(57)【要約】  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）もしくはその活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントの修飾された形を包含する可溶性タンパク質を調製するための方法であって、ｐＨ８．５から１０．５のバッファーと前記タンパク質を接触させることを包含し、前記バッファーはレドックスペアを形成する還元剤および酸化剤を包含し、その場合還元剤は酸化剤と比較して過剰に存在し、そしてその場合還元剤は少なくとも５ｍＭの濃度で存在する前記方法。この方法において得られる材料は、本発明のさらなる側面を形成する。この材料は“天然様の”形にリフォールディングされており、リガンドを検出するための研究、例えばＮＭＲ分析において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）もしくはその活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントの修飾された形を含む可溶性タンパク質を調製するための方法であって、ｐＨ８．５から１０．５のバッファーと前記タンパク質を接触させることを含み、前記バッファーはレドックスペアを形成する還元剤および酸化剤を含み、その中で還元剤は酸化剤と比較して過剰に存在し、還元剤は少なくとも５ｍＭの濃度で存在する前記方法。
【請求項２】
タンパク質が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の非天然の活性なフラグメントまたはそのバリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が、安定な同位体で均一に標識された形である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
バッファーがｐＨ９から１０を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
バッファーがｐＨ９．５を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
レドックスペアが還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
還元剤：酸化剤の比率が少なくとも５：１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
還元剤：酸化剤の比率が５：１から１５：１の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
還元剤：酸化剤の比率が約１０：１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
還元剤の濃度が８ｍＭから１５ｍＭである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
還元剤の濃度が約１０ｍＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
バッファーが、５０ｍＭ  グリシン、１０ｍＭ  還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、１ｍＭ  酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
バッファーが、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ  ２０１）、アルギニンもしくはその塩、Ｌプロリン、３−[{３−コルアミドプロピル}ジメチルアンモニオ]１−プロパンスルホネート(Chaps)、またはラウリルマルトシドより選択される１つまたはそれより多くの添加剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
添加剤が非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ  ２０１）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）がヒトｕＰＡである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質を、タンパク質の精製に有用であるアミノ酸配列に融合させる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質が配列番号２：
【化１】
2007528221.tif 000005
のものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
予備的な工程においてタンパク質を変性させる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
変性が、８Ｎ  尿素または６Ｍ  グアニジン塩酸塩を用いて達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質生成物に、その後のプラスミンによる消化工程を行う請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質が、形質転換されたホスト細胞において発現されたリコンビナントの修飾ｕＰＡもしくはその活性なフラグメント、またはこれらのいずれかのバリアントである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ホスト細胞が細菌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質がホスト細胞内の封入体から回収される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ホスト細胞が、前記タンパク質をコードする核酸で形質転換され、そしてその場合野生型核酸配列中に存在する少なくともいくつかのコドンが、細菌細胞における発現に最適化するように修飾される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｕＰＡもしくは活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントを含む可溶性タンパク質を調製するための方法であって、前記タンパク質をコードする核酸で細菌ホスト細胞を形質転換し、形質転換した細胞を培養し、細胞内の封入体からタンパク質を単離し、溶液中のタンパク質をバッファー中で変性させ、そしてｐＨ８．５から９．５を有するバッファーからタンパク質を沈殿させることを包含する前記方法であって、前記バッファーはレドックスペアを形成する還元剤および酸化剤を含み、この場合還元剤は酸化剤と比較して過剰に存在し、そしてこの場合還元剤は少なくとも５ｍＭの濃度で存在する前記方法。
【請求項２６】
生成物にプラスミンによる消化を行ってｕＰＡの活性なフラグメントを形成する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により得られる、修飾ｕＰＡもしくは活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントを含む可溶性タンパク質。
【請求項２８】
１５Ｎで均一に（９８％以上）同位体標識された、そして５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３のバッファー中で３０３Ｋの温度で測定した時に、図１Ｂに示したような１５Ｎ−１Ｈ  ＴＲＯＰＳＹ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルを有する、請求項２７に記載のタンパク質。
【請求項２９】
同位体標識化が、１５Ｎ、１３Ｃ、またはこれらの核種と２Ｈとのあらゆる組み合わせを含む、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３０】
ｕＰＡに関するリガンドを同定するための方法であって、検査化合物の存在下で請求項２７から２９のいずれか１項に記載のタンパク質におけるＮＭＲ、等温滴定熱量測定または示差走査熱量測定による分析を行うことを包含する、ただしＮＭＲの場合には該材料は適切に標識されているものとする、前記方法。
【請求項３１】
ｕＰＡに関するリガンドを同定するための方法であって、ＮＭＲによる分析を行うことを包含し、その場合タンパク質は安定な同位体で均一に標識された形である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｘ線結晶学による分析を行うための、請求項２７から２９のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を製造するための方法、具体的には、異種核ＮＭＲの研究または他の生化学、機能および構造の研究に特に適する酵素であるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を製造するための方法、ならびにこの方法により得られる酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、腫瘍の転移および浸潤に関与するセリンプロテアーゼである。ｕＰＡの阻害薬は、前立腺癌、乳癌およびその他の癌のための薬剤としての可能性を有すると思われる。ｕＰＡは、ジスルフィド結合した複数のドメインを有する４１１残基の糖タンパク質であり、プラスミンにより活性化されて２本鎖のｕＰＡを生成する。したがってｕＰＡに関するリガンドの同定は、医薬研究の重要な標的である。
【０００３】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、アミノ酸および原子のレベルで、溶液中のタンパク質の構造および立体配置をモニターする方法である。スペクトルにおけるシグナルの位置は、アミノ酸の環境に対して極めて感度が高く、これらのシグナルの位置の変化を、タンパク質および別の分子との間の相互作用に相関させることができる。
【０００４】
ＥＰ−Ｂ−０８６６９６７は、標的生体分子に対するリガンドを核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて同定する技術について記載している。このアプローチは、リガンドのタンパク質への結合により誘発された化学シフトの摂動を経験するアミノ酸残基を同定し、これらの化学シフトの摂動を、先にＸ線結晶学によりまたはホモロジーモデリング法(homology modelling)により全体的に解析されているタンパク質の3次元構造上にマッピングすることに頼る。このアプローチは安定な同位体標識（１５Ｎ、１５Ｎ/２Ｈ、および/または１３Ｃ/２Ｈ）を含むタンパク質サンプルを必要とする。この技術は、特定の生体分子に結合する化合物を同定する上で有用であり、その後それらの化合物を医薬研究プログラムのリード化合物として活用することができる。このようにこの技術は、タンパク質のＮＭＲによる構造に基づいた阻害薬のデザイン（時にＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲと呼ばれる）のための方法として活用できる。
【０００５】
したがってこの方法を用いてｕＰＡを検討することは望ましいことであろう。文献においていくつかの異なるｕＰＡコンストラクトから結晶構造が得られた(Spraggon, G., et al. (1995) Structure 3, 681-691;  Neinaber, V. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 7239-7248;  Katz, B. et al. Chemistry and Biology (2000) 7, 299-312; Zeslawska, E. et al. (2000) J. Mol. Biol. 301, 465-475)。
【０００６】
ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲのアプローチは一般に、多量（＞１００ｍｇ）の均一に１５Ｎ（２Ｈ）で標識されたタンパク質を必要とする。どの化学シフトがタンパク質中のどのアミノ酸に対応するのかを同定するために、配列特異的な割り当てが一般に必要である。したがって配列への共鳴の割り当てを行うために、均一に１５Ｎ、１３Ｃ（２Ｈ）で標識されたタンパク質を必要とする三重共鳴異種核ＮＭＲの実験を記録しなければならない。
【０００７】
ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲ（ＥＰ−Ｂ−０８６６９６７）の分野のエキスパートであるAbbot研究室によるこれまでの異種核ＮＭＲの研究は、昆虫細胞における発現に基づいた部分的１５Ｎ標識化の方法(Hadjuk et al., 2000)により作成されたタンパク質サンプルに頼るものであった。これらの研究では、ｕＰＡ阻害薬の研究および最適化へのＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲアプローチに関しては限定的な使用のみにとどまると思われる、部分的な均一でない生合成による標識化に一致する精度の低い１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを得た。この結果から配列への割り当てを行うことはできず、したがってリガンドの結合の実験で測定された、誘発された化学シフトの摂動を、タンパク質の配列に関して直接解釈することはできなかった。
【０００８】
当該技術の現在の状態は、細菌発現ホストにおいてしか、タンパク質の生合成による均一な１５Ｎ、１３Ｃ（またはこれらの核種と２Ｈとのあらゆる組み合わせ）標識化はできない。しかし多重にジスルフィド結合したタンパク質、例えばｕＰＡは、一般に細菌中の不溶性の形でしか発現されないため、上のＮＭＲ実験をサポートするためには、効率的な“リフォールディング”の方法が必要である。
【０００９】
封入体由来のｕＰＡのリフォールディングのための方法は以前に報告されており(Winkler et al., 1985)、後にこの方法を使用してタンパク質を作成し、Ｘ線結晶学によるタンパク質の構造研究に成功している (Spraggon et al., 1985; Zeslawska et al., 2000)。しかしZeslawskaらにより記載されたタンパク質生成アプローチは、ＮＭＲの研究に関する安定な同位体標識化を支持するための充分な量の天然のタンパク質は得られなかった（コントロールとしてＬＭＷ−ｕＰＡを使用して、湿った細胞ペレット1グラム当たり天然のタンパク質＜１０μｇと均等）。
【発明の開示】
【００１０】
したがって、例えばＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲを有効に行うことを可能とするような充分な量および質の、安定な同位体で均一に標識されたｕＰＡを生成する必要がある。
本発明に従って、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）もしくはその活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントを含む可溶性タンパク質を調製するための方法であって、ｐＨ  ８．５から１０．５のバッファーと前記タンパク質を接触させることを包含し、前記バッファーはレドックスペアを形成する還元剤および酸化剤を含み、その場合還元剤は酸化剤と比較して過剰に存在し、そしてその場合還元剤は少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、前記方法を提供する。
【００１１】
タンパク質は適切には、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）もしくはその活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントの修飾された形である。
【００１２】
本明細書において使用する場合、“ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の修飾された形”という表現は、該タンパク質の非天然の形をいい、この形はタンパク質が切断されている、変異されている、もしくはそれらに融合させたタンパク質を有する、および/または同位体元素標識を保有する、といういずれかの理由で異なる。変異タンパク質の例として、1つもしくはそれより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されたタンパク質、ならびに、欠失が配列末端にあるか、もしくは配列の中間の欠失であるかのいずれかである欠失変異、または1つもしくはそれより多くのアミノ酸を該配列に付加した挿入変異がある。
【００１３】
特に該タンパク質は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の非天然の活性なフラグメント、またはそのバリアントである。そのようなタンパク質の具体的な例は、ｕＰＡの非天然の切断型またはフラグメントのバリアント、例えば以下に記載するものである。特にそれらは、Ｎ末端領域で変異されている。加えて該タンパク質は、少数の、例えば１０までの、そして好ましくは５までのアミノ酸の置換を有する。
【００１４】
上に記載した条件は、リフォールディングにおいて従来より使用されるものより高い還元性、およびより高いｐＨであるが、例外的に高品質の修飾されたｕＰＡまたはｕＰＡ型タンパク質を高収率で提供する。特に得られるタンパク質はリフォールディングされ、その結果“天然様の”三次元構造および活性を有し、その点でこのタンパク質は天然に見出されるタンパク質および活性に非常に似ている。
【００１５】
該条件は、上に定義した特性を有する特定のリフォールディングバッファーの使用により得られる。
タンパク質は適切には、安定な同位体で均一に標識された形であり、これを例えばＮＭＲの研究に使用することが可能である。
【００１６】
特にバッファーは、ｐＨ  ９から１０、そして最も適切にはｐＨ  ９．５を有する。
レドックスペアは適切には、化学系の当業者に明らかであるように、試薬  例えばグルタチオン、システイン等の還元型および酸化型の形を包含する。特にレドックスペアは還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを包含する。還元剤は酸化剤と比較して有意に過剰に存在する。例えば、還元剤：酸化剤の比率は、少なくとも５：１、そして適切には５：１から１５：１の範囲である。還元剤：酸化剤の特定の比率は約１０：１である。
【００１７】
還元剤の濃度はまたかなり高くなくてはならず、少なくとも５ｍＭ、適切には８ｍＭから１５ｍＭ、そして好ましくは約１０ｍＭである。
該方法において使用するための特に好ましいバッファーは、５０ｍＭ  グリシン、１０ｍＭ  還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、１ｍＭ  酸化型  グルタチオン（ＧＳＳＧ）を包含する。
【００１８】
所望によりバッファーは以下の物質：非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ  ２０１）を例えば０．５−１Ｍで  好ましくは１Ｍで、アルギニン  例えばＬ、ＤもしくはＤ/Ｌアルギニンまたはそれらの塩、例えばＬ−アルギニン塩酸塩を例えば０．８−１．２Ｍで  例えば０．９Ｍで、Ｌプロリンを例えば０．８−１．２Ｍで  例えば１Ｍで、または３−[{３−コルアミドプロピル}ジメチルアンモニオ]１−プロパンスルホネート(Chaps)を例えば１０−３０ｍＭで  例えば２０ｍＭで、またはラウリルマルトシドを例えば０．００４−０．０１％ｗ/ｖで  例えば０．００６％ｗ/ｖとして、より選択される１つまたはそれより多くの添加剤をさらに包含する。
【００１９】
好ましくは添加剤はＮＤＳＢ  ２０１である。
この方法で得られたタンパク質は、充分な質の安定な同位体で標識したサンプルの作成を可能にし、ｕＰＡに関する完全な確固たるＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲプログラムの実施を可能にする。
【００２０】
好ましくは該タンパク質は、ヒトｕＰＡの修飾された形、特にその活性なフラグメント、またはこれらのいずれかのバリアントである。
本明細書において使用する場合“バリアント”という表現は、タンパク質の由来する塩基配列（この場合天然のｕＰＡ、そして好ましくは天然のヒトｕＰＡ）とは、該配列内の１つまたはそれより多くのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているという点において異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。アミノ酸の置換は、アミノ酸が大まかには類似する特性を有する異なるアミノ酸で置き換えられている“保存的”であると考えてよい。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸に置き換えられている場合である。大まかに言えば非保存的置換が、ポリペプチドの生物学的活性を変えることなく可能であることはほとんどないだろう。適切にはバリアントは、該塩基配列と少なくとも７０％同一、より適切には少なくとも８０％同一、例えば少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、そしてより好ましくは少なくとも９８％同一とする。
【００２１】
この場合の同一性は、例えばBLAST アルゴリズムまたはLipman-Pearsonのアルゴリズムを用いて、 Ktuple:2、ギャプペナルティ：４、ギャップ長ペナルティ(Gap Length Penalty)：１２、標準的なＰＡＭスコアリングマトリックスにて判定することができる(Lipman, D.J. and Pearson, W.R., Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, 1985, vol. 227, 1435-1441)。
【００２２】
“そのフラグメント”という用語は、完全なアミノ酸配列と同一の酵素活性を有する、所定のアミノ酸配列のあらゆる部分をいう。フラグメントは適切には、基本となる配列から少なくとも１００、そして好ましくは少なくとも２００の連続するアミノ酸を包含するものとする。
【００２３】
例えば本発明の方法を用いて、Nagai et al., (1985) Gene 36, 183-188.7に述べられているような完全長のヒトｕＰＡ配列のアミノ酸１４７−４０３に対応するフラグメント、好ましくはアミノ酸１４７−４１１に対応するフラグメントを生成することができる。該配列に使用した番号はこの文献に示されているとおりである。
【００２４】
本発明の方法に使用するための特に好ましいタンパク質は、酵素のプロテアーゼ活性を低減または排除するために、野生型の配列に対して１つまたはそれより多くの修飾を行なったそのようなフラグメントのバリアントを包含する。例えば、野生型ヒトｕＰＡ配列の３５６の位置に見出されるセリン残基の、セリン以外のアミノ酸、特にアラニンへの変異は、プロテアーゼ活性を排除することができることが見出されている。
【００２５】
加えて、本発明の特に好ましいタンパク質は、そうでなければ残っているＡ鎖ペプチドを触媒作用のあるＢ鎖につなぐことになるジスルフィド結合をはずすように変異されたシステイン残基を有する。特に野生型配列の１４８および２７８の位置のシステインを、ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲにより一層受け入れられる生成物を生成するように、例えばセリン基に適切に変異させる。
【００２６】
所望の場合にはまた、Zeslawska et al. (2000)  上記、により記載されているように、残基、特にメチオニン残基およびアラニン残基を該タンパク質のＮ末端に付加することができる。しかし本発明の方法を使用する場合、そのような付加は所望によるものとする。
【００２７】
特に本発明の方法に使用するタンパク質は、上に定義したようなｕＰＡもしくはそのフラグメントまたはバリアントを包含し、これを該タンパク質の精製に有用であるアミノ酸配列に融合させる。そのような配列の特定の例は、タグ配列、例えば、該タンパク質の末端、好ましくはＮ末端での少なくとも４つ、そして適切には少なくとも６つの連続するヒスチジン残基を包含する“hisタグ”である。あるいは、他の公知の精製配列、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ配列）をｕＰＡに融合させることもできる。
【００２８】
特に本発明に使用するリフォールディングのために精製されたタンパク質コンストラクトは、配列番号１のタンパク質またはそのバリアントであり、そして特に配列番号２のタンパク質である。
【００２９】
【化１】
2007528221.tif 000002
【００３０】
この配列において、各文字はアミノ酸に関する従来の一文字コードに従って使用している。
必要な場合は、このタンパク質コンストラクトは、精製の後半の段階でプラスミンによる（Ｋ１５８およびＩ１５９の間で）タンパク質分解により開裂して、最終的にＮＭＲ実験用に使用するＩ１５９−Ｌ４１１を生成する。
【００３１】
出発材料として使用するｕＰＡは、適切にはバッファーから沈殿させる前に変性させるが、この変性は例えば変性試薬  例えば８Ｍ  尿素または６Ｍ  グアニジン塩酸塩（Ｇｄｎ）を使用して達成してよい。
【００３２】
出発材料として使用するタンパク質は適切には、形質転換されたホスト細胞、例えば真核細胞または原核細胞において発現されたリコンビナントｕＰＡもしくはその活性なフラグメント、またはこれらのいずれかのバリアントである。特に好ましい態様において、ｕＰＡは原核細胞、そして特に細菌細胞  例えば大腸菌において発現される。この方法は、高レベルのタンパク質を得ることを可能にする。本発明のリフォールディングスキームの効能は、ＳＡＲ−ｂｙＮＭＲの研究に適する高品質の安定な同位体で標識された材料の調製にそのような材料を利用することを可能なものとする。
【００３３】
該タンパク質は、従来の方法を用いて封入体から回収してよい。
具体的にはホスト細胞、例えば大腸菌細胞を、所望のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換する。例えば核酸は、(Nagai et al., 1985 supra.)において示されたような野生型ｕＰＡ配列、または好ましくは上に記載したようなｕＰＡの活性なフラグメントもしくはバリアントをコードする、この野生型の修飾された形を包含してよい。
【００３４】
特に好ましい態様において、野生型配列中に存在する少なくともいくつかのコドンは、細菌細胞における発現に最適化するように修飾される。特に配列の開始部分に現れるコドン、例えば最初の２０コドンまで、より適切には最初の１０コドンまでを、当該技術分野において理解されているように細菌に対して最適化する、そして好ましくは大腸菌優先コドンとする。この修飾は高レベルの発現を達成することを確実にする。
【００３５】
その後発現されたタンパク質を、従来の方法を用いて培養細胞内の封入体より回収してよい。特に細胞は希釈液、特に約ｐＨ８．０のバッファー中に懸濁してよい。特定のバッファー溶液は、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および０．３Ｍ  ＮａＣｌを包含する。所望により、プロテアーゼ活性の結果としてのタンパク質の損失を低減するために、プロテアーゼ阻害薬をこの段階でバッファー中に含んでよく、必要な場合には例えばＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害薬の錠剤(Roche, Inc.)を加えてよい。
【００３６】
次に細胞を例えば乳化剤を用いて溶菌し、例えば遠心機を用いて分離してよい。次に上清および脂質層を除去した後に残っている固体残渣を、例えば、所望により変性剤  例えばグアニジン塩酸塩および／または尿素を含有するｐＨ７．５から１０．５の範囲の、適切には約ｐＨ８のバッファー溶液中に、適切に再度懸濁する。あるいは、この段階で使用するバッファー溶液は、所望の場合には本発明の方法で使用するリフォールディングバッファーを包含してよく、このバッファーも所望により変性剤、例えばグアニジン塩酸塩および/または尿素を含有してよい。
【００３７】
次に懸濁液を適切な条件下でインキュベーションして、封入体を可溶化する。適切な条件には、３０℃の温度での適切な時間、例えば１から３時間を含んでよい。次に上清を適切に取り出し、あらゆる残渣を例えば遠心により除去して、タンパク質溶液を残す。
【００３８】
所望により上清を取り出した後に残っている固体に、さらなる再度の懸濁/インキュベーションのステップを行って、収率をさらに高めてもよい。
所望の場合、この段階で使用するバッファーのｐＨは、８．５−１０．５の範囲、適切には約ｐＨ９を有する。所望により該タンパク質は、さらに精製せずに、以下に記載するような適当なリフォールディングバッファーと該タンパク質を接触させることにより、リフォールディングさせることができる。
【００３９】
しかし好ましくはこの溶液は、例えばカラムクロマトグラフィーを用いて精製する。精製タグを含めることは、所望のタンパク質が適切なバッファーで溶出するまでカラムに結合していることを意味するため、このような場合有用である。適切なカラム材料および溶出バッファーは、生化学系の当業者には明らかであろう。特にカラムは、溶液そのものに使用したものと同様のバッファーで処理し、続いて標的タンパク質を溶出するために、漸次より低いｐＨ、例えば４．５までの低いｐＨを有する１つまたはそれより多くのバッファーにより処理してよい。該バッファーは適切には、上に記載したような、例えば尿素またはグアニジン塩酸塩を含有する変性バッファーである。
【００４０】
適切なバッファーの例は、本明細書において以下にバッファーＢ、ＣおよびＤとして説明する。
次に溶出液中に存在する精製されたタンパク質のリフォールディングを、上に記載したように過剰の還元剤を含有する比較的高いｐＨ（８．５−１０．５）のバッファー中にこの溶出液を希釈することにより達成する。再生は適切には、再生（リフォールディング）バッファー中への急激な希釈というプロセスにより達成する。再生バッファーの容量の比率が、加えられるタンパク質溶液の容量の１０倍過剰より高く、そして好ましくは１００倍過剰より高く維持されるように、急激な希釈は、効率的な混合／撹拌を伴うより多量の再生バッファー中に、緩やかな流速  例えば約０．１ｍｌ/分でタンパク質の溶液をポンプで流入することにより達成してよい。撹拌は過剰な期間、例えば１時間から１週間の間、適切には２日またはそれより多くの間にわたり継続してよい。
【００４１】
その後の濃縮は、例えば限外濾過装置を用いて、続いて例えばｐＨ８．０の活性化バッファーでの透析により達成してよい。透析中に形成されるいかなる沈殿も遠心により除去する。得られる溶液は所望の再生タンパク質を含有しており、これは例えば、例えばベンズアミジンセファロース精製技術を用いてのカラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過により、残渣から分離することができる。使用してよい反応条件の特定の例を、本明細書において以下に説明する。
【００４２】
所望または必要な場合には、あらゆる生成物、例えば沈殿を、例えば上に記載したような変性剤を用いて変性させ、記載したようにリフォールディングさせることにより再利用してよい。
【００４３】
本発明の方法を用いて、ｕＰＡコンストラクトを非常に高レベルで不溶性の封入体として細菌中に発現させ、精製し、可溶化して、ラージスケールの重水素、１５Ｎおよび１３Ｃ標識化のための充分な量でｕＰＡコンストラクトを効率的にリフォールディングさせることができる。この方法を用いて、５０ｇ細菌ペーストから〜５ｍｇタンパク質の収量の回収ができる。
【００４４】
このように特定の側面において本発明は、ｕＰＡもしくは活性なフラグメント、またはｕＰＡ活性を有するこれらのいずれかのバリアントを包含するタンパク質を調製するための方法であって、前記タンパク質をコードする核酸で細菌ホスト細胞を形質転換し、形質転換した細胞を培養し、細胞内の封入体からタンパク質を単離し、溶液中のタンパク質をバッファー中で変性させ、そしてｐＨ８．５から９．５を有するバッファー中でタンパク質を再生/リフォールディングさせることを包含する前記方法であって、前記バッファーはレドックスペアを形成する還元剤および酸化剤を包含し、この場合還元剤は酸化剤と比較して過剰に存在し、そしてこの場合還元剤は少なくとも５ｍＭの濃度で存在する前記方法を提供する。
【００４５】
これらの方法を用いて得られる可溶性の再生タンパク質  例えばｕＰＡは、本発明のさらなる側面を形成する。
この再生した材料を、従来の方法を用いて生合成により標識し、ＥＰ−Ｂ−００８６６９６７に記載されているようにＮＭＲを用いてのｕＰＡに関するリガンドを同定するための方法に使用することができる。この方法においては標識タンパク質のＮＭＲ分析は、ｕＰＡに関するリガンドの可能性のある検査化合物の存在下で行う。あるいはリガンドを同定するためのその他の方法、例えばLadbury et al., ‘Biocalorimetry: Applications of calorimetry in the biological sciences’ (1996) (第１版) John Wiley & Sons Ltd,  London、または Ward et al. Progress in Medicinal Chemistry (2001), 38: 309-76により記載されているような、例えば等温滴定熱量測定および示差走査熱量測定を、この様式で得られた材料について行うことができる。
【００４６】
あるいは得られた材料は、Ｘ線結晶学により構造を解析するために使用することのできる結晶の生成を含む、その他の生化学、機能および構造の研究において使用することができる。以下、添付の図面を参照しながら実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例において、記載したバッファーを以下の表にまとめる。
【００４８】
【表１】
2007528221.tif 000003
【００４９】
すべてのバッファーは、使用直前に調製した。
実施例１
ｕＰＡクローニング
ｕＰＡをコードする配列は、ヒトｕＰＡをコードするｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。この研究で作成したコンストラクトは、触媒ドメインを包括的に含むヒトｕＰＡの切断型であった。このコンストラクトはまた、野生型ｕＰＡ配列に関して以下の修飾を有した：すなわちＭＨＨＨＨＨＨＲＳＡ．コドンを５’末端に付加した；Ｃ１４８ＳおよびＣ２７９Ａ変異をQuickchange変異誘発およびＰＣＲにより各々導入して、ジスルフィド結合をはずした；大腸菌コドン優先のコドンへのＱＣＧＱＫＴをコードする最初の６コドンのサイレント変異を、ＰＣＲにより達成した。このコンストラクトを、本明細書において以下ｕＰＡ−ＡＺという。このコンストラクトは、ｕＰＡ−ＡＺのプラスミンを介してのタンパク質分解活性において、先に結晶を得られることが示された(Zeslawska et al., 2000)ｕＰＡ１５９−４１１、Ｃ２７９Ａを包含するフラグメントが作成されるようにデザインされた。ｕＰＡをコードする配列の増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下のとおりであった：
【００５０】
【化２】
2007528221.tif 000004
【００５１】
次にＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ内に挿入し、この配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。次にｕＰＡをコードする配列を、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化することにより切り取り、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＴ７３．３＃６Ｈｉｓにて連結して、最終的な細菌発現ベクターを生成した。
【００５２】
大腸菌における発現およびタンパク質の精製
６Ｈｉｓ−ｕＰＡ１４７−４１１、Ｃ１４８Ｓ、Ｃ２７９Ａ(ｕＰＡ−ＡＺ)は、以下の条件下で大腸菌内において発現させた。ｐＴ７３．３６Ｈｉｓ−ｕＰＡ発現ベクターで形質転換したＢＬ２１Ｓｔａｒ(ＤＥ３)細胞を、１０μｇ/ｍｌ  テトラサイクリンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で培養した。震盪フラスコ培養において、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によりＯＤ６００ｎｍ  〜０．８にて発現を導入し、さらに４時間培養した後、遠心により培養液から細胞を集めた。
【００５３】
高密度の発酵のため、同一の形質転換細胞株を使用した。種(seeder)培養は、プレート培養から１０μｌのループ一杯の細胞を移し、２リットルのエーレンマイヤーフラスコ内の、１０μｇ/ｍｌ  テトラサイクリン、２．０ｇ/Ｌ  グルコースおよび１．０ｇ/Ｌ  １５ＮＨ４Ｃｌを含有するＭ９液体培地  ６００ｍｌ中に接種することにより調製した。この培養液を３７℃、オービタルシェーカー上で、２５０ｒｐｍで２９時間インキュベーションした。作用容積３０リットルのBraun Biostat C 発酵器に、以下の組成、単位ｇ/Ｌ：Ｋ２ＳＯ４,１．０；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．７５；Ｈ３ＰＯ４(８５％)、０．０５５；Ｎａ２ＳＯ４、０．０２５；グルコース、２５．０；１５ＮＨ４Ｃｌ、１０．０；微量の要素（以下に記載）、２ｍｌ/リットル；チアミン塩酸塩、０．００８ ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０２５；ＡｌＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、０．２；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．０８；Ｈ３ＢＯ４、０．０１；ＫＩ、０．２；ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ、０．１；Ｎａ２Ｍｏ４．２Ｈ２Ｏ、０．５；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．５；ＭｎＳＯ４、０．３７９；ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．０２、の規定の基礎培地  ２０リットルを入れた。
【００５４】
種培養  ６００ｍｌを、調製した培地中に接種し、多孔分散管を通して０．５vol/vol/分にて空気を泡立たせながら、３７℃に維持した。倍地中に溶解した酸素圧を、スターラーのスピードの自動コントロールにより、５０％飽和に維持した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４および５Ｍ  ＮａＯＨを用いて、ｐＨ６．６に維持した。
【００５５】
培養液がＯＤ５５０ｎｍ＝５．０に達した時点で、ＩＰＴＧを、最終濃度  ０．４ｍＭとなるように加えることによりｕＰＡ−ＡＺの発現を誘発した。生物量がＯＤ５５０ｎｍ＝２０に達するまで、このプロセスをさらに８時間継続した。細胞ペーストを冷却遠心機での遠心により集め、この細胞ペーストを抽出まで−８０℃で保存した。
【００５６】
不溶性ｕＰＡ−ＡＺの発現は、大腸菌細胞内の封入体の存在について顕微鏡によりチェックした。細菌総タンパク質のパーセントとしての発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により決定した。
【００５７】
細胞ペースト  ５０ｇを解凍し、ホモジェナイズしてバッファーＡ  ５００ｍｌに再度懸濁した。
次に細胞懸濁液を、Emulsiflex乳化機に２回通して溶菌し、２５，０００ｒｐｍで３０分遠心した。上清を廃棄し、脂質層をペレット上層からそっと掻き取り、廃棄した。ペレットを新しいバッファーＡ中にホモジェナイズして再度懸濁し、２５，０００ｒｐｍで３０分再度遠心した。次にペレットを変性バッファーＢ  ２００ｍｌに再度懸濁（〜５ｍｌ/ｇ  湿ったペレット）し、水浴中で３０℃にて、時々混合しながら１時間インキュベーションして、封入体を可溶化し、２５，０００ｒｐｍで１時間遠心した。上清をデカントして分離した後、２５ｋｒｐｍで３０分再度遠心し、以下のように精製した。
【００５８】
精製：
上の上清の半量を、バッファーＢで予め平衡化した３０ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＸＫ２６）上にのせ、１０ＣＶのバッファーＢ、次に１０ＣＶの変性バッファーＣにて洗浄した。次にこのカラムを逆さにして、ｕＰＡ−ＡＺを５ＣＶの変性バッファーＤで溶出した。その後上清の残りの半量についても上の通りに行い、溶出液をプールした。この段階で溶出液のプールは６７ｍｌ、およびＡ２８０ｎｍ＝３．７（〜２．５５ｍｇ/ｍｌ、したがって総ｕＰＡ−ＡＺ  〜１７０ｍｇ）であった。カラムに通して流したバッファー中にはｕＰＡ−ＡＺは観察されなかった。
【００５９】
リフォールフェィング（急激な希釈）
精製した変性ｕＰＡ−ＡＺを、高速遠心機の４５Ｔｉローターにて、４５ｋｒｐｍで３０分遠心し、凝集タンパク質のあらゆる痕跡を除去した。次に上清をバッファーＥ  ２０００ｍｌ中に〜１/３０倍に希釈し、最終的なタンパク質濃度  〜１００μｇ/ｍｌを得た。急激な希釈は、４℃でマグネティックスターラーで高回転数で撹拌している４Ｌビーカー中に、緩やかな流速（〜０．１ｍｌ/分）でタンパク質溶液をポンプで流入することにより達成した。撹拌は、すべてのタンパク質を移した後回転数を下げ、混合液を４℃で〜５日間放置した。わずかな沈殿が目視された。
【００６０】
活性化：
リフォールディング混合液を、４℃（〜１２時間）で10k NMWL Pellican濃縮器を用いての限界濾過により濃縮した後、活性化バッファー（上記バッファーＦ）に対してo/n透析した。透析により、総タンパク質の〜４０％を含有する大きな沈殿の生成物を得た。透析液を４５Ｔｉにて４５ｋｒｐｍで３０分遠心して、不溶性のタンパク質およびあらゆる凝集物を除去した。
【００６１】
ｕＰＡｆ（１ｍｇ/ｍｌ）１ｍｌ当りプラスミン懸濁液(Roche)１μｌを加え、４℃で一晩インキュベーションした。このインキュベーションの結果、タンパク質コンストラクトがタンパク質分解により切断され（Ｋ１５８とＩ１５９の間）て、フラグメントＩ１５９−Ｌ４１１（活性化ｕＰＡ−ＡＺ）を生成した。
【００６２】
ベンズアミジンセファロースによる精製：
次にこの溶液をベンズアミジン−セファロース(Sigma)カラム（Ｖｔ＝１５ｍｌ、ＸＫ１６、バッファーＦで予め平衡化）にかけ、フラットなベースラインが得られるまでバッファーＦで洗浄した。
【００６３】
活性化ｕＰＡ−ＡＺを、活性化バッファー中の５ｍＭ  ベンズアミジンを用いて逆方向にしたカラムから溶出させた。これを２つのバッチにした。
ゲル濾過：
活性化ｕＰＡ−ＡＺ溶出ピーク分画をプールし、〜５ｍｌの２つのバッチにて、Superdex ７５カラム１６/６０にかけた。カラムはバッファーＧで予め平衡化しておき、流した。ただ１つのタンパク質のピークが観察された。
【００６４】
次に活性化ｕＰＡ−ＡＺピーク分画を適当な濃度１−１５ｍｇ/ｍｌに濃縮して使用した、または１−５ｍｇ/ｍｌに濃縮して急速冷凍し、−２０℃で保存した。
ｕＰＡ活性のアッセイ：
すべてのｕＰＡ活性のアッセイは、ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ  ＵＫアッセイ(製品番号. ２４４、American Diagnostica Inc.)を用いて行い、ヒトＬＭＷ−ｕＰＡ(製品番号１２５、American Diagnostica Inc.)に匹敵する活性を有することを発見した（データは示さない）。典型的には冷却した０．５容量のアッセイバッファー（５０ｍＭ  Tris  ＨＣｌ、ｐＨ８．３）を０．５容量の冷却した基質溶液（０．２ｍｇ/ｍｌ  Ｓ−２４４４）および冷却した０．５ｍｌ  検査サンプルと混合した後、２０℃でインキュベーションした。その後４０５ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて、時間間隔を置いてまたは継続的に、のいずれかで記録した。
【００６５】
リフォールディングされた活性化ｕＰＡ−ＡＺの活性と、市販にて入手可能なＬＭＷ  ｕＰＡ(製品番号２４４、American Diagnostica Inc.)を含むスタンダードの活性、およびKatz et al. (2000)に記載されたように生成した材料の活性とのタイムコースのアッセイにおける比較は、このリフォールディングされた材料が本質的に天然のの活性レベルを有することを表す、ほぼ同一の活性を示した。
【００６６】
リフォールディングされた活性化ｕＰＡの特徴づけ
還元および非還元の条件下でのリフォールディング混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ただ１つのバンドしか非還元のサンプルについて観察されず、凝集物のバンドはなかったこと、そしてジスルフィド結合したタンパク質について予測されるように、非還元のバンドは還元のバンドと比較して、わずかに見かけ上より低分子量に移動していた（図２）ことから、本質的にすべてのタンパク質がモノマーでありジスルフィド結合していることを示唆する。精製したリフォールディングされたｕＰＡは、動的光散乱およびゲル濾過により特徴づけを行ったが、双方の分析とも文献から予測されるようにモノマーの状態と一致する（データは示さない）。ＥＳＩ質量分析計により得られたｕＰＡの実測値の質量（２８３９９．０）は、１質量ユニット内に５つのジスルフィド結合を有する活性化ｕＰＡコンストラクト（ｕＰＡ１５９−４１１、Ｃ１４８Ｓ，Ｃ２７９Ａ）とした時の理論値の質量（２８３９８．１２）にマッチした（データは示さない）。
【００６７】
実施例２
ｕＰＡの核磁気共鳴（ＮＭＲ）の研究
ｕＰＡに関するＮＭＲ実験は、三重共鳴（１Ｈ/１３Ｃ/１５Ｎ）、５ｍｍの単回磁場勾配(single-gradient 5mm)クライオプローブを装着したBruker Avance 600 MHzシステムにて３０３Ｋで行った。活性化ｕＰＡ−ＡＺサンプルは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に提供した。ＮＭＲの実験の前にタンパク質サンプルを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＮＭＲバッファー、ｐＨ７．３中に、Millipore社(Billerica, MA, USA)からのAmicon Ultra-15遠心フィルター(centrifugal filter)装置を用いて、充分に透析した。タンパク質濃度は０．１ｍＭであった。５％(ｖ/ｖ)Ｄ２Ｏをロック用の溶媒として加えた。
【００６８】
１５Ｎ−１Ｈ横緩和最適化法−異種核一量子相互作用(heteronuclear single-quantum correlation)（ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣ）(Pervushin et al., J. Biomol. NMR, 12: 345-348, 1998)の実験を、プロトンディメンションにおいて８５ミリセカンド、および窒素ディメンションにおいて２５ミリセカンドの展開時間で記録した。総データ記録時間は１８分だった。データセットはプログラムｎｍｒＰｉｐｅ(Delaglio et al., J. Biomol. NMR, 6: 277-293, 1995)で処理し、プログラムＳＰＡＲＫＹ(Goddard and Kneller, University of California, San Francisco, USA)で分析した。
【００６９】
このプロトコルを用いてｕＰＡについて得られたスペクトルは、以前に記録されたスペクトル（図１Ａを参照のこと）とは対照的に非常に高精度であり、このサイズのタンパク質に対して予測されるピーク数を示す（図１Ｂを参照のこと）。このことは、タンパク質がリガンドと相互作用する場合に、タンパク質のあらゆるアミノ酸における変化をモニターすることが可能であることを意味するため、極めて重要である。
【００７０】
事実ＮＭＲアッセイは、公知の阻害薬の存在下でのタンパク質の環境の変化を検出するのための充分な感度があることが見出されてきた。
本発明の方法により得られたｕＰＡのもう１つの重要な利点は、１５Ｎおよび１３Ｃで均一に標識されたｕＰＡのサンプルにおいて得られた三重共鳴異種核ＮＭＲスペクトルから、配列への共鳴の割り当てを得ることができたことである。このことは、化学シフトの摂動を経験しているアミノ酸残基をｕＰＡの３次元構造上にマッピングすることにより、阻害薬の結合部位を同定することを可能にした。
【００７１】
さらにＮＭＲアッセイは、いくつかの新規阻害薬の同定において、また他のスクリーニング法からのヒットを評価することにおいて使用された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、Abbott (左図; Hajduk et al., J. Med. Chem., 43: 3862-3866, 2000)により記録されたｕＰＡの核磁気共鳴（ＮＭＲ）と、本発明の方法により得られたｕＰＡを用いて得られたスペクトルデータ（右図）との比較を示す。ｙ軸およびｘ軸は、各々窒素ディメンションおよびプロトンディメンションにおける化学シフトをｐｐｍ単位で表す。
【図２】図２は、還元および非還元の条件下で活性化されリフォールディングされたｕＰＡ−ＡＺの比較を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示す。活性化されリフォールディングされたｕＰＡ−ＡＺのサンプル（〜１０マイクログラム）は、還元（２０ｍＭ  ＤＴＴ）または非還元（ＤＴＴなし）のいずれかの条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で沸騰させることにより変性させ、ダブルのサンプルを１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｎｏｖｅｘゲル(Invitrogen, Inc)上で分析し、クーマシーブルーで染色した。この結果は、還元型および非還元型の双方のレーンにただ１つの主要なバンドを示した。非還元のサンプルの観察された泳動距離は、還元のサンプルの値よりわずかに長く（見かけより低分子量）、分子内のジスルフィド結合の存在と一致する。非還元のレーンに見かけ上より高分子量のいかなるバンドも存在しないことは、分子間ジスルフィド結合が存在しないことを示し、間違ってフォールディングされたジスルフィド結合による凝集が存在しないことを示唆した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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