(57)【要約】１０００超のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドが固体支持体合成技術を用いて製造できる。技術の特徴は共有結合したオリゴヌクレオチドを含む再使用可能な固体支持体の使用である。この共有結合オリゴヌクレオチドを架橋オリゴヌクレオチドにアニーリングし、ここで架橋もまた標的ポリヌクレオチドの部分を形成する第１のオリゴヌクレオチドにアニーリングする。標的ポリヌクレオチドを合成した後、これを変性条件下に固体支持体から除去する工程；ができ、そして固体支持体は別の標的ポリヌクレオチドの製造のために再使用される。標的ポリヌクレオチドの収率は成長中のオリゴヌクレオチドに連結している固体支持体に剪断力を適用すると増大する。
2007508825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子または遺伝子フラグメントの組立のための方法であって、下記工程：
（ａ）固体支持体に結合された部分二本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドの溶液を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過する一定方向に及ぼされる力の影響下で、工程（ｂ）の溶液に工程（ａ）の固体支持体を接触させる工程；および、
（ｄ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が少なくとも２回工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するように、工程（ｃ）において及ぼされる力の方向を少なくとも１回反転させる工程；
を包含し、ここで、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが、工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分にアニーリングする、方法。
【請求項２】
工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ｂ）の溶液に繰り返し接触するように、工程（ｃ）で及ぼされる力の方向を複数回反転される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが部分二本鎖である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子または遺伝子フラグメントの組立のための方法であって、下記工程：
（ａ）固体支持体に結合された部分二本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドの溶液を提供する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過する一定方向に及ぼされる力の影響下で、工程（ｂ）の溶液に工程（ａ）の固体支持体を接触させる工程；
を包含し、ここで、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが、工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分にアニーリングする、方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが部分二本鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記力が一定のレベルで及ぼされる、請求項１または４に記載の方法。
【請求項７】
前記力が可変的なレベルで及ぼされる、請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】
前記固体支持体が多孔性である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）の溶液が、前記固体支持体の細孔を複数回通過する必要がある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
自動化された遺伝子フラグメントまたは遺伝子の組立てのための装置であって、
（ａ）複数の反応容器を保持するように適合された複数のキャビティーを含む反応ブロックであって、ここで、各反応容器はキャビティー内に存在する場合、第１のオリフィス、第２のオリフィスおよび該第１のオリフィスと第２のオリフィスとの間の該反応容器内部に位置する固体支持体を含む、反応ブロック；ならびに
（ｂ）存在する場合、該複数の反応容器と流体連絡する試薬送達混合ユニット
を備える、装置。
【請求項１１】
前記反応ブロックが、該反応ブロックの温度を制御またはモニタリングするための１つ以上の手段をさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記反応ブロックが、反応容器内の流体が存在する場合、該流体のレベルをモニタリングするための１つ以上の手段をさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記反応ブロックの前記複数のキャビティー内に前記複数の反応容器を固定するための１つ以上の手段をさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記試薬送達混合ユニットが、１つ以上のバルブと流体連絡する１つ以上のポンプを含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１５】
前記試薬送達混合ユニットのバルブが、存在する場合の前記反応容器の第１のオリフィスと該試薬送達混合ユニットのポンプの１つとの間に位置し、ここで、該バルブがポンプ、反応容器および１つ以上の液体保存容器と流体連絡する、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記液体保存容器のうちの１つにおける液体が、該液体保存容器から前記ポンプの作用により前記バルブを介して前記反応容器内に輸送される、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
マイクロプレート保持器具をさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
前記マイクロプレート保持器具が、温度モニタリング制御手段をさらに含む、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
マルチマイクロプレート保存システムをさらに備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２０】
マルチマイクロプレート保存システムが、温度モニタリング制御手段をさらに含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記マルチマイクロプレート保存システムから前記マイクロプレート保持器具にマイクロプレートを輸送するための手段をさらに備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
マイクロプレートウェルシールピアシング手段をさらに備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２３】
バーコードリーダーをさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項２４】
前記装置により実施された方法の生成物を分析するための１つ以上の手段をさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項２５】
前記手段が分光光度計である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記手段が蛍光プレートリーダーである、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
コンピューター制御ユニットをさらに備え、該コンピューター制御ユニットが装置を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する、請求項１０に記載の装置。
【請求項２８】
前記コンピューター制御ユニットが、前記試薬送達混合ユニットの作動を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記コンピューター制御ユニットが、前記温度モニタリング制御手段を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する、請求項１１、１８および２０に記載の装置。
【請求項３０】
前記コンピューター制御ユニットが、前記反応ブロックの流体モニタリング手段を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する、請求項１２に記載の装置。
【請求項３１】
前記コンピューター制御ユニットが、前記マイクロプレート保持器具に前記マルチマイクロプレート保存システムからマイクロプレートを輸送する手段を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する、請求項２１に記載の装置。
【請求項３２】
前記コンピューター制御ユニットが、前記マイクロプレートウェルシールピアシング手段を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する、請求項２２に記載の装置。
【請求項３３】
自動化された遺伝子フラグメントまたは遺伝子の組立てのための装置であって、
（ａ）複数の反応容器を保持するように適合された複数のキャビティーを含む反応ブロックであって、ここで、各反応容器は、該キャビティー内に存在する場合、第１のオリフィス、第２のオリフィスおよび該第１のオリフィスと第２のオリフィスとの間の反応容器内部に位置する固体支持体を含む、反応ブロック；
（ｂ）複数の反応容器が存在する場合、該反応容器と流体連絡する試薬送達混合ユニット；
（ｃ）マイクロプレート保持器具；
（ｄ）該複数の反応容器が該反応ブロックの該複数のキャビティー内に存在する場合、該反応容器を固定するための１つ以上の手段；
（ｅ）該反応ブロック、該マルチマイクロプレート保存システムまたは該マイクロプレート保持器具の温度をモニタリングまたは制御するための１つ以上の手段；
（ｆ）該装置を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行するコンピューター制御ユニット；
（ｇ）必要に応じて、マルチマイクロプレート保存システム；
（ｈ）必要に応じて、マイクロプレート保持領域にマルチマイクロプレート保存システムからマイクロプレートを輸送する手段；ならびに
（ｉ）必要に応じて、マイクロプレートウェルシールピアシング手段；
を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は固相支持体合成技術を用いたポリヌクレオチドの合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
ポリヌクレオチドはヌクレオチドの直鎖であり、そのヌクレオチドは糖、塩基およびリン酸基を含む。１ヌクレオチドの糖は隣接するヌクレオチドのリン酸基と結合して鎖を形成する。ヒト遺伝子は糖がデオキシリボースであるポリヌクレオチドから形成され、そして鎖の各位置の塩基はアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）から選択される。即ち、ポリヌクレオチドの鎖内の連結部の間の唯一の化学的相違は連結部に存在する塩基である。大部分において遺伝子は、その異なる長さに起因して、そして鎖に沿った４塩基の異なる配列を有する工程；にも起因して、相互に異なっている。
【０００３】
製薬会社の発見的研究の多数は薬剤開発の標的として、または蛋白治療薬としてのいずれかにおいて、遺伝子に着目している。最近および継続されている研究はゲノムＤＮＡ分子の配列の決定を指向しているため、これ等の会社はヒト遺伝子の大部分で塩基配列を入手する工程；ができる。実際、これ等の会社は潜在的な機会に恵まれすぎており、その競合会社が同じセットの可能性に面している工程；を迅速に把握し、そして現時点では発見されている遺伝子の一部より多くに対して研究を行う工程；は不可能である。
【０００４】
遺伝子の分野における研究を実施する際の大きな難点の１つは例えば研究用または診断用の道具または潜在的な治療薬として使用する工程；ができる所望の塩基配列の遺伝子を製造するために必要とされる時間と努力である。遺伝子は典型的には数百から数千ヌクレオチド長であり、そのヌクレオチド配列により定義される。遺伝子を良好に製造するためには、遺伝子のヌクレオチドは厳密に特定された順序で無ければならず、即ち、４塩基の特定の１つが鎖に沿った特定の位置に存在する工程；が特定されれば、他の塩基ではなくその塩基がその特定の位置に存在しなければならず、如何なる余分または欠落したヌクレオチド塩基も存在しないはずである。
【０００５】
鎖が約１００ヌクレオチド長未満である場合にオリゴヌクレオチドと称される場合が多い短鎖ヌクレオチドの製造は十分開発されており、そして商業的に使用されている方法である。典型的には、不溶性の支持体を第１のヌクレオチドに結合させ、支持体を第２のヌクレオチドの反応性前駆体と共に溶液中に入れる。第２のヌクレオチドが第１のヌクレオチドに結合した後、反応性混合物をフリットで洗浄する工程；により何れかの未反応の前駆体から固体支持体を分離する。次に新生したオリゴヌクレオチドを含む固相を第３のヌクレオチドの反応性前駆体に曝露し、この操作を、所望のオリゴヌクレオチドが製造されるまで反復する。
【０００６】
新生オリゴヌクレオチドの全てが反応性の前駆体と所望通りに反応するわけではないため、化学的収率が典型的には９０％より高値であっても、所望の生成物の収率は、固体支持体に結合した第１のヌクレオチドの量を基にして、反復サイクル数が増大するに従って劇的に低下する。さらにまた、このプロセスによって製造された一部のオリゴヌクレオチドはそれらが所望数のヌクレオチドを含有している場合でも、厳密には所望の塩基配列を有していない工程；が実験的にわかっている。恐らくは特定のヌクレオチド前駆体はしばしば成長中の鎖と２回反応するか、または、特定のヌクレオチド前駆体の全てが１回の反応の後に洗浄除去されずにヌクレオチド前駆体の次の添加分と競合してしまうと考えられる。いずれの場合においても、ポリヌクレオチドを作成するためのこの方法は長さ約１００超のヌクレオチド長の所定の配列の鎖の作成においては有効でない工程；がわかっている。オリゴヌクレオチドの作成の説明については非特許文献１を参照できる。
【０００７】
部分的には遺伝子はこのような望ましい研究用の道具であるため、そして潜在的な治療薬ですらあるため、幾つかの研究グループは予め定義された配列において数百の塩基を有するポリヌクレオチドおよび特に遺伝子を製造する方法を発見する工程；に着目しており、そしてその研究結果を公開している。例えば、非特許文献２；Ｅｖａｎｓ，Ｇ．Ａ．特許文献１；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９年８月発行の特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；および非特許文献１２；非特許文献１３を参照できる。
【０００８】
これ等の文献に記載された方法の各々は利点と欠点を有している。これ等の方法の何れも数百のヌクレオチドを有する予め定義された配列のポリヌクレオチドの効率的な製造において完全に良好であると証明されていない。例えば、１つの方法においては、遺伝子または他の大型のＤＮＡフラグメントを酵素ＤＮＡリガーゼを用いて短い化学合成されたＤＮＡフラグメントを連結してより長いフラグメントとする工程；により合成される。１回で数個のオリゴヌクレオチドフラグメントが正確な二本鎖フラグメントの形成に有利な条件下でアニーリングできる。これ等のフラグメントを標的配列の隣接フラグメントと混合し、酵素ＤＮＡ連結反応に付す。フラグメントが組立てられる順序は各短フラグメントの末端における一本鎖オーバーハングにより決定される。この方法による遺伝子の合成の信頼性を制約している１つの基本的要因はＤＮＡリガーゼ反応の低い正確さである。酵素はミスマッチ末端のフラグメントを連結でき、このため、フラグメントを誤った方向に組立てる。この基本的方策の幾つかの変法が報告されている（例えば、非特許文献１４；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，Ｙ．，特許文献３；および非特許文献１５参照）。これ等の方策の一部ではクローニングされた生成物の一部または全部を製造するためにポリメラーゼを使用している（例えば、非特許文献１６ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｉａｔｔへの特許文献４参照）。他の方法は別の欠点を有している。
【０００９】
ＤＮＡは近代生物学の中核であるため、信頼性があり費用効率的な遺伝子合成は純粋に発見に基づく方法よりもむしろ、製品開発のための工学的手法に生物学を移行させる工程；において役割を果たす可能性がある。より詳細には、費用効率的な遺伝子合成は複雑な分子生物学のプロジェクトにそれらを外注する工程；により薬剤発見の研究者等は数億ドルの経費節減が可能となるのである。以下に詳述する通り、本発明は遺伝子のようなポリヌクレオチドの製造における顕著な進歩を提供する。
【特許文献１】国際公開第９９／１４３１８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，９４２，６０９号明細書
【特許文献３】米国特許第４，６５２，６３９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４９２，６０９号明細書
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｔｚ，Ｃ．およびＲｅｅｔｚ，Ｍ．Ｔ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、１９９９年、１（１１）、ｐ．１７２９−１７３１
【非特許文献２】Ｐａｃｈｕｋ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ、２０００年、２４３、ｐ．１９−２５
【非特許文献３】Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｔｅｃｈ．、１９９８年、１２（１）、ｐ．４９−５４
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、１９９５年、１５、ｐ．５４７−５５５
【非特許文献５】Ｋａｔｏ，  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９４年、２２０、ｐ．４２８−４２９
【非特許文献６】Ｓｔａｈｌ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９３年、１４（３）、ｐ．４２４−４３４
【非特許文献７】Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ，Ｋ．Ｅ．およびＷｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｅ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２年、２０（２４）、ｐ．６７４３−６７４４
【非特許文献８】Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（Ｍｏｓｋ）、１９９２年、２６（１）、ｐ．９３−１０３
【非特許文献９】Ｂｅａｔｔｉｅ，  Ｋ．Ｌ．およびＦｏｗｌｅｒ，Ｒ．Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、３５２、ｐ．５４８−５４９、７４２
【非特許文献１０】Ｆｉｌｉｐｐｏｖ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．、１９９０年、１６（８）、ｐ．１０４５−１０５１
【非特許文献１１】Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、１０、ｐ．５１０−５２１
【非特許文献１２】Ｊｅｒａｌａ  Ｒ．およびＴｕｒｋ  Ｖ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８８年、１６（５）、ｐ．１７５９−１７６６
【非特許文献１３】Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８７年、１５（１２）、ｐ．４８４９−４８５６
【非特許文献１４】Ｋｈｏｒａｎａ  Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７９年、２０３、Ｐ．６１４−６２５
【非特許文献１５】Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，Ｚ．およびＪ．Ｓｍｒｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、１９８７年、１８、ｐ．２４１−２４４
【非特許文献１６】Ｗｉｔｈｅｒｓ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９９年、１２、ｐ．１１１３−２０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は固相ポリヌクレオチド合成において使用してよい方法、装置および組成物を提供する。本発明の技術は幾つかの理由、即ち、１）支持体上で成長中の鎖をアンカリングする工程；により反応が簡素化される（一方の末端のみ曝露されるため副反応が低減される）工程、２）溶液相の成分のモル過剰により反応を駆動できる工程、および３）溶液中の副反応が各サイクル毎に洗浄除去される工程；等により有利なものである。固相技術は遺伝子の合成をより信頼性が高く費用効率的なものとするため、広範な従来のクローニングプロジェクトの代替となりえる。
【００１１】
固相合成は幾つかの態様においてポリヌクレオチドの製造方法に影響を与える工程；ができ、例えば１）それは４００塩基対までの製造を迅速化でき、２）より少量の試薬の使用を可能とする工程；により小規模のオリゴ合成の使用を可能にし、そして３）組立方法の信頼性を向上させ、送達時間の変動を小さくし、誤フラグメント再製造に伴う経費を低減する。
【００１２】
１つの特徴において、本発明は（ａ）固体支持体に結合したユニバーサルオリゴを提供する工程；（ｂ）ユニバーサルオリゴに架橋オリゴをアニーリングする工程；により粘性末端を含む開始二本鎖を形成する工程；（ｃ）第１のオリゴまたは第１の二本鎖を架橋オリゴにアニーリングして第１の中間体二本鎖を形成する工程；（ｄ）第２のオリゴまたは第２の二本鎖を第１の中間体二本鎖にアニーリングして第２の中間体二本鎖を形成する工程；（ｅ）必要に応じて工程（ｄ）を反復して最終二本鎖を形成する工程；（ｆ）ユニバーサルオリゴが連結反応を起こさず、そして、架橋オリゴが第１のオリゴおよび第１の二本鎖の何れとも連結しない条件下でオリゴおよび最終二本鎖の二本鎖を共に連結する工程、を含む遺伝子組立のための方法を提供する。
【００１３】
別の特徴において本発明は（ａ）固体支持体に結合されたユニバーサルオリゴ；および（ｂ）粘性末端を含む開始二本鎖が形成されるようにユニバーサルオリゴにアニーリングされた架橋オリゴを含む組成物を提供する。この組成物は場合により（ｃ）第１の中間体二本鎖を形成するように架橋オリゴにアニーリングされた第１のオリゴまたは第１の二本鎖；および場合により（ｄ）第２の中間体二本鎖を形成するように第１の中間体二本鎖にアニーリングされた第２のオリゴまたは第２の二本鎖；および場合により（ｅ）第３の中間体二本鎖を形成するように第２の中間体二本鎖にアニーリングされた第３のオリゴまたは第３の二本鎖；および場合によりリガーゼを含む。
【００１４】
別の特徴において、本発明は固体支持体およびユニバーサルオリゴの末端ヌクレオチドの間に１つ以上のリン酸基およびポリオキシアルキレン基が位置する、ユニバーサルオリゴに結合された固体支持体を含む製品を提供する。好ましい実施形態においてはこの製品はさらに架橋オリゴをふくみ、ここで架橋オリゴはユニバーサルオリゴのヌクレオチド５つ以上にアニーリングされたリンカーポリヌクレオチド領域を含む。関連する特徴において、本発明は（ａ）ユニバーサルオリゴを有するが架橋は有さない本製品を提供する工程；（ｂ）ユニバーサルオリゴに架橋オリゴをアニーリングする工程；および（ｃ）リガーゼを用いて２つ以上のオリゴヌクレオチドを共に連結して標的ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを形成する工程、を含む遺伝子組立の方法を提供する。本製品および方法の好都合な点は、ユニバーサルオリゴ／固体支持体コンストラクトが再使用できる点である。従って、方法はさらに（ｄ）架橋オリゴからユニバーサルオリゴを分離する工程；および（ｅ）製品を再使用して別の標的ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを製造する工程、という任意の工程を包含する。
【００１５】
別の特徴において、本発明は水性環境における固体支持体上のポリヌクレオチドの組立のための方法を提供し、その進歩点は、直接またはリンカー基を介して固体支持体にユニバーサルオリゴを共有結合的に結合する工程、ユニバーサルオリゴに架橋オリゴをアニーリングして開始二本鎖を形成する工程、ここで開始二本鎖は一本鎖の形態において架橋オリゴの部分を有する工程；により粘性末端を提供するものである工程、そして、第１のオリゴまたは第１の二本鎖を開始二本鎖の粘性末端にハイブリダイズする工程；を包含し、ここで第１のオリゴまたは第１の二本鎖はその後連結条件に付され、標的ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントに取り込まれる。
【００１６】
本発明は最終遺伝子または遺伝子フラグメントを固体支持体上に製造する。最終的に所望の遺伝子が非常に長い、例えば約１０００塩基対超のものである場合は、固体支持体上に２つ以上の遺伝子フラグメントを製造し、そして次にそれらの遺伝子フラグメントを最終的に所望の遺伝子内に組み合わせる工程；がより効率的である。従って、１つの特徴において、本発明は固体支持体上に遺伝子の部分を組立てるための方法を提供し、方法は（ａ）固体支持体上に第１の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第１のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有する工程；（ｂ）第１のフラグメントを固体支持体から分離して溶液中の第１のフラグメントを得る工程；（ｃ）固体支持体上に第２の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第２のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有し、そして第１のフラグメントと非同一である工程；（ｄ）固体支持体から第２のフラグメントを分離して溶液中の第２のフラグメントを得る工程；（ｅ）固体支持体上に第３の遺伝子フラグメントを組立てる工程；（ｆ）第３のフラグメントを第１のフラグメントに結合させてより長い遺伝子フラグメントを得る工程；（ｇ）第２のフラグメントを工程（ｅ）のより長い遺伝子フラグメントに結合させて最終遺伝子を得る工程；および（ｈ）最終遺伝子を固体支持体から分離する工程；を含む。
【００１７】
基本的には、上記した方法に従って、如何なる数量の遺伝子フラグメントも本発明の固相合成法を用いて製造してよく、そしてそれらの遺伝子フラグメントの１つを固体支持体に結合したままとし、一方、既に製造している遺伝子フラグメントをその後固体支持体結合遺伝子フラグメントに添加する。或いは、遺伝子フラグメントの全てを固体支持体から遊離させ、次に溶液中に組み立ててもよい。この特徴によれば、本発明は遺伝子またはその部分を溶液中に組立てるための方法を提供し、方法は（ａ）固体支持体上に第１の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第１のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有する工程；（ｂ）第１のフラグメントを固体支持体から分離して溶液中の第１のフラグメントを得る工程；（ｃ）固体支持体上に第２の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第２のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有し、そして第１のフラグメントと非同一である工程；（ｄ）固体支持体から第２のフラグメントを分離して溶液中の第２のフラグメントを得る工程；（ｅ）第１のフラグメントおよび第２のフラグメントを単一の溶液中に組み合わせる工程；および（ｆ）工程（ｅ）の第１および第２のフラグメントを典型的には連結条件下に共有結合させて溶液中の最終遺伝子を得る工程；を含む。
【００１８】
別の特徴において、本発明は支持体結合オリゴおよび溶液相のオリゴを混合して二者の間の高収率のハイブリダイゼーションを達成する方法を提供する。即ち、１つの特徴において、本発明は（ａ）固体支持体に結合された部分二本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドの溶液を提供する工程；（ｃ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するある１つの方向に及ぼされる力の影響下に工程（ｂ）の溶液に工程（ａ）の固体支持体を接触させる工程；および、（ｄ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が少なくとも２回工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するように少なくとも１回工程（ｃ）において及ぼされる力の方向を反転させる工程；を含む遺伝子または遺伝子フラグメントの組立のための方法であって、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分にアニーリングする上記方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明のこの特徴においては、工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ｂ）の溶液に繰り返し接触するように、工程（ｃ）で及ぼされる力の方向を複数回反転させる。より好ましくは、本発明のこの特徴において、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドは部分二本鎖である。
【００２０】
別の関連する特徴において、本発明は（ａ）固体支持体に結合された部分二本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドの溶液を提供する工程；および、（ｃ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するある方向に及ぼされる力の影響下に工程（ｂ）の溶液に工程（ａ）の固体支持体を接触させる工程；を含む遺伝子または遺伝子フラグメントの組立のための方法を提供し；ここで、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分にアニーリングする。
【００２１】
好ましくは、本発明のこの特徴において、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドは部分二本鎖である。
【００２２】
関連する特徴において、本発明は（ａ）固体支持体に結合した部分二本鎖核酸（ｄｓ−ＮＡ）を提供する工程；（ｂ）ｄｓ−ＮＡの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ｓｓ−ＮＡ）の溶液を提供する工程；および（ｃ）工程（ａ）のｄｓ−ＮＡを、工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部がある強制力の影響下にｄｓ−ＮＡを通過するようにしてこの溶液に接触させる工程；を含む遺伝子組立のための方法を提供し、この場合、（ｉ）ｓｓ−ＮＡはｄｓ−ＮＡの一本鎖部分にアニーリングし、そして（ｉｉ）他の条件は一定であるが力が低下すればｄｓ−ＮＡの一本鎖部分にアニーリングするｓｓ−ＮＡの量が低減する。
【００２３】
本発明は遺伝子組立において特に有用な反応器および装置も提供する。１つの特徴において本発明は（ａ）複数の反応容器を保持するように適合された複数のキャビティーを含む反応ブロック、ここで各反応容器はキャビティー内に存在する場合は、第１のオリフィス、第２のオリフィスおよび第１および第２のオリフィスの間の反応容器内部に位置する固体支持体を含むもの；および、（ｂ）存在する場合は複数の反応容器と流体連絡している試薬送達混合ユニット；を含む自動化された遺伝子フラグメントまたは遺伝子の組立てのために特によく適した装置を提供する。
【００２４】
本装置には別の要素を補給してもよく、例えば装置はさらに反応ブロックの温度を制御またはモニタリングするための１つ以上の手段を含んでよく；装置はさらに存在する場合に反応容器内の流体のレベルをモニタリングするための１つ以上の手段を含んでよく；装置はさらに反応ブロックの複数のキャビティー内に複数の反応容器を固定するための１つ以上の手段を含んでよく；装置はさらに１つ以上のバルブと流体連絡している１つ以上のポンプを含んでよく；装置はさらに存在する場合の反応容器の第１のオリフィスと試薬送達混合ユニットのポンプの１つとの間に位置する試薬送達混合ユニットのバルブを含んでよく、ここで、バルブがポンプ、反応容器および１つ以上の液体保存容器と流体連絡しており、ここで液体保存容器の１つの中の液体はポンプの作用により反応容器内にバルブを介して液体保存容器から輸送され；装置はさらに温度モニタリング制御手段をさらに含んでよいマイクロ滴定プレート（マイクロプレート）保持器具をさらに含んでよく；装置はさらにマイクロ滴定プレート（マイクロプレート）保存システムを含んでよく、これはさらに温度モニタリング制御手段を含んでよく；装置はさらにマイクロプレート保持器具にマルチマイクロプレート保存システムからマイクロプレートを輸送するための手段を含んでよく；そして装置はさらにマイクロプレートウェルシールピアシング手段を含んでよく；そして装置はさらにコンピューター制御ユニットを含んでよく、ここでコンピューター制御ユニットは装置の種々の要素を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する。
【００２５】
これ等および他の本発明の特徴は以下に詳述する通りである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明はポリヌクレオチドの合成、特に、固相法によりポリヌクレオチドを合成する工程；に関する。本発明を詳述する前に、本発明の概説および本発明の説明に使用した用語の一部の解説を行う。
【００２７】
（Ａ．定義および慣例）
本明細書においては、「ポリヌクレオチド」および「遺伝子」という用語は単複とも互換的に使用する。即ち「遺伝子」という用語は自然界に存在するヌクレオチド配列の意味も有すものの必ずしもそれを指すものではないが、より一般的には何れかの塩基配列のポリヌクレオチドをさす。後に詳述する通り、本発明はオリゴを共に連結するために固相化学を使用し、これにより遺伝子を組立てる。最終的に望まれる遺伝子が例えば２０００塩基対を有する場合、本発明の１つの特徴において、この２０００ｂｐの二本鎖フラグメントは固体支持体上にオリゴを組立てる工程；により製造し、そして次にこれ等の遺伝子フラグメントを組立てて最終的な（２０００ｂｐ）遺伝子を形成する。後に説明する理由により、オリゴを３００〜５００ｂｐのオーダーの遺伝子フラグメントにまで組立て、そして次にこれ等の遺伝子フラグメントの複数を組立てて最終的な遺伝子とする工程；が好ましい場合がある。明確化の目的のために、オリゴの直接の固相組立により製造された生成物は本明細書においては、「遺伝子フラグメント」または「第１のポリヌクレオチド」と称する。２個以上の「遺伝子フラグメント」または第１および第２等のポリヌクレオチドの組立により製造された生成物は「遺伝子」と称する。
【００２８】
本発明は二本鎖形態の遺伝子フラグメントを製造し、ここで第１のポリヌクレオチド分子（場合によりポリヌクレオチド鎖と称する）におけるヌクレオチド（ｎｔ）塩基は第２の（隣接する）ポリヌクレオチド分子における相当するヌクレオチド塩基に水素結合している。適切な条件下、例えば高温においては、遺伝子フラグメントの二本鎖形（ｄｓ）態は２つの一本鎖（ｓｓ）分子に変換できる。従って、「遺伝子」、「遺伝子フラグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語は各々、二本鎖および一本鎖の形態の両方を指すために使用できる。「ポリヌクレオチド分子」という用語はヌクレオチドの１つの特定の鎖を指し、これは一本鎖または二本鎖の形態であってよい。
【００２９】
遺伝子フラグメントが二本鎖形態である場合は、それは多くの塩基対（ｂｐ）を有する工程；になる。本発明は何れかの数量の塩基対を有する遺伝子フラグメントを提供する。本発明は短い遺伝子フラグメント、即ち１００ｂｐ未満を有する遺伝子フラグメントも製造できるが、短い遺伝子フラグメントの製造のためには別の技術も当該分野で知られている。本発明の利点は長い遺伝子および長い遺伝子フラグメント、即ち１００ｂｐ超を有する遺伝子および遺伝子フラグメントの製造も可能とする点である。本発明の種々の実施形態において、約１００ｂｐ超、または約２００ｂｐ超、または約３００ｂｐ超、または約４００ｂｐ超、または約５００ｂｐ超、または約６００ｂｐ超、または約７００ｂｐ超、または約８００ｂｐ超、または約９００ｂｐ超、または約１０００ｂｐ超の遺伝子および遺伝子フラグメントを製造できる。大部分の遺伝子は約５０００ｂｐ未満を有し、従って典型的には本発明は約１００〜１０００ｂｐを有する遺伝子フラグメントから約１００〜５０００ｂｐを有する遺伝子を製造する際に有用である。
【００３０】
本発明により製造される遺伝子フラグメントは塩基対形態において幾つかのヌクレオチドを有するが、遺伝子フラグメント（または遺伝子）に存在するヌクレオチドの全てが必ずしも塩基対形態にあるわけではない。実際、多くの（全てではないが）場合において、特定のポリヌクレオチド分子の片側または両側の末端におけるヌクレオチドの一部は、その分子の内部に位置するヌクレオチドが塩基対形態にあるとしても、何れかの他の塩基と対にならない場合がある。ポリヌクレオチド分子の末端における非塩基対ヌクレオチドの１つ以上の配列は本明細書においては「粘性末端」を形成するものと称する。このような１つ以上の非塩基対ヌクレオチドは、それらが別の一本鎖ポリヌクレオチド分子とハイブリダイズできるために「粘性」とみなされ、それは既に二本鎖形態にあってもはや「粘性」ではないヌクレオチドとは対照的である。
【００３１】
二本鎖ポリヌクレオチドは本明細書においては、「二本鎖」と称し、ここで二本鎖は２つ（第１および第２の）ポリヌクレオチド分子を含む必要があり、ここで第１のポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドの隣接する配列は第２のポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドの隣接する配列にハイブリダイズする。「ハイブリダイズする」および「アニーリングする」という用語は、本明細書においては互換的に使用し、２つの一本鎖ポリヌクレオチド分子を共に結合させて二本鎖を形成する方法をさす。即ち、「二本鎖」という用語は遺伝子および遺伝子フラグメントの両方を包含する。
【００３２】
２つのｓｓポリヌクレオチドから二本鎖を形成するためには、第１のポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドの配列は第２のポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドの配列に相補的でなければならない。アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）から誘導したヌクレオチドは相補的であり、即ちチミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）から誘導したヌクレオチドと塩基対を形成するという事実は当該分野で知られている。後に詳述する通り、本発明はポリヌクレオチド２つが適切な条件下に混合されれば自発的にハイブリダイズして二本鎖を形成するという現象に依存している。この自発的ハイブリダイゼーションが起こるためには、第１のポリヌクレオチド分子内の十分な数量のヌクレオチドがそれが第２の鎖内の相補ヌクレオチドと塩基対を形成できるような態様において整列していなければならない。換言すれば、ポリヌクレオチド分子２つは相補配列を有していなければならない。
【００３３】
多くの目的のために、本発明により製造された遺伝子または遺伝子フラグメント内の塩基対の多くがＡ／ＴまたはＧ／Ｃの何れかである工程；が望ましく、そしてミスマッチ（例えばＡ／Ａ、Ｔ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ｔ／ＣおよびＴ／Ｇ塩基対）は望ましくない。しかしながら、本発明は生成物の遺伝子または遺伝子フラグメントに一部のミスマッチ塩基を意図的に作成する工程；ができるという柔軟性を有する。即ち、「二本鎖」という用語は本明細書においてはミスマッチ塩基の完全な非存在を必要とせず、そして実際、一部のミスマッチは二本鎖内に存在してよい。しかしながら、これ等のミスマッチの数が増大するに従い、二本鎖は安定性を消失し、最終的には二本鎖は室温で安定ではなくなる。従って本発明により製造される二本鎖はミスマッチ塩基１つ以上を有していてよいが、ミスマッチ塩基の数は二本鎖が室温で安定でなくなるほど大きくてはならない。
【００３４】
本発明はオリゴヌクレオチド（オリゴまたはＯＤＮ）を共に結合させて遺伝子または遺伝子フラグメントを形成する。本明細書においては、「オリゴヌクレオチド」（オリゴ、ＯＤＮ）という用語はヌクレオチドの短鎖を指す。既存の技術を用いて約１００ｎｔ未満のポリヌクレオチド分子を製造する工程；ができ、ここでこの技術は鎖を「成長させる」工程；によりこれ等の分子を作成する。本質的には、この「成長させる」方法は固体支持体に第１のヌクレオチドを結合させる工程、第１のヌクレオチドを活性化する工程、反応性の第２のヌクレオチドを活性化された第１のヌクレオチドに添加する工程、第２のヌクレオチドを第１のヌクレオチドと反応させてジヌクレオチドを形成する工程、未反応の物質および反応副生成物がある場合はそれらを洗浄除去する工程、第２のヌクレオチドから誘導された部分が反応性となるようにジヌクレオチドを活性化する工程、そして次に、方法を反復する工程；（即ち反応性の第３のヌクレオチドを活性化されたジヌクレオチドに添加する工程、第３のヌクレオチドをジヌクレオチドと反応させてトリヌクレオチドを形成する工程；等々）を包含する。方法により形成されたオリゴヌクレオチドは次に固体支持体から遊離させる。
【００３５】
「成長させる」方法は短いポリヌクレオチドを製造するために極めて良好に機能する。しかしながらヌクレオチドを鎖に付加するたびにあるエラーが導入され、例えば１つではなく２つのヌクレオチドが鎖に付加されたり、または、ヌクレオチドが鎖に付加されなかったりする。従って、所望の生成物の収率はポリヌクレオチド長が増大するに従い急速に低下する。部分的にはこのエラー率が原因となり、さらにこの方法の緩徐さおよび他の理由が原因となって、「成長させる」方法は長い遺伝子、即ち１００ｎｔを遥かに超える遺伝子の製造には、不適、または使用不能である。
【００３６】
本発明のオリゴは少なくとも１０ｎｔを有する。好ましくは、オリゴは少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０、または少なくとも１００ｎｔを有する。実際、より長いオリゴが一般的に好ましい。より長いオリゴを使用する工程；の問題点はそれらが標準的な市販の技術を用いて作成された場合、例えば５０塩基オリゴ（５０ｍｅｒ）の試料は９０（重量）％の５０ｍｅｒおよび一部の非５０ｍｅｒ、例えば一部の４８ｍｅｒ、４９ｍｅｒ、５１ｍｅｒ、５２ｍｅｒ等を有する場合があるという点において低純度である場合が多いという事である。さらにまた、５０ｍｅｒの僅か約９０％が所望のヌクレオチドを有するのみである。一般的に所望のオリゴより短いまたは長いオリゴを除去するためにクロマトグラフィーを使用する場合、望ましくないｎｔ配列を有する５０ｍｅｒを除去するために５０ｍｅｒを精製する工程；は極めて困難である。従ってこの工程、即ち遺伝子を製造するための成長方法は商業的には成功していない。
【００３７】
本発明のオリゴはヌクレオチド（ｎｔ）の鎖を含む合成分子である。オリゴは少なくとも１０ｎｔを有する。オリゴにおけるｎｔの数の上限は重要ではない。しかしながら、オリゴ自身が長く（例えば３００ｎｔ以上）、そして所望の遺伝子または遺伝子フラグメントが短い（例えば僅か約３００ｎｔ）の場合、オリゴ（およびその相補体）を作成するための方法を用いて遺伝子を作成する工程；ができ、そして本発明は遺伝子を作成するために必要ではない。本発明はオリゴを共に結合させてより長いポリヌクレオチドを形成する工程；に関するものであり、ここで一部の理由により、オリゴを合成するために使用される技術は不十分であるか、または所望の数量のヌクレオチドを有する長いポリヌクレオチドを形成するには適していない。商業規模においてオリゴを作成する現在の技術は約１００ｎｔまでのオリゴを作成するために十分である。従って、１つの特徴において、本発明のオリゴは１０〜約１００ｎｔを有する。
【００３８】
本明細書においては、単数も複数も同義である。例えば「ポンプ」とは１つ以上のポンプをさす。ある場合においては、明確化の目的のために「１つ以上」という表現を使用するが、単数も複数も一般的には互換である。
【００３９】
（Ｂ．遺伝子または遺伝子フラグメントを合成するための方法）
（１．方法の概説）
本発明は以下の３つの主要な工程により遺伝子を形成するためにオリゴを組立てる。工程１ではオリゴを組立てて遺伝子フラグメントを形成する。反復すれば、遺伝子フラグメントが所望の長さを有する場合、遺伝子および遺伝子フラグメントは同じものである。しかしながら、所望の遺伝子が遺伝子フラグメントより多いｂｐを有する場合、第２の工程において、遺伝子フラグメントをクローニングおよび配列決定する工程；により高純度の形態の遺伝子フラグメントを得る工程；ができる。第３の工程においては、精製された遺伝子フラグメントを組立てて最終的な大きいポリヌクレオチドとする。
【００４０】
工程１、即ち中間体遺伝子フラグメントの組立は図１に示す通りである。要約すると、３つの要素、即ち１）ユニバーサルオリゴを担持している固体支持体、２）成長中のフラグメントに支持体を連結するために使用するフラグメント特異的架橋オリゴ、および３）遺伝子フラグメントをビルドするために使用されるオリゴのセットをこの工程において使用する。架橋オリゴは２つのセクション、即ち１つは固体支持体に結合したユニバーサルオリゴに相補的なもの、そして２つ目は「第１のオリゴ」に相補的なものよりなる。第１のオリゴは一本鎖または二本鎖の形態であってよい。二本鎖形態の場合は、第１のオリゴは「粘性末端」を与え、これによりそれは架橋オリゴにアニーリングできる。図１は二本鎖形態、即ち第２のオリゴと予備アニーリングしている形態の第１のオリゴの使用を示す。架橋は支持体および成長中のフラグメントの間の可逆の連結を与え、そして固体支持体からのフラグメントの放出後には除去される。架橋オリゴはフラグメントクローンまたは最終遺伝子内には含まれない。
【００４１】
即ち、遺伝子をビルドする場合の第１工程は配列を遺伝子フラグメントに分解し、その後フラグメントの配列をオーバーラップしているオリゴのセットに分解する工程；である。次にこれ等のオリゴを当該分野で知られた方法で合成する。各オリゴは１０ヌクレオチドほどの短さから１００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであってよいが、本発明の種々の特徴において各オリゴは２０〜１００ｎｔ、または２０〜８０ｎｔ、または２０〜６０ｎｔ、または２０〜４０ｎｔ、または３０〜１００ｎｔ、または３０〜８０ｎｔ、または３０〜６０ｎｔ、または３０〜４０ｎｔである。好ましい特徴において、各オリゴは約３０〜６０ヌクレオチド長であり、そして対向する鎖における２オリゴとオーバーラップしている。２オリゴ間の各オーバーラップ領域を共にアニーリングして室温で各結合部において安定な二本鎖を形成できる。オリゴは成長中の鎖に順次添加してよいが、１つの特徴においては、２つ以上のオリゴを予備アニーリングして二本鎖（粘性末端を有するもの）を形成し、そして、二本鎖を成長中の鎖の粘性末端にアニーリングする。
【００４２】
組立方法はユニバーサルオリゴで誘導化した固体支持体に架橋オリゴをアニーリングする工程；により開始する。アニーリング工程の後、過剰の未結合の架橋オリゴを固体支持体から洗浄除去する。次に、第１のオリゴ、場合により二本鎖形態のものを、架橋オリゴにアニーリングする。過剰の未結合二本鎖を固体支持体から洗浄除去する。アニーリングおよび洗浄のサイクルを各隣接オリゴまたは二本鎖に付き、全オリゴが共にアニーリングするまで反復する。単一の酵素的連結反応で末端における遺伝子の全結合部が共有結合される。最終的に、二本鎖遺伝子フラグメントを固体支持体から遊離させる。
【００４３】
即ち、本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体に結合したユニバーサルオリゴを提供する工程；
（ｂ）ユニバーサルオリゴに架橋オリゴをアニーリングする工程；により粘性末端を含む開始二本鎖を形成する工程；
（ｃ）第１のオリゴまたは第１の二本鎖を粘性末端にアニーリングして第１の中間体二本鎖を形成する工程；
（ｄ）第２のオリゴまたは第２の二本鎖を第１の中間体二本鎖にアニーリングして第２の中間体二本鎖を形成する工程；；
（ｅ）必要に応じて工程（ｄ）を反復して最終二本鎖を形成する工程；
（ｆ）ユニバーサルオリゴおよび架橋オリゴが相互に、または何れかの他のオリゴまたは二本鎖に連結しない条件下でオリゴおよび最終二本鎖の二本鎖を共に連結する工程、を含む遺伝子組立のための方法を提供する。
【００４４】
（２．固体支持体）
本明細書においては、「固体支持体」という用語は固相支持体上で行われる有機合成の分野における当業者の知るその通常の意味を有する。本発明において有用であるためには、固体支持体は固体、即ち液体および気体ではないものであり、そして室温およびｐＨ７において水に不溶である。本発明の固体支持体は水の存在下で安定であり、即ち、固体支持体は長時間、例えば２４時間、水に曝露されてもその化学組成および形状を保持する。本発明において有用な固体支持体は、水への初回曝露により幾分の変化を起こしてよく、例えばそれは膨潤してよいが、この初回の変化の後は固体支持体は水中で安定、即ち化学構造に関して不変である。固体支持体の表面は、固体支持体が水中に入れられた場合、水に溶解した溶質が接触できるものである。
【００４５】
固体支持体は表面の体積に対する比を有している。表面の体積に対する比を測定する方法は当該分野で知られており、有機合成のための固体支持体の販売元は固体支持体の表面の体積に対する比を報告している場合が多い。典型的には、より高い表面の体積に対する比が本発明の固体支持体のためには好ましい。その理由は、本発明のポリヌクレオチドの製造は固体支持体の表面に初期から連結しているポリヌクレオチドを伸長する工程；に依存しているためである。固体支持体の体積を固定して固体支持体の表面積を増大させれば、典型的には表面により多くの初期ポリヌクレオチドを連結する工程；が可能となり、これにより本発明の望ましい生成物である伸長されたポリヌクレオチドのより多くを製造できるようになる。従って、多孔性の固体支持体が本発明においては好ましい。
【００４６】
固体支持体は好ましくは１つ以上の以下の特徴を有し、即ち（ａ）支持体は大分子の捕獲を回避するため溶液中で非膨潤性でなければならず；（ｂ）支持体は重合体鎖の余分な成長を遮蔽するほど小さい細孔または空隙を含有してはならず；（ｃ）官能基は支持体表面で接触可能でなければならず；（ｄ）支持体は方法において使用される試薬および条件に対して不活性であり、そして組立方法を妨害してはならず；（ｅ）官能基の表面の密度は遺伝子組立のために適切でなければならず；そして（ｆ）表面結合化学は再現性があり、効率的であり、経済的でなければならない。
【００４７】
固相遺伝子組立のための好ましい固体支持体材料は多孔性のポリエチレンまたはポリプロピレンである。これ等の表面はプラズマ処理（Ｒ．Ｍａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｒａｍｐａｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｃｏａｓｓｉｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９９４），ｖｏｌ．２１７，３０６−３１０）、次いで、カルボジイミド化学によるユニバーサルリンカーオリゴへのプラズマ処理により導入された反応性の基の共有結合により誘導してよい。非緊密な樹脂ビーズの集積物とは異なり１ピース、即ちモノリシックな多孔性のフリットを使用する工程；の利点は、アニーリングおよび連結反応の間に固体表面周囲の試薬の小容量を循環させる反復前方／逆方流動方法をフリットが可能にする点である。この混合様式は２００ｂｐ遺伝子長を超える大分子の固相反応に特に有利である。この理論に制約されないが、流動が長コイルｄｓポリヌクレオチド分子の伸長を補助し、その拡張末端を溶液標的がより接触し易いようにしていると考えられる（Ｔ．Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｃｈｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）  ｖｏｌ．２７６，２０１６−２０２１；Ｄ．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｂａｂｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ｓ．Ｃｈｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）ｖｏｌ．２８３，１７２４−１７２７；Ｃ．Ｈａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗｉｒｔｚ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（２０００）  ｖｏｌ．７９，１５３０−１５３６）。結合工程の効率を上昇させるためには、支持体は好ましくは非緊密なビーズではなく固定された支持体である。
【００４８】
本発明の装置および方法において使用するための好ましい固体支持体材料は５〜３５μｍの細孔を有する多孔性ポリエチレンである。この材料は数社、例えばＰｏｒｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆａｉｒｂｕｒｎ，ＧＡ）およびＰｏｒｖａｉｒ  Ａｄｖａｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＮＣ）より製造販売されている。両社ともフリットを直接鋳造できる。或いは、これ等の会社および他の供給元はバルク材料のシートまたはロッドから注文どおりのフリット形状を打ち抜く工程；ができる。
【００４９】
別の固体支持体材料は上記した同じカラムで使用できるポリスチレン樹脂である。この材料を使用する工程；の利点は、従来のバッチ様式において固体支持体を製造し、それにオリゴを結合するために使用できる点である。樹脂は上記した同様の反応カラム内にポリエチレンフリットの２ピースの間に緊密に充填されて含有されている。固体支持体の製造は、カラムの充填により時間がかかるものの、個々のフリットを製造するよりも簡素でより経済的である。
【００５０】
本発明において使用してよい他の有機固体支持体は例えばポリプロピレン、ポリアクリレートおよびポリメタクリレートを包含する。有機固体支持体の代わりに、無機材料も使用してよく、例示される無機材料は金属酸化物、例えばシリカまたはアルミナを包含する。
【００５１】
固体支持体は何れかの従来の形態であってよく、ここで適当な形態は例えばモノリシック多孔性材料およびメンブレンである。固体支持体は非多孔性の材料、例えばビーズ、繊維または他の粒状物質の集積物である工程；により多孔性となってもよい。
【００５２】
（３．ユニバーサルオリゴ）
本発明の組立方法は固体支持体に連結したオリゴヌクレオチドを用いて開始され、この場合、この特定のオリゴヌクレオチドは本明細書においてはユニバーサルオリゴヌクレオチドまたはユニバーサルオリゴと称する。ユニバーサルオリゴは後述する態様において場合により二本鎖形態において別の（第２、第３の等々）オリゴとの接触により伸長され、二本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓ−ポリヌクレオチド）を与える。次にｄｓ−ポリヌクレオチドの部分を固体支持体から分離して所望のｄｓ−ポリヌクレオチドおよびユニバーサルオリゴをなお固体表面上に結合している状態で得る。本発明の多くの利点の１つは原料、即ち固体表面上に結合しているユニバーサルオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチド合成の終了時に再生され、そして別のポリペプチドの作成のために使用できる点である。固体支持体に連結しているオリゴヌクレオチドは本明細書においてはユニバーサルオリゴヌクレオチドと称するが、その理由はユニバーサルオリゴのヌクレオチド配列は第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは独立しており、即ち、ユニバーサルオリゴは「普遍的（ユニバーサル）に」、即ち、第１のポリヌクレオチドの何れの配列に対しても使用できるためである。
【００５３】
ユニバーサルオリゴヌクレオチドが固体支持体に連結する態様は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドが（ｉ）第２のオリゴヌクレオチド（本明細書においては架橋オリゴヌクレオチドと称する）とのハイブリダイゼーション反応のために接触可能な態様で連結しており、そして（ｉｉ）伸長反応の過程において固体支持体に連結した状態で残存する限り本発明においては重要ではない。オリゴヌクレオチドおよび固体支持体の両方とも当該分野で知られている。さらにまた固体支持体にオリゴヌクレオチドを連結させる方法も当該分野で知られている。さらにまた本発明により必要とされる態様において固体支持体に連結したオリゴヌクレオチドも当該分野でよく知られている。
【００５４】
１つの共通する手法はカルボン酸官能基を有する固体支持体を使用し、次にこれ等のカルボキシル基をアミン末端オリゴヌクレオチドと反応させる工程；である。逆の手法、即ちその表面にアミン官能基を有する固体支持体を使用し、支持体とカルボン酸末端オリゴヌクレオチドと反応させる手法も、共通して用いられている。いずれの場合においても、アミド基は固体支持体のオリゴヌクレオチドに連結する。
【００５５】
従来どおり、オリゴヌクレオチドは３’および５’末端の両方を有するものとして認識される。ユニバーサルオリゴの３’末端または５’末端の何かを本発明の固体支持体に連結させてよい。しかしながら支持体結合ユニバーサルオリゴヌクレオチドの特別な条件は固体支持体に連結していないオリゴヌクレオチドの末端、即ち本発明において遊離末端と称するものは、非反応性であると同時に、天然のヌクレオチドと空間的に同様または同一でなければならないというものである。非反応性の遊離末端を得るための選択肢は後に記載する。
【００５６】
ユニバーサルオリゴに存在するヌクレオチドの数およびこれ等のヌクレオチドの塩基配列は重要ではない。好ましくは、ユニバーサルオリゴは５〜５０ヌクレオチドを有する。ユニバーサルオリゴが５ヌクレオチド未満を有する場合、それは架橋オリゴと極めて安定なハイブリッドを形成しない。合理的に安定なハイブリッドを形成するためには、ユニバーサルオリゴは好ましくは１０〜３０ヌクレオチド、例えば約２０ヌクレオチドを有する。３０ヌクレオチド超を有するユニバーサルオリゴを本発明の実施において使用してもよいが、これ等の比較的長いユニバーサルオリゴは特に好都合ではなく（特にリンカー基がユニバーサルオリゴと固体支持体の間に位置する場合）、そして、一般的に作成により経費を要する。
【００５７】
ユニバーサルオリゴの塩基配列は重要ではない。好ましくはユニバーサルオリゴがヘアピンを形成しないように配列を選択する。さらにまた、配列のハイブリッドが反応のワーキング温度より高値、即ち概ね室温より高値のＴｍ（二本鎖５０％の融点）を有するように配列を選択しなければならない。さらにまた、ユニバーサル配列はＡのみ、またはＴのみ、またはＧのみ、またはＣのみを有さない工程；が好ましい。
【００５８】
（４．リンカー基）
ユニバーサルオリゴは固体支持体に直接連結してよいが、本発明の１つの特徴においては、リンカー基はユニバーサルオリゴと固体支持体の間に位置させる。リンカー基は部分的には都合上存在する。即ち、一部の固体支持体はユニバーサルオリゴに容易に、または経済的に存在する反応性の基と反応しない反応性の基を有する。この場合、リンカー基は２官能性であり、固体支持体およびユニバーサルオリゴの両方と反応する官能基を有する。しかしながら、リンカー基はまたユニバーサルオリゴを溶液中にさらに進展させる目的のためにも寄与し、そしてこのため、架橋オリゴとの反応により使用し易くなっている。従って、本発明の１つの特徴において、リンカー基は固体支持体とユニバーサルオリゴの間に位置する。
【００５９】
好ましい特徴において、ポリオキシアルキレンのセグメントを固体支持体とユニバーサルオリゴのヌクレオチド配列の間に位置させる。ポリオキシアルキレンのこのセグメントは好ましくはポリオキシエチレンである。１つの特徴において、ポリオキシアルキレンのセグメント内には２〜５０のオキシアルキレン単位が有るが、種々の他の特徴においては、ポリオキシアルキレン内には２〜４０、４〜４０、６〜４０、２〜３０、４〜３０、６〜３０のオキシアルキレン単位が有る。ポリオキシアルキレン単位は３０より多いオキシアルキレン基を含有してよいが、これはユニバーサルオリゴ／固体支持体製品の経費を増大させる傾向がある。このポリオキシアルキレンセグメントはリン酸基を含有してよい。リン酸基は好都合にはポリオキシアルキレンセグメント内部に位置づけられるが、これは、例えばポリヌクレオチドセグメントの内部またはこれに隣接してポリオキシアルキレンセグメントを含むためにオリゴ製造のための固相合成の手法を容易に使用する工程；ができ、このような場合、ポリオキシアルキレンセグメントはリン酸基を含むためである。
【００６０】
（５．架橋オリゴおよび開始二本鎖）
図２に示す通り、架橋オリゴは固体支持体上のユニバーサルリンカーオリゴおよび標的遺伝子の１末端の両方にアニーリングする。この架橋オリゴは連結に関与せず、従って、穏やかな変性条件下で除去できる。この方法には幾つかの利点がある。ユニバーサルオリゴヌクレオチドを有する単一の固体支持体は製造、品質管理および在庫を単純化させる。連結の選択的な可逆性により、正しい緩衝液および熱条件の下で容易に生成物遺伝子または遺伝子フラグメントを固体支持体から遊離させる工程；ができ、そしてこのため、標的への制限部位配列の付加を回避できる。この可逆的連結の重要な利点は、固体支持体を  再使用できる工程；であり、この工程；は新しい遺伝子の製造が新しい固体支持体を手作業によりロードする過程を含まない工程；を意味する。
【００６１】
本発明の第１工程において、架橋オリゴヌクレオチドはユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。何れかの所望のヌクレオチド配列の架橋オリゴヌクレオチドを得るための方法は当該分野で知られている。実際、このようなオリゴヌクレオチドは多くの製造元より市販されている。この第１工程の生成物を原料（初期）二本鎖と称する。
【００６２】
開始二本鎖の条件は架橋オリゴヌクレオチドの部分がユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない工程；である。好ましくは、ユニバーサルＯＤＮにハイブリダイズしない架橋ＯＤＮの部分は隣接するヌクレオチドの配列よりなり、ここで、配列は少なくとも５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、または１６、または１７、または１８、または１９、または２０ヌクレオチド長以上である。ユニバーサル（支持体結合）オリゴヌクレオチドと架橋（溶液相）オリゴヌクレオチドの間に適当なハイブリッドを形成するための方法も同様に当該分野で知られている。
【００６３】
ユニバーサルおよび架橋オリゴヌクレオチドの間のハイブリッドは、架橋ＯＤＮおよび第１のポリヌクレオチドの部分を形成する第１のＯＤＮの間に形成されるハイブリッドと少なくとも相対比較した場合に強力でなければならない。別の特徴において、ユニバーサルＯＤＮはＧ／Ｃ結合がＡ／Ｔ結合より強力であるため、少なくとも５０％ＧＣ含量である。ハイブリダイズして第１のハイブリッドを形成する塩基の典型的な数は１７である。このハイブリッド中のハイブリダイズした塩基の数が減少するに従い、ハイブリッドは典型的には、ハイブリッドの強度を維持するためにはより高値の比率のＧ／Ｃ塩基対を含有しなければならなくなる。典型的には、ハイブリッドに十分な強度を与えるためには、第１のハイブリッドはハイブリダイズした形態にある少なくとも約１０塩基を有さなければならない。ハイブリッドは１７個より多いハイブリダイズした塩基を含有できるが、約２５塩基より多くがハイブリダイズした形態にある場合は所望の塩基対を有さないハイブリッドが形成される可能性が高くなる。しかしなお、第１のハイブリッド中のハイブリダイズした塩基の数の上限は２５超、むしろ３０超である。
【００６４】
（６．第１の中間体二本鎖）
第１の工程の前、同時または後におこなってよい第２の工程において、第１のＯＤＮを架橋ＯＤＮと接触させる。第１のＯＤＮはそれが第１のポリヌクレオチドの部分となる上記ＯＤＮの一番目のものであるため、「第１のＯＤＮ」と称する。第１のＯＤＮは少なくとも部分的には相補であり、従って、非相補である架橋ＯＤＮの部分にはハイブリダイズし、そしてユニバーサルＯＤＮにはハイブリダイズしない。第１のＯＤＮが架橋ＯＮＤにハイブリダイズする場合、第２のハイブリッドがこれにより形成され、ここで、第２のハイブリッドは架橋ＯＤＮの第１のヌクレオチド領域にハイブリダイズしたユニバーサルＯＤＮおよび架橋ＯＤＮの第２のヌクレオチド領域にハイブリダイズした第１のＯＤＮを含み、ここで第１のＯＤＮはさらにユニバーサルまたは架橋ＯＤＮの何れにもハイブリダイズしないヌクレオチド領域を含む。
【００６５】
第２の工程を第１の工程と同時に行う場合、架橋および第１のＯＤＮを同時にユニバーサルオリゴヌクレオチドに接触させる。この「同時」手法の１つの実施形態において、架橋および第１のＯＤＮを相互にアニーリングした後にそれらをユニバーサルＯＤＮに接触させる。第２の工程を第１の工程の後に行う場合は、第１のＯＤＮを第１のハイブリッドにハイブリダイズさせる。第２の工程を第１の工程よりも前に行う場合は、ユニバーサルおよび第１のＯＤＮを相互に接触させるがハイブリダイズさせず、そして架橋オリゴヌクレオチドを添加した時点でそれをユニバーサルおよび架橋ＯＤＮにハイブリダイズさせる。
【００６６】
この第１の中間体ハイブリッドは、本発明において有用であるためには、多くの基準に合致しなければならない。第１に、ユニバーサルＯＤＮの遊離末端、即ち固体支持体に直接結合していない末端は、オリゴヌクレオチド連結反応の過程を通じて如何なる他のオリゴヌクレオチドとも共有結合してはならない。この目標を達成するための１つの方法はユニバーサルＯＤＮの遊離末端がヒドロキシル基を含まないようにする工程；である。固体支持体をユニバーサルＯＤＮの３’末端に結合させる場合は、５’末端は、それが他のＯＤＮとの連結反応に参加しないようにするためにはリン酸基を保有しなくてよい。さらにまた本発明の好ましい実施形態においては、架橋ＯＤＮは、ユニバーサルＯＤＮにハイブリダイズするヌクレオチド配列と第１のＯＤＮにハイブリダイズするヌクレオチド配列の間に存在する本明細書においてはギャップ配列と称するヌクレオチドの配列が存在するように設計する。このギャップ配列は、ユニバーサルＯＤＮの遊離末端に最も近接している第１のＯＤＮの末端からユニバーサルＯＤＮの遊離末端を、これ等の末端が第２のハイブリッド内に存在する工程；からギャップ配列の長さと等しい距離で、効果的に分離する。
【００６７】
別の基準として、ユニバーサルおよび架橋ＯＤＮの間に形成されたハイブリッドのＴｍ（融点）は好ましくは架橋および第１のＯＤＮの間に形成されたハイブリッドのＴｍより高値である。この態様において、架橋およびユニバーサルＯＤＮは架橋および第１のＯＤＮを融解（脱ハイブリダイズ）する条件下でハイブリダイズしたまま残存している。
【００６８】
（７．洗浄工程）
方法の各工程の間、所望の生成物は精製された形態、即ち望ましくないＯＤＮを含有しない状態で存在しなければならない。例えば、ユニバーサルＯＤＮを固体支持体に連結した後、これを何れの非連結（溶液相）ユニバーサルＯＤＮも除去されるように洗浄する工程；が望ましい。同様に、第１の中間体ハイブリッドを形成する工程；が望ましい場合は、架橋ＯＤＮを好ましくは第１のハイブリッドから洗浄除去した後に、オリゴヌクレオチド伸長反応を継続する。同様に、第２の中間体ハイブリッドを形成した後に、第２のハイブリッドの部分ではない何れかのユニバーサル、架橋または第１のＯＤＮは好ましくはそれらが第２のハイブリッドとそれ以上接触できないように洗浄除去する。そのようにする工程；により、表面結合ユニバーサルＯＤＮのモル量に基づいた場合の所望のポリヌクレオチドの収率が上昇する傾向がある。
【００６９】
（８．第１のオリゴｖｓ第２の二本鎖）
第１のＯＤＮは、第１のＯＤＮが架橋ＯＤＮにハイブリダイズする時点において第２のＯＤＮにハイブリダイズしてもしなくてもよい。しかしながら、第１のＯＤＮの必要な特徴はそれが架橋ＯＤＮにハイブリダイズした後であっても、第２の部分的に相補のＯＤＮにハイブリダイズするために使用できるヌクレオチド配列がある工程；である。第３のＯＤＮおよび第４のＯＤＮ等々についても、第１のポリヌクレオチドまたはその所望の部分を製造するために必要であれば同様の工程；が言える。即ち、第１、第２、第３、第４、第５等々のＯＤＮを含む各ＯＤＮは、本発明により製造された二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖中に存在する２つのＯＤＮにハイブリダイズする。換言すれば、第１、第２等々のＯＤＮの各々は２つのＯＤＮに部分的にハイブリダイズする。ＯＤＮ、例えば第２のＯＤＮが２つの相補ＯＤＮ、例えば第１および第３のＯＤＮにハイブリダイズする場合、２つの相補ＯＤＮの間、例えば共に第２のＯＤＮにハイブリダイズする場合の第１および第３のＯＤＮの間には、ヌクレオチドギャップが無い工程；が好ましい。こうする工程；により、リガーゼは第１および第３のＯＤＮを共に結合する工程；ができるようになる。換言すれば、全体で、第１、第２、第３等々のＯＤＮは第１のポリヌクレオチドまたはその所望の部分に存在するヌクレオチドの各々を含む。
【００７０】
本発明の任意の実施形態において、２つ以上のＯＤＮを共に連結した後に、第１のポリヌクレオチドを形成する最終連結反応を行ってよい。例えば、第１、第２および第３のＯＤＮが共にアニーリングして第１の中間体二本鎖を形成した後、得られたコンストラクトを連結条件に付してよい。この連結生成物を次に第４等々のＯＤＮおよび／または二本鎖に曝露する工程；により第１のポリヌクレオチドを製造する工程；を目標にしてビルドしてよい。最終連結反応の前の、特に部分的または非連結型の表面結合ＯＤＮを本明細書においてはＯＤＮコンストラクトと称する。
【００７１】
（９．連結）
ＯＤＮの各々が所望の順序において相互にハイブリダイズした後、完全ハイブリダイズコンストラクトを連結条件に付す工程；により、第１、第３、第５等々のＯＤＮを順次相互に共有結合させ、そして、第２、第４、第６等々のＯＤＮを順次相互に共有結合させる。この連結反応の後、別のＯＤＮに連結していないＯＤＮはユニバーサルおよび架橋ＯＤＮのみである。
【００７２】
（１０．遺伝子フラグメント単離）
連結反応が終了した後、連結フラグメントが架橋ＯＤＮから変性し、そして架橋ＯＤＮがユニバーサルＯＤＮから変性するように、生成物を変性条件に曝露する。この反応順序による最終生成物はユニバーサルＯＤＮに連結した固体支持体、架橋ＯＤＮ、および、第１、第２、第３、第４等々のＯＤＮの生成物である第１のオリゴヌクレオチドである。この時点でユニバーサルオリゴは別の遺伝子または遺伝子フラグメントの製造のために使用してよい。
【００７３】
（Ｃ．遺伝子フラグメントから遺伝子へ）
（１．遺伝子フラグメントの組立）
本発明の１つの特徴において、オリゴを共に連結する工程；により製造したポリヌクレオチドは最終的な所望のポリヌクレオチド（遺伝子）のフラグメントである。共に連結するオリゴの数が増大するに従って、特定のポリヌクレオチドが所望の配列を有する可能性は低下する。これは大部分はオリゴが１００％純度でないという事実に起因する。従って、約８００塩基対超の所望のポリヌクレオチドを製造するための本発明の好ましい特徴においては、本明細書に記載した固相合成の操作法を用いて２つ以上の遺伝子フラグメントを製造し、そして次に、これ等の２つの遺伝子フラグメントを好ましくは連結条件下に共に結合させて、最終的な所望のポリヌクレオチドを作成する。
【００７４】
即ち、第１のポリヌクレオチドは最終的な所望の標的ポリヌクレオチドであっても無くてもよい。本発明の１つの特徴において、第１のポリヌクレオチドは最終的な所望の標的であり、そしてそれは、第１のポリヌクレオチドが利用される工程、例えばｍＲＮＡ合成のための鋳型として機能する工程；を可能にするベクターまたは他のコンストラクト内にそれ挿入する工程；を可能にする末端基を有する。しかしながら、本発明の別の特徴においては、第１のポリヌクレオチドは最終的な所望の標的ではない。最終的な所望の標的を製造するためには、第２のポリヌクレオチドを、好ましくは第１のポリヌクレオチドを製造した場合と同様の態様において製造する。これ等の第１および第２のポリヌクレオチドは、それらが各々オーバーハングヌクレオチド配列を有するように設計し、ここで第１のポリヌクレオチドにおけるオーバーハングヌクレオチド配列は第２のポリヌクレオチドにおけるオーバーハングヌクレオチド配列に相補である。最終的な標的ポリヌクレオチドを製造するためには、第１および第２のポリヌクレオチドは、溶液中において、第１および第２のポリヌクレオチドを共に結合させるリガーゼの存在下に接触させる。前述したとおり、標的ポリヌクレオチドは、標的がｍＲＮＡ合成のための鋳型として機能できるようにするベクターまたは他のコンストラクト内にそれを挿入できるように設計してよい。
【００７５】
本発明の別の特徴において、複数のポリヌクレオチド、即ち、第１、第２等々のポリヌクレオチドを前述した固相法により製造し、ここでこれ等の複数のポリヌクレオチドは例えば連結反応を介して共に結合でき、標的ポリヌクレオチドを形成できる。換言すれば、本発明は２つ以上のポリヌクレオチドを提供し、ここでこれ等のポリヌクレオチドの少なくとも１つは本発明の固相合成法により製造され、共に連結して標的ポリヌクレオチドを形成してよい。
【００７６】
即ち、本発明の１つの特徴は固体支持体上に遺伝子またはその部分を組立するための方法を提供し、方法は下記工程：
（ａ）固体支持体上に第１の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第１のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有する工程；
（ｂ）第１のフラグメントを固体支持体から分離して溶液中の第１のフラグメントを得る工程；
（ｃ）固体支持体上に第２の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第２のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有し、そして第１のフラグメントと非同一である工程；
（ｄ）第１のフラグメントを支持体結合の第２の遺伝子フラグメントと結合させて最終遺伝子を得る工程；および、
（ｅ）（ｄ）の遺伝子を固体支持体から分離する工程；
を含む。
【００７７】
明確化のため、この場合および記載した方法における遺伝子フラグメントは二本鎖または部分二本鎖の形態内の２核酸分子であり、それらは共にハイブリダイズする個々のオリゴのセットではない工程；に注目されたい。僅か２つの遺伝子フラグメントを共に組み合わせる代わりに、２つより多い遺伝子フラグメントを組み合わせて所望の遺伝子を製造する。例えば本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体上に第１の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第１のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有する工程；
（ｂ）第１のフラグメントを固体支持体から分離して溶液中の第１のフラグメントを得る工程；
（ｃ）固体支持体上に第２の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第２のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有し、そして第１のフラグメントと非同一である工程；
（ｄ）固体支持体から第２のフラグメントを分離して溶液中の第２のフラグメントを得る工程；
（ｅ）固体支持体上に第３の遺伝子フラグメントを組立てる工程；
（ｆ）第１のフラグメントを支持体結合の第３の遺伝子フラグメントに結合させてより長い遺伝子フラグメントとし、そして第２の遺伝子フラグメントをより長い遺伝子フラグメントに結合させて最終遺伝子とする工程；および、
（ｇ）最終遺伝子を固体支持体から分離する工程；
を含む３つの遺伝子フラグメントが組み合わせられる方法を提供する。
【００７８】
この方法を拡張する工程；により、４、５、６、７またはこれより多くの遺伝子フラグメントを組み合わせて最終遺伝子が得られるようになる。これ等の方法は、部分的には遺伝子フラグメントの１つを固体支持体に結合させたままとし、そして次に溶液相の遺伝子フラグメントを固体支持体結合遺伝子フラグメントに添加する工程；に依存している。しかしながら、本発明の別の特徴においては、遺伝子フラグメントの全てを溶液中で共に組み合わせる。例えば、本発明は溶液中で最終遺伝子を組立てるための方法を提供し、方法は下記工程：
（ａ）固体支持体上に第１の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第１のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有する工程；
（ｂ）第１のフラグメントを固体支持体から分離して溶液中の第１のフラグメントを得る工程；
（ｃ）固体支持体上に第２の遺伝子フラグメントを組立てる工程、ここで第２のフラグメントは少なくとも５０塩基対を有し、そして第１のフラグメントと非同一である工程；
（ｄ）固体支持体から第２のフラグメントを分離して溶液中の第２のフラグメントを得る工程；
（ｅ）第１のフラグメントおよび第２のフラグメントを単一の溶液中で組み合わせる工程；および、
（ｆ）工程（ｅ）の第１および第２のフラグメントを共有結合させて溶液中の最終遺伝子を得る工程；
を含む。
【００７９】
この方法は、３、４、５等々の遺伝子フラグメントを製造し、そしてこれ等のフラグメントを溶液中に組み合わせる工程；により最終的な所望の遺伝子を得る工程；にも拡張してよい。
【００８０】
（Ｄ．ユニバーサルオリゴに結合させた固体支持体を含む製品）
（１．固体支持体＋リンカー基＋ユニバーサルオリゴ）
本発明の別の特徴において、固体支持体、ポリヌクレオチド（例えば前述したユニバーサルオリゴ）および支持体とポリヌクレオチドとの間に位置する連結基を含む製品が提供される。連結基は固体支持体およびポリヌクレオチドの両方に共有結合しており、従って本発明のこの特徴は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮにより示してよい製品を提供し、ここで「ＳＳ）」とは固体支持体を示し、「Ｌ」は連結基を示し、そして「ＰＮ」はポリヌクレオチドを示す。ＰＮの５’末端はＬに直接結合してよく、この場合、製品は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ（５’）と示してよく、或いは、ＰＮの３’末端がＬに直接結合してよく、この場合、製品は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ（３’）と示してよく、ここでこれ等は本発明の２つの個別の特徴である。
【００８１】
連結基は（１つ以上の）ポリオキシアルキレン基であるか、これを包含する。種々の実施形態において、以下の基準の１つまたは何れかの２つ以上を用いて製品を説明する：即ち、ポリオキシアルキレン基はポリオキシエチレン基であり；２つのポリオキシアルキレン基が連結基中に存在し、ここでこれ等の２つのポリオキシアルキレン基はリン酸基により分離され、これによりＰＯＡ−ＰＨ−ＰＯＡで示される構造を与え、ここで「ＰＯＡ」はポリオキシアルキレン基を示し、そして「ＰＨ」はリン酸基を示し；３つのポリオキシアルキレン基が連結基中に存在し、ここでそれらはリン酸基により相互に分離され、即ちリンカーは構造ＰＯＡ−ＰＨ−ＰＯＡ−ＰＨ−ＰＯＡを包含し；リンカーはさらに炭化水素基（ＨＣ）を含み、ここで炭化水素基は固体支持体とポリオキシアルキレン基の間に位置し、これによりＨＣ−ＰＯＡ−（場合によりＰＨ−ＰＯＡ等）で示される構造を与え、ここで「ＨＣ」は炭化水素基を示し；炭化水素基は分子式重量５０〜５００ｇ／モルを有し；ポリヌクレオチド基は５〜５０ヌクレオチドよりなり；ポリヌクレオチドの５’末端はリンカー基に結合され、そしてポリヌクレオチドの３’末端はリン酸基または別のオリゴまたは二本鎖の５’ホスホリル化末端に連結できない他の基を含有し；ポリヌクレオチドの５’末端はリンカー基に結合され、そして、ポリヌクレオチドの３’末端はヒドロキシル基で終結している。即ち、１つの特徴において、本発明は式ＳＳ）−（ＰＯＡ−ＰＨ）ｎ−ＰＯＡ−ＨＣ−ＰＮ（３’）により示される製品を提供し、ここでｎは１〜１０から選択される整数である。
【００８２】
（２．固体支持体＋リンカー基＋ユニバーサルオリゴ＋架橋オリゴ）
別の特徴において、本発明は架橋オリゴにアニーリングする上記製品（即ち式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮの製品）を提供する。架橋オリゴは「Ｐ」基中に存在するヌクレオチドの一部または全部にアニーリングするリンカーポリヌクレオチド領域を包含する。好ましくは、リンカーポリヌクレオチド領域は５〜５０の隣接ヌクレオチドよりなる。架橋オリゴはさらに５〜５０隣接ヌクレオチドよりなる架橋ポリヌクレオチド領域を包含し、ここで架橋ポリヌクレオチド領域はＰＮのポリヌクレオチド基にアニーリングしない。ＰＮとのアニーリング形態の架橋オリゴは本明細書においては初期または開始二本鎖と称し、ここでこの開始二本鎖は本発明の１つの特徴である。１つの特徴において、製品は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ（３’）により示され、そしてＰＮにアニーリングする架橋オリゴは架橋オリゴの３’末端においてリン酸基を有さない。
【００８３】
（３．固体支持体＋リンカー基＋ユニバーサルオリゴ＋架橋オリゴ＋第１のオリゴ）
別の特徴において、架橋ＯＤＮの架橋ポリヌクレオチド領域は第１のオリゴ（Ａ）または第１の二本鎖（Ａ＋Ｂ）にアニーリングし、ここでは簡便のため、この説明を第１の二本鎖に関して行う。この状況は図３に示す通りであり、ここで
【００８４】
【化１】
2007508825.tif 000003
は固体支持体を示し、そして
【００８５】
【化２】
2007508825.tif 000004
および
【００８６】
【化３】
2007508825.tif 000005
は各々ポリヌクレオチドを示す。
【００８７】
この配置において、図３に示す通り、Ａの３’末端および５’末端の両方が連結反応を起こす工程；ができ、そしてＢの３’末端および５’末端の両方が連結反応を起こす工程；ができる工程；が望ましい。しかしながら、ＰＮの３’末端とＢＯの５’末端の何れも、図３に示すコンストラクトがリガーゼと接触する場合に連結反応を起こさない工程；が必要である。この目標を達成するために２つの方法を用いてよい。第１のものはギャップ法と称されるものであり、これによればＰＮおよびＡの両方がＢＯにアニーリングするが、それらはヌクレオチドギャップまたはスペーサー領域がＰＮの３’末端とＡの５’末端の間に形成されるような態様でアニーリングする。これは図３においてＧａｐ１として示す。このギャップは少なくとも１ヌクレオチド長であり、そして本発明の種々の特徴においてギャップは２、または３、または４、または５、または６ヌクレオチド長である。この同様の手法、即ちギャップを形成する工程；は、ＢＯの５’末端がＢの３’末端と連結しない工程；を確保するために使用する工程；ができ、この場合、この手法はこれ等の２末端の間に図３においてＧａｐ２として示すギャップを形成する工程；を包含する。
【００８８】
代替的な手法はＰＮの３’末端を「連結不可能」、即ち、リガーゼの作用に対し構造的に不適合とする工程；である。Ａの５’末端はリン酸基で終結しているため、ＰＮの３’末端をＡの５’末端と連結不可能とするためには、ＰＮの３’末端がヒドロキシル基を欠失していなければならない。例えば、ＰＮの３’末端はリン酸基を有してよく、これによりＰＮの３’末端とＡの５’末端の両方がリン酸基を有し、この場合、２つのリン酸基はリガーゼの作用下に共に連結する工程；はない。この場合、Ｇａｐ１は０ヌクレオチド長であってよい。場合により、Ｇａｐ１は１ヌクレオチド長以上であり、ＰＮの３’末端はＡの５’リン酸基と連結不可能となる。この手法によりＰＮの３’末端がＡと連結反応する工程；に２重に対抗できる。
【００８９】
本発明の種々の特徴において、Ｇａｐ１は約５ヌクレオチド長であり、ＰＮが３’ヒドロキシル基を有し、Ｇａｐ２は０ヌクレオチド長であり、そしてＢＯは５’リン酸基を欠失しており；Ｇａｐ１は１〜約５ヌクレオチド長であり、ＰＮが３’ヒドロキシル基を有し、Ｇａｐ２は１〜５ヌクレオチド長であり、ＢＯは５’リン酸基を有し；Ｇａｐ１は０ヌクレオチド長であり、ＰＮが３’ヒドロキシル基を欠失しており、Ｇａｐ２は０ヌクレオチド長であり、そしてＢＯは５’リン酸基を欠失しており；Ｇａｐ１は０ヌクレオチド長であり、ＰＮが３’ヒドロキシル基を欠失しており、Ｇａｐ２は１〜約５ヌクレオチド長であり、そしてＢＯは５’リン酸基を有する。
【００９０】
（４．製品を使用する方法）
別の特徴において、本発明は上記した製品を利用するポリヌクレオチド組立の方法を提供する。即ち、本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体、リンカー基、ユニバーサルオリゴおよび架橋オリゴを含む上記した製品を提供する工程；
（ｂ）オリゴまたは二本鎖を（ａ）の製品にアニーリングする工程；および、
（ｃ）リガーゼを用いてオリゴ２つ以上を共に結合させて第１の標的ポリヌクレオチドを形成する工程；
を包含するポリヌクレオチド合成の方法を提供する。
【００９１】
任意の実施形態において、方法はさらに下記工程：
（ｄ）ユニバーサルオリゴから架橋オリゴを分離する工程；
を包含する。
【００９２】
別の任意の実施形態において、架橋オリゴをユニバーサルオリゴから分離した後、ユニバーサルオリゴを別の架橋オリゴにアニーリングして第２の標的ポリヌクレオチドの形成を可能にする。換言すれば、固体支持体結合ユニバーサルオリゴは再使用され、別の遺伝子または遺伝子フラグメントが形成される。
【００９３】
別の特徴において、本発明は水性環境中の固体支持体上のポリヌクレオチド組立のための方法を提供し、これは当該分野で知られる通りのポリヌクレオチド組立のための方法を利用でき、発明的な進歩点は固体支持体にユニバーサルオリゴを共有結合的に結合する工程、架橋オリゴをユニバーサルＯＤＮにアニーリングして開始二本鎖を形成する工程、開始二本鎖が一本鎖形態の架橋ＯＤＮの部分を有する工程；により粘性末端を与える工程、および、開始二本鎖の粘性末端に第１のオリゴまたは第１の二本鎖をハイブリダイズする工程；を包含し、ここで、第１のオリゴ／二本鎖は後に操作して標的ポリヌクレオチドを形成する。任意の実施形態において、本発明の方法をさらに定義するために以下の基準の１つ以上を使用してよく、即ち、ユニバーサルオリゴはポリオキシアルキレン基およびポリヌクレオチド基を含み、ここでポリオキシアルキレン基は固体支持体とポリヌクレオチド基の間に位置し；ポリオキシアルキレン基はポリオキシエチレン基であり；リン酸基により分離されている２つのポリオキシアルキレン基が固体支持体とユニバーサルオリゴの間に存在し；リン酸基により分離されている複数のポリオキシアルキレン基が固体支持体とユニバーサルオリゴの間に存在し；炭化水素基がユニバーサルオリゴとポリオキシアルキレン基との間に位置し、ここで炭化水素基は分子式重量５０〜５００ｇ／モルを有し；ユニバーサルオリゴは５〜５０ヌクレオチドよりなり；ユニバーサルオリゴは末端リン酸基を欠失しており；ユニバーサルオリゴは末端リン酸基を有し；架橋オリゴはユニバーサルオリゴを形成するヌクレオチドの一部または全部にアニーリングするリンカーポリヌクレオチド領域を含み；架橋オリゴのリンカーポリヌクレオチド領域は５〜５０隣接ヌクレオチドよりなり；架橋オリゴはさらに５〜５０隣接ヌクレオチドよりなる架橋ポリヌクレオチド領域を含み、ここで架橋ポリヌクレオチド領域はユニバーサルオリゴのヌクレオチドにアニーリングせず；架橋ポリヌクレオチド領域はスペーサー基によりユニバーサルポリヌクレオチド領域から分離され、ここでスペーサー基は１〜約ヌクレオチドの隣接シリーズであり；そして、方法はさらに架橋オリゴの架橋ポリヌクレオチド領域を第１のオリゴまたは第１の二本鎖の粘性末端にアニーリングする工程；を包含し、ここで第１のオリゴ／二本鎖は架橋ＯＤＮにアニーリングするポリヌクレオチド領域を含み、第１のオリゴ／二本鎖はさらに一本鎖であるが架橋オリゴにアニーリングしないポリヌクレオチド領域を含み；架橋オリゴにアニーリングしない第１のオリゴ／二本鎖の一本鎖領域は５〜５０ヌクレオチドを有し；この方法により作成された第１の標的ポリヌクレオチドは、少なくとも１００、または少なくとも２００、または少なくとも３００、または少なくとも４００、または少なくとも５００塩基対を含む。
【００９４】
（Ｅ．混合条件）
１つの特徴において、本発明は溶液中のポリヌクレオチドに固体支持体結合ポリヌクレオチド（その何れかが部分二本鎖形態であってよい）を接触させる工程；により溶液ポリヌクレオチドを支持体結合ポリヌクレオチドにアニーリングするための方法を提供する。支持体結合ポリヌクレオチドは好ましくは前記した本発明の特徴によるユニバーサルオリゴおよび架橋オリゴを取り込むが、本発明のこの特徴においては、支持体結合ポリヌクレオチドはこの特定の配置を有する必要はない。換言すれば、溶液中のポリヌクレオチドに固体支持体結合ポリヌクレオチドを接触させる工程；により支持体結合ポリヌクレオチドに溶液ポリヌクレオチドをアニーリングさせる本発明の方法は一般的に何れの支持体結合ポリヌクレオチドにも適用される。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドを製造するためには、表面結合部分二本鎖オリゴヌクレオチド（開始二本鎖）を新規オリゴまたは二本鎖にアニーリングさせる。表面結合オリゴヌクレオチドの長さの伸長を継続するためには、各新規オリゴ／二本鎖の部分を支持体結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトにアニーリングし、新規ＯＤＮの残余部分を一本鎖のままとする工程；によりその後の伸長のための部位を与える。新規オリゴまたは二本鎖を表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトに接触させる反応条件はアニーリング生成物の高収率を達成するために極めて重要である。アニーリング生成物の収率は新規ＯＤＮにアニーリングする表面結合部分二本鎖ＯＤＮの比率である。
【００９６】
本発明の１つの特徴において、部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトが伸長されたコンホーメーションにある時点において固体支持体の表面に新規ＯＤＮを含む溶液を接触させる。この理論に制約されないが、本発明者等はＯＤＮコンストラクトが特定の長さに到達した時点でそれが自身上でコイルまたは折りたたみ構造となる時点でＯＤＮコンストラクトが熱力学的に安定な形態となる工程；を示唆する。即ち、コンストラクトの熱力学的に安定な形態はＯＤＮコンストラクト内に埋没するか、または、ＯＤＮコンストラクトの残余または隣接するＯＤＮコンストラクト内に埋没するか、これ等により別の態様で遮蔽される工程；により、溶液との接触から遮断されている、成長中の末端を有してよく、そして実際に有している場合が多い。この成長中の末端を新規ＯＤＮに接触させるためには、成長中の末端を他の固体支持体結合ＯＤＮと相互させるよりはむしろ溶液中で伸長させる工程；が有益である。この伸長を達成するために、本発明では、ＯＤＮコンストラクトおよび／またはＯＤＮコンストラクトを支持している表面に新規ＯＤＮの溶液を好ましくは猛烈な態様において強制的に通過させる。この強制により成長中の末端は他のＯＤＮ分子から遮断されつつ伸長して溶液中に至り、これにより成長中の末端は新規ＯＤＮに対してより接触容易となる。
【００９７】
即ち、好ましい特徴において、この伸長されたコンホーメーションは、溶液を固体支持体に強制通過させる場合に達成される。例えば、表面は管の内部であってよく、そして溶液はＯＤＮコンストラクトのコンホーメーションを伸長させるために十分の速度で管を通過して流動する。別の例として、表面は反応チャンバーを２つのサブチャンバーに分割するフリットであってよく、そして溶液はＯＤＮコンストラクトのコンホーメーションを伸長させるのに十分な速度で、一方のサブチャンバーから他方に通過する。別の代替例としては、ＯＤＮコンストラクトをチャンバーの内表面に結合させ、新規ＯＤＮを含む溶液をチャンバーに注ぎ込み、そして、攪拌により溶液が表面結合ＯＤＮコンストラクトを通過して成長中の末端がＯＤＮコンストラクトとの緊密な接触から遮断されるように、攪拌装置、例えばメカニカルスターラーを溶液中に入れる。この方法は、新規ＯＤＮの溶液を固定相ＯＤＮコンストラクトを強制通過させる場合には静的表面法と称する。
【００９８】
代替法として、新規ＯＤＮの溶液は静的なものであり、そしてＯＤＮコンストラクトを連結している表面を溶液中に没入または牽引させてよい。例えば新規ＯＤＮの溶液をチャンバー内に位置させ、ＯＤＮコンストラクトを結合している表面は攪拌装置、例えばメカニカルスターラーのフィンである工程；ができる。攪拌装置作動時には、フィン表面は溶液中に没入され、部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトは強制的に伸長コンホーメーションとされる。フィンが回転する方向を交互に変える工程；により洗濯機型の動きを達成してよい。一般的に手法はポリヌクレオチドに結合した表面を強制的に溶液通過させるこの手法は、本明細書においては、静的溶液法と称する。静的溶液法は反復フロースルー手法の一例である。
【００９９】
本発明者等の理論の正誤に関わらず、新規ＯＤＮの溶液を表面結合ＯＤＮコンストラクトを強制通過させる工程、および／または、表面結合ＯＤＮコンストラクトを新規ＯＤＮの溶液に強制的に通す工程；は、何れも強制的に相互通過させない状況と相対比較して第１のポリヌクレオチドの収率の望ましい上昇をもたらす工程；が実験的に観察されている。
【０１００】
アニーリング生成物の高収率を達成するためには、表面結合ＯＤＮコンストラクトは溶液中の新規オリゴヌクレオチドと接触する複数の機会を有する工程；が好ましい。本発明の１つの特徴において、この目標は部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトに結合する表面を経由して固定量のオリゴヌクレオチド含有溶液を反復して（例えば２回、３回、４階）通過させる工程；により達成される。例えば表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトが２つのサブチャンバーを分離するフリットに結合している場合は、新規ＯＤＮ溶液はそれが一方のチャンバーから他方に移行する際にフリットを通過して複数回移行させる工程；ができる。表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトが管の内部に結合している場合は、管でループを形成し、新規ＯＤＮの溶液をループを通過させて反復して送液してよい。固定容量のオリゴヌクレオチド含有溶液が部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトに結合している表面上の位置を反復通過するこの手法は、本明細書においては、連続フロースルー接触または再使用手法と称する。
【０１０１】
或いは、十分なオリゴヌクレオチド含有溶液が使用できる場合は、この目標は漸増量のオリゴヌクレオチド含有溶液が部分二本鎖ＯＤＮコンストラクト結合表面を経由して通過する工程；により達成してもよい。例えば新規ＯＤＮに表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの所望量がアニーリングするのに十分な時間、部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトに結合した内表面を有する管を通してレザバからオリゴヌクレオチド含有溶液を送液してよい。非循環法と称されるこの手法は典型的には、アニーリング生成物の同じ収率を達成するために再循環法の場合よりも多くの溶液オリゴヌクレオチドを必要とし、そしてこの理由のため、非再循環手法は好適度が低い手法である。
【０１０２】
上記した方法において、同じ機械的強制力を用いて部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの伸長と部分二本鎖コンストラクトと溶液中新規ＯＤＮとの間の複数回の接触の両方を達成する。これは本発明の好ましい特徴である。しかしながら、この手法は部分二本鎖コンストラクトと溶液中新規ＯＤＮとの間の複数回の接触を達成するために使用される強制力が、部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの伸長を達成するためにも十分である工程；を必要とする。例えばポリヌクレオチドをメカニカルスターラーのフィンに結合させる場合は、スターラーは結合したＯＤＮコンストラクトが伸長されるのに十分な回転速度において操作しなければならない。同様に、ＯＤＮコンストラクトをフリット表面に結合させる場合は、新規ＯＤＮ溶液は溶液内へのＯＤＮコンストラクトの成長中の末端の伸長を起こすのに十分な速度でフリットを経由して一方のチャンバーから他方に通過しなければならない。本明細書においては、「機械的強制力」とは溶液および／または表面の移動を達成するための系内に導入されるエネルギーの量をさす。
【０１０３】
機械的強制力が表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの伸長をもたらすのに十分であるかどうかは溶液の粘度および反応容器の厳密な形状に依存している。例えば、カラムの長さおよび内径またはフリットの孔径および厚みが挙げられる。何れかの特定の形状に対してＯＤＮコンストラクトの伸長を達成するために必要な条件は数種の探索的反応を実施する工程；により容易に決定してよい。例えば、形状が確立された後、一連の反応条件をランダムに選択し、そしてこれ等の条件下に達成されたアニーリングの収率を測定する。次に機械的強制力を選択された値、例えば５０％だけ増大させ、そしてこれ等の新しい条件下にアニーリング収率を測定する。例えば部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトが結合している表面の上の特定の固定された点を通過する流量を約５０％増大させてよい。これ等の新しい反応条件がより高いアニーリング収率を達成すれば、機械的強制力を例えば５０％だけさらに増大させ、そしてアニーリングの収率を再度測定する。これ等の新しい反応条件がより高いアニーリング収率を達成しなければ、第１の反応に過剰な機械的強制力が使用されており、そして第２の反応はより低値、例えば５０％低値の機械的強制力を用いて実施しなければならない。このようにして、機械的強制力ｖｓアニーリング収率のプロットを容易に得る工程；ができる。典型的には、閾値の機械的強制力未満においては、機械的強制力を変化させてもアニーリングの収率は増大しない。やはり典型的には、特定の機械的強制力を超えている場合、機械的強制力を増大させてもアニーリング収率がさらに上昇する工程；は無く、むしろＤＮＡ鎖／ＯＤＮコンストラクトの破壊をもたらす場合がある。当業者等は特定の制約事項および目標に基づいて適当な機械的強制力および形状を選択できる。
【０１０４】
本明細書においては、より高いアニーリング収率は表面結合部分二本鎖ポリヌクレオチドの伸長によりもたらされると推定され、そして伸長は機械的強制力によりもたらされると推定される。この工程；は観察された結果を説明する本発明者等の理論である。実際に観察された結果は、アニーリング収率はアニーリング反応中に十分な機械的強制力が使用されなければ極めて高値にはならないという工程；である。即ち、ある機械的強制力が使用される工程；により溶液および表面が相互に強制通過されない限り、比較的長い表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトについてはアニーリング収率は極めて低値である工程；が実験的に観察されている。
【０１０５】
本発明の好ましい特徴において、ある容量の溶液を固体支持体の表面領域に反復して通過させ、ここで表面領域は部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトに結合しており、そして、その容量の溶液は表面結合ＯＤＮコンストラクトの一本鎖部分に相補であるオリゴヌクレオチドを含有している。好ましくは、圧力の低下が表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトにアニーリングしているＯＤＮの低収率をもたらすような圧力下にその容量の溶液は固体支持体の表面領域を繰り返し通過し、その際、全ての因子、例えば、時間、オリゴヌクレオチド濃度および温度は一定に保持する。
【０１０６】
関連する特徴においては、表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトを新規ＯＤＮ含有溶液を通して強制的に移動させ、ここで新規ＯＤＮは表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補である。好ましくは、表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトは、強制力の低減が表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトにアニーリングしている新規ＯＤＮの低収率をもたらすような強制力により溶液を通過して強制的に移動させ、その際、全ての因子、例えば、時間、オリゴヌクレオチド濃度および温度は一定に保持する。
【０１０７】
１つの特徴においては、本発明は、表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの全てではないが殆どが新規オリゴヌクレオチドにアニーリングする工程；を提供し、そして従って種々の特徴において、本発明は表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％が新規オリゴヌクレオチドにアニーリングする工程；を提供し、ここで％値は固体支持体に結合している部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトのモル量に基づいたモル％である。
【０１０８】
アニーリング収率に対する流動混合によるＯＤＮコンストラクトの成長中の末端を伸長させる工程；の影響はＯＤＮコンストラクトが比較的短い場合、例えば約２００ヌクレオチド未満である場合には特に顕著ではない。しかしながら、ＯＤＮコンストラクトが長くなるに従って、溶液への成長中の末端の曝露は高いアニーリング収率を達成する工程；においてより重要な要因となる。従って、本発明の種々の特徴において、成長中末端伸長条件に曝露された表面結合部分二本鎖ＯＤＮコンストラクトは２００ヌクレオチド超、または３００ヌクレオチド超、または４００ヌクレオチド超、または５００ヌクレオチド超、または６００ヌクレオチド超、または７００ヌクレオチド超、または８００ヌクレオチド超、または９００ヌクレオチド超、または１０００ヌクレオチド超、または１２００ヌクレオチド超、または１４００ヌクレオチド超、または１６００ヌクレオチド超、または１８００ヌクレオチド超、または２０００ヌクレオチド超、または２５００ヌクレオチド超、または３０００ヌクレオチド超、または３５００ヌクレオチド超、または４０００ヌクレオチド超、または５０００ヌクレオチド超であり、これ等の数値の各々は場合により約６０００ヌクレオチド、または７０００ヌクレオチド、または８０００ヌクレオチド、または９０００ヌクレオチド、または１００００ヌクレオチドの上限を設けられる。
【０１０９】
表面結合部分二本鎖オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド溶液の間の混合を達成するための本発明による「強制力」の使用は一般的にこれ等の２成分を有する如何なる系に対しても適用される。即ち、表面結合部分二本鎖オリゴヌクレオチドは必ずしもではないが好ましくは、ユニバーサルオリゴおよび架橋オリゴから形成された上記定義された「開始二本鎖」である。
【０１１０】
即ち、１つの特徴において、本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体に結合した部分二本鎖核酸（ｄｓ−ＮＡ）を提供する工程；
（ｂ）ｄｓ−ＮＡの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ｓｓ−ＮＡ）の溶液を提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）のｄｓ−ＮＡを、溶液の少なくとも一部がある方向において及ぼされる力の影響下にｄｓ−ＮＡを通過するような条件下で工程（ｂ）の溶液に接触させ、この場合、（ｉ）ｓｓ−ＮＡはｄｓ−ＮＡの一本鎖部分にアニーリングし、そして（ｉｉ）溶液の少なくとも部分が少なくとも２回ｄｓ−ＮＡを通過するように少なくとも１回方向を反転させる工程；
を含む遺伝子組立のための方法を提供する。
【０１１１】
別の特徴において、本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体に結合した部分二本鎖核酸（ｄｓ−ＮＡ）を提供する工程；
（ｂ）ｄｓ−ＮＡの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ｓｓ−ＮＡ）の溶液を提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）のｄｓ−ＮＡを、溶液の少なくとも一部がある強制力の影響下にｄｓ−ＮＡを通過するような条件下で工程（ｂ）の溶液に接触させ、この場合、（ｉ）ｓｓ−ＮＡはｄｓ−ＮＡの一本鎖部分にアニーリングし、そして（ｉｉ）他の条件は一定であるが力が低下すればｄｓ−ＮＡの一本鎖部分にアニーリングするｓｓ−ＮＡの量が低減する工程；
を含む遺伝子組立のための方法を提供する。
【０１１２】
別の特徴において、本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体に結合された部分二本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドの溶液を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するある１つの方向に及ぼされる力の影響下に工程（ｂ）の溶液に工程（ａ）の固体支持体を接触させる工程；
を含む遺伝子または遺伝子フラグメントの組立のための方法であって、
工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分にアニーリングする上記方法を提供する。好ましくは工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドは部分二本鎖である。
【０１１３】
好ましい特徴において、本発明は下記工程：
（ａ）固体支持体に結合された部分二本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドの溶液を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するある１つの方向に及ぼされる力の影響下に工程（ｂ）の溶液に工程（ａ）の固体支持体を接触させる工程；および、
（ｄ）工程（ｂ）の溶液の少なくとも一部が少なくとも２回工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドを通過するように少なくとも１回工程（ｃ）において及ぼされる力の方向を反転させる工程；
を含む遺伝子または遺伝子フラグメントの組立のための方法であって、
工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖部分にアニーリングする上記方法を提供する。
【０１１４】
好ましくは、工程（ａ）の部分二本鎖ポリヌクレオチドが工程（ｂ）の溶液に繰り返し接触するように、工程（ｃ）で及ぼされる力の方向を複数回反転させ、そして、工程（ｂ）の一本鎖または部分二本鎖ポリヌクレオチドは部分二本鎖である。溶液を固体支持体の前を通過させる強制力は一定であってよく、それが好ましいが、或いは可変であってもよい。これ等の特徴の好ましい実施形態においては、固体支持体は多孔性であり、そして工程（ｂ）の溶液は複数回細孔を通過する工程；が必要である。
【０１１５】
（Ｆ．合成方法を評価するための定量試験）
２つの試験方法が固相遺伝子合成プロセスにおける重要な２つの工程を定量するのに用いられる：即ち、（１）固体支持体結合容量、および（２）固相連結効率の推定、である。これらの試験を次に説明する。
【０１１６】
（１．固体支持体結合容量の試験）
本発明の遺伝子組立において使用される固体支持体は好ましくは約１７ヌクレオチドを有するユニバーサルリンカーオリゴヌクレオチドに共有結合している。固体支持体表面の結合容量は以下の蛍光系試験法により測定される。リンカーオリゴを有する固体支持体をまず蛍光標識相補オリゴにハイブリダイズさせる。未ハイブリダイズの標識オリゴは過剰な洗浄により除去し、洗浄液を蛍光によりモニタリングする。次にハイブリダイズした標識オリゴを高温で変性する工程；により遊離させ、そしてその量を蛍光計で測定する。固体支持体は典型的には表面上で約１〜３ｐｍｏｌ／ｃｍ２の結合容量を有する。
【０１１７】
（２．固相の段階的連結効率を推定するための試験）
他の固相系の反応と同様、固相上の酵素的連結は溶液系の反応よりも低効率で緩徐である（Ｖ．Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｆｏｒｔｉｎａ  ａｎｄ  Ｓ．ＭｃＫｅｎｚｉｅ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，（１９９７）ｖｏｌ．１３，３２０−３２９；Ｍ．Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ，Ｓ．Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９７）ｖｏｌ．２５，１１５５−１１６１；Ｈ．Ｈａｋａｌａ，Ｅ．Ｍａｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｌｏｎｎｂｅｒｇ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．（１９９８）  ｖｏｌ．９  ３１６−３２１；およびＰ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｍ．Ｈｅｎｒｙ  ａｎｄ  Ｄ．Ｋｅｌｓｏ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  （１９９９）  ｖｏｌ．２７，１７１９−１７２７）。試薬の１つが拡散しなくなり、立体障害が増大すると、反応部位の近接部における試薬濃度が大きく低下する。さらに、固相連結効率はまたＤＮＡ鎖の全体的長さにも依存する場合がある。従って、ＤＮＡが短い場合の組立の早期の段階における連結効率はＤＮＡが長くなった時点での組立の後期の段階における連結効率を示さない場合がある。
【０１１８】
本明細書に記載した試験法を用いて、連結効率に対する幾つかのパラメーターの影響を評価した。以下のパラメーターが固相連結効率に直接の影響を有する工程；がわかった。その相対的重要度は、各要因が反応の種々の段階において役割を果たしているため、単純な順序で一般化されなかった。
・リガーゼ濃度
・連結時間および温度
・溶液目標濃度
・オリゴ二本鎖オーバーハング長さ
・固体支持体物質
・進展中の末端と固体表面の間の距離
・緩衝液中のイオン濃度
・インキュベーション中の混合
固相連結の効率を評価するために図４に示すモデル系を使用し、これを蛍光標識およびゲル画像分析と組み合わせる。
【０１１９】
第１に蛍光標識オリゴを固体支持体上のリンカーオリゴにハイブリダイズして「粘性末端」を形成する（図４Ａ）。何れかの未ハイブリダイズの標識オリゴをアニーリング緩衝液で固体支持体を洗浄する工程；により除去する。次に相補「粘性末端」を有する第１の二本鎖をリガーゼおよび連結緩衝液の存在下にアニーリングし固体支持体係留オリゴに連結する（図４Ｂ）。何れかの未連結の二本鎖１を洗浄除去する。サイクルを反復して第２の連結サイクルとする（図４Ｃ）。次に二本鎖連結生成物を変性し、そして底部の鎖を固体支持体から溶出させる（図４Ｄ）。次に底部の鎖を含む溶液をアクリルアミド変性ゲル上で分析し、各蛍光標識画分の強度をＫｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）１Ｄ画像分析ソフトウエアにより定量する。この方法により固相遺伝子組立における種々のサイクルにおける連結効率が推定できる。
【０１２０】
固体支持体としてフロースルー多孔性材料を使用する本発明は１０〜３０％の全体的累積収率において１２サイクル中３５塩基オリゴを用いて４００ｂｐ遺伝子フラグメントの合成を可能にしている。これによれば、理論的なサイクル当たり収率は８５〜９０％と計算される。
【０１２１】
（Ｇ．遺伝子フラグメントおよび遺伝子の合成のための装置）
（１．概説）
種々の特徴において、本発明は自動化固相遺伝子または遺伝子フラグメント組立を可能にする装置を含む遺伝子または遺伝子フラグメント合成のための装置、並びに、遺伝子合成においてこれ等の装置を使用するための方法を提供する。１つの特徴において、本発明は下記要素：
ｉ）反応チャンバー複数、ここで複数の各メンバーは、下記要素：
（ａ）チャンバー内部に亘って位置する固体支持体、ここで固体支持体は多孔性の領域を有するもの；
（ｂ）第１のオリフィスから第２のオリフィスに至る直接の経路が固体支持体に沿って、またはその内部を通過するように位置する第１および第２のオリフィス；
（ｃ）第１のオリフィスと固体支持体の間に位置するチャンバーの第１の容量；および、
（ｄ）第２のオリフィスと固体支持体の間に位置するチャンバーの第２の容量；
を含むもの；
を含む固相遺伝子または遺伝子フラグメント組立のための装置を提供する。
【０１２２】
装置はさらに好ましくはバルブと配管の系を含み、これにより第１のオリフィスと第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドの溶液を保持するレザバとの間の流体連絡を与える。操作においては、第２のオリゴヌクレオチドの溶液は好ましくは反復的または連続的に固体支持体に沿って、またはその内部を通過する。即ち本発明は下記工程：
ｉ）下記要素：
（ａ）チャンバー内部に位置する固体支持体、ここで固体支持体は第１のオリゴヌクレオチドに結合されているもの；および、
（ｂ）第１から第２のオリフィスに至る直接の経路が固体支持体に沿って、またはその内部を通過するように位置する第１および第２のオリフィス；
を含む反応チャンバーを提供する工程；
ｉｉ）第１のオリフィスを通過して第２のオリゴヌクレオチドの溶液を送達する工程、および、第２のオリフィスの方向に固体支持体に沿って、またはその内部を通過して第２のオリゴヌクレオチドの溶液を輸送する工程；
ｉｉｉ）固体支持体に沿って、またはその内部を通過して第２のオリゴヌクレオチドの溶液を反復的または継続的に通す工程；
を含む固相遺伝子組立のための方法を提供する。
【０１２３】
本発明の別の特徴において、本発明は下記要素：
（ａ）複数の反応容器を保持するように適合された複数のキャビティーを含む反応ブロック、ここで各反応容器はキャビティー内に存在する場合は、第１のオリフィス、第２のオリフィスおよび第１および第２のオリフィスの間の反応容器内部に位置する固体支持体を含むもの；および、
（ｂ）存在する場合は複数の反応容器と流体連絡している試薬送達混合ユニット；
を含む自動化固相遺伝子または遺伝子フラグメント組立のための装置を提供する。
【０１２４】
本装置の反応ブロックはさらに反応ブロックの温度を制御またはモニタリングするための１つ以上の手段；および／または存在する場合に反応容器内の流体のレベルをモニタリングするための１つ以上の手段を包含してよい。試薬送達混合ユニットは１つ以上のバルブと流体連絡した１つ以上のポンプを含む。特に、試薬送達混合ユニットのバルブは、液体保存容器の１つの中の液体がポンプの作用により反応容器内にバルブを介して液体保存容器から輸送されるように、存在する場合の反応容器の第１のオリフィスと試薬送達混合ユニットのポンプとの間に位置し、バルブがポンプ、反応容器および１つ以上の液体保存容器と流体連絡している。
【０１２５】
自動化装置はさらに、反応ブロックの複数のキャビティーの内部に複数の反応容器を固定するための１つ以上の手段を包含してよい。
【０１２６】
好ましくは、自動化装置は温度モニタリング制御手段を含んでいてよいマイクロプレート保持器具を包含する。装置はさらに、温度モニタリング制御手段を含有してよいマルチマイクロプレート保存システム、および／または、マイクロプレート保持器具にマルチマイクロプレート保存システムからマイクロプレートを輸送するための手段を含んでよい。
【０１２７】
装置はさらにマイクロプレートウェルシールピアシング手段を含んでよい。
【０１２８】
装置はさらに装置の操作の間に使用される試薬（例えばオリゴ）および溶液を同定するためのバーコードリーダー、および／または、装置により実施される方法の生成物を分析するための１つ以上の手段、例えば分光光度計または蛍光プレートリーダーを含んでよい。
【０１２９】
好ましくは、装置はコンピューター制御ユニットを含み、ここでコンピューター制御ユニットは装置の種々の要素、例えば種々の温度および制御手段、反応容器内の流体のレベルをモニタリングする手段、試薬送達混合ユニット、マルチマイクロプレート保存システム、マイクロプレート保持器具にマルチマイクロプレート保存システムからマイクロプレートを輸送するための手段、マイクロプレートウェルシールピアシング手段、および／または、装置により実施される方法の生成物を分析するための手段を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行する。
【０１３０】
好ましい実施形態においては、本発明の自動化遺伝子フラグメントまたは遺伝子組立のための装置は下記要素：
（ａ）複数の反応容器を保持するように適合された複数のキャビティーを含む反応ブロック、ここで各反応容器はキャビティー内に存在する場合は、第１のオリフィス、第２のオリフィスおよび第１および第２のオリフィスの間の反応容器内部に位置する固体支持体を含むもの；
（ｂ）存在する場合は複数の反応容器と流体連絡している試薬送達混合ユニット；
（ｃ）マイクロプレート保持器具；
（ｄ）反応ブロックの複数のキャビティー内に存在する場合は複数の反応容器を固定するための１つ以上の手段；
（ｅ）反応ブロック、マルチマイクロプレート保存システムまたはマイクロプレート保持器具の温度をモニタリングまたは制御するための１つ以上の手段；
（ｆ）装置の種々の要素を操作するための予備プログラミングされたコマンドを実行するコンピューター制御ユニット；
（ｇ）場合により、マルチマイクロプレート保存システム；
（ｈ）場合により、マイクロプレート保持領域にマルチマイクロプレート保存システムからマイクロプレートを輸送する手段；および、
（ｉ）場合により、マイクロプレートウェルシールピアシング手段；
を含む。
【０１３１】
（２．反応容器）
１つの特徴において、本発明の遺伝子または遺伝子フラグメント合成は反応容器内で実施される。各反応容器は、キャビティー内に存在する場合は、オリゴヌクレオチドを結合する内部固体表面を有する。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅは固体表面の５種類の形状を示す。図５Ａにおいて、固体表面は容器の内壁から伸長する繊維である。図５Ｂにおいて、固体表面は容器の内壁に隣接するスリーブである。図５Ｃにおいて、固体表面は容器の幅全体に亘る多孔性の充填物であり、容器の内部を効率的に２つのサブチャンバーに分割している。図５Ｄにおいて、２つの硬い多孔性障壁が反応容器の幅全体に亘っており、そしてビーズで充填された障壁の間に位置する空間を定義している。ビーズはオリゴヌクレオチドを結合する固体支持体である。図５Ｅにおいて、固体支持体は反応容器内に懸垂するブラシであり、この場合、ブラシはモーターの操作により溶液を通って回転させてよい。他の表面の形状を代替として利用してもよい。
【０１３２】
固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを含む工程；に加えて、各反応容器は２つのオリフィスを有する。各オリフィスは溶液および試薬を反応容器に出し入れするために使用できる。オリフィスは一方のオリフィスから他方への直接の経路が固体支持体に沿って、またはその内部を通過するように位置させなければならない。例として固体支持体として多孔性充填物を有する図５Ｃの反応容器を用いながら、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは２つの孔部（オリフィス）に関する３通りの可能な配置を示している。図６Ａにおいては、孔部は反応容器の上および下に位置し、多孔性充填物が中央にある。図６Ｂにおいては孔部は反応容器の同一面において一方が他方の上になるようにする。図６Ｃにおいては孔部は反応容器の対向する面に位置する。各々の場合において、一方の孔部を多孔性充填物の上方に位置させ、他方の孔部を多孔性充填物の下方に位置させる工程；により、２つの孔部の間の直接の経路が多孔性充填物を通過するようにする。「フロースルー反応器」という用語は一方の孔部から他方の孔部への直接の経路が固体支持体に沿って、またはその内部を通過して進行するように位置づけられた２つの孔部を有する反応容器を指す。
【０１３３】
別の特徴において、固体支持体は反応容器の末端、即ち、オリフィスの一方またはその近傍に位置する。これは図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示す通りであり、ここで固体支持体は多孔性充填物である。図７Ａにおいて、多孔性充填物は反応容器の内部の端部に位置する。図７Ｂにおいて、多孔性充填物は反応容器の外部の端部に位置する。図７Ｃにおいて、反応容器は先端を有し、そして多孔性充填物はこの先端の内部に位置する。
【０１３４】
同様の系が本発明の方法を実施するために利用してよい米国特許５，４３７，９７９に記載されている。’９７９特許の系はレセプタクルから引き出された液体を保持するためにピペット先端を利用しており、ここで先端は固体支持体上に固定された化学物質種を保持している。本発明に適用される通り、第１のオリゴヌクレオチドはピペット先端に固定してよく、そして第２のオリゴヌクレオチドの溶液をレセプタクルに入れてよい。第２のオリゴヌクレオチドの溶液をピペット先端内に導入し、次に吐出し、そしてこの操作を少なくとも１回、好ましくは複数回、反復する。’９７９特許は固体支持体を定位置に維持するために多孔性フリット１つまたは２つを使用する工程；を開示している。本発明における使用に適合させる場合、ビーズを固定するために２つの多孔性フリットが必要になる。
【０１３５】
ピペット先端を使用する工程；は、’９７９特許に開示されているもののような摩擦力フィットにより定位置に固定されたピペット先端は先端が装置の残余と結合している接合点において漏出する場合が多いため、本発明の方法の好ましい実施形態ではない。僅かな漏出であっても、（１）第２のオリゴヌクレオチドの溶液の固体支持体を経由する通過が複数回である工程、および（２）オリゴヌクレオチドの新しい溶液および洗浄溶液が反応容器への導入が複数回である工程；から、本発明の方法に対して困難を呈する場合がある。ピペット先端は延長された使用ではなく１回または２回の使用のために設計されている。薄壁ピペット先端は延長された使用のもとでは変形する場合が多く、そしてピペットと共に保有する工程；を意図される摩擦力フィットが消失する。
【０１３６】
上記した通り、本発明の装置および方法において使用するための好ましい固体支持体材料は５〜３５μｍ孔径の多孔性ポリエチレンである。この材料はＰｏｒｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆａｉｒｂｕｒｎ，ＧＡ）およびＰｏｒｖａｉｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  （Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＮＣ）のような数種の製造元から市販されている。両社とも直接フリットを鋳造できる。生原料の多孔性ポリエチレンフリットをプラズマ処理に付す工程；により表面にアミン基を導入してよい。４ｔｈＳｔａｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡはプラズマ処理業務を広告している数種の供給元の１つである。プラズマ処理の後、支持体を反応容器内部に圧着調整する。
【０１３７】
好ましくは、固体支持体はリンカー基を通ってユニバーサルオリゴに結合される。例えば、５’−カルボキシル末端ペギル化リンカーオリゴを上記した通り固体支持体に結合してよい。オリゴ結合および試験反応は全てカラム全体を通して同様の試薬を用いながら室温において実施する。以下に記載する遺伝子フラグメントおよび遺伝子の固相組立ステーションを使用してユニバーサルオリゴ（および所望によりリンカー）を固体支持体に結合する工程；ができる。
【０１３８】
本発明の装置の反応容器と共にユニバーサルオリゴおよび架橋オリゴを使用する工程；は、それにより反応容器を反復使用して新しい遺伝子または遺伝子フラグメントを製造でき、そしてこの再使用可能な特性がロボット的に達成できる工程；から、極めて有用である。即ち、遺伝子フラグメント１つが終了し、別の遺伝子フラグメントの組立が開始した時点で本発明の装置の反応容器内において固体支持体を新しい固体支持体と置き換える必要が無くなる。遺伝子フラグメントは単に固体支持体から洗い出し、支持体にユニバーサルオリゴを結合させたまま残存させ、そして固体支持体／ユニバーサルオリゴに適切な架橋オリゴを添加する工程；により遺伝子組立の方法を開始する工程；ができる。即ち、１つの特徴において、本発明は同じ反応容器から複数の遺伝子フラグメントの逐次的製造を提供し、この場合、遺伝子フラグメントは反応容器内の固体支持体から洗浄され、次に新しい架橋オリゴをその固体支持体に導入して遺伝子フラグメント組立を再開する。
【０１３９】
好ましい実施形態においては、本発明の装置は各反応容器内の流体のレベルをモニタリングするための手段を組み込んでいる。このような手段は当該分野で知られており（例えば米国特許５，５３９，３８６参照）、そして、本発明の装置の反応ブロック内に組み込んでよい。
【０１４０】
（３．試薬送達混合ユニット）
本発明の反応容器の各々は１つ以上のポンプと流体連絡している。同じポンプが反応容器の複数の全てまたは一部と流体連絡していてよい。１つの特徴において、単一のポンプが反応容器の複数の全てと流体連絡している。この特徴は複数のポンプを購入して維持する経費が低減される点において有利である。別の特徴において、各反応容器は個別の独自のポンプと流体連絡している。この特徴は、それが操作の最大の柔軟度を与える工程；から有利であり、即ち、各反応容器を独立して制御でき、そして全ての反応容器を同じ操作条件に付す必要がない。独自のポンプと流体連絡した各反応容器を有する工程；はまた、１つの反応容器の誤操作が他の反応容器の操作に殆ど、または全く影響しない工程；から有利である。各反応容器に存在する２つのオリフィスの一方はポンプと流体連絡している。
【０１４１】
本発明の遺伝子組立を達成するためには、第２のオリゴヌクレオチドの溶液が必要である。第２のオリゴヌクレオチドのこの溶液は反応容器に添加され、そして固体支持体に結合している第１のオリゴヌクレオチドと接触させる。第２のオリゴヌクレオチドの溶液は容器の２つのオリフィスの一方を経由して反応容器内に進入する。ポンプは第２のオリゴヌクレオチドの溶液を反応容器内に移動させる強制力を与える。
【０１４２】
ポンプの作用の下、反応容器内の第２のオリゴヌクレオチドの溶液を反応容器の第２のオリフィスに向けて輸送する。この輸送の過程において、第２のオリゴヌクレオチドの溶液は自身に結合した第１のオリゴヌクレオチドを有する固体支持体と接触し、そして第１および第２のオリゴヌクレオチドはこれにより相互に接触する。
【０１４３】
１つの特徴において、本発明の遺伝子フラグメントおよび遺伝子の組立方法の重要な特徴は、第２のオリゴヌクレオチドの溶液が第２のオリフィスに向けて固体支持体を通って、またはそれに沿って、第１のオリフィスから移動させられ、そして、第１および第２のオリゴヌクレオチドを相互に接触させた後、溶液は方向を反転させるという点である。即ち、第１のオリフィスから第２のオリフィスの方向に移動した後、溶液は逆方向、即ち第２のオリフィスから第１のオリフィスに向けて移動させられる。その後、溶液は再度方向を反転させ、そして、第１のオリフィスから第２のオリフィスに向かう方向の移動を反復する。この方向の変化を複数回反復する工程；により、第１のオリゴヌクレオチドを自身に結合して有する固体支持体を通過させて溶液を行き来させる。固体表面を通って行き来させる溶液を通過させるこの工程を、本明細書においては反復フロースルー接触と称する。
【０１４４】
本発明者等は意外にも反復フロースルー接触が遺伝子組立の収率を上昇させる工程；を発見した。即ち、反復フロースルー接触は第２のヌクレオチドに結合する第１のオリゴヌクレオチドの数を増大させる。この意外な発見の背後にある作用機序はまだ確実にはわかっておらず、本明細書においては前記の通り考察されている。基本的には本発明の遺伝子組立の機序は標準的なヌクレオチド塩基対形成規則に従って第１のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングさせる工程；を包含する。このアニーリング過程を起こすためには、第１のオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチド塩基が第２のオリゴヌクレオチドの塩基に曝露されてそれと接触できるようになるために十分伸長された形態である必要がある。本発明の反復フロースルー接触の特徴は第１のオリゴヌクレオチドの伸長を促進し、これにより、第１および第２のオリゴヌクレオチドの塩基の間のアニーリングを可能とし、促進すると考えられる。
【０１４５】
反復フロースルー接触が第１のオリゴヌクレオチドが多孔性固体支持体の細孔内部に結合している場合に特に重要であると考えられる。多孔性の固体支持体は、それが大きい表面の体積に対する比を与え、これにより第１のオリゴヌクレオチドの比較的多数を固体支持体の比較的小容量に結合できるようにするため、本発明の好ましい固体支持体である。この状況において、固体支持体の細孔内部で溶液の連続的、または少なくとも頻繁な流動を与える工程；が重要であると考えられる。この頻繁な流動は第１のオリゴヌクレオチドが比較的伸長された形態で残存する工程；を促進し、そしてこれにより第２のオリゴヌクレオチドに対して比較的より高い反応性を有するようになると考えられる。
【０１４６】
反復フロースルー接触は図８Ａ〜８Ｅに示すとおりであり、ここでも説明目的のために図５Ｃの反応容器を用いている。図８Ａにおいては、反応容器は伸長されており、そして固体支持体は反応容器に亘って伸び、反応容器の長さに沿ってほぼ中央に位置する多孔性のマトリックスである。この多孔性の固体支持体、またはフリットは反応容器を２つのサブチャンバー、即ち第１および第２のサブチャンバーに分割する。図８Ｂに示すとおりポンプの作用下に、第２のオリゴヌクレオチドの溶液は反応容器の第１のオリフィスを通過してレザバから反応容器内に引きこまれる。溶液はそれが完全に固体支持体を水没させるまで、そして、第２のオリフィスに向けたそれ以上の移動が固体支持体を第１のチャンバー内の空気に曝露させるようになるまで第１のチャンバー内に引き込まれ、この状態は図８Ｃに示すとおりである。この特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの溶液はポンプと第２のオリゴヌクレオチドの溶液の間の真空および第１のオリフィスから溶液が逆流するのを抑制する毛管力の１つ以上により定置される。その後、ポンプにより及ぼされる力により第２のオリゴヌクレオチドの溶液は第１のオリフィスに押し戻される。好ましくは、第２のオリゴヌクレオチドの溶液は固体支持体が完全に水没させ続ける。これは図８Ｄに示す通りである。図８Ｃおよび８Ｄは反復フロースルー接触を示している。反復フロースルー接触は図８Ｅに示す通り継続でき、ここでポンプにより及ぼされる力は反転し、そして第２のオリゴヌクレオチドの溶液を第２のオリフィスに向けて引き戻す。
【０１４７】
別の特徴において、本発明の方法は連続フロースルー接触と本明細書において称する反復フロースルー接触の変法を提供する。この様式においては、第２のオリゴヌクレオチドの溶液は、第１のオリフィスから固体支持体を経由して第２のオリフィスを通るように連続的に通過させる。連続フロースルー接触を達成するために必要な第２のオリゴヌクレオチドの溶液の量を最小限にするために、溶液は、説明目的のために図５Ｃの反応容器を利用している図９に示す通り再循環させてよい。図９に示す通り、反応容器の側面に亘って多孔性の固体支持体またはフリットを有する反応容器を提供する。第２のオリゴヌクレオチドをレザバから反応容器に導入し、次にレザバのバルブを閉じる。次にポンプにより第２のオリゴヌクレオチドの溶液を継続的に時計周りまたは反時計回りに反応容器を循環させる。溶液の流動方向は所望により度々または周期的に反転させてよく、これにより反復フロースルー接触としてよい。
【０１４８】
本発明の好ましい装置において、反応容器は多孔性固体支持体またはフリットを有するカラムである（図１０Ａ）。この設計においては、反応容器はフリットおよびプログラム可能なシリンジポンプに連結され、そして、３方向切り替えバルブを介して緩衝液レザバに連結している上方のＬｕｅｒフィッティングを有する。この反応容器およびシリンジポンプの形状の場合は、試薬（オリゴおよびリガーゼ）は、反応容器下方に位置するマイクロプレートから反応容器の底部を通って引き出される。反応容器内部の試薬の混合は、同じシリンジポンプを用いて上方下方に送液する工程、および、溶液を多孔性固体支持体を通るように流動させる工程；により達成される。洗浄緩衝液は切り替えバルブを介して反応容器の上部より送達される。反応容器の下部に位置する廃棄物収集容器内に反応容器を経由して溶液を送液する工程；により反応容器から廃棄物を洗浄除去する。このような設定により、プログラム可能なシリンジポンプは遺伝子フラグメント組立方法における全ての工程を取り扱う工程；ができる。この設計は図１０Ｂに示すとおりマルチカラムの装置にまで拡張してよい。
【０１４９】
試薬送達混合ユニットは自動化固相遺伝子および遺伝子フラグメント組立ステーションにおける重要な要素である。これは適切な反応容器に試薬および適切な溶液および緩衝液を送達するために必要なポンプ、配管およびバルブを含む装置の要素である。ユニットの好ましい要素は試薬の送達および混合の両方の操作を制御するプログラム可能なパラレルシリンジポンプユニットである。このユニットは全体の固体支持体表面を均一に通過するオリゴ溶液の少容量を送達するために一貫した圧力差を生じさせる工程；ができる。このユニットはまた装置において反応容器内の固体支持体を通過する試薬の連続した流動をもたらす。このユニットはまた、この連続した流動の方向を反転させる手段を提供する。
【０１５０】
本発明の１つの特徴において、各反応容器は反応容器の上面から別のシリンジに連結される。或いは、さらに２つの反応容器を単一のシリンジに連結してよい。各反応サイクルの開始時において、マルチウェルのマイクロプレート中のオリゴは反応ブロック下部に位置し、そして各オリゴ溶液を反応容器の底部にあるオリフィスを通して反応容器内に引き込む。次に溶液が多孔性固体支持体を一定して出入りしながら流動するように特定の速度および容量置換において継続的に上下送液するようにシリンジポンプをプログラミングする。サイクルの終了時に、溶液を反応容器から廃棄物収集器に流し出す。各アニーリング反応の後、シリンジポンプおよび反応容器の間の切り替えバルブを通して反応容器の上面から添加した新しい洗浄緩衝液を用いて反復洗浄サイクルを実施する（図１０）。
【０１５１】
各反応容器に対して個々のシリンジを使用する工程；により、各反応ブロック内および全体の反応ブロックに亘り溶液および流体の流量および容量を信頼性高く一貫して制御できる。全反応ブロックに対して単一のシリンジポンプまたはバキュームチャンバーに基づいた設計の場合は、各反応容器を均一にする工程；はより困難となるが、この方法も使用してよい。
【０１５２】
（４．反応ブロック）
１つの特徴において、本発明の固相遺伝子フラグメントまたは遺伝子組立系は図１０Ｃに示すように複数の反応容器を保持するために適合させられた複数のキャビティーを含む反応ブロックを含む。１つの実施形態において、反応ブロックは各反応容器に対する個別の温度制御を可能にする手段を含む。別の特徴において反応ブロックは全ブロックに亘り均一な温度制御を可能にする手段を含む。別の実施形態においては、反応ブロックは各反応容器内の流体のレベルをモニタリングするための手段を含む。反応ブロックの中心的要素は反応容器（図１０Ｂおよびず１０Ｃ）であり、各反応容器はその中に固体支持体を含む。この型の反応ブロックは、この目的のための業務において加工業者により本発明の目的のために製造されたものであってよい。反応容器は不活性でオートクレーブ可能であり、十分な熱転移特性および低いＤＮＡ吸着性を有する鋳造成型可能なプラスチックから製造してよい。鋳造成型可能な部分は好ましくは寸法安定性を有するものであり、これにより反応容器は反応ブロック内に摩擦力フィットにより定置され、そして固相フリットも容器内に摩擦力フィットにより定置してよい。各反応容器の上面は好ましくは試薬送達混合ユニット配管に容易に接続切断できる結合ジョイントを有する。各反応容器は好ましくは試薬少容量を取り出すための標準的９６穴マイクロプレートの底部に到達できるポイント先端を有する。反応容器の容量は好ましくはその内部に装着されている固体支持体のバルク容量の約３倍である。複数の反応容器を保持する反応ブロックは好ましくは９６穴マイクロプレートフォーマットに適合する態様で反応容器を配置させる工程；により上流および下流の自動化を容易にできる。反応ブロックは好ましくは温度制御モニタリング手段（例えば±１℃または±２℃、昇温速度１０℃／分）を包含する。反応および反応のブロックの模式的ダイアグラムを図１０Ｂおよび図１０Ｃに示す。
【０１５３】
反応容器は図１０Ｃに示す固定手段により反応ブロック内に定置してよい。このような手段は、特に反応容器の内部および／または経由で試薬および溶液を送液する場合に、反応容器を反応ブロックのキャビティー内に固定して装置の操作の間にその移動を防止するためのものである。好ましくは固定手段は反応ブロックおよび各反応容器の上面に存在する結合ジョイントにしっかりと結合する。
【０１５４】
（５．温度制御）
反応ブロックは±１℃の制度で周囲温度から１００℃までの加熱および冷却の能力を有する。温度制御モニタリングユニットは好ましくは中央コンピューター制御ユニットとのインターフェイスによりプログラム可能である。反応ブロックおよび温度制御モニタリングユニットは多くの加工業者の何れか、例えばＪ−ＫＥＭ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により加工したものであってよい。
【０１５５】
（６．マルチマイクロプレート保存システム、ロボット型プレート輸送系、マイクロプレート保持装置およびマイクロプレートウェルシールピアシング手段）
本発明の１つの特徴において、マルチマイクロプレート保存システムおよびロボット型マイクロプレート輸送系が装置の全体的設計内に組み込まれる。この装置は、試薬（オリゴ）を保存し、それを固相アニーリング反応の各サイクルへ送達する機能を有する。ロボット型マイクロプレート輸送系は個々のマクロプレートをマイクロプレート保持装置に出入りさせる機能を有する。マイクロプレート保持装置は、マイクロプレートの個々のウェル内に含有される試薬の反応ブロック内の反応容器への送達を可能にするような態様で装置の反応ブロックの下方にマイクロプレート１つ以上を位置づける機能を有する。好ましくは、マルチマイクロプレート保存システム中にマイクロプレートを保存するよりも前に、個々のマイクロプレートのウェルをシール材によりシールする工程；により、マイクロプレートのウェル内に含有される試薬の蒸発または分解を防止するか、または、送達過程における他の試薬または溶液による試薬の汚染を防止する。このようなシールは、マイクロプレートのウェルに含有される試薬を遺伝子フラグメントおよび遺伝子の組立過程における適切な反応容器に送達可能となる前に、ピアシング手段によりピアシングまたは穿孔しなければならない。このようなピアシングまたは穿孔の手段は市販されており、本発明の装置に容易に組み込む工程；ができる。好ましくは、ピアシング手段はその時点において必要とされる試薬を含むウェルのみのシールをピアシングまたは穿孔する。別の実施形態においてはマイクロプレートのウェルをシールするために使用されるシール材は、分解、蒸発または汚染が進行する工程；なくウェル内に含有される試薬の再使用を可能とするためにシールピアシング手段によりシールがピアシングまたは穿孔された後に自己シールする。さらにまた、マルチマイクロプレート保存システムおよびマイクロプレート保持装置の温度は、好ましくは中央コンピューターユニットにより制御される温度モニタリング制御ユニット１つ以上により、所望の範囲内にモニタリング制御される。
【０１５６】
４８４００−ｂｐの遺伝子フラグメントの組立は約１０アニーリングサイクルを包含する。これ等のサイクルのためのオリゴは１０マイクロプレート中において供給してよい。全バッチサイクルは１回で約２日間まで実施されるため、オリゴは多大な蒸発および分解を起こす工程；なく待機状態に保持されなければならない。１つの解決法はマイクロプレート輸送ロボットアームと連結された温度および湿度制御のマルチマイクロプレート保存システムを有する工程；である。このような機材は現在は種々の供給元より入手可能である。
【０１５７】
図１０Ｂに示すラインに沿って反応ブロック内に反応容器を配置させる工程；は、その配置がマルチウェルのマイクロ滴定プレート内のウェルの配置と対応している工程；から、特に望ましい。本発明の１つの特徴において、遺伝子または遺伝子フラグメントを製造するために必要な試薬の全ては単一の９６穴マイクロプレート内に位置し、そして反応ブロックは８反応器を有する。これにより最大１２の独立したセットのウェルが得られ、これより反応体（例えば第１のオリゴ／第１の二本鎖、第２のオリゴ／第２の二本鎖、リガーゼ等）を反応容器に送達してよい。洗浄緩衝液は別のレザバ内に位置し、そして、配管およびポンプの作用により接触可能とされる。
【０１５８】
（７．開発方法品質管理プロトコル）
製品または装置により実施される方法を分析するための手段は望ましくは遺伝子フラグメントおよび遺伝子の組立方法内の各々の重要な工程において包含される。このような品質管理プロトコルは当該分野で知られているか、本発明に記載される通りであり、例えば固体支持体結合能力および連結効率に関する試験が挙げられる。最終的に溶出した遺伝子および遺伝子フラグメントは当該分野で知られたゲル電気泳動操作法により確認してよい。さらにまた、このような手段は分光光度計または蛍光プレートリーダーのような装置そのもの内に包含されてよい。このような説明書は当該分野で知られており、所望により装置内に組み込まれる。
【０１５９】
（８．自動化合成）
１つの特徴においては、本発明は固相遺伝子法を用いた自動化固相遺伝子組立系に関する。この系は図１１に示す通り、幾つかの重要な要素を含んでいる。最も単純な形状においては、固相遺伝子組立ステーションは本明細書に記載した反応ブロック、温度制御ユニット、試薬送達混合ユニット、マイクロプレート保持装置および中央コンピューター制御ユニットを含む。ステーションはまたマルチマイクロプレート保存システムおよびマイクロプレート保持装置に出入りするマイクロプレートの輸送のためのマイクロプレートロボットも含んでよい。ステーションはまた組立の過程においてウェル内に含有される試薬に接触可能とするためのマイクロプレートウェルシールピアシング手段を含んでよい。ステーションはまたバーコードリーダーおよび分析の説明書、例えば分光光度計および蛍光プレートリーダーを組み込んでよい。
【０１６０】
反応ブロックは個々の反応容器を保持し、そして各反応サイクルの温度を維持する。マルチマイクロプレート維持系は４００ｂｐの遺伝子フラグメントをビルドする際に関与するサイクルの全てに対してオリゴの供給を維持管理する。試薬送達混合ユニットは、組立過程における種々の試薬および溶液を送達するために必要なポンプ、バルブおよび配管を包含し、そしてオリゴおよび緩衝液の添加と除去、並びに組立過程における試薬の混合を制御する。中央コンピューター制御ユニットはプログラム可能であり、予備プログラムされたコマンドを実行する工程；により、ステーションの種々の要素、例えば、温度制御ユニット、マルチマイクロプレート保存システム（マイクロプレートロボットに連結）、試薬送達混合ユニットおよびシールピアシング手段を操作する。
【０１６１】
以下の実施例は説明のために示したものであり、限定するものではない。核酸配列をクローニングし、そしてこれ等の核酸の配列を決定するための方法は本発明の分野における当業者がよく知るものである。例示される手法は例えば以下の実験研究マニュアル、即ちＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（１９９９）（参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、そして、これ等の参考文献は本明細書に記載した操作法を実施するための詳細をさらに明らかにするために参照してよい。
【実施例】
【０１６２】
（実施例１）
（粒状固体支持体上の３１０塩基対の遺伝子のビルド操作）
（樹脂の酸処理）
アミノメチル化ポリスチレン樹脂（３グラム、粒径〜１００ミクロン、Ａｌｄｒｉｃｈ）をガラスシンチレーションバイアル中で濃塩酸（ＨＣｌ）４ｍｌおよび水１２ｍｌと混合した。樹脂を１．５時間室温で酸性溶液中攪拌した。酸処理樹脂を濾液のｐＨが５〜６に達するまで水で洗浄した。この操作を、酸処理条件として濃塩酸の代わりに酢酸を、そして水の変わりにジメチルホルムミド（ＤＭＦ）を用いながら、アミノメチル化ポリスチレン樹脂の第２のバッチに対して反復した。酸処理アミノメチル化ポリスチレン樹脂のバッチを４℃で湿潤固体として保存した。
【０１６３】
２種の洗浄した酸処理樹脂は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）を用いて表面アミン含有量について定性的に試験した。未処理樹脂は対照実験とするために同様に試験した。結果を表１に示す。樹脂が暗橙色に変化した場合、これは表面上の高いアミン含有量を示している。樹脂が淡黄色に変化した場合、これは表面上の低いアミン含有量を示している。これ等の試験条件下、未処理樹脂は殆ど黄変しなかった。しかしながら、未処理樹脂を４０℃でより長時間維持するに従って、黄変は顕著となった。
【０１６４】
（表１）
（アミノメチル化ポリスチレン樹脂上の表面アミン含有量）
【０１６５】
【表１】
2007508825.tif 000006
（樹脂−オリゴ結合）
濃塩酸で処理し、次に水で洗浄したアミノポリスチレン樹脂（上記パートＡにおいて製造）を後述する通りリンカーオリゴに共有結合した。リンカーオリゴは１７ヌクレオチド塩基を含むオリゴヌクレオチド部分、スペーサー基およびその５’末端に第１アミン基を含有しており、それは以下の構造において説明するとおりであり、式中、ｍは１〜５０の範囲の整数から選択され、ｎは１〜２０の範囲の整数から選択され、そしてｐは０および１〜１０の範囲の整数から選択される。
【０１６６】
【化４】
2007508825.tif 000007
本実験において使用されたスペーサーはｐ＝１である場合の上記した構造により示される通り２つのリン酸基によりフランキングされた１ポリエチレングリコール単位であるか、または、ｐ＝２である場合の上記した構造により示される通り１つのリン酸基により分離され、そして、２つのリン酸基によりフランキングされた２ポリエチレングリコール単位である。これ等のリンカーオリゴはＴｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ，ＵＳＡ；＠ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）により製造されたものである。リンカーオリゴは後述するように塩化シアヌル化学を用いて樹脂の個々のバッチに結合した。２ポリエチレングリコール単位より多くを有するリンカーオリゴの場合も同様の方法を使用してよい。
【０１６７】
選択されたリンカーオリゴは脱イオン水に溶解して１ｍＭ溶液を形成した。塩化シアヌル活性化リンカーオリゴを形成するために、リンカーオリゴ溶液２０マイクロリットル（２０ナノモル）をｐＨ８．４の１Ｍホウ酸塩５０マイクロリットルと混合した。この混合物に、５８０マイクロリットルのアセトニトリル（Ａｌｌｉｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ）中に３０．８ｍｇの塩化シアヌル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、トルエンから再結晶）を溶解する工程；により製造した新しい塩化シアヌル溶液１４マイクロリットルを添加した。反応は４０分間室温で実施した。生成物混合物をｐＨ８．４の０．１Ｍホウ酸塩を用いてＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（Ｓｉｇｍａ）ゲルカラムから溶出する工程；により過剰の塩化シアヌルを除去した。塩化シアヌル活性化リンカーオリゴを凍結乾燥し、次に脱イオン水８０マイクロリットルに溶解した。オリゴの回収量は１４ナノモルであった。
【０１６８】
処理し洗浄したアミノポリスチレン樹脂（固体支持体）への塩化シアヌル活性化リンカーオリゴの結合の前に、固体支持体（充填容量で０．５ｍｌ）を５分間ｐＨ８．４の０．５Ｍホウ酸塩１ｍｌで処理し、次にホウ酸塩溶液を濾去した。次に塩化シアヌル活性化リンカーオリゴを固体支持体に添加し、混合物を１時間室温で維持した。この反応時間の後、液体を固体から濾去し、そして固体樹脂を３回ｐＨ８．４の０．１Ｍホウ酸塩２ｍｌで洗浄し、その後後述する通りキャッピング反応を実施した。各洗浄工程は固体支持体に洗浄溶液を接触させる工程；よりなり、そして、混合物を攪拌した後に液体を固体から濾去した。
【０１６９】
（キャッピング反応）
アミノメチル化ポリスチレン樹脂上の未反応の−ＮＨ２基を１．５時間室温で０．５Ｍホウ酸塩１００マイクロリットル、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）５００マイクロリットルおよび無水酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５００マイクロリットルと固体支持体を混合する工程；により無水酢酸でキャッピングした。液体を固体から濾去し、次に固体支持体を３回１−メチル−２−ピロリジノン／水（５０／５０ｖ／ｖ）２ｍｌで、３回１ｍＭＥＤＴＡ２ｍｌで、３回１０ｍＭＴｒｉｓ／１ｍＭＥＤＴＡ／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液２ｍｌで、そして最後に３回１０ｍＭＴｒｉｓ／２ｍＭＥＤＴＡ２ｍｌで洗浄した。各洗浄工程は固体支持体に洗浄溶液を接触させる工程；よりなり、そして、混合物を攪拌した後に液体を固体から濾去した。樹脂は４℃で保存した。
【０１７０】
（分子ビーコンによる固体支持体上のリンカーオリゴの量の測定）
分子ビーコン技術は溶液相オリゴヌクレオチド（即ち溶液中に溶解されているオリゴヌクレオチド）中の特定のヌクレオチド配列を検出するための感度の高い方法としてよく知られている。現発明によれば、本発明者等は固体支持体上に固定されているリンカーオリゴの量を直接測定するために分子ビーコン技術を良好に適用する工程；ができた。この方法は他の溶液系の測定のために一般的に使用されている試験技術を用いた場合に起こるような固体支持体のリンカーオリゴ含有量の過剰評価を回避する。
【０１７１】
本試験に従って使用される分子ビーコン（Ｔｒｉｌｉｎｋ製）はリンカーオリゴ内に存在するヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列を有する１７ヌクレオチドよりなる中央部分を有する。この中央部分の片側にフランキングするものは相互に相補である６ヌクレオチド塩基であり、即ちビーコンの一方の端部上の６塩基はビーコンのもう一方の端部上の６塩基に相補である。その３’末端においてビーコンは蛍光基（特にＦＡＭ）に連結しており、そしてその５’末端においてビーコンはクエンチャーＤＡＢＣＹＬである。分子ビーコンそれ自体は、即ちビーコンの中央部分に相補的なオリゴヌクレオチドの存在下にない場合は、顕著な蛍光シグナルを生成しない。
【０１７２】
試験を実施する前に、リンカーオリゴに結合させた固体支持体１５マイクロリットル（充填容量）を１ｍｌ２ＸＳＳＰＥ緩衝液（０．３ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍリン酸１ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）で洗浄した。次に分子ビーコン溶液（１０ピコモル／マイクロリットル）５マイクロリットルを固体支持体に添加した。混合物を一夜室温で穏やかに攪拌放置した。次に固体支持体を各回洗浄溶液１ｍｌ容量で６回、ＳＤＳ洗浄溶液（０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。
【０１７３】
洗浄した固体支持体は１７０マイクロリットルの３２重量％スクロースを添加する工程；により溶液中に懸濁した。糖溶液は１０分以上沈殿する工程；無く溶液中に懸濁した固体ポリスチレン球状を維持している。安定な固体球状懸濁液を直接蛍光計に入れた。その蛍光シグナル強度を、同じ量の固体支持体樹脂を含むが分子ビーコンは含有しない対照試料懸濁液と比較した。蛍光シグナルの実質増大は、溶液中の同じリンカーオリゴにアニーリングした分子ビーコンの既知量と標準的な検量線を用いる工程；によりピコモル（ｐｍｏｌｅ）に変換し、即ち、リンカーオリゴを数種の溶液に溶解し、そして種々の既知量の分子ビーコンをこれ等の溶液に添加した。この試験によれば、上記したポリスチレン樹脂は樹脂の充填容量マイクロリットル当たりリンカーオリゴ１〜２ｐｍｏｌｅを含有していた。
【０１７４】
（オリゴヌクレオチドの設計）
図１２Ａに示す通り、両方の３’末端にＣＴＴＴＣ配列を有する３１０塩基対を有する標的ポリヌクレオチド（遺伝子）のヌクレオチド配列を得た。この遺伝子は図１２Ｂ中に同定される短いオリゴヌクレオチド配列（オリゴ）のファミリーに概念的に分解し、ここで文字Ａ〜Ｕは特定のオリゴの名称を指し、そして数（例えば３０、３３、３５）は特定のオリゴ中に存在するヌクレオチドの数を指す。図１２Ｂに示す通り、遺伝子内部のオリゴは各々３３〜３５塩基よりなり、一方、遺伝子末端近傍のオリゴ（オリゴＫおよびＵ）は幾分短鎖であった。オリゴ間の破断は、各内部オリゴが１５〜１７ヌクレオチドの長さに亘り相補鎖内の２つの部分相補オリゴとオーバーラップするように存在するように設計した。遺伝子の末端を形成するオリゴは１５〜１６ヌクレオチドの長さに亘りその相補オリゴとオーバーラップするように設計した。これ等のオリゴを設計した後、それらを標準的な固相技術により合成した。
【０１７５】
遺伝子の合成を達成するために、２つの「架橋」オリゴを設計し、そして合成した。これ等の架橋オリゴは「架橋オリゴＬ」（図１２Ｃ）および「架橋オリゴＲ」（図１２Ｄ）と命名した。各架橋オリゴはポリヌクレオチド組立法においてこれ等の領域が実施する機能により定義されるヌクレオチド３領域よりなる。各架橋オリゴはヌクレオチドの「ギャップ配列」と称されるヌクレオチドの隣接セットを含有しており、それはユニバーサルオリゴの第１領域にアニーリングするヌクレオチドの第１の隣接配列と標的ポリヌクレオチド内に組み込まれる第１のオリゴの第１の領域にアニーリングするヌクレオチドの第２の隣接配列との間に位置する。このヌクレオチドのギャップ配列はユニバーサルオリゴの第１の領域および第１オリゴの第１領域の何れともアニーリングしない。実際、ギャップ配列の第１の目的は第１オリゴの第１領域への連結可能な近接部にユニバーサルオリゴの第１の領域が入ってこないようにする工程；である。他方のオリゴに各々部分的にアニーリングした２オリゴは相互への「連結可能な近接部」にそれらが在る場合のみ相互に連結する。本質的には、この工程；は、２つのオリゴが相互に「連結可能な近接部」にあるためには、１つのオリゴに共にアニーリングしている２つのオリゴの間にはギャップは有りえない工程；を意味している。
【０１７６】
ギャップ配列は少なくとも１ヌクレオチド長である。好ましくは、ユニバーサルオリゴが標的ポリヌクレオチドの第１オリゴと連結する可能性をさらに低減するためには、ギャップ配列は１ヌクレオチド長より大きい、例えば２、または３、または４、または５、または６、または７、または８ヌクレオチド長以上である。ギャップ配列内に存在する特定のヌクレオチドは、それらのヌクレオチドがユニバーサルオリゴまたは標的ポリヌクレオチドの第１オリゴの何れともアニーリングしない限り、重要ではない。ＧおよびＣヌクレオチドはＡおよびＴヌクレオチドより強力な水素結合体であるため、１つの特徴において、ギャップ配列は少なくとも優先的にＡおよび／またはＴヌクレオチドから形成される。図１２Ｃおよび１２Ｄにおいて、ギャップ配列は５つの「Ａ」ヌクレオチドにより表わされる。
【０１７７】
この「ギャップ配列」に加えて、固体支持体に固定されているユニバーサルオリゴ中に存在するヌクレオチド塩基（本実施例においてはその内１７）に相補であるヌクレオチド配列を含むように各架橋オリゴを設計して合成した。さらにまた、架橋オリゴは標的ポリヌクレオチドの第１オリゴ内のヌクレオチドの隣接配列に相補であるヌクレオチド塩基配列（本実施例においてはその内１６）を含有している。図１２Ｃおよび１２Ｄから明らかな通り、５ヌクレオチド「ギャップ配列」はユニバーサルオリゴ由来の３’ＯＨと第１オリゴの５’ホスフェートとの間に連結が起こるのを防止する。
【０１７８】
本遺伝子組立法において使用した架橋オリゴを除く全オリゴをホスホリル化した。それらはＭｅｔａｂｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成されＨＰＬＣ精製された。凍結乾燥したオリゴを全て、約１００ｐｍｏｌｅ／マイクロリットルの濃度で精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ；＠Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）中に懸濁した。
【０１７９】
（固体支持体上の遺伝子組立）
１セットに付き２または３メンバーとした相補オリゴのセットをあわせ、アニーリングさせて二本鎖ハイブリッドとした。特定のセットは図１２Ｅおよび１２Ｆにおいて用語「０Ａ」、「１Ａ」等により表記し、識別する。アニーリング方法の内容は１５分間６５℃で１ＸＳＳＰＥ緩衝液中該当オリゴを混合する工程；であり、これによりオリゴは相互にアニーリングした。２つの架橋オリゴ「Ｌ」および「Ｒ」は一本鎖オリゴとして固体支持体にアニーリングするか、または、それぞれその隣接オリゴ二本鎖「３Ａ」および「４Ａ」にアニーリングしてトリプレットとした後に固体支持体に連結できる。遺伝子末端におけるこれ等の短いオリゴについては、二本鎖トリプレットを作成した。図１２Ｅおよび１２Ｆに示す通り、セットには各々識別を容易にするために逐次的番号をつけた。
【０１８０】
図１２Ｅおよび１２Ｆにおいて識別されるハイブリッドの溶液を以下の組立方法において使用した。自身に結合させて約１００ピコモルのリンカーオリゴを有する固体支持体約７５マイクロリットル充填容量を図１２Ｇに示すカートリッジ（Ｏｒｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｅｓｔｍｏｎｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）内に添加した。
【０１８１】
保存緩衝液を除去し、支持体を３回２ＸＳＳＰＥ緩衝液０．４ｍｌで洗浄した。緩衝液および試薬の送達はピペット先端を用いて行い、そして緩衝液および試薬の除去は使い捨てシリンジを用いて行った。フリットの脱離および固体支持体樹脂の緩みを回避するためにはカートリッジへのシリンジの連結の前にプランジャーを引き出す工程；が重要である。
【０１８２】
図１２Ｅにおいて識別されるフラグメントはカートリッジ内に含有される固体支持体に３Ａ、２Ａ、１Ａおよび０Ａを逐次的にアニーリングする工程；により組立てた。同様に、図１２Ｆにおいて識別されるフラグメントは別のカートリッジにおいて固体支持体に４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａおよび８Ａを逐次的にアニーリングする工程；により組立てた。アニーリング方法は、２ＸＳＳＰＥ緩衝液５０マイクロリットルおよび二本鎖または三重鎖溶液４００ピコモルを混合し、２時間室温でカートリッジを穏やかに振とうする工程；よりなるものとした。各アニーリングサイクルの間、５回冷蔵２ＸＳＳＰＥ０．４ｍｌで支持体を処理する工程；よりなる洗浄過程を用いて過剰な二本鎖がある場合はこれを除去した。
【０１８３】
フラグメント全てを共にアニーリングした後、固体支持体を５回冷蔵２ＸＳＳＰＥ０．４ｍｌで、２回冷蔵連結洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）０．４ｍｌおよび１回１Ｘ連結緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）１００マイクロリットルで洗浄した。連結反応は５０マイクロリットルの１Ｘ連結緩衝液および８００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ；＠ｎｅｂ．ｃｏｍ）をカートリッジに添加し、３時間室温でカートリッジを穏やかに振とうする工程；により実施した。固体支持体を３回０．４ｍｌの冷蔵２ＸＳＳＰＥで洗浄した。
【０１８４】
連結した遺伝子フラグメントは０．４ｍｌの５０℃脱イオン水で固体支持体を反復して洗浄する工程；により固体支持体から遊離させた。典型的には、３洗浄サイクルで固体支持体から全ＤＮＡを遊離させるのに十分であった。溶出した溶液を合わせ、ＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で遠心分離する工程；により２５マイクロリットルまで濃縮した。
【０１８５】
ゲル分析はＤＮＡフラグメントのサイズを確認するために行った。６％のネイティブのアクリルアミドゲルを１ＸＴＢＥ泳動緩衝液（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と共に使用した。各フラグメントを含む溶液２．５マイクロリットルをローディング染料（Ｇｅｓｕｒａ  ＴｙｐｅＩＩ  ６Ｘ）と４０％スクロースの混合物（１／１、ｖ／ｖ）２マイクロリットルと混合した。ゲルを１５０ボルト一定で泳動し、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ；＠ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）で後染色した。結果を図１２Ｈに示す。図１２Ｈにおいて、レーン１および４は２０ｂｐのマーカー配列である。レーン２は左フラグメント（１７４ｂｐ）およびレーン３は右フラグメント（１９６ｂｐ）である。ゲルは左および右フラグメントの両方が正しいサイズを有し、主要生成物である工程；を確認するものであった。画像の強度により、両方のフラグメント生成物の推定収率は８０〜９０ピコモルであった。
【０１８６】
左および右のフラグメントの最終的相互接合は溶液中で行った。濃縮した左および右のフラグメントの溶液を５マイクロリットルの１０Ｘ連結緩衝液および８００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと混合した。連結反応は１時間３７℃で行い、その後１５分間６５℃で加熱した。この過程をさらに２回反復し、各々新しい４００単位リガーゼを使用した。生成物の混合物をＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置に入れ、１０ｍＭＴｒｉｓ／１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液４００マイクロリットルで希釈した。溶液を５０マイクロリットル未満に濃縮した。次に脱イオン水４００マイクロリットルを添加し、溶液を５０マイクロリットル未満となるまで遠心分離した。後者の過程を反復し、最終生成物を５０マイクロリットル溶液中に回収した。生成物の一部を５％アクリルアミドゲル上で分析し、その結果は図１２Ｉに示す通りであった。図１２Ｉの画像は４バンドを示しており、レーン１および２は異なるローディング濃度における最終連結生成物である。レーン３は２０ｂｐのマーカーであり、そしてレーン４は１００ｂｐのマーカーである。レーン１および２は最終遺伝子生成物（３１０ｂｐ）、自身の架橋オリゴを有する未反応の左および右のフラグメント（１９６ｂｐおよび１７６ｂｐ）およびアニーリングした架橋オリゴ（６０ｂｐ）を示している。最終生成物をクローニングして配列決定する工程；によりそれが所望の配列を有する工程；を確認した。
【０１８７】
（実施例２）
（多孔性ポリエチレン支持体上の２４０塩基対の遺伝子のビルド操作）
（カルボジイミドによるポリエチレンフリットへのリンカーオリゴの結合）
直径９ｍｍ、厚み１．５ｍｍ、孔径７および２０ミクロンのポリエチレンフリットをＯｒｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｅｓｔｍｏｎｔ，ＩＬ，ＵＳＡ；＠ｏｒｏｃｈｅｍ．ｃｏｍ）より購入した。第１アミン基を４ｔｈＳｔａｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ；＠４ｔｈｓｔａｔｅ．ｃｏｍ）の実施したプラズマ処理によりＰＥフリット表面上に導入した。フリットの関与するその後の全ての反応および方法は図１２Ｇに示すポリプロピレンカートリッジ（やはりＯｒｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）中で実施した。フリットは容器の壁との摩擦力により定置される。
【０１８８】
試薬および緩衝液はカートリッジの上面からフリットに送達し、フリットを通って液体を上昇下降しながら送液するシリンジによりフリットの細孔内で混合し、そして空のシリンジによりフリットから除去する。カートリッジの底部の開口部は反応中は密栓しておく。フリットにリンカーオリゴを結合する前に、フリットを室温で１７時間０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）溶液中１０％無水コハク酸中に入れる工程；により、フリットをスクシニル化した。スクシニル化したフリットは、室温の水、その後０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６〜７）にて４５℃で１回および室温で２回、そして最後に室温の水で３回、洗浄した。
【０１８９】
次にスクシニル化ポリエチレンフリットを、第１アミンで終わる自身の５’末端においてポリ（エチレングリコール）（ｎ＝１２）を含む１７ヌクレオチドのリンカーオリゴヌクレオチドに結合させた（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）。各フリットを３時間室温で、６μＭのリンカーオリゴヌクレオチド濃度および０．４Ｍの塩酸エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）濃度においてｐＨ４．５の０．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）５０μｌ中に入れた。反応の後、フリットを６回洗浄緩衝液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８）で、そして、２回２ＸＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）で洗浄した。フリットは４℃で２ＸＳＳＰＥ中に保存した。
【０１９０】
（蛍光によるハイブリダイゼーション能試験）
オリゴヌクレオチドにアニーリングするフリットの能力を測定するために、以下の試験を実施した。リンカーオリゴヌクレオチドに結合させたポリエチレンフリットをリンカーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドの溶液と合わせた。次にフリットを洗浄して過剰な（非ハイブリダイズの）相補オリゴを除去した。次にフリットをハイブリダイズした相補オリゴを溶出させる条件に付し、そして、溶出した溶液からの蛍光シグナルを測定した。
【０１９１】
アニーリング反応（相補オリゴヌクレオチドと）は２時間室温で２ＸＳＳＰＥ中において実施した。洗浄は２ＸＳＳＰＥで行い、洗浄の完了度は蛍光でモニタリングした。ハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドを３回１ｍｌの５０℃のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水でフリットから溶出させた。蛍光シグナル９５％超が第１の溶出液から得られた。標識相補オリゴの既知量の溶液の標準検量線との比較により測定したところ、７ｕｍの孔径のフリットのハイブリダイゼーション能は１７０ピコモル／フリットであり、２０ｕｍの孔径のフリットのハイブリダイゼーション能は１７５ピコモル／フリットであった。
【０１９２】
（ポリエチレンフリット上の遺伝子組立）
標的遺伝子は図１３Ａに示す通り、一端に５塩基のオーバーハングおよびもう一端に１７塩基のオーバーハングを含む２４０塩基対を有している。
【０１９３】
実施例１に記載した実験の場合と同様、そして、図１３Ｂに示す通り、この標的遺伝子を内部オリゴに３３〜３５塩基および末端により短い配列を有するオリゴのファミリーに「カット」した。各内部オリゴは１５〜１７ヌクレオチドの領域に亘って２つの相補オリゴとオーバーラップしており、そして末端オリゴは１５〜１６ヌクレオチドの領域に亘って１つの相補オリゴにオーバーラップしている。＊＊＊＊を付した架橋オリゴは遺伝子の左末端に付加されるように設計した。架橋オリゴは５’末端にホスフェートを有さず、従ってこれは遺伝子の連結に参加しない。架橋オリゴのオーバーハング領域はポリエチレンフリット上のリンカーオリゴを与える１７塩基配列を有する。
【０１９４】
本遺伝子組立において使用されるオリゴの全ては市販の自動合成装置（ＡＢＩ）上で知られたホスホアミダイト化学により合成し、そしてキナーゼによりホスホリル化した。オリゴを合成した後それらを１５分間６５℃で１ＸＳＳＰＥ緩衝液中１５〜２５ピコモル／μｌでダブレットまたはトリプレットにアニーリングさせた。この遺伝子に関するダブレットおよびトリプレットの厳密な配置は後に記載する通りである。それらには各々識別を容易にするために逐次的な名称を与えた。ダブレットまたはトリプレットフラグメントを含む溶液を放冷して室温とした。フラグメントは図１３Ｃ中の１Ａ〜６Ａの範囲のコードにより識別される。これ等のフラグメント含有溶液を後の組立過程において使用した。
【０１９５】
リンカーオリゴに結合したポリエチレンフリットの１ピースをカートリッジ内に入れた。保存緩衝液を除去し、フリットを３回２ＸＳＳＰＥ０．４ｍｌで洗浄した。第１のオリゴ三重鎖１Ａ合計３００ピコモルを６ＸＳＳＰＥ緩衝液５０μｌと共にフリットに添加した。溶液をシリンジで送液してフリットを上下させた。アニーリングは１時間３０分間実施した。２ＸＳＳＰＥ洗浄（０．５ｍｌ、５回）をアニーリング工程のあとに行い未ハイブリダイズのオリゴトリプレットを除去した。この過程をオリゴダブレット２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａについて、そして最後にトリプレット６Ａについて逐次的に反復した。
【０１９６】
遺伝子に関する全オリゴが共にアニーリングした後、フリットを冷蔵連結洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）０．４ｍｌで１回、そして１Ｘ連結緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）１００マイクロリットルで１回洗浄した。連結反応は５０マイクロリットルの１Ｘ連結緩衝液および８００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をカートリッジに添加し、シリンジを用いて３時間室温で溶液を上下に送液する工程；により反応内容物を混合する工程；により実施した。次にフリットを０．５ｍｌの６ＸＳＳＰＥで３回、そして０．５ｍｌの２ＸＳＳＰＥで３回洗浄した。
【０１９７】
０．４ｍｌの５０℃のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で３回フリットを洗浄する工程；により連結した遺伝子をフリットから遊離させた。溶出した溶液を合わせ、ＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で遠心分離する工程；により２０マイクロリットルまで濃縮した。
【０１９８】
ゲル分析はＤＮＡフラグメントのサイズを確認するために行った。５％のプレキャストのネイティブのアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ；＠ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ）を１ＸＴＢＥ泳動緩衝液（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と共に使用した。ゲルを１６０ボルト一定で泳動し、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で後染色した。結果（図１３Ｄ）は正しいサイズを有する予測された遺伝子フラグメントが主要生成物である工程；を確認するものであった。図１３Ｄ中左レーンの試料は２００ｂｐのラダーである。右レーンの試料は組立生成物の混合物である。
【０１９９】
（実施例３）
（ＰＥＧスペーサー存在下または非存在下の固体支持体上の固相遺伝子組立の比較）
アミノメチル化ポリスチレン樹脂の個別のバッチを２種の異なるリンカーオリゴに結合させた。一方のリンカーオリゴは末端アミン基とオリゴヌクレオチドの間にＰＥＧスペーサー（ｎ＝２４）を含有していた（１７ｂ−オリゴヌクレオチド−ＰＥＧ（ｎ＝２４）−ＮＨ２）。もう一方のリンカーオリゴはスペーサーを含有せず、そしてカルボン酸末端を有し（１７ｂ−オリゴヌクレオチド−ＣＯＯＨ）、ここで両オリゴともＴｒｉｌｉｎｋより入手した。ＰＥＧスペーサーを有するオリゴを実施例１に記載した結合方法を用いてポリスチレン支持体に結合した。スペーサーを有さないリンカーオリゴは同じポリスチレン支持体の異なるバッチに、そしてポリエチレンフリットにも、後述するカルボジイミド法を用いて結合した。
【０２００】
結合の前にポリスチレン樹脂１５０ｕｌ充填容量を０．１ＭｐＨ４．５のモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）１ｍｌで２回洗浄した。結合反応は１．５時間室温で０．１ＭｐＨ４．５ＭＯＰＳ１００μｌ中カルボキシ官能基含有オリゴ（１ナノモル／μｌ）３μｌおよびＥＤＣ溶液（２６．６ｍｇＥＤＣ、５００μｌＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水中）２０μｌを用いて実施した。反応後、樹脂を４５０μｌの０．５Ｍホウ酸塩／０．２５Ｍ塩化ナトリウムで５回洗浄した。残存したアミンは、１．３時間室温で無水酢酸／Ｎ−メチルピロリジノン／０．５Ｍホウ酸塩（８／２／２ｖ／ｖ／ｖ）の混合物３００μｌと混合する工程；により無水酢酸でキャッピングした。次に樹脂を（５０／５０ｖ／ｖ）Ｎ−メチルピロリジノン／１ｍＭＥＤＴＡを含む混合物で３回、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）で３回、洗浄緩衝液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８）で２回、そして、１０ｍＭＴｒｉｓ／１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）で５回洗浄した。
【０２０１】
両方のポリスチレン樹脂のハイブリダイゼーション能を実施例１に記載した分子ビーコン法により試験した。それらは両方とも約０．７ピコモル／μｌ充填樹脂であった。ポリスチレンフリットのハイブリダイゼーション能は実施例２に記載の方法により試験した。これはフリット当たり８４ピコモルと測定された。
【０２０２】
（１３４塩基対遺伝子の組立）
実施例１に記載した方法と同様にして、標的遺伝子を３０〜３３ヌクレオチド塩基を各々有するオリゴのシリーズに「カット」した。２２塩基のより短い配列を下側鎖の末端に置いた。各内部オリゴは１５〜１８ヌクレオチド塩基の領域に亘る２つの相補オリゴとオーバーラップしていた。図１４Ａに示す通り、トップストランドの第１オリゴはその５’末端において蛍光基ＦＡＭ（◎）で標識する。＊＊＊＊を付した架橋オリゴは遺伝子の左末端に付加した。架橋オリゴは５’末端にホスフェートを有さず、従ってこれは遺伝子の連結に参加しない。さらにまた、架橋オリゴはその３’末端において蛍光標識した。
【０２０３】
蛍光標識オリゴはＴｒｉｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．により合成された。他のオリゴの全ては市販の自動合成装置上で知られたホスホアミダイト化学により合成した。全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは１５分間６５℃で１ＸＳＳＰＥ緩衝液中２５〜３０ピコモル／μｌでダブレットまたはトリプレットの何れかにアニーリングした。この遺伝子に関するダブレットおよびトリプレットの厳密な配置は図１４Ｂに記載する通りである。それらには各々識別を容易にするために逐次的な名称を与えた。ハイブリッドを含む溶液を放冷して室温とした。これ等のハイブリッド溶液を後の組立過程において使用した。
【０２０４】
各フリット化ポリプロピレンカートリッジ内にリンカーオリゴと結合した充填固体支持体を１００〜１５０μｌ入れた。ポリエチレンフリットの場合は、未処理（バージン）フリットを用いる代わりにオリゴ結合フリットを直接カートリッジに入れた。保存緩衝液を除去し、そして、支持体を３回２ＸＳＳＰＥ緩衝液０．４ｍｌで洗浄した。第１オリゴ三重鎖０Ａ、全量２００ピコモルを６ＸＳＳＰＥ緩衝液５０μｌとともに各支持体に添加した。アニーリング混合物を１時間４５分間室温で回転混合した。６ＸＳＳＰＥ洗浄（０．４ｍｌ、５回）、次いでアニーリング反応を行い未ハイブリダイズのオリゴトリプレットを除去した。この過程をオリゴダブレット１Ａ、２Ａおよび３Ａついて逐次的に反復し、各々の場合アニーリング時間は室温で１時間とした。
【０２０５】
遺伝子に関する全オリゴが共にアニーリングした後、カートリッジに含有される固体支持体を冷蔵連結洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）０．４ｍｌで２回、そして１Ｘ連結緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）５０μｌで１回洗浄した。連結反応は５０マイクロリットルの１Ｘ連結緩衝液および８００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をカートリッジに添加し、３時間室温で溶液を上下に送液する工程；により反応内容物を混合する工程；により実施した。次に支持体を２ＸＳＳＰＥ０．５ｍｌで５回洗浄した。
【０２０６】
０．４ｍｌの５０℃のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で３回支持体を洗浄する工程；により連結した遺伝子を支持体から遊離させた。溶出した溶液を合わせ、ＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で遠心分離する工程；により２０マイクロリットルまで濃縮した。ゲル分析はＤＮＡフラグメントのサイズを確認するために行った。８％のネイティブのアクリルアミドゲルを１ＸＴＢＥ泳動緩衝液（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と共に使用した。ゲルを１７５ボルト一定で泳動し、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色する前後に画像化した。ゲルの画像は以下の図１４Ｃおよび１４Ｄに示す通りであり、ここでレーンの帰属は、（１）ＰＥＧスペーサーを含むリンカーオリゴと結合させたポリスチレン支持体上にビルドした遺伝子、（２）何れのスペーサーも有さないリンカーオリゴと結合させたポリスチレンフリット上にビルドした遺伝子、（３）スペーサーを有さないリンカーオリゴと結合させたポリスチレン支持体上にビルドした遺伝子；（４）２０ｂｐのラダー（Ｇｅｎｓｕｒａ）である。図１４Ｃは染色前のゲルを示し、図１４Ｄは染色後のゲルを示す。
【０２０７】
染色の前後において、画像は一貫している。スペーサーを有する固体支持体上にビルドした生成物は生成物混合物中最も強度の高いバンドとして現れた（レーン１）。スペーサーを有さない同じ型の支持体上にビルドした生成物は組立方法が成功せず、２０および４０ｂｐの位置の間のＦＡＭ標識架橋オリゴは極めて強度の高いバンドを示した（レーン３）。ポリエチレンフリット（レーン２）上にビルドした遺伝子は全体的強度がかなり低値であった工程；を除き、レーン１のバンドと同様であった。
【０２０８】
（実施例４）
（異なるオーバーハングサイズとの比較）
ＰＥＧ（ｎ＝６）スペーサーを含むリンカーオリゴに結合させたポリスチレンの球状固体支持体を本実施例においては使用する。結合方法は実施例１に記載したものと同様である。固体支持体は１ピコモル／μｌ充填樹脂のハイブリダイゼーション能を有していた。
【０２０９】
（オリゴヌクレオチド設計）
１３４塩基対の標的遺伝子を２種の異なるセットのオリゴヌクレオチドからビルドされるように設計した。一方のセットは１５〜１８塩基の範囲の長いオーバーハングを有していた（図１５Ａ参照）。もう一方のセットは僅か４塩基の短いオーバーハングを有していた（図１５Ｂ参照）。各々のセットにおいて、第１のトップストランドは５’末端において蛍光基（ＦＡＭ、◎）を有し、そして架橋オリゴは３’末端にＦＡＭ基を有していた。
【０２１０】
ＦＡＭ標識オリゴは全て、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．製であった。長いオーバーハングのセットにおいて使用したオリゴは全て、市販のオリゴヌクレオチド合成器（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で合成し、ホスホリル化した。短いオーバーハングのセットにおいて使用したオリゴは全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．により製造され、ホスホリル化された。
【０２１１】
（固体支持体上の１７塩基オーバーハングオリゴヌクレオチドの遺伝子組立）
トップストランドのオリゴヌクレオチドの各々を１５分６５℃で１ＸＳＳＰＥ中二本鎖を形成するために個別の相補のボトムストランドオリゴヌクレオチドにアニーリングした。架橋オリゴは第１の二本鎖とアニーリングしてトリプレットを形成した。得られたフラグメントは図１５Ｃにおいて識別される。
【０２１２】
フラグメントを共に連結するために、自身に結合させて全量約１００ピコモルのリンカーオリゴを有する固体支持体約１２０マイクロリットル充填容量を３回２ＸＳＳＰＥ緩衝液１ｍｌで洗浄した。第１のオリゴトリプレット（０Ａ、総量４００ピコモル）を１００μｌの２ＸＳＳＰＥ緩衝液と共に支持体に添加した。アニーリング混合物を２時間間室温で回転混合した。２ＸＳＳＰＥ洗浄（０．４ｍｌ、５回）、次いでアニーリング過程を行い未ハイブリダイズのオリゴトリプレットを除去した。この過程をオリゴダブレット１Ａ、２Ａおよび３Ａついて逐次的に反復し、各々の場合アニーリング時間は室温で２時間とし、２ＸＳＳＰＥ洗浄（０．４ｍｌ、５回）とした。
【０２１３】
遺伝子に関する全オリゴ二本鎖が共にアニーリングした後、固体支持体を冷蔵連結洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）１ｍｌで３回、そして１Ｘ連結緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）９０μｌで３回洗浄した。連結反応は７０μｌの１Ｘ連結緩衝液および８００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をカートリッジに添加し、２時間室温で回転攪拌して反応内容物を混合する工程；により実施した。次に支持体を１ｍｌの洗浄溶液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８）で５回洗浄した。０．４ｍｌの５０℃のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で３回支持体を洗浄する工程；により連結した遺伝子を支持体から遊離させた。溶出した溶液を合わせ、ＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で遠心分離する工程；により約２０マイクロリットルまで濃縮した。
【０２１４】
（固体支持体上の４塩基オーバーハングオリゴヌクレオチドの遺伝子組立）
トップストランドのオリゴヌクレオチド全てを１５分６５℃で１ＸＳＳＰＥ緩衝液中二本鎖を形成するために１つの相補のボトムストランドオリゴヌクレオチドにアニーリングした。架橋オリゴは第１のトリプレットとアニーリングしてテトラッドを形成した。得られたフラグメントは図１５Ｄにおいて識別される。
【０２１５】
自身に結合させて全量約１００ピコモルのリンカーオリゴを有する固体支持体約１１０マイクロリットル充填容量を３回２ＸＳＳＰＥ緩衝液１ｍｌで洗浄した。２ＸＳＳＰＥ緩衝液１００μｌ中の架橋オリゴ（３５０ピコモル）を１時間室温で固体支持体にアニーリングした。次にクアドルプレット０Ａ／１Ａ（総量４００ピコモル、３１ピコモル／μｌ）を添加した。アニーリング混合物を１時間４０分間室温で回転攪拌した。２ＸＳＳＰＥ洗浄（０．４ｍｌ、４回）をアニーリング工程の後に行い未ハイブリダイズのオリゴを除去した。アニーリングしたオリゴは２時間室温で１Ｘ連結緩衝液１００μｌの存在下で１００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。固体支持体上の連結生成物を２ＸＳＳＰＥ（０．４ｍｌ、５回）で洗浄した。
【０２１６】
アニーリングおよび連結の過程はオリゴ二本鎖２Ａ、３Ａおよび４Ａついて逐次的に反復した。新しい二本鎖のアニーリングと連結を開始する前に、少量の固体支持体を各連結生成物の試料として採取した。最終二本鎖をアニーリングして連結した後、各サイクル後に採取した少量の試料を含む生成物を３回５５℃の水４００μｌで溶出した。溶出した溶液を合わせ、ＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で遠心分離する工程；により約５０〜６０マイクロリットルまで濃縮した。
【０２１７】
（ゲル分析）
ゲル分析はＤＮＡフラグメントのサイズを確認するために行った。８％のネイティブのアクリルアミドゲルを１ＸＴＢＥ泳動緩衝液（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と共に使用した。各フラグメント６〜７マイクロリットルをローディング染料（Ｇｅｓｕｒａ  ＴｙｐｅＩＩ  ６Ｘ）と４０％スクロースの混合物（１／１、ｖ／ｖ）３マイクロリットルと混合した。ゲルを１５０ボルト一定で泳動し、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で後染色した。得られたゲルを図１５Ｅに示す。図１５Ｅにおいて、レーン１および２は１７塩基のオーバーハング組立生成物である。レーン３および７は２０ｂｐのマーカーである。レーン４〜６は、２Ａの連結後（レーン４）、３Ａの連結後（レーン５）および４Ａの連結後（レーン６）の４塩基のオーバーハング組立生成物を示す。
【０２１８】
結果は両方のオリゴセット由来の１４５ｂｐの正しいサイズの遺伝子の生産を確認するものであった。しかしながら１７塩基オーバーハングセットは１種の主要生成物を生成するのみであり、４塩基オーバーハングオリゴセットは全２連結サイクルの生成物を生産していた。
【０２１９】
（実施例５）
（ジェネリックリンカーオリゴに結合させた固体支持体の再使用）
一般的に、本発明に記載したジェネリックリンカーオリゴヌクレオチドに結合させた固体支持体は再使用可能である。１つの遺伝子を組み立てて固体支持体から溶出させた後、支持体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水、次いで２ｘＳＳＰＥで洗浄し、そして精製水中４℃で保存してよい。支持体は別の遺伝子を組立てるために再度使用する工程；ができる。このような過程を複数回反復できる。
【０２２０】
実施例１に記載した操作法と同様にして３５５ｂｐの遺伝子を組立てた。「左」および「右」のフラグメントを２種の異なるポリスチレン樹脂支持体上で個別に組立て、そして次に組み合わせて最終遺伝子とした。組立は新しく製造した支持体および以前に使用／洗浄した支持体を用いて比較した。両方の場合において使用した試薬の量は同じであった。溶出したフラグメントを図１６に示す通り６％アクリルアミドゲル上で分析した。図１６において、レーン１および６は２０ｂｐのラダーであり、レーン３は以前に使用した支持体上で組立てた右フラグメント（長オーバーハング配列を含む１６９ｂｐ）であり、レーン５は新しい支持体上で組立てた右フラグメントであり、レーン２は以前に使用した支持体上で組立て、そして４アニーリングサイクル後に停止した左フラグメント（１６６ｂｐ）であり、そしてレーン４は６アニーリングサイクル後に新しい支持体上で組立てた左フラグメント（２３０ｂｐ）である。ゲルは以前に使用した支持体が新しい支持体と同様のポリヌクレオチドの品質および収率をもたらす工程；ができる工程；を明らかにしている。
【０２２１】
（実施例６）
（多孔性ポリエチレン支持体上の４２５塩基対の遺伝子のビルド操作）
（カルボジイミドによるポリエチレンフリットへのリンカーオリゴの結合）
直径９ｍｍ、厚み１．５ｍｍ、孔径７および２０ミクロンのポリエチレンフリットをＯｒｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃｅｓ（Ｗｅｓｔｍｏｎｔ，ＩＬ）より購入した。第１アミン基を４ｔｈＳｔａｔｅ，Ｉｎｃ．によるプラズマ処理によりＰＥフリット表面上に導入した。フリットの関与するその後の全ての反応および方法は図１２Ｇに示すポリプロピレンカートリッジ（やはりＯｒｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）中で実施した。試薬および緩衝液はカートリッジの上面からフリットに送達され、液体を上昇下降しながら送液するシリンジによりフリットの細孔内を通って混合され、そして空のシリンジによりフリットから除去される。カートリッジの底部の開口部は反応中は密栓しておく。
【０２２２】
オリゴヌクレオチドに結合する前に、フリットを室温で１７時間０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）溶液中１０％無水コハク酸中でスクシニル化した。スクシニル化したフリットは、室温の水、その後０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６〜７）にて４５℃で１回および室温で２回、そして最後に室温の水で３回、洗浄した。次にスクシニル化ポリエチレンフリットを、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．の製造した５’ポリ（エチレングリコール）（式（１）中ｍ＝１２）スペーサーおよび末端第１アミン（式（１）中Ｒ１＝アミノ）を含む１７塩基リンカーオリゴヌクレオチドに結合した。結合は３時間室温で、６μＭのリンカーオリゴヌクレオチド濃度および０．４ＭのＥＤＣ濃度においてｐＨ４．５の０．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）５０μｌ容量／フリットピースにおいて実施した。反応の後、フリットを６回洗浄緩衝液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８）で、そして、２回２ＸＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）で洗浄した。フリットは４℃で２ＸＳＳＰＥ中に保存した。
【０２２３】
（蛍光によるハイブリダイゼーション能の試験）
試験は、実施例１に記載した方法と同様にして、リンカーオリゴヌクレオチドに結合したポリエチレンフリットを蛍光標識相補オリゴヌクレオチドにアニーリングし、フリットを洗浄して過剰の相補オリゴを除去し、ハイブリダイズしたオリゴを溶出し、溶出液の蛍光を測定する工程；により実施した。アニーリングは２ＸＳＳＰＥ中１時間室温にて実施した。洗浄は２ＸＳＳＰＥで行い、洗浄の完了度は蛍光でモニタリングした。ハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドを１ｍｌの５０℃のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水を３回用いてフリットから溶出させた。蛍光シグナル９５％超が第１の溶出液からであった。標識相補オリゴの既知量の溶液の標準検量線との比較により７μｍの孔径のフリットのハイブリダイゼーション能は１７０ピコモル／フリットであり、２０μｍの孔径のフリットのハイブリダイゼーション能は１７５ピコモル／フリットであると測定された。
【０２２４】
（ポリエチレンフリット上の遺伝子組立）
標的遺伝子は図１７Ａに示す通り両方の５’末端に１７塩基オーバーハングを含む４２５塩基対を有する。
【０２２５】
実施例１に記載した方法と同様にして、この４２５ｂｐポリヌクレオチドを図１７Ｂに示す通り３３〜３５ヌクレオチド塩基の配列長を各々有する２４オリゴのセットにカットした。オリゴは前記実施例に記載した１６〜１７塩基のオーバーラップを有する相補鎖中のオリゴとオーバーラップしていた。遺伝子の左５’オーバーハングおよび固体支持体上のリンカーオリゴの両方に相補であるヌクレオチド配列を有する架橋オリゴ（＊＊＊＊を付したもの）を遺伝子組立における使用のために設計した。架橋オリゴはその５’末端にリン酸基を有しておらず、従って何れの連結反応にも関与しない。架橋オリゴは遺伝子と固体支持体の間の除去可能な補助物としてのみ作用する。本遺伝子組立において使用した全オリゴは市販の自動合成装置（ＡＢＩ）上で知られたホスホアミダイト化学により合成され、そしてキナーゼによりホスホリル化された。
【０２２６】
合成方法を開始するために、全ての一本鎖オリゴヌクレオチドを１５分間６５℃の１ＸＳＳＰＥ緩衝液中１９ピコモル／μｌで二本鎖にアニーリングした。この遺伝子に関するダブレットおよびトリプレットの厳密な配置は図１７Ｃに記載する通りである。それらには各々識別を容易にするために逐次的な名称を与えた。ハイブリッドを含む溶液を放冷して室温とした。これ等のハイブリッド含有溶液は後の組立過程において使用した。
【０２２７】
リンカーオリゴに結合したポリエチレンフリットの単一のピースをカートリッジに入れた。保存緩衝液を除去し、フリットを３回２ＸＳＳＰＥ緩衝液０．４ｍｌで洗浄した。第１オリゴ（トリプレット１Ａ、総量３００ピコモル）を６ＸＳＳＰＥ緩衝液５０μｌと共にフリットに添加した。溶液をシリンジでフリットを通して上下に送液した。アニーリングは１時間３０分実施した。２ＸＳＳＰＥ洗浄（０．５ｍｌ、５回）をアニーリングプロセスの後に行う工程；により未ハイブリダイズのオリゴトリプレットを除去した。この過程は、アニーリング時間を１時間に低減した以外は、オリゴハイブリッド２Ａ〜１２Ａについても逐次的に反復した。
【０２２８】
遺伝子についてオリゴ全てがアニーリングした後、フリットを冷蔵連結洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）０．４ｍｌで１回、そして１Ｘ連結緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．５）１００マイクロリットルで１回洗浄した。連結反応は５０マイクロリットルの１Ｘ連結緩衝液および１２００付着末端単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をカートリッジに添加し、３時間室温で溶液を上下に送液する工程；により反応内容物を混合する工程；により実施した。次にフリットを０．５ｍｌの６ＸＳＳＰＥで５回、そして０．５ｍｌの２ＸＳＳＰＥで１回洗浄した。
【０２２９】
０．４ｍｌの５０℃のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で３回フリットを洗浄する工程；により連結した遺伝子をフリットから遊離させた。溶出した溶液を合わせ、ＹＭ−３０ＭｉｃｒｏＣｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で遠心分離する工程；により約２０マイクロリットルまで濃縮した。ゲル分析はＤＮＡフラグメントのサイズを確認するために行った。５％のプレキャストのネイティブのアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を１ＸＴＢＥ泳動緩衝液（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と共に使用した。ゲルを１３０ボルト一定で泳動し、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で後染色した。１００ｂｐのラダーを用いた図１７Ｄに示す結果は正しいサイズを有する予測された遺伝子フラグメントが主要生成物である工程；を確認するものであった。
【０２３０】
プライマーとしてトップストランドオリゴの１番目およびボトムストランドオリゴの最後のものを用いながら、最終遺伝子フラグメントに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ生成物もまた５％アクリルアミドゲルで分析し、その結果は図１７Ｅに示す通りであった。左レーンは組立遺伝子フラグメントのＰＣＲ生成物である。中央のレーンは約５２０ｂｐのＰＣＲ対照試料である。右レーンは１００ｂｐマーカーである。４２５量体のフラグメントがゲル上に明らかに示されている。
【０２３１】
（実施例７）
（１ＫＢ遺伝子フラグメントの合成）
本発明者等がビルドしたモデル遺伝子は１１９９ｂｐのＥ．ｃｏｌｉＬａｃリプレッサー遺伝子（Ｌａｃｌ）である。このモデル遺伝子の構築は図８のフローチャートに示す通りである。各々約４００ｂｐである３種の中間体遺伝子フラグメントを固体支持体上に製造した。最終的な１．２ｋｂの遺伝子は溶液系の技術を用いて組立てた。オリゴは市販のオリゴ合成器上で本発明者等が合成している。
【０２３２】
固体支持体は孔径７〜２０ミクロンのポリエチレンフリットであり、反応器ハウジングはポリプロピレンＳＰＥカートリッジとした。フリットおよびカートリッジの両方ともＯｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｍｏｎｔ，ＩＬ）より購入した。フリットの表面は４ｔｈＳｔａｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）においてプラズマ処理する工程；により誘導体化した。１７ヌクレオチドのユニバーサルオリゴをその５’末端においてＰＥＧスペーサーに結合させ、そして第１アミン基で終結させた。このリンカーオリゴは水相のカルボジイミド化学により固体支持体に共有結合させた。固体支持体の結合能は本明細書に記載する蛍光試験により測定した。
【０２３３】
各中間体フラグメントコンストラクトはオリゴ１２対よりなるものであった。それらは１２反復アニーリング洗浄サイクルにより固体支持体上に個別に組立てた。アニーリングしたフラグメントはＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。遺伝子フラグメントは温水で溶出する工程；により固体支持体から遊離させた。それらのサイズはポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。手作業により４００ｂｐフラグメントを組立てるための全サイクル時間は１８時間であった。
【０２３４】
中間体フラグメントをＰＣＲで増幅させ、より清浄な生成物を形成し、そして後の過程のための物質の品質を向上させた。最終遺伝子組立は酵母相同組み換え法により溶液相において行った（Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ，Ｋ．Ｖｏ，Ｓ．Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐａｄｄｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  （１９９７），ｖｏｌ．２５，４５１−４５２；およびＰ．Ｇｕｎｙｕｚｌｕ，  Ｇ．Ｈｏｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｙｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  （２００１），ｖｏｌ．３１，１２４６−１２５０）。最終組立遺伝子をクローニングし、配列決定した。調べた６種のフルサイズのクローンのうち、各々は補正する工程；ができる４〜５つのランダム１ヌクレオチドエラーを含んでいた。このエラーの比率および型は同様のサイズの溶液相組立遺伝子において観察されるものと同等である（データ示さず）。４００ｂｐの中間体フラグメントの１つを配列決定したところ、１０クローンから４つの正確な配列が得られた工程；がわかった。エラーはやはりランダムであり、大部分は１ヌクレオチドの置換、欠失または挿入であった。
【０２３５】
（実施例８）
（自動化固相遺伝子組立ステーションを用いた１ｋｂの遺伝子フラグメントの合成）
実施例１〜４および６において上記した方法と同様にして、実施例７の標的１ｋｂ遺伝子由来の成分遺伝子フラグメントを本発明の自動化固相遺伝子組立ステーション（装置）を用いて組立てた。
【０２３６】
標的１ｋｂ遺伝子を各々１８０〜２４０ｂｐ長の６遺伝子フラグメント（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３、Ｆｒ４、Ｆｒ５およびＦｒ６）に分割した。これ等の６フラグメントを反応ブロック内に含まれる６つの個別の反応容器上で同時に組立てた。
【０２３７】
自動化装置上で実行された過程は固体支持体を誘導体化する工程、ユニバーサルリンカーオリゴヌクレオチドを結合する工程、ユニバーサルリンカーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能を試験する工程、遺伝子フラグメントを組立てる工程、酵素的な連結および最後に固体支持体から遺伝子フラグメントを除去する工程；を包含する。全過程はコンピューター制御ユニットにより予備プログラミングして操作した。各フラグメントにつき架橋オリゴヌクレオチドおよび逐次的なオリゴヌクレオチド二本鎖をマイクロプレート保持装置上に置いた１枚の９６穴マイクロプレート中に入れて密封し、４℃に維持した。反応ブロックは方法の各工程に必要な温度を維持していた。溶出した遺伝子フラグメントを図１９に示す通りアクリルアミドゲル電気泳動により可視化した。全フラグメントはラダーと比較した場合に正しいサイズを示している。
【０２３８】
本明細書において参照した上記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公開物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
本発明の特定の実施形態を説明目的のために本明細書に記載したが、上記より、種々の変更が本発明の精神および範囲を外れる工程；なく行われる工程；を認識すべきである。例えば本発明の方法、化合物および組成物は固相ＤＮＡ合成および／または自動化された化学ＤＮＡ合成においても使用してよく、その場合、遺伝子は好ましいＤＮＡ分子である。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】図１は本発明の遺伝子フラグメントの組立方法の模式図である。
【図２】図２および３は固体支持体、ユニバーサルオリゴ、架橋オリゴおよび標的遺伝子またはそのフラグメントの間に形成されたコンストラクトの模式図である。
【図３】図２および３は固体支持体、ユニバーサルオリゴ、架橋オリゴおよび標的遺伝子またはそのフラグメントの間に形成されたコンストラクトの模式図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは連結効率を測定するための試験方法の模式図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは本発明で使用してよい固体支持体を有する反応容器を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは本発明で使用してよい反応容器内のオリフィスの相対的配置を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは本発明で使用してよい３つの反応容器を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｅは本発明の反復フロースルー混合方法を示す。
【図９】図９は本発明の連続フロースルー混合を行うために使用してよい装置を示す。
【図１０】図１０Ａは本発明のポンプ、バルブおよび緩衝液レザバと組み合わせた反応容器を示す。図１０Ｂは本発明の遺伝子合成において使用してよい複数の反応容器を含む反応ブロックを示す。図１０Ｃは本発明の遺伝子合成において使用してよい複数のキャビティー内に複数の反応容器を含む反応ブロックを示す。
【図１１】図１１は本発明の固相遺伝子組立系の模式図である。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｆは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｆは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｆは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｆは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜１２Ｆは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１２Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｆは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは本発明において使用してよい反応器の模式図である。
【図１２Ｈ】図１２Ｈおよび１２Ｉはゲル電気泳動の結果である。
【図１２Ｉ】図１２Ｈおよび１２Ｉはゲル電気泳動の結果である。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｃは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１３−２】図１３Ｄはゲル電気泳動の結果である。
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１４−２】図１４Ｃおよび１４Ｄはゲル電気泳動の結果である。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｄは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１５−２】図１５Ｅはゲル電気泳動による分析の結果を示す。
【図１６】図１６はゲル電気泳動による分析の結果を示す。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｃは遺伝子フラグメントを製造するためのオリゴ組立を示す。
【図１７−２】図１７Ｄおよび１７Ｅはゲル電気泳動による分析の結果を示す。
【図１８】図１８は１．２ｋｂ遺伝子を製造するための方法のフローチャートである。
【図１９】図１９は本発明の固相遺伝子組立ステーションにより製造した遺伝子フラグメントのゲル電気泳動による分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５−１】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１４−２】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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