(57)【要約】  本発明は、Ｊａｂ１蛋白質、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、またはＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスを含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物に関するものである。
2007528345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊａｂ１(Jun-activation binding protein 1)蛋白質を含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物。
【請求項２】
Ｊａｂ１蛋白質が配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｊａｂ１蛋白質が配列番号１のヌクレオチド配列にコードされる請求項１記載の組成物。
【請求項４】
Ｊａｂ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物。
【請求項５】
Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する組み換えベクターである請求項４記載の組成物。
【請求項６】
Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を有する組み換えベクターである請求項４記載の組成物。
【請求項７】
組み換えベクターが組み換えウィルスベクターである請求項５または６記載の組成物。
【請求項８】
組み換えウィルスベクターが組み換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス及びヘルペスシンプレックスウィルス由来のベクターの中から選択される請求項７記載の組成物。
【請求項９】
Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスを含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物。
【請求項１０】
Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスが、配列番号２のアミノ酸配列を有するＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスである請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスが、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされるＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスである請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
組み換えウィルスがアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペス及びシンプレックスウィルスの中から選択される請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
組み換えウィルスがレトロウィルス及びアデノウィルスの中から選択される請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
感染疾患がフラビウィルス感染疾患である請求項１、４及び９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
フラビウィルスが西ナイルウィルスである請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
発熱、発疹、出血、黄疸、関節痛、筋肉痛、脳炎または髄膜炎を治療または予防するための請求項１、４及び９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
（ａ）Ｊａｂ１蛋白質発現細胞を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の細胞をＪａｂ１蛋白質の発現を促進させる候補化合物と接触させる段階と、
（ｃ）段階（ｂ）におけるＪａｂ１蛋白質の発現量を、候補化合物に接触させていない対照群の発現量と比較する段階と、
（ｄ）Ｊａｂ１蛋白質発現量の増加を示す化合物を確認する段階とを含み、Ｊａｂ１蛋白質の発現を促進させる物質を検定する方法。
【請求項１８】
（ａ）Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えベクター及びフラビウィルスまたはペスティウィルスのカプシド（Ｃｐ）蛋白質発現組み換えベクターで形質転換された細胞を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の細胞を、Ｊａｂ１蛋白質とＣｐ蛋白質の相互作用を促進させる候補化合物と接触させる段階と、
（ｃ）段階（ｂ）におけるＣｐ蛋白質の発現量を、候補化合物に接触させていない対照群の発現量と比較する段階と、
（ｄ）Ｃｐ蛋白質の発現量の減少を示す化合物を確認する段階とを含み、Ｊａｂ１蛋白質とＣｐ蛋白質の相互作用を促進させる物質を検定する方法。
【請求項１９】
段階（ｃ）での発現量の差を蛋白質水準またはｍＲＮＡ水準で確認する請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
免疫検定法で蛋白質発現量の差を確認する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＲＴ−ＰＣR(Reverse Transcription-Polymerization Chain Reaction)でｍＲＮＡ発現量の差を確認する請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、Ｊａｂ１を含むウィルス感染疾患治療組成物に係り、より具体的には、Ｊａｂ１蛋白質、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、またはＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスを含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
フラビウィルス(Flavivirus)とペスティウィルス(Pestivirus)は、フラビウィルス科(Flaviviridae)に属するウィルスであって、単鎖ＲＮＡをゲノムとして有し、脊椎動物を宿主細胞として様々な疾病を誘発するウィルスである。西ナイルウィルス(West Nile Virus：ＷＮＶ)(Burt et al., Emerg Infect Dis., 8(8):820-826, 2002; Asnis et al., Clin Infect Dis30(30): 413-418, 2000)は、フラビウィルスの代表的なウィルスであって、感染時に発熱、発疹、関節痛、筋肉痛などの疾患を誘発する。野生型(wild type)西ナイルウィルスに感染した脳細胞では、細胞死滅がＢａｘ依存的に誘導され(Parquet et al., FEBS Lett., 500(1-2):17-24. 2001)、ウィルスのカプシド蛋白質がミトコンドリア／カスパーゼ−９(mitochondrial/caspase-9)経路を介して細胞死滅を起こすという研究報告があったが(Yang et al, Emerg Infect Dis., 8(12):1379-1384, 2002)、西ナイルウィルス感染による細胞内病理機序は解明されていない。
【０００３】
西ナイルウィルス感染の予防と治療のために、既存の免疫グロブリン、インターフェロンａｌｆａ２ｂとリバビリン(ribavirin)などのウィルス製剤などを使用したが(Agrawal and Petersen., J Infect Dis, 188(1):1-4, 2003; Morrey et al., Antiviral Res., 55(1):107-116, 2002 ; Anderson et al., Emerg Infect Dis., 8(1):107-108, 2002)、治療効果が低い。未だ西ナイルウィルスの感染を効果的に治療または予防する薬物が不在なので、このような薬物を開発するための研究が要求されている。
【０００４】
Ｊａｂ１(Jun-activation binding protein 1)は、ＡＰ−１蛋白質(Jun/Fos proto-oncogene)の補助活性化因子(coactivator)として最初知られたが、その他後述の様々な機能を行うものとしても知られている。Ｊａｂ１はＣＯＰ９ ｓｉｇｎａｌｏｓｏｍｅ複合体（ＣＳＮ）の５番目の構成要素であり(Wei et al., Annu Rev Cell Dev Biol., 19:261-286, 2003)、酵母から植物および動物までＪａｂ１／ＣＳＮ５をもっている。Ｊａｂ１の過発現はサイクリン依存性キナーゼ抑制剤(cyclin dependent kinase inhibitor)ｐ２７／Ｋｉｐ１を核から細胞質へ移動させ、Ｕｂ−２６Ｓプロテアソーム依存的な分解作用を促進させ、ｐ２７／ｋｉｐ１のＧ１−Ｓ転位(transition)にも関与する(Tomoda et al., Nature, 398(6723):160-165, 1999)。また、Ｊａｂ１は、初期肺癌細胞(primary lung cancer cell)で過発現されるＰＧＰ９．５の核転移(nuclear translocation)にも関与する(Caballero et al., Oncogene, 21(19):3003-3010, 2002)。Ｊａｂ１はｐ５３、Ｓｍａｄ４、ルトロピン／コリオゴナドトロピン(Lutropin/Choriogonadotropin)受容体と相互作用してこれら蛋白質の分解を促進させる(Bech-Otschir et al., EMBO J., 20(6):1630-1639, 2001; Li et al. J Biol Chem., 275(18):13386-13393, 2000; Wan et al., EMBO J., 3(2):171-176, 2002)。Ｊａｂ１は細胞内蛋白質と作用して核から細胞質へ蛋白質を移動させ、プロテアソーム依存的な方式で蛋白質分解を促進する機能を行うことが分かる。
ところが、フラビウィルス科に属するウィルスに感染するとき、Ｊａｂ１とウィルス蛋白質との相互作用については全く解明されていない。
【０００５】
このような背景の下で、本発明者は、フラビウィルスのカプシド蛋白質と相互作用する蛋白質中の一つとして、カプシド蛋白質の分解を促進して細胞死滅を抑制するＪａｂ１を同定し、これをウィルス感染疾患の治療または予防に使用できることを確認することにより、本発明を完成した。
【０００６】
〔発明の開示〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、Ｊａｂ１(Jun-activation binding protein 1)蛋白質を含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物を提供することにある。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物を提供することにある。
【０００８】
また、本発明の別の目的は、Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスを含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の別の目的は、薬理学的有効量のＪａｂ１蛋白質をウィルス感染疾患の治療または予防が必要な対象に投与し、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防する方法を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の別の目的は、薬理学的有効量のＪａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をウィルス感染疾患の治療または予防が必要な対象に投与し、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防する方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の別の目的は、薬理学的有効量のＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスをウィルス感染疾患の治療または予防が必要な対象に投与し、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防する方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、Ｊａｂ１蛋白質の発現を促進させる物質を検定する方法を提供することにある。
【００１２】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、Ｊａｂ１蛋白質を含むフラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物を提供する。
【００１３】
本発明によって治療または予防しようとするウィルス感染は、フラビウィルス及びペスティウィルス感染疾患であって、フラビウィルスとペスティウィルスは、ウィルス学名に関する国際委員会(International Committee on Taxonomy of virus)の分類によれば、フラビウィルス科に属するウィルスである。陽性極性の単鎖ＲＮＡ(positive stranded single strand RNA)をゲノムとして有し、脊椎動物と節足動物が自然宿主(natural host range)である。フラビウィルスとペスティウィルスは膜とヌクレオカプシドを有する構造であり、フラビウィルスは直径４０〜５０ｎｍの円形のウィルスであり、ペスティウィルスは直径４０〜６０ｎｍの円形または不定形のウィルスである。フラビウィルスとペスティウィルスは、非常に類似の構造と感染機序を有するウィルスに感染するとき、細胞の細胞死滅を誘導する。
【００１４】
フラビウィルスは、哺乳類ダニ媒介性ウィルス(mammalian tick-borne virus)群、海鳥ダニ媒介性ウィルス(seabird tick-borne virus)群、アロアウィルス(Aroa virus)群、デングウィルス(Dengue virus)群、日本脳炎ウィルス(Japanese Encephalitis virus)群、タヤウィルス(Ntaya virus)群、ココベラウィルス(Kokobera virus)群、スポンドウェニウィルス(Spondweni virus)群、黄熱ウィルス(Yellow fever virus)群、エンテベウィルス(Entebbe virus)群、モダクウィルス(Modac virus)群、リオブラボウィルス(Rio Bravo virus)群などを含む。本発明の組成物は、日本脳炎ウィルス群の感染に好ましく使用できる。このような日本脳炎ウィルス群には、カシパコレウィルス(Caipacore virus)、コウタンゴウィルス(Koutango virus)、日本脳炎ウィルス(Japanese encephalitis virus)、ムレイバレー脳炎ウィルス(Murray Valley encephalitis virus)、セントルイス脳炎ウィルス(St. Louis encephalitis virus)、ウスツウィルス(Usutu virus)、西ナイルウィルス(West Nile virus)、ヤウンデウィルス(Yaounde virus)などがある。
【００１５】
ペスティウィルスは、ボーダー病ウィルス(Border disease virus)、牛ウィルス性下痢ウィルス１(Bobine viral diarrhea virus 1)、牛ウィルス性下痢ウィルス２(Bovine viral diarrhea virus 2)、豚コレラウィルス(classical swine fever virus)などを含む。
【００１６】
本発明者は、イーストツーハイブリッドアセイを介して、西ナイルウィルスに感染した細胞で細胞死滅を誘導するウィルスのカプシド（Ｃｐ）蛋白質と直接作用する蛋白質のうちＪａｂ１を発掘し、Ｊａｂ１がカプシド蛋白質に及ぼす影響を調査した。その結果、Ｊａｂ１がカプシド蛋白質と直接相互作用してカプシド蛋白質を核から細胞質へ移動させ、カプシド蛋白質の分解を促進することにより、ウィルスのカプシド蛋白質による細胞死滅が著しく阻害されるということを糾明した。
【００１７】
カプシドは、ウィルスの核酸を取り囲んだ蛋白質シェル(protein shell)を意味し、構造的サブユニット(structural subunit)蛋白質の結合によって形成される。カプシドを形成する構造的サブユニット蛋白質をカプシド蛋白質という。本発明の目的上、カプシド蛋白質は、Ｊａｂ１蛋白質が結合するフラビウィルスとペスティウィルスのカプシド蛋白質である。フラビウィルスに属する西ナイルウィルスのカプシド蛋白質の核酸配列を始めとした全体配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから分かる(accession number AF206518, AF196835, AF202541, M12294)。その他異なる種類のフラビウィルスとペスティウィルスのカプシド蛋白質の核酸配列もＧｅｎＢａｎｋから探し出すことができる：例えば、ＪＥＶ(accession number M18370、D90194、及びD90195)、ＳＬＥＶ(accession number M16614)、ＹＦＶ(accession numbers AF094612、U17067、U17066、U54798、U21055、U21056、及びX03700)、ＤＥＮＶ(accession numbers M23027、U88535、U88536、及び U88537)、及びＢＶＤＮ(accession number M31182)である。Ｊａｂ１蛋白質に結合することが可能なカプシド蛋白質をもっているフラビウィルスとペスティウィルス間のカプシド蛋白質は、相同性が約９０％に達する。
【００１８】
本発明の組成物に用いられるＪａｂ１蛋白質は、酵母、植物または動物由来の全てのＪａｂ１蛋白質を含む。野生型のＪａｂ１蛋白質を含んで、フラビウィルスまたはペスティウィルスのカプシド蛋白質との結合によってカプシド蛋白質の分解を促進する機能を行う限り、欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによるＪａｂ１蛋白質の変異体を含む。一つの具体的例示として、配列番号２のアミノ酸配列を有するＪａｂ１蛋白質を挙げることができ、このような配列の置換、挿入、欠失変異体も本発明の組成物に使用することができる。
【００１９】
Ｊａｂ１蛋白質の変異体とは、野生型のアミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基の相違した配列を有する蛋白質を意味する。Ｊａｂ１蛋白質の変異体は、挿入は通常約１〜２０個のアミノ酸の連続配列で行われるが、より大きい挿入も可能であり、欠失は、通常約１〜３０個の残基で行われるが、一部の場合にはドメイン中の一つが欠失できるのと同様に、より大きい欠失も可能である。このような変異体は、当該分野に公知になっている化学的ペプチド合成方法またはＤＮＡ配列を基本とする組み換え方法によって製造できる(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed., 1989)。分子の活性を全体的に変更させない蛋白質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最も通常的に発生する交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００２０】
また、Ｊａｂ１蛋白質は、場合によってはリン酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)などでも修飾(modification)できる。
【００２１】
前記変異体または修飾体は、天然蛋白質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であるが、必要に応じてはこの蛋白質の特性を変形させた変異体または修飾体である。好ましくは、アミノ酸配列上の変異と修飾によって蛋白質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加し或いは蛋白質活性が増加した蛋白質である。
【００２２】
Ｊａｂ１蛋白質は、当該分野に公知になっている方法により天然から抽出及び精製して得ることができ、あるいは、Ｊａｂ１蛋白質の配列が明らかになっているので、化学的合成(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963)或いは遺伝子組み換え技術を用いて得ることができる。
【００２３】
化学的に合成して製造する場合、当該分野に公知になっているポリペプチド合成法を用いて得ることができる。
【００２４】
遺伝子組み換え技術を用いる場合、Ｊａｂ１をコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入し、ベクターを宿主細胞に形質転換して、Ｊａｂ１が発現されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞からＪａｂ１を回収する過程によって得ることができる。
【００２５】
Ｊａｂ１蛋白質を発現させるための発現ベクターは、通常の全ての発現ベクターを使用することができる。宿主細胞によって蛋白質の発現量や修飾などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。使用できる宿主細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)またはスタヒロコッカス(Staphylococcus)などの原核宿主細胞があるが、これに制限されない。この中でもＥ.ｃｏｌｉが最も一般に用いられる。また、真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)、酵母（例えば、ピキア酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces)、アカバンカビ(Neurospora crassa)）などの下等真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞として用いることができる。
【００２６】
蛋白質は、選択された宿主細胞で発現させた後、分離及び精製のために通常生化学分離技術、たとえば蛋白質沈澱劑による処理（塩析法）、遠心分離、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィ（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、親和度クロマトグラフィなどの各種クロマトグラフィなどを用いることができ、通常、高純度の蛋白質を分離するためにこれらを組み合わせて用いる(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990))。
【００２７】
他の様態として、本発明は、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物を提供する。
【００２８】
本発明の組成物でＪａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、野生型または前記のような変異体型のＪａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列であって、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異でき、天然から分離し或いは化学的合成法で製造することができる。
【００２９】
Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を化学的に合成して製造する場合、当業界に公知になっている合成法、例えば文献(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)に開示された方法を用いることができ、トリエステル、ホスファイト(phosphite)、ホスホルアミデート(phosphoramidate)及びＨ−ホスフェート法(H-phosphate method)、ＰＣＲ及びその他のオートプライマー方法、固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成法などを挙げることができる。
【００３０】
Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列に対する一つの具体的例示として、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、配列番号１の配列を、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列として例示することができる。
【００３１】
前記ヌクレオチド配列を有する核酸は、単鎖または二重鎖であり、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子である。
【００３２】
好ましい様態において、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、これを発現するベクターに作動的に連結された組み換え発現ベクターに提供される。
【００３３】
本発明において、「ベクター」とは、目的の遺伝子をコードする核酸配列（例：ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を宿主細胞に導入するための手段を意味する。本発明において、「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的の蛋白質または目的のＲＮＡを発現することが可能なベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００３４】
本発明において、「作動可能に連結された(operably linked)」とは、一般的機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的の蛋白質またはＲＮＡをコードする核酸配列とが機能的に連結(functional linkage)されていることをいう。例えば、プロモーターと蛋白質またはＲＮＡをコードする核酸配列と作動可能に連結され、コーディング配列の発現に影響を及ぼす可能性がある。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて実現することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結には、当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いる。
【００３５】
本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウィルスベクターなどを含む。適した発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどの発現調節要素の他にも、膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて様々に製造できる。開始コドン及び終結コドンは、一般に、免疫原性標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされるもので、遺伝子作製物が投入されたとき、個体で必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)に存在しなければならない。ベクターのプロモーターは構成性または誘導性を有する。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合に複製起源を含む。ベクターは自己複製しあるいは宿主ＤＮＡに統合できる。
【００３６】
より好ましい様態において、本発明は、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する組み換えウィルスベクター組成物を提供する。
【００３７】
本発明において、「組み換えウィルスベクター」は、一つまたはそれ以上の異種性遺伝子を含んでいるウィルスベクターをいい、本発明ではＪａｂ１遺伝子を有するウィルスベクターである。前記ウィルスベクターは、好ましくはレプリコンの欠乏したベクターである。
【００３８】
組み換えウィルスベクターは、レトロウィルス(Retrovirus)、例えばＨＩＶ(Human immunodeficiency virus)、ＭＬＶ(Murine leukemia virus)、ＡＳＬＶ(Avian sarcoma/leukosis)、ＳＮＶ(Spleen necrosis virus)、ＲＳＶ(Rous sarcoma cirus)、ＭＭＴＶ(Mouse mammary tumor virus)など;アデノウィルス(Adenovirus)、アデノ関連ウィルス(Adeno-associated virus)、ヘルペスシンプレックスウィルス(Herpes simplex virus)などから由来する組み換えウィルスベクターであるが、これに制限されない。
【００３９】
Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、当該分野の公知方法、例えばベクター型のネイキッドＤＮＡに直接注射し(Wolff et al., Science, 247:1465-8, 1990: Wolff  et al., J Cell Sci. 103:1249-59, 1992)、リポソーム(Liposome)、陽イオン性高分子(Cationic polymer)などを用いてウィルス感染疾患を治療または予防の目的で患者の細胞内に伝達できる。リポソームは、遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡまたはＤＯＴＡＰなどの陽イオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であって、陽イオン性のリポソームと陰イオン性の核酸を一定の割合で混合すると、核酸−リポソーム複合体が形成される。この複合体は、細胞内へエンドサイトシスされてエンドソーム内に滞留する(Schaefer-Ridder M et al., Sceience. 215(4529):166-168, 1982; Hodgson et al., Nat Biotechnol., 14(3):339-342, 1996)。エンドソームから流入した遺伝子が細胞質を経て核へ移動する度合いが遺伝子転移と治療効率を決定する。このような遺伝子転移方法は、免疫原性が低くて繰返し投与が可能であり、安定性が高いという利点があるが、遺伝子発現効率が低いという欠点がある。遺伝子輸送に用いられる陽イオン性高分子としては、ポリ−Ｌ−リジン(poly-L-lysine)、スペルミン(spermine)、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ：polyethylenimine)、キトサン(chitosan)などがある(Hashida, Br J Cancer., 90(6):1252-1258, 2004; Wiseman, Gene Ther., 10(19):1654-1662, 2003; Koping-Hoggard, Gene Ther.,8(14):1108-1121, 2001)。遺伝子を陽イオン性高分子と複合体の形で体内投与する場合、遺伝子の体内滞留時間及び発現持続時間がネイキッドＤＮＡ(naked DNA)に比べて著しく増加するものと明らかになった。
【００４０】
別の様態として、本発明は、Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスを含む、プラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防するための組成物を提供する。
【００４１】
感染した細胞でＪａｂ１を発現するように操作された感染性ウィルス粒子を患者細胞へ感染させる場合、その発現効率を増大させることができるため、治療効果が優れる。
【００４２】
本発明の組み換えウィルス含有組成物に使用できる組み換えウィルスは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスシンプレックスウィルスなどを含み、これに制限されない。好ましくは、レトロウィルスまたはアデノウィルス、より好ましくはアデノウィルスが使用できる。
【００４３】
レトロウィルスの場合、宿主細胞の染色体内に非可逆的に融合されるため、遺伝子発現が長期間持続されるという利点がある。アデノウィルスの場合、一般的な遺伝子治療の研究で最も多く用いられてきたシステムで様々な種類の哺乳類細胞に使用可能である。アデノ関連ウィルスの場合、遺伝子を伝達する宿主細胞の範囲が広く、繰返し投与の際に免疫副作用が少なく、遺伝子発現期間が長いという利点がある。ヘルペスシンプレックスウィルスの場合、神経組織に親和性が大きいウィルスであって、神経細胞の正常機能に影響を及ぼさず、核中で染色体の外部に安定な染色体副体(episomal element)として存在する。複製−欠乏ヘルペスシンプレックスウィルスを遺伝子転移に使用してレポーター遺伝子の発現期間を研究した結果、神経系で１年以上発現が持続されると報告された。
【００４４】
別の様態として、本発明は、薬理学的有効量のＪａｂ１蛋白質、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、またはＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスをウィルス感染疾患の治療または予防が必要な対象に投与し、フラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００４５】
本発明の治療方法に用いられるＪａｂ１蛋白質、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、またはＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスは上述した通りである。
【００４６】
本発明の治療方法は脊椎動物のウィルス感染疾患の予防または治療のためのもので、脊椎動物には人や家畜などの哺乳動物を含む。
【００４７】
上述したようなＪａｂ１蛋白質、Ｊａｂ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、またはＪａｂ１蛋白質発現組み換えウィルスを含む本発明の薬学組成物は、フラビウィルス科に属するウィルス、好ましくはフラビウィルスまたはペスティウィルス感染疾患の治療または予防に使用される。特に、フラビウィルス感染疾患の治療または予防に好ましく使用できる。前記ウィルスは発熱、発疹、出血、黄疸、関節痛、筋肉痛、脳炎、髄膜炎などを発病させるということが公知になっており(Watt et al., Am J Trop Med Hyg., 68(6):704-706, 2003; Anninger et al., Clin Infect Dis., 38(7):55-56, 2004)、本発明の薬学組成物は前記疾病の発病の抑制または治療に使用することができる。
【００４８】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体としては、経口投与の場合には結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形に製造することができ、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形に製造することができる。
【００４９】
本発明の薬学組成物は、目的の組織に到達することができる限り、いずれの一般的な経路によっても投与できる。したがって、本発明の組成物は、局部、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮などで投与でき、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形できる。好ましい剤形は注射剤である。注射は皮下注射、筋肉内注射及び静脈注射などが可能である。
【００５０】
本発明の組成物は、治療学的または予防学的有効量で投与できる。投与量は、患者の疾病種類及び重症度、年齢、性別、投与方法、標的細胞、発現度合いなど様々な要因によって異なり、当該分野の玄人によって容易に決定できる。
【００５１】
別の様態において、本発明は、（ａ）Ｊａｂ１蛋白質発現細胞を培養する段階、（ｂ）段階（ａ）の細胞を、Ｊａｂ１蛋白質の発現を促進させる候補化合物と接触させる段階と、（ｃ）段階（ｂ）段階におけるＪａｂ１蛋白質の発現量を、候補化合物と接触させていない対照群の発現量と比較する段階と、（ｄ）Ｊａｂ１蛋白質発現量の増加を示す化合物を確認する段階とを含み、Ｊａｂ１蛋白質の発現を促進させる物質を検定する方法に関するものである。
【００５２】
別の様態として、本発明は、（ａ）Ｊａｂ１蛋白質発現組み換えベクター及びフラビウィルスまたはペスティウィルスのＣｐ蛋白質発現組み換えベクターで形質転換された細胞を培養する段階と、（ｂ）段階（ａ）の細胞を、Ｊａｂ１の蛋白質とＣｐ蛋白質の相互作用を促進させる候補化合物と接触させる段階と、（ｃ）段階（ｂ）におけるＣｐ蛋白質の発現量を、候補化合物と接触させていない対照群の発現量と比較する段階と、（ｄ）Ｃｐ蛋白質発現量の減少を示す化合物を確認する段階とを含み、Ｊａｂ１蛋白質とＣｐ蛋白質の相互作用を促進させる物質を検定する方法に関する。
【００５３】
前記検定方法において、フラビウィルスまたはペスティウィルスのＣｐ蛋白質は、好ましくは西ナイルウィルスのＣｐ蛋白質を使用することができる。
【００５４】
Ｊａｂ１蛋白質及びＣｐ蛋白質の発現量の差は蛋白質水準またはｍＲＮＡ水準で確認することができる。
【００５５】
蛋白質発現量の水準は、それぞれの蛋白質をゲルにローディングした後、電気永動によって確認することができるが、好ましくはＪａｂ１蛋白質またはＣｐ蛋白質に対する抗体を用いた抗原−抗体複合体の形成量から免疫検定法で確認することができる。このような分析方法としては、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、免疫沈澱分析法などがある。
【００５６】
前記検出方法において、抗原−抗体複合体の形成量は、検出ラベル(detection label)のシグナルの大きさから定量的に測定可能である。このような検出ラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子(microparticle)、レドックス分子及び放射線同位元素からなる群の中から選択することができ、必ずしもこれに制限されるのではない。
【００５７】
抗原−抗体複合体の形成を検出するために、比色法(colorimetric method)、電気化学法(electrochemical method)、蛍光法(fluorimetric method)、発光法(luminometry)、粒子計数法(particle counting method)、肉眼測定法(visual assessment)及び閃光計数法(scintillation counting method)からなる群の中から選択される方法を用いることができ、必ずしもこれらに制限されるのではない。
【００５８】
ｍＲＮＡ発現量の水準は、Ｊａｂ１蛋白質またはＣｐ蛋白質に特異的なプライマーを用いて確認することができる。具体的な分析方法は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットなどがあるが、バンドのパターンと強度を確認することにより、Ｊａｂ１またはＣｐのｍＲＮＡへの転写を定量的に測定することが可能な、簡便な分析方法であるＲＴ−ＰＣＲが好ましい。
【００５９】
〔実施例〕
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、これらの実施例は本発明を例示するためのものであって、発明の範囲はこれらの実施例によって制限されない。
【００６０】
実施例１：ヒト細胞における西ナイルウィルスカプシド（ＷＮＶ−Ｃｐ）蛋白質の発現
様々なヒト細胞株におけるＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質の発現様相を調べるために、リポフェクタミン試薬を用いるトランスフェクション方法によって、ヒト腎臓２９３Ｔ細胞(Human kidney 293T cell；ＡＴＣＣ)、骨肉腫Ｕ２０Ｓ細胞(osteosarcoma U20S cell；ＡＴＣＣ)、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）、ヒト神経母細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞(human neuroblastma SK-N-SH cell；ＡＴＣＣ)にＷＮＶ−Ｃｐをトランスフェクションさせ、免疫蛍光染色を行った。
【００６１】
２９３Ｔ、Ｕ２０Ｓ、ＨｅＬａ細胞及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にｐｃＤＮＡ３−ＨＡ／ＷＮＶ−Ｃｐ（ｐｃＤＮＡ３．１ＷＮＶ−Ｃｐをテンプレートとし、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＷＮＶ−Ｃｐを増幅させ、ＷＮＶ−Ｃｐ ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切ってｐｃＤＮＡ３ＨＡプラスミドに挿入することによりｐｃＤＮＡ３ＨＡ／ＷＮＶ−Ｃｐを製作）をトランスフェクションして２４時間後に固定した後、１次ＨＡ−マウス単一クローン抗体（１：１００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と２次ＦＩＴＣコンジュゲートされた抗体(secondary fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated antibody)（１：１００）（Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫蛍光染色し、ＵＶ共進点顕微鏡でＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質（緑色）の発現を観察した。核はＤＡＰＩ（青色）で染色した。ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質は、２９３Ｔ、Ｕ２０Ｓ、ＨｅＬａ細胞株では核小体に存在し（図１）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株では細胞質に存在することを確認した（図２）。
【００６２】
主に核小体に存在するＷＮＶ−ＣｐがＳＫ−Ｎ−ＳＨで細胞質に存在することから、ＷＮＶ−Ｃｐとの相互作用を行う蛋白質の存在を類推可能である。
【００６３】
実施例２：ヒト細胞における西ナイルウィルスカプシド蛋白質の細胞死滅の誘導及び観察
ＨｅＬａ細胞でＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質によって細胞死滅が起こる細胞の典型的な特徴である核凝縮が誘導されるという報告から、ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質が細胞死滅を誘導するという事実と、このような細胞死滅がカスパーゼ−９経路を介して起こるという事実は明らかになっている。これを確認するために、アネキシン−Ｖ(Annexin-V)染色、ＰＩ染色で観察した。
【００６４】
２９３Ｔ、Ｕ２０Ｓ細胞に、対照区ベクターとしてＧＦＰ発現ベクターのｐＥＧＦＰ−Ｃ２（対照区ベクター；ＣＬＯＮＴＥＣＨ）とｐＥＧＦＰ−ＷＮＶ−Ｃｐ（ｐｃＤＮＡ３．１ＷＮＶ−Ｃｐをテンプレートとし、配列番号３と配列番号７のプライマーを用いてＷＮＶ−Ｃｐを増幅させ、ＷＮＶ−Ｃｐ ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切ってｐＥＧＦＰ−Ｃ２プラスミドに挿入することによりｐＥＧＦＰ／ＷＮＶ−Ｃｐを製作）をそれぞれトランスフェクションした。２４時間後、細胞死滅を確認することが可能なホスファチジルセリン(phosphatidylserine)をアネキシン−Ｖで染色し（赤色）、カールツァイスビジョン顕微鏡(Carl Zeiss vision microscopy)で観察した結果、ｐＥＧＦＰ−ＷＮＶ−Ｃｐをトランスフェクションした細胞で細胞死滅が起こったことを確認した（図３）。
【００６５】
２９３Ｔ細胞にＧＦＰ発現ベクターのｐＥＧＦＰ−Ｃ２（対照区ベクター）とｐＥＧＦＰ−ＷＮＶ−Ｃｐをそれぞれトランスフェクションした。４８時間後、細胞溶解物(lysate)を集めて細胞死滅を測定することが可能なＰＩ(Propidium iodide)で染色してＦＡＣＳ分析した結果、対照区ベクターのｐＥＧＦＰをトランスフェクションした場合は、１５.９７％の細胞死滅を示すが、ｐＥＧＦＰ−ＷＮＶ−Ｃｐをトランスフェクションした場合は、２７.０３％の細胞死滅を示した（図４）。
【００６６】
実施例３：西ナイルウィルスカプシド蛋白質との相互作用を行う蛋白質のスクリーニング
ＷＮＶ−Ｃｐの細胞死滅誘導は、カプシド蛋白質の細胞死滅を起こしうる調節因子との直間接的な相互作用を起こして誘導される可能性がある。したがって、カプシド蛋白質による細胞死滅が誘導される過程をより具体的に理解するために、ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質との相互作用を行う調節因子を発掘する必要がある。調節因子の発掘のために、西ナイルウィルスの主要感染組織であるヒト脳のｃＤＮＡライブラリーを用いてイーストツーハイブリッドアセイを行った。
【００６７】
まず、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてｐｃＤＮＡ３．１ＷＮＶ−ＣｐからＷＮＶ−Ｃｐ（４５０ｂｐ）をＰＣＲ法によって増幅させた。これをＴＲＰ１マーカーとＧａｌ４−ＤＮＡ結合ドメイン(binding domain)を含んだｐＧＢＫ−Ｔ７ベクターのＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位にクローニングしてｐＧＢＫ−Ｔ７ ＷＮＶ−Ｃｐ構造物を生成した。
【００６８】
配列番号３（Forward primer）
５′−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＧ−３′
配列番号４（reverse primer）
３′−ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＧＣ ＧＣＣ ＣＡＣ ＧＣＴ ＧＧＣ ＧＡＴ ＣＡＧ−５′
ｐＧＢＫ−Ｔ７ ＷＮＶ−Ｃｐプラスミドをベイト(bait)として用い、ＬＥＵ２マーカーを含んだＧａｌ４活性ドメインの下位融合産物であるヒト脳のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプレイ(prey)として用いてイーストツーハイブリッドアセイを行った。イーストストレインＡＨ１０９にバイトプラスミドｐＧＢＫ−Ｔ７ ＷＮＶ−Ｃｐをリチウムアセテート(lithium acetate)方法でトランスフェクションさせ(Gietz et al. 1995)、Ｙ１８７菌株に予め形質転換されたヒト脳のｃＤＮＡライブラリー１ｍＬを混ぜて交配させた後、選択マーカーとして用いられたアデニン、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンのないＳＤ培地を有する１５０ｍｍプレート５０個に塗抹して９４５個のコロニーを得（図５ａ）、同一のプレートにカプシド蛋白質との相互作用が可能な候補群を選択した（図５ｂ）。２回目のスクリーニングでｘ−ｇａｌを有するＳＤ（−Ａｄｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ）選択性培地でレプリカプレーティング(replica plating)して、青色を帯びるクローンを得た（図５ｃ）。このクローンを再び確認して８０個のクローンを獲得した（図５ｄ）。このクローンのプラスミドをリティケース(lyticase)を用いた方法で分離し、配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いてシーケンシングし、ブラストサーチ(Blast search)して蛋白質を糾明した。
【００６９】
配列番号５（Forward primer）
５′−ＣＴＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＡＣ ＣＣ−３′
配列番号６（reverse primer）
３′−ＡＧＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＧＧ ＴＴＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＴＣ ＴＡＣ ＧＡＴ−５′
Ｊａｂ１、ＴＰＲ１、ＲａｎＢＰＭ（ＲａｎＢＰ９）、ＰＡＰ−１ＢＰ、Snapin(Synaptosomal-associated protein)、Bassoon protein、likely ortholog of mouse rabphilin3A、ＣＧ１３２１４−ＰＡの８個の蛋白質を獲得した。
【００７０】
実施例４：Ｊａｂ１による西ナイルウィルスカプシド蛋白質の転位 (translocation)
実施例３でＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質と相互作用するものと明らかになったＪａｂ１発現が細胞に及ぼす影響を確認するために、ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質とＪａｂ１を２９３Ｔ、Ｕ２０Ｓ、ＨｅＬａ細胞株に共に同時に発現させた。２９３Ｔ、Ｕ２０Ｓ、ＨｅＬａ細胞に、ＨＡタグを有するｐｃＤＮＡ−ＨＡ／ＷＮＶ−ＣｐとＦｌａｇタグを有するｐＣＭＶ Ｔａｇ２Ｂ−Ｊａｂ１を同時にトランスフェクションさせ、２４時間後に抗−ＨＡ（緑色）抗体と抗−Ｆｌａｇ抗体（赤色）を用いて染色し、共進点顕微鏡で観察した。ＷＮＶ−Ｃｐの免疫蛍光シグナルは、Ｊａｂ１と共に細胞質に現われることを図６から分かる。ＭｅｒｇｅはＷＮＶ−ＣｐとＪａｂ１の発現を重ねて同位置に発現されるかを示し、ＰＣは位相差(Phase contrast)であって、細胞全体模様を示した。
【００７１】
ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質とＪａｂ１の相互作用を確認するための免疫沈澱（ＩＰ）分析を行った。Ｆｌａｇ−Ｊａｂ１とＨＡ−ＷＮＶ−Ｃｐプラスミドを２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクションして全体細胞溶解物を抗−ＨＡマウス抗体で免疫沈澱した。対照区として抗−Ｍｙｃ抗体を共に免疫沈澱した。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気永動してニトロセルロース膜にトランスファーした後、抗−Ｆｌａｇマウス抗体でＪａｂ１の発現を観察した（図７）。
【００７２】
ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質を免疫沈澱したとき、Ｊａｂ１の発現が観察されるので、Ｊａｂ１は２９３Ｔ細胞株でＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質と相互作用し、これによりＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質が核小体から細胞質へ転位誘導された。
【００７３】
実施例５：Ｊａｂ１による西ナイルウィルスの細胞死滅阻害
病原性蛋白質(Pathogenic protein)のＷＮＰ−Ｃｐは、ミトコンドリア／カスパーゼ−９(mitochondria/caspase-9)経路によって細胞死滅を起こすものと知られている。したがって、Ｊａｂ１が、ＷＶＰ−Ｃｐによって誘導される細胞死滅に及ぼす影響をカスパーゼ活性から調べた。
【００７４】
６０ｍｍのプレートに２９３Ｔ細胞を３×１０５で培養してｐｃＤＮＡ３−ＨＡ、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ／Ｃｐ、ｐＣＭＶ−ｔａｇ２Ｂ−Ｊａｂ１、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ／ＣｐとｐＣＭＶ−ｔａｇ２Ｂ−Ｊａｂ１、ｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘをそれぞれトランスフェクションした。２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、１．５ｍＬのチューブに細胞を集めてバッファＣ（２５％のグリセロール、０．４２Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．９）２０μＬを入れて溶解させた。氷で10分間培養した後、遠心分離して上澄液のみを集め、蛋白質の濃度を測定して９６ウェルプレートに100〜３００μｇの蛋白質を入れた。ここにカスパーゼ発色基質セットＩＩプラスキット(caspase colorimetric substrate set II plus kit；Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ)の２×反応バッファ５０μＬと４ｍＭのＤＮＡコンジュゲートされた基質５μＬを仕込み、３７℃で１時間培養した後、マイクロタイタープレートリーダー(microtiter plate reader)によって４１０ｎｍでカスパーゼ活性を測定した。カスパーゼ３とカスパーゼ９に対する各蛋白質のカスパーゼ活性を測定した結果を示すものが図８Ａである。ＷＮＶ−Ｃｐのカスパーゼ３とカスパーゼ９に対する活性は、ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｃｌ−２ファミリ蛋白質Ｂａｘと類似の活性を示し、Ｊａｂ１を共に発現させた場合、ＪａｂによるＷＮＶ−Ｃｐのカスパーゼ活性が著しく減少した。カスパーゼ活性の分析に使用した蛋白質の発現をウェスタンブロットで示したものが図８Ｂである。
【００７５】
Ｊａｂ１が細胞内に発現されると、ミトコンドリアカスパーゼ−３及び−９(Mitochondria/caspase-3, -9)経路によって細胞死滅を起こすＷＮＶ−Ｃｐを核小体から細胞質へ移動させるので、ＷＮＶ−Ｃｐによる細胞死滅が阻害されるものと判断される。
【００７６】
実施例６：Ｊａｂ１による西ナイルウィルスカプシド蛋白質の分解
Ｊａｂ１がＷＮＶ−Ｃｐの分解を促進させるかどうかを調べるために、２６Ｓプロテアソーム抑制剤のＬＬｎＬ（Ｓｉｇｍａ）を処理してＷＮＶ−Ｃｐの発現量を比較してみた。
【００７７】
６０ｍｍのプレートに２９３Ｔ細胞を３×１０５となるようプレートしてｐｃＤＡＮ３−ＨＡ／ＷＮＶ−Ｃｐ単独、ｐｃＤＡＮ３−ＨＡ／ＷＮＶ−ＣｐとｐＣＭＶ−ｔａｇ２Ｂ−Ｊａｂ１を同時にエフェクテントランスフェクション製剤(Effectene transfection reagent;Ｑｉａｇｅｎ)を用いてトランスフェクションした。同時トランスフェクションの場合、発現されるＤＮＡの量を同一にするため、トランスフェクション１２時間後、ピペッティング(pipetting)によって２つのプレートに分けた。トランスフェクション２０時間後、プロテアソーム抑制剤ＬＬｎＬ(N-acetyl-L-luecinyl-norleucinalｍ、Ｓｉｇｍａ)を２０μＭ／ｍｌの濃度で４時間処理した。処理後、１×ＰＢＳで洗浄して細胞を集めた後、５０μｇの蛋白質をローディングし、抗−ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてウェスタンブロットし、ＷＮＶ−Ｃｐの発現量を確認した。Ｊａｂ１の発現を抗−ＦｌａｇＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて調査し、アクチンはローディング対照区として用いた。
【００７８】
その結果、ＷＮＶ−Ｃｐ単独発現に比べてＪａｂ１を同時に発現させる場合、ＷＮＶ−Ｃｐの分解が誘導されて蛋白質量が著しく減少するが（図９のレイン１、２）、ＬＬｎＬを処理する場合、検出されるＷＮＶ−Ｃｐの量が増加することからみて、Ｊａｂ１によるＷＮＶ−Ｃｐの分解が抑制されることを確認した（図９のレイン３）。
【００７９】
これより、Ｊａｂ１はユビキチンプロテアソーム経路を介してＷＮＶ−Ｃｐの分解を誘導することによりＷＮＶ−Ｃｐの機能を抑制させることが分かった。
【００８０】
実施例７：信号伝達体系調節物質による細胞死滅抑制
ＳＨ−ＳＹ５Ｙに西ナイルウィルスカプシド遺伝子を注入した後、カプシド蛋白質が発現される細胞における細胞死滅率を、アネキシンＶ−ＰＥで染色してＦＡＣＳ（ＢｉｏＲＡＤ、Ｗｉｎ ＢＲＹＴＥ）で分析した。ＦＡＣＳ結果はＡ、Ｂ、ＣとＤ区域に分けられる。Ａ区域は西ナイルウィルスカプシド遺伝子が注入されておらず、アネキシンＶ−ＰＥで染色された細胞群を、Ｂ区域は西ナイルウィルスカプシド遺伝子が注入されており、アネキシンＶ−ＰＥにも染色された細胞群を、Ｃ区域は西ナイルウィルスカプシド遺伝子が注入されておらず、アネキシンＶ−ＰＥにも染色されていない細胞群を、Ｄ区域は西ナイルウィルスカプシド遺伝子が注入されているが、アネキシンＶ−ＰＥには染色されていない細胞群を示す。
【００８１】
Ｃ２−Ｃｐ遺伝子を流入していない正常細胞における細胞死滅率は１４．０％であったが（図１０）、西ナイルウィルスのカプシド蛋白質を発現する細胞の細胞死滅率は６９．６％であった（図１１）。西ナイルウィルスのカプシド蛋白質が発現されると、細胞は高い細胞死滅率を示すことが確認できた。陰性対照群として、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を注入した細胞の細胞死滅率は２３．８％を示したが（図１２）。これはＥＧＥＰの信号が非常に強くてＦＬ２の信号と交差して発生したもので、実際的には、細胞死滅率はこれより低い可能性がある。
【００８２】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙに西ナイルウィルスカプシド遺伝子をトランスフェクションし、６時間経過後、ＰＩ３Ｋ抑制剤のワートマニン(wortmanin;Ｓｉｇｍａ)２００ｎＭを処理し、Ａｋｔ抑制剤のカルビオケム(calbiochem;ＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)５μＭと５０μＭを処理した。２４時間経過後、細胞死滅過程の一つの段階を検出することが可能なアネキシンＶ−ＰＥで染色し、細胞死滅比率をＦＡＣＳ（ＢｉｏＲＡＤ、ＷｉｎＢｒｙｔｅ）で分析した。ＳＨ−ＳＹＳ５Ｙで遺伝子がトランスフェクションされた細胞比率は約１０〜３０％であった。トランスフェクションされた細胞は緑色蛍光領域のＦＬ３領域で調査し、アネキシンｖ−ＰＥ結合有無はＦＬ２領域で調査した。カプシド蛋白質が発現される細胞における細胞死滅比率は数式１で計算した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドをトランスフェクションした細胞を陰性対照群として、抑制剤を処理せずＣ２−Ｃｐプラスミドをトランスフェクションした細胞を陽性対照群として用いた。
【００８３】
【数１】
2007528345.tif 000003
西ナイルウィルスのカプシド蛋白質が発現された細胞では、６９．６％の細胞死滅が観察されたが、５０μＭのＡｋｔ抑制剤のカルビオケムと２００ｎＭのＰＩ３Ｋ抑制剤のワートマニンを処理した場合、それぞれ１５．９％と２２．８％の細胞死滅率を示し、これら抑制剤を処理した場合、西ナイルウィルスのカプシド蛋白質による細胞死滅が抑制されることが分かった（図１３〜図１５）。すなわち、西ナイルウィルスのカプシド蛋白質発現による細胞死滅が、ＰＩ３Ｋ抑制剤とＡｋｔ抑制剤を処理した場合に抑制されることを確認した。
【００８４】
実施例８：Ｊａｂ１発現による内因性(endogenous)ｐ５３発現の減少
ＣＯＰシグナロソーム複合体は、腫瘍抑制剤遺伝子ｐ５３をリン酸化させてＵｂ−２６Ｓプロテアソーム−依存的経路を介して分解させる(Bech-Otschir et al., EMBO J., 20(7):1630-1639, 2001)。Ｊａｂ１はＣＯＰシグナロソーム複合体の構成要素中の一つなので、ｐ５３とＪａｂ１が相互作用するものと見なし、Ｊａｂ１がｐ５３の発現に及ぼす影響を調査した。
【００８５】
Ｕ２０Ｓ細胞にＦｌａｇ／ｍｄｍ２（対照区）とＦｌａｇ／Ｊａｂ１をそれぞれ１、３、５μｇの濃度でリポフェクタミン／プラス試薬(lipofectamin/plus reagent；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いてトランスフェクションした。４８時間後、細胞溶解物を集め、ＢＳＡ（ＰＩＥＲＣＥ）定量法で濃度を測定した。全て１００μｇ／ｍＬの蛋白質を１０％のＳＤＳゲルを用いて分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。このブロットを５％のスキムミルク(skim milk)で３０分間ブロッキングしてＨＡ抗−ウサギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とＦｌａｇ抗−マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてｍｄｍ２とＪａｂ１の発現増加に伴うｐ５３の発現量を調べた。ｐ５３は対照区のｍｄｍ２蛋白質によって殆ど影響されないが、細胞内で発現されるＪａｂ１蛋白質の濃度が増加するほど、ｐ５３の濃度は著しく減少した（図１６）。
【００８６】
実施例９：Ｊａｂ１アデノウィルス安定細胞株(stable cell line)の構築
Ｊａｂ１の過発現を誘導するアデノウィルス安定細胞株を構築するために、ＡｄＥａｓｙ ＸＬ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。Ｊａｂ１をｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰベクターのＢｇｌＩＩ／ｐｖｕＩ酵素部位にクローニングした（図１７Ａ及びＢ）。製造されたｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ／Ｊａｂ１をマキシプレプ(maxi prep)で精製した後、ＰｍｅＩで切って連結し、その後ＡＤ１を含んでいるＢＪ５１８３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にバクテリア形質転換して相同的組み換えアデノウィルスプラスミド(homologous recombinant adenovirus plasmid)を生産した。成長したコロニーを分離して液体培地で培養した後、ＤＮＡを抽出した。これをさらにＰａｃＩ酵素で切ってクローニングを確認した（図１７Ｃ）。確認されると、哺乳類ＡＤ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にリポフェクタミン／プラス試薬(lipofectamin/plus reagent；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて形質転換して増幅した。生産されたアデノウィルスをさらにＡＤ２９３細胞にトランスフェクションしてＪａｂ１アデノウィルス安定細胞株を作った。
【００８７】
アデノウィルス安定細胞株の生産に使用されたＡｄ１−Ｊａｂ１プラスミドは、２００４年８月３１日付けで国際寄託機関の韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１ユリムビル２階所在の韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture Center of Microorganisms）に受託番号ＫＣＣＭ１０５９３で寄託した。
【００８８】
実施例１０：ＮＩＨ３Ｔ３ Ｊａｂ１レトロウィルス安定細胞株の生産
ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ／Ｊａｂ１プラスミドからＨＡ／Ｊａｂ１を得た後、レトロウィルスを生産することが可能なｐＬＰＣＸベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にＥｃｏＲＩ酵素部位にクローニングしてｐＬＰＣ／ＨＡ−Ｊａｂ１を作った。ピューロマイシン(puromycin；Ｓｉｇｍａ)抵抗性遺伝子をもっているｐＬＰＣ／ＨＡ−Ｊａｂ１とウィルスをパッケージングすることが可能なｐＣＬプラスミド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を共に２９３Ｔ細胞にリポフェクタミン（Ｉｎｖiｔｒｏｇｅｎ）を用いて同時にトランスフェクションして２日後にウィルスが生産されると、０．４５μｍのフィルタを用いてウィルスのみを精製した。生産されたウィルス１ｍＬと培地２ｍＬを入れ、感染を助けるポリブレン（Ｓｉｇｍａ）４μｇ／ｍＬをＮＩＨ３Ｔ３細胞に共に入れて感染を行った。２４時間後、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）含有培地に交換した後選別を行って、Ｊａｂ１レトロウィルス安定細胞株を作った。前記細胞株で生産されたウィルスＲｅｔｒｏ−Ｊａｂ１を２００４年８月３１日付けで国際寄託機関の韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１ユリムビル２階所在の韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture Center of Microorganisms）に受託番号ＫＣＣＭ１０５９２で寄託した。Ｊａｂ1のない対照細胞株とＪａｂ１高発現細胞株でＪａｂ１とｐ５３の発現度合いを検査した。レトロウィルス安定細胞株においてＪａｂ１は高発現し、これによりｐ５３の発現は減少した（図１８）。
【００８９】
図１８に示したｐ５３の発現減少は、実施例８の実験結果と一致するもので、Ｊａｂ１を過発現する組み換えレトロウィルスを用いた安定的な遺伝子転移(gene transfer)によって、ウィルスによるカプシド蛋白質を分解することができることを示す。
【００９０】
〔産業上の利用可能性〕
上述したように、本発明のＪａｂ１を含むウィルス感染疾患治療組成物は、フラビウィルスまたはペスティウィルスの感染によって誘発される発現、発疹、出血、黄疸、関節痛、筋肉痛、脳炎または髄膜炎などの疾患を効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は様々な腫瘍細胞における西ナイルウィルスカプシド（Ｃｐ）蛋白質発現様相を示す免疫蛍光分析結果である。
【図２】図２はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞における西ナイルウィルスカプシド蛋白質の発現様相を示す免疫蛍光分析結果である。
【図３】図３は様々な細胞で西ナイルウィルスカプシド蛋白質が細胞死滅を誘導することを示すアネキシンアセイ結果である。
【図４】図４は２９３Ｔ細胞で西ナイルウィルスカプシド蛋白質が細胞死滅を誘導することを示すＦＡＣＳ結果である。
【図５】図５は西ナイルウィルスカプシド蛋白質と相互作用する蛋白質を有するクローンを得るイーストツーハイブリッドアセイ過程を示す。
【図６】図６は西ナイルウィルスカプシド蛋白質がＪａｂ１によって核小体から細胞質へ移動したことを示す免疫蛍光結果である。
【図７】図７は西ナイルウィルスカプシド蛋白質がＪａｂ１と相互作用することを示す免疫沈澱結果である。
【図８】図８はＪａｂ１が西ナイルウィルスカプシド蛋白質と同時発現される場合にカスパーゼ活性が低下することを示す結果である。
【図９】図９は２６Ｓプロテアソーム抑制剤ＬＬｎＬを処理する場合にＪａｂ１による西ナイルウィルスカプシド蛋白質の分解が著しく抑制されることを示すウェスタンブロット結果である。
【図１０】図１０はＣ２−Ｃｐ遺伝子の挿入されていない正常細胞群における細胞死滅を示すＦＡＣＳ結果である。
【図１１】図１１はｐＥＧＦＰ−Ｃ２−Ｃｐプラスミドに遺伝子が注入された細胞群における細胞死滅率を示すＦＡＣＳ結果である。
【図１２】図１２はｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドに遺伝子が注入された細胞群における細胞死滅率を示すＦＡＣＳ結果である。
【図１３】図１３はｐＥＧＦＰ−Ｃ２−Ｃｐプラスミドに遺伝子が注入された細胞に２００ｎＭのＰＩ３Ｋ抑制剤を処理した細胞群における細胞死滅率を示すＦＡＣＳ結果である。
【図１４】図１４はｐＥＧＦＰ−Ｃ２−Ｃｐプラスミドに遺伝子が取り込まれた細胞に５μＭのＡｋｔ抑制剤を処理した細胞群における細胞死滅率を示すＦＡＣＳ結果である。
【図１５】図１５はｐＥＧＦＰ−Ｃ２−Ｃｐプラスミドに遺伝子が取り込まれた細胞に５０μＭのＡｋｔ抑制剤を処理した細胞群における細胞死滅率を示すＦＡＣＳ結果である。
【図１６】図１６はＪａｂｌ濃度の増加に伴うｐ５３発現の減少を示すウェスタンブロット結果である。
【図１７】図１７はＪａｂｌアデノウィルス安定細胞株の構築過程のためのベクターシステム製作過程を示す。
【図１８】図１８はＮＩＨ３Ｔ３ Ｊａｂ１レトロウィルス安定細胞株の構築を示すウェスタンブロット結果である。
【国際調査報告】
2007528345.tif 000004
2007528345.tif 000005