(57)【要約】  組織特異的プロモーター（配列番号１〜５）が開示され、これらは、好ましくは、木本植物の木部組織において発現される。これらのプロモーターを用いて、例えば、遺伝子発現が木部組織において特異的に調節され、植物の木部特性が変化させられる。修飾された木部特性を示すトランスジェニック植物が、これらのプロモーターを用いて得られ得る。
2007528701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−配列番号１ないし５
−配列番号１ないし５のいずれか１つと機能的に相同な配列
−配列番号１ないし５のいずれか１つと少なくとも９０％の相同性を示す配列
から選択されることを特徴とする、植物の木部形成組織において特異的に発現されるか、あるいは活性であるプロモーター配列を含む、単離核酸配列。
【請求項２】
植物の木部形成の特定ステージにおいて発現されるか、あるいは活性である、請求項１記載の核酸配列。
【請求項３】
プロモーター配列が植物において発現されるか、あるいは活性である、請求項１または２記載の核酸配列。
【請求項４】
プロモーター配列が木本植物または繊維植物において発現されるか、あるいは活性である、請求項１または２記載の核酸配列。
【請求項５】
プロモーター配列が双子葉植物である木本植物において発現されるか、あるいは活性である、請求項１または２記載の核酸配列。
【請求項６】
プロモーター配列がポプラ、アスペン、シラカバ、ヤナギ、ユーカリ、モミジバフウ（liquidamber）、トウヒ、カラマツ、アメリカヅカ、マツ、綿、麻、サイザル、亜麻、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、および菜種から選択される植物において発現されるか、あるいは活性である、請求項１または２記載の核酸配列。
【請求項７】
請求項１または２記載の配列の少なくとも１つが機能的に挿入されていることを特徴とする、その野生型と比較して修飾された木質形成特性を示す、トランスジェニック植物。
【請求項８】
請求項１または２記載の配列の少なくとも１つが機能的に挿入されていることを特徴とする、その野生型と比較して修飾されたアポトーシス特性を示す、トランスジェニック植物。
【請求項９】
木本植物または繊維植物である、請求項７または８記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
ポプラ、アスペン、シラカバ、ヤナギ、ユーカリ、モミジバフウ（liquidamber）、トウヒ、カラマツ、アメリカヅカ、マツ、綿、麻、サイザル、亜麻、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、および菜種から選択される、請求項７または８記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項１または２記載の配列の少なくとも１つを用いることを特徴とする、植物の木部において特定の遺伝子を発現させる方法。
【請求項１２】
請求項１記載のプロモーターの少なくとも１つが植物に機能的に挿入されていることを特徴とする、トランスジェニック植物の生産方法。
【請求項１３】
該少なくとも１つの配列をそのゲノムに有する、請求項７ないし１０のいずれか１項記載のトランスジェニック植物の繁殖性材料。
【請求項１４】
種、果実、切枝、およびプロトプラスト、植物細胞、カルスまたは根のような植物の部分から選択される、請求項１３記載の繁殖性材料。
【請求項１５】
請求項１または２記載の配列を含む、核酸構築物。
【請求項１６】
プラスミド、コスミド、ウイルス、またはバクテリオファージから選択されるベクターを含む、請求項１５記載の核酸構築物。
【請求項１７】
ストリンジェントな条件下で請求項１または２記載の配列の少なくとも１つとハイブリダイズできる核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学分野、特に、任意の植物、特に、木本植物の形成層における木部発生中に遺伝子発現をもたらすプロモーターに関するものである。本発明は、かかるプロモーターを利用可能にし、それらの実質的な使用を提供するものである。
【０００２】
発明の背景
植物における木部（Xylem）形成は、発生上重要な過程であり、それは経済的価値のある繊維を得る際にも非常に重要である。樹木における木質（Wood）形成は、この過程の経済上極めて重要な例である。それは、始原細胞の分裂から、細胞エクスパンジョン、そしてアポトーシス領域となる二次壁形成に至る、一連の所定の発生現象の結果である。木質は維管束形成層から生じ、これは細胞プロトプラストの自己消化となる終末分化を経験する側部分裂組織である。
【０００３】
本発明者等は、本発明を創作する研究において、木本多年生植物の十分に確立されたモデルであるポプラ（Poplar）を用いた。それは少量のゲノムを有しており、これは、別の頻繁に用いられるモデルであるシロイヌナズナ（Arabidopsis）の約５倍多いだけである。さらに、ポプラは、順遺伝学に広く用いられる種である。ポプラおよびシロイヌナズナはまた系統発生学的に密接に関連しており、シロイヌナズナのゲノムの全配列と組合わされた１０００００を超えるポプラＥＳＴへのアクセスは、木部分化の研究のため、これら２つのモデルを組合わせることを優れた選択とする。
【０００４】
いつ、そしてどこで、遺伝子が活性であるかが、その機能上重要である。あるレベルの調節は転写開始の制御である。遺伝子の転写発現は、主に（しかし、これだけではない）コード配列の上流（５’）に位置するシス作用性ＤＮＡエレメントにより制御される。遺伝子工学およびＧＭＯ（遺伝学的に改変された生物）を育種および品種改良におけるツールとして用いる場合、２つの基本的な部分：所望の効果を生じる遺伝子；および時、場所、および発現した遺伝子産物のレベルを決定するシス作用性ＤＮＡ調節配列が存在する。調節はまた、転写物の安定性、翻訳の開始および進行、タンパク質の活性などのようなレベルで生じる。分化および木部形成の特定ステージにおいて、それらの発現をもたらすプロモーターを有する遺伝子が存在する。これらのプロモーターは、木部の特性を遺伝学的に改変し、産生される木部の量を変更させるときの、任意の遺伝子に対する作用を特異的に指令する際に必須であろう。利用可能なプロモーターの数は限られる。このことは、新たなものが、木部形成の研究および操作において遺伝子の発現を調節し、さらに十分に調節するときに非常に重要であることを意味する。
【０００５】
より高等な種における細胞発生中の特定の過程の修飾も、それが樹木の特性の改善に達するときのみならず、繊維が商業的用途を有する他の植物においても、商業上非常に興味深い。かかる修飾のため、プロモーターのような新たなツールが必要である。
【０００６】
先行技術
Fredrik Sterky等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 (95), 13330-13335）およびMagnus Hertzberg等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 (98) 14732-14737）は、ポプラトレムラＬ（Populus tremula L.）×トレムロイデス  ミッキス（tremuloides Michx.）およびポプラトリコカルパ（Populus trichocarpa）「トリコベル（Trichobel）」の木質形成組織由来の５，６２９個のＥＳＴを含む、２つのポプラ種におけるラージスケール遺伝子発見プログラムの結果を公開している。これらのＥＳＴは、２つのｃＤＮＡライブラリーについて合計３，７１９個の固有の転写物を表し、推定機能は、これらの転写物のうち２，２４５個に帰属され得る。彼らは、表したＥＳＴデータは、植物における二次木部および師部の形成に関与する遺伝子の同定において価値があるだろうが、同定がどのようにして行われ得るか明らかな方向付けはできないことを指摘している。
【０００７】
先行技術（Hertzberg等）において、木部形成の所定のステージでのｃＤＮＡの転写物プロファイリングが、２９９５個のＥＳＴからなるポプラユニジーン（poplar unigene）のｃＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて行われた。
【０００８】
しかしながら、Sterky等およびHertzberg等により公開された情報の実際的な利用を可能とするためには、新たなアプローチが必要である。
【０００９】
米国第２００２１３８８７０  Ａ１号は、変化した農業形質を示すトランスジェニック植物の種々の株を得るための、４ＣＬ、Ｃａｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＳＡＤ、およびＣＡＤ遺伝子、およびそれらの組合せを含むフェニルプロパノイド経路由来の複数の遺伝子を用いた植物の同時形質転換方法に関する。植物の農業形質は、植物ゲノムに取り込まれている、特定の遺伝子および選択された遺伝子の組合せの向きにより調節される。米国第２００２１３８８７０号は、例えば、導入遺伝子の発現を木部発生に制限するような組織特異的プロモーターの使用が望まれると述べている。
【００１０】
一般に、新たな有用なプロモーターを同定することが依然必要である。残る１つの具体的な課題は、可能性のある最も重要な遺伝子およびそれらに対応するプロモーターをどのようにして同定し、これらを、細胞の発生特性とどのようにして関連付けるかである。別の課題は、クローン化したＤＮＡフラグメントが所望の特異的発現パターンの転写をもたらすように、全ての関連シス作用性転写制御エレメントをクローン化することである。
【００１１】
具体的な課題は、特定の細胞タイプ、発生ステージ、および／または植物の機能と関連する特異的プロモーター（これは、他の植物組織においては発現しない）を同定することである。
【００１２】
発明の要約
本発明は、それぞれが植物の木部形成組織において特異的に発現されるプロモーター配列を含み、配列番号１ないし５；配列番号１ないし５と機能的に相同な配列；および配列番号１ないし５と少なくとも９０％の相同性を示す配列から選択される、利用可能な単離された核酸配列を提供することによる、上記課題の解決法を提供するものである。
【００１３】
配列を、図、および規定のソフトウェア（PatentIn 3.1）を用いて調製した添付の配列表において提示する。
【００１４】
さらに、本発明は、引用により本明細書に取り込まれる、添付の請求の範囲において定義される、利用可能なトランスジェニック植物、その産生方法、およびかかる植物の種および苗木、ならびに植物の木部において特定の遺伝子を発現させる方法、および核酸構築物を提供するものである。
【００１５】
図面の簡単な説明
本発明は、以下の記載、実施例、および図面においてより詳細に説明される。
図１は、ゲノム歩行フラグメント由来の一致配列を示す。１ａ）ＬＭＸ２  Ａ０１４Ｐ１０Ｕ；１ｂ）ＬＭＸ３  Ａ０４４Ｐ２６Ｕ；１ｃ）ＬＭＸ４  Ａ０５０Ｐ４９Ｕ；１ｄ）ＬＭＸ５  Ａ０５５Ｐ１９Ｕ；１ｅ）ＬＭＰ１  Ａ００１Ｐ７９Ｕは配列番号１〜５の配列に対応する。
下線を引いた配列＝プロモーター配列（ＧＵＳ構築物の一部）
イタリック体の配列＝ＥＳＴ由来の配列
ＡＴＧ（太字）＝可能性のある転写開始コドン
【００１６】
図２は、トルイジンブルーで染色した雑種アスペンの幹の切断面を示す。試料の位置を、切断面下の黒の矢印で示す。
図３は、プロモーターがクローン化された、５個のＥＳＴの発現パターンを示す。これは、それぞれのプロモーターにより引き起こされる主な発現に対応する。
【００１７】
図４は、異なる植物組織における選択した遺伝子の発現レベルのノーザンブロット分析結果を示す。
レーン１：頂芽：茎頂の先端約１ｃｍ。
レーン２：葉脈：古い葉から集めた主要葉脈。
レーン３：伸長幹：頂芽より下から幹の８番目の節までの節間。葉と芽を全て取り除いたもの。
レーン４：古い葉：１５ｃｍより大きい、状態の良い葉。葉柄および主要葉脈を取り除いたもの。
レーン５：師部：１５ｃｍの幹断片を集めたもの。これらは、木部および樹皮の内側を解体することにより、師部調製物および木部調製物用に用いられたもの。
レーン６：根：根毛の全くない根端の先端部２〜３ｃｍ。
レーン７：幼若な葉：１２ｃｍ未満の大きさの葉。葉柄および主要葉脈を取り除いたもの。
レーン８：木部：解体された木質側である、幹断片（レーン５参照）として収集された組織。
【００１８】
詳細な説明
定義
説明中、木部形成組織における用語「木部」は、全ての維管束組織（これを通じて、植物の水分およびミネラルの多くが導かれる）を包含することが意図されている。木部の細胞を導く原理は、仮導管と管状要素、または管状要素である。両方とも、二次壁を有し、成熟時にプロトプラストを失っている、細長い細胞である。木部組織はまた、種々の物質を貯蔵する柔細胞を含有する。
【００１９】
用語「維管束形成層」は、分裂により二次木部および二次師部を生じる、維管束分裂組織母細胞を包含することが意図されている。
【００２０】
用語「木質」または「木質形成細胞」は、代謝現象および過程が、維管束分裂組織およびその最終生成物全ての発生に関与する、全ての細胞を包含することが意図されている。用語「木質」もその最も一般的な意味で用いられ、硬い木質および柔らかい木質両方を包含する。
【００２１】
用語「木質形成特性」は、生物学的、化学的、かつ生理学的特性、例えば、細胞伸長、細胞エクスパンジョン、アポトーシス、炭水化物組成、繊維の長さ、繊維の厚さ、および他の繊維の特性（これらに限定しない）を包含する。
【００２２】
「相同性」は、本明細書において、配列間の類似性の程度として用いられる；２つの配列間の配列相同性が高くなればなるほど、ハイブリダイゼーションの程度が高くなる。ハイブリッド形成は、既知の方法を用いて当業者により測定され得る。
【００２３】
本発明において、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、より好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９３％、より好ましくは、少なくとも９４％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、そして最も好ましくは、少なくとも９９％の相同性を有する配列が包含される。
【００２４】
「機能的相同」は、おそらく、開示された配列と低い構造的相同性を有するが、状態の良いあるいは障害された生物体のいずれかにおいて、インビボで相同な機能を示す（例えば、類似の細胞機能を有する、類似または非常に類似するタンパク質をコードする）、配列を意味する。本発明は、開示された配列と機能的に相同な配列を包含する。
【００２５】
本説明に照らして「相補性」は、２つのヌクレオチド間の正確な対形成能に言及している。
【００２６】
さらに、本発明に照らして、「ハイブリダイゼーション」は相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合に言及しており、これは、ワトソン・クリック型、フーグスティーン（Hoogsteen）型、または逆フーグスティーン型水素結合であってもよい。従って、相補性およびハイブリダイゼーションは、安定かつ特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的間で生じるように、十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために用いられる用語である。
【００２７】
アンチセンス化合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を標的とする化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能と干渉し、有用性を失わせ、かつ特異的結合が所望される条件下で、アンチセンス化合物の非特異的標的配列との非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するときに、特異的にハイブリダイズできる。
【００２８】
用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、当業者によく知られた温度および緩衝液に関する基準に言及している。例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA (1989)を参照。
【００２９】
「機能的に挿入された」または「作動可能に挿入された」は、配列が、宿主ゲノムに、必要に応じて該配列の正しい発現が生じる、かかる向き、位置、およびかかるプロモーターと共に挿入されたことを示す。
【００３０】
この文脈で用いられる「調節」は、遺伝子の発現の増大（刺激）または低減（阻害）のいずれかを意味する。本発明に照らし、増大が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲＮＡが好ましい標的である。
【００３１】
詳細な説明
発生ステージ特異的に発現する遺伝子を選択して、遺伝子発現を木部形成組織内の特定の細胞に指令するプロモーターが同定された。クローン化し、分析すると、これらのプロモーターは組織特異的であることを示した。これらのプロモーターを有すると、対象のいずれかの遺伝子の発現を木部発生の特定のステージにおいてもたらし、木部（木質）の産生および特性に作用することが可能となる。発現を変化させる方法は、対象遺伝子の異所性かつ過剰な発現、アンチセンス調節、ＲＮＡ干渉、遺伝子サイレンシング、リボザイムの使用などを含む。
【００３２】
ライブラリーは、細胞分裂領域（Ａ）；細胞エクスパンジョン（ＡＢＣ）；二次細胞壁形成（ＣＤＥ）；細胞アポトーシス（Ｅ）を示す、木部形成組織内の領域から創出された。図２参照。
【００３３】
組織試料は、接線方向の薄片を幹の形成層から取り、調製された。横断側の薄片は、後で正確な位置と各試料の組織内容物の同定が可能なように、平行に集められた。個々の薄片は３０μｍ×２ｍｍ×２０ｍｍであると測定され、これは切り立ての重さ約０．５ｍｇに対応した。薄片は、図２に示される異なる発生領域に一緒に集められた。異なる領域の薄片は、放射状の直径および細胞の構造的特性に基づくものである。これらの領域内での遺伝子プロファイルは、非常に高い程度の組織特異性を示した。
【００３４】
本発明は、遺伝子プロモーターおよびそれらの使用を開示し、該プロモーターは、ｃＤＮＡマイクロアアレイ分析の特徴決定により同定され、多数の配列から選択され、形成層からプログラム化された細胞死またはアポトーシスに入る細胞となる成熟木部要素に至る未分化分裂組織細胞にて見出されたものである。
【００３５】
本発明は、植物の木部形成組織において特異的に発現されるプロモーター配列を含む、利用可能な単離核酸配列を提供し、該配列は、配列番号１ないし５；配列番号１ないし５の該配列の１つを含む配列；配列番号１ないし５と機能的に相同な配列；または配列番号１ないし５の１つと、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、より好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９３％、より好ましくは、少なくとも９４％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、そして最も好ましくは、少なくとも９９％の相同性を示す配列から選択される。
【００３６】
上記の定義は、互いを排除しないが、共に作用し得る。例えば、より低い相同性、例えば、８０％の相同性または７０％の相同性を示すが、機能的にこれらの配列と等しい配列は、この定義に含まれる。本発明はまた、ストリンジェントな条件下でこれらの配列の少なくとも１つとハイブリダイズできる配列を包含する。
【００３７】
本発明の１つの態様は、上で定義された核酸配列であり、プロモーター配列が高等植物において発現するものである。好ましくは、該植物は双子葉植物である。植物の例としては、ポプラ、アスペン、シラカバ、ヤナギ、ユーカリ、モミジバフウ（liquidamber）などのような硬木本種、ならびにトウヒ、カラマツ、アメリカヅカ、およびマツなどの軟木本種（針葉樹）（これらに限らない）を含む。対象となる他の植物は、いわゆる繊維植物であり、例えば、綿、麻、サイザル、亜麻など（これらに限らない）を含む。プロモーターは、遺伝子の発現を維管束発生中にもたらすために、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、菜種などのような他の経済上重要な植物で用いられることもできる。
【００３８】
本発明は、その野生型と比較した場合、修飾された特性、例えば、その野生型と比較して、修飾された木質形成特性、修飾されたアポトーシス特性、変更された発根特性、変更された開花または葉のパターンなどを示す、利用可能なトランスジェニック植物（ここで、上記配列の少なくとも１つが機能的に挿入されている）を提供するものである。
【００３９】
トランスジェニック植物は、好ましくは、木本植物であり、最も好ましくは、木本双子葉植物である。トランスジェニック植物の例としては、ポプラ、アスペン、シラカバ、ヤナギ、ユーカリ、モミジバフウ（liquidamber）などのような硬木本種、ならびにトウヒ、カラマツ、アメリカヅカ、およびマツなどの軟木本種（針葉樹）（これらに限らない）を含む。対象の他の植物は、いわゆる繊維植物であり、例えば、綿、麻、サイザル、亜麻（これらに限らない）などを含む。プロモーターは、遺伝子の発現を維管束発生中にもたらすために、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、菜種などのような他の経済上重要な植物において用いられることもできる。
【００４０】
本発明はまた、植物の特定の領域、好ましくは、植物の木部において特定の遺伝子を発現させる、利用可能な方法（上記の配列の少なくとも１つが用いられ、該植物に機能的に挿入されている）を提供するものである。結果として、本発明は、植物、特に、木本植物（上で定義されたプロモーターが用いられている）において木部形成組織発生過程を調節することを可能とする。
【００４１】
本発明はまた、配列をそのゲノムに有する、本発明の植物の植物再生物、例えば、種、果実、切枝、およびプロトプラスト、植物細胞、カルスまたは根のような植物の部分を包含する。
【００４２】
本発明によりまた包含される中間体は、上で定義された配列を含む核酸構築物である。かかる構築物は、好ましくは、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはバクテリオファージから選択されるベクターを含む。
【００４３】
本発明はまた、該植物の野生型と比較して、修飾された木質形成および／またはアポトーシス特性を示す、トランスジェニック植物（上で定義されたプロモーターが植物に機能的に挿入されている）の産生方法を含む。
【００４４】
当業者が、ベクターを構築し、組換え遺伝子発現のプロトコールを設計することは十分可能である。
【００４５】
プロモーター配列、翻訳リーダー配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、エフェクター遺伝子、マーカー遺伝子、および所望に応じて他の配列を含む適当な調節配列を含有する、適したベクターが選択されるか、あるいは構築され得る。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【００４６】
例えば、核酸構築物の製造、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析における多くの既知の核酸操作技術およびプロトコールが、Ausabel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2nd edition, John Wiley Sons, 1992において詳細に記載されている。
【００４７】
抗生物質に対する耐性のような選択可能なフェノタイプをもたらすキメラ遺伝子からなる、選択可能な遺伝子マーカーが用いられてもよい。かかる選択可能なマーカーは、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスホイノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン、Ｄ−アミノ酸、およびグリホセートを含み得る。
【００４８】
本発明により、天然環境から単離および／または精製され、実質的に純粋または均質な形態、あるいは所望の機能を有するプロモーターをコードする配列以外の、対象または起源である種の核酸または遺伝子のない、核酸分子およびベクターが提供され得る。本発明による核酸は、ゲノムＤＮＡを含み、これは、完全または部分的に合成物であってもよい。用語「単離する」は、これら全ての可能性を包含する。
【００４９】
配列番号１〜５の配列、該配列の１つと機能的に相同な配列、または該配列の１つと少なくとも９０％の相同性を示す配列の少なくとも１つを含有する、これらのＤＮＡセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝子操作として既に知られている標準的な技術により産生され得る。ＤＮＡは、植物細胞に、アグロバクテリウム属により担持される安全なＴｉ−プラスミドベクター（その天然遺伝子輸送能を活用するものである）、粒子または微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接的ＤＮＡ取込みの他の形態、リポソーム介在性ＤＮＡ取込みのようないずれかの適した技術を用いて形質転換され得る。植物細胞の形質転換の物理的方法は、Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11において概説されている。
【００５０】
形質転換に続き、植物は、例えば、１つの細胞、カルス組織、葉片から再生され、これは当該技術分野で標準的なことである。ほぼ全ての植物は、植物の細胞、組織、および器官から完全に再生されることができる。利用可能な技術が、Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II, and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984；Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989；またはClapham et al., Gene Transfer by particle bombardment and Embryonic cultures of Picea abies and the production of transgenic plantlets. Scandinavian Journal of Forest research 15 (2000) 151-160において概説されている。
【００５１】
形質転換技術の具体的な選択は、ある種の植物種を形質転換するためのその効率、ならびに具体的な方法論を選択して本発明を実施する人の経験および好みにより決定されるだろう。当業者にとって、核酸を植物細胞内に導入する形質転換システムの具体的な選択は本質ではなく、あるいは植物再生の技術の選択、または形質転換された植物のその後の操作について選択された技術のいずれも本発明を制限しないことは明らかであろう。
【００５２】
実施例
１．実験系
木部発生は植物の発生の特定の形態であり、これは、シロイヌナズナおよびジニア（Zinnia）を含むいくつかの系で研究されてきた。しかしながら、ポプラの幹の高度に組織化された構造により、所定の発生ステージで特定の組織の正確かつ厳密な試料採取が可能となるので、インビボでの研究にはポプラの系が優れている。
【００５３】
二次木部は高度に組織化されており、異なる細胞株の発生は、空間的に厳密に調整されている。本発明者等は、所定の発生ステージの異なる組織を、形成層からクライオトームを用いて切り離し、３０μｍの薄片を接線方向に低温切断することで、切りたての重さ約０．５ｍｇのものを得た。この薄切技術により、図２に示す分化の特定ステージの細胞について高度に濃縮された試料を得た。木本形成の個体発生：Ａ）分裂組織細胞、Ｂ）早期エクスパンジョン、Ｃ）後期エクスパンジョン、Ｄ）早期二次壁形成、およびＥ）後期ステージの細胞成熟を包含する、５種類の試料を収集した。
【００５４】
他の分裂組織同様、維管束形成層（図２、領域Ａ参照）の主な機能は、細胞分裂、および分化のパターンを設定することである。しかし、頂部分裂組織とは異なり、維管束形成層は、２つの形態学的に異なる始原細胞；軸方向に細長い紡錘状始原細胞および等径の放射組織始原細胞を含有する。両タイプの始原細胞は、並層分裂し、師部および木部要素からなる放射状細胞株を生じる。紡錘状始原細胞からの誘導体は、軸方向の細胞系を作り上げる。ポプラのような被子植物樹木の木質において、これは、２つの主要な細胞タイプ、水分輸送において機能する導管要素、および幹を機械的に支持する繊維からなる。放射組織始原細胞は、師部樹液により供給される炭水化物、および木部樹液において供給される無機物の側部輸送において主に機能する、水平に方向付けられた放射組織細胞を生じる。幹の直径が増大するにつれて、より多くの始原細胞が必要となる。紡錘状始原細胞は偽横垂層分裂により形成され、娘細胞の短縮化を生じる。それゆえ、紡錘状始原細胞は、形成層分裂組織において分裂し、かつ伸長する。
【００５５】
細胞エクスパンジョン領域において、異なる極性を有する形成層誘導体は、細胞タイプに依存して広がる（図２、領域ＢおよびＣ）。繊維の発生は、放射状にエクスパンジョンし、かつ頂部成長により長さが増大するのに対し、導管は放射方向にのみエクスパンジョンする。導管エクスパンジョンは急速で、繊維エクスパンジョンよりずっと広範囲である。これにより、これらの細胞に形態学的特徴を与える。導管の分化はまた、繊維および放射組織の発生よりずっと速い速度で進行し、そしてそれらは同時に起こる。導管は、それにより二次壁をすぐに領域Ｃにおいて形成し、それらの成熟を領域Ｅにおいて成し遂げる。分裂およびエクスパンジョンステージ（領域Ａ、Ｂ、およびＣ）において、一次壁（ポプラでは、主にセルロース、ヘミセルロース、およびペクチンからなる）の連続的生合成が必要である。導管と接触している繊維要素および放射組織細胞（接触放射組織）は、導管と接触しない繊維および放射組織細胞（単独放射組織）より若干速く分裂する。それゆえ、領域Ｃは、一次および一次＋二次壁細胞タイプの混合物を含有する。
【００５６】
細胞エクスパンジョンが完了したらすぐに、二次壁が全ての木部細胞（領域Ｄ）に蓄積される。発生のこのステージの特徴的特性の１つは、一次壁に存在するセルロースミクロフィブリルのランダムな組織化が、この時点で二次細胞壁の高度に組織化されたへリックス構造に変化することである。二次壁のセルロースおよびヘミセルロースフレームワークは、セルロースミクロフィブリル方向の程度から認識され得る、いくつかの壁層（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）に蓄積していく。二次壁肥厚化の最終ステージにおいて、セルロースおよびヘミセルロースネットワーク内の内部空間が木質化される。これは、細胞コーナーから始まり、内部へ進行する。二次壁の形成中、木部要素も広範囲で形作られ、導管／導管、および導管／放射状組織接触を可能とする壁孔および気孔ネットワークが形成される。この活性は、一次壁のパターン化された分解に関与する。成熟過程の最後（ゾーンＥ）において、繊維は、プログラム化された細胞死に入る（導管は、より早く領域ＣおよびＤにおいてプログラム化された細胞死に入る）。対照的に、放射組織細胞は周辺細胞の木質化に関与し、液材中で何年もの間生き続ける。
【００５７】
２．プロモータークローニングおよび配列決定
本発明者等は、組織特異的な遺伝子プロモーターを同定するという課題に、組織特異的な転写物のプロファイリングを行うことで、取り組んだ。低温薄切により、特定の種類の細胞で高度に濃縮された試料を得ることが可能となる。低温薄切技術と共に、組織の組織化された性質により、特定の細胞タイプで高度に濃縮された試料が提供され、これにより、本発明者等は組織特異的な転写物のプロファイリングを行うことが可能となる。
【００５８】
本発明者等は、雑種アスペン（ポプラトレムラ×トレムロイデス）の５種類の遺伝子の５’上流配列をクローン化した。これらの遺伝子は、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析（Hertzberg et al., 2001 PNAS）に基づく、木部（木質）形成の特定フェーズにおいて全て発現される。多数の選択基準を設定し、所望の結果を確かなものとした。選択基準は、ＥＳＴはシロイヌナズナプロテオームにおいてＢＬＡＳＴＸヒットを有していなければならないこと（これは、ＥＳＴが完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、それによりおそらく完全な転写物を含有することを示す）；ＥＳＴは、ｃＤＮＡマイクロアレイデータ（Hertzberg等）に基づき、対象領域において明らかに異なる発現を示し、およびまた、そのＥＳＴの発現をもたらすプロモーターが強力であることを示唆する、強力なハイブリダイゼーションシグナルを有していなければならないこと、を含む。
【００５９】
５種類の遺伝子Ｉ〜Ｖを、以下の表１で示すＥＳＴで表す。表中、クローン化したプロモーターフラグメントに用いた名前、ならびにプロモーターが優性活性である領域も示す。
【００６０】
表１
【表１】
2007528701.tif 000003
ＡＩ１６３５４８  ＥＳＴの発現パターンは、同じ遺伝子から生じたＥＳＴであるＡＩ１６２９２８（Ａ０２７Ｐ１９Ｕ）の発現パターンに基づく。
【００６１】
植物の異なる部分のこれらの遺伝子の発現パターンを、ノーザンブロット分析を用いて分析した。このデータは、遺伝子ＬＭＸ２ないしＬＭＸ５全てが、二次木部で優性発現することを示している。ＬＭＰ１遺伝子は、より一般的な発現パターンを示すが、顕微鏡分析から示唆される維管束形成層（３および５）を含有する試料において、最も高いシグナルを有する。これらの結果は、これらの遺伝子が、形成層細胞分化において優性発現し、他の過程において優先発現しないことを示す。このことは、これらの遺伝子の５’領域（プロモーター）にさらにすすみ、クローン化することに必須の条件である。
【００６２】
ノーザンブロット分析、材料と方法
トータルＲＮＡを、ＣＴＡＢベースの方法（Plant Molecular Biology Reporter volume 11 (2) 1993）を用いて調製し、次に、ＲＮＡをQIAGEN Rneasy［登録商標］Plant Mini Kitを用いて精製した。ＲＮＡ濃度をRibo Green［登録商標］ＲＮＡ定量キット（Molecular Probes Eugen, Oregon）を用いて測定し、ＲＮＡの純度をアガロースゲル電気泳動によりチェックした。異なる試料由来の等量のＲＮＡ（１５μｇ）を、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離させた（Sambrook, J； Fritsch, E, Maniatis, T., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, New York, 1989）。次に、ＲＮＡを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋フィルターに標準的方法でブロットし、フィルターにＵＶ架橋結合させた。ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩフラグメントをＥＳＴクローンから回収した。フラグメントを、AmbionのStrip-EZ［登録商標］ＤＮＡ標識キットを用いて標識した。ハイブリダイゼーションを、チャーチ（Church）バッファー中６５℃にて行った（Church, G.M. and Gilbert, W. Genomic Sequencing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 1991-1995, 1984）。次に、濾液を（６５℃にて）２回、１５分間、０．５％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４  ｐＨ７．２、５％  ＳＤＳ中にて洗浄し、４回、５分間、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４  ｐＨ７．２、１％  ＳＤＳにて洗浄した。ハイブリダイゼーション結果を、ホスホイメージャー（Molecular Imager System GS525）を用いて分析した。それぞれの濾液を最大２回用い、Strip-EZ［登録商標］ＤＮＡキットプロトコールを用いて、再プローブ結合前に剥離させた。
【００６３】
プロモータークローニングおよび植物の形質転換
上流ゲノムＤＮＡ配列を、ClontechのUniversal GenomWalker［登録商標］キットを用いて、製造元の提言に従いクローン化した。８種類のゲノム歩行ライブラリーを構築し、用いた。最も長い、あるいはある場合では、最も特異的に増幅されたフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター（Promega）にクローン化し、配列決定した。ＥＳＴクローンの配列決定後、仮想翻訳開始コドン（シロイヌナズナプロテオームにおける最適ＢＬＡＳＴＸヒットの開始コドンに基づく）を配列上で位置決定した（図１、配列１〜５参照）。これに基づき、仮想プロモーターを、雑種アスペンゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いてクローン化し、次に、ｐＰＣＶ８１２．ｋｍ（R. Walden, C. Koncz, J. Schell. Methods in Plant Moll Cell Biol. 1, 175 (1990)）またはｐＧＷＦＳ７（M. Karimi, D. Inze and A. Depicker. Trends in Plant Sciences 7 (5)193-195, 2002）にライゲーションし、転写プロモーターＧＵＳレポーター構築物を得た。プロモーターフラグメントを、開始コドン上流１０〜５０ｂｐからできる限り５’側で切断し、１０９３から１８０７ｂｐの範囲の５’配列を得た。これらの構築物を、雑種アスペンクローンＴ８９にアグロバクテリウム属を用いて形質転換し、トランスジェニック植物を産生した（Nilsson O. et al., Spatial pattern of cauliflower mosaic virus 25S promoter luciferase expression in transgenic hybrid aspen trees monitored by enzymatic assay and non-destructive imaging. Transgenic research 1. 209-220 (1992)）。発根後、植物を、５０％  膨張粘土（Leca lauttklinker, サイズ２〜６ｍｍ）および５０％  土（Weibulls kronmull, YrkesPlantJord）中に鉢植えし、温室にて、明１８時間、暗６時間の周期で、Osram Powerstar HQI BT 400Wランプを補充光として用いて成長させた。
【００６４】
ＧＵＳ分析
ＧＵＳレポーター遺伝子の発現を視覚化するために、組織薄切および部分を、本質的にはNilsson等（The Agrobacterium rhizogenes rolB and rolC promoters, Physiologia Plantarum 100: 456-462 (1997)）およびRegan等（Accurate and high resolution in situ hybridization analysis of gene expression in secondary stem tissues, Plant J. 19, 363-369 (1999)）に従い、Ｘ−ｇｌｕｃ染色した。プロモーターＬＭＸ５の初期結果は、維管束が（シロイヌナズナおよび雑種アスペンの両方で）発現と関連することを示し、ＬＭＰ１の結果は、維管束がシロイヌナズナにおいて発現と関連し、根および頂部の分裂組織が、雑種アスペンにおける植物再生中の発現と関連することを示す。
【００６５】
これらの結果は、木部関連発現に必要なシス作用性エレメントがこれらの構築物に含まれていることを示し、このことは、これらの配列の位置が転写開始のさらなる上流（５’）およびまた３’側であり得る場合、明らかでなく、それゆえ驚くべき結果である。
【００６６】
高さ２〜３ｍのより高い植物におけるＬｍｐ１およびＬｍｘ５プロモーターのさらなる、そしてより詳細な分析を優先期間中に行い、これら２つのプロモーターそれぞれについて非常に特異的な発現パターンを明らかにした。Ｌｍｐ１  Ｇｕｓ株の幹において、Ｇｕｓ活性は、主に、形成層細胞＋エクスパンジョン発生中の木部に存在するが、二次細胞壁を生じる幼若細胞においてより低い程度で存在した。Ｌｍｘ５は、二次細胞壁を生じる幼若細胞において最も高発現し、形成層およびエクスパンジョン中の木部細胞においてより低く発現する、逆の発現パターンを有していた。Ｌｍｐ１およびＬｍｘ５の両方が、形成層の細胞、および幼若二次細胞壁形成細胞全てで発現する。
【００６７】
これらのプロモーターは、根端、および葉と根の導管構造で活性であった。これらのプロモーターの全てが、頂部分裂組織で全く発現しないようであるが、それらの両方が幼若木部において発現する（特に、Ｌｍｐ１は、発生中の導管構造の頂部分裂組織近くで発現する）。Ｌｍｘ５はまた、発生中の導管構造において発現するが、その後のステージでは発現しない。
【００６８】
Ｌｍｘ２、Ｌｍｘ３、およびＬｍｘ４を、組織培養後期のポプラトランスジェニックにおいて分析した。これら３種のプロモーターを、ｐＫＧＷＦＳ７ベクターにクローン化した。Ｌｍｘ２は、葉、幹、および根の導管構造において発現した。それは根端においても発現した。幹において、主な発現は形成層、および二次細胞壁形成細胞への全ての通路においてでであることを見出した。Ｌｍｘ３は類似の発現パターンを有するが、それは根端では発現しないが、根端から約０．５から７ｍｍの根の導管構造ではっきりと発現するという著しい差を伴っていた。Ｌｍｘ３はまた、頂部分裂組織および幼若葉始原において発現し、その後、葉および一次幹発生では、導管構造に限定される。Ｌｍｘ４遺伝子は、組織培養物に存在する幼若組織で低く発現するが、導管構造での発現を、特に、分析した試料中の最も古くからある導管構造においてはっきりと観察できた。
【００６９】
本発明は、好ましい実施態様に関して記載され、これは本発明者等が現時点で知る最良の形態を構成するが、当業者にとって明らかな種々の変更および修飾が、添付の請求の範囲に説明される本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは理解されるべきである。
【００７０】
参考文献
Ausabel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2nd edition, John Wiley Sons, 1992
Church, G.M. and Gilbert, W. Genomic Sequencing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 1991-1995, 1984
Clapham et al 2000, Gene Transfer by particle bombardment and Embryonic cultures of Picea abies and the production of transgenic plantlets. Scandinavian Journal of Forest research 15,151-160
Hertzberg, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 (98) 14732-14737
Karimi, M., Inze D. and Depicker, A., Trends in Plant Sciences 7 (5)193-195, 2002
Nilsson O. et al., Spatial pattern of cauliflower mosaic virus 25S promoter luciferase expression in transgenic hybrid aspen trees monitored by enzymatic assay and non-destructive imaging. Transgenic research 1. 209-220 (1992)
Nilsson et al., The Agrobacterium rhizogenes rolB and rolC promoters, Physiologia Plantarum 100: 456-462 (1997)
Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11
Regan et al., Accurate and high resolution in situ hybridization analysis of gene expression in secondary stem tissues, Plant J. 19, 363-369 (1999)
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA (1989)
Sterky, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 (95), 13330-13335
Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II, and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984
Walden, R., Koncz, C., Schell, J., Methods in Plant Moll Cell Biol. 1, 175 (1990)
Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１ａ】図１は、ゲノム歩行フラグメント由来の一致配列を示す。
【図１ｂ】図１は、ゲノム歩行フラグメント由来の一致配列を示す。
【図１ｃ】図１は、ゲノム歩行フラグメント由来の一致配列を示す。
【図１ｄ】図１は、ゲノム歩行フラグメント由来の一致配列を示す。
【図１ｅ】図１は、ゲノム歩行フラグメント由来の一致配列を示す。
【図２】図２は、トルイジンブルーで染色した雑種アスペンの幹の断面を示す。
【図３】図３は、プロモーターがクローン化された、５個のＥＳＴの発現パターンを示す。
【図４】図４は、異なる植物組織における選択した遺伝子の発現レベルのノーザンブロット分析結果を示す。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月20日(2005.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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