜２３塩基を含む。ＴＧＦβＲII  ｓｉＲＮＡについての４つの特異配列は、ヒトＴＧＦβＲII配列由来であり(Genbank Accession Number: M85079)、ＮＫ１、ＮＫ２、ＳＳ１およびＳＳ２と指定された。標的配列（５’から３’）は、カッコ内に示したヒトＴＧＦβII受容体配列（M85079から）における第一のヌクレオチドの位置により以下のように設定する。対応する商業的に合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖もまた、以下に設定する：
【００１８】
【表１】
2007502284.tif 000002
【００１９】
当業者が、Genbank Accession Number:M85079でヒトＴＧＦβＲII遺伝子配列の位置５２９、１１１３、１２５３および９４８を囲むさらなるｓｉＲＮＡ分子を生成することができるであろうことを理解すべきである。本発明のｓｉＲＮＡ分子を、当業者に既知の方法を使用して、医薬処方に都合よく処方してもよいことを理解すべきである。かかる医薬組成物はまた、処置中の特定の障害の治療的介入のために、他のｓｉＲＮＡに基づかない治療剤を含んでもよい。他の創傷治癒組成物は、抗癌薬剤であるマイトマイシンおよび５−フルオロウラシル、agaricus bisporusのレクチン、亜鉛−デスフェリオキサミンまたはガリウム−デスフェリオキサミンなどの金属錯体(metallocomplexes)、ペントキシフィリンなどのメチルキサンチン誘導体、GE Amidon Oxydeなどのコラーゲンベースの封止剤、線維芽細胞成長因子および結合組織成長因子を阻害する剤、およびイロマスタット(ilomastat)などのマトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含む。他の血管新生阻害(anti-angiogenic)剤は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および血管新生阻害ステロイドの阻害剤を含む。ＶＥＧＦの阻害剤は、ＶＥＧＦまたはその受容体を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００２０】
本発明の他の特性および利点が、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明および特異的な例は、本発明の好ましい態様を示す一方、例としてのみ挙げられているものであることを理解すべきである。なぜなら、本発明の精神と範囲の範囲内での様々な変化および変更は、この詳細な説明から当業者にとって明らかになるからである。
【００２１】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の側面をさらに説明するために含まれる。本発明は、図面を本明細書中に表された特異的な態様の詳細な説明と組み合わせて参照にすることにより、より良く理解されるだろう。
【００２２】
図１。ｓｉＲＮＡによるＴＧＦβII型受容体の発現の阻害。無処置の（ｌ行目）、あるいはスクランブル(scrambled)ｓｉＲＮＡ（２行目）または１００ｎＭのＮＫ１（３および４行目）により処置したヒト角膜線維芽細胞の免疫蛍光分析を、ＴＧＦβＲII受容体の発現を視覚化するために行った（左の列）。ＤＡＰＩ色素(stain)を使用する核の染色を、右の列に示す。ＮＫ１  ｓｉＲＮＡで４８時間（３行目、左の列）および７２時間（４行目、左の列）処置した細胞は、対照細胞（ｌおよび２行目、左の列）と比較して、染色の大幅な低減が見られる。
【００２３】
図２。角膜線維芽細胞内のｓｉＲＮＡによる、ＴＧＦβI  II型受容体タンパク質の発現の抑制。異なる濃度のＴＧＦβＲII受容体ｓｉＲＮＡまたは対照、スクランブルｓｉＲＮＡにより１６時間（上のパネル）または４８時間（下のパネル）処置したヒト角膜線維芽細胞からの溶解物を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＴＧＦβＲII受容体抗体により免疫ブロットした。レーン１は、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ試薬のみと共に（ｓｉＲＮＡなし）インキュベートした細胞からの溶解物を含有する。レーン２および８は、１００ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡで処置した細胞からの溶解物を含有する。レーン３、４、９および１０は、最終濃度５０ｎＭ（レーン３および９）または１００ｎＭ（レーン４および１０）で、ＮＫ１  ｓｉＲＮＡで処置した細胞の溶解物を含有する。
レーン５、６、１１および１２は、５０ｎＭ（レーン５および１１）または１００ｎＭ（レーン６および１２）で、ＳＳ１  ｓｉＲＮＡで処置した細胞の溶解物を含有する。レーン７において、ＴＧＦβＲII受容体抗体を、正常な細胞溶解物を精査する前に、抗原ペプチドで予めインキュベートした。似た量の全タンパク質を、各レーンに取り込んだ。
【００２４】
図３Ａ〜３Ｇは、ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を提供する。ヌクレオチド数は、II型ＴＧＦβ受容体配列(Genbank Accession Number: M85079)の位置を参照にする。ＧＣ含量は、標的配列内のグアニンおよびシトシン（ＧＣ）の含量を参照にする。
【００２５】
図４。ＨＵＶＥＣ細胞におけるｓｉＲＮＡを使用したＴＧＦβＲIIの阻害。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３×１０−５で平板培養(plate)し、融合性単層に生育させた。翌日、細胞を、（ａ）対照（ＴＫＯ試薬のみ）、（ｂ）スクランブル、（ｃ）ＮＫ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、（ｄ）ＳＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（すべてＴＫＯ試薬中）で処置した。画像を、ＲＮＡｉ処置の４８時間後に撮った。ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、パネルａ、ｂ、ｃおよびｄそれぞれにおける細胞のＤＡＰＩ核染色に対応する。バーは、１０ミクロンである。
【００２６】
発明の好ましい態様の詳細な説明
創傷治癒中に生じる瘢痕を低減させるための新しい治療を開発する必要がある。ＴＧＦβは、創傷治癒における線維形成反応に関係することが知られており、ＴＧＦ誘導活性の阻害は、線維症および瘢痕を低減させるのに治療上効果的であろう。本発明は、創傷治癒を促進するおよび創傷治癒の結果としての瘢痕を低減させる方法における使用のために、特異的ｓｉＲＮＡ組成物を提供する。加えて、本発明は、血管形成を阻害する方法における使用のために、特異的ｓｉＲＮＡ化合物を提供する。これらの組成物については、本明細書中にさらに詳しく説明する。
【００２７】
定義
用語、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡの導入により誘導された転写後遺伝子サイレンシングのことである。
用語、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とは、相同内因性ｍＲＮＡへ、ＴＧＦβＲIIおよびそのｍＲＮＡの開裂および分解のために、複合体を導くために、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれる１９〜２３塩基の長さのヌクレオチドのことである。
用語、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦβ）とは、１から５の番号を付した５種類(member)を含む、一群のペプチド成長因子のことである。
【００２８】
用語、ＴＧＦβ受容体とは、細胞表面タンパク質のことであり、それらのうち３種（Ｉ型、II型およびIII型）が哺乳動物において既知である。ＴＧＦβII型受容体（ＴＧＦβＲII）は、ＴＧＦβに結合する細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを有する膜結合タンパク質である。本明細書中に参照することにより組み込まれるMassague et al., Annu. Rev. Biochem. 67: 753-791, (1998)にて検討したとおりである。
用語、治療上効果的な量とは、必要としている哺乳動物におけるＴＧＦβＲIIタンパク質の発現を効果的に抑制するｓｉＲＮＡ分子の量のことである。
【００２９】
創傷治癒におけるＴＧＦβ群の役割
サイトカインのトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）群は、様々な組織において創傷治癒過程における重要な調節因子である。目において、ＴＧＦβは、緑内障手術の後の創傷部位での角膜の濁りおよび瘢痕に関与してきた。ＴＧＦβはまた、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症および黄斑変性に関係している。発明者は、ＴＧＦβのII型受容体を標的としている低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を作り、これらのＲＮＡフラグメントが、受容体タンパク質の破棄および培養したヒト角膜線維芽細胞における転写に効果的であることを見出した。フィブロネクチンの集合および細胞移動などのＴＧＦβ介在過程が阻害された。ｓｉＲＮＡはまた、マウスの目に結膜下導入したとき、炎症反応およびマトリクス沈着を低減させるのに有効であった。これらの発見は、ＴＧＦβII型受容体レベルを調整し、創傷反応を調節するために、in vitroおよびin vivo両方でｓｉＲＮＡの送達に成功し得ることを示している。ＲＮＡ干渉技術は、目から全身の他の器官および組織に及ぶ多岐にわたる適用があるだろう。
【００３０】
創傷治癒に加えて、ＴＧＦβは、多くの細胞型の増殖および分化の調整において重要な役割を果たすことが知られている。ＴＧＦβはまた、コラーゲン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、プロテオグリカン類およびグリコサミノグリカン類などのマトリクスタンパク質の蓄積と制御することが知られていることから、多くの器官系内の発癌性の変化に寄与すると考えられる。したがって、ＴＧＦβＲII遺伝子発現の抑制は、線維増殖性障害および結合組織障害を処置する方法であってもよい。
【００３１】
ＴＧＦβはまた、in vitroでの内皮管形成を誘導することが知られていて、in vivo形成の毛細管の組織過程に影響を及ぼすと考えられている。ＴＧＦβレベルが、前立腺癌、卵巣癌、形質細胞腫および膠芽細胞腫などのいくつかの癌において上昇したことが知られている。さらに、それはＣＴＧＦと関係することにより、一部血管形成に関係する。したがって、ＴＧＦβＲII受容体遺伝子発現の抑制はまた、これらおよび他の種類の癌、ならびに異常な血管増殖を処置する方法であってもよい。
【００３２】
ＴＧＦβはまた、Ｔリンパ球およびＢリンパ球両方、ナチュラルキラー細胞およびリンフォカイン活性化キラー細胞への成長を阻害することが知られている。したがって、癌に加えて、ＴＧＦβＲII遺伝子発現の抑制は、ＡＩＤＳ、他のウィルス感染およびトリパノソーマ感染などの免疫障害を処置する方法であってもよい。
【００３３】
加えて、ｓｉＲＮＡに基づいた方法を、眼の外傷、障害または手術により誘導されたもの以外の創傷の処置のために使用してもよい。外科的切開は一般的に、外傷誘導裂傷、放射線治療による線維症および腹膜に関する創傷であり、処置してもよい。血管の再狭窄により生じる瘢痕、肥厚性瘢痕およびケロイドもまた、ｓｉＲＮＡ方法により処置してもよい。
【００３４】
眼球線維創傷治癒反応は、特に緑内障のための手術処置の結果として、重大な病態生理的問題を示している（Migdal et al. Ophthalmology 101, 1651-1656 (1994), Addicks et al., Arch. Ophthalmol. 101, 795-798 (1983)）。過度の術後瘢痕はしばしば、濾過手術の失敗へと至らしめる。抗結膜瘢痕(conjunctival anti-scarring)処置としてのマイトマイシン−Ｃおよび５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤の使用は、多数の患者に有益である一方、これらの剤は、低眼圧黄斑症および感染などの失明の可能性がある合併症に関係する（Khaw et al., Arch. Ophthalmol. 111, 263-267 (1993), Cordeiro et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 1975-1982 (1999), Crowston et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 449-454 (1998), Stamper, Am. J. Ophthalmol. 114, 544-553 (1992)）。
【００３５】
成熟したＴＧＦβの隔離は、抗線維化手段の開発の第一の標的である。ＴＧＦβ２に対する抗体は、結膜瘢痕活性を著しく低減させることを実証してきた（Cordeior et al.、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2225-2234 (1999)、(Mead et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3394-3401 (2003)）。加えて、創傷治癒の調節は、ＴＧＦβに対してアンチセンスオリゴヌクレオチド（Cordeior, et al., Gene Therapy 10, 59-70 (2003)、Shen et al., Eur. J. Bioichem. 268, 2331-2337 (2001)）またはリボザイム（Su et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 401-407 (2000), Yamamoto et al., Circulation 102、1308-1314 (2000)）を動物モデルまたは培養細胞に適用するときに観察される。それにもかかわらず、抗体を中和することは一般的に、これらの抗体が標的分子に完全な接近ができないかもしれないため、比較的弱い効果を表す（Shen et al., Eur. J. Bioichem. 268, 2331-2337 (2001)）。
【００３６】
アンチセンスホスホロチオエート(phosphorothioate)オリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、効果的であり得るが、それらの安定性および特異性が、未だに時折疑わしい。必要とされる濃度はまた、一般的にμＭの範囲である。それに対し、ｓｉＲＮＡは、２００ｎＭで有効であり、特に特異的である。したがって、本発明では具体的に、ｓｉＲＮＡを１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１６０ｎＭ、１７０ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭ、２００ｎＭ、２１０ｎＭ、２２０ｎＭ、２４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２６０ｎＭ、２７０ｎＭ、２８０ｎＭ、２９０ｎＭ，および３００ｎＭまたはそれ以上の濃度で含む組成物が考えられる。
【００３７】
本発明のかかる組成物は、緑内障を処置または予防する方法において使用されるだろう。加えて、最近の研究は、ＴＧＦβが実際には原発性開放隅角緑内障の発症に関わるであろうことを示している(Inatani et al., Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology. 239(2): 109-13, 2001; Ochiai et al., Japanese Journal of Ophthalmology. 46(3): 249-53, 2002; Gattanka et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 45(1) : 153-8, 2004)。ＴＧＦβ受容体に対してｓｉＲＮＡを使用する前房におけるＴＧＦβ受容体の下方調整は、緑内障の実際の発現または進行に対する別の処置法になる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡ組成物を、既に発現した緑内障のための処置方法において使用してもよく、または代わりに、緑内障を予防するために、予防的に使用してもよい。当業者は、緑内障の処置またはの予防のための、眼の機能用の動物モデルならびに治療組成物を投与する方法および経路（例えば、短絡、還流など）を知っている。例えば、Inatani et al., supra、およびOchiai et al., supra、米国特許第6,713,498号；6,699,211号；6,699,210号；6,649,625号；6,595,945号；6,531,128号；6,482,854号を参照すること。これらの文書の各々は、本明細書中に参照することにより全体として組み込まれる。
【００３８】
さらに、ＴＧＦβ受容体に対するｓｉＲＮＡの使用は、冠状血管の再狭窄を予防することにおいて、ならびに慢性の肺閉塞疾患からの肺線維症および肺瘢痕ならびに腎線維症および腹部および体の他の部分における術後瘢痕の進行を止めるのを助けることにおいて、貴重であろう。したがって、本発明のｓｉＲＮＡベースの組成物は、循環の改善および狭窄血管における止血のための治療方法として、またはそれらと併せて有用であろうことが考えられる。したがって、これらのｓｉＲＮＡ組成物を、単独で、または狭窄を低減させるまたは除去することにより血流を改善する役目をするバイパス手術および血管再生術（例えば、バルーン血管形成、アテローム切除術、ロトラリー(rotorary)切除(ロトブレーション(rotoblation))）と組み合わせて（例えば、術中、術前または術後に）使用してもよい。
【００３９】
これらの方法は、血管の内腔面積を低減させる血管壁内の新生内膜厚さまたは存在（すなわち、再狭窄）を低減させるのに有用であろう。再狭窄および狭窄を処置するための方法および組成物の詳細については、例えば、米国特許第6,663,863号；6,648,881号；6,596,698号；6,520,957号；6,519,488号；6,458,590号；6,491,720号；6,241,718号参照。これらの文書の各々は、本明細書中に参照することにより全体として組み込まれる。これらの特許は、再狭窄の処置のためのステントおよび医薬の調製のための、当該技術分野における模範的教示を示すために記載してある。本明細書中に記載の組成物を、それらに記載の医薬と同じように使用してもよく、また、それらの模範的特許に記載の処置方法を補うために使用してもよい。
【００４０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術における変化は、実験生物学の多くの手段に革命をもたらし、伝統的な遺伝子工学を補足し、細胞培養および生きた動物の両方における突然変異の効果を模倣している（McManus & Sharp, Nat. Rev. Genet. 3, 737-747 (2002)）。本発明は、ＲＮＡｉ技術を、ＴＧＦβII受容体遺伝子を標的とすることにより、創傷治癒反応を調整するために使用することに成功し得ることを実証する。該効果は、特異的であり、強力である。この技術は、目の結膜、角膜、網膜および脈絡膜にのみならず、血管疾患、高血圧およびアテローム性動脈硬化症を含む障害における創傷反応を調節するために、全身の他の組織においても適用してもよい（Yamamoto et al., Circulation 102, 1308-1314 (2000)）。
【００４１】
現在の研究において、ＲＮＡｉを、ＴＧＦβ経路を標的にするために使用した。動物および真核生物において生じることが知られているＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ；典型的には、２００ヌクレオチド長より長い）が、同じ配列を共有するｍＲＮＡの破壊の引き金となる過程である。ＲＮＡｉを、ｄｓＲＮＡの２１〜２３ヌクレオチドフラグメントへの変換により開始し、およびこれらの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡの分解を命令する（Elbashir et al., Nature 411, 494-498 (2001), Fire et al., Nature 391, 199-213 (1998), Hannon, G. J., Nature 418, 244-251 (2002)）。それは、さまざまな生物系におけるサイレンシング遺伝子に使用するために急速に採用されてきた（Reich et al., Mol. Vis. 9, 210-216 (2003), Song et al., Nat. Med. 9, 347-351 (2003)）。
【００４２】
ＲＮＡｉ技術を、ｓｉＲＮＡ分子のトランスフェクションにより、哺乳動物細胞において行ってもよい。ｓｉＲＮＡ分子を、in vitro転写により発生させて、またはベクターまたはＰＣＲ生成物により発現させて、化学的に合成してもよい。Ambion Inc.（Austin, TX）、Dannacon Inc.（Lafayette, CO）、InvivoGen（San Diego, CA）、およびMolecula Research Laboratories, LLC（Herndon, VA）などの商業的供給者は、カスタムｓｉＲＮＡ分子をつくる。加えて、SILENCER siRNA Construction Kit（Ambion Inc., Austin, TX）またはpsiRNA System（InvivoGen, San Diego, CA）などの市販のキットが、カスタムｓｉＲＮＡ分子を生成するために利用可能である。これらのｓｉＲＮＡ分子を、一過性トランスフェクションを通じてあるいは一過性のまたは安定に導入された哺乳動物細胞においてｓｉＲＮＡを連続的に発現させる発現ベクターの導入により、細胞に導入してもよい。トランスフェクションを、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン方法などの方法あるいは他の既知の技術を含む周知の方法により達成してもよい。これらの技術は、当業者に周知である。
【００４３】
ｓｉＲＮＡ分子を、局所注射により、あるいは他の適当なウィルスによりまたは非ウィルス送達ベクターにより、in vivoで細胞に導入してもよい。Hefti, Neurobiology, 25: 1418-1435 (1994)。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を、標的細胞への送達のために、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター内に含んでもよい（例えば、Johnson、国際公開番号W095/34670；国際出願番号PCT/US95/07178）。組み換えＡＡＶゲノムは典型的に、機能プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に(operably)結合するｓｉＲＮＡ配列を隣接させる(flanking)ＡＡＶ逆方向末端反復を含有する。代替の好適なウィルスベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、単純ヘルペスウィルス、レンチウィルス、肝炎ウィルス、パルボウィルス、パポバウィルス、ポックスウィルス、アルファウィルス、コロナウィルス、ラブドウィルス、パラミクソウィルス、およびパピローマウィルスベクターを含むが、それらに限定されない。
【００４４】
非ウィルス送達方法は、リポソーム介在の転移、裸のＤＮＡの送達（直接注射）、受容体介在の転移（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿および微粒子衝撃(microparticle bombardment)（例えば、遺伝子銃）を含むが、それらに限定されない。ｓｉＲＮＡ分子の導入方法はまた、誘導プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込み(integration)のために作られたＤＮＡ配列、親細胞よりも選択的利点を提供する能力があるＤＮＡ配列、形質転換細胞を同定する標識、陰性選択系および発現対照系（安全対策）、細胞特異的な結合剤（細胞標的用）、細胞特異的内在性因子、ベクターにより発現を増進させる転写因子の使用ならびにベクター製造方法を含んでもよい。
【００４５】
好ましいｓｉＲＮＡ分子は、１９〜２５塩基対の長さであり、最も好ましくは２１〜２３塩基対であって標的遺伝子配列に相補的である。ｓｉＲＮＡ分子は好ましくは、２つのアデニンを５’末端に有するが、絶対条件でなくてもよい。グアニン−シトシン含量を３０〜５０％含有するｓｉＲＮＡ配列は、より高いグアニン−シトシン含量を有する配列よりも効果的であることが知られている。したがって、３０〜５０％を有するｓｉＲＮＡ配列が好ましく、一方、４０〜５０％の配列がより好ましい。好ましいｓｉＲＮＡ配列はまた、連続した４つまたは５つ以上のチミジンまたはアデニンを含有するべきではない。
【００４６】
本明細書は、ＴＧＦβII型受容体（ＴＧＦβII）遺伝子を標的とするために作られたｓｉＲＮＡを用いて行われた研究の詳細を提供する。選択した標的配列を、調整タンパク質により高度構造化または結合すべきではない。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子配列内の異なる位置を対象とすべきである。例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列であるＮＫ１、ＮＫ２、ＳＳ１およびＳＳ２（配列番号１〜４）は、ＴＧＦβＲII遺伝子の異なる部分を対象とする。特にヌクレオチドＮＫ１は、ヌクレオチド５２９〜６１２にわたり、ＮＫ２は、ヌクレオチド１１１３〜１１３３にわたり、ＳＳ１は、ヌクレオチド１２５３〜１２７３にわたり、またＳＳ２は、ＴＧＦβＲII遺伝子のヌクレオチド９４８〜９６９にわたる。ＴＧＦβＲII遺伝子発現を抑制するのに効果的であろうさらなるｓｉＲＮＡ標的配列を、以下の表１に示す。これらの配列を、Ambion, Inc.のウェブサイトにある公的に利用可能なsiRNA Target Finderプログラムを使用してヒトＴＧＦβＲII配列（M85079）を分析することにより導き出した。配列を、ＢＬＡＳＴにより選別し、相同配列についてGenbankデータベースを検索した。非ＴＧＦβＲII配列に適合するヌクレオチドを１６個以上含有するいかなる配列も、さらなる検討から除外された。
【００４７】
３０〜５０％のＧＣ含量を有する配列を、さらに分析した。４つの連続したＡ、Ｃ、ＧまたはＴ塩基を含有するそれらの配列を、除外した。この分析により、ＴＧＦβＲII遺伝子を阻害するのに効果的であると考えられるｓｉＲＮＡ分子をさらに４９個同定した。これらの配列を、図３に示す。２つまでの不一致を含有するｓｉＲＮＡ分子は、ＴＧＦβＲIIの発現を阻害するのに効果的であった。不一致を含有するｓｉＲＮＡの効果は、配列におけるそれらの位置に依存するだろう。したがって、他のｓｉＲＮＡ配列は、既に試験した４種（ＮＫ１、ＮＫ２、ＳＳ１およびＳＳ２）および図３に示したものから導き出される可能性がある。
【００４８】
本明細書は、ＴＧＦβII型受容体（ＴＧＦβＲII）遺伝子を標的とするために作られたｓｉＲＮＡを用いて行われた研究の詳細を提供する。培養したヒト角膜線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現受容体を効果的に抑制し、ＴＧＦβ介在マトリクス沈着を低減させ、細胞移動を遅らせた。加えて、本明細書中に示したデータは、in vivoモデルにおいて、ＴＧＦβＲIIに特異的なｓｉＲＮＡが、マウスの目の結膜において炎症を低減させ、創傷修復を調整することができることを示す。本発明のｓｉＲＮＡ分子はまた、ヒト臍静脈内皮細胞におけるＴＧＦβＲII遺伝子発現を効果的に抑制する。
【００４９】
ヒトＴＧＦβＲIIに特異的なｓｉＲＮＡは、免疫蛍光、ウェスタンブロット法およびリアルタイムＰＣＲ分析により示したように、培養したヒト角膜線維芽細胞における受容体の発現を阻害することができる。２５〜２００ｎＭの範囲の４種の濃度の、および１６〜７２時間の４時点のｓｉＲＮＡを試験した。阻害反応は、用量および時間の両方に依存する。ＴＧＦβＲIIに対するｓｉＲＮＡの特異性もまた、確立した。試験した４種のｓｉＲＮＡは、それらのうち２種がより大きな効果を示したが、すべて有効的であることが見出された。本明細書中に提供された教示を踏まえて、当業者は、ヒトＴＧＦβＲIIのｃＤＮＡ配列から推定された他のｓｉＲＮＡもまた、効果的であろうことを予想するだろう。
【００５０】
In vitroモデルにおいてヒトＴＧＦβII型受容体に特異的なｓｉＲＮＡの有効性を試験するための検定
角膜線維芽細胞は、ＴＧＦβを構成的に発現する（Song et al., J. Cell. Biochem. 77, 186-199 (2000), Imanishi et al., Prog. Retin. Eye Res. 19, 113-129 (2000)）。ｓｉＲＮＡの角膜線維芽細胞における自己分泌ＴＧＦβシグナリングを阻止する効果を検査し、本明細書中に記載する。したがって、ｓｉＲＮＡの機能的役割を、このin vitro培養モデルにおいて良好に確立する。
【００５１】
ＴＧＦβは、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩ型などのマトリクス分子の発現を増進させること（Song et al., J. Cell. Biochem. 77, 186-199 (2000), Massague, Annu. Rev. Cell Biol. 6, 597-641 (1990)）および角膜線維芽細胞の移動を容易にすること（Imanishi et al., Prog. Retin. Eye Res. 19, 113-129 (2000), Andersen et al, Curr. Eye Res. 16, 605-613 (1997)）が示され、およびステップが複合体創傷修復過程に関わる（Clark, Physiology, Biochemistry and Molecular Biology of the Skin, Oxford University Press. P. 576-601, 1997）。肝星細胞においてＴＧＦβ１に相補的なアンチセンスＲＮＡを用いて実証されてきたように（Arias et al., Cell Growth Differ. 13, 265-273 (2002)）、受容体レベルの低下およびＴＧＦβのための受容体結合の阻止が、分泌フィブロネクチンレベルおよびそのマトリクスへの組み込みの低減をもたらした。角膜線維芽細胞の移動はまた、明らかに遅れる。
【００５２】
本発明の教示を踏まえて、当業者は、本明細書中に説明されたｓｉＲＮＡ分子の生成について教えを受け、角膜線維芽細胞の移動、フィブロネクチンの発現、および／またはコラーゲンＩ型の発現におけるかかるｓｉＲＮＡ分子の効果を評価するための検定において、かかる分子を用いる。角膜線維芽細胞の移動レベル、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩ型のいずれかの発現および／または分泌レベルのいかなる低下または減少も、本発明に従って治療剤として使用するのに効果的な、あるｓｉＲＮＡ分子を示すだろう。
【００５３】
マウスモデル
ＴＧＦβに特異的なｓｉＲＮＡ分子の治療効果をまた、結膜瘢痕マウスモデルにおいて実証する。モデルは、Reichelら（Br. J. Ophthalmol. 82, 1072-1077 (1998)）により以前記載されたものを類似していた。しかしながら、結膜下部にＰＢＳのみを注射する代わりに、注射したＰＢＳを、炎症および瘢痕反応が増大した改良マウスモデルを有するため、ラテックスビーズと混合した。ｓｉＲＮＡは２００ｎＭで、この新しいマウスモデルにおける炎症および線維形成反応を低減させるのに効果的であることを明らかに示した。当業者は、これらのモデル研究を、その他のＴＧＦβに特異的なｓｉＲＮＡ分子を用いて繰り返すことができるだろう。このマウスモデルにおいて炎症または線維形成反応を低減させるその他の分子は、本発明の有用なｓｉＲＮＡ分子であることが考えられる。
【００５４】
細胞増殖検定
ＴＧＦβは、線維芽細胞の増殖を刺激し、上皮細胞の、特に腫瘍細胞の増殖を阻害することが知られている。したがって、ＴＧＦβ誘導線維芽細胞の増殖または上皮細胞増殖の阻害へのｓｉＲＮＡの効果を測定することは、ｓｉＲＮＡ分子の効果を評価する方法である。
【００５５】
細胞増殖を、ＤＮＡ合成を測定することにより監視してもよい。ＤＮＡ合成を、Leeら（Endocrinology 136: 796-803, (1995)）に記載されたように、細胞における［３Ｈ］−チミジンの取り込みを用いて測定してもよい。細胞を、ウェル（２４ウェルプレート）あたりおよそ２×ｌ０４個播種し、１％ＦＢＳを含むまたは含まない、ＴＧＦβを選択した濃度で含有する１ｍｌの培養培地中で２２時間インキュベートする。そして、ウェルあたり２ｍＣｉの［３Ｈ］−チミジンを加え、続いて４時間連続でインキュベートし、放射能をシンチレーションカウンターで数える。
【００５６】
細胞の増殖を、細胞計算により測定することができる。細胞を、１％ＦＢＳを含むまたは含まない培養培地中に播種し（２４ウェルプレート）、培地を１日ごとに交換する。４日培養の最後に、細胞をトリプシン処理し、コールターカウンターで数える。
【００５７】
ＴＧＦβＲII活性化検定
ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘ構成体(construct)の使用は、ＴＧＦβII型受容体の活性化の評価を可能にする。細胞を、６ウェルプレートのウェルあたり１×１０５個の細胞で播種し、製造元の指示書（Life technologies, Gaithersburg, MD）に従い、リポフェクションを使用して、プラスミドｐ３ＴＰ−Ｌｕｘにより一過性にトランスフェクトする。ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘは、ヒトコラーゲン遺伝子からの３つの１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート応答素子およびルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合した１型ヒトプラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）プロモーターからの１つのＴＧＦβ応答素子を含有する（Wrana et al., Cell 71: 1003-14, (1996)）。細胞を、１μｇ／ｍｌのｐ３ＴＰ−Ｌｕｘおよび１２μｇ／ｍｌのLipofectamineで２４時間インキュベートする。続いて、細胞を、ＲＰＭＩ中５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβで２４時間処置し、抽出緩衝液（１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５、１％のTriton X-100、１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭのジチオスレイトール）で溶解する。溶解物を反応緩衝液（７５ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｍグリシルグリシン、ｐＨ７．８、１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、６０ｍｇ／ｍｌのＡＴＰ）に希釈し、照度計を使用してルシフェラーゼ活性について検定する。
【００５８】
この検定の使用により、ＴＧＦβＲII活性におけるｓｉＲＮＡの効果を評価することが可能である。本発明の効果的なｓｉＲＮＡ分子は、シグナリングに利用可能な受容体の数を低減させるため、ＴＧＦβＲII受容体を通して一定量のシグナリングを阻害するだろう。好ましくは、効果的なｓｉＲＮＡ分子は、ＴＧＦβＲIIを通して少なくとも２０％、またはより好ましくは少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％または４５％シグナリングを阻害するだろう。効果的なｓｉＲＮＡ分子は、ＴＧＦβＲIIを通して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０、７５％またはそれ以上シグナリングを阻害するのが非常に好ましい。
【００５９】
走化性検定
ＴＧＦβは、サイトカインであり、当業者は、周知の走化性検定を通してかかる剤の活性を監視する。行ってもよい模範的走化性検定は、Martinet et al., J. Immunol Meth., 174:209, 1994およびKeller et al., J. Immunol. Meth., 1:165, 1972に記載されている。簡潔には、２０ｍｌの末梢血液を、医療(health)ボランティアから１０ｍｌのヘパリン化チューブに収集する。血液を、１０ｍｌのHistopaque（Sigma）で１：１に希釈し、そして置く(under laid)。４００ｇで２５分間遠心分離した後、界面にある細胞を収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄する。細胞を、１０６／ｍｌで１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies）と共にＤＭＥＭ（Life Technologies, Gaithersburg, MD）中に再懸濁する。無菌ウシ血清アルブミン（Sigma）を、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に添加する。
【００６０】
１００μｌのこの細胞懸濁液を、各トランスウェルインサート(transwell insert)（Costar）に添加する。ｓｉＲＮＡ分子を含むまたは含まない抗生物質および０．２％のＢＳＡを含むＤＭＥＭを、２４ウェルプレート内のウェルの下部に添加する。トランスウェルインサートを下壁内に置き、３７Ｎ  Ｃで９０分間インキュベートする。インキュベーション期間の完了時に、インサートを除去し、接着細胞を除去する。そしてインサート全部をライト・ギムザ(Wright-Giemsa)で染色する。インサートの下面に接着した細胞およびウェルの下部に移動した細胞を顕微鏡下で数え、加算し、移動細胞の総数を得る。
【００６１】
化学誘引物質の検定および細胞活性化特性
ＴＧＦβＲIIを対象とするｓｉＲＮＡのヒト単球／マクロファージまたはヒト好中球への効果を、例えば、好中球およびマクロファージのマウスＴＣＡ３誘導の活性化を評価するために、Devi et al., J. Immualol., 153: 5376-5383 (1995)に記載の方法により、評価してもよい。かかる研究において測定した活性化指数は、インテグリン活性化によるフィブリノゲンへの接着の増加、走化性、反応性窒素中間体の誘導、呼吸バースト（過酸化物および過酸化水素の生成）、およびサイトカラシンＢの存在下でのリゾチームおよびエラスターゼの開口分泌を含む。
【００６２】
Devi et al.において議論されたように、これらの活性は、炎症への白血球反応の数段階と相互に関係がある。Springer, Cell, 76: 301-314 (1994)により再検討されたこの白血球反応は、血管の内皮細胞への白血球の接着、内皮層を通じての移動、ケモカイン源への走化性、および炎症調節因子の部位特異的放出を伴う。
【００６３】
骨髄性前駆細胞への効果の検定
造血のＴＧＦβ誘導抑制の阻害を、幹／前駆細胞機能および数の検定において試験してもよく、ＬＴＣ−ＩＣ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅを含む。これらの検定は、当業者に周知であり、例えばBroxmeyer et al., Blood, 76: 1110 (1990)に記載のように比較的容易に設定できる。簡潔には、骨髄細胞を、インフォームドコンセントを得た後に、ヒトのドナーから収集する。５×１０４／ｍｌの低密度のヒト骨髄細胞を、コロニー形成単位顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）またはブラスト(blast)形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析のために、３０％ＦＣＳ（Hyclone）、組み換えヒトエリスロポエチン（EPO, 1U/ml, Amgen, Thousand Oaks, CA）、組み換えヒトインターロイキン−３（IL-3,100U/ml, Immune, Seattle, WA）、および組み換えヒト幹細胞因子（SCF, 50ng/ml, Amgen）を補ったIscove's改変必須培地（Biowhitaker, Walkersville, MD）中１％メチルセルロースに平板培養する。培養物を、５％ＣＯ２および低酸素圧（５％）で１４日間インキュベートし、そして盲検法で、倒立顕微鏡を使用してコロニー形成を記録する。
【００６４】
骨髄性細胞株への効果についての検定
骨髄性細胞増殖のＴＧＦβ誘導阻害へのｓｉＲＮＡの効果はまた、ｓｉＲＮＡ分子の機能的活性の有用な試験だろう。かかる機能検定を、最大増殖のためにＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦを必要とするヒト骨髄性細胞株ＴＦ−１およびＭＯ７Ｅを用いて評価してもよい（Avanzi et al., Brit. J. Haematol., 69: 359; 1988）。サイトカイン依存性の原始的な(primitive)急性骨髄性白血病細胞株ＴＦ−１およびＭＯＰＥを、１０％ＦＣＳ（Hyclone）および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えたRPMI 1640(Life Technologies, Gaithersburg, MD）中で培養してもよい。この培地に、正常な対数増殖を促進するために、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１００Ｕ／ｍｌ、Immunex, Seattle, WA)および幹細胞因子（ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、Amgen, Thousand Oaks, CA）を補う。
【００６５】
慢性の骨髄性白血病前駆細胞への効果の検定
慢性の骨髄性白血病（ＣＭＬ）における前駆細胞増殖のＴＧＦβ誘導阻害へのｓｉＲＮＡの効果を、Hromas et al., Blood, 89: 3315-3322 (1997)に記載のようにコロニー形成検定を用いて評価してもよい。簡潔には、骨髄細胞を、慢性期の６人のＣＭＬ患者から収集する。例えば、５×１０４細胞／ｍＬの低密度骨髄細胞を、適当な濃度のＴＧＦβ（例えば１００ｎｇ／ｍｌ）を単独のまたはＥＸＯＤＵＳ、ＭＩＰ−１などの他のケモカインと組み合わせたものの存在下または非存在下で、３０％ウシ胎仔血清、１Ｕ／ｍＬヒトエリスロポエチン（Epogeng（登録商標）, Amgen）、１００Ｕ／ｍＬヒトインターロイキン−３（Genetics Institute）および５０ｎｇ／ｍＬヒト幹細胞因子（Amgen）を補ったIscove's改変ダルベッコ培地中１％メチルセルロースに平板培養する。
【００６６】
培養物を、５％ＣＯ２および低（５％）酸素圧で１４日間インキュベートし、そしてＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＢＦＵ−Ｅについて倒立顕微鏡を使用して記録する。ケモカインで処置した培養についてのコロニー計数を、対照培養のコロニー計数と比較し、対照ＣＦＵまたはＢＦＵのパーセンテージで表した。
【００６７】
前述したように、上記の検定は、本発明のｓｉＲＮＡ分子のin vitroおよびin vivo効果を決定するために行ってもよい検定のタイプを例示することを意図する。決してこれらだけが、ＴＧＦβ活性を決定するのに使用されることが知られている検定ではない。当業者は、これらの上記の代用となってもよいが、それにもかかわらず機能および活性の類似のパラメータを測定する、他の検定が分かるだろう。
【００６８】
血管形成検定
血管形成へのｓｉＲＮＡ分子の効果を、以下の検定を利用して監視してもよい。血管形成は、既存の小血管壁からの内皮細胞の新芽(sprouting)由来の新しい毛細形成の多段階の過程である。新しい毛細管を形成するために、内皮細胞が伸長および移動しなければならない。
【００６９】
管形成検定を、ＴＧＦβＲIIを標的とするｓｉＲＮＡ分子が、ＨＵＶＥＣ細胞などの内皮細胞において管形成を阻害するかどうかを決定するために使用してもよい。例えば、内皮管形成検定を、in vitroでマトリゲルを使用して行ってもよい。内皮細胞を、ＢＤマトリゲル（BD Biosciences）に平板培養するとき、細胞は増殖を停止し、高い運動性および細胞間連絡を表す。さらに、２４時間以内に、細胞は整列し、内皮細胞分化のモデルならびに血管形成カスケードの最終段階の１つとして提案されてきた毛細管の三次元網目構造を形成する。
【００７０】
２４ウェル組織培養プレートを、成長因子を低減させた５００μｌのマトリゲルマトリクスで被覆し、３７℃で少なくとも３０分間インキュベートすることにより、全体的にゲル化させる。マトリゲルがゲルを形成した後、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）またはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの内皮細胞を洗浄し、マトリゲルで被覆したウェル上に播種する。該細胞を、ＴＧＦβＲIIを標的とするｓｉＲＮＡ分子の存在下および非存在下でＴＧＦβで処置する。管形成を見るために、細胞を、培地中に１：２０００で希釈した１ｍＭのCalcein AM（Molecular Probes）で処置し、暗所で少なくとも１５分間インキュベートし、続いて培地＋１０％ＦＢＳで洗浄する。
【００７１】
ＴＧＦβ誘導血管形成へのｓｉＲＮＡ分子の効果を評価するための他の検定は、内皮細胞増殖検定および内皮細胞移動検定を含む。加えて、内皮細胞における交代は、血管が腫瘍に侵入するにつれて血管形成中に生じ、内皮細胞の形態および機能に効果がある。内皮細胞の形態を、内皮細胞の発芽、移動、および増殖を見るために、免疫組織化学または電子顕微鏡を使用して評価してもよい。
【００７２】
ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定はまた、血管形成を評価するための周知の方法である。発生中のニワトリの胚は、胚発生として血管化する絨毛尿膜により囲われている。移植組織片を、卵の殻に作った窓を通してＣＡＭに置く。これにより、移植後４日以内に移植片に向かった血管の典型的な放射状の再構成および移植片の周りの血管の明らかな増加をもたらす。移植片に入る血管を、立体顕微鏡下で数える。ｓｉＲＮＡ分子の抗血管形成活性または血管形成活性を評価するために、化合物を、徐放性ポリマーペレットに調製し、ゼラチンスポンジに吸収させるか、またはプラスチック製のディスク上で空気乾燥させ、そしてＣＡＭ上に移植する。ＣＡＭ検定において、新しく発現したＣＡＭ血管系の回帰へと至らしめる本発明のｓｉＲＮＡが、ＴＧＦβ誘導血管形成の効果的な阻害剤であることを決定する。
【００７３】
ＴＧＦβ誘導血管形成への本発明のｓｉＲＮＡ分子の効果をまた、マイクロポケット(micropocket)検定を使用してマウス角膜において測定してもよい。マウス角膜は、in vivoの血管部位を示す。これにより、新しい血管の増殖について顕微鏡下で簡単に研究できるため、血管形成の研究には非常に良いモデルとなる。角膜輪部から角膜実質内へ突き抜けるいかなる血管も、新しく形成されたと同定できる。血管形成反応を誘導するために、ＴＧＦβを含有する徐放性ポリマーペレット（すなわち、ポリ−２−ヒドロキシエチル−メタクリラート（ヒドロン）またはエチレン−ビニルアセタートコポリマー（ＥＬＶＡＸ））を、マウスの角膜実質に作った「ポケット」に移植する。４〜６日後、新しい血管増殖が生じる。血管反応を、墨汁を用いて、角膜の還流後にコンピュータ画像分析により定量化することができる。このモデルにおける血管もまた、電子顕微鏡により、または免疫組織化学の使用により、微細構造的に研究することができる。
【００７４】
医薬組成物
臨床適用を考える際、ウィルスの発現ベクター、核酸および医薬組成物として、すなわち、in vivo適用のために適当な形の本発明により同定される他の組成物を提供する必要があるだろう。一般的に、これは、本質的にピロゲンならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を含まない、組成物を調製することを伴う。好ましい態様において、本発明は、本発明に記載したように、ｓｉＲＮＡ分子を含有する医薬組成物が考えられる。
【００７５】
本発明の活性組成物は、古典的な医薬製剤を含む。本発明によれば、これらの組成物の投与は、いかなる普通の経路経由でもあり、これは、標的組織がその経路経由である限りである。医薬組成物を、いかなる従来の方法により、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球内、球後、肺内（例えば、定期的(term)放出）により；経口、舌下、経鼻、経肛門、膣内または経皮送達により、または特定の部位での移植手術、例えば、脾臓被膜の下、脳の下または角膜内に埋め込むことにより、対象内に導入してもよい。処置は、単回用量またはある期間にわたる複数回の用量からなってもよい。
【００７６】
活性化合物を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した遊離塩基または薬学的に許容しうる塩の水溶液として投与するために調製してもよい。分散剤をまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール類、およびそれらの混合物中でならびに油中で調製することができる。保管および使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を予防するために、保存剤を含有する。
【００７７】
注射用途に好適な医薬形状は、無菌水溶液または分散剤および無菌注射溶液または分散剤の即席の調製用の無菌粉剤を含む。すべての場合において、形状は、無菌でなければならず、注射容易性の点で、流動体でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、バクテリアおよび真菌類などの微生物の汚染作用に対して保存しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含有する溶剤または分散培地であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散剤の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の予防を、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより、もたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むのが好ましいだろう。注射組成物の持続的吸収を、吸収を遅らせる剤の組成物、例えば、アルミニウムモノステアラートおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【００７８】
無菌注射溶液を、上に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶剤中に必要な量の活性化合物を組み込むことにより調製し、必要に応じて、ろ過滅菌を行う。一般的に、分散剤を、塩基性分散培地および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル内に様々な無菌活性成分を組み込むことにより調製する。無菌注射溶液調製用の無菌粉剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉剤、さらにその前もって滅菌ろ過した溶液からさらなる所望の成分をもたらす真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００７９】
本明細書において使用する「薬学的に許容しうる担体」とは、動物またはヒトに投与したときに拒絶反応、アレルギー反応または他の有害反応を生じさせない、いかなるおよびすべての溶剤、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤なども含む。医薬活性物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当業者にとって周知である。いかなる従来の媒体または剤も活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物における使用が考えられる。補助的活性成分もまた、組成物に組み込むことができる。
【００８０】
経口投与のために、本発明のポリペプチドを、賦形剤と組み込んでもよく、非摂取型のマウスウォッシュおよび歯磨剤の形状で使用してもよい。マウスウォッシュを、ホウ酸ナトリウム溶液(Dobell's Solution)などの適当な溶剤に必要な量の活性成分を組み込むことにより、調製してもよい。代わりに、活性成分を、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウム含有の殺菌洗浄液に組み込んでもよい。活性成分を、ゲル、ペースト、粉剤およびスラリーを含む歯磨剤中に分散させてもよい。活性成分を、水、結合剤、研磨剤、フレーバー剤、発泡剤および保湿剤を含んでもよいペースト状の歯磨剤に治療効果のある量を添加してもよい。
【００８１】
本発明の組成物を、中性のまたは塩の形状で処方してもよい。薬学的に許容しうる塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成された）を含み、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸などにより形成されたものを含む。遊離カルボキシル基により形成された塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来であり得る。
【００８２】
処方の際、溶液を、投薬量処方に適合する形で、および治療上効果的な量で、投与する。処方は、注射溶液、薬剤放出カプセルなどのさまざまな剤形で容易に投与される。水溶液による非経口投与のために、例えば、溶液を必要な場合好適に中和し、希釈液を最初に十分な塩水またはグルコースにより等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮内および腹腔内投与に特に好適である。
【００８３】
「単位用量」は、好適な担体中に分散した別個の量の治療組成物と定義される。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を非経口投与する際、ｓｉＲＮＡ組成物を一般的に、１日あたり体重１ｋｇあたり１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり０．ｌｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で注射する。非経口投与を、薬剤製品の治療循環レベルを維持するために、最初はボーラスで、続いて連続注入により、行ってもよい。当業者は、良好な医療行為および個々の患者の臨床条件により決定されるように、効果的な投薬量および投与規制を直ちに最適化するだろう。
【００８４】
投薬の頻度は、剤の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存するだろう。最適な医薬処方は、当業者により、投与経路および所望の投薬量に依存して、決定されるだろう。例えば、本明細書中に参照することにより組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042)1435〜1712頁参照。かかる処方は、物理的状態、安定性、in vivo放出率および投与した剤のin vivoクリアランス率に影響を与えるだろう。投与経路に依存して、好適な用量を、体重、体表面積または器官の大きさに従い、計算してもよい。適当な処置用量を決定するために必要な計算をさらに精密化することは、必要以上の実験なしに、特に本明細書に開示された投薬量情報および検定ならびに動物またはヒト臨床試験において観察された薬物動態データを踏まえて、当業者によって日常的に行われる。
【００８５】
適当な投薬量を、血液レベルを決定するための確立された検定と、関連がある用量−反応データとを併せて使用することにより確認してもよい。最終投薬量規制は、主治医により、薬剤の作用を変える因子、例えば、薬剤の特異的活性、損害の重篤度および患者の反応性、患者の年齢、条件、体重、性別および食事、いかなる感染の重篤度、投与時間および他の臨床因子を考慮して決定されるだろう。研究を行うにつれ、さらなる情報により、適当な投薬量レベルならびに特異的疾患の処置期間および条件について明らかになるだろう。
【００８６】
ウィルス送達を用いる遺伝子治療態様において、単位用量を、投与しているウィルス粒子の用量に関し、計算してもよい。ウィルス用量は、特定の数のウィルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む。アデノウィルスを伴う態様について、特定の単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４ｐｆｕを含む。粒子用量は、感染欠損粒子が存在するため、いくらか高い（１０〜１００倍）。
【００８７】
本発明の医薬組成物および処置方法が、ヒト医学および獣医学の分野において有用であろうことが、評価されるだろう。したがって、処置されるべき対象は、哺乳動物、好ましくはヒトまたは他の動物であってもよい。獣医目的では、対象は、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびヤギを含む家畜、イヌおよびネコなどのコンパニオンアニマル、珍しいおよび／または動物園の動物、ネズミ、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含む実験動物、およびニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウなどの家禽を含む。
【００８８】
併用治療
ｓｉＲＮＡ分子および関係がある組成物の送達のみに基づく治療に加えて、併用治療を、特異的に考える。
本発明の状況の下で、ｓｉＲＮＡ方法を、創傷の治癒、瘢痕の低減、血管形成の阻害を促進するための他の剤と併せて、または本明細書中に列挙した障害の治療に使用されるものと併せて、同様に使用することが考えられる。また、ＴＧＦβＲIIを対象とするｓｉＲＮＡ分子を、創傷の治癒、瘢痕の低減、および血管形成の阻害を促進する他のｓｉＲＮＡ分子と併せて、または本明細書中に記載の障害の治療に使用されるものと併せて、使用することができることが考えられる。
【００８９】
瘢痕の減少、異物の蓄積の減少、血管形成の低減といった適当な治療結果または本明細書中に論じたｓｉＲＮＡ分子のための他の使用を達成するためには、本発明の方法および組成物を使用して、一般的に「標的」細胞をｓｉＲＮＡの発現構成体および少なくとも１つの他の治療剤（第二の治療剤）に接触させるだろう。これらの組成物を、所望の治療結果を生み出すのに効果的な組み合わせの量で提供するだろう。この過程は、細胞を発現構成体および剤または因子に同時に接触させることを伴う。これは、細胞を単一の組成物または両方の剤を含む薬物の処方に接触させることにより、あるいは、細胞を、一方の組成物が発現構成体を含み、他方が第二の治療剤を含む、２種の異なる組成物または処方に同時に接触させることにより、達成してもよい。
【００９０】
代わりに、ｓｉＲＮＡ処置を、分単位から週単位の範囲の間隔で、他の剤の処置に先立ち、またはその後に、行ってもよい。第二の治療剤および発現構成体を、細胞に別々に適用する態様において、剤および発現構成体がまだ細胞へ有利な併用効果及ぼすことができるよう、一般的に、各送達時間の間にかなりの期間切れなかったことを確実にする。かかる場合において、それぞれの約１２〜２４時間以内に、より好ましくはそれぞれの６〜１２時間以内に両方の療法により細胞を接触させることがあると考えられ、約１２時間の遅延時間が最も好ましい。しかしながら、いくつかの状況において、処置のための期間を著しく延ばすこと、それぞれの投与の間を数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）の経過にすること、が望ましいだろう。
【００９１】
患者へのｓｉＲＮＡの発現構成体または配列の局所送達は、臨床疾患に対抗するためにｓｉＲＮＡ分子を送達するのに、非常に効率的な方法であろう。同様に、第二の治療剤は、対象の身体の特に影響を受ける領域を対象としてもよい。代わりに、発現構成体および／または第二の治療剤の全身送達が、ある事情において適当だろう。
【００９２】
効果的であろう他の抗増殖および抗血管形成組成物は、本発明のｓｉＲＮＡ分子との併用処置を含み、抗癌薬剤であるマイトマイシン−Ｃおよび５−フルオロウラシル、agaricus bisporusのレクチン、亜鉛−デスフェリオキサミンまたはガリウム−デスフェリオキサミンなどの金属錯体、ペントキシフィリンなどのメチルキサンチン誘導体、GE Amidon Oxydeなどのコラーゲンベースの封止剤を含む。加えて、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子、結合組織成長因子を阻害する剤、およびイロマスタットなどのマトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤が、本発明のｓｉＲＮＡ分子と使用するための第二の治療剤として考えられる。かかる阻害剤は、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子、結合組織成長因子またはこれらの成長因子およびマトリクスメタロプロテイナーゼについてのそれぞれの受容体を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００９３】
例
以下の例を、本発明の好ましい態様を実証するために含む。当業者は、以下の例に開示された技術が、本発明の実施において良好に機能するために、発明者によって発見された技術を代表することを評価すべきであり、したがって、その実施に好ましい形態を構成していると考えられる。しかしながら、当業者は、本明細書の開示を踏まえて、開示された特異的な態様において多くの変化をつけることができ、本発明の精神と範囲から逸脱しないまま、同様のまたは類似の結果を得ることができることを評価すべきである。
【００９４】
例１
材料および方法
ヒト角膜線維芽細胞培養
１３、２９、３４、４５および４７歳のドナーからの正常なヒト角膜を、Illinois Eye Bank (Chicago, IL)またはNational Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)から得た。組織の調達は、シカゴにあるイリノイ大学のＩＲＢ委員会により、ヘルシンキ宣言に従い、承認された。内皮および上皮層を角膜から除去し、間質を、角膜線維芽細胞培養を開始するための外植片として使用した。細胞を、YueおよびBlum(Vision Res. 21, 41-43 (1981)）に以前記載のあったように、グルタミン、１０％ウシ胎仔血清、５％仔ウシ血清、非必須および必須アミノ酸および抗生物質を補ったダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で維持した。第３から第５継代の細胞を、研究用に使用した。
【００９５】
ＴＧＦβII受容体ｓｉＲＮＡ配列
ＴＧＦβII受容体ｓｉＲＮＡ用の４種の配列を、ヒトＴＧＦβII受容体配列（Genbank Accession Number: M85079）から導き出した。ｓｉＲＮＡを、Dharmacon Research (Lafayette, Colorado)がカスタム合成し、精製した。
【００９６】
標的配列（５’から３’）は、以下のとおりであり、ヒトＴＧＦβII受容体配列における最初のヌクレオチドの位置を、括弧で示した。
【表２】
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スクランブル配列のＲＮＡを、対照として使用した。
【００９７】
二本鎖ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
正常なヒト角膜線維芽細胞を、トランスフェクションの前日に、５０〜７０％でLab-Tek製４または８ウェルチャンバースライド、カバーガラス、または６ウェルプレート上に合流させて(confluence)平板培養した。トランスフェクション複合体を、２μｌのTransIT-TKO試薬（Takara Mirus Corporation, Madison, Wisconsin）を、５０μｌの無血清培地に添加し、渦流させ、混合物を室温で１０分間インキュベートすることにより、調製した。混合物に、抗ＴＧＦβII受容体ｓｉＲＮＡ二本鎖（最終濃度２５、５０、１００、または２００ｎＭ）を添加した。溶液をさらに、やさしくピペットする(pipeting)ことにより混合し、さらに２０分間インキュベートした。そして最終混合物を、完全培地中の細胞に滴加した。やさしく揺らした後、遺伝子発現について検定する前に、細胞を３７℃で１６、２４、４８または７２時間インキュベートした。対照として、角膜線維芽細胞を、処置しないか、あるいはトランスフェクション試薬のみで処置した。非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ二本鎖(Dharmacon; 100および200mM)もまた、ＴＧＦβＲIIに特異的なｓｉＲＮＡの代わりに使用した。
【００９８】
免疫蛍光
ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、選択した時間で、カバーガラスまたは８−ウェルチャンバースライド(Nalge Nunc International, Naperville, Illinois)内の細胞を、２％のホルムアルデヒド溶液で固定し、ＰＢＳ中０．１％のTriton-Xl00で透過処理した。細胞を、１０％の熱で不活性化した正常なヤギ血清(Colorado Serum Company、Denver、CO)内で４５分間室温で阻止し、ウサギ抗ＴＧＦβII受容体抗体(1:100, Santa Cruz Biologicals, Santa Cruz, California, SC1700)を用いて６０分間インキュベートした。洗浄に続いて、ヤギＦＩＴＣ抗ウサギ(Southern Biotechnology)を、１：２００で６０分インキュベーションに適用した。細胞核を、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド）で対比染色した。スライドを、Zeiss Axiovert蛍光顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)下でエピ蛍光により検査した。
【００９９】
フィブロネクチン染色のために、冷却メタノール中で、Lab-Tek製４ウェルガラスチャンバースライド上の細胞を、トランスフェクションの４８時間後に固定した。免疫蛍光を、ウサギ抗ヒトフィブロネクチン(1:100, BD Science, Lexington, Kentucky)を一次抗体として、およびＦＩＴＣ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ(1:100, Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania)を二次抗体として使用して行った。スライドを、Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, California)中でＤＡＰＩと共に装着した。染色を、Zeiss 100M顕微鏡下で検査した。
【０１００】
ウェスタンブロット法
ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、培地を除去し、６ウェルプレート内の角膜線維芽細胞を採った。細胞を、Triton緩衝液に溶解させ、続いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液を添加した。タンパク質サンプルを、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、ニトロセルロース膜に転移し、ＢＬＯＴＴＯで阻止した。続いて、ブロットを、１：２００希釈の（もちろん、他の希釈、例えば、１：２０００、およびこれらの数字の間の希釈もまた使用可能である）ウサギ抗ＴＧＦβII受容体と西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch)と共にインキュベートした。シグナルを、化学発光分析した。
【０１０１】
フィブロネクチンの研究のために、４８時間のトランスフェクション後の角膜線維芽細胞を、無血清ＭＥＭと共に２４時間インキュベートした。培地を収集し、細胞を、氷上で１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ−４０、２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および１×プロテアーゼ阻害剤反応混液(cocktail)(Roche)に溶解した。細胞残渣をペレット化し、溶解物中のタンパク質を、Bradfordタンパク質検定により定量化した。タンパク質量の調節後、等しいアリコートの培地サンプルを、還元条件下で１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解した。タンパク質を、ニトロセルロース膜上でエレクトロブロットした。５％の脱脂粉乳で阻止した後、膜を、ウサギ抗ヒトフィブロネクチン（１：５０００）およびＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０，０００）と共にインキュベートした。タンパク質バンドを、Pierce(Rockford, IL)製のSuperSignal Substrateを使用して検出した。濃度計分析を、１Ｄ画像分析ソフトウェア(Kodak Digital Imaging, Eastman Kodak Company, New Haven, Connecticut)を使用して、フィブロネクチンバンドの強度を測定するために行った。
【０１０２】
リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、２４、４８および７２時間スクランブル、ＮＫ１またはＳＳ１  ｓｉＲＮＡで処置した細胞からTrizolで抽出した。リアルタイムＰＣＲを、当業者に既知の方法に従って行った。
【０１０３】
細胞移動検定
創傷擦過傷(wound scratch)検定を、細胞移動を評価するために使用した。トランスフェクションの４８時間後、２４ウェルプレート中の角膜線維芽細胞に、Mostafavi-Pour et al., J. Cell Biol. 161: 155-167 (2003)に以前記載されたように、無菌のＰ２０ピペットチップで傷をつけた。細胞の創傷内への移動能力を、損傷の７時間後、位相差顕微鏡下で検査した。移動範囲を定量化するために、１０×の各領域における創傷の総面積および創傷内で細胞が欠損している面積を、Image Processing Tool Kit version 3.0 (Adobe Photoshop 7.1プラグインソフトウェア, Reindeer Graphics, Inc., Asheville, North Carolina)を使用して測定した。合計１０の領域を分析し、各試料において移動細胞により覆われた面積の平均パーセンテージを計算した。統計学的評価のために、スチューデントのｔ分布を使った。すべての実験を、少なくとも３回繰り返した。
【０１０４】
結膜瘢痕のマウスモデル
すべての実験を、６週齢のＣ５７ＢＬ６ネズミを使用して行った。動物の処置は、ARVO Statement for Use of Animals Ophthalmic and Vision Researchに従った。ネズミに、腹腔内注射（ペントバルビタール、０．１ｍｌ／体重１０ｇ）で全身麻酔を施した。手術を、変更を加えて、以前報告したように行った(Reichel et al. Br. J. Ophthalmol. 82,1072-1077 (1998))。側頭結膜下(temporal subconjunctival)部の鈍的切開を、１ｍｌの注射器および３０ゲージの注射針を使用して、ラテックスビーズ（直径１．０５３μｍ、３００μｇ／ｍｌ、Polysciences, Warrington, Pennsylvania)含有の無菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２００ｎＭのＮＫ１、ＳＳ１またはスクランブルミスセンスオリゴヌクレオチドと混合したトランスフェクション試薬と共に注射することにより行った。二重盲検法で、各マウスの片目を、ＨＫ１またはＳＳ１で処置し、反対側の目を、スクランブルｓｉＲＮＡで処置した。他のネズミの目は、対照の役目をさせるために、無処置のままか、またはＰＢＳおよびラテックスビーズを単独で注射した。ネズミを、手術の２、７および１４日に、頚椎脱臼により犠牲にした。各処置／時点について、３匹のネズミを使用した。
【０１０５】
摘出した目を、室温で１０％の緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィン切片用に加工した。５μｍ厚のパラフィンに埋め込まれた切片を脱パラフィンし、再水和し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して炎症反応を評価し、ピクロシリウスレッド(picrocirius red)で染色してコラーゲン沈着を実証した。
【０１０６】
例２
ＴＧＦβII受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現の抑制
ヒト角膜線維芽細胞を、TransIT-TKO試薬を使用して作った４種すべての模範的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを、Ｃｙ３標識ルシフェラーゼを使用して蛍光顕微鏡により実証した。トランスフェクションは、非常に効率的であったようで、９０％以上の細胞が、赤い蛍光を表した。トランスフェクション試薬またはｓｉＲＮＡの細胞毒性は、ほとんど観察されなかった。
【０１０７】
免疫蛍光分析は、ＴＧＦβＲIIが、無処置の対照角膜線維芽細胞の細胞質に広く分布したことを示した（図１、列１）。１００ｎＭのＳＳ１  ｓｉＲＮＡで４８時間処置したとき、ＴＧＦβＲIIの染色度は、劇的に低減した（図１、列３および４）。１００ｎＭでも、ＮＫ１、ＮＫ２およびＳＳ２  ｓｉＲＮＡは、ＴＧＦβＲII強度を抑制した。試験した最低濃度（２５ｎＭ）および最短時点（１６時間）では明白でないが、阻害効果はまた、様々な程度で、他の濃度（５０および２００ｎＭ）および時点（２４および７２時間）で試験した４種すべてのｓｉＲＮＡで観察された。全体的には、ＮＫ１およびＳＳ１が、他に比べてより大きな阻害をもたらしているようであった。スクランブルｓｉＲＮＡで処置した細胞（図１、列２）は、無処置の対照細胞と類似の強度および傾向を示し、ＮＫＩおよびＳＳ１効果の特異性を実証した。
【０１０８】
ウェスタンブロット法（図２）は、ビヒクル処置した対照およびスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたサンプルにおいて、抗ＴＧＦβＲIIへの免疫反応性がある７３〜７５ｋＤａバンド（受容体としての拡散(diffuse)バンドは、糖タンパク質）をもたらした。１６時間の時点では、低減を示したＳＳ１で処置した細胞（レーン６）以外はＴＧＦβＲIIタンパク質レベルにおいて認識できる差異はなかった。４８時間で、ＮＫ１（レーン９および１０）およびＳＳ１（レーン１１および１２）ｓｉＲＮＡの両方が、対照細胞（レーン８）と比較して、ＥＧＦｓII受容体についてシグナル強度の際立った減少を示した。濃度計分析は、免疫ブロットで処置したｓｉＲＮＡにおいてＴＧＦβＲIIの７０〜８５％の低減を提案した。ＮＫ１  ｓｉＲＮＡは、この時点で、ＳＳ１よりも、５０ｎＭおよび１００ｎＭ両方のｓｉＲＮＡ濃度でＴＧＦβＲIIの発現を低減させるのにより効果的なようであった。ＴＧＦβII受容体抗体を、プローブ前に抗原ペプチドと共に予めインキュベートしたとき、免疫反応性バンドが消滅した（図２、レーン７）。このレーンにおけるシグナルの欠如は、抗体の特異性を実証した。代謝回転率は、リガンド結合の存在および使用する細胞型により変化する。ＴＧＦβＲII受容体の半減期は、２〜６時間と様々である。ＴＧＦβII受容体転写を、リアルタイムＰＣＲにより検査し、ｓｉＲＮＡ組成物が、受容体ｍＲＮＡのレベルを著しく変化させたことが分かった。
【０１０９】
例３
ｓｉＲＮＡによる、フィブロネクチンの集合および分泌されたフィブロネクチンの低減
免疫蛍光を使用して、無処置の対照の角膜線維芽細胞が、細胞中に強力なフィブロネクチン沈着および緻密な線維ネットワークを表したことを実証した。類似の傾向が、スクランブルｓｉＲＮＡで処置された細胞においても観察された。これらの分析において、無処置の線維芽細胞、１００または２００ｎＭのＮＫ１、あるいは１００または２００ｎＭのＳＳ１のスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処置した線維芽細胞の免疫蛍光を、フィブロネクチンマトリクスを視覚化するために行った。核の染色を、ＤＡＰＩ色素を使用して行った。これらの研究は、１００および２００ｎＭのＮＫ１およびＳＳ１  ｓｉＲＮＡの両方によるトランスフェクションの４８時間後、フィブロネクチン沈着が角膜線維芽細胞において明らかに低減したことを示した。核を、ＤＡＰＩにより対比染色した。細胞密度は、様々な試料において似ており、したがってフィブロネクチンの集合の減少は、細胞数の減少と関係なかった。
【０１１０】
フィブロネクチン線維形成へのｓｉＲＮＡの効果もまた、フィブロネクチン分泌における変化の観察を通して検査した。トランスフェクションの４８時間後の角膜線維芽細胞を、２４時間無血清培地でインキュベートした。培地において収集したタンパク質は、ウェスタンブロット法の対象となった。２２０Ｋｄａフィブロネクチンバンドが、すべてのサンプルにおいて観察された。免疫蛍光データと一致して、１００および２００ｎＭのＮＫ１およびＳＳ１での処置は、培養培地に分泌されるフィブロネクチンのレベルを減少させた。２つのｓｉＲＮＡは、等しく効果的であり、１００ｎＭよりも、２００ｎＭでより大きな効果を引き出した。
【０１１１】
例４
ｓｉＲＮＡによる細胞移動の遅延
創傷擦過傷検定は、角膜線維芽細胞が創傷を受けた場所に移動できることを示した。７時間以内に、無処置の対照およびスクランブルＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、それぞれ場所の８３．０±２．２％および８０．４±２．６％のピペットの先端でつくったほとんどの創傷を満たした。これに対し、１００および２００ｎＭのＮＫ１およびＳＳ１トランスフェクト細胞により覆われる創傷場所は、著しく小さく（Ｐ＜０．０００１）は、３７〜５７％で変動した。細胞移動の阻止は、より高濃度のｓｉＲＮＡでより劇的であった。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
【０１１２】
例５
マウスモデルにおける炎症反応および線維症の低減
結膜瘢痕マウスモデルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびラテックスビーズを結膜下部内に注射することにより作り出した。炎症反応は、組織切片内の炎症細胞の数により判断したように、ＰＢＳ単独を注射した目から得られたものと比較して、注射後２日目に、より重症であった。２日目に観察された炎症反応は、４および７日目には治まった。
【０１１３】
二重盲検法で、ＮＫ１、ＳＳ１、およびスクランブルｓｉＲＮＡを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびラテックスビーズと共に、マウスの目内に導入した。各マウスの片目を、ＮＫ１またはＳＳ１で処置し、および反対側の目を、スクランブルＲＮＡで処置した。他のネズミの目は、対照の役目をさせるために、無処置のままか、またはＰＢＳおよびラテックスビーズを単独で注射した。注射の２日後、多くの炎症細胞が、スクランブルＲＮＡ処置した対照の目およびＰＢＳ／ビーズを注射した対照の目において、結膜上皮の下で観察された。炎症細胞は、ＮＫ１およびＳＳｌ処置した目において、より少なかった。
【０１１４】
注射後７および１４日目には、炎症細胞の数は、処置したまたは注射したすべての目において低減した。スクランブルＲＮＡ処置した対照の目およびＰＢＳ／ビーズを注射した対照の目において、結膜下部は、線維芽細胞で一杯だった。結膜線維芽細胞の密度は、ＮＫ１またはＳＳ１で処置した目において見られるものよりも高かった。コラーゲン沈着を実証するためのピクロシリウスレッド染色はさらに、１４日目の線維形成反応は、ＮＫ１およびＳＳ１  ｓｉＲＮＡにより抑制されたことを示した。
【０１１５】
例６
内皮細胞におけるｓｉＲＮＡを使用したＴＧＦβＲIIの阻害
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３×１０−５細胞／ウェルで平板培養し、融合性単層に増殖させる。翌日、細胞を、TransIT-TKO試薬のみ（陰性対照）、スクランブルｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＮＫ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＳＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（すべてTransIT-TKO試薬に入っている）で処置した。２００ｎＭの濃度のオリゴヌクレオチドを使用したが、これより高いまたは低い濃度を使用してもよい。オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを、Ｃｙ３標識ルシフェラーゼを使用して蛍光顕微鏡により実証した。画像を、ＲＮＡｉ処置後４８時間で撮影した。
【０１１６】
免疫蛍光分析は、ＴＧＦβＲIIが無処置の対照角膜線維芽細胞（図４ａ）の細胞質内に広く分布したことを示した。ＮＫ１およびＳＳ１  ｓｉＲＮＡの存在下で、ＴＧＦβＲII染色度が、劇的に低減した（それぞれ図４ｃおよびｄ）。これらの結果は、例２に記載の角膜線維芽細胞において行った実験と一致する。スクランブルｓｉＲＮＡで処置した細胞（図４ｂ）は、無処置の対照細胞と同様の強度および傾向を示し、ＮＫ１およびＳＳ１効果の特異性を実証した。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ｓｉＲＮＡによるＴＧＦβII型受容体の発現の阻害を示した図である。
【図２】角膜線維芽細胞内のｓｉＲＮＡによる、ＴＧＦβII型受容体タンパク質の発現の抑制を示した図である。
【図３Ａ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図３Ｂ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図３Ｃ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図３Ｄ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図３Ｅ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図３Ｆ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図３Ｇ】ＴＧＦβII型受容体の配列および対応するｓｉＲＮＡ分子配列において、標的配列を示した図である。
【図４】ＨＵＶＥＣ細胞におけるｓｉＲＮＡを使用したＴＧＦβＲIIの阻害を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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