(57)【要約】本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物およびその組成物に関する。有効量の少なくとも１つの上記の抽出物を被験体に投与するステップを含む、ＰＰＡＲ媒介性生理学的容態の治療方法が提供され、さらにステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、有効量の少なくとも１つのタイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物またはフラボノイド化合物を被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性の増大または相乗作用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイツリオウギ（Astragalus membranaceus; ＨＱ）の抽出物であって、前記抽出物が、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、前記ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される、タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物。
【請求項２】
前記抽出物が、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター生体活性物質に富む、請求項１の抽出物。
【請求項３】
請求項１または２の抽出物を含む組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含む、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療のための薬学的組成物または栄養補助組成物である、請求項３または４の組成物。
【請求項６】
前記ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態が、ＰＰＡＲ媒介性疾患であり、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、炎症性腸疾患、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、または肥満症である、請求項５の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアおよび／または希釈剤をさらに含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抽出物が、ＰＰＡＲγ媒介性生理学的容態の治療のための有効量の１〜１０００μｇ／ｍＬの抽出物を含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抽出物が、ＰＰＡＲα媒介性生理学的容態の治療のための有効量の１〜１０００μｇ／ｍＬの抽出物を含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、食品または飲料中に存在する、請求項３〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が商業包装中に存在し、前記包装が使用説明書を含む、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
タイツリオウギの植物体または前記植物体の一部を、ヘキサン、ジクロロメタン、および／またはクロロホルムで処理するステップを含む、請求項１または２の抽出物の調製方法。
【請求項１３】
ステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大するか相乗作用することができる化合物または抽出物をスクリーニングおよび／または発見する方法であって、
ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドを含む組成物に、化合物または抽出物を接触させるか混合するステップと、
前記リガンドの活性の増大または相乗作用を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
前記リガンドが、ステロイド／核レセプターのポケットに結合し、前記化合物または抽出物が前記ステロイド／核レセプターのリガンド結合ポケットに特異的に結合しない、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記リガンドが、内因性のアンドロゲン、プロゲストゲン、糖質コルチコイド、および／またはＰＰＡＲアゴニストである、請求項１３または１４の方法。
【請求項１６】
医薬品用のタイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物であって、前記抽出物が、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、前記ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される、タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物。
【請求項１７】
前記抽出物が、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター生体活性物質（ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ）に富む、請求項１６の抽出物。
【請求項１８】
少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含む、請求項１６または１７の抽出物。
【請求項１９】
前記フラボノイドが、カリコシン（ｃａｌｙｃｏｓｉｎ）、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン（ａｆｒｏｍｏｒｓｉｎ）、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン（ｏｄｏｒａｔｉｎ）、および／またはダイゼインである、請求項１８の抽出物。
【請求項２０】
被験体のステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態の治療用の薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のためのタイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物の使用であって、前記抽出物が、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、前記ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される、タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物の使用。
【請求項２１】
前記組成物が、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含む、請求項２０の使用。
【請求項２２】
前記フラボノイドが、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、および／またはダイゼインである、請求項２１の使用。
【請求項２３】
前記ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態がＰＰＡＲ媒介性容態である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＰＰＡＲ媒介性容態が、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態である、請求項２３の使用。
【請求項２５】
前記ＰＰＡＲα媒介性疾患が、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、肥満症、および／または結腸癌である、請求項２４の使用。
【請求項２６】
前記ＰＰＡＲγ媒介性疾患が、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、および／または炎症性腸疾患である、請求項２４の使用。
【請求項２７】
前記被験体を、ＰＰＡＲ媒介性容態の治療のために５〜５０００ｍｇの抽出物で治療する、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記被験体を、ＰＰＡＲ媒介性容態の治療のための有効量の１〜１０００μｇ／ｍＬの抽出物で治療する、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態の治療用（但し、前立腺癌および乳癌の治療を除く）の薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のためのカリコシンおよび／またはホルモノネチンの使用。
【請求項３０】
前記ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態がＰＰＡＲ媒介性容態である、請求項２９の使用。
【請求項３１】
前記ＰＰＡＲ媒介性容態が、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態である、請求項３０の使用。
【請求項３２】
前記ＰＰＡＲα媒介性疾患が、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、肥満症、および／または結腸癌である、請求項３１の使用。
【請求項３３】
前記ＰＰＡＲγ媒介性疾患が、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、および／または炎症性腸疾患である、請求項３１の使用。
【請求項３４】
前記組成物が、食品または飲料中に存在する、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
前記組成物が商業包装中に存在し、前記包装が使用説明書を含む、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
ステロイド／核レセプターのリガンドの活性の増大または相乗作用のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のための使用であって、
タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物；および
フラボノイド化合物またはその混合物
のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項３７】
ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、有効量のタイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物およびフラボノイド化合物またはそれらの混合物を被験体に投与するステップを含み、インビボで増大および／または相乗作用させる、請求項３６の使用。
【請求項３８】
前記抽出物が、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、前記ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される、請求項３６または３７の使用。
【請求項３９】
前記フラボノイド化合物が、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、および／またはダイゼインである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記リガンドがＰＰＡＲリガンドである、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
前記リガンドが、抗糖尿病薬または脂質低下薬である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記リガンドがホルモンである、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
前記ホルモンが、アンドロゲン、プロゲストゲン、または糖質コルチコイドである、請求項４２の使用。
【請求項４４】
ａ）前記リガンドがアンドロゲンであり、前記被験体が、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、
ｂ）前記リガンドがプロゲストゲンであり、前記被験体が、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、または月経異常の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、または
ｃ）前記リガンドが糖質コルチコイドであり、前記被験体が、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下にない、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４５】
前記被験体が、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態を罹患している、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
前記ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態がＰＰＡＲ媒介性容態である、請求項４５の使用。
【請求項４７】
前記ＰＰＡＲ媒介性容態が、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態である、請求項４６の使用。
【請求項４８】
前記ＰＰＡＲα媒介性疾患が、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、肥満症、および／または結腸癌である、請求項４７の使用。
【請求項４９】
前記ＰＰＡＲγ媒介性疾患が、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、および／または炎症性腸疾患である、請求項４７の使用。
【請求項５０】
ＨＱ抽出物が、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、前記ＨＱ抽出物はエタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される有効量の少なくとも１つの抽出物を被験体に投与するステップを含む、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態の治療方法。
【請求項５１】
前記方法が、ＰＰＡＲα媒介性容態の治療のために５〜５０００ｍｇの抽出物で被験体を治療するステップを含む、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記方法が、ＰＰＡＲγ媒介性容態の治療のために５〜５０００ｍｇの抽出物で被験体を治療するステップを含む、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記方法が、ＰＰＡＲα媒介性容態の治療のために１ｍＬの血液容量あたり１〜１０００μｇの抽出物で被験体を治療するステップを含む、請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記方法が、ＰＰＡＲγ媒介性容態の治療のために１ｍＬの血液容量あたり１〜１０００μｇの抽出物で被験体を治療するステップを含む、請求項５０の方法。
【請求項５５】
前記ＰＰＡＲγ媒介性容態が、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、および／または炎症性腸疾患である、請求項５２または５４の方法。
【請求項５６】
前記ＰＰＡＲα媒介性容態が、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、肥満症、および／または結腸癌である、請求項５１または５３の方法。
【請求項５７】
有効量のカリコシンおよび／またはホルモノネチンを被験体に投与するステップを含む、ＰＰＡＲ媒介性容態を治療（但し、前立腺癌および乳癌の治療を除く）する方法。
【請求項５８】
前記ＰＰＡＲ媒介性容態が、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、多嚢胞性卵巣疾患、肥満症、異常脂質血症、および／または結腸癌である、請求項５７の方法。
【請求項５９】
ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、
タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物、
フラボノイド化合物、および
有効量のタイツリオウギの抽出物またはフラボノイド化合物を含む薬学的組成物または栄養補助組成物
のうちの有効量の少なくとも１つを被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大または相乗作用させる方法。
【請求項６０】
前記薬学的組成物および栄養補助組成物が、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、前記ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される有効量の少なくとも１つの抽出物を含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記リガンドがＰＰＡＲリガンドである、請求項５９または６０の方法。
【請求項６２】
前記リガンドが、抗糖尿病薬または脂質低下薬である、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記リガンドがホルモンである、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ホルモンが、アンドロゲン、プロゲストゲン、または糖質コルチコイドである、請求項６３の方法。
【請求項６５】
ａ）前記リガンドがアンドロゲンであり、前記被験体が、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、
ｂ）前記リガンドがプロゲストゲンであり、前記被験体が、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、または月経異常の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、または
ｃ）前記リガンドが糖質コルチコイドであり、前記被験体が、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下にない、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記フラボノイド化合物が、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、および／またはダイゼインである、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法が、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣疾患、ホルモン依存性の乳癌、結腸癌、もしくは前立腺癌、または炎症性腸疾患からなる群から選択されるＰＰＡＲγ媒介性容態の治療のためである、請求項５９〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロイド／核媒介性生理学的容態の治療のための組成物および方法に関する。特に、漢方薬（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈｅｒｂ）抽出物およびこれらから抽出された化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド／核レセプター
ステロイド／核レセプターは、そのエンハンサー領域またはプロモーター領域に存在するホルモン応答エレメントへの結合によって遺伝子を活性化するリガンド活性化転写因子である。ステロイド／核レセプタースーパーファミリーのメンバーには、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）、糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、およびペルオキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）が含まれる。ステロイド／核レセプターは、一般に、特異的機能を有するドメインに組織化される。Ｎ末端トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、リガンド独立性活性化機能を有するのに対して、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、レセプターを、応答遺伝子のプロモーター中の同族（cognate）標的部位に結合させることができる。Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、小さな疎水性リガンドとの特異的相互作用のためのポケットを含む。リガンド結合の際、ステロイド／核レセプターは、高次構造が変化してレセプターがＤＮＡと相互作用し、それにより、標的遺伝子由来のＲＮＡ転写が調節される。ＲＮＡ転写の調整によって対応するタンパク質レベルが変化し、これらのレセプターに関連する無数の生理学的活性をもたらす。
【０００３】
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）およびＰＰＡＲアクチベーター（リガンド）
ＰＰＡＲは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成し、標的遺伝子のプロモーター領域中のペルオキシソーム増殖因子応答エレメント（ＰＰＲＥ）への結合によって遺伝子発現を調節する核／ホルモンレセプタースーパーファミリーのメンバーである（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ  ＤＪ，Ｅｖａｎｓ  ＲＭ  １９９５）。３つの公知のＰＰＡＲアイソタイプ（すなわち、α、β、およびγ）が存在する。ＰＰＡＲγは、グルコース代謝、脂質生成、およびインスリン感作の調節ならびに発癌および炎症過程に関与する遺伝子発現を制御する（Ｋｅｒｓｔｅｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）。公知のＰＰＡＲγの合成リガンドには、化合物のチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）クラスが含まれ、これは、血漿グルコースの維持、長期糖尿病合併症の発症の予防、および糖尿病耐性に関してＩＩ型糖尿病の治療に有効であることが臨床的に証明されている（Ｓａｌｔｉｅｌ  ＡＲ，Ｏｌｅｆｓｋｙ  ＪＭ  １９９６）。これらのＰＰＡＲγアクチベーターは、腫瘍成長阻害のための抗増殖薬としても開発されている（Ｋｏｅｆｆｌｅｒ  ＨＰ  ２００３）。さらに、その潜在的な抗炎症効果が証明されたことにより、炎症性疾患モデルおよび炎症性腸疾患患者における治療試験が開始されている（Ｗａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。他方では、多くの研究により、ＰＰＡＲαが脂肪酸取り込み（脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＴＰ））、β酸化（アシル−ＣｏＡオキシダーゼ）、およびω酸化（シトクロムＰ４５０）などの脂質代謝に関与する遺伝子を調節することが証明されている（Ｇｏｕｌｄ  Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ＢＥ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。これらの所見と一致して、ＰＰＡＲαの薬理学的アクチベーターであるフィブレートクラスの薬物（フェノフィブレートおよびゲムフィブロジルが含まれる）は、高脂血症患者の血清トリグリセリド（ＴＧ）を低下させ、ＨＤＬコレステロールを増加させる。ＰＰＡＲαはまた、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（リポタンパク質リパーゼによるＴＧ加水分解を阻害するタンパク質）をダウンレギュレートすることが示されている。ＰＰＡＲαリガンドのこの活性は、脂質低下効果にさらに寄与する（Ｈａｕｂｅｎｗａｌｌｎｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）。さらに、心血管疾患におけるフィブレート介入は、全身のＴＧ減少によって心臓および血管壁の脂肪蓄積が減少するので、有益な可能性が高い。したがって、ＰＰＡＲαアクチベーターは、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、肥満症、および多嚢胞性卵巣疾患などの容態の治療に有用である。
【０００４】
ＰＰＡＲアクチベーターがグルコースおよび脂質代謝の調節において多くの効果があることが、ＩＩ型糖尿病、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、肥満症、および多嚢胞性卵巣疾患の治療においてこれらの薬剤が使用される要因となっている。さらに、乳癌、前立腺癌、および結腸癌に対するその抗増殖効果が、これらの癌の治療で活用されている。最近、結腸炎および炎症性腸疾患などの炎症性疾患に対処するその抗炎症効果のために、ＰＰＡＲアクチベーターに別の治療項目が加えられた。
【０００５】
ＰＰＡＲアクチベーターの広範な治療用途を考慮して、治療で使用することができるＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαのアゴニストまたは相乗活性を有する化合物を同定することが有利であろう。
【０００６】
ホルモンおよびホルモンモジュレーター
テストステロン、エストロゲン、プロゲストゲン、および糖質コルチコイドは、体内でそれぞれＡＲ、ＥＲ、ＰＲ、およびＧＲへの結合によってヒトの生殖器系および免疫系で広範な役割を果たすステロイド系ホルモンである。テストステロンは、子宮内での男性形態形成、思春期の配偶子形成および前立腺成長、および高齢男性の前立腺癌の発症を媒介する。一方で、プロゲステロンはエストロゲンと共に、卵母細胞の受精、胚の着床、および妊娠の維持に重要な女性生殖器官の変化を開始させるように中枢神経系、卵巣、および子宮に作用する。他方では、糖質コルチコイドは、内分泌ホメオスタシス、ストレス応答、脂質代謝、炎症、およびアポトーシスなどの多数の生理学的過程に関与する。これらのホルモンによって調節されるその各ホルモンレセプターに対する複数の効果により、所望の効果を発揮するためにこれらのレセプターに対する選択的親和性を有する合成アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスチン、および糖質コルチコイドを使用する機会が得られる。しかし、これらの薬剤の使用は、癌リスクの増加、視床下部−下垂体軸の抑制、および成長遅延による骨粗鬆症に及ぶ副作用に関する多数の報告により妨げられている。したがって、現在、その有効性を維持し、且つ、有益であるが副作用の少ない薬剤の開発に挑んでいる。したがって、外因性薬剤を使用して以前に試験した副作用を防止および減少させるために体内の既存のステロイド系ホルモンの活性を増大および相乗作用する化合物または天然産物を同定することが有利である。このような物質は、治療組成物の開発および／または栄養補助食品への適用に必要である。
【０００７】
タイツリオウギ（ＨＱ）由来の抽出物および化合物の使用
アストラガルス（Astragalus）は、マメ科（エンドウマメ）に属する。１２５種のアストラガルス種のうち、タイツリオウギ（Astragalus membranaceus）の乾燥根は、最も一般的に医薬品に使用されているものである。中国では、タイツリオウギの乾燥根は、黄耆（Ｈｕａｎｇ  ｑｉ）（ＨＱ）として一般に公知である。これは、伝統的に、気を強化し、表部（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ）の耐性を強化し、排膿および新規の組織の成長を促進するために使用される。伝統的には、真性糖尿病、慢性腎炎のタンパク尿症、気の欠如に起因する浮腫、貧血、および膿瘍の治療に適応される（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ，１９９７）。
【０００８】
タイツリオウギ（ＨＱ）は、ウイルス疾患治療のために他の抗ウイルス薬または薬草と組み合わせて使用されている（Ｑｉａｎ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）。これは、副作用を軽減するための化学療法の補助薬および潜在的な抗癌薬としても研究されている（Ｓｕｎ  Ａ，Ｃｈｉａｎｇ  ＣＰ  ２００１）。さらに、糖尿病予防におけるタイツリオウギの水性抽出物の有用性を決定する研究がいくつか行われている（Ｌｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。多くの研究者は、心臓病治療におけるタイツリオウギの水性抽出物の用途を研究している（Ｍａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  １９９８，Ｙａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）。タイツリオウギの根のエタノール抽出物は、Ｈｅ  ＺＱ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ＢＱ，１９９０に記載されている。タイツリオウギの根のｎ−ブタノール抽出物も、Ｍａ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，２００３に記載されている。要するに、現在報告されている潜在的な臨床上の利点は、ウイルス疾患、心疾患、糖尿病、および炎症症候群から癌に及ぶ。
【０００９】
タイツリオウギの根の医学的性質は、アストラメンブラニン（Ａｓｔｒａｍｅｍｂｒａｎｎｉｎ）およびアストラガロシドＩ〜ＩＶが含まれるその多糖類に帰する（Ｋｅｉｊｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  １９９７，Ｚｈａｎｇ  Ｗ  １９９７）。同様に、この薬草から単離したアフロモルシン（ａｆｒｏｍｏｒｓｉｎ）、カリコシン（ｃａｌｙｃｏｓｉｎ）、ホルモノネチン、およびオドラチン（ｏｄｏｒａｔｉｎ）などのフラボノイドは、薬草の抗酸化特性および抗炎症特性を明らかにすることができる（Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９７，Ｓｈｉｚｕｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。単離された他の成分には、γ−アミノ酪酸、ダウコステロール、β−シトステロール、４−アミノブタン酸、ジメチル４，４’−ジメトキシ−５，６：５’，６’−ビス（メチレンジオキシ）ビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、葉酸、ベタイン、プラリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、アスパラミド（ａｓｐａｒａｍｉｄｅ）、カナバニン、およびγ−アミノ酪酸が含まれる（Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｘｉａｎ  Ｄａｉ  Ｙａｎ  Ｊｉｕ  １９９３；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ  １９９４）。これらの全化合物の濃度は、培養条件によって変化し得る（Ｍａ  ＸＱ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。タイツリオウギの根のエタノール抽出物から単離した１０種の構成要素は、Ｈｅ  ＺＱ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ＢＱ，１９９０に記載されている。１０種の構成要素は、パルミチン酸（Ｉ）、ルペオール（ＩＩ）、β−シトステロール（ＩＩＩ）、アステラガロシド（ａｓｔｅｒａｇａｌｏｓｉｄｅ）ＩＶ（ＩＶ）、３Ｓ−３−（−）ムクロヌラトール（ｍｕｃｒｏｎｕｌａｔｏｌ）−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｖ）、ダウコステロール（ＶＩ）、ジメチル４，４−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２−ジカルボキシレート（ＶＩＩ）、アスパラギン（ＶＩＩＩ）、γ−アミノ酪酸（ＩＸ）、およびスクロース（Ｘ）である。
【００１０】
タイツリオウギから単離した主要化合物の１つであるカリコシンは、（Ｌｉｎ  ＬＺ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）を、イヌカンゾウの根毛培養物などの他の供給源から単離することもできる（Ｌｉ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。天然供給源だけでなく、カリコシンを化学合成することもできる（Ｊａｉｎ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ  １９６９）。研究により、マカエリウム・アリスツラタム（Ｍａｃｈａｅｒｉｕｍ  ａｒｉｓｔｕｌａｔｕｍ）の抗ジアルジア活性が単離されたカリコシンおよびホルモノネチンの生体活性に起因することが示されている（ＥｌＳｏｈｌｙ  ＨＮ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。さらに、ブラウンハート（アンディラ・イネルミス、Ａｎｄｉｒａ  ｉｎｅｒｍｉｓ）の抗プラスモジウム活性も、カリコシンによるものと説明されている（Ｋｒａｆｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）。
【００１１】
他方では、ヒト肝臓でミクロソーム代謝を受けるホルモノネチンはカリコシン（Ｔｏｌｌｅｓｏｎ  ＷＨ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）よりも研究されている。ホルモノネチンは、そのエストロゲン作用（Ｍｉｋｓｉｃｅｋ  ＲＪ  １９９４，Ｗｉｌｌａｒｄ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｆｒａｗｌｅｙ  ＬＳ  １９９８，Ｋｕｉｐｅｒ  ＧＧＪＭ  ｅｔ  ａｌ  １９９８，Ｍｏｒｉｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）および抗酸化能力（Ｐｏｏｌ−Ｚｏｂｅｌ  ＢＬ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）について広範に研究されている。
【００１２】
カリコシンおよびホルモノネチンは、タイツリオウギの根のｎ−ブタノール抽出によっても得られている（Ｍａ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａｐｒ．１１；９９２（１−２）：１９３−７）。
【００１３】
カリコシンおよびホルモノネチンは、イソフラボンファミリーに属し、メンバーの間ではゲニステインが含まれる。強力な植物エストロゲンとしてのゲニステインの性質は広範に研究されている。疫学的研究により、アジア人男性の前立腺癌発症の少なさと高ダイズゲニステイン食とが関連づけられている。しかし、ゲニステインのアンドロゲン効果には解明の余地がある。
【００１４】
最近、薬草または天然の供給源の医薬品の使用に関心が向けられ始めている。さらに、天然産物由来の薬物は、栄養補助処方物または栄養補助食品としての商業上または産業上の機会を生むことができる。最後に、天然産物中の有効成分として同定された化合物は、薬学的研究の重要な基礎を形成する。
【００１５】
しかし、タイツリオウギおよび他の薬草の抽出物ならびにこれらから単離されたフラボノイド化合物を調査する場合でさえ、ステロイド／核レセプター（ＰＰＡＲレセプターが含まれる）に対するタイツリオウギの抽出物またはこれから単離されたフラボノイド化合物（カリコシンおよびホルモノネチン）の効果に関する研究は報告されていない。
【発明の開示】
【００１６】
本発明者らは、薬草、特に、タイツリオウギ（以後、「ＨＱ」と示す）の抽出物および／またはこれから単離したフラボノイド化合物がステロイド／核レセプター関連生理学的容態の治療に有用であることを見出した。
【００１７】
１つの態様によれば、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物、またはクロロホルム抽出物を提供し、タイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物も提供する（但し、ＨＱ抽出物はエタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）。このような抽出物の特徴は、ＰＰＡＲ生体活性物質に富むことである。
【００１８】
本発明はまた、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、またはタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物のうちの少なくとも１つを含む組成物（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）を提供する。
【００１９】
組成物は、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含み得る。
【００２０】
特に、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、ＨＱ抽出物はエタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される有効量の少なくとも１つの抽出物を含む、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療のための薬学的組成物または栄養補助組成物を提供する。
【００２１】
薬学的組成物または栄養補助組成物を、食品または飲料の形態で調製することもできる。
【００２２】
上記組成物の任意の形態および使用説明書を含む商業包装も提供する。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、ＨＱ抽出物はエタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される有効量の少なくとも１つの抽出物を被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療方法を提供する。
【００２４】
ＰＰＡＲγ媒介性生理学的容態は、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、または炎症性腸疾患である。
【００２５】
ＰＰＡＲα媒介性生理学的容態は、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、または肥満症である。
【００２６】
さらなる態様によれば、本発明者らは、フラボノイド化合物（例えば、上記薬草抽出物から単離したイソフラボノイド化合物）もＰＰＡＲ媒介性生理学的容態の治療に有用であり得ることを見出した。したがって、本発明はまた、有効量のカリコシンおよび／またはホルモノネチンを被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療方法（但し、前立腺癌および乳癌の治療を除く）を提供する。
【００２７】
別のさらなる態様によれば、本発明は、ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、有効量の
ｉ）タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物；
ｉｉ）フラボノイド化合物；
ｉｉｉ）本発明の任意の実施形態の組成物；
のうちの少なくとも１つを被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大および／または相乗作用する方法を提供する。
【００２８】
ステロイド／核レセプターリガンドは、抗糖尿病薬または脂質低下薬であり得る。リガンドは、ホルモン（例えば、アンドロゲン、プロゲストゲン、または糖質コルチコイド）であり得る。
【００２９】
特に、上記のステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大または相乗作用する方法では、
ａ）リガンドがアンドロゲンであり、被験体が、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、
ｂ）リガンドがプロゲストゲンであり、被験体が、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、または月経異常の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、および／または
ｃ）リガンドが糖質コルチコイドであり、被験体が、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下にない。
【００３０】
上記方法では、フラボノイド化合物も使用することができる。例えば、適切なフラボノイド化合物は、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、およびダイゼインなどである。
【００３１】
特に、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大または相乗作用する方法は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣疾患、ホルモン依存性の乳癌、結腸癌、もしくは前立腺癌、または炎症性腸疾患からなる群から選択されるＰＰＡＲγ媒介性疾患の治療方法である。
【００３２】
別の態様によれば、本発明は、タイツリオウギの植物体または植物体の一部を、ヘキサン、ジクロロメタン、および／またはクロロホルムで処理するステップを含む、タイツリオウギの抽出物の調製方法を提供する。
【００３３】
別のさらなる態様によれば、本発明は、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大するか相乗作用することができる化合物または抽出物をスクリーニングおよび／または発見する方法であって、
化合物または抽出物をステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドを含む組成物と接触させるか混合するステップと、
リガンドの活性の増大または相乗作用を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３４】
特に、リガンドは、ステロイド／核レセプターのポケットに結合し、化合物または抽出物は、ステロイド／核レセプターのリガンド結合ポケットに特異的に結合しない。
【００３５】
リガンドは、内因性のアンドロゲン、プロゲストゲン、糖質コルチコイド、および／またはＰＰＡＲアゴニストであってよい。
【００３６】
本発明の別の態様によれば、本発明は、医薬品用のタイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物、またはクロロホルム抽出物を提供し、タイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）も提供する。特に、抽出物は、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター生体活性物質に富む。
【００３７】
さらなる態様によれば、抽出物は、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含む。
【００３８】
本発明の別の態様は、被験体のステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態の治療のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のための本発明の抽出物の使用である。組成物は、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含んでもよい。
【００３９】
ｓ／ｎレセプター媒介性容態は、ＰＰＡＲ媒介性容態、特に、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態でもよい。
【００４０】
本発明はまた、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態の治療（但し、前立腺癌および乳癌の治療を除く）のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のためのカリコシンおよび／またはホルモノネチンの使用を提供する。
【００４１】
ｓ／ｎレセプター媒介性容態がＰＰＡＲ媒介性容態、特に、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態であり得る。
【００４２】
さらなる態様によれば、組成物は、食品もしくは飲料中、および／または商業包装中に存在することができ、包装は使用説明書を含む。
【００４３】
本発明の別の態様は、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性の増大または相乗作用のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のための、
タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物；および
フラボノイド化合物またはその混合物
のうちの少なくとも１つの使用である。
【００４４】
ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、有効量のタイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物およびフラボノイド化合物またはその混合物を被験体に投与するステップを含む、インビボで増大および／または相乗作用する方法を実施することができる。特に、抽出物は、本発明の任意の態様による抽出物である。被験体は、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態、特に、ＰＰＡＲ媒介性容態、さらにより詳細には、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態を罹患し得る。
【００４５】
さらに、リガンドは、以下のうちのいずれか１つであってもよい。
（ａ）リガンドがアンドロゲンであり、被験体が、男性妊性、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、
（ｂ）リガンドがプロゲストゲンであり、被験体が、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、または月経異常の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、または
（ｃ）リガンドが糖質コルチコイドであり、被験体が、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下にない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本明細書中に記載の引用文献は、便宜上参考文献一覧表の形態で列挙し、実施例の最後に添付している。このような引用文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本発明者らは、細胞ベースの報告された遺伝子系を使用してステロイド／核レセプター、詳細にはＰＰＡＲ、より詳細にはＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαのアクチベーターを同定するために伝統的な漢方薬（すなわち、真性糖尿病または「喉が渇く疾患（ｔｈｉｒｓｔ−ｄｉｓｅａｓｅ）」に伝統的に適応される薬草）をスクリーニングした。このスクリーニングから、タイツリオウギ（「黄耆」としても知られている）の非水性抽出物が、新規のステロイド／核レセプター、詳細にはＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαのアゴニスト活性を示すことを見出した。
【００４８】
したがって、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）を提供する。特に、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物、またはクロロホルム抽出物に関する。
【００４９】
これらの抽出物は、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター生体活性物質、特に、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαの生体活性物質に富む。
【００５０】
ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプターファミリー、特に、レセプターのペルオキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）ファミリーの強力なアクチベーターであるので、上記タイツリオウギ抽出物は、糖尿病、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、肥満症、多嚢胞性卵巣疾患、ホルモン依存性の乳癌、結腸癌、および前立腺癌、ならびに炎症性腸疾患などのｓ／ｎレセプターファミリーによって媒介される容態の治療に有用であり得る。
【００５１】
「ステロイド／核レセプター」は、エンハンサー領域またはプロモーター領域中に存在するホルモン応答エレメントへの結合によって遺伝子を活性化するリガンド活性化転写因子をいう。ステロイド／核レセプタースーパーファミリーのメンバーには、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）、糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、およびペルオキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）が含まれる。ＰＰＡＲレセプターには、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαが含まれる。
【００５２】
本発明はまた、特にＰＰＡＲに対するｓ／ｎレセプターの活性に基づいたタイツリオウギおよびその抽出物の生物活性を測定および標準化する新規の方法に関する。
【００５３】
本発明の抽出物を、タイツリオウギの植物体または植物体の一部、特に植物体の根から調製することができる。抽出物を、当技術分野で公知の任意の標準的な方法（例えば、Ｈｅ  ＺＱ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ＢＱ，１９９０  ａｎｄ  ｂｙ  Ｍａ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，２００３に記載の方法）にしたがって調製することができる。本発明の方法では、植物の乾燥根を、小片に挽き、その後非水性溶媒（好ましくは、ヘキサン、ジクロロメタン、および／またはクロロホルム）で抽出することが好ましい。本発明の抽出物の調製方法を、実施例に開示する。
【００５４】
タイツリオウギという用語は、天然または人為的に作製されたタイツリオウギの変種も含む。人為的に作製された変種には、選択的交配または遺伝子操作によって作製された変種が含まれる。タイツリオウギの一部には、植物体の樹皮、葉、幹、根、花、種子、他の生殖部分、もしくは植物部分、または２つ以上のこれらの部分の組み合わせが含まれる。
【００５５】
本発明者らは、本発明の抽出物がフラボノイド化合物で富化されることを見出した。特に、カリコシンおよびホルモノネチンのようなイソフラボノイド化合物である。
【００５６】
本発明者らは、カリコシンが強力なステロイド／核レセプターアゴニスト、特に、強力なＰＰＡＲγアゴニストであることを見出した。したがって、カリコシンは、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣疾患、ホルモン依存性の乳癌、結腸癌、および前立腺癌、ならびに炎症性腸疾患などのＰＰＡＲγによって媒介される容態の治療に有用であり得る。
【００５７】
本発明者らはまた、ホルモノネチンが強力なステロイド／核レセプターアゴニスト、特に、強力なＰＰＡＲαアゴニストおよびＰＰＡＲγアゴニストであることを見出した。したがって、ホルモノネチンは、糖尿病、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、肥満症、多嚢胞性卵巣疾患、ホルモン依存性の乳癌、結腸癌、および前立腺癌、ならびに炎症性腸疾患などのＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαによって媒介される容態の治療に有用であり得る。ステロイド／核レセプターのアゴニストとして適切な他のフラボノイド化合物も本発明の範囲内に含まれる。
【００５８】
カリコシン、ホルモノネチン、および他のフラボノイド化合物を、当技術分野で公知の任意の標準的な方法によって調製することができる。カリコシンおよびホルモノネチンの調製方法を、実施例に開示する。カリコシン、ホルモノネチン、および他の適切なフラボノイド化合物を、標準的な方法によって化学合成することもできる。
【００５９】
本明細書中で使用される、用語「アゴニスト」は、任意のステロイド／核レセプターと結合した場合にステロイド／核レセプターを活性化する、本発明の少なくとも１つの抽出物もしくはフラボノイド化合物、その混合物、または本発明の抽出物もしくはフラボノイド化合物を含む組成物をいう。本明細書中で使用される、用語「調整する」は、任意のステロイド／核レセプターの生物活性の変化または変更をいう。調整は、タンパク質活性の増減、結合特性の変化、またはステロイド／核レセプターの生物学的、機能的、または免疫学的性質の任意の他の変化であり得る。
【００６０】
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抽出物および／または少なくとも１つのフラボノイド化合物を含む組成物または処方物に関する。
【００６１】
本発明の組成物は、タイツリオウギの一部、その植物もしくは園芸等価物、その抽出物、抽出物の化学的もしくは機能的等価物、または抽出物の１つ以上の成分の精製形態もしくは化学合成形態を含み、組成物は、被験体のステロイド／核レセプター媒介性容態の調整で有効である。本発明の組成物は、薬草組成物、自然薬品、処方物、および／または医学的または改善特性を有する処方物もしくは組成物ということもできる。用語「処方物」および「組成物」を、本明細書中で交換可能に使用する。
【００６２】
用語「組成物」には、液体、固体、エアゾール、または蒸気形態のタイツリオウギまたはその一部の抽出物が含まれる。特に、処方物は、タイツリオウギの非水性抽出物を含む。より詳細には、抽出物は、エタノールおよびブタノール抽出物ではない。好ましくは、ヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物、またはクロロホルム抽出物である。処方物はまた、当業者が適切と考えるフラボノイド化合物を含み得る。例えば、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、およびダイゼインなどである。しかし、適切なフラボノイド化合物のリストは、これらの化合物に制限されない。任意の適切なフラボノイド（例えば、公的または私的なフラボノイドまたはイソフラボノイドのデータベース（以下を参照のこと）に記載の任意の適切なフラボノイド）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６３】
したがって、組成物は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物、またはフラボノイド化合物（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）のうち、少なくとも１つを含み得る。
【００６４】
特に、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される有効量の少なくとも１つの抽出物を含み、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含む、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療のための薬学的組成物または栄養補助組成物に関する。
【００６５】
特に、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態は、ＰＰＡＲ媒介性疾患であり、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、炎症性腸疾患、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、または肥満症である。
【００６６】
タイツリオウギ抽出物形態の本組成物または処方物を、任意の適切な形態（摂取、局所適用、蒸気、またはエアゾール手段が含まれる）で投与することができる。用語「摂取」は、薬草または抽出物の可食手段または液体手段を介した投与を含む。
【００６７】
インビボ適用のために、抽出物または植物の一部を、投与のための薬学的に許容可能な処方物（キャリアまたは希釈剤が含まれる）に組み込むことができる。当業者は、適切な投薬レベルを容易に決定する。例示的な薬学的に許容可能なキャリアには、経口、静脈内、皮下、および筋肉内への投与などに適切なキャリアが含まれる。クリーム、ローション、錠剤、分散性粉末、顆粒、シロップ、エリキシル、滅菌水性もしくは非水性溶液、懸濁液、または乳濁液などの形態での投与が意図される。経口液の調製のために、適切なキャリアには、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味物質、および香料などの添加物を含む乳濁液、溶液、懸濁液、およびシロップなどが含まれる。非経口投与用の流動物の調製のために、適切なキャリアには、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、または乳濁液が含まれる。非水性溶媒または賦形剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油およびトウモロコシ油など）、ゼラチン、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。このような投薬形態はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのさらなる成分を含み得る。処方物を、例えば、細菌保持フィルターによる濾過、組成物への滅菌薬の組み込み、組成物の照射、または組成物の加熱によって滅菌することができる。処方物を、使用直前の滅菌水またはいくつかの他の滅菌注射用媒体による溶液として製造することもできる。
【００６８】
「適切な投薬レベル」は、ステロイド／核レセプターを活性化するのに十分に高い循環濃度を得るのに十分なレベルを含む。
【００６９】
本発明の組成物は、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態の治療のための有効量の１〜１０００μｇ／ｍＬ（１〜１０００×１０-6ｇ／ｍＬ）の抽出物（血漿中）を含み得る。特に、組成物は、ＰＰＡＲαおよび／またはＰＰＡＲγ媒介性生理学的容態の治療のための有効量の１〜１０００μｇ／ｍＬの抽出物を（血漿中に）含み得る。
【００７０】
本発明はまた、本発明の組成物、薬学的組成物、または栄養補助組成物を含む食品および／または飲料を提供する。
【００７１】
本発明は、さらに、本発明の任意の組成物を含む商業包装を提供する。
【００７２】
別の態様によれば、本発明は、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のジクロロメタン抽出物、タイツリオウギ（ＨＱ）のクロロホルム抽出物、およびタイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物からなる群（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される有効量の少なくとも１つの抽出物を被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核レセプター（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療方法を提供する。
【００７３】
実施例に示すように、５Ｌの正常な血液容量を有する成人における１００％吸収を考慮すると、臨床効果を得るために約５〜５０００ｍｇ（５〜５０００×１０-3ｇ）の乾燥抽出物容量が必要である。
【００７４】
したがって、方法は、１ｍＬの血液容量あたり約１〜１０００μｇの抽出物により被験体を治療するステップを含む。
【００７５】
より詳細には、本発明は、ＰＰＡＲαおよび／またはＰＰＡＲγ媒介性生理学的容態の治療のために、５〜５０００ｍｇの乾燥抽出物により被験体を治療するステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、ＰＰＡＲαおよび／またはＰＰＡＲγ媒介性生理学的容態の治療のための、１ｍＬの血液容量あたり１〜１０００μｇの抽出物により被験体を治療するステップを含む方法を提供する。
【００７６】
より詳細には、本発明の抽出物およびフラボノイド化合物の値および容量を、実施例に開示する。
【００７７】
特に、本発明の方法では、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態はＰＰＡＲγ媒介性生理学的容態であり、且つ糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、または炎症性腸疾患であるか、ＰＰＡＲα媒介性生理学的容態であり、且つ異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、または肥満症である。
【００７８】
本発明は、さらに、有効量のカリコシンおよび／またはホルモノネチンを被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核レセプター（ｓ／ｎ）レセプター媒介性生理学的容態の治療方法（但し、前立腺癌および乳癌の治療を除く）に関する。
【００７９】
特に、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態はＰＰＡＲ媒介性生理学的容態であり、且つ糖尿病、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、多嚢胞性卵巣疾患、肥満症、異常脂質血症、および／または結腸癌である。
【００８０】
本発明者らは、タイツリオウギ抽出物が、ｓ／ｎレセプターの公知のリガンド、特に、公知のＰＰＡＲリガンドに対して相乗活性を有することをさらに見出し、このことは本発明のさらなる目的を示す。したがって、タイツリオウギ抽出物を、標準的な薬物（例えば、抗糖尿病薬および脂質低下薬）の効果を増強するための栄養補助薬として使用することができる。
【００８１】
本明細書中で使用される、「相乗活性」または等価物である「相乗効果」は、単独で作用した場合のその効果の単純な合計よりも高い、共に作用する２つの化合物の任意の効果をいい、このような化学物質は相乗効果を示すと言われる。より詳細には、第１の化学物質は、本発明のタイツリオウギ抽出物、フラボノイド化合物、もしくはこれらの混合物、またはタイツリオウギ抽出物もしくはフラボノイド化合物の少なくとも１つを含む組成物である。第２の化学物質は、ｓ／ｎレセプターの任意の公知のリガンドである。
【００８２】
本発明者らは、タイツリオウギの抽出物から単離したイソフラボノイド化合物がｓ／ｎレセプターのリガンドの活性を増大および相乗作用することも見出した。特に、ＰＰＡＲ、ＡＲ、ＰＲ、およびＧＲによって作用するホルモン活性である。当業者は、タイツリオウギ由来の抽出物のこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγリガンドである、アンドロゲン、プロゲストゲン、および糖質コルチコイドのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患または容態における効果を増強することができることを理解するであろう。アンドロゲン活性の増大が必要な容態の例は、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸であり、プロゲストゲン活性の増大が必要な容態の例は、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、および関連する月経異常（ホルモンの欠損または不均衡に起因する）であり、糖質コルチコイド活性の増大が必要な容態の例は、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息である。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【００８３】
しかし、本発明は、タイツリオウギの植物体、植物体の一部、または抽出物から単離されたフラボノイド化合物に制限されず、異なる供給源から単離されたか化学合成された任意の適切なフラボノイド化合物も含む。
【００８４】
特に、カリコシンは、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、およびＥＲαのシグナル伝達系に対するピオグリタゾン、ＷＹ１４６４３、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、およびエストラジオールの活性を増大することができる。当業者は、カリコシンのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγリガンドである、アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲストゲンのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患における効果を増強することができることを理解するであろう。アンドロゲン活性の増大が必要なこのような疾患または容態の例は、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸であり、プロゲストゲンおよびエストロゲン活性の増大が必要な容態の例は、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、および関連する月経異常（ホルモンの欠損または不均衡に起因する）である。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【００８５】
ホルモノネチンは、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、およびＥＲαのシグナル伝達系に対するＷＹ１４６４３、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、およびエストラジオールの効果を増大することができる。当業者は、ホルモノネチンのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のアンドロゲン、エストロゲン、プロゲストゲン、およびＰＰＡＲαリガンドのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患における効果を増強することができることを理解するであろう。アンドロゲン活性の増大が必要なこのような疾患の例は、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、および停留睾丸であり、プロゲストゲン活性の増大が必要な容態の例は、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、および関連する月経異常（ホルモンの欠損または不均衡に起因する）である。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【００８６】
本発明者らは、ゲニステインおよびダイゼインなどカリコシンおよびホルモノネチン以外のフラボノイドが、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、およびＥＲαのシグナル伝達系に対するピオグリタゾン、ＷＹ１４６４３、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、およびエストラジオールの活性を増大する新規の能力を有することも見出した。当業者は、フラボノイドのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγリガンドである、アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲストゲンのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患または容態における効果を増強することができることを理解するであろう。アンドロゲン活性の増大が必要なこのような疾患および容態の例は、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、および停留睾丸であり、プロゲストゲンおよびエストロゲン活性の増大が必要な疾患および容態の例は、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、および関連する月経異常（ホルモンの欠損または不均衡に起因する）である。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【００８７】
したがって、本発明は、ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、ｉ）タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物；ｉｉ）フラボノイド化合物；またはｉｉｉ）本発明の任意の実施形態の組成物；のうちの少なくとも１つを接触させるステップを含む、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性の増大または相乗作用方法に関する。
【００８８】
１つの実施形態によれば、本発明は、ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で、ｉ）タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物；ｉｉ）フラボノイド化合物；またはｉｉｉ）本発明の任意の実施形態の組成物；のうちの有効量の少なくとも１つを被験体に投与するステップを含む、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性の増大または相乗作用方法に関する。
【００８９】
特に、本発明の方法では、リガンドはＰＰＡＲリガンドである。リガンドは、例えば、抗糖尿病薬または脂質低下薬、例えばホルモンである。ホルモンは、アンドロゲン、プロゲストゲン、エストロゲン、または糖質コルチコイドであってよい。
【００９０】
特に、本発明は、ａ）リガンドがアンドロゲンであり、被験体が、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、ｂ）リガンドがプロゲストゲンまたはエストロゲンであり、被験体が、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、または月経異常の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、および／またはｃ）リガンドが糖質コルチコイドであり、被験体が、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下にない、方法に関する。
【００９１】
任意の適切な公知のまたは依然として発見されていないフラボノイド化合物、特にイソフラボノイド化合物は、本発明の範囲内に含まれる。多数のフラボノイド、特にイソフラボノイドは、例えば、ＵＳＤＡ−Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １．３−２００２およびＵＳＤＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｆｏｏｄｓ−２００３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｆｎｉｃ／ｆｏｏｄｃｏｍｐ／Ｄａｔａ／ｉｓｏｆｌａｖ／ｉｓｏｆｌａｖ．ｈｔｍｌ）および（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｆｎｉｃ／ｆｏｏｄｃｏｍｐ／Ｄａｔａ／Ｆｌａｖ／ｆｌａｖ．ｈｔｍｌ）（その両方が参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。どのようにして本発明の目的に適切なフラボノイド化合物を選択することができるかは当業者に明らかである。例えば、本発明の目的のためのフラボノイド化合物は、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、およびダイゼインなどであり得る（が、これらに限定されない）。
【００９２】
より詳細には、方法は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣疾患、ホルモン依存性の乳癌、結腸癌、もしくは前立腺癌、または炎症性腸疾患からなる群から選択されるＰＰＡＲγ媒介性容態の治療方法である。
【００９３】
本発明はまた、ステロイドレセプターのリガンド結合ポケットに結合する特定のリガンドを含まないＡＲ、ＰＲ、ＧＲ、ＥＲ、およびＰＰＡＲなどのステロイド／核レセプターの作用を増大する新規の方法に関する。この所見により、リガンド−ステロイドレセプターの作用を増大することができる化合物を検索するための新規の薬物発見スクリーニングプラットフォームが開発される。
【００９４】
したがって、本発明は、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性を増大するか相乗作用することができる化合物または抽出物をスクリーニングおよび／または発見する方法であって、化合物または抽出物をステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドを含む組成物と接触させる（または混合する）ステップと、リガンドの活性の増大または相乗作用を決定するステップとを含む方法を提供する。特に、リガンドは、ステロイド／核レセプターのポケットに結合し、化合物または抽出物がステロイド／核レセプターのリガンド結合ポケットに特異的に結合しない。より詳細には、リガンドは、内因性のアンドロゲン、プロゲストゲン、糖質コルチコイド、および／またはＰＰＡＲアゴニストである。このようなスクリーニングおよび／または発見方法を、当業者に公知の標準的方法にしたがって行う。
【００９５】
本発明はまた、上記アゴニスト効果および相乗効果を有するゲニステイン、ダイゼイン、カリコシン、またはホルモノネチンなどに関連する合成または天然化合物をデザインすることができる。
【００９６】
別の態様によれば、本発明は、医薬品用の本発明の任意の態様の抽出物、特に、タイツリオウギ（ＨＱ）のヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物、またはクロロホルム抽出物からなる群（但し、ＨＱ抽出物は、エタノールまたはブタノールＨＱ抽出物ではない）から選択される抽出物を提供し、タイツリオウギ（ＨＱ）の非水性抽出物も提供する。特に、抽出物は、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター生体活性物質に富む。
【００９７】
さらなる態様によれば、抽出物は、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含む。フラボノイド化合物は、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、および／またはダイゼインであり得る。
【００９８】
本発明の別の態様は、被験体のステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態の治療のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のための本発明の抽出物の使用である。組成物は、少なくとも１つのフラボノイド化合物をさらに含み得る。フラボノイド化合物は、上記の任意の適切なフラボノイド化合物であり得る。
【００９９】
ｓ／ｎレセプター媒介性容態は、ＰＰＡＲ媒介性容態、特に、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態であり得る。例えば、ＰＰＡＲα媒介性疾患には、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、肥満症、および結腸癌が含まれるが、これらに限定されない。ＰＰＡＲγ媒介性疾患には、糖尿病、癌、多嚢胞性卵巣疾患、および炎症性腸疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
特に、被験体を、ＰＰＡＲ媒介性容態の治療のために５〜５０００ｍｇの抽出物で治療する。被験体を、ＰＰＡＲ媒介性容態の治療のために１〜１０００μｇ／ｍＬの抽出物で治療することもできる。
【０１０１】
本発明はまた、ステロイド／核（ｓ／ｎ）レセプター媒介性容態の治療（但し、前立腺癌および乳癌の治療を除く）のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のためのカリコシンおよび／またはホルモノネチンの使用を提供する。
【０１０２】
ｓ／ｎレセプター媒介性容態がＰＰＡＲ媒介性容態、特に、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態であり得る。ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態には、上記容態が含まれる。
【０１０３】
さらなる態様によれば、組成物は、食品もしくは飲料中、および／または商業包装中に存在することができ、包装は使用説明書を含む。
【０１０４】
本発明の別の態様は、ステロイド／核レセプターのリガンドの活性の増大または相乗作用のための薬学的組成物または栄養補助組成物の調製のための、
タイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物；および
フラボノイド化合物；またはその混合物
のうちの少なくとも１つの使用である。
【０１０５】
ステロイド／核レセプターの少なくとも１つのリガンドの存在下で有効量のタイツリオウギ（ＨＱ）の抽出物およびフラボノイド化合物またはその混合物を被験体に投与するステップを含む、インビボで増大および／または相乗作用する方法を実施することができる。特に、抽出物は、本発明の任意の態様による抽出物である。被験体は、ｓ／ｎレセプター媒介性生理学的容態、特に、ＰＰＡＲ媒介性容態、さらにより詳細には、ＰＰＡＲα媒介性容態および／またはＰＰＡＲγ媒介性容態を罹患し得るが、ＰＰＡＲα媒介性容態およびＰＰＡＲγ媒介性容態の例は、上に記載されている。
【０１０６】
フラボノイド化合物は、カリコシン、ホルモノネチン、ゲニステイン、アフロモルシン、ビオカニンＡ、クメストロール、オドラチン、および／またはダイゼインであり得る。
【０１０７】
リガンドは、ＰＰＡＲリガンド、抗糖尿病薬、もしくは脂質低下薬、および／またはホルモンであり得る。特に、ホルモンは、アンドロゲン、プロゲストゲン、または糖質コルチコイドであり得る。
【０１０８】
さらに、リガンドは、以下のうちのいずれか１つであってもよい。
（ａ）リガンドがアンドロゲンであり、被験体が、男性妊性、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、または停留睾丸の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、
（ｂ）リガンドがプロゲストゲンであり、被験体が、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、または月経異常の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下になく、または
（ｃ）リガンドが糖質コルチコイドであり、被験体が、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、または喘息の疾患または容態下にあるか、該疾患または該容態下にない。
【０１０９】
［実施例］
本発明は、記載の実施形態に制限されない。当業者に明確な場合、多数の変形形態が本発明の範囲内で可能である。ＰＰＡＲ活性を有する薬草を発見および特徴づけるために、キメラＰＰＡＲレセプターによって駆動されるレポーター遺伝子アッセイ系（以下に詳細に提供する）を使用した。
【実施例１】
【０１１０】
＜ＰＰＡＲアクチベーターの検出のためのキメラＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγレセプター＞
このようなレポーター遺伝子アッセイの例では、キメラＧａｌ４DBD−ＰＰＡＲLBDレセプターｃＤＮＡを含むプラスミドを、全長ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の切り出しならびにｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中での得られたフラグメントのインフレームでの出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡｌ４−ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）へのライゲーションによって構築した。詳細には、Ｇａｌ４DBD−ＰＰＡＲγLBDプラスミドを構築するために、全長ＰＰＡＲγを含むｐＳＧ５発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＲｓａＩで切り出し、ｐＭＧａｌ４DBD発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に平滑末端ライゲーションを行った。Ｇａｌ４DBD−ＰＰＡＲαLBDプラスミドを構築するために、全長ＰＰＡＲαを含むｐＳＧ５発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＢｓｔＵ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切り出し、ｐＭＧａｌ４DBD発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位にインフレームで平滑末端ライゲーションを行った。ＨｅＬａ細胞中で発現する場合、得られたプラスミドにより、対応するＧａｌ４DBD−ＰＰＡＲLBDタンパク質が産生された。これらのキメラＰＰＡＲレセプターに結合するリガンドにより、ルシフェラーゼ遺伝子にタンデムでクローン化したガラクトースの上流活性化配列（ＵＡＳg）の５コピーを含む同時トランスフェクションされたレポーター遺伝子が活性化される（Ｏｌｓｓｏｎ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ  １９８８）。Ｇａｌ４DBDは、外因性ＵＡＳｇプロモーターと非常に強固に結合し、それにより、高感度且つ特異的なアッセイが得られる。ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαアゴニスト活性を測定するために、ＨｅＬａ細胞を、２４ウェルマイクロタイタープレート中で成長させ、その後、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２つのプラスミド（キメラＰＰＡＲレセプターおよびＵＡＳｇレポーター遺伝子）で一過性に同時トランスフェクトした。細胞を、５％二酸化炭素インキュベーター中にて、１０％活性炭処理牛胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で薬草抽出物および純粋な化合物に３７℃で４０時間曝露した。同時に、細胞を、ポジティブコントロールとしての役割を果たす公知のＰＰＡＲリガンドに曝露した。薬草抽出物が溶解した賦形剤溶媒（すなわち、エタノールまたはメタノール）に曝露した複製ウェルを、ネガティブコントロールとして使用した。４０時間のインキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、溶解緩衝液を添加し、照度計を使用したルシフェラーゼ活性の測定のために細胞溶解物を回収した。薬草抽出物／純粋な化合物のＰＰＡＲ活性を、ネガティブコントロール細胞で認められたルシフェラーゼ活性と比較したルシフェラーゼ活性の増加倍率として示した。全てのデータポイントは３連である。データポイントは、３連のウェルの平均を示す。このようなアッセイにおけるルシフェラーゼ活性は、ＰＰＡＲγまたはＰＰＡＲαに対する任意のリガンドの活性を正確に反映する。
【実施例２】
【０１１１】
＜ＰＰＡＲ活性を刺激する薬草抽出物のスクリーニングおよび発見＞
伝統的な中国の医学関係のテキストおよび薬局方を再検討した。「喉の渇き」に対する作用が主張されているか、もしくは、「気を活性化する」と説明されている生薬物質を、小売り業者から購入した。これらの薬草を、表１に列挙する。薬草を挽き、３７℃のエタノールで３日間温浸し、その後、溶媒を濾紙（孔径１１μｍ）で濾過した。濾過した抽出物を、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。乾燥させた抽出物を秤量し、１００％エタノールに２５０×１０-3ｇ／ｍｌの濃度に再懸濁した。各薬草抽出物を、実施例１に記載のバイオアッセイを使用して、最終濃度２５０×１０-6ｇ／ｍｌにてインビトロでＰＰＡＲα活性およびＰＰＡＲγ活性についてスクリーニングした。予備スクリーニングから、３つの薬草抽出物（タイツリオウギ、トリコサンテス属の一種（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｅｓ  ｓｐｐ．）、およびアトラクチリス・オラタ（Ａｔｒａｃｔｙｌｉｓ  ｏｒａｔａ））が、ＰＰＡＲ刺激活性を示すことが見出された。タイツリオウギで非常に強い活性が認められ、その抽出物は、賦形剤（すなわち、エタノールまたはメタノール）のみに曝露したコントロールと比較して、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲα活性をそれぞれ１９倍および４倍刺激する（表１）。トリコサンテス属およびアトラクチリス・オラタの抽出物で中等度であるが有意なＰＰＡＲ刺激活性が認められた。
【０１１２】
【表１】
2007513153.tif 000002
【実施例３】
【０１１３】
＜タイツリオウギ（ＨＱ）抽出物は、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαアゴニスト活性を示す＞
基準化合物に対するタイツリオウギ（ＨＱ）抽出物の活性を定量するために、ＰＰＡＲバイオアッセイにおいて、ＨＱの１００％エタノール抽出物を、生理学的ＰＰＡＲリガンドである１５−デオキシ−δ１２，１４、プロスタグランジンＪ２；抗糖尿病ＰＰＡＲγ化合物であるピオグリタゾン；およびＰＰＡＲαリガンドであるＷＹ１４６４３と比較した。図１（Ａ）で認められるように、ＨＱのＰＰＡＲγ活性は、最初に３０×１０-6ｇ／ｍＬで認められ、３００×１０-6ｇ／ｍＬのピークに上昇した。ピークでのＨＱ活性は、１５ＤＰＧＪ２で認められた最大活性と同等であり、ピオグリタゾンで認められた最大活性の半分であった。ＨＱ、１５ＤＰＧＪ２、およびピオグリタゾンのＥＣ50は、それぞれ、１００、０．５、および５×１０-6ｇ／ｍＬであり、ＨＱのエタノール抽出物はピオグリタゾン（現在真性糖尿病の治療のために使用されている純粋な化合物）の約１／２０のでしかないことを示した。実施例１に示すバイオアッセイ系を、ＨｅＬａ細胞の代わりにＣＯＳ−７細胞を使用して繰り返し、類似の結果が得られた。ＨｅＬａ細胞中でのルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローン化した全長ヒトＰＰＡＲγレセプターおよびＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）を一過性に同時トランスフェクションした場合、ＨＱの類似の用量応答も得られた。したがって、ＨＱエタノール抽出物は、ＰＰＡＲγのアクチベーターであり、したがって、ＰＰＡＲγ媒介性容態の治療で使用することができる。図１ａに基づいて、３０〜１０００×１０-5ｇ／ｍＬの血漿ＨＱが得られるＨＱエタノール抽出物の用量が治療効果を有すると予想される。５Ｌの通常の血液容量を有する成人で１００％吸収と仮定すれば、１５０〜５０００×１０-3ｇの用量のＨＱエタノール抽出物が、臨床効果を得るために必要であろう。したがって、ＨＱを使用して、糖尿病、多嚢胞性卵巣疾患、癌、および炎症性腸疾患のようなＰＰＡＲγによって媒介される容態を治療することができる。
【０１１４】
ＨＱエタノール抽出物は、ＰＰＡＲαのリガンドおよびアクチベーターでもあった。図１Ｂで認められるように、ＨＱのＰＰＡＲα活性は、最初に１×１０-6ｇ／ｍＬで認められ、３００×１０-6ｇ／ｍＬのピークに上昇した。ピークでのＨＱのＰＰＡＲα活性は、純粋なアゴニストであるＷＹ１４６４３で認められた最大活性と同等であった。したがって、ＨＱの用量応答曲線がＷＹ１４６４３と比較して左にシフトしたにもかかわらず、ＨＱおよびＷＹ１４６４３のＥＣ50は、類似しており、それぞれ、２０×１０-6ｇ／ｍＬおよび４×１０-6ｇ／ｍＬであった。したがって、ＨＱのエタノール抽出物はＰＰＡＲαの真のアクチベーターであり、ＰＰＡＲα媒介性容態の治療で使用することができる。図１Ｂに基づいて、治療効果を示す有効用量のＨＱにより、１〜１０００×１０-6ｇ／ｍＬの血漿ＨＱが得られるはずである。５Ｌの通常の血液用量を有する成人で１００％吸収と仮定すれば、５〜５０００×１０-3ｇの容量のＨＱが、臨床効果を得るために必要であろう。したがって、ＨＱを使用して、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、および肥満症のようなＰＰＡＲαによって媒介される容態を治療することができる。
【実施例４】
【０１１５】
＜公知のＰＰＡＲリガンドの活性に対するＨＱ抽出物の相乗作用＞
エタノールを使用してＨＱ抽出物を調製し、実施例１に記載のようにアッセイした。細胞を、固定濃度の基準ＰＰＡＲリガンドであるシグリタゾンの存在下で漸増濃度のＨＱ抽出物に曝露した（表２）。３×１０-6ｇ／ｍＬまたは１０×１０-6Ｍのシグリタゾンで最大ＰＰＡＲγ活性が認められた。相対的に、ＨＱ抽出物は、３００×１０-6ｇ／ｍＬの用量でＰＰＡＲγ活性を最大に刺激することができた。ＨＱはまた、飽和用量のシグリタゾンのＰＰＡＲγ活性を用量依存的に増加させることができた。シグリタゾンおよびＨＱのＰＰＡＲγ活性は、飽和用量のシグリタゾンのみを使用して認められた活性の４５０％であった。これは、ＨＱ抽出物がＬＢＤのリガンド結合ポケット以外の部位に対して直接または間接的に作用する化合物を含むことを示す。このＨＱ抽出物がＰＰＡＲγ薬の活性を増加させる能力を使用して、これらの薬物の効果を増強し、それにより、その有効性を増加させ、使用される中毒量を低下および減少させることができる。
【０１１６】
【表２】
2007513153.tif 000003
【実施例５】
【０１１７】
＜ＥＲα、およびＥＲβレポーター遺伝子系に対するＨＱのアゴニスト効果＞
ＨＱ抽出物が他のステロイドレセプター（すなわち、ＡＲ、ＰＲ、ＧＲ、ＥＲα、およびＥＲβ）を活性化する能力を試験した。ＡＲ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＡＯ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、ＰＲ（Ｖｅｇｅｔｏ  Ｅ，１９９２）、およびＧＲ（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）のいずれかをコードするプラスミドを、３つ全てのレセプターに共通のホルモン応答エレメントを含むレポーター遺伝子（ＡＲＥ）2−Ｌｕｃで同時発現した。（ＡＲＥ）2−Ｌｕｃプラスミドは、ｐＧＬ３基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローン化したアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）の２つの反復からなる。
【０１１８】
ＥＲαおよびＥＲβ活性を、ＥＲＥ−ＬＵＣレポーター遺伝子で同時トランスフェクションしたＥＲαまたはＥＲβのいずれかをコードするプラスミドを使用してアッセイした。エストロゲンレセプターアゴニスト活性をアッセイするために、ＨｅＬａ細胞を、リポフェクタミンを使用して２つのプラスミド（Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）で一過性に同時トランスフェクションした。第１のプラスミドはヒトエストロゲンレセプター（ＥＲαまたはＥＲβのいずれか）をコードするＤＮＡを含み、第２のプラスミドは以下を含むエストロゲン駆動レポーター系を含んでいた：その転写が、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターにクローン化された４コピーのビテロゲニンエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）を含む上流調節エレメントの調節下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＬＵＣ）（レポーター系の正式名称は「ＭＭＴＶ−ＥＲＥ−ＬＵＣ」である）。
【０１１９】
ＡＲ、ＰＲ、ＧＲ、ＥＲα、およびＥＲβ活性を、賦形剤（すなわち、エタノールまたはメタノール）のみに曝露したコントロール細胞との試験細胞中でのルシフェラーゼ活性の比較によって測定し、これらの活性は前の実施例に記載のＰＰＡＲ活性の測定値と類似していた。ＨＱ抽出物は強力なＥＲβ活性を示し、３００×１０-6ｇ／ｍＬの用量のＥＲβ活性は最大で６８倍増加した（エストラジオールの最大活性の２００％に匹敵する）。ＨＱ抽出物はＥＲα活性も示し、３００×１０-6ｇ／ｍｌの用量のＥＲα活性は最大で８倍増加した（エストラジオールの最大活性のたった５０％に匹敵する）。ＥＲαおよびＥＲβのＥＣ50は、それぞれ、約１３０×１０-6ｇ／ｍｌおよび５０×１０-6ｇ／ｍｌであった。
【実施例６】
【０１２０】
＜飽和用量の同族ホルモンの存在下でのＨＱ、ＡＲ、ＰＲ、およびＧＲ活性の相乗効果＞
実施例１に記載のように、エタノールを使用してＨＱ抽出物を調製した。前の実施形態に記載するように、（１）ＡＲ、（２）ＰＲ、（３）ＧＲ、または（４）ＥＲレセプター遺伝子系に対する阻害効果または相乗効果を試験するために、固定した飽和濃度の（１）ジヒドロテストステロン、１×１０-9Ｍ、（２）プロゲステロン、１×１０-6Ｍ、（３）ヒドロコルチゾン、１×１０-9Ｍ、または（４）エストラジオール、１×１０-9Ｍの存在下で漸増濃度のＨＱ抽出物に細胞を曝露した。
【０１２１】
ＨＱ抽出物がＡＲ、ＰＲ、およびＧＲレポーター遺伝子アッセイにおいていかなるアゴニスト作用も持たなかったにもかかわらず、抽出物は、飽和用量のジヒドロテストステロン、プロゲステロン、およびヒドロコルチゾンの対応するレポーター遺伝子アッセイに対する活性を有意に増大させた（表３）。したがって、ＨＱは、ＡＲおよびＧＲに対するＤＨＴおよびヒドロコルチゾンの活性を用量依存的に倍加させた。ＨＱはまた、プロゲステロン活性を１４０％に増大させた。
【０１２２】
ＨＱ抽出物は、ホルモンが飽和用量であるにもかかわらず、アンドロゲン、プロゲステロン、およびヒドロコルチゾンの作用を増加させることができた。このＨＱの性質を使用して、アンドロゲン、プロゲステロン、および糖質コルチコイドの内因性または外因性作用を増大させ、これらのレセプターによる活性の増大を必要とする容態を治療することができる。アンドロゲンによる活性の増大を必要とする容態の例は、男性不妊症、慢性の骨および筋肉の減少、老年男性更年期、アンドロゲン不感性症候群、クラインフェルター症候群、および停留睾丸であり、プロゲストゲンによる活性の増大が必要な容態の例は、閉経後ホルモン代替療法、女性不妊症、子宮内膜癌、続発性無月経、機能性子宮出血、および関連する月経異常（ホルモンの欠損または不均衡に起因する）であり、糖質コルチコイドによる活性の増大が必要な容態の例は、自己免疫疾患、関節炎、術後移植片拒絶、および喘息である。
【０１２３】
【表３】
2007513153.tif 000004
【実施例７】
【０１２４】
＜ＰＰＡＲ活性化合物を富化したタイツリオウギ抽出物の調製方法＞
タイツリオウギ抽出物（ＨＱ抽出物）を、浸軟温度を２０℃から１００℃に変更したこと以外は実施例１に記載のように調製した。ＨＱ抽出物のＰＰＡＲ活性は熱によって不活化せず、ＨＱ中のＰＰＡＲ活性化合物は１００℃までの熱に耐性を示し得ることが示唆された。タイツリオウギ抽出物（ＨＱ抽出物）を、種々の極性の溶媒（ヘキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、およびエタノール）を使用してソックスレー抽出器を４時間使用して調製した。実施例１に記載のように、得られたＨＱ抽出物を、ＰＰＡＲ活性について試験した（表４および５）。このような系では、主に高非極性ヘキサンおよびＤＣＭ画分で強力なＰＰＡＲγ活性を有する化合物が表示濃度で検出され、クロロホルム画分でより低い活性が認められ、エタノール画分で最小の活性が認められた。表４および図１を参照して、１〜３０μｇ／ｍＬの濃度のエタノール抽出物では非常に活性が低いが、３００μｇ／ｍＬで有意な活性が認められた（表４）。
【０１２５】
ヘキサン、ＤＣＭ、およびクロロホルム画分は、ＰＰＡＲα活性を有する化合物も富む（表５）。３０×１０-6ｇ／ｍｌで最大活性が認められ、この濃度でＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲα活性がそれぞれ１６倍および１８倍増加する（すなわち、ヘキサンおよびＤＣＭは共にＰＰＡＲγにおいて１６倍、ＰＰＡＲαにおいて８倍の活性を示した）。ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ生物活性画分を、水を使用するが１６時間継続するソックスレー抽出によって抽出することもできる。水抽出物は、ＰＰＡＲγ活性を用量依存的に増加させ、８×１０-3ｇ／ｍｌの用量で最大１８倍の刺激に達した（表６）。したがって、水抽出物の用量応答曲線は、ヘキサン、ＤＣＭ、およびクロロホルム画分に関して右にシフトし、水抽出物がより低濃度の活性化合物を含むことを示した。
【０１２６】
例えば、表４、５、および６の参照により、ヘキサンおよびＤＣＭ抽出物の最大ＰＰＡＲ活性は、０．０３ｍｇ／ｍＬの濃度で認められるが、水抽出物の最大活性は８ｍｇ／ｍＬでのみ認められた。これは、ヘキサンおよびＤＣＭ抽出物と比較して水抽出物の活性が低い場合、濃度−活性シフトを示す。これはまた、表４、５、および６中のＥＣ50値によって示される。
【０１２７】
水を使用した抽出収率（重量／重量）は５０％であった。相対的に、ヘキサン、ＤＣＭ、およびエタノールを使用した収率は、それぞれ０．８％、１．２％、および１６％であった。したがって、水、ＤＣＭ、エタノール、およびヘキサンを、ＰＰＡＲ生物活性化合物を抽出するための溶媒として使用することができ、上記技術を使用して、ＰＰＡＲアゴニスト活性を有する漢方薬として使用することができる。ヘキサン抽出物およびジクロロメタン抽出物がエタノール抽出物よりも約１０倍強力であったので、これらの溶媒を使用して、ＰＰＡＲ活性化合物に富む抽出物を調製することができる。さらに、ＨＱ抽出物中のホルモノネチンおよびカリコシン濃度を、液体クロマトグラフィ−質量分析−質量分析（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）を使用して分析し（表７）、両化合物がＨＱのＤＣＭ抽出物中で最も高いことが見出された。さらに、ヘキサン抽出物はホルモノネチンおよびカリコシンに富むことも導くことができる（表４〜７中のデータに基づく）。例えば、ＤＣＭ抽出物中で最も高いカリコシン濃度が見出され（表７）、この抽出物はまた非常に活性が高かった（表４で認められるように、ＥＣ50は１５）。ヘキサン抽出物も活性であるので、カリコシンは抽出物中で高濃度で見出されると結論づけた。
【０１２８】
したがって、ＨＱのヘキサン、ＤＣＭ、およびクロロホルム抽出物は、ＰＰＡＲγのアクチベーターであり、したがって、ＰＰＡＲγ媒介性容態の治療で使用することができる。表４に基づいて、３０×１０-6ｇ／ｍＬの血漿ＨＱが得られるＨＱのヘキサンまたはクロロホルム抽出物の用量が治療効果を有することを示す。５Ｌの通常の血液容量を有する成人で１００％吸収を考慮すると、１５０×１０-3ｇの容量のＨＱのヘキサンまたはクロロホルム抽出物が、臨床効果を得るために必要である。したがって、ＨＱを使用して、糖尿病、多嚢胞性卵巣疾患、癌、および炎症性腸疾患のようなＰＰＡＲγによって媒介される容態を治療することができる。
【０１２９】
ＨＱのヘキサン、ＤＣＭ、およびクロロホルム抽出物は、ＰＰＡＲαのアクチベーターでもあった。表５で認められるように、ＰＰＡＲα活性は、最初に１×１０-6ｇ／ｍＬで認められ、３０×１０-6ｇ／ｍＬのピークに上昇した。したがって、有効用量のＨＱのヘキサン、またはクロロホルム抽出物により、１〜３０×１０-6ｇ／ｍＬの血漿ＨＱに治療効果が認められる。５Ｌの通常の血液容量を有する成人で１００％吸収を考慮すると、５〜１５０×１０-3ｇの容量のＨＱが、治療効果を得るために必要である。したがって、ＨＱを使用して、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、および肥満症のようなＰＰＡＲαによって媒介される容態を治療することができる。
【０１３０】
【表４】
2007513153.tif 000005
【０１３１】
【表５】
2007513153.tif 000006
【０１３２】
【表６】
2007513153.tif 000007
【０１３３】
【表７】
2007513153.tif 000008
【実施例８】
【０１３４】
＜ＰＰＡＲ活性化合物の分画および単離方法＞
生物活性化合物を同定するためにバイオアッセイによる分画を行った。実施例１に記載のように、ＰＰＡＲ活性をアッセイした。タイツリオウギの乾燥根（約８Ｋｇ）を、小片に挽き、その後ＤＣＭで抽出した。抽出物を４０℃で真空乾燥させて油性の褐色抽出物を得た（約９０ｇ）。１０ｇのＤＣＭ抽出物を、１５ｇのシリカゲル（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  Ｓｉ６０  ４０〜６３μｍ）と共に乾燥封入し（ｄｒｙ  ｐａｃｋｅｄ）、加圧下で３５０ｇシリカゲル（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  Ｓｉ６０  １５〜２５μｍ）を封入した中圧液体クロマトグラフィガラスカラムの上部にアプライした。９９：１、９８：２、９７：３、．．．、９０：１０、８０：２０、．．．、１０：９０、０：１００に極性を増加させたヘキサンおよびアセトンの混合物を使用してカラムを連続的に溶離し、最後にメタノールで洗浄した。ＭＰＬＣシステムによって回収された３７画分のうち、化合物Ｉおよび化合物ＩＩを、それぞれ、画分１９（７０：３０；ヘキサン：アセトン）（７２．２ｍｇ）および画分２９（６０：４０；ヘキサン：アセトン）（２６．３ｍｇ）から得た。したがって、これは、化合物Ｉおよび化合物ＩＩに富む画分を得るための有効な方法である。
【実施例９】
【０１３５】
＜化合物Ｉの構造の解明＞
化合物Ｉを、融点２５７〜２５８℃（ヘキサン／アセトン）の細かい白色の針状物質として得た。逆相ＨＰＬＣを使用した純度分析により、純度９９％以上であることが示された。そのＨＲＥＩＭＳは、ｍ／ｚ２６８．０７２９での［Ｍ］+を示し、分子式Ｃ16Ｈ12Ｏ4と一致した。1Ｈおよび13ＣＮＭＲスペクトル分析により、７，４’二置換イソフラボンの特徴的な化学シフトが示された。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、最も低い磁場で単一ピークとしてＨ−２が認められた；Ｈ−５（δ７．９５，ｄ）およびＨ−８（δ６．８５，ｄ）の両方とカップリングしたＨ−６（δ６．９２）は、典型的なｄｄピーク（Ｊ＝８．８，２．３５  Ｈｚ）として認められた。Ｂ環の構造対称性の高さにより、低磁場で複数のピークのうちの１群として共鳴するためにＨ−３’および５’のシグナルが生じ（δ６．９６）、その後にＨ−２’およびＨ−６’のシグナルが生じた（δ７．５０，ｍ）。高磁場では、４’−ＯＣＨ3のメチルは、δ３．７９に鋭い単一ピークを示した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータ（ｐｐｍ）は以下である：Ｃ２−１５３．０，Ｃ３−１２４．３，Ｃ４−１７４．６，Ｃ５−１２７．２，Ｃ６−１１５．４，Ｃ７−１６３．０，Ｃ８−１０２．１，Ｃ９−１５７．５，Ｃ１０−１１６．４，Ｃ１’−１２３．１，Ｃ２’−１３０．０，Ｃ３’−１１３．６，Ｃ４’−１５８．９，Ｃ５’−１１３．６，Ｃ６’−１３０．０，ＯＣＨ3−５５。これらは基準のスペクトルと同一である（Ｐ．Ｋ．ＡｇｒａｗａｌによるフラボノイドのＣ13  ＮＭＲ）。上記分析によれば、化合物Ｉの構造を、７−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボンと確定することができ、これは、ホルモノネチンと名付けられた公知の植物エストロゲンである。
【０１３６】
ホルモノネチンの構造は、以下である。
【化１】
2007513153.tif 000009
【実施例１０】
【０１３７】
＜化合物ＩＩの構造の解明＞
化合物ＩＩを、２５１〜２５２℃（ヘキサン／アセトン）のより低い融点の長い白色の針状物質として得た。そのＨＲＥＩＭＳ分析（［Ｍ］+ｍ／ｚ  ２８４．０６８５）は、分子式Ｃ16Ｈ12Ｏ5を示し、ホルモノネチンの分子式よりも「Ｏ」原子が１つ多かった。1Ｈ、13Ｃ  ＮＭＲスペクトルはまた、イソフラボンの特徴的な化学シフトを示したが、Ｂ環のシグナルはホルモノネチンのシグナルと非常に異なっていた。1Ｈ  ＮＭＲ  スペクトルでは、１つ以上の−ＯＨ基のＢ環への置換により、構造対称性が崩壊し、それにより、いくつかのプロトンシグナルが異なる位置に共鳴した。詳細には、Ｈ−２’（δ７．０，ｄ，Ｊ＝１．８５  Ｈｚ）が低磁場に広いｄピークとして認められ、その後にδ６．９４でＨ−５’およびＨ−６’のシグナルが高度に重複した。基準と比較すると、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータ（ｐｐｍ）は以下のように決定された：Ｃ２−１５２．９，Ｃ３−１２４．７，Ｃ４−１７４．５，Ｃ５−１２７．１，Ｃ６−１１５．３，Ｃ７−１６３．１，Ｃ８−１０２．０，Ｃ９−１５７．４，Ｃ１０−１１６．４，Ｃ１’−１２３．３，Ｃ２’−１１６．３，Ｃ３’−１４６．０，Ｃ４’−１４７．４，Ｃ５’−１１２．０，Ｃ６’−１１９．６，ＯＣＨ3−５５．６。最後に、化合物ＩＩの構造を、３’，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボンと特徴づけ、これもカリコシンと名付けられた公知の化合物である。
【０１３８】
カリコシンの構造は、以下である。
【化２】
2007513153.tif 000010
【実施例１１】
【０１３９】
＜ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαならびにＥＲαおよびＥＲβに対するホルモノネチンのアゴニスト作用＞
前の実施例に記載のようにバイオアッセイを行った。ホルモノネチンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、３、１０、および３０×１０-6ｇ／ｍＬの各濃度で試験した。ホルモノネチンは、ＥＲα、ＥＲβ、ＰＰＡＲγ、およびＰＰＡＲαに強力なアゴニスト活性を示した。ホルモノネチンの存在により、３０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度でＥＲα活性が１７倍に増加した（エストラジオールの最大活性に相当する）。ホルモノネチンは強力なＥＲβ活性も示し、３０×１０-6ｇ／ｍｌの用量で最大１３０倍増加した（エストラジオールの最大活性の４００％に相当する）。他のレセプターに対するホルモノネチンの活性を、表８に示し、この表は、賦形剤のみに曝露した細胞と比較したルシフェラーゼ活性の増加倍率として示す。したがって、ホルモノネチンは、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲα活性をそれぞれ６倍および１０倍増加させた（表８）。したがって、ホルモノネチンは、これらのレセプターの活性の欠損に関連する疾患におけるＰＰＡＲγ活性およびＰＰＡＲα活性を増加させるのに有用であろう。
【０１４０】
【表８】
2007513153.tif 000011
【実施例１２】
【０１４１】
＜ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、ＥＲα、およびＥＲβに対するホルモノネチンの相乗作用＞
ＨｅＬａ細胞を、（１）ＰＰＡＲγ、（２）ＰＰＡＲα、（３）ＡＲ、（４）ＰＲ、または（５）ＥＲレセプター遺伝子系に対する阻害効果または相乗効果についてそれぞれ試験するために、固定濃度の（１）ピオグリタゾン（３０×１０-6Ｍ）、（２）ＷＹ１４６４３（３０×１０-6Ｍ）、（３）ジヒドロテストステロン（１×１０-9Ｍ）、（４）プロゲステロン（１０×１０-6Ｍ）、または（５）エストラジオール（１×１０-9Ｍ）の存在下でＤＭＳＯにて希釈した漸増濃度のホルモノネチンに曝露した。これらの濃度は、各レセプターで認められた用量応答曲線のプラトーに存在する。これらのレポーター遺伝子アッセイの全詳細を、前の実施例中に記載のように記載した。
【０１４２】
予想外に、ホルモノネチンは、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、およびＥＲαレポーター遺伝子アッセイに対するＷＹ１４６４３、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、およびエストラジオールの活性を増大させた（表９）。したがって、ホルモノネチンは、相乗作用し、最大用量のＰＰＡＲアゴニストの活性を４．４倍、ＡＲアゴニストについては２倍、ＰＲアゴニストについては１．８倍、ＥＲαについては３．２倍に増加させることができた。対照的に、ピオグリタゾン（３０×１０-6Ｍ）を添加した場合のホルモノネチン（３〜３０×１０-6ｇ／ｍＬの範囲の用量）のＰＰＡＲγ活性は、ピオグリタゾンのみを使用して認められた活性と異ならなかった。さらに、エストラジオール（１×１０-9Ｍ）を添加した場合のホルモノネチン（１〜３０×１０-6ｇ／ｍＬの範囲の用量）のＥＲβ活性は、その強力なエストロゲン活性を示した。したがって、ホルモノネチンは、１〜３０×１０-6ｇ／ｍＬの範囲の用量で、エストラジオールのみの活性を阻害も増大もしなかった。当業者は、ホルモノネチンのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のアンドロゲン、エストロゲン、プロゲストゲン、およびＰＰＡＲαリガンドのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患における効果を増強することができることを理解している。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【０１４３】
【表９】
2007513153.tif 000012
【実施例１３】
【０１４４】
ＰＰＡＲγ、ＥＲα、およびＥＲβに対するカリコシンのアゴニスト作用
前の実施例に記載のようにバイオアッセイを行った。カリコシンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、３、１０、および３０×１０-6ｇ／ｍＬの各濃度で試験した。カリコシンは、強力なＰＰＡＲγ活性を示し、３０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で最大４０倍であった（ＰＰＡＲγに対するピオグリタゾンの最大活性の５０％に相当する）。さらに、カリコシンはＥＲαアゴニスト活性も示し、３０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で最大２０倍であった（ＥＲαに対するエストラジオールの最大活性の５０％に相当する）。同様に、３０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で、カリコシンは強力なＥＲβ活性を示し、最大１００倍に増加した（ＥＲβに対するエストラジオールの最大活性の４００％に相当する）。したがって、カリコシンは、これらのレセプターの活性の欠損に関連する疾患におけるＰＰＡＲγ、ＥＲα、およびＥＲβ活性を増加させることができる。カリコシンはＥＲαよりもＥＲβを活性化するので、ＳＥＲＭでもある。
【実施例１４】
【０１４５】
＜ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、ＥＲα、およびＥＲβに対するカリコシンの相乗作用＞
前の実施例に記載のように、細胞を、（１）ＰＰＡＲγ、（２）ＰＰＡＲα、（３）ＡＲ、（４）ＰＲ、または（５）ＥＲレセプター遺伝子系に対する阻害効果または相乗効果についてそれぞれ試験するために、固定濃度の（１）ピオグリタゾン（３０×１０-6Ｍ）、（２）ＷＹ１４６４３（３０×１０-6Ｍ）、（３）ジヒドロテストステロン（１×１０-9Ｍ）、（４）プロゲステロン（１０×１０-6Ｍ）、または（５）エストラジオール（１×１０-9Ｍ）の存在下でＤＭＳＯにて希釈した漸増濃度のカリコシンに曝露した。
【０１４６】
予想外に、カリコシンは、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＡＲ、ＰＲ、およびＥＲαレポーター遺伝子アッセイに対するピオグリタゾン、ＷＹ１４６４３、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、およびエストラジオールの活性を増大させた（表１０）。これらの濃度は、各レセプターで認められた用量応答曲線のプラトーに存在する。したがって、カリコシンは、相乗作用し、最大用量のＰＰＡＲγアゴニストの活性を３倍、ＰＰＡＲαアゴニストについては１．８倍、ＡＲアゴニストについては５．８倍、ＰＲアゴニストについては１．８倍、ＥＲαについては２．９倍に増加させることができた。ＥＲβ活性に対するカリコシンの効果は、１〜３０×１０-6ｇ／ｍＬの範囲の濃度で付加的であり、その強力なエストロゲン活性のために、エストラジオール（１×１０-9Ｍ）の効果が増加した。当業者は、カリコシンのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγリガンドである、アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲストゲンのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患における効果を増強することができることを理解している。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【０１４７】
【表１０】
2007513153.tif 000013
【実施例１５】
【０１４８】
＜ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＥＲα、およびＥＲβに対するダイゼインのアゴニスト作用＞
前の実施例に記載のようにバイオアッセイを行った。ダイゼインを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、５、１０、および２０×１０-6ｇ／ｍＬの各濃度で試験した。ダイゼインは、ＰＰＡＲγ活性を示し、２０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で最大２０倍であった（ＰＰＡＲγに対するピオグリタゾンの最大活性の２２％に相当する）。ダイゼインはまた、１０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で最大８倍のＰＰＡＲα活性を有する（ＰＰＡＲαに対するＷＹ１４６４３の最大活性の７３％に相当する）。さらに、ダイゼインはＥＲαアゴニスト活性も示し、５×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で最大２０倍増加した（ＥＲαに対するエストラジオールの最大活性の１００％に相当する）。同様に、３０×１０-6ｇ／ｍｌの濃度で、ダイゼインは強力なＥＲβ活性を示し、最大２９倍に増加した（ＥＲβに対するエストラジオールの最大活性の２００％に相当する）。したがって、ダイゼインを使用して、これらのレセプターの活性の欠損に関連する疾患におけるＰＰＡＲαおよびγ、ＥＲα、ならびにＥＲβ活性を増加させることができる。ダイゼインはＥＲαよりもＥＲβを活性化するので、ＳＥＲＭでもある。
【実施例１６】
【０１４９】
＜ＰＰＡＲα、ＡＲ、およびＰＲに対するダイゼインの相乗作用＞
実施例１および４に記載のように、ＨｅＬａ細胞を、（１）ＰＰＡＲγ、（２）ＰＰＡＲα、（３）ＡＲ、（４）ＰＲ、または（５）ＥＲレセプター遺伝子系に対する阻害効果または相乗効果についてそれぞれ試験するために、固定濃度の（１）ピオグリタゾン（３０×１０-6Ｍ）、（２）ＷＹ１４６４３（３０×１０-6Ｍ）、（３）ジヒドロテストステロン（１×１０-9Ｍ）、（４）プロゲステロン（１００×１０-9Ｍ）、または（５）エストラジオール（１×１０-9Ｍ）の存在下でＤＭＳＯにて希釈した漸増濃度のダイゼインに曝露した。
【０１５０】
予想外に、ダイゼインは、ＰＰＡＲα、ＡＲ、およびＰＲレポーター遺伝子アッセイに対するＷＹ１４６４３、ジヒドロテストステロン、プロゲステロンの活性を増大させた（表１１）。これらの濃度は、各レセプターで認められた用量応答曲線のプラトーに存在する。したがって、カリコシンは、相乗作用し、最大用量のＰＰＡＲαアゴニストの活性を７倍、ＡＲアゴニストについては３倍、およびＰＲアゴニストについては３倍に増加させることができた。当業者は、ダイゼインのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のＰＰＡＲαリガンドである、アンドロゲン、およびプロゲストゲンのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患における効果を増強することができることを理解している。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【０１５１】
【表１１】
2007513153.tif 000014
【実施例１７】
【０１５２】
＜ＡＲおよび他のステロイドレセプターに対するゲニステインの相乗作用＞
リガンド化（ｌｉｇａｎｄｅｄ）ＡＲ活性に体するゲニステインの効果を測定するために、ＨｅＬａ細胞を、固定濃度のジヒドロテストステロン（１０×１０-9Ｍ）の非存在下または存在下でエタノールにて希釈した漸増濃度のゲニステインに曝露した（図２Ａ）。３×１０-9Ｍを超えるジヒドロテストステロン濃度により、アンドロゲン作用が最大になり、この濃度は用量応答曲線のプラトーに存在する。細胞を、固定濃度のゲニステイン（３×１０-6Ｍ）の非存在下または存在下で漸増濃度のジヒドロテストステロンにも曝露した（図２Ｂ）。実施例５に記載のように、ＡＲ駆動レポーター遺伝子アッセイを使用して、アンドロゲン活性を測定した。ゲニステイン（０．１〜３０×１０-6Ｍの範囲の濃度）は、いかなる内因性のアゴニストＡＲ活性も示さないにもかかわらず、用量応答様式で飽和用量のジヒドロテストステロン活性をさらに５倍に増加させることができた（図２Ａ）。３×１０-6Ｍの固定濃度のゲニステインはまた、ＡＲに対する０．０１〜１０×１０-9Ｍの濃度範囲のジヒドロテストステロンの活性を増加させた（図２Ｂ）。ＤＨＴの存在下でゲニステインを含むか含まない複製ＨｅＬａ細胞溶解物を使用した免疫ブロット分析がいかなるＡＲタンパク質発現の相違も示さなかったので、このゲニステインの相乗作用は、ＡＲタンパク質発現の増加に起因しなかった。ホルモノネチン、ダイゼイン、およびカリコシンと類似のイソフラボノイド骨格により、ゲニステインはまた、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγリガンドであるエストロゲンおよびプロゲストゲンの作用を増強することができる。一般にダイズイソフラボンとして消費されるゲニステインのこの新規の増大能力を使用して、内因性または外因性のＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγリガンドである、アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲストゲンのこれらのホルモンの欠損に起因する疾患における効果を増強することができることを理解している。これを使用して、このような増強効果が望まれる正常なヒトのこれらのホルモンの効果を増大することもできる。
【実施例１８】
【０１５３】
＜ＨＱの抽出物および化合物の相乗作用に対するＰＰＡＲγアゴニストであるＧＷ９６６２の効果＞
ＨＱの抽出物および化合物の相乗効果がステロイドレセプター発現の増加に起因しないので、本発明者らは、これらの効果がそのリガンド結合ポケットによって媒介されるかどうかを確定するための実験を行った。ＧＷ９６６２は、ＰＰＡＲのリガンド結合ポケットに不可逆的に結合する混合アゴニスト／アンタゴニストである（Ｌｅｅｓｎｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。単独で、ＧＷ９６６２は、弱いＰＰＡＲγアゴニスト活性を示した（表１２）。予想どおり、１×１０-6Ｍを超える用量のＧＷ９６６２の存在により、用量依存性様式でピオグリタゾンのＰＰＡＲγ効果が阻害された。予想外に、ＨＱの水抽出物、ＨＱのＤＣＭ抽出物、ホルモノネチン、ゲニステインの存在により、ＧＷ９６６２の内因性アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を増加することができた。したがって、ＨＱの抽出物および化合物を低用量（０．３〜１．０×１０-6Ｍ）のＧＷ９６６２に添加した場合、ＰＰＡＲγの刺激効果の増大が認められた（表１３）。高用量のＧＷ９６６２（１×１０-6Ｍ）により、ピオグリタゾンと類似のアンタゴニスト作用が得られた。したがって、ＧＷ９６６２のこれらのアゴニスト／アンタゴニスト作用は上方にシフトし、ＨＱの抽出物および化合物ならびにゲニステインの増大効果がＰＰＡＲγのリガンド結合ポケットによって媒介されないことを示した。ＧＷ９６６２がＰＰＡＲγのリガンド結合ポケットに不可逆的に結合するので、ＨＱの抽出物および化合物ならびにゲニステインは、ＰＰＡＲγのリガンドポケットに関与しない機構を介してその増大効果を示す。より一般的には、本発明者らは、ステロイドレセプターのリガンド結合ポケットへの特異的リガンド結合に関与しないＡＲ、ＰＲ、ＧＲ、およびＥＲなどのステロイドレセプターの作用を増大させる新規の方法を発見した。この発見により、リガンド−ステロイドレセプターの作用を増大させることができる化合物を検索するための新規の薬物発見スクリーニングプラットフォームを開発可能である。
【０１５４】
【表１２】
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【０１５５】
【表１３】
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【０１５６】
【表１４】
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【０１５７】
【表１５】
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【０１５８】
【表１６】
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【０１５９】
【表１７】
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【０１６０】
【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＰＰＡＲα活性およびＰＰＡＲγ活性に対するＨＱ抽出物の用量応答効果。（Ａ）ＰＰＡＲγおよび（Ｂ）ＰＰＡＲαのキメラＧＡＬ4−ＤＮＡ結合ドメインおよびＬＢＤを発現するＨｅＬａ細胞を、漸増用量のＨＱのエタノール抽出物に曝露した。これらのキメラＧａｌ４DBD−ＰＰＡＲLBDレセプターに結合するリガンドにより、ルシフェラーゼ遺伝子のＵＡＳgクローン化上流の５コピーを含む同時トランスフェクションしたレポーター遺伝子が活性化される。ＰＰＡＲ生物活性を測定し、（Ａ）基準ＰＰＡＲγリガンドである１５−デオキシ−δ１２，１４、プロスタグランジンＪ２（１５ｄＰＧＪ２）、およびピオグリタゾン、ならびに（Ｂ）ＰＰＡＲαリガンドであるＷＹ１４６４３と比較した。試験物質のＰＰＡＲ活性を、賦形剤のみに曝露した細胞と比較したルシフェラーゼ活性の増加倍率として示す。各データポイントは、平均±ＳＥＭである。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、アンドロゲン作用に対するゲニステインの相乗効果。ヒトアンドロゲンレセプターおよびアンドロゲン応答エレメントによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＨｅＬａ細胞を、漸増用量の（Ａ）固定濃度のＤＨＴ（１０×１０-9Ｍ）の存在下または非存在下でのゲニステイン；または（Ｂ）固定濃度のゲニステイン（３×１０-6Ｍ）の存在下または非存在下でのＤＨＴに曝露した。試験物質のＡＲ活性を、賦形剤のみに曝露した細胞と比較したルシフェラーゼ活性の増加倍率として示す。各データポイントは、平均±ＳＥＭである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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