(57)【要約】  画像形成装置を使用して、複数の生体物質を分析する方法。この方法は、複数の生体物質にマーカーを付与する段階であって、マーカーが、画像形成装置を用いて検出する際に複数の生体物質中の対象を同定できるものであり、マーカーの付与方法が、マーカーが第１の期間中に対象を同定することが可能であるように、且つマーカーが第２の期間中に対象をそれほど同定することができないよう構成される段階と、第１の期間中、対象の空間定義をマーカーから特定することが可能なマークアップ画像を、記録する段階と、第２の期間中、複数の生体物質の第１の画像を記録する段階と、マークアップ画像から得られたデータを使用して、第１の画像内に、対象に関する空間定義を作成する段階とを含む。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
画像形成装置を使用して、複数の生体物質を分析する方法であって、
ａ）複数の生体物質にマーカーを付与する段階であって、マーカーが、画像形成装置を用いて検出する際に複数の生体物質中の対象を同定できるものであり、マーカーの付与方法が、マーカーが第１の期間では対象を同定することができるが第２の期間では対象の同定能力が落ちるようになされる段階と、
ｂ）第１の期間中、対象の空間定義をマーカーから特定することが可能なマークアップ画像を、記録する段階と、
ｃ）第２の期間中、複数の生体物質の第１の画像を記録する段階と、
ｄ）マークアップ画像から得られたデータを使用して、第１の画像内に、対象に関する空間定義を作成する段階と
を含む方法。
【請求項２】
第１の期間が、第２の期間の前である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の期間が、第２の期間の後である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１の画像を記録した後に、マーカーを複数の生体物質に添加することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
マーカーが、経時的に変化するシグナルを有する、請求項２又は請求項３記載の方法。
【請求項６】
マーカーを、遺伝構成系によって付与する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
作成空間定義が、対象の空間範囲及び位置データの少なくとも１つを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
作成空間定義を、マークアップ画像から検出された対象の空間定義を使用して作成する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ｅ）第１の期間中、複数の生体物質の別の画像を記録する段階と、
ｆ）別の画像からデータを得る段階と
を含み、段階ｄ）では、別の画像から得られたデータを使用して、第１の画像を分析する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
別の画像を、第１のカラーチャネルに記録し、マークアップ画像を、第２の異なるカラーチャネルに記録する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
第１の画像を、第１のカラーチャネルに記録する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
段階ｆ）では、マークアップ画像から得られたデータを使用して、別の画像からデータを得ることを含む、請求項９、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
段階ｆ）で得られたデータが、対象に関連した１以上の特性の、１以上の値を含む、請求項９乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
１以上の特性が、平均強度、標準偏差、分散、尖度、自動相関関数、空間相関測度、テキスト相関測度、自動相関関数、フラクタル次元、面積、周辺、主軸の長さ、主軸の幅、コンパクト度及びオリエンテーションの少なくとも１つを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
段階ｄ）が、
ｉ）複数の試験空間定義の１つを定義する段階と、
ｉｉ）試験空間定義を使用して、第１の画像の１以上の特性の値を計算する段階と、
ｉｉｉ）複数の試験空間定義の別の１つに関して、段階ｉ）〜ｉｉ）を繰り返す段階と、
ｉｖ）段階ｉｉ）で計算した１以上の値に従って、複数の試験空間定義の１つを選択する段階と
を含む、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
段階ｉｖ）が、段階ｉｉ）で計算した値を、段階ｆ）における別の画像から得られた値と比較する段階を含む、請求項１５及び請求項９乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
比較する段階が、ユークリッド距離Ｅを計算する段階を含み、ユークリッド距離が、下記の関係式によって計算されるものであり、段階ｉｉ）で計算した値と、段階ｆ）において別の画像から得られた値との両方が、整数Ｋの特性ｉに関係したベクトル、即ちそれぞれＺＮ−１及びＺＮである、請求項１６記載の方法。
【数１】
2007500344.tif 000004
【請求項１８】
段階ｉｖ）が、ユークリッド距離Ｅの実質的に最小限の値を選択する段階を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
比較する段階が、シティブロック関数、チェビシェフ距離、ミンコフスキーのｍ次関数、２次関数、Ｑ正定関数、キャンベラ距離、非近距離関数、又は角分離の少なくとも１つを計算する段階を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
第１の画像内の複数の対象に関し、複数の空間定義を作成するために、段階ｄ）を繰り返すことを含む、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
複数の作成空間定義を、品質基準に従ってフィルタリングする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
段階ｄ）が、マークアップ画像から検出された対象の周囲空間を決定する段階であって、周囲空間が、該周囲空間を、近接した別の対象の少なくとも１つの別の周囲空間から切り離す境界を有するものである段階と、対象の決定された周囲空間内に作成空間定義があるように構成する段階とを含む、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
ボロノイアルゴリズムを使用して、対象の周囲空間を決定する段階を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
第３の期間中に、複数の生体物質の第２の画像を記録し、第２の画像内に、対象に関する空間定義を作成する段階を含む、請求項１乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
生体物質が生体細胞である、請求項１乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
対象が生体細胞核を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
対象が、生体細胞ミトコンドリア、生体細胞の細胞質、生体細胞リソソーム、又は結合抗体を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
対象が、生体細胞核、生体細胞ミトコンドリア、生体細胞リソソーム、生体細胞の細胞質及び結合抗体の少なくとも２つを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
対象が結合抗体を含み、生体細胞を、マーカーを付与する段階の前に固定する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
方法が、第２の別のマーカーを複数の生体物質に付与する段階をさらに含み、第１の画像内の対象に関する空間定義を作成するのに、第２のマーカーをさらに使用する、請求項１乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
第２のマーカーが、生体細胞染色剤、生体細胞ミトコンドリア染色剤、生体細胞リソソーム染色剤、又は生体細胞の細胞質染色剤の１つである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
作成空間定義を使用して、第１の画像を分析することにより、複数の生体物質の特性を分析する段階をさらに含む、請求項１乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
画像形成装置を使用して生成された画像から、複数の生体物質を分析するための、画像分析方法であって、
ａ）複数の生体物質のマークアップ画像を得る段階であって、マークアップ画像は、複数の生体物質に付与されたマーカーが複数の物質内の対象を同定することが可能な第１の期間中に、記録されるものである段階と、
ｂ）複数の生体物質の第１の画像を得る段階であって、第１の画像は、マーカーが対象をそれほど同定することのできない第２の期間中に記録されるものである段階と、
ｃ）マークアップ画像から得られたデータを使用して、第１の画像に関する対象の空間定義を作成する段階と
を含む方法。
【請求項３４】
請求項１乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法を実施するために構成された、コンピュータソフトウェア。
【請求項３５】
請求項３４記載のコンピュータソフトウェアを格納するデータキャリア。
【請求項３６】
請求項１乃至請求項３３のいずれか１項の方法を実施するために構成された装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質を分析する方法に関し、詳細には生体細胞であるが、これに限定するものではない生体物質を分析する方法に関する。本発明はさらに、コンピュータソフトウェアと、そのような方法を実施するよう適合された装置とに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、薬物の発見及び開発では、また一般的な生物学的研究では、細胞ベースのアッセイを正確に実施するための方法及び装置を使用する。細胞ベースのアッセイは、化合物の生物活性を評価するのに有利に用いられる。
【０００３】
化合物の生体活性を評価する際、多数の化合物を迅速に且つ安価にスクリーニングする必要がある。この必要性は、様々な生化学標的、例えば受容体、酵素及び核酸に対して化合物の活性を試験することが必要な、医薬品業界で生じている。これらの化合物は、大きいライブラリーに収集され、場合によっては百万個を超える別個の化合物のライブラリーになる。化合物という用語の使用は、本明細書では、単純な有機及び無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸及びオリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、又は生物学的に関心が持たれる任意の化学構造を含むがこれに限定することのないよう、広く解釈されるものとする。
【０００４】
化合物のスクリーニングの分野では、細胞ベースのアッセイを、細胞集団に関して行う。
【０００５】
国際公開第９９／４７９６３号は、トランスロケーションアッセイについて記述しており、この場合、２つ以上の細胞種、例えば生体細胞核及び生体細胞転写因子タンパク質を蛍光標識する。このアッセイでは、核と転写因子種の両方を含む画像を取得する。画像は、細胞内での転写因子の移動を分析するために、これら２つの種の共存が決定できるように処理される。トランスロケーションアッセイの経過中、細胞核は核染色剤で蛍光標識される。
【０００６】
国際公開第０３／０３１６１２号は、細胞の細胞核の核酸、例えばＤＮＡを経時的に分析することによって、生体細胞周期の段階を決定する方法について記述する。細胞の画像を、アッセイの過程全体を通して記録し、これらの画像を使用して細胞核を分析するために、核を、核染色剤を使用して染色する。
【０００７】
細胞核酸、例えばＤＮＡの、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ヨウ化プロピジウム）やＤＲＡＱ５などの核染色剤による染色を用いて、細胞核の空間定義を特定し、そこから核マスクを形成する。細胞の性質は、核マスク領域内外での細胞の特性を測定することによって、決定することができる。しかし核染色剤は、核酸の構造を破壊する性質があり、したがって細胞の多数のサンプルは、生体活性の進行状況を経時的に調査する必要がある。何百ものサンプルを分析する場合、この核酸の劣化は、律速的になる可能性がある。
【０００８】
そのような核染色剤の構成分子は、核酸の塩基対間に挿入されることによって、核酸分子の分子に結合する。しかし、長時間にわたる実験の過程全体を通したこの挿入は、核酸に有毒であることがわかっている。この毒性により、核酸の構造が損傷を受け、遺伝暗号に変異をもたらす。これらの変異は、細胞の正しい機能を妨げ、生体細胞系に対する化合物の影響に関してその化合物をスクリーニングする場合、収集される結果データに望ましくない誤差が導入される。
【特許文献１】国際公開第９９／４７９６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３１６１２号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５４５２１２５号
【特許文献４】国際公開第０１５７２３７号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願第５７４１６５７号
【特許文献６】米国特許出願第６３０６６００号
【非特許文献１】Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ２３  ５６５−５７０（１９８４）
【非特許文献３】ＳＰＩＥ  ２００  ７３−７８（１９７９）
【非特許文献４】Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ及びＶｉｓｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １７１  １７−２６（１９９３）
【非特許文献５】Ｎａｙｌｏｒ  Ｌ．Ｈ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５８，７４９−７５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、核染色剤などのマーカーの使用に関する従来技術の問題に、対処することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、画像形成装置を使用して、複数の生体物質を分析する方法が提供され、その方法は、
ａ）複数の生体物質にマーカーを付与する段階であって、マーカーが、画像形成装置を用いて検出する際に複数の生体物質中の対象を同定できるものであり、マーカーの付与方法が、マーカーが第１の期間では対象を同定することができるが第２の期間では対象の同定能力が落ちるようになされる段階と、
ｂ）第１の期間中、対象の空間定義をマーカーから特定することが可能なマークアップ画像を、記録する段階と、
ｃ）第２の期間中、複数の生体物質の第１の画像を記録する段階と、
ｄ）マークアップ画像から得られたデータを使用して、第１の画像内に、対象に関する空間定義を作成する段階と
を含む。
【００１１】
第１の期間は、第２の期間の前にあることが好ましく、又は第１の期間は、第２の期間の後に続くことが好ましい。
【００１２】
生体物質は、生体細胞であることが好ましい。
【００１３】
対象は、生体細胞核を含むことが好ましい。
【００１４】
この方法は、作成された空間定義を使用して第１の画像を分析することにより、複数の生体物質の特性を分析する段階を、さらに含むことが好ましい。
【００１５】
マークアップ画像内で細胞核の空間定義を特定することが可能な、複数の生体細胞に付与されたマーカーによって、マーカーが細胞核を同定しにくい第１の画像内の細胞核に関しても、空間定義を作成することができる。したがって、マークアップ画像が記録される第１の期間の前又は後に続く、第２の期間中に記録される第１の画像により、第１の期間以外のいかなる期間中にも、生体細胞内にマーカーを存在させる必要がなくなる。その結果、複数の細胞の特性を分析し、例えば長時間にわたる化合物のスクリーニング分析に関してより正確で信頼性ある結果データを得ることが可能になる。
【００１６】
本発明の第２の態様では、画像形成装置を使用して生成された画像から、複数の生体物質を分析するための、画像分析方法が提供され、この方法は、
ａ）複数の生体物質からマークアップ画像を得る段階であって、マークアップ画像は、複数の生体物質に付与されたマーカーが、複数の生体物質中の対象を同定することが可能な第１の期間中に記録されたものである段階と、
ｂ）複数の生体物質の第１の画像を得る段階であって、第１の画像は、マーカーが対象をそれほど同定することのできない第２の期間中に記録されたものである段階と、
ｃ）マークアップ画像から得られたデータを使用して、第１の画像に関して対象の空間定義を作成する段階と
を含む。
【００１７】
本発明のこの態様は、特に、画像を記録する方法とは異なる時間及び／又は部位で実施することのできる、画像分析の方法に関する。
【００１８】
本発明のさらなる特徴及び利点は、添付図面を参照して単なる例示として挙げる以下の本発明の好ましい実施形態についての説明から、明らかにされよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、疾患治療用の薬理学的物質を同定するのに有用である。本発明は、１以上の発光マーカーを用いて生体応答を測定する、広範な種類の生物学的アッセイを実施するための、処理量の高い方法を提供する。そのようなアッセイは、化合物又は生物学的に問題となっている任意の分子、即ちコンビナトリアルライブラリーに見出されるような薬物候補を含むがこれに限定することのないものに関して実施することができ、したがって、そのような化合物を高処理量でスクリーニングすることが可能になる。
【００２０】
本発明の技法は、統計上有意な細胞集団のサンプルを構成するのに十分な数の細胞に関し、そのようなデータの取得が可能になるように、細胞又は細胞下レベルで十分迅速に、複数の生体物質、例えば個々の生体細胞に関するデータを取得するアッセイで、使用することができる。
【００２１】
これらのアッセイは、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．染色剤Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色剤及びＣｏｕｍａｒｉｎ染色剤を含むがこれらに限定することのない既知の蛍光体又は蛍光標識を含め、様々に異なるマーカーを利用することができる（Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ参照）。
【００２２】
光学的配置
図１は、本発明の実施形態の、線走査共焦点顕微鏡を含む画像形成装置を示す。この顕微鏡は、例えば光の範囲が３５０〜７５０ｎｍの電磁放射線源１００又は１１０、円柱レンズ１２０、第１のスリットマスク１３０、第１のリレーレンズ１４０、２色性ミラー１５０、対物レンズ１７０、サンプルウェル１８２の２次元アレイを含むマイクロタイタープレート１８０、チューブレンズ１９０、フィルタ２００、第２のスリットマスク２１０及び検出器２２０を含む。これらの要素は、図１の平面に垂直に延び且つマスク１３０、２１０内のスリットアパーチャ１３２、２１２を備える光軸ＯＡに沿って、配置されている。レンズ１４０、１７０及び１９０の焦点距離と、これらレンズ同士の間隔、並びにマスク１３０とレンズ１４０との間隔、対物レンズ１７０とマイクロタイタープレート１８０との間隔、レンズ１９０とマスク２１０との間隔は、共焦点顕微鏡が得られるようなものである。この実施形態で、ランプ１００又はレーザ１１０からの電磁放射線は、円柱レンズ１２０を使用することにより線状に集束される。この線の形状は、第１のスリットマスク１３０によって最適化される。スリットマスク１３０は、光学システムの像平面、即ち対象平面に共役な平面に示される。スリットマスク１３０のアパーチャ１３２によって形成された照明ストライプは、レンズ１４０、２色性ミラー１５０及び対物レンズ１７０によって、サンプルウェル１８２の２次元アレイを含むマイクロタイタープレート１８０上へと中継される。図示する便宜上、図１の光学要素を断面で示し、ウェルプレートを斜視図で示す。ウェルプレート１８０上への照明ラインの投影を、線１８４で示し、これもやはり図１の平面に垂直であると理解される。矢印Ａ及びＢで示すように、ウェルプレート１８０は、図示しない手段によって、アレイの次元に平行な２次元（Ｘ，Ｙ）内で移動させることができる。
【００２３】
代替の実施形態では、スリットマスク１３０が、光学システムのフーリエ平面内に在り、即ち対物レンズの後側焦平面（ＢＦＰ）１６０に共役な平面内に在る。この場合、アパーチャ１３２は、図の平面内に在り、レンズ１４０が、アパーチャ１３２によって形成された照明ストライプを、対物レンズ１７０の後側焦平面１６０上へと中継し、図１の平面に垂直な対象平面で、線１８４へと変換する。
【００２４】
追加の代替の実施形態では、スリットマスク１３０の全体を取り除く。この実施形態によれば、照明源はレーザ１１０であり、そこからの光は、対物レンズ１７０の後側焦平面１６０内に集束される。これは、図１に示すように、円柱レンズ１２０と球面レンズ１４０との組合せによって実現することができ、又は照明を、円柱レンズ１２０によって平面１６０内に直接集束させることができる。
【００２５】
サンプル領域の画像、例えばサンプルウェル１８２内の、複数の生体細胞のサンプルの画像は、照明ラインをサンプル内の平面上に投影し、そこからの蛍光放出を検出器２２０上で画像形成し、プレート１８０を、照明ラインに垂直な方向に且つ検出器２２０の読み取りと同期して移動させることによって得られる。図１に示す実施形態では、蛍光放出を対物レンズ１７０により収集し、２色性ビームスプリッタ１５０を通して投影し、無限補正対物レンズ１７０を有する共焦点画像形成システムに適切であるように、フィルタ２００及び第２のスリットマスク２１０を通してレンズ１９０により検出器２２０上で画像形成する。２色性ビームスプリッタ１５０及びフィルタ２００は、照明波長の光を優先的に阻止する。例示される検出器２２０は、カメラであり、１次元又は２次元のどちらでもよい。１次元検出器を使用する場合、スリットマスク２１０は不要である。照明、検出及び並進手順は、定められた領域の画像形成がなされるまで、継続する。機械的な動きは、サンプルが連続した速度で並進する場合、単純化される。連続的な動きは、カメラの読み取り時間が露光時間に比べて短い場合、最も有用である。好ましい実施形態では、カメラを連続的に読み取る。露光時間と読み取り時間とを組合せた期間中の、サンプルの変位ｄは、照明ラインＷの幅より大きくても小さくてもよく、例えば０．５Ｗ≦ｄ≦５Ｗである。マルチウェルプレートの全てのウェルは、同様の手法で画像形成することができる。
【００２６】
或いは顕微鏡は、主に光学システムの視野によって限定される、いくつかの隣接するウェル全体を横断する照明ラインが集束されるように、構成することができる。最後に、複数の顕微鏡を同時に使用することができる。
【００２７】
照明ストライプ１８４のサイズ及び形状は、対物レンズの後側焦平面１６０内の、フーリエ変換ストライプの幅及び長さによって決定される。例えば、線１８４の長さは、１６０内の線の幅によって決定され、逆に１８４の幅は、１６０の長さによって決定される。回折限界性能により、１６０での照明ストライプの長さは、対物レンズの背面アパーチャがアンダーフィルされるよう選択される。照明ストライプ１８４のサイズ及び形状は、円柱レンズ１２０の焦点距離と１２０でのビームサイズとの組合せによって、即ち対物レンズの収差及び対物レンズの視野によって課された制約内での、各次元での有効開口数によって制御できることが、当業者に明らかである。
【００２８】
照明ライン１８４の次元は、信号対雑音比を最適にするよう選択される。その結果、この次元はサンプルに依存的になる。アッセイに応じて、分解能は、回折制限された、即ち０．５μｍ未満と、約５μｍとの間で様々にすることができる。ビーム長は、対物レンズの視野によって決定することが好ましく、例えば０．５〜１．５ｍｍである。例えばＮｉｋｏｎ  ＥＬＷＤ、０．６ＮＡ、１０×対物レンズは、約０．７５ｍｍの視野を有する。この対物レンズによる、６３３ｎｍ放射線に関する回折限界分解能は、約０．６μｍであり、又は約１１００分解能要素である。
【００２９】
有効深さ分解能は、スリットマスク２１０のアパーチャ２１２の幅、又は１次元検出器の幅と、対物レンズ１７０及びレンズ１９０の組合せによって生成された画像倍率によって、主に決定される。共焦点顕微鏡の最良の深さ分解能は、１μｍに近付く。本願では、５〜１０μｍの深さ分解能が十分であり、又は有利でもあると考えられる。
【００３０】
例えば、生細胞などの問題となっているサンプルが、十分短い画像取得時間内で適切な信号対雑音比の画像を得るには不十分な回折限界体積で蛍光体を含有する場合、その回折限界体積を超える量を照明し、そこからの放出を収集することが有利である。同様の状況が、イオンチャネル開口などの一過性の事象に関するビデオ速度論研究の場合にも、大半を占める。実際にこれは、対物レンズの背面アパーチャをアンダーフィルすることによって実現され、即ち照明アパーチャの直径の増大に等しいものである。照明の有効開口数（「ＮＡ」）は、対物レンズのＮＡより小さい。しかし蛍光放出は、対物レンズの完全ＮＡで収集される。アパーチャ２１２の幅は、より大きい照明容積からの放出が検出されるよう、増大させなければならない。アパーチャの幅が、回折限界よりも２〜３倍大きい場合、幾何光学によって、検出容積要素のサイズに関する適切な近似式が与えられる。
【００３１】
横方向の幅：ａｄ＝ｄｄ／Ｍ、
軸方向の幅：ｚｄ＝√２ａｄ√ｔａｎα
但し、Ｍは倍率であり、ｄｄはアパーチャ２１２の幅であり、αは、対物レンズ１７０によって範囲が定められた半角である。照明アパーチャ１３２、又はアパーチャを持たない実施形態でそれと均等なもの及び検出アパーチャ２１２は、独立に制御可能であることが、本発明の重要な部分である。
【００３２】
多波長構成
多波長蛍光画像形成が可能な画像形成装置を使用する、別の実施形態は、ある特定のタイプのアッセイに好ましい。この方法では、同時に複数の異なるカラーチャネルで画像形成された、同じ領域に関して、画像データを作成することができる。
【００３３】
独立した波長又はカラーチャネルの数は、実施される特定のアッセイに応じて様々になる。一実施形態では、３つの照明波長を使用する。図２Ａ及び２Ｂは、３色線走査共焦点画像形成システムの光線経路を、上面図及び側面図でそれぞれ示している。一般に、このシステムは、いくつかの電磁放射線源Ｓｎ、コリメートレンズＬｎ及びミラーＭｎであって、第１の空間フィルタＳＦ１で、円柱レンズＣＬにより細長いビームに集束されたコリメートビームを生成するためのもの、第１の空間フィルタＳＦ１と第２の空間フィルタＳＦ２との間の共焦点顕微鏡、画像形成レンズＩＬ、ビームスプリッタＤＭ１及びＤＭ２及びサンプルからの蛍光放射線の種々の波長成分を分離し検出するための検出器Ｄｎを含む。空間フィルタＳＦ及びＳＦ１及びＳＦ２は、スリットマスクであることが好ましい。
【００３４】
特に、図２Ａは、カラーチャネルλ１、λ２及びλ３用の線源Ｓ１、Ｓ２及びＳ３と、それぞれの線源からの光をコリメートするレンズＬ１、Ｌ２及びＬ３を示す。レンズＬ１、Ｌ２及びＬ３は、システム内のその他のレンズの色度が全て補償されるよう調節することが好ましい。ミラーＭ１、Ｍ２及びＭ３は、線源Ｓｎからの照明カラーチャネルを合わせるのに使用する。ミラーＭ２及びＭ１は、部分的に透過性があり、部分的に反射性があり、大部分が２色性である。例えばＭ２は、優先的にλ３を透過させ、優先的にλ２を反射すべきである。したがってλ３は、λ２よりも大きいことが好ましい。
【００３５】
共焦点モードでの顕微鏡の操作では、線源Ｓｎからの合わせた励起ビームを、対象平面ＯＰ内で、「線」又は高度な偏心楕円状に集束させる必要がある。図１に関して既に論じたように、これを実現するには様々な構成を使用することができる。図２に示す実施形態では、合わせた照明ビームを、円柱レンズＣＬによって、空間フィルタＳＦ１のスリットに一致した細長い楕円に集束させる。図２Ａ及び２Ｂに示すように、スリットマスクＳＦ１は、システムの像平面内に在るが、これは、照明の光の伝播に対して垂直に位置合わせされ、その長軸は図２Ａのページの平面内に在るものである。レンズＴＬ及びＯＬは、ＳＦ１を含む平面から対象平面ＯＰへと、照明ラインを中継する。反射鏡、ＴＭは、便宜上のものである。別の実施形態では、ＤＭ３がＴＬとＯＬの間にあり、ＣＬが、照明の光をＢＦＰに直接集束させる。その他の実施形態は、当業者に明らかにされよう。
【００３６】
図２Ｂを参照すると、サンプルによって放出され且つ対物レンズＯＬによって収集された光は、チューブレンズＴＬによって、空間フィルタＳＦ２上で画像形成される。ＳＦ２は、ページの平面に対して垂直に延びるように並べられた、スリットであることが好ましい。したがって、フィルタＳＦ２を通過する光は、実質的に照明のラインである。ＳＦ２は、像主平面又はそれに共役な任意の平面内に、配置することができる。ＤＭ３は、部分的に反射性があり、部分的に透過性があり、好ましくは「多色性」である。ある特定の波長帯を優先的に反射し、且つその他の波長帯を優先的に透過させる、多波長「２色性」ミラー又は「多色性」ミラーを得ることができる。
【００３７】
この場合、δλ１は、λ１によって励起された蛍光放出となるよう定められる。これは一般に、λ１よりも若干長い波長の分布になる。δλ２及びδλ３は、同様に定められる。ＤＭ３はλｎを優先的に反射し、δλｎ、ｎ＝１、２、３を優先的に透過させる。ＳＦ２を透過した光は、像主平面に共役な平面内に在る検出器上で、画像形成される。図２Ａでは、空間フィルタＳＦ２の画像が、レンズＩＬによって、３つの全ての検出器Ｄｎ上に生成される。この実施形態は、それぞれの検出器によって作成された画像同士をほぼ完全に位置合わせすることが必要な用途において、好ましい。別の実施形態では、個々のレンズＩＬｎが検出器に関連付けられており、レンズの対ＩＬ及びＩＬｎが、空間フィルタＳＦ２の画像をそれぞれの検出器Ｄｎ上へと中継するように働く。光は、ミラーＤＭ１及びＤＭ２によって、複数の検出器に分割される。ミラーは、部分的に透過性があり、部分的に反射性があり、好ましくは２色性である。ＤＭ１は、δλ１を優先的に反射し、δλ２及びδλ３を優先的に透過させる。ブロックフィルタ、ＢＦ１は、δλ１を優先的に透過させて、存在するその他全ての波長を効果的に阻止する。ＤＭ２は、δλ２を優先的に反射し、δλ３を優先的に透過させる。ブロックフィルタ、ＢＦ２及びＢＦ３は、それぞれδλ２及びδλ３を優先的に透過させ、存在するその他全ての波長を効果的に阻止する。
【００３８】
走査ミラー構成
本発明のいくつかの実施形態では、ビデオ速度で画像をフレーム処理することによって、迅速なデータ取得が行われる。ビデオ速度画像形成によって、１秒当たり最高３０フレーム又は６０フレームも得ることは可能になる。本発明の使用では、３０Ｈｚ程度の大きさのフレーム速度を意味するものとする。好ましい実施形態で、ビデオ速度画像形成は、サンプル平面の１次元方向に照明し、それに垂直な方向で照明ビームを走査して、照明とサンプルとの相対的な並進が行われるようにすることにより、実現される。走査ステージは、一般に重量のあるものである。その結果、十分迅速に動かすことができない。
【００３９】
図３は、走査ミラーＳＭを利用する、本発明の実施形態を示す。このミラーは、対物レンズの後側焦平面（ＢＦＰ）に共役な平面内に配置することが有利であり：ＢＦＰ（又はそれに共役な平面）内での回転によって、対象平面（ＯＰ）及びその結合平面内での並進が行われる。ＳＭの完全走査範囲は、レンズＲＬ１及びＲＬ２の焦点距離の典型的な値に対して、２〜３度しか必要としない。図３に示すように、このレンズ対は、倍率１でＳＭ上にＢＦＰの画像形成を行うが、様々な倍率を使用できることが有利である。画像取得速度に対する制限因子は、カメラ読み取り速度及びシグナル長である。上述の画像形成モードでは、カメラ読み取り速度、例えば１ＭＨｚで、データを連続的に取得することができる。走査ミラーによって、データを一方向で取得することが好ましい。データを連続的に取得することが可能な、理想化された走査運動は、鋸歯状である。実際に、転回及び復帰の走査時間を合わせたものは、走査時間の約１／３〜２／３を構成することになる。不感時間５０％、ミラーの振動周波数５０Ｈｚ及び画素取得測度１ＭＨｚと仮定すると、１秒当たり５０フレームで、１フレーム当たり約１００００個の画素が取得されることになるが、これは、フレームごとに、細胞などの個々の対象を特定し追跡するのに十分なものである。しかし、１画像当たり１０４個の画素は、上記にて一般に考えられる値の１０２分の１である。用途に応じて、高分解能で相対的に小さい画像を取得することが有利であり、例えば画素化０．５μｍ×０．５μｍで５０μｍ×５０μｍであり、又はより低い分解能で相対的に大きい画像を取得することが有利であり、例えば画素化２μｍで２００μｍ×２００μｍである。
【００４０】
オートフォーカス
本発明の好ましい実施形態で、サンプルは、画像形成システムの対象平面内に在る。したがって、そのシステムの対象平面内で、画像形成システムの視野内にサンプル部分を維持する、オートフォーカス機構が使用される。平面度の精度は、このシステムの被写界深度によって決定される。好ましい実施形態で、被写界深度は約１０μｍであり、視野は約１ｍｍ２である。
【００４１】
オートフォーカスシステムは、ごくわずかな遅延により動作し、即ち応答時間は、画像取得時間に比べて短く、例えば０．０１〜０．１秒である。さらに、オートフォーカス光源は、照明光源及びサンプル特性とは無関係である。他の利点の中でも、とりわけこの構成は、画像形成システムの光軸に沿ってサンプルキャリアを位置決めすることが可能であり、その結果、対象平面の位置決めとは無関係に決定されるようになる。
【００４２】
単一ビームオートフォーカスの実施形態を、図２Ｃ及び３Ｃに示すが、これらの図には、波長λ４の別個の光源Ｓ４及び検出器Ｄ４が示されている。波長λ４は、サンプルの蛍光とは異なることが必要であり、好ましくは、サンプル中に認められるほどの蛍光を励起できない波長である。したがって波長λ４は、好ましくは近赤外領域内にあり、例えば８００〜１０００ｎｍである。部分的に透過性があり、部分的に反射性のあるミラーＤＭ４は、好ましくは２色性であり、λ４を反射し、λｎ及びδλｎ、ｎ＝１、２、３を透過させる。本願に適切な、光学をベースにしたオートフォーカス機構は、知られている。例えば、サーボ制御に適切な、位置誤差シグナルを生成するための、アスチグマチックレンズをベースにしたシステムが、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ２３  ５６５−５７０（１９８４）に開示されている。「スキュービーム」を利用した焦点誤差検出システムは、ＳＰＩＥ  ２００  ７３−７８（１９７９）に開示されている。後者の手法は、図２Ｃ及び３Ｃに従って容易に実施されるが、この場合、Ｄ４はスプリット検出器である。
【００４３】
しかし、ウェル底部に存在するサンプルを持ったマイクロタイタープレートと共に使用するには、ウェル間を移動するように、サーボループを破壊しなければならない。この結果、照明を別のウェルに移動させるたびに、焦点を定め直す必要があるので、かなりの時間遅延が生ずる可能性がある。
【００４４】
サンプル平面及び対象平面の相対的な位置の、連続閉ループ制御が、図４に示す本発明の好ましい実施形態で提供される。このシステムは、電磁放射線の、２つの独立したビームを利用する。その一方は、Ｓ５から生ずるものであり、連続面、例えばマイクロタイタープレートの底面上で集束する。もう１つは、Ｓ４から生ずるものであり、不連続面、例えばマイクロタイタープレートのウェル底面上で集束する。一実施形態で、Ｓ４及びＳ５から生ずるビームは、それぞれ波長λ４及びλ５を有する。λ４は、Ｌ４でコリメートされ、虹彩絞りＩ４で絞られ、対物レンズＯＬによって不連続面上に集束される。λ５は、Ｌ５でコリメートされ、虹彩絞りＩ５で絞られ、対物レンズＯＬと共役なレンズＣＦＬによって、連続面上に集束される。反射光は、レンズＩＬ４及びＩＬ５によって、それぞれ検出器Ｄ４及びＤ５上に集束する。部分的に透過性であり、部分的に反射性のあるミラーＤＭ４は、好ましくは２色性であり、λ４及びλ５を反射し、λｎ及びδλｎ、ｎ＝１、２、３を透過させる。ミラーＭ４、Ｍ５及びＭ６は、部分的に透過性があり、部分的に反射性がある。λ４及びλ５が全く異なる場合、Ｍ６は、好ましくは２色性である。
【００４５】
サンプルがマイクロタイタープレート内に在る実施形態によれば、λ４は、ウェル底面に集束する。対象平面は、様々な距離だけ、ウェル底面からずらすことができる。これは、Ｌ４を調節することによって実現され、或いはサーボ制御ループ内でのオフセット調節によって、実現される。記述する便宜上、λ４は、対象平面に集束すると仮定する。
【００４６】
オートフォーカスシステムの動作は、以下の通りである。サンプルウェルの底面が、対物レンズＯＬの焦平面内にない場合、検出器Ｄ４は誤差シグナルを生成し、これを、スイッチＳＷを通してＺ制御器に供給する。Ｚ制御器は、マイクロタイタープレートを対物レンズに向けて、又は対物レンズから離れた方向に移動させるため、モータ（図示せず）を制御する。或いはＺ制御器は、対物レンズを動かすことができる。マイクロタイタープレートの底面ＰＢが、レンズＣＦＬと対物レンズＯＬとを組合せた焦平面にない場合、検出器Ｄ５は誤差シグナルを生成し、これを、スイッチＳＷを通してＺ制御器に加える。ＸＹ制御器は、レンズＯＬの対象平面ＯＰ内でマイクロタイタープレートを動かすために、モータ（図示せず）を制御する。
【００４７】
示されるように、走査の全体は、コンピュータの制御下にある。例示的な走査は、以下の通りである：特定のウェルの画像が完成すると、コンピュータはＳＷを操作して、サーボ機構の制御を、Ｄ４により生成された誤差シグナルからＤ５により生成された誤差シグナルへと切り換え；次いでコンピュータは、プレートが次のウェルに移動するように、ＸＹ制御器の方向を定め、その後、サーボを元のＤ４に切り換える。
【００４８】
プレート底面からのシグナルを利用する「粗動」集束機構を使用して、プレート底面の厚さのウェルごとの変動以内に、サンプル平面の位置を維持し、それによって、「精密」機構で探索する必要のある範囲が最小限になるようにする。例えば虹彩絞りＩ５の直径が２ｍｍであり、ＩＬ５が１００ｍｍである場合、検出器上の画像サイズは約１００μｍになる。同様に、虹彩絞りＩ４の直径が０．５ｍｍであり、ＩＬ４が１００ｍｍである場合、検出器上の画像サイズは約４００μｍになる。後者は、「粗動」焦点として機能するように、それほど感度が高くならないよう選択する。
【００４９】
上述の単一ビームの実施形態と同様に、波長λ４及びλ５は、サンプルの蛍光とは全く異なる必要があり、サンプル内に認められる蛍光を励起することができない波長であることが好ましい。したがってλ４及びλ５は、好ましくは８００〜１０００ｎｍなどの近赤外領域内にある。さらに、２つの波長は異なることが好ましく、例えばλ４＝８３０ｎｍ、λ５＝９８０ｎｍである。
【００５０】
２ビームオートフォーカスの代替の実施形態では、λ４＝λ５及び２つのビームは、同じ線源から生ずるものでよい。好ましくは、２つのビームが互いに垂直に偏光し、Ｍ６は、偏光ビームスプリッタである。
【００５１】
擬似閉ループ制御は、以下の通りに動作する単一ビームオートフォーカスの、好ましい実施形態で提供される。走査終了時、コンピュータでＳＷを作動させて、サンプルアンドホールド機器に制御を切り換え、そこでＺ制御器の出力を一定レベルに維持しつつ、プレートを次のウェル上に移動させ、その後、ＳＷを元のＤ４へと切り換える。
【００５２】
検出器
対象平面に共役な平面内に、マニホールド、独立した検出要素を有する検出器を、使用する。上記論じたように、迅速な画像形成を必要とする用途では、主に線照明が有利である。しかし点照明に対して、線照明の平行性に固有の潜在的な速度の増大は、画像形成システムが、照明ラインに沿ってサンプルの各ポイントから放出された光を同時に検出可能な場合にしか実現されない。
【００５３】
上記従来技術の画像形成システムの出力で、電荷結合素子（ＣＣＤ）、又はその他のカメラを配置することが可能である（Ｗｈｉｔｅ他の米国特許第５４５２１２５号、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ及びＶｉｓｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １７１  １７−２６（１９９３））。得られた装置には、本発明に比べて３つの大きな欠点がある。１つは、２次元検出器上で画像を再走査する必要があることであり、これは、不必要な複雑さを装置にもたらすことになる。別の欠点は、典型的な場合にカメラを構成する１０００画素×１０００画素アレイの全体にわたり、十分な品質を有する完全２次元検出器を必要とすることである。第３の欠点は、２次元機器から全画像を読み取るのに、追加の時間が必要であることである。
【００５４】
これらの欠点を回避して、高感度及び低ノイズ検出の制約内で画像形成速度を最適化するだけではなく、処理量も最適化するには、連続読み取りラインカメラを使用し、好ましい実施形態では、長方形のＣＣＤをラインカメラとして使用する。どちらの実施形態でも、画像内の線同士、又は画像同士の間に不感時間はない。追加の利点は、以下に論じるステージ走査の実施形態で、より大きい有効視野が実現可能であることである。
【００５５】
検出器に必要とされる性質は、以下の好ましい実施形態を考慮することによって、さらに明らかにすることができる。対物レンズの分解能限界は＜１μｍであり、典型的な場合は約０．５μｍであり、検出器は、約１０００個の独立した要素のアレイを含む。分解能、視野（ＦＯＶ）及び画像取得測度は、独立した変数ではなく、これらの性能パラメータ同士で妥協する必要がある。一般に、光学システムの倍率は、分解能を犠牲にすることなくできる限り大きなＦＯＶで画像形成されるよう、設定する。例えば、約１ｍｍの視野は、１μｍの画素化で、１０００要素アレイ上に画像形成することができる。検出要素が２０μｍ平方の場合、システムの倍率は、２０×に設定されることになる。これは、１μｍの分解能をもたらすものではないことに留意されたい。画素化は、分解能と均等ではない。例えば、対物レンズの固有の分解能限界が０．５μｍであり、対象平面内の各０．５μｍ×０．５μｍ領域を画素上にマッピングする場合、得られるデジタル画像の真の分解能は、０．５μｍではない。真の０．５μｍ分解能を実現するには、画素化を、対象平面内の約０．２μｍ×０．２μｍの領域に対応させる必要があると考えられる。１つの好ましい実施形態では、画像形成システムの倍率を、光学部品の真の分解能が実現されるように設定する。
【００５６】
現在、本発明の用途に十分な読み出し速度を有して、検出効率が最高でありノイズ検出が最低である機器は、ＣＣＤカメラである。図５には、ｍ×ｎアレイの検出器要素を有し、但しｍがｍよりもかなり小さい長方形ＣＣＤカメラが示されている。蛍光放出の画像は、好ましくは読み取りレジスタに近接している１行をカバーする。これは、移動時間を最小限に抑え、照明された行と読み取りレジスタとの間の行からのシグナルに、擬似カウントが蓄積されないようにする。
【００５７】
原則として、図５に示すように、ＣＣＤカメラ上のスリットＳＦ２の画像の高さが１つの画素になるように、光学システムの倍率を設定することができる。実際に、照明ラインとカメラの行方向の軸との完全な位置合わせを維持することは困難であり、図２及び３で例示した多波長実施形態で、３つのカメラと照明との位置合わせを維持することは、さらに困難である。カメラの各列において、いくつかの検出器要素、例えば２〜５個の検出器要素を一緒にまとめることによって、読み取りノイズ又は読み取り時間の不利益を最小限に抑えながら、位置合わせの条件を緩和することができる。
【００５８】
図２及び３の可変幅検出空間フィルタＳＦ２及び図１の２１０と併せて、１以上の長方形ＣＣＤカメラを検出器として有するものであって、それぞれが対象平面に共役な平面内に配置されたものである、好ましい実施形態の追加の利点は、以下の記述により明らかにされる。上記論じたように、本発明の一実施形態では、検出空間フィルタを省略し、ラインカメラを、検出空間フィルタと検出器とを組み合わせたものとして使用する。しかし、やはり上記論じたように、可変幅検出空間フィルタによって、検出容積の最適化が可能になり、その結果、サンプル依存性の信号対騒音比が最適化されるようになる。以下の好ましい実施形態は、ラインカメラの利点を維持し、即ち速度及び様々な検出容積の柔軟性を維持する。倍率は、カメラの１つの行の上に、高さｈの回折限界ラインが画像形成されるように、設定する。検出空間フィルタｄの幅は、好ましくはｈ≦ｄ≦１０ｈの間で可変である。カメラの照明された列における検出器は、読み取りの前にまとめられるが、これは、露光及び読み取り時間に比べて無視できるような時間しか必要としない操作である。
【００５９】
１つの好ましい実施形態で、カメラはＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＮＴＥ／ＣＣＤ−１３４０／１００−ＥＭＤである。好ましい実施形態での読み取り速度は、読み取りノイズが２〜３個の電子のときに、１ＭＨｚである。画素フォーマットは１３４０×１００であり、カメラは、問題となっている領域から大部分の行（８０％）が離れてシフトするように、ワイヤで留められ、それによってカメラを効率的に１３４０×２０にすることができる。
【００６０】
連続読み取りカメラの上記利点の他に、即ち順次行われる取得と取得との間に不感時間がないことの他、追加の利点とは、サンプルの程度によってのみ制限される長さを持った長方形画像の取得が、可能になることである。その長さは、カメラの幅の小さい方と、線照明の程度とによって決定される。好ましい実施形態では、サンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルであって、その直径が７ｍｍである底面に置く。ストリップ１μｍ×１ｍｍを照射し、照射された領域から放出された放射線を、検出器上に画像形成する。一連の光学部品は、視野が約１ｍｍ２になるよう設計される。本発明によれば、ウェル底面の画像は、１×７ｍｍの視野全体にわたって１μｍの画素化で生成することができる。
【００６１】
環境制御
本発明の実施形態では、アッセイを生細胞で実施する。生細胞のアッセイは、適正に実施するために、生理条件に適切に近い状態をしばしば必要とする。重要なパラメータの中には、温度がある。特にサンプル温度を３７℃に維持するため、温度を上下させる手段を組み込むことが望ましい。別の実施形態では、生細胞の生存可能性を維持するために、相対湿度及び／又はＣＯ２及び／又はＯ２を制御することが必要である。さらに、蒸発が最小限に抑えられるよう湿度を制御することは、サンプルの体積が小さい場合に重要である。
【００６２】
ＬＣＩシステムに適合した、高温の、好ましくは３７℃のマイクロタイタープレートを提供する３つの実施形態は、次の通りである。
【００６３】
画像形成システムは、耐光性エンクロージャ内に在ることが好ましい。第１の実施形態では、エンクロージャの内部全体を所望の温度に維持することによって、サンプルプレートが所望の温度に維持される。しかし３７℃では、高い湿度が目的を持って維持されない限り、蒸発冷却によってサンプル体積が減少し、アッセイの継続時間を制限することになる。
【００６４】
第２の実施形態は、マイクロウェルプレート用に、加熱されたカバーを提供し、それによって、このプレートを静止カバーの下で動かすことが可能になる。このカバーは、顕微鏡の光軸に一致した単一の開口を、ウェル上方に有する。この開口によって、アクティブなウェルに定量吐出しつつ、加熱を維持することが可能になり、またプレートの残りの部分に限定された循環を維持することが可能になる。加熱されたカバープレートとマイクロウェルプレートとの間の、約０．５ｍｍのスペースによって、マイクロウェルプレートを自由に動かすことが可能になり、蒸発が最小限に抑えられる。照会されるウェルの内容物は、ディスペンサ開口を経て多くても２〜３秒間だけ周囲条件に曝されるので、内容物は、測定中に著しい温度変化を被らない。
【００６５】
第３の実施形態では、薄く、加熱されたサファイヤの窓を、プレート底面のエンクロージャとして使用する。ウェルセパレータに沿った抵抗加熱器のパターンは、窓の温度を所望のレベルに維持する。
【００６６】
追加の実施形態では、３つの開示された方法を、様々に組み合わせることができる。
【００６７】
自動スクリーニングアッセイで用いられる、本発明の、追加の好ましい実施形態では、画像形成システムを、Ｚｙｍａｒｋ  Ｔｗｉｓｔｅｒなどのプレート取扱いロボットと一体化する。
【００６８】
データ処理システム
図６は、本発明により構成されたシステムの、データ処理構成要素の概略図を示す。このシステムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システムをベースとしたもので、検出器Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、スイッチＳＷ、制御ユニット４０１、画像データ記憶装置４０２及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイス４０４を含む、上述の共焦点顕微鏡４００を含む。関連するコンピュータターミナル４０５は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）４０８、メモリ４１０、ハードディスクドライブ４１２などのデータ記憶装置及びＩ／Ｏデバイス４０６であって、コンピュータとＭＤＰＵとの相互接続、さらにスクリーンＩ／Ｏデバイス４３０を介したコンピュータとスクリーン４２８の表示素子４３２との相互接続をそれぞれ容易にするものを含む。オペレーティングシステムプログラム４１４は、ハードディスクドライブ４１２に記憶され、コンピュータターミナル４０５の低レベルのオペレーションを、既知の手法で制御する。プログラムファイル及びデータ４２０も、ハードディスクドライブ４１２に記憶され、既知の方法で、関連するデバイスを介してオペレータへの出力を制御し、ハードディスクドライブに記憶させたデータを出力する。関連するデバイスには、スクリーン４２８の要素としてのディスプレイ４３２、ポインティングデバイス（図示せず）及びキーボード（図示せず）が含まれ、これらは、別のＩ／Ｏデバイス（図示せず）を介してオペレータから入力を受信し、またオペレータに情報を出力するものである。ハードドライブ４１２に記憶されたプログラムファイル４２０には、画像処置及び分析アプリケーション４１６と、アッセイ制御アプリケーション４１８と、顕微鏡４００から受信された画像データ及びデータ処理中に生成された出力ファイルを記憶するためのデータベース４２２とが含まれる。画像処理及び分析アプリケーション４１６は、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ製のＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ（商標）など、既知の画像処理及び分析ソフトウェアパッケージを、注文に合わせて作成したものでよい。
【００６９】
共焦点顕微鏡４００を使用するアッセイの性能は、制御アプリケーション４１８を使用して制御され、画像データが取得される。少なくとも１つの検出器、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３によって、マイクロタイタープレートの少なくとも１つのウェルに関する画像データを取得し終えた後、その画像データをコンピュータ４０５に転送し、コンピュータターミナルのハードドライブ４１２のデータベース４２２に記憶させ、その時点で、画像からのデータを、画像処理及び分析アプリケーション４１６を使用して分析することができる。
【００７０】
画像の記録及び分析
図７は、複数の生体物質の画像と、複数の生体物質中の対象の、何組かの空間定義との、概略図を示す。
【００７１】
本発明のこの第１の実施形態で、複数の生体物質は、第１の細胞５００と、第２の異なる細胞５０１とを含む、複数の生体細胞である。各細胞内には、細胞核である対象が在る。第１の核５０２は、第１の細胞５００内に含有され、第２の異なる核５０３は、第２の細胞５０１内に含有される。複数の細胞にマーカーを与える前に、例えば核マーカーを付与する前に、１つのサンプルウェル１８２内の複数の細胞サンプルの、先行する一連の画像を、既に述べた多波長構成の線走査共焦点画像形成システムを使用して、記録する。この実施形態では、２つの独立した組の波長が、共焦点画像形成システムで使用され、したがって、２つの波長λ１、λ２で動作する２つの線源Ｓ１、Ｓ２；２個のレンズＬ１、Ｌ２；２個のミラーＭ１、Ｍ２；２個のブロックフィルタＢＦ１、ＢＦ２；及び２個の検出器Ｄ１、Ｄ２だけを使用する。先行する画像は、第１の線源Ｓ１、第１のレンズＬ１、第１のミラーＭ１、第１のブロックフィルタＢＦ１及び第１の検出器Ｄ１を使用して記録する。蛍光タンパク質励起が生ずる波長λ１及び得られた第１の蛍光放出が生ずる波長δλ１を含む、第１のカラーチャネルは、生体活性データを生成するために、このチャネルを使用して記録された画像を分析することになるので、さらに生体活性カラーチャネルと呼ばれる。
【００７２】
第１のブロックフィルタＢＦ１は、第１の蛍光放出の波長δλ１を選択的に通す、第１のバンドパスフィルタである。この実施形態では、生体活性カラーチャネルが緑色カラーチャネルであり、蛍光タンパク質励起放射線によって励起されたときに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって放出される蛍光放射線を検出する。第１のフィルタは、約４８８ｎｍの第１の放出波長δλ１で、最大の透過率を有する。さらに第１のフィルタは、約５０ｎｍの半値全幅透過率（ＦＷＨＭ）を有するが、これは約７４０〜５９０ｎｍの間の波長を選択したことに対応する（即ち約５６５ｎｍ±２５ｎｍ）。
【００７３】
マーカーを添加する前に記録された、一連の先行画像は、第４の先行期間ｔＮ−３中に記録された、第３の先行画像５０４と、第３の異なる期間ｔＮ−２中に、第３の先行画像の後に記録された、第２の異なる先行画像５０６と、第２の異なる期間ｔＮ−１中に、第２の先行画像の後に記録された、第１の異なる先行画像５０８とを含む。
【００７４】
複数の生体細胞に関する別の画像は、生体活性カラーチャネルを使用して記録する。この別の画像は、マーカーを添加した後の期間ｔＮ中に記録された、後続画像５１０である。
【００７５】
第１の期間ｔＮ中に、マークアップ画像５１２を、第２の線源Ｓ２、第２のレンズＬ２、第２のミラーＭ２、第１のブロックフィルタＢＦ２及び第２の検出器Ｄ２を使用して記録する。蛍光マーカー励起が生ずる波長λ２及び得られた第２の蛍光放出が生ずる波長δλ２を含む、第２のカラーチャネルは、画像中で核マーカーが検出される部位に関連した空間定義を生成するために、このチャネルを使用して記録された画像を分析することになるので、さらに核マーカーカラーチャネルと呼ばれる。
【００７６】
核染色剤がＨｏｅｃｈｓｔタイプのものであるとき、核マーカー励起放射線は、約３６４ｎｍの波長を有する。Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色剤の場合、第２のブロックフィルタＢＦ２は、第２の蛍光放出の波長δλ２を選択的に通す、バンドパスフィルタである。第２のフィルタは、約４５０ｎｍの第１の放出波長δλ２で、最大の透過率を有する。さらにフィルタは、約２５ｎｍの半値全幅透過率（ＦＷＨＭ）を有し、これは約４３７．５〜４６２．５ｎｍの間の波長を選択したことに対応する（即ち約４５０ｎｍ±１２．５ｎｍ）。
【００７７】
核染色剤がＤＲＡＱ５タイプのものであるとき、核マーカー励起チャネルは、約６３３ｎｍの波長を有する。ＤＲＡＱ５核染色剤の場合、第２のブロックフィルタＢＦ２は、第２の蛍光放出の波長δλ２を選択するための、バンドパスフィルタである。第２の放出波長δλ２の最大透過率で、第２のバンドパスフィルタは、約６９５ｎｍの波長を選択する。さらにフィルタは、約５５ｎｍの半値全幅透過率（ＦＷＨＭ）を有し、これは約６６７．５〜７２２．５ｎｍの間の波長を選択したことに対応する（即ち約６９５ｎｍ±２７．５ｎｍ）。
【００７８】
マークアップ画像５１２から、データ処理システムは、閾値を超える強度を有することを利用して核マーカーが存在する画素を特定する閾値処理を使用して、第１及び第２の核５０２、５０３を含む細胞核を同定することが可能である。次に核は、上述のような、所与のサイズの閾値処理済み画素の群の形で同定される。細胞核のこの同定によって、核の複数の空間定義は、第１の核５０２の第１の空間定義５１４と、第２の核５０３の第２の異なる空間定義５１６とを含むマークアップ画像５１２から検出される。空間定義は、例えば画素マップの形をとる空間の広さと、例えば核の重心点の画像画素アドレスの形をとる位置データとの両方を含む。
【００７９】
マークアップ画像５１２の空間定義の実質的に全てを含み、且つ第１及び第２の空間定義５１４、５１６を含む、後続組の空間定義５１８は、第１の期間ｔＮ中に構成される。マークアップ画像５１２は、第１の期間ｔＮ中に記録されるが、これは、マークアップ画像５１２からの空間定義が、後続画像５１０中の第１の核５０２及び第２の核５０３を含む複数の細胞核を空間的に画定するものと想定することができるように、構成される。
【００８０】
作成空間定義の、第１の先行の組５２４は、第２の期間ｔＮ−１中に構成され、また核マーカーが細胞核をそれほど同定することのできない第１の先行画像５０８内の核に関して作成された複数の空間定義を含み、これには、第１の核５０２に対応する、第１の作成空間定義５２０と、第２の核５０３に対応する、第２の異なる作成空間定義５２２とが含まれる。同様に、作成空間定義の、第２の先行する組５２６及び第３の先行する組５２８が、それぞれ期間ｔＮ−２及び期間ｔＮ−３中に構成される。
【００８１】
図８は、複数の生体細胞の核を取り囲む空間を、概略的に示す。
【００８２】
この実施形態で、それぞれの核を取り囲む空間は、ボロノイ領域である。第１のボロノイ重心点６３２の周りの第１のボロノイ領域６３０は、少なくとも１つの、別の異なる近接したボロノイ領域に隣接して存在し、例えば、第２の異なるボロノイ重心点６３４の周りの、第２の異なる近接したボロノイ領域６３３に隣接して存在する。第１のボロノイ領域６３０は、第２のボロノイ領域６３３を含めた少なくとも１つの、別の異なる近接ボロノイ領域から、境界６３５によって隔てられている。境界６３５は、第１のボロノイ重心点６３２と、少なくとも１つの別の、異なる近接ボロノイ重心点との間で、実質的に等しい距離だけ離れて存在する。ボロノイ領域は、細胞核の種々のボロノイ重心点それぞれに関して決定され、得られた複数のボロノイ領域が、ボロノイダイアグラム６３６を形成する。種々のボロノイ重心点のそれぞれは、１つの別々の細胞核の重心点である。図８は、後続画像５１０内の複数の核に関するボロノイダイアグラムを直接表すのではなく、上述の第１の重心点及び第２の重心点がそれぞれ第１及び第２のボロノイ重心点６３２、６３４であることを説明する目的で示したものと解釈すべきである。
【００８３】
図９は、本発明によって、細胞核に関する空間定義を作成するために、複数の生体細胞を分析する方法の一実施形態を、流れ図として示す。
【００８４】
第１の段階７３８では、第１の先行画像５０８を含む、生体細胞の一連の先行画像を、逐次記録する。この後、核マーカーを複数の細胞に添加し（７４０）、その後、共焦点画像形成システムの第１のカラーチャネルλ１を使用して、複数の細胞の別の画像を記録する（７４２）。共焦点画像形成システムの核マーカーチャネルλ２を使用して、実質的に第１の期間ｔＮ中、マークアップ画像５１２を記録する（７４４）。
【００８５】
後続組の空間定義５１８は、後続画像５１０からデータを得るのに使用する。得られたデータは、細胞核のそれぞれに関連した組ｉの、１以上の特性の少なくとも１つの値を含む。この実施形態で、各値は、組ｉでＫ特性を有するベクトルＺＮｘである。第１の核ベクトルＺＮ１は、第１の空間定義５１４を後続画像５１０に与え、第１の核５０２に関する後続画像５１０内の空間定義によって特定された領域に加えられる特性を計算することにより、後続画像５１０から得られる（７４６）。この実施形態で、組ｉの特性の数値Ｋは２であり、この特性は、平均強度及び標準偏差である。次いで第１の核５０２の組ｉに関し、計算された特性を使用して、第１の核ベクトルＺＮ１を構成する。
【００８６】
同様の手法で、第２の空間定義５１６を後続画像５１０に加え、それによって、第２の核５０３に関する後続画像５１０の領域の、組ｉで計算された特性を使用して、第２の核ベクトルＺＮ２が得られるようにする（７４６）。
【００８７】
同様に、後続画像５１０内の複数の細胞核の核を空間的に画定する、空間定義５１８の組の各空間定義ごとの核ベクトルＺＮｘが、得られる。それぞれの核ベクトルＺＮｘは、複数の核の１つに対応した後続画像５１０の領域の組ｉ内の特性を使用して、得られる。
【００８８】
次に、図８に示すように、細胞核の各重心点に関するボロノイ領域を、段階７４８で決定する。各ボロノイ領域を決定するために（７４８）、ボロノイアルゴリズムを使用する。ボロノイアルゴリズムは、各ボロノイ重心点の周りの境界を画定する。第１及び第２のボロノイ重心点６３２、６３４の場合、ボロノイアルゴリズムは、第１及び第２のボロノイ重心点６３２、６３４の間で実質的に等しい距離のところに存在するように、境界６３５の一部を画定する。
【００８９】
次いで第１の核５０２に関する、第１の試験空間定義（図示せず）を、段階７５０で、第１のボロノイ領域６３０内に画定する。第１の核５０２に関する第１の試験空間定義は、試験空間範囲及び試験部位データを有し、これは、第１の空間定義５１４の空間範囲及び部位データと同じである。第１の試験空間定義を使用して、第１の先行画像５０８内の第１の核５０２に関する領域の、組ｉでの１以上の特性の値を計算する。この実施形態で、値は、第１の先行画像５０８内の、第１の核５０２に関する、第１の試験ベクトルＺＮ−１１ａである。第１の核５０２に関する第１の試験ベクトルＺＮ−１１ａは、平均強度及び標準偏差である、組ｉにおける整数Ｋの特性を有する。
【００９０】
第１の核５０２に関する第１の試験ベクトルＺＮ−１１ａを、コスト関数を計算することによって第１の核ベクトルＺＮ１と比較するが、この実施形態では、下記の関係式を使用して、第１の核５０２に関する第１のユークリッド距離ＥＮ−１１ａを計算する（７５２）。
【００９１】
【数１】
2007500344.tif 000003
第１の核５０２に関する第１のユークリッド距離ＥＮ−１１ａを、段階７５２で計算したら、第１の先行画像５０８内の第１の核５０２に関して、第２の異なる試験空間定義（図示せず）を決定する。第２の試験空間定義は、第１の試験空間定義の、試験空間範囲の周辺画素を選択的に取り除き、その画素を、第１の試験空間定義の試験空間範囲の周辺画素の、異なる場所に添加することによって決定する。
【００９２】
次いで第１の核５０２に関する、第２の異なる試験ベクトルＺＮ−１１ｂを、第２の試験空間定義を使用して計算する。第１の核５０２に関する第１の試験ベクトルＺＮ−１１ａと同様に、第１の核５０２に関する第２の試験ベクトルＺＮ−１１ｂは、第１の先行画像５０８の領域の、組ｉ内での特性を含む。
【００９３】
上記関係式（１）を使用して、第１の核５０２に関する第２の異なるユークリッド距離ＥＮ−１１ｂを計算することにより、第１の核５０２に関する第２の試験ベクトルＺＮ−１１ｂと第１の核ベクトルＺＮ１とを比較する（７５２）。
【００９４】
第３の異なる試験空間定義（図示せず）を含む、複数の、別の異なる試験空間定義（図示せず）は、第１の核５０２の試験空間範囲の周辺画素を取り除き、且つ別に添加することによって、第１の先行画像５０８内の第１の核５０２に関して決定する。第１の先行画像５０８内の、第１の核５０２に関する別の試験空間定義を決定する場合、別の試験空間定義は、既に決定され且つ実質的に最小の、計算されたユークリッド距離ＥＮ−１１ｙに対応した、第１の核５０２に関する異なる試験空間定義から決定する。例えば、第１の核５０２に関する第１のユークリッド距離ＥＮ−１１ａは、第１の核５０２に関する第２のユークリッド距離ＥＮ−１１ｂ未満であることが可能である。したがって、第３の試験空間定義は、第１の核５０２の第２の試験空間定義ではなく、第１の核５０２の第１の試験空間定義から決定する。しかし、第１の核５０２に関する第１のユークリッド距離ＥＮ−１１ａが、第１の核５０２に関する第２のユークリッド距離ＥＮ−１１ｂよりも大きい場合、第３の空間定義は、代わりに、第１の核５０２の第２の試験空間定義から決定することになる。
【００９５】
第１の核５０２に関する別の試験空間定義の決定は、第１の核５０２に関する別の試験ベクトルＺＮ−１１ｙと第１の核ベクトルＺＮ１との間の、計算されたユークリッド距離ＥＮ−１１ｙが、実質的に最小限になるまで（７５６）繰り返し継続される（７５４）。第１の核５０２に関する、実質的に最小限のユークリッド距離ＥＮ−１１ｙに対応した試験空間定義を選択し、これを使用して、第１の先行画像５０８内の第１の核５０２の、第１の作成空間定義５２０を作成する（７５８）。
【００９６】
実質的に最小限のユークリッド距離ＥＮ−１１ｙは、作成空間定義、即ちこの場合は、第１の核５０２の第１の作成空間定義５２０が、第１の核５０２に正確に対応するという信頼性のレベルを示す「核確信度」として働く。例えば、ほぼ０である最小限のユークリッド距離ＥＮ−１１ｙは、約１００％の信頼性レベルに対応する。
【００９７】
第１の先行画像５０８内の第１の核について、第１の作成空間定義５２０を作成した後（７５８）、第１の作成空間定義５２０の作成に関して述べたものと同様の手法で、第２の核５０３に関する第１の試験空間定義（図示せず）を、第２のボロノイ領域６３３内に画定する。第２の核５０３に関する第１の先行画像５０８の領域の組ｉでの特性を有する、第２の核５０３に関する第１の試験ベクトルＺＮ−１２ａを、計算する。第２の核５０３に関する第１のユークリッド距離ＥＮ−１２ａを計算することによって、第２の核５０３に関する第１の試験ベクトルＺＮ−１２ａを、第２の核ベクトルＺＮ２と比較する。次に、第２の異なる試験空間定義（図示せず）を、第１の先行画像５０８内の第２の核５０３に関して決定する。第２の試験空間定義は、前述のように、第１の試験空間定義の周辺画素を選択的に取り除き、添加する方法によって、決定する。第２の核５０３に関する、第２の異なる試験ベクトルＺＮ−１２ｂを、第２の試験空間定義を使用して計算し、第２の核５０３に関する第２のユークリッド距離ＥＮ−１２ｂを計算することによって、第２の核ベクトルＺＮ２と比較する。
【００９８】
第１の先行画像５０８内の、第１の核５０３に関して既に同様に述べたように、第１の先行画像５０８で既に決定された、第２の核５０３の異なる試験空間定義の周辺画素を、選択的に取り除き添加することによって、複数の、別の異なる試験空間定義を、第２の核５０３に関して繰り返し決定する。第１の先行画像５０８内の、第２の核５０３に関する試験空間定義を選択するが、これは、第２のベクトルＺＮ２と、選択された試験空間定義との間の、実質的に最小限のユークリッド距離ＥＮ−１２ｂに対応する。この選択された試験空間定義を使用して、第２の核５０３に対応した第２の異なる、作成空間定義５２２を作成する（７５８）。同様に、実質的に最小限のユークリッド距離は、第２の核に関する「核確信度」として働く。
【００９９】
第１の作成空間定義５２０及び第２の作成空間定義５２２の作成と同様に、別の異なる、作成空間定義を、第１の先行画像５０８のそれぞれの核に関して作成し（７５８）、これを逐次実施する（７６０）。
【０１００】
第１及び第２の作成空間定義５２０、５２２のそれぞれを含む、第１の先行画像５０８の、それぞれの核ごとに作成された空間定義を使用して、作成空間定義の、第１の先行の組５２４を構成する（７６２）。第１の先行の組５２４は、実質的に第２の期間ｔＮ−１の間に構成する（７６２）。第１の先行の組５２４は、品質基準に従ってフィルタリングされた、第１の先行画像５０８の作成空間定義の一部を含む。この実施形態で、品質基準は、作成空間定義それぞれに対応する実質的に最小限のユークリッド距離ＥＮ−１ｘｙに関する閾値である。閾値は、作成空間定義に関する「核確信度」の許容可能な値であり、第１の先行画像５０８に関する空間定義の作成前に、決定する。それぞれの作成空間定義では、作成空間定義に対応する実質的に最小限のユークリッド距離ＥＮ−１ｘｙが、決定された閾値よりも大きい値を有する場合、作成空間定義は、「核確信度」の許容できない値を有し、これは、空間定義の、構成された第１の先行の組（５２４）には含まれない。しかし、実質的に最小限のユークリッド距離ＥＮ−１ｘｙが、決定された閾値よりも小さい値を有する場合、作成空間定義は、「核確信度」の許容可能な値を有し、第１の先行組５２４に含まれる。
【０１０１】
第１の先行組５２４を含めた先行するそれぞれの組ごとに、「画像確信度」をさらに計算して、それぞれの核ごとに作成された空間定義が、複数の細胞のそれぞれの核に正確に対応するという信頼性のレベルを示すようにする。第１の先行組５２４に関する「画像確信度」は、第１の先行組５２４のそれぞれの核に関する最小限のユークリッド距離ＥＮ−１１ｙの合計を、第１の先行組５２４内の細胞核の総数で割ることによって、計算する。
【０１０２】
後続組５１８及び後続画像５１０を使用して、第１の先行画像５０８に関する作成空間定義で述べたものと同様の方法で、第１の先行組５２４及び第１の先行画像５０８を使用して作成された作成空間定義を使用して、第２の先行画像５０６内の複数の核に関する、第２の異なる先行組の空間定義５２６を構成する。
【０１０３】
第２の先行組の作成空間定義５２６の、第１の核５０２に関する第１の作成空間定義は、第１の先行組５２４の、第１の作成空間定義が作成される方法と同様の方法で、作成する。第１の核５０２に関する、第１の作成空間定義の作成では、第２の先行画像５０６内の第１の核５０２の重心点に関してボロノイ領域を決定する。第１の核５０２に関する複数の試験空間定義は、第２の先行画像５０６内で決定し、各試験空間定義ごとに、第２の先行画像５０６内の第１の核５０２の領域に関する試験ベクトルＺＮ−２１ｙを計算し、その後、第１の核５０２に関するユークリッド距離ＥＮ−２１ｙを計算する。第１の核５０２に関するユークリッド距離ＥＮ−２１ｙの、実質的に最小限の値に基づいて、第２の先行画像５０６内の第１の核５０２に関する試験空間定義を選択し、これを使用して、第２の先行画像５０６内の、第１の核５０２に関する第１の作成空間定義を作成する。直前に述べたものと同様の方法に従い、第２の先行画像５０６に関する複数の作成空間定義を、作成する。「核確信度」と「画像確信度」との両方は、第１の先行組５２４で使用したものと同様の手法で計算することができる。
【０１０４】
第２の先行組の空間定義５２６の構成方法を、同様に繰り返すことによって、作成空間定義の、第３の異なった先行組５２８を含んだ複数の先行組を、構成する。先行組のそれぞれは、生体細胞の先行画像内に、核に関する複数の作成空間定義を含む。
【０１０５】
図１０は、一連の先行画像を分析する経時的方向を、概略的に示す。第１の実施形態では、種々の図を使用して既に述べた先行画像の要素に対し、８００からの、同じ参照番号を付す。これらの要素の、対応する特徴及び記述は、この場合にも当てはまると解釈すべきである。
【０１０６】
図１０は、第１の期間ｔＮ中に記録された後続画像８１０と、第１、第２及び第３の先行画像８０８、８０６、８０４のそれぞれを含んだ先行画像とを示す。時間軸８６４は、互いに対し、先行画像を記録する期間ｔＮ−ｘと、後続画像８１０を記録する第１の期間ｔＮとを示す。逆方向分析の矢印８６６は、時間軸８６４に対して逆方向であることを示し、先行画像に関する空間定義の、先行組を作成する。逆方向分析の矢印８６６は、時間軸８６４に沿って記録される順序とは逆の方向で行った先行画像の分析を示す。
【０１０７】
複数の組の作成空間定義を構成したら、各先行画像内の細胞の生体活性に関する特性を、これに対応する細胞の先行作成空間定義を使用して、分析することができる。１つの考えられる例では、アッセイの経過時間全体を通して、例えばＨｏｅｃｈｓｔなどの核染色剤で細胞核を染色する必要のない、国際公開第０３／０３１６１２号に記載されるような、即ちその内容が参照により本明細書に援用されるものに記載されるような、生体細胞周期の段階を決定する方法を実施することを含む。
【０１０８】
例えば、第２の先行画像５０６は、期間ｔＮ−３、ｔＮ−２及びｔＮ−１のそれぞれの間に生体細胞の細胞周期のデータが決定されるように、第２の組の作成空間定義５２６を使用して、分析することができる。先行組の作成空間定義を使用して、複数の先行画像を分析することにより、細胞の先行画像が記録される一連の期間中に、細胞の細胞周期のデータを決定することができる。さらに、およそ期間ｔＮ中に細胞周期データが決定されるよう、後続組の空間定義を、細胞の後続画像と共に使用することができる。
【０１０９】
図１１は、本発明の第２の実施形態による、一連の画像の分析の経時的方向を、概略的に示す。第２の実施形態は、第１の期間ｔＮ中にマークアップ画像が記録され、複数の生体細胞の一連の画像が記録される点で、第１の実施形態と同様である。しかし、一連の画像は、第１の期間ｔＮ後に記録される。一連の後続画像には、第２の期間ｔＮ＋１中に記録される第１の後続画像９７０、第３の期間ｔＮ＋２中に記録される第２の後続画像９７２及び第４の期間ｔＮ＋３中に記録される第３の後続画像９７４が含まれる。さらに、複数の生体細胞の別の画像９７５が、第１の期間ｔＮ中に記録される。前述の実施形態と同様に、時間軸９６４は、互いに対する期間ｔＮ＋ｘを示し、その間に後続画像が記録される。順方向分析の矢印９７６は、第１の実施形態と同様に、後続画像に関する空間定義の組が、作成される方向を示す。この実施形態で、順方向分析の矢印９７６は、時間軸９６４に沿って一連の後続画像が記録される順序に対応した、後続画像の順方向で行われる分析を示す。
【０１１０】
この実施形態で、マーカーは、細胞に与えられている細胞マーカーであり、且つ比較的長い時間にわたって細胞が保持しにくく、したがって細胞核を同定しにくい細胞マーカーである。この比較的長い時間にわたり、マーカーは、広がっていく可能性があり、又は細胞から外に、活発に送り出される可能性がある。或いはマーカーは、光退色プロセスが原因で消失する可能性があり、又はマーカーは、高強度の紫外線を使用した励起を必要とするが、その間に、細胞が比較的長い時間にわたって高強度の紫外線に繰り返し曝される場合は、細胞に対する損傷が生ずることになる。
【０１１１】
図１２は、本発明の第３の実施形態による、一連の画像の分析の経時的方向を、概略的に示す。第３の実施形態は、第１の期間ｔＮ中に第１のマークアップ画像が記録され、また複数の生体細胞の一連の画像が記録される点で、前述の実施形態と同様である。さらに第２のマークアップ画像が、第１の期間ｔＮ中に適宜記録される。一連の画像の一部は、第１の期間ｔＮの前に記録され、一連の画像の一部は、第１の期間ｔＮの後に記録される。先行画像には、第１、第２及び第３の先行期間ｔＮ−１、ｔＮ−２、ｔＮ−３中にそれぞれ記録された、第１、第２及び第３の先行画像１０７８、１０８０、１０８２が含まれ、後続画像には、第１、第２及び第３の後続期間ｔＮ＋１、ｔＮ＋２、ｔＮ＋３中にそれぞれ記録された、第１、第２及び第３の後続画像１０８４、１０８６及び１０８８が含まれる。第１の期間ｔＮ中、第１及び第２のマークアップ画像にそれぞれ対応する第１の画像及び適宜に第２又はそれ以上の更なる画像１０９０、１０９２が、複数の細胞に関して記録される。時間軸１０６４は、その間に先行画像及び後続画像が記録される、互いに対する時間を示す。逆方向の第１の分析矢印１０９４によって示されるように、先行画像が記録される順序で逆方向及び適宜に順方向に、先行画像内で前述の実施形態と同様にして、細胞核に関する空間定義が作成されるよう、第１の別の画像１０９０を使用する。後続画像が記録される順序に対応した、順方向の第２の分析矢印１０９６によって示される順方向で、後続画像内で細胞核に関する空間定義が作成されるよう、第２の別の画像を使用する。
【０１１２】
この実施形態では、一時的な修飾にかけられる細胞内の生物学的プロセスが原因で、マーカーを一時的に細胞に付与する。この実施例で、マーカーは、第１の期間ｔＮ中に発現する各細胞のレポーター遺伝子からの、経時的に変化するシグナルである。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質を発現することが可能な、遺伝構成系である。本明細書の参考文献であるNaylor L.H.(1999)Biochemical Pharmacology 58,749-757は、哺乳動物細胞内の様々なレポーター遺伝子を使用した周知の方法について記述している。レポーター遺伝子は、他の細胞タンパク質の存在下で、遺伝子の産物を測定可能にし、宿主細胞内での遺伝子発現の変化に応答する選択された調節配列の制御下で、細胞に付与される。そのような調節配列は、例えば、ホルモン、第２のメッセンジャー、又はその他の細胞制御及びシグナル伝達因子に応答する。調節配列は、レポーター遺伝子を使用して、例えば添加された細胞作用因子又は選択された調節配列を含む細胞プロセスの影響に関してアッセイを行うことができるように、適切に選択される。この実施例で、レポーター遺伝子は、活性化されたとき、細胞透過性基質の活性化によって、蛍光放出シグナルの増大をもたらす。レポーター遺伝子は、例えば、ニトロレダクターゼ（国際公開第０１５７２３７号に記載）、βラクタマーゼ（米国特許出願第５７４１６５７号に記載）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（米国特許出願６３０６６００号）の１つである。
【０１１３】
或いはこの第３の実施形態では、マーカーが、例えば、細胞核に関する青色蛍光タンパク質である。このマーカーの画像形成を首尾良く行うために、紫外線を使用して、マーカーを蛍光励起する必要がある。比較的長い時間にわたり、複数の細胞を紫外線で累積的に露光することは、細胞に有毒であり、したがってマーカーは、第１の期間ｔＮ中にこのような方法でしか励起されない。
【０１１４】
図１３は、本発明の第４の実施形態による、一連の画像の分析の経時的方向を、概略的に示す。前述の実施形態の場合と同様に、複数の細胞に関する一連の画像が記録される。この複数の細胞は、複数の下位系列に分けられる。図１３は、第１の下位系列１１９４を示し、この系列には、第１の下位系列の第１の期間ｔＮ１中に記録された、第１の下位系列の別の画像１１９６が含まれ、さらに、第１の下位系列の第２、第３及び第４の期間ｔＮ−１１、ｔＮ−２１、ｔＮ−３１、中の、第１の期間ｔＮ１の前に記録された、第１の下位系列の第１、第２及び第３の先行画像１１９８、１２００、１２０２のそれぞれが含まれる。さらに、第１の下位系列のマークアップ画像を、第１の下位系列の第１の期間ｔＮ１中に記録する。時間軸１１６４は、第１の下位系列１１９４画像を含めた一連の画像がその間に記録された、互いに対する時間を示す。逆方向の、第１の下位系列の分析矢印１２１４は、第１の下位系列１１９４画像を記録する時間での方向とは逆の方向であって、前述の実施形態と同様に、第１の下位系列の別の画像１１９６を使用して、第１の下位系列の先行画像内に細胞核に関する空間定義を作成する方向を示す。
【０１１５】
第２の下位系列１２０４は、第２の下位系列の第１の期間ｔＮ２中に記録された、第２の下位系列の別の画像１２０６を含み、さらに、第２の下位系列の第２、第３及び第４の期間ｔＮ−１２、ｔＮ−２２、ｔＮ−３２中の、第１の期間ｔＮ２の前にそれぞれ記録された、第１、第２及び第３の先行画像１２０８、１２１０、１２１２を含めた第２の下位系列の先行画像を含む。
【０１１６】
逆方向の第２の下位系列分析の矢印１２１６は、第２の下位系列の先行画像内に細胞核の空間定義を作成する、第２の下位系列画像を記録する順序とは逆の方向を示す。各下位系列は、図１３に示すように、別の画像と、３つの先行画像とを含むが、下位系列は、より多くの先行画像、例えば１０個の先行画像を含むと考えられる。さらに代替として、先行画像は、代わりに下位系列の第１の期間の後に記録され、且つ後続画像を読み取る順序に対応した順方向で分析される、後続画像であってもよい。或いはさらに、画像は、先行画像と後続画像の両方を含むことができ、その空間定義は、別の画像を使用して、逆方向と順方向の両方で作成されるものである。
【０１１７】
述べてきた本発明の実施形態全てにおいて、マーカーは、細胞核を同定することが可能である。さらに、生体細胞の対象は、代替として他の細胞対象でよく、例えば、生体細胞ミトコンドリア、生体細胞細胞質、生体細胞リソソーム、又は結合抗体でよく、またマーカーは、細胞ミトコンドリア、細胞質、リソソーム、又は抗体を同定することが可能であると考えられる。本発明の一実施形態の、記録された画像から同定される対象は、１つのタイプに限定されず、例えば細胞核、細胞ミトコンドリア、細胞の細胞質、細胞リソソーム、又は結合抗体を含めた少なくとも２つの細胞対象を含むことができることが、理解されよう。さらに、Ｈｏｅｃｈｓｔ又はＤＲＡＱ５タイプに代わる核マーカーを使用することができ、その結果、これら代替のマーカーを、適切な波長の核マーカー励起チャネルで励起できることが、理解されよう。例えば、共焦点顕微鏡の、線源Ｓｎ、レンズＬｎ、ミラーＭｎ、ブロックフィルタＢＦｎ及び検出器Ｄｎを含めた要素は、選択された核マーカー励起チャネル及び対応する核マーカーチャネルに、適切に適合される。細胞対象に結合抗体が含まれるとき、適切なマーカー、例えばヨウ化プロピジウムを細胞に付与し、マークアップ画像を記録する前に、生体細胞を固定することが考えられる。
【０１１８】
さらに、第１の期間中に、細胞対象、例えば細胞核を同定することが可能であり、且つ第２の期間中に細胞対象をそれほど同定することができないマーカー（一次）を使用することの他、少なくとも第１の期間及び第２の期間中に細胞対象を同定することが可能な第２のマーカーを使用することが、考えられる。この第２のマーカーは、複数の細胞の二次マークアップ画像を記録するために、適切なカラーチャネルを使用して検出される。これらの二次マークアップ画像から得られたデータは、細胞画像内の細胞対象に関する空間定義を、より正確に作成することができるように、一次マーカーを使用して記録された一次マークアップ画像から得られたデータと一緒に使用する。そのような二次マーカーは、蛍光ミトコンドリア染色剤、例えばＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、蛍光リソソーム染色剤、例えばＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、又は蛍光非特異的細胞染色剤、例えばＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でよい。
【０１１９】
さらに、多波長構成の線走査共焦点顕微鏡は、３組以上の独立した波長と共に使用できることが考えられる。例えば、異なるタイプの対象、例えば細胞核及び細胞ミトコンドリアを含む、生体物質の画像を記録することが可能である。したがって、３つ以上のカラーチャネルを使用して、生体物質の種々の画像を記録し、それによって、異なる細胞対象を別々に同定することが可能である。異なるカラーチャネルに関して、３個以上の線源Ｓｎ、レンズＬｎ、ミラーＭｎ、ブロックフィルタＢＦｎ及び検出器Ｄｎを有する線走査共焦点画像形成システムを、使用することができる。
【０１２０】
記述された本発明の実施形態による空間定義は、重心点の回りの空間範囲と、重心点の画素アドレスとの両方を含む。さらに、空間定義は、複数の生体物質中の対象を空間的に画定する代替のパラメータを使用して、与えることも考えられる。
【０１２１】
上述の品質基準は、これらの実施形態では閾値であり、ユーザによって設定されることが考えられ、また試行錯誤技法を使用して変えられるものである。或いは自動アルゴリズムによって、種々の先行画像に関する空間定義の作成過程中に、閾値の値を適応可能に変化させることができると考えられる。さらに代替として、品質基準は、対象の空間定義を選択することができるよう、閾値とは異なる形のものであると考えられる。
【０１２２】
例えば、空間定義の空間範囲の周辺画素を、選択的に取り除き且つ添加することによって、例えば記述される実施形態における核など、対象の領域の形状の変化を、吸収することが可能である。さらに、一連の時間にわたっての、例えば核などの対象の空間定義のばらつきは、代替の制御されたモーフィング技法を使用して実現されると考えられる。
【０１２３】
記述される本発明の実施形態は、一連の期間中に、複数の生体細胞の一連の画像を記録することを含む。逐次連続する期間、例えばｔＮ−１及びｔＮのそれぞれは、均等な時間だけ互いに離れていることが好ましい。例えば、その均等な時間は、約２分〜約２０分の間であると考えられる。しかし均等な時間は、これより短くても長くてもよいことが考えられる。さらに、例えば一連の画像は、約６０画像までを含むが（Ｎ≦６０）、やはり、より大きい数の一連の画像を記録できることが考えられる。或いは、逐次連続する種々の期間が、種々の不均等な時間だけ互いに離れていることが考えられる。
【０１２４】
記述した実施形態では、ボロノイダイアグラムを作成するが、これはそれぞれの核重心点ごとにボロノイ領域を決定し、且つ引き続き試験空間定義を画定するときに使用されるものである。生体細胞の先行画像内の核に関する、空間定義の作成に使用する目的で、核の周囲空間、又は核の重心点を決定するために、ボロノイアルゴリズム以外の代替のアルゴリズムを使用できることが考えられる。
【０１２５】
上述の実施形態では、組ｉの特性が、記録された生体細胞画像内の核の、平均強度及び標準偏差の形をとる。しかし代替の又は追加の特性は、対象に関する空間定義の作成に使用するために、計算することができる。これらには、分散、尖度、自動相関関数、空間相関測度、テキスト相関測度、自動相関関数、フラクタル次元、面積、周辺、主軸の長さ、主軸の幅、コンパクト度及びオリエンテーションの、少なくとも１つが含まれる。
【０１２６】
試験空間定義の１つを選択するとき、ユークリッド距離Ｅを計算して、生体細胞画像内の核に関するベクトル及び同じ核の試験ベクトルと比較する。試験空間定義の選択中に、以下の関数の少なくとも１つ、即ちシティブロック関数、チェビシェフ距離、ミンコフスキーのｍ次関数、２次関数、Ｑ正定関数、キャンベラ距離、非近距離関数、又は角分離の少なくとも１つを、代わりに計算することができると考えられる。さらに、試験空間定義は、これら関数の少なくとも２つの組合せを使用して、選択できると予測される。
【０１２７】
さらに、「核確信度」及び「画像確信度」は、別々に計算することができ、「核確信度」は、細胞核とは異なる細胞対象に対応させることができると考えられる。
【０１２８】
本発明の別の実施形態では、試験空間定義を繰り返し画定すること及び試験ベクトルを核ベクトルと比較することの代わりとして、作成空間定義が、細胞の１つの先行画像内の組ｉの核の特性と、細胞の別の先行画像の組ｉの特性とを比較することによって作成されると考えられる。
【０１２９】
本発明の別の実施形態では、模擬アニーリングアルゴリズムなどの最適化アルゴリズムを、少なくともいくつかの作成空間定義に適用することができる。この模擬アニーリングアルゴリズムを使用することにより、見掛けの実質的に最小限のユークリッド距離Ｅではなく、実質的に最小限のユークリッド距離Ｅを使用して、選択された試験空間定義を確実に選択することができる。
【０１３０】
上記実施形態では、時間中に生体細胞の細胞周期のデータを決定するために、空間定義の対応する組を使用して、生体細胞の画像を分析する。或いは、本発明の方法を使用して、生体細胞のその他のパラメータ、例えば細胞内の蛍光の突起や粒などを検出することができると考えられる。
【０１３１】
いずれか１つの実施形態に関する任意の特徴を、単独で、又はその他の記述された特徴と組み合わせて使用することができ、さらに、任意のその他の実施形態、或いは任意のその他の実施形態の任意の組合せの、１以上の特徴と組み合わせて使用できることが、理解されよう。さらに、上記に記述されない均等物及び変形例も、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】複数の生体物質の画像形成に使用される、線走査共焦点顕微鏡の概略図である。
【図２ａ】本発明の実施形態による、複数の生体物質の画像形成に使用される、多波長線走査共焦点顕微鏡の、上面図及び側面図をそれぞれ概略的に示す図である。
【図２ｂ】本発明の実施形態による、複数の生体物質の画像形成に使用される、多波長線走査共焦点顕微鏡の、上面図及び側面図をそれぞれ概略的に示す図である。
【図２ｃ】本発明の実施形態による、単一ビームオートフォーカスシステムの光線経路を概略的に示す、上面図である。
【図３ａ】本発明の実施形態による、走査ミラーを備えた多波長線走査共焦点顕微鏡の光線経路をそれぞれ示す、上面図及び側面図である。
【図３ｂ】本発明の実施形態による、走査ミラーを備えた多波長線走査共焦点顕微鏡の光線経路をそれぞれ示す、上面図及び側面図である。
【図３ｃ】本発明の実施形態による、単一ビームオートフォーカスシステムの光線経路を示す、概略上面図である。
【図４】本発明の実施形態による、２ビームオートフォーカスシステムを概略的に示す、側面図である。
【図５ａ】本発明の実施形態による、長方形ＣＣＤカメラ及び読み出しレジスタを、概略的に示す図である。
【図５ｂ】本発明の実施形態による、長方形ＣＣＤカメラ及び読み出しレジスタを、概略的に示す図である。
【図５ｃ】本発明の実施形態による、長方形ＣＣＤカメラ及び読み出しレジスタを、概略的に示す図である。
【図６】本発明の実施形態による、画像形成データ処理システムのデータ処理構成要素を、概略的に示す図である。
【図７】本発明の実施形態による、複数の生体物質中の対象の、画像及び関連した空間定義を示す、概略図である。
【図８】本発明の実施形態による、複数の生体物質の対象の周囲空間を示す、概略図である。
【図９ａ】本発明の実施形態による、複数の生体物質を分析する方法を示す、流れ図である。
【図９ｂ】本発明の実施形態による、複数の生体物質を分析する方法を示す、流れ図である。
【図１０】本発明の種々の実施形態による、生体物質の画像分析の経時的方向を、概略的に示す図である。
【図１１】本発明の種々の実施形態による、生体物質の画像分析の経時的方向を、概略的に示す図である。
【図１２】本発明の種々の実施形態による、生体物質の画像分析の経時的方向を、概略的に示す図である。
【図１３】本発明の種々の実施形態による、生体物質の画像分析の経時的方向を、概略的に示す図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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