(57)【要約】本発明は、精子細胞の生理学的特性を保護、回復、または改善するための、シャペロン受容体に結合することができるポリペプチド、組成物および方法に関する。さらに具体的には、本発明は、シャペロンポリペプチドと接触する精子細胞の運動能、生存率、受精能、冷却、凍結、および解凍に対する保護に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子細胞の生理学的特性を保存、回復、または改善するための、シャペロン受容体に結合することができるポリペプチド。
【請求項２】
シャペロンポリペプチド、熱ショックタンパク質(HSP)、ストレスショックタンパク質、グルコース調節性タンパク質(GRP)、SecA、SecB、SecY、GroEL、マトリックスタンパク質、精子細胞シャペロン受容体に結合することができる分子、またはその類似体もしくは断片からなる群より選択される少なくとも1種類の分子を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
HSPがHSP60である、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項４】
GRPがGRP78である、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項５】
マトリックスタンパク質が上皮細胞の表面タンパク質である、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項６】
上皮細胞が卵管上皮細胞である、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項７】
生理学的特性が、運動能、運動特性、受精能、卵母細胞への結合、卵母細胞との融合、生存率、先体の完全性、先体反応、成熟、または冷却、凍結もしくは解凍の少なくとも1つに対する耐性のうちの少なくとも1つである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項８】
精子細胞が哺乳動物精子細胞である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項９】
精子希釈培地1mlあたり0.1ng〜100ngの濃度である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１０】
精子希釈培地1mlあたり1.0ng〜25ngの濃度である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１１】
精子細胞の少なくとも1つの生理学的特性を保存、回復、または改善するのに有効な量の、シャペロン受容体に結合することができる少なくとも1種類のポリペプチド、および生理学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１２】
前記量が精子希釈培地1mlあたり0.1ng〜100ngである、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
精子細胞とシャペロン受容体に結合することができるポリペプチドとを接触させる工程を含む、精子細胞の生理学的特性を保存、回復、または改善するための方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが、シャペロンポリペプチド、熱ショックタンパク質(HSP)、ストレスショックタンパク質、グルコース調節性タンパク質(GRP)、SecA、SecB、SecY、GroEL、マトリックスタンパク質、精子細胞シャペロン受容体に結合することができる分子、またはその類似体もしくは断片からなる群より選択される少なくとも1種類の分子を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
接触工程が、新鮮な精液、凍結精液、または解凍精液において行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
精子細胞の生理学的特性を保存、回復、または改善するための組成物の調製における、シャペロン受容体に結合することができるポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
a)発明の分野
本発明は、精子細胞(最も具体的には、哺乳動物の精子細胞)の生理学的特性(例えば、生存率、運動能、受精能、または冷却、凍結もしくは解凍に対する耐性)を保存することができるタンパク質の一群に関する。また、本発明は、このようなタンパク質を含む組成物、および精子細胞の生理学的特性を保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
b)先行技術の説明
精子細胞(特に、哺乳動物の精子細胞)の生理学的特性は様々な環境要因によって変化することが、長い間、自然界で観察されてきた。
【０００３】
精子は高度に分化した運動性細胞であり、新たな子孫が生まれる父親のゲノム部分と母親のゲノム部分との出会いを担っている。哺乳動物では、射精後に、精子細胞は雌生殖路を移動し、様々な生理学的改変を受ける。これらの変化が起こると、精子は受精に必要な特徴を獲得する。この現象は受精能獲得として知られる。子宮は、子宮の液体の働きによって受精能獲得プロセスに関与し、子宮収縮によって精子の輸送に関与する。精子は子宮卵管境界を横断すると、あらたな環境すなわち卵管に暴露される。交配は排卵の数時間前に行われることがあるので、この小さな管状の器官には、いつ排卵が起こっても、生きた能力のある十分な数の精子を卵子に送るという、受精プロセスにおいて達成すべき重大な仕事がある。この器官から生じる液体、特に、上皮細胞から分泌されるタンパク質は、精子の運動能、生存能力を維持し、精子受精能獲得の調節を助けることが知られている。また、いくつかの哺乳動物種において、精子細胞は、精子細胞の貯蔵庫を作る、これらの卵管上皮細胞(OEC)に由来する頂端原形質膜(apical plasma membrane)に結合することも知られている。ウサギ、ウマ、およびウシでは、精子とOECからの頂端膜抽出物との同時インキュベーションによって得られた結果から、上皮細胞と精子細胞が直接接触することは運動能および生存率の維持に重要であり、受精能獲得を遅らせることが分かった。精子とOECとの生化学的なつながりは、精子レクチンと、種によって決まる卵管上皮フコース残基との相互作用によって引き起こされると考えられる。しかしながら、これらの観察は、卵管が受精を確実に成功させる細胞機構を理解するのに十分でない。
【０００４】
精液それ自体または子宮もしくは卵管の液体に含まれる数種類の因子が受精を自然に成功させるのに必要不可欠なものであると考えられたが、補助受精プログラムのために精子細胞が操作される場合に、この状況は大きく変化することがある。例えば、精子細胞は一時的に冷却することができ、さらには受精前に凍結解凍することができる。精子の損傷は、多くの場合、選択的透過性の喪失、原形質膜、先体外膜およびミトコンドリアの完全性の喪失として現れる。これらの発現には、運動能または生存能力の喪失、エネルギー産生の低下、膜脂質組成物への変化、卵母細胞に結合および融合する能力の喪失、ならびに膜の動的な動きへの変化が伴う。
【０００５】
精子を人工授精に使用するために、透過性などの選択的生理学的特徴の喪失、および原形質膜、先体外膜、さらにはミトコンドリアの完全性の喪失を阻止および修復することが必要とされている。
【０００６】
精子細胞の生理学的特性への損傷を阻止し、さらには修復するのに使用することができる因子、組成物、および方法を開発することが必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的の1つは、精子細胞の生理学的特性を保存または回復するための、シャペロン受容体に結合することができるポリペプチドを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、精子細胞の少なくとも1つの生理学的特性を保存または回復するのに有効な量の、シャペロン受容体に結合することができる少なくとも1種類のポリペプチド、および生理学的に許容される担体を含む組成物を提供することである。シャペロン受容体結合ポリペプチドは、精子希釈培地1mlあたり0.1ng〜100ngの量で見られる。好ましくは、シャペロン受容体結合ポリペプチドの濃度は、精子希釈培地1mlあたり1.0ng〜25ngである。もう一度言えば、本明細書で使用する希釈培地は、生殖器系によって天然に生成される精液でもよく、受精、成熟、インキュベーション、凍結、解凍、または雌生殖路への移動の準備において精子細胞または精液を希釈するために当技術分野において一般的に知られている他の任意の希釈剤でもよい。
【０００９】
当業者であれば、シャペロン受容体結合ポリペプチドは、直接(例えば、希釈していない精液試料に)適用することによって、精子細胞の生理学的特性を保存または回復するために使用できることも理解すると思われる。
【００１０】
本発明の別の局面によれば、精子細胞とシャペロン受容体に結合することができるポリペプチドとを接触させる工程を含む、精子細胞の生理学的特性を保存または回復する方法が提供される。
【００１１】
本発明の様々な目的を実施するのに使用することができる1種類またそれ以上のポリペプチドは、シャペロンポリペプチド、熱ショックタンパク質(HSP)、ストレスショックタンパク質、グルコース調節性タンパク質(glucose regulated protein)(GRP)、SecA、SecB、SecY、GroEL、マトリックスタンパク質、精子細胞シャペロン受容体に結合することができる分子、またはその類似体もしくは断片からなる群より選択される少なくとも1種類の分子を含んでもよい。
【００１２】
好ましくは、ポリペプチドは、例えば、HSP60、GRP78、または卵管上皮細胞などの上皮細胞の表面タンパク質であるマトリックスタンパク質でもよい。
【００１３】
必要または状況に応じて、前記の方法は、新鮮な精液、凍結精液、または解凍中の精液もしくは解凍した精液において実施することができる。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、精子細胞の生理学的特性を保存または回復するための組成物の調製における、シャペロン受容体に結合することができるポリペプチドの使用である。
【００１５】
本発明に従って保存または回復することができる生理学的特性は、運動能、運動特性、受精能、卵母細胞への結合、卵母細胞との融合、生存率、先体の完全性、先体反応、成熟、または冷却、凍結もしくは解凍の少なくとも1つに対する耐性のうちの少なくとも1つである。
【００１６】
好ましくは、生理学的特性を保存および/または回復することができる精子細胞は、哺乳動物の精子細胞である。
【００１７】
本発明の別の目的によれば、精子細胞の生理学的特性を保存または回復するための組成物の調製における、シャペロン受容体に結合することができるポリペプチドの使用が提供される。
【００１８】
好ましい態様の説明
本発明は、今から、本発明の好ましい態様が示される添付の図面を参照して、下記でさらに詳細に説明される。しかしながら、本発明は多くの異なる形で具体化することができ、本明細書に示した態様に限定されると解釈すべきでない。逆に、これらの態様は、本発明の開示が完璧かつ完全なものになり、本発明の範囲を当業者に完璧に伝えるように示される。
【００１９】
大規模な研究により、本発明者らは、操作前または操作中に精子細胞表面にあるシャペロン受容体に結合するポリペプチドと接触させると、精子の生理学的特性を保存、回復、さらには改善できることを発見した。
【００２０】
本発明に従って精子細胞の生理学的特性(例えば、生存率、受精能、運動能、先体完全性、卵母細胞への結合および融合、または成熟などがあるが、これに限定されない)を保存および/または回復するのに使用することができる分子シャペロンまたはシャペロン受容体結合ポリペプチドのうち、熱ショックタンパク質(HSP40、HSP60、HSP70、およびHSP90)、ストレスショックタンパク質、マトリックスタンパク質、SecA、SecB、SecY、DnaK、DnaJ、TRiC、GroES、およびGroELからなる群より選択される、哺乳動物または微生物のシャペロンタンパク質、その類似体または断片を考慮に入れることができる。
【００２１】
タンパク質の折り畳みはタンパク質それ自体によってのみ支配され、タンパク質の中にはこのプロセスを助けるものもあることが当技術分野において知られている。この助けは、折り畳みプロセスの間に標的タンパク質と結合するタンパク質(シャペロン(またはシャペロニン)と呼ばれる)からなる。しかしながら、折り畳みが完了すると(または折り畳みが完了する前でさえ)、シャペロンはその作業中のタンパク質分子から離れ、別のタンパク質分子の折り畳みを助け続ける。
【００２２】
いくつかの方面の証拠から、シャペロンの主な機能は凝集の阻止である可能性があることが示唆されている。例えば、哺乳動物細胞の「パワー・プラント(power plant)」細胞小器官に見られるが、他の点ではGroELと似ているシャペロンは14のタンパク質鎖からなり、2つのドーナツが互いの上部に積み重なるように並べられていることが示されている。シャペロンがついたタンパク質は2つのドーナツの穴の中に位置し、凝集する可能性のある他の分子から安全に隔離されている。
【００２３】
本発明はまた、本質的に純粋であり、精子の生理学的特性を活性化、回復、または保存することができるタンパク質性の精子シャペロン受容体結合ポリペプチドと、任意の適切な賦形剤、希釈剤、培地または液体担体を含む薬学的調製物または組成物に関する。適切な賦形剤の例は、培地または他の生理学的塩溶液である。
【００２４】
組成物または調製物は、それ自体は既知の方法に従って調製される。本発明による組成物または調製物は、インビトロと同様にインビボで不妊治療において使用することができる。
【００２５】
さらに、本発明は、試料を本発明によるシャペロンタンパク質で処理することによって、精子の潜在的な受精能、運動能、精子-卵の結合、および受精を完了するのに必要な他の生理学的特性を保存、回復、または改善する方法を含む。
【００２６】
本発明の1つの態様によれば、精子細胞の生理学的特性の保存剤または改善剤としてのシャペロンタンパク質が提供される。これは天然のものでも合成のものでもよく、以下の用途のために有用である：a)人工授精または体外受精もしくは類似する補助生殖技術のための精液処理のある時点において精子を懸濁または再懸濁するのに用いられる液体への受精前添加剤としての用途；b)自己投与用の受精前膣剤の活性成分としての用途；c)精液試料の精子1つ1つまたは精子の集団の潜在的な受精能に関した情報を得るための、精子に存在するシャペロンタンパク質の量の定量に用いられる試薬の主成分としての用途；およびd)潜在的な受精能の予測に有用な抗体を作成するための抗原としての用途。
【００２７】
1つの態様において、卵に受精させるために新鮮な精子または凍結解凍精子の能力を保存、回復、または改善するのに、天然または合成のシャペロンタンパク質が用いられる。人工授精の前に、新鮮な精子または凍結解凍精子のアリコートと、精子の受精能力を高めるシャペロンタンパク質を混合することができる。または、分子シャペロンは、凍結前に精子細胞を含むストロー(straw)に直接添加することができる。
【００２８】
別の態様において、天然または合成のシャペロンタンパク質またはポリペプチドを、性交の直前に半固体、液体、または発泡体として腟内に投与される受精前組成物として使用することができる。組成物は、生物学的活性および生理学的特性を維持する適切な担体に懸濁された任意のシャペロンタンパク質またはポリペプチド、その類似体または断片を活性成分として含んでもよい。この担体は、外子宮頸口(external cervical os)近くで適切な分散をもたらし、射精後の活性成分と精子との有効かつ迅速な仕切りを容易にする。
【００２９】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されると思われる。実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を例示するために示されるものである。
【００３０】
実施例I
卵管上皮細胞におけるGRP78およびHSP70の位置
材料および方法
卵管上皮細胞の培養
屠殺場で発情期初期の雌ウシから卵管を集め、輸送中、4℃に保ち、実験室で他の組織から切断した。卵管をはがし、上皮細胞を含む、出てきた液体を集めることで、卵管上皮細胞を回収した。5％FBS(Medicorp, Montreal, Quebec, Canada)を含むハンクス培地(13.7mM NaCl、0.5mM KCl、450μM NaHCO3、110μM Na2HPO4、40μM KHPO4、5.5mM D-グルコース、5 mM PIPES(NaOHでpH 7.4))中で3回連続して沈降させることで、これらの細胞を洗浄し、10％仔ウシ血清(CBS);(ICN, Costa Mesa, California, USA)、0.2mMピルビン酸塩、および50μg/mLゲンタマイシンを添加したTCM199(アール塩(Earle's salts)/Invitrogen(商標), Burlington, On, Canada)に溶解して38.5℃、5％CO2で培養した。
【００３１】
アフィニティ沈殿によるHSP60およびGRP78の頂端表面局在
同定タンパク質の頂端表面局在を、3匹の雌ウシからの培養OECのビオチン化「浮遊(swimming)」小胞を用いて確認した。細胞が繊毛性頂端表面を暴露することによって浮遊小胞を形成するために、頂端表面のみをビオチン化することができた。頂端表面ビオチン化、同定タンパク質の沈殿およびブロットアッセイ法は以前に述べられたように行った(Gorza and Vitadello, 2000, FASEB J., 14: 461-475)。簡単に述べると、培養OEC小胞を冷PBS, pH 8.0で3回洗浄し、次に、1mg Sulfo-NHS-LC-ビオチン(Pierce,Rockford, IL)/mlの存在下でPBSに溶解して、氷上で20分間インキュベートした。次に、これらを冷PBSで3回洗浄した。試料中の総タンパク質濃度は、TCAで予め沈殿させ、再可溶化したアリコートに対するBCAタンパク質アッセイ法(Pierce)によって求めた。ビオチン化小胞を、プロテアーゼインヒビター(17μg/ml PMSF,2μg/mlロイペプチン,0.7μg/mlペプスタチン)を添加した500μl RIPA緩衝液(0.15M NaCl, 1％ Triton X-100, 0.5％デオキシコール酸ナトリウム, 0.1％SDS, 50mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.6)中で30分間ホモジナイズした。細胞破片を取り除くために、試料を16000×gで20分間遠心分離した。次いで、ビオチン化タンパク質を濃縮し、その後に、特異的タンパク質に対する抗体を用いて、イムノブロッティングを行った。
【００３２】
固定化Neutravidin(商標)ビーズ(Pierce)を溶解産物に添加し、混合物を4℃で一晩インキュベートした。ビーズを、PBS+プロテアーゼインヒビターで4回洗浄した。ビーズを1-Dローディング緩衝液に再懸濁し、100℃で10分間加熱した。抽出タンパク質を1-D SDS-PAGEにかけ、ニトロセルロース膜に電気転写した(Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354)。5％(w/v)脱脂粉乳を含むTween 20(商標)添加のTris緩衝食塩水(TBST; 154 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.4, 0.1％ Tween20(商標))中で、膜を1時間インキュベートすることによって、非特異的結合部位をブロックした。特異的タンパク質の存在を、以前に同定されたタンパク質に対する市販抗体を用いたイムノブロットによって調べた。膜をTBSTで3回洗浄した。次いで、膜を、GRP78またはHSP60に対するモノクローナル抗体と室温で1時間インキュベートした。再度、膜を洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgGと45分間インキュベートした。最後に、TBST溶液を30分間に6回交換することで、膜を大規模に洗浄した。免疫反応性のバンドを、ECLキット(商標) (Amersham Bioscience Corp. Baied'Urfe, PQ, Canada)を使用し、製造業者の指示に従った高感度ケミイルミネッセンスおよびフィルムオートラジオグラフィーによって視覚化した。
【００３３】
免疫沈降によるタンパク質の頂端表面局在化
特異的タンパク質の免疫沈降(IP)を行い、その後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを用いて親和性ブロットを行った。この実験では、前記の項に記載のように、ビオチン化細胞溶解産物を作成した。この溶解産物を、1μgの非免疫マウスIgG(Sigma)および35μgのプロテインGセファロースビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて1時間、予め清澄化し、洗浄し、RIPAに再懸濁した。次に、3分間、3000×gで遠心分離することによって、ビーズを取り除いた。1マイクログラムの抗HSP60または抗GRP78を添加し、試料を2時間インキュベートした。次いで、セファロースビーズを添加し、試料をもう2時間インキュベートした。次に、試料を、3000×gで3分間、遠心分離し、ビーズをRIPA緩衝液で3回洗浄し、次いで、1-D電気泳動試料緩衝液中で100℃で5分間加熱した。タンパク質をSDS-PAGEにかけ、ニトロセルロース膜に転写し、HSP60およびGRP78のビオチン化を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを用いて評価し、ECLおよびフィルムオートラジオグラフィーによって明らかにした。
【００３４】
間接免疫蛍光法によるHSP60の細胞表面局在化
3匹の雌ウシからの卵管上皮細胞を2日間培養し、この後に培地を交換した。次いで、細胞をさらに3日間培養で維持した。小胞懸濁液の半分を、2mg/mL BSAを添加したヘペス緩衝タイロード培地(TLH)(TLHB)で3回洗浄した。この後、これらを、5μg/mLの抗HSP60マウスモノクローナル抗体、またはDr.Jonathan Lytton(Department of Biochemistry & Molecular Biology University of Calgary, Alberta, Canada)から提供された筋/小胞体カルシウムATPase(Sarcoplasmic/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase:SERCA)のアイソフォーム2および3に対するウサギポリクローナル抗体の存在下で1時間インキュベートした。次に、これらをTLHBで2回洗浄し、それぞれ、フルオレセイン-イソチオシアネート(FITC)に結合したヤギ抗マウスIgGまたはヤギ抗ウサギIgGと45分間インキュベートした。最後に、小胞をTLHBで6回洗浄し、ポリ-L-リジンでコーティングしたカバーガラスに置き、ガラススライドに載せた。小胞懸濁液のもう半分を、0.1％PVP40を含むTLH(TLHP)で3回洗浄し、3.7％ホルムアルデヒドを含むPBSで室温で10分間固定した。次に、これらをTLHPで3回洗浄し、0.2％Triton X-100(商標)を含むTLHPで10分間透過化処理した。次いで、細胞をTLHPで3回洗浄し、TLHBで3回洗浄した。HSP60またはSERCAに対する間接免疫蛍光法を、非透過化処理細胞について記載されたように実施した。
【００３５】
GRP78-HSP60相互作用
HSP60およびGRP78の免疫沈降を細胞溶解産物に対して行い、試料をSDS-PAGEにかけ、本文書において前述したものと同じプロトコールを正確に用いて転写した。IP試料中のGRP78またはHSP60の存在は、ウェスタンブロッティングについて前述したプロトコールを用いて、HSP60 IP試料の膜と抗GRP78モノクローナル抗体でブロッティングすることによって(逆もまた同じく)評価した。
【００３６】
結果
アフィニティ沈殿によるHSP60およびGRP78の頂端表面局在
GRP78は主に小胞体に局在することが知られており、HSP60は主にミトコンドリアに局在することが言われており、精子はインビボでは両細胞小器官に到達できないので、これらのタンパク質が卵管上皮細胞の頂端表面に局在しているかどうか確認するために実験を行った。HSP60およびGRP78の頂端細胞表面局在は、アフィニティ「プルダウン(pull-down)」法を行い、その後に、抗GRP78モノクローナル抗体または抗HSP60モノクローナル抗体を用いてイムノブロットを行うことによって確認した。頂端タンパク質しかビオチン化されないOEC小胞の細胞表面ビオチン化の後、これらの2種類のタンパク質はニュートラアビジン結合ビーズでプルダウンされた。このことから、GRP78およびHSP60は両方とも卵管上皮細胞の頂端表面で発現していることが示唆される(図1)。
【００３７】
免疫沈降によるタンパク質の頂端表面局在
反対に、GRP78およびHSP60が効果的にビオチン化されているかどうか確かめるために、細胞表面ビオチン化OECからのタンパク質抽出物を、抗GRP78モノクローナル抗体または抗HSP60モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、これらのビオチン化状態を、SDS-PAGEおよびペルオキシダーゼ結合アビジンを用いた転写で評価した。抗GRP78モノクローナル抗体は、ビオチン化78kDaタンパク質を免疫沈降した(図2A左側)。このタンパク質は、抗GRP78モノクローナル抗体を用いた同じ膜上でのウエスタンブロットによって確かめられたようにGRP78であることが分かった(図2A右側)。同様に、HSP60もビオチン化されているように見えた(図2B)。さらに、本発明者らの研究室での以前の結果から、本発明者らの市販の抗HSP60モノクローナル抗体は、予めビオチン化されている頂端原形質膜タンパク質に対するウエスタンブロットアッセイ法において、その抗原を検出するのに有効ではないことが証明された(データは示さず)。図2Bの右パネルに示したように、このビオチン化プロセスは、このHSP60抗体によるHSP60認識を妨げた。結果として、ビオチン化細胞から免疫沈降されたHSP60の量が非ビオチン化細胞と比較して少ないことは、HSP60がビオチン化されたことを強く示唆している。
【００３８】
間接免疫蛍光法によるHSP60の細胞表面局在
IPを用いた、OECにおけるHSP60の細胞表面発現がGRP78ほどはっきりしていなかったので、この仮説も間接免疫蛍光法を用いて調べた。HSP60は無傷のOEC上で検出された(図3A)。このことから、このタンパク質は細胞表面に位置することが再度確かめられた。筋/小胞体カルシウムATPase(SERCA)に対するポリクローナル抗体は、透過化処理されていないOECにおいてSERCAを検出しなかったが(図3C)、この抗体が透過化処理OECにおいて用いられた時に、強いシグナルが観察された。
【００３９】
GRP78-HSP60相互作用
HSP60がGRP78と免疫共沈降できるかどうか確かめることによって、反対に、GRP78を免疫沈降することによってHSP60もプルダウンされるかどうか確かめることによって、HSP60およびGRP78が一緒に結合できるという可能性を評価した。GRP78のIPから得られた試料中にHSP60が存在することは検出されなかった(データは示さず)。反対に、抗GRP78抗体によって、80kDaのバンドがHSP60の免疫沈降から得られた試料中に示された(図4)。
【００４０】
結論
シャペロンタンパク質は健常細胞の表面に位置し、精子結合を可能にすることが証明された。
【００４１】
実施例II
GRP78およびHSP60を用いた処理による精子生存の改善
材料および方法
頂端原形質膜の調製
fOAPMの調製は、Boilard et al. (2002, Biol. Reprod. 67: 1125-1132)で以前に述べられたものに基づいて行った。簡単に述べると、屠殺場で発情期初期の雌ウシから卵管を集め、輸送中、4℃に保ち、実験室で他の組織から切断した。卵管をはがし、上皮細胞を含む、出てきた液体を集めることで、卵管上皮細胞を回収した。回収した直後に、頂端原形質膜濃縮プロトコール(Behnke et al., 1990, Am. J. Physiol. 258 : F311-320)]全体を通して、細胞を直接処理した。具体的には、8個の卵管からの細胞を、20mlの緩衝液#1(60mMマンニトール, 5mM EGTA;全ての化学薬品はSigma Chemical Company, St-Louis, MOから入手し、pHは、1M Tris-HCl pH 7.4溶液を用いて7.4に調節した)中で、ポリトロン凝集ホモジナイザー(polytron aggregate homogenizer)(Kinematica, Luzerm, Switzerland)を用いてホモジナイズした。次いで、頂端に由来しない膜を凝集させるために氷上で30分間置いたホモジネートに、200μlの0.1M MgCl2を添加した。1回目の遠心分離(3000×g)を4℃で15分間行った。頂端膜を含む上清を取り出し、27000×gで30分間遠心分離した。次いで、結果として得られた上清を除去し、膜を含むペレットを20mlの緩衝液#2(60mMマンニトール, 7mM EGTA, Tris塩基でpH 7.4)に再懸濁し、Potter Sホモジナイザー(Fisher Scientific)でホモジナイズした。次いで、混合物を、前記のようなMgCl2との30分間のインキュベーションならびに3000×gおよび27000×gでの遠心分離を含む精製工程に再度まわした。ペレットを、20mlの緩衝液#3(300mMマンニトール, 0.1M Tris-HCl pH 7.4でpH 7.4)に再懸濁し、Potter Sで再度ホモジナイズした。最後に、最終混合物を27000×gでペレット化した。
【００４２】
培養OECからの頂端原形質膜も調製した。OECを前記のように回収し、5％FBS(Medicorp, Montreal, Quebec, Canada)を含むハンクス培地(13.7mM NaCl,0.5mM KCl, 450μM NaHCO3, 110μM Na2HPO4, 40μM KHPO4, 5.5mM D-グルコース, 5mM PIPES(NaOHでpH 7.4))中で3回連続して沈降させることによって洗浄し、10％仔ウシ血清(CBS);(ICN, Costa Mesa, California, USA)、0.2mMピルベート、および50μg/mLゲンタマイシンを添加したTCM199(アール塩(商標)/Invitrogen, Burlington, On, Canada)に溶解して38.5℃、5％CO2で培養した。16時間のインキュベーションの後、OECは、拍動する頂端繊毛を外表面に有する浮遊小胞を形成した。50×g、2分間の遠心分離によって、小胞を培地から分離した。これらの培養細胞に対しては、最初の27000×gペレットを緩衝液#3に直接入れてホモジナイズし、緩衝液#2を用いた2番目の精製工程を行う代わりに頂端材料を27000×gで再度ペレット化した以外は、前記の頂端原形質膜濃縮プロトコールを行うことによって、cOAPMを入手した。各調製物のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ法(Pierce, Rockford, Illinois, USA)によって求め、実験に使用したOAPM調製物の量は、使用したOAPMタンパク質の総量によって定量した。
【００４３】
放射標識OECの調製
OECを前記のように培養した。標識に必要なインキュベーションは全て38.5℃および5％CO2で行った。細胞を70mlのRPMI1640培地(ICN)に再懸濁し、75cm2培養フラスコに入れて15分間インキュベートした。次いで、これらを、2分間、50×gの遠心分離によって再度洗浄した。最終ペレットを、1％FBS(Medicorp)および50μCi/ml放射性アミノ酸(Tran35S-Label(商標), ICN)を含むRPMI1640に再懸濁し、放射標識のために3.5時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離で洗浄し、放射標識OEC用の試料を、50μlの1-D電気泳動ローディング緩衝液(125mM Tris-HCl pH 6.8, 4.6％ SDS, 20％ グリセロール, 87μMブロモフェノールブルー, 10％β-メルカプトエタノール)、または250μlの2-D電気泳動ローディング緩衝液(8M尿素, 2％ CHAPS, 0.5％IPG緩衝液, pH 3-10直線等電点電気泳動(linear isofocusing)用; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に溶解した。
【００４４】
精子の調製および処理
凍結精子試料は、L'Alliance Semex Inc.(Guelph, ON, Canada)およびCentre d'Insemination Artificielle du Quebec (Saint- Hyacinthe, PQ, Canada)の厚意により提供された。実験1回ごとに、5匹の雄ウシからプールした精液を含むストローを37℃の水浴で1分間解凍した。精液を、BSA(画分V)、ピルビン酸、およびゲンタマイシンを添加した改変タイロード培地(Sp-TALP; Parrish et al., 1988, Biol. Reprod. 38: 1171-1180)を用いて、250×gで10分間、2回洗浄した。精子濃度は、コンピュータ援用精液分析器(CASA)(Hamilton Thorne Research version 12.0f)を用いて求めた。
【００４５】
精子を含む第一組の実験では、500万個の洗浄した運動性精子を、6つの500μl Sp-TALPアリコート(150μgの総fOAPMタンパク質に相当する量のfOAPMを予め含んでいる)のそれぞれに添加した。38.5℃、5％CO2で同時インキュベーションを30分間行った後、全量を45％/60％パーコール勾配(各2ml)の上に重ね、精子細胞に強く結合していない物質を除去するために、30分間遠心分離(700×g)した。ペレットを、5mlのSp-TALPに溶解して370×gの遠心分離で洗浄し、2回目の45％/60％パーコール勾配の上に重ね、700×gで30分間遠心分離した。2回目のパーコール洗浄の後、精子を、Sp-TALP培地に溶解して遠心分離で2回洗浄した。精子の最終濃度を求め、25×106精子/mlに調整した。38.5℃、5％CO2で0時間、2時間、6時間、および12時間インキュベートした後に、CASAを用いて運動能パラメータを評価した。同時に、先体完全性および生存率を、エオシン-ニグロシン染色(Bamba, et al., 1988, Theriogenology, 29: 1245-1251)で評価した。運動能、生存率、および先体反応のそれぞれの値は、最低100個の精子細胞を分析することによって得た。この実験は、異なる日に異なるcOAPM調製物および異なる精液ストローを用いて3回繰り返した。統計解析は、反復分析用のStatistical Analysis System (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA. Release 6.12)「proc glm」法を用いて行った。
【００４６】
精子を用いた第二組の実験では、前記のように放射性cOAPMを放射標識OECから調製した。精子を、前記の放射標識cOAPMとインキュベートした。2回目のパーコール勾配洗浄から得られた精子ペレットを、Sp-TALP培地の代わりに冷リン酸緩衝食塩水(PBS；0.15M NaCl, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4)で2回、再洗浄し、タンパク質を、1-Dまたは2-D電気泳動ローディング緩衝液のいずれかに可溶化した。
【００４７】
タンパク質の同定
タンパク質を、1-D SDS-PAGE[Laemmli, 1970#52] または2-D電気泳動(一次元には、固定された直線3-10pH勾配を有する13cm Immobiline DryStrip(商標) ゲルおよびIPGphor Isoelectric Focusing System(Amersham Pharmacia Biotech)を使用し、二次元にはSDS-PAGEを使用する)のいずれかで分離した。最初に、ゲルを、40％メタノールおよび10％酢酸の溶液で30分間固定し、次いで、放射線を強めるためにAmplify(Amersham Pharmacia Biotech)に30分間浸漬した。次に、ゲルを乾燥させ、Kodak BioMax(商標) MRフィルムを用いてオートラジオグラフィーにかけた。精子に結合した標識タンパク質の質量およびpIを求めた。
【００４８】
精子に結合したタンパク質は、新鮮に抽出された非標識OECのクーマシーブリリアントブルー染色2-Dゲルに存在していた。このゲルを複製し、PVDF膜に転写した。この膜をクーマシーブリリアントブルーで染色し、精子に結合した35S-標識タンパク質に対応する質量およびpIを有するタンパク質を切り出した。試料を、Service Proteomique de l'Est du Quebec (Centre Hospitalier Universitaire de Quebec, pavillon CHUL, PQ, Canada)に持って行き、Applied Biosystemsモデル473Aパルスドリキッドプロテインシーケンサー(pulsed liquid protein sequencer) (Applied Biosystems, Foster city, CA)で行った自動エドマン分解によるN末端配列決定にかけた。
【００４９】
結果
結合OAPMタンパク質による精子機能の調節
卵管上皮に由来する頂端原形質膜は精子機能を調節するのに最も効率的であることが知られている。最初に、卵管上皮細胞の頂端原形質膜(OAPM)に由来するタンパク質の効果を調べた。精子をOAPMの存在下で6時間インキュベートした後に分析した以前の実験とは反対に、今回は、精子を、培養細胞に由来するOAPM(cOAPM)の存在下でプレインキュベートするか、またはcOAPMの非存在下でプレインキュベートし(対照)、強く結合していないタンパク質を除去するために2回連続パーコール勾配で洗浄した。次いで、特異的OAPMタンパク質を有するこれらの洗浄精子をインキュベートした。この目的は、生存率、先体完全性、および運動能を含む様々な精子パラメータに対する結合タンパク質の効果を確かめることであった。2時間および6時間のインキュベーション後、cOAPMの非存在下でプレインキュベートした精子において観察された先体消失(それぞれ、73％および80％、図5A)は、cOAPMの存在下でプレインキュベートした精子において観察された先体消失(それぞれ、51％および54％、図5A)より大きかったので、精子が有するcOAPMタンパク質に先体完全性の保護効果があるのは明らかであった。しかしながら、12時間のインキュベーション後から、2つの精子群において有意な差は観察されなかったので、この効果は一過的であった(cOAPM=70％、対照=82％)。
【００５０】
さらに、結合cOAPMタンパク質は精子の生存能力も保護した。6時間のインキュベーション後、87％の対照精子が死んだのに対して、cOAPMの存在下でプレインキュベートした精子では67％が死んだ(図5B)。しかしながら、12時間のインキュベーション後では、差は認められなかった。精子運動能パラメータに対するcOAPMタンパク質の効果を12時間まで測定し、最初の測定を2時間後に行った。分析した多くのパラメータのうち、経路の直線性(linearity)および直線係数(straightness)だけがcOAPMとのインキュベーションの影響を受けた(それぞれ、図6Aおよび図6B)。12時間で、処理精子の直線性(73％)は未処理精子の直線性(38％)より大きかった。12時間のインキュベーション後、cOAPM処理精子の直線係数(97％)も未処理精子の直線係数(75％)より大きかった。
【００５１】
OAPM精子結合タンパク質の同定
1次元(1-D)SDS-PAGEによって明らかにされたタンパク質パターンにより示されるように(図7)、卵管上皮細胞において35S標識されたタンパク質のごくわずかしかOAPMに存在していなかった。50kDaおよび80kDaの2種類の主用バンドしか観察されなかったので(図7)、不連続パーコール勾配がOAPMタンパク質の精子への非特異的結合の大部分を無くすのに有効であることも明らかになった。放射標識OECの二次元(2-D)電気泳動(図8A)および放射標識cOAPMとインキュベートした精子の二次元(2-D)電気泳動(図8B)から、概算の分子量および等電点(MW/pI)が80kDa/5.0、75kDa/5.8、60kDa/5.5、55kDa/6.5、50kDa/5.0、および45kDa/5.1である6つの主要なタンパク質が精子に強く結合することが明らかになった(図8B)。また、5つのさらなるタンパク質(160kDa/5.5、60kDa/6.2、40kDa/7.3、37kDa/7.3、30kDa/4.9)も精子細胞と著しく結合することを示した。
【００５２】
6つの主要な35S標識タンパク質(全て図8で囲みに入れられている)をゲルから切り出し、N末端配列決定のためにエドマン分解にかけた。この後、これらのうち3つが同定された(表1)。80kDaタンパク質は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)としても知られるグルコース調節性タンパク質78(GRP78)として同定された。その同一性は、市販のモノクローナル抗体(BD PharMingen, ON Canada)を用いたウエスタンブロットによって確かめられた(示されていない)。同様に、pI5.5の60kDaタンパク質は熱ショックタンパク質60(HSP60)に対応し、その同一性も市販のモノクローナル抗体(StressGen Biotechnologies Corp, BC, Canada)を用いたウエスタンブロットによって確かめられた(示されていない)。最後に、55kDa/6.5pIタンパク質は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)としても知られるグルコース調節性タンパク質58(GRP58)とある程度一致していたが、GRP58に対して使用した多くの抗体(生化学研究用にMax Plank institute(Gottingen, Germany)のDavid Ferrariから提供された抗PDI、抗PDI/SPA890、および抗ERP57/SPA-725)のどれを使用しても、このタンパク質の同一性が確かめられなかった。
【００５３】
次に、HSP60と精子との結合およびGRP78と精子との結合を、市販抗体を用いて確かめた。精子と、新鮮に抽出したOECに由来するOAPM(fOAPM)と同時インキュベートし、パーコール勾配で洗浄した。タンパク質を電気泳動で分離し、HSP60およびGRP78の存在をウェスタンブロッティングで検出した。図9Aに示したように、GRP78は、新鮮に射精された雄ウシ精子または凍結保存された雄ウシ精子に存在しない。しかしながら、GRP78は、fOAPMと予めインキュベートした精子に豊富に存在している。このことは、精子は、OECからの頂端抽出物との同時インキュベーション時にGRP78を手に入れることを裏付けている。同様の手順を用いて、HSP60は精子に存在するが(図9B)、精子がfOAPMとインキュベートされた時に、さらに高濃度のHSP60が検出されたことが分かる。このことは、GRP78と同様に、OAPMとのインキュベーション中に精子がHSP60を手に入れることを裏付けている。さらに、凍結保存プロセスは、この熱ショックタンパク質が雄ウシ精子に存在することに影響を及ぼさなかった(図9B)。
【００５４】
結論
本実験では、精子結合OAPMタンパク質は単独で、生存率、先体完全性、ならびに精子運動の直線性および直線係数に対して正の効果を有し、精子運動能および細胞内カルシウム濃度([Ca++]i)を調節することができる。
【００５５】
本実験で示された結果は、強固な相互作用またはOAPMから精子細胞へのタンパク質移動を介して精子の生理学的特性を保護および保存する新規の細胞機構を証明している。
【００５６】
実施例III
ヒト精子細胞の評価
材料および方法
ヒトおよびウシの精子タンパク質をSDS-PAGE試料緩衝液に可溶化し、ゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースに転写し、次いで、ビオチン化された市販の組換えGRP78およびHSP60タンパク質とインキュベートした。大規模な洗浄の後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとインキュベートし、GRP78またはHSP60に結合する精子タンパク質を、高感度ケミイルミネッセンスおよびオートラジオグラフィーフィルム暴露によって検出した。
【００５７】
インキュベーション中に起こるヒト精子細胞の自発的先体反応のレベルを評価する。前記のウシ精子細胞について行ったように、データを入手した。
【００５８】
結果
非特異的バンドは、ビオチン化GRP78の非存在下でもストレプトアビジンに結合するタンパク質である(図12)。
【００５９】
大規模な洗浄の後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとインキュベートし、HSP60に結合する精子タンパク質を、高感度ケミイルミネッセンスおよびオートラジオグラフィーフィルム暴露によって検出した。非特異的バンドは、ビオチン化HSP60の非存在下でもストレプトアビジンに結合するタンパク質である(図13)。
【００６０】
図14から、HSP60またはGRP78タンパク質を含有する培地に入れられた場合に、ヒト精子細胞の完全性は、非含有培地中でインキュベートされた精子細胞と比較して先体反応から良好に守られたことが分かる。
【００６１】
本発明は本発明の特定の態様に関して説明されたが、さらなる変更が可能であり、この適用は、一般的に本発明の原理に従って、かつ本発明が属する技術分野内の既知のまたは従来の実施の中に入り、前記の本質的な特徴に適応することができ、添付の特許請求の範囲に従うような本発明の開示からの逸脱を含めて、本発明の任意の変化、使用、または適合を含むと意図されることが理解されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】HSP60およびGRP78がOEC原形質膜のビオチン化タンパク質として同定されたことを示す。
【図２】2Aおよび2B：抗GRP78(2A)抗体および抗HSP60(2B)抗体を用いた、ビオチン化(BIOT)OECまたは非ビオチン化(NB)OECからのGRP78およびHSP60の免疫沈降を示す。
【図３】3A〜3D：間接免疫蛍光法によってHSP60が卵管上皮細胞の表面にあることを示す。
【図４】GRP78およびHSP60の免疫共沈降を示す。
【図５】5Aおよび5B：先体消失(5A)および死亡率(5B)に対する精子結合性OAPMタンパク質の効果を示す。
【図６】6Aおよび6B：運動能パラメータに対する精子結合性OAPMタンパク質の効果を示す。
【図７】卵管上皮細胞に由来する35S放射標識タンパク質の一次元電気泳動パターンのオートラジオグラフィーを示す。
【図８】8A〜8C：卵管上皮細胞に由来する35S放射標識タンパク質の2-D電気泳動パターンのオートラジオグラフィーを示す。
【図９】9Aおよび9B：fOAPMとインキュベートした雄ウシ精子におけるGRP78およびHSP60の免疫検出を示す。
【図１０】10A〜10C：10ng/ml HSP60とインキュベートした後の凍結解凍精子の運動能(10A)、生存率(10B)、および先体完全性(10C)の評価を示す。
【図１１】10ng/ml GRP78と6時間インキュベートした後の凍結解凍精子の運動能の評価を示す。
【図１２】シャペロン受容体結合ポリペプチドであるHSP60およびGRP78とのインキュベートション中にヒト精子の先体完全性が守られることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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