(57)【要約】  本発明は、哺乳動物において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して、免疫応答を誘導する方法を提供する。本方法は、哺乳動物に、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ以上のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクター組成物を投与し、その結果、哺乳動物においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する。本発明は、ＨＩＶクレイドＡ  Ｅｎｖタンパク質、ＨＩＶクレイドＢ  Ｅｎｖタンパク質、ＨＩＶクレイドＣ  Ｅｎｖタンパク質、並びにＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質をコードする４つのアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクター組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物にアデノウイルスベクター組成物を投与することを含み、アデノウイルスベクター組成物が２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ以上のアデノウイルスベクターを含み、それによりＨＩＶ抗原が哺乳動物において産生され、かつＨＩＶに対する免疫応答が誘導される、方法。
【請求項２】
アデノウイルスベクター組成物が、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする２つ以上のアデノウイルスベクターを含み、各々のアデノウイルスベクターが、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アデノウイルスベクター組成物が、３つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする３つ以上のアデノウイルスベクターを含み、各々のアデノウイルスベクターが、３つ以上の異なるＨＩＶ抗原のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
アデノウイルスベクター組成物が、４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする４つ以上のアデノウイルスベクターを含み、各々のアデノウイルスベクターが、４つ以上の異なるＨＩＶ抗原のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
１つ以上のアデノウイルスベクターの各々が、（ｉ）２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列、又は（ｉｉ）異なるＨＩＶ抗原を各々コードする２つ以上の核酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
１つ以上のアデノウイルスベクターの各々が、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１つ以上のアデノウイルスベクターの各々が、異なるＨＩＶ抗原を各々コードする２つ以上の核酸配列を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルスベクター組成物のアデノウイルスベクターによってコードされるＨＩＶ抗原と同じである少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むプライマー組成物を、哺乳動物に投与することをさらに含み、プライマー組成物の投与が、アデノウイルスベクター組成物の投与の少なくとも一週前に行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
プライマー組成物が、アデノウイルスベクター組成物の１つ以上のアデノウイルスベクターによってコードされるＨＩＶ抗原と同じである２つ以上のＨＩＶ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
プライマー組成物の投与が、アデノウイルスベクター組成物の投与の約六ヶ月から約九ヶ月前に行われる、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
プライマー組成物が、１つ以上の核酸配列を含む１つ以上のプラスミド、裸のＤＮＡ分子、又はウイルスベクターを含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１つ以上の必須遺伝子機能を欠損する、請求項１２記載の方法。  
【請求項１４】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１つ以上の必須遺伝子機能を欠損する、請求項１２又は１３記載の方法。  
【請求項１５】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ３領域の１つ以上の遺伝子機能を欠損する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのＨＩＶ抗原が、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質、ＨＩＶ  Ｐｏｌタンパク質、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）タンパク質、ＨＩＶ  Ｖｉｆタンパク質、ＨＩＶ  Ｖｐｒタンパク質、ＨＩＶ  Ｖｐｕタンパク質、ＨＩＶ  Ｖｐｏタンパク質、ＨＩＶインテグラーゼタンパク質、ＨＩＶ  Ｎｅｆタンパク質、及びＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質、ＨＩＶ  Ｐｏｌタンパク質、又はＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の全て又は一部を含む融合タンパク質からなる群より選ばれる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのＨＩＶ抗原が、ＨＩＶ  ｇｐ１４０又はｇｐ１４０ｄｖ１２である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのＨＩＶ抗原が、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質の全て又は一部及びＨＩＶ  Ｐｏｌタンパク質の全て又は一部を含む融合タンパク質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＨＩＶ抗原が、ＨＩＶクレイドＡ抗原、ＨＩＶクレイドＢ抗原、ＨＩＶクレイドＣ抗原、及びＨＩＶクレイドＭＮ抗原からなる群より選ばれる少なくとも１つのメンバーを含む、請求項1〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＨＩＶ抗原が、ＨＩＶクレイドＡ抗原、ＨＩＶクレイドＢ抗原、ＨＩＶクレイドＣ抗原、及びＨＩＶクレイドＭＮ抗原からなる群より選ばれる少なくとも２つのメンバーを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
アデノウイルスベクターが、３つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードし、ＨＩＶ抗原が、ＨＩＶクレイドＡ抗原、ＨＩＶクレイドＢ抗原、ＨＩＶクレイドＣ抗原、及びＨＩＶクレイドＭＮ抗原からなる群より選ばれる少なくとも３つのメンバーを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
アデノウイルスベクター組成物が、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物の一部として投与される、請求項1〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
医薬組成物が、２つ以上の用量において投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
医薬組成物が、１×１０８から１×１０１２粒子単位（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含む用量において投与される、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、１×１０８から１×１０１０ｐｕのアデノウイルスベクターを含む用量において投与される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、１×１０９から１×１０１１ｐｕのアデノウイルスベクターを含む用量において投与される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、１×１０１０から１×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む用量において投与される、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
アデノウイルスベクター組成物が、（ａ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｂ）ＨＩＶクレイドＡ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｃ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、並びに（ｄ）ＨＩＶクレイドＣ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質が、ＨＩＶプロテアーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、及びインテグラーゼタンパク質をさらにコードする核酸配列によってコードされ、核酸分子が、１つ以上の点突然変異を含み、該点突然変異が、プロテアーゼ、ＲＴ、及びインテグラーゼタンパク質を非機能的にする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Ｅｎｖタンパク質がｇｐ１４０又はｇｐ１４０ｄｖ１２である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
アデノウイルスベクター組成物が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７の核酸配列をそれぞれ有する４つのアデノウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｂ）ＨＩＶクレイドＡ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｃ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、並びに（ｄ）ＨＩＶクレイドＣ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、アデノウイルスベクター組成物。
【請求項３３】
ＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質が、ＨＩＶプロテアーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、及びインテグラーゼタンパク質をさらにコードする核酸配列によってコードされ、核酸分子が、１つ以上の点突然変異を含み、該点突然変異が、プロテアーゼ、ＲＴ、及びインテグラーゼタンパク質を非機能的にする、請求項３２記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項３４】
Ｅｎｖタンパク質が、ｇｐ１４０又はｇｐ１４０ｄｖ１２である、請求項３２記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項３５】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７の核酸配列をそれぞれ有する、請求項３２記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項３６】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項３２〜３５のいずれかに記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項３７】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１つ以上の必須遺伝子機能を欠損する、請求項３６記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項３８】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１つ以上の必須遺伝子機能を欠損する、請求項３６又は３７記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項３９】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ３領域の１つ以上の遺伝子機能を欠損する、請求項３２〜３８のいずれかに記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項４０】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）が、組成物中に３：１：１：１の重量比で存在する、請求項３２〜３９のいずれかに記載のアデノウイルスベクター組成物。
【請求項４１】
請求項３２〜４０のいずれかに記載のアデノウイルスベクター組成物及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７の核酸配列をそれぞれ有する、請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４３】
約１×１０８から１×１０１２粒子単位（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含む、請求項４１又は４２記載の医薬組成物。
【請求項４４】
約１×１０８から１×１０１０ｐｕのアデノウイルスベクターを含む、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４５】
約１×１０９から１×１０１１ｐｕのアデノウイルスベクターを含む、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４６】
約１×１０１０から１×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む、請求項４３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本特許出願は、２００４年４月１２日に出願された米国仮特許出願番号６０／５６１，３４１の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府後援の研究及び開発に関する記述
本発明は、ＧｅｎＶｅｃ，Ｉｎｃ．と国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）を代表する米国公衆衛生局との間で施行された、共同研究開発契約（ＣＲＡＤＡ）番号ＡＩ−１０３４、及びその改定の下での政府の支援で部分的になされた。政府は、本発明において、一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は、米国において、８５０，０００〜９５０，０００人の人々がＨＩＶ感染とともに暮らし、およそ２５％が彼らの感染に気づいていないと見積もっている（非特許文献１）。世界的には、新たなＨＩＶ感染の速度は、受け入れ難いほど高いレベルで増加し続けている。新たなＡＩＤＳの診断及び死は、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の出現以来、先進国においては大いに減少したが、発展途上世界においては、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの流行は加速し続けている。その流行の世界的な影響は考慮すべきである。Ｊｏｉｎｔ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｏｎ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ及び世界保健機構によると、２００２年末現在、４０００〜４２００万人の人々がＨＩＶ／ＡＩＤＳとともに暮らし、世界の合計の９５％が発展途上世界に居住すると見積もられた（非特許文献２、３）。世界的には、２００３年における、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに起因する死は推定２５０〜３５０万人であり（非特許文献３）、その流行の始まり以来、ＨＩＶ感染の結果として、３０００万人もの数に上る死があった（非特許文献２）。ＨＩＶ／ＡＩＤＳという人類の悲劇を超えて、その流行の費用は、多くの国の経済成長及び政治的安定度に大いなる障壁をもたらす。発展途上国において及び米国の人々の部分において、抗ＨＩＶ療法は頻繁に予算範囲を超える。したがって、ＨＩＶ予防のための効果的な低費用の手段（例えばワクチン）が、ＨＩＶの流行を制御下に置くために、早急に必要とされている。
【０００４】
治療法として又は生物学的に適切な量の免疫応答を誘導するためのタンパク質の送達は、数十年間、薬物及びワクチン開発の障害物となってきた。伝統的な抗原送達アプローチの成功した代替物であることを証明された１つの解決法は、インビボでの抗原分子の産生のための外因性核酸配列の送達である。遺伝子移入ベクターは、理想的には幅広い種類の細胞型に入り、大きな核酸配列を受け入れる許容量があり、安全であり、患者の処置のために必要な量で産生され得る。ウイルスベクターはこれらの有利な性質を有し、生物学的障害を処置又は予防する種々のプロトコルにおいて用いられている。
【０００５】
それらの有利な性質にも関わらず、ウイルス遺伝子移入ベクターの広範な使用は、いくつかの要因によって、妨げられている。この関連で、一定の細胞は、現在入手可能なウイルスベクターによる遺伝子送達を容易に受け入れない。例えば、リンパ球は、アデノウイルスの取り込みにおいて、正常に機能しない（非特許文献４）。
【０００６】
ウイルス遺伝子移入ベクターの使用はまた、ウイルスベクターの免疫原性によって邪魔される。米国の人々の大多数は、遺伝子移入ベクター（例、アデノウイルス）として現在開発下の多数のウイルスの野生型の形態にさらされてきた。その結果、米国の人々の多くは、一定のウイルスベースの遺伝子移入ベクターに、既存の免疫を発達させてきた。そのようなベクターは、血流から急速に除去され、それによって生物学的に適切な量の遺伝子産物の送達の際のベクターの有効性を低減させる。その上、一定のウイルスベクターの免疫原性は、病原体に対する免疫系を「ブーストする（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」のに有利であり得る、効率的な繰り返し投薬を妨げ、そしてウイルスベクターの服用量のうちの小量のみが、有効積載量を宿主細胞に送達される結果をもたらす。
【０００７】
さらに、ＨＩＶワクチンとしてのウイルスベクターの設計における主要な挑戦は、可能な限り幅広い範囲の多様性にわたる防御性の体液性及び細胞性免疫応答についての重要な決定因子であるウイルスの構造を、同定及び標的化することである。数々の普及しているＨＩＶ亜類型からの免疫原の規定混合物を含有する、多価ワクチンの使用は、広範囲に保護的なＨＩＶワクチンを達成するのにふさわしいアプローチであるかもしれない。
【０００８】
したがって、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導するための方法及び組成物の改善への必要性が依然として存在する。本発明は、そのような方法及び組成物を提供する。本発明のこれら及び他の利点、並びに本発明のさらなる特徴は、本明細書中に提供される発明の記述から明白になる。
【非特許文献１】ＣＤＣ，Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．，５２（４７），１１４５−８（２００３）
【非特許文献２】ＷＨＯ，Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ３  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｂｙ  ２００５：ＷＨＯ戦略，ジュネーブ，スイス．ｐ．１−５３（２００３）
【非特許文献３】国連合同エイズ計画（ＵＮＡＩＤＳ），ＡＩＤＳ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００３
【非特許文献４】Ｓｉｌｖｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６５，３７７−３８７（１９８８）；Ｈｏｒｖａｔｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２（１），３４１−３４５（１９８８）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本方法は、哺乳動物にアデノウイルスベクター組成物を投与することを含み、そのアデノウイルスベクター組成物は、ＨＩＶ抗原が哺乳動物において産生され、ＨＩＶに対する免疫応答が誘導されるような、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ以上のアデノウイルスベクターを含む。
【００１０】
本発明はまた、（ａ）ＨＩＶクレイド（ｃｌａｄｅ）Ａ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｂ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｃ）ＨＩＶクレイドＣ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、並びに（ｄ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、アデノウイルスベクター組成物を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本方法は、アデノウイルスベクター組成物を哺乳動物に投与することを含み、そのアデノウイルスベクター組成物は、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ以上のアデノウイルスベクターを含む。
【００１２】
本発明はまた、アデノウイルスベクター組成物を提供する。アデノウイルスベクター組成物は、（ａ）ＨＩＶクレイドＡ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｂ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、（ｃ）ＨＩＶクレイドＣ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、並びに（ｄ）ＨＩＶクレイドＢ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む。
【００１３】
「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を誘発する分子である。「免疫応答」は、例えば抗体産生及び／又は免疫エフェクター細胞の活性化を内包し得る。本発明の文脈におけるＨＩＶ抗原は、哺乳動物において免疫応答を引き起こす、任意のタンパク性のＨＩＶ分子又はその部分でを含み得る。「ＨＩＶ分子」は、ヒト免疫不全ウイルスの一部であるか、ヒト免疫不全ウイルスの核酸配列によってコードされるか、あるいは任意のそのような分子に由来するか、又はそのような分子を合成の基礎とする、分子である。本発明にしたがって免疫応答を引き起こすＨＩＶ抗原の投与は、好ましくはＨＩＶに対する防御性免疫につながる。この関連で、ＨＩＶへの「免疫応答」は、任意の１つ以上のＨＩＶ抗原への免疫応答である。
【００１４】
適切なＨＩＶ抗原の例としては、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、逆転写酵素(ＲＴ)、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｐｏ、インテグラーゼ、又はＮｅｆタンパク質の全て又は一部が挙げられる。好ましくは、２つ以上のＨＩＶ抗原の各々は、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及び／又はＰｏｌタンパク質の全て又は一部を含む。適切なＥｎｖタンパク質は、当技術分野で公知であり、例としては、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１４５、及びｇｐ１４０が挙げられる。さらに、ＨＩＶ抗原は、インビボで増強された免疫原性を示す改変Ｅｎｖタンパク質であり得る。例えば、抗原は、Ｅｎｖタンパク質の切断部位、融合ペプチド、又はヘリックス間コイルドコイルドメインにおける変異を含むＥｎｖタンパク質（ΔＣＦＩ  Ｅｎｖタンパク質）であり得る（例、Ｃａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１、９８０８−９８１２（１９９７），及びＹａｎｇら，Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.，７８、４０２９−４０３６（２００４）参照）。
【００１５】
ＨＩＶクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＭＮなどを含む、ＨＩＶの任意のクレイドは、抗原選択に適当である。したがって、当然のことながら、以下のＨＩＶ抗原は本発明の方法に用いられ得る：ＨＩＶクレイドＡ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及び／又はＰｏｌ；ＨＩＶクレイドＢ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及び／又はＰｏｌタンパク質；ＨＩＶクレイドＣ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及び／又はＰｏｌタンパク質；並びにＨＩＶクレイドＭＮ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及び／又はＰｏｌタンパク質。抗原はＧａｇ、Ｅｎｖ、及び／又はＰｏｌタンパク質であることが好ましいが、哺乳動物において免疫応答を誘導し得る任意のＨＩＶタンパク質又はその部分が、本発明の方法に関連して用いられ得る。異なるＨＩＶクレイド（例、ＨＩＶクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、ＭＮ等）からのＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及びＰｏｌタンパク質、並びにそのようなタンパク質をコードする核酸配列及びそのような核酸配列の操作及びそのベクター中への挿入のための方法が、公知である （例、ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，ＡＩＤＳ部門，国立アレルギー感染症研究所（２００３），ＨＩＶ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ.ｌａｎｌ.ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌ），Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，コールドスプリングハーバー出版社，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（１９８９），及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン出版連合及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．（１９９４）参照）。
【００１６】
当然のことながら、免疫応答を産生するのに、インタクトなＨＩＶタンパク質全体は必要ない。実際に、ＨＩＶタンパク質のほとんどの抗原性エピトープは比較的サイズが小さい。したがって、本明細書中に記載の任意のＨＩＶタンパク質のような、ＨＩＶタンパク質の断片（例、エピトープ又は他の抗原性断片）が、ＨＩＶ抗原として用いられ得る。ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、及びＰｏｌタンパク質の抗原性断片及びエピトープ、並びにそのような抗原性断片及びエピトープをコードする核酸配列が、公知である（例、ＨＩＶ免疫学及びＨＩＶ／ＳＩＶワクチンデータベース、第１巻、ＡＩＤＳ部門、国立アレルギー感染症研究所（２００３）参照）。
【００１７】
ＨＩＶ抗原としてはまた、融合タンパク質及びポリタンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、他方に融合しているか、あるいは異なるＨＩＶタンパク質又は他のポリペプチドの全て又は一部に融合している、１つ以上の抗原性ＨＩＶタンパク質断片（例、エピトープ）を含み得る。融合タンパク質は、本明細書中に記載される任意のＨＩＶ抗原の全て又は一部を含み得る。例えば、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質（例、ｇｐ１２０又はｇｐ１６０）の全て又は一部は、ＨＩＶ  Ｐｏｌタンパク質の全て又は一部と融合し得るか、あるいはＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質の全て又は一部は、ＨＩＶ  Ｐｏｌタンパク質の全て又は一部と融合し得る。そのような融合タンパク質は、本発明の文脈中では複数のＨＩＶ抗原を効率的に提供し、そして単一のＨＩＶ抗原によって生じるのと比較して、所定のＨＩＶ病原体に対して、より完全な免疫応答を生じるのに用いられ得る。同様に、ポリタンパク質もまた、複数のＨＩＶ抗原を提供し得る。本発明に関連して有用なポリタンパク質としては、本明細書中に記載の任意のＨＩＶ抗原の２つ以上のもののような、２つ以上のＨＩＶ抗原を提供するものが挙げられる。アデノウイルスベクターを介した融合タンパク質又はポリタンパク質の哺乳動物への送達は、免疫系が、単一の核酸配列を用いた複数の抗原に曝されることを可能にし、したがって、単一の組成物が、複数のＨＩＶ抗原又は単一の抗原の複数のエピトープに対する免疫を提供することを、都合よく可能にする。ＨＩＶ抗原の融合タンパク質及びポリタンパク質をコードする核酸配列は、公知の方法（例、米国特許第５，１３０，２４７号及び同第５，１３０，２４８号、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）及びＡｕｓｕｂｅｌら（同上）参照）によって調製され、そしてベクター中へと挿入され得る。
【００１８】
アデノウイルスベクター組成物は、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ以上のアデノウイルスベクターを含む。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクター中へと挿入された核酸配列により、抗原を「コード」することが知られている。ＨＩＶ抗原は、それらが異なる抗原性アミノ酸配列を含む場合に「異なる」。２つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、本明細書中に記載されている２つ以上のＨＩＶ抗原のような、任意のＨＩＶ抗原であり得る。好ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、３つ以上、又はさらには４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする、１つ以上のアデノウイルスベクターを含む。当然のことながら、哺乳動物の免疫系を、異なるＨＩＶ抗原の「反応混液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）」に曝すことは、免疫系を単一のＨＩＶ抗原のみに曝すよりも、より広範かつより効果的な免疫応答を引き出し得る。
【００１９】
２つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、異なるＨＩＶタンパク質（例、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ等)又は異なるＨＩＶクレイド（例、ＨＩＶクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＭＮ等）からの２つ以上の抗原によって、提供され得る。例えば、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質及びＰｏｌタンパク質は異なる抗原である。同様に、ＨＩＶクレイドＡ  Ｅｎｖタンパク質及びＨＩＶクレイドＢ  Ｅｎｖタンパク質は異なるＨＩＶ抗原である。好ましくは、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、２つ以上の異なるＨＩＶクレイドからのＨＩＶ抗原を含む。より好ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、３つ以上の異なるＨＩＶクレイドからの３つ以上の異なるＨＩＶ抗原、又は更には、４つ以上の異なるＨＩＶクレイドからの４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする、アデノウイルスベクターを含む。あるいは、２つ以上のＨＩＶ抗原の少なくとも１つは、２つ以上の異なるＨＩＶクレイドから取得された同じ抗原由来のアミノ酸配列を含む、キメラ抗原であり得る。例えば、キメラＥｎｖタンパク質は、クレイドＡ  ＨＩＶから取得したＥｎｖアミノ酸配列の部分及びクレイドＢ  ＨＩＶから取得したＥｎｖアミノ酸配列の部分を含み得る。
【００２０】
アデノウイルスベクター組成物は、例えば、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原を各々コードする１つ以上のアデノウイルスベクター（例、単一のアデノウイルスベクター）を含む組成物によって、又は１つ以上の異なるＨＩＶ抗原を各々コードする２つ以上のアデノウイルスベクター（例、複数のアデノウイルスベクター）を含む組成物によって、提供され得、それによって、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をまとめてコードする。アデノウイルスベクター組成物が、２つ以上のＨＩＶ抗原を各々コードする１つ以上のアデノウイルスベクター（例、単一のアデノウイルスベクター）を含む場合、各アデノウイルスベクターは、（ｉ）２つ以上の異なるＨＩＶ抗原（例、ポリタンパク質又は融合タンパク質）をコードする核酸配列、あるいは（ｉｉ）異なるＨＩＶ抗原を各々コードする２つ以上の核酸配列を含み得る。構成（ｉ）と一致して、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原（例、３つ以上、４つ以上、又はさらには５つ以上の異なるＨＩＶ抗原）をコードするか、あるいは少なくとも２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードするという条件で、複数コピーの同じ抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを用いることは、本発明の範囲内である。同様に、構成（ｉｉ）と一致して、アデノウイルスベクターが少なくとも２つの異なるＨＩＶ抗原をコードするという条件で、異なるＨＩＶ抗原、又は複数コピーの同じ抗原を各々コードする数個の核酸配列（例、３つ以上、４つ以上、又はさらには５つ以上の異なる核酸配列）を含むアデノウイルスベクターを用いることは、本発明の範囲内である。構成（ｉ）であろうと（ｉｉ）であろうと、アデノウイルスベクター組成物は好ましくは、３つ以上、又はさらには４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする、１つ以上のアデノウイルスベクター（例、各ベクターが、３つ以上、又は４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含むか、あるいは各ベクターが、３つ以上、又は４つ以上の核酸配列を含み、そして各核酸配列が異なるＨＩＶ抗原をコードする）を含む。望ましくは、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の異なるＨＩＶクレイドからのものである。
【００２１】
好ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする２つ以上のアデノウイルスベクターを含み、そして各アデノウイルスベクターは、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む。アデノウイルスベクター組成物が、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする２つ以上のアデノウイルスベクターを含むものの、アデノウイルスベクター使用の数又はそれによってコードされる異なるＨＩＶ抗原の数の上限はない。好ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、３つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする３つ以上のアデノウイルスベクターを含み、そして各アデノウイルスベクターは、３つ以上の異なるＨＩＶ抗原の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む。最も好ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする４つ以上のアデノウイルスベクターを含み、そして各アデノウイルスベクターは、４つ以上の異なるＨＩＶ抗原の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む。望ましくは、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の異なるＨＩＶクレイドからのものである。
【００２２】
もちろん、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、上記の構成のアデノウイルスベクターの組み合わせが用いられ得る。例えば、本発明に従って用いられるアデノウイルスベクター組成物は、単一のＨＩＶ抗原をコードする第一のアデノウイルスベクター及び第一のアデノウイルスベクターによってコードされるＨＩＶ抗原とは異なる２つ以上のＨＩＶ抗原をコードする第二のアデノウイルスベクターを含み得る。本明細書中に開示されているアデノウイルスベクターの構成の他の類似の組み合わせ及び順列は明白であり、本発明に従って用いられ得る。
【００２３】
アデノウイルスベクター組成物が２つ以上のアデノウイルスベクターを含む場合、組成物に含有される２つ以上のアデノウイルスベクターの各々の相対量は、他のＨＩＶ抗原と比較した特定のＨＩＶ抗原の免疫原性を含む、数々の要因次第である。アデノウイルスベクター組成物は、２つ以上のアデノウイルスベクターの各々の等量を含み得る。あるいは、アデノウイルスベクター組成物は、２つ以上のアデノウイルスベクターの各々の異なる量を含み得る。
【００２４】
本発明の特に好ましい実施形態では、アデノウイルスベクター組成物は、それぞれクレイドＢ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質、クレイドＡ  ｇｐ１４０、クレイドＢ  ｇｐ１４０、及びクレイドＣ  ｇｐ１４０をコードする核酸配列を各々含む、４つのアデノウイルスベクターを含む。最も好ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７の核酸配列を有する、４つのアデノウイルスベクターを含む。配列番号４は、クレイドＢ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする、Ｅ１／Ｅ４−欠損アデノウイルスベクターの核酸配列である。配列番号５は、クレイドＡ  ｇｐ１４０タンパク質をコードする、Ｅ１／Ｅ４−欠損アデノウイルスベクターの核酸配列である。配列番号６は、クレイドＢ  ｇｐ１４０タンパク質をコードする、Ｅ１／Ｅ４−欠損アデノウイルスベクターの核酸配列である。配列番号７は、クレイドＣ  ｇｐ１４０タンパク質の核酸配列である。望ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、以下のアデノウイルスベクターを、それぞれ３：１：１：１の重量比において含む：クレイドＢ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター、クレイドＡ  ｇｐ１４０をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター、クレイドＢ  ｇｐ１４０をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター、及びクレイドＣ  ｇｐ１４０をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター。
【００２５】
典型的には、アデノウイルスベクターは、発現カセットの一部として１つ以上のＨＩＶ抗原をコードする核酸、即ち、核酸配列（例、１つ以上の制限部位）のサブクローニング及び回収あるいは核酸配列（例、ポリアデニル化又はスプライス部位）の発現を促進する機能を保有する特定のヌクレオチド配列を含む。核酸は、好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域中に位置するか（例、Ｅ１領域を全体又は一部で置換する）あるいはＥ４領域中に位置する。例えば、Ｅ１領域は、抗原をコードする核酸を含むプロモーター可変発現カセットによって、置換され得る。発現カセットは、必要に応じて、３’−５’配向（例、発現カセットの転写の方向が、周囲の隣接アデノウイルスゲノムと逆となるような配向）にて挿入され得る。しかしながら、発現カセットが、周囲のゲノムの転写の方向に関して５’−３’配向において挿入されることもまた適当である。抗原をコードする核酸を含む発現カセットに加えて、アデノウイルスベクターは、他の外因性核酸を含む他の発現カセットであって、アデノウイルスゲノムの任意の欠失領域を置換することが可能なカセットを、含み得る。アデノウイルスゲノム中（例、ゲノムのＥ１領域中）への発現カセットの挿入は、公知の方法、例えば、アデノウイルスゲノムの所定の位置での独特な制限部位の導入、によって促進され得る。上で説明したように、好ましくは、アデノウイルスベクターのＥ３領域の全て又は一部もまた、欠失される。
【００２６】
好ましくは、抗原コーディング核酸は、例えば、プロモーター可変発現カセットの一部として、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントと機能可能に連結している（即ち、転写制御下にある）。配列を機能可能に一緒に連結する技術は、当技術分野では周知である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。核酸配列は、プロモーターがその核酸配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに「機能可能に連結している」。プロモーターは、それが機能可能に連結している核酸配列に対して、ネイティブ又は非ネイティブであり得る。
【００２７】
任意のプロモーター（即ち、天然から単離されたか、あるいは組換えＤＮＡ又は合成技術によって産生されたかに関わらず）は、本発明に関連して、核酸配列の転写を提供するために、用いられ得る。プロモーターは、好ましくは、真核生物（望ましくは哺乳動物）細胞において、転写を指示し得る。プロモーターの機能は、ベクター上に存在する１つ以上のエンハンサー及び／又はサイレンサーの存在によって、変更され得る。「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害する、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーはまた、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、エンハンサーがいずれの配向でも、そして転写領域の下流の位置からであっても、数キロベース対（ｋｂ）もの距離にわたって、機能し得るという点で、プロモーターにおいてのみ見出される配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質についてのＤＮＡ結合部位（それらは「プロモーターエレメント」とも呼ばれる）とは異なる。
【００２８】
プロモーター領域は、長さ及び配列において変動し得、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質及び／あるいはエンハンサー又はサイレンサーの１つ以上のＤＮＡ結合部位をさらに含み得る。エンハンサー及び／又はサイレンサーは、同様に、プロモーター自体の外側の核酸配列上に存在し得る。望ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーのような、細胞性又はウイルスのエンハンサーは、プロモーター活性を増強するために、プロモーターに近接して配置され得る。加えて、スプライスアクセプター及びドナー部位は、転写を増強するために、核酸配列上に存在し得る。
【００２９】
任意の適切なプロモーター又はエンハンサー配列は、本発明の文脈において用いられ得る。この点において、抗原コーディング核酸配列は、ウイルスプロモーターに機能可能に連結し得る。適切なウイルスプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（例えば、米国特許第５，１６８，０６２号及び同第５，３８５，８３９号に記載）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端反復プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来するプロモーター、ＲＳＶ長末端反復のようなラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，１４４−１４５（１９８１））のようなＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０又はエプスタインバーウイルスに由来するプロモーター、ｐ５プロモーターのようにアデノ随伴ウイルスのプロモーターなどが挙げられる。
【００３０】
あるいは、本発明は、細胞プロモーター、即ち、細胞タンパク質の発現を駆動するプロモーターを用いる。本発明での使用のために好ましい細胞プロモーターは、抗原を産生するのに望ましい発現プロファイルに依存する。１つの局面では、細胞プロモーターは、好ましくは、本明細書中に記載されている免疫細胞のような、種々の細胞型で働く構成的プロモーターである。適切な構成的プロモーターは、真核細胞に共通の転写因子、ハウスキーピング遺伝子、又は構造遺伝子をコードする遺伝子の発現を駆動し得る。例えば、Ｙｉｎｇ  Ｙａｎｇ  １（ＹＹ１）転写因子（ＮＭＰ−１、ＮＦ−Ｅ１、及びＵＣＲＢＰとも呼ばれる）は、核マトリクスの固有成分である、遍在性の核内転写因子である（Ｇｕｏら，ＰＮＡＳ，９２，１０５２６−１０５３０（１９９５））。本明細書中に記載されているプロモーターは、構成的プロモーターとみなされるものの、当技術分野においては、構成的プロモーターは上方調節され得ることが理解される。プロモーター解析は、基底転写に重要なエレメントが、プロモーターからの転写開始部位を起点として、ＹＹ１遺伝子の−２７７から＋４７５までに存在し、そしてＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴボックスを含有することを示す。ＪＥＭ−１（ＨＧＭＷ及びＢＬＺＦ−１としても知られる）もまた、正常及び腫瘍性の組織で同定されている、遍在性の核内転写因子である（Ｔｏｎｇら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２（１１），１７３３−１７４０（１９９８），及びＴｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６９（３），３８０−３９０（２０００））。ＪＥＭ−１は細胞の増殖制御及び成熟に関与し、レチノイン酸によって上方調節され得る。ＪＥＭ−１プロモーターの最大活性を担う配列は、プロモーターからの転写開始部位を起点として、ＪＥＭ−１遺伝子の−４３２から＋１０１に位置する。ＹＹ１プロモーターとは異なり、ＪＥＭ−１プロモーターはＴＡＴＡボックスを含まない。ユビキチンプロモーター（具体的にはＵｂＣ）は、いくつかの種において機能的である、強力な構成的活性プロモーターである。ＵｂＣプロモーターは、Ｍａｒｉｎｏｖｉｃら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９），１６６７３−１６６８１（２００２）において、さらに特徴付けられている。
【００３１】
上記のプロモーターの多くは、構成的プロモーターである。構成的プロモーターである代わりに、プロモーターは、調節可能なプロモーター、即ち、適当なシグナルに応じて、上方及び／又は下方調節されるプロモーターであり得る。調節可能なプロモーター又は発現制御配列の使用は、特に、相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）細胞株に毒性がある、ウイルスおよび寄生虫抗原を含む抗原性タンパク質としてＤＮＡワクチン開発に応用できる。１つの実施形態において、抗原コーディング核酸配列に機能可能に連結した調節配列としては、テトラサイクリン発現系の成分（例、ｔｅｔオペレーター部位）が挙げられる。例えば、抗原コーディング核酸配列は、１つ以上のｔｅｔオペレーター部位に機能可能に連結したプロモーターに機能可能に連結している。そのような発現カセットを含むアデノウイルスベクターは、例えば、ｔｅｔリプレッサータンパク質をコードする核酸配列を含む、米国特許第５，９９４，１０６号及び国際特許出願公開ＷＯ９５／３４６７１に記載される２９３−ＯＲＦ６のように、相補細胞株において増殖され得る。相補細胞株においてｔｅｔリプレッサータンパク質を産生することによって、抗原産生が阻害され、そしていかなる付随の抗原媒介性毒性もなく、増殖が進行する。適切な調節可能なプロモーター系としてはまた、ＩＬ−８プロモーター、メタロチオニン誘導性プロモーター系、細菌性ｌａｃＺＹＡ発現系、及びＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、異なる発生段階に選択的に活性化されるプロモーター（例、グロビン遺伝子は、胚及び成体におけるグロビン付随プロモーターから差次的に転写される）が、用いられ得る。プロモーター配列は、外因性の薬剤による調節に応答性の少なくとも１つの調節配列を含み得る。調節配列は好ましくは、薬物、ホルモン、放射線、又は他の遺伝子産物のような、しかしそれらに限定されない、外因性の薬剤に応答性である。
【００３２】
プロモーターは、組織特異的プロモーター（即ち、所定の組織において優先的に活性化され、活性化された組織において遺伝子産物の発現をもたらすプロモーター）であり得る。本発明における使用のために適切な組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞型に基づいて、当業者によって選択され得る。本発明の方法における使用のために好ましい組織特異的プロモーターは、Ｍｏｒｉｔａら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８、 １７２９−３７（２００１）中に記載の樹状細胞特異的なデクチン−２（Ｄｅｃｔｉｎ−２）プロモーターのように、免疫細胞に特異的である。
【００３３】
さらに別の実施形態では、プロモーターは、キメラプロモーターであり得る。プロモーターは、それが少なくとも２つの異なる供給源（例、生物のゲノムの２つの異なる領域、２つの異なる生物、又は合成配列と組み合わせられた生物）から取得されたか、それらに由来するか、又はそれらに基づく少なくとも２つの核酸配列の部分を含むという点において、「キメラ」である。好ましくは、２つの異なる核酸配列の部分は、約４０％未満、より好ましくは約２５％未満、及びさらにより好ましくは約１０％未満の核酸配列の同一性を、互いに示す（それは本明細書中の他の箇所に記載の方法によって決定され得る）。任意の適切なキメラプロモーターは、本発明の方法において、用いられ得る。
【００３４】
プロモーターは、活性のその特定のパターンを、抗原の所望の発現のパターン及びレベルと適合させることによって、本発明における使用のために選択され得る。例えば、アデノウイルスベクターが異なる抗原をコードする２つ以上の核酸配列を含む実施形態において、各核酸配列は、別々の発現プロファイルを表示する異なるプロモーターに機能可能に連結され得る。例えば、第一のプロモーターは、抗原産生の最初のピークを媒介するように選択され、それによって免疫系を、コード化抗原に対してプライムする。第二のプロモーターは、発現のピークが第一のプロモーターのそれの数日後になるように、同じ又は異なる抗原の産生を駆動するように選択され、それによって免疫系を、抗原に対して「ブースト」する。あるいは、複数のプロモーターの所望の性状を組み合わせたキメラプロモーターが、構築され得る。例えば、ＣＭＶプロモーターの活性の最初の急増をＲＳＶプロモーターの活性の高い維持レベルと組み合わせたＣＭＶ−ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明の方法の多くの実施形態における使用のために、特に好ましい。抗原は、真核生物細胞に毒性があり得るという点で、アデノウイルスベクターを増殖させるのに用いられる相補細胞株における活性を減少させるのに、プロモーターを改変するのは有利であり得る。
【００３５】
タンパク質産生を最適化するため、好ましくは、抗原コーディング核酸配列はさらに、抗原コーディング核酸配列のコード配列に続いて、ポリアデニル化部位を含む。任意の適切なポリアデニル化配列が用いられ得、例として、合成された最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、並びにヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列が挙げられる。好ましいポリアデニル化配列は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス４０）ポリアデニル化配列である。また、好ましくは、全ての相応な転写シグナル（及び、適当な場合には、翻訳シグナル）は、核酸配列が、それが導入される細胞において相応に発現するように、正確に整列される。所望される場合、核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を促進するために、スプライス部位（即ち、スプライスアクセプター及びスプライスドナー部位）を組み込み得る。
【００３６】
もし抗原コーディング核酸配列が、プロセス又は分泌されたタンパク質又はペプチドあるいは細胞内で作用するタンパク質をコードするならば、好ましくは、抗原コーディング核酸配列は、プロセシング、分泌、細胞内局在などのために適当な配列をさらに含む。抗原コーディング核酸配列は、分泌のために細胞性機構へタンパク質を標的化するシグナル配列に機能可能に連結され得る。適当なシグナル配列としては、免疫グロブリンの重鎖及びサイトカインのリーダー配列（例えば、Ｌａｄｕｎｇａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１３−１８（２０００）参照）が挙げられるが、それらに限定されない。宿主細胞からタンパク質を分泌するため、他のタンパク質改変が必要とされ得、それは慣用的な実験室技術を用いて決定され得る。抗原及びシグナル配列をコードする発現コンストラクトを調製することは、例えば、米国特許第６，５００，６４１号中に、さらに記載されている。非分泌性タンパク質を分泌させる方法は、例として、米国特許第６，４７２，１７６号、及び国際特許出願公開ＷＯ０２／４８３７７中に、さらに記載されている。
【００３７】
アデノウイルスベクターの核酸配列によってコードされる抗原タンパク質はまた、宿主細胞表面上に抗原を付着させるか又は組み込むために改変され得る。この点において、抗原は、細胞表面上への結合のための、ｇｐｉ−アンカーのような膜アンカーを含み得る。膜貫通ドメインは、抗原タンパク質の末端を細胞膜中へと組み込むために、抗原と融合され得る。細胞表面上にペプチドを表示するための他の戦略は、当技術分野において公知であり、本発明の文脈中での使用に適当である。
【００３８】
本発明に従って、アデノウイルスベクター組成物は、動物、好ましくは哺乳動物（例、ヒト）に投与され、そこにおいて各抗原コーディング核酸配列は、その抗原に対する免疫応答を誘導するために発現される。免疫応答は、体液媒介免疫応答、細胞媒介免疫応答、又は、望ましくは、体液性及び細胞媒介免疫応答の組み合わせであり得る。理想的には、免疫応答は、抗原を含む感染剤のそれに続くチャレンジの際に、防御を提供する。しかしながら、防御免疫は、本発明の文脈中では必要ではない。本発明の方法はさらに、抗体産生及び回収のために用いられ得る。
【００３９】
ＨＩＶ抗原に対して生じる免疫応答を増強するために、アデノウイルスベクターベクター組成物はまた、サイトカイン、ケモカイン、又はシャペロンのような免疫促進剤をコードする核酸配列を含み得る。サイトカインとしては、例えば、マクロファージコロニー刺激因子（例、ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、及びＩＬ−１８）、タンパク質のＴＮＦファミリー、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ３リガンド、（Ｆｌｔ３Ｌ）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、及びＣＤ４０リガンドが挙げられる。ケモカインとしては、例えば、Ｂ細胞誘因性ケモカイン−１（ＢＣＡ−１）、フラクタルカイン、メラノーマ成長刺激性活性タンパク質（ＭＧＳＡ）、血液ろ過ＣＣケモカイン１（ＨＣＣ−１）、インターロイキイン８（ＩＬ８）、インターフェロン刺激性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、リンフォタクチン、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単球走化性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、ＲＡＮＴＥＳ、ＢＲＡＫ、エオタキシン、エクソーダス（ｅｘｏｄｕｓ）１〜３などが挙げられる。シャペロンとしては、例えば、熱ショックタンパク質のＨｓｐ１７０、Ｈｓｃ７０、及びＨｓｐ４０が挙げられる。サイトカイン及びケモカインは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ（２００２），サンディエゴ，カリフォルニアを始めとして、当技術分野において一般に記載されている。
【００４０】
アデノウイルスベクター組成物の投与は、哺乳動物においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導するための複数工程レジメンの一成分であり得る。この点において、本発明の方法はさらに、アデノウイルスベクター組成物のアデノウイルスベクターによってコードされるＨＩＶ抗原と同じ、少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むプライマー組成物を、哺乳動物に投与することを含み、そこにおいて、プライマー組成物の投与は、アデノウイルスベクター組成物の投与の少なくとも一週間前に行われる。従って、本発明の本実施形態は、プライム及びブースト免疫レジメンの１つの力（ａｒｍ）を表し、そこにおいて免疫応答は、プライマー組成物の投与によって「プライム（ｐｒｉｍｅ）」され、そしてアデノウイルスベクター組成物の投与によって「ブースト（ｂｏｏｓｔ）」される。プライマー組成物の１つ以上の核酸配列は、遺伝子移入ベクターの一部として又は裸のＤＮＡとして、投与され得る。任意の遺伝子移入ベクターは、ウイルス性及び非ウイルス性遺伝子移入ベクターを含有するプライマー組成物に、用いられ得る。適切なウイルス性遺伝子移入ベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、又はアデノウイルスベクターが挙げられるが、それらに限定されない。適切な非ウイルス性遺伝子移入ベクターの例としては、プラスミド、リポソーム、及び分子接合体（例、トランスフェリン）が挙げられるが、それらに限定されない。理想的には、遺伝子移入ベクターは、プラスミド又はアデノウイルスベクターである。あるいは、免疫応答は、抗原自体（例、抗原性タンパク質、不活化病原体など）の投与によって、プライム又はブーストされ得る。
【００４１】
プライマー組成物の１つ以上の核酸配列によってコードされる抗原は、アデノウイルスベクター組成物のアデノウイルスベクターによってコードされるＨＩＶ抗原と好ましくは同じであるが、いくつかの実施形態においては、アデノウイルスベクター組成物によってコードされる抗原とは異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むプライマー組成物を用いることが適当であり得る。好ましくは、プライマー組成物は、アデノウイルスベクター組成物の1つ以上のアデノウイルスベクターによってコードされるＨＩＶ抗原と同じである、２つ以上のＨＩＶ抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含む。より好ましくは、プライマー組成物は、アデノウイルスベクター組成物の１つ以上のアデノウイルスベクターによりコードされる全てのＨＩＶ抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含む。
【００４２】
プライマー組成物が、ＨＩＶへの免疫応答をプライムするために、哺乳動物に投与される。１つを超える用量のプライマー組成物が、任意の適切な時間枠（例、ブーストの少なくとも約１週、２週、４週、８週、１２週、１６週前、又はそれよりも前）において提供され得る。好ましくは、プライマー組成物は、アデノウイルスベクター組成物の投与の少なくとも３ヶ月（例、３、６、９、１２、又はそれより多い月数）前に、哺乳動物に投与される。最も好ましくは、プライマー組成物は、アデノウイルスベクター組成物の投与の少なくとも約６ヶ月から約９ヶ月前に、哺乳動物に投与される。アデノウイルスベクター組成物は、ＨＩＶへの免疫応答をブーストするために、哺乳動物に投与される。１つを超える用量のアデノウイルスベクター組成物が、免疫を維持するために、任意の適切な時間枠で、提供され得る。
【００４３】
アデノウイルスベクター組成物及び／又はプライマー組成物は、担体、好ましくは、生理学的に（例、医薬的に）許容可能な担体及びアデノウイルスベクター組成物を含む、医薬的に許容可能な（例、生理学的に許容可能な）組成物において、望ましくは投与される。任意の適切な担体が、本発明の文脈中において用いられ得、そのような担体は当技術分野において周知である。担体の選択は、組成物が投与されるべき特定の部位及び組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。理想的には、アデノウイルスベクターの文脈においては、医薬組成物は、好ましくは複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）なアデノウイルスを含んでいない。医薬組成物は必要に応じて、無菌又は1つ以上のアデノウイルスベクターを除いて無菌であり得る。
【００４４】
医薬組成物の適切な製剤としては、水溶性及び非水溶性溶液、等張滅菌溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤を含み得る）、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含み得る水溶性及び非水溶性滅菌懸濁液が挙げられる。この製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数用量を密封した容器で提示され得、使用直前に滅菌液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。好ましくは、担体は、緩衝化生理食塩水溶液である。より好ましくは、本発明の方法における使用のための医薬組成物は、投与の前に損傷からアデノウイルスベクターを保護するように製剤化される。例えば、医薬組成物は、発現ベクターを調製、保存、又は投与するために用いられるデバイス（例、ガラス器具、シリンジ、又は針）上でのアデノウイルスベクターの損失を低減するように製剤化され得る。医薬組成物は、アデノウイルスベクターの光感受性及び／又は温度感受性を減少するように製剤化され得る。この目的のために、医薬組成物は、好ましくは、医薬として許容可能な液体担体（例えば、上記のもの等）、並びにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる安定化剤を含む。そのような組成物の使用は、ベクターの貯蔵寿命を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を増加させる。アデノウイルスベクター含有組成物の製剤は、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号、同第６，５１４，９４３号、米国特許出願公開番号２００３／０１５３０６５  Ａ１、及び国際特許出願公開ＷＯ００／３４４４４中にさらに記載されている。医薬組成物はまた、アデノウイルスベクターの形質導入効率を増強させるように製剤化され得る。さらに、当業者は、医薬組成物が、他の治療又は生物学的活性剤を含み得ることを理解する。例えば、イブプロフェン又はステロイド等の炎症を制御する因子は、アデノウイルスベクターのインビボ投与に伴う膨潤及び炎症を低減するための医薬組成物の一部であり得る。本明細書中で議論されているように、免疫系刺激剤は、抗原に対する任意の免疫応答を増進させるために、投与され得る。抗生物質、即ち、殺微生物剤及び殺真菌剤は、現存する感染を治療する、及び／又は遺伝子移入方法に伴う感染のような将来の感染のリスクを低減するために存在し得る。
【００４５】
医薬組成物を哺乳動物に送達するために、任意の投与の経路が用いられ得る。実際、医薬組成物を投与するために１つより多い経路が用いられ得るが、特定の経路は、別の経路よりも、より迅速かつより効果的な反応を提供し得る。好ましくは、医薬組成物は、筋肉注射を介して投与される。医薬組成物はまた、体腔中へ塗布又は注入されるか、皮膚を通して吸収されるか（例、経皮貼布を介するか）、吸入されるか、経口摂取されるか、組織に局所的に塗布されるか、あるいは、例えば静脈内、腹膜、又は動脈内投与を介して、非経口投与され得る。
【００４６】
医薬組成物は、スポンジ、生体適合性網目構造、機械的容器、又は機械的移植片のような、制御又は持続性の放出を可能とするデバイス中又はデバイス上で投与され得る。移植片（例、米国特許第５，４４３，５０５号参照）、移植可能なデバイス（例、機械的容器）のようなデバイス（例、米国特許第４，８６３，４５７号参照）あるいはポリマー組成物から構成される移植片又はデバイスは、医薬組成物の投与に特に実用的である。医薬組成物はまた、例えばゲル発泡剤、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）のようなポリホスフォエステル、及び／又はポリ乳酸−グリコール酸を含む徐放性製剤の形態で、投与され得る（例、米国特許第５，３７８，４７５号参照)。
【００４７】
哺乳動物へ投与される医薬組成物の用量は、標的組織のサイズ、任意の副作用の範囲、投与の特定の経路などを含む数々の要因に依存する。用量は、理想的には、アデノウイルスベクター組成物及び／又はプライマー組成物の「有効量」（即ち、哺乳動物において所望される免疫応答を引き起こすアデノウイルスベクター組成物及び／又はプライマー組成物の用量）を含む。所望される免疫応答は、抗体の産生、それに続くチャレンジの際の保護、免疫寛容、免疫細胞の活性化などを内包し得る。アデノウイルスベクター組成物が２つ以上のアデノウイルスベクターを含む実施形態においては、当然ながら、本発明の方法の医薬組成物は、その中に含有される２つ以上のアデノウイルスベクターの各々の組合せ用量であるアデノウイルスベクターの用量を含む。
【００４８】
望ましくは、アデノウイルスベクター組成物は、少なくとも約１×１０５の粒子（それはまた、粒子単位とも呼ばれる）のアデノウイルスを含む、単一用量のアデノウイルスベクターを含む。用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６の粒子（例、約１×１０６〜１×１０１２の粒子）、より好ましくは、少なくとも約１×１０７の粒子、より好ましくは、少なくとも約１×１０８の粒子（例、約１×１０８〜１×１０１１の粒子又は約１×１０８〜１×１０１２の粒子）、及び最も好ましくは、少なくとも約１×１０９の粒子（例、約１×１０９〜１×１０１０の粒子又は約１×１０９〜１×１０１２の粒子）、又はさらには約１×１０１０の粒子（例、約１×１０１０〜１×１０１２の粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、用量は、約１×１０１４以下の粒子、好ましくは、約１×１０１３以下の粒子、さらにより好ましくは、約１×１０１２以下の粒子、さらにより好ましくは、約１×１０１１以下の粒子、及び最も好ましくは、約１×１０１０以下の粒子（例、約１×１０９以下の粒子）を含む。言い換えれば、アデノウイルスベクター組成物は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、２×１０６ｐｕ、４×１０６ｐｕ、１×１０７ｐｕ、２×１０７ｐｕ、４×１０７ｐｕ、１×１０８ｐｕ、２×１０８ｐｕ、４×１０８ｐｕ、１×１０９ｐｕ、２×１０９ｐｕ、４×１０９ｐｕ、１×１０１０ｐｕ、２×１０１０ｐｕ、４×１０１０ｐｕ、１×１０１１ｐｕ、２×１０１１ｐｕ、４×１０１１ｐｕ、１×１０１２ｐｕ、２×１０１２ｐｕ、又は４×１０１２ｐｕのアデノウイルスを含むアデノウイルスベクターの単一用量を含み得る。
【００４９】
プライマー組成物は、望ましくは、少なくとも約１ｍｇの核酸、典型的かつ好ましくはＤＮＡを含む。プライマー組成物は、好ましくは、１ｍｇ以上の核酸（例、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、又はそれより多い）を含む。好ましい実施形態では、プライマー組成物は、約２ｍｇから約５ｍｇの核酸（例、約３ｍｇ又は４ｍｇ）、より好ましくは、約３ｍｇから約５ｍｇの核酸（例、約３．５ｍｇ）、及び最も好ましくは、約４ｍｇから約５ｍｇの核酸（例、約４．５ｍｇ）を含む。
【００５０】
改変ウイルスは、研究及び治療遺伝子移入適用のために便利なベクター系であることが証明されており、アデノウイルスベクター系は、そのような使用のためのいくつかの利点を提示する。アデノウイルスは、一般的にヒトにおける良性の病変と関連し、３６キロベース（ｋｂ）のアデノウイルスゲノムは、広く研究されてきた。アデノウイルスベクターは、高い力価（例、約１０１３粒子形成単位（ｐｆｕ））で産生され得、例として、レトロウイルスベクターが、複製細胞にのみ遺伝物質を移入するのと対照的に、そのようなベクターは、遺伝物質を、非複製、及び複製細胞へ移入し得る。アデノウイルスゲノムは、多量の外因性ＤＮＡ（最大で約８ｋｂまで）を運ぶために操作され得、アデノウイルスキャプシドはさらに長い配列の移入を増強し得る（Ｃｕｒｉｅｌら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９２））。さらに、アデノウイルスは一般的には宿主細胞の染色体中へと組み込まれず、むしろ直鎖状エピソームとして維持され、従って組換えアデノウイルスが正常細胞機能と干渉する可能性を最小限にする。広範な種々の細胞型へ遺伝物質を移入するための優れたビヒクルであることに加えて、アデノウイルスベクターは、特に治療適用についての特定の懸念である、遺伝子移植のための安全な選択肢を示す。
【００５１】
種々の起源、亜型、又は亜型の混合物からのアデノウイルスが、アデノウイルスベクターについてのウイルスゲノムの供給源として用いられ得る。非ヒトアデノウイルス（例、サル、トリ、イヌ、ヒツジ、又はウシアデノウイルス）が、アデノウイルスベクターを作製するために用いられ得るものの、好ましくは、ヒトアデノウイルスが、本発明の方法のアデノウイルスベクターについてのウイルスゲノムの供給源として用いられる。アデノウイルスは、種々のサブグループ又は血清型であり得る。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例、血清型１２、１８及び３１）、サブグループＢ（例、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５及び５０）、サブグループＣ（例、血清型１、２、５、及び６）、サブグループＤ（例、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、及び４２〜４８）、サブグループＥ（例、血清型４）、サブグループＦ（例、血清型４０及び４１）、未分類の血清群（例、血清型４９及び５１）、あるいは任意の他のアデノウイルス血清群であり得る。アデノウイルス血清型１〜５１は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア）から入手可能である。好ましくは、本発明の文脈中では、アデノウイルスベクターは、ヒトサブグループＣ、特に血清型２又はさらにより望ましくは血清型５である。しかしながら、非グループＣアデノウイルスは、宿主細胞への遺伝子産物の送達のためのアデノウイルス遺伝子移入ベクターを調製するために使用され得る。非グループＣアデノウイルス遺伝子移入ベクターの構築に用いられる好ましいアデノウイルスとしては、Ａｄ１２（グループＡ）、Ａｄ７及びＡｄ３５（グループＢ）、Ａｄ３０及びＡｄ３６（グループＤ）、Ａｄ４（グループＥ）、並びにＡｄ４１（グループＦ）が挙げられる。非グループＣアデノウイルスベクター、非グループＣアデノウイルスベクターの製造方法、及び非グループＣアデノウイルスベクターの使用方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第５，８３７，５１１号、及び同第５，８４９，５６１号、並びに国際特許出願ＷＯ９７／１２９８６及びＷＯ９８／５３０８７に開示されている。
【００５２】
アデノウイルスベクターは、サブタイプの混合物を含み得、それによって「キメラ」アデノウイルスベクターである。キメラアデノウイルスベクターは、２つ以上（例、２、３、４等）の異なるアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルスゲノムを含み得る。本発明の文脈中では、キメラアデノウイルスベクターは、２つ以上の異なるアデノウイルス血清型の各々と、およそ等量のゲノムを含み得る。キメラアデノウイルスベクターゲノムが、２つの異なるアデノウイルス血清型のゲノムから構成される場合、キメラアデノウイルスベクターゲノムは、好ましくは１つのアデノウイルス血清型のゲノムの約７０％以下（例、約６５％、約５０％、又は約４０％以下）を含み、残りのキメラアデノウイルスゲノムは他のアデノウイルス血清型のゲノムに由来する。１つの実施形態では、キメラアデノウイルスベクターは、血清型２のゲノムの部分及び血清型５のゲノムの部分を含むアデノウイルスゲノムを含有し得る。例えば、アデノウイルス血清型５のゲノムの５’領域（即ち、アデノウイルスＥ１領域に対して５’のゲノム領域）は、アデノウイルス血清型２のゲノムの対応する領域と置換され得る（例、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に対して５’のＡｄ５ゲノム領域は、Ａｄ２ゲノムのヌクレオチド１〜４５６と置換される）。
【００５３】
本発明のアデノウイルスベクターは、複製可能であり得る。例えば、アデノウイルスベクターは、宿主細胞におけるウイルス複製を阻害しない、アデノウイルスゲノムにおける変異（例、欠失、挿入、又は置換）を有し得る。本発明のアデノウイルスベクターはまた、条件的に複製可能であり得る。しかしながら、好ましくは、アデノウイルスベクターは、宿主細胞において複製欠損である。
【００５４】
「複製欠損」とは、例えば、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能における欠損の結果（即ち、それにより、アデノウイルスベクターが、典型的な宿主細胞において、特に、本発明の過程においてアデノウイルスベクターによって感染され得るヒト患者中の宿主細胞において複製しないように）、アデノウイルスベクターが、複製に必要なアデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を必要とすることを意味する。本明細書中で用いられる場合、遺伝子、遺伝子機能、又はゲノム領域における欠損は、核酸配列が全体的又は部分的に欠失した遺伝子の機能を消失させるか、損なわせる（例、それによって遺伝子産物の機能が少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、又は５０倍に低減される）、ウイルスゲノムの十分な遺伝物質の欠失として定義される。遺伝子領域全体の欠失は、しばしば、複製必須遺伝子機能の破壊に必要ではない。しかしながら、１つ以上の導入遺伝子についてアデノウイルスゲノムに十分な余地を提供する目的のために、遺伝子領域の大部分の除去が望ましいものであり得る。遺伝物質の欠失が好ましいが、付加又は置換による遺伝物質の変異もまた、遺伝子機能の破壊に適切である。複製必須遺伝子機能は、複製（例、増殖）に必要であり、例えば、アデノウイルス初期領域（例、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ４領域）、後期領域（例、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例、ＩＶａ２遺伝子）、及びウイルス付随ＲＮＡ（例、ＶＡ−ＲＮＡ１及び／又はＶＡ−ＲＮＡ−２）によりコードされる遺伝子機能である
【００５５】
複製欠損アデノウイルスベクターは、望ましくは、アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の補完を必要とする。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、又はＥ４領域の少なくとも１つの遺伝子機能の補完を必要とする（Ｅ１欠損又はＥ４欠損アデノウイルスベクターと表記される）。Ｅ１領域における欠損に加えて、組換えアデノウイルスはまた、国際特許出願公開ＷＯ００／００６２８において議論されるように、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）中に変異を有し得る。最も好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（望ましくは、全ての複製必須遺伝子機能）及び非必須Ｅ３領域の少なくとも１つの遺伝子機能を欠損する（例、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表記される）。Ｅ１領域に関して、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の一部又は全て及び／あるいはＥ１Ｂ領域の一部又は全て（例、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の各々の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能）を欠損し得、従って複製のためにアデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域の補完を必要とする。アデノウイルスベクターはまた、例えばＥ４領域の１つ以上の複製必須遺伝子機能における欠損を通じて、複製のためにアデノウイルスゲノムのＥ４領域の補完を必要とし得る。
【００５６】
アデノウイルスベクターがＥ１欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、ヌクレオチド３３５〜３７５の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド３５６）において開始し、ヌクレオチド３，３１０〜３，３５０の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド３，３２９）において終了する欠失又はヌクレオチド３，４９０と３，５３０との間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド３，５１０）（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）において終了する欠失さえも、含み得る。
【００５７】
Ｅ２Ａ欠損である場合、アデノウイルスベクターゲノムは、ヌクレオチド２２，４２５〜２２，４６５の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド２２，４４３）において開始し、ヌクレオチド２４，０１０〜２４，０５０の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド２４，０３２）（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）において終了する欠失を含み得る。Ｅ３欠損である場合、アデノウイルスベクターゲノムは、ヌクレオチド２８，５７５〜２９，６１５の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド２８，５９３）において開始し、ヌクレオチド３０，４５０〜３０，４９０の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド３０，４７０）（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）において終了する欠失を含み得る。
【００５８】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの１つの領域における少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損する場合（例、Ｅ１又はＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクター）、アデノウイルスベクターは「単一複製欠損」といわれる。特に好ましい単一複製欠損アデノウイルスベクターは、例えば、最大限でも、アデノウイルスベクターを増殖するため（例、アデノウイルスベクター粒子を形成するため）にアデノウイルスゲノムのＥ１領域の補完を必要とする、複製欠損アデノウイルスベクターである。
【００５９】
本発明のアデノウイルスベクターは、「多重複製欠損」であり得る。これは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域の各々において、１つ以上の複製必須遺伝子機能を欠損しており、そして複製のためにそれらの機能の補完が必要であることを意味する。例えば、上記Ｅ１欠損、又はＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域（Ｅ１／Ｅ４又はＥ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターと表記される）、及び／あるいはＥ２領域（Ｅ１／Ｅ２又はＥ１／Ｅ２／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表記される）、好ましくはＥ２Ａ領域（Ｅ１／Ｅ２Ａ又はＥ１／Ｅ２Ａ／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表記される）の少なくとも１つの複製必須遺伝子をさらに欠損し得る。Ｅ４領域全体が欠失したアデノウイルスベクターは、より低い宿主免疫応答を誘発し得る。Ｅ４欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、必要に応じてＥ１領域における欠失（例、ヌクレオチド３５６〜３，３２９又はヌクレオチド３５６〜３，５１０）（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）及び／又はＥ３領域における欠失（例、ヌクレオチド２８，５９４〜３０，４６９又はヌクレオチド２８，５９３〜３０，４７０）に加えて、例えば、３２，８０５〜３２，８４５の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド３２，８２６）において開始し、ヌクレオチド３５，５４０〜３５，５８０の間の任意のヌクレオチド（例、ヌクレオチド３５，５６１）（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）において終了する欠失を含み得る。欠失されたヌクレオチド部分を規定する端点は、正確に決定するのが困難であり得、典型的にはアデノウイルスベクターの性質に有意に影響を与えない。即ち、上記ヌクレオチド数の各々は、±１、±２、±３、±４、±５、あるいは±１０又は±２０ヌクレオチドでさえあり得る。
【００６０】
本発明のアデノウイルスベクターが、Ｅ２Ａ領域の複製必須遺伝子機能を欠損する場合、ベクターは、好ましくは、Ｅ２Ａ領域の完全な欠失を含まず、その欠失は、好ましくは、長さが約２３０塩基対未満である。一般的には、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＮＡ複製に必要なポリペプチドであるＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードする。ＤＢＰは、ウイルス血清型に依存して、４７３〜５２９アミノ酸から構成される。ＤＢＰは、伸長Ｎｔドメインを持つ球状Ｃｔからなる長楕円として存在する不斉タンパク質であると考えられている。研究は、ＤＢＰが核酸に結合し、亜鉛に結合し、かつＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成において機能する能力を、Ｃｔドメインが担うことを示す。しかしながら、Ｎｔドメインは、転写及び転写後の両方のレベルでの後期遺伝子発現において機能し、タンパク質の効率的な核局在に責任があり、そしてまたそれ自身の発現の増強に関与し得ると考えられている。Ｎｔドメインのアミノ酸２〜３８の間における欠失は、この領域がＤＢＰ機能のために重要であることを示してきた（Ｂｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９６，２６９−２８１（１９９３））。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス複製に対して影響を何ら有しないものの、ＤＢＰのＮｔ領域のアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス複製を損なう。任意の多重複製欠損アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含むことが好ましい。特に、例えば、保持されるのにＥ２Ａ領域の望ましい部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって定義されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のその部分であり、具体的には血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の位置Ａｄ５（２３８１６）〜Ａｄ５（２４０３２）である。アデノウイルスベクターのこの部分は、望ましくはアデノウイルスベクターに含有される。なぜなら、それは、所望されるレベルのウイルスの増殖を提供するように現在のＥ２Ａ細胞株において補完されていないからである。
【００６１】
上記の欠失は、アデノウイルス血清型５のゲノムについて記載されているものの、当業者は、他のアデノウイルス血清型、例えばアデノウイルス血清型２のゲノムの同じ領域のヌクレオチド配位を、種々のアデノウイルス血清型、特にアデノウイルス血清型２及び５のゲノム間の類似性に基づいて、過度の実験をせずに決定し得る。
【００６２】
本発明の方法の１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１及びＥ４領域の各々の１つ以上の複製必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含み得（即ち、アデノウイルスベクターは、Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターである）、好ましくは、Ｅ４領域のコーディング領域全体がアデノウイルスゲノムから欠失されている。言い換えれば、Ｅ４領域の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が除去されている。最も好ましくは、アデノウイルスベクターは、全てのＥ１領域の欠失によって及びＥ４領域の部分の欠失によって、複製欠損にされる。アデノウイルスベクターのＥ４領域は、ネイティブなＥ４プロモーター、ポリアデニル化配列、及び／又は右側の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を保持し得る。
【００６３】
当然のことながら、アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変化し得る。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベクターによって生じる炎症応答を低減し得る。さらには、国際特許出願ＷＯ９８／４０５０９中に記載されているように、アデノウイルスベクターのコートタンパク質は、アデノウイルスベクターが野生型コートタンパク質に対する中和抗体により認識される能力又はされない能力を減少するように改変され得る。そのような改変は、持続性眼疾患の長期処置に有用である。
【００６４】
アデノウイルスベクターは、特にＥ１及びＥ４領域の複製必須遺伝子機能において、多重複製欠損である場合、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特にＥ１欠損アデノウイルスベクターによって達成されるウイルス増殖と同様の相補細胞株におけるウイルス増殖を提供するスペーサー配列を含み得る。Ｌ５ファイバー領域が保持される本発明の好ましいＥ４欠損アデノウイルスベクターでは、スペーサーは、望ましくは、Ｌ５ファイバー領域と右側のＩＴＲとの間に位置する。より好ましくは、このようなアデノウイルスベクターでは、Ｅ４ポリアデニル化配列は、単独で、又は、最も好ましくは、別の配列との組合せにおいて、Ｌ５ファイバー領域と右側のＩＴＲとの間に存在することによって、保持されたＬ５ファイバー領域を右側のＩＴＲから十分に分離し、それによりこのようなベクターのウイルス産生は、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に単一複製欠損Ｅ１欠損アデノウイルスベクターのウイルス産生に近づく。
【００６５】
スペーサー配列は、所望の長さ、例えば、配列が少なくとも約１５塩基対（例、約１５塩基対と約１２，０００塩基対との間）、好ましくは約１００塩基対〜約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対〜約８，０００塩基対、さらにより好ましくは約１，５００塩基対〜約６，０００塩基対、及び最も好ましくは約２，０００〜約３，０００塩基対の長さである任意のヌクレオチド配列（単数）又は配列（複数）を含み得る。スペーサー配列は、アデノウイルスゲノムに関して、コーディングであっても非コーディングであってもよく、そしてネイティブであっても非ネイティブであってもよいが、欠損領域に対する複製必須機能を回復させない。スペーサーはまた、プロモーター可変発現カセットを含み得る。より好ましくは、スペーサーは、さらなるポリアデニル化配列及び／又はパッセンジャー遺伝子を含む。好ましくは、スペーサーがＥ４を欠損する領域に挿入された場合、Ｅ４ポリアデニル化配列及びアデノウイルスゲノムのＥ４プロモーターもしくは任意の他の（細胞性又はウイルス）プロモーターの両方がベクター中に残存する。スペーサーは、Ｅ４ポリアデニル化部位とＥ４プロモーターとの間に位置するか、又はＥ４プロモーターがベクターに存在しない場合、スペーサーは、右側のＩＴＲに近接する。スペーサーは、任意の適切なポリアデニル化配列を含み得る。適切なポリアデニル化配列の例としては、合成最適化配列、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、並びにヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスが挙げられる。好ましくは、特にＥ４欠損領域において、スペーサーはＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウイルスベクターのより高いウイルス産生レベルを可能とする。スペーサーの非存在下では、多重複製欠損アデノウイルスベクターのファイバータンパク質の産生及び／又はウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのものと比較して低減される。しかし、欠損アデノウイルス領域の少なくとも１つ、好ましくはＥ４領域におけるスペーサーの含有は、ファイバータンパク質産生及びウイルス増殖におけるこの低減に対して対抗し得る。理想的には、スペーサーは、グルクロニダーゼ遺伝子を含む。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、例えば、米国特許第５，８５１，８０６号及び国際特許出願ＷＯ９７／２１８２６中にさらに記載されている。
【００６６】
少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第６，２２５，１１３号、同第６，６４９，３７３号、及び同第６，６６０，５２１号、並びに国際特許出願公開ＷＯ００／３４４９６中に記載されているように、インビボで限られた時間の間、高レベルで導入遺伝子を発現すること、並びに少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現の持続は、とりわけ、ＨＳＶ  ＩＣＰ０、ＡｄｐＴＰ、ＣＭＶ−ＩＥ２、ＣＭＶ−ＩＥ８６、ＨＩＶｔａｔ、ＨＴＬＶ−ｔａｘ、ＨＢＶ−Ｘ、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８などのトランス作用性因子、ＨＳＶ  ＩＣＰ０のように機能するＵ２０５骨肉腫細胞株からの細胞性因子、又は神経成長因子によって誘導されるＰＣ１２細胞における細胞性因子の作用により調節され得ることが観察されている。上記を考慮すると、多重欠損アデノウイルスベクター（例、少なくともＥ４欠損ベクター）又は第二の発現ベクターは、核酸配列の発現の持続性を調節するトランス作用性因子をコードする核酸配列を含み得る。抗原性ＤＮＡの持続的発現は免疫寛容を生じる場合に所望され得る。
【００６７】
望ましくは、アデノウイルスベクターは、複製（即ち、増殖）のために、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、及び／又はＥ４領域の複製必須遺伝子機能の補完を必要とする。しかしながら、アデノウイルスベクターが欠損したままであり、例えば、破壊された複製必須遺伝子機能をコードする相補細胞及び／又は外因性ＤＮＡ（例、ヘルパーアデノウイルス）を用いて増殖され得る限り、アデノウイルスゲノムは、実施者により所望されるように、１つ以上の複製必須遺伝子機能を破壊するように改変され得る。この点では、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみの、アデノウイルスゲノムの後期領域のみの、及びアデノウイルスゲノムの初期及び後期領域の両方の複製必須遺伝子機能を欠損し得る。アデノウイルスベクターはまた、本質的に、アデノウイルスゲノム全体が除去されたものであり得、この場合、ウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）及び１つ以上のプロモーター又はウイルスＩＴＲ及びパッケージングシグナルの少なくともいずれかがインタクトなままであること（即ち、アデノウイルスアンプリコン）が好ましい。多重複製欠損アデノウイルスベクターを含む適切な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許第５，８３７，５１１号、同第５，８５１，８０６号、同第５，９９４，１０６号、同第６，１２７，１７５号、及び同第６，４８２，６１６号、米国特許出願公開２００１／００４３９２２Ａ１、２００２／０００４０４０Ａ１、２００２／００３１８３１Ａ１、２００２／０１１０５４５Ａ１、及び２００４／０１６１８４８Ａ１、並びに国際特許出願公開ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／１６７７２、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／２２３７８、ＷＯ９７／１２９８６、ＷＯ９７／２１８２６、及びＷＯ０３／０２２３１１に開示されている。
【００６８】
理想的には、哺乳動物に投与されるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクター組成物、特に医薬組成物の形態であり、それは複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）共雑物を実質的に含まない（例、組成物は、約１％未満のＲＣＡ共雑物を含む）。最も望ましくは、組成物は、ＲＣＡを含まない。ＲＣＡを含まないアデノウイルスベクター組成物及びストックは、米国特許第５，９４４，１０６号及び同第６，４８２，６１６号、米国公開特許出願２００２／０１１０５４５Ａ１、並びに国際特許出願ＷＯ９５／３４６７１に記載されている。
【００６９】
アデノウイルスゲノムの、例えば、Ｅ１、Ｅ３、及びＥ４領域の全て又は一部を除去することによって、その結果として生じるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスカプシド中へとパッケージされる能力を保持しつつ、外因性核酸配列の挿入を受け入れることが可能である。核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域、又はＥ４領域に配置され得る。実際、核酸配列は、その配置が核酸配列の発現を妨げないか、又はアデノウイルスベクターのパッケージングを妨害しない限り、アデノウイルスゲノムのどこにでも挿入され得る。
【００７０】
アデノウイルスベクターが複製欠損でない場合、理想的には、アデノウイルスベクターは、ベクターの複製を標的組織内に限定するよう操作される。アデノウイルスベクターは条件的に複製するアデノウイルスベクターであり得、それは実施者によって、あらかじめ定められた条件下で複製するように設計される。例えば、複製必須遺伝子機能（例、アデノウイルス初期領域によってコードされる遺伝子機能）は、誘導性、抑制性、又は組織特異的転写制御配列（例、プロモーター）に機能可能に連結され得る。本実施形態では、複製は、転写制御配列と相互作用する特定の因子の存在又は非存在を必要とする。自己免疫疾患処置においては、継続的な抗原産生を取得しそして免疫細胞産生を制御するために、例えば、リンパ節におけるアデノウイルスベクター複製を制御することが有利であり得る。条件的に複製するアデノウイルスベクターは、米国特許第５，９９８，２０５号中に、さらに記載されている。
【００７１】
複製必須遺伝子機能をコードするアデノウイルス配列の改変（例、欠失、変異、又は置換）に加えて、アデノウイルスゲノムは、良性又は非致死性の改変、即ち、このような改変が、複製必須遺伝子機能を他に含むアデノウイルスゲノムの領域にある場合でさえも、アデノウイルスを複製欠損にしない改変、又は、望ましくは、ウイルスの機能性及び／又はウイルスタンパク質の産生に有害な影響を与えない改変を含み得る。そのような改変は、通常、ＤＮＡ操作から生じるか、又は発現ベクター構築を容易にするのに役立つ。例えば、アデノウイルスゲノムにおいて制限酵素部位を除去又は導入することは有利であり得る。そのような良性変異は、しばしば、ウイルスの機能性に対する検出可能な有害な効果を何ら有していない。例えば、アデノウイルスベクターは、ＶＡ−ＲＮＡ−１転写に関連するヌクレオチド１０，５９４及び１０，５９５（アデノウイルス血清型５のゲノムに基く）の欠失を含み得るが、その欠失は、ＶＡ−ＲＮＡ−１の産生を禁じない。
【００７２】
同様に、アデノウイルスベクターのコートタンパク質は、潜在的な宿主細胞上のウイルス受容体に対するアデノウイルスの結合特異性又は認識を変化させるために操作され得る。アデノウイルスについて、そのような操作としては、ファイバー、ペントン、又はヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質の部分中への種々のネイティブ又は非ネイティブリガンドの挿入などを挙げることができる。コートタンパク質の操作は、アデノウイルスベクターによって感染される細胞の範囲を広め得、又はアデノウイルスベクターを、特定の細胞型に標的化することを可能とする。
【００７３】
例えば、１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、好ましくは、カルボキシル末端の又はその近くでの非ネイティブアミノ酸配列の導入によって、野生型（即ち、ネイティブ）コートタンパク質とは異なる、キメラコートタンパク質（例、ファイバー、ヘキソンｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はペントンタンパク質）を含む。好ましくは、非ネイティブアミノ酸配列は、内部コートタンパク質配列中に又はその代わりに挿入される。当業者は、非ネイティブアミノ酸配列は、内部コートタンパク質配列内又は内部コートタンパク質配列の終点に挿入され得ることを理解する。その結果生じるキメラウイルスコートタンパク質は、キメラアデノウイルスコートタンパク質よりもむしろ野生型アデノウイルスコートタンパク質を含むことを除いて、同一であるベクターの細胞中への進入よりも効率的に、コートタンパク質を含むアデノウイルスベクターの細胞中への進入を指示し得る。好ましくは、キメラアデノウイルスコートタンパク質は、野生型コートタンパク質を含むベクターによって認識されないか、又は僅かしか認識されない細胞表面上に存在する新規の内因性結合部位に結合する。進入のこの増大した効率の１つの直接の結果は、野生型コートタンパク質を含むアデノウイルスが典型的には進入できないか又は低効率でのみ進入し得る多数の細胞型に、結合しそして進入し得ることである。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、真核生物細胞の特定の型に選択的ではないキメラウイルスコートタンパク質を含む。キメラコートタンパク質は、内部コートタンパク質配列中又はその代わりへの非ネイティブアミノ酸配列の挿入によって、野生型コートタンパク質と異なる。本実施形態においては、国際特許出願ＷＯ９７／２００５１中に記載されているように、キメラアデノウイルスコートタンパク質は、野生型アデノウイルスコートよりも広い範囲の真核生物細胞と効率的に結合する。
【００７５】
米国特許第５，９６２，３１１号において議論されているように、所定の細胞に対するアデノウイルスの結合の特異性はまた、短軸（ｓｈｏｒｔ−ｓｈａｆｔｅｄ）アデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用によって調整され得る。短軸アデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、アデノウイルスファイバーが、その細胞表面受容体と結合するレベル又は効率を低減させ、アデノウイルスペントンベースのその細胞表面受容体に対する結合を増大し、それによってアデノウイルスの所定の細胞に対する結合の特異性を増大させる。あるいは、短軸アデノウイルスファイバーを含むアデノウイルスの使用は、非ネイティブアミノ酸配列の、ペントンベース又はファイバーノブのいずれかの中への導入によって、所望される細胞表面受容体へのアデノウイルスの標的化を可能とする。
【００７６】
さらに別の実施形態では、ネイティブ基質の結合と関連するアミノ酸残基をコードする核酸残基は、変異核酸残基を組み込んだ（又はそれによってコードされるファイバータンパク質を有する）アデノウイルスベクターが、そのネイティブ基質をより結合し得ないように、変化、補充、又は欠失され得る（例、国際特許出願公開ＷＯ００／１５８２３；Ｅｉｎｆｅｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２３），１１２８４−１１２９１（２００１）；及びｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（６）、２７５３−２７６２（２００２）参照）。例えば、それぞれアデノウイルスファイバータンパク質のノブドメイン及びアデノウイルスペントンベース中に位置するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列のような、血清型５又は血清型２アデノウイルスベクターのネイティブなＣＡＲ及びインテグリン結合部位は、除去又は破壊され得る。ノブとＣＡＲとの間の相互作用を媒介又は支援するファイバータンパク質の任意の適切なアミノ酸残基は、ファイバータンパク質が三量体形成することが可能な限り、変異又は除去され得る。同様に、アミノ酸は、ファイバータンパク質が三量体形成する能力を保持する限り、ファイバーノブに付加され得る。適切な残基としては、例えば、血清型５ファイバーノブドメインのＡＢループ、ＤＥループ、及びＦＧループのような、ファイバータンパク質の露出ループ内におけるアミノ酸が挙げられ、それらは、例えば、Ｒｏｅｌｖｉｎｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、１５６８−１５７１（１９９９）、及び米国特許第６，４５５，３１４号中にさらに記載されている。ペントンベースとインテグリンとの間の相互作用を媒介又は支援する、ペントンベースタンパク質の任意の適切なアミノ酸残基は、変異又は除去され得る。適切な残基としては、例えば、Ａｄ５ペントンベースタンパク質の超可変領域中に位置する、５つのＲＧＤアミノ酸配列モチーフの１つ以上が挙げられる（例えば、米国特許５，７３１，１９０中に記載されている)。ペントンベースタンパク質上のネイティブインテグリン結合部位もまた、ネイティブＲＧＤアミノ酸配列がαｖインテグリン受容体に結合するのに、立体配置的に隔絶されるように、ネイティブＲＧＤモチーフをコードする核酸配列を改変することによって破壊され得る。例えば、それは、ＤＮＡ配列を、アデノウイルスペントンベースタンパク質をコードする核酸配列中へ又は隣接して挿入することによってなされ得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、それぞれＣＡＲ及びインテグリンと結合しない、ファイバータンパク質及びペントンベースタンパク質を含む。あるいは、アデノウイルスベクターは、対応する野生型コートタンパク質よりも低い親和性ではあるが、それぞれＣＡＲ及びインテグリンと結合する、ファイバータンパク質及びペントンベースタンパク質を含む。アデノウイルスベクターは、改変アデノウイルスファイバータンパク質及びペントンベースタンパク質がそれぞれＣＡＲ及びインテグリンと結合する場合に、ＣＡＲ及びインテグリンと低減された結合を示し、それは、同じ血清型の非改変アデノウイルスファイバータンパク質及びペントンベースタンパク質よりも、少なくとも約５倍、１０倍、２０���、３０倍、５０倍、又は１００倍低い親和性を持つ。
【００７７】
好ましくはあるが、アデノウイルスの宿主細胞へのネイティブ結合は、取り除かなくて良い。抗原コード化配列を宿主細胞に送達するためのアデノウイルスベクターの使用のような、いくつかの場合においては、アデノウイルスの広い宿主範囲は有利であり得る。
【００７８】
アデノウイルスベクターはまた、基質（即ち、リガンド）を結合する非ネイティブアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含み得る。キメラアデノウイルスコートタンパク質の非ネイティブアミノ酸配列は、キメラコートタンパク質を含むアデノウイルスベクターが、非ネイティブアミノ酸配列のない対応するアデノウイルスによって天然では感染しない宿主細胞（即ち、対応する野生型アデノウイルスによって感染しない宿主細胞）に結合し、かつ望ましくは感染するか、非ネイティブアミノ酸配列のない対応するアデノウイルスベクターよりも大きい親和性で対応するアデノウイルスベクターによって天然に感染した宿主細胞に結合するか、又は非標的細胞よりも大きい親和性で特定の標的細胞と結合することを可能とする。「非ネイティブ」アミノ酸配列は、アデノウイルスコートタンパク質中に天然では存在しないアミノ酸配列又はアデノウイルスコートに見出されるが、カプシド中の非ネイティブな位置に位置するアミノ酸配列を含み得る。「好ましくは結合する」とは、非ネイティブアミノ酸配列が、例として、αｖβ３インテグリンのような受容体を、非ネイティブリガンドが、例としてαｖβ１インテグリンのような異なる受容体を結合するよりも、少なくとも約３倍大きい親和性（例、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３５倍、４５倍又は５０倍大きい親和性）で結合することを意味する。
【００７９】
非ネイティブアミノ酸配列は、キメラコートタンパク質を形成するために任意のアデノウイルスコートタンパク質に結合体化され得る。従って、例えば、非ネイティブアミノ酸配列は、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、ＩＸ、ＶＩ、又はＩＩＩａタンパク質などに結合体化され得るか、それらに挿入され得るか、又はそれらに付着され得る。このようなタンパク質の配列、及びそれらを組換えタンパク質において用いるための方法は、当該技術分野で周知である（例、米国特許第５，５４３，３２８号；同第５，５５９，０９９号；同第５，７１２，１３６号；同第５，７３１，１９０号；同第５，７５６，０８６号；同第５，７７０，４４２号；同第５，８４６，７８２号；同第５，９６２，３１１号；同第５，９６５，５４１号；同第５，８４６，７８２号；同第６，０５７，１５５号；同第６，１２７，５２５号；同第６，１５３，４３５号；同第６，３２９，１９０号；同第６，４５５，３１４号；同第６，４６５，２５３号；及び同第６，５７６，４５６号；米国特許出願公開２００１／００４７０８１及び２００３／００９９６１９；並びに国際特許出願ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／４０５０９、ＷＯ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０、及びＷＯ０１／９２５４９参照）。キメラコートタンパク質のコートタンパク質部分は、リガンドドメインが付属又は短縮（例、内部的に、あるいはＣ及び／又はＮ末端にて）される全長アデノウイルスコートタンパク質であり得る。コートタンパク質部分は、それ自体、アデノウイルスベクターに対してネイティブである必要はない。例えば、コートタンパク質は、アデノウイルス血清型５ベクター中へと組み込まれたアデノウイルス血清型４（Ａｄ４）ファイバータンパク質であり得、そこにおいてＡｄ４ファイバーのネイティブＣＡＲ結合モチーフは、好ましくは取り除かれる。どのように改変されても（非ネイティブアミノ酸の存在を含む）、キメラコートタンパク質は好ましくは、そのネイティブなカウンターパートコートタンパク質として、アデノウイルスカプシド中へと取り込まれることが可能である。一旦、所定の非ネイティブアミノ酸配列が同定されれば、それは、基質（即ち、ウイルス表面）と相互作用し得るウイルスの任意の位置中へと組み込まれ得る。例えば、リガンドは、ファイバー、ペントンベース、ヘキソン、ＩＸ、ＶＩ、又はＩＩＩａタンパク質、あるいは他の適切な位置の中へと組み込まれ得る。リガンドがファイバータンパク質に付着される場合、好ましくは、それは、ウイルスタンパク質間又はファイバーモノマー間の相互作用を妨害しない。従って、非ネイティブアミノ酸配列は好ましくは、それ自体、アデノウイルスファイバーの三量体化ドメインと有害に相互作用し得るような、オリゴマー化ドメインではない。好ましくは、リガンドは、ビリオンタンパク質に付加され、そして基質に対して非ネイティブアミノ酸配列を最大に存在させるために、基質に容易に露出されるような様式（例、タンパク質のＮ又はＣ末端にて、基質に面する残基に付着する、基質と接触するペプチドスペーサー上に配置するなど）において取り込まれる。理想的には、非ネイティブアミノ酸配列は、キメラコートタンパク質を創出するために、ファイバータンパク質のＣ末端にてアデノウイルスファイバータンパク質に取り込まれるか（及びスペーサーを介して付着するか）、あるいはファイバーの露出ループ（例、ＨＩループ）に取り込まれる。非ネイティブアミノ酸配列がペントンベースの部分に付着されるか又はそれを交換する場合、好ましくは、それは、それが基質と接触することを保障するように可変領域内にある。非ネイティブアミノ酸配列がヘキソンに付着される場合、好ましくは、それは可変領域内にある（Ｍｉｋｓｚａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（３），１８３６−４４（１９９６））。アデノウイルス粒子の表面から離れて非ネイティブアミノ酸配列を伸長させるためのスペーサー配列の使用は、非ネイティブアミノ酸配列がレセプターに対する結合についてより利用可能であり得ること、並びに非ネイティブアミノ酸配列とアデノウイルスファイバー単量体との間の任意の立体相互作用が低減されるという点で有利であり得る。
【００８０】
非ネイティブアミノ酸配列は、狭い分類の細胞型（例、腫瘍細胞、心筋、骨格筋、平滑筋等）又は、いくつかの細胞型を含むより広いグループ上に存在する特定の細胞受容体を結合し得る。他の実施形態では（例、特定の操作された細胞型内での精製又は増殖を容易にするため）、非ネイティブアミノ酸（例、リガンド）か、細胞表面タンパク質以外の化合物を結合し得る。従って、リガンドは、血液及び／又はリンパ液由来のタンパク質（例、アルブミン）、ポリアミノ酸（例、ポリリジン、ポリヒスチジン等）のような合成ペプチド配列、人工ペプチド配列（例、ＦＬＡＧ）、並びにＲＧＤペプチド断片を結合し得る（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３０，１１８９（１９９５））。
【００８１】
適切な非ネイティブアミノ酸配列及びそれらの基質の例としては、インテグリンによって認識される短い（例、６アミノ酸以下）直鎖状のひと続きのアミノ酸、及びポリリジン、ポリアルギニン等のようなポリアミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。複数のリジン及び／又はアルギニンを挿入することは、ヘパリン及びＤＮＡの認識を提供する。キメラアデノウイルスコートタンパク質を作製するための適切な非ネイティブアミノ酸配列は、米国特許第６，４５５，３１４号及び国際特許出願ＷＯ０１／９２５４９中に、さらに記載されている。
【００８２】
好ましくは、アデノウイルスコートタンパク質は、αｖβ３、αｖβ５、又はαｖβ６インテグリンを結合する非ネイティブアミノ酸配列を含む。ＲＧＤモチーフのようなαｖβ３インテグリンに特異的なリガンドを表示するアデノウイルスベクターは、そのような程度にインテグリンを発現しない細胞と比較して、より多数のαｖβ３インテグリン成分を細胞表面上にもつ細胞に感染し、それによって、目的の特定の細胞にベクターを標的化する。
【００８３】
本発明の別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ＣＲＧＤＣ（配列番号１)、Ｘが任意のアミノ酸を表すＣＸＣＲＧＤＣＸＣ（配列番号２）、及びＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３）を含むがそれらに限定されないＲＧＤモチーフを含むアミノ酸配列（例、非ネイティブアミノ酸配列）を含むキメラファイバータンパク質を含み得る。ＲＧＤモチーフは、好ましくは、ＨＩループのような、アデノウイルスノブの露出ループにおいて、アデノウイルスファイバーノブ領域中へと挿入され得る。ＲＧＤアミノ酸配列は、ＨＩループの領域を置換し得るか、又はネイティブアミノ酸を除去することなくＨＩループ中へと挿入され得る。ＲＧＤモチーフはまた、必要に応じてスペーサー配列を介して、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に付属され得る。スペーサー配列は好ましくは、１００と２００との間のアミノ酸を含み、そして意図された機能を有し得る（しかし必ずしも必要ではない）。１つの実施形態では、キメラファイバータンパク質は、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を認識する。理想的には、ファイバータンパク質のネイティブＣＡＲ結合は、ファイバータンパク質の変異又は改変によって影響されない。その上、アデノウイルスベクターは、ペントンベースタンパク質がインテグリンを結合するそれらの能力を保持するアデノウイルスコートを含み得る。しかしながら、本明細書中にて議論されるように、アデノウイルスコートタンパク質のペントンベースタンパク質によるネイティブ結合は、所望される場合には取り除かれ得る。別の実施形態では、ＲＧＤモチーフは、好ましくは１又は２セットのシステイン残基に隣接する。
【００８４】
アデノウイルスベクターは、特定の型の真核生物細胞に選択的ではないキメラウイルスコートタンパク質を含み得る。キメラコートタンパク質は、内部コートタンパク質配列の中又はその代わりへの非ネイティブアミノ酸配列の挿入、あるいはコートタンパク質のＮ又はＣ末端への非ネイティブアミノ酸配列の付着によって、野生型コートタンパク質と異なる。例えば、約５〜約９個のリジン残基（好ましくは７個のリジン残基）を含むリガンドが、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に、非コーディングスペーサー配列を介して付着される。本実施形態では、キメラウイルスコートタンパク質は、（国際特許出願ＷＯ９７／２００５１中に記載されているように）野生型ウイルスコートよりも、広い範囲の真核生物細胞に効率的に結合する。
【００８５】
もちろん、アデノウイルスベクターが潜在的宿主細胞を認識する能力は、コートタンパク質を遺伝的に操作することなく調節され得る。例えば、アデノウイルスを、ペントンベース結合ドメイン及び特定の細胞表面結合部位を選択的に結合するドメインを含む二重特異性分子を複合体化することは、当業者がベクターを特定の細胞型に標的化することを可能にする。
【００８６】
複製欠損アデノウイルスベクターは、典型的には、複製欠損アデノウイルスベクター中に存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を提供する相補細胞株において、高力価のウイルスベクターストックを作製するために適切なレベルにて産生される。望ましくは、相補細胞株は、細胞ゲノム中に組み込まれた、アデノウイルス増殖のために必要である遺伝子機能をコードするアデノウイルス核酸配列を含む。好ましい細胞株は、複製欠損アデノウイルスに存在しない少なくとも１つ、及び好ましくは全ての複製必須遺伝子機能について補完する。相補細胞株は、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス付随ＲＮＡ領域、又は全てのアデノウイルス機能を含むそれらの組合せによりコードされる少なくとも１つの複製必須遺伝子機能における欠損について補完し得る（例、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にするため）。最も好ましくは、相補細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（例、２つ以上の複製必須遺伝子機能）における欠損、特にＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の各々の複製必須遺伝子機能における欠損について補完する。その上、相補細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び末端タンパク質に関して）並びに／又はＥ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能における欠損について補完し得る。望ましくは、Ｅ４領域における欠損について補完する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を産生する。このような細胞は、望ましくは、少なくともＯＲＦ６を含み、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の他の如何なるＯＲＦも含まない。細胞株は、好ましくは、ベクターゲノムが細胞性ＤＮＡと組換える可能性を最小にし、かつ現実的には排除する、アデノウイルスベクターと非重複様式で補完する遺伝子を含むことによってさらに特徴付けられる。従って、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の存在は、ベクターストックにおいて回避されない場合には最小にされ、従って、一定の治療目的、特にワクチン接種目的のために適切である。ベクターストックにおけるＲＣＡの欠落は、非相補細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を回避する。このような相補細胞株の構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）及びＡｕｓｕｂｅｌら（同上）に記載されているような、標準的な分子生物学及び細胞培養技術を含む。
【００８７】
アデノウイルスベクターを産生するための相補細胞株としては、２９３細胞（例、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６，５９−７２（１９７７）に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例、国際特許出願公開ＷＯ９７／００３２６、並びに米国特許第５，９９４，１２８号及び同第６，０３３，９０８号に記載されている）、並びに２９３−ＯＲＦ６細胞（例、国際特許出願公開ＷＯ９５／３４６７１及びＢｒｏｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，９２０６−９２１３（１９９７）に記載されている）が挙げられるが、それらに限定されない。さらなる相補細胞は、例えば、米国特許第６，６７７，１５６号及び第６，６８２，９２９、並びに国際特許出願公開ＷＯ０３／２０８７９中に記載されている。幾つかの場合においては、細胞ゲノムは、複製欠損アデノウイルスベクターの全ての欠損を補完する遺伝子産物である核酸配列を含む必要がない。複製欠損アデノウイルスベクター中に欠く、１つ以上の複製必須遺伝子機能は、ヘルパーウイルス（例、所望のアデノウイルスベクターの複製のために必要な１つ以上の必須遺伝子機能をトランスで供給するアデノウイルスベクター）によって供給され得る。ヘルパーウイルスは、感染性ヘルパーウイルスのパッケージングを防ぐために、しばしば設計される。例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１つ以上の複製必須遺伝子機能は、相補細胞によって提供される一方で、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１つ以上の複製必須遺伝子機能は、ヘルパーウイルスによって提供される。
【００８８】
アデノウイルスベクターに対する適切な改変は、米国特許第５，５４３，３２８号、同第５，５５９，０９９号、同第５，７１２，１３６号、同第５，７３１，１９０号、同第５，７５６，０８６号、同第５，７７０，４４２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８７１，７２７号、同第５，８８５，８０８号、同第５，９２２，３１５号、同第５，９６２，３１１号、同第５，９６５，５４１号、同第６，０５７，１５５号、同第６，１２７，５２５号、同第６，１５３，４３５号、同第６，３２９，１９０号、同第６，４５５，３１４号、同第６，４６５，２５３号、同第６，５７６，４５６号、同第６，６４９，４０７号、同第６，７４０，５２５号、並びに国際特許出願ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／１６７７２、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２２３７８、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／４０５０９、ＷＯ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０、及びＷＯ０１／９２５４９中に記載されている。同様に、当然のことながら、数多くのアデノウイルスベクターが市販されている。アデノウイルスベクターの構築は、当該技術分野で十分に理解されている。アデノウイルスベクターは、該技術分野で公知の方法（例、２３９細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株、又は２９３−ＯＲＦ６細胞株のような相補細胞株を使用する）、並びに、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号、同第５，９９４，１２８号、同第６，０３３，９０８号、同第６，１６８，９４１号、同第６，３２９，２００号、同第６，３８３，７９５号、同第６，４４０，７２８号、同第６，４４７，９９５号、及び同第６，４７５，７５７号、米国特許出願公開２００２／００３４７３５  Ａ１、並びに国際特許出願ＷＯ９８／５３０８７、ＷＯ９８／５６９３７、ＷＯ９９／１５６８６、ＷＯ９９／５４４４１、ＷＯ００／１２７６５、ＷＯ０１／７７３０４、及びＷＯ０２／２９３８８、並びに本明細書中で明示される他の参考文献に示される方法を用いて、構築及び／又は精製され得る。
【００８９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、もちろん、その範囲を如何なる様式にも制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９０】
実施例１
本実施例は、各々が異なるＨＩＶ抗原をコードする４つのアデノウイルスベクターを含む組成物の産生を実証する。
【００９１】
アデノウイルスベクターを、迅速ベクター構築系（ＡｄＦＡＳＴ（登録商標）、ＧｅｎＶｅｃ、Ｉｎｃ．）を用いて構築した。ＡｄＦＡＳＴ（登録商標）を用いて、４つのＨＩＶ抗原：ｇｐ１４０（クレイドＡ）、ｇｐ１４０（クレイドＢ）ｄｖ１２、ｇｐ１４０（クレイドＣ）、及びＧａｇＰｏｌ（クレイドＢ）のうちの１つを各々が発現する、４つのアデノウイルスベクターを作製した。抗原の発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターによって駆動した。臨床産生の間の複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）作製のリスクを低減するために、ＧＶ１１アデノウイルス骨格を選んだ。ＧＶ１１骨格は、必須Ｅ１及びＥ４領域の欠損、並びに（アデノウイルスベクターを複製欠損にする）部分的なＥ３欠損を含む。
【００９２】
ＡｄｔＧａｇＰｏｌ（Ｂ）．１１Ｄプラスミド
ＨＩＶ−１クレイドＢからのＧａｇ及びＰｏｌタンパク質の配列を作出するのに用いた配列を用いて、ヒト細胞における発現のために最適化したコドンを用いるＧａｇ／Ｐｏｌ遺伝子の合成ポリタンパク質コード化バージョンを作出した。合成Ｇａｇ遺伝子は、ＨＩＶ−１クレイドＢ株ＨＸＢ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３４５５）からであり、合成Ｐｏｌ遺伝子（Ｐｏｌ／ｈ）は、ＨＩＶ−１クレイドＢ  ＮＬ４−３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１９９２１）からであった。Ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼタンパク質を含む融合タンパク質として存在していたため、非機能的であった。プラスミドのプロテアーゼ及び逆転写酵素遺伝子をコードする核酸配列中に、点突然変異を導入した。プロテアーゼの改変は、Ｐｏｌ遺伝子産物のプロセシングを防ぎ、そして機能的プロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼの酵素活性の可能性を低減した。Ｇａｇタンパク質には、改変を行わなかった。アデノウイルスベクター中への挿入のため、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｅ１シャトルプラスミドにおける発現カセット中へと、Ｇａｇ／Ｐｏｌ融合ポリタンパク質をコードする核酸配列をサブクローニングした。
【００９３】
Ａｄｇｐ１４０（Ａ）．１１Ｄプラスミド
ＨＩＶ−１クレイドＡ菌株９２ｒｗ０２０（ＣＣＲ５指向性、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０８７９４）からのエンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）のタンパク質配列を用いて、ヒト細胞における発現のために変化させたコドンを用いるＨＩＶ−１クレイドＡ遺伝子ｇｐ１４０ｄｅｌＣＦＩの合成バージョンを作出した。これに関して、ヒト細胞において典型的に見出されるコドンを用いることによって、タンパク質発現を制限するウイルスＲＮＡの構造を破壊するように設計された配列で、ＨＩＶ−１遺伝子を発現するプラスミドを合成的に作った。アデノウイルスベクター中への挿入のため、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、クレイドＡ  ｇｐ１４０ｄｅｌＣＦＩ遺伝子をコードする核酸配列を、Ｅ１シャトルプラスミドにおける発現カセット中へとサブクローニングした。
【００９４】
Ａｄｔｇｐ１４０ｄｖ１２（Ｂ）．１１Ｄプラスミド
ＨＩＶ−１クレイドＢ菌株ＨＸＢ２（Ｘ４指向性、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３４５５）からのエンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）のタンパク質配列を用いて、ヒト細胞における発現のために最適化したコドンを用いるＨＩＶ−１クレイドＢ遺伝子Ｘ４ｇｐ１６０／ｈの合成バージョンを作製した。エンベロープタンパク質Ｒ５ｇｐ１６０／ｈのＣＣＲ５指向性バージョンを産生するため、ＨＩＶ−１株Ｘ４ｇｐ１６０／ｈからのＨＩＶ−１エンベロープポリタンパク質のアミノ酸２７５〜３６１をコードする領域を、ＨＩＶ−１のＢａＬ株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６８８９３）からの対応する領域と置換した。ｐＲ５ｇｐ１６０／ｈからのエンベロープタンパク質遺伝子の全長ＣＣＲ５指向性バージョンを、アミノ酸６８０のためのコドンの後で終結させた。短縮Ｅｎｖ糖タンパク質（ｇｐ１４０）は、表面タンパク質全体及び融合ドメインを含有するｇｐ４１の外部ドメイン、及びオリゴマー形成のために重要な領域（特に２つのヘリックス状コイルドコイルモチーフ）を含む。産生細胞株におけるベクターの安定性及び収量を改善するため、Ｅｎｖ  Ｖ１及びＶ２ループを欠失させた。制限酵素部位の作出に起因して、欠失の直後に、２つのさらなるアミノ酸が組み込まれた。アデノウイルスベクター中への挿入のため、ｇｐ１４０ｄｖ１２遺伝子をコードする核酸配列を、Ｅ１シャトルプラスミド中の発現カセット中へと、標準的な組換えＤＮＡ技術でサブクローニングした。
【００９５】
Ａｄｇｐ１４０（Ｃ）．１１Ｄプラスミド
ＨＩＶ−１株９７ＺＡ０１２（ＣＣＲ５指向性、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２８６２２７）からのエンベロープポリタンパク質ｇｐ１４０ｄｅｌＣＦＩのタンパク質配列を用いた、ヒト細胞における発現のために最適化したコドンを用いたＨＩＶ−１クレイドＣ遺伝子ｇｐ１４０ｄｅｌＣＦＩの合成バージョン。アデノウイルスベクター中への挿入のために、合成ｇｐ１４０ｄｅｌＣＦＩ遺伝子をコードする核酸配列を、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｅ１シャトルプラスミド中の発現カセット中へとサブクローニングした。
【００９６】
アデノウイルスベクター
（ＡｄｔＧａｇＰｏｌ（Ｂ）．１１Ｄ、Ａｄｇｐ１４０（Ａ）．１１Ｄ、Ａｄｔｇｐ１４０ｄｖ１２（Ｂ）．１１Ｄ、及びＡｄｇｐ１４０（Ｃ）．１１Ｄ）４つのＥ１シャトルプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢｊＤＥ３細菌において、ＧＶ１１アデノベクターベースのＡｄＦＡＳＴ（登録商標）プラスミドｐＡｄＥ１（ＢＮ）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１）と組換えて、アデノウイルスベクタープラスミドを作製した。次いで、パッケージング細胞株、２９３−ＯＲＦ６中へとアデノウイルスベクタープラスミドを導入することによって、複製欠損アデノウイルスベクターＡｄｔＧａｇＰｏｌ（Ｂ）．１１Ｄ、Ａｄｇｐ１４０（Ａ）．１１Ｄ、Ａｄｔｇｐ１４０ｄｖ１２（Ｂ）．１１Ｄ、及びＡｄｇｐ１４０（Ｃ）．１１Ｄを作製した。
【００９７】
アデノウイルスベクター組成物
４つのアデノウイルスベクターコンストラクトを、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（フレデリック、メリーランド）で特別注文にて製造された最終製剤緩衝液（ＦＦＢ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  トレハロース、２５ｐｐｍポリソルベート８０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に対して、精製及び透析した。ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰと命名されたアデノウイルスベクター組成物を、それぞれ重量比が３：１：１：１である、ＡｄｔＧａｇＰｏｌ（Ｂ）．１１Ｄ、Ａｄｇｐ１４０（Ａ）．１１Ｄ、Ａｄｔｇｐ１４０ｄｖ１２（Ｂ）．１１Ｄ、Ａｄｇｐ１４０（Ｃ）．１１Ｄの４つのアデノウイルスベクターの各々の混和物から調製した。
【００９８】
実施例２
本実施例は、哺乳動物に投与されたアデノウイルスベクター組成物の生体内分布を実証する。
【００９９】
アデノウイルスベクター組成物ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの分布を評価するため、針とシリンジによって送達される筋肉内注射を用いた単一用量の生体内分布研究を、ニュージーランドシロウサギにおいて実施した。ベクター組成物を単一用量として、ウサギに投与し（０．９５×１０１１ｐｕ）、そしてベクター投与の９、６１、及び９１日後に、アデノウイルスベクターの存在について組織を試験した。
【０１００】
ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの４つの異なるアデノウイルスベクターの各々における特定の標的配列を検出するために開発され、そして認定されたＧＬＰ確認済みＴａｑｍａｎ（登録商標）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いて、アデノウイルスベクターの存在について、組織を試験した。アッセイは、アデノウイルスベクターの各々からアンプリコンを検出する。５’−ＰＣＲプライマー、３’−ＰＣＲプライマー及び蛍光標識プローブは、挿入物、ポリリンカー、及びプロモーターを含む領域にまたがる。本アッセイの検出の下限値は、１０コピーのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ  ＤＮＡであり、アッセイの定量の下限値は、５０コピーのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ  ＤＮＡであった。
【０１０１】
３つの時点からのＰＣＲデータは、投与の９及び６１日後に注射部位（皮下組織及び筋肉）並びに肝臓における、並びに全ての時点で脾臓における、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ  ＤＮＡの存在を示した。コピー数及び陽性組織の数は、陽性結果の組織については、研究日（ｓｔｕｄｙ  ｄａｙ：ＳＤ）９とＳＤ６１との間で、肝臓及び注射部位についてはＳＤ６１とＳＤ９１との間で大幅に減少した。毒性及び肉眼的病変の臨床的徴候は観察されなかった。
【０１０２】
実施例３
本実施例は、哺乳動物に投与されたアデノウイルスベクター組成物の免疫原性を実証する。
【０１０３】
アデノウイルスベクター組成物ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを、マウスに単一用量（１×１０１１ｐｕ）投与し、そしてウサギに２度投与した。免疫原性について、マウスについては投与４週間後、そしてウサギについては投与３６日後に、組織を分析した。
【０１０４】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びフローサイトメトリーベースの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによって、細胞性免疫応答を試験した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴは、免疫動物からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮ−γの産生を、定量的に測定する。細胞を、ＨＩＶ−１抗原（即ち、アデノウイルスベクターにおいて発現するタンパク質の長さにまたがる、一連の短い重複したペプチド）にインビトロで曝した。抗原感作したＴリンパ球によって産生されたＩＦＮ−γ分子は、アッセイプレートをコーティングする抗体に結合させ、アルカリホスファターゼ結合体化読み取り系を用いることによって、スポット形成細胞（ＳＦＣ）として比色的に計数し得る。同様に、ＩＣＳアッセイは、抗原刺激細胞によって産生されたＩＦＮ−γ（そして時にはさらなるサイトカイン）を測定するために、フローサイトメトリーベースの系を用いる。この系では、刺激細胞は、表現型リンパ球マーカーによってさらに特徴付けられ、ワクチン抗原に応答する細胞の型（例えば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球）の正確な定量を可能とする。体液性免疫応答を、ＥＬＩＳＡアッセイ、又はアデノウイルスベクターによって発現された抗原を、レクチン捕獲系を用いて試験プレートに結合した改変アッセイを用いて、測定した。
【０１０５】
ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰでの免疫は、マウスにおいて体液性及び細胞性免疫応答を誘発し、ウサギにおいて体液性免疫応答を誘発した。
【０１０６】
実施例４
本実施例は、哺乳動物に投与されたアデノウイルスベクター組成物の生体内分布を実証する
【０１０７】
およそ生後１５週齢の雄性及び雌性のニュージーランドシロウサギを、２つの処置グループに分けた。グループ１は、各性別につき３匹のウサギからなり、グループ２は各性別につき１５匹のウサギからなり、合計のウサギは３６匹であった。グループ１の動物には、研究日（「ＳＤ」）１に針とシリンジを用いて、最終製剤緩衝液（ＦＦＢ）（０．５ｍＬ／動物）の単一筋肉内注射（右大腿筋）を受けさせた。グループ２の動物には、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの１．０×１０１１ｐｕ用量の単一筋肉内注射（右大腿筋）を受けさせた。
【０１０８】
動物を、毎日少なくとも２回、瀕死及び死亡率並びに毒性の臨床的徴候について観察した（ケージ側面）。動物を秤量した時点（前処置、その後毎週、及び剖検にて）で、ケージ側面からの観察の代わりに詳細な検査を行った。評価した臨床的徴候としては、皮膚及び毛皮の特徴、眼及び粘膜、呼吸器、循環器、自律神経及び中枢神経系、並びに身体運動及び行動パターンが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０９】
試験グループ（グループ２）から性別あたり５匹の動物及びビヒクルコントロールグループ（グループ１）から性別あたり１匹の動物を、研究日９、６１及び９１に屠殺した。安楽死に先立って、内側耳介動脈の穿刺によって、０．６ｍｌの血液を、滅菌エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブ中へと採取した。各動物を、ネンブタールナトリウム注射によって安楽死させ、血液を抜いた。各動物から、以下の臓器を、採取した各臓器につき清潔な一式の器具を用いて採取した：血液、生殖腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、リンパ節、脾臓、胸腺、皮下組織及び大腿筋（注射部位における）、骨髄（注射した側面の大腿から）並びに脳。組織を直ちに無菌バイアルに置き、液体窒素中で瞬間凍結し、−７５℃±１０℃にて保存した。
【０１１０】
各組織試料における４つのアデノウイルスベクターの存在を検出するために、アデノウイルスベクター特異的ＰＣＲアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ポリメラーゼ連鎖反応法）を用いた。アッセイの検出の下限値は、１０コピーの標的／μｇＤＮＡであり、そして定量の下限値は、５０コピーの標的／μｇＤＮＡであった。検出の下限値より大きく、定量の下限値より小さい試料は、定量化できない（ｎｏｎ−ｑｕａｎｔｉｆｉａｂｌｅ：ＮＱ）と明示した。研究日９、６１、及び９１に回収した試料から、ＰＣＲ評価を行った。陽性の生体内分布結果を示す組織の概要を、表１に示す。
【０１１１】
処置に関連した死亡率の変化、毒性の臨床的徴候、体重、又は体重の変化は観察されなかった。ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを受けている雄性グループにおける摂食量は、注射後２４時間の期間の間は低下したが、その期間の後は正常に戻った。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
本実施例の結果は、複数のアデノウイルスベクターを含む組成物が、最小の毒性を示しつつ、種々の組織に形質導入することを実証する。
【０１１４】
実施例５
本実施例は、哺乳動物に投与されたアデノウイルスベクター組成物の免疫原性を実証する。
【０１１５】
２つのグループの雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、通常の生理食塩水中に希釈した空のアデノウイルスベクターか、又はＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰアデノウイルスベクター組成物で免疫した。具体的には、５匹のマウスに１×１０１０ｐｕ／動物の空のアデノウイルスベクターの筋肉内注射を受けさせ、そして１０匹のマウスに１×１０１０ｐｕ／動物のＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの筋肉内注射を受けさせた。各マウスに注射した総容量は２００μＬであった。注射の１０日後、マウスを出血させ、血清を採取し、試験するまで４℃にて保存した。脾臓を無菌的に除去し、単一細胞の懸濁液に穏やかにホモジナイズし、洗浄し、そして１０６細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。
【０１１６】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルのＬｅｃｔｉｎ−Ｇａｌａｎｔｈａｕｓ  Ｎｉｖａｌｉｓ（Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。レクチンを除去し、各ウェルを１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する２００μＬのＰＢＳで、室温で２時間ブロッキングした。プレートを０．２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、２９３細胞からのタンパク質上清（〜１μｇ／ｍＬ）の１：４の希釈液５０μＬを各ウェルに加えた。上清を、アデノウイルスベクターコンストラクトと同じＨＩＶ−１クレイドＡ、Ｂ及びＣエンベロープ抗原を発現するＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞から調製した。空のｐ２０００ベクターでトランスフェクトした２９３細胞の抽出物からの総タンパク質を、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１１７】
プレートを、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。（コントロールプラスミドｐ２０００で免疫したマウスからの）コントロール血清、又は試験プラスミドをワクチン接種したマウスからの血清のいずれかの５０μＬを、１：１００の希釈から始まる４倍希釈系列において各ウェルに加えた。プレートを、室温で１時間インキュベートし、洗浄し、そして５０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧを各ウェルに加えた。プレートを、室温で１時間インキュベートし、洗浄し、そして５０μＬの基質（Ｆａｓｔ  ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加えた。次いでプレートを、室温で３０分間インキュベートした。反応を、５０μＬの１（Ｎ）Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止し、吸光度を４５０ｎｍにて読んだ。
【０１１８】
回収した脾臓細胞（１０６細胞／ペプチドプール）を、６時間刺激した。刺激の最後の５時間は、アデノウイルスベクターによって発現したアミノ酸配列と同じものを有するペプチドプールで、１０μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在中で行った。使用した全てのペプチドは、試験した遺伝子の完全な配列にわたる１１アミノ酸が重複する１５マーであった。細胞を、透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）し、固定し、そしてモノクローナル抗体（ラット抗マウス細胞表面抗原ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））で染色し、続いてＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α陽性細胞を検出するためのマルチパラメトリックフローサイトメトリーを行った。コントロールプラスミドワクチン接種マウスと試験物ワクチン接種マウスとの間で観察されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答の統計学的解析を、Ｐｒｉｓｍ３．０ソフトウェア（サンディエゴ、カリフォルニア）を用いたＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験によって行った。
【０１１９】
ワクチン接種したマウスにおけるＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答を、細胞内フローサイトメトリーによって実証した。０．１％より大きい頻度のサイトカイン産生細胞が陽性結果を表すと仮定すれば、ＣＤ４＋応答は、３／１０（Ｇａｇ）、７／１０（Ｐｏｌ）、８／１０（Ｅｎｖ−Ａ）、１０／１０（Ｅｎｖ−Ｂ）、及び９／１０（Ｅｎｖ−Ｃ）マウスにおいて観察された。ＣＤ８＋応答は、９／１０（Ｇａｇ）、１０／１０（Ｐｏｌ）、６／１０（Ｅｎｖ−Ａ）、６／１０（Ｅｎｖ−Ｂ）、及び７／１０（Ｅｎｖ−Ｃ）マウスにおいて観察された。全てのマウスは、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰでの免疫後に、ＨＩＶ−１タンパク質に対する実証可能な抗体価（ＥＬＩＳＡによって測定）を有した。
【０１２０】
これらの結果は、アデノウイルスベクター組成物がマウスにおける免疫応答を誘発したことを実証する。
【０１２１】
実施例６
本実施例は、哺乳動物に投与されたアデノウイルスベクター組成物の免疫原性を実証する。
【０１２２】
ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（１×１０１１ｐｕ）を、針とシリンジを用いて、２０匹のウサギのグループ（グループ２）に筋肉内に投与し、等しいサイズのプラシーボグループをコントロールとして用いた（グループ１）。第三のグループのウサギ（グループ３）に、それぞれクレイドＢ  Ｇａｇ、クレイドＢ  Ｐｏｌ、クレイドＢ  ｎｅｆ、並びにクレイドＡ、Ｂ及びＣからのＥｎｖ  ｇｐ１４５を各々コードする６つのプラスミドを含むプライマー組成物（ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ）（４ｍｇ）を投与した。クレイドＢ  Ｐｏｌプラスミドはまた、逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼタンパク質を含む融合タンパク質をコードした。プラスミドのプロテアーゼ及び逆転写酵素遺伝子をコードする核酸配列中に点突然変異を導入し、これは、逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼタンパク質を非機能性にした。プライマー組成物の投与に続いて、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの用量（１×１０１１ｐｕ）を、グループ３のウサギに投与した。グループ３の動物を、等しいサイズのプラシーボグループ（グループ４）と比較した。
【０１２３】
免疫に続いて、体液性免疫応答をＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。具体的には、ワクチン研究センター、国立衛生研究所（ベセスダ、メリーランド)（ＶＲＣ）にて産生された、ＨＩＶ−ＥｎｖＡ、Ｂ、及びＣをそれぞれコードするプラスミド（即ち、プラスミド番号５３０４、２８０１、及び５３０８）を、２９３細胞において発現させ、主要なタンパク質産物について精製した。最適濃度の組換え抗原をマイクロタイタープレート上にコーティングし、４℃にて一晩保った。マイクロタイタープレートを洗浄し、２０％ＦＢＳ／１％ＢＳＡ緩衝溶液でブロッキングし、インキュベートした。ウサギ血清の系列希釈の二連のウェルをインキュベートし、続いてビオチン標識ヤギ及びウサギ、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ、並びにＴＭＢ基質処理を行った。発色を停止し、プレートを３０分以内に４５０ｎｍで読んだ。報告の結果は、二連のウェルの平均に基づく。
【０１２４】
グループ１中のウサギからの全ての血清試料及びグループ２の処理前の血液（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）は、低い未加工の吸光度（ＯＤ）を示し、１：１００及び１：１０００の希釈にて平均ＯＤ±標準偏差は０．１５９±０．１０５（ｎ＝４８０）であった。投与２４日後のグループ２のウサギからの全てのサンプルは、１：１０００の血清の希釈にて、セロコンバージョン（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の証拠を示した。具体的には、全ての抗原についての未加工の吸光度は０．２１より大きく、平均ＯＤ±標準偏差は２．７１±１．０７（ｎ＝１６０）であった。グループ２の全てのウサギは、ＨＩＶ−ＥＮＶ−Ａ、ＥＮＶ−Ｂ、ＥＮＶ−Ｃ 及びＧＡＧについて、検出可能な抗体濃度を示した。
【０１２５】
グループ３中のウサギからの全ての試料及びグループ４の動物の処理前の血液は、低い未加工の吸光度（ＯＤ）を示し、平均のワクチン接種前のＯＤ±標準偏差は０．０９９±０．０６５（グループ３、ｎ＝１６０試料）及び０．１２９±０．１３８（グループ４、ｎ＝１６０試料）であった。さらに、グループ４のウサギは、ワクチン接種後の全ての抗原について、非常に高いＯＤ値であった。グループ４の数匹のウサギは、ワクチン接種前により高いＯＤ値を示したものの、誘導免疫応答の指標である上昇したＯＤ値が１０８日目に観察された（ＯＤ＝３．５２９±０．８１２）。
【０１２６】
本実施例は、本発明の方法が哺乳動物においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する能力を実証する。
【０１２７】
実施例７
本実施例は、哺乳動物において、単独で又はＤＮＡプライム／アデノウイルスブーストレジメンの一部として投与された、アデノウイルスベクター組成物の免疫原性を実証する。
【０１２８】
非近交系の成体アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）に、ＳＩＶｍａｃ２３９Ｇａｇ／Ｐｏｌ及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質をコードするアデノウイルスベクター（単一又はマルチクレイド）（１×１０１２ｐｕ又は３．３×１０１１ｐｕ）（ＶＲＣ／ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド）を単独で、あるいは研究グレードのＳＩＶｍａｃ２３９Ｇａｇ／Ｐｏｌ−ｎｅｆプラスミド及び単一又はマルチクレイドＨＩＶ−１  Ｅｎｖプラスミド（ＶＲＣ／ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド）の混合物との組み合わせのいずれかで、筋肉内に注射した。各々の場合において、ワクチン材料を無菌生理食塩水中で一緒に混合し、３番のＢｉｏｊｅｃｔｏｒシリンジ（Ｂｉｏｊｅｃｔ）を用いて大腿四頭筋における２回の０．５ｍＬの注射として送達した。０週目、８週目、及び２６週目に、動物をアデノウイルスベクター単独について免疫した。ＤＮＡ／アデノウイルスベクタープライム−ブーストレジメンのために、サルに、０週目、４週目、８週目にプラスミドを投与し、２６週目にアデノウイルスベクターを投与した。サルを、免疫後９０週を通して、２〜４週毎に出血させた。
【０１２９】
複数のウイルス抗原へのワクチン誘発性のＴ細胞性免疫応答の出現をモニターするため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用した。ＳＩＶ  Ｇａｇタンパク質にわたる１１アミノ酸が重複する１５アミノ酸のペプチドのプール、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ８９．６Ｐタンパク質（異種クレイドＢ  Ｅｎｖ）にわたる１０アミノ酸が重複する２０アミノ酸のペプチドのプール、並びにＭａｍｕ−Ａ＊０１拘束（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＣＴＬエピトープペプチドｐ１１ｃ、ｐ４１ａ、及びｐ６８ａを用いて、各動物について、別個のアッセイを行った。内毒素フリーのＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で、１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍＬ抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂ２７；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、９６ウェルマルチスクリーンプレートを一晩コーティングした。次いで、プレートを、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＤ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、５％のＦＢＳを含有するＤ−ＰＢＳで３７℃にて２時間ブロッキングし、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、Ｔｗｅｅｎ−２０を除去するために１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０でリンスし、そして１００μｌの反応容量において三連でペプチドプール及び２×１０５のＰＢＭＣとインキュベートした。３７℃での１８時間のインキュベーションの後、プレートを、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで９回及び蒸留水で１回洗浄した。次いで、プレートを２μｇ／ｍＬのビオチン化ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）と室温で２時間インキュベートし、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｗａｓｈ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で６回洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：５００希釈液とともに２．５時間インキュベートした。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｗａｓｈでの５回の洗浄及びＰＢＳでの１回の洗浄に続いて、プレートをＮＢＴ／ＢＣＩＰ色素原（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色し、水道水で洗浄することによって停止し、風乾し、そしてＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｈｉｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて読んだ。１０６ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）を算出した。培地のバックグラウンドは、一貫して１５スポット形成細胞／１０６ＰＢＭＣ未満を示した。
【０１３０】
単一アデノウイルスベクター免疫に続いて、Ｇａｇ及びＥｎｖペプチドプールへの応答が両方のサルで検出された。免疫の４週間後、合計のスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０６ＰＢＭＣは、サルＡｗ１３及びＡＶ８３のそれぞれについて、２，５６０及び２，１６０であった。サルＡＶ８３は、８週目における２度目のアデノウイルスベクター免疫に続いて、増強されたＧａｇ及びＥｎｖ特異的細胞性免疫応答を生じたが、サルＡｗ１３の応答において如何なる変化も観察されなかった。いずれのサルも、２６週目の第三のアデノウイルスベクター免疫には、増大した応答を実証しなかった。これらのワクチンコード抗原に対する細胞応答は、サルＡｗ１３及びＡＶ８３において、免疫後５２週を通して依然として持続した。
【０１３１】
Ｇａｇ及びＥｎｖベクターコード抗原に対する細胞性免疫応答を、ＤＮＡプライム／アデノウイルスベクターブーストレジメンでの免疫に続いて、プールしたペプチドのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。２６週目におけるアデノウイルスベクターブーストに続いて、Ｇａｇ及びＥｎｖペプチドプールへの細胞性免疫応答は、サルＡｗ２Ｐ及びＡｗ２８において、ＤＮＡワクチン接種単独と比較して、５〜６倍高く増加した。３０週目（即ち、免疫４週後）には、合計のＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣは、サルＡｗ２Ｐ及びＡｗ２８のそれぞれについて７０１０及び７８０５であった。これらのベクターコード抗原に対する細胞応答は、免疫後５８週を通して依然として持続し、サルＡｗ２Ｐ及びＡｗ２８において４２６５及び３０００ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣが測定された。
【０１３２】
アデノウイルスベクターコンストラクトによって誘発される細胞性免疫における、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の寄与を評価するため、最終アデノウイルスベクター免疫の２週後の２８週目に、未分画及びＣＤ８＋リンパ球枯渇ＰＢＬを用いてペプチドＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。全ＰＢＬを用いるとＧａｇ及びＥｎｖペプチドプールに対して強力な細胞性免疫応答が測定されたが、これらの応答は、ＣＤ８＋リンパ球がＰＢＬ集団から除去された場合には実質的に低減された。このことは、アデノウイルスベクターでの免疫が、優勢にＣＤ８＋Ｔリンパ球に媒介される強力な細胞性免疫応答を誘発することを実証する。
【０１３３】
直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ−ＭＮ）及び抗ｐ２７  ＳＩＶｍａｃ２３９抗体の血漿力価を測定した（例、ＶａｎＣｏｔｔら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，７３（６），４６４０−５０（１９９９）参照）。両方のサルは、アデノウイルスベクター免疫後に、ｇｐ１４０  ８９．６エンベロープタンパク質に対する実証可能な抗体力価（ＥＬＩＳＡによって測定）を有した。強い相同中和抗体力価が、４匹の動物全てにおいてまた測定されたが、ＤＮＡプライム／アデノウイルスブースト動物における応答の規模は、単独のアデノウイルスベクターワクチン接種後に観察される応答のものより、数倍高かった。
【０１３４】
フローベースの中和アッセイを用いて、血漿媒介ウイルス中和反応を測定した。血漿試料を、補体タンパク質を枯渇させるため熱失活させ、１：５希釈にて試験した。２８週及び３２週までに媒介された中和百分率を、０週の免疫前血漿と比較して算出した（例、Ｍａｓｃｏｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（１０），４８１０−２１（２００２）参照）。ＨＩＶ−１  ８９．８エンベロープ抗原に対する中和抗体もまた、実証した。ＤＮＡプライム／アデノウイルスブーストワクチン接種動物における中和抗体応答の規模は、アデノウイルスベクターワクチン接種動物よりも高かった。
【０１３５】
これらの結果は、アデノウイルスベクター組成物が、哺乳動物において単独で投与された場合に免疫応答を誘発し得、そしてアデノウイルスベクター組成物が哺乳動物においてＤＮＡプライム／アデノウイルスブーストレジメンの一部として用いられた場合に、免疫応答を増強し得ることを示す。
【０１３６】
実施例８
本実施例は、アデノウイルスベクター組成物又はプライマー組成物中に存在しないＨＩＶ抗原に対する防御免疫を誘導するための、本発明の方法の使用を実証する。
【０１３７】
２４匹の非近交系成体インド由来アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）に、ＳＩＶｍａｃ  ２３９  Ｇａｇ／Ｐｏｌ  ＤＮＡ、ＨＩＶ−１  ８９．６Ｐ  Ｅｎｖ  ＤＮＡ（ＶＲＣ／ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド）、又はＨＸＢ２／Ｂａｌ  Ｅｎｖ  ＤＮＡを発現するＤＮＡコンストラクトを筋肉内に注射し、続いて組換えアデノウイルスベクターのブースト投与を行った。不安定性のために、研究グレードアデノウイルスベクターを、Ｎｅｆを用いることなく作製した（Ｌｅｔｖｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（印刷中）参照）。
【０１３８】
各場合において、ワクチンコンストラクトを、滅菌生理食塩水中で一緒に混合し、３番のＢｉｏｊｅｃｔｏｒシリンジ（Ｂｉｏｊｅｃｔ）を用いて、大腿四頭筋における２回の０．５ｍＬの注射として送達した。ＤＮＡ免疫を０、４、８週目に行い、ＤＮＡ／アデノウイルスベクタープライム−ブーストレジメンのためにアデノウイルスベクター免疫を２６週目に行った（１×１０１２ｐｕ）。サルを、免疫後９０週を通して、２〜４週毎に出血させた。以下の４つの実験グループを試験した：（１）コントロール、（２）Ｅｎｖを持たない、Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ  ＤＮＡ及びＧａｇ／Ｐｏｌアデノウイルスベクター（モック）、（３）ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ  Ｅｎｖを持つ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ  ＤＮＡ及びＧａｇ／Ｐｏｌアデノウイルスベクター、又は（４）ＨＸＢ２／Ｂａｌ  Ｅｎｖを持つ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ  ＤＮＡ及びＧａｇ／Ｐｏｌアデノウイルスベクター。
【０１３９】
全てのサルを、３８週目（即ちアデノウイルスベクターブーストの１２週後）にサル感染性用量５０（ＭＩＤ５０）のＳＨＩＶ−８９．６Ｐを静脈内でチャレンジした。サルを、免疫及びチャレンジの両方の後２〜４週毎に出血させた。
【０１４０】
新鮮な単離末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＳＩＶｍａｃ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質にわたるペプチドプールへのインビトロ暴露の後、ＳＩＶｍａｃへのインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答について評価した。全てのＥｎｖ特異的応答を、Ｅｎｖ免疫原と一致させたペプチドを用いて評価した。試験系は、Ｌｅｔｖｉｎら（同上）中に記載されている。
【０１４１】
実験的免疫原を受けている全てのサルのＰＢＭＣからのＥＬＩＳＰＯＴ応答は、頑強であった。ＳＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆへの細胞性免疫は、ワクチン接種サルの全てのグループにおいて生じ、ＨＩＶ−１  ８９．６Ｐ及びＨＸＢ２／Ｂａｌ  Ｅｎｖへの細胞性免疫は、これらのそれぞれの免疫原を受けているサルにおいて生じた。最終プラスミドＤＮＡ接種の２週後では、全てのウイルスタンパク質に対するワクチン誘発ＥＬＩＳＰＯＴ応答の平均合計は、不適合なＥｎｖグループのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値の標準誤差（ＳＥＭ）１，５８８±５５４であった。組換えアデノウイルスベクターでのブーストの２週後、ＤＮＡプライミング単独によって誘発されるのに対して、細胞性免疫は＞２．５倍増加した。
【０１４２】
３８週目のサル感染用量５０（ＭＩＤ５０）のＳＨＩＶ−８９．６Ｐのチャレンジの後には、全てのコントロールにおいてＣＤ４＋Ｔリンパ球の深刻な損失が観察され、同時に全てのワクチン接種動物において、そのＣＤ４＋Ｔリンパ球枯渇の実質的な鈍化が見られた。この鈍化は、ＳＩＶ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ−Ｎｅｆに加えてＨＩＶ−１  Ｅｎｖを受けたサルにおいて最も顕著であり、ワクチン中のＥｎｖ成分の含有によって提供されるＣＤ４＋Ｔリンパ球損失に対する統計学的に有意な防御作用を裏付ける。重要なことに、不適合なＥｎｖ抗原を受けたサルは、適合する抗原を接種されたサルに匹敵する防御作用を示した。ＳＩＶ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ＋の不適合なＥｎｖ免疫原を受けたサルのグループはまた、低減したウイルスロード（ｌｏａｄ）によって示される、より良いウイルスの封じ込めを実証した。
【０１４３】
これらの結果は、アデノウイルスベクター組成物が、哺乳動物におけるＨＩＶへの免疫応答を誘発するために用いられ得ることを示す。
【０１４４】
実施例９
本実施例は、哺乳動物において、ＤＮＡプライム／組換えアデノウイルスブーストレジメンの一部として投与されたアデノウイルスベクター組成物によって誘発される細胞性免疫応答を実証する。
【０１４５】
非近交系の成体アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）に、ＳＩＶ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆタンパク質をコードするＧＬＰグレードのプラスミドＤＮＡベクター並びにＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰと命名された組成物中に含有されるマルチクレイドＡ、Ｂ、及びＣ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質の混合物を筋肉内に注射した。ＳＩＶｍａｃ  ２３９  Ｇａｇ／Ｐｏｌをコードするアデノウイルスベクター並びにＨＩＶ−１クレイドＡ、Ｂ、及びＣをコードするアデノウイルスベクターを、ブーストに用いた。
【０１４６】
各々の場合に、プラスミド又はアデノウイルスベクターを、滅菌生理食塩水中で一緒に混合し、３番のＢｉｏｊｅｃｔｏｒシリンジ（Ｂｉｏｊｅｃｔ）を用いて大腿四頭筋における２回の０．５ｍＬの注射として送達した。動物を、０、４、８週目にプラスミドＤＮＡで、２６週目にアデノウイルスベクターで免疫した。動物を、４２週を通して、２〜４週毎に出血させた。特定のプライム及びブースト免疫を、それぞれ表２及び３に記載する。
【０１４７】
【表２】
2007532656.tif 000003
【０１４８】
【表３】
2007532656.tif 000004
【０１４９】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、複数のウイルス抗原へのワクチン誘発Ｔ細胞免疫応答の出現をモニターした。アデノウイルスベクターによってコードされる免疫原の配列に適合するＳＩＶ  Ｇａｇ、ＳＩＶ  Ｐｏｌ、ＳＩＶ  Ｎｅｆ、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖクレイド  Ａ、ＨＩＶ−１  ＥｎｖクレイドＢ、及びＨＩＶ−１  ＥｎｖクレイドＣタンパク質にわたる１１アミノ酸が重複する１５アミノ酸のペプチドのプールを用いて、各動物について、別個のアッセイを行った。また、アデノウイルスベクターによってコードされる抗原と非相同的なクレイドＢ  Ｅｎｖ配列であるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ８９．６Ｐにわたる１０アミノ酸が重複する２０アミノ酸のペプチドのプールを用いてアッセイを行った。内毒素フリーのＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で、１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂ２７；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、９６ウェルマルチスクリーンプレートを一晩コーティングした。次いで、プレートを、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＤ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、５％のＦＢＳを含有するＤ−ＰＢＳで３７℃にて２時間ブロッキングし、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、Ｔｗｅｅｎ−２０を除去するために１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０でリンスし、そして１００μｌの反応容量において三連でペプチドプール及び２×１０５のＰＢＭＣとインキュベートした。３７℃での１８時間のインキュベーションの後、プレートを、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで９回及び蒸留水で１回洗浄した。
【０１５０】
次いで、プレートを２μｇ／ｍＬのビオチン化ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）と室温で２時間インキュベートし、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｗａｓｈ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で６回洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：５００希釈液とともに２．５時間インキュベートした。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｗａｓｈでの５回の洗浄及びＰＢＳでの１回の洗浄に続いて、プレートはＮＢＴ／ＢＣＩＰ色素原（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させ、水道水で洗浄することによって停止し、風乾し、そしてＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｈｉｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて読んだ。スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０６ＰＢＭＣを算出した。培地のバックグラウンドは、一貫して１５スポット形成細胞／１０６ＰＢＭＣ未満を示した。
【０１５１】
単一のクレイドＥｎｖ免疫によって誘発される細胞性免疫応答の交差クレイド反応性の程度を、グループ１（高クレイドＢ  Ｅｎｖ）及びグループ２（高クレイドＣ  Ｅｎｖ）における応答を評価することによって、調査した。ＤＮＡプライム免疫のために、サルは、クレイドＢ（グループ１）又はクレイドＣ（グループ２）からの４．５ｍｇのＥｎｖプラスミドと共に４．５ｍｇのＧａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆプラスミドを受けた。ＰＢＭＣを、ＥｎｖクレイドＡ、ＥｎｖクレイドＢ、ＥｎｖクレイドＣ、及びＥｎｖ８９．６Ｐ（非相同的クレイドＢ  Ｅｎｖ）からのペプチドプールを用いたプールペプチドＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、Ｅｎｖ特異的細胞性免疫応答について試験した。ＥｎｖクレイドＢプラスミドを受けたグループ１中のサルは、全てのＥｎｖペプチドプールに対する応答を生じた。このことは、一定の交差クレイド反応性を実証した。しかしながら、クレイドＢペプチドの応答は、クレイドＡ又はクレイドＣの応答よりも高かった。グループ１中のサルのＤＮＡプライム細胞性免疫応答は、１．０×１０１２ｐｕのＧａｇ／Ｐｏｌ及び１．０×１０１２ｐｕのクレイドＢ  Ｅｎｖアデノウイルスベクターでのブースト免疫後、劇的に増大した。全てのＥｎｖペプチドプールへの応答が、アデノウイルスベクターブースト免疫後にこれらのサルから観察されたものの、全ての６匹の動物は、クレイドＢ  Ｅｎｖへ最高の応答を実証した。
【０１５２】
同様に、Ｅｎｖプラスミド及びクレイドＣからのアデノウイルスベクターを受けたグループ２中のサルは、全てのＥｎｖペプチドプールに対する応答を生じた。ＤＮＡプライム免疫後及びアデノウイルスベクターブースト後では、クレイドＣの応答は、６匹の動物全てにおいて、クレイドＡ又はクレイドＢ応答よりも高かった。これらのデータは、単一クレイドＥｎｖ免疫原でのＤＮＡプライム／アデノウイルスベクターブースト免疫が、部分的に交差クレイド反応性を有するＥｎｖ特異的細胞性免疫応答を誘発するが、最高の応答は一般的に、免疫原と適合するＥｎｖクレイドに対するものであったことを実証した。
【０１５３】
グループ４（低クレイドＢ  Ｅｎｖ）中のサルのＥｎｖ特異的細胞性免疫応答は、グループ１（高クレイドＢ  Ｅｎｖ）中のサルの応答に匹敵した。グループ４のサルは、ＤＮＡプライム免疫のために、クレイドＢからの１．５ｍｇのＥｎｖプラスミドとともに４．５ｍｇのＧａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆプラスミドを受け、そしてブースト免疫のために、３．３×１０１１ＰＵのクレイドＢ  Ｅｎｖアデノウイルスベクターとともに１．０×１０１２ｐｕのＧａｇ／Ｐｏｌアデノウイルスベクターを受けた。これらの観察は、単一のＥｎｖプラスミド又はアデノウイルスベクターの用量を３倍低くしても、免疫原性における主要な低減を生じないことを示唆している。偽プラスミド及びアデノウイルスベクターのみを受けたグループ５中のサルにおいては、最小限のバックグラウンド応答を観察した。
【０１５４】
マルチクレイドＥｎｖ免疫によって誘発される細胞性免疫応答の幅及び規模を、グループ３（クレイドＡ＋Ｂ＋Ｃ  Ｅｎｖ）における応答を評価することによって調査した。ＤＮＡプライム免疫については、これらのサルは、クレイドＡ、Ｂ、及びＣからの１．５ｍｇの各Ｅｎｖプラスミド（合計４．５ｍｇのＥｎｖプラスミド）とともに４．５ｍｇのＧａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆプラスミドを受けた。ＥｎｖクレイドＡ、Ｂ、及びＣと同様の規模及び幅広い細胞性免疫応答を観察した。これらのデータは、グループ３中の３つのＥｎｖプラスミドの混合物が、グループ３中の各Ｅｎｖプラスミド成分が４．５ｍｇではなく１．５ｍｇの用量を与えられたという事実にも関わらず、応答の規模を損なうことなく幅の増加をもたらすことを実証する。１．０×１０１２ｐｕのＧａｇ／Ｐｏｌアデノウイルスベクター及び各クレイドＡ、Ｂ、及びＣの３．３×１０１１ｐｕのＥｎｖアデノウイルスベクターでのブースト免疫の後には、６匹のサル全てが、クレイドＡ、Ｂ、及びＣ  Ｅｎｖペプチドプールへ同様の規模の応答を実証した。これらのデータは、グループ３における個々のクレイド特異的応答の各々の規模が、グループ１及び２において誘発された至適クレイド特異的応答に匹敵することを実証する。
【０１５５】
ＳＩＧ  Ｇａｇ及びＰｏｌへの細胞性免疫応答が、ＤＮＡ免疫後及びアデノウイルスベクターブースト後に、ワクチン接種したサルの全てにおいて観察された。４成分のマルチクレイドワクチン産物（グループ３）を受けたサルは、単一クレイドＥｎｖ免疫原を受けたサルにおいて観察されたような、ＳＩＶ  Ｇａｇ及びＳＩＶ  Ｐｏｌに対する同様の規模の細胞性免疫応答を誘発した。４成分のマルチクレイドワクチン産物（グループ３）は、従って単一クレイドワクチン（グループ１、２、及び４）と比較して、免疫原性を損なうことなく、全てのワクチンコード抗原に対するより幅広い応答を生じた。さらに、これらの抗原への細胞性免疫応答は、ＤＮＡプライム及びアデノウイルスベクターブースト免疫の両方の後に持続することが見出された。
【０１５６】
単一クレイド及びマルチクレイドＥｎｖ免疫によって誘発される体液性免疫応答を、アデノウイルスベクターブースト免疫後のサルからのＥｎｖ特異的抗体力価を評価することによって調査した。ＥＬＩＳＡによって測定されるようなＥｎｖクレイドＡ、クレイドＢ、又はクレイドＣ特異的抗体結合活性について、血漿試料を試験した。
【０１５７】
免疫前の最終希釈を０．２より大きい吸光度（ＯＤ）に補正するように、１０週（ＤＮＡ後）及び４０週（アデノウイルスベクター後）のエンドポイント力価を決定した。ウェルを、３７．５ｎｇの精製Ｅｎｖ抗原で、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、３７℃で１時間ブロッキング（２０％ＦＢＳ／１％ＢＳＡ緩衝溶液）した。血清の系列希釈の二連のウェルを、３７℃で２時間インキュベートし、続いてビオチン標識ヤギ抗サル（３７℃で１時間）、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（３０分、室温（ＲＴ））、及びＴＭＢ基質（３０分、ＲＴ）処理を行った。硫酸を加えて発色を停止し、プレートを３０分以内に４５０ｎｍで読んだ。報告の結果は、二連のウェルの平均に基づく。
【０１５８】
グループ１中のサル（高クレイドＢ  Ｅｎｖ）は、３つのＥｎｖ抗原全てに結合し得る抗体応答を生じた。このことは、一定の交差クレイド反応性を実証する。クレイドＢ及びＣ  Ｅｎｖ抗原に対して頑強な応答が測定されたものの、最高の抗体力価が、相同クレイドＢ  Ｅｎｖに対して検出された。グループ４中のサル（低クレイドＢ  Ｅｎｖ）は、グループ１のサルにおいて測定されたような幅及び規模と同様のＥｎｖ特異的抗体力価を示した。このことは、Ｅｎｖ免疫原の用量を１／３に下げても、免疫原性の低減を生じないことを実証する。グループ２中のサル（高クレイドＣ  Ｅｎｖ）は同様に、３つのＥｎｖ抗原全てを認識し得る抗体応答を誘発したが、最高の力価が、相同クレイドＣ  Ｅｎｖに対して検出された。しかしながら、クレイドＡ、クレイドＢ、及びクレイドＣ  Ｅｎｖ抗原（グループ３）の混合物で免疫されたサルは、３つのＥｎｖ抗原全てに高い規模の抗体力価を実証した。
【０１５９】
これらのデータは、マルチクレイドＥｎｖ免疫が、単一クレイドＥｎｖ免疫によって誘発される応答と比較した場合に、免疫原性を損失することなく、体液性免疫応答の幅の増加をもたらすことを示唆する。
【０１６０】
実施例１０
本実施例は、哺乳動物において、ＤＮＡプライム／組換えアデノウイルスブーストレジメンの一部として投与されたアデノウイルスベクター組成物によって誘発される細胞性及び体液性免疫応答を実証する。
【０１６１】
非近交系の成体カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）に、ワクチンプラスミド又はアデノウイルスベクターコンストラクトの混合物を筋肉内に注射した。具体的に、プライム免疫のために、組成物ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ（実施例８）に含有されるＧａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆタンパク質並びにマルチクレイドＡ、Ｂ、及びＣ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を発現するＧＬＰプラスミドＤＮＡを用いた。アデノウイルスベクターブーストとしては、ＧＭＰグレードＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（実施例１）を用いた。
【０１６２】
動物研究における３回の計画した注射に必要な量を達成するために、３ロットの製剤化材料を調製した。３ロットは、５０ｍｌコニカルチューブ中で組み合わせた。混ぜるためにチューブを数回反転させた後、１５．６〜１５．７ｍＬの混合物を、３つの５０ｍＬコニカルチューブの各々に分注した。チューブを標識し、分配するまで−２０℃にて保存した。
【０１６３】
８ｍｇのＤＮＡ組成物を、０、４、８週目にＢｉｏｊｅｃｔｏｒによって筋肉内（ｉ．ｍ．）に送達し、合計１０１１ｐｕのアデノウイルスベクターワクチンコンストラクトを、３８週目に針とシリンジによってｉ．ｍ．に送達した。動物を、４２週を通して、２〜４週毎に出血させた。
【０１６４】
実施例８中に記載されているように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、複数のウイルス抗原へのワクチン誘発Ｔ細胞免疫応答の出現をモニターした。実施例８中に記載されているように、直接ＥＬＩＳＡを用いて、ＥｎｖクレイドＡ、クレイドＢ、及びクレイドＣ抗体の血漿力価を測定した。
【０１６５】
ＤＮＡプラスミドワクチンプライム及びアデノウイルスベクターブーストを受けたサルは、６匹の動物全てにおいて、ＤＮＡプライム免疫後及びアデノウイルスベクターブースト後に、クレイドＡ、Ｂ、及びＣ  Ｅｎｖペプチドプールに対する応答を生じた。６匹のうちの５匹の動物は、３つのエンベロープ抗原（クレイドＡ、Ｂ、及びＣ）の全てに対して抗体応答を発生した。１匹の動物は、クレイドＡ及びＣエンベロープのみに体液性免疫応答を発生した。６匹のサル全ては、アデノウイルスブースト後に強いＥｎｖ抗体応答を有した。
【０１６６】
これらのデータは、臨床的ＤＮＡプライム／アデノウイルスベクター産物が免疫原性であり、クレイドＡ、Ｂ、Ｃ  Ｅｎｖ並びにＧａｇ及びＰｏｌに対する細胞性免疫応答、並びにクレイドＡ、Ｂ及びＣ  Ｅｎｖ並びにＧａｇに対する抗体応答を誘導することを実証する。アデノベクターブーストは、免疫応答を数倍に増加した。
【０１６７】
実施例１１
本実施例は、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）において、組換えアデノウイルスブースト免疫によって誘発される細胞性免疫応答を実証する。６匹のカニクイザル（Ｍａｕｒｉｔｉｕｓ由来）を、１×１０１１ｐｕ用量のアデノウイルスベクター組成物ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（実施例１）で筋肉内に１回免疫した。組成物を、針とシリンジを用いた大腿四頭筋における２回の０．５ｍＬの注射として送達した。サルを、免疫後４週を通して、２〜４週毎に出血させた。実施例８中に記載されているように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、複数のウイルス抗原へのワクチン誘発Ｔ細胞免疫応答の出現をモニターした。
【０１６８】
アデノウイルスベクターを受けたサルは、６匹の動物全てにおいて、クレイドＡ、Ｂ、及びＣ  Ｅｎｖペプチドプールに対する応答を生じた。これらのデータは、臨床的アデノウイルスベクター産物が免疫原性であり、クレイドＡ、Ｂ、Ｃ  Ｅｎｖ、並びにＧａｇ及びＰｏｌに対する細胞性免疫応答を誘導することを実証する。
【０１６９】
動物を、実験動物医学（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）認定の獣医師によって、免疫前（−１週目）、０週目（第一の免疫）、並びに１、２、３、４、５、及び８週目の時点で、塩酸ケタミンによる化学麻酔後に臨床的に評価した。血清化学及び完全な血球数を、−１、３、及び５週目に決定した。被験動物は、評価した全ての時点において、健康で優れた状態であることが見出された。身体的検査としては、聴診、触診、並びに体温、脈拍、及び呼吸の決定が含まれた。体温、脈拍、及び呼吸は正常限界内であった。２匹のサル（ＣＯ７４２２及びＣＯ７４１４）において、それぞれ１週目及び５週目に、豆サイズの鼠径リンパ節を、接種と同側面上に検出した。白血球数及びヘマトクリット値は、全ての動物について、一般的に正常限界内であり、免疫前後の時点の間で、最小限の変動であった。血清電解質、血中尿素窒素及びクレアチニンもまた、正常限界内であった。
【０１７０】
全ての動物は、免疫前及び免疫において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ／ＧＯＴ）、アルカリホスファターゼ、及び総ビルブビン（ｂｉｌｂｕｂｉｎ）レベルを正常限界で有した。動物ＣＯ７４１２は、９７Ｕ／Ｌ（正常範囲０〜１３８Ｕ／Ｌ）の免疫前アラニンアミノトランズフェラーゼ／グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ／ＧＰＴ）を有した。ＡＬＴは、免疫後わずかに上昇した（３週目に１７７Ｕ／Ｌ、５週目に１６６Ｕ／Ｌ）が、免疫後８週目には、正常限界内（１３６Ｕ／Ｌ）であった。酵素クレアチニンキナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼは、動物ＣＯ７４２３及びＣＯ７４２０において、５週目に最小限に増加し、それは最もおそらくはケタミン誘導性筋肉損傷を表していた。値は、８週目に正常に戻った。
【０１７１】
これらのデータは、本発明の方法が、カニクイザルにおける全てのウイルス抗原に対して、強固かつ幅広い細胞性免疫応答を誘発したことを実証する。
【０１７２】
実施例１２
本実施例は、哺乳動物に投与されたアデノウイルスベクター組成物の安全性を実証する。
【０１７３】
ＤＮＡプライミングコンストラクト（ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ）及びアデノウイルスベクターコンストラクトＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰをブーストとして、又はＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを単独で、雌性及び雄性のニュージーランドシロウサギに、筋肉内注射を介して投与した。ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを、実施例１中に記載されているように産生した。
【０１７４】
ＤＮＡプライム／アデノウイルスブースト法について、４ｍｇのＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ又はＰＢＳコントロール（研究日１、２２）を、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ２０００（登録商標）Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｂｉｏｊｅｃｔ）を用いて、１日あたり２回の筋肉内注射（０．５ｍＬ／注射部位；各注射の用量の容量を、体重について調製しなかった）を介して、大腿筋中へと投与した（２回の注射は、およそ１インチ離れるように間隔を空けた）。注射を、各時点で交互の側面に投与した。各注射を、剪毛／付印した部位に投与した。注射部位を可視化するために、部位を必要に応じて再剪毛及び再付印した。
【０１７５】
ＤＮＡプライム／アデノウイルスブーストの研究及びアデノウイルスベクターのみが関与する研究の両方について、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（１×１０１１ｐｕ）又は希釈液コントロール（ＶＲＣ−ＤＩＬＵＥＮＴ０１３−ＤＩＬ−ＶＰ）の注射を、一日あたり２回の０．５ｍＬの用量を、針とシリンジで後部大腿筋に投与した。各注射を、剪毛／付印した部位に投与した。注射部位を可視化するために、部位を必要に応じて再剪毛及び再付印した。
【０１７６】
動物を、無作為に処置グループに割り当てた。処置期間は２２日であり、研究持続期間は３６日であった。注射を、各時点で交互の側面に投与した。体重に関わらず、ＤＮＡ及びアデノベクターの用量並びにそれらのそれぞれのコントロールについて、１．０ｍＬを投与した。
【０１７７】
血液試料（およそ２ｍＬ）を、第一の用量の投与に先立って、全ての動物から単離した。試料を、血液学、化学、凝固、及び免疫学解析に供した。血清を単離し、移動のために、ドライアイス上で−７５℃±１０℃にて保存した。これらの試料の幾つか又は全てを、試験物への暴露の指標として、セロコンバージョンについて解析した。
【０１７８】
最終血液回収に続いて、全ての動物をペントバルビタールナトリウム又は同等の注射によって安楽死させ、失血させた。動物を、屠殺の時間にできるだけ早く、剖検した。獣医学の病理学者の監督のもと、計画した剖検を行った。
【０１７９】
全ての必要な動物を、体の外表面、注射／処置部位、全ての開口部、並びに頭蓋、胸部、及び腹部の内腔並びにそれらの内容物の検査を含有する、完全な肉眼的剖検に供した。各動物の胸骨から、２つの骨髄スメア（ｓｍｅａｒ）を調製した。スライドを風乾し、メタノール中で固定し、将来可能性のある評価のために保存した。予定された剖検にて必要な動物の全てからの以下の臓器（性別に応じる）を、できるだけ早く秤量した：副腎、心臓、肺、脳、脾臓、腎臓、肝臓（排液した胆嚢を伴う）、精巣／卵巣、下垂体、胸腺、子宮、及び甲状腺／副甲状腺。対の臓器を、一緒に秤量した。
【０１８０】
各剖検動物からの全ての組織は、１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で保存した。組織を、パラフィン中に包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びイオシンで染色し、そして有資格の獣医学的な病理学者によって顕微鏡的に検査した。各動物から及び肉眼的病変から（全てのグループから）の組織を解析した。
【０１８１】
正規性についてはＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験を用い、等分散にはＬｅｖｅｎｅ Ｍｅｄｉａｎ試験を用い、そして一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって定量的結果を解析した。正規性又は等分散試験のいずれかが失敗した場合、解析には順位変換したデータに対するノンパラメトリックなＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡを利用した。パラメトリックなデータについては、ＡＮＯＶＡが実験グループの間に統計学的な有意性を示した場合、ダネットｔ検定を用いて、どのグループ（もしあれば）がコントロールと異なるかを描写した。ノンパラメトリックなデータについては、ＡＮＯＶＡが実験グループの間に統計学的な有意性を示した場合、ダン（Ｄｕｎｎ）試験を用いて、どのグループ（もしあれば）がコントロールと異なるかを描写した。０．０５未満の確率値（両側）を、全ての試験についての有意性の臨界レベルとして用いた。統計学的解析には、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（登録商標）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，サン・ラファエル，カリフォルニア）を利用した。
【０１８２】
ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ単独の投与に関与する免疫ストラテジーについては、全ての動物が計画した最終点まで生存し、以下のパラメータにおいては処置関連性の効果は見られなかった：死亡率、臨床及びケージ側面からの観察、ドレーズ観察、体重、眼科学、臨床病理学、及び臓器重量（例外として、おそらく免疫刺激剤への暴露の予期された結果である脾臓重量の増加）又は臓器重量比。処置した動物において、第一の注射の２４時間後に、体温の上昇があった。また、処置した動物において、各注射の２４〜４８時間後の期間について、摂食量の減少があった。処置した動物における注射部位での、回復可能な一過性の炎症、坐骨神経及び隣接のリンパ管及び毛細血管の周辺の結合組織における慢性的な炎症が観察された。ＳＤ３のコレステロール及びトリグリセリドレベルにおける一過性の増加は、臨床症状又は病理学と関連性はなく、そしてＳＤ２４のＣＰＫにおける一過性の増加は、おそらく筋肉の炎症に関連していた。
【０１８３】
ＤＮＡプライム／アデノウイルスベクターブースト戦略について、注射部位（ドレーズ採点法及び組織病理学的に観察）及び坐骨神経の周辺の神経周囲組織（組織病理学的にのみ見られた）での回復可能な炎症が観察された。さらに、免疫ウサギにおいて、最初のブーストに続く２４時間中に、そして免疫雌において第二のアデノベクターブーストに続く３時間中に、発熱が見られた。摂食量もまた、各ワクチン接種に続く２４〜４８時間中に低減したが、これは雄においては回復し、体重又は重量増加に影響を与えなかった。しかしながら、処置した雌は、コントロール雌に比べて低減した体重及び重量増加を有し、それはＳＤ７１後（体重）及び最初のアデノベクターブースト後（重量増加）に統計学的に有意となったが、早ければＳＤ３６（ＤＮＡプライミング系列の間に）観察され始めた。
【０１８４】
本実施例は、本発明の方法がウサギにおいて最小限の毒性を誘導することを実証する。
【０１８５】
実施例１３
本実施例は、アデノウイルスベクター組成物のヒトへの投与を実証する。
【０１８６】
１×１０９ｐｕ、１×１０１０ｐｕ、又は１×１０１１ｐｕの用量でのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの単一注射後のヒトにおける安全性、耐用性及び免疫応答を検討するため、無作為化した、プラシーボ対照の、二重盲検の、用量増大研究を開始した。各処置グループは、１２人の被験者（１０人のワクチン、２人のプラシーボ）を含んでいた。研究を、２００４年７月１９日に開始し、そして研究は３６人の被験者の登録を２００４年１１月１０日に完了した。ＮＩＡＩＤ所内データ及び安全性監視委員（Ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ  Ｄａｔａ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ）（ＤＳＭＢ）が、各用量増加に先立つ１４日間の経過観察を通して、予備安全性データを審査した。予備データは、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰが、評価した３つの用量レベルでは健常被検体について安全らしいことを示した。１×１０９ｐｕ及び１×１０１０ｐｕの用量レベルは、１×１０１１ｐｕの用量レベルよりも、低い反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）と関連していた。１×１０９ｐｕ及び１×１０１０ｐｕの用量のグループの両方において、５日目の日誌カードに記録された局所的及び全身性の症状は、重症度においては皆無〜軽度であり、被験者の誰も発熱を経験しなかった。１×１０１１ｐｕの用量のグループにおいて、４人の被験者が、１日目に発熱を報告した（重症度において、３人が軽度、１人が中度）。発熱した４人の被験者の各々はまた、１日目に中度の頭痛を報告し、これらの被験者の３人はまた、少なくとも１つの他の中度の全身性のパラメータ（例、倦怠感、筋肉痛、及び悪寒）を報告した。発熱のない２人の被験者が、少なくとも１つの中度の全身性のパラメータ（例、倦怠感、筋肉痛、及び悪心）を報告した。１×１０１１ｐｕの用量のグループにおける１人の被験者は、中度の注射部位の疼痛を報告した；そのほかの点では、注射部位の反応原性は皆無又は軽度であった。
【０１８７】
２００５年１月３１日現在で、１つのグレード４（潜在的に重篤）の事象があった。おそらくワクチン接種に関連した３つのグレード２（中度）の有害事象があった。研究は、ワクチンｖｓプラシーボ注射の割当について盲検であった。グレード４の有害事象は、研究登録に３年先立って１度の発作の病歴を有する１×１０１１ｐｕの容量のグループにおける健康な被験者で、研究の注射の６４日後に起こった発作であった。以前の発作の病歴及び研究の注射後の２ヶ月を越えたタイミングでの事象を考えると、発作が研究の薬剤と関連していたことはありそうにない。研究の薬剤とおそらく関連していたグレード２の有害事象としては、以下が挙げられる：（１）登録に先立って、無症候性の低好中球数を時々有することが知られていた被験者における、注射の２１日後に気付いた無症候性好中球減少、（２）研究の注射の３日後の、異なる被験者における下痢（持続時間１日）、及び（３）臨床的に無症候性の被験者において、研究のワクチン接種の２５日後に始まったことが気付かれた、持続性のグレード１のＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の上昇の原因を同定するための詳細な評価後に診断された脂肪性肝炎（脂肪肝）。肝臓学のコンサルタントは、状態がおそらくは研究登録に先立って存在していたという印象を報告した。持続性のグレード１のＡＬＴに寄与する因子は、アルコール摂取及び最近の重量増加であり得る。脂肪性肝炎の診断は、グレード２の状態であると全体的にみなされているが、２００５年１月３１日現在、肝機能試験は、重症度においてグレード１より大きくなかった。
【０１８８】
１×１０１１ｐｕの用量でより大きな反応原性が観察されたものの、それは十分に許容的な用量であるらしく、短期的な症状の軽減には、鎮痛性／解熱性の非処方薬物を自己投与し得た。プラシーボ及び３つの投薬グループを比較するため、プロトコルによって特定された暫定的免疫原性解析が進行中である。盲検の免疫原性のデータは、より高い用量で、免疫応答が増加する用量効果を示唆する。市販のＨＩＶ抗体アッセイによる１２週目のワクチン誘導性ＥＬＩＳＡの被験者の数は、グループあたり（研究割当は盲目的であった）、１２人の被験者（２人のプラシーボ及び１０人のワクチンレシピエント）のうち、１×１０９ｐｕのグループにおける３人から、１×１０１０ｐｕのグループにおける６人へ、そして１×１０１１ｐｕのグループにおける９人へと増加した。反応性のデータは、下の表４中に概説した。
【０１８９】
【表４】
2007532656.tif 000005
【０１９０】
これらの結果は、本発明の方法が、ヒトにおいて十分に許容的であることを示す。
【０１９１】
実施例１４
本実施例は、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰのヒトへの投与を実証する。
【０１９２】
未感染の大人の被験者における単一の薬剤として、アデノウイルスベクター組成物ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの第二のフェーズＩ研究が、現在進行中である。この盲検の用量増大研究は、ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ又はプラシーボに対して、５：１の比で無作為化される、低Ａｄ５抗体力価（＜１：１２）の２４人の２つのグループの被験者を登録するよう設計されている。ワクチンの第一のグループは、１×１０１０ｐｕのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを受け、第二のグループは１×１０１１ｐｕのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを受ける。
【０１９３】
実施例１５
本実施例は、ＤＮＡ分子での免疫に続くブースターとしてのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰのヒトへの投与を実証する。
【０１９４】
ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰでのＤＮＡ注射レジメンを完了した参加者に、１×１０１０ｐｕ（又はプラシーボ）でのＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰの単一のアデノウイルスベクターブーストを提供する、フェーズＩの盲検のプラシーボ対照研究を開始した。アデノウイルスベクターワクチンブーストを、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ（又はプラシーボ注射）での最初のＤＮＡワクチン接種後、６〜９ヶ月の間隔で与える。第一の参加者を、２００４年１１月２２日に登録した。２００４年１２月２１日現在、１１人の参加者が、彼らのブースト注射を受けている。これらの参加者のうち、６人が注射部位に軽度な疼痛及び／又は圧痛を経験している。他の局所的な反応原性事象の報告はない。５人の参加者が、軽度な又は中度のどちらかの、頭痛、倦怠感、及び悪心を含有する全身性の症状を報告した。発熱の報告はなく、グレード３の事象はなく、そして重篤な有害事象もない。
【０１９５】
これらの結果は、本発明の方法が、ヒトにおいて十分に許容的であることを示す。
【０１９６】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が本明細書中に示されるのと同じ程度に、本明細書により参考として援用される。
【０１９７】
本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示語の使用は、本明細書中で他に示されない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注記されない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の列記は、本明細書中で他に示されない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載されている全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、又は他に文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言語（例、「例、等、など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に主張されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして、主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１９８】
本発明の実施について本発明者らが把握する最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されている。それらの好ましい実施形態のバリエーションは、先の記載を読むことで、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合せが、本明細書中で他に示されない限り、又は他に文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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