(57)【要約】  本発明は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に特異的な配列をコードしている遺伝子に関する。このようにして合成されるＰＫＳは、ＰＵＦＡ（ポリ不飽和脂肪酸）を生成するその酵素能力を特徴とする。本発明はまた、組み換えおよび／またはトランスジェニックの生物の作製のための前記ヌクレオチド配列の使用に加えて、対応するＤＮＡ配列の同定にも関する。
2007532104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、８および／または８０（ＯＲＦ３）において表されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含み、かつ、少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有する、それらに相同な配列を有し、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つのドメインの生物活性を有する、あるいは、
ｂ．配列番号３２、３４、４５、５８、５９、６０、６１、７２、７４、および／または７７において表されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含み、かつ、少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有する、それらに相同な配列を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つのドメインの生物活性を有することを特徴とするＰＵＦＡ−ＰＫＳ。
【請求項２】
１０個以上のＡＣＰドメインを有する、請求項１に記載の単離されたＰＵＦＡ−ＰＫＳ。
【請求項３】
配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、ならびに８および／または８０（ＯＲＦ３）の配列の少なくとも５００個の直線的に連続したアミノ酸との間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つのドメインの生物活性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のＰＵＦＡ−ＰＫＳ。
【請求項４】
配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、ならびに８および／または８０（ＯＲＦ３）の配列の少なくとも５００個の直線的に連続したアミノ酸との間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％の一致率を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つのドメインの生物活性を有する、アミノ酸配列。
【請求項５】
前記請求項のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードしている単離されたＤＮＡ分子、およびそれに完全に相補的なＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３、４、ならびに５および／または９に由来する少なくとも５００個の連続したヌクレオチドとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９５％の一致率を有することを特徴とする、請求項５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項７】
配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、ならびに８および／または８０（ＯＲＦ３）の配列の少なくとも５００個の直線的に連続したアミノ酸と少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項５または６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
好ましくは、配列番号ＸＸ〜ＹＹ（ターミネーター／プロモーター）または少なくとも５００個のヌクレオチドからのそれらの一部分、ならびにそれらの機能的変異体からなる群から選択される、転写を制御する少なくとも１つのＤＮＡ配列と機能的に結合され、請求項５、６、および／または７に記載のＤＮＡ分子のうちの１つを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のＰＵＦＡ−ＰＫＳを内因的に発現し、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つ以上のドメインの活性を有する、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
翻訳を制御するエレメントが配列番号ＸＸ〜ＹＹ（ターミネーター／プロモーター）または少なくとも５００個のヌクレオチドからのそれらの一部分、ならびにそれらの機能的変異体からなる群から選択される組換えＤＡＮ構築物を含む組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の宿主細胞の培養を含む、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＨＡを含有する油を製造するための方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法に従って製造される油。
【請求項１４】
請求項９または１０に記載の宿主細胞の培養を含む、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＨＡを含有するバイオマスを製造するための方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法に従って製造されるバイオマス。
【請求項１６】
請求項８に記載の核酸、および／または請求項１に記載のアミノ酸配列もしくはそれに相同な少なくとも５０個の連続したアミノ酸の部分を含む、請求項１５に記載の組換えバイオマス。
【請求項１７】
人工ポリケチドを製造するためのＰＵＦＡ−ＰＫＳを含む、配列番号６、７、８、および／または８０からの個々の酵素ドメインの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に特異的な配列をコードする遺伝子について述べる。それらから合成されるＰＫＳは、ＰＵＦＡ（ポリ不飽和脂肪酸）を生成するその酵素能力を特徴とする。本発明は、対応するＤＮＡ配列の同定、ならびに組換え生物および／またはトランスジェニック生物の作製のためのヌクレオチド配列の使用もさらに含む。
【背景技術】
【０００２】
ＰＵＦＡ（ポリ不飽和脂肪酸）という用語は、鎖長がＣ１２より長くかつ少なくとも２つの二重結合を有する、多数重なった不飽和長鎖脂肪酸を意味する。ＰＵＦＡには、ω−３（ｎ−３）脂肪酸およびω−６（ｎ−６）脂肪酸という２種の主要なファミリーがあり、これらは、アルキル末端に対する最初の二重結合の位置によって異なっている。これらは、細胞膜の重要な成分であり、脂質、特にリン脂質の形態で存在している。ＰＵＦＡは、例えばプロスタグランジン、ロイコトリエン、およびプロスタサイクリンなど、ヒトおよび動物において重要な分子の予備段階としても機能する（Ａ．Ｐ．Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９９（７０）、５６０〜５６９頁）。ω−３脂肪酸のグループの重要な代表例は、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）およびＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）であり、これらは魚油および海洋微生物中に見出すことができる。ω−６脂肪酸の重要な代表例は、例えば糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔａｒｙ  ｆｕｎｇｉ）中に存在するが、肝臓や腎臓などの動物組織からも単離することができるＡＲＡ（アラキドン酸）である。ＤＨＡおよびＡＲＡは、ヒトの母乳中に共に存在する。
【０００３】
ＰＵＦＡは、適切な発育に関して、特に発達中の脳、組織形成およびその修復のために、ヒトにとって不可欠である。したがって、ＤＨＡは、ヒト細胞膜、特に神経の細胞膜の重要な成分である。これは、脳機能の成熟に重要な役割を果たし、視覚の発達に不可欠である。ＤＨＡの十分な供給を伴うバランスのとれた栄養物はいくつかの疾患の予防に有利であるため、ＤＨＡやＥＰＡなどのω−３  ＰＵＦＡは、栄養補給物として使用されている（Ａ．Ｐ．Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １９９９（７０）、５６０〜５６９頁）。例えば、非インスリン依存性糖尿病の成人は、後で発生する心臓の問題に関係のある欠乏または少なくとも均衡を欠いたＤＨＡバランスを提示する。同様に、アルツハイマー病や精神分裂病などの神経性疾患は、低いＤＨＡレベルを伴っている。
【０００４】
例えば、海洋冷水魚、卵黄部分、または海洋微生物に由来する油など、ＤＨＡを商業用に抽出するための多数の供給源がある。ｎ−３ＰＵＦＡの抽出に適した微生物は、例えば、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の細菌（例えば、ビブリオマリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ））において、または渦鞭毛藻類（渦鞭毛植物（Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ））、特に、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉなどのクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属において、または、例えば、グロッソマスチキス（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ）、ファエオモナス（Ｐｈａｅｏｍｏｎａｓ）、ピングイオクリシス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ピングイオコッカス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｏｃｃｕｓ）、およびポリポドクリシス（Ｐｏｌｙｐｏｄｏｃｈｒｙｓｉｓ）などのピングイオ藻綱（Ｐｉｎｇｕｉｏｐｈｙｃｅａｅ）などのストラメノパイル（もしくはラビリンツラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）において見出される。ＰＵＦＡを製造するのに好ましい他の微生物は、特に、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属を含むヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）（ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｃｈｙｔｒｉｉｄｅａ））に属する。
【０００５】
植物や動物など商業的に公知のＰＵＦＡ供給源から抽出される油は、しばしば、極めて不均一な組成を特徴とする。この方式で抽出される油は、１種または数種のＰＵＦＡの濃縮を可能にするために高価な精製工程にかけられなければならない。さらに、このような供給源からのＰＵＦＡの供給は、制御不可能な変動も被る。すなわち、病害および気候の影響により、動物および同様に植物の収量が低減され得る。魚類からのＰＵＦＡの抽出は、季節的変動の影響を受け、また、乱獲または気候の変化（例えば、エルニーニョ現象）のために一時的に休止されることさえある。動物油、特に魚油は、食物連鎖を介して、環境に由来する有害物質を蓄積し得る。動物は、特に商業的な養魚場において、魚消費の健康的な側面の効果を打ち消す、例えばポリ塩化ビフェニルなどの有機塩化物によって著しくストレスを加えられることが知られるようになった（Ｈｉｔｅｓ他、２００４年、Ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｆａｒｍｅｄ  ｓａｌｍｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３、２２６〜２２９頁）。結果として魚製品の質が低下することにより、消費者は、魚および魚油をω−３ＰＵＦＡ供給源として受け入れないようになる。さらに、魚類からのＤＨＡの濃縮は、高度な技術を要するため、比較的高価である。一方、ＤＨＡは、数種の海洋微生物中に細胞の全脂肪成分の約５０％の量で存在し、これらの微生物は、大型発酵槽中で比較的経済的に培養することができる。微生物の別の利点は、数種の成分に限定されている、それらから抽出される油の組成である。
【０００６】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６、ｎ−３）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５、ｎ−３）などの長鎖ＰＵＦＡの生合成のための様々な生体触媒経路が公知である。真核生物における長鎖ＰＵＦＡを生成するための通常の生合成経路は、リノール酸（ＬＡ；１８：２、ｎ−６）およびαリノール酸のδ−６不飽和化で始まる。これにより、リノール酸からγリノール酸（ＧＬＡ；１８：３、ｎ−６）が合成され、αリノール酸からオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ；１８：４、ｎ−３）が合成される。ｎ−６ならびにｎ−３脂肪酸に対して、この不飽和化工程に続いて、伸長工程ならびにδ−５不飽和化が起こり、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４、ｎ−６）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５、ｎ−３）が生じる。次いで、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５、ｎ−３）から出発するドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６、ｎ−３）の合成が、２つの異なる生合成経路を介して起こり得る。いわゆる直鎖生合成経路においては、さらに２つの炭素単位によるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５、ｎ−３）の伸長が起こり、それに続いて、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６、ｎ−３）の形成のためのδ−４不飽和化が起こる。この生合成経路の存在は、トラウストキトリウム（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）やユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）などの生物におけるδ−４不飽和化酵素の存在によって確認することができた（Ｑｉｕ他、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｌｔａ  ４  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１年）、３１５６１〜３１５６６頁、およびＭｅｙｅｒ他、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｄｅｌｔａ  ４  ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ  ｇｒｏｕｐ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（２００３年）、９７７９〜９７８８頁）。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５、ｎ−３）から出発するドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６、ｎ−３）の合成の第２の経路、いわゆるシュプレッヒャー（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ）経路は、δ−４不飽和化に依存していない。これは、テトラコサペンタエン酸（２４：５、ｎ−３）を生じる、２つの炭素単位による２つの連続的な伸長工程、およびそれに続く、テトラコサヘキサエン酸（２４：６、ｎ−３）へのδ−６不飽和化からなる。その後、ペルオキシソームのβ酸化の結果としての２つの炭素単位の短縮によって、ドコサヘキサエン酸の形成が続いて起こる（Ｈ．Ｓｐｒｅｃｈｅｒ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｎ−３  ａｎｄ  ｎ−６  ｆａｔｔｙ  ａｃ���ｄｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４８６（２０００年）、２１９〜２３１頁）。この第２の生合成経路は、哺乳動物において主なＤＨＡ合成経路である（Ｌｅｏｎａｒｄ他、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ＰＵＦＡ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  ３７（２００２年）、７３３〜７４０頁）。Ｃ２０  ＰＵＦＡを形成するための代替の生合成経路が、δ６デナチュラーゼ（ｄｅｎａｔｕｒａｓｅ）活性を欠くいくつかの生物中に存在している。これらの生物としては、例えば、原生生物アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種およびユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）が挙げられる。代替のＣ２０  ＰＵＦＡ合成における第１工程は、２つの炭素単位による、Ｃ１８脂肪酸、すなわちリノール酸（ＬＡ；１８：２、ｎ−６）およびαリノール酸（ＡＬＡ；１８：３、ｎ−３）の伸長にある。次いで、結果として生じる脂肪酸のエイコサジエン酸（２０：２、ｎ−６）およびエイコサトリエン酸（２０：３、ｎ−３）は、δ８不飽和化およびそれに続くδ５不飽和化によって、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４、ｎ−６）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５、ｎ−３）へと変換される（ＳａｙａｎｏｖａおよびＮａｐｉｅｒ、Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｏｕｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５（２００４年）、１４７〜１５８頁；ＷａｌｌｉｓおよびＢｒｏｗｓｅ；Ｔｈｅ  ｄｅｌｔａ−８  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｏｆ  Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ：Ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２０−ｃａｒｂｏｎ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６２（１９９９年）、３０７〜３１６頁）。
【０００７】
高等植物は、予備段階からＣ２０  ＰＵＦＡを合成する能力を有していない。それらは、ステアリン酸（１８：０）から出発して、様々な不飽和化酵素を介して、オレイン酸（Ｃ１８：１；δ−９不飽和化酵素）、リノール酸（１８：２、ｎ−６，δ１２不飽和化酵素）、およびαリノール酸（１８：３、ｎ−３；δ１５不飽和化酵素）を形成する。
【０００８】
しかし、いくつかの海洋微生物は、ＥＰＡおよびＤＨＡを生成するために全く異なる生合成経路を利用する。これらのＰＵＦＡ生成微生物としては、γプロテオバクテリアの海洋性の代表種、ならびにサイトファーガフラボバクテリウムバクテロイデス（ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）群のいくつかの種、および、現在までのところ、真核原生生物シゾキトリウム種ＡＴＣＣ  ２０８８８が挙げられる（Ｍｅｔｚ他、２００１年、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：２９０〜２９３頁）。これらは、いわゆるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって長鎖ＰＵＦＡを合成する。これらのＰＫＳは、ケチド単位からなる二次代謝産物の合成を触媒する大型酵素に相当する（Ｇ．Ｗ．Ｗａｌｌｉｓ，Ｊ．Ｌ．ＷａｔｔｓおよびＪ．Ｂｒｏｗｓｅ、Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｗｈａｔ  ｗｉｌｌ  ｔｈｅｙ  ｔｈｉｎｋ  ｏｆ  ｎｅｘｔ？Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７（９）４６７〜４７３頁）。ポリケチドの合成は、脂肪酸合成の酵素反応に類似したいくつかの酵素反応を含む（Ｈｏｐｗｏｏｄ＆Ｓｈｅｒｍａｎ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４（１９９０年）３７〜６６頁；Ｋａｔｚ＆Ｄｏｎａｄｉｏ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７（１９９３年）８７５〜９１２頁）。
【０００９】
様々なＰＵＦＡ−ＰＫＳ（ＰＵＦＡ合成ＰＫＳ）の遺伝子配列が既知である。すなわち、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生成するための情報を含む３８ｋｂのゲノム断片が、海洋細菌シュワネラ種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．）から単離された。続いてこの断片が配列決定され、８つの読み取り枠（ＯＲＦ）が同定された（Ｈ．Ｔａｋｅｙａｍａ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３（１９９７年）２７２５〜２７３１頁）。シュワネラに由来するこれらの読み取り枠のうちの５つは、ポリケチドシンターゼ遺伝子に密接な関係がある。同様に、米国特許第５７９８２５９号は、シュワネラプトレファシエンス（ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＳＣＲＣ−２８７４に由来するＥＰＡ遺伝子クラスターを説明している。ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子は、海洋原核生物のフォトバクテリウムプロファンダム（ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）ＳＳ９株（ＡｌｌｅｎおよびＢａｒｔｌｅｔｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２、１４８  １９０３〜１９１３頁）およびモリテラマリナ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）ＭＰ−１株、すなわち以前のビブリオマリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（Ｔａｎａｋａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９、２１、９３９〜９４５頁）においても発見された。類似した、ＰＵＦＡを生成するＰＫＳ様のＯＲＦも、真核原生生物シゾキトリウムにおいて同定されることができた（Ｍｅｔｚ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（２００１年）２９０〜２９３頁および米国特許第６５５６５８３号、ＷＯ０２／０８３８７０  Ａ２号）。シュワネラに由来するＥＰＡ遺伝子クラスターと部分的な一致を示す３つのＯＲＦがシゾキトリウムにおいて決定された。数種の原核生物および真核生物シゾキトリウムにおいてこれらの保存されたＰＫＳ遺伝子が存在することは、原核生物と真核生物の間の、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の遺伝子水平伝播が可能であることを暗示している。
【００１０】
通常はＰＵＦＡを生成しない微生物における、単離された遺伝子クラスターを用いたＰＵＦＡのトランスジェニック生成さえも、既に示されることができた。したがって、シュワネラ種ＳＣＲＣ−２７３８に由来するクラスター中に存在する、上述した５つのＯＲＦ（読み取り枠）は、ＩＰＡ非生産者である大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）およびシネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）種において測定可能な量のＥＰＡを製造するのに十分である（Ｙａｚａｗａ、Ｌｉｐｉｄｓ  １９９６、３１、２９７〜３００頁、およびＴａｋａｙａｍａ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７、１４３、２７２５〜２７３１頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般に、ＰＵＦＡを大量製造するための新しいＰＵＦＡ生産者が常に必要とされている。この製造が、例えば、原核生物、原生生物、または植物で起こるかどうかは、最初は重要ではない。目的は常に、出来るだけ経済的に、かつ、出来るだけ環境を保護する方式で、良質のＰＵＦＡを大量に製造することである。本発明は、特に効率的なＰＵＦＡ生産者であるウルケニア種に由来する適切なＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を説明するという点で、この目的を達成する。
【００１２】
したがって、本発明は、現況技術を考慮して、ＰＵＦＡの製造に申し分なく適したＤＨＡを産生する微生物ウルケニア種からＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を同定し、さらに単離するという課題を有した。さらに、このような遺伝子ならびにそれらの調節エレメントの位置および配置に関する知識も得るべきである。これから得られる知識、特にこれから得られる核酸物質は、同遺伝子型生物ならびにトランスジェニック生物におけるＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子発現の強化を可能にするはずである。
【００１３】
これらの課題、ならびに明示的に挙げなかったが、本文書で最初に論じた文脈から容易に推論または推断することができる他の課題は、本発明の特許請求の範囲において定義する主題によって解決される。
【００１４】
１．ａ．配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、８および／または８０（ＯＲＦ３）において表されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含み、かつ、少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有する、それらに相同な配列を有し、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つのドメインの生物活性を有する、あるいは、
ｂ．配列番号３２、３４、４５、５８、５９、６０、６１、７２、７４および／または７７において表されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含み、かつ、少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有する、それらに相同な配列を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの少なくとも１つのドメインの生物活性を有することを特徴とするＰＵＦＡ−ＰＫＳ。
【００１５】
２．１０個以上のＡＣＰドメインを有する、請求項１に記載の単離されたＰＵＦＡ−ＰＫＳ。
【００１６】
さらに、本発明は、好ましい態様において、配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、ならびに／あるいは８および／または８０（ＯＲＦ３）の配列の少なくとも５００個の直線的に連続したアミノ酸との間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％の一致を示す少なくとも１つのアミノ酸配列を含むようなＰＵＦＡ−ＰＫＳに関する。
【００１７】
さらに、本発明は、好ましい態様において、配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、ならびに／あるいは８および／または８０（ＯＲＦ３）の配列の少なくとも５００個の直線的に連続したアミノ酸との間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９９％の一致を示すアミノ酸配列に関する。
【００１８】
さらに好ましい態様において、本発明は、前述の特許請求の範囲のうちの一項に記載のＰＵＦＡ−ＰＫＳをコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。
【００１９】
後者は、好ましくは、配列番号６（ＯＲＦ１）、７（ＯＲＦ２）、ならびに／あるいは８および／または８０（ＯＲＦ３）の配列の少なくとも５００個の直線的に連続したアミノ酸に少なくとも７０％一致するアミノ酸配列をコードすることを特徴とする。
【００２０】
さらに、本発明は、配列番号３、４、５および／または９の配列に由来する少なくとも５００個の連続したヌクレオチドとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特により好ましくは少なくとも９５％の一致を示すような、単離されたＤＮＡ分子に関する。
【００２１】
さらに好ましい態様において、本発明は、配列番号３、４ならびに５および／もしくは９、または少なくとも５００個のヌクレオチドからのそれらの一部分、ならびにそれらの機能的変異体からなる群から好ましくは選択される、転写を制御する少なくとも１つのＤＮＡ配列と機能的に連結された、前述のＤＮＡ分子のうちの１つを含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００２２】
さらにより好ましい態様において、本発明は、前述の組換えＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞に関する。
【００２３】
さらに好ましい観点において、本発明は、少なくとも１０個のＡＣＰドメインを有する、本発明によるＰＵＦＡ−ＰＫＳを内因的に発現する組換え宿主細胞に関する。
【００２４】
さらに、さらにより好ましい態様において、本発明は、そのような組換え宿主細胞の培養を含む、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＨＡを含有する油を製造するための方法、ならびに、その方法で製造される油に関する。
【００２５】
さらに、さらにより好ましい態様において、本発明は、そのような組換え宿主細胞の培養を含む、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＨＡを含有するバイオマスを製造するための方法、ならびに、その方法で製造されるバイオマスに関する。
【００２６】
したがって、さらにより好ましい態様において、本発明は、請求項８に記載の核酸、および／または請求項１に記載のアミノ酸配列、もしくはそれに相同な少なくとも５００個の連続したアミノ酸の部分を含む、請求項１５に記載の組換えバイオマスにも関する。
【００２７】
本発明はまた、さらにより好ましい態様において、人工ポリケチド、例えば、ポリケチド抗生物質および／または新しい、改変された脂肪酸を製造するための、配列番号３２、３３、３４、４５、５８、５９、６０、６１、７２、７４、および／または７７で表される、配列番号６、７、８、および／または８０を含むＰＵＦＡ−ＰＫＳに由来する個々の酵素ドメインの使用に関する。
【００２８】
本発明によれば、核酸の場合の一致とは、比較される鎖の特定の位置における同一の塩基対を意味する。しかし、ギャップは存在し得る。％で表される一致率を計算するための実行可能な手段の代表例は、ｂｌａｓｔｎプログラムおよびｆａｓｔａプログラムである。
【００２９】
アミノ酸に関しては、相同性という概念は、例えば、タンパク質の機能および／または構造に認めうるほどの影響を与えない、アミノ酸中の保存的交換も含む。このような相同性の値も、例えば、ｂｌａｓｔｐ、マトリックスＰＡＭ３０、ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）：９、伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：１など当技術分野の熟練者には公知のプログラムによって計算される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、ＮＡＲ  ２５、３３８９〜３４０２頁）。
【００３０】
ウルケニア種に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の配列情報は、配列番号３〜５および／または９において定義される核酸配列およびアミノ酸配列によって入手可能である。配列番号１および２は、現在単離されている２種のコスミド上のゲノムＤＮＡ配列全体を表す（実施例２および３を参照されたい）。後者は、それらとしては、ＰＵＦＡ合成に不可欠である、３つの重要な読み取り枠ＯＲＦ１〜３、ならびにそれらに隣接する調節配列に関する情報を含む。さらに、そのゲノム配列から誘導することができるタンパク質配列が、その結果として表される。
【００３１】
本発明は、高純度のＰＵＦＡを製造するための、本発明による核酸を用いた宿主生物の同種間および異種間形質転換のための方法もさらに含む。単離された読み取り枠は、ＰＵＦＡ、特にＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡの製造において、好ましくは、同遺伝子型生物ならびにトランスジェニック生物を生じる。
【００３２】
それらによって産生されるＰＵＦＡは、好ましくは、バイオマスの成分または油として存在する。
【００３３】
本発明より前には、真核生物、すなわち原生生物シゾキトリウムのＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子のみが公知であった（米国特許第６５６６５８３号、ＷＯ０２／０８３８７０）。次いで決定された配列データは、部分的にｃＤＮＡおよび染色体ＤＮＡに由来する。本発明において、初めて、ＰＵＦＡ合成に不可欠な真核原生生物のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子全てが、染色体ＤＮＡから完全に説明される。これにより、以前は知られていなかった、ウルケニア種に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳコーディング遺伝子の情報が決定されるだけでなく、さらに、転写のプロモーターやターミネーターなど隣接する調節エレメントに関するデータも与えられる。さらに、染色体の配列情報により、個々のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の位置および配置を洞察することが可能になる。
【００３４】
シュワネラ、フォトバクテリウム、またはモリテラなどの原核生物ＰＵＦＡ−ＰＫＳの代表例から以前に知られていたような、クラスター自体はもはや存在しないことが、この場合全く驚くべきことであった。最初に同定されたコスミド（配列番号１）により、個々のＯＲＦの直線的配置がウルケニアでは中断されていること、また、個々のＯＲＦの読み取り方向が反対向きであることも示された（図１）。これは、広範囲の遺伝子転位の結果である可能性がある。個々のＯＲＦは、転位の結果として、明らかにより大きな相互間の間隔も提示する。すなわち、２つのＯＲＦ１および２の間隔は、約１３ｋｂである。第３のＯＲＦは、別のコスミド（配列番号２）上で同定されるまで、この場面では同定することができず、また、これらの２種のコスミド（配列番号１および２）の間に部分的な一致を発見することはできなかった（図１）。このことは、ウルケニア種に由来するＯＲＦが、空間的に２つのＯＲＦ１および２の近傍にもはや位置していないことを意味する。これにより、前述の原核生物の代表例から知られているような、ＰＵＦＡ遺伝子クラスターは、真核生物ウルケニア種中にはもはや存在しないと結論づけることができる。ゲノム上の原生生物シゾキトリウムの個々のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の位置および配置は、部分的に決定されており（ＷＯ０２／０８３８７０）、これらもまた、２つのＯＲＦＡおよびＢの逆の向きを示している。しかし、それらは互いから４２２４塩基対しか離れていない。この配列部分は、特許出願ＷＯ０２／０８３８７０において、双方向的なプロモーターエレメントを有する遺伝子間領域として考察されている。少なくともウルケニアに関して、同種のＯＲＦ１と２の間の双方向的なプロモーターエレメントは、ウルケニアについて測定された１２．９５ｋｂの間隔を考慮すると、ありそうにないと思われる。ウルケニアに由来するＯＲＦ１とＯＲＦ２の間の１２．９５ｋｂの領域内に、別の明らかなＯＲＦは存在していない。これは、広範囲の組換えおよび／または転位事象が起こった領域を示す。トランスポザーゼ様の事象は、いくつかの反復配列の重複に基づいても起こり得た。
【００３５】
ウルケニア種に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳが、ＥＰＡ生産者シュワネラ（６×ＡＣＰ）およびフォトバクテリウム（５×ＡＣＰ）のＰＵＦＡ−ＰＫＳ、ならびにＤＨＡ生産者モリテラ（５×ＡＣＰ）およびシゾキトリウム（９×ＡＣＰ）のそれらと比較して、１０個のＡＣＰドメインを有し、アシルキャリアータンパク質の最も多数の繰り返しを有することも、さらに特に驚くべきことであった（図３）。このことは、ウルケニア種から単離されたＰＵＦＡ−ＰＫＳが、近縁の原生生物シゾキトリウムに由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳと比べて異なったアミノ酸配列を有しているだけでなく、構造的にも独特であることを意味する。別の独自性は、ウルケニア種に由来する第３のＯＲＦが、シゾキトリウム由来のＯＲＦ  Ｃに比べて３８アミノ酸短く、また、シゾキトリウム中にはこのように存在していないアラニンに富むドメインをさらに含有するということである（図６）。興味深いことに、この配列は、ＯＲＦ１に由来する個々のＡＣＴドメインの間に存在する領域に似ており、リンカー領域に相当する可能性がある。配列の長さにも、アラニン連続部位が単一のプロリンおよびバリンによってのみ中断されているということにも、類似性が認められる。シゾキトリウムのＯＲＦ  Ｃに比べて欠けている、ＯＲＦ３中のアミノ酸の最も大きな部分は、デヒドラーゼ／イソメラーゼドメイン間の３０アミノ酸長の欠失の結果である（図６）。結果として、これらのドメインは、互いから少し間隔を置いて、対応するタンパク質上に位置し、このことは、酵素活性に影響を及ぼし得る。ＯＲＦ３の場合、さらに遠くの５’側に位置するＡＴＧコドンが開始コドンとして考えられ、したがって、理論的には、最大１８４８アミノ酸長のＯＲＦさえも存在し得る（配列番号９および８０）。同時に存在するＯＲＦ３の変異体も、この文脈においてあり得る。
【００３６】
具体的には、ウルケニア種由来のＯＲＦ１（配列番号３および６）は、一方では、モチーフ（ＤＸＡＣ）（配列番号１２および３０）を特徴とする、いわゆるβケトアシルシンターゼドメイン（配列番号１４および３２）を有する。ウルケニアＯＲＦ１中の酵素ドメインの活性中心のためのモチーフは、好ましい形態において、１７アミノ酸（ＧＭＮＣＶＶＤＡＡＣＡＳＳＬＩＡＶ）の範囲まで拡大することができる（配列番号１１および２９）。βケトアシルシンターゼドメイン全体は、Ｎ末端（配列番号１０および２８）およびＣ末端（配列番号１３および３１）部分に分けることができる。βケトアシルシンターゼドメインの生物学的機能は、脂肪酸および／またはＰＫＳの合成における縮合反応の触媒である。伸長が予定されているアシル基は、チオエステル結合を介してその酵素ドメインの活性中心のシステイン基に結合されており、アシルキャリアータンパク質上のマロニル基の２位の炭素原子へといくつかの工程で転移され、ＣＯ2を放出する。βケトアシルシンターゼドメインに続いて、マロニルＣｏＡ−ＡＣＰトランスフェラーゼドメイン（配列番号１５および３３）がある。このドメインは、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）上の４’−ホスホパンテテイン基へのマロニルＣｏＡの転移を触媒する。マロニルＣｏＡ−ＡＣＰトランスフェラーゼドメインはまた、マロン酸メチルまたはマロン酸エチルをＡＣＰに転移させ、その間に、それらは、別の直鎖炭素鎖中に分枝を導入することができる。次に、リンカー領域に続いて、アシルキャリアータンパク質ドメイン（ＡＣＰドメイン）の１０個の繰り返し（１７〜２６および３５〜４４）を有する、アラニンに富む配列（配列番号１６および３４）が存在する。これらのＡＣＰドメインは、それらとしては、主としてアラニンおよびプロリンからなるリンカー領域によって、互いから隔てられている。各ＡＣＰドメインは、４’−ホスホパンテテイン分子（ＬＧＸＤＳ（Ｌ／Ｉ））に対する結合モチーフを特徴とする。この場合、４’−ホスホパンテテイン分子は、モチーフ内部の保存されたセリンに結合している。ＡＣＰドメインは、４’−ホスホパンテテイン基を介して、伸長中の脂肪酸および／またはポリケチド鎖のための担体としての機能を果たす。ケトレダクターゼに部分的に一致する配列（配列番号２７および４５）が、その後に続く。これらのドメインの生物学的機能は、３−ケトアシル−ＡＣＰ化合物のＮＡＤＰＨ依存性の還元にある。これは、脂肪酸生合成における最初の還元反応に相当する。この反応はまた、ポリケチド合成においても頻繁に起こる（図３も参照されたい）。
【００３７】
ウルケニア種由来のＯＲＦ２（配列番号４および７）もまた、モチーフ（ＤＸＡＣ）（配列番号４８および５６）を特徴とする、βケトアシルシンターゼドメイン（配列番号５０および５８）で始まる。ウルケニアＯＲＦ２中の酵素ドメインの活性中心のためのモチーフは、好ましい形態において、１７アミノ酸（ＰＬＨＹＳＶＤＡＡＣＡＴＡＬＹＶＬ）の範囲まで拡大することができる（配列番号４７および５５）。βケトアシルシンターゼドメイン全体は、Ｎ末端（配列番号４６および５４）およびＣ末端（配列番号４９および５７）部分に分けることができる。このドメインの生物活性は、ＯＲＦ１において説明したβケトアシルシンターゼドメインに相当する。ケトシンターゼ（Ｋｅｔｈｏｓｙｎｔｈａｓｅｓ）は、伸長サイクルにおいて重要な役割を果たし、脂肪酸合成の他の酵素より高い基質特異性を示す。この場合もまた、これに続いて、βケトアシルシンターゼドメインに部分的に少し一致する配列部分が存在する。さらに、このドメインは、活性中心のためのモチーフＤＸＡＣを欠いている。これは、ＩＩ型ＰＫＳに類似した系（配列番号５１および５９）に由来するいわゆる鎖長因子（ＣＬＦ）の特性を有する。ＣＬＦアミノ酸配列は、ケトシンターゼに部分的に一致するが、対応するシステイン基を有する特徴的な活性中心は有していない。ＰＫＳ系におけるＣＬＦの役割は、現在、議論の的となって論議されている。最近の結果により、ＣＬＦドメインの役割は、マロニルＡＣＰの脱炭酸にあることが示唆されている。生成されるアセチル基は、続いて、βケトアシルシンターゼドメインの活性中心に結合することができ、したがって、最初の縮合反応のいわゆる出発分子（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に相当する。ＣＬＦに相同な配列は、分子的なＰＫＳ系におけるロードドメイン（ｌｏａｄ  ｄｏｍａｉｎ）としても発見されている。ＣＬＦ配列特性を有するドメインは、すべての既知のＰＵＦＡ−ＰＫＳ系において存在している。これに続いて、アシルトランスフェラーゼドメイン（配列番号５２および６０）が存在する。このドメインは、アシルから補酵素ＡまたはＡＣＰドメインへの転移などいくつかのアシル転移を触媒する。ＯＲＦ２に由来する終結ドメインは、オキシドレダクターゼ（配列番号５３および６１）との部分的な一致を示し、高い確率で、エノイルレダクターゼドメインに相当する。エノイルレダクターゼドメインの生物活性は、脂肪酸合成の第２の還元反応に存在する。これは、脂肪酸アシルＡＣＰのトランス二重結合の還元を触媒する（図２も参照されたい）。
【００３８】
ウルケニア種由来のＯＲＦ３（配列番号５および８）は、２つのデヒドラーゼ／イソメラーゼドメイン（配列番号６６、６８、７２、および７４）からなる。いずれのドメインも、直接隣接したシステインを有する「活性部位」ヒスチジンを含む（配列番号６７および７３ならびに配列番号６９および７５）。これらのドメインの生物学的機能は、Ｈ2Ｏの分離（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ｏｆｆ）を伴う、脂肪酸またはポリケチド分子中へのトランス二重結合の挿入、およびそれに続く、シス異性体への二重結合の変換である。第２のデヒドラーゼ／イソメラーゼドメインは、機能は知られていないが、おそらくはリンカー領域に相当する、アラニンに富む領域（配列番号７０および７６）に合流する。これに続いて、ＯＲＦ２中に既に存在する、ウルケニア由来のエノイルレダクターゼドメインに対する部分的一致率が高いエノイルレダクターゼドメイン（配列番号７１および７７）が存在する。その生物学的機能は、既に前述したエノイルレダクターゼドメインに対応する（図２も参照されたい）。
【００３９】
好ましくは２０００ｂｐ（配列番号６２）が、ウルケニア種由来のＯＲＦ１に対する開始コドンＡＴＧの前に、プロモーター配列として存在する。それらは、開始点の前の特に好ましくは１５００ｂｐ、特により好ましくは１０００ｂｐである。
【００４０】
好ましくは２０００ｂｐ（配列番号６３）が、ＯＲＦ１の終結配列として停止コドンＴＡＡの後に存在することができる。停止点の後の１５００ｂｐが特に好ましく、１０００ｂｐが特により好ましい。塩基配列ＡＡＴＡＡＡを有する、ＯＲＦ１のｍＲＮＡ合成に対する潜在的な終結シグナルは、停止コドンＴＡＡの４１２ｂｐ後に存在する。
【００４１】
好ましくは２０００ｂｐ（配列番号６４）が、ウルケニア種由来のＯＲＦ２に対する開始コドンＡＴＧの前に、プロモーター配列として存在する。それらは、開始点の前の特に好ましくは１５００ｂｐ、特により好ましくは１０００ｂｐである。
【００４２】
好ましくは２０００ｂｐ（配列番号６５）が、ＯＲＦ２の終結配列としての停止コドンＴＡＡの後に存在することができる。塩基配列ＡＡＴＡＡＡを有する、ＯＲＦ２のｍＲＮＡ合成に対する潜在的な終結シグナルは、停止コドンＴＡＡの１６５０ｂｐ後に存在する。
【００４３】
好ましくは２０００ｂｐ（配列番号７８）が、ウルケニア種由来のＯＲＦ３に対する開始コドンＡＴＧの前に、プロモーター配列として存在する。それらは、開始点の前の特に好ましくは１５００ｂｐ、特により好ましくは１０００ｂｐである。
【００４４】
好ましくは２０００ｂｐ（配列番号７９）が、ＯＲＦ３の終結配列としての停止コドンＴＡＡの後に存在することができる。塩基配列ＡＡＴＡＡＡを有する、ＯＲＦ３のｍＲＮＡ合成に対する潜在的な終結シグナルは、停止コドンＴＡＡの４２２９ｂｐ後に存在する。
【００４５】
例えばＤＨＡなどのＰＵＦＡは、ウルケニア種において同種的に、ならびに、本発明で決定される配列情報を用いて、例えば大腸菌などの宿主において異種的にも、製造することができる。本発明による核酸配列は、例えば、ＰＵＦＡ生成生物中のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の数を増加させるのに使用されるという点で、ＰＵＦＡの生成を増加させるのに使用することができる。当然、例えばＡＴＰドメインをコードする配列部分など個別の核酸部分も、同種またはさらに異種の生成生物において増やすことができる。特に、ＡＣＰドメインは、ＰＵＦＡ合成のために不可欠な補助因子４’−ホスホパンテテインに対する結合部位として、生成を増加させるために生じる。当然、例えば、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーエレメントなどの様々な調節エレメントの使用も、遺伝的に改変されたＰＵＦＡ生産者における生成を増加させることができる。個々の配列部分の遺伝的改変は、結果として生じる生成物の構造の変化をもたらし、したがって、様々なＰＵＦＡの生成をもたらし得る。さらに、ＰＵＦＡシンターゼはポリケチドシンターゼに類似しているため、混合系の構築が可能となる。このいわゆるコンビナトリアル生合成は、新しい人工の生物活性物質の製造を可能にする。例えば、ＰＫＳおよびＰＵＦＡ−ＰＫＳ単位の混合系により、トランスジェニック微生物中で製造される新しいポリケチド抗生物質が考えられる。
【００４６】
この場合に存在するＰＵＦＡ遺伝子の異種発現に適した宿主は、大腸菌の他に、例えば、サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、または、例えば、アスペルギルスニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）やアクレモニウムクリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）などの糸状真菌である。例えば、ダイズ、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、アマ、または他の植物、好ましくは油の豊富な植物に本発明による遺伝子を導入することによって、ＰＵＦＡ生成植物を作製することができる。ＰＵＦＡ遺伝子の効果的な異種発現のために、例えば、４−ホスホパンテテイントランスフェラーゼなどさらに他の補助的な遺伝子も使用することができる。さらに、強化された、または誘導性の遺伝子発現のために、宿主に特異的なプロモーター／オペレーターの系も使用することができる。
【００４７】
ＰＵＦＡの異種産生のために、複数の原核生物発現系を使用することができる。対応するＰＵＦＡ遺伝子に加えて、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写ターミネーターも有する発現ベクターを構築することができる。大腸菌トリプトファン生合成のプロモーター／オペレーター領域、およびλファージのプロモーターが、大腸菌におけるこのような調節エレメントの例として挙げられる。同様に、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに対する耐性などの選択マーカーを、適切なベクター上で使用することができる。大腸菌の形質転換に非常に適したベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＣＱＶ２、およびｐＵＣプラスミド、ならびにそれらの誘導体である。これらのプラスミドは、ウイルスならびに細菌のエレメントを含有し得る。例えば、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＲＲ１、ＨＢ１０１、ＤＨ１、またはＡＧ１などの大腸菌Ｋ１２に由来するすべての株を、大腸菌宿主株として使用することができる。当然、他のすべての通例の原核生物発現系も、ＰＵＦＡの異種産生のために考え得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他も参照されたい）。宿主系として油生成（ｏｉｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ）細菌を使用することも考え得る。
【００４８】
哺乳動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞、ならびに、酵母などの真菌を、真核生物発現系として使用することができる。酵母系の場合、解糖作用からの酵素の遺伝子に由来する転写開始エレメントを使用することができる。これには、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼなどの調節エレメントが含まれる。しかし、酸性ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、またはグルコアミラーゼなどに由来する遺伝子からの調節エレメントでも、使用することができる。強化された、または誘導性の発現を可能にするプロモーターも、この場合使用される。ガラクトース（ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０）によって誘導可能なプロモーターも、特に興味深い（Ｌｕｅ他、１９８７年  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７、３４４６頁以降、およびＪｏｈｎｓｔｏｎ  １９８７年  Ｍｉｒｃｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１、４５８頁以降）。３’終結配列も、好ましくは、酵母に由来する。開始コドン（ＡＴＧ）のすぐ周辺のヌクレオチド配列は、酵母における遺伝子発現に影響を及ぼすため、酵母に由来する効率的な翻訳開始配列もまた、好ましい。酵母プラスミドが使用される場合、それらは、酵母に由来する複製起点を有し、かつ、選択マーカーを有する。この選択マーカーは、好ましくは、例えば、ＬＥＵ、ＴＲＰ、またはＨＩＳなどの栄養要求性マーカーである。このような酵母プラスミドは、いわゆるＹＲｐ（酵母複製プラスミド）、ＹＣｐ（酵母セントロメアプラスミド）、およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）である。複製起点を持たないプラスミドは、Ｙｉｐ（酵母組込み型プラスミド）であり、形質転換されたＤＮＡをゲノム中へ組み込むのに使用される。プラスミドｐＹＥＳ２およびｐＹＸ４２４、ならびにｐＰＩＣＺプラスミドが、特に興味深い。
【００４９】
例えば、アスペルギルスニダランスなどの糸状菌が異種のＰＵＦＡ生産者として使用される場合、対応する生物に由来するプロモーターも使用することができる。強化された発現のためのｇｐｄＡプロモーター、および誘導発現のためのａ／ｃＡプロモーターを、例として使用することができる。ｐＨＥＬＰなどの酵母プラスミド（Ｄ．Ｊ．ＢａｌａｎｃｅおよびＧ．Ｔｕｒｎｅｒ（１９８５年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｍｍｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ．Ｇｅｎｅ  ３６、３２１〜３３１頁）、およびｕｒａ、ｂｉｏ、またはｐａｂａなどの選択マーカーが、好ましくは、糸状菌の形質転換のために使用される。また、糸状菌に由来する３’調節エレメントも好ましい。
【００５０】
昆虫細胞におけるＰＵＦＡの製造は、バキュロウイルス発現系によって行われることができる。このような発現系は、例えば、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されている。
【００５１】
例えば、アグロバクテリウムに由来するＴｉプラスミド、またはカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、トマトゴールデンモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｇｏｌｄｅｎ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）、もしくはタバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕ）（ＴＭＶ）などの完全ウイルスなどのベクターを、植物の形質転換のために使用することができる。好ましいプロモーターは、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターである。植物を形質転換するための別の実行可能な手段は、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、プロトプラストのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションである。ＤＮＡを担わせた微粒子の撃ち込みによる形質転換（遺伝子銃）も好ましい。植物におけるＰＵＦＡ製造の代替手段は、葉緑体の形質転換の結果として得られる。例えば、Ｎ末端リーダーペプチドは、葉緑体におけるタンパク質の輸送を可能にする。好ましいリーダーペプチドは、リブロース２リン酸カルボキシラーゼの小型サブユニットに由来するが、他の葉緑体内の（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｄａｒｙ）タンパク質のリーダーペプチドも、使用することができる。葉緑体ゲノムの安定な形質転換によって、別の実行可能な手段が提供される。特に、遺伝子銃、ただし他の方法も、このために検討することができる（Ｂｌｏｗｅｒｓ他、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９８９  １  １２３〜１３２頁、Ｋｌｉｎｅ他、Ｎａｔｕｒｅ  １９８７  ３２７  ７０〜７３頁、およびＳｃｈｒｉｅｒ他、Ｅｍｂｏ  Ｊ．４  ２５〜３２頁）。
【００５２】
市販されている発現系も、哺乳動物細胞用に使用することができる。特に、例えばレンチウイルスもしくはアデノウイルスの系、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｒｅｘ系などのウイルス系および非ウイルス系の形質転換系および発現系も例として使用することができる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＦｌｐ−Ｉｎ系もまた、哺乳動物細胞におけるＤＮＡの意図された組み込みに使用される。
【００５３】
いくつかの実施例を用いて、本発明による方法の基礎を構成している核酸およびアミノ酸を以下に説明する。しかし、それらの配列および本発明はこれらの実施例に限定されない。
図面の簡単な説明
図１は、ウルケニア種に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子のゲノム上の位置を説明する。さらに、これらの遺伝子によってコードされるＰＵＦＡ−ＰＫＳの個々のドメインを示す。ＫＳ：ケトシンターゼ、ＭＡＴ：マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ：アシルキャリアータンパク質、ＫＲ：ケトレダクターゼ、ＣＬＦ：鎖長因子、ＡＴ：アシルトランスフェラーゼ、ＥＲ：エノイルレダクターゼ、およびＤＨ：デヒドラーゼ／イソメラーゼ
図２は、ウルケニア種に由来するＯＲＦ２およびＯＲＦ３の、モリテラマリナ（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＢ０２５３４２．１）、フォトバクテリウムプロファンダムＳＳ９（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ４０９１００）、シュワネラ種ＳＣＲＣ−２７８３（ジェンバンクアクセッション番号：Ｕ７３９３５．１）、およびシゾキトリウム（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ３７８３２７、ＡＦ３７８３２８、ＡＦ３７８３２９）に由来する、対応する相同なＯＲＦとの比較を示す。進化の過程における個々のＯＲＦ中およびＯＲＦ間の遺伝子転位も、ドメイン構造の隣に示す。
【００５４】
図３は、ウルケニア種に由来するＯＲＦ１の、モリテラマリナ（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＢ０２５３４２．１）、フォトバクテリウムプロファンダムＳＳ９（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ４０９１００）、シュワネラ種ＳＣＲＣ−２７８３（ジェンバンクアクセッション番号：Ｕ７３９３５．１）、およびシゾキトリウム（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ３７８３２７、ＡＦ３７８３２８、ＡＦ３７８３２９）に由来する、対応する相同なＯＲＦとの比較を示す。ＡＣＰドメイン数およびアミノ酸連続（ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬの反復数を強調している。
【００５５】
図４は、ウルケニア種に由来するＯＲＦ１の、シゾキトリウムに由来するＯＲＦ  Ａとの配列比較を含む。双方の配列の部分的一致率は、約８１．５％である。
【００５６】
図５は、ウルケニア種に由来するＯＲＦ２の、シゾキトリウムに由来するＯＲＦ  Ｂとの配列比較を含む。双方の配列の部分的一致率は、約７５．９％である。
【００５７】
図６は、ウルケニア種に由来するＯＲＦ３の、シゾキトリウムに由来するＯＲＦ  Ｃとの配列比較を含む。双方の配列の部分的一致率は、約８０．０％である。
【００５８】
図７は、ＦＡＳＴＡＸを用いて実施した、実施例１で説明するＰＣＲ生成物と、データバンク配列（Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ  Ａｌｌライブラリー）との配列比較を示す。
【００５９】
図８は、実施例２からコスミドバンクを生成するのに使用されたＣｏｓｍｉｄ  ＳｕｐｅｒＣｏｓ１（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ社製）のベクターマップを示す。
【００６０】
図９は、ＢＬＡＳＴＸを用いて実施した、実施例３で説明するＰＣＲ生成物と、データバンク配列（Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ  Ａｌｌライブラリー）との配列比較を示す。
【００６１】
実施例
実施例１：ウルケニア種ＳＡＭ２１７９から単離されたＤＮＡからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的配列の増幅
１．１  ＰＵＦＡ−ＰＫＳをコードしている遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの単離
フロースポイラー（ｆｌｏｗ  ｓｐｏｉｌｅｒ）付き２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌ  ＤＨ１培地（５０ｇ／ｌグルコース；１２．５ｇ／ｌ酵母抽出物；１６．６５ｇ／ｌトロピックマリン（Ｔｒｏｐｉｃ  Ｍａｒｉｎ）；ｐＨ６．０）にウルケニア種ＳＡＭ２１７９を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養した。続いて、滅菌した水道水で細胞を洗浄し、遠心分離し、細胞沈降物を−８５℃で凍結した。次いで、さらに検査するために、細胞沈降物を乳鉢に移し、液体窒素下で乳棒を用いて粉砕して微粉末にした。次いで、微粉砕された細胞物質の１０分の１を２ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス／Ｃｌ  ｐＨ７．２；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；３％（ｖ／ｖ）ＳＤＡ；０．０１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール）と混合し、６８℃で１時間インキュベートした。次いで、２ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、攪拌し、１０００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上層の水相を除去した後、下層を２つの新しい反応容器中に各６００μｌ移し、再び、各６００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）と混合し、攪拌し、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、個々の上層の相の各４００μｌを新しい反応容器に移し、各例において１ｍｌエタノール（１００％）を添加した後２〜３回逆さにした。次いで、沈殿したＤＮＡをガラス棒上に巻き取り、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、５０μｌの蒸留水中に溶解させた。この方法で抽出したＤＮＡを２μｌのＲＮアーゼＡと混合し、次に使用するまで４℃で保存した。
【００６２】
１．２  モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応
モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドとしてＰＣＲプライマーＭＯＦ１およびＭＯＲ１を使用した。
【００６３】
ＭＯＦ１：５’−ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ−３’（配列番号８１）ＭＯＲ１：５’−ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＧ  ＣＴＴ−３’（配列番号８２）。上記１．１の節で説明したウルケニア種２１７９から得たゲノムＤＮＡを１：１００に希釈した。次いで、この希釈物２μｌを体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物（１×緩衝液（Ｓｉｇｍａ社製）；ｄＮＴＰ（各２００μＭ）；ＭＯＦ１（２０ｐｍｏｌ）、ＭＯＲ１（２０ｐｍｏｌ）、および２．５Ｕ  Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製））に移し入れた。以下の条件下でＰＣＲを実施した：最初の変性を９４℃で３分間、その後に続いて、それぞれ９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、最後に７２℃で８分間。次いで、ゲル電気泳動によってＰＣＲ生成物を解析し、Ｔ／Ａクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によってベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ中に適切なサイズの断片を組み込んだ。大腸菌ＴＯＰ  １０Ｆ’を形質転換した後、プラスミドＤＮＡを単離し（Ｑｉａｐｒｅｐスピン、ＱＵＡＧＥＮ社製）、配列決定した。
【００６４】
得られた配列データを公式にアクセス可能なＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）と比較し、評価した。ＦＡＳＴＡＸを用いて得られる配列比較により、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９に由来するＰＣＲの主要生成物について、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアータンパク質（ＯＲＦ  Ａ；ＯＲＦ：読み取り枠）と部分的な一致が示され、この一致はアミノ酸レベルで約９０％であった（図７）。驚くべきことに、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９中のこのＰＵＦＡ−ＰＫＳを測定するために、わずか１回のＰＣＲ実験しか実施する必要がなかった。このことは、使用されたオリゴヌクレオチドの特に高い有効性を示す。
【００６５】
実施例２：
ウルケニア種ＳＡＭ２１７９に由来するゲノムＤＮＡからの遺伝子バンクの作製
３７℃で２分間、５００μｌの体積中で２．５Ｕ  Ｓａｕ３ＡＩを用いて、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９に由来する５０μｇのゲノムＤＮＡを部分的に分割し、続いて、同じ体積量のフェノール／クロロホルムを用いて直ちに沈殿させ、次いで、エタノールを用いて沈殿させ、蒸留水中に取り出した。次いで、製造業者の取扱い説明書に従って、このＳａｕ３ＡＩで分割したゲノムＤＮＡをＳＡＰ（エビのアルカリホスファターゼ；Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて脱リン酸化した。続いて、反応バッチを６５℃で２０分間加熱することによって、酵素失活を行った。Ｃｏｓｍｉｄ  Ｓｕｐｅｒｃｏｓ  Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、図８）をベクターとして使用した。３７°Ｃで数時間、ＸｂａＩを用いて、１０μｇのＳｕｐｅｒｃｏｓ  Ｉ  を完全に分割した。次いで、６５℃で２０分間、酵素を熱失活させ、また、製造業者の取扱い説明書に従って、切断されたコスミドをＳＡＰ（エビのアルカリホスファターゼ；Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて脱リン酸化した。この場合も、反応バッチを６５℃で２０分間加熱することによって、酵素失活を行った。次いで、ＸｂａＩで分割され、脱リン酸化されたＳｕｐｅｒｃｏｓ  Ｉコスミドを、３７℃で数時間、ＢａｍＨＩを用いて完全に分割した。次いで、フェノール／クロロホルムを用いて、切断されたコスミドＤＮＡを沈殿させ、エタノールを用いて沈殿させ、続いて、蒸留水中に取り出した。ライゲーションのために、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて分割した１μｇのコスミドＤＮＡ、ならびにＳａｕ３ＡＩで分割したゲノムＤＮＡ３．５μｇを２０μｌの体積中で混合し、製造業者の取扱い説明書に従ってＴ４リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて、数時間、連結させた。続いて、製造業者の取扱い説明書に従ってＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ファージ中にライゲーションバッチの約７分の１をパッケージングした。後者は、その後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲのトランスフェクション用に使用した。続いて、この遺伝子バンクからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的コスミドの単離が、ＱＩＡＧＥＮ社（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）によって、ウルケニアＰＫＳに特異的なオリゴヌクレオチドＰＳＦ２：５’−ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＣＧＴ−３’（配列番号８３）およびＰＳＲ２：５’−ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号８４）を用いたＰＣＲスクリーニングの形態で行われた。続いて、それによって決定されたコスミドクローンＣ１９Ｆ０９のコスミドＤＮＡを単離し、配列決定した（配列番号１）。
【００６６】
実施例３：
ウルケニア種に由来するＯＲＦ３の同定
ウルケニア種ＳＡＭ２１７９に由来するＯＲＦ３を同定するために、様々なＰＵＦＡ−ＰＫＳの高度に保存された配列部分からオリゴヌクレオチドを導き出した。興味深いことに、ＰＣＲ増幅に適していると思われた非常に高率の部分的一致が、個々の種間で、デヒドラーゼ／イソメラーゼをコードしている配列部分の領域に現れた。
【００６７】
３．１  ＰＵＦＡ−ＰＫＳをコードしている遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの単離
実施例１．１を参照されたい。
【００６８】
３．２  ＰＵＦＡ−ＰＫＳに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応
ＰＵＦＡ−ＰＫＳに特異的なオリゴヌクレオチドとして以下のＰＣＲプライマーを使用した：
ＣＦＯＲ１：５’−ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＧＡＴ−３’（配列番号８５）
ＣＲＥＶ３：５’−ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号８６）
上記３．１の節で説明したウルケニア種２１７９から得たゲノムＤＮＡを１：１０の比に希釈した。次いで、この希釈物２μｌを体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物（１×緩衝液（Ｓｉｇｍａ社製）；ｄＮＴＰ（各２００μＭ）；ＣＦＯＲ１（２０ｐｍｏｌ）、ＣＲＥＶ３（２０ｐｍｏｌ）、および２．５Ｕ  Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製））に移し入れた。以下の条件下でＰＣＲを実施した：最初の変性を９４℃で３分間、その後に続いて、それぞれ９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、最後に７２℃で８分間。次いで、ゲル電気泳動によってＰＣＲ生成物を解析し、Ｔ／Ａクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によってベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ中に適切なサイズの断片を組み込んだ。大腸菌ＴＯＰ  １０Ｆ’を形質転換した後、プラスミドＤＮＡを単離し（Ｑｉａｐｒｅｐスピン、ＱＵＡＧＥＮ社製）、部分的に配列決定した。
【００６９】
得られた配列データ（配列番号１）を公式にアクセス可能なＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）と比較し、評価した。ＦＡＳＴＡＸを用いて得られる配列比較により、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９に由来するＰＣＲの主要生成物について、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳシンターゼのＯＲＦ  Ｃと部分的な一致が示され、この一致はアミノ酸レベルで約８０％であった（図９）。驚くべきことに、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９中のこのＰＵＦＡ−ＰＫＳを測定するために、わずか１回のＰＣＲ実験しか実施する必要がなかった。このことは、使用されたオリゴヌクレオチドの特に高い有効性を示す。続いて、実施例２で説明した遺伝子バンクからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的コスミドの単離が、ＱＩＡＧＥＮ社（ヒルデン、ドイツ）によって、ＰＣＲ用に以前に使用されたオリゴヌクレオチドＣＦＯＲ１：５’−ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＧＡＴ−３’（配列番号８５）およびＣＲＥＶ３：５’−ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号８６）を用いたＰＣＲスクリーニングの形態で行われた。続いて、それによって決定されたコスミドクローン０５８Ｇ０９のコスミドＤＮＡを単離し、配列決定した（配列番号２）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ウルケニア種に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子のゲノム上の位置を説明する図である。
【図２】ウルケニア種に由来するＯＲＦ２およびＯＲＦ３の、モリテラマリナ（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＢ０２５３４２．１）、フォトバクテリウムプロファンダムＳＳ９（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ４０９１００）、シュワネラ種ＳＣＲＣ−２７８３（ジェンバンクアクセッション番号：Ｕ７３９３５．１）、およびシゾキトリウム（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ３７８３２７、ＡＦ３７８３２８、ＡＦ３７８３２９）に由来する、対応する相同なＯＲＦとの比較を示す。
【図３】ウルケニア種に由来するＯＲＦ１の、モリテラマリナ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＢ０２５３４２．１）、フォトバクテリウムプロファンダムＳＳ９（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９）（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ４０９１００）、シュワネラ種ＳＣＲＣ−２７８３（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８）（ジェンバンクアクセッション番号：Ｕ７３９３５．１）、およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（ジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ３７８３２７、ＡＦ３７８３２８、ＡＦ３７８３２９）に由来する、対応する相同なＯＲＦとの比較を示す。
【図４】ウルケニア種に由来するＯＲＦ１の、シゾキトリウムに由来するＯＲＦ  Ａとの配列比較を示す図である。
【図５】ウルケニア種に由来するＯＲＦ２の、シゾキトリウムに由来するＯＲＦ  Ｂとの配列比較を示す図である。
【図６】ウルケニア種に由来するＯＲＦ３の、シゾキトリウムに由来するＯＲＦ  Ｃとの配列比較を示す図である。
【図７】ＦＡＳＴＡＸを用いて実施した、実施例１で説明するＰＣＲ生成物と、データバンク配列（Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ  Ａｌｌライブラリー）との配列比較を示す。
【図８】実施例２からコスミドバンクを生成するのに使用されたＣｏｓｍｉｄ  ＳｕｐｅｒＣｏｓ１（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ社製）のベクターマップを示す。
【図９】ＢＬＡＳＴＸを用いて実施した、実施例３で説明するＰＣＲ生成物と、データバンク配列（Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ  Ａｌｌライブラリー）との配列比較を示す。
【図１】
2007532104.tif 000003
【図２】
2007532104.tif 000004
【図３】
2007532104.tif 000005
【図４】
2007532104.tif 000006
【図４】
2007532104.tif 000007
【図４】
2007532104.tif 000008
【図４】
2007532104.tif 000009
【図５】
2007532104.tif 000010
【図５】
2007532104.tif 000011
【図５】
2007532104.tif 000012
【図６】
2007532104.tif 000013
【図６】
2007532104.tif 000014
【図７】
2007532104.tif 000015
【図８】
2007532104.tif 000016
【図９】
2007532104.tif 000017
【配列表】
2007532104000001.app
【国際調査報告】
2007532104.tif 000018
2007532104.tif 000019
2007532104.tif 000020
2007532104.tif 000021
2007532104.tif 000022
2007532104.tif 000023
2007532104.tif 000024
2007532104.tif 000025
2007532104.tif 000026
2007532104.tif 000027