(57)【要約】  プラチナをベースとした化学療法薬によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療に対する腫瘍細胞の応答を予測する方法であって、ＢＣＲＰ蛋白質をコードする１種または複数の遺伝子の発現の測定をベースとし、前記遺伝子の発現亢進が化学治療薬に対する耐性の増強と相関する方法を記載する。癌細胞、特に結腸直腸癌細胞を治療に対して感作する方法もまた記載する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラチナをベースとした化学療法薬によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療に対する癌細胞の応答を予測する方法であって、
（ａ）対象から腫瘍細胞を含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を準備するステップと、
（ｂ）ＢＣＲＰ蛋白質をコードする１種または複数の遺伝子の基準発現を測定するステップと
を含み、
前記遺伝子の発現亢進が化学治療薬に対する耐性の増強と相関する方法。
【請求項２】
プラチナをベースとした化学療法薬に対して癌細胞を感作する方法であって、前記細胞にＢＣＲＰ阻害剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３】
治療有効量のＢＣＲＰ阻害剤およびプラチナをベースとした化学療法薬を、別々に、連続して、もしくは同時に投与することを含む癌の治療法。
【請求項４】
癌治療用の薬剤調製におけるＢＣＲＰ阻害剤およびプラチナをベースとした化学療法薬の使用。
【請求項５】
癌治療用の医薬組成物であって、ＢＣＲＰ阻害剤と、プラチナをベースとした化学療法薬と、薬剤として許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含む組成物。
【請求項６】
癌の治療において、同時に、別々に、もしくは連続して使用するための併用調製物として、
ａ）ＢＣＲＰ阻害剤と、
ｂ）プラチナをベースとした化学療法薬と
を含む製品。
【請求項７】
癌治療用キットであって、
ａ）ＢＣＲＰ阻害剤と、
ｂ）プラチナをベースとした化学療法薬と、
ｃ）（ａ）および（ｂ）を別々に、連続して、もしくは同時に投与するための指示書と
を含むキット。
【請求項８】
癌の治療において使用するための化学療法薬を同定する測定方法であって、
（ａ）腫瘍細胞の試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料の一部を化学療法薬候補に曝露するステップと、
（ｃ）前記試料中のＢＣＲＰの発現を測定するステップと
を含み、
対照試料中の発現と比較してＢＣＲＰの発現が減少していることが化学療法活性の指標となる方法。
【請求項９】
化学療法薬がオキサリプラチンである、請求項１、２または３に記載の方法、請求項４に記載の使用、請求項５に記載の組成物、請求項６に記載の製品または請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項１、２、３、８または９に記載の方法、請求項４または９に記載の使用、請求項５または９に記載の組成物、請求項６または９に記載の製品または請求項７または９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は癌の治療に関する。特に、プラチナ抗悪性腫瘍薬などの抗癌剤、ならびに、癌治療のための方法および組成物に対する耐性の生じやすさを測定する測定法および方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、西洋では癌関連死の２番目に主要な原因である。全世界に広がる新たなＣＲＣ症例数は増加しており、ＣＲＣ患者の約半分が転移性疾患を発症する。この悪性腫瘍に対して最も活性のある薬剤、代謝拮抗剤５−ＦＵは、４０年以上前に開発された。病期ＩＩＩのＣＲＣを切除した患者では、５−ＦＵをベースにしたアジュバント化学療法によって、健存期間（ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）が３５％、全生存期間（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）が２２％改善されることが示された（１）。しかし、進行型ＣＲＣにおいては、５−ＦＵ単独治療では１０から１５％の応答率しか生じない（２）。応答率を高めるための努力によって、より新しい細胞毒ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチンと５−ＦＵとの併用が導かれた。これによって著しく応答率が改善し（４０〜５０％）、無増悪生存期間が延長した（３、４）。このような改善はなされたが、半数を上回る患者では、進行型ＣＲＣに対する化学療法を受けてもこれらの疾患の測定可能な縮小は何ら生じない。
【０００３】
治療の選択肢が増加するつれ、（アジュバントセッティングおよび転移セッティング両方における）予測マーカー試験によって、腫瘍の分子表現型および患者によって化学療法計画を選択することが可能になった。これによって、応答率および生存率が改善され、患者を、有益とは言えない薬剤の毒性作用に対して不必要に曝露することが回避される。結腸直腸癌の治療では、５−ＦＵをベースとした化学治療の使用が世界的に広まっているので、この薬剤について最も多くの予測的なデータが報告されている。チミジル酸合成酵素（ＴＳ）の発現は、５−ＦＵに対する不十分な応答性を予測するために示された（５〜７）。さらに、ジヒドロピリミジン脱水素酵素（ＤＰＤ）およびＴＰ発現レベルの高さは、５−ＦＵに対する転移性疾患の耐性と関連した（８、９）。
【０００４】
しかし、オキサリプラチンもしくはＣＰＴ−１１に最も応答しやすい患者の予測的同定を可能にする分子マーカーは現在のところほとんど入手不可能である。ＥＲＣＣ１およびＴＳ遺伝子のｍＲＮＡ高発現は、５−ＦＵと併用してオキサリプラチンで処理した患者の不十分な応答性の予測となることが示され（１０）、ＥＲＣＣ１がオキサリプラチン感受性の決定因子となり得ることを示唆している。ＣＰＴ−１１耐性細胞株では、減少したＴＯＰＯ  Ｉ発現が示された。しかし、治療前のＴＯＰＯ  Ｉ発現とＣＰＴ−１１に対する腫瘍応答との間の一貫した関連は記載されていない（１１）。
【０００５】
化学療法に対する耐性の決定因子に関していくつかのデータが入手可能であるが、このような薬剤耐性をさらに調べるために、着実なモデル系が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞から得られた、一群の５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１およびオキサリプラチン耐性ｐ５３野生型細胞株およびヌル細胞株を開発して特徴付けた。これらの細胞株は、個別に、および集合的に、本発明の独立した態様を構成する。臨床の場で使用できる耐性もしくは感受性の鍵となる調節因子を同定するために、これらのモデル系は、これらの化学治療に対する応答のいくつかの潜在的に重要な媒介物のｍＲＮＡ発現レベルを調べるために使用されてきており、かつ使用できる。
【０００７】
該細胞株は、様々なスクリーニング法で個別に、もしくは一緒に使用することができる。たとえば、本発明の１細胞株は、薬剤耐性の１種または複数の決定因子を同定するためのスクリーニング法で使用することができる。
【０００８】
実施例で説明するように、本発明者等は、本発明の細胞株を特徴付け、特定の化学療法薬に対する耐性のいくつかのマーカーを同定した。
【０００９】
オキサリプラチン耐性細胞株に関して、本発明者等は、ＡＢＣ半輸送体ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２の過剰発現とプラチナをベースとした化学療法薬オキサリプラチンに対する耐性との間の関連を確認した。
【００１０】
癌細胞におけるＢＣＲＰの高レベルの発現が、このような細胞のオキサリプラチン誘導性アポトーシスを阻害することを示すことは、プラチナをベースとした薬剤計画による治療が特定の患者に有効であるか否かを早期に決定することを可能とする。したがって、本発明は、プラチナをベースとした化学療法薬による治療が特定の患者において有効であるか否かを決定するための測定法で使用することができる。
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様では、プラチナをベースとした化学療法薬によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療に対する腫瘍細胞の応答を予測する方法であって、
（ａ）対象から腫瘍細胞を含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を提供するステップと、
（ｂ）ＢＣＲＰ蛋白質をコードする１種または複数の遺伝子の基準発現を測定するステップとを含み、前記遺伝子の発現亢進が化学治療薬に対する耐性の増強と相関する方法を提供する。
【００１２】
腫瘍細胞における基準発現は、１種または複数の対照試料における基準発現と比較することができる。対照試料は、対象の、好ましくは腫瘍細胞を含む試料と同じ対象の正常な（すなわち、非新生物形成）細胞であってよい。他の実施形態では、対照試料は、オキサリプラチン感受性癌細胞株であってよい。たとえば、対照試料は、ＨＣＴ１１６オキサリプラチン感受性癌細胞株であってよい。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、前記化学療法薬に曝露された試料中のＢＣＲＰ発現は、発現が対照試料中のＢＣＲＰの発現の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、さらにより好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも１２倍であるならば、増強されていると見なされる。
【００１４】
化学療法薬は、腫瘍を治療するために適した任意のプラチナをベースとした化学療法薬であってよい。たとえば、薬剤はオキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチンであってよい。本発明の好ましい実施形態では、化学療法薬はオキサリプラチンである。
【００１５】
本発明の方法は、プラチナをベースとした化学療法薬によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療に対する任意の腫瘍細胞の応答を予測するために使用できる。しかし、本発明の特に好ましい実施形態では、腫瘍細胞は結腸直腸細胞である。
【００１６】
腫瘍細胞中のＢＣＲＰの過剰発現がプラチナをベースとした化学療法に対する耐性の増強と関連していることを示すことは、プラチナをベースとした化学療法による治療に対して腫瘍細胞が感作される可能性を提供する。
【００１７】
したがって、第２の態様では、本発明は、プラチナをベースとした化学療法に対して癌細胞を感作する方法であって、前記細胞ＢＣＲＰ阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明の第３の態様では、治療有効量のＢＣＲＰ阻害剤およびプラチナをベースとした化学療法薬の投与を含む、癌の治療方法を提供する。ＢＣＲＰ阻害剤およびプラチナをベースとした化学療法薬は、別々に、連続して、もしくは同時に投与できる。
【００１９】
本発明の第４の態様では、癌治療用薬剤の調製における、ＢＣＲＰ阻害剤およびプラチナをベースとした化学療法薬の使用を提供する。
【００２０】
第５の態様では、癌治療用の医薬組成物であって、ＢＣＲＰ阻害剤と、プラチナをベースとした化学療法薬と薬剤として許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含む組成物を提供する。
【００２１】
第６の態様では、癌の治療において同時に、別々に、もしくは連続して使用するための併用調製物として、
ａ）ＢＣＲＰ阻害剤と、
ｂ）プラチナをベースとした化学療法薬とを含む製品を提供する。
【００２２】
第７の態様では、癌治療用のキットであって、
ａ）ＢＣＲＰ阻害剤と、
ｂ）プラチナをベースとした化学療法薬と、
ｃ）（ａ）および（ｂ）を別々に、連続して、もしくは同時に投与するための指示書とを含むキットを提供する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、ＢＣＲＰ阻害剤は化学療法薬の前に投与される。
【００２４】
任意の適切なＢＣＲＰ阻害剤を本発明の方法で使用できる。阻害剤は、ペプチドもしくは非ペプチドであってよい。たとえば、適切なＢＣＲＰ阻害剤は、ＧＦ１２０９１８であってよい（ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  Ｍ．、Ｍｉｙａｋｅ  Ｋ．、Ｌｉｔｍａｎ  Ｋ．、Ｒｏｂｅｙ  Ｒ．、Ｂａｔｅｓ  Ｓ．Ｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、１４６：１１７−１２６、１９９９；Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒ  ＣＭ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  Ｊｕｌ  １；２０（１３）：２９４３〜５０）。
【００２５】
好ましい一実施形態では、前記ＢＣＲＰ阻害剤は、ＢＣＲＰをコードする遺伝子の発現を調節するアンチセンス分子である。
【００２６】
より好ましい一実施形態では、前記ＢＣＲＰ阻害剤は、ＢＣＲＰ遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ剤である。剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ、それらの構築物もしくは転写鋳型、たとえば、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡであってよい。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＢＣＲＰをコードする遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部と相同なｓｉＲＮＡである。
【００２７】
本発明の、および本発明で使用するための好ましいＲＮＡｉ剤の長さは、ヌクレオチド１５個と２５個の間、好ましくはヌクレオチド１９個と２２個の間、最も好ましくはヌクレオチド２１個である。
【００２８】
さらに、本発明はまた、本発明で使用でき、化学療法および計画で有用であり得る新規ＢＣＲＰ阻害剤を同定するために使用できる。このような剤は、ＢＣＲＰの効果を直接的もしくは間接的に減少させるか、または阻害することができる。
【００２９】
したがって、本発明の第８の態様では、癌、好ましくは結腸癌の治療で使用するための化学療法薬を同定するための測定方法であって、
（ａ）腫瘍細胞の試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料の一部を化学療法薬候補に曝露するステップと、
（ｃ）前記試料中のＢＣＲＰの発現を測定するステップとを含み、
対照試料中の発現と比較してＢＣＲＰの発現が減少していることが化学療法活性の指標となる方法を提供する。
【００３０】
対照試料中の発現は、前記候補薬剤に曝露していない前記腫瘍細胞の異なる試料を参照にして、あるいは化学療法薬候補の適用前の同試料中の発現を参照にして、測定できる。
【００３１】
本発明の各態様の好ましい特徴は、特に要求がなければ、必要に応じて変更を加えて、その他各態様と同様である。
【詳細な説明】
【００３２】
前述したように、本発明は、様々な化学療法薬に対する耐性の決定因子の調査のための実験手段として、ならびに、化学療法薬を使用した治療および癌の治療方法の安定性を測定するために特定の遺伝子の発現について腫瘍細胞を含む試料をスクリーニングする方法として使用できる、新規細胞株を提供する。
【００３３】
本発明の方法は、ＢＣＲＰなどの蛋白質の発現の測定法に関係する。
【００３４】
蛋白質の発現は、当業界で公知の任意の技術を使用して測定できる。ｍＲＮＡもしくは蛋白質のいずれかは、遺伝子発現の上方もしくは下方制御を測定する手段として測定できる。定量技術が好ましい。しかし、半定量もしくは定性技術もまた使用できる。遺伝子産物測定に適した技術には、ＳＡＧＥ分析、ＤＮＡマイクロアレイ分析、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、免疫細胞化学分析およびＥＬＩＳＡが含まれるが、それだけには限定しない。
【００３５】
本発明の方法では、ＲＮＡは、当業界で公知の技術のいずれかを使用して検出できる。試料のＲＮＡ量は非常に少ない可能性があるので、増幅段階を使用することが好ましい。適切な技術は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸プローブのアレイへの複製ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のハイブリダイゼーションおよびノーザンブロットを含むことができる。
【００３６】
たとえば、ｍＲＮＡ検出を使用するとき、該方法は、標準的方法に従って単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、変換したｃＤＮＡを容器内において核酸プライマーの適切な混合物を加えて増幅反応試薬（たとえば、ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応試薬）で処理して、増幅産物を生成するために容器の内容物を反応させて、蛋白質をコードする１個もしくは複数の遺伝子の遺伝子発現産物の存在を検出するために増幅産物を分析することによって実施することができる。分析は、増幅産物中の遺伝子産物の存在を検出するためにノーザンブロットを使用して実施できる。ノーザンブロット分析は当業界で公知である。分析段階は、増幅産物中のこのような遺伝子産物の存在を定量的に検出し、かつ検出された産物の量を、同様のプライマーを使用して得られた正常組織および悪性腫瘍組織中の有無が知られている一群の期待値に対して比較することによってさらに実施できる。
【００３７】
たとえば、本発明の方法の実施において遺伝子発現を測定する場合、当業界で公知の従来の分子生物学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を使用できる。このような技術の詳細は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２）に記載されている。
【００３８】
本発明の方法は、化学療法計画に適した任意の癌の治療の適合性を測定するために使用することができる。たとえば、本発明の方法は、限定はしないが、胃腸癌、たとえば、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、頭部癌および頸部癌を含めた癌の治療に対する感受性もしくは耐性を測定するために使用できる。
【００３９】
腫瘍もしくは癌の性質は、本発明の方法で使用する試料の性質を決定するだろう。たとえば、試料は、腫瘍組織生検、骨髄生検、もしくは、たとえば、血中の循環腫瘍細胞の試料であってよい。あるいは、たとえば、腫瘍が胃腸腫瘍である場合、腫瘍細胞は糞便試料から単離できる。腫瘍細胞のその他の供給源には、血漿、血清、脳脊髄液、尿、間質液、腹水などが含まれる。
【００４０】
たとえば、固形腫瘍は抗生物質を含む完全組織培養培地中に収集することができる。必要であれば、腫瘍標本から手作業で細断してよく、もしくはコラゲナーゼ／ＤＮＡ分解酵素と共にインキュベートすることによって酵素的に消化して、たとえば、ヒトもしくは動物の血清を含有する適切な培地に懸濁してもよい。
【００４１】
その他の実施形態では、生検試料は単離して、凍結するか、もしくはホルマリンなどの固定液で固定できる。次に、試料は、その後の段階で、遺伝子の発現濃度を試験することができる。
【００４２】
結合要素（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｅｒ）
本明細書で説明したように、本発明で使用するためのＢＣＲＰ阻害剤はペプチドもしくは非ヘプチドであってよい。これらは結合要素であってよい。本発明の、および本発明で使用するための本発明の結合要素は、好ましくはＢＣＲＰに結合できる任意の部分、たとえば、抗体もしくはリガンドであってよい。
【００４３】
本発明の場合では、「結合要素」は、他の分子に、好ましくはＢＣＲＰに結合特異性を有する分子であり、この分子類は一組の特異的結合要素を構成する。この一組の分子類の１要素は、この一組の分子類のもう１つの要素の一部もしくは全部に特異的に結合するか、または相補的な領域を有することができる。
【００４４】
本発明の場合では、「抗体」は、イムノグロブリンもしくはその一部、または抗体結合ドメインもしくは抗体結合ドメインに相補的な結合ドメインを含む任意のポリペプチドを意味するものと考えられる。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体およびそれらの断片ならびに他のポリペプチドに融合したイムノグロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体が含まれるが、それらだけには限定しない。
【００４５】
完全な抗体は、それぞれが、それぞれＶＨおよびＶＬと称する可変領域を備えた、重鎖および軽鎖から成るイムノグロブリン分子を含む。可変領域は、３種類の相補性決定領域（超可変領域としても知られるＣＤＲ）および４種類の枠組み領域（ＦＲ）もしくは骨格から構成される。ＣＤＲは、抗原分子と共に相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。
【００４６】
抗体の断片は、完全な抗体の結合能力を維持でき、完全な抗体の代わりに使用できる。したがって、本発明において、特に要求がなければ、「抗体」という用語は、抗体断片ならびに抗体の誘導体およびそれらの断片を包含するものと考えられる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂおよびＦｖ断片、ｓｃＦｖｓ、２重特異的ｓｃＦｖｓ、２重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ８（１０）：１０５７〜１０６２（１９９５））を参照のこと）、１本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
【００４７】
Ｆａｂ断片は、ＶＨおよびＣＨ１と共に完全なＬ鎖（ＶＬおよびＣＬ）から成る。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域の１個もしくは複数のシステインを含む数個の残基が付け加えられていることがＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合により結合された２個のＦａｂ断片を含む。
【００４８】
Ｆｄ断片はＶＨおよびＣＨ１ドメインから成る。
【００４９】
Ｆｖ断片は単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成る。
【００５０】
１本鎖Ｆｖ断片は、ｓｃＦｖが抗原結合部位を形成するのを可能にするリンカーによって結合されたＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片である（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４）を参照のこと）。
【００５１】
２重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）は、Ｖドメインの鎖間の組合せを実現するが、鎖内の組合せを実現せず、多価断片、すなわち、２個の抗原結合部位を有する断片を生じるように、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に短い（約５〜１０残基の）リンカーを有するｓｃＦｖ断片（前段落を参照）を構築することによって調製された小抗体断片である（たとえば、ＥＰ  ４０４０９７；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照のこと）。
【００５２】
さらに、断片に包含されるのは個々のＣＤＲである。
好ましい実施形態では、結合要素は、少なくとも１個のヒト定常領域を含む。
【００５３】
抗体はまた、天然であるか、または、完全にもしくは部分的に合成されるイムノグロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む抗体誘導体、機能的な同等物および抗体の相同体を包含する。「キメラ」抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定種から得られた抗体、または特定の抗体種もしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、もしくは相同で、鎖の残部が他の種から得られた抗体、または他の抗体種もしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、もしくは相同であるキメラ抗体、ならびに、所望する生物学的活性を示す限りこのような抗体の断片が包含される（米国特許第４８１６５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）を参照のこと）。本明細書で関心のあるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（たとえば、旧世界ザル、類人猿など）から得られた可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【００５４】
本発明で使用するための抗体の断片もしくはポリペプチドの断片は一般的に、少なくとも５個から７個の隣接したアミノ酸、しばしば少なくとも約７個から９個の隣接したアミノ酸、一般的に少なくとも約９個から１３個の隣接したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０個から３０個以上の隣接したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約３０個から４０個以上の連続したアミノ酸残基の鎖を意味する。
【００５５】
このような抗体もしくはポリペプチドの、あるいは断片抗体の「誘導体」は、たとえば、蛋白質をコードする核酸の操作によって、もしくは蛋白質自体を改変することによって、蛋白質のアミノ酸配列を変化させて改変した抗体もしくはポリペプチドを意味する。天然のアミノ酸配列のこのような誘導体は、１個もしくは複数のアミノ酸の挿入、添加、欠失および／または置換を含むことができ、好ましくは、一方で、細胞死受容体を有するペプチド、たとえばＢＣＲＰの中和活性および／または結合活性を提供する。このような誘導体は、２５個以下のアミノ酸、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１０個以下、さらにより好ましくは４個以下、最も好ましくは１個もしくは２個のみのアミノ酸の挿入、添加、欠失および／または置換を含む。
【００５６】
結合要素もしくは抗体は、ヒト化することが可能である。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する改変抗体であってよい。超可変領域以外の可変領域はまた、ヒト抗体の可変領域から得ることが可能で、および／またはモノクローナル抗体から得ることが可能である。ヒト化抗体の作製方法は周知で、たとえば、米国特許第５２２５５３９号を参照のこと。
【００５７】
モノクローナル抗体およびその他の抗体を入手して、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持したその他の抗体もしくはキメラ分子を製造することが可能である。このような技法は、１抗体のイムノグロブリンの可変領域、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）をコード化するＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの定常領域、もしくは定常領域および枠組み領域に導入することが関与することが可能である。たとえば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡもしくはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマもしくはその他の細胞に、産生される抗体の結合特異性を変化させるか、もしくは変化させない遺伝子的変異もしくはその他の変更を与えることができる。
【００５８】
ＲＮＡ剤
本明細書で説明したように、本発明で使用するためのＢＣＲＰ阻害剤は、ＲＮＡｉ剤であってよい。
【００５９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）もしくは転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、２本鎖ＲＮＡが潜在的および特異的遺伝子のサイレンシングを誘導する方法である。ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーと相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、配列特異的な多成分性ヌクレアーゼによって媒介される。ＲＩＳＣは、２本酸ＲＮＡトリガーから得られた短いＲＮＡ（ヌクレオチド約２２個）を含有することが知られている。
【００６０】
一態様では、本発明は、哺乳類、好ましくはヒトの腫瘍細胞、好ましくは結腸直腸腫瘍細胞における標的遺伝子、ＢＣＲＰの発現を調節する、好ましくは発現を減少させるＲＮＡｉ剤を使用する方法を提供する。発現の減少とは、標的遺伝子もしくはコーディング配列の発現レベルが、対照と比較して、少なくとも約２倍、通常は少なくとも約５倍、たとえば、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、または１００倍以上減少するか、もしくは阻害されることを意味する。ある実施形態では、標的遺伝子の発現は、ＢＣＲＰ遺伝子／コーディング配列の発現が効果的に阻害されるような範囲まで減少する。標的遺伝子の発現の調節とは、コーディング配列、たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリペプチド、たとえば、蛋白質、生成物への転写／翻訳の変化、たとえば、減少を意味する。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態で使用できるＲＮＡｉ剤は、２本鎖構造、たとえば、互いにハイブリダイズする２種の異なるオリゴヌクレオチド、または２本鎖構造を生じるために小ヘアピンを形成すると考えられる１本のリボオリゴヌクレオチドの中に存在する小リボ核酸分子（本明細書では、干渉リボ核酸とも称する）である。好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが１００ｎｔ以下、一般的には長さが７５ｎｔ以下のリボ核酸である。ＲＮＡ剤がｓｉＲＮＡである場合、２本鎖構造の長さは一般的に、約１５から３０ｂｐの範囲で、通常は約２０から２９ｂｐ、最も好ましくは２１ｂｐである。ＲＮＡ剤は、ヘアピン構造中に存在する単一のリボ核酸の２本鎖構造、すなわち、ｓｈＲＮＡの場合、ヘアピンのハイブリダイズされた部分の長さは一般的に、ｓｉＲＮＡ型の薬剤のために前記で示したものと同様であるか、もしくはヌクレオチド４〜８個長い。
【００６２】
ある実施形態では、干渉リボ核酸、たとえば、前述したようなｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡであるＲＮＡｉ剤の代わりに、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸をコードすることができる。これらの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、一般的に干渉リボ核酸をコードするＤＮＡである。ＤＮＡは、ベクター中に存在することができる。
【００６３】
ＲＮＡｉは、当業界で公知の任意の適切な方法を使用して宿主に投与できる。たとえば、核酸は、ウイルス感染、微量注入、小胞の融合、微粒子銃、もしくは水力学的核酸投与によって組織もしくは宿主細胞に導入できる。
【００６４】
ＤＮＡ特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）は、本発明の方法で使用することができるＲＮＡｉ技術である。ｄｄＲＮＡｉは、米国特許第６５７３０９９号およびＧＢ２３５３２８２に記載されている。ｄｄＲＮＡｉは、ＲＮＡｉを誘発するための一方法であり、この方法は、細胞中にＤＮＡ構築物を導入して２本鎖（ｄｓＲＮＡ）の産生を誘発し、次いで２本鎖をＲＮＡｉプロセスの一部として低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断するものである。ｄｄＲＮＡｉ発現ベクターは一般的に、ｓｉＲＮＡ標的配列を発現させるために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（たとえば、Ｕ６もしくはＨ１）を使用し、哺乳類細胞にトランスフェクトされる。ｄｄＲＮＡｉ発現カセット系から作成されたｓｉＲＮＡ標的配列は、Ｕ６プロモーターを含有しないベクター中に直接クローニングできる。あるいは、ヘアピンｓｉＲＮＡ標的配列を含有する短い１本鎖ＤＮＡオリゴをベクターのｐｏｌＩＩＩプロモーターの下流にアニーリングして、クローニングできる。ｄｄＲＮＡｉ発現ベクターの主要な利点は、長期間の干渉効果を可能にし、細胞中の天然のインターフェロン応答を最小限に抑えることである。
【００６５】
アンチセンス核酸
本明細書で説明したように、本発明で使用するためのＢＣＲＰ阻害剤は、アンチセンス分子、またはＲＮＡのようなアンチセンス分子を発現する核酸コンストラクトであってよい。アンチセンス分子は、天然もしくは合成であってよい。合成アンチセンス分子は、天然の核酸から化学的に修飾されてよい。アンチセンス配列は、標的ＢＣＲＰ遺伝子のｍＲＮＡに相補的で、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々な機構、たとえば、翻訳に使用可能なｍＲＮＡの量を減少させることによって、ＲＮアーゼＨの活性化によって、または立体妨害によって遺伝子発現を阻害する。アンチセンス分子１個もしくは組合せを投与することができ、組合せは複数の異なる配列を含むことができる。
【００６６】
アンチセンス分子は、適切なベクター中においてＢＣＲＰ配列の全部もしくは一部の発現によって作製でき、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として産生されるように、転写開始を調整する。あるいは、アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、一般的に少なくとも約７個、通常は少なくとも約１２個、より通常は少なくとも約１６個、通常は約５０個以下、好ましくは約３５個以下のヌクレオチドである。
【００６７】
内在性ＢＣＲＰセンス鎖ｍＲＮＡ配列に特異的な領域もしくは領域類は、アンチセンス配列に相補的であるように選択される。オリゴヌクレオチドに特異的な配列の選択は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくは動物モデルにおいて標的遺伝子の発現を阻害するためのいくつかの候補配列を測定する実験方法を使用できる。ｍＲＮＡ配列のいくつかの領域をアンチセンス相補性のために選択し、配列を組合せることもまた、使用できる。
【００６８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の方法によって化学的に合成できる（Ｗａｇｎｅｒ他、（１９９３）、前述、およびＭｉｌｌｉｇａｎ他、前述）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内での安定性および結合親和性を増加させるために、天然のホスホジエステル構造から化学的に修飾される。骨格、糖もしくは複素環ベースの化学構造を変化させるいくつかのこのような修飾は、文献に記載されている。骨格化学構造の有用な変化の中には、ホスホロジアミデート結合、メチルホスホン酸ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（いずれも架橋してない酸素が硫黄で置換されている）、ホスホロアミダイト、アルキルホスホロトリエステルおよびボラノホスフェートがある。アキラルホスフェート誘導体には、３’−Ｏ−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが含まれる。ペプチド核酸は、ペプチド結合を有する完全なリボースホスホジエステル骨格と置換できる。糖の修飾はまた、安定性および親和性を高めるために使用できる。
【００６９】
治療
治療」には、ヒトもしくは非ヒト動物に有益であり得るいかなる計画も含める。治療は、既存の状態に関係してよく、もしくは予防的（予防的治療）であってもよい。治療には、治癒、緩和もしくは予防的効果が含まれる。
【００７０】
「癌の治療」には、癌性増殖によって引き起こされる状態の治療が含まれ、新生物増殖もしくは腫瘍の治療が含まれる。本発明を使用して治療することができる腫瘍の例には、たとえば、骨肉腫および軟骨肉腫を含む肉腫、癌、たとえば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、胃癌、肝癌、子宮癌、子宮頸癌および卵巣癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫、神経芽細胞種、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍ならびに急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病を含めた白血病、神経膠腫および網膜芽細胞腫がある。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、癌は結腸直腸癌である。
【００７２】
投与
本明細書で説明したように、本発明で使用するためのＢＣＲＰ阻害剤は任意の適切な方法で投与することができる。さらに、その他の治療、たとえば、その他の化学療法薬もしくは結合要素との併用療法で使用することができる。このような実施形態では、本発明のＢＣＲＰ阻害剤もしくは組成物は、他の化学療法薬と同時に、別々に、もしくは連続して投与できる。
【００７３】
別々に、もしくは連続して投与する場合、互いに任意の適切な期間以内で、たとえば、１、２、３、６、１２、２４、４８もしくは７２時間以内で投与することができる。好ましい実施形態では、互いに６以内、好ましくは２以内、より好ましくは１以内、最も好ましくは２０分以内に投与される。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明のＢＣＲＰ阻害剤および／または組成物は、企図する投与経路に応じて選択された適切な賦形剤、希釈剤もしくは担体を一般的に含む医薬組成物として投与できる。
【００７５】
本発明のＢＣＲＰ阻害剤および／または組成物は、任意の適切な経路を介して治療を必要とする患者に投与できる。
【００７６】
いくつかの適切な投与経路には、（限定はしないが）経口、直腸、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣内もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔内および硬膜外を含む）投与が含まれる。静脈内投与が好ましい。
【００７７】
ＢＣＲＰ阻害剤、製品もしくは組成物は、局所的方法で、腫瘍部位もしくはその他の所望する部位に投与することが可能であり、または腫瘍もしくはその他の細胞を標的とする方法で送達することが可能である。標的指向化治療は、抗体もしくは細胞特異的リガンドなどの標的指向化系を使用することによって、ある種の細胞により特異的に活性剤を送達するために使用できる。様々な理由で、たとえば、その薬剤が許容できないほど毒性である場合、もしくは通常必要とされる投与量が多すぎる場合、もしくは通常では標的細胞に入ることができない場合のために、標的指向化が望ましい。
【００７８】
静脈内注射もしくは疾患部位への注射の場合、活性成分は病原体を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態に入れる。当業者であれば、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張溶媒を使用して、適切な溶液を調製できる。必要であれば、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／またはその他の添加物を含めることができる。
【００７９】
経口投与用医薬組成物は、錠剤、カプセル、散剤もしくは液剤の形態であってよい。錠剤は、ゼラチンなどの固形担体もしくは補助剤を含むことができる。液体医薬組成物は一般的に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油もしくは合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたはその他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含めることができる。
【００８０】
本発明で使用するＢＣＲＰ阻害剤および／または組成物はまた、小球体、リポソーム、その他の微粒子送達系または血液を含むある種の組織に置いた徐放製剤を介して投与できる。徐放担体の適切な例には、共用物質、たとえば、座剤もしくはミクロカプセルの形態の半透性ポリマー基質が含まれる。埋め込み可能な、もしくはミクロカプセル徐放基質には、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号；ＥＰ−Ａ−００５８４８１）Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ他、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２（１）：５４７〜５５６、１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）もしくは酢酸エチレンビニル（Ｌａｎｇｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７、１９８１およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５、１９８２）が含まれる。ポリペプチド含有リポソームは、周知の方法によって調製される：ＤＥ３２１８１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８２：３６８８〜３６９２、１９８５；Ｈｗａｎｇ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ；７７：４０３０〜４０３４、１９８０；ＥＰ−Ａ−００５２５２２；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号。通常、リポソームは、液体含量が約３０ｍｏｌ％コレステロールを上回り、コレステロールは、最適なポリペプチド漏出速度に調節されるように選択された割合である小（約２００〜８００オングストローム）単層型である。
【００８１】
前述の技術および方法ならびに本発明に従って使用できるその他の技術および方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｌｏ、Ａ．（編）、１９８０に見いだすことができる。
【００８２】
医薬組成物
前述のように、本発明は、癌の治療のための医薬組成物であって、ａ）プラチナ化学療法薬と、ｂ）ＢＣＲＰ阻害剤と、ｃ）薬剤として許容される賦形剤、希釈剤もしくは担体とを含む組成物に適用される。プラチナ化学療法薬およびＢＣＲＰ阻害剤は、同時に、別々に、もしくは連続的に投与できる。
【００８３】
本発明による、および本発明によって使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、薬剤として許容される賦形剤、担体、緩衝安定化剤もしくは当業者に周知のその他の材料を含むことができる。
【００８４】
このような材料は、非毒性でなければならず、活性成分の効果を妨害してもならない。担体もしくはその他の材料の厳密な性質は、経口であることが可能な、もしくは注射、たとえば静脈内注射による投与経路に左右されよう。
【００８５】
製剤は、液体、たとえば、ｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理学的塩溶液、もしくは凍結乾燥粉末であってよい。
【００８６】
投与量
本発明のＢＣＲＰ阻害剤もしくは組成物は、「治療有効量」で個体に投与することが好ましく、これは個体に利点を示すために十分である。投与する実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、治療するものの性質および重症度に左右される。治療の処方、たとえば、投与量などの決定は、最終的には一般医およびその他の医師の責任の範囲内で、自由裁量で行い、一般的に、治療する疾患、個々の患者の健康状態、送達する部位、投与方法および医師に公知のその他の要素を考慮する。
【００８７】
さて、本発明はさらに、以下の非限定的実施例で説明する。添付図面について記載する。
【００８８】
結果
材料および方法
材料。５−ＦＵは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＣＰＴ−１１はＰｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）から、オキサリプラチンはＳａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）から入手した。１ｍＭ保存溶液は、滅菌１×ＰＢＳ中で調製し、ただし、オキサリプラチンは滅菌注射水で調製して、使用するまで４℃で保存した。β−チューブリン抗体はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、ＰＡＲＰ抗体はＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。
【００８９】
組織培養。ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−同質遺伝子ヒト結腸癌細胞は、Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ教授（Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から恵与された。薬剤耐性ＨＣＴ１１６亜細胞株は、本発明者の研究室で、約１０ヶ月間、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１もしくはオキサリプラチンの濃度を段階的に増加させて繰り返し曝露することによって開発した。親ＨＣＴ１１６細胞株および薬剤耐性ＨＣＴ１１６細胞株は、透析牛胎児血清（ＦＣＳ）１０％、ペニシリン−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭおよびピルビン酸ナトリウム１ｍＭを補給したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（いずれもＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で増殖させ、５％  ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気下で３７℃で維持した。５−ＦＵ耐性ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞は、それぞれ５−ＦＵ  ２μＭおよび４μＭの存在下で維持した。ＣＰＴ−１１耐性ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞は、それぞれＣＰＴ−１１  １μＭおよび３μＭの存在下で維持した。オキサリプラチン耐性ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞は、安定して耐性であることが発見され、したがって、オキサリプラチンを含まない培地で維持して、４週間毎にそれぞれオキサリプラチン８μＭおよび９μＭを加えた。各実験の前に、耐性亜細胞株を薬剤非存在下で４８時間培養した。
【００９０】
細胞毒性研究。９６ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり２０００個の細胞を接種した。４８時間後、細胞を様々な濃度の５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１もしくはオキサリプラチンで処理した。７２時間後、ＭＭＴ色素（５ｍｇ／ｍｌ）２５μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。生細胞によって形成された青紫色ホルマザン結晶をＤＭＳＯ２００μｌに溶解し、個々のウェルの吸収は、Ｅｍａｘ精密マイクロタイターリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して５７０ｎｍで測定した。結果は、未処理細胞に対して５０％の細胞増殖阻害に必要な濃度で表した（ＩＣ５０（７２ｈ））。
【００９１】
フローサイトメトリー。６ウェルプレートにウェル当たり５×１０４個の細胞を接種した。４８時間後、細胞を様々な濃度の５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１もしくはオキサリプラチンで処理した。処理７２時間後、細胞を１×ＰＢＳ／ＥＤＴＡ  ０．５ｍＭ  ５ｍｌに収集し、１０００ｒｐｍ／４℃で５分間遠心することによってペレット状にした。細胞ペレットは、１×ＰＢＳ／１％  ＦＣＳで１回洗浄して、７０％エタノールで固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した。分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーター（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）で実施した。
【００９２】
イムノブロッティング。９０ｍｍ組織培養皿にプレート当たり１×１０６個の細胞を接種した。薬剤処理４８時間後、細胞を、記載した濃度の５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１もしくはオキサリプラチンで処理した。４８時間後、細胞を収集し、１×ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ８．０、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ＳＤＳ）２００μｌに再懸濁した。細胞を溶解して、１３２００ｒｐｍ／４℃で１５分間遠心して、細胞残渣を除去した。蛋白質濃度は、ＢＣＡ蛋白質測定試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。各蛋白質試料２０マイクログラムをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、電気ブロッティングによってＰＶＤＦ膜に移した。免疫検出は、抗ＰＡＲＰもしくは抗βチューブリンマウスモノクローナル抗体および１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して実施した。蛍光信号は、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ化学ルミネセンス検出系（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、製造元の指示に従って検出した。
【００９３】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析。全ＲＮＡは、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０試薬（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｐｏｏｌｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、製造元の指示に従って検出した。逆転写は、ＲＴ緩衝液（５×）４μｌ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１μｌ、ＤＤＴ（０．１Ｍ）２μｌ、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー（５００μｇ／ｍｌ）１μｌ、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ（４０単位／μｌ）１μｌ、およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（２００単位／μｌ）１μｌ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を含有する全反応量１０μｌ中で、ＲＮＡ１μｇによって実施した。混合物を３７℃で５０分間インキュベートして、７０℃で１０分間加熱して、次にすぐ氷上で冷却した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（１０×）５μｌ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１．０μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）０．５μｌおよびＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）１．５μｌ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、プライマー（１０μＭ）２．５μｌおよびＤＮＡ２μｌを含有する最終量５０μｌ中で実施した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマー配列を表１に挙げた。
【００９４】
結果
細胞毒性分析。１０ヶ月にわたって薬剤の濃度を段階的に増加させて繰り返し曝露することによって、本発明者等は、５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１に耐性の一群の同質遺伝子ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株を作製した。ｐ５３野生型の場合、本発明者等は、感受性親細胞と比較して、それぞれの耐性細胞株の５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１に対するＩＣ５０（７２時間）値が、３．０倍、３１．０倍および１０．０倍に増加したことを示した（表２Ａ）。興味深いことに、ＭＴＴ分析を使用すると、ｐ５３＋／＋５−ＦＵ耐性細胞株では、親細胞よりも、ＣＰＴ−１１に対して約２倍を上回る耐性が示された。しかし、この交差耐性は、さらにフローサイトメトリーを使用して調べたときは明らかではなかった（データは示さず）。ｐ５３ヌルの場合、親細胞と比較してそれぞれの耐性細胞株の５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１に対するＩＣ５０（７２時間）値は９．０倍、１０．５倍および６５．０倍に増加した（表２Ｂ）。さらに、ＩＣ５０（７２時間）の約２倍の増加は、５−ＦＵ処理後のｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞では示されなかった。しかし、細胞周期分析を使用してさらに調べると、ＣＰＴ−１１耐性細胞株における５−ＦＵに対する交差耐性の証拠は明らかではなかった（データは示さず）。
【００９５】
本発明者等はまた、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞株はいずれも、ＣＰＴ−１１活性代謝物ＳＮ−３８に対して同様に耐性であり、ＩＣ５０（７２時間）用量はそれぞれ約１０倍および約１００倍に増加することを見出した（表３）。
【００９６】
オキサリプラチンは、シスプラチンおよびカルボプラチンに耐性を示すいくつかの細胞株で活性を示した（１２）。これによって、本発明者等はｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−いずれのオキサリプラチン耐性細胞株もシスプラチンに対して交差耐性であることを発見した（表４）。カルボプラチンのＩＣ５０（７２時間）用量の少量の増加（約２倍）がオキサリプラチン耐性細胞株で観察されたが、これはオキサリプラチンに対する耐性の増強よりも著しく少なかった。これらの結果は、オキサリプラチンがシスプラチンおよびカルボプラチンとは異なる作用機構および／または耐性機構を有することを示唆している。
【００９７】
細胞周期分析。各薬剤の様々な濃度で処理した後の親細胞および耐性細胞の細胞周期分布を調べるために、フローサイトメトリーを使用した。ｐ５３野生型の場合、Ｓ期停止および倍数性（ＤＮＡ含量＞４Ｎ）の証拠は、親細胞を５−ＦＵ  １μＭで７２時間処理した後で観察された（図１Ａ）。５−ＦＵ  ５μＭおよび１０μＭに曝露した後で、ｐ５３＋／＋親細胞の大部分がＧ２／Ｍ期で停止して、ｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１含量（対照試料の約４％に対して約３０〜３５％）が著しく増加した。対照的に、ｐ５３＋／＋５−ＦＵ耐性細胞は、５−ＦＵ  １μＭに曝露した後の細胞周期プロフィールに変化を示さなかったが、５−ＦＵ  ５μＭおよび１０μＭに対しては細胞の大部分がＧ１／Ｓ境界で停止した。さらに、５−ＦＵ  ５μＭおよび１０μＭに応じたアポトーシスの誘導は、５−ＦＵ耐性亜細胞株において著しく減少した。ｐ５３＋／＋親細胞をオキサリプラチン０．５μＭで７２時間処理したとき、細胞の大部分は細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止した。これに伴って小倍数体ピークが出現した（図１Ｂ）。本発明者等は、親細胞株をオキサリプラチン１μＭおよび５μＭで処理した後、アポトーシス細胞の割合（対照試料の約２％と比較して約４０〜５０％）およびＤＮＡ含量が＞４Ｎである細胞数の著しい増加を認めた。対照的に、ｐ５３＋／＋オキサリプラチン耐性細胞の細胞周期プロフィールは、オキサリプラチン０．５μＭおよび１μＭで処理することによって影響を受けなかった。ｐ５３＋／＋オキサリプラチン耐性細胞をオキサリプラチン５μＭに曝露した後、細胞の大部分はＳ期で停止した。さらに、オキサリプラチン耐性亜細胞株におけるアポトーシスの誘導は、親細胞と比較して劇的に弱くなった。ｐ５３＋／＋親細胞をＣＰＴ−１１  ０．５μＭで処理すると、Ｓ期の細胞の蓄積が生じ、ＤＮＡ含量＞４Ｎの細胞が認められた（図１Ｃ）。倍数性のさらなる証拠は、ｐ５３＋／＋親細胞株におけるＣＰＴ−１１  １μＭで示されたが、細胞の大部分が今度はＧ２／Ｍで停止した。ＣＰＴ−１１  ５μＭで処理すると、ｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１アポトーシス期の細胞の約４０％の蓄積が引き起こされた。ｐ５３＋／＋ＣＰＴ−１１耐性細胞株は、ＣＰＴ−１１  ０．５μＭおよび１μＭにほとんど完全に非感受性であった。しかし、ＣＰＴ−１１  ５μＭで処理すると、著しいＧ２／Ｍ停止および倍数体細胞の蓄積が生じた。程度の著しいアポトーシスがまた示された（約１４％）が、親細胞株で認められ程度（約４０％）より少なかった。
【００９８】
ｐ５３−／−の場合、５−ＦＵ  １μＭで７２時間処理した親細胞はＳ期で停止し、倍数体ピークの出現が認められた（図２Ａ）。５−ＦＵ  ５μＭおよび１０μＭに曝露した後、ｐ５３−／−親細胞株の大部分のＤＮＡ含量は＞４Ｎで、倍数体細胞であることが示された。対照的に、ｐ５３−／−５−ＦＵ耐性細胞は、５−ＦＵ  １μＭ、５μＭおよび１０μＭに曝露した後、未処理対照細胞と比較して、細胞周期プロフィールの変化を示さなかった。ｐ５３−／−親細胞をオキサリプラチン１μＭで処理したとき、本発明者等はＳ期遮断および倍数体画分の中等度の増加を観察した（図２Ｂ）。オキサリプラチン  ５μＭに応じて、細胞の大部分はＧ２／Ｍ期で停止し、かなりの割合のＤＮＡ含量は＞４Ｎであった。対照的に、ｐ５３−／−オキサリプラチン耐性細胞は、同濃度のオキサリプラチンによって処理した後、細胞周期分布に何ら変化を示さなかった。ｐ５３−／−親細胞株をＣＰＴ−１１  ０．５μＭおよび１μＭで処理すると、劇的なＧ２／Ｍ期細胞周期停止が引き起こされた（図２Ｃ）。本発明者等は、ｐ５３＋／＋細胞株で観察されたのと同様に、ＣＰＴ−１１  ５μＭで処理した後でアポトーシス細胞数が増加すること（対照試料の約２％と比較して約３５％）を認めた。対照的に、５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞株では、ＣＰＴ−１１  ５μＭに応じたアポトーシスは全く観察されなかった。さらに、耐性亜細胞株では、ＣＰＴ−１１  ０．５μＭおよび１μＭに応じたＧ２／Ｍ停止は全く観察されなかった。総合すると、これらの特性は、増殖阻害分析において認められた耐性表現型の基礎となる細胞周期進行の違いを特徴付けている。
【００９９】
薬剤耐性におけるｐ５３の役割。様々な濃度の５−ＦＵ、オキサリプラチンもしくはＣＰＴ−１１で処理した後のｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−親ＨＣＴ１１６細胞における薬剤誘導性アポトーシスを比較するために、フローサイトメトリーを使用した。本発明者等の結果は、５−ＦＵで処理したｐ５３−／−細胞ではｐ５３＋／＋細胞と比較するとアポトーシスが著しく少ないことを示唆している（図３Ａ）。同様に、オキサリプラチン誘導性アポトーシスは、ｐ５３−／−細胞ではｐ５３＋／＋細胞と比較して著しく弱くなった（図３Ｂ）。対照的に、ＣＰＴ−１１は、ｐ５３＋／＋細胞株およびｐ５３−／−細胞株でほとんど同一レベルのアポトーシスを誘導した（図３Ｃ）。これらのデータは、ＣＰＴ−１１で処理した親ｐ５３＋／＋細胞およびｐ５３−／−細胞ではほとんど同一のＩＣ５０（７２時間）値がもたらされるという細胞毒性分析と一致している（表２Ａおよび２Ｂ）。さらに、ｐ５３＋／＋細胞株およびｐ５３−／−細胞株におけるＳＮ−３８のＩＣ５０（７２時間）用量は類似していた（表３）。対照的に、５−ＦＵおよびオキサリプラチンのＩＣ５０（７２時間）は、５−ＦＵおよびオキサリプラチンそれぞれで処理した後で、ｐ５３−／−細胞においてはｐ５３＋／＋細胞と比較してそれぞれ４．６倍および５．７倍増加した。さらに、ＰＡＲＰ切断（アポトーシスの特徴）は、５−ＦＵ  ５μＭおよびオキサリプラチン  １μＭで４８時間処理した後、ｐ５３＋／＋細胞では認められたが、ｐ５３−／−細胞では認められなかった（図３Ｄ）。対照的に、ＰＡＲＰ切断は、ＣＰＴ−１１  ５μＭで処理した５３＋／＋細胞およびｐ５３−／−細胞の両方で明らかであった（図３Ｄ）。これらの結果は、ｐ５３は、５−ＦＵおよびオキサリプラチンに応じたアポトーシス応答の重要な決定因子であり得るが、ＣＰＴ−１１に応じたアポトーシスの決定因子ではないことを示唆している。
【０１００】
薬剤耐性に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現。５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１をベースとした化学療法に対する感受性の決定に関与したいくつかの遺伝子の発現濃度を分析するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用した。
【０１０１】
５−ＦＵ耐性細胞
ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−５−ＦＵ耐性細胞の両方において、本発明者等は、親細胞と比較して５−ＦＵ同化酵素ＴＰのレベルが著しく減少していることを観察した（図４Ａ）。さらに、本発明者等は、外因性チミジンからチミジル酸を再利用するチミジンキナーゼ（ＴＫ）がｐ５３＋／＋５−ＦＵ耐性細胞では非常に過剰発現していることを認めた。注目すべきことに、５−ＦＵ標的酵素ＴＳは、親細胞および耐性細胞で変化しないままであった（図４Ａ）。本発明者等はまた、５−ＦＵ異化酵素ＤＰＤおよび５−ＦＵ同化酵素ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰ）およびウリジンキナーゼ（ＵＫ）のｍＲＮＡレベルは、５−ＦＵ耐性細胞株および親細胞株で同等であることを認めた。興味深いことに、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）発現は、ｐ５３−／−５−ＦＵ耐性細胞では低く、ｐ５３野生型の場合では逆になることは事実であった。これらの結果は、これらの細胞株における５−ＦＵの基礎となる機構は、少なくとも部分的に、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞の両方において、ＴＰによって活性型５−ＦＵ代謝物の合成が減少し、ｐ５３−／−細胞ではＯＰＲＴが下方制御され、ｐ５３＋／＋細胞ではＴＫが過剰発現していることによって説明できることを示唆している。これらのデータはまた、ＴＳ阻害はこれらの細胞株における５−ＦＵの作用の重要な機構ではないことを示しており、その他の結果と一致している（１３）。
【０１０２】
オキサリプラチン耐性細胞
ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−オキサリプラチン耐性細胞において、本発明者等は、ヌクレオチド除去修復遺伝子ＥＲＣＣ１のｍＲＮＡレベルが親細胞と比較して著しく増加していることを発見した（図４Ｂ）。さらに、本発明者等は、オキサリプラチン耐性細胞ではいくつかのＥＲＣＣ１スプライシングバリアントの上方制御を認めた。対照的に、本発明者等は、ＤＮＡ損傷結合因子ＸＰＡもしくはグルタチオン代謝酵素γＧＣＳの変化を認めなかった。しかし、ＡＢＣ輸送体ＢＣＲＰは、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−オキサリプラチン耐性細胞株の両方において、それぞれの親細胞株と比較して劇的に上方制御されていた。これらのデータは、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−の両方の場合において、オキサリプラチン耐性表現型は、プラチナＤＮＡ付加物のヌクレオチド除去修復の増加によって少なくとも部分的に説明され得ることを示唆している。さらに、多薬剤耐性蛋白質ＢＣＲＰによるオキサリプラチンの細胞輸出の増加は、この化学療法に対する感受性を減少させることができる。
【０１０３】
ＣＰＴ−１１耐性細胞
ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞の両方において、本発明者等は、親細胞と比較して、ＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に変換する酵素であるＣＥのレベルが著しく減少していることを認めた（図４Ｃ）。ＳＮ−３８標的酵素ＴＯＰＯ  Ｉは、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞株の両方において劇的に下方制御された。対照的に、本発明者等は、ＴＯＰＯ  ＩＩα  ｍＲＮＡ発現の変更は認めなかった。さらに、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞株の両方において、ＢＣＲＰ発現はそれぞれの親細胞株と比較すると増加した。総合すると、これらのデータは、ＣＰＴ−１１のＳＮ−３８への変換の阻害、ＳＮ−３８標的酵素ＴＯＰＯ  Ｉの下方制御およびＳＮ−３８の細胞輸出の増加は、これらの細胞における耐性表現型に関与できることを示唆している。しかし、本発明者等は、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞株の両方ではＳＮ−３８に対する交差耐性が強いことを認め（表３）、ＣＥ下方制御はこれらの細胞におけるＣＰＴ−１１に対する耐性の主要な機構ではないことを示唆した。
【０１０４】
考察
本発明者等は、結腸直腸癌の治療で通常使用する化学療法に対する耐性機構を研究するためのモデルとして、５−ＦＵ、オキサリプラチンもしくはＣＰＴ−１１に対して耐性の一群のｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−結腸癌細胞株を開発した。さらに、本発明者等はまた、ｐ５３発現と５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１に対する応答との間の関係を調べるために、これらのモデル系を使用した。
【０１０５】
薬剤の濃度を段階的に増加させて細胞を増殖させることによって、本発明者等は、ＭＴＴ分析で測定して、それぞれの化学療法に対する耐性が、感受性のある親細胞の３倍と６５倍の間である細胞を単離することができた。さらに、本発明者等は、フローサイトメトリー分析を使用して、薬剤処理後の親細胞株と比較したこれらの耐性細胞株の細胞周期停止障害およびアポトーシス障害を示した。これらのデータは、細胞周期チェックポイントの活性化障害および細胞死経路障害が新たに生じた薬剤耐性細胞株それぞれにおいて認められた耐性表現型の根源となることを示している。
【０１０６】
ｐ５３腫瘍抑制蛋白質は、ＤＮＡ損傷後の、協調性細胞周期停止、ＤＮＡ修復およびプログラムされた細胞死において重要な役割を果たす。ｐ５３の変異は、結腸直腸癌の４０〜５０％に見られ、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究は、機能的ｐ５３の損失は５−ＦＵに対する細胞感受性を減少させることを報告している（１４、１５）。この研究で示された結果は、これらのデータと一致する。本発明者等は、５−ＦＵ処理後のｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞では、ｐ５３＋／＋細胞と比較して５−ＦＵ  ＩＣ５０（７２時間）用量の４．６倍の増加およびアポトーシスの著しい減少を示した。いくつかの臨床研究はまた、ｐ５３変異の代理マーカーとしてしばしば使用されるｐ５３の過剰発現は５−ＦＵに対する耐性と相関することを報告している（１６〜１８）が、いくつかの研究は、ｐ５３発現濃度と５−ＦＵ応答との間に相関はないと報告している（１９、２０）。現在、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるデータは明らかであるが、５−ＦＵをベースとした化学療法のための予測マーカーとしてのｐ５３の臨床的有用性については、議論の余地が残されている。オキサリプラチンに関しては、本発明者等は、ＩＣ５０（７２時間）用量の５．７倍の増加および細胞周期停止障害およびアポトーシス障害によって示されるように、ｐ５３−／−細胞では、ｐ５３＋／＋細胞と比較してこの薬剤に対する感受性が減少していることを認めた。ｐ５３の状態およびプラチナ化合物に対する感受性に関する大半の臨床データは、第１世代化合物シスプラチンに焦点を当ててきた。Ｈｏｕｌｄｗｏｒｔｈおよび共同研究者等による研究は、ヒト男性生殖細胞腫瘍におけるシスプラチンに対する耐性は、ｐ５３の変異と関連があり得ることを示した（２１）。さらに、Ｒｅｌｅｓおよび共同研究者等は、ｐ５３変更は、卵巣癌患者におけるプラチナをベースとした化学療法に対する耐性、早期再発および全生存期間の短縮と相関したことを報告した（２２）。オキサリプラチンは、シスプラチンに対して様々な範囲の活性を有するようだが、この研究を含めたいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ｐ５３機能の損失によってオキサリプラチンに対する耐性が増加することが発見された（２３、２４）。現在のところ、オキサリプラチン耐性に対するｐ５３の状態の臨床的な重要性はこれから確立しなければならないことである。野生型ｐ５３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてトポイソメラーゼＩ阻害剤に対する感受性増加に関連したが、機能的ｐ５３を欠如した細胞は、カンプトテシンに曝露した後、アポトーシスを受けることができることも示された（２５、２６）。本研究では、本発明者等は、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞において、細胞毒性分析、フローサイトメトリー分析およびＰＡＲＰ切断測定によって測定したところ、ＣＰＴ−１１に対する同等の感受性を認めた。Ｊａｃｏｂ他はまた、いくつかの結腸直腸癌細胞株において、ｐ５３の状態はＣＰＴ−１１に対する感受性と相関しなかったことを発見した（２７）。臨床の場では、Ｌａｎｓｉａｕｘおよび共同研究者等は、ＤＮＡ−トポイソメラーゼＩ複合体のレベルは、それらのＭＳＩおよびｐ５３表現型には関わりなく、ＣＰＴ−１１に対する感受性と相��することを示した（２８）。こうして、本研究およびいくつかのその他の研究は、ｐ５３の状態はＣＰＴ−１１に対する化学感受性に影響を及ぼすことができないことを示唆している。
【０１０７】
代謝拮抗物質に対する耐性の機構は、薬剤代謝もしくは標的蛋白質の発現における変更が関与していることが多い。５−ＦＵについては多くこのことが分かっているが、その代謝活性化に関与するいくつかの酵素の作用機序は複雑である。ＴＳおよびＤＰＤの活性化の増強は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびいくつかの臨床研究の両方において、５−ＦＵに対する耐性と関連があった（６、８、２９〜３１）。ＴＳは、５−ＦＵの主要な細胞標的であり、ＤＰＤは５−ＦＵの異化作用における律速段階を触媒する（３２）。この研究において、本発明者等は、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−５−ＦＵ耐性細胞のいずれにおいても、ＴＳおよびＤＰＤ  ｍＲＮＡ発現の変更を認めなかった。これらの分子に加えて、ＯＰＲＴ、ＴＰ、ＵＰおよびＵＫなどの５−ＦＵ同化酵素の活性減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける５−ＦＵに対する感受性の調節に関与することが示唆された（３３）。本発明者等は、親細胞と比較して５−ＦＵ耐性細胞におけるＴＰ  ｍＲＮＡの下方制御を示した。細胞培養および異種移植モデル系は、癌細胞にＴＰを形質移入すると、おそらく５−ＦＵのＦｄＵＭＰへの代謝活性化の増加によって、５−ＦＵに対する感受性が増加することを示した（３４）。対照的に、ＴＰの強い過剰発現が結腸直腸癌患者の予後不良の指標であることが発見された（９）。これらの矛盾した所見は、血管新生因子としてのＴＰの役割による可能性があり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、ＴＰ発現は、化学療法に対する応答が不十分な、より侵襲的で悪性度の高い腫瘍表現型のマーカーとなる可能がある（３５）。さらに、本発明者等は、ｐ５３−／−５−ＦＵ耐性細胞におけるＯＰＲＴ  ｍＲＮＡ発現の下方制御を示した。これは、ＯＰＲＴレベルと５−ＦＵ薬剤感受性との間の相関を示したいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究と一致した（３３、３６）。最近の臨床データはまた、ＯＰＲＴ活性によって、結腸直腸癌患者における５−ＦＵに対する感受性を予測でき、レベルの高さが感受性の増加と関係があることを示唆している（３７、３８）。興味深いことに、ＯＰＲＴレベルは、親細胞株と比較してｐ５３＋／＋５−ＦＵ耐性細胞では僅かに上昇しているようである。ＨＣＴ１１６細胞の５−ＦＵに対する応答を媒介するＯＰＲＴの役割を決定するには、さらに研究することが必要である。本発明者等はまた、ｐ５３＋／＋５−ＦＵ耐性細胞におけるＴＫ  ｍＲＮＡの過剰発現を示した。これは、５−ＦＵ耐性胃癌細胞におけるＴＫの発現増加を報告した、Ｃｈｕｎｇ他（３６）と一致した。さらに、Ｏｌｉｖｅｒおよび共同研究者等は、異種ＴＫ遺伝子の過剰発現はメソトレキセートもしくはフルオロデオキシウリジンなどのヌクレオチド合成阻害剤によって誘導されるアポトーシスからマウスＢＡＦ３細胞を防御することを示した（３９）。この著者等は、ＴＫによるチミジンの再利用は、チミジル酸デノボ合成の阻害を補い、それによってチミン欠乏死を阻止できることを示唆している。臨床の場合では、ＴＳおよびＴＫ活性の増加は、結腸直腸癌患者の全生存期間のための重要な予後因子であることが報告された（４０）。これらのデータとは対照的に、本発明者等は、親細胞株と比較してｐ５３−／−５−ＦＵ��性細胞におけるＴＫ  ｍＲＮＡレベルの中等度の下方制御を示した。これらの細胞における５−ＦＵに対する応答を媒介するＴＫの役割を明確にするには、さらに研究することが必要である。
【０１０８】
オキサリプラチンに最も応答しやすい患者の同定に現在使用可能な予測的バイオマーカーは比較的少ない。この研究では、本発明者等は、オキサリプラチン耐性細胞においてヌクレオチド除去修復蛋白質ＥＲＣＣ１をコードするｍＲＮＡレベルの上昇を示した。同様に、Ｈｅｃｔｏｒ他は、ＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルは、感受性親細胞に対してオキサリプラチン耐性卵巣癌細胞株では約２倍高いことを示した（４１）。Ａｒｎｏｕｌｄおよび共同研究者等はまた、ＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルはオキサリプラチン感受性を予測することを示した（４２）。高いＥＲＣＣ１遺伝子発現は、５−ＦＵ／オキサリプラチンで治療後の転移性結腸直腸癌の患者の生存率の低さと相関することが示された（１０）。この研究から、ＥＲＣＣ１は、５−ＦＵ／オキサリプラチンをベースとした化学療法に対する応答の独立した予測マーカーであることは明らかであろう。この研究では、本発明者等は、オキサリプラチン耐性細胞における完全長ＥＲＣＣ１およびいくつかのスプライシングバリアントの両方の上方制御を示した。他のスプライシング変種は、ＤＮＡ損傷認識／除去複合体の形成中に完全長ＥＲＣＣ１と競合することが可能で、ＤＮＡ除去修復の阻害をもたらすことが想定された（４３）。明らかに、プラチナ化学療法に対する感受性の決定における完全長および他のスプライシングＥＲＣＣ１蛋白質の両方の生物学的役割を完全に評価するためには、さらなる研究が必要である。
【０１０９】
オキサリプラチン耐性細胞におけるＤＮＡ修復の補因子ＸＰＡもしくはグルタチオン（ＧＳＨ）代謝酵素γＧＣＳの発現の変化は、プラチナをベースとした化学療法に対する感受性の減少と関連することがいくつかの臨床研究および非臨床研究で記載されている（４２、４４〜４６）が、本発明者等は、その証拠は見いださなかった。しかし、本発明者等は、親細胞に対してｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−オキサリプラチン耐性細胞株の両方でＡＢＣ半輸送体ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２が過剰発現していることを示した。ＢＣＲＰの高い発現は、いくつかの薬剤耐性細胞株および腫瘍試料において示された（４７〜４９）。いくつかの化学療法薬は、アントラセンジオンミトキサントロン、ダウノルビシンおよびドキソルビシンなどのアントラサイクリン、トポテカン、ビサントラン（ｂｉｓａｎｔｒａｎｅ）および活性型イリノテカン、ＳＮ−３８を含めたＢＣＲＰの基質であることが示された（５０）。本発明者の知る限りでは、これはＢＣＲＰ過剰発現とプラチナ化学療法に対する耐性との間の関係の最初の報告である。何人かの著者は、シスプラチンはＢＣＲＰの基質ではないことを報告しているが（５１、５２）、これら２種類の分子の間の構造の違いおよび交差耐性の欠如を考えれば、様々な細胞輸送機構を利用できる可能性がある。さらに、その他の多剤耐性蛋白質とは異なり、ＧＳＨはＢＣＲＰ媒介輸送の必須の補因子ではないことが示唆された。これらのデータは、オキサリプラチン耐性細胞におけるγＧＣＳ発現の調節の欠如に関する本発明者等の以前の観察を支持する。オキサリプラチン耐性におけるＢＣＲＰの生物学的役割を完全に解明するために、さらに研究が行われるだろう。
【０１１０】
ＣＰＴ−１１に対する耐性の様々な機構がｉｎ  ｖｉｖｏでは特徴付けられてきたが、臨床の場におけるそれらの重要性については比較的少ししか知られていない。ＣＥ活性が欠如した細胞は、ＣＰＴ−１１を活性代謝物ＳＮ−３８に変換することができず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてプロドラッグに対する感受性の減少を示す（５３）。本発明者等は、野生型ｐ５３の存在下および非存在下の両方において、ＣＰＴ−１１耐性細胞におけるＣＥ  ｍＲＮＡレベルの減少を示した。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでは肝臓変換が最も優勢と思われるので、腫瘍細胞内のＣＥ活性はこの薬剤に対する感受性を決定するのに主要な役割を果たさないだろう。実際に、本発明者等は、これらのＣＰＴ−１１耐性細胞はまた、ＳＮ−３８に耐性であることを示し、耐性表現型は、ＣＥ発現レベルの低さに左右されないことを示した。既に述べたように、ＢＣＲＰ輸送体は、ＳＮ−３８の胆汁中排泄に関与することが示唆された（５４）。本研究では、本発明者等は、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＣＰＴ−１１耐性細胞両方において、ＢＣＲＰ  ｍＲＮＡの著しい上方制御を示した。現在では、ＳＮ−３８のＢＣＲＰ媒介輸送とＣＰＴ−１１耐性との臨床的関連に関する情報はほとんど入手できない。ＴＯＰＯ  Ｉは、ＳＮ−３８の細胞標的であるので、ＴＯＰＯ  Ｉの細胞レベルはＣＰＴ−１１感受性に比例すると考えられる。この見解は、細胞中のＴＯＰＯ  Ｉ発現の減少が、感受性親細胞と比較して、ＣＰＴ−１１に対して耐性にさせることを報告した何人かの研究者による実験証拠によって支持される（１１、５５、５６）。本研究では、本発明者等は、ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−の両方の場合において、ＣＰＴ−１１耐性細胞中のＴＯＰＯ  Ｉ  ｍＲＮＡの劇的な下方制御を示した。ＣＰＴ−１１耐性細胞におけるＴＯＰＯ  Ｉ発現の減少がこのＩＩ型トポイソメラーゼの過剰発現によって補われるという報告に続いて、本発明者等はさらに、ＴＯＰＯ  ＩＩαのｍＲＮＡレベルを調べたが、本発明者等は、本発明者のモデル系におけるＴＯＰＯ  ＩＩα  ｍＲＮＡ発現の変化の証拠を発見しなかった。今までに、トポイソメラーゼ発現とＣＰＴ−１１に対する反応性との間の一貫した関連は示されていない。
【０１１１】
結論として、本発明者等は、５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびＣＰＴ−１１に対して耐性の一群のｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−同質遺伝子的結腸癌細胞株の作製に成功した。本発明者等は、進行型ＣＲＣの治療で使用する化学療法に対する応答の予測に関与するいくつかのマーカーの発現レベルを確立するために、これらの細胞株を使用した。さらに、本発明者等は、ｐ５３の潜在的役として、５−ＦＵおよびオキサリプラチンに対する応答の重要な決定因子であるが、ＣＰＴ−１１に対する決定因子ではないことを示した。結腸直腸癌においてｐ５３変異の発生率が高いことを考慮すると、これは興味深い所見であり、ＣＰＴ−１１は、ｐ５３野生型および変異腫瘍の治療に同等に有効であり得ることを示唆している。さらに研究するために、本発明者等は、ＤＮＡマイクロアレイおよびプロテオミクス技術と一緒にこのモデル系を使用して、野生型ｐ５３の存在下および非存在下における化学感受性の新規決定因子を同定し、臨床の場における有用性を評価することを企図する。
【０１１２】
本明細書で言及した文書は全て、本明細書に参考として援用する。本発明の範囲および精神を逸脱しない本発明で記載した実施形態の様々な改変および変更は、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、請求された本発明はこのような特定の実施形態に不当に制限されないことを理解されたい。実際に、記載された当業者に明らかな本発明実施様式の様々な変更は、本発明の対照として含まれるものとする。
【０１１３】
【表１】
2007528730.tif 000002
【０１１４】
表２Ａ  ５−ＦＵ、オキサリプラチン、およびＣＰＴ−１１処理ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６親細胞および薬剤耐性細胞のＭＴＴ測定から得られたＩＣ５０（７２時間）値。値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して算出した。
【０１１５】
【表２Ａ】
2007528730.tif 000003
【０１１６】
表２Ｂ  ５−ＦＵ、オキサリプラチン、およびＣＰＴ−１１処理ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞および薬剤耐性細胞のＭＴＴ測定から得られたＩＣ５０（７２時間）値。値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して算出した。
【０１１７】
【表２Ｂ】
2007528730.tif 000004
【０１１８】
表３  ＳＮ−３８処理ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞および薬剤耐性細胞のＭＴＴ測定から得られたＩＣ５０（７２時間）値。値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して算出した。
【０１１９】
【表３】
2007528730.tif 000005
【０１２０】
表４  カルボプラチン処理ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞およびオキサリプラチン耐性細胞のＭＴＴ測定から得られたＩＣ５０（７２時間）値。値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して算出した。
【０１２１】
【表４】
2007528730.tif 000006
【０１２２】
参考文献リスト
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】（Ａ）５−ＦＵ  ０μＭ、１μＭ、５μＭおよび１０μＭ、（Ｂ）オキサリプラチン（ＯＸＡ）  ０μＭ、０．５μＭ、１μＭおよび５μＭ、および（ｃ）ＣＰＴ−１１  ０μＭ、０．５μＭ、１μＭおよび５μＭで処理した後のｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６親細胞および耐性細胞の細胞周期分布を示した図である。
【図２】（Ａ）５−ＦＵ  ０μＭ、１μＭ、５μＭおよび１０μＭ、（Ｂ）オキサリプラチン（ＯＸＡ）  ０μＭ、０．５μＭ、１μＭおよび５μＭ、および（ｃ）ＣＰＴ−１１  ０μＭ、０．５μＭ、１μＭおよび５μＭで処理した後のｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞および耐性細胞の細胞周期分布を示した図である。
【図３】様々な濃度の（Ａ）５−ＦＵおよび（Ｂ）オキサリプラチン（ＯＸＡ）で７２時間処理したｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞におけるアポトーシスレベルの減少をｐ５３＋／＋細胞と比較して示した図である。（Ｃ）ＣＰＴ−１１で処理したｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞は同一のアポトーシスレベルを示す。（Ｄ）ＣＰＴ−１１  ５μＭで４８時間処理した後のｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＡＲＰ切断を示したウェスタンブロットの図である。５−ＦＵ  ５μＭおよびオキサリプラチン  １μＭで４８時間曝露した後、ＰＡＲＰ切断はｐ５３＋／＋細胞でのみ明瞭であった。
【図４】（Ａ）ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞および５−ＦＵ耐性細胞におけるチミジル酸合成酵素（ＴＳ）、ジヒドロピリミジン脱水素酵素（ＤＰＤ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）、ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰ）およびウリジンキナーゼ（ＵＫ）の基準ｍＲＮＡ発現レベルを示した図である。（Ｂ）ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞およびオキサリプラチン耐性細胞における除去修復種間相補蛋白質１（ＥＲＣＣ１）、ガンマ−グルタミルシステイン合成酵素（γＧＣＳ）、乳癌耐性蛋白質（ＢＣＲＰ）および色素性乾皮症群Ａ相補蛋白質（ＸＰＡ）の基準ｍＲＮＡ発現レベルを示した図である。（Ｃ）ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６親細胞およびＣＰＴ−１１耐性細胞におけるカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰＯ  Ｉ）、ＢＣＲＰおよびトポイソメラーゼＩＩアルファ（ＴＯＰＯ  ＩＩα）の基準ｍＲＮＡ発現レベルを示した図である。それぞれの場合において、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現を添加対照として評価した。
【図１】
2007528730.tif 000007
【図２】
2007528730.tif 000008
【図３】
2007528730.tif 000009
【図４】
2007528730.tif 000010
【配列表】
2007528730000001.app
【国際調査報告】
2007528730.tif 000011
2007528730.tif 000012
2007528730.tif 000013
2007528730.tif 000014
2007528730.tif 000015