(57)【要約】  本発明は、例えば、太り過ぎ若しくは肥満体の患者（例えば、ヒト若しくはコンパニオン動物）の処置における、又はフードストック動物（例えばウシ、ニワトリ、ブタ）の低脂肪肉を生産するための手段としての、動物における体重及び／又は体脂肪を減少させるための方法と、摂食障害（例えば、過食症若しくは多食症）の処置を必要とする患者にＰＤＥ９阻害剤を投与することによる摂食障害の処置方法に関する。本発明はまた、ＰＤＥ９機能をさらに研究するための生物学的ツール、即ち、ＰＤＥ９遺伝子破壊を有する遺伝子改変マウス及び動物細胞を特徴とする。【選択図】図７
2007509923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体脂肪を減少するための動物の処置方法であって、それを必要とする動物に療法的有効量のホスホジエステラーゼ９(ＰＤＥ９)阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記動物が太り過ぎである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記動物が肥満体である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＰＤＥ９阻害剤がＰＤＥ９選択的阻害剤である、請求項１の方法。
【請求項５】
摂食障害のための動物の処置方法であって、それを必要とする動物に、療法的有効量のＰＤＥ９阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項６】
前記ＰＤＥ９阻害剤がＰＤＥ９選択的阻害剤である、請求項５の方法。
【請求項７】
ＰＤＥ９遺伝子の破壊に関して同型接合性である遺伝子改変マウスであって、６週間の高脂肪食餌後に、６週間の高脂肪食餌後の野生型マウスに比べて、体重減少又は脂肪蓄積中の脂質量減少を示す遺伝子改変マウス。
【請求項８】
前記ＰＤＥ９遺伝子の調節配列の制御下で外因性レポーター遺伝子を発現する、請求項７のマウス。
【請求項９】
検出不能なＰＤＥ９活性を示す、請求項７のマウス。
【請求項１０】
ＰＤＥ９遺伝子の破壊に関して同型接合性である遺伝子改変培養哺乳動物細胞であって、該細胞若しくは該細胞に由来する子孫細胞が検出不能なＰＤＥ９ポリペプチド活性を示し、該細胞若しくは子孫細胞が、前記同型接合性破壊なしでＰＤＥ９ポリペプチド活性を示す遺伝子改変培養哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記細胞が胚幹（ＥＳ）細胞である、請求項１０の遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記細胞がネズミＥＳ細胞である、請求項１１の遺伝子改変細胞。
【請求項１３】
前記細胞がヒトＥＳ細胞である、請求項１１の遺伝子改変細胞。
【請求項１４】
以下の工程：
（ａ）ＰＤＥ９遺伝子との組み換え時に該ＰＤＥ９遺伝子を破壊するＰＤＥ９遺伝子ターゲッティング構築体を含むＤＮＡ配列をマウスＥＳ細胞中に導入する工程；
（ｂ）ゲノムがＰＤＥ９遺伝子破壊を含むマウスＥＳ細胞を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で選択したＥＳ細胞をマウス胚盤胞又は桑実胚中に導入する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の胚盤胞又は桑実胚を養母マウス中に移植する工程；
（ｅ）移動した胚盤胞又は桑実胚をキメラマウスを生じる期間まで発達させる工程；及び（ｆ）工程（ｅ）のキメラマウスと、ＰＤＥ９破壊に関して異型接合性のマウスとを交配することによって、ＰＤＥ１１遺伝子破壊に関して同型接合性のマウスを得る工程；
を含む請求項１０のマウスの作製方法であって、
ＰＧＥ９遺伝子破壊に関して同型接合性の前記マウスが、６週間の高脂肪食餌後に、６週間の高脂肪食餌後の野生型マウスに比べて、体重減少又は脂肪蓄積中の脂質量減少を示す方法。
【請求項１５】
ＰＤＥ９遺伝子ターゲッティング構築体を含む単離された核酸分子であって、ＰＤＥ９遺伝子との組み換え時に、前記構築体がＰＤＥ９遺伝子を破壊する単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホジエステラーゼ９（ＰＤＥ９）阻害剤を投与することによる、例えば、太り過ぎ及び／又は肥満体患者の処置における体重及び／又は体脂肪を減ずる方法並びに摂食障害（例えば、過食症及び多食症）を処置する方法を提供する。本発明はまた、ＰＤＥ９遺伝子破壊を伴う、遺伝子改変哺乳動物細胞及び遺伝子改変マウスを取り上げる。
【背景技術】
【０００２】
肥満体又は太り過ぎと診断された個体は、例えば、冠動脈性心疾患、発作、高血圧、２型糖尿病、異脂血症(dyslipidemia)、睡眠時無呼吸、変形性関節症、胆嚢疾患、うつ病、及びある種の癌（例えば、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌及び結腸癌）のような、他の健康状態を発症させる、大きな危険性に苦しんでいる。肥満の不利な健康結果は、肥満を合衆国における予防可能な死亡の第二の主要原因にしており、社会に重大な経済的及び心理社会的な影響を与える（例えば、McGinnis and Foege,JAMA 270:2207-2212,1993参照）。
【０００３】
肥満は、そのますます増大する罹患率のために主要な公共健康問題になっており、今や、その関連した健康リスクを軽減するために処置を必要とする慢性病として認識されている。減量自体が重要な処置成果であるが、肥満管理の主要な目的の１つは、肥満に関連した疾病率及び死亡率を減ずるために心血管値及び代謝値を改良することである。体重の５〜１０％の減量が、例えば、血糖値、血圧及び脂質濃度のような代謝値を実質的に改善することができることが判明している。このため、体重の５〜１０％の意図的減量が疾病率及び死亡率を低下させうることが考えられる。
【０００４】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、例えば、第２メッセンジャーｃＡＭＰ（サイクリックアデノシン３’，５’−一リン酸）及びｃＧＭＰ（サイクリックグアニン３’，５’−一リン酸）のような環状ヌクレオチドの加水分解を触媒する。したがって、ＰＤＥは、非常に多様なシグナル伝達経路において極めて重要な調節役割を果たす(Beavo, Physiol. Rev. 75: 725-748, 1995)。例えば、ＰＤＥは、視覚（(McLaughlin et al., Nat. Genet. 4: 130-134, 1993)、嗅覚(Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9677-81, 1995)、血小板凝集(Dickinson et al. Biochem. J. 323: 371-377, 1997)、アルドステロン合成(MacFarland et al., J. Biol. Chem. 266: 136-142, 1991)、インシュリン分泌(Zhao et al., J. Clin. Invest. 102: 869-873, 1998)、Ｔ細胞活性化(Li et al., Science 283: 848-51, 1999)、平滑筋弛緩(Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47-52, 1996; Ballard et al., J. Urol. 159: 2164-171, 1998)に関与するプロセスを仲介する。
【０００５】
ＰＤＥは、１１種類の主要遺伝子ファミリーに細分類される、酵素のスーパーファミリーを形成する(Beavo, Physiol. Rev. 75: 725-748, 1995; Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46: 399-405, 1994; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991-8996, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570-577, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-756, 1998; Soderling et al., J. Biol. Chem. 273: 15553-58, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559-15564, 1998; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-7076, 1999; 及び Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-3707, 2000)。
【０００６】
各ＰＤＥ遺伝子ファミリーは、特有の酵素特徴と薬理学的プロフィルによって機能的に識別されるホスホジエステラーゼをコードする。さらに、各ファミリーは、識別可能な組織、細胞、及び細胞レベル下(subcellular)発現パターンを示す(Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46: 399-405, 1994; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991-8996, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570-577, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-756, 1998; Soderling et al., J. Biol. Chem. 273: 15553-15558, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559-15564, 1998; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-7076, 1999; Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-3707, 2000; Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47-52, 1996; Ballard et al., J. Urol. 159: 2164-71, 1998; Houslay, Semin. Cell Dev. Biol. 9: 161-67, 1998; 及び Torphy et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 12: 131-135, 1999)。それ故、ＰＤＥ酵素の１つのファミリー又はサブファミリーの活性を選択的に調節する化合物を投与することによって、ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰシグナル伝達経路を細胞−又は組織−特異的な方法で調節することが可能である。
【０００７】
Fisher et al. (J. Biol. Chem. 273: 15559-15564, 1998)は、ＰＤＥ９酵素を、ｃＡＭＰに比べてｃＧＭＰを選択的に加水分解するＰＤＥ酵素ファミリーの新規メンバーとして同定している。ＰＤＥ９は、精巣、脳、小腸、骨格筋、心臓、肺、胸腺及び脾臓を含めた、多様なヒト組織中に存在する。ＰＤＥ９阻害剤は、心血管系障害(WO 03/037899)及びインシュリン耐性症候群、高血圧及び／又は２型糖尿病(WO 03/037432)の治療に有用であるとして報告されている。
【０００８】
発明の概要
第１態様では、本発明は、体脂肪を減少するための動物の処置方法であって、それを必要とする動物に療法的有効量のＰＤＥ９阻害剤を投与することを含む方法を特徴とする。好ましくは、該動物はヒト又はコンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）であって、太り過ぎであり、より好ましくは、該動物は肥満体である。他の好ましい実施態様では、該動物はフードストック(food stock)動物（例えば、ニワトリ、ウシ、ブタ）であり、このような処置は、脂肪の少ない肉を生産するためになされる。別の好ましい実施態様では、該ＰＤＥ９阻害剤はＰＤＥ９選択的阻害剤であるか、又は該ＰＤＥ９阻害剤は経口投与される。
【０００９】
第２態様では、本発明は、摂食障害のための動物の処置方法であって、それを必要とする動物に、療法的有効量のＰＤＥ９阻害剤を投与することを含む方法を特徴とする。好ましくは、該摂食障害は、過食症(bringe eating disorder)又は多食症(bulimia)であり、該ＰＤＥ９阻害剤は、ＰＤＥ９選択的阻害剤であるか又は該ＰＤＥ９阻害剤は経口投与される。
【００１０】
第３態様では、本発明は、代謝症候群のための動物の処置方法であって、それを必要とする動物に、療法的有効量のＰＤＥ９阻害剤を投与することを含む方法を特徴とする。好ましくは、該ＰＤＥ９阻害剤は、ＰＤＥ９選択的阻害剤であるか又は該ＰＤＥ９阻害剤は経口投与される。
【００１１】
本発明はさらに、遺伝子改変マウス(genetically-modified mouse)であって、ＰＤＥ９遺伝子の破壊に関して同型接合性であり、６週間の高脂肪食餌後に、６週間の高脂肪食餌後の野生型マウスに比べて、体重減少又は脂肪蓄積(adipose depot)中の脂質量(fat mass)減少を示す遺伝子改変マウスを特徴とする。好ましい実施態様では、該マウスは、ＰＤＥ９遺伝子の調節配列の制御下で外因性レポーター遺伝子を発現するか、又は該マウスは検出不能なＰＤＥ９活性を示す。関連する態様では、本発明は、上記マウスに由来する培養遺伝子改変ネズミ細胞を提供する。他の関連態様では、本発明は、上記マウスの作製方法であって、（ａ）ＰＤＥ９遺伝子との組み換え時に該ＰＤＥ９遺伝子を破壊するＰＤＥ９遺伝子ターゲッティング構築体を含むＤＮＡ配列を、マウスＥＳ細胞中に導入する工程；（ｂ）そのゲノムがＰＤＥ９遺伝子の破壊を含むマウスＥＳ細胞を選択する工程；（ｃ）工程（ｂ）で選択したＥＳ細胞をマウス胚盤胞又は桑実胚中に導入する工程；（ｄ）工程（ｃ）の胚盤胞又は桑実胚を偽妊娠マウス中に移植する工程；（ｅ）移動した(transferred)胚盤胞又は桑実胚をキメラマウスを生じる期間まで発達させる工程；及び（ｆ）性的に成熟したキメラマウスと、ＰＤＥ９破壊に関して異型接合性のマウスとを交配する(mating)ことによって、ＰＤＥ９遺伝子破壊に関して同型接合性のマウスを得る工程；を含み、該マウスが、６週間の高脂肪食餌後に、６週間の高脂肪食餌後の野生型マウスに比べて、体重減少又は脂肪蓄積中の脂質量減少を示す方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、遺伝子改変培養哺乳動物細胞であって、該細胞がＰＤＥ９遺伝子の破壊に関して同型接合性であり、該細胞若しくは該細胞に由来する子孫細胞が、検出不能なＰＤＥ９ポリペプチド活性を示し、ここで、該細胞若しくは子孫細胞が該同型接合性破壊なしでＰＤＥ９ポリペプチド活性を示す遺伝子改変培養哺乳動物細胞を特徴とする。好ましい実施態様では、該細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞であり、より好ましくは、該細胞はネズミＥＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である。
【００１３】
他の実施態様では、本発明は、ＰＤＥ１１遺伝子ターゲッティング構築体を含む単離された核酸分子であって、該構築体が、ＰＤＥ９遺伝子との組み換え時に、該ＰＤＥ９遺伝子を破壊する単離された核酸分子を提供する。
【００１４】
当業者は、明細書及び特許請求の範囲において本発明を説明するために、本出願で用いられる用語を完全に理解するであろう。それでもなお、次の用語は、本明細書で他に指定しない限り、すぐ下記に記載するとおりである。
【００１５】
「ＰＤＥ９阻害剤」とは、ＰＤＥ９ポリペプチドの生物学的活性を低下させる又は軽減する作用剤(agent)を意味する。このような作用剤は、タンパク質（例えば抗ＰＤＥ９抗体）、核酸（例えば、ＰＤＥ９アンチセンス若しくはＲＮＡ干渉(（ＲＮＡｉ）核酸)、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、小分子（有機若しくは無機）、又は細胞中に存在するＰＤＥ９量を効果的に減少させるか若しくはＰＤＥ９ポリペプチドの酵素活性を低下させるかのいずれかによってＰＤＥ９ポリペプチドの活性を低下させる、任意の他の化合物若しくは組成物を包含する。ＰＤＥ９阻害剤である化合物は、該化合物の溶媒和物、水和物、製薬的に受容される塩、互変異性体、立体異性体及びプロドラッグの全てを包含する。好ましくは、本発明に用いる小分子ＰＤＥ９阻害剤は、１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、さらにより好ましくは０．１μＭ未満のＩＣ５０を有する。本発明に用いる任意のＰＤＥ９阻害剤は、さらに、一部又は全ての他のＰＤＥ、好ましくは、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ｃ、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ８Ｂ、ＰＤＥ１０、及び／又はＰＤＥ１１に対しても、選択的であることが好ましい。
【００１６】
「選択的」ＰＤＥ９阻害剤とは、１種類以上の他のＰＤＥの阻害に関するＩＣ５０よりも、少なくとも１０倍低い、好ましくは少なくとも１００倍低いＩＣ５０でＰＤＥ９活性を阻害する作用剤を意味する。好ましくは、このような作用剤を、製薬的に受容されるデリバリー・ビヒクル又はキャリヤーと組み合わせる。ＰＤＥ９遺伝子又はｍＲＮＡの発現を阻害するためにＰＤＥ９遺伝子又はｍＲＮＡに向けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標準方法によって作製される（例えば、Agrawal et al. Methods in Molecular Biology:  Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Vol. 20, 1993を参照のこと）。同様に、細胞におけるＰＤＥ９酵素の産生を減ずるように機能するＲＮＡ分子は、当業者に知られた標準方法によって作製することができる（例えば、Hannon, Nature 418: 244-251, 2002; Shi, Trends in Genetics 19: 9-12, 2003; Shuey et al., Drug Discovery Today 7: 1040-1046, 2002を参照のこと）。ＰＤＥ９阻害剤の例は、本明細書に、及び本明細書に援用される WO 03/037899、WO 03/037432及び米国仮特許出願No.60/466,639（２００３年４月３０日出願）に記載されている。
【００１７】
「ＰＤＥ９活性の低下」とは、細胞中の機能的ＰＤＥ９ポリペプチドのレベルを減少させる、遺伝子破壊若しくはＰＤＥ９遺伝子機能の操作の結果として、又はＰＤＥ９活性を阻害する薬理学的作用剤の投与の結果としての、ＰＤＥ９酵素のポリペプチド活性の人為的低下を意味する。
【００１８】
「製薬的に受容される」なるフレーズは、指定されたキャリヤー、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（単数又は複数）及び／又は塩が、製剤に含まれる他の成分と、一般に化学的及び／又は物理的に相容性であり、そしてそのレシピエントと生理的に相容性であることを意味する。
【００１９】
「プロドラッグ」なる用語は、投与後に、in vivoで、化学的又は生理的プロセス（例えば、生理的ｐＨになった時に又は酵素活性によって）によって薬物を放出する薬物前駆体である化合物を意味する。プロドラッグの合成と使用についての考察は、Higuchi と Stellaの Prodrugs as Novel Delivery Systems, vol. 14 of the ACS Symposium Series、及びBioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987に記載されている。
【００２０】
「塩」及び「製薬的に受容される塩」なる用語は、化合物の有機塩及び無機塩、化合物の立体異性体又は化合物のプロドラッグを意味する。
「太り過ぎ」とさらに重症な「肥満体」状態は、１８才以上の成人において、理想体重を越えている（さらに具体的には、理想体脂肪を越えている）ことであり、肥満度指数(body mass index)（ＢＭＩ）によって一般的に定義され、ＢＭＩは、総体脂肪と相関し、また、太り過ぎ又は肥満体状態の結果としての疾患によって早死若しくは身体障害を被るという相対的リスクに相関する。該健康リスクは、過度の体脂肪の増加に伴って上昇する。ＢＭＩは、ｋｇでの体重をｍでの身長の平方で除する（ｋｇ／ｍ２）ことによって、或いは、ポンドでの体重に７０３を乗じて、インチでの身長の平方によって除する（ｌｂｓｘ７０３／ｉｎ２）ことによって算出される。「太り過ぎ」は、典型的に２５．０〜２９．９のＢＭＩになる。「肥満」は、典型的に３０以上のＢＭＩとして定義される(例えば、National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U.S. Department of Health and Human Services, NIH publication no. 98-4083,1998を参照のこと)。筋肉のたくましい個体では、ＢＭＩと体脂肪と疾患リスクとの相関関係は、他の個体におけるよりも弱くなる。それ故、このような筋肉のたくましい個体が実際に太り過ぎ又は肥満体であるかどうかの評価は、例えば、全体脂肪の直接の測定又はウェスト・ヒップ比評価のような、他の手段によっての方が正確に行なわれる可能性がある。
【００２１】
遺伝子改変マウス又は野生型マウスに投与されるような「高脂肪食餌(high fat diet)」とは、少なくとも４５％ｋｃａｌ脂肪(fat)、好ましくは、少なくとも５８％脂肪から成る食餌を意味する。具体的な食餌は、Surwit食(Surwit et al., Metabolism 47: 1354-1359; Surwit et al., Metabolism 47: 1089-1096, 1998; Surwit et al., J. Biol. Chem. 271: 9437-9440, 1996; and Surwit et al., Metabolism 44: 645-651, 1995)、D12451 Rodent 食(45% kcal fat, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)、及び D12331 Rodent 食 (58% kcal fat, Research Diets, Inc.)を包含する。
【００２２】
本明細書で定義するような、及びAdult Treatment Panel III (ATP III; National Institutes of Health: Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III), Executive Summary; Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, 2001 (NIH pub. no. 01-3670)によるような「代謝症候群」は、ヒトが下記基準の３つ以上：
１．腹部肥満：男性ではウェスト周り＞１０２ｃｍ、女性ではウェスト周り＞８８ｃｍ；
２．高トリグリセリド血症：≧１５０ｍｇ（１．６９５ｍｍｏｌ／ｌ）；
３．低ＨＤＬコレステロール：男性では＜４０ｍｇ／ｄｌ（１．０３６ｍｍｏｌ／ｌ）、女性では＜５０ｍｇ／ｄｌ（１．２９５ｍｍｏｌ／ｌ）；
４．高血圧：≧１３０／８５ｍｍＨｇ；
５．高い空腹時血糖：≧１１０ｍｇ／ｄｌ（≧６．１ｍｍｏｌ／ｌ）
を有するときに生じる；又は
World Health Organization 基準 (Alberti and Zimmet, Diabet. Med. 15: 539-53, 1998)によると、ヒトが糖尿病、耐糖能異常、空腹時血糖異常、若しくはインシュリン抵抗性に加えて、下記異常の２つ以上：
１．高血圧：≧１６０／９０ｍｍＨｇ；
２．高脂血症：トリグリセリド濃度  ≧１５０ｍｇ／ｄｌ（１．６９５ｍｍｏｌ／ｌ）及び／又はＨＤＬコレステロールが男性では＜３５ｍｇ／ｄｌ（０．９ｍｍｏｌ／ｌ）、女性では＜３９ｍｇ／ｄｌ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）；
３．中心性肥満：ウェスト・ヒップ比が男性では＞０．９０、女性では＞０．８５、及び／又はＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２；
４．微量蛋白尿：尿中アルブミン排泄速度  ≧２０μｇ／ｍｉｎ又はアルブミン・クレアチニン比  ≧２０ｍｇ／ｋｇ
を有するときに生じる。
【００２３】
「療法的有効」とは、体脂肪の減少を生じることを意味する。
「ＰＤＥ９遺伝子破壊(disrupted PDE9 gene)」は、野生型バージョンのＰＤＥ９遺伝子を正常に発現する細胞において、破壊された遺伝子によってコードされるＰＤＥ９ポリペプチドの細胞活性が低下する又は、好ましくは、除去されるように、遺伝子改変されているＰＤＥ９遺伝子を意味する。遺伝子改変が細胞中のＰＤＥ９遺伝子の野生型コピーの全てを効果的に排除する（例えば、遺伝子改変された、非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞が、ＰＤＥ９遺伝子破壊に関して同型接合性であるか、又はもともと存在するＰＤＥ９遺伝子の野生型コピーのみが今や破壊される）場合には、遺伝子改変が、野生型ＰＤＥ９遺伝子を発現する対照細胞に比べて、ＰＤＥ９ポリペプチド活性を低下させる。このＰＤＥ９ポリペプチド活性の低下は、ＰＤＥ９遺伝子発現の低下に由来する（即ち、ＰＤＥ９ｍＲＮＡレベルが効果的に低下して、ＰＤＥ９ポリペプチドレベルの低下を生じる）及び／又はＰＤＥ９ポリペプチド活性の低下は、破壊されたＰＤＥ９遺伝子が、野生型ＰＤＥ９ポリペプチドに比べて変化した（例えば、低下した）機能を有する突然変異ポリペプチドをコードするために生じる。好ましくは、遺伝子改変された、非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞中のＰＤＥ９ポリペプチド活性は、野生型レベルの５０％以下に、より好ましくは２５％以下に、さらにより好ましくは野生型レベルの１０％以下に、低下する。最も好ましくは、同型接合性ＰＤＥ９遺伝子破壊は、野生型ＰＤＥ９活性を実証する種類の細胞において、検出不能なＰＤＥ９活性を生じる。
【００２４】
破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有する「遺伝子改変された非ヒト哺乳動物」とは、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有するように遺伝子操作によって作製された非ヒト哺乳動物、並びに該破壊されたＰＤＥ９遺伝子を遺伝で受け継ぐような、そのような非ヒト哺乳動物の子孫を意味する。遺伝子改変された非ヒト哺乳動物は、例えば、所望の遺伝子改変を有する未分化胚芽細胞又は胚を作製し、次に該未分化胚芽細胞又は胚を、子宮内発達のために、養母中に移植することによって、発生させることができる。遺伝子改変した未分化胚芽細胞又は胚は、マウスの場合には、遺伝子改変した胚幹（ＥＳ）細胞をマウス未分化胚芽細胞に移植することによって、又は四倍体胚にＥＳ細胞を凝集させることによって作製することができる。或いは、多様な種の遺伝子改変した胚を核移植によって得ることができる。核移植の場合には、ドナー細胞は体細胞又は多能性幹細胞であり、これは、ＰＤＥ９遺伝子を破壊する所望の遺伝子改変を含むように操作される。次に、この細胞の核を、除核された受精卵母細胞又は単為発生卵母細胞に移入して；得られた胚を再構成して、未分化胚芽細胞に発達させる。上記方法のどちらかで得られた遺伝子改変未分化胚芽細胞を、次に当業者に周知の標準方法によって、養母に移植する。「遺伝子改変非ヒト哺乳動物」は、上記方法で作製された非ヒト哺乳動物の全ての子孫を、該子孫が、ＰＤＥ９遺伝子を破壊する遺伝子改変の少なくとも１つのコピーを受け継ぐ限り、包含する。遺伝子改変非ヒト哺乳動物の全ての体細胞と生殖細胞が該改変を含有することが好ましい。破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有するように遺伝子改変される、好ましい非ヒト哺乳動物は、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ及びフェレットを包含する。
【００２５】
破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有する「遺伝子改変動物細胞」は、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有するように遺伝子操作によって作製された、ヒト細胞を含めた動物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）、並びに破壊されたＰＤＥ９遺伝子を受け継ぐ、娘細胞及び遺伝子改変親ＥＳ細胞又は幹細胞から分化した細胞を意味する。これらの細胞は、当該技術分野で知られた任意の標準方法によって培養中に遺伝子改変することができる。培養中に細胞を遺伝子改変させることの代替手段として、ＰＤＥ９遺伝子破壊を含有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から、非ヒト哺乳動物細胞を単離することもできる。本発明の動物細胞は、一次細胞若しくは組織プレパレート並びに培養に適合した、腫瘍形成性若しくは形質転換細胞系統から得ることができる。これらの細胞と細胞系統は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、島細胞、ニューロン及び他の神経組織由来細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要腺若しくは器官（例えば、精巣、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、及び皮膚）の細胞、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋及び心筋を含む）、外分泌若しくは内分泌細胞、線維芽細胞、並びに胚及びその他の全能性若しくは多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ＥＳ様細胞、胚性生殖細胞及び他の幹細胞、例えば、前駆細胞及び組織由来幹細胞）に由来する。好ましい遺伝子改変細胞は、ＥＳ細胞であり、より好ましくは、マウス若しくはラットＥＳ細胞であり、最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞並びに、遺伝子改変ＥＳ細胞から分化した細胞である。
【００２６】
「遺伝子改変している」非ヒト哺乳動物又は動物細胞は、遺伝子操作によって、非ヒト哺乳動物又は動物細胞中へ又は前駆非ヒト哺乳動物又は動物細胞中へ移入される改変に関して、異型又は同型接合性である。改変を移入するために用いることができる、遺伝子操作の標準方法は、相同的組み換え、ウイルスベクター遺伝子トラッピング、照射、化学的突然変異及び、アンチセンスＲＮＡを単独で又は触媒リボザイムと組み合わせてコードするヌクレオチド配列のトランスジェニック発現を包含する。遺伝子を破壊するための遺伝子改変の好ましい方法は、「異種核酸配列」を遺伝子座に挿入することによって（例えば、相同的組み換え若しくはウイルスベクター遺伝子トラッピングによって）、内因性遺伝子を改変する方法である。「異種核酸配列」は、遺伝子中に非自然的に発生する外因性配列である。異種ＤＮＡのこの挿入は、ＰＤＥ９遺伝子のいずれの領域においても（例えば、エンハンサー、プロモーター、調節領域、非コード領域、コード領域、イントロン又はエクソンにおいて）、起こることができる。遺伝子破壊のための遺伝子操作の最も好ましい方法は、相同的組み換えであり、相同的組み換えでは、異種核酸配列が単独で又は内因性遺伝子配列の一部の欠失と共に、目標を絞った方法で挿入される。
【００２７】
「同型接合性(homozygosity)」は、非ヒト哺乳動物又は動物細胞におけるＰＤＥ９遺伝子破壊に関する場合に、ＰＤＥ９遺伝子の全対立遺伝子の破壊を有する非ヒト哺乳動物又は動物細胞を意味する。しかし、これらの破壊対立遺伝子の各々のＰＤＥ９遺伝子配列は、同一である必要はない。例えば、非ヒト哺乳動物は、ＰＤＥ９の１対立遺伝子が該遺伝子配列の１領域の欠失の結果として破壊され、他の対立遺伝子は該遺伝子配列の他の領域の欠失の結果として破壊されるような場合に、ＰＤＥ９破壊に関して同型接合性であり得る。
【００２８】
「ＥＳ細胞」又は「ＥＳ様細胞」は、胚、原始生殖細胞、又は奇形癌に由来する多能性幹細胞であって、無限自己再生並びに３胚葉全てをあらわす細胞種に分化することができる、多能性幹細胞を意味する。
「マイクロアレイ」は、本明細書でさらに詳しく説明するように、基質上の識別可能なポリヌクレオチド又はポリペプチドの配置を意味する。
【００２９】
「野生型」は、非ヒト哺乳動物又は動物細胞に関する場合に、場合によっては、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含まない、非ヒト哺乳動物又は動物細胞を意味する。例えば、本発明の非ヒト哺乳動物の特定の特徴を、野生型哺乳動物の該特徴と比較する場合に、野生型なる用語は、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含まない非ヒト哺乳動物（即ち、そのＰＤＥ９遺伝子が野生型である哺乳動物）を意味する。好ましくは、野生型非ヒト哺乳動物は、ＰＤＥ９遺伝子の非破壊又は破壊をそれぞれ別にすれば、本発明の非ヒト哺乳動物に実質的に類似しており、より好ましくは、実質的に同じである。同様に、例えば、本発明の動物細胞の特定の特徴を、野生型動物細胞の該特徴と比較する場合に、野生型なる用語は、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含まない動物細胞（即ち、そのＰＤＥ９遺伝子が野生型である細胞）を意味する。好ましくは、野生型動物細胞は、ＰＤＥ９遺伝子の非破壊又は破壊をそれぞれ別にすれば、本発明の動物細胞に実質的に類似しており、より好ましくは、実質的に同じである。
【００３０】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明から及び特許請求の範囲から、さらに詳しく明らかになるであろう。本発明を特定の実施態様に関連して説明するが、実施可能である他の変更及び改変も本発明の一部であり、特許請求の範囲内であることは理解されるであろう。この出願は、以下に記載する本発明の如何なる同等物、変化、使用若しくは適合も、一般に当該技術分野内で知られた若しくは慣習的な実施の範囲内であり過度の実験なしに確認されることができるような、本開示からの逸脱を含めた本発明の原理も、網羅するように意図される。核酸及びポリペプチドの作製と使用に関する、更なるガイダンスは、分子生物学、タンパク質化学及び免疫学の標準的テキストブック中に見出される（例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, NY, 1986; Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Molecular Cloning, Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley and Sons, 2001; Current Protocols in Human Genetics, Eds. Dracopoli et al., John Wiley and Sons, 1994; Current Protocols in Protein Science, Eds. John E. Coligan et al., John Wiley and Sons, 2002;及び Current Protocols in Immunology, Eds. John E. Coligan et al., John Wiley and Sons, 1994を参照のこと）。公開特許出願及び発行された特許を含めて、本明細書に記載した全ての刊行物はそれらの全体で本明細書に援用される。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、例えば、太り過ぎ若しくは肥満体の患者（例えば、ヒト若しくはコンパニオン動物）の処置における又はフードストック動物（例えば、ウシ、ニワトリ、ブタ）の脂肪の少ない肉を生産するための手段としての、動物における体重及び／又は体脂肪を減少するための方法、及び摂食障害（例えば、過食症及び多食症）の処置方法であって、それを必要とする患者にＰＤＥ９阻害剤を投与することによる方法に関する。本発明はまた、ＰＤＥ９機能をさらに研究するための生物学的ツール、即ち、ＰＤＥ９遺伝子破壊を有する、遺伝子改変されたマウス及び動物細胞を特徴とする。本明細書の実施例に開示するように、ＰＤＥ９阻害剤の投与は、肥満のｏｂ／ｏｂマウス・モデルにおける体重増加を減じ、ＰＤＥ９ノックアウト・マウスは、高脂肪食餌をとらせた後の体重増加及び脂肪蓄積増強が比較的起こりにくい。両方の実施例は、ＰＤＥ９活性を低下させることが、体重及び／又は体脂肪を減ずるための有効な方法であり、例えば、太り過ぎ、肥満体であるか又は摂食障害に苦しむ動物患者の処置に用いることができ、そして、脂肪の少ない肉を生産するためにフードストック動物種に用いることができることを実証する。
【００３２】
例示的なＰＤＥ９阻害剤
如何なるＰＤＥ９阻害剤も、本発明に使用可能である。ＰＤＥ９阻害剤は当業者に知られており、例えば、WO 03/037899及びWO 03/037432におけるような、当業者に知られた標準アッセイによって決定することができる。本発明の方法に用いるＰＤＥ９阻害剤は、上文に援用される、WO 03/037899及びWO 03/037432並びに、米国仮特許出願第60/466,639号（２００３年４月３０日出願）に開示されているＰＤＥ９阻害剤を包含する。上記米国仮特許出願にＰＤＥ９阻害剤として開示されている化合物は、下記化合物を包含する：
３−イソプロピル−５−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（以下、「化合物Ａ」と呼ぶ）；
１−｛［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−フェノキシ］−アセチル｝−ピロリジン−２−カルボン酸；
３−イソプロピル−５−［２−（２−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン・トリフルオロ酢酸塩；
３−イソプロピル−５−［２−（２−モルホリン−４−イル−２−オキソ−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−イソプロピル−５−［２−（２−オキソ−２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−フェノキシ］−アセトアミド；
１−｛［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−フェノキシ］−アセチル｝−ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル；
４−｛［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−フェノキシ］−アセチル｝−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；
Ｎ−（２−ジメチルアミノ−エチル）−２−［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−フェノキシ］−アセトアミド；
［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−フェノキシ］−酢酸；
３−イソプロピル−５−［２−（５−クロロ−２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−イソプロピル−５−［２−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−イソプロピル−５−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−シクロヘキシルメチル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−［５−フルオロ−２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−３イソプロピル−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−シクロペンチル−５−［５−フルオロ−２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
９−（１，２−ジメチル−プロピル）−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−９−（テトラヒドロ−フラン−３−イル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
５−［２−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−ベンジル］−３−イソプロピル−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−シクロペンチル−５−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
９−（１（Ｒ），２−ジメチル−プロピル）−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
９−（２−メチル−ブチル）−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
９−シクロペンチル−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
５−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−３−ピリジン−３−イル−１，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
９−（１，２−ジメチル−プロピル）−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
９−イソプロピル−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−９−（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
９−（１−イソプロピル−２−メチル−プロピル）−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；
９−（１−エチル−プロピル）−２−［２−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ベンジル］−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン；及び
Ｎ−［２−（３−イソプロピル−７−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イルメチル）−シクロヘキシル］−２−ピロリジン−１−イル−アセトアミド。
【００３３】
上記に列挙した化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、プロドラッグ及び製薬的に受容される塩の全てもまた包含されることが、当業者によって理解されるであろう。
【００３４】
治療方法
ＰＤＥ９阻害剤として同定される作用剤を、体重又は体脂肪を減少する（例えば、１つ以上の脂肪蓄積の質量を減ずることによって）ために充分な投与量で投与する。このような療法的有効量は、例えば、患者若しくは動物の状態、投与経路、製剤、担当医師(practioner)の判断、及びこの開示を考慮すれば当業者に明らかになる他の要因に依存する、ルーチン最適化技術を用いて、決定されるであろう。
【００３５】
本発明において用いるために適したＰＤＥ９阻害剤は、単独で投与することができるが、ヒトの療法の場合には、一般に、予定の投与経路及び標準製薬法に関して選択される、適当な製薬的賦形剤、希釈剤又はキャリヤーとの混合物として投与されるであろう。
【００３６】
例えば、本発明において用いるために適当なＰＤＥ９阻害剤又はその塩若しくは溶媒和物は、経口、頬側又は舌下に投与することができ、即時−、遅延−、調節−、持続−、二段階−、制御−放出又はパルスデリバリー用途のための、錠剤、カプセル剤（軟質ゲルカプセルを包含する）、多粒子、ゲル、フィルム、腔座剤(ovules)、エリキシル剤、溶液又は懸濁液の形態で、フレーバー剤又は着色剤を含有することができる。このような化合物は、迅速に分散する若しくは迅速に溶解する投与形によって又は高エネルギー分散系の形態で又は被覆粒子として投与することもできる。適当な薬剤製剤は、必要に応じて、被覆形でも非被覆形でもよい。
【００３７】
このような固体薬剤組成物、例えば錠剤は、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシン及び澱粉（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ若しくはタピオカ澱粉）のような賦形剤、例えば、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロース・ナトリウム及びある一定の錯体シリケートのような崩壊剤、並びに例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、スクロース、ゼラチン及びアラビアゴムのような造粒結合剤を含有することができる。さらに、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート及びタルクのような滑剤を含めることもできる。
【００３８】
同様な種類の固体組成物を、ゼラチンカプセル又はＨＰＭＣカプセル中の充填剤として用いることもできる。これに関して好ましい賦形剤は、ラクトース、澱粉、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールを包含する。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤のためには、ＰＤＥ９阻害剤化合物と、種々な甘味剤若しくはフレーバー剤、着色剤若しくは染料や、乳化剤及び／又は懸濁化剤や、例えば水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンのような希釈剤や、これらの組み合わせを一緒にすることができる。
【００３９】
調節放出及びパルス放出投与形は、例えば、即時放出投与形に関して詳述したような賦形剤を、放出速度調節剤（これらは、デバイスの本体上に塗布されるか及び／又はデバイスの本体中に含まれる）として作用する、付加的な賦形剤と共に含有することができる。放出速度調節剤は、ＨＰＭＣ、ＨＰＭＣＡＳ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、水素化ヒマシ油、カルナウバワックス、パラフィンワックス、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー及びこれらの混合物を、排他的に限定する訳ではなく、包含する。調節放出及びパルス放出投与形は、１種類の又は組み合わせの放出速度調節賦形剤を含有することができる。放出速度調節賦形剤は、投与形の内部（即ち、マトリックス内）及び／又は投与形上（即ち、表面若しくは被膜上）の両方に存在することができる。
【００４０】
迅速分散性若しくは溶解性投与製剤（ＦＤＤＦ）は、下記成分：アスパルテーム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、エチルアクリレート、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メチルメタクリレート、ミントフレーバー、ポリエチレングリコール、フュームドシリカ、二酸化ケイ素、澱粉グリコール酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトールを含有することができる。ＦＤＤＦを説明するために本明細書で用いる、「分散性若しくは溶解性」なる用語は、用いる薬物物質の溶解性に依存する。即ち、薬物物質が不溶性である場合には、迅速分散性投与形を製造することができ、薬物物質が溶解性である場合には、迅速溶解性投与形を製造することができる。
【００４１】
本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤は、非経口的に、例えば、海綿体内、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下に投与することも可能である。又は該ＰＤＥ９阻害剤は注入(infusion)若しくは無針技術によって投与することができる。このような非経口投与のためには、該ＰＤＥ９阻害剤は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張性にするために充分な塩若しくはグルコースを含有することができる、無菌水溶液の形態で用いるのが最良である。該水溶液は、必要に応じて、適当に緩衝化（好ましくは、約３〜９のｐＨに）する。無菌条件下での適当な非経口製剤の製造は、当業者に周知の標準製薬法によって、容易に達成される。
【００４２】
ヒト患者に経口若しくは非経口投与するために、本発明に用いるＰＤＥ９阻害剤の１日投与量レベルは、通常、１〜５００ｍｇ（単回量又は分割量で）である。好ましい投与量範囲は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇである。該投与量は、単回量、分割日用量、又は複数回日用量によることができる。或いは、例えば、制御放出投与形によるような連続投与（この場合に、このような連続投与形は１日規模で投与することができ、又はこのような連続投与は、一度に２日間以上にわたる投与をするような、緩慢放出製剤による）によって行なうことができる。
【００４３】
したがって、例えば、本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤の錠剤又はカプセル剤は、一度に１個又は２個以上を投与するために、１ｍｇ〜２５０ｍｇの活性化合物を、適切に含有することができる。好ましい錠剤又はカプセル剤は、一度に１個又は２個以上を投与するために、約１ｍｇ〜約５０ｍｇの活性化合物を、適切に含有することができる。いずれにせよ、医師は、任意の個々の患者に対して、最も適切であって、特定の患者の年齢、体重及び反応によって変化する、実際の投与量を決定するであろう。もちろん、これより高い又は低い投与量範囲が有利である、個々の場合が存在する可能性があり、このような投与量範囲も本発明の範囲内である。
【００４４】
本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤はまた、鼻腔内に又は吸入によって投与することもでき、乾燥粉末吸入器又はエアゾールスプレープレゼンテーションの形態で、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーから、適当な噴射剤［例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン（例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ（商標））若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ（商標）））、二酸化炭素又は他の適当なガス］を用いて投与することもできる。加圧エアゾールの場合には、計量した量をデリバリーするように弁を備えることによって、投与量単位を決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、活性化合物の溶液又は懸濁液（例えば、付加的に滑剤（例えば、ソルビタントリオレエート）を含有することができる、エタノールと噴射剤との混合物を溶媒として用いる）を含有することができる。吸入器又は吹き入れ器に用いるためのカプセル又はカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、本発明の化合物と、適当な粉末基剤（例えばラクトース若しくは澱粉）との粉末ミックスを含有するように製造することができる。
【００４５】
エアゾール又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各計量した量又は「パフ」が１〜５０ｍｇのＰＤＥ９阻害剤を、処置されるべき動物にデリバリーするために含有するように用意される。エアゾールによる総１日量は、１〜５０ｍｇの範囲内であり、これは単回量で又はより通常には１日を通して分割量で、投与することができる。
【００４６】
本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤は、アトマイザーによってデリバリーするように製剤化することもできる。アトマイザーデバイスのための製剤は、可溶化剤、乳化剤又は懸濁化剤として、下記成分：水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、フルオロカーボン、ポリエチレングリコールエーテル、ソルビタントリオレエート、オレイン酸、を含有することができる。
【００４７】
或いは、本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤は、座薬若しくはペッサリーの形態で投与することができ、又は該ＰＤＥ９阻害剤は、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散粉粉末の形態で局所塗布することができる。本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤はまた、例えば皮膚パッチの使用によって、皮膚又は経皮投与することもできる。該阻害剤は、肺又は直腸経路で投与することもできる。
【００４８】
該ＰＤＥ９阻害剤は、眼経路で投与することもできる。眼科使用のためには、該化合物を等張性のｐＨ調節済み無菌生理食塩水中の微細懸濁液として、又は好ましくは、任意に例えば塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤と組み合わせた、等張性のｐＨ調節済み無菌生理食塩水中の溶液として製剤化することができる。或いは、該ＰＤＥ９阻害剤は、例えばワセリンのような軟膏中で製剤化することができる。
【００４９】
皮膚への局所塗布のために、本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤は、例えば、下記：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水、の１つ以上との混合物中に、懸濁又は溶解した有効成分若しくは作用剤を含有する、適当な軟膏として製剤化することができる。或いは、該ＰＤＥ９阻害剤は、例えば、下記：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水、の１つ以上の混合物中に、懸濁又は溶解した適当なローション又はクリームとして製剤化することができる。
【００５０】
本発明による使用に適したＰＤＥ９阻害剤は、シクロデキストリンと組み合わせて用いることもできる。シクロデキストリンは、薬物分子と包接錯体及び非包接錯体を形成することが知られている。薬物−シクロデキストリン錯体の形成は、薬物分子の溶解性、溶解速度、バイオアベイラビリティ及び／又は安定特性を調節することができる。薬物−シクロデキストリン錯体は、大抵の投与形及び投与経路のために一般に有用である。薬物との直接の錯体形成の代替手段として、シクロデキストリンを補助添加剤として、例えば、キャリヤー、希釈剤又は可溶化剤として用いることができる。α−、β−及びγ−シクロデキストリンが、最も一般的に用いられる例の一部であり、適切な例は、WO 91/11172、WO 94/02518 及び WO 98/55148に記載されている。
【００５１】
一般に、ヒトでは、経口投与が好ましい経路であり、最も便利である。レシピエントが嚥下障害又は経口投与後の薬物吸収障害に悩んでいる状況では、薬物を非経口、舌下又は頬側投与することができる。
【００５２】
獣医学的使用のためには、ＰＤＥ９阻害剤は、通常の獣医学的実施によって適当に受容される製剤として投与され、獣医が、特定の動物に最も適当である投与計画及び投与経路を決定するであろう。このような動物は、太り過ぎ、肥満体である、又は太り過ぎ若しくは肥満体の危険性にあるコンパニオン動物を包含する。本発明によって処置されうる、他の動物は、本発明による処置なしに得られるよりも脂肪の少ない肉を得るためのフードストック動物である。
【００５３】
このようなＰＤＥ９阻害剤の治療効力は、この開示を考慮して、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がある用量）の決定に関して、細胞培養又は実験動物における標準治療方法によって測定することができる。
【００５４】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量範囲を決定するのに利用することができる。投与量は、例えば、製剤及び投与経路に依存して変化しうる。本発明の方法に用いる、いずれのＰＤＥ９阻害剤に関しても、療法的有効量は、細胞培養アッセイから最初に算出することができる。細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲を得るように、投与量を動物モデルで決定することができる。このような情報を利用して、ヒトの場合の有効な投与量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００５５】
本発明によって用いるＰＤＥ９阻害剤は、本明細書に記載する疾患、状態及び／又は障害の治療のための他の薬剤と共に用いることもできる。それ故、ＰＤＥ９阻害剤を他の薬剤と組み合わせて投与することを含む処置方法もまた提供される。本発明の化合物と組み合わせて用いることができる適当な薬剤は、肥満抑制薬、例えばβ３−アドレナリン作用性受容体アゴニスト、アポリポタンパク質−Ｂ分泌／ミクロソームトリグリセリド転送タンパク質（ａｐｏ−Ｂ／ＭＴＰ）阻害剤、ペプチドＹＹ３-３６とその類似体、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤（例えばシブトラミン）、交感神経様作用薬、カンナビノイド受容体アンタゴニスト（例えばリモナバント（SR-141,716A））、ドーパミンアゴニスト（例えばブロモクリプチン）、メラノサイト刺激ホルモン受容体類似体、５ＨＴ２ｃアゴニスト、メラニン凝集ホルモンアンタゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）、レプチン類似体、レプチン受容体アゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（例えばテトラヒドロリプスタチン、即ちオルリスタット）、食欲抑制薬（例えばボンベシンアゴニスト）、ニューロペプチド−Ｙアンタゴニスト、甲状腺様作用剤、デヒドロエピアンドロステロン若しくはその類似体、グルココルチコイド受容体アゴニスト若しくはアンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、毛様体神経栄養因子（例えば、Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tarrytown, NY 及びProcter & Gamble Company, Cincinnati, OHから入手可能なAxokine（商標））、ヒトアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体アンタゴニスト若しくは逆アゴニスト、ニューロメジンＵ受容体アゴニスト、ＩＩβ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ−１阻害剤等、を包含する。以下に挙げる、好ましい作用剤を含めて、他の肥満抑制薬は、当業者に周知であるか、又は本発明の開示を考慮するならば、当業者に容易に明らかになるであろう。
【００５６】
オルリスタット、シブトラミン、ブロモクリプチン、エフェドリン、レプチン、偽エフェドリン及びペプチドＹＹ３−３６（その類似体を含む）から成る群から選択される肥満抑制薬が、特に好ましい。本発明の化合物及び併用療法を、運動及び目的に適った食餌療法と併せて投与することが好ましい。
【００５７】
本発明の組み合わせ、薬剤組成物及び方法に用いるための代表的な肥満抑制薬は、当業者に知られた方法を用いて製造することができ、例えば、シブトラミンは、例えば米国特許No. 4,929,629に記載されているように;ブロモクリプチンは、例えば米国特許No.3,752,814 とNo.3,752,888に記載されているように;オルリスタットは、例えば米国特許No.5,274,143;No.5,420,305;No.5,540,917;及びNo.5,643,874に記載されているように;並びにＰＹＹ３−３６（類似体を含む）は、例えば米国特許出願公開No.2002/0141985及びWO 03/027637に記載されているように、製造することができる。
【００５８】
熟練した技術者は、非限定的に、哺乳動物の疾患若しくは障害の重症度、処置歴、全身の健康状態及び／又は年齢、及び他の存在する疾患を包含する、ある一定の要因が、哺乳動物を効果的に処置するために必要な投与量及びタイミングに影響を及ぼすことを理解するであろう。さらに、療法的有効量のＰＤＥ９阻害剤による哺乳動物の処置は、単回処置を含むことができ、或いは好ましくは、一連の処置を含むことができる。
【００５９】
遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び細胞
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び、ヒト細胞を含めた、遺伝子改変動物細胞は、ＰＤＥ９遺伝子を破壊する改変に関して異型若しくは同型接合性である。該動物細胞は、培養中の細胞の遺伝子操作によって導出することができ、又は非ヒト哺乳動物細胞の場合には、遺伝子改変した非ヒト哺乳動物から細胞を単離することができる。
【００６０】
ＰＤＥ９遺伝子の破壊
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び哺乳動物細胞を作製するために、化学的突然変異誘発(Rinchik, Trends in Genetics 7: 15-21, 1991, Russell, Environmental & Molecular Mutagenesis 23 (Suppl. 24): 23-29, 1994)、照射(Russell,上記文献)、単独又は触媒ＲＮＡリボザイム配列と組み合わせた、ＰＤＥ９遺伝子アンチセンスＲＮＡのトランスジェニック発現(Luyckx et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 12174-79, 1999; Sokol et al., Transgenic Research 5:363-71, 1996; Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2051-55, 1994; Larsson et al.,Nucleic Acids Research 22: 2242-48, 1994)及び、以下でさらに考察するような、ＰＤＥ９遺伝子座への異種核酸配列の挿入によるＰＤＥ９遺伝子の破壊を含めた、当該技術分野で知られた遺伝子改変の技術を用いて、ＰＤＥ９遺伝子座を破壊することができる。好ましくは、相同的組み換えによって又はウイルスベクターの挿入によって、該異種配列を挿入する。最も好ましくは、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び哺乳動物細胞を作製するためのＰＤＥ９遺伝子破壊の方法は、相同的組み換えであり、内因性ＰＤＥ９遺伝子配列の一部の欠失を含む。
【００６１】
異種配列の組み込みは、下記機構：ＰＤＥ９遺伝子転写又は翻訳プロセスの妨害（例えば、プロモーター認識の妨害により、又は転写停止部位若しくは翻訳停止コドンのＰＤＥ９遺伝子中への挿入により）；又はＰＤＥ９遺伝子コード配列を、それがもはや正常な機能のＰＤＥ９ポリペプチドをコードしないように歪めること（例えば、異種コード配列をＰＤＥ９遺伝子コード配列中に挿入することにより、フレームシフト変異若しくはアミノ酸（単数又は複数）置換の導入により、又はダブルクロスオーバーイベントの場合には機能性ＰＤＥ９タンパク質の発現のために必要であるＰＤＥ９遺伝子コード配列の一部の欠失により）の１つ以上によってＰＤＥ９遺伝子を破壊する。
【００６２】
異種配列を細胞のゲノム中のＰＤＥ９遺伝子座に挿入して、本明細書に基づいて本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製するために、該異種ＤＮＡ配列は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、バイオリスティクス、リポソームトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、又はトランスファーインフェクションのような、当該技術分野で知られた標準方法によって、細胞中に導入される（例えば、Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 7161-65, 1984; Chu et al., Nucleic Acids Res. 15: 1311-26, 1987; Thomas and Capecchi, Cell 51: 503-12, 1987; Baum et al., Biotechniques 17: 1058-62, 1994; Biewenga et al., J. Neuroscience Methods 71: 67-75, 1997; Zhang et al., Biotechniques 15: 868-72, 1993; Ray and Gage, Biotechniques 13: 598-603, 1992; Lo, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-14, 1983; Nickoloff et al.,Mol.Biotech. 10: 93-101, 1998; Linney et al., Dev. Biol. (Orlando) 213: 207-16, 1999; Zimmer and Gruss, Nature 338: 150-153, 1989;及び Robertson et al., Nature 323:445-48,1986を参照のこと）。異種ＤＮＡを細胞中に導入するための好ましい方法は、エレクトロポレーションである。
【００６３】
相同的組み換え
ＰＤＥ９遺伝子を破壊のターゲットとする相同的組み換え方法は、ＰＤＥ９遺伝子を含有する細胞中にＰＤＥ９遺伝子ターゲッティングベクターを導入することによって行う。ＰＤＥ９遺伝子を破壊のターゲットとする該ベクターの能力は、ＰＤＥ９遺伝子と相同的である、即ち、ＰＤＥ９遺伝子と関連する、ベクター中のヌクレオチド配列を用いることから生じる。該相同領域は、該ベクターとＰＤＥ９遺伝子の内因性配列との間のハイブリダイゼーションを促進する。ハイブリダイゼーションが起こると、ターゲッティングベクターとゲノム配列との間にクロスオーバーイベントが生じる確率は大きく増大する。該クロスオーバーイベントの結果として、ＰＤＥ９遺伝子座中への該ベクター配列の組み込みと、ＰＤＥ９遺伝子の機能的破壊が生じる。
【００６４】
ターゲッティングに用いられるベクターの構築に関する一般原則は、Bradley等（Biotechnol. 10:534,1992）に概説されている。２つの異なる種類のベクター：挿入ベクター又は置換ベクター、を用いて、相同的組み換えによってＤＮＡを挿入することができる。挿入ベクターは、二本鎖破壊を有するＰＤＥ９遺伝子相同性の領域を含有する環状ＤＮＡである。該相同性領域と内因性ＰＤＥ９遺伝子とのハイブリダイゼーション後に、二本鎖破壊でのシングルクロスオーバーイベントが、クロスオーバーの部位で内因性遺伝子中への全ベクター配列の挿入を生じる。
【００６５】
相同的組み換えによって本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製するために、より好ましいベクターは、環状よりも共直線状(colinear)である置換ベクターである。ＰＤＥ９遺伝子中への置換ベクター組み込みは、ダブルクロスオーバーイベント、即ち、ターゲッティングベクターとＰＤＥ９遺伝子との間のハイブリダイゼーションの２部位におけるクロスオーバーを必要とする。該ダブルクロスオーバーイベントの結果として、２部位のクロスオーバーの間に挟まれたベクター配列の、ＰＤＥ９遺伝子中への組み込みと、本来、該２部位のクロスオーバーの間を橋渡しする対応内因性ＰＤＥ９遺伝子配列の欠失とが生じる（例えば、Thomas and Capecchi et al., Cell 51: 503-12, 1987; Mansour et al., Nature 336: 348-52, 1988; Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7688-7692, 1990;及びMansour, GATA 7: 219-227, 1990を参照のこと）。
【００６６】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製するために用いるターゲッティングベクター中の相同性領域は、一般に、少なくとも１００ヌクレオチド長さである。最も好ましくは、該相同性領域は少なくとも１〜５キロベース（ｋｂ）長である。相同性領域に必要な最小の相関長若しくは最小の相関度は実証されていないが、相同的組み換えのためのターゲッティング効率は、一般に、ターゲッティングベクターとＰＤＥ９遺伝子座との間の相関長と相関度に対応する。置換ベクターが用いられ、相同的組み換え時に内因性ＰＤＥ９遺伝子の一部が欠失する場合には、さらなる問題は、該内因性ＰＤＥ９遺伝子の該欠失部分のサイズである。該内因性ＰＤＥ９遺伝子のこの部分の長さが１ｋｂよりも大きい場合には、１ｋｂより長い相同性領域を有するターゲッティングカセットが、組み換え効率を強化するために望ましい。本明細書に基づいて、相同的組み換えに効果的な配列を選択し、用いることに関するさらなるガイダンスは、文献（例えば、Deng and Capecchi, Mol. Cell. Biol. 12: 3365-3371, 1992; Bollag et al., Annu. Rev. Genet. 23: 199-225, 1989;及びWaldman and Liskay, Mol. Cell. Biol. 8: 5350-5357, 1988を参照のこと）に記載されている。
【００６７】
本発明に基づいて、当業者であれば認識するように、本発明のＰＤＥ９遺伝子ターゲッティングベクターの構築にベクターバックボーンとして、pBluescript-関連プラスミド(例えばBluescript KS+11)、pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、ファージスクリプト、phiX174、pBK Phagemid、pNH8A、pNH16a、pNH18Z、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及びpRIT5 PWLNEO、pSV2CAT、pXT1、pSG (Stratagene)、pSVK3、PBPV、PMSG及びpSVL、pBR322及びpBR322に基づくベクター、pMB9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、ファージCharon 28、pKB11、pKSV-10、pK19関連プラスミド、pUC プラスミド 及びpGEMシリーズのプラスミドを含めた、非常に多様なクローニングベクターを用いることができる。これらのベクターは、多様な商業的供給源（例えば、Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; Qiagen, Valencia, CA; Stratagene, La Jolla, CA; Promega, Madison, WI;及びNew England Biolabs, Beverly, MA）から入手可能である。しかし、如何なる他のベクター、例えば、プラスミド、ウイルス又はこれらの部分も、それらが複製可能であり、所望のホスト中で生存可能である限り、使用可能である。該ベクターは、そのゲノムが改変されるべき宿主中での複製を可能にする配列を含むこともできる。このようなベクターの使用は、組み換えが起こりうる相互作用期間を拡張することができ、ターゲッティング効率を高めることができる（Molecular Biology, ed. Ausubel et al, Unit 9.16, Fig. 9.16.1参照）。
【００６８】
本発明のターゲッティングベクターの作製に用いる特定のホストは重大ではない。例には、E. coli K12 RR1 (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977)、E. coli K12 HB101 (ATCC No. 33694)、E. coli MM21 (ATCC No. 336780)、E. coli DH1 (ATCC No. 33849)、E. coli菌株 DH5α、及びE. coli STBL2が包含される。或いは、C. cerevisiae又はB. subtilisのようなホストが使用可能である。上記ホストは、商業的に入手可能である（例えば、Stratagene, La Jolla, CA;及びLife Technologies, Rockville, MD）。
【００６９】
ターゲッティングベクターを作製するために、ＰＤＥ９遺伝子ターゲッティング構築体を上記ベクターバックボーンに加える。本発明のＰＤＥ９遺伝子ターゲッティング構築体は、少なくとも１つのＰＤＥ９遺伝子相同性領域を有する。該ＰＤＥ９遺伝子相同性領域を作製するために、ＰＣＲプライマー作製の基礎としてＰＤＥ９ゲノム又はｃＤＮＡ配列を用いる。これらのプライマーを用いて、高フィデリティＰＣＲ増幅によってＰＤＥ９配列の所望の領域を増幅する（Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991; Eckert and Kunkel 1:17,1991;及び米国特許No.4,683,202）。ゲノム配列は、ゲノム・クローンライブラリーから、又はゲノムｃＤＮＡ（好ましくは、ＰＤＥ９遺伝子破壊のためにターゲットとされるべき動物種からの）の調製から得られ、ＰＤＥ９ｃＤＮＡ配列はＰＤＥ９ターゲッティングベクターの作製に用いることができる（例えば、GenBank（登録商標） NM008804 (ネズミ)又はGenBank（登録商標）NM002606 (ヒト)）。
【００７０】
好ましくは、本発明のターゲッティング構築体はさらに、ポジティブマーカータンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。ベクター組み込み後のポジティブマーカーの安定な発現は、理想的には細胞生存性を危なくすることなく、細胞に同定可能な特徴を与える。それ故、置換ベクターの場合には、該マーカー遺伝子は２つのフランキング相同性領域の間に配置され、ダブルクロスオーバーイベント後に（該マーカー遺伝子は組み込み後に発現されるように配置される形式で）ＰＤＥ９遺伝子中に組み込まれる。
【００７１】
ポジティブマーカータンパク質が選択可能(selectable)タンパク質であること；細胞におけるこのようなタンパク質の安定な発現が、選択可能な表現型特徴（即ち、該特徴がなくば致命的条件下での細胞の生残を高める特徴）を与えること、が好ましい。したがって、選択可能な条件を課することによって、ポジティブ選択可能マーカーコーディングベクター配列を安定に発現する細胞を、ベクター配列を首尾よく組み込んでいない他の細胞から、生存性に基づいて単離することができる。ポジティブ選択可能マーカータンパク質（及びそれらの選択作用因子）の例は、neo(G418 又はカノマイシン)、hyg(ヒグロマイシン)、hisD (ヒスチジノール)、gpt (キサンチン)、ble (ブレオマイシン)及びhprt (ヒポキサンチン)を包含する(例えば、Capecchi and Thomas, 米国特許No. 5,464,764,及び Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989を参照のこと)。選択可能マーカーの代替手段としても用いられうる、他のポジティブマーカーは、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、又は緑色蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質を包含する(例えば、Current Protocols in Cytometry, Unit 9.5, 及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Unit 9.6, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000を参照のこと)。
【００７２】
上記ポジティブ選択工程は、ＰＤＥ９遺伝子座における標的相同的組み換えによってベクターを組み込んでいる細胞を、任意の染色体位置にベクター配列をランダムで非相同的に組み込む細胞対して識別しない。それ故、相同的組み換えのために置換ベクターを用いて、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製する場合には、ネガティブ選択可能マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含めることも、好ましい。ネガティブ選択マーカーの発現は、該マーカーを発現する細胞に、それがある一定の作用因子に暴露されたときに、生存性を失わせる（即ち、ある一定の選択条件下で、該マーカータンパク質は、該細胞に対して致死的になる）。ネガティブ選可能択マーカー（及びそれらの致死性作用因子）の例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ガンシクロビル又は１，２−デオキシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフランシル−５−ヨードウラシル）、Ｈｐｒｔ（６−チオグアニン又は６−チオキサンチン）、及びジフテリア毒素、リシン毒素、並びにシトシンデアミナーゼ（６−フルオロシトシン）を包含する。
【００７３】
ネガティブ選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列は、置換ベクターの２つの相同性領域の外側に配置される。この配置を与えられると、ランダム非相同的組み換えによって組み込みが生じる場合；ＰＤＥ９遺伝子と、ターゲッティング構築体中の２つの相同性領域との間の相同的組み換えが、該ネガティブ選択可能マーカーをコードする配列を組み込みから除外する場合、細胞はネガティブ選択マーカーを組み込んで、安定に発現する。したがって、ネガティブ条件を与えることによって、ランダム非相同的組み換えによってターゲッティングベクターを組み込んでいる細胞は、生存性を失う。
【００７４】
ポジティブ及びネガティブ選択可能マーカーの上記組み合わせは、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞の作製に用いるターゲッティング構築体において好ましい。なぜなら、相同的組換えによるベクター組み込みを受けている細胞（故に、恐らく破壊されたＰＤＥ９遺伝子を有する細胞）のみをより効果的に選択するように、一連のポジティブ選択工程及びネガティブ選択工程を設計することができるからである。ポジティブ−ネガティブ選択スキーム、選択マーカー及びターゲッティング構築体のさらなる例は、例えば、米国特許No. 5,464,764、WO 94/06908、米国特許No. 5,859,312及びValancius and Smithies, Mol. Cell. Biol. 11:1402,1991に記載されている。
【００７５】
ベクター組み込み時にマーカータンパク質が安定に発現されるには、マーカーコード配列がベクター組み込み時に内因性ＰＤＥ９遺伝子プロモーターに機能的に連結するように、ターゲッティングベクターを設計することができる。次に、マーカーの発現が、ＰＤＥ９遺伝子を正常に発現する、細胞中のＰＤＥ９遺伝子プロモーターによって駆動される。或いは、該ベクターのターゲッティング構築体中の各マーカーは、ＰＤＥ９遺伝子プロモーターに関係なく発現を駆動する、それ自体のプロモーターを含有する。この後者のスキームは、ＰＤＥ９遺伝子を典型的には発現しない細胞におけるマーカーの発現を可能にするという利点を有する(Smith and Berg, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 49: 171, 1984; Sedivy and Sharp, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 227, 1989; Thomas and Capecchi, Cell 51: 503, 1987)。
【００７６】
マーカー遺伝子発現を駆動するために用いることができる外因性プロモーターは、細胞特異的若しくはステージ特異的プロモーター、構成的プロモーター、及び誘導若しくは調節プロモーターを包含する。これらのプロモーターの非限定的例は、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＭＣ１−ｎｅｏ、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルスレートプロモーター、ワクチンウイルス７．５Ｋプロモーター、鳥類βグロビンプロモーター、ヒストンプロモーター（例えば、マウスヒストンＨ３−６１４）、βアクチンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ、筋肉アクチンプロモーター及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを包含する（一般的に、Sambrook et al., Molecular Cloning, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989及びCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Stratagene, La Jolla, CAを参照のこと）。
【００７７】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製する間に、細胞が該ベクター配列を標的ＰＤＥ９遺伝子座に組み込んだかどうかを確認するために、所望のベクター組み込みイベントに特異的であるプライマー又はゲノムプローブを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はサザンブロット分析と組み合わせて用いて、ＰＤＥ９遺伝子座への所望のベクター組み込みの存在を同定することができる（Erlich et al., Science 252: 1643-51, 1991; Zimmer and Gruss, Nature 338: 150, 1989; Mouellic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 4712, 1990;及び Shesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 4294, 1991）。
【００７８】
遺伝子トラッピング
本明細書に基づくと、ＰＤＥ９遺伝子を破壊するためにＰＤＥ９遺伝子座に異種核酸配列を挿入するのに有効な、他の利用可能な方法は遺伝子トラッピングである。この方法は、
遺伝子トラップベクターコード配列をランダム式に遺伝子中に挿入するために、全ての哺乳動物細胞中に存在する細胞機構(cellular machinery)である、エキソンのｍＲＮＡにスプライスを利用する。ひと度挿入されたならば、該遺伝子トラップベクターは、トラップされたＰＤＥ９遺伝子を破壊しうる突然変異を生じる。相同的組み換えとは対照的に、この突然変異誘発システムは大規模にランダムな突然変異を生じる。したがって、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有する遺伝子改変細胞を得るには、この特定の突然変異を含有する細胞を同定して、多様な遺伝子中にランダム突然変異を含有する細胞のプールから選択しなければならない。
【００７９】
遺伝子トラッピングシステム及びベクターは、ネズミ細胞及び他の細胞種の遺伝子改変における使用に関して発表されている（例えば、Allen et al., Nature 333: 852-55, 1988; Bellen et al., Genes Dev. 3: 1288-1300, 1989; Bier et al., Genes Dev. 3: 1273-1287, 1989; Bonnerot et al., J. Virol. 66: 4982-91, 1992; Brenner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 5517-21, 1989; Chang et al., Virology 193: 737-47, 1993; Friedrich and Soriano, Methods Enzymol. 225: 681-701, 1993; Friedrich and Soriano, Genes Dev. 5: 1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol. 152: 469-81, 1987; Gossler et al., Science 244: 463-65, 1989; Hope, Develop. 113: 399-408, 1991; Kerr et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2: 767-776, 1989; Reddy et al., J. Virol. 65: 1507-1515, 1991; Reddy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6721-25, 1992; Skarnes et al., Genes Dev. 6: 903-918, 1992; von Melchner and Ruley, J. Virol. 63: 3227-3233, 1989; 及びYoshida et al., Transgen. Res. 4: 277-87, 1995を参照のこと）。
【００８０】
破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有する、個々の突然変異細胞系は、突然変異細胞集団中で、例えば、ＰＤＥ９遺伝子配列中の突然変異を同定するための逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲを用いて同定される。この方法は、クローンをプールすることによって簡素化することができる。例えば、破壊されたＰＤＥ９遺伝子を含有する個々のクローンを見い出すためには、遺伝子トラップベクター中に固定された１つのプライマーと、ＰＤＥ９遺伝子配列中にある他のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行なう。ポジティブなＲＴ−ＰＣＲ結果は、ベクター配列がＰＤＥ９遺伝子転写体中にコードされていることを実証し、該ＰＤＥ９遺伝子が遺伝子トラップ組み込みイベントによって既に破壊されていることを実証する（例えば、Sands et al., WO 98/14614、米国特許No. 6,080,576参照）。
【００８１】
時間的、空間的及び誘導ＰＤＥ９遺伝子破壊
本発明のある一定の実施態様では、内因性ＰＤＥ９遺伝子の機能的破壊が、特定の発達若しくは細胞サイクルステージで（時間的破壊）、又は特定の細胞種において（空間的破壊）、生じる。他の実施態様では、ＰＤＥ９遺伝子破壊は、ある一定の条件が存在する場合に誘導される。例えばＣｒｅ−Ｌｏｘシステムのような組み換え切除システムを用いて、特定の発達ステージで、特定の組織若しくは細胞種において、又は特定の環境条件下で、ＰＤＥ９遺伝子を活性化又は不活性化することができる。一般に、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ技術を用いる方法は、Torres and Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997によって記載されているように行なわれる。Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムに関して記載されている方法論と同様な方法論を利用して、ＦＬＰ−ＦＲＴシステムを用いることもできる。相同的組み換え又はウイルス挿入によって遺伝子を条件的に破壊するためのレコンビナーゼ切除システムの使用に関するさらなるガイダンスは、例えば、米国特許No. 5,626,159；米国特許 No. 5,527,695；米国特許 No. 5,434,066；WO 98/29533; 米国特許No. 6,228,639; Orban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 6861-65, 1992; O’Gorman et al., Science 251: 1351-55, 1991; Sauer et al., Nucleic Acids Research 17: 147-61, 1989; Barinaga, Science 265: 26-28, 1994;及びAkagi et al., Nucleic Acids Res. 25: 1766-73, 1997に与えられている。２つ以上のレコンビナーゼシステムを利用して、本発明の非ヒト哺乳動物又は動物細胞を遺伝子改変することができる。
【００８２】
例えばＣｒｅ−Ｌｏｘシステムのようなレコンビナーゼシステムを用いて、時間的、空間的及び誘導形式でＰＤＥ９遺伝子を破壊するために相同的組み換えを用いる場合に、ＰＤＥ９遺伝子コード領域の一部は、ｌｏｘＰサイトがフランキングするＰＤＥ９遺伝子コード領域を含むターゲッティング構築体によって置換される。この遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物及び動物細胞は、機能的ｌｏｘＰフランキング(loxP-flanked)ＰＤＥ９遺伝子を含有する。ＰＤＥ９遺伝子改変の時間的、空間的又は誘導態様は、それぞれ、所望の空間的調節、時間的調節又は誘導プロモーターの制御下で、非ヒト哺乳動物又は動物細胞中に発現される付加的導入遺伝子、Ｃｒｅレコンビナーゼ導入遺伝子の発現パターンによって惹起される。Ｃｒｅレコンビナーゼは、組み換えのためにｌｏｘＰサイトを標的とする。それ故、Ｃｒｅ発現が活性化される場合には、該ｌｏｘＰは組み換えを受けて、挟まれたＰＤＥ９遺伝子コード配列を切除して、結果としてＰＤＥ９遺伝子の機能的破壊が生じる（(Rajewski et al., J. Clin. Invest. 98: 600-03, 1996; St.-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24: 3875-77, 1996; Agah et al., J. Clin. Invest. 100: 169-79, 1997; Brocard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14559-63, 1997; Feil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10887-90, 1996;及びKuhn et al., Science 269: 1427-29, 1995)。
【００８３】
Ｃｒｅレコンビナーゼ導入遺伝子とｌｏｘＰフランキングＰＤＥ９遺伝子の両方を含有する細胞は、標準トランスジェニック技術によって、又は遺伝子改変非ヒト哺乳動物の場合には、所望のプロモーターの制御下で、一方の親がｌｏｘＰフランキングＰＤＥ９遺伝子を含有し、他方の親がＣｒｅレコンビナーゼ導入遺伝子を含有する、遺伝子改変非ヒト哺乳動物の異種交配によって作製することができる。ＰＤＥ９遺伝子を時間的、空間的又は条件的に破壊するためのレコンビナーゼシステム及び特異的プロモーターの使用に関するさらなるガイダンスは、例えば、Sauer, Meth. Enz. 225: 890-900, 1993; Gu et al., Science 265: 103-06, 1994; Araki et al., J. Biochem. 122: 977-82, 1997; Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6191-96, 1996;及びMeyers et al., Nature Genetics 18: 136-41, 1998に見出される。
【００８４】
ＰＤＥ９遺伝子の誘導破壊は、テトラサイクリン反応２元系を用いても達成することができる（Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51, 1992）。この系は、内因性ＰＤＥ９遺伝子調節要素及びテトラサイクリン制御性リプレッサー（ＴｅｔＲ）発現導入遺伝子中にＴｅｔプロモーターを導入して細胞を遺伝子改変することを含む。このような細胞では、テトラサイクリンの投与がＴｅｔＲを活性化し、このＴｅｔＲが次にＰＤＥ９遺伝子発現を阻害し、そのため、ＰＤＥ９遺伝子を破壊する(St.-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24: 3875-77, 1996;米国特許No. 5,922,927)。
【００８５】
ＰＤＥ９遺伝子の時間的、空間的及び誘導破壊のための上記系は、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製するために、例えばWO98/29533及び米国特許No.6,288,639に記載されているように、遺伝子改変方法として遺伝子トラッピングを用いる場合に、採用することもできる。
【００８６】
遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞の作製
本発明の遺伝子改変動物細胞を作製するために、動物に由来する実際に如何なる種類の体細胞又は幹細胞におけるＰＤＥ９遺伝子破壊にも、上記遺伝子改変方法を用いることができる。本発明の遺伝子改変動物細胞は、非限定的に、ヒト細胞及び鳥類細胞を含めた哺乳動物細胞を包含する。これらの細胞は、例えば、培養適応性細胞系、腫瘍形成性若しくは形質転換細胞系、分化した遺伝子操作ＥＳ細胞のような、任意の動物細胞系の遺伝子操作に由来することができ、或いは、これらの細胞は、所望のＰＤＥ９遺伝子改変を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から単離することができる。
【００８７】
これらの細胞は、破壊されたＰＤＥ９遺伝子に対して異型接合性又は同型接合性であることができる。ＰＤＥ９遺伝子破壊に対して同型接合性（−／−）である細胞を得るには、両方の対立遺伝子の直接順次ターゲッティングを行なうことができる。これらの方法は、ポジティブ選択可能マーカーのリサイクリングによって促進することができる。このスキームによると、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムを用いて１つの対立遺伝子の破壊後に、ポジティブ選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列が除去される。したがって、同じベクターをその後のターゲッティング・ラウンドに用いて、第２ＰＤＥ９遺伝子の対立遺伝子を破壊することができる（Abuin and Bradley, Mol. Cell. Biol. 16: 1851-56, 1996; Sedivy et al., T.I.G. 15: 88-90, 1999; Cruz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7170-74, 1991; Mortensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7036-40, 1991; te Riele et al., Nature (London) 348: 649-651, 1990）。
【００８８】
ＰＤＥ９-/-であるＥＳ細胞を得るための代替計画は、ＰＤＥ９遺伝子破壊に関して異型接合性(ＰＤＥ９+/-)である細胞集団からの細胞の同型遺伝子接合体化(homogenotization)である。この方法は、選択可能な薬物耐性マーカーを発現するＰＤＥ９+/-標的クローンを非常に高い薬物濃度に対して選択するスキームを用いる；この選択は、薬物耐性マーカーをコードする配列の２コピーを発現し、そのため、ＰＤＥ９遺伝子破壊に対して同型接合性である細胞を優先する（Mortensen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2391-95, 1992）。さらに、以下で詳述するように、生殖細胞においてＰＤＥ９+/-である非ヒト哺乳動物の交配によって作製される遺伝子改変ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物から、遺伝子改変動物細胞を得ることができる。
【００８９】
所望の細胞若しくは細胞系の遺伝子改変後に、当業者に知られた標準ＰＣＲによるＰＣＲ分析又はサザン・ブロット法によって、ＰＤＥ９遺伝子座を改変部位として確認することができる（例えば、米国特許No. 4,683,202;及び Erlich et al.,Science 252: 1643, 1991を参照のこと）。ＰＤＥ９遺伝子メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベル及び／又はＰＤＥ９ポリペプチドレベルが、ＰＤＥ９遺伝子を正常に発現する細胞中で低下するならば、ＰＤＥ９遺伝子の機能的破壊がさらに実証されることになる。ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析又はin situハイブリダイゼーションを用いて、ＰＤＥ９遺伝子ｍＲＮＡレベルを測定することができる。細胞によって産生されるＰＤＥ９ポリペプチドレベルの数量化は、例えば、当該技術分野で知られた標準イムノアッセイ方法によって行なうことができる。このようなイムノアッセイは、非限定的に、例えばＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えば、コロイド状金、酵素若しくは放射性同位体ラベルを用いる）ウェスターン・ブロット、２次元ゲル分析、沈降反応、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ及び免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる、競合及び非競合アッセイ系を包含する。
【００９０】
本発明の好ましい遺伝子改変動物細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞とＥＳ様細胞である。これらの細胞は、例えば、マウス（Evans et al., Nature 129:154-156, 1981; Martin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 7634-7638, 1981）、ブタとヒツジ(Notanianni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 43: 255-260, 1991; Campbell et al., Nature 380: 64-68,1996)及びヒトを含めた霊長類(Thomson et al.,米国特許No. 5,843,780, Thomson et al., Science 282: 1145-1147, 1995;及びThomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848, 1995)のような、多様な種の着床前胚と未分化胚芽細胞に由来する。ヒトＥＳ細胞における相同的組み換え−仲介遺伝子破壊の成功が、報告されている(Zwaka and Thomson, Nature Biotech. 21: 319-21, 2003)。
【００９１】
これらの種類の細胞は多能性であり、即ち、適当な条件下で、３胚葉の全て：内胚葉、中胚葉及び外胚葉に由来する、非常に多様な細胞種に分化する。培養条件に依存して、ＥＳ細胞のサンプルは、幹細胞として無制限に分化することができ、単一サンプルで非常に多様な種類の異なる細胞種に分化することが許されうる。又は例えば、マクロファージ様細胞、ニューロン細胞、心筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、ケラチノサイト、及び造血細胞、例えば好酸球、マスト細胞、赤血球前駆細胞、又は巨核球のような特定の細胞種に分化するように導かれうる。例えば、Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7: 862-69, 1995; Li et al., Curr. Biol. 8: 971, 1998; Klug et al., J. Clin. Invest. 98: 216-24, 1996; Lieschke et al., Exp. Hematol. 23: 328-34, 1995; Yamane et al., Blood 90: 3516-23, 1997; 及び Hirashima et al., Blood 93: 1253-63, 1999に詳述されているように、培養条件に特異的成長因子又はマトリックス成分を含めることによって、有向性分化が達成される。
【００９２】
遺伝子改変に用いられる、特定の胚幹細胞系は重要ではなく；例示的なネズミＥＳ細胞系は、AB-1 (McMahon and Bradley, Cell 62:1073-85, 1990)、E14 (Hooper et al., Nature 326: 292-95, 1987)、D3 (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45, 1985)、CCE (Robertson et al, Nature 323: 445-48, 1986)、RW4 (Genome Systems, St. Louis, MO)、及びDBA/1lacJ (Roach et al., Exp. Cell Res. 221: 520-25, 1995)を包含し;例示的なヒトＥＳ細胞系は、H1.1細胞(Zwaka and Thomson, Nature Biotech. 21: 319-321, 2003)である。遺伝子改変ネズミＥＳ細胞を用いて、公開されている方法によって、遺伝子改変マウスを作製することができる (Robertson, 1987, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Ed. E. J. Robertson, Oxford: IRL Press, pp. 71−112, 1987; Zjilstra et al., Nature 342: 435-438, 1989;及び Schwartzberg et al., Science 246: 799-803, 1989)。
【００９３】
ＥＳ細胞がＰＤＥ９遺伝子の所望の機能的破壊を含有することを確認した後に、当該技術分野に知られた方法に従って、キメラマウスの作製のために、これらのＥＳ細胞を適当な未分化胚芽細胞ホストに注入する(Capecchi, Trends Genet. 5: 70, 1989)。本発明に用いられる、特定のマウス未分化胚芽細胞は重要ではない。このような未分化胚芽細胞の例は、C57BL6マウス、C57BL6アルビノマウス、Swiss 異系交配マウス、CFLPマウス、及びMFIマウスに由来する未分化胚芽細胞を包含する。或いは、ＥＳ細胞を凝集穴(aggregation well)中で四倍体胚の間にサンドイッチすることができる(Nagy et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8424-8428,1993)。
【００９４】
次に、遺伝子改変ＥＳ細胞を含有する胚の未分化胚芽細胞を偽妊娠している雌マウスに移植し、子宮内で発達させる(Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY 1988;及び Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987)。養母に生まれた子供をスクリーニングして、ＰＤＥ９遺伝子破壊に関してキメラである子供を同定することができる。一般に、このような子供は、遺伝子改変ドナーＥＳ細胞に由来する幾らかの細胞並びにオリジナルの未分化胚芽細胞に由来する他の細胞を含有する。このような状況で、コートカラー計画を用いている場合には、子供を最初にモザイクコートカラーに関してスクリーニングして、ドナーＥＳ細胞に由来する細胞を、未分化胚芽細胞の他の細胞から区別することができる。或いは、子供の尾組織からのＤＮＡを用いて、遺伝子改変細胞を含有するマウスを同定することができる。
【００９５】
生殖細胞系の細胞にＰＤＥ９遺伝子破壊を含有するキメラマウスの交配は、生殖細胞系細胞及び体細胞の全てにＰＤＥ９遺伝子破壊を有する子孫を生じる。次に、ＰＤＥ９遺伝子破壊に対して異型接合性であるマウスを交配させて、同型接合体を生じることができる(例えば、米国特許No. 5,557,032;及び米国特許No. 5,532,158参照)。
【００９６】
遺伝子改変を細胞から動物全体に移入するための上記ＥＳ細胞テクノロジーの代替手段は、核移入を用いることである。この方法は、マウス以外の他の遺伝子改変非ヒト哺乳動物、例えば、ヒツジ(McCreath et al., Nature 29: 1066-69, 2000; Campbell et al., Nature 389: 64-66, 1996; 及びSchnieke et al., Science 278: 2130-33, 1997)及びウシ(Cibelli et al., Science 280: 1256-58, 1998)を作製するために利用することができる。簡単に説明すると、体細胞（例えば、線維芽細胞）又は多能性幹細胞（例えば、ＥＳ様細胞）を核ドナーとして選択して、ＰＤＥ９遺伝子の機能的破壊を含有するように遺伝子改変する。ＤＮＡベクターを体細胞に挿入して、ＰＤＥ９遺伝子を変異させる場合に、ＰＤＥ９遺伝子中への該ベクター組み込みがＰＤＥ９遺伝子プロモーターの制御下でマーカーの発現を生じるように、プロモーターレス・マーカーを該ベクターに用いることが好ましい(Sedivy and Dutriaux, T.I.G. 15: 88-90, 1999; McCreath et al., Nature 29: 1066-69, 2000)。次に、適当なＰＤＥ９遺伝子破壊を有するドナー細胞からの核を、除核された受精卵母細胞又は単為生殖卵母細胞に移入する(Campbell et al., Nature 380: 64, 1996; Wilmut et al., Nature 385: 810, 1997)。胚を再構築して、培養して、桑実胚／未分化胚芽細胞ステージまで発達させ、全期間子宮内発達のために養母に移入する。
【００９７】
本発明は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び遺伝子改変動物細胞の子孫をも包含する。該子孫はＰＤＥ９遺伝子を破壊する遺伝子改変に対して異型接合性又は同型接合性であるとしても、該子孫は、後続の世代で起こりうる、ＰＤＥ９遺伝子のオリジナル遺伝子破壊の遺伝子改変のほかにも、突然変異又は環境の影響のために、親の非ヒト哺乳動物及び動物細胞に遺伝子的に同じでないこともある。
【００９８】
遺伝子改変非ヒト動物からの細胞は、当業者に知られた技術を用いて、組織又は器官から単離することができる。１実施態様では、本発明の遺伝子改変細胞は不死化される。この実施態様によると、テロメラーゼ遺伝子、癌遺伝子、例えば、mos 若しくはv-src、又はアポトーシス抑制遺伝子、例えば、ｂｃｌ−２を細胞中に遺伝子操作することによって、細胞を不死化することができる。或いは、当業者に知られた技術を用いるハイブリダイゼーションパートナーとの融合によって、細胞を不死化することができる。
【００９９】
「ヒト化」非ヒト哺乳動物と動物細胞
破壊された内因性ＰＤＥ９遺伝子を含有する、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞（非ヒト）を、ヒトＰＤＥ９配列を発現するように、さらに改変することができる（本明細書では、「ヒト化」と呼ぶ）。細胞の好ましいヒト化方法は、相同的組み換えによって、内因性ＰＤＥ９配列を、ヒトＰＤＥ９配列をコードする核酸配列と置換することを包含する(Jakobsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7220-25, 1999)。該ベクターは、５’及び３’相同性アームと、ポジティブ／ネガティブ選択スキームに関してターゲッティングベクターとして伝統的に用いられるベクターに類似する。しかし、該ベクターはさらに、組み換え後に、該内因性配列の代わりにヒトＰＤＥ９コード配列を有するか又は、ヒトＰＤＥ９をコードするように該内因性配列を修飾する塩基対変化、エキソン置換若しくはコドン置換を行なう配列をも包含する。相同的組み換えがひと度同定されたならば、Ｃｒｅ又はＦｌｐ仲介部位指向組み換えを用いて、任意の選択に基づく配列（例えば、ｎｅｏ）を削除することが可能である(Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6191-96, 1996)。
【０１００】
該内因性配列の代わりにヒトＰＤＥ９配列を用いる場合には、これらの変化を、内因性翻訳開始部位の下流に直接導入することが好ましい。この位置決めは、ＰＤＥ９遺伝子の内因性時間的及び空間的発現パターンを保護する。該ヒト配列は、適当なプロセシングのために３’末端に付着したpolyAテールを有する全長ヒトｃＤＮＡ配列又は全ゲノム配列であることができる(Shiao et al., Transgenic Res. 8: 295-302, 1999)。細胞及び非ヒト哺乳動物を、内因性遺伝子の発現をそのヒト対応物と置換するように、遺伝子改変するこれらの方法に関するさらなるガイダンスは、例えば、Sullivan et al., J. Biol. Chem. 272: 17972-17980, 1997, Reaume et al., J. Biol. Chem. 271: 23380-23388, 1996及びScott et al., 米国特許No. 5,777,194に見出される。
【０１０１】
このような「ヒト化」生物を作製するための他の方法は、内因性遺伝子の破壊と、その後の、ノックアウト胚への前核ミクロインジェクションによる、ヒト配列をコードする導入遺伝子の導入とを含む２工程方法である。
【０１０２】
遺伝子改変非ヒト哺乳動物と動物細胞の使用
ＰＤＥ９機能と治療的関連性とは、例えば、以下の実施例で説明するように、本発明のＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物及び動物細胞の表現型のさらなる研究によってさらに解明することができる。例えば、遺伝子改変ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物及び動物細胞を用いて、ある一定の疾患モデル、例えば、肥満、摂食障害、心血管系障害、インシュリン抵抗性症候群、高血圧、及び／又は２型糖尿病において症状又は表現型の進展又は予防に、ＰＤＥ９が役割を果たすのかどうかを知ることができる。症状又は表現型が、ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞では、野生型（ＰＤＥ９+/+）又はＰＤＥ９+/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞に比べて、異なる場合には、ＰＤＥ９ポリペプチドが該症状若しくは表現型に関連した調節機能に役割を果たしていることになる。ＰＤＥ９機能の評価に用いることができる試験の例は、ＰＤＥ９-/-マウスと野生型マウスとの、体重、体脂肪、血圧、グルコース／インシュリン代謝（例えば、単離組織におけるグルコース取り込み、グリコーゲン代謝酵素活性の変化、肝臓若しくは筋肉中のグリコーゲンレベルの変化、及び／又は体組成の変化）、並びにインシュリンシグナル伝達経路の構成要素の活性又はリン酸化状態の変化に関する比較を包含する。
【０１０３】
さらに、作用剤がＰＤＥ９アゴニスト又はアンタゴニストとして同定されている（例えば、作用剤をＰＤＥ９+/+若しくはＰＤＥ９+/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞に投与する場合に、該作用剤がＰＤＥ９ポリペプチド活性の１つ以上を有意に修飾する）状況下では、本発明の遺伝子改変ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物及び動物細胞は、ＰＤＥ９のアンタゴニズム（アゴニズム）の結果として生じると知られている効果以外の、該作用剤によって惹起される任意の他の効果を特徴付けるために有用である（即ち、該非ヒト哺乳動物及び動物細胞はネガティブ対照として用いることができる）。例えば、該作用剤の投与が、ＰＤＥ９ポリペプチド活性に関連するとは知られていない、ＰＤＥ９+/+非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞における効果を惹起する場合には、該作用剤がこの効果を単独で及ぼすのか、又は対応するＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞への該作用剤の投与によるＰＤＥ９のモジュレーションによって初めてこの効果を及ぼすのかを知ることができる。この効果がＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞に存在しないか又は有意に低い場合には、この効果の少なくとも一部は、ＰＤＥ９によって仲介されることになる。しかし、ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞が、ＰＤＥ９+/+若しくはＰＤＥ９+/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞に匹敵しうる程度に効果を示す場合には、該効果は、ＰＤＥ９シグナル伝達を含まない経路によって仲介される。
【０１０４】
さらに、作用剤が主としてＰＤＥ９経路を介して恐らく効果を及ぼすと疑われる場合には、ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞はこの仮説を試験するためのネガティブ対照として有用である。該作用剤が実際にＰＤＥ９を介して作用する場合には、ＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞は、該作用剤の投与時に、ＰＤＥ９+/+非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞に見られる同じ効果を示さない。
【０１０５】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞を用いて、その発現がＰＤＥ９+/+若しくはＰＤＥ９+/-非ヒト哺乳動物若しくは動物細胞では、それらのそれぞれの野生型対照に比べて、差別的に調節される遺伝子を同定することもできる。当業者に知られた技術を用いて、このような遺伝子を本明細書に基づいて同定することができる。例えば、ＤＮＡアレイを用いて、その発現がＰＤＥ９+/-若しくはＰＤＥ９-/-マウスでは、ＰＤＥ９発現における欠損差別的に調節される遺伝子を同定することができる。ＤＮＡアレイは当業者に知られている(例えば、Aigner et al., Arthritis and Rheumatism 44: 2777-89, 2001; 米国特許No. 5,965,352; Schena et al., Science 270: 467−470, 1995; Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, 1996; DeRisi et al., Nature Genetics 14: 457−460, 1996; Shalon et al., Genome Res. 6: 639−645, 1996; and Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 10539−11286, 1995; 米国特許No. 5,474,796; U.S. Pat. No. 5,605,662; WO 95/25116; WO 95/35505; Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155, 1997を参照のこと)。
【０１０６】
化学的カップリング方法とインクジェットデバイスを用いて、基質表面上でアレイ要素を合成することができる。基質の表面に該要素を配置し、連結するために、熱的、ＵＶ、化学的又は機械的結合方法を利用して、ドット若しくはスロットブロットに類似したアレイを用いることもできる。典型的なアレイは、手で又は利用可能な方法及び装置を用いて作製することができ、任意の適当な数の要素を含有することができる。ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしないプローブを取り出し、スキャナーを用いて、蛍光のレベルとパターンを測定する。マイクロアレイ上の要素にハイブリダイズする各プローブの相補性度と相対存在量を、スキャンイメージの分析によって評価することができる。
【０１０７】
全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）又はそれらの断片は、マイクロアレイの要素を含むことができる。ハイブリダイゼーションに適した断片は、例えばLASERGENE ソフトウェア(DNASTAR)のような、当該技術分野で周知のソフトウェアを用いて選択することができる。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応する、又は本発明に関連するｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択される、全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ又はそれらの断片を、適当な基質（例えば、ガラス・スライド）上に配置する。例えば紫外線架橋と、その後の熱的及び化学的処置と、続く乾燥を用いて、ｃＤＮＡをスライドに固定する。基質上の要素へのハイブリダイゼーションのために、蛍光プローブを用意し、用いる。該基質を当該技術分野で周知の方法によって、例えば、マイクロアレイのイメージをスキャンし、分析することによって、分析する。
【０１０８】
さらに、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を用いて、ＰＤＥ９+/-又はＰＤＥ９-/-非ヒト哺乳動物における発現プロフイル又は翻訳後改変が、それらのそれぞれの野生型対照に比較して変化している、任意のタンパク質を同定することができる。本明細書に基いて、このようなタンパク質を同定に、当業者に知られた技術を用いることができる。例えば、プロテオームアッセイを用いて、ＰＤＥ９+/-又はＰＤＥ９-/-マウスにおける発現プロフイル又は翻訳後改変が、ＰＤＥ９発現の欠損を補償するように変化しているタンパク質を同定することができる。プロテオームアッセイは当業者に知られている（例えば、Conrads et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 290: 896-890, 2002; Dongre et al., Biopolymers 60: 206-211, 2001; Van Eyk, Curr Opin Mol Ther 3: 546-553, 2001; Cole et al., Electrophoresis 21: 1772-1781, 2000; Araki et al., Electrophoresis 21: 180-1889, 2000を参照のこと）。
【実施例】
【０１０９】
１．ＰＤＥ９ターゲッティングベクターの調製
図１に示したスキームに従って、ターゲッティングベクター構築体を設計した。この構築体は、ネズミＰＤＥ９ゲノム配列に相同な２アーム：０．９ｋｂ５’相同性アームと４．３ｋｂ３’相同性アーム、を含有した。これらのアームは、ＬａｃＺ−Ｎｅｏ構築体を間に挟んだ。ターゲッティング構築体を含有するＤＮＡをＥＳ  Ｒ１細胞中にエレクトロポレーションによって挿入した（Deng et al., Dev. Biol. 185: 42-54, 1997; Udy et al., Exp. Cell Res. 231: 296-301, 1997）。相同的組み換え時に、図２に示したＰＤＥ９  ｃＤＮＡコード配列の塩基対１４２〜１７５（塩基対１４２〜１７５は下線で示される）が、内因性遺伝子から欠失され、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットによって置換された。ネオマイシン耐性であるＥＳ細胞をサザンブロットによって分析して、ＰＤＥ９遺伝子の破壊を確認した。次に、これらの標的ＥＳ細胞を未分化胚芽細胞中に注入し、該未分化胚芽細胞を偽妊娠雌マウス中に移植することによって、該標的ＥＳ細胞をキメラマウスの産出に利用した(Capecchi et al., Trends Genet. 5: 70, 1989, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;及び Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987)。次に、キメラマウスをC57BL/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) マウスと交配して(bred)、Ｆ１  ＰＤＥ９+/- 異型接合体を作製して、該接合体を交配して、Ｆ２  ＰＤＥ９-/-同型接合性マウスを産出した(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)。該異型接合体及び同型接合体中のＰＤＥ９遺伝子の機能的破壊をＰＣＲとサザンブロット分析によって確認した。
【０１１０】
２．体重、体組成及び代謝産物に対するＰＤＥ９遺伝子破壊の効果
方法
既述したような、雄と雌のＰＤＥ９  ＫＯ(-/-)マウス及び野生型(+/+)同腹子対照を、試験の開始前少なくとも１週間環境に順化させ、水とＤ１１マウス固形飼料(chow)(Purina,Brentwood,MO)に自由にアクセスさせた。
【０１１１】
雄と雌のマウス（生後１７〜１９週間）をケージ当り２〜５匹で、４実験群に分けた。各性別の対照マウス１群は、Ｄ１１マウス固形飼料のまま、各性別の残りの群は、５８ｋｃａｌ％脂肪から構成される食餌(D12331 Rodent Diet, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)に６週間の試験期間、切り換えた。体重を０日目に測定し、毎週モニターした。脂肪蓄積の質量を０日目と、試験の終了時に、以下でさらに記載するように分析した。
【０１１２】
１日目に、血漿グルコースを眼窩後方の血液サンプルによって測定した。血液２５μｌを微小試験管(Denville Scientific, Inc., Metuchen, NJ)中の０．０２５％ヘパリン添加生理食塩水１００μｌに加えた。これらの試験管をBeckman Microfuge 12において最高のセッティングで２分間回転させた。以下でさらに記載する、血漿グルコースとトリグリセリド測定のために、血漿を回収した。この試験の過程の間に、体重と食物摂取量を評価し、以下でさらに記載するように、血漿グルコースとトリグリセリド測定のために、約８ａ．ｍ．に血液サンプルを採取した。
【０１１３】
試験の最後の日の朝に、血漿グルコースとトリグリセリド測定のために、眼窩後方の洞を介して血液サンプルを採取した。次に、マウスを殺して、ヘパリンリチウムを含むMicrotainer（登録商標）血漿分離管（Becton-Dickinson, Inc., Franklin Lakes, NJ）中に血液約１ｍｌを回収した。これらの管をBeckman Microfuge 12において最高のセッティングで５分間回転させた。血漿を１．５ｍｌEppendorf管中に回収し、液体窒素中で迅速凍結し(snap frozen)、インシュリン、フルクトサミン又はｃＧＭＰレベルに関して分析するまで、−８０℃で貯蔵した。
【０１１４】
血漿グルコース、トリグリセリド及びフルクトサミンを、Roche/Hitachi 912 Clinical Chemistry Analyzer (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN)を用いて測定した。血漿ｃＧＭＰをBioTrak（商標）酵素−イムノアッセイ系 (Amersham, Piscataway, NJ)を用いて測定した。血漿インシュリンをALPCO (Uppsala, Sweden)によって供給されるMercodia ELISA Insulin キットを用いて、同様な方法によって評価した。全てのアッセイは、各製造者のインストラクションに従って行なった。
【０１１５】
該試験の終了の５日間前に、脂肪蓄積質量の定量を行なった。脂肪蓄積質量を評価するために、市販のマイクロコンピューター断層撮影（ＣＴ）システム(MicroCAT（登録商標），ImTek Inc., Oak Ridge, TN)を高分解能ＣＣＤ／リン・スクリーン・デテクターと共に用いて、マウスの３６０°放射線透視画像を得た。該スキャナーは、５０μＭ未満の空間分解能を有する、３６ｍｍ／３６ｍｍのシリンダー直径／ロング・フィールド・ビューから成るものであった。Ｘ線源は、０．４ｍＡに設定したアノード電流によって、４０ＫｅＶにバイアスした。麻酔したマウスを放射線透過性マウス床上に解剖学的に正確な仰臥体位で、尾末端をマイクロＣＴに密接させ、口の先端を麻酔デリバリー管に適所で接触させて置いた。各マウスの腸骨稜のレベルにスキャン撮影面をセンターリングさせて、マウスの正確な位置決めを可能にするように、最初の放射線画像をマウス床の面に対して９０°で得た。正確な照準が確保されたならば、各マウスをスキャンした。各スキャンは、２５０μｓ／投射の露光時間で１９６回の個別投射から成り；総画像撮影時間は、１４５μＭ解像度で約１２分間であった。
【０１１６】
マウスのマイクロＣＴスキャンで得た１９６投射を操作して、マウスの２次元断面像を作製する、画像再構成を、MicroCAT（登録商標）Reconstruction、Visualization及びAnalysis Software (ImTek Inc., Oak Ridge, TN)を用いて行なった(Paulus et al., Neoplasia 2: 62-70, 2000)。個々の脂質蓄積質量を知るために、各マウスに関して、スキャン当り２セットの再構成画像を作製した。６再構成画像の最初のセットは、鼠径及び副睾丸の脂肪組織蓄積質量の分析のためのモンタージュを形成した。第２再構成セットは、椎骨間目標と脊椎中間目標の両方(both intervertebral and midvertebral landmarks)によって決定される、９枚のスライスから成り、このセットは、腹膜後及び腸間膜の脂肪蓄積組織蓄積質量を決定するために用いた。
【０１１７】
画像分析のために、再構成ビットマップ画像をＴＩＦＦ画像に転換した。続いて、該ＴＩＦＦ画像を分析して、Scion Image for Windows（登録商標）(Scion Corporation, Frederick MD)を用いて脂質蓄積質量を決定した。ペイントブラシツール(ピクセルサイズ#3)を用いて、個々の脂質蓄積を分離する境界線を引き、各脂肪領域の総ピクセル・カウントをScion Imageソフトウェアによって決定した。上下ピクセル強度閾値を選択した、この試験では、１１５〜１８７のルックアップテーブル（ＬＵＴ）が脂肪蓄積を測定するために最適であると判明した。
【０１１８】
各スライス間の平均ピクセル数を算出した（(slicen+slicen+1)/2）。各スライス間の平均ピクセル数に各スライスの平均ピクセル数を乗じることによって、個々の脂質蓄積を表す総ピクセル数を算出した。最後に、該ピクセルカウントを下記式：蓄積質量（ｍｇ）＝0.000915g/ul x 0.000757 μl/voxel x 1000mg/g ｘ ボクセルカウントによって蓄積組織質量に換算した。第１ファクターは、脂肪組織中の脂質の主要貯蔵形（即ち、トリグリセリド）の密度の代表であるグリセリルトリオレエートの比重について補正する。第２ファクターはピクセル当りの量であり、第３ファクターは得られた質量をｍｇ単位に換算する。
【０１１９】
結果
ＰＤＥ９破壊は、雄と雌両方のＫＯマウスに高脂肪食餌を取らせているときに、それらの野生型対応物に比べて、体重増加の減少及び体重減少を生じた（図３）。雌マウスは、身長の６％減少をも証明した。雄と雌のＫＯマウスは、体重減少と共に、種々の脂肪蓄積中の脂質量の減少をも証明した（図４）。雄ＫＯマウスでは、腹膜後及び腸間膜の脂肪蓄積において顕著な減少が見られた；雌ＫＯマウスでは、鼠径、生殖腺及び腹膜後の蓄積において顕著な減少が見られた。比較すると、標準固形飼料食餌を与えられた雌では、ＫＯマウスと野生型マウスの間に体重の差異は見られなかった（図５）、そして生殖腺脂肪蓄積においてのみ脂肪脂質量の減少傾向が顕著であった（図６）。
【０１２０】
高脂肪食餌後の血漿代謝産物に関して、雌ＫＯマウスは、ｃＧＭＰ上昇、グルコース低下及びインシュリン低下を実証した（表１）；雄ＫＯマウスは、ｃＧＭＰ上昇傾向とグルコース低下傾向を実証した（表１）。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
３．ob/obマウスにおける、体重、体組成及び食物摂取に対する薬理学的ＰＤＥ９阻害の影響
方法
Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から入手した、生後６〜１０週間の雌ob/obマウスを用いた。マウスをケージ当り５匹で収容し、水と、最初は、Ｄ１１マウス固形飼料に自由にアクセスさせた。１週間の順化期間後に、粉末食餌(Mouse Breeder/Auto-JL K20 mouse chow, PMI Feeds, Inc., St. Louis, MO)に３日間切り換え、ＰＤＥ９阻害剤投与期間の開始前に該食餌に順応させた。
【０１２３】
ＰＤＥ９阻害剤化合物（化合物Ａ）を、化合物／固形飼料混合物として外注磨砕した(custom ground)粉末マウス固形飼料(Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)に入れて投与した；化合物を該固形飼料と混合して、１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の指定投与量を摂取させた。化合物なしの対照群の他に、ダルグリタゾン（１ｍｇ／ｋｇ／日）摂取群をもポジティブ対照として含めた。
【０１２４】
ケージ当り５匹による１０群に、マウスをランダムに割り当てた。体重を０日目に、その後は毎週、測定した。１日目に、眼窩後血液サンプルを採取し、血漿グルコースを既述したように測定した。試験の最終日に、既述したような、グルコース、トリグリセリド、インシュリン及びｃＧＭＰ測定のために、血液サンプルを採取した。
【０１２５】
結果
下記結果は、上記と同じプロトコールを用いた、幾つかの別々の試験からの結果を表す。図７は、ＰＤＥ９阻害剤化合物Ａ  １００ｍｇ／ｋｇ／日を与えたob/obマウスにおける、化合物なし対照食餌又はダルグリタゾン処理食餌のいずれかを与えたマウスに比較した、体重増加の減少を示す。化合物Ａは、２日間及び４日間の処置後に、正常体重増加の減少（図８Ａ）とさらに食物摂取量の減少（図８Ｂ）の両方に関して用量依存性効果を誘発した。試験の後期ステージ（図９）において、１００ｍｇ／ｋｇ／日の介在用量(intermediate dose)で食物摂取量に影響が見られないならば、食物摂取量に対するＰＤＥ９効果は一過性であることもありうる。
【０１２６】
化合物Ａの１００ｍｇ／ｋｇ／日の介在用量は、グルコース、トリグリセリド及びフルクトサミンの減少をも生じた。典型的な結果は、図１０、図１１及び図１２にそれぞれ示す。
【０１２７】
両方の実施例は、ＰＤＥ９活性を低下させることが、体重及び／又は体脂肪を減少させるための効果的な方法であり、例えば太り過ぎ、肥満体であるか若しくは摂食障害に苦しむ動物患者を処置するために用いることができ、動物のフードストック種に用いて、脂肪の少ない肉を生産することができることを実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、ＰＤＥ９遺伝子を破壊するために用いられるターゲッティング構築体の概略図である。それぞれ、０．９ｋｂ及び４．３ｋｂ長さの、ＰＤＥ９ゲノム配列に相補的な５’及び３’−相同性アームが、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットを間に挟んでいる。各相同性アームのゲノム配列の一部を配列番号ＮＯ：１及び配列番号ＮＯ：２として示す。
【図２】図２は、ネズミＰＤＥ９のｃＤＮＡ配列を示す（配列番号ＮＯ：３）。ターゲッティング構築体による相同的組み換え時に、下線を施した配列、塩基対１４２〜１７５、が欠失し、ＬａｃＺ−Ｎｅｏと置換される。
【図３】図３は、６週間高脂肪食餌のコース中の、野生型（ＷＴ）と、ＰＤＥ９遺伝子破壊について同型接合性の遺伝子改変マウス（ＰＤＥ９ノックアウト（ＫＯ）マウス）とにおける体重変化を詳細に示す線グラフである。
【図４】図４Ａ（雄）及び図４Ｂ（雌）は、６週間高脂肪食餌後のＷＴ及びＰＤＥ９  ＫＯマウスにおける幾つかの脂肪蓄積の質量を示す棒グラフである。ＳＣ−皮下；ＴＢＷ−総体重。
【図５】図５は、６週間対照固形飼料食餌後の雌のＷＴマウスとＰＤＥ９  ＫＯマウスとの体重を比較する棒グラフである。
【図６】図６Ａ（基準）と図６Ｂ（６週間固形飼料食餌後）は、雌のＷＴ及びＰＤＥ９  ＫＯマウスにおける脂肪蓄積の質量を示す棒グラフである（Ｉｎｇ−鼠径部皮下；Ｇｏｎ−生殖腺；ＲＰ−腹膜後；Ｍｅｓ−腸間膜）。
【図７】図７は、対照群、化合物Ａ処置（１００ｍｇ／ｋｇ／日）群及びダルグリタゾン処置群の雌ob/obマウスにおける体重増加の時間的経過を詳しく示す線グラフである。
【図８】図８Ａは、雌ob/obマウスにおける２日目と４日目の、体重に対する化合物Ａ用量効果を示す棒グラフである。図８Ｂは、雌ob/obマウスにおける２日目と４日目の、食物消費に対する化合物Ａの用量効果を示す棒グラフである。
【図９】図９は、対照、化合物Ａ処置（１００ｍｇ／ｋｇ／日）及びダルグリタゾン処置雌ob/obマウスにおける食物消費の時間的経過を比較する棒グラフである。
【図１０】図１０は、対照、化合物Ａ処置（１００ｍｇ／ｋｇ／日）及びダルグリタゾン処置雌ob/obマウスにおける血漿グルコースを比較する線グラフである。
【図１１】図１１は、対照及び化合物Ａ処置（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）雌ob/obマウスにおける１、２及び４日目の血漿トリグリセリドを示す線グラフである。
【図１２】図１２は、対照、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）及びダルグリタゾン処置雌ob/obマウスにおける１６日目の血漿フルクサアミンを比較する棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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