(57)【要約】  以下の構造式（Ｉ）  【化１】2007523166.tif 000012を有し、ＨＭ７４受容体に対してアゴニスト活性を有するフロセミド様分子、および炎症性障害を処置するためのそれらの使用。
2007523166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2007523166.tif 000006
を有する分子を治療の必要な患者に投与することを含む、ＨＭ７４シグナリング活性またはシグナル伝達を調節するための治療方法。
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；若しくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されることができ、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）であり、そして
Ｚは、それぞれＲである。
【請求項２】
アゴニスト候補を、ＨＭ７４を発現する細胞に接触させること、およびアゴニスト候補の不在下におけるＨＭ７４のシグナリング活性に比べて、アゴニスト候補の存在下において、ＨＭ７４のシグナリング活性が増大しているかどうかを判定することを含む、ＨＭ７４のアゴニストを同定する方法であって、アゴニスト候補が、以下の構造：
【化２】
2007523166.tif 000007
を有する上記方法。
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されることができ、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）であり、そして
Ｚは、それぞれＲである。
【請求項３】
インバース・アゴニスト候補を、ＨＭ７４を発現する細胞に接触させること、およびインバース・アゴニスト候補の不在下におけるＨＭ７４の活性に比べて、インバース・アゴニスト候補の存在下において、ＨＭ７４の活性が低減しており、そしてアゴニストの存在下において低減しているかどうかを判定することを含む、ＨＭ７４のインバース・アゴニストを同定する方法であって、インバース・アゴニスト候補が、以下の構造：
【化３】
2007523166.tif 000008
を有する上記方法。
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されることができ、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）であり、
Ｚは、それぞれＲである。
【請求項４】
アンタゴニスト候補を、ＨＭ７４を発現する細胞に接触させること、およびアゴニストの存在下におけるＨＭ７４の活性に比べて、アンタゴニスト候補の存在下において、ＨＭ７４のシグナリング活性が低減しているかどうかを判定することを含む、ＨＭ７４のアンタゴニストを同定する方法であって、アンタゴニスト候補が、以下の構造：
【化４】
2007523166.tif 000009
を有する上記方法。
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されることができ、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）であり、そして
Ｚは、それぞれＲである。
【請求項５】
式：
【化５】
2007523166.tif 000010
で表わされる化合物。
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されることができ、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）であり、そして
Ｚは、それぞれＲである。
【請求項６】
式：
【化６】
2007523166.tif 000011
で表わされる化合物を含む炎症調節量の薬剤組成物を、治療を必要とする患者に暴露することを含む、炎症を調節する方法。
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であっても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有していても、架橋を含有していても、ヘテロ原子を含有していても、もしくは置換されていても、またはそれらの組合せであってもよい）；またはそれらの組合せであり、
ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されることができ、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有していてもよい）であり、そして
Ｚは、それぞれＲである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＭ７４に結合する分子を同定し、かつ特性を明らかにし、関連する疾患の同定および処置の発見に応用するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞シグナル伝達に関与する内在性膜タンパク質である。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質、および光を含む種々の細胞外シグナルに応答し、細胞内でセカンド・メッセンジャー応答を開始するためにシグナルを変換することができる。ＧＰＣＲは、炎症、血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌、および蠕動を含む多種多様な生理反応を媒介するため、多くの治療薬剤がＧＰＣＲを標的としている。
【０００３】
喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、乾癬、および関節リウマチ（ＲＡ）などの疾患は一般に、ヘルパーＴ細胞、単球マクロファージ、および好酸球が関与する炎症性病因を有すると考えられている。現在行われているコルチコステロイドによる抗炎症療法は、喘息に有効であるが、代謝系および内分泌系副作用を伴う。これは肺または鼻粘膜を通して吸収され得る吸入製剤に関しても同様である可能性がある。ＲＡまたはＣＯＰＤに対する満足できる経口療法は、現在のところ存在しない。
【０００４】
ヒト単球からのＨＭ７４の分子クローニングは、ＨＭ７４がケモカイン受容体であることを予測した（Ｎｏｍｕｒａ等、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）５（１０）：１２３９〜１２４９）。ＨＭ７４は、主として骨髄、脾臓、扁桃、および気管に発現する。ＨＭ７４リガンドは知られていない。
【０００５】
ヒト細胞は、関連しているが、別の受容体であるＨＭ７４Ａを含む。ＨＭ７４とＨＭ７４Ａのアミノ酸配列は、約９５％同一である。しかしながら、ＨＭ７４Ａは脱オーファン化されているが、ＨＭ７４はされていない。ナイアシンまたはニコチン酸は、ＨＭ７４Ａリガンドである（Ｗｉｓｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９８６９〜９８７４、２００３）。ナイアシンは、ＨＭ７４の不良な活性化剤である。
【０００６】
マウスゲノムは、ＨＭ７４Ａ遺伝子を含むが、ＨＭ７４遺伝子を含まない。
【０００７】
ある種の条件下で、ＨＭ７４およびＨＭ７４Ａは同時制御を示す。Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲを用いて、出願人等は、ＨＭ７４およびＨＭ７４Ａの発現が顆粒球でＴＮＦαによって５０倍、単球でＬＰＳまたはＴＮＦαによって１０〜２０倍誘導されることを見出した。ＨＭ７４の発現はまた、喘息の病因において重要であることが知られている、ＴH2サイトカイン、ＩＬ−４、またはＩＬ−１３によって正常ヒト気管支上皮細胞で４〜５倍誘導される。ＨＭ７４およびＨＭ７４Ａの発現は、ＩＬ−５によってヒト一次好酸球でアップレギュレートされる。最後に、肺ＨＭ７４Ａの発現は、マウス実験喘息モデルでアップレギュレートされる。
【０００８】
ＨＭ７４およびＨＭ７４Ａの限定組織分布、ならびにその制御は、炎症における喘息、ＲＡ、およびＣＯＰＤなど、炎症過程でのＨＭ７４およびＨＭ７４Ａの役割を示唆している。
【非特許文献１】Ｎｏｍｕｒａ等、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）５（１０）：１２３９〜１２４９
【非特許文献２】Ｗｉｓｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９８６９〜９８７４、２００３
【非特許文献３】「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、ＮＹ、１９８７
【非特許文献４】「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」ＨｉｇｕｃｈｉおよびＳｔｅｌｌａ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ＤＣ、１９７５
【非特許文献５】「Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」、ＴｅｓｔａおよびＭａｙｅｒ、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第２版、３巻、ＳｗａｒｂｒｉｃｋおよびＢｏｙｌａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、２００２
【非特許文献６】Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９
【非特許文献７】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）６．３．１．〜６．３．６．
【非特許文献８】Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）
【非特許文献９】Ｂａｌｄａｒｉ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：２２９〜２３４
【非特許文献１０】Ｋｕｒｊａｎ等、Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３〜９４３
【非特許文献１１】Ｓｃｈｕｌｔｚ等、Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３〜１２３
【非特許文献１２】Ｓｍｉｔｈ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６〜２１６５
【非特許文献１３】Ｌｕｃｋｌｏｗ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７０：３１〜３９
【非特許文献１４】Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０
【非特許文献１５】Ｋａｕｆｍａｎ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：１８７〜１９５
【特許文献１】米国特許第４,４０６,８９５号
【特許文献２】米国特許第５,７３９,３６１号
【特許文献３】米国特許第４,５２２,８１１号
【特許文献４】国際公開第９４／０４１８８号
【特許文献５】国際公開第００／２２１２９号
【非特許文献１６】Ｉｍ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５（１９）：１４２８１〜１４２８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
疾患におけるＧＰＣＲの役割、およびＧＰＣＲの活性を調節することによって疾患を処置できる能力を前提とすれば、ＧＰＣＲリガンドの同定および特性の解明により、ＧＰＣＲの活性が関与する疾患状態を処置する新しい組成物および方法の開発を提供することができる。本発明は、ＨＭ７４に結合する分子を同定し、かつ特性を明らかにし、関連する疾患の同定および処置の発見に応用するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＨＭ７４を活性化するが、ＨＭ７４Ａを活性化しない分子に関する。
【００１１】
これらの分子は、以下の構造を有し、
【化１】
2007523166.tif 000003
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；またはそれらの組合せであり、ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されていてよく、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）であり、
Ｚは、それぞれＲである。
【００１２】
本発明の他の態様において、ＨＭ７４の調節剤を同定する方法が開示される。例えば、対象となる方法は、化学物質を用意する工程、ＨＭ７４を発現する細胞を用意する工程、および化学物質がＨＭ７４のシグナリング活性を調節するかどうか例えばそのような調節が本発明のアゴニストの存在下または不在下で起こるかどうかを判定する工程を含む。関連する態様において、化学物質は、これに限定するものではないが、ペプチド、抗体、アゴニスト、インバース・アゴニスト、およびアンタゴニストを含むことができる。別法として、他の調節剤を同定するために、競合アッセイにおいて既知の調節剤を用いることができる。
【００１３】
対象となる塩基置換アントラニル酸、またはフロセミドは、ＨＭ７４を活性化する。これらの化合物は、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、およびＬ１．２細胞のようなヒト細胞などの、ＨＭ７４を発現する細胞で選択的用量反応性カルシウム動員を引き起こす。ＨＭ７４コード配列で形質転換されていないコントロール細胞は、カルシウム応答を示さなかった。対象となる化合物はまた、酵母レポーター・アッセイにおいてＨＭ７４を活性化し、トランスフェクトＬ１．２細胞で走化性を誘導した。
【００１４】
対象となる化合物は、一般にアゴニストである。したがって、対象となる化合物は、薬剤候補として開発することができた。対象となる化合物はまた、例えば競合アッセイによって、ＨＭ７４を活性化、結合、および／または調節する他の分子を同定するために用いることができた。
【００１５】
本発明の他の態様には、治療組成物が含まれ、そのような組成物には、核酸、抗体、ポリペプチド、アゴニスト、インバース・アゴニスト、およびアンタゴニストが含まれる。さらに、本発明の方法には、治療組成物を、それを必要としている患者に投与することによる疾患状態の処置方法およびＨＭ７４シグナリング活性の調節方法も含まれる。
【００１６】
本発明のそれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかとなるであろう。さらに、いくつかの手順または組成物をより詳細に説明する種々の参考文献を以下に記載する。本明細書の各参考文献は、本明細書に組み入れることを個々に示したのと同様に、参照により本明細書に組み入れるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、ＨＭ７４を活性化する分子の発見に基づく。
【００１８】
ＨＭ７４コード配列は知られている（Ｎｏｍｕｒａ等、上記を参照）。ＨＭ７４を得る方法、製造する方法、および使用する方法を本明細書に示す。ＨＭ７４コード配列およびアミノ酸の変化は、ＨＭ７４の既知の機能活性に悪影響を及ぼさないかぎり許容される。
【００１９】
本発明の化合物は、ＨＭ７４の活性を調節し、ＨＭ７４のアゴニストであり、したがって喘息などの炎症を特徴とする障害の薬剤候補である。
【００２０】
本発明の化合物はまた、ＨＭ７４のアンタゴニストをスクリーニングするために用いることができる。例えば、ＨＭ７４を発現する細胞を試験化合物に暴露し、次いで、本発明のアゴニストに暴露する。その後、例えばカルシウム動員に対する試験化合物の作用を確認して、本発明のアゴニストによって誘導されたカルシウム動員レベルを試験化合物が低減するかどうかを判定することができる。
【００２１】
例えば、アゴニストおよびインバース・アゴニストを同定するための、そのような他のアッセイは、本発明の範囲内であることが企図される。
【００２２】
適切なそのような化合物には、スルファモイルアントラニル酸、例えば以下の構造を有するものなどが含まれ、
【化２】
2007523166.tif 000004
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；またはそれらの組合せであり、ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されていてよく、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であってもまた、側基を含有してもよい）であり、
Ｚは、それぞれＲである。
【００２３】
本発明の他の態様において、ＨＭ７４の調節剤を同定する方法が開示される。例えば、対象となる方法は、化学部分を用意する工程、ＨＭ７４を発現する細胞を用意する工程、および化学部分がＨＭ７４のシグナリング活性を調節するかどうか例えばそのような調節が本発明のアゴニストの存在下または不在下で起こるかどうかを判定する工程を含む。関連する態様において、化学部分は、これに限定するものではないが、ペプチド、抗体、アゴニスト、インバース・アゴニスト、およびアンタゴニストを含むことができる。別法として、他の調節剤を同定するために、競合アッセイにおいて既知の調節剤を用いることができる。
【００２４】
「アルキル」という用語は、直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。代表的な例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルがある。炭化水素は、アルケンおよびアルキンなど、１つまたはそれ以上の不飽和２重結合または３重結合を含有することができる。
【００２５】
「アルコキシル」という用語は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシである。
【００２６】
「アリール」は、芳香族炭化水素である環である。例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００２７】
「ヘテロ原子」は一般に、分子を代表する原子とは異なる原子である。したがって、炭化水素では、炭素または水素ではない任意の原子がヘテロ原子である。生物学的に許容される一般的なヘテロ原子には、酸素、硫黄、および窒素が含まれる。
【００２８】
「ヘテロアリール」という用語は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているアリール基に関する。例は、ピリジル、イミダゾリル、ピロリル、チエニル、フリル、ピラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、ナフチリジニル、およびイソオキサゾリルである。
【００２９】
「シクロアルキル」という用語は、環式炭化水素を指す。いくつかの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。
【００３０】
「複素環」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているシクロアルキルである。例は、ピロリジニル、ピペリジニル、およびピペラジニルである。
【００３１】
「ヘテロアルキル」という用語は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているアルキルである。エーテルは、ヘテロアルキルである。
【００３２】
「置換されている」とは、ベースとなる有機基が１つまたはそれ以上の置換基を有することを意味する。したがって、原子または基は、分子内で他の原子または基に取って代わる。代表的な置換基には、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、−ＣＮ、−ＮＯ2、アルコキシル、ヒドロキシル、スルフィド、スルフェート、スルホンアミド、アミン、およびアミドが含まれる。
【００３３】
「分枝鎖状」とは、１つまたはそれ以上の部位で１つまたはそれ以上の分枝鎖を含有する構造を意味する。分枝鎖は、上に定義したＲ基、または他の側基であることができる。
【００３４】
「環」という用語は、１つの環構造、複数の環構造の１つ、または複数の環構造を意味し、２つ以上の複数の環は縮合していることができ、１つまたはそれ以上の複数の環は、芳香族であることができ、ヘテロ原子を含有し、置換されていることができ、またはそれらの組合せである。環は、２環式、または多環式であることができる。環は、多様な長さの架橋を含有することができる。
【００３５】
「ハロゲン」は、例えば、塩素、フッ素、または臭素である。
【００３６】
「側基」という用語は、他の構造に結合している原子または分子を意味する。したがって、側基は、上に定義したＲ基、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキルなどであることができる。
【００３７】
「架橋」という用語は、２つの構造間のリンカーを指す。例えば、ヘテロ原子を含有することができ、置換されていることができ、分枝鎖状であることができるか、あるいはそれらの組合せである、アルキル、アルケニルなどの非環式炭化水素は、アリールまたはシクロアルキル基などの２つの環式炭化水素を連結することができる。架橋はまた、環構造の少なくとも２つの原子を結合している環構造内に含まれることもできる。この分子内架橋は、０、１、２、３、４個、またはそれ以上の原子を含有することができる。分子内架橋は、直鎖状、分枝鎖状であることができ、または置換されていることができる。
【００３８】
対象となる特定の化合物は、１）Ｒが水素であり、そしてＱは酸素または硫黄であるとき、Ｗは水素ではないか、またはＺ基の１つもしくは両方が水素でなく、２）両方のＺ基、Ｗ、およびＲが水素であり、そしてＱは酸素であるとき、ＸとＹは共に環構造内にある化合物である。
【００３９】
対象となる化合物は、誘導体化されて、当分野で知られているプロドラッグを形成し、例えばバイオアベイラビリティを高めることのできる官能基を含有する。したがって、本発明は、投与後に生物活性形態に代謝される、対象となる活性化合物の変形を企図する。そのような生物活性薬剤前駆体は、生物可逆的（ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）担体、潜在的薬剤、薬剤送達系、またはプロドラッグとしても知られている（「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、ＮＹ、１９８７；「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」ＨｉｇｕｃｈｉおよびＳｔｅｌｌａ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ＤＣ、１９７５）。
【００４０】
薬剤の化学修飾は、脂質関門を越えなければならない極性化合物の有用性をどのように高めるか、通常はｉｎ  ｖｉｖｏで分解されやすい化合物をどのように安定化するかなど、薬力学の特定の局面に対処することを対象としている。
【００４１】
プロドラッグを製造する他の理由には、生物活性薬剤の毒性、特異性の欠如、不安定性、吸収部位での代謝、急速すぎる吸収、患者のコンプライアンス、例えば、味の悪さ、または注射部位の痛みなど、医師の受け入れ性不良、あるいは製剤化の問題が含まれる。
【００４２】
一般的な修飾はエステル化であるが、これはカルボキシル基の誘導に限定されない。化学反応は、例えば、アミン、イミン、硫黄を含有する置換基、およびアミドなど、そのような誘導体の製造についても同様である。
【００４３】
エステルの場合、種々の置換基を添加することができ、このような置換基には置換されていることができ、１つまたはそれ以上の２重結合または３重結合を含有することができ、環構造を含有することのできる非分枝鎖状、環式、または分枝鎖状炭化水素が含まれ、炭化水素骨格は、窒素、硫黄、または酸素などの１つまたはそれ以上のヘテロ原子を含有することができる。
【００４４】
エステルを構成するＲ基を考えるとき、考慮すべき他の要因は、酵素開裂の感受性である。したがって、立体的電荷、および立体配座的要因が、バイオアベイラビリティの決定因となり得る。例えば、分枝鎖アルキル基は、エステラーゼ活性部位への近づきやすさに立体障害をもたらし、それによって加水分解速度を遅らせる可能性がある。これは、バイオアベイラビリティが遅延され望ましくないか、バイオアベイラビリティが延長され望ましいか、いずれかの可能性がある。
【００４５】
他の状況では、薬剤の水溶性を高めることが望ましい。その目的を達成する置換基の例には、スクシネート、スルフェート、ヘミスクシネート、ホスフェート、アミノ酸、アセテート、アミンなどが含まれる。
【００４６】
アミド、イミド、カーボネート、ヒダントイン（hydrantoin）などの窒素は誘導体化できる。窒素に対する反応に適した基には、ヒドロキシメチル基またはヒドロキシアルキル基一般、アシルオキシアルキル基、およびアシル基が含まれる。
【００４７】
カルボニル基も誘導化部位である。誘導体の例は、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジン、およびエノールエステルである。
【００４８】
上述の誘導体は薬剤に対する置換基の共有結合を含むが、置換基は他の方法で薬剤に結合してもよく、例えば、水素結合、ファン・デル・ワールス力、静電気力、疎水相互作用などである。
【００４９】
他の誘導体化手段は、非酵素的機構によってプロドラッグから除去される置換基の使用である。例には、（２−オキソ−１，３−ジオキソール−４−イル）メチルエステル、マンニッヒ塩基、オキサゾリジン、分子内加水分解を触媒する塩基性側鎖を有するエステル、および分子内求核環化／脱離反応を受けるエステルまたはアミドを含有するプロドラッグが含まれる。環化機構は、フェノール、アルコール、およびアミンを含有する薬剤に利用可能である。「Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」、ＴｅｓｔａおよびＭａｙｅｒ、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第２版、３巻、ＳｗａｒｂｒｉｃｋおよびＢｏｙｌａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、２００２。
【００５０】
したがって、本発明は、ひとたび投与されるとｉｎ  ｖｉｖｏで反応または作用する化合物を得るための既知の合成法を実施して、ＨＭ７４活性を調節する化合物を得る、対象となる化合物のさらなる任意の投薬を企図する。
【００５１】
本明細書では、「等価アミノ酸残基」という用語は、２つ以上の配列を分析のために整列させたとき、タンパク質配列内で実質的に同じ位置を占めるアミノ酸を意味する。本発明の好ましいＨＭ７４ポリペプチドは、野生型ＨＭ７４のアミノ酸配列と充分に同一のアミノ酸配列を有する。「野生型」とは、局所かまたはより広い範囲かにかかわらず、定義された集団に存在するもっとも一般的な形態または対立遺伝子を意味する。本明細書では、「充分に同一」という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、充分または最小数の同一または等価（例えば、類似の側鎖を有する）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含有する第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。例えば、ＨＭ７４活性と少なくとも９６％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列は、本明細書では充分に同一であると定義される。
【００５２】
本明細書で同義的に用いられる「ＨＭ７４活性」、「ＨＭ７４の生物活性」、または「ＨＭ７４の機能活性」という用語は、標準的な技法に従ってｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで求められた、ＨＭ７４発現細胞に影響を及ぼすＨＭ７４タンパク質、ポリペプチド、または核酸分子の活性を指す。ＨＭ７４活性は、第２のタンパク質との関連またはそれに対する酵素活性のような直接的活性、あるいはＨＭ７４と第２のタンパク質との相互作用によって媒介される細胞シグナリング活性のような間接的活性であることができる。好ましい一実施形態において、ＨＭ７４活性は、少なくとも１つまたはそれ以上の次のような活性を含む。（ｉ）ＨＭ７４シグナリング経路におけるタンパク質との相互作用能力、（ｉｉ）ＨＭ７４リガンドとの相互作用能力、（ｉｉｉ）活性化されたときに宿主細胞を改変する能力、（ｉｖ）本発明による分子の結合の活性化、および（ｖ）細胞内標的タンパク質との相互作用能力である。
【００５３】
本発明の一態様は、ＨＭ７４が活性化されたときに応答を示す細胞におけるＨＭ７４の発現に関する。本明細書では、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて産出されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であることができるが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００５４】
「単離された」核酸分子とは、核酸の天然供給源に存在している他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する有機体のゲノムＤＮＡにおいてＨＭ７４をコードする核酸に天然状態で隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。単離されたＨＭ７４核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてオープン・リーディング・フレーム核酸分子に天然状態で隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、または０.１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって作製されたとき、他の細胞物質または培地を実質的に含まないことができ、あるいは化学的に合成されたとき、前駆化学物質、または他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【００５５】
本発明の核酸分子、例えば、ＨＭ７４をコードする核酸分子は、標準的な分子生物学技術および配列を用いて単離することができる（Ｎｏｍｕｒａ等、上記を参照）。ＨＭ７４核酸分子は、ＨＭ７４配列の全部または一部を用い、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載）を用いて単離することができる。
【００５６】
本発明の核酸分子は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチド・プライマーを用い、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。さらに、ＨＭ７４ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて製造することができる。
【００５７】
さらに、本発明の核酸分子は、ＨＭ７４をコードする核酸配列の一部のみ、例えば、リガンドが結合したとき、検出可能な細胞内事象を生じる細胞外ドメインおよび／または細胞内ドメインをコードするフラグメントを含むことができる。好ましくは、その検出可能な細胞内事象は、正常宿主細胞においてＨＭ７４が活性化されたときに観察される事象である。
【００５８】
「ＨＭ７４の生物活性部分」をコードする核酸フラグメントは、ＨＭ７４生物活性を有するポリペプチドをコードするＨＭ７４の一部分を単離し、ＨＭ７４タンパク質のコード部分を発現し（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換え発現によって）、ＨＭ７４のコード部分の活性を評価することによって製造できる。
【００５９】
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重により開示されたＨＭ７４のヌクレオチド配列とは異なるが、前に開示されたものと実質的に同じＨＭ７４タンパク質をコードする核酸分子を包含する。
【００６０】
ＨＭ７４のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団内（例えば、ヒト集団）に存在する可能性のあることが当業者に理解されるであろう。ＨＭ７４コード配列におけるそのような遺伝的多型は、天然対立遺伝子変異のため、集団内の個体間に存在する可能性がある。対立遺伝子は、所与の遺伝子座において選択的に生じる遺伝子群の１つである。本明細書では、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＨＭ７４タンパク質、好ましくは哺乳類ＨＭ７４タンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を指す。本明細書では、「対立遺伝子多型」という語句は、ＨＭ７４遺伝子座で生じるヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。選択的対立遺伝子は、多くの異なる個体において対象となる遺伝子を配列決定することによって同定することができる。これは、種々の個体において同一の遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーション・プローブを用いて容易に行うことができる。天然対立遺伝子変異の結果であり、ＨＭ７４の機能活性を変化させない、ＨＭ７４のそのようなヌクレオチド変異、および結果として生じるアミノ酸多型または変異のすべてのものは、本発明の範囲内であることが意図される。
【００６１】
さらに、ヒトＨＭ７４とは異なるヌクレオチド配列を有するが、実質的に同じ活性を有する、他の種由来のＨＭ７４タンパク質（ＨＭ７４相同体）をコードする核酸分子も、本発明の範囲内であることが意図される。本発明のＨＭ７４ｃＤＮＡの天然対立遺伝子多型および相同体に対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーション・プローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用い、本明細書に開示のヒトＨＭ７４核酸との同一性に基づいて単離することができる。
【００６２】
本明細書では、「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」という用語は、ヌクレオチド配列が典型的にハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を説明することを意図する。そのようなストリンジェント条件は、当業者に知られており、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）６．３．１．〜６．３．６．に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、それに続く５０〜６５℃、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの１回またはそれ以上の洗浄である。好ましくは、配列ＨＭ７４またはその相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然核酸分子に対応する。本明細書では、「天然」核酸分子は、天然で生じる（例えば、天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。
【００６３】
集団に存在する可能性のあるＨＭ７４配列の天然対立遺伝子多型に加えて、突然変異によってヌクレオチド配列に変化を導入することができ、それによってＨＭ７４タンパク質の生物活性を実質的に変えることなく、コードされたＨＭ７４のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることを当業者はさらに理解するであろう。したがって、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を実質的に変えることなく、ＨＭ７４の野生型配列から変化させることのできる残基である。「必須」アミノ酸残基は、実質的な生物活性に必要な残基である。例えば、様々な種のＨＭ７４間で保存されていないか、または半保存のみされているアミノ酸残基は、活性には非必須である可能性があり、したがって変化の標的となる可能性が高い。一方、様々な種のＨＭ７４タンパク質間で保存されているアミノ酸残基は、活性に必須である可能性があり、したがって変化の標的とはならない可能性が高い。
【００６４】
したがって、本発明の他の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基に変化を含むＨＭ７４タンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＨＭ７４タンパク質は、既知のＨＭ７４アミノ酸配列とは異なるが、生物活性を保持する。一実施形態において、単離された核酸分子は、既知のＨＭ７４アミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
既知のＨＭ７４とは異なる配列を有するＨＭ７４タンパク質をコードする単離核酸分子は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を既知のＨＭ７４のヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。
【００６６】
突然変異は、部位特異的突然変異誘発、およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な技法によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上の推定非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、およびシステイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、およびイソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）が含まれる。したがって、ＨＭ７４の推定非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって、ＨＭ７４コード配列の全体または一部にランダムに導入することができ、結果として生じた突然変異体は、ＨＭ７４生物活性に関してスクリーニングし、活性を保持している突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされたタンパク質は、組換えによって発現させ、タンパク質の活性を測定することができる。
【００６７】
対象となる核酸を生成するために用いることのできる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。
【００６８】
ＨＭ７４機能に影響を与える一方法は、ＨＭ７４発現に影響を及ぼすことである。したがって、転写レベルを操作して、ＨＭ７４ｍＲＮＡのレベルを低減または増加することができ、これが次いで細胞表面でのＨＭ７４発現レベルを低減または増加させる。そのような操作を達成する一方法は、例えば相同組換えによって、ＨＭ７４コード配列の近傍、ゲノムの適切な部位に導入することのできる調節可能プロモーターを用いることによるものである。
【００６９】
したがって、本発明の他の態様は、抗ＨＭ７４抗体に関する。本明細書では、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわちＨＭ７４などの抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。ＨＭ７４に特異的に結合する分子は、天然の状態でＨＭ７４を含有する試料、例えば生体試料において、ＨＭ７４に結合するが、他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって産出することのできる、Ｆ(ab)およびＦ(ab')2フラグメントが含まれる。本発明は、ＨＭ７４に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書では、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＨＭ７４の特定のエピトープと免疫反応することのできる抗原結合部位のイディオタイプまたはクローンを１種のみ含む抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は典型的に、特定のＨＭ７４タンパク質エピトープに単一の結合親和性を示す。
【００７０】
抗体の他の様々な抗原結合形態を、当分野で知られているとおり作製することができ、それにはフラグメント、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
【００７１】
本発明の他の態様は、ＨＭ７４をコードする核酸（またはその一部）を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書では、「ベクター」という用語は、それに結合している別の核酸を運ぶことのできる核酸分子を指す。ベクターの１つの型が「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントをライゲートすることのできる環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターにはウイルス・ベクターがあり、さらなるＤＮＡセグメントをウイルス・ゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、そこに作動可能に結合した遺伝子の発現を導くことができる。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミド（ベクター）の形態である。しかしながら、本発明は、ウイルス・ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）などの、等価の機能を果たす他の発現ベクターの形態を含むことを意図する。
【００７２】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現する核酸に作動可能に結合している、１つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に結合」とは、対象となるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするような様式で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞において）調節配列に結合していることを意味するものである。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれるものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞において、ヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることを当業者は理解するであろう。本発明の発現ベクターは、本明細書に記載のとおり、宿主細胞に導入して、核酸によってコードされたタンパク質またはペプチドを産生することができる（例えば、ＨＭ７４、ＨＭ７４の突然変異体、融合タンパク質など）。
【００７３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳類細胞において、ＨＭ７４を発現するように設計することができる。適切な宿主細胞は、さらに上記のＧｏｅｄｄｅｌの文献に記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【００７４】
他の実施形態において、ＨＭ７４発現ベクターは、酵母発現ベクターである。サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母での発現用のベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ等、Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ等、Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。
【００７５】
あるいは、ＨＭ７４は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞に発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルス・ベクターには、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７０：３１〜３９）が含まれる。
【００７６】
他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて、哺乳類細胞において発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：１８７〜１９５）が含まれる。哺乳類細胞に用いられるとき、発現ベクターの制御機能は、多くの場合ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系に関しては、上に記載したＳａｍｂｒｏｏｋ等の文献の１６章および１７章を参照されたい。
【００７７】
哺乳類細胞の安定な形質転換では、用いられる発現ベクターおよび形質転換技術に応じて、わずかな細胞のみが外来ＤＮＡをベクターに組み込めることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの、薬剤に耐性を付与するものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸は、ＨＭ７４をコードするベクターと同じベクターで宿主細胞に導入することができ、あるいは別個のベクターで導入することもできる。導入された核酸によって安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。
【００７８】
ＨＭ７４に結合し、ＨＭ７４を活性化する調節剤は、フロセミド様化合物とも称される、スルファモイルアントラニル酸である。
【００７９】
これらの分子は、以下の構造を有し、
【化３】
2007523166.tif 000005
式中、Ｒは、水素、またはＣ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；またはそれらの組合せであり、
ＱおよびＸは、それぞれＯ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｙは、Ｃ1〜Ｃ18アルキル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルケニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ1〜Ｃ18アルキニル（これは分枝鎖状であるか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；Ｃ3〜Ｃ18アリール（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；もしくはＣ5〜Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含有するか、架橋を含有するか、ヘテロ原子を含有するか、もしくは置換されているか、またはそれらの組合せであっても良い）；またはそれらの組合せであり、ＸがＮであるとき、ＸおよびＹは、１つまたはそれ以上の環に縮合されていてよく、ここでこの環は、Ｃ3〜Ｃ18複素環（これは分枝鎖状であっても、側基を含有してもよい）、Ｃ3〜Ｃ18ヘテロアリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有してもよい）、置換Ｃ3〜Ｃ18シクロアルキル（これは分枝鎖状であっても、側基を含有してもよい）、またはＣ3〜Ｃ18アリール（これは分枝鎖状であっても、側基を含有してもよい）であり、
Ｚは、それぞれＲである。
【００８０】
「アルコキシル」という用語は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシである。
【００８１】
「アリール」は、芳香族炭化水素である。例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００８２】
「ヘテロ原子」は一般に、分子を代表する原子とは異なる原子である。したがって、炭化水素では、炭素または水素ではない任意の原子がヘテロ原子である。生物学的に許容される一般的なヘテロ原子には、酸素、硫黄、および窒素が含まれる。
【００８３】
「ヘテロアリール」という用語は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているアリール基に関する。例は、ピリジル、イミダゾリル、ピロリル、チエニル、フリル、ピラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、ナフチリジニル、およびイソオキサゾリルである。
【００８４】
「シクロアルキル」という用語は、環式炭化水素を指す。いくつかの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。
【００８５】
「複素環」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているシクロアルキルである。例は、ピロリジニル、ピペリジニル、およびピペラジニルである。
【００８６】
「ヘテロアルキル」という用語は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているアルキルである。エーテルは、ヘテロアルキルである。
【００８７】
「置換されている」とは、ベースとなる有機基が１つまたはそれ以上の置換基を有することを意味する。したがって、原子または基は、分子内で他の原子または基に取って代わる。代表的な置換基には、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、−ＣＮ、−ＮＯ2、アルコキシル、ヒドロキシル、スルフィド、スルフェート、スルホンアミド、アミン、およびアミドが含まれる。
【００８８】
対象となる特定の化合物は、１）Ｒが水素であり、そしてＱは酸素または硫黄であるとき、Ｗは水素ではないか、またはＺ基の１つもしくは両方が水素でなく、２）両方のＺ基、Ｗ、およびＲが水素であり、そしてＱは酸素であるとき、ＸとＹは共に環構造内にある化合物である。
【００８９】
生物学的に適合する塩を生じるアントラニル酸のカチオンは、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウム基などのものである。
【００９０】
対象となるスルファモイルアントラニル酸は、米国特許第４,４０６,８９５号および第５,７３９,３６１号に記載のとおり製造することができる。したがって、教示のとおりニトライト中間体を製造し、それを加水分解して、対象となる対応するカルボン酸を得る。次いで、このカルボン酸を、対応する塩に変換する。
【００９１】
そのようなフロセミド様化合物は、利尿剤として知られていた。したがって、ＨＭ７４を調節するためのそのような化合物の使用は新規であり、予期されないものである。
【００９２】
対象となるフロセミド様化合物は、ＨＭ７４を活性化するが、ＨＭ７４Ａは活性化しない。
【００９３】
本発明のＨＭ７４調節剤であるフロセミド様化合物は、投与に適した薬剤組成物に組み込むことができる。そのような組成物は典型的に、活性成分、および薬剤として許容される担体を含む。本明細書では、「薬剤として許容される担体」という用語は、薬剤投与に適合するすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬剤として活性な物質にそのような媒質および物質を用いることは当分野でよく知られている。任意の通常の媒質または物質が活性化合物と不適合でないかぎり、本組成物での使用が企図される。追加の活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【００９４】
本発明の薬剤組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下的に適用するために用いられる液剤および懸濁剤は、次のような成分を含むことができる。注射用の水などの滅菌希釈剤、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整する物質である。ｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多回投与バイアルに封入することができる。
【００９５】
注射による使用に適した薬剤組成物には、滅菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤、および注射可能な滅菌液剤または分散剤を即時調製するための滅菌粉剤が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合も、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度に流体であるべきである。本組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、溶媒および分散媒であることができ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの適切な混合物を含む。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散剤の場合には所要の粒径を保持することによって、さらには界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤によって防止することができ、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどである。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましいであろう。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含有させることによって達成できる。
【００９６】
注射可能な滅菌液剤は、上に挙げた成分の１種または成分の組合せと共に、所要量の活性化合物を適切な溶媒に混合し、必要に応じて、その後濾過滅菌することによって調製できる。一般に分散剤は、ベースの分散媒と上に挙げた成分のなかから必要とされる他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌液剤を調製するための滅菌粉剤の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌濾過したそれらの溶液から活性成分および所望する任意の追加成分の粉剤を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９７】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または可食性担体を含む。組成物は、ゼラチン・カプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口による治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と混合し、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で用いることができる。経口組成物はまた、流動担体を用いてシロップ剤または液体製剤を得ることによって調製することができ、あるいは口腔洗浄剤として用いる場合、流動担体中の化合物は、経口で適用され、うがいされて吐き出されるか、または飲み込まれる。
【００９８】
薬剤として適合する結合剤および／または補助剤を組成物の一部として含有させることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の任意の成分、または類似の性質の化合物を含むことができる。微結晶性セルロース、トラガカント・ゴム、またはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味剤などの香味剤である。
【００９９】
吸入による投与の場合、化合物は、適切な発射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１００】
全身投与は、経粘膜または経皮的手段によることもできる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透する障壁に適した浸透剤を製剤中に用いる。そのような浸透剤は一般に当分野で知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐薬を用いることによって達成できる。経皮投与の場合、活性化合物は、当分野で一般的に知られているように軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【０１０１】
この化合物は、直腸送達するための、坐薬（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような坐薬の通常の基剤を用いる）、または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１０２】
一実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達系を含む放出制御製剤など、その化合物が体内から急速に排泄されるのを防ぐ担体と共に調製される。生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができ、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などである。
【０１０３】
そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。それらの材料もＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよび  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されており、入手することができる。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体による感染細胞を標的とするリポソームを含む）も薬剤として許容される担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載されているように、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０１０４】
投与を容易にし、用量を均一にするために、経口または非経口組成物を用量単位形態に製剤化するのが特に有利である。本明細書では、用量単位形態とは、治療される対象の単一用量として適した物理的に分離された単位を指し、各単位は、必要とされる薬剤担体と関連して所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物を含有する。疾患の種類および重篤度に応じて、活性成分約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０.１から２０ｍｇ／ｋｇ）という用量が、例えば、１回またはそれ以上の個別投与、または持続注入によって患者に投与するための初回候補用量である。典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であってよい。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状に対して所望の抑制が生じるまで治療が持続される。しかしながら、他の投薬計画も有用である可能性がある。治療の経過は、通常の技法およびアッセイによって容易にモニターされる。例となる投薬計画は、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。本発明の用量単位形態の詳細は、活性化合物に固有の特徴、達成されるべき特定の治療効果、および個体を処置するためにそのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定され、かつそれらに直接的に依存する。
【０１０５】
薬剤組成物は、投与に関する説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含有させることができる。
【０１０６】
対象となるＨＭ７４調節剤は、スクリーニング・アッセイ、ならびに処置方法（例えば、治療および予防）に用いることができる。対象となるＨＭ７４調節剤は、ＨＭ７４活性または発現を調節する他の薬剤または化合物をスクリーニングするため、および炎症を特徴とする障害を処置するために用いることができる。対象となる調節剤は、ＨＭ７４タンパク質の不充分な産生または過剰な産生に起因する状態、あるいはＨＭ７４野生型タンパク質に比べて、活性が低減しているか、または異常である形態のＨＭ７４タンパク質の産生による状態に用いることができる可能性がある。本発明はさらに、スクリーニング・アッセイによって同定された新規なＨＭ７４調節剤、および本明細書に記載した処置を行うためのそれらの使用に関する。
【０１０７】
本発明は、ＨＭ７４に結合し、例えばＨＭ７４の発現またはＨＭ７４の活性に対して、刺激作用または阻害作用を有する調節剤、すなわち候補または試験化合物または物質（例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、抗体または他の薬剤）を同定する方法（本明細書では「スクリーニング・アッセイ」とも称する）を提供する。
【０１０８】
一実施形態において、本発明は、ＨＭ７４に結合するかまたはＨＭ７４の活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。したがって、このスクリーニング・アッセイは、ＨＭ７４を調節する他のフロセミド様化合物を同定するために用いることができる。そのような調節剤は、ＨＭ７４アンタゴニストなどの他の調節剤を同定するための競合アッセイにも用いることができる。
【０１０９】
一実施形態において、アッセイは、細胞表面において膜結合型のＨＭ７４を発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がＨＭ７４を活性化する能力を測定する、細胞に基づいたアッセイである。例えば、細胞は、酵母細胞または哺乳類起源の細胞であることができる。試験化合物がＨＭ７４を活性化する能力の測定は、例えば、ＨＭ７４との複合体において標識化合物またはＨＭ７４の位置を検出することによって試験化合物のＨＭ７４との結合が求められるように、試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識と結合させることによって達成できる。例えば、試験化合物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで直接または間接的に標識することができ、放射性同位体は、放射性放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は、適切な基質の生成物への変換を求めることによって検出できる。好ましい実施形態において、アッセイは、細胞表面において膜結合型のＨＭ７４を発現する細胞を、試験化合物と共に、ＨＭ７４と結合する既知化合物に接触させること、および試験化合物が既知化合物と競合して、ＨＭ７４と相互作用する能力を測定することを含む。
【０１１０】
他の実施形態において、アッセイは、細胞表面において膜結合型のＨＭ７４を発現する細胞を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＨＭ７４の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を測定することを含む、細胞に基づいたアッセイである。試験化合物がＨＭ７４の活性を調節する能力の測定は、例えば、試験化合物がＨＭ７４を活性化するかまたは阻害する能力を測定することによって達成できる。これは、活性化ＨＭ７４がシグナリング経路と関連する細胞内または膜標的分子と相互作用するとき、明らかとなる可能性がある。本明細書では、「標的分子」とは、本質的にＨＭ７４と結合または相互作用する分子であり、例えば、ＨＭ７４を発現する細胞の表面上の分子、第２細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内側面に結合している分子、または細胞質分子である。ＨＭ７４標的分子は、非ＨＭ７４分子であることができる。一実施形態において、ＨＭ７４標的分子は、細胞膜を経て、細胞内に伝達される細胞外シグナル（例えば、化合物のＨＭ７４への結合によって生じるシグナル）の伝達を促進するシグナル伝達経路の成分である。この標的は、例えば、触媒活性を有する第２細胞内タンパク質、または下流シグナリング分子のＨＭ７４との結合を促進するタンパク質であることができる。
【０１１１】
ＨＭ７４がＨＭ７４標的分子と結合または相互作用する能力の測定は、直接結合の測定に関して上述した方法の１つによって達成することができる。好ましい実施形態において、ＨＭ７４がＨＭ７４標的分子と結合または相互作用する能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって達成できる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞セカンド・メッセンジャー（例えば、細胞内Ｃａ2+、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（例えば、検出可能マーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸と作動可能に結合しているＨＭ７４応答性調節エレメント）の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば細胞分化または細胞増殖を検出することによって測定することができる。
【０１１２】
他の実施形態において、本発明のアッセイは、ＨＭ７４を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＨＭ７４と結合する能力を測定することを含む、無細胞アッセイである。試験化合物のＨＭ７４への結合は、上述のとおり、直接または間接的に測定することができる。好ましい実施形態において、アッセイは、ＨＭ７４を、試験化合物と共に、本発明の既知化合物と接触させること、および試験化合物が本明細書に記載の既知化合物のＨＭ７４活性に影響を与える能力を測定することを含む。試験化合物がＨＭ７４と相互作用する能力の測定は、本明細書に記載の既知化合物の結合と比較して、試験化合物が優先的にＨＭ７４と結合する能力を測定することを含む。
【０１１３】
他の実施形態において、アッセイは、ＨＭ７４を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＨＭ７４の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を測定することを含む、無細胞アッセイである。試験化合物がＨＭ７４の活性を調節する能力の測定は、例えば、直接結合の測定に関して上述した方法の１つによって、活性化ＨＭ７４がＨＭ７４標的分子と結合する能力を測定することによって達成することができる。別の実施形態において、試験化合物がＨＭ７４の活性を調節する能力の測定は、ＨＭ７４がＨＭ７４標的分子をさらに調節する能力を測定することによって達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性は、前述のとおり測定することができる。
【０１１４】
他の実施形態において、無細胞アッセイは、ＨＭ７４を、試験化合物と共に、ＨＭ７４と結合する既知化合物と接触させること、および試験化合物がＨＭ７４と相互作用する能力を測定することを含み、試験化合物がＨＭ７４と相互作用する能力の測定は、ＨＭ７４がＨＭ７４標的分子と優先的に結合する能力、またはＨＭ７４標的分子の活性を調節する能力を測定することを含む。
【０１１５】
受容体は、必ずしもリガンド結合を阻害しないが、活性化をもたらし得るＧタンパク質結合、あるいは場合によって受容体凝集、二量化、またはクラスタリングを可能にする受容体の構造変化を引き起こす非リガンド分子によって活性化され得る。
【０１１６】
本発明の無細胞アッセイは、可溶型および膜結合型のＨＭ７４の使用に適している。膜結合型のＨＭ７４を含む無細胞アッセイの場合、膜結合型のＨＭ７４が溶液中に保持されるように、可溶化剤を用いるのが望ましい。そのような可溶化剤には、非イオン系界面活性剤、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートなどが含まれる。
【０１１７】
他の実施形態において、ＨＭ７４は、宿主細胞で発現したとき、持続的活性状態に改変される。ＨＭ７４を改変することにより、リガンドに結合する必要なしに、受容体を活性にすることができる。活性化受容体を得る一方法は、リガンドと結合せずに、Ｇタンパク質と相互作用するようにＨＭ７４を改変することである。この改変は、受容体が細胞内Ｇタンパク質に結合することを可能にするリガンド結合における受容体の立体構造変化を模倣する。そのようなアプローチの１つは、ＷＯ００／２２１２９に記載されている。
【０１１８】
ＷＯ００／２２１２９は、構成的活性を生じるＴＭ６およびＩＣ３領域の特定のアミノ酸を教示している。それらの特定のアミノ酸をＨＭ７４に組み込む方法は、当分野で知られており、例えば、部位特異的突然変異誘発、サブクローニングなどである。次いで、改変ＨＭ７４分子を宿主細胞で発現させ、構成的に活性なＨＭ７４を得る。
【０１１９】
その後、活性化細胞を、ＨＭ７４アゴニスト、アンタゴニスト、インバース・アゴニストなど、ＨＭ７４活性を改変する分子であると考えられる分子に暴露する。Ｇタンパク質活性を改変するそのような分子は、薬剤開発において知られている方法を用いて、改変ＨＭ７４代謝に関連する障害を処置する標的とされる。
【０１２０】
上述の本発明によるアッセイ方法の複数の実施形態において、望ましくは、ＨＭ７４またはその標的分子を固定して、それらのタンパク質の一方または両方の非複合体形態から複合体を分離することを容易にし、かつアッセイの自動化に適応させることができる。候補化合物の存在下および不在下における、試験化合物のＨＭ７４との結合、またはＨＭ７４の標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適した任意の容器で行うことができる。そのような容器の例には、マイクロタイター・プレート、試験管、および微小遠心管が含まれる。一実施形態において、１つまたは両方のタンパク質がマトリクスに結合するのを可能にするドメインを付加する、融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＨＭ７４融合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはグルタチオン誘導体化マイクロタイター・プレートに吸着させることができる。その後、複合体を試験化合物と混合し、非吸着標的タンパク質またはＨＭ７４タンパク質とその混合物とを、複合体形成を促す条件下（例えば、塩およびｐＨの生理的条件）でインキュベートする。インキュベートした後、ビーズまたはマイクロタイター・プレートのウェルを洗浄して、結合していない成分があればそれを除去し、複合体の形成を、例えば上述のとおり直接または間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリクスから解離させ、ＨＭ７４結合または活性レベルを標準的な技法を用いて求めることもできる。
【０１２１】
マトリクスにタンパク質を固定化するための他の技法も本発明のスクリーニング・アッセイにおいて用いることができる。例えば、ＨＭ７４またはその標的分子は、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を用いて固定化することができる。ビオチン化ＨＭ７４または標的分子は、当分野でよく知られている技法（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウェル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定することができる。あるいは、ＨＭ７４または標的分子と反応するが、ＨＭ７４タンパク質の標的分子との結合を妨げない抗体で、プレートのウェルを被覆し、非結合標的またはＨＭ７４を抗体複合体によってウェルに捕捉することもできる。ＧＳＴ固定化複合体に関して上述した方法に加えて、そのような複合体を検出する方法には、ＨＭ７４または標的分子と反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出法、ならびにＨＭ７４または標的分子と関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１２２】
他の実施形態において、ＨＭ７４発現の調節剤は、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法において同定される。候補化合物存在下のＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物不在下のＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。その後、候補化合物は、この比較に基づいてＨＭ７４発現の調節剤として同定することができる。例えば、ＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の不在下に比べてその存在下で多い（統計学的に有意に多い）とき、その候補化合物は、ＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤またはアゴニストとして同定される。あるいは、ＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の不在下に比べてその存在下で少ない（統計学的に有意に少ない）とき、その候補化合物は、ＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤またはアンタゴニストとして同定される。ＨＭ７４活性がリガンドまたはアゴニストの存在下で低減している場合、あるいは構成的ＨＭ７４においては、ベースラインを下回る場合、その候補化合物は、インバース・アゴニストとして同定される。細胞中のＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＨＭ７４ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書に記載した方法によって測定することができる。
【０１２３】
大量の純粋ＨＭ７４を製造することができるため、機能すると思われる領域の立体構造の物理的特性を合理的な薬剤設計のために確認することができる。例えば、分子のＩＣ３領域およびＥＣドメインは、特に興味深い領域である。ひとたび領域の形状およびイオン配置が識別されると、それらの領域と相互作用する候補薬剤を構成し、次いで、無傷細胞、動物、および患者において試験することができる。そのような構造情報を得ることのできる方法には、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ分光法、分子モデリングなどが含まれる。３Ｄ構造はさらに、特定の部位で作用する既知の薬剤が存在する場合、他の既知タンパク質における類似の立体構造部位の同定を導くことができる。これらの薬剤またはそれらの誘導体は、ＨＭ７４と共に使用できる可能性がある。
【０１２４】
本発明はさらに、上述のスクリーニング・アッセイによって同定された新規の作用物質、および本明細書に記載した処置を行うためのそれらの使用に関する。
【０１２５】
本発明は、ＨＭ７４の異常な発現または活性に関連する障害のリスクのある（または罹患しやすい）対象、あるいはそのような障害を有する対象を処置する予防方法と治療方法の両方を提供する。そのような障害には、これに限定されるものではないが、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および関節リウマチなどの炎症性障害が含まれる。
【０１２６】
一態様において、本発明は、ＨＭ７４発現または少なくとも１種のＨＭ７４活性を調節する剤を対象に投与することによって、ＨＭ７４の異常な発現または活性に関連する疾患または状態を対象において予防する方法を提供する。ＨＭ７４の異常な発現または活性によって生じる疾患、あるいはＨＭ７４の異常な発現または活性が一因となる疾患のリスクのある対象は、例えば、本明細書に記載の診断または予後アッセイのいずれか、あるいはそれらの組合せによって同定することができる。予防薬の投与は、疾患または障害が予防される、あるいは進行が遅延されるように、ＨＭ７４の異常を特徴とする症状が発現する前に行うことができる。ＨＭ７４異常の種類に応じて、対象を処置するために、例えば、ＨＭ７４アゴニストまたはＨＭ７４アンタゴニスト剤を用いることができる。適切な作用物質は、本明細書に記載のスクリーニング・アッセイに基づいて決定することができる。
【０１２７】
本発明の他の態様は、治療目的でＨＭ７４の発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、その細胞に関連するＨＭ７４活性の１つまたはそれ以上を調節する作用物質に細胞を接触させることを含む。ＨＭ７４活性を調節する作用物質は、本明細書に記載の作用物質、例えば、フロセミド、核酸またはタンパク質、ＨＭ７４タンパク質の天然同種リガンド、ペプチド、ＨＭ７４ペプチドミメティック、または他の小分子などであることができる。一実施形態において、作用物質は、ＨＭ７４の１つまたはそれ以上の生物活性を刺激する。他の実施形態において、作用物質は、ＨＭ７４タンパク質の１つまたはそれ以上の生物活性を阻害する。そのような阻害剤の例には、抗ＨＭ７４抗体が含まれる。この調節方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、その作用物質と共に細胞を培養することによって）、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、その作用物質を対象に投与することによって）行うことができる。そのように、本発明は、ＨＭ７４の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害を罹患している個体を処置する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ＨＭ７４発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）作用物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニング・アッセイによって同定された作用物質）、または作用物質の組合せを投与することを含む。
【０１２８】
ＨＭ７４活性の刺激は、ＨＭ７４が異常にダウンレギュレートされ、かつ／またはＨＭ７４活性の上昇が有益な効果を有する可能性の高い状況において望ましい。逆に、ＨＭ７４活性の阻害は、ＨＭ７４が異常にアップレギュレートされ、かつ／またはＨＭ７４活性の低下が有益な効果を有する可能性の高い状況において望ましい。
【０１２９】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例は限定的なものであると解釈されるべきではない。本出願を通じて引用されたすべての参考文献、特許、公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に組み入れる。
【０１３０】
〔実施例１〕
ＨＭ７４を発現する哺乳類細胞の産出
ｈＨＭ７４をコードするｃＤＮＡを発現ベクターにクローン化し、ＣＨＯ細胞または２９３細胞などの哺乳類細胞にトランスフェクトした。
ＨＭ７４を過剰に発現する哺乳類細胞を産出するために、哺乳類細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１６００−０４４）の存在下、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１７６５−０５４）２ｍｌ中、６ウェル３５ｍｍ組織培養プレートに平板培養した（ウェル当たり哺乳類細胞３×１０5（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１５７３））。
【０１３１】
次いで、細胞が５０〜８０％コンフルエントになるまで、細胞をＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。ＨＭ７４のクローン化ｃＤＮＡ核酸配列を、ｐｃＤＮＡ３．１クローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９０−２０）に挿入した。ＤＮＡ２μｇを、無血清Ｆ１２Ｈａｍ培地１００μｌに希釈した。それとは別に、リポフェクタミン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８３２４−０２０）２５μｌを、無血清Ｆ１２Ｈａｍ培地１００μｌに希釈した。次いで、このＤＮＡ溶液とリポフェクタミン溶液を穏やかに混合し、室温で４５分間インキュベートして、ＤＮＡ−脂質複合体を形成させた。
【０１３２】
細胞を、無血清Ｆ１２Ｈａｍ培地２ｍｌで１回洗浄した。トランスフェクションごとに（６ウェル・プレートで６回のトランスフェクション）、無血清Ｆ１２Ｈａｍ培地０.８ｍｌを、ＤＮＡ−脂質複合体を含有する溶液に添加し（総量０.２ｍｌ）、穏やかに混合した。生じた混合物（以下「トランスフェクション混合物」とする）を、リンスした細胞に重層した（０.８ｍｌ＋０.２ｍｌ）。抗菌試薬は添加しなかった。その後、細胞を脂質−ＤＮＡ複合体と共に、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で１６時間インキュベートして、トランスフェクションさせた。
【０１３３】
インキュベーション時間の完了後、１０％ウシ胎児血清を含有するＦ１２Ｈａｍ培地１ｍｌを、まずトランスフェクション混合物を除去せずに、細胞に重層した。トランスフェクションの１８時間後、細胞に重層している培地を吸引した。次いで、細胞を、ＰＢＳ、ｐＨ２〜４（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１００１０−０２３）で洗浄し、ＰＢＳを５％血清含有Ｆ１２Ｈａｍ培地（「選択培地」）と交換した。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、４００μｇ／ｍｌで抗菌剤ジェネテシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１８１１）を含有する選択培地に１０倍に希釈した。
【０１３４】
〔実施例２〕
アゴニスト・アッセイ
ヒトＨＭ７４のアゴニストをスクリーニングするために、ＨＭ７４をＧqメカニズムに人工的に結合させることができる。Ｇqメカニズムの活性化は、細胞内の筋小胞体ベシクルからのＣａ2+放出を刺激する。Ｃａ2+は細胞質に放出され、そこでＣａ2+キレート色素を用いて検出することができる。蛍光イメージング・プレート・リーダー、またはＦＬＩＰＲ（登録商標）装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、蛍光に生じた変化をモニターする。アゴニストの活性は、蛍光の増加によって反映される。
【０１３５】
無差別型のＧqタンパク質（Ｇα16）を発現させるために、ＨＭ７４を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞をあらかじめ操作した。そのような細胞を調製するために、市販のＧα16結合ＣＨＯ細胞を得て（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＩＶＥＷＡＲＥ（商標）細胞、カタログ番号ＲＤ−ＨＧＡ１６）、実施例１のプロトコルに従って、それらの細胞でＨＭ７４の発現を促進させた。
【０１３６】
１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５１４０−１４８）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４００μｇ／ｍｌジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１０１３１−０３５）、および２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２５０−０５）を含むＦ１２Ｈａｍ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１７６５−０５４）中、３７℃および５％ＣＯ2で細胞を対数増殖期に維持した。アッセイ１日前、ＣＨＯ−Ｋ１細胞１２,５００細胞／ウェルを、９６／３８４マルチドロップ装置（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｙｐｅ８３２）を用いて、ウェル容量５０μｌの３８４ウェル透明底アッセイ・プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ、カタログ番号Ｎ５８１０２）で平板培養した。細胞を、加湿５％ＣＯ2インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣＯ2ウォーター・ジャケット式インキュベーター、Ｍｏｄｅｌ３１１０）において３７℃でインキュベートした。
【０１３７】
次のストック溶液を調製した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５６３０−０８０）の１Ｍストック溶液、１ＮのＮａＯＨ中で製造したプロベネシド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８７６１）の２５０ｍＭストック溶液、およびＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）中で製造したＦｌｕｏ  ４−ＡＭ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｆ１４２０２）の１ｍＭストック溶液。ハンクス平衡塩溶液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ２１０２３）１０００ｍｌ、１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液２０ｍｌ、および２５０ｍＭプロベネシドストック溶液１０ｍｌを用いて、反応緩衝液を調製した。ローディング緩衝液を調製するために、１ｍＭのＦｌｕｏ  ４−ＡＭ  Ｄｙｅストック溶液１.６ｍｌを、プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｐ６８６６）０.３２ｍｌと混合し、次いで、上述の反応緩衝液４００ｍｌおよびウシ胎児血清４ｍｌと混合した。
【０１３８】
アッセイ１時間前、新しく調製したローディング緩衝液５０μｌを、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて、３８４ウェル・プレートの各ウェルに加えた。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートし、色素の取り込みを最大にした。アッセイ直前、プレート底部の少なくとも１０ｍｍ上に設置された吸引ヘッドを有する３８４ＥＭＢＬＡ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ、モデル番号１２３８６）を用いて、細胞を反応緩衝液９０μｌで２回洗浄し、ウェル当たり緩衝液４５μｌを残した。
【０１３９】
計器ＦＬＩＰＲ（登録商標）ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をｆストップ２.０、露出０.４秒に設定した。このカメラを用いて、色素ローディングの精度に関して細胞プレートをモニターした。
【０１４０】
可能性のあるフロセミド様化合物を含む化合物ライブラリーを、ウェルごとに生理食塩水緩衝液中それぞれ約１０μＭの濃度で試験した。化合物添加前、蛍光の変化を１０秒間測定した。化合物添加後、３分の総実験分析時間中、最初の１分は毎秒測定し、続いて、６秒ごとに露光を行った。１０回目のスキャン後、１００μＭのストック化合物のアリコート５μｌを添加し、細胞の化合物最終濃度を１０μＭとした。最初の８０回のスキャン中の最大蛍光変化をアゴニスト活性の測定値として記録し、１０μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０６２）によって誘導される最大蛍光変化と比較した。
【０１４１】
多くのフロセミド様化合物は、ＨＭ７４を活性化することが見出された。
【０１４２】
〔実施例３〕
アンタゴニスト・アッセイ
ヒトＨＭ７４のアンタゴニストをスクリーニングするために、ＨＭ７４をＧqメカニズムに人工的に結合させることができる。実施例２と同様に、ＦＬＩＰＲ（登録商標）装置を用いて、蛍光に生じた変化をモニターする。アンタゴニストの活性は、蛍光の減少によって反映される。
【０１４３】
実施例２に記載のとおり、無差別型のＧqタンパク質（Ｇα16）を発現させるために、ＨＭ７４を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞をあらかじめ操作した。１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５１４０−１４８）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４００μｇ／ｍｌジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１０１３１−０３５）、および２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２５０−０５）を含むＦ１２Ｈａｍ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１７６５−０５４）中、３７℃および５％ＣＯ2で細胞を対数増殖期に維持した。アッセイ１日前、ＣＨＯ−Ｋ１細胞１２,５００細胞／ウェルを、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて、ウェル容量５０μｌの３８４ウェル黒／透明底アッセイ・プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ、カタログ番号Ｎ５８１０２）で平板培養した。これらの細胞を、加湿５％ＣＯ2、３７℃でインキュベートした。
【０１４４】
次のストック溶液を調製した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５６３０−０８０）の１Ｍストック溶液、１ＮのＮａＯＨ中で製造したプロベネシド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８７６１）の２５０ｍＭストック溶液、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）中で製造したＦｌｕｏ  ４−ＡＭ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｆ１４２０２）の１ｍＭストック溶液、およびリガンドまたはアンタゴニストのストック溶液。ハンクス平衡塩溶液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ２１０２３）１０００ｍｌ、１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液２０ｍｌ、２５０ｍＭプロベネシドストック溶液１０ｍｌ、および１ｍＭのＣａＣｌ2を用いて、反応緩衝液を調製した。ローディング緩衝液を調製するために、１ｍＭのＦｌｕｏ  ４−ＡＭ  Ｄｙｅストック溶液８０μｌを、プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｐ６８６６）１６μｌと混合し、次いで、上述の反応緩衝液２０ｍｌおよびウシ胎児血清０.２ｍｌと混合した。
【０１４５】
アッセイ３０分前、新しく調製したローディング緩衝液３０μｌを、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて、３８４ウェル・プレートの各ウェルに加えた。細胞を加湿ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートし、色素の取り込みを最大にした。アッセイ直前、プレート底部の少なくとも４０ｍｍ上に設置された吸引ヘッドを有する３８４ＥＭＢＬＡ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈｅｒを用いて、細胞を反応緩衝液１００μｌで３回洗浄し、ウェル当たり緩衝液４５μｌを残した。
【０１４６】
１００μＭのストック・アンタゴニスト化合物５μｌを、Ｐｌａｔｅｍａｔｅ−３８４ピペッター（Ｍａｔｒｉｘ）を用いて、細胞に添加した。インキュベーション工程中の化合物濃度は、約１０μＭであった。細胞をＦＬＩＰＲ（登録商標）ＩＩに置き、プレートの蛍光を３分の総実験分析時間中、最初の１分は毎秒測定し、続いて、６秒ごとに露光を行った。１０回目のスキャン後、アンタゴニストまたはリガンド（１０μＭ）を添加した。各添加後、３８４チップを０.０１％ＤＭＳＯ水溶液２０ｍｌで１０回洗浄した。
【０１４７】
ＨＭ７４細胞は、候補アンタゴニストによる試験前に、同定されたアゴニストに暴露しても、しなくてもよい。
【０１４８】
〔実施例４〕
受容体結合アッセイ
ＨＭ７４を含有する膜分画を調製するために、ＨＭ７４を発現するＣＨＯ細胞系を、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（１０ｍｌ）中でインキュベートすることによって採取した。細胞を１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（１０ｍｌ）でさらに３回洗浄し、その後、緩衝液Ａ５ｍｌ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７９１）、５ｍＭのＭｇＣｌ2（Ｓｉｇｍａ  Ｍ８２６６）、および１ｍＭのＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ  ０３９６））に再懸濁した。
【０１４９】
次いで、組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、Ｋｉｎｅｍｅｔｉｃａ、Ｍｏｄｅｌ  ＰＴ１０／３５）で、細胞を１分間粉砕した。得られたホモジネートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＲＣ３Ｂ冷凍遠心機において、４９,０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。得られたペレットを、緩衝液Ａ２５ｍｌに再懸濁し、遠心分離工程を３回繰り返した。最後の遠心分離後、ペレットを再び緩衝液Ａ５ｍｌに再懸濁し、アリコートに分け、−７０℃で貯蔵した。
【０１５０】
膜分画、およびトレーサーとして対象となる放射性標識アゴニストを用いて、受容体結合アッセイを行った。このアッセイは、９６ウェル・プレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行った。結合反応は、０.１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３４２８７）を含む緩衝液Ａ最終量０.２ｍｌ中、放射性アゴニスト（０.０１ｎＭ〜２５ｎＭ）の存在下でのＣＨＯ細胞調製物１８μｇからなる（Ｉｍ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５（１９）：１４２８１〜１４２８６を参照のこと）。反応を室温で１時間インキュベートした。０.３％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ３１４３）および０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間、前処理したマルチチャンネル・ハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌｌ）でＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルターに通して濾過することによって、反応を終了させた。この混合物をフィルターに適用し、１時間インキュベートした。フィルターを氷冷した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１ｍｌで６回洗浄した。放射能を測定し、各トレーサー濃度に対する総結合と非特異結合（バックグラウンド）との差異に基づいて、特異結合を算出した。８から１６の濃度データ・ポイントを得て、アゴニストと受容体との平衡状態で達成されたアゴニストの受容体への結合を求めた（平衡結合パラメータ）。競合アッセイでは、試験化合物を混合物に添加して、放射性アゴニストの受容体への結合に競合させた（競合結合値）。阻害曲線を作製して、結合の５０％阻害を達成するのに必要な濃度（ＩＣ50）を求めた。
【０１５１】
〔実施例５〕
小分子アゴニスト
一連のフロセミド様分子を、上述のとおりＨＭ７４を発現する細胞に暴露した。標的分子を標識し、ＨＭ７４に結合しているかどうかを判定した。洗浄後、細胞のラベリングの度合いを求めることによって、結合を検出した。結合はさらに、２Ｄゲル電気泳動によってＨＭ７４を単離し、そのタンパク質と結合したラベリングの度合いを求めることによっても確認した。結合の評価後、または結合の評価とは独立して、候補アゴニストがＨＭ７４を活性化する能力を測定した。ＦＬＩＰＲアッセイを用いて、標的分子のＨＭ７４への結合による細胞内カルシウム動員を評価した。このようにカルシウム動員をもたらす分子を同定した。
【０１５２】
ここまで本発明を述べてきたが、本明細書に教示した本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書の教示に様々な変更および修正を加えることができることを、当業者は理解するであろう。
【０１５３】
本明細書に引用したすべての参考文献は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【国際調査報告】
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