(57)【要約】  本発明は、生物学的、環境的、または化学的サンプルから標的を分離および／または剥離するための改良された方法、組成物、および装置を提供する。
2007502420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均質なサンプルから標的を分離する方法であって、
（ａ）前記サンプルと基質とを、前記基質が前記標的と結合して、基質−標的複合体を形成するために十分な時間接触させること、基質は、非標的材料に対してよりも、前記標的に対して高いアフィニティーで結合する：
（ｂ）前記サンプルから前記基質−標的複合体を除去し、それによって前記不均質なサンプルから前記標的を分離することを含む、方法。
【請求項２】
前記基質−標的複合体を形成するための前記十分な時間は、１５分未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質−標的複合体を形成するための前記十分な時間は、５分未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基質を、１以上の表面変性剤で変性して表面変性基質を形成し、前記表面変性基質は、非標的材料に対してよりも、前記標的に対して高いアフィニティーで結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１以上の表面変性剤は、図２、図３または図１０のいずれかに示される作用物質から選択され、該表面変性基質は、非標的材料に対してよりも、前記標的に対して高いアフィニティーで結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記基質は、磁性基質、または常磁性基質である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
前記１以上の表面変性剤は、前記基質に分裂可能なリンカーを介して付加される、請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的は、真核生物細胞、古細菌、細菌細胞もしくは胞子、またはウイルス粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小有機分子、または化学化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記不均質なサンプルは、生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
不均質なサンプルは、乾燥サンプル請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記乾燥サンプルと前記基質を接触させる前に、前記乾燥サンプルに液体を添加する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）前記基質−標的複合体を溶出緩衝液と、前記基質から前記標的が溶出するために十分な時間接触させ、それによって、前記基質から前記標的を分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質から前記標的を溶出するための前記十分な時間は、１５分未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質から前記標的を溶出するための前記十分な時間は、５分未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質から前記標的を溶出するための前記十分な時間は、１分未満である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｄ）前記分離した標的を分析すること、をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
不均質なサンプルから標的を分離する方法であって、
（ａ）前記サンプルと基質とを、前記基質が前記標的と結合して基質−標的複合体を形成するために十分な時間接触させること、基質は、非標的材料に対してよりも、前記標的に対して高いアフィニティーで結合する、
（ｂ）前記サンプルから前記基質−標的複合体を除去し、それによって前記不均質なサンプルから前記標的を分離させること；
（ｃ）前記基質−標的複合体と溶出緩衝液とを、前記標的が前記基質から溶出されるのに十分な時間接触させ、それによって前記基質から前記基質を分離させることを含み、
前記標的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、真核生物細胞、古細菌、細菌細胞もしくは胞子、ウイルス、小有機分子、または化学化合物を含み、前記分離方法は、不均質なサンプルから、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、真核生物細胞、古細菌、細菌細胞もしくは胞子、ウイルス、小有機分子、または化学化合物を分離することを含む、方法。
【請求項１９】
（ｄ）前記分離した標的を分析することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離した標的の分析は、前記分離した標的からのＤＮＡまたはＲＮＡを分析することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記基質−標的複合体を形成するための前記十分な時間は、１５分未満である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記基質−標的複合体を形成するための前記十分な時間は、５分未満である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記基質は、１以上の表面変性剤を用いて変性され、表面変性基質を形成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記１以上の表面変性剤は、図２、図３、または図１０のいずれかに示される作用物質から選択され、該表面変性基質は、非標的材料に対してよりも、１以上の標的に対して高いアフィニティーで結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質は、磁性基質、または常磁性基質である、請求項１８または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記１以上の表面変性剤は、分裂可能なリンカーを介して前記基質に付加される、請求項２３または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質から前記標的を溶出するための前記十分な時間は、１５分未満である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記基質から前記標的を溶出するための前記十分な時間は、５分未満である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記基質から前記標的を溶出するための前記十分な時間は、１分未満である、請求項２８に記載の方法
【請求項３０】
１以上の表面変性剤を用いて変性し、表面変性基質を形成する基質であり、前記１以上の表面変性剤は、図２、図３または図１０のいずれかに示される作用物質から選択され、該表面変性基質は、非標的材料に対してよりも、１以上の標的に対して高いアフィニティーで結合する、基質。
【請求項３１】
前記基質は、磁性基質または常磁性基質である、請求項３０に記載の表面変性基質。
【請求項３２】
１以上の表面変性剤は、前記基質に分裂可能なリンカーを介して付加される、請求項３０に記載の表面変性基質。
【請求項３３】
前記表面変性基質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小有機分子、または化学化合物と結合する、請求項３０に記載の表面変性基質。
【請求項３４】
前記表面変性基質は、真核生物細胞、古細菌、細菌細胞もしくは胞子、またはウイルス粒子である、請求項３０に記載の表面変性基質。
【請求項３５】
表面変性基質は、ある種からの真核生物細胞、古細菌、細菌細胞もしくは胞子、またはウイルス粒子に対しては、別の種からの真核生物細胞、古細菌、細菌細胞もしくは胞子、またはウイルス粒子に対するよりも高いアフィニティーで結合する、請求項３４に記載の表面変性基質。
【請求項３６】
表面変性基質は、少なくともある種からの細菌細胞に対しては、少なくともある種からの細菌胞子に対するよりも高いアフィニティーで結合する、請求項３４に記載の表面変性基質。
【請求項３７】
表面変性基質は、少なくとも１つの種からの細菌胞子に対しては、少なくとも１つの種からの細菌細胞に対するよりも高いアフィニティーで結合する、請求項３４に記載の表面変性基質。  
【請求項３８】
前記基質はビーズであり、前記ビーズは粒径が０．１μｍ乃至１２０μｍである、請求項３０に記載の基質。
【請求項３９】
前記基質は、直径が０．５ｍｍ乃至１０ｍｍである、請求項３０に記載の基質。
【請求項４０】
前記基質は、チューブまたは培養容器である、請求項３０に記載の基質。
【請求項４１】
１以上の層を含むフィルターであって、前記１以上の層の少なくとも１つは、１以上の基質を含み、前記１以上の基質は、１以上の表面変性剤で変性され、請求項３０に記載の表面変性基質を形成する、フィルター。
【請求項４２】
前記フィルターは、１以上の基質を含む１つの層をさらに含み、前記基質は、多数の表面変性剤で変性されている、請求項４１に記載のフィルター。
【請求項４３】
前記フィルターは、多数の層を含む、請求項４１に記載のフィルター。
【請求項４４】
前記基質は、２以上の表面変性剤で変性されている、請求項３０に記載の表面変性基質。
【請求項４５】
請求項３０に記載の表面変性基質を含む、カートリッジ。
【請求項４６】
標的を放出する方法であって、前記標的は、基質に結合して、標的−基質複合体を形成しており、前記方法は、前記標的−基質複合体と溶出緩衝液を、溶出時間である一定時間接触させ、それによって標的−基質複合体を分裂させ、前記基質から前記標的を放出させることを含む、方法。
【請求項４７】
前記溶出緩衝液が子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記溶出緩衝液が約ｐＨ１１乃至１３である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶出緩衝液が約ｐＨ１１．５乃至１２．３である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記溶出時間が１〜１０分である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記溶出時間が１〜５分である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記溶出時間が１分未満である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
標的を捕捉する方法であって、前記標的を含有するサンプルを一定量の基質と、捕捉時間、すなわち、標的を捕捉し、標的−基質複合体を形成するのに十分な時間である一定時間接触させることを含み、前記捕捉時間は１〜１０分である、方法。
【請求項５４】
前記捕捉時間が１〜５分である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記捕捉時間が１分未満である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記基質の量がサンプルの約１〜５ｍｇ／ｍＬである、請求項５３の方法。
【請求項５７】
前記基質の量がサンプルの約１ｍｇ／ｍＬである、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記基質の量がサンプルの約１ｍｇ／ｍＬ未満である、請求項５７の方法。
【請求項５９】
不均質なサンプルから標的を分離する方法であって、
（ａ）前記サンプルと、前記表面変性基質が前記標的と結合して基質−標的複合体を形成するのに十分な時間、１以上の表面変性剤で変性した基質とを接触させて、表面変性基質を形成し、その表面変性基質は、非標的材料に対してよりも、前記標的に対して高いアフィニティーで結合しており、前記１以上の表面変性剤は、分裂可能なリンカーを介して前記基質に付着しており；
（ｂ）前記サンプルから前記基質−標的複合体を除去し、それによって前記不均質なサンプルから前記標的を分離し；
（ｃ）前記分裂可能なリンカーの分裂を誘導し、それによって前記基質から標的を分離することを含む、方法。
【請求項６０】
（ｄ）前記分離した標的を分析すること、さらに含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記分離した標的を分析することは、前記分離した標的からのＤＮＡまたはＲＮＡを分析することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記分裂可能なリンカーは、フロリド不安定アルキルシリル（fluoride labile alkysilyl）リンカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記分裂可能なリンカーは、酸不安定カルボニル（acid labile carbonyl）リンカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記分裂可能なリンカーは、塩基不安定カルボニル（base labile carbonyl）リンカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記分裂可能なリンカーは、求核性不安定カルボニル（nucleophile labile）リンカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記分裂可能なリンカーは、フォト不安定（photo labile）リンカーである、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２００３年８月１２日に出願された米国特許出願第６０／４９４，７０２号の優先権を主張する。これらの出願の内容全体を本明細書中に引用によって援用する。
【０００２】
政府援助
本発明は、全体的に、または部分的に、Defense Directorate of
Research and Engineeringからの援助（Lincoln契約番号：Ｆ１９６２８−９５−Ｃ−０００２）を受けた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
背景技術
生物学的、化学的および環境的研究はしばしば、不均質な材料個体群の中から、特定の標的を分離する必要がある。しばしば、特定の標的の分離、ならびに、さらなる分析は、（ａ）不均質な材料開始混合物の濃度が極めて低いこと、（ｂ）標的を劣化させる作用物質の存在、（ｃ）標的の単離を阻害する作用物質の存在、および（ｄ）単離後の標的の分析を阻害する作用物質の存在、といったファクターによって妨害される。最も有利な方法および組成物を用いれば、広範囲の、非標的の材料の不均質な混合物を含有する液体または固体サンプルのいずれかから低濃度の標的を容易に分離することできる。そのような方法および組成物は、標的の完全性を維持する（例えば、劣化または異物混入を阻害する）ことを助ける、および／または標的のさならる分析を妨害する作用物質（例えば、ＤＮＡサンプルのＰＣＲ分析を妨害する作用物質、タンパク質サンプルの質量分光分析を妨害する作用物質、または細菌またはウイルスの細胞学的分析を妨害する作用物質）の活性を阻害するために、さらに改変してもよいし、または既存の方法と組み合わせてもよい。
【０００４】
細胞生物学、分子生物学、化学、毒物学および薬理学を含む分野の進歩によって、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌細胞および胞子（グラム陽性およびグラム陰性を含む）、ウイルス（ＤＮＡベースおよびＲＮＡベースのものを含む）、小有機分子、および大きな化学化合物を含む、生物学的材料、化学的材料および環境的材料を分析するための種々の技術が生まれた。しかしながら、関連する標的材料を、サンプルに含有されている材料の不均質個体群から分離することができないため、多くの強力な分析ツールを効率的に適用できないことがある。本発明は、環境的、生物学的および化学的サンプルからの標的の分離および／または同定を容易にするための方法、組成物および装置を提供する。
【０００５】
[発明の概要]
本発明は、作用物質の不均質な混合物から標的を分離および／または同定するために使用することができる方法、組成物および装置を提供する。ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌細胞もしくは胞子、ウイルス、小有機分子、または化学化合物であり得る標的を分離することによって、標的のさらなる分析および同定が容易になる。本発明は、広範囲の法医学的、医学的、環境的、産業的、公衆衛生および対バイオテロリズムに適用され、広範囲の気体、液体および固体サンプルからの標的の分離に使用するのに好適である。  
【０００６】
第１の局面において、本発明は、不均質なサンプルから標的を分離するための、改良された方法を提供する。ある態様において、該方法は、関連する標的を含有するサンプルを標的と、非標的材料の基質に対してより高いアフィニティーで結合することが可能な基質と接触させることを含む。別の態様において、基質表面に、１以上の特定の標的のための基質のアフィニティーをさらに高める変性剤を塗布する。別の態様において、該基質に、本明細書に記載の変性剤を含有する１以上のアミンを塗布する。１以上の単純な変性剤を塗布した磁性基質または非磁性基質のいずれかを使用することは、特定の標的に対して免疫反応性を示す抗体を塗布したビーズを用いた標的の分離または検出に依存する分離技術にとって有意な進歩である。本明細書に開示されている、単一の変性剤は、抗体を塗布したビーズより安価かつ容易に作製されるだけでなく、それらはより一般的に適用可能であり、全ての可能な関連する標的と免疫反応性を示す抗体を同定および作製する必要はない。可能な標的のそのような広範囲の情報が必要であることは、これまでに適用可能であった一般的な適用可能性およびコスト効果をかなり制限するものである。
【０００７】
標的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌細胞もしくは胞子、ウイルス、小有機分子、または化学化合物であることができる。さらに、標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、ヒトもしくは非ヒト動物、植物、細菌、ウイルス、真菌類、または原生動物に由来し得る。本発明は、この方法を、単独、または既に開示されている、核酸の劣化または核酸サンプルと標的核酸のさらなる分析を阻害する作用物質の核酸への混入を阻害する条件下で核酸を分離および分析するためのＳＮＡＰ方法と組み合わせて用いることができる。
【０００８】
いずれかの方法を用いた標的の分離に続いて、細胞生物学、分子生物学、化学または毒物学におけるルーチンの技法を用いて標的をさらに分析することができる。標的に基づいて特定の技法を選択することができ、当業者は、容易に適切な技法を選択することができる。ある態様において、標的は、特定の生物学的または環境学的サンプルから取得されたＤＮＡである。そのＤＮＡの更なる分析はＤＮＡのＰＣＲ分析を含んでもよい。ＤＮＡは、特定の技法にしたがって、ヒト、動物、細菌、植物、真菌類、原生動物、またはウイルス起源とすることができる。別の態様において、該標的は、特定の生物学的または環境的サンプルから取得したＲＮＡであってもよい。また、ＲＮＡの分析は、ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析、またはＲＮＡのin situハイブリダイゼーション分析であってもよい。ＲＮＡは、ヒト、動物、細菌、植物、真菌類、原生動物、またはウイルス起源とすることができる。さらに別の態様において、標的は、特定の生物学的または環境学的サンプルから取得した細菌細胞または胞子を含むことができる。さらなる分析は、細菌細胞または胞子自身の分析を含むことができる。細胞または胞子を分析する方法の例としては、限定されないが、顕微鏡検査、培養、細胞学的試験、および細菌細胞表面マーカーの分析が挙げられる。さらに、標的細菌細胞または胞子の分析は、標的細胞または胞子から調製されたＤＮＡまたはＲＮＡの分析、ならびに細胞または胞子自身、および細胞または胞子から調製されたＤＮＡまたはＲＮＡの両方の分析を含み得る。さらに別の態様において、該標的は、特定の細胞学的サンプルまたは環境的サンプルから取得したタンパク質である。タンパク質は、技法の特定の適用にしたがって、ヒト、動物、細菌、植物、真菌類、原生動物またはウイルス起源であることができる。タンパク質のさらなる分析は、ペプチドシーケンシング、質量スペクトロスコピー、および１次元もしくは２次元のゲル電気泳動法を含み得る。
【０００９】
第２の局面において、本発明は、基質の表面と結合することが可能な特定の表面変性剤を提供する。１以上の表面変性剤によって変性された基質は、変性されていない基質または他の表面変性剤で変性された基質と比較して、特定の標的に対するアフィニティーが高くなっている。本発明は、限定されないが、プレート、チップ、カバーガラス、培養容器、チューブ、ビーズ、プローブ、光ファイバー、フィルター、カートリッジ、細片などを含む広範囲の基質の変性を意図している。さらに、本発明は、そのような基質が、限定されないが、プラスチック、ガラス、金属およびシリカを含むあらゆる広範囲の材料からなり得ること、さらに、その材料が磁性的または常磁性的性質を有し得ることを意図している。例示した基質から構成することができるように、好適な基質は、実際はあらゆる大きさや形状にすることができ、当業者は、特定の標的ならびにそれによって標的が分析されなければならない特定の材料に基づいて、好適な基質を容易に選択することができる。
【００１０】
ある態様において、基質は、１つの表面変性剤によって変性することができる。別の態様において、基質は、２以上の表面変性剤によって変性することができる。さらに別の態様において、表面変性剤は、基質から変性剤を剥がすことができる分裂可能なリンカーを介して基質に結合する。多数の表面変性剤を用いる場合、作用物質は、変性された基質が複数の標的を分離することができるように、それぞれ、同じ標的に対するアフィニティーを増加させるかもしれないし、または作用物質は、異なる標的に対するアフィニティーを増加させるかもしれない。さらに、多数の表面変性剤を用いる場合、作用物質はそれぞれ、特定の標的に対して、同じアフィニティーを有するかもしれないし、または特定の標的に対するアフィニティーは変化するかもしれない。 
【００１１】
第３の局面において、本発明は、生物学的、化学的、または環境的サンプルから標的を分離することができる装置を提供する。本発明は、２つのクラスの装置を含む。第１のクラスは、基質とサンプルの間の相互作用を容易にする装置を含む。そのような装置は、本発明の方法の大規模な実用化にとって特に重要である。実施例によって、土壌、水、または体液から少量のサンプルを分離するとき、変性された基質の、標的を含有するサンプルへの効率的な送達は直接的に成される。そのような状況においては、全てのサンプルを確実に基質に接触させることは比較的容易である。したがって、基質はサンプル全体において標的と相互作用する機会を持つ。しかしながら、より大きなサンプルに関しては、均一または不均一に大きなサンプル全体に分散するかもしれない標的に基質を確実に接触させるためには、あまり直接的なプロセスを用いない。そのような適用には、本発明は、標的を含有する大きなサンプル全体に、均一な混合を容易に行うための装置を提供する。この装置が適用される一例は、産業的な食物加工施設内である。食物、飲料、または種々の食物もしくは飲料の原料を含有する大きな容器には、加工または保存中、細菌、ウイルスまたは化学物質が混入するかもしれない。しかしながら、そのような潜在的に有害な混入物を効率的に検出することは、大量のサンプルによって妨害されるかもしれない。この第１のクラスの装置の一適用は、大量の食物または原料の質を定期的および効率的に評価することができる食品加工業においてである。
【００１２】
第２のクラスの装置は、別のコーティングされた基質、例えば、フィルターおよびカートリッジなどを提供する。それは、容易に標的を含有するサンプルを処理するために使用することができる。これらの装置には、生物学的、環境的および産業的といった広範囲の用途があり、固体、液体、または気体のサンプルを効率的に分析するために使用することができる。特に注目すべきことは、アフィニティープロトコル（Affinity Protocol）に基づいてサンプルを分析するフィルターおよびカートリッジは、単一で用いることができるし、または他の入手可能なフィルターおよびカートリッジと組み合わせて用いることができる。フィルターおよびカートリッジは、種々の状況のいずれにおいても用いることができる。
【００１３】
特に注目すべきことは、本発明の方法、組成物および装置は、従来の実験室または病院の状況、または他の実験室の器具や供給品へのアクセスが制限されている現場において使用することができる。さらに、本発明の組成物および装置を用いる際、その分離方法は、他の伝統的な分離方法より短い時間で行うことができる。サンプルを迅速に分析することができることは、多くの実験室および現場での適用のいずれにおいても重要である。実施例によれば、サンプル分析時間を減少させることによって、医師や病院はすぐに診断結果を患者に提供することができるようになる。これによって、治療開始までの時間が短くなり、患者の脱出（flight）や服薬不履行のリスクが減少する。さらなる実施例によれば、迅速な分析は、犯罪現場での調査を容易にする。さらに別の分析によれば、特定の産業もしくは自然事象に関連する環境汚染の分析が容易になる。  
【００１４】
前述のいずれにおいても、本発明の分離方法（フィルター、カートリッジ、または他の基質を用いて行われるかに関わらない）は、３０分未満に行うことができる。別の態様において、分離方法は、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９または８分以内に行うことができる。さらに別の態様において、分離方法は、７、６、５または４分以内に行うことができる。本発明の方法を用いて分離した標的は、他の迅速な分析技法を用いてさらに分析することができる。
【００１５】
前述のいずれにおいても、本発明の分離方法（フィルター、カートリッジ、または他の基質を用いて行われるかに関わらない）を行うために必要な時間は、標的を基質に結合するのに必要な時間（例えば、捕捉時間）を含み、また、基質から標的を分離するために必要な時間（例えば、溶出時間）を含むこともある。ある態様において、捕捉時間は、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９または８分以内とすることができる。別の態様において、捕捉時間は、７、６、５、４、３、２または１分以内とすることができる。別の態様において、捕捉時間は、５〜１０分、１〜５分、１分または１分未満とすることができる。本発明の方法によって捕捉された標的は、任意に基質から溶出することができる。溶出された標的は、任意に、さらに他の迅速な分析技法によって分析することができる。
【００１６】
別の態様において、溶出時間は、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９または８分以内とすることができる。別の態様において、溶出時間は、７、６、５、４、３、２または１分以内とすることができる。別の態様において、溶出時間は、５〜１０分、１〜５分、１分または１分未満とすることができる。本発明の方法によって溶出された標的は、任意に、さらに他の迅速な分析技法によって分析することができる。
【００１７】
前述のいずれにおいても、本発明の分離方法は、有効量の基質を用いることが必要かもしれない。いくつかの適用においては、高濃度の基質を用いることが有利であるかもしれないが、最小濃度の基質を使用することがその方法のコストを減少することを助けることになり、また、その分野における方法を容易にする助けとなる（例えば、使用する必要がある消費可能な試薬を減少させる）。ある態様において、基質の量は、サンプルに対して１０ｍｇ／ｍＬより多い。ある態様において、基質の量は、サンプルに対して１０ｍｇ／ｍＬ以下である。別の態様において、基質の量は、サンプルに対して７、６または５ｍｇ／ｍＬ未満である。さらに別の態様において、基質の量は、サンプルに対して４、３、２または１ｍｇ／ｍＬである。さらに別の実施例において、基質の量は、サンプルに対して５〜１０ｍｇ／ｍｌまたは１〜５ｍｇ／ｍＬである。 
【００１８】
特に記載がない限り、本発明のプラクティスは、当該技術分野の技量の範囲である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技法を採用するものである。そのような技法は、文献に記載がある。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Sambrook、FritschおよびManiatis編（Cold Spring
Harbor Laboratory Press: 1989）；DNA Cloning、第Ｉ、ＩＩ巻（D. N. Glover ed.、1985）；Oligonucleotide Synthesis （M. J. Gait編、1984）; Mullisら、米国特許第4,683,195号； Nucleic
Acid Hybridization （B. D. Hames & S. J. Higgins編、1984）；
Transcription And Translation （B. D. Hames & S. J. Higgin編、1984）；Culture Of
Animal Cells （R. I. Freshney、Alan R. Liss、Inc.、1987）；Immobilized Cells And Enzymes （IRL Press、1986）；B. Perbal、A Practical
Guide To Molecular Cloning （1984）；論文、Methods In Enzymology （Academic
Press、Inc.、N.Y.）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells （J. H. MillerおよびM. P. Calos
編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory）；Methods In Enzymology、第154巻、155巻（Wuら編）、Immunochemical
Methods In Cell And Molecular Biology （MayerおよびWalker編、Academic Press、London、1987）；Handbook Of Experimental Immunology、第I-IV巻（D. M. Weirおよび C. C.
Blackwell編、1986）；Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring
Harbor、N.Y.、1986）を参照されたい。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかであろう。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
（ｉ）概説
生物学的、化学的および環境的科学は、しばしば、標的を分析する必要があり、その標的をまず、材料の不均質個体群から分離もしくは検出しなければならない。このプロセスは、サンプル内に、標的を劣化し得る、または標的の後の分析を阻害する混入物の存在によってさらに複雑になるかもしれない。本発明は、不均質な材料個体群から標的を精製する際に用いられる方法、組成物および装置を提供する。これらの方法、組成物、および装置は、広範囲の標的（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌、および細菌胞子（グラム陽性およびグラム陰性を含む）、ウイルス（ＤＮＡベースおよびＲＮＡベースのものを含む）、小有機分子、および化学化合物）に用いることができ、生物学的、化学的および環境的など多様に適用される。
【００２１】
本明細書において詳細に概説した、改良された方法および組成物は、気体、液体および固体といった広範囲のサンプルから標的を分離または検出する可能性を非常に高めるものである。さらに、本発明は、分離の間、および更なる分析の前に、標的の完全性を維持することを助ける既に記載された方法および装置と組み合わせることができる。標的の完全性を維持することを助ける、そのような方法および組成物は、共係属の米国特許第２００３／０１２９６１４号（２００３年７月１０日出願）に記載されている。その全てを引用によって本明細書において援用する。簡単に述べれば、米国特許第２００３／０１２９６１４号は、標的を劣化させ得る、または標的と結合し得る、およびそのさらなる分析を阻害させ得るサンプル中の作用物質を阻害する組成物の存在下でサンプルを処理することによってサンプルから取得した、核酸の単離および分析を容易にするよう設計された方法および組成物を開示している。実施例によれば、サンプル中の作用物質は、核酸、例えば、ＤＮＡを劣化させることができる。この劣化は、所与のサンプル中のＤＮＡ濃度を低下させ、また、ＰＣＲなどのアッセイにおけるさらなる分析においてＤＮＡを処理することが困難となるようにＤＮＡの量を減少させる。
【００２２】
適用
本発明の方法、組成物、および装置は、多くの潜在的適用がある。例えば、法医学的科学における多くのアッセイは、ＤＮＡ、タンパク質、または複合サンプル中の非ペプチドホルモンなどの小有機分子の精製を必要としている。そのようなサンプルとしては、限定されないが、唾液、痰、尿、糞便、皮膚細胞、毛嚢、精液、膣液、骨片、骨髄、脳物質、脳脊髄液、羊水などを含めたヒトもしくは動物の体液もしくは組織が含まれる。これらの複合サンプルからの標的の精製およびさらなる分析は、（ａ）サンプル内の標的の濃度がしばしば低いこと、（ｂ）環境的混入物による、または経時的に標的を劣化させるサンプル内の作用物質の存在によるサンプルの劣化、および（ｃ）精製後、標的を分析するために必要な技法を妨害するこれらの複合体液内の作用物質の存在によって、妨害される。したがって、本発明は、法医学的科学に十分適用することができ、生物学的サンプルを分析する可能性を高めるであろう。さらに、本発明の方法および組成物は、土壌もしくは水のような「汚れた」環境中に存在するかもしれない物質の混合物から標的を効率的に分離するために使用することができる。したがって、本発明は、個体から直接提供される、またはかく乱されていない環境において見出される、新鮮な体液のサンプルの法医学的および他の研究を容易にするのみならず、土壌、水（新鮮なものもしくは塩水を含む）から回収しなければならないサンプル、または混入物および他の劣化物質の濃度が高いかもしれない他のソースの研究に使用することもできる。したがって、本発明の方法、組成物、および装置は、実験室、病院、または診察室の場での生物学的物質の分析、ならびに警察、監察医、救命医、犯罪捜査、Haz-mat人事および他の分野をベースとしたワーカーによる生物学的物質の分析に広く適用可能である。 
【００２３】
しかしながら、生物学的科学における本発明の適用は、法医学に限定されるものではない。医学および遺伝子試験の進歩は、すでに我々が取り組む健康管理のやり方を変えつつある。ある範囲の診断試験が利用可能であり、または現時点で開発中である。そのような試験は、ヒトもしくは組織のサンプル中に含有される特定の標的（ＤＮＡ、タンパク質、ホルモン）を分析できる能力に依存している。したがって、本発明は、さらに生物学的サンプルの分析の容易さおよび効率性を改良するために用いられる。したがって、本発明の方法および組成物は、少量の標的の分離を可能にし、これらの方法および組成物を診断の場で利用することによって、特定の患者から採取しなければならないサンプルの量を減らすことを助けるであろう。さらに、本発明は、これまでに実施不可能であった速度で、少量の試薬を用いて、広範囲のサンプルから標的を分離する方法を提供する。サンプルを迅速かつ低コストで分析することができることは、ヘルスケアおよび医学産業において、ならびに、本明細書において詳細に示した本発明の他の用途の多くにおいて有利である。 
【００２４】
更なる実施例によれば、本発明は、血液、血液製剤、または他のパッケージ前の医薬品をスクリーニングし、これらの医薬品が細菌やウイルスなどの特定の混入物を含まないことを確認するために使用することができる。
【００２５】
医学的用途に加えて、本発明には、種々の環境的用途がある。水、土壌または空気サンプルが特定の標的を含むかどうかを分析することができる。そのような標的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小有機分子、化学化合物、細菌細胞もしくは胞子（グラム陽性およびグラム陰性を含む）、およびウイルス（ＤＮＡベースおよびＲＮＡベースのものを含む）を含む。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌類、原生動物、およびウイルスから誘導することができる。例えば、地域の池、湖、および海辺から採取した水のサンプルを分析して、潜在的な有害細菌または化学汚染物質の存在および濃度について分析することができる。そのような分析は、これらの水資源の健康をモニターするため、そして、それらのヒトリクリエーションのための安全性を評価するために使用することができる。同様に、土壌のサンプルを採取して、自然または産業資源の混入物のレベルを評価するために分析することができる。
【００２６】
さらに別の実施例によれば、本発明の組成物を含むカートリッジおよびフィルターは、空気および水の供給をモニターするために使用することができる。そのようなカートリッジおよびフィルターは、空気を再循環させる、建物、飛行機、および他の閉ざされた環境内の空気の質を評価するために使用することができる。さらに、そのようなカートリッジは、魚のタンク、水族館などに使用して、水質のモニターを助け、また、あらゆる水質の変化の源を追跡することを助けることができる。
【００２７】
本発明の装置の最終的な非限定的な例は、自国の安全の分野において広く分類することができる。生物兵器および／または化学兵器を用いた戦争の脅威がある場合、食物、水、土壌または空気中の生物学的または化学的物質の存在を突き止めるために用いることができる方法および組成物は、適用可能性が多い。例えば、地域の貯水池または他の同様の攻撃資源のまわりの水および土壌のサンプルを回収して、その生物学的または化学的混入物の存在を分析することができるであろう。さらに、カートリッジおよびフィルターを用いて、空気（建物、電車、飛行機、または他の乗り物の内部または外部）をモニターすることができる。本発明は、生物学的混入物を、特定の生物学的物質（例えば、細菌もしくはウイルス）からのＤＮＡまたはＲＮＡの検出によって、または細菌もしくはウイルス自体を検出することによって、同定することができることを意図している。化学的混入物は、有機分子自体、ならびに、その化学的副産物もしくは代謝物をを検出することによっても同定することができる。検出され得る生物学的および化学的物質の例としては、炭疽菌、リシン、ブルセラ症、天然痘、ペスト、Ｑ熱、野兎病、ボツリヌス中毒、ブドウ球菌、およびエボラを含むウイルス性出血性熱、マスタードガス、クロストリジウム−パーフリンジェンス、ラクダ痘、サリン、ソマン、Ｏ−エチルＳ−ジイソプロピルアミノメチルメチルホスホノチオレート、およびシアン化水素が挙げられる。臨床的および環境的に関連するウイルスの例は、ゲノムの型およびそれらが包含されているかどうかに基づいて分類することができ、（ｉ）一本鎖、正センス鎖、エンベロープ、ＲＮＡウイルス；（ｉｉ）一本鎖、正センス鎖、非エンベロープ、ＲＮＡウイルス；（ｉｉｉ）一本鎖、負センス鎖、エンベロープ、ＲＮＡウイルス；（ｉｖ）二本鎖、非エンベロープ、ＲＮＡウイルス；および（ｖ）二本鎖、エンベロープ、ＤＮＡウイルスを含む。一本鎖、正センス鎖、エンベロープ、ＲＮＡウイルスは、限定されないが、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎、セントルイス脳炎、ＳＡＲＳ、Ｃ型肝炎、および西ナイル熱を含む。一本鎖、負センス鎖、エンベロープ、ＲＮＡウイルスは、限定されないが、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎、およびライノウイルスを含む。一本鎖、負センス鎖、エンベロープ、ＲＮＡウイルスは、限定されないが、エボラ、マルブルクおよびインフルエンザを含む。二本鎖、非エンベロープ、ＲＮＡウイルスは、限定されないが、ロタウイルスを含む。二本鎖、エンベロープ、ＤＮＡウイルスは、限定されないが、Ｂ型肝炎、および大痘瘡を含む。
【００２８】
上で概説した本発明の潜在的な法医学的、医学的、診断的、環境的、産業的、および安全的適用可能性のそれぞれについて、本発明は、不均質なサンプルから標的を分離および／または同定するための本発明の方法、装置および組成物を意図している。したがって、これらの方法、組成物および装置は、特定の標的およびサンプルの更なる分析のみならず、サンプルから標的（例えば、望ましくない標的）を除去することにもまた有用である。標的を除去するための本発明の利用例には、サンプルからの混入物の除去が含まれる。サンプルからの標的の全部または一部の分離（例えば、除去、物理的分離）後、該サンプルを、標的を除去する前により安全に処理することができる。分離した標的は、廃棄することができ（例えば、標的と関連するかもしれないあらゆる有害な性質を考慮して適切に捨てる）、または、標的と関連するかもしれないあらゆる有害な性質を考慮してに適切に、試薬を用いて、注意を払って、更なる研究の対象とすることもできる。    
【００２９】
（ｉｉ）定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において用いた、いくつかの用語をここに集めた。他に記載がない限り、本明細書において用いられている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を持つものとする。
【００３０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書においては、該冠詞の文法上の目的語が１または１より多い（すなわち、少なくとも１である）ことをを意味する。例えば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つのエレメントまたは１より多くのエレメントを意味する。
【００３１】
用語「標的」は、関連する特定の分子を表すのに用いられている。標的の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、グラム陽性菌、グラム陰性菌、細菌胞子、ＤＮＡおよびＲＮＡベースのウイルス（レトロウイルスを含む）、小有機分子（非ペプチドホルモンを含む）、および化学化合物を含む。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質は、ヒト、非ヒト動物、植物、真菌類、原生動物、細菌およびウイルスに由来する。上述の標的のいずれかに対して、本発明は、一般的なクラスの標的（例えば、サンプル中の全てのＤＮＡ）の精製、ならびにあるクラスの特定の種の標的（例えば、特定の細菌または所定の抗原に対する抗体）を意図している。本発明において、標的は、本発明の方法、組成物、および装置を用いて、不均質なサンプルから実質的に精製された分子を言う。
【００３２】
用語「サンプル」は、生物学的、化学的、または環境的材料の不均質な混合物を言う。本発明の方法、組成物、および装置によって、該サンプルから特定の標的を分離、検出、または実質的に精製することができる。サンプルは、気体、液体または固体（例えば、湿潤固体サンプルもしくは固体サンプル）であることができ、生物学的、化学的、または環境的材料を含むことができる。生物学的サンプルの例としては、限定されないが、血液、唾液、痰、尿、糞便、皮膚細胞、毛嚢、精液、膣液、骨片、骨髄、脳物質、脳脊髄液、および羊水が挙げられる。環境的サンプルの例としては、限定されないが、土壌、水、非ラボラトリーグレードの環境水、汚泥、植物および他の植物性物質、オイル、液体鉱物沈殿物、および鉱物沈殿物が含まれる。本発明はさらに、食品加工または他の商業的生成物の生成中においける混入物の精製を含む、商業的および産業的用途での、これらの方法および組成物を意図している。
【００３３】
用語「基質」は、コーティングされた基質と１以上の標的の間の相互作用を促進もしくは向上させるために、「表面変性剤」によって変性される、そうでなければそれによってコーティングされ得る表面を言う。基質は、大きさおよび形状を広範囲に変えてもよく、特定の基質は、本発明の特定の用途に特異的な変性剤、標的、サンプルおよび他の事実に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。基質の例としては、限定されないが、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、チューブ（例えば、ポリプロピレンチューブ、プリウレタンチューブなど）、ガラススライドもしくはカバーガラス、チップ、カセット、フィルター、カートリッジおよび光ファイバープローブを含めたプローブを含むことができる。
【００３４】
表面変性剤は、基質に共有的結合または非共有結合することができ、該表面変性剤は、表面変性剤の活性領域を基質から離すことができるように、任意に分裂可能なリンカーを含有することができる。用語「活性領域」は、標的と相互作用する領域を含有する変性剤の部分を表すために用いられる。変性剤が分裂可能なリンカーを含む態様においては、リンカーの分裂が、標的および変性剤の活性領域を剥離し、一方、基質に付着する変性剤のある部分を残す。
【００３５】
用語「アフィニティープロトコル」もしくは「ＡＰ」は、サンプルと基質を接触させることによって、サンプルから標的を実質的に精製または分離する方法を言うために用いられる。基質表面を変性剤でコーティングし、基質と特異的な標的との間の相互作用を促進または向上させる。
【００３６】
用語「アフィニティーマグネットプロトコル」もしくは「ＡＭＰ」は、その基質が磁性特性を有するＡＰ法の態様を言うために用いられる。ＡＰ法に用いられる基質と同様に、ＡＭＰ法に用いられる基質は、基質と特異的な標的との間の相互作用を促進または向上させるために変性剤をコーティングすることができる。  
【００３７】
アフィニティープロトコルおよびアフィニティーマグネットプロトコルは、標的と基質が相互作用して標的−基質複合体を形成する標的捕捉フェーズを含む。標的と基質が結合して標的−基質複合体を形成するために必要な時間を本明細書において「捕捉時間」と言う。「標的と基質が相互作用して標的−基質複合体を形成する」は、サンプル中の５０％を超える（例えば、少なくとも５１％）標的と基質が相互作用して標的−基質複合体を形成するように、標的と基質の間の十分な相互作用することを意味する。いくつかの態様において、サンプル中の標的の６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が基質と相互作用して標的−基質複合体を形成する。
【００３８】
ＡＰおよびＡＭＰのいくつかの適用において、標的−基質複合体を分裂させ、結合した標的を基質から溶出する。基質から標的を溶出させるのに必要な時間を本明細書において「溶出時間」と言う。「基質から標的を溶出または除去して、標的−基質複合体を分裂する」とは、標的−基質複合体の５０％より多く（例えば、少なくとも５１％）を分裂させることを意味する。いくつかの態様において、既に標的に結合しているサンプル中の標的の６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くを溶出させる。
【００３９】
用語「カップリング領域」は、基質と相互作用する変性剤の部分を言う。 
【００４０】
用語「ＳＮＡＰ」もしくは「ＳＮＡＰ法」もしくは「ＳＮＡＰプロトコル」は、全体において互換可能に用いられ、共係属の米国公開第２００３／０１２９６１４号（米国特許第１０／１９３，７４２号）に詳細に述べられている方法を言うために用いられる。本明細書で用いられているように、これらの用語の使用は、共係属出願に記載した特定の器具および装置の使用に限定されることを意味せず、核酸サンプルの劣化を阻害し、および／またはサンプルの更なる処置および分析と相互作用するサンプル内の物質（例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによってサンプルの分析を阻害する物質）を阻害する条件下で、核酸サンプルを単離するための一般的な方法を言うことを意味する。
【００４１】
本明細書において、「脂肪族基」は、直鎖状、分枝鎖状、もしくは環状の脂肪族炭化水素基を言い、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基などの飽和および不飽和の脂肪族基を含む。
【００４２】
「アルケニル」および「アルキニル」は、長さが類似しており、上記のアルキルと置換可能であるが、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む、不飽和脂肪族基を言う。
【００４３】
本明細書において用いられているところの用語「アルコキシル」もしくは「アルコキシ」は、上で定義したアルキル基に酸素ラジカルが付着したものを言う。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、第三ブトキシ、などが挙げられる。「エーテル」は、酸素によって共有結合した２つの炭化水素である。
【００４４】
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基のラジカルを言う。好ましい態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に３０以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖ではＣ１〜Ｃ３０、分枝鎖ではＣ１〜Ｃ３０）、そして、より好ましくは２０以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、３〜１０個の炭素原子をその環構造に有しており、より好ましくは、５、６または７個の炭素原子をその環構造に有している。
【００４５】
さらに、明細書、実施例および請求の範囲全体において用いられているところの用語「アルキル」（または「低級アルキル」）は、「置換されていないアルキル」と「置換されたアルキル」の双方を含み、後者は、炭化水素骨格の１以上の炭素が水素に置換されたアルキル部分を言う。そのような置換基の例としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、チオホルマート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホン酸塩、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロ環、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。適切な場合は、炭化水素鎖の置換された部分はそれ自身が置換されていることを当業者は、理解するであろう。例えば、置換されたアルキルの置換基は、置換されたおよび置換されていない形状のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホナートおよびホスフィナートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホン酸塩を含む）およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、−ＣＦ３、−ＣＮなどを含む。置換されたアルキルの例としては、下記を挙げることができる。シクロアルキルは、さらにアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮなどでさらに置換することができる。
【００４６】
炭素数について他に特に記載がない限り、本明細書において用いられている「低級アルキル」は、上記のアルキル基を意味するが、１〜１０、より好ましくは、１〜６の炭素原子をその骨格構造に有する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、類似の鎖長を有する。明細書全体において、好ましいアルキル基は、低級アルキルである。好ましい態様において、本明細書においてアルキルと呼ばれる置換基は、低級アルキルである。
【００４７】
用語「アルキルチオ」は、上で定義したように、イオウラジカルが付着したアルキル基を言う。代表的なアルキルチオ基は、メチルチオ、エチルチオなどを含む。
【００４８】
用語「アミン」および「アミノ」は、当該技術において認識されており、置換されていないアミンおよび置換されたアミンの両方を言う。例えば、下記の一般式で表すことができる部分である。
【化１】
2007502420.tif 000003
【００４９】
式中、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ’１０のそれぞれは個別に、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８、または、Ｒ９およびＲ１０を表し、それらが付着するN原子と一緒に、 環構造中に４〜８の原子を有する複素環を完成し；Ｒ８は、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環または多環を表し；ｍは、ゼロまたは１〜８の範囲の整数を表す。好ましい態様において、Ｒ９またはＲ１０の１つだけがカルボニルであることができる。例えば、Ｒ９、Ｒ１０と窒素はともにアミドを形成することはない。さらに好ましい態様において、Ｒ９およびＲ１０（および任意にＲ’１０）は、それぞれ個別に水素、アルキル、アルケニル、または、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８を表す。したがって、本明細書において用いられている用語「アルキルアミン」は、上で定義した、置換されたまたは置換されていないアルキルが付着したアミン基を表す。すなわち、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つがアルキル基である。
【００５０】
用語「アミド」は、当該技術分野において、アミノ置換されたカルボニルとして認識されており、下記の一般式によって表される部分を含む：
【化２】
2007502420.tif 000004
【００５１】
式中、Ｒ９、Ｒ１０は上記したとおりである。アミドの好ましい態様は、不安定であるかもしれないイミドを含まない。
【００５２】
本明細書において用いられているところの用語「アラルキル」は、アリール基（例えば、芳香族基またはヘテロ芳香族基）で置換されたアルキル基を言う。
【００５３】
本明細書で用いられている用語「アリール」は、０〜４のヘテロ原子を含むことができる５−、６−および７−員単環芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどを含む。こうした、環構造中にヘテロ原子を有するアリール基本は、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」とも呼ばれる。芳香族環は、１以上の位置における環が上記したような置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロ環、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ、などで置換されている。用語「アリール」はまた、２以上の炭素が２つの結合環（このような環は「融合環」である）に共有されており、芳香族、例えば、他の環式環の少なくとも１つは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロ環であることができる多環式の環系を含む。
【００５４】
本明細書において用いられている用語「炭素環」は、環の各原子が炭素である芳香族もしくは非芳香族環を言う。
【００５５】
用語「カルボニル」は、当該技術分野において認識されており、以下の一般式によって表されるような物質を含む。
【化３】
2007502420.tif 000005
【００５６】
式中、Ｘは結合であり、または酸素、イオウを表し、Ｒ１１は、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８もしくは薬学的に許容される塩であり、Ｒ’１１は、水素、アルキル、アルケニルもしくは−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８であり、ｍおよびＲ８は上のように定義される。Ｘが酸素である、Ｒ１１またはＲ’１１が水素ではない場合、式は、「エステル」を表す。Ｘが酸素である、Ｒ１１が上のように定義される場合、その部分は本明細書においては、カルボキシル基と言われ、特にＲ１１が水素であれば、式は「カルボン酸」を表す。Ｘが酸素であり、Ｒ’１１が水素である場合、式は「ホルマート」を表す。一般的に、上記式の酸素原子をイオウに置き換えた場合、式は「チオカルボニル」基を表す。Ｘがイオウであり、Ｒ１１またはＲ’１１が水素でない場合、式は「チオエステル」を表す。Ｘがイオウであり、Ｒ１１が水素である場合、式は「チオカルボン酸」を表す。Ｘがイオウであり、Ｒ’１１水素である場合、式は「チオホルマート」を表す。一方、Ｘは結合であり、Ｒ１１は水素ではない場合、上記式は、「ケトン」基を表す。Ｘは結合であり、Ｒ１１は水素ではある場合、上記式は「アルデヒド」基を表す。
【００５７】
本明細書において用いられている用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外のあらゆる元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、炭素、窒素、酸素、リン、イオウおよびセレンである。
【００５８】
用語「ヘテロ環」または「複素環基」は、３〜１０員環構造、より好ましくは３〜７員環で、その環構造が１〜４のヘテロ原子を含む基を言う。複素環はまた、多環であることもできる。ヘテロ環基には、例えば、チオフェン、チアンスレン（thianthrene）、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチン（phenoxathiin）、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン（phenarsazine）、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンおよびピロリジノンなどのラクタム、スルタム、スルトンなどが含まれる。複素環式の環は、上記のような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロ環、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどといったで、１以上の位置において置換することができる。
【００５９】
本明細書において用いられているように、用語「ニトロ」は、−ＮＯ２を意味し、用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを意味し、用語「スルフヒドリル」は、−ＳＨを意味し、用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味、そして、用語「スルホニル」は、−ＳＯ２−を意味する。
【００６０】
用語「多環」または「多環式の基」は、２以上の炭素が２以上の結合環（例えば、「融合環」）に共有されている、２以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロ環）を言う。非隣接原子が結合している環は「架橋された」環という。多環の環のそれぞれは、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロ環、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどの上記の置換基と置換してもよい。
【００６１】
本明細書において用いられている「保護基」と言うフレーズは、望ましくない化学的変化からの潜在的に反応性のある官能基を保護する仮の置換基（temporary substituents）を表す。そのような保護基の例としては、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、ならびにアルデヒドおよびケトンのアセタールおよびケタールがそれぞれ含まれる。保護基の化学の分野について概説されている（Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis、第２版； Wiley: New York, 1991）。
【００６２】
「セレノアルキル」は、置換されたセレノ基が付着したアルキル基を言う。アルキルに置換することができる「セレノエーテル」の例は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニルおよび−Ｓｅ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（ｍおよびＲ８は上記のとおり）から選択される。
【００６３】
本明細書において用いられているように、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容可能な置換基を含むことが意図されている。広い局面において、許容可能な置換基には、非環式および環式、枝分かれしている、および枝分かれしていない、炭素環式および複素環、芳香族、および非芳香族置換基が含まれる。置換基の例としては、例えば、上に記載のものが含まれる。許容可能な置換基は、１以上であることができ、有機化合物と同じであっても、異なっていてもよい。本発明の目的において、窒素などのヘテロ原子は、本明細書に記載の、ヘテロ原子の原子価を満足する有機化合物の水素置換基および／または許容可能な置換基を有していてもよい。本発明は、有機化合物の許容可能な置換基によっていかなる方法によっても限定されることを意図していない。  
【００６４】
「置換」または「〜で置換された」は、そのような置換が、その置換された原子および置換基の許容される原子価にしたがっていること、および置換の結果、例えば、再組み換え、環形成、除去などの変性を自発的に行わない安定した化合物が得られるという暗黙の条件を含んでいることが理解されるであろう。
【００６５】
類似の置換をアルケニルおよびアルキニル基に対して行って、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニル、またはアルキニルを作製することができる。
【００６６】
本明細書に記載されているように、各式の定義、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどは、あらゆる構造において一回以上出てくる場合、同じ構造における他の箇所の定義は独立していることが意図される。
【００６７】
用語トリフリル（triflyl）、トシル（tosyl）、メシル（mesyl）およびノナフリル（nonaflyl）は、当該技術分野において認識されており、トリフルオロメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル、およびノナフルオロブタンスルホニル基をそれぞれ示す。用語トリフラート、トシラート、メシラート、およびノナフラート（nonaflate）は、当該技術分野において認識されており、トリフルオロメタンスルホン酸エステル、p-トルエンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル、およびノナフルオロブタンスルホン酸エステル官能基および前記基を含有する分子をそれぞれ示す。  
【００６８】
略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ、Ｍｓは、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、およびメタンスルホニルをそれぞれ表す。通常の技量を有する有機化学者によって用いられている、より総合的な略語のリストは、Journal
of Organic Chemistryの各版の第１刊に記載されている。このリストは典型的に、Standard List of Abbreviationsというタイトルの表中に示されている。前記リストに含まれている略語、および通常の技量を有する有機化学者によって用いられている略語の全てを本明細書において引用によって援用する。
【００６９】
本発明のいくつかの化合物は、特定の幾何学形状または立体異性体形状で存在し得る。本発明は、シス−およびトランスアイソマー、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（ｄ）−アイソマー、（ｌ）−アイソマー、そのラセミ混合物、およびその他の混合物を含む全てのそのような化合物を本発明の範囲であると考えている。さらに非対称的な炭素原子は、アルキル基などの置換基に存在することができる。そのような全てのアイソマーならびにその混合物は、本発明に含まれることが意図されている。  
【００７０】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが望ましい場合、それは非対称合成、またはキラル補助による誘導によって調製してもよい。そこでは、得られたジアステレオマー混合物が分離され、補助基が切断され、純粋な所望のエナンチオマーが提供される。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基、またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有する場合、ジアステレオマー塩は、適切な、任意に活性のある酸または塩基を用いて形成され、当該技術分野において公知の分別結晶作用またはクロマトグラフィーの手段によって形成されたジアステレオマーを溶解させ、その後純粋なエナンチオマーが回収される。
【００７１】
本発明の目的において、化学元素は、CAS版、Handbook of Chemistry and Physics, 第67刷、1986〜87年の裏表紙に記載の元素周期表によって確認される。また本発明の目的において、用語「炭化水素」は、少なくとも１つの水素および１つの炭素原子を有するあらゆる許容可能な化合物を含むことが意図されている。広い局面において、該許容可能な炭化水素は、非環式および環式、枝分かれしている、および枝分かれしていない、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の有機化合物であって、置換することができる、または置換することができない有機化合物を含む。
【００７２】
「アミノ酸」−モノマー単位のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。天然に存在するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質中には約８０のアミノ酸が発見されている。その全ては、Ｌ−アイソマーである。この用語はまた、アミノ酸およびタンパク質アミノ酸のＤ−アイソマーおよびそれらのアナログを含む。
【００７３】
用語「疎水性の」は、無極性の原子を伴う化学的部分が水または他の極性の原子よりもむしろ互いに相互作用する傾向を言う。「疎水性」である物質は、たいていの場合、不溶性である。疎水性の特性を持つ天然の物質としては、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レテノイド（retinoid）、ビオチン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリン、およびチロシンなどの疎水性アミノ酸が挙げられる。化学的部分もまた、物理的特性が無極性の原子によって決定される場合、疎水性または疎水性の部分を持つ。
【００７４】
用語「親水性」は、水に対して高いアフィニティー部分を持つ化学的部分を言う。「親水性」である物質は、たいていの場合、水溶性である。
【００７５】
本明細書において用いられているように、「タンパク質」は、本質的に約８０のアミノ酸からなるポリマーである。「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して用いられ、「ペプチド」は、しばしば小さなポリペプチドに関して用いられる。当該技術分野においては、これらの用語の使用は、重複しており、また変化している。
【００７６】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換可能に用いられている。
【００７７】
用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」もまた本明細書において互換可能に用いられている。
【００７８】
本明細書において用いられているように、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを表す。この用語は、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことを理解すべきである。
【００７９】
用語「小分子」は、化合物を言う。分子量が約２５００ａｍｕ未満、好ましくは、約２０００ａｍｕ未満、さらに好ましくは、約１５００ａｍｕ未満、さらにより好ましくは、１０００ａｍｕ未満、あるいは最も好ましくは、約７５０ａｍｕ未満の化合物を言う。.
【００８０】
（ｉｉｉ）方法の例
本発明は、標的をさらに分析することができるように、サンプルから標的を分離するための改良された方法を提供する。本明細書においてこの方法は、「アフィニティープロトコル」、「ＡＰ」または「アフィニティー法」と呼ばれる。この方法のいくつかの態様では、基質を使用するが、それは、「アフィニティーマグネットプロトコル」または「ＡＭＰ」とも呼ばれる。 
【００８１】
アフィニティープロトコルは、サンプルから１以上の標的を同定するのを助けるために、基質を用いている。ＡＰは、限定されないが、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、タンパク質、細菌細胞または胞子（例えば、グラム陽性およびグラム陰性）、ウイルス（例えば、ＤＮＡベースおよびＲＮＡベース、小有機分子（例えば、毒素、ホルモン、など）、および大きな化学化合物を含む広範囲の標的のいずれかに用いることができる。ＡＰは、気体サンプル（例えば、濾過された空気もしくは濾過されていない空気）、環境的液体サンプル（例えば、新鮮な水、海水、汚泥、泥、再水和した土壌、ガソリン、オイル）、生物学的液体および半固体サンプル（例えば、血液、尿、痰、唾液、糞便、脳脊髄液、骨髄、精液、膣液、脳物質、骨片）、ならびに環境的固体サンプル（例えば、乾燥土壌もしくは粘土）を含む広範囲のサンプルのいずれかから標的を同定するために使用してもよい。さらに、ＡＰは、全体的な処理の影響を受けにくい固体表面上の標的の存在、例えば、デスクトップ、コンピュータキーボード、ドアノブ、などの上の標的の存在を分析するために用いてもよい。そのような場合、標的の存在は、固体表面をまず表面拭き取りを行い、次いで表面拭き取りを行って標的の存在を調べることによって評価することができる。さらに、ＡＰは、調製物中に含有するいくつかの標的によって阻害される食品加工、化学処理、またはあらゆる大規模な生産努力などの多くの産業的用途中の標的を同定するために使用してもよい。
【００８２】
本発明は、サンプル中の標的を同定するために、アフィニティープロトコルを単独で使用すること、およびその標的の更なる分析を容易にすることを意図している。例えば、アフィニティープロトコルは、水サンプル中の特定の細菌細胞の存在を同定するために用いることができる。次いでこれらの細菌細胞は、細胞学的または分子的にさらに分析することができる。
【００８３】
アフィニティープロトコルは、不均質なサンプルから標的を単離または分離する他の方法に対して有意な有利な点を多く有している。アフィニティープロトコルおよびアフィニティーマグネットプロトコルにおいて使用される基質は、コーティングされていなくてもよい（例えば、被覆されていなくてもよい）し、あるいは、比較的単純な化学的部分によって被覆されていてもよい。この点は、これまで可能であった、特定の標的に対して免疫応答性を有する抗体でコーティングすることが必要であった、多くの分離技法とは対照的である。抗体を作製し基質に付着させることは、高価であり、それらを使用するには、関連する標的についての多くの先験的な知識が必要である。それぞれの抗体は、狭い範囲の免疫反応性を有する可能性が高い。さらに、アフィニティープロトコルおよびアフィニティーマグネットプロトコルは、不均質なサンプルから迅速に標的を分離することができ、その方法は、最小限の試薬を使用するだけでよい。これらの特徴によって、該プロトコルは、コストを減少させることができ、外部（例えば、非ラボラトリー条件）、ならびに、実験室での使用が可能となる。
【００８４】
しかしながら、本発明はさらに、アフィニティープロトコルを従来開示されているＳＮＡＰ法または他の方法と組み合わせて用い、核酸をさらに分析することができることを意図している。ＳＮＡＰ法は、米国公開公報第  ２００３／０１２９６１４号に詳細に概説されているが、本明細書においてこれらの出願の内容全体を本明細書中に引用によって援用する。それは、核酸のさらなる分析を疎外するサンプル中の試薬が劣化および／または阻害するのを防ぐ方法で、サンプルからの核酸を単離することができる。ＳＮＡＰ様方法の典型例である市販の製品の例は、ＩｓｏＣｏｄｅペーパーである。アフィニティープロトコルとＳＮＡＰ法を組み合わせることによって、本発明は、複合体、不均質のサンプルから標的を同定するための、大きく改良された方法を提供する。本明細書の実施例は、アフィニティープロトコルおよびＳＮＡＰ法を提供し、サンプル中において同定された標的の質を改善している。さらに組み合わせ方法は、ＳＮＡＰ法のみより高い感受性を示し、サンプル中の標的の濃度がより低い場合の同定が可能になる。  
【００８５】
アフィニティープロトコルは、サンプルに存在する標的と相互作用する基質を使用する。該基質は、実際にはいかなる大きさ、形状であってもよく、基質の例としては、ビーズ、プローブ、光ファイバー、プレート、フィルター、カートリッジ、カバーガラス、チップ、フィルム、皿、スワブ、紙や他の拭き取り用の物などが挙げられる。さらに、該基質は、限定されないが、ガラス、プラスチック、シリカを含む、いくつかの材料を混合してもよい。該基質は、磁性化されていてもよい（例えば、磁性的特徴を持つ）。該基質は、多孔性であっても非多孔性であってもよく、多孔性基質はあらゆる範囲の多孔率を有していてもよい。
【００８６】
アフィニティープロトコルに使用するための基質は、サンプル中の非標的材料より標的に対してアフィニティーが高い。本明細書において詳細に示すように、いくつかの基質は、いくつかの他の標的よりも特定の標的に対して高いアフィニティーを有している。そして、当業者は、標的、サンプルなどを含むファクターに基づいて、特定の基質を容易に選択することができる。本発明はさらに、基質表面を変性して基質と１以上の標的との間の相互作用をさらに促進することを意図している。基質表面に付着して、基質相互作用の相互作用に影響を及ぼす物質を表面変性剤と呼ぶ。本発明は、１以上の表面変性剤を基質の表面に付加して基質と特定の標的との相互作用を促進することを意図している。表面変性剤の例を本明細書において提供する。本発明のある態様において、１以上の本明細書に記載の表面変性剤で変性された基質をアフィニティープロトコルにおいて、サンプルから標的を同定および／または分離するために用いることができる。
【００８７】
本発明はさらに、基質の混合物を採用するアフィニティープロトコルを意図している。例えば、該方法は、異なる表面変性剤で変性された２以上の基質を用い、１より多くの標的を同定することができる。および／または、該方法は、大きさ、形状または組成の異なる基質を使用してもよいが、同じ表面変性剤で変性されてもよい。
【００８８】
アフィニティープロトコルをさらに説明するために、図１は模式図を示す。図１に示した模式図においては、サンプルをアフィニティープロトコルおよびＳＮＡＰ法の双方において分析し、さらに分析するために核酸を単離および調製しているのがわかる。しかしながら、本発明はまた、アフィニティープロトコルのみを使用して、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌細胞および胞子、ウイルス、小有機分子および大きな化合物を含むいくつかの標的のあらゆるものを分離することができる。
【００８９】
図１に概略を示した仮説の例においては、特定の細菌標的を含有するとされる土壌サンプルを用いる（ステップ１）。該土壌サンプルを取得し、水および基質と組み合わせる（ステップ２）。この例においては、基質は、存在すると思われる細菌細胞にアフィニティーを有する磁性ビーズである。土壌のスラリー、水およびビーズを混合し、基質と標的との相互作用を容易にする（ステップ３）。ステップ３の間、サンプル内の標的は、基質と結合することができる。標的と基質の間の相互作用に続いて、標的−基質複合体をサンプルから分離する。この例においては、基質は磁性ビーズであるので、その複合体を、磁石を用いて容易に分離することができる（ステップ４）。ステップ１〜４は、アフィニティープロトコルをまとめたものである。基質−標的複合体の分離に続いて、標的を特定の標的および取得しようとする情報の種類に基づいて、いくつかの方法のあらゆるものにおいて分析することができる。ある態様において、アフィニティープロトコルは、ＳＮＡＰ法と容易に組み合わせて、標的から核酸を単離することができ、劣化を阻害し、および／または、核酸のさらなる分析を阻害する作用物質を阻害する条件下で核酸を処理することができる。ステップ５〜７は、ＳＮＡＰ法をどのようにしてアフィニティープロトコルと組み合わせることができるかを示したものである。
【００９０】
基質を用いた、サンプルからの標的の同定および／または分離は、多くの用途がある。当業者は、用語「分離」は、本発明の文脈において２通りの意味を持ち得ることを認識するであろう。用語「分離」は、標的と基質を会合（例えば、標的−基質複合体の形成）し、その基質との会合によって、標的がサンプルの残りからその時点で分離されるようにすることを言う。用語「分離」は、さらにサンプルの残りからの標的および／または標的−基質複合体の物理的除去を言う。本発明は、これらのいずれかが好ましい態様を意図している。
【００９１】
本願は、不均質な液体、固体、または気体サンプル殻標的を同定および／または分離するための改良された方法（アフィニティープロトコル）を提供する。本明細書に記載の実施例からわかるように、アフィニティープロトコルは、実験室、病院または食品加工工場などのコントロールされた状況、ならびにあまりコントロールされていない状況において用いることができる。アフィニティープロトコルは、迅速な同定および／または分離を容易にし、用途、サンプルおよび標的の特定の用件に基づいて選択することができる多くの基質のあらゆるものを使用することができる。 
【００９２】
（ｉｖ）組成物の例
上で概説したように、アフィニティープロトコルのある態様において、基質表面を表面変性剤で変性することができる。例示された表面変性剤は、コーティングされた基質と標的との相互作用を促進するために用いることができる。好ましい表面変性剤は、コーティングされた他の基質やコーティングされていない基質と比較して、コーティングされた基質と標的とのアフィニティーを増加させる。
【００９３】
本発明は、基質を多くの表面変性剤のうちのいずれかでコーティングすることができること、さらに基質を単一の表面変性剤または複数の表面変性剤でコーティングすることができることを意図している。いくつかの表面変性剤は、特定のクラスの標的（例えば、全ＤＮＡもしくは全ＲＮＡもしくは全細菌細胞）に対するアフィニティーを示し、他の表面変性剤は、特異的な標的（例えば、細胞の形態の特定の細菌もしくは細菌のクラスに対する特定の細菌種もしくは胞子）に対するアフィニティーを示すであろうことが予期される。当業者は、容易に種々の表面変性剤を試験し、所望の標的に対する所望のアフィニティーを有する作用物質を選択することができる。  
【００９４】
所望の表面変性剤または作用物質を同定した後、多くの基質のいくつかは、コーティングすることができる、そうでなければ、基質表面が表面変性剤でコーティングされるように誘導体化することができる。本発明は、いくつかの表面変性剤は、特定の基質をより容易にコーティングし、または、共有的に相互作用することできること、したがって、全ての表面変性剤が全ての可能な基質をコーティングするのに好適というわけではないかもしれないということを意図している。しかしながら、表面変性剤でコーティングすることができる好適な基質は、特定の用途、標的、サンプルなどがわかれば、当業者によって容易に選択され得る。
【００９５】
本発明の一局面は、シリコン含有表面変性剤を用いて、基質表面を変性し、図２に示される表面変性基質とすることである。基質は、多くの表面変性剤で、モル／グラムで表される表面範囲の量として典型的に表される表面変性の程度で、変性することができる。基質はまた、作用物質を連続的または同時に付着させることによって、複数種の表面変性剤を用いて変性することができる。本発明は、同じ標的に対するアフィニティーをもつ２以上の表面変性剤の使用、ならびに異なる標的に対するアフィニティーをもつ２以上の表面変性剤の使用を意図している。 
【００９６】
図２の左のパネルは、表面変性剤を表し、右のパネルは、変性された基質を表す。図２のように変性された基質を用いて、標的（アフィニティープロトコル）をあらゆる範囲の生物学的、環境的または化学的サンプルから同定および／または分離することができる。便宜上、図２の図は、複数の変数を使用しており、本発明は、これらの変数が下記のうちのいずれかである表面変性剤を意図している。所与の構造のために、変数は、可能な多様性（valiance）および安定性を得られるように選択する。
【００９７】
Ｒ１＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ
Ｒ３＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ
Ｍ＝金属
Ｘ＝ＮＲ、Ｏ
Ｒ＝置換された、もしくは置換されていない、アルキル、アルケニル、アリール、もしくはヘテロアリール、水素
Ｙ＝リンカー／スペーサー＝置換された、もしくは置換されていない、アルキル、アルケニル、アリール、もしくはヘテロアリール、シラニル（silanyl）、シロキサニル（siloxanyl）、ヘテロアルキル
Ｚ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ、Ｎ（ＣＯ）Ｒ、ＰＲ２、ＰＲ（ＯＲ）、Ｐ（ＯＲ）２、ＳＲ、ＳＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ３Ｒ
【００９８】
図２の例は、シリコン含有表面変性剤と基質が付着して１つの点を発生させることを示している。Ｒ１、Ｒ２またはＲ３のあらゆる組み合わせを含むＲ１、Ｒ２またはＲ３のズレを介した付着によって、シリコン含有表面変性剤と基質の間の２もしくは３の付着点が生じることは当業者には公知である。１つのシリコン含有表面変性剤および既に基質に付着している第２のシリコン含有表面変性剤のＲ１、Ｒ２またはＲ３ズレを介して付着が生じることもまた当業者に公知である。シリコン含有表面変性剤の、基質に対するいかなる形態の付着（例えば、共有もしくは非共有）も本発明のプラクティスに受け入れられる。
【００９９】
表面変性剤は、典型的に、加水分解性の部分、任意にＹによって示されるスペーサー／リンカー領域、およびＺで示される活性領域の少なくとも１つに結合したシリコン原子を含有するカップリング領域を含んでいる。シリコン原子は、典型的にＹで示されるスペーサー領域で置換されるが、この基は任意であり、Ｚは、シリコンに直接付着しても良い。シリコンはまた、典型的に、１つの基が加水分解性であれば、同一であっても異なっていてもよい、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３で示される３つの基で置換されている。加水分解性の基としては、限定されないが、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯおよびＯＣＯＲを含むことができる。  
【０１００】
スペーサー領域は、典型的にアルキル（置換された、もしくは置換されていない）、アルケニル、芳香族シラン、またはアシルハロゲン化物、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アミド、アミン、アレーン、ヘテロアレーン、アジド、カルボン酸、ジスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ケトン、ニトリル、ニトロ、フェノール、スルフィド、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、シラン、シロキサンもしくはチオールなどの他の有機部分で置換されていてもよいシロキサンベースの有機部分である。アルキル、アルケニル、または芳香族ベースの有機部分は、最大５０の炭素原子を含有していてもよく、好ましくは、最大２０の炭素原子、そして最も好ましくは最大１０の炭素原子を含有していてもよい。シランまたはシロキサンベースのシリコン部分は、最大５０のシランもしくは炭素原子を含有していてもよく、好ましくは、最大２０のシランもしくは炭素原子、および最も好ましくは最大１０のシランもしくは炭素原子を含有していてもよい。Ｙスペーサー領域に付着して、または任意に直接シリコンに付着して、活性領域がＺで示されている。活性領域は、対象とする生物もしくは生物学的分子を引き付ける、または結合するために採用される。標的の活性領域への結合は、相互作用の数によって生じる。理論に拘束されるわけではないが、活性領域と標的の間の結合は、ファンデルワールス相互作用、水素結合、共有結合、および／またはイオン結合を介して生じる。  
【０１０１】
さらに、活性領域は、アルキル、アルケニル、もしくはアシルハロゲン化物、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アミド、アミン、、アレーン、ヘテロアレーン、アジド、カルボン酸、ジスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ケトン、ニトリル、ニトロ、フェノール、スルフィド、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、シラン、シロキサンもしくはチオールなどの他の有機部分で置換されていてもよい芳香族ベースの有機部分を含有することもできる。アルキル、ビニル、または芳香族ベースの有機部分は、最大５０の炭素原子を含有していてもよく、好ましくは、最大２０の炭素原子、および最も好ましくは最大１０の炭素原子を含有していてもよい。
【０１０２】
本発明の第２の局面は、シリコン含有表面変性剤を用いて、基質の表面を変性させ、図３に示されているような物質を得ることである。本発明の局面において、表面変性剤中の活性領域の数は、スペーサー領域で分離されたそれぞれについて１より多い。表面変性剤上に１より多くの活性領域を採用した場合、該活性領域は、スペーサー／リンカー領域から直線状または枝分かれした状態で付着させることができる。本発明はさらに、１より多くの活性領域がスペーサー領域に付着することができること、およびスペーサー領域自信が枝分かれすることも意図している。表面変性剤上の活性領域の数は、２〜１０００のいずれか、好ましくは２〜１００の範囲、より好ましくは、２〜２０の範囲、最も好ましくは２〜５である。
【０１０３】
表面変性剤上の活性領域は、同じでもよく、または異なっていてもよい。また、表面変性剤上のスペーサー領域は、同じでもよく、または異なっていてもよい。基質は、典型的には、モル／グラムで表面被覆の量として表される一定の表面活性レベルを有する表面変性剤のいくつかによって変性することができる。基質はまた、作用物質を連続的に、または同時に、付着させることによって、１より多くの、ある種の表面変性剤によって変性することができる。
【０１０４】
図３の左のパネルは、表面変性剤を表し、右のパネルは、変性された基質を表す。図２のように変性された基質を用いて、標的（アフィニティープロトコル）をあらゆる範囲の生物学的、環境的または科学的サンプルから同定および／または分離することができる。便宜上、図３の図は、複数の変数を使用しており、本発明は、これらの変数が下記のうちのいずれかである表面変性剤を意図している。所与の構造のために、変数は、可能な多様性（valiance）および安定性を得られるように選択する。
【０１０５】
Ｒ１＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ
Ｒ３＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ
Ｍ＝金属
Ｘ＝ＮＲ、Ｏ
Ｒ＝置換された、もしくは置換されていない、アルキル、アルケニル、アリール、もしくはヘテロアリール、水素
Ｙ＝置換された、もしくは置換されていない、アルキル、アルケニル、アリール、もしくはヘテロアリール、シラニル（silanyl）、シロキサニル（siloxanyl）、ヘテロアルキル
Ｚ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＭ、ＯＲ、Ｒ、ＮＲ２、ＳｉＲ３、ＮＣＯ、ＣＮ、Ｏ（ＣＯ）Ｒ、Ｎ（ＣＯ）Ｒ、ＰＲ２、ＰＲ（ＯＲ）、Ｐ（ＯＲ）２、ＳＲ、ＳＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ３Ｒ  
【０１０６】
図２に示された変性剤、図３に示された変性剤、または他の変性剤のいずれかによって変性された基質として、本発明は、あらゆる基質が変性され得ることを意図している。さらに、基質の大きさと形状は、特定の技術の適用に基づいて変更および選択することができる。形状の例としては、球形、不規則形および棒状が挙げられ、また、その大きさや形状は、平均的な基質について述べたものである。該基質は、固体であっても、穴があいているものであっても、または多孔質であってもよく、当業者は、基質の表面積に影響を及ぼすことを容易に認識するであろう。基質の大きさが平均値付近で変化するであろうこと、および、本発明のいくつかの局面においては、基質の大きさを混合させることも有利であるかもしれない。例えば、いくつかの態様において、コーティングされたビーズを使用することが有利かもしれない。一般的に、基質の大きさは、０．０１〜１００ｍｍである。いくつかの用途においては、基質の直径は、０．５〜１０ｍｍ、１〜５ｍｍ、または１〜２ｍｍの範囲である。他の用途においては、基質の直径は、０．０１〜５００μｍ、０．１〜１２０μｍ、または１〜５０μｍである。しかしながら、本発明はさらに、プレート、皿などのより大きな表面積の改変、ならびに大規模な産業的適用における本発明の方法および組成物をさらに意図している。
【０１０７】
基質は、あらゆる材料で作ることができる。好ましい基質は、全体または部分的が金属酸化物、水酸化物、またはハロゲン化物で構成された表面を有している。当業者は、あらゆる金属酸化物表面は、もともと、または金属酸化物を部分的に加水分解する処置によって水酸化物機能性を含有することができることを認識するであろう。さらに、あらゆる金属ハロゲン化物は、もともと、または金属酸化物を部分的に加水分解する処置によって水酸化物機能性を含有することができる。表面が顕在または潜在する形で水酸化物部分を有している場合、有機性表面を本発明に採用することもできる。好ましい材料は、他の金属もしくは金属酸化物もしくは金属ハロゲン化物の存在下もしくは非存在下で、シリコン酸化物もしくはシリコン水酸化物を含有する材料である。本発明の方法に使用される、さらなる基質は、ガラスおよびプラスチックを含む。
【０１０８】
本発明のいくつかの局面において、基質は、基質を常磁性とするために（以下、処理磁性特性と称する）、十分な量の材料を含有し、基質が磁界に引き付けられている。好ましい態様において、基質は、鉄、ニッケルまたはコバルトを含み、より好ましい形状の基質は、鉄または鉄酸化物を含有するであろう。この局面において、常磁性の基質を使用することは有利である。他の非磁性材料から磁性材料を分離するために磁場を使用することができる。  
【０１０９】
本発明のいくつかの局面において、基質は、糸が基質を通過することができるように穿孔を有している。そのような糸、つなぎ鎖または他の結合手段は、基質同士を結合させることができ、基質、または基質−標的複合体のいずれかを後に回収することを容易にすることができる。
【０１１０】
表面変性剤の活性領域を基質から剥離することが有利である本発明の局面がある。したがって、本発明は、分裂可能なリンカーを含有する変性剤を意図している。分裂可能なリンカーが存在することによって、変性剤および標的の活性領域を剥離することが可能となる。このように標的を剥離することができることによって、標的をさらに分析することが非常に容易になるかもしれない。例えば、標的を剥離することができることは、基質と標的との間の会合が非常に強い場面において特に重要である。  
【０１１１】
剥離する方法としては、標的および活性領域を引き付ける結合力を破壊または逆転させるあらゆる方法、または化学物質を有する表面変性基質がある。これらは、ｐＨまたは塩濃度を変化させたり、複合体を熱や光に曝露することを含む。そのような方法の使用は、変性剤自信を破壊したり、分断したりしないが、変性剤を不活性な状態にしたまま、活性剤から標的を剥離する。    
【０１１２】
別の局面において、本発明は、標的の剥離が変性剤の部位内での分裂（例えば、リンカーの開裂および活性領域と標的の剥離）を含むことを意図している。これは、スペーサー領域の共有結合を分裂させ、それによって、表面変性剤の活性領域を基質から分離することを含む。これはまた、カップリング領域の共有結合を分裂させ、それによって、表面変性剤の活性領域を基質から分離することを含む。変性剤中の分裂事象を誘導するために使用できる本発明の特定の具体例については、実施例を参照されたい。
【０１１３】
（ｖ）スクリーニングアッセイの例
本発明は、サンプルから標的を同定および／または分離するためのアフィニティープロトコルを提供する。基質は、種々の方法のいずれかで変性し、さらに基質と特定の標的との間の相互作用を促進することができる。例えば、基質表面は、本明細書において提供されるアミン含有作用物質などの１以上の表面変性剤を用いて変性することができる。 
【０１１４】
標的と変性された基質との間の相互作用を促進する多くの表面変性剤を同定するとすれば、本発明は、変性剤として使用される更なる作用物質を同定するためのスクリーニングを意図している。適切なアッセイまたは基質コーティングの相対的に効率的な評価をすることが可能なアッセイを備えているので、当業者は、基質と特定の標的との間の相互作用を促進するのに有用かもしれない多くのコーティングのいくつかを容易にスクリーニングすることができる。例えば、基質とＤＮＡ、ＲＮＡ、細菌細胞および胞子全体、または特殊な細菌細胞もしくは胞子との間の相互作用を促進するコーティングを特異的にスクリーニングすることができるであろう。
【０１１５】
アフィニティープロトコルに用いられる表面変性剤を効率的に同定するために使用することができるいくつかのスクリーニングアッセイを提供する。候補表面変性剤で変性された基質を、これらのアッセイのうちのいずれかを用いてスクリーニングすることができ、1以上の候補表面変性剤でコーティングされた基質が標的と相互作用する能力を評価することができる。コーティングされていない基質に対するよりも大きなアフィニティーで、特定の標的と相互作用する候補作用物質でコーティングされた基質を、さらに分析してそれらの標的特異性、製造の容易さを分析することができるかもしれない。 
【０１１６】
アッセイ１−フローサイトメトリースクリーニングアッセイ。図４に模式的に示した以下のプロトコルは、いくつかの候補基質コーティングの有用性を容易に評価するために使用することができるアッセイを表す。細菌を、適切な条件下で培養して、レイトログ（late log）もしくは固定相にし、蛍光染色する。細菌のサンプル（１０５〜１０７個／ｍｌ、標準偏差１５％未満）を、フローサイトメーターを用いて計測し、初期濃度を求める。一定量の、ｐＨを変化させた（２、７、１０）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または脱イオン水（ｐＨ５）中で、細菌とコーティングされた基質とを混合する。基質のコーティングによっては、細菌の特定の量が細菌ビーズに接触するであろう。基質と標的を混合した後、サンプルを５μｍのＰＶＤＦシリンジフィルタ（Millipore）に通してゆっくりと濾過し、細胞と結合した基質を除去し、また、フリーの細胞はフィルターを通ってチューブに入るようにする。フィルターの大きさは、標的の大きさおよびビーズの大きさに基づいて、効率的分離が行われるように調整する。フィルターを通過した未結合の細菌をフローサイトメトリーによって分析し、ビーズによって除去された細菌のパーセンテージを計算する（図４）。細菌のサンプルも、対照としての基質の添加がなければ、同じタイプのフィルターを通過するかもしれない。  
【０１１７】
このタイプのアッセイを用いて、多数の基質コーティングを迅速に評価および比較することができる。更なる分析をする価値のある候補コーティングは、コーティングされていない基質と比較して、細菌細胞とより容易に結合する（例えば、標的と基質の間の相互作用を促進する）。
【０１１８】
フローサイトメトリーによる細菌の計測は、サンプル間で再生可能であること、および、フローサイトメトリーによって求められた細胞濃度は、光顕微鏡によって決定された予測濃度に一致することがわかった（標準偏差２以内）。  
【０１１９】
アッセイ２−フローサイトメトリースクリーニングアッセイ。図５に模式的に示した以下のプロトコルは、いくつかの候補基質コーティングの有用性を容易に評価するために使用することができるアッセイを表している。基質の核酸に対するアフィニティーを定量化するために、特定の、コーティングされた基質によって捕捉されたｄｓＤＮＡのパーセンテージを定量化するために用いることができる蛍光技法を開発した。このアッセイの重要な用途は、表面変性剤として現在使用可能な新規なコーティングのユーティリティーの評価である。
【０１２０】
好適な量の適切な混合緩衝液を遠心管に入れる。該緩衝液は、特定のサンプルおよび標的に基づいて選択することができる。基質を添加する前にｄｓＤＮＡを測定する。in
vitroスクリーニングアッセイとしては、ｄｓＤＮＡの開始濃度は５０ｐｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲が適切である。ピコグリーンｄｓＤＮＡインターカレーティング色素（Pico-green dsDNA intercalating dye）をｄｓＤＮＡに添加する。ピコグリーンは、励起波長が４８８ｎｍ、発光波長が５２２ｎｍである。他の蛍光インターカレーティング色素を用いることもでき、当業者は、実験室での分析を容易にするために、適切な励起および発光特性を有する色素を選択することができる。他に一般的に用いられる蛍光インターカレーティング色素としては、限定されないが、アクリジンオレンジ（Acridine Orange）、プロピジウムヨード（Propidium Iodine）、ＤＡＰＩ、ＳＹＢＲグリーン（ＳＹＢＲ Green 1）、およびエチジウムブロミドがある。色素を添加後、色素とＤＮＡを混合させ、蛍光を測定する。これによって分析のベースラインを提供する。
【０１２１】
コーティングされた基質を標識されたＤＮＡサンプルに添加し、基質とサンプルを混合させる。約３０秒間、振とうおよびボルテックスを行い、接着させる。遠心分離または沈降によって、フリーＤＮＡから基質を分離し、溶液中に残留するＤＮＡの蛍光を測定する。
【０１２２】
ＤＮＡ混合物の蛍光を、コーティングされた基質を添加する前後で比較することによって、それぞれのコーティングされた基質の捕捉効率を定量化することができる。これによって、いくつかの基質コーティングをを評価することができる。
【０１２３】
アッセイ３−ＰＣＲスクリーニングアッセイ。ＰＣＲもまた、コーティングされた基質を添加する前後においてサンプルの周期数を測定することによって接着を測定するために用いることができる。ステップは、ＤＮＡをインターカレーティング物質で染色すること以外は、蛍光アッセイについて上で概説したものと同様である。最初の保存液中のサンプルおよび基質添加物を除去した後の上清のサンプルをＰＣＲによって比較する。基質添加後のサンプルからのＤＮＡを増幅するために必要なサイクル数の増加によって、ＤＮＡが基質に接着したことがわかる。
【０１２４】
（ｉｖ）装置の例
本発明は、２つのクラスの装置を提供する。第１のクラスの装置は、大量のサンプルをもつ変性された基質の効率的な相互作用を容易にするように設計されている。そのような装置は、基質と特定の標的を含有するサンプルとを即座に接触させることが困難かもしれない大規模な産業的状況におけるアフィニティープロトコルの用途に有用であり、その標的がサンプル全体に均等に分散していないかもしれないときに、特に重要である。
【０１２５】
本明細書において詳細に説明したアフィニティープロトコルおよびアフィニティーマグネットプロトコルは、液体、スラリー、および空気などの物質から標的を捕捉するためのビーズのような基質を用いている。大量のサンプル材料は、基質−標的相互作用を最大にし、ビーズ表面上での効率性を得るために効率的に混合することが必要である。本発明の第１のクラスの装置は、粘性のスラリーを混合するための公知の技法の変更例に基づいて設計された。これらの技法は、カオス型の混合(chaotic mixing)の原理を用いるものであり、ジャーナルベアリングフロー（ジャーナルベアリング−その軸の周りを回転する固体シャフトを包含する中空筒の中の流体のフローと言う）として公知である。ジャーナルベアリングフローは、オイル、セメントなどの粘性の流体を大量（マルチガロン）に混合するのに典型的に使用される。その原理は、材料を、第１の円筒の内部に第２の円筒を置くことによって環を有している円筒状の容器に入れる。この１つの円筒を互いに偏心するように、そしてそれらの長手方向の軸の周りを同一方向もしくは逆方向にゆっくり回転させる（典型的に１分間２０回転未満）。低速回転によって環内の材料は、延伸し、折れ曲がり、それによって、材料中のいずれかの２つの粒子間の相互作用距離を減少させる。回転が多いと、効率的な混合が達成できる。図６は、円筒の構成を示し、混合後、かなり均一に分散していることを示すものである。
【０１２６】
図７は、この原理の特定のシナリオへの適用を模式的に示している。ここでは土壌サンプル中の標的が分析されている。サンプルおよび基質を水と混合し、スラリーを形成する。基質を、カオス型混合方法を用いてサンプルを介して混合する。そうして、サンプルから基質を抽出し、水または緩衝液に放出する。
【０１２７】
基質とサンプルとの混合を容易にするように設計された特定の装置について、本明細書の実施例の項目において詳細に説明する。さらに、実施例は、代表的な例の装置の性能を示すデータを提供している。本発明は、このクラスの装置の多くのバリエーションを意図している。それらを本明細書において、「クラスＩ装置（Class I
apparatuses）」、「クラスＩ装置（Class I devices）」、「カオス型混合装置（Chaotic Mixing apparatus）」、または「カオス型混合装置（Chaotic Mixing devices）」と言う。その装置は実際、あらゆるサイズであることができる。そして、その装置のサイズは、収容されなければならないサンプルの合計量によって増減させることができる。その装置の重要な局面は、その全体の大きさではなく、むしろ、（ａ）２つの偏心的に存在する円筒、（ｂ）内側の円筒より大きな外側の円筒、および（ｃ）比較的低速度での円筒の回転である。その円筒は、大きさおよび形状を変更してもよく、その２つの円筒は、同じ形状でなくてもよい。さらに、１つまたは両方の円筒は、例えば、フィン、ベーン、もしくはリブを内側の円筒および／または外側の円筒の内側表面に追加することによって、その表面積を増加させるように変更することができる。そのようなフィンまたはベーンは、表面積を増加させるだけでなく、混合中のサンプルの垂直方向の循環を増加させ、したがって、基質−標的相互作用を増加させる。
【０１２８】
本発明は、円筒が中実または中空であること、そして円筒が中実または中空のいずれであるかは、円筒の大きさに基づいて、および円筒を構築するために用いられる材料に基づいて決定することができることを意図している。これらのファクターは、円筒の重さおよび強さ、ならびにそれらを構築するためのコストに影響を及ぼすであろう。円筒は、多くの材料のあらゆるものから構築することができ、その２つの円筒は、同じ材料で構築する必要はない。その材料は、円筒の大きさおよび形状、ならびにサンプル、基質および標的の特定の種類に基づいて選択することができる。材料の例としては、限定されないが、テフロン（登録商標）、ステンレススチール、鉄その他の金属、およびプラスチックが挙げられる。さらに、本発明は、円筒を金、プラチナ、鉄、テフロン（登録商標）などの金属でめっきして、円筒の特別の特性を向上させることができることを意図している。
【０１２９】
円筒の回転は、同じ方向または反対方向とすることができる（例えば、双方の円筒を時計回りに回転させることができ、または双方の円筒を反時計回りに回転させることができ、または１つの円筒を時計回りに回転させ、他方を反時計回りに回転することできる）。円筒の回転は、比較的低速５〜５０ｒｐｍ、好ましくは１０〜２０ｒｐｍで回転する。例示された装置の円筒の回転は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｒｐｍとすることができる。しかしながら、最適な回転は、特定のサンプル、混合の合計量および特定の標的に基づいて選択することができることを、本発明は意図している。
【０１３０】
本発明はさらに、混合物中を循環するときのビーズの動力学が、外部磁場、例えば、円筒の外側の回転磁場などを変更することによって、影響を受けることを意図している。これは、基質が磁性的な性質（例えば、コーティングされた、もしくはコーティングされていないビーズ）を有するときに特に有用かもしれない。磁場を用いる更なる用途において、内側円筒は、鉄ベースのコアのまわりに巻かれたコイルを有する電磁石として構築されることによって、二重の目的を果たすことができる。電磁石を活性化するとき、内側の円筒は、態様において、基質の回収ロッドとして機能することができる。このように、内側の円筒は、基質と標的の混合を促進するための機器、および混合後、基質−標的複合体を回収するための手段としての２つの機能を果たすことができる。
【０１３１】
本発明はさらに、第２のクラスの装置を意図している。これらの装置は、１以上の基質を含有するフィルターまたはカートリッジを含む。標的との相互作用を可能にする、１以上の基質を含有するフィルターまたはカートリッジのデザインは、種々の空気および液体サンプルのモニタリングおよび分析を容易にするであろう。例えば、そのようなフィルターおよびカートリッジは、建物、飛行機、公共の運搬用車両中の空気のより詳細な分析、ならびに貯水池および河川中の水の分析を可能にするであろう。
【０１３２】
本発明は、アフィニティープロトコルを採用したフィルターおよびカートリッジが単独、または、ＤＮＡの分析を容易にする従前に開示されているフィルターおよびカートリッジと組み合わせて（米国特許公報第２００３／０１２９６１４号、その全体を引用によってここに援用する）、また、空気および水を分析するために用いられるその他の市販のフィルター（例えば、ＨＶＡＣ空気フィルター、ＨＥＰＡフィルター、チャコールベースの水フィルター、など）と組み合わせて用いられる。 
【０１３３】
図２７〜３０は、いくつかのフィルターおよびカートリッジのデザインの例である。しかしながら、本発明は、フィルターおよびカートリッジデザインの範囲を意図している。いくつかの態様において、カートリッジまたはフィルターは、基質の多数の層を含有している。各層は、同じ基質または異なる基質のいずれかを含有することができる。他の態様において、カートリッジまたはフィルターは、単一の層のみを含有している。しかしながら、単一の層は、任意に、多数の表面変性剤を用いて変性された多数の基質または単一の基質を含有してもよい。 
【０１３４】
特に注目すべきことは、本発明の全ての基質および変性された基質と同様、アフィニティープロトコルは、ある範囲の条件での使用に耐えるフィルターおよびカートリッジは、分析のために容易に変更し、または処理することができ、ベンチ（例えば、医者の診察室、病院、実験室、処理植物）、または現場（例えば、混入物があるかもしれない場所、空港の滑走路上、犯罪の現場）で使用することができる。
【０１３５】
実施例
さて、本発明を一般的に説明する。以下の実施例を参照することによって、本発明をより容易に理解することができるであろう。これらの実施例は、本発明のいくつかの局面および実施態様を説明する目的で記載したものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１３６】
実施例１：アフィニティープロトコルの適用
上で詳細に概説したように、アフィニティープロトコルは、サンプル中の標的を同定するための改良された方法を提供する。プロトコルは、単独で、またはＳＮＡＰ法と組み合わせて用いて、多様なサンプルから広範囲の標的を同定するために用いることができる。特定の標的を同定するために有用な基質は、市販の磁性ビーズである。そのようなビーズは、多くの製造業者から入手可能であり、種々の大きさおよび形状のものがあり、あらゆる数の材料から構成される。これらのファクターのそれぞれは、特定の標的、サンプルおよび他のファクターに基づいて最適化することができる。  
【０１３７】
以下の方法は、市販の磁性ビーズをアフィニティープロトコルの基質として用いた方法を簡単にまとめたものである。市販の磁性ビーズは、緩衝液中で出荷される。使用する前に、該ビーズを以下のように洗浄する。１ｍＬの磁性ビーズを微量遠心機のチューブ中に入れ、ビーズを最大微量遠心機速度（１４，０００ｒｐｍ）でペレット化し、上記ビーズペレットから全て液体を除去し、必要に応じてビーズの洗浄を繰り返す。
【０１３８】
図１に模式的に示しているように、アフィニティープロトコルは、液体サンプル上で行うためには、対象となる特定の標的を含有する液体サンプルを取得しなければならない。該サンプルを簡単に攪拌して、混合し、該サンプルの一部を微量遠心管に入れる。土壌サンプルなどの固体サンプルについては、サンプルを取得して、微量遠心管に入れる。濾過し、蒸留した水をサンプルに加え、混合してスラリーを作製する。
【０１３９】
サンプルの第１の調製後、調製した磁性ビーズを、サンプルを含有するチューブに添加し、チューブを閉じる。サンプルとビーズをを含有するチューブを回転撹拌器に１０〜２０分間入れる。回収磁石を使用して、ビーズをチューブの側面に引き付け、十分な時間をかけて全てのビーズを移動させる。回収時間は、１０〜２０秒とすべきである。フィルターチップを持つピペッタを使用して、全ての、しかし少量の液体をチューブから除去し、チューブの側面に回収された磁性ビーズをかく乱しないように注意する。前のステップにおいて残留している少量の液体を用いて、穏やかに（標的に結合させるべき）基質を再懸濁させる。標的−基質複合体を再懸濁させた後、全ての液体（標的−基質複合体を含有する）を除去し、ＩｓｏＣｏｄｅペーパー（これによってＳＮＡＰ法をサンプル上で行うことができる）などの市販の媒体に適用する。
【０１４０】
上で詳細に示したアフィニティープロトコルのステップの後、ＩｓｏＣｏｄｅペーパーまたは他のＳＮＡＰ法を用いて、サンプルから核酸を処理し、その核酸をＰＣＲまたは核酸分析に用いられる他の一般的に採用される技法によって分析することができる。簡単に述べれば、４つの方法のうち１つを用いて、三角形にしたＩｓｏＣｏｄｅペーパーを皿中で乾燥する。皿（カバーされていない）を６０℃±５℃で１５分間、真空オーブン中に三角形とともに入れ（湿潤トレイ中の水が確実に存在しないようにする）、皿（カバーされていない）を三角形とともにバイオセイフティーフードに室温で入れ、完全に乾燥させ、各皿を乾燥剤の入った密封したポーチに三角形とともに室温で入れ、完全に乾燥させる。サンプルが乾燥した後、ＳＮＡＰプロトコルでの処理を続けて、標的をＩｓｏＣｏｄｅから溶出させ、ＰＣＲまたは一般的に用いられる分子生物学的アプローチによって核酸を分析する。
【０１４１】
実施例２：表面変性剤の予備分析−市販の基質の分析
種々のコーティングおよび大きさを持つ（表１）１９の市販の磁性ビーズの最初のスクリーニングを行い、アフィニティープロトコルにおけるそれらの有用性を確かめた。その目標は、シグナルを増加させる（ＰＣＲを用いて循環数を減少させる）際、ＳＮＡＰプロトコルのみを用いて達成される場合と比較して、どの市販ビーズが最もよい全体的な効率性を提供するかを決定することとした。市販の基質および種々のサンプルから核酸を分離および同定する際の効率性を増加させるコーティングの特徴の同定を用いて、更なる基質とコーティングを設計するための原理的方法を開発する。市販のビーズを用いるこれらの実験において、それぞれのビーズの効果を、ＳＮＡＰのみによる標的の分析との比較において評価した。上記した蛍光アッセイとフローサイトメトリーアッセイと用いて、各ビーズの結合効率を評価した。
【０１４２】
【表１】
2007502420.tif 000006
【０１４３】
簡単に述べれば、図８は、市販の磁性ビーズの分析結果をまとめたものである。図に示されたグラフがどのビーズがシグナル対ＳＮＡＰのみを高めるかを示すようにデータをＳＮＡＰのみによって分析したサンプルの信号に正規化した。１０４個／ｇの植物炭疽菌（B. anthracis）で土壌サンプルを播いた。土壌サンプルを種々のアフィニティーで細菌細胞と結合したビーズと接触させた。 
【０１４４】
図８は、アフィニティープロトコルとＳＮＡＰ技法の組み合わせは、ＳＮＡＰのみの場合と比較してサンプルの分析を高めることを示した。さらに、この図は、いくつかの表面変性剤は、基質と標的との相互作用をさらに高めることができることを示している。.
【０１４５】
いくつかの市販の非磁性ビーズについても試験した。最初に大量のビーズをスクリーニングしたが、５０μｍの大きさのもののみを直接比較し、データを示した。
【０１４６】
【表２】
2007502420.tif 000007
【０１４７】
ビーズをサンプルとともにインキュベーションした後、ビーズに接着しているＤＮＡのパーセンテージを測定することによって、これらのビーズの効果を評価した。図９は、これらの結果をまとめたものである。アミン官能化ビーズは、基質とＤＮＡの間の相互作用を増加させた。したがって、本明細書に詳細に示すように、本発明は、多様な他のアミン官能化表面変性剤をデザインし、本発明は、他のアミン官能化表面変性剤が、基質と標的、特に、基質と核酸の間の相互作用を促進するように設計することもできることを意図している。
【０１４８】
この実験においては、基質とＤＮＡの間の相互作用を直接試験したが、基質とＲＮＡなどの他の核酸の間の相互作用も評価することができる。ＲＮＡの化学的構造に基づいて、ＤＮＡと相互作用する基質は、ＲＮＡと相互作用する可能性があり、標的ＲＮＡをサンプルから分離するかもしれない。ＲＮＡを標的とする方法は、ＤＮＡに比べて通常安定性の低いＲＮＡの劣化を防止するよう、さらに修正してもよい。
【０１４９】
実施例３：アミン含有表面変性剤の調製
種々の市販のコーティングを含有する市販のビーズ（例えば、基質）の分析後、種々の新規なコーティングされた基質を調製して、これらのコーティングされた基質の、アフィニティープロトコルにおける有用性を評価した。特に、アミン含有表面変性剤に注目したが、他のクラスの表面変性剤を用いた場合も同様の実験を容易に行うことができる。本明細書に詳細に述べたように、多くの表面変性剤を調製し、これらを用いて様々な大きさ、形状および材料の基質を変性する。 
【０１５０】
Ａ．５０ミクロメーター表面修飾シリカゲルの調製
Waters Corporation（ＹＭＣ−ゲルシリカ）から購入した２．０グラムの５０μｍ粒径のシリカゲルおよび２０ｍｌのイソプロピルアルコールからスラリーを調製した。そのスラリーに、１０ｍｍｏｌｅの表面変性剤を添加した。そのスラリーを１６時間穏やかに攪拌し、次いで濾過した。シリカゲルを２０ｍｌのイソプロピルアルコール中に再懸濁させ、未反応の表面変性剤を除去するため、さらに２倍の時間、濾過を行った。表面修飾シリカゲルを５０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。表面修飾の量を熱重量分析によって測定した。表３は、採用した表面変性剤および修飾された５０μｍ粒径のシリカゲルについて測定した得られた表面被覆率を記載している。Ｗという表示は、得られた基質が修飾したWaters Corporation シリカゲルであることを示し、文字は採用した表面変性剤を示すために用いられる。
【０１５１】
【表３】
2007502420.tif 000008
【０１５２】
Ｂ．１ミリメーター表面修飾ソーダライムガラスビーズの調製
２．０グラムの１ｍｍソーダライムガラスビーズ（PGC Scientific）および２ｍｌの１０％硝酸水溶液から懸濁液を調製し、３０分間穏やかに攪拌しながら還流させた。硝酸溶液をデカントし、ビーズを濾過し、脱イオン水で洗浄した。次いでそのビーズを２ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムに添加し、１２０分間穏やかに攪拌しながら還流させた。水酸化ナトリウム溶液をデカントし、ビーズを濾過し、脱イオン水で広範に洗浄した。そのビーズを１００℃で４時間、真空乾燥させた。
【０１５３】
乾燥したビーズ、１ｍｌの表面変性剤および１９ｍｌの乾燥トルエンから懸濁液を調製した。その懸濁液を４５分間穏やかに攪拌し濾過した。ビーズをトルエンで洗浄し、エタノールで洗浄し、室温で３時間、１００℃で３０分間、真空乾燥させた。カイザー（Kaiser）テストを行い、吸光度５７５ｎｍでの変化を追跡することによって、表面修飾の量を測定した。表４は、採用した表面変性剤および修飾された１ｍｍのソーダライムガラスビーズについて測定した得られた表面被覆率を記載している。ＰＳという表示は、得られた基質が修飾したＰＧＣソーダライムガラスビーズであることを示し、文字は採用した表面変性剤を示すために用いられる。
【０１５４】
【表４】
2007502420.tif 000009
【０１５５】
Ｃ．1ミリメートル表面修飾ホウケイ酸塩ガラスビーズの調製
２．０グラムの１ｍｍホウケイ酸塩ガラスビーズ（PGC Scientific）および２ｍｌの１０％硝酸水溶液から懸濁液を調製し、３０分間穏やかに攪拌しながら還流させた。硝酸溶液をデカントし、ビーズを濾過し、脱イオン水で洗浄した。次いでそのビーズを２ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムに添加し、１２０分間穏やかに攪拌しながら還流させた。水酸化ナトリウム溶液をデカントし、ビーズを濾過し、脱イオン水で広範に洗浄した。そのビーズを１００℃で４時間、真空乾燥させた。
【０１５６】
乾燥したビーズ、１ｍｌの表面変性剤および１９ｍｌの乾燥トルエンから懸濁液を調製した。その懸濁液を５時間穏やかに攪拌し濾過した。ビーズをトルエンで洗浄し、エタノールで洗浄し、室温で３時間、１００℃で３０分間、真空乾燥させた。カイザー（Kaiser）テストを行い、吸光度５７５ｎｍでの変化を追跡することによって、表面修飾の量を測定した。表５は、採用した表面変性剤および修飾された１ｍｍのホウケイ酸塩ガラスビーズについて測定した得られた表面被覆率を記載している。Ｐという表示は、得られた基質が修飾したＰＧＣホウケイ酸塩ガラスビーズであることを示し、文字は採用した表面変性剤を示すために用いられる。
【０１５７】
【表５】
2007502420.tif 000010
【０１５８】
Ｄ．６．０マイクロメーター表面修飾磁性粒子の調製
１．９ｍｌの水に懸濁させた０．１グラムの６．０μｍ磁性粒子（Micromod Partikeltechnologieから購入したSicastar-M-CT）、０．５ｍｍｏｌｅの表面変性剤および１．２５ｍｌのイソプロピルアルコールから懸濁液を調製した。そのスラリーを１６時間穏やかに攪拌した。粒子を磁石上に置き、液体をデカントした。以下のステップを２回行った。さらに４ｍｌのイソプロピルアルコールを該粒子に添加し、新たな懸濁液を１分間激しく攪拌し、その粒子を磁石上に置き、液体をデカントした。表面修飾シリカゲルを５０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。熱重量分析によって表面修飾の量を測定した。表６は、採用した表面変性剤および修飾された６．０μｍ磁性粒子について測定した得られた表面被覆率を記載している。Ｓ６という表示は、得られた基質が修飾した６μｍ磁性粒子（Sicastar）であることを示し、文字は採用した表面変性剤を示すために用いられる。
【０１５９】
【表６】
2007502420.tif 000011
【０１６０】
Ｅ．５．０〜１０．０マイクロメーター表面修飾磁性粒子の調製
３．２ｍｌの水に懸濁させた０．１グラムの５．０〜１０．０μｍ磁性粒子（CPG,
Incから購入したMPG Uncoated）、０．５ｍｍｏｌｅの表面変性剤および１．２５ｍｌのイソプロピルアルコールから懸濁液を調製した。そのスラリーを１６時間穏やかに攪拌した。粒子を磁石上に置き、液体をデカントした。以下のステップを２回行った。さらに４ｍｌのイソプロピルアルコールを該粒子に添加し、新たな懸濁液を１分間激しく攪拌し、その粒子を磁石上に置き、液体をデカントした。表面修飾シリカゲルを５０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。熱重量分析によって表面修飾の量を測定した。表７は、採用した表面変性剤および修飾された５．０〜１０．０μｍ磁性粒子について測定した得られた表面被覆率を記載している。Ｍという表示は、得られた基質が修飾した５．０〜１０．０μｍ磁性粒子であることを示し、文字は採用した表面変性剤を示すために用いられる。
【０１６１】
【表７】
2007502420.tif 000012
【０１６２】
表８は、本明細書において詳細に分析した表面変性剤の化学名を提供している。本発明は、アフィニティープロトコル（単独、またはＳＮＡＰ法と組み合わせて）において、これらの表面変性剤の１以上を用いたいずれかの基質をコーティングすること、フィルターおよびこれらの表面変性剤の１以上によって修飾された層を備えたカートリッジなどの装置の設計を意図している。
【０１６３】
【表８】
2007502420.tif 000013
【０１６４】
さらに、表面変性剤Ａ〜Ｙの各化学構造を図１０に示している。カップリング剤Ａ〜Ｙのそれぞれの配合重量に関する以下の情報、ならびにそれぞれを表すために用いられる一般的な短縮形を併せて示している。
【０１６５】
【表９】
2007502420.tif 000014
【０１６６】
Ｆ．ペプチドベースの表面変性剤
これまでに述べたアミンベースの化学官能性に加えて、本発明は、全体として、または部分的にペプチドで構成された表面変性剤を意図している。そのようなペプチドは、基質の表面に直接付着させることもできるし、または、分裂可能なリンカーもしくはそれ自身が基質表面に直接付加される化学官能基を介して、付着させることもできる。 
【０１６７】
表面変性剤に用いられるペプチドの例としては、コーティングされた基質の標的に対するアフィニティーを増加させるように相互作用するあらゆるペプチドが含まれる。表面変性剤として好適なペプチドの具体例としては、抗菌ペプチドのファミリー、アプタマーおよびＰＮＡが挙げられる。他の種類の基質および基質コーティング、ペプチドベースの表面変性剤を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌細胞または胞子（グラム陽性もしくはグラム陽性）、ウイルス（ＤＮＡベースもしくはＲＮＡベース）、小有機分子、および化学化合物を含むあらゆる広範な標的と結合させることができる。好ましいペプチドベースの表面変性剤は、ペプチドベースのコーティングされた基質と標的の相互作用を促進させるために必要な、特定の条件下で比較的安定している。
【０１６８】
実施例４：基質から活性領域−標的複合体を剥離するための分裂可能なリンカー
以下は、表面変性剤＋基質の残留物から活性領域−標的複合体を
を剥離するために用いることができる方法の非限定的な例である。  
【０１６９】
Ａ．カップリング反応におけるフロリド不安定アルキルシリルリンカー
カップリング領域にアルキルシリル部分を用いて表面変性剤を基質に付着させることができる。標的と表面変性剤の活性領域とを結合させた後、フッ化水素酸を用いてシリコン−酵素結合を分裂させ、表面変性剤＋基質の残留部分から活性領域を剥離することができる。
【０１７０】
Ｂ．スペーサー領域中のフロリド不安定アルキルシリルリンカー
活性領域を基質に付着させるスペーサー領域の骨格にアルキルシリル部分を用いることができる。標的と表面変性剤の活性領域とを結合させた後、フッ化水素酸を用いてシリコン−酵素結合を分裂させ、表面変性剤＋基質の残留部分から活性領域を剥離することができる。
【０１７１】
Ｃ．スペーサー領域中の酸不安定カルボニルリンカー
活性領域を基質に付着させるスペーサー領域の骨格において酸不安定カルボニル部分を用いることができる。酸不安定カルボニル部分の例としては、アミド、エステル、炭酸塩、ウレタンおよび尿素が挙げられる。標的と表面変性剤の活性領域とを結合させた後、トリフルオロ酢酸、塩酸、硝酸、リン酸、および硫酸などの酸を用いて、酸不安定カルボニル部分を分解することができる。
【０１７２】
Ｄ．スペーサー領域中の塩基不安定カルボニルリンカー
活性領域を基質に付着させるスペーサー領域の骨格において塩基不安定カルボニル部分を用いることができる。塩基不安定カルボニル部分の例としては、アミド、エステル、炭酸塩、ウレタンおよび尿素が挙げられる。標的と表面変性剤の活性領域とを結合させた後、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどの塩基を用いて、塩基不安定カルボニル部分を分解することができる。
【０１７３】
Ｅ．スペーサー領域中の求核性不安定リンカー
活性領域を粒子に付着させるために使用されるスペーサー領域の骨格に求核性不安定部分を用いることができる。求核性不安定部分の例としては、オキシムまたはスルホンアミドがある。あらゆる有機系アミンを、分裂を引き起こす求核性として用いることができる。
【０１７４】
Ｆ．スペーサー領域中の光不安定リンカー
活性領域を粒子に付着させるために使用されるスペーサー領域の骨格に光不安定部分を用いることができる。光不安定部分の例としては、エステル、窒素置換されたアリールヒドロキシメチルエステルおよびアリール置換されたジアゾ誘導体を挙げることができる。標的と表面変性剤の活性領域とを結合させた後、光を用いて光不安定部分の分裂を誘発することができる。採用される光の波長は、重要ではないが、その光は、８００〜１００ｎｍの波長、好ましくは４６５〜１９０ｎｍの波長、最も好ましくは３６５〜２４０ｎｍの波長を有することが好ましい。
【０１７５】
実施例５：新規な表面修飾ビーズの試験
上で詳細に説明したように、アミン官能化表面変性剤で修飾された種々のビーズ状の基質を合成した。コーティングされたビーズについて、それらの二重鎖ＤＮＡとの相互作用、ならびに細菌細胞および胞子との相互作用を評価した。そのビーズを文字Ａ〜Ｐで表す。Ａ〜Ｐは、他に特に記載がない限り、上記表８で表したものと同じ修飾を表す（ビーズＰは、ビーズＷ〜Ｕに対応する）。具体的にビーズは、表３において示された、Ｗで示された５０μｍシリカゲルビーズである。 
【０１７６】
図１１は、いくつかのアミン官能化基質がＤＮＡに対する接着性を向上させたことを示す結果をまとめたものである（図１１）。ＤＮＡ接着性のビーズスクリーニングとして、５ｍｇの５０μｍビーズを２００ｎｇの子ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（標的）を１．５ｍＬの脱イオン水（ｐＨ５）に含有するサンプルに添加した。接着のための混合時間は、合理的な処理時間とするために５分に設定するが、混合時間をより長くすることで、典型的に接着の効率性を高める。二本鎖ＤＮＡのビーズへの接着性を本明細書に記載の蛍光検出を用いて測定した。  
【０１７７】
細胞および胞子のビーズに対する接着効率を調べるための条件は、ＤＮＡとの相互作用を測定するために用いられたものと主に同じとした。簡単に述べれば、５ｍｇのビーズを、１．５ｍＬの水中に１０９個／ｍＬ以下の細胞を含有するサンプル（ｐＨ５）と５分間混合させた。サンプルとビーズをゆっくり回転させながら混合し、溶液を、ビーズを添加する前後に、蛍光法またはフローサイトメトリーを用いて試験した。サンプル中の標的の量の減少は、より良好な接触、したがって、より効率的な捕捉がなされたことを示すものである。細胞接着を測定するために、吸光度の測定によってもその結果を確認した。
【０１７８】
図１２は、２つの異なる細菌細胞（２つの異なる標的）とビーズＡ〜Ｐおよびビーズ１〜１１との相互作用の分析結果をまとめたものである。ビーズ１〜１１は、表２に記載の市販のビーズに対応する。簡単に述べれば、種々の修正されたビーズについて、それが炭疽菌（B. anthracis）（Ｂａ）またはB. thuriengensis （Ｂｔｋ）由来の細菌細胞と相互作用する能力を分析した。 
【０１７９】
図１３は、２つのさらなる（２つの異なる標的）とビーズＡ〜Ｐおよびビーズ１〜１１との相互作用の分析結果をまとめたものである。ビーズ１〜１１は、表２に記載の市販のビーズに対応する。簡単に述べれば、種々の修正されたビーズについて、それが大腸菌（E. coli）またはペスト（Y. pestis）（Ｙｐ）由来の細菌細胞と相互作用する能力を分析した。
【０１８０】
図１４は、ビーズＡ〜Ｐおよびビーズ１〜１１と、炭疽菌（B. anthracis）（Ｂａ）細胞（植物性）または胞子形成された炭疽菌（B. anthracis）（Ｂａ胞子）の相互作用の分析結果をまとめたものである。ビーズ１〜１１は、表２に記載の市販のビーズに対応する。種々の修正されたビーズについて、それが植物性または胞子形成された形状の炭疽菌（B. anthracis）（Ｂａ）のいずれかと相互作用する能力を分析した。
【０１８１】
図１５は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による画像を示す。これらの画像は、細胞（標的）がビーズに物理的に接着していることを証明するものである。簡単に述べれば、ビーズを炭疽菌（B. anthracis）植物性細胞または胞子を含有するサンプルとともにインキュベートし、ＳＥＭ画像を撮影して、細胞および胞子が物理的にビーズと会合するかどうかを確認した。ＳＥＭ画像の試験によって明らかにわかるように、細胞および胞子がビーズの表面に接着していた。しかしながら、細胞または胞子が１０９個の細胞である場合であっても、ビーズの表面は標的で飽和していないようである。植物性のＢａの場合、細菌の鎖が複数のビーズにまたがり、それらを凝集させているのが観察される。
【０１８２】
図１６は、アフィニティープロトコルとＳＮＡＰ法の双方を用いたサンプル分析が、ＳＮＡＰ法のみの場合と比較して、細菌性の標的ＤＮＡの検出を改良することを証明している。
【０１８３】
実施例６：接着に影響を及ぼすファクター
本発明の方法の重要な目的は、（ａ）現場（例えば、犯罪現場、環境的領域、事件現場、など）に容易に適用することができ、（ｂ）広範囲のサンプル、基質および標的に適用可能な条件下でアフィニティープロトコル技法を使用することができるようにするパラメーターの同定である。したがって、ＤＮＡの基質への接着性に影響を及ぼすファクターを理解するために設計された一連の実験を行った。
【０１８４】
ｐＨおよび塩濃度の範囲がコーティングＢ（トリアミンコーティング）でコーティングされたビーズの相互作用に及ぼす影響を示す。簡単に述べれば、この実験は、サンプル溶液のｐＨおよびイオン強度の調整、および対応する標的の捕捉と続くビーズからの放出に及ぼす影響を測定することを含む。ｐＨもイオン強度もＤＮＡのビーズに対する接着性の％効率に及ぼす深い影響を有している。
【０１８５】
図１７〜１８は、コーティングＢでコーティングされたビーズと二本鎖子ウシ胸腺ＤＮＡとの相互作用を調べた実験の結果をまとめたものである。ＤＮＡとビーズとの相互作用は、塩濃度およびｐＨによって影響を受けていた。この相互作用は、塩濃度が０〜５００ｍＭの範囲のとき、急激に低下していた。 
【０１８６】
次の一連の実験において、コーティングＤでコーティングされたビーズと、水、細菌性培養上清、または非ラボラトリーレベルの環境水のいずれかのサンプル中に播かれたＤＮＡとの相互作用を分析した。図１９は、実験の結果をまとめたものであり、コーティングされたビーズが広範囲のサンプル中に含有されている標的と効率的に結合し得ることを示している。
【０１８７】
実験７：標的の剥離に影響を及ぼすファクター
特定のコーティングされた基質もしくはコーティングされていない基質の有益性を評価するための第１のステップが、基質の、標的と相互作用する能力の決定を行うにもかかわらず、さらなら標的の分析は、基質から標的を回収する能力を必要とする。標的を分析するための多くの近代的な技法の感受性のレベルが高いとすれば、標的の全ては基質から容易に剥離する必要がない。しかしながら、更なる分析にとって十分な量の標的を回収する能力は重要である。
【０１８８】
ＤＮＡの基質に対する接着性に影響を及ぼすファクターについての我々の事前の分析が示すように、基質と標的ＤＮＡの間の接着（例えば、標的の接着および剥離）は、ｐＨおよび塩濃度に非常に影響される。したがって、基質から標的を剥離するために用いることができる方法は、ｐＨおよび塩濃度の操作を含む。さらに、我々は、温度が標的ＤＮＡの基質に対する接着に影響を及ぼすことを見出した（図２０）。    
【０１８９】
本発明は、多くの変数のうちのいずれかを操作することによって基質から標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細菌細胞など）を剥離することができることを意図している。当業者は、これらの変数の中から容易に選択することができ、そして最適溶出（例えば、剥離）条件は、採用する具体的な基質、具体的な標的、標的の濃度および初期接着条件に基づいて変化するであろう。操作され得る変数の例としては、限定されないが、塩濃度（例えば、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＢｒ、ＨＣｌ）、ｐＨ、スペルミジンの存在、ＳＤＳの存在、緩衝液のタイプ（例えば、炭酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液）、血清の存在、界面活性剤の存在、アルコール類の存在、接着時間、温度、および機械的攪拌の適用が含まれる。機械的操作の例としては、超音波処理、フレンチプレスの使用、電気ショック、脱水処理、ボルテックス、またはレーザーの適用が含まれる。 
【０１９０】
本発明はさらに、標的の剥離は、表面変性剤を基質に結合する部分の分裂によって達成されることを意図している。
【０１９１】
さらに別の態様において、本発明は、基質から標的核酸を回収するために電気溶出を使用することを意図している。
【０１９２】
アミン表面感応化ビーズは、開発され、ＤＮＡに対する高いアフィニティーを示してきた。ＤＥＴＡＰ修飾ビーズが捕捉した核酸は、種々の液体環境において、きわめて良好である。しかしながら、この基質のＤＮＡに対する高いアフィニティーは望ましい。標的がさらに分析され得るように基質から標的を効率的に剥離することができることが等しく好ましい。
【０１９３】
基質からの標的の剥離を促進するための他の方法に加えて、我々は、ＤＥＴＡＰビーズ結合ＤＮＡの回収の効率性を向上させるために電解を用いた。現在テストされているプロトコルは、少量のＤＮＡを基質から回収する際に効率的でなかったものの、この方法は、初期濃度が大きい場合に、基質への接着がうまくいくことが証明されている。
【０１９４】
アガロースおよび子ウシ胸腺ＤＮＡは、Invitrogen（Carlsbad、CA）から購入した。アガロースを０．５Ｘ ＴＢＥ電気泳動法緩衝液（４５ｍＭ Tris-Borate、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶融させた。ＤＥＴＡＰビーズを合成し、バッチラベルＰＢ−７を用いてアミン官能化ビーズを示した。GeneCapsule（登録商標）装置は、Geno Technology（St. Louis、MO）から入手した。他の標準的な試薬は、分子生物学グレードで高純度である。
【０１９５】
２０のＰＢ−７ビーズを、５０μｇ／ｍＬの子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する１ｍＬの水の中に一晩おいた。ビーズを、見えるようにするために０．２μｇ／ｍＬのエチジウムブロミドを含んだノーマルモードの０．５％アガロース−ＴＢＥゲル中に入れ、１Ｎ ＮａＯＨを含有する上部のアガロースで被覆した。またビーズを種々の濃度のＮａＯＨを含有する０．５％アガロース−ＴＢＥを用いてGeneCapsule（登録商標）装置に入れた。１００μＬのアガロース層をGelPICK（登録商標）中に設定した。入れられたビーズをこの支持層の上に層状に置き、アガロースをその上にかぶせた。GelTRAP（登録商標）をＴＢＥ中で１５分間均衡化して、１５０μＬの新鮮なＴＢＥを添加し、GelPICK（登録商標）を、図２１に示したようにトラップＴＢＥのレベルに挿入した。両方の状況において電気泳動法を２００Ｖで１５分間行い、さらに３回の５秒間パルスを逆極性で行い、GeneTRAP（登録商標）膜からＤＮＡを剥離した。GeneCapsule（登録商標）からの溶出物は、Collection Portに穴をあけ、ピペットで液体を除去することによって行った。
【０１９６】
全ての低ＤＮＡ実験は、０．１Ｎ ＮａＯＨもしくは０．１Ｎ ＮａＯＨプラス１００μｇ／ｍＬの子ウシ胸腺ＤＮＡをのいずれかを含有する０．５％アガロース−ＴＢＥを用いて、GeneCapsule（登録商標）装置を用いて行った。２０のＰＢ−７ビーズを３０分間、５、５０もしくは５００ｐｇ／ｍＬのpCR2.1Topo-BtkCryIA Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki 遺伝子コピー標準プラスミドを含有する１ｍＬの水の中に入れた。上記のように、入れられたビーズを１００μＬの、GelPICK（登録商標）中の支持ゲル上に層状におき、約４５０μＬのアガロースの被覆をセットし、残りの容量を満たした。予め均衡化しているGeneTRAPs（登録商標）を１５０μＬの新鮮なＴＢＥで満たし、入れられたGelPICK（登録商標）を挿入した。入れられたGeneCapsules（登録商標）について、電気泳動法を、２００Ｖで１５分間または４５分間行った。溶出物を、穴を開けた回収ポートからピペットで除去した。対照サンプルを、１５０μＬの０．０１Ｎ ＮａＯＨと１００μｇ／ｍＬの子ウシ胸腺ＤＮＡ中で１５分間室温で、インキュベーションによって溶出した。TaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲによって、サンプルのアッセイを行った。
【０１９７】
図２１に示されたベルによって示されているように、高い量のＤＮＡを効率的に電気溶出によって回収することができる。図２１Ｃは、電解にさらされるとビーズから容易に移動する５０μｇの量の子ウシ胸腺ＤＮＡを示している。
【０１９８】
最初に、我々の実験は、ＤＮＡを比較的低い電圧（〜１０Ｖ／ｃｍ、１５分以内）でアミンビーズから分離することができたことを示している。以下の表は、複数の低電圧電気溶出を用いて、ＤＮＡを基質から剥離して得られた結果をまとめたものである。塩濃度を変化させた条件下で、ＤＮＡの収率は良好であるが、ＮａＯＨ濃度がより高い条件下で（例えば、アルカリ性環境）、最も高い回収率が観察された。
【０１９９】
【表１０】
2007502420.tif 000015
【０２００】
これらの実験は、電気溶出が基質から標的を剥離することができる別のメカニズムであることを示すものである。現在の条件は、非常に低濃度のＤＮＡに最適化されていなかったが、結果は、電気溶出が基質から標的を剥離するための、高速、安全かつコスト効率の良いメカニズムであることを示している。  
【０２０１】
実施例８：基質から標的を剥離するための分裂可能なリンカーの使用
上で詳細に概説したように、本発明の重要な局面は、標的をさらに分析することができるように、基質から標的を剥離する能力である。基質からの標的の剥離を容易にすることができる１つのメカニズムは、基質から標的を剥離するために特に分裂することができる分裂可能なリンカーを含有する表面変性剤の使用である。本発明は、多数の分裂可能なリンカーのいずれかの使用を意図している。
【０２０２】
分裂可能なリンカーの使用についての起こりうる１つの懸念は、リンカーの分裂を誘導するために必要とされる作用物質は、標的を劣化させるかもしれないし、またはそうでなければ、標的のさらなる分析を阻害するかもしれないということである。この可能な関連を処理するために、我々は、ＤＥＴＡＰまたは分裂プロダクトＤＥＴＡの存在下で標的ＤＮＡの分析を行い、ＰＣＲによるＤＮＡの更なる分子分析におけるこれらの部分の可能な阻害的役割を評価した。我々は、分析に基づいて、ＤＥＴＡＰおよび分裂プロダクトＤＥＴＡが存在することによって、リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡのさらなる分析を阻害することはないという結論に達した。
【０２０３】
簡単に述べれば、ジエチレントリアミンおよび（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンを、Sigma-Aldrich（ＤＥＴＡ １０３．２ｇ／ｍｏｌ、０．９５ｇ／ｍＬ；ＤＥＴＡＰ ２６５．４ｇ／ｍｏｌ、１．０３１ｇ／ｍＬ）から入手した。オートクレーブしたジエチルピロカーボネート処理した水（Ambion製）中でそれぞれの連続希釈を行った。
【０２０４】
標的ＤＮＡは、Bacillus thuriengensis subspecies kurstakiに由来する粗プラスミドＤＮＡまたは、遺伝子コピー標準pCR2.1Topo-BtkCryIAのいずれかである。TaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲ化学を用いて、ABI 7700 Sequence Detection System上のサンプルをアッセイした。
【０２０５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを標準的な５０μＬ容量中で行った。陰性対照を除き、アッセイ試薬を５０ｐｇ／ｍＬの標的ＤＮＡで固定した。サンプルをＤＥＴＡＰまたはＤＥＴＡのいずれかの濃度を変化させながら固定し、陽性対照に水を添加した。
【０２０６】
アミン添加物を含有しない陽性対照に対する閾値周期の変化として、ＰＣＲの阻害を測定した。パーセント阻害を陽性対照の閾値周期における変化の比率として求めた。我々に結果によれば、ＤＥＴＡＰは、高濃度において、ＰＣＲに対して阻害することが可能であることが示されている。しかしながら、ビーズベースのＤＮＡ捕捉および放出（〜２５ｎｍｏｌアミン官能性）の用途に関連する濃度において、阻害レベルは有意に減少した。２０ｎｍｏｌのＤＥＴＡＰを５０μＬのＰＣＲ反応によって、約２（信号の阻害：〜９％）の閾値周期が移動した。
【０２０７】
対照的に、我々の結果から、ＤＥＴＡのみでは、ＰＣＲを有意に阻害しないことがわかった。ビーズベースのアッセイに関連する量および、規模の大きい複数のオーダーである量の双方において、陽性対照に関連するＤＥＴＡ添加物による閾値周期の明らかな移動は認められなかった。
【０２０８】
これらの結果は、分裂可能なリンカーを含有する表面変性剤の使用が、基質ベースの標的の捕捉、それらの標的の放出およびそれらの標的のさらなる分子分析を容易にするための実行可能なアプローチであることを示している。
【０２０９】
表面変性剤を基質に対して逆に付着させるように使用することができる第２のクラスの分裂可能なリンカーは、アンモニア不安定リンカーである。したがって、第２の一連の実験において、我々は、アンモニアがＰＣＲによる標的ＤＮＡの更なる分析を阻害するかどうかを分析した。
【０２１０】
２つの実験を行った。標的は、ＢＨＩ（培養培地）で一晩成長させ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って細胞をペレット化した植物性Ｂａの上清とした。上清希釈液は、ＢＨＩで調製した。
【０２１１】
種々の濃度のアンモニアを、種々のＢａ上清の希釈液と混合し、室温でインキュベートした。得られた混合物を、ＡＢＩ７７００の標準TaqMan反応における溶出物として使用した。各溶出物を（５０μＬから）５μＬずつＰＣＲ反応ウェルに、Ｂａプライマー−プローブセットとともに添加した。全てのサンプルを２つずつ調製した。対照は、ＰＣＲウェル中に直接配置した上清希釈液（アンモニア不存在）で構成した。
【０２１２】
２つの独立した実験の結果は、アンモニアを添加することによってＰＣＲ反応の０．００５Ｍの濃度レベルまで、ＰＣＲ効率のロスなく、持続することができることが示された。アンモニア濃度０．０５Ｍのときでさえ、ＰＣＲ効率のロスは、わずかに約１〜２程度であった。さらに、我々の観察によれば、低レベルのアンモニアも実際は、ＰＣＲ反応の効率を向上させ得ることが示された。おそらく、ＰＣＲ反応混合物のｐＨにおける好ましい変化によるものであろう。
【０２１３】
実施例９：標的の捕捉と放出の最適化
アフィニティープロトコルは、不均一な液体および固体サンプルの中から多くの標的のあらゆるものを同定および／または分離するために広く適用可能である。比較的最適化されていない形態においてさえ、アフィニティープロトコルは、不均質なサンプルから低濃度の標的を検出するための感受性を増加させる。したがって、最適化されていない形態プロトコルは、多様な状況において実質的な利点を有する。しかしながら、アフィニティープロトコルをさらに最適化することによって、更なる利点が得られる。それらの利点としては、限定されないが、（ｉ）より低濃度の標的を検出することができる、（ｉｉ）より短い時間で標的を同定および／または分離することができる、（ｉｉｉ）サンプル内の高いパーセンテージの入手可能な標的の、基質上での捕捉を検出することができる、（ｉｖ）基質（例えば、さらなる分析または分離のため）から高いパーセンテージの結合した標的を放出／溶出させることができる、ならびに（ｖ）開始物質（例えば、消費を減らし、基質を少なくする）を用いるアフィニティープロトコルを行うことができる、が挙げられる。
【０２１４】
以下は、アフィニティープロトコルを最適化し、したがって、上記利点のいくつかを達成するために行われた実験を詳細に示したものである。
【０２１５】
（ａ）コーティングされた基質の捕捉および放出
いくつかの市販の、および実験室で合成したコーティングされた基質を試験して、それぞれのコーティングされた基質が標的を捕捉および放出する効率性を評価した。この特別の例において、標的はＤＮＡとし、基質は表面変性剤で修飾した種々の磁性ビーズとした。  
【０２１６】
以下の市販のビーズ：Cortex-Biochemポリスチレン−アミンビーズ、Dynal
Ｍ−２７０ポリスチレン−アミンビーズ、Polysciencesポリスチレンビーズ、Biosourceシラン処理されたＦｅＯ−アミンビーズ、およびストレプトアビジン官能化ビーズを使用した。さらに以下の実験室で合成されたビーズ：Ｍ−Ｂ−１、Ｍ−Ｂ−２およびＭ−Ｂ−３を使用した。この実験室で合成されたビーズは、以下のようにして作製した：５〜１０μｍのコーティングされていない磁性粒子（５〜１０μｍの粒径のａｋａ−ビーズ、または直径５〜１０μｍビーズ；ＣＰＧ，Ｉｎｃ．から入手）を水、表面変性剤およびイソプロピルアルコールと組み合わせて懸濁させた。このスラリーを１６時間穏やかに攪拌した。この粒子を磁石の上に配置し、液体をデカントした。以下のステップを２回繰り返した。さらにイソプロピルアルコールを粒子に添加し、懸濁液を１分間激しく攪拌し、粒子を磁石上に置き、液体をデカントした。表面修飾シリカビーズを５０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。乾燥後、熱重量分析によって表面修飾の量を測定した。  
【０２１７】
図２２は、ビーズＭ−Ｂ−１、Ｍ−Ｂ−２、Ｍ−Ｂ−３、ならびに市販のビーズを用いて行った一連の実験をまとめたものである。これらの実験では、各コーティングされた磁性ビーズの捕捉と放出の活性を、ＤＮＡ標的を用いて調べた。簡単に述べれば、１ミリグラムのコーティングされたビーズを１ｍＬの５００ｐｇ／ｍＬのＤＮＡに添加した。ビーズがＤＮＡを補足する効率を測定した。図２２の一番左の棒グラフに示している。ビーズからＤＮＡが放出される（例えば、溶出される）効率を測定した。その溶出効率は、パーセンテージ回収率と互換可能に用いられるものであり、図２２の中央の棒グラフに示す。ＤＮＡを１００μｇ／ｍＬの子ウシ胸腺ＤＮＡが入った１５０μＬの０．０１Ｎ ＮａＯＨを含む溶出緩衝液中に放出した。回収したＤＮＡと補足したＤＮＡの比率が溶出効率である。最終的に、各ビーズのパーセンテージ効率を分析し、図２２の一番右の棒グラフに示している。このパーセンテージ効率は、開始サンプル（本実施例においては、５００ｐｇ）における、回収したＤＮＡと補足したＤＮＡの比率である。
【０２１８】
いくつかの態様において、本発明は、捕捉効率が７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％以上、または９９％以上であることを意図している。他のいくつかの態様において、本発明は、捕捉効率が１００％であることを意図している。
【０２１９】
いくつかの態様において、本発明は、溶出効率が７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％以上、または９９％以上であることを意図している。他のいくつかの態様において、本発明は、溶出効率が１００％であることを意図している。
【０２２０】
前記のいずれかにおいて、本発明は、全体的な効率が７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％以上、または９９％以上であることを意図している。他のいくつかの態様において、本発明は、全体的な効率が１００％であることを意図している。
【０２２１】
（ｂ）基質量および捕捉時間
アフィニティープロトコルは、多くの用途に好適である。これらの用途の多くは、この方法を行うのに必要なコスト、時間、および消費可能な電力量に影響されやすい。よって、我々は、多くの実験を行って、捕捉効率を、基質量と捕捉時間（例えば、基質−サンプル相互作用に割り当てられる時間の量）の関数として調べた。これらの実験の結果を図２３および２４のグラフに示している。簡単に述べれば、市販のアミンコーティング磁性ビーズ（Dynal製）を使用して、水で希釈した１ｍＬの細菌性培養上清からＤＮＡ標的を捕捉した。基質の濃度は、１ｍｇ〜５ｍｇの間で変化させ、捕捉時間は１分〜１０分の間で変化させた。  
【０２２２】
１ｍｇ程度の基質（例えば、ビーズ）では、サンプル中の標的の９０％以上を捕捉するのに１分で十分であることがわかる。基質の濃度、捕捉時間またはその両方が増加すると、捕捉効率は、９９．９９％以上にまで増加する。アフィニティープロトコルの特定の用途の要件にしたがって、これらのパラメーターを操作し、効率とコストの適切な組み合わせに到達することができる。
【０２２３】
（ｃ）基質の量と溶出時間
上で詳細に概説したように、アフィニティープロトコルの多くの可能な用途として、この方法を行うのに必要な合計時間は、重要なファクターである。したがって、我々は、溶出効率を、基質の量と溶出時間の両方の関数として調べた。これらの実験の結果を、図２５および２６にグラフで示している。簡単に述べれば、市販のアミンコーティング磁性ビーズ（Dynal製）を使用して、水で希釈した１ｍＬの細菌性培養上清からＤＮＡ標的を捕捉した。この溶出は、１５０μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡの入った０．０１Ｎ ＮａＯＨ（１００mｇ／ｍＬ）を含む溶出緩衝液で行った。基質の濃度は、１ｍｇ〜５ｍｇの間で変化させ、捕捉時間は１分〜１０分の間で変化させた。基質の濃度と溶出時間に関して溶出効率に有意な変化は認められなかった。
【０２２４】
（ｄ）溶出量
上で詳細に概説したように、アフィニティープロトコルの多くの可能な適用において、この方法を行うために必要な試薬の量は重要なファクターである。試薬の必要性は、その方法のコストを増加させるだけでなく、従来の実験室状況では行われない本発明の適用の分野において輸送および維持されなければならない材料の量をも増加させる。アフィニティープロトコルに必要な可能な試薬の１つは、基質から捕捉された標的を回収するのに必要な溶出緩衝液である。したがって、われわれは、溶出緩衝液の容積が溶出効率に及ぼす影響を調べた。
【０２２５】
これらの実験の結果を図２７にまとめている。簡単に述べれば、５０μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡの入った０．０１Ｎ  ＮａＯＨ（１００μｇ／ｍＬ）を含む溶出緩衝液中の５ｍＬのサンプルからの捕捉に続いて、標的を溶出した。溶出緩衝液の容積は、１ｍＬ〜１５０μＬの間で変化した。この範囲の溶出緩衝液においては、溶出効率における有意な変化は認められなかった。したがって、溶出緩衝液の容積は、アフィニティープロトコルの適用の特定の要件に基づいて選択することができる。
【０２２６】
いくつかの態様において、基質から標的を溶出させる方法は、標的が捕捉される開始サンプル量の５分の１未満の溶出緩衝液で行われる。他のいくつかの態様において、基質から標的を溶出させる方法は、標的が捕捉された開始サンプル量の６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、または２５分の１未満の溶出緩衝液中で行われる。他の特定の態様において、基質から標的を溶出する方法は、標的が捕捉された開始サンプル量の３０分の１、４０分の１、または５０分の１未満の溶出緩衝液中で行われる。 
【０２２７】
（ｅ）溶出ｐＨ
これらの実験に用いられる標準溶出緩衝液（１００μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡの入った０．０１Ｎ ＮａＯＨ（１００μｇ／ｍＬ））のｐＨは、１１．８である。溶出緩衝液のｐＨの小さな変化が溶出効率に及ぼす影響を調べた。図２８は、これらの実験の結果をまとめたものである。簡単に述べれば、溶出緩衝液のｐＨがほぼ１１．５〜１２．３の間で変動するのであれば、溶出効率には統計学的に有意な影響はないことがわかった。  
【０２２８】
（ｆ）溶出緩衝液の最適化
上で詳細に概説したように、溶出緩衝液には子ウシ胸腺ＤＮＡが含まれていた。したがって、我々は、溶出効率が緩衝液に含まれる子ウシ胸腺ＤＮＡの濃度に影響されやすいかどうかを調べるために実験を行った。簡単に述べれば、溶出緩衝液中の子ウシ胸腺ＤＮＡの濃度を５０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬで変化させた。子ウシ胸腺ＤＮＡの濃度が１００μｇ／ｍＬより大きい場合、溶出効率の有意な増加が認められた。したがって、更なる試薬の使用（例えば、付随する費用が伴う）が溶出効率に対して有意な効果をもたらさないことを考慮して、溶出緩衝液に使用するために、子ウシ胸腺ＤＮＡの濃度が１００μｇ／ｍＬの標準濃度を選択した。    
【０２２９】
（ｇ）洗浄
多くの単離または分離プロトコルにおいては、１以上の洗浄ステップが通常採用される。したがって、アフィニティープロトコルの１つの態様は、標的の捕捉の後、標的の放出の前に洗浄ステップを含むことができるであろう。そのような洗浄ステップは、低アフィニティー材料を基質から除去し、したがって、基質に対するアフィニティーが増加した標的の特異的な捕捉および溶出を増加させるために利用することができるであろう。しかしながら、１以上の洗浄ステップが必要であるということは、アフィニティープロトコルを行うのに必要な時間、コスト、および試薬の量を増加させるものである。したがって、我々は、一連の実験を行って、標的の捕捉の後、標的の放出の前における１以上の洗浄ステップの必要性を調べた。  
【０２３０】
簡単に述べれば、２つの１ｍＬの洗浄ステップを行って、または行わずに、アフィニティープロトコルを行った。これらの実験の結果は、洗浄ステップは必要でなく、実際は、ＤＮＡ回収効率を有意に変化させることはなかったことを示している。成長培地や非実験室水などの、他のより多くの不均質なサンプル中に懸濁させたＤＮＡを用いて、更なる実験を行ったところ、洗浄ステップが必要でないことがわかった。２つの洗浄ステップは、ＤＮＡの回収効率を有意に減少させることはなく、したがって、洗浄ステップは、いくつかの用途において、必要な場合もしくは望ましい場合に行うことができる。例えば、サンプルが極端に不均一、危険であるか、または単離した標的の更なる分析を行うかもしれない高濃度の阻害物質を含有する場合、回収効率に対して有意な否定的な効果を及ぼさずに洗浄ステップを採用することができる。一方、速度またはコストが重要である場合、捕捉後の洗浄ステップを省略することができる。
【０２３１】
実施例１０：高速アフィニティープロトコル
アフィニティープロトコルは、基質を用いた不均質なサンプルから標的を分離および／または単離するための改良された方法を提供する。基質は、事実上あらゆる大きさまたは形状とすることができ、磁性であっても非磁性であってもよく、また、修飾された基質と特定の標的とのアフィニティーを、修飾された基質とサンプル中の他の物質とのアフィニティーと比較して、優先的にさせる、１以上の表面変性剤によって修飾することができる。
【０２３２】
アフィニティープロトコルは、実験室または現場での多くの用途のいずれかに好適である。さらに実施例９で詳細に概説したように、アフィニティープロトコルの局面は、（ｉ）方法を行うのに必要な時間を短縮させる、（ｉｉ）方法を行うのに必要な材料コストを減少させる、および（ｉｉｉ）方法を行うのに必要な材料数を減少させるように操作することができる。例えば、アフィニティープロトコルは、あるサンプル容量の範囲、例えば、１ｍＬ〜５ｍＬで行うことができる。アフィニティープロトコルは、ある基質濃度の範囲、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬのビーズなどの基質を用いて行うことができる。アフィニティープロトコルは、捕捉時間５分、または５分未満、溶出時間１分、１分未満、または３０秒で行うことができる。もちろん、当業者は、本発明が多くのパラメーターのいくつかを用いることを意図している。そして、前述したものは、単に方法を行うための時間およびコストを減らすために有利に用いられるパラメーターを示したに過ぎない。
【０２３３】
不均質なサンプルから標的を分離すつために用いられるアフィニティープロトコルの高速な適用をここに詳細に提供する。本実施例において、標的を分離するために必要な時間は、５分未満である。本実施例において、基質は、２．７μｍ、アミン誘導性、磁性ビーズ（Dynal）とし、標的は、ＤＮＡとし、サンプルは、脱イオン化ラボラトリー水で希釈された細菌性上清とした。以下に、高速プロトコルの例を示す。各ステップの他に、プロトコルの各ステップを行うために必要な時間と合計経過時間を記載している。
【０２３４】
【表１１】
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【０２３５】
本発明の方法、組成物および装置のある適用は、サンプルから分離した標的の長期保存である。そのような長期保存は、様々な場合において有用である。例えば、効率的かつ信頼できる長期保存は、生物学的証拠のカタログを作る法医学的の状況において有用である。さらに、長期保存は、教育的目的のためのサンプル、ならびに、標的を採取してすぐには実施できない分析のためのサンプルを保存する医学的状況において有用である。さらに、長期保存は、種々の環境的状況において有用である。標的の採取はフィールドにおいてなされるが、標的の分析は、フィールドとは地理的に離れたところにある実験室で行われる場合に有用である。
【０２３６】
長期保存の一例としては、基質自身を標的の媒体として使用することを含む。例えば、基質上で標的を捕捉した後、標的−基質複合体をサンプルから分離し、真空乾燥し、保存することができる。これは、非常に高速に行うことができる。上記に要約した高速プロトコルにおいては、この乾燥および保存は、以下のステップ５に任意に導入すればよい（例えば、約２分の処理時間）。具体的な例としては、標的−ビーズ複合体を含有するチューブを８０℃の真空オーブン中に約３０分間またはビーズペレットが乾燥するまでおくことができる。この乾燥ペレットは、例えば、乾燥剤とともに暗い容器に保存することができる。 
【０２３７】
実施例１２：複合体サンプルからの標的の回収
上で詳細に概説したように、アフィニティープロトコルは、効果的にサンプルから標的を分離するために用いることができる。多くの複合サンプルからの標的の回収の効率性を評価するために、特定のビーズ、実施例９に詳細に記載の捕捉および溶出条件をさらに試験した。これらの多くの複合サンプルは、この技術を適用する医学的および環境的サンプルのタイプをより正確に模倣するかもしれない。複合サンプルの例としては、土壌、泥、粘土および砂またはその他の高腐植質の土壌などの固体サンプルが含まれる。複雑なサンプルのさらに別の例としては、血液、尿、糞便、精液、膣液、骨髄および脳脊髄液などの生物学的サンプルが挙げられる。複雑なサンプルのさらに別の例としては、海水、池の水、油、液体沈殿物もしくは鉱床、乾燥もしくは湿潤食物原料が挙げられる。 
【０２３８】
簡単に述べれば、アフィニティープロトコルを用いて多くの複合サンプルから標的ＤＮＡを分離した。分離した標的ＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅した。結果は、標的ＤＮＡがアフィニティープロトコルを用いて複合サンプルから分離され、その分離は、ＰＣＲを阻害するかもしれない試薬を除去するのに十分であることを示していた。炭疽菌（B. anthracis）（Ｂａ）およびB. thuringiensis（Ｂｔｋ）培養上清の双方からの標的ＤＮＡを、ラボラトリーグレードの水では認められなかった多くの複合混入物質のいずれかを含有する非ラボラトリーグレード、環境的水から効率的に分離した。ＤＮＡが効率的に補足され、溶出されただけでなく、それは、ＰＣＲ反応においてＤＮＡの増幅を十分に可能にする阻害性混入物質を分離した。
【０２３９】
第２の一連の実験において、炭疽菌（B.
anthracis）（Ｂａ）およびB. thuringiensis（Ｂｔｋ）培養上清の双方からの標的ＤＮＡを、ラボラトリーグレードの水または非ラボラトリーグレードの水の中には認められなかった多くの複合添加物のいずれかを含有する濃縮する成長培地（ＢＨＩ）から効率的に分離した。ＤＮＡが効率的に補足され、溶出されただけでなく、それは、ＰＣＲ反応においてＤＮＡの増幅を十分に可能にする阻害性混入物質を分離した。
【０２４０】
第３の一連の実験において、アフィニティープロトコルを用いて複合サンプルから標的細菌細胞を分離した。簡単に述べれば、我々は、アフィニティープロトコルを用いて、多くの複合サンプルから標的ＤＮＡを分離した。ＰＣＲを用いて標的細胞から分離したＤＮＡを増幅した。結果は、細菌細胞が複合サンプルから効率的に分離されること、さらにはこれらの細菌細胞からのＤＮＡがその後ＰＣＲによって増幅されることを示していた。Ｂａ、Ｂｔｋ、およびＹｐ植物性細胞を標的細菌細胞として用いて、これらの標的を、ラボラトリーグレードの水には認められなかった多くの複合混入物質のいずれかを含有する非ラボラトリーグレード水、環境的水から分離した。
【０２４１】
実施例１３：アフィニティープロトコルの乾燥サンプルへの適用
本明細書において詳細に示しているように、アフィニティープロトコルを用いて、広範囲の標的を気体、液体および固体サンプルを含む種々のサンプルから分離することができる。我々は今、種々のサンプルからの標的の分離は、サンプルがまず最初に水中で再水和し、またはそうでなければ処理されてスラリーが形成されることを証明する。いくつかのタイプのサンプルの再水和は、有用であるかもしれないにもかかわらず、粘土土壌などの特定の物質は、再水和が困難であるか、または再水和に続く処理をすることが困難である。  
【０２４２】
乾燥した生物学的粒子は、典型的に電荷を有しており、この電荷は、土壌サンプルや空気などの乾燥サンプルからの標的の分離を容易化するために使用される。より特に説明するために、磁性の基質または表面変性剤でコーティングされた磁性の基質をサンプルに添加し、次いでこのサンプルと基質を、基質がサンプルと接触するように混合する。混合後、標的−基質複合体が形成され、これは本明細書に詳細に示した方法のいずれかを用いて、アフィニティープロトコルによって分離された標的を試験するために処理することができる。
【０２４３】
図２９は、標的が乾燥サンプルから効率的に同定され得ることを説明するために行われた実験の結果をまとめたものである。我々は、乾燥土壌サンプルに細菌性の標的を播いた。ＳＮＡＰのみを用いて細菌性の標的から単離したＤＮＡについてＰＣＲ分析を行い、乾燥アフィニティープロトコルとＳＮＡＰを組み合わせて用いて細菌性の標的から単離したＤＮＡと比較した。この実験においては、アフィニティープロトコルは、土壌サンプルと静電帯電した非磁性ビーズとを接触させ、ＳＮＡＰとＰＣＲ分析を用いてＤＮＡの単離の前に標的を濃縮化した。図２９は、ＤＮＡの単離とＰＣＲの前に乾燥アフィニティープロトコルを用いることによって、アフィニティープロトコルの不存在下での土壌サンプルの分析と比較して、相対シグナルを増加させることを示している。そのようなシグナルの増加は、（ａ）乾燥アフィニティープロトコルを用いて乾燥サンプルから標的を分離することができること、および（ｂ）アフィニティープロトコルを使用することによって、乾燥サンプルを含む種々のサンプルからの標的の検出を改良する。    
【０２４４】
実施例１４：アフィニティープロトコルの乾燥サンプルへの適用
アフィニティープロトコルの非液体サンプルへの適用には、種々の重要な環境的、医学的、産業的および安全な適用がある。上で概説したように、乾燥サンプルからの標的の分離は、まず乾燥サンプルを再水和してスラリーを作製し、それを基質と接触させて分離可能な標的−基質複合体を形成し、そして任意にさらなる分析を行うことによって達成される。別法として、乾燥サンプルからの標的の分離は、最初に乾燥サンプルを再水和する必要なく達成される。    
【０２４５】
乾燥サンプルから標的を分離し、任意に分析するために更なる実験を行った。これらの実験において、表面修飾された、磁性基質を含むカートリッジを用いて、乾燥サンプル上でアフィニティープロトコルを行った。簡単に述べれば、Ｂａ胞子（標的）を、希釈（０〜１０６胞子／ｍＬの砂）を変化させながら、砂サンプルに播いた。各カートリッジに５ｍＬの蒸留水で湿らせた１グラムの砂を充填した。カートリッジ中に１５ｍｇ（３ｍｇ／ｍＬ）の磁性ビーズ（基質）を用いて標的を捕捉した。アフィニティープロトコルのこの用途において、捕捉時間を５分とし、溶出時間を１分とした。    
【０２４６】
標的胞子を溶出した後、標的からのＤＮＡをＰＣＲによって分析し、ＰＣＲ分析の前にアフィニティープロトコルを用いて、砂中の標的の検出の限界を、ＰＣＲのみを用いた検出の限界と比較して、調べた。図３０は、これらの実験の結果をまとめたものである。アフィニティープロトコルを用いた標的の分離を用いた結果、ＰＣＲのみによる検出と比較してあるレベルの規模の標的の検出が改良された。具体的に、１００胞子／ｍＬといった低濃度で砂中の細菌性の胞子からＤＮＡを検出した。  
【０２４７】
磁性ビーズ（基質）を含有するこのカートリッジを同様に用いて、標的を含有する他のサンプルについて効果的にアフィニティープロトコルを行った。例えば、このカートリッジを用いて、細菌細胞または細菌性の胞子を、非ラボラトリーグレード、環境水から分離した。濃度が３ｍｇ基質／ｍＬサンプルの基質を使用、標的捕捉時間を５分とし、標的溶出時間を１分とし、あるレベルの規模またはＰＣＲのみと比較してより改良した。具体的には、細菌細胞および細菌性の胞子の検出濃度は、１０細胞／ｍＬサンプルと低かった。
【０２４８】
実施例１５：カオス型混合装置の設計と使用
上で詳細に概説したように、アフィニティープロトコルおよびアフィニティーマグネットプロトコルの大規模な適用は、大きなサンプル内の基質と標的の効率的な混合を促進する装置の開発によって容易になるかもしれない。我々は、図６に概説した原理に基づいて、ジャーナルベアリングフローを達成するための装置を構築した。この装置はここでは、カオス型混合装置またはクラスＩ装置として知られており、そのような装置の一例を図３１に示した。図３１に示した装置は、２つのテフロン（登録商標）製の円筒（そのそれぞれは、モーターによってその中心軸の周りを自由に回転する）から構成される。小さい方の円筒円筒は固体であり、大きいほうの円筒の内部に偏心的に配置されている。サンプルをこの２つの円筒の間の環状部分に配置し、両円筒を同時に１６回転/分で回転させることによって混合する。この低速回転によって、サンプルスラリーを伸ばし、折り畳むことによって形成されるストリームラインの間で、拡散性の混合を最大化する。この装置を用いるいくつかの態様においては、小さい方の円筒は、基質と標的を混合した後に除去し、その後電磁石に置き換えた。次いで、この電磁石を用いて基質−標的複合体をサンプルから回収した。この特別の例においては、基質は、磁性ビーズとし、電磁石を用いて効率的に磁性ビーズを回収した。
【０２４９】
アフィニティープロトコルとともにカオス型混合装置を用いて、種々の土壌からの細菌性の標的を、サンプルあたり２グラムの量で抽出した。アフィニティープロトコルの大規模な適用によって、これらの方法および装置が小さなサンプルサイズに好適であるのみならず、産業的用途にまでスケールアップすることもできる。アフィニティープロトコルをスケールアップすることができる能力は、この技術の産業的用途のみを意図するものではない。この結果は、本明細書において、いくつかの標的−基質相互作用がより容易に大量に検出されるかもしれないことを証明するものである。
【０２５０】
図３２および３３は、大規模アフィニティープロトコル（カオス型混合装置内で行われたアフィニティープロトコル）およびＳＮＡＰを用いて抽出されたＤＮＡのゲル電気泳動法の結果を、少量でＳＮＡＰのみを使用した場合との比較において、示した図である。簡単に述べれば、特定の土壌サンプルをＳＮＡＰプロトコルまたは大規模アフィニティープロトコルおよびＳＮＡＰのいずれかを用いて分析し、単離された標的ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。この特定の実施例において、基質は、磁性ビーズでコーティングしなかった。図３２および３３に記載の結果から明らかなように、大規模アフィニティープロトコルを使用した結果、いくつかの土壌タイプにおける検出の限界において改良が成された。具体的には、汚泥サンプルにおいては、ある規模の検出限界を改良することができた。そして、Ｃａｒｙ土壌タイプ（高いレベルのフミン酸（ＰＣＲインヒビターとして公知）を含有している）においては、ＳＮＡＰ処理のみでは何も検出できなかった。
【０２５１】
実施例１６：代替的装置
本明細書において詳細に概説されているように、本発明は、広範囲の基質をアフィニティープロトコルに用いることができることを意図している。そのような基質を１以上の表面変性剤を用いてさらにコーティングする。１以上の表面変性剤を用いてコーティングすることができる別の基質の一例を図３４に示している。図３４は、広範囲の用途に有用な官能化された基質を示す図である。この実施例においては、遠心分離の内壁、またはＰＣＲチューブ（但し、Ｘ＝１以上の表面変性剤）である。
【０２５２】
官能化されたチューブおよび培養容器を使用することで、サンプル移動を除去する助けとなるであろう。それは、可能なエラーおよび混入物質を減少させ、さらなる供給の必要性を減少させるであろう。さらに、そのような基質を使用することで、標的接着および更なる分析が単一の容器内で生じることが可能となり、したがって、供給や時間が限定されるかもしれない現場または他の状況での適用が容易になる。
【０２５３】
本明細書に記載のアフィニティープロトコルに基づいて設計することができる他の具体的な装置は、ガスまたは液体サンプルの回収および分析を容易にする装置である。これらの装置は、広くクラス２装置と称される。本発明は、湿潤および乾燥フィルターの双方の構築を意図している。このフィルターは、１以上の基質の層（例えば、ビーズ、紙など）を含有することができる。フィルターを横切る／通過する乾燥または湿潤サンプルは、基質を通過するであろう。そしてサンプル内の標的は、基質に接着するであろう。図３５は、空気または水のサンプル内の標的を検出するのに使用される代表的なフィルターを示す図である。
【０２５４】
乾燥形状のフィルターの更なる例によって、基質（ビーズなど）の１以上の層をパックすることができる。本発明は、同じ基質もしくは異なる基質のいずれかからなる多数の層を含有するフィルター、ならびに単一層を含有するフィルターを意図している。フィルターが単一の層を含有する態様において、その層は、単一の基質、多数の表面変性剤で誘導体化された単一の基質、または多数の基質を含有してもよい。空気がフィルターを通過する。空気サンプル中の標的はビーズ上に吸着する。
【０２５５】
本発明は、これらのフィルターの単独での使用、または一般的に建物、車両において使用される他の空気フィルターと組み合わせての使用を意図している。例えば、アフィニティープロトコルベースのフィルターは、建物ＨＶＡＣシステムに添加して、建物の空気循環の質をさらに分析する手段を提供する。
【０２５６】
同様に、湿潤フィルターを使用して、水サンプル中の標的の存在を調べることができる。そのようなフィルターを使用して、貯蔵槽をモニターし、したがって、飲み水の質を評価し、湖や池をモニターし、したがって、これらの環境の健康を評価する。これらのフィルターは、水族館で使用するために修飾することができ、したがって、水の質を評価し、水に関連するあらゆる問題を診断する助けとなる。さらに、これらのフィルターは、市販の水精製装置と組み合わせて家庭で用いることができる。本発明は、これらのフィルターの単独での使用、または一般的に家庭での用途、環境的または産業的用途において使用される他の水フィルターとの組み合わせでの使用を意図している。
【０２５７】
本発明はさらに、別のクラス２装置：アフィニティープロトコルカートリッジを意図している。これらの特別のカートリッジは、既に示され、米国特許第２００３／０１２９６１４号（米国特許第１０／１９３，７４２号、その全体を引用によってここに援用する）に開示されているカートリッジに基づいて設計されたものである。しかしながら、本発明は、サンプル上でアフィニティープロトコルを行うための手段のみを含むカートリッジ、ならびにアフィニティープロトコルを行うための手段とＳＮＡＰプロトコルを行うための手段の双方を含有するカートリッジを意図している。  
【０２５８】
環境的、臨床的、生物物質、またはＤＮＡを含有する法医学的サンプルの回収および精製のために使用される以下の装置は、米国特許第２００３／０１２９６１４号に記載されている。この装置は、サンプルのアフィニティープロトコルを促進するための手段を含むように変性することができる。
【０２５９】
図３６は、装置の簡略図である。装置は、２つの部分、外側の容器と内側のハウジングからなる。内側のハウジングは、ＤＮＡの精製と、抽出されたＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）に対する阻害物質の保持の機能を提供する多孔性基質を有する（例えば、この多孔性基質は、サンプルについてＳＮＡＰ法を行うための手段を提供する）。外側の容器は、図３６に示されているように、それが調製される方法にしたがって、二重の目的を果たすことができる。保存および輸送のために用いられる場合、外側の容器は、サンプルをそれに適用した後、多孔性基質の乾燥を向上させるための乾燥剤を含む。その乾燥剤は、多孔性基質が乾燥剤と接触しないように、リングによって多孔性基質から分離されている。多孔性基質上に集められたサンプルの処理のために用いられる場合、外側の容器は、熱融着可能な膜で遮蔽されており、ＤＮＡを溶出するための液体を含有している。サンプルは、熱融着可能な膜を除去し、内側のハウジングを外側の円筒に押し込み、液体が多孔性基質を通過するようにし、得られた溶出液までＤＮＡを運ぶことによって処理される。.
【０２６０】
外側の容器は、外側の容器の底部のテザーやネジまたはスナップによって、内側のハウジングに付着させることができる。外側の容器はまた、円筒が表面に静止しているとき、安定性を提供し、傾斜しないようにするために、底面と一体となったフランジを有することもできる。
【０２６１】
この装置の１つの変更例において、サンプルがＳＮＡＰフィルターと接触する前に、アフィニティープロトコルを行うための手段と接触するように、更なる層（例えば、標的と結合する基質）を導入する。
【０２６２】
装置の別の可能な変更例は、精製後の処理ステップと、先に記載した阻害物質結合ステップとを追加する。適切な塩およびｐＨ条件下で、核酸がシリカやガラスと強く結合し、一方他のクラスの化合物は強く結合しないであろうということは、公知である（例えば、Tianら、2000 Analytical Biochemistry、283：175-191参照）。ｐＨおよび／または塩条件を変えることによって、核酸をシリカ/ガラス材料から溶出することができ、選択的な結合が可能となり、混合サンプルからの核酸の連続的な放出が可能となる。 “Boom”特許、米国特許第５，２３４，８０９号に記載されているこの効果は、QiagenやPromegaなどの会社によって製造された、いくつかの実在する商業的な核酸精製技術を基礎としている。われわれの装置と機械的および化学的に両立可能であり、サンプル内の標的の検出および分析をさらに容易にすることができる、“Boom”効果の新規な実用化を提供する。 
【０２６３】
装置を用いたサンプルの処理は、先に述べたように、それが、固体マトリックス上のカオトロピック塩と接触し、マトリックスから溶出される時点まで進行する。処理のこの時点において、サンプルは、核酸のシリカまたはガラスへの結合を促進する高濃度のカオトロピック塩を含有する。次にサンプルをシリカまたは溶融した基質に接着させる。好ましい態様において、プランジャーを用いて正の圧力をかけることによって、シリカカラムを介してサンプルを溶出させる（図３７参照）。サンプルがシリカカラムを横切るとき、核酸はカラムと結合する。流体は、シリカカラムを通過し、サンプルの液体を捕捉し、保持する吸収性の材料に入る。シリカカラムは、「スライダー」の形状に構築することができ、それによって、ユーザーは、スライダーを引くことによって容易にシリカカラムを第２のチャンバーに移動させることができる。ある態様において、スライダーを引く動作は、第２のチャンバーの緩衝液貯蔵場所を開くよう働きかける。図３７において、第２の低塩の、緩衝液貯蔵場所が開き、ユーザーが第２のプランジャーによって圧力をかけることによって、液体がシリカカラムを通過し、核酸をクリーンなコンパートメントに溶出させることができる。このサンプルへは、隔壁、スレッドプラグ、または一体化されたシリンジを含む、多くの形態のいずれかによってアクセスすることができる。第２のチャンバーの方向は、第１のチャンバーに対して１８０°回転することができる。すなわち、２つのプランジャーは、シリカまたはガラスカラムを含有するスライダーが１つのチャンバーから別のチャンバーへ移動することができる限り、隣り合わせ、または反対側とすることができる。
【０２６４】
この方法および装置は、本願および先の特許出願に既に記載されている、多様な存在するサンプル捕捉および細胞リーシス技法と組み合わせることができる。この方法はまた、このプロセスの直ぐ前にサンプルの組成物が高濃度の塩を含み、実用的なｐＨ範囲（例えば、ｐＨ３〜１２）である限り、サンプル捕捉および細胞リーシス技法と組み合わせることができた。
【０２６５】
既に述べたように、この装置の好ましい態様は、他の機能の中でも、とりわけ、サンプル中の作用物質を不活性化もしくは殺傷する、高濃度のカオトロピック塩を含有するサンプルを多孔性の支持体にサンプルを適用することを含む。この効果は、続く取り扱いおよび輸送に関してカートリッジを安全にするものである。しかしながら、いくつかの用途において、ユーザーは、カオトロピック塩を用いてサンプルを処理する他の利点を得ながらサンプル中に存在するあらゆる生物を培養したいかもしれない。サンプルカートリッジの２つの別の構成は、これらの対立する目的を対処する（図３８参照）。１つのデザインにおいて、多孔性支持体上にカオトロピック塩を持たない装置が、カオトロピック塩を有する装置に物理的に結合している。この結合は、塩を持つ装置がカオトロピック塩を持たない装置と独立して処理されることを可能にし、一方、２つの平行なアッセイを維持することによって、サンプルの追跡を容易にする。カオトロピック塩を含まない装置は、培養が可能になるまで生物の生存能力を支持する他の化学物質を含んでもよい。
【０２６６】
第２のデザインにおいて、装置の内側のチャンバーは、流体連通のない２つのサブチャンバーに分かれている。多孔性支持体も２つの部分に分かれており、１つはカオトロピック塩を含み、他方は、その代わりに培養を向上させる化学物質を含んでいる。両方の部分が同時に処理されなければならないため、このデザインは、アーカイブの目的により適している。カオトロピック塩を含まない側の内側の円筒から取得した溶出液で培養することが可能であろうと思われるが、溶出前の多孔性支持体が高濃度で生物を産出するであろう。
【０２６７】
実施例１７：ＲＮＡの単離および精製
上で詳細に概説したように、ＤＮＡとＲＮＡの特徴および構造が類似していることは、ＤＮＡと相互作用する基質はＲＮＡとも相互作用することを示唆するものである。本発明は、サンプルからのＤＮＡの分離および／または同定をするための組成物および方法は、ＲＮＡの同定および／または分離に用いることができることを意図している。しかしながら、ＲＮＡが典型的にあまり安定しておらず、ＤＮＡより劣化しやすいことから、本発明はさらに、ＲＮＡの分裂および／または同定は、本方法に更なる改変を加える必要があるかもしれないことを意図している。  
【０２６８】
関連するサンプルからＲＮＡを急速に単離および精製する能力は、ＲＮＡを保存する条件下でＲＮＡを単離することを必要とする。ＲＮＡは全ての生物に存在するので、本明細書に記載の方法は、真核細胞、原核細胞、古細菌、またはウイルスからのＲＮＡの単離に適用することができるであろう。我々は特に、ウイルスからのＲＮＡの単離を検討した。 
【０２６９】
ＲＮＡの単離は、環境におけるヌクレアーゼによる急速な劣化に対するＲＮＡの感受性によって複雑になる。ウイルスＲＮＡは、これらのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）を不活化するように、ビリオン粒子から単離しなければならない。ＲＮａｓｅｓを阻害する、またはそうでなければ不活化する物質を、現時点で入手可能な実験室処置、およびＲＮＡを単離するために用いられる市販のキットに組み込まれるむ。しかしながら、これらの方法の多くは、時間と労力がかかり、かつ高価である。  
【０２７０】
我々はこれまでに、ＤＮＡの劣化を阻害する条件下でＤＮＡの効率的な単離を助けるために、ＳＮＡＰ法の使用およびＩｓｏＣｏｄｅペーパーなどの試薬の使用を報告してきた。さらに、我々はこれまでに、ＬｉＮＫと称される装置の開発を報告してきた。それは、より簡単な取り扱い、手頃で、かつ、実地での使用のために、ＳＮＡＰ法をカートリッジフォーマットに組み込んだものである。本発明は、サンプルからの標的ＲＮＡを分離および分析する能力をさらに高めるためにＳＮＡＰおよびＬｉＮＫ技術を採用し得ることを意図している。ＳＮＡＰおよびＬｉＮＫの、ＲＮＡに注目したそのような変性は、単独で使用することができ、または本願に記載のアフィニティープロトコルの効果をさらに高めることができる。
【０２７１】
ＳＮＡＰおよびＬｉＮＫ技術のＲＮＡ特異的改変は、以下の原理に基づく。ＲＮＡの保存は、ＲＮａｓｅｓによるＲＮＡの劣化の阻止とＲＮＡにおけるホスフォジエステル結合の非酵素的加水分解の阻止の両方を含むべきである。この加水分解は、高温または極端なｐＨおよび２価の陽イオンによって媒介される。したがって、ＲＮＡの精製は、適切な緩衝液中で行われなければならない。
【０２７２】
ＲＮＡウイルスの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）による同定は、４つのステップに分割できる。すなわち、ＲＮＡの抽出および単離、Ｒｎａｓｅｓおよび加水分解によるＲＮＡの劣化の阻止、ＲＴ−ＰＣＲ  によるＲＮＡからｃＤＮＡへの転換、およびＤＮＡのＰＣＲによる増幅。これらのステップについて、以下に詳細に述べる。
【０２７３】
ａ）ＲＮＡの抽出および単離
ウイルスからのＲＮＡの単離は、ＲＮＡを劣化させずに、外部ウイルスコーティングを解離することを必要とする。一般的に用いられているＲＮＡ抽出法としては、ＳＤＳ、フェノールまたは高分子カオトロピック塩が含まれる。ＳＮＡＰプロトコルで用いられるＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）ペーパーは、そのペーパーに適用されるサンプルからＲＮＡを放出する能力をも有する。
【０２７４】
ｂ）ＲＮａｓｅによるＲＮＡの劣化の阻止
多くのＲＮａｓｅ阻害物質が存在する。これらの阻害物質の多くは、単独で用いることができるし、または高速な単一のＲＮＡ単離プロトコルと組み合わせて用いることができる。有用な阻害物質は、広範な特異性（いくつかのＲＮａｓｅ阻害物質が１クラスのＲＮａｓｅｓのみに働く）を有していなければならず、それら自身が下流のＲＴ−ＰＣＲ反応を阻害しなければならない（いくつかのＲＮａｓｅ阻害物質は一般的な酵素阻害物質である）、またはそれらは容易に、抽出されたＲＮＡから完全に除去される必要がある。
【０２７５】
本発明は、ＲＮＡ標的の分離および／または同定において用いられる下記の阻害物質、すなわち、粘土（ベントナイト、マカロイド）；オーリントリカルボン酸（ＡＴＡ）；グアニジニウムチオシアネート（ＧＴ）およびグアニジニウムヒドロクロリド（ＧＨ）を含むカオトロピック塩；ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）；ＳＤＳ；尿素；およびバナジル−リボヌクレオシド複合体（vanadyl-ribonucleoside complexes）（ＶＲＣ）を意図している。
【０２７６】
本発明はさらに、極端なｐＨおよび温度による加水分解の阻害がＴｒｉｓ−ＥＤＴＡなどのｐＨ緩衝液中でＲＮＡを溶出することによって媒介され得ることを意図している。.
【０２７７】
以下のＲＮａｓｅ阻害物質、すなわち、マカロイド、ベントナイト、ＡＴＡ、ＳＤＳ、尿素、ＤＥＰＣおよびカオトロピック塩は、それらを本発明の方法において使用するのに好適な物質にする特徴を有している。これらの物質は室温で安定しており、下流のＲＴやＰＣＲ反応を阻害しないし、または有機抽出を行わずに容易に除去もしくは希釈されない。以下のパラグラフにおいては、これらの阻害物質のそれぞれについて簡単に説明している。
【０２７８】
ＲＮａｓｅ阻害物質の概説
ＲＮａｓｅ阻害物質のうちの２つは、マカロイドとベントナイトであり、粘土の一種である。それらの阻害特性は、それらの全体的な負電荷によって引き起こされると考えられ、そのため、ＲＮａｓｅｓと他の塩基性タンパク質が結合することができる。マカロイドは、精製されたヘクトライト（ナトリウム、マグネシウム、シリケートからなる粘土）である。ベントナイトは、モンモリロナイト粘土（Ａｌ２Ｏ３．５ＳｉＯ２．７Ｈ２Ｏ）である。粘土のそれぞれから調製された小部分は、室温で安定しており、カートリッジフォーマットへの組み込みに両立することができるようである。それらは、ＲＮａｓｅ阻害に最適な異なるｐＨを有し、別々に、または一緒に使用することができるであろう。
【０２７９】
オーリントリカルボン酸（ＡＴＡ）は、in vitro アッセイにおけるヌクレアーゼの一般的な阻害物質であり（ＤＮａｓｅｓおよびＲＮａｓｅｓが含まれる）、細菌性ＲＮＡの単離に用いられている。ＡＴＡは、市販のＲＮａｓｅ阻害物質、ＲＮａｓｅブロック（Innogenex, Inc.）の主要な構成物質である。それは、ゲル濾過（Sephadex G-100を介する）により精製された核酸から除去することができる高度に水溶性の暗赤色の溶液である。ＡＴＡによって単離されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。ＡＴＡは、ＤＮＡの単離を阻害することができないようであるが、わずかな量でも逆転写酵素の活性を阻害することができるかもしれない。そのような逆転写酵素の阻害を観察すれば、逆転写の前にＡＴＡを除去するための抽出ステップを容易に採用することができるかもしれない。
【０２８０】
グアニジニウム化合物（ＧＴおよびＧＨ）などのカオトロピック塩は、ＲＮａｓｅｓの活性を阻害する強いタンパク質変性剤であり、多くのＲＮＡ抽出処理の基礎となるものである。これらの化合物は、ＳＮＡＰプロトコルに使用されるＩｓｏＣｏｄｅ（商標登録）ペーパーに基づいている。
【０２８１】
バナジル−リボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）は、ＲＮａｓｅｓの競合的な阻害物質である。それらは、ＤＥＰＣ、ポリビニルサルフェート、ヘパリン、ベントナイト、マカロイド、ＳＤＳ、およびプロテイナーゼＫより優れている。あいにく、それらは、少量でＲＴおよびＰＣＲポリメラーゼ活性を阻害するという点で有意な欠点を持ち、有機抽出による除去を必要としている。さらに、ＶＲＣは、すべてのＲＮａｓｅｓを阻害するわけでなく、ＲＮａｓｅ Ｈの活性を特異的に阻害しない。克服しがたいわけではないが、さらなる限定は、ＶＲＣは、＜−２０℃での保存が必要であるということである。しかしながら、我々はＶＲＣの特定の表面（例えば、サンプルが通過するカートリッジ、またはサンプルに添加され、サンプルから除去されるビーズ）への物理的な付着は、修飾された表面の存在下でサンプルを混合することによってＲＮａｓｅｓを結合すること、および続く分子分析の前にサンプルからＶＲＣを引き続き物理的に分離することを可能にするであろう
【０２８２】
ＳＤＳは、タンパク質を変性する界面活性剤であり、ＲＮａｓｅｓを含む。
【０２８３】
前述のいずれかについて、現時点で採用されるＲＮＡ単離処理によって、関連する溶液は、ＤＥＰＣによって前処理されるであろう。ＤＥＰＣは、それがアミンと反応するとき、環境的 サンプルのスタンドアローンのＲＮａｓｅ阻害物質として有用ではなく、不活性化する。
【０２８４】
ｃ）逆転写およびＰＣＲ
抽出されたＲＮＡは、下流の分析と両立しなければならない。すなわち、逆転写酵素およびＰＣＲ阻害物質を含まない。Wilson、1997に概説されているように、阻害物質を除去するための物質は、とりわけ、５％ＤＭＳＯ、ＢＳＡおよびＴ４ Ｇｅｎｅ ３２を含む。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ反応の条件は、関連する多くのウイルスの検出のために利用可能なものである（De Paula、2002；Drosten、2002；Leroy、2000；Pfeffer、2002；Warrilow、2002）。
【０２８５】
標的ＲＮＡを分離し、さらに分析するための、上で概説した方法の１つの適用は、標的ＲＮＡの劣化の防止および／またはＲＮＡ標的の後の分子分析を阻害する活性の防止を助ける試薬を組み込んだ装置の構築である。そのような装置および方法は、単独で用いることもできるし、本明細書に記載のアフィニティープロトコルを基礎とした装置および方法と組み合わせて用いることもできる。
【０２８６】
以下は、層状の装置の例についての詳細な説明である。しかしながら、本発明は、同じまたは類似の試薬を使用するが、層状構成に組織化されていない装置の構築を意図している。装置の構築、またはサンプルが置かれるカートリッジアプローチの開発は、以下のように層状のアプローチにおいてなされることが可能である。
【０２８７】
ａ）関連する生物の溶解
まず最初にサンプルと接触する装置の一部は、ウイルス、細菌、真核生物、古細菌生物を溶解するための試薬を含有することができる。この溶解は、生物を分解して開き、ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出を可能にするであろう。これを行うための試薬は、カオトロピック塩、ＳＤＳまたは尿素から構成することができるであろう。さらに、加熱または冷却を用いて、サンプルを溶解することができるであろう。温度変化は、カートリッジの支持構造に内蔵された電池式のレジスターベースの加熱サーキットによって、または化学反応によってもたらされる。
【０２８８】
溶解メカニズムの可能な実用化は、前記試薬を含有する溶液の添加； サンプルの乾燥フィルター、もしくはこれらの試薬を含有しているマトリックスへの添加を含む。これによって、水（乾燥サンプルの場合）もしくはサンプル自身（液体サンプルの場合）を添加して直ぐ、試薬を再溶解して適正な濃度となる。
【０２８９】
ｂ）ＲＮａｓｅｓの阻害
サンプルを溶解するための試薬と、ＲＮａｓｅｓの活性を阻害するため、ＲＮａｓｅｓを物理的にトラップするため、または該ＲＮａｓｅｓと結合するための試薬を混合する。これらの試薬は、ＧＴ、ＧＨ、尿素、ＳＤＳ、ベントナイト、マカロイド、ＡＴＡ、ＶＲＣ、およびセルロースベースの紙、ＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）などを含む。ＧＴ、ＧＨ、尿素、およびＳＤＳは、溶液中に存在することができ、また脱塩処理ステップを添加することによって、または下流の検出ステップの活性を阻害しない濃度に希釈することによって、除去することができる。粘土であるベントナイトおよびマカロイドは、ＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）または他のセルロースベースの紙の上に層状に形成することができる。ＲＮＡを含有する溶出液中に存在しないようにＡＴＡまたはＶＲＣを固体支持体に化学的に結合することによって、または濾過ステップを導入することによってＡＴＡまたはＶＲＣの導入は達成され得る。
【０２９０】
ｃ）ＡＴＡを除去するための濾過
装置がＲＮａｓｅ阻害物質としてＡＴＡを組み込む場合、ＡＴＡを溶出液から除去する必要がある。これは、サイズ排除カラム（例えば、Sephadex G-100カラム）を通して濾過することによって行うことができる。そのようなカラムは、カートリッジベースの装置中の層として含まれ得る。
【０２９１】
ｄ）核酸の結合およびＲＮａｓｅｓの除去
サイズ分割シリカの層、化学的に処理されたビーズ、または化学的に処理された膜もしくは表面を用いて、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合して、溶解したサンプルをすすいで、金属、塩、もしくはこれまで層に特異的に結合していなかった他の物質を除去することによって、続く精製を行うことができる。次に、核酸は、シリカ、ビーズまたは表面から、適切な条件で溶出することができ、分子生物学における標準的な方法を用いて分析することができる。
【０２９２】
実施例１８：多数の標的の同時検出
本発明の多くの用途に関して、多数の標的に同時にアクセスすることができれば有利である。例えば、異なる２種の細菌細胞を分離することができれば、多数の潜在的感染因子の存在に単回の試験でアクセスする医学的診断が可能となるであろう。同時に、同じサンプルからＤＮＡとＲＮＡの双方を分離することができれば、細菌性生物およびウイルス性生物の評価、またはＤＮＡベースおよびＲＮＡベースのウイルス評価を同時に行うことができる。
【０２９３】
市販のガラスファイバーフィルターを用い、このフィルターを用いるため標準プロトコルによって、ＤＮＡとＲＮＡを単離する能力を評価した。我々の結果によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、標準的なプロトコルを用いて、同じサンプルから同時に単離することができることがわかった。また、アフィニティープロトコルを用いて多数の標的を同時に単離することも可能である。アフィニティープロトコルの使用によって、時間と労力がかかり、多くの試薬を要する、現時点で利用可能な技術と比較して、多数の作用物質の分離が非常に簡単になる。
【０２９４】
簡単に述べれば、細菌（bacillus
thuringiensis-Ｂｔｋ）、ＭＳ２バクテリオファージ（E. coliを感染させ、一本鎖のＲＮＡウイルスのモデルとして機能するバクテリオファージ）、またはＢｔｋとＭＳ２の双方を含有するサンプルを分析した。サンプルをＬ６緩衝液（グアニジンイソチオシアネートを含有する緩衝液；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）；０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；Triton-X 100）中で希釈し、１ｍＬの市販のガラスファイバーフィルターを通過させた。６０ｍＬの空気を、６０ｍＬのシリンジを用いてフィルターに通した。２ｍＬのＬ２緩衝液（グアニジンイソチオシアネートを含有する緩衝液；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）；０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；Triton-X 100）をフィルターに適用した。Ｌ２緩衝液を適用した後、６０ｍＬの強制空気（forced air）、３ｍＬの７０％ＥｔＯＨ、次いで、さらに６０ｍＬの強制空気（繰り返し２Ｘ）を適用した。その後フィルターを乾燥させ、標的をＴＥ（Ｔｒｉｓ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ−最終ｐＨ＝７．０）で溶出した。  
【０２９５】
溶出液のアリコートについてＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲを行い、ウイルスＲＮＡおよび細菌性ＤＮＡをそれぞれ検出した。ＲＴ−ＰＣＲを２５μｌの反応容量で行った。ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応（TaMan One-Step、Applied Biosystems）をＭＳ２特異的プライマーおよびプローブセットを用いて調製し、ＡＢＩ７７００リアルタイムＰＣＲマシーン（Applied Biosystems）内で行った。各２５μｌの反応物は、２．５μｌのサンプル溶出液を含有していた。以下のＲＴ−ＰＣＲ条件を用いた：４８℃で３０分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒ずつ、６０℃で１分の５０サイクル。ＰＣＲを同様に行ったが、Ｂｔｋ特異的プライマーを用いた。 
【０２９６】
ＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＳ２のみ、またはＭＳ２とＢｔｋの組み合わせのいずれかを含有するサンプル中のＭＳ２の存在を検出した。ＭＳ２のみを含有するサンプル中でのＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２０．６５（標準偏差＝０．３３）のときのみ発生した。ＭＳ２とＢｔｋの双方を含有するサンプル中でのＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２１．７５（標準偏差＝２．０４）のときに発生した。
【０２９７】
ＰＣＲによって、Ｂｔｋのみ、またはＢｔｋとＭＳ２の組み合わせのいずれかを含有するサンプル中のＢｔｋの存在を検出した。Ｂｔｋのみを含有するサンプル中でのＢｔｋのＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２３．６５（標準偏差＝０．２３）のときのみ発生した。ＢｔｋとＭＳ２の双方を含有するサンプル中でのＢｔｋのＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２３．８１（標準偏差＝０．３９）のときに発生した。  
【０２９８】
実施例１９：ＲＮＡ標的の分離および同定
市販のガラスファイバーフィルター、およびそれに伴う方法を用いて、ＤＮＡとＲＮＡ標的の分離することができるが、これらの方法は、多くの時間と試薬を要する。したがって：（ｉ）現場でのそれらの使用；（ｉｉ）時間の影響を受けやすい用途でのそれらの使用；（ｉｉｉ）コストの影響を受けやすい用途でのそれらの使用に限界がある。本願において詳細に概説しているように、アフィニティープロトコルは、当該技術分野において公知の他の分析方法の限界の多くを克服し、最小の試薬と時間で、種々の標的の分離および任意にその更なる分析を可能にする。
【０２９９】
アフィニティープロトコルは、細菌細胞および細菌性胞子を含む種々の標的を分離するために効果的に使用することができ、さらにアフィニティープロトコルによって分離される細菌細胞および胞子からのＤＮＡをＰＣＲなどの方法によってさらに分析することができることをが証明された。アフィニティープロトコルを効果的に使用して、ウイルス標的を分離することができ、さらにアフィニティープロトコルによって分離されたウイルス標的からのＲＮＡをさらにＲＴ−ＰＣＲなどの方法によってさらに分析することができることがわかる。      
【０３００】
市販のガラスファイバーフィルターおよび製造元の指示書（実施例１８に概説）、またはアフィニティーマグネットプロトコル（１００ｕｇ／ｍｌの子ウシ胸腺ＤＮＡの入った０．０１ＮのＮａＯＨを含有する緩衝液中で標的を捕捉および溶出するためのアミン誘導体化磁性ビーズ）のいずれかを用いて、サンプルの水からＭＳ２を分離した。いずれかの方法を用いてＭＳ２を分離した後、溶出液をＲＴ−ＰＣＲで処理してＭＳ２  ＲＮＡを同定した。簡単に述べれば、我々は、いずれかの方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってＭＳ２を分離し、さらに分析することに成功した。ガラスファイバーフィルターを用いてＭＳ２を分離した後、ＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２９．８３（標準偏差＝０．１９）の時に生じた。アフィニティープロトコルを用いてＭＳ２を分離した後、ＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が３３．０２（標準偏差＝０．７２）の時に生じた。検出の感度は、ガラスファイバーフィルターを用いた分離後の方がやや高かったが、時間、コスト、および操作の容易さに関しては、アフィニティープロトコルを用いた場合に、有意に改善されていた。
【０３０１】
ガラスファイバーフィルター法を用いた場合とアフィニティープロトコルを用いた場合の分離後のＲＮＡの検出における感度の違いは、阻害物質がＲＴ−ＰＣＲ分析に及ぼす影響によるものであり、アフィニティープロトコルを用いることによる標的の捕捉または溶出の非効率性によるものでないことが、更なる実験によって示された。簡単に述べれば、ＲＴ−ＰＣＲ分析の前に、溶出液を含有するＭＳ２を水またはＡＰ溶出緩衝液で希釈し、ＭＳ２をＲＴ−ＰＣＲ分析する前に、０分、３０分、または６０分間インキュベートした。水中で０分、３０分、または６０分間サンプルをインキュベートした後、ＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２０．５７、２０．６５、および２１．０２の時にそれぞれ生じた（標準偏差＝ＮＡ）。溶出緩衝液中で０分、３０分、または６０分間サンプルをインキュベートした後、ＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲによる検出は、サイクル閾値が２４．１５、２４．０５および２４．１４の時にそれぞれ生じた（標準偏差＝それぞれ０．０３、０．９３および０．０４）。 
【０３０２】
更なる引例
米国特許第５９３５８５８号
米国特許第５７０５６２８号
米国特許第６０５７０９６号
米国特許第５９４５５２５号
米国特許第５６９５９８９号
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http://www.grc.uri.edu/programs/2003/antimicr.htm
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【０３０３】
全ての公開公報、特許および特許出願を、その全部を引用によって本明細書中に援用する。それぞれの公開公報、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体を引用によって組み込んでいることを示している。
【０３０４】
等価：  当該技術分野の当業者は、本明細書に記載する発明の特別な態様の多くの等価を認識し、或いは単にルーチンの実験により確認できる。本発明の具体的な態様の等価の多くを本明細書に記載した。
【図面の簡単な説明】
【０３０５】
【図１】図１は、アフィニティープロトコルを模式的に表した図である。
【図２】図２は、代表的なシリコン含有表面変性剤（左の図）およびシリコン含有表面変性剤（右の図）で変性された基質を示す図である。
【図３】図３は、代表的なシリコン含有表面変性剤（左の図）およびシリコン含有表面変性剤（右の図）で変性された基質を示す図である。図２に示した表面変性剤とは対照的に、このモデルは、互いに同一または異なる多数の活性領域を含有する表面変性剤を提供する。
【図４】図４は、基質と標的の間の相互作用を容易に評価、定量化するために用いることができるフローサイトメトリーアッセイを示す図である。
【図５】図５は、基質と標的の相互作用を容易に評価し、定量化するために用いることができる蛍光アッセイを示す図である。
【図６】図６は、ジャーナルベアリングフローの原理を示す図である。右側の模式図は、微粒子スラリーを混合するために用いられるジャーナルベアリングフローのシミュレーションである。
【図７】図７は、大規模アフィニティープロトコルを模式的に示す図である。大規模プロトコルは、標準的なアフィニティープロトコルにおける基質と標的の相互作用を容易にするためのカオス型混合装置の使用を含む。この模式図において、基質（磁性ビーズ）、サンプル土壌および水を混合し、スラリーを作製する。標的および基質を含む該スラリーをカオス型混合装置に入れ、低速で混合し、標的と基質の間の相互作用を容易にする。混合に続いて、内側の筒を、標的−基質複合体を除去するために用いる電磁石と取り換える。基質が磁性ビーズなので、標的−基質複合体は容易に電磁石に引き付けられる。標的−基質複合体をスラリーから除去した後、標的細胞をビーズから分離し、ＳＮＡＰを用いて溶解および処理し、標的細胞内に含有されるＤＮＡを調べる。
【図８】図８は、市販されている磁性ビーズの分析結果をまとめた図である。図中のグラフによって、どのビーズがＳＮＡＰのみに対してシグナルを高めたかを証明するために、データをＳＮＡＰのみによって分析したサンプルのシグナルに正規化した。
【図９】図９は、市販の非磁性ビーズの分析結果をまとめた図である。これらのビーズの効果は、ビーズに付着したＤＮＡのパーセンテージを測定し、次いで、サンプルとともにビーズをインキュベーションして評価した。
【図１０】図１０は、いくつかの異なる基質の表面を変性するために用いる表面変性剤（Ａ〜Ｙ）の構造を示す図である。
【図１１】図１１は、我々のアミン官能化ビーズのうちのいくつかが、ＤＮＡの接着性を向上させたことを示す図である。
【図１２】図１２は、我々のアミン官能化ビーズおよびいくつかの市販のビーズの双方の、２つの異なる細菌標的に対する接着性を示す図である。
【図１３】図１３は、我々のアミン官能化ビーズおよびいくつかの市販のビーズの双方の、２つの異なる細菌標的に対する接着性を示す図である。
【図１４】図１４は、我々のアミン官能化ビーズおよびいくつかの市販のビーズの双方の、植物性の細菌標的と、胞子形成された形態の細菌標的に対する接着性を示す図である。
【図１５】図１５は、種々の基質の表面に物理的に接着した細菌標的のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１６】図１６は、標的（この場合、細菌ＤＮＡ）の同定がアフィニティープロトコルとＳＮＡＰの組み合わせを用いて改良されることを示す図である。
【図１７】図１７は、ＤＮＡのコーティングされた基質に対する接着性が塩濃度によって影響を受けることを示す図である。
【図１８】図１８は、ＤＮＡのコーティングされた基質に対する接着性が塩濃度およびｐＨの双方によって影響を受けることを示す図である。
【図１９】図１９は、基質が、水、培養培地、および非実験ランクの環境水を含む種々のサンプル中に存在する標的ＤＮＡに効率的に結合できることを示す図である。
【図２０】図２０は、基質から標的ＤＮＡを溶出するために温度操作を利用できることを示す図である。
【図２１】図２１は、電気溶出を利用して標的を基質から放出させることができることを示す図である。図２１Ａは、ＧｅｎｅＣａｐｓｕｌｅ装置の図および装置内への基質の配置を示す図である。図２１Ｂは、基質が置かれた後のＧｅｎｅＣａｐｓｕｌｅ装置を示す図である。図２１Ｃは、電気溶出後のアミンビーズからの子ウシ胸腺ＤＮＡの溶出を示す。大量の子ウシ胸腺ＤＮＡが、基質から移動しているのが認められる。
【図２２】図２２は、ＤＮＡに対するアフィニティーを持つ種々の磁性ビーズの捕捉および放出活性の比較を示す図である。それぞれのタイプのビーズについて、１ミリグラムの基質を１ｍＬのＤＮＡの入った脱イオン水（５００ｐｇ／ｍＬ）に添加した。それぞれのタイプのビーズについて、最も左のバーは、基質に捕捉されたＤＮＡのパーセンテージを表す。中間のバーは、１５０μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡの入った０．０１Ｎ ＮａＯＨ（１００μｇ／ｍＬ）を含む溶出緩衝液に放出された捕捉ＤＮＡのパーセンテージを表す。これを回収標的のパーセンテージと称し、回収ＤＮＡと捕捉ＤＮＡの比率である。最も右のバーは、効率を表し、もとのサンプル中に存在する全ＤＮＡ（５００ｐｇ）に対する回収ＤＮＡの比率である。
【図２３】図２３は、市販の、アミンコーティングした磁性ビーズがＤＮＡを捕捉する効率を、基質の量と捕捉時間（例えば、基質とサンプルの接触時間）の関数で示した図である。
【図２４】図２４は、市販の、アミンコーティングした磁性ビーズがＤＮＡを捕捉する効率を、基質の量と捕捉時間（例えば、基質とサンプルの接触時間）の関数で示した図である。
【図２５】図２５は、市販の、アミンコーティングした磁性ビーズがＤＮＡを放出する効率を、基質の量と溶出時間の関数で示した図である。
【図２６】図２６は、市販の、アミンコーティングした磁性ビーズがＤＮＡを放出する効率を、基質の量と溶出時間の関数で示した図である。
【図２７】図２７は、溶出効率に及ぼす溶出量の影響を示す図である。
【図２８】図２８は、溶出効率に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２９】図２９は、乾燥アフィニティー磁性プロトコルを用いて、細菌ＤＮＡを乾燥土壌サンプルからの単離した後のＰＣＲの結果を示す図である。破線は、ＤＮＡの単離にＳＮＡＰ法のみを用いて処理した土壌サンプルを示し、実線は、ＳＮＡＰ処理の前に静電気的に荷電した非磁性ビーズでコーティングした土壌サンプルを示す。
【図３０】図３０は、水と砂を混合して形成したスラリーからなるサンプルから、磁性ビーズ含有カートリッジを用いて細菌胞子を分離した後のＰＣＲの結果を示す図である。直接もしくはアフィニティープロトコルを用いてサンプルから分離後に、砂中の標的胞子からのＤＮＡをＰＣＲによって分析した。ＰＣＲを行う前に標的を分離した結果、標的含有サンプルの直接的ＰＣＲ分析との比較において１レベルの大きさを検出した。
【図３１】図３１は、カオス型混合のための装置（カオス型混合装置）を示す図である。
【図３２】図３２は、ＳＮＡＰプロトコルのみを用いて単離したＤＮＡ（一番上のパネル）または大規模アフィニティープロトコルとＳＮＡＰプロトコルを併用して単離したＤＮＡ（一番下のパネル）のいずれかに対して行ったＰＣＲ反応のゲル電気泳動法を示す図である。双方のパネルにおいて、矢印は、増幅されたバンドを示すために用いられている。これらの結果は、大規模アフィニティープロトコルが大量のサンプルでの検出の限界を改善したことを示している。
【図３３】図３３は、ＳＮＡＰプロトコルのみを用いて単離したＤＮＡ、または大規模アフィニティープロトコルとＳＮＡＰプロトコルを併用して単離したＤＮＡのいずれかに対して行ったＰＣＲ反応のゲル電気泳動法を示す図である。矢印は、増幅されたバンドを示すために用いられている。これらの結果は、大規模アフィニティープロトコルが大量のサンプルでの検出の限界を改善したことを示している。
【図３４】図３４は、表面変性された回収用チューブを示す図である。
【図３５】図３５は、表面が変性された基質を含有するための２つのフィルターの設計を示す図である。この図に示されている特別の例は、フィルターが空気サンプル（気体サンプル）を回収するために用いられることを示している。液体サンプルを回収するために用いられるフィルターの構築にも類似の設計を容易に適用することができる。
【図３６】図３６は、１以上の基質を介してサンプルを処理するために用いられるＬｉＮＫ装置の種類を示す図である。さらに該装置は、回収後のサンプルを保存することを助ける。
【図３７】図３７は、改良された２チャンバー（ＬｉＮＫ）装置を示す図である。該改良された装置は、サンプルの精製および濃縮を高めるためにシリカカラムを含有している。
【図３８】図３８は、ＬｉＮＫ様装置の２つの改変された設計を示す図である。一対のデザインまたは２チャンバー設計によって、サンプル内の核酸の分析を容易にするカオトロピック塩の不存在下で、サンプル中で細菌および他の細胞を培養することが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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