(57)【要約】  本発明は、第ＩＸ因子とＰＥＧ部分とのコンジュゲートを提供する。該コンジュゲートは、ペプチドと修飾基の間に配置され、それらと共有結合的に付着される完全なグリコシル連結基を介して連結される。該コンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼの作用によって、グリコシル化されたペプチドから形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチド上のグリコシル残基に、改変された糖部分を連結する。該コンジュゲートを調製するための方法、該コンジュゲートを用いて様々な疾患状態を治療するための方法、および該コンジュゲートを含む医薬製剤も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化１】
2007513190.tif 000059
（式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基から選択されたメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を有する少なくとも１つの部分を含む第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が次式：
【化２】
2007513190.tif 000060
（式中、
ａは、０から２０までの整数である）
を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項３】
Ｒ１が、
【化３】
2007513190.tif 000061
（式中、
ｅおよびｆは、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは、０から２０までの整数である）から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項４】
Ｒ１が、
【化４】
2007513190.tif 000062
（式中、
ｅ、ｆ、およびｆ’は、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑおよびｑ’は、１から２０からそれぞれ独立に選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項５】
Ｒ１が、
【化５】
2007513190.tif 000063
（式中、
ｅ、ｆ、およびｆ’は、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１から２０からそれぞれ独立に選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項６】
Ｒ１が、
【化６】
2007513190.tif 000064
（式中、
ｅおよびｆは、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項７】
前記部分が次式：
【化７】
2007513190.tif 000065
を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項８】
前記部分が次式：
【化８】
2007513190.tif 000066
を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項９】
前記部分が次式：
【化９】
2007513190.tif 000067
（式中、
ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基である）
を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項９に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基が、配列番号１の位置６１のセリンである、請求項１１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項１３】
前記部分が次式：
【化１０】
2007513190.tif 000068
［式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは、１であり、
ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０から６までの整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｊ、ｋ、１、およびｍは、０から１００までの整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１からそれぞれ独立に選択され、かつｖ、ｗ、ｘ、およびｙのうちの少なくとも１つは、１であり、
ＡＡは、前記第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸残基であり、
Ｓｉａ−（Ｒ）は、次式：
【化１１】
2007513190.tif 000069
（ここで、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−ＬおよびＣ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を有する］
を有する、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項１４】
前記グリコシル残基が、Ａｓｎ  １５７、Ａｓｎ  １６７およびそれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合される、請求項７に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載の第ＩＸ因子および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤。
【請求項１６】
哺乳類において血液凝固を刺激する方法であって、前記哺乳類に、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１７】
対象において血友病を治療する方法であって、前記対象に、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１８】
次の部分
【化１２】
2007513190.tif 000070
（式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を含む第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートを製造する方法であって、
（ａ）次式：
【化１３】
2007513190.tif 000071
を有するＰＥＧ−シアル酸供与体部分をもつ基質第ＩＸ因子ペプチドと、前記ＰＥＧ−シアル酸を前記第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移する酵素と、を転移に適切な条件下で接触させること、を含む方法。
【請求項１９】
Ｌ−Ｒ１が次式：
【化１４】
2007513190.tif 000072
（式中、
ａは、０から２０までの整数である）
を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ１が、以下：
【化１５】
2007513190.tif 000073
（式中、
ｅおよびｆは、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは、０から２０までの整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１が、以下：
【化１６】
2007513190.tif 000074
（式中、
ｅ、ｆ、およびｆ’は、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑおよびｑ’は、１から２０からそれぞれ独立に選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１が、以下：
【化１７】
2007513190.tif 000075
（式中、
ｅ、ｆ、およびｆ’は、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１から２０からそれぞれ独立に選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１が、以下：
【化１８】
2007513190.tif 000076
（式中、
ｅおよびｆは、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートが、次式：
【化１９】
2007513190.tif 000077
を有する部分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートが、次式：
【化２０】
2007513190.tif 000078
を有する部分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートが、次式：
【化２１】
2007513190.tif 000079
（式中、
ＡＡは、前記第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸残基である）
を有する部分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第ＩＸ因子基質ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸残基が、配列番号１の６１位のセリンである、請求項２８に記載の第ＩＸ因子ペプチド。
【請求項３０】
前記第ＩＸ因子コンジュゲートが、次式：
【化２２】
2007513190.tif 000080
［式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは、１であり、
ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０から６までの整数から独立して選択されるメンバーであり、
ｊ、ｋ、１、およびｍは、０から１００までの整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１からそれぞれ独立に選択され、かつ、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙの少なくとも１つは、１であり、
ＡＡは、前記第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸残基であり、
Ｓｉａ−（Ｒ）は、次式：
【化２３】
2007513190.tif 000081
ここで、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を有する］
を有するグリコシル残基を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記グリコシル残基が、Ａｓｎ  １５７、Ａｓｎ  １６７、およびそれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）の前に、さらに、
（ｂ）適切な宿主細胞において前記基質第ＩＸ因子ペプチドを発現させること
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主が、昆虫細胞および哺乳類細胞から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年１２月３日に出願の米国仮特許出願第６０／５２７，０８９号（あらゆる目的のために、その内容全体を参照により本明細書に援用する）、２００４年１月２６日に出願の米国仮特許出願第６０／５３９，３８７号；２００４年７月２９日に出願の米国仮特許出願第６０／５９２，７４４号；２００４年９月２９日に出願の米国仮特許出願第６０／６１４，５１８号；および２００４年１０月２９日に出願の米国仮特許出願第６０／６２３，３８７号（それぞれ、あらゆる目的のために、その内容全体を参照により本明細書に援用する）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ビタミンＫ依存性のタンパク質（例えば第ＩＸ因子）は、そのアミノ末端４５残基中に９〜１３のガンマ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）を含有する。Ｇｌａ残基は、ビタミンＫを利用して、肝臓で、タンパク質前駆体におけるグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化する酵素によって産生される。ビタミンＫ依存性のタンパク質は、いくつかの生物学的プロセスに関与し、そのうち最もよく記述されるものは、血液凝固である（ネルセストヴェン（Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ）、「Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．」５８：３５５〜３８９（２０００年）に概説される）。ビタミンＫ依存性のタンパク質には、プロテインＺ、プロテインＳ、プロトロンビン（第ＩＩ因子）第Ｘ因子、第ＩＸ因子、プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、Ｇａｓ６、およびマトリックスＧＬＡタンパク質が含まれる。第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、および第ＩＩ因子は、凝血前プロセスで働くのに対し、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺは、抗凝血的役割で働く。Ｇａｓ６は、増殖抑制（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ）特異的な遺伝子６（ｇａｓ６）によってコードされる増殖抑制ホルモンであり、プロテインＳに関連する。マンフィオレッティ（Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ）ら「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」１３：４９７６〜４９８５（１９９３年）を参照のこと。マトリックスＧＬＡタンパク質は、通常骨に見られ、循環における軟部組織の石灰化の予防に重要である。ルオ（Ｌｕｏ）ら「Ｎａｔｕｒｅ」３８６：７８〜８１（１９９７年）。
【０００３】
血液凝固の調節は、血餅を形成できないことと、血栓症、すなわち望ましくない血餅の形成の両方を含めて、いくつかの主要な健康問題を与えるプロセスである。望ましくない血餅を防止する薬剤は、多くの状況で使用されており、様々な薬剤が利用可能である。残念なことに、大抵の現在の治療法は、望ましくない副作用を有する。ワルファリンなどの経口投与の抗凝血剤は、肝臓中のビタミンＫの作用を阻害し、それによって、ビタミンＫ依存性のタンパク質中のグルタミン酸残基の完全なカルボキシル化を防止することで作用するので、その結果、循環系における活性なタンパク質の濃度の低下、および血餅を形成する能力の低下を引き起こす。ワルファリン療法は、薬物と標的の競合的性質によって、複雑化されている。食事のビタミンＫの変動は、ワルファリンの過量または過少量という結果になる可能性がある。凝固活性の変動は、この治療法の望ましくない結果である。
【０００４】
低分子量ヘパリンを含む、ヘパリンなどの注射される物質も、一般的に用いられる抗凝血剤である。これらの化合物もまた、過量服用されやすく、慎重にモニタリングされるべきである。
【０００５】
より新しいカテゴリの抗凝血剤には、第ＶＩＩａ因子および第ＩＸａ因子などの、活性部位が改変されたビタミンＫ依存性の凝固因子が含まれる。活性部位は、アミノ酸または短いペプチドのクロロメチルケトン誘導体などのセリンプロテアーゼ阻害剤によってブロックされる。活性部位が改変されたタンパク質は、そのそれぞれの因子との複合体を形成する能力は保持するが、不活性であり、それによって、酵素活性を生じず、それぞれの活性な酵素と補助因子の複合体形成を防止する。要するに、これらのタンパク質は、他の抗凝血剤の有害な副作用を伴わずに抗凝血治療法の利益を提供すると思われる。活性部位が改変された第Ｘａ因子は、この群内の別の可能な抗凝血剤である。その補助因子タンパク質は、第Ｖａ因子である。活性部位が改変された活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）もまた、凝固の有効な阻害剤を形成することができる。ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７２：１１８６３〜１１８６８（１９９７年）を参照のこと。活性部位が改変されたＡＰＣは、第Ｖａ因子と結合し、第Ｘａ因子が結合するのを防止する。
【０００６】
ビタミンＫ依存性の凝固因子の使用を主に抑制するものは、費用である。ビタミンＫ依存性のタンパク質の生合成は、少数の動物細胞タイプに存在する、損なわれていないグルタミン酸カルボキシル化システムに依存している。これらのタンパク質の過剰生産は、この酵素系によって制限される。さらに、これらのタンパク質の有効量は多い。共通の投薬量は、ペプチド１０００μｇ／ｋｇ（体重）である。ハーカー（Ｈａｒｋｅｒ）ら１９９７年、上記を参照のこと、
【０００７】
治療的ペプチドの使用を妨げる別の現象は、タンパク質グリコシル化のよく知られた態様であり、これらのペプチドにより示される比較的短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期である。概して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの短い半減期の問題は、治療用グリコペプチドが、しばしば高い投薬量で投与されなければならないということを意味し、これは、最終的に、言い換えれば、より長続きする、より有効な糖タンパク質治療法を行うためのより効率的な方法が利用可能な場合に必要とされる可能性があるよりも、より高い保健医療費が必要となる。
【０００８】
第ＶＩＩａ因子は、例えば、この問題を例証する。第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子は、ヒトにおける循環半減期が、約２〜４時間である。すなわち、２〜４時間以内に、血清中のペプチドの濃度は、半分だけ減少する。第ＶＩＩａ因子が血友病のある種の形を治療するプロコアグラントとして使用される場合、標準のプロトコルは、２時間毎に、高い投薬量（４５〜９０μｇ／ｋｇ（体重））で、ＶＩＩａを注入することとなる。ヘドナー（Ｈｅｄｎｅｒ）ら、「Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．」７：７８〜８３（１９９３年））を参照のこと。したがって、プロコアグラントまたは抗凝血剤としてのこれらのタンパク質の使用では（第ＶＩＩａ因子の場合）、タンパク質が、頻度が高い間隔で、かつ高い投薬量で投与される必要がある。
【０００９】
費用効率が高いグリコペプチド療法を提供する１つの問題解決法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期がより長いペプチドを提供することであった。例えば、薬物動態学的特性を向上させたグリコペプチド治療薬が、ペプチド主鎖に合成のポリマーを結合させることによって産生されている。ペプチドに結合されてきた典型的なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ペプチド治療薬を誘導体化するためのＰＥＧの使用は、ペプチドの免疫原性を減少させることが実証されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールを結合させた酵素やペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の低下に加えて、循環におけるクリアランス時間が、当該ポリペプチドのＰＥＧ−コンジュゲートのサイズの増大によって延長される。
【００１０】
ペプチドに、ＰＥＧおよびその誘導体を付着させる主要な様式は、ペプチドのアミノ酸残基を介する非特異的な結合である（例えば、米国特許第４，０８８，５３８号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，４１４，１４７号明細書、米国特許第４，０５５，６３５号明細書、および、国際公開第８７／０００５６号パンフレット参照のこと）。ペプチドにＰＥＧを付着する別の様式は、グリコペプチド上のグリコシル残基の非特異的な酸化を介するものである（例えば、国際公開第９４／０５３３２号パンフレットを参照のこと）。
【００１１】
これらの非特異的方法では、ポリ（エチレングリコール）は、ペプチド主鎖上の反応性の残基に、ランダムな非特異的方式で加えられる。当然、ＰＥＧ分子のランダムな付加は、最終の産物の均質性の欠如、およびペプチドの生物学的または酵素的活性の低下の可能性を含めて、その欠点を有する。したがって、治療用ペプチドの産生のために、特異的に標識され、容易に特徴づけられる、本質的に均一な産物を形成させる誘導体化戦略が、優れている。こうした方法は、開発されている。
【００１２】
特異的に標識された、均一なペプチド治療薬は、酵素の作用を介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生できる。ペプチドに、合成のポリマーまたは他の標識を付着させるための典型的な非特異的方法とは異なり、酵素に基づく合成は、位置選択性および立体選択性という利点を有する。標識されたペプチドの合成で使用するための２つの主要なクラスの酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素は、糖（これは、その後、治療的部分を含むように改変される可能性がある）の特異的な付着のために使用することができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび改変されたグリコシダーゼは、改変された糖をペプチド主鎖に直接転移するために使用することができる（例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３９９，３３６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３００４００３７号明細書、同第２００４０１３２６４０号明細書、同第２００４０１３７５５７号明細書、同第２００４０１２６８３８号明細書、および同第２００４０１４２８５６号明細書を参照のこと）。化学的合成と酵素的合成の要素の両方を組み合わせた方法もまた、知られている（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．」３０５：４１５〜４２２（１９９８年）、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号明細書を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
第ＩＸ因子は、極めて有益な治療用ペプチドである。今日、商業的に入手可能な形の第ＩＸ因子が使用されているが、これらのペプチドを、得られる単離された糖タンパク質産物の薬物動態を増強する改変によって、改良することができる。したがって、向上された効果およびより優れた薬物動態をもつ、より永続的な第ＩＸ因子ペプチドは、当分野で依然として必要である。さらに、最も多くの人にとって有効であるように、何度も容易に再生できる予測可能な本質的に均一な構造をもつ、治療的薬物動態が向上した第ＩＸ因子ペプチドを、工業規模で産生することが可能でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
幸いにも、ここでは、薬物動態が向上した第ＩＸ因子ペプチド、およびそれらを作製するための方法が、発見された。薬物動態が向上した第ＩＸ因子ペプチドに加えて、本発明はまた、これらの第ＩＸ因子ペプチドの産生のための産業的に実用的かつ費用効率が高い方法を提供する。本発明の第ＩＸ因子ペプチドは、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子などの修飾基（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を含む。したがって、本発明は、第ＩＸ因子が有効な治療法を提供するような状態および疾患の治療のための、治療的効果が向上され、薬物動態が向上された第ＩＸ因子ペプチドの必要性を満たす。
【００１５】
１つまたは複数のポリ（エチレングリコール）部分を用いる、第ＩＸ因子の制御された改変が、薬物動態学的特性が向上した新規の第ＩＸ因子誘導体を与えるということが、ここでは発見された。さらに、本発明の改変された第ＩＸ因子ペプチドの、信頼性が高い産生のための、費用効率が高い方法が、発見および開発された。
【００１６】
一態様では、本発明は、次の部分：
【化１】
2007513190.tif 000002
を含む第ＩＸ因子ペプチドを提供する。上式で、Ｄは、−ＯＨまたはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。通常、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。当分野の技術者であれば理解できる通り、本明細書に記述するシアル酸の類似体においては、ＣＯＯＨはまた、ＣＯＯ−またはその塩を表す。
【００１７】
別の態様では、本発明は、上述の部分を含むＰＥＧ化された第ＩＸ因子を製造する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）ＰＥＧ−シアル酸供与体をもつ基質第ＩＸ因子ペプチドと、ＰＥＧ−シアル酸を、転移に適した条件下で、第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移する酵素とを接触させることを含む。典型的なＰＥＧ−シアル酸供与体部分は、次式を有する。
【化２】
2007513190.tif 000003
【００１８】
一実施形態では、宿主は、哺乳類の細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、植物細胞、細菌、または真菌である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、それが必要な対象において、状態を治療する方法を提供する。ただし、この状態は、対象における損なわれた凝固によって特徴づけられる。この方法は、対象における状態を改善するのに有効な量の本発明の第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートを、対象に投与するステップを含む。この方法によって治療可能な典型的な疾患は、血友病である。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明の第ＩＸ因子ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。
【００２１】
本発明の他の目的および利点は、この後の詳細な説明から、当分野の技術者に明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、酢酸マンノサミニル（ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−リン酸；Ｓｉａ、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミニル、ならびにその誘導体および類似体。
【００２３】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は通常、本発明に属する当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。通常、本明細書で使用される学術用語、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学、およびハイブリッド形成における実験法は、よく知られており、かつ当分野で一般に用いられるものである。核酸およびペプチド合成のために、標準技術が使用される。これらの技術および手順は通常、当分野の従来の方法および様々な一般的な基準（概して、参照により本明細書に組み込まれる、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、第２版（１９８９年）コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）に従って実施され、これらは、この文書全体を通して提供される。本明細書で使用される学術用語、および分析化学における実験法、ならびに以下で述べられる有機合成物は、よく知られており、かつ当分野で一般に用いられるものである。標準技術、またはその改変形態は、化学合成および化学分析のために使用される。
【００２４】
本明細書で記述するオリゴ糖はすべて、非還元糖類（すなわちＧａｌ）に関する名前または省略形、それに続いて、グリコシド結合（αまたはβ）の構造、環結合（１または２）、結合（２、３、４、６または８）に使用される還元糖類の環位置、次いで、還元糖（すなわちＧｌｃＮＡｃ）の名前または省略形を用いて記述される。各糖類は、好ましくはピラノースである。標準の糖鎖生物学の用語の総説のために、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」ファルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編  ＣＳＨＬプレス（ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９９年）を参照のこと。
【００２５】
還元末端の糖類が、実際は、還元糖であってもなくても、オリゴ糖は、還元末端と非還元末端を有すると考えられる。公認されている用語に従って、オリゴ糖は、本明細書では、左に非還元末端、右に還元末端を付けて表す。
【００２６】
用語「シアル酸」は、９−炭素のカルボキシル化された糖のファミリーのいずれのメンバーも指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−１−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノ−１−ソン（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ−１−ｏｎｉｃ）酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略記される）である。このファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基が水酸化された、Ｎ−グリコリル―ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＫＤＮ）である（ナダノ（Ｎａｄａｎｏ）ら（１９８６年）「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６１：１１５５０〜１１５５７、カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：２１８１１〜２１８１９（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、および９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの、９−置換型シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説のために、例えば、ファルキ（Ｖａｒｋｉ）、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」２：２５〜４０（１９９２年）；「Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｒ．シャウアー（Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ）編（シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９２年））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願国際公開第９２／１６６４０号パンフレットに開示されている。
【００２７】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、かつアミド結合を介して共に連結されるポリマーを指し、あるいは、ポリペプチドと呼ばれる。さらに、非天然のアミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされないアミノ酸もまた、本発明に使用できる。さらに、反応性の基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように改変されたアミノ酸もまた、本発明に使用できる。本発明に使用されるアミノ酸はすべて、ｄ−またはｌ−異性体のどちらかであり得る。ｌ−異性体が、通常好ましい。さらに、他のペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）もまた、本発明に有用である。本明細書では、「ペプチド」は、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドを発現するシステムによって、不完全にグリコシル化されたペプチド（ｐｅｔｉｄｅ）も含まれる。一般的な総説のために、スパトラ，Ａ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」内、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂ．ウェインスタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２６７ページ（１９８３年）を参照のこと。
【００２８】
用語「ペプチドコンジュゲート」は、ペプチドが、本明細書に記述される通りの改変された糖と結合されるような本発明の種を指す。
【００２９】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するおよび合成のアミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様に働くアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後で改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合されるα炭素）を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。こうした類似体は、改変されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティクスは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に働く化合物を指す。本明細書では、「アミノ酸」は、それが、ペプチド配列のリンカーまたは成分であるかどうかに関係なく、アミノ酸のＤ−およびＬ−異性体、ならびにこれらの２つの異性体の混合物を指す。
【００３０】
本明細書では、用語「改変された糖」は、本発明のプロセス内で、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に加えられる、天然に存在するあるいは天然に存在しない炭水化物を指す。改変された糖は、これに限定されないが、糖ヌクレオチド（一、二、および三リン酸）、活性化された糖（例えば、ハロゲン化グリコシル、グリコシルメシラート）、ならびに、活性化されておらず、ヌクレオチドでもない糖を含めて、いくつかの酵素基質から選択される。「改変された糖」は、「修飾基」を用いて共有結合的に官能性をもたせられる。有用な修飾基には、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断用部分、生体分子などが含まれるが、これに限定されない。修飾基は、好ましくは、天然に存在する、あるいは改変されていない炭水化物ではない。修飾基を用いる機能化の位置は、「改変された糖」が、ペプチドに酵素的に加えられることが妨げられないように選択される。
【００３１】
用語「水溶性」は、水に対するある程度の検出可能な程度の可溶性をもつ部分を指す。水溶性を検出および／または定量化する方法は、当分野でよく知られている。典型的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが含まれる。ペプチドは、単一のアミノ酸、例えばポリ（リジン）からなる混合された配列を有する可能性がある。典型的な多糖類は、ポリ（シアル酸）である。典型的なポリ（エーテル）は、ポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）は、典型的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は、代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００３２】
水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）であり得る。しかし、他の関連するポリマーもまた、本発明の実施において使用するのに適していること、また、用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、この点については包括的であり排他的ではないと意図されることを理解すべきである。用語ＰＥＧは、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多数の腕をもつＰＥＧ、二叉のＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖にぶら下がった１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連するポリマー）、あるいはその中に分解可能な結合を含むＰＥＧを含めた、そのいずれかの形のポリ（エチレングリコール）を含む。
【００３３】
ポリマー主鎖は、線状であっても分枝状であってもよい。分枝ポリマー主鎖は通常、当技術分野で知られている。一般的に、分枝ポリマーは、中心枝の中心部分と、中心枝の中心に連結された、複数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは一般的に、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々な多価アルコールへの、エチレンオキシドの付加によって調製できる分枝形で用いられる。中心枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸から得ることができる。分枝ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして一般形で表すことができる。ただし、Ｒは、グリセロールまたはペンタエリスリトールなどの中心部分を表し、ｍは、アームの数を表す。米国特許第５，９３２，４６２号明細書（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記述されるものなどの多数の腕をもつＰＥＧ分子を、ポリマー主鎖として使用することもできる。
【００３４】
多くの他のポリマーもまた、本発明に適している。非ペプチド性かつ水溶性であり、２から約３００末端をもつポリマー主鎖が、本発明に特に有用である。適切なポリマーの例には、これに限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載される通りのものなど）、およびそれらのコポリマー、ターポリマー、ならびにそれらの混合物が含まれる。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は、変動する可能性があるが、これは、一般的に、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、しばしば約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００３５】
「曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、本明細書では、患者にペプチド薬物を投与することにおいて、ゼロから無限大までの時間の関数としての、患者の体循環における薬物の濃度を示す、曲線下の総面積と定義される。
【００３６】
用語「半減期」または「ｔ１／２」は、本明細書では、患者にペプチド薬物を投与することにおいて、患者における薬物の血漿濃度が、半分だけ減少するのに必要とされる時間と定義される。複数のクリアランスメカニズム、再分布（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、および当分野でよく知られた他の機構に応じて、ペプチド薬物に関連する２つ以上の半減期が存在する可能性がある。通常、アルファ相が、再分布に関連し、ベータ相が、クリアランスに関連するように、アルファおよびベータ半減期が、定義される。しかし、大部分は血流に限られるタンパク質薬物を用いると、少なくとも２つのクリアランス半減期が存在する可能性がある。ある種のグリコシル化されたペプチドについては、迅速なベータ相クリアランスは、末端のガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、またはフコースを認識する、マクロファージまたは内皮細胞上のアクセプターを介して仲介される可能性がある。有効な半径＜２ｎｍ（約６８ｋＤ）をもつ、かつ／または組織における特異的または非特異的な取り込みおよび代謝を行う分子については、腎臓糸球濾過を介するより遅いベータ相クリアランスが起こる可能性がある。ＧｌｙｃｏＰＥＧ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、末端糖（例えばガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を覆うことができ、それによって、これらの糖を認識するアクセプターを介する迅速なアルファ相クリアランスをブロックする。これはまた、より大きな有効な半径を与えることができ、それによって、分布の体積および組織取り込みを減少させ、それによって、後期のベータ相を延長する。したがって、当分野で知られている通り、アルファ相およびベータ相半減期に対するＧｌｙｃｏＰＥＧ化の厳密な影響は、サイズ、グリコシル化の状態、および他のパラメータに応じて変動する。「半減期」のさらなる説明は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９７年、ＤＦＡ  クロンメリン（ＤＦＡ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ）およびＲＤ  シンデラー（ＲＤ  Ｓｉｎｄｅｌａｒ）編、ハーウッド出版社（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、１０１〜１２０ページ）に出ている。
【００３７】
用語「糖結合（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」は、本明細書では、ポリペプチド（例えば第ＩＸ因子ペプチド基質）のアミノ酸またはグリコシル残基への、改変された糖種の、酵素的に仲介される結合を指す。「糖結合」の下の属は、「グリコール−ＰＥＧ化」である。ただし、改変された糖の修飾基は、ポリ（エチレングリコール）およびアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）またはその反応性の誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である。
【００３８】
用語「大規模」および「工業規模」は、同義的に使用され、単一の反応サイクルの完了時に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、および好ましくは少なくとも約１グラムの糖コンジュゲート（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を産生する反応サイクルを指す。
【００３９】
用語「グリコシル連結基」は、本明細書では、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有結合的に付着されるグリコシル残基を指し、グリコシル連結基は、コンジュゲートの残部に修飾基を連結する。本発明の方法では、「グリコシル連結基」は、グリコシル化されたまたはグリコシル化されていないペプチドに、共有結合的に付着されるようになり、それによって、ペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に薬剤を連結する。「グリコシル連結基」は、通常、「改変された糖」の酵素的付着による「改変された糖」から、ペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基に誘導される。グリコシル連結基は、修飾基で改変される糖カセットの形成中に分解される、糖類から得られる構造であってもよいし（例えば酸化→シッフ塩基形成→還元）、グリコシル連結基は、損なわれなくてもよい。「完全なグリコシル連結基」は、修飾基をコンジュゲートの残部に連結する糖類モノマーが、分解（例えば、例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによって、酸化）されない、グリコシル部分から得られる連結基を指す。本発明の「完全なグリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加、あるいは親の糖類構造からの１つまたは複数のグリコシル単位の除去によって、天然に存在するオリゴ糖から得ることができる。
【００４０】
用語「ターゲティング部分」は、本明細書では、それが体の特定の組織または領域に選択的に集中することとなる種を指す。局在化は、分子決定因子の特異的な認識、ターゲティング薬剤またはコンジュゲートの分子サイズ、イオン相互作用、疎水的相互作用などによって仲介される。薬剤を特定の組織または領域に向ける他の機構は、当分野の技術者に知られている。典型的なターゲティング部分には、抗体、抗体フラグメント、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、血清タンパク質（例えば第ＶＩＩ、第ＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ因子）などが含まれる。
【００４１】
本明細書では、「治療的部分」は、これに限定されないが、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒および放射性の薬剤を含めて、治療法に有用ないずれの薬剤も意味する。「治療的部分」には、生物活性剤のプロドラッグ、２つ以上の治療的部分が担体（例えば多価の薬剤）に結合される構成体が含まれる。治療的部分には、また、タンパク質およびタンパク質を含む構成体が含まれる。典型的なタンパク質には、これに限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えばインターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば第ＶＩＩ、第ＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ因子）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ならびに抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子レセプター（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が含まれる。
【００４２】
本明細書では、「薬学的に許容される担体」には、コンジュゲートと組み合わせられる場合にコンジュゲートの活性を保持し、かつ対象の免疫系と反応しないいずれの材料も含まれる。その例には、これに限定されないが、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（油／水エマルジョンなど）、および様々な形の湿潤剤などの、標準の薬剤担体のいずれも含まれる。他の担体にはまた、滅菌溶液、コートされた錠剤を含めた錠剤、およびカプセルが含まれ得る。一般的に、こうした担体は、デンプン、牛乳、糖、ある種のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩（ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム）、タルク、植物性脂肪または油、ゴム、グリコール、あるいは他の既知の賦形剤などの賦形剤を含有する。こうした担体にはまた、フレーバーおよび着色添加物または他の成分が含まれ得る。こうした担体を含む組成物は、よく知られた従来方法によって調製される。
【００４３】
本明細書では、「投与」は、経口投与、坐薬としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内または皮下投与、または、対象への徐放性の装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの埋め込みを意味する。投与は、非経口、および経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣、直腸、または経皮）を含めた任意の経路によるものである。非経口的投与には、例えば、静脈内、筋肉内、小動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内が含まれる。さらに、例えば、注入が、腫瘍を治療する、例えばアポトーシスを誘発するためのものである場合、投与は、腫瘍に、かつ／または腫瘍の周囲の組織に直接的であり得る。送達の他の様式には、リポソーム調合物、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これに限定されない。
【００４４】
用語「改善している」または「改善する」は、症状の減少、緩解、または減弱、あるいは、患者の身体的または精神的健康の改善などの、いずれの客観的または主観的なパラメータも含めて、病状または状態の治療における成功のいずれの徴候も指す。症状の改善は、理学的検査および／または精神医学的な評価の結果を含めた、客観的または主観的なパラメータに基づくことが可能である。
【００４５】
用語「治療法」は、疾患の素因をもつが、まだ疾患の症状を経験または呈示していない動物において、疾患または状態が起こるのを予防すること（予防療法）疾患を阻害する（その発症を遅らせるあるいは抑える）こと、疾患の症状または副作用を軽減させること（対症療法を含めて）、および疾患を楽にする（疾患の退行を引き起こす）ことを含めて、疾患または状態を「治療すること」または「治療」を指す。
【００４６】
用語「有効な量」または、「〜に有効な量」または、「治療上有効量」または任意の語法的に同等の用語は、疾患を治療するために動物に投与される場合に、疾患の治療を実施するのに十分である量を意味する。
【００４７】
用語「単離される」は、材料を生成するために使用される成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。本発明のペプチドコンジュゲートについては、用語「単離される」は、通常、ペプチドコンジュゲートを調製するために使用される混合物内の材料を伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。「単離された」と「純粋である」は、同義的に使用される。一般的に、本発明の単離されたペプチドコンジュゲートは、次の範囲として示される純度のレベルを有することが好ましい。ペプチドコンジュゲートに対する純度の範囲の下端は約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％超である。
【００４８】
ペプチドコンジュゲートが約９０％を超える純度である場合、その純度はまた、好ましくは、次の範囲として示される。純度の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
【００４９】
純度は、当分野で認識された任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または同様の手段）によって決定される。
【００５０】
「集団の本質的にそれぞれのメンバー」は、本明細書では、ペプチドに付加される選択された割合の改変された糖が、ペプチド上の複数の、同一の受容部位に付加される、本発明のペプチドコンジュゲートの集団の特性を記述する。「集団の本質的にそれぞれのメンバー」は、改変された糖に結合されるペプチド上の部位の「均質性」を示し、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明のコンジュゲートを指す。
【００５１】
「均質性」は、改変された糖が結合されるアクセプター部分の、集団全体の構造的な一貫性を指す。したがって、それぞれの改変された糖部分が、受容部位（これに、すべての他の改変された糖が結合される）と同一の構造を有する受容部位と結合された、本発明のペプチドコンジュゲートでは、ペプチドコンジュゲートは、約１００％均質であると言われる。均質性は一般的に、次の範囲として示される。ペプチドコンジュゲートに対する均質性の範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％超である。
【００５２】
ペプチドコンジュゲートが、約９０％以上均質である場合、その均質性はまた好ましくは、次の範囲として示される。均質性の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％均質である。ペプチドコンジュゲートの均質性は、当分野の技術者に知られている１つまたは複数の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリクス支援レーザ脱離飛行時間型質量分光測定法（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、毛管電気泳動などによって、一般的に決定される。上述の議論は、他のＯ−グリコシル化およびＮ−グリコシル化部位に同様に関連する。
【００５３】
「実質的に均一のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」または「実質的に同一のグリコシル化パターン」は、グリコペプチド種に関する場合、当該のグリコシルトランスフェラーゼ（例えばフコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されるアクセプター部分の割合を指す。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、本発明のペプチドコンジュゲートにおいて、実質的にすべて（以下で定義する通り）のＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアル酸付加類似体がフコシル化されるならば、実質的に均一のフコシル化パターンが存在する。出発材料が、グリコシル化されたアクセプター部分（例えばフコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有できることは、当分野の技術者により理解されるであろう。したがって、算出されるグリコシル化（％）は、本発明の方法によって、グリコシル化されるアクセプター部分、ならびに出発材料において、既にグリコシル化されていたアクセプター部分を含むこととなる。
【００５４】
「実質的に均一の」という上述の定義における「実質的に」という用語は通常、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、あるいは、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されることを意味する。例えば、第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートが、Ｓｅｒ連結グリコシル残基を含む場合、集団内のペプチドの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、または好ましくは９９．８％は、同じＳｅｒ残基と共有結合した同じグリコシル残基を有する。
【００５５】
置換基が、（左から右に書かれる）その通常の化学式により指定される場合、これは、右から左への構造を書くことに起因するであろう、化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−はまた、−ＯＣＨ２−とも記述されるものである。
【００５６】
用語「アルキル」は、特に明記しない限り、それ自体で、あるいは別の置換基の一部としての、直鎖または分枝鎖または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味する。これは、指定された炭素原子数（すなわちＣ１〜Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する）の、完全に飽和した、一価または多価不飽和であり得、ニ価および多価のラジカルを含むことができる。これに限定されないが、飽和炭化水素ラジカルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、相同体および異性体（例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなど）などの基が含まれる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例は、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高級の相同体および異性体が含まれるが、これに限定されない。用語「アルキル」はまた、特に明記しない限り、例えば「ヘテロアルキル」などの、以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むこととなる。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル（ｈｏｍｏａｌｋｙｌ）」と称される。
【００５７】
用語「アルキレン」は、それ自体で、あるいは別の置換基の一部としての、これに限定されないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示される通りの、アルカンから得られる二価のラジカルを意味し、「ヘテロアルキレン」として以下で述べるものをさらに含む。一般的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４個の炭素原子を有することとなり、１０個以下の炭素原子を有する基が、本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、通常８個以下の炭素原子を有する、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【００５８】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、その従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に付着されるアルキル基を指す。
【００５９】
用語「ヘテロアルキル」は、特に明記しない限り、それ自体で、あるいは別の用語と組み合わせて、所定の数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる、安定な直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味する。ただし、窒素および硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で４級化（ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅ）されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ならびにＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、あるいはアルキル基が分子の残部に付着される位置に配置され得る。その例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれるが、これに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、最高２つまでのヘテロ原子は、連続的であり得る。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体で、あるいは別の置換基の一部としての、ヘテロアルキルから得られる二価のラジカルを意味し、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示されるが、それに限定されない。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子はまた、鎖末端の片方または両方を占める可能性がある（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。また、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、連結基の方向は、連結基の式が書かれる方向により暗示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方に相当する。
【００６０】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、特に明記しない限り、それ自体で、あるいは他の用語と組み合わせて、それぞれ、環状型の「アルキル」および「ヘテロアルキル」を表す。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、複素環が分子の残部に付着される位置を占める可能性がある。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例には、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが含まれるが、これに限定されない。
【００６１】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、特に明記しない限り、それ自体で、あるいは別の置換基の一部としての、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むこととなる。例えば、用語「ハロゲン（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むこととなるが、これに限定されない。
【００６２】
用語「アリール」は、特に明記しない限り、共に融合する、あるいは共有結合的に連結される、単一の環または複数の環（好ましくは１から３個の環）である可能性がある、多価不飽和の芳香族置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、窒素および硫黄原子が、任意選択で酸化された、また、窒素原子が、任意選択で４級化された、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１から４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着することができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ダイオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、および６−キノリルが含まれる。上記の各々のアリールおよびヘテロアリール環系のための置換基は、以下で述べられる許容される置換基の群から選択される。
【００６３】
簡潔にするために、用語「アリール」は、他の用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ（ａｒｙｌｔｈｉｏｘｙ）、アリールアルキル）と組み合わせて使用される場合、上で定義した通りのアリール環とヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、例えば、炭素原子（例えばメチレン基）が酸素原子によって置き換えられたアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル、など）を含めたアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）にアリール基が付着されたラジカルを含むことになる。
【００６４】
各々の上述の用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）は、示されたラジカルの置換されたおよび非置換形を含むことになる。各タイプのラジカルのための好ましい置換基は、以下で提供される。
【００６５】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）のための置換基は、一般に、「アルキル基置換基」と呼ばれ、これらは、これに限定されないが、ゼロから（２ｍ’＋１）（ただし、ｍ’は、こうしたラジカル中の炭素原子の合計である）までの範囲の数の以下から選択される様々な基のうちの１つまたは複数であり得る：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、および−ＮＯ２。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、好ましくはそれぞれ独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換のアリール（例えば、１〜３個のハロゲン、置換または非置換アルキル、アルコキシ、またはチオアルコキシ基、あるいはアリールアルキル基で置換されたアリール）を指す。例えば、本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、２つ以上のこうした基が存在する場合の、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基と同様に、各々のＲ基は独立して選択される。Ｒ’とＲ’’が同じ窒素原子に付着される場合、これらは、窒素原子と組み合わせられて、５、６、または７員環を形成する可能性がある。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’には、これに限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが含まれることとなる。置換基の上記説明から、当分野の技術者であれば、用語「アルキル」には、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などの、水素基以外の基に結合される炭素原子を含む基が含まれることになることを理解するであろう。
【００６６】
アルキルラジカルのための記述された置換基と同様、アリールおよびヘテロアリール基のための置換基は、一般的に「アリール基置換基」と呼ばれる。例えば、これらの置換基は、以下から選択される：ゼロから芳香環系上の開いた結合（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）の合計までの範囲の数の、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯＲ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル。ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから好ましくは独立して選択される。例えば、本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、２つ以上のこうした基が存在する場合の、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基と同様に、各々のＲ基は、独立して選択される。以下のスキームでは、記号Ｘは、上で述べた通りの「Ｒ」を表す。
【００６７】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で、任意選択で置き換えることができる。式中、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−、または単結合であり、ｑは、０から３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で、任意選択で置き換えることができる。ただし、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−、または単結合であり、ｒは、１から４の整数である。こうして形成される新規の環の単結合のうちの１つは、二重結合で、任意選択で置き換えることができる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基で、任意選択で置き換えることができる。式中、ｓおよびｄは、独立して、０から３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、水素、あるいは置換または非置換の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから、好ましくは独立して選択される。
【００６８】
本明細書では、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、およびシリコン（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００６９】
序論
上で述べた通り、第ＩＸ因子は、血液凝固カスケードに重要である。第ＩＸ因子の構造および配列は、図１に提供される。体内における第ＩＸ因子の欠乏は、あるタイプの血友病（タイプＢ）を特徴づける。この疾患の治療は通常、第ＩＸ因子のヒト血漿タンパク質濃縮物の静脈内輸血に限定される。しかし、時間および費用の実際的な不都合に加えて、血液濃縮物の輸血は、レシピエントへの、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群、または血栓塞栓性疾患の伝染のリスクを伴う。
【００７０】
第ＩＸ因子が、それ自体で治療的適用のために重要かつ有用な化合物と実証されている一方、組換え細胞から第ＩＸ因子を産生するための現在の方法（米国特許第４，７７０，９９９号明細書）は、かなり短い生物学的半減期と不正確なグリコシル化パターンを伴う産物という結果になり、これによって、免疫原性、機能の喪失、また、同じ効果を達成するために、より大きく、より頻度が高い用量が必要になることなどが潜在的に引き起こされる可能性がある。
【００７１】
治療目的で使用される組換え型第ＩＸ因子の効果を向上させるために、本発明は、グリコシル化および非グリコシル化第ＩＸ因子ペプチドの、ポリマー（例えば、ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）、ＰＰＧ（ｍ−ＰＰＧ）など）とのコンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、さらにまたはあるいは、治療的部分、診断的部分、ターゲティング部分などの様々な種とのさらなる結合によって改変できる。
【００７２】
本発明のコンジュゲートは、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドへの、改変された糖の酵素的付着によって形成される。グリコシル化部位およびグリコシル残基は、例えば糖結合によって、ペプチドに修飾基を結合するための位置を提供する。典型的な修飾基は、例えばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）などのポリ（エチレングリコール）などの、水溶性ポリマーである。第ＩＸ因子ペプチドの改変は、患者の循環における組換え第ＩＸ因子の安定性および保持時間を向上させることができる、かつ／または組換え型第ＩＸ因子の抗原性を減少させることができる。
【００７３】
本発明の方法は、実質的に均一な誘導体化パターンを有するペプチドおよびグリコペプチドを組み立てることを可能にする。本発明に使用される酵素は通常、特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の組み合わせ、またはペプチドの特定のグリコシル残基に対して選択的である。この方法はまた、改変されたペプチドおよびグリコペプチドの大規模産生のために実用的である。したがって、本発明の方法は、予め選択された均一の誘導体化パターンを有するグリコペプチドの大規模な調製のための実用的な手段を提供する。
【００７４】
本発明はまた、例えば、クリアランス速度の低下、あるいは、免疫または細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みの割合の低下によって、治療的な半減期が増大されたグリコシル化および非グリコシル化ペプチドのコンジュゲートを提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスキングし、それによって、ペプチドに対する宿主の免疫反応を低下させるあるいは排除するための手段を提供する。標的薬剤の選択的な付着はまた、特定の標的薬剤に特異的である特定の組織または細胞表面アクセプターにペプチドを向けるために使用できる。
【００７５】
コンジュゲート
第１の態様では、本発明は、選択された修飾基と第ＩＸ因子ペプチドとのコンジュゲートを提供する。
【００７６】
ペプチドと修飾基との結合には、ペプチドと選択された部分との間に配置されるグリコシル連結基が含まれる。本明細書に述べる通り、選択された部分は、本質的に、糖単位に付着することができ、ペプチドに、改変された糖を追加する、適切なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「改変された糖」という結果になる、任意の種である。改変された糖の糖成分は、ペプチドと選択された部分との間に配置される場合、「グリコシル連結基」、例えば「完全なグリコシル連結基」になる。グリコシル連結基は、修飾基を用いる改変の後は、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に改変された糖を付加する酵素に対する基質である、いずれの単糖またはオリゴ糖からも形成される。
【００７７】
グリコシル連結基は、修飾基の付加の前または間に分解的に改変される糖類部分である可能性がある、あるいはこれを含む可能性がある。例えば、グリコシル連結基は、例えば、メタ過ヨウ素酸塩の作用を介して、完全な糖類の、相当するアルデヒドへの酸化的分解によって生成される糖類残基から得ることができ、その後、適切なアミンを用いてシッフ塩基に転換され、これは、その後、相当するアミンにその後還元される。
【００７８】
本発明の典型的なコンジュゲートは、次の一般的構造に相当する：
【表１】
2007513190.tif 000004
【００７９】
ただし、記号、ｂ、ｃ、ｄ、およびｓは、ゼロ以外の正の整数を表し、ｔは、０または正の整数である。「薬剤」は、治療薬、生物活性剤、検出可能な標識、水溶性部分（例えばＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧおよびｍ−ＰＰＧ）などである。「薬剤」は、ペプチド（例えば、酵素、抗体、抗原など）である可能性もある。リンカーは、以下の（ｉｎｆｒａ）多様な連結基のうちのいずれかである可能性がある。あるいは、リンカーは、単結合または「ゼロオーダー（ｚｅｒｏ  ｏｒｄｅｒ）リンカー」であってもよい。
【００８０】
典型的な実施形態では、選択された修飾基は、水溶性ポリマー、例えばｍ−ＰＥＧである。水溶性ポリマーは、グリコシル連結基を介してペプチドに共有結合的に付着される。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残留物に共有結合的に付着される。本発明はまた、アミノ酸残基およびグリコシル残基が、グリコシル連結基を用いて改変されるコンジュゲートを提供する。
【００８１】
典型的な水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明に使用されるポリ（エチレングリコール）は、任意の特定の形または分子量範囲に限定されない。枝分かれしていないポリ（エチレングリコール）分子については、分子量は、好ましくは、５００と１００，０００の間である。２，０００〜６０，０００ダルトンの分子量が、使用されることが好ましく、好ましくは、約５，０００から約３０，０００ダルトンである。
【００８２】
別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上ＰＥＧ部分が付着された分枝ＰＥＧである。分枝ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、米国特許第５，３４２，９４０号明細書、米国特許第５，６４３，５７５号明細書、米国特許第５，９１９，４５５号明細書、米国特許第６，１１３，９０６号明細書、米国特許第５，１８３，６６０号明細書、国際公開第０２／０９７６６号パンフレット、コデラＹ．（Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５：２８３〜２８８（１９９４年）、およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、５２：２１２５〜２１２７、１９９８年に記載されている。さらなる有用な分枝ポリマー種は、本明細書に記述される。
【００８３】
好ましい実施形態では、分枝ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、約２，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、４０，０００、５０，０００、および６０，０００ダルトン以上である。
【００８４】
本発明は、酵素的に付加されたグリコシル連結基を介して形成されるコンジュゲートを提供することに加えて、その置換パターンにおいて非常に均質であるコンジュゲートを提供する。本発明の方法を使用すると、本発明のコンジュゲートの集団全体の改変された糖部分の本質的にすべては、構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基の複数のコピーに付着されたペプチドコンジュゲートを形成することが可能である。したがって、第２の態様では、本発明は、完全なグリコシル連結基を介してペプチドと共有結合された、水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチドコンジュゲートを提供する。本発明の好ましいコンジュゲートにおいては、集団の本質的にそれぞれのメンバーは、ペプチドのグリコシル残基と、グリコシル連結基を介して結合され、グリコシル連結基が付着されるペプチドの各グリコシル残基は、同一の構造を有する。
【００８５】
グリコシル連結基を介してさらに共有結合的に結合される水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチドコンジュゲートも提供される。好ましい実施形態では、水溶性ポリマー部分の集団の本質的にあらゆるメンバーは、グリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸残基と結合され、それに付着されたグリコシル連結基を有する各アミノ酸残基は、同一の構造を有する。
【００８６】
本発明はまた、ペプチドが、完全なグリコシル連結基を介して、治療的部分、診断的部分、ターゲティング部分、毒素部分などに結合された、上記のものに類似するコンジュゲートを提供する。各々の前述の部分は、小分子、天然のポリマー（例えばポリペプチド）または合成のポリマーであり得る。本発明のペプチドは、ＰＥＧ部分を含むグリコシル残基でグリコシル化された、少なくとも１つのＮ−またはＯ−結合型グリコシル化部位を含む。ＰＥＧは、完全なグリコシル連結基を介して第ＩＸ因子ペプチドに共有結合的に付着される。グリコシル連結基は、第ＩＸ因子ペプチドの、アミノ酸残基またはグリコシル残基と共有結合的に付着される。あるいは、グリコシル連結基は、グリコペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に付着される。本発明はまた、グリコシル連結基がアミノ酸残基およびグリコシル残基に付着されたコンジュゲートを提供する。
【００８７】
典型的な実施形態では、第ＩＸ因子ペプチドは、次式を有する部分を含む。
【化３】
2007513190.tif 000005
【００８８】
上式で、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、ただし、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【００８９】
一実施形態では、Ｒ１−Ｌは、次式を有する：
【化４】
2007513190.tif 000006
式中、ａは、０から２０の整数である。
【００９０】
典型的な実施形態では、Ｒ１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する：
【化５】
2007513190.tif 000007
式中、ｅおよびｆは、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは、１から２０の整数である。他の実施形態では、Ｒ１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する：
【化６】
2007513190.tif 000008
式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１から２０からそれぞれ独立に選択される整数である。
【００９１】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、以下から選択されるメンバーである構造を有する第ＩＸ因子ペプチドコンジュゲートを提供する：
【化７】
2007513190.tif 000009
式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１から２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１から２０の独立して選択される整数である。
【００９２】
他の実施形態では、Ｒ１は、以下選択されるメンバーである構造を有する：
【化８】
2007513190.tif 000010
式中、ｅおよびｆは、１から２５００の独立して選択される整数である。
【００９３】
別の典型的な実施形態では、本発明は、以下の式を有する部分を含むペプチドを提供する。
【化９】
2007513190.tif 000011
Ｇａｌは、アミノ酸に、あるいは、直接的または間接的に（例えば、グリコシル残基を介して）アミノ酸に付着されたグリコシル残基に付着させることができる。
【００９４】
他の実施形態では、この部分は、次式を有する。
【化１０】
2007513190.tif 000012
Ｇａｌは、アミノ酸に、あるいは、直接的または間接的に（例えば、グリコシル残基を介して）アミノ酸に付着されたグリコシル残基に付着させることができる。
【００９５】
典型的な実施形態では、この構造は、第ＩＸ因子上のＯ−グリコシル化部位のＧｌｙｃｏＰＥＧ化に関連する（図２Ｂ）。
【００９６】
さらなる典型的な実施形態では、ペプチドは、次式による部分を含む。
【化１１】
2007513190.tif 000013
式中、ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基であり、各々の上述の構造において、ＤおよびＧは本明細書に記述する通りである。
【００９７】
上述の種の１つまたは複数が結合することができるペプチドの典型的なアミノ酸残基には、セリンおよびトレオニン、例えば、配列番号１のセリン５３または６１、あるいはトレオニン１５９、１６２、または１７２が含まれる。
【００９８】
別の典型的な実施形態では、本発明は、次式を有するグリコシル残基を含む第ＩＸ因子コンジュゲートを提供する。
【化１２】
2007513190.tif 000014
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１から独立して選択される整数である。指数ｑは、１である。指数ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０から６の整数から独立して選択される。指数ｊ、ｋ、１、およびｍは、０から１００の整数から独立して選択される。指数ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１から独立して選択され、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙのうちの少なくとも１つは１である。記号ＡＡは、第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸残基を表す。
【００９９】
記号Ｓｉａ−（Ｒ）は、次式を有する基を表す。
【化１３】
2007513190.tif 000015
式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択される。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。Ｒ１は、直鎖のまたは分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分を表す。Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。一般に、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【０１００】
別の典型的な実施形態では、本発明のコンジュゲート中のＰＥＧ改変されたシアル酸部分は、次式を有する。
【化１４】
2007513190.tif 000016
式中、指数「ｓ」は、０から２０の整数を表し、ｎは、１から２５００の整数である。選択された実施形態では、ｓは１であり、ＰＥＧは約２０ｋＤである。
【０１０１】
さらなる典型的な実施形態では、ＰＥＧ改変されたシアル酸は、次式を有する。
【化１５】
2007513190.tif 000017
式中、Ｌは、シアル酸部分とＰＥＧ部分を連結している、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルリンカー部分である。
【０１０２】
グリコシル残基が、上で記述される構造を有する、典型的な実施形態では、これは、Ａｓｎ  １５７とＡｓｎ  １６７の一方または両方に結合される。
【０１０３】
第ＩＸ因子は、クローン化され、配列決定されている。任意の配列を有する本質的に任意の第ＩＸ因子ペプチドは、本発明のコンジュゲートの第ＩＸ因子ペプチド成分として使用されるものである。典型的な実施形態では、ペプチドは、配列番号１として本明細書で示される配列を有する：
【０１０４】
【表２】
2007513190.tif 000018
【０１０５】
本発明は、本明細書で記述される配列に決して限定されない。例えば、米国特許第４，７７０，９９９号明細書、同第５，５２１，０７０号明細書（第一位で、チロシンが、アラニンにより置き換えられる）、米国特許第６，０３７，４５２号明細書（第ＸＩ因子がアルキレンオキシド基に連結される）、および米国特許第６，０４６，３８０号明細書（第ＩＸ因子をコードするＤＮＡが、少なくとも１つのスプライス部位に改変される）に記載される通り、第ＩＸ因子変種（ｖａｒｉａｎｔ）は、当分野でよく知られている。本明細書で実証される通り、第ＩＸ因子の変種は、当分野でよく知られており、本開示は、知られている変種、あるいは将来開発および発見されることとなる変種を包含する。
【０１０６】
変異体または改変された第ＩＸ因子の活性を決定するための方法は、例えば、ビッグズ（Ｂｉｇｇｓ）（１９７２年、「Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」（第１版）、オックスフォード、ブラックウェル、サイエンティフィック（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、６１４ページ）に記載されている、一段階（ｏｎｅ  ｓｔａｇｅ）活性化部分卜ロンボプラスチン時間アッセイなどの、当分野で記載されている方法を使用して実施できる。簡単に言うと、本発明の方法に従って開発される第ＩＸ因子分子の生物活性を分析するために、アッセイは、等しい体積の、活性化部分トロンボプラスチン試薬、当分野でよく知られた無菌の静脈切開技術を使用して、血友病Ｂを患う患者から単離された第ＩＸ因子が欠乏した血漿、および標準としての通常のプールされた血漿またはサンプルを用いて実施できる。このアッセイでは、活性の１単位は、１ミリリットルの通常のプールされた血漿中に存在する量と定義される。さらに、第ＩＸ因子が欠乏した患者からの血漿の凝固時間を、通常まで減少させる第ＩＸ因子の能力に基づく、生物活性のためのアッセイを、例えば、プロクター（Ｐｒｏｃｔｏｒ）およびラパポート（Ｒａｐａｐｏｒｔ）、「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．」３６：２１２（１９６１年）に記載される通りに実施できる。
【０１０７】
本発明のペプチドは、少なくとも１つのＮ結合型またはＯ結合型グリコシル化部位（このうちの少なくとも１つは、ＰＥＧ部分を含むグリコシル残基に結合される）を含む。ＰＥＧは、完全なグリコシル連結基を介してペプチドに共有結合的に付着される。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合的に付着される。あるいは、グリコシル連結基は、グリコペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に付着される。本発明はまた、グリコシル連結基がアミノ酸残基およびグリコシル残基に付着されるコンジュゲートを提供する。
【０１０８】
ＰＥＧ部分は、直接的に、または非グリコシルリンカー、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルを介して、完全なグリコシルリンカーに付着される。
【０１０９】
改変された糖
本発明は、改変された糖のコンジュゲートを形成するために、改変された糖および改変された糖ヌクレオチドを使用する。本発明の改変された糖化合物では、糖部分は、好ましくは糖類、デオキシ糖類、アミノ糖類またはＮ−アシル糖類である。用語「糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」およびその等価物、「サッカリル（ｓａｃｃｈａｒｙｌ）」、「糖（ｓｕｇａｒ）」および「グリコシル」は、単量体、二量体、オリゴマー、およびポリマーを指す。糖部分はまた、修飾基を用いて官能性をもたせられる。修飾基は一般的に、アミン、スルフヒドリル、またはヒドロキシル（例えば糖上の第１のヒドロキシル部分）とのコンジュゲートを介して、糖部分に結合される。典型的な実施形態では、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、例えば、修飾基の反応性の誘導体とアミンの反応を介して形成される、アミド、ウレタン、または尿素を介して付着される。
【０１１０】
任意の糖を、本発明のコンジュゲートの糖中心として利用できる。本発明の組成物を形成するのに有用な典型的な糖中心には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシアル酸が含まれるが、これに限定されない。他の有用な糖には、アミノ糖（グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなど）、シアル酸の５−アミン類似体などが含まれる。糖中心は、天然に見られる構造であってもよいし、修飾基と結合するための部位を提供するために改変されてもよい。例えば、一実施形態では、本発明は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置き換えられたシアル酸誘導体を提供する。アミンは、選択された修飾基の活性化された類似体を用いて、容易に誘導体化される。
【０１１１】
典型的な実施形態では、本発明は、次式を有する改変された糖アミンを利用する。
【化１６】
2007513190.tif 000019
式中、Ｇは、グリコシル部分であり、Ｌは、結合またはリンカーであり、Ｒ１は、修飾基である。典型的な結合は、グリコシル部分上のＮＨ２と、修飾基上の相補的な反応性の基との間に形成されるものである。したがって、典型的な結合には、ＮＨＲ１、ＯＲ１、ＳＲ１が含まれるが、これに限定されない。例えば、Ｒ１が、カルボン酸部分を含む場合、この部分は、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１構造を有する結合を与えるグリコシル残基上のＮＨ２部分を用いて、活性化させ、これと結びつけることができる。同様に、ＯＨおよびＳＨ基を、それぞれ、相当するエーテルまたはチオエーテル誘導体に転換させることができる。
【０１１２】
典型的なリンカーには、アルキルおよびヘテロアルキル部分が含まれる。リンカーには、連結基、例えばアシルベースの連結基、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、などが含まれる。連結基は、本発明の種の成分の間に、例えば、グリコシル部分とリンカー（Ｌ）との間に、あるいは、リンカーと修飾基（Ｒ１）との間に形成される結合である。他の連結基は、エーテル、チオエーテル、およびアミンである。例えば、一実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基（グリシン残基など）である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応によって、相当するアミドに転換され、グリシンのアミンは、修飾基の活性化されたカルボン酸または炭酸エステルとの反応によって、相当するアミドまたはウレタンに転換される。
【０１１３】
別の典型的なリンカーは、ＰＥＧ部分、またはアミノ酸残基を用いて官能性をもたせられたＰＥＧ部分である。ＰＥＧは、片方のＰＥＧ末端でアミノ酸残基を介してグリコシル基に結合され、もう片方のＰＥＧ末端を介してＲ１に結合される。あるいは、アミノ酸残基は、Ｒ１に結合され、アミノ酸に結合されないＰＥＧ末端はグリコシル基に結合される。
【０１１４】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ１のための典型的な種は、次式を有する：
−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｏ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１
式中、指数ｓおよびｔは、独立して０または１である。指数ａ、ｂ、およびｄは、独立して、０から２０の整数であり、ｃは、１から２５００の整数である。他の同様のリンカーは、−ＮＨ部分が別の基、例えば、−Ｓ、−Ｏ、または−ＣＨ２により置き換えられた種がベースである。
【０１１５】
より詳細には、本発明は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ１が、以下である化合物を利用する：
ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、およびＮＨＲ１。これらの式では、指数、ａ、ｂ、およびｄは、０から２０の整数から、好ましくは１〜５から独立して選択される。指数ｃは、１から２５００の整数である。
【０１１６】
後に続く議論では、本発明は、シアル酸の選択された誘導体の使用を参照することにより説明される。当分野の技術者であれば、議論の焦点は、説明を明確にするためのものであること、また、記述される構造および組成物は、通常、糖類基、改変された糖類基、活性化された改変された糖類基、および改変された糖類基のコンジュゲートの種類全体に適用可能であることを認識するであろう。
【０１１７】
例示的な実施形態では、Ｇはシアル酸であり、本発明に使用される選択された化合物は次式を有する。
【化１７】
2007513190.tif 000020
【０１１８】
当分野の技術者であれば理解できるであろう通り、上述の典型的な化合物中のシアル酸部分は、これに限定されないが、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、そのＮ−アセチル誘導体などを含めて、他の任意のアミノ糖類で置き換えることができる。
【０１１９】
別の例示的な実施形態では、糖の第１ヒドロキシル部分は、修飾基を用いて官能性をもたせられる。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルは、相当するアミンに転換させることができ、本発明による化合物を提供するために官能性をもたせられることが可能である。この実施形態に従う式には、次のものが含まれる：
【化１８】
2007513190.tif 000021
【０１２０】
さらなる典型的な実施形態では、本発明は、上で述べたものなどのリンカー−修飾基カセットをもつ、６−ヒドロキシル位置が相当するアミン部分に転換された、改変された糖を利用する。これらの改変された糖の中心として使用できる典型的なサッカリル基には、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが含まれる。この実施形態に従う典型的な改変された糖は、次式を有する：
【化１９】
2007513190.tif 000022
式中、Ｒ３〜Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３から独立して選択されるメンバーであり、Ｒ６は、ＯＲ１、ＮＨＲ１、またはＮＨ−Ｌ−Ｒ１であり、これは、上記の通りである。
【０１２１】
本発明で使用される選択されたコンジュゲートは、マンノース、ガラクトース、またはグルコース、あるいはマンノース、ガラクトース、またはグルコースの立体化学を有する種がベースである。これらのコンジュゲートの一般式は、次の通りである。
【化２０】
2007513190.tif 000023
【０１２２】
別の典型的な実施形態では、本発明は、相当するヌクレオチド糖として活性化される、上で述べた通りの化合物を利用する。その改変形態で、本発明に使用される典型的な糖ヌクレオチドには、ヌクレオチド一、二、または三リン酸またはその類似体が含まれる。好ましい実施形態では、改変された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシドまたはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらに好ましくは、改変された糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。典型的な実施形態では、ヌクレオチドリン酸は、Ｃ−１に付着される。
【０１２３】
したがって、グリコシル部分がシアル酸である例示的な実施形態では、本発明は、次式を有する化合物を利用する：
【化２１】
2007513190.tif 000024
式中、Ｌ−Ｒ１は上で述べた通りであり、Ｌ１−Ｒ１は修飾基に結合されたリンカーを表す。Ｌと同様に、Ｌ１に従う典型的なリンカー種には、結合、アルキル、またはヘテロアルキル部分が含まれる。これらの実施形態による典型的な改変された糖ヌクレオチド化合物は、図７および図８に記述される。
【０１２４】
別の典型的な実施形態では、本発明は、本発明の改変された糖と基質第ＩＸ因子ペプチドとの間に形成されるコンジュゲートを提供する。この実施形態では、改変された糖の糖部分は、基質と修飾基の間に配置されるグリコシル連結基になる。典型的なグリコシル連結基は、連結基を形成しているグリコシル部分が、化学物質（例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素的プロセス（例えばオキシダーゼ）によって、弱められていない、完全なグリコシル連結基である。本発明の選択されたコンジュゲートには、アミノ糖類（例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸など）のアミン部分に付着された修飾基が含まれる。この主旨に従う典型的な修飾基−完全なグリコシル連結基カセットは、次式を有するものなどの、シアル酸構造がベースである。
【化２２】
2007513190.tif 000025
【０１２５】
上式で、Ｒ１およびＬ１は、上記の通りである。
【０１２６】
さらなる典型的な実施形態では、コンジュゲートは、基質第ＩＸ因子と、サッカリル部分（修飾基が、サッカリル部分の６−炭素位置でリンカーを介して付着される）との間に形成される。したがって、この実施形態による例示的なコンジュゲートは、次式を有する。
【化２３】
2007513190.tif 000026
式中、ラジカルは、上に述べた通りである。当分野の技術者であれば、上で述べた改変されたサッカリル部分はまた、２、３、４、または５炭素原子で、酸素または窒素原子を介して基質と結合させることができることを理解するであろう。
【０１２７】
本発明で使用される例示的な化合物には、次式を有する化合物が含まれる：
【化２４】
2007513190.tif 000027
式中、Ｒ基および指数は、上記の通りである。
【０１２８】
本発明はまた、６−炭素位置で、Ｌ−Ｒ１で改変される糖ヌクレオチドの使用を提供する。この実施形態による典型的な種には、次のものが含まれる：
【化２５】
2007513190.tif 000028
式中、Ｒ基およびＬは、上で示した通りの部分を表す。指数「ｙ」は、０、１または２である。
【０１２９】
本発明で使用されるさらなる典型的なヌクレオチド糖は、ＧＤＰマンノースの立体化学を有する種がベースである。この実施形態に従う典型的な種は、次の構造を有する。
【化２６】
2007513190.tif 000029
【０１３０】
さらなる典型的な実施形態では、本発明は、改変された糖がＵＤＰガラクトースの立体化学に基づくコンジュゲートを提供する。本発明で使用される典型的なヌクレオチド糖は、次の構造を有する。
【化２７】
2007513190.tif 000030
【０１３１】
別の典型的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、グルコースの立体化学に基づく。この実施形態に従う典型的な種は、次式を有する。
【化２８】
2007513190.tif 000031
【０１３２】
修飾基Ｒ１は、これに限定されないが、水溶性ポリマー、非水溶性ポリマー、治療薬、診断薬などを含めて、いくつかの種のうちのいずれかである。典型的な修飾基の性質を、以下に、より詳細に述べる。
【０１３３】
修飾基
水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーは、当分野の技術者に知られており、本発明を実施するのに有用である。用語「水溶性ポリマー」は、糖類（例えばデキストラン、アミロース、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｏｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えばポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの種を包含する。本発明は、そのポリマーが、コンジュゲートの残部が付着できる位置を含まなければならないという唯一の制限を伴う任意の水溶性ポリマーを用いて実践できる。
【０１３４】
ポリマーの活性化のための方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、およびさらに国際公開第９３／１５１８９号パンフレットに見ることができ、活性化ポリマーとペプチドと間の結合のための方法は、例えば、凝固第ＶＩＩＩ因子（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキサイドジスムターゼ（ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、「Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」１１：１４１〜４５（１９８５年））に見ることができる。
【０１３５】
好ましい水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプル中のかなりの割合のポリマー分子が、ほぼ同じ分子量のものである。こうしたポリマーは、「同一分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）」である。
【０１３６】
本発明を、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートを参照することによって、さらに説明する。ＰＥＧの機能化および結合に関するいくつかの総説および研究書が、利用可能である。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、「Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．」Ｃ２５：３２５〜３７３（１９８５年）；スカウテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１３５：３０〜６５（１９８７年）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」１４：８６６〜８７４（１９９２年）；デルガード（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」９：２４９〜３０４（１９９２年）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．」６：１５０〜１６５（１９９５年）；およびバドラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、「Ｐｈａｒｍａｚｉｅ」、５７：５〜２９（２００２年）を参照のこと。反応性のＰＥＧ分子を調製するための経路、および反応性の分子を使用してコンジュゲートを形成することは、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号明細書は、線状または分枝ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン（ａｃｒｙｌｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ））から選択されるポリマー酸の活性なエステルの水溶性かつ単離可能なコンジュゲートを開示している。
【０１３７】
米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、有機溶剤中でジ（１−ベンゾトリアゾリル（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｙｌ））炭酸エステルとポリマーの末端ヒドロキシルを反応させることによって、水溶性かつ非ペプチド性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリル炭酸エステルを調製するための方法を記載している。活性なエステルは、生物学的に活性な薬剤（タンパク質またはペプチドなど）とのコンジュゲートを形成するために使用される。
【０１３８】
国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、安定な結合を介してポリマー主鎖に連結される少なくとも１つの末端を有するポリマー主鎖を含む生物学的に活性な薬剤および活性化水溶性ポリマーを含むコンジュゲートを記載する。ここで、少なくとも１つの末端は、分岐部分に連結された近位の反応性の基を有する分岐部分を含み、また、生物学的に活性な薬剤は、近位の反応性の基のうちの少なくとも１つに連結される。他の分枝ポリ（エチレングリコール）は、国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書は、反応性の官能基を含む分枝末端を含む分枝ＰＥＧ分子を用いて形成されたコンジュゲートを記載している。遊離の反応性の基は、タンパク質またはペプチドなどの生物学的に活性な種と反応させ、ポリ（エチレングリコール）と生物学的に活性な種とのコンジュゲートを形成するために利用可能である。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は、二官能性ＰＥＧリンカー、および、各々のＰＥＧリンカー末端でペプチドを有するコンジュゲートを形成する際のその使用を記載する。
【０１３９】
分解可能なＰＥＧ結合を含むコンジュゲートは、国際公開第９９／３４８３３号パンフレット；および国際公開第９９／１４２５９号パンフレット、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号明細書に記載されている。こうした分解可能な結合は、本発明に適用可能である。
【０１４０】
上で記述したポリマーの活性化の当分野で認識された方法は、本明細書に記述される分枝ポリマーの形成において、また、他の種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどへのこれらの分枝ポリマーの結合のために、本発明において有用である。
【０１４１】
本発明で使用される典型的なポリ（エチレングリコール）分子には、次式を有するものが含まれるが、これに限定されない。
【化２９】
2007513190.tif 000032
式中、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、置換または非置換アルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、または−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である。指数「ｅ」は、１から２５００の整数を表す。指数ｂ、ｄ、およびｑは、独立して、０から２０の整数を表す。記号ＺおよびＺ１は、独立して、ＯＨ、ＮＨ２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド、Ｓ−Ｒ９、活性化エステル類のアルコール部分、−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ、または−（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ｓＣ（Ｙ１）Ｖを表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１、およびＵは、独立して、部分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。指数ｐ、ｑ、ｓ、およびｖは、０から２０の整数から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１ｌ、およびＲｌ２は、独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換のヘテロアリールを表す。
【０１４２】
他の典型的な実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、次から選択される。
【化３０】
2007513190.tif 000033
【０１４３】
本発明のコンジュゲートを形成するのに有用なポリ（エチレングリコール）は、線状または分枝状である。本発明で使用するための適切な分枝ポリ（エチレングリコール）分子には、以下の式によって示されるものが含まれるが、これに限定されない：
【化３１】
2007513190.tif 000034
式中、Ｒ８およびＲ８’は、独立して、上の、Ｒ８について定義された基から選択されるメンバーである。Ａ１およびＡ２は、独立して、上の、Ａ１について定義された基から選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆ、ｏおよびｑは、上記の通りである。ＺおよびＹは、上記の通りである。Ｘ１およびＸ１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択されるメンバーである。
【０１４４】
他の典型的な実施形態では、分枝ＰＥＧは、システイン、セリン、またはジ−リジン中心がベースである。したがって、さらに典型的な分枝ＰＥＧには、以下が含まれる：
【化３２】
2007513190.tif 000035
【０１４５】
さらに別の実施形態では、分枝ＰＥＧ部分は、トリ−リジンペプチドがベースである。トリ−リジンは、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−ＰＥＧ化される可能性がある。この実施形態に従う典型的な種は、次式を有する。
【化３３】
2007513190.tif 000036
式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１から２５００の独立して選択された整数であり、およびｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１から２０の独立して選択された整数である。
【０１４６】
本発明の典型的な実施形態では、ＰＥＧは、ｍ−ＰＥＧ（５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤまたは３０ｋＤ）である。典型的な分枝ＰＥＧ種は、ｍ−ＰＥＧが２０ｋＤのｍ−ＰＥＧである、セリン−またはシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）２である。
【０１４７】
当分野の技術者であれば理解できるであろう通り、本発明で使用される分枝ポリマーには、上で述べた論旨に関する変形が含まれる。例えば、上記のジ−リジン−ＰＥＧコンジュゲートは、３つの高分子サブユニットを含む可能性があり、第３のものは、上述の構造において、改変されていないと示されたα−アミンと結合される。同様に、３つまたは４つの高分子サブユニットを用いて官能性をもたせられるトリ−リジンの使用も、本発明の範囲内である。
【０１４８】
本発明で使用されるさらなる典型的な種には、次のものが含まれる。
【化３４】
2007513190.tif 000037
および、例えば、これらの種の炭酸エステルおよび活性なエステル類：
【化３５】
2007513190.tif 000038
【０１４９】
本明細書で記述する化合物を調製するのに使用される線状ＰＥＧを活性化するために適切である、他の活性化基、または脱離基には、これに限定されないが、次の種が含まれる。
【化３６】
2007513190.tif 000039
【０１５０】
これらの種および他の種を用いて活性化されるＰＥＧ分子、および活性化ＰＥＧを製造する方法は、国際公開第０４／０８３２５９号パンフレットに記載されている。
【０１５１】
当分野の技術者であれば、分枝ポリマーのｍ−ＰＥＧアームの１つまたは複数を、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキルなどをもつＰＥＧ部分によって置き換えることができることを理解するであろう。さらに、上述の構造は、「アミノ酸」の側鎖のα−炭素原子と官能基の間にアルキルリンカーを挿入すること（または炭素原子を除去すること）によって、容易に改変される。したがって、「ホモ」誘導体およびより高級の相同体、ならびに、より低級の相同体は、本発明で使用される分枝ＰＥＧのための有用な「アミノ酸」中心である。
【０１５２】
本明細書で記述される分枝ＰＥＧ種は、下のスキームに記述するものなどの方法によって、容易に調製される。
【化３７】
2007513190.tif 000040
式中、Ｘａは、ＯまたはＳであり、ｒは１から５の整数である。指数ｅおよびｆは、１から２５００の、独立して選択される整数である。
【０１５３】
したがって、このスキームに従って、天然または非天然のアミノ酸を、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合トシラートと接触させ、側鎖ヘテロ原子Ｘａをアルキル化することによって、１を形成する。単一の（ｍｏｎｏ）−官能性をもたせられたｍ−ＰＥＧアミノ酸を、反応性のｍ−ＰＥＧ誘導体と共にＮ−アシル化条件にかけ、それによって、分枝ｍ−ＰＥＧ  ２を組み立てる。当分野の技術者であれば、トシラート脱離基を、任意の適切な脱離基、例えば、ハロゲン、メシラート、トリフレートなどで置き換えることができることを理解するであろう。同様に、アミンをアシル化するために利用される反応性の炭酸エステルを、活性なエステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどで置き換えることができる。あるいは、酸を、脱水剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなど）を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕ活性化できる。
【０１５４】
典型的な実施形態では、修飾基は、ＰＥＧ部分であるが、任意の修飾基（例えば、水溶性ポリマー、非水溶性ポリマー、治療的部分など）を、適切な結合を介してグリコシル部分に組み込むことができる。改変された糖は、それにより改変された糖を産生する、酵素的手段、化学的手段、またはそれらの組み合わせによって形成される。典型的な実施形態では、糖は、活性なアミン（任意の位置で、修飾部分の付着を可能にし、さらに、糖が、ペプチドに改変された糖を結びつけることができる酵素のための基質として機能することを可能にする）で置換される。典型的な実施形態では、ガラクトサミンが改変された糖である場合、アミン部分は、６−位置で炭素原子に付着される。
【０１５５】
水溶性ポリマーで改変された種
糖部分が水溶性ポリマーを用いて改変される、水溶性ポリマーで改変されたヌクレオチド糖種は、本発明に有用である。典型的な改変された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分を介して改変された糖基を持つ。改変された糖ヌクレオチド、例えば糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体もまた、本発明の方法に使用される。例えば、サッカリルアミン（修飾基を含まない）は、ペプチド（または他の種）と酵素的に結合させ、遊離のサッカリルアミン部分を、所望の修飾基に、その後結合させることができる。あるいは、改変された糖ヌクレオチドは、基質（例えば、ペプチド、グリコペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質など）上のサッカリルアクセプターに、改変された糖を転移する酵素のための基質として機能できる。
【０１５６】
糖中心がガラクトースまたはグルコースである一実施形態では、Ｒ５は、ＮＨＣ（Ｏ）Ｙである。
【０１５７】
典型的な実施形態では、改変された糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分がベースである。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて以下に示すように、６−アミノ−糖部分は、標準の方法によって、容易に調製される。
【化３８】
2007513190.tif 000041
【０１５８】
上のスキームでは、指数ｎは、１から２５００、好ましくは１０から１５００、好ましくは、１０から１２００の整数を表す。記号「Ａ」は、活性化基、例えば、ハロゲン、活性化エステルの成分（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、炭酸エステルの成分（例えばｐ−ニトロフェニル炭酸エステル）などを表す。当分野の技術者であれば、他のＰＥＧ−アミド・ヌクレオチド糖が、この方法および類似の方法によって、容易に調製されることを理解するであろう。
【０１５９】
他の典型的な実施形態では、アミド部分は、ウレタンまたは尿素などの基によって置き換えられる。
【０１６０】
さらなる実施形態では、Ｒ１は、分枝ＰＥＧ、例えば、上で述べた種のうちの１つである。この実施形態に従う例示的化合物には、次のものが含まれる。
【化３９】
2007513190.tif 000042
式中、Ｘ４は、結合またはＯである。
【０１６１】
さらに、上で示した通り、本発明は、直鎖または分枝した水溶性ポリマーを用いて改変されるヌクレオチド糖を提供する。例えば、下で示される式を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【化４０】
2007513190.tif 000043
式中、Ｘ４は、Ｏまたは結合である。
【０１６２】
同様に、本発明は、６−位置の炭素が改変される、改変された糖種のヌクレオチド糖を提供する：
【化４１】
2007513190.tif 000044
式中、Ｘ４は、結合またはＯである。
【０１６３】
本発明の組成物を含めた、ペプチドおよびグリコペプチド、脂質および糖脂質のコンジュゲートも提供される。例えば、本発明は、次式を有するコンジュゲートを提供する。
【化４２】
2007513190.tif 000045
【０１６４】
非水溶性ポリマー
上で述べたものに類似した別の実施形態では、改変された糖は、水溶性ポリマーではなく、非水溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートはまた、１つまたは複数の非水溶性ポリマーを含むことができる。本発明のこの実施形態は、制御された方式で治療的ペプチドを送達するための媒体としてのコンジュゲートを使用することによって説明される。高分子薬物送達システムは、当技術分野で知られている。例えば、ダン（Ｄｕｎｎ）ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ」、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第４６９巻、米国化学学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９９１年を参照のこと。当分野の技術者であれば、実質的に任意の既知の薬物送達システムが、本発明のコンジュゲートに適用可能であることを理解するであろう。
【０１６５】
代表的な非水溶性ポリマーには、これに限定されないが、ポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、およびポリビニルフェノール、ならびにそれらのコポリマーが含まれる。
【０１６６】
本発明のコンジュゲートに使用される、合成的に改変される天然のポリマーには、これに限定されないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステルおよびニトロセルロースが含まれる。合成的に改変される天然のポリマーの幅広いクラスの特に好ましいメンバーには、これに限定されないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリルおよびメタクリル酸エステルとアルギン酸のポリマーが含まれる。
【０１６７】
本明細書で述べられるこれらのポリマーおよび他のポリマーは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ、ペンシルバニア州）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ニューヨーク州）、およびバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）などの市販の供給源から容易に得ることができる、あるいは、これらの供給元から得られるモノマーから、標準の技術を使用して合成される。
【０１６８】
本発明のコンジュゲートに使用される代表的な生分解性ポリマーには、これに限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコリドおよびそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、これらのブレンドおよびコポリマーが含まれる。特に有用なものは、コラーゲン、プルロニックなどを含めたものなど、ゲルを形成する組成物である。
【０１６９】
本発明に使用されるポリマーには、その構造の少なくとも一部の中に生体再吸収性分子を有する非水溶性材料を含む「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。こうしたポリマーの例は、ポリマー鎖ごとに、生体再吸収性領域、親水性領域、および複数の架橋性の官能基を有する、非水溶性コポリマーを含むものである。
【０１７０】
本発明の目的を達成するために、「非水溶性材料」は、水または含水環境に実質的に不溶性である材料を含む。したがって、コポリマーのある種の領域またはセグメントが、親水性または水溶性であったとしても、ポリマー分子は、全体としては、任意の実質的な測定に対して水に溶解しない。
【０１７１】
本発明の目的では、用語「生体再吸収性分子」は、体によって、通常の排泄経路を介して、代謝または分解および再吸収および／または排除されることが可能な領域を含む。こうした代謝産物または分解された産物は、体に対して好ましくは実質的に非毒性である。
【０１７２】
コポリマー組成物が全体として水溶性にならない限り、生体再吸収性領域は、疎水性でも親水性でもよい。したがって、生体再吸収性領域は、ポリマーが、全体として、非水溶性のままであるという優先度に基づいて選択される。したがって、相対的な特性、すなわち、含有される官能基の種類、および生体再吸収性領域の相対的な割合、および親水性領域は、有用な生体再吸収性組成物が、確実に非水溶性のままであるように選択される。
【０１７３】
典型的な再吸収可能なポリマーには、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の、合成的に生成された再吸収可能なブロックコポリマーが含まれる（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照のこと）。これらのコポリマーは、架橋されず、かつ水溶性であり、その結果、体が、分解されたブロックコポリマー組成物を排出できる。ユネス（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、「Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．」２１：１３０１〜１３１６（１９８７年）、およびコーン（Ｃｏｈｎ）ら、「Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．」２２：９９３〜１００９（１９８８年）を参照のこと。
【０１７４】
目下のところ好ましい生体再吸収性ポリマーには、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（炭酸エステル）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ（チオエステル）、ポリサッカリド、およびこれらの混合物から選択される１つまたは複数の成分が含まれる。より好ましくは、生体再吸収性ポリマーには、ポリ（ヒドロキシ）酸成分が含まれる。ポリ（ヒドロキシ）酸の中では、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が好ましい。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで吸収される（「生体再吸収される（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂｅｄ）」）フラグメントを形成することに加えて、本発明の方法で使用するための好ましい高分子コーティングはまた、排出可能（ｅｘｃｒｅｔａｂｌｅ）かつ／または代謝性のフラグメントを形成できる。
【０１７６】
より高い程度のコポリマーもまた、本発明に使用できる。例えば、１９８４年３月２０日に発行された、ケーシー（Ｃａｓｅｙ）ら、米国特許第４，４３８，２５３号明細書は、ポリ（グリコール酸）とヒドロキシル末端のポリ（アルキレングリコール）のエステル転移反応から産生されるトリ−ブロックコポリマーを開示している。こうした組成物は、再吸収可能なモノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。こうした組成物の柔軟性は、芳香族オルト炭酸エステル（テトラ−ｐ−トリルオルト炭酸エステルなど）の、コポリマー構造への組み込みによって制御される。
【０１７７】
乳酸および／またはグリコール酸を主成分とした他のポリマーもまた利用できる。例えば、１９９３年４月１３日に発行された、スピヌ（Ｓｐｉｎｕ）、米国特許第５，２０２，４１３号明細書は、オリゴマーのジオールまたはジアミン残基のいずれかへのラクチドおよび／またはグリコリドの開環重合、それに続く二官能性化合物（例えばジイソシアネート、ジアシルクロライド（ｄｉａｃｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）、またはジクロロシラン）を用いる鎖延長によって産生される、ポリ乳酸および／またはポリグリコリドの連続的に順序づけられたブロックを有する、生体分解性のマルチ−ブロックコポリマーを開示している。
【０１７８】
本発明に有用なコーティングの生体再吸収性領域は、加水分解的かつ／または酵素的に切断可能であるように設計できる。本発明の目的では、「加水分解的に切断可能」は、コポリマー、特に生体再吸収性領域が、水または含水の環境における加水分解に対して感受性であることを指す。同様に、本明細書では、「酵素的に切断可能」は、コポリマー、特に生体再吸収性領域が、内在性または外因性の酵素による切断に対して感受性であることを指す。
【０１７９】
体内に配置される場合、親水性領域は排出可能かつ／または代謝性のフラグメントに加工される可能性がある。したがって、親水性領域には、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリサッカリド、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が含まれ得る。さらに、親水性領域はまた、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドである可能性がある。こうしたポリ（アルキレン）オキシドには、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシド、ならびにそれらの混合物およびコポリマーが含まれ得る。
【０１８０】
ヒドロゲルの成分であるポリマーもまた、本発明に有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収できるポリマー材料である。ヒドロゲルを形成する化合物の例には、これに限定されないが、ポリアクリル酸、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラゲナンおよび他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体などが含まれる。安定な、生体分解性の、生体再吸収性のヒドロゲルを生成できる。さらに、ヒドロゲル組成物は、１種または複数のこうした特性を示すサブユニットを含むことができる。
【０１８１】
その完全性を、架橋を介して制御することが可能な、生体適合性のヒドロゲル組成物が知られており、これは、本発明の方法で使用するために、目下のところ好ましい。例えば、ハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）ら、１９９５年４月２５日に発行された米国特許第５，４１０，０１６号明細書、１９９６年６月２５日に発行された同第５，５２９，９１４号明細書は、２つの加水分解的に変化しやすい伸張部にはさまれた、水溶性の中心ブロックセグメントを有する架橋されたブロックコポリマーである、水溶性のシステムを開示している。こうしたコポリマーは、さらに、光重合性のアクリル酸官能基を用いて末端を覆われる。架橋される場合、これらのシステムはヒドロゲルになる。こうしたコポリマーの水溶性の中心ブロックには、ポリ（エチレングリコール）が含まれ得るが、加水分解的に変化しやすい伸張部は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（ポリグリコール酸またはポリ乳酸など）であり得る。ソーニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」２６：５８１〜５８７（１９９３年）を参照のこと。
【０１８２】
別の好ましい実施形態では、ゲルは、熱可逆的なゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲル、およびそれらの組み合わせなどの成分を含む熱可逆的なゲルが、目下のところ好ましい。
【０１８３】
さらに別の典型的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リポソームの成分を含む。リポソームは、周知の方法に従って、例えば、１９８５年６月１１日に発行された、エップシュタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されている通りに調製できる。例えば、リポソーム調合物は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（ａｒａｃｈａｄｏｙｌ）ホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を、無機溶媒に溶解し、次いでこれを蒸発させ、容器の表面上に乾燥した脂質の薄膜を残すことによって調製できる。活性な化合物またはその薬学的に許容される塩の水溶液を、その後、その容器に導入する。その後、この容器を、手で回し、脂質材料を容器の側面から剥がし、脂質凝集物を分散させ、それによって、リポソームの懸濁液を形成させる。
【０１８４】
前述の微粒子、およびこうした微粒子を調製する方法は、実施例として提供されるが、これは、本発明に使用される微粒子の範囲を定義するためのものではない。異なる方法によって作られる一連の微粒子が、本発明に有用であることは、当分野の技術者には明らかであろう。
【０１８５】
水溶性ポリマー（直鎖と分枝の両方）において、上で述べた構造的な形式は、通常、非水溶性ポリマーに関して同様に適用可能である。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリジン、およびトリリジン分岐中心は、２つの非水溶性ポリマー部分を用いて官能性をもたせることができる。こうした種を生成するために使用される方法は、通常、水溶性ポリマーを生成するために使用される方法と密接に類似している。
【０１８６】
コンジュゲートのＰＥＧ置換の程度は、化学量論の選択、利用可能なグリコシル化部位の数、特定の部位に選択的である酵素の選択などによって制御することができる（図２Ｆ）。ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子種は、標識された第ＩＸ因子と比較した場合に循環半減期の増大を示す（図３、図６）。
【０１８７】
方法
上で述べたコンジュゲートに加えて、本発明は、こうしたコンジュゲートおよび他のコンジュゲートを調製するための方法を提供する。さらに、本発明は、疾患を発症する危険にさらされた対象または疾患を患う対象に、本発明のコンジュゲートを投与することによって、病態を予防、治療、または改善する方法を提供する。
【０１８８】
したがって、本発明は、選択された部分と第ＩＸ因子ペプチドとの共有コンジュゲートを形成する方法を提供する。
【０１８９】
典型的な実施形態では、水溶性ポリマー、治療的部分、ターゲティング部分、または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化第ＩＸ因子ペプチドとのコンジュゲートが形成される。ポリマー、治療的部分、または生体分子は、ペプチドと修飾基（例えば水溶性ポリマー）の間に配置され、これら両方と共有結合的に連結するグリコシル連結基を介してペプチドに結合される。この方法は、改変された糖および酵素、例えば、改変された糖を基質（例えばペプチド、アグリコン、糖脂質）と結合させるグリコシルトランスフェラーゼを含有する混合物とペプチドを接触させることを含む。この反応は、改変された糖と第ＩＸ因子ペプチドとの共有結合を形成するのに適した状態下で行われる。
【０１９０】
アクセプター第ＩＸ因子ペプチドは、一般的に、新規に合成される、あるいは、原核細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）において、または真核生物の細胞（哺乳類、酵母、昆虫、菌類、または植物細胞など）において、組換えによって発現される。ペプチドは、全長のタンパク質またはフラグメントである可能性がある。さらに、ペプチドは、野生型または変異されたペプチドであってもよい。典型的な実施形態では、ペプチドは、ペプチド配列に、１つまたは複数のＮ−またはＯ−結合型グリコシル化部位を加えるような、あるいはこれらの部位が除去されるような変異を含む。
【０１９１】
典型的な実施形態では、第ＩＸ因子は、Ｏ−グリコシル化され、以下のように、水溶性ポリマーを用いて官能性をもたせられる。ペプチドは、利用可能なアミノ酸グリコシル化部位を用いて生成される、あるいは、グリコシル化される場合、グリコシル部分が取り除かれてアミノ酸に暴露される。例えば、セリンまたはトレオニンは、アミノガラクトシル化α−１Ｎ−アセチル（ＧａｌＮＡｃ）であり、ＮＡｃ−ガラクトシル化ペプチドは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１を使用してシアル酸−修飾基カセットを用いてシアル酸付加される。あるいは、ＮＡｃ−ガラクトシル化ペプチドは、Ｃｏｒｅ−１−ＧａｌＴ−１を使用してガラクトシル化され、この生成物は、ＳＴ３ＧａｌＴ１を使用してシアル酸−修飾基カセットを用いてシアル酸付加される。この方法に従う典型的な接合体は、以下の結合を有する：
Ｔｈｒ−α−１−ＧａｌＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−α２，３−Ｓｉａ＊、
式中、Ｓｉａ＊は、シアル酸−修飾基カセットである。
【０１９２】
複数の酵素およびサッカリル供与体を使用する、上で述べたものなどの、本発明の方法では、個々のグリコシル化ステップは、別々に実施してもよいし、「単一ポット（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｔ）」反応に組み合わせてもよい。例えば、上で述べた３つの酵素反応では、ＧａｌＮＡｃ転移酵素（ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）、ＧａｌＴおよびＳｉａＴ、ならびにそれらの供与体は、単一の容器内で組み合わせることが可能である。あるいは、ＧａｌＮＡｃ反応は、単独で実施することができ、ＧａｌＴとＳｉａＴの両方、および適切なサッカリル供与体を、単一のステップとして加えることができる。この反応を実行する別の様式は、連続的に各酵素および適切な供与体を加え、「単一ポット」の主旨で反応を行うものである。上で述べた各々の方法の組み合わせは、本発明の化合物を調製するのに有用である。
【０１９３】
本発明のコンジュゲートにおいては、特に、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＮ結合型グリカン、Ｓｉａ−修飾基カセットは、α−２，６またはα−２，３結合で、Ｇａｌに連結させることができる。
【０１９４】
本発明の方法はまた、組換えによって生成される不完全にグリコシル化された第ＩＸ因子ペプチドの改変を提供する。本発明の方法において、改変された糖を用いて、ペプチドを、例えば、水溶性ポリマー、治療的薬剤などと同時に、さらにグリコシル化および誘導体化できる。改変された糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチド中のアクセプターに適切に結合されるであろう残基、または望ましい特性をもつ別の糖部分である可能性がある。
【０１９５】
本発明に使用されるペプチドを改変する典型的な方法は、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレット、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、および、その中に記載された参考文献に記載されている。
【０１９６】
典型的な実施形態では、本発明は、次の部分を含むＰＥＧ化された第ＩＸ因子を製造する方法を提供する。
【化４３】
2007513190.tif 000046
式中、Ｄは、−ＯＨまたはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分である。記号Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーを表す。一般に、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。本発明の方法は、（ａ）ＰＥＧ−シアル酸供与体をもつ基質第ＩＸ因子ペプチドと、供与体のＰＥＧ−シアル酸部分を、基質第ＩＸ因子ペプチドに転移することができる酵素とを接触させることを含む。
【０１９７】
典型的なＰＥＧ−シアル酸供与体は、次式を有するものなどのヌクレオチド糖：
【化４４】
2007513190.tif 000047
および転移に適切な状態下で、第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基にＰＥＧ−シアル酸を転移する酵素である。
【０１９８】
一実施形態では、基質第ＩＸ因子ペプチドは、本発明のコンジュゲートの形成の前に宿主細胞中で発現される。典型的な宿主細胞は、哺乳類細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、植物細胞、細菌、または真菌である。
【０１９９】
本明細書で示される方法は、上のセクションで記述した各々の第ＩＸ因子コンジュゲートに適用可能である。
【０２００】
本発明の方法によって改変される第ＩＸ因子ペプチドは、合成または野生型のペプチドであってもよいし、部位特異的突然変異誘発などの当技術分野で知られた方法によって生成される、変異させたペプチドであってもよい。ペプチドのグリコシル化は、一般的に、Ｎ−結合型またはＯ−結合型である。典型的なＮ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への、改変された糖の付着である。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこうしたいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的なグリコシル化部位をもたらす。Ｏ−結合型グリコシル化は、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、またはキシロース）の、ヒドロキシアミノ酸（好ましくはセリンまたはトレオニンだが、通常でないあるいは非天然のアミノ酸、例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使用できる）のヒドロキシ側鎖への付着を指す。
【０２０１】
ペプチドまたは他の構造へのグリコシル化部位の付加は、それが、１つまたは複数のグリコシル化部位を含有するように、アミノ酸配列を変えることによって、好都合に達成される。付加はまた、（Ｏ−結合型グリコシル化部位については）−ＯＨ基に相当する１つまたは複数の種、好ましくはセリンまたはトレオニン残基の、ペプチドの配列内への組み込みによって行うことができる。付加は、変異によって、あるいはペプチドの完全な化学合成によって行うことができる。ペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルの変化を介して、特に、予め選択された塩基で、ペプチドをコードするＤＮＡを変異させて、所望のアミノ酸に翻訳されることとなるコドンが産生されるようにすることによって変えられることが好ましい。ＤＮＡ変異（１種または複数）は、当技術分野で知られた方法を使用して行われることが好ましい。
【０２０２】
典型的な実施形態では、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャッフルすることによって付加される。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングプロトコルを用いて調節できる。ＤＮＡシャッフリングは、関連する遺伝子のプールのランダム断片化、それに続くポリメラーゼ連鎖反応のようなプロセスによるフラグメントの再構築により実施される、反復的な（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）組換えおよび突然変異のプロセスである。シュテマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：１０７４７〜１０７５１（１９９４年）、シュテマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）「Ｎａｔｕｒｅ」３７０：３８９〜３９１（１９９４年）、ならびに米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８３７，４５８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、および同第５，８１１，２３８号明細書を参照のこと、
【０２０３】
グリコシル化部位を加えるあるいは除去する典型的な方法、および、グリコシル構造または下部構造を加えるあるいは除去する典型的な方法は、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレット、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、および関連する米国およびＰＣＴ出願に詳述されている。
【０２０４】
本発明はまた、第ＩＸ因子ペプチドに、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基を加えて（または除去して）、その後、改変された糖を、ペプチドの選択されたグリコシル残基の少なくとも１つに結合させる手段を利用する。こうした技術は、例えば、第ＩＸ因子ペプチド上に存在しない、あるいは所望の量で存在しない、選択されたグリコシル残基に、改変された糖を結合することが所望される場合に有用である。したがって、ペプチドに改変された糖を結びつける前に、選択されたグリコシル残基は、酵素的または化学的な結合によって、ペプチドに結合される。別の実施形態では、グリコペプチドのグリコシル化パターンは、グリコペプチドから炭水化物残留物を除去することによって、改変された糖の結合の前に変えられる。例えば、国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照のこと。例えば、シアル酸基は、ＰＥＧ修飾されたシアル酸を用いるＧｌｙｃｏＰＥＧ化の前に、第ＩＸ因子から除去して、アシアロ第ＩＸ因子を形成できる（図２Ｅ）。
【０２０５】
選択されたグリコシル残基のための典型的な付着位置には、これに限定されないが、以下が含まれる：（ａ）Ｎ−結合型グリコシル化のためのコンセンサス部位、およびＯ−結合型グリコシル化のための部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプターである末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン、およびヒスチジン、（ｄ）遊離カルボキシル基、（ｅ）システインのものなどの遊離のスルフヒドリル基、（ｆ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのものなどの芳香族の残基、または（ｈ）グルタミンのアミド基。本発明に使用される典型的な方法は、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびアプリン（Ａｐｌｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、「ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．」、２５９〜３０６ページ（１９８１年）に記載されている。
【０２０６】
ＰＥＧ修飾された糖は、結合を仲介するために、適切な酵素を使用して、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに結合される。好ましくは、改変された供与体糖（１種または複数）、酵素（１種または複数）、およびアクセプターペプチド（１種または複数）の濃度は、アクセプターが消費されるまでに、グリコシル化が進行するように選択される。後述する考察は、シアリルトランスフェラーゼについて記述されるが、通常、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。
【０２０７】
所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを使用するいくつかの方法は、知られており、本発明に通常適用可能である。典型的な方法は、例えば、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、「Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．」６５：７５３（１９９３年）、米国特許第５，３５２，６７０号明細書、同第５，３７４，５４１号明細書、同第５，５４５，５５３号明細書、および一般に所有された米国特許第６，３９９，３３６号明細書および同第６，４４０，７０３号明細書（これらを、参照により本明細書に援用する）に記載されている。
【０２０８】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用して実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用できる。２つ以上の酵素を使用する実施形態では、酵素と基質は、最初の反応混合物中で組み合わせられる、あるいは、第１の酵素的反応が、完全またはほぼ完全となった時に、第２の酵素的反応のための酵素および試薬が、反応培地に加えられることが好ましい。単一の容器内で連続して２つの酵素的反応を行うことによって、総収量は、中間の種が単離される手順よりも向上する。さらに、余分な溶媒および副産物の浄化および処分が少なくなる。
【０２０９】
好ましい実施形態では、第１および第２の酵素はそれぞれ、グリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態では、１つの酵素は、エンドグリコシダーゼである。さらなる好ましい実施形態では、本発明の改変された糖タンパク質を組み立てるために、３種以上の酵素が使用される。これらの酵素は、改変された糖のペプチドへの付加よりも前または後のいかなる点でも、ペプチド上の糖類構造を変えるために使用される。
【０２１０】
別の実施形態では、この方法は、１つまたは複数のエクソ−またはエンドグリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは、一般的に、グリコシル結合が、破断するのではなく形成されるように操作された変異体である。変異体グリカナーゼは、一般的に、活性部位の酸性アミノ酸残基の、アミノ酸残基への置換を含む。例えば、エンドグリカナーゼが、エンド−Ｈである場合、置換される活性部位残基は、一般的に位置１３０のＡｓｐ、位置１３２のＧｌｕ、またはその組み合わせとなる。アミノ酸は、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで通常置き換えられる。
【０２１１】
通常、エンドグリカナーゼ加水分解ステップの逆反応と類似の合成ステップによって、変異体酵素は、反応を触媒する。これらの実施形態では、グリコシル供与体分子（例えば所望のオリゴ−またはモノ−サッカリド構造）は、脱離基を含有し、反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への供与体分子の付加と共に進行する。例えば、脱離基は、ハロゲン（例えばフッ化物）である可能性がある。他の実施形態では、脱離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらに他の実施形態では、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は、改変される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含むことができる。
【０２１２】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを生成するために利用される各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに反応条件（温度、時間、およびｐＨ値など）によって変動する。予め選択された基質濃度および反応条件下での、所与の酵素に対する触媒量を決定するための手段は、当分野の技術者によく知られている。
【０２１３】
上のプロセスが実施される温度は、凍結温度のすぐ上から、最も感受性が高い酵素が変性する温度までの範囲であり得る。好ましい温度範囲は、約０℃から約５５℃、好ましくは、約２０℃から約３７℃である。別の典型的な実施形態では、本発明の方法の１つまたは複数の構成要素は、好熱性の酵素を使用して、高温で行われる。
【０２１４】
反応混合物を、アクセプターがグリコシル化されるのに十分な時間維持し、それによって、所望のコンジュゲートを形成させる。いくつかのコンジュゲートは、２、３時間後にしばしば検出される可能性があり、通常２４時間以内に、回収可能な量が得られる。当分野の技術者であれば、反応の速度が、いくつかの様々な因子（例えば、酵素濃度、供与体濃度、アクセプター濃度、温度、溶媒体積）に依存し、これは、選択されたシステムのために最適化されることを理解するであろう。
【０２１５】
本発明はまた、改変されたペプチドの工業規模の生成を提供する。本明細書では、工業規模は、通常、少なくとも２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも５００ｍｇ、好ましくは少なくとも１グラムの、完成した、精製されたコンジュゲートを生成する。
【０２１６】
後に続く議論では、本発明は、グリコシル化されたペプチドに、改変されたシアル酸部分を結合させることによって例示される。典型的な改変されたシアル酸は、ＰＥＧを用いて標識される。ＰＥＧ改変されたシアル酸およびグリコシル化されたペプチドの使用に関する以下の説明の焦点は、具体例を明確にするためのものであり、これらの２つのパートナーの結合に限定することを暗示するためのものではない。当分野の技術者であれば、この議論が、通常、シアル酸以外の改変されたグリコシル部分の付加に適用可能であることを理解するであろう。さらに、この議論は、他のＰＥＧ部分、治療的部分、および生体分子を含めたＰＥＧ以外の薬剤を用いる、グリコシル単位の改変に等しく適用可能である。
【０２１７】
酵素的手法は、ペプチドまたはグリコペプチド上への、ＰＥＧ化されたまたはＰＰＧ化された炭水化物の選択的な導入のために使用できる。この方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性の官能基を含有する改変された糖を利用し、また、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせられる。所望の炭水化物結合を作製するグリコシルトランスフェラーゼを選択し、改変された糖を供与体基質として利用することによって、ＰＥＧまたはＰＰＧは、ペプチド主鎖上へ、グリコペプチドの既存の糖残基上へ、あるいは、ペプチドに加えられた糖残基上へ、直接導入できる。
【０２１８】
シアリルトランスフェラーゼのためのアクセプターは、天然に存在する構造として、あるいは、組換え的に、酵素的に、あるいは化学的にそこに配置されるものとして、本発明の方法によって改変されるべきペプチド上に存在する。適切なアクセプターには、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−４糖、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβｌ，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシルアクセプター、および当分野の技術者に知られている他のアクセプターが含まれる。（パールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５３：５６１７〜５６２４（１９７８年）を参照のこと）。
【０２１９】
一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼのためのアクセプターは、グリコペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの合成に応じて改変されるべきグリコペプチド上に存在する。こうしたグリコペプチドは、グリコペプチドのグリコシル化パターンの従来の改変を含まない、主張された方法を使用して、シアル酸付加することができる。あるいは、本発明の方法は、適切なアクセプターを含まないペプチドをシアル酸付加するために使用することができ、これは最初に、当分野の技術者に知られている方法によって、アクセプターを含むようにペプチドを改変する。典型的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃ転移酵素の作用によって付加される。
【０２２０】
典型的な実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、ペプチド（例えばＧｌｃＮＡｃ）に連結される適切なアクセプターに、ガラクトース残基を付着することによって、組み立てられる。この方法は、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）および適切なガラクトシル供与体（例えばＵＤＰ−ガラクトース）を含有する反応混合物と共に、改変されるべきペプチドを保温することを含む。反応は、実質的に完了するまで進行させる、あるいは、ガラクトース残基の予め選択された量が加えられたら、反応を終結させる。選択された糖類アクセプターを組み立てる他の方法は、当分野の技術者には明らかであろう。
【０２２１】
さらに別の実施形態では、グリコペプチドが連結されたオリゴ糖を、第一に、全体または一部を「トリミングし」、シアリルトランスフェラーゼのためのアクセプター、あるいは、１つまたは複数の適切な残基を、適切なアクセプターを得るために加えることが可能な部分を暴露させる。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照のこと）は、付着反応およびトリミング反応に有用である。
【０２２２】
後に続く議論では、本発明の方法は、それに付着されるＰＥＧ部分を有する改変された糖を用いることによって例示される。議論の焦点は、具体例を明確にするためのものである。当分野の技術者であれば、この議論が、改変された糖が、治療的部分、生体分子などをもつ実施形態に等しく関連することを理解するであろう。
【０２２３】
炭水化物残基が、改変された糖の付加の前に「トリミングされる」本発明の典型的な実施形態では、高級（ｈｉｇｈ）マンノースは、第一世代の二分岐（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造にトリミング・バックされる。ＰＥＧ部分をもつ改変された糖は、「トリミング・バック」により暴露される糖残基の１つまたは複数と結合される。一実施例では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ部分に結合されたＧｌｃＮＡｃ部分を介して付加される。改変されたＧｌｃＮＡｃは、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に付着される。あるいは、改変されていないＧｌｃＮＡｃを、分枝種の末端の一方または両方に付加させることができる。
【０２２４】
別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ部分は、ガラクトース残基を有する改変された糖を介して、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に付加され、これは、末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に結合される。あるいは、改変されていないＧａｌを、一方または両方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に付加させることができる。
【０２２５】
さらなる実施例では、ＰＥＧ部分は、改変されたシアル酸を使用してＧａｌ残基上に付加される。
【０２２６】
別の典型的な実施形態では、高級マンノース構造は、そこから、二分岐構造が分岐するマンノースに「トリミング・バック」される。一実施例では、ＰＥＧ部分は、ポリマーを用いて改変されたＧｌｃＮＡｃを介して付加される。あるいは、改変されていないＧｌｃＮＡｃは、マンノース、それに続いて、付着されたＰＥＧ部分をもつＧａｌに付加される。さらに別の実施形態では、改変されていないＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基は、マンノース、それに続いて、ＰＥＧ部分を用いて改変されたシアル酸部分に、連続的に付加される。
【０２２７】
さらなる典型的な実施形態では、高級マンノースは、第１のマンノースが付着されるＧｌｃＮＡｃに「トリミング・バック」される。ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分をもつＧａｌ残基に結合される。あるいは、改変されていないＧａｌは、ＧｌｃＮＡｃに付加され、水溶性の糖を用いて改変されたシアル酸の付加がそれに続く。さらなる実施例では、末端ＧｌｃＮＡｃは、Ｇａｌと結合され、ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分をもつ改変されたフコースを用いてその後フコシル化される。
【０２２８】
高級マンノースはまた、ペプチドのＡｓｎと付着された第１のＧｌｃＮＡｃにトリミング・バックすることができる。一実施例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーをもつＧｌｃＮＡｃと結合される。別の実施例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーをもつＧａｌを用いて改変される。さらなる実施形態では、ＧｌｃＮＡｃは、Ｇａｌを用いて改変され、ＰＥＧ部分を用いて改変されたシアル酸のＧａｌへの結合がそれに続く。
【０２２９】
他の典型的な実施形態は、一般に所有される米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号明細書、同第２００４００６３９１１号明細書、同第２００４０１３７５５７号明細書、米国特許出願第１０／３６９，９７９号明細書、同第１０／４１０，９１３号明細書、同第１０／３６０，７７０号明細書、同第１０／４１０，９４５号明細書、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号明細書（これらをそれぞれ、参照により本明細書に援用する）に記載されている。
【０２３０】
上で述べた実施例は、本明細書で記述される方法の能力の具体例を提供する。本明細書で述べた方法を使用すれば、実質的に任意の所望の構造の炭水化物残基を「トリミング・バック」および構築（ｂｕｉｌｄ  ｕｐ）することが可能である。改変された糖は、上で述べた通りに炭水化物部分の末端に加えてもよいし、ペプチド中心と炭水化物の末端との間の中間であってもよい。
【０２３１】
典型的な実施形態では、既存のシアル酸は、シアリダーゼを使用して第ＩＸ因子グリコペプチドから除去され、それによって、根底にあるガラクトシル残基のすべてまたは大部分のマスクを取る。あるいは、ペプチドまたはグリコペプチドは、ガラクトース残基、またはガラクトース単位で終結するオリゴ糖残基で標識される。ガラクトース残基の暴露または付加の後、改変されたシアル酸を付加するために、適切なシアリルトランスフェラーゼが使用される。この手法は、スキーム１に概要を述べる。
【化４５】
2007513190.tif 000048
【０２３２】
スキーム２に概要が述べられるさらなる手法では、マスクされた反応性の官能基が、シアル酸上に存在する。マスクされた反応性の基は、改変されたシアル酸を第ＩＸ因子に付着するために使用される条件によって影響を受けないことが好ましい。ペプチドへの改変されたシアル酸の共有結合の後、マスクを除去し、ペプチドをＰＥＧなどの薬剤と結合させる。この薬剤は、改変された糖残基上の、マスクを取られた反応性の基との反応によって、特異的な方式でペプチドと結合させる。
【化４６】
2007513190.tif 000049
【０２３３】
本明細書で述べる任意の改変された糖は、グリコペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に応じて、その適切なグリコシルトランスフェラーゼと共に使用できる（表１）。上記の通り、ＰＥＧ化された構造の導入のために必要とされるグリコペプチドの末端糖は、発現中に天然に導入されてもよいし、適切なグリコシダーゼ（１種または複数）、グリコシルトランスフェラーゼ（１種または複数）、または、グリコシダーゼ（１種または複数）およびグリコシルトランスフェラーゼ（１種または複数）の混合物を使用して、発現の後に生成してもよい。
【０２３４】
【表３】
2007513190.tif 000050
【０２３５】
さらなる典型的な実施形態では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧを、牛乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させ、それによって、適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造に、改変されたガラクトースを転移させる。グリコペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳類、昆虫、植物または真菌としてのこうした発現システムにおいて起こる可能性があるように、発現中に生成される可能性があるが、必要に応じて、シアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼを用いてグリコペプチドを処理することによって生成することもできる。
【０２３６】
別の典型的な実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素（例えばＧＮＴ１−５）は、グリコペプチド上の末端マンノース残基に、ＰＥＧ化されたＧｌｃＮを転移するために利用される。さらなる典型的な実施形態では、Ｎ−結合型および／またはＯ−結合型のグリカン構造は、グリコペプチドから酵素的に除去され、改変された糖とその後結合されるアミノ酸または末端グリコシル残基が暴露される。例えば、エンドグリカナーゼを使用して、グリコペプチドのＮ結合型構造を除去して、グリコペプチド上のＧｌｃＮＡｃ−連結−Ａｓｎとしての末端ＧｌｃＮＡｃを暴露させる。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、暴露されたＧｌｃＮＡｃ上に、ＰＥＧ−ガラクトース官能基を導入する。
【０２３７】
別の実施形態では、改変された糖は、ペプチド主鎖に糖残基を転移することが知られているグリコシルトランスフェラーゼを使用して、ペプチド主鎖に直接的に付加される。この典型的な実施形態は、スキーム３に記述される。本発明を実施するのに有用な典型的なグリコシルトランスフェラーゼには、これに限定されないが、ＧａｌＮＡｃ転移酵素（ＧａｌＮＡｃ  Ｔ１〜１４）、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが含まれる。この手法の使用は、いずれかの炭水化物を欠くペプチド上への、あるいは、既存のグリコペプチド上への、改変された糖の直接的付加も可能にする。いずれの場合においても、改変された糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって定義される通りの、ペプチド主鎖上の特異的な位置で起こるが、化学的な方法を使用するタンパク質のペプチド主鎖の改変中に起こるようなランダムな方式では起こらない。一連の薬剤は、ポリペプチド鎖中に適切なアミノ酸配列を操作することによって、グリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列を欠くタンパク質またはグリコペプチドに導入できる。
【化４７】
2007513190.tif 000051
【０２３８】
上で述べた各々の典型的な実施形態では、改変された糖のペプチドへの結合の後、１つまたは複数のさらなる化学的または酵素的改変ステップを利用できる。典型的な実施形態では、酵素（例えばフコシルトランスフェラーゼ）は、ペプチドに付着された、末端が改変された糖上に、グリコシル単位（例えば、フコース）を追加するために使用される。別の実施例では、酵素的反応は、改変された糖が結合し損なった「キャップ」部位に利用される。あるいは、化学的な反応は、結合された改変された糖の構造を変えるために利用される。例えば、結合された改変された糖を、改変された糖が付着されるペプチド成分との結合を安定させるまたは不安定にする薬剤と反応させる。別の実施例では、改変された糖の成分を、ペプチドへのその結合の後に脱保護する。当分野の技術者であれば、改変された糖がペプチドに結合された後の段階で、本発明の方法に有用である一連の酵素的および化学的な手順が存在することを理解するであろう。改変された糖−ペプチドコンジュゲートのさらなる仕上げは、本発明の範囲内である。
【０２３９】
酵素
アシルが連結されたコンジュゲートを形成することにおいて、上で述べた酵素に加えて、コンジュゲートおよび出発基質（例えばペプチド、脂質）のグリコシル化パターンを、精密なものにする、トリミング・バックする、あるいは、他の酵素を利用する方法によって改変することができる。アクセプターに糖供与体を転移する酵素を使用して、ペプチドおよび脂質を再構築する方法は、２００３年４月１７日に公開された、デフリー（ＤｅＦｒｅｅｓ）、国際公開第０３／０３１４６４  Ａ２号パンフレットに非常に詳細に述べられている。本発明の方法に使用される選択された酵素の概要は、以下で述べる。
【０２４０】
グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、活性化糖（供与体ＮＤＰ−またはＮＭＰ−糖）の、タンパク質、グリコペプチド、脂質、または糖脂質への付加、あるいは、成長中の（ｇｒｏｗｉｎｇ）オリゴ糖の非還元末端への付加を、段階的様式で触媒する。Ｎ−結合型グリコペプチドは、一括した転移、それに続く中心のトリミングにおける、転移酵素および脂質が連結されたオリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９を介して合成される。この場合、「中心」糖類の性質は、その後の付着とはいくらか異なる。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当技術分野で知られている。
【０２４１】
本発明に使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、それが、改変された糖を糖供与体として利用する可能性がある限り、いずれのものでもよい。こうした酵素の例には、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどの、ルロアール経路グリコシルトランスフェラーゼ（Ｌｅｌｏｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が含まれる。
【０２４２】
グリコシルトランスフェラーゼ反応に関与する酵素的な糖類合成のために、グリコシルトランスフェラーゼは、クローン化する、あるいはいずれの供給源からも単離できる。そのポリヌクレオチド配列であるものとしての、多くのクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼが知られている。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列、およびグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（そこからアミノ酸配列を推測できる）、はまた、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ他を含めて、様々な公的に利用可能なデータベースに見られる。
【０２４３】
本発明の方法に用いることができるグリコシルトランスフェラーゼには、これに限定されないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが含まれる。適切なグリコシルトランスフェラーゼには、真核生物、ならびに原核生物から得られるものが含まれる。
【０２４４】
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、化学的な合成によって、適切な細胞または細胞系培養物からｍＲＮＡの逆転写産物をスクリーニングすることによって、適切な細胞からゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、あるいは、これらの手順の組み合わせによって得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から産生されるオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施できる。プローブは、既知の手順に従って、蛍光基、放射性原子または化学発光基などの検出可能な基を用いて標識することができ、従来のハイブリダイゼーション検定法に使用できる。変形例では、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を使用することによって、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から産生されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、得ることができる。マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，１９５号明細書、およびマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照のこと。
【０２４５】
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて形質転換された宿主細胞中で合成できる。ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅するために、かつ／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現するために使用される。発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列が、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を実施できる適切な制御配列に作動可能に連結される、複製可能なＤＮＡ構築物である。こうした制御配列の必要性は、選択される宿主、および選択される形質転換方法に応じて変化することとなる。通常、制御配列には、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、および、転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要なものは、通常、複製の開始点によって与えられる、宿主中で複製する能力、ならびに、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子だけである。
【０２４６】
典型的な実施形態では、本発明は、原核生物の酵素を利用する。こうしたグリコシルトランスフェラーゼには、多くのグラム陰性菌により産生される、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が含まれる（プレストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ）ら、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２３（３）：１３９〜１８０（１９９６年））。こうした酵素には、これに限定されないが、大腸菌およびサルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの種のｒｆａオペロンのタンパク質（β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼが含まれる）（例えば、ＥＭＢＬ受託番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を参照のこと）；ＥＭＢＬ受託番号Ｓ５６３６１（Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２５７４０（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２７１２９（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１９８１７（Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）））、およびβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ０００３９（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が含まれる。アミノ酸配列が知られている他のグリコシルトランスフェラーゼには、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エルシニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、マイコバクテリウムレプロサム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｒｈｌオペロンなどの生物において特徴づけられる、ｒｆａＢなどのオペロンによってコードされるものが含まれる。
【０２４７】
本発明の使用に適したものはまた、粘膜の病原体である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬＯＳで同定されている、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰｋ血液型三糖配列（Ｐｋ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含有する構造の産生に関与するグリコシルトランスフェラーゼである（スコルテン（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ）ら、「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」４１：２３６〜２４３（１９９４年））。これらの構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの遺伝子は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）免疫型Ｌ３およびＬ１（ジェニングズ（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」１８：７２９〜７４０（１９９５年））、および淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）変異体Ｆ６２（ゴットシリック（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）、「Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」１８０：２１８１〜２１９０（１９９４年））から同定されている。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）では、３つの遺伝子（ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢ、およびｌｇＥ）からなる座位は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖における糖の最後の３つの付加のために必要とされるグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（ワカルシュック（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ）ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７１：１９１６６〜７３（１９９６年））。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素的活性が実証され、その提案されたグリコシルトランスフェラーゼ機能についての第１の直接的証拠が提供された（ワカルシュック（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ）ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７１（４５）：２８２７１〜２７６（１９９６年））。淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）では、２つのさらなる遺伝子、すなわち、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位置にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを付加するｌｇｔＤと、切断されたＬＯＳのラクトース要素に末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加するｌｇｔＣが存在し、それによってＰｋ血液型抗原構造がもたらされる（ゴットシリック（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）（１９９４年）、上記）。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）では、別々の免疫型Ｌ１がまた、ｐｋ血液型抗原を発現し、ｌｇｔＣ遺伝子を運ぶことが示された（ジェニングズ（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、（１９９５年）上記）。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）グリコシルトランスフェラーゼおよび関連する遺伝子はまた、米国特許第５，５４５，５５３号明細書（ゴットシリック（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ））に記載されている。ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）由来のα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼのための遺伝子もまた、特徴づけられている（���ーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７２：２１３４９〜２１３５６（１９９７年））。本発明に使用されるものはまた、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシルトランスフェラーゼである（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０２４８】
フコシルトランスフェラーゼ
ある実施形態では、本発明の方法に使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当分野の技術者に知られている。典型的なフコシルトランスフェラーゼには、Ｌ−フコースを、ＧＤＰ−フコースから、アクセプター糖のヒドロキシ位置に転移する酵素が含まれる。アクセプターに非ヌクレオチド糖を転移するフコシルトランスフェラーゼもまた、本発明に使用されるものである。
【０２４９】
ある実施形態では、アクセプター糖は、例えば、オリゴ糖グリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧＩｃＮＡｃβ−基におけるＧｌｃＮＡｃである。この反応のための適切なフコシルトランスフェラーゼには、最初にヒト母乳から特徴づけられた、Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（パルシック（Ｐａｌｃｉｃ）ら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．」１９０：１〜１１（１９８９年）；プリーエール（Ｐｒｉｅｅｌｓ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５６：１０４５６〜１０４６３（１９８１年）；およびヌニェス（Ｎｕｎｅｚ）ら、「Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．」５９：２０８６〜２０９５（１９８１年）を参照のこと）、ならびに、ヒト血清中に見られるＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）が含まれる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）、シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼもまた、特徴づけられている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え型の形もまた、特徴づけられている（デュマ（Ｄｕｍａｓ）ら、「Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ」１：４２５〜４２８（１９９１年）、およびクコフスカ−ラタロ（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ）ら、「Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」４：１２８８〜１３０３（１９９０年））。他の典型的なフコシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が含まれる。酵素的フコシル化は、モリコーネ（Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ）ら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１９１：１６９〜１７６（１９９０年）または米国特許第５，３７４，６５５号明細書に記載されている方法によって実施できる。フコシルトランスフェラーゼを産生するために使用される細胞には、また、ＧＤＰ−フコースを合成する酵素的システムが含まれることとなる。
【０２５０】
ガラクトシルトランスフェラーゼ
別の群の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。典型的なガラクトシルトランスフェラーゼには、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、ダブコフスキー（Ｄａｂｋｏｗｓｋｉ）ら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．」２５：２９２１（１９９３年）およびヤマモトら「Ｎａｔｕｒｅ」３４５：２２９〜２３３（１９９０年）を参照のこと）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９、ジョジアッセ（Ｊｏｚｉａｓｓｅ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６４：１４２９０〜１４２９７（１９８９年））、ネズミ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５、ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８６：８２２７〜８２３１（１９８９年））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２、ストラハン（Ｓｔｒａｈａｎ）ら、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」４１：１０１〜１０５（１９９５年））が含まれる。別の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するものである（ＥＣ  ２．４．１．３７、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：１１４６〜１１５１（１９９０年）（ヒト））。さらに典型的なガラクトシルトランスフェラーゼは、コア（ｃｏｒｅ）Ｇａｌ−Ｔ１である。
【０２５１】
本発明の方法での使用に適したものはまた、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには、例えば、ＥＣ  ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃ合成酵素）およびＥＣ  ２．４．１．２２（ラクトース合成酵素）（ウシ（ディアゴスターロ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏ）ら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１８３：２１１〜２１７（１９８９年））、ヒト（マスリ（Ｍａｓｒｉ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７〜６６３（１９８８年））、ネズミ（ナカザワ（Ｎａｋａｚａｗａ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１０４：１６５〜１６８（１９８８年））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８、およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４５、シュタール（Ｓｔａｈｌ）ら、「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．」３８：２３４〜２４２（１９９４年））が含まれる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来、チャペル（Ｃｈａｐｅｌｌ）ら、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ」５：５１９〜５２８（１９９４年））が含まれる。
【０２５２】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組換え細胞および反応混合物に有用である、別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換え型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞はまた、ＣＭＰ−シアル酸も産生することとなり、これは、シアリルトランスフェラーゼのためのシアル酸供与体である。本発明で使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例には、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えばラットまたはヒトＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩが含まれる（本明細書で使用されるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、ツジ（Ｔｓｕｊｉ）ら、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６年）で説明される通りである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）と呼ばれる典型的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖類またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌにシアル酸を転移する。ファンデンアイジンデン（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５６：３１５９（１９８１年））、ウェインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５７：１３８４５（１９８２年）、およびウェン（Ｗｅｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６７：２１０１１（１９９２年）を参照のこと。別の典型的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、二糖類またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌにシアル酸を転移する。リアリック（Ｒｅａｒｉｃｋ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５４：４４４４（１９７９年））、およびギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６７：２１００４（１９９２年）を参照のこと。さらに典型的な酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼが含まれる。（クロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）ら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２１９：３７５〜３８１（１９９４年）を参照のこと）。
【０２５３】
好ましくは、グリコペプチドの炭水化物のグリコシル化については、シアリルトランスフェラーゼは、配列Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−、すなわち、完全にシアル酸付加された炭水化物構造上の末端シアル酸の基礎をなしている最も一般的な最後から２番目の配列にシアル酸を転移することが可能である（表２を参照のこと）。
【０２５４】
【表４】
2007513190.tif 000052
【０２５５】
本発明に使用される他のシアリルトランスフェラーゼには、図４の表に記述されるものが含まれる。シアリルトランスフェラーゼは、ＰＥＧ化されたシアル酸供与体種から、ペプチドのＮ結合型グリコシル残基（図２Ｃ）または第ＩＸ因子のＯ−結合型グリコシル残基（図２Ｄ）に、ＰＥＧ化されたシアル酸部分を転移するために使用できる。
【０２５６】
主張された方法に有用であるシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩであり、これは、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）とも呼ばれる。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（ウェン（Ｗｅｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６７：２１０１１（１９９２年）、ファンデンアイジンデン（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５６：３１５９（１９９１年）を参照のこと）、グリコペプチドにおけるアスパラギン連結オリゴ糖のシアリル化を担う。シアル酸は、２つの糖類の間のα−結合の形成を伴ってＧａｌに連結される。糖類間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間である。この特定の酵素は、ラット肝臓（ウェインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５７：１３８４５（１９８２年））、ヒトｃＤＮＡ（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら（１９９３年）「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６８：２２７８２〜２２７８７、キタガワおよびパールソン（Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ）（１９９４年）「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６９：１３９４〜１４０１）、ならびにおよびゲノム（キタガワ（Ｋｉｔａｇａｗａ）ら（１９９６年）「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７１：９３１〜９３８）から単離できる。組換え発現によって、この酵素の産生を容易にするＤＮＡ配列は、知られている。好ましい実施形態では、主張されたシアリル化方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０２５７】
本発明に使用される他の典型的なシアリルトランスフェラーゼには、α（２，３）を含めて、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）から単離されるものが含まれる。例えば、国際公開第９９／４９０５１号パンフレットを参照のこと。
【０２５８】
表２に列挙されたシアリルトランスフェラーゼの他のものはまた、商業的に重要なグリコペプチドのシアリル化のための、経済的かつ効率的な大規模プロセスに有用である。これらの他の酵素の有用性を発見する簡単な試験として、様々な量（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）の各酵素を、（１〜１０ｍｇ／ｍｌの）アシアロ−α１  ＡＧＰと反応させて、当該のシアリルトランスフェラーゼの、グリコペプチドをシアル酸付加する能力を、ウシＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩのいずれか、または両方のシアリルトランスフェラーゼに対して比較した。あるいは、他のグリコペプチドまたはグリコペプチド、またはペプチド主鎖から酵素的に放出されたＮ結合型オリゴ糖を、この評価のためのアシアロ−α１  ＡＧＰの代わりに使用できる。ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉよりも効率的に、グリコペプチドのＮ−結合型オリゴ糖をシアル酸付加する能力をもつシアリルトランスフェラーゼは、ペプチドシアリル化のための実用的な大規模プロセスに有用である。
【０２５９】
ＧａｌＮＡｃ転移酵素
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、特に、ペプチドのＯ−結合型グリコシル化部位のアミノ酸にＧａｌＮＡｃ部分を結合するために、本発明を実施するのに使用される。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼには、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ」２６７：１２０８２〜１２０８９（１９９２年）、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．」２６９：１５１６２（１９９４年））、およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ホウマ（Ｈｏｍａ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６８：１２６０９（１９９３年）が含まれるが、これに限定されない。
【０２６０】
遺伝子工学によってクローン化された遺伝子からの酵素ＧａｌＮＡｃ  ＴＩ−ＸＸなどのタンパク質の産生は、よく知られている。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号明細書を参照のこと。ある方法は、十分なサンプルのコレクションを含み、その後、酵素のアミノ酸配列は、Ｎ末端配列決定により決定される。この情報は、昆虫細胞系Ｓｆ９において、発現されると、完全に活性な酵素が合成される、全長の（膜結合型）転移酵素をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、その後使用される。酵素のアクセプター特異性は、その後、１６の異なるタンパク質における既知のグリコシル化部位の周囲のアミノ酸の半定量的な分析、それに続く、合成ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏのグリコシル化研究を使用して決定される。この研究は、ある種のアミノ酸残基が、グリコシル化されたペプチドセグメントに過度に多いこと、また、グリコシル化されたセリンおよびトレオニン残基の周囲の特定の位置における残基は、アクセプター効率に対して、他のアミノ酸部分よりも著しい影響を与える可能性があることを実証した。
【０２６１】
細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼ
別の実施形態では、本発明の方法に利用される酵素は、細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性のグリコシルトランスフェラーゼが知られている（例えば、米国特許第５，０３２，５１９号明細書を参照のこと）が、グリコシルトランスフェラーゼは、細胞に結合する場合、通常膜結合型の形である。これまで研究された多くの膜結合酵素は、内在性のタンパク質であると考えられる、すなわち、それらは、超音波処理によって、膜から放出されず、可溶化のための界面活性剤を必要とする。表面（ｓｕｒｆａｃｅ）グリコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物および無脊椎細胞の表面上で同定されており、これらの表面トランスフェラーゼは、生理的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）グリコシルトランスフェラーゼのより認識された機能は、細胞間認識についてのものである。（ロス（Ｒｏｔｈ）、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ  ｔｏ  ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ」、１９９０年）。
【０２６２】
この方法は、細胞によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼを変化させるために開発された。例えば、ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８６：８２２７〜８２３１（１９８９年）は、細胞表面のオリゴ糖構造およびその同族のグリコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化されたｃＤＮＡ配列を単離するための遺伝的アプローチを報告している。ＵＤＰ−ガラクトースを発現することが知られているネズミ細胞系から単離されたｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡライブラリ：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを、ＣＯＳ−１細胞に形質移入させた。形質移入させた細胞を、その後、培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性について検定した。
【０２６３】
フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８９：２７１３〜２７１７（１９９２年））は、大腸菌の外面にβ−ラクタマーゼを固定する方法を開示している。（ｉ）外側の膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外側の膜タンパク質の膜貫通セクション、および（ｉｉｉ）完全な成熟したβ−ラクタマーゼ配列からなる三者の融合物が産生され、活性な表面結合β−ラクタマーゼ分子がもたらされる。しかし、フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）法は、原核細胞系のみに限定され、また、著者によって認識されている通り、適切な機能化のための完全な三者の融合を必要とする。
【０２６４】
スルホトランスフェラーゼ
本発明はまた、例えば、硫酸化された多糖類（ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラゲナン（ｃａｒｒａｇｅｎｅｎ）、および関連化合物など）を含めて、硫酸化された分子を含むペプチドを産生するための方法を提供する。適切なスルホトランスフェラーゼには、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（フクタ（Ｆｕｋｕｔａ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７０：１８５７５〜１８５８０（１９９５年））によって記載されているニワトリｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら、「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」２６：２３９〜２４１（１９９５年）、ＵＬ１８９１８）、およびグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（オレリャナ（Ｏｒｅｌｌａｎａ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６９：２２７０〜２２７６（１９９４年）、およびエリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら、「Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６９：１０４３８〜１０４４３（１９９４年）に記載されているネズミｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２３０４に記載されているヒトｃＤＮＡ）が含まれる
【０２６５】
グリコシダーゼ
本発明はまた、野生型および変異体グリコシダーゼの使用を包含する。変異体β−ガラクトシダーゼ酵素は、ガラクトシルアクセプター分子へのα−フッ化糖の結合を介して、二糖類の形成を触媒することが実証されている。（ウィザーズ（Ｗｉｔｈｅｒｓ）、米国特許第６，２８４，４９４号明細書、２００１年９月４日に発行）。本発明に使用される他のグリコシダーゼには、例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ／シアリダーゼが含まれる。典型的な実施形態では、シアリダーゼは、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化する前に第ＩＸ因子のＮ−グリカン（図２Ａ）からシアル酸を除去するために使用される。本発明はまた、シアル酸の従来の除去を必要としない方法を提供する。したがって、改変されたシアル酸部分およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアル酸交換反応を組み込む方法は、本発明に有用である。
【０２６６】
固定化された酵素
本発明はまた、固体および／または可溶性の支持体上に固定された酵素の使用を提供する。典型的な実施形態では、本発明の方法に従う完全なグリコシルリンカーを介してＰＥＧに結合されるグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧ−リンカー−酵素コンジュゲートは、固体支持体に任意選択で付着される。本発明の方法における固体に支持された酵素の使用は、反応混合物の後処理および反応産物の精製を簡単にし、さらに、酵素の容易な回収を可能にする。グリコシルトランスフェラーゼコンジュゲートは、本発明の方法に利用される。酵素と支持体の他の組み合わせは、当分野の技術者には明らかであろう。
【０２６７】
融合タンパク質
他の典型的な実施形態では、本発明の方法は、所望のグリコペプチドコンジュゲートの合成に関与する、２種以上の酵素的活性を有する融合タンパク質を利用する。例えば、融合ポリペプチドは、補助酵素の触媒的に活性なドメインに連結されるグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインからなる可能性がある。補助酵素触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖の形成におけるステップを触媒する、あるいは、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応を触媒する可能性がある。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）連結できる。得られた融合タンパク質は、その後、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、また、アクセプター分子への糖部分の転移も触媒できる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列に連結される２種以上の循環酵素（ｃｙｃｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ）であり得る。他の実施形態では、融合タンパク質は、２つまたはそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼの、触媒的に活性なドメインを含む。例えば、５，６４１，６６８を参照のこと。本発明の改変されたグリコペプチドは、様々な適切な融合タンパク質を利用して、容易に設計および製造できる（１９９９年６月２４日に国際公開第９９／３１２２４号パンフレットとして公開された、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０号明細書を参照のこと）。
【０２６８】
改変された糖の調製
一般に、糖部分または糖部分−リンカーカセットと、ＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーカセット基は、反応性の基を用いることにより共に連結され、これは、連結プロセスによって、新規の有機官能基または反応性の種に一般的に変換される。糖反応性の官能基（１種または複数）は、糖部分上のいずれか位置に位置される。本発明を実施するのに有用な反応の反応性の基およびクラスは、通常、生体コンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）化学の分野でよく知られているものである。反応性の糖部分と共に利用可能な、現在好都合なクラスの反応は、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これには、求核置換（例えばハロゲン化アシルを用いるアミンおよびアルコールの反応、活性なエステル）、求電子置換（例えばエナミン反応）、および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加が含まれるが、これに限定されるものではない（例えばマイケル反応（Ｍｉｃｈａｅｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ディールス−アルダー付加（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  ａｄｄｉｔｉｏｎ））。これらの反応および他の有用な反応は、例えば、マーチ（Ｍａｒｃｈ）、「ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８５年；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、米国化学学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９８２年に述べられている。
【０２６９】
糖の中心または修飾基からぶら下がる有用な反応性の官能基には、これに限定されないが、以下が含まれる：
（ａ）これに限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステルを含めて、カルボキシル基およびその様々な誘導体；
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに転換させることが可能な水酸基；
（ｃ）ハロアルキル基（ただし、ハライドは、後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置き換えることが可能であり、それによって、ハロゲン原子の官能基での新規の基の共有結合がもたらされる）；
（ｄ）ディールス−アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）反応に関与することが可能なジエノフィル基（例えばマレイミド基など）；
（ｅ）アルデヒドまたはケトン基（ただし、その後の誘導体化が、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、またはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介する、あるいはグリニャール（Ｇｒｉｇｎａｒｄ）付加またはアルキルリチウム付加としてのこうした機構を介することが可能である）；
（ｆ）例えば、スルフォンアミドを形成するための、アミンを用いるその後の反応のためのハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）例えば、ジスルフィドに転換させる、あるいはハロゲン化アシルと反応させることが可能なチオール基；
（ｈ）アシル化、アルキル化、または酸化させることが可能なアミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加（Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）などを受けることが可能なアルケン；および
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応させることが可能なエポキシド。
【０２７０】
反応性の官能基は、これらが、反応性の糖中心または修飾基を組み立てるのに必要な反応に関与しない、あるいは、こうした反応を妨げないように選択できる。あるいは、反応性の官能基は、保護基の存在によって、反応への関与から防護できる。当業者であれば、それが、選択される一連の反応条件を妨げないように、特定の官能基を保護する方法を理解するであろう。有用な保護基の例については、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１年を参照のこと。
【０２７１】
後に続く議論では、本発明を実施するのに有用である改変された糖のいくつかの具体例が記述される。典型的な実施形態では、シアル酸誘導体は、それに修飾基が付着される糖中心として利用される。シアル酸誘導体に関する議論の焦点は、具体例の明瞭性のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。当分野の技術者であれば、様々な他の糖部分を、一例としてシアル酸を用いて記述するのと類似の方式で活性化および誘導体化できることを理解するであろう。例えば、多数の方法は、当分野で認識された方法によって容易に改変される、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびフコース（数例の糖基質を挙げると）を改変するために利用可能である。エルハラビィ（Ｅｌｈａｌａｂｉ）ら「Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」６：９３（１９９９年）；およびシェーファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」６５：２４（２０００年）を参照のこと。
【０２７２】
典型的な実施形態では、本発明の方法により改変されるペプチドは、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）中で、あるいはトランスジェニック動物中で産生されるグリコペプチドであり、したがって、不完全にシアル酸付加されるＮ−連結型および／またはＯ−連結型オリゴ糖鎖を含有する。シアル酸を欠き、末端ガラクトース残留物を含有しているグリコペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化することができる、ＰＰＧ化することができる、あるいは、改変されたシアル酸を用いて別の方法で改変することができる。
【０２７３】
スキーム４では、アミノグリコシド１は、保護されたアミノ酸（例えばグリシン）誘導体の、活性なエステルを用いて処理され、糖アミン残基を、相当する防護されたアミノ酸アミド付加物に転換する。この付加物を、アルドラーゼで処理して、α−ヒドロキシカルボン酸エステル２を形成する。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡシンセターゼの作用によって、相当するＣＭＰ誘導体に転換され、ＣＭＰ誘導体の触媒水素化がそれに続き、化合物３が生成される。グリシン付加物の形成を介して導入されるアミンを、活性化されたＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えばＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と化合物３を反応させることによって、ＰＥＧ付着の位置として利用し、それぞれ、４または５などの種を生成させる。
【化４８】
2007513190.tif 000053
【０２７４】
表３は、ＰＥＧ部分を用いて誘導体化される糖一リン酸の代表例を記述する。表３のある種の化合物は、スキーム４の方法によって調製される。他の誘導体は、当分野で認識された方法によって調製される。例えば、ケップラー（Ｋｅｐｐｌｅｒ）ら、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」１１：１１Ｒ（２００１年）；およびチャータ（Ｃｈａｒｔｅｒ）ら、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」１０：１０４９（２０００年）を参照のこと。他のアミン反応性のＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は、商業的に入手可能である、あるいは、これらは、当分野の技術者に容易に利用可能な方法によって調製できる。
【０２７５】
【表５】
2007513190.tif 000054
【０２７６】
本発明を実施するのに使用される改変された糖リン酸は、上で述べた位置だけでなく、他の位置で置換できる。シアル酸の目下のところ好ましい置換は、下の式に記述される：
【化４９】
2007513190.tif 000055
式中、Ｘは、好ましくは−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ２−、および−Ｎ（Ｒ）２から選択される連結基であり、上式で、各Ｒは、Ｒ１〜Ｒ５から独立して選択されるメンバーである。記号Ｙ、Ｚ、Ａ、およびＢは、それぞれ、Ｘの識別特性について上で述べた群から選択される基を表す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは、それぞれ独立して選択され、したがって、これらは同じであっても異なってもよい。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、Ｈ、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子、または他の部分を表す。あるいは、これらの記号は、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子、または他の部分に結合されるリンカーを表す。
【０２７７】
本明細書で開示するコンジュゲートに付着される典型的な部分には、ＰＥＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリールＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療的部分、診断的部分、マンノース−６−リン酸、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−リン酸、シアリルルイス（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ）Ｘ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、分岐（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴ糖、ペプチドなどが含まれるが、これに限定されない。糖類部分に様々な修飾基を結合する方法は、当分野の技術者に容易に利用可能である（「ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｊ．ミルトンハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ）編、プレナム出版社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．）、１９９２年；「ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｊ．ミルトンハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ）編、ＡＣＳシンポジウムシリーズ（ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ）Ｎｏ．６８０、米国化学学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９９７年；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびダン（Ｄｕｎｎ）ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ」、ＡＣＳシンポジウムシリーズ（ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ）第４６９巻、米国化学学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９９１年）。
【０２７８】
リンカー基（架橋基）
本発明の方法で使用するための改変された糖の調製には、糖残基へのＰＥＧ部分の付着、および、好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼのための基質である安定な付加物の形成が含まれる。したがって、リンカー（例えば、ＰＥＧと糖を結合させるための架橋剤を用いる、ＰＥＧと糖部分の反応によって形成されるもの）を使用することが、しばしば好ましい。炭水化物部分に修飾基を付着するために使用できる典型的な二官能性化合物には、これに限定されないが、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが含まれる。他の分子に炭水化物を連結するための一般的な手法は、文献内で知られている。例えば、リー（Ｌｅｅ）ら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２８：１８５６（１９８９年）；バティア（Ｂｈａｔｉａ）ら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１７８：４０８（１９８９年）；ヤンダ（Ｊａｎｄａ）ら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１１２：８８８６（１９９０年）；およびベドナルスキー（Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ）ら、国際公開第９２／１８１３５号パンフレットを参照のこと。後に続く議論では、反応性の基は、新生の改変された糖の糖部分上で害のないもの（ｂｅｎｉｇｎ）として処理される。議論の焦点は、具体例を明確にするためのものである。当分野の技術者であれば、この議論が、同様に修飾基上の反応性の基にも関連することを理解するであろう。
【０２７９】
分子内の化学的な架橋を用いて、改変された糖の成分を改変するために、様々な試薬が使用される（架橋試薬および架橋手順の総説のために、以下を参照のこと：ウォルド，Ｆ．（Ｗｏｌｄ，Ｆ．）、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｙｎｏｌ．」２５：６２３〜６５１、１９７２年；ウェータル，Ｈ．Ｈ．（Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．）およびクーニー，Ｄ．Ａ．（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．）「ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ．」（ホルセンベルク（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ）およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）編）３９５〜４４２ページ、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８１年；ジ，Ｔ．Ｈ．（Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．）、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」９１：５８０〜６０９、１９８３年；マッソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）ら、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．」１７：１６７〜１８３、１９９３年（これらをすべて、参照により本明細書に援用する）。好ましい架橋試薬は、様々な、ゼロレングス（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性架橋試薬から得られる。ゼロレングス架橋試薬は、外部材料の導入を伴わない、２つの内因性の化学的な基の直接的結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリに属している。別の例は、カルボキシル基と第１のアミノ基の縮合を誘発し、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワードの（Ｗｏｏｄｗａｒｄ’ｓ）試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホン酸）、およびカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．２．１３）も、ゼロレングス架橋試薬として使用できる。この酵素は、通常、第１のアミノ基を基質として用いる、タンパク質が結合されたグルタミニル残基のカルボキサミド基でのアシル転移反応を触媒する。それぞれ、好ましいホモ−およびヘテロ−二官能性試薬は、２つの同一の部位または２つの異なる部位を含有し、これらは、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または、非特異的な基と反応性であり得る。
【０２８０】
第ＩＸ因子コンジュゲートの精製
上のプロセスにより産生される産物は、精製せずに使用できる。しかし、産物を回収することが、通常好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過などのグリコシル化された糖類の回収のための標準の、よく知られた技術を使用できる。膜濾過を使用する、より好ましくは逆浸透圧膜、または、以下で述べる、また、本明細書で引用される文献に述べられるような、回収のための１つまたは複数のカラムクロマトグラフィー技術を利用することが好ましい。例えば、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去するために、膜が約３０００から約１０，０００の分子量分画を有する膜濾過を使用できる。その後、塩を除去するかつ／または産物糖類を精製するために、その後ナノ濾過または逆浸透法を使用できる。（例えば、国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照のこと）。ナノフィルター膜は、一価の塩は通過させるが、使用される膜に応じて約１００〜約２，０００ダルトンよりも大きな多価の塩および荷電してない溶質は保持する逆浸透膜のクラスである。したがって、典型的な用途では、本発明の方法により調製される糖類は膜に保持され、不純な塩は通過することとなる。
【０２８１】
第１のステップとして、改変された糖タンパク質が細胞内に産生される場合、微粒子片（宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれか）は、例えば、遠心分離または限外濾過により除去され、任意選択で、タンパク質は、商業的に入手可能なタンパク質濃度フィルタを用いて濃縮することができ、それに続いて、以下から選択される１つまたは複数のステップによって、他の不純物からポリペプチド変種を分離する：免疫親和性クロマトグラフィー、（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）上、またはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含有するマトリックス上での）イオン交換カラム分別、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＷＧＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃｏｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、またはプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上でのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基が加えられたシリカゲル）、例えばセファデックス分子ふるいを使用するゲル濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィー、選択的にポリペプチドを結合するカラム上でのクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈殿。
【０２８２】
培養中に産生される改変されたグリコペプチドは通常、細胞、酵素などからの最初の抽出、それに続く１種または複数の濃縮、塩析法、水性（ａｑｕｅｏｕｓ）イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離される。さらに、改変された糖タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。最後に、最終の精製ステップのために、ＨＰＬＣが用いられてもよい。
【０２８３】
タンパク質加水分解を阻害するために、プロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）が、前述ステップのいずれかに含まれてもよく、また偶然の混入物の増殖を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。
【０２８４】
別の実施形態内では、本発明の改変されたグリコペプチドを産生するシステムからの上清は、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルタ、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、第一に濃縮される。濃縮ステップの後、濃縮物を、適切な精製マトリックスに適用できる。例えば、適切な親和性マトリックスは、適切な支持体に結合されたペプチド、レクチン、または抗体分子のためのリガンドを含むことができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基体を用いてもよい。適切なマトリックスには、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に一般に用いられる他のタイプが含まれる。あるいは、陽イオン交換ステップを用いてもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が、特に好ましい。
【０２８５】
最後に、ポリペプチド変種組成物をさらに精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダント・メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１つまたは複数ＲＰ−ＨＰＬＣステップを用いてもよい。前述の精製ステップのうちのいくつかまたはすべてを、様々な組み合わせで用いて、均一な改変された糖タンパク質を提供できる。
【０２８６】
大規模な発酵から得られる本発明の改変されたグリコペプチドを、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．」２９６：１７１（１９８４年））によって開示されるものと類似した方法によって精製してもよい。この参考文献は、調製用ＨＰＬＣカラム上の組換え型ヒトＩＬ−２の精製のための、２つの連続的なＲＰ−ＨＰＬＣステップを述べる。あるいは、改変された糖タンパク質を精製するために、アフィニティークロマトグラフィーなどの技術を利用してもよい。
【０２８７】
薬剤組成物
別の態様では、本発明は、薬剤組成物を提供する。この薬剤組成物は、薬学的に許容される希釈剤、ならびに、天然に存在しないＰＥＧ部分、治療的部分、または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化第ＩＸ因子ペプチドとの共有コンジュゲートを含む。ポリマー、治療的部分、または生体分子は、完全なグリコシルを連結基（ペプチドと、ポリマー、治療的部分、または生体分子との間に配置され、これら両方と共有結合的に連結される）を介してペプチドに結合される。
【０２８８】
本発明の薬剤組成物は、様々な薬物送達システムで使用するのに適している。本発明で使用するのに適した調合物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、メイス出版社（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ペンシルベニア州（ＰＡ）、第１７編（１９８５年）に出ている。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４９：１５２７〜１５３３（１９９０年）を参照のこと。
【０２８９】
薬剤組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含めて、任意の適切な方式の投与のために調製できる。皮下注射などの非経口的投与のためには、担体は、水、食塩水、アルコール、脂肪、蝋、または緩衝液を含むことが好ましい。経口投与のためには、上記の担体または固体担体（マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムなど）のいずれかを使用できる。生体分解性のマイクロスフェア（例えばポリラクテートポリグリコレート）もまた、本発明の薬剤組成物のための担体として用いることができる。適切な生体分解性のマイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号明細書および同第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。
【０２９０】
一般に、薬剤組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水溶性担体（例えば、水、緩衝水、食塩水、ＰＢＳなど）に溶解または懸濁される化合物を含む、非経口的投与のための組成物を提供する。この組成物は、およその生理的条件に必要とされる薬学的に許容される補助的な物質（ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含有できる。
【０２９１】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって、殺菌してもよいし、無菌濾過してもよい。得られた水溶液はそのままで使用するために包装することもできるし、凍結乾燥させることもでき、この凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌水性担体と組み合わせられる。調製物のｐＨは、一般的に、３と１１の間、好ましくは、５から９、最も好ましくは７から８となる。
【０２９２】
ある実施形態では、本発明のグリコペプチドを、標準のベシクル形成脂質から形成されるリポソームに組み込むことができる。リポソームを調製するために、例えば、ショーカ（Ｓｚｏｋａ）ら、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．」９：４６７（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、および同第４，８３７，０２８号明細書に記載されるような様々な方法が利用可能である。様々なターゲティング薬剤（例えば本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームのターゲティングは、当分野でよく知られている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号明細書および同第４，６０３，０４４号明細書を参照のこと）。
【０２９３】
リポソームへのターゲティング薬剤の結合のための標準の方法を、使用できる。これらの方法は、通常、ターゲティング薬剤の付着のために活性化できる、あるいは、本発明の、脂質で誘導体化されたグリコペプチドなどの親油性化合物を誘導体化できる、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質成分の、リポソームへの組み込みを使用する。
【０２９４】
ターゲティング機構は、通常、標的部分が標的（例えば細胞表面アクセプター）との相互作用に利用可能であるように、ターゲティング薬剤が、リポソームの表面上に配置されることが必要である。本発明の炭水化物は、脂質分子に付着させ、その後、リポソームを当分野の技術者に知られている方法（例えば、それぞれ、長鎖ハロゲン化アルキルを用いる、あるいは脂肪酸を用いる、炭水化物上に存在する水酸基のアルキル化またはアシル化）を使用して形成させることができる。あるいは、リポソームは、膜が形成されると同時に、コネクター部分が、第一に膜に組み込まれるような方式で形作ることができる。コネクター部分は、確実に埋め込まれ、膜に固定された親油性部分を有する必要がある。コネクター部分はまた、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能である反応性の部分も有する必要がある。反応性の部分は、ターゲティング薬剤または炭水化物（これは、後で加えられる）との安定な化学結合を形成するのに化学的に適しているように選択される。ある種の場合では、直接的にコネクター分子に標的薬剤を付着することが、可能であるが、大抵の場合では、化学的な橋として作用し、それによって、標的薬剤と共に膜にあるコネクター分子、またはベシクル表面から三次元的に延長される炭水化物を連結するための第３の分子を使用することが、より適切である。
【０２９５】
本発明の方法によって調製される化合物は、また、診断試薬としての使用が見いだされている。例えば、標識された化合物は、炎症を有することが疑われる患者において、炎症または腫瘍転移の領域の位置決めのために使用できる。この使用のためには、化合物を、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで標識できる。
【０２９６】
本発明の薬剤組成物に使用される活性成分は、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子、および、血液凝固カスケードに関与することの生物学的特性をもつその誘導体である。本発明のリポソームの分散液は、様々な形の血友病などの、凝固の低下や欠陥によって、特徴づけられる、凝固異常を治療する際の非経口的調合物にとって有用である。好ましくは、本発明の第ＩＸ因子組成物は、非経口的に（例えばＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、またはＩＰ）投与される。有効な投薬量は、治療される状態および投与経路に応じてかなり変動することが予測されるが、体重１ｋｇにつき約０．１から０００μｇの活性物質の範囲であることが予測される。凝固異常の治療のための好ましい用量は、１週につき３回、約５０〜約３０００μｇ／ｋｇである。好ましくは、１週につき３回、約５００から約２０００μｇ／ｋｇである。より好ましくは、１週につき３回、約７５０から約１５００μｇ／ｋｇ、および好ましくは、１週につき３回、約１０００μｇ／ｋｇである。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間が向上された第ＩＸ因子を提供するので、本発明の組成物が投与される場合、所定の投薬量は任意選択で低下される。［これらの投薬量は、適切か？］
【０２９７】
以下の実施例は、本発明のコンジュゲートおよび方法を説明するために提供されるが、主張された発明を限定するために提供されるのではない。
【実施例】
【０２９８】
実施例１
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６’−ＣＨＯの調製
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌｅ）を、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４溶液（２０ｍｌ）および２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ  ６．０；２０ｍＬ）に溶解した。その後、ガラクトースオキシダーゼ（２４０Ｕ；２４０μＬ）、およびカタラーゼ（１３０００Ｕ；１３０μＬ）を加え、風船を備える反応システムを、酸素で充填して、７日間室温で撹拌した。反応混合物を、その後、濾過し（スピンカートリッジ；ＭＷＣＯ  ５Ｋ）濾液（約４０ｍｌ）は、必要とされるまで４℃で保管した。ＴＬＣ（シリカ；ＥｔＯＨ／水（７／２）；Ｒｆ＝０．７７；アニスアルデヒド染料を用いて視覚化）。
【０２９９】
実施例２
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６’−ＮＨ２の調製
酢酸アンモニウム（１５ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌｅ）およびＮａＢＨ３ＣＮ（１Ｍ  ＴＨＦ溶液；０．１７ｍＬ（０．１７ｍｍｏｌｅ））溶液を、０℃の上（２ｍｌまたは約２０ｍｇ）からのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６’−ＣＨＯに加え、終夜室温まで暖めた。反応物を、水および収集された産物と共にＧ−１０カラムを介して濾過した。適切な画分を、凍結乾燥し、凍結して保管した。ＴＬＣ（シリカ；エタノール／水（７／２）；Ｒｆ＝０．７２；ニンヒドリン試薬を用いて視覚化）。
【０３００】
実施例３
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１ｋＤａ）の調製
ガラクトサミニル−１−リン酸塩−２−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１ｋＤａ）（５８ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（６ｍＬ）およびピリジン（１．２ｍＬ）に溶解した。その後、ＵＭＰ−モルホリデート（ｍｏｒｐｈｏｌｉｄａｔｅ）（６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌｅ）を加え、得られた混合物を４８時間７０℃で撹拌した。溶媒を、反応混合物を通して窒素を泡立たせることによって除去し、残基を、逆相クロマトグラフィーによって精製した。（Ｃ−１８シリカ、１０から８０％の間のステップ勾配、メタノール／水）。所望の画分を、収集し、減圧で乾燥させて、５０ｍｇの白色固体（７０％）を生じた。ＴＬＣ（シリカ、プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ、（３０／２０／２）、Ｒｆ＝０．５４）。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：観察された、１４８５、１５２９、１６１８、１７０６。
【０３０１】
実施例４
システイン−ＰＥＧ２（２）の調製
【化５０】
2007513190.tif 000056
【０３０２】
４．１  （１）の合成
水酸化カリウム（８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、粉末として）を、アルゴン下で、Ｌ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２０ｍＬ）の溶液に加えた。この混合物を、３０分間室温で撹拌し、その後、分子量２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシラート（Ｔｓ；１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を、２時間かけて、数回に分けて加えた。この混合物を、５日間室温で撹拌し、回転蒸発によって濃縮した。残留物を、水（３０ｍＬ）で希釈し、２時間室温で撹拌し、いくらかの過剰な２０キロダルトン  ｍＰＥＧ−Ｏ−トシラートを破壊した。その後、溶液を、酢酸を用いて中和し、ｐＨを、ｐＨ  ５．０に調整して、逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラム上に装填した。カラムを、メタノール／水の勾配を用いて溶出させ（産物は、約７０％メタノールで溶出する）、産物溶出を、蒸発光散乱によってモニタリングし、適切な画分を収集し、水（５００ｍｌ）で希釈した。この溶液を、色層分析し（イオン交換、ＸＫ  ５０  Ｑ、ビッグビーズ（ＢＩＧ  Ｂｅａｄｓ）、３００ｍＬ、水酸化物形；水から水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）、適切な画分のｐＨを、酢酸を用いて６．０に下げた。この溶液を、その後逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上に捕獲し、上で述べた通りのメタノール／水の勾配で溶出した。生成物分画をプールし、濃縮し、水に再溶解し、凍結乾燥させて、白色の固体（１）の４５３ｍｇ（４４％）を与えた。化合物についての構造的なデータは、以下の通りであった：１Ｈ−ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ），３．０５（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ），３．１８（ｑ，１Ｈ，（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ），３．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｏ），３．７（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ），３．９５（ｑ，１Ｈ，ＣＨＮ）。生成物の純度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって確認した。
【０３０３】
４．２  （２）の合成
トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を、溶液が塩基性になるまで、無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）に１（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）を溶解した溶液に滴下した。２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）の、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）溶液を、数回にわけて室温で、１時間かけて加えた。この反応混合物を、２４時間、室温で撹拌した。その後、溶媒を回転蒸発によって除去し、残留物を水（１００ｍＬ）に溶解し、ｐＨを１．０Ｎ  ＮａＯＨを用いて９．５に調整した。この塩基性の溶液を、２時間、室温で撹拌し、その後、酢酸を用いてｐＨ７．０に中和した。この溶液を、その後、逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラム上に装填した。カラムは、メタノール／水（生成物は、約７０％メタノールで溶出する）の勾配を用いて溶出され、生成物溶出を、蒸発光散乱によってモニタリングし、適切な分画を収集し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液を、色層分析し（イオン交換、ＸＫ  ５０  Ｑ、ビッグビーズ（ＢＩＧ  Ｂｅａｄｓ）、３００ｍＬ、水酸化物形；水から水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）、適切な画分のｐＨを、酢酸を用いて６．０に下げた。この溶液を、その後逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上で捕獲し、上で述べた通りのメタノール／水の勾配を用いて溶出した。生成物分画を、プールし、濃縮し、水に再溶解し、凍結乾燥させて、５７５ｍｇの白色の固体（２）（７０％）を与えた。この化合物についての構造的なデータは、以下の通りだった：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ），３．１２（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ），３．３９（ｓ，３Ｈ  ＣＨ３Ｏ），３．７１（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。産物の純度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって確認した。
【０３０４】
実施例５
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１ｋＤａ）の調製
ガラクトサミニル−１−リン酸−２−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１キロダルトン）（５８ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（６ｍＬ）およびピリジン（１．２ｍＬ）に溶解した。その後、ＵＭＰ−モルホリデート（６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌｅ）を加え、得られた混合物を４８時間７０℃で撹拌した。溶媒を、反応混合物を介して窒素を泡立たせることによって除去し、残留物を、逆相クロマトグラフィーによって精製した（Ｃ−１８シリカ、１０から８０％の間のステップ勾配、メタノール／水）。所望の画分を収集し、減圧で乾燥させ、５０ｍｇの白色固体（７０％）を与えた。ＴＬＣ（シリカ、プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ（３０／２０／２）、Ｒｆ＝０．５４）。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：観察された、１４８５、１５２９、１６１８、１７０６。
【０３０５】
実施例６
ＣＨＯ細胞中で産生される第ＩＸ因子のＧｌｙｃｏＰＥＧ化
この実施例は、アシアロ第ＩＸ因子の調製およびＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧを用いるそのシアリル化を記述する。
【０３０６】
６．１  ｒ第ＩＸ因子の脱シアリル化
組換え型の形の凝固第ＩＸ因子（第ＩＸ因子）を、ＣＨＯ細胞内で作製した。６０００ＩＵのｒ第ＩＸ因子を、合計１２ｍＬのＵＳＰ  Ｈ２Ｏに溶解した。この溶液を、別の６ｍｌのＵＳＰ  Ｈ２Ｏと共に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０、ＰＬ−１０遠心濾過機に移した。溶液を２ｍＬに濃縮し、次いで、１５ｍＬ  ５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３で希釈し、その後、再濃縮した。希釈／濃縮を、４回繰り返し、緩衝液を、３．０ｍＬの最終の体積に効率的に変化させた。この溶液のうち、２．９ｍＬ（ｒ第ＩＸ因子の約２９ｍｇ）を、小さいプラスチック管に移し、これに、５３０ｍＵ  α２−３，６，８−ノイラミニダーゼ−アガロースコンジュゲートを加えた（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、４５０μＬ）。この反応混合物を、３２℃で２６．５時間穏やかに回転させた。この混合物を、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離機にかけ、上清を収集した。アガロースビーズ（ノイラミニダーゼを含有）を、０．５ｍｌ  ５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．１２、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３で６回洗浄した。プールされた洗浄液および上清を、１０，０００ｒｐｍで２分間、再び遠心分離機にかけ、いずれかの残存するアガロース樹脂を除去した。プールされた、脱シアリル化されたタンパク質溶液を、同じ緩衝液を用いて１９ｍＬに希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０  ＰＬ−１０遠心濾過機で、約２ｍＬまで濃縮した。この溶液を、１５ｍｌの５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３で二倍に希釈し、２ｍＬに再濃縮した。最終の脱シアリル化されたｒ第ＩＸ因子溶液を、トリス緩衝液を用いて、最終の体積３ｍＬ（約１０ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。天然および脱シアリル化されたｒ第ＩＸ因子サンプルを、ＩＥＦ−電気泳動によって分析した。等電点電気泳動ゲル（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｇｅｌｓ）（ｐＨ３〜７）を、はじめに１０μＬトリス緩衝液で希釈され、１２μＬサンプル装填緩衝液と混合された、１．５μＬ（１５μｇ）サンプルを使用して実施した。ゲルは、装填し、流され、標準の手順を使用して固定された。ゲルを、コロイド状のブルー染料（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ）（図１５４）で着色すると、脱シアリル化された第ＩＸ因子に対するバンドが示された。
【０３０７】
実施例７
ＰＥＧ（１ｋＤａおよび１０ｋＤａ）−ＳＡ−第ＩＸ因子の調製
脱シアリル化されたｒ第ＩＸ因子（２９ｍｇ、３ｍｌ）を、２つの１５ｍＬの遠心管において、２つの１．５ｍｌ（１４．５ｍｇ）のサンプルに分けた。各溶液を、１２．６７ｍｌ  ５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３で希釈し、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ｋまたは１０ｋ（７．２５μｍｏｌ）を加えた。管を、穏やかにひっくり返して混合し、２．９Ｕ  ＳＴ３Ｇａｌ３（３２６μＬ）を加えた（総体積１４．５ｍｌ）。管を、再びひっくり返し、３２℃で６５時間穏やかに回転させた。反応を、−２０℃で凍結させることによって中断させた。反応物の１０μｇサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＥＧ化されたタンパク質を、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．１（ギブコ））、６ｍＬ／分を用いて、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｂｉｏｓｅｐ  Ｇ３０００ＳＷ  （２１．５×３０ｃｍ、１３ｕｍ）ＨＰＬＣカラム上で精製した。反応および精製を、ＳＤＳページおよび等電点電気泳動ゲルを使用してモニタリングした。Ｎｏｖｅｘトリス−グリシン（Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ）４〜２０％  １ｍｍのゲルを、２μＬの５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３緩衝液での希釈、および１２μＬサンプル装填緩衝液および１μＬ  ０．５Ｍ  ＤＴＴとの混合の後、１０μＬ（１０μｇ）のサンプルと共に装填し、８５℃で６分間加熱した。ゲルを、コロイド状のブルー染料（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ）（図１５５）を用いて着色すると、ＰＥＧ（１ｋＤａおよび１０ｋＤａ）−ＳＡ−第ＩＸ因子に対するバンドが示された。
【０３０８】
実施例８
第ＩＸ因子の直接的なシアリル−ＧｌｙｃｏＰＥＧ化
この実施例は、従来のシアリダーゼ処理を含まない第ＩＸ因子のシアリル−ＰＥＧ化の調製を記述する。
【０３０９】
８．１  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（１０ｋＤａ）を用いる第ＩＸ因子のシアリル−ＰＥＧ化
ＣＨＯ細胞中に発現され、完全にシアル酸付加された第ＩＸ因子（１１００ＩＵ）を、５ｍｌの２０ｍＭヒスチジン、５２０ｍＭグリシン、２％スクロース、０．０５％  ＮａＮ３、および０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．０に溶解した。その後、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（１０ｋＤａ）（２７ｍｇ、２．５μｍｏｌ）を、この溶液に溶解し、１ＵのＳＴ３Ｇａｌ３を加えた。３２℃で２８時間穏やかに混合した後、反応を終了させた。反応物を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載されている通りのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質産物は、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．０（ＰＢＳ）１ｍＬ／分を用いてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０ｘ３００ｍｍ、１３μｍ）ＨＰＬＣカラム上で精製した。Ｒｔ＝９．５分。
【０３１０】
実施例９
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を用いる第ＩＸ因子のシアリル−ＰＥＧ化
ＣＨＯ細胞中に発現され、完全にシアル酸付加された第ＩＸ因子（１１００ＩＵ）を、５ｍｌの２０ｍＭヒスチジン、５２０ｍＭグリシン、２％スクロース、０．０５％  ＮａＮ３および０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．０に溶解した。その後、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（２０ｋＤａ）（５０ｍｇ、２．３μｍｏｌ）を、この溶液に溶解し、ＣＳＴ−ＩＩを加えた。３２℃で４２時間穏やかに混合した後、反応を終了させた。反応物を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載されている通りのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３１１】
タンパク質産物は、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．０（フィッシャー）１ｍＬ／分を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０ｘ３００ｍｍ、１３μｍ）ＨＰＬＣカラム上で精製した。Ｒｔ＝８．６分。
【０３１２】
実施例１０
ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子を覆うシアル酸
この実施例は、シアリル−ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたペプチドのシアル酸被覆のための手順を記述する。ここでは、第ＩＸ因子は、典型的なペプチドである。
【０３１３】
１０．１  第ＩＸ因子−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）のＮ−結合型およびＯ−結合型グリカンのシアル酸被覆
精製されたｒ−第ＩＸ因子−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）（２．４ｍｇ）を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ２０  ＰＬ−１０（ミリポアコーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））遠心濾過機で濃縮し、緩衝液を、５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に変化させ最終体積１．８５ｍＬとした。タンパク質溶液を、３７２μＬの同じトリス緩衝液で希釈し、７．４ｍｇのＣＭＰ−ＳＡ（１２μｍｏｌ）を、固体として加えた。溶液を、穏やかにひっくり返して混合し、０．１Ｕ  ＳＴ３Ｇａｌ１および０．１Ｕ  ＳＴ３Ｇａｌ３を加えた。反応混合物を、３２℃で４２時間穏やかに回転させた。
【０３１４】
反応物の１０μｇサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｎｏｖｅｘトリス−グリシン（Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ）４〜１２％  １ｍｍのゲルを、実施し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載されている通りに、コロイド状のブルー（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ）を使用して染色した。簡単に言うと、サンプル１０μＬ（１０μｇ）を、１２μＬサンプル装填緩衝液および１μＬ  ０．５Ｍ  ＤＴＴと混合し、８５℃で６分間加熱した（図１５６、レーン４）。
【０３１５】
実施例１１
ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子の薬物動態学的研究
４つのＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＦＩＸ変種（ＰＥＧ−９変種）を、通常のマウスの薬物動態学的研究で試験した。４つの化合物の活性は、血餅、内在性トロンビン可能性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＥＴＰ）およびトロンボエラストグラフ（ＴＥＧ）アッセイによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏですでに確立されている。活性の結果を、表Ｉに要約する。
【０３１６】
【表６】
2007513190.tif 000057
【０３１７】
循環における４つのＰＥＧ−９化合物の活性の延長を評価するために、薬物動態学的研究を、設計および実施した。非血友病マウスを、１時点につき２動物、１動物につき３サンプルで使用した。サンプリング時点は、化合物投与の、０、０．０８、０．１７、０．３３、１、３、５、８、１６、２４、３０、４８、６４、７２、および９６時間後であった。血液サンプルを、遠心分離機にかけ、２つのアリコート（１つは血餅分析用、１つはＥＬＩＳＡ用）に保管した。材料の制限に起因して、ＰＥＧ−９は、異なる量で投与された：ＢｅｎｅＦＩＸ  ２５０Ｕ／ｋｇ；２Ｋ（低い置換：「ＬＳ」（ペプチド分子あたり１〜２のＰＥＧ置換  ２００Ｕ／ｋｇ；２Ｋ（高い置換：「ＨＳ」（ペプチド分子あたり３〜４のＰＥＧ置換  ２００Ｕ／ｋｇ；１０Ｋ  １００Ｕ／ｋｇ；３０Ｋ  １００Ｕ／ｋｇ。全ての用量は、測定された凝固アッセイ単位に基づいていた。
【０３１８】
これらの結果を、図６および表ＩＩに概説する。
【０３１９】
【表７】
2007513190.tif 000058
【０３２０】
結果は、全てのＰＥＧ−９化合物について、延長に向かう傾向を実証する。ＡＵＣおよびＣｍａｘの値は、直接比較されなかった。しかし、クリアランス（ＣＬ）は、比較され、ＣＬは、ＢｅｎｅＦＩＸと比較して、ＰＥＧ−９化合物では、より低く、これは、マウスにおけるより長い滞留時間を示唆している。最後の検出可能な血餅活性のための時間は、たとえＢｅｎｅＦＩＸが最も高い用量で投与されても、ＢｅｎｅＦＩＸと比較して、ＰＥＧ−９化合物では増大される。
【０３２１】
実施例１２
ＬＳおよびＨＳＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子の調製
ＰＥＧでの置換の程度が低い、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子は、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩによって触媒される交換反応によって天然の第ＩＸ因子から調製された。反応は、１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％スクロース、および０．０２％トゥイーン８０（ｐＨ７．２）の緩衝液中で実施した。ＣＭＰＳＡ−ＰＥＧ（２ｋＤおよび１０ｋＤ）を用いるＰＥＧ化については、第ＩＸ因子（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、３２℃で１６時間、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（５０ｍＵ／ｍＬ）およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（０．５ｍＭ）と共に保温した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ  ３０ｋＤを用いるＰＥＧ化については、第ＩＸ因子の濃度を、１．０ｍｇ／ｍＬに増大させ、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの濃度を、０．１７ｍＭに低下させた。これらの条件下では、第ＩＸ因子分子の９０％超は、少なくとも１つのＰＥＧ部分で置換された。
【０３２２】
高程度にＰＥＧで置換されたＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子を、天然の第ＩＸ因子の酵素的脱シアリル化によって調製した。第ＩＸ因子ペプチドは、ＰＤ１０カラムを使用して、５０ｍＭ  ｍＥＳ（ｐＨ６．０）に緩衝液交換され、０．６６ｍｇ／ｍｌの濃縮物に調整され、３２℃で１６時間、ＡＵＳシアリダーゼ（５ｍＵ／ｍＬ）で処理される。脱シアリル化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、およびＭＡＬＤＩグリカン分析によって立証された。アシアロ第ＩＸ因子を、シアリダーゼを除去するためのＱセファロースＦＦ上で精製した。ＣａＣｌ２画分を、Ｕｌｔｒａ１５濃縮器を使用して濃縮し、ＰＤ１０カラムを使用して、ＭＥＳ、ｐＨ６．０に緩衝液交換した。
【０３２３】
３２℃で１６時間、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ（５０ｍＵ／ｍＬ）およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（０．５ｍＭ）とインキュベーションさせることによって、アシアロ第ＩＸ因子（０．５ｍｇ／ｍｌ）の２ｋＤおよび１０ｋＤのＰＥＧ化を実施した。ＣＭＰＳＡ−ＰＥＧ−３０ｋＤを用いるＰＥＧ化については、第ＩＸ因子の濃度を、１．０ｍｇ／ｍＬに増大させ、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの濃度を、０．１７ｍＭに低下させた。１６時間のＰＥＧ化の後、末端ガラクトースをもつグリカンは、１ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡを加え、３２℃でさらに８時間のインキュベーションを続けることによって、シアル酸で覆われた。これらの条件下では、第ＩＸ因子分子の９０％超は、少なくとも１つのＰＥＧ部分で置換された。この方法によって産生される第ＩＸ因子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、より大きい見かけの分子量を有する。
【０３２４】
実施例１３
Ｏ−ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子の調製
ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ（２５ｍＵ／ｍＬ）および１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとペプチドを、３２℃でインキュベーションすることによって、Ｏ−グリカン鎖を、新規に天然の第ＩＸ因子（１ｍｇ／ｍｌ）に導入した。４時間のインキュベーションの後、ＣＭＰＳＡ−ＰＥＧ（０．５ｍＭの２Ｋｄまたはｌ０Ｋｄまたは０．１７ｍＭの３０ｋＤｄ）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（２５ｍＵ／ｍＬ）を加え、さらに２０時間保温することによって、ＰＥＧ化反応を開始した。
【０３２５】
本明細書に記述する実施例および実施形態は、例示目的に過ぎないこと、また、それらの点から見た様々な改変または変更は、当分野の技術者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれることとなることが理解されよう。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、そのすべての目的のために、その内容全体を本明細書に援用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３２６】
図面の説明
【図１】Ａｓｎ  １５７、Ａｓｎ  １６７、Ｓｅｒ  ５３、Ｓｅｒ  ６１、Ｔｈｒ  １５９、Ｔｈｒ  １６９、およびＴｈｒ  １７２での潜在的なグリコシル化部位の存在および位置を示す、第ＩＸ因子の構造である。
【図２】第ＩＸ因子ペプチド上の炭水化物残基が改造およびＧｌｙｃｏＰＥＧ化される、本発明の典型的な実施形態を示すスキームである：（Ａ）シアル酸部分が、シアリダーゼによって除去され、得られたガラクトース残基は、図５のシアル酸誘導体を用いてＧｌｙｃｏＰＥＧ化される；（Ｂ）マンノース残基が、シアル酸ＰＥＧを用いてＧｌｙｃｏＰＥＧ化される；（Ｃ）Ｎ−グリカンのシアル酸部分が、シアル酸ＰＥＧを用いてＧｌｙｃｏＰＥＧ化される；（Ｄ）Ｏ−グリカンのシアル酸部分が、シアル酸ＰＥＧを用いてＧｌｙｃｏＰＥＧ化される；（Ｅ）２（Ａ）からの第ＩＸ因子のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル；（Ｆ）２（Ｃ）および２（Ｄ）を産生する反応からの第ＩＸ因子のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル。
【図３】非グリコシル化第ＩＸ因子と、酵素的にＧｌｙｃｏＰＥＧ化された第ＩＸ因子のｉｎ  ｖｉｖｏでの残留寿命を比較するプロットである。
【図４】図３に示される種の活性を比較する表である。
【図５】第ＩＸ因子のアミノ酸配列である。
【図６】ＰＥＧ化されていない第ＩＸ因子と比較した、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された様々な第ＩＸ因子分子の薬物動態学的特性のグラフ表示である。
【図７】本発明に使用される代表的な改変された糖種の表である。
【図８】本発明に使用される代表的な改変された糖種の表である。
【図９】本明細書に記述するものなどの改変されたシアル酸部分、および改変されていないシアル酸部分をアクセプターに転移するために使用されるシアリルトランスフェラーゼの表である。
【図１】
2007513190.tif 000082
【図２Ａ】
2007513190.tif 000083
【図２Ｂ】
2007513190.tif 000084
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2007513190.tif 000086
【図２Ｅ】
2007513190.tif 000087
【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007513190.tif 000093
【図８】
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【図９Ａ】
2007513190.tif 000095
【図９Ｂ】
2007513190.tif 000096
【図９Ｃ】
2007513190.tif 000097
【図９Ｄ】
2007513190.tif 000098
【図９Ｅ】
2007513190.tif 000099
【図９Ｆ】
2007513190.tif 000100
【図９Ｇ】
2007513190.tif 000101
【図９Ｈ】
2007513190.tif 000102
【図９Ｉ】
2007513190.tif 000103
【図９Ｊ】
2007513190.tif 000104
【図９Ｋ】
2007513190.tif 000105
【図９Ｌ】
2007513190.tif 000106
【図９Ｍ】
2007513190.tif 000107
【図９Ｎ】
2007513190.tif 000108
【配列表】
2007513190000001.app
【国際調査報告】
2007513190.tif 000109