(57)【要約】本多層化組織構築物は：第一のヒドロゲルを含む第一の層；および第二のヒドロゲルを含む第二の層；を含み、ここで、上述の第一の層は第一の移行帯において第二の層に結合されており、第一の層および第二の層のうちの少なくとも１つは、さらに、細胞および生物活性物質からなるグループから選択された成分を含んでいる。別の本多層化組織構築物は：第一のヒドロゲルを含む第一の層；第一のタイプの細胞を含み、上述の第一の層の上に配置された第二の層；ならびに第二のヒドロゲルおよび、必要に応じて、前述の第二のヒドロゲル中にカプセル化された第一のタイプの細胞を含み、上述の第二の層の上に配置された第三の層；を含む。また、これらの多層化組織構築物を作製するための方法も開示される。
2007508058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層化組織構築物を作製する方法であって、以下の工程：
必要に応じて第一の重合開始剤を含む、第一の重合可能な混合物を提供し、そして該第一の重合可能な混合物を第一の細胞および第三の細胞と混合して、第一のポリマー−細胞懸濁物を形成する工程；
必要に応じて第二の重合開始剤を含む、第二の重合可能な混合物を提供し、そして該第二の重合可能な混合物を第二の細胞と混合して、第二のポリマー−細胞懸濁物を形成する工程；
ある体積の該第一の混合物をあるスペースに配置し、次いで、該第一の混合物が少なくとも部分的にゲル化された第一の層を形成するまで、第一の予め定められた時間の間、該第一の混合物を架橋させる工程；および、
ある体積の該第二の混合物を、該少なくとも部分的にゲル化された第一の層を含む該スペースに配置し、次いで、該第二の混合物が少なくとも部分的にゲル化されて第二の層を形成するまで、第二の予め定められた時間の間、該第二の混合物を架橋させる工程、
を包含し、
ここで、該第一および第二の混合物は、細胞および生物活性物質からなる群から選択される成分を含む、
方法。
【請求項２】
前記体積の前記第二の混合物を前記スペースに配置する工程の前に、前記少なくとも部分的にゲル化された第一の層の表面に細胞の懸濁物を加える工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物活性物質が、栄養素、細胞メディエーター、増殖因子、細胞の分化を誘導する化合物、生物活性ポリマー、遺伝子ベクターまたは薬剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の層および前記第二の層がさらに重合して統合された多層化ゲルを形成するまで、前記第一の混合物および前記第二の混合物をさらに架橋させる工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の細胞および前記第二の細胞が、表部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞からなる細胞タイプのグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の細胞が前記第二の細胞とは異なるタイプの細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の細胞が深部帯の軟骨細胞であり、前記第二の細胞が表部帯の軟骨細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、以下の工程：
哺乳類の関節軟骨を採取し、該軟骨の上部帯、中間帯および深部帯に対応する組織標本を切り取る工程；および、
それぞれ、該上部帯、該中間帯および該深部帯に由来する該組織標本を別々に消化し、上部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞を単離する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項９】
各懸濁物の細胞濃度が約２千万細胞／ｃｃである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多層化ゲルを、予め定められた培養期間の間、完全培地中において培養して、前記多層化組織構築物を形成する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
必要に応じて第三の重合開始剤を含む、第三の重合可能な混合物を提供する工程であって、ここで、該第三の重合可能な混合物が第三の細胞と混合されて、第三のポリマー−細胞懸濁物を調製する、工程；および、
ある体積の該第三の混合物を、前記少なくとも部分的にゲル化された第一の層および前記少なくとも部分的にゲル化された第二の層を含む前記スペースに配置し、次いで、該第三の混合物が少なくとも部分的にゲル化されて第三の層を形成するまで、第三の予め定められた時間の間、該第三の混合物を架橋させる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
前記第一の層、前記第二の層および前記第三の層をさらに架橋させて、統合された多層化ゲルを形成する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の細胞、前記第二の細胞および前記第三の細胞が、表部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞からなる細胞タイプの群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の細胞、前記第二の細胞および前記第三の細胞が異なる細胞タイプであるように選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の細胞が深部帯の軟骨細胞であり、前記第二の細胞が中間帯の軟骨細胞であり、そして前記第三の細胞が表部帯の軟骨細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記多層化ゲルを、予め定められた培養期間の間、完全培地中において培養して、前記多層化組織構築物を形成する工程；
をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の方法であって、以下の工程：
前記第一の層、前記第二の層および前記第三の層が完全に重合して多層化ゲルを形成するまで、該第一の層、該第二の層および該第三の層をさらに架橋させる工程；および、
必要に応じて、該多層化ゲルを、予め定められた時間の間、完全培地中において培養して、前記多層化組織構築物を形成する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、前記第一の重合可能な混合物および前記第二の重合可能な混合物が、両方とも、１０％ｗ／ｖの溶液を作製するようにリン酸緩衝生理食塩水である溶媒中に溶解された光重合可能なポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含み、前記第一の重合開始剤が該第一の混合物に加えられ、前記第二の重合開始剤が該第二の混合物に加えられ、ここで、該第一の重合開始剤および該第二の重合開始剤の両方は同じ光開始剤であり、そしてそれぞれの懸濁物が２千万細胞／ｃｃの濃度を有する、方法。
【請求項１９】
前記光開始剤が各懸濁物中において０．０５％ｗ／ｖの濃度で混合されたＩｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一の重合可能な混合物の架橋が外部放射線への暴露により制御され、そして前記第二の重合可能な混合物の架橋が該外部放射線への暴露により制御される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
形成された前記部分的にゲル化された第一の層と、形成された前記部分的にゲル化された第二の層とが、異なるヒドロゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
多層化組織構築物であって：
第一のヒドロゲルを含む第一の層；および、
第二のヒドロゲルを含む第二の層；を含み、ここで、該第一の層は第一の移行帯において該第二の層に結合されており、該第一の層および該第二の層は、さらに、細胞および生物活性物質からなる群から選択される成分を含んでおり、ここで、
該第一の層は、該第一のヒドロゲル中にカプセル化された、第一の細胞タイプの細胞を含んでおり、該第二の層は、該第二のヒドロゲル中にカプセル化された、第二の細胞タイプの細胞を含んでおり、該第一の細胞タイプは該第二の細胞タイプとは異なっており、該第一の細胞タイプは幹細胞であり、そして該第二の細胞タイプはエジュケーター細胞である、
多層化組織構築物。
【請求項２３】
第三のヒドロゲル中にカプセル化された、第三の細胞タイプの細胞を含む第三の層をさらに含み、ここで、第二の移行帯が該第三の層を前記第二の層に結合しており、そして該第三の細胞タイプが前記第二の細胞タイプとは異なる；
請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項２４】
前記第一のタイプの細胞が深部帯の軟骨細胞であり、前記第二のタイプの細胞が中間帯の軟骨細胞であり、前記第三のタイプの細胞が表部帯の軟骨細胞である、請求項２３に記載の多層化組織構築物。
【請求項２５】
前記第一のヒドロゲル、前記第二のヒドロゲルおよび前記第三のヒドロゲルが、光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含む、請求項２４に記載の多層化組織構築物。
【請求項２６】
前記第一のタイプの細胞が深部帯の軟骨細胞であり、前記第二のタイプの細胞が表部帯の軟骨細胞である、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項２７】
前記第一のヒドロゲルおよび前記第二のヒドロゲルの両方が、光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含む、請求項２６に記載の多層化組織構築物。
【請求項２８】
前記第一のヒドロゲルおよび前記第二のヒドロゲルの両方が、光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含む、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項２９】
前記エジュケーター細胞が軟骨細胞であり、前記幹細胞が骨髄から採取された胚性幹細胞または間葉幹細胞のいずれかである、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項３０】
前記第一の層が、さらに、前記第一のヒドロゲル中にカプセル化された第二の細胞タイプの細胞を含む、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項３１】
前記第一の層が：栄養素、細胞メディエーター、増殖因子、細胞の分化を誘導する化合物、生物活性ポリマー、遺伝子ベクターまたは薬剤からなる群から選択される生物活性物質を含む、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項３２】
前記第二の層が生物活性物質を含む、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項３３】
前記第一のヒドロゲルおよび前記第二のヒドロゲルが異なるヒドロゲルである、請求項２２に記載の多層化組織構築物。
【請求項３４】
多層化組織構築物であって：
第一のヒドロゲルを含む第一の層；
第一のタイプの細胞を含む第二の層であって、該第二の層は該第一の層の上に配置されている、第二の層；および、
第二のヒドロゲルおよび、必要に応じて、該第二のヒドロゲル中にカプセル化された、該第一のタイプの細胞を含む、第三の層であって、該第三の層は該第二の層の上に配置されている、第三の層；
を含む、多層化組織構築物。
【請求項３５】
前記第二の層が急激な移行帯を通じて前記第一の層に結合され、そして、該第二の層が滑らかな移行帯を通じて前記第三の層に結合されている、請求項３４に記載の多層化組織構築物。
【請求項３６】
前記第一のタイプの細胞が、前記急激な移行帯と前記滑らかな移行帯との間に主に配置されている、請求項３５に記載の多層化組織構築物。
【請求項３７】
前記第三の層が該第三の層全体に分散された前記第一のタイプの細胞を含む、請求項３４に記載の多層化組織構築物。
【請求項３８】
前記第一のヒドロゲルと前記第二のヒドロゲルとが同じ材料から作製されている、請求項３４に記載の多層化組織構築物。
【請求項３９】
前記材料が、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートおよびポリ（エチレンオキシド）ジアクリラートからなる群から選択されるポリマーの光重合により形成されている、請求項３８に記載の多層化組織構築物。
【請求項４０】
前記第一のヒドロゲルと前記第二のヒドロゲルとが異なる材料から作製されている、請求項３４に記載の多層化組織構築物。
【請求項４１】
前記第一の層および前記第二の層のうちの１つ以上が、さらに、生物活性物質を含む、請求項３４に記載の多層化組織構築物。
【請求項４２】
多層化組織構築物であって：
第一のヒドロゲルを含む第一の層；
第一のタイプの細胞を含む第二の層であって、該第二の層が該第一の層の上に配置されている、第二の層；および、
第二のヒドロゲルおよび、必要に応じて、該第二のヒドロゲル中にカプセル化された、該第一のタイプの細胞を含む第三の層であって、該第三の層は該第二の層の上に配置されており、ここで、該第一のタイプの細胞が：胚性幹細胞および間葉幹細胞からなる群から選択される、第三の層；
を含む、多層化組織構築物。
【請求項４３】
前記第一のヒドロゲルと前記第二のヒドロゲルとが異なるヒドロゲルである、請求項４２に記載の多層化組織構築物。
【請求項４４】
多層化組織構築物であって、以下の工程：
（ａ）第一の重合可能な混合物をあるスペースに配置し、そして該第一の重合可能な混合物を架橋させて、少なくとも部分的にゲル化された第一のヒドロゲル層を作製する工程；
（ｂ）細胞懸濁物を該第一のヒドロゲル層の上に配置して、細胞層を形成する工程であって、ここで、該細胞懸濁物が第一のタイプの細胞を含む、工程；
（ｃ）ある体積の第二の重合可能な混合物を該細胞層の上に配置する工程；および、
（ｄ）該第二の重合可能な混合物を架橋させて、該細胞層および該第一のヒドロゲル層と一体化された、少なくとも部分的にゲル化された第二のヒドロゲル層を作製する工程；
を包含するプロセスにより作製される、多層化組織構築物。
【請求項４５】
前記第一の重合可能な混合物および前記第二の重合可能な混合物が、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートおよびポリ（エチレンオキシド）ジアクリラートからなる群から選択される、同じポリマーを含む、請求項４４に記載の多層化組織構築物。
【請求項４６】
光開始剤が前記第一の重合可能な混合物中に溶解され、そして光開始剤が前記第二の重合可能な混合物中に溶解され、これにより、外部放射線に暴露された場合に該第一の重合可能な混合物が架橋され、そして外部放射線に暴露された場合に該第二の重合可能な混合物が架橋される、請求項４５に記載の多層化組織構築物。
【請求項４７】
前記第一のタイプの細胞が成体幹細胞である、請求項４６に記載の多層化組織構築物。
【請求項４８】
前記第一のタイプの細胞が前記第二の重合可能な混合物中に懸濁される、請求項４４に記載の多層化組織構築物。
【請求項４９】
第二のタイプの細胞が前記第二の重合可能な混合物中に懸濁される、請求項４４に記載の多層化組織構築物。
【請求項５０】
作製された前記第一のヒドロゲル層および前記第二のヒドロゲル層が異なるヒドロゲルである、請求項４４に記載の多層化組織構築物。
【請求項５１】
多層化組織構築物を作製する方法であって、以下の工程：
必要に応じて第一の重合開始剤を含む、第一の重合可能な混合物を提供する工程；
必要に応じて第二の重合開始剤を含む、第二の重合可能な混合物を提供する工程；
ある体積の該第一の混合物をあるスペースに配置し、次いで、該第一の混合物が少なくとも部分的にゲル化された第一の層を形成するまで、第一の予め定められた時間の間、該第一の混合物を架橋させる工程；および、
ある体積の該第二の混合物を、該少なくとも部分的にゲル化された第一の層を含む該スペースに配置し、次いで、該第二の混合物が少なくとも部分的にゲル化されて第二の層を形成するまで、第二の予め定められた時間の間、該第二の混合物を架橋させる工程；
を包含し、
ここで、該第一および第二の混合物のうちの１つは、細胞および生物活性物質からなる群から選択される成分を含む、
方法。
【請求項５２】
形成された前記第一の層と前記第二の層とが異なるヒドロゲルである、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に関する相互参照）
本出願は、２００３年１０月９日に出願された米国非仮出願第１０／６８１，７５３号の特許協力条約第８条の下における利益を主張するものであり、前述の非仮出願の開示全体は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本出願は、２００３年９月２５日に出願された「Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ，ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ」と題する、米国仮出願第６０／４１３，１５２号（２００２年９月２５日出願）の優先権を主張した実用特許出願に関係するものであり、前述の実用特許出願の開示全体は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
また、本出願は、２００３年１０月９日に出願された「Ｔｉｓｓｕｅ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｒｏ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」と題する、米国仮出願第６０／４１６，８８１号（２００２年１０月９日出願）の優先権を主張した実用特許出願にも関係し、前述の実用特許出願の開示全体は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、広くは、組織工学を利用する方法に関係する。より詳細には、本発明は、統合された別々のヒドロゲル層を伴う組織工学骨格として使用するための多層化組織構築物を作製する方法に関係する。本発明は、さらに、上述の方法により作製された多層構築物、特にその構築物中に１つまたはそれ以上の異なるタイプの細胞を含む多層構築物に関係する。また、本発明は、宿主受容者もしくは患者の失われた組織または損傷を被った組織を本発明の多層構築物を用いて置換するための方法にも関係する。
【背景技術】
【０００５】
生体工学を利用した組織は、特にヒト供与者組織の可用性が限られていることを考慮した場合、受容する宿主および患者における損傷を被った臓器および組織を修復するための解決手段を提供する。特に、軟骨および骨などの構造的な組織に対する大きな需要が存在する。これらの組織は複雑な構成様式を有しており、構造的および機能的に同等な組織置換物を得るべく、これらの構造物にしっかりと似せることが有利である。別な言葉で表現すれば、生体工学を利用して置換物組織を作製するときには、置換される組織の天然の細胞の構成様式をできるだけ厳密に再生することが有利であろう。
【０００６】
生体外または生体内におけるポリマーの製造は、組織工学などの様々な生物医学的適用にとって多くの利点をもたらす。光重合可能な材料の最初の生物医学的な適用は歯科の分野で行われ、そこでは、そのような材料が歯に被せるシーラントおよび歯科的修復用のシーラントとして使用された。光重合可能な混合物の光重合を利用して、大きな体積分率の水を保持することができる架橋親水性高分子網目構造物であるヒドロゲルを合成することができる。この高い水分含有量は栄養素および老廃物の効率的な輸送を可能にし、このことが、組織骨格を生成するときに生細胞を支持するための基質としてこれらのヒドロゲルを魅力的なものに成している。
【０００７】
組織工学の分野において、ヒドロゲルの重合は、さらに、ヒドロゲルの重合体が生体適合性を有しており、従って、Ｂａｒｒｅｒａらに付与された特許文献１で検討されているような極めて侵襲性の低い仕方で生体内において適用できるため、魅力的な骨格を提供する。ヒドロゲルは光、紫外線、酸化還元系物質（例えば過硫酸ナトリウムとの組合せにおけるチオ硫酸ナトリウム）を用いて重合することができ、またはカルシウムの如き二価のカチオンなどの何らかの他の適切な重合開始剤を使用することにより重合させることができる。光または紫外線いずれかの重合開始剤を外科用内視鏡を用いて便利に適用することができるため、ヒドロゲルの光重合は、現在、手術後の組織癒着および血管形成術後の再発狭窄症の防止を含め、極めて侵襲性の低い外科的処置において使用すべく研究されている。さらに、最近では、Ｈｕｂｂｅｌｌらの特許文献２で教示される如く、光重合可能なヒドロゲルを薬剤の送給および組織工学の分野に関与させる工夫も為されている。
【０００８】
ポリ（エチレンオキシド）ジメタクリラートをベースとしたヒドロゲルの重合を用いる従前の研究は、これらのゲルが軟骨細胞をカプセル化する能力を有しており、最終的に軟骨性組織をもたらすことを示している。例えば、参照によりその内容全体が本明細書に組み入れられる、非特許文献１を参照のこと。
【０００９】
しかし、従来の細胞カプセル化手法の欠点は、これらの細胞がヒドロゲル全体を通じて均一にカプセル化されることである。この均一な構造は、天然組織の生理学的細胞機構を正確に再生せず、天然の組織は、一般的に、細胞外基質における種々の異なるタイプの細胞の高度に機構化された配列から成っている。別な言葉で表現すれば、天然の組織は、一般的に、細胞外基質に均一に分散された単一のタイプの細胞から成ってはいない。
【００１０】
軟骨は、様々な層を有しており、非層状組織構築物によって充分に満足のいくほどには似せられない、天然に生じるタイプの組織の一例である。詳細には、図８に示されているように、天然に生じる哺乳類の軟骨Ｃは、細胞外基質Ｍによりカプセル化された軟骨細胞ｃｈを含んでいる。軟骨Ｃは、表部（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ）ＳＴＺ帯（ｚｏｎｅ）１、中間帯（ｍｉｄｄｌｅ  ｚｏｎｅ）２および深部帯（ｄｅｅｐ  ｚｏｎｅ）３からなる３つの異なる層状帯に機構化されている。大まかに言えば、骨幹関節における硝子軟骨の厚みについて考察した場合、表部ＳＴＺ帯１は軟骨Ｃの厚みのうちの約１０〜２０％を構成し、一方、中間帯２および深部帯３は、関節表面７と石灰化線６との間の軟骨の厚みのうち、それぞれ、約４０〜６０％および３０％を構成している。石灰化線６の下側には石灰化帯４として知られている石灰化軟骨の帯域があり、石灰化帯の下は軟骨下骨５である。
【００１１】
各帯１、２、３における軟骨細胞の表現型および各帯の生化学的環境は異なっており、軟骨の大きな機械的強度をもたらす独特な構成様式を提供している。例えば、帯１においては軟骨細胞が高い密度で詰め込まれており、細胞外基質Ｍは比較的少なく、これにより、比較的弱いものの、この組織を通じる流体およびプロテオグリカンの流動を調節し、機械的機能に直接的に関係する流体不浸透性帯がもたらされる。その一方で、深部帯３における軟骨細胞は比較的大きく、帯１の軟骨細胞よりも多くの基質Ｍを生成し、これにより、軟骨Ｃの圧縮強度がもたらされる。最近、本発明者らにより、帯１における表部軟骨細胞は帯３における深部軟骨細胞と相互作用して深部軟骨細胞の増殖速度を遅速化し、これにより、深部軟骨細胞が比較的多くの基質Ｍを生成する状態がもたらされることが発見された（データ未発表）。
【００１２】
硝子軟骨Ｃは、典型的には、可動関節における骨端で見られ、骨端の表面を覆い、摩擦を少なくし、緩衝装置を提供すべく機能する。しかし、個人が年を重ねると、比較的弱い表部ＳＴＺ帯１が損傷を被り、または腐食し、骨関節炎のプロセスが始まる。このプロセスが進行すると、中間帯２および深部帯３が、軟骨下骨５を露出させる段階にまで損傷を被り、または腐食されることがある。軟骨および骨の両方を置換しなければならない骨軟骨病変を患っている多数の患者が存在するため、従来の非層状組織構築物よりももっと厳密に軟骨の構成様式に似せた組織置換物として使用することができる多層化組織構築物に対するニーズが存在する。
【００１３】
混合された細胞の集団は、近在する細胞の機能に影響を及ぼす化学的なメッセンジャーおよび生物学的な信号の使用を通じて、様々なタイプの細胞の機能を増強することが知られている。従って、先行技術において既知の、従来の均一に分散された非層状の単一細胞型の組織構築物は、天然に生じる哺乳類組織の生理学的構成様式内における不均一な細胞群集において天然に生じる細胞機能の増強を再現することができない。非特許文献１により教示された組織構築物１０または特許文献３においてＧｒｉｆｆｉｔｈ−Ｃｉｍａらにより教示された組織構築物などの幾つかの組織構築物は、すべての軟骨帯１、２および３から得られた軟骨細胞を親水性ヒドロゲル１５に埋め込んでいる。しかし、このような構築物は、図９に示されているように、非層状的な様式で表部帯の軟骨細胞１１を中間帯の軟骨細胞１２および深部帯の軟骨細胞１３と共に均一に分配したものである。この件に関してさらに述べれば、先行技術のＥｌｉｓｓｅｅｆｆらによる組織構築物は、光重合を用いて重合されたヒドロゲルに多数のタイプの細胞を組み込んではいるが、天然軟骨の層状構成様式に似せようとはされていない。
【００１４】
先行技術による非層状組織構築物の他の例も知られている。例えば、Ｖａｃａｎｔｉら（特許文献４）は、工学を利用した腱または靱帯を生成するため、生物分解性ポリマー中にカプセル化された腱細胞または軟骨細胞を使用することを教示している。
【００１５】
このように、従来の非層状組織構築物は天然に生じる組織の細胞構成様式に厳密に似せたものではなく、これにより、これらの組織置換物の有用性が制限されかねない。その一方で、重合可能な材料の重合反応を時間的および空間的に調節できる能力を利用して、１つまたはそれ以上の異なるタイプの細胞を含有する多数の層を伴うヒドロゲルを作ることが本発明の目的である。このようにして、軟骨または骨などの標的組織における実際の細胞機構にもっと厳密に似せた多層化組織構築物を生体外または生体内のいずれかにおいて製造することができる。
【特許文献１】米国特許第５，３９９，６６５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５６７，４３５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７０９，８５４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，１２３，７２７号明細書
【非特許文献１】Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９９年、ｖｏｌ．９６、ｐ３１０４〜３１０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、重合可能なヒドロゲルを用いて、生理学的組織の複雑な組織構成様式にもっと厳密に似せるため、異なるタイプの細胞を含む多数の層を含めるべく工学的に処理された多層化組織構築物を提供することに努める。このようにして、本発明は、非層状組織構築物よりももっと厳密に生理学的組織の複雑な細胞構成様式に似せた多層化組織構築物を提供し、また、これらの多層化組織構築物を作製するための方法も提供する。
【００１７】
従って、本発明の目的は、先行技術による非層状組織構築物の利点を維持し、さらにはその利点に改善を加えながら、先行技術の非層状組織構築物の欠点を克服することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、生組織との生体適合性を有する多層化組織構築物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、先行技術の非層状組織構築物よりももっと厳密に生理学的層化組織の構造に似せた多層化組織構築物を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、先行技術の非層状組織構築物よりももっと厳密に生理学的層化組織に似せるため、それぞれの層が特定のタイプの細胞を優位に含む種々の細胞を含む、多層化組織構築物を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、複数の層が統合されてはいるが別々の層であり、各層がヒドロゲル中に埋め込まれた単一のタイプの細胞を優位に含み、組織工学を利用した骨格として使用可能な多層化組織構築物を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、天然の軟骨、ならびに骨および軟骨からなる骨軟骨複合組織にもっと厳密に似せるため、表部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞を優位に含む別々の層を含む、多層化組織構築物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、ヒドロゲルの光重合を利用して多層化組織構築物を作製または生成する方法を提供することであり、従って、この方法は、光ポリマー−細胞懸濁物を極めて侵襲性の低い仕方（即ち、関節鏡を用いる関節手術による方法）で哺乳類の関節に注入することにより行うことができ、それ故、この多層化構築物をその場で合成することができる。
【００２４】
本発明の別の目的は、関節鏡を使用する移植技法を用いて哺乳類の関節環境における組織骨格の現場形成に適用することができる、多層化組織構築物を作製または生成する方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、骨層を組み入れることにより、アンカー組織インプラントを助け、インプラントと宿主組織との統合を改善することができる、工学を利用した多層化組織構築物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（発明の概要）
上述の目的に従って、本発明は、方法に関する第一の実施態様において：（ａ）必要に応じて第一の重合開始剤を含む、第一の重合可能な混合物を提供する工程；（ｂ）必要に応じて第二の重合開始剤を含む、第二の重合可能な混合物を提供する工程；（ｃ）ここで、上述の第一および第二の混合物のうちの一つは、細胞および生物活性物質からなるグループから選択された成分を含んでおり；（ｄ）ある体積の第一の混合物をあるスペースに入れた後、この第一の混合物が少なくとも部分的にゲル化された第一の層を形成するまで、第一の予め定められた時間の間、この第一の混合物を架橋させる工程；および（ｅ）ある体積の第二の混合物を、上述の少なくとも部分的にゲル化された第一の層を含む前述のスペースに入れた後、この第二の混合物が少なくとも部分的にゲル化されて第二の層を形成するまで、第二の予め定められた時間の間、この第二の混合物を架橋させる工程；を含むことを要件とする、多層化組織構築物を製造する方法を提供する。
【００２７】
方法に関する本発明の第二の実施態様によれば、前述の第一および第二の混合物が細胞を含むように、方法に関する上述の第一の実施態様が改変される。
【００２８】
方法に関する本発明の第三の実施態様によれば、前述のある体積の第二の混合物を前述のスペースに入れる工程の前に、上述の少なくとも部分的にゲル化された第一の層の表面に細胞の懸濁物を加える工程をさらに加えるべく、方法に関する上述の第一の実施態様が改変される。
【００２９】
方法に関する本発明の第四の実施態様によれば、上述の生物活性物質が：栄養素、細胞メディエーター、増殖因子、細胞の分化を誘導する化合物、生物活性ポリマー、遺伝子ベクターまたは薬剤；からなる群から選択されるように、方法に関する上述の第一の実施態様が改変される。
【００３０】
方法に関する本発明の第五の実施態様によれば、前述の第一の混合物を提供する工程が第一の重合可能な混合物を第一の細胞と混合して第一のポリマー−細胞懸濁物を形成することを含み、前述の第二の混合物を提供する工程が第二の重合可能な混合物を第二の細胞と混合して第二のポリマー−細胞懸濁物を形成することを含むように、方法に関する上述の第一の実施態様が改変される。
【００３１】
方法に関する本発明の第六の実施態様によれば、方法に関する上述の第五の実施態様が、さらに、第一の層および第二の層がさらに重合して統合された多層化ゲルを形成するまで、第一の混合物および第二の混合物を付加的に架橋させる工程を含む。
【００３２】
方法に関する本発明の第七の実施態様によれば、前述の第一の細胞および第二の細胞が、表部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞からなる細胞タイプのグループから選択されるように、方法に関する上述の第五の実施態様が改変される。
【００３３】
方法に関する本発明の第八の実施態様によれば、前述の第一の細胞が第二の細胞とは異なるタイプの細胞であるように、方法に関する上述の第七の実施態様が改変される。
【００３４】
方法に関する本発明の第九の実施態様によれば、前述の第一の細胞が深部帯の軟骨細胞であり、第二の細胞が表部帯の軟骨細胞であるように、方法に関する上述の第八の実施態様が改変される。
【００３５】
方法に関する本発明の第十の実施態様によれば、方法に関する上述の第七の実施態様が、さらに：哺乳類の関節の軟骨を採取し、この軟骨の上部帯、中間帯および深部帯に対応する組織標本を切り取る工程；および、それぞれ、上部帯、中間帯および深部帯から得られたこれらの組織標本を別々に消化し、上部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞を単離する工程；を含むように改変される。
【００３６】
方法に関する本発明の第十一の実施態様によれば、各懸濁物の細胞濃度が約２千万個の細胞／ｃｃであるように、方法に関する上述の第五の実施態様が改変される。
【００３７】
方法に関する本発明の第十二の実施態様によれば、方法に関する上述の第六の実施態様が、さらに：本多層化組織構築物を形成すべく、上述の多層化ゲルを、予め定められた培養期間の間、完全培地中において培養する工程；を含むように改変される。
【００３８】
方法に関する本発明の第十三の実施態様によれば、方法に関する上述の第五の実施態様が、さらに：必要に応じて第三の重合開始剤を含む、第三の重合可能な混合物を提供し、第三のポリマー−細胞懸濁物を調製すべく、前述の第三の重合可能な混合物を第三の細胞と混合する工程；ならびに、ある体積の第三の混合物を、少なくとも部分的にゲル化された第一の層および少なくとも部分的にゲル化された第二の層を含む上述のスペースに入れ、次いで、第三の混合物が少なくとも部分的にゲル化されて第三の層を形成するまで、第三の予め定められた時間の間、この第三の混合物を架橋させる工程；を含むように改変される。
【００３９】
方法に関する本発明の第十四の実施態様によれば、方法に関する上述の第十三の実施態様が、さらに：統合された多層化ゲルを形成すべく、上述の第一の層、第二の層および第三の層を付加的に架橋させる工程；を含むように改変される。
【００４０】
方法に関する本発明の第十五の実施態様によれば、上述の第一の細胞、第二の細胞および第三の細胞が表部帯の軟骨細胞、中間帯の軟骨細胞および深部帯の軟骨細胞からなる細胞タイプのグループから選択されるように、方法に関する上述の第十四の実施態様が改変される。
【００４１】
方法に関する本発明の第十六の実施態様によれば、前述の第一の細胞、第二の細胞および第三の細胞が異なるタイプの細胞であるように選択されるべく、方法に関する上述の第十五の実施態様が改変される。
【００４２】
方法に関する本発明の第十七の実施態様によれば、前述の第一の細胞が深部帯の軟骨細胞であり、第二の細胞が中間帯の軟骨細胞であり、第三の細胞が表部帯の軟骨細胞であるように、方法に関する上述の第十五の実施態様が改変される。
【００４３】
方法に関する本発明の第十八の実施態様によれば、方法に関する上述の第十七の実施態様が、さらに：本多層化組織構築物を形成すべく、前述の多層化ゲルを、予め定められた培養期間の間、完全培地中において培養する工程；を含むように改変される。
【００４４】
方法に関する本発明の第十九の実施態様によれば、方法に関する上述の第十三の実施態様が、さらに：前述の第一の層、第二の層および第三の層が完全に重合して多層化ゲルを形成するまで、前述の第一の層、第二の層および第三の層を付加的に架橋させる工程；および、必要に応じて、本多層化組織構築物を形成すべく、前述の多層化ゲルを、予め定められた時間の間、完全培地中において培養する工程；を含むように改変される。
【００４５】
方法に関する本発明の第二十の実施態様によれば、前述の第一の重合可能な混合物および第二の重合可能な混合物が共に、１０％ｗ／ｖの溶液を成すべく、リン酸緩衝生理食塩水である溶媒中に溶解された光重合可能なポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含み、第一の重合開始剤が前述の第一の混合物に加えられ、第二の重合開始剤が前述の第二の混合物に加えられ、ここで、前述の第一の重合開始剤および第二の重合開始剤の両方は同じ光開始剤であり、それぞれの懸濁物が二千万個の細胞／ｃｃの濃度を有するように、方法に関する上述の第五の実施態様が改変される。
【００４６】
方法に関する本発明の第二十一の実施態様によれば、前述の光開始剤が各懸濁物中において０．０５％ｗ／ｖの濃度で混合されたＩｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９であるように、方法に関する上述の第二十の実施態様が改変される。
【００４７】
方法に関する本発明の第二十二の実施態様によれば、前述の第一の重合可能な混合物の架橋が外部放射線への暴露により制御され、また、前述の第二の重合可能な混合物の架橋がこの外部放射線への暴露により制御されるように、方法に関する上述の第二十一の実施態様が改変される。
【００４８】
方法に関する本発明の第二十三の実施態様によれば、第一のポリマー−細胞懸濁物を形成するときに、第一の細胞を伴う第一の重合可能な混合物中において前述の第三の細胞も混合されるように、方法に関する上述の第五の実施態様が改変される。
【００４９】
装置に関する本発明の第一の実施態様によれば、本多層化組織構築物は：（ａ）第一のヒドロゲルを含む第一の層；および（ｂ）第二のヒドロゲルを含む第二の層；を含み、ここで、前述の第一の層は第一の移行帯において前述の第二の層に結合されており、第一の層および第二の層のうちの少なくとも一方は、さらに、細胞および生物活性物質からなるグループから選択された成分を含んでいることを要件とする。
【００５０】
装置に関する本発明の第二の実施態様によれば、前述の第一の層が第一のヒドロゲル中にカプセル化された第一の細胞タイプの細胞を含むように、装置に関する上述の第一の実施態様が改変される。
【００５１】
装置に関する本発明の第三の実施態様によれば、前述の第二の層が第二のヒドロゲル中にカプセル化された第二の細胞タイプの細胞を含み、上述の第一の細胞タイプが前述の第二の細胞タイプとは異なるように、装置に関する上述の第二の実施態様が改変される。
【００５２】
装置に関する本発明の第四の実施態様によれば、装置に関する上述の第三の実施態様が、第三のヒドロゲル中にカプセル化された第三の細胞タイプの細胞を含む第三の層を含み、ここで、第二の移行帯が前述の第三の層を上述の第二の層に結合しており、前述の第三の細胞タイプが上述の第二の細胞タイプとは異なるように改変される。
【００５３】
装置に関する本発明の第五の実施態様によれば、前述の第一のタイプの細胞が深部帯の軟骨細胞であり、第二のタイプの細胞が中間帯の軟骨細胞であり、第三のタイプの細胞が表部帯の軟骨細胞であるように、装置に関する上述の第四の実施態様が改変される。
【００５４】
装置に関する本発明の第六の実施態様によれば、前述の第一のヒドロゲル、第二のヒドロゲルおよび第三のヒドロゲルが、光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含むように、装置に関する上述の第五の実施態様が改変される。
【００５５】
装置に関する本発明の第七の実施態様によれば、前述の第一のタイプの細胞が深部帯の軟骨細胞であり、第二のタイプの細胞が表部帯の軟骨細胞であるように、装置に関する上述の第三の実施態様が改変される。
【００５６】
装置に関する本発明の第八の実施態様によれば、前述の第一のヒドロゲルおよび第二のヒドロゲルの両方が、光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含むように、装置に関する上述の第七の実施態様が改変される。
【００５７】
装置に関する本発明の第九の実施態様によれば、前述の第一のタイプの細胞が幹細胞であり、前述の第二のタイプの細胞がエジュケーター細胞であるように、装置に関する上述の第三の実施態様が改変される。
【００５８】
装置に関する本発明の第十の実施態様によれば、前述の第一のヒドロゲルおよび第二のヒドロゲルの両方が、光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含むように、装置に関する上述の第九の実施態様が改変される。
【００５９】
装置に関する本発明の第十一の実施態様によれば、前述のエジュケーター細胞が軟骨細胞であり、前述の幹細胞が骨髄から採取された胚性幹細胞または間葉幹細胞のいずれかであるように、装置に関する上述の第九の実施態様が改変される。
【００６０】
装置に関する本発明の第十二の実施態様によれば、前述の第一の層が、さらに、第一のヒドロゲル中にカプセル化された第二の細胞タイプの細胞を含むように、装置に関する上述の第二の実施態様が改変される。
【００６１】
装置に関する本発明の第十三の実施態様によれば、前述の第一の層が：栄養素、細胞メディエーター、増殖因子、細胞の分化を誘導する化合物、生物活性ポリマー、遺伝子ベクターまたは薬剤からなる群から選択される生物活性物質を含むように、装置に関する上述の第一の実施態様が改変される。
【００６２】
装置に関する本発明の第十四の実施態様によれば、前述の第一の層が生物活性物質も含むように、装置に関する上述の第二の実施態様が改変される。
【００６３】
装置に関する本発明の第十五の実施態様によれば、前述の第二の層が生物活性物質を含むように、装置に関する上述の第二の実施態様が改変される。
【００６４】
装置に関する本発明の第十六の実施態様によれば、本多層化組織構築物は：（ａ）第一のヒドロゲルを含む第一の層；（ｂ）第一のタイプの細胞を含む第二の層であって、ここで、前述の第二の層が上述の第一の層の上に配置されている、第二の層；ならびに（ｃ）第二のヒドロゲルおよび、必要に応じて前述の第二のヒドロゲル中にカプセル化された第一のタイプの細胞を含む第三の層であって、前述の第三の層が上述の第二の層の上に配置されている、第三の層；を含んでいることを要件とする。
【００６５】
装置に関する本発明の第十七の実施態様によれば、前述の第二の層が急激な移行帯を通じて第一の層に結合され、また、この第二の層が滑らかな移行帯を通じて第三の層に結合されるように、装置に関する上述の第十六の実施態様が改変される。
【００６６】
装置に関する本発明の第十八の実施態様によれば、上述の第一のタイプの細胞が前述の急激な移行帯と滑らかな移行帯との間に主に配置されるように、装置に関する上述の第十七の実施態様が改変される。
【００６７】
装置に関する本発明の第十九の実施態様によれば、前述の第三の層がこの第三の層全体に隈無く分散された第一のタイプの細胞を含むように、装置に関する上述の第十六の実施態様が改変される。
【００６８】
装置に関する本発明の第二十の実施態様によれば、前述の第一のタイプの細胞が：胚性幹細胞および間葉幹細胞からなる群から選択されるように、装置に関する上述の第十六の実施態様が改変される。
【００６９】
装置に関する本発明の第二十一の実施態様によれば、前述の第一のヒドロゲルおよび第二のヒドロゲルが同じ材料から作製されるように、装置に関する上述の第十六の実施態様が改変される。
【００７０】
装置に関する本発明の第二十二の実施態様によれば、前述の材料が：ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートおよびポリ（エチレンオキシド）ジアクリラートからなる群から選択されるポリマーの光重合により形成されるように、装置に関する上述の第二十一の実施態様が改変される。
【００７１】
装置に関する本発明の第二十三の実施態様によれば、前述の第一の層および第二の層のうちの１つまたはそれ以上が、さらに、生物活性物質を含むように、装置に関する上述の第十六の実施態様が改変される。
【００７２】
装置に関する本発明の第二十四の実施態様によれば、本多層化組織構築物が：（ａ）第一の重合可能な混合物をあるスペースに入れ、この第一の重合可能な混合物を架橋して、少なくとも部分的にゲル化された第一のヒドロゲル層を作製する工程；（ｂ）細胞層を形成すべく、細胞懸濁物を前述の第一のヒドロゲル層に載せる工程であり、ここで、前述の細胞懸濁物が第一のタイプの細胞を含む、細胞層の形成工程；（ｃ）ある体積の第二の重合可能な混合物を前述の細胞層に載せる工程；ならびに（ｄ）前述の第二の重合可能な混合物を架橋して、上述の細胞層および第一のヒドロゲル層と共に一体化される、少なくとも部分的にゲル化された第二のヒドロゲル層を生成する工程；を含むプロセスにより作製されることを要件とする。
【００７３】
装置に関する本発明の第二十五の実施態様によれば、前述の第一の重合可能な混合物および第二の重合可能な混合物が：ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートおよびポリ（エチレンオキシド）ジアクリラートからなる群から選択される同じポリマーを含むように、装置に関する上述の第二十四の実施態様が改変される。
【００７４】
装置に関する本発明の第二十六の実施態様によれば、ある光開始剤が前述の第一の重合可能な混合物中に溶解され、また、ある光開始剤が前述の第二の重合可能な混合物中に溶解され、従って、外部放射線に晒されたときに前述の第一の重合可能な混合物が架橋され、また、外部放射線に晒されたときに前述の第二の重合可能な混合物が架橋されるように、装置に関する上述の第二十五の実施態様が改変される。
【００７５】
装置に関する本発明の第二十七の実施態様によれば、前述の第一のタイプの細胞が成体幹細胞であるように、装置に関する上述の第二十六の実施態様が改変される。
【００７６】
装置に関する本発明の第二十八の実施態様によれば、前述の第一のタイプの細胞が前述の第二の重合可能な混合物中に懸濁されるように、装置に関する上述の第二十四の実施態様が改変される。
【００７７】
装置に関する本発明の第二十九の実施態様によれば、第二のタイプの細胞が前述の第二の重合可能な混合物中に懸濁されるように、装置に関する上述の第二十四の実施態様が改変される。
【００７８】
本発明の更なる目的、特徴および利点は、添付図面と共に考慮すれば、以下の「例証的な実施態様の詳細な説明」から明らかになるであろう。
【００７９】
（例証的実施態様の詳細な説明）
本発明の多層化組織構築物およびこの構築物を作製するための方法は少なくとも二層を成す構造物を要件とする。三層またはそれ以上のヒドロゲル層を要件とする多層化組織構築物も本発明の範囲内に収まる。本発明の容易な理解を促進するため、先ず、方法に関する実施態様について説明し、次いで、この方法の生成物について説明するが、この生成物は、組織インプラントとして、または組織骨格として使用可能な多層化組織構築物である。
【００８０】
工学を利用して多層化組織構築物を作製するための本発明による方法における操作工程が図６に概略的に示されている。本方法は、簡潔に述べると、以下の如くにまとめられる。最初に、層状を成す標的組織の細胞タイプに対応した細胞が収集される。二番目に、特定の異なるタイプの細胞を有するそれぞれの層に対するポリマー−細胞懸濁物が調製される。三番目に、逐次的な仕方で、予め定められた体積の各ポリマー−細胞懸濁物が「スペース」（即ち、型内における空洞または組織内における空洞）に入れられ、次の層を加える前に、（重合開始剤の使用を伴って、または重合開始剤の使用を伴わずに）部分的にゲル化される。一旦、すべての層がスペースに入れられて部分的にゲル化されると、これらの部分的にゲル化されたすべての層は、すべての層がさらにゲル化されるまで、または完全にゲル化されるまで、付加的な架橋を受けることが許される。最後に、生体外で生成されたときには、移植用の多層組織構築物を調製するため、この多層化組織構築物をさらに培養することができる。
【００８１】
（定義）
この開示の目的上、以下の用語が定義される。
【００８２】
多層化組織構築物という用語は、多層化組織の構造に似せた多層化構築物または組織の再生を促進する多層化構築物のいずれかとして広い意味で定義される。本定義による多層化組織構築物は生細胞を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００８３】
本明細書で使用する場合、重合可能な混合物は：重合開始剤の存在を伴って、もしくは重合開始剤の存在を伴わずに、共有結合により架橋された網目構造物もしくはイオン的に架橋された網目構造物、または共有結合により架橋された網目構造物とイオン的に架橋された網目構造物との混合網目構造物；を形成する、あらゆる適切な重合可能なポリマー、モノマー、またはモノマーおよびポリマーの混合物である。本発明による重合可能な混合物は、カプセル化される細胞にとって無毒な重合網目構造物を形成することができなければならない。
【００８４】
光重合可能なポリマーは、外部の供給源によりもたらされた放射線を用いて共有結合により架橋された網目構造物を形成するあらゆる適切なポリマー、または、外部の供給源からもたらされた放射線に晒されたときに、その内部に懸濁された細胞を有する半相互貫入網目構造物を形成する、共有結合的およびイオン的に架橋可能なポリマー混合物または親水性のポリマー混合物である。本発明による光重合可能な混合物は、カプセル化される細胞にとって無毒な重合網目構造物を形成することができなければならない。
【００８５】
重合開始剤は、ヒドロゲル網目構造物を形成すべくポリマーの架橋を開始するあらゆる物質であり、酸化還元剤、カルシウムなどの二価のカチオン、ならびに可視光及び／又は紫外線に晒されたときに活性種を形成する物質を含む。光開始剤は、紫外光及び／又は可視光に晒されたときに活性種を発生し、光重合可能な混合物の重合（即ち、架橋）を開始させるために使用することができる特殊なタイプの重合開始剤である。本発明による重合開始剤および光開始剤は、重合可能な混合物の架橋を開始させるために必要な量で使用されたときに、カプセル化される細胞にとって無毒でなければならない。
【００８６】
生細胞をカプセル化するためのヒドロゲルは、高い水分含有量を有する親水性高分子網目構造物である。本発明によるこのようなヒドロゲルは、例えば約７０〜９０％より高い水分含有量を有していてよい。また、本発明によるこのようなヒドロゲルはカプセル化される細胞にとって無毒であり、この高分子網目構造を通じて、細胞への栄養素の移動、および細胞からの老廃物の移動を可能にする。本発明による多層化組織構築物は７０％未満の水分含有量を有するヒドロゲルでできた１つまたはそれ以上の層を含むことができるが、このような水分含有量の低いヒドロゲルはバリヤー層または支持層を提供するために使用され、生細胞をカプセル化するためには使用されないことに留意すべきである。
【００８７】
ヒドロゲルが形成される場所を開述するために使用される場合、「スペース」という用語は広い意味で定義され、型内に形成された空洞、手術により組織内に形成された空洞、または手術によりアクセスすることができる、組織内に天然に存在する空洞（即ち、関節腔または関節欠損）を含むことができる。
【００８８】
（細胞の供給源）
本発明による多層組織構築物を作製または生成するための方法における第一工程２０は、ヒドロゲルによりカプセル化されるべき特定のタイプの細胞を得ることを要件とする。一般的に、興味のある特定のタイプの細胞が供与者から直接的に採取され、または供与者から得られた細胞の細胞培養物から採取され、もしくは供与者に由来する確立細胞培養系統から採取される。最も好適な実施態様においては、自己細胞が使用される。しかし、本発明の範囲は、同じ哺乳類種、好適には同じ免疫学的プロフィールを有する哺乳類種から得られた細胞の使用を含む。標的宿主がヒト患者である場合、好適には、これらの細胞はこの患者または近い親類縁者から採取されるが、死体から提供された細胞も適切であり得る。
【００８９】
以下では、本発明が特定の例証的実施態様（即ち、軟骨細胞、幹細胞などを利用した多層化組織構築物）に基づいて説明されるが、本発明はどのような特定のタイプの細胞にも限定されるものではない。本発明は、軟骨細胞、骨芽細胞、骨を形成する他の細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、肝細胞、島細胞、腸由来の細胞、腎臓由来の細胞、幹細胞、ならびに主として合成および分泌の作用を有する他の細胞、またはＬａｎｇｅｒらに付与された米国特許第６，２２４，８９３  Ｂ１号（この特許の開示内容全体が、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている如き、主として材料を代謝する作用を有する他の細胞を含め、多くの異なる臓器細胞を移植するために使用することができる。
【００９０】
（ポリマー−細胞懸濁物の調製）
本発明による多層組織構築物を作製または生成するための方法における第二工程３０は、この多層化組織構築物の各層に対するポリマー−細胞懸濁物を調製することを要件とする。本発明による多層組織構築物の特定の実施態様においては、重合可能なポリマーの重合により形成されたヒドロゲルを含んでいるが、細胞は含んでいない少なくとも１つのヒドロゲル層が存在していてよい。本発明による多層組織構築物における他の特定の実施態様においては、ポリマー中に懸濁化されなかった特定のタイプの細胞を含む少なくとも１つの細胞層が存在していてよい。本発明による基本的な方法の理解を促進するため、先ず、図６に概要が示されている方法について説明し、その後、種々の変更態様について説明する。
【００９１】
ヒドロゲル溶液は、例えば、ｐＨを約７．４に調節された適切な溶媒である無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中において１０％（重量／体積（ｗ／ｖ））の重合可能なポリマーを混合することにより調製される。好適には、このポリマーは光重合可能なポリ（エチレングリコール）ジアクリラート（ＰＥＧＤＡ）または光重合可能なポリ（エチレンオキシド）ジアクリラート（ＰＥＯＤＡ）のいずれかであり、これらのポリマーはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）から商業的に入手可能である。
【００９２】
必要に応じて、微生物による汚染を抑制するための１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンなど、様々な添加剤をこのヒドロゲル溶液に含めることができる。しかし、これらの添加剤がこのヒドロゲル溶液に含めることができる唯一の生物活性添加剤ではない。例えば、生物活性添加剤は、単独または組み合わせにおいて、増殖因子、細胞分化因子、他の細胞メディエーター、栄養素、抗生物質、抗炎症薬、および他の薬剤を含むことができよう。これらに限定するものではないが、幾つかの適切な細胞増殖因子は、同じヒドロゲル層内または隣接するヒドロゲル層内のいずれかにおいてカプセル化されるべき細胞のタイプに依存して、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦαまたはＴＧＦβ）、アルファ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、様々な血管形成因子、神経成長因子（ＮＧＦ）および筋肉形態成長因子を含む。
【００９３】
さらに、ヒドロゲル溶液は、必要に応じて、最終的な濃度を０．０５％ｗ／ｖに成すべく充分に混合された、適切な無毒の重合開始剤を含む。ポリマーとしてＰＥＧＤＡまたはＰＥＯＤＡが選択された場合、好適には、重合開始剤が加えられ、他の適切な光開始剤も使用することができるが、光開始剤Ｉｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから商業的に入手可能）を選択するのが好適である。
【００９４】
本発明によるヒドロゲルを作製するには、光重合可能なＰＥＧＤＡおよびＰＥＯＤＡが中でもとりわけ好適なポリマーであるが、他の適切な親水性ポリマーも使用することができる。適切な親水性ポリマーは、合成ポリマー、例えば部分的または完全に加水分解されたポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー（ポロキサマーおよびメロキサポール）、ポロキサミン、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシアルキル化セルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースおよびメチルヒドロキシプロピルセルロースなど、ならびに天然ポリマー、例えばポリペプチド、多糖類または炭水化物、例えばＦｉｃｏｌｌ（登録商標）ポリスクロース、ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンもしくはアルギン酸塩、さらにはタンパク質、例えばゼラチン、コラーゲン、アルブミンもしくはオボアルブミンなど、または前述のもののコポリマーもしくは混合物を含む。本明細書で使用する場合、「セルロース」という用語は、セルロースおよび上で述べられているタイプの誘導体を含み；「デキストラン」という用語は、デキストランおよびデキストランの同様な誘導体を含む。光重合可能な混合物に関するこのリストは例証するためのものであり、包括的なものではない。例えば、本発明において使用するのに適した他の光重合可能な混合物が、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第６，２２４，８９３  Ｂ１号に記載されている。
【００９５】
同様に、好適な光開始剤はＩｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９であるが、他の様々な光開始剤も代わりに使用することができる。例えば、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能なＨＰＫは別の適切な光開始剤である。さらに、様々な染料およびアミン触媒は、外部放射線に晒されたときに活性種を形成することが知られている。詳細には、染料による光の吸収により、染料は三重項状態を呈することとなり、続いて、この三重項状態の染料がアミンと反応し、重合を開始させる活性種を形成する。典型的には、重合は、約２００〜７００ｎｍの間の波長における光、最も好適には長波長側の紫外域の光または可視域の光、３２０ｎｍまたはそれ以上の波長、最も好適には約３６５ｎｍから５１４ｎｍまでの間の光で照射することにより開始させることができる。
【００９６】
光重合用に数多くの様々な染料を使用することができ、これらの染料はエリトロシン、フロキシム、ローズベンガル、トニン、ショウノウキノン、エチルエオシン、エオシン、メチレンブルー、リボフラビン、２，２−ジメチル−２−フェニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−フェニルアセトフェノン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、他のアセトフェノン誘導体、およびショウノウキノンを含む。適切な共触媒は、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジルエタノールアミン、Ｎ−イソプロピルベンジルアミンなどのアミンを含む。トリエタノールアミンは、これらの染料のうちの一つと共に用いるのに好適な共触媒である。これらのポリマー溶液の光重合は、ポリマーおよび光開始剤（細胞にとって無毒な濃度における光開始剤、重量で０．１％未満、より好適には、重量パーセントで０．０５％から０．０１％までの間の開始剤）の組合せが１ミリワット／ｃｍ２から３ミリワット／ｃｍ２までの間に相当する光に暴露されると架橋するという発見に基づいている。
【００９７】
光ポリマーは、外科用内視鏡を通じて供給される外部放射線を用いて重合をコントロールするのに都合がよいため、ヒドロゲルを作製するのに好適であるが、本発明は他のポリマー材料および重合開始剤を用いて実践することもできる。ヒドロゲルを形成するために使用することができる他の材料の例は、（ａ）修飾アルギン酸塩、（ｂ）一価のカチオンに暴露されることによりゲル化する多糖類（例えばジェランガム（ｇｅｌｌａｎ  ｃｕｍ）およびカラゲナン）、（ｃ）非常に粘度の高い液体であるか、または揺変性（ｔｈｉｏｔｒｏｐｉｃ）であり、構造のゆっくりとした進化により長い時間を掛けてゲルを形成する多糖類（例えばヒアルロン酸）、および（ｄ）高分子ヒドロゲル前駆体（例えばポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーおよびタンパク質）を含む。米国特許第６，２２４，８９３  Ｂ１号は、本発明によるヒドロゲルを作製するのに適した種々のポリマーおよびこのようなポリマーの化学的特性に関する詳細な説明を提供しており、この特許は、参照により、その開示内容全体が本明細書に組み入れられる。
【００９８】
米国特許第６，２２４，８９３  Ｂ１号に記載されているヒドロゲルのリストが以下で再掲されている。本発明の重合可能な物質はモノマー、マクロマー、オリゴマー、ポリマー、または前述のものの混合物を含んでいてよい。これらのポリマー組成物は、共有結合により架橋可能なポリマーだけから成っていてよく、または共有結合的およびイオン的に架橋可能なポリマーの混合物もしくは親水性のポリマーの混合物から成っていてもよい。
【００９９】
適切な親水性ポリマーは、合成ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、部分的または完全に加水分解されたポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー（ポロキサマーおよびメロキサポール）、ポロキサミン、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシアルキル化セルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースおよびメチルヒドロキシプロピルセルロースなど、ならびに天然ポリマー、例えばポリペプチド、多糖類または炭水化物、例えばＦｉｃｏｌｌ（商標）、ポリスクロース、ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンもしくはアルギン酸塩、さらにはタンパク質、例えばゼラチン、コラーゲン、アルブミンもしくはオボアルブミンなど、または前述のもののコポリマーもしくは混合物を含む。本明細書で使用する場合、「セルロース」という用語は、セルロースおよび上で述べられているタイプの誘導体を含み；「デキストラン」という用語は、デキストランおよびデキストランの同様な誘導体を含む。
【０１００】
ヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例は修飾アルギン酸塩を含む。アルギン酸塩は、海藻から単離された炭水化物ポリマーであり、例えばＷＯ第９４／２５０８０号に記載されているように、カルシウムなどの二価のカチオンに晒すことによりヒドロゲルを形成すべく架橋させることができ、この特許の開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。アルギン酸塩は、室温において、水中で、二価のカチオンの存在下においてイオン的に架橋され、ヒドロゲル基質を形成する。ヒドロゲルを形成する改善された能力を有する修飾アルギン酸塩誘導体を合成することができる。アルギン酸塩は１つより多くの供給源から入手することができ、また、良好な純度および特性で入手することができるため、開始材料としてアルギン酸塩を使用することが有利である。本明細書で使用する場合、「修飾アルギン酸塩」という用語は、修飾されたヒドロゲル特性を有する、化学的に修飾されたアルギン酸塩を表す。天然に生じるアルギン酸塩を化学的に修飾し、より迅速に分解するアルギン酸塩ポリマー誘導体を生成することができる。例えば、アルギン酸塩を化学的に開裂し、ゲル化可能なオリゴ糖ブロックからなるもっと小さなブロックを生成することができ、別の予め選択された部分、例えば乳酸またはイプシロン−カプロラクトンと共に線状コポリマーを形成することができる。結果として生じるポリマーは、イオン的に触媒されてゲル化することができるアルギン酸塩ブロック、および合成設計に依存してもっと急速な分解をもたらすオリゴエステルを含む。代替的に、アルギン酸塩ポリマーは、マンヌロン酸とグルロン酸との比がフィルムゲルを生成しないような条件で使用されてよく、これらのアルギン酸塩ポリマーは、疎水性の水不安定性連鎖、例えばイプシロン−カプロラクトンのオリゴマーで誘導体化される。この疎水性相互作用は、これらのポリマーが体内において分解するまで、ゲル化を誘発する。
【０１０１】
さらに、ジェランガムなどの細菌の多糖類およびカラゲナンなどの植物の多糖類を含め、一価のカチオンに晒すことによりゲル化する多糖類を架橋させ、上で述べられているアルギン酸塩の架橋で利用可能な方法と類似の方法を用いてヒドロゲルを形成することもできる。一価のカチオンの存在下においてゲル化する多糖類は、例えば生理学的レベルのナトリウムを含む溶液に晒すことによりヒドロゲルを形成する。また、ヒドロゲル前駆体溶液をマンニトールなどの非イオン性物質で浸透性を調節し、この後、注入してゲルを形成することもできる。
【０１０２】
非常に粘度の高い液体であるか、または揺変性であり、構造のゆっくりとした進化により長い時間を掛けてゲルを形成する多糖類も有用である。例えば、整髪用ジェルの如き稠度を有する注入可能なゲルを形成するヒアルロン酸を利用することができる。修飾ヒアルロン酸誘導体は特に有用である。本明細書で使用する場合、「ヒアルロン酸」という用語は、天然のヒアルロン酸および化学的に修飾されたヒアルロン酸を表す。修飾ヒアルロン酸は、架橋および生物分解の速度および程度を調節すべく予め選択された化学的修飾が成されるように設計および合成することができる。例えば、修飾ヒアルロン酸は、ポリマーを一層疎水性およびゲル形成性に成すべく、プロピオン酸またはベンジル酸などの比較的疎水性の基でエステル化されるように設計および合成することができ、または、静電的な自己集合を促進すべく、アミンを用いてグラフトされるように設計および合成することもできる。従って、修飾ヒアルロン酸は注入可能となるように合成することができ、そこでは、修飾ヒアルロン酸は、応力下では流動するが、応力が働いてないときにはゲル様構造を維持する。ヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体はＧｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．およびＦｉｄｉａ、Ｉｔａｌｙから入手することができる。
【０１０３】
他の高分子ヒドロゲル前駆体は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）またはＴｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）などのポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーを含み、これらの前駆体は、ＳｔｅｉｎｌｅｉｔｎｅｒらによるＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ＆  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、７７：４８〜５２（１９９１年）；およびＳｔｅｉｎｌｅｉｔｎｅｒらによるＦｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、５７：３０５〜３０８（１９９２年）に記載されているように、水素結合及び／又は温度変化により架橋される。利用され得る他の材料は、フィブリン、コラーゲンおよびゼラチンなどのタンパク質を含む。また、ポリマー混合物も使用することができる。例えば、混合したときに水素結合によりゲル化する、ポリエチレンオキシドとポリアクリル酸との混合物を使用することができる。一つの実施態様においては、ポリアクリル酸の５％ｗ／ｗ溶液と５％ｗ／ｗのポリエチレンオキシド（ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン）１００，０００との混合物を化合させ、例えば数秒もの速さで、時間の経過にわたってゲルを形成することができる。
【０１０４】
電荷を帯びた側鎖基を伴う水溶性ポリマーは、このポリマーを反対の電荷のイオンを含有した水溶液と反応させることにより架橋させることができ、前述のイオンは、ポリマーが酸性の側鎖基を有している場合のカチオンであるか、ポリマーが塩基性の側鎖基を有している場合のアニオンであるかのいずれかである。酸性の側鎖基を有するポリマーを架橋してヒドロゲルを形成するためのカチオンの例は、ナトリウムなどの一価のカチオン、カルシウムなどの二価のカチオン、ならびに銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムおよびスズなどの多価のカチオン、さらには、アルキルアンモニウム塩などの二−、三−または四−官能性有機カチオンである。軟質で高度に膨潤したヒドロゲルおよび膜を形成すべく、これらのカチオンの塩の水溶液がポリマーに加えられる。カチオンの濃度が高くなればなるほど、または原子価が高くなればなるほど、ポリマーの架橋度が高くなる。さらに、これらのポリマーを酵素的に、例えばフィブリンとトロンビンとにより架橋させることもできる。
【０１０５】
イオン的に架橋可能な適切な基はフェノール、アミン、イミン、アミド、カルボン酸、スルホン酸およびリン酸基を含む。脂肪族ヒドロキシ基は、本明細書において開示されている化学における反応基とは考えられていない。カルボン酸、スルホン酸およびリン酸イオンなどの負に帯電した基は、カルシウムイオンなどのカチオンを用いて架橋させることができる。カルシウムイオンを用いるアルギン酸塩の架橋は、このタイプのイオン性架橋の一例である。アンモニウムイオンなどの正に帯電した基は、カルボン酸、スルホン酸およびリン酸イオンなどの負に帯電したイオンを用いて架橋させることができる。好適には、負に帯電したイオンは、１つより多くのカルボン酸、スルホン酸またはリン酸基を含む。
【０１０６】
ヒドロゲルを形成すべくポリマーを架橋させるのに好適なアニオンは、低分子量ジカルボン酸、例えばテレフタル酸、硫酸イオンおよび炭酸イオンなどの一価、二価または三価のアニオンである。カチオンに関する説明で述べられているように、軟質で高度に膨潤したヒドロゲルおよび膜を形成すべく、これらのアニオンの塩の水溶液がポリマーに加えられる。
【０１０７】
様々なポリカチオンを使用して錯体を形成し、これにより、半浸透性の表面を有する膜内においてポリマーヒドロゲルを安定化させることができる。使用することができる材料の例は、アミンまたはイミン基などの塩基性反応基を有するポリマー、好適には、ポリエチレンイミンおよびポリリジンなどの３，０００から１００，０００までの間の分子量を有するポリマーを含む。これらの材料は商業的に入手することができる。ポリカチオンの一例はポリ（Ｌ−リジン）である；合成ポリアミンの例は：ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（アリルアミン）である。また、多糖、キトサンなどの天然のポリカチオンも存在する。
【０１０８】
ポリマーヒドロゲルの塩基性表面基との反応により半浸透性膜を形成するために使用することができるポリアニオンは、アクリル酸、メタクリル酸、およびアクリル酸の他の誘導体のポリマーおよびコポリマー、スルホン化ポリスチレンなどのペンダントＳＯ３Ｈ基を伴うポリマー、ならびにカルボン酸基を伴うポリスチレンを含む。これらのポリマーは、活性種により重合可能な基及び／又はイオン的に架橋可能な基を含めるべく修飾することができる。これらの基を含めるべく親水性ポリマーを修飾するための方法は当業者に広く知られている。
【０１０９】
これらのポリマーは、本質的に生物分解性であってもよいが、好適には、（溶解の予測性のため）低度の生物分解性を有し、但し、排出を可能に為すに充分な低い分子量を有するポリマーである。人間（または、使用が意図されている他の種）において排出を可能に為す最大分子量はポリマーのタイプによって様々に変動するが、多くの場合、約２０，０００ダルトンかそれ以下であろう。本質的な生物分解性のため、使用することはできるが、一般的な使用での好適性に劣る材料は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび分解性多糖類を含む、水溶性の天然ポリマーおよび合成の同等物または誘導体である。
【０１１０】
これらのポリマーは、少なくとも６００の分子量、好適には２０００またはそれ以上、より好適には少なくとも３０００の分子量を有する単一のブロックであってよい。代替的に、これらのポリマーは、他の基により接合された２つまたはそれ以上の水溶性ブロックを含むことができ、そのような２つまたはそれ以上の水溶性ブロックであってもよい。このような接合基は生物分解性の結合、重合可能な結合、または前述のものの両方を含むことができる。例えば、マレイン酸、フマル酸またはアコニット酸などの不飽和ジカルボン酸は、ポリエチレングリコールなどのヒドロキシ基を含有した親水性ポリマーを用いてエステル化することができ、または、ポリキサミンなどのアミン基を含有した親水性ポリマーを用いてアミド化することもできる。
【０１１１】
共有結合により架橋可能なヒドロゲル前駆体も有用である。例えば、キトサンなどの水溶性ポリアミンは、ポリエチレングリコールジイソチオシアナートなどの水溶性ジイソチオシアナートを用いて架橋することができる。これらのイソチオシアナートはアミンと反応し、化学的に架橋されたゲルを形成するであろう。アミンを用いるアルデヒド反応、例えばポリエチレングリコールジアルデヒドを用いるアルデヒド反応も利用することができる。また、ヒドロキシル化された水溶性ポリマーも使用することができる。
【０１１２】
代替的に、ラジカル開始剤と接触した際のラジカル反応により架橋される置換基を含んだポリマーも使用することができる。例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられるＷＯ第９３／１７６６９号に開示されているように、光化学的に架橋され得るエチレン的に不飽和な基を含んだポリマーを使用することができる。この実施態様においては、少なくとも１つの水溶性領域、生物分解性領域、および少なくとも２つのフリーラジカル−重合可能領域を含んだ水溶性マクロマーが提供される。これらのマクロマーは、前述の重合可能な領域を例えば感光性化学物質及び／又は光により発生されたフリーラジカルに晒すことにより重合される。これらのマクロマーの例はＰＥＧ−オリゴラクチル−アクリラートであり、この場合、アクリル酸基がエオシン染料などのラジカル開始系を用いて重合され、または単に紫外光もしくは可視光に晒すことにより重合される。さらに、ＭａｔｓｕｄａらによるＡＳＡＩＤ  Ｔｒａｎｓ．，３８：１５４〜１５７（１９９２年）に開示されているように、光化学的に架橋され得るシンナモイル基を含んだ水溶性ポリマーも使用することができる。
【０１１３】
「活性種により重合可能な基」という用語は、活性種に晒されたときに、付加的な共有結合を形成し、結果としてポリマーの相互結合をもたらす能力を有する反応性官能基として定義される。活性種はフリーラジカル、カチオンおよびアニオンを含む。フリーラジカルにより重合可能な適切な基は、ビニルエーテルなどのエチレン的に不飽和な基（即ち、ビニル基）、アリル基、不飽和なモノカルボン酸、不飽和なジカルボン酸、および不飽和なトリカルボン酸を含む。不飽和なモノカルボン酸はアクリル酸、メタクリル酸およびクロトン酸を含む。不飽和なジカルボン酸はマレイン酸、フマル酸、イタコン酸、メサコン酸またはシトラコン酸を含む。一つの実施態様においては、活性種により重合可能な基は、好適には、親水性ポリマーの１つまたはそれ以上の端部に位置付けられる。別の実施態様においては、活性種により重合可能な基は、個々のブロックを形成する１つまたはそれ以上の親水性ポリマーを伴うブロックコポリマー内に位置付けられる。好適な重合可能な基はアクリラート、ジアクリラート、オリゴアクリラート、ジメタクリラート、オリゴメタクリラート、および生物学的に許容可能な他の光重合可能な基である。アクリラートが最も好適な、活性種により重合可能な基である。
【０１１４】
一般的に、これらのポリマーは、水、緩衝塩類溶液または水性アルコール溶液などの水性溶液中において少なくとも部分的に可溶性である。上で述べられているそれ以外のポリマーを合成するための方法は当業者にとって既知である。例えば、Ｅ．Ｇｏｅｔｈａｌｓを編集者としたＣｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ（Ｐｅｒｇａｍｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．１９８０年）を参照のこと。ポリ（アクリル酸）などの多くのポリマーは商業的に入手することができる。天然に生じるポリマーおよび合成ポリマーは、当技術分野において利用可能な化学反応を用いて修飾することができ、また、例えばＭａｒｃｈによる「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第４版、１９９２年（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている化学反応を用いて修飾することができる。
【０１１５】
好適には、活性種または架橋可能な基を含む親水性ポリマーは、平均で少なくとも１．０２個の重合可能な基または架橋可能な基を含み、より好適には、それぞれが平均で２個もしくはそれ以上の重合可能な基または架橋可能な基を含む。それぞれの重合可能な基が重合して連鎖の形態に成るため、架橋されたヒドロゲルは、１つのポリマー当たり１個より僅かだけ多い反応基（即ち、平均で約１．０２個の重合可能な基）を用いて製造することができる。しかし、パーセンテージが高くなればなるほど好適であり、殆どの分子またはすべての分子が２個もしくはそれ以上の反応性二重結合を有しているポリマー混合物中において優れたゲルを得ることができる。親水性ポリマーの一例としてのポロキサミンは４本の腕を有しており、従って、４個の重合可能な基を含めるべく容易に修飾することができる。
【０１１６】
本発明を実践するのに適した付加的なヒドロゲルが、Ｈｕｂｂｅｌｌらに付与された米国特許第５，５６７，４３５号に記載されており、この特許の開示内容全体も参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１７】
カプセル化の直前に、カプセル化すべき標的細胞がヒドロゲル溶液（ポリマー溶液と呼ばれることもある）を用いて細胞ペレットの形態から懸濁される。詳細には、ポリマー溶液が、約２千万個の細胞／ｃｃの細胞濃度を有する均一な懸濁物を作製することができる量の標的細胞を含有した細胞ペレットと穏やかに、且つ、充分に混合される。細胞を含有する多層化組織構築物のそれぞれの層に対して別々のポリマー−細胞懸濁物を作製しなければならないことに留意すべきである。例えば、それぞれの層が異なるタイプの細胞を有する状態の二層化組織構築物が工学を利用して作製される場合、２つの異なるポリマー−細胞懸濁物が作製されなければならない。各懸濁物は、好適には、同じヒドロゲル溶液および同じ重合開始剤を使用する；しかし、ヒドロゲル溶液中に懸濁される細胞のタイプは、一般的に、異なるタイプの細胞であろう。同様に、それぞれの層が細胞を有する状態の３つの層を生成すべきときには、３つの異なるポリマー−細胞懸濁物を調製する必要があり、その他同様である。
【０１１８】
それぞれの層に対して同じヒドロゲル材料を用いて多層化組織構築物を作製するのが好適であるが、本発明は、これらの層のうちの１つまたはそれ以上に対して異なるヒドロゲル材料を用いて実践することもできる。例えば、ＰＥＯＤＡを重合することにより形成されたヒドロゲル層および修飾アルギン酸塩誘導体を重合することにより形成された別のヒドロゲル層を有する多層化組織構築物を作製することも本発明の範囲内である。この例は、勿論、限定的なものではなく、本発明の範囲内における組織構築物を形成すべく、他の種々のヒドロゲルポリマーを共に層状に成すことができよう。
【０１１９】
（層形成／細胞カプセル化工程）
本発明による多層化組織構築物を作製または生成するための方法における第三工程４０は、予め定められた体積の第一のポリマー−細胞懸濁物Ａを図７に示されている如き標的スペースに入れることを要件とする。このケースにおいては、標的スペースは型４５内における空洞として描かれている。しかし、標的スペースは組織内に存在する空洞であってもよい。
【０１２０】
第四工程５０は、架橋を開始させるべく重合開始剤を提供することにより、またはポリマー−細胞懸濁物Ａが自体で重合するのを可能に成すことにより、第一のポリマー−細胞懸濁物Ａを部分的にゲル化することを要件とする。図７は、懸濁物Ａが光開始剤を含む光ポリマー−細胞懸濁物である、本発明の一つの好適な実施態様を描いている。このケースにおいては、光ポリマー−細胞懸濁物Ａを外部放射線源に晒すことにより光開始剤が活性種に変換され、ポリマーの架橋がコントロールされた様式で開始される。この実施態様を実践する場合、好適には、外部放射線源は、上述の懸濁物を約１〜４ｍＷ／ｃｍ２の放射線強度に晒すため、２００ｎｍまたはそれ以上の波長を有するＵＶＡランプである。さらに、この実施態様を実践する場合、放射線暴露時間は、所望の部分的なゲル化の程度に依存して、約３〜５分である。
【０１２１】
次に、本方法は決定ポイント６０へ移る。しかし、この時点では１つの層しか形成されていないため、本方法は工程４０へ戻り、そこでは、予め定められた体積の第二のポリマー−細胞懸濁物Ｂが標的スペースに入れられる。この実施態様を実践する場合、図７に示されているように、懸濁物Ｂは光開始剤を含んだ光ポリマー−細胞懸濁物であり、この光ポリマーの架橋は、第二のポリマー−細胞懸濁物Ｂを部分的にゲル化させるため、懸濁物Ａおよび懸濁物Ｂの両方を、約２〜３分間、工程５０で説明されているようにＵＶＡ照射に晒すことにより、開始され、コントロールされる。
【０１２２】
この後、本方法は決定ポイント６０へ戻る。図１に示されているような二層化組織構築物１００を作製するときには、この時点における決定ポイント６０に対する答えは「ノー」となり、本方法は工程７０へと進められる。工程７０は、部分的にゲル化されたこれらの層が更なる時間を掛けて架橋するのを受動的に許容するか、または、更なる架橋を能動的にコントロールするかのいずれかにより、組織構築物のすべてのヒドロゲル層が完全にゲル化されているのを確実化することを要件とする。
【０１２３】
この実施態様を実践する場合、光ポリマーの更なる架橋は、多層化組織構築物を完全にゲル化すべく、部分的にゲル化された組織構築物のすべての層を付加的な放射線に晒すことにより能動的にコントロールすることができる。従って、二層化組織構築物１００の場合には、それぞれ、懸濁物Ａおよび懸濁物Ｂを重合することにより形成されたヒドロゲル層１０５、１１０は、共に、各層の完全なゲル化が生じているのを確実化するため、付加的な時間の間、一般的には約２〜３分間、外部紫外線で照射される。
【０１２４】
必要に応じて、工程７０の後に工程８０が行われ、工程８０では、完全にゲル化された多層化組織構築物１００がこの構築物を生成するために使用されたスペースから取り出され、他の添加剤を伴った、または他の添加剤を伴わないＤｕｌｂｅｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地などの完全培養培地を備えた容器に入れられる。多層化組織構築物は、この後、移植の準備が整うまで培養され、この期間は数週間を要することも考えられる。当業者であれば、工程８０は、組織構築物が生体外で（即ち、型内で）生成されるときにのみ実施されることが認識されよう。しかし、組織構築物が生体内で生成され、その組織構築物を作製するために使用されるスペースが組織内における空洞であるときには、工程８０は適用されないであろう。詳細には、多層化組織構築物を、宿主となる受容者における生組織内で直接的に生成するときには、移植する前に組織構築物を培養する工程を省略することができるように成しながら、この組織構築物は宿主に直接的に移植される。
【０１２５】
３層もしくはそれ以上の層を有する多層化組織構築物が所望されるケースにおいては、本発明による多層組織構築物を作製または生成するための方法は、決定ポイント６０において別な具合に進行するであろう。詳細には、ポリマー−細胞懸濁物Ａおよびポリマー−細胞懸濁物Ｂがスペース内において部分的にゲル化された後、工程４０から６０までを繰り返すことにより付加的な層が加えられる。例えば、図４に示されているような三層化組織構築物２００を生成する場合には、本発明による方法は、この時点で、決定ポイント６０から（「イエス」と答えて）工程４０へ進むであろう。この後、予め定められた体積のポリマー−細胞懸濁物Ｃが標的スペースに入れられる。
【０１２６】
この実施態様を実践する場合、懸濁物Ｃは光開始剤を含有した光ポリマー−細胞懸濁物であり、図７に示されているように、この光ポリマーの架橋は、光ポリマー−細胞懸濁物Ｃを外部放射線に晒すことによりコントロールされる。従って、懸濁物Ａ、懸濁物Ｂおよび懸濁物Ｃは、第三の光ポリマー−細胞懸濁物Ｃを部分的にゲル化させるため、工程５０で説明されているように、約２〜３分間、ＵＶ照射に暴露される。
【０１２７】
本方法は再び決定ポイント６０へ戻る。図４に示されているような三層化組織構築物２００を作製する場合には、この時点で、決定ポイント６０に対する答えは「ノー」となり、本法は工程７０へと進むであろう。工程７０は、これらの懸濁物が更なる時間を掛けて架橋するのを受動的に許容するか、または、更なる架橋を能動的にコントロールするかのいずれかにより、すべてのヒドロゲル層が完全にゲル化されているのを確実化することを要件とする。
【０１２８】
この実施態様を実践する場合、光ポリマーの付加的な架橋は、多層化組織構築物を完全にゲル化すべく、部分的にゲル化された組織構築物のすべての層を付加的な放射線に晒すことにより能動的にコントロールされる。従って、三層化組織構築物２００の場合には、それぞれ、懸濁物Ａ、懸濁物Ｂおよび懸濁物Ｃを重合することにより形成されたヒドロゲル層２０５、２１０、２１５は、各層の完全なゲル化が生じているのを確実化するため、付加的な時間の間、一般的には約２〜３分間、外部紫外線で照射される。
【０１２９】
上で検討されているように、標的スペースが組織内に形成された空洞であるケースにおいては、本方法は、三層化組織構築物を作製した時点で終了する。しかし、標的スペースを提供すべく型の空洞を使用したときには、本方法は、必要に応じて工程８０を含むことができ、この工程８０は、型から多層化組織構築物２００を取り出し、更なる培養のため、移植の用意が整うまで、この多層化組織構築物を完全培地に入れることを要件とする。
【０１３０】
当業者であれば、所望の数の層が作製されるまで工程４０、５０および６０を通じて反復することにより、図６で概要説明されている方法を用いて三層より多くの層を有する多層化組織構築物を生成できることが認識されよう。この場合、工程３０では、各層が細胞を含有するものと仮定して、はっきりと異なるタイプの細胞を含有するヒドロゲル層の数に対応する、同じ数のポリマー−細胞懸濁物を調製する必要がある。例えば、図８においては、次の５つの帯：予備（ｒｅｓｅｒｖｅ）軟骨細胞を含有した表部ＳＴＺ帯１、増殖性軟骨細胞を含有した中間帯２、肥厚性軟骨細胞を含有した深部帯３、石灰形成性軟骨を含有した石灰化帯４、および骨芽細胞を含有した軟骨下骨５；を有するものとして、軟骨−骨界面が描かれている。本発明によれば、図６で概要説明されている方法を用いて五層化組織構築物を生成することができ、この場合、五層化組織構築物が作製されるまで反復される工程３０および工程４０〜６０において、５種類の異なる光ポリマー−細胞懸濁物が調製されるであろう。この後、本方法は、工程７０において多層化組織構築物を完全にゲル化すべく進行し、構築物２００が型内の標的スペース内において生成されたときには、必要に応じて、工程７０に続いて培養工程８０が実施される。
【０１３１】
（多層化組織構築物の構造に関する説明）
上では、本発明による多層組織構築物を作製または生成するための方法を全般にわたり詳細に説明してきた。次に、特定の非限定的な例証的実施態様について説明する前に、様々な多層化組織構築物の構造について全般にわたり詳細に説明する。
【０１３２】
図１は、２つの層１０５および１１０を有する、本発明による多層組織構築物１００を示している。第一の層１０５は、ヒドロゲル１０７中にカプセル化された第一のタイプの細胞が優位な細胞１０６を含んでいる。ヒドロゲル１０７は、上で説明されている適切なポリマーのうちの１つの重合により形成された重合網目構造物であり、高い水分含有量を有している。第二の層１１０は、第二のタイプの細胞が優位な細胞１１１およびヒドロゲル１０８を含んでいる。好適には、ヒドロゲル１０７およびヒドロゲル１０８は同じ材料である。しかし、本発明は、ヒドロゲル１０８が上で説明されている適切なポリマーのうちの別の１つの重合により形成された重合網目構造物であって、高い水分含有量を有しており、ヒドロゲル１０８を作るために用いられたポリマーがヒドロゲル１０７を作るために使用されたポリマーとは別のものである場合にも実践することができる。一般的に、第一のタイプの細胞１０６および第二のタイプの細胞１１１はタイプの異なる細胞である。
【０１３３】
この開示の文脈上、細胞が同じ表現型を有している場合（これは、細胞が同じ遺伝子発現及び／又は形態学を有していることを意味する）、細胞は「同じタイプ」であると見なされる。この文脈における遺伝子発現は細胞表面タンパク質及び／又はタンパク質分泌の発現を含む。従って、細胞が異なるタイプの組織（例えば、軟骨対骨）から誘導されたものである場合、細胞が異なる胚起源（例えば、外胚葉起源対中胚葉起源対内胚葉起源）から誘導されたものである場合、細胞が有意に異なる成熟度を有している場合（例えば、幹細胞対部分的に分化された細胞対完全に分化された細胞）、ならびに細胞が、遺伝子発現および形態学を除いて、それ以外では同様な細胞である場合（例えば、表部軟骨細胞対深部軟骨細胞）、細胞は「異なるタイプ」であると見なされる。この点について例証すると、例えば、深部帯軟骨細胞である複数の細胞は、これらの細胞はすべて同じタイプの組織（即ち、軟骨）に由来し、同じ胚起源を有しており、また、同じ成熟度を有しており（即ち、成熟細胞である）、さもなければ、軟骨の深部帯における他の軟骨細胞と同じ遺伝子発現および形態学を分かち合っているため、互いに「異なっていない」。
【０１３４】
組織構築物１００の第一の層１０５は、移行帯１２０を通じて第二の層１１０に結合されている。この移行帯１２０は、既に部分的にゲル化されている第一の層１０５の上で第二の層１１０を部分的にゲル化したときに形成されたものである。移行帯１２０は、第二の層１１０が形成されたときの第一の層１０５の部分的なゲル化の程度に依存して、かなり急激な移行であってよく、または滑らかな移行が存在していてもよい。本発明の異なる実施態様を表すことになるが、図１０は、急激な移行帯が意味するものおよび滑らかな移行帯が意味するものを示している。
【０１３５】
図１０に示されているように、急激な移行帯は、細胞またはポリマー−細胞懸濁物の別の層を加える前に、支持用ヒドロゲル層が殆どゲル化されているときに生じる。これらの条件下においては、加えられた層からの細胞が前述の殆どゲル化された層内に混入するのは非常に僅かである。その一方で、細胞またはポリマー−細胞懸濁物の他の層を加える前に、支持用ヒドロゲル層のゲル化が非常に僅かであるか、または全くゲル化されていない場合には、支持層内における多くの細胞が前述の加えられた層内に混入し、これにより、図１０に示されているような「滑らかな移行」が生成されることとなる。
【０１３６】
２つの結合された層１０５、１１０内におけるヒドロゲル１０７および１０８が高い水分含有量を有しているため、移行帯１２０は、両方の層内における細胞の代謝産物に対して浸透性である。それ故、第一のタイプの細胞１０６により生成された細胞メディエーターは、移行帯１２０を横断し、第二の細胞タイプの細胞１１１に影響を及ぼすことができるに違いない。同様に、第二の細胞タイプの細胞１１１により生成された細胞メディエーターは、移行帯１２０を横断し、第一の細胞タイプの細胞１０６に影響を及ぼすことができるに違いない。移行帯１２０のこの浸透可能な特徴は、異なる帯内において機構化された異なるタイプの細胞間における相互作用を保持し、実際の組織内における環境に似せる上で重要である。本発明による幾つかの実施態様においては、ヒドロゲル層１０５および１１０のうちの１つは、カプセル化されるべき細胞の代わりに、またはカプセル化されるべき細胞に加えて、栄養素、細胞メディエーターもしくは薬剤などの物質を含むポリマー懸濁物から形成することができる。
【０１３７】
細胞タイプ１０６および１１１はどんな特定の細胞タイプの組合せにも特に限定されるものではないが、本発明による一つの特定の実施態様においては、細胞タイプ１０６または１１１のうちの１つは幹細胞である。例えば、細胞タイプ１０６のうちの１つが間葉幹細胞であり、もう一方の細胞タイプ１１１が関節軟骨における軟骨細胞などの「エジュケーター細胞」であるときには、この間葉幹細胞は骨生成細胞に分化することができる。この実施態様は、エジュケーター細胞が骨における欠損の治療において使用することができる骨を生成するタイプの細胞に分化することができるようにこの間葉幹細胞を「教示」もしくは誘導するため、有用である。別の有用な実施態様においては、例えば、細胞タイプ１０６のうちの１つが複数の能力または多数の能力を備えた胚性幹細胞であり、もう一方の細胞タイプ１１１が軟骨細胞などの「エジュケーター細胞」である場合、この胚性幹細胞は細胞を生成する軟骨基質に分化する。この実施態様は、エジュケーター細胞が軟骨における欠損の治療において使用することができる軟骨基質を生成するタイプの細胞に分化することができるようにこの複数の能力を備えた胚性幹細胞を「教示」もしくは誘導するため、有用である。
【０１３８】
図４は、３つの層２０５、２１０および２１５を有する、本発明による多層化組織構築物２００を示している。第一の層２０５は、ヒドロゲル２０７中にカプセル化された第一のタイプの細胞が優位な細胞２０６を含んでいる。ヒドロゲル２０７は、上で説明されている適切なポリマーのうちの１つの重合により形成された重合網目構造物であり、高い水分含有量を有している。第二の層２１０は、第二のタイプの細胞が優位な細胞２１１およびヒドロゲル２０８を含んでいる。第三の層２１５は、第三のタイプの細胞が優位な細胞２１６およびヒドロゲル２１７を含んでいる。好適には、ヒドロゲル２０７、２０８および２１７は同じ材料である。しかし、本発明は、ヒドロゲル２０８が上で説明されている適切なポリマーのうちの別の１つの重合により形成された重合網目構造物であって、高い水分含有量を有しており、ヒドロゲル２０８を作るために用いられたポリマーがヒドロゲル２０７及び／又はヒドロゲル２１７を作るために使用されたポリマーとは別のものである場合にも実践することができる。同様に、本発明は、ヒドロゲル２１７が上で説明されている適切なポリマーのうちのさらに別の１つの重合により形成された重合網目構造物であって、高い水分含有量を有しており、ヒドロゲル２１７を作るために用いられたポリマーがヒドロゲル２０７及び／又はヒドロゲル２０８を作るために使用されたポリマーとは別のものである場合にも実践することができる。別な言葉で表現すれば、これらすべてのヒドロゲル層は同じヒドロゲル材料でできていてよく、もしくはこれらすべてのヒドロゲル層を種々の異なるヒドロゲル材料から作ることもでき、またはこれらのヒドロゲル層のうち、すべてではなく、幾つかが同じヒドロゲル材料でできていてもよい。
【０１３９】
一般的に、第一のタイプの細胞２０６、第二のタイプの細胞２１１および第三のタイプの細胞２１６はタイプの異なる細胞である。しかし、本発明は、これらの層のうちの幾つかが同じタイプの細胞を含んでいる場合にも実践することができ、但し、この場合、これらの層は、好適には、隣接した層ではないであろう。さらに、３層もしくはそれ以上のヒドロゲル層を有する本発明による実施態様を実践する場合、これらのヒドロゲル層のうちの幾つかは、どんな細胞も含んでいないポリマー懸濁物から形成されてよい。これらの条件下においては、細胞を含んでいないポリマー懸濁物から形成されたヒドロゲルは、幾つかの細胞が移行帯にこぼれる程度までには「細胞不含」（即ち、細胞が存在していなくてよい）のヒドロゲル層であろう。
【０１４０】
組織構築物２００の第一の層２０５は移行帯２２０を通じて第二の層２１０に結合されている。この移行帯２２０は、既に部分的にゲル化されている第一の層２０５の上で第二の層２１０を部分的にゲル化したときに形成されたものである。移行帯２２０は、第二の層２１０が形成されたときの第一の層２０５の部分的なゲル化の程度に依存して、かなり急激な移行であってよく、または滑らかな移行が存在していてもよい。第二の層２１０は移行帯２２２を通じて第三の層２１５に結合されている。この移行帯２２２は、既に部分的にゲル化されている第二の層２１０の上で第三の層２１５を部分的にゲル化したときに形成されたものである。移行帯２２２は、第三の層２１５が形成されたときの第二の層２１０の部分的なゲル化の程度に依存して、かなり急激な移行であってよく、または滑らかな移行が存在していてもよい。
【０１４１】
上で検討されているように、移行帯２２０および２２２は浸透性であり、従って、栄養素および細胞の代謝産物はこれらの層の間を拡散することができる。本発明による幾つかの実施態様においては、ヒドロゲル層２０５、２１０、２１５のうちの１つまたはそれ以上は、カプセル化されるべき細胞の代わりに、またはカプセル化されるべき細胞に加えて、栄養素、細胞メディエーター、増殖因子、細胞の分化を誘導する化合物、生物活性ポリマー、遺伝子ベクターまたは薬剤（即ち、抗生物質、抗炎症薬など）などの生物活性添加剤を含むポリマー懸濁物から形成されてよい。層が細胞を含んでいないケースにおいては、上述の生物活性添加剤はポリマー溶液と混合される。生物活性添加剤は、合成中に、ポリマー溶液またはポリマー−細胞懸濁物に加えることができる。さらに、生物活性添加剤は、ポリマー溶液またはポリマー−細胞懸濁物に加えられる場合、ミクロスフェア、リポソームなどの送給用担体中に含有されていてよい。
【０１４２】
本発明によれば、これらのヒドロゲル層は、構造的な完全性および強度を促進する他の添加剤も含むことができる。これらの添加剤は、合成している間にポリマー溶液またはポリマー−細胞懸濁物中に混ぜ合わされる。ヒドロゲル層の機械的な特性を改善するための他の添加剤の例はヒアルロン酸およびヒドロキシアパタイトを含む。
【０１４３】
図３は本発明による別の実施態様を描いており、この実施態様は３つの層３０５、３１０および３１５を有する多層化組織構築物３００であって、ここで、中間層３１０は、上で述べられている方法の工程３０から５０までとは異なる仕方で形成される。詳細には、図６で概要説明されている方法が、（ａ）基底層３０５に対応する懸濁物がポリマーを含み、細胞を含まず、（ｂ）中間層３２０に対応する懸濁物が細胞を含み、ポリマーを含まない；ように修飾される。しかし、上部の層３１５に対応する懸濁物は、細胞およびポリマーの両方を含めるべく調製される。さらに、層３１０および３１５内における細胞３０６は同じタイプの細胞であり、好適には何らかのタイプの幹細胞である。
【０１４４】
これらの条件下において、第一の層３０５が形成されるとき、この層は基本的には「細胞不含」のヒドロゲル層３０７である。しかし、図１０から明らかなように、移行帯３２０付近の第一の層３０５には幾つかの細胞３０６がカプセル化されることに成るであろう。ヒドロゲル３０７は、上で述べられている適切なポリマーのうちの１つの重合により形成された重合網目構造物であり、高い水分含有量を有している。第二の層３１０は、高い密度で詰め込まれた層内に細胞３０６を含んでいる。上で検討されているように、第二の層３１０を作るために使用された懸濁物は何らポリマーを含んでいなかった。しかし、このポリマー不含の懸濁物が第一の層３０５の上に配置されると、ヒドロゲル３０７の重合されていないポリマーのうちの幾分かがこの懸濁物中に混ぜ合わされ、第二の層３１０を形成するであろう。この時点では第二の層中に比較的少量のポリマーしか存在しないため、第三の層３１５に対応する懸濁物は、別個の部分的なゲル化工程５０を実施することなく、第二の層の上に配置される。
【０１４５】
もっと広い観点で言えば、第三の層３１５に対応するポリマー−細胞懸濁物が第二の層３１０の上に配置されるとき、架橋されていないポリマーは拘束を受けずに第二の層内に混ぜ合わされる。従って、第二の層３１０は、一方では、非常に高い細胞密度を含んでいるが、第三の層３１５からの幾分かのポリマー、および、恐らくは第一の層３１０からの幾分かのポリマーも含んでいるであろう。この後、部分的なゲル化工程５０が第二の層３１０および第三の層３１５の両方に対して同時的に適用される。工程７０においてすべての層のゲル化が完了したときには、図２の領域Ａの拡大図である図３で図式的に描かれているように、移行帯３２０が第一の層３０５と第二の層３１０との間に形成されており、移行帯３２２が第二の層３１０と第三の層３１５との間に形成されているであろう。
【０１４６】
第三の層３１５は細胞３０６およびヒドロゲル３１７を含んでいる。好適には、ヒドロゲル３０７および３１７は同じ材料である；しかし、本発明の多層化組織構築物３００は、ヒドロゲル３０８がヒドロゲル３１７を作るために使用したポリマーとは異なるポリマーの重合により形成された重合網目構造物である場合にも実践することができる。従って、上部の層３１５および基底層３０５は、好適には、同じヒドロゲル材料でできているが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、これら２つのヒドロゲル層は異なるポリマーを用いて作ることができ、及び／又はこれら２つの層は異なる添加剤を含有することができよう。
【０１４７】
多層化組織構築物３００は型内において工学的に処理することができるが、この構築物は、特に、組織内における欠損を治療するために使用することができる。この様式で使用する場合、細胞３０６は、好適には、組織Ｔ内における欠損（即ち、図２に示されている空洞４５）内において成長しながら、望ましいタイプの細胞に分化する幹細胞である。
【０１４８】
図５は本発明による別の実施態様を描いており、この実施態様は３つの層４０５、４１０および４１５を有する多層化組織構築物４００であって、ここで、この中間層４１０は、上で説明されている方法の工程３０から５０までとは異なる仕方で形成される。詳細には、図６で概要説明されている方法が、（ａ）基底層４０５および上部の層４１５に対応する懸濁物がポリマーを含み、細胞を含まず、（ｂ）中間層４１０に対応する懸濁物が細胞を含み、ポリマーを含まないように修飾される。従って、細胞４０６はこの実施態様における唯一のタイプの細胞である。どのような特定のタイプの細胞にも限定するものではないが、多層化組織構築物４００は、好適には、何らかのタイプの幹細胞を用いて作られる。
【０１４９】
上で述べられている条件下において、第一の層４０５が形成されるとき、この層は基本的に「細胞不含」のヒドロゲル層４０７である。しかし、図１０に示されているように、幾つかの細胞４０６は、移行帯４２０付近の第一の層４０５内にカプセル化されることになろう。ヒドロゲル４０７は、上で説明されている適切なポリマーのうちの１つの重合により形成された重合網目構造物であり、高い水分含有量を有している。第二の層４１０は、高い密度で詰め込まれた層内に細胞４０６を含んでいる。上で検討されているように、第二の層４１０を作るために使用した懸濁物は何らポリマーを含んでいなかった。しかし、このポリマー不含の懸濁物が第一の層４０５の上に配置されると、ヒドロゲル４０７の重合されていないポリマーのうちの幾分かがこの懸濁物中に混ぜ合わされ、第二の層３１０を形成するであろう。この時点では第二の層中に比較的少量のポリマーしか存在しないため、第三の層４１５に対応する懸濁物は、別個の部分的なゲル化工程５０を実施することなく、第二の層の上に配置される。
【０１５０】
もっと広い観点で言えば、第三の層４１５に対応するポリマー−細胞懸濁物が第二の層４１０の上に配置されるとき、架橋されていないポリマーは拘束を受けずに第二の層内に混ぜ合わされる。従って、第二の層４１０は、一方では、非常に高い細胞密度を含んでいるが、第三の層４１５から混入された幾分かのポリマー、および、恐らくは第一の層４１０から混入された幾分かのポリマーも含んでいるであろう。この後、部分的なゲル化工程５０が第二の層４１０および第三の層４１５の両方に対して同時的に適用される。工程７０においてすべての層のゲル化が完了したときには、概略的に描かれた図５に示されている領域Ｂの拡大図である図３の写真で描かれているように、比較的急激な、またはシャープな移行帯４２０が第一の層４０５と第二の層４１０との間に形成されており、比較的滑らかな、または不鮮明な移行帯４２２が第二の層４１０と第三の層４１５との間に形成されているであろう。
【０１５１】
当業者であれば、基底層４０５および上部の層４１５が細胞不含の懸濁物から作られたものであるため、これらの層内における全ての細胞４０６は中間層４１０を作るために使用された細胞懸濁物に由来したものであることが認識されよう。さらに、中間層４１０から発した細胞が、程度は異なるものの、如何にして隣接した層内においてカプセル化された状態になるかを、図５および１０から一層容易に理解することができる。隣接したヒドロゲル層がポリマー−細胞懸濁物から作られるときにはもっと分かり難くなるが、これ以外の実施態様を作製するときにもこの同じ現象が起こる。
【０１５２】
さらに、上部の層４１５および基底層４０５は、好適には、同じヒドロゲル材料で作製されるが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、これら２つのヒドロゲル層は異なるポリマーを用いて作製することもでき、および／または、これら２つの層は異なる添加剤を含有することもできる。
【０１５３】
本発明および本発明の主要な変更態様について詳細に説明してきたが、特定の利点を強調する幾つかの個々の例証的な実施例について以下で説明する。
【実施例】
【０１５４】
（例証的実施例１：関節軟骨の３つの帯から得られた軟骨細胞をカプセル化した多層化組織構築物）
この例証的実施例においては、図４に示されているような三層化組織構築物が、光ポリマー、光開始剤、ならびに架橋およびヒドロゲルの形成を果たすためのＵＶＡ放射線を用いて生成され、これらのカプセル化される細胞は、哺乳類の関節軟骨における３つの異なる組織帯から収集された軟骨細胞である。この三層化組織構築物は、型の空洞内において形成されたが、移植するのに適しており、また、関節欠損の空洞内において直接的にその場で工学的に処理することもできよう。
【０１５５】
初めに、異なるヒドロゲル層内においてカプセル化されるべき３つの異なるタイプの細胞に相当する軟骨細胞を収集した。３匹の５〜８週齢の子牛から得た６本の脚の膝蓋骨と大腿骨の溝および大腿骨顆から軟骨の薄片を採取した。同様な形を有する軟骨ブロックを得るため、膝蓋骨と大腿骨の溝、大腿骨内側顆および大腿骨外側顆から中央部の領域のみを取り除いた。３つの帯を容易に定められるようにするため、軟骨下骨からまとめて軟骨を採取した。軟骨ブロックの厚みは、関節領域に依存して、２ｍｍから６ｍｍまでの範囲であった。隣接した帯からの細胞による汚染を最小化するため、上部帯、中間帯および下部帯に対して、それぞれ、上部の１０％、中央の１０％および底部の１０％のみを採取した。簡単に言えば、最初に、外科用ブレードを用いて軟骨ブロックから上部の１０％（２００〜６００μｍ）を採取した。これに続く３０％を廃棄した後、次の１０％（２００〜６００μｍ）を中間帯として採取した。これに続く３０％および、残存する軟骨下骨を含めた最も底部の１０％を廃棄した後、底部の１０％（２００〜６００μｍ）を下部帯として採取した。
【０１５６】
（採取された軟骨細胞の表現型特性決定）
軟骨の薄片が特定の帯から得られたものであることを確認するため、まとめて採取された軟骨および３つの層から得られた軟骨薄片の組織学的な評価を実施した。ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された標本を切片化し、標準的な組織学的手順を用いてサフラニン−Ｏ／Ｆａｓｔ  ＧｒｅｅｎおよびＭａｓｓｏｎトリクロームで染色した。
【０１５７】
組織学的な評価により、これらの軟骨薄片は軟骨ブロックの上部（表部ＳＴＺ）帯、中間帯および下部（深部）帯１、２、３から得られたものであることを視覚的に確認することができた。上部帯が最も高い細胞充実性を有しており、続いて中間帯および下部帯の順番であった。上部帯の細胞は中間帯および下部帯の細胞よりも小さかった。上部帯の関節面に沿った細胞は平坦化された形状または楕円形の形態学を有しており、関節面に平行な配列を示した。プロテオグリカン含有量を示すサフラニン−Ｏ染色の強度は下部帯で最も高く、続いて中間帯および上部帯の順番であった。コラーゲン含有量に直接的に関係するＭａｓｓｏｎトリクローム染色の強度は中間帯で最も高く、続いて上部帯および下部帯の順番であった。
【０１５８】
切除された軟骨薄片の生化学的な組成を、３つの帯の各帯における軟骨細胞の細胞タイプの表現型を描写するための様々な特性を提供するＤＮＡアッセイ、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）アッセイおよびコラーゲンアッセイにより決定した。含水重量（ｗｗ）および乾燥重量（ｄｗ）を、凍結乾燥前および４８時間の凍結乾燥後における軟骨薄片（３匹の異なる動物から、ｎ＝９）を用いて測定した。これらの乾燥標本を、１ｍｌのパパイン溶液（１２５μｇ／ｍｌのＰａｐａｉｎ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）、１００ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭのシステイン、１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ６．３］中において、６０℃で１８時間消化した。ＤＮＡ含有量（ｎｇ単位のＤＮＡ量／１ｍｇ（ｄｗ）の軟骨薄片）はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８を用いて決定された。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量は、ジメチルメチレンブルー染料を用いて硫酸コンドロイチンにより見積もられた。総コラーゲン含有量は、ヒドロキシプロリンとコラーゲンとの比として０．１を用い、酸加水分解、ならびにｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドおよびクロラミン−Ｔとの反応後における標本のヒドロキシプロリン含有量を測定することにより決定された。すべての生化学的な結果は平均値および標準偏差（ｎ＝９）として表されている。
【０１５９】
異なる層から得られた軟骨薄片の生化学的アッセイの結果は組織学的な知見と一致していた。水分含有量は上部帯で最も高く、他の２つの層における水分含有量が８０％を下回っていたのに対し、８０％を上回っており、上部帯を他の２つの帯の各帯と比較した際の水分含有量における差は有意であった（ｐ＜０．０１）。また、上部帯はＤＮＡ含有量も最も高く、１．５〜２μｇ／ｍｇ（含水重量）の範囲であり、これは、組織学的な試験において観測された最も高い細胞充実性と一致するものであった。中間帯および下部帯は共に有意（ｐ＜０．０１）に低いＤＮＡ含有量を有しており、その含有量は約１μｇ／ｍｇ（含水重量）またはそれ以下であった。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量は下部帯で最も高く、乾燥重量で約６０％であり、続いて中間帯および上部帯の順番となり、中間帯および上部帯の各帯は、それぞれ、乾燥重量で約４２％および３８％であった。各帯は、それ以外の２つの帯のＧＡＧ含有量とは有意（ｐ＜０．０１）に異なるＧＡＧ含有量を有していた。コラーゲン含有量は中間帯で最も高く、乾燥重量で約７８％であり、続いて上部帯および下部帯の順番となり、それぞれ、乾燥重量で約７０％および５９％であった。コラーゲン含有量の差は、中間帯と上部帯との間の有意性（ｐ＜０．０５）よりも中間帯と下部帯との間で一層有意性（ｐ＜０．０１）が高かった。
【０１６０】
軟骨細胞を単離するため、軟骨片を、０．２％のコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）および５％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤｕｌｂｅｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）中において、３７℃および５％ＣＯ２の環境下で１４〜１６時間培養した。この後、結果として得られた細胞懸濁物を７０μｍのナイロンフィルター（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を通じて濾過し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗った。次いで、単離された細胞の個数およびサイズをＺ２  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて決定した。ＲＴ−ＰＣＲ用の総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて３つの帯のそれぞれの細胞から得られた２百万個の細胞から単離された。
【０１６１】
単離後、３つの帯から得られた軟骨細胞を別々の１０ｃｍの組織培養皿に１０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。細胞は、１０％のウシ胎児血清、０．４ｍＭのプロリン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、ならびに１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中において、３７℃および５％ＣＯ２の環境下で培養された。培養培地は１週間に２回取り替えられた。細胞が８０〜９０％コンフルエンスに達したときに、単一の１０ｃｍの培養皿内における細胞から総ＲＮＡを抽出した。
【０１６２】
細胞の個数およびサイズに関する評価が、異なる時点における３回の実験で行われた（３匹の動物から得られた各層につきｎ＝３）。細胞の個数およびサイズはＺ２  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数され、細胞の生存率はＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染料除去法により決定された。組織１グラム当たりの最大細胞数は上部帯［４２．７（±１．４５）×１０６個の細胞／グラム］から得られ、続いて中間帯［２４．２（±２．５７）×１０６個の細胞／グラム］および下部帯［１３．２（±１．１６）×１０６個の細胞／グラム］の順番であった（Ｕ対Ｍ、ｐ＝０．０００；Ｕ対Ｌ、ｐ＝０．０００；およびＭ対Ｌ、ｐ＝０．００１）。下部軟骨細胞の細胞サイズ（直径：１３．２±０．５２μｍ）が最大であり、続いて中間部軟骨細胞（１２．０±０．１５μｍ）および上部軟骨細胞（１０．７±０．１４μｍ）の順番であった（Ｕ対Ｍ、ｐ＝０．００５；Ｕ対Ｌ、ｐ＝０．０００；およびＭ対Ｌ、ｐ＝０．０１）。これらの定量的な測定値は天然の関節軟骨における軟骨細胞の組織学的観測結果と一致した。３つすべての帯から得られた軟骨細胞の生存率は９７％より大きく、これら３つの帯間に差異はなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１６３】
これら３つの軟骨細胞帯に対する増殖動態も決定された。各帯から採取した軟骨細胞を１２ウェルの培養プレートに２５００個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。細胞は３７℃および５％ＣＯ２の環境下において１２日間培養され、培地は１週間に２回取り替えられた。それぞれの日にちの決まった時間に、３つのウェルから採取した細胞をトリプシン処理し、Ｚ２  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて計数した。細胞の個数およびサイズは平均値および標準偏差（ｎ＝９）として算出された。集団の倍加および集団倍加時間は以下の式を用いて決定された：ＰＤ＝３．３２
［ｌｏｇ（細胞数採取時）−ｌｏｇ（細胞数プレーティング後）］。
【０１６４】
各帯から最初に単離された細胞（Ｐ０）を単層で培養した場合、これらの細胞は、図１１に示されているように、有意差のある増殖動態を示した。下部帯の細胞が、遅滞期、集団倍加時間および飽和密度の評価により示唆されているように、最大の増殖能力を有していた。下部の細胞は、上部および中間部における細胞集団の如き増殖の遅滞期を呈さなかった（図１１Ａ、１１Ｃ）。培養を開始してから最初の３日間における初めの細胞の集団倍加数は下部の細胞（１．８）で最も大きく、続いて中間部の細胞（０．８）および上部の細胞（０．６）の順番であった。プレーティングされた細胞には遅滞期がなかった。指数増殖期の間、下部軟骨細胞（１８．８±１．１時間）は、中間部軟骨細胞（２２．４±０．９時間）および上部軟骨細胞（２６．１±１．１時間）よりも速い集団倍加時間を示した（以下の３つすべての比較において、ｐ＝０．０００：Ｕ対Ｍ；Ｕ対Ｌ；およびＭ対Ｌ）（図１１Ｄ）。これら３つの層の中での集団倍加時間におけるこの差異は、プレーティングされた細胞においても維持された。
【０１６５】
（採取された軟骨細胞の遺伝子型特性決定）
３つの細胞集団に対するＲＴ−ＰＣＲも得られた。２０μｌの反応液当たり１マイクログラムの総ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。この後、１マイクロリットルのｃＤＮＡサンプルを、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼプレミックス（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ、Ｊａｐａｎ）を用いて３５サイクルの間、５５℃のアニーリング温度において増幅した。軟骨特異的プライマーはタイプＩＩコラーゲン（Ｆ−ｇｔｇｇａｇｃａｇｃａａｇａｇｃａａｇａ、Ｒ−ｃｔｔｇｃｃｃｃａｃｔｔａｃｃａｇｔｇｔｇ）、アグリカン（Ｆ−ｇｃｃｔｔｇａｇｃａｇｔｔｃａｃｃｔｔｃ、Ｒ−ｃｔｃｔｔｃｔａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｇ）ＣＯＭＰ（Ｆ−ｃａｇｇａｃｇａｃｔｔｔｇａｔｇｃａｇａ、Ｒ−ａａｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇｔａ）およびタイプＩＸコラーゲン（Ｆ−ｇｔｇｔｔｇｃｔｇｇｔｇａａａａｇｇｇｔ、Ｒ−ｇｇｇａｔｃｃｃａｃｔｇｇｔｃｃｔａａｔｔｃ）を含んだ。内部対照として２つのハウスキーピング遺伝子、β−アクチン（Ｆ−ｔｇｇｃａｃｃａｃａｃｃｔｔｃｔａｃａａｔｇａｇｃ、Ｒ−ｇｃａｃａｇｃｔｔｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｃａｃｇｃ）およびＧＡＰＤＨ（Ｆ−ｇｃｃｔｇｇｔｃａｃｃａｇｇｇｃｔｇｃ、Ｒ−ｔｇｃｔａａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｇｔｇｃａ）を使用した。ＰＣＲ生成物は、ＴＡＥ緩衝液中の２％アガロースゲル上での１００Ｖにおける電気泳動により分離された。
【０１６６】
軟骨特異的マーカーの遺伝子発現は、異なる帯から得られた細胞間で異なっており、プレーティングでの変化のパターンも図１２に示されている如く異なっていた。上部軟骨細胞のタイプＩＩコラーゲンの発現は、中間部軟骨細胞および下部軟骨細胞よりも顕著に低かった。最初に単離された細胞のアグリカンの発現は、これらの帯間で顕著な差異を有しておらず、プレーティングした際には僅かな減少が観測された。最初に単離された細胞においては、下部の細胞のタイプＩＸコラーゲンの発現レベルが最も強く、続いて中間部の細胞および上部の細胞の順番であった。この傾向はプレーティングしたときにおいてさえ維持された。ＣＯＭＰの遺伝子発現は、最初に単離された下部の細胞の方が、上部の細胞および中間部の細胞の場合よりも高かった。
【０１６７】
（非層状組織構築物の評価）
三次元培養における種々の基質合成を比較するため、異なる帯から採取した軟骨細胞を光重合ゲル内に別々にカプセル化した。これら３つの組織構築物は、図９の組織構築物が一つのヒドロゲル中に各帯から得られた軟骨細胞１１、１２および１３を含んでいる点を除き、図９に示されている先行技術の非層状組織構築物と同様であった。本ケースにおいては、この実施例によるそれぞれの非層状組織構築物は、表部ＳＴＺ帯、中間帯または深部帯のいずれかからの軟骨細胞を含んだ。
【０１６８】
この実施例で使用したヒドロゲル溶液は、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を伴う無菌ＰＢＳ中において１０％（重量／体積（ｗ／ｖ））のポリ（エチレングリコール）ジアクリラート（ＰＥＧＤＡ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を混合することにより調製された。このＰＥＧＤＡ溶液に光開始剤、Ｉｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を加え、充分に混合して最終濃度を０．０５％ｗ／ｖにした。光カプセル化の直前に、軟骨細胞をこの溶液中で再懸濁させて濃度を２０×１０６個の細胞／ｍｌにし、均一な懸濁物を作製すべく穏やかに混合した。１００マイクロリットルの細胞／ポリマー／光開始剤懸濁物を、内径が６ｍｍの円筒状の型に移し、４ｍＷ／ｃｍ２の長波長、３６５ｎｍ  ＵＶ光（Ｇｌｏｗｍａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ、ＮＪ）に５分間晒した。この後、これらの単層状ヒドロゲルを型から取り出し、１２ウェルプレートの別々のウェル内において培養した。培養培地は１週間に２回取り替えられた。３週間の培養後、各帯から得られた構築物から含水重量（ｗｗ）および４８時間の凍結乾燥後の乾燥重量（ｄｗ）を得た（ｎ＝９）。これらの乾燥構築物を組織摩砕器（Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐｅｓｔｌｅ  Ｍｉｘｅｒ；Ｋｉｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ）で潰し、１ｍｌのパパイン溶液（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で消化した。上で説明されているのと同じ方法でＤＮＡアッセイ、ＧＡＧアッセイおよびコラーゲンアッセイを実施した。ＧＡＧアッセイおよびコラーゲンアッセイの結果はＤＮＡ含有量に正規化された。
【０１６９】
これらの単層状ＰＥＧＤＡヒドロゲルの生化学アッセイは、三次元培養の後においてさえ、各帯から得られた軟骨細胞は基質合成が異なることを明らかにした（ｎ＝３）。中間部軟骨細胞および下部軟骨細胞によるＧＡＧ合成は、上部軟骨細胞の場合よりも、それぞれ、２６％および４６％だけ有意に大きかった。さらに、下部軟骨細胞は、上部軟骨細胞および中間部軟骨細胞よりも、それぞれ、５５％および３５％多くのコラーゲンを合成した。
【０１７０】
（三層化組織構築物の作製および評価）
多層化組織構築物を生成するための工程が図７に示されている。最初に、上で説明されている単層状組織構築物を作製するために使用されたヒドロゲル溶液を用いて光ポリマー−細胞懸濁物Ａ、ＢおよびＣが作られる。同じく上で検討されているように、このヒドロゲル溶液は０．０５％ｗ／ｖの濃度における光開始剤、Ｉｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９を含んだ。簡単に説明すると、下部軟骨細胞（２０×１０６個の細胞／ｍｌ）を含有する１２０μｌの光ポリマー−細胞懸濁物Ａを８ｍｍの円筒状の型に入れ、（この溶液が部分的にのみゲル化されるように）ＵＶＡランプの下で３分間重合させ、この後、中間部軟骨細胞（２０×１０６個の細胞／ｍｌ）を伴う１２０μｌの光ポリマー−細胞懸濁物を加え、ＵＶＡ光に３分間晒した。最後に、上部軟骨細胞（２０×１０６個の細胞／ｍｌ）を含有する１２０μｌの光ポリマー−細胞懸濁物Ｃを加え、ＵＶＡ光に３分間晒した。これら３つすべての層が完全にゲル化されているのを確実化するため、この後、これら３つの層をさらに１分間ＵＶＡ光に晒した。結果として生じたこの多層化複合ゲル（組織構築物とも呼ばれる）を型から取り出し、別々の１２ウェルプレート内で培養した。
【０１７１】
個々の層内にカプセル化された細胞が存在していたことを確証するため、製造業者のプロトコルによるカプセル化の３日後、細胞トラッキングプロトコル（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｐｒｏｂｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を実施した。簡単に説明すると、上部軟骨細胞および下部軟骨細胞を５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡを伴う１０ｍｌのＤＭＥＭ培地中において３０分間培養することにより標識した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲを用いて同じ仕方で中間部軟骨細胞を標識した。上で説明されているのと同じ仕方で多層化構築物を作製すべく、これらの標識された細胞をカプセル化した。カプセル化した直後およびカプセル化してから３日後に、蛍光顕微鏡検査用にこれらの構築物を収集した。蛍光顕微鏡検査は、ＣＭＦＤＡ用にはフルオレセイン光学フィルター（４８５±１０ｎｍ）を用い、ＣＭＴＭＲ用にはローダミン光学フィルター（５３０±１２．５ｎｍ）を用いて実施された。
【０１７２】
カプセル化した当日およびカプセル化してから３日後に行われた細胞トラッキング研究は、それぞれの層にカプセル化された細胞が存在していたことを確証した。これらのゲルの下部セクションに少量の細胞沈降が観測されたが、ゼロ日目から３日目まで、これらの構築物の層間における細胞移動は存在しなかった。
【０１７３】
カプセル化された細胞の生存率は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞生存率／細胞毒性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて評価した。簡単に説明すると、培養の３日後および２１日後に、外科用ブレードを用いてこれらの構築物から３つの層の薄片（１００〜２００μｍ）を調製した。これらの薄片をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ試薬（２μＭのカルセインＡＭおよび４μＭのエチジウムホモダイマー−１）中において３０分間培養した。カルセインＡＭ用にはフルオレセイン光学フィルター（４８５±１０ｎｍ）を用い、エチジウムホモダイマー−１用にはローダミン光学フィルター（５３０±１２．５ｎｍ）を用いて蛍光顕微鏡検査を実施した。
【０１７４】
これらの多層化ヒドロゲル構築物の細胞生存率アッセイは、細胞が光カプセル化に耐え、約８ｍｍの厚みの三層化構築物内において生存可能な状態のまま留まることを明らかにした。異なる層から得られた細胞の間で、培養の３日後および２１日後における細胞生存率に差異は見られなかった。
【０１７５】
培養の３週間後に、これらの三層化組織構築物を組織学的および免疫組織化学的研究用に収集した。これらのヒドロゲルは４℃における２％パラホルムアルデヒド中において夜通し固定され、標準的な組織学的技法によりパラフィン中に包埋されるまで、７０％エタノールに移された。これらの切片をサフラニン−Ｏ／Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色した。製造業者のプロトコルに従い、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ＳＰキット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて免疫組織化学検査を実施した。一次抗体として、タイプＩＩコラーゲンに対するウサギポリクローナル抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。
【０１７６】
サフラニン−Ｏ染色は、多層化構築物の各層が天然軟骨の相当する帯と同様な組織学的知見を示すことを明らかにした。上部層は平坦化された形状または楕円形の細胞形態学を備えた小さな細胞を有しており、一方、中間層および下部層は卵形または丸形の細胞形態学を備えた大きな細胞を有していた。サフラニン−Ｏで染色された細胞周囲基質の直径は下部層が最も大きく、続いて中間層および上部層の順番であった。
【０１７７】
タイプＩＩコラーゲンに対する免疫組織化学検査は、コラーゲン沈着の位置がサフラニン−Ｏ染色で示されたプロテオグリカン合成の場合と同様であることを示した。陽性に染色される細胞周囲領域の直径は下部層が最も大きかった。上部層における多くの細胞は細胞周囲領域が陽性に染色されなかった。
【０１７８】
従って、上述の結果は、生理学的な多層化組織構成様式に似せるべく、生存可能な多層化組織構築物を本発明により工学的に加工できることを示している。また、上述の結果は、カプセル化された細胞が移動せず、長い期間にわたって多層化構成様式を維持することを示している。さらに、各層内のカプセル化された細胞は、これらの細胞が当初収集された個々の組織帯に恰も留まっている如くに機能するようである。
【０１７９】
（例証的実施例２：関節軟骨の２つの帯から収集された軟骨細胞をカプセル化した多層化組織構築物）
この例証的実施例においては、図１に示されているような二層化組織構築物が、光ポリマー、光開始剤、ならびに架橋およびヒドロゲルの形成を果たすためのＵＶＡ放射線を用いて生成され、これらのカプセル化される細胞は、哺乳類の関節軟骨における２つの異なる組織帯（即ち、表部帯および深部帯）から収集された軟骨細胞である。この二層化組織構築物は、型の空洞内において形成されたが、移植するのに適しており、また、関節欠損の空洞内において直接的にその場で工学的に処理することもできよう。
【０１８０】
初めに、異なるヒドロゲル層内においてカプセル化されるべき２つの異なるタイプの細胞（即ち、表部ＳＴＺ帯軟骨細胞および深部帯軟骨細胞）に相当する軟骨細胞を、第一の例証的実施例で説明されている方法を用いて別々に収集した。次に、ＰＥＧＤＡおよび光開始剤Ｉｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９を用いるヒドロゲル溶液を、第一の例証的実施例で説明されている手順により調製する。次に、２つの異なる光ポリマー−細胞懸濁物を作製すべく、ある量のヒドロゲル溶液に表部軟骨細胞および深部帯軟骨細胞を別々に加える。
【０１８１】
次に、深部軟骨細胞（２０×１０６個の細胞／ｍｌ）を含有する１２０μｌの光ポリマー−細胞懸濁物を８ｍｍの円筒状の型に入れ、（この溶液が部分的にのみゲル化されるように）ＵＶＡランプの下で３分間重合させ、この後、表部軟骨細胞（２０×１０６個の細胞／ｍｌ）を伴う１２０μｌの光ポリマー−細胞懸濁物を加え、ＵＶＡ光に３分間晒した。これら３つすべての層が完全にゲル化されているのを確実化するため、この後、これら３つの層をさらに１分間ＵＶＡ光に晒した。結果として生じたこの二層化組織構築物を型から取り出し、別々のウェルプレート内において、完全培地中で６週間培養した。
【０１８２】
６週間の培養後、本発明の例証的実施例２により生成されたこれらの二層化組織構築物の剪断強さおよび剥離強度を試験し、様々な非層状（即ち、単層化）組織構築物と比較した。このようにして、様々な単層化組織構築物の機械的な強度特性に対する多層化組織構築物の機械的特性の比較が為された。
【０１８３】
詳細には、これらの単層化組織構築物は、それぞれ、この二層化組織構築物の各層を作製するのに使用されたのと同じ光ポリマーおよび光開始剤を用いる同一のヒドロゲル溶液を用いて作製された。しかし、各タイプの細胞に対して２０×１０６個の細胞／ｍｌを含有する光ポリマー−細胞懸濁物が調製されるようにこのヒドロゲル溶液に種々の細胞を加え、この後、２０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で軟骨細胞を含有する１２０μｌの各光ポリマー−細胞懸濁物を８ｍｍの円筒状の型に入れ、（この溶液が部分的にのみゲル化されるように）ＵＶＡランプの下で２分間重合させ、続いて、完全な重合を確実化すべく、ＵＶＡランプの下でさらに３分間重合させることにより、４種類の異なる単層化組織構築物が作製された。次いで、各単層化組織構築物を型から取り出し、完全培地中において６週間培養した。
【０１８４】
４種類の異なるタイプの単層化組織構築物における細胞の組成は以下の通りであった：Ｓ：表部軟骨細胞のみ；Ｄ：深部軟骨細胞のみ；Ａ：すべての種類の軟骨細胞（即ち、図９に示されている如き、表部帯軟骨細胞、中間帯軟骨細胞および深部帯軟骨細胞）、およびＳ−Ｄ混合：等しい数の表部帯軟骨細胞および深部帯軟骨細胞。
【０１８５】
ＲＦＳ３  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｅｒ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて剪断強さおよび圧縮強さについての機械的な試験を実施した。各軟骨細胞−ヒドロゲル組織構築物に対する線形粘弾性帯（即ち、ひずみ範囲）を決定するため、先ずひずみ掃引を実施した。各構築物に対する平衡剛性率およびヤング率は、それぞれ、以下の２つの試験から決定された：１）ステップモードにおいて１％の大きさを有する剪断応力緩和、および２）４００秒間における１０％ひずみの軸方向圧縮試験。
【０１８６】
上で説明されている機械的な試験の結果が以下の表１に一覧表で表されている。Ｓ／Ｄ（全体）は、本例証的実施例により作製された二層化組織構築物に対応しており、一方、試験された残りの構築物はすべて単層構築物である。表１において、ｎは試験された構築物の個数に等しく、剪断強さおよび剥離強度はｋＰａ単位で測定されたものである。
【０１８７】
（表１）
【０１８８】
【表１】
2007508058.tif 000003
表１のデータに示されているように、二層化組織構築物（Ｓ／Ｄ）に対する剛性率およびヤング率の測定値は、図９に相当する先行技術による単層化組織構築物を含めたどの単層化組織構築物の場合よりも有意に大きかった。別な言葉で表現すれば、二層化組織構築物は単層化組織構築物よりも強く、単層化組織構築物よりも大きな剪断強さ特性および剥離強度特性を有していた。この例証的実施例は、関節軟骨などの層状組織における実際の生理学的構成様式に厳密に似せた組織インプラントを作製することが、層状組織構造物にあまり似ていない単層化インプラント構造物を上回る機械的な利点を有していることを証明している。
【０１８９】
（例証的実施例３：関節軟骨の２つの帯から収集された軟骨細胞をカプセル化した多層化組織構築物）
この実施例においては、二層化組織構築物が、ヒト患者における軟骨組織欠損部にその場で直接的に形成される。上で説明されている軟骨細胞収集技法を用いることにより、前もって患者（即ち、自己供与者）または死体のいずれかから表部帯軟骨細胞および深部帯軟骨細胞を採取し、培養する。次に、無菌ＰＢＳ中において１０％ｗ／ｖのＰＥＯＤＡまたはＰＥＧＤＡのいずれかと光開始剤Ｉｇｒａｃｕｒｅ  ２９５９（最終濃度５％ｗ／ｖ）とを充分に混合することによりヒドロゲル溶液を調製する。このヒドロゲル溶液に抗生物質および増殖因子も含められる。詳細には、このヒドロゲル溶液に１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ならびに形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β、ＲＤＩ、１５０ｎｇ／ｍｌ）が加えられる。次に、このヒドロゲル溶液中において表部軟骨細胞および深部軟骨細胞を２千万個の細胞／ｍｌの濃度で別々に再懸濁させ、この後、表部軟骨細胞を含有する均一なヒドロゲル懸濁物および深部軟骨細胞を含有する別個の均一なヒドロゲル懸濁物が得られるように、穏やかに混合する。
【０１９０】
当技術分野における外科医師にとって既知の標準的な整形外科学的プロトコルを用いて、患者の膝関節が手術用に準備され、通常の無菌的な仕方により滅菌布で覆われる。本方法は外科的にアクセス可能なあらゆる関節を治療するために使用することができるが、膝の病態を治療するのに最も有用である。適切な関節鏡を用いて、外科医師は、第一の切開部を通じて関節腔へアクセスし、治療されるべき関節欠損部を視覚化する。必要な場合、この欠損部は、関節鏡のポートを通じて挿入された外科用のツールを使用することにより、または膝の第二の切開部を通じて挿入された外科用ツールを利用することにより、外科医師により鮮創される。
【０１９１】
次に、外科医師は、欠損部の底を満たすのに充分な量の深部帯軟骨細胞を含有した、ある体積のヒドロゲル懸濁物を適用する。この第一のヒドロゲル懸濁物は、関節鏡のポートを通じて供給され、または第二の切開部を通じて関節腔内に一時的に挿入されたチューブを通じて供給される。この後、第一のヒドロゲル懸濁物は、基底ヒドロゲル層を形成すべく、４ｍＷ／ｃｍ２における長波長の３６５ｎｍＵＶ光（Ａｃｔｉｃｕｒｅ）に３〜５分間晒すことにより部分的にゲル化される。このＵＶ光は、関節鏡の光ファーバーを通じて適用され、または第二の切開部を通じて一時的に挿入された別の光ファイバー装置を通じて適用される。
【０１９２】
この後、外科医師は、部分的にゲル化された基底部のヒドロゲルの上面に、表部帯軟骨細胞を含有した、ある体積のヒドロゲル懸濁物を適用する。外科医師は、この第二のヒドロゲル懸濁物を、基底部のヒドロゲルの上面を完全に覆い、且つ、軟骨欠損部を満たすのに充分な量で適用する。第二のヒドロゲル懸濁物は、関節鏡のポートを通じて供給され、または第二の切開部を通じて関節腔内に一時的に挿入されたチューブを通じて供給される。この後、第二のヒドロゲル懸濁物は、上部ヒドロゲル層を形成すべく、４ｍＷ／ｃｍ２における長波長の３６５ｎｍＵＶ光（Ａｃｔｉｃｕｒｅ）に３〜５分間晒すことにより部分的にゲル化される。このＵＶ光は、関節鏡の光ファーバーを通じて適用され、または第二の切開部を通じて一時的に挿入された別の光ファイバー装置を通じて適用される。
【０１９３】
最後に、外科医師は、必要であると考えられる場合、上部ヒドロゲル層および基底部ヒドロゲル層の両方の完全なゲル化を確実化するため、ＵＶ光をさらに１〜５分間適用する。この後、外科医師は、患者の膝からすべての手術用の器械を取り除き、すべての切開部を縫合糸および／または外科用ステープルで閉じる。患者は術後回復室へ移され、そこで術後ケアプロトコルが続けられる。
【０１９４】
本発明を一般的に説明し、続いて、幾つかの例証的な実施例の説明を行ってきたが、当業者であれば、これらの実施態様は制限的なものではないことが認識されよう。例えば、本発明は、基底層が骨細胞を含むべく作製され、残りのヒドロゲル層がそれぞれ異なるタイプの軟骨細胞を含む場合などの如く、ヒドロゲル層のうちの一つがそれ以外のものとは非常に異なるタイプの細胞を含有する、四層化または五層化された組織構築物を作製するために使用することもできよう。
【０１９５】
さらに、本発明により工学的に加工された多層化組織構築物の各層は細胞を全く含んでいないか、または各層のヒドロゲル中にカプセル化された単一タイプの細胞を有するものとして説明されているが、本発明はこの様式に限定されるものではない。ある層のヒドロゲル中にカプセル化された２つまたはそれ以上の異なるタイプの細胞を伴う少なくとも１つの層を有する多層化組織構築物を作製することは本発明の範囲内である。また、それぞれの層が１つまたはそれ以上の異なるタイプの細胞をカプセル化した２つまたはそれ以上の層を有する多層化組織構築物を作製することも本発明の範囲内である。
【０１９６】
特定の好適な実施態様を参照しながら本発明を説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求項により定められる通りの本発明の精神および範囲内に留まりながら、付加、削除、置換、修飾および改善を為し得ることが認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】図１は、本発明の一つの実施態様による、２つの層を有する多層化組織構築物を概略的に示している。
【図２】図２は、本発明の別の実施態様による、濃密な細胞層を含めた３つの層を有する多層化組織構築物を概略的に示している。
【図３】図３は、図２の領域Ａにおける移行帯の拡大図を概略的に示している。
【図４】図４は、本発明の別の実施態様による、３つの層を有する多層化組織構築物を概略的に示している。
【図５】図５は、本発明の別の実施態様による、２つのヒドロゲル層の間に挟まれた１つの濃密な細胞層を含めた３つの層を有する多層化組織構築物を概略的に示している。
【図６】図６は、本発明による多層化組織構築物を作製するための一般的な方法における工程の概要である。
【図７】図７は、外部放射線に晒されたときに光重合可能な混合物を架橋させることによりヒドロゲルが形成される、本発明による多層化組織構築物を作製するための方法による工程を図解したものである。
【図８】図８は、関節軟骨における種々の帯の概略図である（先行技術）。
【図９】図９は、先行技術による非層状の均一な組織構築物の概略図である。
【図１０】図１０は、図５における領域Ｂの拡大図の写真である。
【図１１−１】図１１は、異なる軟骨帯から得られた細胞の増殖曲線および増殖動態研究の概要を表している。（Ａ）最初に単離された軟骨細胞の増殖曲線。（Ｂ）継代細胞の増殖曲線（継代、ＰＯ）。
【図１１−２】図１１は、異なる軟骨帯から得られた細胞の増殖曲線および増殖動態研究の概要を表している。（Ｃ）プレーティング後の最初の３日間で集団が倍加した個数として定義される初期集団倍加数。（Ｄ）集団倍加時間（＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１２】図１２は、軟骨特異的マーカーのＲＴ−ＰＣＲを示しており、ここでは、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨが内部対照として表されている（Ｕ＝上部軟骨細胞、Ｍ＝中間部軟骨細胞、Ｌ＝下部軟骨細胞）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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