(57)【要約】本発明は、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するための少なくとも１つの干渉ＲＮＡ分子を発現する細胞及び動物、及び細胞及び動物を産生する方法に関する。本発明はさらに、新規なｉＲＮＡ分子、及びｉＲＮＡ分子を産生するためのＤＮＡテンプレートに関する。一実施形態では、本発明は、細胞又は動物のホメオスタシスに最小限の効果を有する標的化された挿入ベクターの使用を含む、タンパク質の発現を抑制するための新規方法及び材料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ構築物を細胞のゲノムの所定の位置に挿入する工程を含む、トランスジェニック細胞を産生するための方法。
【請求項２】
ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ構築物を細胞のゲノムの所定の位置に挿入する工程を含み、該挿入が該細胞の正常な遺伝子発現を破壊しない、トランスジェニック細胞を産生するための方法。
【請求項３】
（ｉ）標的ｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１つのｉＲＮＡ配列を同定する工程；
（ｉｉ）細胞中の標的内因性遺伝子配列を同定する工程；
（ｉｉｉ）ｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物及び該内因性標的配列に対して相同な標的配列を製造する工程；
（ｉｖ）該ＤＮＡ構築物を該細胞に導入する工程；及び
（ｖ）該ｉＲＮＡ分子が発現され、それによって該標的ｍＲＮＡの発現を調節する条件下で、該細胞を増殖させる工程
を含む、標的ｍＲＮＡの発現を調節するための方法。
【請求項４】
前記挿入が標的遺伝子のエキソン内へのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記挿入が標的遺伝子のイントロン内へのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記挿入が前記標的遺伝子の機能を破壊しない、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ構築物が、該標的遺伝子と前記ＤＮＡ構築物との間の相同的組換えを可能にするために、標的遺伝子に対して相同な配列を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ構築物が合成イントロン内に含有される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記合成イントロンが機能性イントロンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成イントロンが内因性イントロン内に挿入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成イントロンが内因性エキソン内に挿入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ構築物が、Ｄｒｏｓｈａ基質であるＲＮＡ分子をコードする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
ｉＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが相同的組換えを介して前記遺伝子内に挿入される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１又は２に従って産生されるトランスジェニック細胞。
【請求項１７】
請求項１又は２に記載の細胞を含むトランスジェニック動物。
【請求項１８】
第１の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第１のヌクレオチド配列と、第２の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第２のヌクレオチド配列とを含み、該第１及び第２のヌクレオチド配列が実質的に共にハイブリダイズして二本鎖ｉＲＮＡ分子を形成する、二本鎖ｉＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記第１及び第２の標的ｍＲＮＡが同じである、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記第１及び第２の標的ｍＲＮＡが異なる、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記第１及び第２のヌクレオチド配列が反復性である、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記第１及び第２のヌクレオチド配列を分離する第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記第１及び第２のヌクレオチド配列が１９〜３２ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記第３のヌクレオチド配列が４〜１０ヌクレオチド長である、請求項２２に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２５】
第１の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第１のヌクレオチド配列と、第２の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第２のヌクレオチドとを含み、該第１及び第２のヌクレオチド配列が実質的に共にハイブリダイズして二本鎖ｉＲＮＡ分子を形成する、二本鎖ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
（ｉ）標的ｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を同定する工程；
（ｉｉ）該相補的な配列を分析して、共にハイブリダイズ可能な配列の一部分を同定する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で同定された２つの相補的な配列を含有するｉＲＮＡ分子を製造する工程
を含み、該製造する工程を細胞中で行なうことができる、標的ｍＲＮＡの発現を調節するために二本鎖ｉＲＮＡ分子を産生するための方法。
【請求項２７】
前記ｉＲＮＡがＤＮＡ構築物によってコードされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｉＲＮＡ分子が、共にハイブリダイズする２個の相補的なヌクレオチド配列を分離する第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記相補的な配列が約１９〜３２ヌクレオチド長である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１つの遺伝子の少なくとも２つの領域の発現を調節し、前記遺伝子の発現が機能的に排除される、１個のｉＲＮＡ分子。
【請求項３１】
標的ｍＲＮＡの同じ領域を標的化する２つのｉＲＮＡ分子を投与する工程を含む、標的ｍＲＮＡの発現を排除するための方法。
【請求項３２】
遺伝子ファミリーの全てのメンバーに共通の相同性領域を標的化することによって、前記遺伝子ファミリーの発現を調節する１個のｉＲＮＡ分子。
【請求項３３】
ブタ内因性レトロウイルスの発現を阻害するｉＲＮＡ分子。
【請求項３４】
複数の種類のブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）に結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３５】
前記ｉＲＮＡがＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂに結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３６】
前記ｉＲＮＡがＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｃに結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３７】
前記ｉＲＮＡがＰＥＲＶ−Ｂ及びＰＥＲＶ−Ｃに結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３８】
前記ブタ内因性レトロウイルスのｅｎｖ領域を標的化する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項３９】
前記ブタ内因性レトロウイルスのｇａｇ領域を標的化する、請求項３８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項４０】
前記ブタ内因性レトロウイルスのｐｏｌ領域を標的化する、請求項３９に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項４１】
以下のｇａｇ配列を標的化する、請求項３９に記載のｉＲＮＡ分子：
ＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＴ、又はこれに実質的に相同性を有するか、又はこれにハイブリダイズする配列。
【請求項４２】
以下のｐｏｌ配列を標的化する、請求項４０に記載のｉＲＮＡ分子：
ＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＴ、又はこれに実質的に相同性を有するか、又はこれにハイブリダイズする配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００３年１１月２１日に出願された、米国特許出願第６０／５２３，９３８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するために少なくとも１つの干渉ＲＮＡ分子を発現する細胞及び動物、及び細胞及び動物を産生する方法に関する。本発明はさらに、新規なｉＲＮＡ分子、及びｉＲＮＡ分子を産生するためのＤＮＡテンプレートに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
トランスジェニック細胞及び動物の潜在能力を調査用途及び治療用途の両方に利用するために、外因性及び内因性の遺伝子転写物の発現を制御するための実用的な技術が存在しなければならず、内因性又は外因性のいずれかの遺伝子機能が遺伝的に排除されている動物を産生するためにこれを適用することができる。現在の技術は、それらがこれらの必要条件を満たすという能力において制限されている。
【０００４】
遺伝子機能の標的化された破壊は、外因性制御核酸のマイクロインジェクション又はトランスフェクション、突然変異生成及び相同組み換えを含む技術によって現在達成されている。伝統的に、選択された遺伝子は、標的ベクターを用いた組換えによって、又は組み込みベクターを用いたランダムな破壊によって細胞において破壊された。目的の遺伝子が破壊された細胞は、例えば、ゲノムに挿入された選択マーカーを使用して、又は目的の遺伝子の機能検査によって確認することができる。破壊が細胞中で確認されると、異種接合動物を、体細胞核移植又は胚幹細胞からの子孫の産生を経てクローン化によって産生することができる。異種接合動物は、時々、所望の遺伝子破壊が各対立遺伝子中に存在し、完全な遺伝子相補体が機能しなくなり、ホモ接合動物を産生するように育つ場合がある。異種接合動物にはさらに、さらなる遺伝子標的化又は突然変異生成が行われることがある（非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００５】
潜在的に貴重であるにもかかわらず、従来の技術は時間がかり、面倒な産生及びふるい分けプログラムを必要とし、非常に低い成功率を示す。さらに、共通に使用される技術は、遺伝子操作を受け入れることが知られている（例えば、選択可能なマーカー遺伝子、遺伝子の分離を制御する能力、又は有性生殖が証明されている）有機体に限られている。それらの低い成功率のため、これらの技術はさらに、大量の細胞又は有機体を所望の表現型を単離するために殺すことができるような適用に限られている。それに加えて、既知の技術は、外因性遺伝子の調節（例えば、ウイルス感染によって細胞に導入されるもの）、又は異なってアクセス可能な表現型が導かれない冗長な機能を有する遺伝子の調節に容易には適用されない。同様に、遺伝子破壊は、所望の表現型を得るためにホモ接合の状態に維持されなければならないので、この技術は、必要な同系交配のために広く採用されることはできない。遺伝的多様性からの利点を得る任意の適用は、現在の方法論に修正することができない。
【０００６】
遺伝子の発現を破壊するための代替技術が最近現れた。ＲＮＡ干渉（ｉＲＮＡ）は、もともとはモデル有機体Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで記載された（非特許文献３；特許文献１（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．））。遺伝子データ及び生化学データは、主に低級真核生物の研究に起因して、ＲＮＡ干渉のための可能な機構を示す。小さい非翻訳ＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって発生遺伝子の発現を制御する、転写後遺伝子−サイレンシング機構を調節する。この機構は、植物、菌類及び動物に共通であり、これらのミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、小阻害ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとしても知られる）の生成は、一連の続いて起こるステップを含み、ここで、一次ＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、核においてより小さいｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに切断される。ＲＮａｓｅＩＩＩ（例えば、Ｄｒｏｓｈａ）は、核におけるｍｉＲＮＡ処理の開始ステップを実行するヌクレアーゼである（非特許文献４）。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを切断してｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを放出する。これらはサイトゾルへ移動し、Ｄｉｓｅｒ（ＲＮＡｓｅＩＩＩヌクレアーゼファミリーのメンバー）がは、さらにこれらを処理してｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから成熟ｍｉＲＮＡを生成する。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ分子のサイレンシングに影響を与える多成分リボヌクレオタンパク質複合体（すなわちＲＩＳＣ）と結びつく（非特許文献５）。ＲＩＳＣは、二本鎖ｍｉＲＮＡ分子の１つの鎖だけと結合する。他の鎖は細胞によって分解される。
【０００７】
植物、昆虫及び線虫において、ＲＮＡ干渉は、標的化されたノックアウト（ＫＯ）遺伝子型を生成する唯一の実用的方法である。しかし、最近までは、ＲＮＡ干渉技術は、哺乳動物のシステムに適用できるとは考えられていなかった。哺乳動物において、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化させると、アポトーシスカスケード及び細胞死を生じる（非特許文献６）。このように、ＲＮＡ干渉は、低級真核生物の遺伝子の調節に限られていると考えられていた。しかし、Ｅｌｂａｓｈｉｒ及び同僚は、２００１年に、ＰＫＲ活性化が約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡを必要とするということを発見した。それ故に、短いＲＮＡ配列を、アポトーシスカスケードを開始することなく哺乳動物の細胞に導入することができる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて発見されたデータに基づいて、２１〜２３塩基対のｓｉＲＮＡ配列が有効に遺伝子発現を制限することが知られていた。それ故に、単離においてこれらの配列を提供することによって、細胞の自然な防衛機構を迂回しつつ、遺伝子発現を減らすことを標的化することが可能になった（非特許文献７）。Ｅｌｂａｓｈｉｒらの公開から３ヶ月以内に、ある範囲のｓｉＲＮＡ分子（全て３０塩基対長未満）が、哺乳動物細胞における遺伝子発現を効果的に減らすことが示された（非特許文献８）。これらの二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含有していた。これらの発見に続き、いくつかのグループが、二本鎖干渉ＲＮＡ分子を安定化させ、異なる種類のｉＲＮＡ分子を作成し、それらを細胞に導入するためのいくつかのさらなるストラテジーを同定した。
【０００８】
Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌに対する特許文献１は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で細胞にＲＮＡを導入することによって、インビトロで細胞の標的遺伝子の発現を阻害する方法を請求する。ここで、ＲＮＡは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列から本質的になる第１の鎖と、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なリボヌクレオチド鎖から本質的になる第２の鎖とを有する二本鎖分子であり、第１及び第２のリボヌクレオチド配列は、互いにハイブリダイズして上記二本鎖分子を形成し、この二本鎖分子が標的遺伝子の発現を阻害する、別個の相補鎖である。
【０００９】
Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌによる特許文献２は、小さな合成二本鎖ＲＮＡ分子（１５〜４０ヌクレオチド長、各鎖に約０〜５ヌクレオチドの３’又は５’オ−バ−ハングを有する）を開示し、ここで、二本鎖ＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの一部分又は標的遺伝子の転写物と実質的に同じである。この出願はさらに、細胞機能に対する遺伝子「サイレンシング」の効果を試験するために使用可能なｓｉＲＮＡのアレイを開示する。
【００１０】
Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌによる特許文献３は、高い効力を有するｓｉＲＮＡ分子を開示する。この出願は、合成方法（例えば、ｓｉＲＮＡ分子の酵素的合成方法）及びｓｉＲＮＡ分子における改変ヌクレオチドアナログの使用を記載する。
【００１１】
小さな二本鎖ＲＮＡ分子の細胞への送達は、一部は分子の送達が非効率で不確定であるということに起因して、さらにｉＲＮＡの一時的な発現だけを生じるため、インビトロ用途には修正できない。ｉＲＮＡ技術における次の進歩は、ＤＮＡテンプレートから細胞内部でｉＲＮＡ分子を産生し、細胞内でのｉＲＮＡの安定な発現を得ることであった。
【００１２】
Ｂｅｎｉｔｅｃ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｌｔｄ．による特許文献４及び特許文献５は、遺伝子構築物でトランスフェクトされた動物細胞中の標的遺伝子の発現を遅延させ、抑制させ、又は減らすことができる、単離された遺伝子構築物を請求し、ここで、この遺伝子構造物は、構造的遺伝子配列の少なくとも２つの複製物を含有する。構造的遺伝子配列は、標的遺伝子の少なくともある領域と実質的に同じヌクレオチド配列として記載される、構造的遺伝子配列の少なくとも２つの複製物は、１個のプロモーター配列の制御下で使用可能な状態で配置され、その結果、構造的遺伝子配列の少なくとも１つの複製物が、プロモーター配列の制御下で同じ方向に使用可能な状態で配置される。
【００１３】
２００２年に、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献８）は、哺乳動物の細胞においてｓｉＲＮＡを発現するための安定なベクター系を報告した。このベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１プロモーターを含有し、その後にｓｉＲＮＡ配列及びポリ−Ｔテールを含有していた（ｐＳＵＰＥＲ）。ｓｉＲＮＡは、センス鎖、５、７、又は９ヌクレオチドのループ配列、及びアンチセンス配列を含有していた。さらに、２００２年に、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００２年８月２２日にオンラインで公開）は、ｓｉＲＮＡを発現するためのレトロウイルスの使用を報告した（ｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲ）。
【００１４】
マサチュ−セッツ大学による特許文献６は、ｄｓＲＮＡに対する増加した安定性を提供するＲＮＡヘアピン構造を開示する。このヘアピンは、標的に対して相補的なステム及び標的に対して相補的な第２のステム及びこれら２つを接続するループ部分で作成され、細胞内で複数に開裂され、二本鎖ｍＲＮＡを提供する。このようなｄｓＲＮＡ分子は、上に述べられたように、Ｄｉｃｅｒ酵素の基質である。この出願はさらに、外因性プロモーター（例えば、ＰｏｌＩＩ又はＰｏｌＩＩＩ）の制御下で、このようなｓｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含有する発現構築物を開示する。
【００１５】
Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌによる特許文献７は、対応するｍＲＮＡのＲＮＡ干渉を媒介する約２１〜約２３ヌクレオチド長の単離されたＲＮＡ、及びそれらをコードする単離されたＤＮＡを記載する。
【００１６】
カリフォルニア工科大学による特許文献８は、レトロウイルスベクター系を用いた、細胞においてｓｉＲＮＡを発現する方法を開示する。さらに、この出願は、ｓｉＲＮＡ発現が、ウイルスゲノム又はウイルス複製が必要な宿主細胞遺伝子における標的核酸を用いた干渉を通して、病原体のライフサイクルの態様を阻害することによって、感染の処置又は予防のために有用であり得ることを示す。この出願は、ヒトウィルス感染の処置について特に記載されている。開示された構築物は、少なくとも１つのＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーター、ＲＮＡセンス領域、ＲＮＡアンチセンス領域及びセンス領域とアンチセンス領域とを異なる方向で分離するループ領域を含む。
【００１７】
Ｅｎｇｅｌｋｅ，ｅｔ  ａｌらによる特許文献９は、細胞における発現のためのヘアピンＲＮＡ構造を記載する。本出願は、外因性プロモーター要素を用いて調節されるｓｉＲＮＡ及びＲＮＡヘアピンを細胞内で発現するため発現カセットを記載する、例えば、Ｕ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター。
【００１８】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．による特許文献１０は、細胞においてｓｉＲＮＡを安定に発現するためのシステムを記載する。このシステムは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーター、ｓｉＲＮＡをコードする領域、及び５つの連続的なチミン残基を含む転写末端要素を含む。この出願は、複数のｓｉＲＮＡ配列が使われてもよいことを開示するが、これらが使用される場合、別個の転写物として発現されるべきであることを示唆する。
【００１９】
ｉＲＮＡ技術の開発における次の進歩は、ＤＮＡテンプレートからｉＲＮＡ分子を産生し、そのｉＲＮＡをそれらの子孫に引き継ぐことが可能なトランスジェニック動物を作成することであった。ｉＲＮＡ分子の遺伝的な発現を提供することが、主要な研究目的となった。遺伝子機能が効果的に排除されている細胞及び動物の産生は、有益な研究ツールを提供すると共に、異種移植術、治療的クローニング及び遺伝的に強化された農業の可能性を理解するために非常に貴重である。
【００２０】
２００２年に、Ｈａｓｕｗａ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献９）は、マウス及びラットにおける、ＰｏｌＩＩプロモーターによって調節される高められた緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｓｉＲＮＡを用いた導入遺伝子に基づくＲＮＡｉ系を報告した。具体的には、使用されたプロモーターはＨ１プロモーターであり、、ｓｉＲＮＡ領域は、センス配列、接続配列、ｅＧＦＰに対するアンチセンス配列を含有していた。この構築物は、偏在的に発現される、動物ゲノムへのＤＮＡのランダム組み込みを可能にした。
【００２１】
２００３年に、Ｃａｒｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１０）は、外因性プロモータ及びｓｉＲＮＡ順序を含有する導入遺伝子のランダムな挿入を経る、マウスにおけるＲＮＡｉの生殖系列伝達を報告した。さらに２００３年に、Ｋｕｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１１）は、ランダム組み込みを介する、トランスジェニックショート−ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を有するノックダウンマウスの胚幹（ＥＳ）細胞株の生成を報告した。Ｈ１  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、次いでｓｈＲＮＡ配列（７塩基対スペーサーによって分離されるセンス配列及びアンチセンス配列）、次いで転写を終わらせるための５個のチミジンを含有する線形導入遺伝子がＥＳ細胞にエレクトロポレーションを経て導入され、構築物のランダム組み込みを達成し、結果として標的遺伝子のための遺伝的に無効な表現型を生じた。Ｋｕｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌは、ｓｉＲＮＡ技術を介する遺伝子標的化を行なわずに遺伝子機能をインビボでアッセイすることの利点を議論する。
【００２２】
Ｔｒａｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．及びＯｚｇｅｎｅ  Ｐｔｙ．，Ｌｔｄ．による特許文献１１はレンチウイルスベクターを用いて遺伝的に改変された動物の産生を記載する。特に、記載されるベクターは、ランダム組み込みのための外因性プロモーター配列を用いて調節不可能にされる選択可能なマーカーを含む。本出願は、ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子移動ベクター中に含有され、ＲＮＡ干渉を媒介可能なＲＮＡ分子を発現する目的のヌクレオチド配列を記載する。
【００２３】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｌｔｄ．による特許文献１２は、ゲノムにランダム挿入するためにレンチウイルスベクターを使用してトランスジェニック細胞を産生する方法を記載する。使用可能なヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡ及び外因性プロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。
【００２４】
２００３年に、ｉＲＮＡ標的化ストラテジーが開発され、ランダム組み込みのための外因性プロモーターの制御下で発現ベクターを用いて同時に２個の遺伝子を標的化したことが報告された（非特許文献１２，非特許文献１３）。Ｋａｒｌａｓ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１４）は、ＰＥＲＶ遺伝子の異なる部分に対応するｉＲＮＡ分子を用いた、ｉＲＮＡによるブタ内因性レトロウイルスの阻害を開示する。ｉＲＮＡ分子は、ランダム組み込みのためにインビトロで外因性ポリメラーゼＩＩＩの制御下でポリメラーゼショートヘアピンＲＮＡとして発現した。
【００２５】
Ｆｉｎｎｅｙ及びＬｏｆｑｕｉｓｔによる特許文献１３、標題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ」は、疾患に関連する遺伝子を同定する方法、疾患の動物モデルを産生する方法、及び条件付のノックアウトストラテジーを介した候補薬物を同定する方法を開示する。本出願は、ｓｉＲＮＡ標的（ｓｉＲＮＡ分子ではない）を内因性遺伝子内で設計するための相同組換えの使用を開示する。
【００２６】
遺伝可能な導入遺伝子を有する動物を提供するためのこれらの初期のストラテジーが開発されてきたが、タンパク質発現をさらに制御するため、及び宿主細胞又は有機体に対する副作用を最小化するために、さらなる改良が要求されている。
【特許文献１】米国特許第６，５０６，５５９号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０１２０５２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願番号第２００３／０１６６２８２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５７３，０９９号明細書
【特許文献５】国際公開第９９／４９０２９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０３／００６４７７号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願第２００３／０１０８９２３号明細書
【特許文献８】国際公開第０３／０２３０１５号パンフレット
【特許文献９】米国特許出願第２００３／０１４８５１９号明細書
【特許文献１０】国際公開第０３／０５６０１２号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０３／０５９９２３号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０３／０５６０２２号パンフレット
【特許文献１３】米国特許出願第２００４／００４５０４３号明細書
【非特許文献１】Ｓｈａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）１３６：１７１−１８２
【非特許文献２】Ｇａｌｌｉ−Ｔａｌｉａｄｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．．（１９９５）１８１：１−５
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９１：８０６−８１１
【非特許文献４】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２５，４１５−４１９
【非特許文献５】Ｈｏｌｄｉｎｇ，Ｃ．「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍｉＲＮＡ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５，２００３
【非特許文献６】Ｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９９７）Ａｐｒ  １；９４（７）：３２７９−８３
【非特許文献７】Ｅｌｂａｓｌｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４−４９８
【非特許文献８】Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（２００１）９８（１７）：９７４２−９７４７
【非特許文献８】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９６：５５０−５５３
【非特許文献９】Ｈａｓｕｗａ  ｅｔ  ａｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）５３２：２２７−２３０
【非特許文献１０】Ｃａｒｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）１０（２）９１−９２
【非特許文献１１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３，Ｍａｙ）２１：５５９−５６１
【非特許文献１２】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）７：２２８−２３６
【非特許文献１３】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００３）１３：３０３−３１２
【非特許文献１４】Ｋａｒｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４）３２５：１８−２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
それ故に、本発明の目的は、細胞及び動物中でタンパク質の発現を抑制するための改良された方法を提供することである。
【００２８】
また、本発明の目的は、細胞及び動物中で、最適には他の正常なプロセスの破壊を最小限にしつつ、標的タンパク質の発現を抑制する改良された能力を有する細胞及び動物を提供することである。
【００２９】
本発明のなお別の目的は、タンパク質の効果的な抑制を達成するための新規ツールを提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、長く感じられてきた必要性を持つ特定の領域に対してタンパク質を抑制するための新規技術を適用することである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
（発明の要旨）
細胞及び動物中のタンパク質の発現を抑制するための改良された技術が提供される。一実施形態では、本発明は、細胞又は動物のホメオスタシスに最小限の効果を有する標的化された挿入ベクターの使用を含む、タンパク質の発現を抑制するための新規方法及び材料を提供する。特に、標的タンパク質を抑制するためのｉＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートは、（ｉ）細胞の内因性制御要素（例えば、内因性プロモーター）を使用すること、（ｉｉ）遺伝子のイントロン配列内に標的化されること、及び／又は（ｉｉｉ）細胞のホメオスタシスを破壊しないこと、が提供される。第２の実施形態では、新規ｉＲＮＡ分子及びそれらをコードするＤＮＡ配列、及びそれらを産生するための方法が提供される。一例において、両方の鎖が抑制されるタンパク質の標的ｍＲＮＡに対して相補性であり、ヘアピンの形態であり得るｉＲＮＡ分子（本明細書中「ｃＴａｒｇｅｔ」と称される）が提供される。第３の実施形態では、共通の相同性配列を有し、遺伝子の発現を機能的に排除可能な特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するｉＲＮＡ分子が提供される。
【００３２】
本発明の１つの局面では、所定の位置でｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック細胞及び動物を産生するための方法、及びそれらによって産生された細胞及び動物が提供される。一実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生し、ゲノムの特定の位置を標的化する配列を含有するＤＮＡテンプレート又は構築物は、細胞内に導入可能であり、その結果、ＤＮＡテンプレートは、細胞の内因性制御要素（例えば、プロモーター及び／又は遺伝子の他の制御要素）の制御下にある。別の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、内因性遺伝子機能を破壊することなくｉＲＮＡ分子の発現を達成することができるように標的化可能である。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートはベクターの形態であることができる。ベクターは、直接細胞に導入することができるか、又は細胞に導入する前に線形にすることができる。別の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、オリゴヌクレオチドとして合成され、細胞内に導入することができる。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、標的化組み込みを経て細胞のゲノムに組み込むことができる。標的化組み込みを相同組み換えを経て行なうことができる。ＤＮＡテンプレートは、標的化挿入を可能にするために標的化遺伝子に相同性の５’及び３’標的化配列を含有することができる。ＤＮＡテンプレートは、例えば、ｉＲＮＡ分子の発現は、ハウスキーピング遺伝子の関連プロモーターの制御下にあるようにハウスキーピング遺伝子への相同組換えを経て挿入することができる。あるいは、ＤＮＡテンプレートは、相同組換えを経て、ｉＲＮＡ分子の発現は、細胞又は臓器に特異的な遺伝子の関連プロモーターの制御下にあるように特定の細胞又は臓器中でのみ発現する遺伝子に挿入することができる。このようなテンプレートは、哺乳動物、例えば、ヒト、ブタ、ヒツジ、又はウシ細胞、微生物細胞（例えばＥ．Ｃｏｌｉ）、及び／又は酵母細胞内に導入することができる。
【００３３】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレート／構築物は、標的遺伝子のエキソン内に組み込まれるように設計することができる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子のイントロン（例えば、内因性イントロンの非必須位置）内に組み込まれるように設計することができる。ＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子の内因性プロモーターが外因性ＤＮＡテンプレートの転写を導くように標的化することができる。なおさらなる実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子のイントロン又はエキソン内に組み込むために設計されたイントロン中に埋め込むことができる。これらの設計されたイントロンは、任意の内因性イントロンに由来することができる。一実施形態において、内因性イントロンは、その最小機能成分に減らすことができる。別の実施形態では、制限部位は、設計されたイントロンに付加することができる。一実施形態では、制限酵素部位は、ＤＮＡテンプレートを設計されたイントロンの中に配置することを可能にする。さらなる実施形態では、合成イントロンは、内因性遺伝子の機能を破壊することなく、内因性エキソン又はイントロンに挿入することができる。
【００３４】
別の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子が標的遺伝子の発現を制御するために発現される細胞及び動物を産生するための方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、以下の工程を含むことができる：（ｉ）標的ｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１つのｉＲＮＡ配列を同定する工程；（ｉｉ）ｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を製造する工程；（ｉｉｉ）細胞中の標的内因性遺伝子配列を同定する工程；（ｉｖ）前記ＤＮＡ構築物を前記細胞に導入する工程（ここで、ＤＮＡ構築物はさらに、内因性標的遺伝子に相同性のフランキング配列を含有する）；及び／又は（ｖ）前記ｉＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡ配列に結合するような条件下で細胞中でＤＮＡ構築物を発現し、それによって１つ以上の標的ｍＲＮＡの発現を調節する工程。一実施形態では、本発明は、１つ以上の標的遺伝子の発現を調節するｉＲＮＡ分子を遺伝的に発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。一実施形態では、上記動物は、体細胞核移植を経て産生することができる。上記体細胞は、本明細書中に記載される技術のいずれかによってｉＲＮＡ分子を発現するように設計することができる。
【００３５】
本発明の別の局面では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は、両方の鎖がｍＲＮＡ標的配列に対して相補性であるように提供される（本明細書中「ｃＴａｒｇｅｔ」と称される）。二本鎖ｉＲＮＡ（ｄｓ  ｉＲＮＡ）分子の細胞内処理に起因して、分子の２つの鎖の１つのみが、標的ｍＲＮＡを阻害するように実際に機能する。本発明は、両方の鎖が機能性であり得る（すなわち、標的ＲＮＡ配列と結合可能な）新規ｄｓ  ｉＲＮＡ分子を提供する。この発見の前に、ｉＲＮＡ分子は、ｉＲＮＡ分子の１つの鎖のみが機能性（すなわち、典型的には、１つの鎖が標的配列と実質的に同一（すなわち「センス」配列）鎖であり、他の鎖が標的配列と相補性（すなわち「アンチセンス」配列）である機能性鎖であるように設計され、機能的でない鎖がインビボで加工される場合、阻害効果は生じなかった。
【００３６】
一実施形態では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は、第２のｃＴａｒｇｅｔ鎖配列にハイブリダイズするヌクレオチドの第１のｃＴａｒｇｅｔ鎖を含有することができる。一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ鎖は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５のヌクレオチドを含有することができる。このようなｉＲＮＡ分子を得るために、ｃＴａｒｇｅｔ配列のセグメントは、ハイブリダイズしてｄｓ  ｉＲＮＡ分子を形成する部分を決定するために評価されなければならない。一実施形態では、少なくとも１００、２００又は３００ヌクレオチド長のｃＴａｒｇｅｔ配列のセグメントは、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定するために分析することができる。一実施形態では、これらの配列は、自己ハイブリダイゼーションの領域を検出するコンピュータープログラムに入力することができ、例えば、１つの特定の実施形態では、核酸フォールディング及びハイブリダイゼーション予測についてＭ．Ｚｕｋｅｒ  Ｍｆｏｌｄウェブサーバー中に記載されるようなＭＦｏｌｄソフトウェアに入力することができる。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）３４０６−１５，（２００３），［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］。一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は上記標的配列と相補性であることができる。別の実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は異なる標的配列に対して相補性であることができる。さらなる実施形態では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は回帰性のｃＴａｒｇｅｔ配列であることができ、ここで、両方の鎖は同一であるか又は機能的に同一である。一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は、例えば、コンピュータープログラム（例えばＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ）を用いて回帰性配列を同定するために分析することができる。
【００３７】
他の実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列の２つの鎖であるｄｓ  ｉＲＮＡ分子を産生するＤＮＡテンプレートが提供される。一実施形態では、ｉＲＮＡ前駆体を産生するＤＮＡテンプレートが提供される。一実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は２つのｃＴａｒｇｅｔ配列を分離することができる。別の実施形態では、標的に相補的な第１の鎖と、標的に相補的な第２の鎖とを含有し、第２の鎖が第１の鎖及び２つの鎖を接続するスペーサー配列に実質的にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列が提供される。一実施形態では、スペーサーは、ループ又はヘアピン構造を形成することができる。このようなヘアピンは、細胞内で開裂して、２つのステムを含有する二本鎖ｍＲＮＡを提供することができる。一実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１５ヌクレオチド長であることができる。別の実施形態では、スペーサー配列は、ループ構造を形成するヌクレオチドを含有することができ、例えば、配列番号４又は本明細書中に記載される配列のいずれかに開示されるようなｍｉｒ３０ループ構造であることができる。一実施形態では、ループ構造は、第１のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも２、３、４、又は５ヌクレオチド）を含有することができ、その後に第２のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも２、３、４、又は５ヌクレオチド）、その後に、ヌクレオチドの第１の配列に対して実質的にハイブリダイズする第３のヌクレオチド配列、その後にヌクレオチドの第４の配列（例えば、２、３、４、又は５ヌクレオチド）を含有することができ、それによって２つのループ構造を形成することができる。一実施形態では、この２つのループ構造は、ヌクレアーゼ（例えばＤｒｏｓｈａ）のための基質として役立つことができる。
【００３８】
さらなる実施形態では、さらなるヌクレオチド配列は、２つのｃＴａｒｇｅｔ鎖配列をフランキングすることができる。一実施形態では、さらなるヌクレオチド配列は、ｃＴａｒｇｅｔ鎖に対して少なくとも３、４、５、１０又は１５ヌクレオチドの５’及び３’であることができる。一実施形態では、ステム配列はｃＴａｒｇｅｔ鎖配列に対する５’及び３’であることができる。一実施形態では、ステム配列は、少なくとも４、５、６又は７ヌクレオチドを含有することができる。５’ステム配列は、第１のｃＴａｒｇｅｔ鎖の上流に第１、第２及び第３のヌクレオチド配列を含有することができる。３’ステム配列は、第４、第５、及び第６のヌクレオチド配列を含有することができ、ここで、第５のヌクレオチド配列は、５’ステムの第２のヌクレオチド配列に対して実質的にハイブリダイズし、第４及び第６のヌクレオチド配列は５’ステムの第１及び第３の配列に対してハイブリダイズしない。ステム配列は、本明細書中に記載される配列のいずれかに開示されるようなｍｉｒ３０ステム配列であることができる。
【００３９】
別の実施形態では、さらなるヌクレオチド配列は、ｃＴａｒｇｅｔ配列に対してクローニング部位５’及び／又は３’であることができる。一実施形態では、クローニング部位は、ステム配列の５’及び／又は３’であることができる。クローニング部位は、さらに大きな配列内のヌクレオチド配列をクローニング及びスプライシング可能にするために設計された制限酵素部位を含有することができる。
【００４０】
１つの特定の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、以下の成分のうち少なくとも２つを有するＲＮＡ分子を産生することができ、ここで、標的相補体Ａ及び標的相補体Ｂは、細胞によって処理され、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子を形成する。１つの非限定的な例示的な実施形態を以下に示す：
【００４１】
【化１】
2007512027.tif 000002
さらなる実施形態では、阻害ＲＮＡは、個々の阻害ＲＮＡをアレイ又はクラスターに付加することによって構築することができる。一実施形態では、リンカー配列を有して又は有さずにタンデムに結合した個々のヘアピンｉＲＮＡのクラスターが提供される。一実施形態では、この構造は、放射相称（例えば、図２を参照）を有することができる。これらの放射ｉＲＮＡ分子は、配列において放射相称を有さずに構造において放射相称を示すことができる。代替の実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、一連のスペーサー配列と結合して、ほぼ線形又は湾曲した構造を作り出すことができる（例えば、図３参照）。これらの構造は、スペーサー配列を用いて又は用いずに種々のオリゴヌクレオチドを結合し、次いでリンカー配列を用いて又は用いずにこれらのオリゴヌクレオチドの相補性配列を逆順に付加するすることによって作り出すことができる。さらなる実施形態では、これらの構造ストラテジーを組み合わせて複雑な構造を作り出すことができる。他の実施形態では、放射ｉＲＮＡ及び線形クラスター状ｉＲＮＡは、小さな干渉ＲＮＡを介してｍＲＮＡの標的化阻害を媒介することができる。
【００４２】
他の実施形態では、２つのｃＴａｒｇｅｔ鎖、又はハイブリダイゼーションが望ましい任意の配列のハイブリダイゼーションを最適化するための方法が提供される。非ワトソン−クリック塩基対がＲＮＡ分子中で可能なため、推定配列中のシトシン残基はウラシル残基と交換することができる。これらのウラシル残基は、グアニン又はアデノシンのいずれかと結合することができ、それによって鎖間のハイブリダイゼーション度が潜在的に増加する。
【００４３】
本発明のさらなる局面では、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節し、遺伝子の発現を排除することができるｉＲＮＡ分子が提供される。一実施形態では、遺伝子の同じ領域を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。別の実施形態では、同じ遺伝子の少なくとも２つの異なる領域を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。さらなる実施形態では、少なくとも２つの異なる遺伝子を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。本発明のさらなる実施形態は、遺伝子標的化のための上述のストラテジーの組み合わせを提供する。
【００４４】
一実施形態では、ｉＲＮＡ分子は同じ配列であることができる。代替の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は異なる配列であることができる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、同じ又は異なるベクター又はＤＮＡテンプレートのいずれかに組み込むことができる。一実施形態では、ベクター内又はＤＮＡテンプレート内のｉＲＮＡ分子は、プロモーター配列（例えば、偏在的に発現するプロモーター又は細胞型に特異的なプロモーター）に使用可能な状態で結合する。別の実施形態では、ベクター内又はＤＮＡテンプレート内のｉＲＮＡ分子は、プロモーター配列の制御下にない。さらなる実施形態では、これらのベクター又はＤＮＡテンプレートは、細胞に導入することができる。一実施形態では、ベクター又はＤＮＡテンプレートは、細胞のゲノム内に組み込むことができる。この細胞への組み込みは、ランダム組み込み又は標的化組み込みのいずれかを介して行なうことができる。標的化組み込みは相同組換えを経て行なうことができる。
【００４５】
他の実施形態では、１つ以上の遺伝子のファミリーをｉＲＮＡ分子の発現によって調節可能な少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。別の実施形態では、１つ以上の遺伝子のファミリーをｉＲＮＡ分子の発現によって調節可能な少なくとも３つ、４つ、又は５つのｉＲＮＡ分子が提供される。ｉＲＮＡ分子は、１つ以上の遺伝子内の保存配列に相同性であることができる。本発明のこのような方法を用いて調節される遺伝子のファミリーは、細胞、関連するウイルス遺伝子のファミリー、ウイルス属の中で保存される遺伝子のファミリー、関連した真核生物寄生虫遺伝子のファミリー、又はより特定的にはブタ内因性レトロウイルス由来の遺伝子のファミリーに対して内因性であることができる。１つの特定の実施形態では、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子は、遺伝子の同じファミリーのメンバーである少なくとも２つの異なる遺伝子を標的化することができる。ｉＲＮＡ分子は、遺伝子のファミリー内の相同領域を標的化することができ、１つのｉＲＮＡ分子は、複数の遺伝子の同じ領域を標的化することができる。
【００４６】
例えば、ｉＲＮＡ分子は、限定されないが、以下の種類のｉＲＮＡから選択することができる：アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、逆位反復、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さな一時的に制御されたＲＮＡ、及び放射クラスター状制御ＲＮＡを含むクラスター状制御ＲＮＡ（ｃｉＲＮＡ）、非対称クラスター状阻害ＲＮＡ、線形クラスター状阻害ＲＮＡ、及びクラスター状阻害ＲＮＡの混合物又は化合物。
【００４７】
別の実施形態では、哺乳動物細胞株又はトランスジェニック動物において標的遺伝子を調節するためのｉＲＮＡ分子の発現は、標的遺伝子の発現が機能的に排除されるか又は検出限界未満にされるように提供され、すなわち、標的遺伝子の発現が、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％減少する。
【００４８】
本発明のこの局面の別の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子が発現して標的遺伝子の発現が調節される細胞及び動物を産生するための方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、以下の工程を含む：細胞中の１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；上記標的核酸配列に結合する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を得る工程；ｉＲＮＡ分子、場合により発現ベクター中に封入されたｉＲＮＡ分子を細胞内に導入する工程；及びｉＲＮＡが標的核酸配列に結合するような条件下で細胞中でｉＲＮＡ分子を発現させ、それによって１つ以上の標的遺伝子の発現を調節する工程。一実施形態では、本発明は、１つ以上の標的遺伝子の発現を調節する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を遺伝的に発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。一実施形態では、上記動物は、体細胞核移植を介して産生することができる。体細胞は、本明細書中に記載される技術のいずれかによって、ｉＲＮＡを発現するように設計することができる。
【００４９】
他の実施形態では、本発明はさらに、細胞又はトランスジェニック動物において少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を発現するための方法を提供し、ここで、ｉＲＮＡは遺伝子のファミリー内の共通の位置を標的化する。このような方法は、例えば、以下の工程を含むことができる：遺伝子のファミリー内の相同領域である細胞中の１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；上記標的核酸配列に結合する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を調製する工程；ｉＲＮＡ分子、場合により発現ベクター中に封入されたｉＲＮＡ分子を細胞内に導入する工程；及びｉＲＮＡが遺伝子ファミリー内の相同領域に結合するような条件下で細胞中又は動物中でｉＲＮＡ分子を発現させる工程。
【００５０】
本発明はさらに、本発明の方法によって産生されるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明の方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ネズミ、有蹄類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ動物、ウサギ、イヌ、ウマ、ラバ、シカ、ネコ、サル及び他の非ヒト霊長類）、鳥（特に鶏、カモ及びガチョウ）、魚、爬虫類、両生類、虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）及び昆虫（Ｍｏｓｑｕｉｔｏｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ及び、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａが挙げられるが、これらに限られない）の産生のための例として有用である。いずれかの種類の非ヒト動物を産生することができるが、一実施形態では、非ヒト動物はトランスジェニック有蹄類（ブタを含む）である。本発明はさらに、このような非ヒトトランスジェニック動物から単離された細胞、組織及び臓器を提供する。
【００５１】
本発明の実施形態では、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現によって調節可能な内因性遺伝子としては、限定されないが、細胞生存又は細胞複製のために必要な遺伝子、ウイルス複製のために必要な遺伝子、免疫グロブリン遺伝子座をコードする遺伝子（例えば、カッパ軽鎖）、及び細胞表面タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＶＣＡＭ））、及び細胞、組織、臓器及び動物の構造及び／又は機能にとって重要な他の遺伝子が挙げられる。本発明の方法はさらに、干渉ＲＮＡの遺伝可能な導入遺伝子を発現させることによって、トランスジェニック細胞中又はトランスジェニック動物中の１つ以上の非コードＲＮＡ配列の発現を調節するために使用することができる。これらの非コードＲＮＡ配列は、ＲＮＡウイルスゲノムの配列、内因性遺伝子、真核生物寄生虫遺伝子、又は当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた他の非コードＲＮＡ配列であることができる。
【００５２】
本発明の例示的な実施形態では、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子は、ＰＥＲＶウイルスの発現が機能的に排除されるか又は検出限界未満にされるような少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現によって調節することができる。ＰＥＲＶは、主要な種類が今日までに同定されているレトロウイルスのファミリーを指す：ＰＥＲＶ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３８６０１）、ＰＥＲＶ−Ｂ（ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＥＲＹ１７０１３）及びＰＥＲＶ−Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３８６００）（Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。ＰＥＲＶ−Ａ、Ｂ及びＣのｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子は高度に相同性であり、異なる種類のＰＥＲＶ（例えば、ＰＥＲＶ−Ａ、ＰＥＲＶ−Ｂ、ＰＥＲＶ−Ｃ）間で顕著に異なるのはｅｎｖ遺伝子である。また、ＰＥＲＶ−Ｄは、最近同定された（例えば、米国特許番号第６，２６１，８０６号を参照）。
【００５３】
一実施形態では、ＰＥＲＶウイルスに指向するｉＲＮＡは、ＰＥＲＶの発現を少なくとも約７０％、７５％，８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％減少させることができるか、又は検出限界未満にすることができる。この目標を達成するために、本発明は、ＰＥＲＶゲノムのｇａｇ領域、ｐｏｌ領域、又はｅｎｖ領域内の同じ配列を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を提供する。さらに、ＰＥＲＶゲノムのｇａｇ領域、ｐｏｌ領域、又はｅｎｖ領域内の異なる配列を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。なおさらに、ＰＥＲＶゲノムの異なる領域（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、又はｅｎｖのいずれか）をそれぞれ標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。さらに、これらの異なる標的化ストラテジーを組み合わせた複数のｉＲＮＡ分子が提供され、例えば：ＰＥＲＶのｇａｇ領域に対して指向する少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子；ＰＥＲＶのｐｏｌ領域に対して指向する少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子；及びＰＥＲＶのｅｎｖ領域に対して指向する少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子がＰＥＲＶ遺伝子を標的化するために提供される。
【００５４】
本発明はさらに、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現を経て、ＰＥＲＶの発現が機能的に排除される、有蹄類、特にブタ動物、及び非ヒトトランスジェニック動物から単離された細胞、組織及び臓器を提供する。特定のこのような実施形態では、これらは、ブタ内因性レトロウイルス遺伝子、ブタ内因性レトロウイルス遺伝子のファミリーメンバー、又はブタ内因性レトロウイルス遺伝子ファミリーのサブセットのメンバーと干渉する１つ以上の干渉ＲＮＡを発現するトランスジェニックブタから得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（発明の詳細な記載）
細胞におけるタンパク質発現の抑制のための改良された技術が提供される。一実施形態では、本発明は、細胞のホメオスタシスに最小限の効果を有する標的化挿入ベクターの使用を含む、タンパク質発現の抑制のための新規方法及び物質を提供する。特に、ｉＲＮＡをコードして標的タンパク質を抑制するＤＮＡテンプレートは、（ｉ）細胞の内因性制御要素（例えば、内因性プロモーター）を使用すること、（ｉｉ）遺伝子のイントロン配列内に標的化されること、及び／又は（ｉｉｉ）細胞のホメオスタシスを破壊しないこと、が提供される。第２の実施形態では、新規ｉＲＮＡ分子及びそれらをコードするＤＮＡ配列、及びそれらを産生するための方法が提供される。一例において、両方の鎖が抑制されるタンパク質の標的ｍＲＮＡに対して相補性であり、ヘアピンの形態であり得るｉＲＮＡ分子（本明細書中「ｃＴａｒｇｅｔ」と称される）が提供される。第３の実施形態では、共通の相同性配列を有し、遺伝子の発現を機能的に排除可能な特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するｉＲＮＡ分子が提供される。
【００５６】
遺伝子ノックアウト技術とは異なり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝的に優位な現象であり、すなわち、導入遺伝子はホモ接合になることは必要でない。さらに加えて、ＲＮＡ干渉は、ゲノム中に存在しても存在しなくてもよい遺伝子に対して行なうことができる。
【００５７】
本発明の１つの局面では、所定の位置でｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック細胞及び動物を産生するための方法、及びそれらによって産生された細胞及び動物が提供される。一実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生し、ゲノムの特定の位置を標的化する配列を含有するＤＮＡテンプレートは、細胞内に導入可能であり、その結果、ＤＮＡテンプレートは、細胞の内因性制御要素（例えば、プロモーター及び／又は遺伝子の他の制御要素）の制御下にある。別の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、内因性遺伝子機能を破壊することなくｉＲＮＡ分子の発現を達成することができるように標的化可能である。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートはベクターの形態であることができる。ベクターは、直接細胞に導入することができるか、又は細胞に導入する前に線形にすることができる。別の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、オリゴヌクレオチドとして合成され、細胞内に導入することができる。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、標的化組み込みを経て細胞のゲノムに組み込むことができる。標的化組み込みを相同組み換えを経て行なうことができる。ＤＮＡテンプレートは、標的化挿入を可能にするために標的化遺伝子に相同性の５’及び３’標的化配列を含有することができる。ＤＮＡテンプレートは、例えば、ｉＲＮＡ分子の発現がハウスキーピング遺伝子の関連プロモーターの制御下にあるようにハウスキーピング遺伝子への相同組換えを経て挿入することができる。あるいは、ＤＮＡテンプレートは、相同組換えを経て、ｉＲＮＡ分子の発現が細胞又は臓器に特異的な遺伝子の関連プロモーターの制御下にあるように特定の細胞又は臓器中でのみ発現する遺伝子に挿入することができる。このようなテンプレートは、哺乳動物、例えば、ヒト、ブタ、ヒツジ、又はウシ細胞、微生物細胞（例えばＥ．Ｃｏｌｉ）、及び／又は酵母細胞内に導入することができる。
【００５８】
本発明の別の局面では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は、両方の鎖がｍＲＮＡ標的配列に対して相補性であるように提供される（ｃＴａｒｇｅｔ）。二本鎖ｉＲＮＡ（ｄｓ  ｉＲＮＡ）分子の細胞内処理に起因して、分子の２つの鎖の１つのみが標的ｍＲＮＡを阻害するように実際に機能する。本発明は、両方の鎖が機能性であり得る（すなわち、標的ＲＮＡ配列と結合可能な）新規ｄｓ  ｉＲＮＡ分子を提供する。この発見の前に、ｉＲＮＡ分子は、ｉＲＮＡ分子の１つの鎖のみが機能性（すなわち、典型的には、１つの鎖が標的配列と実質的に同一（すなわち「センス」配列）であり、他の鎖が標的配列と相補性（すなわち「アンチセンス」配列）であるように設計され、機能的でない鎖がインビボで加工される場合、阻害効果は生じなかった。
【００５９】
本発明のさらなる局面では、遺伝子の発現を機能的に排除することができる特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するｉＲＮＡ分子が提供される。一実施形態では、遺伝子の同じ領域を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。別の実施形態では、同じ遺伝子の少なくとも２つの異なる領域を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。さらなる実施形態では、少なくとも２つの異なる遺伝子を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。本発明のさらなる実施形態は、遺伝子標的化のための上述のストラテジーの組み合わせを提供する。
【００６０】
本発明の例示的な実施形態では、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子は、ＰＥＲＶウイルスの発現が機能的に排除されるか又は検出限界未満にされるような少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現によって調節することができる。ＰＥＲＶは、主要な種類が今日までに同定されているレトロウイルスのファミリーを指す：ＰＥＲＶ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３８６０１）、ＰＥＲＶ−Ｂ（ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＥＲＹ１７０１３）及びＰＥＲＶ−Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３８６００）（Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。ＰＥＲＶ−Ａ、Ｂ及びＣのｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子は高度に相同性であり、異なる種類のＰＥＲＶ（例えば、ＰＥＲＶ−Ａ、ＰＥＲＶ−Ｂ、ＰＥＲＶ−Ｃ）間で顕著に異なるのはｅｎｖ遺伝子である。また、ＰＥＲＶ−Ｄは、最近同定された（例えば、米国特許番号第６，２６１，８０６号を参照）。
【００６１】
（Ｉ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語及び専門的用語は、当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「動物」は、任意の動物を含むことを意味し、動物としては、限定されないが、非ヒト哺乳動物（ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ウシ科の動物）、シカ、ラバ、ウマ、サル及びその他の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、ウサギを含むがこれに限られない）、鳥（鶏、シチメンチョウ、カモ、ガチョウを含むがこれに限られない）、爬虫類、魚、両生類、虫（例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａを含むがこれに限られない）が挙げられる。「トランスジェニック動物」は、細胞内レベルの慎重な遺伝子操作によって遺伝情報を直接的又は間接的に受ける１つ以上の細胞を含有する任意の動物である。「トランスジェニック細胞」は、細胞内レベルの慎重な遺伝子操作によって遺伝情報を直接的又は間接的に受ける任意の細胞である。
【００６３】
用語「有蹄類」は、有蹄の哺乳動物を指す。偶蹄目の動物は、均一なつま先の（割れた蹄）の有蹄類であり、アンテロ−プ、ラクダ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ及びヒツジを含む。奇蹄類は奇数の足指の有蹄類であり、ウマ、シマウマ、サイ及びバクを含む。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」、「ブタ動物（ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｎｉｍａｌ）」、「ブタ（ｐｉｇ）」及び「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」は、性別、サイズ又は種類に関係なく同じ種類の動物を指す一般的な用語である。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝可能な」は、特に、「遺伝可能な遺伝子」、「遺伝可能な特色」、「遺伝可能な特徴」、「遺伝可能なｉＲＮＡ」の内容で使用される場合、単位（例えば、遺伝子、特色、特徴、ｉＲＮＡなど）が遺伝可能であるか、又は遺伝的形質によって遺伝されるか又は受け継がれることが可能なことを意味する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現の調節」は、遺伝子の転写の能力、タイミング、レベル、様式又は細胞型を制御する作用を指す。調節によって、本明細書中に記載されるように、遺伝子の発現を増加させ、遺伝子の発現を減少させ、又は遺伝子の発現を維持することができる。
【００６７】
（ＩＩ．ｉＲＮＡ分子）
（Ａ．ｉＲＮＡ設計）
本発明の１つの局面では、両方の鎖が標的配列に対して相補的なｄｓ  ｉＲＮＡ分子（ｃＴａｒｇｅｔ）が提供される。二本鎖ｉＲＮＡ（ｄｓ  ｉＲＮＡ）分子の細胞内処理に起因して、分子の２つの鎖の１つのみが、標的ｍＲＮＡを阻害するように実際に機能する。本発明は、両方の鎖が機能性であり得る（すなわち、標的ＲＮＡ配列と結合可能な）新規ｄｓ  ｉＲＮＡ分子を提供する。この発見の前に、ｉＲＮＡ分子は、ｉＲＮＡ分子の１つの鎖のみが機能性（すなわち、典型的には、１つの鎖が標的配列と実質的に同一（すなわち「センス」配列）であり、他の鎖が標的配列と相補性（すなわち「アンチセンス」配列）であるように設計され、機能的でない鎖がインビボで加工される場合、阻害効果は生じなかった。
【００６８】
（内因性ｉＲＮＡ処理）
マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の転写後調節に関与する小さな内因性ＲＮＡである。このようなｍｉＲＮＡの１つ（ｍｉｒ３０）は、Ｄｒｏｓｈａを介して、核から出されるさらに小さなヘアピン構造（ｐｒｅ−ｍｉｒ３０）へと処理される大きな転写物（ｐｒｉｍｉｒ３０）として記載される。細胞原形質では、ｐｒｅ−ｍｉｒ３０は、Ｄｉｃｅｒによってさらに処理され、成熟ｍｉｒ３０を生じる。このプロセスは当該技術分野で知られている（例えば、Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｒｔｉｎ  ５．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｓｅｐ  ０８；３２（１６）：４７７６−８５；Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＲＮＡ．２００３  Ｊａｎ；９（１）：１１２−２３を参照）。ｐｒｉ−ｍｉｒ３０の一部分のＭＦｏｌｄ（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ．Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３）［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］）による推定予測構造を以下に示す。
【００６９】
【化２】
2007512027.tif 000003
ｐｒｅ−ｍｉｒ３０  Ｄｒｏｓｈａ開裂産物のＭＦｏｌｄ推定予測構造は以下のとおりである：
【００７０】
【化３】
2007512027.tif 000004
最少のｐｒｉ−ｍｉｒ３０  Ｄｒｏｓｈａ基質は、インビトロ開裂のために記載されている（Ｌｅｅ  Ｙ，Ａｈｎ  Ｃ，Ｈａｎ  Ｊ，Ｃｈｏｉ  Ｈ，Ｋｉｍ  Ｊ，Ｙｉｍ  Ｊ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｐｒｏｖｏｓｔ  Ｐ，Ｒａｄｍａｒｋ  Ｏ，Ｋｉｍ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＶＮ．Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  Ｄｒｏｓｈａ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３  Ｓｅｐ２５；４２５（６９５６）：４１５−９）。この基質の推定予測構造は以下のとおりである：
【００７１】
【化４】
2007512027.tif 000005
最少のｐｒｉ−ｍｉｒ３０  Ｄｒｏｓｈａ基質はさらに、無関係なｉＲＮＡの内容においてインビボ開裂のために記載されている（Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｗａｇｎｅｒ  ＥＪ，Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．Ｂｏｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｍＲＮＡｓ  ｗｈｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２  Ｊｕｎ；９（６）：１３２７−３３；Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＲＮＡ．２００３  Ｊａｎ；９（１）：１１２−２３）。この構造の推定予測構造は以下のとおりである：
【００７２】
【化５】
2007512027.tif 000006
さらに、ｓｉＲＮＡ活性を有する新規なヘアピンを作成するためにｍｉＲＮＡの活性部分が交換可能であることが示されている（Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｗａｇｎｅｒ  ＥＪ，Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．Ｂｏｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｍＲＮＡｓ  ｗｈｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２  Ｊｕｎ；９（６）：１３２７−３３；；Ｂｏｄｅｎ  Ｄ，Ｐｕｓｃｈ  Ｏ，Ｓｉｌｂｅｒｍａｎｎ  Ｒ，Ｌｅｅ  Ｆ，Ｔｕｃｋｅｒ  Ｌ，Ｒａｍｒａｔｎａｒｎ  Ｂ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｆｅｂ  １３；３２（３）：１１５４−８）。
【００７３】
（ｉＲＮＡ分子）
一実施形態では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は、第２のｃＴａｒｇｅｔ鎖配列に対してハイブリダイズするヌクレオチドの第１のｃＴａｒｇｅｔ鎖を含有することができる。ｃＴａｒｇｅｔ鎖は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０のヌクレオチドを含有することができ、特に、１９〜３２ヌクレオチド、又は２１〜２３ヌクレオチド長を含有することができる。
【００７４】
また、第２のｃＴａｒｇｅｔ鎖配列に対してハイブリダイズするヌクレオチドの第１のｃＴａｒｇｅｔ鎖であるｉＲＮＡ分子を得るための方法が提供される。標的配列に対して相補的な配列（ｃＴａｒｇｅｔ）が最初に決定され、次いで、ｃＴａｒｇｅｔ配列のセグメントが評価され、共にハイブリダイズしてｄｓ  ｉＲＮＡ分子を形成する部分が決定される。一実施形態では、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチド長のｃＴａｒｇｅｔ配列のセグメントが分析され、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定することができる。一実施形態では、これらの配列は、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定するコンピュータープログラム、例えば、１つの特定の実施形態では、Ｍ．Ｚｕｋｅｒ  Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）３４０６−１５，  （２００３），［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］に記載されるようなＭＦｏｌｄソフトウェアに入力することができる。
【００７５】
他の実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列の２つの鎖であるｄｓ  ｉＲＮＡ分子を産生するＤＮＡテンプレートが提供される。一実施形態では、ｉＲＮＡ前駆体を産生するＤＮＡテンプレートが提供される。一実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は２つのｃＴａｒｇｅｔ配列を分離することができる。別の実施形態では、標的に相補的な第１の鎖と、標的に相補的な第２の鎖とを含有し、第２の鎖が第１の鎖及び２つの鎖を接続する配列に実質的にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列が提供される。一実施形態では、スペーサーは、ループ又はヘアピン構造を形成することができる。このようなヘアピンは、細胞内で開裂して、２つのステムを含有する二本鎖ｍＲＮＡを提供することができる。一実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０又は５０ヌクレオチド長であることができる。別の実施形態では、スペーサー配列は、ループ構造を形成するヌクレオチド（例えば、ｍｉｒ３０ループ構造）を含有することができ、ｍｉｒ３０ループ構造は、少なくとも以下の配列を含有することができる：ＧＵＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧ（配列番号４）又は本明細書中に記載される配列のいずれかに示されるようなもの。一実施形態では、ループ構造は、第１のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも２、３、４、又は５ヌクレオチド）を含有することができ、その後に第２のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも２、３、４、又は５ヌクレオチド）、その後に、ヌクレオチドの第１の配列に対して実質的にハイブリダイズする第３のヌクレオチド配列、その後にヌクレオチドの第４の配列（例えば、２、３、４、又は５ヌクレオチド）を含有することができ、それによって２つのループ構造を形成することができる。一実施形態では、この２つのループ構造は、ヌクレアーゼ（例えばＤｒｏｓｈａ）のための基質として役立つことができる。
【００７６】
さらなる実施形態では、さらなるヌクレオチド配列は２つのｃＴａｒｇｅｔ鎖配列をフランキングすることができる。さらなるヌクレオチド配列は、ｃＴａｒｇｅｔ鎖に対して少なくとも３、４、５、１０又は１５ヌクレオチドの５’及び３’であることができる。一実施形態では、ステム配列はｃＴａｒｇｅｔ鎖配列に対する５’及び３’であることができる。ステム配列は、少なくとも４、５、６又は７ヌクレオチドを含有することができる。５’ステム配列は、第２のｃＴａｒｇｅｔ鎖の上流に第１、第２及び第３のヌクレオチド配列を含有することができる。３’ステム配列は、第４、第５、及び第６のヌクレオチド配列を含有することができ、ここで、第５のヌクレオチド配列は、５’ステムの第２のヌクレオチド配列に対して実質的にハイブリダイズし、第４及び第６のヌクレオチド配列は５’ステムの第１及び第３の配列に対してハイブリダイズしない。ステム配列は、本明細書中に記載される配列のいずれかに開示されるようなｍｉｒ３０ステム配列（例えば配列番号５）であることができる。
【００７７】
別の実施形態では、さらなるヌクレオチド配列は、ｃＴａｒｇｅｔ配列に対してクローニング部位５’及び／又は３’であることができる。一実施形態では、クローニング部位は、ステム配列の５’及び／又は３’であることができる。クローニング部位は、さらに大きな配列内のヌクレオチドをクローニング及びスプライシングするために設計された制限酵素部位を含有することができる。
【００７８】
１つの特定の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、以下に示されるように、以下の成分のうち少なくとも２つを有するＲＮＡ分子を産生することができ、ここで、標的相補体Ａ及び標的相補体Ｂは、細胞によって処理され、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子を形成する：
【００７９】
【化６】
2007512027.tif 000007
一実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、機能性ｉＲＮＡ分子へと処理されるＤｒｏｓｈａ基質を産生することができる。
【００８０】
一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は、同じ標的配列に対して相補性であることができる。別の実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は、異なる標的配列に対して相補性であることができる。さらなる実施形態では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は回帰性ｃＴａｒｇｅｔ配列であることができ、ここで、両方の鎖は同一であるか又は機能的に同一である。一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は回帰性配列を同定するために、例えば、コンピュータープログラム（例えばＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ）を用いて分析することができる。
【００８１】
他の実施形態では、２つのｃＴａｒｇｅｔ鎖、又はハイブリダイゼーションが望ましい任意の配列のハイブリダイゼーションを最適化するための方法が提供される。非ワトソン−クリック塩基対がＲＮＡ分子中で可能なため、推定配列中のシトシン残基はウラシル残基と交換することができる。これらのウラシル残基は、グアニン又はアデノシンのいずれかに潜在的に結合し、両鎖間のハイブリダイゼーション度が潜在的に増加する。
【００８２】
ｍＲＮＡの２つの部位を同時に標的化すること
一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列は、同じ標的配列に対して相補性であることができる。ｍＲＮＡに対して相補的な配列を用いることによって、ステムの両方の鎖が標的ｍＲＮＡに対して相補性であるｉＲＮＡ分子（例えばヘアピン）を設計することができる。一実施形態では、このようなヘアピンはＤｒｏｓｈａ基質として役立つことができ、得られた構造は開裂して２つの鎖を産生することができ、これらの鎖のそれぞれは標的ｍＲＮＡに対して阻害効果を発揮することができる。
【００８３】
標的配列に対して相補的な配列（ｃＴａｒｇｅｔ）が最初に決定され、次いで、ｃＴａｒｇｅｔのセグメントが評価され、共にハイブリダイズしてｄｓ  ｉＲＮＡ分子を形成する部分が決定される。一実施形態では、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチド長のｃＴａｒｇｅｔ配列のセグメントが分析され、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定することができる。一実施形態では、これらの配列は、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定するコンピュータープログラム、例えば、１つの特定の実施形態では、Ｍ．Ｚｕｋｅｒ  Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）３４０６−１５，（２００３），［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］に記載されるようなＭＦｏｌｄソフトウェアに入力することができる。次いで、自己ハイブリダイゼーションの領域を同定し、細胞におけるその効果を試験することができる。
【００８４】
（２つのｍＲＮＡを同時に標的化すること）
上に記載されるストラテジーに加えて、２つのｍＲＮＡの一部分のアンチセンス鎖を組み合わせて、２つのｍＲＮＡを潜在的に標的化する１個のｉＲＮＡ分子（例えばヘアピンｉＲＮＡ分子）を作成することができる。標的配列のそれぞれに対して相補的な配列（ｃＴａｒｇｅｔ）が最初に決定され、次いで、各ｃＴａｒｇｅｔ配列のセグメントを共にスプライシングすることができる。例えば、第１の標的に対する少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチド長（ｃＴａｒｇｅｔ１）は、第２の標的に対する少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチドのｃＴａｒｇｅｔ（ｃＴａｒｇｅｔ２）と結合することができる。ヌクレオチドのこの配列を、共にハイブリダイズしてｄｓ  ｉＲＮＡ分子を形成する部分を決定するための評価することができる。一実施形態では、これらの配列は、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定するコンピュータープログラム、例えば、１つの特定の実施形態では、Ｍ．Ｚｕｋｅｒ  Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）３４０６−１５，  （２００３），［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］に記載されるようなＭＦｏｌｄソフトウェアに入力することができる。次いで、ｃＴａｒｇｅｔ１とｃＴａｒｇｅｔ２間のハイブリダイゼーションの領域を同定し、細胞における標的ｍＲＮＡの抑制についてを試験することができる。
【００８５】
（回帰性配列）
さらなる実施形態では、ｄｓ  ｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が同一であるか又は機能的に同一である回帰性ｃＴａｒｇｅｔ配列であることができる。一実施形態では、ｃＴａｒｇｅｔ配列が分析され、例えば、コンピュータープログラム（例えばＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ）を経て回帰性配列を同定することができる。一実施形態では、標的ｍＲＮＡに対して相補的な配列が最初に決定される、回帰性配列を同定するための方法が提供される。次いで、この配列を少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０のヌクレオチド、特に、１９〜３２ヌクレオチド、又は２１〜２３ヌクレオチド長の回帰性配列の存在について分析することができる。代替の実施形態では、このような配列を、例えば、コンピュータープログラム（例えばＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒソフトウェア）を用いて分析することができる。このような回帰性ｉＲＮＡ分子は、ｉＲＮＡ加工において内因性鎖選択の効果を本質的に排除する。
【００８６】
（ヘアピン形成を最適化することができる）
他の実施形態では、２つのｃＴａｒｇｅｔ鎖、又はハイブリダイゼーションが望ましい任意の配列のハイブリダイゼーションを最適化するための方法が提供される。非ワトソン−クリック塩基対がＲＮＡ分子中で可能なため、推定配列中のシトシン残基はウラシル残基と交換することができる。これらのウラシル残基は、グアニン又はアデノシンのいずれかに潜在的に結合し、両鎖間のハイブリダイゼーション度が潜在的に増加する。一実施形態では、Ｄｒｏｓｈａ基質は、このストラテジーを用いてＲＮＡｉ標的化における顕著な変更なく改変することができる。
【００８７】
（クラスター状阻害ＲＮＡ（ｃｉＲＮＡ）：放射状及び線形）
さらに、阻害ＲＮＡは、個々の阻害ＲＮＡをアレイ又はクラスターに付加することによって構築することができる。種々の構造モチ−フを使用することができる。１つのこのようなモチ−フは、リンカー配列を有して又は有さずにタンデムに結合した個々のヘアピンＲＮＡのクラスターである。このような構造は、配列において放射相称（すなわち、放射状ｉＲＮＡ分子）を有さずに構造において放射相称を示すことができる（例えば、図２参照）。あるいは、二本鎖ＲＮＡは、一連のスペーサー配列と結合して、ほぼ線形又は湾曲した構造を作り出すことができる（例えば、図３参照）。これらの構造は、スペーサー配列を用いて又は用いずに種々のオリゴヌクレオチドを結合し、次いでリンカー配列を用いて又は用いずにこれらのオリゴヌクレオチドの相補性配列を逆順に付加するすることによって作り出すことができる。それに加えて、種々の構造ストラテジーを組み合わせて複雑な構造を作り出すことができる。放射及びクラスター状阻害ｉＲＮＡ及び線形クラスター状阻害ｉＲＮＡ構造は両方とも、小さな干渉ＲＮＡを介して細胞ｍＲＮＡの標的化阻害を媒介することができる。
【００８８】
クラスター状阻害ＲＮＡは、１個の発現ベクター又はＤＮＡテンプレートが少なくともｍＲＮＡ配列上の１個の領域を標的化可能な２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、７５又は１００ｓｉＲＮＡ分子を含有するように製造することができる（例えば、図４（ａ）参照）。さらに、クラスター状阻害ＲＮＡは、１個の発現ベクター又はＤＮＡテンプレートが１個のｍＲＮＡ標的配列上の複数の領域を標的化可能な少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、７５又は１００ｓｉＲＮＡ分子を含有するように製造することができる（例えば、図４（ｂ）参照）。あるいは、クラスター状阻害ＲＮＡは、１個の発現ベクター又はＤＮＡテンプレートが複数のｍＲＮＡ標的上の複数の領域を標的化可能な１つより多いｓｉＲＮＡを含有するように製造することができる（例えば、図４（ｃ））。別の実施形態では、クラスター状阻害ＲＮＡは、１個の発現ベクターが複数のｍＲＮＡ標的配列上の相同領域を標的化可能な少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、７５又は１００ｓｉＲＮＡ分子を含有するように製造することができる。
【００８９】
（Ｂ．さらなるｉＲＮＡ分子）
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、あらかじめ選択された核酸配列を用いた特異的なハイブリダイゼーションを成し遂げるために、同一性、数及びサイズにおいて十分な１つ以上のヌクレオチド配列を含む。本発明に従って使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、好ましくは生理学的条件下でアンチセンスオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡと安定なハイブリッドを形成し、ｍＲＮＡ配列の翻訳を阻害するように、標的核酸配列（適切には、標的細胞又は有機体中のｍＲＮＡ）に対して十分に相補性であるように選択される配列を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子配列の一部分に対して１００％相補性であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、標的核酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相補性であることができる。
【００９０】
当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた手順に従って、本発明に従って使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができ、使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成、設計、選択及び使用に関する代表的な教示としては、限定されないが、例えば、米国特許第５，７８９，５７３号、米国特許第６，１９７，５８４号、及びＥｌｌｉｎｇｔｏｎ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）が挙げられる。
【００９１】
（リボザイム）
本発明において使用可能な核酸分子はさらに、リボザイムを含む。一般的に、リボザイムは、リボザイムが結合した核酸配列の開裂、スプライシング、又は結合に通常は関連する酵素活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムについての典型的な構造はＲＮＡ分子を含むが、リボザイムはさらに、ＤＮＡ分子が基質として役立つ反応を触媒することができる。以下の２個の別個の領域をリボザイムにおいて同定することができる：特定の核酸配列に対するハイブリダイゼーションの際にリボザイムに特異性を与える結合領域、及び開裂、結合又はスプライシングの活性をリボザイムに与える触媒領域。細胞内で活性なリボザイムはｃｉｓで作用し、１回のターンオーバー反応のみを触媒し、反応中に通常は自己改変される。しかし、リボザイムはｔｒａｎｓで作用するように設計することもでき、真実の触媒様式では、１回よりも多いターンオーバーを有し自己改変も起こらない。リボザイムの触媒的性質によれば、１個のリボザイム分子は多くの標的核酸を開裂させ、アンチセンス処理に必要な濃度よりも比較的低い濃度で治療活性が達成される（例えば、Ｗｏ９６／２３５６９を参照）。
【００９２】
当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた手順に従って、本発明に従って使用可能なリボザイムを合成することができ、使用することができる。リボザイムの合成、設計、選択及び使用に関する代表的な教示としては、限定されないが、例えば、米国特許第４，９８７，０７１号、及び米国特許第５，８７７，０２１号が挙げられる。
【００９３】
（小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））
ＲＮＡ干渉は、それらの「標的」核酸配列に対して配列特異的な相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎ．，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７（２００１））。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞フリ−溶菌液における生化学研究は、本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエ−タ−が２１〜２５ヌクレオチドの「小さな干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることを示す。従って、ｓｉＲＮＡ分子は、適切には本発明の方法において使用される。ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＲＮａｓｅ酵素によるｄｓＲＮＡの処理から誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡ二本鎖産物は、マルチ−タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体（ＲＩＳＣ（ＲＮＡにより誘発されるサイレンシング複合体）と呼ばれる）に補充される。特定の理論によって束縛されることを望むものではなく、ＲＩＳＣは標的核酸（適切にはｍＲＮＡ）へ導かれ、ｓｉＲＮＡ二本鎖は配列特異的な様式で触媒様式における開裂を媒介することに相関関係にあると考えられている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６（２００１）；Ｂｏｕｒｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１７７６−１７８０（２００１））。
【００９４】
本発明に従って使用可能な小さな干渉ＲＮＡは、当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた手順に従って合成され、使用することができる。本発明の方法において使用するための小さな干渉ＲＮＡは、適切には、約０〜約５０ヌクレオチド（ｎｔ）を含む。非限定的な実施形態の一例では、ｓｉＲＮＡは約５〜約４０ｎｔ、約５〜約３０ｎｔ、約１０〜約３０ｎｔ、約１５〜約２５ｎｔ、又は約２０〜２５ヌクレオチドを含むことができる。
【００９５】
（逆位反復）
逆位反復は、互いに少なくとも部分的に相補性であり、１つの領域が他の領域に対して相対的に逆なように配向している２つの領域を含有する一本鎖核酸分子を含む。この配向は、互いに塩基対について２つの相補的な配列を可能にし、それによってヘアピン構造を形成する。この逆位反復の２つの複製物は連続的である必要はない。ヘアピンを形成する配列間に「ｎ」個のさらなるヌクレオチドが存在することができ、ここで、「ｎ」は任意のヌクレオチド数である。例えば、ｎは少なくとも１、５、１０、２５、５０、又は１００ヌクレオチド、又はそれ以上であることができ、これらの別個の値内の任意のヌクレオチド数であることができる。
【００９６】
本発明に従って使用可能な逆位反復は、当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた手順に従って合成され、使用することができる。ＲＮＡ干渉のための逆位反復の産生及び使用は、限定されないが、例えば、Ｋｉｒｂｙ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１６１６２−１６１６７（２００２），Ａｄｅｌｍａｎ，Ｚ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１２９２５−１２９３３（２００２），Ｙｉ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９３４−９３９（２００３），Ｙａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１：７８０７−７８１６（２００１），Ｓｖｏｂｏｄａ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８７：１０９９−１１０４（２００１）、及びＭａｒｔｉｎｅｋ，Ｓ．及びＹｏｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５６：１７１−１７２５（２０００）中に見出すことができる。
【００９７】
（ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））
Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８（２００２）は、ＲＮＡ干渉に影響を与えるための手段としてヘアピンに折りたたまれた小さなＲＮＡ分子を使用した。このようなショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子はさらに、本発明の方法において有利に使用される。本明細書中に記載される逆位反復に対して機能的に同一な、機能性ｓｈＲＮＡのステム及びループの長さは逆位反復からそれらを区別する。一実施形態では、ステム長さは、少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長であることができ、ループサイズは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０又は５０ヌクレオチド長であることができる。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらのｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ  ＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に似ており、任意の事象では、特定の遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられている。ヘアピンＲＮＡ構造は、小さな干渉ＲＮＡを経て細胞ＲＮＡの標的化破壊を媒介することができる（例えば、図１参照）。
【００９８】
ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーターで開始され、４−５−チミン転写終了部位の２位で終了すると考えられている。発現の際に、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵ−オ−バ−ハングを有するステムループ構造内に折りたたまれると考えられる。続けて、これらのｓｈＲＮＡの末端が加工され、ｓｈＲＮＡが約２１ｎｔのｓｈＲＮＡ様分子に変換される。
【００９９】
本発明に従って使用可能なショートヘアピンＲＮＡは、当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた手順に従って合成することができ、使用することができる。ｓＲＮＡ干渉のための逆位反復の産生及び使用は、限定されないが、Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８（２００２），Ｙｕ，Ｊ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２（２００２）、及びＰａｕｌ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８（２００２）中に見出すことができる。
【０１００】
（小さな一時的に制御されたＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ））
使用可能な小さなＲＮＡの別のグループは、小さな一時制御されたＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）である。一般的に、ｓｔＲＮＡは、約２０〜約３０ｎｔを含む（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２４：１１９−１２９（２００２））が、任意のサイズのｓｔＲＮＡをさらに本発明に従って使用することができる。ｓｉＲＮＡとは異なり、ｓｔＲＮＡは、ｍＲＮＡを分解することなく翻訳を開始した後、標的ｍＲＮＡの発現を下方修正する。
【０１０１】
（ＩＩＩ．ｉＲＮＡ分子の発現）
（Ａ．構築物の設計）
本発明は、ｉＲＮＡ分子を発現するための新規構築物及びＤＮＡテンプレート、及びこのような構築物を作成するための方法を提供する。
【０１０２】
本発明の１つの局面では、所定の位置でｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック細胞及び動物を産生するための方法、及びそれらによって産生された細胞及び動物が提供される。ｉＲＮＡ分子を産生し、ゲノムの特定の位置を標的化する配列を含有するＤＮＡテンプレートは、細胞内に導入可能である。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、ｉＲＮＡ分子の発現が内因性遺伝子機能を破壊することなく達成可能なように標的化することができる。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートはベクターの形態であることができる。ベクターは、直接細胞に導入することができるか、又は細胞に導入する前に線形にすることができる。別の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、オリゴヌクレオチドとして合成され、細胞内に導入することができる。一実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、標的化組み込みを経て細胞のゲノムに組み込むことができる。標的化組み込みを相同組み換えを経て行なうことができる。ＤＮＡテンプレートは、例えば、ｉＲＮＡ分子の発現は、ハウスキーピング遺伝子の関連プロモーターの制御下にあるようにハウスキーピング遺伝子への相同組換えを経て挿入することができる。あるいは、ＤＮＡテンプレートは、相同組換えを経て、ｉＲＮＡ分子の発現が細胞又は臓器に特異的な遺伝子の関連プロモーターの制御下にあるように特定の細胞又は臓器中でのみ発現する遺伝子に挿入することができる。
【０１０３】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子のエキソン内に組み込まれることができる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子のイントロン（例えば、内因性イントロンの非必須位置）内に組み込まれることができる。ＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子の内因性プロモーターが外因性ＤＮＡテンプレートの転写を導くように標的化することができる。なおさらなる実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子のイントロン又はエキソン内に組み込むために設計された（又は合成された）イントロン中に埋め込むことができる。これらの設計されたイントロンは、任意の内因性イントロンに由来することができる。一実施形態において、内因性イントロンは、その最小機能成分に減らすことができる。別の実施形態では、制限部位は、合成イントロン内で設計することができる。一実施形態では、制限酵素部位は、ＤＮＡテンプレートを合成イントロンの中に配置することを可能にする。さらなる実施形態では、合成イントロンは、内因性遺伝子の機能を破壊することなく、内因性エキソン又はイントロンに挿入することができる。
【０１０４】
別の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子が標的遺伝子の発現を調節するために発現される細胞及び動物を産生するための方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、以下の工程を含むことができる：細胞中の１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；標的配列に結合するｉＲＮＡ分子を産生し、さらに細胞内に相同組換えのためのフランキング配列を含有するＤＮＡテンプレートを導入する工程；及び前記ｉＲＮＡ分子が標的核酸配列に結合するような条件下で細胞中でＤＮＡ構築物を発現し、それによって１つ以上の標的遺伝子の発現を調節する工程。一実施形態では、本発明は、１つ以上の標的遺伝子の発現を調節するｉＲＮＡ分子を遺伝的に発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。一実施形態では、上記動物は、体細胞核移植を経て産生することができる。上記体細胞は、本明細書中に記載される技術のいずれかによってｉＲＮＡ分子を発現するように設計することができる。
【０１０５】
（設計された（合成）イントロン）
さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ分子を産生するために使用されるＤＮＡテンプレートは、標的遺伝子のイントロン又はエキソン内に組み込むために設計された（合成）イントロン中に埋め込むことができる。これらの設計されたイントロンは、任意の内因性イントロンに由来することができる。一実施形態において、内因性イントロンは、その最小機能成分に減らすことができる。別の実施形態では、制限部位は、合成イントロン内で設計することができる。一実施形態では、制限酵素部位は、ＤＮＡテンプレートを合成イントロンの中に配置することを可能にする。さらなる実施形態では、合成イントロンは、内因性遺伝子の機能を破壊することなく、内因性エキソン又はイントロンに挿入することができる。
【０１０６】
内因性遺伝子の発現パタ−ン、レベル、及びタイミングを得るために、内因性遺伝子の全ての調節要素を取り込むために、相同組換えを使用することができる。しかし、多くの適用のためには、内因性遺伝子の破壊が受け入れられない。このストラテジーを特性決定された遺伝子内で利用するために、標的遺伝子の内因性イントロン内の非必須位置にｓｉＲＮＡを挿入することができる。あるいは、挿入される外因性イントロンを標的遺伝子のエキソンに整列させることができる。外因性イントロンは、天然に生じるか又は設計することができる（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  Ｍ．Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８５：５１２−２７；Ｃｈｏｉ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｍ，Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．Ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｉｎｔｒｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｊｕｎ；１１（６）：３０７０−４；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ＲＤ，Ｓａｎｄｇｒｅｎ  ＥＰ，Ａｖａｒｂｏｃｋ  ＭＲ，Ａｌｌｅｎ  ＤＤ，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬ）。Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｔｒｏｎｓ  ｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｊａｎ  １５；８８（２）：４７８−８２；Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ  Ｄ，Ａｔｔａｌ  Ｊ，Ｔｈｅｒｏｎ  ＭＣ，Ｂｅａｒｚｏｔｔｉ  Ｍ，Ｂｏｌｉｆｒａｕｄ  Ｐ，Ｋａｎｎ  Ｇ，Ｓｔｉｎｎａｋｒｅ  ＭＧ，Ｐｏｉｎｔｕ  Ｈ，Ｐｕｉｓｓａｎｔ  Ｃ，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  ＬＭ。Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｉｎｔｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９５  Ｊｕｎ  ２１；４０（３）：１６９−７８。
【０１０７】
内因性遺伝子のエキソン内の設計された（又は合成）イントロンの挿入は、転写がこの遺伝子によって制御されることを可能にする。さらに、一旦スプライシングが起こると、得られた内因性遺伝子のｍＲＮＡはその正常状態に戻ることができる。スプライシングされたイントロンは、細胞成分によるさらなる処理のために利用可能であり、効果的に阻害ＲＮＡを産生することができる。
【０１０８】
（合成イントロンアセンブリ）
合成イントロンを任意の既知のイントロンに基づいて設計することができる。一実施形態では、既知のイントロンは当該技術分野で十分に特性決定されており、ｉＲＮＡ分子を産生するＤＮＡテンプレートは、イントロンの機能に影響を与えないことが知られているイントロン内の部位に挿入することができる。簡単に言うと、制限酵素部位はイントロン内に設計することができ、ＤＮＡテンプレートはある位置（イントロン機能に必須ではない位置）でイントロン内に挿入することができる。さらに、制限酵素部位は、標的エキソン又はイントロン内に合成イントロンを標的化挿入可能にするためにイントロンの配列５’又は３’に付加することができる。１つの特定の実施形態では、合成イントロンは５’末端に少なくとも１つの制限酵素部位、イントロンスプライスドナー部位、少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を産生可能なＤＮＡテンプレート、イントロンブランチ部位、イントロンスプライスアクセプター部位、及び３’末端に制限酵素部位を含有することができ、例えば、以下の図を参照：
【０１０９】
【化７】
2007512027.tif 000008
他の実施形態では、設計されたイントロンは、任意の既知の遺伝子（例えば、細胞又は組織に特異的な遺伝子）から作成することができる。一実施形態では、イントロンが特性決定されていない場合、以下の非限定的な方法論により、ＤＮＡテンプレートのために適切な、イントロン機能に影響を与えない挿入部分を同定することができる。最初にイントロンを配列決定する。次いで、遺伝子をリポーター遺伝子に結合してイントロンの機能について試験するためのリポーターッセイを設定する。次いで、制限酵素部位をイントロンのある位置に設計し、イントロンをＤＮＡテンプレート配列内にクローン化する。最後に、合成構築物をリポーターッセイ中で試験して、ＤＮＡテンプレートの挿入が遺伝子の機能と相互作用するか否かを決定する。このプロセスは、イントロンの非必須部位がＤＮＡテンプレートの挿入について同定されるまでに終了することができる。さらに、このプロセスはさらに、最小限の機能性イントロンが同定されるまでイントロン配列の順次欠失を含むことができる。
【０１１０】
（Ｂ．クローニングストラテジー）
本発明の実施形態では、ＤＮＡが共にスプライシングされ、特定のヌクレオチド配列を形成することができる。一実施形態では、相同組換えのために少なくとも５’標的化ア−ム、第１のヌクレオチド配列、場合により、リンカー配列、第１のヌクレオチド配列に実質的にハイブリダイズする第２のヌクレオチド配列、及び相同組換えのための３’標的化ア−ムを含有するＤＮＡテンプレートが提供される。場合により、これらのＤＮＡテンプレートはさらに合成イントロンへクローニングすることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡテンプレート及び／又は合成イントロンの各成分のために合成することができ、制限酵素を用いて共にクローン化することができる。別の実施形態では、各成分は発現ベクター中で設計することができる。一実施形態では、ベクターは細胞内に導入され、それらの細胞の遺伝的改変を達成することができる。別の実施形態では、ベクターは線形であることができ、細胞に挿入することができる。
【０１１１】
本発明の他の実施形態では、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を細胞中に発現させることができる。一実施形態では、クラスター状ｉＲＮＡ分子は細胞中に発現する。一実施形態では、一連のｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを発現ベクター内にクローン化するために、以下のストラテジーを使用することができる。最初に、ベクターを２つの非適合性の、固有の制限部位を有して得ることができ、次いで第１のオリゴヌクレオチドをこれらの部位に直接的にクローン化することができる。第１のオリゴヌクレオチドは、クローニングの際に制限部位の１つを破壊し、反対側の末端に機能的な制限部位を供給するように設計することができる。このストラテジーを用いて、２つのもともとの制限酵素のための開裂部位が新規構築物中に存在し、次のオリゴヌクレオチドがこれらの部位にクローン化される。所望な数のオリゴヌクレオチドがクローン化され、導入遺伝子が組み込まれるまでこのサイクルを繰り返すことができる。ＢｃＩＩ（ｔｇａｔｃａ）及びＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）のための制限部位を利用する一例として、以下の組成を使用することができる：
【０１１２】
【化８】
2007512027.tif 000009
別の実施形態では、例えば、クラスター状干渉ＲＮＡのためにオリゴヌクレオチドを組み込むために、以下のストラテジーに従うことができる。リンカー配列を使用して、意図的でない構造が形成されることを防ぐことができる。非適合性の制限部位、例えば、Ｂｃｌ  Ｉ又はＭｌｕ  Ｉ部位を使用することができる。これらの部位を直接的にクローン化することができ、上流部位を破壊することができ、さらに、次のヘアピンオリゴヌクレオチドの調製において下流領域に新しいベクターを再供給することができる。
【０１１３】
本明細書において開示されるＤＮＡ構築物、テンプレート及び／又はベクターは、内因性遺伝子のエキソン又はイントロンのいずれかに挿入することができる。特定の実施形態では、挿入は標的イントロン又はエキソンの機能を変更しない。標的化ストラテジーは、細胞においてｉＲＮＡ分子を発現するための内因性制御能力を利用しつつ、標的化された遺伝子の機能的な健全性を維持するのに役立つ。イントロン及びエキソン機能を含む遺伝子は、機能性アッセイを用いてアッセイされ、遺伝子機能が挿入によって損傷しているか否かを決定することができる。
【０１１４】
（ベクター）
一実施形態では、約少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、又は１００のｉＲＮＡ分子をベクターにクローン化することができる。ｉＲＮＡ分子を含有するベクターは、さらに原核生物又は真核細胞細胞に導入し、又は挿入することができ、好ましくはｉＲＮＡ分子の発現を生じる。一実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ベクター中のプロモーターに使用可能に結合することができる。プロモーターは外因性又は内因性プロモーターであることができる。代替の実施形態では、ｉＲＮＡ分子はプロモーターを含まないベクターにクローン化され、真核細胞のゲノムに挿入され、ここで、プロモーターを含まないベクターは、内因性遺伝子と関連するプロモーター及び／又は他の調節要素の制御下にある。特定の実施形態では、このようなプロモーターを含まないベクターは、細胞ホメオスタシス又は内因性遺伝子の機能を破壊しない。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、挿入された核酸に対して有用な生物学的性質又は生化学的性質を提供する核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を指す。本発明に従う「発現ベクター」は、ベクターの細胞内への形質転換の際に、ベクターに挿入又はクローン化された１つ以上のｉＲＮＡ分子の発現を高めることが可能なベクターを含む。用語「ベクター」及び「プラスミド」は、本明細書中で互換可能に使用される。ベクターの例としては、ファ−ジ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、及びインビトロ又は細胞中で複製可能又は複製されることが可能な他の配列、又は動物の細胞内の所望な位置に対して所望な核酸セグメントを運ぶことが可能な他の配列が挙げられる。本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体に由来するベクター、エピソ−ムに由来するベクター、ウイルスに由来するベクター、例えば、細菌性プラスミド又はバクテリオファージに由来するベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、コスミド及びファ−ジミドが挙げられる。ベクターは、ベクターの必須の生物学的機能を失うことなくその部位で配列を決定可能な様式で切断し、核酸フラグメントをその複製及びクローニングをもたらすためにスプライシング可能な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。ベクターはさらに、例えばＰＣＲ、転写開始及び／又は翻訳開始及び／又は調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択可能なマーカー等のためのプライマ−部位を提供することができる。明らかに、相同組換え、転位又は制限酵素（例えば、限定されないが、ＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号）、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｒ）ブランドＰＣＲクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））の使用を必要としない所望な核酸フラグメントを挿入する方法が、本発明に従って使用されるベクターに核酸をクローン化するために適用することができる。ベクターは、ベクターを用いて形質転換された細胞を同定するためのさらに１つ以上の選択可能なマーカー、例えば、本明細書中に記載される選択可能なマーカー及びリポーター遺伝子を含有することができる。それに加えて、ｉＲＮＡを含有する発現ベクターは、クローニング領域及びポリ（Ｕ）依存ＰｏｌＩＩＩ転写ターミネーターを含むように組み立てられる。
【０１１６】
本発明に従って、任意のベクターは、本発明の発現ベクターを含有するｉＲＮＡを構築するために使用することができる。それに加えて、当該技術分野で既知であり、市販のベクター（及びそれらの改変体又は誘導体）は、本発明に従って、本発明の方法において使用するための１つ以上の組換え部位を含むように設計することができる。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから得ることができる。特定の目的を有するベクターの一般的な種類としては、原核生物及び／又は真核生物クローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、２ハイブリッドベクター又は逆２ハイブリッドベクター、異なる宿主において使用するためのシャトルベクター、突然変異生成ベクター、転写ベクター、大きな挿入物を受けるためのベクターが挙げられる。
【０１１７】
他の目的のベクターとしては、ウィルス起源ベクター（Ｍ１３ベクター、細菌ファ−ジλベクター、アデノウイルスベクタ及びレトロウィルスベクター）、高複製数ベクター、低複製数ベクター、及び調節可能な複製数を有するベクター、単一の宿主において組み合わせて使用するための適合可能なレプリコンを有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４及びｐＢＲ３２２）、及び真核生物エピソ−ム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）が挙げられる。
【０１１８】
目的のベクターとしては、原核生物発現ベクター、例えば、ｐＣＤＮＡ  ＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ、及びＣ、ｐＲＳＥＴ  Ａ、Ｂ、及びＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ｐＧＥＭＥＸ−１、及びｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸベクター、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、及びｐＭＣ１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ＫＫ２３３−２及びｐＫＫ３８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、及びｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）及びそれらの改変体及び誘導体が挙げられる。目的の他のベクターとしては、真核生物発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、及びｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、及びｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、及びｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、及びｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、及びｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃｆｆｉｓ  Ａ、Ｂ、及びＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＨＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡｌ、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４及びｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）及びそれらの改変体又は誘導体が挙げられる。
【０１１９】
使用可能な他のベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファ−ジミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、Ｐ１（大腸菌ファ−ジ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＦＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０及びｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びそれらの改変体又は誘導体が挙げられる。ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターもさらに使用可能である（例えば、ＷＯ０３／０５９９２３；Ｔｉｓｃｏｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １００：１８４４−１８４８（２００３）を参照）。
【０１２０】
目的のさらなるベクターとしては、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ＰＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、及びｐＣＲＢａｃ；ＰｈａｒｍａｃｉａからのλＥｘＣｅｌｌ、λｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫ３Ｃ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、及びｐＵＣ４Ｋ；ＮｏｖａｇｅｎからのｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ｃｐ  ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ  ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、及びＳｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ；ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ  ＧＬ、ｐＧＡＤ  ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐ���ＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐｐｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＨｉＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｌｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−ｌ／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５、及びＴｒｉｐｌＥｘ；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４  Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ  ＦＩＸ  ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ  Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／−、ｐＢＣ  ＫＳ＋／−、ｐＢＣ  ＳＫ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−１１ａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３  ＣＡＴ，ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ  Ａ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＸβＧＡＬ、ｐＮＥＯｐＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、及びｐＲＳ４１６が挙げられる。
【０１２１】
目的の２ハイブリッドベクター及び逆２ハイブリッドベクターとしては、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−ｌ、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ及びそれらの改変体又は誘導体が挙げられる。
【０１２２】
（（１）プロモーター制御下でのベクター）
真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」及び「エンハンサ−」要素を含む。プロモーター及びエンハンサ−は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列のショートアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７［１９８７］）。プロモーター及びエンハンサ−要素は、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、及びウイルス中の遺伝子を含む種々の真核生物源から単離された（類似した制御要素、すなわちプロモーターは、原核生物においても見出される）。特定のプロモーター及びエンハンサ−の選択は、どの細胞種を目的のタンパク質を発現するために使用するのかに依存する。いくつかの真核生物プロモーター及びエンハンサ−は、他のものが限定された細胞種のサブセットにおいて機能性であるのに反し、広範囲の宿主範囲を有する（総説として、Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７［１９８６］；及びＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（前出）を参照）。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサ−は、多くの哺乳動物種由来の広範囲の細胞種において非常に活性であり、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のために広く使用される（Ｄｉｊｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１［１９８５］）。広範囲の哺乳動物細胞種において活性なプロモーター／エンハンサ−要素の２つの他の例は、ヒト延長因子１α遺伝子由来のもの（Ｕｅｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５７９１［１９８９］；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ９１：２１７［１９９０］；及びＭｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１８：５３２２［１９９０］）；及びニワトリ肉腫ウイルス機能（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７［１９８２］）及びヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１［１９８５］）の長い末端繰り返しである。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、プロモーター機能（すなわち、プロモーター要素によって提供される機能）を提供可能な配列を含有するＤＮＡのセグメントを示す。例えば、レトロウイルスの長い末端繰り返しは、プロモーター機能を含有する。プロモーターは、「内因性」又は「外因性」又は「異種」であってもよい。「内因性」プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と関連するものである。「外因性」又は「異種」プロモーターは、遺伝子の転写が結合したプロモーターによって開始されるような、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術、例えば、クローニング及び組換え）を用いることによって遺伝子に対して並置されるものである。プロモーターはさらに、エンハンサ−活性を含有することができる。
【０１２４】
（ａ．内因性プロモーター）
一実施形態では、ｉＲＮＡ分子を含有するベクターの使用可能に結合したプロモーターは内因性プロモーターである。本実施形態の１つの局面では、内因性プロモーターは、その関連する遺伝子の連続的な転写を可能にする任意の非調節プロモーターであることができる。
【０１２５】
別の局面では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターであることができる。さらに好ましくは、内因性プロモーターはハウスキーピング遺伝子と関連する。プロモーターがｉＲＮＡに使用可能に結合することができるハウスキーピング遺伝子の非限定例としては、以下のヒトハウスキーピング遺伝子の保存された交叉種アナログが挙げられる：糸粒体１６ＳｒＲＮＡ、リボソームタンパク質Ｌ２９（ＲＰＬ２９）、Ｈ３ヒストン、ファミリ３Ｂ（Ｈ３．３Ｂ）（Ｈ３Ｆ３Ｂ）、ポリ（Ａ）−結合タンパク質、細胞質内１（ＰＡＢＰＣ１）、ＨＬＡ−Ｂ関連転写物−１（Ｄ６Ｓ８１Ｅ）、サーフェイト（ｓｕｒｆｅｉｔ）１（ＳＵＲＦ１）、リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、カテコ−ル−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、リボソームタンパク質Ｓ７（ＲＰＳ７）、熱ショック２７ｋＤタンパク質１（ＨＳＰＢ１）、真核生物翻訳伸長１因子デルタ（グアニンヌクレオチド交換タンパク質）（ＥＥＦ１Ｄ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、リボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、カルボキシエステラ−ゼ２（腸、肝臓）（ＣＥＳ２）、エックスポルチン（ｅｘｐｏｒｔｉｎ）１（ＣＲＭ１、酵母、ホモログ）（ＸＰＯ１）、ユビキノール−チトクロムｃレダクターゼヒンジタンパク質（ＵＱＣＲＨ）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、リボホリンＩＩ（ＲＰＮ２）、Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ及びＳｅｃ７領域タンパク質（ＰＳＤ）、ヒト心臓トロポニンＴ、プロテアソーム（プロソ−ム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、５（ＰＳＭＢ５）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳＡＲＳ）、カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１（８８ｋＤ）（ＣＴＮＮＢ１）、ダッフィー血液型（ＦＹ）、赤血球膜タンパク質バンド７．２（ストマチン（ｓｔｏｍａｔｉｎ））（ＥＰＢ７２）、Ｆａｓ／Ａｐｏ−１、ＬＭ及びＳＨ３タンパク質１（ＬＡＳＰ１）、アクセサリタンパク質ＢＡＰ３１／ＢＡＰ２９（ＤＸＳ１３５７Ｅ）、新生ポリペプチド−会合複合体αポリペプチド（ＮＡＣＡ）、リボソームタンパク質Ｌ１８ａ（ＲＰＬ１８Ａ）、ＴＮＦ受容体関連第４因子（ＴＲＡＦ４）、ＭＬＮ５１タンパク質（ＭＬＮ５１）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、ポリ（ｒＣ）−結合タンパク質２（ＰＣＢＰ２）、チオレドキシン（ＴＸＮ）、グルタミニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＱＡＲＳ）、精巣強化された遺伝子転写物（ＴＥＧＴ）、前立腺結合タンパク質（ＰＢＰ）、シグナル配列レセプター、β（トランスロコン関連タンパク質β）（ＳＳＲ２）、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、セントリン（ｃｅｎｔｒｉｎ）、ＥＦハンドタンパク質、２（ＣＥＴＮ２）、異種核リボ核タンパク質Ｋ（ＨＮＲＰＫ）、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ホスホリピドヒドロペルオキシダーゼ）（ＧＰＸ４）、ｔ（１２；１６）悪性脂肪肉腫から誘導された融合物（ＦＵＳ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｃ（サブユニット９）、イソ型２（ＡＴＰ５Ｇ２）、リボソームタンパク質Ｓ２６（ＲＰＳ２６）、リボソームタンパク質Ｌ６（Ｒ��Ｌ６）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、セリン（又はシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレ−ド（ｃｌａｄｅ）Ａ（α−１抗プロテイナーゼ、抗トリプシン）、メンバー３（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、二重特異性ホスファターゼ１（ＤＵＳＰ１）、ペルオキシレドキシン１（ＰＲＤＸ１）、精巣上体分泌タンパク質（１９．５ｋＤ）（ＨＥ１）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、転位したプロモーター領域（活性ＭＥＴオンコジーンに対して）（ＴＰＲ）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、ＳＯＮ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＯＮ）、リボソームプロットＬＩ９（ＲＰＬ１９）、リボソームプロット（酵母Ｓ２４に対するホモログ）、ＣＤ６３抗原（黒色腫１抗原）（ＣＤ６３）、タンパク質チロシンホスファターゼ、非レセプタータイプ６（ＰＴＰＮ６）、真核生物翻訳伸長１因子β２（ＥＥＦ１Ｂ２）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｂ、イソ型１（ＡＴＰ５Ｆ１）、溶質キャリア族２５（糸粒体のキャリア；リン酸トランスポーター）、メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＷＡＲＳ）、グルタメートアンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（ＧＬＵＬ）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、インターフェロンから誘導された膜貫通タンパク質２（１−８Ｄ）（ＩＦＩＴＭ２）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、βポリペプチド（ＹＷＨＡＢ）、カゼインキナーゼ２、βポリペプチド（ＣＳＮＫ２Ｂ）、ユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合産物１（ＵＢＡ５２）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、ジュンＤプロトオンコジーン（ＪＵＮＤ）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、θポリペプチド（ＹＷＨＡＱ）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、リボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、フィラミンＡ、α（アクチン結合タンパク質−２８０）（ＦＬＮＡ）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（サイクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、ビリン２（エズリン）（ＶＩＬ２）、真核生物翻訳延長因子２（ＥＥＦ２）、ジュンＢプロトオンコジーン（ＪＵＮＢ）、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩｃ（ＣＯＸ７Ｃ）、異種核リボ核タンパク質Ｌ（ＨＮＲＰＬ）、腫瘍タンパク質、翻訳制御された１（ＴＰＴ１）、リボソームタンパク質Ｌ３１１（ＲＰＬ３１）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド２（肝臓）（ＣＯＸ７Ａ２）、ＤＥＡＤ／Ｈ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５（ＲＮＡヘリカーゼ、６８ｋＤ）（ＤＤＸ５）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩａポリペプチド１（ＣＯＸ６Ａ１）、熱ショック９０ｋＤタンパク質１、α（ＨＳＰＣＡ）、シェーグレン症候群抗原Ｂ（自己抗原Ｌａ）（Ｓ���Ｂ）、乳酸デヒドロゲナーゼＢ（ＬＤＨＢ）、高移動群（非ヒストン性染色体）タンパク質１７（ＨＭＧ１７）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ（ＣＯＸ６Ｃ）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ＨＮＫＰＡ１）、アルドラ−ゼＡ、フラクトース−ビスホスフェート（ＡＬＤＯＡ）、インテグリン、β１（フィブロネクチンレセプター、βポリペプチド、抗原ＣＤ２９、ＭＤＦ２、ＭＳＫ１２）（ＩＴＧＢ１）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、低分子リボ核タンパク７０ｋＤポリペプチド（ＲＮ抗原）（ＳＮＲＰ２０）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド１（ＧＮＢ１）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＡ１）、カルパイン４、小サブユニット（３０Ｋ）（ＣＡＰＮ４）、延長因子ＴＵ単位（Ｎ末端）／Ｘ０３６８９、リボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＰα１（ＨＬＡ−ＤＰＡ１）、ス−パ−オキシドジスムターゼ１、可溶性（筋萎縮性側索硬化症１（成人））（ＳＯＤ１）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、Ａｃｔｉｎ、β（ＡＣＴＢ）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＰα（ＨＬＡ−ＤＲＡ）、チュービュリン、βポリペプチド（ＴＵＢＢ）、メタロチオネイン２Ａ（ＭＴ２Ａ）、ホスホグリセレ−トキナーゼ１（ＰＧＫ１）、ＫＲＡＢ関連タンパク質１（ＴＩＦ１Ｂ）、真核生物翻訳開始第３因子、サブユニット５（イプシロン、４７ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ５）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１αサブ複合体、４（９ｋＤ、ＭＬＲＱ）（ＮＤＵＦＡ４）、塩化物菌体内チャネル１（ＣＬＩＣ１）、アダプタ−関連タンパク質複合体３、シグマ体１、サブユニット（ＡＰ３Ｓ１）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ（ＣＯＸ４）、ＰＤＺ及びＬＥＭドメイン１（エルフィン）（ＰＤＬＩＭ１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ様；グルタチオントランスフェラーゼω（ＧＳＴＴＬｐ２８）、インターフェロン刺激された遺伝子（２０ｋＤ）（ＩＳＧ２０）、核因子Ｉ／Ｂ（ＮＦＩＢ）、ＣＯＸ１０（酵母）ホモログ、シトクロムｃオキシダーゼアセンブリタンパク質（ヘムＡ：ファルネシルトランスフェラーゼ）、骨肉腫中で増殖した保存遺伝子（ＯＳ４）、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＰＳ）、ガラクトシダーゼ、α（ＧＬＡ）、ミクロソ−ムグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ２（ＭＧＳＴ２）、真核生物翻訳開始第４因子γ、２（ＥＩＦ４Ｇ２）、ユビキチンキャリアータンパク質Ｅ２−Ｃ（ＵＢＣＨ１０）、ＢＴＧファミリー、メンバー２（ＢＴＧ２）、Ｂ−細胞関連タンパク質（ラット赤血球抗原）、ＣＯＰ９サブユニット６（ＭＯＶ３４ホモログ、３４ｋＤ）（ＭＯＶ３４−３４ＫＤ）、ＡＴＸ１（抗酸化剤タンパク質１、酵母）ホモログ１（ＡＴＯＸ１）、ロイシン中で豊富な酸性タンパク質（ＳＳＰ２９）、ポリ（Ａ）−結合プロット（ＰＡＢＰ）プロモーター領域、セレノタンパク質Ｗ、１（ＳＥＰＷ１）、真核生物翻訳開始第３因子、サブユニット６（４８ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ６）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、筋肉（ＣＰＴＩＢ）、膜内外トラッフィングタンパク質（ＴＭＰ２１）、４つ半のＬＥＶＴ領域１（ＦＨＬ１）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、骨髄性白血病第２因子（ＭＬＦ２）、神経フィラメントトリプレットＬプロット／Ｕ５７３４１、キャッピングタンパク質（アクチンフィラメント）筋肉Ｚ−ライン、α１（ＣＡＰＺＡ１）、１−アシルグリセキソ−ル−３−ホスフェートＯ−アシルトランスフェラーゼ１（リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、α）、（ＡＧＰＡＴ１），１，３，４−トリホスフェート５／６キナーゼ（ＩＴＰＫｌ）、ヒスチジントライアドヌクレオチド−結合タンパク質（ＨＩＮＴ）、ダイナミチン（ジナクチン）複合体５０ｋＤサブユニット）（ＤＣＴＮ−５０）、アクチン関連タンパク質２／３複合体、サブユニット２（３４ｋＤ）（ＡＲＰＣ２）、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）、ユビキチンＢ、キチナ−ゼ３様２（ＣＨＩ３Ｌ２）、Ｄ−ド−パクロムト−トメラーゼ（ＤＤＴ）、Ｚｎフィンガータンパク質２２０（ＺＮＦ２２０）、シークエストソーム（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ）１（ＳＱＳＴＭ１）、シスタチンＢ（ステフィンＢ）（ＣＳＴＢ）、真核生物翻訳開始第３因子、サブユニット８（１１０ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ８）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチ−フ）レセプター９（ＣＣＲ９）、ユビキチン特定プロテアーゼ１１（ＵＳＰ１１）、ラミニンレセプター１（６７ｋＤ、リボソームタンパク質ＳＡ）（ＬＡＭＲ１）、骨肉腫（ＯＳ−９）、スプライシングファクター３ｂ、サブユニット２、１４５ｋＤ（ＳＦ３Ｂ２）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ユビキチン接合酵素Ｅ２Ｄ３（酵母ＵＢＣ４／５に対して相同）（ＵＢＥ２Ｄ３）、シャペロニン含有ＴＣＰ１、サブユニット４（δ）（ＣＣＴ４）、ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向性）ポリペプチドＬ（７．６ｋＤ）（ＰＯＬＲ２Ｌ）、核レセプターコリプレッサー２（ＮＣＯＲ２）、アクセサリ−タンパク質ＢＡＰ３１／ＢＡＰ２９（ＤＸＳ１３５７Ｅ、ＳＬＣ６Ａ８）、１３ｋＤ分化関連タンパク質（ＬＯＣ５５９６７）、Ｔａｘ１（ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ）結合タンパク質１（ＴＡＸ１ＢＰ１）、損傷特有ＤＮＡ結合タンパク１（１２７ｋＤ）（ＤＤＢ１）、ダイニン、細胞質内、軽ポリペプチド（ＰＩＮ）、メチオニンアミノペプチダーゼ；ｅＩＦ−２関連ｐ６７（ＭＮＰＥＰ）、Ｇタンパク質経路サプレ
ッサー２（ＧＰＳ２）、リボソームタンパク質Ｌ２１（ＲＰＬ２１）、コートマータンパク質複合体、サブユニットα（ＣＯＰＡ）、Ｇタンパク質経路サプレッサー１（ＧＰＳ１）、低分子リボ核タンパク質Ｄ２ポリペプチド（１６．５ｋＤ）（ＳＮＲＰＤ２）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ５（ＲＰＳ５）、リボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、タンパク質チロシンホスファターゼタイプＩＶＡ、メンバー２（ＰＴＰ４Ａ２）、リボソームプロットＬ３６（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、ＩｇＧのＦｃフラグメント、レセプター、トランスポーター、α（ＦＣＧＲＴ）、妊婦Ｇ１０転写物（Ｇ１０）、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｃ（サブユニット９）イソ型３（ＡＴＰ５Ｇ３）、シグナル認識粒子１４ｋＤ（相同性ＡｌｕＲＮＡ−結合タンパク質）（ＳＲＰ１４）、ｍｕｔＬ（大腸菌）ホモログ１（大腸癌、非ポリ−プ性２型）（ＭＬＨ１）、染色体Ｉｑサブテロマー配列Ｄ１Ｓ５５３．／Ｕ０６１５５、フィブロモジュリン（ＦＭＯＤ）、スピリットのアミノ末端エンハンサ−（ＡＥＳ）、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ活性タンパク質（ＡＲＨＧＡＰ１）、非−ＰＯＵドメイン含有、オクタマ−結合（ＮＯＮＯ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫３６１１ウイルス発癌遺伝子ホモログ１（ＡＲＡＦ１）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＡ１）、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、リボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、ブロモドメイン含有２（ＢＲＤ２）、無精子症１因子（ＡＺＦ１）、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ−３によって上方調節される（ＶＤＵＰ１）、セリン（又はシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー６（ＳＥＲＰＩＮＢ６）、デストリン（アクチン解重合因子）（ＡＤＦ）、サイモシンβ−１０（ＴＭＳＢ１０）、ＣＤ３４抗原（ＣＤ３４）、スペクトリン、β、非赤血球１（ＳＰＴＢＮ１）、血管関連の、遊走性の細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ａ（ＨＬＡ−Ａ）、ＭＹＣ関連のＺｎフィンガータンパク質（プリン結合性転写因子）（ＭＡＺ）、ＳＥＴトランスロケ−ション（骨髄性白血病関連の）（ＳＥＴ）、ペアードボックス遺伝子（無虹彩、角膜炎）（ＰＡＸ６）、マウスにおいてＺｆｐ−３６に対して相同性な亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ３６）、ＦＫ５０６−結合タンパク質４（５９ｋＤ）（ＦＫＢＰ４）、ヌクレオソーム組立てタンパク質１−様１（ＮＡＰ１Ｌ１）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド（ＹＷＨＡＺ）、リボソームタンパク質Ｓ３Ａ（ＲＰＳ３Ａ）、ＡＤＰリボシル化因子１、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、転写伸長因子Ａ（ＳＩＩ）、１（ＴＣＥＡ１）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、ＡＤＰリボシル化第３因子（ＡＲＦ３）、モエシン（ＭＳＮ）、Ｂ細胞インヒビターにおけるカッパ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子、α（ＮＦＫＢＩＡ）、相補成分１、ｑ亜成分結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）、リボソームタンパク質Ｓ２５（ＲＰＳ２５）、クラステリン（細胞溶解インヒビター、ＳＰ−４０，４０、硫酸化グリコプロテイン２、テストステロンを抑制された前立腺のメッセ−ジ２、アポリポーターンパクＪ）（ＣＬＵ）、ヌクレオリン（ＮＣＬ）、リボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、ユビキチン−活性化酵素Ｅｌ（Ａ１Ｓ９Ｔ及びＢＮ７５温度感受性相補性）（ＵＢＥ１）、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、３（ガレクチン３）（ＬＧＡＬＳ３）、真核生物翻訳伸長１因子γ（ＥＥＦ１Ｇ）、ｐｉｍ−１オンコジーン（ＰＩＭ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１０、アネキシンＩＩリガンド、カルパクチンＩ（軽ポリペプチド（ｐ１１））、Ｈ２Ａヒストンファミリー、メンバーＺ（Ｈ２ＡＦＺ）、ＡＤＰリボシル化第４因子（ＡＲＦ４）（ＡＲＦ４）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＱα１（ＨＬＡ−ＤＱＡ１）、ＦＫ５０６−結合タンパク質１Ａ（１２ｋＤ）（ＦＫＢＰ１Ａ）、ＣＤ８１抗原（抗増殖性抗体１の標的）（ＣＤ８１）、リボソームタンパク質Ｓ１５（ＲＰＳ１５）、Ｘ−ボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ１）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＮα（ＨＬＡ−ＤＮＡ）、リボソームタンパク質Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、白血病関連リンタンパク質ｐ８（スタスミン）（ＬＡＰ１８）、ミオシン、重ポリペプチド９、非筋肉（ＭＹＨ９）、カゼインキナーゼ２、βポリペプチド（ＣＳＮＫ２Ｂ）、フコシダーゼ、α−Ｌ−１、組織（ＦＵＣＡ１）、ジアホラーゼ（ＮＡＤＨ）（チトクロムｂ−５レダクターゼ）（ＤＩＡ１）、シスタチンＣ（アミロイド脈管障害及び脳溢血）（ＣＳＴ３）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、ユビキノール−チトクロムｃレダクターゼ結合タンパク質（ＵＱＣＲＢ）、プロチモシン、α（遺伝子配列２８）（ＰＴＭＡ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ（ＧＳＴＰ１）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド２−様１（ＧＮＢ２Ｌ１）、ヌクレオホスミン（核小体リンタンパク質Ｂ２３、ヌマトリン）（ＮＰＭ１）、ＣＤ３Ｅ抗原、イプシロンポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）（ＣＤ３Ｅ）、カルパイン２、（ｍ／ＩＩ）大サブユニット（ＣＡＰＮ２）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）フラボタンパク質２（２４ｋＤ）（ＮＤＵＦＶ２）、熱ショック６０ｋＤタンパク質１（シャペロニン）（ＨＳＰＤ１）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、αを刺激する活性ポリペプチド１（ＧＮＡＳ１）、クラトリン、軽ポリペプチド（Ｌｃａ）（ＣＬＴＡ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、ミトコンドリアＦｌ複合体、βポリペプチド、カルモジュリン２（ホスホリラ−ゼキナーゼ、δ）（ＣＡＬＭ２）、アクチン、γ１（ＡＣＴＧ１）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質、大きい、Ｐ１（ＲＰＬＰ１）、リボソームタンパク質、大きい、Ｐ０（ＲＰＬＰＯ）、サイモシン、β４、Ｘ染色体（ＴＭＳＢ４Ｘ）、異種核リボ核��ンパク質Ｃ（Ｃ１／Ｃ２）（ＨＮＲＰＣ）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、グルクロニダーゼ、β（ＧＵＳＢ）、ＳＲＣ、ＦＧＲ、ＹＥＳに関連したＦＹＮオンコジーン（ＦＹＮ）、プロチモシン、α（遺伝子配列２８）（ＰＴＭＡ）、エノラ−ゼ１、（α）（ＥＮＯ１）、ラミニンレセプター１（６７ｋＤ、リボソームタンパク質ＳＡ）（ＬＡＭＲ１）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）、ＣＤ７４抗原（主要組織適合性複合体の不変のポリペプチド、クラスＩＩ抗原関連）、エステラ−ゼＤ／ホルミルグルタチオンヒドロラ−ゼ（ＥＳＤ）、Ｈ３ヒストン、ファミリー３Ａ（Ｈ３Ｆ３Ａ）、フェリチン、軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、Ｓｅｃ２３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ホモログＡ（ＳＥＺ２３Ａ）、アクチン、β（ＡＣＴＢ）、プレセニリン１（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病３）（ＰＳＥＮ１）、インターロイキン１レセプター関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、Ｚｎフィンガータンパク質１６２（ＺＮＦ１６２）、リボソームタンパク質Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、ベクリン１（コイル状コイル、ミオシン−様ＢＣＬ２−相互作用タンパク質）（ＢＥＣＮ１）（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的）αポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）、ＩＱのＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（ＩＱＧＡＰ１）、シグナルトランスデューサー、及び、転写３のアクティベーター（急性段階応答因子）（ＳＴＡＴ３）、異種核リボ核タンパク質Ｆ（ＨＮＲＰＦ）、推定翻訳開始因子（ＳＵＩ１）、タンパク質転座複合体β（ＳＥＣ６１Ｂ）、ラス推定ホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＡ（ＡＲＨＡ）、フェリチン、重ポリペプチド１（ＦＴＨ１）、Ｒｈｏ  ＧＤＰ解離インヒビター（ＧＤＩ）β（ＡＲＨＧＤＩＢ）、Ｈ２Ａヒストンファミリー、メンバーＯ（Ｈ２ＡＦＯ）、アネキシンＡ１１（ＡＮＸＡ１１）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、アデニリルシクラーゼ関連タンパク質（ＣＡＰ）、フィンガータンパク質９１（ＨＰＦ７、ＨＴＦ１０）（ＺＮＦ９１）、リボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＣＡＡＸボックス、α（ＦＮＴＡ）、ナトリウムチャネル、電位作動型、Ｉ形、βポリペプチド（ＳＣＮ１Ｂ）、カルネキシン（ＣＡＮＸ）、プロテオリピドタンパク質２（結腸上皮に豊富な）（ＰＬＰ２）、アミロイドβ（Ａ４）前駆体−様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、膜電位依存性陰イオンチャネル２、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）アクティベーターサブユニット１（ＰＡ２８α）（ＰＳＭＥ１）、リボソームプロットＬ１２（ＲＰＬ１２）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ、１（ＰＳＭＣ１）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＱβ１（ＨＬＡ−ＤＱＢ１）、複製タンパク質Ａ２（３２ｋＤ）（ＲＰＡ２）、熱ショック９０ｋＤタンパク質１、β（ＨＳＰＣＢ）、チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＵＩ（ＣＯＸ８）、真核生物翻訳伸長１因子α１（ＥＥＦ１Ａ１）、ＳＮＲＰＮ上流のリーディングフレーム（ＳＮＵＲＦ）、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶��、１（ガレクチン１）（ＬＧＡＬＳ１）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ホスホグリセレートムターゼ１（脳）（ＰＧＡＭ１）、インターフェロンによって誘発された膜貫通タンパク質１（９−２７）（ＺＦＩＴＭ１）、ヌクレアーゼゲージ受感部結合タンパク質１（ＮＳＥＰ１）、溶質キャリア族２５（ミトコンドリアキャリア；アデニンヌクレオチドトランスロケ−タ）、メンバー６（ＳＬＣ２５Ａ６）、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＤ＋；ポリ（ＡＤＰリボ−ス）ポリメラーゼ）（ＡＤＰＲＴ）ロイコトリエンＡ４ヒドロラ−ゼ（ＬＴＡ４Ｈ）、プロフィリン１（ＰＦＮ１）、プロサポシン（異型Ｇａｕｃｈｅｒ病及び異型異染性ロイコジストロフィ−）（ＰＳＡＰ）、溶質キャリアファミリー２５（糸粒体キャリア；アデニンヌクレオチドトランスロケーター）、メンバー５（ＳＬＣ２５Ａ５）、β−２ミクログロブリン、ＩＧＦ結合タンパク質７、リボソームプロットＳ１３、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｒｎａ−関連プロット、主組織適合性複合体、クラスＩ、ＣＸ５８５３６）、リボソームプロットＳ１２、リボソームプロットＬ１０、形質転換関連プロット、リボソームプロットＬ５、転写コアクチベーターＰｃ４、カテプシンＢ、リボソームプロットＬ２６、「主組織適合性複合体、クラスＩ  Ｘ１２４３２」、Ｗｉｌｍ  Ｓ  Ｔｕｍｏｒ−Ｒｅｌａｔｅｄプロット、トロポミオシンＴｍ３０ｎｍＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ、リポソームタンパク質Ｓ４、Ｘ−結合した、リボソームプロットＬ３７、Ｍｅｔａｌｌｏｐａｎｓｔｉｍｕｌｉｎ１、リボソームプロットＬ３０、異種核リボ核タンパク質Ｋ、主組織適合性複合体、クラスＩ、ＥＭ２１５３３、主組織適合性複合体、クラスＩ、ＥＭ２００２２、リボソームタンパク質Ｌ３０ホモログ、熱ショックプロット７０Ｋｄａ、「ミオシン（軽鎖／Ｕ０２６２９）」、「ミオシン（軽鎖／Ｕ０２６２９）」、カルサイクリン、一本鎖Ｄｎａ−結合プロットＭｓｓｐ−１、トリセホスフェートイソメラーゼ、ＮｕＭＡプロット１、プロットキナーゼＨｔ３１Ｃａｍｐ−依存性、チュービュリン、β２、カルモジュリンＩ型、リボソームプロットＳ２０、転写因子Ｂｔｆ３ｂ、グロビン、β、Ｓｍａｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＡｌｔ．Ｓｐｌｉｃｅ２、ヌクレオシド
ジホスフェートキナーゼＮｍ２３−Ｈ２ｓ、Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリウム毒素基質、活性化転写第４因子（タックス応答性エンハンサー要素Ｂ６７）（ＡＴＦ４）、プレフォジュリン（ＰＦＤＮ５）、Ｎ−ｍｙｃ下方修正（ＮＤＲＧ１）、リボソームタンパク質Ｌ１４（ＲＰＬ１４）、ニカストリン（ＫＩＡＡ０２５３）、プロテアーゼ、セリン、１１（ＩＧＦ結合）（ＰＲＳＳ１１）、ＫＩＡＡ０２２０タンパク質（ＫＩＡＡ０２２０）、撹乱３（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｓｈに対して相同）（ＤＶＬ３）、基本のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログのエンハンサー（ＥＲＨ）、複数のスプライシングを有するＲＮＡ結合タンパク質遺伝子（ＲＢＰＭＳ）、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、ＫＩＡＡ０１６４遺伝子産物（ＫＩＡＡ０１６４）、リボソームタンパク質Ｌ３９（ＲＰＬ３９）、チロシン３モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、イータポリペプチド（ＹＷＨＡＨ）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓのサブユニット、非−ＡＴＰａｓｅ、２（ＰＳＭＤ２）、冷誘導性ＲＮＡ−結合タンパク質（ＣＩＲＢＰ）、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された５（ＮＥＤＤ５）、高泳動性群非ヒストン染色体タンパク質１（ＨＭＧ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１、ＮＡＤ（可溶性）（ＭＤＨ１）、サイクリンＩ（ＣＣＮＩ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、非−ＡＴＰａｓｅ、７（Ｍｏｖ３４ホモログ）（ＰＳＭＤ７）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、ＡＴＰアーゼ、空胞状、１４ｋＤ（ＡＴＰ６Ｓ１４）、転写因子−様１（ＴＣＦＬ１）、ＫＩＡＡ００８４タンパク質（ＫＩＡＡ００８４）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、非−ＡＴＰアーゼ、８（ＰＳＭＤ８）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ａ（ＨＩＡ−Ａ）、アラニル−ｔＫＮＡシンセターゼ（ＡＡＲＳ）、リシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＫＡＲＳ）、ＡＤＰリボシル化因子−様６相互作用タンパク質（ＡＲＬ６ＩＰ）、ＫＩＡＡ００６３遺伝子産物（ＫＩＡＡ００６３）、アクチン結合ＬＩＭタンパク質１（ＡＢＬＩＭ）、ＤＡＺ関連タンパク質２（ＤＡＺＡＰ２）、真核生物翻訳開始第４Ａ因子、イソ型２（ＥＩＦ４Ａ２）、ＣＤ１５１抗原（ＣＤ１５１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、６（ＰＳＭＢ６）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、４（ＰＳＭＢ４）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、２（ＰＳＭＢ２）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、３（ＰＳＭＢ３）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群染色体部位１（ＷＢＳＣＲ１）、古代遍在タンパク質１（ＡＵＰ１）、ＫＩＡＡ０８６４タンパク質（ＫＩＡＡ０８６４）、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された８（ＮＥＤＤ８）、リボソームタンパク質Ｌ４（ＲＰＬ４）、ＫＩＡＡ０１１１遺伝子��物（ＫＩＡＡ０１１１）、トランスジェリン２（ＴＡＧＬＮ２）、クラスリン、重ポリペプチド（Ｈｃ）（ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ２）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ１複合体、γポリペプチド１（ＡＴＰ５Ｃ１）、カルパスタチン（ＣＡＳＴ）、ＭＯＲＦ関連遺伝子Ｘ（ＫＩＡ００２６）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ１複合体、αサブユニット、イソ型１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）、ホスファチジルセリンシンターゼ１（ＰＴＤＳＳ１）、抗酸化剤タンパク質２（非−セレニウムグルタチオンペルオキシダーゼ、酸性カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２）（ＫＩＡＡ０１０６）、ＫＩＡＡ０１０２遺伝子産物（ＫＩＡＡ０１０２）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、ＣＤ１６４抗原、シアロムチン（ＣＤ１６４）、ＧＤＰ解離インヒビター２（ＧＤＩ２）、エノイル補酵素Ａヒドラターゼ、短鎖、１、糸粒体（ＥＣＨＳ１）、真核生物翻訳４Ａ開始因子、イソ型１（ＥＩＦ４Ａ１）サイクリンＤ２モデル（ＣＣＮＤ２）、異種核リボ核タンパク質Ｕ（骨格結合Ａ因子）（ＨＮＲＰＵ）、ＡＰＥＸヌクレアーゼ（多機能ＤＮＡ修復酵素）（ＡＰＥＸ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｃ（サブユニット９）、イソ型１（ＡＴＰ５Ｇ１）、ミリストイル化アラニン豊富プロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ、８０Ｋ−Ｌ）（ＭＡＣＳ）、Ｓと同様で、アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＲＥＲ１に類似（ＲＥＲ１）、ヒアルロノグルコサミニダーゼ２（ＨＹＡＬ２）、ウロプラキン１Ａ（ＵＰＫ１Ａ）、核孔複合体相互作用タンパク質（ＮＰＩＰ）、カリョフェリンα４（インポーチンα３）（ＫＰＮＡ４）、及び４ｐ１６．３でＨＤ遺伝子座の近くの複数のスプライス改変体を有する遺伝子（ＲＥＳ４−２２）。
【０１２６】
それに加えて、内因性プロモーターは、組織特異的な遺伝子又は生理学的に特異的な遺伝子、例えば、熱ショック遺伝子に関連するプロモーターであることができる。この様式で、ｉＲＮＡ分子の発現は厳しく調節され得る。
【０１２７】
（ｂ．外因性プロモーター）
別の実施形態では、プロモーターは、外因性プロモーター、例えば偏在して発現するプロモーター、例えばＲＮａポリメラーゼプロモーター、例えば、Ｈ１又はＵ６；又は構成的に活性なウイルスプロモーターであることができる。プロモーターの非限定例としては、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、Ｓｒα−プロモーター（ＨＴＬＶ−Ｉ  ＬＴＲ由来のＲ／Ｕ５配列に融合したＳＶ４０初期プロモーターで構成される非常に強いハイブリッドプロモーター）、及びＨｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂプロモーターが挙げられる。
【０１２８】
（Ｂ．標的感染性の確認）
配列保存に基づいて、プライマ−が設計され、標的遺伝子のコード領域を増幅するために使用される。最初に、各遺伝子由来の最も高度に発現されたコード領域は、モデル制御遺伝子を作成するために使用されるが、任意のコード領域又は非コード領域を使用することができる。各制御遺伝子は、リポーターコード領域及びそのポリ（Ａ）シグナル間の各コード領域に挿入することによって組み入れられる。これらのプラスミドは、遺伝子の上流部位にリポーター遺伝子を有し、３’非コード領域に潜在的なｉＲＮＡ標的を有するｍＲＮＡを産生する。個々のｉＲＮＡの効果は、リポーター遺伝子の抑制によってアッセイされる。本発明の方法において有用なリポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコ−ル、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサ−ト、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーが利用可能である。リポーター遺伝子の抑制を決定するための方法は当該技術分野で周知であり、限定されないが、蛍光定量的方法（例えば蛍光分光学法、蛍光励起細胞分離捕集装置（ＦＡＣＳ）、蛍光鏡検法）、抗生物質抵抗性の決定が挙げられる。
【０１２９】
バイオゲノム情報及びモデル遺伝子が潜在的なｉＲＮＡの高スループットスクリーニングのために貴重であるが、標的核酸に対する干渉活性は、究極的に、標的核酸を発現する細胞において実験的に確立されなければならない。
【０１３０】
ｉＲＮＡ配列の干渉能力を決定するために、ｉＲＮＡを含有するベクターは、標的核酸を発現する適切な細胞株にトランスフェクトされる。それぞれの選択されたｉＲＮＡ構築物は、標的核酸の定常状態のｍＲＮＡを減らす能力について試験される。それに加えて、第１ラウンドの試験を「生き残る」任意の標的ｍＲＮＡは、逆転写酵素−ＰＣＲによって増幅され、配列決定される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照）。これらの配列は、ｍＲＮＡがｉＲＮＡの現在のライブラリ−を回避することが可能な個々の多型を決定するために分析される。この情報は、さらにまれな多型を標的化するためにｉＲＮＡ構築物をさらに改変するために使用される。
【０１３１】
ｉＲＮＡベクターを用いて細胞をトランスフェクトするための方法は当該技術分野で周知であり、限定されないが、エレクトロポレーション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、ウィルスベクターを用いたトランスフェクション、レトロウィルスに基づくベクターを用いたトランスフェクション、及びリポソームにより媒介されるトランスフェクションが挙げられる。
【０１３２】
（Ｃ．発現パタ−ン）
（ｉＲＮＡの一時的な発現）
本発明の一実施形態では、細胞におけるｉＲＮＡの発現は一時的である。一時的な発現は、細胞のゲノムに挿入されない発現ベクターから生じることができる。あるいは、一時的な発現は、細胞内へのｉＲＮＡ分子の直接挿入から生じることができる。
【０１３３】
ＲＮＡ干渉を媒介する核酸の種類のいずれかは、当該技術分野で周知の種々の方法を用いてインビトロで合成され、細胞に直接挿入することができる。それに加えて、ｄｓ  ＲＮＡ及びＲＮＡ干渉を媒介する他の分子は、商業的なベンダ−、例えば、Ｒｉｂｏｐｈａｒｍａ  ＡＧ（Ｋｕｌｍａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｓｅｑｕｉｔｕｒ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃは、蛍光体（例えば、ＨＥＸ／ＴＥＴ；５’−フルオレセイン、６−ＦＡＭ；３’−フルオレセイン、６−ＦＡＭ；フルオレセインｄＴインタ−ナル；５’  ＴＡＭＲＡ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ；３’  ＴＡＭＲＡ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されたｄｓＲＮＡを与え、これらも本発明において使用することができる。ｉＲＮＡ分子は、固相合成の周知の技術で製造することができる。このような合成のための装置は、いくつかのベンダ−、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）によって販売される。当該技術分野で知られるこのような合成のための他の方法は、さらに又は代替的に使用することができる。オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体）を調製するための類似の技術を使用することは周知である。非限定的な例として、例えば、米国特許第４，５１７，３３８号、及び同第４，４５８，０６６号；Ｌｙｅｒ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１：３４４−３５８（１９９９）；及びＶｅｒｍａ  Ｓ、及びＥｃｋｓｔｅｉｎ  Ｋ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４（１９９８）を参照。
【０１３４】
細胞に直接挿入されるｉＲＮＡは、ホスフェート−糖骨格又はヌクレオシドのいずれかに対する改変を含むことができる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄へテロ原子の少なくとも１つを含むように改変することができる。干渉ＲＮＡは、酵素的に又は部分／全有機合成によって製造することができる。構築物は、細胞ＲＮＡポリメラーゼ又はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ３、Ｔ７、ＳＰ６）によって合成することができる。化学的又はインビトロ酵素合成によって合成される場合、ＲＮＡは細胞又は動物内に導入する前に精製することができる。例えば、ＲＮＡは、溶媒又は樹脂を用いる抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー又は当該技術分野で知られているようなそれらの組合せによって混合物から精製することができる。あるいは、干渉ＲＮＡ構築物は、サンプル処理による損失を回避するために、精製なし、又は最小限の精製を用いて使用することができる。ｉＲＮＡ構築物は、貯蔵のために乾燥することができるか、又は水溶液に溶解することができる。溶液は、アニーリング、及び／又は二本鎖の安定化を促進するためのバッファー又は塩を含有することができる。本発明において使用可能なバッファー又は塩類の例としては、限定されないが、食塩水、ＰＢＳ、Ｎ（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ（Ｒ））、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ビス（２−ヒドロキシエチレン）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオ−ル（ビス−ＴＲＩＳ（Ｒ））、リン酸カリウム（ＫＰ）、リン酸ナトリウム（ＮａＰ）、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、一塩基リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、一塩基ナトリウムリン酸カリウム（ＮａＫＨＰＯ４）、リン酸マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２・４Ｈ２Ｏ）、酢酸カリウム（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、Ｄ（＋）α−ナトリウムグリセロリン酸（ＨＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＰＯ３Ｎａ２）、及び当該技術分野で既知の他の生理学的バッファーが挙げられる。本発明において使用するためのさらなるバッファーとしては、水溶液に溶解した塩Ｍ−Ｘ、その関連生成物、又はその解離生成物（ここで、Ｍは、アルカリ金属（例えばＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋）、好適にはナトリウム又はカリウムであり、Ｘは、リン酸イオン、酢酸イオン、重炭酸イオン、硫酸イオン、ピルビン酸イオン及び有機モノリン酸エステル、グルコ−ス６−ホスフェート又はＤＬ−α−グリセロ−ルホスフェートからなる群から選択されるアニオンである）
（ｉＲＮＡの安定な発現）
（１．ランダム挿入）
ｉＲＮＡを含有するベクターのゲノム挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて達成することができる。一実施形態では、ベクターは、ウイルス系ベクターを用いてランダムにゲノムに挿入される。ウイルス系ベクターの挿入は、ウイルス挙動と整合するランダム部位で起こる（例えば、Ｄａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：８２４−８３０；Ｇｕｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２：３７９５−３８０１；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：１−２４；Ｓａｍａｒｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２５４：２０６−２２８を参照）。ウイルス系ベクターの非限定的な例としては、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病レトロウィルス、マウス幹細胞ウイルス、ワクシニアウィルスベクター、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔアルファウイルス、ＥＢＶ、ＯＮＹＸ−１５、アデノウィルス、又はレンチウイルス系ベクターが挙げられる（例えば、Ｈｅｍａｎｎ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ３３：３９６−４００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＆  Ｈａｒｍｏｎ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：１７−２３；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：２４３−２４７；Ｓｔｅｗａｒｔ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＲＮＡ  ９：４９３−５０１；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｎ．３３：４０１−４０６；Ｑｉｎ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １００：１８３−１８８；Ｌｏｉｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：８６８−８７２を参照）。
【０１３５】
別の実施形態では、導入遺伝子は、ベクターから開裂されるか、又はベクターを含まずに維持される。ベクター除去は、当該技術分野で以前に記載された特定の導入遺伝子形状のために重要である（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｌ，Ｈｏｌｍｂｅｒｇ  Ｋ，Ｐｅｒｅｒａ  ＪＤ，ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ  Ｊ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ｍａｊｏｒ  ｂｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｊｕｌ；１（４）：１８２−７）。「ベクターを含まない」導入遺伝子は、当該技術分野で既知の任意の方法を用いてランダムにゲノムに挿入される。
【０１３６】
（２．標的化挿入）
別の実施形態では、挿入は、相同組換えを介する特定の遺伝子座に標的化される。相同組換えは、生存細胞中のゲノムに対する規定の改変を標的化するための正確な機構を提供する（例えば、Ｖａｓｑｕｅｚ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９８（１５）：８４０３−８４１０を参照）。相同組み換えにおける主要なステップは、ＤＮＡ鎖交換であり、このステップは、相補的な配列を含有する少なくとも１つのＤＮＡ鎖を有するＤＮＡ二本鎖を対にして、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを含有する中間的な組換え構造を形成する工程を含む（例えば、Ｒａｄｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：４０５；米国特許第４，８８８，２７４号を参照）。ヘテロ二本鎖ＤＮＡは、三本鎖形態を含有する３つのＤＮＡの鎖を含む、いくつかの形態をなすことができ、ここで、１個の相補的な鎖がＤＮＡ二本鎖に侵入しており（例えば、Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１９５１；Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：２９８４）を参照）、２つの相補的なＤＮＡ鎖がＤＮＡ二本鎖と対になる場合、伝統的なＨｏｌｌｉｄａｙ組換え接合部又はｃｈｉ構造（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｒ．（１９６４）Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．５：２８２）を形成することができるか、又は二重Ｄ−ループを形成することができる（「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  Ｌｏｏｐ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」米国特許第５，２７３，８８１号）。一旦形成されると、ヘテロ二本鎖構造は、鎖破壊及び交換によって分解することができ、その結果、侵入されたＤＮＡ鎖の全て又は一部分は、受容ＤＮＡ二本鎖内に挿入され、受容ＤＮＡ二本鎖のセグメントを付加するか、又は交換する。あるいは、ヘテロ二本鎖構造は、遺伝子変化を生じることができ、ここで、侵入する鎖の配列は、テンプレートとして侵入する鎖を用いてミスマッチの対を再対形成することによって受容ＤＮＡ二本鎖に移される（例えば、Ｇｅｎｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．（１９８７）Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｊｏｉｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５６４３を参照）。破壊又は組換えの機構によるか、又は遺伝子変換の機構によるか否かにかかわらず、相同性に対になった結合点でのヘテロ二本鎖ＤＮＡの形成は、１つのＤＮＡ遺伝子から別のＤＮＡ遺伝子へ遺伝配列情報を移動するのに役立ち得る。
【０１３７】
多くの雑誌は、哺乳動物における相同組換えの使用を記載する。説明に役立つこれらの雑誌は、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３１５３−３１５７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５：７１４−７２０；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０−２３４；Ｗａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：２０８０−２０８９；Ａｙａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１１：３７５−３８８；Ａｙａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．７：１６５６−１６６２；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８２０−６８２４；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−４２８；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２；Ｎａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３８４５−３８４９；及びＭａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２；Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｉｎａｎ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：１４６−１５４；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６−５７８；Ｔｈｏｍａ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：３１６−３２１である。
【０１３８】
相同組換えのために有用な細胞としては、例として、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン合成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単核球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞及び他の筋細胞が挙げられる。
【０１３９】
ｉＲＮＡテンプレートを含有するベクター構築物は、挿入のために標的化される遺伝子の１つ以上のエキソン及び／又はイントロンの全配列又は部分配列、挿入のために標的化された遺伝子の全プロモーター配列又は部分プロモーター配列、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡを含有する構築物の核酸配列は、挿入のために標的化された遺伝子の第１の核酸配列領域に相同性な第１の核酸配列領域と、挿入のために標的化された遺伝子の第２の核酸配列領域に相同性な第２の核酸配列領域とを含む。ベクター構築物の配向は、第１の核酸配列が第２の核酸配列の上流にあり、ｉＲＮＡテンプレートがその間にあるようなものであるべきである。
【０１４０】
核酸配列領域は、ｉＲＮＡテンプレートを含有するベクター構築物配列と目的の遺伝子との間に相同性が存在するように選択することができる。好ましくは、構築物の配列は、標的配列に関して同系である。構築物の核酸配列領域は、遺伝子の任意の領域に対して相関関係にあってもよく、但し、核酸配列領域は遺伝子に対して相同性である。核酸配列は、核酸配列に対して少なくとも約９０％同一、好ましくは少なくとも約９５％同一、又は最も好ましくは約９８％同一である場合に、「相同性」であるとみなされる。さらに、５’及び３’核酸配列をフランキングする選択可能なマーカーは、構築物が標的配列のゲノムＤＮＡに導入される場合に、ハイブリダイゼーションのための相補性配列を提供するために十分大きくあるべきである。例えば、相同核酸配列をフランキングする選択的なマーカー遺伝子は、少なくとも５００ｂｐ長、好ましくは少なくとも約１キロ塩基（ｋｂ）長、さらに好ましくは約２〜４ｋｂ長、最も好ましくは約３〜４ｋｂ長であるべきである。一実施形態では、構築物の両方の相同核酸配列をフランキングする選択可能なマーカー遺伝子は、少なくとも５００ｂｐ長、好ましくは少なくとも約１ｋｂ長、さらに好ましくは約２〜４ｋｂ長、最も好ましくは約３〜４ｋｂ長であるべきである。
【０１４１】
別の種類のＤＮＡ配列は、十分に大きいｃＤＮＡ配列であることができる。構築物を作成するために使用されるフランキング核酸配列のそれぞれが、好ましくは、１つ以上のエキソン及び／又はイントロン領域、及び／又はプロモーター領域に対して相同性である。
【０１４２】
これらの配列のそれぞれは互いに異なっているが、同じエキソン内及び／又はイントロン内の領域に対して相同性でもよい。あるいは、これらの配列は、遺伝子の異なるエキソン内及び／又はイントロン内の領域に対して相同性でもよい。好ましくは、構築物の２つのフランキング核酸配列は、目的の遺伝子の同じ又は異なるイントロンの２つの配列領域に対して相同性である。それに加えて、同系ＤＮＡは、本発明の構築物を作成するために使用することができる。このように、構築物を作成するために得られた核酸配列は、好ましくは、標的細胞として使用されるようものと同じ細胞株から得られる。
【０１４３】
あるいは、相同性を有する１個の領域が存在する標的化構築物を使用することができる。このような構築物では、１個の相同性交叉事象が相同性領域内での挿入を生じさせる。この構築物は、供給された円形であるか、又は線形であるかのいずれかであり、天然プロセスを経て細胞内で自発的に環状になることができる（Ｈａｓｔｙ  Ｐ，Ｒｉｖｅｒａ−Ｐｅｒｅｚ  Ｊ，Ｃｈａｎｇ  Ｃ，Ｂｒａｄｌｅｙ  Ａ．Ｔａｒｇｅｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｓｅｐ；１１（９）：４５０９−１７）。
【０１４４】
本発明の一実施形態では、相同組換えは、細胞（例えば繊維芽細胞）のゲノム内のプロモーターに使用可能に結合したｉＲＮＡを含有する発現ベクターを挿入するために使用される。ＤＮＡは、好ましくは少なくとも１つの、場合により標的遺伝子の両方の複製物への発現ベクターの導入を用いて、特定の遺伝子座に遺伝子の少なくとも一部分を含むことができる。
【０１４５】
あるいは、プロモーターを欠失しているｉＲＮＡを含有する発現ベクターを、内因性遺伝子に挿入することができる。この挿入は、内因性遺伝子の関連プロモーターによって開始されるプロモーターを含まないベクターの発現を可能にする。一実施形態では、ベクターは、遺伝子の３’−非コード領域に挿入される。本発明の特定の局面では、ベクターは、組織特異的な遺伝子又は生理学的い特異的な遺伝子に挿入される。例えば、肝細胞に特異的な発現は、所望のレベル及び一時的なパターンであらゆる肝細胞において発現される内因性遺伝子を標的化することによって提供される。
【０１４６】
別の実施形態では、標的化ベクターは、ｉＲＮＡベクターがハウスキーピング遺伝子の１個の対立遺伝子に挿入されるように組み立てられる。標的化ハウスキーピング遺伝子の非限定的な例としては、以下のヒトハウスキーピング遺伝子の保存された交叉種アナログが挙げられる；糸粒体１６ＳｒＲＮＡ、リボソームタンパク質Ｌ２９（ＲＰＬ２９）、Ｈ３ヒストン、ファミリ３Ｂ（Ｈ３．３Ｂ）（Ｈ３Ｆ３Ｂ）、ポリ（Ａ）−結合タンパク質、細胞質内１（ＰＡＢＰＣ１）、ＨＬＡ−Ｂ関連転写物−１（Ｄ６Ｓ８１Ｅ）、サーフェイト（ｓｕｒｆｅｉｔ）１（ＳＵＲＦ１）、リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、カテコ−ル−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、リボソームタンパク質Ｓ７（ＲＰＳ７）、熱ショック２７ｋＤタンパク質１（ＨＳＰＢ１）、真核生物翻訳伸長１因子デルタ（グアニンヌクレオチド交換タンパク質）（ＥＥＦ１Ｄ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、リボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、カルボキシエステラ−ゼ２（腸、肝臓）（ＣＥＳ２）、エックスポルチン（ｅｘｐｏｒｔｉｎ）１（ＣＲＭ１、酵母、ホモログ）（ＸＰＯ１）、ユビキノール−チトクロムｃレダクターゼヒンジタンパク質（ＵＱＣＲＨ）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、リボホリンＩＩ（ＲＰＮ２）、Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ及びＳｅｃ７領域タンパク質（ＰＳＤ）、ヒト心臓トロポニンＴ、プロテアソーム（プロソ−ム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、５（ＰＳＭＢ５）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳＡＲＳ）、カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１（８８ｋＤ）（ＣＴＮＮＢ１）、ダッフィー血液型（ＦＹ）、赤血球膜タンパク質バンド７．２（ストマチン（ｓｔｏｍａｔｉｎ））（ＥＰＢ７２）、Ｆａｓ／Ａｐｏ−１、ＬＩＭ及びＳＨ３タンパク質１（ＬＡＳＰ１）、アクセサリタンパク質ＢＡＰ３１／ＢＡＰ２９（ＤＸＳ１３５７Ｅ）、新生ポリペプチド−会合複合体αポリペプチド（ＮＡＣＡ）、リボソームタンパク質Ｌ１８ａ（ＲＰＬ１８Ａ）、ＴＮＦ受容体関連第４因子（ＴＲＡＦ４）、ＭＬＮ５１タンパク質（ＭＬＮ５１）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、ポリ（ｒＣ）−結合タンパク質２（ＰＣＢＰ２）、チオレドキシン（ＴＸＮ）、グルタミニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＱＡＲＳ）、精巣強化された遺伝子転写物（ＴＥＧＴ）、前立腺結合タンパク質（ＰＢＰ）、シグナル配列レセプター、β（トランスロコン関連タンパク質β）（ＳＳＲ２）、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、セントリン（ｃｅｎｔｒｉｎ）、ＥＦハンドタンパク質、２（ＣＥＴＮ２）、異種核リボ核タンパク質Ｋ（ＨＮＲＰＫ）、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ホスホリピドヒドロペルオキシダーゼ）（ＧＰＸ４）、ｔ（１２；１６）悪性脂肪肉腫から誘導された融合物（ＦＵＳ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｃ（サブユニット９）、イソ型２（ＡＴＰ５Ｇ２）、リボソームタンパク質Ｓ２６（ＲＰＳ２６）、リボソームタンパク質Ｌ６（ＲＰＬ６）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、セリン（又��システイン）プロテイナーゼインヒビター、クレ−ド（ｃｌａｄｅ）Ａ（α−１抗プロテイナーゼ、抗トリプシン）、メンバー３（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、二重特異性ホスファターゼ１（ＤＵＳＰ１）、ペルオキシレドキシン１（ＰＲＤＸ１）、精巣上体分泌タンパク質（１９．５ｋＤ）（ＨＥ１）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、転位したプロモーター領域（活性ＭＥＴオンコジーンに対して）（ＴＰＲ）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、ＳＯＮ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＯＮ）、リボソームプロットＬＩ９（ＲＰＬ１９）、リボソームプロット（酵母Ｓ２４に対するホモログ）、ＣＤ６３抗原（黒色腫１抗原）（ＣＤ６３）、タンパク質チロシンホスファターゼ、非レセプタータイプ６（ＰＴＰＮ６）、真核生物翻訳伸長１因子β２（ＥＥＦ１Ｂ２）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｂ、イソ型１（ＡＴＰ５Ｆ１）、溶質キャリア族２５（糸粒体のキャリア；リン酸トランスポーター）、メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＷＡＲＳ）、グルタメートアンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（ＧＬＵＬ）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、インターフェロンから誘導された膜貫通タンパク質２（１−８Ｄ）（ＩＦＩＴＭ２）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、βポリペプチド（ＹＷＨＡＢ）、カゼインキナーゼ２、βポリペプチド（ＣＳＮＫ２Ｂ）、ユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合産物１（ＵＢＡ５２）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、ジュンＤプロトオンコジーン（ＪＵＮＤ）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、θポリペプチド（ＹＷＨＡＱ）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、リボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、フィラミンＡ、α（アクチン結合タンパク質−２８０）（ＦＬＮＡ）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（サイクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、ビリン２（エズリン）（ＶＩＬ２）、真核生物翻訳延長因子２（ＥＥＦ２）、ジュンＢプロトオンコジーン（ＪＵＮＢ）、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩｃ（ＣＯＸ７Ｃ）、異種核リボ核タンパク質Ｌ（ＨＮＲＰＬ）、腫瘍タンパク質、翻訳制御された１（ＴＰＴ１）、リボソームタンパク質Ｌ３１１（ＲＰＬ３１）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド２（肝臓）（ＣＯＸ７Ａ２）、ＤＥＡＤ／Ｈ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５（ＲＮＡヘリカーゼ、６８ｋＤ）（ＤＤＸ５）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩａポリペプチド１（ＣＯＸ６Ａ１）、熱ショック９０ｋＤタンパク質１、α（ＨＳＰＣＡ）、シェーグレン症候群抗原Ｂ（自己抗原Ｌａ）（ＳＳＢ）、乳酸デヒドロゲナーゼＢ（ＬＤＨＢ）、高移動群（非ヒスト���性染色体）タンパク質１７（ＨＭＧ１７）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ（ＣＯＸ６Ｃ）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ＨＮＫＰＡ１）、アルドラ−ゼＡ、フラクトース−ビスホスフェート（ＡＬＤＯＡ）、インテグリン、β１（フィブロネクチンレセプター、βポリペプチド、抗原ＣＤ２９、ＭＤＦ２、ＭＳＫ１２）（ＩＴＧＢ１）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、低分子リボ核タンパク７０ｋＤポリペプチド（ＲＮ抗原）（ＳＮＲＰ２０）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド１（ＧＮＢ１）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＡ１）、カルパイン４、小サブユニット（３０Ｋ）（ＣＡＰＮ４）、延長因子ＴＵ単位（Ｎ末端）／Ｘ０３６８９、リボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＰα１（ＨＬＡ−ＤＰＡ１）、ス−パ−オキシドジスムターゼ１、可溶性（筋萎縮性側索硬化症１（成人））（ＳＯＤ１）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、Ａｃｔｉｎ、β（ＡＣＴＢ）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＰα（ＨＬＡ−ＤＲＡ）、チュービュリン、βポリペプチド（ＴＵＢＢ）、メタロチオネイン２Ａ（ＭＴ２Ａ）、ホスホグリセレ−トキナーゼ１（ＰＧＫ１）、ＫＲＡＢ関連タンパク質１（ＴＩＦ１Ｂ）、真核生物翻訳開始第３因子、サブユニット５（イプシロン、４７ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ５）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１αサブ複合体、４（９ｋＤ、ＭＬＲＱ）（ＮＤＵＦＡ４）、塩化物菌体内チャネル１（ＣＬＩＣ１）、アダプタ−関連タンパク質複合体３、シグマ体１、サブユニット（ＡＰ３Ｓ１）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ（ＣＯＸ４）、ＰＤＺ及びＬＥＭドメイン１（エルフィン）（ＰＤＬＩＭ１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ様；グルタチオントランスフェラーゼω（ＧＳＴＴＬｐ２８）、インターフェロン刺激された遺伝子（２０ｋＤ）（ＩＳＧ２０）、核因子Ｉ／Ｂ（ＮＦＩＢ）、ＣＯＸ１０（酵母）ホモログ、シトクロムｃオキシダーゼアセンブリタンパク質（ヘムＡ：ファルネシルトランスフェラーゼ）、骨肉腫中で増殖した保存遺伝子（ＯＳ４）、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＰＳ）、ガラクトシダーゼ、α（ＧＬＡ）、ミクロソ−ムグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ２（ＭＧＳＴ２）、真核生物翻訳開始第４因子γ、２（ＥＩＦ４Ｇ２）、ユビキチンキャリアータンパク質Ｅ２−Ｃ（ＵＢＣＨ１０）、ＢＴＧファミリー、メンバー２（ＢＴＧ２）、Ｂ−細胞関連タンパク質（ラット赤血球抗原）、ＣＯＰ９サブユニット６（ＭＯＶ３４ホモログ、３４ｋＤ）（ＭＯＶ３４−３４ＫＤ）、ＡＴＸ１（抗酸化剤タンパク質１、酵母）ホモログ１（ＡＴＯＸ１）、ロイシン中で豊富な酸性タンパク質（ＳＳＰ２９）、ポリ（Ａ）−結合プロット（ＰＡＢＰ）プロモーター領域、セレノタンパク質Ｗ、１（ＳＥＰＷ１）、真核生物翻訳開始第３因子、サブユニット６（４８ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ６）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、筋肉（ＣＰＴＩＢ）、膜内外トラッフィングタンパク質（ＴＭＰ２１）、４つ半のＬＥＶＴ領域１（ＦＨＬ１）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、骨髄性白血病第２因子（ＭＬＦ２）、神経フィラメントトリプレットＬプロット／Ｕ５７３４１、キャッピングタンパク質（アクチンフィラメント）筋肉Ｚ−ライン、α１（ＣＡＰＺＡ１）、１−アシルグリセキソ−ル−３−ホスフェートＯ−アシルトランスフェラーゼ１（リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、α）、（ＡＧＰＡＴ１），１，３，４−トリホスフェート５／６キナーゼ（ＩＴＰＫｌ）、ヒスチジントライアドヌクレオチド−結合タンパク質（ＨＩＮＴ）、ダイナミチン（ジナクチン）複合体５０ｋＤサブユニット）（ＤＣＴＮ−５０）、アクチン関連タンパク質２／３複合体、サブユニット２（３４ｋＤ）（ＡＲＰＣ２）、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）、ユビキチンＢ、キチナ−ゼ３様２（ＣＨＩ３Ｌ２）、Ｄ−ド−パクロムト−トメラーゼ（ＤＤＴ）、Ｚｎフィンガータンパク質２２０（ＺＮＦ２２０）、シークエストソーム（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ）１（ＳＱＳＴＭ１）、シスタチンＢ（ステフィンＢ）（ＣＳＴＢ）、真核生物翻訳開始第３因子、サブユニット８（１１０ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ８）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチ−フ）レセプター９（ＣＣＲ９）、ユビキチン特定プロテアーゼ１１（ＵＳＰ１１）、ラミニンレセプター１（６７ｋＤ、リボソームタンパク質ＳＡ）（ＬＡＭＲ１）、骨肉腫（ＯＳ−９）、スプライシングファクター３ｂ、サブユニット２、１４５ｋＤ（ＳＦ３Ｂ２）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ユビキチン接合酵素Ｅ２Ｄ３（酵母ＵＢＣ４／５に対して相同）（ＵＢＥ２Ｄ３）、シャペロニン含有ＴＣＰ１、サブユニット４（δ）（ＣＣＴ４）、ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向性）ポリペプチドＬ（７．６ｋＤ）（ＰＯＬＲ２Ｌ）、核レセプターコリプレッサー２（ＮＣＯＲ２）、アクセサリ−タンパク質ＢＡＰ３１／ＢＡＰ２９（ＤＸＳ１３５７Ｅ、ＳＬＣ６Ａ８）、１３ｋＤ分化関連タンパク質（ＬＯＣ５５９６７）、Ｔａｘ１（ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ）結合タンパク質１（ＴＡＸ１ＢＰ１）、損傷特有ＤＮＡ結合タンパク１（１２７ｋＤ）（ＤＤＢ１）、ダイニン、細胞質内、軽ポリペプチド（ＰＩＮ）、メチオニンアミノペプチダーゼ；ｅＩＦ−２関連ｐ６７（ＭＮＰＥＰ）、Ｇタンパク質経路サプレッサー２（ＧＰＳ２）、リボソームタンパク質Ｌ２１（ＲＰＬ２１）
、コートマータンパク質複合体、サブユニットα（ＣＯＰＡ）、Ｇタンパク質経路サプレッサー１（ＧＰＳ１）、低分子リボ核タンパク質Ｄ２ポリペプチド（１６．５ｋＤ）（ＳＮＲＰＤ２）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ５（ＲＰＳ５）、リボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、タンパク質チロシンホスファターゼタイプＩＶＡ、メンバー２（ＰＴＰ４Ａ２）、リボソームプロットＬ３６（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、ＩｇＧのＦｃフラグメント、レセプター、トランスポーター、α（ＦＣＧＲＴ）、妊婦Ｇ１０転写物（Ｇ１０）、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｃ（サブユニット９）イソ型３（ＡＴＰ５Ｇ３）、シグナル認識粒子１４ｋＤ（相同性ＡｌｕＲＮＡ−結合タンパク質）（ＳＲＰ１４）、ｍｕｔＬ（大腸菌）ホモログ１（大腸癌、非ポリ−プ性２型）（ＭＬＨ１）、染色体Ｉｑサブテロマー配列Ｄ１Ｓ５５３．／Ｕ０６１５５、フィブロモジュリン（ＦＭＯＤ）、スピリットのアミノ末端エンハンサ−（ＡＥＳ）、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ活性タンパク質（ＡＲＨＧＡＰ１）、非−ＰＯＵドメイン含有、オクタマ−結合（ＮＯＮＯ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫３６１１ウイルス発癌遺伝子ホモログ１（ＡＲＡＦ１）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＡ１）、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、リボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、ブロモドメイン含有２（ＢＲＤ２）、無精子症１因子（ＡＺＦ１）、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ−３によって上方調節される（ＶＤＵＰ１）、セリン（又はシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー６（ＳＥＲＰＩＮＢ６）、デストリン（アクチン解重合因子）（ＡＤＦ）、サイモシンβ−１０（ＴＭＳＢ１０）、ＣＤ３４抗原（ＣＤ３４）、スペクトリン、β、非赤血球１（ＳＰＴＢＮ１）、血管関連の、遊走性の細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ａ（ＨＬＡ−Ａ）、ＭＹＣ関連のＺｎフィンガータンパク質（プリン結合性転写因子）（ＭＡＺ）、ＳＥＴトランスロケ−ション（骨髄性白血病関連の）（ＳＥＴ）、ペアードボックス遺伝子（無虹彩、角膜炎）（ＰＡＸ６）、マウスにおいてＺｆｐ−３６に対して相同性な亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ３６）、ＦＫ５０６−結合タンパク質４（５９ｋＤ）（ＦＫＢＰ４）、ヌクレオソーム組立てタンパク質１−様１（ＮＡＰ１Ｌ１）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド（ＹＷＨＡＺ）、リボソームタンパク質Ｓ３Ａ（ＲＰＳ３Ａ）、ＡＤＰリボシル化因子１、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、転写伸長因子Ａ（ＳＩＩ）、１（ＴＣＥＡ１）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、ＡＤＰリボシル化第３因子（ＡＲＦ３）、モエシン（ＭＳＮ）、Ｂ細胞インヒビターにおけるカッパ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子、α（ＮＦＫＢＩＡ）、相補成分１、ｑ亜成分結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）、リボソームタンパク質Ｓ２５（ＲＰＳ２５）、クラステリン（細胞溶解インヒビター、ＳＰ−４０，４０、硫酸化グリコプロテイン２、テストステロンを抑制された前立腺のメッセ−ジ２、アポリポーターンパクＪ）（ＣＬＵ）、ヌクレオリン（ＮＣＬ）、リボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、ユビキチン−活性化酵素Ｅｌ（Ａ１Ｓ９Ｔ及びＢＮ７５温度感受性相補性）（ＵＢＥ１）、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、３（ガレクチン３）（ＬＧＡＬＳ３）、真核生物翻訳伸長１因子γ（ＥＥＦ１Ｇ）、ｐｉｍ−１オンコジーン（ＰＩＭ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１０、アネキシンＩＩリガンド、カルパクチンＩ（軽ポリペプチド（ｐ１１））、Ｈ２Ａヒストンファミリー、メンバーＺ（Ｈ２ＡＦＺ）、ＡＤＰリボシル化第４因子（ＡＲＦ４）（ＡＲＦ４）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＱα１（ＨＬＡ−ＤＱＡ１）、ＦＫ５０６−結合タンパク質１Ａ（１２ｋＤ）（ＦＫＢＰ１Ａ）、ＣＤ８１抗原（抗増殖性抗体１の標的）（ＣＤ８１）、リボソームタンパク質Ｓ１５（ＲＰＳ１５）、Ｘ−ボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ１）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＮα（ＨＬＡ−ＤＮＡ）、リボソームタンパク質Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、白血病関連リンタンパク質ｐ８（スタスミン）（ＬＡＰ１８）、ミオシン、重ポリペプチド９、非筋肉（ＭＹＨ９）、カゼインキナーゼ２、βポリペプチド（ＣＳＮＫ２Ｂ）、フコシダーゼ、α−Ｌ−１、組織（ＦＵＣＡ１）、ジアホラーゼ（ＮＡＤＨ）（チトクロムｂ−５レダクターゼ）（ＤＩＡ１）、シスタチンＣ（アミロイド脈管障害及び脳溢血）（ＣＳＴ３）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、ユビキノール−チトクロムｃレダクターゼ結合タンパク質（ＵＱＣＲＢ）、プロチモシン、α（遺伝子配列２８）（ＰＴＭＡ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ（ＧＳＴＰ１）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド２−様１（ＧＮＢ２Ｌ１）、ヌクレオホスミン（核小体リンタンパク質Ｂ２３、ヌマトリン）（ＮＰＭ１）、ＣＤ３Ｅ抗原、イプシロンポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）（ＣＤ３Ｅ）、カルパイン２、（ｍ／ＩＩ）大サブユニット（ＣＡＰＮ２）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）フラボタンパク質２（２４ｋＤ）（ＮＤＵＦＶ２）、熱ショック６０ｋＤタンパク質１（シャペロニン）（ＨＳＰＤ１）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、αを刺激する活性ポリペプチド１（ＧＮＡＳ１）、クラトリン、軽ポリペプチド（Ｌｃａ）（ＣＬＴＡ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、ミトコンドリアＦｌ複合体、βポリペプチド、カルモジュリン２（ホスホリラ−ゼキナーゼ、δ）（ＣＡＬＭ２）、アクチン、γ１（ＡＣＴＧ１）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質、大きい、Ｐ１（ＲＰＬＰ１）、リボソームタンパク質、大きい、Ｐ０（ＲＰＬＰＯ）、サイモシン、β４、Ｘ染色体（ＴＭＳＢ４Ｘ）、異種核リボ核タンパク質Ｃ（Ｃ１／Ｃ２）（ＨＮＲＰＣ）、リボソームタンパク質��３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、グルクロニダーゼ、β（ＧＵＳＢ）、ＳＲＣ、ＦＧＲ、ＹＥＳに関連したＦＹＮオンコジーン（ＦＹＮ）、プロチモシン、α（遺伝子配列２８）（ＰＴＭＡ）、エノラ−ゼ１、（α）（ＥＮＯ１）、ラミニンレセプター１（６７ｋＤ、リボソームタンパク質ＳＡ）（ＬＡＭＲ１）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）、ＣＤ７４抗原（主要組織適合性複合体の不変のポリペプチド、クラスＩＩ抗原関連）、エステラ−ゼＤ／ホルミルグルタチオンヒドロラ−ゼ（ＥＳＤ）、Ｈ３ヒストン、ファミリー３Ａ（Ｈ３Ｆ３Ａ）、フェリチン、軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、Ｓｅｃ２３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ホモログＡ（ＳＥＺ２３Ａ）、アクチン、β（ＡＣＴＢ）、プレセニリン１（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病３）（ＰＳＥＮ１）、インターロイキン１レセプター関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、Ｚｎフィンガータンパク質１６２（ＺＮＦ１６２）、リボソームタンパク質Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、ベクリン１（コイル状コイル、ミオシン−様ＢＣＬ２−相互作用タンパク質）（ＢＥＣＮ１）（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的）αポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）、ＩＱのＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（ＩＱＧＡＰ１）、シグナルトランスデューサー、及び、転写３のアクティベーター（急性段階応答因子）（ＳＴＡＴ３）、異種核リボ核タンパク質Ｆ（ＨＮＲＰＦ）、推定翻訳開始因子（ＳＵＩ１）、タンパク質転座複合体β（ＳＥＣ６１Ｂ）、ラス推定ホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＡ（ＡＲＨＡ）、フェリチン、重ポリペプチド１（ＦＴＨ１）、Ｒｈｏ  ＧＤＰ解離インヒビター（ＧＤＩ）β（ＡＲＨＧＤＩＢ）、Ｈ２Ａヒストンファミリー、メンバーＯ（Ｈ２ＡＦＯ）、アネキシンＡ１１（ＡＮＸＡ１１）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、アデニリルシクラーゼ関連タンパク質（ＣＡＰ）、フィンガータンパク質９１（ＨＰＦ７、ＨＴＦ１０）（ＺＮＦ９１）、リボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＣＡＡＸボックス、α（ＦＮＴＡ）、ナトリウムチャネル、電位作動型、Ｉ形、βポリペプチド（ＳＣＮ１Ｂ）、カルネキシン（ＣＡＮＸ）、プロテオリピドタンパク質２（結腸上皮に豊富な）（ＰＬＰ２）、アミロイドβ（Ａ４）前駆体−様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、膜電位依存性陰イオンチャネル２、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）アクティベーターサブユニット１（ＰＡ２８α）（ＰＳＭＥ１）、リボソームプロットＬ１２（ＲＰＬ１２）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ、１（ＰＳＭＣ１）、主組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＱβ１（ＨＬＡ−ＤＱＢ１）、複製タンパク質Ａ２（３２ｋＤ）（ＲＰＡ２）、熱ショック９０ｋＤタンパク質１、β（ＨＳＰＣＢ）、チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＵＩ（ＣＯＸ８）、真核生物翻訳伸長１因子α１（ＥＥＦ１Ａ１）、ＳＮＲＰＮ上流のリーディングフレーム（ＳＮＵＲＦ）、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、１（ガレクチン１）（ＬＧＡＬＳ１）、リソソーム関連膜タンパ��質１（ＬＡＭＰ１）、ホスホグリセレートムターゼ１（脳）（ＰＧＡＭ１）、インターフェロンによって誘発された膜貫通タンパク質１（９−２７）（ＺＦＩＴＭ１）、ヌクレアーゼゲージ受感部結合タンパク質１（ＮＳＥＰ１）、溶質キャリア族２５（ミトコンドリアキャリア；アデニンヌクレオチドトランスロケ−タ）、メンバー６（ＳＬＣ２５Ａ６）、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＤ＋；ポリ（ＡＤＰリボ−ス）ポリメラーゼ）（ＡＤＰＲＴ）ロイコトリエンＡ４ヒドロラ−ゼ（ＬＴＡ４Ｈ）、プロフィリン１（ＰＦＮ１）、プロサポシン（異型Ｇａｕｃｈｅｒ病及び異型異染性ロイコジストロフィ−）（ＰＳＡＰ）、溶質キャリアファミリー２５（糸粒体キャリア；アデニンヌクレオチドトランスロケーター）、メンバー５（ＳＬＣ２５Ａ５）、β−２ミクログロブリン、ＩＧＦ結合タンパク質７、リボソームプロットＳ１３、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｒｎａ−関連プロット、主組織適合性複合体、クラスＩ、ＣＸ５８５３６）、リボソームプロットＳ１２、リボソームプロットＬ１０、形質転換関連プロット、リボソームプロットＬ５、転写コアクチベーターＰｃ４、カテプシンＢ、リボソームプロットＬ２６、「主組織適合性複合体、クラスＩ  Ｘ１２４３２」、Ｗｉｌｍ  Ｓ  Ｔｕｍｏｒ−Ｒｅｌａｔｅｄプロット、トロポミオシンＴｍ３０ｎｍＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ、リポソームタンパク質Ｓ４、Ｘ−結合した、リボソームプロットＬ３７、Ｍｅｔａｌｌｏｐａｎｓｔｉｍｕｌｉｎ１、リボソームプロットＬ３０、異種核リボ核タンパク質Ｋ、主組織適合性複合体、クラスＩ、ＥＭ２１５３３、主組織適合性複合体、クラスＩ、ＥＭ２００２２、リボソームタンパク質Ｌ３０ホモログ、熱ショックプロット７０Ｋｄａ、「ミオシン（軽鎖／Ｕ０２６２９）」、「ミオシン（軽鎖／Ｕ０２６２９）」、カルサイクリン、一本鎖Ｄｎａ−結合プロットＭｓｓｐ−１、トリセホスフェートイソメラーゼ、ＮｕＭＡプロット１、プロットキナーゼＨｔ３１Ｃａｍｐ−依存性、チュービュリン、β２、カルモジュリンＩ型、リボソームプロットＳ２０、転写因子Ｂｔｆ３ｂ、グロビン、β、Ｓｍａｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＡｌｔ．Ｓｐｌｉｃｅ２、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼＮｍ２３−Ｈ２ｓ、Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリウ
ム毒素基質、活性化転写第４因子（タックス応答性エンハンサー要素Ｂ６７）（ＡＴＦ４）、プレフォジュリン（ＰＦＤＮ５）、Ｎ−ｍｙｃ下方修正（ＮＤＲＧ１）、リボソームタンパク質Ｌ１４（ＲＰＬ１４）、ニカストリン（ＫＩＡＡ０２５３）、プロテアーゼ、セリン、１１（ＩＧＦ結合）（ＰＲＳＳ１１）、ＫＩＡＡ０２２０タンパク質（ＫＩＡＡ０２２０）、撹乱３（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｓｈに対して相同）（ＤＶＬ３）、基本のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログのエンハンサー（ＥＲＨ）、複数のスプライシングを有するＲＮＡ結合タンパク質遺伝子（ＲＢＰＭＳ）、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、ＫＩＡＡ０１６４遺伝子産物（ＫＩＡＡ０１６４）、リボソームタンパク質Ｌ３９（ＲＰＬ３９）、チロシン３モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、イータポリペプチド（ＹＷＨＡＨ）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓのサブユニット、非−ＡＴＰａｓｅ、２（ＰＳＭＤ２）、冷誘導性ＲＮＡ−結合タンパク質（ＣＩＲＢＰ）、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された５（ＮＥＤＤ５）、高泳動性群非ヒストン染色体タンパク質１（ＨＭＧ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１、ＮＡＤ（可溶性）（ＭＤＨ１）、サイクリンＩ（ＣＣＮＩ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、非−ＡＴＰａｓｅ、７（Ｍｏｖ３４ホモログ）（ＰＳＭＤ７）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、ＡＴＰアーゼ、空胞状、１４ｋＤ（ＡＴＰ６Ｓ１４）、転写因子−様１（ＴＣＦＬ１）、ＫＩＡＡ００８４タンパク質（ＫＩＡＡ００８４）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、非−ＡＴＰアーゼ、８（ＰＳＭＤ８）、主組織適合性複合体、クラスＩ、Ａ（ＨＩＡ−Ａ）、アラニル−ｔＫＮＡシンセターゼ（ＡＡＲＳ）、リシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＫＡＲＳ）、ＡＤＰリボシル化因子−様６相互作用タンパク質（ＡＲＬ６ＩＰ）、ＫＩＡＡ００６３遺伝子産物（ＫＩＡＡ００６３）、アクチン結合ＬＩＭタンパク質１（ＡＢＬＩＭ）、ＤＡＺ関連タンパク質２（ＤＡＺＡＰ２）、真核生物翻訳開始第４Ａ因子、イソ型２（ＥＩＦ４Ａ２）、ＣＤ１５１抗原（ＣＤ１５１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、６（ＰＳＭＢ６）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、４（ＰＳＭＢ４）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、２（ＰＳＭＢ２）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、３（ＰＳＭＢ３）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群染色体部位１（ＷＢＳＣＲ１）、古代遍在タンパク質１（ＡＵＰ１）、ＫＩＡＡ０８６４タンパク質（ＫＩＡＡ０８６４）、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された８（ＮＥＤＤ８）、リボソームタンパク質Ｌ４（ＲＰＬ４）、ＫＩＡＡ０１１１遺伝子産物（ＫＩＡＡ０１１１）、トランスジェリン２（ＴＡＧＬＮ２）、��ラスリン、重ポリペプチド（Ｈｃ）（ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ２）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ１複合体、γポリペプチド１（ＡＴＰ５Ｃ１）、カルパスタチン（ＣＡＳＴ）、ＭＯＲＦ関連遺伝子Ｘ（ＫＩＡ００２６）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ１複合体、αサブユニット、イソ型１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）、ホスファチジルセリンシンターゼ１（ＰＴＤＳＳ１）、抗酸化剤タンパク質２（非−セレニウムグルタチオンペルオキシダーゼ、酸性カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２）（ＫＩＡＡ０１０６）、ＫＩＡＡ０１０２遺伝子産物（ＫＩＡＡ０１０２）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、ＣＤ１６４抗原、シアロムチン（ＣＤ１６４）、ＧＤＰ解離インヒビター２（ＧＤＩ２）、エノイル補酵素Ａヒドラターゼ、短鎖、１、糸粒体（ＥＣＨＳ１）、真核生物翻訳４Ａ開始因子、イソ型１（ＥＩＦ４Ａ１）サイクリンＤ２モデル（ＣＣＮＤ２）、異種核リボ核タンパク質Ｕ（骨格結合Ａ因子）（ＨＮＲＰＵ）、ＡＰＥＸヌクレアーゼ（多機能ＤＮＡ修復酵素）（ＡＰＥＸ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋トランスポーティング、糸粒体Ｆ０複合体、サブユニットｃ（サブユニット９）、イソ型１（ＡＴＰ５Ｇ１）、ミリストイル化アラニン豊富プロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ、８０Ｋ−Ｌ）（ＭＡＣＳ）、Ｓと同様で、アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＲＥＲ１に類似（ＲＥＲ１）、ヒアルロノグルコサミニダーゼ２（ＨＹＡＬ２）、ウロプラキン１Ａ（ＵＰＫ１Ａ）、核孔複合体相互作用タンパク質（ＮＰＩＰ）、カリョフェリンα４（インポーチンα３）（ＫＰＮＡ４）、及び４ｐ１６．３でＨＤ遺伝子座の近くの複数のスプライス改変体を有する遺伝子（ＲＥＳ４−２２）。
【０１４７】
一実施形態では、ｉＲＮＡを含有するベクターは、標的ハウスキーピング遺伝子のイントロン内で標的化されたハウスキーピング遺伝子に挿入される。副次的な一実施形態では、標的ハウスキーピング遺伝子は、標的遺伝子のイントロン内の構築物の３’末端における複数の停止コドンを含有する、プロモーターを含まないように設計されたｉＲＮＡテンプレートの挿入によって翻訳されることから防がれる。この「プロモーター−トラップ」ストラテジーを用いて、ｉＲＮＡ構築物は、潜在的には、標的遺伝子を含むエキソンの上流を用いてインフレームで、染色体にスプライシングされる。このことにより、標的化されたハウスキーピング遺伝子の前に、ｉＲＮＡテンプレートの発現が生じる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡテンプレート発現は、ｉＮＲＡテンプレートの下流の複数の停止コドンの存在に起因して、ハウスキーピング遺伝子の発現を付随して阻害する。さらに、ｉＲＮＡテンプレートの発現は、内因性ハウスキーピング遺伝子プロモーターの制御下にある。このような「プロモーター−トラップ」ストラテジーのために、ハウスキーピング遺伝子を標的化する、標的ハウスキーピング遺伝子のイントロン配列に対して相同性を有する配列と、ＡＧジヌクレオチドスプライスアクセプター部位を含む下流のイントロンスプライスアクセプターシグナル配列と、ｉＲＮＡテンプレートの３’に複数の停止コドンを含有するように設計されたプロモーターを含まないｉＲＮＡテンプレートと、設計されたｉＲＮＡテンプレートをすぐ下流のエキソンにスプライシングするためのＧＴジヌクレオチドスプライスドナー部位を含むイントロンスプライスドナーシグナル配列と、標的遺伝子に対してアニーリングを補助するための標的遺伝子のイントロン配列に対して相同性を有するさらなる配列とを含有する構築物が設計される。
【０１４８】
別の実施形態では、「プロモーター−トラップ」ストラテジーは、内因性ハウスキーピングエキソンをインフレームでプロモーターを含まないｉＲＮＡテンプレート含有ベクターと交換することによって、ｉＲＮＡテンプレートを含有するベクターを標的ハウスキーピング遺伝子に挿入するために使用される。ｉＲＮＡテンプレート含有ベクターは、染色体内でスプライシングされ、ｉＲＮＡテンプレート及び付随物の発現を生じ、全長標的ハウスキーピング遺伝子の発現を阻害する。さらに、ｉＲＮＡテンプレートは、ハウスキーピング遺伝子の関連プロモーターの制御下にある。
【０１４９】
この「プロモータートラップ」遺伝子標的化構築物は、開始コドンの上流の標的ハイスキーピング遺伝子３’イントロン配列に対して相同性を有する配列と、ＡＧジヌクレオチドスプライスアクセプター部位を含む上流イントロンスプライスアクセプター配列と、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列と、例えば、ポリＡ末端配列を含有するプロモーターを含まないｉＲＮＡテンプレート含有ベクターと、開始コドンの下流のイントロン領域からのＧＴジヌクレオチド配列スプライスドナー部位を含むスプライスドナー配列と、下流イントロンに対して相同性の５’配列を有する配列とを含有するように設計されてもよい。この方法が標的化ハウスキーピング遺伝子内で任意のエキソンを標的化するために使用されてもよいことが理解される。
【０１５０】
一実施形態では、ＤＮＡは、染色体にランダムに挿入され、リポーター遺伝子の活性化を経てその存在をシグナル化するように設計され、その両方は、内因性遺伝子の発現を模倣し、遺伝子座を潜在的に変異させる。リポーター遺伝子が活性化した細胞を細胞培養物中で選択することによって、各遺伝子を別個に標的化させる必要がないので、動物は、従来の遺伝子変異よりもかなり迅速に産生することができる。
【０１５１】
別の実施形態では、ｉＲＮＡは、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ミニ染色体ベクターの使用を介してプロモーターに使用可能に結合したｉＲＮＡを含有するベクターの導入遺伝子発現に関与する。多くの雑誌が、ベクターの導入遺伝子発現についてＥＭＶミニ染色体の使用を議論する（例えば、Ｓａｅｋｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２７８７−２７９４；Ｓａｅｋｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１０３１−１０３７を参照）。
【０１５２】
本発明の実施形態では、５’及び３’組換えアーム及びｉＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートを含有する線形ベクター又は合成オリゴヌクレオチドが提供される。一実施形態では、これらの標的化構築物は、内因性遺伝子の発現を破壊することなく、内因性遺伝子のエキソン又はイントロンに挿入することができる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡテンプレートは、イントロンとして機能可能な自己含有される配列内に埋め込まれる。次いで、ｓｉＲＮＡ含有イントロンは、内因性遺伝子のエキソンに挿入され、得られた組換えは、内因性遺伝子調節要素の制御下でｓｉＲＮＡ発現を可能にし、同じ内因性遺伝子の発現及び翻訳を妨害しない。
【０１５３】
別の実施形態では、標的化構築物を遺伝子内に挿入することができ、遺伝子を不活性化「ノックアウト」することができる。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法に従って産生された標的化構築物は、ノックアウト異種抗原性遺伝子、例えば、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼであることができる（例えば、Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：ｐｐ．４１１−４１４（２００３）又はＷＯ２００４／０２８２４３に記載されるもの）。異種抗原移植に対して潜在的な障壁であると考えられ、標的化可能なさらなる遺伝子としては、以下が挙げられる：ブタｉＧｂシンターゼ遺伝子（例えば、ＵＳＳＮ６０／５１７，５２４参照）、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子（例えば、ＵＳＳＮ１０／８６３，１１６参照）、及び／又はＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願第６０／５６８，９２２号参照）。特定の実施形態では、本明細書中に記載される標的化構築物は、これらの１つ以上の異種抗原をコードする遺伝子配列に対して相同性の５’及び３’標的化アームを含有することができる。他の実施形態では、異種接合ノックアウト及び／又はホモ接合ノックアウトを産生することができる。特定の実施形態では、本明細書中で記載される方法に従って産生される標的化構築物は、ＰＥＲＶ  Ｉブタ細胞の発現を抑制し、少なくとも１つの異種抗原をノックアウトするｉＲＮＡ分子を産生することができる。
【０１５４】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ分子をコードするベクター又は合成オリゴヌクレオチド構築物は、さらに、選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、標的遺伝子の上流配列を有するリーディングフレームに融合することができる。他の実施形態では、首尾よく標的化が行なわれたかどうかを決定するために細胞を機能的にアッセイすることができる。さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの適切な組み込みが行なわれたか否かを決定するために、制限分析、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲ法、シークエンシング又は当該技術分野で既知の別の技術によって細胞を分析することができる。
【０１５５】
選択可能なマーカー遺伝子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：特定の培地基質上で増殖する能力を与える遺伝子、例えば、ｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）、又はＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）上で増殖する能力を与えるｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸、アデニン及びキサンチン）上で増殖可能な細菌ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）。Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６８２０−６８２４（１９８７）を参照。さらに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）の第１６章を参照。選択可能なマーカーの他の例としては、以下のものが挙げられる：化合物（例えば、抗生物質）に対して耐性を与える遺伝子、選択された基質上で増殖する能力を与える遺伝子、検出可能なシグナル（例えば、発光、緑色蛍光タンパク質、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））を生じるタンパク質をコードする遺伝子。広範囲のこのようなマーカーが知られており、入手可能であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．，及びＰ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２）；及びハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：６８９５−６９１１（１９８３）、及びＴｅ  Ｒｉｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６４９−６５１（１９９０）。他の選択可能なマーカー遺伝子としては、以下のものが挙げられる：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びそれらの誘導体。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、ＭＴＸ、ホスフィノチリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーが利用できる。
【０１５６】
抗生物質耐性遺伝子及びネガティブ選択因子を組み込むための方法は、当業者に知られている（例えば、ＷＯ９９／１５６５０；米国特許第６，０８０，５７６号；米国特許第６．１３６，５６６号；Ｎｉｗａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３４３−３４９（１９９３）；及びＹｏｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：２７７−２８７（１９９５）参照）。
【０１５７】
本発明において有用なさらなる選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、以下の米国特許に記載される：
【０１５８】
【化９】
2007512027.tif 000010
選択可能なマーカーの組み合わせも使用することができる。
【０１５９】
ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを導入するために相同的にゲノム内に組み込まれた細胞は、適切な組み込みを提供する細胞を同定するために、適切に選択された培地中で増殖される。所望の表現型を示すこれらの細胞は、制限分析、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲ法、シークエンシング又は当該技術分野で既知の別の技術によってさらに分析することができる。標的遺伝子部位に適切な挿入を示すフラグメントを同定することによって、相同組換えが起こった細胞を同定することができる。
【０１６０】
ｉＲＮＡ分子の発現に基づく所望な表現型を示す細胞は、相同又は非相同組換えが起こったか否かを確立する目的でＤＮＡを分析するために、制限分析、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲ法などによってさらに分析することができる。このことは、挿入のためにプローブを使用し、構築物のフランキング領域を超えて延びるｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡテンプレートの存在について５’及び３’領域フランキング挿入物を配列決定することによって決定することができる。構築物内の配列に対して相補性であり、構築物の外側及び標的遺伝子座での配列に対して相補性であるプライマーをさらに使用することができる。この様式では、相同組換えが起こった場合、両方のプライマーが相補鎖中に存在するＤＮＡ二本鎖のみを得ることができる。プライマー配列及び予想されるサイズ配列の存在を示すことによって、相同組換えの発生が裏づけられる。
【０１６１】
相同組換え事象をスクリーニングするために使用されるＰＣＲ法は、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３，１９８８；及びＪｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５３−１５６，１９８９に記載される。ネオマイシン遺伝子を活性化させるための変異ポリオーマエンハンサー及びチミジンキナーゼプロモーターの組み合わせは、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ（前出、１９８７）；Ｎｉｃｈｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８３）ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ｅｄｓ．Ｓｉｖｅｒ，Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｋｌａｎｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（ｐｐ．４６９−４９７）；及びＬｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｄｏｎｅｒｌｙ，Ｃｅｌｌ  ３５：６９３−６９９，（１９８３）により、胚幹細胞及びＥＣ細胞の両方において活性であることが示された。
【０１６２】
第１ラウンドの標的化から得られる細胞株は、標的化対立遺伝子について異種接合体である。両方の対立遺伝子が改変されたホモ接合体は、多くの様式で達成可能である。１つのアプローチは、１つの複製物が改変され、異なる選択可能なマーカーを用いてこれらの細胞をさらなるラウンドで標的化することによって、多くの細胞を育てることである。あるいは、ホモ接合体は、従来のメンデル遺伝子に従って、改変された対立遺伝子について異種接合的に動物を育てることによって得ることができる。いくつかの状況では、２つの異なる改変対立遺伝子を有することが望ましい場合がある。このことは、首尾よいラウンドの遺伝子標的化によって、又は異種接合体を育てることによって達成することができ、これらそれぞれは、望ましく改変された対立遺伝子のうち１つを有する。
【０１６３】
（ＩＶ．ｉＲＮＡ分子によって調節され／標的化された遺伝子）
本発明のさらなる局面では、遺伝子の発現を機能的に排除可能な、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するｉＲＮＡ分子が提供される。一実施形態では、遺伝子の同じ領域を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。別の実施形態では、同じ遺伝子の少なくとも２つの異なる領域を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。さらなる実施形態では、少なくとも２つの異なる遺伝子を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。本発明のさらなる実施形態は、遺伝子標的化のための上述のストラテジーの組み合わせを提供する。
【０１６４】
一実施形態では、ｉＲＮＡ分子は同じ配列であることができる。代替の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は異なる配列であることができる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、同じ又は異なるベクター又はＤＮＡテンプレートのいずれかに組み込むことができる。一実施形態では、ベクター内又はＤＮＡテンプレート内のｉＲＮＡ分子は、プロモーター配列（例えば、偏在的に発現するプロモーター又は細胞型に特異的なプロモーター）に使用可能な状態で結合する。別の実施形態では、ベクター内又はＤＮＡテンプレート内のｉＲＮＡ分子は、プロモーター配列の制御下にない。さらなる実施形態では、これらのベクター又はＤＮＡテンプレートは、細胞に導入することができる。一実施形態では、ベクター又はＤＮＡテンプレートは、細胞のゲノム内に組み込むことができる。この細胞への組み込みは、ランダム組み込み又は標的化組み込みのいずれかを介して行なうことができる。標的化組み込みは相同組換えを経て行なうことができる。
【０１６５】
他の実施形態では、１つ以上の遺伝子のファミリーをｉＲＮＡ分子の発現によって調節可能な少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。別の実施形態では、１つ以上の遺伝子のファミリーをｉＲＮＡ分子の発現によって調節可能な少なくとも３つ、４つ、又は５つのｉＲＮＡ分子が提供される。ｉＲＮＡ分子は、１つ以上の遺伝子内の保存配列に相同性であることができる。本発明のこのような方法を用いて調節される遺伝子のファミリーは、細胞、関連するウイルス遺伝子のファミリー、ウイルス属の中で保存される遺伝子のファミリー、関連した真核生物寄生虫遺伝子のファミリー、又はより特定的にはブタ内因性レトロウイルス由来の遺伝子のファミリーに対して内因性であることができる。１つの特定の実施形態では、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子は、遺伝子の同じファミリーのメンバーである少なくとも２つの異なる遺伝子を標的化することができる。ｉＲＮＡ分子は、遺伝子のファミリー内の相同領域を標的化することができ、１つのｉＲＮＡ分子は、複数の遺伝子の同じ領域を標的化することができる。
【０１６６】
ｉＲＮＡ分子は、限定されないが、以下の種類のｉＲＮＡから選択することができる：アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、逆位反復、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さな一時的に制御されたＲＮＡ、及び放射クラスター状制御ＲＮＡを含むクラスター状制御ＲＮＡ（ｃｉＲＮＡ）、クラスター状阻害ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、放射クラスター状阻害ＲＮＡ、及び非対称クラスター状阻害ＲＮＡ、線形クラスター状阻害ＲＮＡ、及び複合体又は化合物クラスター状阻害ＲＮＡの混合物又は化合物。
【０１６７】
別の実施形態では、哺乳動物細胞株又はトランスジェニック動物において標的遺伝子を調節するためのｉＲＮＡ分子の発現は、標的遺伝子の発現が機能的に排除されるか又は検出限界未満にされるように提供され、すなわち、標的遺伝子の発現が、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％減少する。
【０１６８】
本発明のこの局面の別の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子が発現して標的遺伝子の発現が調節される細胞及び動物を産生するための方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、以下の工程を含む：細胞中の１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；上記標的核酸配列に結合する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を得る工程；ｉＲＮＡ分子、場合により発現ベクター中に封入されたｉＲＮＡ分子を細胞内に導入する工程；及びｉＲＮＡが標的核酸配列に結合するような条件下で細胞中でｉＲＮＡ分子を発現させ、それによって１つ以上の標的遺伝子の発現を調節する工程。一実施形態では、本発明は、１つ以上の標的遺伝子の発現を調節する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を遺伝的に発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。一実施形態では、上記動物は、体細胞核移植を介して産生することができる。体細胞は、本明細書中に記載される技術のいずれかによって、ｉＲＮＡ分子を発現するように設計することができる。
【０１６９】
他の実施形態では、本発明はさらに、細胞又はトランスジェニック動物において少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を発現するための方法を提供し、ここで、ｉＲＮＡは遺伝子のファミリー内の共通の位置を標的化する。このような方法は、例えば、以下の工程を含むことができる：遺伝子のファミリー内の相同領域である細胞中の１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；上記標的核酸配列に結合する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を調製する工程；ｉＲＮＡ分子、場合により発現ベクター中に封入されたｉＲＮＡ分子を細胞内に導入する工程；及びｉＲＮＡが遺伝子ファミリー内の相同領域に結合するような条件下で細胞中又は動物中でｉＲＮＡ分子を発現させる工程。
【０１７０】
本発明はさらに、本発明の方法によって産生されるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明の方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウサギ、イヌ、ウマ、ラバ、シカ、ネコ、サル及び他の非ヒト霊長類）、鳥（特に鶏、カモ及びガチョウ）、魚、爬虫類、両生類、虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）及び昆虫（Ｍｏｓｑｕｉｔｏｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ及び、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａが挙げられるが、これらに限られない）の産生のための例として有用である。いずれかの種類の非ヒト動物を産生することができるが、一実施形態では、非ヒト動物はトランスジェニックブタである。本発明はさらに、このような非ヒトトランスジェニック動物から単離された細胞、組織及び臓器を提供する。
【０１７１】
本発明の実施形態では、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現によって調節可能な内因性遺伝子としては、限定されないが、細胞生存又は細胞複製のために必要な遺伝子、ウイルス複製のために必要な遺伝子、免疫グロブリン遺伝子座をコードする遺伝子（例えば、カッパ軽鎖）、及び細胞表面タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＶＣＡＭ））、及び細胞、組織、臓器及び動物の構造及び／又は機能にとって重要な他の遺伝子が挙げられる。本発明の方法はさらに、干渉ＲＮＡの遺伝可能な導入遺伝子を発現させることによって、トランスジェニック細胞中又はトランスジェニック動物中の１つ以上の非コードＲＮＡ配列の発現を調節するために使用することができる。これらの非コードＲＮＡ配列は、ＲＮＡウイルスゲノムの配列、内因性遺伝子、真核生物寄生虫遺伝子、又は当該技術分野で既知であり、当業者によく知られた他の非コードＲＮＡ配列であることができる。
【０１７２】
本発明の局面に従う細胞又は動物において発現するｉＲＮＡ分子は、１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させ、増加させ、又は維持することができる。１つ以上の遺伝子、遺伝子のファミリー、遺伝子の所望なサブセット、又は遺伝子の対立遺伝子の発現が調節される特定の標的核酸領域を同定するために、各標的遺伝子についての配列の代表的なサンプルを得ることができる。配列を比較して、類似領域及び非類似領域を見つけることができる。この分析は、全てのファミリーメンバー間及びサブセット（すなわち、遺伝子ファミリー内のグループ）内の同定領域を決定することができる。それに加えて、この分析は、各ファミリーメンバーの対立遺伝子間の同定領域を決定することができる。ファミリーメンバーの対立遺伝子間、及びファミリー全体にわたる同定領域を考慮することによって、ファミリー全体、ファミリーメンバーのサブセット、個々のファミリーメンバー、個々のファミリーメンバーの対立遺伝子のサブセット、又はファミリーメンバーの個々の対立遺伝子を特定する標的領域を同定することができる。
【０１７３】
発現の調節は、１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させることができる。減少した発現により、標的遺伝子の後転写下方修正が生じ、究極的には、標的遺伝子の最終産物タンパク質の後転写下方修正が生じる。下方修正について、標的核酸配列は、配列に対するｉＲＮＡの結合が標的遺伝子の発現を減少させるように同一である。遺伝子の減少した発現は、ｉＲＮＡの導入がない場合と比較して、１つ以上の標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルがゼロであること、又は観測可能又は検出可能に減少することを指す。標的遺伝子の完全な抑制／阻害及び部分的に抑制された発現は、本発明の方法を用いて可能である。「部分的に抑制された発現」とは、標的遺伝子が、約１０〜約９９％抑制される（すなわち、標的遺伝子の発現が減少する）ことを意味し、１００％は標的遺伝子の完全な抑制／阻害を意味する。例えば、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％を抑制することができる。あるいは、発現は、検出閾値限界未満に抑制又は阻害される。
【０１７４】
本発明の他の実施形態では、発現の抑制は、１つ以上の遺伝子の発現を減少させることができる。減少した発現は、干渉ＲＮＡが目的の１つ以上の遺伝子のサプレッサーとして作用する核酸配列を標的化する場合に生じることができる。本発明のこの実施形態では、標的核酸及び目的の遺伝子は、別個の配列であることができる。遺伝子の増加した発現は、ｉＲＮＡの導入がない場合と比較して、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルがゼロでないこと、又は観測可能又は検出可能に増加することを指す。遺伝子の増加した発現とは、ｉＲＮＡの導入がない場合と比較して、発現される測定可能な量の標的核酸が任意の量で増加することを意味する。例えば、遺伝子の発現のレベルは、干渉ＲＮＡの非存在下で生じるレベルを超えて、約２倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、又は約２０００倍に増加することができる。
【０１７５】
本発明のなお他の局面では、発現の調節は、１つ以上の遺伝子が、一般的に１つ以上の遺伝子の発現を増加又は減少させる環境下に置かれる場合、１つ以上の遺伝子の発現を維持することができる。１つ以上の遺伝子の発現は、発現を増加又は減少させる環境が存在する前の発現と比較して、遺伝子発現を通常は増加又は減少させる環境下で、遺伝子発現の定常状態のレベルを生じる（すなわち、時間にともなって発現が減少も増加もしない）ように維持することができる。遺伝子発現を増加可能な環境の例としては、限定されないが、増殖因子の存在、グルコース産生の増加、高熱及び細胞サイクルの変化が挙げられる。遺伝子発現を減少可能な環境の例としては、限定されないが、酸素圧低下、低体温、成育因子の欠如及びブドウ糖減少が挙げられる。
【０１７６】
遺伝子発現の定量化により、１つ以上のｉＲＮＡ分子を含有する細胞又は動物における遺伝子発現の阻害（又は向上）の程度を決定することができる。注射された物質の用量が低いほど、及び投与又はｉＲＮＡ組み込み後の経過時間が長いほど、細胞又は動物の阻害又は向上のフラクションが小さくなり得る（例えば、標的化細胞又は動物の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、又は９５％）。細胞又は動物における遺伝子発現の定量化は、標的ｍＲＮＡの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳レベルで同じ阻害量又は向上量を示すことができる。阻害又は向上の効力は、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて細胞又は動物における遺伝子産物の量を評価することによって決定することができる。例えば、ｍＲＮＡは、干渉ＲＮＡのために使用される領域の外側にヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて検出することができるか、又は、翻訳されたポリペプチドは、この領域のポリペプチド配列に対して集まる抗体を用いて検出することができる。ｍＲＮＡ及びポリペプチドを定量化するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照。
【０１７７】
本発明はさらに、遺伝子のファミリーの発現の調節に関する。用語「遺伝子のファミリー」は、類似の機能、配列、又は表現型を有する１つ以上の遺伝子を指す。遺伝子のファミリーは、保存配列、すなわち、遺伝子ファミリーの全てのメンバーの中で同じ又は高度に相同性のヌクレオチド配列を含有することができる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ配列は、遺伝子ファミリーのこの保存配列にハイブリダイズすることができ、１つのｉＲＮＡ配列は、遺伝子ファミリーの１つより多いメンバーを標的化することができる。
【０１７８】
一実施形態では、標的遺伝子又は遺伝子のファミリーは、内因性ウイルスの遺伝子、例えば、ブタ内因性レトロウイルスの遺伝子である。本発明の別の実施形態では、標的遺伝子又は遺伝子ファミリーは外因性ウイルスである。外因性ウイルスの例としては、限定されないが、人畜共通ウイルス（例えば、西ナイルウイルス、ハンタウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、腸内ウイルス、狂犬病ウイルス、フィロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス及びニパウイルス）、家畜ウイルス（例えば牛疫ウイルス、口蹄疫ウィルス及びマレック病ウィルス）、合成ウイルス及びある地域に特有のウイルスが挙げられる。種のゲノム（染色体又は染色体外）の積分要素として遺伝可能でない任意のウイルス遺伝子は、外因性ウイルスとみなすことができ、本発明の方法によって調節することができる。１つのこのような実施形態では、調節される外因性ウイルスの１つ以上の遺伝子のファミリーは、関連ウイルス遺伝子のファミリーであることができる。関連ウイルス遺伝子の例としては、限定されないが、レトロウイルス遺伝子のファミリーとして関連する、ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子が挙げられる。
【０１７９】
本発明の方法はさらに、遺伝子の進化的に関連したファミリー内の遺伝子の発現を調節するために使用することができる。進化的に関連した遺伝子は、共通の原種遺伝子配列とは相違した遺伝子であり、それ自身は１つ以上のｍＲＮＡをコードする配列であってもそうでなくてもよい。この進化的に関連したファミリーに、遺伝子のサブセットが存在することができ、このサブセット内で、保存されたヌクレオチド配列が存在することができる。本発明はさらに、ｉＲＮＡ分子をこの保存されたヌクレオチド配列に対して標的化することによって、遺伝子のこのサブセットの発現を調節する方法を提供する。本発明の方法によって調節可能な進化的に関連した遺伝子は、細胞又は動物に対して内因性又は外因性であることができ、遺伝子のウイルスファミリーのメンバーであることができる。それに加えて、本発明の方法によって調節可能なウイルス遺伝子のファミリーは、細胞又は動物に対して内因性であるファミリーメンバーを有することができる。
【０１８０】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、ウイルスの寿命を調節するために使用することができる。本発明の１つのこのような局面では、この調節は、寿命の打ち切り又は短期間化を生じることができる。寿命を打ち切り又は短期間化することとは、ウイルスが、調節されていない同じウイルスよりも短い時間生存することを意味する。より短い期間は、調節されていない同じウイルスの寿命よりも短い任意の時間を包含する。例えば、ウイルスは、調節されていない同じウイルスよりも約１％、約５％、約１０％、約３３％、約５０％、約６７％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％短い時間生存することができる。その寿命が１００％打ち切られたウイルスは、ウイルス、又はウイルスを含む宿主細胞をｉＲＮＡで処理した後のいずれの時間も生存しないウイルスを表す。
【０１８１】
代替的な局面では、ｉＲＮＡにより誘発された調節は、ウイルスの寿命を延長し、又は延ばすことができる。寿命の延長又は延ばすこととは、ウイルスが、調節されていない同じウイルスよりも長い時間生存することを意味する。より長い時間は、調節されていない同じウイルスの寿命よりも長い任意の時間を包含する。例えば、ウイルスは、調節されていない同じウイルスよりも約２倍、約５倍、約７０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約２０００倍などの、長い時間生存することができる。
【０１８２】
本発明のなお他の局面では、ウイルスがその寿命の延長又は打ち切りを一般的に導く環境下に置かれる場合に、発現の調節により、ウイルスの寿命を維持することができる。通常はこの寿命を延長又は打ち切る環境下で維持されるウイルスの寿命は、ウイルスの寿命が延長又は打ち切られる環境下でのウイルスと比較して、ウイルスの寿命に対して定常状態（すなわち、延長又は打ち切りのない状態）を生じる。ウイルスの寿命を延長し得る環境の例としては、限定されないが、増殖因子の存在、グルコース産生の増加、高熱、細胞サイクルの変化が挙げられる。ウイルスの寿命を打ち切り得る環境の例としては、限定されないが、酸素圧低下、低体温、成育因子の欠如及びブドウ糖減少が挙げられる。
【０１８３】
ウイルスの寿命の調節は、ウイルスの寿命が必要とされる内因性遺伝子又は内因性遺伝子のファミリーの調節から生じることができる。干渉ＲＮＡはさらに、ウイルス遺伝子又はウイルス遺伝子のファミリーを標的化し、ウイルスの寿命を調節する。
【０１８４】
他の実施形態では、本発明の方法は、細胞又は動物に対して内因性の遺伝子、又は遺伝子のファミリーの発現を調節するために使用することができる。内因性遺伝子は、動物種のゲノムの積分要素として遺伝可能な任意の遺伝子である。本発明の方法による内因性遺伝子の調節は、細胞又は動物の表現型又は生物学的状態を抑制又は高めるための方法を提供することができる。調節され得る表現型又は生物学的状態の例としては、限定されないが、ウイルスの脱粒又は伝達、飼料効率、成長速度、美味性、多産性、二次性徴、カーカス収率、カーカス脂肪分、毛質、ウール収率、耐病性、産後の生存及び生殖力の伝達が挙げられる。また、本発明の方法によって調節され得るさらなる内因性遺伝子としては、限定されないが、細胞生存のために必要である内因性遺伝子、細胞複製のために必要である内因性遺伝子、ウィルス複製のために必要である内因性遺伝子、免疫グロブリン場所をコード化する内因性遺伝子及び細胞表面タンパク質をコード化する内因性遺伝子が挙げられる。内因性遺伝子のさらなる例としては、発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Ｗｒｉｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、Ｗｉｎｇｅｄらせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカイン及びそれらのレセプター、成長／分化因子及びそれらのレセプター、神経伝達物質及びそれらのレセプター）、癌抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３及びＷＴＩ）、及び酵素（例えば、ＡＣＣシンターゼ及びオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リソチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、フォスフォリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼ及びキシラナーゼ）が挙げられる。
【０１８５】
本発明の一実施形態では、調節された遺伝子、又は遺伝子のファミリーは、組み込まれた内因性ウイルスの遺伝子である。組み込まれた内因性ウイルス遺伝子の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子、オンコジーン（たとえば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬｉ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、Ｐｍ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３及びＹＥＳ）、成長因子レセプター遺伝子、Ｂウィルス遺伝子及びサルのＴリンパ増殖性ウイルス遺伝子が挙げられる。種のゲノムの要素として遺伝する任意のウイルス遺伝子は、内因性ウイルス遺伝子とみなされ、本発明の方法によって調節することができる。一実施形態では、調節される１つ以上の遺伝子のファミリーは、関連したウイルス遺伝子のファミリーであることができる。
【０１８６】
本発明の方法はさらに、特定の対立遺伝子の発現を調節するために使用することができる。対立遺伝子は、同じ染色体座を占める遺伝子の多型改変体である。本発明の方法は、遺伝子又は遺伝子のファミリーの１つ以上の特定の対立遺伝子の調節を可能にする。この実施形態では、ｉＲＮＡの配列は、遺伝子又は遺伝子のファミリーの１つ以上の特定の対立遺伝子が調節され、同じ遺伝子又は遺伝子のファミリーの他のさらなる対立遺伝子は調節されないように調製可能である。
【０１８７】
本発明の別の実施形態では、調節された遺伝子又は遺伝子のファミリーは、真核生物寄生虫の遺伝子である。真核生物寄生虫の例としては、ぜん虫、原生動物及び節足動物が挙げられる、これに限定されるものではない。
【０１８８】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、非コードＲＮＡ配列の発現の調節を可能にする。非コードＲＮＡ配列は、活性タンパク質を転写しない配列である。これらの非コードＲＮＡ配列は、内因性又は外因性ウイルスゲノムの配列であることができ、これらは、細胞又は動物に対して内因性であることができるか、又は真核生物寄生虫の配列であることができる。
【０１８９】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、相同組換え事象の強化を可能にする。ｓｉＲＮＡ導入遺伝子が相同性標的化アームの「外側」に配置される場合、ｓｉＲＮＡ導入遺伝子は遺伝子組換えが起こった細胞のゲノムにおいて保持されない。しかしながら、標的化ベクターがランダムな位置に組み込まれ、相同的組換え事象があらわれない場合、ｓｉＲＮＡ導入遺伝子はこのような細胞のゲノム中に存在する。ｓｉＲＮＡ導入遺伝子が、必要とされる遺伝子、選択可能な表現型を生じる遺伝子、又はもともとの標的化ベクターを含有する選択可能なマーカーのいずれかを標的化する場合、ランダム組み込みが標的化事象とは異なることがあり得る。この場合には、非標的化組み込み事象に関連して、標的化事象を豊富にすることができる。
【０１９０】
（Ａ．ＰＥＲＶ）
本発明の１つの例示的な実施形態では、調節された遺伝子、又は遺伝子のファミリーは、組み込まれた内因性ウイルスの遺伝子である。内因性ウイルスのプロトタイプはＰＥＲＶ（ブタ内因性レトロウイルス）である。
【０１９１】
本発明の例示的な実施形態では、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子は、ＰＥＲＶウイルスの発現が機能的に排除されるか、又は検出レベル未満にされる少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現によって調節することができる。ＰＥＲＶは、主要な３種類が今日までに同定されているレトロウイルスのファミリーを指す：ＰＥＲＶ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３８６０１）、ＰＥＲＶ−Ｂ（ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＥＲＹ１７０１３）及びＰＥＲＶ−Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３８６００）（Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。ＰＥＲＶ−Ａ、Ｂ及びＣのｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子は高度に相同性であり、異なる種類のＰＥＲＶ（例えば、ＰＥＲＶ−Ａ、ＰＥＲＶ−Ｂ、ＰＥＲＶ−Ｃ）間で顕著に異なるのはｅｎｖ遺伝子である。また、ＰＥＲＶ−Ｄは、最近同定された（例えば、米国特許番号第６，２６１，８０６号を参照）。
【０１９２】
一実施形態では、ＰＥＲＶウイルスに指向するｉＲＮＡは、ＰＥＲＶの発現を少なくとも約７０％、７５％，８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％減少させることができるか、又は検出限界未満にすることができる。この目標を達成するために、本発明は、ＰＥＲＶゲノムのｇａｇ領域、ｐｏｌ領域、又はｅｎｖ領域内の同じ配列を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子を提供する。さらに、ＰＥＲＶゲノムのｇａｇ領域、ｐｏｌ領域、又はｅｎｖ領域内の異なる配列を標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。なおさらに、ＰＥＲＶゲノムの異なる領域（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、又はｅｎｖのいずれか）をそれぞれ標的化する少なくとも２つのｉＲＮＡ分子が提供される。さらに、これらの異なる標的化ストラテジーを組み合わせた複数のｉＲＮＡ分子が提供され、例えば：ＰＥＲＶのｇａｇ領域に対して指向する少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子；ＰＥＲＶのｐｏｌ領域に対して指向する少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子；及びＰＥＲＶのｅｎｖ領域に対して指向する少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子がＰＥＲＶ遺伝子を標的化するために提供される。
【０１９３】
本発明はさらに、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子の発現を経て、ＰＥＲＶの発現が減少するか又は機能的に排除される、ブタ動物、及び非ヒトトランスジェニック動物から単離された細胞、組織及び臓器を提供する。特定のこのような実施形態では、これらは、ブタ内因性レトロウイルス遺伝子、ブタ内因性レトロウイルス遺伝子のファミリーメンバー、又はブタ内因性レトロウイルス遺伝子ファミリーのサブセットのメンバーと干渉する１つ以上の干渉ＲＮＡを発現するトランスジェニックブタから得られる。
【０１９４】
ブタクローニング（Ｐｏｌｅｊａｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２０００）及びブタにおけるα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３ＧＴ）遺伝子のノックアウト（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２）における近年の成功に伴い、異種移植術は現実味を帯びるようになってきている。ブタ臓器及び組織からのα１，３ｇａｌエピトープ、主要な異種抗原の完全な除去は、ブタ異種移植の超急性拒絶反応を顕著に減らす。ヒトに対するブタの異種移植の潜在的なリスクは、ヒトがブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）に感染する潜在性である。ＰＥＲＶは、Ｃ型ファミリーレトロウイルスであり、全てのブタ細胞、組織又は臓器中に偏在的に見出される。ＰＥＲＶは、１細胞あたり５０個の複製のＰＥＲＶプロウイルスを有するブタゲノムの積算部分である（Ｌｅ  Ｔｉｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。プロウイルスのほとんどは欠損しており、それらの非常に少量が複製能を有する（Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。３つの異なるｅｎｖ遺伝子サブファミリー内で相対的な相同性に従って分類される、少なくとも３つの別個のＰＥＲＶ配列が同定された（ＰＥＲＶ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃ）（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｂｌｕｓｃｈ  ２００２）。Ｐｅｒｖ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは、互いに９２％アミノ酸同一性を示し、テナガザル白血病ウィルス、ネコ白血病ウィルス及びフレンドマウス白血病ウィルスに対して６３〜６６％の同一性を示す。複製能のあるＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは、ＰＫ−１５（ブタ腎臓由来）細胞、活性化末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）、ブタすい島及びブタ大動脈内皮細胞から検出された（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。ＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは両方とも、ヒト細胞及びブタ細胞に感染可能であるが、ＰＥＲＶ−Ｃ、環境栄養性ウイルスは、正常なヒト細胞に感染可能でないことが示された。感染及び偽遺伝子型同定実験は、ＰＥＲＶ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃが異なる細胞レセプターであることを示した。生きたブタ臓器、組織又は細胞で処理されたヒトの研究は、ＰＥＲＶ感染の証拠をなんら見出せなかった（Ｈｅｎｅｉｎｅ  １９９８；Ｐａｒａｄｉｓ１９９９；Ｐａｔｉｅｎｃｅ  １９９８）。しかし、これらの研究では、ヒトＰＢＭＣ細胞のみがスクリーニングされ、患者のほとんどが免疫抑制下ではなかった。異種移植設定において、ブタ由来の臓器又は細胞は、患者の血流に直接さらされてもよく、これらの患者が通常は免疫抑制されるため、ＰＥＲＶ感染のリスクは高まる場合がある。それに加えて、α１，３Ｇａｌネガティブブタの開発で、ウイルス（例えば、ＰＥＲＶ）に対する別の天然欠損が抑制される場合がある。通常は、全てのヒトにおいて存在するαｇａｌに対するあらかじめ形成された高タイター抗体は、エンベロープがα−ｇａｌエピトープで装飾されるウイルスに対して防御の最初のラインとして作用する。しかし、内因性プロウイルスがα１，３Ｇａｌネガティブブタから生じる場合、それらはα−ｇａｌを欠失しており、この主要な免疫防御を避けることができる。このように、この潜在能力は、α１，３Ｇａｌネガティブブタ由来のＰＥＲＶが患者を感染させる大きな機会を有する場合があることを示す。
【０１９５】
ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）の伝達を減らすための現在のストラテジーは、従来の繁殖によってＰＥＲＶ複製数を減らすことを含む。ＰＥＲＶ複製数及び組み込み部位がブタ間で変動するため、ブタゲノム中でＰＥＲＶの数を減らすための選択的な繁殖を使用することが可能である。このストラテジーは、必要な時間の観点から非実用的であるだけではなく、ＰＥＲＶがメンデル遺伝によって排他的に伝達されることを推定する。Ｃ型レトロウイルスが組み込まれて新規プロウイルスを形成するので、この推定は間違っている（Ｍａｎｇ，ｅｔ  ａｌ，２００１）。同様のストラテジーは、低い数のＰＥＲＶを有し及び／又は主にＰＥＲＶが欠失した遺伝的背景を見つけることを期待して、大量の個々のブタ及びブタの種族をスクリーニングすることである。再び、ＰＥＲＶ数及び組み込み部位が安定であるという推定がなされた。それに加えて、このようなブタが数少ない機能的又はヒト屈性ＰＥＲＶのために選択されるため、人工的な快適さが作られる。しかし、特徴決定されたほとんどのヒトに伝達可能なＰＥＲＶは、新規ｍＲＮＡ組換えから生じ、もともとのゲノム中にはない新規ＰＥＲＶを作成する（Ｏｌｄｍｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
【０１９６】
本発明の１つの局面では、ＰＥＲＶ遺伝子のファミリーを調節することができる。関連ＰＥＲＶウイルスの例としては、例えば、ＰＥＲＶ  Ａ、ＰＥＲＶ  Ｂ、ＰＥＲＶ  Ｃ、及びＰＥＲＶ  Ｄが挙げられる。関連ＰＥＲＶ遺伝子の例としては、限定されないが、ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子が挙げられる。
【０１９７】
代表的なｇａｇ配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を有して見出すことができる：
【０１９８】
【化１０】
2007512027.tif 000011
代表的なｐｏｌ配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を有して見出すことができる：
【０１９９】
【化１１】
2007512027.tif 000012
代表的なｅｎｖ−Ａ配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を有して見出すことができる：
【０２００】
【化１２】
2007512027.tif 000013
代表的なｅｎｖ−Ｂ配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を有して見出すことができる：
【０２０１】
【化１３】
2007512027.tif 000014
代表的なｅｎｖ−Ｃ配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を有して見出すことができる：
【０２０２】
【化１４】
2007512027.tif 000015
代表的なｅｎｖ−Ｄ配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を有して見出すことができる：ＡＦ４０２６６１、ＡＦ４０２６６２、ＡＦ４０２６６３、又は米国特許第６，２６１，８０６中のもの。
【０２０３】
一実施形態では、遺伝子のＰＥＲＶ−Ａ、ＰＥＲＶ−Ｂ、及びＰＥＲＶ−Ｃファミリーは、少なくとも２つのｉＲＮＡ分子によって同時に標的化することができる。別の実施形態では、ウイルスは、ブタ内因性レトロウイルスファミリーのサブセットである。
【０２０４】
別のものでは、ＰＥＲＶを調節するｉＲＮＡ分子を含有するブタの細胞、組織及び臓器を、異種移植のために使用することができる。
【０２０５】
（細胞型）
本明細書中で記載される構築物、テンプレート、及びベクターは、限定されないが、マイクロインジェクション、トランスフェクション、形質転換、及び／又はエレクトロポレーションを含む、当該技術分野で既知の任意の技術を経て宿主細胞へと導入することができる。宿主細胞は、任意の哺乳動物、植物、酵母又は細菌の細胞であることができる。一実施形態では、宿主細胞は、原核生物（例えば、限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種を含む細菌細胞）である。別の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞であり、例えば、昆虫細胞（限定されないが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ又はＥｓｔｉｇｍｅｎｅ種を含む）、又は哺乳動物細胞（限定されないが、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヒツジ細胞、げっ類細胞、ハムスター細胞、サル、霊長類又はヒトの細胞を含む）である。哺乳動物細胞は、種々の異なる臓器及び組織から得られる細胞であることができ、例えば、限定されないが、皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、及び胚、胎児又は成体動物の全部又は一部の非骨格調製物；又は上皮細胞、繊維芽細胞細胞、神経細胞、ケラチン合成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴ）、マクロファージ、単核球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、粒状細胞、卵丘細胞、表皮細胞又は血管内皮細胞。宿主細胞は、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞、又は細胞培養物中で通常使用される他の細胞であることができる。別の実施形態では、宿主細胞は、植物細胞（限定されないが、タバコ細胞、トウモロコシ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種由来の細胞、ジャガイモ細胞又は米細胞）である。
【０２０６】
（Ｖ．遺伝的に改変された動物の産生）
本発明はさらに、１つ以上の干渉ｉＲＮＡ分子を遺伝的に発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を含む。非ヒトトランスジェニック動物は、限定されないが、非ヒト哺乳動物（ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ウシ科の動物）、シカ、ラバ、ウマ、サル及びその他の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギを含むがこれに限られない）、鳥（鶏、シチメンチョウ、カモ、ガチョウを含むがこれに限られない）、爬虫類、魚、両生類、虫（例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａを含むがこれに限られない）を含む、本発明の方法のいずれか１つによって産生することができる。
【０２０７】
本発明はさらに、そのゲノム中に挿入される少なくとも２つのｉＲＮＡ配列を有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。一実施形態では、動物は、その細胞の大多数の中でｉＲＮＡ分子を発現することができる。別の実施形態では、動物は、その細胞の実質的に全てにおいてｉＲＮＡ分子を発現することができる。配列が動物のゲノムに組み込まれるため、ｉＲＮＡ分子は後に続く生成によって遺伝され、これらの生成はさらにそれらの細胞内にｉＲＮＡを産生することを可能にする。
【０２０８】
本発明の１つの局面では、非ヒトトランスジェニック動物は、核移植のプロセスを経て産生される。代替の局面では、本発明は、全能の胚細胞の遺伝子改変によって非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。
【０２０９】
（核移植／クローニング）
本発明の一実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、核移植のプロセスを経て産生される。一実施形態では、核ドナー細胞は、本明細書中に記載の構築物を標的化してｉＲＮＡ分子を産生することによって遺伝的に改変することができる。核移植を経て１つ以上の干渉ＲＮＡを発現する非ヒトトランスジェニック動物の産生は、以下の工程を含む：（ａ）動物において１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；（ｂ）標的核酸配列に対して結合する１つ以上の干渉ＲＮＡを調製する工程；（ｃ）１つ以上の干渉ＲＮＡを含有する１つ以上の発現ベクターを調製する工程；（ｄ）１つ以上の干渉ＲＮＡ発現ベクターを核ドナー細胞のゲノムに挿入する工程；（ｅ）核ドナー細胞の遺伝物質をアクセプター細胞に移す工程；（ｆ）アクセプター細胞を受容体のメス動物に移す工程；及び（ｇ）移されたアクセプター細胞をメス動物中で期限どおりに成長させる工程。限定されないが、以下のものを含む任意の動物を核移植によって産生することができる：ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、及びげっ歯類（マウス及びラットを含む）、ウサギ。
【０２１０】
核移植（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）技術又は核移植（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）技術は、当該技術分野で既知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｌｉｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ  Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；ＷＯ９４／２６８８４；ＷＯ９４／２４２７４、及びＷＯ９０／０３４３２、米国特許第４，９４４，３８４号及び同第５，０５７，４２０号）。１つの非限定的な例では、卵母細胞への挿入の前に、ドナー染色体又はドナー細胞が再プログラミングされる哺乳動物をクローニングするための方法を記載する、米国特許出願番号２００３／００４６７２２（Ｃｏｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌに対する）に記載されるような方法が提供される。本発明はさらに、染色体、核又は細胞を卵母細胞を用いて挿入又は融合する方法を記載する。
【０２１１】
ドナー細胞核は、受容体ブタ卵母細胞に移すことができる。この方法の使用は、特定のドナー細胞種に制限されない。ドナー細胞は、Ｗｉｌｍｕｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５  ８１０（１９９７）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０  ６４−６６（１９９６）；又はＣｉｂｅｆｆｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０  １２５６−１２５８（１９９８）に記載されるようなものであることができる。核移植において首尾よく使用可能な正常核型の全ての細胞（胚細胞、胎児細胞、成人体細胞を含む）は、原則として使用することができる。胎児繊維芽細胞は、特に有用な種類のドナー細胞である。核移植の一般的に適切な方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｌｉｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４３  １８１（１９９５），Ｃｏｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８  ２６４−２６７（１９９４），Ｋｅｅｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０  ９３５−９３９（１９９４），Ｓｉｍｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６１４３−６１４７（１９９３）、ＷＯ−Ａ−９４２６８８４、ＷＯ−Ａ−９４２４２７４、ＷＯ−Ａ−９８０７８４１、ＷＯ−Ａ−９００３４３２、米国特許第４，９９４，３８４号及び米国特許第５，０５７，４２０号に記載される。分化又は少なくとも部分的に分化したドナー細胞も使用することができる。ドナー細胞はさらに、そうである必要はないが、培養物中にあることができ、休止状態であることができる。休止状態の核ドナー細胞は、休止状態に入るために誘導され得るか、又はインビボで休止状態で存在するために誘導され得る細胞である。従来の方法はさらに、クローニング手順において胚細胞種を使用していた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８，１９９６）及びＳｔｉｃｅ，ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２０  ５４：１００−１１０，１９９６）。
【０２１２】
核ドナー体細胞は、種々の異なる臓器及び組織、例えば、限定されないが、皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、及び胚、胎児又は成体動物の全部又は一部の非骨格調製物から得られてもよい。本発明の適切な実施形態では、核ドナー細胞は、上皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞、ケラチン合成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴ）、マクロファージ、単核球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、粒状細胞、卵丘細胞、表皮細胞又は血管内皮細胞からなる群から選択される。別の実施形態では、核細胞は、胚幹細胞である。好ましい実施形態では、繊維芽細胞をドナー細胞として使用することができる。
【０２１３】
本発明の別の実施形態では、本発明の核ドナー細胞は、動物の生殖細胞である。胚、胎児、又は成人期の段階の動物種の任意の生殖細胞が、核ドナー細胞として使われてもよい。適切な実施形態では、核ドナー細胞は胚生殖細胞である。
【０２１４】
核ドナー細胞は、細胞サイクルの任意の段階（ＧＯ、ＧＩ、Ｇ２、Ｓ、Ｍ）で停止されてもよい。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して細胞サイクルの段階を操作してもよい。細胞サイクルの段階を制御するための方法としては、限定されないが、培養された細胞の接触阻害によって誘導されるＧＯ休止状態、血清又は他の必須栄養分の除去により誘導されるＧＯ休止状態、老化によって誘導されるＧＯ休止状態、特定の増殖因子の添加によって誘導されるＧＯ休止状態、又は物理的手段又は科学的手段、例えば、熱ショック、高気圧、又は化学物質、ホルモン、増殖因子又は他の基質を用いた他の処置により誘導されるＧＯ又はＧＩ休止状態；いずれかと相互作用する化学薬剤を用いる処置を介するＳ段階制御が挙げられる。複製手順の点；蛍光励起細胞分離捕集装置を用いた選択を介するＭ段階制御、有糸分裂の進行の崩壊、微小管破壊剤又は有糸分裂の進行を破壊する任意の化学物質を用いた処置（さらに、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ，．「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｍｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）を参照）。
【０２１５】
卵母細胞を単離するための方法は当該技術分野で周知である。例えば、卵母細胞は、卵巣又は動物の生殖管から単離することができる。動物の卵母細胞の容易に入手可能な供給源は、屠殺場材料である。遺伝子操作、核移植及びクローニングのような技術を組み合わせるために、卵母細胞は、これらの細胞を核移植のための受容体細胞として使用することができる前に、及び精子細胞によって受精してそれらが胚に成長する前に、一般的にインビボで成熟させなければならない。このプロセスは、一般的に、哺乳動物の卵巣（例えば屠殺場で得られたウシ卵巣）から未成熟な（前期Ｉ）卵母細胞を集め、受精又は核摘出の前に、卵母細胞が中期ＩＩ段階に達するまで卵母細胞を成熟培地中で成熟させることを必要とし、ウシ卵母細胞の場合には、一般的に、約１８〜２４時間後の吸引を生じる。この時間は、「成熟時間」として知られている。
【０２１６】
中期ＩＩ段階の卵母細胞は受容体卵母細胞であることができ、この段階で、卵母細胞は受精する精子として導入された核を処置するためのものであるか、又は十分に「活性化」されていると考えられている。インビボで成熟した中期ＩＩ段階の卵母細胞は、核移植技術において首尾よく使用された。本質的に、成熟中期ＩＩ卵母細胞は、発情期の発症を３５〜４８時間又は３９〜４１時間過ぎ、又はヒトじゅう毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）又は類似のホルモンを注射した３５〜４８時間又は３９〜４１時間後の、過剰排卵していないか又は過剰排卵しているブタから外科的に集めることができる。
【０２１７】
約１０〜４０時間、好ましくは約１６〜１８時間の範囲の固定された時間の成熟期間の後、卵母細胞を摘出することができる。摘出の前に、卵母細胞は、除去され、核摘出の前に、１ミリリットルあたり１ミリグラムのヒアルロニダーゼを含有するＨＥＣＭのような適切な培地中に置くことができる。取り除かれた卵母細胞は極体のためにスクリーニングすることができ、極体の存在によって決定されるような選択された中期ＩＩの卵母細胞は、核移植のために使用される。次いで核を摘出する。
【０２１８】
核摘出は、米国特許第４，９９４，３８４号に記載されるような既知の方法によって行なうことができる。例えば、中期ＩＩの卵母細胞は、迅速な核摘出のためにＨＥＣＭ、場合により１ミリリットルあたり７．５マイクログラムのサイトカラシンＢを含有するＨＥＣＭ中に置かれるか、又は、適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ及び１０％発情期ウシ血清のような胚培地）中に置くことができ、その後、好ましくは４２時間を越えない時間で、さらに好ましくは１６〜１８時間後に核摘出される。核摘出は、極体及び隣接した細胞原形質を除去するためにマイクロピペットを使用して、精密に外科的に達成されることができる。次いで、卵母細胞をスクリーニングして、首尾よく核摘出される卵母細胞を同定する。卵母細胞をスクリーニングするための１つの様式は、ＨＥＣＭ１ミリリットルあたり１マイクログラムの３３３４２Ｈｏｅｃｈｓｔ染料を用いて卵母細胞を染色し、１０秒未満の紫外線照射下で卵母細胞を視覚化することである。首尾よく核摘出された卵母細胞は、適切な培地、例えば、ＣＲ１ａａ及び１０％血清中に置くことができる。
【０２１９】
核摘出される卵母細胞と同じ種の１個の哺乳動物細胞を、ＮＴユニットを産生するために使用される摘出された卵母細胞の囲卵腔に移すことができる。哺乳動物細胞及び核摘出された卵母細胞を使用して、当該技術分野で既知の方法に従ってＮＴユニットを産生することができる。例えば、細胞を電気的融合によって融合することができる。電気的融合は、形質膜の一時的な破壊を生じるのに十分な電気のパルスを提供することによって達成される。膜が迅速に再形成されるため、形質膜のこの破壊は非常に短い。このように、２つの隣接した膜が誘発されて破壊し、脂質二層の再形成の際に、小さなチャネルを２つの細胞間に開けることができる。このような小さな開口部の熱力学的不安定性に起因して、２つの細胞が１つになるまで開口部が拡大する。例えば、Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第４，９９７，３８４号参照。種々の電気的融合の媒体、例えば、ショ糖、マンニトール、ソルビトール及びリン酸緩衝溶液を使用することができる。融合はさらに、融合剤としてＳｅｎｄａｉウイルスを使用して達成することができる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ  Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９，１９６９）。また、核は、エレクトロポレーション融合を用いるよりも、直接卵母細胞に注入することができる。例えば、Ｃｏｌｌａｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）参照。融合の後に、得られた融合ＮＴユニットを活性化するまで適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ培地）に置く。典型的な活性化は、あまり長く経過しないうちに行なうことができる（例えば、２４時間たたない後、又は約４〜９時間後）。
【０２２０】
ＮＴ単位は、所望な結果を達成する任意の方法によって活性化することができる。このような方法としては、例えば、ＮＴユニットを生理学的温度に近い温度で培養すること、本質的には冷たい、又は実際に冷たい温度のショックをＮＴユニットに与えることが挙げられる。このことは、胚が通常さらされる生理学的温度条件と比較して冷たい、室温でＮＴユニットを培養することによって最も簡便になすことができる。あるいは、活性化は、既知の活性化剤の適用によって達成することができる。例えば、受精中の精液による卵母細胞への浸透は、核移植の後で、生存可能な妊娠及び複数の遺伝的に同一な動物（例えばブタ）をより多く生じるために融合前の卵母細胞を活性化することが示された。また、電気的ショック及び化学的ショックのような処置を使用して、融合後のＮＴ胚を活性化することができる。例えば、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ，ｅｔ  ａｌらに対する米国特許第５，４９６，７２０号を参照。さらに、活性化は、卵母細胞中の二価カチオンのレベルを増加させ、卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化を減らすことによって、同時又は連続的に行なうことができる。このことは、一般的に、卵母細胞の細胞原形質に二価カチオン（例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム又はカルシウム）を例えばイオノフォアの形態で導入することによって行なうことができる。二価カチオンのレベルを増加する他の方法としては、電気ショックの使用、エタノールを用いた処理、及びかご型キレーターを用いた処理が挙げられる。リン酸化は、既知の方法、例えば、キナーゼインヒビター（例えばセリンスレオニンキナーゼインヒビター、例えば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン及びスフィンゴシン）の添加によって減らすことができる。あるいは、細胞タンパク質のリン酸化は、卵母細胞へのホスファターゼ（例えば、ホスファターゼ２Ａ及びホスファターゼＢ）の導入によって阻害することができる。
【０２２１】
活性化されたＮＴユニットを、細胞コロニーが生成するまで適切なインビトロ培地中で培養することができる。胚を培養し、成熟させるために適切な培地は当該技術分野で周知である。胚培養及び維持のために使用可能な既知の媒体の例としては、ＨａｍのＦ−１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、組織培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、タイロード−アルブミン−ラクテート−ピルベート（ＴＡＬＰ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ及びＷｈｉｔｔｅｎの培地が挙げられる。
【０２２２】
その後、培養されたＮＴユニットを洗浄し、好ましくは適切な集密的な供給層を含有するウェルプレート中に含有される適切な培地中に置くことができる。適切な供給層としては、例として、繊維芽細胞及び上皮細胞が挙げられる。ＮＴユニットは、ＮＴユニットが受容体のメスに移すのに適切なサイズに到達するまで、又は細胞コロニーを産生するために使用可能な細胞を得るために、供給層の上で培養される。好ましくは、これらのＮＴユニットは、少なくとも約２〜４００細胞、さらに好ましくは約４〜１２８細胞、最も好ましくは少なくとも約５０細胞になるまで培養することができる。
【０２２３】
活性化されたＮＴユニットは、メスの動物の卵管へ移される（胚移植される）ことができる。一実施形態では、メスの動物は、発情期に同調させられた受容体メスブタであることができる。品種間交雑したブタ（ラージホワイト／Ｄｕｒｏｃ／Ｌａｎｄｒａｃｅ）（２８０〜４００ｌｂｓ）を使用することができる。餌と混合した１８〜２０ｍｇのＲｅｇｕＭａｔｅ（Ａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔ，Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）を経口投与することによってブタを受容体動物として同調させることができる。Ｒｅｇｕ−Ｍａｔｅを１４日間連続して与えることができる。じゅう毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ，Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）１０００ユニットを、最後のＲｅｇｕ−Ｍａｔｅ処置の約１０５時間後に筋肉内投与することができる。ｈＣＧ注射の約２２〜２６時間後に、胚の移動を行なうことができる。一実施形態では、妊娠は、期限までにもたらされ、子供が誕生し得る。別の実施形態では、妊娠は５早く終わらすことができ、胚細胞を収穫することができる。
【０２２４】
本発明における胚移動及び受容体動物の管理のための方法は、胚移植産業において使用される標準的な手段である。同調性移植は、本発明の成功のために重要であり、すなわち、ＮＴ胚の段階は、受容体のメスの発情周期と同調状態にある。例えば、Ｓｉｅｄｅｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｊｒ．「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｗｉｔｉｉ  ｃａｔｔｌｅ」  ｉｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（１９８１）Ｌ．Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｂｉｇｇｅｒｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅ  ３２３を参照。
【０２２５】
（遺伝的に改変された動物を産生するための他の方法）
本発明のさらなる実施形態では、トランスジェニック動物は、当該技術分野で任意の手段によって産生することができ、この任意の手段としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：卵母細胞、受精卵又は未着床割球（例えば、２細胞、４細胞又は８細胞の未着床割球）へのＤＮＡのマイクロインジェクション、胚幹細胞のトランスフェクション、精子により媒介されるＤＮＡの移動及び血流を経るインビボでの胚のトランスフェクション。
【０２２６】
一実施形態では、本発明は、全能胚細胞の遺伝的改変を経る、少なくとも２つの干渉ＲＮＡを発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。一実施形態では、動物は、以下の工程によって産生することができる：（ａ）動物において１つ以上の標的核酸配列を同定する工程；（ｂ）標的核酸配列に結合する１つ以上の干渉ＲＮＡを調製する工程；（ｃ）１つ以上の干渉ＲＮＡを含有する１つ以上の発現ベクターを調製する工程；（ｄ）１つ以上の干渉ＲＮＡ発現ベクターを動物種の複数の全能細胞のゲノムに挿入し、複数のトランスジェニック全能細胞を産生する工程；（ｅ）動物種の４倍体の胚盤胞を得る工程；（ｆ）複数の全能細胞を４倍体の胚盤胞に挿入し、トランスジェニック胚を産生する工程；（ｇ）この胚を受容体のメス動物に移す工程；及び（ｈ）胚を期限までメス動物中で成長させる工程。トランスジェニック動物（例えばマウス）を生成させるためのここで記載されるトランスジェニック動物産生の方法は、米国特許第６，４９２，５７５号にさらに記載される。
【０２２７】
別の実施形態では、全能細胞は胚幹（ＥＳ）細胞であることができる。胚盤胞からのＥＳ細胞の単離、ＥＳ細胞株及びそれらの後に続く培養を確立することは、例えば、Ｄｏｅｔｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７：２７−４５（１９８５）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６９：９１５−９２６（１９９２）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．「Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）；Ｗｕｒｓｔ  ａｎｄ  Ｊｏｙｎｅｒ，「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ｅｄ．Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；Ｈｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｅｄｓ．Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）；ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：７４１−７４４  （１９９２）に記載されるような従来の方法によって行なわれる。
【０２２８】
本発明のさらなる実施形態では、全能細胞は、胚細菌（ＥＧ）細胞であることができる。胚細菌細胞は、ＥＳ細胞と機能的に等価な未分化の細胞であり、それらはインビトロで培養され、トランスフェクトされ、キメラの体細胞及び生殖細胞の系統に関与する（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．１６１：６２６−６２８（１９９４））。ＥＧ細胞は、以下の増殖因子の組合せとともに、原始生殖細胞、生殖体の前駆体の培養によって分割される：白血病抑制因子、スティール因子（ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１−８４７（１９９２）；Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５５０−５５１（１９９２））。ＥＧ細胞の培養は、例えば、Ｄｏｎｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」，Ｅｄ．Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９７）に記載されるような当業者に既知の方法を用いて行なうことができる。
【０２２９】
本発明において使用するための四倍体胚盤胞は、天然受精卵産生及び成長によって得ることができるか、又は、例えば、Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．Ｃａｍｂ．６０：１８５−１９４（１９９２）；Ｎａｇｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ｅｄ．Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；又はＫｕｂｉａｋ  ａｎｄ  Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５７：５６１−５６６（１９８５）に記載されるように、２つの細胞の胚を電気的融合し、培養する既知の方法によって得ることができる。
【０２３０】
胚盤胞へのＥＳ細胞又はＥＧ細胞の導入は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２４３７−２４５０（１９９１）によって記載されるような、当該技術分野で既知の任意の方法によって行なうことができる。
【０２３１】
「複数」の全能細胞は、１つより多い任意の数の細胞を包含することができる。例えば、本発明において使用するための全能細胞の数は、約２〜約３０細胞、約５〜約２０細胞、又は約５〜約１０細胞であることができる。一実施形態では、１個の細胞懸濁液から採取された約５〜１０のＥＳ細胞は、マイクロ操作装置においてホールディングピペットによって固定された胚盤胞に注入される。次いで、当該技術分野で既知の方法を経てメス受容体動物に導入する前に、胚を少なくとも３時間、可能な場合は一晩インキュベートする（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）参照）。次いで、胚をメス動物中で期限どおりに成長させることができる。
【０２３２】
本発明の一実施形態では、トランスジェニック動物を産生する方法は、核移植、胚生成、又は当該技術分野で知られる他の方法を利用するか否かにかかわらず、ｉＲＮＡ分子を移すために使用される発現ベクターの顕著なフラグメントを含有しないゲノムを含むトランスジェニック動物を生じる。発現ベクターの「顕著なフラグメント」との用語は、本明細書中で使用される場合、発現ベクターの元々の全核酸配列の約１０％〜約１００％を含む発現ベクターの量を示す。これは、トランスジェニック動物のゲノムに移されたｉＲＮＡ挿入部分を排除する。それ故に、例えば、ｉＲＮＡを移すために使用される発現ベクターの顕著なフラグメントを含有しないトランスジェニック動物のゲノムは、ｉＲＮＡを含有する配列の外側に、発現ベクターのフラグメントを含有することができない。同様に、ｉＲＮＡを移すために使用される発現ベクターの顕著なフラグメントを含有しないトランスジェニック動物のゲノムは、ｉＲＮＡを含有する配列の外側に、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％の発現ベクターを含有することができる。顕著ではないフラグメントに移される発現ベクターの量を制限しつつ、ｉＲＮＡ配列のゲノムへの移動を可能にする任意の方法は、本発明の方法において使用することができる。
【０２３３】
顕著ではないフラグメントに移される発現ベクターの量を制限しつつ、ｉＲＮＡ配列のゲノムへの移動を可能にする本発明の一実施形態は、組換えクローニング方法であり、例えば、米国特許第５，８８８，７３２及び６，２７７，６０８を参照。
【０２３４】
組換えクローニング（例えば、米国特許第５，８８８，７３２及び６，２７７，６０８を参照）は、少なくとも１つの組換え部位と、少なくとも１つの組換えタンパク質を用いてキメラＤＮＡ分子を提供する、核酸セグメントを移動又は交換するための方法を記載する。ｉＲＮＡ発現ベクターを産生するための本発明の方法において有用なこれらのキメラ分子を産生する１つの方法は、以下の工程を含む：（ａ）第１の組換え部位及び第２の組換え部位によってフランキングされ、第１及び第２の組換え部位は互いに実質的に組み合わさらない、本発明の１つ以上のｉＲＮＡ配列を含む１つ以上の核酸分子；（ｂ）第３の組換え部位及び第４の組換え部位を含み、第３及び第４の組換え部位は互いに実質的に組み合わさらない、１つ以上の発現ベクター分子；及び（ｃ）第１及び第３の組換え部位及び／又は第２及び第４の組換え部位を組換え可能な１つ以上の部位特異的な組換えタンパク質をインビトロ又はインビボで組み合わせ、組換えを行い、１つ以上のｉＲＮＡ配列を含む少なくとも１つの共挿入した核酸分子を産生する工程。
【０２３５】
本発明の方法において使用するための組換え部位及び組換えタンパク質としては、限定されないが、米国特許第５，８８８，７３２号及び同第６，２７７，６０８号に記載されるような、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、インテグラーゼ（λＩｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦ及びＦＩＳ）／ａｔｔ部位（ａｒｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ）、及びＦＬＰ／ＦＲＴが挙げられる。部位特異的なレコンビナーゼの第２のファミリーのメンバーであるレゾルバーゼファミリー（例えば、ｇｄ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、及びＣｉｎ）もさらに知られており、本発明の方法において使用することができる。レコンビナーゼのこの非常に関連したファミリーのメンバーは、典型的には、分子内反応（例えば、逆転及び切除）に拘束され、宿主をコードする因子を必要とする場合がある。分子内組換えのいくつかの制限とともに、宿主因子のいくつかの必要条件を緩和する変異体が単離された（Ｍａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｈｎｍａｎｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６（１９９１））。
【０２３６】
当該技術分野で知られ、当業者によく知られたλＩｎｔ及びＰ１  Ｃｒｅと類似の他の部位特異的なレコンビナーゼは、Ｉｎｔ及びＣｒｅと置換することができる。多くの場合には、このような他のレコンビナーゼの精製は、当該技術分野で記載されている。これらが知られていない場合には、細胞抽出物を使用することができるか、又はＣｒｅ及びＩｎｔについて記載される手順を用いて酵素を部分的に精製することができる。
【０２３７】
酵素のファミリーであるトランスポサーゼはさらに、レプリコン間で遺伝情報を移すために使用されており、ｉＲＮＡを移すための本発明の方法において使用することができる。トランスポゾンは構造的に変動するが、単純なもの又は化合物として記載されているが、典型的には、逆配向に組織化されるＤＮＡ配列によってフランキングされるレコンビナーゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組み込みは、ランダムであるか、又は非常に特異的であることができる。例えばＴｎ７のような代表例（非常に部位特異的である）は、インビボでレプリコン間のＤＮＡセグメントの移動に適用されている（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））。例えば、Ｄｅｖｉｎｅ及びＢｏｅｋｅ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２（１９９４））は、インビトロでのＤＮＡセグメントの受容体ＤＮＡ分子への挿入のための人工的なトランスポゾンの構築を開示する。このシステムは、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。目的の核酸セグメントは、標準的な方法を用いてトランスポゾン様要素ＴＹ１の末端間にクローン化される。ＴＹ１インテグラーゼの存在下で、得られた要素は、第２の標的ＤＮＡ分子へとランダムに組み込まれる。
【０２３８】
例えば、米国特許第５，８８８，７３２号、６，２７７，６０８号及び６，１４３，５５７号に記載されるような、さらなる組換え部位及び組換えタンパク質、及び変異体、改変体及びそれらの誘導体は、本発明の方法においても使用することができる。
【０２３９】
組換えタンパク質によってフランキングされる１つ以上のｉＲＮＡ分子を含有する発現ベクターの産生の後、ｉＲＮＡ核酸配列は、組換えクローニングを経て標的細胞のゲノムへと移すことができる。この実施形態では、ｉＲＮＡをフランキングする組換えタンパク質は、標的細胞のゲノム中の１つ以上の組換えタンパク質と組換え可能である。組換え部位を組換えることが可能な１つ以上の部位特異的な組換えタンパク質と組み合わせて、ｉＲＮＡ配列は、標的細胞のゲノムに対して残存する顕著な量の発現ベクターを移すことなく、標的細胞のゲノムに移される。標的細胞のゲノム中の組換え部位は、天然に生じることができるか、又は、組換え部位は、当該技術分野で既知の任意の方法によってゲノムへと導入することができる。いずれかの場合では、発現ベクター中で１つ以上のｉＲＮＡ配列をフランキングする組換え部位は、組換えクローニングを可能にするために標的細胞のゲノム中の組換え部位に対して相補性でなければならない。
【０２４０】
本発明の別の実施形態は、本発明の方法のいずれか１つによって産生されるオス及びメスの非ヒトトランスジェニック動物をかけあわせてさらなるトランスジェニック又はキメラ動物の子孫を産生する工程を含む、非ヒトトランスジェニック動物又はキメラ動物を産生するための方法に関する。そのゲノム中に１つ以上のｉＲＮＡを両方含有するトランスジェニックオス及びメス動物をかけあわせることによって、このかけあわせによって産生される子孫はさらに、そのゲノム中にｉＲＮＡを含有する。このかけあわせパターンを所望な回数だけ繰り返すことができる。
【０２４１】
別の実施形態では、本発明の方法によって産生されるオス又はメスの非ヒトトランスジェニック動物は、それぞれメス又はオスの動物とかけあわせることができ、このかけあわせに関与する第２のメス又はオスの動物は、本発明の方法によって産生される非ヒト動物ではない。ｉＲＮＡが天然では優勢であるため、これらのかけあわせからの子孫はさらに、このゲノム中でｉＲＮＡを発現することができる。少なくとも１つの動物が本発明の非ヒトトランスジェニック動物であるかけあわせにより、それらのゲノム中にｉＲＮＡ配列を有する子孫を生じさせることができる。別の実施形態では、本発明の方法によって産生されたオスの非ヒトトランスジェニック動物由来の精液を使用して、メス動物を妊娠させ、それらのゲノム中にｉＲＮＡ配列を含有する子孫を産生することができる。
【０２４２】
（ＶＩ．治療的使用及び薬学的組成物）
（Ａ．治療的使用）
本発明の非ヒトトランスジェニック動物はさらに、導入遺伝子から発現した治療用タンパク質のための供給源として使用することができる。
【０２４３】
一実施形態では、本発明の方法は、動物によって発現される１つ以上の内因性タンパク質の量を減らすために使用することができる。導入遺伝子発現は、このようなタンパク質の区分に分けられた単離を与えるために、特定の組織又は細胞種に対して標的化することができる。例えば、タンパク質は、乳房に特異的なプロモーター由来のタンパク質の発現を開始させることによって、トランスジェニック動物のミルク中で濃縮することができる。それに加えて、導入遺伝子は、特定の処理を可能にするために、特定の細胞種中で選択的に発現させることができる。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、家畜Ｂ−細胞におけるヒトポリクローナル抗体の組換え、発現、及び処理に指向するために使用することができる。治療タンパク質の供給源としてトランスジェニック動物を利用することに対する現在の問題点の１つは、治療設定における精製及び最終的な使用について、動物に対して内因性のタンパク質が集めた物質（すなわち、ペプチド、タンパク質、及び核酸）を汚染し得ることである。汚染するタンパク質は進化的に無関係であるが、それらは所望な産物と一緒に精製される場合がある。あるいは、汚染するタンパク質は、導入遺伝子産物の内因性相対物であることができる。いずれかの場合で、内因性遺伝子の発現における減少は、経済的及び治療的な観点から有利である。本発明の方法の１つの実施形態は、トランスジェニック動物において非キメラ、非汚染ヒトポリクローナル抗体の産生を可能にする内因性免疫グロブリンの減少である。
【０２４４】
別の局面では、本発明は、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の全てのレパートリーのノックアウト／阻害、及び動物Ｉｇ遺伝子とそれらのヒト等価物との交換を経る、非ヒトトランスジェニック動物におけるｉＲＮＡにより媒介される遺伝子調節を提供する。このストラテジーを用いて産生された遺伝的に改変された動物は、それらの血液及びミルク中で、特定の病原体又は免疫原を用いてチャレンジされる場合、完全なヒト抗体を産生することができる。以下に挙げられる一般的なヘルスケア分野におけるこの技術のための多くの適用が存在する：感染症予防、抗菌耐性感染の処置、肝炎及びＣＭＶに対する移植後ウィルス予防における免疫グロブリンのための免疫抑制状態の患者における受動的な免疫化、ＨＩＶ治療、Ｃ型肝炎に対する免疫化、ポリクローン性の抗癌剤としての抗毒物、癌診断法、自己免疫性疾患（多発性硬化症、川崎病）の処置、及びＲｈネガティブな妊婦のための抗−Ｄの産生。
【０２４５】
それに加えて、非ヒトポリクローナル抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物は、細菌戦対策における重要な適用を有し、動物は、既知の感染疾患病原体、又はそれらの産物のいずれかで免疫化され、治療として使用するための、又はＡｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅ人員の受動的免疫化のための、特異的なヒト抗体（好ましくはＩｇＧ）を産生する。動物に由来するヒトポリクローナル抗体の使用は、広範囲なスペクトルを有し、１つ又はいくつかの病原体に限られていない。任意の免疫原は、これらの動物を免疫化するために、種々の病原体（限定されないが、炭疽菌、ブドウ球菌、グラム陰性菌、エボラウィルス及びハンタウイルスが挙げられる）から予防するための抗体の産生を誘発するために使用することができる。さらなる免疫原としては、限定されないが、毒素及び細菌毒素が挙げられる。動物におけるヒト抗体の産生は、血液又はミルクから単離されるか否かに依存して与えられるが、スケールについて利点を有し、（特にブタ、ヒツジ、又はウシの使用を考慮する場合には）１年間で動物１匹あたり特定の抗体２〜５ｋｇを得ることができ、その結果、少ない数の動物が数千の患者の必要性を容易に供給することができる。これらの有機体の多くに対する抗体は、一般的に発症した人口におけるそれらの希少性に起因して、それらのビルレンス／毒性に起因してヒトにおいて任意の形態で免疫原として使用することができないため、任意の顕著な量では現在は利用不可能である。また、これらの抗体は完全にヒトであり、ウマ及びヤギにおいて現在産生されている抗血清に対して、特異性、結合活性及び効力において非常に優れている。この適用についての優先例は、マウスＥＳ細胞技術を用いて、マウスにおいて達成された。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ．ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６，（１９９７））は、Ｉｇ欠損ノックアウトマウス内でのメガベースの免疫グロブリン遺伝子座の機能的移植を示し、ヒトにおいてみられるものと非常によく似たこれらのマウスにおけるヒト抗体産生が観察された。
【０２４６】
一実施形態では、本発明の方法は、トランスジェニックウシ、ヒツジ及びブタにおけるヒトポリクローナル抗体の産生を提供する。ウシは、発現されたヒト免疫グロブリンを産生することができるが、これらのウシは、抗体のキメラ現象及び内因性抗体の汚染のために有用性が制限されている。ウシ遺伝子を不活性化するための方法は、生産性及び精製の両方の観点から非常に望ましい。本発明の方法を介するＲＮＡ干渉の適用は、比較的少ない阻害ＲＮＡを用いて、大量の特徴決定されていないゲノムＤＮＡをクローンアウトしなければならない要求もなく、非常に反復性の家畜免疫グロブリン遺伝子を不活性化／抑制することを可能にする。ヒトＩｇ遺伝子を発現したクローン化された動物は、家畜Ｉｇの非存在下で、内因性動物Ｉｇからの汚染の問題なく容易に精製されるヒトポリクローナル抗体を産生する。本発明の非ヒトトランスジェニック動物から単離された抗体を精製するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照）。
【０２４７】
一実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ分子を発現する動物から得られた、臓器、組織、及び／又は精製されているか又は実質的に純粋な細胞又は細胞株を提供する。
【０２４８】
一実施形態では、本発明は、臓器を提供し、限定されないが、以下に挙げられる任意の臓器を使用することができる：脳、心臓、肺、腺、脳、目、胃、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、髪、爪、耳、鼻、口、唇、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、幽門、甲状腺、胸腺、副腎、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節及びリンパ管。
【０２４９】
別の実施形態では、本発明は組織を提供する。限定されないが、以下に挙げられる任意の組織を使用することができる：上皮、結合組織、血液、骨、軟骨、筋肉、神経、アデノイド、脂肪、乳輪、骨、褐色脂肪、海綿状、褐色筋肉、軟骨性（ｃａｒｔａｇｉｎｏｕｓ）、洞穴状、軟骨、クロム親和体、上皮、脂肪質、線維ヒアリン、繊維、Ｇａｍｇｅｅ、ゼリー状、造粒、消化管関連リンパ、Ｈａｌｌｅｒの脈管、硬質造血、未分化、介在性、被覆、骨髄性、小島、リンパ、リンパ球系、間葉、中腎、粘液の結合、多室の脂肪、脊髄、軟組織、鼻根点、結節、骨、骨形成、骨状、歯根尖端周囲、細網状、網様、ゴム状、骨格筋、平滑筋及び皮下組織。
【０２５０】
さらなる実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ分子を発現する動物由来の細胞及び細胞株を提供する。一実施形態では、これらの細胞又は細胞株は、異種移植に使用することができる。限定されないが、以下に挙げられる任意の組織又は臓器由来の細胞を使用することができる：上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン合成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単核球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、血管内皮細胞、ランゲルハンス細胞島、膵臓インスリン分泌細胞、膵臓α−２細胞、膵臓β細胞、膵臓α−１細胞、血液細胞、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、ニューロンの幹細胞、原始幹細胞、肝細胞、ケラチン合成細胞、臍状の静脈内皮細胞、大動脈の血管内皮細胞、微小血管血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝臓星状細胞、大動脈の平滑筋細胞、心臓ミオサイト、神経単位、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞及び上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単核細胞、好酸球性、好塩基、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺の細胞、甲状腺傍の細胞、耳下腺の細胞、腫瘍細胞、こう細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体の細胞、副腎の細胞、有毛細胞、ブラッダーセル、腎臓細胞、網膜細胞、かん体細胞、錐体細胞、心臓の細胞、ペースメーカ細胞、ひ細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、プラズマ細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、ちつ上皮細胞、精子、精巣の細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、管周細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、けい部細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、ろ胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角質化した上皮細胞、肺細胞、杯状細胞、欄型表示上皮細胞、ドーパミエルジック細胞（ｄｏｐａｍｉｅｒｇｉｃ  ｃｅｌｌ）、鱗片状の上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、繊維芽細胞及び胎児の繊維芽細胞。特定の実施形態では、α−１，３−ＧＴを発現しないランゲルハンス細胞、インスリン分泌細胞、α−２細胞、β細胞、ブタ由来のα−１細胞を含むが、これらに限定されない膵細胞が提供される。
【０２５１】
これらの組織誘導体の酵素処理又は化学処理による生存可能な細胞が除去された組織を含む生育不可能な誘導体は、移植における使用の前に架橋又は他の化学処理を経てさらに加工することができる。一実施形態では、誘導体は、種々の組織（皮膚、尿、膀胱）又は臓器粘膜下組織から誘導される細胞外マトリックスを含む。また、心臓弁及び他の成育不能の組織を含むために生存可能な組織が除去された腱、ジョイント及び骨が提供される。
【０２５２】
細胞は、多種多様な様式で宿主に投与することができる。投与様式は、腸管外、腹腔内、静脈内、内皮、硬膜外麻酔、髄腔内、胸骨内で、関節腔内、滑液包内、クモ膜下、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、皮下、眼窩内、嚢内、局所、経皮パッチ、直腸、膣又は尿道の投与を経るもの（坐剤を経る）、経皮、鼻スプレー、外科用移植材料、内部外科的塗料、インフュージョンポンプを経る投与、又はカテーテルを経る投与である。一実施形態では、薬剤及びキャリアは、持続放出性処方物において投与される（例えば、直接の組織注射、又はボーラス、インプラント、ミクロ粒子、微小球、ナノ粒子又はナノ小球）。
【０２５３】
開示された細胞の注入によって処置され得る障害としては、限定されないが、通常の血液細胞産生及び成熟の不全の失敗から生じる疾患（すなわち、再生不良性貧血及び過剰増殖性幹細胞障害）；造血器官（例えば白血病及びリンパ腫）の腫瘍性の、悪性疾患；非造血起源の広域抗菌スペクトル悪性充実性腫瘍；自己免疫状態；及び遺伝障害が挙げられる。このような障害としては、限定されないが、薬、放射又は感染性、特発性に起因する再生不良性貧血、はん血球減少症、無顆粒球症、血小板減少症、赤血球形成不全、Ｂｌａｃｋｆａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ症候群を含む通常の血液細胞生産及び成熟し過剰増殖した幹細胞障害の失敗又は機能不全から生じる疾患；急性のリンパ芽球性（リンパ性）白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性の悪性骨髄硬化症、多発性骨髄腫、真性多血症、原因不明の骨髄様化生、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍのマクログロブリン血症、Ｈｏｄｇｋｉｎのリンパ腫、非Ｈｏｄｇｋｉｎのリンパ腫を含む造血悪性；、胃癌、卵巣悪性腫瘍、乳癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、精巣の癌、神経グリア芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、Ｓｗｉｎｇの肉腫、リンパ腫を含む、悪性の固体腫瘍を有する患者における免疫抑制；自己免疫性疾患を含む慢性関節リウマチ、糖尿病Ｉ形、慢性肝炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス；貧血症、家族的な形成不全、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏、ギ酸アミノトランスフェラーゼ欠乏、レッシューナイハン症候群、先天性異常赤血球産生症症候群Ｉ〜ＩＶ、Ｃｈｗａｃｈｍａｎｎ−ダイアモンド症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏、ギ酸アミノトランスフェラーゼ欠乏、レッシューナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天性楕円赤血球症、先天性ストマトサイト増多症、先天性Ｒｈヌル病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）改変体１、２、３、ピルベートキナーゼ欠乏、先天的なＥＰＯ感度、欠乏症、鎌状赤血球症及び特徴、サラセミアα、β、γ、メトヘモグロビン血症、免疫、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、裸のリンパ球症候群、イオノフォア応答性複合型免疫欠損、キャッピング異常を有する複合型免疫欠損、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠乏、幼児の顆粒球アクチン欠乏の先天性障害、無顆粒球症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠損、Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群、細網異形成症、先天性白血球機能不全症候群を含む遺伝子的な（先天的な）障害；及び他のもの（例えば骨粗鬆症、骨髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全、一次性又は二次免疫不全を引き起こしている伝染性障害、細菌感染症（例えばＢｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｏｓｉｓ、結核、癩）、寄生虫感染症（例えばマラリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）、真菌感染、不均衡なリンパ細胞セットが関与する障害、及び老化による障害性の免疫不全、食細胞障害、Ｋｏｓｔｍａｎｎの無顆粒球症、慢性肉芽腫症、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｃｈｉ症候群、好中性のアクチン欠乏、好中性の膜ＧＰ−１８０欠乏、代謝蓄積症、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、免疫機構を含んでいる雑多な障害、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｙｎｄｒｏｍ���、α１−アンチリプシン欠乏などが挙げられる。
【０２５４】
疾患又は病理学としては、神経変性疾患、肝変性疾患、腎変性疾患、脊髄損傷、頭部外傷又は手術、組織、臓器又は腺退化から生じるウイルス感染が挙げられる。このような真剣変性疾患としては、限定されないが、ＡＩＤＳ痴呆合併症；脱髄疾患（ｄｅｍｙｅｌｉｒｉａｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えば多発性硬化症及び急性のトランスフェラーゼ脊髄炎；錐体外路の及び小脳の障害（例えばｅｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌシステムの病変）；基底神経節又は小脳の障害の障害；多動の運動障害（例えばハンチントンのＣｈｏｒｅａ及び老人舞踏病）；薬物により誘発される運動障害、例えば、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬によって誘導される障害；減動性運動障害、例えばパーキンソン病；漸進性の前掲の核麻痺；小脳の構造病変；脊髄小脳変性症、例えば脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調、小脳の皮質の退化、並列式退化（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性障害、例えば、Ｒｕｆｓｕｍ疾患、ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｍｉａ、運動失調症、末梢血管拡張症；及びミトコンドリア多システム障害；脱髄性中心性障害、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；及び運動単位、例えば、神経形成性筋肉萎縮症（例えば、前角細胞退化、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄筋萎縮及び若年性脊髄筋肉萎縮症）の障害；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｌｅｗｙ身体疾患；Ｌｅｗｙ体型の老人性Ｄｅｍｅｔｉａ；パーキンソン病、ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性萎縮性脳炎Ｈａｌｌｅｒｒｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ疾患；及びＤｅｍｅｎｔｉａ  ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａが挙げられる。例えば、Ｂｅｒｆｃｏｗ  ｅｔ．  ａｌ，（ｅｄｓ．）（１９８７），Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，（１５ｔｈ）ｅｄ．），Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪを参照。
【０２５５】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、任意の種類の化合物（例えば抗生物質、抗菌類、抗ウイルス性、化学療法剤、心臓血管薬及びホルモン類）をスクリーニングするために使用することができる。本発明の動物を用いることによってスクリーニング可能な化合物は、低分子又は生体物質（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸）であることができる。試験される化合物は、当該技術分野で既知の任意の送達ルート（例えば、限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射）を経て、経口、舌下、皮下、くも膜下腔内、眼球内、直腸、及び経皮を経て本発明の動物に導入することができる。
【０２５６】
１つ以上の化合物の活性は、動物の細胞の１つ以上の生物学的応答又は生理学的応答を測定することによって決定することができる。例えば、スクリーニングされる（「処置される」）１つ以上の化合物と接触した細胞又は動物は、１つ以上の不活性化合物（すなわち、プラセボ又は他のコントロール処置）と接触した「コントロール」細胞又は動物と比較される。次いで、１つ以上の化合物に対する細胞又は動物の応答を測定し、コントロールと処置したサンプルとの間の比較を行い、１つ以上の化合物も治療有効性を決定する。
【０２５７】
細胞中で産生される標的ｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定することによって、１つ以上の化合物の活性を評価することができる。「処置された」細胞及び「コントロール」細胞サンプルを分析することによって、コントロールサンプルの治療有効性を超えて、上でスクリーニングされた１つ以上の化合物の治療有効性を決定するための定量比較が可能になる。あるいは、標的タンパク質及び非標的タンパク質、細胞、組織又は臓器の両方に関連する化合物の量を測定することができ、コントロール又は処置された細胞又は動物の１つ以上の化合物の薬動力学的プロフィールを決定するために比較することができる。細胞においてｍＲＮＡ及びタンパク質の量を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照）。
【０２５８】
１つ以上の化合物の治療有効性を決定するために測定可能な細胞又は動物の生物学的応答の例としては、限定されないが、炎症、活性酸素種の生成、溶菌、細胞死、免疫応答（すなわち抗体産生）、タンパク質産生が挙げられる。
【０２５９】
１つ以上の化合物の治療有効性を決定するために測定可能な細胞又は動物の生理学的応答の例としては、限定されないが、温度変化、ｐＨ変化、酸素濃度、グルコース濃度、血流、電気生理学性質が挙げられる。
【０２６０】
生物学的応答及び生理学的応答は、当該技術分野で周知の方法によって決定される。限定されないが、分光分析、当該技術分野で既知のマーカー染料及びプローブを利用する顕微鏡による視覚化又は他の視覚化、装置によるモニタリング（すなわち、温度、ｐＨ、血圧、血流、電気的測定）が挙げられる。
【０２６１】
用語「治療的に有効な」は、陽性の形態で疾患又は障害を患う化合物又は組成物が細胞又は動物に影響を与える活性、及び／又は陰性の形態で病原体又は寄生虫に影響を与える活性を有することを示す。このように、治療的に有効な化合物は、病原体又は寄生虫の増殖及び／又は維持に対して悪影響を与える動物内で、又は異常増殖又は生化学的特徴を有する動物の細胞、組織又は臓器（例えば、癌細胞）（内）で、生物学的活性又は生化学的活性を生じるか又は促進することができる。あるいは、治療的に有効な化合物は、細胞又は動物の増殖及び／又は維持に有益な細胞又は動物内で生物学的活性又は生化学的活性を生じるか又は促進することによって、細胞又は動物に陽性の形態で影響を与えることができる。治療的に有効な化合物が陽性の様式で（又は陰性の様式で病原体又は寄生虫に）影響を与えるか否か（又はどの程度まで影響を与えるか）は、種々の生物学的又は生化学的な特徴又は機能の当該技術分野で知られるアッセイを用いることによって、処置された細胞又は動物において観察される与えられた生物学的又は生化学的な特徴又は機能のレベルを試験し、そのレベルを、未処理のコントロール細胞又は動物において観察される同じ生物学的又は生化学的特徴又は機能のレベルと比較することによって決定することができる。処置された細胞又は動物において、コントロール細胞又は動物において観察されたものとは定量的に区別できる量によって、試験される生物学的又は生化学的特徴又は機能における変化を誘発する任意の化合物又は組成物は、「治療的に有効な」といわれる。定量的に区別可能な量は、治療的な有効性を決定するために使用される方法又は測定に関連する標準的な実験エラーを超える任意の量である。例えば、試験された化合物又は組成物が治療的に有効であることを示す定量的に区別可能な量は、コントロール細胞又は動物におけるアッセイされた特徴又は機能のレベルに対して、約１％、約５％、約１０％、約３３％、約５０％、約６７％、約７５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の処置された細胞又は動物におけるアッセイされた特徴又は機能における差である。
【０２６２】
本発明の１つのこのような実施形態では、試験される１つ以上の化合物と接触されるトランスジェニック細胞は、トランスジェニック動物から除去され、維持され、培地中でアッセイすることができる。本発明のこの実施形態は、高スループットスクリーニングアプローチが化合物の治療的な有効性を評価することを可能にし、複数の異なる化合物が同じ生物学的種類又は動物種の個々の細胞で試験されることができる。同様に、１個の化合物は、１個の動物種からの多くの異なる細胞種（例えば、筋肉、骨、皮膚、神経）、又は複数の種由来の細胞で試験することができる。培地中で細胞を維持するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）及びＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ，．「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）参照）。
【０２６３】
本発明の別の実施形態は、本発明の非ヒトトランスジェニック動物に移植されるヒト腫瘍に対する治療効果について１つ以上の化合物をスクリーニングする方法であり、この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）ヒト腫瘍又はヒト腫瘍細胞をトランスジェニック動物に移植する工程；
（ｂ）ヒト腫瘍と試験される一つ以上の化合物とを接触させる工程；
（ｃ）１つ以上の化合物に対して腫瘍の１つ以上の生物学的又は生理的応答を測定する工程；及び
（ｄ）ヒト腫瘍について１つ以上の化合物の治療的有効性を決定する工程。
【０２６４】
本発明の方法のいずれか１つによって産生される任意の非ヒト動物は、腫瘍受容体として使用することができ、これらの非ヒト動物は、限定されないが、非ヒト哺乳動物（ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ウシ科の動物）、シカ、ラバ、ウマ、サル及びその他の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギを含むがこれに限られない）、鳥（鶏、シチメンチョウ、カモ、ガチョウを含むがこれに限られない）、爬虫類、魚、両生類などが挙げられる。
【０２６５】
任意のヒト腫瘍又は腫瘍細胞株は、スクリーニングの目的のために動物に移植することができる。腫瘍としては、限定されないが、乳癌腫瘍、子宮癌腫、卵嚢癌腫瘍、前立腺癌腫瘍、精巣癌腫瘍、肺癌腫瘍、白血病の腫瘍、リンパ腺腫瘍、大腸癌腫瘍、胃腸の癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、腎臓癌腫瘍、骨癌腫瘍、神経病学的癌腫瘍、頭頚部癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肉腫、アデノーマ及びミエローマが挙げられる。動物に移植される腫瘍は、固体腫瘍塊、１個の腫瘍細胞、又は複数の（すなわち、２、１０、５０、１００、１０００の）腫瘍細胞の形態であることができる。腫瘍は、動物の任意の組織又は臓器に移植することができるか、又は全身に送達することができる。腫瘍及び腫瘍細胞を動物に移植する当該技術分野で既知の任意の方法は、本発明で使用することができる。ヒト腫瘍又は腫瘍細胞は、任意の供給源から得ることができ、限定されないが、確立された細胞株、切除された原発性腫瘍組織、及び組織バンクを含む市販の／政府の／研究機関の供給源などから得ることができる。
【０２６６】
移植されたヒト腫瘍を有する本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、低分子又は整体物質（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸）をスクリーニングするために使用することができる。試験される化合物は、当該技術分野で既知の任意の送達ルート（例えば、限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射）を経て、経口、舌下、皮下、くも膜下腔内、眼球内、直腸、及び経皮を経て、本発明の動物に導入することができる。
【０２６７】
１つ以上の化合物の活性は、動物に移植されたヒト腫瘍の１つ以上の生物学的応答又は生理学的応答を測定することによって決定することができる。例えば、化合物の活性は、細胞において産生された標的ｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定することによって評価することができる。あるいは、標的タンパク質及び非標的タンパク質、細胞、組織又は臓器の両方に関連する化合物の量を測定し、比較することができる。細胞におけるｍＲＮＡ及びタンパク質の量を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。
【０２６８】
１つ以上の化合物の治療的有効性を決定するために測定可能な移植されたヒト腫瘍の生物学的応答の例としては、限定されないが、炎症、活性酸素種の生成、溶菌、免疫応答（すなわち抗体産生）、タンパク質産生などが挙げられる。
【０２６９】
１つ以上の化合物の治療的有効性を決定するために測定可能な移植されたヒト腫瘍の生理学的応答の例としては、限定されないが、温度変化、ｐＨ変化、酸素濃度、腫瘍成長、グルコース濃度、血流などが挙げられる。
【０２７０】
この内容では、用語「治療的に有効な」は、化合物が移植されたヒト腫瘍に陰性の態様で影響を与える活性を有することを示す。このように、治療的に有効な化合物は、腫瘍の増殖及び／又は維持に対して悪影響を与える動物内で生物学的活性又は生化学的活性を生じるか又は促進することができる。
【０２７１】
本発明はさらに、本発明のスクリーニング方法のいずれか１つを用いて同定される治療的に有効な化合物を提供する。このような実施形態では、化合物は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア又は腑形剤を含有することができる。本発明の方法によって提供される化合物は、コントロールと比較して区別可能な治療的有効性の任意のレベルを生じることができる。
【実施例】
【０２７２】
（実施例１：遺伝子の標的化ファミリー）
遺伝子のファミリーを特異的に標的化するために、遺伝子の所望なサブセット、又は遺伝子又は遺伝子のファミリーの特定の対立遺伝子、配列の代表的なサンプルが得られる。これらの配列は、類似性の領域を同定するために比較される。この比較は、所与の遺伝子ファミリー間、及びファミリー内の配列のサブセット内の類似性及び同一性の領域を決定する。それに加えて、この分析は、ファミリーメンバーの対立遺伝子間の類似性及び同一性の領域を決定する。これらの配列を考慮することによって、ファミリー全体、ファミリーメンバーのサブセット、個々のファミリーメンバー、個々のファミリーメンバーの対立遺伝子のサブセット、又はファミリーメンバーの個々の対立遺伝子のいずれかを標的化するために使用可能な領域を同定する。
【０２７３】
典型的な分析結果を図８に示す。この分析では、領域２は、所与の４遺伝子ファミリーの全てのメンバーを標的化することができる。同様に、領域３は、遺伝子１及び２と遺伝子３及び４を区別し、領域４は、遺伝子１及び４と遺伝子２及び３とを区別するために使用することができる。領域５は遺伝子、対立遺伝子Ａ及びＢと全ての他のファミリーメンバーとを区別するために使用することができ、一方、領域１又は領域６は、ファミリー中の任意の遺伝子の個々の対立遺伝子を特定することができる。
【０２７４】
潜在的な標的領域が同定された後、限定される必要はないが、１つ以上の潜在的な標的領域が挙げられる「リポーター」構築物（ベクター）が構築される。リポーター構築物の発現は、標的遺伝子の出力を測定することによって、又はさらなる遺伝子、例えば、蛍光リポーター、の出力（リードアウト）を測定することによって測定可能である。リポーター構築物は、細胞又は細胞産物に導入される。リポーター構築物に加えて、ｉＲＮＡ構築物は、潜在的なｉＲＮＡをコードするように組み立てられる。ｉＲＮＡ構築物は、例えば、転写のプロモーターとして役立つ配列及び試験されるｉＲＮＡ分子を表す配列を含むＤＮＡフラグメントを組み合わせることによって組み立てることができる（図５参照）。試験構築物はさらに、上述の培養された細胞に導入される、リポーター構築物リードアウトの測定は、ｉＲＮＡ分子の効力を示し、導入遺伝子が効果的なｉＲＮＡ分子をコードする場合、リポーター分子のリードアウトは変更される。リポーター遺伝子の下方調節を首尾よく提供する試験構築物は、トランスジェニック動物を産生するために単独又は組み合わせて使用されるｉＲＮＡ配列を提供する。トランスジェニック動物を産生するためにｉＲＮＡ分子を細胞に導入する方法としては、内因性又は外因性プロモーターを用いる相同組換えが挙げられる。得られた動物は、標的化された遺伝子ファミリー、所与のファミリー内の遺伝子のサブセット、個々の遺伝子、個々の遺伝子の対立遺伝子のサブセット、又は１個の遺伝子の個々の対立遺伝子の発現を減少させる。
【０２７５】
図８に示される例示的な分析では、遺伝子又は対立遺伝子ののサブセットは、サブセットのすべてのメンバーに存在する固有の標的化領域を含有しなくてもよい。このような場合では、複数の構築物は、各ｉＲＮＡ分子が、排除された標的のメンバーのいずれにも存在しない所望の標的遺伝子サブセット少なくとも１つのメンバーを特定するように使用される。それ故に、ｉＲＮＡ分子のグループは、標的の固有のサブセットを特定するが、ｉＲＮＡ転写物のグループにおける分子はどれも、所望のサブセットの全てのメンバーを標的化することができない。
【０２７６】
標的又は標的のセットに影響を与える配列を同定した後に、さらなる構築物は、標的の発現を完全に減らすために開発される。遺伝子、遺伝子のファミリー、又はファミリー内の対立遺伝子を標的化するｉＲＮＡ分子又は分子のセットの集合を提供する構築物が開発される。これらのグループ化された構築物は、複数の試験構築物の配列を組み合わせることによって開発されるか、又はｉＲＮＡの複数の複製物又はｉＲＮＡ標的化分子のグループをコードする新規構築物を組み立てることによって開発される。
【０２７７】
図８において示される例示的な分析では、垂直に切断された配列、水平に切断された配列、及び取り囲まれた領域５の配列に対して有効な試験構築物の組み合わせは、遺伝子１及び遺伝子３の全ての対立遺伝子を下方修正する。一方、グループ化された構築物のこのセットでは、領域５における水平に切断された配列を特定する構築物の脱落は、遺伝子１、対立遺伝子Ａ、及びＢ、及び遺伝子３の対立遺伝子の標的化を生じる。
【０２７８】
（実施例２−ブタ内因性レトロウイルスを阻害するためのＲＮＡ干渉の使用）
ＲＮＡ干渉は、ブタにおいて見出される、異なっているがなお相同性のレトロウイルスをコードする関連配列のファミリーの発現を遺伝的に抑制するために使用される。広く、センス及び逆アンチセンス配列を有し、ＰＥＲＶ改変体（少なくとも３つ（ＰＥＲＶ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃ）が知られている）間で保存されるブタ内因性レトロウイルスゲノムの領域に対して相同性のｉＲＮＡ分子の産生を生じる導入遺伝子が構築される。導入遺伝子は、ブタのゲノムに付加され、ｄｓＲＮＡを形成するために自己ハイブリダイズ可能なＲＮＡ分子を遺伝的に発現する遺伝株を産生する。このＲＮＡは、導入遺伝子を発現する各細胞において発現されたブタ内因性レトロウイルスの干渉を誘発する。全ＰＥＲＶ産生が非常に下方調節されるだけではなく、標的化改変体間の組換えは新規な非標的化改変体を産生し得ない。このような動物由来の細胞、組織、又は臓器は、ＰＥＲＶ伝達の減少リスクを伴う異種移植のたえに使用することができる。
【０２７９】
（ステップ１）
個々のｉＲＮＡ分子の有効性を定量化するためのアッセイが開発される。それに加えて、リポーターベクターは、ｉＲＮＡの能率的なスクリーニングを可能にするために構築され、ｉＲＮＡ発現ベクターは、個々の潜在的なｉＲＮＡをコードする配列の効率よい挿入を可能にするために組み立てられる。潜在的な標的は、標的ＰＥＲＶのファミリーの配列分析によって同定される。
【０２８０】
モデル遺伝子コントロールプラスミド：配列保存に基づいて、プライマーは設計され、細胞株ＰＫ−１５、感染性のＰＥＲＶを減らすことが知られている細胞株（Ｌｅ  Ｔｉｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、及び胎児繊維芽細胞（α１，３−ＧＴノックアウト繊維芽細胞を含む）の両方由来のｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、及びｅｎｖ配列を増幅するために使用される。各遺伝子由来の最も高度に発現されたコード領域は、モデルリポーター構築物を作るために使用される。各リポーター構築物は、リポーター分子コード領域とそのポリ（Ａ）シグナルとの間にＰＥＲＶコード配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、又はｅｎｖ）を挿入することによって組み立てられる。プラスミドは、潜在的なｉＲＮＡ標的の上流に（３’非コード領域に）リポーター遺伝子（すなわち、β−Ｇａｌ、ＧＦＰ）を有するｍＲＮＡを産生する。個々のｉＲＮＡ分子の有効性は、リポーター遺伝子発現の抑制を分析することによってアッセイされる。プロトコルはさらに、コード配列の代わりに、又はコード配列に加えて、非コードＰＥＲＶ配列を分析するために改変することができる。
【０２８１】
ｉＲＮＡ発現プラスミド：いくつかのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）依存性プロモーターが増幅され、クローン化され、トランスジェニック動物における偏在性発現のために試験される。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、末端配列（すなわち、ポリ（Ａ）テール）の付加なく、ｉＲＮＡの発現を開始させることができる。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、Ｈ１ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡＵ６、７ＳＫ、ＭＲＰ  ＲＮＡ、又は７ＳＬ由来のプロモーターを含んでもよい。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、偏在性発現を有するプロモーターを選択するためにスクリーニングすることができる。ｉＲＮＡ試験ベクターは、クローニング領域及びポリ（Ｕ）−依存性Ｐｏｌ  ＩＩＩ転写ターミネーターを含んで組み立てられる。タンパク質コード領域はさらに、干渉ＲＮＡについての遺伝子内に提供されてもよい。
【０２８２】
ＰＥＲＶアッセイ：ＰＥＲＶ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃに対して特異的なプローブは、対応するプロウイルスＰＥＲＶ  ＤＮＡ配列を検出するために開発される。プロウイルスＰＥＲＶ  ＤＮＡのためのＰＣＲアッセイは、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、及びｅｎｖ配列に対して、及び内部コントロール遺伝子（例えばβ−グロブリン遺伝子）に対して特異的なプライマーを利用する。ブタミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は動原体性配列に特有のリアルタイムＰＣＲは、ブタ細胞汚染（キメラ化）及び伝播性分析を定量化するために使用される。ＰＥＲＶのｇａｇ領域及びｐｏｌ領域に対して特異的なＰＣＲプライマーはさらに、標的サンプルにおいてＰＥＲＶ  ＲＮＡを検出するために開発される。
【０２８３】
（ステップ２）
ｉＲＮＡのための理想的な標的は、ほとんどのＰＥＲＶにわたって保存されるＰＥＲＶ  ｍＲＮＡの領域である。このような配列は、初期の構築物について同定される。全ての既知のＰＥＲＶ配列及びこの努力から生じるさらなるＰＥＲＶ配列の分析は、ｉＲＮＡベクターの論理的な設計のための情報を提供する。全てのｉＲＮＡベクターは、トランスジェニック動物産生において使用する前に、細胞アッセイにおける機能について試験される。
【０２８４】
バイオインフォマティクス：全ての利用可能なＰＥＲＶ  ｅｎｖ  ｍＲＮＡ配列の分析を図９に示す。この分析は、保存配列及びコンセンサス配列の両方の領域を決定するために行なわれる。６３６４ｂｐ〜６３８４ｂｐの領域に対して標的化される有効なｉＲＮＡは、この実施例において示されるすべてのＰＥＲＶ  ｅｎｖ遺伝子を標的化する。あるいは、６３８６ｂｐ〜６４０７ｂｐの領域における２つの配列に対する一対の効果的なｉＲＮＡ分子はさらに、この実施例中に示されるすべてのＰＥＲＶ  ｅｎｖ遺伝子を標的化する。６４０８ｂｐ〜６４３１ｂｐの配列を含む配列を標的化するための企ては、それぞれ３つのあらわされた配列の１つを標的化する、３つの効果的なｉＲＮＡ分子を必要とする。同様に、塩基６３８５を含む領域はさらに、３つの有効なｉＲＮＡ分子を必要とする。
【０２８５】
配列分析が得られる実験配列に限定されるため、全てのＰＥＲＶ配列があらわされない可能性がある。未知又は記載されていない改変体が存在する可能性がある。それ故に、同定されたｉＲＮＡは、人工のマーカー遺伝子の代わりに天然の標的に対する有効性について再試験される。干渉を避ける任意のｍＲＮＡがクローン化され、分析に加えられる。全てのｍＲＮＡが抑制されるまで、プロセス全体が繰り返される。
【０２８６】
干渉ＲＮＡについての潜在的な標的を選択する別の方法を図１０に示す。ＰＥＲＶの半保存された領域についてコンセンサスな８６塩基は、最初の行に示される（ライン１、下線及び太字文字）。この配列内の阻害ＲＮＡを標的化する６８個の潜在的な１９塩基が、次の行に示される（ライン２〜６９）。標的は１７〜３５塩基長であり、理想的には２１〜２５塩基長である。このプロセスは、１７〜３５塩基の標的について繰り返され、任意のン完全又は部分ＰＥＲＶゲノム内に含まれる任意の領域、コードするタンパク質、又はコードしないタンパク質に対して適用することができる。全てのＰＥＲＶ配列は潜在的な標的である。この例では、１９ヌクレオチドの固定された長さの配列が、潜在的な標的として選択される。
【０２８７】
図１０に示される単純化されたスクリーニングに加えて、バイオインフォマティクスを使用して、非特異的な標的配列を減らすことができる。図１１に示されるように、標的化された遺伝子は、非標的化遺伝子と相同性を分け合ってもよい。この場合では、非標的化遺伝子と有意な相同性を分け合う潜在的な標的は、スクリーニングプロセスから除外される。標的遺伝子のＲＮＡ配列は、非標的化ＲＮＡに対する相同性についてスクリーニングされる。未知のブタにおいて発現された配列（ＧｅｎｂａｋエントリーＢＩ３０５０５４）の１９塩基領域は、半保存されたＰＥＲＶ配列（黒色の太字及び下線で示される）に対して有意に相同性である。非標的化ＲＮＡに対して有意な相同性を有する潜在的な標的領域が有用であることがわかっているが、このような標的領域は，初期の標的スクリーニングにおいて除外され、非常に下方修正した目的でない遺伝子産物のリスクを減らす。図１１のライン１は、ＰＥＲＶ配列をあらわす。ライン２〜６９は、バイオインフォマティクスによって同定された標的化ＰＥＲＶ配列をあらわす。ライン７０は、未知の発現されたブタ配列をあらわす。ライン３６〜５６は、除外された標的を示す、配列分析の結果をあらわす。
【０２８８】
図１２は、発現ｉＲＮＡの予想される三次元構造の例を示す。ｉＲＮＡは、標的配列５’（ＮＹ）ＡＡＵ  ＵＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＵ  ＡＡＣ  ＣＡＵ  Ｃ（ＮＹ）Ｇ  ＡＵＧ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＵＵＵ  ＣＣＡ  ＡＵＵ（ＮＹ）３’である（ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオチドをあらわし、「Ｙ」は０以上の任意の整数を指す）。非特異的な配列の各部分である（ＮＹ）は、ホモポリマ−状であることができる。同一でない配列はさらに、同一でない塩基から構成されることができる。それに加えて、任意の連続した長さの非特異的な配列である（ＮＹ）は、さらなる機能（例えば、限定されないが、タンパク質をコードすること、安定化又は増加した半減期のためのシグナルを提供すること、回帰性配列の長さを増加させること、スプライシングのためのシグナル及び機能を提供すること、又は特定の構造に折りたたむこと）を提供することができる。
【０２８９】
（ステップ３）
組織培養確認：ステップ１及び２において同定された配列及びプラスミドに基づいて、ステップ１に記載されるプロトコルを用いて、複数の個々のｉＲＮＡを発現するプラスミドが設計され、構築され、組織培養物における機能について試験された。各ｉＲＮＡプラスミドは、安定な発現及び適切な標的配列を含有するリポータープラスミドに対する有効性について試験される。天然ＰＥＲＶ  ｍＲＮＡに対する干渉活性は、実験的に確立される。それに加えて、ＰＥＲＶ  ｍＲＮＡの減少は、ウイルス粒子産生の減少と相関関係にある。
【０２９０】
各選択されたｉＲＮＡ構築物は、ヒト等価可能なＰＥＲＶを減らすことが知られているＰＫ−１５細胞にトランスフェクトされる。各選択されたｉＲＮＡ構築物は、定常状態のｍＲＮＡを減らす能力、削減されたウイルス粒子の数を減らす能力、及びヒト細胞に対するＰＥＲＶの透過性を減らす能力について試験される。それに加えて、第１ラウンドの試験の後の任意のＰＥＲＶ  ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、配列決定される。これらの配列は、ｍＲＮＡがｉＲＮＡを逃がすことが可能な個々の多型を決定するために分析される。この情報は、まれな多型を標的化するためにｉＲＮＡ構築物をさらに改変するために使用される。
【０２９１】
個々のｉＲＮＡ構築物の同定の後に、選択された細胞においてＰＥＶの発現を硬化的に排除する構築物のグループが開発される。このグループ分けに含まれる特定の配列は、前のステップに記載される方法を用いて同定される。
【０２９２】
（ステップ４）
ＰＥＲＶを含まない細胞の作成：タンパク質を阻害する相補体を発現するブタのα−ＧＴノックアウト株を使用するが、ＰＥＲＶを含まない遺伝的バックグラウンドは、任意のブタ株を用いて達成することができる。繊維芽細胞は、動物を作成する前に、ある程度の機能的試験を可能にするｉＲＮＡ構築物を用いて設計される。これらの細胞はさらに、機能的効果を分析するために組み込み部位についてスクリーニングされる。繊維芽細胞の使用は、トランスジェニック動物を産生する他の方法よりも有利であり、通常は、動物が生まれた後に、組み込み部位に特異的な導入遺伝子の発現をアッセイすることができる。
【０２９３】
主要なα−１，３−ＧＴノックアウト胎児繊維芽細胞は、ステップ１〜３において設計された、機能的にスクリーニングされ、最適化されたｉＲＮＡを発現するために設計される。それぞれ固有の組み込み事象をあらわす細胞の個々のコロニーが選択される。これらのコロニーが繁殖し、サブセットは、遺伝子発現及び機能についての後のスクリーニングのために保存（凍結）される。この保存された細胞はさらに、体細胞核移植のための細胞を提供するために役立ち得る。
【０２９４】
機能は、各細胞株の固有のＰＥＲＶについて確立される。ゲノムに組み込まれたｉＲＮＡを含有する繊維芽細胞の各コロニーは、定常状態のＰＥＲＶ  ｍＲＮＡの減少について試験される。任意の生存するＰＥＲＶ  ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、配列決定される。これらの配列決定されたｍＲＮＡは、これらのｍＲＮＡが現在のｉＲＮＡを避けることが可能な個々の多型を決定するために分析される。この情報は、さらにまれな多型を標的化するためにｉＲＮＡ構築物をさらに改変するために使用される。
【０２９５】
（ステップ５）
体細胞各移植は、効果的な、比較的安価で比較的早いトランスジェニックブタの産生を可能にする。ステップ４において開発され、スクリーニングされた細胞（最適化された、機能的な、ｉＲＮＡを抑制するＰＥＲＶを含有するように設計されたα−１，３ＧＴノックアウト繊維芽細胞）は、体細胞核移植において核ドナーとして使用される。体細胞核移植の技術は、ブタの卵母細胞由来の核を除去し、繊維芽細胞由来の核を摘出された卵母細胞に挿入する工程を含む。次いで、胚細胞段階まで細胞を増殖させて、次いで、凍結し、メスブタに移植される。
【０２９６】
ＰＫ−１５細胞及び胎児繊維芽細胞を用いた組織培養実験は非常に有用であることがわかり、今日まで、インビボ導入遺伝子機能の完全なモデルに対して存在するインビトロアッセイは存在しなかった。それに加えて、いくつかの組織特異的な改変は、ｉＲＮＡ機能及びＰＥＲＶ  ｍＲＮＡ発現の両方において存在してもよい。導入遺伝子を有するブタの退治組織の分析は、ｉＲＮＡの有用性のさらに拡大した分析を可能にする。
【０２９７】
妊娠期間半ばの胎児が集められる。組織を収穫し、ｉＲＮＡ発現及びＰＥＲＶ  ｍＲＮＡ抑制について分析した。有効なＰＥＲＶ抑制を提供する組み込み部位が選択される。体細胞核移植は、スクリーニングされた胎児として同一の組み込みを有する導入遺伝子を有するブタの生成を可能にする。クローニングは、貯蔵物から増殖し、回収される細胞、又は妊娠期間半ばの胎児から集められた細胞がトランスジェニック動物を作るために使用されることを可能にする。スクリーニングされ、ＰＥＲＶが有効に排除された細胞は、体細胞核移植における核ドナーとして使用される。再構築された胚は、受容体のメスに移され、期限どおりに成長する。
【０２９８】
ＰＥＲＶの完全な排除は、生きた動物において確認された。子ブタは種々の成熟段階で殺され、導入遺伝子発現及びＰＥＲＶ  ｍＲＮＡの抑制について分析される。それに加えて、複数の組織は、ＰＥＲＶが治療的に有用な臓器中で排除されることを確実にするために試験される。
【０２９９】
（特定のＰＥＲＶ標的）
潜在的なｓｉＲＮＡ標的を同定するために使用されたＰＥＲＶの特定のｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ配列を以下に列挙する。核配列は、全長遺伝子のサブセットである。このサブセットは、モデル遺伝子を組み入れるために使用した各遺伝子の一部分をあらわす。考慮からはずされる領域は、ホモポリマーで交換された（ｔｔｔｔｔ・・・ｔ又はＧＧＧＧ．．．Ｇ）と交換された。
【０３００】
【化１５−１】
2007512027.tif 000016
【０３０１】
【化１５−２】
2007512027.tif 000017
【０３０２】
【化１５−３】
2007512027.tif 000018
これらのモデル遺伝子配列から誘導された特定のｓｉＲＮＡ配列を以下に列挙する。
【０３０３】
【表１−１】
2007512027.tif 000019
【０３０４】
【表１−２】
2007512027.tif 000020
【０３０５】
【表１−３】
2007512027.tif 000021
【０３０６】
【表１−４】
2007512027.tif 000022
【０３０７】
【表１−５】
2007512027.tif 000023
オリゴヌクレオチドは、設計され、構築され、アニーリングされ、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドへとクローン化された。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを、哺乳動物における適切なモデル遺伝子（ｇａｇモデルを用いた抗ｇａｇ  ｓｉＲＮＡ、ｐｏｌモデルを用いた抗−ｐｏｌ  ｓｉＲＮＡ）を用いた有効性についてスクリーニングした。ほとんどのｓｉＲＮＡ発現プラスミドはいくらかのレベルの有効性を示した。最も強力な抗−ｇａｇ発現プラスミド（ｇ４９）及び最も強力な抗−ｐｏｌ発現プラスミド（ｐ１０６）は、ＰＫ−１５細胞のトランスフェクションにおいてＰＥＲＶ  ｍＲＮＡに対して有効であることが確認された。この効果は、ＰＥＲＶを産生した逆転写酵素活性及びＰＥＲＶ  ｍＲＮＡの直接測定の両方の検出によってアッセイされた。
【０３０８】
（ｉＲＮＡ発現プラスミド）
ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖＡ、ｅｎｖＢ、及びｅｎｖＣの部分を増幅し、ｐＣＲ−ＸＬＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。各挿入物を独立してＸｂａＩ／ＳｐｅＩフラグメントとして、ウマベクターｐＰＬ７３２．８にリポーター遺伝子及びそのポリ（Ａ）シグナルのコード領域の間に位置するＸｂａＩ部位でサブクローン化した。このストラテジーの図示は図１３にある。
【０３０９】
各ｉＲＮＡについて、製造業者の推奨に従って、オリゴ体をｐｓｉＲＮＡ−Ｈ１ｎｅｏ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローン化した。簡単に言うと、オリゴ体をアニーリングし、ブルー／ホワイトスクリーニングのためのＬａｃＺ  αペプチドの代わりにＢｂｓＩ部位にクローン化した。各プラスミドについて、ｉＲＮＡの完全性をシークエンシングによって確認した。
【０３１０】
各ｉＲＮＡの強い機能について試験するために、適切なモデル遺伝子及び１個のｉＲＮＡ試験ベクターを、製造業者の推奨に従って、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＧＴＳ），Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＣＨＯ細胞又はＰＫ−１５細胞に共トランスフェクトした。コントロールとして、さらに、細胞をリポーター遺伝子及び抗−ＧＦＰ  ｉＲＮＡベクターと共に、又はリポーター及び非機能性の、ネガティブコントロールｉＲＮＡ構築物と共に共トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞あたりのリポーター発現の全レベル（ＦＡＣＳによって測定されるような）又はリポーター遺伝子を発現した細胞の比率（視覚評価又はＦＡＣＳ）のいずれかの抑制を、ｉＲＮＡ機能の指標とみなした。ｇａｇ及びｐｏｌの両方について明らかに最も強力なｉＲＮＡを、リポーターモデル遺伝子なしで、ＰＫ−１５細胞に独立してトランスフェクトした。ウイルス粒子産生の抑制を決定するために、市販のキット（Ｃａｖｉｄｉ  Ｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、逆転写酵素をこれらの細胞の媒体中で測定した。さらに、安定なコロニーを各ｉＲＮＡについて単離し、定常状態のｍＲＮＡのレベルを定量ＲＴＰＣＲを経て測定した。これらのコロニーをさらにＲＴ活性及び一時的にトランスフェクトされたモデル遺伝子を抑制する能力について評価した。
【０３１１】
（さらなるＰＥＲＶ標的化ストラテジー：Ｄｒｏｓｈａ基質の同定）
以下の配列（フラグメントＡ）は、潜在的に固有でない配列が、同じ数の下側の部分「ｔ」と交換された、ＰＥＲＶ  ｐｏｌの一部分をあらわす。
【０３１２】
【化１６】
2007512027.tif 000024
上の下線が引かれたｐｏｌのセクションは、以下のその相補体に変換された。
【０３１３】
（フラグメントＢ）：
【０３１４】
【化１７】
2007512027.tif 000025
ＭＦｏｌｄ（核酸フォールディング及びハイブリダイゼーション予測についてＭ．Ｚｕｋｅｒ．Ｍｆｏｌｄウェブサーバー。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）３４０６−１５，（２００３），［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｉｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］）をしようして、以下のフラグメントＢの「折りたたまれた」構造予測を行なった。
【０３１５】
【化１８】
2007512027.tif 000026
上の構造では、塩基１１８〜２４８が顕著なヘアピン構造を形成する。塩基１４７〜１６６（ＣＴＴＣＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＧＣＡＧＴＣ（配列番号１１））及び塩基１９９〜２１８（ＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＧＧＧ（配列番号１２））を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計した。この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３１６】
【化１９】
2007512027.tif 000027
類似の様式で、塩基１９２〜２１４（ＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴ（配列番号１４））及び塩基１５５〜１７８（ＣＴＴＣＴＡＧＣＡＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＣＴ（配列番号１５））を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計した。この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３１７】
【化２０】
2007512027.tif 000028
同様に、塩基１１８〜１３９（ＧＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣ（配列番号１７））及び塩基２３０〜２５１（ＡＴｃＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＣＣＣ（配列番号１８））を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計した。第２のオリゴの３番目の塩基の小文字の「ｃ」は、フォールディングを最適化するために「Ａ」に変更された。この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３１８】
【化２１】
2007512027.tif 000029
フラグメントＣは以下に示され、フラグメントＡにおいて上にイタリックで示される配列の相補体である。
【０３１９】
【化２２】
2007512027.tif 000030
ＭＦｏｌｄによって予想された折りたたまれたフラグメントＣ構造を以下に示す：
【０３２０】
【化２３】
2007512027.tif 000031
上の構造において、塩基１４１〜２００（ＡＡＧＡＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＣＧＧＧＡＣ（配列番号２１））及び塩基１７６〜２０１（ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＴＴＴＡＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣ（配列番号２２））を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計した。この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３２１】
【化２４】
2007512027.tif 000032
フラグメントＤは以下に示され、フラグメントＡにおいて上に太字で示される配列の相補体である。
【０３２２】
【化２５】
2007512027.tif 000033
ＭＦｏｌｄによって予想された折りたたまれたフラグメントＤ構造を以下に示す：
【０３２３】
【化２６】
2007512027.tif 000034
上の構造において、塩基３５〜１７１は顕著なヘアピン構造を形成する。塩基３６〜６１（ＡＡＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＧ（配列番号２５））及び塩基１５０〜１７１（ＧＧＧＴＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＧＴＴＴ（配列番号２６））を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計した。塩基３６〜６１フラグメントとｍｉｒ−３０ループ間の相補性に起因してｍｉｒ−２９ループを選択した。この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３２４】
【化２７】
2007512027.tif 000035
類似の様式で、塩基８６〜１０７（ＧＡＣＴＧＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＧＧ（配列番号２８））及び塩基１１１〜１３０（ＣＴＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＡＴＡＧＴＣＧＡ（配列番号２９）を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計した。この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３２５】
【化２８】
2007512027.tif 000036
（さらなるＰＥＲＶ標的化ストラテジー：２つのｍＲＮＡを同時に標的化すること）
２つのｍＲＮＡの一部分のアンチセンス鎖を組み合わせて、２つのｍＲＮＡを標的化する１個のヘアピンを作成した。
【０３２６】
以下の配列は、ｇａｇの相補体（イタリック）及びｐｏｌの相補体（下線）を組み合わせた領域である。
【０３２７】
【化２９】
2007512027.tif 000037
このフラグメントの潜在的な構造をＭＦｏｌｄによって予想した場合、以下のものが得られた。
【０３２８】
【化３０】
2007512027.tif 000038
ｇａｇ及びｐｏｌの両方を標的化する潜在能力を有する１個のヘアピンを作成するために、塩基１００〜１２３（ａｇａｔｃａｃｇｔａａｃｔｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｔ（配列番号３３））及び塩基１０〜３４（ｇｃａｇｃｔｇｇｔａｇａｇｔｇａａｃｇｔｇａｔｃｃ（配列番号３４））を使用して、ｍｉｒ−３０ループ及び塩基を有するＤｒｏｓｈａ基質を設計し、この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる。
【０３２９】
【化３１】
2007512027.tif 000039
（さらなるＰＥＲＶ標的化ストラテジー：回帰性ｓｉＲＮＡの使用）
ｓｉＲＮＡ効力の鎖選択の効果を減らすために、ヘアピンの両方の鎖を同一又は機能的に同一になるように設計することができる。例えば、ｐｏｌの相補体（フラグメントＡ）をＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒを用いて分析し、潜在的な回帰性配列を同定した。１つのこのような分析（パラメーター：ストリンジェンシー１１、ウインドウ２３）では、以下の配列が同定された：ＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＧ（配列番号３６）。この配列を使用してｍｉｒ−３０塩基及びループを有するＤｒｏｓｈａ基質を設計し、この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３３０】
【化３２】
2007512027.tif 000040
類似の様式で、別の部分的な回帰性配列（ＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧ（配列番号３８））を使用してｍｉｒ−３０塩基及びループを有するＤｒｏｓｈａ基質を設計し、この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３３１】
【化３３】
2007512027.tif 000041
同様に、ＣＡＴＣＧＧＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＡＴＧ（配列番号４０）を使用してｍｉｒ−３０塩基及びループを有するＤｒｏｓｈａ基質を設計し、この基質のＭＦｏｌｄ予想構造は以下のようになる：
【０３３２】
【化３４】
2007512027.tif 000042
さらなるＰＥＲＶ標的化ストラテジー：ヘアピン形成の最適化
上のストラテジーを用いて不完全なヘアピンが生じる場合がある。しかし、非ワトソン／クリック塩基対形成がＲＮＡにおいて可能なため、Ｄｒｏｓｈａ基質は、ＲＮＡｉ標的化において顕著な改変なく改変することができる。以下は、ＰＥＲＶ  ｅｎｖ  ｍＲＮＡの一部分を標的化するために設計されたＤｒｏｓｈａ基質である。いくつかの「バブル」は、ヘアピンのステム部分に存在する。
【０３３３】
【化３５】
2007512027.tif 000043
１５位の「Ｃ」を「Ｕ」に変更した。「Ｕ」は、「Ｃ」の相補体として、標的中に見出される「Ｇ」と塩基対になり得る。しかし、「Ｕ」は、ヘアピンの６５位の「Ａ」とも塩基対を形成することができる。同様に、１８位の「Ｃ」を、６２位の「Ａ」と塩基対にするために「Ｕ」に変更した。得られた予想構造は、改良されたステムを有し、その構造を以下に示す。
【０３３４】
【化３６】
2007512027.tif 000044
また、Ｚｅｎｇ  Ｙ，  Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｒｔｉｎ  ５．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｓｅｐ  ０８；３２（１６）：４７７６−８５；  Ｚｅｎｇ  Ｙ，  Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  ＲＮＡ．  ２００３  Ｊａｎ；９（１）：  １  １２−２３；  Ｚｅｎｇ  Ｙ，  Ｗａｇｎｅｒ  ＥＪ，  Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ．  Ｂｏｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｍＲＮＡｓ  ｗｈｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２００２  Ｊｕｎ；９（６）：  １３２７−３３；  Ｂｏｄｅｎ  Ｄ，  Ｐｕｓｃｈ  Ｏ，  Ｓｉｌｂｅｒｍａｎｎ  Ｒ，  Ｌｅｅ  Ｆ，  Ｔｕｃｋｅｒ  Ｌ，  Ｒａｍｒａｔｎａｍ  Ｂ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｆｅｂ  １３；３２（３）：  １  １５４−８；  Ｌｅｅ  Ｙ，  Ａｈｎ  Ｃ，  Ｈａｎ  Ｊ，  Ｃｈｏｉ  Ｈ，  Ｋｉｍ  Ｊ，  Ｙｉｍ  Ｊ，  Ｌｅｅ  Ｊ，  Ｐｒｏｖｏｓｔ  Ｐ，  Ｒａｄｍａｒｋ  Ｏ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  ＫｉｍＶＮ．  Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＥ  Ｄｒｏｓｈａ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００３  Ｓｅｐ２５；４２５（６９５６）：４  １５−９；  Ｍ．  Ｚｕｋｅｒ．  Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３  １  （１３），３４０６−１５，（２００３）［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｉｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ］を参照。
【０３３５】
（実施例３：ヘアピンオリゴヌクレオチドの連続的なクローニング）
クラスター状干渉ＲＮＡのためのオリゴを組み立てるために、リンカー配列は、目的でない構造が形成されることを防ぐことが考慮されなければならない。同じ制限部位が連続して使用される場合、ヘアピンの塩基での相同性は、目的でない塩基対を生じる場合がある。例えば、ベクターが、２つの非適合性制限部位を有する場合、配列はそれらの２つの部位内で直接的にクローン化することができる。このプロセスでは、上流部位が破壊される場合があり、さらに、次のヘアピンのための調製において下流領域に新しいベクターを再供給する場合がある。
ＢｃｌＩ及びＭｌｕＩを用いて切断した後のベクター末端
【０３３６】
【化３７】
2007512027.tif 000045
【０３３７】
【化３８】
2007512027.tif 000046
このストラテジーでは、オリゴヌクレオチドが供給されたＢｃｌＩ部位は、次のクローニングステップのために使用することができ、新しいオリゴヌクレオチドは、それぞれの連続的なベクターに添加するために連続することができる。但し、導入されたステム配列はいずれもＢｃｌＩ又はＭｌｕＩのいずれかのためのさらなる部位を供給しない。
【０３３８】
以下のものは、すぐ上に記載されたストラテジーを用いた一連のベクターにクローン化された３つのオリゴのシリーズ（ベクター、オリゴ１、オリゴ２、オリゴ３）の得られた配列である：
【０３３９】
【化３９】
2007512027.tif 000047
この配列の予想構造を以下に示す。３つのヘアピンのそれぞれは、同じ一般的な構造を有すると予想される。
【０３４０】
【化４０】
2007512027.tif 000048
このストラテジーを用いて、任意の数のさらなるＤｒｏｓｈａ基質を、個々の予想される構造の改変を伴うことなく、付加することができる。
【０３４１】
（実施例４：合成イントロンアセンブリ）
好酸球性関連リボヌクレアーゼＡファミリー遺伝子（ＥａｒＸ）及び市販のベクターｐＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に見出されるイントロンにゆるく基づくイントロンを設計した。このイントロンの設計は、イントロンの位置がエキソン配列内の任意のＳｂｆＩ部位内にある制限部位の作成を含んでいた。このイントロンを含有する主要な転写物のスプライシングの際に、得られたｍＲＮＡは、その設計されていない内因性対象物と比較して改変されていない。それに加えて、少量の一連のクローニング部位は、ｉＲＮＡ分子／Ｄｒｏｓｈａ基質の後に続くクローニングを可能にするためにイントロン内に含まれていた。ｄｓＲＥＤ発現ベクター（ｃｏｒａｌｌｉｍｏｒｐｈａｒｉａｎからの赤色蛍光タンパク質）のコード領域内に天然に見出されるＳｂｆＩ部位にこの配列をクローン化した。哺乳動物へのトランスフェクションの際に、得られたイントロンは、適切にスプライシングされ、機能的なｄｓＲＥＤタンパク質を与える。ＳｂｆＩ部位の中心の６ヌクレオチドがＰｓｔＩ部位を含むため、このイントロンはさらに、ＰｓｔＩ部位に直接クローン化することができる。
イントロン配列：
（ＳｂｆＩ部位は太字で示され、複数のクローニング部位はイタリックで示され、機能的イントロンは下線部分である）
【０３４２】
【化４１】
2007512027.tif 000049
（実施例５−汚染するタンパク質の発現を減らすためのｉＲＮＡの使用）
この実施例では、導入遺伝子の産物の汚染を防ぐか又は減らすために、内因性タンパク質の発現が減らされる。トランスジェニック動物は、治療用タンパク質のための供給源として使用され始めている。これらのタンパク質は、導入遺伝子から発現される。導入遺伝子発現は、このようなタンパク質の区分に分けられた単離を与えるために、特定の組織又は細胞種に対して標的化することができる。例えば、タンパク質は、乳房に特異的なプロモーター由来のタンパク質の発現を開始させることによって、トランスジェニック動物のミルク中で濃縮することができる。それに加えて、導入遺伝子は、特定の処理を可能にするために、特定の細胞種中で選択的に発現させることができる。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、家畜Ｂ−細胞におけるヒトポリクローナル抗体の組換え、発現、及び処理に指向するために使用することができる。これらの場合のいずれかにおいて、内因性タンパク質は、精製のために集められた物質を汚染することができる。このタンパク質は、進化的に関連していないが、所望の産物とともに精製される。あるいは、汚染するタンパク質は、導入遺伝子産物の内因性対象物であってもよい。
【０３４３】
トランスジェニック家畜における汚染するタンパク質産生を減少するための干渉ＲＮＡの適用のためのガイダンスを提供するために、免疫グロブリン遺伝子を用いて以下の実施例が提供される：
（ステップ１）
実施例１に記載されるような技術を使用した。ここで、実施例１において記載されるｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子は、ブタ免疫グロブリン（Ｉｇ）の可変ドメインのための遺伝子と、可変又は一定のいずれかで交換される。それに加えて、Ｉｇ重鎖、Ｉｇ軽鎖カッパ、及びＩｇ軽鎖ラムダは、本ストラテジーにおける潜在的な標的として含まれる。
【０３４４】
（ステップ２）
実施例１に記載されるような技術を使用した。ここで、ＰＥＲＶ標的の分析は、所与の標的に対するｉＲＮＡ構築物の特異性を決定するためにＩｇ標的の分析と交換される。ブタＩｇ標的の試験に加えて、ヒトＩｇ導入遺伝子と相同性を有し、動物において発現される潜在的な標的は排除される。
【０３４５】
（ステップ３）
それぞれ選択されたｉＲＮＡ構築物を、ブタＢ−細胞株に導入する。Ｉｇ遺伝子産物の下方修正は、実施例１に記載される方法によってアッセイされる。特に、ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって評価され、表面Ｉｇは標識された抗体を経て測定される。
【０３４６】
（ステップ４及び５）
胎児繊維芽細胞を、上のステップで同定されるｉＲＮＡ構築物と接触させる。しかし、胎児繊維芽細胞がＩｇ遺伝子産物を発現しないため、このアッセイ中のスクリーニングにおけるそれらの有用性は制限されている。この場合では、妊娠後期胎児は、ＲＴ−ＰＣＲ及びイムノアッセイによってｉＲＮＡ有効性を確認するために使用される。平衡した１セットの実験では、同定された標的に対応する発現されたブタＩｇ導入遺伝子に対して胎児繊維芽細胞を設計し、ｉＲＮＡ構築物を効力について試験する。ヒトＩｇの目的でない標的化もアッセイする。ヒトＩｇ導入遺伝子を標的化しないｉＲＮＡ構築物のみが胎児を産生するために使用される。
【０３４７】
全ｍＲＮＡは、妊娠後期胎児の胸腺、脾臓及び血液から収穫される。このＲＮＡは、各Ｉｇ遺伝子座に対して特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって内因性Ｉｇ下方修正についてスクリーニングするために使用される。各アッセイは、エラーが導入されないことを確実にするためにさらなるコントロール配列を含む。
【０３４８】
ヒトＩｇ導入遺伝子を含有する細胞は、核移植を経て胚を再構築するために使用される。これらの細胞はスクリーニングされた胎児、凍結し保存した細胞、又はスクリーニングした胎児を産生するために使用される細胞から誘導することができる。再構築された胚は、所望の特徴を持つ導入遺伝子を有する子孫を産生するために使用される。
【０３４９】
内因性ブタＩｇ遺伝子産物の下方修正及び導入遺伝子産物（すなわち、ヒトＩｇ）の両方の確認が行なわれる。動物は、種々の成熟段階で採血され、ｉＲＮＡ導入遺伝子発現、Ｉｇ導入遺伝子発現、及び内因性Ｉｇ遺伝子抑制について分析される。この手順はさらに、種々の免疫学的状態を誘発する条件下で繰り返される。
【０３５０】
（実施例６−ウイルス耐性動物を産生するための干渉ＲＮＡの使用）
ＲＮＡ干渉技術は、ウイルスに耐性であり、及び／又はウイルスを増殖させる能力が減らされた、動物を産生するために適用される。Ｍａｒｅｋの疾患ウイルスの１つ以上の必須領域を標的化する干渉ＲＮＡの発現を生じる導入遺伝子を構築する。次いで、導入遺伝子構築物をニワトリのゲノムに付加し、ｉＲＮＡを遺伝的に発現する遺伝子株を産生する。この実施例では、ゲノム株は、ハイブリダイズして、Ｍａｒｅｋ疾患ウイルスの必須領域に対して標的化される、ｄｓＲＮＡ分子を作成する２つのＲＮＡを遺伝的に発現する。非疾患状態では、ｄｓＲＮＡは機能的に不活性であるが、細胞がＭａｒｅｋ疾患ウイルスに感染した場合には、ｄｓＲＮＡはウイルス遺伝子と干渉し、ウイルスの寿命を破壊する。それ故に、このようなニワトリはＭａｒｅｋ疾患に耐性である。
【０３５１】
ウイルスに対する高められた耐性を有する動物を産生するために干渉ＲＮＡの適用におけるガイダンスを与えるために、以下のものが提供される：
（方法）
ＰＥＲＶがＭａｒｅｋ疾患ウイルスによって交換される場合、実施例１において記載されるような技術が使用される。それに加えて、Ｍａｒｅｋ疾患を減らす細胞が、ＰＫ−１５細胞の代わりに使用される。さらに、当該技術分野で既知である記載からわずかに改変した導入遺伝子を有する家禽の産生のための方法を行なうことができる。ニワトリの胚を効果を確認するために使用する。ｉＲＮＡのための適切な組み込み部位は、それらが再生された後に、導入遺伝子を有する動物におけるｉＲＮＡ発現についてスクリーニングすることによって同定される。この目的で、導入遺伝子を有する子孫は、適切な株のさららなる普及のために利用可能である。
【０３５２】
（実施例７−異種移植された臓器の拒絶を減らすための干渉ＲＮＡの使用）
上述の技術を使用して、導入遺伝子は、異種移植された臓器における炎症を抑制するためにＶＣＡＭを標的化するｄｓＲＮＡの発現のために構築される。高められた臓器生存率を有する異種移植ブタを産生するための干渉ＲＮＡの適用におけるガイダンスを与えるために、以下のものが提供される：
（方法）
実施例１において記載される方法は、ｉＲＮＡ標的をスクリーニングするためのモデルとして役立つ。本実施形態では、ブタＶＣＡＭが標的である。ＶＣＡＭを発現するブタ細胞株がＰＫ−１５細胞の代わりに使用される。実施例１、ステップ２及び図１１に開示される同様のストラテジーを使用して、ＶＣＡＭファミリーメンバーに対して活性なｉＲＮＡ標的を除去する。
【０３５３】
（実施例８−内因性遺伝子の発現を減少させるための干渉ＲＮＡの使用）
ＲＮＡ干渉は、組織特異的な様式で内因性遺伝子の発現を抑制するために使用される。導入遺伝子は、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）を標的化するｄｓＲＮＡの発現のために組みこまれる。ミオスタチンの変異は、家畜及びマウスにおいて筋肉重量の増加を与え、経済的に有利な表現型がミオスタチンの機能の欠損を伴うことを示す。しかし、ミオスタチンの完全な排除は、肉産生のために経済的に生存可能でない表現型を産生する（Ｙａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．６０（３）：３５１−６１）。干渉ＲＮＡ技術は、ミオスタチンの発現が抑制された動物を産生するために使用される。完全ではない抑制を提供するｉＲＮＡ分子の組織特異的な発現は、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターに対して組織特異的な様式で提供される。
【０３５４】
（方法）
実施例１に記載される様式は、ｉＲＮＡ標的をスクリーニングするためのモデルとして役立つ。本実施例では、ブタＧＤＦ−８はＰＥＲＶよりもよい標的である。ＧＤＦ−８を発現したブタ細胞株は、ＰＫ−１５細胞の代わりに使用される。最初に仮想配列組み立てによって、その後にインビトロスクリーニングによって同定されたｉＲＮＡ分子は、同定されるパラメーター内で有効ではない場合には、排除される。それ故に、以前の実施例とは異なり、ミオスタチンの完全な廃止は、考慮からｉＲＮＡ分子を排除する。
【０３５５】
（実施例９−ウイルスに対する耐性を提供するための干渉ＲＮＡの使用）
ＲＮＡ干渉技術は、異種移植を受ける患者に対して危険なウイルスに耐性なブタを産生するために適用される。異種移植手順では、ブタ、ウイルスに加えて、ドナー臓器は病原体保有ヒトであるリスクが存在する。例えば、異種移植を受ける患者に対してリスクを有する１つのウイルスは、インフルエンザウイルスである。それ故に、異種移植された臓器を受ける患者に対するリスクが存在するウイルスの１つ以上の必須領域を標的化する干渉ＲＮＡの発現を生じる導入遺伝子が構築される。実施例１に記載されるような方法は、ｉＲＮＡ標的をスクリーニングするための方法として役立つ。この場合には、インフルエンザウイルス及びその相同物は、ＰＥＲＶの代わりに標的を提供する。ＰＫ−１５細胞の代わりに、インフルエンザウイルスを減らす細胞がスクリーニングのために使用される。ｉＲＮＡ構築物は、インフルエンザウイルスｍＲＮＡ及びウイルス粒子産生を完全に阻害する能力についてスクリーニングされる。有用なｉＲＮＡ配列が同定されるばあ、それらはベクター内に結合し、ウイルス遺伝子産物の発現を完全に排除することができる導入遺伝子構築物を提供する。スクリーニングのさらなるラウンドは、最も有効な組み合わせが同定されることを確実にする。スクリーニングの後、核移植手順において使用される繊維芽細胞に構築物を導入し、インフルエンザウイルスに耐性なトランスジェニック細胞株を与える。
【０３５６】
（実施例１０−遺伝的選択を提供するための干渉ＲＮＡの使用）
選択的なマーカーは、ほとんどのマーカー遺伝子が抗菌耐性を提供し、有限数が特徴付けられたという点において、哺乳動物細胞において制限されている。それ故に、選択可能な表現型を提供するｓｉＲＮＡ導入遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子として役立つことができる。実施例１に記載される方法は、ｉＲＮＡ標的をスクリーニングするためのモデルとして役立つ。この場合には、特定の遺伝子が下方修正さえる選択可能な表現型を提供する細胞が使用される。ｉＲＮＡ構築物は、選択可能な表現型を産生する能力についてスクリーニングされる。有用なｉＲＮＡ構築物が同定される場合、それらは他の遺伝子又は他のＤＮＡフラグメントに結合し、選択可能な表現型を与える。さらに、このストラテジーを使用して、相同組換え事象の選択を可能にする遺伝子の組み合わせを作成することができる。例として、非ｉＲＮＡ選択可能なマーカー遺伝子は、２つの標的化アームの間に含まれる。これらのアームの外側に、抗−選択可能なマーカーｉＲＮＡ導入遺伝子が配置される。ｉＲＮＡ導入遺伝子は、標的遺伝子として選択可能なマーカー遺伝子を用いて上の例におけるように同定される。ランダム組み込みの際に、ｉＲＮＡ導入遺伝子は、選択可能なマーカーの機能を妨害し、組み込み事象は選択されない。相同組換えの際に、ｉＲＮＡ導入遺伝子は存在せず、選択可能な遺伝子機能は存在しない。同様に又はあるいは、ｉＲＮＡ導入遺伝子は、細胞製造のために必須な遺伝子に対して指向することができる。
【０３５７】
本明細書中に記載される本発明は、本明細書中で特に開示されていない任意の要素の非存在下で実行することができる。使用された用語及び表現は、記載の意味で使用され、限定の意味では使用されず、このような用語及び表現の使用において、示され記載される特徴の任意の等価体又はそれらの一部分を排除することは意図されないが、請求される本発明の範囲内で可能な種々の改変が可能であることが理解される。このように、本発明が本明細書中に特定的に開示されるが、本明細書中に開示される概念の任意の特徴、改造及び改変は、当業者の助けを借りることができ、このような改造及び改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。それに加えて、本発明の特徴又は局面がマーカッシュ群で記載される場合、本発明はさらに、マーカッシュ群のいずれかの個々のメンバー又はメンバーのサブグループを用いて記載されていると当業者は理解する。
【図面の簡単な説明】
【０３５８】
【図１】図１は、干渉ＲＮＡが細胞ＲＮＡの標的化された破壊を媒介することができる機構の一例を示す。このモデルでは、発現ベクターは、ＲＮＡセンス鎖（黒色四角）及びアンチセンス鎖（灰色四角）をコードする核酸配列を逆配列で含み、１個のプロモーター（白色四角）に使用可能な状態で結合している。構築物の転写後、センス鎖はその相補的なアンチセンス鎖に結合し、二本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が生じる。ｄｓＲＮＡは、酵素（Ｄｉｃｅｒ、ＲＮＡｓｅＩＩＩとしても知られる）によって加工され、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を産生する。次いで、１つのｓｉＲＮＡが、ＲＮＡにより誘発されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）及び標的細胞ｍＲＮＡと合わされる。細胞ｍＲＮＡのＲＩＳＣへの結合は、ｍＲＮＡの開裂を誘発し、それにより、特定の遺伝子産物の機能的発現を制限する。
【図２】図２は、クラスター状阻害ＲＮＡ（ｃｉＲＮＡ）が細胞ＲＮＡの破壊を媒介することができる機構の一例を示す。このモデルでは、発現ベクターは、複数の相補的なＲＮＡセンス鎖（黒色四角）及び逆転したアンチセンス鎖（灰色四角）をコードする核酸配列のパタ−ンを含む。このパタ−ンは、１個のプロモーター（白色四角）に使用可能な状態で結合することができる。転写後、各センス鎖が相補的なアンチセンス鎖に結合することができるようにｃｉＲＮＡ転写物は自動的に折りたたまれる。このフォールディングは、放射状に整列し、各外側の軸にヘアピン構造を有する二本鎖ＲＮＡ複合体を生じることができる。この複合体は、酵素（Ｄｉｃｅｒ、ＲＮＡｓｅＩＩＩとしても知られる）によって加工され、複数の小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を産生する。得られたｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡにより誘発されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）及び複数の標的ｍＲＮＡ配列と合わすことができる。細胞ｍＲＮＡのＲＩＳＣへの結合は、ｍＲＮＡ配列の開裂を誘発し、それにより、１つ以上の特定の遺伝子産物の機能的発現を制限する。
【図３】図３は、クラスター状阻害ＲＮＡ（ｃｉＲＮＡ）が細胞ＲＮＡの標的化された破壊を媒介することができる別の潜在的な機構の一例を示す。このモデルでは、発現ベクターは、１個のプロモーター（白色四角）に使用可能な状態で結合した、複数の相補的なＲＮＡセンス鎖（黒色四角）及び逆転したアンチセンス鎖（灰色四角）をコードする核酸配列を含む。転写後、各センス鎖が相補的なアンチセンス鎖に結合することができるようにｃｉＲＮＡ転写物は自動的に折りたたまれる。得られた構造は、少なくとも１つのヘアピン回転を含有する線形の二本鎖ＲＮＡ複合体であることができる。次いで、この線形の二本鎖ｃｉＲＮＡ複合体は、酵素（Ｄｉｃｅｒ、ＲＮＡｓｅＩＩＩとしても知られる）によって加工され、複数の小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を産生する。得られたｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡにより誘発されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）及び複数の標的ｍＲＮＡ配列と合わすことができる。細胞ｍＲＮＡのＲＩＳＣへの結合は、ｍＲＮＡ配列の開裂を誘発し、それにより、１つ以上の特定の遺伝子産物の機能的発現を制限する。
【図４】図４は、本発明の分子の代表例である。本発明の分子は、ｉＲＮＡ配列の１つ以上の「セット」を含有する。これらのセットは、標的遺伝子の１個の領域に対して標的化する少なくとも１つのｉＲＮＡ配列（セット１）、標的遺伝子の複数の領域に対して標的化する少なくとも１つのｉＲＮＡ配列（セット２）、又は複数の遺伝子上の領域に対して標的化する少なくとも１つのｉＲＮＡ配列（セット３）を含むことができる。本実施形態は、本文中でさらに記載され、例示される。
【図５】図５は、代表的なベクタープロモーターにより駆動されるベクター（ｔｏｐ）の例示及び本発明の実施において使用可能な代表的なプロモーターを含まないベクターの例示である。
【図６】図６は、本文中に記載される「プロモータートラップ（ｔｏｐ）」技術及び「遺伝子トラップ（ｂｏｔｔｏｍ）」技術のプロセスの代表例である。ｔｏｐでは、ｉＲＮＡベクターは１つ以上のｉＲＮＡ配列（黒色四角）及び所望の遺伝子の１つ以上のエキソン配列に対して相同性な５’及び３’配列（斜線四角）を含む。この図は、ｉＲＮＡインサートを有する最終的な遺伝子を提供するための相同配列の組換えを示す。ｂｏｔｔｏｍでは、遺伝子トラップベクターは、１つ以上のＲＮＡ配列、遺伝子中のイントロン領域に対して相同性な配列（斜線四角）、及びプロモーターのないｉＲＮＡ配列インサートのすぐ上流にスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含有して示される。ｉＲＮＡインサートのイントロンへの組み込みは、転写の際に遺伝子の上流エキソンを用いた融合転写を導くことができる。
【図７】図７は、４つの遺伝子の対立遺伝子の分析結果の図示である。遺伝子１は３つの対立遺伝子を有することが示されている。遺伝子２、３、及び４は、４つの対立遺伝子を有することが示されている。領域内の同じ模様を有する四角は、同一な配列をあらわす。領域内の異なる模様を有する四角は、領域内の異なる配列をあらわす。領域１は、遺伝子１の対立遺伝子Ａ及びＢを除き、全ての遺伝子及び対立遺伝子間で配列が異なっている。領域２は全てのファミリーメンバーで保存されている。領域３にはたった２つの配列のみが見出されている。同様に、領域４にはたった２つの配列のみが見出されている。領域５には７つの配列が見出されている。領域６は任意のファミリーメンバーで保存されていない。領域２の効果的な標的化は、全てのファミリーメンバーの抑制を与える。領域３中の２つの配列のうち１つの効果的な標的化は、遺伝子のサブセットを特定する。標的化する導入遺伝子のセットは、対立遺伝子又は遺伝子のサブセットを抑制するために整列させることができる。
【図８】図８は、ＰＥＲＶ  ｅｎｖ遺伝子の一部分の分析結果を示す。塩基６３６４〜６３８４にわたる領域は、示された全てのファミリーメンバー間で相同である。塩基６４００及び６４０１のジヌクレオチドについて２つの多型が示される。このジヌクレオチドを含む領域を標的化する場合、示された遺伝子を効果的に抑制するために２つの導入遺伝子が必要である。６４０８〜６４３１にわたる領域は３つの多型をあらわす。同様に、塩基６３８５を含む領域は３つの多型をあらわす。この３多型領域の３つの多型の１つを標的化する１個の導入遺伝子は、示された配列のサブセットを区別する。この３多型領域において異なる多型をそれぞれ標的化する３つの導入遺伝子のセットが、全ての示された配列を標的化するために必要とされる。
【図９】図９は、代表的な阻害ＲＮＡ標的を示す。ＰＥＲＶの半保存された領域についての８６塩基コンセンサスが最初の行に示されている。この配列内の阻害ＲＮＡについての６８個の潜在的な１９塩基標的がその後の行に示されている。標的は、１７〜３５塩基長であることができる。このプロセスは、１７〜３５塩基の標的化のために繰り返すことができ、任意の完全又は部分的なＰＥＲＶゲノム内に含まれる、タンパク質をコードするか又はコードしない任意の領域に適用することができる。全てのＰＥＲＶ配列は潜在的な標的である。ライン１、ＰＥＲＶ配列；ライン２〜６９、潜在的な標的。
【図１０】図１０は、非標的化遺伝子と顕著な相同性を共通して有する潜在的な標的の同定を示す。標的遺伝子のＲＮＡ配列は、非標的化ＲＮＡに対する相同性についてスクリーニングされた。未知のブタにより発現される配列（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＢＩ３０５０５４）の１９塩基領域は、半保存されたＰＥＲＶ配列の領域（黒色の太字で示される）に対して顕著に相同性である。潜在的な標的領域が有用であるとわかっているにもかかわらず、このような標的領域は、厳しい下方調節による意図されない遺伝子産生のリスクを減らすために、初期の標的化スクリーニングから排除される。ライン１、ＰＥＲＶ配列；ライン２〜６９、潜在的な標的；ライン７０、発現された未知のブタ配列；ライン３６〜５６、排除された標的。
【図１１】図１１は、最初に列挙された（図３、２行目）図９の潜在的な標的配列のために設計された阻害ＲＮＡの構造をあらわす。「Ｎ」は任意のヌクレオチドをあらわし、「Ｙ」は０以上の任意の整数を指す。非特異的な配列の各部分である（ＮＹ）は、ホモポリマ−状であることができるか、又は非同一塩基で構成されることができる。それに加えて、任意の連続した長さの非特異的な配列である（ＮＹ）は、さらなる機能（例えば、限定されないが、タンパク質をコードすること、安定化又は増加した半減期のためのシグナルを提供すること、回帰性配列の長さを増加させること、スプライシングのためのシグナル及び機能を提供すること、又は特定の構造に折りたたむこと）を提供することができる。
【図１２】図１２は、標的化ＰＥＲＶｇａｇコンセンサス配列に対する、放射クラスター状阻害ＲＮＡ、非対称バブルｃｉＲＮＡ、線形ｃｉＲＮＡ、及び複合体ｃｉＲＮＡの例示的な配列を表す。
【図１３】図１３は、ベクターに遺伝子の一部分を挿入するためのクローニングストラテジーの代表例を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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