(57)【要約】開示されるのは、融合ポリペプチドであって、ａ）この融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチド；およびｂ）組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントであって、この組織因子およびこのフラグメントは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる、組織因子またはそのフラグメントを含む、融合ポリペプチドである。ペプチドａ）とペプチドｂ）とは、互いに直接結合しているか、または１５個までのアミノ酸を含むリンカーによって連結されており、なおもこの融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得るペプチドのＣ末端に結合されている。
2007528722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドであって、
ａ）該融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチド；および
ｂ）組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントであって、該組織因子および該フラグメントは、該融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる、組織因子またはそのフラグメント
を含み、
ここで、該ペプチドａ）および該ペプチドｂ）は、互いに直接結合しているかまたは１５個までのアミノ酸を有するリンカーを介して互いに結合されており、該融合ポリペプチドは、該融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、該融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得るペプチドのＣ末端に結合されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドａ）および前記ペプチドｂ）、ならびに１５個までのアミノ酸を有するリンカーからなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドａ）と前記ペプチドｂ）とが互いに直接結合している、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得る前記ペプチドが、組織因子ＴＦであり、該組織因子ＴＦは、配列番号１に示す配列を有することによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得る前記ペプチドが、組織因子ＴＦのフラグメントであり、該組織因子ＴＦのフラグメントは、好ましくは配列番号２に示す配列を有することによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチドが、直鎖状または環状の構造を有することによって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤまたはＮＧＲを含むことによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、ＧＲＧＤＳＰおよびＧＮＧＲＡＨＡを含む群より選択されることによって特徴付けられる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、ＧＣＮＧＲＣＧ、ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣおよびＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧを含む群より選択されることによって特徴付けられる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３〜８に示される配列のうちの１つを有することによって特徴付けられる、請求項１〜９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１２】
配列番号１０〜１５に示す配列のうちの１つを有することによって特徴付けられる、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１１もしくは請求項１２に記載の核酸または請求項１４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
薬学的組成物であって、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド、請求項１１もしくは請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または佐剤をさらに含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
新生物疾患の処置のための、請求項１５または請求項１６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１８】
前記新生物疾患が、気管支癌ならびに胸郭および縦隔の他の腫瘍、胸部癌および他の婦人科腫瘍、結腸直腸癌、膵臓癌および胃腸管の他の腫瘍、悪性黒色腫および皮膚の他の腫瘍、頭部および頚部の領域の腫瘍、前立腺癌および他の尿生殖器腫瘍、肉腫、内分泌活性腫瘍、白血病および骨髄形成異常症候群ならびにホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む群より選択されることによって特徴付けられる、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのペプチドを含む融合ポリペプチドに関する。一方のペプチドは、３〜３０個のアミノ酸を含み、この融合ポリペプチドを、腫瘍血管内の内皮細胞に選択的に結合させる。他方のペプチドは、組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントからなり、この組織因子およびフラグメントは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内の内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる。これらのペプチドは、直接一緒に連結されてもよく、または１５個までのアミノ酸を有するリンカーを介して一緒に連結されてもよい。本発明はさらに、新生物疾患の抗血管治療におけるこれらの融合タンパク質の使用、および新生物疾患の処置のための薬物を製造する際のそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
適切な新生血管新生は、進行性の腫瘍増殖に必須である（１（非特許文献１））。血管新生は、膨張性腫瘍増殖を維持するために特に必要とされる。なぜなら、充分な酸素供給のみが、腫瘍への栄養供給および腫瘍からの腫瘍分解産物の除去を確実にするからである。
【０００３】
腫瘍処置に関する先行技術では、抗血管治療ストラテジーが開発されており、これらは、血管の増殖および分化の複雑なプロセスを攻撃する抗血管治療ストラテジーに加えて、腫瘍血管および関連する腫瘍梗塞の破壊を目的としている。
【０００４】
これらのストラテジーの前提条件は、正常組織内の静止内皮細胞に生じない、腫瘍の血管内皮内の標的構造の同定である。これらの特異的標的構造は、細胞増殖抑制剤または特定の毒素を、腫瘍細胞自体に対してよりも低い程度で、腫瘍血管内皮細胞へと提供するために利用され得る。この目的のために使用され得る標的構造は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）およびＶＥＧＦ−２（ＶＥＧＦレセプター２）、エンドグリン、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、フィブロネクチンアイソフォーム（ＥＤ−Ｂドメイン）、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、α１β１およびα１β２、アミノペプチダーゼＮ、ＮＧ２プロテオグリカン、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ２および９（ＭＭＰ２およびＭＭＰ９）（２〜１３（非特許文献２〜１３））。例えば、Ａｒａｐら（８（非特許文献８））は、α１インテグリンに特異的に結合するペプチドを、化学療法についての技術水準で使用された活性物質（ドキソルビシン）へと結合させた。動物モデルにおいて、ドキソルビシンの抗腫瘍効果が、このペプチドに結合することによって改善され得ることが実証された。
【０００５】
代替の抗血管治療アプローチは、腫瘍壊死を誘導するための、腫瘍血管における血液凝固の選択的活性化を含む。例えば、短縮型組織因子（ｔＴＦ）およびＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントが生成された。腫瘍内皮細胞内でのこの抗原の実験的誘導後、抗血管治療は、この抗体をマウス神経芽細胞腫モデルに投与することによって実証され得る（１４（非特許文献１４））。同じチームによる第２の研究では、ｔＴＦを、天然に存在する腫瘍血管内皮マーカーＶＣＡＭ−１（血管細胞付着分子−１）に選択的に結合させる免疫結合体が用いられた（１５（非特許文献１５））。
【０００６】
非常に類似したアプローチでは、腫瘍胎児性ＥＤ−Ｂドメインに特異的である抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）をｔＴＦと融合させた。生成された融合タンパク質ｓｃＦｖ−ｔＴＦは、マウスモデルにおいて種々の腫瘍内で完全かつ選択的な梗塞をもたらした（１６（非特許文献１６））。
【０００７】
あるいは、ｔＴＦは、前立腺特異的膜抗原のインヒビターに結合された（１７（非特許文献１７））。この融合タンパク質は、静脈内投与後、ラット前立腺モデルにおいて、選択的梗塞壊死を誘導した。この融合タンパク質を低用量の細胞傷害性物質（ドキソルビシン）と組み合わせて投与することにより、大規模な腫瘍後退、さらには完全な腫瘍根絶がもたらされた（１７（非特許文献１７））。ＶＥＧＦＲに対する抗体フラグメント、エンドグリンに対する抗体フラグメントおよびＶＣＡＭ−１に対する抗体フラグメントからなる他のｔＴＦ融合タンパク質は、近年記載されている（１８（非特許文献１８））。
【０００８】
しかし、技術水準で抗血管腫瘍治療のために生成された分子は、欠点を有する。特に、これらの分子は、それらのサイズに起因して免疫原性であるとみなされるべきである。それゆえ、これらの分子での哺乳動物の処置は、これらの分子に対する免疫反応を誘発し、その結果、これらの分子の反復投与が不可能になる。
【０００９】
血液凝固を活性化し得るペプチド部分を腫瘍組織に導く結合パートナーのサイズは、さらに、血液凝固に重要である高分子第ＶＩＩａ因子／ＦＸ酵素−基質複合体の形成に対する立体障害を引き起こし得る。この複合体の形成はまた、血液凝固を活性化し得るペプチドが、比較的大きな融合パートナーに起因して変化したコンホメーションを有する場合にも阻害され得る。
【００１０】
技術水準（ＷＯ  ０３／０３５６８８（特許文献１））では、選択的結合ドメイン（例えば、フィブロネクチンのうちの、インテグリンに結合するドメイン（例えば、ＲＧＤペプチドを含むドメイン）またはＤ−β−Ｅジペプチド（ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）に結合する））が組織因子ポリペプチドのＮ末端に結合された融合ポリペプチドもまた公知である。アミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）効果およびタンパク質分解効果がインビトロで実証されたが、これらの構築物は、第ＶＩＩａ因子との組合せでさえも、極めて弱い抗腫瘍効果をインビボで示したに過ぎない。これらの動物は、ドキシサイクリンとの組合せにおいてのみ、より長期に生存した。
【００１１】
Ｈｕら（４６（非特許文献１９））は、短縮型組織因子に結合された、ＲＧＤ配列を含む９アミノ酸のオリゴペプチド由来の融合タンパク質を含め、種々の融合タンパク質および腫瘍血管における血栓の生成のためのそれらの使用を記載する。さらに、ＲＧＤペプチドは、ｔＴＦのＮ末端に連結され、ＲＧＤ−ｔＴＦが得られた。機能分析は、ＲＧＤを含む融合タンパク質が、腫瘍増殖の顕著な阻害を全く生じないことを示した。
【００１２】
技術水準で公知の構築物は、選択的結合ドメインが組織因子ポリペプチドのＮ末端に連結するような様式でこのようにして構築された。この構築物が選択されなければならないことが強調されさえした。なぜなら、構造モデルに基づいて、Ｎ末端は、血栓の開始を阻害しない特に好ましい結合部位であると考えられたからである。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ  ０３／０３５６８８号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ，Ｗａｔｓｏｎ  Ｋ，Ｉｎｇｂｅｒ  Ｄ，Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｔｏ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：５８−６１，１９８９
【非特許文献２】Ｄｖｒｏｒａｋ  ＨＪ，Ｓｉｏｕｓｓａｔ  ＴＭ，Ｂｒｏｗｎ  ＬＦ，Ｂｅｒｓｅ  Ｂ，Ｎａｇｙ  ＪＡ，Ｓｏｔｒｅｌ  Ａ，Ｍａｎｓｅａｕ  ＥＪ：Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：１２７５−１２７８，１９９１
【非特許文献３】Ｄｖｏｒａｋ  ＨＪ，Ｂｒｏｗｎ  ＬＦ，Ｄｅｔｍａｒ  Ｍ，Ｄｖｏｒａｋ  ＡＭ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４６：１０２９−１０３９，１９９５
【非特許文献４】Ｔｅｒｍａｎ  ＢＪ，Ｄｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒｍａｚｅｎ  Ｍ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＶＥＧＦ／ＶＰＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  １５：１５９−１６３，１９９６
【非特許文献５】Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＦＪ，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ＥＪ，Ｔａｚｚａｒｉ  ＰＬ，Ａｍｌｏｔ  Ｐ，Ｇａｚｄｚａｒ  ＡＦ，Ｋｉｎｇ  ＳＷ，Ｌｅｔａｒｔｅ  Ｍ，Ｖｉｔｅｔｔａ  ＥＳ，Ｔｈｏｒｐｅ  ＰＥ：Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｌｉｎ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １：１６２３−１６３４，１９９５
【非特許文献６】Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ，Ｇａｒｉｎｃｈｅｓａ  Ｐ，Ｈｅａｌｅｙ  ＪＨ，Ｓｕ  ＳＬ，Ｊａｆｆｅ  ＥＡ，Ｏｌｄ  ＬＪ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ，ａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０８３２−１０８３６，１９９２
【非特許文献７】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  Ｂ，Ｂａｌｚａ  Ｅ，Ｓｉｒｉ  Ａ，Ｚａｒｄｉ  Ｌ，Ｎｉｃｒｏｔｒａ  ＭＲ，Ｂｉｇｏｔｔｉ  Ａ，Ｎａｔａｌｉ  ＰＧ：Ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８：１１３９−１１４８，１９８９
【非特許文献８】Ａｒａｐ  Ｗ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ：Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０，１９９８
【非特許文献９】Ｓｅｎｇｅｒ  ＤＲ，Ｃｌａｆｆｅｙ  ＫＰ，Ｂｅｎｅｓ  ＪＥ，Ｐｅｒｕｚｚｉ  ＣＡ，Ｓｅｒｇｉｏｕ  ＡＰ，Ｄｅｔｍａｒ  Ｍ：Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  α１β１  ａｎｄ  α２β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１３６１２−１３６１７，１９９７
【非特許文献１０】Ｏｌｓｏｎ  ＴＡ，Ｍｏｈａｎｒａｊ  Ｄ，Ｒｏｙ  Ｓ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｓ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ａ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：８６５−８７０，１９９７
【非特許文献１１】Ｂｈａｇｗａｔ  ＳＶ，Ｌａｈｄｅｎｒａｎｔａ  Ｊ，Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｒ，Ａｒａｐ  Ｗ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＬＨ：ＣＤ１３／ＡＰＮ  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ９７：６５２−６５９，２００１
【非特許文献１２】Ｂｕｒｇ  ＭＡ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ，Ａｒａｐ  Ｗ，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ，Ｓｔａｌｌｃｕｐ  ＷＢ：ＮＧ２  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：２８６９−２８７４，１９９９
【非特許文献１３】Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  Ｅ，Ａｒａｐ  Ｗ，Ｖａｌｔａｎｅｎ  Ｈ，Ｒａｉｎｉｓａｌｏ  Ａ，Ｍｅｄｉｎａ  ＯＰ，Ｈｅｉｋｋｉｌａ  Ｐ，Ｋａｎｔｏｒ  Ｃ，Ｇａｈｍｂｅｒｇ  ＣＧ，Ｓａｌｏ  Ｔ，Ｋｏｎｔｔｉｎｅｎ  ＹＴ，Ｓｏｒｓａ  Ｔ，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ：Ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：７６８−７７４，１９９９
【非特許文献１４】Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｍｏｌｅｍａ  Ｇ，Ｋｉｎｇ  Ｓ，Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｌ，Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ  ＴＳ，Ｔｈｏｒｐｅ  ＰＥ：Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：５４７−５５０，１９９７
【非特許文献１５】Ｒａｎ  Ｓ，Ｇａｏ  Ｂ，Ｄｕｆｆｙ  Ｓ，Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｌ，Ｒｏｔｅ  Ｎ，Ｔｈｏｒｐｅ  ＰＥ：Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：４６４６−４６５３，１９９８
【非特許文献１６】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｆ，Ｋｏｓｍｅｈｌ  Ｈ，Ｚａｒｄｉ  Ｌ，Ｎｅｒｉ  Ｄ：Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＥＤ−Ｂ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：７１１−７１６，２００１
【非特許文献１７】Ｌｉｕ  Ｃ，Ｈｕａｎｇ  Ｈ，Ｄｏｎａｔｅ  Ｆ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃ，Ｓａｎｔｕｃｃｉ  Ｒ，ＥＩ−Ｓｈｅｉｋｈ  Ａ，Ｖｅｓｓｅｌｌａ  Ｒ，Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ  ＴＳ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：５４７０−５４７５，２００２
【非特許文献１８】Ｇｏｔｔｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｗｅｌｓ  Ｗ，Ｏｂｅｒ  Ｂ，Ｔｈｏｒｐｅ  ＰＥ：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：１９０−２００，２００１
【非特許文献１９】Ｈｕ  Ｐ，Ｙａｎ  Ｊ，Ｓｈａｒｉｆｉ  Ｊ，Ｂａｉ  Ｔ，Ｋｈａｗｌａ  ＬＡ，Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＡＬ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：５０４６−５０５３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これらの先行技術を考慮して、それゆえ、課題は、腫瘍増殖をインビボで効果的に阻害し得る代替的トロンボゲン形成物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
この課題は、融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞に選択的にさせる３〜３０個のアミノ酸のペプチド、および組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントを含む融合ポリペプチドによってここで解決され、この融合ポリペプチドは、この組織因子およびフラグメントが、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得、これらのペプチドが、互いに直接結合しているかまたは１５個までのアミノ酸を有するリンカーを介して互いに結合されていること特徴付けられる。このペプチドは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に選択的に結合することを可能にし、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに血液凝固を活性化し得るペプチドのＣ末端に結合されている。本発明はさらに、対応する融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、および腫瘍の処置のためのその使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
先行技術で観察された課題は、以下のペプチドを含む融合ポリペプチドによっていまや克服された：
ａ）この融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチド；および
ｂ）組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントであって、この組織因子およびこのフラグメントは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる、組織因子またはそのフラグメント。ここで、このペプチドａ）およびペプチドｂ）は、互いに直接結合しているかまたは１５個までのアミノ酸を有するリンカーを介して互いに結合されており、この融合ポリペプチドは、この融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得るペプチドのＣ末端に結合されていることを特徴とする。本発明はさらに、対応する融合ポリペプチドを含む薬物、および腫瘍の処置のためのその使用に関する。
【００１６】
配列ａ）および配列ｂ）に加えて、本発明による融合ポリペプチドは、さらなる配列を含み得る。ただし、これらは、融合ポリペプチドの立体コンホメーションに対して有害な効果を有さず、そして血液凝固を誘発する酵素−基質複合体の形成を妨げない。本発明による融合ポリペプチドは、例えば、Ｈｉｓ−Ｔａｇの配列を含み得る。Ｈｉｓ−Ｔａｇの配列は、このペプチドの組換え発現および精製を単純にする（実施例を参照のこと）。しかし、これらの配列の存在は必要ではない。本発明の好ましい実施形態によれば、この融合ポリペプチドは、それゆえ、以下を含む：
ａ）この融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチド；および
ｂ）組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントであって、この組織因子およびこのフラグメントは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる、組織因子またはそのフラグメント。ここで、このペプチドａ）およびペプチドｂ）は、互いに直接結合しているかまたは１５個までのアミノ酸を有するリンカーを介して互いに結合されている。本発明の特に好ましい実施形態によれば、この融合ポリペプチドは、以下を含む：
ａ）この融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチド；および
ｂ）組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントであって、この組織因子およびこのフラグメントは、この融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる、組織因子またはそのフラグメント。ここで、このペプチドａ）およびペプチドｂ）は、互いに結合している。
【００１７】
本発明によれば、融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る特に小さなペプチド、および融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに血液凝固を活性化し得るペプチド由来の融合ポリペプチドが、抗血管腫瘍治療に特に有利であることが驚くべきことに示された。腫瘍血管内皮細胞への結合を可能にするポリペプチドのサイズが小さいことにより、この融合タンパク質の内皮細胞のリン脂質膜への配向が改善される。
【００１８】
血液凝固に必須である酵素／基質複合体の形成は、立体的に障害を受けず、そして組織因子ＴＦ（これは、血液凝固を活性化し得る）はコンホメーションの変化を受けない。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに血液凝固を活性化し得るペプチドは、配列番号１（図１２）に示すアミノ酸配列を有する組織因子ＴＦである。本発明はさらに、配列番号１（図１２）に対して少なくとも７０％または少なくとも８０％のアミノ酸相同性を有する組織因子配列を含み、少なくとも９５％の相同性を有する配列が特に好ましい。相同性の程度は、１００アミノ酸の長さにつき４つのギャップが可能として比較される配列の可能な最大の一致を達成するように２つの配列を上下に書くことにより決定される（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，１２４，１９７２を参照のこと）。次いで、２つのアミノ酸鎖のうちの短い方について、他方の鎖における同一のアミノ酸残基に対向する鎖のアミノ酸残基の百分率を決定する。
【００２０】
融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに腫瘍血管における血液凝固を活性化し得るペプチドは、さらに、組織因子ＴＦのフラグメントまたはＴＦに相同な配列のフラグメントであり得る。好ましくは、このフラグメントは、配列番号２（図１３）に示す配列を有する。配列番号２（図１３）に示す配列（ｔＴＦ１−２１８または省略してｔＴＦ）は、ＴＦのＮ末端の２１８アミノ酸を含む。さらに、本発明によれば、ｔＴＦと比較してＮ末端またはＣ末端のいくつかのアミノ酸を欠くｔＴＦフラグメントを使用することもまた可能である。例えば、Ｎ末端の１０アミノ酸までを欠くフラグメント（ｔＴＦ１１−２１８）を使用することが可能である。さらに、Ｃ末端の８アミノ酸までを欠くフラグメント（ｔＴＦ１−２１０）（例えば、ｔＴＦ１−２１４）が使用され得る。
【００２１】
本発明は、融合ポリペプチドに関し、ここで、腫瘍血管の内皮細胞に選択的に結合し得るペプチドは、血液凝固を活性化し得るペプチドのＣ末端に結合している。本発明によれば、用語「腫瘍血管内皮細胞」および用語「腫瘍血管内の内皮細胞」は、腫瘍の血管を覆う細胞をいうために使用される。上記の配置により、内皮細胞のリン脂質膜に対して垂直な融合タンパク質の配向が確実になり、このことが血液凝固の誘発に特に有利であることが本発明によって確立された。この配向は、血液凝固を誘導する間のＴＦの天然での配向に対応する。図３に示すように、第Ｘ因子の活性化に関して、このようにして生成された全ての構築物について、ＦＶＩＩａ／ｔＴＦ１−２１８またはＦＶＩＩａ／ｔＴＦ１−２１８融合タンパク質によって、非常に類似したミカエリス−メンテン反応速度が見出される。対照的に、先行技術では、凝固を活性化するペプチドは、標的化分子のＣ末端に結合された（（１６）を参照のこと）。したがって、本発明による融合ポリペプチドは、先行技術で用いられたペプチドとは基本的に異なる。
【００２２】
融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドは、３〜３０アミノ酸の長さを有しかつ腫瘍血管内皮細胞を高い特異性で結合する、任意のペプチドであり得る。対応するペプチドは、技術水準で通常である方法によってペプチドライブラリーから単離され得る。これらは、選択されるペプチドライブラリーに依存して、直鎖状または環状の構造を有し得る。
【００２３】
本発明の１つの実施形態によれば、融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞に選択的に結合させ得るペプチドは、アミノ酸配列ＲＧＤまたはＮＧＲを含む。両方の配列とも、インテグリン（特にαｖβ３インテグリンおよびαｖβ５インテグリン）に対する特異的結合に関して（ＲＧＤペプチド）、ならびに細胞付着モチーフとして（ＮＧＲペプチド）先行技術で公知である（（８）を参照のこと）。本発明によれば、これらのペプチドが、融合ポリペプチドの一部として特に適切であり、融合ポリペプチドの他の部分は、融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合したときに腫瘍において血液凝固を活性化し得るペプチドであることが驚くべきことに示された。
【００２４】
特に有利な効果は、配列ＧＲＧＤＳＰを有する直鎖状ペプチド、配列ＧＮＧＲＡＨＡを有する直鎖状ペプチドおよび配列ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧを有する直鎖状ペプチド、ならびに配列ＧＣＮＧＲＣＧを有する環状ペプチド、配列ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣを有する環状ペプチドおよび配列ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣを有する環状ペプチドを用いて得られた。これらの配列およびヒトＴＦの最初の２１８アミノ酸の配列を含む融合ポリペプチドが、抗血管腫瘍治療に非常に適切であることが実証された。特に、これらの融合ポリペプチドが、腫瘍増殖の顕著な阻害または腫瘍サイズの低下を引き起こすことが示された（図７および図８を参照のこと）。腫瘍の部分的後退の観察された誘導（図８を参照のこと）は、マウスモデルの高い予測力（４２、４３、４４）に基づいて、ヒト腫瘍治療におけるポジティブな結果の期待を示す。
【００２５】
本発明はさらに、環状ＲＧＤペプチドを有する融合タンパク質を含む。なぜなら、環化は、インテグリンへの親和性を改善するからである（例えば、参考文献２１に記載の通り）。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号３〜配列番号８（図１４〜図１９）に示す配列のうちの１つを有する融合ポリペプチドに関する。
【００２７】
別の実施形態によれば、本発明は、上記の通りの融合ポリペプチドをコードする核酸に関する。対応する核酸は、例えば、配列番号１０〜配列番号１５（図２１〜２６）に示す配列のうちの１つを有し得る。
【００２８】
なお別の局面では、本発明は、上記の核酸のうちの１つを含むベクターに関する。対応するベクターは通常、核酸配列の発現のための調節配列もまた含む。このベクターは、先行技術に包括的に記載されており、多数の会社から市販される。
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明は、上記の核酸またはベクターのうちの１つを含む細胞に関する。この細胞は一般に、この核酸の発現および本発明による融合ポリペプチドの組換え産生のために用いられる。Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母細胞および動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）を含めた多数の細胞は、この目的に対する適用を見出し得る。適切な細胞およびその使用は、先行技術に包括的に記載される。
【００３０】
請求項１に記載の本発明のポリペプチドは、他の適切な方法によって（例えば、個々のペプチドの化学的結合によって）さらに産生され得る。従って、個々のペプチドは、技術水準で従来ある方法によって（例えば、化学合成によって、または異種発現によって）産生され得、次いで結合によって一緒に連結される。
【００３１】
最後に、本発明はまた、上記の融合ポリペプチド、核酸、ベクターまたは細胞を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、薬学的に適合性のキャリア、賦形剤または佐剤をさらに含み得る。さらに、この薬学的組成物中のポリペプチドは、改変状態（例えば、ｐｅｇ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）、すなわち、ポリエチレングリコール分子へ結合した状態）で存在し得る。
【００３２】
本発明による融合ポリペプチドまたはこれらの融合ポリペプチドを含む薬学的組成物は、新生物疾患の処置のために、特に抗血管腫瘍治療のために用いられ得る。本発明による融合ポリペプチドまたはこれらの融合ポリペプチドを含む薬学的組成物の助けによる処置が考えられ得る新生物疾患としては、例えば、気管支癌ならびに胸郭および縦隔の他の腫瘍、胸部癌および他の婦人科腫瘍、結腸直腸癌、膵臓癌および胃腸管の他の腫瘍、悪性黒色腫および皮膚の他の腫瘍、頭部および頚部の領域の腫瘍、前立腺癌および他の尿生殖器腫瘍、肉腫、内分泌活性腫瘍、白血病および骨髄形成異常症候群ならびにホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【００３３】
さらに、良性腫瘍（例えば、血管腫）および糖尿病性網膜症における新生血管形成もまた処置され得る。
【００３４】
静脈内投与以外に、融合ポリペプチドまたは薬学的組成物の皮下投与および腹腔内投与もまた可能である。融合ポリペプチドが胃腸管において切断するのを防ぐ薬学的ビヒクル中に詰めることにより、この融合ポリペプチドまたは薬学的組成物はまた、経口投与され得る。
【００３５】
本発明による融合ポリペプチドと他の治療アプローチ（例えば、細胞傷害性化学療法または照射）を組み合わせることはさらに有利であり得る。他の活性物質との組合せ（例えば、第ＶＩＩａ因子またはドキシサイクリンとの組合せ）もまた可能であるが、好ましくは本発明によるポリペプチドと第ＶＩＩａ因子またはドキシサイクリンとの組合せは必要ない。
【００３６】
本発明は、以下の実施例に基づいて、より詳細に記載される：
【実施例】
【００３７】
（実施例１：ｔＴＦおよびｔＴＦ融合タンパク質の発現および精製）
組織因子ＴＦのＮ末端２１８アミノ酸（本明細書以下、ｔＴＦと省略する）をコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列番号１６および配列番号１７（図２７）に示すプライマーを用いて合成し、そして発現ベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）中に形質転換し、発現させ、そして精製した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ）。
【００３８】
短縮型組織因子ｔＴＦに加えて、ｔＴＦペプチド融合タンパク質を構築し、ここで、標的ペプチドを、可溶性組織因子ｔＴＦのカルボキシル末端に最初に結合させる。以下の直鎖状融合タンパク質を構築した：
ｔＴＦ−ＧＲＧＤＳＰ（配列番号３；図１４；本明細書以下、ｔＴＦ−ＲＧＤと省略する；ＰＣＲプライマー配列番号１８および配列番号１９（図２８）を用いた）；
ｔＴＦ−ＧＮＧＲＡＨＡ（配列番号４；図１５；本明細書以下、ｔＴＦ−ＮＧＲと省略する；ＰＣＲプライマー配列番号２０および配列番号２１（図２９）を用いた）；
ｔＴＦ−ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧ（配列番号５；図１６；ＰＣＲプライマー配列番号２８および配列番号２９（図３３）を用いた）。
【００３９】
さらに、以下の環状融合タンパク質を合成した：
ｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＧ（配列番号６；図１７；本明細書以下、ｔＴＦ−シクロＮＧＲ１と省略する；ＰＣＲプライマー配列番号２２および配列番号２３（図３０）を用いた）；
ｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号７；図１８；本明細書以下、ｔＴＦ−シクロＮＧＲ２と省略する；ＰＣＲプライマー配列番号２４および配列番号２５（図３１）を用いた）；
ｔＴＦ−ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号８；図１９；本明細書以下、ｔＴＦ−シクロＮＧＲ３と省略する；ＰＣＲプライマー配列番号２６および配列番号２７（図３２）を用いた）。
【００４０】
全ての構築物（ｔＴＦを含む）を、ｐＥＴ３０ａ（＋）ベクター中で発現させた。このベクターは、６ヒスチジン残基のＮ末端親和性タグおよびベクターによってコードされるいくつかのアミノ酸のさらなる発現を媒介する。この親和性タグの助けを借りて、この構築物を、ニッケル−ニトリロトリ酢酸カラム（Ｎｉ−ＮＴＡ，Ｎｏｖａｇｅｎ）での親和性クロマトグラフィーによって精製し得た。この親和性タグを配列番号３０に示す。配列番号３１および配列番号３２は、例として、親和性タグを有する、ｔＴＦ−ＧＲＧＤＳＰおよびｔＴＦ−ＧＮＧＲＡＨＡの完全なアミノ酸配列を示す。
【００４１】
この構築物を、ｔＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体（１９）の公知のＸ線結晶構造に基づいて、内皮細胞へのリン脂質膜へのｔＴＦ融合タンパク質の垂直の配向（これは、ネイティブなＴＦの配向に対応する）が確実になるように選択した。選択された構造がｔＴＦにおいて、ＦＶＩＩａおよび高分子物質ＦＸとの相互作用に対して何の立体障害も引き起こすべきでないことをさらに考慮した。ＲＧＤ配列のαｖβ３インテグリン特異性およびＮＧＲ配列のＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）特異性に起因して、腫瘍選択性が達成された。なぜなら、これらのレセプターは、いくつかの例外を除いて、正常組織内の静止内皮細胞上には存在しないが、腫瘍内皮細胞上に高密度で選択的かつ特異的に発現されるからである（図１を参照のこと）。
【００４２】
ｔＴＦ、ならびにｔＴＦ−ＲＧＤ、ｔＴＦ−ＮＧＲ、ｔＴＦ−ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧおよびｔＴＦ−シクロＮＧＲ１〜ｔＴＦ−シクロＮＧＲ３と記載される融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）にｐＥＴ３０ａ（＋）によって形質転換して発現させた。形質転換されたＩＰＴＧ誘導Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＤＥ３を遠心分離し、そして５〜７ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン；２ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム）／ｇペレット中に吸収させ、そして２０μｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。室温（ＲＴ）にて９０分間のインキュベーションおよび１２０００ｇ、４℃にて２０分間の遠心分離後、ペレットを再懸濁し、そして洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の超音波処理によってホモジナイズした。封入体を、２〜４ｍｌ／ｇペレットの変性緩衝液（６Ｍ  塩化グアニジニウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でＲＴにて一晩かけて溶解した。遠心分離（５０００ｇ、３０分間、４℃）による上清を０．２２μｇフィルターで濾過した。構築物のさらに導入したＨｉｓ−Ｔａｇ配列によってニッケル−ニトリロトリ酢酸カラム（Ｎｉ−ＮＴＡ，Ｎｏｖａｇｅｎ）で均質になるまで構築物を精製した。タンパク質の精製および折り畳みを、Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で実施した。この後、ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対する透析を行った。
【００４３】
タンパク質の正体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットおよび質量分析法によって確認した（図２を参照のこと）。
【００４４】
（実施例２：ｔＴＦおよびｔＴＦ−融合タンパク質の機能的特徴付け）
第ＶＩＩａ因子を介した第Ｘ因子から第Ｘａ因子への活性化における補因子活性についてのこれらの融合タンパク質の機能活性を、ミカエリス−メンテン分析によりインビトロで実証した。ｔＴＦおよびｔＴＦ融合ポリペプチドが、リン脂質の存在下でＦＶＩＩａを介したＦＸの特異的タンパク質分解活性化を強化する能力を、Ｒｕｆ（４５）によって記載された方法のわずかに改変したバージョンにおいて決定した。これに関しては、各々２０μｌの以下の試薬を、マイクロタイタープレート中ピペッティングした：（ａ）ＴＢＳ−ＢＳＡ中の５０ｎＭ組換えＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）；（ｂ）ＴＢＳ−ＢＳＡ中の０．１６ｎＭ〜１．６μＭのｔＴＦ／ｔＴＦ融合ポリペプチド；（ｃ）２５ｍＭ  ＣａＣｌ２および５００μＭのリン脂質小胞（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン、７０／３０、Ｍ／Ｍ；Ｓｉｇｍａ）。室温にて１０分間のインキュベーション後、２０μｌの天然基質ＦＸ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５μＭの濃度で添加した。次いで、サンプルをピペットによって１分間隔で採取し、そして１００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液の添加によって反応を停止させた。形成されたＦＸａの量を、４０５ｎｍでの吸光度の変化によって決定することにより、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ中での色素形成性基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａの添加によって測定し、そしてミカエリス−メンテン反応速度についてのパラメーターを、Ｒｕｆによって記載された方法により分析した。結果は、ｔＴＦおよびｔＴＦ融合ポリペプチドが両方とも、これらの条件下で機能的に活性であることを示す（図３）。融合ポリペプチドについて見出されたミカエリス定数（Ｋｍ）は、０．１２〜１．２ｎＭの範囲内にあり（図３）、従って、ｔＴＦについて公開されているよりも低い範囲であった、それゆえ、機能活性は、ペプチドとｔＴＦとの融合によって影響を受けないとみなされ得る。
【００４５】
（実施例３：インビトロおよびインビボでの、αｖβ３に対するｔＴＦ融合タンパク質の結合）
αｖβ３インテグリンに対するｔＴＦ−ＲＧＤおよびｔＴＦ−ＮＧＲの結合を、精製αｖβ３をマイクロタイタープレートに固定することにより、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）において実証した（図４を参照のこと）。αｖβ３に対するｔＴＦ−ＲＧＤの結合の特異性は、配列ＧＲＧＤＳＰを有する合成ペプチド（Ｇｉｂｃｏ社製）がこの試験系においてｔＴＦ−ＲＧＤのαｖβ３に対する結合を完全に阻害するという事実によって強調された（図５を参照のこと）。
【００４６】
次に、内皮細胞に対するｔＴＦ−ＲＧＤのαｖβ３に対する特異的結合を評価した。これについては、懸濁した内皮細胞に対するビオチン化ｔＴＦおよびｔＴＦ−ＲＧＤの差次的結合を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって分析した。組織培養において保持された全ての内皮細胞が活性化される（すなわち、αｖβ３分子を発現する）という事実は実験的に利用される。これは、種々の免疫組織化学法によって検出され得る。培養された内皮細胞は従って、αｖβ３に関するその発現パターンに関して、腫瘍内皮細胞に対応する。従って、培養された内皮細胞は、腫瘍内皮細胞に対する物質の特異的結合に関するモデル系として用いられ得、そしてまた、予測される毒性に関して予想がなされるのを可能にする。
【００４７】
ストレプトアビジン−フィコエリトリンを、検出方法として用いた。ｔＴＦ−ＲＧＤについての測定した蛍光強度は、ｔＴＦについてよりも８倍高かった（図６Ａ）。さらに、内皮細胞に対する０．１μＭ  ｔＴＦ−ＲＧＤの結合は、１μＭの合成ペプチドＧＲＧＤＳＰの投与によって競合的に７５％低下した（図６Ｂ）。このことは、内皮細胞表面上のＲＧＤ結合レセプター（例えば、αｖβ３）に対するｔＴＦ−ＲＧＤの結合の特異性を強調する。
【００４８】
（実施例４：動物モデルにおけるｔＴＦ融合タンパク質の抗腫瘍効果）
ｔＴＦ−ＲＧＤ融合タンパク質およびｔＴＦ−ＮＧＲ融合タンパク質を、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片に対するそれらの効果および副作用に関して評価した。本発明者らの実験室で確立したモデルをこのために用いた（３３、３４）。細胞株ＣＣＬ１８５（ヒト肺腺癌）およびＭ−２１（ヒト黒色腫）を、雄性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（９〜１２週齢）の脇腹に皮下注射した。約５０〜１００ｍｍ３（ＣＣＬ１８５）または４００〜６００ｍｍ３（Ｍ−２１）の腫瘍体積が得られたら、マウスをランダムに４つの群に割り当てた。群１は、生理学的生理食塩水溶液（ＮａＣｌ）のみを受け、群２はｔＴＦを、群３はｔＴＦ−ＲＧＤを、そして群４はｔＴＦ−ＮＧＲを受けた（各々の場合、１．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）のタンパク質）。（特定の細胞株の増殖速度に依存して）１〜３日間の間隔で動物の尾静脈に注射を行った。融合タンパク質のかなりの治療活性が観察された。ｔＴＦ−ＲＧＤ融合タンパク質またはｔＴＦ−ＮＧＲ融合タンパク質で処置したマウスの腫瘍は、それらの増殖が有意に阻害されたか、または部分的後退の場合は、ｔＴＦまたはＮａＣｌと比較してサイズが低下した（図７および図８を参照のこと）。
【００４９】
腫瘍血管中の血栓誘導の作用機構を確認するために、以下の実験を実施した：ヒト黒色腫細胞株を２匹の雄性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの脇腹に注射した。腫瘍のサイズが約５００ｍｍ３になったら、２．０ｍｇ／ｋｇ体重のｔＴＦ−ＮＧＲまたはＮａＣｌを尾静脈に注射した。図９Ａは、ｔＴＦ−ＮＧＲ融合タンパク質（写真の左半分）またはＮａＣｌ（写真の右半分）の注射の２０分後の腫瘍保有マウスのインビボでの拡大図を示す。ｔＴＦ−ＮＧＲの注射後の腫瘍の青みがかった青藍色の着色の肉眼的写真は、腫瘍壊死を示す。６０分間後、マウスを放血し、腫瘍を完全に切り出し、そして組織学的に調べた。図９Ｂは、初期腫瘍壊死の結果としての二次出血の徴候として、ｔＴＦ−ＮＧＲで処置した腫瘍の出血膨潤を示す。対照的に、ＮａＣｌで処置した腫瘍は、元気なようである（図９Ｃ）。
【００５０】
黒色腫腫瘍の組織学的分析は、血管中の顕微鏡的に可視的な血栓形成を示す（図１０Ａ〜Ｄ）。この知見は、ｔＴＦ−ＮＧＲの抗腫瘍効果の示唆された機構（すなわち、血管中の血栓の誘導）を確認する。腫瘍血管についてのｔＴＦ−ＮＧＲの高い選択性は、心臓、腎臓、肝臓および肺のような正常組織において凝固および壊死が組織学的に検出されないことによって実証される（図１１Ａ〜１１Ｄ）。反復した高い用量のｔＴＦ−ＮＧＲ（４ｍｇ/ｋｇ体重）でさえも、肉眼的血餅形成も器官毒性ももたらされなかった。
【００５１】
（実施例５：ＨＴ１０８０腫瘍動物モデルにおけるｔＴＦ融合タンパク質の抗腫瘍効果）
ｔＴＦ−ＲＧＤ融合タンパク質の抗腫瘍活性をまた、線維肉腫（ＨＴ１０８０）を有するＢＡＬＢ/ｃヌードマウスにおいて調べた。これらの腫瘍は、迅速に増殖し、充分に新生血管形成されている。２つの実験の結果を表２および図３４に提示する。ｔＴＦ−ＲＧＤの２回目の注射後、コントロール群と比較して有意なＨＴ１０８０腫瘍増殖阻害が観察された。この効果は、７日目の実験の最後まで持続した（緩衝液コントロール（生理学的食塩水溶液）と比較して、ｔＴＦ−ＲＧＤについてＰ＝０．０２１、ｔＴＦと比較してｔＴＦ−ＲＧＤについてＰ＝０．００５）。先の実験と同様に、このモデルにおいて、腫瘍体積の部分的後退が観察された。
【００５２】
【表１】
2007528722.tif 000003
【００５３】
【表２】
2007528722.tif 000004
【００５４】
【表３】
2007528722.tif 000005
他のｔＴＦ融合タンパク質を、本発明の開示に基づいて当業者によって何の問題もなく構築し得た。可能性のある候補は、ヒト黒色腫プロテオグリカンのマウスホモログであるＮＧ２に結合するペプチドＴＡＡＳＧＶＲＳＭＨおよびＬＴＬＲＷＶＧＬＭＳである（１２）。ＮＧ２の発現は、腫瘍細胞および腫瘍の血管形成血管に制限される（３５）。別の候補は、合成ペプチドＴＴＨＷＧＦＴＬであり、これは、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）の選択的かつ強力な阻害を生じる（１３）。インテグリンαｖβ３はまた、ＲＧＤ依存性様式でＭＭＰ−２に明らかに結合する。このことは、活性な酵素が、血管形成血管の表面に局在することを意味する（３６）。ｔＴＦおよびこのＭＭＰ−２阻害ペプチドからなる構築物は、腫瘍血管の内皮細胞膜へのｔＴＦ１−２１８の選択的結合を同様に媒介し得る。
【００５５】
【表４】
2007528722.tif 000006
【００５６】
【表５】
2007528722.tif 000007
【００５７】
【表６】
2007528722.tif 000008
【００５８】
【表７】
2007528722.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ｔＴＦ−ＲＧＤ融合タンパク質およびｔＴＦ−ＮＧＲ融合タンパク質の、αｖβ３およびＣＤ１３への結合の提示の概略図。腫瘍選択性は、ＲＧＤ配列のαｖβ３−インテグリン特異性およびＮＲＧ配列のＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）特異性に起因して達成される。これらのレセプターは、腫瘍内皮細胞上に、選択的かつ特異的に、高密度で発現されるが、正常組織内の静止内皮細胞においてはそうではない（いくつかの例外は除く）。融合タンパク質の提示は、非常に概略的であり、一次配列に関する何らかの情報を提供するわけではない。
【図２】組換えｔＴＦ１−２１８およびｔＴＦ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。ｔＴＦの純度およびｔＴＦ融合タンパク質の純度を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１  ＤＥ３）からの抽出および線形尿素勾配（６Ｍ〜１Ｍ）での再折り畳み後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によってチェックした。タンパク質の正体を、モノクローナル抗組織因子抗体（クローンＶ１Ｃ７、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いたウェスタンブロッティングによって確認した。個々のレーンにおけるローディング：１＝ｔＴＦ；２＝ｔＴＦ−ＲＧＤ；３＝ｔＴＦ−ＮＧＲ；４＝ｔＴＦ−シクロＮＧＲ１；５＝ｔＴＦ−シクロＮＧＲ２：６＝ｔＴＦ−シクロＮＧＲ３；７＝ｔＴＦ−ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧ；Ｍ＝分子量マーカー。
【図３】ＦＶＩＩａ／ｔＴＦ１−２１８融合タンパク質またはＦＶＩＩａ／ｔＴＦ１−２１８融合タンパク質によるＦＸの活性化についてのミカエリス定数（Ｋｍ）の決定。ミカエリス−メンテン反応速度のパラメーターを、Ｒｕｆ（４５）によって記載された方法を用いて計算した。
【図４】インテグリンαｖβ３に対するｔＴＦ、ｔＴＦ−ＲＧＤおよびｔＴＦ−ＮＧＲの結合。０．１μＭのｔＴＦ、ｔＴＦ−ＲＧＤおよびｔＴＦ−ＮＧＲの、固定化αｖβ３に対する結合を、ヒトＴＦに対するポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いてＥＬＩＳＡにおいて定量した。結果を、メジアンおよび四分位範囲として表す。ｔＴＦ−ＲＧＤとｔＴＦとの間の結合の差、またはｔＴＦ−ＮＧＲとｔＴＦとの間の結合の差は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【図５】インテグリンαｖβ３に対するｔＴＦ−ＲＧＤの結合の特異性。ｔＴＦ−ＲＧＤ（０．１μＭ）の、固定化αｖβ３に対する結合は、合成ペプチドＧＲＧＤＳＰ（１〜１０μＭ）を用いた競合阻害によって有意に阻害された（両方のＲＧＤペプチド濃度について、ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【図６】ヒト内皮細胞に対するｔＴＦおよびｔＴＦ−ＲＧＤの結合。Ａ：０．１μＭ  ｔＴＦ（２）または０．１μＭ  ｔＴＦ−ＲＧＤ（３）とともに４℃で６０分間インキュベートした内皮細胞のＦＡＣＳ分析。Ｂ：結合の７５％の減少が、１μＭ  ＧＲＧＤＳＰ（４）を用いたｔＴＦ−ＲＧＤ融合タンパク質の競合阻害によって実証された。ＡおよびＢにおける曲線１は、ネガティブコントロールを示す。
【図７】生理学的食塩水溶液（ＮａＣｌ、ｎ＝８）またはｔＴＦ（ｎ＝１）の注入を用いた腫瘍増殖と比較した、ｔＴＦ融合タンパク質（ｔＴＦ−ＲＧＤ、ｎ＝６；ｔＴＦ−ＮＧＲ、ｎ＝６）を用いた静脈内治療による、無胸腺ヌードマウスにおける異種移植片としてのヒト肺癌（ＣＣＬ１８５）の増殖の阻害。垂直の矢印は、それぞれの物質を用いた注射時間を示す。
【図８】生理学的食塩水溶液（ＮａＣｌ、ｎ＝４）またはｔＴＦ（ｎ＝４）の注入を用いた腫瘍増殖と比較した、ｔＴＦ融合タンパク質（ｔＴＦ−ＲＧＤ、ｎ＝３；ｔＴＦ−ＮＧＲ、ｎ＝３）を用いた静脈内治療による、無胸腺ヌードマウスにおける異種移植片としてのヒト悪性黒色腫（Ｍ２１）の増殖の阻害および部分的後退。垂直の矢印は、それぞれの物質を用いた注射時間を示す。
【図９】ｔＴＦ−ＮＧＲ融合タンパク質（Ａ、写真の左半分）またはＮａＣｌ（Ａ、写真の右半分）の注射２０分後の腫瘍保有マウスの巨視的インビボ写真。ｔＴＦ−ＮＧＲの注射後の腫瘍の青みがかった青藍色の着色の肉眼的写真は、腫瘍壊死を示す。６０分後、２匹のマウスを放血し、この腫瘍を完全に切り出し、そして組織学的に調べた。Ｂでは、本発明者らは、初期腫瘍壊死の結果としての二次出血の徴候として、ｔＴＦ−ＮＧＲで処置した腫瘍の出血膨潤がわかり得る。対照的に、ＮａＣｌ処置腫瘍は、元気なようである（Ｃ）。
【図１０】腫瘍保有ヌードマウスの尾静脈におけるｔＴＦ−ＲＧＤ（ＡおよびＢ）、ｔＴＦ−ＮＧＲ（ＣおよびＤ）および普通塩（ＥおよびＦ）の静脈内注射の１時間後の黒色腫腫瘍の組織構造。ｔＴＦ融合タンパク質で処置した腫瘍では、血管は、血栓崩壊的に閉塞しているようであった（矢印）。大規模腫瘍壊死は、血餅によって閉塞された血管の供給領域において観察可能である（Ａ〜Ｄ）。写真は、腫瘍の代表的な領域のものである（Ａ、ＣおよびＥ：倍率２００倍、Ｂ、ＤおよびＦ  倍率４００倍；ＨＥ染色（例えば、Ｈ．Ｃ．Ｂｕｒｃｋ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｋ−Ｌｅｉｔｆａｄｅｎｆｕｅｒ  ｄｉｅ  Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ  ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒａｅｐａｒａｔｅ  ｉｎ  Ｕｎｔｅｒｒｉｃｈｔ  ｕｎｄ  Ｐｒａｘｉｓ，第５版、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９８２，１０９ｆｆ頁に記載の染色））。
【図１１】４ｍｇ／ｋｇ体重  ｔＴＦ−ＮＧＲの注射１時間後の心臓（Ａ）、腎臓（Ｂ）、肝臓（Ｃ）および肺（Ｄ）の代表的組織構造。血栓または壊死は、これらの器官のいずれにおいても顕微鏡的に検出されなかった（ＨＥ染色；倍率２００倍）。
【図１２】ヒト組織因子（ＴＦ）のアミノ酸配列。
【図１３】短縮型ヒト組織因子ｔＴＦ１−２１８（本出願の範囲内で、略してｔＴＦとも省略する）のアミノ酸配列。
【図１４】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＲＧＤＳＰ（ｔＴＦ−ＲＧＤとも省略する）のアミノ酸配列。
【図１５】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＮＧＲＡＨＡ（ｔＴＦ−ＮＧＲとも省略する）のアミノ酸配列。
【図１６】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧのアミノ酸配列。
【図１７】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＧ（ｔＴＦ−シクロＮＧＲ１とも省略する）のアミノ酸配列。
【図１８】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（ｔＴＦ−シクロＮＧＲ２とも省略する）のアミノ酸配列。
【図１９】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（ｔＴＦ−シクロＮＧＲ３とも省略する）のアミノ酸配列。
【図２０】短縮型ヒト組織因子ｔＴＦ１−２１８（本出願の範囲内で、略してｔＴＦとも省略する）のヌクレオチド配列。
【図２１】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＲＧＤＳＰ（ｔＴＦ−ＲＧＤとも省略する）のヌクレオチド配列。
【図２２】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＮＧＲＡＨＡ（ｔＴＦ−ＮＧＲとも省略する）のヌクレオチド配列。
【図２３】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧのヌクレオチド配列。
【図２４】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＧ（ｔＴＦ−シクロＮＧＲ１とも省略する）のヌクレオチド配列。
【図２５】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（ｔＴＦ−シクロＮＧＲ２とも省略する）のヌクレオチド配列。
【図２６】融合ポリペプチドｔＴＦ−ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（ｔＴＦ−シクロＮＧＲ３とも省略する）のヌクレオチド配列。
【図２７】ｔＴＦ１−２１８の生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図２８】ｔＴＦ−ＧＲＧＤＳＰの生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図２９】ｔＴＦ−ＧＮＧＲＡＨＡの生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図３０】ｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＧの生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図３１】ｔＴＦ−ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣの生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図３２】ｔＴＦ−ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣの生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図３３】ｔＴＦ−ＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧの生成のためのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。Ａ：５’−プライマー；Ｂ：３’−プライマー。
【図３４】ａ：生理学的食塩水溶液（ＮａＣｌ、ｎ＝９）またはｔＴＦ（ｎ＝１１）の注入を用いた腫瘍増殖と比較した、ｔＴＦ融合タンパク質（ｔＴＦ−ＲＧＤ、ｎ＝７）を用いた静脈内治療による、無胸腺ヌードマウスにおける異種移植片としてのヒト悪性黒色腫（Ｍ２１）の増殖の阻害および部分的後退。垂直の矢印は、それぞれの物質を用いた注射時間を示す。ｂ：生理学的食塩水溶液（ＮａＣｌ、ｎ＝１５）またはｔＴＦ（ｎ＝１４）の注入を用いた腫瘍増殖と比較した、ｔＴＦ融合タンパク質（ｔＴＦ−ＲＧＤ、ｎ＝１２）を用いた静脈内治療による、無胸腺ヌードマウスにおける異種移植片としてのヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）の増殖の阻害。垂直の矢印は、それぞれの物質を用いた注射時間を示す。ｃ：生理学的食塩水溶液（ＮａＣｌ、ｎ＝１０）またはｔＴＦ（ｎ＝５）の注入における腫瘍増殖と比較した、ｔＴＦ融合タンパク質（ｔＴＦ−ＲＧＤ、ｎ＝１１）を用いた静脈内治療による、無胸腺ヌードマウスにおける異種移植片としてのヒト肺癌（ＣＣＬ１８５）の増殖の阻害。垂直の矢印は、それぞれの物質を用いた注射時間を示す。統計学的有意性を、独立した群についてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて各々の場合に調べた。０．０５未満のＰ値は、有意とみなされる。＊は、ｔＴＦ−ＲＧＤと緩衝液との間の差の統計学的有意性を示す。
【図３５】ｔＴＦ−ＲＧＤ融合タンパク質（Ａ、Ｃ）またはＮａＣｌ（Ｂ、Ｄ）を用いた処置の終了時（７日目）の、Ｍ２１腫瘍を保有するマウスの拡大図。明らかに元気なコントロールの腫瘍とは対照的に、壊死の明確な徴候を示す、ｔＴＦ−ＲＧＤ処置腫瘍のサイズの差および異なる外観が容易に識別可能である。
【図３６】ｔＴＦ−ＲＧＤ処置マウスおよび生理学的食塩水溶液処置マウスの腫瘍および器官のＨ−Ｅ染色。腫瘍細胞の重篤な血栓および壊死は、ｔＴＦ−ＲＧＤで処置した動物において観察された（Ａ：２００倍、Ｂ：４００倍）。矢印は、腫瘍の血管中の血栓の例を示す。生理食塩水で処置した動物においては、明らかな血栓も壊死も生じなかった（Ｃ：２００倍、Ｄ：４００倍）。矢印は、いくつかの赤血球を有する腫瘍のインタクトな血管を示す。ｔＴＦ−ＲＧＤで処置した動物の心臓（Ｅ）、肺（Ｆ）、肝臓（Ｇ）および腎臓は、可視の血栓も壊死も示さなかった。
【図３７】線維肉腫モデルにおけるｔＴＦ−ＮＧＲの作用。線維肉腫（ＨＴ１０８０）を保有するマウスを、ｔＴＦ−ＮＧＲの静脈内投与なし（プレｔＴＦ−ＮＧＲ）およびｔＴＦ−ＮＧＲの静脈内投与６時間後（ｔＴＦ−ＮＧＲ後）に磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）によって調べた。高いまたは低い血管体積割合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
2007528722000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月24日(2006.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007528722000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月21日(2007.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドであって、
ａ）該融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチド；および
ｂ）組織因子（ＴＦ）またはそのフラグメントであって、該組織因子および該フラグメントは、該融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得ることによって特徴付けられる、組織因子またはそのフラグメント
を含み、
ここで、該ペプチドａ）および該ペプチドｂ）は、互いに直接結合しているかまたは１５個までのアミノ酸を有するリンカーを介して互いに結合されており、該融合ポリペプチドは、該融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、該融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得るペプチドのＣ末端に結合されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドａ）および前記ペプチドｂ）、ならびに１５個までのアミノ酸を有するリンカーからなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドａ）と前記ペプチドｂ）とが互いに直接結合している、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得る前記ペプチドが、組織因子ＴＦであり、該組織因子ＴＦは、配列番号１に示す配列を有することによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドが腫瘍血管内皮細胞に結合した際に血液凝固を活性化し得る前記ペプチドが、組織因子ＴＦのフラグメントであり、該組織因子ＴＦのフラグメントは、好ましくは配列番号２に示す配列を有することによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチドが、直鎖状または環状の構造を有することによって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得る、３〜３０アミノ酸のペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤまたはＮＧＲを含むことによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、ＧＲＧＤＳＰおよびＧＮＧＲＡＨＡを含む群より選択されることによって特徴付けられる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドを腫瘍血管内皮細胞へと選択的に結合させ得るペプチドが、ＧＣＮＧＲＣＧ、ＧＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＧＣＶＬＮＧＲＭＥＣおよびＧＡＬＮＧＲＳＨＡＧを含む群より選択されることによって特徴付けられる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３〜８に示される配列のうちの１つを有することによって特徴付けられる、請求項１〜９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１２】
配列番号１０〜１５に示す配列のうちの１つを有することによって特徴付けられる、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１１もしくは請求項１２に記載の核酸または請求項１４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
薬学的組成物であって、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド、請求項１１もしくは請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または佐剤をさらに含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
新生物疾患の処置のための、請求項１５または請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記新生物疾患が、気管支癌ならびに胸郭および縦隔の他の腫瘍、胸部癌および他の婦人科腫瘍、結腸直腸癌、膵臓癌および胃腸管の他の腫瘍、悪性黒色腫および皮膚の他の腫瘍、頭部および頚部の領域の腫瘍、前立腺癌および他の尿生殖器腫瘍、肉腫、内分泌活性腫瘍、白血病および骨髄形成異常症候群ならびにホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む群より選択されることによって特徴付けられる、請求項１７に記載の組成物。
【国際調査報告】
2007528722.tif 000065
2007528722.tif 000066
2007528722.tif 000067
2007528722.tif 000068
2007528722.tif 000069
2007528722.tif 000070