(57)【要約】  本発明の実施態様によれば、本方法では動物移植片による腫瘍移植の前と後に試験動物に重水素減少水が投与され、このために以下の諸工程を経由する。Ａ）非近交系ウィスターラットにＤ２濃度２５ｐｐｍ、Ｄ２濃度６０ｐｐｍおよびＤ２濃度１００ｐｐｍの重水素減少水を６０日の期間にわたり給餌投与し、それと同時に対照群の動物に同じ期間にわたり重水素含量１５０ｐｐｍの水（生水）を給餌する工程。Ｂ）移植する腫瘍細胞の生存率をトリパンブルーにより確認する工程。Ｃ）０．５ｃｃの通常生理食塩溶液中にてウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）とゲランＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）の悪性腫瘍細胞１×１０７個を６０日目の実験群と対照群の動物の皮下に移植する工程、ただし、これら両腫瘍細胞の生存率は９８％を越える。Ｄ）連続的かつ長期にわたり重水素濃度２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、１００ｐｐｍの重水素減少水を給餌する工程、その全期間に以下のことを行う：  ａ．移植４日後から開始して２〜３日ごとに腫瘍結節の測定と検査を実施すること、  ｂ．動物の生理学的状態を監視するために、毎週秤量し、飼料と水の消費量を監視し、中毒状態の発生を報告すること、  ｃ．６０日後であって、対照群の全動物が死んだ時点で、好ましくは移植後１６０日目と２００日目の間の時点で、所定濃度の重水素減少水を投与して得られる効果を、実験群からの生存動物の生体恒常性に基づいて、あるいは、これらの動物の体液性免疫系と細胞性免疫系がどのように影響されたかに基づいて観察し、そのために動物の免疫学的状態についての一連の検査を行う、すなわち白血球成分試験によりリンパ球と芽細胞の濃度を確定し；造血骨髄試験によりプラズマ細胞とＮＫ−Ｋ細胞の濃度を確定すること。Ｅ）試験された生存動物について、新たな生体恒常性の出現と、腫瘍退縮並びに癌治癒例に関連して得られた所見とによって重水素減少水の有効な濃度を決定する工程。この方法によれば、濃度６０ｐｐｍの重水素減少水が癌療法及び癌予防のために最も有効であることが決定され、このためにこの種の水を毎日の食餌にて連続的かつ長期に投与する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重水素減少水の癌治療に有効な濃度を試験動物の生体内試験で決定する方法であって、動物移植片を腫瘍移植する前後で試験動物に重水素減少水を投与するにあたり、以下の諸工程を経由することを特徴とする方法：
Ａ）非近交系ウィスターラットにＤ２濃度２５ｐｐｍ、Ｄ２濃度６０ｐｐｍおよびＤ２濃度１００ｐｐｍの重水素減少水を６０日の期間にわたり給餌投与し、それと同時に対照群の動物に同じ期間にわたり重水素含量１５０ｐｐｍの水（生水）を給餌する工程、
Ｂ）移植する腫瘍細胞の生存率をトリパンブルーにより確認する工程、
Ｃ）０．５ｃｃの通常生理食塩溶液中にてウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）とゲランＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）の悪性腫瘍細胞１×１０７個を６０日目の実験群と対照群の動物の皮下に移植する工程、ただし、これら両腫瘍細胞の生存率は９８％を越える、
Ｄ）連続的かつ長期にわたり重水素濃度２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、１００ｐｐｍの重水素減少水を給餌する工程、その全期間に以下のことを行う：
ａ．移植４日後から開始して２〜３日ごとに腫瘍結節の測定と検査を実施すること、
ｂ．動物の生理学的状態を監視するために、毎週秤量し、飼料と水の消費量を監視し、中毒状態の発生を報告すること、
ｃ．６０日後であって、対照群の全動物が死んだ時点で、好ましくは移植後１６０日目と２００日目の間の時点で、所定濃度の重水素減少水を投与した場合に得られる効果を、実験群からの生存動物の生体恒常性に基づいて、あるいは、これらの動物の体液性免疫系と細胞性免疫系がどのように影響されたかに基づいて観察し、そのために、動物の免疫学的状態についての一連の検査を行う、すなわち白血球成分試験によりリンパ球と芽細胞の濃度を確定し；造血骨髄試験によりプラズマ細胞とＮＫ−Ｋ細胞の濃度を確定すること、
Ｅ）試験された生存動物について、新たな生体恒常性の出現と、腫瘍退縮並びに癌治癒に関連して得られた所見とによって重水素減少水の有効な濃度を決定する工程。
【請求項２】
この方法により、濃度６０ｐｐｍの重水素減少水が癌治療及び癌予防に最も有効な濃度であると決定され、そのためにこの種の水を毎日の食餌として連続的かつ長期に投与することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重水素減少水の癌治療に有効な濃度を試験動物の生体内試験で決定する方法−実験腫瘍学において実現できた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然水から又は重水製造法により重水素減少水を得る方法及び装置は複数知られている（特許番号ＲＯ１１２４２２号；特許出願番号：ＦＲ２５５２３２４号；国際出願番号ＰＣＴ
ＷＯ９６／３３１２９号；特許番号ＲＵ２１８２５６２号）。
【０００３】
また、重水素減少水の特性は、種々の疾病、例えば癌を回復又は治癒させるという点でよく知られており、この場合にこの種の水はそのままで又は製造した医薬品として又は化粧品として患者に投与される（ＵＳ５、７８８９５３号、ＷＯ９６／０３９９６号、ＷＯ９５／１８５４５号）。
【０００４】
本発明の技術背景によれば、癌療法に必要な重水素減少水の濃度を生体内決定する実験法は公知（ＵＳ５、７８８９５３号）であるが、この方法は多数の欠点があることが判っている。記載されている方法の中にはヒト腫瘍（前立腺腫瘍、乳房腫瘍など）を使用し、免疫抑制した動物に移植する。この異種移植物（すなわち動物に移植したヒト腫瘍）は事前に免疫抑制した近交系マウス、すなわちＣＢＡ／Ｃａ純系で得られている（ＷＯ９５／１８５４５号第３頁）。
【０００５】
しかしながら、動物に移植された悪性のヒト腫瘍については、主に拒絶反応の危険があることが知られている（Billingham, R.E. et al., 1953, Nature, 172, 603; Miles, C.P., 1965,
J.Natl. Cancer Inst. 34, 103; Comisel V. et al, 2001, Romanian Journal of
Comparative Oncology, 4, 295）。
【０００６】
既に、細胞、組織、そして器官の異種移植は実施が極めて困難であり、ほぼ不可能であることがよく知られている。理由は、異種移植部は時が経つと宿主により拒絶されるからである。また、悪性腫瘍移植片は異種系で拒絶される。一般に、試験動物に対する腫瘍異種移植、特に悪性腫瘍について、その異種腫瘍移植が成功するための好ましい条件が多数の発表論文で提示され、また検討されており、例えば以下に記載する：
【０００７】
ａ）腫瘍細胞接種のための特殊な技術の使用（胚内接種；新生ハムスターでの頭蓋内接種；睾丸内接種；前眼房内接種；腎被膜下移植、ハムスターの頬袋内移植など）。いわゆる特定部位に腫瘍を異種移植した結果、陽性の移植片は比率が高くなく、不定でもあり、従ってこの技術を使用しても一定の再現的な実験モデルを提供することができないことが判っている（Comisel V. et al, 2001, Romanian Journal of Comparative Oncology, 4,
295）。
【０００８】
ｂ）先天的又は後発的に免疫不全である動物の使用（細胞性の即時型免疫応答が不全であることを特徴とする先天的な胸腺欠損の“欠損”ホモ接合マウス、新生動物の外科的胸腺摘出）。
【０００９】
ｃ）種々の方法、例えば抗生物質保護下での非致死線量の照射；多量のコロイド懸濁液の静脈内接種による免疫系の遮断；腎上体コルチコイド系ステロイド（corticoid over renal steroids）又は抗リンパ球血清又は免疫抑制剤（シクロホスファミド、サイトスター（Cytostar）など）又はシクロスポリンの投与により異種移植組織に対する特異的な寛容を誘導する免疫反応性抑制。悪性腫瘍異種移植が行われる動物に免疫抑制状態を引き起こすための公知の手段は免疫抑制される動物の健康状態に悪影響を及ぼし、そしてこの状態が実験結果に影響を及ぼすことが分かっている（Comisel V. et al, 2001, Romanian Journal of Comparative Oncology, 4,
295）。
【００１０】
また、移植遂行前、移植後、重水素減少水の有効な濃度を確立する試験の間に免疫学的な抑制処理を盛り込むことは、免疫学的に抑制された動物が正常の動物と比べて全く異なる応答を有するので供与量効果は真の効果ではなくなるという結果を招く。応答がないか、又は免疫学的観点からは応答水準が非常に低い。
【００１１】
異種移植に関連した別の重要な側面は、免疫抑制過程が引き起こされたとしても、免疫抑制された動物が４〜６週後には正常組織移植片又は悪性腫瘍組織を拒絶する能力を回復するという事実である。
【００１２】
特許番号ＵＳ５．８５５９２１号に記載される実験では、ヒト悪性腫瘍を動物に移植し、動物中に発生させると、重水素減少水処理を施している全期間、その悪性腫瘍は前記処理により退縮し、ついには排除されることが認められる。しかしながらこの場合、その排除は恐らく通常の免疫学的反応、すなわち前記のような宿主対腫瘍移植片反応の結果である。
【００１３】
また、悪性腫瘍を動物に移植した後に重水素減少水で処理すると転移に発展しないと言ってもそれは重水素減少水を投与した結果であるとは考えることができない。理由は、既に前記の説明のように、実験的に移植されたヒト悪性腫瘍は転移に発展しないか、又は発展するとしても非常に希であるからである。
【００１４】
特許番号ＵＳ５８５５９２１号では、実験の間に投与される重水素減少水の濃度は一定ではないので、単一の有効な濃度を確立できていない。このように、その実験の間には、開始から３週間にわたり３０ｐｐｍの重水素含量の水を投与し、次いで同じ群の動物に実験の終わりまで１１０〜１２０ｐｐｍの重水素含量の水を投与している。これが特許ＵＳ５８５５９２１号による重水素含量範囲を構成する様式である。
【００１５】
前記のことを顧慮すると、本発明の技術背景にあるGabor Somlaryl氏の実験は説得力がないものと結論することができる。なぜならば、投与した異種移植物に関する結果は、実験が行われた条件：それぞれ非常に広い濃度範囲で投与していること並びに事前に免疫抑制された動物にヒト腫瘍を使用していることによって影響を受けるからである。また、特許ＵＳ５．８５５．９２１号に示される実験からは、癌療法の所要時間は明示されていないか、あるいは、最大効果のための所要時間と濃度が示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明が解決する技術的問題は、ラットでの癌療法で最適な結果を得るために、水中の有効な重水素含量を実験的に生体内で決定する方法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、本方法は、動物移植片を腫瘍移植する前後で試験動物に重水素減少水を投与することにあり、以下の諸工程を経由する：
Ａ）非近交系ウィスターラットにＤ２濃度２５ｐｐｍ、Ｄ２濃度６０ｐｐｍおよびＤ２濃度１００ｐｐｍの重水素減少水を６０日の期間にわたり給餌投与し、それと同時に対照群の動物に同じ期間にわたり重水素含量１５０ｐｐｍの水（生水）を給餌する工程、
Ｂ）移植する腫瘍細胞の生存率をトリパンブルーにより確認する工程、
Ｃ）０．５ｃｃの通常生理食塩溶液中にてウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）とゲランＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）の悪性腫瘍細胞１×１０７個を６０日目の実験群と対照群の動物の皮下に移植する工程、ただし、これら両腫瘍細胞の生存率は９８％を越える。
Ｄ）連続的かつ長期にわたり重水素濃度２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、１００ｐｐｍの重水素減少水を給餌する工程。その全期間に以下のことを行う：
ａ．移植４日後から開始して２〜３日ごとに腫瘍結節の測定と検査を実施すること、
ｂ．動物の生理学的状態を監視するために、毎週秤量し、飼料と水の消費量を監視し、中毒状態の発生を報告すること、
ｃ．６０日後であって、対照群の全動物が死んだ時点で、好ましくは移植後１６０日目と２００日目の間の時点で、所定濃度の重水素減少水を投与して得られる効果を、実験群からの生存動物の生体恒常性に基づいて、あるいは、これらの動物の体液性免疫系と細胞性免疫系がどのように影響されたかに基づいて観察し、そのために動物の免疫学的状態についての一連の検査を行う、すなわち白血球成分試験によりリンパ球と芽細胞の濃度を確定し；造血骨髄試験によりプラズマ細胞とＮＫ−Ｋ細胞の濃度を確定すること、
Ｅ）試験された生存動物について、新たな生体恒常性の出現と、腫瘍退縮並びに癌治癒に関連して得られた所見とによって重水素減少水の有効な濃度を決定する工程。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による方法の利点は以下のとおりである：
−  該方法は同種腫瘍移植片を投与する方法であり、その知見は人体に拡張することが可能であり、他の特許出願人が同系動物（singeneic animal）を用いて得た知見とは異なる
−  有効な重水素濃度の正確な決定が可能である
−  方法の具体例での結果は正確かつ再現性があり、同種系に移植した腫瘍の腫瘍獲得（tumor catching）率は１００％であり、しかも腫瘍の自発的退縮がない
−  動物の免疫学的抑制は行われないので、偽の陽性結果の可能性を排除することができる
−  重水素濃度を確立するにあたり任意要素の導入がない
−  公知の実験腫瘍をスクリーニングに使用し、現在これを利用して細胞増殖抑制効果を評価している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明による方法実施態様について例示する。
【００２０】
本発明によれば、本方法は、動物移植片を腫瘍移植する前と後に、重水素減少水を試験動物（ラット）に投与することにある。
【００２１】
該方法は以下の工程を含む：
Ａ）腫瘍移植前の重水素減少水の投与
雄と雌のそれぞれの非近交系ウィスターラットであって、体重１２０±２０ｇを有し、臨床検査後に良好な生理学的状態が観察された約８００匹の試験動物を選択する。
【００２２】
試験動物を１ケージあたり７〜８匹に振り分けた（雄と雌は隔離する）。３群のラットに濃度２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、そして１００ｐｐｍの重水素減少水を６０日間にわたり投与し、それと同時に対照動物に１５０ｐｐｍの重水（生水）を同じ期間にわたり投与した。
【００２３】
Ｂ）移植しようとする腫瘍細胞の生存率の確認
移植遂行前に、移植される腫瘍細胞の生存率をトリパンブルーで確認する。この確認のために、腫瘍細胞を顕微鏡ブレード（microscope blade）上に集め、同種腫瘍から公知の手順に従って０．５ｃｃの通常の生理食塩溶液中に細胞を取得し、そして１〜２滴のトリパンブルーを添加する。青色に着色した細胞は死細胞である。細胞生存率の計算はブレード上に見える１０００個の細胞から死細胞を計数することによって行い、そうしてその結果を％に変換する。
【００２４】
細胞生存率は９８％を上回ることが望ましい。
【００２５】
Ｃ）実験動物と対照動物へのウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）とＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）の移植
動物に重水素減少水を投与した項目Ａ）による前処理から６０日目に、試験ラットと対照ラットの両方によく知られた手順を用いて移植を開始する、つまり０．５ｃｃの通常の生理食塩溶液中にてウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）とゲランのＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）の悪性腫瘍細胞１×１０７個を背面皮下に移植する。両肉腫の細胞の生存率は９８％より高い。
【００２６】
それぞれ３種の濃度：２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍの重水素減少水を与えた各２２０頭の３群の動物に移植を実施した。
【００２７】
２２０匹の試験動物の各グループの内、2つの７９匹からなるグル−プにはウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）を、そして他の７９匹のグループにはゲランのＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）を移植した。
【００２８】
他の動物は対照群として使用した。
【００２９】
Ｄ）対照群には１５０ｐｐｍの生重水（Deuterium tap water）を投与するのに対して重水素濃度２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、１００ｐｐｍの重水素減少水を給餌により連続的かつ長期にわたり投与
試験用の３群から構成される試験動物に、給餌により３種の濃度２５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、そして１００ｐｐｍの重水素減少水を７００日の期間にわたり投与した。試験動物への投与の開始と同時に、対照動物にも同様に毎日の給餌により重水素含量１５０ｐｐｍの生水を投与した。
【００３０】
前記試験の経過中に、以下のことを実施した：
ａ．移植後４日目に開始して、２〜３日おきに試験動物に発生する腫瘍結節の検査と測定を接種部位で行う。腫瘍発生率は全ての群にわたり１００％であった。腫瘍成長は、種々の腫瘍成長段階で２種の直径：長直径と短直径を測定することによって評価した。腫瘍容積は、方程式Ｖ＝ａ×ｂ２×０．４（式中、Ｖはｍｍ３で測定した容積；ａとｂは２種の直径、そして０．４は定数である）を用いて計算した
ｂ．動物の生理学的状態を、秤量、飼料と水の消費量の監視及び中毒現象（出血、下痢、脱毛など）の発生の観察によって毎日検査した。また、死亡率を毎日記録した。動物の秤量を腫瘍測定の開始時に行うが、それは突然の体重減少が中毒現象の表れとなることがあるからである
ｃ．６０日後であって、全ての対照動物が死んだ時点、好ましくは移植日後の１６０日目〜２００日目の間の時点で、指定濃度の重水素減少水によって得られた効果を、生存している試験動物の生体恒常性に基づいて、つまりこれらの動物で体液性免疫系と細胞性免疫系がどのように影響されたかに基づいて観察し、そのために動物の免疫学的状態の一連の検査を実施する、すなわち白血球成分試験によりリンパ球と芽細胞の水準、例えばＮｋ−Ｋ細胞と樹状細胞の存在の水準を確立し；腫瘍移植ゾーン、例えば腫瘍移植形成体（tumor grafted formation）の影響下にあるリンパ節域の造血骨髄を分析する。
【００３１】
Ｅ）新たな生体恒常性の出現と腫瘍退縮並びに癌治癒に関連して得られた結果に基づいて生存した試験動物にとっての重水素減少水の有効な濃度の決定
重水素減少水の抗腫瘍活性の評価をＮＣＩ（１９９０）の判定規準に従って実施した。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％）を測定し、この指標の５０％値から腫瘍成長への強力な阻害が判った。
【００３２】
動物の生存について以下を計算した：
−  平均生存日数（ＭＴＳ）
−  Ｔ／Ｃ比（処理／対照×１００）、これは１２５より大きくなければならない
−  生存日数延長率（ＩＬＳ％）、これは使用される実験系によっては２５〜３６を上回る値を有さねばならない
−  長期生存動物数対処理された動物数の計数。
【００３３】
引き続き、医薬調査で使用した実験モデルのＧＬＰ適合性調査のための標準的手順を踏んだ。ＧＬＰにより要求される２つの変数を満たした：独立（予想）変数、つまり全ての動物に同じ標準状態で接種された腫瘍細胞を同数使用すること（１×１０７腫瘍細胞）及び従属（判定規準）変数、つまり
−  潜伏期間（腫瘍移植から触知可能な腫瘍結節の出現までの日数として表される）
−  腫瘍発生率：腫瘍を有する動物数、腫瘍を有しない、つまり腫瘍排除された動物数
−  腫瘍移植から最後の動物が死亡するまでの平均生存日数（ＭＴＳ日数）。
【００３４】
結果
第一の結果として、腫瘍移植の前と後に食餌として通常の生水（水道水）が投与されている対照と重水素減少水、特に６０ｐｐｍの濃度の重水素減少水が投与されているラットの腫瘍の発生と腫瘍の進展に関して２つの大きな差異があるという事実が強調できる。
【００３５】
潜伏期間に関して、重水素減少水を６０ｐｐｍの濃度で与えた群において対照群に対して５日間の潜伏期間の延長が実証された。このことはウォーカー２５６腫瘍とゲランのＴ８腫瘍の両者について当てはまる。この潜伏期間の延長は、種々の腫瘍成長段階の腫瘍を有するラットの比率を左右した。
【００３６】
動物の生存に関して、以下のことが実証された：
−  腫瘍接種から６０日後に、６０ｐｐｍの濃度の重水素減少水を投与しゲランのＴ８腫瘍を移植した動物でＭＴＳの僅かな延長が示され、また、ウォーカー２５６腫瘍を移植した動物でＭＴＳの大きな延長が示された。ウォーカー２５６腫瘍を移植した動物で、腫瘍活性についての評価判定規準も大きな値を示した（Ｔ／Ｃ％＝１５０及びＩＬＳ％＝５０）
−  ６０ｐｐｍの濃度の重水素減少水で処理したウォーカー２５６腫瘍を移植した動物で、６０日目に、３３／４７匹（４１％）のラットが依然として生存しており、それに対し、２５ｐｐｍの重水素濃度の水で処理した動物では２０％であり、かつ１００ｐｐｍの重水で処理した動物では２８．５％であった
−  腫瘍接種日から６０日目までに、全ての対照動物は癌のため死んだ
−  ８０日目で、６０ｐｐｍの濃度の重水素減少水を投与しウォーカー２５６腫瘍を移植した動物７９匹のうち、２７匹は依然として生存しており、そのうち２２匹は腫瘍を全く有さなかった。癌を発生しないラットについての比率は３４％であった
−  ゲランのＴ８腫瘍と６０ｐｐｍの濃度の重水素減少水に関しては、１８４日目で、８／７７匹（１０．４％）のラットが癌を発生せず、１１／７７匹（１４．２％）が非常に遅い腫瘍成長を示した
−  ウォーカー腫瘍と６０ｐｐｍの濃度の重水素減少水に関しては、５８４日目で、２０／７０匹のラット、つまり２８．５％が依然として生きており、かつ８／６０匹（１１．１％）のラットが極めて遅延型の腫瘍成長を示した。
【００３７】
これらの結果は、本発明の手順による方法の適用後に出されたが、この結果の原因は、とりわけ体液媒介性と細胞媒介性の免疫系が細胞で変化したことであって、試験した２種類の悪性腫瘍（ウォーカー２５６とゲランのＴ８）の発生と成長の阻害はこれにより決定された。このことの証拠は以下によって説明される：
−  ウォーカー２５６腫瘍に関しては１６２日目に、そしてゲランのＴ８腫瘍に関しては１９２日目に、腫瘍成長が極めて遅い生存動物での白血球成分が、対照で１５〜２０％であるのに対して、約７０〜８０％の高い比率のリンパ球を示した
−  高い比率の樹状細胞（対照で０〜１％であるのに対して５〜８％）とＮＫ−Ｋ細胞（対照で０〜１％であるのに対して９〜１５％）が記録された；
−  ６０ｐｐｍの重水素減少水で処理した動物の造血骨髄では免疫芽細胞、プラズマ細胞及びマスト細胞が大きく浸潤しており、免疫反応に特異的な細胞型は体液媒介性であることが判明すると結論された；
−  リンパ球生成領域は造血骨髄と同じイメージであった；
−  極めて遅い成長を示す腫瘍の細胞型は対照で見られる細胞型とは全く異なる。したがって、対照では腫瘍細胞は約１００％の割合でその細胞型に由来するが、重水素減少水、特に６０ｐｐｍの重水素減少水を与えた動物では、これらの腫瘍細胞についての閾値は１０％を超過しておらず、残りの腫瘍細胞は壊死過程にあった；
−  リンパ球とＮＫ−Ｋ細胞による腫瘍への浸潤が見られる；
−  造血系（hematopoiety）の細胞形態学的分析によれば、連続的に専ら６０ｐｐｍの重水素減少水を１〜２年の期間にわたり消費したラットにおいて、白血球成分として高い水準のリンパ球（６０〜７５％）、芽球性リンパ系細胞（５〜７％）、および樹状細胞（５〜８％）及びＮＫ−Ｋ細胞（９〜１５％）の存在が示された。
【００３８】
従って、癌を乗り切ったラットでは、腫瘍移植の前後で６０ｐｐｍの重水素減少水を連続的に投与することによって、この意外な免疫刺激が非常に長期間残存することが判った。
【００３９】
本発明の手順による方法の適用により得られた結果に基づくと、６０ｐｐｍの重水素減少水を連続的に腫瘍移植前に６０日の期間にわたり投与し、かつこの種の水を長期にわたり投与することは、非近交系ウィスターラットが受けた２種の悪性腫瘍の発生と成長をまさに阻害し、最終的には、高い比率にて癌は進展せず、かつ腫瘍を有する動物の生存時間は有意に延長し、腫瘍の成長遅延の原因となる。
【００４０】
また、濃度６０ｐｐｍの重水素減少水は、長期にわたり連続的に投与した場合には、悪性腫瘍の発生と成長を阻害するための生体恒常性因子として作用すると言明できる。
【００４１】
癌を乗り切ったラットは、６０ｐｐｍの重水素減少水を連続的に投与した後に免疫系が非常に長期間残存するので、濃度６０ｐｐｍの重水素減少水が、それを投与した試験動物において新たな生体恒常性を引き起こし、体液媒介性と細胞媒介性の免疫系における細胞変化をもたらすと言明できる。
【００４２】
重水素減少水によって誘導された生体恒常性を維持するためには、前記の水の投与を、一度開始したら不用意に中断することなく無期限に継続することが望ましく、この継続を止めると惹起した生体恒常性が簡単に乱され、重水素減少水以前の生体恒常性段階に逆戻りし、その場合の生体恒常性状態が再び悪性クローンの増殖を促進する。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月26日(2005.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重水素減少水の癌治療に有効な濃度を試験動物の生体内試験で決定する方法であって、動物移植片を腫瘍移植する前後で試験動物に重水素減少水を投与するにあたり、以下の諸工程を経由することを特徴とする方法：
Ａ）非近交系ウィスターラットに濃度１００ｐｐｍ以下の重水素減少水を６０日の期間にわたり給餌投与し、それと同時に対照群の動物に同じ期間にわたり重水素含量１５０ｐｐｍの水（生水）を給餌する工程、
Ｂ）移植する腫瘍細胞の生存率をトリパンブルーにより確認する工程、
Ｃ）０．５ｃｃの通常生理食塩溶液中にてウォーカー２５６肉腫（充実性腫瘍）とゲランＴ８リンパ球好性上皮種（充実性腫瘍）の悪性腫瘍細胞１×１０７個を６０日目の実験群と対照群の動物の皮下に移植する工程、ただし、これら両腫瘍細胞の生存率は９８％を越える、
Ｄ）連続的かつ長期にわたり重水素濃度１００ｐｐｍ以下の重水素減少水を給餌する工程、その全期間に以下のことを行う：
ａ．移植４日後から開始して２〜３日ごとに腫瘍結節の測定と検査を実施すること、
ｂ．動物の生理学的状態を監視するために、毎週秤量し、飼料と水の消費量を監視し、中毒状態の発生を報告すること、
ｃ．６０日後であって、対照群の全動物が死んだ時点で、好ましくは移植後１６０日目と２００日目の間の時点で、所定濃度の重水素減少水を投与した場合に得られる効果を、実験群からの生存動物の生体恒常性に基づいて、あるいは、これらの動物の体液性免疫系と細胞性免疫系がどのように影響されたかに基づいて観察し、そのために、動物の免疫学的状態についての一連の検査を行う、すなわち白血球成分試験によりリンパ球と芽細胞の濃度を確定し；造血骨髄試験によりプラズマ細胞とＮＫ−Ｋ細胞の濃度を確定すること、
Ｅ）試験された生存動物について、新たな生体恒常性の出現と、腫瘍退縮並びに癌治癒に関連して得られた所見とによって重水素減少水の有効な濃度を決定する工程。
【請求項２】
この方法により、濃度６０ｐｐｍの重水素減少水が癌治療及び癌予防に最も有効な濃度であると決定され、そのためにこの種の水を毎日の食餌として連続的かつ長期に投与することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【国際調査報告】
2007502406.tif 000002
2007502406.tif 000003
2007502406.tif 000004