(57)【要約】  本発明は、核酸源からの核酸の迅速な単離方法であって、カオトロピック塩の非存在下かつアルコールの非存在下で核酸源を溶解する方法に関する。次に、この溶解物は、カオトロピック塩の非存在下かつアルコールの非存在下で核酸と結合する、シリカをベースとする材料またはシリカコート材料からなる多孔質マトリックスで濾過する。最後に、核酸をバッファー水溶液によって多孔質マトリックスから溶出する。さらに、本発明は、核酸を単離するための試験キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）核酸源を溶解する工程；
ｂ）溶解物を、シリカをベースとする材料またはシリカコート材料からなる多孔質マトリックスで濾過して、アルコールの非存在下かつカオトロピック塩の非存在下で、核酸を多孔質マトリックスに結合させる工程；
ｃ）バッファー水溶液を使用することによって、工程ｂ）の多孔質マトリックスから核酸を溶出する工程；
を含む、核酸源から核酸を迅速に単離する方法。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、約１０ｋｂｐ〜約５０ｋｂｐの範囲の大きさである、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸源が、あらゆる種類の生体組織または細胞材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸源が、哺乳動物細胞、器官、バイオプシー、血液、血清、筋肉、骨髄、細菌、酵母、及び／または、種子または葉などのあらゆる種類の植物組織または細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸源を、カオトロピック塩を含有せず、かつアルコールを含有しないバッファーを使用して溶解する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮａｓｅ及び／またはプロテアーゼ及び／またはリゾチームを、請求項１の１以上の工程に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多孔質マトリックスが、ケイ素系酸化物で被覆された表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多孔質マトリックスが、多孔質シリカ膜である、請求項１または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記多孔質マトリックスが、０．２μｍ〜３．２μｍの範囲の大きさの細孔を含む、請求項１、９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多孔質マトリックスが、０．３μｍ〜２．８μｍの範囲の大きさの細孔を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多孔質マトリックスが、０．５μｍ〜２．０μｍの範囲の大きさの細孔を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記の単離された核酸が、ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、マイクロサテライト分析、サザンブロット、ＰＣＲ、または定量的リアルタイムＰＣＲなどの、その後の使用において鋳型として供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の単離された核酸が、その後、ＰＣＲまたは定量的リアルタイムＰＣＲに使用される際に鋳型として供給される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１の工程（ａ）の前記溶解物を請求項１の段階ｂ）の前に遠心分離して、溶解物から細胞残屑を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１の工程ｂ）の後であって、請求項１の工程ｃ）の前に、１回以上、洗浄工程を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記洗浄工程を洗浄バッファーを使用して実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１の工程ｂ）の前記多孔質マトリックスが、一本のカラムフィルター管に埋め込まれた膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１の工程ｂ）の前記多孔質マトリックスが、マルチウェル・フィルタープレートに組み込まれた膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記膜が、１層以上の層で構築される、請求項１９及び２０に記載の方法。
【請求項２２】
ある層の細孔径が、その他の層（１層または複数層）の細孔径と異なる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２に記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも：
ａ）シリカをベースとする材料またはシリカコート材料からなる多孔質マトリックス；
ｂ）アルコールを含有せず、かつカオトロピック塩を含有しない溶解バッファー；
ｃ）溶出バッファー；
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸源から核酸を単離するための迅速な方法であって、その核酸源が、カオトロピック塩の非存在下かつアルコールの非存在下で溶解される方法に関する。
【０００２】
当業界において、複合出発材料、例えば全血、バイオプシー、植物組織等から核酸を単離する方法は知られている。これらの方法は通常、タンパク質分解酵素の存在下で洗浄剤によって、生体物質を溶解し、続いて、有機溶媒、例えばフェノール及び／またはクロロホルムで数回抽出し、核酸をエタノール沈殿させて透析することを含む。この種のＤＮＡの単離方法は非常に面倒で時間がかかる。このような出発材料からの核酸精製には比較的多くの工程が必要であることから、いくつかの異なる試料を同時処理する場合は試料間で核酸が移転するリスクが高くなる。その後、核酸増幅法、例えば感受性が最大のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、例えば遺伝子型判定等の特異的な核酸配列を検出するために核酸が単離される場合、偽陽性の結果を生じる、そのような異なる試料間の核酸移転のリスクが増大することは、重大きな難点である。
【０００３】
複合出発材料からの核酸の単離方法はやがて簡略化された。これらの方法は、カオトロピック塩、例えば、塩化グアニジニウムの使用、及び／またはアルコール、例えば、エタノールまたはイソプロパノールの使用を含む場合が多かった。ブーム(Boom)ら（米国特許第５，２３４，８０９号）は、核酸含有出発原料に由来する核酸をカオトロピック塩の存在下で核酸結合性材料に結合させる方法を記載している。
【０００４】
本発明の根底にある問題は、迅速であり、かつ危険で高価な化合物、つまりカオトロピック塩及び／またはアルコールなどの試薬に依存しない、簡単な核酸の単離方法を提供することである。
【０００５】
本発明は、迅速かつ低コストな核酸の単離方法を提供することによって、この問題を解決する。本発明による方法は有利なことに、どちらも高コスト要因であるアルコール及びカオトロピック塩を使用せずに作業するよう設計されている。さらに、本発明による方法は、非常に迅速な核酸の単離方法である。したがって、本発明による方法は、例えば通常の、時間がかかり、かつコストの大きいハイスループット・スクリーニング系において極めて有用である。
【０００６】
特に、本発明は、アルコールの非存在下かつカオトロピック塩の非存在下で核酸源を溶解することによる、核酸源からの核酸の簡単な単離方法に関する。得られた溶解物を任意に、適切な遠心力で遠心分離して、溶解物から細胞残屑を除去する。続いて、溶解物、または遠心分離工程を経た場合には遠心分離した溶解物の上清を、シリカをベースとする材料またはシリカコート材料からなる多孔質マトリックスを通過させて濾過し、それによって、核酸がカオトロピック塩の非存在下かつアルコールの非存在下で多孔質マトリックスに結合する。濾過工程の後、１回以上の任意の洗浄工程を実施してもよい。最後に、核酸は、好適な溶出バッファーを使用して、多孔質マトリックスから溶出される。
【０００７】
好ましい態様において、本発明によって単離される核酸は、その後、ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、マイクロサテライト分析、サザンブロット、ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ等に使用される際に、さらに好ましくはＰＣＲまたは定量的リアルタイムＰＣＲに使用される際に、鋳型として供給される。このことによって、本発明による方法は、例えば、迅速かつ経済的な遺伝子型判定において、またはコストの大きいハイスループット遺伝子スクリーニングにおいて有用なツールとなる。
【０００８】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡならびにそれらのハイブリッドを表す。好ましい態様において、核酸はＤＮＡである。さらに好ましい態様において、核酸はゲノムＤＮＡである。通常、本発明による方法によって単離される核酸は、約１０ｋｂｐ〜約５０ｋｂｐの範囲の大きさである。
【０００９】
本明細書で使用される「核酸源」という用語は、あらゆる種類の生体組織または細胞材料、例えば哺乳動物細胞、器官、バイオプシー、血液、血清、筋肉、骨髄、細菌、酵母、種子または葉などのあらゆる種類の植物組織または細胞を表す。以下の非限定的な態様によって、本発明による方法の適用範囲が示される。代表的な例は、遺伝子導入のための一連の個体、例えばマウス等の遺伝子導入動物のスクリーニングであって、組織試料からゲノムＤＮＡを単離し、その後、導入遺伝子特異的プライマーでＰＣＲを行うか、またはサザンブロット分析を行うか、またはＲＦＬＰ分析を行うことを含むスクリーニングである。もう１つの代表的な例は、上述の例に沿った種子の遺伝子スクリーニングである。さらに別の例は、全血試料からのＤＮＡの単離である。例えばその後のＰＣＲと組み合わせると、これは、例えば遺伝的障害を迅速に検出する、低コストかつ強力なツールである。
【００１０】
核酸源の溶解は、核酸源の種類に応じて、当業界で公知のあらゆる好適な方法によって実施することができる。したがって、例えばミキサーミル(MixerMill)（レツフ(Retsch)社、ドイツ，ハーン）において液体窒素中で凍結した核酸源の均質化、ならびに、例えば、洗浄剤、例えばＳＤＳを含む溶解バッファーを使用することによる穏やかな溶解が好適である。本発明によれば、溶解バッファーはアルコールを含有せず、かつカオトロピック塩を含有しない。多くの好適な溶解バッファーが当業界で公知である。典型的には、限定されないが、溶解バッファーは例えば、洗浄剤、例えばＳＤＳを、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で含有し、及び／またはトリトン(Triton)Ｘ−１００を好ましくは１％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）の濃度で含有し、及び／またはツイーン(Tween)２０を好ましくは１％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で含有し、及び／またはＮＰ４０（ノニデット(Nonidet)（登録商標）Ｐ４０）を好ましくは１％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で含有し、及び／またはサルコシルを好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）〜４％（ｖ／ｖ）の濃度で含有し；及び／またはキレート剤、例えばＥＤＴＡを好ましくは５ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で含有し；及び／または他の好適な試薬、例えばトリスを好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で、かつｐＨ７．０〜９．０で含有し、及び／または尿素を好ましくは０．１Ｍ〜７Ｍの濃度で含有し、及び／またはＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）を好ましくは１％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有し、及び／またはＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有し、及び／またはβ−メルカプトエタノールを好ましくは５０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度で含有し、及び／または塩化リチウムを好ましくは０．１Ｍ〜３Ｍの濃度で含有し、及び／または酢酸ナトリウムを好ましくは１０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度で含有し、及び／または塩化ナトリウムを好ましくは０．１Ｍ〜５Ｍの濃度で含有し、及び／または他の塩、例えば塩化カリウム及び／または塩化アンモニウムをモル濃度範囲(molar ranges)で含有し、及び／または酵素、例えばタンパク質分解酵素及び／またはリゾチーム等を含有する。いくつかの溶解バッファーの非限定的な例を表１に示す。
【００１１】
【表１】
2007509620.tif 000002
2007509620.tif 000003
【００１２】
核酸源の種類に応じて、核酸源／溶解バッファーの混合物を適切な温度で適切な時間、インキュベートする。好適な溶解プロトコルは当業者に良く知られており、使用される核酸源の種類によって異なる。
【００１３】
溶解操作の後、濾過工程に先立つ遠心分離工程は、細胞残屑による多孔質マトリックス材料の目詰りを防ぐための任意の工程である。遠心分離工程は、好適な条件で、即ち当業者に良く知られた好適な温度及び好適な遠心力で行われる。典型的には、限定されないが、遠心分離は、約４℃〜およそ室温の範囲の温度かつ約１０００×ｇ〜約６０００×ｇの範囲の遠心力で実施される。
【００１４】
本発明による方法の性能を高めるために、１種以上の酵素、例えば、限定されないがＲＮａｓｅ活性及び／またはプロテアーゼ活性を有する酵素を、任意に、溶解工程、濾過工程、溶出工程、または溶出工程で得られる単離された核酸に添加してもよい。プロテアーゼは、例えば、核酸源の種類及び選択される溶解方法に応じて溶解性能を高め、及び／またはＤＮａｓｅ活性をなくす。ＲＮａｓｅは、例えば、単離されたＤＮＡのＲＮＡ混入を低減し、したがって、その後のＰＣＲの性能を高める。典型的には、プロテアーゼまたはＲＮａｓｅは、溶解工程の間に添加される。さらに、細菌細胞壁の溶解を助けるリゾチームを１以上の工程に添加することは有用であり得る。このような酵素の取り扱いは当業者には良く知られている。
【００１５】
本発明による方法において使用されるフィルター材料は、シリカをベースとする材料またはシリカコート材料からなる多孔質マトリックスである。このマトリックスは、あらゆる大きさの粒子及び一枚膜で構成されていてもよい。好ましい態様において、多孔質マトリックス材料は、多孔質シリカ膜である。好ましくは、多孔質マトリックス材料は、ケイ素系酸化物(siliceous oxide)で被覆された表面を有する。本明細書で使用される「多孔質」という用語は、マトリックス材料が、０．２μｍ〜３．２μｍ、好ましくは０．３μｍ〜２．８μｍ、さらに好ましくは０．５μｍ〜２．０μｍの範囲の大きさの細孔を含むことを意味する。好ましい態様において、多孔質マトリックス材料は、１本のカラムフィルター管に埋め込まれた膜であるか、または、別の好ましい態様では、マルチウェル・フィルタープレート、好ましくは９６穴フィルタープレートまたは３８４穴フィルタープレートに組み込まれる。これらの支持材料の内部に、１層以上の膜を構築することができ、ある層の細孔径はその他の層（１層または複数層）の細孔径と異なってもよい。溶解物、または遠心工程を経た場合には、遠心分離された溶解物の上清を、例えば遠心分離または吸引等で、多孔質マトリックス材料を通過させることによって濾過する。
【００１６】
濾過工程の後、溶出工程に先立って、１回以上の任意の洗浄工程を、あらゆる好適な洗浄バッファーを使用することによって実施してもよい。多くの好適な洗浄バッファーが当業者に良く知られている。当業界で良く知られている通り、アルコール、例えばエタノール及び／またはイソプロパノールを含む好適なバッファーが、洗浄工程に好適であり得る。好適な洗浄バッファーは、限定されないが、例えば、塩化ナトリウムを好ましくは１０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度で含有してもよく、及び／またはトリスを好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度かつｐＨ７．０〜９．０で含有してもよく、及び／またはエタノールを好ましくは１０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で含有してもよく、及び／またはイソプロパノールを好ましくは２５％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で含有してもよく、及び／またはツイーン(Tween)２０を好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）〜３％（ｖ／ｖ）の濃度で含有してもよく、及び／または塩化リチウムを好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で含有してもよく、またはこれら等の他のものを含有してもよい。溶解バッファーのいくつかの非限定的な例を表２に示す。
【００１７】
【表２】
2007509620.tif 000004
【００１８】
多孔質シリカ材料からの核酸の溶出は、あらゆる好適なバッファーを使用して実施することができる。多くの溶出バッファーが当業界で公知であり、当業者には自明である。典型的には、溶出バッファーは、限定されないが、低塩のバッファー及び／または低モルのトリスバッファーである。好適な溶出バッファーは、限定されないが、例えばトリスを好ましくは１ｍＭ〜１５ｍＭの濃度かつｐＨ７．５〜９．０で含有してもよく、及び／またはＥＤＴＡを好ましくは０．１ｍＭ〜２ｍＭの濃度で含有してもよい。溶出は、蒸留水を使用して実施してもよい。非限定的な例は、例えば、ｐＨ範囲８．０〜９．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌであり、任意に０．５ｍＭ〜１ｍＭのＥＤＴＡと組み合わせられる。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明による方法によって核酸源からの核酸の単離を実施するための試験キットに関する。この試験キットは、少なくともａ）シリカをベースとする材料またはシリカコート材料からなる多孔質マトリックス、ｂ）カオトロピック塩を含有せず、かつアルコールを含有しない溶解バッファー、及びｃ）溶出バッファーを含有する。
【実施例】
【００２０】
実施例１：マウス心臓からのゲノムＤＮＡの単離
マウスの心臓組織（１標本１０ｍｇ）を、１８０μｌの溶解バッファー（３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１００ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭトリス／ＨＣｌ；ｐＨ８．３）及び２０μｌのプロテイナーゼＫ（６００ＡＵ／ｍｌ）（ドイツ，ヒルデン，ＱＩＡＧＥＮ社）と混合した。混合物を５５℃で２４時間インキュベートした。続いて、２００μｌの溶解物をボルテックスし、その後遠心分離工程（５０００×ｇ，２分間）を実施した。ワットマン(Whatman)ＧＦ／Ｂガラス超極細繊維膜の直径７．５ｍｍ円形パンチ２枚を挿入して組み立てた、標準的なポリプロピレン・フリットを有するミクロフィルターカラム成形品を含むスピンカラム上に、上清を負荷し、続いて、遠心分離によって濾過した。濾過工程に続いて、２回の洗浄工程を、それぞれ１００μｌの洗浄バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭトリスＨＣｌ；７０％（ｖ／ｖ）エタノール；ｐＨ５）を使用して行った。溶出工程は、１００μｌのバッファー（０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０ｍＭトリス／ＨＣｌ；ｐＨ９）を用いて実施した。１５μｌの溶出液をアガロースゲル上に負荷した。ゲルは、約１０ｋｂｐ〜約５０ｋｂｐの範囲の大きさに、ゲノムＤＮＡの独特なバンドを明瞭に示した。
【００２１】
実施例２：コムギからのゲノムＤＮＡの単離
ＭｉｘｅｒＭｉｌｌ  ＭＭ３００（レツフ(Retsch)社、ドイツ、ハーン）を使用して、コムギ（１標本５０ｍｇ）を微粉末に粉砕し、続いて、２００μｌの溶解バッファー（１．４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン；５００ｍＭ  ＮａＣｌ；１００ｍＭ酢酸ナトリウム；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ５．５）及び１μｌのＲＮａｓｅＡ（７０００Ｕ／ｍｌ）（ドイツ，ヒルデン，ＱＩＡＧＥＮ社）中に再懸濁した。続いて、その混合物をボルテックスし、５０００×ｇで２分間遠心分離した。ワットマン(Whatman)ＧＦ／Ｂガラス超極細繊維膜の直径７．５ｍｍ円形パンチ２つを挿入して組み立てた、標準的なポリプロピレン・フリットを有するミクロフィルターカラム成形品を含むスピンカラム上に、上清を負荷し、続いて、遠心分離によって濾過した。濾過工程に続いて、２回の洗浄工程を、それぞれ１００μｌの洗浄バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭトリスＨＣｌ；７０％（ｖ／ｖ）エタノール；ｐＨ５）を使用して行った。溶出工程は、１００μｌのバッファー（０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０ｍＭトリス／ＨＣｌ；ｐＨ９）を用いて行った。１５μｌの溶出液をアガロースゲル上に負荷した。ゲルは、約１０ｋｂｐ〜約５０ｋｂｐの範囲の大きさに、ゲノムＤＮＡの独特なバンドを明瞭に示した。
【国際調査報告】
2007509620.tif 000005
2007509620.tif 000006