(57)【要約】【解決手段】  分娩後臍帯および胎盤から由来した細胞が開示される。前記分娩後由来細胞を用いた、眼組織の再生或いは修復のための薬学的組成物、装置、および方法も開示される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯組織に由来する細胞を有する単離された分娩後由来細胞であって、前記細胞は、培養において自己複製および増殖増殖することができ、また神経表現型の細胞へ分化する能力を有するものであり、前記細胞は、成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができ、また前記細胞はさらに、以下の特徴、
ａ）培養内で少なくとも約４０回倍加の能力、
ｂ）コーティングされた、またはコーティングされていない組織培養容器に接着し増殖増殖するものであり、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、
ｃ）組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生する、
ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つを産生する、
ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱのマーカー少なくとも１つの産生の欠如、
ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関して、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御されている遺伝子１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコードする遺伝子少なくとも１つが増加した遺伝子の発現、
ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２  ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネルサブファミリーＮ  メンバー４と、インテグリン  ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメインを含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利���ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つが減少した遺伝子の発現、
ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるように、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
の少なくとも１つを有するものである細胞。
【請求項２】
メタルプロテアーゼ活性、粘性溶解活性、および中性プロテアーゼ活性を含む１若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離される、請求項１の分娩後由来細胞。
【請求項３】
正常な核型を有することを特徴とする、請求項６の分娩後由来細胞。
【請求項４】
フローサイトメトリーで検知されるように、ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＦＤＧＦｒ−アルファとＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを含むが、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれをも含まないことを特徴とする、請求項９の分娩後由来細胞。
【請求項５】
請求項１の前記分娩後由来細胞群を有する、細胞集団。
【請求項６】
前記分娩後由来細胞群の実質的に均一な集団であることを特徴とする、請求項５の細胞集団。
【請求項７】
分娩後由来細胞群のクローン細胞株を含むことを特徴とする、請求項６の細胞集団。
【請求項８】
前記分娩後由来細胞群および少なくとも１つの他の細胞タイプを有する不均一な集団である、請求項５の細胞集団。
【請求項９】
請求項８の細胞集団において、
前記少なくとも１つの他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、神経細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、他の多分化能幹細胞、または他の多能性幹細胞である。
【請求項１０】
請求項５の細胞集団から調製された、細胞溶解物。
【請求項１１】
請求項１０の細胞溶解物から調製された、溶解性細胞分画。
【請求項１２】
請求項５の細胞集団から調製された、細胞外マトリックス。
【請求項１３】
幹細胞の分化を神経系統または上皮系統の方へ刺激させる１若しくはそれ以上の因子に接触させて培養される、請求項５の細胞集団。
【請求項１４】
眼変性の病状を有する患者を治療する方法であって、
前記方法は、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量で、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された、多分化能または多能性の細胞を前記患者に投与する工程と有するものである。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、
前記眼変性疾患は、急性眼変性疾患である。
【請求項１６】
請求項１５の方法において、
前記急性眼変性疾患は、脳損傷、視神経損傷、または眼障害である。
【請求項１７】
請求項１４の方法において、
前記神経眼病状は、慢性変性病状、または進行性変性病状である。
【請求項１８】
請求項１７の方法において、
前記慢性病状または前記進行性変性病状は、黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、または縁上皮細胞欠損症である。
【請求項１９】
請求項１４の前記方法において、
前記多分化能細胞または前記多能性細胞は、実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来する単離分娩後由来細胞であり、前記細胞は、培養において自己複製および増殖をすることができ、少なくとも１つの神経表現型の細胞群に分化する能力を有するものであって、さらに前記細胞は、成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができるものであって、また、前記細胞はさらに以下の特徴、
ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器に接着し増殖するものであり、前記のコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むもの、
ｃ）組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの細胞表面マーカー類の少なくとも１つの産生の欠如、
ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるにヒト細胞に関連して、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコード化する少なくとも１つの遺伝子の発現が増加していること、
ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２  ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネルサブファミリーＮ  メンバー４と、インテグリン  ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニ���酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つに対する発現が減少していること、
ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるように、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
の少なくとも１つを有するものである方法。
【請求項２０】
請求項１４の方法において、
前記細胞は、神経系統細胞または上皮系統細胞に分化するように、投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されるものである。
【請求項２１】
請求項１４の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞タイプと共に投与されるものである。
【請求項２２】
請求項２１の方法において、
前記他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、ニューロン前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多分化能または多能性の幹細胞である。
【請求項２３】
請求項２１の方法において、
前記少なくとも１つの他の細胞タイプは、前記分娩後由来細胞と同時に、以前に、または以後に投与されるものである。
【請求項２４】
請求項１４の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の薬剤と共に投与されるものである。
【請求項２５】
請求項２４の方法において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、前記細胞と同時に、以前に、または以後に投与されるものである。
【請求項２６】
請求項１４の方法において、
前記細胞は、眼の表面に投与されるものである。
【請求項２７】
請求項１４の方法において、
前記細胞は、眼の内部に投与されるものである。
【請求項２８】
請求項２７の方法において、
前記細胞は、眼内部でまたは眼の近辺で、前記患者の身体に移植されたカニューレを通して、若しくは装置から投与されるものである。
【請求項２９】
請求項２７の方法において、
前記細胞は、前記細胞を含む基質または骨格の移植によって投与されるものである。
【請求項３０】
眼変性疾患を有する患者を治療するための薬学的組成物であって、薬理学的に許容される担体と、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量の、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞とを有するものである薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項３０の薬学的組成物において、
前記眼変性疾患は、急性眼変性疾患である。
【請求項３２】
請求項３０の薬学的組成物において、
前記神経眼病状は、慢性変性病状、または進行性変性病状である。
【請求項３３】
請求項３０の前記薬学的組成物において、
前記多分化能または多能性の細胞は、実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来する単離された分娩後由来細胞であって、前記細胞は、培養において自己複製および増殖をすることができ、少なくとも１つの神経表現型の細胞群に分化する能力を有するものであって、また、前記細胞は、成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができるものであって、さらに前記細胞は、以下の特徴、
ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器に接着し増殖するものであって、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むものである、
ｃ）組織因子とビメンチンとα−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの細胞表面マーカー類の少なくとも１つの産生の欠如、
ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連して、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコード化する遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している、
ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２  ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネルサブファミリーＮ  メンバー４と、インテグリン  ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心���ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つに対する遺伝子の発現が減少している、
ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるように、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
の少なくとも１つを有する薬学的組成物。
【請求項３４】
請求項３０の薬学的組成物において、
前記細胞は、神経系統細胞群または上皮系統細胞群に分化するように、投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されるものである。
【請求項３５】
少なくとも１つの他の細胞タイプを有する、請求項３０の薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項３５の薬学的組成物において、
前記他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、ニューロン前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多分化能または多能性の幹細胞である。
【請求項３７】
少なくとも１つの他の薬剤を有する、請求項３０の薬学的組成物。
【請求項３８】
請求項３７の薬学的組成物において、
前記他の薬剤は、前記眼変性疾患を治療するための薬剤である。
【請求項３９】
眼の表面に投与するために調製された、請求項３０の薬学的組成物。
【請求項４０】
眼の内部に投与するために調製された、請求項３０の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記細胞を含む基質または骨格として調製された、請求項３０の薬学的組成物。
【請求項４２】
眼変性の病状を有する患者を治療するためのキットであって、
前記キットは、薬理学的に許容される担体、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性細胞の集団、及び前記患者を治療する方法で前記キットを使用するための使用説明書を有するキット。
【請求項４３】
前記細胞群を培養するための少なくとも１つの試薬および使用説明書をさらに有する、請求項４２のキット。
【請求項４４】
少なくとも１つの他の細胞タイプの集団をさらに有する、請求項４２のキット。
【請求項４５】
眼変性疾患を治療するための少なくとも１つの試薬をさらに有する、請求項４２のキット。
【請求項４６】
眼変性疾患を有する患者を治療する方法であって、
前記方法は、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量で、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤を前記患者に投与する工程を有するものであって、前記製剤は、前記細胞群の細胞溶解物、若しくは前記細胞が増殖した条件培地、或いは前記細胞の細胞外マトリックスを有するものである方法。
【請求項４７】
眼変性疾患を有する患者を治療する薬学的組成物であって、
前記組成物は、薬理学的に許容される或る担体、および、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤を有するものであって、前記製剤は、前記細胞群の細胞溶解物、若しくは前記細胞が増殖した条件培地、或いは前記細胞の細胞外マトリックスを有するものである薬学的組成物。
【請求項４８】
眼変性疾患を有する患者を治療するキットであって、
前記キットは、薬理学的に許容される或る担体、および、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤を有するものであって、前記製剤は、前記細胞の細胞溶解物、若しくは前記細胞が増殖した条件培地、或いは前記細胞の細胞外マトリックス、及び前記眼変性疾患の治療のための前記キット構成成分を使用するための使用説明書を有するものであるキット。
【請求項４９】
眼変性疾患を治療するための移植用の細胞の生存、増殖、または活性を増加させる方法であって、移植用の前記細胞の生存、増殖、または活性を増加するのに有効な条件下で、分娩後胎盤組織または分娩後臍帯組織から由来する培養細胞と、前記移植用の細胞とを共培養する工程を有する方法。
【請求項５０】
眼変性疾患を治療するための移植用の細胞の生存、増殖、または活性を増加させるキットであって、分娩後胎盤組織または分娩後臍帯組織から由来する培養細胞、および前記移植用の細胞の生存、増殖、または活性を増加するのに有効な条件下で、分娩後細胞と、前記移植用の細胞群とを共培養するための使用説明書を有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年６月２７日出願の米国仮出願番号第６０／４８３，２６４号に対して優先権を主張するものであって、この参照によってその全体の開示は本明細書に組み込まれる。他の関連出願には、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ１］号明細書、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ２］号明細書、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ３］号明細書、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ４］号明細書、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ７］号明細書、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ８］号明細書、および２００４年３月２４日出願の米国特許仮出願第６０／５５５，９０８の同一出願者の同時係属出願を含むものであって、この参照によって、これら全体の開示は本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、眼疾患および眼障害のための、細胞に基づいた治療または再生治療に関する。具体的には、本発明は、分娩後由来細胞を使用した、眼の細胞および組織の再生または修復のための薬剤成分、装置、および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
種々の特許または他の刊行物が、本明細書を通して引用される。これらの各刊行物は、この参照によって、その全体の開示は本明細書に組み込まれる。
【０００４】
身体の複雑な感覚器官として、眼は、多くの疾患および他の有害状態を経験する場合があり、眼の正常な機能に影響を与える。これらの状態の多くは、特定の眼細胞、およびそれらの細胞から成る組織の損傷および変性に関連する。一例として、視神経および網膜の疾患および変性状態は、世界中で盲目の主要原因である。角膜、レンズ、および随伴眼組織の損傷または変性は、世界中で失明の別の重大な原因である。
【０００５】
前記網膜は、７層の交互に異なる細胞を含み、光シグナルを神経シグナルに変換する過程を含む。網膜視細胞および隣接の網膜色素上皮細胞が機能的ユニットを形成するが、多くの障害では、遺伝的突然変異または環境的条件（年齢を含める）のため、そのような機能的ユニットが不安定になる。この結果、アポトーシスまたは二次変性によって視細胞の損失が起こり、視覚の進行的劣化となり、いくつかの場合には、盲目に至らせる（概説については、Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．ら、２００１，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：４１５〜４４９を参照）。このパターンに含まれる、２種類の眼疾患は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ＲＰ）である。
【０００６】
ＡＭＤは、米国内の５０歳以上で失明の最も一般的な原因であり、その有病率は年齢と共に増加する。ＡＭＤで主要な障害は、ＲＰＥの機能障害およびブルーフ膜の変化（例えば、脂質の堆積と、タンパク質の架橋結合と、栄養物への減少した透過性）のためであるらしい（上記のＬｕｎｄら、２００１を参照）。遺伝子構造と、年齢と、栄養と、喫煙と、太陽光への曝露など、種々の要素が黄斑変性に関与している可能性がある。
【０００７】
ＲＰは主に、遺伝子病として考えられており、１００を超える突然変異が視細胞の損失に関連付けられている（上記のＬｕｎｄら、２００１を参照）。突然変異の大多数は視細胞を標的とするが、いくつかの突然変異は直接、ＲＰＥ細胞に影響を与える。ともに、これらの突然変異は、例えば、視細胞およびＲＰＥ細胞の間の分子輸送、および光情報伝達のような過程に影響を与える。
【０００８】
それほど一般的でないが、衰弱性の他の網膜症もまた、失明および盲目に至らせる、進行性の細胞変性を伴い得る。これらには、例えば、糖尿病性網膜症および脈絡膜新生血管膜（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＣＮＶＭ））などが含まれる。糖尿病性網膜症は、（１）非進行性網膜症、または背景性網膜症（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）（増加した毛細管透過性と、浮腫と、出血と、毛細管瘤と、滲出液によって特徴付けられる）、（２）進行性網膜症（前記網膜から硝子体に伸展する新血管形成と、瘢痕化と、繊維組織の形成と、網膜剥離の可能性によって特徴付けられる）、として類別され得る。ＣＮＶＭでは、脈絡膜から起因する異常な血管が、前記網膜層を通って成長する。この脆弱で新規の血管は容易に壊れ、前記網膜の前記層内に血液および液体が溜まる原因となる。
【０００９】
眼の視神経および関連神経の損傷または進行性変性は、失明および盲目のもう１つの原因となっている。典型的な例は緑内障であり、これは、前記視神経への損失による失明を起こす一群の眼疾患から成る、眼の状態である。不適当な眼からの排膿による、眼圧（ＩＯＰ）の上昇は、緑内障の主な原因であるが、緑内障は、上昇したＩＯＰがない場合でも起こり得る。緑内障は、眼の年齢と共に起こる場合があり、または、眼の損傷、炎症、腫瘍の結果として、または白内障または糖尿病の進んだ症例でも起こる場合があり、またはステロイドのような或る種の薬品によって起こされる場合がある。緑内障での視神経症の主な特徴には、視神経乳頭での特徴的な変化、生存する網膜神経節細胞数の減少、および失明が含まれる。一連の事象によって、前記視神経乳頭の変性が前記疾患で観察される網膜神経節細胞のゆっくりとした死に結び付けられていることが提案されており、このような一連の事象が、神経保護的試薬の使用によって遅らせ得るか、または阻止され得ることが提案されている（Ｏｓｂｏｒｎｅら、２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３（Ｓｕｐｐ  ３）：Ｓ１９−Ｓ２６）。
【００１０】
細胞性損傷および変性病状はまた、眼の他の部分に影響する。例えば、白内障は眼のレンズの漸進的混濁から起こる。一旦始まると、白内障の発達は１若しくはそれ以上の共通経路に沿って進み、最終的に水晶体繊維への損傷で終わる。この病状は現在、影響を受けたレンズの、手術による除去および交換によって治療されている。別の実施例は、眼の表面を作り上げる、角膜およびその周辺の結膜に関連する。角膜および眼球結膜の間にある縁上皮には、角膜上皮幹細胞が含まれる。縁上皮細胞欠損症（Ｌｉｍｂａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：（ＬＥＣＤ））は、例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群、熱火傷、および化学火傷で起こる病状である。ＬＥＣＤはしばしば、前記角膜上皮および前記結膜の間に不均衡をもたらし、前記角膜が侵入する結膜上皮細胞によって覆われるが、前記侵入する結膜上皮細胞は前記角膜表面を大幅に危うくし、視覚の鋭敏さに影響を与える（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．&  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｓ、２００３．Ｃｏｒｎｅａ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ７５〜Ｓ８０）。
【００１１】
組織修復および再生のための幹細胞に基づく治療法が近年出現し、いくつかの前述の神経変性病変および他の眼障害のいくつかの有望な治療法を提供している。幹細胞は自己自己複製能があり、分化して種々の成熟細胞系統を発生することができる。そのような細胞の移植は、標的組織を再構成することによって、生理学的および解剖学的機能を修復するための臨床的手段として利用され得る。幹細胞技術の応用は広範で、組織工学、遺伝子治療デリバリ（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、および細胞治療（すなわち、生物学的薬物を生成するか、またはそれらを含む、生きた細胞または細胞成分を体外から供給することによって、標的部位にそのような生物学的薬物をデリバリすること）を含む（概説に関しては、Ｔｒｅｓｃｏ，Ｐ．Ａ．ら、２０００，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４２：２〜３７を参照）。
【００１２】
幹細胞技術の治療での能力を現実化するための１つの障害は、十分な数の幹細胞を取得する困難さにあった。幹細胞の１つの由来は、胚組織または胎児組織である。ヒトを含めた、いくつかの哺乳類種から、胚の幹細胞および前駆細胞が単離されており、数種のそのような細胞タイプは、自己複製と増殖の能力、並びに種々の細胞系統に十分に分化できる能力を有することが示されている。動物モデル系では、胚幹細胞がＲＰＥ細胞表現型に分化し、移植後にホスト動物の視細胞の生存を高めることが報告されている（Ｈａｒｕｔａ，Ｍ．ら、２００４，Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．４５：１０２０〜１０２５、Ｓｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒ，Ｕ．ら、２００１，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０：６７３〜６８０）。胚または胎児の由来から幹細胞を取得することについては、多くの倫理上の問題が挙げられており、多分化能または多能性の細胞の他の由来を特定することによって回避することが望ましい。
【００１３】
成体組織もまた、細胞に基づいた眼治療に有用な幹細胞を産出し得る。例えば、網膜幹細胞および角膜幹細胞は、眼内の細胞置換治療に利用され得る。さらに、海馬からの神経幹細胞が、ホストの網膜に組み入れられ、或る種の神経細胞およびグリア細胞の特徴を示すことが報告されている（概説はＬｕｎｄ，Ｒ．Ｌ．ら、２００３，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７４：１５１〜１６０を参照）。ラット胎児皮質から調製された神経幹細胞が、成体の網膜下空間に移植された後、ＲＰＥ細胞の分化経路に沿って分化することが示された（Ｅｎｚｍａｎｎ，Ｖ．ら、２００３，Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．４４：５４１７〜５４２２）。脊髄幹細胞が、ホスト網膜に移植された後に、網膜神経細胞および視細胞に分化することが報告されている（Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．ら、２００２，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：２７９〜２８３；  Ｋｉｃｉｃ，Ａ．ら、２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：７７４２〜７７４９）。培養された粘膜上皮幹細胞を利用した、ウサギモデルシステムでの眼表面の復元が報告されている（上記Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．&  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｓ．、２００３）。これらの報告は、眼に対する細胞に基づいた治療での成体前駆細胞および幹細胞の使用に将来性を示しているが、成体幹細胞集団の比較的稀であり、しばしば、侵襲的処置によってのみ取得可能である。さらに、成体幹細胞は、培養内で増殖する能力が、胚幹細胞に比べて限定されている可能性がある。
【００１４】
したがって、眼の失われた細胞機能の支持、増大、または置換を行える能力を有する細胞を十分に供給できる代替由来への需要が存在する。そのような細胞から成る実質的に均一な集団の供給が、信頼性のあるものであり、十分に特徴付けられており、また十分な量があると、薬剤スクリーニングアッセイと、眼細胞タイプおよび他の有用な細胞タイプのｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）の栄養因子サポートと、ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）細胞に基づく治療を含む、眼修復および眼再生での様々な診断および治療の応用で有益であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、眼疾患および眼障害のための、細胞に基づいた治療または再生治療に適用され得る、薬剤成分および方法を提供する。具体的には、本発明の特色は、分娩後に由来する細胞を使用した、眼組織の再生または修復のための薬剤成分、装置、および方法である。
【００１６】
本発明の１つの観点は、単離された分娩後に由来する細胞を特徴とし、これは、実質的に血液を含まない、ヒトの胎盤または臍帯組織に由来するのもであって、前記細胞は培養中で自己複製能があり、また増殖することができ、神経表現型の細胞に分化する能力を有するものであり；また前記細胞は成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長し得る。この細胞は、（ａ）培養内で少なくとも約４０回倍加する能力、（ｂ）コーティングされた培養容器、またはコーティングされていない培養容器で付着、増殖するものであって、前記コーティング培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを有する、（ｃ）少なくとも１つの組織因子、ビメンチン、およびアルファ−平滑筋アクチンを産生、（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つを産生、（ｅ）フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、（ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞（ｉｌｅａｃ  ｃｒｅｓｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌ）である、ヒト細胞に関して、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３、Ｃ−タイプ・レクチンスーパーファミリーメンバー２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポプロテイン受容体１、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、プロテインキナーゼＣゼータ、仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌において下方制御された遺伝子１、およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコード化する遺伝子の少なくとも１つに対して増加した遺伝子の発現、（ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、クリスタリン  アルファＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０  タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ、ｒｕｎｔ関連転写因子３、インターロイキン１１受容体  アルファ、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサー、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲン  タイプＶＩＩＩ  アルファ１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５、ヘファエスチン、インテグリン、  ベータ８；シナプス小胞糖タンパク２、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４、インテグリン、ベータ７、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータ、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス５、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド・ケト還元酵素ファミリー１  メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）、バイグリカン、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータ、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリン  ベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメインを含む）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサート  ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、ニューラリン１の類似体（ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｎｅｕｒａｌｉｎ  １）、Ｂ細胞転座遺伝子１（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  １）、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１、およびＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つが減少した遺伝子の発現、（ｈ）ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、および（ｉ）ＥＬＩＳＡによる検出で、ＴＧＦ−ベータ２、Ａ��Ｇ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、の特徴の１つ以上を有する。
【００１７】
１実施形態では、前記分娩後由来細胞は臍帯由来細胞である。他の実施形態では、前記分娩後由来細胞は胎盤由来細胞である。特定の実施形態では、前記細胞は以下のいずれかの細胞タイプの識別特徴のすべてを有する：これらは、細胞タイプＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７４）、細胞タイプＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７５）、細胞タイプＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７９）、細胞タイプＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）、または細胞タイプＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６８）である。
【００１８】
１実施形態では、分娩後由来細胞は、メタルプロテアーゼ活性、粘性溶解活性、および中性プロテアーゼ活性を含む、１若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離される。好適には、前記細胞は正常の核型を有するものであって、この核型は、前記細胞が培養で継代されるときに維持される。好適な実施形態では、前記分娩後由来細胞は、フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを含むが、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれをも含まない。
【００１９】
本発明の別の観点は、上記の前記分娩後由来細胞を構成する細胞集団を特徴とする。１つの実施形態では、前記集団は、実質的に均質の集団の前記分娩後由来細胞である。特定の実施形態では、前記集団は、クローン細胞系の前記分娩後由来細胞である。別の実施形態では、前記集団は、前記分娩後由来細胞および少なくとも１つの他の細胞タイプを含む、不均一集団である。或る種の実施形態では、前記他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、ニューロン前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多分化能または多能性の幹細胞である。他の実施形態では、神経系統または上皮系統の方へ幹細胞の分化を刺激させる、１若しくはそれ以上の因子に、前記細胞集団を触れさせて培養する。
【００２０】
また、分娩後由来細胞から調製された細胞溶解物も、本発明に従った特色である。前記細胞溶解物は、膜を豊富に含む１つの分画および１つの溶解性細胞分画に分離でき得る。本発明はまた、前記分娩後由来細胞によって生成される細胞外マトリックス、並びに、前記細胞が成長した条件培地を特色とする。
【００２１】
本発明の別の観点は、眼変性の病状を有する患者を治療する方法を特色とし、前記方法には、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量で、前記患者に分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞を投与することが含まれる。好適には、前記細胞は、上記のような分娩後由来細胞である。ある種の実施形態では、前記眼変性疾患は、急性の眼変性疾患（例えば、脳損傷、視神経損傷、または眼障害）である。他の実施形態では、それは慢性または進行性の変性病状（例えば、黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、または縁上皮細胞欠損症）である。或る種の実施形態では、前記細胞は、投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されて、神経系統細胞または上皮系統細胞に分化する。
【００２２】
１実施形態では、前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞タイプ、例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、ニューロン前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多分化能または多能性の幹細胞、と共に投与される。これらの実施形態では、前記他の細胞タイプは、前記分娩後由来細胞と同時に、或いは、前記分娩後由来細胞の、投与以前に、または投与以後に、投与され得る。同様に、これらの実施形態および他の実施形態で、前記細胞は、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、眼治療用の薬剤）、または別の有益な補助薬剤（例えば、抗炎症性薬剤、抗アポトーシス薬剤、酸化防止剤、または成長因子）と共に投与される。これらの実施形態では、前記他の薬剤は、前記分娩後細胞と同時に、或いは、前記分娩後細胞の、投与以前に、または投与以後に、投与され得る。
【００２３】
種々の実施形態で、前記細胞は眼の表面に投与されるか、眼の内部、または眼に近接した位置（例えば、眼の後ろ）に投与される。前記細胞は、眼内または眼の近接の、患者の身体に挿入されたカニューレまたは装置から投与されることができ、または、前記細胞を含むマトリックスまたは骨格の移植によって前記細胞が投与され得る。
【００２４】
本発明の別の観点は、眼変性の疾患を有する患者を治療するための薬学的組成物を特色とし、前記組成物には、薬理学的に許容される担体と、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量の、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞とが含まれる。好適には、前記分娩後細胞は、上記のような分娩後由来細胞である。前記眼変性疾患は、急性、慢性、または進行性の病状であり得る。或る種の実施形態では、前記成分は、前記成分の調製の以前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されて、神経系統細胞または上皮系統細胞に分化した細胞を含む。
【００２５】
１実施形態では、前記薬学的組成物は、少なくとも１つの他の細胞タイプ、例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、ニューロン前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多分化能または多能性の幹細胞、を含む。これらの実施形態または他の実施形態で、前記薬学的組成物は、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、眼変性障害を治療するための薬剤）、または別の有益な補助薬剤（例えば、抗炎症性薬剤、抗アポトーシス薬剤、酸化防止剤、または成長因子）を含む。
【００２６】
１実施形態では、前記薬学的組成物は、眼の表面に投与するために調製される。別法では、前記成分は、眼の内部、または眼の近接部位（例えば、眼の後ろ）に投与されるために調製され得る。前記成分はまた、前記細胞を含むマトリックスまたは骨格としても調製され得る。
【００２７】
本発明の更に別の観点によると、眼変性疾患を有する患者を治療するためのキットが提供される。前記キットには、薬理学的に許容される担体、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞の集団（好適には上記の分娩後由来細胞）、および前記患者を治療する方法で前記キットを使用するための説明書が含まれる。前記キットには、１若しくはそれ以上の追加成分を含んでもよく、それらは、例えば、前記細胞を培養するための試薬および説明書、または少なくとも１つの他の細胞タイプの集団、または眼変性疾患の治療に有用な１若しくはそれ以上の薬剤、である。
【００２８】
本発明の別の観点によると、眼変性の病状を有する患者を治療する方法が提供され、前記方法は、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量で、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤を前記患者に投与することを含み、前記製剤は、前記細胞の細胞溶解物（またはその分画）、または、その中で前記細胞が成長されたことを特徴とする条件培地、または、前記細胞の細胞外マトリックスを含む。好適には、前記細胞は、上記の前記分娩後由来細胞である。別の観点では、本発明は薬剤成分を特色とし、そのような薬剤成分は、薬理学的に許容される担体、および前記分娩後細胞から作られた製剤を含み、前記製剤は、前記分娩後細胞の細胞溶解物（またはその分画）、前記分娩後細胞の細胞外マトリックス、または前記分娩後細胞が培養された条件培地、であり得る。本発明のこの観点を実践するためのキットもまた、提供される。これらのキットには、薬理学的に許容される担体または他の薬剤や試薬、の１若しくはそれ以上、細胞溶解物またはその分画、細胞外マトリックス、または、前記分娩後細胞からの条件培地、の１若しくはそれ以上、および前記キットの構成部品の使用説明書、を含み得る。
【００２９】
本発明の別の観点は、眼変性障害を治療するための移植用の細胞の生存、成長、または活性を増加させる方法を特徴とする。前記方法は、移植用前記細胞の生存、成長、または活性を増加させるのに効果的な前記条件下で、分娩後胎盤組織または分娩後臍帯組織から由来する培養された細胞と、移植用前記細胞とを共培養することを含む。好適には、前記分娩後細胞は、上記の前記分娩後由来細胞である。前記方法を実践するためのキットもまた、提供される。前記キットは、培養された前記分娩後細胞、および、移植用の前記細胞の生存、成長、または活性を増加させるのに効果的な前記条件下で前記分娩後細胞と共に、移植用前記細胞を共培養するための説明書、を含む。
【００３０】
本発明の他の特色および有利性は、下記の詳細な説明および実施例から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
定義
本明細書および本請求項を通して使用される種々の用語は、下記のように定義する。
【００３２】
「幹細胞」は、未分化の細胞であって、単一の細胞が、自己複製できる能力と、分化して子孫細胞（自己複製する前駆細胞、自己複製できない前駆細胞、および最終分化細胞を含む）を産生する能力によって定義される。幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）からの種々の細胞系統の機能的な細胞に分化できる能力によっても特徴付けられ、並びに、移植後、複数の胚葉組織を生じさせること、および、胚盤胞に注入後にすべてではなくてもほとんどの組織に実質的に寄与すること、の能力によっても特徴付けられる。
【００３３】
幹細胞は、その発生能に従って、（１）全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）、（２）多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、（３）多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、（４）少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）、および（５）単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）、として分類される。「全能性」細胞は、すべての胚細胞タイプおよび胚体外タイプを生じさせることができる。「多能性」細胞は、すべての胚細胞タイプを生じさせることができる。「多分化能」細胞は、細胞系統のサブセットであるが特定の組織、器官、または生理的システム内のすべてを生じさせる細胞を含む（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限られた少能性前駆細胞、および、血液の正常成分である全細胞タイプおよび要素（例えば、血小板）、を含む子孫を生じ得る）。「少能性」である細胞は、多分化能幹細胞より限られたサブセットの細胞系統を生じることができ、「単能性」である細胞は１つの細胞系統（精子形成幹細胞）を生じさせることができる。
【００３４】
幹細胞もまた、それらが採取された由来に基づいて分別される。「成体幹細胞」は一般的に、複数の分化した細胞タイプを含む組織内で見つけられる多分化能未分化細胞である。前記成体幹細胞は自己複製し得る。通常の環境では、前記成体幹細胞は分化して、それが由来する前記組織の特定細胞タイプ、および可能性として他の組織タイプを産出し得る。「胚幹細胞」は、胚胞期の胚の内部細胞塊からの多能性細胞である。「胎児」幹細胞は、胎児の組織または膜から由来する細胞である。「分娩後幹細胞」は、多分化能細胞または多能性細胞であって、出産後に利用できる胚体外組織、すなわち胎盤および臍帯、から実質的に由来する。これらの細胞は、多能性幹細胞の特徴的な特色（急速な細胞増殖および多くの細胞系統に分化できる能力を含む）を有することが見つけられている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から採取された細胞）または血液以外に由来（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から採取された細胞）であり得る。
【００３５】
「胚組織」は通常、胚に由来する組織として定義される（ヒトでは、胚は、受精から約６週間の発生までの期間を意味する）。「胎児組織」は、胎児に由来する組織を意味する（ヒトでは、胎児は、約６週間の発生から出産までの期間を意味する）。「胚体外組織」は、胚または胎児に随伴する組織であるが、胚または胎児に由来しない組織である。胚体外組織には、胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄、および尿膜）、臍帯、および胎盤（それ自体は、前記絨毛膜および母体側の基底脱落膜から形成される）が含まれる。
【００３６】
「分化」は、特殊化されていない（「コミットしていない」）細胞、またはそれほど特殊化されていない細胞が、特殊な細胞（例えば、神経細胞または筋肉細胞）の特色を獲得する過程である。「分化した」細胞は、細胞の系統内で、より特殊化した（「コミットした」）状態を取った細胞である。用語「コミットした」が、分化の過程に適用された場合、以下のような細胞を意味する。そのような細胞は、その分化経路を進み、通常の状況では、前記細胞が特定細胞タイプ、または細胞タイプのサブセットに分化し続け、通常の状況では、他の細胞タイプに分化したり、またはより分化していない細胞タイプに逆戻りすることができない。「脱分化」は、細胞が、細胞の系統内でより特殊化していない（コミットしていない）位置に逆戻りする過程を意味する。当明細書では、細胞の「系統」は、前記細胞の遺伝、すなわち、前記細胞がどの細胞から生じたのか、また前記細胞が何の細胞に成り得るか、を意味する。細胞の系統は、発生および分化の生来性の枠内に前記細胞を置く。
【００３７】
広範な意味では、「前駆細胞」は、その前駆細胞よりもっと分化した子孫を作る能力を有するものであって、子孫の集団を補給する能力をまだ保持する、細胞である。その定義によって、幹細胞自体もまた前駆細胞であり、最終的に分化した細胞にとっては、すぐ以前の前駆の細胞も前駆細胞である。以下の詳細な記述で、本発明の細胞を参照する場合、この広範な定義の「前駆細胞」が使用される場合がある。狭い意味では、前駆細胞はしばしば、前記分化経路中の中間体である細胞として定義される、すなわち、前駆細胞は幹細胞から発生し、成熟した細胞タイプまたはサブセットの細胞タイプの産生段階の中間体である。このタイプの前駆細胞は一般的に、自己複製することができない。したがって、このタイプの細胞が当明細書で言及される場合は、「非自己複製前駆細胞」または「中間体前駆細胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）または中間体先駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）」として呼ばれるであろう。
【００３８】
当明細書で使用される「眼系統または眼表現型に分化」の成句は、特定の眼表現型に部分的に、または完全にコミットした細胞を意味し、そのような眼表現型には、限定するものではないが、網膜および角膜の幹細胞、網膜および虹彩の色素上皮細胞、視細胞、網膜神経節および他の眼神経系統（例えば、網膜グリア、ミクログリア、アストロサイト、ミューラー細胞）、レンズを形成する細胞、および強膜、角膜、角膜輪部、および結膜の上皮細胞が含まれる。「神経系統または神経発現型に分化する」の成句は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の特定の神経発現型（すなわち神経細胞またはグリア細胞、後者のカテゴリーはアストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、およびミクログリア細胞を含むがこれに限らない）に、部分的にまたは完全に、コミットした細胞を意味する。
【００３９】
本明細書で例示され、本発明で使用に好適である前記細胞は一般的に、「分娩後由来細胞（ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」または（ＰＰＤＣ）として呼ばれる。これらはまた時々、より特異的に「臍帯由来細胞」または「胎盤由来細胞」（「ＵＤＣまたはＰＤＣ」）として呼ばれる場合がある。さらに、前記細胞は幹細胞または前駆細胞として記述されることもあり、後者の用語は広範な意味で使用される場合がある。用語「由来」は、前記細胞がそれらの生物学的由来から取得されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長されるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されたこと（例えば、前記集団を増殖し、細胞株を作成するために成長培地で培養されること）を意味するために使用される。臍帯幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの操作、および本発明の臍帯由来細胞のユニークな特徴は、以下に詳細に記載される。分娩後胎盤および分娩後臍帯から他の手段によって単離された細胞もまた、本発明の使用に適していると考えられる。これらの他の細胞は、当明細書では（分娩後「由来」細胞ではなく）「分娩後細胞」として呼ばれる。
【００４０】
種々の用語は、培養内の細胞を記述するために使用される。一般的に、「細胞培養」は、生物から取得され、制御された条件下で培養される細胞を意味する（「培養において」、或いは「培養された」）。「初代培養細胞」は、最初の継代培養の前の、生物（または複数の生物）から直接採取された細胞、組織、または器官の培養である。細胞が培養内で「増殖」されるとは、成長および／または分裂を促進する条件下で成長培地内に前記細胞が置かれ、その結果、前記細胞の集団が増加することである。細胞が培養内で増殖されるとき、細胞増殖の速度は、細胞数で２倍になるのに必要な時間によって測定されることが時々ある。これは「倍加時間」と呼ばれる。
【００４１】
「細胞株」は、初代細胞培養の１回若しくはそれ以上の継代培養によって形成された、１集団の細胞である。１回の継代培養は、１継代として呼ばれる。細胞が継代培養されるとき、これらの細胞は「継代された」と呼ばれる。特定の集団の細胞、または細胞株、は時々、継代された回数によって呼ばれ、特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、「Ｐ１０」培養として呼ばれることがある。初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養、はＰ０と指定される。最初の継代培養後、前記細胞は２番目の培養（Ｐ１または継代１）として記述される。前記２番目の継代培養後、前記細胞は３番目の培養（Ｐ２または継代２）として記述され、それ以降も同様に記述される。継代間に多数の集団倍加がある可能性があり、したがって、培養の集団倍加の数が継代数より大きいことは当業者が理解できるであろう。継代間の細胞の増大（すなわち、集団倍加の数）は、多くの因子に依存し、それらの因子には、限定するものではないが、播種密度、基材、培地、成長条件、および継代の間の時間、が含まれる。
【００４２】
「条件培地」は、培地であって、その培地内で、特定の細胞、または特定の細胞集団が培養された後、除去されたことを特徴とする。細胞が培地内で培養されたとき、これらの細胞は、他の細胞に栄養素の支持を提供し得る細胞性因子を分泌している可能性がある。そのような栄養素因子には、限定するものではないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、および顆粒が含まれる。前記細胞性因子を含む前記培地が、前記条件培地である。
【００４３】
一般的に、「栄養因子」は、細胞の生存性、成長、分化、増殖、および／または成熟を促進するか、または細胞の増加した活性を刺激するような物質として定義される。異なるタイプの細胞の間で、栄養因子を介して細胞の間での相互作用が起こり得る。栄養因子を介する、細胞間の相互作用は、基本的にすべての細胞タイプで見られ、特に、神経細胞タイプの間での重要な情報伝達手段である。栄養因子はまた、自己分泌の仕方で機能し得る、すなわち、細胞は、その細胞自体の生存性、成長、分化、増殖、および／または成熟に影響する栄養因子を産生し得る。
【００４４】
培養されている脊椎動物の細胞について言及するとき、用語「老化」（または「複製老化」または「細胞老化」）は、限界のある細胞培養に起因する特性、すなわち、前記細胞が、有限数の集団倍加（時々、「Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界」と呼ばれる）を超えて成長できないこと、を意味する。細胞老化は最初、繊維芽様細胞を用いて説明されていたが、培養内で成長することに成功したほとんどのヒト正常細胞タイプは、細胞性老化を起こす。異なる細胞タイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの寿命は異なるが、最大寿命は通常、１００未満の集団倍加である（これは、培養内の全細胞が老化になり、したがって前記培養が分裂できなくなる倍加数である）。老化は実際の時間に依存せず、むしろ前記培養の細胞分裂の回数、または集団倍加数によって測定される。このように、必須成長因子を取り除くことによって休止状態になった細胞は、前記成長因子が再導入されると、成長と分裂を再開することができ、その後、同等の細胞が連続的に成長するのと同じ倍加数を行える。同様に、細胞が、種々の集団倍加数の後、液体窒素で冷凍され、その後、凍解し培養されると、前記細胞は、冷凍されずに培養内に維持された細胞と実質的に同一の倍加数を行う。老化細胞は、死んだ細胞または死につつある細胞ではなく、実際には老化細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）に抵抗性があり、３年間もの間、非分裂の状態に維持されている。これらの細胞は非常に活動的であり、代謝的に活発であるが、分裂しない。老化細胞の非分裂状態が、いずれの生物学的試薬、化学的試薬、またはウイルス試薬によって逆転され得ることはまだ発見されていない。
【００４５】
用語「眼の（ｏｃｕｌａｒ）」、「眼の（ｏｐｔｈａｌｍｉｃ）」、および「目の（ｏｐｔｉｃ）」は、「眼の、または、眼について、または、眼に関連する」を定義するのに当明細書で同義的に使用される。
【００４６】
用語「眼変性疾患（または障害）」は、眼の急性疾患、慢性疾患、障害、または、眼の疾患を網羅する包括的な用語であるが、ここで、前記眼は、眼と脳の間の神経接続を含み、前記病状は、細胞の損傷、変性、または損失を含む。眼変性状態は年齢に関連する場合があり、或いは損傷や外傷から起こる場合があり、或いは特定の疾患または障害に関連する場合がある。急性の眼変性疾患には、限定するものではないが、脳血管不全から生じる病状を含む、眼に影響を与える細胞死または障害に関連する病状、巣性またはびまん性の脳外傷、びまん性脳損傷、眼の感染または炎症病状、網膜の裂傷または剥離、眼内の病変（挫傷、貫入、圧迫、裂傷）または他の肉体的損傷（例えば、物理的火傷、または化学的火傷）が含まれる。慢性眼変性疾患（進行性病状を含む）は、限定するものではないが、網膜症および他の網膜／黄斑の障害（例えば、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、慢性新生血管膜（ＣＮＶＭ））、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症、閉塞性網膜症（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、鎌状赤血球網膜症、および高血圧性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、頚動脈の狭窄、緑内障および関連の症候群のような視神経症）、レンズおよび眼の外側の障害（例えば、縁上皮幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）、縁上皮細胞欠乏症（ｌｉｍｂａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＬＥＣＤ）とも呼ばれ、化学的損傷または熱損傷で起こる）、スティーブンス・ジョンソン症候群、コンタクトレンズ誘導性の角膜症、眼類天庖瘡、無虹彩や外胚葉異形成症の先天的疾患、および多発性内分泌腺欠乏に関連する角膜炎）を含む。
【００４７】
用語「眼変性疾患の治療」は、当明細書で定義された眼変性疾患の効果を改善すること、または、前記眼変性疾患の進行を遅らせるか、停止するか、または逆転すること、または、前記眼変性疾患の開始を遅らせるか、阻止することを意味する。
【００４８】
用語「有効な量」は、試薬または薬学的組成物（例えば、成長因子、分化薬剤、栄養因子、細胞集団、または他の薬剤）の濃度または量を意味し、それが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞成長および／または分化、または当明細書に記述されたように眼変性疾患を治療すること、を含む、目的の結果を生み出すのに効果的であることを特徴とする。成長因子に関して、有効な量は、約１ナノグラム／ミリリットルから約１マイクログラム／ミリリットルの範囲であり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与されるＰＰＤＣに関しては、有効な量は数百またはそれ以下から数百万またはそれ以上までの範囲であり得る。特定の実施形態では、有効な量は、１０３〜１０１１の細胞の範囲であってよく、より特異的には、少なくとも約１０４の細胞であり得る。投与される細胞数は、処理される障害の詳述によって異なるであろうことを理解されるものであり、そのような障害の詳述には、治療されるサイズまたは全容積／表面面積に限定するものではなく、投与部位から治療される領域までの近接性や医薬生物学者が精通した他の因子が含まれる。
【００４９】
用語「有効な期間（または時間）」および「有効な条件」は、その目的の結果を達成するために薬剤または薬学的組成物に必要な、または好適な、期間、または他の制御可能な条件（例えば、温度、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法での湿度）を意味する。
【００５０】
用語「患者」または「被験者」は、当明細書で記載された前記薬学的組成物で治療される、または当明細書で記載された前記方法にしたがって治療される、動物を意味し、これは哺乳類を含み、好適には人間である。
【００５１】
用語「生物学的に適合する担体または培地」と同義的に使用され得る用語「薬理学的に許容される担体（または培地）」は、治療で投与される細胞および他の薬剤と適合するだけでなく、適切な医学的判断の観点内で、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合併症を伴わずに、人間および動物の組織との接触しての使用に好適な、試薬、細胞、化合物、物質、成分、および／または投薬形態を意味する。
【００５２】
細胞補充療法（ｃｅｌｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）に関するいくつかの用語が、本明細書で使用される。用語「自己移行（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」等は、細胞ドナーがまた、細胞補充療法の受容者であるような治療群を意味する。用語「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）」等は、細胞ドナーが、細胞補充療法の受容者と同じ種であって、同一の個人でない場合の治療群を意味する。ドナーの細胞が受容者と組織適合的に一致しているような細胞移植は時々、「同系移植」として呼ばれる。用語「異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）」等は、前記細胞ドナーが、前記細胞補充療法の前記受容者とは異なる種であるような治療群を意味する。
【００５３】
記述
眼変性疾患（急性、慢性、および進行性の障害および広範に異なる原因を有する疾患を網羅する）は、特定または脆弱な群の眼細胞の機能障害または損失を、１つの共通の特色として有する。この共通性は、脆弱な眼組織または損失された眼組織の修復または再生のための類似な治療アプローチの開発を可能にし、その１つが、細胞に基づく治療である。これまでの眼変性疾患の細胞治療の開発は、眼由来幹細胞（例えば、網膜幹細胞および角膜幹細胞）、胚幹細胞、および２〜３の成人の幹細胞または前駆細胞（例えば、神経幹細胞、粘膜上皮幹細胞、および骨髄幹細胞）を含む、比較的少数の幹細胞または前駆細胞に限られていた。本発明者は、この目的用の幹細胞の重要な新しい由来、すなわち、分娩後の胎盤および臍帯から単離された細胞を同定した。従って、ここに記載される種々の実施形態で、本発明は、分娩後組織から由来する前駆細胞および細胞集団を利用する、眼組織の修復および眼再生のための方法および薬剤成分を特色とする。本発明は任意の眼変性疾患に適用できるが、治療または療法がこれまで困難であったか、または利用できなかった、いくつかの眼障害に特に適していると予測される。これらには、限定するものではないが、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜症、緑内障および他の視神経症、および縁上皮幹細胞欠損に関する障害を含む。
【００５４】
当分野で周知の任意の方法に従って、分娩後胎盤および分娩後臍帯から単離された幹細胞または前駆細胞は、本発明で使用に適していると考えられる。しかし、好適な実施形態では、本発明は、実質的に血液を含まないようにされた胎盤組織または臍帯組織から由来し、上記のように定義された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）を、好適には下記に示される方法に従って、利用する。ＰＰＤＣは、培養内で自己複製して増殖することができ、他の細胞表現型の細胞に分化する能力を有する。或る種の実施形態は、そのような細胞から成る集団、前記細胞またはそれらの成分や産物から成る薬剤成分、急性または慢性の眼変性疾患を有する患者を治療するために前記薬剤成分を使用する方法、を特色とする。前記分娩後由来細胞は、培養内でのその成長の特性、すなわち、それらの細胞表面マーカーによって、それらの遺伝子発現によって、或る種の生化学的栄養素によって、および、それらの免疫学的性質によって、特徴付けられている。
【００５５】
ＰＰＤＣの調製
当明細書に記載された方法に従うと、満期妊娠または早産のどちらかの終了後に、またはそのすぐ後に、例えば出産後の娩出後に、１つの哺乳類の胎盤および１つの臍帯が回収される。前記分娩後組織は、滅菌済みの容器（例えば、フラスコ、ビーカー、培養皿、または袋）で、出産場所からラボまで輸送され得る。前記容器には溶液または培地が含まれていてもよく、そのような溶液または培地には、限定するものではないが、食塩水（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、または移植用臓器輸送に使用される任意の溶液（例えば、ＵＷ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）液またはパーフルオロケミカル溶液）が含まれる。１若しくはそれ以上の抗生物質／抗真菌剤（例えば、限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチン）が前記培地または前記緩衝液に加えられてもよい。前記分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝血剤溶液でリンスされ得る。ＰＰＤＣの摘出前に、前記組織を約４〜１０℃に保つことが好ましい。ＰＰＤＣの摘出前に、前記組織を凍結させないことがさらに好ましい。
【００５６】
好適には、ＰＰＤＣの単離は無菌環境で行われる。前記臍帯は、当技術分野で周知の方法で前記胎盤から分離され得る。別法では、前記臍帯および前記胎盤は分離させずに使用される。好適には、ＰＰＤＣの単離の前に前記分娩後組織から血液および残渣を除去する。例えば、前記分娩後組織が、緩衝溶液（例えば、限定するものではないが、リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄され得る。前記洗浄緩衝液はまた、１若しくはそれ以上の抗生物質／抗真菌剤（例えば、限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチン）を含み得る。
【００５７】
胎盤全体、またはその断片や部分を含む分娩後組織は、機械力（刻み力とせん断力）によって離解される。本発明で好ましい実施形態では、前記単離処理はまた、酵素消化の過程を利用する。培養内で成長を促進するために、複雑な組織マトリックスから個々の細胞を単離するために有用な多くの酵素が、当技術分野で周知である。消化の弱い酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から消化の強い酵素（例えば、パパインおよびトリプシン）の範囲まで、これらの酵素は市販されている。網羅するものではないが、これらに適合する酵素のリストには、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ活性、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼ）、およびデオキシリボヌクレアーゼが含まれる。本発明で好ましい酵素活性は、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、および粘液溶解活性剤から選択される。例えば、コラゲナーゼは、組織から種々の細胞を単離するのに有用であることが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは１本鎖ＤＮＡを消化でき、単離中に細胞の塊化を最小限にできる。好適な方法は、例えば、コラゲナーゼおよびディスパーゼでの、またはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼでの、酵素処理を伴い、ある種の好適な実施形態で、前記分離段階でコラゲナーゼおよび前記中性プロテアーゼのディスパーゼの混合物が使用される場合にこのような方法が提供される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからの少なくとも１つのコラゲナーゼ、および前記プロテアーゼ活性、ディスパーゼ、およびサーモライシンのいずれかの存在下で消化を使用するこれらの方法が、より好適である。コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素活性の両方で消化を使用する方法は、さらにより好適である。コラゲナーゼおよびディスパーゼの活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性で消化を含む方法もまた、好適である。当業者は、種々の組織由来から細胞を単離するための多くの酵素処理が当技術分野で知られていることを理解されるであろう。例えば、ＬＩＢＥＲＡＳＥ  Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅシリーズ（ロッシュ社）の酵素組み合わせは、前記簡単な方法での使用に適している。酵素の他の由来が知られている。当業者は、その天然由来から直接そのような酵素を取得し得る。当業者はまた、十分に装備されており、新しいまたは追加の、酵素または酵素組み合わせの、本発明の前記細胞を単離の際の有用性を査定できる。好適な酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、または２時間、若しくはそれ以上である。他の好適な実施形態では、前記分離段階の前記酵素処理中に、前記組織が３７℃にインキュベートされる。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態では、分娩後組織は、前記組織の種々の側（例えば、前記胎盤の新生児側、新生児／母側、および母側）を含む部分に分けられる。これらの分けられた部分は、その後、本明細書に記載された前記方法に従って、機械的分離および／または酵素的分離によって分離される。新生児系統または母性系統の細胞は、当分野で周知のいずれかの手段、例えば、核型分析、または１つのＹ染色体に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法，によって同定され得る。
【００５９】
単離細胞、または、ＰＰＤＣが増殖して出てくる分娩後組織を使用して、細胞培養を開始、または播種し得る。単離細胞は、滅菌された組織培養容器に移植されるが、これらの組織培養容器は、コーティングされていないか、または細胞外マトリックスまたはリガンド（例えば、ラミニン、コラーゲン（天然、変性、またはクロスリンクされた）、ゼラチン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックスタンパク質）でコーティングされている。ＰＰＤＣは、前記細胞の成長を維持できる任意の培養培地で培養されるが、そのような培養培地には、限定されるものではないが、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）、アドバンストＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ  ２０１、イーグル基礎培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ‐１０培地（Ｆ‐１０）Ｈａｍ’ｓ  Ｆ‐１２培地（Ｆ‐１２）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞用培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、およびＣＥＬＬＧＲＯ−ＦＲＥＥなどが含まれる。前記培養培地には、１若しくはそれ以上の成分が追加され得るが、そのような成分には、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（好ましくは約２〜１５％（容量比））、ウマ血清（ＥＳ）、ヒト血清（ＨＳ）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥまたは２−ＭＥ）（好ましくは約０．００１％（容量比））、１つまたはそれ以上の成長因子（例えば、血小板由来増殖成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、およびエリスロポエチンを含む）、Ｌ−バリンを含めたアミノ酸、微生物汚染を抑制するための１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤（例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチン、１つだけ或いは組み合わせのいずれか）が含まれる。好適には、前記培養培地は、成長培地（低グルコースＤＭＥＭ、血清、ＢＭＥ、および、１つの抗生物質）を含む。
【００６０】
前記細胞は、細胞増殖を許容する密度で培養容器内に播種される。好適な実施形態では、前記細胞は、空気中に約０％から約５％（容積比）の範囲のＣＯ２で培養される。いくつかの好適な実施形態では、前記細胞は、空気中に約２％から約２５％の範囲のＯ２で培養され、好ましくは空気中に約５％から約２０％の範囲のＯ２で培養される。好適には、前記細胞は約２５℃から約４０℃の範囲で培養され、より好適には３７℃で培養される。好適には、前記細胞はインキュベーター内で培養される。前記培養容器内の前記培地は、静止状態にあるか、または、例えばバイオリアクターを使用して、攪拌され得る。好適には、ＰＰＤＣは、低い酸化ストレス下（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインの添加）で成長される。本明細書で使用されている「低酸化ストレス」は、前記培養細胞へのフリーラジカルの損傷が無いか最小限である状態を意味する。
【００６１】
最適の培養培地の選択方法、培地の調製、および細胞培養技術は、当技術分野で周知であり、種々の情報源に記載されているが、そのような情報源には、Ｄｏｙｌｅら（編集者）、１９９５、ＣＥＬＬ  &  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、チチェスター市、およびＨｏおよびＷａｎｇ（編集者）、１９９１、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、ボストン市、が含まれ、ここで参照することによって、それら全体を開示に含める。
【００６２】
前記単離細胞または組織部分を、十分な期間培養すると、前記分娩後組織からの遊走または細胞分裂、またはその両方、の結果のいずれかとして、ＰＰＤＣが遊出する。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＰＤＣは継代される。すなわち、ＰＰＤＣは、最初に使用されていたのと同一タイプまたは異なるタイプの新しい培地を含む、別の培養容器に移され、そこで前記細胞集団が有糸分裂で増殖し得る。本発明の細胞は、継代０と老化の間のいずれの時点でも使用され得る。好適には、前記細胞は約３回から約２５回の範囲で継代され、より好適には約４回から約１２回の範囲で継代され、好適には、１０回または１１回継代される。クローン系集団の細胞が単離されたことを確認するために、クローニングおよび／またはサブクローニングが行われ得る。
【００６３】
本発明のいくつかの観点では、分娩後組織に存在する異なる細胞タイプは、亜集団に分画され、これらの亜集団からＰＰＤＣが単離され得る。これは、細胞分離用の標準的技術を使用して達成でき、そのような技術には、限定するものではないが、酵素処理で、分娩後組織をその構成細胞に分離した後、特定の細胞タイプ（例えば、限定するものではないが、形態学的マーカーおよび／または生化学的マーカーに基づいての選択）をクローニングし選択する技術、望ましい細胞の選択的増殖（ポジティブセレクション）、不要な細胞の選択的破壊（ネガティブセレクション）、混合した集団中で異なる細胞凝集力に基づく選択（例えば、大豆アグルチニンを使用して）、凍結融解手順、混合した集団中の異なる接着性、濾過、従来の遠心分離法およびゾーン遠心分離法、遠心溶出法（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）（逆流遠心：ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、単位重力分離法（ｕｎｉｔ  ｇｒａｖｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、向流分配法、電気泳動法、および蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）が含まれる。クローン選択および細胞単離の手法の概説に関しては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９４、ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社（ニューヨーク）を参照されたい。この文献は、参照することによって開示に含める。
【００６４】
前記培養培地は必要に応じて交換され、例えば、これは、（例えば、ピペットを使って）培養ディシュから培地を注意深く吸引し、新しい培地を補給することによって行う。十分な数、または十分な密度の細胞が前記培養ディシュに累積するまで、インキュベーションを続ける。元の外植組織部分は除去されてもよく、残りの細胞は、標準的な技術を使用してトリプシン処理することによって、またはセルスクレーパーを使用して、除去され得る。トリプシン処理後、前記細胞は収集され、新しい培地に移され、上記のようにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、トリプシン処理後約２４時間後に、浮遊細胞を除去するために、前記培地は少なくとも１回交換される。培養内に残った細胞はＰＰＤＣと考えられる。
【００６５】
ＰＰＤＣは低温保存され得る。従って、以下に詳細に記述される好適な実施形態では、自己移植（母親または子供のいずれか）のためのＰＰＤＣは、子供の出産後の適度な分娩後組織から由来し、その後低温保存され、後に移植に前記ＰＰＤＣが必要な場合に利用可能にすることが可能である。
【００６６】
ＰＰＤＣの特徴
ＰＰＤＣを特徴付けることが可能である。これは、例えば、成長特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常な核型、母性系統または新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および従来のＰＣＲ））、タンパク質配列、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＤＣ条件培地の分析（例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって））、混合培養試験（例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の刺激の指標として）および／または当分野で周知の他の方法、で行える。
【００６７】
胎盤組織から由来するＰＰＤＣの実施例は、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）に預けられており、以下のようにＡＴＣＣ受入れ番号が指定されている：（１）株表示  ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）は、２００４年６月１５日に預けられ、受入れ番号ＰＴＡ−６０７４が指定された；（２）株表示  ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）は、２００４年６月１５日に預けられ、受入れ番号ＰＴＡ−６０７５が指定された；および、（３）株表示  ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）は、２００４年６月１６日に預けられ、受入れ番号ＰＴＡ−６０７９が指定された。臍帯組織から由来するＰＰＤＣの実施例は、２００４年６月１０日にアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクションに預けられており、以下のようにＡＴＣＣ受入れ番号が指定されている：（１）株表示  ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）は、受入れ番号ＰＴＡ−６０６７が指定された；および、（２）株表示  ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）は、受入れ番号ＰＴＡ−６０６８が指定された。
【００６８】
種々の実施形態では、前記ＰＰＤＣは、以下の成長特性の１若しくはそれ以上を有する。それらの成長特性は、（１）前記ＰＰＤＣは、培養内での成長にＬ−バリンを必要とする、（２）前記ＰＰＤＣは、約５％から少なくとも約２０％の範囲の酸素を含む大気内で成長することが可能である、（３）前記ＰＰＤＣは、老化に達する前に培養内で少なくとも約４０回倍加する能力を有する、および（４）前記ＰＰＤＣは、コーティングされた組織培養容器またはコーティングされていない組織培養容器上に接着し増殖するが、ここで、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、である。
【００６９】
ある種の実施形態では、前記ＰＰＤＣは正常の核型を有するものであって、この核型は、培養で継代されるときに維持される。核型分析は、胎盤に由来する母性細胞から新生児細胞を同定し、区別するのに特に有用である。核型分析の方法は、取得可能であり、当分野で周知である。
【００７０】
他の実施形態では、前記ＰＰＤＣはある種のタンパク質の産生によって特徴付けられることが可能である。そのような特性は、（１）組織因子、ビメンチン、およびアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、および（２）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの細胞表面マーカーの少なくとも１つの産生であり、これらはフローサイトメトリーで検知される。他の実施形態では、前記ＰＰＤＣは、フローサイトメトリーで検知されるところでは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの細胞表面マーカーの少なくとも１つの産生の欠如によって特徴付けられ得る。組織因子、ビメンチン、およびアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも２つを産生する細胞は、特に好適である。組織因子、ビメンチン、およびアルファ−平滑筋アクチンの３つをすべて産生する細胞は、より好適である。
【００７１】
他の実施形態では、前記ＰＰＤＣは遺伝子発現によって特徴付けられ得る。この遺伝子発現は、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関してであって、インターロイキン８、レチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３、Ｃ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポプロテイン受容体１、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、プロテインキナーゼＣゼータ、仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、卵巣癌で下方制御されている遺伝子１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）、およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子、の少なくとも１つをコードする遺伝子で増加している。
【００７２】
さらに他の実施形態では、ＰＰＤＣは、遺伝子発現によって特徴付けられ、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞である、ヒト細胞に関してであって、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、クリスタリン  アルファＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０  タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、コレステロール２５ヒドロキシラーゼ、ｒｕｎｔ関連転写因子３、インターロイキン１１受容体  アルファ、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサー、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲン  タイプＶＩＩＩ  アルファ１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５、ヘファエスチン、インテグリン  ベータ８、シナプス小胞糖タンパク２、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）、インスリン様成長因子結合タンパク質２  ３６ｋＤａ、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネル  サブファミリーＮ  メンバー４、インテグリン  ベータ７、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータ、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１、初期成長応答３、ディスタル・レス・ホメオボックス５、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド・ケト還元酵素ファミリー１  メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）、バイグリカン、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータ、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリン  ベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメインを含む）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサート  ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、の少なくとも１つをコードする遺伝子で減少している。
【００７３】
他の実施形態では、前記ＰＰＤＣは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌によって特徴付けられ得る。別の実施形態では、前記ＰＰＤＣは、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如によって特徴付ることができ、これはＥＬＩＳＡで検出される。
【００７４】
好適な実施形態では、前記細胞は、上記にリストした成長、タンパク質／表面マーカーの産生、遺伝子発現、または物質の分泌の特徴の２つ若しくはそれ以上を有する。前記特徴の３つ、４つ、５つ、若しくはそれ以上を有するこれらの細胞は、より好適である。前記特徴の６つ、７つ、８つ、若しくはそれ以上を有するＰＰＤＣは、更により好適である。上記の特徴をすべて有するこれらの細胞は、本発明で更により好適である。
【００７５】
上記の前記特徴、より具体的には、前記細胞が正常な核型を有するものであって、継代と共に正常な核型を維持し、さらに前記細胞がマーカーのＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現し、前記細胞が、リストされた前記マーカーに対応し、免疫学的に検出可能なタンパク質を産生することを含む特徴、を有する分娩後細胞は、その観点の幾つかの点で、本発明で使用に好適な細胞に含まれる。上記の特徴に加えて、マーカーのＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれに対応するタンパク質を産生しない前記細胞は、更により好適であり、これは、フローサイトメトリーによって検出される。
【００７６】
細胞系に従って分化し、種々の表現型に至る能力を有するある種の細胞は、不安定であり、そのため自然発生的に分化し得る。自然発生的に分化（例えば、神経細胞系に従って）することのない細胞が、本発明の使用では好適である。好適な細胞は、成長培地で増殖されたときに、それらの表面上で産生される前記細胞マーカーに関して実質的に安定しており、また種々の遺伝子の前記発現パターン（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのジーンチップ（ＧＥＮＥＣＨＩＰ）を使用して決定される）に関して安定している。前記細胞は、複数回の集団倍加の後、例えば、継代を越えてそれらの表面マーカー特徴で、実質的に定常のままである。
【００７７】
しかし、ＰＰＤＣの１つの特徴は、ＰＰＤＣを分化誘導細胞培養条件におくことによって、これらの細胞が種々の系統の表現型への分化を意図的に誘導されることが可能であることである。或る種の眼変性疾患の治療での使用で、前記ＰＰＤＣは、当分野で周知の１若しくはそれ以上の方法によって神経系表現型に分化するように誘導され得る。例えば、本明細書で例示されるように、ＰＰＤＣは、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培養液（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）（この組み合わせは、本明細書で、神経前駆細胞増殖（Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：（ＮＰＥ））培地と呼ばれる）中で、ラミニンでコーティングされたフラスコにプレーティングされ得る。ＮＰＥ培地には、更にｂＦＧＦおよび／またはＥＧＦが添加され得る。別法では、（１）ＰＰＤＣを神経前駆細胞と共に共培養することによって、または（２）神経前駆細胞条件培地内でＰＰＤＣを成長させることによって、ＰＰＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化を誘導され得る。
【００７８】
前記ＰＰＤＣの神経系表現型への分化は、伸長した突起を伴う双極性の細胞形態によって実証され得る。それらの誘導された細胞集団は、ネスチンの存在で陽性に染色され得る。分化したＰＰＤＣは、ネスチン、ＴｕＪ１（ＢＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、Ｏ４、および／またはＭＢＰの検出によって評価され得る。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣは、神経幹細胞のニューロスフェア形成に特徴的である３次元体の形成能力を示した。
【００７９】
細胞集団、細胞の改変、細胞成分、および細胞産物
本発明の別の観点は、胎盤組織または臍帯組織から単離された細胞の集団を特徴とする。好適な実施形態では、前記集団は上記のＰＰＤＣを含み、これらの細胞集団は以下の項に記述される。いくつかのの実施形態では、前記細胞集団は不均一な集団である。本発明の不均一な細胞集団は、ＰＰＤＣを、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％含み得る。本発明の前記不均一な細胞集団はさらに、例えば、上皮前駆細胞または神経前駆細胞のような、幹細胞または他の前駆細胞を含んでもよく、または、さらに完全に分化した細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、前記集団は、実質的に均一であり、すなわち実質的にＰＰＤＣのみ（好適には、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上のＰＰＤＣ）を含む。本発明の前記均一な集団は、臍帯または胎盤に由来する細胞を含み得る。臍帯由来細胞の均一な集団は、好適には、母性系統の細胞を含まない。胎盤由来細胞の均一な集団は、新生児系統または母性系統であり得る。均一な細胞集団の均一性は、当分野で周知の任意の方法（例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、または周知の方法に従うクローン性増殖によって）によって達成され得る。したがって、好適な均一なＰＰＤＣ集団は、クローン細胞株の分娩後由来細胞を含み得る。非常に望ましい機能性を有する細胞クローンが単離された場合は、そのような集団は特に有用である。
【００８０】
本明細書では、また、１若しくはそれ以上の因子の存在下で、または条件下でインキュベートされた細胞集団も提供されるが、ここで、そのような因子または条件は、望ましい経路（例えば、神経、上皮）にそって幹細胞分化を刺激する。そのような因子は当分野で周知であり、分化に適した条件の決定は、通常の実験で達成し得ることを当業者は理解できるであろう。そのような条件の最適化は、統計的な実験計画および分析によって達成が可能であり、例えば、応答曲面法によって、複数の変数（例えば、生物学的培養内で）を同時に最適化することができる。好適な因子には、例えば成長因子または栄養因子などの因子に限定するものではなく、脱メチル剤、神経系統細胞または上皮系統細胞との共培養、または神経系統細胞または上皮系統細胞の条件培地内の培養を含み、並びに、これらの経路に沿って幹細胞の分化を刺激するような当分野で周知の他の条件を含む（神経細胞の分化に有用な因子については、例えば、Ｌａｎｇ，Ｋ．Ｊ．Ｄ．ら、２００４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７６：１８４〜１９２、Ｊｏｈｅ，Ｋ．Ｋ．ら、１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．１０：３１２９〜３１４０、Ｇｏｔｔｌｅｉｂ，Ｄ．、２００２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３８１〜４０７を参照）。
【００８１】
分娩後細胞、好適にはＰＰＤＣ、は、また遺伝的に改変されて、例えば、治療的に有用な遺伝子産物を産生したり、腫瘍を治療するための抗腫瘍薬を産生するようにできる。遺伝的改変は、種々のベクターの任意を使用して達成され得るが、そのようなベクターには、限定するものではないが、組込みウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター）、組み込まれない複製ベクター（例えば、乳頭腫ウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または非複製ウイルスベクター）を含む。ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、パーティクルガン、またはＤＮＡの注入が含まれる。
【００８２】
好適には、宿主細胞はＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションされ、このような形質転換またはトランスフェクションは、１若しくはそれ以上の適度の発現コントロールエレメント、例えば、数あるなかでも、プロモーター配列と、エンハンサー配列と、転写ターミネーターと、ポリアデニル化部位と、選択可能なマーカーによってコントロールされるか、またはこれらと作動上で関連してコントロールされる。前記挿入遺伝子の発現を促進するために任意のプロモーターが使用され得る。例えば、ウイルスプロモーターには、限定するものではないが、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、乳頭腫ウイルス、ＥＢウイルス、またはエラスチン遺伝子プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の発現を制御するために使用される前記コントロールエレメントは、その産物がｉｎ  ｖｉｖｏで必要なときにのみ合成されるように、前記遺伝子の制御された発現を可能にする。もし一時的な発現が望ましい場合は、構成的プロモーターは、好適には非組み込みベクターおよび／または複製不能ベクター内で使用される。別法では、誘導可能なプロモーターが、必要に応じて、前記挿入遺伝子の発現を促進するために使用され得る。誘導可能なプロモーターには、限定するものではないが、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質に付随するプロモーターが含まれる。
【００８３】
外来ＤＮＡの導入後、改変された細胞は強化培地で成長させ、その後、選択培地に切り替えることも可能である。前記外来ＤＮＡ内の前記選択可能マーカーは、前記選択への抵抗を与え、それによって、細胞が、例えば、プラスミド上に、前記外来ＤＮＡを前記細胞の染色体上に安定的に組み込み、増殖巣を形成することができる。そのような増殖巣はクローン化され、細胞株に増殖されることができる。この方法を有利に使用して、前記遺伝子産物を発現する細胞株を作製することが可能である。
【００８４】
細胞を遺伝的に操作して、移植部位で炎症または拒絶を促進する因子の発現を「ノックアウト」または「ノックダウン」し得る。標的遺伝子の発現レベルを下げるために、または標的遺伝子産物の活性レベルを下げるための、ネガティブ調節の技術を以下に考察する。本明細書で使用される「ネガティブ調節（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、調節処置がない場合の標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性に関して、前記標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性が低いことを意味する。神経細胞またはグリア細胞に生来の遺伝子の発現は、いくつかの技術を使用して、減らされること、または、ノックアウトされることが可能であり、そのような技術には、例えば、相同的組み換え技術を使用して前記遺伝子を不活性化して発現を阻害することが含まれる。通常、前記タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（または、その領域に５’のエキソン）が、ポジティブセレクション可能なマーカー（例えば、ｎｅｏ）によって妨害され、前記標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡが産生されることを阻止し、その結果、前記遺伝子の不活性化となる。遺伝子はまた、遺伝子の部分的な欠失を作ることによって、または、遺伝子全体を欠失させることによって、不活性化され得る。前記標的遺伝子に相同の２つの領域をゲノム中で離れさせる作成物を使用することによって、その２つの領域の間の配列が欠失され得る（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４）。アンチセンス、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および、前記標的遺伝子の発現を阻害する他のそのような分子を使用して、標的遺伝子活性を減らすことも可能である。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答に関して最も多用途であることが示されている。さらに、三重らせん分子を利用して、標的遺伝子の活性のレベルを減らすことが可能である。これらの技術は、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら（編集）１９９４、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  &  Ｌａｎｇｅ，コネチカット州ノーウォークに、詳細に記載されている。
【００８５】
他の観点では、本発明は、分娩後幹細胞、好適にはＰＰＤＣからの細胞溶解物および細胞溶解性分画、或いはＰＰＤＣを含む不均一または均一な細胞集団、並びに遺伝的に改変された、若しくは神経原性経路に沿って分化するように刺激されたＰＰＤＣまたはそれらの集団から調製されたものである。そのような溶解物およびそれらの分画は多くの有用性がある。前記細胞溶解物のｉｎ  ｖｉｖｏ溶解性分画（すなわち、実質的に膜のないもの）の使用は、有益な細胞内環境が、拒絶または悪影響を与える他の免疫学的応答を最も起こしやすい前期細胞表面タンパク質を大量に誘導せずに、患者で同種異型的に使用されることを可能にする。細胞を溶解する方法は当分野で周知であり、機械的崩壊、酵素的崩壊、化学的崩壊、またはこれらの組み合わせが含まれる。そのような細胞溶解物は、成長培地中の細胞から直接に調製され、そのため分泌された成長因子などを含んでいてもよく、または、例えばＰＢＳまたは他の溶液で洗浄して、培地を含まない細胞から調製してもよい。望ましい場合には、洗浄された細胞は元来の細胞集団密度よりも高い濃度で懸濁され得る。
【００８６】
実施形態では、細胞全体の溶解物が調製されるが、これは、すなわち、細胞崩壊の後に細胞分画を分離せずに調製される。別の実施形態では、細胞膜の分画が、当分野で周知の通常の方法（例えば、遠心、濾過、または同様の方法）によって前記細胞の溶解性分画から分離される。
【００８７】
分娩後由来細胞の集団から調製された、細胞溶解物または細胞溶解性分画は、そのまま使用されてもよく、または、例えば限外濾過または凍結乾燥によってさらに濃縮されてもよく、または乾燥させてもよく、または部分的に精製されてもよく、または、当分野で周知の、薬理学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせてもよく、または生体化合物のような他の化合物（例えば、薬理学的に有用なタンパク質化合物）と組み合わせてもよい。細胞溶解物またはそれらの分画は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用されてよく、またはそれのみで使用されるか、例えば自己の生細胞または同系の生細胞と共に使用され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏで導入される場合は、前記溶解物は、治療部位に局所的に導入されてもよく、或いは、例えば、患者に必要な成長因子を提供するために、離れた位置に導入されてもよい。
【００８８】
更に別の実施形態では、生物学的産物を高収量で産生するために、分娩後細胞（好適には、ＰＰＤＣ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。例えば、目的の特定の生物学的産物（例えば、栄養因子など）を天然に、産生する細胞、または遺伝的に操作されて特定の生物学的産物を産生するようになった細胞のいずれかを、当明細書で記載された前記培養技術を使用して、クローンとして増殖され得る。別法では、細胞は、望ましい系統への分化を誘導する培地中で増殖され得る。いずれの場合でも、前記細胞によって産生され前記培地に分泌される生物学的産物は、標準的分離技術（例えば、２〜３の例を挙げるとすれば、分別タンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、およびＨＰＬＣ）を使用して、前記条件培地から容易に分離され得る。「バイオリアクター」を使用して、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３次元培養などの、栄養補給のフロー法を活用することが可能である。基本的には、新鮮な培地が前記３次元培養を通るときに、前記生物学的産物が前記培養から洗浄され、上記のように、その流出液から単離され得る。
【００８９】
別法では、目的の生物学的産物は前記細胞に留まっていてもよく、その収集には、上記のように、前記細胞が溶解される必要がある。前記生物学的産物は、上記の技術の１若しくはそれ以上を使用して、精製され得る。
【００９０】
他の実施形態では、本発明は、以下に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用法のために、培養された分娩後細胞（好適には、ＰＰＤＣ）からの条件培地を提供する。そのような条件培地を使用すると、拒絶または悪影響を与える他の免疫学的応答を起こし得る無傷細胞を導入せずに、前記分娩後細胞が分泌する有益な栄養因子が、患者で同種異型的に使用されることを可能にする。条件培地の調製は、培養培地で細胞を培養して、前記培地から前記細胞を除去して行った。
【００９１】
分娩後由来細胞の集団から調製された条件培地は、そのまま使用されてもよく、または、例えば限外濾過または凍結乾燥によってさらに濃縮されてもよく、または乾燥させてもよく、または部分的に精製されてもよく、または、当分野で周知の、薬理学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせてもよく、または生体化合物のような他の化合物（例えば、薬理学的に有用なタンパク質化合物）と組み合わせてもよい。条件培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用されてよく、またはそれのみで使用されるか、例えば自己の生細胞または同系の生細胞と共に使用され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏで導入される場合は、前記条件培地は、治療部位に局所的に導入されてもよく、或いは、例えば、患者に必要な成長因子または栄養因子を提供するために、離れた位置に導入されてもよい。
【００９２】
別の実施形態では、液体、固体、または半流動の培養基質上で分娩後細胞（好適には、ＰＰＤＣ）を培養することによって産生される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が調製され、収集され、組織修復または組織交換を必要とする被験者に生細胞を移植する代替として利用される。前記細胞は、本明細書の他の項で記載した３次元の骨格構造上でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されるが、これは、好適な量のＥＣＭが前記骨格構造に分泌されるような条件下で行われる。新しい組織は除去され、前記ＥＣＭは、別の目的用に（例えば、注入可能な製剤として）処理された。これを達成するために、前記骨格構造上の細胞は殺生され、すべての細胞性残渣が前記骨格構造から除去される。この処理はいくつかの異なる方法で実行され得る。例えば、その生きた組織は、冷凍保存剤を含まない液体窒素で急速冷凍されてもよく、または前記組織は滅菌済み純水に浸して、浸透圧のため前記細胞を破裂させてもよい。
【００９３】
前記細胞が殺生された後、細胞膜は崩壊されてもよく、細胞性残渣は中性洗剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、または両性イオン界面活性剤）のリンスで処理して除去され得る。別法では、前記組織は、酵素による消化、および／または、細胞膜を破壊し細胞内容物の除去を可能にする試薬による抽出、を受け得る。そのような酵素の例には、限定するものではないが、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、タンパク質分解酵素および核酸分解酵素が含まれる。洗剤の例には、非イオン性洗剤には、例えば、アルキルアリールポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノール（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノール・ラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、カリフォルニア州サンジエゴ）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０）、ポリエトキシエタノール・ソルビタン・モノラウリル酸（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、ポリエチレン・ラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、およびイオン性洗剤には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪酸アルコール、分岐鎖または非分岐鎖に７〜２２の炭素原子を含む、硫酸化アルカンおよび硫酸化アルキルアレン、を含む。
【００９４】
前記ＥＣＭの収集は、種々の方法で達成することができ、これは、例えば、前記新組織が生体分解性または非生体分解性の３次元骨格構造上に形成されているかによって変わる。例えば、前記骨格構造が非生体分解性である場合は、前記ＥＣＭは、前記骨格構造を音波破砕、高圧ジェット水流、機械的削り、洗剤または酵素での温和な処理、または、これらの任意の組み合わせによって除去され得る。
【００９５】
前記骨格構造が生体分解性である場合は、前記ＥＣＭは、例えば、前記骨格構造を溶液中で分解するか、溶解するようにさせて、収集され得る。別法では、前記生体分解性骨格構造を構成する材料が、前記骨格構造自体が前記ＥＣＭと共に注入可能であるような場合には、前記骨格構造および前記ＥＣＭは、その後の注入で、その全体として処理され得る。別法では、前記ＥＣＭは、非生体分解性骨格構造からＥＣＭを収集するための上記の方法のいずれかによって、前記生体分解性骨格構造から除去され得る。好適には、すべての収集過程は前記ＥＣＭを変性させないように計画される。
【００９６】
収集された後。前記ＥＣＭはさらに処理され得る。例えば、前記ＥＣＭは、例えば音波処理など当分野で周知の技術を使用して、手術針が通れるように微粒子にホモジナイズされ得る。必要ならば、前記ＥＣＭの成分はガンマ照射によって架橋され得る。好適には、前記ＥＣＭを０．２５から２までのメガラドの範囲で照射して、前記ＥＣＭを滅菌し架橋することが可能である。グルタルアルデヒドのような毒性の試薬を用いて化学架橋は可能であるが、一般的には好適でない。
【００９７】
前記ＥＣＭにある種々のタイプのコラーゲンのようなタンパク質の量および／または比は、本発明の前記細胞によって産生される前記ＥＣＭを、１つの、若しくは、それ以上の他の細胞タイプのＥＣＭと混合することによって調節され得る。さらに、タンパク質、成長因子および／または薬品のような生物学的に活性な物質を前記ＥＣＭに組み入れることが可能である。典型的な生物学的に活性な物質には、注入部位で治癒および組織修復を促進するＴＧＦ−ベータなどの組織成長因子が含まれる。そのような追加の試薬は、当明細書に記載された前記実施形態のいずれでも利用することができ、すなわち、細胞溶解物、溶解性細胞分画、または、前記細胞によって産生される、さらに精製された成分および産物と共に利用できる。
【００９８】
薬学的組成物
別の観点では、本発明は、眼変性疾患の治療のために、種々の方法で分娩後細胞（好適にはＰＰＤＣ）、分娩後細胞集団、分娩後細胞の成分および産物を利用する薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態は、生細胞（例えば、ＰＰＤＣのみ、または他の細胞タイプと混合）を含む薬学的組成物を網羅する。他の実施形態は、ＰＰＤＣ細胞性成分（例えば、細胞溶解物、溶解性細胞分画、条件培地、ＥＣＭ、または前述のいずれかの成分）、またはＰＰＤＣ産物（例えば、ＰＰＤＣによって産生されるか、または遺伝的修正を通して産生される栄養因子および他の生物学的因子、ＰＰＤＣ培養からの条件培地）を網羅する。いずれの場合でも、前記薬理成分は、さらに他の活性試薬（例えば、当分野で周知の、抗炎症剤、抗アポトーシス薬剤、酸化防止剤、成長因子、神経栄養因子、神経再生薬剤、神経保護薬剤、または点眼薬）を含み得る。
【００９９】
ＰＰＤＣ薬学的組成物に加えられ得る他の成分の例には、限定するものではないが、２〜３の例を挙げるとすれば、（１）他の神経保護的薬剤または神経保護薬、（２）選択された細胞外マトリックス成分、例えば、当分野で知られる１若しくはそれ以上のタイプのコラーゲン、および／または、成長因子、多血小板血漿、および薬剤（別法では、ＰＰＤＣは遺伝的に操作されて成長因子を発現し産生し得る）、（３）抗アポトーシス薬剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ模倣剤、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、（４）抗炎症剤（例えば、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１の阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、および非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ））（例えば、ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、およびＳＵＰＲＯＦＥＮ）、（５）免疫抑制剤または免疫調節剤、例えば、カルシニュリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖性物質、コルチコステロイド、および種々の抗体、（６）酸化防止剤、例えばプロブコール、ビタミンＣ、ビタミンＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、およびＮ−アセチルシステイン、および（６）局所麻酔薬、が含まれる。
【０１００】
本発明の薬学的組成物には、薬理学的に許容される担体または培地と共に調製された、分娩後細胞（好適には、ＰＰＤＣ）、分娩後細胞の成分、または分娩後細胞の産物を含む。好適な、薬理学的に許容される担体には、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液）、アルコール、オイル、ゼラチン、および炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース、またはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニールピロリジン、が含まれる。そのような製剤は滅菌されてもよく、また必要ならば、助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、バッファー、および着色剤など、と混合されてもよい。包括的ではないが、典型的には、細胞の成分または産物を含む薬理学的成分であって、生細胞でないものは、液体として調製される。ＰＰＤＣの生細胞を含む薬理学的成分は、通常、液体、半固形（例えば、ゲル）、または固形（例えば、マトリックス、骨格、眼組織の生体工学に好適な同等物）として調製される。
【０１０１】
薬学的組成物は、医薬化学者または生物学者が精通しているように、補助成分を含み得る。例えば、それらには、使用される酸化防止剤の種類によって異なる範囲内で、酸化防止剤を含み得る。一般に使用される酸化防止剤の妥当な範囲は、ＥＤＴＡの重量パーセントで約０．０１％から約０．１５％までの範囲、亜硫酸ナトリウムの重量パーセントで約０．０１％から約２．０％までの範囲、およびメタ重亜硫酸ナトリウムの重量パーセントで約０．０１％から約２．０％までの範囲である。当業者は、上記のそれぞれに関して約０．１％の重量パーセントの濃度を使用し得る。他の代表的な化合物には、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチル・システイン、ベータ−メルカプトエチルアミン、グルタチオン、および同様の種類が含まれるが、眼の投与に好適な他の抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびその塩類、または亜硫酸またはメタ重亜硫酸ナトリウム、もまた使用され得る。
【０１０２】
緩衝剤を使用して、点眼液の製剤のｐＨを約４．０から約８．０までの範囲内に維持して、前記眼の刺激を最小限にすることが可能である。直接の硝子体内注入または眼球内注入のためには、製剤のｐＨは７．２から７．５であるべきであり、好適にはｐＨ７．３〜７．４であるべきである。眼科用成分はまた、目の投与に好適な等張化剤を含み得る。好適な等張化剤には塩化ナトリウムがあり、０．９％の食塩水でほぼ等張の製剤を作成する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は粘性増強剤で調製される。典型的な試薬剤には、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンがある。前記薬学的組成物は、必要に応じて加えられる共溶媒を有し得る。好適な共溶媒には、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを含み得る。防腐剤にはまた、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、チメロソール、メチルパラベン、またはプロピルパラベンが含まれる。
【０１０４】
注入用の製剤は、好適には、１回使用の投与用に設計され、防腐剤を含まない。注入可能な溶液は、０．９％塩化ナトリウム溶液（２９０〜３００ミリオスモルの浸透圧）と等しい等張性を有するべきである。これは、上記のように塩化ナトリウムまたは他の共溶媒、または上記のような緩衝剤および酸化防止剤のような賦形剤を加えることによって、得られ得る。
【０１０５】
眼の前眼房の組織は眼房水で満たされており、一方、網膜は硝子体液に常に曝されている。これらの流動体／ゲルは、酸化防止の化合物および酵素を含むため、非常に還元したレドックス状態にある。したがって、眼科用成分に還元剤を含むことが有益であり得る。好適な還元剤には、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸またはアスコルビン酸の塩、亜硫酸ナトリウム、またはメタ重亜硫酸ナトリウムが含まれ、アスコルビン酸および／またはＮ−アセチルシステイン、またはグルタチオンが注入用溶液には特に好適である。
【０１０６】
細胞、細胞成分、または細胞産物を含む薬学的組成物は、当分野で周知のいくつかの送達の様式の１若しくはそれ以上で、患者の眼に送達され得る。いくつかの場合で使用で好適であり得る実施形態では、前記成分は点眼液または洗浄液で眼に局所的に送達される。別の実施形態では、前記成分は、定期的な眼内注入、ＢＳＳまたはＢＳＳ  ＰＬＵＳ（Ａｌｃｏｎ  ＵＳＡ、テキサス州フォートワース）のような潅流液内の輸液によって、眼内の種々の位置に送達され得る。別法では、前記成分は、例えば、形成済みゲル、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成ゲル、またはリポソームなどの当分野で周知の他の投薬形態で適用され得る（例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｖａｎｒｅｌｌの米国特許第５，７１８，９２２号に開示されている）。別の実施形態では、前記成分は、治療の必要な眼のレンズに、またはレンズを通して送達されてもよく、これは、コンタクトレンズ（例えば、Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ  Ｂ、Ｂａｕｓｃｈ&Ｌｏｍｂ  ＣＷ７９、またはＤＥＬＴＡＣＯＮ（Ｄｅｌｔａｆｉｌｃｏｎ  Ａ））または前記眼の表面に一時的に置ける他の物体を介して行える。他の実施形態では、コラーゲン角膜シールド（例えば、ＢＩＯ−ＣＯＲ溶解型角膜シールド、Ｓｕｍｍｉｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ウォータータウン）のような支持体を使用し得る。前記成分はまた、輸液によって球眼に投与されてもよく、これは、浸透圧ポンプからカニューレを通して（ＡＬＺＥＴ、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州パロアルト）、または、持続放出性カプセル（ＯＣＣＵＳＥＮＴ）または生体分解性ディスク（ＯＣＵＬＥＸ、ＯＣＵＳＥＲＴ）の移植によって、のいずれかで行える。これらの投与経路は、前記眼への前記薬学的組成物の連続的な供給を提供できる有利性を有する。これは、例えば、角膜への局所的な送達に有利であり得る。
【０１０７】
半固形担体または固形担体内に生細胞を含む薬学的組成物は、通常、眼損傷または眼困難の部位への外科的な移植用に調製される。液体成分もまた、外科処置によって投与され得ることは理解されるものである。具体的な実施形態では、半固形またか固形の薬学的組成物は、半透性のゲル、格子、細胞性骨格、および同等物を含んでもよく、これらは非生体分解性または生体分解性であり得る。例えば、ある種の実施形態では、その外因性細胞を周辺から隔離して、前記細胞が周辺の細胞に生物学的分子を分泌し、送達できるようにすることが望ましいか、または適切であり得る。これらの実施形態では、細胞は、自立的な移植物として調製されてもよく、そのような移植物は、生存ＰＰＤＣ、またはＰＰＤＣを含む細胞集団を含み、非生体分解性で選択的に透過性の障壁によって囲まれており、ホスト組織から前記移植細胞を物理的に分離する。そのような移植物は、薬理学的に誘導される免疫抑制がなくても、免疫細胞および高分子が前記移植細胞を殺すのを防護する能力があるため、「免疫防御性」と呼ばれることもある（そのような装置および方法の概説については、例えば、Ｐ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏら、２０００，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４２：３〜２７を参照）。
【０１０８】
他の実施形態では、異なる種類の、分解性のゲルおよび網状組織が本発明の前記薬学的組成物に利用される。例えば、持続放出の製剤に特に好適な分解性物質には、例えば、ポリ乳酸、乳酸／グリコール酸コポリマー、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等のような生体適合性のあるポリマーが含まれる。薬剤送達手段での分解性ポリマーの構造、選択、および使用は、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３：２７９など、いくつかの出版物で概説されている。Ｗｏｎｇらの米国特許番号第５，８６９，０７９号公報は、生物分解性で持続放出性の眼移植物内での親水性物質および疎水性物質の組み合わせを開示している。さらに、Ｇｕｏらの米国特許番号第６，３７５，９７２号公報、Ｃｈｅｎらの米国特許番号第５，９０２，５９８号公報、Ｗｏｎｇらの米国特許番号第６，３３１，３１３号公報、Ｏｇｕｒａらの米国特許番号第５，７０７，６４３号公報、Ｗｅｉｎｅｒらの米国特許番号第５，４６６，２３３号公報、Ａｖｅｒｙらの米国特許番号第６，２５１，０９０号公報はそれぞれ、薬学的組成物を送達するのに使用され得る眼内の移植装置およびシステムを説明している。
【０１０９】
他の実施形態では、例えば、損傷した或いは切断された視神経のような、神経病変部の修復の場合には、生体分解性の、好適には生体再吸収性または生体吸収性の、骨格またはマトリックス内で、またはその表面上で、前記細胞を送達することが望ましい、若しくは適切である。これらの、典型的には３次元の生体材料は、前記生細胞を含み、このような前記生細胞は前記骨格に付着されるか、前記骨格内に分散されるか、前駆骨格内に封入された細胞外マトリックスに組み込まれる。これらの移植物が身体の前記標的地域に移植されると、前記移植物はホスト組織に組み込まれるようになり、そこで、前記移植細胞が徐々に定着するようになる（例えば、前述のＰ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏら、２０００（ｓｕｐｒａ．）を参照のこと、またＤ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．１２：１０７〜１７４を参照）。
【０１１０】
本発明で使用され得る骨格またはマトリックス（これらは、まとめて「骨格構造」として呼ばれることもある）の物質の例には、不織マット、多孔性発泡体、または自己集合性ペプチドが含まれる。不織マットは、例えば、商品名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州サマービル）で販売されているような、グリコール酸および乳酸の合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）から成る繊維を用いて形成されることが可能である。例えば、ポリ（イプシロン−カプラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから構成され、米国特許番号第６，３５５，６９９号公報で考察されている、フリーズドライまたは凍結乾燥のような工程によって形成される発泡体もまた利用され得る。自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）のようなヒドロゲルもまた利用され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕ（原位置で）形成する分解性の網状組織もまた、本発明の使用に好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．ら、２００２，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７８：１９９〜２０９、Ｗａｎｇ，Ｄ．ら、２００３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：３９６９〜３９８０、Ｈｅらの米国特許番号第２００２／００２２６７６号公報を参照のこと）。これらの物質は、注入に好適な流動体として調製され、種々の手段（例えば、温度やｐＨにおける変化、光への曝露）によって誘導され、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで分解性のヒドロゲル網状組織を形成し得る。
【０１１１】
別の実施形態では、前記骨格構造はフェルトであり、そのようなフェルトは、生体吸収性の物質（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬのコポリマーまたは混紡、またはヒアルロン酸）から成るマルチフィラメント糸から構成され得る。前記糸は、クリンピング、裁断、カーディング、および穿刺から成る標準的繊維加工技術を用いて、フェルトに加工される。別の実施形態では、細胞は、複合構造であり得る発泡体骨格に播種される。
【０１１２】
上記の実施形態の多くでは、前記骨格構造は、有用な形態に成形され得る。さらに、ＰＰＤＣは、例えば、繊維芽細胞含有ＧＤＣ血管内コイルを調製するために使用されるのに対応する仕方で、前もって成形された非分解性の手術用装置または移植装置に培養され得る（Ｍａｒｘ，Ｗ．Ｆ．ら、２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．２２：３２３〜３３３）。
【０１１３】
前記マトリックス、骨格、または装置は、細胞接着を向上するために、細胞を接種する前に処理され得る。例えば、接種の前に、ナイロン製基質は、そのナイロンをコーティングするために０．１モルの酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートされ得る。ポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理され得る。骨格構造の外部表面もまた、細胞の接着および成長、および組織の分化を改善するために改変することができ、それは、例えば、前記骨格構造をプラズマコーティングするか、１若しくはそれ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリサミノグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞性マトリックス、および／または他の物質（例えば、限定するものではないが、特に、ゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、および植物ゴム）の追加によって行われる。
【０１１４】
生存細胞を含む骨格構造は、当分野で周知の方法に従って調製される。例えば、細胞は、培養容器内で、サブコンフルエントまたはコンフルエントまで自由に成長させ、前記培養から拾い上げて前記骨格構造に接種され得る。必要に応じて、前記細胞の接種の前に、接種中に、または接種の後に、成長因子を前記培養培地に加えて、分化および組織形成を誘導し得る。別の方法では、前記骨格構造自体を修飾することができ、その骨格構造上の細胞の成長が向上されるか、または前記移植の拒絶の危険性が下げられる。このようにして、１若しくはそれ以上の生物学的に活性な化合物（例えば、限定するものではないが、抗炎症剤、免疫抑制剤、または成長因子）を、局所的放出のために前記骨格構造に加えることが可能である。
【０１１５】
使用方法
分娩後細胞（好適にはＰＰＤＣ）、または、それらの細胞集団、そのような細胞の成分またはそのような細胞によって産生される産物は、眼細胞および眼組織の修復および再生を支持し促進するための種々の方法で使用され得る。そのような利用法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）、ｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）、およびｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）の方法を網羅する。以下に説明された前記方法はＰＰＤＣを対象にするが、他の胎盤細胞もまた、これらの方法の使用に適している可能性がある。
【０１１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの方法：
１つの実施形態では、ＰＰＤＣは、薬理学的試薬、成長因子、調節因子などの効力および細胞毒性のために広範な化合物をスクリーニングするためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用され得る。例えば、そのようなスクリーニングは、実質的に均一な集団に行え、眼病状の治療のために、前記ＰＰＤＣと共に調製される、または前記ＰＰＤＣと同時投与される、候補化合物の効力または毒性を査定し得る。別法では、そのようなスクリーニングは、新しい薬剤候補の効率を評価する目的で、刺激されて、眼に見られる細胞タイプまたはその前駆細胞に分化したＰＰＤＣに行え得る。この実施形態では、前記ＰＰＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持され、検査される前記化合物に曝される。細胞毒性の能力を有する化合物の活性は、培養内の細胞を損傷するか、殺す能力によって測定され得る。これは、生体染色技術によって容易に査定され得る。成長因子または調製因子の効果は、前記因子に曝されていない細胞に比較して、前期培養細胞の数または頑健性を分析することによって査定され得る。これは、標準の細胞学的技術および／または組織学的技術を用いて達成することができ、タイプ特異的な細胞抗原を特徴付ける抗体を使用した免疫細胞化学技術の使用が含まれる。
【０１１７】
更に別の実施形態では、上記のように、ＰＰＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されて生物学的産物を産生させることが可能であるが、このような生物学的産物は、前記細胞が天然に、産生するもの、他の系統に分化するように誘導されたときに前記細胞が産生するもの、または、遺伝子修正によって前記細胞が産生するもののいずれかである。例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８は、成長培地で成長された臍帯由来細胞から分泌されていることが発見された。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８が、成長培地で培養された胎盤由来ＰＰＤＣから分泌されていることが発見された（実施例を参照）。これらの栄養因子のいくつか、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６、は神経再生で重要な複数の役割を果たしている。眼組織の修復および再生で使用されるが、まだ検出されていないか、または検査されていない他の栄養因子が、ＰＰＤＣによって産生されており、おそらく培地に分泌されている可能性が高い。
【０１１８】
これに関して、本発明の別の実施形態は、条件培地の産生のためにＰＰＤＣの使用を特色とし、これは、分化していないＰＰＤＣからか、または分化を刺激する条件下でインキュベートされたＰＰＤＣからかのいずれかである。そのような条件培地は、例えば、上皮前駆細胞または神経前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの培養での使用、または、ＰＰＤＣの均一な集団、またはＰＰＤＣおよび他の前駆細胞から成る不均一な集団を含む移植された細胞を支持するためにｉｎ  ｖｉｖｏでの使用、を意図とする。
【０１１９】
更に別の実施形態は、ＰＰＣＤ細胞溶解物、それらの溶解性細胞分画または成分、または前記溶解物のＥＣＭまたは成分を種々の目的での使用を含む。上記したように、これらの成分のいくつかは薬学的組成物で使用され得る。他の実施形態では、細胞溶解物またはＥＣＭは、物質または装置をコーティングまたは他の処理で使用されるが、これらは、そのような治療の過程で接触される細胞や組織の治癒や生存性を促進するために、外科治療用、移植用、ｅｘ  ｖｉｖｏの目的で使用される。
【０１２０】
実施例１３および実施例１５に記載されるように、ＰＰＤＣが成体神経前駆体細胞との共培養で成長されたときに、前記ＰＰＤＣが、前記成体神経前駆体細胞の生存性、成長、および分化を支持する能力を有することが実証された。同様に、実施例１８に説明された実験結果は、ＰＰＤＣが栄養機構によって、前記網膜の細胞の支持するために機能し得ることを示す。したがって、別の実施形態では、ＰＰＤＣは、他の細胞、特に神経前駆細胞および眼前駆細胞（例えば、神経幹細胞、網膜幹細胞、および角膜幹細胞）、への栄養支持を提供するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共培養で有利に使用される。共培養では、前記ＰＰＤＣおよび望ましい他の細胞が接触するような前記条件下で共培養することが望ましい可能性がある。これは、例えば、前記細胞を不均一な集団の細胞として培養培地内に、または好適な培養基質に、播種することによって達成し得る。別法では、前記ＰＰＤＣがまずコンフルエントまで成長され、これが、培養で、２番目の前記望ましい細胞タイプの基質としての機能をすることが可能である。この後者の実施形態では、前記細胞はさらに、物理的に分離させることが可能であり、これは、例えば膜または同様の装置によって可能であり、前記共培養期間の後、他の細胞タイプを取り除いて、別々に使用することが可能である。神経細胞タイプまたは眼細胞タイプの増殖および分化を促進するために共培養でＰＰＤＣを使用することは、研究分野および臨床／治療の分野で適用性が見つけられる可能性がある。例えば、ＰＰＤＣ共培養は、例えば、基礎研究の目的で、また薬剤スクリーニングアッセイでの使用で、培養内のそのような細胞の成長および分化を促進するために利用され得る。ＰＰＤＣ共培養はまた、治療目的での後の投与のために、神経前駆細胞または眼前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖にも利用され得る。例えば、個人から神経前駆細胞または眼前駆細胞が収集され、ＰＰＤＣと共に共培養内でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され、その後、前記個人（自己移植）または別の個人（同系移植または同種移植）に戻すことが可能である。これらの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖後に、前記ＰＰＤＣおよび前駆細胞を含む細胞の混合集団が、治療の必要な患者に投与され得ることを理解されたい。別法では、自己移植が好適で望ましい場合には、前記共培養の細胞集団は培養内で物理的に分離されてもよく、前記患者への投与のために自己の前駆細胞を取り出すことを可能にする。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏの方法
実施例１６、実施例１７、および実施例１８で説明されるように、ヒトでの効力の予測に関して受け入れられている動物モデルで、ＰＰＤＣが、その体に効果的に移植され、失われた神経機能または眼機能を提供することが示された。これらの結果は、眼変性疾患を治療するためにＰＰＤＣが細胞治療で使用されることを特徴とする、本発明の好適な実施形態を支持する。ＰＰＤＣが眼の標的神経部位に移植されると、ＰＰＤＣ自体が１若しくはそれ以上の表現型に分化することが可能であり、またはＰＰＤＣがｉｎ  ｓｉｔｕの眼細胞の栄養支持を提供することが可能であり、またはＰＰＤＣは、とりわけ、これらの方法の両方で有益な効果を果たす可能性がある。
【０１２２】
ＰＰＤＣは、単独で投与されてもよく（例えば実質的に均一な集団として）、または他の細胞との混合物として投与されてもよい。上記のように、ＰＰＤＣは、マトリックスまたは骨格として薬理的製剤に調製されて、または、従来の薬理学的に許容された担体と共に投与され得る。ＰＰＤＣが他の細胞と共に投与する場合は、前記ＰＰＤＣは、前記他の細胞と同時に投与されるか、或いは、順番に（前記他の細胞の前に、または後に）投与され得る。ＰＰＤＣと共に投与され得る細胞には、限定するものではないが、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、神経前駆細胞、神経幹細胞、眼前駆細胞、網膜幹細胞、角膜幹細胞、および／または、他の多分化能または多能性の幹細胞が含まれる。異なるタイプの細胞は、投与の直前または少し前に前記ＰＰＤＣと混合されてもよく、またはそれらは投与前の期間中、一緒に共培養されてもよい。
【０１２３】
前記ＰＰＤＣは、有益な他の薬剤または生物学的分子、例えば、成長因子、栄養因子、（分娩後細胞からの、または、前駆細胞または分化細胞の培養からの）条件培地、または他の活性試薬（例えば、当分野で周知の、抗炎症試薬、抗アポトーシス試薬、酸化防止剤、成長因子、神経栄養因子、または神経再生薬剤または神経保護薬剤）と共に投与され得る。ＰＰＤＣが他の試薬と投与されるとき、それらは１つの薬学的組成物内に一緒に投与されてもよく、または別々の薬学的組成物で、他の試薬と同時に、または順番に（他の試薬の投与の前に、または後に）投与され得る。
【０１２４】
分娩後細胞と共に投与され得る他の成分の例には、限定するものではないが、（１）他の神経保護的薬剤または神経保護薬、（２）選択された細胞外マトリックス成分、例えば、当分野で知られる１若しくはそれ以上のタイプのコラーゲン、および／または、成長因子、多血小板血漿、および薬剤（別法では、前記細胞は遺伝的に操作されて成長因子を発現し産生し得る）、（３）抗アポトーシス薬剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ模倣剤、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、（４）抗炎症剤（例えば、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１の阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、および非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ））（例えば、ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、およびＳＵＰＲＯＦＥＮ）、（５）免疫抑制剤または免疫調節剤、例えば、カルシニュリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖性物質、コルチコステロイド、および種々の抗体、（６）酸化防止剤、例えばプロブコール、ビタミンＣ、ビタミンＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、およびＮ−アセチルシステイン、および（６）局所麻酔薬、が含まれる。
【０１２５】
実施形態では、ＰＰＤＣは、成長培地内で培養された非分化細胞として投与される。別法では、ＰＰＤＣは、培養内で、望ましい表現型への分化を刺激する条件に曝された後に、投与され得る。
【０１２６】
前記細胞は、眼損傷または眼の苦痛の部位に、手術的に移植されるか、注入されるか、または、直接的にまたは非直接的に他の方法で投与され得る。細胞が半固形または固形の装置内で投与されるときは、身体の正確な位置への手術的移植が通常、適した投与手段である。しかし、液体または流動体の薬学的組成物は、眼内のより一般的な位置（例えば、局所的に、または眼内）に投与され得る。
【０１２７】
他の実施形態は、ＰＰＤＣ細胞性成分（例えば、細胞溶解物、またはそれらの成分）、または産物（例えば、ＰＰＤＣが天然に産生する、或いは遺伝的修飾を介してＰＰＤＣが産生する栄養因子および他の生物学的因子、またはＰＰＤＣ培養からの条件培地）を含む薬学的組成物を投与することによって、眼変性疾患を治療する方法を含む。再び、これらの方法はさらに、他の活性試薬（例えば、成長因子、神経栄養因子、または当分野で周知の神経再生薬剤または神経保護薬剤）を投与することを含み得る。
【０１２８】
ＰＰＤＣまたは当明細書に記載されたその他の薬学的組成物のいずれかを投与するための投薬形態および処方計画は、適切な診療能力に従って作成され、個々の患者の条件、例えば、眼変性疾患の性質および程度、性別、体重、および一般的な医学的状態、および医師に知られる他の因子が考慮に入れられる。従って、患者に投与される薬学的組成物の有効な量は、当分野で周知のこれらの考慮によって決定される。
【０１２９】
細胞治療を開始する前に患者を薬理的に免疫抑制することが望ましいか、または好適であり得る。これは、全身的なまたは局所的な免疫抑制剤の使用によって達成され得るか、または、上記のように、封入された装置内で前記細胞を送達することによって達成され得る。前記移植細胞への免疫応答を減らすか、または除去するための、これらの方法および他の方法は当分野で周知である。別法として、上記のように、ＰＰＤＣは遺伝的に改変されて、それらの免疫原性を減らし得る。
【０１３０】
生きた患者内での移植された細胞の生存性は、例えば、コンピューター断層撮影法（ＣＡＴまたはＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、またはポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）のような種々の撮影法の使用によって決定され得る。移植物の生存性の決定はまた、死後に前記組織を取り除いて、肉眼で検査するか、顕微鏡によって検査することによって行え得る。別法では、細胞は、神経細胞または眼細胞、またはそれらの産物（例えば、神経伝達物質）に特異的な染色で処理され得る。移植された細胞はまた、ローダミン標識微粒子、フルオレセイン標識微粒子、ファーストブルー、鉄微粒子、ビスベンザミド（ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、または、ベータガラクトシダーゼまたはベータグルクロニダーゼのような遺伝的に誘導されるレポーター遺伝子のような追跡用色素を以前に取り込ませることによって同定され得る。
【０１３１】
移植された細胞の、被験者の眼組織への機能的な融合は、損傷された、または病的な前記眼機能の回復を検査することによって評価され得る。例えば、黄斑変性症、または他の網膜症の治療での効力は、視覚の鋭敏さの改善、および、立体的色基底の写真（ｓｔｅｒｅｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｏｌｏｒ  ｆｕｎｄｕｓ  ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ）の異常さおよびグレード分けの評価によって決定され得る（Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，ＮＥＩ，ＮＩＨ，ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．８，２００１，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１９：１４１７〜１４３６）。
【０１３２】
キットおよび貯蔵
別の観点では、本発明は、上記のように、眼の再生および修復ための種々の方法で分娩後細胞（好適には、ＰＰＤＣ）、細胞集団、それらの成分および産物を利用するキットを提供する。眼変性疾患の治療または他の定期的な治療のために使用される場合は、前記キットは、少なくとも分娩後細胞を含む、１若しくはそれ以上の細胞集団、および薬理的に許容される担体（液体、半固形、または固形）を含み得る。前記キットは、オプションとして、前記細胞を投与する手段（例えば、注射によって）を含み得る。前記キットはさらに、前記細胞を使用するための使用説明書を含み得る。軍隊用のように野外病院での使用に調製されるキットは、全手順の供給品を含んでもよく、そのような供給品には、組織骨格、手術用縫合糸などが含まれ、前記細胞は、急性な損傷の修復と共に使用される。当明細書に記載されたアッセイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法のキットは、例えば、（１）ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣの成分、またはＰＰＤＣの産物、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を実践するための試薬、（３）必要に応じて、他の細胞または他の細胞集団、および（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を行うための使用説明書、の１若しくはそれ以上を含み得る。
【０１３３】
更に別の観点では、本発明は、本発明の組織、細胞、細胞成分、および細胞集団の貯蔵を提供する。上記で考察したように、前記細胞は容易に冷凍保存される。したがって、本発明は貯蔵所に前記細胞を冷凍保存する方法を提供し、その方法では、前記細胞は、冷凍して保存され、前記細胞の免疫学的性質、生化学性質、および遺伝的性質に基づいて前記細胞の完全な特徴付けが付随される。前記冷凍細胞は解凍され、増殖されて、前記手順の必要条件および前記患者の必要性によって、自家治療、同系治療、または同種治療に直接に使用され得る。好適には、各冷凍保存検体の情報はコンピューターに保存され、その情報は外科医、手順、および患者の必要に基づいて検索可能であり、前記細胞または集団の特徴に基づいて好適なマッチが見つけられる。好適には、本発明の前記細胞は、成長され、望ましい細胞量まで増殖され、治療用細胞成分は、マトリックスまたは支持体の存在下で、または非存在下で、別々に調製されるか、または共培養として調製される。いくつかの応用では、新鮮に調製された細胞を使用することが好適であり得るが、残りの細胞は冷凍保存され、前記細胞を冷凍し、前記コンピューターに前記情報を入力し、前記検体に前記コンピューター入力を関連付けることによって貯蔵され得る。免疫学的目的のためにそのような細胞の受容者を、由来またはドナーにマッチすることが必要でない場合でも、前記貯蔵システムは、例えば、前記貯蔵細胞の望ましい生化学的性質または遺伝的性質を治療の必要性に一致することを容易にする。貯蔵された検体と前記望ましい性質が一致すると、前記検体が取り出され、治療用に調製される。当明細書で記載されたように調製された細胞溶解物、ＥＣＭ、または細胞性成分もまた、冷凍保存されるか、他の方法で保存されることができ（例えば、凍結乾燥）、本発明にしたがって貯蔵され得る。
【０１３４】
以下の実施例は、本発明を詳細に説明するのに提供される。これらは、本発明を例証することを意図しており、本発明を限定するものではない。
【０１３５】
以下の実施例および本明細書の他の部分で使用された場合、用語「成長培地」は一般的に、ＰＰＤＣの培養に満足な培地を意味する。具体的には、本発明の前記細胞の培養に好適な１つの培地は、ダルベッコ改変必須培地（当明細書では「ＤＭＥＭ」とも略される）を含む。特に好適な培地は、低グルコースＤＭＥＭ（当明細書では「ＤＭＥＭ−ＬＧ」とも略される）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）である。好適には、前記低グルコースＤＭＥＭは、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（例えば、規定化ウシ胎仔血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、抗生物質／抗真菌剤（好適には、５０〜１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０〜１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０〜０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド））、および０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）が添加される。以下の実施例で使用される場合、「成長培地」は、１５％のウシ胎仔血清、および抗生物質／抗真菌剤（ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれる場合は、好適には、それぞれ５０Ｕ／ｍｌおよび５０マイクログラム／ｍｌであり、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢが使用される場合は、好適には、それぞれ１００Ｕ／ｍｌ、１００マイクログラム／ｍｌ、および０．２５マイクログラム／ｍｌである。）を含む低グルコースＤＭＥＭを指す。いくつかの場合では、異なる成長培地が使用されるか、または異なる添加が提供されるが、これらは通常、成長培地への添加として文章で示されている。
【０１３６】
以下の略記は、実施例、および当明細書および請求項の他の部分で用いられた。アンジオポエチン２は「ＡＮＧ２」（または「Ａｎｇ２」）、抗体提示細胞は「ＡＰＣ」、脳由来神経栄養因子は「ＢＤＮＦ」、塩基性繊維芽細胞成長因子は「ｂＦＧＦ」、ｂｉｓ  ｉｎ  ｄｉｅ（１日２回）は「ｂｉｄ（ＢＩＤ）」、サイトケラチン１８は「ＣＫ１８」、中枢神経系は「ＣＮＳ」、ケモカイン受容体リガンド３は「ＣＸＣリガンド３」、ダルベッコ改変必須培地は「ＤＭＥＭ」、低グルコースを含有するＤＭＥＭは「ＤＭＥＭ：ｌｇ」（または「ＤＭＥＭ：Ｌｇ」或いは「ＤＭＥＭ：ＬＧ」）、エチレンジアミン４酢酸は「ＥＤＴＡ」、上皮細胞成長因子は「ＥＧＦ」（または「Ｅ」）、蛍光活性化細胞選別装置は「ＦＡＣＳ」、ウシ胎児血清は「ＦＢＳ」、繊維芽細胞成長因子は「ＦＧＦ」（または「Ｆ」）顆粒球走化性タンパク質２は「ＧＣＰ２」、グリア細胞繊維性酸性タンパクは「ＧＦＡＰ」、ヘパリン結合上皮細胞成長因子は「ＨＢ−ＥＧＦ」、ヒト冠動脈内皮細胞は「ＨＣＡＥＣ」、肝細胞増殖因子は「ＨＧＦ」、ヒト間葉系幹細胞は「ｈＭＳＣ」、肝細胞特異的転写因子は「ＨＮＦ−１アルファ」、ヒト臍帯静脈内皮細胞は「ＨＵＶＥＣ」、ケモカインかつＣＣＲ８受容体のリガンドは、「Ｉ３０９」、インスリン様成長因子１は「ＩＧＦ−１」、インターロイキン６は「ＩＬ−６」、インターロイキン８は「ＩＬ−８」、ケラチン１９は「Ｋ１９」、ケラチン８は「Ｋ８」、ケラチノサイト成長因子は「ＫＧＦ」、白血病抑制因子は「ＬＩＦ」、ミエリン塩基性タンパク質は「ＭＢＰ」、単球走化性タンパク質１は「ＭＣＰ−１」、マクロファージ由来ケモカインは「ＭＤＣ」、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファは「ＭＩＰ１アルファ」、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータは「ＭＩＰ１ベータ」、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は「ＭＭＰ」、間葉系幹細胞は「ＭＳＣ」、ヒト皮膚繊維芽細胞は「ＮＨＤＦ」、神経前駆細胞増殖培地は「ＮＰＥ」、オリゴデンドロサイトまたはグリア分化のマーカーＯ４は「Ｏ４」、末梢血単核細胞は「ＰＢＭＣ」、リン酸緩衝生理食塩水は「ＰＢＳ」、血小板由来増殖因子は「ＰＤＧＦｂｂ」、経口（ｐｅｒ  ｏｓ）は「ＰＯ」、末梢神経系は「ＰＮＳ」、活性化を制御され、発現および分泌した正常のＴ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）は「Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）」、組み換えられたヒトの成長因子および分化因子は「ｒｈＧＤＦ−５」、皮下は、「ＳＣ」、ストローマ細胞由来因子は「ＳＤＦ−１アルファ」、ソニック・ヘッジホッグは「ＳＨＨ」、標準実施要領は「ＳＯＰ」、甲状腺および活性化調節ケモカインは「ＴＡＲＣ」、組織培養用プラスチック製は「ＴＣＰ」、組織培養用ポリスチレン製は「ＴＣＰＳ」、形質転換成長因子ベータ２は「ＴＧＦベータ２」、形質転換成長因子ベータ３は「ＴＧＦベータ３」、マトリックス・メタロプロテアーゼの組織阻害剤１は「ＴＩＭＰ１」、トロンボポエチンは「ＴＰＯ」、ＢＩＩＩチューブリンは「ＴｕＪ１」、血管内皮細胞増殖因子は「ＶＥＧＦ」、フォンウィルブラン���因子は、「ｖＷＦ」、アルファ・フェトプロテインは「アルファＦＰ」。
【実施例１】
【０１３７】
分娩後組織から細胞の樹立
この実施例は、胎盤組織および臍帯組織から分娩後由来細胞の調製を説明する。分娩後の臍帯および胎盤は、満期妊娠または早産妊娠のいずれかの出産時に取得された。細胞は、５人の別のドナーの臍帯組織および胎盤組織から収集された。細胞単離の異なる方法は、１）異なる表現型を有する細胞に分化する能力（幹細胞に共通の特徴）、または２）他の細胞および組織に有用な栄養因子を提供する能力、を有する細胞を産出する能力に関してテストされた。
【０１３８】
方法および材料
臍帯細胞の単離
臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から取得された。前記組織は、正常の分娩後に取得された。細胞単離のプロトコールは、層流フード内で無菌操作で行われた。血液と残渣を除くため、前記臍帯は、抗真菌剤および抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）の存在下でリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄された。その後、前記組織は、細かい果肉に刻まれるまで、５０ミリリットルの培地（低グルコースＤＭＥＭまたは高グルコースＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で１５０ｃｍ２の組織培養プレート内で機械的に分離された。この刻まれた組織は、５０ミリリットルのコニカルチューブに移された（各チューブに約５グラムの組織）。その後、前記組織は、低グルコースＤＭＥＭまたは高グルコースＤＭＥＭ内で消化され、各ＤＭＥＭは前述のような抗真菌剤と抗生物質を含んでいた。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物が使用された（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルの「Ｃ：Ｄ；」コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ、５ユニット／ミリリットルのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ））。前記組織、培地、および消化酵素を含む前記コニカルチューブは、毎分２２５回転で、オービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ社、ニューヨーク州ブルックリン）内で３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３９】
消化後、前記組織は１５０ｘｇで５分間遠心され、その上清が吸引された。その沈殿は、２０ミリリットルの成長培地（低グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（容量比）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；  規定化  ウシ胎児血清；  ロット番号：ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（容量比）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００ミリリットルにつき１ミリリットルの前述の抗真菌剤および抗生物質）に再検濁された。この細胞懸濁液は、１つの７０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通して濾過した。成長培地を含む５ミリリットルのリンス液がさらに、前記ストレーナーを通した。その後、この細胞懸濁液は、１つの４０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通し、さらに５ミリリットルの成長培地でリンスされた。
【０１４０】
この濾過液は成長培地中（全容量：５０ミリリットル）に再懸濁され、１５０ｘｇで５分間遠心された。その上清が吸引され、前記細胞は５０ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。この過程を、もう２回繰り返した。
【０１４１】
最終的な遠心で、その上清が吸引され、前記細胞は５ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。トリパンブルー染色を使用して、生細胞の数が決定された。その後、細胞は標準的条件下で培養された。
【０１４２】
臍帯から単離された前記細胞は、前述のように、抗生物質／抗真菌剤を含む成長培地で、ゼラチンコーティングされたＴ‐７５  ｃｍ２のフラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）に５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種された。２日後（種々の実験では細胞は２〜４日インキュベートされた）、浪費培地が吸引された。細胞は、残渣と血液由来細胞を除くために、ＰＢＳで３回洗浄された。その後、細胞に成長培地が補給され、コンフルエントになるまで成長させ、（継代０から約１０日で）継代１が行われた。その後の継代（継代１から継代２へ、以降も同様）では、細胞は４〜５日でサブコンフルエント（７５〜８５％コンフルエント）に達した。これらの以降の継代では、細胞は５０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、５％の二酸化炭素と大気中酸素を含む、湿度制御されたインキュベータ内で、３７℃で成長させた。
【０１４３】
胎盤細胞の単離
胎盤組織は、ＮＤＲＩ（ペンシルバニア州フィラデルフィア）から取得された。前記組織は、妊娠に由来し、正常な手術分娩時に取得された。胎盤細胞は、臍帯細胞の単離で記述されたのと同様に単離された。
【０１４４】
以下の実施例は、胎盤組織からの母性由来細胞および胎児由来細胞の別々の集団の分離に適用される。
【０１４５】
細胞単離のプロトコールは、層流フード内で無菌操作で行われた。血液と残渣を除くため、前記胎盤組織は、抗真菌剤および抗生物質（上記と同様）の存在下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で洗浄された。その後、前記胎盤組織は、３つの部分、すなわち上部（新生児側）、正中部（混合した細胞単離の新生児側および母性側）、および底部（母側）、に分けられた。
【０１４６】
これらの分けられた部分は個々に、抗生物質／抗真菌剤を含むＰＢＳ中で洗浄され、さらに血液および残渣を除去した。その後、各部分は、５０ミリリットルのＤＭＥＭ／低グルコースの存在下で１５０ｃｍ２の組織培養プレート内で、細かい果肉に刻まれるまで機械的に分離された。前記パルプ状組織は５０ミリリットルのコニカルチューブに移された、各チューブには、約５グラムの組織が含まれていた。前記組織は、抗生物質および抗真菌剤（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）、および消化酵素を含む、低グルコースＤＭＥＭまたは高グルコースＤＭＥＭ内で消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）および５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む）が使用された。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ、５ユニット／ミリリットルのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ））。前記組織、培地、および消化酵素を含む前記コニカルチューブは、毎分２２５回転で、１つのオービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ社、ニューヨーク州ブルックリン）内で３７℃で２時間インキュベートした。
【０１４７】
消化後、前記組織は１５０ｘｇで５分間遠心され、その上清が吸引された。その沈殿物は、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢを含む、２０ミリリットルの成長培地に再懸濁された。この細胞懸濁液は、１つの７０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通して濾過され、さらに５ミリリットルの成長培地でリンスされた。前記細胞懸濁液の全体は、１つの４０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通して濾過され、その後、さらに５ミリリットルの成長培地がリンスとして濾過された。
【０１４８】
この濾過液は成長培地中（全容量：５０ミリリットル）に再懸濁され、１５０ｘｇで５分間遠心された。その上清が吸引され、その細胞沈殿物は５０ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。この過程を、もう２回繰り返した。最終的な遠心の後、その上清が吸引され、前記細胞は５ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。トリパンブルー排除法を使用して、細胞数が決定された。その後、細胞は標準的条件下で培養された。
【０１４９】
ＬＩＢＥＲＡＳＥの細胞単離
細胞は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナ州インディアナポリス）（２．５ミリグラム／ミリリッター、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ３、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナ州インディアナポリス）およびヒアルロニダーゼ（５ユニット／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）を含む低グルコースＤＭＥＭ培地中で臍帯組織から単離された。前記組織の消化および前記細胞の単離は、他のプロテアーゼ消化で記述されたと同様であり、Ｃ：ＤまたはＣ：Ｄ：Ｈの代わりにＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼの混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥでの組織消化の結果、分娩後組織から細胞集団が単離され、これらは容易に増殖した。
【０１５０】
他の酵素組み合わせを使用した細胞単離
異なる酵素組み合わせを使用して、前記臍帯から細胞を単離する手順が比較された。消化に関して比較された酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、およびｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれる。これらの異なる酵素消化条件を使用して、細胞単離の差異が観察された（表１−１）。
【０１５１】
【表１】
2007528703.tif 000002
【０１５２】
前記臍帯内の残余血液から細胞の単離
異なるアプローチによって臍帯から細胞集団を単離する他の試みがなされた。一例では、血塊およびゲル状物質を取り除くために、臍帯は薄切りにされ、成長培地で洗浄された。血液、ゲル状物質、および成長培地の混合物は収集され、１５０ｘｇで遠心された。その沈殿物は、成長培地に再懸濁され、ゼラチンコーティングされたフラスコに播種された。これらの実験から、容易に増殖した細胞集団が単離された。
【０１５３】
臍帯血から細胞の単離
細胞はまた、ＮＤＲＩから取得された臍帯血からも単離された。ここで使用されたプロトコールは、Ｈｏらによる国際特許出願ＵＳ０２２９９７１号（Ｈｏ、Ｔ．Ｗ．ら、ＷＯ２００３０２５１４９  Ａ２）のプロトコールである。臍帯血（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）の検体（それぞれ、５０ミリリットルおよび１０．５ミリリットル）は、溶解バッファー（濾過滅菌、１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ミリモル炭酸水素カリウム、０．１ミリモルＥＤＴＡ、ｐＨ７．２に緩衝化（全成分はミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａから購入））で混合された。臍帯血と溶解バッファーの比を１：２０にして、細胞が溶解された。その結果得られた細胞懸濁液は５秒間ボルテックスにかけ、室温で２分間インキュベートした。前記溶解液は遠心された（２００ｘｇで１０分間）。その細胞沈殿物は、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、４ミリモルのグルタミン（メディアテック社、バージニア州ハーンドン）、１００ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、および１００ミリリットル当たり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カリフォルニア州カールズバッド）を含む、完全最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ社、カリフォルニア州カールズバッド）に再検濁された。前記懸濁細胞は遠心（２００ｘｇで１０分間）され、その上清が吸引され、その細胞沈殿物は完全培地で洗浄された。細胞は、Ｔ１７５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州）、ラミニンでコーティングされたＴ７５フラスコまたはフィブロネクチンでコーティングされたＴ７５フラスコ（両フラスコは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォードから取得）に直接、播種された。
【０１５４】
異なる酵素の組み合わせおよび成長条件を使用した細胞の単離
細胞集団は異なる条件下で単離され、単離後すぐに或る種の条件下で増殖できるかどうかを決定するために、細胞は、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含む、または含まない成長培地内で、上記の処置にしたがってＣ：Ｄ：Ｈの酵素組み合わせを使って消化された。このように単離された胎盤由来細胞は、種々の条件下で播種された。すべての細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖された（表１−２）。
【０１５５】
【表２】
2007528703.tif 000003
【０１５６】
異なる酵素の組み合わせおよび成長条件を使用した細胞の単離
すべての条件で、細胞は継代０および継代１の間で接着し、増殖した（表１−２）。５〜８、および１３〜１６の条件の細胞は、播種後、継代４まで十分に増殖することが実証され、その時点で冷凍保存され、貯蔵された。
【０１５７】
結果
異なる酵素組み合わせを使用した細胞単離
Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせが、単離後の最も良好な細胞数を提供し、また、他の条件よりも、培養内で多い世代数で増殖した細胞を発生した（表１）。増殖可能な細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼのみを使用した場合には得られなかった。この結果が、検査した前記コラーゲンに特異的であるかどうかを決定する試みはなされなかった。
【０１５８】
異なる酵素の組み合わせおよび成長条件を使用した細胞の単離
酵素の消化および成長に関して検査されたすべての条件下で、継代０および継代１の間の細胞は、良好に接着し増殖した（表２）。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞は、播種後４回の継代まで十分に増殖し、その時点で細胞は冷凍保存された。すべての細胞は更なる研究のために貯蔵された。
【０１５９】
前記臍帯内の残余血液から細胞の単離
有核細胞は急速に接着し、成長した。これらの細胞はフローサイトメトリーで分析され、酵素消化によって得られた細胞と類似していた。
【０１６０】
臍帯血から細胞の単離
前記製剤は、赤血球および血小板を含んでいた。有核細胞は最初の３週間、接着したり、分裂しなかった。前記培地は播種後３週間で交換され、接着し成長した細胞は観察されなかった。
【０１６１】
要約
細胞集団は、コラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（神経プロテアーゼ）、およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解性酵素）の前記酵素組み合わせを用いて、臍帯組織および胎盤組織から効率的に導き出し得る。ＢｌｅｎｄｚｙｍｅであるＬＩＢＥＲＡＳＥを使用してもよい。特に、細胞を単離するために、コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈユニット／グラム）およびサーモライシン（１７１４カゼインユニット／グラム）であるＢｌｅｎｄｚｙｍｅ３もまた、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック上で、成長培地内で培養されたとき、多くの継代にわたって容易に増殖した。
【０１６２】
前記臍帯内の残余血液からも、細胞が単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。前記組織から洗浄された血塊中の細胞は使用した条件下で接着し成長したが、このような細胞の存在は、解剖分離の過程中に放出された細胞のためである可能性がある。
【実施例２】
【０１６３】
分娩後由来細胞の成長の特徴
分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）の細胞増殖の能力が、他の単離された幹細胞集団と比較された。老化までの細胞増殖の過程は、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．１９７４ａ、１９７４ｂ）と呼ばれる。分娩後由来細胞は、十分な細胞数に容易に増殖することが可能であるため、治療用に非常に適している。
【０１６４】
材料および方法
ゼラチンコーティングされたフラスコ
組織培養用のプラスチック製フラスコは、１つのＴ７５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）に２％（ｗ／ｖ）のブタのゼラチン（タイプＢ：２２５ブルーム、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を２０ミリリットル加えて、２０分間室温でコーティングした。前記ゼラチン溶液を取り除いた後、１０ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を加えて、次に吸引した。
【０１６５】
ＰＰＤＣの増殖の能力と他の細胞集団との比較
成長増殖の能力の比較に関して、以下の細胞集団が使用された。それらは、ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６５５５３７４  Ｂ１号公報、米国特許出願第ＵＳ２００４００５８４１２号）、ｉｉｉ）正常皮膚繊維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号：９Ｆ０８４４、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｖ）臍由来細胞、およびｖ）胎盤由来細胞、である。細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢを含む成長培地内で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコに、５，０００細胞／ｃｍ２で最初に播種された。その後の継代のために、細胞培養は以下のように処理した。トリプシン処理後、トリパンブルー染色した後、生細胞が計数された。細胞懸濁液（５０マイクロリットル）と、トリパンブルー液（５０ミリリットル、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）とが混ぜられた。生細胞数が、血球計算板を用いて推定された。
【０１６６】
計数後、細胞は、２５ミリリットルの新しい成長培地内で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は３７℃で標準的条件下で成長された。前記成長培地は１週間に２回交換された。細胞は８５％コンフルエントに達したときに、継代され、この過程は前記細胞が老化に達するまで繰り返された。
【０１６７】
各継代時には、細胞はトリプシン処理され、計数された。生細胞数、集団倍加時間［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ  ２］および倍加時間（培養内での時間／集団倍加時間）が計算された。最適の細胞増殖を決定する目的のために、その前の継代の全細胞数に各継代に対する増殖因子（すなわち、増殖因子＝最終的細胞数／初期細胞数）を掛け算することによって、継代あたりの全細胞数が決定された。
【０１６８】
低密度の細胞バンクの増殖能力
異なるセットの条件を使用して、継代１０で保存された細胞の増殖能力もまた検査された。正常な皮膚繊維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号：９Ｆ０８４４、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ウオーカーズビル）、臍帯由来細胞、および胎盤由来細胞が検査された。継代１０で以前に保存されていた、これらの細胞集団は、５，０００細胞／ｃｍ２で培養され、その時点まで各継代でコンフルエントまで増殖されていた。継代１０で細胞解凍後、細胞密度が細胞集団に与える影響を決定した。細胞は標準条件下で凍解し、トリパンブルー染色を使用して計数した。解凍された細胞は、その後、上記のように抗生物質／抗真菌剤を含む低グルコースＤＭＥＭ成長培地内で１０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は３７℃で標準的大気圧条件下で増殖された。成長培地は１週間に２回交換され、前記細胞は約８５％コンフルエントに達すると継代された。細胞は、老化まで（すなわち、前記細胞が増殖できなくなるまで）、繰返し継代された。各継代時には、細胞はトリプシン処理され、計数された。細胞数、集団倍加時間［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ  ２］および倍加時間（培養内での時間／集団倍加時間）。その前の継代の全細胞数に各継代に対する増殖因子（すなわち、増殖因子＝最終的細胞数／初期細胞数）を掛け算することによって、継代あたりの全細胞数が決定された。
【０１６９】
最初に細胞播種されてからの低密度でのＰＰＤＣの増殖
新しく単離されたＰＰＤＣの増殖能力が、低密度の播種条件下で検査された。ＰＰＤＣは、当明細書で記述されたように調製された。細胞は１０００細胞／ｃｍ２で播種され、老化に至るまで上記の方法で継代された。細胞は３７℃で標準的大気圧条件下で増殖された。前記成長培地は１週間に２回交換された。細胞は約８５％コンフルエントに達すると継代された。各継代時には、細胞はトリプシン処理され、トリパンブルー染色によって計数された。細胞数、集団倍加時間［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ  ２］および倍加時間（培養内での時間（ｈ）／集団倍加時間）が各継代に対し計算された。その前の継代の全細胞数に各継代に対する増殖因子（すなわち、増殖因子＝最終的細胞数／初期細胞数）を掛け算することによって、継代あたりの全細胞数が決定された。細胞は、ゼラチンコーティングされたフラスコおよびゼラチンコーティングされていないフラスコで増殖された。
【０１７０】
クローン細胞系新生児性胎盤由来細胞の増殖
胎盤組織から新生児性細胞の集団を増殖するためにクローニングが使用された。前記胎盤から３種類の異なる細胞集団の単離に続いて、これらの細胞集団は標準的成長条件下で増殖し、その後、前記単離された細胞集団の特定を明らかにするために核型分析された。前記細胞は、一人の男児を分娩した一人の母親から単離されたため、中期染色体伸展を行って男性の染色体および女性の染色体の間で区別することは容易であった。これらの実験は、新生児側の細胞は、核型が新生児表現型に陽性であり、中層の細胞は、核型が新生児表現型および母性表現型の両方に陽性であり、母側の細胞は、核型が母性表現型に陽性であった。
【０１７１】
低酸素培養条件における細胞の増殖
低酸素の培養条件での細胞の増殖低酸素の細胞培養条件は、或る種の状況で細胞増殖を改善し得ることが実証されている（米国特許第２００４０００５７０４号公報）。ＰＰＤＣの細胞増殖が、細胞培養条件を変更することによって改善され得るかを決定するために、臍帯由来細胞の培養を低酸素条件で成長した。細胞は、ゼラチンコーティングされたフラスコで、成長培地内で５０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞はまず、継代５まで標準の大気条件下で培養され、その時点で前記細胞は低酸素培養条件（５％のＯ２）に移された。
【０１７２】
他の成長条件
他のプロトコールでは、細胞は、コーティングされていないプレート、コラーゲンコーティングされたプレート、フィブロネクチンコーティングされたプレート、ラミニンコーティングされたプレート、および細胞外マトリックスでコーティングされたプレートで増殖された。培養は、これらの異なるマトリックス上で十分に増殖することが実証されている。
【０１７３】
結果
ＰＰＤＣの増殖の能力と、他の幹細胞集団および非幹細胞集団との比較
臍帯由来細胞および胎盤由来細胞の両者は、４０回を上回る継代の回数、増殖し、６０日内に>１Ｅ１７の細胞数を生み出した。対照的に、ＭＳＣおよび繊維芽細胞は、それぞれ２５日後未満および６０日後未満に老化した。脂肪由来細胞は約６０日間増殖したが、>４．５Ｅ１２の全細胞数を産生した。このように、使用した実験条件下で分娩後由来細胞が５０００細胞／ｃｍ２で播種されたとき、前記細胞は、同一の条件下で増殖された他の細胞タイプより、ずっと良好に増殖した（表２−１）。
【０１７４】
【表３】
2007528703.tif 000004
【０１７５】
低密度の細胞バンクの増殖能力
臍帯由来細胞と胎盤由来細胞と繊維芽細胞は、１０回を上回る継代の回数、増殖し、６０日内に>１Ｅ１１の細胞数を生み出した（表２−２）。これらの条件下で６０日後に、前記繊維芽細胞は老化になったが、前記臍帯由来細胞集団および胎盤由来細胞集団は８０日後に老化し、それぞれ５０回超の集団倍加および４０回超の集団倍加を完了した。
【０１７６】
【表４】
2007528703.tif 000005
【０１７７】
最初に細胞播種されてからの、低密度でのＰＰＤＣの増殖
ＰＰＤＣは、ゼラチンコーティングされた、および、ゼラチンコーティングされていない、プレートまたはフラスコに低い密度（１，０００細胞／ｃｍ２）で増殖された。これらの条件下でのこれらの細胞の成長能力は良好であった。前記細胞は、対数期に容易に増殖した。細胞増殖の割合は、胎盤由来細胞が、ゼラチンコーティングされたフラスコ上で、成長培地内で５０００細胞／ｃｍ２で播種されたときに観察された割合と同様であった。コーティングされていないフラスコ、またはゼラチンコーティングされたフラスコのどちらかでの培養の間で、細胞増殖能力に差は見られなかった。しかし、ゼラチンコーティングされたフラスコ上では、細胞が表現型としてずっと小さく見え、コーティングされていないフラスコ上では、より大きな細胞の表現型が観察された。
【０１７８】
新生児性または母性のクローン細胞系胎盤由来細胞の増殖
新生児性または母性のクローン細胞系細胞集団は、前記胎盤の新生児側または母性側のそれぞれから単離された胎盤由来細胞から増殖することができる。細胞は順に希釈され、増殖のために、成長培地内で、ゼラチンコーティングされたプレート上に播種され、ゼラチンコーティングされた９６ウェルプレート内に各ウェルにつき１つの細胞で播種される。この最初のクローニングから、増殖クローンが同定され、トリプシン処理され、成長培地内で、ゼラチンコーティングされた１２ウェルプレート上に再播種され、その後、成長培地内で、ゼラチンコーティングされたＴ２５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で継代される。クローン系集団の細胞が同定されたことを確認するために、サブクローニングが実施される。サブクローニング実験では、細胞はトリプシン処理され、各ウェルに０．５細胞の割合で再播種される。良好に成長する前記サブクローンは、ゼラチンコーティングされたＴ２５フラスコに、５，０００細胞  ｃｍ２／フラスコで増殖される。細胞は５，０００細胞  ｃｍ２／Ｔ７５フラスコで継代される。細胞の増殖を実証するために、クローンの増殖特性がプロットされてもよい。核型分析は、前記クローンが新生児性または母性のいずれであるかを確認できる。
【０１７９】
低酸素の培養条件での細胞の増殖
低酸素条件下で細胞は良好に増殖した。しかし、低酸素条件下での培養は、使用した条件下で、ＰＰＤＣの細胞増殖に重大な影響を与えなかったようであった。
【０１８０】
要約
標準の大気酸素下で、ゼラチンコーティングされたフラスコまたはコーティングされていないフラスコで、成長培地内で、約５０００細胞／ｃｍ２の密度で、単離された分娩後由来細胞を成長させることを含む細胞増殖条件は、継代１１で大量数の細胞を発生させるのに十分である。さらに、前記データは、より低い密度の培養条件（例えば、１０００細胞／ｃｍ２）を用いると前記細胞が容易に増殖され得ることを示唆している。低酸素条件での分娩後由来細胞の増殖もまた、細胞増殖を促進するが、これらの条件を成長に使用しても、細胞増殖の可能性に漸進的な改善はまだ観察されていない。現在のところ、標準の大気条件下で分娩後由来細胞を培養することが、大量の細胞を発生するのに望ましい。しかし、前記培養条件が変更されると、分娩後由来細胞の増殖も同様に変わる可能性がある。この対策を用いて、これらの細胞集団の増殖能力および分化能力を向上することが可能である。
【０１８１】
使用された条件下では、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞の増殖能力は限定されているが、分娩後由来細胞は、大量の数まで容易に増殖する。
【０１８２】
実施例２の参考文献
１）Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．１９７４ａ．  Ｊ  Ａｍ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｓｏｃ．２２：１〜１２．
２）Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．１９７４ｂ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ．１４：３７〜４５．
３）米国特許第２００４００５８４１２号公報
４）米国特許第２００４００４８３７２号公報
５）米国特許第２００４０００５７０４号公報
【実施例３】
【０１８３】
胎盤由来細胞用の成長培地の評価
いくつかの細胞培養培地が、胎盤由来細胞の成長を支える能力について評価された。正常レベル（２０％）の酸素および低レベル（５％）の酸素での胎盤由来細胞の成長が、ＭＴＳ比色分析を使用して３日後に評価された。
【０１８４】
方法および材料
継代８（Ｐ８）の胎盤由来細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地内で、９６ウェルプレートで、各ウェルに１×１０３細胞で播種された。８時間後、前記培地は以下に記載されるように交換され、細胞は正常レベル（大気圧）の酸素または低レベル（５％、ｖ／ｖ）の酸素で、３７℃、５％のＣＯ２で、４８時間インキュベートされた。ＭＴＳが前記培地（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、プロメガ社、ウイスコンシン州マジソン）に３時間加えられ、その吸収が、４９０ナノメートルで測定された（モレキュラーデバイス社、カリフォルニア州サニーベール）。
【０１８５】
【表５】
2007528703.tif 000006
【０１８６】
結果
ＭＴＳアッセイの標準曲線は、吸収の増加、および細胞数の増加の間に線形相関を確立した。取得された吸収値は、推定細胞数に変換され、最初の播種と比較した変化（％）が計算された。
【０１８７】
血清の効果
正常酸素条件での培養液への血清の添加は、再現性のある吸光度の用量依存的増加、さらには生存細胞数の増加を導いた。ＭＳＣＧＭを完成するために血清を添加すると、用量依存的な吸収の減少が起こった。血清なしの培地では、細胞は、ＣＥＬＬＧＲＯ−ＦＲＥＥと、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０と、ＤＭＥＭで認識できるほどしか成長しなかった。
【０１８８】
酸素の効果
酸素を減らすと、成長培地と、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０と、ＭＳＣＧＭ内での細胞の成長速度が増加したようであった。前記細胞の最良の成長を起こす培地は、成長が良好な順番に、成長培地>ＭＳＣＧＭ>Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ＋１０％のＦＢＳ＝ＤＭＥＭ−Ｈ＋１０％のＦＢＳ＝Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％のＦＢＳ＝ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％のＦＢＳであった。
【０１８９】
要約
胎盤由来細胞は、正常の酸素または低酸素下で、種々の培養培地で成長し得る。胎盤由来細胞の短期間の成長が、０％（ｖ／ｖ）と、２％（ｖ／ｖ）と、１０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、１２種類の基本培地で、５％酸素または大気中酸素で決定された。一般的に、胎盤由来細胞は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０およびＣＥＬＬＧＲＯ−Ｆｒｅｅを除いては無血清の条件下ではそれほど成長しなかった。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０およびＣＥＬＬＧＲＯ−Ｆｒｅｅはまた、タンパク質をも含まない。これらの無血清の培地での成長は、１５％の血清を含む培地で観察される最大の成長の約２５〜３３％であった。
【実施例４】
【０１９０】
Ｄ−バリンを含む培地内での分娩後由来細胞の成長
通常のＬ−バリンのイソ型の代わりにＤ−バリンを含む培地を使用して、培養内の繊維芽様細胞の成長を選択的に阻害し得ることが報告されている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、２０００；  Ｓｏｒｄｉｌｌｏら、１９８８）。分娩後由来細胞がＤ−バリンを含む培地内で成長できるかどうか、以前には知られていなかった。
【０１９１】
方法および材料
胎盤由来細胞（Ｐ３）と、繊維芽細胞（Ｐ９）と、臍帯由来細胞（Ｐ５）は、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）に５×１０３細胞／ｃｍ２で播種された。２４時間後、培地が取り除かれ、前記細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄し、残余の培地を取り除いた。前記培地は、改変成長培地（Ｄ−バリン（Ｇｉｂｃｏ、特別注文）、１５％（ｖ／ｖ）の透析済みウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）のベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ）に取り替えられた。
【０１９２】
結果
Ｄ−バリンを含む培地に播種された、胎盤由来細胞と、臍帯由来細胞と、繊維芽細胞は、透析済み血清を含む成長培地に播種された細胞とは違って、増殖しなかった。繊維芽細胞は形態的に変化し、より大きく、形態が異なっていた。４週間後には、すべての細胞が死んで、最終的には前記フラスコの表面から剥離した。これらの結果は、Ｄ−バリンを含む培地は、分娩後由来細胞を選択的に増殖するのに適していないことを示している。
【０１９３】
実施例４の参考文献
１）Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ  Ｊ．２０００．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．２４：１〜７．
２）Ｓｏｒｄｉｌｌｏ  ＬＭ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＳＰ，Ａｋｅｒｓ  ＲＭ．  １９８８）．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  Ｒｅｐ．１２：３５５〜６４．
【実施例５】
【０１９４】
胎盤由来細胞用の冷凍保存培地
胎盤由来細胞の冷凍保存用の冷凍保存培地が評価された。
【０１９５】
方法および材料
ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ内で成長培地で成長された胎盤由来細胞はＰＢＳで洗浄され、１ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してトリプシン処理された。前記トリプシン処理は、１０ミリリットルの成長培地を加えることによって停止された。前記細胞は１５０ｘｇで遠心され、その上清が取り除かれ、その細胞沈殿物は１ミリリットルの成長培地中に再懸濁された。一定量の細胞懸濁液（６０マイクロリットル）が取り除かれ、６０マイクロリットルのトリパンブルー液（Ｓｉｇｍａ）に加えられた。生細胞数が、血球計算板を用いて推定された。前記細胞懸濁液は、各一定量が８８×１０４の細胞を含むように、４つの一定量に分割された。前記細胞懸濁液は遠心され、１ミリリットルの以下の各培地に懸濁され、クライオバイアル（ナルゲン社）に移された。
【０１９６】
１．）成長培地＋１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）
２．）細胞凍結培地（ＤＭＳＯおよびメチルセルロースを含む、無血清）（Ｃ６２９５、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）
３．）無血清細胞凍結培地（Ｃ２６３９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）
４．）細胞凍結培地（グリセロールを含む）（Ｃ６０３９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）
【０１９７】
前記細胞は、１つの「Ｍｒ  Ｆｒｏｓｔｙ」冷凍容器を、その製造業者の使用説明書（ナルゲン社、ニューヨーク州ロチェスター）に従って使用し、−８０℃の冷凍庫内で、一晩、約−１℃／分で冷凍された。細胞のバイアルは、２日間液体窒素に移した後、３７℃の水槽内で急速に解凍した。前記細胞は、１０ミリリットルの成長培地に加えて遠心した後に、前記細胞の細胞数および生存能力が推定された。前記細胞が接着して増殖するかどうかを決定するために、前記細胞は、ゼラチンコーティングされたフラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。
【０１９８】
結果
冷凍保存される前記細胞の初期生存能力は、トリパンブルー染色によって、１００％であることが評価された。冷凍保存される前記細胞の初期生存能力は、トリパンブルー染色によって、１００％であることが評価された。
【０１９９】
Ｃ６２９５に関する生存能力については、細胞溶解のため、細胞数に比例する減少があった。４種類の溶液のすべてで冷凍保存された生存細胞は、接着して分裂し、３日以内にコンフルエントの単層を形成した。推定された成長速度に認識可能な差はなかった。
【０２００】
要約
細胞の冷凍保存は、細胞バンクまたは細胞製品の準備に利用できる１つの処理である。４種類の冷凍保存混合液が、ヒトの胎盤由来細胞を冷凍による損傷から防護する能力に関して比較された。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、胎盤由来細胞の冷凍保存で比較された培地の中で好適な培地である。
【実施例６】
【０２０１】
分娩後由来細胞の核型分析
細胞治療で使用される細胞株は、好適には均一で、混在する細胞タイプを含まない。細胞治療で使用される細胞は、正常の染色体数（４６）および構造を有するべきである。胎盤由来細胞株および臍帯由来細胞株が、均一であって、分娩後組織以外の由来の細胞を含まないことを同定するために、細胞標本の核型が分析された。
【０２０２】
材料および方法
男子の新生児の分娩後組織からのＰＰＤＣが、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地で培養された。男子の新生児（Ｘ、Ｙ）からの分娩後組織が選択されたため、新生児由来細胞および母性由来細胞（Ｘ、Ｘ）の間の区別を可能にした。細胞は、Ｔ２５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）内で、成長培地で５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、８０％のコンフルエントまで増殖された。細胞を含むＴ２５フラスコは、首部まで成長培地で満たされた。標本は、臨床細胞遺伝学研究室まで配達業者によって配達された（両研究室の間の推定輸送時間は１時間である）。細胞は、染色体の視覚化が最適である中期の間に分析された。中期にあった２０細胞の内、５つの細胞が、正常の均一な核型数（２）に関して分析された。２つの核型が観察された場合は、細胞標本は均一として特徴付けられた。２つ以上の核型が観察された場合は、細胞標本は不均一として特徴付けられた。不均一な核型（４）が同定されたときは、追加の中期の細胞が分析された。
【０２０３】
結果
染色体分析に送られた全細胞標本は、正常の外観を示すと判断された。分析された１６細胞株の内の３株が、不均一な発現型（ＸＸおよびＸＹ）を示した。これは、新生児および母性の両方の由来から由来する細胞の存在を示す（表６−１）。胎盤−Ｎの組織から由来する細胞は、胎盤の新生児側から単離された。継代０では、この細胞株は均一（ＸＹ）であるようであった。しかし、継代９で、前記細胞株は不均一（ＸＸ／ＸＹ）であった。これは、以前に検出できなかった、母性を由来とする細胞の存在を意味する。
【０２０４】
【表６】
2007528703.tif 000007
【０２０５】
要約
染色体分析は、胎盤由来細胞および臍帯由来細胞を同定し、その核型は、臨床細胞遺伝学研究室によって解釈されたところでは、正常のようであった。核型分析はまた、母性細胞のない細胞株を同定したが、これは、均一な核型によって決定された。
【実施例７】
【０２０６】
フローサイトメトリーによるヒト分娩後由来細胞表面マーカーの評価
細胞表面タンパク質、すなわち「マーカー」、のフローサイトメトリーによる特徴付けを使用して、細胞株の特定性を決定し得る。発現の一貫性は、複数のドナーから決定されることができ、また異なる処理および培養の条件に曝露された細胞で決定され得る。胎盤および臍帯から単離された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）株は、（フローサイトメトリーによって）特徴付けられ、これらの細胞株の同定のための特徴を提供する。
【０２０７】
材料および方法
培地および培養容器
細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）内で培養された。細胞は、血漿で処理された、Ｔ７５とＴ１５０とＴ２２５の組織培養フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）内でコンフルエントになるまで培養された。前記フラスコの成長表面は、２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を室温で２０分間インキュベートすることによって、ゼラチンコーティングされた。
【０２０８】
抗体染色およびフローサイトメトリー分析
フラスコ内の接着細胞は、ＰＢＳで洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで剥がされた。細胞は集められ、遠心され、細胞の濃度が１ミリリットル当たり１×１０７になるように、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＰＢＳ中に懸濁された。目的の細胞表面マーカー（下記を参考）に対する抗体を、その製造業者の仕様に従って、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加えられ、その混合液は、４℃で３０分間、暗室でインキュベートされた。インキュベートの後、細胞はＰＢＳで洗浄され、結合していない抗体を除くために遠心された。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳに懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホゼ）で行われた。
【０２０９】
以下の細胞表面マーカーに対する抗体が使用された。
【０２１０】
【表７】
2007528703.tif 000008
【０２１１】
胎盤および臍帯の比較
継代８で、胎盤由来細胞が臍帯由来細胞と比較された。
【０２１２】
継代別の比較
胎盤由来細胞および臍帯由来細胞が、８と１５と２０の継代で分析された。
【０２１３】
ドナーとドナーの比較
ドナー別の比較ドナーの中での差を比較するために、異なるドナーからの胎盤由来細胞が互いに比較され、また異なるドナーからの臍帯由来細胞が互いに比較された。
【０２１４】
表面コーティングの比較
ゼラチンコーティングされたフラスコ上で培養された胎盤由来細胞が、コーティングされていないフラスコ上で培養された胎盤由来細胞と比較された。ゼラチンコーティングされたフラスコ上で培養された臍帯由来細胞が、コーティングされていないフラスコ上で培養された臍帯由来細胞と比較された。
【０２１５】
消化酵素の比較
細胞の単離および調製に使用された４種類の処理が比較された。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、および４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼ、で処理された、胎盤から単離された細胞が比較された。
【０２１６】
胎盤層の比較
胎盤組織の母側から由来する細胞は、胎盤組織の絨毛域から由来する細胞および胎盤の新生児側から由来する細胞と比較された。
【０２１７】
結果
胎盤と臍帯の比較
フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞および臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性の発現を示したが、これはＩｇＧのコントロールに比較して上昇した蛍光値によって示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現で陰性であったが、これはＩｇＧのコントロールに比較して蛍光値によって示された。陽性のカーブの蛍光値の変動は説明が付けられた。前記陽性カーブの平均（すなわち、ＣＤ１３）および範囲（すなわち、ＣＤ９０）がいくらかの変動を示したが、前記カーブは正常のようであり、均一な集団であることを確認した。両方のカーブは個々に、ＩｇＧコントロールより大きな値を示した。
【０２１８】
継代別の比較−胎盤由来細胞
ＩｇＧのコントロールに比較して上昇した値によって反映されたように、フローサイトメトリーで分析された８と１５と２０の継代の胎盤由来細胞はすべて、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現で陽性であった。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現で陰性であり、これらの発現はＩｇＧのコントロールと一致した蛍光値を有していた。
【０２１９】
継代別の比較−臍帯由来細胞
ＩｇＧのコントロールに比較して上昇した値によって反映されたように、フローサイトメトリーで分析された、８と１５と２０の継代の臍帯由来細胞はすべて、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱで陰性であったが、これはＩｇＧのコントロールと一致する蛍光値によって示された。
【０２２０】
ドナー別の比較−胎盤由来細胞
ＩｇＧのコントロールに比較して上昇した蛍光値によって示されたように、別のドナーから単離され、フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。ＩｇＧのコントロールと一致した蛍光値によって示唆されたように、これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であった。
【０２２１】
ドナー別の比較−臍帯由来細胞
別のドナーから単離され、フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性の発現を示し、これらはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値によって反映された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であり、ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値を有していた。
【０２２２】
ゼラチンでの表面コーティングの胎盤由来細胞への影響
ゼラチンコーティングされたフラスコ、またはゼラチンコーティングされていないフラスコ上で増殖された胎盤由来細胞が、フローサイトメトリーで分析され、すべてはＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していたが、これらはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値によって反映された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であったが、これは、ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値によって示された。
【０２２３】
ゼラチンでの表面コーティングの臍帯由来細胞への影響
ゼラチンコーティングされたフラスコ、またはコーティングされていないフラスコ上で増殖された臍帯由来細胞が、フローサイトメトリーで分析され、すべてはＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現で陽性であったが、これらはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であり、ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値を有していた。
【０２２４】
前記細胞の調製に使用される酵素消化処理の、前記細胞表面マーカーのプロフィールへの効果
種々の消化酵素を用いて単離された胎盤由来細胞が、フローサイトメトリーで分析され、すべてはＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現したが、これは、ＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値によって示された。ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値によって示されたように、これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であった。
【０２２５】
胎盤層の比較
前記胎盤の母性層、絨毛層、新生児側層から単離された細胞が、それぞれ、フローサイトメトリーで分析され、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性の発現を示したが、これはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値によって示された。ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値によって示されたように、これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であった。
【０２２６】
要約
フローサイトメトリーによる胎盤由来細胞および臍帯由来細胞の分析は、これらの細胞株の特定性を確立した。胎盤由来細胞および臍帯由来細胞は、ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対し陽性であり、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対し陰性である。この特定性は、ドナー、継代、培養容器の表面コーティング、消化酵素、および胎盤層を含む変数の変動の間で一貫性があった。個々の蛍光値のヒストグラムカーブの平均および範囲での程度の変動が観察されたが、検査された、すべての条件下でのすべての陽性カーブは正常であり、前記ＩｇＧコントロールより高い蛍光値を発現し、したがって前記細胞は、前記マーカーの陽性の発現を有する均一な集団を含むことを確証した。
【実施例８】
【０２２７】
分娩後組織発現型の免疫組織化学的特徴付け
ヒトの分娩後組織、すなわち臍帯および胎盤の中に見つけられる細胞の発現型が免疫組織化学によって分析された。
【０２２８】
方法および材料
組織の調製ヒトの臍帯組織および胎盤組織は、収集され、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドで一晩、４℃で固定された。次のエピトープに対する抗体を用いて免疫組織化学が行われた。それらは、ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、デスミン（１：１５０、ウサギに対する抗体、Ｓｉｇｍａ、または１：３００、マウスに対する抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、アルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ、１：４００、Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８、１：４００、Ｓｉｇｍａ）、フォンウィルブラント因子（ｖＷＦ、１：２００、Ｓｉｇｍａ）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４、クラスＩＩＩ、１：１００、ダコサイトメーション社、カリフォルニア州カーピンテリア）、である。さらに、以下のマーカーがテストされた。それらは、抗ヒトＧＲＯａｌｐｈａ−ＰＥ（１：１００、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレークス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、１：１００、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。固定された標本は、外科用メスで切り取られ、エタノールを含むドライアイス槽の上でＯＣＴ包埋剤（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ，Ｓａｋｕｒａ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，カリフォルニア州）内に置かれた。凍結ブロックは、標準的クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて切片（１０μｍの厚さ）に切られた。
【０２２９】
免疫組織化学
免疫組織化学は、以前の研究（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａら、２００３，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：８１６〜８２９）に類似した方法で行われた。組織切片はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質ブロッキング溶液に１時間に曝し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。目的の前記エピトープが細胞表面上に位置するであろう場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）は、エピトープの損失を避けるために、トライトンが前記手順の全ステップで省略された。さらに、前記１次抗体がヤギに対して作られた場合（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）は、前記手順を通してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体は、室温で４時間、前記切片に適用された。１次抗体溶液が取り除かれ、ＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用された。
【０２３０】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落斜型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）上で適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を視覚化した。陽性の染色は、コントロール染色より高い蛍光シグナルによって表される。代表的な画像が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。
【０２３１】
結果
臍帯の特徴付け
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４のマーカーは、臍帯内に見つけられる細胞の一部の細胞で発現されていた。特に、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は、前記臍帯内に含まれる血管に限られていた。ＣＤ３４＋細胞は、最も内側の層（内腔側）にあった。ビメンチンの発現は、前記臍帯の基質および血管に見つけられた。ＳＭＡは、前記基質と、動脈および静脈の外壁に限られていたが、前記血管自体には含まれていなかった。ＣＫ１８およびデスミンは前記血管内にのみ観察され、デスミンは中層と外層に限られていた。
【０２３２】
胎盤の特徴付け
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４はすべて、胎盤内に見つけられ、領域的に特異的であった。
【０２３３】
ＧＲＯａｌｐｈａ、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、およびＮＯＧＯ−Ａの組織発現
これらのマーカーのいずれも、臍帯組織または胎盤組織内で観察されなかった。
【０２３４】
要約
ビメンチン、デスミン、アルファ−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォンウィルブラント因子、およびＣＤ３４は、ヒトの臍帯および胎盤内の細胞で発現されている。
【実施例９】
【０２３５】
オリゴヌクレオチド・アレイを用いた分娩後組織由来細胞の分析
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧＥＮＥＣＨＩＰアレイを使用して、臍帯由来細胞および胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールが、繊維芽細胞およびヒトの間葉系幹細胞と、ヒト骨髄から由来する別の細胞株とで比較された。この分析は、前記分娩後由来細胞の特徴付けを提供し、これらの細胞に対するユニークな分子マーカーを同定した。
【０２３６】
材料および方法
細胞の単離および培養
ヒトの臍帯および胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から、患者の承諾を得て、正常の満期出産から取得された。実施例１に記載されたように、これらの組織は受け取られ、細胞が単離された。細胞は、ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチック製フラスコで、成長培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ）内で培養された。前記細胞は、５％のＣＯ２下で３７℃でインキュベートされた。
【０２３７】
ヒトの皮膚繊維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウオーカーズビル、ロット番号：９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入された。両方の細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）内で培養された。前記細胞は、標準的な組織処理されたプラスチック上で成長された。
【０２３８】
ヒトの間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウオーカーズビル、ロット番号：２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６および２Ｆ１６５７）から購入され、ＭＳＣＧＭ培地内で前記製造業者の仕様に従って培養された。前記細胞は、５％のＣＯ２下で３７℃で、標準的な組織培養のプラスチック上で成長された。
【０２３９】
ヒトの腸骨稜骨髄は、患者の承諾を得て、ＮＤＲＩから受け取った。前記骨髄は、Ｈｏら（ＷＯ０３／０２５１４９）によって概説された方法に従って処理された。前記骨髄は溶解バッファー（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と混合されたが、これは、前記骨髄と前記溶解バッファーが１：２０の比で混合された。前記細胞懸濁液はボルテックスにかけられ、室温で２分間インキュベートされ、５００ｘｇで１０分間遠心された。その上清は廃棄され、その細胞沈殿物は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清および４ｍＭのグルタミンを添加された最小必須培地−アルファ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−ａｌｐｈａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁された。前記細胞は再び遠心され、その細胞沈殿物は新鮮な培地に再懸濁された。トリパンブルー排除法（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を使用して、生存可能な単核細胞が計数された。前記単核細胞は、５×１０４細胞／ｃｍ２で、組織培養のプラスチック製フラスコ上に播種された。前記細胞は、標準大気のＯ２、または５％のＯ２で、５％のＣＯ２下で３７℃でインキュベートされた。細胞は、培地を交換せずに５日間培養された。培地および非接着細胞は、５日の培養後、取り除かれた。その接着細胞は培養内で維持された。
【０２４０】
ｍＲＮＡの単離およびＧＥＮＥＣＨＩＰ分析
活動的に成長している培養の細胞が、冷やしたＰＢＳ中で、セルスクレーパーを用いて、前記フラスコから取り除かれた。前記細胞は、３００ｘｇで５分間遠心され、その上清が除かれ、その細胞は新鮮なＰＢＳ中に再懸濁され、再び遠心された。その上清が取り除かれ、その細胞沈殿物はすぐに冷凍され、−８０℃で保存された。細胞性ｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに転写され、このｃＤＮＡはｃＲＮＡおよびビオチン標識に転写された。前記ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＨＧ−Ｕ１３３ＡＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）とハイブリダイゼーションされた。前記ハイブリダイゼーションおよびデータ収集は、前記製造業者の仕様に従って行われた。分析は、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ；  Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５１１６〜５１２１）を用いて行われた。
【０２４１】
結果
１４の異なる細胞集団が分析された。表９−１に細胞、継代データ、培養基質、および培養培地がリストされている。
【０２４２】
【表８】
2007528703.tif 000009
【０２４３】
前記データは主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）によって評価され、前記細胞で差次的に発現された２９０の遺伝子が分析された。この分析は、前記集団の間の類似性の相対比較を可能にする。表９−２は、細胞の対の比較で計算されたユークリッド距離を示す。前記ユークリッド距離は、前記細胞の比較に基づいていたが、この比較は前記細胞タイプの間で差次的に発現された２９０の遺伝子に基づく。前記ユークリッド距離は、前記２９０遺伝子の発現の間の類似性に逆比例する（すなわち、その距離が長いほど、類似性は少ない）。
【０２４４】
【表９】
2007528703.tif 000010
【０２４５】
表９−３、表９−４、および表９−５は、胎盤由来細胞で増加した遺伝子発現（表９−３）、臍帯由来細胞で増加した遺伝子発現（表９−４）、および、胎盤由来細胞および臍帯由来細胞で減少した遺伝子発現（表９−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と題された列は、前記チップ上の特定の部位に位置する、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブのセットに対する、製造業者の同定コードを意味するが、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、命名された遺伝子（「遺伝子名」列）にハイブリダイゼーションし、このような遺伝子はＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データ−ベース内の特定の受入れ番号（「ＮＣＢＩ受入れ番号」列）に見つけられる配列を含む。
【０２４６】
【表１０】
2007528703.tif 000011
【０２４７】
【表１１】
2007528703.tif 000012
【０２４８】
【表１２−１】
2007528703.tif 000013
【０２４９】
【表１２−２】
2007528703.tif 000014
【０２５０】
表９−６、表９−７、および９−８は、ヒト線維芽細胞（表９−６）、ＩＣＢＭ細胞（表９−７）、およびＭＳＣｓ（表９−８）において増加した遺伝子の発現を示している。
【０２５１】
【表１３】
2007528703.tif 000015
【０２５２】
【表１４】
2007528703.tif 000016
【０２５３】
【表１５】
2007528703.tif 000017
【０２５４】
要約
この検査は、臍帯および胎盤に由来する分娩後細胞の分子的特徴付けを提供するために行われた。この分析には、３種類の異なる臍帯、および３種類の異なる胎盤から由来する細胞が含まれた。この検査にはまた、異なる２株の皮膚繊維芽細胞、３株の間葉系幹細胞、および３株の腸骨稜骨髄細胞が含まれた。これらの細胞によって発現されたｍＲＮＡは、２２，０００の遺伝子に対するプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを用いて分析された。結果は、５種類の異なる細胞タイプで２９０の遺伝子が差次的に発現されている。これらの遺伝子には、前記胎盤由来細胞で特異的に増加されている１０の遺伝子と、前記臍帯由来細胞で特異的に増加した７つの遺伝子が含まれる。５４の遺伝子は、他の細胞タイプと比較して、胎盤および臍帯で特異的に低いレベルの発現を有することが発見された。選択された遺伝子の発現はＰＣＲによって確認されている（以下の実施例を参照）。これらの結果は、前記分娩後由来細胞が、例えば、骨髄由来細胞および繊維芽細胞と比較して、特有の遺伝子発現プロフィールを有することを実証している。
【実施例１０】
【０２５５】
分娩後由来細胞の細胞マーカー
上記の実施例では、ヒトの胎盤およびヒトの臍帯から由来する細胞での類似性および差が、その遺伝子発現を他の由来から由来する細胞の遺伝子発現と比較すること（オリゴヌクレオチドアレイを用いて）によって評価された。６つの「サイン」遺伝子が同定された。それらは、酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン‐８、レニン、レチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、および顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）である。これらの「サイン」遺伝子は、分娩後由来細胞で比較的高レベルで発現された。
【０２５６】
この実施例で記載される手順は、前記マイクロアレイのデータを確かめるために、遺伝子発現とタンパク質発現の一致／不一致を見つけるために、また、胎盤由来細胞および臍帯由来細胞に対するユニークな識別体の検出用に一連の信頼性のおけるアレイを確立するために、行われた。
【０２５７】
方法および材料
細胞
胎盤由来細胞（３つの単離株、主に新生児系（核型分析によって同定）の１つの単離株を含む）、臍帯由来細胞（４つの単離株）、および正常のヒト皮膚繊維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）：（ＮＨＤＦ、新生児および成人）が、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコで、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地内で成長された。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉系幹細胞成長培地キット（ＭＳＣＧＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ウオーカーズビル）で成長された。
【０２５８】
ＩＬ−８のプロトコールでは、細胞は液体窒素から解凍され、ゼラチンコーティングされたフラスコに５，０００細胞／ｃｍ２でプレーティングされ、成長培地内で４８時間成長され、その後、１０ミリリットルの血清飢餓培地［低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、および０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡＳｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）］でさらに８時間成長された。この処置後、ＲＮＡが抽出され、細胞の残渣を除くためにその上清が１５０ｘｇで５分間遠心された。ＥＬＩＳＡ分析用に上清が−８０℃で冷凍された。
【０２５９】
ＥＬＩＳＡアッセイ用の細胞培養
胎盤および臍帯からの分娩後由来細胞、並びにヒト新生児の包皮から由来するヒト繊維芽細胞は、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ上で成長培地で培養された。細胞は、継代１１で液体窒素で冷凍保存された。細胞は解凍され、１５ミリリットル遠心管に移された。１５０ｘｇで５分間遠心された後、その上清が廃棄された。細胞は４ミリリットルの培養培地に再懸濁され、計数された。細胞は、１５ミリリットルの成長培地を含む７５ｃｍ２フラスコで、３７５，０００細胞／フラスコの密度で２４時間成長された。前記培地は血清飢餓培地に８時間取り替えられた。血清飢餓培地はインキュベートの終了時に収集され、１４，０００ｘｇで５分間遠心された（−２０℃で保管）。
【０２６０】
各フラスコ内の細胞数を推定するために、各フラスコに２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）が加えられた。細胞が前記フラスコから剥がれた後、トリプシン活性は８ミリリットルの成長培地で無効化された。細胞は１５ミリリットルの遠心管に移され、１５０ｘｇで５分間、遠心された。その上清が除去され、１ミリリットルの成長培地を各遠心管に加えて前記細胞が再懸濁された。血球計算板を用いて細胞数が推定された。
【０２６１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
前記細胞が血清飢餓培地に分泌したＩＬ−８量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）で分析された。すべてのアッセイは、前記製造業者が提供した使用説明書に従って行われた。
【０２６２】
総ＲＮＡの単離
ＲＮＡはコンフルエントの分娩後由来細胞および繊維芽細胞から抽出され、またＩＬ−８発現用ＲＮＡは上記のように処理された細胞から抽出された。細胞は、ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含む３５０マイクロリットルのバッファーＲＬＴで溶解されたが、これは前記製造会社（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）の使用説明書に従って行われた。ＲＮＡは、製造会社（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）の使用説明書に従って抽出され、デオキシリボヌクレアーゼ処理（２．７ユニット／サンプル）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）された。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保管された。
【０２６３】
逆転写
ＲＮＡはまた、ヒトの胎盤および臍帯からも抽出された。組織（３０ミリグラム）は、２−メルカプトエタノールを含む、７００マイクロリットルのバッファーＲＬＴに懸濁された。標本は機械的にホモジナイズされ、ＲＮＡ抽出は製造会社の仕様に従って行われた。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保管された。ＲＮＡは、２５℃で１０分間と、３７℃で６０分間と、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）でランダム六量体を用いて逆転写された。標本は−２０℃で保管された。
【０２６４】
ｃＤＮＡマイクロアレイによって、分娩後由来細胞内でユニークに制御されていると同定された遺伝子（サイン遺伝子−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン、およびレチキュロン）は、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを用いてさらに検査された。
【０２６５】
リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）遺伝子発現製品を用いてｃＤＮＡ標本に行われた。それらは、酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）である。ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）がｃＤＮＡとＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスと混合され、これは製造業者の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）に従って、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）付きの７０００シークエンス・ディテクション・システムを用いて行われた。熱サイクル条件は、最初５０℃で２分間および９５℃で１０分間、その後、４０回の、９５℃で１５秒および６０℃で１分間であった。ＰＣＲデータは製造会社の仕様（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００シークエンス・ディテクション・システム用のアプライドバイオシステムズからのユーザー用広報Ｎｏ．２）に従って分析された。
【０２６６】
従来のＰＣＲ
従来のＰＣＲは、前記リアルタイムＰＣＲからの結果を確認するために、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて行われた。ＰＣＲは、２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応バッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）および９４℃で５分間の初期の変性を用いて行われた。増殖は各プライマーセットで最適化された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレチキュロンには、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３０回、レニンには、９４℃で１５秒、５３℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３８回、酸化ＬＤＬ受容体およびＧＡＰＤＨには、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間、を３３回。表１に増殖に使用されたプライマーがリストされている。最終的なＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、ＧＡＰＤＨ以外は１マイクロモルであった。ＧＡＰＤＨは０．５マイクロモルであった。ＧＡＰＤＨプライマーは、製造業者のＴａｑＭａｎプローブが最終的なＰＣＲ反応に加えられなかった以外は、前記リアルタイムＰＣＲと同一であった。標本は２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで泳動され、エチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で染色された。焦点長ポラロイドカメラ（ＶＷＲインターナショナル、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて、６６７ユニバーサル・ツインパック・フィルム（ＶＷＲインターナショナル、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて、画像が取られた。
【０２６７】
【表１６】
2007528703.tif 000018
【０２６８】
免疫蛍光
ＰＰＤＣは、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で、室温で１０分間固定された。継代０（Ｐ０）（単離後直接に）および継代１１（Ｐ１１）にある、臍帯由来細胞および胎盤由来細胞のそれぞれの１単離株（２単離株の胎盤由来細胞株、２単離株の臍帯由来細胞株）、および繊維芽細胞（Ｐ１１）が使用された。次のエピトープに対する抗体を用いて免疫細胞化学が行われた。それらは、ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、デスミン（１：１５０、Ｓｉｇｍａ、ウサギに対する抗体、または１：３００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ、マウスに対する抗体）、アルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ、１：４００、Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８、１：４００、Ｓｉｇｍａ）、フォンウィルブラント因子（ｖＷＦ、１：２００、Ｓｉｇｍａ）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４、クラスＩＩＩ、１：１００、ダコサイトメーション社、カリフォルニア州カーピンテリア）、である。さらに、以下のマーカーが継代１１の分娩由来細胞にテストされた。それらは、抗ヒトＧＲＯａｌｐｈａ−ＰＥ（１：１００、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレークス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、１：１００、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。
【０２６９】
培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。目的の前記エピトープが細胞表面上に位置した場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）は、エピトープの損失を避けるために、トライトンＸ‐１００が前記手順の全ステップで省略された。さらに、前記１次抗体がヤギに対して作られた場合（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）は、前記手順を通してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体は、室温で１時間、前記培養に適用された。前記１次抗体溶液が取り除かれ、前記培養がＰＢＳで洗浄されてから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用された。
【０２７０】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落斜型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク市メルビル）上で適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、陽性の染色は、コントロール染色より高い蛍光シグナルによって表されるが、ここで、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。
【０２７１】
ＦＡＣＳ分析用の細胞の調製
フラスコ内の接着細胞は、リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で剥がされた。細胞は集められ、遠心され、細胞の濃度がミリリットル当たり１×１０７になるように、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＰＢＳ中に懸濁された。１００マイクロリットルの一定量がコニカルチューブに移された。細胞内抗原のために染色される細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）で透過処理された。製造会社の仕様にしたがって抗体を一定量で加え、前記細胞は暗所に４℃で３０分間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞はＰＢＳで洗浄され、余分の抗体を除くために遠心された。２次抗体を必要とする細胞は、１００マイクロリットルの３％のＦＢＳに再懸濁された。製造会社の仕様にしたがって２次抗体が加えられ、前記細胞は暗所に４℃で３０分間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞はＰＢＳで洗浄され、余分の２次抗体を除くために遠心された。洗浄された細胞は０．５ミリリットルのＰＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。以下の抗体が使用された。それらは、酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、マウスＩｇＧ１カッパ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ヤギＩｇＧに対するロバ抗体（ｓｃ−３７４３、Ｓｕｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、である。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホゼ）で行われた。
【０２７２】
結果
ヒト胎盤に由来する細胞、成人および新生児の繊維芽細胞、および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのｃＤＮＡで行われた選択「サイン」遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲの結果は、酸化ＬＤＬ受容体およびレニンの両者が、他の細胞に比べ前期胎盤由来細胞で高レベルに発現されていたことを示す。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ法で分析され、対数目盛で表された。レチキュロンおよび酸化ＬＤＬ受容体の発現レベルは、他の細胞に比べ臍帯由来細胞で高かった。ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルでは、分娩後由来細胞およびコントロールの間で有意な差は見つけられなかった。リアルタイムＰＣＲの結果は従来のＰＣＲにより確認された。ＰＣＲ産物の配列決定はさらに、これらの観察結果を確認した。ＣＸＣリガンド３の発現レベルは、従来のＰＣＲ  ＣＸＣリガンド３プライマーを使用したコントロール群と分娩後由来細胞の間で有意な差は見つけられなかった。
【０２７３】
分娩後でサイトカイン、ＩＬ−８の産生が、成長培地で培養された分娩後由来細胞および血清飢餓の分娩後由来細胞の両方で上昇していた。リアルタイムＰＣＲのデータはすべて、従来のＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列決定によって確認された。
【０２７４】
無血清培地で成長された細胞の上清がＩＬ−８の存在に関して検査されたとき、最も高い量は、臍帯細胞、および胎盤細胞のいくつかの単離株から由来する培地内に検出された（表１０−１）。ＩＬ−８は、ヒト皮膚繊維芽細胞から由来する培地には検出されなかった。
【０２７５】
【表１７】
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【０２７６】
胎盤由来細胞はまた、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、およびＧＲＯアルファの産生についてＦＡＣＳ分析によって検査された。テストされた細胞はＧＣＰ−２に陽性であった。酸化ＬＤＬ受容体およびＧＲＯはこの方法では検出されなかった。
【０２７７】
胎盤由来細胞はまた、選択されたタンパク質の産生について、免疫細胞化学分析によって検査された。単離後すぐに（継代０）、ヒト胎盤から由来する細胞が４％パラホルムアルデヒドで固定され、６種類のタンパク質（フォンウィルブラント因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、アルファ平滑筋アクチン、ビメンチン）に対する抗体に曝された。細胞は、アルファ平滑筋アクチンおよびビメンチンに対し陽性に染色された。このパターンは継代１１まで保たれた。継代０では２〜３の細胞（５％未満）のみがサイトケラチン１８に陽性に染色された。
【０２７８】
ヒト胎盤から由来する細胞が継代０で、選択されたタンパク質の産生について、免疫細胞化学分析によって検査された。単離後すぐに（継代０）、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定され、６種類のタンパク質（フォンウィルブラント因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、アルファ平滑筋アクチン、ビメンチン）に対する抗体に曝された。胎盤由来細胞は、アルファ平滑筋アクチンおよびビメンチンに対し陽性であり、その染色パターンは継代１１まで一貫していた。
【０２７９】
要約
マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイムおよび従来の両方）で測定された遺伝子発現レベルの間での一致性が、４つの遺伝子、酸化ＬＤＬ受容体１、レニン、レチキュロン、およびＩＬ−８で確立された。これらの遺伝子の発現は、ＰＰＤＣのｍＲＮＡレベルで差次的に調節されており、ＩＬ−８はタンパク質レベルでも差次的に調節されていた。酸化ＬＤＬ受容体の存在は、胎盤から由来する細胞では、ＦＡＣＳ分析によるタンパク質レベルで検出されなかった。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の差次的発現は、ｍＲＮＡレベルで確認できなかったが、ＧＣＰ−２は胎盤由来細胞で、ＦＡＣＳ分析によるタンパク質レベルで検出された。この結果は、前記マイクロアレイ実験から最初得られたデータに反映されえいないが、これは前記方法の感度の差による可能性がある。
【０２８０】
単離後すぐに（継代０）、ヒト胎盤から由来する細胞は、アルファ平滑筋アクチンおよびビメンチンの両方に陽性に染色された。このパターンはまた、継代１１の細胞でも観察された。これらの結果は、ビメンチンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現が、成長培地で、およびこれらの処理で利用された条件下で、継代と共に細胞内で保たれている可能性があることを示唆する。ヒト胎盤から由来する細胞が継代０で、ビメンチンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現について検査され、両方で陽性であった。この染色パターンは継代１１まで保たれていた。
【実施例１１】
【０２８１】
分娩後由来細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫学的評価
分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植の際に誘導するであろう免疫学的応答を予測する試みとして、これらの細胞の免疫学的特徴がｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価された。ＰＰＤＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の存在下でフローサイトメトリーで分析された。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の直接の刺激に必要である（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第５版（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ（フィラデルフィア）、１７１ページ）。前記細胞株はまた、ＨＬＡ−Ｇ（前述のＡｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ、２００３、Ｓｕｐｒａ．）、ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓら、（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５〜１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（前述のＡｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ、２００３、Ｓｕｐｒａ．、Ｂｒｏｗｎら、（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０，１２５７〜１２６６）の発現についてフローサイトメトリーによって分析された。胎盤組織内に存在する細胞による、これらのタンパク質の発現は、ｉｎ  ｕｔｅｒｏ（胎内）で胎盤組織塁の免疫特権的（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）ステータスを仲介すると考えられる。胎盤由来細胞株および臍帯由来細胞株がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を誘導する程度を推定するために、前記細胞株が一方向（ｏｎｅ−ｗａｙ）法のリンパ球混合反応（ＭＬＲ）で検査された。
【０２８２】
材料および方法
細胞の培養
細胞は、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でコーティングされたＴ７５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）で、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地にコンフルエントまで培養された。
【０２８３】
抗体染色
細胞は、リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で剥がされた。細胞は集められ、遠心され、細胞の濃度がミリリットル当たり１×１０７になるように、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＰＢＳ中に懸濁された。製造会社の仕様にしたがって、抗体（表１１−１）が１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加えられ、暗所に４℃で３０分間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞はＰＢＳで洗浄され、結合していない抗体を除くために遠心された。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホゼ）を用いてフローサイトメトリー分析が行われた。
【０２８４】
【表１８】
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【０２８５】
リンパ球混合反応
細胞株Ａとしてラベルされた継代１０の臍帯由来細胞、および、細胞株Ｂとしてラベルされた継代１１の胎盤由来細胞の冷凍保存されたバイアルがドライアイス上に置かれて、ＣＴＢＲ（ケベック州Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ）に送られ、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いてリンパ球混合反応を行った。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は複数の男女ドナー志願者から収集された。刺激性（ドナー）同種異型ＰＢＭＣ、自己ＰＢＭＣ、および分娩後細胞株はマイトマイシンＣで処理された。自己細胞およびマイトマイシンＣ処理済み刺激性細胞が、応答性（受容者）ＰＢＭＣに加えられ、４日間培養された。インキュベーション後、［３Ｈ］チミジンが各標本に加えられ、１８時間培養された。前記細胞の収集後、放射性標識されたＤＮＡが抽出され、［３Ｈ］チミジンの取り込みがシンチレーションカウンタを用いて測定された。
【０２８６】
同種異型に対する刺激係数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｏｎｏｒ：ＳＩＡＤ）が、受容者の平均増殖にマイトマイシンＣ処理済み同種異型ドナーを加えて、前記受容者のベースライン増殖で割って計算された。ＰＰＤＣの刺激係数は、受容者の平均増殖にマイトマイシンＣ処理済み分娩後細胞株を加えて、前記受容者のベースライン増殖で割って計算された。
【０２８７】
結果
リンパ球混合反応−胎盤由来細胞
１人の同種異型のドナーを同定するために、７人のドナー志願者の血液がスクリーニングされた。その１人のドナーは、他の６人のドナーの血液とのリンパ球混合反応で強い増殖応答を示すはずである。このドナーが同種異型の陽性コントロールドナーとして選択された。残りの６人の血液ドナーは受容者として選択された。前記同種異型の陽性コントロールドナーおよび胎盤由来細胞株は、マイトマイシンＣで処理され、前記６人の個々の同種異型受容者とリンパ球混合反応で培養された。反応は、２細胞培養プレート（ｔｗｏ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅｓ）を用い、各プレートに３つの受容体を入れて、３回の多重検査で行われた（表１１−２）。平均の刺激計数は１．３（プレート２）から３（プレート１）の範囲であり、前記同種異型ドナーの陽性コントロールは４６．２５（プレート２）から２７９（プレート１）までの範囲であった（表１１−３）。
【０２８８】
【表１９】
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【０２８９】
【表２０】
2007528703.tif 000022
【０２９０】
【表２１】
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【０２９１】
リンパ球混合反応−臍帯由来細胞
１人の同種異型のドナーを同定するために、６人のドナー志願者の血液をスクリーニングし、この１人のドナーは、他の５人のドナーの血液とのリンパ球混合反応で強い増殖応答を示すはずである。このドナーが同種異型の陽性コントロールドナーとして選択された。残りの５人の血液ドナーは受容体として選択された。前記同種異型の陽性コントロールドナーおよび胎盤細胞株は、マイトマイシンＣで処理され、前記５人の個々の同種異型受容体とリンパ球混合反応で培養された。反応は、２細胞培養プレートを用い、各プレートに３つの受容体を入れて、３回の多重検査で行われた（表１１−４）。平均の刺激計数は６．５（プレート１）から９（プレート２）の範囲であり、前記同種異型ドナーの陽性コントロールは４２．７５（プレート１）から７０（プレート２）までの範囲であった（表１１−５）。
【０２９２】
【表２２−１】
2007528703.tif 000024
【０２９３】
【表２２−２】
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【０２９４】
【表２３】
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【０２９５】
抗原提示細胞マーカー−胎盤由来細胞
フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性の発現を示し、前記胎盤細胞株がＣＤ４＋Ｔ細胞を直接に刺激するのに必要な細胞表面分子を欠くことを示唆している。
【０２９６】
免疫調節マーカー−胎盤由来細胞
フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに比較して増加した蛍光値によって示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性の発現を示し、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性の発現を示す。
【０２９７】
抗原提示細胞マーカー−臍帯由来細胞フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性の発現を示し、前記臍帯細胞株がＣＤ４＋Ｔ細胞を直接に刺激するのに必要な細胞表面分子を欠くことを示唆している。
【０２９８】
免疫調節細胞マーカー−臍帯由来細胞
フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに比較して増加した蛍光値によって示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性の発現を示し、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性の発現を示す。
【０２９９】
要約
胎盤由来細胞株で行われたリンパ球混合反応では、平均刺激係数は１．３から３までの範囲にあり、前記同種異型陽性コントロールの平均刺激係数は４６．２５から２７９までの範囲にあった。臍帯由来細胞株で行われたリンパ球混合反応では、平均刺激係数は６．５から９までの範囲にあり、前記同種異型陽性コントロールの平均刺激係数は４２．７５から７０までの範囲にあった。胎盤由来細胞株および臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーで測定されたように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の刺激タンパク質の発現で陰性であった。胎盤由来細胞株および臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーで測定されたように、免疫調節性タンパク質のＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現で陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現で陽性であった。同種異型ドナーのＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含み、それらによって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激を可能にする。胎盤由来細胞株および臍帯由来細胞株に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を直接に刺激するために必要な抗原提示の細胞表面分子がないこと、および免疫調節製タンパク質であるＰＤ−Ｌ２が存在することは、同種異型コントロールに比較して、ＭＬＲでこれらの細胞が示した低い刺激係数を説明し得る。
【実施例１２】
【０３００】
分娩後由来細胞による栄養因子の分泌
臍帯由来細胞および胎盤由来細胞からの選択栄養因子の分泌が測定された。検出に選択された因子には、（１）血管形成活性を有することが知られる因子、例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら、（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら、（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２〜８）、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ストローマ細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、（２）神経栄養活性／神経保護的活性を有することが知られる因子、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら、（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、形質転換成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、および（３）ケモカイン活性を有することが知られる因子、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化を制御された、発現し分泌された正常Ｔ細胞）、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ（胸腺および活性−調節性ケモカイン）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８が含まれる。
【０３０１】
方法および材料
細胞の培養
胎盤および臍帯からのＰＰＤＣ、並びにヒト新生児の包皮から由来するヒト繊維芽細胞は、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ上で、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地で培養された。細胞は継代１１で冷凍保存され、液体窒素中に保管された。前記細胞を解凍した後、成長培地が前記細胞に加えられ、１５ミリリットルの遠心管に移され、１５０ｘｇで５分間遠心された。その上清が廃棄され、その細胞沈殿物は４ミリリットルの成長培地に再懸濁され、細胞が計数された。細胞は、１５ミリリットルの成長培地を含む７５ｃｍ２フラスコにつき３７５，０００細胞の割合で播種され、２4時間培養された。前記培地は、８時間の間、無血清培地（低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に取り替えられた。インキュベートの終了時に１４，０００ｘｇで５分間遠心することによって、無血清の条件培地が収集され、−２０℃で保管された。各フラスコにある細胞数を推定するために、細胞はＰＢＳで洗浄され、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を剥がした。トリプシン活性は、８ミリリットルの成長培地を加えることで阻害された。細胞は１５０Ｇで５分間、遠心された。その上清が除され、細胞は１ミリリットルの成長培地に再懸濁された。血球計算板を用いて細胞数が推定された。
【０３０２】
ＥＬＩＳＡアッセイ
細胞は、５％の二酸化炭素と大気中酸素下で３７℃で増殖させた。胎盤由来細胞（バッチ番号：１０１５０３）はまた、５％の酸素またはベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在下で増殖された。各細胞標本によって産生されるＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、およびＴＧＦ−ベータ２の量が、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）によって測定された。すべてのアッセイは、前記製造業者の使用説明書に従って行われた。
【０３０３】
サーチライト（ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ）マルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイ
ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および血管形成因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、サーチライト・プロテオームアレイ（ピアス・バイオテクノロジー社）を用いて測定された。前記プロテオームアレイは、ウェル当たり２〜１６のタンパク質の定量的測定用のマルチプレックスのサンドイッチＥＬＩＳＡである。前記アレイは、９６ウェルプレートの各ウェルに２×２、３×３、または４×４のパターンの４〜１６の異なる捕捉用抗体をスポットすることによって作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ処置の後に、前記プレートの各ウェル内の各スポットで発生される化学発光シグナルを捕獲するために、全体のプレートの画像を取得する。各スポット内で発生するシグナル量は、本来の標準または標本内の標的タンパク質の量に比例する。
【０３０４】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、胎盤由来細胞、臍帯由来細胞、および皮膚繊維芽細胞によって分泌されていた（表１２−１）。ＳＤＦ−１アルファは、５％Ｏ２で培養された胎盤由来細胞、および繊維芽細胞によって分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍帯由来細胞によって、および、ＢＭＥまたは５％のＯ２の存在下で培養された胎盤由来細胞によって、分泌されていた。ＧＣＰ−２はまた、ヒト繊維芽細胞によって分泌されていた。ＴＧＦ−ベータ２はＥＬＩＳＡアッセイによって検出されなかった。
【０３０５】
【表２４】
2007528703.tif 000027
【０３０６】
サーチライト（ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ）マルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイ
ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８が、臍帯由来細胞から分泌されていた（表１２−２および１２−３）。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８が、胎盤由来細胞から分泌されていた（表１２−２および１２−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。
【０３０７】
【表２５】
2007528703.tif 000028
【０３０８】
【表２６】
2007528703.tif 000029
【０３０９】
要約
臍帯由来細胞および胎盤由来細胞はいくつかの栄養因子を分泌していた。これらの栄養因子のいくつか、例えば、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８、は血管形成で重要な複数の役割を果たしている。他の栄養因子、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６、は神経再生で重要な複数の役割を果たしている。
【実施例１３】
【０３１０】
短期間における分娩後由来細胞の神経分化
胎盤由来細胞および臍帯由来細胞（集合的に、分娩後由来細胞またはＰＰＤＣ）が神経系統細胞に分化する能力について、検査された。
【０３１１】
方法および材料
分娩後細胞の単離および増殖
胎盤組織および臍帯組織からのＰＰＤＣは、実施例１に記載されたように、単離され、増殖された。
【０３１２】
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール
（Ａ）このアッセイは、骨髄間質細胞（１）の神経系誘導の能力を検査するために本来行われたアッセイから適応された。臍帯由来細胞（０２２８０３）Ｐ４および胎盤由来細胞（０４２２０３）Ｐ３が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖された。細胞はトリプシン処理され、ＴｉｔｒｅｔｅｋＩＩスライドグラス（ＶＷＲインターナショナル、コネチカット州ブリストル）の各ウェルごとに６，０００細胞で播種された。コントロールとして、間葉系幹細胞（Ｐ３、１Ｆ２１５５、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ウオーカーズビル）、骨芽細胞（Ｐ５、ＣＣ２５３８、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ）、脂肪由来細胞（アーテセル（Ａｒｔｅｃｅｌ）社、ＵＳ６５５５３７４  Ｂ１）（Ｐ６、ドナー２）およびヒト新生児皮膚繊維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ）もまた、同一の条件下で播種された。
【０３１３】
すべての細胞はまず、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ロッキーヒル）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）内で４日間増殖された。４日後、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でリンスされ、次にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシンで２４時間培養された。２４時間後、細胞はＰＢＳでリンスされた。その後、細胞は誘導培地で１〜６時間培養されたが、そのような誘導培地は、２００ｍＭのヒドロキシアニソール、１０μＭの塩化カリウム、５ミリグラム／ミリリットルのインスリン、１０μＭのホルスコリン、４μＭのバルプロ酸、および２μＭのヒドロコーチゾンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）から成る（すべての化学試薬はＳｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス、から取得）。その後、細胞は、氷冷された１００％メタノールで固定され、ヒトのネスチンタンパク質の発現を査定するために、免疫細胞化学が行われた（方法については以下を参照）。
【０３１４】
（Ｂ）ＰＰＤＣ（臍帯（０２２８０３）Ｐ１１、胎盤（０４２２０３）Ｐ１１）およびヒト成人皮膚繊維芽細胞（１Ｆ１８５３、Ｐ１１）が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖された。細胞はその後、トリプシン処理され、（Ａ）と同様の密度で播種されたが、これは、（１）２４ウェル組織培養用表面処理されたプレート（ＴＣＰ，ファルコンブランド、ＶＷＲインターナショナル）、（２）ＴＣＰウェル＋室温で１時間、２％（ｗ／ｖ）のゼラチンで吸着処理、または（３）ＴＣＰウェル＋２０μｇ／ミリリットルのマウスラミニンで吸着処理（３７℃で最低２時間吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種された。
【０３１５】
（Ａ）と全く同様に、細胞はまず、前述のタイムフレームで、増殖され、培地が交換された。１組の培養が、５日目に以前と同様に固定され、また６時間目に、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間固定された。２番目の組の培養では、培地が除かれ、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成る神経前駆細胞増殖培地（ＮＰＥ）に切り替えられた。ＮＰＥ培地にはさらに、レチン酸（ＲＡ、１μＭ、Ｓｉｇｍａ）が加えられた。この培地は４日後に除かれ、培養は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で室温で１０分間固定され、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色された。
【０３１６】
【表２７】
2007528703.tif 000030
【０３１７】
２段階の分化プロトコール
ＰＰＤＣ（臍帯（０４２２０３）Ｐ１１、胎盤（０２２８０３）Ｐ１１）およびヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１、１Ｆ１８５３、ケンブレックス）が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖された。その後、細胞はトリプシン処理され、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＮＰＥ培地の存在下［この全培地成分は、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅと呼ぶ］で、２，０００細胞／ｃｍ２で、ラミニン（ＢＤバイオサイエンスズ社、ニュージャージー州フランクリンレーク）でコーティングされた２４ウェルプレートに播種された。同時に、海馬から単離されたラット成体神経前駆細胞（Ｐ４、（０６２６０３））もまた、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地内で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングされた。すべての培養は、６日間、そのような条件下で維持され（細胞は、その期間中１回栄養補給された。）、その時点で、培地は、表Ｎ１−２にリストされた分化条件下に切り替えられ、さらに７日間維持された。培養は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で室温で１０分間固定され、ヒトまたはラットのネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色された。
【０３１８】
【表２８】
2007528703.tif 000031
【０３１９】
複数成長因子プロトコール
臍帯由来細胞（Ｐ１１、（０４２２０３））が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）まで増殖された。その後、細胞はトリプシン処理され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、２，０００細胞／ｃｍ２で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルプレートに播種された。さらに、いくつかのウェルはＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳを含んでいた。４日間の「分化前」条件の後、すべての培地が除かれ、標本は、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ、２００ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、ＦＧＦ８（１００ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＢＤＮＦ（４０ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）、およびレチン酸（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＮＰＥ培地に切り替えられた。培地の交換後７日後に、培養は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で室温で１０分間固定され、ヒトのネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１、デスミン、およびアルファ平滑筋アクチンの発現に関して染色された。
【０３２０】
神経前駆細胞の共培養プロトコール
成体ラット海馬前駆細胞（０６２６０３）は、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルのシャーレ（ＢＤバイオサイエンスズ社）に、ニューロスフェアとして、または単一の細胞（１０，０００細胞／ウェル）としてプレーティングされた。
【０３２１】
別に、臍帯由来細胞（０４２２０３）Ｐ１１および胎盤由来細胞（０２２８０３）Ｐ１１が解凍され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）に、５，０００細胞／ｃｍ２で、４８時間の期間中、増殖された。その後、細胞はトリプシン処理され、神経前駆細胞の存在する培養の上に２，５００細胞／ウェルで播種された。その時に、存在する培地は新鮮な培地に交換された。４日後に、培養は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で室温で１０分間固定され、ヒトの核タンパク（ｈＮｕｃ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（上記の表ＮＵ１−１）で染色して、ＰＰＤＣを同定した。
【０３２２】
免疫細胞化学
免疫細胞化学は、表ＮＵ１−１にリストされた前記抗体を使用して行われた。培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体は、室温で１時間、前記培養に適用された。次に、１次抗体溶液が取り除かれ、培養をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用された。
【０３２３】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落斜型蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルビル）上で適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、陽性の染色は、コントロール染色より高い蛍光シグナルによって表されるが、ここで、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。
【０３２４】
結果
Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール
（Ａ）この神経誘導性成分内でインキュベートすると、すべての細胞タイプは、伸長した突起を伴う双極性の形態を有する細胞に変形した。他の大きな非双極性の形態もまた、観察された。さらに、これらの誘導された細胞集団は、多分化能神経幹細胞および神経前駆細胞のマーカーであるネスチンに陽性に染色された。
【０３２５】
（Ｂ）組織培養用プラスチック製（ＴＣＰ）ディシュ上で繰返し行われたとき、ラミニンが前記培養表面に前もって吸着されていない場合は、ネスチンの発現は観察されなかった。ネスチンを発現する細胞が、その後、成熟した神経細胞を発生させ得るかどうかを更に評価するために、ＰＰＤＣおよび繊維芽細胞がＮＰＥ＋ＲＡ（１μＭ）に曝された。ＲＡは、神経幹細胞および前駆細胞の、そのような細胞への分化を誘導させることが知られる培地成分である（２、３、４）。細胞は、未成熟神経細胞および成熟神経細胞のマーカーであるＴｕＪ１、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、およびネスチンで染色された。いかなる条件下でもＴｕＪ１は検出されず、神経細胞の形態を有する細胞も観察されなかった。これは、神経細胞が前記短期間で発生されなかったことを示唆する。さらに、免疫細胞化学で決定されたところによると、ネスチンおよびＧＦＡＰは、もはやＰＰＤＣによって発現されていなかった。
【０３２６】
２段階の分化
臍帯および胎盤のＰＰＤＣ単離（並びに、陰性および陽性のコントロール細胞タイプとして、それぞれヒト繊維芽細胞およびげっ歯類の神経前駆細胞）が、ラミニン（神経促進）コーティングされたディシュにプレーティングされ、神経前駆細胞が神経細胞およびアストロサイトに分化するのを促進することが知られている１３の異なる成長条件（および２つのコントロール条件）に曝された。さらに、ＧＤＦ５およびＢＭＰ７のＰＰＤＣの分化への影響を検査するために、２つの条件が加えられた。一般的に、２段階の分化アプローチが取られ、前記細胞はまず、６日間、神経前駆細胞増殖条件に置かれ、その後、７日間、完全な分化条件に置かれた。形態的には、臍帯由来細胞および胎盤由来細胞は、この過程の期間を通じて、細胞形態で根本的な変化を示した。しかし、神経細胞またはアストロサイトの形態の細胞は、神経前駆細胞のプレーティングされた条件のコントロールを除いては観察されなかった。ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対して陰性であった免疫細胞化学は、前記形態学的観察を確認した。
【０３２７】
複数の成長因子
種々の神経分化薬剤に１週間曝された後、細胞は神経前駆細胞（ヒトのネスチン）、神経細胞（ＴｕＪ１）、およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）を示すマーカーで染色された。最初の段階で無血清培地で成長された細胞は、血清を含む（２％または１０％）培地の細胞より異なる形態を有していたが、これは神経分化能力を示す。特に、臍帯由来細胞をＥＧＦおよびｂＦＧＦに曝し、その後、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびレチン酸に曝す２段階処置の後に、細胞は、培養されたアストロサイトの形態に似た、長く伸長した突起を示した。２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳが分化の第１段階に含まれたときには、細胞数が増し、細胞形態は、高密度のコントロール培養と変わらなかった。神経分化能力は、ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、またはＧＦＡＰに対する免疫細胞化学分析によって明らかにならなかった。
【０３２８】
神経前駆細胞およびＰＰＤＣの共培養
ＰＰＤＣが、神経増殖条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に２日前に播種されたラットの神経前駆細胞の培養の上にプレーティングされた。プレーティングされたＰＰＤＣの肉眼の確認は、これらの細胞が単一の細胞としてプレーティングされたことを立証したが、プレーティング後４日目（合計６日目）に行ったヒトに特異的な核染色（ｈＮｕｃ）は、ＰＰＤＣが丸くなりがちで、前記神経前駆細胞と接触を避ける傾向があった。さらに、ＰＰＤＣが接着している場合は、これらの細胞は伸展し、ラット由来である分化した神経細胞によって神経支配されているようであり、これは、前記ＰＰＤＣが筋細胞に分化した可能性があることを示唆する。この観察は、位相差顕微鏡下の形態に基づいていた。別の観察では、大きな細胞体（神経前駆細胞より大きい）は通常、神経前駆細胞に似た形態を有しており、複数の方向に細い突起が出ていた。ＨＮｕｃ染色（前記細胞の核の半分に見られた）は、いくつかの場合には、これらのヒト細胞はラット前駆細胞と融合し、前記ラット前駆細胞の表現型を示していた可能性があったことを示唆していた。神経前駆細胞のみを含むコントロールウェルでは、臍帯ＰＰＤＣまたは胎盤ＰＰＤＣを含む共培養のウェルに比べて、前駆細胞および明らかに分化した細胞の合計が少なかったが、これは、臍帯由来細胞および胎盤由来細胞が、ケモカインおよびサイトカインの放出によって、または接触を仲介とする効果によって、のいずれかで、神経前駆細胞の分化および振る舞いに影響を与えたことを示す。
【０３２９】
要約
ＰＰＤＣは神経系統細胞に分化する短期間の能力を決定するために、複数のプロトコールが行われた。これらには、多分化能神経幹細胞および前駆細胞、未成熟神経細胞および成熟神経細胞、およびアストロサイトのそれぞれに関連するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対する免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相差画像法が含まれた。これらの短期間プロトコールのいくつかの場合に、神経分化が起こったことを示唆する証拠が観察された。
【０３３０】
神経前駆細胞とのＰＰＤＣの共培養で、いくつかの顕著な観察結果が得られた。ヒトＰＰＤＣを異種細胞タイプと共に使用する、このアプローチは、これらの培養で各細胞の由来の絶対的な決定を可能にした。まず、いくつかの細胞がこれらの培養で観察されたが、それらの細胞質は増大し、神経突起陽突起が前記細胞体から伸展し、しかし前記細胞体の半分のみがｈＮｕｃタンパク質で標識されていた。それらの細胞は、神経系統細胞に分化したヒトＰＰＤＣであった可能性があり、または前記細胞は、神経前駆細胞と融合したＰＰＤＣであった可能性もある。第２に、神経前記細胞は、程度、ＰＰＤＣに突起を伸長していたようであり、これは、前記神経前駆細胞が神経細胞に分化し、前記ＰＰＤＣを神経支配したことを示す。第３に、神経前駆細胞およびＰＰＤＣの培養は、ラット由来の細胞がより多くあり、神経前駆細胞のみのコントロール培養より分化の量が大きかった。これは、プレーティングされたＰＰＤＣが、水溶性因子を提供するか、または接触依存性の機構を提供し、これらが神経前駆細胞の生存性、増殖、および／または分化を刺激したことをさらに示す。
【０３３１】
実施例１３の参考文献
（１）Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．ら、（２０００）．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１（４）：３６４〜７０．
（２）Ｊａｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、（２００４）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７５（４）：５７３〜８４．
（３）Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，Ｅ．Ｍ．ら、（１９８３）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  Ｂｉｏｌ．３（１２）：２２７１〜９．
（４）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ら、（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５
【実施例１４】
【０３３２】
長期間における分娩後由来細胞の神経分化
胎盤由来細胞および臍帯由来細胞（まとめて、分娩後由来細胞またはＰＰＤＣ）が長期的に神経系統細胞に分化する能力について、評価された。
【０３３３】
方法および材料
ＰＰＤＣの単離および増殖
ＰＰＤＣは、以前の実施例に記載されたように、単離され、増殖された。
【０３３４】
ＰＰＤＣ細胞の解凍およびプレーティング
以前に成長培地で増殖されたＰＰＤＣ（臍帯（０２２８０３）Ｐ１１、（０４２２０３）Ｐ１１、（０７１００３）Ｐ１２、胎盤（１０１５０３）Ｐ７）の冷凍一定量が解凍され、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１０ミリリットル）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）（この組み合わせは、本明細書で、神経前駆細胞増殖（Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：ＮＰＥ）培地と呼ぶ）中で、ラミニン（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレーク）でコーティングされたＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２でプレートされた。ＮＰＥ培地はさらに、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）が添加された（本明細書で「ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ」と呼ばれる）。
【０３３５】
コントロール細胞のプレーティング
さらに、ヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ウオーカーズビル）および間葉系幹細胞（Ｐ５、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｔｐｏｒａｔｅｄ）が解凍され、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内で、ラミニンでコーティングされたＴ７５フラスコに同一の細胞播種密度でプレーティングされた。。更なるコントロールとして、繊維芽細胞、臍帯ＰＰＤＣ、および胎盤ＰＰＤＣが、成長培地で、すべての培養で指定された期間、成長された。
【０３３６】
細胞の増殖
すべての培養からの培地は、１週間で１回新鮮な培地と取り替えられ、細胞の増殖が観察された。一般的には、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内での成長が限られているため、各培養は１ヶ月の期間に１回継代された。
【０３３７】
免疫細胞化学
１ヶ月の期間後、すべてのフラスコは、４％（ｗ／ｖ）の冷やしたパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間固定された。免疫細胞化学は、ＴｕＪ１（ＢＩＩＩチューブリン、１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）およびＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク、１：２０００、ダコサイトメーション社、カリフォルニア州カーピンテリア）に対する抗体を用いて行われた。簡潔に述べると、培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体は、室温で１時間、前記培養に適用された。次に、１次抗体溶液が取り除かれ、培養をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用された。
【０３３８】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落斜型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）上で適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、コントロール染色より高い蛍光シグナルによって表される、陽性の染色は、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。
【０３３９】
【表２９】
2007528703.tif 000032
【０３４０】
結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地はＰＰＤＣの増殖を遅くし、それらの形態を変える
プレーティング後すぐに、サブセットのＰＰＤＣが、ラミニンでコーティングされた培養フラスコに接着した。この理由は、冷凍／解凍の過程の結果としての、または新規の成長培地のための、細胞死であった。接着した細胞は、成長培地で観察された形態とは異なる形態を取っていた。
【０３４１】
コンフルエント時に、培養は継代され、成長が観察された。継代を生存したこれらの細胞では増殖がほとんど起こらなかった。この時点では、伸展した形態をもたず、位相差で明るい特徴を有する、非常に少数の細胞が、臍帯由来細胞の培養で現れ始めた。前記フラスコのこれらの範囲は、長期にわたって観察された。これらの少数の細胞から、その長軸に沿って軸索瘤を伴う分岐した突起が現れた。この特徴は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋神経前駆細胞、およびＴｕＪ１＋脳および脊髄（１、２）から由来する未成熟な神経細胞に非常に類似している。時間と共に、これらの細胞がより多数になるが、クローンにのみ見つけられた。
【０３４２】
臍帯由来細胞のクローンは神経タンパク質を発現する
培養は、解凍／プレーティングの後、１ヶ月で固定され、前記神経タンパク質であるＴｕＪ１およびＧＦＡＰ（アストロサイトに見つけられる中間径フィラメント）に対して染色された。成長培地で成長されたすべてのコントロール培養、および、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦで成長されたヒト繊維芽細胞およびＭＳＣは、ＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが発見されたが、ＴｕＪ１は臍帯および胎盤のＰＰＤＣで検出された。発現は、神経細胞様の形態を有する細胞、および、そのような形態を有しない細胞で観察された。ＧＦＡＰの発現は、どちらの培養でも観察されなかった。ＴｕＪ１を発現し、神経細胞様の形態を有する細胞の割合は、全集団の１％以下であった（ｎ＝３で検査された臍帯由来細胞単離）。定量化はされなかったが、神経細胞の形態を有しない、ＴｕＪ１＋の細胞の割合は、胎盤由来細胞培養より臍帯由来細胞培養で高かった。成長培地内で年齢の一致するコントロールはＴｕＪ１を発現しなかったため、これらの結果は特異的であるらしい。
【０３４３】
要約
臍帯由来細胞から分化した神経細胞（ＴｕＪ１の発現および神経細胞の形態に基づく）を発生する方法が開発された。１ヶ月以前では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｕＪ１の発現は検査されなかったが、少なくとも少数集団の臍帯由来細胞が、既定の分化に沿って、または、Ｌ−グルタミン、塩基性ＦＧＦ、およびＥＧＦを添加した最小培地に１ヶ月曝された後の長期間誘導に沿って、ニューロンを生じ得ることは明らかである。
【０３４４】
実施例１４の参考文献
（１）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ら、（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５
（２）Ｙａｎｇ，Ｈ．ら、（２０００）．ＰＮＡＳ．９７（２４）：１３３６６〜７１
【実施例１５】
【０３４５】
神経前駆細胞の支持のためのＰＰＤＣ栄養因子
非接触依存性（栄養性）のメカニズムを介して、臍帯由来細胞および胎盤由来細胞（集合的に、分娩後由来細胞またはＰＰＤＣ）が、成体の神経幹細胞および神経前駆細胞の生存性および分化におよぼす影響を検査した。
【０３４６】
方法および材料
成体の神経幹細胞および神経前駆細胞の単離
Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４成体ラットは、ＣＯ２で窒息させて、その後、頚椎脱臼させて犠牲された。骨鉗子を用いて脳全体が無傷で除かれ、海馬組織が、脳の運動領域および体性感覚領域の後方の冠状切開（ｃｏｒｏｎａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎｓ）に基づいて解離された（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．&  Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．１９９７．Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）。組織は、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（この組み合わせは、当明細書で神経前駆細胞増殖（Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：ＮＰＥ）培地と呼ばれる）で洗浄された。ＮＰＥ培地はさらにｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）が添加された（本明細書で「ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ」と呼ばれる）。
【０３４７】
洗浄後、覆っている髄膜が除かれ、前記組織が外科用メスで刻まれた。刻まれた組織が収集され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が全容量の７５％加えられた。ＤＮＡｓｅ（８ミリリットルの全容量につき１００マイクロリットル、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）も加えられた。次に、前記組織／培地が、順に、１８ゲージの注射針、２０ゲージの注射針、最後に２５ゲージの注射針にそれぞれ一回づつ通された（すべての注射針は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレークスから取得された）。前記混合液は、２５０Ｇで３分間遠心され、その上清が除かれ、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦが加えられ、前記沈殿物が再懸濁された。その結果得られる細胞懸濁液は、４０マイクロメーターのセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に通され、ラミニンでコーティングされたＴ７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、または低クラスター２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にプレーティングされ、概要された検査のために十分な細胞数が得られるまでＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で成長された。
【０３４８】
ＰＰＤＣプレーティング
成長培地で以前に成長された分娩後由来細胞（臍帯（０２２８０３）Ｐ１２、（０４２１０３）Ｐ１２、（０７１００３）Ｐ１２、胎盤（０４２２０３）Ｐ１２）は、５，０００細胞／トランスウェル（２４ウェルプレート用の大きさ）でプレーティングされ、インサート内で、成長培地で一週間の期間成長され、コンフルエントを達成した。
【０３４９】
成体の神経前駆細胞のプレーティング
ニューロスフェアとして、または単一の細胞として成長された神経前駆細胞が、約２，０００細胞／ウェルの密度で、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルプレート上に、１日の期間、播種され、細胞の接着を促進させた。１日後、分娩後細胞を含むトランスウェルインサートは、以下のスキームで加えられた。
（１）トランスウェル（成長培地内の臍帯由来細胞、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（２）トランスウェル（成長培地内の胎盤由来細胞、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（３）トランスウェル（成長培地内の成人ヒト皮膚繊維芽細胞［１Ｆ１８５３、ケンブレックス、メリーランド州ウオーカーズビル］Ｐ１２、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（４）コントロール：神経前駆細胞のみ（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（５）コントロール：神経前駆細胞のみ（ＮＰＥのみ、１ミリリットル）
【０３５０】
免疫細胞化学
共培養で７日後、すべて条件は、４％（ｗ／ｖ）の冷やしたパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間固定された。免疫細胞化学は、表１５−１にリストされた前記エピトープに対する抗体を使用して行われた。簡潔に述べると、培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体は、室温で１時間、前記培養に適用された。次に、１次抗体溶液が取り除かれ、培養をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用された。
【０３５１】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落斜型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）上で適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、コントロール染色より高い蛍光シグナルによって表される、陽性の染色は、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。
【０３５２】
【表３０】
2007528703.tif 000033
【０３５３】
神経前駆細胞の分化の定量的分析
海馬の神経前駆細胞の分化の定量的分析が検査された。各条件につき、最小１０００の細胞が計数され、それより少ない場合は、その条件で観察された全細胞数が計数された。与えられた染色に対し陽性の細胞の割合は、陽性の細胞数を、ＤＡＰＩ（核）染色で決定された全細胞数で割って評価された。
【０３５４】
質量分析および２次元ゲル電気泳動
共培養の結果としてのユニークな分泌因子を同定するために、培養固定の前に取られた条件培地の検体が−８０℃で一晩冷凍された。その後、検体は限外濾過回転装置（分子量カットオフ：３０ｋＤ）に適用された。保持物は、免疫親和性クロマトグラフィー（抗ヒトアルブミン、ＩｇＹ）にかけられた（免疫親和性が前記検体からアルブミンを除去しなかった）。濾過物はＭＡＬＤＬによって分析された。前記通過物は、シバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅ）親和性クロマトグラフィーにかけられた。検体はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２次元電気泳動によって分析された。
【０３５５】
結果
ＰＰＤＣ共培養は成体神経前駆細胞の分化を刺激する
臍帯由来細胞または胎盤由来細胞との培養後、成体ラット海馬から由来し、共培養された神経前駆細胞は、中枢神経系の３種類のすべての主要系統に沿っての有意な分化を示した。この効果は、共培養で５日後にはっきりと観察され、多くの細胞は複雑な突起を出し。分裂する前駆細胞の特徴である、位相差で明るい特徴（ｐｈａｓｅ  ｂｒｉｇｈｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）を失っていた。逆に、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの非存在下でそれだけで成長された神経前駆細胞は健康的でないように見え、生存性も限定されていた。
【０３５６】
前記処置の終了後に、培養は、未分化幹細胞および前駆細胞を示すマーカー（ネスチン）、未成熟神経細胞および成熟神経細胞を示すマーカー（ＴｕＪ１）、アストロサイトを示すマーカー（ＧＦＡＰ）、および成熟したオリゴデンドロサイトを示すマーカー（ＭＢＰ）で染色された。３種類のすべて系統に沿っての分化が確認されたが、コントロール条件は、大多数の細胞でのネスチン陽性の保持によって明らかなように、有意な分化を示さなかった。臍帯由来細胞および胎盤由来細胞の両方が細胞分化を誘導したが、３種類の系統のすべてで、臍帯由来細胞との共培養よりも胎盤由来細胞との共培養で、分化の程度が低かった。
【０３５７】
臍帯由来細胞との共培養後の分化した神経前駆細胞の割合が定量化された（表１５−２）。臍帯由来細胞は、成熟したオリゴデンドロサイト（ＭＢＰ）の数を有意に増加させた（２４％対０％（両方のコントロール条件））。さらに、共培養は、ＧＦＡＰ＋のアストロサイトおよびＴｕＪ１＋の神経細胞の培養内での数を増加させた（それぞれ、４７．２％および８．７％）。これらの結果はネスチンの染色によって確認され、前駆細胞の状態が共培養後に失われたことを示唆した（１３．４％対７１．４％（コントロール条件４））。
【０３５８】
分化はまた、ヒト成人繊維芽細胞によって影響を受けるように見えたが、そのような細胞は、成熟したオリゴデンドロサイトの分化を促進することができず、また大量な量の神経細胞を発生することもできなかった。定量化されなかったが、繊維芽細胞は神経前駆細胞の生存性を向上するようであった。
【０３５９】
【表３１】
2007528703.tif 000034
【０３６０】
ユニークな化合物の同定
臍帯由来との共培養および胎盤由来との共培養からの条件培地が、好適なコントロール（ＮＰＥ培地±１．７％血清、繊維芽細胞との共培養からの培地）と共に、それらの差異について検査された。潜在的にユニークな化合物が同定され、それらの個々の２Ｄゲルから切り取られた。
【０３６１】
要約
成人神経前駆細胞と、臍帯ＰＰＤＣまたは胎盤ＰＰＤＣとの共培養によって、これらの細胞の分化が起こった。この実施例で示された結果は、臍帯由来細胞との共培養後の成人神経前駆細胞の分化が特に著しい。特に、有意な割合の成熟オリゴデンドロサイトが、臍帯由来細胞との共培養内で発生された。前記臍帯由来細胞および前記神経前駆細胞の間で接触がなかったことから考えると、この結果は、前記臍帯由来細胞からの水溶性因子の機能であるらしい（栄養作用）。
【０３６２】
いくつかの他の観察結果が見られた。第１に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが除かれた場合のコントロールでは非常に少数の細胞しかなかった。ほとんどの細胞が死亡し、平均で各ウェルに約１００以下の細胞があった。第２に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが初めから終わりまで培地内に保持された前記コントロール条件は、通常、増殖培地であるため、全く分化がないであろうと予想されている。約７０％の前記細胞はその前駆細胞の状態（ネスチン＋）を保っていることが観察されたが、約３０％はＧＦＡＰ＋（アストロサイトの徴候）であった。これは、前記処置中にそのような大幅な増殖が起こったため、前駆細胞の間の接触がこの分化を誘導したためであり得る（Ｓｏｎｇ，Ｈ．ら、２００２．Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：２９〜３２）。
【実施例１６】
【０３６３】
分娩後由来細胞の移植
前記分娩後臍帯および前記分娩後胎盤から由来する細胞は、再生治療に有用である。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、生体分解性の物質と共に移植された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）が産生した組織が評価された。評価された前記物質は、不織Ｖｉｃｒｙｌ、３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、およびＲＡＤ１６自己集合性ペプチドヒドロゲルであった。
【０３６４】
方法および材料
細胞の培養
胎盤由来細胞および臍帯由来細胞は、成長培地（低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）のベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））中で、ゼラチンコーティングされたフラスコで成長された。
【０３６５】
検体の調製
１００万の生細胞は、直径５ｍｍで２．２５ｍｍの厚さの不織Ｖｉｃｒｙｌ骨格（６４．３３ミリグラム／ｃｃ、ロット番号：３５４７−４７−１）または直径５ｍｍの３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体（ロット番号：３４５１−５３）上に、１５マイクロリットルの成長培地内に播種された。細胞は接着するまで２時間置かれ、前記骨格を覆うために成長培地がさらに加えられた。細胞は骨格上で一晩、成長された。細胞のない骨格もまた培地にインキュベートされた。
【０３６６】
ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド（３Ｄマトリックス社、マサチューセッツ州ケンブリッジ、物質移動合意書に従って）は、滅菌された１％（ｗ／ｖ）の水溶液として取得され、これは、使用直前に、１０％（ｗ／ｖ）蔗糖（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中の１×１０６の細胞と１：１で混合された。ＲＡＤ１６ハイドロゲル中の細胞の最終的濃度は、１×１０６細胞／１００マイクロリットルであった。
【０３６７】
検査物質（Ｎ＝４／Ｒｘ）
１．不織Ｖｉｃｒｙｌ＋１×１０６臍帯由来細胞
２．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０６臍帯由来細胞
３．ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド＋１×１０６臍帯由来細胞
４．不織Ｖｉｃｒｙｌ＋１×１０６胎盤由来細胞
５．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０６胎盤由来細胞
６．ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド＋１×１０６胎盤由来細胞
７．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
８．不織Ｖｉｃｒｙｌ
【０３６８】
動物の準備
動物は、米国動物保護法の現在の必要条件にしたがって扱われ、維持された。前記公法の順守は、米国動物保護法の規制（９  ＣＦＲ）を忠実に守り、動物実験指針（ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、第７版で公表された現在の基準を確認することによって、達成された。
【０３６９】
マウス（Ｍｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ／オス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、インディアナ州インディアナポリス）、生後５週間ＳＣＩＤマウスのすべての取り扱いは、フードの下で行われた。前記マウスは個々に体重測定され、６０ミリグラム／ｋｇのＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン、Ａｖｅｃｏ、アイオワ州フォートドッジ）および１０ミリグラム／ｋｇのＲＯＭＰＵＮ（キシラジン、Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ．、カンザス州ショウニー（Ｓｈａｗｎｅｅ））および生理的食塩水の混合液の腹腔内注入で麻酔された。麻酔の導入後、背側の頚部から背側の腰仙部までの背部全体の毛が、動物用電気バリカンを用いて刈り取られた。その後、この部分は酢酸クロルヘキシジンでこすり、アルコールでリンスされ、乾燥され、１％の有効ヨードのヨードフォア水溶液で塗られた。麻酔期間中に組織が乾燥しないように、眼軟膏が眼に塗布された。
【０３７０】
皮下移植技術
それぞれが約１．０ｃｍの長さの、４つの皮膚切開が、前記マウスの背に作られた。２つの上方部位は、背側外側の胸部上で、肩甲骨の触診的下方縁から約５ｍｍ尾側の位置で、横に位置し、１つの切開が背柱の左側に、もう１つの切開が右側に行われた。別の２つは、触診的腸骨稜から約５ｍｍ尾側で、尾側の仙腰椎レベルの殿筋部位上に、横に位置しており、１つの切開が正中線の左側に、もう１つの切開が右側に行われた移植物は、実験の計画にしたがって、これらの部位に無作為に置かれた。皮膚が、その下にある結合組織から分離され、小さいポケットが作られ、前記切開部から約１ｃｍ尾側に前記移植物が置かれた（或いはＲＡＤ１６の場合は注入された）。好適な検査物質が前記皮膚下空間に移植された。前記皮膚切開部は金属クリップで閉じられた。
【０３７１】
動物飼育設備
マウスは、前記検査期間中を通して、マイクロアイソレーター・ケージ内で、６４〜７９°Ｆの温度範囲、３０％から７０％までの相対的湿度で、個々に飼育され、約１２時間の昼／１２時間の夜の照明サイクルで維持された。温度および相対湿度は、最大限可能な限り、記述された範囲内に維持された。餌は、放射線照射されたＰｉｃｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ  ５０５８（Ｐｕｒｉｎａ  Ｃｏ．）から成り、水は無制限に与えた。
【０３７２】
マウスは、二酸化炭素の吸入によって、計画された期間後に安楽死させた。前記皮膚下移植部位はその上の皮膚と共に切り取られ、組織学のために冷凍された。
【０３７３】
組織学
移植物の付いた摘出皮膚は、１０％の中性に緩衝化されたホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州カラマズー）で固定された。覆っている組織および隣接組織の付いた検体は中央部で二等分され、パラフィンで処理され、通常の方法を用いて切断表面に埋め込まれた。５ミクロンの組織切片がミクロトームで取得され、通常の方法を用いてヘマトキリンおよびエオシン（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨーク州ベイショア）で染色された。
【０３７４】
結果
３０日後に、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植された発泡体への組織の成長は最小限であった（細胞なし）。対照的に、臍帯由来細胞または胎盤由来細胞で移植された発泡体には広範な組織の充填があった。ある程度の組織の成長は、不織Ｖｉｃｒｙｌの骨格に観察された。臍帯由来細胞または胎盤由来細胞が播種された不織の骨格は、マトリックスの沈殿および成熟した血管の増加を示した。
【０３７５】
要約
合成吸収性の不織／発泡体の円板（５．０ｍｍ直径×１．０ｍｍ厚さ）または自己集合性のペプチドヒドロゲルが、ヒトの臍帯または胎盤のどちらかから由来する細胞で播種され、ＳＣＩＤマウスの脊椎部分の両側に皮下に移植された。その結果は、分娩後由来細胞は、生体分解性骨格に良質の組織形成を劇的に増加させ得ることを実証した。
【実施例１７】
【０３７６】
分娩後由来細胞の神経修復での使用
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）病変が、哺乳類成体ＣＮＳでの種々の修復の方策のモデルとして広範に使用されている。げっ歯類成体のＲＧＣの軸索の球後部分が、不成功の発芽（Ｚｅｎｇら、１９９５）および親細胞集団の進行的死亡（Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚら、１９９３）に至ることが実証されている。多くの研究は、軸索切断されたＲＧＣの生存性およびそれらの軸索の再生への種々の外因性因子および内因性因子の刺激的効果を実証している（ＹｉｐおよびＳｏ，２０００、Ｆｉｓｃｈｅｒら、２００１）。さらに、他の複数の研究は、細胞移植が、切断された神経軸索の再生に用いられて得ることを実証している（Ｌｉら、２００３、Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏら、２０００）。このように、これらの研究および他の研究は、脊髄、末梢神経、陰部神経、視神経、または、神経損傷が起こり得る損傷による他の疾患／外傷を治療するために、細胞に基づく治療が利用されうることを実証している。
【０３７７】
自己集合性ペプチド（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）、米国特許第５，６７０，４８３号および第５，９５５，３４３号、米国／ＰＣＴ出願番号第ＵＳ２００２／０１６０４７１号、第ＷＯ０２／０６２９６９号）は、細胞を３次元で封入するための、２次元のコーティング内に細胞をプレーティングするための、細胞接着用の骨格として、または、懸濁培養でのマイクロキャリアとして、働くように開発されている。３次元の細胞培養は、それらに固有な再現性および細胞シグナル伝達組織を有する動物由来の物質（マウス肉腫抽出物）、若しくは、物理的にナノメータースケールに近づけず且つ天然ＥＣＭの化学的寄与もしないより大きな合成骨格を必要とした。ＲＡＤ１６（ＮＨ２−（ＲＡＤＡ）３−ＣＯＯＨ）およびＫＬＤ（ＮＨ２−（ＫＬＤＬ）３−ＣＯＯＨ）は、小さい（ＲＡＤ１６は５ナノメートルである）オリゴペプチド断片で合成され、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に類似のスケールでナノファイバーに自己集合する（３Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）。前記自己集合性は、培養培地内に見つけられる一価陽イオンまたは二価陽イオンによって、または生理学的環境によって、開始される。この実施例に記載された前記プロトコールでは、ＲＡＤ１６は、分娩後細胞の眼の異常への移植用のマイクロキャリアとして使用された。この実施例では、分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）の移植が、成体ラットの視神経の軸索再生モデルで効力を提供し得ることが実証される。
【０３７８】
方法および材料
細胞
ヒト成人のＰＰＤＣ（臍帯および胎盤）、および繊維芽細胞（継代１０）の培養が、１回の継代で増殖された。すべての細胞は、まず、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む成長培地内で、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコに、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。継代１１で、細胞はトリプシン処理され、生存性がトリパンブルー染色によって決定された。簡潔に述べると、５０マイクロリットルの細胞懸濁液が、５０マイクロリットルの０．０４％（ｗ／ｖ）トリパンブルー液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）と混ぜられ、血球計算板を用いて生細胞数が推定された。その後、細胞は、添加物を含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）内で３回洗浄された。その後、細胞は、製造会社の推奨の通り、緩衝化され等張化された２５マイクロリットルのＲＡＤ−１６（３ＤＭ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に２００，０００細胞の濃度で懸濁された。１００マイクロリットルの、添加物を含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地が、上記の細胞／マトリックス懸濁液に加えられ、使用までそれを湿った状態に保った。これらの細胞／マトリックス培養は、移植が起こるまで標準の大気条件に維持された。移植の時点で、過剰な培地が除かれた。
【０３７９】
動物および外科処置
ロングエバンスのメスのラット（２２０〜２４０グラムの体重）が使用された。腹腔内でトリブロモエタノールの麻酔下（２０ミリグラム／１００グラムの体重）で、視神経が露出され、視神経髄が視神経円板から焼く２ミリメートルのところで眼窩内で切開され、前記神経が前記髄から持ち上げられ、細いはさみで完全に横に切断することを可能にした（Ｌｉら、２００３）。切断の完全性は、近位断端および遠位断端の完全な分離を視覚的に観察することで確認された。コントロールグループは、移植されなかった障害ラットから成る。移植ラットでは、１つのマイクロピンセットを用いて、ＲＡＤ−１６に播種され、培養された細胞が、前記近位断端および前記遠位断端の間に挿入された。ＲＡＤ−１６中の約７５，０００細胞が、切断された視神経に移植された。１つの細いマイクロピンセットを用いて、細胞／マトリックスが前記切断部に塗布された。切断された視神経の髄は、１０／０ブラック・モノフィラメント・ナイロン（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、英国エジンバラ）で閉じられた。このように、前記間隙は、前記神経の前記切断近位端および前記切断遠位端が互いに近づくように引っ張って閉じられた。
【０３８０】
細胞の注入が行われた後、動物は、移植後１０日間の間、デキサメタゾン（２ミリグラム／キログラム）で注入された。この検査の期間中、動物は、移植の２日前から前記検査の終了時まで、経口的なシクロスポリンＡ（２１０ミリグラム／リットルの飲み水、その結果の血液内濃度：２５０〜３００μグラム／リットル）（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｓ、オハイオ州ベッドフォード）の飲み水で維持された。食物と水は無制限に利用可能であった。動物は、移植後３０日または６０日に犠牲にされた。
【０３８１】
ＣＴＢの適用
動物が犠牲にされる３日前に、麻酔下で、３０〜５０ミリメートルの先端を有するガラスマイクロピペットが、前記レンズの後ろに前記強膜を通して、接線方向に挿入され、１％逆行性トレーサーコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）水溶液（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ、カリフォルニア州カンベル）の２定量分（各一定量は４〜５マイクロリットル）がガラス体に注入された。動物は、固定液で潅流され、視神経が同一の固定液中で１時間、収集された。前記視神経は、一晩蔗糖中に移された。２０マイクロメートルの凍結切片は、０．１モルのグリシンに３０分間インキュベートされ、２．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ、マンハイム）および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含むＰＢＳ溶液でブロックされた後、ＰＢＳ中に２％の正常のウサギ血清（ＮＲＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、２．５％ＢＳＡ、および２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含むＰＢＳに、１：４０００で希釈されたヤギ抗ＣＴＢ抗体（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ、カリフォルニア州カンベル）を含む溶液でブロックされ、ＰＢＳ中に２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、１：２００で希釈されたビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンガム）中に、室温で２時間インキュベートされた。これは、その後、ＰＢＳ中で１：２００希釈のストレプトアビジン・グリーン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４３８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）中で、室温で２時間、染色された。染色された切片は、その後、ＰＢＳで洗浄され、共焦点顕微鏡のためにプロピジウムヨウ素で対比染色された。
【０３８２】
組織学用調製
簡潔に述べると、ＣＴＢ注射の５日後、ラットは４％ホルムアルデヒドで潅流された。ラットは４立方センチメートルのウレタンが与えられ、次にＰＢＳ（０．１モル）で潅流され、その後４％のパラホルムアルデヒドで潅流された。脊髄が切断され、頭から骨が除かれて、小隆起を露出した。前記小隆起が取り除かれて、４％パラホルムアルデヒド中に置かれた。前記眼の外側に沿ってできるだけ後方まで切断して、前記眼を取り除いた。前記眼の下側に横たわる前記視神経を切断しないように注意が払われた。前記眼が取り除かれ、筋肉が切断され、前記視神経が露出された。その後、これは４％パラホルムアルデヒド中に置かれた。
【０３８３】
結果
病変部のみ
前記視神経の管後方（ｒｅｔｒｏｔｕｂｕｌａｒ）の切断の１ヶ月後に、いくつかのＣＴＢ標識の軸索が、前記網膜に付着した神経部分に同定された。前記切断部の近くの２００マイクロメートル内に、軸索が、主軸に直角にいくつかの副軸索を出し、前記切断面に神経腫様（ｎｅｕｒｏｍａｔｏｕｓ）として末端化ことが発見された。前記近位断端および前記遠位断端の間のこの切断部では、前記間隙は、２〜３ミリメートル断片の血管新生化結合組織によって進行的に橋渡しされていることが観察されたが、軸索がこの橋渡し部分に進行するのは見られなかった。したがって、病変のみを受容した動物では、軸索成長が前記遠位断端に到達することは観察されなかった。
【０３８４】
ＲＡＤ−１６移植
前記切断部へのＲＡＤ−１６の移植後、血管新生化結合組織の内部への可視的な成長が観察された。しかし、前記近位断端および前記遠位断端の間で、軸索の内部への成長は観察されなかった。ＲＡＤ−１６の適用のみは、この状況での軸索再生を誘導するには不十分であることが、前記結果から実証される。
【０３８５】
分娩後由来細胞の移植
分娩後由来細胞の前記切断視神経への移植は、視神経の成長を刺激した。繊維芽細胞が移植された条件では、いくつかの再成長がまた観察されたが、前記移植胎盤由来細胞で観察された前記再成長に比較すると、これは最小限であった。視神経の再成長は、胎盤由来細胞で移植された動物の４／５で観察され、成人皮膚繊維芽細胞で移植された動物の３／６で観察され、臍帯由来細胞で移植された動物の１／４で観察された。再成長が観察された状況では、ＣＴＢ標識によって、網膜神経節細胞の軸索の再生が確認された。これらの軸索は前記移植部分を貫通していることが実証された。グリア瘢痕のレベルを決定するために、ＧＦＡＰ標識もまた行われた。ＧＦＡＰ発現は、前記近位断端で高く、前記再神経化された移植片内に程度の免疫染色が観察された。
【０３８６】
要約
これらの結果は、移植されたヒト成人の分娩後由来細胞が、切断された網膜神経節細胞軸索の再生を刺激して、導くことができることを実証する。
【０３８７】
実施例１７の参考文献
１）Ｚｅｎｇ  ＢＹ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＮ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｇ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＡＲ．１９９５．Ｊ．Ａｎａｔ．１８６：４９５〜５０８．
２）Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚ  ＭＰ，Ｖｉｄａｌ−Ｓａｎｚ  Ｍ，Ｂｒａｙ  ＧＭ，Ａｇｕａｙｏ  ＡＪ．１９８８．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６５〜８０．
３）Ｙｉｐ  ＨＫ，Ｓｏ  ＫＦ．２０００．Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９：５５９〜７５．
４）Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，Ｈｅｉｄｕｓｃｈｋａ  Ｐ，Ｔｈａｎｏｓ  Ｓ．２００１．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１７２：２５７〜７２．
５）Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏ  Ａ，Ｃｏｒｄｅｒｏ  ＭＩ，Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｉｔｏ  ＦＦ，Ａｖｉｌａ  Ｊ．２０００．Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：４２５〜３５．
【実施例１８】
【０３８８】
網膜色素変性症の治療での分娩後由来細胞の使用
網膜内の細胞の変性から起因する失明障害に対する真の治療は現在存在しない。アポトーシスまたは二次的変性の結果としての視細胞の損失は、視覚の進行的劣化をもたらし、最終的には盲目に至らせる。これが起こる疾患には、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ＲＰ）が含まれる。ＲＰは通常、１つの遺伝子突然変異に関連しており、この遺伝子突然変異が視細胞の細胞死に関与している。
【０３８９】
前記網膜視細胞および隣接の網膜色素上皮細胞が機能的ユニットを形成する。Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＲＣＳ）ラットは、外節の食作用に影響を与えるチロシン受容体キナーゼ（Ｍｅｒｋｔ）の欠陥があり、これが視細胞の死を導く（１）。網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）細胞をＲＣＳラットの網膜下空間へ移植すると、視細胞の損失の進行を制限し、視覚機能を保つことが発見された（２）。この実施例では、分娩後由来細胞を用いて視細胞の救済を促進し、このようにしてＲＣＳモデルで視細胞を保護することが実証される。
【０３９０】
方法および材料
細胞移植
ヒト成人の臍帯細胞、胎盤細胞、および繊維芽細胞（継代１０）の培養が、１回の継代で増殖された。すべての細胞は、最初、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ上に、成長培地内で５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。それ以降の継代では、すべての細胞は以下のように処理された。トリプシン処理後、トリパンブルー染色した後、生細胞が計数された。簡潔に述べると、５０マイクロリットルの細胞懸濁液が、５０マイクロリットルの０．０４％（ｗ／ｖ）トリパンブルー液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）と混ぜられ、血球計算板を用いて生細胞数が推定された。細胞はトリプシン処理され、添加物を含まない低グルコースＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）内で３回洗浄された。継代１１のヒトの臍帯細胞、胎盤細胞、および繊維芽細胞の培養はトリプシン処理され、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で２回洗浄された。移植の手順のために、栄養障害性ＲＣＳラットはキシラジン−ケタミン（以下の混合物を１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．：２０ｍｇ／ｍｌで２．５ｍｌのキシラジン、１００ｍｇ／ｍｌで５ｍｌのケタミン、および０．５ｍｌの純水）で麻酔され、それらの頭部がノーズバー（ｎｏｓｅ  ｂａｒ）で固定された。血清のない細胞は、２マイクロリットルのＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中に再懸濁（１回の注入につき２×１０５細胞）され、細いガラスピペット（７５〜１５０マイクロメーターの内径）を用いて移植された。細胞は、麻酔された生後３週間の栄養障害性で色素性のＲＣＳラット（全体でＮ＝１０／細胞タイプ）の背側−側頭（ｄｏｒｓｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ）網膜下空間に送達された。
【０３９１】
細胞は右眼に片側に注入されるが、左眼は培地のみで注入された（虚偽コントロール、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地）。残余移植細胞の生存性が、前記移植処置の終了後にトリパンブルー排除法によって評価され、９５％より高いままであった。細胞の注入が行われた後、動物は、移植後１０日間の間、デキサメタゾン（２ミリグラム／キログラム）で注入された。この検査の期間中、動物は、移植の２日前から前記検査の終了時まで、経口的なシクロスポリンＡ（２１０ミリグラム／リットル、その結果の血液内濃度：２５０〜３００μグラム／リットル）（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｓ、オハイオ州ベッドフォード）の飲み水で維持された。食物と水は無制限に利用可能であった。動物は、処置後６０日または９０日で犠牲にされ、いくつかの動物は、細胞移植に関連する短期間の変化の組織学的評価のために、早い時点で犠牲にされた。
【０３９２】
ＥＲＧ記録
一晩、暗順応した後、以前に記述した（３）ように、暗赤色灯でＥＲＧ記録のために動物が準備された。簡潔に述べると、麻酔下（１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐのケタミン、および１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のキシラジンの混合物を用いて）で、頭が定位ヘッドホルダーで固定され、その体温は直腸体温計で監視され、保温毛布を用いて３８℃に維持された。局所的２．５％のフェニレフリンおよび１％のトロピカミドの等量分を用いて、瞳孔が散大された。角膜反射を防ぐために、０．７５％のブピバカインでの局所的麻酔が使用され、角膜の脱水を防ぎ、記録用電極（金線ループ）との電気的接触を可能にするために、０．９％の食塩水の１滴が頻繁に適用された。２つの眼の間の頭皮に２５ゲージの針が挿入され、基準電極として作動した。増殖（１〜１０００Ｈｚバンドパスで、ノッチフィルタリングなし）と刺激呈示とデータ収集は、ＬＫＣテクノロジーズ（ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ゲイサーズバーグ）からのＵＴＡＳ−３０００システムによって提供された。ＥＲＧは、前記臍帯細胞のグループでは６０日目および９０日目で記録され、前記胎盤および繊維芽細胞のグループでは６０日目のみに記録された。
【０３９３】
混合ａ波および混合ｂ波の記録
暗順応のｂ波の定量化のために、記録は、１回のフラッシュ提示（１０マイクロ秒の時間長）から成り、必要に応じて、反応の信頼性を確認するために、またシグナル対雑音比を改善するために、３〜５回繰り返した。刺激は、輝度で−３．６から１．４の対数カンデラ／ｍ２まで１対数ユニットのステップで変わる、６つの増加する強度で提示された。桿体の退色の可能性を最小限にするために、前記刺激輝度が増加するにつれて刺激間の間隔が、最も低い刺激強度の１０秒から、最も高い刺激強度の２分まで増加された。最大のｂ波の振幅は、前記刺激強度にかかわらず、フラッシュ強度シリーズから取得された振幅として定義された。栄養障害性動物では、高輝度レベルでのＥＲＧ反応はしばしば異常であり、０．４および１．４の対数カンデラ／ｍ２の周辺では低下した反応の傾向を示したため、Ｎａｋａ−Ｒｕｓｈｔｏｎ曲線でのデータ近似法からの真のＶｍａｘは使用されなかった。ＥＲＧ成分が得られ、失われた週齢を決定するために、判断基準振幅が使用された。それは、ａ波およびｂ波で２０μＶであり、ＳＴＲ様反応では１０μＶである。前記ｂ波の振幅は、前記ａ波の負のピークから、振動のピーク（ピークは前記ｂ波の正の頂点を超える可能性がある）ではなく、前記ｂ波の正の頂点までで測定された（４）。
【０３９４】
桿体および錐体の反応の分離
ダブルフラッシュプロトコールを使用して、桿体および錐体の反応の分離を決定した（５）。較正された全体野を有する前記ＵＴＡＳ−３０００システム（ＬＫＣテクノロジーズ）の特殊な機能を用いて、条件性フラッシュの１秒後にプローブフラッシュが提示され、使用された前記条件下で前記刺激装置の完全な充電を確実にした。前記処置での前記条件性フラッシュの役割は、桿体を一時的に飽和させて、前記プローブフラッシュに無反応性にすることである。前記プローブフラッシュへの反応は、錐体による活性を反映していると考えられた。桿体によるｂ波は、前記混合反応（１回のプローブフラッシュのみの提示後に得られた。すなわち、いずれの条件性フラッシュもその前に行われなかった。）から前記錐体による反応を差し引くことによって得られた。
【０３９５】
機能的な評価
生理的な網膜の感度の検査が、薄暗い光への網膜反応を実証するために行われた。動物は、１．２５ｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の回復用用量のウレタンで麻酔された。移植後の動物で、９０日目に、前記動物での生理学的評価が検査されたが、これは、それぞれの視覚受容野の照明に対する、上丘内での複合的細胞外活性を記録することによって行った（６）。前記手順は、無関連の２０ヶ所で繰り返され（２００ｍｍの間隔で、各ステップは前記視覚野の約１０〜１５０の移動に対応）、前記視覚野を覆った。視覚閾値は、バックグランド以上に強度を増加させて測定され、前記上丘の２００μｍ平方内の単位を活性化に必要な、０．０２カンデラ／ｍ２（輝度単位）［桿体の飽和より少なくとも２．６対数単位低い（７）］に維持された。移植された眼と媒介物のみを受容した虚偽コントロール眼の間で、反応パラメータが比較された。
【０３９６】
組織学
動物は、過剰用量（１２．５ｇ／ｋｇ）のウレタンで犠牲にされた。目の方向は、摘出前に、６．０縫合糸を上直筋に通して固定された。角膜切開をした後、前記眼は、２．５％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．０１％のピクリン酸を含む、０．１Ｍのカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で固定された。固定後、毛様体の周りを切断することによって、角膜およびレンズが取り除かれた。眼の方向の維持を補助している前記上直筋の除去の前に、網膜後方の周辺に小さい切り目が入れられた。前期網膜は、その後、１％四酸化オスミウムで１時間、術後固定された。一連のアルコールおよびエポキシプロパンを介する脱水化の後、前記網膜はＴＡＡＢ包埋樹脂（ＴＡＡＢラボラトリーズ、英国アルデマーストン）に包埋された。半薄切片は、１％トルイジンブルーを含む１％ホウ酸緩衝液で染色され、超薄切片は、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で造影された。
【０３９７】
ニッスル染色では、切片は０．７５％のクレシルバイオレット（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で染色され、その後、前記切片は７０％、９５％、および１００％で２回の段階的なアルコールを介して脱水された。前記切片は、キシレン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）中に置かれ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）でリンスされ、カバースリップで覆われ、ＤＰＸ封入液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で封入された。
【０３９８】
結果
ＥＲＧ記録
臍帯細胞の注入を受けた動物は、術後６０日目および９０日目に視覚反応の特性の相対的な維持を示した（表１８−１）。これらの動物で観察された反応は、胎盤、繊維芽細胞、または虚偽の処理動物で見られた反応より大きかった。胎盤細胞移植（ｎ＝４）は、６０日目に、虚偽コントロール（０）に対して、ａ波で改善が見られなかった（２０±２０）が、混合ｂ波（８１±７２）では、虚偽コントロール（１．５±２）に対して、程度の改善が見られ、錐体ｂ波（５０±１９）では、虚偽コントロール（７±７）に対して、良好な改善が見られ、桿体の寄与（３０％）で、虚偽コントロール（０）に対して、良好な改善が見られた。これらの結果は、虚偽コントロールに対して、視覚反応性で程度の改善を示した。
【０３９９】
臍帯細胞移植の動物（ｎ＝６）は、６０日目に検査されたすべての結果判定で良好な改善を実証した（表Ｎ５−１）。すなわち、虚偽コントロール（０）に対するａ波（２７±１１）、虚偽コントロール（１８±１３）に対する混合ｂ波（１１７±６７）、虚偽コントロール（２８±１１）に対する錐体ｂ波（５５±２５）、虚偽コントロール（６±７％）に対する桿体の寄与（４９±１６％）である。さらに、９０日目に、改善した反応が、検査した２つの動物で測定され、測定値には、虚偽コントロール（０）に対するａ波（１５±７）、虚偽コントロール（０）に対する混合ｂ波（３７±１５）、虚偽コントロール（７±５）に対する錐体ｂ波（１６±１１）、虚偽コントロール（０％）に対する桿体の寄与（５８±３９％）が含まれる。これらの結果は、前記ＲＣＳモデルでの視細胞の維持の証拠と共に、臍帯細胞が移植された動物で視覚反応性が改善したことを示す。ＥＲＧへの反応性での低下が、検査した前記９０日目の動物で観察されたが、虚偽で処理されたコントロールと比較した視覚機能の維持は良好であった。
【０４００】
臍帯細胞または胎盤細胞と対照的に、繊維芽細胞の移植は、検査した前記パラメータのいずれでも改善を示さず、値は、虚偽で処理されたコントロール以下であった。
【０４０１】
【表３２】
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【０４０２】
組織学
移植後に、炎症反応の組織学的証拠はなく、浸潤する免疫細胞が、前記分娩後細胞グループのニッスル染色切片に観察されなかった。しかし、繊維芽細胞の移植は、動物の死を起こし（ｎ＝７）、初期段階の炎症反応の兆候があった。臍帯移植の動物で９０日目の組織学検査では、視細胞の救済が形態学的に、はっきりと実証された。前記視細胞は、前記内顆粒層から、間隙によって分離された厚い層を形成しており、これは他の網膜細胞から構成されていた。これに比較して、前記虚偽コントロールで前記外層の厚さは、最善でも不連続的な単層であり、前記移植された眼の約５つの細胞の厚さと対照的であった。正常な動物に比較すると、これは、通常観察される視細胞層の厚さの半分よりわずかに大きかった。
【０４０３】
機能的な評価
移植物が視力喪失を防護する効力は、２匹の動物で電気生理学的反応を評価することによって監視された。光反応の感度閾値を使用して、虚偽注入のコントロール眼と臍帯細胞が移植された眼で、視覚野の救済の領域を明確にした。非栄養障害ラットでは、視覚閾値は、バックグランドより０．５対数カンデラ／ｍ２高い値を超えることは決してなかった。手術されていない栄養障害性ラットでは、前記閾値は通常、４対数カンデラ／ｍ２の高さである（８）。対照的に、手術されていない虚偽注入の栄養障害性ラットでは、前記閾値は２．９〜４．９対数カンデラ／ｍ２の範囲であり、平均の閾値は４．０対数カンデラ／ｍ２であった。また、いくつかの場合には記録が取得できなかった。このように、前記虚偽注入のラットは、耳側網膜で非常に局所的な機能的な救済を示した。しかし、前記ヒト臍帯で移植されたラットは、閾値が０．８から２．１対数カンデラ／ｍ２の範囲であり、平均閾値が１．３対数カンデラ／ｍ２であって、実質的により高いレベルの視覚維持を示した。
【０４０４】
要約
栄養障害性ＲＣＳラットに臍帯細胞を移植すると、視細胞を保護することが示された。この反応は、胎盤細胞での移植後にも少し見られた。しかしａ波反応での改善は観察されなかった。この変性モデルでは、前記ａ波は３０日目から６０日目の間に消え、前記ｂ波は３ヶ月以内に消えると予想される。したがって、維持されたａ波は、真の正常な桿体機能が保持されたことを示す。ｂ波への桿体の寄与は、異常な桿体の機能の可能性がなお存在することを示唆する。維持された非桿体ｂ波は、どれだけの錐体の機能が維持されているかの基準であり、それは視覚の真の基準である。したがって、臍帯移植後に、生理的および解剖的の両方で査定された改善のレベルが、当明細書で明確である。ＥＲＧ測定値は、視細胞の損失後の視覚機能の評価を提供し、前記網膜での電気活動の変化を示す。しかし、ＥＲＧは、画像形成機能に関しては直接の情報を提供しない。この研究で使用された小丘の感度閾値の測定は、視覚野が比較的に維持されている兆候を提供する。この測定の重要性は、機能的な救済および解剖学的な維持の程度の間の相関に基づき、また、収集された前記データと、ヒトでの視覚野の視野測定結果との比較に基づいている（９）。前記移植は、前記検査された動物で疾患過程の遅滞を実証した。このように、当明細書で示された前記結果は、前記網膜下空間へのヒトＰＰＤＣを移植することの機能的効力の明らかな証拠と、前記移植された細胞が位置する一般的な領域に救済が起こることを実証している。
【０４０５】
実施例１８の参考文献
１．Ｄ’Ｃｒｕｚ  Ｐ．Ｍ．ら、２０００，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．９：６４５〜６５１．
２．Ｌｉ，Ｌ．Ｘ．&  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，１９８８，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．４７：９１１〜９１７．
３．Ｓａｕｖｅ，Ｙ．ら、２００４，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４４：９〜１８
４．Ｎｕｓｉｎｏｗｉｔｚ，Ｓ．ら、１９９９，Ｒｉｄｄｅｒ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４０：２８４８〜２８５８．
５．Ｎｉｘｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、２００１，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２９：１９３〜１９６．
６．Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．ら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８：９９４２〜９９４７．
７．Ｓｉｍｉｎｏｆｆ，Ｒ．&  Ｋｒｕｇｅｒ，Ｌ．，１９６８，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０：４０３〜４１４．
８．Ｂｌａｋｅｍａ，Ｇ．Ｗ．&  Ｄｒａｇｅｒ，Ｕ．Ｃ．，１９９１．Ｖｉｓｕａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．６：５７７〜５８５．
９．Ｂｅｃｋ，Ｒ．Ｗ．ら、１９８５，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ９２：７７〜８２．
【０４０６】
本発明は、以上に記述された、または例示された前記実施形態に限定されるものではない。本発明は、添付の請求項の範囲内での変更および修正が可能である。
【配列表】
2007528703000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月23日(2007.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記眼変性疾患を治療するのに有効な量の眼変性疾患を治療するための分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された細胞。
【請求項２】
請求項１記載の細胞において、この細胞は、実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯組織に由来する細胞を有する単離された分娩後由来細胞であって、前記細胞は、培養において自己複製および増殖することができ、また神経表現型の細胞へ分化する能力を有するものであり、前記細胞は、成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができ、また前記細胞はさらに、以下の特徴の少なくとも１つを含み、その特徴は、
ａ）培養で少なくとも約４０回の倍加能力を有する、
ｂ）コーティングされた、またはコーティングされていない組織培養容器に接着し増殖するものであり、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、
ｃ）組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生する、
ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つを産生する、
ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱのマーカー少なくとも１つの産生の欠如、
ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関して、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御されている遺伝子１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコードする遺伝子少なくとも１つが増加した遺伝子の発現、
ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２  ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネルサブファミリーＮ  メンバー４と、インテグリン  ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメインを含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利���ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つが減少した遺伝子の発現、
ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
ｉ）ＥＬＩＳＡで検出した場合、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
である、細胞。
【請求項３】
１若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離される、請求項１記載の細胞であって、この細胞は、
メタルプロテアーゼ活性、粘性溶解活性、および中性プロテアーゼ活性を含むものである、細胞。
【請求項４】
正常な核型を有する、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
請求項１記載の細胞において、前記細胞はそれぞれ、フローサイトメトリーで検知した場合、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを含むが、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれをも含まないものである。
【請求項６】
請求項１記載の細胞を有する、細胞集団。
【請求項７】
請求項６記載の細胞集団であって、この細胞集団は、
分娩後由来細胞の実質的に均一な集団である。
【請求項８】
分娩後由来細胞群のクローン細胞株を含む、請求項７記載の細胞集団。
【請求項９】
請求項６記載の細胞集団であって、この細胞集団は、
前記分娩後由来細胞群および少なくとも１つの他の細胞タイプを有する不均一な集団である。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞集団において、前記少なくとも１つの他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、神経細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、他の多分化能幹細胞、または他の多能性幹細胞である。
【請求項１１】
請求項６記載の細胞集団から調製された、細胞溶解物。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞溶解物から調製された、溶解性細胞分画。
【請求項１３】
請求項６記載の細胞集団から調製された、細胞外マトリックス。
【請求項１４】
請求項６記載の細胞集団であって、この細胞集団は、
幹細胞の分化を神経系統または上皮系統の方へ刺激させる１若しくはそれ以上の因子に接触させて培養されるものである。
【請求項１５】
請求項１４記載の細胞において、前記眼変性疾患は、急性眼変性疾患である。
【請求項１６】
請求項１５記載の細胞において、前記急性眼変性疾患は、脳損傷、視神経損傷、または眼障害である。
【請求項１７】
請求項１４記載の細胞において、前記眼変性疾患は、慢性変性疾患、または進行性変性疾患である。
【請求項１８】
請求項１７記載の細胞において、前記慢性疾患または前記進行性変性疾患は、黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、または縁上皮細胞欠損症である。
【請求項１９】
請求項１４記載の細胞において、
前記細胞は、神経系統細胞または上皮系統細胞に分化するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されるものである。
【請求項２０】
眼変性疾患を治療するための薬学的組成物であって、薬理学的に許容される担体と、前記眼変性疾患を治療するのに有効な量の分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞とを有するものである薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項２０記載の薬学的組成物において、前記眼変性疾患は、急性眼変性疾患である。
【請求項２２】
請求項２０記載の薬学的組成物において、前記眼変性疾患は、慢性変性疾患、または進行性変性疾患である。
【請求項２３】
請求項２０記載の薬学的組成物において、前記多分化能または多能性の細胞は、実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来する単離された分娩後由来細胞であって、前記細胞は、培養において自己複製および増殖することができ、少なくとも１つの神経表現型の細胞群に分化する能力を有するものであって、また、前記細胞は、成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができるものであって、さらに前記細胞は、以下の特徴の少なくとも１つを含むものであって、それらの特徴は、
ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器に接着し増殖するものであって、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むものである、
ｃ）組織因子とビメンチンとα−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの細胞表面マーカー類の少なくとも１つの産生の欠如、
ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連して、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコード化する遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している、
ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連して、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫  腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２  ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ  クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カリウム活性化チャネルサブファミリーＮ  メンバー４と、インテグリン  ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心���ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質  ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つに対する遺伝子の発現が減少している、
ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるように、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
である、薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項２０記載の薬学的組成物において、
前記細胞は、神経系統細胞群または上皮系統細胞群に分化するように、投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されるものである。
【請求項２５】
請求項２０記載の薬学的組成物であって、
少なくとも１つの他の細胞タイプを有する、薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項２５記載の薬学的組成物において、
前記他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、ニューロン前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多分化能または多能性の幹細胞である。
【請求項２７】
請求項２０記載の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、
少なくとも１つの他の薬剤を有するものである。
【請求項２８】
請求項２７記載の薬学的組成物において、前記他の薬剤は、前記眼変性疾患を治療するための薬剤である。
【請求項２９】
請求項２０記載の薬学的組成物であって、この組成物は、
眼の表面に投与するために調製されたものである。
【請求項３０】
請求項２０記載の薬学的組成物であって、この組成物は、
眼の内部に投与するために調製されたものである。
【請求項３１】
請求項２０記載の薬学的組成物であって、この組成物は、
前記細胞を含む基質または足場として処方されるものである。
【請求項３２】
眼変性疾患を治療するためのキットであって、このキットは、
薬理学的に許容される担体、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性細胞の集団、及び前記患者を治療する方法で前記キットを使用するための使用説明書を有するものである、キット。
【請求項３３】
請求項３２記載のキットであって、このキットは、さらに、
前記細胞群を培養するための少なくとも１つの試薬および使用説明書をさらに有するものである。
【請求項３４】
請求項３２記載のキットであって、このキットは、さらに、
少なくとも１つの他の細胞タイプの集団を有するものである。
【請求項３５】
請求項４２記載のキットであって、このキットは、さらに、
眼変性疾患を治療するための少なくとも１つの試薬を有するものである。
【請求項３６】
眼変性疾患を治療するのに有効な量で、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤であって、この製剤は、
前記細胞群の細胞溶解物、若しくは前記細胞が増殖した条件培地、或いは前記細胞の細胞外マトリックスを有するものである、製剤。
【請求項３７】
眼変性疾患を治療するための薬学的組成物であって、前記組成物は、
薬理学的に許容される或る担体、および、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤を有するものであり、前記製剤は、前記細胞群の細胞溶解物、若しくは前記細胞が増殖した条件培地、或いは前記細胞の細胞外マトリックスを有するものである薬学的組成物。
【請求項３８】
眼変性疾患を有する患者を治療するためのキットであって、このキットは、
薬理学的に許容される或る担体、および、分娩後胎盤または分娩後臍帯から単離された多分化能または多能性の細胞から作られた製剤を有するものであり、前記製剤は、前記細胞の細胞溶解物、若しくは前記細胞が増殖した条件培地、或いは前記細胞の細胞外マトリックス、及び前記眼変性疾患の治療のための前記キット構成成分を使用するための使用説明書を有するものである、キット。
【請求項３９】
眼変性疾患を治療するための移植用の細胞の生存、増殖、または活性を増加させる方法であって、この方法は、
移植用の前記細胞の生存、増殖、または活性を増加するのに有効な条件下で、分娩後胎盤組織または分娩後臍帯組織から由来する培養細胞と、前記移植用の細胞とを共培養する工程を有する方法。
【請求項４０】
眼変性疾患を治療するための移植用の細胞の生存、増殖、または活性を増加させるためのキットであって、このキットは、分娩後胎盤組織または分娩後臍帯組織に由来する培養細胞、および前記移植用の細胞の生存、増殖、または活性を増加するのに有効な条件下で、分娩後細胞と、前記移植用の細胞群とを共培養するための使用説明書を有するものである、キット。
【国際調査報告】
2007528703.tif 000039
2007528703.tif 000040
2007528703.tif 000041
2007528703.tif 000042