(57)【要約】  脂肪酸抱合により修飾したペプチド、及び、細菌感染の処置、例えば抗生物質体制細菌感染の処置における当該修飾ペプチドの使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主として正電荷のアミノ酸残基を含んで成る一面と、主として疎水性のアミノ酸残基を含んで成る反対面とを有する両親媒性のα−ヘリックス又は３10ヘリックス構造を有するポリペプチドを含んで成り、これらの残基が表面活性ドメインを規定し、当該ポリペプチドが最大１４アミノ酸残基を有し、当該ポリペプチドが少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾され、且つ修飾されたポリペプチドが、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾される前のポリペプチドの殺菌活性と比較して強化された殺菌活性を示す、修飾ポリペプチド。
【請求項２】
最大１２アミノ酸残基を有する、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号１〜１７及びそのアナログから成る群から選択され、ここで、Ｘがアミノ酸であり、
そしてその活性アナログが１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の欠失、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の付加、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の置換、化学的修飾、及び／又は酵素的修飾を含む、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘがノルロイシンである、請求項３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが配列番号１〜８及びその活性アナログから成る群から選択され、
その活性アナログが、又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の欠失、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の付加、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の置換、化学的修飾、及び／又は酵素的修飾を含む、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項６】
脂肪族基が１又は複数の不飽和炭素間結合を含む、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項７】
脂肪族基がポリペプチドとＮ末端及び／又はＣ末端で結合している、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項８】
脂肪族基が脂肪酸由来のアルキル基である、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項９】
脂肪酸がＣ８−Ｃ２２脂肪酸である、請求項８に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１０】
脂肪酸がＣ１０−Ｃ２０脂肪酸である、請求項８に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１１】
脂肪族基が少なくとも１１炭素原子を有する、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１２】
脂肪族基が１１〜１９炭素原子を有する、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１〜１７及びその活性アナログから成る群から選択されるポリペプチドを含んで成り、ここで、Ｘがアミノ酸であり、
当該ポリペプチドが少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾されており、
活性アナログが１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の欠失、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の付加、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の置換、化学的修飾、及び／又は酵素的修飾を含む、修飾ポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端を修飾する前のポリペプチドの殺菌活性と比較して増大した殺菌活性を示す、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘがノルロイシンである、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが請求項１〜８及びそれらの活性アナログから成る群から選択される、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号４又はその活性アナログである、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号４である、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１９】
脂肪族基が１又は複数の不飽和炭素間結合を含む、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２０】
脂肪族基がポリペプチドとＮ末端及び／又はＣ末端で結合している、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２１】
脂肪族基が脂肪酸由来のアルキル基である、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２２】
脂肪酸がＣ８−Ｃ２２脂肪酸である、請求項２１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２３】
脂肪酸がＣ１０−Ｃ２０脂肪酸である、請求項２１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２４】
脂肪酸がＣ８−Ｃ２２脂肪酸である、請求項２１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２５】
脂肪族基が少なくとも１１炭素原子を有する、請求項１３に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２６】
脂肪族基が１１〜１９炭素原子を有する、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１に記載の修飾ポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項２８】
請求項１に記載の修飾ポリペプチド及び医薬として許容される担体を含んで成る組成物。
【請求項２９】
主として正電荷のアミノ酸残基を含んで成る一面と、主として疎水性のアミノ酸残基を含んで成る反対面とを有する両親媒性のベータシート構造を有するポリペプチドを含んで成り、
ここで、これらの残基が表面活性ドメインを規定し、当該ポリペプチドが最大１４アミノ酸残基を有し、
当該ポリペプチドが少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾され、
且つ修飾されたポリペプチドが、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾される前のポリペプチドの殺菌活性と比較して強化された殺菌活性を示す、修飾ポリペプチド。
【請求項３０】
対象者の細菌感染を処置する方法であって、対象者に対し、殺菌活性を示すのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドを投与することを含んでなる方法。
【請求項３１】
修飾ポリペプチドが更に内毒素を中和する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象者の内毒素を処置する方法であって、対象者に対し、内毒素を中和するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドを投与することを含んでなる方法。
【請求項３３】
修飾ポリペプチドが更に殺菌活性を示す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
in vitroでの細菌増殖を阻害する方法であって、細菌細胞の増殖を阻害し、そして／あるいは殺菌活性を示すのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドと細菌を接触させることを含んで成る方法。
【請求項３５】
in vitroで内毒素を中和するための方法であって、内毒素を中和するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドと細胞を接触させることを含んで成る方法。
【請求項３６】
対象者のＴＮＦα量を低下させるための方法であって、当該対象者に対し、請求項１に記載の修飾ポリペプチドをＴＮＦα量を低下させるのに有効な量投与することを含んで成る方法。
【請求項３７】
in vitroでのＴＮＦα量を低下させるための方法であって、細胞と、ＴＮＦα量を低下させるのに有効な量の前記修飾ポリペプチドとをインキュベートすることを含んで成る方法。
【請求項３８】
対象者の内皮細胞増殖を阻害するための方法であって、当該対象者に対し、内皮細胞増殖を阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
【請求項３９】
in vitroでの内皮細胞増殖を阻害するための方法であって、内皮細胞と、内皮細胞増殖を阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドとを接触させることを含んで成る方法。
【請求項４０】
対象者の血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害するための方法であって、当該対象者に対し、血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
【請求項４１】
in vitroでの血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害するための方法であって、内皮細胞と、血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドとを接触させることを含んで成る方法。
【請求項４２】
対象者の血管新生を阻害するための方法であって、当該対象者に対し、血管新生を阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
【請求項４３】
in vitroでの血管新生を阻害するための方法であって、細胞と、血管新生を阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドとを接触させることを含んで成る方法。
【請求項４４】
対象者の腫瘍形成を阻害するための方法であって、当該対象者に対し、腫瘍形成を阻害するのに有効な量の請求項１に記載の修飾ポリペプチドを当該対象者に投与することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
継続出願データ
本願は、引用により本明細書に組み入れられる、２００３年１０月１７日に出願した米国仮出願番号第６０／５１２，３７２号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原菌に対する抗生物質の勝利は、現代医学の最大のサクセスストーリーである。これらの薬物は初めて広く第二次世界大戦で使用されるようになってから、数え切れないほどの命を救い、そして多数の恐れられていた疾患と感染症の深刻な合併症を減少させてきた。しかしながら、広範な使用から３０年超経過した後、多くの抗生物質の効果が失われつつある。病原体は、薬物治療に対して耐性を有するようになり、そして公衆衛生の問題を増大させている。結核、淋病、マラリア、幼児期の耳感染等の疾患は、数十年前よりも処置するのが困難である。薬物耐性（抗生物質耐性又は抗菌剤耐性としても知られている）は、病院が一般集団よりも感染に対して脆弱な重症患者を収容しており、その結果より抗生物質を必要とするため、特に病院にとって困難な問題である。これらの患者における抗生物質の頻繁な使用は細菌の突然変異を早め、これが薬物耐性をもたらす。不幸なことに、このことは、最強の抗生物質による処置に対して生き残る能力がより強い細菌を生み出すことによりかかる問題を悪化させている。これらのより強い薬物耐性細菌は、脆弱な入院患者を苦しめ続けている。
【０００３】
抗生物質に対して防衛を発展させた生物には、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneurnoniae)（肺炎、髄膜炎、及び耳感染を引き起こすことがある）、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gorrhoeae)（性感染性の淋病を引き起こす）、サルモネラ、エスケリッチャ・コリ(Esclierichia coli)、及びマイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)（結核を引き起こす）が含まれる。
【０００４】
疾病対策予防センター（ＣＤＣ）によると、米国内のほぼ２００万人の患者が毎年病院内で感染している。これらの患者のうち、約９０，０００人が毎年それらの感染の結果死亡しており、これは１９９２年の１３，３００人の患者の死亡から増大している。院内感染を引き起こす細菌の７０％超が、それらを処置するのに最も一般的に使用されている薬物のうちの少なくとも１つに耐性がある。薬物耐性の生物に感染した人は、より長期の入院になりやすく、そしてあまり有効でなく、より毒性があり、より効果である場合がある第二又は第三希望の薬物で処置することを余儀なくされる。要約すると、抗菌剤耐性は、医療費を高騰させ、疾患の重症度を増大させ、そしてある感染からの死亡率を増大させる。
【０００５】
抗生物質に対する細菌耐性の問題が増大しているという複数の徴候が存在している。２００３年には、複数の疫学者が、The New England Journal of Medicineにおいて、入院患者の５〜１０％が入院中に感染すること、そして院内感染の危険性はここ数十年で確実に増大していること、を報告している。Ｓ．アウレウスのメチシリン耐性菌株は病院内で流行しており、そして病院以外の環境、例えばロッカールームにおいても増大している。２０００年の９月から、メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（黄色ブドウ球菌）感染のアウトブレークは、ＣＤＣによると、カリフォルニア、インディアナ、そしてペンシルバニアにおいて、高校生のフットボール選手、そしてレスリング選手間で報告されている。最初のバンコマイシン耐性Ｓ．アウレウス感染は、２００２年に米国で起こり、医師と患者に重大な問題を提起した。バンコマイシンへの依存度の増大がバンコマイシン耐性腸球菌感染の出現をもたらした。１９８９年よりも前に、米国の病院はバンコマイシン耐性腸球菌について何ら報告していなかったが、ＣＤＣによると、次の１０年間で、そのような病原体は米国の病院内で一般的になった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトの病気を処置するのに現在使用されている抗生物質に対する耐性は、公衆衛生に対する深刻な脅威となっている。従って、新規で且つ改善された抗菌剤についての要求が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、主として正電荷のアミノ酸残基を含んで成る一面と、主として疎水性のアミノ酸残基を含んで成る反対面とを有する両親媒性のα−ヘリックス又は３10ヘリックス構造を有するポリペプチドを持ち、これらの残基が表面活性ドメインを規定し、当該ポリペプチドが最大１４アミノ酸残基を有し、当該ポリペプチドが少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾され、且つ修飾されたポリペプチドが、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾される前のポリペプチドの殺菌活性と比較して、増大した殺菌活性を示す、修飾ポリペプチド、を提供する。修飾ポリペプチドの態様によっては、当該ポリペプチドは、配列番号１〜１７又はそれらの活性アナログから選択され、ここで、Ｘはアミノ酸であり、そしてそれらの活性アナログには、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の欠失、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の付加、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の置換、化学的修飾、及び／又は酵素的修飾が含まれる。態様によっては、Ｘはノルロイシンであってもよい。態様によっては、前記ポリペプチドは配列番号１〜８又はそれらの活性アナログから選択されてもよく、ここで、それらの活性アナログには、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の欠失、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の付加、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の置換、化学的修飾、及び／又は酵素的修飾が含まれる。
【０００８】
本発明はまた、主として正電荷のアミノ酸残基を含んで成る一面と、主として疎水性のアミノ酸残基を含んで成る反対面とを有するベータシート構造を有するポリペプチドを持ち、これらの残基が表面活性ドメインを規定し、当該ポリペプチドが最大１４アミノ酸残基を有し、当該ポリペプチドが少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾され、且つ修飾されたポリペプチドが、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾される前のポリペプチドの殺菌活性と比較して増大した殺菌活性を示す、修飾ポリペプチド、を提供する。
【０００９】
本発明はまた、配列番号１〜１７から選択される配列を有するポリペプチド又はそれらの活性アナログを持ち、Ｘがアミノ酸であり、当該ポリペプチドが少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端で修飾され、そしてそれらの活性アナログには、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の欠失、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の付加、１又は２つの連続又は不連続アミノ酸残基の置換、化学的修飾、及び／又は酵素的修飾が含まれる、修飾ポリペプチドも提供する。態様によっては、Ｘはノルロイシンである。態様によっては、前記ポリペプチドは配列番号１〜８又はそれらの活性アナログから選択される。態様によっては配列番号４又はその活性アナログを有する。態様によっては、修飾ポリペプチドは配列番号４である。
【００１０】
本発明の修飾ポリペプチドの態様によっては、当該修飾ポリペプチドは、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むようにＮ末端及び／又はＣ末端を修飾する前のポリペプチドの殺菌活性と比較して増大した殺菌活性を示す。
【００１１】
本発明の修飾ポリペプチドの態様によっては、当該修飾ポリペプチドは約８〜約３３アミノ酸長であってもよく、約１０〜約２５アミノ酸長であってもよく、あるいは約１２〜約１４アミノ酸長であってもよい。態様によっては、本発明の修飾ポリペプチドは、最大約１４アミノ酸残基、最大約１２アミノ酸残基、又は最大約１０アミノ酸残基を有することがある。態様によっては、修飾ポリペプチドは１２アミノ酸残基を有するドデカマーである。
【００１２】
本発明の修飾ポリペプチドの態様によっては、脂肪族基には、１又は複数の不飽和炭素間結合が含まれる。態様によっては、当該脂肪族基は、少なくとも１１炭素原子を有することがある。態様によっては、当該脂肪族基は、約１１〜約１９炭素原子を有することがある。態様によっては、当該脂肪族基は、Ｎ末端又はＣ末端でポリペプチドと結合しうる。脂肪族基は、脂肪酸、例えばＣ８−Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１０−Ｃ２０脂肪酸、又はＣ８−Ｃ２２脂肪酸を含む脂肪酸由来のアルキル基である。
【００１３】
本発明には、１又は複数の修飾ポリペプチドを含む組成物が含まれる。本発明にはまた、１又は複数の修飾ポリペプチド及び医薬として許容される担体を含む組成物が含まれる。
【００１４】
本発明には、殺菌活性を示すのに有効な量の修飾ポリペプチドを対象者に投与することにより対象者の細菌感染を処置するための方法、が含まれる。態様によっては、当該修飾ポリペプチドはまた、内毒素を中和することもある。
【００１５】
本発明には、内毒素血症を中和するのに有効な量の修飾ポリペプチドを対象者に投与することにより対象者の内毒素血症を処置するための方法、が含まれる。態様によっては、当該修飾ポリペプチドはまた、殺菌活性を示すこともある。
【００１６】
本発明には、細菌細胞の増殖を阻害し、そして／あるいは殺菌活性を示すのに有効な量の修飾ポリペプチドと細菌を接触させることによりin vitroでの細菌増殖を阻害するための方法、が含まれる。
【００１７】
本発明には、内毒素を中和するのに有効な量の修飾ポリペプチドと細胞を接触させることによりin vitroで内毒素を中和するための方法、が含まれる。
【００１８】
本発明には、対象者に請求項１に記載の修飾ポリペプチドをＴＮＦα量を低下させるのに有効な量投与することにより対象者のＴＮＦα量を低下させるための方法、が含まれる。
【００１９】
本発明には、細胞と、ＴＮＦα量を低下させるのに有効な量の前記修飾ポリペプチドとをインキュベートすることによりin vitroでのＴＮＦα量を低下させるための方法、が含まれる。
【００２０】
本発明には、対象者に内皮細胞増殖を阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドを投与することにより対象者の内皮細胞増殖を阻害する方法、が含まれる。
【００２１】
本発明には、内皮細胞増殖を阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドと内皮細胞を接触させることにより内皮細胞増殖をin vitroで阻害する方法、が含まれる。
【００２２】
本発明には、血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドを対象者に投与することにより対象者の血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害する方法、が含まれる。
【００２３】
本発明には、血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドと内皮細胞を接触させることによりin vitroでの血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害する方法、が含まれる。
【００２４】
本発明には、血管新生を阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドを対象者に投与することにより対象者の血管新生を阻害する方法、が含まれる。
【００２５】
本発明には、血管新生を阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドと細胞を接触させることによりin vitroでの血管新生を阻害する方法、が含まれる。
【００２６】
本発明には、腫瘍形成を阻害するのに有効な量の修飾ポリペプチドを対象者に投与することにより対象者の腫瘍形成を阻害するための方法、が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、単数形の用語は、１又は複数の変更された用語を意味する。従って、本発明の組成物には、１又は複数の修飾ポリペプチドが含まれる。
【００２８】
「アミノ酸」は、本明細書では、一般式：ＮＨ2−ＣＲＨ−ＣＯＯＨ（ここで、側鎖ＲはＨ又は有機基である）化合物を意味するように使用される。Ｒが有機基である場合、Ｒは変化することがあり、そして極性又は無極性（すなわち疎水性）のいずれかである。本発明のアミノ酸は、天然又は合成（しばしばノンプロテイノジェニック(nonproteinogenic)とも称される）であってもよい。本明細書で使用する場合、有機基は、脂肪族基、環式基又は脂肪族基と環式基の組み合わせとして分類される炭化水素基である。用語「脂肪族基」は、飽和又は不飽和直鎖又は分枝鎖炭化水素基を意味する。この用語は、アルキル、アルケニル、及びアルキル基等を包含するように使用される。用語「環式基」とは、脂環式基、芳香族基、又は複素環基として分類される閉環の炭化水素基を意味する。用語「脂環式基」は、脂肪族基の特性と類似の特性を有する環状炭化水素基を意味する。用語「芳香族基」は、単環式又は多環式の芳香族炭化水素基を意味する。本明細書で使用する場合、有機基は置換されても置換されなくてもよい。
【００２９】
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、交換可能に使用され、そしてアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、特定の長さのアミノ酸のポリマーを暗示していない。従って、例えば、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素という用語は、組換え技術を用いて、化学的又は酵素的合成で、あるいは天然のいずれで産生されていても、ポリペプチド又はペプチドの前記定義内に含まれる。
【００３０】
以下の略語は、本願を通じて使用される：
【表１】
2007512234.tif 000002
【００３１】
本発明の種々の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲及び添付図面を参照して直ちに明らかとなるであろう。明細書中数箇所、実施例のリストを通じて手引きを示す。それぞれの場合において、引用したリストは単に代表的なグループとしての役割を果たし、そして排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、脂肪酸抱合により修飾されたポリペプチドに関する。脂肪酸抱合により修飾されたこのようなポリペプチドは、本明細書では「修飾ポリペプチド」と称する。当該修飾ポリペプチドは、好ましくは「ペプチド−両親媒性物質」であり、そして、特にグラム陽性細菌に対する高い細菌活性、及び／又は高い内毒素中和を示す。本発明の修飾ポリペプチドはまた、内皮細胞の増殖を阻害し、血管新生因子媒介型の細胞内接着分子のダウンレギュレーションを阻害し、血管新生を阻害し、そして／あるいは腫瘍形成を阻害することもある。本発明の修飾ポリペプチドはまた、抗真菌活性及び／又は抗寄生虫活性を示すこともある。
【００３３】
本発明の修飾ポリペプチドは、様々な用途で使用することができ、これは治療、予防、又は診断上のものであってもよい。本明細書で使用する場合、症状又は対象を「処置する」には、治療的、予防的、そして診断的な処置が含まれる。例えば、本発明の修飾ポリペプチドは、細菌感染の処置、例えば抗生物質耐性細菌による感染の処置において特に有効なことがある。
【００３４】
本発明の修飾ポリペプチドはまた、種々の用途の抗菌剤として使用してもよい。例えば、本発明の１又は複数の修飾ポリペプチドは、抗菌性の添加物として働くように組成物に添加してもよい。あるいは、１又は複数の修飾ポリペプチドは、表面上に、例えば医療器具の表面上にコーティングすることでコーティングされた表面に抗菌活性を賦与することもできる。
【００３５】
ポリペプチド
本発明の修飾ポリペプチドには、１つの側面として、脂肪酸が抱合されるポリペプチドが含まれる。このポリペプチドは、ＷＯ０１／５３３３５、米国特許第２００２０１４６４０６、Mayo et al. , Biochem. J. 349,717-728 (2000)及びLockwood et al. , Biochem. J. 378,93-103 (2004)に既述のとおりである。要約すると本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドとしての側面は、主として正電荷のアミノ酸残基を有する一面と、主として疎水性のアミノ酸残基を有する反対面を有するポリペプチドであってもよく、ここで、これらの残基が表面活性ドメインを規定する。
【００３６】
ＷＯ０１／５３３３５は、表面活性ドメインの形状と構造についての詳細情報を提供している。本明細書で使用する場合、「表面活性ドメイン」とは、その形状の結果として、抗菌活性を示し、そして／あるいは１又は複数の症状、例えば本明細書に記載のものの処置にとって活性である一分子又は分子複合体の一領域を意味する。このような表面活性ドメインは、所望の機能を賦与するのに重要であると考えられるポリペプチドの部分である。従って、まさにこのドメインの構造的情報を、候補ポリペプチドを同定するために使用することができる。「構造配位」とは、ＮＭＲ分光学的実験から得られた核間距離を用いてのコンピューターモデリングに由来するデカルト座標を意味する。構造配位は、空間内に独特なポイント構成を生成する。注意すべきは、これらの配位が任意な１つのポリペプチドについての多数の構造の統計的に最良なフィットの代表を表していること、そして個々の構造配位における若干の変更が予想されうること、である。また、同様の構成又は同一の構成を、全体的に異なる配位のセットにより規定することもでき、但し、配位間の距離と角度は本質的に同一のままである。
【００３７】
通常、前記構造は両親媒性構造、例えばヘリックス（円筒と見なすことができる）又はベータシートであり、ここで、１つの面には、主として正電荷のアミノ酸残基が含まれ（好ましくは、１つの面は、主として正電荷のアミノ酸残基（すなわち、親水性アミノ酸残基）から構成される）、そして反対面には、疎水性アミノ酸残基が含まれる（好ましくは、反対面は、主として疎水性のアミノ酸残基から構成される）。表面活性ドメインは、正電荷アミノ酸残基と疎水性の反対面により同定される。
【００３８】
種々のコンピューター解析を使用して、化合物が所望とする三次元構造に十分類似するか否かを決定することができる。この様な解析は、当業界で知られているような、最新のソフトウェアアプリケーションで実施することができる。これには、三次元構造、疎水性、立体的嵩高さ、静電的特性、結合角、サイズ又は分子組成等の比較が含まれることがある。例えば、Quanta's Molecular Similarity package (Molecular Simulations Inc., Waltham, MA)は、異なる構造間、同一構造の異なる構成間、及び同一構造の異なる部分間の比較を可能にする。典型的に、解析される化合物の構造は、活性ポリペプチドの構造との最適なフィットを得るために平行移動又は回転される。
【００３９】
好ましい候補構造は、関連構造配位に重ね合わせた場合、２．０Å未満の保存残基原子の標準偏差（すなわち、平均の偏差の平方根の算術平均の平方根）を有する一組の構造配位を有するものである。更に好ましくは、当該標準偏差は１．０Å未満である。
【００４０】
態様によっては、本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドは、ベータシート構造を有することもある。例えば、本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドは、１又は複数の一連の設計された３３量体のペプチドであってもよく、これはβｐｅｐペプチドと称され、そして殺菌性であり、且つ細菌性内毒素リポ多糖（ＬＰＳ）を中和することができることが知られている。Mayo et al. , Biochim. Biophys. Acta 1425,81-92 (1998)を参照のこと。これらの新規なベータシート形成ペプチド３３量体は、基本的な折り畳み原理を採用し、そして抗血管新生タンパク質のベータシートドメイン由来の短い配列を組み込んだコンビネーションアプローチを用いることで設計した。
【００４１】
これらの設計されたペプチドのうちの１つである、アミノ酸配列ANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSLD（配列番号１９）を有するβｐｅｐ−２５ペプチドも、強力な抗血管新生活性を有する。Griffioen et al. , Biochem J. 354 (Pt 2): 233-42 (2001)を参照のこと。βｐｅｐ−２５はまた、サブディプロイド(sub-diploid)細胞のフローサイトメトリー検出、ＴＵＮＥＬ（ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラー ゼdUTPニック末端標識）解析及び細胞形態学が示すとおり、血管内皮細胞の増殖を阻害し、そしてこれらの細胞のアポトーシスを阻害する。βｐｅｐ−２５はまた、異なる細胞外マトリックス成分に対する内皮細胞の接着及び遊走を阻害する。in vitroでの血管新生の阻害は、出芽形成アッセイ及びin vivoでのニワトリ胚絨毛尿膜血管新生アッセイにおいて証明された。Griffioen et al. , Biochem J. 354 (Pt 2): 233-42 (2001)及びＷＯ０１／５３３３５を参照のこと。
【００４２】
本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドは、βｐｅｐ−２５ペプチドのアミノ酸配列を「ウォークスルー」する一連のドデカペプチドのうちの１つであってもよい。このようなドデカペプチドには、ＳＣ−１からＳＣ−８のドデカペプチドが含まれ、ＳＣ−１ドデカペプチドはアミノ酸配列ANIKLSVQMKLF（配列番号１）を有し；ＳＣ−２ドデカペプチドはアミノ酸配列KLSVQMKLFKRH（配列番号２）を有し；ＳＣ−３ドデカペプチドはアミノ酸配列VQMKLFKRHLKW（配列番号３）を有し；ＳＣ−４ドデカペプチドはアミノ酸配列KLFKRHLKWKII（配列番号４）を有し；ＳＣ−５ドデカペプチドはアミノ酸配列KRHLKWKIIVKL（配列番号５）を有し；ＳＣ−６ドデカペプチドはアミノ酸配列LKWKIIVKLNDG（配列番号６）を有し；ＳＣ−７ドデカペプチドはアミノ酸配列KIIVKLNDGREL（配列番号７）を有し；ＳＣ−８ドデカペプチドはアミノ酸配列VKLNDGRELSLD（配列番号８）を有する。Mayo et al. , Biochem J. 349 (Pt 3): 717-28 (2000)及びＷＯ０１／５３３３５を参照のこと。このように、本発明の態様によっては、修飾ポリペプチドのポリペプチドは、１又は複数の配列番号１〜８のドデカペプチドのアミノ酸配列を有してもよい。他の態様において、修飾ポリペプチドのポリペプチドは、βｐｅｐ−２５の以下の配列のうちの１又は複数を表すアミノ酸配列を有することがある；QMKLFKRHLKWK（配列番号９）、MKLFKRHLKWKI（配列番号１０）、及び／又はMKLFKRHLKWKIIV（配列番号１１）。
【００４３】
ＳＣ−１〜ＳＣ−８ドデカペプチドがグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌を殺し、そして内毒素を中和する能力は、Mayo et al. , Biochem J. 349 (Pt 3): 717-28 (2000)及びＷＯ０１／５３３３５において報告されている。全てのＳＣペプチドについての円二色性のデータは、αヘリックス、３10ヘリックスの両方の存在を強力に示している。３０％トリフルオロエタノールの存在下でＳＣペプチドで獲得したＮＯＥＳＹデータも、αヘリックス、３10ヘリックスの両方のＮＯＥ特性を示している。大部分が３10ヘリックス様の、ドデカペプチドであるＳＣ−４ドデカペプチドの場合、ＮＯＥベースのコンピューターモデリングは、一面に４個の正電荷アミノ酸残基が含まれ、そして反対面に疎水性アミノ酸残基が含まれている両親媒性の３10ヘリックス構造をもたらした。具体的には、正電荷アミノ酸残基であるＫ１、Ｋ４、Ｒ５、Ｋ８及びＫ１０がヘリックスの一面に五角形に配置される。更に具体的には、ＳＣ−４の場合、表面活性ドメインには、ＷＯ０１／５３３３５で提示されているとおり、アミノ酸残基であるＫ１、Ｋ４、Ｒ５、及びＫ８の原子の構造配位が含まれる。
【００４４】
態様によっては、修飾ポリペプチドのポリペプチドは、ＳＣ−４ドデカペプチドのアミノ酸配列KLFKRHLKWKII（配列番号４）を有することがある。ＳＣ−４ドデカペプチドは、強力な抗菌剤として同定されている。ＳＣ−４ドデカペプチドは、グラム陰性細菌に対してはナノモル濃度で、そしてグラム陽性細菌に対してはマイクロモル濃度未満で殺菌活性を示す。ＳＣ−４ドデカペプチドはまた、リポ多糖の内毒素を効果的に中和し、そして１００μＭ未満では溶血活性を示さない。ＳＣ−４は、膜模倣トリフルオロエタノール／水の溶液中で両親媒性のヘリックスとしてフォールディングし、そして膜浸透機構を通じて殺菌効果を発揮するようである。直鎖ペプチドのヘリックス形成カテゴリー内の他の既知の殺菌ペプチドと比較して、ＳＣ−４は、これまで同定されているなかで最も強力で広範なスペクトルの殺菌剤であると思われる。Mayo et al. , Biochem J. 349 (Pt 3): 717-28 (2000)及びＷＯ０１／５３３３５を参照のこと。
【００４５】
本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドは、既に研究されているＳＣ−４の一残基置換変異体のうちの１つであってもよい（Mayo et al. , Biochem J. 349 (Pt 3): 717-28 (2000)及びＷＯ０１／５３３３５）。そのような変異体には、ＳＣ−４のリジン／アルギニン置換ノルロイシン変異体を含んでもよく、これは、例えばＳＳＣ−４のＫ１、Ｋ４及び／又はＲ５位置の１又は複数についてイソロイシンで置換されている。例えば、態様によっては、ポリペプチドは、XLFKRHLKWKII（配列番号１２）；KLFXRHLKWKII（配列番号１３）；KLFKRHLXWKII （配列番号１４）；KLFKRHLKWXII（配列番号１５）；KLFKKHLKWKII（配列番号１６）又はKLFKHLKWKII（配列番号１７）（ここで、Ｘは天然又は合成のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を有してもよい。好ましくは、Ｘはノルロイシンである。
【００４６】
本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドは、配列番号１〜１７から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそれらの活性アナログであってもよく、ここで、Ｘはアミノ酸である。態様によって、Ｘはノルロイシンであってもよい。本発明の修飾ポリペプチドのポリペプチドは、配列番号１〜８から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそれらの活性アナログであってもよい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「それらの活性アナログ」には、１個，２個，３個又はそれ以上連続している又は連続していないアミノ酸残基の欠失、１個，２個，３個又はそれ以上連続している又は連続していないアミノ酸残基の付加、及び／又は１個，２個，３個又はそれ以上連続している又は連続していないアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置換が含まれる。本発明のポリペプチドのアミノ酸の置換は、好ましくは保存的置換であり、これは、そのアミノ酸が属するクラスのほかのメンバーから選択される。例えば、タンパク質生化学業界で周知であるように、特定のサイズ又は特徴（例えば、電荷、疎水性及び親水性）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を、通常、別のアミノ酸の代わりに、ポリペプチドの構造を実質的に変化させることなく置換することができる。
【００４８】
本発明のために、保存的アミノ酸置換は、以下の残基のクラスのうちの１つの中からのアミノ酸残基の交換に起因すると定義される：クラスＩ：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＰｒｏ（小さい両親媒性の側鎖及びヒドロキシル基側鎖を表す）；クラスＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒ（−ＯＨ又は−ＳＨ基を含む側鎖を表す）；クラスＩＩＩ：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ（カルボキシル基を含む側鎖）；クラスＩＶ：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ（塩基性の側鎖を表す）；クラスＶ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、及びＭｅｔ（疎水性の側鎖を表す）；並びにクラスＶＩ：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＨｉｓ（芳香族の側鎖を表す）。これらのクラスにはまた、関連アミノ酸、例えば３Ｈｙｐ及び４ＨｙｐがクラスＩに；ホモシステインがクラスＩＩに；２−アミノアジピン酸、β−カルボキシグルタミン酸、β−カルボキシアスパラギン酸、及び相当のアミノ酸アミドがクラスＩＩＩに；オルニチン、ホモアルギニン、Ｎ−メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ、ホモアルギニン、サルコシン及びヒドロキシリジンがクラスＩＶに；置換フェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−アミノオクタン酸、２−アミノヘプタン酸、スタチン及びβ−バリンがクラスＶに；そしてナフチルアラニン、置換フェニルアラニン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、及びハロゲン化チロシンがクラスＶＩに含まれる。
【００４９】
それらのアナログには、本明細書で使用する場合、１又は複数の構成アミノ酸において１又は複数の化学的及び／又は酵素的誘導体化、例えば側鎖の修飾、主鎖の修飾、そしてＮ−及びＣ末端の修飾、例えばアセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び炭水化物又は脂質（部分、補因子等）の付着が含まれるように修飾されたポリペプチドが含まれる。アナログはまた、ペプチドミメティクス（例えば、ペプチドの主鎖が１又は複数のベンゾジアゼピン分子で置換されているペプチド性の化合物、そして、１又は複数のＬ−アミノ酸が相当のＤ−アミノ酸で置換されているポリペプチド）が含まれる。好ましいアナログは、本明細書に記載の生体活性のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする。そのようなアナログは、本明細書では「生体活性アナログ」又は単純に「活性アナログ」と称される。
【００５０】
本発明の修飾ポリペプチドは、長さが変化しうる。例えば、態様によっては、ポリペプチドは約３３アミノ酸長であってもよい。態様によっては、ポリペプチドは約８〜約３３アミノ酸長、約１０〜約２５アミノ酸長、約１０〜約１４アミノ酸長又は約１２〜約１４アミノ酸長であってもよい。態様によっては、ポリペプチドは最大１４アミノ酸残基、最大１２アミノ酸残基、最大１０アミノ酸残基を有することもある。ポリペプチドは、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、又は１６アミノ酸長であってもよい。好ましい態様において、ポリペプチドは１２アミノ酸残基を有するドデカマーである。
【００５１】
前記ポリペプチドは、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）又は９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＯＭＣ）保護基のいずれかをベースとする標準的な方法を用いた固相法により特徴付けられることがある。この方法は、G. B. Fieldsらにより"Synthetic Peptides: A User's Guide," W.M. Freeman & Company, New York, NY, pp. 77-183 (1992)において説明されている。ポリペプチドはまた、当業者に周知の組換え技術を介して合成されうる。例えば、米国特許第５，５９５，８８７号は、結合タンパク質及び１又は複数の所望の標的ペプチドのコピーを含む融合タンパク質をコードする組換え遺伝子コンストラクトの発現を介した種々の比較的小さいペプチドを形成する方法を説明している。発現後、融合タンパク質は単離され、そして化学的及び／又は酵素的方法を用いて開裂され、所望の標的ペプチドが生成する。
【００５２】
アシル化
本発明の修飾ポリペプチドは、脂肪酸抱合により修飾されているポリペプチドである。このような修飾ポリペプチドはまた、本明細書ではペプチド−両親媒性物質、アシル化ポリペプチド、アシルペプチド抱合体、リポペプチド、脂質化ペプチド、又はリポペプチド抱合体とも称されることがある。
【００５３】
抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、又は細胞溶解活性を有する天然のリポペプチドが指摘されているが（Arima et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 31,488-494 (1968); Bernheimer et al. , J. Gen. Microbiol. 61, 361-369 (1970); Muhlradt et al. , J. Exp. Med. 185,1951-1958 (1997); 及びVollenbroich et al. , Biologicals 25,289-297 (1997)）、そのような天然のリポペプチドは、本発明の修飾ポリペプチドと、それらの以上に短い長さ（通常は約６〜７アミノ酸長）、環化（De Lucca et al. , Antimicrob. Agents Chemother. 43,1-11 (1999)）、負電荷、及び主として疎水性で且つ酸性のアミノ酸という組成の点で異なる。
【００５４】
本明細書では脂肪酸残基によるアシル化、脂肪酸アシル化、又は親油性酸による抱合とも称される脂肪酸抱合によるポリペプチドの修飾は、共有結合による。このような修飾は、当業者にとって利用可能な多数の方法のうちのいずれでもよい。例えば、脂肪酸抱合は、実施例１に記載のとおり、手作業でのＦｍｏｃ固相化学を用いる樹脂結合ペプチド上で、本質的にBerndt et al. , J. Am. Chem. Soc. 117, 9515-9522 (1995)に記載のとおり実施することができる。脂肪酸抱合はまた、カテプシンＧペプチド（Shafer et al. , J. Biol. Chem. 266,112-116(1991)及びMak et al., Int. J. Antimicrob. Agents 21,13-19 (2003)）、ラクトフェリンペプチド（Wakabayashi et al. , Antimicrob. Agents Chemother. 43,1267-1269 (1999)及びMajerle et al. , J. Antimicrob. Chemother. 51,1159-1165 (2003)）、マゲイニンペプチド（Avrahami and Shai, Biochemistry 41,2254-2263 (2002)）の脂肪酸抱合体を生成するために使用される方法を用いて実施することもできる。
【００５５】
本発明の修飾ポリペプチドにおいて、脂肪酸抱合体は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端に、そして／あるいは当該ポリペプチドの配列内部に配置されうる。好ましくは、そのような修飾は、ポリペプチドに対し、Ｎ末端及び／又はＣ末端で結合されることがあり、更に好ましくはＮ末端で結合されることがある。
【００５６】
本発明の修飾ポリペプチドには、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖脂肪族基を含むように修飾されているポリペプチドが含まれる。態様によっては、直鎖又は分枝鎖脂肪族（好ましくはアルキル）基は、約８〜約２２の炭素原子を有することがある。態様によっては、脂肪族基は、約１０〜約２０の炭素原子を有することがある。態様によっては、脂肪族基は約１２〜約１８の炭素原子を有することがある。態様によっては、直鎖又は分枝鎖脂肪族基は、２２超の炭素原子を有することがある。直鎖又は分枝鎖脂肪族基には、１又は複数の不飽和炭素間結合が含まれることがある。これらは、二重又は三重の炭素間結合であってもよいが、典型的には、それらが存在する場合には、それらは二重結合である。存在している場合、典型的には１又は２つの不飽和炭素間結合が存在する。
【００５７】
直鎖又は分枝鎖脂肪族基は、脂肪酸に由来することがある。脂肪酸を使用してポリペプチドを修飾する場合、修飾される炭素原子のうちの１つは脂肪酸のカルボニル炭素に由来するであろう。脂肪酸以外の脂肪族基又はアルキル基を使用してポリペプチドを修飾する場合、炭素原子数は、脂肪酸由来のカルボニル炭素原子の寄与が無いので、１つ少ないであろう。脂肪酸には、動物又は植物の脂肪又は油に由来する又は含まれるカルボン酸が含まれる。脂肪酸は、４〜２２の炭素原子（通常偶数）を含む炭化水素鎖から構成され、そして末端のカルボキシル基−ＣＯＯＨを特徴とする。例えば、８〜２２炭素原子を有する脂肪酸（Ｃ８〜Ｃ２２）は、本発明の修飾ポリペプチドに使用することもできる。好ましくは、Ｃ１０〜Ｃ２０の脂肪酸を使用してもよい。上記酢酸の一般式は、ＣＨ3（ＣＨ2）xＣＯＯＨである（炭素原子数にはカルボキシル基が含まれる）。脂肪酸は飽和であっても不飽和（すなわちオレフィン）であってもよく、そして固体、半固体、又は液体のいずれでもよい。それらは石鹸及び蝋と一緒に脂質に分類される。飽和脂肪酸は、アルキル鎖の炭素原子が単結合で繋がっている脂肪酸である。一般的な飽和脂肪酸には、酪酸（Ｃ4）、ラウリン酸（Ｃ12）、パルミチン酸（Ｃ18）、及びステアリン酸（Ｃ18）がある。不飽和脂肪酸は、鎖の中の炭素原子間に１又は複数の二重結合又は三重結合が存在する脂肪酸である。これらの酸は、通常植物由来であり、そして特徴的な末端基である−ＣＯＯＨを有する１８以上の炭素原子を含む炭素鎖から成る。
【００５８】
態様によっては、脂肪族基には、１又は複数の不飽和炭素間結合が含まれる。態様によっては、直鎖又は分枝鎖脂肪族基は、脂肪酸由来のアルキル基である。脂肪酸は、Ｃ８−Ｃ２２脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、Ｃ１０−Ｃ２０脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、直鎖又は分枝鎖アルキル基が少なくとも１１個の炭素原子を有し、そして直鎖又は分枝鎖アルキル基が１１〜１９個の炭素原子を有するＣ１０−Ｃ２０脂肪酸であってもよい。
【００５９】
抗菌活性
本発明の修飾ポリペプチドは抗菌活性を示す。殺菌活性は、様々な細菌、例えばグラム陰性細菌又はグラム陽性細菌に対して評価することができる。細菌の型は、シュードモナス種(Pseudonionas spp,)、例えばＰ．アエルギノサ(P.aeruginosa)及びＰ．セパシア(P. cepacia)、Ｅ．コリ(E. coli) 株、例えばＥ．コリＢ、サルモネラ(SalnaoJella)、プロテウス・ミラビリス(Proteus nzirabilis)及びスタフィロコッカス株、例えばスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)を含んでもよい。本発明の修飾ポリペプチドは、臨床的に関連する薬物耐性細菌株に対する抗菌活性を示すことがある。
【００６０】
本発明の修飾ポリペプチドは、培養細胞に添加することもでき、あるいは対象、例えば哺乳類の対象、例えばヒトの対象を処置するために使用することもできる。修飾ポリペプチドを使用して対象を処置する場合、当該修飾ポリペプチドは、医薬として許容される担体及び／又は医薬として許容される緩衝液と一緒になった組成物の状態でもよい。処置とは予防的又は治療的であってもよい。従って、処置は、処置される症状、例えば細菌感染及び／又は内毒素血症の発症の前、その間、又はその後に開始することができる。このように、症状、例えば細菌感染及び／又は内毒素血症の「阻害」又はそれを「阻害するのに有効」との語句は、例えば、予防的と治療的両方の処置を含む（すなわち、症状の予防及び／又は回復）。
【００６１】
本発明は、対象の細菌感染を処置する方法であって、対象に本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを、細菌感染を阻害するのに有効な量投与することによる方法を提供する。本発明はまた、細菌感染をin vitroで阻害する方法であって、細胞を本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを、細菌感染を阻害し、細菌細胞の増殖を阻害し、そして／あるいは殺菌活性を示すのに有効な量投与することによる方法を提供する。
【００６２】
細菌感染を処置するためのポリペプチドの有効量は、細菌感染、感染の位置及びそのペプチドに左右される。細菌感染を処置するためのペプチドの有効量は、動物における細菌数を減少させ、且つ細菌感染に関連する症候、例えば発熱、疼痛及び細菌感染の関連の症候を軽減する量である。ペプチドの有効量は、in vitroの標準的な用量応答方法により決定することができ、少なくとも５０から少なくとも１００％の細菌を殺すのに有効な量（ＬＤ50）、そしてより好ましくは約６０％から約１００％の細菌を殺すのに有効な量がが有効量と考えられる。好ましくは、当該ペプチドは、有効量が約１ｘ１０-4Ｍ〜約１ｘ１０-10Ｍ、そしてより好ましくは約１ｘ１０-7Ｍ〜約１ｘ１０-9Ｍの濃度である。殺菌性があると考えられるペプチドは、Ｐ．アエルギノサ(P.aeruginosa)、Ｐ．セパシア(P. cepacia)、Ｅ．コリＢ、サルモネラ(SalnaoJella)、プロテウス・ミラビリス(Proteus nzirabilis)及びスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の群から選択される少なくとも１つの生物を、約１０-10Ｍ以上の濃度で生理学的条件（例えば約ｐＨ７．４）のもと殺しうる。
【００６３】
あるいは、細菌感染を処置するための修飾ポリペプチドの有効量は、動物系、例えばマウスで決定することができる。急性腹膜炎は、Dunnら(Surgery, 98 :283, 1985)又はCodyら(Int. Surg. Res. , 52: 315,1992)によって説明されているように、マウス、例えば非近交系スイスウェブスターマウスにおいて、細菌、例えばＰ．アエルギノサを用いた腹腔内注射により誘導することができる。異なる量のペプチドを、細菌注射の１時間前に静脈内注射することができる。血液、脾臓、及び肝臓内の生菌の割合は、前記ペプチド又は他の抗生物質の存在下又は不在下で決定することができる。本発明を限定することを意味するものではないが、殺菌性ペプチドは他の抗生物質、例えばエリスロマイシン等の有効性を強化することができると考えられる。
【００６４】
in vivoとin vitro両方の方法において、細菌感染の「阻害」には、対象又は細胞性試料中の細菌の増殖の予防、並びに逆転又は軽減が含まれる。細菌感染レベルは、例えば実施例の項目に記載の殺菌アッセイに従い決定することができる。これらのアッセイを使用して、in vivo又はin vitroでの使用に関係なく、ポリペプチドの有効性を決定することができる。細菌に感染している患者の処置の有効性を決定するために、実施例の項目に記載の殺菌アッセイに従い、血液試料を採取し、培養を展開し、そして生菌の量を決定することができる。
【００６５】
殺菌活性を有する１又は複数の修飾ポリペプチドは、細菌感染を処置することが知られ、そしてそのために使用される他の物質と組み合わせることができる。
【００６６】
本発明の修飾ポリペプチドはまた、内毒素中和活性も示し、そして内毒素血症を処置するために使用されることがある。本発明は、対象の内毒素血症を処置する方法を提供する。これには、対象に対し、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを、内毒素を中和するのに有効な量投与することを包含する。本発明はまた、細胞を本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドと接触させることによりin vitroで内毒素を中和するための方法を提供する。
【００６７】
内毒素血症は、典型的には、グラム陰性細菌、例えばシュードモナス種、Ｅ．コリのラフ株(rough strain)、被包性Ｅ．コリ及びスムース株(smooth strain)のＥ．コリに由来する毒性ＬＰＳにより生じるが、グラム陽性細菌、場合によっては真菌によって引き起こされることもある。内毒素血症を引き起こしうるグラム陽性細菌により放出される成分には、ペプチドグリカン及びリポテイコ酸が含まれ、リポアラビノマンナンはマイコバクテリウム種の細胞壁由来である。グラム陰性細菌に全身的に感染した動物は、内毒素ショック(endotoxin shock)（内毒素性ショック(endotoxic shock)、敗血症ショック、循環性ショック、及び敗血症とも称される）、例えば発熱、ショック、及びＴＮＦ−α放出の症候を示す。
【００６８】
毒性ＬＰＳ含有複合体による細胞の活性化は、細胞由来の炎症誘発性のメディエーターであって、サイトカイン（例えばインターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８、及び腫瘍壊死因子α）、血小板活性化因子、一酸化窒素、補体（例えば、Ｃ５ａ及びＣ３ａ）、プロスタグランジン、ロイコトリエン、キニン系、酸素代謝物、カテコールアミン及びエンドルフィンを含むことがあるもの合成、放出、又は活性化をもたらす。このメディエーターは、器官系、例えば心臓、血管系、凝結系、肺、肝臓、腎臓及び中枢神経系に衝撃を与えることがある。
【００６９】
内毒素中和活性は、修飾ポリペプチドが完全にリムルス・アモエボサイト（Limulus. amoebocyte）ライゼートアッセイ（LAL, Sigma Chemicals, St. Louis, MO）又は発色ＬＡＬ１０００テスト（Biowhittacker, Walkersville, MD）のようなアッセイにおいてリポ多糖の作用を阻害するモル濃度を決定することで測定することができる。内毒素中和活性はまた、阻害量(inhibitory dose)５０（ＬＤ50）を、標準的な用量応答法を用いて算出することで決定することができる。阻害量５０は、内毒素の活性を５０％阻害することが出来るペプチドの量である。ペプチドは、好ましくは約１ｘ１０-4Ｍ〜約１０-8Ｍ、更に好ましくは約１０-5Ｍ〜約１０-6Ｍのモル濃度で内毒素を中和した。内毒素中和活性を持たないと考えられるペプチドは、約１０-4以下のモル濃度で内毒素を中和しない。
【００７０】
in vivo及びin vitro両方の方法において、内毒素の「中和」には、ＬＰＳに結合し、そしてそれによりこれを対象又は細胞試料の系から除去することが含まれる。内毒素のレベルは、例えば、実施例の項目に記載のＬＰＳ中和アッセイに従い決定することができる。これらのアッセイを使用することで、in vivo又はin vitroでの使用に関係なく、ポリペプチドの有効性を決定することができる。内毒素血症を有する対象の処置の有効性を決定するために、血液試料を採取し、培養を展開し、そしてサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１）の量を決定することができ、これには当業者に知られている方法を用いる。例えば、ＷＥＨＩアッセイを使用してＴＮＦ−αを検出することができる（Battafarano etal., Surgery 118,318-324(1995)）。
【００７１】
内毒素を中和することができる１又は複数の修飾ポリペプチドは、内毒素ショックを処置することが知られ、且つそのために使用されている他の物質と組み合わせることができる。研究により、サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の血清中濃度が内毒素血症の開始後に増大し、血清ＴＮＦ活性は異常な痛み及び発熱のような徴候の開始と直接関連していることが示された。従って、内毒素活性はまた、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）がマクロファージ細胞系から放出される量を決定することにより、あるいは動物のショックの症候を評価することにより測定することができる。ＴＮＦ−αの産生は、Mossman等により説明されているようにアッセイすることができる（Immunological Methods 65: 55, 1983）。
【００７２】
本発明の修飾ポリペプチドは、対象のＴＮＦα量を低下させるための方法で使用することができる。これには、ＴＦＮαの血清レベルを評価することで決定される対象の系におけるＴＮＦα量を低下させるための量の、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを対象に投与することを包含する。更に、本発明は、in vitroでＴＮＦαの量を低下させるための方法であって、細胞と、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドとを、細胞培養中のＴＮＦα量を低下させるのに有効な量で接触させ、そして／あるいはインキュベートすることによる方法を提供する。in vivo、in vitroいずれの方法においても、ＷＥＨＩアッセイは、細胞培養中又は患者由来の血清中のＴＮＦαの検出のために使用することができる（Battafarano et al. , Surgery 118,318-324 (1995)）。あるいは、試料中のＴＮＦα量は、抗ＴＮＦα抗体を用いてアッセイすることができる。ＴＮＦαを低下させるのに「活性な」修飾ポリペプチドは、in vitro試験を用いて評価することができ、そして、好ましくはＴＮＦα量の少なくとも１０％の低下を示す。
【００７３】
本発明の修飾ポリペプチドは抗真菌活性を示すことがあり、そして真菌感染症を処置するために使用してもよい。本発明は、対象の真菌感染症を処置する方法を提供する。これは、真菌の増殖を阻害するのに有効な量、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを対象に投与することを包含する。更に、本発明は、in vitroで真菌の増殖を阻害するための方法であって、細胞と、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドとを、真菌細胞の増殖を阻害するのに有効な量で接触させることによる方法を提供する。修飾ポリペプチドの抗真菌活性は、例えば、Cavallarin et al., Mol Plant Microbe Interact. 11 (3), 218-27 (1998)に記載の通りアッセイすることができる。
【００７４】
本発明の修飾ポリペプチドは抗寄生虫活性を示すことがあり、そして寄生虫感染症を処置するために使用してもよい。本発明は、対象の寄生虫感染症を処置する方法を提供する。これは、寄生虫活性を阻害するのに有効な量の、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを対象に投与することを包含する。更に、本発明は、in vitroで寄生虫活性を阻害するための方法であって、寄生虫及び／又は寄生虫に感染した細胞と、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドとを、寄生虫の代謝、増殖、及び／又は複製を阻害するのに有効な量で接触させることによる方法を提供する。修飾ポリペプチドの抗寄生虫活性は、例えば、Chicarro et al. , Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2441-9 (2001)に記載の通りアッセイすることができる。
【００７５】
血管新生は、正常な過程、例えば胚形成及び創傷治癒から、異常な過程、例えば腫瘍増殖関節炎、再狭窄及び糖尿病性網膜症まで、体内の多数の生物学的機能にとって必須であり、そしてin vitro、in vivoで血管新生を阻害する物質を使用することは、特に腫瘍の処置において、有効な治療的モダリティーであろう。更なる仮定として、腫瘍増殖は、血管化の喪失により制御することができる（Folkman J. natl. Cancer. Inst. 82,4-6 (1990); Folkman et al. , J. Biol. Chem. 267,10931-10934 (1992)）。益々多くの血管新生の内因性阻害剤、例えば、血小板因子−４（ＰＦ４）、インターフェロン−γ誘導タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、アンギオスタチン、並びに合成物質、例えばサリドマイド、ＴＮＰ−４７０、及びメタロプロテイナーゼ阻害剤が説明されてきている。これらの物質の幾つかは、現在フェーズＩ／ＩＩの臨床試験において試験されている。Griffioen et al. , Blood 88,667-673 (1996)、及びGriffioen et al. , Cancer Res. 56,1111-1117 (1996)に記載のこれまでの研究では、腫瘍の血管新生誘導(proangiogenic)因子が腫瘍の脈管構造において内皮細胞に対する接着分子のダウンレギュレーションを誘導し、そして炎症シグナル、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１、及びインターフェロン−ファンγに対するアネルギーを誘導することが示されている。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）(Griffioen et al., Blood 88,667-673 (1996))及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ） (Griffioen et al., Blood 88,667-673 (1996); 及びMelder et al., Nature Med. 2,992-997 (1996))に曝露されたＥＣは、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）のアップレギュレーション並びに血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）及びＥ−セレクチンの誘導を激しく妨害した。この現象は、腫瘍誘導型ＥＣアネルギーと称されており、血管新生の表現型を有する腫瘍が細胞障害性の白血球による炎症を回避しうる１つの方法である。
【００７６】
内皮細胞接着分子（ＥＡＭ）の血管新生媒介型のダウンレギュレーションは、免疫反応を回避することで腫瘍の成長を促進しうるので（Griffioen et al., Blood 88,667-673 (1996); Kitayama et al., Cancer. Res. 54 4729-4733 (1994); 及びPiali et al. , J. exp. Med. 181, 811-816 (1995)）、血管新生の阻害が接着分子のダウンレギュレーション及び炎症シグナルの無応答性を克服しうると考えられる。この仮説の裏づけにおいて、Ｅ−セレクチンのアップレギュレーションと血管新生抑制(angiostatic)物質であるＡＧＭ−１４７０との関係が報告されている(Budson et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 225,141-145 (1996))。また、ＰＦ４による血管新生の阻害は、ｂＦＧＦに刺激されたＥＣ上のＩＣＡＭ−１をアップレギュレートする。尚、ＰＦ４による血管新生の阻害は、炎症シグナルに対する血管新生関連のＥＣアネルギーを克服する。
【００７７】
本発明は、対象の内皮細胞増殖を阻害する方法であって、細胞と、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドとを、内皮細胞の増殖を阻害するのに有効な量で接触させることによる方法を提供する。本発明はまた、in vitrで内皮細胞増殖を阻害するための方法であって、内皮細胞の増殖を防ぎ、そして／あるいは軽減するのに有効な量で接触させることによる方法を提供する。内皮細胞の増殖を決定する場合、当業者に知られている方法を使用することができる。例えば、腫瘍における内皮細胞増殖の評価のために、組織切片を適切に染色することで血管密度を定量することができる。in vitroでの内皮細胞増殖の程度を決定するために、ＥＣ増殖アッセイを使用することができ、これは、細胞培養中の細胞によるトリチウム標識したチミジンの取り込みを包含する。内皮細胞の増殖を阻害するのに活性なポリペプチドは、好ましくは、１０-4Ｍ未満の濃度で内皮細胞の増殖を少なくとも１０％低下させるものである。
【００７８】
本発明はまた、対象の血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害する方法であって、ＩＣＡＭの発現のダウンレギュレーションを防ぎ、そして／あるいはその程度を軽減するのに有効な量の、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを対象に投与することによる方法を提供する。本発明はまた、in vitroでの血管新生因子媒介型細胞接着分子の発現のダウンレギュレーションを阻害する方法であって、ＩＣＡＭの発現のダウンレギュレーションを防ぎ、そして／あるいはその程度を軽減するのに有効な量の、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを、細胞と接触させることによる方法を提供する。
【００７９】
本発明は、対象の血管新生を阻害する方法であって、血管新生を予防し、そして／あるいは軽減するのに有効な量の本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを対象に投与することによる方法を提供する。本発明はまた、in vitroでの血管新生を阻害する方法であって、血管新生を予防し、そして／あるいは軽減するのに有効な量の、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを、細胞と接触させることによる方法を提供し、ここでは、組成物も含まれる。in vivoでの血管新生の程度を決定する場合、当業者に知られている種々の方法を使用することができる。例えば、組織切片を適切に染色することで血管密度を定量することができる。in vitroでの血管新生の程度を決定する場合、in vitro血管新生アッセイを使用することができ、これは、細胞培養におけるＥＣ細胞出芽の消失を包含する。血管新生を阻害するのに「活性」なポリペプチドは、好ましくは、１０-4Ｍ未満の濃度で内皮細胞の発芽を少なくとも１０％低下させるものである。
【００８０】
本発明は、対象の腫瘍形成を阻害するための方法であって、腫瘍の増殖を防ぎ、そして／あるいは軽減するのに有効な量の、本明細書に記載の１又は複数の修飾ポリペプチドを対象に投与することによる方法を提供する。腫瘍形成の阻害を決定する方法は当業者にとって周知であり、これには腫瘍の収縮、生存等の評価が含まれる。
【００８１】
本発明の方法には、対象、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに対し、所望な効果を生み出すのに有効な量の本発明の組成物を投与することが含まれる。修飾ポリペプチドは、単回量として、又は複数回投与で投与することができる。活性物質の有用な投与量は、それらのin vitroでの活性と、動物モデルにおけるin vivoでの活性とを比較することで決定することができる。マウス、その他の動物の有効量をヒトに外挿する方法は当業界で知られており、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照のこと。
【００８２】
本発明の修飾ポリペプチドは、医薬組成物に製剤化することができ、そして、本発明の方法に従い、対象に対し、選択した投与経路に適した種々の形態で投与することができる。製剤は、便宜的に単位剤形で存在することができ、そして医薬業界で周知な任意の方法により調製することができる。製剤には、限定しないが、経口、経腸、経膣、局所、経鼻、経眼、又は非経口（例えば皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、及び血管内）投与が含まれる。
【００８３】
非経口投与に適した製剤は、活性物質の滅菌水性調製物、又は活性物質の滅菌粉末の分散物を便宜的に含み、これらはレシピエントの血液と好ましくは等張性である。液体調製物に含まれ得る等張性物質には、糖類、緩衝物質、及び塩化ナトリウムが含まれる。活性物質溶液は水中で調製することができ、任意に非毒性の界面活性剤と混合することができる。活性物質の分散物は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、グリセロールエステル、及びそれらの混合物中で調製することができる。究極的な剤形は、滅菌で、液体で、且つ製造条件と保存条件のもとで安定なものである。必要とされる流動性は、例えば、リポソームを用いることにより、分散物の場合には適切な粒径を採用することにより、又は界面活性剤を用いることにより達成することができる。液体調製物の滅菌は、活性物質の生体活性を保存する任意な常用の方法により、好ましくは濾過滅菌により達成することができる。粉末を調製するのに好ましい方法には、滅菌注射溶液の真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。その後の微生物のコンタミネーションは、種々の抗微生物剤、例えば抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤を用いて予防することができ、これらにはパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等が含まれる。長期間にわたる活性物質の吸収は、遅延のための物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより達成することができる。
【００８４】
経口投与に適した本発明の製剤は、個別の単位、例えば錠剤、トローチ、カプセル、ロゼンジ (lozenge)、ウェハー、又はカシェとして提供することができ、それぞれ、規定量の活性物質を、粉末又は顆粒として、化学予防物質を含むリポソームとして、あるいは水溶液又は非水溶液、例えばシロップ、エリキシル、エマルジョン、又はドラフト(draught)の溶液又は懸濁液として含む。このような組成物及び調製物は、典型的に少なくとも約０．１重量％の活性物質を含む。ポリペプチド（すなわち活性物質）の量は、投与レベルが対象において所望の結果をもたらすのに有効であろうものである。
【００８５】
点鼻製剤は、活性物質と防腐剤及び等張性物質の精製水溶液を含む。このような製剤は、好ましくは鼻粘膜に適合するｐＨ及び等張性状態に調節される。経腸又は経膣投与のための製剤は、適当な担体、例えばココアバター、又は硬化脂肪若しくは硬化脂肪カルボン酸を有する座薬として提供することができる。点眼用製剤は、点鼻薬と類似の方法により調製され、但し、ｐＨと等張性因子は好ましくは眼のものに適合するよう調節される。局所製剤は、１又は複数の媒体、例えば鉱油、石油、ポリヒドロキシアルコール、又は局所用医薬製剤に使用される他の基材中に溶解し、又は懸濁した活性物質を含む。
【００８６】
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等はまた、１又は複数の以下の結合剤、例えばトラガカントガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム；及び天然又は人工の香味剤を含むことがある。単位剤形がカプセルである場合、これは更に液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールを含んでもよい。種々の他の材料も、コーティングとして、あるいは場合によって固体の単位剤形の物理的形態を修飾するために存在することもある。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルをゼラチン、ワックス、シェラック、糖などでコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシルも１又は複数の甘味剤、防腐剤、例えばメチルパラベン、又はプロピルパラベン、糖の結晶化を遅らせるための物質、任意な他の成分の溶解性を増大させるための物質、例えば多価アルコール、例えばグリセロール又はソルビトール、色素、及び香味剤を含んでもよい。任意な単位剤形を調製するのに使用する材料は、採用する量で実質的に非毒性のものである。活性物質は、徐放の調製物及び装置内に組み入れることができる。
【００８７】
本発明を以下の実施例で例示する。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従い広く解釈されるべきであると理解されたい。
【実施例】
【００８８】
実施例１
ＳＣ４ドデカペプチドのアシル化(actylation)によるグラム陽性で且つ薬物耐性の細菌に対しての殺菌能の増大
ドデシル脂肪酸及びオクタデシル脂肪酸を、アミノ酸配列KLFKRHLKWKII（配列番号４）を有する１２量体の潜在的に殺菌性のヘリックス形成ペプチドであるＳＣ４のＮ末端に抱合させ、そして生じたＳＣ４「ペプチド−両親媒性物質」分子の殺菌活性を試験した。ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質は、グラム陽性菌種であるＳ．アウレウス、Ｓ．パイオジェネス(S. pyogenes)、Ｂ．アンスラシス(anthracis)、例えば常用の抗生物質に対して耐性のあるＳ．アウレウス菌種に対して最大三倍の殺菌活性の増大を示したが、グラム陰性細菌であるＥ．コリ及びＰ．アエルギノサ(P. aeruginosa)に対しては殆んど又は全く増大を示さなかった。脂肪酸抱合により、内毒素（リポ多糖）の中和は３〜６倍向上した。アシル化はややヒト赤血球の溶解を増大させたが、内皮細胞の溶解は増大させず、そして溶血作用は、細菌細胞に要求されるものよりも１０〜１００倍高い濃度で生じた。ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の作用機構に対する洞察のために、円二色、ＮＭＲ及び蛍光分光法による研究を、ミセルとリポソームのモデルにおいて、真核細胞膜及び細菌細胞膜を用いずに行った。円二色法は、ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質が細菌細胞膜を模倣しているリポソームにおいて最も強いヘリックスの傾向を有していること、そしてＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の強固な膜の統合がこれらの条件下でトリプトファン蛍光分光法により観察されたことを示し；これは、ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の殺菌活性の増大と一致していた。ミセルのＮＭＲ構造解析は、脂肪酸の尾に最も近いペプチドの２／３がヘリックス構造を示し、モデル膜表面とより層と作用している両親媒性のヘリックスの正電荷側鎖を有していたことを証明した。これらの結果は、疎水性脂肪酸をＳＣ４ペプチドに抱合させることで、膜の相互作用が増大し、そして膜結合状態のペプチドのヘリックス構造が安定化して殺菌能が増大することを示している。
【００８９】
材料と方法
ペプチド配列と両親媒性物質の構造。設計した１２残基のＳＣ４ペプチド配列は、殺菌性／浸透性増大タンパク質(Mayo et al. , Biochem. J. 349,717-728 (2000))由来のペプチドを基礎とした。ＳＣ４のＣ１２とＣ１８の両親媒性物質のバージョンは、ペプチドのＮ末端に適切な脂肪酸を共有結合させている（図１）。ＳＣ４ペプチド及びＳＣ４ペプチド−両親媒性物質は、Ｃ末端をアミド化した。
【００９０】
ＳＣ４ペプチド合成。ＳＣ４ペプチドは、ミネソタ大学の微量化学施設において、Milligen/Biosearch 9600ペプチド固相合成機上で、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を用いて合成した。凍結乾燥した粗製ペプチドを調製用の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ｃ１８カラム上で、０．１％トリフルオロ酢酸／水を含む０〜６０％アセトニトリルの溶出勾配で精製した。ペプチドの純度及び粗製は、ＨＰＬＣ、アミノ酸解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により確認した。
【００９１】
ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の合成。ペプチド−両親媒性物質は、樹脂結合型ＳＣ４ペプチドとドデカン酸（ラウリン酸）又はオクタデカン酸（ステアリン酸）の脂肪酸類とから、本質的に既述されている手動のＦｍｏｃ固相化学(Berndt et al. , J. Am. Chem. Soc. 117,9515-9522 (1995))を用い合成した。要約すると、Ｃ１２又はＣ１８の脂肪酸尾部は、樹脂結合型ペプチドに対し、４倍モル過剰の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミド（ＤＩＥＡ）、及び脂肪酸尾部のジクロロメタン（ＤＣＭ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を用いて３時間Ｎ末端側でカップリングさせた。ペプチド−両親媒性物質と保護基は、reagent K（８２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール）で２時間処理することで樹脂から開裂した。粗製ペプチド−両親媒性物質は、逆相Ｃ４カラム上での、水に対し３０〜６０％（Ｃ１２−ＳＣ４の場合）又は３５〜７０％（Ｃ１８−ＳＣ４の場合）の勾配で０．１％ＴＦＡを含むものによるＨＰＬＣで精製した。精製したペプチド−両親媒性物質産物の同一性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で確認した。
【００９２】
細菌種。グラム陰性のエスケリッチャ・コリＪ９６及びＩＡ２はスムースな菌種であり、尿路疾患性の臨床分離株であり、これはJohnson及びBrownにより説明されている(Johnson and Brown, J. Infect. Dis. 173,920-926 (1996))。シュードモナス・アエルギノサＩ型は、臨床学的なスムースな菌種の分離株であり、これはHomma et al., Japan. J. Exp. Med. 46,329-336 (1976)に記載のスキームを用いて血清型が分類されていおり、そして血液アガープレート上に毎月移行することで研究室で維持されている。グラム陽性のＭＮ８及びＭＮＨＯは、スタフィロコッカス・アウレウスの患者由来分離株であり；イートン及びウイルソンは、２人の患者に由来するスタフィロコッカス・パイオジェネスの分離株である(Lockwood et al. , Biochem. J. 378,93-103 (2004))。Ｍ４９７８８０及びＷ７３１３４は、バンコマイシンを除くあらゆる常用の抗生物質に対して耐性を示すＳ．アウレウスの臨床的分離株の菌種である(Lockwood et al., Biochem. J. 378,93-103 (2004))。バチルス・アントラシス(Bacillus antracis)は、P. M. Schlievertのラボの研究用菌種である。全てのグラム陽性菌種がP. M. Schlievertにより提供されたものである。Ｅ．コリ及びＳ．アウレウスの菌種を栄養アガープレート上で維持し、そしてプレーティングした。Ｓ．パイオジェネス菌種は、血液アガープレート上で維持し、そして脳−心臓注入液アガープレート上にプレーティングした。Ｂ．アントラシスは、Todd Hewittブロス中で生育させた。
【００９３】
殺菌アッセイ。パイロジェンフリー溶液は本アッセイを通じて使用した。対数期の細菌は、一晩培養物を移すか、あるいは一晩培養物の−８５℃グリセロールストックから結晶を掬い取ることで得られた。細菌は洗浄し、そして０．９％塩化ナトリウム溶液中で再懸濁し、６５０ｎｍで３ｘ１０8コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ミリリットル（ｍＬ）をもたらす光学密度に調節した。細菌は、続いてｐＨ７．０の０．０８Ｍクエン酸リン酸緩衝液（０．０８Ｍクエン酸を０．０８Ｍ二塩基性リン酸ナトリウムと混合することで調製した）中で希釈した。細菌（０．１５ｍＬ）と適切な量のペプチドと１，０ｍＬの緩衝液とを１７ｘ１００ｍｍのポリプロピレンチューブ内で混合し、そしてレシプロ式のウォーターバスにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。Ｂ．アントラシスを除く全ての細菌菌種について、１：１０、１：００、及び１：１０００希釈物を０．９％塩化ナトリウム溶液中で調製し、そして２０マイクロリットルの（μＬ又はμｌ）の各希釈物をアガープレート全体にストリーキングした。グラム陰性の生物を、２％アガーを含む栄養アガープレート上にプレーティングし、そしてグラム陽性の生物をＭａｃＣｏｎｋｅｙアガー（２％）上でプレーティングした。プレートを一晩３７℃でインキュベートし、そしてコロニーを次の朝カウントした。１０〜１００の細菌コロニーを含む希釈物をカウントし、そしてその数に５０掛けて全てのカウントを１ｍＬ当たり死んだ細菌数に調節した。Ｂ．アントラシスの場合、５ｍＬのTodd Hewittブロスをインキュベーション後に溶液に添加し、そして細菌を連続攪拌しながら対数期の中間部まで生育させた。細胞の生存は、Ｂ．アントラシスの場合、６５０ｎｍの光学密度でアッセイした。
【００９４】
殺菌活性は、シグモイド用量応答方程式に対してデータフィットすることで決定したＬＤ50（細菌の５０％致死量）値として報告する：
死亡率（％）＝Ｒmin＋｛（Ｒmin−Ｒmax）／［１＋（Ｃ／ＬＤ50）＾ｍ］｝
（ここで、Ｃは濃度であり、Ｒmin＝０であり、これは最小の応答である；Ｒmax＝１００であって最大の応答であり；ＬＤ50は移行の中点であり；そしてｍは移行の傾きである。ＬＤ50とｍは、データフィットに使用した自由変項であった）
【００９５】
リポ多糖（ＬＰＳ）中和についてのリムルス・アモエボサイト（Limulus. amoebocyte）ライゼートアッセイ。ＳＣ４ペプチドと両親媒性物質が内毒素を中和する能力は、BioWhittackerの発色ＡＱＣＬ−１０００キット（Walkersville, MD）を用いて測定した。この方法はグラム陰性細菌の内毒素（ＬＰＳ）にとって定量的であり、そして活性の測定値としてプロ酵素のＬＰＳ媒介型の活性化のペプチド阻害を使用している(Young et al. , J. Clin. Invest. 51, 1790-1797 (1972))。適切な濃度のペプチドは、リムルス・アモエボサイトライゼート、０．０４ユニット（０．０１ナノグラム（ｎｇ））のＥ．コリ０５５：Ｂ５  ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ）、及び無色の合成基質（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）（配列番号１８）と一緒に混合した。ＬＰＳに対するペプチド結合は、４１０ｎｍでの吸収を介して前記基質が黄色いｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）へと酵素変換されるのをモニタリングすることで決定した。内毒素濃度は、酵素活性の初速度から決定した。ＬＰＳ結合についてのＩＣ50（５０％阻害を示す濃度）値は、用量応答曲線にフィットさせることで決定した。
【００９６】
真核細胞溶解活性。ＳＣ４分子の溶解活性は、ヒト赤血球とヒト内皮細胞に対して試験した。赤血球は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；３５ｍＭリン酸緩衝、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で３回洗浄し、溶血アッセイを実施した。１００マイクロリットル（μｌ）の連続希釈したペプチド（１〜１００マイクロモーラー（μＭ））／ＰＢＳを、０．４％体積／体積（ｖ／ｖ）のＰＢＳ懸濁ヒト赤血球を含有するエッペンドルフチューブに添加した。チューブを１時間３７℃でインキュベートし、そして次に１０００ｘｇで５分間遠心した。上清の１００μｌのアリコートを続いてエッペンドルフチューブに移し、そして溶血を４１４ｎｍの吸光度で測定した。ゼロと１００％の溶血をＰＢＳと１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中でそれぞれ決定した。溶血のパーセンテージは：
溶血（％）＝｛［Ａ414（ペプチド）−Ａ414（ＰＢＳ）］／［Ａ414（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）−Ａ414（ＰＢＳ）］｝ｘ１００
として算出した。
【００９７】
細菌細胞膜及び真核細胞膜の模倣体。二重層形成リン脂質とミセル形成界面活性剤とを膜の模倣体として使用した。双性イオンの１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を、主に天然の双性イオンの脂質から構成される真核細胞膜の模倣体として使用した。中性ＤＰＰＥと負電荷１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）の７：３モル混合物から構成されたリポソームであって、全体的に負の膜電荷と、前記模倣体において使用したものと本質的に適合する組成とを有しているリポソームを使用して細菌細胞膜を模倣した。ミセル形成ドデシルホスファチジルコリン（ＤＰＣ）とドデシル硫酸ナトリウム（ＤＳＤ）を、それぞれ真核細胞膜と細菌細胞膜の単純な模倣体として、共鳴広がりを制限するのに小さな凝集体サイズを必要とする核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験において使用し、そして円二色（ＣＤ）実験において凝集体からの光散乱を最小化させて使用した。
【００９８】
リポソームの調製。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）のリン脂質類をAvanti Polar Lipids, Incから入手した。純粋なリン脂質のクロロホルム溶液をガラスチューブ内で所望の脂質比で混合し、そして低流のＮ2のもと乾燥させて薄い脂質フィルムを形成させた。残留溶媒を減圧下で数時間乾燥させた。生じた脂質フィルムを少なくとも１．５時間脂質転移温度超の温度で、４ｍＭの最終脂質濃度をもたらすのに適当な量の水を用いて水和させた。この溶液を水和期間中定期的にボルテックスにかけた。溶液を続いて２０分以上バスソニケーター内で、脂質転移温度超の温度で超音波処理し、小さいリポソームを生成させた。脂質溶液は、室温に冷却して使用した。
【００９９】
リポソームとミセル溶液の調製。水性のストック溶液は、乾燥ペプチド、両親媒性物質、界面活性剤を水に溶解することで調製した；水性の脂質ストック溶液は、上述のとおり調製した。ＳＤＳ又はＤＰＣ界面活性剤−ペプチド溶液は、ペプチド／両親媒性物質のストック溶液を、別々に水で希釈して所望の終濃度の２倍にすることで調製した。希釈溶液を混合して、１：５０（ＤＰＣ）又は１：１００（ＳＤＳ）のペプチド：界面活性剤比にある適切な最終のペプチド濃度（ＣＤの場合０．１ｍＭ、ＮＭＲの場合０．５ｍＭ）を生じさせた。これらの比率は、界面活性剤の凝集体数に基づくと、１ミセル当たり大体１ペプチドに相当する。蛍光分光法のための界面活性剤ミセル溶液は、最終ペプチド濃度が５〜１０マイクロモーラー（μＭ）で、ペプチド：界面活性剤比がＤＰＣにおいて１：５００、ＳＤＳにおいて１：１０００であることを除いて同様に調製した。リポソーム溶液は、希釈したペプチドのストック溶液とリポソームとを混合して最終ペプチド濃度を５〜１０μＭ、ペプチド：脂質比を１：２０にすることで同様に調製した。ペプチドと界面活性剤／脂質の希釈溶液を混合する方法は、より高濃度のストックを混合する場合に観察される凝集体を制限した。
【０１００】
円二色。ＣＤスペクトルは、ＪａｓｃｏＪ−７１０スペクトロフォトメーター上で、２５℃又は３７℃で、０．１ｃｍ（水性の界面活性溶液）又は１．０ｃｍ（脂質溶液）の光路の石英キュベットにおいて記録した。捕捉は、５０ｎｍ／分の走査速度、１ｎｍのバンド幅、そして2秒の応答で実施した。相当の基線（水、界面活性剤、又は脂質溶液）は、各スペクトル（θ）から引いた。報告するスペクトルは、6回の走査の平均であり、そして平均残基楕円率として表した。ペプチド濃度は水又は界面活性剤ミセル溶液中で０．１ｍＭであり、リポソーム溶液中では１０μＭであった。ＣＤの基礎のスペクトルは、ポリリジン及びポリグルタミン酸(Sigma)を用い、他で報告されている条件及びパラメーター(Adler et al. , Methods Enzymol. 27,675-735 (1973) and Greenfield et al. , Biochemistry 8,4108-4116 (1969))で測定した。α−ヘリックス、β−シート、及びランダムコイルの基礎のスペクトルの一次結合(linear combination)を使用して、二次構造の寄与の予測についての実験的なＣＤスペクトルにフィットさせた。
【０１０１】
ＮＭＲ測定。ＮＭＲ測定のための溶液は、９０％のＨ2Ｏ、１０％Ｄ2Ｏに溶解させて最終的なペプチド／両親媒性物質の濃度を０．５ｍＭ、ｐＨを５．３（緩衝化していない）にした点を除き上述のとおり調製した。プロトンＮＭＲスペクトルは、Varian UNITY Plus-600 NMR分光計上で、２５℃で得た。スピン系は、６０ミリ秒（ｍｓ）で得られた２Ｄ−等核磁化移動ＴＯＣＳＹスペクトルで同定した。核オーバーハウザー効果分光（ＮＯＥＳＹ）実験は、１００ｍｓの混合時間で、立体解析のために実施した。水の共鳴は、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）又はＷＥＴ核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）パルスシーケンスを用いて抑制した。構造解析実験のために、２Ｄ−ＮＭＲスペクトルは、５１２のｔｌの増加について、それぞれ８ｋＨｚのスペクトル幅にわたる１ｋの複雑なデータ点で、両方の次元で、水の共鳴に据えられたキャリヤーを用いて回収した。３２回の走査は、それぞれのｔｌの増加につき平均化した。データは、ＮＭＲＰｉｐｅ（Delaglio et al. , J. Biomol. NMR 6,277-293 (1995)）及びＳｐａｒｋｙ（Goddard, T. D. and Kneller, D. G. , University of California, San Franciscoでにより提供されているもの）を用い、アップルのｉＢｏｏｋ上でオフラインで処理した。データセットは、両方の次元において、フーリエ変換前に、変動したサインベル関数を掛け、ベースライン補正し、そしてｔｌ次元においては１ｋに、そしてｔ２次元においては２ｋに対しゼロ充填した。より短いＴＯＣＳＹ実験（１２８ｔ１の増大のそれぞれについての４回の過渡現象）を使用して、ペプチド−ミセルの相互作用を研究し、そしてＮＨの化学シフトの温度依存性を通じて水素結合を試験した。
【０１０２】
構造モデリング。分子間距離拘束は、1Ｈ  ＮＯＥＳＹスペクトルで割り当てられた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）クロスピークから導き出した。ＮＯＥは、２．９、３．３、４．０、及び５．０Åの上限距離拘束にそれぞれ対応させて、強、中、弱又は最弱として分類した。非結合プロトン間の下限の拘束１．８Åに設定した。０．５Åの訂正を、側鎖のプロトンを包含するＮＯＥの上限に加えた。水素結合の拘束は、ＮＨ及びＣaＨのプロトンを包含する、連続的で且つ鎖間のＮＯＷのパターンと、遅いアミドプロトン−溶媒交換の証拠とから同定した。各水素結合は、ＮＨ−Ｏ及びＮ−Ｏの距離の場合、それぞれ３．５Å及び４．０Åの上限距離拘束で定義した。
【０１０３】
Ｘ−ＰＬＯＲソフトウェアパッケージ(Nilges, M.,Kuszewski, J. and Brunger, A. T.(1991) in Computational Aspects of the Study of Biological Macromolecules by NMR, Plenum Press, New York)をＮＯＥから導いた距離拘束と一緒に使用して、既述の方法（Mayo et al. , Biochem. J. 349, 717-728 (2000)）に従い、ＤＰＣミセルにおけるＣ１２−ＳＣ４の構造を算出した。最終構造は、いずれの最終構造もＮＯＥ違反が０．５Å超でなく、且つそして結合角度、長さ又は不適切な角度が、それぞれ５°、０．０５Å、そして５°超の理想的な形状から逸脱しないように、結果をフィルターにかけることで得られた。構造は、ＶＭＤソフトウェアパッケージ（Humphrey et al. , J. Mol. Graph. 14,33-38 (1996)）を用いて重ね合わせ、そして視覚化し、そしてＸ−ＰＬＯＲをルーチンに行い解析した。
【０１０４】
トリプトファン蛍光分光法。トリプトファン蛍光スペクトルは、２５℃又は３７℃でＩＳＳ−Ｋ２定常状態蛍光光度計上で得た。溶液を上述のとおり調製し、そして測定のために１ｃｍ石英キュベットに据えた。ペプチド濃度は、水中又は１：２０（モル／モル）脂質溶液中で５μＭであった。試料を２８０ｎｍで励起させ、そして発光は、３００〜４５０ｎｍから、１ｎｍの分解能で記録した。
【０１０５】
結果
殺菌活性。ＳＣ４ペプチド、並びにＣ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質（図１）は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、及び薬物耐性細菌の複数の臨床的に関連している菌種に対する殺菌活性について試験した。活性は、用量応答データのシグモイドフィット（図２で例示）で決定した場合に５０％の細菌を殺すペプチド濃度（ＬＤ50）として報告する。Ｃ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４は共に、概して、ＳＣ４と比較して増大した殺菌活性を示した（表１）。脂肪酸抱合の結果としての殺菌活性の最大の増大は、Ｓ．アウレウス及び薬物耐性Ｓ．アウレウス菌種に対して３０倍超高かった。Ｓ．パイオジェネスに対する有効な増大は、ＳＣ４からの活性の欠如により正確には算出できなかったものの、この増大は、試験したＳＣ４の最大濃度（２．０ｍＭ）を用いて２０倍超高かった。ＳＣ４と比較して、Ｃ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４は、グラム陰性菌種に対しては、活性がある場合にはわずかな増大を示し、Ｅ．コリに対してはＬＤ50を２倍以下に変化させ、そしてＰ，アエルギノサに対しては本質的にそのままであった。
【０１０６】
【表２】
2007512234.tif 000003
【０１０７】
ＬＰＳ中和。グラム陰性細菌の溶解は、内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を酸性させ、これは、十分大量に体内に放出された場合には、病理的障害である内毒素血症を引き起こして、敗血症に至ることがある。これに関して、殺菌性があり、且つＬＰＳを効果的に中和するペプチドは、医薬としてかなり重要なものである。ＳＣ４、Ｃ１２−ＳＣ４、及びＣ１８−ＳＣ４のＬＰＳ結合活性及び中和活性は、リムルス・アモエボサイトライゼートアッセイで測定した。ＩＣ50値は、用量応答曲線から決定した。Ｃ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４は、ＳＣ４ペプチドよりもそれぞれ約３倍及び約６倍高いＬＰＳ結合活性を示した（表１）。より高い疎水性を有するペプチドほどより強くＬＰＳと結合する傾向があり、そしてＳＣ４両親媒性物質における尾部の基の性質は、ＬＰＳの脂質Ａ部分に対する結合を行わせ、これは相互作用、そしてその後の中和の最も可能性がある部位である。
【０１０８】
真核細胞溶解活性。ＳＣ４及びその両親媒性物質はおそらく細菌細胞膜を崩壊させるため、真核細胞を溶解するそれらの能力を評価した。抗生物質として動物に投与した場合、これらの物質が血管内で遭遇するであろう２つの主な真核細胞の型は、赤血球と血管壁に裏打ちしている内皮細胞である。最大０．４ｍＭの濃度で、ＳＣ４、Ｃ１２−ＳＣ４、Ｃ１８−ＳＣ４のいずれも培養液中の内皮細胞を殺さなかった。ＳＣ４はまた、最大０．４ｍＭでほとんど溶血活性を示さなかった。しかしながら、Ｃ１２−ＳＣ４とＣ１８−ＳＣ４は、マイクロモーラーの範囲で赤血球を溶解し（表１）；Ｃ１８−ＳＣ４はＣ１２−ＳＣ４よりも大よそ３倍溶血性があった。
【０１０９】
円二色。膜と相互作用しているＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の構造的挙動を洞察するために、ＳＣ４、Ｃ１２−ＳＣ４、及びＣ１８−ＳＣ４の、水溶液中で且つ真核細胞膜模倣体（ＤＰＣミセル又はＤＰＰＣリポソーム）及び細菌細胞膜模倣体（ＳＤＳミセル又はＤＰＰＥ／ＤＰＰＧリポソーム）の存在下での高次構造をＣＤ分光法で試験した（図３）、純粋なＳＣ４、Ｃ１２−ＳＣ４、及びＣ１８−ＳＣ４の水溶液は、不規則な構造と一致したＣＤスペクトルをもたらし；基礎スペクトルの一次結合を用いたデータフィットは、分子それぞれにつき６３％〜７７％のランダムコイルを示した。同様のＣＤスペクトルがＤＰＣ又はＳＤＳミセル環境のいずれかにおけるＳＣ４について観察され、同時にフィットは６２〜６７％のコイルを示唆していた。しかしながら、Ｃ１２−ＳＣ４とＣ１８−ＳＣ４のＣＤスペクトルは、それぞれ７８％と８２％のα−ヘリックスをＤＰＣミセルにおいて示し、そしてそれぞれ５３％と５４％のα−ヘリックスをＳＤＳミセルにおいて示した。
【０１１０】
真核細胞膜を模倣している１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ）リポソームにおいて、ＳＣ４分子のいずれも有意なヘリックス構造を示さなかった（ＳＣ４の場合７６％のコイル、そしてＣ１２−ＳＣ４とＣ１８−ＳＣ４の場合には６０％のコイル）。細菌細胞膜を模倣している７０％１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン／３０％１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＰＥ／ＰＧ）リポソームにおいて、ＣＤスペクトルの質は、ＳＣ４又はその両親媒性物質をＰＥ／ＰＧリポソーム溶液と混合した場合に濁った溶液が形成するため、比較的悪かった。この効果は、排除することはできないが、より低いペプチドと液体の濃度の溶液を用いることにより最小化された。ＳＣ４スペクトルは特にノイジーであり、そして２１５ｎｍ超のスペクトルがＰＣのものに似ていると言う以外には解釈することはできない。Ｃ１２−ＳＣ４とＣ１８−ＳＣ４のＣＤスペクトルは、それらの対応するＰＣスペクトルとは異なっていた。ＰＥ／ＰＧ中のＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４は、構造化されたペプチドと一致するＣＤスペクトルをもたらした。定性的には、これらのＣＤトレース全体形状は、有意なα−ヘリックス構造の存在を示唆している。
【０１１１】
ＮＭＲ研究。ＮＭＲ研究は、リポソーム溶液と比較して全体的に改善した溶液挙動とより小さい凝集体サイズの結果として、ＳＤＳとＤＰＣのミセル環境におけるＣ１２−ＳＣ４ペプチドに対し実施された。ＤＰＣとＳＤＳにおけるＴＯＣＳＹとＮＯＥＳＹスペクトルは、Ｈ−ＮＨ領域とＮＨ−ＮＨ領域においてよく分離され、そしてよく分散した交差ピークを示しており（図４）、これらは、安定なペプチド構造の存在を示唆している。Ｃ１２−ＳＣ４のＨとＮＨの共鳴は、同一のミセル溶液におけるＳＣ４と比較して、概して高磁場にシフトしており、特に、Ｈ共鳴には、残基Ｋ１〜Ｈ７が属しており、そしてＮＨ共鳴には残基Ｌ２〜Ｋ８が属している（図５）。これらのシフトの性質は、Ｃ１２−ＳＣ４におけるアシル鎖の存在が、これらのミセル系との相互作用時に、ペプチドのこのＮ末端領域内により安定なヘリックスを誘導したことを示唆している(Wishart etal., Biochemistry 31,1647-1651 (1992))。しかしながら、注目すべきは、Ｆ４とＷ９の芳香族化合物が種々の共鳴の環電流シフトを誘導して、幾つかのＨ又はＮＨ共鳴の実際の高磁場シフトを弱めることがあるということである；このことは、何故幾つかのＨとＮＨのシフト差がゼロ又はポジティブであるかを説明することの一助となるであろう。ＨとＮＨのシフト差は、ＳＤＳにおけるＤＰＣの両親媒性物質についてのものよりも概して大きく、これはＤＰＣにおけるヘリックス安定性の増大を示唆している。ＮＯＥＳＹデータは、長い範囲のＮＯＥが、ＤＰＣミセルの存在下でのＣ１２−ＳＣ４の場合に、ＳＤＳミセルのものよりもより多く、そしてより強いというこの結論を支持している。
【０１１２】
ＮＭＲ構造モデリング。ＳＣ４両親媒性物質の構造をより詳細に特徴付けるために、完全なＮＭＲ構造解析は、ＤＰＣミセルにおけるＣ１２−ＳＣ４に対し、２５℃で、我々のＣＤ解析において最高レベルのαヘリックス含量を示した条件で実施した。Ｃ１２−ＳＣ４について観察されたＮＯＥのパターンは、α−ヘリックス構造と一致した（図６）。
【０１１３】
構造モデリングは、ＮＯＥＳＹ実験から得られたＮＯＥ距離拘束を用いて実施した。合計１９６のＮＯＥ距離拘束は、ＮＯＥＳＹスペクトル解析から導き、これには、２３の残基間の拘束、８３の連続的な拘束、及び９０の中距離（Ｉｉ−ｊＩ＜５）の拘束が含まれる。尚、４個の水素結合は、最初のＣ１２−ＳＣ４構造の検査により、そして同定することができ、これは８つの水素結合の距離拘束をもたらしている。実験的に導かれた拘束の総数は、それ故に２０４であり、残基当たり平均１７の拘束であった。１００個の構造をＮＯＥ及びＨ結合拘束で算出した；０．５Å超のＮＯＥ違反の無い２４個の最終的な構造が得られた（図７Ａ）。構造的な統計学（表２）は、前記の構造が実験的な拘束を十分満たしていることを示している。同時に、上記データは、Ｃ１２−ＳＣ４の溶液構造を表すのに使用した構造がよく集中していることを示している。α−ヘリックス残基の主鎖の重原子について平均ＲＭＳＤが０．２４Åであり、主鎖の重原子全てについては０．８０Åであり、そして分子全体（脂肪酸尾部を除く）については１．４５３Åであった。ＤＰＣミセルにおけるＣ１２−ＳＣ４のＮＭＲ構造は、前記ペプチドの長さ全体にわたる両親媒性のα−ヘリックス構造を示した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。
【０１１４】
【表３】
2007512234.tif 000004
ａ）２４個の最終構造のいずれも、０．５Å超の距離拘束違反示さなかった。示した値は、平均±標準偏差である。
ｂ）全ＲＭＳＤは重原子について算出し、そしてこれには脂肪酸尾部は含まれない。
【０１１５】
【表４】
2007512234.tif 000005
ａ）発光スペクトルは３００〜４５０ｎｍ、励起スペクトルは２８０ｎｍ、２５℃、Ｃ＝５μＭで集めた。値はピーク位置（ｎｍ）±標準偏差、ｎ＝３である。
ｂ）ペプチド−脂質比：ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ／ＤＰＰＧ、１：２０；ＤＰＣ、１：５００；ＳＤＳ、１：１０００．
ｃ）ｎ＝１
【０１１６】
トリプトファン蛍光分光法を介した膜相互作用。トリプトファン蛍光分光法を使用して、水、リポソーム、そしてミセルにおけるＳＣ４分子のＷ９残基の環境をプローブした（表３）。水中のＳＣ４、Ｃ１２−ＳＣ４、そしてＣ１８−ＳＣ４についての発光極大はおよそ３５４ｎｍであった。この極大値由来のブルーシフトは、トリプトファンがより疎水性環境にあることを示唆している(Lakowicz, J. (1983) Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York)。ＰＣリポソーム（真核細胞膜模倣体）において、発光極大値の位置はＳＣ４の場合変化しなかったが、Ｃ１２−ＳＣ４とＣ１８−ＳＣ４についての極大値は若干ブルーシフトであった。ＰＥ／ＰＧリポソーム（細菌細胞膜模倣体）において、発光極大値は、３分子全てについて強力なブルーシフトを示し、同時に、シフトの値は、ＳＣ４両親媒性物質のいずれについても、ＳＣ４ペプチドよりも大きかった。同様の結果が３７℃で得られ、この温度は殺菌アッセイを実施した温度である。ＤＰＣ又はＳＤＳミセル環境において、Ｗ９発光ピークはブルーシフトであり、そしてＤＰＰＥ／ＤＰＰＧリポソームにおいて観察されるものに匹敵するレベルである。このことは、ＤＰＣミセルのＮＭＲ構造研究が細菌細胞膜におけるＣ１２−ＳＣ４の環境を恐らく反映していることを示唆している。
【０１１７】
ＮＭＲの化学シフトを介した膜相互作用。αＨとＮＨの化学シフト差は、概して、α−ヘリックス又はβ−シート構造及び安定を反映しており(Wishart etal., Biochemistry 31,1647-1651 (1992))、側鎖の化学シフトは、折りたたまれたペプチドが相互作用する環境に対する洞察を提供することができる。このことは、より長い側鎖のＣＨ２基以外のシフト差が大きい場合に特に洞察力が優れていると言える。
【０１１８】
側鎖の化学シフトを、ミセル（ＤＰＣ又はＳＤＳ）内のＣ１２−ＳＣ４について、ＳＣ４ペプチドのものと同一条件下で比較した（図８）；この比較は、脂肪酸尾部をＳＣ４ペプチドに付加することの効果を試験するものである。γＣＨとδＣＨ基に関連している化学シフト差は、より長い側鎖を含むアミノ酸残基において比較的大きく、これは、それらのαＨ、βＣＨ及びＮＨ基と比較した場合（図５との比較）でも大きい。このことは、側鎖周囲の環境が、脂肪酸尾部の存在によって、恐らくは高次構造の変化と界面活性剤ミセルとの相互作用の増大との組み合わせにより有意に乱されていることを示唆している。側鎖の化学シフト差は、ＳＤＳ中のＣ１２−ＳＣ４の場合、ＤＰＣ中のものよりも大きい傾向があった。ＤＰＣ中での最大の化学シフト差はＫ５とＫ９について観察された；ＳＤＳ中のシフト差は、これらの２つの残基について同様に大きかった。Ｃ末端の１１１と１１２残基についてのより大きいシフト差は、ＤＰＣ中のペプチド末端に関して、よりミセルが埋没した環境を示すようである。ＳＤＳ中、大きいシフトはＫ１、Ｆ３、及びＫ１１についても見られた。ＳＤＳ中のリジン側鎖の大きいシフト差は、相互作用が主にペプチドのリジンとＳＤＳミセル上の表面の負電荷との間にあることを示唆している。このことはまた、ペプチド内のほかの残基について観察されるより小さいシフト差と一致している。
【０１１９】
リジン側鎖とＳＤＳミセル表面との間の相互作用はまた、ＳＤＳミセル中のＣ１２−ＳＣ４リジン残基の末端側鎖アミン由来の、ＴＯＣＳＹのαＨ、βＨ、γＨ、及びδＨのプロトン交差ピークによっても裏付けられている（図９Ｂ）。ＳＤＳミセルの存在下でのペプチド由来のリジンのＮＨ3+共鳴の観察は、εＮＨプロトンが直ちに水と交換しないことを示している。このことは、ペプチドが、低誘電性の環境内、すなわち、ミセル内に埋没している場合に起こり得るが、より可能性がある説明としては、特に交差ピークがＤＰＣミセル中で観察されないことを考慮すると（図９Ａ）、この作用がミセル表面との静電相互作用の結果であるということである。
【０１２０】
考察
それ自体潜在的に抗菌性であるＳＣ４ペプチドへの脂肪酸抱合は、より一層強力な殺菌剤を創出し、そして薬物耐性細菌、グラム陽性細菌、及び炭素菌の菌株を含むように感受性細菌の範囲を広げる。ＳＣ４に対する脂肪酸の抱合は、グラム陽性細菌に対して最も劇的に殺菌活性を増大させて、ＳＣ４の活性を最大３０倍増大させる（図２及び表１）。更に、常用の抗生物質であるバンコマイシンに対してのみ感受性のある薬物耐性グラム陽性菌株が、マイクロモル濃度未満のＳＣ４ペプチド−両親媒性物質で効果的に死滅した。
【０１２１】
かかる結果は、殺菌活性に対する尾部の長さの以下の効果を示している。Ｃ１２脂肪酸鎖に対して抱合されたＳＣ４は、典型的には、グラム陽性細菌に対してより有効であった。かかる結果は、最適な尾部の長さとは、事実上、細菌種の機能であり、単純な規則ではないことを示している。このことは、必然的に特定の細菌細胞膜環境の組成及び構造と関連している。尾部の鎖長と活性の増大との単純な関係も、脂肪酸抱合の他の研究において同様に分かり難くいものであったが、この従来の研究の多くの一般的な結論は、最適な尾部の長さが１１〜１２炭素原子であることを示唆していた(Mak et al., Int. J. Antimicrob. Agents 21,13-19 (2003); Wakabayashi et al. , Antimicrob. Agents Chemother. 43,1267-1269 (1999); Majerle et al. , J. Antimicrob. Chemother. 51,1159- 1165 (2003)。ＳＣ４は、存在している場合、最大ミリモル濃度の範囲で真核細胞に対しわずかに破壊作用（溶解）を示した；しかしながら、ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の溶血活性の相対的増大が観察された（表１）。このことは、部分的に、恐らくは相対的に大きい陽イオン性の面を有するα−ヘリックスの高次構造の安定化によるものと思われる。Weiprechtとその共同研究者は、モデルペプチドの陽イオン性の面の角度を増大させた際に同様の効果を観察した(Wieprecht etal., Biochemistry 36,6124-6132 (1997))。力学的な観点から、脂肪酸尾部をＳＣ４に付加した際の溶血活性の増大は、細菌細胞膜の特異性の低下、換言すると、膜親和性の一般的な増大を示している。このことは、脂肪酸尾部の非特異的な疎水性の性質を考慮すると驚くべく事ではない。全体的なペプチドの疎水性が増大する際の特異性の同様の低下について示している者もいる(Wieprecht etal., Biochemistry 36,6124-6132 (1997))。溶血活性とは対照的に、培養内皮細胞に対するＳＣ４又はその両親媒性物質の溶解活性は観察されなかった。単に、処理済の赤血球が、ペプチド−両親媒性物質様の分子から溶解作用をより受けやすいとも考えられる。それにも関わらず、試験した細菌株の大部分に関して、ＳＣ４−両親媒性物質で観察された溶血性のＩＣ50は効果的な殺菌のＬＤ50よりも１０倍から１００倍高く、このことは、これらの物質をin vivoで使用する場合に毒性が増大しうるとの懸念を緩和する。
【０１２２】
かかる結果は、ペプチドに対する脂肪酸の抱合が、膜親和性を増大させ、且つ膜環境の二次構造を強化することにより殺菌活性を増大させることを示唆している。ペプチド−両親媒性物質は、ペプチドのα−ヘリックス及び三重らせんの種々の構造であって、さもなければ構造化されていないものを安定化させ(Yu et al. , J. Am. Chem. Soc. 120,9979-9987 (1998); Fields et al. , Biopolymers 47,143-151 (1998))、自己集合又はミセル若しくはリポソーム内への取り込みを通じて媒介されると考えられるプロセスを安定化させること(Gore et al. , Langmuir 17,5352-5360 (2001))、が示されている。本発明でのＣＤの結果は、ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質が適切な凝集物で同程度の挙動を示すことを証明している（図３）。ＳＣ４ペプチドは、研究した全ての条件下でランダムコイルの高次構造を示すＣＤスペクトルを示したが、Ｃ１２−ＳＣ４両親媒性物質とＣ１８−ＳＣ４両親媒性物質は共に、ミセル系及びＰＥ／ＰＧリポソームにおける有意なヘリックス含量と一致するＣＤスペクトルを生成させた。
【０１２３】
ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質のヘリックスの二次構造の安定化には、重要な機能的含みがあると考えられ、これは特に、本発明で試験した濃度で、全てのＳＣ４誘導体が水中でランダムコイルの高次構造を示すＣＤトレースもたらすことを考慮した場合である。膜との相互作用の際のα−ヘリックス構造の発生は、抗菌ペプチドの活性における重要な段階であり(Bechinger et al., Protein Sci. 2,2077-2084 (1993))、そして膜結合ペプチドのヘリックス構造を安定化する要因は、それ故に、細菌細胞膜の溶解に恐らく必要とされる両親媒性の発生の一助となり得る。反対に、膜と相互作用する前に溶液中で構築するペプチドは、抗菌的な効力の低下を示している(Houston et al. , J Pept Res 52, 81-88 (1998))。溶液中でのＳＣ４両親媒性物質の構築は観察されているが、このような凝集は生物学的に関連する濃度を大幅に上回るときだけに生じた。Ｃ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４は、約０．５ｍＭ〜５ｍＭ超の濃度であって、本発明の生物学的アッセイ又は生物物理的実験のいずれかで使用したものよりも１００超高いレベルでのみ凝集物を形成する。しかしながら、ＳＣ４両親媒性物質が自己集合する傾向が、膜結合型の両親媒性物質をＳＣ４ペプチドに必要とされるものよりも低い表面濃度で膜内に凝集させることによって、細胞膜を透過する役割を果たしうるという可能性もある。
【０１２４】
Ｃ１２−ＳＣ４の頭部の構造的な詳細は、恐らく、尾部の存在により賦与される高次構造の安定化と同じぐらい重要である。ＤＰＣのＮＭＲの結果は、恐らく、トリプトファン蛍光スペクトルにおいて各条件下で観察されるブルーシフトの類似性に基づいて、細菌細胞膜におけるＣ１２−ＳＣ４の挙動とよく関連付けられている（表３）。ＤＰＣミセル中のＣ１２−ＳＣ４のＮＭＲ構造モデルによって、これらの分子が何故上述のような強力な抗菌物質であるかという詳細の一部が解明される。前記ペプチドにより形成されるヘリックスの二次構造は明確な両親媒性物質としての特徴を示しており、陽イオン性面と、ヘリックスの反対面上でより小さな疎水性面とを有している。ヘリックスの陽イオン性面によって規定される大きな角は、モデル系において、より小さい陽イオン性面を有するペプチドと比較して高い殺菌能に繋がることが証明されている(Wieprecht et al., Biochemistry 36, 12869-12880 (1997))。Ｃ１２−ＳＣ４のヘリックスは、脂肪酸尾部に最も近いペプチドの部分で最も規定されており、ＳＣ４と比較した場合に、ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質のＣＤスペクトルで観察されるヘリックス含量の増大を示唆する結果は、ミセル−又はリポソーム−水の界面でのペプチドのアンカリングの直接的な結果である。
【０１２５】
Ｃ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４の膜親和性の非特異的な増大も、恐らく、殺菌活性における役割を果たしているようである。ＰＥ／ＰＧリポソームが細菌細胞膜を模倣しており、且つＰＣリポソームが赤血球膜を模倣していることを思い出すと、ＳＣ４及びその両親媒性物質についての我々のトリプトファン蛍光スペクトルと、同一分子による我々の生物学的アッセイとを比較することは容易である。脂肪酸抱合によるＳＣ４殺菌活性の一般的な増大（表１）は、ＰＥ／ＰＧリポソームとＰＣリポソーム中のＣ１２−ＳＣ４とＣ１８−ＳＣ４内それぞれのトリプトファンのより疎水性の環境に反映されている（表３）。ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質の膜親和性の増大は（それらの蛍光スペクトルが示す通り）、当該両親媒性物質の生体活性の増大を少なくとも一部説明しているようである。
【０１２６】
ＳＣ４及びＣ１２−ＳＣ４は細菌細胞膜を透過することが知られており、その結果、ＳＣ４両親媒性物質の機構に対する洞察のために膜透過ペプチドのモデルに目を向けることは論理的である。両親媒性のα−ヘリックス抗菌ペプチドの膜破壊活性を説明するために使用する基本モデルは、１つ目が、膜貫通孔が細菌細胞膜に及んでいる少数のペプチドの凝集を介して形成している樽板(barrelstave)モデルであり、２つ目が、多数のペプチドが細菌細胞膜の領域上で凝集し、そして当該領域を溶解するカーペットモデルであり、そして３つ目が、カーペットモデルとの類似性を有するが、脂質とペプチドで裏打ちされている一続きの孔であるトロイダルな孔モデルである(Oren and Shai, Biopolymers 47,451-463 (1998)にて概説済み)。
【０１２７】
データによると、Ｃ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４の殺菌作用が膜表面に対する静電的結合であり、上記３モデルのそれぞれと一致する第一の段階であることが示唆される、静電的相互作用は、因みに、ＳＣ４ペプチド又は両親媒性物質をＰＥ／ＰＧリポソームの溶液に対して添加した際の沈殿物の形成（ミリモル濃度のペプチド濃度）又は溶液の霞み（マイクロモル濃度のペプチド濃度）として観察した。Ｃ１２−ＳＣ４側鎖の化学シフト（図８）とＮＨプロトン間でのＴＯＣＳＹの接続性の存在（図９）は、ＳＤＳミセルにおける、リジン側鎖とＳＤＳミセル表面との静電的相互作用のモデルを証明している。
【０１２８】
樽板モデルは、単純な幾何学的条件でしか起こりえない選択である。１２残基を有するＳＣ４は、恐らく、短すぎて細菌細胞膜を網羅することはできない。更に、ＳＣ４上での電荷は＋５であり、このモデリングは、安定な樽様の孔を形成するのは高すぎることが示唆されている(Zemel et al. , Biophys. J. 84, 2242-2255 (2003))。しかしながら、他の証拠も樽板モデルを軽視している。Ｃ１２−ＳＣ４ミセルとＳＤＳミセルとの間で観察された静電的相互作用は長期間持続し（本研究で使用した試料は、少なくとも数時間平衡であった）、これは、最終状態も優位な静電的成分を有していることを示唆している。また、構造的シフトと化学シフトのデータの組み合わせは、ヘリックスが恐らくミセルの表面に平行に横たわっており、更に、両親媒性のヘリックス面のあまり極性でない側面はより溶媒に曝露されていることを示唆している。この最終状態の型は、トロイダルな孔のモデルと一致しており、ここでの膜の孔は、膜脂質とペプチドの混合物で裏打ちされており、ペプチドは樽板モデルのように、膜の厚さ全体に完全に及ぶことはないが、脂質膜をわずかな距離だけ透過する。
【０１２９】
ＳＣ４ペプチド−両親媒性物質における脂肪酸尾部の存在は、膜表面での凝集を増大させる手段を提供し、これは溶液中でＳＣ４について観察される凝集の２次元アナログとなる。トロイダルな孔のモデルとの関連で、凝集挙動のこの増大は、ＳＣ４と比較して、膜の穿孔に必要とされる表面濃度を低下させる。本発明の殺菌アッセイは、少なくともグラム陽性生物についてこのモデルを支持しており、それは、殺菌濃度がＳＣ４両親媒性物質の場合前記ペプチドのものよりも低いためである。脂肪酸尾部の別の潜在的な影響は、前記ペプチドの疎水性面を有する細菌細胞膜内に挿入されていることであり、これが、恐らくは局所的な曲率に影響を及ぼし、そしてトロイダルな孔を誘導する。このことはまた、観察した様式での殺菌活性をも強化させる。
【０１３０】
本発明は、ＳＣ４の脂肪酸抱合体が強力で広域スペクトルの抗菌剤であることを示している。脂肪酸尾部は、殺菌活性とＬＰＳ内毒素に対する結合との観点で、ＳＣ４ペプチドの生体活性を増大させるが、最も劇的な増大は、グラム陽性細菌に対して観察された。ＣＤ及びＮＭＲによる構造解析は、脂肪酸抱合が、膜結合型のＳＣ４ペプチド−両親媒性物質内での両親媒性のヘリックスの形成を強化することで殺菌活性を増大させることを示唆している。ＮＭＲ及び蛍光を用いた膜相互作用の解析は、脂肪酸抱合の第二の効果が膜親和性の増大であり、これがより強力な殺菌活性をもたらしていることを示唆している。
【０１３１】
実施例２
Ｎ末端のアシル化による抗菌活性の向上
実施例１で概説した手順に従い、ＳＣ−４ペプチド並びにＳＣ４のＣ１２−ＳＣ４及びＣ１８−ＳＣ４のＮ末端のアシル化の、５種類の異なるグラム陽性細菌の菌株に対する抗菌作用を決定した。使用した細菌株は、ＮＭ８、Ｈｏｃｈ、Ｋｎｕｔｓｏｎ、ＦＲ１７２２、及びＲＮ６３９０である(Lockwood et al., Biochem. J. 378,93-103 (2004))。用量応答の結果をそれぞれ図１０〜図１４に示す。
【０１３２】
これらの結果は、ＳＣ４のＮ末端アシル化（Ｃ１２及びＣ１８）がＳＣ−４ペプチドの抗菌活性を大きく向上させることを証明している。この抗菌作用は、グラム陽性細菌、例えばブドウ球菌及び炭素菌に特異的な傾向がある。グラム陰性細菌株に対する活性は、最高でもわずかに約２倍まで増大する。このことは、ＳＣ４及びこの全体的な新規抗菌剤のクラスが働くこれらの細菌細胞膜における既知の差異と一致している。
【０１３３】
Ｃ１８誘導体の場合、抗菌作用の１０〜２０倍の増大が異なるグラム陽性細菌株；ＭＮ８（図１０）、Ｈｏｃｈ（図１１）、Ｋｎｕｔｓｏｎ（図１２）、ＦＲ１７２２（図１３）、及びＲＮ６３９０（図１４）上で観察された。
【０１３４】
更に、ＳＣ−４、Ｃ１２−ＳＣ４、及びＣ１８−ＳＣ４を、Ｓ．アウレウス(S. aureus)の２種類の薬物耐性菌株（実施例１に記載のＷ７３１３４及びＭ４９７８０）に対して試験した。
【０１３５】
薬物耐性は、現在利用可能な抗生物質の大きな問題である。いずれの場合でも、Ｓｃ−４のＣ１２−及びＣ１８−誘導体は、両方の薬物耐性菌株を死滅させた。両菌株は、通常、最も強力な市販の抗生物質であるバンコマイシンを用いた場合にのみ死滅する。これらの２種類のグラム陽性薬物耐性菌株についての用量応答の結果（図１５及び１６）は、親のＳＣ−４と比較した場合のＣ１２及びＣ１８改変ＳＣ−４の効果を証明している。
【０１３６】
実施例３
脂肪酸抱合によるペプチド抗菌活性の促進
３つのペプチド、ＹＧＡＡ［ＫＫＡＡＫＡＡ］（２）（配列番号２０）であって、「ＡＫＫ」とも称されるもの、ＫＬＦＫＲＨＬＫＷＫＩＩ（ＳＣ４）、及びＹＧ［ＡＫＡＫＡＡＫＡ］（２）（配列番号２１）であって、「ＫＡＫ」とも称されるもの、をラウリル酸と抱合させ、そしてそれらの構造、抗菌活性、及び真核細胞毒性に対する効果について試験した(Chu-Kung et al. , Bioconjug Chem. 15(3) : 530-5 (2004))。抱合したＡＫＫペプチドとＳＣ４ペプチドは、抱合されていないペプチドと比較して抗菌活性の増大を示したが、抱合したＫＡＫペプチドはそうではなかった。ＡＫＫの円二色スペクトルは、抱合型におけるそのアルファヘリックス含量において、細菌細胞膜を模倣しているホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルグリセロール小胞を含む溶液中でのペプチドＫＡＫよりも有意により大きな増大を示した。ＫＡＫ及びＡＫＫペプチド並びにそれらの相当の脂肪酸抱合体は、真核細胞の細胞膜を模倣する、ホスファチジルコリン小胞の存在下で、それらの構造のわずかな変化を示した。ＫＡＫ及びＡＫＫペプチド並びに抱合体の溶血活性は低かった。しかしながら、ＳＣ４脂肪酸抱合体は、溶血活性の大きな増大と、ホスファチジルコリン小胞の存在下でのヘリックス含量の相当の増大を示した。これらの結果は、抗菌ペプチドの溶血活性と抗菌活性が二次構造の変化と関連しており、そして、修飾ペプチドが脂質膜と相互作用する能力を向上させることを示している。脂肪酸抱合は、抗菌剤としてのペプチドの有用性を、細菌細胞膜との相互作用の際にそれらが二次構造を形成する能力を強化させることにより向上させる。
【０１３７】
本明細書で引用する全ての特許、特許出願、刊行物、及び電気回線を通じて利用可能な材料（例えば、ヌクレオチド配列の、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑへの提出、及びアミノ酸配列の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢへの提出、並びに、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きのコード領域由来の翻訳）の開示は、引用により組み入れられる。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためのみに示したものである。不必要な限定はそれから理解されるべきではない。本発明は、示し、そして記載した詳細に正確には限定されず、当業者にとって自明の変更については特許請求の範囲で規定する本発明の範囲内に含まれる。
【０１３８】
全ての表題は読み手の便宜のためにあり、そして、特に断らない限り表題の後のテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、ペプチド配列（配列番号４）、ペプチド−両親媒性物質の構造、及び命名を表す図である。各配列の右側の「−ＮＨ2」はＣ末端のアミド化を示す。
【図２】図２は、グラム陰性のＥ．コリＪ９６、グラム陽性のＳ．パイオジェネス(S. pyogenes)  イートンに対するＳＣ４（黒丸）、Ｃ１２−１４（黒四角）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の代表的な用量応答曲線、グラム陽性のＳ．アウレウスのＷ７３１３４細菌の薬物耐性、を示す。線は、ＬＤ５０値を決定するために使用したシグモイドカーブフィットである。
【図３】図３は、ＤＰＣミセル、ＳＤＳミセル、ＤＰＰＣリポソーム、及びＤＰＰＥ／ＤＰＰＧリポソームにおけるＳＣ４（実線）、Ｃ１２−ＳＣ４（点線）及びＣ１８−ＳＣ４（破線）のＣＤスペクトルである。ミセル膜模倣体において、ＳＣ４両親媒性物質は、ＤＰＣミセル内のヘリックス構造と一致するスペクトルと、ＳＤＳミセル内のややヘリックスとは言えない構造と一致するスペクトルを示した。リポソーム膜模倣体は、ＤＰＰＣリポソーム（赤血球模倣体）内の小さなＳＣ４両親媒性構造を示すスペクトルを示す一方で、細菌性の模倣体としてのＤＰＰＥ／ＤＰＰＧリポソームにおけるより構造化された状態を示すスペクトルを示した。ＳＣ４ペプチドスペクトルは、あらゆる条件下で小さな構造を示す。水中でのスペクトルは、ＤＰＰＣリポソーム内のものと類似しているように見え、３７℃での結果は全ての条件で同じであった。
【図４Ａ−Ｄ】ＳＤＳ及びＤＰＣミセル内のＣ１２−ＳＣ４のＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルの領域。図４Ａは、ＳＤＳミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのＴＯＣＳＹスペクトルを表す。ＴＯＣＳＹスペクトルの分散の増大及びより長い範囲のＮＯＥは、ＤＰＣミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのより構造化された状態を示す。図４Ｂは、ＤＰＣミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのＴＯＣＳＹスペクトルを表す。図４Ｃは、ＳＤＳミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのＮＯＥＳＹスペクトルを表す。図４Ｄは、ＤＰＣミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのＮＯＥＳＹスペクトルを表す。
【図５】同一条件下でのＳＣ４に関連するＤＰＣ又はＳＤＳ内のＣ１２−ＳＣ４についてのαＨ及びＮＨ化学シフト。当該シフトの高磁場の性質は、脂肪酸抱合の結果、ヘリックス構造、特に残基Ｋ１−Ｈ７におけるヘリックス構造の安定化を示す。
【図６】ＤＰＣミセル及びＳＤＳミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのＮＯＥ結合性。ＤＰＣ内のＮＯＥ結合性の数及び規則性は、秩序のある状態を示唆し、このパターンは、Ｋ１からＫ８残基のαヘリックス構造と一致している。ＳＤＳにおいて、観測可能なＮＯＥはかなり少なかったが、それらのうちの幾つかがやや構造化されたペプチドと一致している。
【図７Ａ−Ｃ】ＤＰＣミセル内のＣ１２−ＳＣ４のＮＯＥに由来する構造。図７Ａは、アラインメントのためにＫ１からＷ９の残基を用いた２４個の最後の構造の重ね合わせを表す。図７Ｂは、１つの構造のリボンバックボーン表示であり、これは全体的にヘリックス状の折りたたみとやや秩序の無いＣ末端を示している。極性の残基を黒で示し、無極性の残基を灰色で示す。脂肪酸の尾部は丸と棒として示す。図７Ｃは平均構造の軸方向像を表しており、これは両親媒性ヘリックスにおける荷電側鎖（アルギニンとリジン）の分布を示す。極性の残基を黒で示し、無極性の残基を灰色で示す。
【図８】ＳＤＳミセル及びＤＰＣミセル内のＣ１２−ＳＣ４と同一条件下のＳＣ４ペプチドとの間の側鎖の化学シフト差。全ての化学シフト差は、正の数と負の数についての解釈に対する憶測を回避するために絶対値として示す。
【図９】ＤＰＣ及びＳＤＳミセル内のＣ１２−ＳＣ４についてのＴＯＣＳＹスペクトルのリジン側鎖アミン領域。
【図１０】グラム陽性のＭＮ８細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【図１１】グラム陽性のＨｏｃｈ細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【図１２】グラム陽性のＫｎｕｔｓｏｎ細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【図１３】グラム陽性のＦＲ１７２２細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【図１４】グラム陽性のＲＮ６３９０細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【図１５】グラム陽性の薬物耐性Ｗ７３１３４細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【図１６】グラム陽性のＭ４９７８０細菌に対するＳＣ４（黒四角）、Ｃ１２−ＳＣ４（黒丸）、及びＣ１８−ＳＣ４（黒三角）の抗菌活性。
【配列表フリーテキスト】
【０１４０】
配列番号１−１７、１９−２１                    合成ポリペプチド
配列番号１８                                    合成ペプチド基質
【図１】
2007512234.tif 000006
【図２】
2007512234.tif 000007
【図３】
2007512234.tif 000008
【図４】
2007512234.tif 000009
【図５】
2007512234.tif 000010
【図６】
2007512234.tif 000011
【図７】
2007512234.tif 000012
【図８】
2007512234.tif 000013
【図９】
2007512234.tif 000014
【図１０】
2007512234.tif 000015
【図１１】
2007512234.tif 000016
【図１２】
2007512234.tif 000017
【図１３】
2007512234.tif 000018
【図１４】
2007512234.tif 000019
【図１５】
2007512234.tif 000020
【図１６】
2007512234.tif 000021
【国際調査報告】
2007512234.tif 000022
2007512234.tif 000023
2007512234.tif 000024
2007512234.tif 000025
2007512234.tif 000026