(57)【要約】【解決手段】  ヒトミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を利用し、高頻度変異細胞および生物を作成することができる。これらの遺伝子を細胞とトランスジェニック動物に導入することで、新規かつ有用な特徴を持った新しい細胞株と動物種が、自然の変異率に依存するよりも効率的に調整され得る。これらの方法は、対象抗原に対する免疫グロブリン遺伝子に遺伝的多様性を発生させ、生化学的活性が上昇するように変化した抗体を産生するために有用である。さらに、これらの方法は、抗体産生レベルが上昇した抗体産生細胞を発生させるために有用である。本発明では、モノクローナル抗体とエフェクター機能が増強されたモノクローナル抗体のエフェクター機能を上昇させる方法も提供する。【選択図】      図７
2007500508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクター機能が増強された抗体を産生する方法であって、
抗体産生細胞をミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子に導入し、それによって前記抗体産生細胞が高頻度変異可能となる工程と、
前記高頻度変異可能細胞からエフェクター機能が増強された抗体を産生する細胞をスクリーニングし、それによってエフェクター機能が増強された抗体を産生する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
前記ドミナントネガティブ対立遺伝子は、ＰＭＳ２対立遺伝子である。
【請求項３】
請求項２の方法において、
前記ＰＭＳ２対立遺伝子は、コドン１３４に切断変異を有するものである。
【請求項４】
請求項３の方法において、
前記切断変異は、野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンである。
【請求項５】
請求項３の方法において、
前記ＰＭＳ２対立遺伝子は、野生型ＰＭＳ２の第１の１３３アミノ酸をコード化しているものである。
【請求項６】
請求項２の方法において、
前記ＰＭＳ２対立遺伝子は、ヒトＰＭＳ２である。
【請求項７】
請求項１の方法において、
前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性である。
【請求項８】
請求項１の方法であって、さらに、
前記抗体産生細胞に遺伝的安定性を回復させる工程を有するものである。
【請求項９】
請求項１の方法であって、さらに、
前記抗体産生細胞を化学的突然変異誘発要因に曝露させる工程を有するものである。
【請求項１０】
請求項１の方法において、
前記抗体は、プロリンまたはヒドロキシプロリンでのアミノ酸置換を有するものである。
【請求項１１】
請求項１の方法において、
前記抗体は、重鎖可変領域においてアミノ酸置換を有するものである。
【請求項１２】
請求項１の方法において、
前記抗体は、軽鎖可変領域においてアミノ酸置換を有するものである。
【請求項１３】
請求項１の方法において、
前記抗体は、重鎖の第１のフレームワーク領域においてアミノ酸置換を有するものである。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、
前記置換は、配列ＩＤ番号：１８のアミノ酸配列を有する、第１のフレームワーク領域の６位で生じるものである。
【請求項１５】
請求項１の方法において、
前記抗体は、軽鎖の第２のフレームワーク領域においてアミノ酸置換を有するものである。
【請求項１６】
請求項１４の方法において、
前記アミノ酸置換は、プロリンまたはヒドロキシプロリンを有するものである。
【請求項１７】
請求項１５の方法において、
前記置換は、配列ＩＤ番号：２１のアミノ酸配列を有する、第２のフレームワーク領域の２２位で生じるものである。
【請求項１８】
請求項１の方法において、
前記抗体は、重鎖の第１のフレームワーク領域においてアミノ酸置換を有し、軽鎖の第２のフレームワーク領域においてアミノ酸置換を有するものである。
【請求項１９】
請求項１７の方法において、
前記アミノ酸置換は、プロリンまたはヒドロキシプロリンを有するものである。
【請求項２０】
請求項１の方法により産生された、エフェクター機能が増強された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年６月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／４９１，３１０号に対して優先権を主張し、その全内容はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗体のエフェクター機能と、細胞生産との分野に関するものである。特に、変異誘発性の分野に関係する。
【背景技術】
【０００３】
外因性および／または内因性ポリペプチドの活性を遮断するための抗体の使用は、基礎疾患の治療に効果的で選択的な戦略を提供する。例えば、ＦＤＡで承認されたＲｅｏＰｒｏ（Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ．（１９９６）"Ｃａｎ  ＲｅｏＰｒｏ  ｒｅｐｏｌｉｓｈ  ｔａｒｎｉｓｈｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２１６〜１２１７）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの抗血小板ＭＡｂであるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１９９９）"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ"Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３〜５  １）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＭＡｂ、およびＭｅｄｉｍｍｕｎｅで製造された抗呼吸器合胞体ウイルスＭＡｂであるシナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ，Ｘ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）"Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ"Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７〜７９１）などのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が効果的な治療法として使用されてきた。
【０００４】
候補タンパク質標的に対するＭＡｂｓを作成する標準的な方法は、当業者に知られている。簡単に言えば、マウスやラットなどのげっ歯類に、免疫反応を発生させるアジュバント存在下で精製された抗原を注射するものである（Ｓｈｉｅｌｄ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＯＫＴ３  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｄａｖｅｒｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２７：８５５〜８６４）。免疫血清が陽性のげっ歯類は屠殺され、脾細胞が単離される。単離された脾細胞はメラノーマと融合され、不死化細胞株を生産し、その抗体生産がスクリーニングされる。陽性細胞株が単離され、抗体生産の特徴が決定される。ヒト治療薬としてげっ歯類のＭＡｂｓを直接使用することは、ヒト抗げっ歯類抗体（ＨＡＲＡ）反応が、げっ歯類由来抗体を投与した患者の多数において発生したという事実により混乱した（Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２〜５２）。ＨＡＲＡの問題を回避するため、前記抗原結合ドメインを作り、前記免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットの重鎖および軽鎖可変領域にみられる重要なモチーフである相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体骨格に接合すると、これらのキメラ分子で抗原に結合活性を保持することができるが、ＨＡＲＡ反応はなくなることが分かった（Ｅｍｅｒｙ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"Ｉｎ：ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  （Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９９５．ｐｐ．１５９〜１８３）。げっ歯類由来ＭＡｂｓ（本明細書ではＨＡｂと言及される）の「ヒト化」中に共通の問題は、ヒトＩｇ骨格に接合すると、ＣＤＲドメインの３次元骨格で立体配座が変化することにより、結合親和性が失われることである（Ｑｕｅｅｎらの米国特許番第５，５３０，１０１号）。この問題を克服するため、通常はフレームワーク領域および／またはＣＤＲコード化領域自体の中でさらにアミノ酸残基を挿入するか、欠失することで、ＨＡｂの親和性を再び高くし、追加ＨＡｂベクターを作成する必要がある（Ｑｕｅｅｎらの米国特許番号第５，５３０，１０１号）。このプロセスは、高価なコンピュータモデリングプログラムを使用し、ＨＡｂの親和性を高める可能性がある変化を予測することを含む、非常に時間のかかる方法である。場合によってはＨＡｂの親和性がＭＡｂの親和性を復元せず、治療にほとんど利用されないこともある。
【０００５】
抗体作成における別の問題は、臨床材料となる分子を生産するために必要な、安定的、高収率産生細胞株の作成法である。この問題を回避するため、当業者によって標準的な方法にいくつかの戦略が採用された。１つの方法は、前記接合したヒト軽鎖および重鎖を含む外因性Ｉｇ融合遺伝子をトランスフェクトし、抗体全体または単鎖抗体を作成するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用するものであり、この抗体は抗原結合ペプチドを形成する軽鎖および重鎖をいずれも含むキメラ分子である（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７３〜５７６）。別の方法では、ヒト移植免疫系を含むトランスジェニックマウスまたはヒトＩｇ遺伝子レパートリーを含むトランスジェニックマウス由来のヒトリンパ球を使用している。さらに別の方法では、霊長類のＭａｂを生産するためにサルを利用し、ヒト抗サル反応がないことが報告された（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．（１９９７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｉｃｅ  ｐｅｒｆｏｒｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２５〜２６）。すべてのケースで、十分な量の高親和性抗体を作成することができる細胞株の作成において、臨床研究用に十分な材料を作成するには大きな制約がある。これらの制約があるため、植物など他の組み換え系の有用性は、現在、ヒト化抗体を安定的に高レベルで生産する系として調査されている（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｒａｄ，Ｕ．（１９９５）Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｅｅｄｓ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１０９０〜１０９３）。
【０００６】
さらに別の抗体機能の観点は、前記Ｍａｂのエフェクター機構である。抗体のエフェクター機能を増強させると考えられる多数の方法のうちの１つは、グリコシル化の変化によるものである。このトピックは、最近Ｒｕｊｕによって再調査され、ＲｕｊｕはヒトＩｇＧにみられるオリゴ糖の重要性をエフェクター機能の程度によってまとめた（Ｒａｊｕ，ＴＳ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｒｉｌ  ２００３．４４〜５３）。ＷｒｉｇｈｔとＭｏｒｒｉｓｏｎによれば、ヒトＩｇＧオリゴ糖の微小不均一性は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）や抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）などの生物機能、様々なＦｃ受容体への結合、Ｃ１ｑタンパク質への結合に影響する可能性がある（Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １９９７，１５  ２６〜３２）。抗体のグリコシル化パターンは、細胞の生産と細胞培養条件に依存して異なる可能性があることは、はっきり報告されている（Ｒａｊｕ，ＴＳ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｒｉｌ  ２００３．４４〜５３）。そのような差は、エフェクター機能と薬物動態両方の変化につながる可能性がある（Ｉｓｒａｅｌ  ＥＪ，Ｗｉｌｓｋｅｒ  ＤＦ，Ｈａｙｅｓ  ＫＣ，Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｄ，Ｓｉｍｉｓｔｅｒ  ＮＥ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｄｅｃ；８９（４）：５７３〜５７８；Ｎｅｗｋｉｒｋ  ＭＭ，Ｎｏｖｉｃｋ  Ｊ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＭＭ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ｍｉ，Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｓ  Ｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．１９９６  Ｎｏｖ；１０６（２）：２５９〜６４）。エフェクター機能の差は、前記エフェクター細胞に対するＦｃγ受容体（ＦｃγＲｓ）のＩｇＧ結合能力と関連している可能性がある。Ｓｈｉｅｌｄｓらは、アミノ酸配列が変化し、ＦｃγＲへの結合が改善した変異株のＩｇＧ１で、ヒトエフェクター細胞を用い、１００％までＡＤＣＣが強化されうることを示した（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ  ＡＫ，Ｈｏｎｇ  Ｋ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｒａｅ  Ｊ，Ｂｒｉｇｇｓ  Ｊ，Ｘｉｅ  Ｄ，Ｌａｉ  Ｊ，Ｓｔａｄｌｅｎ  Ａ，Ｌｉ  Ｂ，Ｆｏｘ  ＪＡ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｒ  ２；２７６（９）：６５９１〜６０４）。これらの変異体には、結合接点には認められないアミノ酸の変化を含むが、前記糖成分とその構造パターンの性質は、認められた差にも寄与する可能性がある。さらに、ＩｇＧ１のオリゴ糖成分のフコースの有無によっては、結合とＡＤＣＣが改善される可能性がある（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，Ｌａｉ  Ｊ，Ｋｅｃｋ  Ｒ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＬＹ，Ｈｏｎｇ  Ｋ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｗｅｉｋｅｒｔ  ＳＨ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｊｕｌ  ２６；２７７（３０）：２６７３３〜４０）。Ａｓｎ２９７に結合したフコシル化炭水化物を欠如したＩｇＧ１は、Ｆｃγ受容体に対して通常の受容体結合性を示した。対照的に、特に抗体濃度が低いと、ＦｃγＲＩＩＡ受容体への結合は５０％改善し、ＡＤＣＣの上昇が伴っていた。
【０００７】
Ｓｈｉｎｋａｗａらの研究によって、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）で生産された抗体と比べ、ラットハイブリドーマで生産されたヒトＩＬ−５受容体抗体でＡＤＣＣが５０％以上高いことが示されると証明された（Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，Ｙａｍａｎ  Ｎ，Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａ  Ｅ，Ｋａｎｄａ  Ｙ，Ｓａｋｕｒａｄａ  Ｍ，Ｕｃｈｉｄａ  Ｋ，Ａｎａｚａｗａ  Ｈ，Ｓａｔｏｈ  Ｍ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｍ，Ｈａｎａｉ  Ｎ，Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ  ３１；２７８（５）：３４６６〜７３）。単糖の組成物とオリゴ糖のプロファイリングにより、前記ラットハイブリドーマ産生ＩｇＧ１のフコース含有量が前記ＣＨＯ産生タンパク質よりも低いことが示された。彼らは、ＩｇＧ１のフコシル化の欠如は、ＡＤＣＣ活性の亢進に重要な役割を果たしていると結論付けた。
【０００８】
Ｕｍａｎａらによって異なるアプローチがとられ、彼らはキメラＩｇＧ１抗神経芽細胞腫抗体であるｃｈＣＥ７のグリコシル化パターンを変化させた（Ｕｍａｎａ  Ｐ．Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  Ｊ，Ｍｏｕｄｒｙ  Ｒ，Ａｍｓｔｕｔｚ  Ｈ，Ｂａｉｌｅｙ  ＪＥ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  Ｆｅｂ；１７（２）：１７６〜８０）。彼らはテトラサイクリンを用い、ＡＤＣＣ活性に関連していたオリゴ糖を二等分する、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）の活性を制御した。前記親抗体のＡＤＣＣ活性は、バックグラウンドレベルよりわずかに高かった。異なるテトラサイクリン濃度で生産されたｃｈＣＥ７のＡＤＣＣ活性を測定すると、最大ｃｈＣＥ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性でＧｎＴＩＩＩ発現の最適範囲が示された。この活性は、定常領域と関連し、二等分された複合オリゴ糖レベルと関連していた。新たに最適化された変異株では、かなりのＡＤＣＣ活性が示された。
【０００９】
ＨａｂｓおよびＭＡｂｓとなる、抗原親和性が高い可変ドメイン内で様々な抗体配列を作成する方法は、それぞれ、より強力な治療薬および診断薬の作成に有用であろう。さらに、抗体分子全体でランダムに改変させたヌクレオチドおよびポリペプチド残基を生成すると新しい試薬の開発を導き、これは抗原性が低いおよび／または有益な薬物動態学的性質を有する。ここで説明した発明は、生化学的に活性な抗体をコードする、免疫グロブリンを生産する宿主細胞の内在性ミスマッチ修復（ＭＭＲ）活性を遮断することで、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗体構造全体のランダム遺伝子変異を利用することに関するものである。本発明は、結合強化と薬物動態学的プロフィールを用いた、繰り返しｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子変化と抗体の選択に利用される方法に関するものでもある。本発明の方法は、前記抗体のエフェクター機能を亢進するためにも利用されうる。
【００１０】
さらに、より多くの抗体を分泌できる遺伝子組み換え宿主細胞を開発することができれば、製品開発用の細胞宿主を作成する貴重な方法を提供することになる。ここで説明した発明は、ＭＭＲを遮断することによる抗体生産の亢進と、遺伝子組み換え細胞宿主の作成に関するものである。
【００１１】
本発明は、エフェクター機能を亢進した抗体の作成と、抗体生産レベルが増強された細胞株の生産を促進するものである。本発明の他の利点は、ここで説明される実施例と図で述べられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで（単鎖分子を含む）遺伝子組み換え抗体と、抗体産生細胞宿主とを作成する方法を提供し、それによって抗体は、これに限定されるものではないが、宿主細胞による抗原結合性の亢進、遺伝子発現の亢進、エフェクター機能の亢進および／または細胞外分泌の亢進など、望みの生化学的性質を有する。結合活性が増強された抗体、または抗体産生が増加した細胞を同定する１つの方法は、結合性が強化され、（これだけに限らないが）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能が増強された分子を産生する細胞クローン、または抗体産物の生産量が増加するように遺伝子組み換えされたクローンを産生するＭＭＲ欠損抗体をスクリーニングするものである。
【００１３】
本発明での使用に適した細胞を産生する抗体には、これだけに限定されるものではないが、げっ歯類、霊長類、またはヒトハイブリドーマまたはリンパ芽球様細胞、外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子をトランスフェクトするか、発現した哺乳類細胞、外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子をトランスフェクトするか、発現した植物細胞、酵母、または細菌を含む。
【００１４】
従って、本発明では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するポリヌクレオチドを、抗体を産生することができる細胞に導入することで、高頻度変異可能な抗体産生細胞を作成する方法を提供する。抗体を産生することができる細胞には、自然に抗体を産生する細胞、免疫グロブリンコード化配列の導入により抗体を産生するように設計された細胞を含む。都合の良いことに、ポリヌクレオチド配列の細胞への導入は、トランスフェクションにより達成される。
【００１５】
本発明では、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ１、またはＭＳＨ２などのドミナントネガティブミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を、抗体を産生することができる細胞に導入することで、高頻度変異可能な抗体を作成する方法も提供する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の切断変異としてもよい（好ましくはコドン１３４の切断変異、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジン）。本発明では、ミスマッチ修復遺伝子活性が抑制される方法も提供する。これは、例えばミスマッチ修復遺伝子または転写物のアンチセンス分子を用いて達成されてもよい。
【００１６】
本発明の他の実施形態では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するポリヌクレオチドを動物の受精卵に導入することで、高頻度変異可能な抗体産生細胞を作成する方法を提供する。これらの方法には、その後、前記受精卵を疑似妊娠した女性に移植する段階も含み、それによって前記受精卵が成熟トランスジェニック動物に発達するものである。このミスマッチ修復遺伝子には、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ１、またはＭＳＨ２を含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の切断変異としてもよい（好ましくはコドン１３４における切断変異、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジン）。
【００１７】
本発明はさらに、抗体を生産でき、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む、培養高頻度変異哺乳類細胞の均一な組成物を提供する。前記ミスマッチ修復遺伝子には、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ１、またはＭＳＨ２を含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の切断変異としてもよい（好ましくはコドン１３４の切断変異、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジン）。前記培養細胞には、ＰＭＳ２、（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１を含むか、ヒトｍｕｔＬホモローグ、またはｈＰＭＳ２の第１の１３３アミノ酸を発現してもよい。
【００１８】
本発明では、さらに対象免疫グロブリンを選択する免疫グロブリン産生細胞を培養することで、対象の免疫グロブリン遺伝子の変異を作成する方法を提供し、前記細胞にはミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む。前記細胞から産生される免疫グロブリンの性質がアッセイされ、前記免疫グロブリン遺伝子が変異を含むか否かを確認することができる。前記アッセイは、前記免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを分析するように指示されてもよく、前記免疫グロブリンポリペプチド自体を対象としてもよい。
【００１９】
本発明では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現した細胞を培養し、前記細胞を検査して、前記細胞に新しい生化学的特徴など、対象遺伝子内に変異があるか否かを決定することで、抗体産生細胞の遺伝子に影響する抗体産生で変異を作成する方法も提供する。前記検査には、対象免疫グロブリン遺伝子の定常状態での発現分析および／または対象免疫グロブリン遺伝子でコードされた分泌タンパク質量の分析を含んでもよい。前記発明には、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒトの細胞など、このプロセスで作成された原核細胞と真核細胞のトランスジェニック細胞も含む。
【００２０】
本発明の他の観点には、抗体産生細胞の高頻度変異を可逆的に変化させる方法を含み、誘導プロモーターに結合するように操作可能なミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む誘導ベクターが、抗体産生細胞に導入されるものである。前記細胞が誘導因子で処理され、前記ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を発現する（これは、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１とすることができる）。代わりに、前記細胞を導入し、ヒトｍｕｔＬホモローグまたはｈＰＭＳ２の第１の１３３アミノ酸を発現してもよい。別の実施形態では、事前に選択された対象免疫グロブリン遺伝子を同時にトランスフェクトすることで、前記細胞が抗体を産生できてもよい。前記高頻度変異細胞の免疫グロブリン遺伝子、またはこれらの方法で作成されたタンパク質の望みの性質が分析されてもよく、前記宿主細胞の遺伝的安定性を回復させるように、導入を中止してもよい。
【００２１】
本発明には、（自然に、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子が前記細胞に導入されるように）ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を含む細胞に、免疫グロブリンタンパク質をコード化するポリヌクレオチドをトランスフェクトし、前記免疫グロブリン遺伝子が変異し、変異型免疫グロブリンを産生できるように前記細胞を培養し、前記免疫グロブリンタンパク質の望みの性質をスクリーニングし、前記望みの性質を有する前記選択変異型免疫グロブリンをコードするヌクレオチド分子を単離し、前記変異型ポリヌクレオチドを遺伝的に安定な細胞にトランスフェクトし、これ以上遺伝子組み換えを行わずに前記変異型抗体が常に生産されるようにすることで、遺伝子組み換え抗体を作成する方法も含む。前記ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子はＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１としてもよい。代わりに、前記細胞が、ヒトｍｕｔＬホモローグまたはｈＰＭＳ２の第１の１３３アミノ酸を発現してもよい。
【００２２】
本発明は、さらに抗原結合ポリペプチドの発現量が増加した遺伝子組み換え細胞株を作成する方法も提供する。これらの抗原結合ポリペプチドは、例えば免疫グロブリンであってもよい。本発明の方法は、抗原結合ポリペプチドの分泌量が増加した遺伝子組み換え細胞株を作成する方法も含む。前記細胞株はドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子により高頻度変異が可能となり、抗体などの細胞産生抗原結合ポリペプチドで遺伝子高頻度変異率の上昇を提供する。そのような細胞には、これだけに限定されるものではないが、ハイブリドーマを含む。抗原結合ポリペプチドの増加された量の発現は、例えば、前記抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写または翻訳を増加することで、または前記抗原結合ポリペプチドの分泌を増加することで行われてもよい。
【００２３】
前記細胞宿主のＭＭＲ活性を遮断するか、ＭＭＲ欠損細胞宿主の免疫グロブリンをコードする遺伝子をトランスフェクトすることで、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝子組み換え抗体を作成する方法も提供される。
【００２４】
前記様々なドメインで遺伝子が変化したため、抗原に対する結合性が増強された抗体は、前記細胞宿主の外因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法で提供される。軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ領域で遺伝子が変化したため、抗原に対する結合性が増強された抗体も、前記細胞宿主の外因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法で提供される。
【００２５】
本発明では、これだけに限定されるものではないが、げっ歯類、霊長類、ヒトを含む宿主生物の薬物動態特性を強化し、ＭＭＲ欠損Ａｂ産生細胞株で遺伝子操作した抗体を作成する方法を提供する。
【００２６】
これらの本発明の観点は、以下に説明される実施形態の１若しくはそれ以において提供される。本発明の１つの実施形態において、抗体産生細胞株に高頻度変異を生じさせる方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコード化するポリヌクレオチドが、抗体産生細胞に導入される。前記遺伝子を導入した結果として、前記細胞は高頻度変異可能となるものである。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする外因性遺伝子に変異を導入する方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコード化するポリヌクレオチドは、細胞に導入される。前記ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を導入、発現させた結果として、前記細胞は高頻度変異可能となる。前記細胞はさらに、対象免疫グロブリン遺伝子を有する。前記細胞は、増殖、検討され、対象の免疫グロブリンまたは単鎖抗体をコードする遺伝子に変異があるか否かを決定される。本発明の別の観点では、前記変異型免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする遺伝子が、遺伝的に安定した細胞で単離、発現されてもよい。好適な実施形態では、これだけに限らないが、結合性の増強など、少なくとも１つの望ましい特性について、前記変異型抗体がスクリーニングされる。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、Ｉｇの軽鎖と重鎖またはその組み合わせをコードする遺伝子または遺伝子セットが、ＭＭＲを欠損した哺乳類細胞宿主に導入される。前記細胞が増殖され、クローンで結合性が増強された抗体が分析される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、細胞の新しい表現型を作成する方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコード化するポリヌクレオチドが、細胞に導入される。前記遺伝子を導入した結果として、前記細胞は高頻度変異可能となる。前記細胞は増殖される。前記細胞は、新しい表現型の発現が検討され、前記表現型ではポリペプチドの分泌が増加するものである。
【００３０】
本発明では、免疫グロブリン分子を有する抗原に対する親和性が増加された抗体も提供し、ここにおいて前記重鎖および／または軽鎖の可変ドメインで少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものである。いくつかの実施形態では、前記置換は、その位置のアミノ酸の親配列が非極性側鎖のアミノ酸である位置にあるものである。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸の親配列は、非極性側鎖を有する異なるアミノ酸で置換される。他の実施形態では、前記アミノ酸の親配列は、プロリンまたはヒドロキシプロリンで置換されているものである。いくつかの実施形態では、前記置換は、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域で行われる。いくつかの実施形態では、前記置換は、前記重鎖の第１のフレームワーク領域にあるものである。いくつかの実施形態では、前記置換は、前記軽鎖の第２のフレームワーク領域にあるものである。いくつかの実施形態では、前記置換は、前記重鎖の第１のフレームワーク領域と前記軽鎖の第２のフレームワーク領域にあるものである。いくつかの実施形態では、配列ＩＤ番号：１８に示されるとおり、前記置換は、前記重鎖の第１のフレームワーク領域の６位で行われるものである。いくつかの実施形態では、配列ＩＤ番号：２１に示されるとおり、前記置換は、前記軽鎖の第２のフレームワーク領域の２２位で行われるものである。特定の位置の変異に対して、いくつかの実施形態においては、アミノ酸置換はプロリンまたはヒドロキシプロリンである。
【００３１】
本発明では、抗原に対する抗体の親和性を高める方法も提供し、この方法は前記対象抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインにあるアミノ酸を、非極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換する工程を有する。いくつかの実施形態では、この位置のオリジナルアミノ酸がプロリンで置換されるものである。いくつかの実施形態では、プロリンを用い、非極性側鎖を有する別のアミノ酸を置換するものである。いくつかの実施形態では、アラニンおよび／またはロイシンがプロリンで置換される。特定の実施形態では、配列ＩＤ番号：１８で示されるとおり、前記抗体重鎖の第１のフレームワーク領域の６位のアミノ酸がプロリンで置換される。他の実施形態では、配列ＩＤ番号：２１で示されるとおり、前記軽鎖可変ドメインの第２のフレームワーク領域の２２位のアミノ酸がプロリンで置換される。本発明では、これらの方法で産生された抗体も提供する。
【００３２】
本発明で生産された抗体は、本発明のプロセスを用いて作成されてもよく、ここにおいてミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、抗体産生細胞に導入され、ここでさらに説明されるとおり、前記細胞は、高頻度変異可能となる。代わりに、２００２年６月１８日に公開されたＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ０２／０５４８５６号に説明されているとおり、アントラセンおよび／またはその誘導体を用いるなどの、ミスマッチ修復の化学的阻害剤を用いてミスマッチ修復を妨害してもよく、その全体に開示されている内容はこの参照により本明細書に具体的に組み込まれている。ミスマッチ修復を妨害する化学物質で処理されるか、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を発現した細胞は、高頻度変異可能となる。高頻度変異細胞によって生産される抗体は、親和性の上昇がスクリーニングされ、前述のアミノ酸置換を有するこれらの抗体では、抗原の親和性が上昇することが示される。親和性が上昇し、ここで説明した分子の特徴を有する抗体を産生する細胞は、前記化学的阻害剤を中止するか、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子の発現を不活化することを通じて遺伝的に安定化した細胞を与えることで、再び遺伝的に安定させてもよい。例えば、誘導プロモーターをコントロールした状態で、前記誘導因子を中止することにより、ドミナントネガティブ対立遺伝子が不活化されてもよい。代わりに、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子がノックアウトされるか、ＣＲＥ−ＬＯＸ発現系が利用され、それによって遺伝的に多様な免疫グロブリンを含む細胞が確立された時点で、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子が前記ゲノムからスプライスされてもよい。
【００３３】
他の実施形態において、当該分野の当業者は、タンパク質に変異を誘導し、前記アミノ酸置換と高い親和性を有する抗体を選択する既知のいずれかの方法を使用してもよい。変異を導入する方法は、化学的突然変異などのようにランダムであってもよく、または部位特異的突然変異誘発などのように特異的であってもよい。ランダムおよび特異的突然変異誘発法は、当該分野で周知であり、これだけに限定されるものではないが、例えば化学的突然変異誘発（例えばメタンスルホン酸塩、ジメチルスルホン酸塩、Ｏ６−メチルベンザジン、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチルニトロソウレア（ＥＮＵ）などの化学物質を用いる）、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ突然変異誘発（例えばＫｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５〜１３９を参照）、部位特異的突然変異誘発（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（２）：１９４〜１９６を参照）、カセット式変異誘発、および（Ｈａｕｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６（１）：４７−４８）の制限選択突然変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を含む。
【００３４】
本発明のこれらの実施形態では、細胞と動物で変異性を上昇させることができる方法を用いた技術を提供するだけでなく、有益な薬理学的プロフィールがある高親和性抗体の大規模生産に有用と考えられる変異を有する細胞と動物も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
宿主細胞の保存ミスマッチ修復（ＭＭＲ）プロセスをうまく利用することで、高頻度変異抗体産生細胞を作成する方法が発見された。そのような遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を細胞またはトランスジェニック動物に導入すると、ＤＮＡ修復の有効性が低下し、それによって細胞または動物が高頻度変異することで、自然突然変異率が上昇する。次に、高頻度変異細胞または動物を利用し、対象遺伝子で新しい変異を生じる可能性がある。これだけに限らないが、ハイブリドーマ、Ｉｇ軽鎖および重鎖をコードした遺伝子をトランスフェクトした哺乳類細胞、単鎖抗体をコードした遺伝子をトランスフェクトした哺乳類細胞、Ｉｇ遺伝子をトランスフェクトした真核細胞などの抗体産生細胞で、ＭＭＲを遮断すると、これらの細胞の変異率が上昇し、抗体産生が増加したクローン、および／または遺伝子組み換え抗体を含む細胞が生じ、抗原結合性の上昇など、生化学的特性が上昇する。細菌から哺乳類細胞の範囲で、細胞のタンパク質複合体により、ミスマッチ校正と呼ばれるＭＭＲのプロセスが実施される。ＭＭＲ遺伝子は、ミスマッチ修復複合体などのタンパク質の１つをコードした遺伝子である。特定の作用機序の理論に縛られることなく、ＭＭＲ複合体は、ＤＮＡらせんのゆがみを検出し、ヌクレオチド塩基の非相補的ペアから生じると考えられている。新しいＤＮＡ鎖の非相補的塩基は除去され、前記切除された塩基は前記適当な塩基と交換され、これは前記古いＤＮＡ鎖と相補的である。このように、細胞はＤＮＡ複製の誤りの結果発生する多くの突然変異を排除する。
【００３６】
ドミナントネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞に野生型対立遺伝子が存在する場合でも、ＭＭＲ欠損表現型を発生させる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の例は、前記ヒト遺伝子のｈＰＭＳ２−１３４であり、コドン１３４（配列ＩＤ番号：１５）に短縮型変異を有する。前記変異は、前記１３４番目のアミノ酸の位置でこの遺伝子産物を異常に停止させ、Ｎ末端１３３アミノ酸を含む短縮型ポリペプチドとなる。そのような変異は変異率を上昇させ、ＤＮＡ複製後の細胞を蓄積する。野生型対立遺伝子がある場合でも、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が発現することで、ミスマッチ修復活性が障害される。そのような作用を生じる対立遺伝子は、すべて本発明で利用することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、細菌、その他の生物の細胞から入手され得る。そのような対立遺伝子は、細胞の欠損ＭＭＲ活性をスクリーニングすることで同定されうる。癌のある動物またはヒトの細胞では、欠損ミスマッチ修復をスクリーニングすることができる。結腸癌患者の細胞は、特に有用と考えられる。ＭＭＲタンパク質をコード化する細胞のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡでは、前記野生型配列の変異を分析することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、例えば前記ｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子または他のＭＭＲ遺伝子の変異株を産生することで、人工的に作成されることも可能である。部位特異的突然変異誘発の様々な技術が利用され得る。そのような対立遺伝子を高頻度変異細胞または動物の作成に使用する適合性は、天然または人工かによらず、１若しくはそれ以上の野生型対立遺伝子の存在下で、前記対立遺伝子によって生じるミスマッチ修復活性を検討することで評価し、ドミナントネガティブ対立遺伝子か否かを決定することができる。
【００３７】
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が導入された細胞または動物は、高頻度変異可能となる。これは、そのような細胞または動物の自然突然変異率が、そのような対立遺伝子のない細胞または動物と比べて上昇していることを意味する。前記自然突然変異率の上昇度は、正常な細胞または動物の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍の可能性がある。これだけに限らないが、メタンスルホン酸塩、ジメチルスルホン酸塩、０６−メチルベンザジン、ＭＮＵ、ＥＮＵなどの化学的突然変異誘発要因をＭＭＲ欠損細胞に使用することで、突然変異率を前記ＭＭＲの欠損率自体のさらに１０〜１００倍に上昇させることができる。
【００３８】
本発明の１つの観点に従うと、ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ型をコード化するポリヌクレオチドは、細胞に導入される。前記遺伝子は、例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、またはＭＳＨ２など、ＭＭＲ複合体の一部であるタンパク質をコード化する全てのドミナントネガティブ対立遺伝子であり得る。前記ドミナントネガティブ対立遺伝子は、自然に発生するか、実験室で作成することができる。前記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学合成されたポリヌクレオチドの形とすることができる。
【００３９】
前記ポリヌクレオチドは、構成的活性化プロモーター断片（これだけに限らないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、またはＬＴＲ配列など）を含む発現ベクター、または前記ステロイド誘導ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの誘導プロモーター配列にクローニングされる可能性があり、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子の発現が制御される可能性がある。前記ポリヌクレオチドは、形質移入によって前記細胞に導入される可能性がある。
【００４０】
本発明の別の観点に従うと、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子、Ｉｇ遺伝子セット、Ｉｇ遺伝子の全体または一部を含むキメラ遺伝子は、ＭＭＲ欠損細胞宿主にトランスフェクトされる可能性があり、新しい生化学的特徴を持った遺伝子組み換えＩｇ遺伝子を含むクローンに関して、前記細胞が増殖、スクリーニングされる。ＭＭＲ欠損細胞は、ヒト、霊長類、哺乳類、げっ歯類、植物、酵母、または原核界の細胞としてもよい。新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコード化する突然変異遺伝子は、それぞれのクローンから単離され、遺伝的に安定な細胞（つまり、正常ＭＭＲを持った細胞）に導入され、前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇを一貫して生産するクローンを提供してもよい。前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコードするＩｇ遺伝子を単離する方法は、当該分野で既知のいずれの方法であってもよい。前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコードする単離ポリヌクレオチドの導入は、これだけに限らないが、前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターのトランスフェクションを含む、当該分野で既知の方法により実施され得る。Ｉｇ遺伝子、Ｉｇ遺伝子セット、Ｉｇ遺伝子全体または一部を含むキメラ遺伝子をＭＭＲ欠損宿主細胞にトランスフェクトする代わりに、そのようなＩｇ遺伝子を、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子をコード化する遺伝子と同時に、遺伝的に安定な細胞にトランスフェクトし、前記細胞を高頻度変異可能にしてもよい。
【００４１】
トランスフェクションは、ポリヌクレオチドが細胞に導入されるプロセスである。トランスフェクションのプロセスは、生きている動物で、例えば遺伝子療法のベクターを用いて実行される可能性があり、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば１若しくはそれ以上の単離細胞を培養液に懸濁することで実施される可能性もある。前記細胞は、例えばヒトまたは他の霊長類、哺乳類、その他の脊椎動物、無脊椎動物、原虫、酵母、または細菌などの単細胞生物から単離された細胞を含む、全てのタイプの真核細胞とすることができる。
【００４２】
一般に、トランスフェクションは、細胞懸濁液、または単細胞を用いて実施されるが、前記処理細胞または組織の十分な分画が前記ポリヌクレオチドを含む限り、トランスフェクトした細胞が増殖、利用できるような他の方法を適用してもよい。前記ポリヌクレオチドのタンパク質産物は、前記細胞に一時的または安定的に発現されてもよい。トランスフェクション技術も周知である。ポリヌクレオチドの導入に利用できる方法には、これだけに限らないが、電気穿孔法、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの利用、前記ポリヌクレオチドと脂質のパッケージングにより対象細胞と融合させる方法を含む。細胞に前記ＭＭＲ遺伝子がトランスフェクトされると、前記細胞が増殖され、培養液で再生産されうる。前記トランスフェクションが安定化し、前記遺伝子が多くの細胞世代で一貫したレベルで発現された場合、これを細胞株とする。
【００４３】
単離細胞は、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンなどの酵素で前記組織を前処理した場合と前処理しない場合で、個々の細胞を機械的に分離し、適当な細胞培養液に移動することで、ヒトまたは動物組織から得られた細胞である。そのような単離細胞は、典型的には、他の細胞タイプがない状態で培養される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入するために選択された細胞は、初代細胞培養または不死化細胞株の形での真核生物由来であってもよく、または単細胞生物の懸濁液に由来してもよい。
【００４４】
ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ型をコード化するポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を生産することで、動物のゲノムに導入されうる。前記動物は、どの種であってもよく、適当な技術を利用し、トランスジェニック動物を作成する。例えば、トランスジェニック動物は、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜から、例えばミルクに組み換えポリペプチドを発現したウシ、ブタ、ヒツジなど、組み換えタンパク質を生産するために利用される動物から、または例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど、研究または製品検査用の実験動物から調整されうる。次にＭＭＲが欠損していると判定された細胞株は、未処理の免疫グロブリン遺伝子全体および／または単鎖抗体をコードするキメラ遺伝子を、前記ＭＭＲ欠損動物組織のＭＭＲ欠損細胞に導入することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子組み換え免疫グロブリン遺伝子を産生する供給源として使用され得る。
【００４５】
トランスフェクトされた細胞株またはトランスジェニック動物のコロニーが生産されると、１若しくはそれ以上の対象遺伝子で新たな突然変異を発生させるために利用され得る。対象遺伝子は、前記細胞株またはトランスジェニック動物で自然に処理されたか、前記細胞株またはトランスジェニック動物に導入された遺伝子とすることができる。そのような細胞または動物を用いて突然変異を誘導する利点は、前記細胞または動物が変異原性化学物質に曝露されるか、照射される必要がない点であり、これらは前記曝露される対称および作業員に二次的な有害作用を有する可能性があるものである。しかし、化学的変異はＭＭＲ欠損性と組み合わせて利用することができ、未確定のメカニズムにより、そのような変異による毒性があまりない。次に高頻度変異動物が飼育され、遺伝的に変化するＢ細胞を生産する動物が選択され、これが単離、クローニングされ、遺伝的に可変性の細胞を生産するために有用な新しい細胞株を同定することができる。一度新しい形質が同定されると、前記ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、当業者が利用する技術により前記対立遺伝子を直接ノックアウトするか、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子がない動物とつがいにするように飼育し、望みの形質および安定的なゲノムを持つ子孫を選択することで除去されうる。別の代替法としては、ＲＥ−ＬＯＸ発現系を利用する方法であり、これによって遺伝的に多様な免疫グロブリンプロフィールを含む動物が確立されると、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子が前記動物ゲノムからスプライシングされる。さらに別の代替法として、コルチコステロイド存在下、外因性遺伝子を発現した前記ステロイド誘導ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）ベクターなどの誘導ベクターを利用する方法がある。
【００４６】
変異は、前記細胞または動物の遺伝子型の変化を分析することで、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または対象遺伝子と関連したアミノ酸を検討することで、検出され得る。変異は、抗体力価の産生をスクリーニングすることで検出され得る。変異型ポリペプチドは、変異型遺伝子でコード化されるタンパク質の電気泳動移動度、分光学的特性、または他の物理的または構造的特徴の変化を同定することで検出され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕで、単離型またはモデル系で、タンパク質の機能変化をスクリーニングすることもできる。これだけに限らないが、Ｉｇ分泌など、対象遺伝子の機能と関連した細胞または動物の特徴変化をスクリーニングすることができる。
【００４７】
前記ドミナントネガティブ対立遺伝子を発現した細胞は、誘導可能に前記細胞から除去されるなどのように、前記細胞が遺伝的にもう一度安定になり、異常に高い割合で変異が蓄積しない場合は、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子をオフにできる点で、「回復」することができる。前記ポリヌクレオチドは、構成的活性化プロモーター断片（これだけに限らないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、またはＬＴＲ配列など）を含む発現ベクター、またはステロイド誘導ｐＩＮＤベクターなどの誘導プロモーター配列にクローニングされる可能性があり、前記ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現が制御される可能性がある。前記ｃＤＮＡは、形質移入によって前記細胞に導入される。前記望みの発現型または形質を同定後、前記生物は遺伝的に安定化する可能性がある。
【００４８】
ミスマッチ修復タンパク質と核酸配列の例には、マウスＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：５および６）、ヒトＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：７および８）、ヒトＰＭＳ１（配列ＩＤ番号：９および１０）、ヒトＭＳＨ２（配列ＩＤ番号：１１および１２）、ヒトＭＬＨ１（配列ＩＤ番号：１３および１４）、ヒトＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：１５および１６）を含む。
【００４９】
抗原の親和性が上昇したことを示す変異型抗体の配列が決定され、前記野生型（ＷＴ）Ｈ３６親抗体の配列と比較された。アミノ酸をプロリンに置換させると、前記免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖の可変領域に導入した場合、抗原の親和性が上昇する効果があることが発見された。特定の操作理論に縛られることなく、前記プロリンは、限局した強度の高い領域を導入し、前記免疫グロブリン分子、特に前記抗原結合部位周辺の領域に安定性を与えると考えられる。
【００５０】
従って、本発明は、前記重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸とプロリンまたはヒドロキシプロリン（まとめて「プロリン」と呼ばれる）との置換を有する、抗体の親和性を増強させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、プロリンの置換が前記重鎖可変ドメインにある。いくつかの実施形態では、プロリンの置換が前記軽鎖可変ドメインにある。他の実施形態では、プロリンの置換が前記免疫グロブリン分子の可変ドメインの重鎖および軽鎖の両方にある。いくつかの実施形態では、前記プロリンが非極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン）を有する別のアミノ酸と置換される。いくつかの実施形態では、非極性側鎖を有するアミノ酸と非極性側鎖を有する他のアミノ酸をさらに置換することで、前記抗原に対する抗体の親和性が増強されてもよい。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記重鎖のフレームワーク領域にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記軽鎖のフレームワーク領域にある。
【００５１】
他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記重鎖および軽鎖のフレームワーク領域にある。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記重鎖の第１のフレームワーク領域（ＦＲ１）にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記重鎖の第２のフレームワーク領域（ＦＲ２）にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記重鎖の第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記重鎖の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）にある。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記軽鎖の第１のフレームワーク領域（ＦＲ１）にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記軽鎖の第２のフレームワーク領域（ＦＲ２）にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記軽鎖の第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）にある。他の実施形態では、前記アミノ酸の置換が前記軽鎖の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）にある。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、配列ＩＤ番号：１８の６位のプロリンがアラニンに置換される。他の実施形態では、配列ＩＤ番号：１８の６位のプロリンがアラニンに置換され、配列ＩＤ番号：１８の９位のグリシンおよび／または配列ＩＤ番号：１８の１０位のリジンが、非極性側鎖を有するアミノ酸（好ましくは、それぞれバリンおよびアルギニン）で置換される。他の実施形態では、配列ＩＤ番号：２１の２２位のプロリンがロイシンと置換される。
【００５３】
リツキシマブ（リツキサン）およびトラスツズマブ（ハーセプチン）などの抗癌抗体や、メシル酸イマチニブ（グリベックまたはＳＴＩ−５７１）などの小分子シグナル伝達阻害剤の最近の臨床的、商業的成功は、造血器悪性腫瘍や固形腫瘍の「標的」療法で大きな利益を生み出した。小分子の細胞毒性物質と比べ、前記治療効果を維持または上昇しながら、これらのアプローチで毒性が低くなることが期待される。
【００５４】
放射性核種、薬物、または毒素と結合した抗体は、特異的な抗原結合性のため、本質的に特異性を有する。特異性の程度は、標的腫瘍に対する抗原の相対的特異性に依存する。前記放射性核種は、全身を循環する間に正常組織を照射し（ヒト化抗体では長くなる）、薬物と毒素は酵素的、非酵素的機序により前記抗体から分離されうるために、正常組織に前記毒素を送達するため、前記合成毒性成分は前記アプローチを複雑にする。さらに、前記結合があると、前記身体が前記複合体を異物として認識し、結果として前記肝臓などの除去臓器に取り込まれる可能性がある。
【００５５】
モノクローナル抗体の治療の可能性を最大限にするこれまでの試みは、ほとんどが前記標的抗原に対する親和性と結合力を改善することに焦点を当てていた。本発明の方法では、非結合抗体の効果を最大限とすることができる。亢進の背後にあるメカニズムに関わらず、前記タンパク質のエフェクター機能（Ｆｃ）が亢進した分子を生産、アッセイすることで、モノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）を改善させることが本発明の目的である。これらの新しい分子は、次にヒト腫瘍を標的とし、腫瘍細胞を死滅させる効力が高い可能性がある。前記で得られた産物は、毒性を上昇させずに低用量で機能することが予想され、治療域が上昇することになる。さらに、これまでの研究の多くで、腫瘍への抗体の付着は比較的少ないことが示された（Ｓａｎｄｓ，Ｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ｓｕｐｐｌ）１９９０，５０：８０９ｓ〜８１３ｓ）。エフェクター機能の亢進により治療効果が上昇するため、ヒト化モノクローナル抗体がヒト腫瘍に見られる付着率で治療効果を有する可能性がある。
【００５６】
本発明の方法は、これだけに限らないが、癌治療用に現在開発されている抗体など、前記モノクローナル抗体のエフェクター機能を増強させることができる。グリコシル化は、抗体エフェクター機能が操作される可能性がある、多数の方法の中で唯一の方法である。前記技術は、グリコシル化パターンおよび／または他の既知および未知の機序で、アミノ酸配列の変化が最小限のより強力な抗体を生み出すことができるため、本研究に理想的である。これらの変化は、前記ＤＮＡの遺伝的変化により生じ、免疫グロブリンモチーフ自体のアミノ酸配列、または前記翻訳後パターンの配列または性質をコントロールする細胞機構が生じてもよい。
【００５７】
本発明の方法を利用し、これだけに限らないが、治療標的に対するげっ歯類の抗体、そのキメラ版およびヒト化版を含む抗体の特徴を増強させてもよい。ＭＯＲＡｂ−０３と呼ばれるそのような抗体の１つは、正常な胎盤および妊娠性絨毛癌の細胞表面にある成人型、高親和性葉酸結合糖タンパク質抗原（指定ＭＯＲＡｂ−０３抗原）に結合する。発現プロフィールは、ＭＯＲＡｂ−０３抗原では正常組織の分布が制限され、単層上皮のサブセット（Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ，Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，Ｋｏｕｌｏｓ  ＪＰ，Ｌｅｗｉｓ  ＪＬ  Ｊｒ，Ｏｅｔｔｇｅｎ  ＨＦ，Ｏｌｄ  Ｕ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９８５  Ａｐｒ  １５；３５（４）：４６９〜７５；Ｃｏｎｅｙ  ＬＲ，Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉ  Ａ，Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｌ，Ｆｒａｓｃａ  Ｖ，Ｋａｍｅｎ  ＢＡ，Ｃｏｌｎａｇｈｉ  ＭＩ，Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ＶＲ  Ｊｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｎｏｖ  １５；５１（２２）：６１２５〜３２）、およびヒト膵臓、近位尿細管、気管支の新鮮凍結切片で主に発現されることを示している。ＭＯＲＡｂ−０３抗原の分布は、１５０腫瘍細胞株と正常細胞の培養の免疫組織化学的分析により、またＭＯＲＡｂ−０３抗原特異的マウス由来モノクローナル抗体（Ｌ−２６）を用い、原発性腫瘍組織において、さらに決定された。ＭＯＲＡｂ−０３抗原は、すべての培養された絨毛癌と奇形癌で発現されることが分かった。原発性腫瘍の免疫組織化学像では、有意な数の卵巣腫瘍、および他の組織学的タイプの腫瘍４００種類以上で、ＭＯＲＡｂ−０３抗原の発現が認められた（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｉ，Ｓａｉｇｏ  ＰＥ，Ｌｅｗｉｓ  ＪＬ  Ｊｒ，Ｏｌｄ  Ｕ，Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３  Ｆｅｂ；１４２（２）：５５７〜６７）。体腔上皮由来の卵巣癌は、前記ＭＯＲＡｂ−０３抗体で最も一貫して、強く免疫染色され、５６例中５２例がＭＯＲＡｂ−０３陽性であることが示された。ＭＯＲＡｂ−０３抗原は正常な胎児または成人の卵巣で検出されたが、良性卵巣嚢胞のサブセットでは上皮内側にあることが認められた。
【００５８】
本発明の方法を利用し、前記現在の産業基準で明記された治療および製造要件（つまり、高い親和性と生産性）を満たすことができる抗体を生産する生産ラインを開発してもよい。本発明の方法は、標準的なマウスハイブリドーマ技術により作成したｍＡｂｓへの応用に適している。いくつかの実施形態では、マウス相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩｇＧ１ｋ骨格に移植され、前記軽鎖および重鎖ｃＤＮＡがＮＳ０細胞にトランスフェクトされ、この産業においては「トランスフェクトーマ」として知られる抗体生産系が生成する。前記ＣＤＲをヒト免疫グロブリン配列に移植するプロセスは、「ヒト化」と呼ばれる。残念ながら、前記トランスフェクトーマ株が１ｐｇ／細胞／１日未満の割合でＭＯＲＡｂ−０３を生産し、前記ヒト化プロセスにより前記親和性が減少し、現在はマイクロモルの範囲にある。本発明の方法により、良好な抗原結合活性（低ナノモル解離定数）と生産率（>１０ｐｇ／細胞／１日）を示す、最適なヒト化ＭＯＲＡｂ−０３抗体の産生を成功させることができた。標的としてヒト卵巣癌細胞、エフェクター細胞として末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＡＤＣＣアッセイでは、２００ｎｇ／ｍｌのＮＳ０細胞で生産されたＭＯＲＡｂ−０３は標的細胞の４４％の溶解を媒介することができることが示されたが、対照ＩｇＧ１抗体を介した溶解は約６％のみであった（図７）。対照的に、ＣＨＯ細胞で生産された同濃度のＭＯＲＡｂ−０３は標的細胞の３２％の溶解を媒介し、２７％低下した（２標本ｔ検定＝０．０００８）（図４）。複数の独立したＡＤＣＣアッセイで同様の傾向が示され、細胞で生産されたＭＯＲＡｂ−０３  ＣＨＯではＮＳＯ細胞で生産されたＭＯＲＡｂ−０３と比べ、５０％も活性が低下することが示された。ＣＨＯはＦＤＡによって認識された標準的な細胞株であり、契約製造機関によってよく特徴付けられている。その長所は、その成長の頑健性と安定性、異なる製造スキームと無血清培地の順応性、その高能力と抗体産生の再現性である。ＮＳ０細胞産生ＭＯＲＡｂ−０３と同等またはそれ以上のＡＤＣＣ活性を持つＭＯＲＡｂ−０３産生ＣＨＯ株は、治療用抗癌生物生産にとって、非常に貴重な製造資産である。ＡＤＣＣ活性が上昇した抗体を産生する変異体を同定するため、本発明の方法はＭＯＲＡｂ−０３産生細胞株に適用されてもよい。
【００５９】
まとめると、前記ＭＯＲＡｂ−０３抗原は、正常組織で発現が非常に制限され、大きな卵巣腫瘍で多く発現された糖タンパク質である。前記抗体はＡＤＣＣを誘導することができるため、卵巣癌の治療に優れた薬物候補となる。
【００６０】
本発明の背景に関するさらなる情報については、以下の参考文献を参照してもよく、それぞれの全体がこの参照により本明細書に組み込まれている。
【００６１】
【表１−１】
2007500508.tif 000003
【００６２】
【表１−２】
2007500508.tif 000004
【００６３】
【表１−３】
2007500508.tif 000005
【００６４】
上記に開示された内容は、一般に本発明について説明している。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することで得られるが、これは説明のみの目的でここに提供されているものであり、本発明の範囲を制限する意図はない。
【実施例１】
【００６５】
ハイブリドーマ細胞のドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の安定的な発現
それ以外にＭＭＲ成熟細胞のドミナントネガティブ対立遺伝子の発現がこれらの宿主細胞のＭＭＲを欠損性にすることが、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）によって示された。ＭＭＲ欠損細胞を作成することで、宿主生物の子孫のゲノム全体で遺伝子を変化させることができ、特徴が変化した生化学物質を生産することができる遺伝子組み換え子孫または同胞の集団を生み出すことができる。本特許出願では、抗体産生細胞のドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の使用について示し、これだけに限らないが、げっ歯類ハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、ヒト免疫グロブリン遺伝子産物を産生するキメラげっ歯類細胞、免疫グロブリン遺伝子を発現するヒト細胞、単鎖抗体を産生する哺乳類細胞、哺乳類免疫グロブリン遺伝子、または単鎖抗体に含まれる分子など、キメラ免疫グロブリン分子を産生する原核細胞を含む。抗体を産生するために使用される上述の細胞発現系は、抗体治療の分野で当業者に周知である。
【００６６】
ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を用い、ＭＭＲ不完全ハイブリドーマを作成する能力について証明するため、本発明者らは、まず、前記ヒトＰＭＳ２（ＨＢＰＭＳ２と呼ばれる細胞株）を含む発現ベクター、ここでＰＭＳＩ３４（ＨＢ１３４と呼ばれる細胞株）と呼ばれるこれまでに発表されたドミナントネガティブＰＭＳ２変異株を用い、またはインサートを用いずに（ＨＢｖｅｃと呼ばれる細胞株）、前記ヒトＩｇＥタンパク質に対する抗体を産生することが知られているマウスハイブリドーマ細胞株をトランスフェクトした。結果より、前記ＰＭＳ１３４変異株が実際に強いドミナントネガティブ効果を示し、ＭＭＲ欠損性を生化学的、遺伝的に発現させることができることを示された。完全な長さのＰＭＳ２によりＭＭＲ活性が低下するが、前記空ベクターを含む細胞に効果は認められないという所見は意外であった。前記方法の簡単な説明が以下に示されている。
【００６７】
前記ＭＭＲ成熟マウスＨ３６ハイブリドーマ細胞株に、ＭＭＲ活性を評価するため、様々なｈＰＭＳ２発現プラスミドとレポーターコンストラクトをトランスフェクトした。前記ＭＭＲ遺伝子は、前記ｐＥＦ発現ベクターにクローニングし、前記クローニング部位の上流に伸長因子プロモーターを含み、次に哺乳類ポリアデニル化シグナルを含ませた。このベクターには、このプラスミドを保持する細胞を選択することができるＮＥＯｒ遺伝子を含んだ。簡潔に言えば、前記製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のプロトコールに従い、ポリリポソームを用いて各ベクター１μｇを細胞にトランスフェクトさせた。１０日間、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を選択し、Ｇ４１８耐性細胞を一緒にプールし、遺伝子発現を分析した。前記ｐＥＦ作成物には、エキソン２から前記ＥＦ遺伝子のエキソン１を分離したイントロンが含まれ、前記ポリリンカークローニング部位の５’末端に並列に並べた。これにより、前記スプライスされた作成物を発現した細胞の急速逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）スクリーニングが可能となった。１７日の時点で、１００，０００個の細胞を単離し、これまでに説明されたとおり、前記トリゾール法によりそのＲＮＡを抽出した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，８．（１９９５）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＰＭＳ２  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９：３２９〜３３４）。ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写させ、前記ＥＦ遺伝子のエキソン１に位置するセンスプライマー（５’−ｔｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｇｇｇ  ｔｔｔ  ｇｃｃ  ｇ−３’）（配列ＩＤ番号：２３）と、前記開示されたヒトＰＭＳ２  ｃＤＮＡのｎｔ  ２８３を中心としたアンチセンスプライマー（５’−ｇｔｔ  ｔｃａ  ｇａｇ  ｔｔａ  ａｇｃ  ｃｔｔ  ｃｇ−３’）（配列ＩＤ番号：２４）を用いてＰＣＲ増幅し、全長と前記ＰＭＳ１３４遺伝子発現の両方を検出した。反応はこれまでに説明された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＰＭＳ２  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１９５〜２０６）緩衝液と条件により実施し、９４℃で３０秒、５２℃で２分、７２℃で２分を３０サイクルの増幅パラメータとして用いた。反応は、アガロースゲルで分析した。図１は、安定的に形質導入されたＨ３６細胞でＰＭＳ発現のそれぞれの例を示している。
【００６８】
これらの遺伝子でコード化されたタンパク質の発現は、これまでに報告された手順に従い、前記タンパク質のＮ末端に位置する第１の２０アミノ酸に対するポリクローナル抗体を用い、ウエスタンブロット法で確認した（データは示さず）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）。
【実施例２】
【００６９】
ｈＰＭＳ１３４はハイブリドーマ細胞のＭＭＲ活性と高頻度変異に欠損を発生させる
ＭＭＲ欠損性の特徴は、宿主細胞のゲノムに不安定なマイクロサテライト反復が発生していることである。この表現型は、マイクロサテライト不安定性（ＭＩ）と呼ばれる（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ，ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９〜１９６０；Ｐａｌｏｍｂｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６：４  １７）。ＭＩは、宿主細胞のゲノム全体にある反復モノ、ジ、および／またはトリヌクレオチドの欠失および／または挿入から成る。真核細胞の広範な遺伝分析では、ＭＩを作成できる生化学的欠損のみが欠損ＭＭＲであることが分かった（Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｍｐｌｅ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：２７４〜２７６；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３７７：６７５〜６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ  Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９〜４９４）。ＭＩを促進する際に欠損ＭＭＲが有するこの固有の特徴を考慮し、現在は宿主細胞にＭＭＲ活性がない調査での生化学的マーカーとして利用されている（Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３７７：６７５〜６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ  Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９〜４９４；Ｌｉｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２７：１７〜２５）。
【００７０】
真核細胞のＭＭＲ欠損性の検出に用いる方法は、フレームシフトのためリーディングフレームが中断したコード領域に挿入された、ポリヌクレオチド反復配列を有するレポーター遺伝子を採用することである。ＭＭＲが欠損な場合、前記レポーター遺伝子が前記ポリヌクレオチド反復配列にランダム突然変異を獲得し（つまり、挿入および／または欠失）、オープンリーディングフレームとレポーターを含むクローンを生じる。本発明者らは、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を利用し、ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、ＨＢＰＭＳ  １３４細胞のＭＭＲ活性を測定した。前記レポーター作成物ではｐＣＡＲ−ＯＦを利用し、これはハイグロマイシン耐性（ＨＹＧ）遺伝子とそのコード領域の５’末端に２９塩基対のフレーム外ポリＣＡ領域を含むβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。フレーム回復変異（つまり、挿入または欠失）がトランスフェクション後に生じない限り、前記ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターはβガラクトシダーゼ活性を発生させない。ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、ＨＢ１３４細胞は、実施例１で説明したプロトコールの後、複製反応によりｐＣＡＲ−ＯＦベクターをそれぞれトランスフェクトした。細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．５ｍｇ／ｍｌのＨＹＧ中で選択し、前記ＭＭＲエフェクターと前記ｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドの両方を保持する細胞を選択した。前記ｐＣＡＲベクターをトランスフェクトした細胞全てで、同数のＨＹＧ／Ｇ４１８耐性細胞が生じた。培養は、次に増殖させ、ｉｎ  ｓｉｔｕでβ−ガラクトシダーゼ活性について、また細胞抽出物の生化学的分析により検討した。ｉｎ  ｓｉｔｕ分析では、１００，０００個の細胞を収集し、１％グルタールアルデヒドで固定し、リン酸緩衝生理食塩水溶液で洗浄し、２時間、３７℃で２４ウェルプレート中に１ｍｌのＸ−ｇａｌ基質溶液（０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、３．３ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、３．３ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２％のＸ−Ｇａｌ）でインキュベートした。反応は、５００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液で停止し、分析のため、顕微鏡スライドに移動した。細胞２００個のフィールド３種類それぞれを青色（β−ガラクトシダーゼ陽性細胞）または白色（β−ガラクトシダーゼ陰性細胞）で計算し、ＭＭＲの不活化を評価した。表１は、これらの研究の結果を示している。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞は、ＨＢｖｅｃ細胞で観察されたが、１フィールド当たり１０％の細胞が、ＨＢ  １３４培養でβ−ガラクトシダーゼ陽性であり、１フィールド当たり２％の細胞が、ＨＢＰＭＳ２培養でβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
【００７１】
細胞抽出物は、上記の培養から調整し、これまでに報告されたとおり、定量的生化学アッセイによりβ−ガラクトシダーゼを測定した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ  Ｊｕｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ，ｃ−ＪＵＮ  ａｎｄ  ＪＵＮＤ，ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ｍｙｂ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｉａ  ａｎ  Ａｐ１  ｌｉｋｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６６５〜１９６７２）。簡潔に言えば、１００，０００個の細胞を、２００μｌｓの０．２５ＭのＴｒｉｓ中、ｐＨ８．０で回収、遠心分離、再懸濁した。細胞は、３回冷凍／解凍で溶解させ、上清を１４，０００ｒｐｍｓで遠心分離（ｍｉｃｒｏｆｕｇａｔｉｏｎ）後に回収し、細胞片を除去した。タンパク質含有量は、ＯＤ２８０で分光学的分析により決定した。生化学的アッセイでは、２０μｇのタンパク質を、４５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ＭのＮａＰＯ４、０．６ｍｇ／ｍｌのクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む緩衝液に追加した。反応は、１時間インキュベートし、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３を添加することによって終了し、５７６ｎｍにて分光測光法で分析した。Ｈ３６細胞溶解物を使用し、バックグラウンドを差し引いた。図２は、前記様々な細胞株の抽出物における前記β−ガラクトシダーゼ活性を示している。示されているとおり、前記ＨＢ１３４細胞は、最高量のβ−ガラクトシダーゼを産生したが、前記ｐＣＡＲ−ＯＦを含む前記ＨＢｖｅｃ細胞に活性は認められなかった。これらのデータは、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を用い、ＭＭＲ欠損ハイブリドーマ細胞を生成する能力を証明している。
【００７２】
【表２】
2007500508.tif 000006
【実施例３】
【００７３】
結合親和性が高く、および／または免疫グロブリン産生が増加した抗体を産生するハイブリドーマクローンを同定するスクリーニング戦略
本明細書内で紹介されている方法の応用は、ＭＭＲ欠損ハイブリドーマまたは細胞を産生する他の免疫グロブリンを利用し、生化学的特徴が変化した抗体を産生する免疫グロブリン遺伝子を遺伝的に変化させるものである。この適用の例はこの実施例の中で証明され、これによって、抗ヒト免疫グロブリンＥ（ｈＩｇＥ）ＭＡｂを産生するＭＭＲ欠損細胞株のＨＢ１３４ハイブリドーマ（実施例１）を２０世代増殖させ、そのクローンは９６ウェルプレートで単離し、ｈＩｇＥ結合をスクリーニングした。図３は、高親和性ＭＡｂｓを産生するクローンを同定するスクリーニング法の概要を示しており、前記タンパク質の軽鎖または重鎖可変領域の変化が原因と推定される。前記アッセイではプレート酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用し、高親和性ＭＡｂｓを産生するクローンをスクリーニングした。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４プールの単細胞を含む９６ウェルプレートは、増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎仔血清）＋０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８において９日間増殖させ、クローンが前記発現ベクターを保持していることを確認した。９日後、プレートはｈＩｇＥプレートＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、それによって９６ウェルプレートは、５０μｌｓの１μｇ／ｍｌのｈＩｇＥ溶液で４時間、４℃でコーティングさせた。プレートは、カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ−／−）で３回洗浄し、室温で１時間、１００μｌｓのＰＢＳ−／−と５％ドライミルク中でブロッキングした。ウェルは、１：５に希釈した各細胞クローンの条件培地を含む１００μｌｓのＰＢＳ溶液で、２時間洗浄、インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、室温で１時間、１：３０００に希釈した２次抗体と結合したヒツジ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む５０μｌｓのＰＢＳ−／−溶液でインキュベートさせた。次にプレートは、ＰＢＳ−／−で３回洗浄し、室温で１５分間、５０μｌｓのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（ＢｉｏＲａｄ）でインキュベートし、各クローンで生産された抗体量を検出した。反応は、５０μｌｓの５００ｍＭ重炭酸ナトリウムを添加することで停止し、ＢｉｏＲａｄプレートリーダーを用い、４１５ｎｍでのＯＤで分析した。次に、バックグラウンド細胞（Ｈ３６コントロール細胞）においてシグナルが増強することが示されたクローンを単離し、１０ｍｌの培地に増殖し、３回の実験でＥＬＩＳＡデータの特徴をさらに確認した。ＥＬＩＳＡは前記同じクローンの条件培地（ＣＭ）で実施し、各ウェルの条件培地で総Ｉｇの生産を測定した。次に、ＥＬＩＳＡシグナルを増強させ、抗体レベルが上昇したクローンでさらに、実施例４で説明されるとおり、抗体が過剰発現および／または過剰分泌した変異体を分析した。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４細胞の９６ウェルプレート５枚を分析し、前記ＨＢｖｅｃコントロールと比べ、光学濃度（ＯＤ）値が高い、有意な数のクローンが前記ＭＭＲ欠損ＨＢ１３４細胞で観察されることが分かった。図４は、親和性が高く、（ＩｇＥの場合）特異的抗原に結合する抗体を産生するＨＢ１３４クローンの代表例を示している。図４では、９６ウェルのＨＢｖｅｃ（左のグラフ）またはＨ���１３４（右のグラフ）の分析による生データを提供し、１）ＩｇＥ抗体への結合力が増強された抗体可変ドメインの遺伝的変化、または２）前記抗体分子の過剰生産／分泌につながる細胞宿主の遺伝的変化により、ＨＢ１３４プレートの２クローンでＯＤの読み値が高くなることを示している。抗Ｉｇ  ＥＬＩＳＡでは、図４で示される２種類のクローンで、ＩｇレベルがＣＭ内にあり、ＯＤ値が低いことを示す周囲のウェルと同等であることが分かった。これらのデータは、前記抗体の抗原結合ドメインで遺伝的変化が発生し、これにより抗原結合力が高くなる可能性があることを示している。
【００７４】
ＥＬＩＳＡで決定されたとおり、ＯＤ値が高いクローンは、遺伝子レベルでさらに分析し、前記軽鎖または重鎖可変領域に変異が発生し、結合親和性が増強され、ＥＬＩＳＡシグナルが強くなることが確認された。簡潔に言うと、上述の通り、トリアゾール法により１００，０００個の細胞を採取し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が示したとおり、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩで逆転写し、前記可変部の軽鎖と重鎖に含まれる抗原結合部位でＰＣＲ増幅させた。これらの遺伝子の性質は不均一であるため、以下の縮重プライマーを利用し、前記親Ｈ３６株の軽鎖および重鎖対立遺伝子を増幅させた。
【００７５】
軽鎖センス：５’−ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ−３’  （配列ＩＤ番号：ｌ）
軽鎖アンチセンス：５’−ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ−３’  （配列ＩＤ番号：２）
重鎖センス：５’−Ａ（Ｇ／Ｔ）ＧＴＮ  （Ａ／Ｃ）ＡＧ  ＣＴＮ  ＣＡＧ  （Ｃ／Ｇ）ＡＧ  ＴＣ−３’  （配列ＩＤ番号：３）
重鎖アンチセンス：５’−ＴＮＣ  ＣＴＴ  Ｇ（Ａ／Ｇ）Ｃ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  Ａ（Ｇ／Ａ）（Ａ／Ｔ）Ｃ−３’  （配列ＩＤ番号：４）
【００７６】
変性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、７２℃で１分間、３５サイクル実施した。生成物は、アガロースゲルで分析した。予想される分子量の生成物は、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ  １０１）で前記ゲルから精製され、Ｔ−ｔａｉｌｅｄベクターにクローニング、配列決定し、前記可変部の軽鎖と重鎖の野生型配列を同定した。前記野生型配列が決定したら、非変性プライマーを作り、ポジティブＨＢ１３４クローンをＲＴ−ＰＣＲ増幅させた。軽鎖および重鎖の両方を増幅、ゲル精製し、対応するセンスおよびアンチセンスプライマーで配列決定した。前記ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列では、前記内因性免疫グロブリン遺伝子それぞれの配列データを示しているが、ＰＣＲで誘導された変異によるものではない。クローンの配列は、次に配列比較で前記野生型配列と比較した。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖にｉｎ  ｖｉｖｏで変異を作る能力の例が、図５に示されており、ＨＢ１３４クローン９２は、ＥＬＩＳＡでｈＩｇＥシグナルが上昇していることを同定した。特異的センスおよびアンチセンスプライマーにより、前記軽鎖を増幅させた。前記軽鎖は、ＲＴ−ＰＣＲ増幅させ、前記で得られた生成物を精製し、自動ＡＢＩ３７７シーケンサーで分析した。クローンＡに示されるとおり、前記ＣＤＲ領域３の上流にある残基−４は、ＡＣＴからＴＣＴの遺伝的変化を有し、ＣＤＲ＃３のすぐ前にあるフレームワーク領域でＴｈｒがＳｅｒに変化している。クローンＢでは、前記ＣＤＲ領域の上流にある残基−６がＣＣＣからＣＴＣへの遺伝的変化を有し、ＣＤＲ＃２の前にあるフレームワーク領域でＰｒｏがＬｅｕに変化している。
【００７７】
免疫グロブリン遺伝子またはキメラ免疫グロブリン遺伝子のランダム変異を発生させる能力は、ハイブリドーマに限定されない。Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）は、これまでに高頻度変異のハムスター細胞を作成、外来遺伝子で変異を発生させる能力を示した。ヒト化抗体を作成する一般的な方法は、ＭＡｂ（げっ歯類宿主に免疫性を与えることで作成）からヒトＩｇ骨格にＣＤＲ配列を移植するものであり、前記キメラ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトし、これが前記ＣＨＯ細胞から分泌される機能性Ａｂを産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２〜４１３）。この適用内で説明されている方法は、げっ歯類細胞株、植物、酵母、原核細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされたＩｇ遺伝子またはキメラＩｇの遺伝的変化を作成するためにも有用である（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：１４８３〜１４９４）。
【００７８】
これらのデータは、高頻度変異可能なハイブリドーマ、または他の増殖および選択可能なＩｇ産生宿主細胞を作成し、これだけに限らないが、抗原結合親和性が上昇するなど、生化学的特徴が増強された抗体を産生する、構造が変化した免疫グロブリンを同定する能力を証明している。さらに、アミノ酸が変化した免疫グロブリン遺伝子にミスセンス変異を含む高頻度変異可能なクローンで、さらにｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、抗原除去、抗原などの結合のオン・オフの特徴が決定されうる。クローンはさらにその後のｉｎ  ｖｉｖｏ変異で増殖され、前述の戦略によりスクリーニングされ得る。
【００７９】
細胞または生物全体の遺伝的変異を生じる化学的突然変異誘発要因の利用は、これらの因子が「正常な」細胞に有する毒性作用のため、制限されている。ＭＭＲ欠損生物のＭＮＵなどの化学的突然変異誘発要因の利用でははるかに耐性があり、ＭＭＲ欠損性のみの遺伝的変異が１０〜１００倍増加する（Ｂｉｇｎａｍｉ  Ｍ，（２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  ａ  ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ  Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１〜８２）。この戦略は、化学的突然変異誘発要因を利用するため、免疫グロブリン遺伝子またはキメラにさらに変異を増加し、抗原結合親和性の亢進などの生化学的特徴が変化した機能性Ａｂを生じることができる方法として、ＭＭＲ欠損Ａｂ産生細胞で利用できる。
【実施例４】
【００８０】
抗体産生が増加した抗体産生細胞の生成
前述のスクリーニング戦略の後、Ｈ３６およびＨＢ１３４のクローンを分析することで、培地への抗体生産量が増加した有意な数のクローンを同定した。これらのクローンのサブセットはＥＬＩＳＡで決定されたとおり、前記可変領域に含まれる前記抗原結合ドメインの変異の結果として、より高いＩｇ結合性のデータを示したが、その他は抗体産生の「増強」を含むことが分かった。Ｍａｂの産生分泌量が増加したクローンのまとめは、表２に示されており、ＨＢ１３４細胞の有意な数のクローンで、Ｈ３６コントロール細胞と比べ、前記条件培地のＡｂ産生が亢進することが分かった。
【００８１】
【表３】
2007500508.tif 000007
【００８２】
前記条件培地（ＣＭ）のＭＡｂレベルが高いＨＢ１３４クローンの細胞分析を分析し、前記産生増加が単に前記Ｉｇ遺伝子座の遺伝的変化のためであり、前記抗体を産生するポリペプチドを過剰発現する可能性があるか否か、または分泌経路のメカニズムに影響する遺伝的変化により、分泌が亢進したためであるか否かを決定した。この問題を扱うため、ＣＭ内の抗体レベルが上昇した３種類のＨＢ１３４クローンを増殖させた。ウエスタンブロット分析用に１０，０００個の細胞を調整し、細胞内定常状態のＩｇタンパク質レベルをアッセイした（図６）。さらに、Ｈ３６細胞を標準的基準として利用し（レーン２）、げっ歯類の線維芽細胞（レーン１）をＩｇネガティブコントロールとして利用した。簡潔に言えば、細胞を遠心分離によりペレット化し、３００μｌのＳＤＳ溶解緩衝液（６０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、０．１Ｍの２−メルカプトエタノール、０．００１％のブロモフェノールブルー）で直接溶解させ、５分間沸騰させた。溶解物タンパク質は、４〜１２％の（Ｉｇ重鎖の分析用）ＮｕＰＡＧＥゲルで電気泳動により分離させた。ゲルは、４８ｍＭのＴｒｉｓ塩基、４０ｍＭのグリシン、０．０３７５％のＳＤＳ、２０％のメタノール中、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で電気ブロットし、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および５％のコンデンスミルク中、１時間、室温でブロッキングさせた。フィルターを、１：１０，０００に希釈されたヒツジ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体を用い、ＴＢＳ緩衝液中でプローブし、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、化学発光で検出した。実験は２回繰り返し、再現性を確認した。図６は代表的な分析を示しており、あるクローンのサブセットでＩｇ産生が亢進し、これはＡｂ産生の増加を説明しているが（レーン５）、他のクローンサブセットでは前記コントロールサンプルと同様の定常状態レベルを有し、前記ＣＭ内でＡｂレベルが高かったことを示している。これらのデータは、ＨＢ１３４クローンのサブセットに遺伝的変化が含まれ、これによって抗体の分泌が上昇するメカニズムを示唆している。
【００８３】
細胞または生物全体の遺伝的変異を生じる化学的突然変異誘発要因の利用は、これらの因子が「正常な」細胞に有する毒性作用のため、制限されている。ＭＭＲ欠損生物のＭＮＵなどの化学的突然変異誘発要因の利用でははるかに耐性があり、ＭＭＲ欠損性のみの遺伝的変異が１０〜１００倍増加する（Ｂｉｇｎａｍｉｉ  Ｍ，（２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  ａ  ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ  Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１〜８２）。この戦略では、化学的突然変異誘発要因を利用するため、免疫グロブリン遺伝子またはキメラにさらに変異を増加し、抗原結合性の亢進などの生化学的特徴が変化した機能性Ａｂを生じることができる工程において、ＭＭＲ欠損Ａｂ産生細胞で利用できる。
【実施例５】
【００８４】
新しいアウトプット形質を持つハイブリドーマ細胞の遺伝的安定性の確立
ＭＭＲの初期段階は、ＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαと呼ばれる２種類のタンパク質複合体に依存している（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）。ドミナントネガティブＭＭＲ対立遺伝子は、「補正された」ヌクレオチドを有するヌクレオチドの切除と重合に関与する下流の生化学物質を用い、これらの複合体形成を混乱させることができる。この適用の例は、ハイブリドーマ細胞株に発現された時、切断されたＭＭＲ対立遺伝子（ＰＭＳ１３４）と完全長のヒトＰＭＳ２がＭＭＲをブロッキングし、細胞分裂ごとにゲノム全体で遺伝的変化を獲得する高頻度変異細胞株となる能力を示している。抗体、単鎖抗体、免疫グロブリン遺伝子の過剰発現、および／または抗体分泌の亢進をコードする遺伝子に遺伝的変化を含む細胞株が産生されると、前記細胞宿主の遺伝的統合性を回復することが望ましい。これは、誘導ベクターを利用することで達成される可能性があり、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子はそのようなベクターにクローニングされ、Ａｂ産生細胞に導入される。前記細胞は誘導分子存在下および／または条件下で培養される。誘導ベクターには、これだけに限らないが、前記ステロイド誘導ＭＭＴＶ、テトラサイクリン制御プロモーター、温度感受性ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子、温度感受性プロモーターなど、化学的に制御されたプロモーターを含む。
【００８５】
上述の結果から、いくつかの結論が得られる。まず、ｈＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４が発現することで、ハイブリドーマ細胞のマイクロサテライト不安定性が上昇する。このマイクロサテライト不安定性の上昇はＭＭＲ欠損性が原因であることは、安定的に形質導入された細胞の抽出物を評価することで証明された。ＰＭＳ１３４が発現するとＭＭＲの極性に異常が生じ、これは５’方向からの修復を検査するようにデザインされた異種二重性（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ）を利用した場合にのみ観察された（前記３’方向からの修復で、同じ抽出物に重大な異常が観察された）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）。興味深いことに、ｈＭＬＨ１が不十分な細胞もＭＭＲに極性の異常を有しているが、この場合、３’方向からの選択的修復に影響する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＭｕｔＬａ  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９６４５〜１９６４８）。これまでの研究から、原核細胞および真核細胞の両方で、前記別の酵素成分が前記２種類の方向から修復を媒介することが分かっている。本発明者らの結果は、Ｄｒｕｍｍｏｎｄらの結果と（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２〜４１３）と組み合わせる、５’修復は主にｈＰＭＳ２に依存しているが、３’修復は主にｈＭＬＨ１に依存しているモデルを強く示唆している。ＰＭＳ２とＭＬＨ１の二量体複合体はこの方向性で作る。前記総合的結果も、方向性ＭＭＲの異常がＭＭＲ欠損表現型を生じるために不十分であることを証明しており、すべてのＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子が遺伝子組み換えハイブリドーマ細胞、またはＩｇ遺伝子産物を生産する細胞株の産生に有用であることを示している。さらに、そのようなＭＭＲ対立遺伝子の利用が、生化学的特徴が変化した遺伝子組み換えＩｇポリペプチド、および多量の抗体分子を生産する宿主細胞の生成に有用である。
【００８６】
本応用から分かる別の方法は、ＭＭＲの遮断に利用されるすべての方法を実行し、抗体産生細胞で高頻度変異を作成できる方法であり、これだけに限らないが、抗原結合性の上昇、薬物動態学的プロフィールなどの生化学的特徴が亢進した遺伝子組み換え抗体ができる可能性がある。これらのプロセスを利用して、実施例４、図６に示されるとおりＩｇ発現が亢進し、および／または表２に示されるとおり抗体分泌が上昇した抗体産生細胞を作成することもできる。
【００８７】
さらに、本発明者らは、抗体産生細胞でＭＭＲのブロッキングを利用し、Ｉｇ遺伝子の遺伝的変化を促進することにより、これだけに限らないが、抗原結合親和性の上昇など、生化学的特徴が変化する可能性があることを証明した（図５ＡおよびＳＢ）。そのような細胞におけるＭＭＲの遮断は、細菌、酵母、原虫、昆虫、げっ歯類、霊長類、哺乳類細胞、ヒトを含む全ての種のドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を利用して行うことができる。ＭＭＲの遮断は、前記ＭＭＲ生化学的経路に関与する全ての遺伝子に関与するアンチセンスＲＮＡまたはデオキシヌクレオチドを利用することで発生させることもできる。ＭＭＲの遮断は、これだけに限らないが、抗体などのＭＭＲ複合体サブユニットと干渉するポリペプチドを利用して行うことができる。最後に、ＭＭＲの遮断は、これだけに限らないが、ＭＭＲを遮断することが示された非加水分解性ＡＴＰアナローグなどの化学物質を利用して行うことができる（Ｇａｌｉｏ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＡＴＰ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＭｕｔＳ  ａｎｄ  ＭｕｔＬ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２３２５〜２３３１）。
【実施例６】
【００８８】
高親和性抗体を産生する変異型Ｈ３６細胞株の遺伝子配列の分析
前記親クローンと比べ、前記抗体の親和性上昇に寄与する前記免疫グロブリンコード配列の変異について、前記Ｈ３６変異型細胞株によって産生された抗体の軽鎖および重鎖の核酸配列を検討した。この結果は、表３に示した。このデータは、前記重鎖および軽鎖の可変ドメイン両方におけるプロリン置換が、抗体の抗原に対する親和性上昇に寄与することを示している。特定のホットスポットは、配列ＩＤ番号：６のアミノ酸の６位にあるように見られ、ここにおいてアミノ酸置換が起こり、ＨＢ９１−４７、ＨＢ１３４ＤＲＭＡ１３、ＨＢ１３４ＤＲＭＡ５５で前記親配列のアラニンがプロリンに変化した。これら３つのクローンは、９位および１０位の変異も有していた。９位では、前記親配列のバリンがグリシンまたはアルギニンに置換されていたが、配列ＩＤ番号：６の１０位で、前記親配列のアルギニンがいずれの場合もリジンに置換されていた。
【００８９】
【表４】
2007500508.tif 000008
【００９０】
前記遺伝子組み換え抗体は、以下の配列の違いとコンセンサス配列を示している。
【００９１】
【表５】
2007500508.tif 000009
【００９２】
【表６】
2007500508.tif 000010
【００９３】
前記データは、前記軽鎖では、配列ＩＤ番号：２１の２２位で軽鎖の第２フレームワーク領域（ＦＲ２）がプロリンに置換され、前記抗体の結合親和性が上昇したことを示している。
【実施例７】
【００９４】
前記エフェクター機能を判定する効率的なスクリーニングシステム
本発明の方法を用いて作成した抗体クローン変異体により抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が上昇すると、おそらく以下のように検出される。１つの実施形態では、健常ドナーから単離されたヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）がエフェクター細胞として利用され得る。簡潔に言えば、４００ｍｌの全血をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１：１（容積：容積）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）溶液に入れ、２，０００  ＲＰＭ、１８℃で、３０分間遠心分離した。前記単核細胞を含む間期を回復させ、新しい試験管に移し、細胞はＰＢＳで洗浄した。赤血球細胞は、次にＡＣＫ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮＨ４Ｃ１、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）で５分間、室温にて溶解させた。ＰＢＭＣは再び洗浄し、トリパンブルー排除によりその数と生存度を決定した。典型的には、２×１０８個以上の細胞がこの方法で回復され、このうち６０％は凍結保存とその後の培養に耐えるものである（以下を参照）。ＰＢＭＣは、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含む完全高グルコースＲＭＰＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、細胞密度２０×１０６／ｍｌで懸濁させた。細胞は、１ｍｌ／バイアルで凍結用バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）に移し、使用するまで−８０℃で保存した。細胞は、急速に３７℃にさらし、事前に暖めた競合ＲＰＭＩで１回洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えインターロイキン２（ｈＩＬ−２）（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む完全高グルコースＲＰＭＩに、細胞密度２．５×１０６／ｍｌで再懸濁し、３日間、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。このインキュベーションの最後に、ＰＢＭＣの生存度が典型的には８５％を超え、前記予想収率では６００個以上の抗体産生クローンをスクリーニングすることができ、エフェクター：標的細胞比が５：１であると想定された。前記アッセイの前に、細胞を一度ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、トリパンブルー排除で計数し、ＣＤ−ＣＨＯ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、ＡＤＣＣアッセイに使用した。５，０００個のクローンをスクリーニングするためには、約１０件のドナーからＰＢＭＣを単離することが必要である。従来は、この数で望みの特徴を持ったクローンの単離に十分であった。各ドナーのＰＢＭＣは別のスクリーニングに利用され、他のドナーのＰＢＭＣとは混合されない。
【００９５】
別の実施形態では、ヒト安定株がエフェクター細胞の別の供給源として使用される。Ｕ９３７およびＨＬ−６０細胞（それぞれＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２およびＣＣＬ−２）がエフェクター機能を持つようにできることが報告された（Ｓａｒｍａｙ  Ｇ，Ｌｕｎｄ  Ｊ，Ｒｏｚｓｎｙａｙ  Ｚ，Ｇｅｒｇｅｌｙ  Ｊ，Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  Ｍａｙ；２９（５）：６３３〜９）。このアプローチでは、これらの細胞が試験抗体（例えば、腫瘍細胞に応用された腫瘍抗原に対する抗体）でオプソニン化された標的細胞に対して細胞溶解反応を誘発するか否かを検討した。簡潔に言えば、Ｕ９３７またはＨＬ−６０細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、完全ＲＰＭＩ中において培養し、１０ｎｇ／ｍｌの組み換え型ヒトインターフェロンγ（ＩＮＦ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または１００ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）で刺激した。２日間インキュベーション後、細胞は一度ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、トリパンブルー排除で計数し、ＣＤ−ＣＨＯ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁させ、ＡＤＣＣアッセイに使用した。
【実施例８】
【００９６】
改良抗体を産生する細胞株の産生
ＡＤＣＣ活性が上昇したクローン産生抗体を選択するために、表現型が多様な細胞を作成するように、ｍＡｂ産生細胞は前記ベクターｐ０１２４（ｐＥＦ１−ｈＰＭＳ２−１３４−ＩＲＥＳ−ＴＫ）をトランスフェクトして、前記ｈＰＭＳ−１３４遺伝子を発現させ、上述のＦｕｇｅｎｅ試薬を用いてミスマッチＤＮＡ修復を抑制した。Ｇ４１  ８（０．７５ｍｇ／ｍｌ）で選択後、それぞれＥＬＩＳＡとウエスタンブロット法で評価されたとおり、細胞をサブクローニングして、同時にｈＰＭＳ−１３４タンパク質を発現した抗体産生クローンを単離した。細胞は２０世代以上増殖させ、次に使用まで液体窒素中に凍結保存した。
【実施例９】
【００９７】
エフェクター機能が増強された抗体の産生に関する細胞スクリーニング
前記ｈＰＭＳ−１３４を発現したｍＡｂ産生細胞は、限界希釈法でサブクローニングし、平底９６ウェルプレートに播種した。１プレート当たり４０個の単細胞コロニーを入手して単クローン性を概算するための播種密度は、経験的に決定された。
【００９８】
前記クローンは、長期間増殖させることができ、その日数は経験的に決定され、この後、ＡＤＣＣ活性を媒介することができる十分な量の抗体が産生された。前記親抗体は、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＡＤＣＣ活性を誘発することができるため、本発明者らは、１０〜１５日間、単細胞由来クローンをインキュベートすることで、エフェクター機能を支持する十分な抗体を生産する必要があると予測していた。このインキュベーション期間の最後に、各クローン／ウェルの条件培地５０ｕｌを利用し、ＥＬＩＳＡによる抗体濃度を評価し、同じウェル／クローンのさらに５０ｕｌの条件培地を、前記ＡＤＣＣアッセイに利用した。簡潔に言えば、例えば、標的細胞ＳＫＯＶ３（継代１〜２０、ＡＴＣＣから入手）と併せて抗卵巣癌ｍＡｂを利用し、３０，０００細胞／ウェルの密度で完全増殖培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）中、平底９６ウェルマイクロプレートでアッセイを行う前に播種した。次の日、前記完全培地を１００μｌのＣＨＯ−ＣＤ無血清培地で置換し、５０μｌの抗体を含む条件培地を標的細胞に添加し、２０分間、３７℃でインキュベートした。その後、２×１０５のエフェクター細胞を含む１００μｌの無血清培地を各ウェルに添加し、細胞を５〜６時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートさせた。次にプレートを簡単に遠心分離し、１００μｌの上清を各ウェルから回収し、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。１００μｌのＬＤＨ基質（Ｒｏｃｈｅ）を上清に添加し、室温で１０分間インキュベートさせた。ＬＤＨ活性は、溶解した標的細胞から放出されたＬＤＨ酵素の程度と比例した。４９０μｍでの光学密度（ＯＤ４９０）を分光光度法で測定し、細胞毒性のパーセントは、（サンプルＯＤ４９０−任意のＯＤ４９０）／（最高ＯＤ４９０−任意のＯＤ４９０）×１００％（「任意の」＝エフェクター細胞または抗体がない状態での標的細胞の溶解、「最高」＝２％のＴｒｉｔｏｎ存在下での標的細胞の溶解）で決定した。１００ｎｇ／ｍｌの基準抗体（精製プロテインＡ、親抗体）で誘発される細胞毒性は、ポジティブコントロールとして使用した。非特異的細胞毒性は、１００ｍｇ／ｍｌの正常ヒトＩｇＧ１を用いてモニターした。前記％細胞毒性を各ウェル／クローンの抗体濃度で割って得られた比（つまり、比＝５０（％）／１００（ｎｇ／ｍｌ）＝０．５）は、エフェクター機能が亢進する可能性があるリードクローンを選択する基準として設定した。リードクローンは、５０ｍｌの培地に増殖させ、抗体は説明したとおり、プロテインＡ親和性カラムによる条件培地から精製した。前記リードクローンで産生された抗体のＡＤＣＣ活性は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を利用し、前記親抗体と比較した。
【実施例１０】
【００９９】
エフェクター機能と受容体結合活性の相関
腫瘍抗原に対する非結合治療用モノクローナル抗体の主な作用モデルの１つは、前記腫瘍細胞に免疫エフェクター集団を補充するものである（Ｃｌｙｎｅｓ  Ｒ，Ｔａｋｅｃｈｉ  Ｙ，Ｍｏｒｏｉ  Ｙ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ａ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８  Ｊａｎ  ２０；９５（２）：６５２〜６；Ｃｌｙｎｅｓ  ＲＡ，Ｔｏｗｅｒｓ  ＴＬ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０００  Ａｐｒ；６（４）：４４３〜６）。特定の抗体が腫瘍細胞に免疫エフェクター細胞を補充できる効果は、前記腫瘍細胞表面の同種抗原で前記抗体の親和性の影響を受け、高親和性抗体は、同じ抗原を認識する低親和性抗体よりも、前記腫瘍細胞に免疫エフェクターを効率的に増強することを示していると仮定される。限られた報告から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの関連性を証明する試みがなされた（Ａｌｓｍａｄｉ，０．ａｎｄ  Ｔｉｌｌｅｙ，ＳＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｊａｎ；７２（１）：２８６〜２９３；ＭｃＣａｌｌ，ＡＭ．，Ｓｈａｈｉｅｄ，Ｌ．，Ａｍｏｒｏｓｏ，ＡＲ．，Ｈｏｒａｋ，ＥＭ．，Ｓｉｍｍｏｎｓ，ＲＨ．，Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｕ．，Ａｄａｍｓ，ＧＰ．，Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．，Ｍａｒｋｓ，ＪＤ．，Ｗｅｉｎｅｒ，ＬＭ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｍａｙ  １５；１６６（１０）：６１１２〜７，ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  （Ｖｅｌｄｅｒｓ，ＭＰ，ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，ＣＭ．，Ｏｓｋａｍ，ＧＪ．，Ｗａｒｎａａｒ，ＳＯ．ａｎｄ  Ｌｉｔｖｉｎｏｖ，ＳＶ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７８（４）：４７６〜４８３）。このような関連性があるか否かを決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加したｍＡｂのＡＤＣＣ活性、およびこれらの抗体の親和性は、表面プラスモン共鳴分光法により、これらの関連抗原と比較した。
【０１００】
表面プラスモン共鳴分光法は、全内部反射（ＴＩＲ）の条件下、光子によって発生した電場（エバネセント波）の短波範囲（〜１５０ｎｍ）での相互作用と、異なる屈折指標の２種類の培地の境界にある導電性皮膜の電子（表面プラスモン）に依存し、前記培地の１種類がアルカンリンカーでコーティングされ、ＣＭ−デキストランと結合した薄い金層（導電性皮膜）である。溶液中で伸展したヒドロゲルを形成し、前記フローセルにほぼ１００〜１５０ｎｍ突出した前記ＣＭ−デキストラン表面は、ＣＭ−デキストラン層にあるカルボキシル基に共有結合することで、選択したリガンドによりさらに誘導体化され得る。エバネセント波を金層と相互作用させるために必要な角度は、ＴＩＲを観察するために必要な角度に依存し、これは前記チップ表面の厚さまたは重量に依存する。従って、前記装置は経時的に前記チップの表面で重量が変化することが観察でき、固定化リガンドと相互作用する分析物が前記フローセルに注入されるときにも観察されうる。分析物の注入の後に緩衝液を注入した場合、前記結合の（前記分析物の注入中の）結合期と（緩衝液注入中の）解離期の両方を追跡することができる。従って、動力学的オンレート（ｋａ）とオフレート（ｋｄ）、および定常状態の平衡定数（ＫａおよびＫｄ）は外挿可能である。
【０１０１】
前記可溶性、分泌型の抗原は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）からクロマトグラフィーにより標的細胞の無血清培養上清から精製し、次にＳ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのイオン交換でフォローアップした。簡潔に言えば、分泌された抗原を含む培養上清を、塩を添加した状態でＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）カラムに充填させた。広範なＨＩＣ  Ａの洗浄（２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．２））により非結合性タンパク質を除去し、次にＨＩＣ緩衝液中、直線勾配の０〜２０ｍＭのＣＨＡＰＳにより、結合した抗原を溶出させた。ピークＭＯＲＡｂ−０３を含む分画をプールし、１Ｍのクエン酸（ｐＨ５．５）で酸性化し、次にＳ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換カラムに供した。ＩＥＸ緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５．５））で洗浄後、ＩＥＸ緩衝液中、直線勾配の０〜１Ｍ  ＮａＣｌを用い、結合した抗原を溶出させた。ピーク分画をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮させ、ＰＢＳに対して透析した。前記抗原製剤の純度に基づき、さらに共有結合した葉酸セファロース樹脂のアフィニティークロマトグラフィー段階が必要と考えられる（Ｓａｄａｓｉｖａｎ，Ｅ．，ｄａ  Ｃｏｓｔａ，Ｍ．，Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，ＳＰ．ａｎｄ  Ｂｒｉｎｋ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９８７；（９２５）：３６〜４７）。
【０１０２】
アッセイされるｍＡｂは、組み換えプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＲＰＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の親和性クロマトグラフィーにより、１段階で精製した。組織培養上清を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）は、重力により、１０ｍｇ／ｍＬの樹脂のＩｇ／ｍｌ樹脂値でＲＰＡＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填した。ＰＢＳで広く洗浄することにより非結合タンパク質を除去した後、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出した。分画は、１ＭのＴｒｉｓで中和した。ピーク分画をプールし、１０００用量のＰＢＳで透析した。Ｉｇ濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）およびＩｇ特異的ＥＬＩＳＡで決定した。
【０１０３】
精製した抗原は、カップリング緩衝液（１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０））に希釈し、Ｎ−ヒドロキシスクシミド（ＮＨＳ）と１−エチル−３−［ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の混合物を用いて、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のフローセルに固定化し、前記ＣＭ５センサーチップの表面に結合したＣＭ−デキストランヒドロゲルのカルボキシル基を活性化した。活性化し、誘導されていないカルボキシル基は、１Ｍエタノールアミンでクエンチした。クエンチされたＣＭデキストランの表面から成る参照フローセルは、抗原がない状態で活性化させ、全ての測定を規準化するために使用した。ランニングバッファーとしては、ＨＢＳ−ＥＰ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＯＨ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ−２０（ｐＨ７．４））を用い、粗生成物、ｍＡｂを含む培地の上清、または精製したｍＡｂ製剤を、動態検査では３０μｌ／ｍｉｎ、定常状態での親和性ランキング実験では５μｌ／ｍｍの流速で注入した。１０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ分析で使用する前に、精製したｍＡｂ製剤をＨＢＳ−ＥＰに対して透析させた。組織培養上清を含むサンプルには、それぞれ最終濃度１％および１ｍｇ／ｍｌまでＢＳＡと可溶性ＣＭ−デキストランを添加した。前記表面の再生は、１００μｌ／ｍｉｎの流速で５０ｍＭのＮａＯＨを３０秒間注入することで達成された。データ分析は、Ｂｉａ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて実施した。動態データは、単純に１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）の結合モデルにあてはめた。ランキング実験では、ランクはサンプルの異なる濃度でＲｅｑとＣのプロットから得られたＫＤ値から決定した。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、安定的にＰＭＳ２とＰＭＳ１３４  ＭＭＲ遺伝子を発現したハイブリドーマ細胞を示す図である。マウスハイブリドーマ細胞株にトランスフェクトさせたＭＭＲ遺伝子の定常状態でのｍＲＮＡ発現が示されている。３ヵ月間継続的に増殖させた後、安定的な発現が認められた。（−）レーンは逆転写酵素を添加しなかったネガティブコントロールを示し、（＋）レーンは逆転写し、ＭＭＲ遺伝子をＰＣＲ増幅したサンプルと、コントロールとして内部ハウスキーピング遺伝子を示す。
【図２】図２は、安定的にＰＭＳ２とＰＭＳ１３４  ＭＭＲ遺伝子を発現したハイブリドーマ細胞を示すグラフである。マウスハイブリドーマ細胞株にトランスフェクトされたＭＭＲ遺伝子の定常状態でのｍＲＮＡ発現が示されている。３ヵ月間継続的に増殖させた後、安定的な発現が認められた。（−）レーンは逆転写酵素を添加しなかったネガティブコントロールを示し、（＋）レーンは逆転写し、ＭＭＲ遺伝子をＰＣＲ増幅したサンプルと、コントロールとして内部ハウスキーピング遺伝子を示す。
【図３】図３は、抗体を含み、結合活性が上昇し、および／または発現／分泌が上昇した抗体産生細胞を同定するスクリーニング方法を示す図である。
【図４】図４は、結合活性が上昇した遺伝子組み換え抗体の作成を示すグラフである。ｈＩｇＥ特異的抗体をスクリーニングした９６ウェルプレートのＥＬＩＳＡ値が示されている。ＨＢ１３４培地に高結合値をもつ２つのクローンが認められた。
【図５Ａ】図５は、様々な抗体鎖の配列変化（ＭＭＲ不完全ＨＢ１３４抗体産生細胞の軽鎖可変領域の変異）を示すグラフである。矢印は、ＨＢ  １３４細胞由来のクローンから細胞サブセットに変異が発生したヌクレオチドを示している。パネルＡ：この変化により、軽鎖可変領域のＴｈｒがＳｅｒに変化している。前記コード化配列はアンチセンス方向である。
【図５Ｂ】図５は、様々な抗体鎖の配列変化（ＭＭＲ不完全ＨＢ１３４抗体産生細胞の軽鎖可変領域の変異）を示すグラフである。矢印は、ＨＢ  １３４細胞由来のクローンから細胞サブセットに変異が発生したヌクレオチドを示している。パネルＢ：この変化により、軽鎖可変領域のＰｒｏがＬｅｕに変化している。
【図６】図６は、定常状態のＩｇタンパク質レベルが上昇したＭＭＲ欠損クローンの作成を示す図である。条件培地でＭＡｂ（>５００ｎｇｓ／ｍｌ）のレベルが高いＨＢ１３４クローンの重鎖免疫グロブリンのウエスタンブロットは、クローンのサブセットがより高レベルの定常状態免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現することを示している。前記Ｈ３６細胞株をコントロールとして使用し、前記親株の定常状態レベルを測定した。レーン１：線維芽細胞（ネガティブコントロール）、レーン２：Ｈ３６細胞、レーン３：ＭＡｂレベルが上昇したＨＢ１３４クローン、レーン４：ＭＡｂレベルが上昇したＨＢ１３４クローン、レーン５：ＭＡｂレベルが上昇したＨＢ１３４クローン。
【図７】図７は、ＭＯＲＡｂ−００３は、正常ヒトＰＢＭＣを介したヒト卵巣腫瘍細胞で細胞毒性を誘導することができることを示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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