(57)【要約】インビトロで血液生成物を生成する方法および処置の方法が提供される。この方法は、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉細胞を成長因子と一緒に培養する工程を包含する。間葉細胞を分化させる方法も提供される。この間葉細胞を分化させる方法は、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養する工程および少なくとも一つの血球生成物を生成する工程を包含する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで血液生成物を生成する方法であって、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞を成長因子と一緒に培養する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血液生成物の必要な患者を処置する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞を、インビトロで成長因子と一緒に培養する工程；
該血液生成物を単離する工程；および
生成された少なくとも一つの型の血液生成物の治療有効量を、該患者に送達する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
非ＳＶ４０形質転換間葉細胞を分化させる方法であって、以下：
単離された間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養する工程；および
少なくとも一つの型の血球生成物を生成する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養する工程によって入手可能な少なくとも一つの型の血液生成物の使用であって、白血病、血小板減少症、白血球減少症、顆粒球減少症、リンパ球減少症、再生不良性貧血、および／または骨髄が関与した自己免疫疾患もしくは骨髄が関与していない自己免疫疾患を処置するため、化学療法、全身照射もしくは身体の一部の照射後の患者を処置するため、血管性疾患、虚血性疾患および／もしくは悪性疾患、または貧血を処置するための薬学的組成物を調製するための、使用。
【請求項２３】
少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養する工程によって入手可能な、癌および転移の診断のための薬学的組成物を調製するための少なくとも一つの型の血液生成物の使用であって、該少なくとも一つの型の血液生成物が、放射性化合物で標識されている、使用。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２７】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２８】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２９】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１〜７または１５〜２１のいずれかに記載の方法に従って得られた血液生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（１．技術分野）
本発明は、血液生成物、および間葉幹細胞から血液生成物を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．背景情報）
造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉幹細胞（ＭｅｓＳＣ）は、細胞表面マーカーに基づいて容易に識別可能な細胞集団である。ＨＳＣおよびＭｅｓＳＣは、これまで別個の細胞および組織の集団を生じると考えられてきた。
【０００３】
ＨＳＣは、血球（例えば、赤血球、骨髄球、血小板、樹状細胞およびリンパ球）を形成することが知られていた。ＨＳＣはまた、骨髄幹細胞（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＢＭＳＣ）および骨髄幹細胞（Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＭＳＣ）としてもまた知られている。ＨＳＣは、骨髄に由来し、非付着性の、ＣＤ３４陽性およびＣＤ３８陰性の細胞として同定されている。さらに、ＨＳＣは、Ｌｉｎ陰性かつＨＬＡ  ＤＲ陽性の細胞として同定されている。
【０００４】
ＭｅｓＳＣは、非造血組織（例えば、骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞、筋細胞および神経細胞）を形成する。ＭｅｓＳＣは、骨髄、血液、および種々の非造血組織（骨、軟骨、腱、脂肪、筋および神経細胞の初期の前駆体が挙げられる）に分化し得る他の組織に位置する、分化能力の乏しい（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞である。ＭｅｓＳＣは、成長因子および物理的環境を含む、細胞に対する種々の環境の影響の相互作用に依存して、種々の細胞型に分化する。ＭｅｓＳＣは、ＣＤ３４陰性細胞として同定されるという点で、ＨＳＣとは異なる。ＭｅｓＳＣはまた、ＣＤ４５に対して陰性であると同定され、培養して少なくとも一継代後、ＣＤ１０５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１３およびＭＨＣ  Ｉに対して陽性であると同定され得る。
【０００５】
ＭｅｓＳＣの非造血組織への分化の例としては、ＭｅｓＳＣの中胚葉（脂肪、軟骨、骨、腱、心筋および骨格筋）（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）および外肺葉（神経細胞）（非特許文献５、非特許文献６）への分化が挙げられる。ＭｅｓＳＣの、ラットの梗塞心筋への移植後、移植された細胞は、心筋に分化し、数週間後に心臓組織を再生したことをマーカー遺伝子によって検出された（非特許文献７）。他の動物モデルにおいて、ＭｅｓＳＣは、損傷を受けた動物か、またはノックアウト動物において脳および脊髄に分化することが示されており、このことは、損傷を受けた神経組織の改善または治癒につながる（非特許文献８）。
【０００６】
いくつかの研究は、ＭｅｓＳＣが、例えば、骨髄移植、免疫調節および移植促進における、造血細胞を補助するのに有益であり得ることを示唆している。しかし、ＭｅｓＳＣは、血球を形成するために、インビトロで培養されていなかった。
【０００７】
血液生成物を形成するために、ＭｅｓＳＣを使用する利点としては、ＭｅｓＳＣの単離後の培養における大きな増殖能力が挙げられる。培養において良好に増殖しないＨＳＣとは違って、ＭｅｓＳＣは、培養において非常に増殖し、なお複数の血液生成物へ分化する能力を保持し得る。例えば、少量の骨髄吸引物は、本発明の血液生成物を形成するための多数の細胞に分化するのに十分なＭｅｓＳＣを提供し得る。
【０００８】
従って、ＭｅｓＳＣ由来の血液生成物を提供するための方法が、所望されている。
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ，ＭＦら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９９９、２４８、ｐ．３８５−３８９
【非特許文献２】Ｊａｉｓｗａｌ，Ｎら、「Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１９９７、６４（２）、ｐ．２９５−３１２
【非特許文献３】Ｓｈａｋｉｂａｅｉ，Ｍら、「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．」、１９９７、２１（２）、ｐ．１１５−２５
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｄａ，Ｋ、「Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ．」、２００１、２５（３）、ｐ．１８７−９３
【非特許文献５】Ｄｅｎｇら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．」、２００１、２８２（１）：ｐ．１４８−５２
【非特許文献６】Ｗｏｏｄｂｕｒｙら、「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．」、２０００、６１（４）、ｐ．３６４−７０
【非特許文献７】Ｔｏｍａ，Ｃら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２、１０５（１）、ｐ．９３−８
【非特許文献８】Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、１９９９、９９（４）、ｐ．２１９９−２０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（概要）
従って、本発明の一つの目的は、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞を成長因子と一緒に培養する工程を包含する、インビトロで血液生成物を生成する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞を分化させる方法を提供することであって、この方法は、単離された間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養する工程、および少なくとも一つの型の血球生成物を生成する工程を包含する。
【００１１】
本発明の別の目的は、血液生成物の必要な患者の処置の方法を提供することであり、この方法は、少なくとも一つの血液生成物を生成するのに十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養する工程によって生成された少なくとも一つの型の血液生成物の治療量を送達する工程を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（図面の詳細な説明および本発明の好ましい実施形態）
本発明は、細胞の形態の血液生成物を生成するために、単離された、培養された間葉幹細胞（ＭｅｓＳＣ）を利用する。本方法を用いて生成された血液生成物としては、造血幹細胞から従来法で形成した血液生成物が挙げられる。用語「血液生成物」または「血液生成物の型」とは、本明細書中で使用される場合、末梢血で見出される全ての細胞（幹細胞、未成熟細胞集団および成熟した細胞集団）をいう。例として、血液生成物としては、培養ＭｅｓＳＣから形成された造血幹細胞、骨髄幹細胞、内皮細胞、リンパ球幹細胞、抗原提示細胞、赤血球系細胞および巨核球、ならびにこれらに由来する細胞の集団が挙げられるが、これらに限定されない。図１は、血球形成における主要な発生段階を図示する。血球形成のプロセスは、幹細胞から循環血液に見出される成熟細胞への増殖および分化の連続である。図１は、培養ＭｅｓＳＣから形成され得る例示的な血液生成物を図示する。例えば、赤血球、マクロファージおよび樹状細胞は、全て骨髄幹細胞に由来し得る。しかし、図１に図示する血液生成物は、限定的であることを意味しない。
【００１３】
（ＭｅｓＳＣの単離）
本発明に従ったＭｅｓＳＣは、細胞表面発現マーカーによって同定され得る。適切なＭｅｓＳＣは、表１に示される表面マーカーの大多数を有する。
【００１４】
【表１】
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本明細書中に記載されるように、本発明の一実施形態において、血液生成物を生成するために使用されるＭｅｓＳＣは、骨髄または血液、好ましくは骨髄吸引物に由来し得る。しかし、ＭｅｓＳＣは、当業者に公知の任意の細胞源に由来し得、それらとしては、骨髄、血液、真皮および骨膜（ｐｅｒｉｏｓｔｉｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。用語「培養する」は、本明細書中で使用される場合、血液生成物を形成するために、ＭｅｓＳＣを増殖すること、ＭｅｓＳＣを成長させること、およびＭｅｓＳＣを分化させることを包含する。用語「ＳＶ４０形質転換」は、本明細書中で使用される場合、限られた数で細胞を倍加させる細胞を、集団を無限に倍加させる細胞株へと形質転換するために、ＳＶ４０ラージＴ抗原を使用した、無限の寿命を有し、無制限に倍加して増殖し得る細胞株へのインビトロでの細胞の形質転換をいう。非ＳＶ４０形質転換細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換されていない。本明細書中で使用される場合、用語「幹細胞」とは、他の細胞型を生じ得る未成熟細胞をいう。
【００１５】
（ＭｅｓＳＣの培養、成長および分化）
本発明の好ましい実施形態において、ＭｅｓＳＣは、以下に記載されるＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）勾配を使用して骨髄吸引物から単離される。単離されたＭｅｓＳＣの増殖特性は、図２に示される。
【００１６】
Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）勾配単離の後、ＭｅｓＳＣは、インビボで培養され得、成長し得る。培養における継代の後、ＭｅｓＳＣは、分化培地および成長因子の存在下で増殖され、血液生成物を生成し得る。例として、この培地は、個々に添加された以下の成長因子か、またはそれらを組合せて含有し得る。これらの成長因子としては、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むインターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびヒドロコルチゾン（ＨＣ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。あるいは、ＭｅｓＳＣは、分化の前にＭｅｓＳＣを継代することなく、分化培地および成長因子の存在下で増殖され得る。インビトロでＭｅｓＳＣから形成された血球生成物は、分化のために選択された培養条件に依存し、そして以下でより詳細に記載される。
【００１７】
骨髄から単離された細胞は、ただちに使用され得るか、またはこの細胞は、後の成長および／もしくは分化のために保存され得る。例えば、新たに単離された骨髄細胞は、保存され得、好ましくは骨髄移植の分野で日常的になされるように、凍結保存され得る。新鮮に単離された骨髄は、ＭｅｓＳＣおよびＨＳＣを含む細胞の混合物を含む。保存した骨髄細胞は、実質的に増殖能力または分化能力を損なわずにＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）勾配上で分離され得、単離され得、培養され得、そして、後の時点で、分化され得る。単離されたＭｅｓＳＣはまた、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）遠心分離の後、かつインビトロ培養の前に、保存され得、好ましくは凍結保存され得る。培養されたＭｅｓＳＣはまた、細胞培養におけるプラスチック上にプレートした後の初期継代（例えば、Ｐ０またはＰ１）において、増殖能力または分化能力を実質的に減少させずに、保存、好ましくは凍結保存され得る。潜在的に、全ての血液生成物は、収集した骨髄から分化した血液生成物へのプロセスの任意の工程において、患者への送達の前に、一定期間保存され得る。血液生成物の保存は、当業者に公知の任意の型の保存であり得る。血液生成物の保存は、多くの理由（患者への繰り返しの投与、後の使用のための自己提供、細胞集団の特徴付けおよびその後の使用などが挙げられるが、これらに限定されない）のため有利であり得る。
【００１８】
好ましい実施形態において、ＭｅｓＳＣは、骨髄吸引物から単離される。骨髄は、当業者に公知の手順に従って、自己ドナーまたは同種異系ドナーから入手される。一旦骨髄がドナーから入手されると、ＭｅｓＳＣは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）勾配を使用して骨髄吸引物から単離される。
【００１９】
好ましい実施形態において、不連続勾配が好ましい。勾配の調製およびＭｅｓＳＣの分離は、独国特許出願番号第１０３  ３６  １５２．９（２００３年８月６日出願）および国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８８６５（２００４年８月６日出願）に記載され（これらの出願は両方とも発明の名称が「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」である）、これらの文献は、両方とも、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００２０】
好ましい実施形態において、１．１２４ｇ／ｍｌの密度を有するＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）溶液（Ｆａ．Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が、不連続密度勾配を調製するために使用される。塩基性溶液の希釈は、以下の式に従ってＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないリン酸緩衝塩溶液、Ｇｉｂｃｏ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製され：
【００２１】
【化１】
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ここで：
Ｄ’    所望の最終密度（ｇ／ｍｌ）
Ｄ’’  高塩基性溶液の密度（ｇ／ｍｌ）
Ｄ％    等オスモル希釈液の密度（ｇ／ｍｌ）
Ｖ％    高密度を有する塩基性溶液の体積％
この方法を使用する分離溶液は、種々の密度、好ましくは以下の密度：１．０５０ｇ／ｍｌ、１．０６３ｇ／ｍｌ、１．０６８ｇ／ｍｌ、１．０７７ｇ／ｍｌ、１．０８８ｇ／ｍｌおよび１．１００ｇ／ｍｌを使用して調製され得る。
【００２２】
骨髄吸引物は、ＰＢＳで１：１に希釈され、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）勾配上で層状にされ、室温（ＲＴ）で、８００×ｇで２０分間遠心される。低密度の細胞は、以下の実施例１に記載されるように、より高密度の赤血球および単核造血細胞から単離される。低密度の細胞は、さらなる増殖アッセイ、表現型アッセイおよび分化アッセイにおける特徴付けに基づいて、高増殖能力について選択される。あるいは、ＭｅｓＳＣは、当業者に公知の任意の方法によって単離され得る。
【００２３】
ＭｅｓＳＣを含む低密度の細胞を収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＤＭＥＭ／低グルコースを含有し、１０％の予め選択したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ａｐｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した増殖培地中に再懸濁する。ＦＣＳをＤＭＥＭ／ＬＧ＋１０％  ＦＣＳ中で増殖したＭｅｓＳＣの増殖特性と比較することによって、予め選択した。このＭｅｓＳＣを、Ｐ４継代で、ＦＡＣＳ分析および分化アッセイにおいてＭｅｓＳＣの表現型（脂質生成能力、骨形成能力および軟骨形成能力が挙げられる）について試験した。ＦＣＳを、分化の促進に関して、および試験ＭｅｓＳＣの最大成長に関して選択した。単離された、ＭｅｓＳＣを含む細胞を、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバ中で計数する。初期播種については、１×１０７細胞を、２５ｃｍ２の増殖表面を有する組織培養フラスコ中に播種し、５％ＣＯ２および９７％以上の湿度を有するインキュベーター中で、約９０％のコンフルーエンシーまで増殖させる。ＭｅｓＳＣを含む単離された細胞は、好ましくは、ＣＤ３４陰性のプラスチック付着性の線維芽細胞様の細胞である。単離されたＭｅｓＳＣは、ドナー材料の質に依存して４〜１０継代増殖し、図２に示すほぼ定常な倍加速度に達する。最終的に、増殖能力は減少し、ＭｅｓＳＣは、増殖を停止する。活発な増殖期の間、単離されたＭｅｓＳＣは、ＭｅｓＳＣに特異的な細胞表面マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１３およびＭＨＣ  Ｉを含む）を提示する。ＭｅｓＳＣの複数の血液生成物への分化のために、種々の分化培地および成長因子が使用され得る。例えば、汎性の（ｐａｎ）白血球マーカー、ＣＤ４５を発現する白血球の集団は、培養約２週間以内に得られ得る。ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性ならびに少なくともＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性である単離されたＭｅｓＳＣは、分化培地中で増殖し、白血球を含み、ＣＤ４５を発現する血液生成物の集団を生成し得る。ＣＤ４５陽性細胞を得るための分化培地は、基本培地としてＩＭＤＭを含み、１０％  ＦＣＳおよび１０％  ウマ血清（ＨＳ）、メチルセルロースＮｏ．４５３５（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、増殖増強サイトカインＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを含む）と１：１で混合した１×１０−６Ｍ  ＨＣを補充されている。Ｅｐｏもこの培養物に添加される。ＣＤ４５陽性細胞を含む血液生成物は、２週間以内のインキュベーションで得られる。培養したＭｅｓＳＣのための培地は、二日毎に交換される。
【００２４】
骨髄幹細胞を含む血液生成物を得るために、ＭｅｓＳＣを最初に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦＬを補充した無血清基本培地としてのＳｔｅｍＳｐａｎ（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で２週間培養し、ＭｅｓＳＣを予め刺激する。培養したＭｅｓＳＣのための培地は、二日毎に交換される。その後、ＭｅｓＳＣを収集し、無血清メチルセルロースＮｏ．４４３６（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、増殖増強サイトカインＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥｐｏを含む）中に再懸濁し、さらに２週間インキュベートする。この血液生成物は、単球／マクロファージ（ＣＤ１４陽性染色によって示される）および顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球を含み、ＣＤ１６陽性染色によって示される）を含み得る。さらに、ＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位赤血球（ｂｕｒｓｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ））構造は、骨髄培養条件から形成され得、形態およびグリコホリンＡに対する抗体を用いた免疫組織化学染色によって同定され得る。
【００２５】
内皮細胞を含む血液生成物のために、ＭｅｓＳＣを、チャンバスライド中で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＨＧＦならびに１０−６Ｍ  ＨＣを補充した、無血清基本培地としてのＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）中に播種した。ＭｅｓＳＣを二日毎に培地を交換しながら三週間インキュベートした。あるいは、ＭｅｓＳＣを、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬを補充したＳｔｅｍＳｐａｎ中で二週間、前刺激し、その後ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦを補充したＳｔｅｍｓｐａｎ中で二週間分化させた。内皮細胞を含む血液生成物は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ｖＷＦ（フォンビルブラント因子）およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２、血管内皮成長因子レセプター２としても公知である）に対する免疫組織化学染色によって同定される。
【００２６】
（細胞型の確認）
分化後、形成された血液生成物は、培養物中に存在する細胞型を確認するために、必要に応じて細胞化学的に染色され得る。好ましくは、血液生成物細胞型は、免疫組織化学を使用して確認され、より好ましくは、その細胞型は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）エピトープの細胞表面マーカー発現を使用して確認される。
【００２７】
形成された血液生成物の各系統内および各系統間で、抗原（例えば、ＣＤ抗原）は、所定の系統内の細胞の表面上で差示的に発現され、そして所定の系統内の細胞の細胞質中で発現される。一種以上の抗原の発現および／または発現の強度は、系統内および系統間の成熟段階を区別するのに使用され得る。分化した細胞から形成された血液生成物は次いで、患者に投与され得る。
【００２８】
上記のように、ＭｅｓＳＣに由来する血液生成物およびＭｅｓＳＣは、形成された血液生成物を同定するために、細胞表面マーカー発現について染色される。本発明の一実施形態において、血液生成物は収集され、ＰＢＳ中で洗浄され、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物のためのスライド上で遠心される。あるいは、付着性の血液生成物（例えば、内皮細胞）は、後の染色のために、チャンバスライド上で直接増殖され得る。そのスライドは、風乾され、氷冷したアセトン中で１０分間固定される。このアセトン固定した細胞は、染色まで、−２０℃で保存され得る。
【００２９】
染色のために、スライドは室温まで温められ、ＰＢＳ中の５％  正常ヤギ血清を用いて１０分間ブロックされる。ブロック溶液の除去後、サイトスピン調製物またはチャンバスライド調製物は、滴定量の一次抗体と一緒に、加湿したチャンバ内で、室温で３０分間インキュベートされる。染色後、室温で、ＰＢＳ中で１０分間、２回洗浄され、その後、滴定量の蛍光色素標識した二次抗体と一緒に、加湿したチャンバ内で３０分間インキュベートされる。スライドは、ＰＢＳで２回洗浄され、細胞核を可視化するために１分間ＤＡＰＩで染色され、その後ＰＢＳで１０分間２回洗浄される。蒸留水を用いたスライドの短い洗浄の後、無水エタノール中で５分間固定され、その後風乾される。スライドは、ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｃｈｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で覆われ、カバーガラスがのせられ、分析まで４℃で保存される。染色するための代替的な方法は、当業者に公知であるか、または、本発明のこの記述から明らかになる。
【００３０】
染色した血液生成物の分析は、強力光学顕微鏡および蛍光顕微鏡を使用して行われる。上記のように、同定されたマーカー単独またはそれらの組合せを使用する以下の染色を、同定された血液生成物について観察した：
ａ）ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５に対して陽性である骨髄幹細胞；
ｂ）グリコホリンＡに対して陽性である赤血球系細胞；
ｃ）ＣＤ４１に対して陽性である巨核球細胞；
ｄ）ｖＷＦ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＫＤＲに対して陽性である内皮細胞；
ｅ）ＣＤ３に対して陽性であるリンパ球細胞、および
ｉ）ＣＤ４、ＣＤ８に対して陽性であるＴ細胞；
ｉｉ）ＣＤ５６に対して陽性であるＮＫ細胞；
ｉｉｉ）ＣＤ３、ＮＫ１．１に対して陽性であるＮＫ−Ｔ細胞；
ｉｖ）ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０に対して陽性である、Ｂ細胞；
ｆ）ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ１ａ、ＣＤ４０に対して陽性である樹状細胞。
【００３１】
（血液生成物の送達）
分化した間葉幹細胞の送達は、患者への血液生成物の注射、注入または点滴注入によるものであり得る。血液生成物は、所望の標的器官に直接注射、注入、または点滴注入され得るか、あるいは、血液生成物は、静脈内、動脈内または腹腔内に注射され得る。一般に当該分野で公知である、細胞の任意の送達方法が、ＭｅｓＳＣから形成された血液生成物の送達のために使用され得る。
【００３２】
培養したＭｅｓＳＣから形成された血液生成物は、血液生成物の必要な患者を処置するために使用され得る。特定の実施形態において、治療有効用量の血液生成物が患者に送達される。処置のための有効用量は、処置を受ける患者の体重によって決定される。治療用量は、治療の１回以上の投与であり得る。例えば、血球数の回復が、約２週間以内に達成された場合、ＭｅｓＳＣの１回の注入は、処置に十分であり得る。しかし、ＭｅｓＳＣ血液生成物の多数回の適用は、患者にとって有害ではなく、単回投与を上回る利点を提供し得る。血液生成物の例示的な用量は、体重１ｋｇあたり約１〜５０×１０６であり得る。
【００３３】
処置のために使用される血液生成物は、自己ドナーＭｅｓＳＣまたは同種異系ドナーＭｅｓＳＣに由来し得る。自己ＭｅｓＳＣの使用は、同種異系細胞により誘発される免疫反応に関する懸念を排除する。さらに、自己ＭｅｓＳＣの繰り返し投与が可能である。同種異系ＭｅｓＳＣは、当業者に一般的に公知の器官移植についての適合基準を使用して患者に提供される。適合性のドナーに由来する同種異系ＭｅｓＳＣはまた、患者に投与するための血液生成物を生成するのに有利であり得る。同種異系血液生成物は、例えば、血液生成物を必要とする患者が骨髄毒性薬物もしくは放射線を受けたか、または白血病もしくは骨髄転移を有する可能性があるので、その患者の骨髄が、適切な数の使用可能な幹細胞の供給源である可能性が低い場合、患者自身の骨髄細胞の収集に患者が拒絶するか、または同意することができない場合、そして適合性の生体関連ドナーもしくは生体非関連ドナー由来の骨髄由来幹細胞が、レシピエント自身の幹細胞に比較して優れた質および量である可能性のある場合、に投与され得る。
【００３４】
自己血液生成物を受け得る患者の例としては、骨髄移植を必要とし、適合性のドナーが利用可能でない癌／白血病患者、化学療法を受けている癌／白血病患者、および骨髄移植または化学療法後に血小板減少症を発症した患者が挙げられる。さらに、骨髄移植または化学療法後に、赤血球数または顆粒球数の減少した患者は、自己ＭｅｓＳＣ由来の血液生成物を受け得る。自己血液生成物処置は、アレルギー反応および自己免疫反応を有する患者に対して有利であり得る。
【００３５】
同種異系血液生成物を受け得る患者の例としては、上に列挙した自己血液生成物のレシピエントについて例示した患者と同じ患者が挙げられる。ＭｅｓＳＣの同種異系細胞調製物は、特定の細胞型が生成され、スクリーニングされ、そして保存され得る集団において有利であり得る。従って、患者への投与の前にスクリーニングされ、例えば、疾患を含まないことが保証された血小板、赤血球、白血球またはこれらの特殊化した細胞、リンパ球および樹状細胞を含む特定の血液生成物のプールが有利であり得る。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、少なくとも一つの型の血液生成物の使用である。この血液生成物は、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養することによって得られる。この血液生成物の使用は、骨髄に関係するか、または関係しない白血病、血小板減少症、白血球減少症、顆粒球減少症、リンパ球減少症（例えば、ＨＩＶ患者）、再生不良性貧血、および／または自己免疫疾患を罹患する患者、化学療法（高用量化学療法を含む）後、全身照射後もしくは身体の一部の照射（骨および器官の照射を含む）後の患者、ならびに血管疾患、虚血性疾患（心臓虚血を含む）、および／または悪性疾患を有する患者を処置するための薬学的組成物を調製するための使用である。特に、本発明のさらなる目的は、薬学的組成物を調製するための、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養することにより入手可能である少なくとも一つの型の血液生成物の使用であり、この薬学的組成物は、急性白血病に起因する貧血、慢性白血病に起因する貧血、骨髄線維症に起因する貧血、再生不良性貧血に起因する貧血、サラセミアに起因する貧血、鎌状赤血球症に起因する貧血、例えば事故後の、血液の減少に起因する貧血、化学療法に起因する貧血、化学療法以外の医療用薬物に起因する貧血、放射線に起因する貧血、および／または毒性化合物の乱用に起因する貧血、を罹患する患者を処置するための薬学的組成物、急性白血病に起因する白血球減少症、慢性白血病に起因する白血球減少症、骨髄線維症に起因する白血球減少症、再生不良性貧血に起因する白血球減少症、サラセミアに起因する白血球減少症、鎌状赤血球症に起因する白血球減少症、例えば事故後の、血液の減少に起因する白血球減少症、化学療法に起因する白血球減少症、化学療法以外の医療用薬物に起因する白血球減少症、放射線に起因する白血球減少症、および／または毒性化合物の乱用に起因する白血球減少症、を罹患する患者を処置するための薬学的組成物、急性白血病に起因する血小板減少症、慢性白血病に起因する血小板減少症、骨髄線維症に起因する血小板減少症、再生不良性貧血に起因する血小板減少症、サラセミアに起因する血小板減少症、鎌状赤血球症に起因する血小板減少症、例えば事故後の、血液の減少に起因する血小板減少症、化学療法に起因する血小板減少症、化学療法以外の医療用薬物に起因する血小板減少症、放射線に起因する血小板減少症、および／または毒性化合物の乱用に起因する血小板減少症、を罹患する患者の処置のための薬学的組成物、血管疾患（例えば、自己免疫脈管炎、動脈閉塞性障害、静脈閉塞性疾患および／またはアテローム性動脈硬化症）、を罹患する患者の処置のための薬学的組成物、虚血性疾患（例えば、冠状動脈心臓疾患、脳卒中、急性腎不全および／または間欠性跛行症（ｃｌａｕｄｉｃａｔｉｏ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｓ））を罹患する患者の処置のための薬学的組成物である。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間、単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞をインビトロで成長因子と一緒に培養することによって入手可能である少なくとも一つの型の血液生成物の使用であり、この血液生成物の使用は、癌および転移の診断のための薬学的組成物を調製するための使用であり、この少なくとも一つの型の血液生成物は、放射性化合物で標識される。癌および転移を診断する場合、この型の血液生成物（または細胞のそれぞれ）は、当業者に周知の手段および方法によって患者の体内に注入され、患者の体内で検出される。
【００３８】
好ましくは、上記の使用と関連して、上記少なくとも一つの血液生成物は、骨髄幹細胞、内皮細胞、リンパ系幹細胞、内皮細胞、リンパ球幹細胞、樹状細胞、赤血球系細胞、および巨核球からなる群より選択される細胞を含む。
【００３９】
さらに、本発明は、本発明の方法（すなわち、インビトロで血液生成物を生成する方法、または本発明の非ＳＶ４０形質転換間葉細胞を分化させる方法のそれぞれ）により得られた血液生成物に関する。既に上記で概説したように、上記血液生成物は、骨髄幹細胞、内皮細胞、リンパ球幹細胞、樹状細胞、赤血球系細胞および巨核球からなる群より選択される細胞を含む。
【００４０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに記載され、例証される。
【実施例】
【００４１】
（実施例１  ＭｅｓＳＣの単離）
それぞれ１．０５０ｇ／ｍｌ、１．０６３ｇ／ｍｌ、１．０６８ｇ／ｍｌ、１．０７７ｇ／ｍｌ、１．０８８ｇ／ｍｌおよび１．１００ｇ／ｍｌの密度のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）（上記）５ｍｌを５０ｍｌ管中に互いに注意深く層状にした。１０ｍｌの骨髄を１０ｍｌのＰＢＳで希釈し、密度勾配上に注意深く層状にした。平行して、コントロールとして、ａ）１ｍｌのＰＢＳで希釈した１ｍｌの骨髄を、１５ｍｌの管中で、１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有する３ｍｌのＦｉｃｏｌｌ上に層状にした（幹細胞ＳＣと称される；単核細胞およびＭｅｓＳＣを分離するための従来法）、およびｂ）１ｍｌのＰＢＳで希釈したそれぞれ別々の１ｍｌの骨髄を、別の１５ｍｌ管中で、１．０６８ｇ／ｍｌの密度を有する３ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ上に層状にした（ＬＤ＝低密度と名付けた）か、または１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有する３ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ（ＭＮＣ＝単核細胞と名付けた）上に層状にした。
【００４２】
全ての管を室温で、中断せずに、８００ｇで２０分間遠心分離した。ＰＢＳと混合した血漿を、その管から取り除き、各画分を別の管に収集した。細胞をＰＢＳで１０分間４００ｇで、２度洗浄した後、Ｆ４−Ｆ６（Ｆ１＝最も低い密度  １．０５０ｇ／ｍｌ、Ｆ６＝最も高い密度  １．１００ｇ／ｍｌ）画分に含まれる赤血球を、溶血緩衝液で溶解させ、その細胞を再度ＰＢＳ中で洗浄し、培養培地ＤＭＥＭ／ＬＧ（ダルベッコ改変イーグル培地／低グルコース、Ｇｉｂｃｏ）＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン＋１０％の予め選択したウシ胎仔血清中に再懸濁し、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバ内でトリパンブルーで計数した。２５ｃｍ２の増殖面積に対して、１×１０７細胞を、５ｍｌの培地中に播種した。３日後、付着していない細胞をＰＢＳで洗い流した。３日毎に、細胞に新鮮な培地を与え、位相差顕微鏡によって評価して約８０〜９０％のコンフルーエンスに達するまでインキュベートした。この時点で、この培養物をＰ０と名付けた。
【００４３】
ＣＦＵ−Ｆ（コロニー形成単位線維芽細胞；ＭｅｓＳＣの個別の画分の増殖活性の証拠として）を実証するために、１０６細胞の各画分ならびにＬＤコントロール細胞およびＭＮＣコントロール細胞を、６ウェルプレートのウェルの３ｍｌの培地中に播種した。この細胞を、インキュベーター中で、３７℃で５％  ＣＯ２でインキュベートした。３日後、付着していない細胞を、ＰＢＳで洗い流した。３日毎に、細胞に新鮮な培地を与えた。ＣＦＵ−Ｆを１４日間のインキュベーション期間の後、ＰＢＳで洗浄し、１％クリスタルバイオレットで染色した。
【００４４】
細胞の継代のために、培地を取り除き、プレートをＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで５分間インキュベートし、その細胞を、培地に再懸濁し、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバで計数した。５００細胞／ｃｍ２を、新しい組織培養フラスコ中に播種し、これをＰ１と名付けた。
【００４５】
（実施例２  ＭｅｓＳＣの単離および分化）
吸引した骨髄をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１：１に希釈し、１．０６８ｇ／ｍｌの密度を有するＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に層状にし、室温で、８００ｇで２０分間遠心分離した。低密度の細胞を収集し、ＰＢＳ中で２度洗浄し、１０％の予め選択したＦＣＳ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ａｐｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した増殖培地ＤＭＥＭ／低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバ中で計数した。初期播種のために、１×１０７細胞を２５ｃｍ２の増殖表面を有する組織培養フラスコ中に入れ、５％ＣＯ２を有し、９７％以上の湿度を有するインキュベーター中で、約９０％のコンフルーエンシーまで増殖させた。培養培地を取り除き、ＰＢＳで増殖表面を洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で５分間インキュベートすることにより継代を行なった。この細胞を培養培地中に再懸濁し、計数し、５００細胞／ｃｍ２を新しい培養フラスコに播種した。
【００４６】
造血分化のために、インビトロで培養した、２〜４継代のＭｅｓＳＣを使用した。
【００４７】
白血球への分化のために、１×１０５細胞をチャンバスライドの０．８ｃｍ２の範囲に播種し、一週間に３回分化培地を供給した。この培地は、１０％  ＦＣＳ、１０％  ＨＳ（ウマ血清、ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｔ．Ｋａｔｈａｒｉｎｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１０−６Ｍ  ヒドロコルチコゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた基本培地ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含み、メチルセルロースＮｏ．４５３５（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、増殖増強サイトカインＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを含む）と１：１で混合され、Ｅｐｏを含む。
【００４８】
丸い細胞の形成は、これらの培養物の内の数個に、早くも５日目に注目され、１０日目に、約１００細胞のコロニーが産生した。コロニーを選び取り、細胞を遠心し（ｃｙｔｏｓｐｕｎ）、チャンバスライドをＰＢＳで一度洗浄し、全てのスライドを風乾し、氷冷アセトン中で１０分間固定し、染色まで−２０℃で保存した。あるいは、チャンバスライド中で培養した細胞は、ＦＡＣＳ分析のために、トリプシン処理され得る。トリプシン処理した細胞を、抗ＣＤ３４抗体またはそれぞれのアイソタイプ適合免疫グロブリンと一緒にインキュベートし、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【００４９】
染色のために、スライドを室温（ＲＴ）に数分間適応させ、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清で１０分間ブロックした。ブロック溶液を取り除いた後、サイトスピンを加湿したチャンバ内でＲＴで３０分間、滴定量の一次抗体と一緒にインキュベートした。骨髄細胞、巨核球細胞および赤血球系細胞の検出のために、ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＣＤ４１およびグリコホリンＡ（全ての抗体：Ｄａｋｏ）に対して指向する抗体を含有した。各抗体について、適切なアイソタイプコントロールを、抗体に対する染色と同様に行なった。
【００５０】
染色後、ＰＢＳ中で１０分間、２回それぞれ室温で洗浄し、加湿したチャンバ内で、滴定量の蛍光色素標識した二次抗体Ａｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒に３０分間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で１分間染色し、核を可視化し、その後、ＰＢＳで１０分間２回洗浄した。蒸留水による短い洗浄の後、無水エタノール中で５分間固定し、風乾した。このスライドを、ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔおよびカバーガラスで覆い、分析まで４℃で保存した。
【００５１】
分析を、強力光学顕微鏡および蛍光顕微鏡で実施した。このアプローチを使用して、ＣＤ４５陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞およびＣＤ３４陽性細胞を上記のクラスター中に検出した。
【００５２】
（実施例３  ＭｅｓＳＣの骨髄細胞および赤血球系細胞への分化）
ＭｅｓＳＣの骨髄細胞および赤血球系細胞への分化を得るために、２〜４継代由来の１×１０５細胞を、２ｃｍ２の培養面積に播種し、サイトカインＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）（全てＴｅｂｕ、Ｏｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した基本培地ＳｔｅｍＳｐａｎ（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）からなる血清なしの分化培地で二週間、前刺激した。細胞に、一週間に３回培地を与えた。
【００５３】
１４日目に、細胞を激しくピペッティング（ｈｅａｖｙ  ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）することまたはトリプシン処理によりに取り出し、血清なしのメチルセルロース（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｎｏ．４４３５、増殖増強サイトカインＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびエリスロポエチンを含む）中で培養する。１４日間の培養の後、単一のコロニーおよび分化した細胞を取り出し、サイトスピン後に、形態、および骨髄の表面抗原に対する抗体を用いた免疫化学、および実施例２に記載される赤血球特徴により試験した。
【００５４】
このアプローチを使用して、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ１４陽性細胞、ＣＤ１６陽性細胞、ＣＤ４５陽性細胞、ＣＤ４１陽性細胞およびグリコホリンＡ陽性細胞を検出した。
【００５５】
（実施例４  ＭｅｓＳＣの内皮細胞への分化）
ＭｅｓＳＣの内皮細胞への分化を得るために、２〜４継代からの１×１０５細胞を、０．８ｃｍ２の培養面積に播種し、サイトカインＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）（全てＴｅｂｕ由来）および１０−６Ｍ  ＨＣを補充した基本培地ＳｔｅｍＳｐａｎ（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）を含む血清なしの分化培地で３週間刺激した。あるいは、ＭｅｓＳＣをＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充した血清なしの培地中で２週間、前刺激し、その後ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地中で２週間分化させた。細胞に、一週間に３回培地を与えた。分化の終了後、スライドを風乾し、氷冷アセトン中で１０分間固定し、染色まで−２０℃で保存した。
【００５６】
細胞を、ｖＷＦ、ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＫＤＲに対して指向する抗体を用いて上記の手順に従って染色した。陽性細胞染色を、ＣＤ３４およびｖＷＦまたはＣＤ３１およびＫＤＲに対して検出した。
【００５７】
（実施例５  ＭｅｓＳＣの移植）
ＭｅｓＳＣを、幹細胞除去マウスに移植し、本発明のＭｅｓＳＣの多能性を実証した。
【００５８】
移植のためのＭｅｓＳＣを、Ｌｙ５．２表現型の成体雄性Ｃ５７ＢＩ／６Ｊマウスから産生した。大腿骨および脛骨由来の細胞を、２０％  ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％  グルタミンを補充したＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２培地（一般的には、造血幹細胞の増殖を補助するには不十分な培地とみなされている）に播種した。プラスチックに付着した増殖細胞の迅速な増殖、および造血細胞の増殖に対する補助の欠如に関してＦＣＳを選択した。非付着細胞を３日後に取り除き、コンフルーエンスまで週に２回交換される。Ｐ５までの初期の継代の間に、細胞を１×１０５細胞／ｃｍ２で播種した。その後の継代を１０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞を、約６ヶ月の期間にわたって９回までの培養において継代した。Ｐ８の細胞を、ＣＤ４５およびＣＤ３４に対して陰性、Ｓｃａ−１、ＣＤ９０およびＣＤ５９に対して陽性、かつＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）に対して弱い陽性であると決定した。
【００５９】
ＭｅｓＳＣ移植のために、Ｌｙ５．１表現型のレシピエントＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスを９．５Ｇｙのγ線照射で致死量で照射し、上記のように培養した１×１０６ＭｅｓＳＣを移植した。血球計数およびドナー細胞での再構成の暫定的な分析を、眼窩後部（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｌｙ）で採取した末梢血から行なった。血球計数を図３に示す。この血球計数は、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）血球計数器を使用して行った。再構成の分析を、蛍光色素を結合した、ドナー抗原ＣＤ４５．２（Ｌｙ５．２）に対する抗体で標識した細胞を使用して行い、ドナー細胞とレシピエント細胞とを区別するためにＢｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎにおいて分析した。再構成分析の結果を以下の表２に列挙し、ここで、パーセントは、ドナー起源であった細胞の全細胞に対する百分率を示す。
【００６０】
【表２】
2007508023.tif 000005
結果は、マウスが本発明のＭｅｓＳＣで再構成され、約６週間後に正常な白血球数を生じ、約３週間後に、感染の急性の危険性に対する危険な領域を外れたことを示す。
【００６１】
骨髄、胸腺および末梢血に対するＭｅｓＳＣ移植マウス由来の個々の組織の細胞組成の分析を、表３、４および５にそれぞれ示す。一般的に、移植したマウスは、骨髄および胸腺において低いドナーキメラ現象を示し、末梢血において３５％までのキメラ現象を示した（図４）。集団分析は、ドナー細胞が主に骨髄区画を再構成し、一部はリンパ系細胞を再構成したことを明らかにする。
【００６２】
【表３】
2007508023.tif 000006
【００６３】
【表４】
2007508023.tif 000007
【００６４】
【表５】
2007508023.tif 000008
略語：
ｄｔ            ドナー型ＣＤ４５．２（Ｌｙ５．２）の細胞
ＣＤ４５        全ての白血球に対する全白血球マーカー
ｃ−ｋｉｔ      非常に初期の（多能性の、再構成されている）幹細胞のマーカー
Ｂ２２０        全ての成熟段階のＢ細胞に対するマーカー
Ｔｅｒ１１９    全ての赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ）（赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ））段階に対するマーカー
ＣＤ３          ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞を含む全てのＴリンパ球に対するマーカー
ＧＲ１          顆粒球に対するマーカー
ＣＤ１１ｂ      骨髄マーカー（白血球）として一般に使用されるが、リンパ系細胞上でも検出される。
【００６５】
（実施例６  培養ｈＭｅｓＳＣに対するＲＴ−ＰＣＲ）
ｈＭｅｓＳＣを、ＨＳＣおよび内皮細胞に分化させるために、上記のように培養した。細胞を、上記の免疫蛍光およびＲＴ−ＰＣＲのために収集した。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲのために、ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｓｏｒｂ  Ｓｐｉｎ  Ｃｅｌｌ−ＲＮＡ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｉｎｖｉｔｅｋ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造者の指示書に従って使用して抽出した。ＲＮＡを−８０℃で保存した。抽出したＲＮＡの逆転写（ＲＴ）を、バルクＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃ−ＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。ｃＤＮＡを−２０℃で保存した。ＰＣＲ反応のために、５μｌのｃＤＮＡテンプレートを、各プローブに対して合計２５μｌの体積中２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌの各プライマー（５０ｎｇ／μｌ）および０．５μｌのポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ．、Ｇｉｂｃｏ）と混合した。表６に示すプライマーを使用して、プログラム可能なＢｉｏｍｅｔｒａ  Ｕｎｏ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＰＣＲを行なった。ｃＤＮＡの代わりに水を含むネガティブコントロールをプライマーの各セットに対して行なった。サンプルを２％アガロースゲル上で分析した。ＰＣＲフラグメントの大きさを、ＤＮＡ標準マーカーＶＩＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して推定した。プライマーを、表６の配列に従って、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。
【００６７】
遺伝子発現を示すＲＴ−ＰＣＲの結果は、系統の限定された（ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）造血転写因子をコードするＣＤ４１Ｂ、Ｎｏｔｃｈ−１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、Ｒｕｎｘ１、ＳＣＬおよびＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）に対するプライマーを使用して検出した。ＳＣＬ、ＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２は、系統分化の前に、多能性前駆体において発現するが、顆粒球／単球の分化の間にダウンレギュレートされる。２継代までの細胞に対するＲＴ−ＰＣＲの結果はまた、より後の継代の細胞では検出されないＣＤ１４およびＣＤ３４に対する弱いバンドを示した。
【００６８】
【表６−１】
2007508023.tif 000009
【００６９】
【表６−２】
2007508023.tif 000010
本明細書中の発明は、その好ましい実施形態と関連して記載されたが、具体的に記載されていない付加、改変、置換、削除が、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが当業者に理解される。従って、前述の詳細な説明が、限定的ではなく例示的であるとみなされることが意図され、全ての等価物を含む添付の特許請求の範囲が、本発明の精神および範囲を定義することを意図するものであることが理解されるべきであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、本発明の種々の血液生成物を形成するための、間葉幹細胞分化の図である。
【図２】図２は、本発明の単離された間葉幹細胞の増殖特性および倍増特性を示すグラフである。
【図３】図３は、マウスに本発明のＭｅｓＳＣを移植した後の血球数を示すグラフである。
【図４】図４は、移植されたマウスにおける血球の部分集団を示す図である。
【図１】
2007508023.tif 000011
【図２】
2007508023.tif 000012
【図３】
2007508023.tif 000013
【図４】
2007508023.tif 000014
【配列表】
2007508023000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月28日(2005.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで血液生成物を生成する方法であって、
ａ）非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞が単離され、ここで、該非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞は、ＣＤ３４陰性であり、そして培養における少なくとも一継代後、ＣＤ４５に対して陰性であり、かつＣＤ１０５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１３およびＭＨＣ  Ｉに対して陽性であり、そして
ｂ）該単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞は、以下の成長因子：
幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むインターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびヒドロコルチゾン（ＨＣ）、
を個々に添加されるか、または組み合わせて添加されて、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間培養される、
方法。
【請求項２】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血液生成物を必要とする患者を処置するための薬学的組成物を調製するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従って得られた、血液生成物の使用。
【請求項９】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１５】
前記薬学的組成物が、白血病、血小板減少症、白血球減少症、顆粒球減少症、リンパ球減少症、再生不良性貧血、および／または骨髄に関係するか、もしくは関係しない自己免疫疾患を罹患する患者、ＨＩＶ患者、化学療法、全身照射もしくは身体の一部の照射後の患者、血管疾患、虚血性疾患、および／または悪性疾患を有する患者、あるいは心臓虚血を有する患者を処置するための薬学的組成物である、請求項８に記載の使用。
【請求項１６】
前記薬学的組成物が、貧血、白血球減少症、血小板減少症および血管疾患に罹患する患者を処置するための薬学的組成物である、請求項８に記載の使用。
【請求項１７】
前記貧血が、急性白血病に起因するか、慢性白血病に起因するか、骨髄線維症に起因するか、再生不良性貧血に起因するか、サラセミアに起因するか、鎌状赤血球症に起因するか、血液の減少に起因するか、化学療法に起因するか、化学療法以外の医療用薬物に起因するか、放射線に起因するか、そして／または毒性化合物の乱用に起因し、前記白血球減少症が、急性白血病に起因するか、慢性白血病に起因するか、骨髄線維症に起因するか、再生不良性貧血に起因するか、サラセミアに起因するか、鎌状赤血球症に起因するか、例えば事故後の、血液の減少に起因するか、化学療法に起因するか、化学療法以外の医療用薬物に起因するか、放射線に起因するか、そして／または毒性化合物の乱用に起因し、前記血小板減少症が、急性白血病に起因するか、慢性白血病に起因するか、骨髄線維症に起因するか、再生不良性貧血に起因するか、サラセミアに起因するか、鎌状赤血球症に起因するか、例えば事故後の、血液の減少に起因するか、化学療法に起因するか、化学療法以外の医療用薬物に起因するか、放射線に起因するか、そして／または毒性化合物の乱用に起因する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１６に記載の使用であって、前記血管疾患が、自己免疫性脈管炎、動脈閉塞性障害、静脈閉塞性疾患および／またはアテローム性動脈硬化症である、冠状動脈心臓疾患、脳卒中、急性腎不全および／または間欠性跛行症などの虚血性疾患に罹患する患者の処置のための、使用。
【請求項１９】
インビトロで非ＳＶ−４０形質転換間葉細胞を分化させる方法であって、
ａ）非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞が単離され、ここで、該非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞は、ＣＤ３４陰性であり、そして培養における少なくとも一継代後、ＣＤ４５に対して陰性であり、かつＣＤ１０５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１３およびＭＨＣ  Ｉに対して陽性であり、
ｂ）該単離された非ＳＶ４０形質転換間葉幹細胞は、以下の成長因子：
幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むインターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびヒドロコルチゾン（ＨＣ）、
を個々に添加されるか、または組み合わせて添加されて、少なくとも一つの型の血液生成物を生成するために十分な時間培養される、
方法。
【請求項２０】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液生成物を必要とする患者を処置するための血液生成物を含有する薬学的組成物を調製するための方法であって、該血液生成物を提供するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を包含する、方法。
【請求項２７】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、骨髄幹細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、内皮細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、リンパ球幹細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、樹状細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、赤血球系細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも一つの型の血液生成物が、巨核球を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬学的組成物が、白血病、血小板減少症、白血球減少症、顆粒球減少症、リンパ球減少症、再生不良性貧血、および／または骨髄に関係するか、もしくは関係しない自己免疫疾患を罹患する患者、ＨＩＶ患者、化学療法、全身照射もしくは身体の一部の照射後の患者、血管疾患、虚血性疾患および／または悪性疾患を有する患者、あるいは心臓虚血を有する患者を処置するための組成物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬学的組成物が、貧血、白血球減少症、血小板減少症および血管疾患に罹患する患者を処置するための組成物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記貧血が、急性白血病に起因するか、慢性白血病に起因するか、骨髄線維症に起因するか、再生不良性貧血に起因するか、サラセミアに起因するか、鎌状赤血球症に起因するか、血液の減少に起因するか、化学療法に起因するか、化学療法以外の医療用薬物に起因するか、放射線に起因するか、そして／または毒性化合物の乱用に起因し、前記白血球減少症が、急性白血病に起因するか、慢性白血病に起因するか、骨髄線維症に起因するか、再生不良性貧血に起因するか、サラセミアに起因するか、鎌状赤血球症に起因するか、例えば事故後の、血液の減少に起因するか、化学療法に起因するか、化学療法以外の医療用薬物に起因するか、放射線に起因するか、そして／または毒性化合物の乱用に起因し、前記血小板減少症が、急性白血病に起因するか、慢性白血病に起因するか、骨髄線維症に起因するか、再生不良性貧血に起因するか、サラセミアに起因するか、鎌状赤血球症に起因するか、例えば事故後の、血液の減少に起因するか、化学療法に起因するか、化学療法以外の医療用薬物に起因するか、放射線に起因するか、そして／または毒性化合物の乱用に起因する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１６に記載の方法であって、前記血管疾患が、自己免疫性脈管炎、動脈閉塞性障害、静脈閉塞性疾患および／またはアテローム性動脈硬化症である、冠状動脈心臓疾患、脳卒中、急性腎不全および／または間欠性跛行症など虚血性疾患に罹患する患者の処置のための、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月12日(2006.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007508023000001.app
【国際調査報告】
2007508023.tif 000025
2007508023.tif 000026
2007508023.tif 000027
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2007508023.tif 000029