(57)【要約】本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子を含有する組成物を提供する。本発明は、さらに、ＴＩＭ標的化分子結合体、例えば、治療用または診断用部分に標的させるＴＩＭ標的化分子を提供する。本発明は、さらに、かかる組成物の使用方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を投与することにより、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子（これらは、単一の組成物にて一緒に、または別々に投与され得る）を投与することにより、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。
2007530560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれてなる組成物。
【請求項２】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原および腫瘍関連抗原から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
治療用部分または診断用部分と結合体化させたＴＩＭ標的化分子を含む組成物。
【請求項１０】
前記治療用部分が、化学療法剤、細胞傷害剤および毒素から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞傷害剤が放射性核種または化合物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、カリケアマイシン、エスペラマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、メトトレキサート、クロラムブシル、シタラビン、ビンデシン、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記放射性核種がヨウ素−１３１またはイットリウム−９０である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記毒素が植物または細菌の毒素である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記植物毒素が、リシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンから選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細菌毒素が、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれてなる組成物を投与することを含む、個体における免疫応答の刺激方法。
【請求項２４】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原および腫瘍関連抗原から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原がペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
個体に、抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれてなる組成物を投与することを含む、疾患の予防的処置方法。
【請求項３１】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が感染性疾患である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生虫抗原から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患が癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
個体に、抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれてなる組成物を投与することを含む、疾患と関連する徴候または症状の改善方法。
【請求項４０】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患が感染性疾患である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生虫抗原から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患が癌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することを含む腫瘍の標的化方法であって、前記腫瘍がＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現するものである、腫瘍の標的化方法。
【請求項４９】
前記ＴＩＭ標的化分子を抗原とともに投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍が、癌腫、肉腫およびリンパ腫から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＴＩＭ標的化分子を治療用部分に結合体化させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療用部分が、化学療法剤、細胞傷害剤および毒素から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞傷害剤が放射性核種または化合物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記化合物が、カリケアマイシン、エスペラマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、メトトレキサート、クロラムブシル、シタラビン、ビンデシン、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記放射性核種が、ヨウ素−１３１またはイットリウム−９０である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記毒素が植物または細菌の毒素である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記植物毒素が、リシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンから選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細菌毒素が、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
ＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することを含む腫瘍成長の抑制方法であって、前記腫瘍がＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現するものである、腫瘍成長の抑制方法。
【請求項７３】
前記ＴＩＭ標的化分子を抗原とともに投与する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記腫瘍が、癌腫、肉腫およびリンパ腫から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＴＩＭ標的化分子を治療用部分に結合体化させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記治療用部分が、化学療法剤、細胞傷害剤および毒素から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞傷害剤が放射性核種または化合物である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記化合物が、カリケアマイシン、エスペラマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、メトトレキサート、クロラムブシル、シタラビン、ビンデシン、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルから選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記放射性核種が、ヨウ素−１３１またはイットリウム−９０である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記毒素が植物または細菌の毒素である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記植物毒素が、リシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンから選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記細菌毒素が、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
診断用部分と結合体化させたＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することを含む腫瘍の検出方法であって、前記腫瘍がＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現するものである、腫瘍の検出方法。
【請求項９６】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患と関連する徴候または症状の改善方法。
【請求項１０１】
前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性真性糖尿病、全身性エリテマトーデスおよび自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＴＩＭ標的化分子を抗原とともに投与する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＴＩＭ標的化分子を治療用部分に結合体化させる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１０】
前記治療用部分が、化学療法剤、細胞傷害剤および毒素から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞傷害剤が放射性核種または化合物である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記化合物が、カリケアマイシン、エスペラマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、メトトレキサート、クロラムブシル、シタラビン、ビンデシン、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルから選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記放射性核種が、ヨウ素−１３１またはイットリウム−９０である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記毒素が植物または細菌の毒素である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
前記植物毒素が、リシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンから選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記細菌毒素が、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ抗体である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＴＩＭ抗体が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択されるＴＩＭに特異的である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＴＩＭ標的化分子がＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が標的細胞枯渇性である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分が非標的細胞枯渇性である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＴＩＭ部分が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４から選択される、請求項１１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
微生物に対する身体の防御は、初期の先天的免疫系の反応および後期の適応的免疫系の応答によって媒介される。先天的免疫性は、例えば、微生物病原体に特徴的であり、かつ哺乳動物細胞には存在しない構造を認識する機構を伴う。かかる構造の例としては、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ウイルスの二本鎖ＲＮＡおよび非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡヌクレオチドが挙げられる。先天的免疫応答のエフェクター細胞には、好中球、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。先天的免疫性に加え、哺乳動物を含む脊椎動物は進化した免疫学的防御機構を有し、これは、感染性因子への曝露によって刺激され、かつ特定の抗原に対する連続的な曝露の各々の場合で大きさと有効性が増加するというものである。ある特定の感染または抗原性傷害（ｉｎｓｕｌｔ）に対するその適応性から、この免疫防御機構は、適応的免疫性と表現されている。適応的免疫応答には、体液性免疫（Ｂリンパ球によって産生される抗体が関与）および細胞媒介性免疫（Ｔリンパ球によって媒介）と呼ばれる２つの型がある。
【０００２】
Ｔリンパ球には、２つの主な型：ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）が示されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して、例えばウイルスまたは細菌に感染した細胞上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示される外来抗原を認識するエフェクター細胞である。外来抗原が認識されると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化、成熟および増殖のプロセスを受ける。この分化プロセスは、外来抗原をディスプレイする標的細胞を破壊する能力を有するＣＴＬクローンをもたらす。他方、Ｔヘルパー細胞は、エフェクター免疫応答の体液性形態および細胞媒介性形態の両方に関与する。体液性免疫応答または抗体免疫応答に関しては、Ｂリンパ球により、Ｔｈ細胞との相互作用によって抗体が産生される。具体的には、細胞外抗原（例えば、循環微生物など）が、特殊（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれ、プロセッシングされ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と会合してＣＤ４＋Ｔｈ細胞に提示される。これらのＴｈ細胞が、こんどは、Ｂリンパ球を活性化し、抗体産生をもたらす。細胞媒介性または細胞性免疫応答は、対照的に、標的細胞の成功裡の感染後などに細胞内部に存在する微生物を中和する機能を果たす。外来抗原（例えば、微生物抗原など）は、感染細胞内で合成され、ＭＨＣクラスＩ分子と会合してかかる細胞の表面上に提示される。かかるエピトープの提示は、上記のＣＤ８＋ＣＴＬの刺激をもたらし、これは、こんどはＣＤ４＋Ｔｈ細胞によっても刺激されるプロセスである。Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞と称される少なくとも２つの性質の異なる亜集団から構成される。Ｔｈ１およびＴｈ２亜型は、抗原への曝露後、共通の前駆体から分化するＴｈ細胞の分極した集団を表す。
【０００３】
各Ｔヘルパー細胞サブタイプは、互いに対立し、かつ互いの拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および機能を交差調節（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）する、性質の異なる免疫学的効果を促進するサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は、高量のサイトカイン、例えばインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびＩＬ−１２など、ならびに低量のＩＬ−４を分泌する。Ｔｈ１関連サイトカインは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を促進し、非常に多くの場合、細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫応答と関連する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、高量のサイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−１０など分泌するが、ＩＦＮ−γは少なく、抗体応答を促進する。Ｔｈ２応答は、体液性応答（例えば、炭疽菌からの保護および蠕虫感染の排除）に特に関連している。
【０００４】
生じる免疫応答がＴｈ１駆動性であるかＴｈ２駆動性であるかは、関与する病原体および細胞内環境の因子（例えば、サイトカインなど）に大きく依存する。Ｔヘルパー応答または正確なＴヘルパーサブセットの活性化がなされないと、ある具体的な病原体に抵抗するための充分な応答を高めることができなくなるばかりでなく、再感染に対してもたらされる免疫性が不充分となり得る。多くの感染性因子は細胞内病原体であり、この場合、細胞媒介性応答（Ｔｈ１免疫性が例示される）が、保護および／または治療において重要な役割を果たすことが予想され得る。さらに、これらの感染の多くでは、不適切なＴｈ２応答の誘発は、疾患転帰にマイナスの影響を与えることが示された。例としては、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ、またリーシュマニア属も挙げられる。非治癒性形態のヒトおよびマウスリーシュマニア症は、強力だが逆効果を生じるＴｈ２様優勢免疫応答に起因する。らい腫らいもまた、優勢だが不適切なＴｈ２様応答を特色とするようである。ＨＩＶ感染は、別の例を示す。この場合、他のＴｈ細胞亜集団に対するＴｈ１様細胞の比率の低下は、疾患症状の進行に重要な役割を果たし得ることが示されている。
【０００５】
感染性因子に対する保護的措置として、微生物に対するワクチン接種プロトコルが開発されている。感染性病原体に対するワクチン接種プロトコルは、多くの場合、不充分なワクチン免疫原性、不適切な型の応答（細胞性免疫に対する抗体）、長期免疫学的記憶を惹起する能力の欠如、および／または所与の病原体の異なる血清型に対する免疫性の発生に対する機能不全が障害となる。現行のワクチン接種ストラテジーは、所与の血清型に特異的な抗体および多くの一般的な病原体（例えば、ウイルス系の血清型または病原体）に特異的な抗体を惹起することを目標としている。どの血清型が世界中に蔓延しているかを反復的にモニターすることに尽力されるべきである。この一例は、主要な感染性株であると予測されるＡ型インフルエンザ血清型の出現を毎年モニタリングすることである。
【０００６】
ワクチン接種プロトコルを補助するため、特定の感染性疾患に対する免疫応答の発生を補助し得るアジュバントが開発されている。例えば、アルミニウム塩は、ある特定の病原体に対する抗体応答を増強させるために、比較的安全で有効なワクチンアジュバントとして使用されている。かかるアジュバントの不都合点の１つは、これらが、細胞媒介性免疫応答の刺激の際に比較的非有効性であること、および主にＴｈ２に偏った免疫応答をもたらすことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
適応的免疫応答の有効性を増大させるためには（例えば、ワクチン接種プロトコルにおいて、または微生物性感染時）、したがって、新規でより有効なワクチンアジュバントを開発することが重要である。本発明はこの必要性を満たし、その上、関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を含有する組成物を提供する。本発明は、さらに、かかる組成物の使用方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を投与することにより、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子を投与すること（これらは、単一の組成物にて一緒に投与してもよく、または別々に投与してもよい）により、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子を含有する組成物ならびにかかる組成物の使用方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を投与することにより、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子を投与すること（これらは、単一の組成物にて一緒に投与してもよく、または別々に投与してもよい）により、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明の組成物および方法は、ＴＩＭシグナル伝達を標的化し、それにより、Ｔｈ１およびＴｈ２ヘルパー細胞のレベルを調節するために使用され得る。本発明の組成物および方法は、適切でより有効な免疫応答を増大させるためにＴｈ１およびＴｈ２のレベルを調節するのに好都合に使用され得る。
【００１０】
感染性病原体に対するワクチン接種プロトコルは、多くの場合、不充分なワクチン免疫原性、不適切な型の応答（抗体対細胞性免疫）、長期記憶の欠如および／または所与の病原体の異なる血清型に対する免疫性をもたらすことができないことが障害となる。アジュバント（例えば、アルミニウム塩など）がワクチン配合物に、７０年以上にわたって使用されており、ある特定の適応症では、その安全性および有効性が充分確立されている（Ｂａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  増補版３，Ｓ１８−２３（２００２））。アルミニウム塩をワクチンアジュバントとして細胞内病原体に対して使用することの潜在的な欠点の１つは、ＩｇＧ１およびＩｇＥ抗体応答の誘発である。さらにまた、アルミニウム塩は、Ｔｈ１免疫を刺激できず、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を促進しない（Ｎｅｗｍａｎら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２３５７−２３６２（１９９２）；Ｓｈｅｉｋｈら  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２９７４−２９８２（１９９９））。これまで、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを随意に改変できるアジュバントまたは生物学的製剤はない。アルミニウム塩以外のアジュバントを含有するワクチンで、米国において認可されたものはまだない。
【００１１】
最近、新しいファミリーの分子であって、現在はＴＩＭ（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン（Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｍｕｃｉｎ）と呼ばれている、活性化されたＴｈ１またはＴｈ２  Ｔヘルパー細胞の応答の調節において重要な役割を果たす分子がキャラクタライズされた（Ｍｏｎｎｅｙら  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３６−５４１（２００２）；Ｍｃｌｎｔｉｒｅら  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１０９−１１１６（２００１））。具体的には、ＴＩＭ−３は、最終分化Ｔｈ１細胞上で発現される細胞表面分子であることが確認された。対照的に、ＴＩＭ−１は、分化Ｔｈ２細胞上で発現される（Ｋｕｃｈｒｏｏら  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：４５４−４６２（２００３））。本発明は、抗ＴＩＭ抗体およびＴＩＭ融合タンパク質（例えば免疫グロブリンＦｃドメインと融合させた細胞外ＴＩＭドメイン（ＴＩＭ／Ｆｃ）からなる）の、免疫応答を増強させるためのワクチンアジュバントおよび刺激物質としての使用を提供する。本発明の分子は、感染性疾患の処置のため、および悪性疾患（例えば、腫瘍など）の処置のためのワクチンアジュバントとして使用され得る。
【００１２】
感染性因子に対する保護は、病原性生物に対する固有の適応的免疫応答の誘発を必要とする。適応的免疫応答のエフェクター期（ｐｈａｓｅ）は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞がＴｈ１またはＴｈ２サブタイプのどちらに成熟するかによって、決定的な影響を受ける。各サブタイプは、互いに対立し、かつ互いの拡張および機能を交差調節する性質の異なる免疫学的効果を促進するサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は、高量のサイトカイン、例えばインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびＩＬ−１２など、ならびに低量のＩＬ−４を分泌する（Ｍｏｓｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２３４８−２３５７（１９８６））。Ｔｈ１関連サイトカインは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性、およびマウスでは、細胞内病原体に感染した細胞を効果的に溶解するＩｇＧ２ａ抗体を促進する（Ａｌｌａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３９８０−３９８６（１９９０））。対照的に、Ｔｈ２細胞は、高量のサイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−１０など分泌するが、ＩＦＮ−γは少なく、抗体応答を促進し、マウスでは、一般的に、高量のＩｇＧ１非溶解性イソタイプを分泌する。Ｔｈ２応答は、体液性応答、例えば、炭疽菌からの保護（Ｌｅｐｐｌａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１４１−１４４（２００２））および蠕虫感染の排除（Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｉｎｔ．４８：７３−７９（１９９９））に特に関連している。
【００１３】
生じる免疫応答がＴｈ１駆動性であるかＴｈ２駆動性であるかは、関与する病原体および細胞内環境の因子（例えば、サイトカインなど）に大きく依存する。Ｔヘルパー応答または正確なＴヘルパーサブセットの活性化がなされないと、ある具体的な病原体に抵抗するための充分な応答を高めることができなくなるばかりでなく、再感染に対してもたらされる免疫が不充分となり得る。多くの感染性因子は細胞内病原体であり、この場合、細胞媒介性応答（Ｔｈ１免疫が例示される）が、保護および／または治療において重要な役割を果たすことが予想され得る。さらに、細胞内病原体、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｌｉｎｄｂｌａｄら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：６２３−６２９（１９９７））もしくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ、またはＳ．ｍａｎｓｏｎｉ（Ｓｃｏｔｔら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１２：１６１−１８２（１９８９））などに対する不適切なＴｈ２応答の誘発は、疾患転帰にマイナスの影響を与える。非治癒性形態のヒトおよびマウスリーシュマニア症は、強力だが逆効果を生じるＴｈ２様優勢免疫応答に起因する。らい腫らいもまた、優勢だが不適切なＴｈ２様応答を特色とするようである。ＨＩＶ感染は、別の例を示す。この場合、他のＴｈ細胞亜集団に対するＴｈ１様細胞の比率の低下は、疾患症状の進行に重要な役割を果たし得ることが示されている。
【００１４】
多くのウイルス系感染のクリアランスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能（これは、こんどはＴｈ１初回免疫サイトカイン環境によって増強される）に依存する。さらにまた、異なる血清型のウイルスに対して保護的免疫（ヘテロサブタイプ的免疫として知られる現象）が誘発され得るためには、１つのウイルス血清型に対するＴｈ１応答が必要とされる。現行のワクチン接種ストラテジーは、所与のウイルスの血清型に特異的な抗体の惹起を目標としたものである。しかしながら、このストラテジーの不都合点は、抗体が非常に特異的であり、（インフルエンザの例では、血球凝集素およびノイラミニダーゼの）表面タンパク質のアミノ酸配列の変化によりもたらされる異なる血清型のウイルスに対する保護をもたらさないことである。このような変異は、あまり見られないもの（ｍｉｎｏｒ）（抗原連続変異）またはよく見られるもの（ｍａｊｏｒ）（抗原不連続変異）であり得る。多くの一般的なウイルス系病原体に対し、どの血清型が世界中で流行しているのかをモニターするために、反復的に尽力されなければならない。この一例は、主要な感染性株であると予想されるインフルエンザ血清型の出現の年間モニタリングである。また、ヘテロサブタイプ的免疫の誘発はできないことが、インフルエンザのマウスモデルで観察された。このモデルでは、不活化されたウイルス系ワクチンの使用はＴｈ１プロフィールを促進しない。これにより、マウスは効率的なウイルス系のクリアランスが不能となり、血清学的に性質の異なるウイルスに再感染しやすくなる（Ｍｏｒａｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：５７９−５８５（１９９９））。対照的に、ワクチン接種の際に、不活化したウイルスとともにＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体で処置したマウスは、Ｔｈ１サイトカインの産生を特徴とする免疫応答を生じた。これらのマウスは、血清学的に異なるウイルスによるその後の抗原刺激に対するヘテロサブタイプ細胞性免疫応答を高める（ｍｏｕｎｔ）ことができる。Ｔｈ１／Ｔｈ２初回免疫環境に関して知られていることと合わせると、データは、Ｔヘルパー刺激および／またはＴｈ１サイトカイン応答への偏り（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）が、抗原連続変異または抗原不連続変異のいずれかに由来する種々の血清型に対して広域の免疫を生じ得ることを示す。したがって、Ｔｈ１応答のＴＩＭ媒介性誘導は、現在使用されているワクチンを改善するために実行可能なストラテジーであり得、ＴＩＭ標的化試薬（例えば、ＴＩＭタンパク質またはＴＩＭ抗体）は、種交差またはヘテロサブタイプ的免疫を刺激するために使用され得る。
【００１５】
アルミニウム塩は、ある特定の病原体に対する抗体応答を増強させるために、比較的安全で有効なワクチンアジュバントとして使用されている。かかるアジュバントの不都合点の１つは、これらが、細胞媒介性免疫応答の刺激の際に比較的非有効性であることである（ＧｒｕｎおよびＭａｕｒｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：１３４−１４５（１９８９））。低い毒性および／または細胞性免疫を正確に制御および刺激する能力を有する他のアジュバントの開発は依然として課題である。適応的免疫応答の有効性を増大させるため（例えば、ワクチン接種プロトコルにおいて、または微生物性感染の際）、本発明は、ＴＩＭ−１シグナル伝達経路、ＴＩＭ−２シグナル伝達経路、ＴＩＭ−３シグナル伝達経路またはＴＩＭ−４シグナル伝達経路を標的化する因子の、宿主の保護に有効なアジュバントとしての使用を提供する。
【００１６】
免疫系の応答を刺激するためのワクチン接種プロトコルは、例えばウイルス系、寄生虫系、細菌系、古細菌系、マイコプラズマ系およびプリオン外的病原因子によって引き起こされる感染などの感染性疾患の予防および処置ために使用され得る。ワクチン接種プロトコルはまた、過形成および悪性疾患（例えば、腫瘍など）の予防および処置のため、ならびに免疫系の刺激が有益である任意の他の疾患のために予防的または治療的処置として、使用され得る。かかる他の疾患の例としては、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬および他の自己免疫疾患が挙げられる。自己免疫疾患の特性の１つは、自己エピトープに対する自己反応性抗体の生成である。かかる自己反応性抗体は、自己免疫疾患の発症、進行および慢性性性質に非常に重要な役割を果たす。例えば、かかる自己反応性抗体を中和する抗イディオタイプ抗体の生成をもたらすワクチンが使用され得る。
【００１７】
本明細書に開示するように、ＴＩＭ−１シグナル伝達経路を標的化する試薬は、有効なワクチンアジュバントとしての機能を果たす（実施例を参照）。かかる試薬としては、ＴＩＭ−１に対する抗体、ＴＩＭ−１リガンドに対する抗体、組換えＴＩＭ−１タンパク質（ＴＩＭ−１融合タンパク質を含む）およびＴＩＭ−１リガンドタンパク質（ＴＩＭ−１リガンド融合タンパク質を含む）が挙げられる。したがって、本発明は、有効なワクチンアジュバントとして機能するＴＩＭ−１標的化分子を提供する。本発明は、さらに、他のＴＩＭ（限定されないが、ＴＩＭ−３ならびにＴＩＭ−２およびＴＩＭ−４が挙げられる）を標的化する同様の型の分子を提供する。
【００１８】
本発明は、ＴＩＭシグナル伝達経路を標的化し、有効なワクチンアジュバントとしての機能を果たす因子を提供する。本明細書で使用する場合、用語「因子」は、ＴＩＭシグナル伝達経路に関して使用する場合、ＴＩＭによって媒介されるシグナル伝達経路調節する分子をいう。ＴＩＭを標的化する因子は、本明細書では、ＴＩＭ標的化分子または試薬ともいう。かかる因子としては、ＴＩＭ−１について例示すると、ＴＩＭ−１に対する抗体、ＴＩＭ−１リガンドに対する抗体、組換えＴＩＭ−１タンパク質（ＴＩＭ−１融合タンパク質を含む）およびＴＩＭ−１リガンドタンパク質（ＴＩＭ−１リガンド融合タンパク質を含む）が挙げられる。同様の型の因子が、他のそれぞれのＴＩＭシグナル伝達経路（ＴＩＭ−２シグナル伝達経路、ＴＩＭ−３シグナル伝達経路またはＴＩＭ−４シグナル伝達経路が挙げられる）を調節するために使用され得る。融合タンパク質としては、例えば、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−１リガンドと、タンパク質またはタンパク質断片（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域、アルブミン、トランスフェリン、Ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグまたは他の所望のタンパク質もしくはタンパク質断片）との融合体が挙げられる。また、本発明の因子としては、化学的に修飾された因子、例えば、ペグ化されたＴＩＭもしくはＴＩＭリガンドまたは他の所望の化学的修飾体が挙げられる。ある具体的なＴＩＭについて言及する場合、そのＴＩＭの多型およびスプライスバリアントも含まれることを理解されたい。また、本発明の因子は、低分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（アンチセンスおよびｓｉＲＮＡを含む）、炭水化物（多糖を含む）、脂質、薬物、ならびにある特定のＴＩＭ（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４）とそのリガンドとの相互作用を刺激もしくは阻害するか、またはＴＩＭもしくはＴＩＭリガンドシグナル伝達を刺激もしくは阻害するその擬似物、誘導体および組合せであり得る。ＴＩＭ−１シグナル伝達経路を標的化する因子の使用に関する本明細書の任意の記載は、例示であって、他のＴＩＭシグナル伝達経路（ＴＩＭ−２シグナル伝達経路、ＴＩＭ−３シグナル伝達経路およびＴＩＭ−４シグナル伝達経路が挙げられる）を標的化する因子にに同様に適用され得ることを理解されたい。本発明の因子は、例えばワクチン接種において身体の免疫応答を刺激するためのアジュバントとして使用され得る。これらの因子のアジュバントとしての使用は、なんら特定の型の免疫刺激処置またはワクチン接種に限定されず、ワクチン接種プロトコルの上記の例の任意のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「ＴＩＭ標的化分子」は、ＴＩＭまたはＴＩＭリガンドに結合する分子をいう。例示的なＴＩＭ標的化分子としては、限定されないが、ＴＩＭに対する抗体、ＴＩＭリガンドに対する抗体、組換えＴＩＭタンパク質、ＴＩＭ融合ポリペプチド、ＴＩＭリガンド（ＴＩＭリガンド融合ポリペプチドを含む）が挙げられる。本明細書に開示するように、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、単一の組成物にて、または別々の組成物として投与され得る。
【００２０】
種々のＴＩＭが当業者によく知られており、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４が挙げられる。種々のＴＩＭは、例えば、ＷＯ０３／００２７２２；ＷＯ９７／４４４６０；米国特許第５，６２２，８６１号（１９９７年４月２２日に発行）；および米国特許公開公報第２００３／０１２４１１４号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に教示されている。例示的なＴＩＭ配列を図３１および３２に示す。異なる種由来の多様なＴＩＭが、所望の用途に応じて本発明の組成物および方法に使用され得る。ある具体的な種に由来するＴＩＭを、ある具体的な用途に使用することができ、例えば、ヒトＴＩＭが、所望によりヒトにおいて使用され得る。また、他の種に由来するＴＩＭを所望のとおりに使用してもよい。
【００２１】
１つの実施形態において、ＴＩＭ標的化分子は、例えば、ＴＩＭ（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４）との融合タンパク質であり得、ＴＩＭの細胞外領域の少なくとも１つのドメインまたはその部分と、免疫グロブリンの定常重鎖またはその部分とを含み得る。ある具体的な実施形態では、可溶性ＴＩＭ融合タンパク質は、ＴＩＭの細胞外ドメインの少なくとも１つのドメインと別のポリペプチドとを含む融合タンパク質をいう。１つの実施形態において、可溶性ＴＩＭは、例えばペプチド結合を介して免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧなど）のＦｃ断片と共有結合したＴＩＭの細胞外領域を含む融合タンパク質であり得、かかる融合タンパク質は、典型的にはホモ二量体である。別の実施形態では、可溶性ＴＩＭ融合体は、例えばペプチド結合を介して免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧなど）のＦｃ断片と共有結合したＴＩＭの細胞外領域のＩｇドメインだけ（ｊｕｓｔ）を含む融合タンパク質であり得、かかる融合タンパク質は、典型的にはホモ二量体である。当該技術分野ではよく知られているように、Ｆｃ断片は、２つの部分定常重鎖のホモ二量体である。各定常重鎖は、少なくともＣＨＩドメイン、ヒンジならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。かかるＦｃ融合タンパク質の各単量体は、免疫グロブリンの定常重鎖またはその部分（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン）と連結させたＴＩＭの細胞外領域を含む。ある特定の実施形態における定常重鎖は、免疫グロブリンのヒンジ領域のＮ末端であるＣＨＩドメインの一部または全部を含むものであり得る。他の実施形態では、定常重鎖は、ヒンジを含むがＣＨ１ドメインは含まないものであり得る。また別の実施形態では、定常重鎖は、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含まず、例えば、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含む。
【００２２】
１つの実施形態において、ＴＩＭ標的化分子は、ＴＩＭ抗体、例えばＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４に特異的な抗体であり得る。他のＴＩＭに対する抗体もまた、使用され得る。別の実施形態では、ＴＩＭ標的化分子は、Ｆｃと融合させたＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチド（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４）である。当業者は、Ｆｃまたは他の所望のポリペプチド（所望のドメインを含有するＴＩＭポリペプチド断片など）との多様なＴＩＭ融合ポリペプチドを容易に作製することができる。また別の実施形態では、本発明のＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、低分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（アンチセンスおよびｓｉＲＮＡを含む）、炭水化物（多糖を含む）、脂質、薬物、ならびにＴＩＭとそのリガンドとの相互作用またはＴＩＭもしくはＴＩＭリガンドシグナル伝達を刺激もしくは阻害するその擬似物、誘導体および組合せであり得る。
【００２３】
標的化は、因子またはＴＩＭ標的化分子が、ＴＩＭもしくはＴＩＭリガンドまたはＴＩＭもしくはＴＩＭリガンドシグナル伝達経路の成分に直接または間接的に結合するか、あるいはこれと、ＴＩＭまたはＴＩＭリガンドの活性に影響を及ぼすような様式で相互作用する場合に起こる。活性は、当業者によって、常套的な実験室用の方法（例えば、Ｒｅｉｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ（２００１）；Ｈａｒｄｉｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（１９９９）；ＫｅｎｄａｌｌおよびＨｉｌｌ，Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第４１巻，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ（１９９５）を参照のこと）を用いて評価され得る。例えば、情報伝達の強度、またはレセプター結合後に起こるか、通常起こり得る別の下流の生物学的事象が評価され得る。ＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを標的する因子によってもたらされる活性は、天然に存在するＴＩＭまたはＴＩＭリガンドが天然に存在するＴＩＭまたはＴＩＭリガンドに結合する場合にもたらされる活性と異なり得るが、必ずしもそうでない。例えば、ＴＩＭ−１を標的化する因子またはＴＩＭ標的化分子は、該レセプターに天然に存在するＴＩＭ−１リガンドが結合したら生じ得るものと実質的に同じ活性をもたらすならば、本発明の範囲に含まれる。加えて、因子またはＴＩＭ標的化分子は、天然に存在するＴＩＭリガンドによるシグナル伝達を阻害するアンタゴニストであり得る。
【００２４】
上記のように、本発明の因子は、２つの機能的部分：因子をＴＩＭまたはＴＩＭリガンドをもつ細胞（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４など）に標的化する標的化部分と、例えば、本明細書に記載のように、例えばＴＩＭまたはＴＩＭリガンドをもつ細胞を溶解するか、あるいは排除をもたらす二量体化および／または標的細胞枯渇性（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）部分とを含有し得る。したがって、因子は、ＴＩＭポリペプチドおよび異種のポリペプチド（例えば、抗体のＩｇＧおよびＩｇＭサブクラスのＦｃ領域など）を含むキメラポリペプチドであり得る。Ｆｃ領域は、補体結合およびＦｃレセプター結合を抑制する変異を含み得るか、または細胞溶解性または標的細胞枯渇性であり得る、すなわち、補体に結合することにより、または別の機構（例えば、抗体依存的補体溶解）により細胞を破壊し得る。したがって、Ｆｃは細胞溶解性であり得、補体およびＦｃレセプター媒介性活性を活性化し、標的細胞溶解をもたらし、ＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現する所望の細胞の枯渇を可能にし得る。
【００２５】
Ｆｃ領域は、天然の供給源から単離されたもの、組換えにより作製されたもの、または周知のペプチド合成法を用いた化学的に合成されたものであり得る。例えば、ＩｇＧ  Ｃ末端ドメインに相同なＦｃ領域を、パパインでのＩｇＧの消化によって作製し得る。ＩｇＧ  Ｆｃは、およそ５０ｋＤａの分子量を有する。本発明のポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、または細胞溶解能を保持したより小さい部分を含むものであり得る。加えて、完全長または断片のＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであり得る。すなわち、これらは、変異（該ポリペプチドの機能に影響し得る、または影響し得ない）を含有し得る。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくは類縁の哺乳動物ＩｇＧに由来のものなど）、またはＩｇＭ（例えば、ヒトＩｇＭもしくは類似の哺乳動物ＩｇＭなど）に由来のものであり得る。ある具体的な実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ａのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
【００２６】
本発明のＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の一部分であり得るＦｃ領域は、「標的細胞枯渇性」（本明細書では細胞溶解性ともいう）、であってもよく、または「非標的細胞枯渇性」（本明細書では非細胞溶解性ともいう）であってもよい。非標的細胞枯渇性Ｆｃ領域は、典型的には、高親和性Ｆｃレセプター結合性部位およびＣ’１ｑ結合部位を欠く。マウスＩｇＧ  Ｆｃの高親和性Ｆｃレセプター結合性部位は、Ｌｅｕ残基をＩｇＧ  Ｆｃの２３５位に含む。したがって、マウスＦｃレセプター結合性部位は、Ｌｅｕ２３５を変異または欠失させることにより破壊され得る。例えば、Ｌｅｕ２３５をＧｌｕに置換することにより、Ｆｃ領域の高親和性Ｆｃレセプターへの結合能力が抑制される。マウスＣ’１ｑ結合性部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基を変異または欠失させることにより、機能が破壊され得る。例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２をＡｌａ残基で置換することにより、ＩｇＧ１  Ｆｃは、抗体依存性補体溶解を指示することができなくなる。対照的に、標的細胞枯渇性ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、高親和性Ｆｃレセプター結合性部位およびＣ’１ｑ結合性部位を有し、例えば、本明細書に開示したようなＦｃ細胞溶解性活性または他の機構によって標的細胞の量を低減させ得る。高親和性Ｆｃレセプター結合性部位はＬｅｕ残基をＩｇＧ  Ｆｃの２３５位に含み、Ｃ’１ｑ結合性部位はＩｇＧ１のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基を含む。標的細胞枯渇性ＩｇＧ  Ｆｃは、野生型残基または保存的アミノ酸置換をこれらの部位に有する。標的細胞枯渇性ＩｇＧ  Ｆｃは、細胞を、抗体依存性細胞性細胞傷害または補体特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞溶解（ＣＤＣ）に標的化し得る。また、ヒトＩｇＧに対する適切な変異も公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１１９−１２４（１９９４）；およびＢｒｅｋｋｅら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１２５，１９９４を参照のこと）。当業者は、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子との標的細胞枯渇性融合体または非標的細胞枯渇性融合体を作製するための他の種のＦｃ領域の類似の残基を容易に決定することができよう。
【００２７】
多様な抗原が本発明の組成物において使用され得る。例示的な抗原としては、限定されないが、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原および腫瘍関連抗原が挙げられる。抗原は、種々の形態であり得、限定されないが、完全体の不活化された生物、これに由来するタンパク質抗原またはペプチド抗原、または生物もしくは細胞型に対して免疫応答を惹起するのに適した他の抗原性分子が挙げられる。また、抗原は、抗原をコードしている核酸（例えば、核酸ワクチンに使用されるもの）の形態であり得る。本明細書に開示するように、本発明の組成物は、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の存在下で、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を欠く組成物と比べ、免疫応答を増強するために使用され得る（実施例を参照）。免疫応答の増強は、Ｂ型肝炎ウイルス、炭疽菌、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶについて観察された（実施例ＶＩ〜Ｘを参照）。また、免疫応答の増強は、癌モデルにおいて観察された（実施例ＸＩＩを参照）。
【００２８】
本発明の組成物において使用され得る例示的な抗原としては、限定されないが、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、炭疽菌、リステリア菌、ボツリヌス菌、結核菌（特に、多剤耐性株）、ツラレミア、大痘瘡（天然痘）、ウイルス性出血性熱、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、ＨＩＶ、および感染性因子と関連する他の抗原が挙げられる。さらなる例示的な抗原としては、腫瘍細胞と関連する抗原、自己免疫性疾患と関連する抗原またはその抗原に対する抗体、またはアレルギーおよび喘息と関連する抗原が挙げられる。かかる抗原は、それぞれの疾患に対するワクチンとしての使用のための、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を含有する本発明の組成物に含まれ得る。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の方法および組成物は、感染症を有するか、または感染症を有するリスクのある個体を、その感染性因子由来の抗原を含めることにより処置するために使用され得る。感染症とは、宿主内で複製される外来の生物または因子が宿主内に存在することに起因する疾患または状態をいう。感染症は、典型的には、感染性の生物または因子による粘膜バリアまたは他の組織のバリアの破壊を伴う。感染症を有する被験体は、被験体の身体内に存在する客観的に測定可能な感染性生物または因子を有する被験体である。感染症を有するリスクのある被験体は、感染症を発症する素因のある被験体である。かかる被験体には、例えば、感染性の生物または因子に曝露されたことがわかっているか、またはそれが疑われる被験体が含まれ得る。また、感染症を有するリスクのある被験体には、感染性の生物または因子に対する免疫応答を高める能力の障害と関連する状態を有する被験体、例えば、先天性または後天性免疫不全を有する被験体、放射線療法または化学療法を受けている被験体、火傷を有する被験体、外傷を有する被験体、外科手術もしくは他の侵襲的処置もしくは歯科処置を受けている被験体、または同様に免疫無防備状態（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）の個体も含まれ得る。
【００３０】
感染症は、関与する感染性の生物または因子の種類に基づき、大きく、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性に分類される。また、他のあまり一般的でない型の感染症も当該技術分野で知られており、例えば、リケッチア、マイコプラズマが関与する感染症、ならびにヒツジ海綿状脳症、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）およびプリオン疾患（例えば、クールーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病）を引き起こす因子が挙げられる。感染症を引き起こす細菌、ウイルス、真菌および寄生虫の例は、当該技術分野でよく知られている。感染症は、急性、亜急性、慢性または潜伏性のものであり得、限局性または全身性のものであり得る。さらにまた、感染症は、宿主内での感染性の生物または因子の生活環の少なくとも１つの期において、細胞内または細胞外で優勢となり得る。
【００３１】
細菌としては、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、限定されないが、パスツレラ菌種、ブドウ球菌種およびストレプトコッカス菌種が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、限定されないが、大腸菌、シュードモナス菌種およびサルモネラ菌種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、マイコバクテリア種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群ストレプトコッカス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群ストレプトコッカス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ヴィリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、コリネバクテリウム種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロイデス種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、レプトスピラ属、リケッチア属、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられる。
【００３２】
ヒトにおいて感染を引き起こすことがわかっているウイルスの例としては、限定されないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩとも称する）、ＨＩＶ−２、ＬＡ  ＶもしくはＩＤＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡ  Ｖ、またはＨＩＶ−ＩＩＩ、および他の単離されたもの、例えばＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、ＥＣＨＯウイルス）；カルジオウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンヤ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フェレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｕｒｓ）およびロタウイルス）；Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病因因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝経腸感染；クラス２＝腸管外感染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）が挙げられる。
【００３３】
真菌の例としては、アスペルギルス属菌種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、他のカンジダ菌種、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ノカルジア属菌種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉが挙げられる。
【００３４】
寄生虫としては、限定されないが、血液媒介性および／または組織寄生虫、例えば、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア属、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ならびにトキソプラスマ、ガンビアトリパノソーマおよびローデシアトリパノソーマ（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（シャーガス病）、ならびにトキソプラスマ、扁虫、回虫が挙げられる。
【００３５】
本発明は、さらに、本発明の組成物の使用方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を投与することにより、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。かかるＴＩＭ標的化分子は、ＴＩＭ抗体（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４に対する抗体）であり得る。
【００３６】
本明細書に開示するように、本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答の刺激または増強方法において使用され得る。本発明は、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子および抗原を含有する本発明の組成物を投与することにより免疫応答を刺激する方法を提供する。ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を含むものは、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を欠く組成物と比べて免疫応答を増強するアジュバントとして機能し得る（実施例を参照）。
【００３７】
本発明の組成物および方法は、多様な疾患を予防および／または処置するために免疫応答を刺激するのに使用され得る。かかる疾患としては、感染性疾患、例えば、限定されないが、ウイルス系生物、細菌系生物または寄生虫系生物（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、炭疽菌、リステリア菌、ボツリヌス菌、結核菌（特に、多剤耐性株）、ツラレミア、大痘瘡（天然痘）、ウイルス性出血性熱、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、ＨＩＶおよび本明細書に開示したような他の感染性因子）によって引き起こされる疾患が挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物および方法は、さらに、癌を有するか、または癌を有するリスクのある被験体を処置するために使用され得る。癌は、細胞の成長が制御されていない状態であって、身体の器官および系の正常な機能が妨害される状態である。癌を有する被験体は、被験体の身体内に存在する客観的に測定可能な癌細胞を有する被験体である。癌を有するリスクのある被験体は、癌を発症する素因のある被験体である。かかる被験体には、例えば、癌の発症に対する家族歴または遺伝的素因を有する被験体が含まれ得る。また、癌を有するリスクのある被験体には、癌を引き起こす因子に曝露されたことがわかっているか、またはそれが疑われる被験体が含まれ得る。
【００３９】
最初の位置から移動して重要な臓器に播種される癌は、最終的に、冒された器官の機能障害による被験体の死をもたらし得る。造血系の癌（例えば、白血病など）は、被験体内の正常な造血系区画を打ち負かす（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）ことができ、それにより、造血系機能不全（貧血、血小板減少症および好中球減少症の形態で）をもたらし、最終的に死をもたらす。
【００４０】
転移は、原発性腫瘍の位置とは異なる癌細胞の領域であり、原発性腫瘍から他の身体部分への癌細胞の播種に起因する。原発性腫瘍塊の診断時、被験体を、転移の存在についてモニターするのがよい。転移は、最も多くの場合、具体的な症状のモニタリングに加え、磁気共鳴画像形成（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）スキャン、血球および血小板の計測、肝機能試験、胸部Ｘ線および骨スキャンの単独使用または併用によって検出される。
【００４１】
本発明の組成物および方法はまた、腫瘍関連抗原を該組成物中に含めることにより、多様な癌または癌を発症するリスクのある被験体を処置するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞で発現される腫瘍抗原である。多くのの腫瘍関連抗原がある特定の腫瘍細胞と関連することが当該技術分野でよく知られており、多様な癌（限定されないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌および血液の癌（例えば、白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）など）が挙げられる）を処置するために本発明の組成物に含めることができる。本発明の方法は、腫瘍の成長を阻害または遅延させることにより、または腫瘍の大きさを小さくすることにより、免疫応答を刺激して腫瘍を処置するために使用され得る（実施例ＸＩＩを参照）。また、腫瘍関連抗原は、この抗原が、主に（必ずしも排他的ではないが）、癌細胞において発現されるという点で、腫瘍特異的抗原であり得る。かかる場合では、腫瘍特異的抗原が、好都合に標的化され、腫瘍細胞に対する選択的標的化が可能になり得ることを理解されたい。
【００４２】
さらなる癌としては、限定されないが、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨の癌；脳および中枢神経系（ＣＮＳ）の癌；頸部癌；絨毛上皮腫；結腸直腸癌；結合組織の癌；消化器系の癌；子宮内膜の癌；食道癌；眼の癌；頭部および頚部の癌；胃癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含む）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられる。
【００４３】
現在使用されているか、または開発中の癌免疫療法剤の例としては、限定されないが、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８、抗ＣＤ２０  Ｍａｂ、ＰａｎｏｒｅｘＴＭ、３６２２Ｗ９４、抗ＥＧＰ４０（１７−１Ａ）、腺癌に対するパンカルシノーマ（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ、抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦｒ、ＢＥＣ２、抗イディオタイプＧＤ３エピトープ、ＯｖａｒｅｘＴＭ、Ｂ４３．１３、抗イディオタイプＣＡ１２５、４Ｂ５、抗ＶＥＧＦ、ＲｈｕＭＡｂ、ＭＤＸ−２１０、抗ＨＥＲ−２、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＤＸ−２６０、抗ＧＤ−２、ＱｕａｄｒａｍｅｔＴＭ、ＣＹＴ−４２４、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＯｎｃｏｌｙｍＴＭ、Ｌｙｍ−１、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮＴＭ、ＬＤＰ−０３、抗ＣＡＭＰＡＴＨ、ｉｏｒ  ｔ６、抗ＣＤ６、ＭＤＸ−１ｌ、ＯＶ１ＩＯ３、ＺｅｎａｐａｘＴＭ、抗Ｔａｃ、抗ＩＬ−２レセプター、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１および−２、ＣＥＡＣＩＤＥＴＭ、ＰｒｅｔａｒｇｅｔＴＭ、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、抗ヒストン、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ  ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ、ｉｏｒ  ｅｇｆ／ｒ３、ｉｏｒ  ｃ５、抗ＦＬＫ−２、ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１Ｏ、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ  ３６４、およびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡが挙げられる。
【００４４】
癌ワクチンは、癌細胞に対する内因性免疫応答を刺激するために使用される医薬である。現在作製されているワクチンは、主に、体液性免疫系（すなわち抗体依存性免疫応答）を活性化する。現在開発中の他のワクチンは、細胞媒介性免疫系（腫瘍細胞を死滅させることができる細胞傷害性Ｔリンパ球を含む）の活性化に焦点をあてたものである。癌ワクチンは、一般的に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージや樹状細胞）および／または他の免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞やＮＫ細胞など）の両方に対する癌抗原の提示を増強する。癌ワクチンは、本明細書に記載したいくつかの形態の１つをとり得るが、その目的は、ＡＰＣによるかかる抗原の内因性プロセッシングおよびＭＨＣクラスＩ分子との関連で（ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ）細胞表面上での最終的な抗原提示を助長にするために、癌抗原および／または癌関連抗原をＡＰＣに送達することである。癌ワクチンの一形態は全細胞ワクチンであり、これは、被験体から取り出し、エキソビボで処理し（一般的に、癌細胞を死滅させるため、またはその増殖を抑制するため）、次いで被験体内で全細胞として再導入される、癌細胞調製物である。腫瘍細胞の細胞溶解物もまた、免疫応答を惹起するための癌ワクチンとして使用され得る。癌ワクチンの別の形態はペプチドワクチンであり、これは、Ｔ細胞を活性化する癌特異的低分子タンパク質または癌関連低分子タンパク質を用いたものである。癌関連タンパク質は、癌細胞によって排他的に発現されるのではないタンパク質である、すなわち、他の正常細胞もなおこれらの抗原を発現し得る。しかしながら、癌関連抗原の発現は、一般的に、一貫してある特定の型の癌によって上方調節される。癌ワクチンのまた別の形態は樹状細胞ワクチンであり、これは、癌抗原または癌関連抗原にインビトロで曝露された樹状細胞全体を含む。樹状細胞の細胞溶解物または膜画分もまた、癌ワクチンとして使用され得る。樹状細胞ワクチンは、ＡＰＣを直接活性化することができる。他の癌ワクチンとしては、ガングリオシドワクチン、熱ショックタンパク質ワクチン、ウイルス系および細菌系ワクチン、ならびに核酸ワクチンが挙げられる。
【００４５】
本発明の組成物および方法は、さらに、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬または他の自己免疫性障害）を処置するために使用され得る。自己免疫疾患は、被験体自身の抗体が宿主組織と反応するか、または免疫エフェクターＴ細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であり、組織の破壊を引き起こす疾患の一類型である。したがって、被験体自身の抗原（自己抗原と呼ばれる）に対する免疫応答が高められている。自己免疫疾患としては、前述の例、また、クローン病および他の炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎など）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺腫、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーヴズ病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、インスリン抵抗性、自己免疫性真性糖尿病（Ｉ型糖尿病；インスリン依存性糖尿病）、自己免疫性肝炎、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、およびギヤン−バレー症候群が挙げられる。最近、自己免疫疾患は、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病も包含すると認識されている。自己抗原は、正常宿主組織の抗原をいう。正常宿主組織は癌細胞を含まない。したがって、自己抗原に対する高い免疫応答（自己免疫疾患との関連で）は、望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷に寄与するが、癌抗原に対する高い免疫応答は望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊に寄与する。
【００４６】
図１９に例示したように、ＴＩＭ−３シグナル伝達は、マウスにおいて糖尿病を加速する（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｕｅｙｏら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１０９３−１１０１（２００３）を参照のこと）。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、糖尿病マウス由来のＴ細胞が投与され、対照Ｉｇまたは抗ＴＩＭ−３（実験継続期間中、１００μｇを週２回）で処理した。抗ＴＩＭ−３の投与により、Ｔｈ１媒介性疾患である糖尿病発症が加速され、これは、ＴＩＭ−３がＴｈ１機能の調節において機能することを示す。したがって、ＴＩＭ−３標的化分子を用いた１つ以上のＴＩＭ−３シグナル伝達経路の妨害は、糖尿病を処置するために使用され得る。
【００４７】
本発明の組成物および方法はまた、喘息およびアレルギー反応を処置するために使用され得る。喘息は、気道の炎症および狭窄ならびに吸入因子に対する気道の反応性の増大を特徴とする呼吸器系の障害である。喘息は、多くの場合（排他的ではないが）アトピー性またはアレルギー性の症状を伴う。アレルギーは、物質（アレルゲン）に対する後天性過敏症である。アレルギー状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎またはコリーザ、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ／ｈｉｖｅｓ）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性の状態が挙げられる。「アレルギーを有する被験体」は、アレルゲンに応答したアレルギー反応を有するか、またはそのアレルギー反応を発症するリスクのある被験体である。「アレルゲン」は、易罹患性被験体にアレルギー性または喘息性の応答を誘導し得る物質をいう。数多くのアレルゲンがあり、花粉、昆虫毒、動物皮あか、ほこり、真菌胞子および薬物（例えば、ペニシリン）が挙げられる。
【００４８】
天然動物および植物アレルゲンの例としては、以下の属：イヌ属（Ｃａｎｉｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）；ヒョウヒダニ属（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）；ネコ属（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）；ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ；Ｌｏｔｉｕｍ（例えば、Ｌｏｔｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｔｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）；アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）；ハンノキ属（Ａｌｄｅｒ）；ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ）（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ）；カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）；カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ）；オレア属（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ）；ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；プランタゴ属（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；ヒカゲミズ属（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）；チャバネゴキブリ属（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｎｎａｎｉｃａ）；ミツバチ属（例えば、Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｎｍ）；イトスギ属（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ，Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａおよびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）；ビャクシン属（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ，Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ，Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓおよびＪｕｎｉｐｅｒｎｓ  ａｓｈｅｉ）；ニオイヒバ属（例えば、Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；ヒノキ属（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）；ワモンゴキブリ属（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）；カモジグサ属（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ）；ライムギ属（例えば、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）；コムギ属（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）；カモガヤ属（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；フェスツカ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）；イチゴツナギ属（例えば、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓまたはＰｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；エンバク属（例えば、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）；コウボウ属（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）；ハルガヤ属（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ）；アルテナルム属（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ）；ヌカボ属（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）；オオアワガエリ属（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）；クサヨシ属（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；スズメノヒエ属（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）；ソルガム属（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）；およびスズメノチャヒキ属（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）に特異的なタンパク質が挙げられる。
【００４９】
さらにまた、本発明の組成物および方法は、臓器拒絶反応を抑制するための移植に、および炎症性サイトカインに影響を与えることにより心臓疾患において使用され得る。種々の疾患モデルにおける種々のＴＩＭ標的化分子の効果は、図１９および実施例ＶＩ〜ＸＩＩに示されている。ＴＩＭまたは抗ＴＩＭ抗体での処置により、ワクチン接種による強い免疫応答の誘発が促進された。
【００５０】
本発明の方法は、Ｔｈ１またはＴｈ２を増加させるために使用され得、これは、ある特定の適応症に好都合である。例えば、Ｔｈ１サイトカインは、細胞内病原体（例えば、細菌またはウイルスなど）、癌および遅延型過敏症に適する。Ｔｈ２サイトカインは、細胞外蠕虫寄生虫（例えば、サナダムシおよび線虫など）ならびに循環しているウイルスおよび細菌を中和するための抗体応答の発現に適する。対照的に、不適切なＴｈ１応答は、自己免疫性障害、例えば、多発性硬化症、乾癬、慢性関節リウマチ、および１型糖尿病、ならびに移植片拒絶反応をもたらし、Ｔｈ１サイトカインの不足は、細胞内病原体（例えば、ウイルスおよび細菌）と戦う能力の不足をもたらす。不適切なＴｈ２応答は、喘息、アレルギー性障害、細胞内感染のクリアランスの能力不足、およびＨＩＶに対する易感染性をもたらし、Ｔｈ２サイトカインの不足は、ウイルスおよび細菌の侵入を中和する能力不足をもたらす。
【００５１】
本発明の方法は、所望のとおりにＴｈ１応答またはＴｈ２応答を増大させるために使用され得るため、好都合である。免疫応答が増進されると、ＴＩＭ分子が発現され、適切なサイトカインメッセンジャーの分泌の指示が補助される。ＴＩＭ−１はＴｈ２の刺激において機能し、一方、ＴＩＭ−３がＴｈ１の刺激において機能する。したがって、ある具体的なＴＩＭ標的化分子の使用がＴｈ１またはＴｈ２の相対量を調節するために使用され得、これは、ある特定の所望の免疫応答に有用である。例示的な疾患、および種々の疾患の処置のために免疫応答を増強するのに、ＴＩＭ標的化分子の所望の効果をどのように使用し得るかを図３０に示す。
【００５２】
本発明の組成物および方法は、ある特定の状態を処置するための他の治療法と組合せてもよいことは理解されよう。例えば、本発明の組成物の癌ワクチンとしての使用は、任意選択で、他の癌治療法（例えば、周知の化学療法または放射線療法）と組み合わせて用いられ得る。同様に、自己免疫疾患を処置するための本発明の組成物の使用は、任意選択で、ある具体的な自己免疫疾患を処置するのに使用される治療法と組み合わせてもよい。同様に、喘息またはアレルギー状態を処置するための本発明の組成物は、任意選択で、それぞれの状態の治療法と組み合わせてもよい。
【００５３】
本発明の組成物および方法は、治療用および／または診断用の目的に使用され得、ヒト用または獣医科用の適用であり得る。例えば、本発明の組成物は、治療用部分または診断用部分を標的させるために使用され得る。治療用部分の場合では、該部分は、薬物、例えば化学療法剤、細胞傷害剤、毒素などであり得る。例えば、細胞傷害剤は、放射性の核種または化合物であり得る。治療用因子として有用な例示的な放射性核種としては、例えば、Ｘ線またはγ線放射体が挙げられる。加えて、該部分は、薬物送達ビヒクル、例えば、チャンバ型マイクロデバイス、細胞、リポソームまたはウイルスなどであり得、これらは、因子（例えば、薬物または核酸）を収容し得る。
【００５４】
例示的な治療用因子としては、例えば、アントラサイクリン系のドキソルビシンが挙げられ、これは抗体に結合されたものであり、抗体／ドキソルビシン結合体は、腫瘍の処置において治療有効性である（Ｓｉｖａｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：２３５２−２３５６（１９９５）；Ｌａｕら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：１２９９−１３０４（１９９５）；Ｓｈｉｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３８：９２−９８（１９９４））。同様に、他のアントラサイクリン系、例えば、イダルビシンおよびダウノルビシンなどは、抗体に化学的に結合体化されたものであり、これは、有効用量の因子を腫瘍に送達する（Ｒｏｗｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：１９５−２０２（１９９３）；Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：６４１−６４８（１９８９））。
【００５５】
アントラサイクリン系の他に、アルキル化剤（例えば、メルファランおよびクロラムブシルなど）を抗体に結合させて治療有効性の結合体が作製されており（Ｒｏｗｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：１９５−２０２（１９９３）；Ｓｍｙｔｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：３１５−３２１（１９８７））、ビンカアルカロイドでも作製されている（例えば、ビンデシンおよびビンブラスチンなど）（Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら（前出），１９８９；Ｓｔａｒｌｉｎｇら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３１５−３２２（１９９２））。同様に、抗体や代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル，５−フルオロウリジンおよびその誘導体など）の結合体は、腫瘍の処置において有効である（Ｋｒａｕｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１３２−１３７（１９９２）；Ｈｅｎｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１５７０−１５７９（１９９３））。他の化学療法剤、例えばシスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７−１７２（１９９１））、メトトレキサート（Ｓｈａｗｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．７：６０８−６１８（１９８８）；ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋおよびＧａｒｎｅｔｔ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１０：１１−２４（１９９５））ならびにミトマイシン−Ｃ（Ｄｉｌｌｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｈｅｒ．１：２５０−２５５（１９８９））もまた、種々の異なる抗体との結合体として投与した場合、治療有効性である。治療剤はまた、毒素（例えば、リシンなど）であり得る。
【００５６】
また、治療剤は、物理的、化学的または生物学的材料、例えば、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロポンプまたは他のチャンバ型マイクロデバイスなどであり得、これらは、例えば薬物送達系として使用され得る。一般的に、かかるマイクロデバイスは、非毒性で、所望により生分解性であるべきである。種々の部分（例えば、マイクロカプセルなどであって、因子を収容し得る）、および部分（チャンバ型マイクロデバイスなど）を本発明のＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子と連結させるための方法は、当該技術分野においてよく知られており、市販されている（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」  第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９０）、第８９〜９１章；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照のこと）。
【００５７】
診断用目的のため、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、検出可能な部分をさらに含み得る。検出可能な部分は、例えば、放射性核種、蛍光部分、磁気部分、比色部分などであり得る。インビボ診断用目的のため、γ光線放射性の放射性核種（例えば、インジウム−１１１またはテクニチウム−９９）などの部分を本発明の抗体と連結させることができ、被験体への投与後、固体シンチレーション検出器を用いて検出し得る。同様に、陽電子放射性の放射性核種（例えば、炭素−１１）または常磁性スピン標識（例えば、炭素−１３など）を該分子と連結させることができ、被験体への投与後、該部分の局在化を、それぞれ、陽電子放射型断層撮影または磁気共鳴映像法を用いて検出し得る。かかる方法により、原発性腫瘍ならびに転移病変を確認することができる。
【００５８】
診断用目的のため、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、インビボ診断に、または個体から（例えば、組織生検材料により）得た組織試料にてインビトロで使用され得る。例示的な体液としては、限定されないが、血清、血漿、尿、滑液などが挙げられる。
【００５９】
治療用または検出可能な部分は、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子と、部分をカップリングまたは結合体化させるための多くの周知の方法によりカップリングさせ得る。かかるカップリング方法により、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の結合活性を妨害または阻害することなく、治療用部分または検出可能部分の結合が可能になることが理解されよう。部分を本発明のＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子に結合体化させるための方法は、当業者によく知られている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照のこと）。さらに、治療用または検出可能な部分は、非共有結合の結合体が所望の目的のための充分な結合親和性を有する限り、非共有結合でＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子に結合体化され得ることが、理解されよう。例えば、治療用または検出可能な部分をＴＩＭ標的化分子に、ビオチンまたはアビジンをそれぞれの部分およびＴＩＭ標的化分子と結合体化させ、ビオチン−アビジンを用いて該部分とＴＩＭ標的化分子を非共有結合性に結合体化させることにより、結合体化させ得る。よく知られた結合分子ペアの他の型を同様に使用することができ、例えば、マルトース結合性タンパク質／マルトース、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ／グルタチオンなどが挙げられる。
【００６０】
したがって、本発明の１つの実施形態では、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子、例えば抗ＴＩＭ抗体またはＴＩＭタンパク質は、毒性の放射性同位元素または毒素を、適切なＴＩＭ分子をその表面上に発現する（抗ＴＩＭ抗体によって標的化される）またはＴＩＭリガンド分子（ＴＩＭタンパク質によって標的化される）をその表面上に発現する癌細胞または自己反応性ＢおよびＴ細胞の特異的標的化のための送達系として使用され得る。抗体または組換えタンパク質（ＴＩＭタンパク質、例えば、ＦｃテイルとのＴＩＭタンパク質など）を、植物毒素（リシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニンなど）または細菌毒素（シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素など）、または化学物質毒素（例えば、カリケアマイシンおよびエスペラマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、メトトレキサート、クロラムブシル、シタラビンもしくはアラビノシルシトシ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（ＡＲＡ−Ｃ）、ビンデシン、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルなど）；または放射性同位元素（ヨウ素−１３１もしくはイットリウム−９０など）と結合体化され得る。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、共有結合または非共有結合により、毒性の分子（化学物質毒素、細菌毒素または植物毒素および放射性同位元素が挙げられる）と結合体化され得る。別の実施形態では、本発明は、癌または自己免疫疾患の処置方法であって、治療用様式としての使用のために、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子、例えば抗ＴＩＭ抗体またはＴＩＭタンパク質を、共有結合または非共有結合により、治療用部分、例えば毒性の分子（化学物質毒素、細菌毒素または植物毒素および放射性同位元素が挙げられる）と結合体化される、癌または自己免疫疾患の処置方法を提供する。また、種々の毒素の組合せを１つの抗体分子にカップリングさせることもあり得る。他の化学療法剤は当業者に知られており、本明細書に開示している。
【００６２】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体における自己免疫性障害の処置用の医薬の製造のための、治療用部分（例えば、抗毒素など）と結合体化させたＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を含む組成物の使用を提供する。またさらなる実施形態では、本発明は、治療用部分と結合体化させたＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の使用を提供し、この場合、自己免疫性障害は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性真性糖尿病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）などから選択される障害である。
【００６３】
さらに別の実施形態では、本発明は、被験体における癌の処置のためのＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の使用を提供する。例えば、癌は、癌腫、肉腫もしくはリンパ腫、または他の型の癌であり得る。ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、適切にＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現する腫瘍の処置のために使用され得る。ＴＩＭまたはＴＩＭリガンドは、腫瘍生検材料試料において確認され得る。本明細書に開示するように、腎腺癌、胸腺腫およびリンパ腫を含む種々の細胞株がＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現することが示されている（実施例ＸＶおよび図３３〜３６を参照のこと）。腫瘍生検材料試料がＴＩＭ発現に対して陽性であるならば、ＴＩＭ標的化分子（例えば細胞傷害剤と結合体化させた抗ＴＩＭ抗体）が、腫瘍細胞を標的化するために使用し得る。他方、腫瘍がＴＩＭ分子の適切なリガンドを発現するならば、適切なＴＩＭ分子を、単独で、または細胞傷害剤と結合体化させた融合タンパク質としてＴＩＭリガンド発現腫瘍の標的化に使用され得る。同様に、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子、またはその治療用部分もしくは診断用部分との結合体は、ＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現する種々の細胞型または組織を標的化するために使用され得る。
【００６４】
本発明は、治療用部分または診断用部分と結合体化させたＴＩＭ標的化分子を含む組成物を提供する。治療用部分は、化学療法剤、細胞傷害剤または毒素であり得る。細胞傷害剤は、例えば、放射性核種または化合物であり得、限定されないが、化合物としては、カリケアマイシン、エスペラマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、メトトレキサート、クロラムブシル、シタラビン、ビンデシン、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシル、または放射性核種としては、ヨウ素−１３１もしくはイットリウム−９０が挙げられる。ある具体的な実施形態では、毒素は、植物毒素または細菌毒素であり得、限定されないが、植物毒素としてはリシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンもしくはゲロニン、またはシュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素由来の細菌性毒素が挙げられる。
【００６５】
組成物をワクチンとして作製および投与する方法は、当業者によく知られている。成分の免疫学的有効量は、経験的に決定されるが、例えば、動物モデルにおける免疫学的有効量を基にし得る。考慮すべき要素としては、抗原性、配合、投与経路、免疫化用量を投与する回数、個体の健康状態、体重および年齢などが挙げられる。かかる要素は、当該技術分野においてよく知られており、当業者なら容易に決定し得る（例えば、ＰａｏｌｅｔｔｉおよびＭｃＩｎｎｅｓ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書に開示するように、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、アジュバントとして使用され得る（実施例を参照）。本発明のＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、アジュバントとして単独で、または所望により他のよく知られたアジュバントと組み合わせて、使用され得ることを理解されたい。
【００６６】
本発明の組成物は、限局的または全身に、当該技術分野で知られた任意の方法（限定されないが、筋肉内，皮内，静脈内，皮下，腹腔内，鼻腔内，経口または他の粘膜経路が挙げられる）によって投与され得る。さらなる経路としては、頭蓋内（例えば、槽内または脳室内），眼窩内，眼内（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ），包内，脊椎内，および局所投与が挙げられる。本発明の組成物は、適当な非毒性の医薬用担体において投与され得るか、またはマイクロカプセルに、もしくは徐放性インプラントとして処方され得る。本発明の免疫原性組成物は、所望により、所望の免疫応答を持続させるために多数回投与され得る。適切な経路、処方および免疫処置スケジュールは、当業者により決定され得る。
【００６７】
本発明の方法では、本発明の組成物は、抗原およびＴＩＭ標的化分子が、抗原およびＴＩＭ標的化分子が共投与されるように投与される単一の組成物内にあるように投与してもよい。あるいはまた、本発明の方法は、抗原およびＴＩＭ標的化分子が別々の組成物（例えば、別々の医薬組成物）として投与されるように行われ得る。別々に抗原およびＴＩＭ標的化分子を含有するかかる組成物は、組成物を一緒に混合するか、または同じ部位に注射するかのいずれかによって同時に投与してもよく、またはこれらの組成物を、同じもしくは異なる位置に別々に投与してもよい。ＴＩＭ標的化分子は、同じ部位に抗原として、または異なる部位に投与してもよく、同時に、または数分から数日の期間にわたって逐次投与してもよい。当業者は、所望の効果のため、抗原およびＴＩＭ標的化分子の所望される投与計画を容易に決定できよう。抗原が既に存在する場合、例えば、疾患関連抗原が免疫系に曝露されている進行中の感染または疾患では、ＴＩＭ標的化分子は、個体内で既に発現されている抗原に対する免疫応答を刺激するために投与され得る。
【００６８】
ＴＩＭ標的化分子は、１つ以上の異なる形態で投与され得る。ＴＩＭ標的化分子がペプチドまたはポリペプチド（抗ＴＩＭ抗体またはＴＩＭ融合タンパク質など）である場合、投与様式としては、限定されないが、精製された該ペプチドもしくはポリペプチドの投与、該ペプチドもしくはポリペプチドを発現する細胞の投与、または該ペプチドもしくはポリペプチドをコードされた核酸の投与が挙げられる。
【００６９】
本発明の方法およびこれを実施するために使用される治療用組成物は、「実質的に純粋な」因子を含有する。例えば、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子がポリペプチドである場合、該ポリペプチドは、他のポリペプチドまたは該ポリペプチドの元の供給源中の望ましくない成分に対して少なくとも約６０％純粋であり得る。例えば、ポリペプチドが、天然の供給源から精製されたもの、組換え発現によるもの、または化学合成物である場合、純度は、元の天然の供給源、組換え供給源または合成反応における他の成分に対するものである。当業者は、本発明のポリペプチド因子または他の因子のための適切な周知の精製方法を容易に決定できよう。具体的に、因子は、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の純度であり得る。当業者は、ある具体的な所望の適用用途に好適な純度を容易に決定できよう。純度は、任意の適切な標準方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ解析によって測定され得、所望の定量基準（例えば、紫外吸収、染色など）または因子の化学的性質に依存する量を測定する同様の方法に基づくのがよい。本発明の因子を、アジュバントとしての他の成分と、例えばワクチンにおいて組み合わせる場合、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、ある特定の純度、例えば９５％純度で投与され得るが、ワクチン中の抗原、バッファーなどの成分の９５％であることは必要とされないことを理解されたい。当業者は、本発明の組成物中の他の望ましい成分に対するＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の適当な純度および適当な量を容易に決定できよう。
【００７０】
本発明の方法において有用な因子は、天然に存在する供給源から得られ得るが、例えば、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子をコードする組換え核酸分子の発現によって、合成するか、あるいは製作してもよい。ポリペプチドを組換えにより発現するための方法は、当業者によく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（増補版５６），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１））。ペプチド合成法もまた、当業者によく知られている（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６４）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８４））。天然の供給源、例えば真核生物系生物から精製するポリペプチドは、自然状態で会合している成分を実質的に含まないように精製するのがよい。同様に、真核生物細胞または原核生物細胞（例えば、大腸菌もしくは他の原核生物）内で組換えにより発現されるポリペプチド、または化学的に合成されるポリペプチドは、所望のレベルの純度に精製し得る。該ポリペプチドがキメラである場合、これは、因子の全部または一部をコードする１つの配列（例えば、ＴＩＭポリペプチドをコードする配列）およびＩｇＧのＦｃ領域をコードする配列を含有するハイブリッド核酸分子にコードされ得る。
【００７１】
本発明の因子、特に、組換えにより発現されるポリペプチドは、該ポリペプチドの精製を容易にするために、親和性タグと融合させ得る。１つの実施形態において、親和性タグは、該ポリペプチドの機能（例えば、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子の結合性）に干渉しない、比較的低分子であり得る。あるいはまた、親和性タグは、親和性タグが組換えにより発現されたポリペプチドから除去されるのを可能にするプロテアーゼ切断部位を有するポリペプチドと融合させ得る。プロテアーゼ切断部位を含めることは、親和性タグが比較的大きく、該ポリペプチドの機能に潜在的に干渉し得る場合、特に有用である。例示的な親和性タグとしては、ポリヒスチジンタグ（一般的に、約５〜約１０個のヒスチジンを含有する）、または血球凝集素タグ（これは、組換えにより発現されるポリペプチドを原核生物細胞または真核生物細胞から精製するのを助長するために使用され得る）が挙げられる。他の例示的な親和性タグとしては、マルトース結合性タンパク質またはレクチン（ともに糖類に結合する）、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、アビジンなどが挙げられる。他の適切な親和性タグとしては、特異的抗体が利用し得るエピトープが挙げられる。エピトープは、例えば、約３〜５個以上のアミノ酸の短鎖ペプチド、炭水化物、有機系低分子などであり得る。エピトープタグは、組換えタンパク質をアフィニティ精製するために使用されており、市販されている。例えば、エピトープタグ（ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ポリＨｉｓなどが挙げられる）に対する抗体が市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ，セントルイス  ＭＯ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ボストン  ＭＡを参照のこと）。
【００７２】
治療用途では、本発明の因子は、生理的に許容され得る担体（例えば、生理食塩水など）とともに投与され得る。本発明の治療用組成物はまた担体または賦形剤を含有し、その多くは当業者に知られている。使用され得る賦形剤としては、バッファー、例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、および重炭酸バッファー；アミノ酸；ウレア；アルコール；アスコルビン酸；リン脂質；タンパク質（例えば、血清アルブミン）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；塩化ナトリウムまたは他の塩；リポソーム；マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどが挙げられる。本発明の因子は、種々の様式で、対応する投与経路に応じて処方され得る。例えば、液体の液剤は、摂取または注射のために作製され得、ゲルまたは粉剤は、摂取、吸入または局所適用用途のために作製され得る。かかる処方物の作製方法はよく知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）を見るとよい。
【００７３】
上記のように、本発明のポリペプチド因子（融合タンパク質であるものを含む）は、適当な真核生物または原核生物の発現系における１つ以上の核酸分子の発現およびその後の該ポリペプチド因子の精製によって得られ得る。加えて、本発明のポリペプチド因子はまた、患者に、１つ以上の核酸分子をコードする適当な治療用発現ベクターによって、インビボまたはエキソビボのいずれかで投与され得る。さらにまた、該核酸は、移植片の細胞内に該移植片の移植前に導入させ得る。したがって、前記因子をコードする核酸分子は本発明の範囲内である。
【００７４】
本発明のポリペプチドが、野生型ポリペプチドとのその同一性に関して示され得るように、これらをコードする核酸分子は、対応する野生型ポリペプチドをコードするものと、ある一定の同一性を有する。例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４をコードする核酸分子は、天然または野生型のＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４をコードする核酸と、少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり得る。同様に、ＴＩＭポリペプチドは、天然または野生型のＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４ポリペプチドと、少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一性を有し得る。対応する野生型分子と１００％未満の同一性を有するポリペプチドまたはそれをコードする核酸は、依然としてＴＩＭポリペプチドの所望の機能を保持していることを理解されよう。
【００７５】
本発明の因子をコードする核酸分子は、天然に存在する配列を含有するもの、または天然に存在するものとは異なるが、遺伝コードの縮重により同じポリペプチドをコードする配列を含有するものであり得る。これらの核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ（例えば、ホスホロアミダイト合成により作製されるものなど）、またはこれらの型の核酸内のヌクレオチドの組合せまたは修飾体からなるものであり得る。加えて、該核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかであり得る。当業者には、核酸の適当な形態は、所望の利用目的（例えば、一本鎖または二本鎖であり、センスまたはアンチセンスであるウイルス系ベクターを用いる発現）に基づいて選択され得ることが理解されよう。
【００７６】
本発明の核酸分子が天然に存在するものの場合、この核酸分子は、ゲノム内で直接隣接する５’または３’コード配列のいずれかと分離されるため、生物の天然に存在するゲノムから「単離された」ものであり得る。したがって、核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列を含み、コード配列の上流または下流に存在する非コード配列を含み得る。当業者は、核酸分子を単離するための常套的な手順がよくわかっている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（増補版５６），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）を参照のこと）。該核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼでの処理によって、または周知の方法を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの所望の領域を増幅することによって作製され得る（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）を参照のこと）。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）の場合、分子は、インビトロ転写によって作製され得る。
【００７７】
単離された本発明の核酸分子は、天然状態では見られない断片を含むことがあり得る。したがって、本発明は、組換え分子、例えば、核酸配列（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２  ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４をコードする配列）がベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルス系ベクター）内に組み込まれたもの、または異種の細胞のゲノム内もしくは同種の細胞のゲノム内に天然の染色体内の位置とな異なる位置に組み込まれたものを包含する。
【００７８】
上記のように、本発明の因子は融合タンパク質であり得る。上記の異種のポリペプチドに加え、またはこれの代わりに、本発明の因子をコードする核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含み得る。マーカーまたはレポーター遺伝子の例としては、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。本発明の実施と関連する標準的な手順の多くに関して、当業者には、さらなる有用な試薬（例えば、マーカーまたはレポーターの機能を果たし得るさらなる配列）が認識されよう。
【００７９】
本発明の核酸分子は、任意の生物細胞（哺乳動物の細胞など）から得た、または常套的なクローン化方法によって作製した本発明の因子（例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４分子）に変異を導入することにより得られ得る。したがって、本発明の核酸は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌまたはネコのものであり得る。ある具体的な実施形態では、核酸分子はヒトＴＩＭをコードするものであり得る。
【００８０】
本明細書に記載する本発明の核酸分子はベクター内に含有され得、このベクターは、例えば、該ベクターによって形質導入された細胞内でその発現を指示することができるものである。したがって、ポリペプチド因子に加え、該因子をコードする核酸分子を含有する発現ベクター、および該ベクターで形質転換された細胞が提供される。
【００８１】
本発明における使用に適したベクターとしては、細菌における使用のためのＴ７系ベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅ  ５６：１２５−１３５（１９８７）を参照のこと）、哺乳動物細胞における使用のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５２１−３５２７（１９８８））、酵母発現系（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなど、例えば、ＰＩＣＺファミリーの発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ））およびバキュロウイルス由来ベクター（例えば、昆虫細胞における使用のための発現ベクターｐＢａｃＰＡＫ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））が挙げられる。かかるベクター内の目的のポリペプチドをコードする核酸挿入物はプロモーターと作動可能に連結させ得、プロモーターは、例えば、該核酸が発現される細胞型に基づいて選択される。例えば、Ｔ７プロモーターは細菌において使用され得、ポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用され得、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターは哺乳動物細胞において使用され得る。また、高等真核生物の場合、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターは、広範囲に利用可能である。これらのプロモーターは、身体内の所与の組織または細胞型内での核酸分子の発現を指示する能力のため、そのように命名されている。当業者は、所望の細胞または生物内での核酸の発現を指示するために使用され得る適当なプロモーターおよび／または他の調節エレメントを容易に決定できよう。
【００８２】
挿入された核酸分子の転写を助長する配列に加え、ベクターは、複製起点、および選択可能マーカーをコードする他の遺伝子を含有し得る。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子は、これが発現される細胞に対してＧ４１８耐性を付与し、したがって、トランスフェクト細胞の表現型の選択を可能にする。細胞の表現型の選択を可能にする他の実行可能な選択可能マーカー遺伝子としては、種々の蛍光タンパク質，例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体が挙げられる。当業者は、所与の調節エレメントまたは選択可能マーカーが、ある具体的な使用目的に適当か否かを容易に決定できよう。例示的なベクターを図１８に示す。
【００８３】
本発明において使用され得るウイルス系ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクターならびにウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（編），Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００８４】
本発明の因子をコードする核酸分子を含有し、該核酸分子にコードされるタンパク質を発現する原核生物系または真核生物系細胞もまた提供される。本発明の細胞は、トランスフェクト細胞、すなわち、１つ以上の核酸分子、例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４ポリペプチドをコードする核酸分子または、例えば、抗ＴＩＭ抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸が、組換えＤＮＡ手法により導入された細胞である。かかる細胞の子孫もまた、本発明の範囲内とみなされる。多様な発現系を利用し得る。例えば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３もしくはＴＩＭ−４または抗ＴＩＭポリペプチドは、原核生物系宿主（細菌である大腸菌など）、または真核生物系宿主（昆虫細胞、例えばＳｆ２１細胞、もしくは哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞など）内で産生され得る。これらの細胞は多くの供給源（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス，ＶＡ）が挙げられる）から入手可能である。当業者は、所望の細胞または生物に適したある特定の発現系に適切な成分（上記のような発現ベクター、プロモーター、選択可能マーカーなどが含まれる）を容易に選択できよう。種々の発現系の使用の選択については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；およびＰｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５  増補版．１９８７）を見るとよい。本発明の因子をコードする核酸分子を含有し、かかる核酸分子にコードされるタンパク質を発現する真核生物系細胞もまた提供される。
【００８５】
さらにまた、本発明の真核生物系細胞は、移植細胞、移植組織または移植臓器の一部である細胞であり得る。かかる移植片は、ドナー生物から採取した初代（ｐｒｉｍａｒｙ）細胞か、レシピエント生物内（例えば、真核生物細胞株（幹細胞または先祖細胞を含む））への移植前にインビトロで培養、改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）および／または選択された細胞のいずれかを含み得る。レシピエント生物内への移植後、細胞増殖が起こる場合、かかる細胞の子孫もまた、本発明の範囲内とみなされる。移植細胞、移植組織または移植臓器の一部である細胞は、ＴＩＭまたは抗ＴＩＭポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトし、続いて、レシピエント生物内に移植し得、ここで該ポリペプチドの発現が起こる。さらにまた、かかる細胞は、レシピエント生物内への移植前に、例えば、特定の細胞系統または細胞型の選択手順の適用を可能にする１つ以上のさらなる核酸構築物を含有し得る。かかる移植細胞は、治療用適用用途において使用され得る。例えば、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子がポリペプチドである場合、ＴＩＭ標的化分子を発現する細胞を、周知の遺伝子送達方法および適当なベクター（例えば、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ，Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９５）を参照のこと）を用いて移植し、ＴＩＭ標的化分子の供給源を提供することができる。
【００８６】
移植細胞の場合、該細胞は、植込み手順によるか、または血管壁を介したカテーテル媒介注射手順を用いるかのいずれかで投与され得る。場合によっては、該細胞は、脈管構造内への放出によって投与され得、ここから細胞は、引き続いて血流によって分散され、および／または周囲組織内に移動する。
【００８７】
別の実施形態では、免疫抑制剤として機能するＴＩＭ標的化分子を、臓器の細胞への遺伝子送達方法によって導入し得る。かかる場合において、ドナー臓器それ自体が、臓器移植を容易にし、移植片拒絶反応を抑制するための免疫抑制剤を提供する。
【００８８】
本発明は、さらに、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を含む組成物を含むキットを提供する。本発明は、さらに、抗原と、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子を含む組成物とを含む組成物を含むキットを提供する。本発明の組成物の投与に関して上記に示したように、抗原とＴＩＭ標的化分子の別々の（ｓｅｐａｒａｔｅ）組成物を含むキットは、共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）してもよく、同じ位置または異なる位置のいずれかに別々に投与してもよい。別々に抗原とＴＩＭ標的化分子組成物とを含むキットは、本明細書に開示したように、同時に投与してもよく、異なる時点で投与してもよい。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、その最も広い意味で用い、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにかかる抗体の抗原結合性断片を含む。抗原に特異的な抗体、またはかかる抗体の抗原結合性断片は、抗原またはそのエピトープに対して少なくとも約１×１０５Ｍ−１の特異的結合活性を有することを特徴とする。したがって、抗原に特異的な抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖ断片であって、抗原に対する特異的結合活性を保持しているものは、抗体の定義に含まれる。ＴＩＭなどの抗原に対する特異的結合活性は、例えば、ある抗体のそのそれぞれの抗原と非抗原対照分子とに対する結合活性を比較することにより、当業者によって容易に測定され得る。当業者には、ある具体的な抗原（例えば、ＴＩＭ）に対する特異的結合活性を有する抗体の意味が容易に理解されよう。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製方法は、当業者によく知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）。ポリクローナル抗体を用いる場合、ポリクローナル血清は、低下したバックグラウンド結合性およびより高比率の抗原特異的抗体を有する単一特異的抗体を調製するために、抗原を用いてアフィニティ精製され得る。
【００９０】
加えて、用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、天然に存在する抗体ならびに非天然の抗体（例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体およびヒト化抗体が挙げられる）、ならびにその抗原結合性断片を含む。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン配列（例えば、ヒトフレームワーク配列）を、抗原特異性を提供する相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する非ヒト免疫グロブリン配列と合わせることによって作製される組換え抗体を含むことを意図する。非ヒト免疫グロブリン配列は、抗体生成に適した種々の非ヒト生物から入手され得、限定されないが、ラット、マウス、ウサギ，ヤギなどが挙げられる。ヒト化抗体はまた、完全にヒトの抗体を含むことを意図する。例えば、ファージディスプレイライブラリー系またはヒトＭＨＣ遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）トランスジェニックマウスなどを用いて完全にヒトの抗体を得る方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，６９３，７６２号；同第６，１８０，３７０号；同第６，３００，０６４号；同第６，６９６，２４８号；同第６，７０６，４８４号；同第６，８２８，４２２号；同第５，５６５，３３２号；同第５，８３７，２４３号；同第６，５００，９３１号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１５０，５８４号；同第６，６５７，１０３号；同第６，１６２，９６３号を参照のこと）。かかる非天然の抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えにより作製することができ、または、例えば、Ｈｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））に記載されたようにして、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ−移植化抗体、単鎖抗体、および二機能性抗体のこれらのおよび他の作製方法は、当業者によく知られている（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出），１９８８；Ｈｉｌｙａｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２版．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５））。
【００９１】
抗原に特異的な抗体は、単離されたＴＩＭポリペプチドまたはその断片（これらは、天然の供給源から調製されるもの、または組換えにより作製されるものであり得る）、またはエピトープとして機能し得る抗原の抗原性部分などの免疫原を用いて惹起され得る。かかるエピトープは、そのエピトープが、抗原に特異的な抗体を生成させるために使用可能ならば、機能的抗原性断片である。非免疫原性または弱免疫原性の抗原またはその部分は、ハプテンを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体分子とカップリングさせることにより免疫原性とし得る。種々の他の担体分子、およびハプテンを担体分子とカップリングさせるための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出），１９８８を参照のこと）。抗原の免疫原性ペプチド断片はまた、該ペプチド部分を、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリＨｉｓなどとの融合タンパク質として発現させることにより生成させ得る。ペプチド融合体を発現させるための方法は、当業者によく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（増補版４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９））。
【００９２】
ＴＩＭ標的化分子は、本明細書に開示したように、ポリペプチド、所望の活性を有するポリペプチドの機能的断片、または融合ポリペプチドとして、組換えにより発現させ得る。ＴＩＭ標的化分子の組換え形態の作製および発現方法は、当業者によく知られており、これは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（増補版５６），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に教示されている。かかる方法を実施例において例示し、図１８に、ＴＩＭ標的化分子構築物用の例示的な発現ベクターを示す。当業者は、ＴＩＭ標的化分子としての使用のための、所望の断片、例えば所望の機能を有するＴＩＭの機能的断片、例えば細胞外ドメインまたはその断片（Ｉｇドメインおよび／またはムチンドメインなど）を容易に決定できよう。
【００９３】
上記のように、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子は、低分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（アンチセンスおよびｓｉＲＮＡを含む）、炭水化物（多糖を含む）、脂質、薬物、ならびに擬似物などであり得る。かかる分子を作製するための方法は、当業者によく知られている（Ｈｕｓｅ，米国特許第５，２６４，５６３号；Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４２２−４２８（１９９８）；Ｔｉｅｔｚｅら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２：３６３−３７１（１９９８）；Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：７５−９４（１９９８）；Ｅｉｃｈｌｅｒら，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８１−４９６（１９９５）；Ｇｏｒｄｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１（１９９４）；Ｇｏｒｄｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｇｏｒｄｏｎら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１４４−１５４（１９９６）；ＷｉｌｓｏｎおよびＣｚａｒｎｉｋ編，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７））。アンチセンス核酸分子の選択および調製のための方法は、当該技術分野においてよく知られており、インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）アプローチが挙げられる（Ｐａｔｚｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：４３２８−４３３４（１９９９）；Ｃｈｅｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８５０２−８５０７（１９９６）；ＬｅｂｅｄｅｖａおよびＳｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：４０３−４１９（２００１）；ＪｕｌｉａｎｏおよびＹｏｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：２９７−３０３（２０００）；ならびにＣｈｏ−Ｃｈｕｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２：４３７−４４９（１９９９））。ｓｉ  ＲＮＡの作製方法およびＲＮＡ干渉の使用方法は、以前に報告されている（Ｆｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１（１９９８）；Ｈａｍｍｏｎｄら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５−４９０（２００１）；ならびにＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２（２００２）；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２（２００２）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６（２００１）；（Ｎｙｋａｎｅｎら，Ｃｅｌｌ  １０７：３０９−３２１（２００１））。
【００９４】
本発明はまた、個体に、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を投与することによる、疾患の予防的処置方法を提供する。したがって、本発明の組成物は、疾患の発症を予防するため、または疾患の重篤度を軽減するためのワクチンとして使用され得る。該方法は、多様な疾患に使用され得、限定されないが、感染性疾患または癌が挙げられる。
【００９５】
本発明は、さらに、個体に、抗原およびＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化因子が薬学的に許容され得る担体中に含まれた組成物を投与することによる、疾患と関連する徴候または症状の改善方法を提供する。該方法は、疾患の重篤度を軽減するために使用され得る。したがって、本発明の組成物は、疾患を処置するために治療的に使用され得る。当業者は、ある具体的な疾患と関連する徴候または症状および関連する徴候または症状の改善を容易に判断できよう。該方法は、多様な疾患に使用され得、限定されないが、感染性疾患または癌が挙げられる。感染性疾患の場合、該方法は、感染を有する個体における感染性因子の量を減少させるために使用され得る。
【００９６】
本発明は、さらに、腫瘍の標的化方法を提供する。該方法は、ＴＩＭ標的化分子を被験体に投与する工程を含み得、この場合、腫瘍はＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現するものである。腫瘍は、例えば、癌腫、肉腫およびリンパ腫であり得る。別の実施形態では、本発明は、ＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することによる腫瘍成長の抑制方法であって、腫瘍がＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現するものである、腫瘍成長の抑制方法を提供する。また別の実施形態では、本発明は、診断用部分と結合体化させたＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することによる腫瘍の検出方法であって、腫瘍がＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現するものである、腫瘍の検出方法を提供する。
【００９７】
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示したようにしてＴＩＭ標的化分子を被験体に投与することによる、自己免疫疾患と関連する徴候または症状の改善方法を提供する。自己免疫疾患は、例えば、本明細書に開示したような、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性真性糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎など）、重症筋無力症および自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、ならびにアテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病、または他の自己免疫疾患であり得る。自己免疫障害は、細胞性エフェクター、例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞およびこれらが産生する抗体、ならびに他の細胞によって媒介される。これらの細胞は、本明細書に開示したような１つ以上のＴＩＭまたはＴＩＭリガンドを発現する。自己免疫性応答に関与する細胞を、例えば、抗体中の細胞溶解性Ｆｃまたは融合タンパク質を用いて、または毒性の結合体を用いることによって排除することにより、かかる自己免疫性障害における治療上の利益が得られる。
【００９８】
本発明の方法において、ＴＩＭ標的化分子は、単独で投与してもよく、または任意選択で、抗原とともに投与してもよい。免疫応答が刺激される本発明の方法では、本明細書に開示したように、ＴＩＭ標的化分子は、１種類の内因性抗原もしくは複数種類の抗原に対する免疫応答、またはＴＩＭ標的化分子とともに投与される１種類の外因性抗原もしくは複数種類の抗原に対する免疫応答を増強し得る。例えば、抗原は、腫瘍の標的化方法における腫瘍抗原であり得る。同様に、細胞媒介性自己免疫疾患と関連する抗原が、所望により、ＴＩＭ標的化分子またはその結合体とともに投与され得る。ＴＩＭ標的化分子はまた、治療用部分と結合体化させ得る。加えて、ＴＩＭ標的化分子またはＴＩＭ標的化分子結合体は、ＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドであり得る。かかるＴＩＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、標的細胞枯渇性（細胞溶解性）または非標的細胞枯渇性（非細胞溶解性）であり得る。
【００９９】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的な影響を与えない改変もまた、本明細書に示した本発明の定義内に規定されることを理解されたい。したがって、以下の実施例は例示を目的とし、本発明を限定しない。
【実施例】
【０１００】
（実施例  Ｉ）
（抗ＴＩＭ−１抗体の精製）
マウス抗ヒトＴＩＭ−１抗体またはラット抗マウスＴＩＭ−１抗体を分泌するハイブリドーマを、まず細胞培養フラスコ中で培養し、続いて、Ｂｉｏｐｅｒｍ細胞培養反応器に移した。分泌された抗体を含有する培養上清み液を４８時間毎に回収し、除濁し（ｃｌａｒｉｆｙ）、４℃で保存した。回収した上清み液をプールし、抗ＴＩＭ−１抗体を上清み液から、プロテインＧセファロース親和性クロマトグラフィーによって精製し、カラムから、グリシン（ｐＨ２．５〜３．５）を用いて溶出した。溶出液をｐＨ中和し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。精製された抗体を、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０１０１】
（実施例  ＩＩ）
（マウスとヒトのＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質発現用ＤＮＡベクターの構築）
ＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質遺伝子セグメントのクローン化のためのシャトルプラスミドベクター（ｐＴＰＬ−１）を設計および構築した。基礎となるベクターｐＴＰＬ−１は、細菌系および真核生物系耐性遺伝子、ならびにＣＭＶエンハンサーおよびβ−グロビンポリＡ部位と隣接するマルチプルクローニングサイトを担持する（ＴＩＭ−３融合体に関する図１８も参照のこと）。マウス非細胞溶解性ＩｇＧ２ａ／Ｆｃ断片（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発により作製し、Ｃ１ｑ結合性モチーフを取替え、ＦｃγＲｌ結合部位を不活性化した（Ｚｈｅｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５））。
【０１０２】
本発明の因子の一部分であり得るＦｃ領域は、「細胞溶解性」または「非細胞溶解性」であり得る。非細胞溶解性Ｆｃ領域は、典型的には、高親和性Ｆｃレセプター結合性部位およびＣ’１ｑ結合部位を欠く。マウスＩｇＧ  Ｆｃの高親和性Ｆｃレセプター結合性部位は、ＩｇＧ  Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含む。したがって、マウスＦｃレセプター結合性部位は、Ｌｅｕ２３５を変異または欠失させることにより破壊され得る。例えば、Ｌｅｕ２３５をＧｌｕで置換すると、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃレセプターに結合する能力が抑制される。マウスＣ’１ｑ  結合性部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基を変異または欠失させることにより機能が破壊され得る。例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２をＡｌａ残基で置換すると、ＩｇＧ  Ｆｃは、抗体依存性補体溶解を指示できなくなる。対照的に、細胞溶解性ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、高親和性Ｆｃレセプター結合性部位およびＣ’１ｑ結合部位を有する。高親和性Ｆｃレセプター結合性部位は、ＩｇＧ  Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含み、Ｃ’１ｑ結合性部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基を含む。細胞溶解性ＩｇＧ  Ｆｃは、野生型残基または保存的アミノ酸置換をこれらの部位に有する。細胞溶解性ＩｇＧ  Ｆｃは、抗体依存性細胞性細胞傷害性または補体特異的細胞溶解（ＣＤＣ）のために細胞を標的化し得る。また、ヒトＩｇＧに対する適切な変異も知られている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１１９−１２４（１９９４）；およびＢｒｅｋｋｅら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１２５（１９９４）を参照のこと）。
【０１０３】
野生型および点変異ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ断片はともに、それぞれＰＣＲによって増幅し、ｐＴＰＬ−１内にクローン化してｐＴＰＬ−１／ｍＦｃ２ａおよびｐＴＰＬ−１／ｍＦｃ２ａ／ｎｌ（ｎｌは非細胞溶解性）を創製した。続いて、ヒトＣＤ５シグナル配列遺伝子セグメントを、以下の２つのオリゴヌクレオチド（遺伝子座（Ｌｏｃｕｓ）：ＮＭ＿０１４２０７、フォワードオリゴヌクレオチド：５’−ＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧ−３’、配列番号：４３；およびリバースオリゴヌクレオチド：５’−ＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧ−３’、配列番号：４４）を用いたアニーリングおよびフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応によって合成した。フォワードオリゴヌクレオチドは、適当な制限部位およびＣＤ５シグナル配列の開始ＡＴＧ（下線部）の前であってこの配列の５’末端にコザックコンセンサス配列を含有する。リバースオリゴヌクレオチドは、ＣＤ５シグナル配列の３’末端由来の配列および適当な制限部位から構成される。合成した遺伝子断片を消化し、ｐＴＰＬ−１／Ｆｃベクター内にクローン化した。これにより、プラスミドｐＴＰＬ−１／ＣＤ５／ｍＦｃ２ａおよびｐＴＰＬ−１／ＣＤ５／ｍＦｃ２ａ／ｎｌが創製された。最後に、マウスＴＩＭ−１のそれぞれの細胞外ドメインをＰＣＲ増幅し、ｐＴＰＬ−１／ＣＤ５／ｍＦｃ２ａおよびｐＴＰＬ−１／ＣＤ５／ｍＦｃ２ａ／ｎｌベクター内のヒトＣＤ５シグナル配列とＩｇ  Ｆｃ領域との間にクローン化した。このクローン化工程により、最終発現プラスミドｐＴＰＬ−１／ＴＩＭ−１ＦｃおよびｐＴＰＬ−１／ＴＩＭ−１Ｆｃ／ｎｌを得た。プラスミド構築物の正確さは、ＤＮＡ配列決定によって確認した。以下のマウスＴＩＭ−１／Ｆｃ発現ベクターを構築物した：（１）非細胞溶解性および細胞溶解性マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃと融合させたＴＩＭ−１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインのみ。Ｉｇドメインのそれぞれのヌクレオチド配列を図１および２に示す。（２）非細胞溶解性および細胞溶解性マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃと融合させたマウスＴＩＭ−１（ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７Ｂｌ／６対立遺伝子のいずれか）の完全長の細胞外ドメイン。細胞外ドメイン（Ｉｇドメイン＋ムチンドメイン）の配列を図１および２に示す。タンパク質の配列を図２に示す。例示的なＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質配列を図４に示す。
【０１０４】
上記のマウスＴＩＭ−１／Ｆｃ発現ベクターと同様にして、ヒトＴＩＭ−１／Ｆｃを発現するベクターも作製した。これを行うため、ヒトＩｇＧ１  ＦｃまたはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（それぞれの免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）のいずれかをＰＣＲによって増幅し、ｐＴＰＬ−１内にクローン化した。次いで、ＣＤ５リーダー配列を、上記のようにして挿入し、最後に、異なるＴＩＭ−１対立遺伝子（米国特許出願公開第２００３０１２４１１４号に記載）を該発現ベクター内にクローン化した。この場合も、ＴＩＭ−１のＩｇドメインのみ、またはＴＩＭ−１のＩｇドメインおよびムチンドメインのいずれかを含有するベクターを用いてＴＩＭ−１／Ｆｃ発現ベクターを作製した。同様の構築物を、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４ならびにマウスＴＩＭ−２について作製した。
【０１０５】
（実施例  ＩＩＩ）
（２９３細胞におけるＴＩＭ／Ｆｃ融合タンパク質一過性発現）
作製した発現ベクターの機能性を試験するため、２９３細胞において一過性トランスフェクションを行った。簡単には、血清無含有成長培地（２９３−ＳＦＭ  ＩＩ；ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）中の８０〜９０％コンフルエント２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００系を製造業者の取扱説明書（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）に従って用い、トランスフェクトした。常套的には、１０５個の細胞あたり１μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。トランスフェクションの１日後、成長培地を新たな培地と交換し、細胞を７日間まで培養した。細胞培養上清み液を遠心分離によって除濁し、ＴＩＭ−１／ＦｃまたはＴＩＭ−３／Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＧセファロース親和性クロマトグラフィーによって精製した。プロテインＧビーズからの低ｐＨ溶出後、精製タンパク質をＰＢＳに対して透析し、−８０℃で保存した。生成されたタンパク質の同一性、純度および完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）ならびに銀染色またはクマシー染色、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによって解析した。
【０１０６】
（実施例  ＩＶ）
（ＴＩＭ−１／Ｆｃ、ＴＩＭ−３／ＦｃおよびＴＩＭ−４／Ｆｃを安定発現するＣＨＯ細胞株の作製）
種々のＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞株を、以下のようにして作製した。接着（ＣＨＯ−Ｋ１）または懸濁成長ＣＨＯ−Ｓ細胞（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）を、適切な発現プラスミド（ｐＴＰＬ−１；ＴＩＭ−１／Ｆｃ系列）により、市販のキット（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００，ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）を製造業者の取扱説明書に従って用いるか、またはエレクトロポレーションによるかのいずれかによってトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、１日中、成長培地（ＣＨＯ−ＳＦＭ  ＩＩ；ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，カールズバッド，ＣＡ；またはＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清）中で回収し、次いで、抗生物質Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ）を含有する選択培地中に移した。個々のクローンを、単一細胞限界希釈クローン化（懸濁株）によって、または「クローンピッキング」（接着細胞株）によって調製し、さらに増殖させた。ＥＬＩＳＡを用い、培養培地の上清み液を分泌されたＴＩＭ−１／Ｆｃタンパク質の存在についてアッセイした。高産生性クローンを、さらにサブクローン化し、タンパク質産生のために拡大（ｅｘｐａｎｄ）させた。本質的に同一のプロトコルを用いて、ＴＩＭ−３／ＦｃおよびＴＩＭ−４／Ｆｃ融合タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞株を作製した。
【０１０７】
（実施例  Ｖ）
（マウスＴＩＭ／Ｆｃ融合タンパク質の作製および精製）
ＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞株を、血清無含有成長培地（ＣＨＯ−ＳＦＭ  ＩＩ；ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）またはＤＭＥＭ（５％ウシ胎仔血清）中で拡大させた。培養培地を回収し、遠心分離により除濁および／または濾過し、限外濾過（Ｐａｌｌ  ＵｌｔｒａｓｅｔｔｅＴＭ，アナーバー，ＭＩ）によって濃縮し、プロテインＡまたはＧにより固定化した。タンパク質が結合した樹脂を洗浄し、ＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質を低ｐＨで溶出した。画分を回収し、中性ｐＨに調整した。必要により、溶出ＴＩＭ−１／Ｆｃタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製タンパク質を、適当な生理学的バッファー（例えば、ＰＢＳ）に対して透析し、アリコートに分けて−８０℃で保存した。本質的に同一のプロトコルを用いて、ＴＩＭ−３／ＦｃおよびＴＩＭ−４／Ｆｃ融合タンパク質を作製および精製した。
【０１０８】
（実施例  ＶＩ）
（Ｂ型肝炎ワクチン接種用アジュバントとしての抗ＴＩＭ−１）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、単回用量（１０マイクログラム、「ｍｃｇ」）のＥｎｇｅｒｉｘ−ＢＴＭワクチン（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）を、５０ｍｃｇ／ｍＬの抗ＴＩＭ−１抗体とともに、またはこれなしで、ワクチン接種した。抗体は、注射の前に、ワクチン（アジュバントとして０．５ｍｇ／ｍＬの水酸化アルミニウムを含有するワクチン）と混合した。対照マウスは、水酸化アルミニウム含有ＰＢＳ、ＰＢＳ単独、またはイソタイプ適合抗体を含有するビヒクルの対照で処置した。免疫処置後第７日、第１４日および第２１日に、各群のマウスを解析に供した。簡単には、脾臓および血清を回収し、処理して、β−メルカプトエタノール、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン）を加えたＲＰＭＩ培地中で単一細胞懸濁液とした。処理した脾臓細胞（３×１０５個の細胞）を、精製Ｂ型肝炎表面抗原（５ｍｃｇ／ｍＬ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フランダース，ニュージャージー州）の存在下でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で９６時間のインキュベーション後、全生存細胞を、ＷＳＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス，ＩＮ）によって解析した。さらに、９６時間後、これらの実験ウェルから上清み液を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネアポリス  ＭＮ）の取扱説明書に従って用いて解析した。血清試料を１：２００に希釈し、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡにて解析した。
【０１０９】
他の実験では、ワクチン接種した動物から単離した脾臓細胞を、０．３、１．０または３．０ｍｃｇ／ｍＬのＢ型肝炎表面抗原とともに、上記のようにしてインキュベートした。抗原に応答した細胞の増殖を、Ｄｅｌｆｉａ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ボストン，ＭＡ）を用いて測定した。簡単には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり６匹のマウス）を、アジュバントとしてミョウバンを含むＥｎｇｅｒｉｘ  ＢＴＭおよび１００ｍｃｇのＴＩＭ−１抗体によりワクチン接種した。Ｂ型肝炎表面抗原特異的脾臓細胞の増殖を、リンパ球調製物を４日間、抗原の存在または非存在下、全容量０．２ｍＬの完全培地（ＲＰＭＩ  １０％ウシ胎仔血清、ペニシリン−ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール）中でインキュベートすることにより測定した。各増殖時点の終了の２４時間前、９６ウェル平底組織培養プレート内の細胞を、０．０２ｍＬの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識化溶液を用いて標識した。２４時間後、プレートを遠心分離し、培地を除去した。ウェルの核酸内容物を該プラスチック（ｐｌａｓｔｉｃ）に固定し、ユウロピウムで標識した抗ＢｒｄＵ抗体を添加して、取り込まれたＢｒｄＵと結合させた。ウェルの洗浄および蛍光誘導物質の添加後、ユウロピウム蛍光を、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ２マルチラブル（ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ）解析装置を用いて解析し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。アッセイ対照には、細胞なしのウェル、ＢｒｄＵ無含有細胞および抗原刺激なしの細胞を含めた。
【０１１０】
実験結果は、市販のＢ型肝炎ワクチン（Ｅｎｇｅｒｉｘ−ＢＴＭ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）の投与がマウスにおいて不充分な免疫原性しかないことを示す。このワクチンは、マウスにおいて細胞媒介性免疫応答を惹起せず、Ｂ型肝炎抗原に対する抗体は免疫処置の３週間後にしか検出されない。抗ＴＩＭ−１抗体をアジュバントとしてワクチン接種時にＢ型肝炎ワクチンとともに投与することにより、ワクチン接種後の７日以内にＢ型肝炎抗原に対する抗原特異的細胞媒介性免疫応答の発生がもたらされた。細胞媒介性免疫は、抗原への再曝露後の免疫細胞増殖モニタリングすることにより、およびＴヘルパーサイトカインの産生を測定することによりアッセイした。また、抗ＴＩＭ−１抗体をアジュバントとしてワクチン接種時に投与することにより、ワクチン接種後の７日以内にＢ型肝炎抗原に対する抗体の生成ももたらされた。
【０１１１】
図５は再刺激時の抗原に対する増殖を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｅｎｇｅｒｉｘ−ＢＴＭ（１０ｍｃｇ）単独または単回用量の抗ＴＩＭ抗体（５０ｍｃｇ）によりワクチン接種した。表示した時間に、脾臓を、Ｂ型肝炎表面抗原に対する増殖について解析した（９６時間アッセイ）。ワクチン単独は、抗原に応答した脾細胞およびＴ細胞増殖をほとんど刺激しなかったが、抗ＴＩＭ−１抗体は、抗原に対する細胞の増殖応答を大いに増強し、細胞性免疫の増大が示された。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１抗体がＢ型肝炎ワクチンに対する応答を改善したことを示す。
【０１１２】
図６は、抗原での再刺激後のサイトカイン産生を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇのＢ型肝炎ワクチンにより、または抗ＴＩＭ抗体とともに１０ｍｃｇのワクチンにより免疫処置した。第７日、第１４日、および第２１日に、インビトロでＢ型肝炎抗原により脾臓細胞を刺激した。９６時間後、上清み液をそれぞれＩＦＮ−γおよびＩＬ−４について解析した。ワクチン単独は、抗原に応答したＩＦＮ−γ産生（Ｔｈ１サイトカイン）をほとんど刺激しなかったが、抗ＴＩＭ−１抗体は、このサイトカインの産生を大いに増強し、Ｔｈ１応答の増大が示された。対照的に、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４の発現すべての時点でバックグラウンドレベルであった。これらの結果は、インターフェロン−γ産生に対する抗ＴＩＭ−１抗体のアジュバント効果を示す。
【０１１３】
図７は、Ｂ型肝炎特異的抗体の産生を示す。Ｂ型肝炎ワクチンで抗ＴＩＭ抗体（単回用量；５０ｍｃｇ）とともに、またはこれなしでワクチン接種したマウス由来の血清試料を、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体の存在について免疫処置後第７日に試験した。ワクチン単独は、免疫処置後の初期ではＢ型肝炎抗原に対する抗体応答をほとんど刺激しなかったが、抗ＴＩＭ−１抗体は強い抗体応答を刺激した。これらの結果は、Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた抗ＴＩＭ−１抗体での処置がＢ型肝炎抗原に対する抗体を誘発することを示す。
【０１１４】
図８は、Ｂ型肝炎表面抗原特異的脾細胞の抗原刺激と用量依存的関係での増殖を示す。１０ｍｃｇのＥｎｇｅｒｉｘ  ＢＴＭを１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂとともに、またはこれなしで１回ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を単離し、漸増濃度のＢ型肝炎表面抗原の存在または非存在下で培養した。４日間のインキュベーション後、ウェルを、Ｄｅｌｆｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて増殖について解析した。ＴＩＭ−１  ｍＡｂとともにワクチンを接種したマウスは、Ｅｎｇｅｒｉｘ  ＢＴＭワクチンを単独またはイソタイプ対照抗体とともにワクチン接種した場合と比べ、特異的抗原に対して統計学的に有意な応答（ｐ＜０．０５）を生じた。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１が、Ｂ型肝炎表面抗原に対する脾細胞の増殖を増強することを示す。
【０１１５】
図９は、特異的抗原での刺激におけるＩＦＮ−γの産生を示す。インターフェロン−γ発現は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｅｐＢｓＡｇ）に対する全脾細胞において測定した。上記の増殖アッセイウェルから上清み液を、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン解析のために取り出した。ＴＩＭ−１  ｍＡｂをワクチン接種したマウスは、抗原刺激に応答して、ワクチン単独またはイソタイプ対照抗体とともにワクチンを接種したマウスよりも有意に高い量のＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０５）を生成した。ＩＬ−４は検出され得なかった。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１が、Ｂ型肝炎表面抗原に応答してＩＦＮ−γ発現を増強することを示す。
【０１１６】
（実施例ＶＩＩ）
（ＨＩＶ抗原用アジュバントとしての抗ＴＩＭ−１）
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群あたり４匹）に、単回用量のＨＩＶ  ｐ２４抗原（２５または５０ｍｃｇ）をＰＢＳにて皮下に、５０もしくは１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂ、イソタイプ対照抗体または５０もしくは１００ｍｃｇのＣｐＧ  １８２６オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カールズバッド  ＣＡにより合成）のいずれかを腹腔内に、第１日および第１５日にワクチン接種した。ＣｐＧ  １８２６オリゴは、
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号：４５）
ＺＯＯＦＺＥＦＯＥＺＺＯＯＺＥＦＯＥＺＴ
である。上列は、標準的な一文字略号命名法でのヌクレオチドの配列である。塩基はすべて、最後のＴを除き、ホスホロチオエート化により修飾されている。第２列は、ホスホロチオエート化塩基の一文字略号を用いた配列である。コードは、Ｆ＝Ａ−ホスホロチオエート、Ｏ＝ｃ−ホスホロチオエート、Ｅ＝ｇ−ホスホロチオエート、Ｚ＝Ｔ−ホスホロチオエートである。次いで、マウスを第２１日に致死させ、抗原に対する増殖を測定するため脾臓細胞を回収した。簡単には、脾臓細胞を、リンパ球調製物を４日間、ＨＩＶ  ｐ２４抗原の存在または非存在下で、全容量０．２ｍＬの完全培地（ＲＰＭＩ  １０％ウシ胎仔血清、ペニシリン−ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール）中でインキュベートすることにより測定した。細胞増殖は、Ｄｅｌｆｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。インキュベーション期間終了の２４時間前、９６ウェル丸底組織培養プレート内の細胞を、０．０２ｍＬのＢｒｄＵ標識化溶液で標識した。２４時間後、プレートを遠心分離し、培地を除去した。ウェルの核酸内容物を該プラスチックに固定し、ユウロピウムで標識した抗ＢｒｄＵ抗体を添加して、取り込まれたＢｒｄＵと結合させた。ＢｒｄＵの取り込みを、蛍光定量的解析装置を用い、ユウロピウムの相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。アッセイ対照には、細胞なしのウェル、ＢｒｄＵ無含有細胞、およびビヒクル単独（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）を含めた。
【０１１７】
図１０は、ＨＩＶ  ｐ２４抗原＋ＴＩＭ−１  ｍＡｂで免疫処置したマウスが、イソタイプ対照抗体またはＣｐＧ  オリゴヌクレオチドのいずれかと比べ、抗原に対して有意に高い増殖応答（ＣｐＧと比べてｐ＜０．０５）を生じたことを示す。マウスに、単回用量のＨＩＶ  ｐ２４抗原（５０ｍｃｇ）をＰＢＳにて皮下に、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂ、イソタイプ対照抗体または１００ｍｃｇのＣｐＧ（１８２６）オリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを腹腔内に、第１日および第１５日にワクチン接種した。次いで、マウスを第２４日に致死させ、脾臓細胞を、抗原に対する増殖のために回収した。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１がＨＩＶ  ｐ２４抗原に対する増殖応答を増強することを示す。
【０１１８】
（実施例ＶＩＩＩ）
（インフルエンザワクチン接種用アジュバントとしての抗ＴＩＭ−１）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、単回用量（３０ｍｃｇ）のＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭワクチン（Ｅｖａｎｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｌｔｄ）を、５０ｍｃｇ／ｍＬの抗ＴＩＭ−１抗体とともに、またはこれなしでワクチン接種した。抗体を、注射の直前にワクチンと混合した。対照マウスは、ＰＢＳ単独またはイソタイプ適合抗体含有ＰＢＳの対照で処置した。免疫処置後、第１０日に、各群のマウスを解析に供した。簡単には、脾臓および血清を回収し、処理して、β−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン）を加えたＲＰＭＩ培地中で単一細胞懸濁液とした。処理した脾臓細胞（３×１０５個の細胞）を、不活化した完全体（ｗｈｏｌｅ）インフルエンザ（１ｍｃｇ／ｍＬ、北京株、Ｈ１Ｎ１；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フランダース，ニュージャージー州）の存在下でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で９６時間のインキュベーション後、生存細胞を、ＷＳＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス，ＩＮ）によって解析した。９６時間後、これらの実験用ウェルから上清み液を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の取扱説明書に従って用いて解析した。血清試料を１：２００に希釈し、インフルエンザウイルスに特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡにて解析した。
【０１１９】
図１１は、インフルエンザ抗原に対する脾細胞の増殖応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、インフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭまたはＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ＋抗ＴＩＭ−１抗体（単回用量；５０ｍｃｇ）で免疫処置した。１０日後、ウイルス（Ｈ１Ｎ１）による刺激に対する応答を、９６時間増殖アッセイにおいて測定した。ＰＢＳ、および抗ＴＩＭ−１抗体単独を処置対照とした。ワクチン単独は、抗原に応答した脾細胞およびＴ細胞増殖をほとんど刺激しなかったが、抗ＴＩＭ−１抗体は、抗原に対する細胞の増殖応答を大いに増強し、細胞性免疫の増大が示された。これらの結果は、インフルエンザワクチン接種に対する抗ＴＩＭ−１抗体のアジュバント効果を示す。
【０１２０】
図１２は、インフルエンザ免疫処置マウスのサイトカイン産生を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３０ｍｃｇのインフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭまたはＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ＋抗ＴＩＭ抗体（単回用量；５０ｍｃｇ）で免疫処置した。１０日後、脾細胞を調製し、ウイルス（Ｈ１Ｎ１）での再刺激におけるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４）の産生を、９６時間の培養後に測定した（ＰＢＳ、ＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ、抗ＴＩＭ−１、およびＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ＋抗ＴＩＭ−１を図１２の左から右に示す）。ワクチン単独は、抗原に応答したＩＦＮ−γ産生（Ｔｈ１サイトカイン）をほとんど刺激しなかったが、抗ＴＩＭ−１抗体は、このサイトカインの産生を大いに増強し、Ｔｈ１応答の増大が示された。ＩＬ−４産生はバックグラウンド以下であった。したがって、ＩＦＮ−γとは対照的に、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４の発現はバックグラウンドレベルであった。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１アジュバントは、インフルエンザ特異的Ｔｈ１サイトカイン応答を惹起することを示す。
【０１２１】
（実施例ＩＸ）
（異なるインフルエンザ株に対してヘテロサブタイプ的免疫応答を生じさせるためのアジュバントとしての抗ＴＩＭ−１）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり３匹）を、単回用量（１０ｍｃｇ）の北京インフルエンザウイルス（Ａ／北京／２６２／９５、Ｈ１Ｎ１）で、１００ｍｃｇ／ｍＬ  抗ＴＩＭ−１抗体とともに、またはこれなしでワクチン接種した。抗体を、注射の直前に抗原と混合した。対照マウスは、ＰＢＳ単独、またはイソタイプ適合（ラットＩｇＧ２ｂ）抗体含有抗原の対照で処理した。免疫処置後第２１日に、各群のマウスを解析に供した。簡単には、脾臓および血清を回収し、処理し、β−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン）を加えたＲＰＭＩ培地中で単一細胞懸濁液とした。処理した脾臓細胞（３×１０５個の細胞）を、不活化した完全体インフルエンザ（１ｍｃｇ／ｍｌ、北京株、Ｈ１Ｎ１、またはＡ／キエフ様３０１／９４−ヨハネスブルグ／３３／９４、Ｈ３Ｎ２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フランダース，ニュージャージー州）の存在下でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で９６時間のインキュベーション後、生存細胞を、Ｄｅｌｆｉａ増殖キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって解析した。インキュベーション期間終了の２４時間前、９６ウェル丸底組織培養プレート内の細胞を、２０μＬのＢｒｄＵ標識化溶液で標識した。２４時間後、プレートを遠心分離し、培地を除去した。ウェルの核酸内容物を該プラスチックに固定し、ユウロピウムで標識した抗ＢｒｄＵ抗体を添加して、取り込まれたＢｒｄＵと結合させた。ＢｒｄＵの取り込みを、蛍光解析装置を用い、ユウロピウムの相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。アッセイ対照には、細胞なしのウェル、ＢｒｄＵ無含有細胞および抗原刺激なしの細胞を含めた。９６時間後、これらの実験用ウェルから上清み液を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の取扱説明書に従って用いて解析した。
【０１２２】
図１３は、北京ウイルス（Ａ）またはキエフウイルス（Ｂ）による刺激に対する北京免疫処置マウスでの増殖応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇの不活化された北京インフルエンザウイルスで、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ）の存在または非存在下で免疫処置した。２１日後、脾臓を、インビトロ解析のために回収した。増殖はＴＩＭ−１  ｍＡｂを用いると増強され、キエフ刺激に対する応答は、種交差免疫（ｐ＜０．０１）を示す。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１がＡ型インフルエンザに対する脾細胞の増殖を増強し、種交差免疫を刺激することを示す。
【０１２３】
図１４は、北京ウイルス（Ａ）またはキエフウイルス（Ｂ）による刺激に対する北京免疫処置マウスでのサイトカイン応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇの不活化された北京インフルエンザウイルスで、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ）の存在または非存在下で免疫処置した。２１日後、脾臓を、インビトロ解析のために回収した。増殖アッセイの上清み液を、ＩＦＮ−γの存在について解析した。パネルＡは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加が、北京ウイルス（Ｈ１Ｎ１）刺激応答したＩＦＮ−γの産生を有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。パネルＢは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加がまた、ヘテロサブタイプキエフ株（Ｈ３Ｎ２）による刺激に応答したＩＦＮ−γの産生も有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１が種交差免疫を増強することを示す。
【０１２４】
図１５は、北京ウイルス（Ａ）またはキエフウイルス（Ｂ）による刺激に対する北京免疫処置マウスでのＩＬ−４サイトカイン産生を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇの不活化された北京インフルエンザウイルスで、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ）の存在または非存在下で免疫処置した。２１日後、脾臓をインビトロ解析のために回収した。増殖アッセイの上清み液をＩＬ−４の存在について解析した。パネルＡは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加が、北京ウイルス（Ｈ１Ｎ１）刺激応答したＩＬ−４の産生を有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。パネルＢは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加がまた、ヘテロサブタイプキエフ株（Ｈ３Ｎ２）による刺激に応答したＩＬ−４の産生も有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。これらの結果は、ＩＬ−４発現が、Ａ型インフルエンザで刺激した脾細胞において、抗ＴＩＭ−１によって増強されたことを示す。
【０１２５】
（実施例Ｘ）
（炭疽ワクチン接種用アジュバントとしての抗ＴＩＭ−１および抗ＴＩＭ−３）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単回用量（４０ｍｃｇ）の組換えＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ｒＰＡ、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；キャンベル  ＣＡ）を、５０ｍｃｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ−３抗体とともに、またはこれなしでワクチン接種した。抗体を注射直前に、抗原とアジュバントとしての１．２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムとともに混合した。対照マウスは、水酸化アルミニウム含有ＰＢＳまたはイソタイプ適合対照抗体を含有するビヒクルで処置した。免疫処置後、第１０日に、各群のマウスを解析に供した。簡単には、脾臓および血清を回収し、処理して、β−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン）を加えたＲＰＭＩ培地中で単一細胞懸濁液とした。処理した脾臓細胞（３×１０５個の細胞）を、ｒＰＡ（１ｍｃｇ／ｍＬ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フランダース，ニュージャージー州）の存在下でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で９６時間のインキュベーション後、生存細胞を、ＷＳＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス，ＩＮ）によって解析した。さらに、９６時間後、これらの実験用ウェルから上清み液を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の取扱説明書に従って用いて解析した。血清試料を１：２００に希釈し、ｒＰＡ抗原に特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡにて解析した。
【０１２６】
あるいはまた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、単回用量（０．２ｍＬ）のＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ（ＡＶＡ；Ｂｉｏｐｏｒｔ、ランシング、ＭＩ）で、５０ｍｃｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ−１抗体とともに、またはこれなしでワクチン接種した。抗体を、注射直前に抗原とアジュバントとしての１．２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムとともに混合した。対照マウスは、ＢｉｏＴｈｒａｘＴＭワクチン単独またはイソタイプ適合対照抗体を含有するＢｉｏＴｈｒａｘＴＭワクチンで処置した。免疫処置後、第７日に、各群のマウスを解析に供し、血清試料を採取した。血清試料を１：２００に希釈し、ｒＰＡ抗原に特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡにて解析した。また、第１５日に脾臓を回収し、処理し、β−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン）を加えたＲＰＭＩ培地中で単一細胞懸濁液とした。処理した脾臓細胞（３×１０５個の細胞）を、ｒＰＡ（１ｍｃｇ／ｍｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フランダース，ニュージャージー州）の存在下でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で９６時間のインキュベーション後、生存細胞を、ＷＳＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス，ＩＮ）によって解析した。さらに、９６時間後、これらの実験用ウェルから上清み液を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の取扱説明書に従って用いて解析した。
【０１２７】
図１６は、ワクチン接種後の抗ｒＰＡ抗体応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．２ｍＬのＡＶＡ（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ）ＢｉｏＴｈｒａｘＴＭまたはＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ＋抗ＴＩＭ−１抗体で免疫処置した。７日後、ｒＰＡに特異的な全血清抗体をＥＬＩＳＡにて測定した。ＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ単独およびＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ＋イソタイプ適合抗体を処置対照とした。ワクチン単独は、炭疽菌抗原に対する抗体応答をほとんど刺激しなかったが、抗ＴＩＭ−１抗体は、有意に高い抗体応答を刺激した。これらの結果は、ＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ＋抗ＴＩＭ−１が抗体産生を増大させることを示す。
【０１２８】
図１７は、炭疽菌ワクチン接種に対する抗ＴＩＭアジュバント効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、組換えＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ｒＰＡ；４０ｍｃｇ）またはｒＰＡ＋抗ＴＩＭ−３抗体（単回用量；５０ｍｃｇ）で免疫処置した。１０日後、ｒＰＡによる再刺激に対する脾細胞の応答を、９６時間増殖アッセイにおいて測定した。ＰＢＳおよびｒＰＡ＋イソタイプ適合対照抗体を処置対照とした。これらの結果は、炭疽菌ワクチン接種に対する抗ＴＩＭ−３のアジュバント効果を示す。
【０１２９】
（実施例ＸＩ）
（リステリア菌ワクチン接種用アジュバントとしての抗ＴＩＭ−１）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単回用量の加熱殺菌Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＨＫＬＭ）を、５０ｍｃｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ−１抗体とともに、またはこれなしでワクチン接種した。抗体を、注射の前に抗原および水酸化アルミニウム（アジュバントとして）と混合した。対照マウスは、水酸化アルミニウム含有ＰＢＳ、ＰＢＳ単独またはイソタイプ適合抗体を含有するビヒクルの対照で処置した。免疫処置後第１０日に、各群のマウスを解析に供した。簡単には、脾臓および血清を回収し、処理して、β−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン）を加えたＲＰＭＩ培地中で単一細胞懸濁液とした。処理した脾臓細胞（３×１０５個の細胞）を、１ｍｃｇ／ｍｌ  ＨＫＬＭの存在下でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で９６時間のインキュベーション後、生存細胞を、ＷＳＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス，ＩＮ）によって解析した。９６時間後、これらの実験用ウェルから上清み液を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の取扱説明書に従って用いて解析した。血清試料を１：２００に希釈し、ＨＫＬＭに特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡにて解析した。
【０１３０】
（実施例ＸＩＩ）
（癌ワクチン用アジュバントとして、および腫瘍の処置用治療剤としてのＴＩＭ−１／Ｆｃ、ＴＩＭ−４／Ｆｃおよび抗ＴＩＭ−１）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０６γ照射またはマイトマイシン処置Ｂｌ６．Ｆ１０細胞（黒色腫）、ＥＬ４細胞（胸腺腫）またはｐ８１５細胞（肥満細胞腫）を皮下注射した。不活化された腫瘍細胞でのワクチン接種時、動物をまた０．１ｍｇのラット抗マウスＴＩＭ−１またはＴＩＭ−１／Ｆｃで、皮下または腹腔内のいずれかにて処置した。対照マウスは、等量のラットまたはマウスのＩｇＧ２ａで処置した。このワクチン接種プロトコルを１４日後に繰り返した。第２０日に、マウスを、１０５〜１０６個の肝腫瘍細胞（各腫瘍型について、処置なしで１００％腫瘍発生をもたらすように漸増（ｔｉｔｒａｔｅ）：Ｂ１６．Ｆ１０：５×１０５個の細胞；Ｐ８１５およびＥＬ４：１０６細胞）で抗原刺激し、腫瘍の発生および大きさを２日ごとにモニターした。
【０１３１】
実験で用いたマウスおよび細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２またはＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（納期の時点で８〜１０週齢）であった。ＥＬ４胸腺腫、Ｂｌ６Ｆ１０黒色腫およびＰ８１５肥満細胞腫の腫瘍細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，マナサス，ＶＡ）から購入し、ＡＴＣＣにより推奨されたとおり、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ウッドランド，ＣＡ）および１０００ｍｃｇ／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、１０００ｍｃｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンおよび２．５ｍｃｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を加えたＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールズバッド，ＣＡ）中で培養した。記載の場合、腫瘍細胞に、モデルＣ−１８８型コバルト−６０線源（ＭＤＳ−Ｎｏｒｄｉｏｎ，オタワ，ＯＮ，カナダ）により放射される２０，０００Ｒａｄのγ−放射線を照射した。
【０１３２】
動物処置では、マウスをまず、右側腹部の皮膚上の毛を刈り、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）単独、１００ｍｃｇのクローン１もしくはクローン２の抗ＴＩＭ−１抗体、または１０６γ照射したＥＬ４細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞もしくはＰ８１５細胞＋１００ｍｃｇのクローン１抗体もしくはクローン２抗体のいずれかを含有するＰＢＳビヒクルのいずれかを注射した。これらの注射は、それぞれの数（上記参照）の腫瘍生細胞（対数成長期の培養物から新たに調製したもの）を動物に注射する１０、１７および３２日前に行った。腫瘍抗原刺激注射は、毛を刈った左側腹部の皮膚に行った。抗原刺激および（ｐｒｅ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）抗原刺激前の注射はすべて、皮下経路により１００μｌの容量で送達し、２６ゲージ５／８インチの皮下用斜端皮下ニードル（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，フランクリンレークス，ＮＪ）を用いて行った。
【０１３３】
腫瘍測定および統計学的解析のため、腫瘍抗原刺激マウスの左側腹部の皮膚下の腫瘍成長を、デジタルカリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、オーロラ、ＩＬ）を用い、腫瘍抗原刺激細胞の皮下送達の１０、１３、１７、２３および２６日後に測定した。腫瘍測定値（単位ミリメートル）を、腫瘍の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および周囲体輪郭からの高さ（Ｈ）を表す３つのほぼ垂直な軸上で採寸した。腫瘍の容積を、式：容積＝［（４／３）・π・（Ｌ／２）・（Ｗ／２）・（Ｈ／２）］を適用することにより算出した。平均の標準誤差（ＳＥＭ）およびスチューデントｔ検定の確率（ｐ）値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて求めた。
【０１３４】
図２０に示されるように、ワクチン接種とともに抗ＴＩＭ−１抗体を送達することは、完全な腫瘍拒絶を惹起する。マウスには、腫瘍抗原刺激の１０、１７および３２日間前に、記載の材料を注射した。γ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞を、１回の注射につき１０６細胞で送達した。抗ＴＩＭ−１抗体を、１回の注射につき１００ｍｃｇで送達した。注射はすべて、１００μＬ容量を、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの毛を刈った右側腹部の皮膚に皮下送達することによって行った。第０日に、マウスを、毛を刈った左側腹部の皮膚への１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、これは、１００μＬ容量のＰＢＳで送達した。示したデータは、抗原刺激後第２６日のものである。これらの結果は、ワクチン接種とともに抗ＴＩＭ−１抗体を送達することは、完全な腫瘍拒絶を惹起することを示す。
【０１３５】
図２１に示されるように、抗ＴＩＭ−１抗体を加えたワクチンは、腫瘍生細胞での抗原刺激時の腫瘍成長を大きく抑制する。マウスには、腫瘍抗原刺激の１０、１７および３２日間前に、記載の材料を注射した。γ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞を、１回の注射につき１０６細胞で送達した。抗ＴＩＭ−１抗体を、１回の注射につき１００ｍｃｇで送達した。注射はすべて、１００μＬ容量を、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの毛を刈った右側腹部の皮膚に皮下送達することによって行った。第０日に、マウスを、毛を刈った左側腹部の皮膚への１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、これは、１００μＬの容量のＰＢＳにて送達した。腫瘍の容積を、続く２６日間にわたって測定し、統計学的有意差を、対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）両側スチューデントｔ検定計算値を当てはめることにより求めた。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１抗体を加えたワクチンが、腫瘍生細胞での抗原刺激時の腫瘍成長を大きく抑制することを示す。
【０１３６】
図２２に示されるように、抗ＴＩＭ−１抗体を加えたワクチンは、腫瘍生細胞での抗原刺激時の腫瘍成長を大きく抑制する。マウスには、腫瘍抗原刺激の１０、１７および３２日間前に、記載の材料を注射した。γ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞を、１回の注射につき１０６細胞で送達した。抗ＴＩＭ−１抗体は、１回の注射につき１００ｍｃｇで送達した。注射はすべて、１００μＬ容量を、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの毛を刈った右側腹部の皮膚に皮下送達することによって行った。第０日に、マウスを、毛を刈った左側腹部の皮膚への１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、これは、１００μＬの容量のＰＢＳにて送達した。腫瘍の容積を２６日後に測定し、統計学的有意差を、対応のない両側スチューデントｔ検定計算値を当てはめることにより求めた。示したデータは、抗原刺激後第２６日のものである。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１抗体を加えたワクチンが、腫瘍生細胞での抗原刺激時の腫瘍成長を大きく抑制することを示す。
【０１３７】
図２３に示されるように、腫瘍生細胞抗原刺激前での抗ＴＩＭ−１抗体による動物の前処置は、腫瘍成長を有意に抑止する。マウスには、腫瘍抗原刺激の１０、１７および３２日間前に、１回の注射につき１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−１抗体を注射した。注射は、１００μＬ容量を、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの毛を刈った右側腹部の皮膚に皮下送達することによって行った。第０日に、マウスを、毛を刈った左側腹部の皮膚への１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、これは、１００μＬの容量のＰＢＳにて送達した。腫瘍の容積を、続く２６日間にわたって測定し、統計学的有意差を、対応のない両側スチューデントｔ検定計算値を当てはめることにより求めた。これらの結果は、腫瘍生細胞抗原刺激前での抗ＴＩＭ−１抗体による動物の前処置が、腫瘍成長を有意に抑止することを示す。
【０１３８】
図２４に示されるように、腫瘍生細胞抗原刺激前での抗ＴＩＭ−１抗体による動物の前処置は、腫瘍成長を有意に制限する。マウスには、腫瘍抗原刺激の１０、１７および３２日間前に、１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−１抗体を注射した。γ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞を、１回の注射につき１０６細胞で送達した。注射は、１００μＬ容量を、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの毛を刈った右側腹部の皮膚に皮下送達することによって行った。第０日に、マウスを、毛を刈った左側腹部の皮膚への１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、これは、１００μＬの容量のＰＢＳにて送達した。腫瘍の容積を２６日後に測定し、統計学的有意差を、対応のない両側スチューデントｔ検定計算値を当てはめることにより求めた。示したデータは、抗原刺激後第２６日のものである。これらの結果は、腫瘍生細胞抗原刺激前での抗ＴＩＭ−１抗体による動物の前処置が、腫瘍成長を有意に制限することを示す。
【０１３９】
図２５に示されるように、抗ＴＩＭ−１は、腫瘍ワクチンの有効性を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０６個のγ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞（皮下注射による送達）による１回目のワクチン接種を行った。同時に、１００μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル対照、または１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−１抗体もしくは１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ｂイソタイプ対照抗体含有１００μＬＰＢＳビヒクルのいずれかを腹腔内に送達した。１回目のワクチン接種の３週間後、マウスに、同一の調製物による１回目の追加抗原刺激を行った。この２週間後、２回目の同一の追加抗原刺激を行った。この２回目の追加抗原刺激の１１日後、マウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射（ワクチン接種および追加抗原刺激投与の部位の反対側に送達）により抗原刺激した。すべての場合において、腫瘍生細胞を受けたマウスに、抗原刺激後１０日までに測定可能な腫瘍塊が生成した。腫瘍直径を、デジタルカリパスを用い、腫瘍生細胞抗原刺激後１９日間のいくつかの時点で測定した。各腫瘍の３つのほぼ垂直な軸の直径、長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および高さ（Ｈ）を各時点で記録した。腫瘍の容積を、容積（Ｖ）＝（４／３）・π・（Ｌ／２）・（Ｗ／２）・（Ｈ／２）の式を用いて算出した。処置群の平均腫瘍体積を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。Ｐ値は、スチューデントｔ検定により求め、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ミネアポリス  ＭＮ）から購入した（ｍＡｂ  ＡＦ１８１７）。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１が、腫瘍ワクチンの有効性を増強することを示す。
【０１４０】
図２６に示されるように、抗ＴＩＭ−１  アジュバントでのワクチン接種は、保護的免疫の発生を誘発する。未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０６個のγ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞を、１００μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル単独中の混合物、または１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−１抗体もしくは１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ａイソタイプ対照抗体との１００μＬのＰＢＳ中の混合物のいずれかにより、ワクチン接種した（皮下注射による送達）。この１５日後、同一の方法を用いて追加抗原刺激を行った。同じ方法による２回目の追加抗原刺激は、１回目の７日後に行った。この２回目の追加抗原刺激の１０日後、マウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射（ワクチン接種および追加抗原刺激投与の部位の反対側に送達）により抗原刺激した。腫瘍生細胞による抗原刺激の３１日後、ＥＬ４腫瘍抗原刺激を拒絶したマウスから脾細胞を回収した。同様に、ｒＩｇＧ２ａ対照群マウス、および年齢が適合した未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスからも脾細胞を回収した。インビトロでの赤血球枯渇後、抗ＴＩＭ−１、ｒＩｇＧ２ａまたは未処置マウスにいずれかに由来する１０７個の脾細胞を、未処置Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント動物内に尾静脈注射によって養子移入した。伝達の１日後、レシピエントマウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激した。養子移入の１８日後、マウスを、先の皮下の生腫瘍抗原刺激の部位の皮下の触診可能な腫瘍塊の存在について評価した。検出可能な腫瘍塊を示さない動物は、腫瘍を含まないと思われ、同一の養子移入処置を受けた全動物のパーセンテージで示す。これらの結果は、養子移入が腫瘍拒絶を誘導することを示す。
【０１４１】
図２７に示されるように、抗ＴＩＭ−１療法は、腫瘍成長を遅延させる。未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射によって抗原刺激し、次いで、６日後、１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−１抗体または１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ａ対照抗体の１回の腹腔内注射で処置した。個々の動物の腫瘍を、抗ＴＩＭ−１または対照抗体処置の送達の１５日後に測定した。腫瘍直径を、各腫瘍の３つのほぼ垂直な軸、長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および高さ（Ｈ）について記録した。腫瘍の容積を、容積（Ｖ）＝（４／３）・π・（Ｌ／２）・（Ｗ／２）・（Ｈ／２）の式を用いて算出した。算出された各平均の群の平均腫瘍体積および標準誤差（ＳＥＭ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて計算した。Ｐ値は、スチューデントｔ検定により求め、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。これらの結果は、抗ＴＩＭ−１療法が腫瘍成長を遅延させることを示す。
【０１４２】
抗ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４／Ｆｃはともに、Ｔｈ１免疫を増強することが示された（実施例ＸＩＶを参照のこと）。したがって、ＴＩＭ−４／Ｆｃは、実施例ＸＩＩに示す実験的研究で示されるように、腫瘍ワクチンアジュバントおよび腫瘍の処置のため治療剤の両方として作用する。
【０１４３】
（実施例ＸＩＩＩ）
（癌ワクチン用アジュバントとして、および腫瘍の処置用治療剤としてのＴＩＭ−３／Ｆｃおよび抗ＴＩＭ−３）
この実施例は、癌ワクチンおよび腫瘍の治療的処置のためのＴＩＭ−３／Ｆｃおよび抗ＴＩＭ−３のアジュバント活性を示す。
【０１４４】
図２８に示されるように、ＴＩＭ−３特異的抗体は、ワクチンアジュバントとして使用したとき、腫瘍成長を低下させる。未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０６個のγ照射（２０，０００Ｒａｄ）ＥＬ４腫瘍細胞を、１００μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル単独中の混合物、または１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−３抗体もしくは１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ａイソタイプ対照抗体とのＰＢＳ中の混合物のいずれかによる、１回目のワクチン接種を行った。１回目のワクチン接種の２週間後、マウスに、１回目のワクチン接種と同一の追加抗原刺激注射を行った。この追加抗原刺激の１０日後、マウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射（ワクチン接種および追加抗原刺激投与の部位の反対側に送達）により抗原刺激した。すべての場合において、腫瘍生細胞を受けたマウスに、抗原刺激後第１０日までに測定可能な腫瘍塊が生成した。腫瘍抗原刺激後３６日の間、腫瘍直径を、デジタルカリパスを用いて測定した。腫瘍直径を、各腫瘍の３つのほぼ垂直な軸、長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および高さ（Ｈ）についていくつかの時点で記録した。腫瘍の容積を、容積（Ｖ）＝（４／３）・π・（Ｌ／２）・（Ｗ／２）・（Ｈ／２）の式を用いて算出した。処置群の平均腫瘍体積を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。これらの結果は、接種抗ＴＩＭ−３の存在下での腫瘍ワクチンが腫瘍成長を抑止することを示す。
【０１４５】
図２９に示されるように、抗ＴＩＭ−３療法は腫瘍成長を制限する。未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、次いで、９日後、１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−３抗体または１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ａイソタイプ対照抗体の１回の腹腔内注射で処置した。個々の動物の腫瘍を、デジタルカリパスを用い、治療の時点で、そして抗ＴＩＭ−３または対照抗体での処置後のいくつかの時点で測定した。腫瘍直径を、各腫瘍の３つのほぼ垂直な軸、長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および高さ（Ｈ）について記録した。腫瘍の容積を、容積（Ｖ）＝（４／３）・π・（Ｌ／２）・（Ｗ／２）・（Ｈ／２）の式を用いて算出した。算出された各平均の処置群の平均および標準誤差（ＳＥＭ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。Ｐ値は、２要因の（ｔｗｏ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡ統計学的解析によって求め、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を用いて計算した。これらの結果は、抗ＴＩＭ−３療法が腫瘍成長を制限することを示す。
【０１４６】
抗ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−３／Ｆｃはともに、Ｔｈ１免疫を増強すること、およびＴｈ１疾患モデル（Ｍｏｎｎｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３６−５４１（２００２）；Ｓａｂａｔｏｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１０２−１１１０（２００３））の疾患を悪化させることが示された。したがって、ＴＩＭ−３／Ｆｃは、図２８および２９に示す実験的研究で示されるように、腫瘍ワクチンアジュバントおよび腫瘍の処置のための治療剤の両方として作用する。
【０１４７】
（実施例ＸＩＶ）
（抗ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４／Ｆｃはともに、マウスにおいてＴｈ１誘発免疫反応の免疫応答を刺激する）
６〜８週齢の雌ＳＪＬ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した１００ｍｃｇのＰＬＰ１３９−１５１ペプチドで、右腹側および左腹側において免疫処置し、該ペプチドに対するＴｈ１免疫応答を刺激した。ＰＬＰ１３９−１５１含有ＣＦＡの注射後、１００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．（尾静脈）注射した。２回目の１００ｎｇ用量の百日咳毒素４８時間後に投与した。ＩｇＧ２ａイソタイプ対照抗体（１００ｍｃｇ／マウス）、ＴＩＭ−１  モノクローナル抗体（１００ｍｃｇ）またはＴＩＭ−４／Ｆｃを、ＰＬＰでの免疫処置後に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。これらの動物を抗原に対する免疫学的応答の発現についてモニターした。結果は、ＰＬＰペプチドへの再曝露に応答してＴ細胞増殖を測定することによって、ならびにＩＬ−４およびＩＦＮ−γサイトカインのＥＬＩＳＡによってモニターされるように、ＴＩＭ−１抗体およびＴＩＭ−４／Ｆｃはともに、ＰＬＰペプチドに対する免疫応答を刺激することを示す。
【０１４８】
これらの結果は、ＴＩＭ標的化分子（抗ＴＩＭ−１抗体が例示される）が、腫瘍成長を抑制するために使用され得ることを示す。
【０１４９】
（実施例ＸＶ）
（ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３ならびにＴＩＭリガンドを発現するマウス腫瘍細胞株およびヒト腫瘍細胞株）
マウス腫瘍細胞株およびヒト腫瘍細胞株を、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３発現について、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析により解析した。培養腫瘍細胞株を、対照、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−３モノクローナル抗体のいずれかの存在下でインキュベートし、ＴＩＭ特異的抗体の結合を、蛍光タグを用いたＴＩＭ抗体の直接の結合、または蛍光標識二次抗体の使用のいずれかによって検出した。ＴＩＭ−１発現は、ヒト腎腺癌細胞株７６９−Ｐ（図３３）ならびにヒト肝細胞癌腫ＨｅｐＧ２において検出された。また、ＴＩＭ−１発現は、マウス腎腺癌ＲＡＧにおいても検出された。ＴＩＭ−３発現は、胸腺腫およびリンパ腫を含むいくつかの異なる腫瘍において検出された（図３５に図示および図３６に要約のとおり）。ＴＩＭ−３／Ｆｃを用い、ＴＩＭ−３リガンドの発現もまた腫瘍細胞株において解析した。図３６にまとめたように、ＴＩＭ−３リガンド（ＴＩＭ−３Ｌ）を発現する種々の腫瘍が確認され、胸腺腫、リンパ腫および肥満細胞腫が含まれる。
【０１５０】
本出願書類全体を通して、種々の刊行物に言及している。これらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術分野の水準をより充分に記載するために、本出願書類内での引用により、その全体が本明細書に組み込まれる。本発明を、上記の実施例に関して記載したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の変形が行われ得ることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１は、マウスＣ５７ＢＬ／６  ＴＩＭ−１対立遺伝子の８４６ｂｐ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。シグナル配列に下線を付し、ムチンドメインをコードする配列はイタリック体で示し、膜貫通ドメインは下線を付してイタリック体で示す。
【図２】図２は、マウスＢＡＬＢ／ｃ  ＴＩＭ−１対立遺伝子の９１５ｂｐ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号２：）を示す。シグナル配列に下線を付し、ムチンドメインをコードする配列はイタリック体で示し、膜貫通ドメインは下線を付してイタリック体で示す。
【図３】図３は、一文字アミノ酸コードを用いた、マウスＣ５７Ｂｌ／６（Ｂ６）（配列番号：３）とＢＡＬＢ／ｃ（ＢＡＬＢ）（配列番号：４）ＴＩＭ−１対立遺伝子のタンパク質配列の比較を示す。単一アミノ酸置き換えに三角で印を付け、潜在的なＮ−グリコシル化部位に星印を付けている。
【図４】図４は、ＴＩＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質（３６５個のアミノ酸タンパク質で示されるマウスＴＩＭ−１  Ｉｇ  Ｆｃ．ｎｌタンパク質（配列番号：５））の一例を示す。示した例は、ヒトＣＤ５リーダー（下線）、その後ろにＴＩＭ−１のＩｇドメイン（標準字体）および点変異された非細胞溶解性マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）のＦｃ領域（イタリック体）を有する前駆体ポリペプチドのものである。ＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメイン内の点変異されたアミノ酸に陰影を付けている。
【図５】図５は再刺激時の抗原の増殖を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、対照（白）を注射するか、またはＥｎｇｅｒｉｘ−ＢＴＭ（１０マイクログラム（ｍｃｇ））を単独（薄いグレーの陰影）、もしくは単回用量の抗ＴＩＭ抗体（５０ｍｃｇ）とともに（濃いグレーの陰影）ワクチン接種した。表示した時間に、脾臓を、Ｂ型肝炎表面抗原に対する増殖について解析した（９６時間アッセイ）。
【図６】図６は、抗原での再刺激後のサイトカイン産生を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、対照（白）を注射するか、または１０ｍｃｇのＢ型肝炎ワクチン（薄いグレーの陰影）で、もしくは１０ｍｃｇのワクチンで抗ＴＩＭ−１抗体とともに（濃いグレーの陰影）免疫処置した。第７日、第１４日、および第２１日に、脾臓細胞インビトロでＢ型肝炎抗原により刺激した。９６時間後、上清み液をそれぞれＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生について解析した。
【図７】図７は、Ｂ型肝炎特異的抗体の産生を示す。対照（ＰＢＳ＋ミョウバン：白）を注射するか、またはＢ型肝炎ワクチンを抗ＴＩＭ抗体（単回用量；５０ｍｃｇ）とともに（薄いグレーの陰影）もしくはこれなしで（濃いグレーの陰影）ワクチン接種したマウス由来の血清試料を、ＥＬＩＳＡにより、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体の存在について、免疫処置後第７日に試験した。
【図８】図８は、Ｂ型肝炎表面抗原特異的脾細胞の、抗原刺激と用量依存的関係での増殖を示す。１０ｍｃｇのＥｎｇｅｒｉｘ  ＢＴＭを、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともに、またはこれなしで１回ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を単離し、漸増濃度のＢ型肝炎表面抗原の存在または非存在下で培養した。４日間のインキュベーション後、ウェルを、Ｄｅｌｆｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて増殖について解析した。ＴＩＭ−１  ｍＡｂとともにワクチンを接種したマウスでは、Ｅｎｇｅｒｉｘ  ＢＴＭワクチン単独またはイソタイプ対照抗体をワクチン接種した場合と比べ、特異的抗原に対する統計学的に有意に高い増殖応答（ｐ＜０．０５）が生じた。
【図９】図９は、特異的抗原（Ｂ型肝炎表面抗原）での刺激におけるＩＦＮ−γの産生を示す。上記の増殖アッセイウェルから上清み液を、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン解析のために取り出した。ＴＩＭ−１  ｍＡｂとのワクチンを接種されたマウスでは、ワクチン単独またはイソタイプ対照抗体とのワクチンを接種されたマウスよりも、抗原刺激に応答した有意に高い量のＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０５）が生じた。ＩＬ−４は検出され得なかった。
【図１０】図１０は、ＨＩＶｐ２４抗原＋ＴＩＭ−１  ｍＡｂで免疫処置したマウスが、イソタイプ対照抗体またはＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかと比べ、抗原に対して有意に高い増殖応答（ＣｐＧと比べてｐ＜０．０５）を生じたことを示す。マウスには、皮下に単回用量のＨＩＶｐ２４抗原（２５ｍｃｇ）をＰＢＳにて、腹腔内に、５０ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂ、イソタイプ対照抗体または５０ｍｃｇのＣｐＧ（１８２６）オリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを、第１日および第１５日にワクチン接種した。次いで、マウスを第２１日に致死させ、脾臓細胞を、抗原に対する増殖のために回収した。
【図１１】図１１は、インフルエンザ抗原に対する脾細胞の増殖応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３０ｍｃｇのインフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ（フルビリン）またはＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ＋抗ＴＩＭ−１抗体（単回用量；５０ｍｃｇ抗体）で免疫処置した。１０日後、ウイルス（Ｈ１Ｎ１）による刺激に対する応答を、９６時間増殖アッセイにおいて測定した。ＰＢＳ、および抗ＴＩＭ−１抗体単独を処置対照とした（ｎ＝４）。
【図１２】図１２は、インフルエンザ免疫処置マウスのサイトカイン産生を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３０ｍｃｇのインフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭまたはＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ＋抗ＴＩＭ抗体（単回用量；５０ｍｃｇ抗体）で免疫処置した。１０日後、脾細胞を調製し、ウイルス（Ｈ１Ｎ１）での再刺激におけるＴｈ１（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２（ＩＬ−４）サイトカインの産生を、９６時間の培養後に測定した（ｎ＝４）（Ｎ．Ｄ．＝測定せず）。ワクチン＋ＴＩＭ−１抗体を接種したマウスでは、不活化されたインフルエンザでの刺激に応答した有意に高量のＩＦＮ−γが生じた。ＩＬ−４は検出されなかった。
【図１３】図１３は、ＴＩＭ−アジュバント処置後の種交差（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）応答を示す。北京ウイルス（Ａ）またはＫｉｅｖウイルス（Ｂ）による刺激に対する北京免疫処置マウスの増殖応答を、Ｄｅｌｆｉａ増殖アッセイによって９６時間の培養後に測定した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇの不活化された北京インフルエンザウイルスで、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ）の存在または非存在下で免疫処置した。２１日後、脾臓を、インビトロ解析のために回収した。増殖はＴＩＭ−１  ｍＡｂを用いると増強され、Ｋｉｅｖ刺激に対する応答は、種交差免疫性を示す（ｐ＜０．０１）。
【図１４】図１４は、北京ウイルス（Ａ）またはＫｉｅｖウイルス（Ｂ）による刺激に対する北京免疫処置マウスの種交差サイトカイン応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇの不活化された北京インフルエンザウイルスで、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ）の存在または非存在下で免疫処置した。２１日後、脾臓を、インビトロ解析のために回収した。増殖アッセイの上清み液を、ＩＦＮ−γの存在について解析した。パネルＡは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加が、有意に（ｐ＜０．０１）北京ウイルス（Ｈ１Ｎ１）刺激応答したＩＦＮ−γの産生を増強することを示す。パネルＢは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加がまた、ヘテロサブタイプＫｉｅｖ株（Ｈ３Ｎ２）による刺激に応答したＩＦＮ−γの産生も有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。
【図１５】図１５は、北京ウイルス（Ａ）またはＫｉｅｖウイルス（Ｂ）による刺激に対する北京免疫処置マウスでのＩＬ−４サイトカイン産生を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０ｍｃｇの不活化された北京インフルエンザウイルスで、１００ｍｃｇのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ）の存在または非存在下で免疫処置した。２１日後、脾臓を、インビトロ解析のために回収した。増殖アッセイの上清み液を、ＩＬ−４の存在について解析した。パネルＡは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加が、北京ウイルス（Ｈ１Ｎ１）刺激応答したＩＬ−４の産生を有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。パネルＢは、ＴＩＭ−１  ｍＡｂの添加がまた、ヘテロサブタイプＫｉｅｖ株（Ｈ３Ｎ２）による刺激に応答したＩＬ−４の産生も有意に（ｐ＜０．０１）を増強することを示す。
【図１６】図１６は、ワクチン接種後の抗ｒＰＡ抗体応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．２ｍＬのＡＶＡ（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ）ＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ（バイオスラックス）またはＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ＋抗ＴＩＭ−１抗体で免疫処置した。７日後、ｒＰＡに特異的な全血清抗体をＥＬＩＳＡにて測定した。ＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ単独およびＢｉｏＴｈｒａｘＴＭ＋イソタイプ適合抗体を処置対照とした。
【図１７】図１７は、炭疽菌ワクチン接種に対する抗ＴＩＭアジュバント効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、組換えＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ｒＰＡ；４０ｍｃｇ）またはｒＰＡ＋抗ＴＩＭ−３抗体（単回用量；５０ｍｃｇ）で免疫処置した。１０日後、ｒＰＡによる再刺激に対する脾細胞の応答を、９６時間増殖アッセイにおいて測定した。ＰＢＳおよびｒＰＡ＋イソタイプ適合対照抗体を処置対照とした。
【図１８】図１８は、例示的なＴＩＭ発現ベクターを示す。
【図１９】図１９は、ＴＩＭ−３シグナル伝達が、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｕｅｙｏら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１０９３−１１０１（２００３）に記載のように、マウスにおいて糖尿病を加速することを示す（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｕｅｙｏらから適合（ａｄａｐｔｅｄ）させた図）。
【図２０】図２０は、ワクチン接種とともに抗ＴＩＭ−１抗体を送達することが、完全な腫瘍拒絶を惹起することを示す。
【図２１】図２１は、抗ＴＩＭ−１抗体を加えたワクチンが、肝腫瘍細胞での抗原刺激時の腫瘍成長を大きく抑制することを示す。
【図２２】図２２は、抗ＴＩＭ−１抗体を加えたワクチンが、肝腫瘍細胞での抗原刺激時の腫瘍成長を大きく抑制することを示す。
【図２３】図２３は、肝腫瘍細胞抗原刺激前での抗ＴＩＭ−１抗体による動物の前処置が、腫瘍成長を有意に抑止することを示す。
【図２４】図２４は、肝腫瘍細胞抗原刺激前での抗ＴＩＭ−１抗体による動物の前処置が、腫瘍成長を有意に制限することを示す。
【図２５】図２５は、抗ＴＩＭ−１抗体が癌ワクチンアジュバントとして有効であることを示す。この試験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、抗原の供給源としてのγ照射ＥＬ４細胞、および抗ＴＩＭ−１抗体またはｒＩｇＧ２ｂイソタイプ対照のいずれかを用いてＥＬ４胸腺腫瘍に対するワクチン接種を行った。これらの動物には、最初のワクチン接種後、２回追加抗原刺激し、続いて、ＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射で抗原刺激した。抗原刺激後の観察期間を通し、抗ＴＩＭ−１抗体を腫瘍ワクチンアジュバントとして受けたマウスの平均腫瘍サイズは、イソタイプ対照抗体を受けたマウスのものより小さかった。また、肝腫瘍抗原刺激の１９日後、抗ＴＩＭ−１抗体を受けた８匹の動物のうち４匹は、完全に腫瘍を拒絶したが、イソタイプ対照抗体を受けた８匹のマウスでは腫瘍拒絶は観察されなかった。
【図２６】図２６は、抗ＴＩＭ−１アジュバントでのワクチン接種が保護的免疫性の発生を促進（ｄｒｉｖｅ）することを示す。脾細胞は、最初に、抗ＴＩＭ−１を腫瘍ワクチンアジュバントとして用いてＥＬ４胸腺腫に対するワクチン接種を行い、また、その後の肝腫瘍抗原刺激を完全に拒絶したマウスから回収した。インビトロでの赤血球枯渇後、１０７個の脾細胞を未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスレシピエント内に養子移入した。他のマウスに、未処置マウスまたは腫瘍ワクチン接種および追加抗原刺激の際にｒＩｇＧ２ａを受けたマウスのいずれかから採取した脾細胞の養子移入を行った。移入の１日後、すべてのレシピエントマウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激した。抗ＴＩＭ−１抗体を腫瘍ワクチンアジュバントとして受けたマウスから移入された脾細胞は、レシピエントマウスにおいて、その後の腫瘍抗原刺激に対する保護を与えることができた。この保護は、未処置マウス、またはγ照射ＥＬ４＋ｒＩｇＧ２ａをワクチン接種したマウスのいずれに由来する脾細胞を移入した場合でも得られ得なかった。これらの結果は、ワクチン接種が抗ＴＩＭ−１抗体アジュバントを用いてなされた場合の、腫瘍に対する永続性かつ移転性（ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ）の免疫性の確立を示す。
【図２７】図２７は、抗ＴＩＭ−１治療が、腫瘍成長の防止に有効であることを示す。抗ＴＩＭ−１抗体は、以前に確立されたＥＬ４胸腺腫瘍の成長を遅延できる単独（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ）治療剤として有効である。この試験では、未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射により抗原刺激し、次いで６日後、１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−１抗体または１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ａ対照抗体の腹腔内注射によって処置した。処置開始後の腫瘍成長後、腫瘍成長の統計学的に有意な抑制が、抗ＴＩＭ−１処置マウス内への抗体送達後１５日目に観察された。この結果は、抗ＴＩＭ−１抗体が治療用として、腫瘍の確立後に腫瘍成長を制限する能力を示す。
【図２８】図２８は、ＴＩＭ−３−特異的抗体が、ワクチンアジュバントとして使用したとき腫瘍成長を低下させることを示す。ＴＩＭ−３特異的抗体の潜在的なアジュバント効果を評価するため、抗原供給源としてγ照射ＥＬ４細胞、および抗ＴＩＭ−３抗体またはｒＩｇＧ２ａイソタイプ対照のいずれかを用い、マウスにＥＬ４胸腺腫瘍に対するワクチン接種を行った。これらの動物には、最初のワクチン接種後、追加抗原刺激を１回、続いてＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射で抗原刺激を行った。経時的に、抗ＴＩＭ−３抗体を腫瘍ワクチンアジュバントとして受けたマウスにおける抗原刺激腫瘍の平均サイズは、イソタイプ対照抗体を受けたマウスのものより小さかった。
【図２９】図２９は、抗ＴＩＭ−３抗体は、以前に確立されたＥＬ４胸腺腫瘍の成長を遅延できる単独治療剤として有効であることを示す。この試験では、未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１０６個のＥＬ４腫瘍生細胞の皮下注射によって抗原刺激し、次いで９日後、１００ｍｃｇの抗ＴＩＭ−３抗体または１００ｍｃｇのｒＩｇＧ２ａイソタイプ対照抗体の３回の毎週の腹腔内注射の初回によって処置した。処置開始後の腫瘍成長後、抑制された進行が、抗ＴＩＭ−３処置マウスにおいて初回投与の１週間以内に確認された。この効果は経時的に持続し、第１７日まで腫瘍成長の統計学的に有意な抑制に進展（ｄｅｖｅｌｏｐ）した。この結果は、抗ＴＩＭ−３抗体が、以前に確立された腫瘍の腫瘍成長を制限する能力を示す。
【図３０Ａ】図３０は、例示的な疾患、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答との関係、およびＴＩＭ標的化分子を含有する本発明の組成物を用いたＴｈ１およびＴｈ２の量の所望のシフトを示す。
【図３０Ｂ】図３０は、例示的な疾患、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答との関係、およびＴＩＭ標的化分子を含有する本発明の組成物を用いたＴｈ１およびＴｈ２の量の所望のシフトを示す。
【図３１】図３１は、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマウスＴＩＭ−２のｃＤＮＡ配列（配列番号：６）を示す。このｃＤＮＡ配列は、シグナル配列、Ｉｇ、ムチン、膜貫通および細胞内ドメインを含む。
【図３２】図３２は、ＷＯ０３／００２７２２に記載の種々のマウスおよびヒトＴＩＭ分子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。示した配列は、マウスＴＩＭ−１  ＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：７および８）；マウスＴＩＭ−１  Ｃ．Ｄ２  ＥＳ−ＨＢＡおよびＤＢＡ／２Ｊ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：９および１０）；マウスＴＩＭ−２  ＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：１１および１２）；マウスＴＩＭ−２  Ｃ．Ｄ２  ＥＳ−ＨＢＡおよびＤＢＡ／２Ｊ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：１３および１４）；マウスＴＩＭ−３  ＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：１５および１６）；マウスＴＩＭ−３  Ｃ．Ｄ２  ＥＳ−ＨＢＡおよびＤＢＡ／２Ｊ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：１７および１８）；ＴＩＭ−４  ＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：１９および２０）；ＴＩＭ−４  マウスＣ．Ｄ２  ＥＳ−ＨＢＡおよびＤＢＡ／２Ｊ（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：２１および２２）；ヒトＴＩＭ−１対立遺伝子１（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：２３および２４）；ヒトＴＩＭ−１，対立遺伝子２（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：２５および２６）；ヒトＴＩＭ−１対立遺伝子３（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：２７および２８）；ヒトＴＩＭ−１対立遺伝子４（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号２９および３０）；ヒトＴＩＭ−１対立遺伝子５（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：３１および３２）；ヒトＴＩＭ−１対立遺伝子６（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：３３および３４）；ヒトＴＩＭ−３対立遺伝子１（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：３５および３６）；ヒトＴＩＭ−３対立遺伝子２（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：３７および３８）；ヒトＴＩＭ−４対立遺伝子１（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：３９および４０）；ヒトＴＩＭ−４対立遺伝子２（アミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号：４１および４２である。
【図３３】図３３は、マウス腎腺癌細胞株ＲＡＧは、その細胞表面上にＴＩＭ−１を発現することを示す。ＴＩＭ−１抗体（充実（ｆｉｌｌｅｄ））は、非染色対照または対照抗体（中空（ｏｐｅｎ））で染色した細胞と比べ、ＲＡＧ細胞に特異的に結合する。
【図３４】図３４は、ヒト腎腺癌細胞株７６９−Ｐは、その細胞表面上にＴＩＭ−１を発現することを示す。ＴＩＭ−１抗体（充実）は、非染色対照または対照抗体（中空）で染色した細胞と比べ、７６９−Ｐ細胞に特異的に結合する。
【図３５】図３５は、マウス腫瘍細胞株ＥＬ４（胸腺腫）および１１ＰＯ−１（形質転換マスト細胞）がその細胞表面上にＴＩＭ−３を発現することを示す。ＴＩＭ−３  抗体（充実）は、非染色対照または対照抗体（中空）で染色した細胞と比べ、それぞれの腫瘍細胞に特異的に結合する。
【図３６】図３６は、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−３リガンド（ＴＩＭ−３Ｌ）の発現について試験したマウス腫瘍細胞株のまとめを示す。腫瘍細胞株を発現するＴＩＭ−３およびＴＩＭ−３リガンドの両方が同定された。ＴＩＭ−３発現は、ＴＩＭ−３モノクローナル抗体を用いてモニターした。ＴＩＭ−３リガンド発現は、ＴＩＭ−３／Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれの細胞に対する特異的結合を測定することによって示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３２Ｉ】
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【図３２Ｊ】
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【図３２Ｋ】
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【図３２Ｌ】
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【図３２Ｍ】
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【図３２Ｎ】
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【図３２Ｏ】
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【図３２Ｐ】
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【図３２Ｑ】
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【図３２Ｒ】
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【図３２Ｓ】
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【図３２Ｔ】
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【図３２Ｕ】
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【図３２Ｖ】
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【図３２Ｗ】
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【図３２Ｘ】
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【図３２Ｙ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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