(57)【要約】本発明は、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）の分子レベルの検出および同定に関する。より詳細には、ＭＡＰに特異的なＩＳ９００因子の種々のゲノム領域を標的とした１以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲアッセイの開発がもたらされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）を検出するのに有用なオリゴヌクレオチドであって、以下の配列のオリゴヌクレオチド：
Ｐ１Ｎ    ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  Ｇ
Ｐ２Ｎ    ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＧ
Ｐ３Ｎ    ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＣＧ
Ｐ４Ｎ    ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＴＣ
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の１以上のオリゴヌクレオチドを単独または組み合わせて含んで成るオリゴヌクレオチドのセットであって、特に、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ、Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎ、およびＰ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎのうち少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドの組合せを含んで成るオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３】
試料中のＭＡおよびＭＡＰのうち少なくともいずれか１つを検出する方法であって、
（ａ）試料からＤＮＡを単離する工程と、
（ｂ）単離したＤＮＡを用いて、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つから１チューブのＰＣＲを実施する工程と、
（ｃ）陽性のＰＣＲ増幅結果についてスクリーニングする工程と、
（ｄ）ＭＡＰを含む試料を同定する工程と
からなり、
ＰＣＲにおいて請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを使用することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２に記載の１以上のオリゴヌクレオチドのセット、特に４つのオリゴヌクレオチド全てを含んで成るセットを使用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生きている動物由来の試料と、ヒトまたは動物などの生物由来、特に畜牛、家禽またはニワトリ由来の製品と、生物以外、特に埃または植物に由来する試料とのうち少なくともいずれか１つにおいてＭＡＰを検出するための、請求項３または４に記載の方法の使用方法。
【請求項６】
ヒトなどの生物、特に畜牛、家禽またはニワトリにおけるＭＡＰ感染を診断するための、請求項３または４に記載の方法の使用方法。
【請求項７】
標本中のＭＡＰを検出するためのキットであって、
ａ）試料からＤＮＡを単離する手段と、
ｂ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項２に記載のオリゴヌクレオチドのセットのうち少なくともいずれか１つと、
ｃ）陽性のＰＣＲ増幅結果についてスクリーニングする手段と、
ｄ）ＭＡＰを含む試料を同定する手段と
からなるキット。
【請求項８】
請求項１に記載の１以上のオリゴヌクレオチドおよび請求項２に記載の１以上のオリゴヌクレオチドのセットのうち少なくともいずれか１つと、容器とからなるキット。
【請求項９】
請求項１に記載の４つのオリゴヌクレオチド全てと、容器とからなるキット。
【請求項１０】
請求項３および４のうち少なくともいずれか１つに記載の方法のための、請求項７、８、または９に記載のキットの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis ：ＭＡＰ）の分子レベルの検出に関する。より詳細には、ＭＡＰの分子レベルの検出および同定において使用するために、ＭＡＰに特異的なＩＳ９００因子の種々のゲノム領域を標的としたオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたＰＣＲアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）は、微生物学的同定という観点では細心の注意が必要な細菌であり、数種の動物に対して、重篤かつ致命的であることも多い疾患すなわちパラ結核（ヨーネ病）を引き起こしうる。さらに、増加しつつある報告により、この特定の細菌ＭＡＰは、ある種のヒトの感染性腸疾患の病因と関連付けられつつある。（キオディーニ（Chiodini）、１９８９年）、（チャンバリン（Chamberlin）ら、２００１年）。
【０００３】
ＭＡＰの同定は、分子レベルの技法を広く適用することにより現在では容易である。しかしながら、結果の検証が必要であることから現在の方法は煩雑であり、実際には研究用にしか適用できないことが多い。
【０００４】
より具体的には、血清学によるＭＡＰ感染の診断には、感染初期に多い偽陰性の結果と、遺伝学的に関連のある天然のマイコバクテリウム菌種との交差反応とを回避するために、さらに確認が必要である（リッジ（Ridge ）ら、１９９１年；ニールセン（Nielsen ）ら、２００１年）。診断方法または確認方法としての培養の有用性は、ＭＡＰが増殖するのに必要なインキュベーション期間が長いことにより損なわれる。
【０００５】
従って、上記の細菌を検出および同定するためにはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が非常に有用なツールであると長い間考えられてきた（ハンス（Hance ）ら、１９８９年）。しかしながら、分子レベルの技法についても、特に該技法が日常的な診断に適用される場合は結果の確認が必要である。このことから、通常はハイブリダイゼーションアッセイを取り入れることが考えられるが、その場合は手順全体が煩雑となり、実際には研究用にしか適用できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、日常業務として臨床材料からＭＡＰを同定する際に確実に取り入れることが可能な低費用かつ迅速なＰＣＲを用いる方法が非常に重要である。低費用であっても、非常に高感度で特異性が高くなければならない。結果の再現性が非常に良いことを確実にすることも大変重要である。特に、ある実験室では申し分なく機能する方法が、別の実験室で使用すると採用できない結果を出すということは実際によくあるからである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、日常業務として臨床材料またはその他任意の材料からＭＡＰを同定する際に確実に取り入れることが可能な低費用かつ迅速なＰＣＲを用いる方法の開発が可能となった。
【０００８】
本発明のアッセイの信頼性および異なる実験室における結果の再現性を確実にするため
に、実験室間の照合確認を実施した。
本発明により、ヒト、動物、植物その他の由来の組織試料から、日常業務としてＭＡＰを検出および同定する方法を開発することが可能となった。前記方法は、臨床材料のみならず、ヒト、動物、または植物由来の他の材料、埃、一般の食品などについても適用可能である。
【０００９】
本発明のアッセイは、個別の様々な条件および慣行とは関係なく、最適な性能および費用と高い再現性とを兼ね備え、異なる実験室において適用可能である。
本発明は、以下に記載するオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
Ｐ１Ｎ    ＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴＴＧＡＧ
Ｐ２Ｎ    ＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧ
Ｐ３Ｎ    ＧＧＧＴＧＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＣＴＴＣＧ
Ｐ４Ｎ    ＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣ
のうち１つ以上を用いるＰＣＲアッセイの開発により実現される。
【００１０】
好適な実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットを作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーの組合せが用いられる。好適なオリゴヌクレオチドセットは、Ｐ１Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎである。特に好適なのは、４つ全てのオリゴヌクレオチドプライマーからなるオリゴヌクレオチドセット、すなわちＰ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎである。
【００１１】
これらのプライマーはＭＡＰに特異的なＩＳ９００因子のゲノム領域を標的としており、該プライマーによりマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）を効率よく迅速かつ信頼性をもって検出することが可能となる。これらのプライマーは、良い結果が得られるため多くの中から選択されたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上述のオリゴヌクレオチドプライマーを、単独または組合せとして使用することは、１チューブのＰＣＲアッセイで信頼性をもってＭＡＰを検出するのに好適であることが見出された。
【００１３】
好適な実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットを作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーの組合せが用いられる。ＭＡＰの検出に有用なオリゴヌクレオチドセットは、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ、Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ１Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎ、Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎである。
【００１４】
特に好適な別の実施形態では、４つ全てのオリゴヌクレオチドプライマーからなるオリゴヌクレオチドセット、すなわちＰ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎが用いられる。さらに好適なのは、４つ全てのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわちＰ１Ｎ／Ｐ２Ｎ／Ｐ３Ｎ／Ｐ４Ｎを用いて、１チューブのネスティドＰＣＲを使用することである。
【００１５】
ＰＣＲによりＭＡＰを信頼性高く検出する方法を得るために、異なる国にある実験室も一部含めたいくつかの実験室において試験を実施した。方法の正確さおよび信頼性を検出するために、通常ＰＣＲ反応を構成する種々のパラメータについて全ては統一せず、この要素を本発明の方法の評価にも取り入れた。上記の手法は、ＭＡＰに関してはこれまで報告されていない。
【００１６】
種々の実験室で、ＭＡＰ検出のためのＤＮＡ抽出法および種々のＰＣＲアッセイについ
て評価が開始された。ＤＮＡ抽出については、１つは実験室独自の方法、１つは市販の方法を使用し、ＰＣＲについては、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの拡張検索を用いたプライマーの特異性評価を始めとして、多数の異なるアッセイについて評価した。
【００１７】
こうして、本発明者らは、ＭＡＰに特異的なＩＳ９００因子の種々のゲノム領域を標的とした、１チューブのネスティドＰＣＲアッセイ、２つのネスティドＰＣＲアッセイ、および単一のＰＣＲアッセイに達した。これらの４つの方法を、陽性対照および陰性対照の試料に適用したが、該試料は、純粋な細菌培養物、ならびにパラ結核の蓄牛およびマイコバクテリウム・アビウムに感染したニワトリから採取したホルマリン固定パラフィン包埋組織試料（ＦＦＰＥ）で構成されるものとした。試験の実施に際しては、全ての試料をコード番号で特定し、その結果について共同研究中の実験室間で連絡した。信頼性および費用という基準では、好成績が得られたのは、上述のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる１チューブのネスティドＰＣＲアッセイを実験室独自のＤＮＡ抽出法と組み合わせた方法であった。この方法は、使用した陽性対照および陰性対照の試料から予想通りの結果をもたらし、遺伝学的に関連のあるマイコバクテリウム菌種からも識別が可能であった。試験を実施した種々の実験室から得られた結果の一致により、異なる実験室の条件下でも提示のアッセイの信頼性が高いことが示唆される。
【実施例】
【００１８】
（材料）
培養物および臨床材料（ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料（ＦＦＰＥ））からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡについて以下に記載する分子レベルの技法を実施した。
【００１９】
より詳細には、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）１０株とその他の種々のマイコバクテリウム属細菌３０株（表１に詳細に記載）の培養物を使用した。記載の方法の特異性を評価するために、いくつかの遺伝学的に関連のある細菌種（大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）、サルモネラ属細菌、エンテロバクター属細菌）の培養物を使用した。
【００２０】
実施した試験に含めた臨床材料（組織試料）は、畜牛およびニワトリから採取したホルマリン固定パラフィン包埋組織試料（ＦＦＰＥ）で構成されるものとした。畜牛からは、典型的なパラ結核の病変を有する腸のＦＦＰＥ試料を１０個使用した。ニワトリからは、典型的なマイコバクテリウム感染の病変を有する肝臓および腸のＦＦＰＥ試料を同数使用した。畜牛およびニワトリ由来の臨床材料は、培養ではそれぞれＭＡＰおよびマイコバクテリウム・アビウム亜種アビウム（ＭＡＡ）について陽性であった。さらに、マイコバクテリウム感染について臨床上またはその他の兆候がないヒトおよび動物から採取した、腸およびリンパ節の新鮮なＦＦＰＥ試料について検査した。この材料を陰性対照として使用した（このデータは本明細書には示していない）。
【００２１】
（方法）
Ａ．  ＦＦＰＥ組織試料および細菌培養物からのＤＮＡ抽出
ＦＦＰＥ組織試料からのＤＮＡ抽出を２つの方法で実施し、いずれの方法においても試料ごとに１０μｍ厚のパラフィン切片２〜３枚を使用した。
【００２２】
Ａ１．  ＤＮＡ抽出については、既報（実験室独自の方法）（イコノモプーロス（Ikonomopoulos ）ら、１９９９年）のように実施したが、材料をキシレン中で６０℃にて繰り返しインキュベーションし、１００％エタノールおよび最後に７５％エタノールによりワックスを除去した。前記処理工程で得られた産物を、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫ中で５０℃にて約１時間インキュベートすることにより消化する。
【００２３】
これらのタンパク質を、フェノールおよびフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール溶液を逐次添加することによって取り除いた。続いて、ＤＮＡをエタノールおよび酢酸ナトリウム（サムブルック（Sambrook）ら、１９８９年）で沈殿させ、沈殿物の形態で回収してこれを５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解する。
【００２４】
Ａ２．  別法として、ＦＦＰＥ試料からのＤＮＡ抽出を、ＭｉｃｒｏＬｙｓｉｓ（商標）キット（マイクロゾーン（Microzone ））を用いて製造業者の指示書に従って実施した。
【００２５】
細菌からのＤＮＡ抽出は、ＣＴＡＢ‐プロテイナーゼＫに続いてフェノールとフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールの組合せを用いることにより実施した。ＤＮＡ抽出物を、上述のようにエタノールおよび酢酸ナトリウムにより沈殿させた。
ＤＮＡ抽出物の量、純度、および完全性についての品質評価は、光学密度の計算とアガロースゲル電気泳動により実施した。
【００２６】
Ｂ．  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによるＧｅｎＢａｎｋデータベースの拡張検索を用いたプライマーの特異性評価を始めとして、多数のＰＣＲアッセイについて評価を実施した。こうして、ＭＡＰに特異的なＩＳ９００因子のゲノム領域を標的とする全部で７対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる４つの異なるＰＣＲアッセイに達し、該アッセイを評価した。これらの異なるＰＣＲアッセイについて、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４の各項目において以降に記載する。より具体的に以下に述べる。
【００２７】
Ｂ１．  第１の対照ＰＣＲアッセイには、オリゴヌクレオチドプライマーＩＳ９００‐ＦおよびＩＳ９００‐Ｒ（表２に示す）を用いた。これらのプライマーによりＭＡＰのＩＳ９００因子の７０７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される（グリーン（Green ）ら、１９８９年）。
【００２８】
Ｂ２．  別の対照ＰＣＲアッセイは、ＭＡＰのＩＳ９００因子の５６３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するプライマーｓ２０４およびｓ７４９（表２）を用いるネスティドＰＣＲとした。この反応の産物の１：１０希釈物を、プライマーｓ３４５およびｓ５３５（表２）を用いる第２の反応に組み入れたが、ｓ３４５およびｓ５３５は、ｓ２０４およびｓ７４９プライマーにより増幅された５６３ｂｐのＤＮＡ断片の内部の２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するプライマーである（イングルンド（Englund ）ら、１９９９年）。
【００２９】
Ｂ３．  別の対照ＰＣＲアッセイは、ＩＳ９００因子の３０２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するプライマーＩＳ０１およびＩＳ０４（表２）を用いるネスティドＰＣＲとした。この反応の産物の１：１０希釈物を、プライマーＩＳ０２およびＩＳ０３（表２）を用いる第２の反応に組み入れたが、ＩＳ０２およびＩＳ０３は、この前に増幅された３０２ｂｐのＤＮＡ断片の内部の１５９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するプライマーである。
【００３０】
Ｂ４．  最後に、本発明による１つのＰＣＲアッセイを、プライマーＰ１Ｎ、Ｐ２Ｎ、Ｐ３Ｎ、およびＰ４Ｎ（表２）を含む１チューブのネスティドＰＣＲとした。全てのプライマーを、ＩＳ９００因子の２５７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲ反応混合物に同時に加える。
【００３１】
上述のＰＣＲアッセイそれぞれについての反応混合物を、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（室温でｐＨ８．４）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ（Promega ））、０．０５‐０．１μｇ  ＤＮＡとし、ＨＰＬＣ用の水
を用いて最終容量をアッセイＢ１およびＢ４については５０μｌ、アッセイＢ２およびＢ３については２５μｌとして調製した。
【００３２】
アッセイＢ１‐Ｂ３について使用した温度設定（表３）は、９４℃、５分間の初期変性ステップ、続いて、９４℃で１分間、６３℃（アッセイＢ１およびＢ２）または６２℃（アッセイＢ３）で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３５回とした。この段階に続いて、ＤＮＡ産物を完成させるために７２℃で１０分間のインキュベーションステップを実施した（表３）。ネスティド反応Ｂ２およびＢ３ではいずれの段階も同じ温度設定で実施したが、アッセイＢ４ではネスティド反応の２つの段階それぞれについて異なる温度設定とした（表３）。第１段階は、９４℃、１分間の初期変性ステップに続いて、９４℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを１６回とし、そして９４℃で１分間、６７℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３０回、その後最終伸長ステップを７２℃で３分間とした（表３）。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで電気泳動して分析し、エチジウムブロマイドで染色し、写真を撮影した。
【００３３】
上述の各方法の感度について、既報（イコノモプーロス（Ikonomopoulos ）ら、１９９８年）のように、ＭＡＰ培養物から抽出したＤＮＡの１０倍段階希釈物に対して該方法を適用することによって評価した。
【００３４】
（再現性の評価）
ＤＮＡ抽出法およびＰＣＲアッセイを、種々の実験室それぞれの異なる特定の条件（サーマルサイクラーの種類、ＤＮＡポリメラーゼの種類、緩衝液）の下で、上述の参照用材料および臨床材料に対して適用した。試料はコード番号で特定し、結果について実験室間で連絡して比較した。
【００３５】
（結果）
Ａ．  ＤＮＡ抽出
方法Ａ１およびＡ２により、使用したＦＦＰＥ試料から十分な品質および量のＤＮＡが得られた。２〜３枚の１０μｍ厚パラフィン切片から得られたＤＮＡの量は１μｇ／μｌと概算され、品質（純度および完全性に関して）は、ＤＮＡ抽出に使用した方法に関係なく同じであった。しかしながら、実験室独自の方法（Ａ１）はより煩雑ではあるものの大幅に低費用であることが明らかとなった。
実験室独自の方法（Ａ１）で細菌培養物から抽出されたＤＮＡ産物の品質は、予想通り、産物の量および完全性に関して全く十分であった。
【００３６】
Ｂ．  ＰＣＲ
上述の４種のＰＣＲアッセイ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）を、使用した細菌培養物（表１）から抽出したＤＮＡに対して適用したところ、使用した全てのＭＡＰ菌株の特異的な検出および同定が可能であった。一方で、陰性対照は、細菌培養物についてもＦＦＰＥ試料についても、評価したどのプライマー対を用いても陽性の結果を生じるものはなかった。ヨーネ病の畜牛由来の１０種のＦＦＰＥ試料から、方法Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４を用いて記録された陽性結果の数は、それぞれ６、９、６、および１０件であった（表４）（図１）。
【００３７】
評価したＰＣＲ法の感度は、特にネスティドアッセイについて十分なものであった。細菌培養物から陽性結果を得るのに必要な最少のＤＮＡ量は、約１５００個の細菌細胞に相当する（バエス（Baess ）ら、１９８４年）８ｐｇ（方法Ｂ４）と概算された。
【００３８】
Ｃ．  再現性の評価
細菌培養物およびＦＦＰＥ組織試料からＭＡＰを検出するために方法Ｂ１〜Ｂ４を適用
することによって、参加した全ての実験室において完全に一致した結果が得られた。
【００３９】
より具体的には、方法Ｂ２およびＢ３は、組み合わせて用いた場合にのみ、あらゆる種類のＭＡＰを診断対象とすることが可能であることが判明し、さらに同じ問題が方法Ｂ１についても見出された。方法４では、使用した材料に関係なくＭＡＰの検出が可能であった。
【００４０】
本発明者らの実験データに基づいて、１チューブのネスティドＰＣＲである方法Ｂ４が、最も高い感度、特異性および再現性を同時に示し、さらに可能なかぎり短時間かつ必要な費用を最少として結果を直接確認することも同時に可能であることが示されている。方法Ｂ１およびＢ４は、培養物から抽出された細菌の中から特異的にＭＡＰを検出することが見出された。しかしながら、全てのプライマーがＭＡＰを検出するために設計され、該プライマーの合成が同一のゲノム領域（ＩＳ９００）に基づいて規定されたにもかかわらず、使用した全ての陽性ＦＦＰＥ試料について検出したのは方法Ｂ２およびＢ４だけであった。この事実は、本発明の意義についてさらに別のパラメータを示唆し、設計された評価手法の正しさを証明し、その結果、本発明で提供されるプライマーを用いる方法は、研究用だけでなく日常的に信頼性を伴って使用するために結果の誤りを確実に最小限とする。
【００４１】
実験室間の共同研究による検証も実施された方法Ｂ１およびＢ３により記録された結果の食い違いは、意外ではなかった。方法Ｂ１はネスティド反応よりも感度が低いことが予想されており、一方、方法Ｂ３は特に方法Ｂ２の診断上の有効性を実践しかつ増大させるために設計されたものである。このことが的確であることは、方法Ｂ２およびＢ３の組合せによっても本発明者らの全ての陽性対照のＦＦＰＥ試料が正確に同定されてはいない（図１）ことから実際に証明された。
【００４２】
方法Ｂ１およびＢ３により記録された結果の食い違いは、少なくとも評価したＦＦＰＥ試料に関しては、ＭＡＰ菌株の遺伝的多様性に起因するとの可能性も考えられる。特にＦＦＰＥ試料について偽陰性の結果を引き起こすことの多いＰＣＲ阻害剤の存在（ハーモン‐テイラー（Hermon-Taylor ）ら、２０００年）に関しては、全てのＰＣＲ反応に同一のＤＮＡ産物を使用した（方法Ｂ２およびＢ４についても同様）ことから、上記のような食い違いの原因にはなりえない。同じ理由から、ＤＮＡ抽出法の産物を常に電気泳動および分光分析法により評価して、品質の悪いＤＮＡが得られた試料は必ず廃棄したので、上記の結果は、生じうるＤＮＡ断片化に起因するものでもありえない。最後に、上記の全てのＰＣＲ反応の共通の標的としてＩＳ９００因子を選択したことも、方法Ｂ１およびＢ３を無効としうる要因からは除外されるべきである。この特定の標的ＤＮＡ領域を選択することは、ＩＳ９００因子の存在を実証することが現在ではＭＡＰの分子レベルの同定において必須条件とみなされている（グリーン（Green ）ら、１９９８年）ので、必須のことであった。
【００４３】
方法Ｂ４およびＢ２がいずれも診断上十分な方法であると分かったという事実とはかかわりなく、方法Ｂ４は、方法Ｂ２と比較しても重要な有利な点を示すものである。より具体的には、方法Ｂ２は連続した２つの段階からなるＰＣＲアッセイである。１つの段階から別の段階へと進行させるために、第１の段階で使用したチューブを開けなければならないが、このことは、すぐ前の反応物が混合物中に入る可能性が高いことから、実験室内でよく見られるそれ以前の陽性アッセイ由来のＤＮＡ産物の影響を受ける危険を有する（キャリーオーバー効果）。これに対して、このような偽陽性の結果の増大を引き起こすことの多い事実は、方法Ｂ４によって回避される。なぜならば、このネスティドアッセイの全ての構成要素は反応用チューブに一緒に入れられて、アッセイの間にチューブを開けることはないからである。以上のことに加えて、方法Ｂ４は方法Ｂ２と比較して顕著な有利な
点を有するが、方法Ｂ３についても有利な点を有する。方法Ｂ４に必要な時間は著しく短く、反応が１回だけなので必要な消耗品が少ないため低費用だからである。
【００４４】
方法Ｂ４の上記の有利な点ならびに、上述の他のＰＣＲアッセイと同様に、アッセイの費用および複雑度を著しく増大させるであろう内部対照を用いることなく、また該方法に要する時間を特に増大させるであろうＤＮＡハイブリダイゼーションを用いることもなく、結果が制御されるという事実から、方法Ｂ４は明らかに評価した他のいずれの方法よりも優れている。
【００４５】
以上に加えて、方法Ｂ４は非常に高い感度を示したが、感度が高いことにより偽陰性の結果の割合は非常に低くなる。さらに、この本発明により提供されるアッセイ（Ｂ４）が使用した全ての材料から完全にＭＡＰのみを検出したという事実は、該アッセイの高い特異性を示しており、特異性が高いことによっても偽陰性の結果の割合は非常に低くなりうる。この点に関して、特記すべき重要な点は、前記アッセイが、培養物中の抽出された細菌についてだけでなく、ＭＡＰと特に高い遺伝学的関連を示すマイコバクテリウム・アビウムに感染したニワトリ由来のＦＦＰＥ試料中の細菌についても絶対的特異性を示したことである。評価を実施した他の方法の一部に予想された効率の悪さとは対照的に、方法Ｂ４に関して共同研究している実験室により記録された結果の完全な再現性は、信頼性を高め、上記のことを支持するものである。
【００４６】
最後に、ネスティドＰＣＲアッセイＢ４が速さと比較的低費用であることとを特徴とし、さらにホルマリン固定パラフィン包埋組織試料由来のＭＡＰを検出することも可能であるということについて証拠を提示することができる。後者については、本発明者らの細菌培養物によってだけでなく、ニワトリ由来のＭＡＡ陽性のＦＦＰＥ試料によっても（ＭＡＰと遺伝学的類似性が高いにもかかわらず）実証された。最後に、共同研究している実験室により方法Ｂ４を用いて得られた結果の一致から、Ｂ４の反応が、信頼性の高い日常業務としてのＭＡＰ診断のために最も有望な方法である。
【００４７】
ＰＣＲ反応の技術的原理を考慮すると、ＤＮＡ抽出法が上述と同様の品質のＤＮＡを生成すると仮定すれば、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明の方法により臨床試料以外の試料についても同等（感度と特異性）の結果を得ることが可能である。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明のアッセイの最適性能は、ギリシャ国およびチェコ共和国から採取して種々のＰＣＲアッセイおよび培養により評価したチーズ試料およびミルク試料からのＭＡＰの検出により検証済みである。
【００４８】
（表の説明）
表１は、本発明のＰＣＲ法の評価のために使用したマイコバクテリウム菌種の原型株を示す。
表２は、使用したプライマーのヌクレオチド配列組成を示す。
表３は、ＰＣＲ反応Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４の温度設定を示す。
表４は、畜牛から採取した典型的なヨーネ病の病変を有するＦＦＰＥ試料についての、ＰＣＲ結果の比較を示す。
【００４９】
【表１】
2007508029.tif 000002
2007508029.tif 000003
【００５０】
【表２】
2007508029.tif 000004
【００５１】
【表３】
2007508029.tif 000005
【００５２】
【表４】
2007508029.tif 000006
【００５３】
【表５】
2007508029.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】畜牛およびニワトリから採取したＦＦＰＥ試料の検査に取り入れた、方法Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図。より具体的には、  レーン１は１００ｂｐＤＮＡラダー（バイオラブス（Biolabs ））を示し、  レーン２〜４は畜牛の小腸由来の試料について実施したＰＣＲのＤＮＡ産物を示し、  レーン５は畜牛の腸間膜リンパ節由来の試料について実施したＰＣＲのＤＮＡ産物を示し、  レーン６〜７は畜牛の回腸由来の試料について実施したＰＣＲのＤＮＡ産物を示し、  レーン８はニワトリ脾臓試料から得られたＰＣＲ結果を示し、  レーン９はニワトリ肝臓試料から得られたＰＣＲ結果を示し、  レーンＴは陰性対照試料（ＤＮＡなし）から得られたＰＣＲ結果を示す。
【図１】
2007508029.tif 000008
【配列表】
2007508029000001.app
【国際調査報告】
2007508029.tif 000009
2007508029.tif 000010
2007508029.tif 000011