(57)【要約】【課題】安全性および安定性が改善されかつ皮膚浸透力に優れたビタミンＣ誘導体を提供することにある。【解決手段】本発明は、ペプチドが結合したビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩、その製造方法およびそれを含む組成物を開示する。【選択図】図１
2007528356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表わされるビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
2007528356.tif 000031
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同じでも異なってもよく、−ＯＨまたは
【化２】
2007528356.tif 000032
であり、Ｒ１とＲ２が同時に−ＯＨではなく、
Ｘは−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）−であり、
【化３】
2007528356.tif 000033
はグリシン、リシン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキプロリンおよびトレオニンの中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、
Ｒはグリシン、リシン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキプロリンおよびトレオニンの中から選択されるアミノ酸残基の側鎖であり、
ｎは３〜１０の整数であり、
ｍは２〜５の整数である。）
【請求項２】
ｎが３〜５の整数であり、ｍが２の整数であることを特徴とする、請求項１に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
【化４】
2007528356.tif 000034
がグリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリンおよびリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンの中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
６−（スクシニル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン）アスコルビン酸、６−（スクニシル−グリシル−リシル−ヒスチジン）アスコルビン酸および６−（スクシニル−グリシル−ヒスチジン−リシル）アスコルビン酸の中から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
下記化学式２で表わされるビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【化５】
2007528356.tif 000035
（式中、Ｘは−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−であり、
【化６】
2007528356.tif 000036
はグリシン、リシン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキプロリンおよびトレオニンの中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、
Ｒはグリシン、リシン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキプロリンおよびトレオニンアミノの中から選択されるアミノ酸残基の側鎖であり、
ｎは３〜１０の整数であり、
ｐは２〜５の整数である。）
【請求項６】
ｎが３〜５の整数であり、ｐが３の整数であることを特徴とする、請求項５に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
【化７】
2007528356.tif 000037
がグリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリンおよびリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
化学式３の５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を４０〜６０℃で３〜５時間化学式４のハロゲン化ベンジルと反応させて２番および３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基を導入させる段階と、
化学式５のベンジル基が導入された５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を開環させた後、化学式６のジカルボン酸と反応させる段階と、
生成された化学式７の化合物を化学式８のペプチドとアミド結合させる段階と、
保護基を除去する段階とを含むことを特徴とする、請求項１による化学式１のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩を製造する方法。
【化８】
2007528356.tif 000038
【化９】
2007528356.tif 000039
【化１０】
2007528356.tif 000040
【化１１】
2007528356.tif 000041
[化学式６]
ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ
【化１２】
2007528356.tif 000042
【化１３】
2007528356.tif 000043
（式中、Ｂｎはベンジルであり、
Ｒ１’とＲ２’はそれぞれ同じでも異なってもよく、−ＯＨまたは−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＨであり、Ｒ１’とＲ２’が同時に−ＯＨではなく、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同じでも異なってもよく、−ＯＨまたは
【化１４】
2007528356.tif 000044
であり、Ｒ１とＲ２が同時に−ＯＨではなく、
Ｘは−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）−であり、
【化１５】
2007528356.tif 000045
はグリシン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニンの中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、
Ｒはグリシン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニンの中から選択されるアミノ酸残基の側鎖であり、
ｎは３〜１０の整数である。
ｍは２〜５の整数であり、
Ｙは塩素、臭素、フッ素またはヨウ素である。）
【請求項９】
ｎが３〜５の整数であり、ｍが２の整数であり、Ｙが塩素であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化学式３の５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を４０〜６０℃で１４〜１８時間化学式４のハロゲン化ベンジルと反応させて３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基を導入させる段階と、
化学式９の化合物の２番炭素位置のヒドロキシル基を化学式１０のハライドアルコールと反応させる段階と、
アルコール基が導入された５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸をアミノ酸残基のＣ末端とエステル結合させる段階と、
ペプチド延長反応させる段階と、
保護基を除去する段階とを含むことを特徴とする、請求項５による化学式２のビタミンＣ誘導体およびその薬学的に許容される塩を製造する方法。
【化１６】
2007528356.tif 000046
【化１７】
2007528356.tif 000047
【化１８】
2007528356.tif 000048
【化１９】
2007528356.tif 000049
[化学式１０]
Ｙ（ＣＨ２）ｐＯＨ
（式中、Ｂｎはベンジルであり、
Ｘは−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−であり、
【化２０】
2007528356.tif 000050
はグリシン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニンの中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、
Ｒはグリシン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニンの中から選択されるアミノ酸残基の側鎖であり、
ｎは３〜１０の整数である。
ｐは２〜５の整数であり、
Ｙは塩素、臭素、フッ素またはヨウ素である。）
【請求項１１】
ｎが３〜５の整数であり、ｐが３の整数であり、Ｙが塩素であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１または５に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩を含む、皮膚外用組成物。
【請求項１３】
前記組成物は化粧料用組成物であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ペプチドが結合したビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩、その製造方法およびそれを含む組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
皮膚は、保護機能、障壁機能、温度調節機能、排泄機能、呼吸機能などをする器官であって、表皮、真皮および皮下組織からなる。表皮は、最も薄い層であって、角質細胞とメラニン細胞との有機的な結合からなっている。真皮は、皮膚の約９５％を担当し、皮膚の保湿および保護を担当する層であって、皮膚弾力（皺）に重要な役割をする代表的な蛋白質であるコラーゲンとエラスチンが網の如く絡み合っており、血管、神経が存在し、アレルギー反応に関与する肥満細胞、およびＮａ−ＰＣＡやヒアルロン酸などの天然保湿因子も含有している。皮下組織は、表皮および真皮への栄養供給、体型決定、体温維持、外部的な衝撃吸収、および皮下組織下の細胞保護などの役割をする。
【０００３】
ところが、歳を取るにつれて、内因性および外因性原因によって皮膚機能が急激に低下する老化を感じるようになる。老化が進みながら、皮膚の構成成分である表皮、真皮および皮下組織の厚みが薄くなり、コラーゲンとエラスチンが細くかつ緩くなって弾力が低下し、皺などが生ずる。また、皮膚障壁の機能を担当している脂質障壁(Lipid barrier)の脂質の組成と含量が変わるにつれて皮膚の水分含量が低下し肌が乾いてしまうといった生理的変化を経験する。また、染み、雀斑、色素沈着およびその他様々な皮膚病変が誘発される。
【０００４】
このような皮膚老化による問題点を解決するために、皮膚改善効果を持つ各種有効成分とそれを含む組成物が研究されている。
【０００５】
皮膚老化を抑制させる効果のある成分としては、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチンといった抗酸化ビタミンなどが多く用いられている。この中でも、ビタミンＣは、紫外線（ＵＶ）カット効果、抗酸化効果、コラーゲン形成促進による皮膚皺改善効果、染み／雀斑／黒斑などの色素沈着の改善効果、免疫体系強化効果などを持つ。このようなビタミンＣの作用をまとめると、次のとおりである。
【０００６】
ビタミンＣは、紫外線、特にＵＶＡに対する遮断機能が強い(Darr, D. et al., 1996, Acta Derm. Venereol. (Strckh). 76: 264-268; Black, H. S. et al., 1975, J. Invest. Dermatol. 65: 412-414)。また、ビタミンＣは、ＵＶＢにより発生する皮膚損傷から保護する役割をするが、ＵＶＢ照射の前に、ビタミンＣを豚と人間のＵＶＢ照射皮膚部位につけると、赤み（紅斑）および日焼け現象が防止される(Darr, D. et al., 1992, Brit. J. Dermatil. 127: 247-253; Murry, J. et al., 1991, J. Invest. Dermatol. 96: 587)。
【０００７】
皮膚、血液およびその他の組織における、化学的汚染、吸煙、特に紫外線（ＵＶ）によって誘発されるＲＯＳ(Reactive Oxygen Species)を中和させる強力な生体抗酸化剤としてのビタミンＣの作用は、ビタミンＣが２つの電子を受け入れて脱水素−Ｌ−アスコルビン酸(Dehydro-L-ascorbic acid)の形で容易に酸化できる構造を持つためである。ビタミンＣは、皮膚の非酵素的抗酸化剤防御システムの重要な要素であって、ビタミンＣが高濃度で存在するとき、一重項酸素(single oxygen)、スーパーオキシドアニオン(superoxide anion)、ヒドロキシラジカル(hydroxyl radical)といったＲＯＳなどが蛋白質、核酸、細胞膜脂質などの生体成分を酸化または変性させる前に、これらを中和させる役割をする(Buettner, G. R. et al. 1996. Cadenas, E., Packer, L., eds. Handbook of antioxidants. pp. 91-115)。
【０００８】
角質層に経皮的に供給されることにより皮膚光沢、皮膚色および弾力の改善、および皺の減少などを示すビタミンＣの効果（米国特許第４，９８３，３８２号）は、ビタミンＣによってコラーゲンの合成が促進されるためである。コラーゲンポリペプチドの１０％程度を占めるヒドロキシプロリンは、プロリンヒドロキシラーゼ(praline hydroxylase)によって生合成されるが、この酵素の補因子(cofactor)としてビタミンＣが作用する(Tomita, Y. et al., 1980, J. Invest. Dermatol. 75(5): 379-382)。すなわち、ビタミンＣは、プロリンヒドロキシラーゼの活性を促進してヒドロキシルプロリンの合成を促進し、これにより三重螺旋構造のコラーゲンの生合成を測定して皮膚皺形成抑制などの皮膚改善効果を持つのである。
【０００９】
ビタミンＣの美白効果は、ビタミンＣがメラニンの形成に重要なチロシナーゼ(tyrosinase)の活性とメラニンの形成を抑えるからである(Tomita, Y. et al., 1980, J. Invset. Dermatol. 75(5); 379-382)。
【００１０】
上述したように、ビタミンＣは免疫体系を強化させる。具体的には、ビタミンＣは、細胞膜からのヒスタミンの放出を抑えることにより、敏感性皮膚におけるアレルギー反応を抑制し、抗原との接触の際に紫外線による免疫抑制と耐性からマウスを保護する(Nakamura, T. et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 109: 20-24)。また、白血球の食菌作用を助け、ウィルス感染の間に白血球の移動を促進させて感染を抑制し、ウィルス増殖抑制物質であるインターフェロンの生合成を増加させる作用をして、様々な感染性疾患に対する生体抵抗性を上昇させる役割もする。その他、ビタミンＣは生体内の葉酸代謝およびアミノ酸代謝過程にも関与するなど様々な機能を行う。
【００１１】
上述した様々な役割を担当するビタミンＣは、Ｃ６Ｈ８Ｏ６の化学式を有する水溶性の物質である。ビタミンＣは、分子の２、３、５、６番炭素に位置する水酸基のため、親水性(hydrophilicity)を持つ。水のような中性のｐＨではこれらの水酸基、特に２番と３番炭素における水酸基が陰の電荷を持つが、これにより水溶液に速くかつ完全に溶けるが、水溶液ではなく皮膚のような有機的な環境では溶解度の制限がある。また、ビタミンＣは、外用剤に公式的に使用される有機溶媒、例えばグリセリン、プロピレングリコール、様々な脂肪などによく溶解されないため、ビタミンＣを皮膚に運搬するのに限界を持つ。すなわち、ビタミンＣがイオン化されていないとき、皮膚障壁を容易に通過して吸収されるが、非イオン状態を保つためにはｐＨが４．２以下でなければならないという制限点がある。
【００１２】
ビタミンＣの皮膚蓄積量は、経口投与より外用剤として使用したとき、２０倍〜４０倍程度高いものと知られている。ＵＶカット効果、抗酸化効果、コラーゲン形成促進による皮膚皺改善効果、染み／雀斑／黒斑などの色素沈着の改善効果、面積体系強化などを図るための目的で使用する皮膚外用剤の場合には、効能物質が皮膚の角質層を通過して表皮の細胞まで到達しなければ作用しないため、効能物質の経皮吸収率が高くなければならない。一般に、ある物質の皮膚浸透率はその物質の親油性(lipophilicity)と関係がある。皮膚の親油性と類似の物質であれば皮膚への分配係数が大きくなって経皮吸収が容易になると知られているが、ビタミンＣの場合は、親水性が高くて皮膚への分配が低いため、経皮吸収が難しい。
【００１３】
上述したようにビタミンＣは様々な効果を示すが、安定性および経皮吸収性が低いため、これを改善するための研究が盛んに行われてきた。
【００１４】
後述するように、ビタミンＣ誘導体は３つの類型に区分される。その一つの類型は、リン酸化アスコルビン酸またはリン酸化アスコルビン酸の金属塩を含む。アルコルビン酸の２番炭素と３番炭素のヒドロキシル基をリン酸化基とエステル結合によって連結してそれぞれアスコルビル−２−ホスフェートまたはアスコルビル−３−ホスフェート(ascorbyl-3-phosphate)を形成したが、この種の誘導体は、他の誘導体に比較して、人体が使用可能な形態であるＬ−アスコルビン酸への転換は容易になされるが、陰の電荷を持つため、皮膚吸収が難しいという欠点がある。
【００１５】
ビタミンＣ誘導体の他の類型は、脂肪酸が結合した形態のアスコルビン酸を含む。例えば、米国特許第５４０９６９３号は、アスコルビン酸の親油性脂肪酸エステル(fat soluble fatty acid ester)形態、例えばパルミチン酸アスコルビル、ラウリン酸アスコルビル、ミリスチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルなどのビタミンＣ誘導体を開示している。この中でも、アルコルビル−６−パルミテートが最も広く使用される。ところが、アスコルビル−６−パルミテートは、皮膚に吸収され易いが、Ｌ−アスコルビン酸への転換が難しいという欠点がある。アスコルビル−６−パルミテートは、マウスの肌を光酸化から保護するのに失敗したという結果が発表された(Bissett, D. et al., 1990, Photodermatol Photoimmunol Photomed 7: 56-62)。また、１０ｗｔ％のアスコルビル−６−パルミテートを含んだ血清を処理したとき、皮膚からアスコルビン酸の顕著な増加が観察されなかったという結果も発表された(Pinnell, S. R. et al., 2001. Dermatologic Surgery. 27(2): 137-142)。
【００１６】
第３の類型は、アスコルビン酸が単糖類に誘導体化された形態、例えばグリコシル化、マンノシル化、フルクトシル化、フコシル化、ガラクトシル化、Ｎ−アセチルグルコースアミン化、Ｎ−アセチルムラミン化された誘導体を含む。ところが、生体内の生理活性に対する具体的かつ正確な究明は未だ行われていない実情である。
【００１７】
コラーゲンは、皮膚、血管、内臓、骨などから非常に多く発見される。皮膚を構成する真皮の７０％はコラーゲンから構成されており、筋肉を取り囲んでいる筋膜もコラーゲンから構成されている。生体蛋白質の総重量の３０％を占めるコラーゲンは、皮膚の機械的堅固性、結合組織の抵抗力、組織の結合力、細胞接着の保持、有機体の成長、または傷治癒時の細胞分割と分化を誘導する機能をする。コラーゲンは、線維芽細胞で生合成されるが、自然老化および光老化によって量が減少し、２０歳から８０歳に達する間に６５％の減少が起こると知られている(Shuster S., 1975, British Journal of Dermatology, 93(6): 639-643)。生体内コラーゲンの合成が活発になると、真皮基質成分が増加して傷治癒、弾力増加、皺改善などの効果が期待できるという事実が確認されることにより、化粧品、食品、医薬品などに使用されている。このようなコラーゲンを形成する最小活性単位である１０個以下のオリゴーペプチドは、メッセンジャー、刺激剤、神経伝達剤としての役割と成長調節、授乳、免疫、消化、血圧、治癒などの生理代謝作用とも関連がある。特に、皮膚再生効果を示すことが明らかになったペプチドは、フランス特許第２，６６８，２６５号、米国特許４，６６５，０５４号、国際特許公開第ＷＯ０９１／３４８８号および第ＷＯ９１／７４３１号などに公知になっている。ところが、このようなペプチドの場合、沈澱物が形成されて製品の安定度が大幅低下するという欠点がある。
【００１８】
〔発明の要約〕
前記従来のビタミンＣ誘導体の問題点を克服するために、本発明の目的は、ビタミンＣをコラーゲンペプチドと結び付けることにより、安全性および安定性が改善されかつ皮膚浸透力に優れたビタミンＣ誘導体を提供することにある。
【００１９】
〔図面の簡単な説明〕
この発明の前記及び他の目的、特徴及びその他の利点は、添付図面を参照する次の説明によって明確に理解されるであろう。
【００２０】
図１は本発明の化合物、ビタミンＣおよびアルブチンを用いてメラニン細胞Ｂ１６によるメラニン生産量を検定したグラフである。
【００２１】
図２は本発明の化合物およびビタミンＣを用いてエラスターゼ活性を検定したグラフである。
【００２２】
図３は本発明の化合物およびビタミンＣを用いてコラーゲン生合成能を検定したグラフである。
【００２３】
図４は本発明の化合物およびビタミンＣを用いてラジカル除去能を検定したグラフである。
【００２４】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態において、本発明は、下記化学式１で表わされるビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２５】
【化１】
2007528356.tif 000003
【００２６】
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同じでも異なってもよく、−ＯＨまたは
【化２】
2007528356.tif 000004
であり、Ｒ１とＲ２が同時に−ＯＨではなく、Ｘは−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）−であり、
【化３】
2007528356.tif 000005
は天然または非天然アミノ酸の中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、Ｒは天然または非天然アミノ酸残基残基の中から選択されるアミノ酸残基の側鎖であり、ｎは３〜１０の整数であり、ｍは２〜５の整数である。
【００２７】
具体的に、化学式１の化合物は、下記化学式１ａ、１ｂおよび１ｃを含む。
【００２８】
【化４】
2007528356.tif 000006
【００２９】
【化５】
2007528356.tif 000007
【００３０】
【化６】
2007528356.tif 000008
【００３１】
好適な様態において、
【化７】
2007528356.tif 000009
は、グリシン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニンの中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、Ｒは前記アミノ酸残基の側鎖であり、ｎは３〜７、より好ましくは３〜５の整数であって、好ましくはトリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチドであり、特に好ましくはグリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリンまたはリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンである。また、ｍは２〜４、より好ましくは２または３の整数、特に好ましくは２の整数であり、Ｘはスクシニル基である。
【００３２】
他の様態において、本発明は、化学式２で表わされるビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００３３】
【化８】
2007528356.tif 000010
【００３４】
式中、Ｘは−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−であり、
【化９】
2007528356.tif 000011
は天然または非天然アミノ酸の中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、Ｒは天然または非天然アミノ酸残基の中から選択されるアミノ酸残基の側鎖であり、ｎは３〜１０の整数であり、ｐは２〜５の整数である。
【００３５】
好適な様態において、
【化１０】
2007528356.tif 000012
は、グリシン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニンの中から選択される同一または異なるアミノ酸残基がアミド結合したペプチドであり、Ｒは前記アミノ酸残基の側鎖であり、ｎは３〜７、より好ましくは３〜５の整数であって、好ましくはトリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチドであり、特に好ましくはグリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリン、またはリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンである。また、ｐは２〜４、より好ましくは３または４、特に好ましくは３の整数であり、Ｘはプロパノールである。
【００３６】
好適な様態において、本発明の化合物は、６−（スクシニル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン）アスコルビン酸、５−（スクシニル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン）アスコルビン酸、５，６−ジ（スクシニル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン）アスコルビン酸、６−（スクシニル−グリシル−リシル−ヒスチジン）アスコルビン酸、５−（スクシニル−グリシル−リシル−ヒスチジン）アスコルビン酸、５，６−ジ（スクシニル−グリシル−リシル−ヒスチジン）アスコルビン酸、６−（スクシニル−グリシル−ヒスチジン−リジン）アスコルビン酸、５−（スクシニル−グリシル−ヒスチジン−リジン）アスコルビン酸、５，６−ジ（スクシニル−グリシル−ヒスチジン−リジン）アスコルビン酸、６−（スクシニル−グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリン）アスコルビン酸、５−（スクシニル−グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリン）アスコルビン酸、５，６−ジ（スクシニル−グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリン）アスコルビン酸、２−（プロピル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン）アスコルビン酸、２−（プロピル−グリシル−リシル−ヒスチジン）アスコルビン酸、２−（プロピル−グリシル−ヒスチジン−リジン）アスコルビン酸、２−（プロピル−グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリン）アスコルビン酸、およびこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選択される。
【００３７】
最も好適な様態において、本発明の化合物は、６−（スクシニル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン）アスコルビン酸、６−（スクニシル−グリシル−リシル−ヒスチジン）アスコルビン酸、６−（スクシニル−グリシル−ヒスチジン−リシル）アスコルビン酸、およびこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選択される。
【００３８】
本願で使用された用語「天然アミノ酸」とは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸よりなる群から選択されたα−アミノ酸を意味する。また、「非天然アミノ酸」は、核酸コドンによって暗号化されないアミノ酸であって、その例には前記の天然α−アミノ酸のＤ異性体；アミノ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノイソ酪酸（ｂＡｉｂ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、β−Ａｌａ、２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３−アミノアジピン酸（ｂＡａｄ）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（Ｇａｂａ）、６−アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、α−アミノピメリン酸、トリメチルシリル−Ａｌａ（ＴＭＳＡ）、アロ−イソロイシン（ａｌｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、３級−Ｌｅｕ、シトルリン（Ｃｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，２’−ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α−またはβ−Ｎａｌ、シクロヘキシル−Ａｌａ（Ｃｈａ）、ヒドロキシプロリン、サルコシン（Ｓａｒ）など；環状アミノ酸；Ｎα−アルキル化アミノ酸、例えばＮα−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）、Ｎα−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）およびＮα−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；およびα−炭素が２つの側鎖置換体を持つアミノ酸が含まれる。
【００３９】
本願で使用された用語「ペプチド」とは、アミド結合（またはペプチド結合）で連結された３〜１０個のアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。ペプチドは、生体内の蛋白質を抽出して蛋白質分解酵素を処理して低分子量化させるか、あるいは遺伝子組み換えと蛋白質発現システムを利用することもでき、好ましくはペプチド合成器などを用いて試験管内で合成する方法などで製造される。目的によっては、ペプチドは特定の原子または原子団がヒドロキシル基などで置換された誘導体である。ペプチドにおいて、ＣＯＯＨをＣ−末端といい、ＮＨ２をＮ−末端という。
【００４０】
本願において、ペプチドは特にコラーゲンペプチドを含み、「コラーゲンペプチド」は、コラーゲン蛋白質の断片であって、コラーゲンの合成を促進し或いはコラーゲン蛋白質の構成要素として使用できる。例えば、本発明の具体例で使用されたトリないしペンタペプチドは、真皮の内部に多量存在するコラーゲンと、グリコスアミノグリカンの合成を促進させて水分保有効率を高め、真皮の弾力を増進させることにより、保湿効果と皺改善効果を与える機能を持っている。特に、ペンタペプチドであるリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン(Lysyl-Threonyl-Threonyl-Lysyl-Serine)は、皮膚結合組織、皺形成および保湿と関連して重要なコラーゲンタイプＩのカルボキシル基の末端断片(fragment)であって、コラーゲンを生合成する細胞である線維芽細胞の細胞培養においてコラーゲンタイプＩおよびIII、細胞と細胞間の接着に関連して細胞間の情報伝達が円滑に行われるように助けるフィブロネクチン(fibronectin)、および成長因子β−ＴＧＦの合成を促進し(Kou Katayama et al., 1991, Biochemistry 30: 7097-7104)、コラーゲン遺伝子のプロモータに結合してその転写を促進させるものと報告された(Kou Katayama et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 268(14): 9941-9944)。
【００４１】
韓国特許出願第１０−２００１−００６０２４４号は、ＨＩＶ蛋白質の一種であるＴａｔペプチドが結合したビタミンＣ誘導体を開示している。前記特許において、Ｔａｔペプチドは、ビタミンＣの２番炭素位置のヒドロキシル基または３番炭素位置のヒドロキシル基に直接（リンカーの連結なしに）エステル結合し、炭素数６以上の反復的なアルコール、例えば−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−リンカーを介してエーテル結合している。これは、コラーゲンペプチドが炭素数５以下のアルコール−（ＣＨ２）２−５−Ｏ−リンカーを介してエーテル結合し、リンカーとペプチドとがエステル結合した本発明のビタミンＣ誘導体とは異なる構造を持つ化合物である。エステル結合で連結されたビタミンＣ誘導体の場合は、エーテル結合で連結されたビタミンＣ誘導体の場合と比較するとき、生体内でビタミンＣからコラーゲンペプチドを分離することが容易である。
【００４２】
本願で使用された用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容される無機および有機酸および塩基から誘導されたものを含む。適宜な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、琥珀酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、ベンゾ酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを含むことができる。適宜な塩基から誘導された塩は、ナトリウムなどのアルカリ金属と、マグネシウム、アンモニウムなどのアルカリ土金属を含むことができる。
【００４３】
別の様態において、本発明は、ヒドロキシル基の保護のためにビタミンＣの２、３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基を導入し、ビタミンＣの５番、６番または５番と６番炭素位置のヒドロキシル基と炭素数２〜５のジカルボン酸をエステル結合させた後、ペプチドとアミド結合させることを特徴とする、化学式１のビタミンＣ誘導体又はその薬学的に許容される塩の製造方法に関する。
【００４４】
好適な様態において、本発明は、化学式３の５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を化学式４のハロゲン化ベンジルと反応させて２番および３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基を導入する段階と、化学式５のベンジル基が導入された５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を開環させた後、化学式６のジカルボン酸と反応させる段階と、化学式７の化合物を化学式８のペプチドとアミド結合させる段階と、保護基を除去する段階とを含むことを特徴とする、化学式１のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩を製造する方法を提供する。
【００４５】
【化１１】
2007528356.tif 000013
【００４６】
【化１２】
2007528356.tif 000014
【００４７】
【化１３】
2007528356.tif 000015
【００４８】
[化学式６]
ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ
【００４９】
【化１４】
2007528356.tif 000016
【００５０】
【化１５】
2007528356.tif 000017
【００５１】
式中、ｍは２〜５の整数であり、Ｂｎはベンジルであり、Ｙは塩素、臭素、フッ素またはヨウ素であり、Ｒ１’とＲ２’はそれぞれ同じでも異なってもよく、−ＯＨまたは−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＨであり、Ｒ１’とＲ２’が同時に−ＯＨではなく、Ｒは保護されておりあるいは保護されていない天然または非天然アミノ酸残基の側鎖であり、ｎは３〜１０の整数である。
【００５２】
より好適な様態において、化学式３の５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸は、化学式４のハロゲン化ベンジル、好ましくは塩化ベンジルと４０〜６０℃、好ましくは５０℃の温度で３〜５時間、好ましくは４時間反応させる。具体的に、アスコルビン酸の２番および３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基が導入された化学式５の生成物に酸、好ましくはトリフルオロ酢酸を添加して３〜５時間、好ましくは４時間反応させて５，６−イソプロピリジエン環を開環させ、化学式６のジカルボン酸、好ましくは琥珀酸を添加して１５〜１７時間、好ましくは１６時間室温でアスコルビン酸とエステル結合させて化学式７の化合物を合成し、樹脂上で典型的な固相合成法によって保護されたペプチドＮ末端のＮＨ２とアミド結合させた後、保護基を除去する。
【００５３】
前記反応は、無水条件の下、例えば無水有機溶媒を用いて行う。無水有機溶媒は、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタンなど、好ましくはジメチルホルムアミドを含む。前記反応の縮合剤は、ＤＣＣ(N,N¢-dicycllohexylcarbodiimide)、ＨＯＢＴ(N-hydroxybenzotriazole)、ＰｙＢＯＰ(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate)、ＨＢＴＵ(2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)などを含む。
【００５４】
別の様態において、本発明は、ヒドロキシル基の保護のためにビタミンＣの３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基を導入し、２番位置のヒドロキシル基と炭素数２〜５のアルコールをエーテル結合させた後、ペプチドとエステル反応させることを特徴とする化学式２のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩の製造方法に関する。
【００５５】
好適な様態において、本発明は、化学式３の５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を化学式４のハロゲン化ベンジルと反応させて３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基を導入させる段階と、化学式９の化合物の２番炭素位置のヒドロキシル基を化学式１０のハライドアルコールと反応させる段階と、アルコール基が導入された５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸をアミノ酸残基のＣ末端とエステル結合させる段階と、ペプチド延長反応させる段階と、保護基を除去する段階とを含むことを特徴とする、化学式２のビタミンＣの誘導体またはその薬学的に許容される塩を製造する方法を提供する。
【００５６】
【化１６】
2007528356.tif 000018
【００５７】
【化１７】
2007528356.tif 000019
【００５８】
【化１８】
2007528356.tif 000020
【００５９】
[化学式１０]
Ｙ（ＣＨ２）ｐＯＨ
式中、ｐは２〜５の整数であり、Ｂｎはベンジルであり、Ｙは塩素、臭素、フッ素またはヨウ素である。
【００６０】
より好適な様態において、化学式３の５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸は、化学式４のハロゲン化ベンジル、好ましくは塩化ベンジルと４０〜６０℃、好ましくは５０℃の温度で１４〜１８時間、好ましくは１６時間反応させる。３番炭素位置のヒドロキシル基にベンジル基が導入された化学式９の化合物を化学式１０のハライドアルコール、好ましくはブロモプロパノールと４０〜６０℃、好ましくは５０℃で３〜５時間、好ましくは４時間反応させてエーテル結合させた後、アルコール基の導入された５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸を保護されたアミノ酸残基のＣ末端とエステル結合させ、次いでペプチド延長反応させた後、保護基を除去する。
【００６１】
前記反応は、無水条件の下、例えば無水有機溶媒を用いて行う。無水有機溶媒は、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタンなどを含む。また、前記反応の縮合剤は、ＤＣＣ(N,N¢-dicyclohexylcarbodiimide)、ＨＯＢＴ(N-hydroxybenzotriazole)、ＰｙＢＯＰ(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorphosphate)、ＨＢＴＵ(2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)などを含む。
【００６２】
本発明で使用できる縮合剤、触媒および溶媒は、反応に悪影響を及ぼさない範囲内で、当業界に通常公知されているいずれのものでも使用できる。
【００６３】
前記のような方法で製造された本発明の化学式１および２のビタミンＣ誘導体は、通常の分離、精製方法、例えば再結晶またはカラムクロマトグラフィ法を用いて精製することができる。
【００６４】
化学式１の化合物を製造するための前述した本発明の製造方法において、ヒドロキシル基がベンジル基で保護されたアスコルビン酸と結合するペプチドは、固相合成法で製造できる。例えば、それぞれのアスコルビン酸のヒドロキシル基を保護した後、保護されていないヒドロキシル基に選択的にスクシニル基を導入し、樹脂上で典型的な固相合成法によって合成されたペプチドのＮ末端とスクシニル基の導入されたアスコルビン酸とを反応させた後、アスコルビン酸とペプチドの保護基を除去する。
【００６５】
化学式２の化合物を製造するための前述した本発明の製造方法において、ヒドロキシル基がベンジル基で保護されたアスコルビン酸と結合するアミノ酸残基の延長反応は、固相合成法で行われる。例えば、アスコルビン酸のヒドロキシル基を保護した後、保護されていないヒドロキシル基にプロパノール基を導入し、溶液相でアミノ酸残基のＣ末端と結合させた後、樹脂上で典型的な固相合成法によってペプチドを延長反応させ、その後アスコルビン酸とペプチドの保護基を除去する。
【００６６】
本発明の化学式１および２の化合物を固相または溶液相合成法を用いて製造する方法を図式化して下記反応式１および２に示した。反応式１は特に化学式１ｂの化合物の製造過程を示し、反応式２は化学式２の化合物の製造過程を示す。
【００６７】
【化１９】
2007528356.tif 000021
ａ．Ｂｎｃｌ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、５０℃、４ｈｒ
ｂ．ＴＦＡ、ＤＣＭ、室温、４ｈｒ
ｃ．琥珀酸無水物、ＴＥＡ、ＤＭＦ、室温、１６ｈｒ
ｄ．固相合成
ｅ．ＴＦＡ／フェノール／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（８５／５／５／３／２）ｖ／ｖ、室温、３ｈｒ
ｆ．１０％Ｐｄ／Ｃ、ＭｅＯＨ、Ｈ２、室温、１ｈｒ
（ＢｎＣｌ：塩化ベンジル；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸）
ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＭｅＯＨ：メタノール
【００６８】
【化２０】
2007528356.tif 000022
ａ．ＢｎＣｌ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ，５０℃、１６ｈｒ
ｂ．３−ブロモプロパノール、ＣｓＣＯ３、ＤＭＦ、５０℃、４ｈｒ
ｃ．Ｆｍｏｃ−アミノ酸、ＤＣＣ、ＨＯＢＴ、ＤＭＦ、室温
ｄ、ｅ．固相合成
ｆ．ＴＦＡ／フェノール／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（８５／５／５／３／２）ｖ／ｖ、室温、３ｈｒ
ｇ．１０％Ｐｄ／Ｃ、ＭｅＯＨ、Ｈ２、室温、１ｈｒ
（ＢｎＣｌ：塩化ベンジル；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；Ｆｍｏｃ：フルオレニルメチルカルボニル；ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＨＯＢＴ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＭｅＯＨ：メタノール）
【００６９】
前記製造された本発明のビタミンＣ誘導体は、優れた抗酸化効果、皮膚皺の改善効果、美白効果を示すうえ、皮膚刺激、感作性および光毒性などを示さない。
【００７０】
したがって、別の様態において、本発明は、化学式１および２の化合物の中から選択された１種以上を含む皮膚外用のための組成物に関する。好適な様態において、本発明の組成物は化粧料、特に美白、皮膚皺改善などに有用である。
【００７１】
本願で使用された用語「皮膚外用」とは、皮膚の保湿効果、皺抑制効果、皮膚粗さ改善効果、経皮吸収促進効果などの様々な効果を示し、皮膚状態を改善しあるいは皮膚状態の悪化を抑制するために使用するということを意味する。本発明の皮膚外用剤は、化粧料、医薬品、医薬部外品などに使用できる。その中でも、化粧料の形で使用することが好ましく、このような化粧料の形態は特に限定されない。
【００７２】
本発明に係る組成物は、化学式１および２で表わされる化合物の中から選択された１種以上の物質を０．００１〜５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０１〜３％（ｗ／ｗ）含有する。これは、０．００１％未満の濃度では実質的な美白効果を期待し難いためである。
【００７３】
本発明の皮膚美白用組成物を製造する場合、溶媒としてエタノール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセレス−２６、メチルグルセス−２０、ミリスチン酸イソセチル、オクタン酸イソセチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オクチルドデカノール、イソステアリン酸イソステアリル、オクタン酸セチルおよびネオペンチルグリコールジカプレートの中から選択された１種以上を使用する。このような溶媒を用いて本発明の組成物を製造する場合、化合物の種類および溶媒と化合物との比によって溶媒に対する化合物の溶解度が少しずつ異なるが、本発明の属する技術分野の当業者であれば、製品の特性に応じて溶媒の種類および使用量を適切に選択して適用することができる。
【００７４】
本発明に係る組成物は、皮膚外用のための軟膏、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、パックなどの化粧料の形で製造できる。ここで、皮膚外用軟膏は、化学式１または２の化合物の有効成分以外にワセリン５０．０〜９７．０重量％およびポリオキシエチレンオレイル−エーテルホスフェート０．１〜５．０重量％を含有するように製造され、柔軟化粧水はプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類１．０〜１０．０重量％およびポリエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤０．０５〜２．０重量％を含有するように製造される。栄養化粧水および栄養クリームは、化学式１または２の有効成分以外にスクアレン、ワセリン、オクチルドデカノールなどのオイル類５．０〜２０．０重量％、およびエタノール、ステアリルアルコール、蜜蝋などのワックス成分３．０〜１５．０重量％を含有し、エッセンスはグリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール類５．０〜３０．０重量％を含有する。マッサージクリームは化学式１または２の有効成分以外に流動パラフィン、ワセリン、イソノニルイソノナノエートなどのオイルを３０．０〜７０．０重量％含有して製造され、パックは、ポリビニルアルコールを５．０〜２０．０重量％含有するピールオフパック、または一般乳化型化粧料にカオリン、タルク、酸化亜鉛、二酸化チタンなどの顔料が５．０〜３０．０重量％含有されたウォッシュオフパックの形で製造される。
【００７５】
また、本発明の前記化学式１または２で表わされる化合物を含有する化粧料組成物は、一般皮膚化粧料に配合される通常の成分、例えば油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを必要な分だけ適用配合することが可能である
以下、本発明について下記の実施例を挙げてより詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００７６】
〔実施例１：２，３−Ｏ−ジベンジル−６−Ｏ−スクシニル−アスコルビン酸の合成〕
【００７７】
【化２１】
2007528356.tif 000023
【００７８】
（ａ）５，６−イソプロピリジエン−Ｌ−アスコルビン酸（５ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解させた後、固体炭酸水素セシウム（１５ｇ、４６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に塩化ベンジル（７．３ｇ、５８ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃で４時間攪拌した。この反応物から減圧の下でジメチルホルムアミドを除去した後、濃縮された溶液をジクロロメタンで希釈し、生成された固体を濾過した後、濾液を減圧の下で濃縮した。
【００７９】
（ｂ）前記生成された化合物をジクロロメタンに溶かした後、２０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを添加した後、４時間攪拌させた。この反応物から減圧の下で溶媒とＴＦＡを除去した後、再結晶化して薄黄色の半固体の形で得た。
【００８０】
（ｃ）前記得られた化合物をジメチルホルムアミドに溶解させ、琥珀酸（１．２ｅｑ．）を加えた後、トリエチルアミン（１．２ｅｑ．）を徐々に滴加した。１６時間室温で攪拌した後、減圧の下でジメチルホルムアミドを除去し、その後濃縮された溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィを用いて薄黄色の半固体状の化合物（３．９ｇ）を得た。
【００８１】
前記２，３−Ｏ−ジベンジル−６−Ｏ−スクシニル−アスコルビン酸の1HNMR (CDCl3)：2.67 (s, 4H, CH2CH2COOH) 4.06 (t, 1H, C-5-H), 4.32 (d, 2H, C-6-H2), 4.67 (d, 1H, C-4-H), 5.17 (m, 4H, O-CH2-Ph), 7.36 (m, 10H, Ar-H)
【００８２】
〔実施例２：２−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−３−Ｏ−ベンジル−５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸の合成〕
【００８３】
【化２２】
2007528356.tif 000024
【００８４】
（ａ）５，６−イソプロピリジエン−Ｌ−アスコルビン酸（５ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解させた後、固体炭酸水素セシウム（３．８ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃で１６時間攪拌した。この反応物から減圧の下でジメチルホルムアミドを除去した後、濃縮された溶液をジクロロメタンで希釈し、精製された固体を濾過した後、濾液を減圧の下で濃縮した。
【００８５】
（ｂ）前記生成された化合物をジメチルホルムアミドに溶かした後、３−ブロモプロパノール１当量と固体炭酸水素セシウム１当量を添加し、その後５０℃で４時間攪拌した。この反応物から減圧の下でジメチルホルムアミドを除去した後、濃縮された溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィを用いて白色の固体化合物（２．９ｇ）を得た。
【００８６】
前記２−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−３−Ｏ−ベンジル−５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸の1HNMR (CDCl3)：1.35 (s, 3H, C-CH3), 1.39 (s, 3H, C-CH3), 1.85 (m, 2H, O-CH2CH2CH2-OH), 3.58 (t, 2H, O-CH2CH2CH2-OH), 3.9(t, 2H, O-CH2CH2CH2-OH), 3.98-4.24 (m, 3H, C-5-H, C-6-H2), 4.51 (d, 1H, C-4-H), 5.17 (s, 2H, O-CH2-Ph), 7.37 (m, 5H, Ar-H)
【００８７】
〔実施例３：ペプチドの合成〕
本発明に使用される様々な種類のペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ(9-fluorenylmethoxycarbonyl)をＮα−アミノ酸の保護基として使用する固相法によって合成し、ＨＯＢｔ−ＤＣＣ(N-hydroxybenzotriazole-dicyclohexylcarbodiimide)方法によってペプチドを延長した(Wang C. Chan, Perter D. white, “Fmoc solid phase peptide synthesis" Oxford)。グリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリン、リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンペプチドを合成した。
【００８８】
〔実施例４：ビタミンＣ誘導体の合成〕
〈４−１：化合式１の化合物の合成〉
Ｎ末端のアミノ酸までカップリングされた、実施例３で合成されたペプチドに２０％ピペリジン／Ｎ−メチルピロリドン(Piperidine/N-methylpyrrolidone)溶液を加えてＦｍｏｃ基を除去し、Ｎ−メチルピロリドンとジクロロメタン(dichloromethane)で洗浄した後、実施例１で合成されたビタミンＣ誘導体をカップリングさせた。カップリング完了の後、Ｎ−メチルピロリドンとジクロロメタンで複数回洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。ここにトリフルオロ酢酸：フェノール：チオアニソール：水：トリイソプロピルシラン(trifluoroacetic acid: phenol: thioanisole: water: triisopropylsilane)の８５：５：５：３：２（ｖ／ｖ）溶液で２〜３時間反応させてペプチド保護基を除去し、ペプチドが結合したビタミンＣ誘導体を樹脂から分離させた後、ジエチルエーテルでペプチドを沈澱させた。ビタミンＣの２番および３番炭素に結合したアルコール基を保護しているベンジル基を除去するために、１０％Ｐｄ／Ｃをメタノールに添加し、水素雰囲気の下に約１時間室温で攪拌した後、セライトを用いてＰｄ／Ｃを除去して得た濾液を減圧濃縮した。こうして得たビタミンＣ誘導体は、０．１％トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリルを勾配として精製逆相高性能液体クロマトグラフィカラム(purified reverse phase high performance liquid chromatography column，Zobax, C8 300Å, 21.1mm ´ 25cm)を用いて精製することにより、化学式１のペプチドが結合したビタミンＣ誘導体を合成した。
【００８９】
〈４−２：化学式２の化合物の合成〉
実施例２で合成されたビタミンＣ誘導体と側鎖をトリフェニルメタン基で保護したＣ末端のペプチドをジメチルホルムアミドに溶解させた後、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加した。この混合物にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカボジイミドを加えた後、常温で２時間攪拌して、実施例２で合成されたビタミンＣ誘導体とＣ末端のペプチドとをカップリングさせた。この反応物から減圧の下でジメチルホルムアミドを除去した後、濃縮された溶液をジクロロメタンで希釈し、トリフルオロ酢酸を１％添加した。この混合物を常温で１０分間攪拌してＣ末端のペプチド側鎖の保護基であるトリフェニルメチル基を除去した。この反応物にトリエチルアミンを添加した後、クロロトリフェニルメチル樹脂とカップリングして実施例３のペプチド合成に応じてペプチドを延長反応した。Ｎ末端のアミノ酸までカップリングされた前記ペプチドが結合したビタミンＣ誘導体に２０％ピペリジン／Ｎ−メチルピロリドン(Piperidine/N-methylpyrrolithane)溶液を加えてＦｍｏｃ基を除去し、Ｎ−メチルピロリドンとジクロロメタンで洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。ここにトリフルオロ酢酸：フェノール：チオアニソール：水：トリイソプロピルシラン(trifluoroacetic acid: phenol: thioanisole: water: triisopropylsilane)の８５：５：５：３：２（ｖ／ｖ）溶液で２〜３時間反応させてペプチド保護基を除去し、ペプチドの結合したビタミンＣ誘導体を樹脂から分離させた後、ジエチルエーテルでペプチドを沈澱させた。ビタミンＣの３番炭素に結合したアルコール基を保護しているベンジル基を除去するために、１０％Ｐｄ／Ｃをメタノールに添加し、水素雰囲気の下に約１時間室温で攪拌した後、セライトを用いてＰｄ／Ｃを除去して得た濾液を減圧濃縮した。こうして得たビタミンＣ誘導体は、０．１％トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリルを勾配として精製逆相高性能液体クロマトグラフィカラム(purified reverse phase high performance liquid chromatography column，Zobax, C8 300Å, 21.1mm ´ 25cm)を用いて精製することにより、化学式２のペプチドが結合したビタミンＣ誘導体を合成した。
【００９０】
このような方法で合成された、それぞれのペプチドが結合したビタミンＣ誘導体を質量分光光度計(mass spectrophotometer)で分子量を測定し、ペプチドと琥珀酸基またはプロピル基が導入されたビタミンＣの結合を確認した。表１は実施例４で説明した方法で合成されたビタミンＣ誘導体の測定分子量をまとめたものである。
【００９１】
【表１】
2007528356.tif 000025
【００９２】
表１において、化合物番号Ｉ、II、IIIおよびIVはそれぞれ化学式１ａ、１ｂ、１ｃおよび２の化合物を示す。
【００９３】
化合物II−１に対する1H NMR (CD3OD)：8.78(dd, 1H), 7.38(s, 1H), 4.73(m, 3H), 4.42(m, 1H), 4.27(m, 2H), 4.14(m, 1H), 3.84(m, 2H), 3.19(m, 1H), 2.96(td, 2H), 2.76(m, 2H), 2.59(m, 2H), 1.81(m, 4H), 1.50(m, 2H)
-  化合物II−２に対する1H NMR (CD3OD)：8.78(m, 1H), 7.36(s, 1H), 4.74(m, 3H), 4.24(m, 3H), 3.86(d, 2H), 3.29(m, 2H), 2.95(t, 2H), 2.66(m, 4H), 1.80(m, 4H), 1.51(m, 2H)
化合物II−４に対する1H NMR (CD3OD)：4.78(m, 3H), 4.31(m, 10H), 3.90(m, 2H), 2.96(q, 4H), 2.65(m, 4H), 1.92(m, 2H), 1.74(m, 6H), 1.52(m, 4H), 1.23(q, 6H)
【００９４】
〔試験例１：着色実験〕
実施例４で合成された化合物Ｉ〜IVとビタミンＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれｐＨ７の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液に５０ｍＭの濃度で溶かし、４０℃の恒温槽で３週間保管した後、着色有無の経時変化を前記評価基準に基づいて観察し、その結果を表２に示した。
【００９５】
【表２】
2007528356.tif 000026
【００９６】
表２から分かるように、本発明の化合物Ｉ〜IVは、ビタミンＣに比べて比較的安定であり、変色が起こらず、沈澱物が生成されていない。
【００９７】
〔試験例２：チロシナーゼ阻害活性の評価〕
実施例４で合成された化合物II−１、II−２およびII−４を用いてチロシナーゼ活性阻害効果を測定した。チロシナーゼは、茸から分離されて精製されたもので、Ｓｉｇｍａ社から購入して使用した。基質であるチロシンは、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６．８）に溶かして０．３ｍｇ／ｍＬ溶液に作って使用した。化合物およびビタミンＣは、蒸留水に１０ｍＭの濃度で溶解させ、さらに適切な濃度で蒸留水に希釈して使用した。
【００９８】
試料チロシン溶液と緩衝溶液をそれぞれ０．５ｍＬずつ試験管に仕込み、ここに前記化合物またはビタミンＣ溶液０．５ｍＬを加えて３７℃の恒温器で１０分間放置した後、２，０００Ｕ／ｍＬチロシナーゼ０．０５ｍＬを仕込んで３７℃で１０分間反応させた。この際、対照群は各化合物の代わりに蒸留水０．５ｍＬを仕込んだものである。反応液入りの試験管を氷で急冷させて反応を中止させ、分光光度計によって波長４７５ｎｍで吸光度を測定してチロシナーゼ活性阻害率を求めた。ＩＣ５０値は、酵素活性阻害率が５０％に達する阻害剤の濃度で決定した。阻害率は数式１によって求め、その結果は表３に示した。
【００９９】
[数式１]
阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
【０１００】
式中、Ａは阻害剤が添加されていないものの４７５ｎｍにおける吸光度であり、Ｂは阻害剤が添加されたものの４７５ｎｍにおける吸光度である。
【０１０１】
【表３】
2007528356.tif 000027
【０１０２】
〔試験例３：メラニン形成抑制能の評価〕
試験管内でメラニン細胞のＢ６黒色腫細胞（韓国細胞株銀行）を培養し、その後培地を除去し、試料が適切な濃度で希釈された培地で取り替えた後、５％ＣＯ２、３７℃の下で各濃度別試験物質（ビタミンＣ、アルブチン、化合物II−１、II−２、II−４）を添加して一定の時間培養した。培地を除去した細胞をＰＢＳ(phosphated buffer saline)で洗浄し、これをトリプシンで処理して細胞を回収した。回収された細胞は、血球計算盤(hematocytometer)を用いて細胞数を測定し、５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上澄み液を除去してペレットを得た。この細胞ペレットを６０℃で乾燥させた後、１０％ＤＭＳＯ含有の１Ｍ水酸化ナトリウム液１００μＬまたは適量の細胞分解緩衝液を入れて６０℃の恒温槽で細胞内メラニンを得た。この液をもってマイクロプレートリーダーによって４９０ｎｍで吸光度を測定して一定の細胞数当たりのメラニン量または一定の蛋白質当たりのメラニン量を求めて図１に示した。
【０１０３】
図１に示すように、化合物II−４は１ｍＭ濃度でアルブチン（albutin）より約２４％高いメラニン生成抑制能を示し、ビタミンＣよりは約１０〜２０％高い抑制能を示した。化合物II−１の場合、化合物II−４と類似の抑制能を示した。
【０１０４】
〔試験例４：エラスターゼ抑制能の評価〕
エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ）の基質としてＭｅＯ−Ｓｕｃ−（Ａｌａ）２−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡを用いて、エラスターゼによる分解産物ｐ−ニトロアニリンの色を測定してエラスターゼの活性を評価し、その結果を図２に示した。
【０１０５】
図２に示すように、１ｍＭ濃度以下ではビタミンＣとエラスターゼの抑制能において大きい差を示していないが、１ｍＭ以上の濃度では２〜２０％程度高い抑制能を示した。
【０１０６】
〔試験例５：細胞毒性の評価〕
化粧品に使用される原料としての１次安全性を検証するために化合物II−１、II−２およびII−４に対してヒト正常線維芽細胞、Ｂ１６黒色腫、ＨａＣａＴ細胞を培養してそれぞれ濃度別に試験物質を処理してＭＴＴ試験(Mossman T., 1983, Journal of Immunological Methods 65, 55-63)を行って細胞毒性を評価した結果、化合物II−４の場合は、ビタミンＣと比較するとき、５ｍＭ濃度でも細胞毒性が見られず、化合物II−１、II−２の場合は、１０ｍＭ以下で類似の効果を示して安全性に優れた。
【０１０７】
〔試験例６：皮膚刺激性試験〕
前記化合物II−４の皮膚刺激性試験のために、ウサギを用いた貼布試験を行った(Draize J.H. et al., 1944, J. Pharmacol. Exp. Ther., 82: 377-390; Gfeller W et al., 1985, Fd. Chem. Toxic., 23: 165-168; Bosshard, E et al., 1985, Fd. Chem. Toxic., 12:149-154)。
【０１０８】
化合物II−４を０．０１Ｍ ＰＢＳに１％となるように調製した後、除毛した背中部位（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）に１区画当たり０．５ｍＬずつ使用して１回２４時間塗布し、適用部位から試験化合物の漏洩を防止するためにガーゼ（１０ｃｍ×１０ｃｍ）一枚を被せた後、試験化合物の蒸発を防ぐために不浸透性および非反応性の固体薄膜を覆い、弾力包帯でウサギの行動に支障を来たさないように取り巻いた後、紙テープで包帯を固定した。試験化合物の塗布２４時間後、７２時間後の刺激の度合いを判定した。その結果、化学式II−４の化合物は皮膚に非常に安全であった。
【０１０９】
〔試験例７：眼粘膜刺激性試験〕
局所的に現われる眼粘膜刺激性の有無およびその度合いを評価するために、ウサギ(New Zealand White Rabbit；ＮＺＷ)の眼粘膜に化合物II−４を適用した。
【０１１０】
試験化合物II−４を０．０１Ｍ ＰＢＳに１％となるように調製して適用部位に０．１ｍＬずつ適用した。すなわち、９匹のウサギの片目（右眼）に「医薬品などの毒性試験基準（韓国食品医薬品安全庁告示第１９９９−６１号、１９９９．１２．２２）」によって試験化合物を０．１ｍＬ／ｈｅａｄずつ適用した後、約１秒間目を瞑った状態に維持させて試験化合物の損失を防止し、これを利用して角膜、虹彩および結膜の損傷の度合いを観察した。１日目から７日目まで試験物質による結膜発赤および結膜浮腫は観察されなかった。眼粘膜刺激性試験結果、急性眼刺激指数(Acute Ocular Irritation；Ｉ.Ａ.Ｏ.Ｉ)は洗浄群および非洗浄群の両者ともにおいて「０」であって、化合物II−４は「無刺激物」と判明された。
【０１１１】
〔試験例８：皮膚感作性試験〕
化合物II−４の皮膚感作性をＨａｒｔｌｅｙ系雄モルモット（（株）セムタコバイオコリア）を用いてＧＰＭＴ(Guinea Pig Maximization Test)法によって検討した。この試験は、化粧品およびその他ヒトとの接触可能性のある物質の場合に対して皮膚接触刺激を起こるアレルギー誘発可能性の検討が必要であるため使用される。
【０１１２】
試験化合物投与群は、頚背部感作部位に１％試験化合物調製液を０．１ｍＬ／部位で皮内投与して１次感作し、１％試験化合物調製液１ｍＬ／動物および０．２ｍＬ／動物を含むパッチを貼って４８時間閉塞貼布して２次感作をした。２次感作２週後、左側腹部誘起部位に１％試験化合物調製液を２４時間閉塞貼布して誘起した。その結果が表４（チャレンジ反応に対する感作等級）に示されている。
【０１１３】
【表４】
2007528356.tif 000028
【０１１４】
表４に示すように、いずれの１０匹の試験物質投与群の誘起部位においても皮膚反応は確認されていない。また、皮膚感作率はそれぞれ０％であって、皮膚感作性評価基準等級は「１」（非常に弱い、Very weak）と評価された。この結果より、モルモットを用いた皮膚感作性試験において化合物II−４は皮膚感作性を誘発しない物質と判断された。
【０１１５】
〔試験例９：光毒性試験〕
Ｈａｒｔｅｌｙ系モルモット雄２０匹を各群当たり５匹ずつ賦形剤対照群（０．０１Ｍ ＰＢＳ）、試験化合物II−４投与群、陽性対照群１(Chlorpromazine、ＣＰ：クロロプロマジン)および陽性対照群２(8-methoxypsoralen、８−ＭＯＰ：８−メトキシプソラレン)の４群を設定してモルモットの皮膚に適用した後、ＵＶＡを照射するときに現われる光毒性誘発可能性を検査した。これは化学物質によって非免疫学的に起こる皮膚の紫外線および可視光線などの光刺激に対する異常反応であって、アレルギーとは異なり十分な光量と薬物で反応強度の予測が可能である。
【０１１６】
化合物II−４は、賦形剤の０．０１ＭＰＢＳを用いて０．１％、０．５％および１％に調製して使用した。ＣＰおよび８−ＭＯＰをＤＭＳＯに最終１０％となるように均一に調製して１％の濃度でさらに希釈して陽性対照物質を作った。動物を固定器に固定した後、５０μＬずつ均等に塗布し、その後動物の右側部位を光遮断対照部位とし、左側部位を光照射部位としてＵＶＡ（３２０〜３８０ｎｍ）で約１０ｃｍの距離から約２時間最終エネルギーが１５Ｊ／ｃｍ２となるように照射した後、２４、４８および７２時間の後に陽性対照群と皮膚反応を比較して光毒性の有無を評価した結果、表５に示すように「光毒性が殆どない」と評価された。
【０１１７】
【表５】
2007528356.tif 000029
【０１１８】
〔試験例１０：単回投与毒性試験〕
化合物II−４に対する単回経口投与時の安全性を検討するために、雌、雄マウス（（株）セムタコバイオコリア）を用いて化合物II−４を単回経口投与するときに現われる毒性を評価するために、試験化合物II−４投与群は単一用量として０および２，０００ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ、対照群は０．１Ｍ ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液）１０ｍＬ／ｋｇを雌、雄それぞれ５匹ずつ単回経口投与し、投与後１４日間、投与に起因した死亡例、一般症状、体重変化は観察されておらず、単回経口投与時の概略の致死量は雌、雄それぞれ２，０００ｍｇ／ｋｇ以上と判断された。
【０１１９】
〔試験例１１：光感作性試験〕
化合物II−４の光感作性試験をＨａｒｔｌｅｙ系雄モルモットを用いてＡｄｊｕｖａｎｔ ＆ Ｓｔｒｉｐ法によって行った。
【０１２０】
モルモットの頚背部皮膚に感作部位を定め、４区画に、注射用水とＦＣＡを混合して乳化した乳化液をそれぞれ皮内投与した。感作部位の皮膚は、少し紅斑が生ずる程度にストリッピング(stripping)を行い、賦形剤対照群には０．０１Ｍ ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液）、試験物質投与群には化合物II−４、陽性対照群にはＣＰ(chlorpromazine：クロロプロマジン)をそれぞれ開放塗布した。塗布２時間後に約１０Ｊ／ｃｍ２で長波長紫外線を照射した。紫外線照射２４、４８および７２時間後、誘起部位を観察し、光感作性の有無を判定した。
【０１２１】
賦形剤対照群および試験物質投与群のＵＶＡ非照射部位と照射部位の皮膚刺激指数(irritation index)はそれぞれ「０」と評価され、光感作性指数(Photosensitivity index)はそれぞれ「０」であって「刺激が殆どない(Practically non-irritating)」と評価された。陽性対照群のＵＶＡ非照射部位における皮膚刺激指数は「０」であり、ＵＶＡ照射部位皮膚刺激指数は「５．８」であって「激しい刺激がある(Extremely irritating)」と評価された。したがって、本試験に使用されたモルモットは、既に知られている光感作性物質ＣＰ(Chlorpromazine)で正常的な反応を示すことが確認された。観察期間中、試験物質による特異な一般症状および死亡動物は観察されておらず、全ての群において有意性のある体重変化も確認されていない。その結果を表６(Group summary)に示した。
【０１２２】
【表６】
2007528356.tif 000030
【０１２３】
表６に示すように、以上の試験結果より、モルモットを用いた光感作性試験において化合物II−４は光感作性を誘発しない物質と判断される。
【０１２４】
〔試験例１２：コラーゲン生合成能〕
ヒトの正常線維芽細胞に本発明の有効活性成分を添加して細胞水準でコラーゲン合成促進効果を試験した。
【０１２５】
生合成されたコラーゲンの測定は、文献(Martens, Gut, 1992, 33, 1664-1670)の方法を応用してコラーゲン生合成促進効果を測定し、試料を添加していないものを１００％とした。詳細な試験方法は次のとおりである。
【０１２６】
ヒトの正常線維芽細胞を細胞培養用６ウェルプレートに分注し、一定数の細胞をシーディングし、０．０５％含有ＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)条件下で４８時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄した。培養終了の後、前記の細胞および培養液をそれぞれ１／２ずつ分けて一方の分画にのみコラゲナーゼを処理した後、ＴＣＡ(trichloroacetic acid)で蛋白質を沈澱させて２分画の放射活性の差異からコラーゲン生合成促進効果を測定し、試料を添加していないものを１００％とした。
【０１２７】
図３に示すように、化合物II−４は、ビタミンＣと類似のコラーゲン生合成能を示し、このような結果は、試験例１の着色試験から分かる安定性の改善効果と共に優れたコラーゲン生合成能を持つことを立証する。
【０１２８】
〔試験例１３：抗酸化効果〕
実施例４で合成された化合物II−１、II−２およびII−４を選別してフリーラジカル除去能を行った。使用されたＤＰＰＨ(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)は、酸化／還元環境に応じて変色するラジカルを用いて試料のラジカル除去能力をＯ.Ｄ.値の測定によって確認することができる。
【０１２９】
前記選別された化合物を蒸留水または溶媒に溶かした後、液相状態の１００μＬ試料に２００μＭ ＤＰＰＨ１００μＬを混ぜた。よく混ぜた後、常温で１０分間放置した後、５１７ｎｍにおける吸光度を測定する。この際、使用された対照群は、化合物を除いた蒸留水または溶媒を入れたものである。
【０１３０】
図４に示すように、選別された化合物II−４の場合、ビタミンＣと同様に、１００μＭで７０％以上フリーラジカル消去能を示し、化合物II−１および化合物II−２の場合も、１００μＭで７０％台のフリーラジカル消去能を示した。その結果、選別された化合物II−４は、優れた抗酸化効果を持つ物質であるビタミンＣと類似の抗酸化効果を持つ。
【０１３１】
〔産業上の利用可能性〕
以上述べたように、本発明のビタミンＣ誘導体は、皮膚刺激などの副作用なしに、安定性、安全性および皮膚浸透力が向上した。よって、本発明のビタミンＣ誘導体は、皮膚状態を改善しあるいは皮膚状態の悪化を抑制するために使用できる。
【０１３２】
以上、本発明の好適な実施例について説明したが、当業者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲および精神から逸脱することなく、各種の変形、追加および置換が可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】本発明の化合物、ビタミンＣおよびアルブチンを用いてメラニン細胞Ｂ１６によるメラニン生産量を検定したグラフである。
【図２】本発明の化合物およびビタミンＣを用いてエラスターゼ活性を検定したグラフである。
【図３】本発明の化合物およびビタミンＣを用いてコラーゲン生合成能を検定したグラフである。
【図４】本発明の化合物およびビタミンＣを用いてラジカル除去能を検定したグラフである。
【図１】
2007528356.tif 000051
【図２】
2007528356.tif 000052
【図３】
2007528356.tif 000053
【図４】
2007528356.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月21日(2006.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
【化４】
2007528356.tif 000055
がグリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリンおよびリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンの中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
【化７】
2007528356.tif 000056
がグリシル−ヒスチジル−リジン、グリシル−リシル−ヒスチジン、グリシル−プロリル−ヒドロキシプロリンおよびリシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のビタミンＣ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【国際調査報告】
2007528356.tif 000057
2007528356.tif 000058