(57)【要約】  本発明の非治療的な動物の飼育方法は、同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥ誘導体を、単独で又は添加剤及び/又は飼料物質と混合して、飼育される単胃動物に経口的に投与することからなり、上記ビタミンＥ誘導体はソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた消化性乳化剤の少なくとも１種の存在下で上記動物に投与される。本発明は、更に、安定なビタミンＥ誘導体と少なくとも１種の消化性乳化剤とからなる製剤及び消化性乳化剤の動物栄養における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥ誘導体を、単独で又は添加剤及び/又は飼料物質と混合して、飼育される単胃動物に経口的に投与することからなる非治療的な動物の飼育方法において、上記ビタミンＥ誘導体をソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた消化性乳化剤の少なくとも１種の存在下で上記動物に投与することを特徴とする非治療的な動物の飼育方法。
【請求項２】
ビタミンＥ誘導体と前記の少なくとも１種の乳化剤とを同時に動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビタミンＥ誘導体を動物に投与する前に前記の乳化剤を動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ビタミンＥ誘導体及び/又は前記の少なくとも１種の乳化剤を飼料物質と混合する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記の少なくとも１種の乳化剤は、ソルビトールと、少なくとも11個の炭素原子を有する飽和又は不飽和炭化水素鎖を有する脂肪酸とのエステルから選ばれる、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥの誘導体を含有する動物の栄養用消化性製剤であって、ソルビトールの非エトキシルかエステルから選ばれた、少なくとも１種の消化性乳化剤を更に含有することを特徴とする消化性製剤。
【請求項７】
ソルビトールと脂肪酸の非エトキシルかエステルから選ばれた２種の消化性乳化剤を含有する、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
１種又は２種以上の乳化剤とビタミンＥ誘導体の重量比は10/1〜1/200である、請求項６又は７に記載の製剤。
【請求項９】
１種又は２種以上の乳化剤とビタミンＥ誘導体の重量比は1/5〜1/100である、請求項６又は７に記載の製剤。
【請求項１０】
前記の少なくとも１種の乳化剤は、ソルビトールと、少なくとも11個の炭素原子を有する飽和又は不飽和炭化水素鎖を有する脂肪酸とのエステルから選ばれる、請求項６〜９のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１１】
ビタミンＥ誘導体はビタミンＥ エステルである、請求項６〜１０のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１２】
ビタミンＥ誘導体はビタミンＥ アセテートである、請求項６〜１０のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１３】
前記の少なくとも１種の乳化剤は、モノラウレエート、モノパルミテート、モノステアレエート、モノオレエート及びトリステアレートから選ばれたソルビトールエステルである、請求項６〜１２のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１４】
ビタミンＥ アセテートと、ソルビトール モノラウレエート及びソルビトール モノオレエートから選ばれた少なくとも１種の乳化剤とを含有する、請求項６〜１３のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１５】
ソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた消化性乳化剤の、ビタミンＥ誘導体に基づく動物の栄養用消化性製剤の調製における使用。
【請求項１６】
同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥの誘導体と、ソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた栄養性乳化剤との組合の、飼育される単胃動物におけるビタミンＥの生体利用性を増大させるための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、ブタ及び家禽のごとき飼育される(reared)単胃動物
(monogastric animal)及び更に魚類及びエビにビタミンＥを投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＥ、即ち、d-α-トコフェロールは、天然においては、主として植物油中で見出される；ビタミンＥは種々の合成経路の最後に、ラセミ型のd,l-α-トコフェロール
(Tolと略記される)として得られる。本来の状態では、ビタミンＥは任意の疎水性相又は脂質相と任意の割合で混和する油状の親油性液体である。ビタミンＥは極めて不安定であり、容易に酸化され、酸化された状態ではその生物学的活性の大部分を失う。動物におけるその生体利用性(bioavailability)は、経口的に投与した場合、50％を越えない；その理由は、ビタミンＥは急速に酸化されるため、その大部分が酸化された、不活性な形で吸収されるからである。従って、経口的に投与する場合、ビタミンＥは、一般的には、ビタミンＥのエステル、例えば酢酸エステル及び塩から選ばれた、より安定な誘導体の形である。
【０００３】
本発明に最も近似する従来技術及びこの従来技術において遭遇する問題を取り扱う前に、及び、本発明を提示する前に、以下の記載において理解されるごとき生体利用性の定義を以下に述べる。ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体の生体利用性は、動物の食餌(ration)中に存在するビタミンＥの濃度に関連して、或いは、ビタミンＥ誘導体が投与される場合には、動物の食餌中に導入されたビタミンＥ誘導体の、ビタミンＥ当量(vitamin E 
equivalent)で表される濃度に関連して、血液中に放出されるビタミンＥの濃度によって表される。従って、このビタミンＥの生体利用性の表現では、消化の進行中の腸管内のビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体の吸収が考慮されている。
【０００４】
T．Julianto等、International Journal of Pharmaceutics，200 (2000) pp 53-57によれば、これらの著者は、ビタミンＥのパーム油中の溶液を調製し、この溶液を乳化剤の混合物中で乳化している；溶液を水で稀釈した後、かかる溶液中のビタミンＥのヒトにおける生体利用性を検討し、ビタミンＥをカプセルの形で供給した場合の生体利用性と比較している。上記の著者等によれば、ビタミンＥの生体利用性は、ビタミンＥを上記溶液中に供給した場合には３倍大きい。エステル化されていない形のビタミンＥの不安定性を考慮に入れた場合、この種の溶液は食品補充剤(feed supplement)中では使用することができない。
【０００５】
ビタミンＥをビタミンＥ アセテート、即ち、d,l-α-トコフェリル アセテート(Tac)の形で、種々の担体に支持させて、例えば、シリカ上に吸着させて、或いは、種々の物理的形態で、例えば、水中油型エマルジョンの形で投与する、動物用の種々の食品補充剤、特に、本出願人によって市販されているものが知られている。
【０００６】
H．E．Gallo-Torresによる、Lipids (1970) Vol．５，No.４，p379-384の出版以来、
Tacはヒト又は動物において、直接、同化されず(assimilate)、実際には、コレステロールエステルヒドロラーゼ(CEHと略記される)と呼ばれる膵臓酵素の作用によって胃腸管内でビタミンＥに加水分解され、このビタミンＥは腸管を経て最終的に吸収されることが知られている。しかしながら、Tacは、問題の動物が何であれ、極めて限られた、例えば、最良でも40％の生体利用性しか有していない。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ビタミンＥ誘導体、特に、Tacの生体利用性を改善することである。
【０００８】
極めて驚くべきことに、特定の乳化剤を存在させることにより、ビタミンＥ誘導体の生体利用性を著しく増大させることができることが見出された；このビタミンＥの誘導体は同化し得る形(assimilable)のビタミンＥに加水分解することができるものである。この乳化剤は消化性であり(alimentary)、ソルビトールと脂肪酸の非エトキシル化エステルから選ばれる。
【０００９】
ロシア特許SU-1,676,572号には、ビタミンＥ アセテート、ポリエトキシル化乳化剤及びエタノールからなる組成物が開示されている。この組成物は所定の期間に亘って、一日に３mg程度のビタミンＥが吸収されるような割合で家禽用飲料水に添加される。上記特許の発明者らはビタミンＥの同化性、生存率及び家禽の体重の増加が、慣用の組成物について得られるものより若干大きいことを観察している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ビタミンＥをその飼育動物の食餌中に投与した場合の、その生体利用性の問題は、既知の組成物を使用した場合に得られる水準が余りにも低いため、解決されていない。
【００１１】
本出願人は、特に、ポリエトキシル化乳化剤と比較して明らかにすぐれている本発明の組成物のビタミンＥの生体利用性に対する、本発明に従った乳化剤の効果を立証した。更に、本出願人は、前記乳化剤は胃腸管内でのビタミンＥ誘導体の、その同化性型への加水分解を促進することを発見した；この現象は生体利用性のビタミンＥの放出に好ましい影響を与える。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下においては、本発明をより詳細に説明する；その利点は実施例、特に、比較例に例示されている。
【００１３】
本発明の好ましい態様によれば、乳化剤は長鎖脂肪酸エステル、例えば、炭素数が少なくとも11個の飽和又は不飽和炭化水素鎖を有する長鎖脂肪酸エステルから選ばれる。
【００１４】
従って、本発明は、第１に、1回にかつ同時に、ビタミンＥがその吸収部位に到達するまで保護されているかつ高度に生体利用性であるビタミンＥ誘導体の製剤を、飼育される単胃動物に投与することを可能にする動物の飼育方法に関する。本発明の方法は、同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥ誘導体を、それ単独で又は添加剤及び/又は飼料物質と混合して、ソルビトールと脂肪酸の非エトキシル化エステルから選ばれた、少なくとも１種の消化性乳化剤の存在下、飼育される単胃動物に経口的に投与することからなる動物の非治療的な飼育方法である。
【００１５】
本発明によれば、脂肪酸は、好ましくは、ｎ個の炭素原子(ｎは０〜30の整数である)を有する、飽和または不飽和の炭化水素鎖を有するモノカルボン酸である。本発明のより有利な態様によれば、脂肪酸は炭素数が少なくとも11個の飽和または不飽和の炭化水素鎖を有する。
【００１６】
本発明の方法によれば、ビタミンＥの誘導体と乳化剤は同時に又は逐次的に動物に投与し得る；例えば、ビタミンＥ誘導体を投与する前に乳化剤を動物に供給し得る。従って、ビタミンＥ誘導体及び/又は乳化剤を食餌物質と混合し得る。
【００１７】
本発明は、更に、特に、前記の方法を満足させることのできる動物の栄養用消化性製剤であって、同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥ誘導体と、ソルビトールと脂肪酸の非エトキシル化エステルから選ばれた、少なくとも１種の消化性乳化剤とを含有する消化性製剤(alimentary formulation)に関する。本発明の一つの態様によれば、上記定義に相当する２種の消化性乳化剤を使用することが好ましい。
【００１８】
本発明の消化性製剤は下記の特性の少なくとも一つを満足させることが好ましい。
【００１９】
乳化剤(単一又は複数)とビタミン誘導体の重量比が0/1〜1/200の間で変動し得る；この比は1/5〜1/200であることが有利である。
【００２０】
ビタミンＥ誘導体はビタミンＥ エステル、、特に、ビタミンＥアセテートであることが好ましい。
【００２１】
好ましい乳化剤はモノラウレート(SML)、モノパルミテート(SMP)、モノステアレート
(SMS)、モノオレエート(SMO)及びトリステアレートから選ばれる。モノオレエートが好ましい。
【００２２】
後記実施例に例示されるごとく、本発明の有利な製剤はビタミンＥアセテートと、ソルビトールモノラウレート及びソルビトールモノモノオレエートから選ばれた少なくとも１種の乳化剤とからなる。
【００２３】
本発明の他の主題は、ソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた消化性乳化剤の、ビタミンＥ誘導体に基づく動物の栄養用の消化性製剤の調製における使用である；上記脂肪酸は前記定義に対応することが有利である。
【００２４】
更に、本発明の他の主題は、飼育される単胃動物における生体利用性を増大させるための、上記消化性乳化剤の使用である；上記ビタミン誘導体は、同化し得る形のビタミンＥ
に加水分解することができるものである。
【００２５】
以下の実施例は、本発明に従った乳化剤の、ビタミンＥ誘導体の生体利用性への影響、既知の乳化剤と比較した場合のその優れた効果及びビタミンＥ誘導体の加水分解に対するその効果を、図面を参照して例示するものである。
【００２６】
図１は、ビタミンＥ当量で表したかつnmoles/cm２で表した、細胞培養によって固定された量と、nmoles/cm２で表した、インキュベートしたTacの量との関係を示すグラフである；上記Tacのインキュベートは、SMOを使用することなしに(空白カラム)及び0.05％のSMOを使用して(ハッチカラム)行った。
【００２７】
図２及び３は、黒色カラムに示されているレチニルアセテート(Rac、内部対照)、ハッチカラムに示されているTac及び空白カラムに示されている d,l-α-トコフェロールに対応する、ビタミンＥ当量で表された固定量と、Tacと共にインキュベートされる乳化剤の存在又は不存在及び種類との関係を示すグラフである。図２によれば乳化剤/ビタミンＥ当量比は６であり、この値は、図３によれば１である。
【００２８】
図４は、実施例５、5.2)に記載される条件下での、TacのTolへの加水分解の程度と、インキュベーション時間との関係を示す。
【００２９】
図５は、実施例５、5.1)に記載される条件下での、TacのTolへの加水分解の程度と、インキュベーション時間との関係を示す。
【００３０】
実施例１：生体外細胞系での、ビタミンＥ アセテート(Tac)の吸収に対する乳化剤の影響
適当な細胞モデルについての生体外での評価を実施することにより、ビタミンＥ当量で表した、細胞によって固定されたTacの量の測定を下記の方法、即ち、一方では、Tacだけの存在下で、他方では、Tacと本発明に従った消化性乳化剤の１種又はそれ以上との存在下で対応する細胞培養物(cell culture)をインキュベートすることにより行った。
【００３１】
選択された細胞モデルはCaCo-２と呼ばれるかつAmerican Type Culture Collection
(ATCC)からHTB-37の参照番号で入手又はアクセスされる親細胞系である。
【００３２】
この評価試験によれば、予め同定された細胞系の細胞培養物を、Tacの水中の懸濁物からなるミセルの存在下で３時間インキュベートした。
【００３３】
細胞培養物中に導入されるミセルの量を、nmoleのTac/cm２として測定し、４から60nmole/cm２の間で変動させた。
【００３４】
かくして、細胞培養物中に導入されたTacの濃度の各々について、細胞培養物によって固定されたTacの量であって、ビタミンＥ当量/cm２で表されるかつnmol/cm２ので表される
Tacの量を、一方では、前記培養物中に乳化剤を導入することなしに測定し、他方では、
0.05％(m/v)の量の乳化剤SM0(ソルビタン モノオレエ−ト)の存在下で測定した；このパーセンテージは培養物中に導入された乳化剤の質量を、同一の培養物中に導入されたミセルの容量で割ることによって得られる。
【００３５】
図１に示すグラフは、ビタミンＥ当量で表されるかつnmol/cm２で表される固定された
Tacの量と、nmol/cm２で表されるインキュベートTacの量との比較を示している；空白カラムはSMOなしに導入されたミセルに関するものであり、ハッチカラムは0.05％のSMOと共に導入されたミセルに関するものである。対応するビタミンＥ当量で表される量により、最終評価において、乳化剤SMOを使用した場合に６倍大きい細胞によるTacの固定の程度が、観察した時点まで、インキュベートされるTacの量に比例して増大することが判る。
【００３６】
実施例２：生体外細胞系での、ビタミンＥアセテート(Tac)の吸収及びビタミンＥの吸収に対する乳化剤の影響
2.1) 実験プロトコール：
吸収評価試験は、前記と同様の細胞系を使用して、この細胞を腸管媒体に類似するかつコレステロールエステルヒドロラーゼ(CEH)、動物内でTacをビタミンＥに加水分解する膵臓酵素及び胆汁酸塩に相当するタウロコール酸ナトリウムを含有する生理的媒体中で３時間インキュベートすることにより行った。この媒体は、水中油型エマルジョンの形で、即ち、ミセルの形で入手され、商業的にM20の商品番号で識別される。Tac及び、適当な場合には、試験される乳化剤をこの媒体中に導入した。各々のウエル中にTacの形で導入された、ビタミンＥ当量で表される濃度は156μMである。
【００３７】
上記した媒体と、それぞれ、異なる乳化剤を含有する６−ウエルプレート(各々のウエルの場合、9.6cm２の面積を提供する)３個を各々の評価試験で使用した。従って、各々の試験は３回行った。
【００３８】
2.2) 添加した乳化剤の、M20のTac(ビタミンＥ当量)に対する重量比＝約６
この評価試験によれば、M20媒体中に導入された乳化剤の濃度は、M20の容量当たりの乳化剤の質量で表して、0.05％である；この比は、M20のTacに対する添加された乳化剤の重量比の６に概略、相当する。
【００３９】
６種の試験を行った；各々の試験は、下記のごとく、３時間、インキュベーションを行うことからなるプロトコ−ルを使用して、３回反復して行った：
1) M20、単独、ウエル１個当たり、M20 ２mMの割合；従って、Tacは単独であり、乳化剤を使用していない；
2) M20 ＋ SML(ソルビタン モノラウレート)乳化剤；
3) M20 ＋ SMP(ソルビタンン モノパルミテート)乳化剤；
4) M20 ＋ ESML(ポリオキシエチル化ソルビタン モノラウレート)乳化剤；
5) M20 ＋156μMのTac及び156μMの d、l-α-トコフェロールの混合物；
6) 分析を確証するための、Rac(レチニルアセテート)と称する内部対照。
【００４０】
各々の評価について、そして、ウエル１個当たりの固定されたビタミンＥ当量の
nmolで表して、図２に示すグラフは、下記のものを示す：
−Racの量；黒色カラムに示されている；
−細胞によって固定されたTacの量；ハッチカラムに示されている；及び
−加水分解によって得られついで固定されたビタミンＥの量；空白カラムに示されてい    る。
【００４１】
評価試験２）及び３）によって示されるごとく、細胞培養物によって吸収されるビタミンＥの量は、M2O自体から吸収されるものと比較して、約50％増大している。
【００４２】
これと対照的に、評価試験４）においては、乳化剤を使用しない評価試験１）と比較して、エトキシル化乳化剤２）(SML)に相当する乳化剤 ESMLは、Tac及びビタミンＥの吸収を阻害することが観察される。
【００４３】
予期しなかったことに、乳化剤のエトキシル化により、Tac及びビタミンＥの吸収についての本発明の乳化剤の好ましい影響が抑制されることが見出された。
【００４４】
2.3) 添加した乳化剤の、M20のTac(ビタミンＥ当量)に対する重量比＝約１
この評価試験によれば、M20媒体中に導入される乳化剤の濃度は、M20の容量と比較した乳化剤の質量として表して0.01％である；この比は、M20のTacに対する添加された乳化剤の重量比の１に概略、相当する。
【００４５】
６種の試験を行った；各々の試験を３回行い、３時間、インキュベーションを行うことからなるプロトコ−ルを使用して、下記のごとく行った：
1) M20、単独、ウエル１個当たり、M20 ２mMの割合；従って、これは、タウロコール酸及びTac単独を表す；
2) M20 ＋ SML(ソルビタン モノラウレート)乳化剤；
3) M20 ＋ SMP(ソルビタンン モノパルミテート)乳化剤；
4) M20 ＋ SML乳化剤及びSMP乳化剤；
5) M20 ＋ SMO(ソルビタン モノオレエート)乳化剤；
6) 分析を確証するため内部対照、即ち、Rac。
【００４６】
各々の評価について、そして、ウエル１個当たりの固定されたビタミンＥ当量の
nmolで表して、図３に示すグラフは、下記のものを示す：
−Racの量；黒色カラムに示されている；
−細胞によって固定されたTacの量；ハッチカラムに示されている；及び
−加水分解によって得られついで固定されたビタミンＥの量；空白カラムに示されてい    る。
【００４７】
Tacの量に対する乳化剤の比率が低い場合でも(2.2)と比較して)、本発明による乳化剤はTac及びビタミンＥの吸収に影響することが認められる。
【００４８】
実施例３：生体外細胞系でのTac及びビタミンＥの吸収に対する本発明の乳化剤の影響と対応するエトキシル化乳化剤の影響との比較
3.1) 実験プトトコール
一般的な実験条件は、ウェルの面積とM20媒体中に導入されたTacの濃度が異なること以外、実施例２、2.1)に記載したプロトコールと同一である。ウェルの面積は6.5cm２であり、Tacの濃度は23.7μM/cm２である。
【００４９】
3.2) SML、SMP及びESMLの比較：
４種の試験を行った；各々の試験を３回反復し、37℃で１時間、インキュベーションを行うことからなるプロトコ−ルを使用して、下記のごとく行った：
1) M20単独、２mMの割合；従って、Tac単独であり、乳化剤は使用していない；
2) M20 ＋ SML(ソルビタン モノラウレート)乳化剤；
3) M20 ＋ SMP(ソルビタンン モノパルミテート)乳化剤；
4) M20 ＋ ESML(エトキシル化ソルビタン モノラウレート)。
【００５０】
評価試験２）、３）及び４）の各々の場合において、添加された乳化剤とTac(ビタミンＥ当量)の重量比は1:6.9である。
【００５１】
得られた結果は表１に示されている。
【００５２】
2007508834.tif 000002
【００５３】
これらの結果から、本発明に従った乳化剤により、ビタミンＥ当量で表したTol又はTacの吸収率が、乳化剤を使用しない対照評価試験 1)と比較して、SMLの場合、1.9倍、SMPの場合、1.78倍、増加することに注目される。
【００５４】
これと対照的に、エトキシル化乳化剤(ESLM)は、ビタミンＥの吸収率を評価試験 1)と比較して、0.76倍減少させることが認められる。
【００５５】
3.3) SML、SMP及びMOSEの比較：
４種の試験を行った；各々の試験を３回反復し、37℃で１時間、インキュベーションを行うことからなるプロトコ−ルを使用して、下記のごとく行った：
1) M20、単独、；従って、Tac、単独であり、乳化剤は使用していない；
2) M20 ＋ SML(ソルビタン モノラウレート)乳化剤；
3) M20 ＋ SMP(ソルビタンン モノパルミテート)乳化剤；
4) M20 ＋ MOES(エトキシル化ソルビタン モノラウレート)。
【００５６】
評価試験２）、３）及び４）の各々の場合において、添加された乳化剤とTac(ビタミンＥ当量)の重量比は1:6.9である。
【００５７】
得られた結果は表２に示されている。
【００５８】
2007508834.tif 000003
【００５９】
これらの結果から、本発明に従った乳化剤により、ビタミンＥ当量で表したTol及びTacの吸収率が、乳化剤を使用しない対照評価試験 1)と比較して、SMLの場合、1.92倍、SMPの場合、1.81倍、増加することに注目される。
【００６０】
エトキシル化乳化剤(MOSE)は、ビタミンＥの吸収率を評価試験 1)と比較して、僅かしか増大させないことも認められる。
【００６１】
実施例４：Tacの、その支持体からの開放に対する本発明に従った乳化剤の影響
この実施例においては、シリカに結合したTacの開放に対する、本発明に従った乳化剤、即ち、SMO(ソルビタンモノオレエート)の影響を試験した。この目的のために、乳化剤を使用しない試験については、重量比で１：１のTacとシリカ支持体及び重量比で50:5:45のTac＋乳化剤(SMO)＋シリカを使用した。
【００６２】
上記シリカ上の10gのTac(適当な場合、＋SMO)(即ち、Tacの最終濃度10μM)を、撹拌しながら、38℃で、異なるpH条件下、下記の溶液中で、2.5時間インキュベートした。
【００６３】
35mMリン酸塩、pH 6.5、0.15mM Nacl又は35mM HCl/グリシン、pH2.5。
【００６４】
下記の表３に示す結果が得られた。
【００６５】
2007508834.tif 000004
【００６６】
pH2.5においては、SMOの添加により、Tacの、その(シリカ)支持体からの開放が1.18倍、即ち、18％以上、増大した。
【００６７】
pH6.5においては。この増加率は1.21倍(即ち、21％以上)であった。
【００６８】
実施例５：TacのTolへの生体外加水分解に対する、本発明に従った乳化剤の影響
5.1) SMOの影響
この実施例では、TacのTolへの加水分解に対する、本発明に従った乳化剤、即ち、SMO
(ソルビタンモノオレエート)の影響を試験した。この目的のために、乳化剤を使用しない試験についてはTacを使用し、また、10:1の重量比のTac＋SMOを使用した。
【００６９】
0.5gのTac(適当な場合、＋ SMO)(即ち、Tacの最終濃度10μM)を、撹拌しながら、38℃で、下記の溶液中で、16時間インキュベートした。
【００７０】
35mMのリン酸塩、pH 6.5、0.15mMのNacl、パンクレアチン：Tac の重量比 ２：１のパンクレアチン及び胆汁酸塩(bile salt)：Tac の重量比 ５：１の胆汁酸塩。
【００７１】
パンクレアチンは、特に、コレステロールエステルヒドロラーゼからなる膵臓エキスであり、胆汁酸塩はCEH活性化剤を含有している。
【００７２】
Tacの当初の量と比較したビタミンＥの放出の程度を、前記した条件下、異なるインキュベート時間で測定した。
【００７３】
図４に示されている曲線は、溶液中のTolの濃度(w/w％)として表される加水分解の程度とインキュベーション時間の関係を示す。
【００７４】
SMO(■)は、乳化剤を使用しない試験(◆)と比較して、TacのTolへの加水分解の程度を (加水分解曲線のスロープの比率から計算して)、22％増大させることが注目される。
【００７５】
5.2) インキュベーション溶液中の胆汁酸の濃度に対するSMOの影響
この実施例では、TacのTolへの加水分解に対する、本発明に従った乳化剤、即ち、SMO
(ソルビタンモノオレエート)の影響を試験した。この目的のために、乳化剤を使用しない試験についてはTacを使用し、また、１０：１の重量比のTac＋SMOを使用した。
【００７６】
４mgのTac(適当な場合、＋ SMO)(即ち、Tacの最終濃度8.45μM)を、撹拌しながら、37℃で、下記の溶液中で、３時間インキュベートした。
【００７７】
35mMのリン酸塩、pH 6.5、0.15mMのNacl、２mgのパンクレアチン、即ち、パンクレアチン：Tac の重量比 １：２及び種々の濃度の胆汁酸塩。
【００７８】
下記の評価試験を行った。
【００７９】
1) Tac；乳化剤を使用せず；10mMの胆汁酸塩を使用；
2) Tac＋SMO；10mMの胆汁酸塩を使用；
3) Tac；乳化剤を使用せず；20mMの胆汁酸塩を使用；
4) Tac＋SMO；20mMの胆汁酸塩を使用；
5) Tac；乳化剤を使用せず；50mMの胆汁酸塩を使用；
6) Tac＋SMO；50mMの胆汁酸塩を使用。
【００８０】
インキュベーション前及び前記条件下でインキュベーションを行ってから１時間及び３時間後、Tacの当初の量と比較して、ビタミンＥの放出の程度を測定した。
【００８１】
図４のグラフは、各々の試験についての、溶液中のTolの濃度(w/w％)で表される加水分解の程度を示す。
【００８２】
前記の場合と同様、SM0は、CEHを活性化することにより、TacのTolへの加水分解の程度を著しく増大させることが注目される。この増加は胆汁酸塩の濃度に依存する：即ち、胆汁酸塩の濃度が50mMの場合、２倍になり、胆汁酸塩の濃度が20mMの場合、4.1倍になり、胆汁酸塩の濃度が10mMの場合、4.7倍になる。
【００８３】
実施例６：Tacの、その支持体からの開放に対する乳化剤の影響及び開放されたTacのTol
への加水分解の影響の両者を測定することにより得られた、TacからのビタミンＥの生体利用性に対する、本発明に従った乳化剤の影響；
この実施例では、本発明に従った乳化剤、即ち、SMO(ソルビタンモノオレエート)の影響を検討した。この目的のために、乳化剤を使用しない試験では、重量比で１：１のシリカ支持体上のTacを使用し、また、重量比で50:5:45の、Tac＋乳化剤(SMO)及びシリカを使用した。
【００８４】
８mgのTac(適当な場合、＋ SMO)(即ち、Tacの最終濃度16.9μM)を、撹拌しながら、37℃で、下記の溶液中で、３時間インキュベートした。
【００８５】
35mMのリン酸塩、pH 6.5、0.15mMのNacl、パンクレアチン(２mg)及び胆汁酸塩(20mM)。  
インキュベーション前及び前記条件下でインキュベーションを行ってから１時間及び３時間後、溶液中のビタミンＥの放出の濃度を測定し、Tacの当初の量と比較した。
【００８６】
表４に示す結果が得られた。
【００８７】
2007508834.tif 000005
【００８８】
Tacの、その支持体からの解放の効率及びTacのTolへの加水分解の効率により評価した場合、SMOを添加することによりTacの生体利用性が改善される。この増加はインキュベーションを３時間行った後には、開放が増大し、加水分解が促進されるため、90％以上に到達する。
【００８９】
実施例７：盲腸切除したオンドリにおけるビタミンＥの排出に対する乳化剤の影響
盲腸切除した(caecectomized)オンドリについて２系列の試験を行った。第一の系列では32羽のオンドリを使用し、第二の系列では51羽のオンドリを使用した。オンドリに
Tac(ビタミンＥアセテート)、又は、本発明に従った消化性乳化剤の１種又は２種と種々の割合で組合せたTacを配合した食餌を“乾燥摂食”(“dry gavage“)により投与した。
【００９０】
Tac又はTacの組合せはゼラチンカプセル中で製剤した；この製剤は、ピペットを使用して所定の量のTac又はTacの組合せをカプセルシェルの半分に装入しついで他の半分のカプセルシェルを使用してカプセルを閉鎖することにより得られたものである。
【００９１】
ボールから食餌を摂取させてから48時間後、糞を捕集し、その中のビタミンの排出を測定した。このために、ビタミンＥをビタミンＥ溶剤、例えばヘキサンで抽出し、排出された量をHPLCクロマトグタフィーにより測定した。消化されたビタミンＥの割合は、排出された割合から減じた。
【００９２】
7.1) 第一の系列
2007508834.tif 000006
【００９３】
本発明の方法は、対照と比較して、ビタミンＥの消化性を31％まで増大させ得ることが観察される。
【００９４】
7.2) 第二の系列
2007508834.tif 000007
【００９５】
第一の系列におけるごとく、ビタミンＥを本発明に従って投与した場合には、ビタミンＥの消化性が増大する。この増加率は、Tacを単独で投与して得られる消化率の40.5％に到達し得る。
【００９６】
実施例８：ビタミンＥ誘導体の加水分解に対する乳化剤の影響
8.1) 
試験を行った条件は下記の通りである：
細胞モデル：CaCo ２ 細胞
ウェルの面積：6.5cm２：
Tacの量：67nmol/cm２：
使用した溶液：Mathias等によるM40ミセル(Mathias，P．M．，Harries，J．T．，Muller，
D．P．R．(1981)：Optimization and ｖalidation of assays to estimate pancreatic 
ester activity using well-characterized micellar solutions of cholesteryl oleateand tocooheryl asetate．Journal of Lipid Research 22，177-184)；1.34 nmolのコレステロールエステルヒドロラーゼと併用 (EC 3.1.1.13)/cm２。
【００９７】
処理：
A：乳化剤を使用しない
B：乳化剤を使用 (SML＋SMS混合物；比率1/1)、Tac/乳化剤比  100/1
C：乳化剤を使用 (SMP＋SM0混合物；比率1/1)、Tac/乳化剤比  100/1
インキュベーション時間：37℃で１時間。
【００９８】
分析：加水分解の程度を算定するための媒体中のTacの分析。
【００９９】
得られた結果を表７に示す。
【０１００】
2007508834.tif 000008
【０１０１】
この表によれば、乳化剤の存在によりTacの加水分解が２倍になる。本発明に従った乳化剤によりコレステロールエステルヒドロラーゼについての加水分解条件が改善される。
【０１０２】
8.2) 
試験を行った条件は下記の通りである：
細胞モデル：CaCo ２ 細胞
ウェルの面積：4.2cm２：
Tacの量：67nmol/cm２：
使用した溶液：Mathias等によるM40ミセル
処理：
A：乳化剤を使用しない
B：乳化剤を使用 (SMP＋SM0混合物；比率1/1)、Tac/乳化剤比  100/1
インキュベーション時間：37℃で２時間。
【０１０３】
分析：加水分解の程度を算定するための媒体中のTacの分析。
【０１０４】
得られた結果を表８に示す。
【０１０５】
2007508834.tif 000009
【０１０６】
乳化剤の存在によりTacの加水分解が44％改善される。8.1)におけるごとく、乳化剤によりコレステロールエステルヒドロラーゼについての加水分解条件が改善される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ビタミンＥ当量で表したかつnmoles/cm２で表した、細胞培養によって固定された量と、nmoles/cm２で表した、インキュベートしたTacの量との関係を示すグラフである
【図２】黒色カラムに示されているレチニルアセテート(Rac、内部対照)、ハッチカラムに示されているTac及び空白カラムに示されている d,l-α-トコフェロールに対応する、ビタミンＥ当量で表された固定量と、Tacと共にインキュベートされる乳化剤の存在又は不存在及び種類との関係を示すグラフである。
【図３】黒色カラムに示されているレチニルアセテート(Rac、内部対照)、ハッチカラムに示されているTac及び空白カラムに示されている d,l-α-トコフェロールに対応する、ビタミンＥ当量で表された固定量と、Tacと共にインキュベートされる乳化剤の存在又は不存在及び種類との関係を示すグラフである。
【図４】TacのTolへの加水分解の程度と、インキュベーション時間との関係を示すグラフである。
【図５】TacのTolへの加水分解の程度と、インキュベーション時間との関係を示すグラフである。
【図１】
2007508834.tif 000010
【図２】
2007508834.tif 000011
【図３】
2007508834.tif 000012
【図４】
2007508834.tif 000013
【図５】
2007508834.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月25日(2005.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥ誘導体を、単独で又は添加剤及び/又は飼料物質と混合して、飼育される単胃動物に経口的に投与することからなる非治療的な動物の飼育方法において、上記ビタミンＥ誘導体をソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた消化性乳化剤の少なくとも１種の存在下で上記動物に投与することを特徴とする動物の飼育方法。
【請求項２】
ビタミンＥ誘導体と前記の少なくとも１種の乳化剤とを同時に動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビタミンＥ誘導体を動物に投与する前に前記の乳化剤を動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ビタミンＥ誘導体及び/又は前記の少なくとも１種の乳化剤を飼料物質と混合する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記の少なくとも１種の乳化剤は、ソルビトールと、少なくとも11個の炭素原子を有する飽和又は不飽和炭化水素鎖を有する脂肪酸とのエステルから選ばれる、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
同化し得る形のビタミンＥに加水分解することができる安定なビタミンＥ誘導体を含有する動物の栄養用の消化性製剤であって、ソルビトールの非エトキシルかエステルから選ばれた、少なくとも１種の消化性乳化剤を更に含有することを特徴とする非治療的消化性製剤。
【請求項７】
シリカ支持体を含有する、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
ソルビトールと脂肪酸の非エトキシル化エステルから選ばれた２種の消化性乳化剤を含有する、請求項６又は７に記載の製剤。
【請求項９】
１種又は２種以上の乳化剤とビタミン誘導体の重量比は10/1〜1/200である、請求項６〜８のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１０】
１種又は２種以上の乳化剤とビタミンＥ誘導体の重量比は1/5〜1/100である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記の少なくとも１種の乳化剤は、ソルビトールと、少なくとも11個の炭素原子を有する飽和又は不飽和炭化水素鎖を有する脂肪酸とのエステルから選ばれる、請求項６〜１０のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１２】
ビタミンＥ誘導体はビタミンＥ エステルである、請求項６〜１１のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１３】
ビタミンＥ誘導体はビタミンＥ アセテートである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
前記の少なくとも１種の乳化剤は、モノラウレエート、モノパルミテート、モノステアレエート、モノオレエート及びトリステアレートから選ばれたソルビトールエステルである、請求項６〜１３のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１５】
ビタミンＥ アセテートと、ソルビトール モノラウレエート及びソルビトール モノオレエートから選ばれた少なくとも１種の乳化剤とを含有する、請求項６〜１４のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１６】
重量比で50:5:45のビタミンＥアセテートとソルビトール モノオレエートとシリカを含有する、請求項６〜１５のいずれか一つに記載の製剤。
【請求項１７】
ソルビトールと脂肪酸との非エトキシル化エステルから選ばれた消化性乳化剤の、ビタミンＥ誘導体に基づく動物の栄養用の非治療的消化性製剤の調製における使用。
【国際調査報告】
2007508834.tif 000015
2007508834.tif 000016
2007508834.tif 000017
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