(57)【要約】  本発明は、一般に、配列が知られているもしくは未知であるｍＲＮＡをその翻訳されたタンパク質と連結して同族対を形成することによる、所望のタンパク質または核酸分子を同定かつ選択するための系および方法に関する。同族対は、タンパク質または核酸の所望の特性に基づいて選択される。また、この方法には、選択された同族対の核酸部分を増幅すること、核酸に変異を導入すること、核酸を翻訳すること、核酸をそのタンパク質に結合させて第２の同族対を形成すること、および所望の特性に基づいてこの同族対を再選択することによる、所望のタンパク質または核酸分子の進化が含まれる。ｔＲＮＡに架橋結合する働きをする修飾されたｍＲＮＡも提供する。ソラレンモノ付加体または架橋結合の生成方法も提供する。ｍＲＮＡライブラリおよびワクチンの産生方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストップコドン上またはその近隣に位置する架橋剤を含み、ｔＲＮＡ分子に架橋結合することができる、修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記架橋剤が、活性化されることにより前記ｔＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用物質である、請求項１に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記架橋剤が、光を用いて活性化されることにより前記ｔＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成する作用物質である、請求項１に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記架橋剤が、前記ｍＲＮＡ内に直接組み込まれている修飾された塩基である、請求項１に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記架橋剤が、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記架橋剤がソラレンである、請求項１に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項７】
疑似ストップコドン上またはその近隣に位置する架橋剤を含み、ｔＲＮＡ分子に架橋結合することができる、修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記架橋剤が、活性化されることにより前記ｔＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用物質である、請求項７に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記架橋剤が、光を用いて活性化されることにより前記ｔＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成する作用物質である、請求項７に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記架橋剤が、前記ｍＲＮＡ内に直接組み込まれている修飾された塩基である、請求項７に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記架橋剤が、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項７に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記架橋剤がソラレンである、請求項７に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子。
【請求項１３】
付加のない安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体に結合した少なくとも１つのソラレンモノ付加体、またはオリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つのソラレンモノ付加体、を含む同族対を生成するキット。
【請求項１４】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合しているものを、前記ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と；
複数の同族対を提供し、前記複数の同族対のうちの少なくとも１つを１つまたは複数の結合因子と結合させる事と；
前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望のタンパク質または核酸分子を選択することで第１の所望の同族対を選択する事と；
前記第１の所望の同族対を回収して、回収した同族対を生成する事と；
前記回収した同族対の第１の核酸成分を増幅する事と；
１つまたは複数の変異を有する前記第１の核酸成分を含む、第２の核酸成分を生成する事と；
前記第２の核酸成分を翻訳することによって第２のタンパク質を生成する事と；
前記第２のタンパク質を前記第２の核酸成分と連結させて第２の所望の同族対を生成する事と；
少なくとも１つの所望の特性に基づいて前記第２の所望の同族対を再選択することによって前記所望のタンパク質配列を得る事と、
を含む所望のタンパク質配列を進化させる方法。
【請求項１５】
前記所望の特性が、結合特性、酵素反応および化学修飾のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記所望の特性が結合、酵素反応または化学修飾、に抵抗する能力である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の所望の同族対を選択するステップが、
所望の結合特徴を有する第１のリガンドを提供する事と；
前記第１の同族対のうちの１つまたは複数を前記第１のリガンドと接触させて、結合していない複合体および結合した複合体を生成する事と；
前記結合した複合体または前記結合していない複合体のどちらかを回収する事と；
前記回収した複合体の少なくとも１つの核酸成分を増幅する事と；
前記回収した複合体の前記核酸成分の配列に変異を導入する事と；
前記核酸成分から１つまたは複数の第２のタンパク質を翻訳する事と、
前記第２のタンパク質のうちの少なくとも１つを前記第２の核酸成分のうちの少なくとも１つと連結させて、１つまたは複数の第２の同族対を生成する事と；
前記第２の同族対のうちの前記少なくとも１つを、少なくとも１つの第２のリガンドであって、前記第２のリガンドは前記第１のリガンドと同じまたは異なるもの、と接触させて、前記第２の同族対のうちの１つまたは複数を選択することにより所望のタンパク質配列を得る事と、
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
第１の核酸および第２の核酸であって、前記第１の核酸および前記第２の核酸は実質的に互いに相補的であり、前記第１の核酸は１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物を含み、前記第２の核酸が少なくとも１つの疑似ウリジンを含むもの、を提供する事と、
ソラレンの存在下で前記第１の核酸と前記第２の核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する事と；
前記ハイブリッドを紫外光で照射して前記第１の核酸上に前記ソラレンモノ付加体を形成する事と、
を含む、核酸上にソラレンモノ付加体を形成する方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物がアデノシンに隣接して位置するウリジンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物がアデノシンに隣接してその３’側に位置するウリジンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
第１の核酸および第２の核酸であって、前記第１の核酸および前記第２の核酸は実質的に互いに相補的であり；前記第１の核酸は１つもしくは複数のウリジンモノ付加体標的物または架橋結合標的物ならびに１つもしくは複数のウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物を含み；前記ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物は１つまたは複数の疑似ウリジンで置き換えることができるもの、を提供する事と；
前記ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物のうちの１つもしくは複数を疑似ウリジンで置き換える事と；
ソラレンの存在下で前記第１の核酸と前記第２の核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する事と；
前記ハイブリッドを照射することによって、前記非標的物を保護しながら、前記第１の核酸上の前記標的物上に前記ソラレンモノ付加体または前記架橋結合を形成する事と、
を含む、ソラレンモノ付加体または架橋結合の生成方法。
【請求項２２】
前記所望のタンパク質がＳＡＲＳウイルスの１つまたは複数のタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをその対応する翻訳されたタンパク質に連結させて少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つまたは複数を選択する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子からなる群から選択された分子を同定する事を含む、前記翻訳されたタンパク質または前記所望の核酸分子を選択する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の選択方法。
【請求項２４】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して少なくとも１つの翻訳された第１のタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをその対応する翻訳された第１のタンパク質と連結させて少なくとも１つの第１の同族対を形成する事と；
前記翻訳された第１のタンパク質または前記ｍＲＮＡの少なくとも１つの所望の特徴に基づいて前記第１の同族対のうちの少なくとも１つを選択する事と；
前記所望の特徴を有する前記第１の同族対のうちの少なくとも１つを回収して少なくとも１つの回収した同族対を生成する事と；
前記回収した同族対のうちの１つまたは複数の第１の核酸成分を増幅する事と；
１つまたは複数の変異を有する前記第１の核酸成分のうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの第２の核酸成分を生成する事と；
前記第２の核酸成分のうちの少なくとも１つを翻訳することによって少なくとも１つの第２のタンパク質を生成する事と；
前記第２のタンパク質のうちの少なくとも１つを前記第２の核酸成分のうちの少なくとも１つと連結させて、１つまたは複数の第２の同族対を生成する事と；
少なくとも１つの所望の特性であって前記所望の特徴と同じかまたは異なるもの、に基づいて前記第２の同族対のうちの１つまたは複数を再選択することによって前記所望のタンパク質配列を得る事と、
を含む、所望のタンパク質配列を進化させる方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのウリジンおよび少なくとも１つの修飾されたウリジンを含む標的オリゴヌクレオチドを提供する事と、
前記標的オリゴヌクレオチドをソラレンと接触させる事と、
前記ソラレンを前記標的オリゴヌクレオチドとカップリングさせてモノ付加体を形成する事と、
を含む、モノ付加体の形成方法。
【請求項２６】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合しているものを、前記ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と；
複数の同族対を提供し、前記複数の同族対を１つまたは複数の結合因子と結合する事と；
前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望のタンパク質または核酸分子を選択する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定および選択方法。
【請求項２７】
２つ以上のＤＮＡ配列のアレイであって、前記２つ以上のＤＮＡ配列が事前に決定された位置に配置されるもの、を提供する事と；
前記１つまたは複数の同族対であって、ｍＲＮＡ部分およびタンパク質部分を含むもの、に前記アレイを曝す事と；
前記１つまたは複数の同族対の前記ｍＲＮＡ部分を前記アレイ上にハイブリダイズさせる事と；
前記１つまたは複数の同族対の前記タンパク質部分を結合因子に曝すことで反応を生じさせるまたは生じさせない事と；
前記結合因子に対する前記反応が存在するまたは存在しないことに基づいて前記所望のタンパク質を選択することで前記翻訳されたタンパク質のＤＮＡ配列を決定する事と、
を含む前記翻訳されたタンパク質のＤＮＡ配列を決定する事をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合しており、前記ｔＲＮＡ分子は実質的に修飾されていない天然ｔＲＮＡであり、前記架橋剤は少なくとも１つのｍＲＮＡ分子上のみに位置するもの、をｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合しているもの、を前記ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と；
核酸が事前に決定された位置に配置された核酸アレイを提供する事と；
前記同族対のうちの少なくとも１つを前記アレイ上にハイブリダイズさせる事と；
前記同族対のうちの前記少なくとも１つを１つまたは複数の結合因子と反応させる事と；
前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望の核酸分子を選択する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定および選択方法。
【請求項３０】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、ｔＲＮＡ分子と結合しており、前記ｔＲＮＡ分子はリボソームと結合し、ペプチド鎖を受容し、かつ、次のペプチド転移においてドナーとして働かない部分を含み、前記部分が３’デオキシアデノシン上の２’エステル、アミノアシルｔＲＮＡox-redおよびピューロマイシンのうちの１つまたは複数からなる群から選択されるもの、をｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定方法。
【請求項３１】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子あって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳することであって、前記翻訳がｉｎ  ｓｉｔｕで行われること、により少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、ｔＲＮＡ分子と結合しているものを、前記ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定方法。
【請求項３２】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、架橋剤によってｔＲＮＡ分子と結合しているもの、を前記ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と；
複数の同族対を提供し、前記複数の同族対のうちの少なくとも１つを１つまたは複数の結合因子と結合させる事と；
前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望のまたはタンパク質核酸分子を選択することで第１の所望の同族対を選択する事と；
前記第１の所望の同族対を回収して、回収した同族対を生成する事と；
前記回収した同族対の第１の核酸成分を増幅する事と；
１つまたは複数の変異を有する前記第１の核酸成分を含む、第２の核酸成分を生成する事と；
前記第２の核酸成分を翻訳することによって第２のタンパク質を生成する事と；
前記第２のタンパク質を前記第２の核酸成分と連結させて第２の所望の同族対を生成する事と；
少なくとも１つの所望の特性に基づいて前記第２の所望の同族対を再選択することによって前記所望のタンパク質配列を得る事と、
を含む、所望のタンパク質配列を進化させる方法。
【請求項３３】
前記第１の所望の同族対を選択するステップが、
所望の結合特徴を有する第１のリガンドを提供する事と；
前記第１の同族対のうちの１つまたは複数を前記第１のリガンドと接触させて、結合していない複合体および結合した複合体を生成する事と；
前記結合した複合体または前記結合していない複合体のどちらかを回収する事と；
前記回収した複合体の少なくとも１つの核酸成分を増幅する事と；
前記回収した複合体の前記核酸成分の配列に変異を導入する事と；
前記核酸成分から１つまたは複数の第２のタンパク質を翻訳する事と、：
前記第２のタンパク質のうちの少なくとも１つを前記第２の核酸成分のうちの少なくとも１つと連結させて、１つまたは複数の第２の同族対を生成する事と；
前記第２の同族対のうちの前記少なくとも１つを、少なくとも１つの第２のリガンドであって、前記第１のリガンドと同じまたは異なるもの、と接触させて、前記第２の同族対のうちの１つまたは複数を選択することにより前記所望のタンパク質配列を得る事と、
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１の核酸および第２の核酸であって、前記第１の核酸および前記第２の核酸は実質的に互いに相補的であり、前記第１の核酸は１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物を含み、前記第２の核酸が少なくとも１つの疑似ウリジンを含むもの、を提供する事と、
ソラレンの存在下で前記第１の核酸と前記第２の核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する事と；
前記ハイブリッドを紫外光で照射して前記第１の核酸上に前記ソラレンモノ付加体を形成する事と、
を含む、核酸上にソラレンモノ付加体を形成する方法。
【請求項３５】
第１の核酸および第２の核酸であって、前記第１の核酸および前記第２の核酸は実質的に互いに相補的であり、前記第１の核酸は１つもしくは複数のウリジンモノ付加体標的物または架橋結合標的物ならびに１つもしくは複数のウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物を含み、前記ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物は１つまたは複数の疑似ウリジンで置き換えることができるもの、を提供する事と；
前記ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物のうちの１つもしくは複数を疑似ウリジンで置き換える事と；
ソラレンの存在下で前記第１の核酸と前記第２の核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する事と；
前記ハイブリッドを照射することによって、前記非標的物を保護しながら、前記第１の核酸上の前記標的上に前記ソラレンモノ付加体または前記架橋結合を形成する事と、
を含む、ソラレンモノ付加体または架橋結合の生成方法。
【請求項３６】
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがストップコドンおよび疑似ストップコドンからなる群から選択された少なくとも１つのコドンを含むもの、を提供する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成する事と；
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つであって、架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合しているもの、を前記ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成する事と；
前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定する事と；
前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定する事と；
複数の同族対を提供し、前記複数の同族対を１つまたは複数の結合因子と結合する事と；
前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望のタンパク質または核酸分子を選択する事と、
を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定および選択方法。
【請求項３７】
請求項１４に記載の方法によって産生したワクチン。
【請求項３８】
主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）の配列をランダムｍＲＮＡライブラリのｃＤＮＡに付加させることにより、適切なＴ細胞の応答および最終的にはＢ細胞の応答を可能にする、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とする事と、
前記ライブラリを転写および翻訳することによって、その同族ｍＲＮＡに対応するタンパク質を生成する事と；
前記タンパク質を前記同族ｍＲＮＡと連結させる事と；
「Ｓ」エピトープに特異的なプローブであって、ＳＰＲ膜に化学的に連結されているもの、を用いて前記ライブラリから１つまたは複数の所望のタンパク質を選択する事と；
抗Ｓ抗体に対して高い親和性を有するタンパク質を選択する事と、
を含む、ＳＡＲＳワクチンの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に核酸およびポリペプチドを同定かつ選択するための組成物ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リガンド−受容体の相互作用は、基本的な生物学的な部位認識機構の解明から薬物スクリーニングおよび合理的な薬物設計までの数々の理由で興味がもたれている。長年の間、選択された標的に選択的に結合する分子を大集団から選択し、その後それらを増幅および突然変異させて後に再選択することによって核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化を駆動することが可能であった（本明細書中に参考として組み込まれているＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５（１９９０））。
【０００３】
タンパク質を用いてこのような選択過程を行うことができる能力は、非常に有用となる。これにより、選択されたリガンドに特異的に結合するタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ設計および産生が可能となる。タンパク質中の２０種の多様なアミノ酸側鎖は、核酸側中の４種の類似の鎖よりも結合可能性がはるかに高いので、核酸と比較してタンパク質の使用は特に有利である。さらに、多くの生物学的および医学的に関係するリガンドはタンパク質に結合する。
【０００４】
核酸およびタンパク質の進化方法はどちらも、試験分子の多様性の高い大集団に接近する手段、所望の特性を示す集団メンバーを選択する方法、および突然変異させた変異を有する選択された分子を複製して後の選択のための別の大集団を得る能力、を必要とする。
【０００５】
したがって、必ずしも核酸配列または核酸の反復化学修飾の知識を最初に必要としない、ｍＲＮＡをそのタンパク質に正確に連結することができる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸に基づいたタンパク質の進化系の必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明の実施形態は、タンパク質および核酸の所望の特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を選択かつ進化させる組成物ならびに方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ類似体を提供する。他の実施形態には、ポリペプチドの産生方法、所望の特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を有するポリペプチドの集団の個々のメンバーの選択を可能にするアッセイ、このような選択されたポリペプチドをコードしている核酸の増幅方法、および増強された特性のスクリーニングを行うための新しい変異体の生成方法が含まれる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、天然のｍＲＮＡの修飾を必要とせずにタンパク質がそのメッセージに結合することを可能とするが、修飾されたｍＲＮＡも依然として使用し得る。本発明の様々な態様で具体化した方法の特異性は、コドン−アンチコドンの相互作用の特異性によって決定される。
【０００８】
好ましい実施形態では、本発明は、核酸がコードしているタンパク質を選択することによって、その核酸の選択を可能にする。これは、翻訳の最後にタンパク質をその同族ｍＲＮＡに結合することによって成してもよく、立ち代ってこれは、タンパク質およびｍＲＮＡをどちらもｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体に結合させることによって行う。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態は、ポリペプチドをコードしている核酸およびポリペプチドをｔＲＮＡに共有結合することができるｔＲＮＡ分子であって、核酸の結合がポリペプチドとの結合以外のｔＲＮＡの一部分上で起こり、ｔＲＮＡはｔＲＮＡのアンチコドンと会合した連結分子を含む、ｔＲＮＡ分子を含む。このｔＲＮＡのアンチコドンは、所要の波長の光の照射下でｍＲＮＡと架橋結合を形成する能力を有し、好ましくは、ＵＶＡ、好ましくは約３００〜４５０ｎｍの範囲、より好ましくは約３２０〜４００ｎｍの範囲、最も好ましくは約３６５ｎｍのＵＶＡで照射することでアンチコドン上にフラン側鎖のソラレンモノ付加体を形成する能力を有する。好ましくは、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、安定した結合によってｔＲＮＡ分子の３’末端に結合して、安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体（ＳＡＴＡ、ｓｔａｂｌｅ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ  ｔＲＮＡ  ａｎａｌｏｇ）を生じる。
【００１０】
他の実施形態には、好ましくは読み枠の３’領域中に位置し、より好ましくは読み枠の最も３’側のコドン、最も好ましくは読み枠の３’ストップコドンにソラレンを含むｍＲＮＡが含まれる。好ましい実施形態では、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとの連結は架橋結合したソラレン分子、より好ましくはフラン側鎖のソラレンモノ付加体である。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、モノ付加体の形成方法を提供する。この方法によれば、少なくとも１つのウリジンおよび少なくとも１つの修飾されたウリジンを有する標的オリゴヌクレオチドをソラレンと接触させ、標的オリゴヌクレオチドおよびソラレンがカップリングされてモノ付加体を形成する。本実施形態による修飾されたウリジンは、ソラレンとのカップリングを回避するために修飾されていてもよく、好ましくは、修飾されたウリジンは疑似ウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）である。この実施形態によれば、標的オリゴヌクレオチドは、ｔＲＮＡ、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ類似体などのｔＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ、修飾されたｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ類似体などのｍＲＮＡ分子であってよい。さらなる実施形態では、ソラレンは１つまたは複数の架橋結合によって標的オリゴヌクレオチドにカップリングされている。この実施形態によれば、標的オリゴヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドが存在していてもよい。この第２のオリゴヌクレオチドは、ウリジンを含まないか、または標的オリゴヌクレオチドとの架橋結合を回避するために修飾されたウリジン残基を含んでもよい。好ましくは、修飾されたウリジンは疑似ドウリジンである。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態は、核酸、ｔＲＮＡ、および核酸によってコードされているポリペプチドを一緒に安定に連結して、連結したヌクレオチド−ポリペプチド複合体を形成する方法を含む。好ましい実施形態では、核酸はｍＲＮＡであり、連結したヌクレオチド−ポリペプチド複合体はｍＲＮＡ−ポリペプチド複合体である。この方法は、複数の相異なる核酸−ポリペプチド複合体を提供すること、所望の結合特徴を有するリガンドを提供すること、複合体をリガンドと接触させること、結合していない複合体を取り除くこと、および、リガンドに結合した複合体を回収することをさらに含むことができる。
【００１３】
本発明のいくつかの方法は、核酸分子および／またはタンパク質の進化を含む。一実施形態では、本発明は、回収した複合体の核酸成分を増幅することおよび変異を核酸の配列に導入することを含む。他の実施形態では、この方法は、増幅して変化した核酸からポリペプチドを翻訳すること、ｔＲＮＡを用いてそれらを一緒に連結すること、および、結合した複合体の別の新しい集団を選択するためにそれらをリガンドと接触させることをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化の過程、特に選択されたｍＲＮＡが変異を持って複製され、翻訳され、選択のために再度同族タンパク質に結合される反復過程において、選択されたタンパク質−ｍＲＮＡ複合体を用いる。
【００１４】
一実施形態では、選択するための戦略を提供する。一実施形態では、この戦略はｍＲＮＡライブラリの作製を含む。一実施形態では、ＲＮＡライゲーションを用いる。一実施形態では、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使用したＲＮＡライゲーションを用いる。一実施形態では、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の診断試験を提供する。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態は、効率的かつ迅速な、核酸およびポリペプチドを同定かつ選択する組成物ならびに方法を提供する。特定の実施形態は、本発明の一実施形態による核酸およびタンパク質の同定、選択、ならびに／または進化が、試験分子の多様性の高い大集団に接近する手段、所望の特性を示す集団メンバーを選択する方法、および突然変異させた変異を有する選択された分子を複製して後の選択のための別の大集団を得る能力、に適応しているので、特に有利である。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態は、いくつかの疾患の予防および治療において用いられる遺伝子およびタンパク質の同定および選択に有用である。たとえば、疾患に関連する核酸配列が知られている場合は、本発明のいくつかの実施形態は、対応するタンパク質を急速かつ正確に同定および選択するために用いることができる。その後、このタンパク質を大量生産し、診断剤または治療剤として用いることができる。さらに、疾患に関連するタンパク質が知られている場合は、本発明のいくつかの実施形態は、対応する核酸の迅速な同定を可能にすることができる。その後、核酸を診断剤または治療剤として用いることができる。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の別の利点は、タンパク質が自己複製できないこと、およびポリペプチドをコードしているｍＲＮＡを翻訳産物に連結できないこと、を克服できることにある。さらに、大きなペプチドライブラリの作製およびスクリーニング方法は、最近まで、過程にｉｎ  ｖｉｖｏ発現ステップが含まれることが必要であった。例には、酵母の二重または三重ハイブリッド、酵母ディスプレイおよびファージディスプレイ方法が含まれる（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２４５（１９８９）；ＬｉｃｉｔｒａおよびＬｉｕ、ＰＮＡＳ、９３：１２８１７（１９９６）；ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５：５５３（１９９７）；ならびにＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６（１９９０））。場合によっては、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法には、ライブラリのサイズの制限および厄介なスクリーニングステップを含めた不利点がある。さらに、宿主の細胞による制約によって変異体の生成に望ましくない選択的圧力がかかる可能性がある。このようなことにもかかわらず、当業者は、これらのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を使用して本発明の一実施形態を用いることができることを理解するであろう。
【００１８】
より最近では、リボソームディスプレイなどの原核および真核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が開発されている（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＭａｔｔｈｅａｋｉｓ他、ＰＮＡＳ、９１：９０２２（１９９４）；ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、ＰＮＡＳ、９４：４９３７（１９９７）；Ｊｅｒｍｕｔｕｓ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：５３４（１９９８））。これらの方法では、タンパク質とそれをコードしているｍＲＮＡとをリボソームで連結し、選択されたリガンドに対して複合体全体のスクリーニングを行う。この方法の潜在的な不利点には、リボソームが大きいことが含まれ、これは、結合した比較的小さなタンパク質のスクリーニングを妨害する可能性がある。当業者は、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用して本発明の一実施形態を用いることができることを理解するであろう。
【００１９】
１９９７年に、２つの研究グループが、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼをリンカーＤＮＡに結合したピューロマイシンと共に用いることによって翻訳中にタンパク質をそのコード配列に結合させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を開発した（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＳｚｏｓｔａｋ他、国際公開公報ＷＯ９８／３１７００号；ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、ＰＮＡＳ、９４：１２２９７（１９９７）；Ｎｅｍｏｔｏ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４１４：４０５（１９９７））。コード配列とペプチドとが連結されたあと、ペプチドを選択されたリガンドに曝す。リガンドによるペプチドの選択または結合により結合したコード配列の選択も行われ、その後、これを標準の手段によって複製することができる。ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋならびにＮｅｍｏｔｏ他はどちらも、ＤＮＡリンカーまたは他の翻訳不可能な鎖によってピューロマイシン分子をコード配列の３’末端に結合する技術を用いていた。ピューロマイシンは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用下で新生ペプチド鎖を受容し、それに安定かつ不可逆的に結合して翻訳を中断させる、ｔＲＮＡアクセプター基部（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｅｍ）類似体である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の制限のうちの１つまたは複数を克服するので、特に有用である：（１）それぞれのペプチドをコードしているコード配列が知られており、かつ最初およびそれぞれの選択操作間のどちらにおいても修飾されていなければならない；（２）、天然で未知のｍＲＮＡの選択のみである；（３）コード配列の修飾により過程のステップが数ステップ増える；ならびに（４）リンカー分子上に結合したピューロマイシンが、翻訳反応において、そのコード配列を読んでいるリボソームまたは近隣のリボソーム上のＡ部位に関して、天然ｔＲＮＡと競合し得、したがって、翻訳反応溶液中の結合していないピューロマイシンがそうするように、翻訳過程に「毒が入れられる」可能性がある。ピューロマイシンとリボソームとの間の意図的でない相互作用は２種類の反応非特異性、すなわち成熟前に短縮されたタンパク質および誤ったメッセージに結合したタンパク質をもたらす可能性がある。従来技術には、ピューロマイシンに対するＡ部位およびペプチジルトランスフェラーゼの結合力がＭｇ++の濃度によって変調され得ることを示す報告が存在する（本明細書中に参考として組み込まれているＲｏｂｅｒｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、３：２６８（１９９９））。第１種の非特異性（たとえば翻訳の成熟前停止）を制御するためにＭｇ++の濃度を滴定し得るが、第２種（たとえば、不正確なｍＲＮＡ−タンパク質の連結）には影響しない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態の他の利点には、架橋結合を高収率で生じる能力、アミノ酸の完全な相補体を使用する能力、およびストップコドンを使用する能力が含まれる。
【００２２】
したがって、一部の実施形態において、必ずしも核酸配列または核酸の反復化学修飾の知識を最初に必要とせず、ｍＲＮＡをそのタンパク質に正確に連結可能な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸に基づいたタンパク質の進化系の必要性が存在する。ストップコドンの存在下においてアミノ酸の完全な相補体を良好な効率で用いることができる系の必要性も依然として存在する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態は、タンパク質および核酸の所望の特性を同定、選択、かつ進化させる組成物ならびに方法を提供する。多くの実施形態では、本発明は、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ類似体を含めたｔＲＮＡ分子を提供する。他の実施形態では、ｔＲＮＡ分子には、天然または修飾されていないｔＲＮＡが含まれる。他の実施形態には、ポリペプチドの産生方法、所望の特徴を有するポリペプチドの集団の個々のメンバーの選択を可能にするアッセイ、このような選択されたポリペプチドをコードしている核酸の増幅方法、および増強された特性のスクリーニングを行うための新しい変異体の生成方法が含まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、天然のｍＲＮＡの修飾を必要とせずに、タンパク質がそのそれぞれのｍＲＮＡに結合することを可能にする。別の実施形態では、ＳＡＲＳ用のワクチンおよびその産生方法を提供する。最小限の修飾のみが必要とされる。さらに別の実施形態では、広範囲に修飾されたｍＲＮＡを用いることができる。一部の実施形態で具体化した方法の特異性は、コドン−アンチコドンの相互作用の特異性によって決定される。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明は、核酸がコードしているタンパク質を選択することによって、その核酸の選択を可能にする。これは、一実施形態では、これは翻訳の最後にタンパク質をその同族ｍＲＮＡに結合することによって成し、立ち代ってこれは、タンパク質およびｍＲＮＡをどちらもｔＲＮＡ分子に結合させることによって行う。
【００２６】
一実施形態では、所望のタンパク質または核酸分子の同定方法を提供する。一実施形態では、少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を提供する。ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、ストップコドンおよび／または疑似ストップコドン（ｐｓｅｕｄｏ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を含む。ｍＲＮＡ分子は翻訳されて、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質が生じる。ｍＲＮＡ分子はｔＲＮＡ分子を用いてその対応する翻訳されたタンパク質に連結、カップリングまたは会合されており、少なくとも１つの同族の対を形成している。ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合している。一実施形態では、同族対は翻訳されたタンパク質またはｍＲＮＡ分子の特性を用いて同定する。選択された同族対のｍＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および／またはｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子が同定され、これにより所望のタンパク質または所望の核酸分子が同定される。
【００２７】
一実施形態では、ｔＲＮＡ分子は安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体（ＳＡＴＡ）である。本明細書中で使用するＳＡＴＡとは、好ましくは同族コドンがリボソームの読み位置にある場合であって、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用によってペプチド鎖を受容することができるように、選択されたコドンを認識することができる実体である。
【００２８】
一実施形態では、ＳＡＴＡは、どちらもＳＡＴＡ上に位置するピューロマイシンおよび架橋剤を含む。本明細書中で使用する用語「それ上に位置する」とは、その通常の意味を有し、さらに、それ上に配置されている、組み込まれている、結合している（ａｔｔａｃｈ  ｔｏ）、カップリングしている、結合している（ｂｏｕｎｄ  ｔｏ）、またはその一部であるという意味も与えられる。一実施形態では、ＳＡＴＡはピューロマイシンを含むが、架橋剤はｍＲＮＡ分子上に位置する。一実施形態では、架橋剤はｍＲＮＡ上にのみ位置し、ｔＲＮＡ上には位置しない。
【００２９】
一実施形態では、ｔＲＮＡ分子は連結ｔＲＮＡ類似体である。一実施形態では、架橋剤は連結ｔＲＮＡ類似体上に位置し、ピューロマイシンは存在しない。
【００３０】
一実施形態では、ｔＲＮＡ分子はナンセンスサプレッサーｔＲＮＡである。一実施形態では、架橋剤はｔＲＮＡ上には位置せず、ｍＲＮＡ上に位置し、ピューロマイシンは存在しない。一実施形態では、架橋剤はｍＲＮＡ上にのみ位置し、ｔＲＮＡ上には位置しない。一実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡは、実質的に修飾されていない、天然のｔＲＮＡである。
【００３１】
本発明の一実施形態では、架橋剤は、２つの分子を化学的または力学的に一緒に連結する作用物質である。一実施形態では、架橋剤は、活性化されてｔＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用物質である。一実施形態では、架橋剤は硫黄で置換したヌクレオチドである。別の実施形態では、架橋剤はハロゲンで置換したヌクレオチドである。架橋剤の例には、それだけには限定されないが、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体が含まれる。一実施形態では、架橋剤はソラレンまたはソラレン類似体である。１つまたは複数の架橋剤を用いることができ、これら架橋剤の位置は変化することができる。
【００３２】
一実施形態では、架橋剤はｍＲＮＡ上に位置する。別の実施形態では、架橋剤はｔＲＮＡ分子上に位置する。一実施形態では、架橋剤はコドン上またはその近隣に位置する。別の実施形態では、架橋剤はストップコドンもしくは疑似ストップコドン上またはその近隣に位置する。一実施形態では、架橋剤はＲＮＡ分子のアンチコドン上またはその近隣に位置する。一実施形態では、架橋剤はＲＮＡ分子のストップアンチコドンもしくは疑似ストップアンチコドン上またはその近隣に位置する。
【００３３】
本発明の一実施形態では、架橋剤はｔＲＮＡ分子とｍＲＮＡ分子との間に単一の結合もしくはカップリングを形成する。一実施形態では、ｔＲＮＡ分子はリボソームのペプチジルトランスフェラーゼによってその翻訳されたタンパク質に結合されている。別の実施形態では、ｔＲＮＡ分子は、紫外線に誘導されるｔＲＮＡ分子のアンチコドンとｍＲＮＡのコドンとの間での架橋結合によって、ｍＲＮＡに結合されている。
【００３４】
一実施形態では、ｔＲＮＡ分子は安定したペプチドアクセプターを有する。一実施形態では、安定したペプチドアクセプターはピューロマイシンまたはピューロマイシン類似体である。一実施形態では、ｔＲＮＡ分子は、ペプチド鎖を受容して、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼによって脱離が行われないような安定した様式で鎖を保持するように作用可能である。一実施形態では、ｔＲＮＡ分子は、リボソームに結合し、ペプチド鎖を受容し、次のペプチド転移においてドナーとして役割を果たさない部分を含む。この部分はｔＲＮＡ上に位置することができる。一実施形態では、この部分には、それだけには限定されないが、３’デオキシアデノシン上の２’エステル、アミノアシルｔＲＮＡｏｘ−ｒｅｄおよびピューロマイシンが含まれる。１つまたは複数の部分がｔＲＮＡ分子上に位置していてもよい。
【００３５】
一実施形態では、ｍＲＮＡ分子は連結コドンより先の翻訳が不可能である。一実施形態では、ｔＲＮＡ分子は、後のコドン中のメッセージが翻訳不可能であるので、ペプチド鎖を受容し、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼによって脱離が行われないような様式で鎖を保持する。別の実施形態では、ｔＲＮＡ分子は、メッセージが翻訳不可能であるので、ペプチド鎖を受容し、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼによって脱離が行われないような様式で鎖を保持する。メッセージは、メッセージの最後にあるか、または適切なコドンを認識するｔＲＮＡが欠失していることが原因で、翻訳不可能となることができる。ｍＲＮＡを翻訳不可能にする他の技術も用いることができる。
【００３６】
本発明の一実施形態では、翻訳はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。別の実施形態では、翻訳はｉｎ  ｓｉｔｕで行われる。さらに別の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳が提供される。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、この方法は複数の同族対を提供すること、これらの同族対のうちの少なくとも１つを１つまたは複数の結合因子と結合させること、および、結合因子に対する反応に基づいて所望のタンパク質または核酸分子を選択することによって、所望の核酸またはタンパク質を選択することをさらに含む。結合因子に対する反応を欠くことに基づいてもセクションを行うことができる。
【００３８】
一実施形態では、複数の同族対を提供するステップは、マトリックス、溶液中、ビーズ上、およびアレイ上のうちの１つもしくは複数からなる群から選択された媒体上または媒体中に、１つまたは複数の同族対を提供することを含む。当業者は、さらなる結合または選択に適した任意の媒体中に同族対を置くことができることを理解するであろう。一実施形態では、同族対はリガンド結合に基づいて選択される。リガンドには、それだけには限定されないが、タンパク質、核酸、化学化合物、ポリマーおよび金属が含まれる。別の実施形態では、反応は、リガンド結合、免疫沈降、および酵素反応のうちの１つまたは複数からなる群から選択される。当業者は、標的分子を識別するために役立つ任意の反応を用いることができることを理解するであろう。このような反応には、それだけには限定されないが、化学反応、力学的反応、および生物学的反応が含まれる。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、本方法は、所望の核酸分子を選択することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、核酸が事前に決定された位置に配置された核酸アレイを提供すること、同族対のうちの少なくとも１つをアレイ上にハイブリダイズさせること、同族対を１つまたは複数の結合因子と反応させること、および、結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて所望の核酸分子を選択することを含む。結合因子には、それだけには限定されないが、上述のリガンドが含まれる。当業者は、所望の核酸分子を識別するために役立つ任意の反応を用いることができることを理解するであろう。このような反応には、それだけには限定されないが、化学反応、力学的反応、および生物学的反応が含まれる。
【００４０】
さらに別の実施形態では、この方法は、翻訳されたタンパク質のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、ＤＮＡ配列が事前に決定された位置に配置された、２つ以上のＤＮＡ配列のアレイを提供すること、アレイを、１つまたは複数の、ｍＲＮＡ部分およびタンパク質部分を含む同族対に曝すこと、同族対のｍＲＮＡ部分をアレイ上にハイブリダイズさせること、１つまたは複数の同族対のタンパク質部分を結合因子に曝すことで反応を生じさせるまたは生じさせないこと、ならびに、リガンドなどの結合因子に対する反応、または反応がないことに基づいて所望のタンパク質を選択することで翻訳されたタンパク質のＤＮＡ配列を決定することを含む。
【００４１】
本発明の一実施形態では、ｔＲＮＡ分子に架橋結合するよう作用可能に修飾されたｍＲＮＡ分子を提供する。一実施形態では、修飾されたｍＲＮＡ分子は、ストップコドン上またはその近隣に位置する架橋剤を含む。一実施形態では、修飾されたｍＲＮＡ分子は、疑似ストップコドン上またはその近隣に位置する架橋剤を含む。
【００４２】
一実施形態では、架橋剤は、活性化されてｔＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用物質である。一実施形態では、架橋剤は、光を用いて活性化されてｔＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用物質である。別の実施形態では、架橋剤は、ｍＲＮＡ内に直接組み込まれている修飾された塩基である。一実施形態では、架橋剤は、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体のうちの１つまたは複数からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、架橋剤はソラレンである。
【００４３】
本発明の一実施形態では、同族対を生成するキットを提供する。一実施形態では、キットは、付加していない安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体に結合した少なくとも１つのソラレンモノ付加体を含む、品目のコンピレーション、コレクション、系または群である。別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つのソラレンモノ付加体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、同族対の生成に関する指示書を含む。さらに別の実施形態では、キットは、同族対の生成に有用となる追加の化学薬品、作用物質、または装置を含む。
【００４４】
本発明の一実施形態では、所望の配列を進化させる方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ストップコドンおよび／または疑似ストップコドンを含む、少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子を提供すること；ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成すること；ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを、ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成することであり、候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが架橋剤によってｔＲＮＡ分子に結合していること；翻訳されたタンパク質またはｍＲＮＡ分子の特性に基づいて同族対のうちの１つまたは複数を同定すること；選択された同族対のｍＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子、およびｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子、のうちの１つまたは複数からなる群から選択された分子を同定することで所望のタンパク質または所望の核酸分子を同定すること、を含む。
一部の実施形態では、この方法は、複数の同族対を提供すること、複数の同族対のうちの少なくとも１つを１つまたは複数の結合因子と結合させること、１つもしくは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて所望のまたはタンパク質核酸分子を選択することで第１の所望の同族対を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の所望の同族対を回収して、回収した同族対を生成すること、回収した同族対の第１の核酸成分を増幅すること、１つまたは複数の変異を有する前記第１の核酸成分を含む第２の核酸成分を生成すること、第２の核酸成分を翻訳することによって第２のタンパク質を生成すること、第２のタンパク質を第２の核酸成分に連結させて第２の所望の同族対を生成すること、および、少なくとも１つの所望の特性に基づいて第２の所望の同族対を再選択することによって所望のタンパク質配列を得ることを、さらに含む。好ましい実施形態では、所望の配列は、ＳＡＲＳウイルスの１つまたは複数の配列の配列である。
【００４５】
一実施形態では、所望の特性は、結合特性、酵素反応および化学修飾のうちの１つまたは複数からなる群から選択される。一実施形態では、所望の特性は反応を欠く（または結合、酵素反応または化学修飾に抵抗する能力を有する）。一実施形態では、第１の所望の同族対を選択するステップは、所望の結合特徴を有する第１のリガンドを提供すること、第１の同族対のうちの１つまたは複数を第１のリガンドと接触させて結合していない複合体および結合した複合体を生成すること、結合した複合体または結合していない複合体のどちらかを回収すること、回収した複合体の少なくとも１つの核酸成分を増幅すること、回収した複合体の核酸成分の配列に変異を導入すること、１つまたは複数の第２のタンパク質を核酸成分から翻訳すること、第２のタンパク質のうちの少なくとも１つを第２の核酸成分のうちの少なくとも１つと連結させて１つまたは複数の第２の同族対を生成すること、ならびに、第２の同族対のうちの少なくとも１つを少なくとも１つの第２のリガンドと接触させることによって所望のタンパク質配列を得て、第２の同族対のうちの１つまたは複数を選択することであり、第２のリガンドは第１のリガンドと同じまたは異なること、を含む。
【００４６】
本発明の一実施形態は、少なくとも１つのウリジンおよび少なくとも１つの修飾されたウリジンを含んだ標的オリゴヌクレオチドを提供するステップと、前記標的オリゴヌクレオチドをソラレンと接触させるステップと、前記ソラレンを前記標的オリゴヌクレオチドとカップリングさせてモノ付加体を形成するステップと、を含むモノ付加体の形成方法に向けられている。
【００４７】
本発明の一実施形態は、少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子を提供するステップであって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、ストップコドンまたは疑似ストップコドンである少なくとも１つのコドンを含むステップと；前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成するステップと；前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを、ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成するステップであって、前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが架橋剤によって前記ｔＲＮＡ分子に結合しているステップと；前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定するステップと；前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数である分子を同定することで前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定するステップと；複数の同族対を提供するステップと、１つまたは複数の結合因子を用いて前記複数の同族対と結合するステップと；前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望のタンパク質または核酸分子を選択するステップと、を含む、所望のタンパク質または核酸分子の同定および選択方法に向けられている。
【００４８】
本発明の一実施形態では、本発明は、核酸上にソラレンモノ付加体を形成する方法を含む。一実施形態では、この方法は、第１の核酸および第２の核酸を提供することを含み、第１の核酸および第２の核酸は実質的に互いに相補的であり、第１の核酸は１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物を含み、第２の核酸は少なくとも１つの疑似ウリジンを含む。この方法は、第１の核酸および第２の核酸の少なくとも一部分をソラレンの存在下でハイブリダイズさせてハイブリッドを形成すること、ハイブリッドに紫外光を照射することによって第１の核酸上にソラレンモノ付加体を形成することをさらに含む。一実施形態では、１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物は、アデノシンに隣接して位置する、好ましくはアデノシンの３’側に位置するウリジンを含む。
【００４９】
本発明の一実施形態では、ソラレンモノ付加体または架橋結合の生成方法を提供する。一実施形態では、この方法は、第１の核酸および第２の核酸を提供することを含み、第１の核酸および第２の核酸は実質的に互いに相補的であり、第１の核酸は１つもしくは複数のウリジンモノ付加体標的物または架橋結合標的物および１つもしくは複数のウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物を含み、ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物は１つもしくは複数の疑似ウリジンで置き換えられるように作用可能である。この方法は、ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物のうちの１つもしくは複数を疑似ウリジンで置き換えること、第１の核酸および第２の核酸の少なくとも一部分をソラレンの存在下でハイブリダイズさせてハイブリッドを形成すること；ならびに、ハイブリッドを照射することによって、標的上の第１の核酸上にソラレンモノ付加体または架橋結合を形成させながら非標的物を保護することをさらに含む。一実施形態では、可視光を用いて付加体または架橋結合を形成する。別の実施形態では、紫外光を用いる。
【００５０】
本発明の一実施形態は、少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子を提供するステップであって、前記ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、ストップコドンまたは疑似ストップコドンである少なくとも１つのコドンを含むステップ；前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成するステップと；前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを、ｔＲＮＡ分子を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成するステップであって、前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが架橋剤によって前記ｔＲＮＡ分子に結合しているステップと；前記翻訳されたタンパク質または前記ｍＲＮＡ分子の特性に基づいて前記同族対のうちの１つもしくは複数を同定するステップと；前記選択された同族対のｍＲＮＡ分子、前記ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子および前記ｍＲＮＡ分子に相同的な核酸分子のうちの１つまたは複数から選択された分子を同定することによって、前記所望のタンパク質または前記所望の核酸分子を同定するステップと；複数の同族対を提供するステップと、前記複数の同族対のうちの少なくとも１つを１つまたは複数の結合因子と結合させるステップと；前記１つまたは複数の結合因子に対する反応または反応を欠くことに基づいて前記所望のまたはタンパク質核酸分子を選択することで第１の所望の同族対を選択するステップと、前記第１の所望の同族対を回収して、回収した同族対を生成するステップと；前記回収した同族対の第１の核酸成分を増幅するステップと；第２の核酸成分を生成するステップであって、前記第２の核酸成分が、１つまたは複数の変異を有する前記第１の核酸成分を含むステップと；前記第２の核酸成分を翻訳することによって第２のタンパク質を生成するステップと；前記第２のタンパク質を前記第２の核酸成分と連結させて第２の所望の同族対を生成するステップと；少なくとも１つの所望の特性に基づいて前記第２の所望の同族対を再選択することによって所望のタンパク質配列を得るステップと、を含む、所望のタンパク質配列を進化させる方法に向けられている。
【００５１】
好ましい実施形態では、前記第１の所望の同族対を選択するステップには、所望の結合特徴を有する第１のリガンドを提供するステップと；前記第１の同族対のうちの１つまたは複数を前記第１のリガンドと接触させて、結合していない複合体および結合した複合体を生成するステップと；結合した複合体または結合していない複合体のどちらかを回収するステップと；回収した複合体の少なくとも１つの核酸成分を増幅するステップと；前記回収した複合体の前記核酸成分の配列に変異を導入するステップと；前記核酸成分から１つまたは複数の第２のタンパク質を翻訳するステップと、前記第２のタンパク質のうちの少なくとも１つを前記第２の核酸成分のうちの少なくとも１つと連結させて、１つまたは複数の第２の同族対を生成するステップと；前記第２の同族対のうちの前記少なくとも１つを少なくとも１つの第２のリガンドと接触させることによって所望のタンパク質配列を得て、前記第２の同族対のうちの１つまたは複数を選択するステップであって、前記第２のリガンドは前記第１のリガンドと同じまたは異なるステップと、が含まれる。
【００５２】
一部の実施形態は、第１の核酸および第２の核酸を提供するステップであって、前記第１の核酸および前記第２の核酸は実質的に互いに相補的であり、前記第１の核酸は１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物を含み、前記第２の核酸はソラレンの存在下で前記第１の核酸と前記第２の核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する少なくとも１つの疑似ウリジンを含むステップと；前記ハイブリッドを紫外光で照射して前記第１の核酸上に前記ソラレンモノ付加体を形成するステップと、を含む、核酸上にソラレンモノ付加体を形成する方法に向けられている。
【００５３】
一部の実施形態は、第１の核酸および第２の核酸を提供するステップであって；前記第１の核酸および前記第２の核酸は実質的に互いに相補的であり；前記第１の核酸は１つもしくは複数のウリジンモノ付加体標的物または架橋結合標的物、ならびに１つもしくは複数のウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物を含み；前記ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物は、１つまたは複数の疑似ウリジンで置き換えられるように作用可能であるステップと；前記ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物のうちの１つもしくを複数を疑似ウリジンで置き換えるステップと；ソラレンの存在下で前記第１の核酸と前記第２の核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成し；前記非標的物を保護しながら、前記ハイブリッドを照射することによって、前記標的上の前記第１の核酸上に前記ソラレンモノ付加体または前記架橋結合を形成させるステップと、を含む、ソラレンモノ付加体または架橋結合の生成方法に向けられている。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、ワクチンの産生に向けられている。一実施形態では、所定の分布内で最も高い結合親和性を有する数種のタンパク質を選択するよりも、多くの異なる配列を得るためにストリンジェンシーがより低い選択を用い、高い結合親和性を有するタンパク質の大集団を進化させるためにストリンジェンシーを徐々に増して複数回の突然変異を用いる。このようなタンパク質はワクチンの産生において貴重である。その論理は、ただ１つの表面エピトープのみが免疫系と反応することができること以外は抗イディオタイプワクチンと同じである。タンパク質ファミリーによって免疫系に提示される所望のタンパク質の凝集濃度は、Ｔ細胞およびＢ細胞応答を刺激するのに必要な閾値レベルに達するほど十分に高い。しかし、ファミリー内の任意の単一のタンパク質の濃度は、そのタンパク質に対する応答を刺激するのに必要な閾値よりも低くなる。したがって、ワクチンは所望のエピトープに対する抗体産生のみを刺激し、タンパク質ファミリー上に存在する他のエピトープのどれに対する抗体産生も刺激しない。これにより、ワクチンを失活させる可能性のある抗体の産生が防がれる。別の実施形態では、ワクチンは、所望のエピトープおよび所望のエピトープの活性と中立的もしくは相乗的効果を有する１つまたは複数の他のエピトープに対する抗体産生を刺激するように合成される。
【００５５】
図面の簡単な説明
図１は、修飾されたｔＲＮＡまたは類似体によって連結された場合における、ｍＲＮＡおよびそのタンパク質産物によって形成された複合体の一例を示す模式図である。図のように、ｍＲＮＡのコドンは修飾されたｔＲＮＡのアンチコドンと対を成し、ＵＶ照射によってソラレンモノ付加体、または非ソラレン架橋剤もしくはアリールアジドと共有結合的に架橋結合する。翻訳されたポリペプチドは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼを介して修飾されたｔＲＮＡに連結される。いずれの連結も、ｍＲＮＡおよび新生タンパク質がリボソームによって適所に保持されている間に起こる。
【００５６】
図２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択および進化過程の一例を示す模式図であり、開始核酸およびそのタンパク質産物は連結されており（たとえば図１参照）、タンパク質によって示される特定の特徴によって選択される。特定の特徴を示さないタンパク質は廃棄され、特徴を有するタンパク質は、変異を有して増幅する、好ましくは変異を有するｍＲＮＡの増幅を介して増幅して、新しい集団を形成する。様々な実施形態では、結合していないタンパク質が選択される。新しい集団は翻訳され、修飾されたｔＲＮＡまたは類似体を介して連結され、選択過程が繰り返される。タンパク質産物を最適化するために、所望するだけの回数の選択および増幅／突然変異を行うことができる。
【００５７】
図３は、本発明のｔＲＮＡ分子を構築する一方法を例示する図である。この実施形態では、ｔＲＮＡの５’末端と、アンチコドンループをコードしており、ｍＲＮＡに安定して連結することができる分子（本例で用いるソラレンなど）を有する核酸と、末端ピューロマイシン分子で修飾されたｔＲＮＡの３’末端とをライゲーションして、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化方法で用いる完全な修飾されたｔＲＮＡを形成する。他の実施形態にはピューロマイシンは含まれない。
【００５８】
図４は、本発明の方法において、ｍＲＮＡをｔＲＮＡに連結することができるように架橋結合分子であるソラレンを配置することができる、２つの代替実施形態について記載した図である。第１の実施形態には架橋剤（たとえばソラレンモノ付加体）をｍＲＮＡに連結させることが含まれ、第２の実施形態には架橋剤をｔＲＮＡ分子のアンチコドンに連結させることが含まれる。架橋剤は、知られているもしくは部分的に知られているメッセージの読み枠のアンチコドンまたは３’末端コドンのどちらかとのモノ付加体とすることができる。これは、翻訳とは別の手順、たとえば翻訳が起こる前に行うことができる。
【００５９】
図５は、ウリジンおよび疑似ウリジンの化学構造を示す図である。疑似ウリジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である５−６二重結合を欠く、ｔＲＮＡ中に見つかる天然に生じる塩基である。
【００６０】
図６は、本発明の一部の実施形態を示す図である。特定の実施形態におけるＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサー類似体を示す。
【００６１】
図７は、所定の長さのヌクレオチドが得られる確率を示す図である。
【００６２】
図８は、１２８個のアミノ酸のタンパク質のｍＲＮＡを生成する反応スキームを示す図である。
【００６３】
図９は、濃度ｐＴ＝６とｌｏｇ  ｋとの関係を示す図である。
【００６４】
図１０は、濃度とｌｏｇ  ｋとの関係を示す図である。
【００６５】
図１１は、同じ平均値を用いたＬａｎｃｅｔの経験分布とポアソンとの関係を示す図である。
【００６６】
図１２は、様々な［Ｔ］値によって結合される曲線のファミリーを示す図である。
【００６７】
図１３は、［Ｔ］＝１０-12を用いた４回の生成を示す図である。
【００６８】
図１４は、通常のタンパク質合成と非限定的な実施形態でのタンパク質合成方法との比較を示す図である。通常の翻訳：リボソーム内での翻訳の後、ｍＲＮＡおよび生じたタンパク質が分離される。好ましい実施形態（Ａ）は、好ましいリンカーはＳＡＴＡ連結試薬上にあり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳の後、ｍＲＮＡおよびタンパク質がＳＡＴＡリンカーによって連結されることを示している。好ましい実施形態（Ｂ）は、好ましいリンカーはｍＲＮＡ上にあり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳の後、ｍＲＮＡおよびタンパク質がｍＲＮＡ上に位置するリンカーによって結合されることを示している。
【００６９】
図１５は、リンカー技術の非限定的な一実施形態を、開始ｍＲＮＡライブラリを作製するその独自の方法の一実施形態、及びその独自の選択手順の一実施形態と合わせることによって、ｍＲＮＡを目的タンパク質から迅速に単離し、その後、そのタンパク質を製品スケールの量で生成するまたは生成を加速させるためにそれを用い、増強された特性を有するタンパク質の選択を行うことが可能になる様子を示す図である。
【００７０】
図１６は、タンパク質ライブラリの結合定数の分布を作成するために、ＳＡＲＳ「Ｓ」タンパク質または他の標的「Ｔ」タンパク質（以降「ＳＴ」）タンパク質でコーティングした表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）膜と連結させたランダムライブラリを示す図である。
【００７１】
図１７は、捕捉タンパク質（Ｐｔｒａｐ）で飽和させたＰｔｒａｐ結合ドメインすべてを示し、異なるドメインに結合したシグナル伝達タンパク質（Ｐｓｉｇ）を示す、ＳＰＲ膜上の「Ｓ」または「Ｔ」タンパク質を示す図である。
【００７２】
図１８は、捕捉プローブでコーティングしたポリアクリルアミド磁気ビーズを示す図である。
【００７３】
図１９は、ｐｓｉｇタンパク質およびバーコードオリゴヌクレオチドでコーティングした金粒子を示す図である。
【００７４】
図２０は、ＳＡＲＳウイルスのアッセイを示す図である。
【００７５】
図２１は、抗Ｓ抗体によってＳＰＲ膜上に捕捉されたタンパク質−ＳＡＴＡ−ｍＲＮＡライブラリを示す図である。
【００７６】
図２２は、癌の治療を示す図である。
【００７７】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の様々な態様は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をその翻訳されたタンパク質産物に連結させて「同族対」を形成するｔＲＮＡ機構を用いる。いくつかの実施形態では、配列が知られていないｍＲＮＡを発現させることができ、所望のまたは選択された特性を有するリガンドに対する選択過程によって特徴づけられたタンパク質および、タンパク質の進化をもたらす核酸の進化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行って、増強された特性を有する分子に達することができる。同族対は、ｔＲＮＡ分子を介して結合していることが好ましい。
【００７８】
本明細書中で使用する用語「ｔＲＮＡ分子」とは、その通常の意味を有し、さらに、すべて本明細書中に記載されている安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体（ＳＡＴＡ）、連結ｔＲＮＡ類似体、およびナンセンスサプレッサー類似体の意味も与えられる。ｔＲＮＡ分子には、天然ｔＲＮＡ、合成ｔＲＮＡ、天然および合成ｔＲＮＡの組合せ、ならびにその任意の修飾体が含まれる。好ましい実施形態では、ｔＲＮＡは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼによって新生ペプチドに結合しており、また、ｔＲＮＡ分子のアンチコドンとＲＮＡメッセージのコドンとの間で紫外線に誘導される架橋結合によってｍＲＮＡに結合している。これは、たとえばチオウラシルによって行うことができる。好ましい一実施形態では、リンカーは、ｍＲＮＡの翻訳可能な最終のコドン上、または好ましくは選択したｔＲＮＡアンチコドン上のどちらかに事前に配置した、ソラレンモノ付加体、非ソラレン架橋剤、またはそれらの類似体もしくは修飾体から作成されたソラレン架橋結合である。好ましくは、ｔＲＮＡストップアンチコドンが選択される。ストップコドン／アンチコドンの対は、完全長の転写物を選択する。当業者は、ストップコドンを有さないｍＲＮＡを用いてもよく、さらに、本発明のいくつかの実施形態にしたがって任意のコドンまたは核酸トリプレットを用いてもよいことを理解するであろう。天然に存在しないアンチコドンを有するｔＲＮＡは、当分野で公知の方法にしたがって合成することができる（たとえば図３）。
【００７９】
一実施形態では、ｔＲＮＡのアンチコドンはｍＲＮＡと架橋結合を形成することができ、架橋結合は、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体のうちの１つまたは複数からなる群から選択される。これらの架橋剤は、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、および他の周知の科学材料の製造者から購入可能である。
【００８０】
本明細書中で定義する用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」とは、任意の型のアミノ酸（たとえばペプチド結合を介して重合することができるＤもしくはＬアミノ酸、合成または修飾されたアミノ酸など）を含む２つ以上の単位の高分子を意味し、これらの用語は本明細書中で互換性があるように使用してもよい。
【００８１】
本明細書中で定義する用語「疑似ストップコドン」とは、自然にはナンセンスコドンではないが、メッセージがさらに翻訳されることを防ぐコドンを意味する。疑似ストップコドンは、下述の「安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体」またはＳＡＴＡを用いて作製してもよい。このように、疑似ストップコドンとは、ＳＡＴＡによって認識され、それに結合するコドンである。疑似ストップコドンを作製する別の方法は、疑似コドンに相補的なアンチコドンを有する必要なｔＲＮＡが実質的に欠失している人工系を作製することである。したがって、存在しないｔＲＮＡが必要となった際に、たとえば疑似ストップコドンで、翻訳が停止する。
【００８２】
別の実施形態では、選択されたコドンは、以下の方法のうちの１つまたは複数によって、翻訳可能な読み枠の最後に位置する、またはそこに配置される：（１）それを３’末端とすること；（２）連結コドンの３’側の部分に修飾を与えるか、または修飾を有することによって、それを翻訳不可能にして放出因子の活性化ができないようにすること；および（３）連結コドンの３’側に、対応するｔＲＮＡが欠失したコドンをおくこと。
【００８３】
当業者は、本発明のいくつかの実施形態に従って用いることができる、疑似ストップコドンの作製方法が複数存在することを理解するであろう。
【００８４】
ｍＲＮＡとそのタンパク質産物との間の結合の形成は、一般にｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ類似体、または特定の特徴を有するｍＲＮＡを必要とする。本発明のいくつかの実施形態では、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体は安定したペプチドアクセプターを有するであろう。この修飾により、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用によって新生ペプチド鎖が受容された後、ペプチジルトランスフェラーゼによって脱離が行われないような安定した様式で鎖を保持するように、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体が変化する。これは、３’デオキシアデノシン上の２’エステルなどの単結合、または、リボソームに結合することができ、ペプチド鎖を受容することができ、次のペプチド転移においてドナーとして役割を果たさないアミノ「アシルｔＲＮＡox-red」を用いて成し得る（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＣｈｉｎａｌｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３：３００１（１９７４）；ＫｒａｙｅｖｓｋｙおよびＫｕｋｈａｎｏｖａ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、２３：１（１９７９）ならびにＳｐｒｉｎｚｌおよびＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、２２：１（１９７９））。
【００８５】
さらなる実施形態では、選択されたコドンは、それを翻訳不可能にして放出因子の認識ができないようにするために、それを３’末端とすることによって、またはより３’側の部分に修飾を有することで、翻訳可能な読み枠の最後に位置する、またはそこに配置される。
【００８６】
一実施形態では、アミノ酸またはアミノ酸類似体は安定した結合によってｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体の３’末端に結合している。この安定した結合は、天然の構造においてこれら２つを結合する不安定な高エネルギーのエステル結合と対照的である。安定した結合は、結合をペプチジルトランスフェラーゼの作用から保護するだけでなく、後のステップにおいて構造の保存も行う。利便上、この修飾されたｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体を「安定したアミノアシルｔＲＮＡ類似体」またはＳＡＴＡと呼ぶ。本明細書中で使用するＳＡＴＡとは、好ましくは同族コドンがリボソームの読み位置にある場合に、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用によってペプチド鎖を受容することができるように、選択されたコドンを認識することができる実体である。ペプチド鎖は、ペプチドが安定して結合され、ペプチジルトランスフェラーゼによって脱離が行われないように結合される。好ましくは、選択されたコドンは水素結合によって認識される。
【００８７】
安定した修飾されたｔＲＮＡを作製する一方法が１９７３年に発表されている（本明細書中に参考として組み込まれているＦｒａｓｅｒおよびＲｉｃｈ、ＰＮＡＳ、７０：２６７１（１９７３））。この方法は、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体を３’−アミノ−３’−デオキシｔＲＮＡへと変換することを含む。これは、ヘビ毒ホスホジエステラーゼを用いて３’−アミノ−３’−デオキシアデノシンから、天然のアデノシンを取り除いたあと、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてそれを、天然ｔＲＮＡの末端に付加することによって成される。その後、この修飾されたｔＲＮＡに、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によってアミノ酸を荷担する。ＦｒａｓｅｒおよびＲｉｃｈは、ｔＲＮＡの２’ヒドロキシルではなく３’ヒドロキシルに荷担されるａａＲＳを用いた。アミノ酸は、通常の不安定な高エネルギーのエステル結合ではなく安定したアミド結合によってｔＲＮＡに結合している。したがって、これがリボソームのペプチジルトランスフェラーゼからペプチドを受容した際、ペプチドは安定して保持され、別のアクセプターに供与することができなくなる。
【００８８】
好ましい方法では、ＳＡＴＡは、コドンとアンチコドンとの間でソラレン架橋結合によって翻訳されたメッセージに結合される。ソラレン架橋結合は、相補的５’ピリミジン−プリン３’配列、特にＵＡまたはＴＡ配列、を含む配列間で優先的に生じる（本明細書中に参考として組み込まれているＣｉｍｉｎｏ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。ＳＡＴＡをコードするコドン、または連結コドンは、連結コドンにいくつかのコドンが用いられてもよいために、ＰＹＲ−ＰＵＲ−ＸまたはＸ−ＰＹＲ−ＰＵＲであることができる。便利なことに、ストップコドンまたはナンセンスコドンがこの立体配置を有する。アミノ酸をコードするコドンを用いることは遺伝暗号の微調整を必要とするかもしれず、これは一部の用途を複雑にする可能性がある。したがって、好ましい実施形態では、ストップコドンを連結コドンとして用い、ＳＡＴＡは、連結コドンを認識するという意味でナンセンスサプレッサーとして機能する。しかし、当業者は、系に適切な調整を加えることによって任意のコドンを用いることができることを理解するであろう。
【００８９】
ＦｒａｓｅｒおよびＲｉｃｈは大腸菌でその研究を行ったが、最も効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系は真核細胞である。真核生物の翻訳系中で原核生物のサプレッサーを用いることは実行可能と考えられる（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＧｅｌｌｅｒおよびＲｉｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、２８３：４１（１９８０）；Ｅｄｗａｒｄｓ他、ＰＮＡＳ、８８：１１５３（１９９１）；ＨｏｕおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２８：６８００（１９８９））。それらは主に常在するａａＲＳによって制限される。ｔＲＮＡまたは類似体を原核生物系中で荷担し、その後確立された方法に従って精製することができるので（本明細書中に参考として組み込まれているＬｕｃａｓ−ＬｅｎａｒｄおよびＨａｅｎｎｉ、ＰＮＡＳ、６３：９３（１９６９））、この制限は本発明の様々な実施形態によって克服される。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態では、ｔＲＮＡおよび類似体での使用に適したアクセプター基部の修飾は、当分野で公知の様々な方法によって生じさせることができる。このような方法は、たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＳｐｒｉｎｚｌおよびＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２２：１（１９７９）に見つかる。代替実施形態では、「転写ｔＲＮＡ」、すなわち転写後プロセッシング後の配列ではなく転写されるｔＲＮＡの配列は、ｔＲＮＡに共通する非定型かつ修飾された塩基をもたらす。これら転写ｔＲＮＡはｔＲＮＡとして機能することができる（どちらも本明細書中に参考として組み込まれているＤａｂｒｏｗｓｋｉ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４：４８７２、１９９５；およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２：７６１７、１９９３）。転写ｔＲＮＡは、転写によって生成することができ、または市販のＲＮＡ配列を図３に記載のように一片ずつ連結して一緒にするか、もしくは確立された方法をいくつか併用することにより、作製することができる。たとえば、５’リン酸および３’ピューロマイシンは、オリゴリボヌクレオチドと結合したものが市販されている。市販のＲＮＡ配列はＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、ＬａＦａｙｅｔｔｅ，ＣＯから入手可能である。この企業は、ウリシルおよび疑似ウリジンでチミンが置換されている配列などの、修飾された、天然ｔＲＮＡも提供することができる）。これらの断片は、当分野で周知のようにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結することができる（本明細書中に参考として組み込まれているＭｏｏｒｅおよびＳｈａｒｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：９９２、１９９２）。あるいは、好ましい実施形態では、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いる（本明細書中に参考として組み込まれているＲｏｍａｎｉｕｋおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００：５２（１９８３））。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態では、ソラレンで連結されたオリゴヌクレオチドを含めた断片からのｔＲＮＡの構築によって（図３）、または、天然もしくは修飾されたｔＲＮＡもしくは類似体へのモノ付加（ｍｏｎｏａｄｄｕｃｔｉｏｎ）することによって（図４）、ソラレンをＳＡＴＡのモノ付加体とする。好ましい実施形態では、ソラレンをまず下述のようにアンチコドンループの一部を含むオリゴヌクレオチドへのモノ付加体とし、次いでこの生成物をＳＡＴＡの残りの断片とライゲーションさせる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ペプチジルトランスフェラーゼによって新生タンパク質がＳＡＴＡに結合された際に翻訳が停止する。多数のリボソームがこの位置にあるとき、ＳＡＴＡおよびｍＲＮＡはＵＶ光によって連結される。好ましい方法では、これはソラレン架橋結合を形成することによって成す。ソラレンはフラン側鎖およびピロン側鎖を有し、これらは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの相補的塩基対の間に容易に介入する（本明細書中に参考として組み込まれているＣｉｍｉｎｏ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。ＵＶ、好ましくは３２０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲のＵＶで照射したあと、架橋結合が起こり、互い違いのピリミジンが共有結合された状態を維持する。架橋結合を形成してそれらを光逆反応（ｐｈｏｔｏ  ｒｅｖｅｒｓｅ）させること、または選択された波長を用いることのどちらかによって、以下により詳細に記述するモノ付加体を形成することが可能である。これらは、ピロン側鎖またはフラン側鎖のモノ付加体となる。さらに照射すると、フラン側鎖のモノ付加体を相補的塩基対に共有的に架橋結合することができる。ピロン側鎖のモノ付加体はさらに架橋結合することができない。フラン側鎖のソラレンモノ付加体（ＭＡｆ）の形成も確立された方法に従って行う。好ましい方法では、ソラレンはＳＡＴＡのアンチコドンに結合している。しかし、ソラレンは、図４に示すようにメッセージの読み枠の最後に結合することもできる。
【００９３】
精製したオリゴヌクレオチドのＭＡｆの大量生成方法は文献に記載されており（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＳｐｅｉｌｍａｎｎ他、ＰＮＡＳ、８９：４５１４、１９９２）、また、より少ない資源しか必要としないが架橋結合不可能なピロン側鎖のソラレンモノ付加体の汚染を一部含む方法も記載されている（たとえば、いずれも本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第４，５９９，３０３号；Ｇａｍｐｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７：３４９（１９８７）；Ｇａｍｐｅｒ他、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４０：２９（１９８４））。本発明のいくつかの実施形態では、どちらかの方法を用いてソラレンの標識化を行う。好ましい実施形態では、どちらも本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，４６２，７３３号およびＧａｓｐａｒｒｏ他、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：１００７（１９９３）に記載の方法に従って、可視光、好ましくは約４００ｎｍ〜４２０ｎｍの範囲の可視光を用いてフラン側鎖のモノ付加体を作製する。本発明の一態様では、ｍＲＮＡの３’末端に配置するための、フラン側鎖モノ付加体を有するＳＡＴＡ、またはモノ付加体化したオリゴヌクレオチド、および付加していないＳＡＴＡを、キットの主成分として提供する。
【００９４】
一実施形態では、本明細書中に参考として組み込まれているＢａｃｈｅｌｌｅｒｉｅ他（Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、９：２２０７（１９８１））の方法に従って、モノ付加体および架橋結合の形成および逆転を行う。好ましい実施形態では、どちらも本明細書中に参考として組み込まれているＫｏｂｅｒｔｚおよびＥｓｓｉｇｍａｎｎ、Ｊ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７、１１９、５９６０〜５９６１ならびにＫｏｂｅｒｔｚおよびＥｓｓｉｇｍａｎｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、６２、２６３０〜２６３２の方法を用いることによって、モノ付加体が効率的に生成されて最終生成物が高収率でもたらされる。
【００９５】
好ましい実施形態では、標的以外のすべてのウリジンが疑似ウリジンで置き換えられたＳＡＴＡ断片および相補的ＲＮＡまたはＤＮＡを用いる。図５は、ウリジンおよび疑似ウリジンの化学構造を比較している。疑似ウリジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成する、ｔＲＮＡ中に見つかる天然に存在する塩基である。疑似ウリジンは、天然のウリジンと同じワトソン−クリック水素結合を形成するが、ソラレン分子のフランまたはピロン側鎖のどちらかに相互作用するための標的である５−６二重結合を欠くので、この実施形態は特に有利である。これにより、ウリジンと同じオリゴヌクレオチドとしての塩基対特徴が可能となるが、ソラレンに対して１つの標的しか提供しない。通常はフラン側鎖が反応したあとにピロン側鎖の結合が形成されるので、この互い違いの標的を取り除くことによって、高効率照射でのモノ付加体の形成が、架橋結合が形成されることなく、かつピロン側鎖のモノ付加体（ＭａＰ）の最小限の形成で可能となる。照射は、好ましくは約３００〜４５０ｎｍの範囲、より好ましくは約３２０〜４００ｎｍの範囲、最も好ましくは約３６５ｎｍである。より詳細には、ＳＡＴＡ上の疑似ウリジンにより、以下のことが可能となる：１）ソラレンの潜在的な標的であるウリジンを含むＳＡＴＡ配列を使用すること、および２）ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡにおいて架橋結合の形成を排除し、可視光よりもはるかに効率的なＵＶＡ波長を用いた場合に、フラン側鎖のモノ付加体（ＭａＦ）の形成で過程を停止させること。
【００９６】
本明細書中に記載のように、非ソラレン架橋剤またはその修飾体および類似体をいくつかの実施形態で用いる。非ソラレン架橋剤の１つの利点は、これらは市販されている手段によってｔＲＮＡまたはｍＲＮＡ内に組み込むことができるので、場合によっては作業が容易となることである。たとえば、アリールアジドの使用が、本明細書中に参考として組み込まれているＤｅｍｅｓｈｋｉｎａ，Ｎ他、ＲＮＡ、６：１７２７〜１７３６、２０００中に実証されている。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態におけるＳＡＴＡおよびモノ付加体の使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系において特に有利である。しかし、当業者は、ｉｎ  ｓｉｔｕ系も用いることができることを理解するであろう。本発明の様々な実施形態が、それだけには限定されないが、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＬＬ）、コムギ胚芽、大腸菌、および酵母溶解物系を含めた任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に適用可能である。本発明の多くの実施形態は、様々な系の成分を組み合わせるハイブリッド系での使用にもよく適している。
【００９８】
３’アミド結合がアミノアシル化されたｔＲＮＡは、Ａ部位への結合を補助する伸長因子ＥＦ−ＴＵと結合しないことが報告されている（本明細書中に参考として組み込まれているＳｐｒｉｎｚｌおよびＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２２：１（１９７９））。しかし、このような修飾されたｔＲＮＡはＡ部位に結合する。この３’修飾されたｔＲＮＡの結合は、Ｍｇ＋＋濃度を変えることによって増加させることができる（本明細書中に参考として組み込まれているＣｈｉｎａｌｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３：３００１（１９７４））。ＳＡＴＡおよびＭｇ＋＋の適切な濃度ならびに／またはモル比は経験的に決定することができる。ＳＡＴＡの濃度またはＡ部位結合力が高すぎる場合は、ＳＡＴＡは非同族コドンに関して、天然のｔＲＮＡと競合する可能性がある、すなわち、ＳＡＴＡはピューロマイシンと酷似した機能で翻訳を引き止める可能性がある。ＳＡＴＡの濃度またはＡ部位結合力が低すぎる場合は、ＳＡＴＡは放出因子と有効に競合しないかもしれない、すなわち、有効なナンセンスサプレッサーｔＲＮＡとして作用しない。これらのバランスは経験的に決定することができる。
【００９９】
また、伸長因子がコドン−アンチコドンの認識のプルーフリーディングを補助すると考えられている。伸長因子および関連するＧＴＰ加水分解が存在しない場合における誤り率は、ヌクレオチド１つ離れたコドンの認識について１００回に１回であると推定される（本明細書中に参考として組み込まれているＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ１０００〜１００２（１９９５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。好ましい実施形態では、ＵＡＡが連結コドンとして用いられる。ＵＡＡが連結コドンである場合、差異がアミノ酸１個である非ストップコドンが７個存在する。これは、非ストップコドンの７／６１個、すなわち約１１．５％である。所定のコドンのミスコードの確率は、コドン１個あたり（０．０１）（０．１１５）＝１．１５×１０−３個のミスコードであると推定することができる。したがって、約８７０個のコドン毎に１つのミスコードが推定され、これは本発明の様々な方法の性能を実質的に損なわない頻度である。代替実施形態では、ＵＡＧまたはＵＧＡを連結コドンとして用いる。
【０１００】
一実施形態では、たとえば、それを３’末端とするか、もしくはより３’側の部分に修飾を有することによってそれを翻訳不可能にして放出因子の認識ができないようにするか、または連結コドンの３’側にある、あらゆるコドンに同族のｔＲＮＡを欠失させることによって、翻訳可能な読み枠の最後に選択されたコドンを有するｍＲＮＡを使用することで、この問題が取り除かれる。代替実施形態では、ＵＡＧまたはＵＧＡを連結コドンとして用いる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、適切な濃度のＳＡＴＡおよびＭｇ＋＋が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、たとえばＲＲＬで、そのプール中にｍＲＮＡ分子を存在させて、用いられる。これにより、リボゾームが、ＳＡＴＡに前記ペプチド鎖（上述の連結コドン）を受容させるコドンに達した際に、翻訳が停止される。短時間内に、連結コドンのほとんどがリボソーム内のＳＡＴＡによって占有される。好ましい実施形態では、その後、系にＵＶ光、好ましくは約３２０ｎｍ〜４００ｎｍのＵＶ光を照射する。核酸は通常この波長範囲対して透明である、すなわちこれを吸収しない。照射後、ソラレンモノ付加体は、安定した共有結合によってアンチコドンおよびコドンを結合する架橋結合に変換される。
【０１０２】
好ましい実施形態では、標的ｍＲＮＡは事前に選択される。別の実施形態では、標的ｍＲＮＡを人工的に生成する。代替実施形態では、標的は検査する系に由来するメッセージからなり、これは未知かつ／または未同定であってもよい。未知かつ／または未同定のｍＲＮＡが用いられることは、本発明のいくつかの実施形態の特定の利点である。
ランダムまたは疑似ランダムｍＲＮＡライブラリの作製方法。
【０１０３】
ヌクレオチドのランダム重合によってメッセンジャーＲＮＡを組み立てることの難点の１つは、ランダムに起こるコドンの３／６４個、すなわち０．０４７がストップコドンとなることである。ストップコドンとならない確率は１−０．０４７、すなわち０．９５３であるからである。これは、長さＮ個のヌクレオチドのメッセージとなる確率が（．０９５３）Nであることを意味する。これは、図７に示すように、このような生成方法によるメッセージの長さを制限する可能性がある。
【０１０４】
したがって、１００個の長さのヌクレオチドメッセージの収率は０．００８である。これらのライブラリを作製する通常の方法は、まずそのｃＤＮＡを生成し、次いでそれらを転写する方法である。本発明の一実施形態では、ＲＮＡライゲーションを用いる。一実施形態では、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使用したＲＮＡライゲーションを用いる。ＲＮＡライゲーションを用いる利点の１つは高収率であり、これは、二次構造が干渉する場合に低下し得る。
【０１０５】
一実施形態では、この方法ではまずコドンライブラリを取得する、すなわち、６１個のセンスコドンに対応するが３個のナンセンスコドンは含まれない高純度のトリプレットを組み立てる。これらは、ヌクレオチド１個あたり０．９９の精度で生成される。６１個のコドンのうち１８個のみが、１つ突然変異によってストップコドンとなる可能性がある。これらのうち、５個が１つの突然変異でストップコドンとなる確率０．２２を有し、１３個が１つの突然変異でストップコドンとなる確率０．１１を有する。すなわち、５／６１個のコドンが０．０１の頻度でストップコドンとなる確率０．２２を有し、１３／６１個のコドンが．０１の頻度でストップコドンとなる確率０．１１を有し、５／６１×０．２２×０．０１＝１．８０×１０-4および１３／６１×０．１１×０．０１＝２．３４×１０-4が得られ、ストップコドンに突然変異する和４．１５×１０-4が得られる。結合したこのようなコドンを１００個得ることは、（４．１５×１０-4）100＝０．９６の収率である。欠失または挿入に対して保護するために、長さの識別を高純度で得るために有効な手段である陰イオン交換ＨＰＬＣによってそれぞれのトリプレットを精製する。これにより、長さの純度は少なくとも０．９９９となるはずである。ここでも、１００個のコドンの収率は（０．９９９）100＝０．９０の収率となる。
【０１０６】
一実施形態では、これら異なる６１種の高度に精製したトリプレットを用いて、以下の手順を実施する：
ＮＮＮｐトリプレットで開始する
【０１０７】
【化１】
2007513631.tif 000002
【０１０８】
一実施形態では、アクセプターは５’または３’リン酸を有さず、ドナーは、５’および３’リン酸をどちらも有するように処理する。アクセプターは、３’ホスファターゼ活性に好都合な緩衝液を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３’リン酸を取り除かせる。ドナーは、３’ホスファターゼ活性を欠く突然変異Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび適切な緩衝液を用いることによって５’リン酸を付加させる。
【０１０９】
一実施形態では、６１種のアクセプターおよび６１種のドナーをすべて混合して、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼの基質を形成する。生じるＲＮＡ構築体の偏りを変化させるために、それぞれの比率を変動させることができる。
【０１１０】
一実施形態では、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼの作用の下で、アクセプターの３’末端はドナーの５’末端に結合する。その結果、リン酸化された３’末端を有する６量体が生じる。ドナー上に３’リン酸化を持たせる理由の１つは、ドナーおよびアクセプターの両方になることができる種を存在させないことである。これは、存在する場合、様々な大きさの自発的な環が生じることができるからである。６量体は、ここでも陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて大きさによって精製することができる。当業者は、３’リン酸化が本発明のいくつかの実施形態に従って他の場所に位置することができることを理解するであろう。
【０１１１】
これらの６量体を２つの試料に分け、一方を脱リン酸化してアクセプターを形成し、他方を二重リン酸化してドナーを形成する。上記ライゲーションステップを繰り返し、生じた１２量体を大きさによって精製する。これを計４または５サイクル繰り返すことができる。この時点で、陰イオン交換ＨＰＬＣは大きさによって識別するその能力を失い、長さの精製ステップは省略する。ドナーおよびアクセプターの形成ならびにライゲーションのステップの合計数は７となり、平均２7、すなわち１２８個のコドンを有する読み枠が得られる。各回で８０％の収率を予測することが妥当であり、０．８7、すなわち．２％収率が得られる。トリプレットはマイクロモル量で市販されているので、これにより、おおよそ１０17種の異なるランダム構築体が得られる。その後、これらをリボソーム結合配列およびＡＵＧ開始コドンを有する５’アクセプターに結合させる。その後、この構築体を、本発明のＳＡＴＡに同族のストップコドンを有する、または通常ポリＡテールを含むＰｈｙｌｏｓまたはＮｅｍｏｔｏの方法に矛盾しないリンカーを有する、３’ドナーに結合させる。これにより、１２８個のアミノ酸を有するペプチドをコードする、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡディスプレイ技法用の構築体が得られる。米国特許第６，３１２，９２７号および第５，６５８，７５４号、ならびに以下の参考文献が本明細書中に参考として組み込まれている：（１）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｄａｖｉｓ、Ｋｕｅｈｌ  Ｂａｔｔｅｙ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ出版、１９９４；および（２）Ｒｏｍａｎｉｕｋ，Ｐ．Ｊ．、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ  Ｏ．Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００：５２〜５９（１９８３）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ出版、１９９４。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、ＳＡＴＡは３’末端にピューロマイシンを有し、アンチコドンループ上に架橋剤（ソラレンなど）を有する。別の実施形態では、ＳＡＴＡは３’末端にピューロマイシンを有し、架橋剤はｍＲＮＡ上に位置する。一部の実施形態では、架橋剤がｍＲＮＡ上にある場合、架橋剤はｍＲＮＡ上のストップコドンに位置する。他の実施形態では、架橋剤はストップコドンの近隣に、好ましくは約１〜２０個のヌクレオチド離れて、より好ましくは１〜１０個のヌクレオチド離れて、最も好ましくは１〜３個のヌクレオチド離れて位置する。当業者は、架橋剤がストップコドンから２０個を超えるヌクレオチド離れて位置するように設計することもできることを理解するであろう。本明細書中に記載のように、ソラレンは架橋剤の一例である。他の架橋剤は本明細書中に記載されている。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡをその同族ペプチドに連結させるために連結ｔＲＮＡ類似体を用いる。一実施形態では、連結ｔＲＮＡ類似体は、アンチコドンループ上に位置する架橋剤を有する、天然もしくは合成ｔＲＮＡ（または、天然−合成ハイブリッドの組合せ）である。好ましくは、架橋剤は共有結合によってアンチコドンループに結合している。一実施形態では、連結ｔＲＮＡ類似体は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用によって新生ペプチドをその３’アミノアシル部分上に受容する。３’アミノアシル部分は、ｔＲＮＡに由来するか、または合成によって導入することができる。一実施形態では、ｔＲＮＡによって結合されたコドン（連結コドン）より先のメッセージは翻訳不可能であるので、ペプチドとｔＲＮＡとの間のエステル結合はリボソームのペプチジルトランスフェラーゼから保護されている。したがって、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼは、ｔＲＮＡからペプチドを放出させることができない。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、ｔＲＮＡとペプチド鎖との間のエステル結合は、ピューロマイシンの必要性が取り除かれるほど凹凸がある。エステル結合によって連結された場合、連結ｔＲＮＡ類似体とペプチドとの間の結合は、翻訳されたメッセージを連結コドンより先で「翻訳不可能」にすることによって、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼによる分解から保護されている。有利なことに、メッセージはその後、そのペプチドに安定に結合し、さらに同定され、選択され、進化する。別の利点は、連結ｔＲＮＡ類似体を用いた一部の実施形態において合成または修飾されたｔＲＮＡを使用する必要がないことである。特定の一実施形態では、ｔＲＮＡは３’末端が修飾されていないという意味で修飾されておらず、アンチコドンループに軽微な修飾を有していても有していなくてもよい。多くの実施形態では、修飾されていない、天然ｔＲＮＡ（特に３’末端が修飾されていないもの）を用いることができ、したがって、この系は、とりわけ、対費用効果のより高い、効率的な、より速い、誤りの少ない、及びはるかに高い収率を生じることができる、系となる。以下の理論に束縛されることを望まずに、本発明者らは、ピューロマイシン（または類似のリンカー）が存在しないことにより、場合によってはピューロマイシンが伸長因子とｔＲＮＡとの相互作用を妨害することで低収率がもたらされので、収率に影響が与えられると考える。さらに、伸長因子は、ピューロマイシン（または類似のリンカー）に妨害されない場合は動的なプルーフリーディングを行って誤り率を低下させることができる。
【０１１４】
さらなる実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを用いる。ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはストップコドンまたは疑似ストップコドンを認識する。ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはｍＲＮＡをその同族のペプチドに連結させるために用いる。一実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡは、天然もしくは合成ｔＲＮＡ（または、天然−合成ハイブリッドの組合せ）である。一実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはストップコドンまたは疑似ストップコドンと水素結合するアンチコドントリプレットを有する。一実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはＹａｒｕｓの延長アンチコドン則に沿った３’修飾および配列を有する（本明細書中に参考として組み込まれているＹａｒｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６４６〜６５２、１９８２）。一実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡ類似体は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用によって新生ペプチドをその３’アミノアシル部分上に受容する。３’アミノアシル部分は、ｔＲＮＡに由来するか、または合成によって導入することができる。一実施形態では、ｔＲＮＡによって結合されたコドン（連結コドン）より先のメッセージは翻訳不可能であるので、ペプチドとｔＲＮＡとの間のエステル結合はリボソームのペプチジルトランスフェラーゼから保護されている。したがって、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼは、ｔＲＮＡからペプチドを放出させることができない。好ましい実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはどのような種類の架橋剤も有さない。その代わりに、架橋剤はｍＲＮＡ上に位置する。一部の実施形態では、架橋剤がｍＲＮＡ上にある場合、架橋剤はｍＲＮＡ上のストップコドンにまたはその近隣に位置する。したがって、本発明のいくつかの実施形態はいくつかの利点を提供する。たとえば、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡとの間のエステル結合が驚くほど凹凸を有することは、ピューロマイシン、ピューロマイシン類似体、または他のアミドリンカーの必要がないことを意味する。別の利点は、エステル結合によって連結された場合、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡとペプチドとの間の結合は、翻訳されたメッセージを連結コドンより先で「翻訳不可能」にすることによって、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼによる分解から保護されていることである。有利なことに、メッセージはその後、そのペプチドに安定に結合し、さらに同定され、選択され、進化する。したがって、いくつかの実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ自体の上にピューロマイシンまたは架橋剤が位置している必要がない。さらに別の利点は、合成または修飾されたｔＲＮＡを使用する必要がないことである。特定の一実施形態では、ｔＲＮＡは３’末端が修飾されていないという意味で修飾されておらず、アンチコドンループに軽微な修飾を有していても有していなくてもよい。多くの実施形態では、修飾されていない、天然ｔＲＮＡ（特に３’末端が修飾されていないもの）を用いることができ、したがって、この系は、とりわけ、対費用効果のより高い、効率的な、より速い、誤りの少ない、高収率を提供することができる系となる。以下の理論に束縛されることを望まずに、本発明者らは、ピューロマイシン（または類似のリンカー）が存在しないことにより、場合によってはピューロマイシンが伸長因子とｔＲＮＡとの相互作用を妨害することで低収率がもたらされので、収率に影響が与えられると考える。さらに、伸長因子は、ピューロマイシン（または類似のリンカー）に妨害されない場合は動的なプルーフリーディングを行って誤り率を低下させることができる。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態は、ポリペプチドをコードしている核酸およびポリペプチドをｔＲＮＡに共有結合することができるｔＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、核酸の結合がポリペプチドとの結合以外のｔＲＮＡの一部分上で起こり、ｔＲＮＡはｔＲＮＡのアンチコドンと会合した連結分子を含む。このｔＲＮＡアンチコドンは、所要の波長の光の照射下でｍＲＮＡと架橋結合を形成する、好ましくはアンチコドン上にフラン側鎖のソラレンモノ付加体を、ＵＶＡ、好ましくは約３００〜４５０ｎｍの範囲、より好ましくは約３２０〜４００ｎｍの範囲、最も好ましくは約３６５ｎｍのＵＶＡの照射下で形成する、能力を有する。一実施形態では、アミノ酸またはアミノ酸類似体は安定した結合によってｔＲＮＡ分子の３’末端に結合してＳＡＴＡを生じる。本発明の一部の実施形態の利点の１つは、この時点で翻訳過程が引き止められることを確実にし、後の用途において結合を安定させることである。
【０１１６】
一実施形態では、ｔＲＮＡのアンチコドンはｍＲＮＡと架橋結合を形成する能力を有し、架橋結合は非ソラレンの架橋結合分子または部分である。本明細書中で使用する用語「非ソラレン架橋剤」とはその通常の意味を有し、さらに、以下の化合物、すなわち２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジン、２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにその修飾体または類似体のうちの１つまたは複数が含まれる。
【０１１７】
他の実施形態には、好ましくは読み枠の３’領域中に、より好ましくは読み枠の最も３’側のコドンに、最も好ましくは読み枠の３’ストップコドンに、位置するソラレンまたは非ソラレン架橋剤を含むｍＲＮＡが含まれる。好ましい実施形態では、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとの間の連結は架橋結合したソラレン、または非ソラレンの架橋結合分子である。一実施形態では、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとの間の連結はフラン側鎖のソラレンモノ付加体である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、天然ｔＲＮＡのいかなる修飾もしくは実質的な修飾を必要とせずに、タンパク質がそのそれぞれのｍＲＮＡに結合することを可能にする。一実施形態では、修飾されたｔＲＮＡを用いる。
【０１１９】
本発明の一実施形態は、ｍＲＮＡにコードされているポリペプチドに共有結合しているｔＲＮＡと共有結合することができるｍＲＮＡ分子を含み、ｔＲＮＡはｍＲＮＡのコドンと会合する連結分子を含む。このｍＲＮＡのコドンは、所要の波長の光の照射下でｔＲＮＡと架橋結合を形成する能力を有する。架橋結合させられるこの部分は、好ましくは、フラン側鎖のソラレンモノ付加体、またはコドン上の非ソラレン架橋剤であって、それらはＵＶＡ、好ましくは約３００〜４５０ｎｍの範囲、より好ましくは約３２０〜４００ｎｍの範囲、最も好ましくは約３６５ｎｍのＵＶＡ、が照射されるコドン上にある。好ましくは、このコドンは、読み枠の最後（最も３’側）の翻訳可能なコドンであり、したがって翻訳を停止させる、および、ストップコドンまたは疑似ストップコドンである。ｍＲＮＡをこの時点より先で翻訳不可能にすることによって、ｔＲＮＡもしくはｔＲＮＡ類似体とコードされたペプチドとの間の、ぺプチジルトランスフェラーゼに対して安定している単結合を使用することが、翻訳を引きとめるために不要となる。多くの用途において、天然のエステル結合は十分に安定している。一実施形態では、メッセージは、以下の技法のうちの１つまたは複数によって翻訳不可能にする：（１）コドンを物理的な終端とすること；（２）修飾されたヌクレオチドを用いること；（３）リボソームによってプロセッシングされることができない部分を用いること；および（４）選択されたコドンより先のメッセージを認識するｔＲＮＡを欠失させること。当業者は、メッセージを翻訳不可能にさせる他の方法も、本発明のいくつかの実施形態に従って用いることができることを理解するであろう。
【０１２０】
当業者は、本発明の一部の実施形態に従って、リボソームの内部にある間にｍＲＮＡを翻訳されているｔＲＮＡに架橋結合させる他の方法も用いることができることを理解するであろう。このような方法には、それだけには限定されないが、リボソーム中で効率的なｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ光架橋結合をもたらす、ウラシルやグアニン残基上のアリールアジドなどの修飾されたヌクレオチドの使用が含まれる（本明細書中に参考として組み込まれているＤｅｍｅｓｈｋｉｎａ，Ｎ他、ＲＮＡ、６：１７２７〜１７３６、２０００）。
【０１２１】
本発明のさらなる実施形態は、モノ付加体の形成方法を提供する。一実施形態によれば、少なくとも１つのウリジンおよび少なくとも１つの修飾されたウリジンを有する標的オリゴヌクレオチドをソラレンと接触させ、標的オリゴヌクレオチドおよびソラレンをカップリングさせてモノ付加体を形成する。本実施形態による修飾されたウリジンは、ソラレンとのカップリングを回避するために修飾されていてもよい。一実施形態では、修飾されたウリジンは疑似ウリジンである。この実施形態によれば、標的オリゴヌクレオチドは、ｔＲＮＡ、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ類似体などのｔＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ、修飾されたｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ類似体などのｍＲＮＡ分子であってもよい。さらなる実施形態では、ソラレンは１つまたは複数の架橋結合によって標的オリゴヌクレオチドにカップリングされている。この実施形態によれば、標的オリゴヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドが存在していてもよい。この第２のオリゴヌクレオチドは、ウリジンを含まなくとも、または標的オリゴヌクレオチドとの架橋結合を回避するために修飾されたウリジン残基を含んでもよい。好ましくは、修飾されたウリジンは疑似ウリジンである。
【０１２２】
本発明の一実施形態では、本発明は核酸上にソラレンモノ付加体を形成する方法を含む。この方法は、一部の実施形態では、少なくとも実質的に互いに相補的である第１の核酸および第２の核酸を提供することを含む。第１の核酸は１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物を含み、第２の核酸は少なくとも１つの疑似ウリジンを含む。この方法は、第１の核酸および第２の核酸の少なくとも一部分をソラレンまたはソラレン様の作用物質の存在下でハイブリダイズさせてハイブリッドを形成すること、ハイブリッドに紫外光を照射することによって第１の核酸上にソラレンモノ付加体を形成することをさらに含む。一実施形態では、１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物は、アデノシンに隣接して位置する、好ましくはアデノシンの３’側に位置するウリジンを含む。
【０１２３】
別の実施形態では、ソラレンモノ付加体または架橋結合の生成方法は、少なくとも実質的に互いに相補的である第１の核酸および第２の核酸を提供することを含む。第１の核酸は１つまたは複数のウリジンモノ付加体標的物または架橋結合標的物および１つまたは複数のウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物を含む。ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物は、１つまたは複数の疑似ウリジンで交換される（ｒｅｐｌａｃｅｄ）または置換される（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ように作用可能である。この方法は、ウリジンモノ付加体非標的物または架橋結合非標的物のうちの１つもしくは複数を疑似ウリジンで置き換えること、第１および第２の核酸の少なくとも一部分をソラレンの存在下でハイブリダイズさせて少なくとも部分的なハイブリッドを形成すること；ならびにハイブリッドを照射することによって、または他の方法によって活性化させて、標的上の第１の核酸上にソラレンモノ付加体もしくは架橋結合を形成させながら非標的物を保護することをさらに含む。一実施形態では、可視光を用いて付加体または架橋結合を形成する。別の実施形態では、紫外光を用いる。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態は、核酸、ｔＲＮＡ、および核酸によってコードされているポリペプチドを一緒に安定に連結して、連結したヌクレオチド−ポリペプチド複合体を形成する方法を含む。好ましい実施形態では、核酸はｍＲＮＡであり、連結したヌクレオチド−ポリペプチド複合体はｍＲＮＡ−ポリペプチド複合体である。この方法は、たとえばアレイ上に複数の相異なる核酸−ポリペプチド複合体を提供すること、所望の結合特徴を有するリガンドを提供すること、複合体をリガンドと接触させること、結合していない複合体を取り除くこと、およびリガンドに結合した複合体を回収することをさらに含むことができる。
【０１２５】
本発明のいくつかの方法は、核酸分子ならびに／またはタンパク質の同定、選択および／もしくは進化を含む。一実施形態では、本発明は、回収した複合体の核酸成分を増幅することおよび変異を核酸の配列に導入することを含む。他の実施形態では、この方法は、増幅して変化した核酸からポリペプチドを翻訳すること、ｔＲＮＡを用いてそれらを連結すること、および結合した複合体から別の新しい集団を選択するためにそれらをリガンドと接触させることをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化の過程において、特に選択されたｍＲＮＡが変異を持って複製され、翻訳され、選択のために再度同族タンパク質に結合される反復過程において、選択されたタンパク質−ｍＲＮＡの複合体を用いる。
【０１２６】
本発明の一実施形態では、選択されたコドンは、それを３’末端とするか、またはより３’側の部分を修飾し、それを翻訳不可能にして放出因子の認識ができないようにすることによって、翻訳可能な読み枠の最後に位置する、またはそこに配置される。この実施形態の利点の１つは、ｔＲＮＡの３’末端にアミド結合したアミノ酸類似体が、翻訳を引き止めるために必要ないことである。さらに、これにより、ペプチドｔＲＮＡ複合体の効率的な産生が可能となる。このような複合体は、そのエステル結合のエネルギー含有量が高いにもかかわらず相当に頑強である（図６）。
【０１２７】
好ましい方法では、ＳＡＴＡまたはペプチジル−ｔＲＮＡは、ソラレン、または２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジン、２−クロロアデノシン、もしくはアリールアジドによるコドンとアンチコドン間の架橋結合の群のうちの１つによって、翻訳されたメッセージに結合される。
一部の実施形態では、ソラレン架橋結合は、相補的５’ピリミジン−プリン３’配列、特にＵＡまたはＴＡ配列を含む配列間で優先的に生じられる（本明細書中に参考として組み込まれているＣｉｍｉｎｏ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。一部の実施形態では、非ソラレン架橋剤またはアリールアジドが用いられ、特定の実施形態では、その要件においてストリンジェンシーがより低く、可能なコドン−アンチコドン対が増加するので特に有利である。
【０１２８】
ＳＡＴＡまたは連結ｔＲＮＡ類似体をコードするコドンは連結コドンと呼んでもよい。ソラレンを架橋結合部分として用いる場合、連結コドンは、連結コドンにいくつかのコドンが用いられるように、ＰＹＲ−ＰＵＲ−ＸまたはＸ−ＰＹＲ−ＰＵＲであることができる。この場合、「Ｘ」は任意のヌクレオチドであってよい。便利なことに、ストップコドンまたはナンセンスコドンがこの立体配置を有する。アミノ酸をコードするコドンを用いることは遺伝暗号の微調整を必要とするかもしれず、これは一部の用途を複雑にする可能性がある。したがって、好ましい実施形態では、ストップコドンを連結コドンとして用い、ＳＡＴＡまたは連結ｔＲＮＡが、連結コドンを認識するという意味でナンセンスサプレッサーとして機能する。しかし、当業者は、系に適切な調整を加えることによって任意のコドンを用いることができることを理解するであろう。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、新生タンパク質がすべてその同族ｍＲＮＡに結合したあと、リボソームを放出または変性させる。好ましくは、これは透析、単純希釈、またはキレート化によるＭｇ++の除去によって行う。当業者は、それだけには限定されないが、イオン強度、ｐＨ、または溶媒系を変えることによる変性を含めた他の方法も用いることができることを理解するであろう。
【０１３０】
本発明のいくつかの実施形態では、同族対の選択は、それだけには限定されないが、アレイ、親和性カラム、免疫沈降、および数々のハイスループットスクリーニング手法を含めた様々な確立された方法のうち任意のものに従ったタンパク質の親和性結合に基づく。それだけには限定されないが、タンパク質、核酸、化学物質、ポリマーおよび金属を含めた様々なリガンドも用いてもよい。さらに、細胞膜もしくは受容体、またはさらには細胞全体を、同族対を結合するために用いてもよい。選択は陽性または陰性であることができる。すなわち、選択された同族対は、リガンドに良好に結合するものか、または結合しないものであることができる。たとえば、タンパク質が熱力学的に有利な反応を加速するためには、たとえばその反応の酵素として作用するためには、基質および遷移状態の類似体のどちらにも結合するべきである。しかし、遷移状態の類似体が基質よりもはるかに密に結合しているべきである。これは、以下の式によって説明される。
【０１３１】
【数１】
2007513631.tif 000003
【０１３２】
［式中、酵素を用いた場合の反応速度（ｋ酵素）の、酵素を用いない場合の速度（ｋψ遷移状態）に対する比は、酵素と遷移状態との結合（Ｋ遷移状態）の、基質と酵素との結合（Ｋ基質）に対する比に等しい（本明細書中に参考として組み込まれているＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ３８０、（１９９５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）］。
【０１３３】
好ましい実施形態では、基質との結合に関して競合が不良であるが遷移状態の類似体との結合に関して良好に競合するタンパク質を選択する。操作上では、これはマトリックスに基質または基質類似体が結合している場合にマトリックスから容易に溶出され、マトリックスに遷移状態の類似体が結合している場合にマトリックスから除去が最も困難であるタンパク質を採ることによって達成してもよい。この選択を逐次的に繰り返し、同族対の核酸の複製および翻訳によりタンパク質を再生産することにより、改良された酵素が進化するはずである。本発明のいくつかの実施形態では、同一選択過程において、１つの部分に対する親和性、および別の部分に対する親和性の欠如を用いる。多くの実施形態では、選択はＲＮＡによっても行うことができる。
【０１３４】
選択によって同族対の集団が同定されたあと、ｍＲＮＡ鎖をｔＲＮＡ分子から脱離させて複製することが好都合であり得る。これは必ずしも必要ではないが、特定の実施形態において所望される場合は、連結フォトリンカーとしてソラレンを用い、前記対をＵＶ、好ましくは約３１３ｎｍまたはそれより少し低いＵＶで照射することによって達成することができる。これは、ＭＡｆへのソラレン架橋結合を光逆反応させ、核酸への損傷を最小限にする波長であると同定されている。光逆反応対核酸損傷の比は、光逆反応１つに対して６００個中１個の塩基の損傷であると推定されている（本明細書中に参考として組み込まれているＣｉｍｉｎｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２５：３０１３（１９８６））。
【０１３５】
当業者は、それだけには限定されないが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる方法または逆転写およびＰＣＲによる方法を含めた数々の方法によってｍＲＮＡを複製することができることを理解するであろう。これは、同族対から分離したｍＲＮＡを使用して、たとえばポリＴもしくはポリＵを用いてたとえば天然で未知のメッセージのポリＡテールにハイブリダイズさせることを使用して、または同族対を無処置のままにして、知られているメッセージの読み枠内に部分的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、行うことができる。あるいは、ｃＤＮＡ末端を迅速に増幅する市販のキットを用いてもよい。いくつかの実施形態では、光活性化が可能な部分をオリゴヌクレオチド上に配置する上述の方法を用いて修飾されたオリゴリボヌクレオチドを作製することができ、その後Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いてこれをメッセージの３’末端に結合させることができる。結合させたオリゴヌクレオチドはその光活性化が可能な部分を有する連結コドンを含む。
【０１３６】
本明細書中に記載のように、本発明のいくつかの実施形態に従ってメッセージをｔＲＮＡに連結させる方法はいくつか存在する。たとえば、以下の表は本発明の一部の実施形態の概要を示す。
【０１３７】
【表１】
2007513631.tif 000004
【０１３８】
一実施形態では、タンパク質中のそれぞれの位置において少なくとも１つのアミノ酸置換をサンプリングする。これは、タンパク質の進化に特に有利である。
【０１３９】
複製の閾値
効率的な進化のための複製の公称最小回数は、以下の式を用いて推定してもよい。長さがｎ配列であり、選択的改善が突然変異ｒ離れており、突然変異率ｐである配列がある場合、複製において選択的改善が生じる確率は以下のように決定してもよい：
ｒ＝１では、正しい点で突然変異が起こる確率（ｐ）×開始点とは異なる、３個のヌクレオチドのうち正しいものへと突然変異する確率（１／３）×他のｎ−１箇所の部位が突然変異されないままである確率（（１−ｐ）(n-r)）、または
【０１４０】
【数２】
2007513631.tif 000005
【０１４１】
［式中、Ｐは、突然変異ｒ離れて所定の変化を達成する確率である］。より一般的には、すべてのｒ値において：
【０１４２】
【数３】
2007513631.tif 000006
【０１４３】
突然変異１つ離れた場所で利点を見つける確率と、突然変異３つ離れた場合の確率とを比較することが有益である。これは、トリプレットの遺伝暗号を考慮すると、任意の１種のコドンは１つの突然変異において９種の他のコドンにしか変化できないからである。実際に、１つの突然変異で９種の他のアミノ酸コードに実際に変化できるコドンは存在しないことが判る。１つの突然変異でアクセスすることができるアミノ酸の最大数は７種のアミノ酸であり、これを行うことができるのは６４個のコドンのうち８個のみである。ほとんどのコドンでは、１つの突然変異で１９種の他のアミノ酸のうち５または６種となる。開始アミノ酸とは異なる１９種のアミノ酸すべてに達するためには、一般に３つの突然変異が必要である。間に入る２つの変異は一般に選択的に有利とならないので、これら３つの突然変異は逐次的であることはできない。したがって、２０種のアミノ酸すべてを用いるためには、大きさが少なくとも３つの突然変異（ｒ＝３）であるステップを用いる必要がある。
【０１４４】
「変異性ＰＣＲ」に関して報告されている突然変異率である０．００６７では、１００個のアミノ酸の短いタンパク質を与える３００個のヌクレオチドのメッセージを用いると：
Ｐ3＝１．５１×１０-9
したがって、有利である次のアミノ酸に合理的に達するために予測するためには、その突然変異率において：
【０１４５】
【数４】
2007513631.tif 000007
【０１４６】
回の複製の閾値が必要であると予測される。二項展開により、１／３回を超える試験（実際には約１／ｅ）でも選択的利点を有する所定の配列が含まれないことが示されるのでこれは用いるべき複製ではない。
【０１４７】
所定のμについて大きなｎおよび小さなｐポアソン近似の計算することができる。これにより、ｎがたとえば１０9の桁数であり、ｐが１０-9の桁数の場合の一般項を算出することができる。近似の一般項は以下のとおりである：
【０１４８】
【数５】
2007513631.tif 000008
【０１４９】
約６／Ｐを超える増幅係数により、すべてのアミノ酸の使用を伴って進化が進行することが保証される。これは、新規タンパク質の産生が既に存在するタンパク質の「シャッフリング」の使用を妨げる場合に有用である。
精製に対する制限
ＢおよびＣがＡに対して競合する可逆的結合において：
ＡＢ←→Ａ＋Ｂ  ＡＣ←→Ａ＋Ｃ
【０１５０】
【数６】
2007513631.tif 000009
【０１５１】
全濃度は以下のように表すことができる：
［Ｂ］T＝［Ｂ］＋［ＡＢ］  （３）
［Ｃ］T＝［Ｃ］＋［ＡＣ］  （４）
（３）を（４）で割り算し：
【０１５２】
【数７】
2007513631.tif 000010
【０１５３】
（１）および（２）を［Ｂ］および［Ｃ］に代入し：
【０１５４】
【数８】
2007513631.tif 000011
【０１５５】
方程式を再度整理し、以下の結果が得られる：
【０１５６】
【数９】
2007513631.tif 000012
【０１５７】
分子および分母の［Ａ］を約分し、方程式から以下の結果が得られる：
【０１５８】
【数１０】
2007513631.tif 000013
【０１５９】
最後に方程式を再度整理し、以下の方程式が得られる：
【０１６０】
【数１１】
2007513631.tif 000014
【０１６１】
上記係数は「濃縮係数」と呼ばれる。結合した成分の比、またはＣに対するＢの濃縮を計算するために、全成分の比にこの係数を掛け算する。最大濃縮係数は、［Ａ］がｋCまたはｋBよりも有意に小さい場合にｋc／ｋBである。［Ａ］がｋCまたはｋBよりも有意に大きな場合は、濃縮は１である、すなわち、他方に対して一方の濃縮は存在しない。
【０１６２】
濃縮は結合定数の比によって制限される。その競合相手よりも１００倍強力に結合している乏しいタンパク質を濃縮するためには、３回の濃縮でその競合相手に対するタンパク質の比が百万に上昇する。その競合相手よりも２倍強力にしか結合していないタンパク質を濃縮するためには、１０回の濃縮サイクルでも〜１０００の濃縮しか得られない。
【０１６３】
まったく同様の方法によって、結合が不良である選択タンパク質の濃縮係数を示すことができる：
以下の方程式において：
【０１６４】
【数１２】
2007513631.tif 000015
【０１６５】
ここでの濃縮は、［Ａ］＞ｋＡまたはｋＢで最大である。
【０１６６】
【数１３】
2007513631.tif 000016
【０１６７】
選択するための戦略
分子の集団を扱う場合は、選択基準はしばしば、標的リガンドへの親和性または結合強度である。この選択における制限は何であろうか。標的リガンドＴへの結合に関して競合する分子集団、Ａｉ（ｉは様々な結合親和性に対応する）を検討されたい。
反応は
【０１６８】
【数１４】
2007513631.tif 000017
【０１６９】
と表すことができる。解離定数（ｋｄ）値は以下の方程式から導く：
【０１７０】
【数１５】
2007513631.tif 000018
【０１７１】
解離定数は便利なことに濃度と同じ単位を有するので、これを結合定数の代わりに用いた。
【０１７２】
存在するＡｉの全量を結合しているおよび結合していないＡｉの和として表すと、方程式を以下のように表すことができる：
［Ａi］tot＝［Ａi］＋［ＡiＴ］
［Ａi］＝［Ａi］tot−［ＡiＴ］
代入および再度整理すると、結合しているＡｉの合計の分率を以下のように表すことができる：
【０１７３】
【数１６】
2007513631.tif 000019
【０１７４】
遊離したまたは結合していないＴの濃度（［Ｔ］）が解離定数よりも高い場合、結合した分率が１となることに注目されたい（図９および１０参照）。すなわち、そのｋ値を有するすべてのＡｉが結合されている。たとえば、集合内のすべての結合タンパク質が１〜１０12のすべてのＫ値において等濃度であれば、データは図１０に示すような平らな曲線を生じる。
【０１７５】
しかし、より密に結合するタンパク質を、結合していない標的の濃度［Ｔ］１０-6に達するまで標的リガンドと平衡にすることによって濃縮する場合は、結合しているタンパク質の分布は上に示したようなＳ字型曲線を生じるであろう。
【０１７６】
結合による回収は平衡時における結合していないＴに依存するので、所定の結合していないまたは遊離のＴを得るためにどの程度の全標的を加えるべきかを知ることができれば、便利である。全Ｔは、以下の方程式に示す結合しているおよび結合していないＴの和に等しい：
［Ｔ］total＝［Ｔ］＋Σ［ＴＡi］
［Ｔ］は、試験者が選択する遊離のＴであり、Σ［ＴＡi］は上述のように最初の分布を知ることによって算出される曲線下の量である。多くの場合、曲線より下の面積は選択された［Ｔ］よりも小さく、全Ｔは、遊離のまたは結合していないＴによって近い近似を得ることができる。
【０１７７】
ここで、より現実的な分布を検討されたい。配列が多かれ少なかれランダムであるｍＲＮＡを翻訳することによって配列が多かれ少なかれランダムであるタンパク質を産生し、その後、生じたタンパク質をリガンドに曝した場合、そのリガンドに対するタンパク質集団の親和性分布はどのように見えるだろうか。言い換えれば、濃度対会合定数をプロットした場合、どのような種類の曲線が生じるであろうか。１９６３年のＢｕｒｎｅｔ（１６）の説明、「．．．ほとんどの分子は最小限の吸着親和性を示し、一方、偶発的な結合部位のパターンのみが高い親和性を示す」に従うと予測するであろう。これは、この分布が会合定数の対数二項式であると予測することができると提案している、Ｌａｎｃｅｔ他（１７）によって洗練されている。彼らは、リガンドに由来する免疫グロブリンの集団を用いて、このような分布のパラメータの値を経験的に導いた。彼らは、パラメータの多くの範囲においてこの二項式手法が図１１に示したポアソン分布に近づくことを示した。
【０１７８】
図１２に実証するように、この分布を用いて様々な［Ｔ］値によって結合される曲線のファミリーを見ることができる。
【０１７９】
十分にストリンジェントなまたは高いｐ［Ｔ］値によって、［Ｔ］よりも有意に小さい結合曲線より下の面積が得られ、これにより［Ｔ］を［Ｔ］ｔｏｔの近似として用いることができる。
【０１８０】
最後に、必要なストリンジェンシーを検討しなければならない。解離定数ｋｉおよびｋｊ（ｋｉ＜ｋｊ）を有する２つのタンパク質集団ＡｉおよびＡｊを含む混合物を考える場合、これらはどれだけ良好に分離することができるであろうか。これは、以下の方程式に示すように上記方程式１を両方のタンパク質にあてはめることによって決定することができる：
【０１８１】
【数１７】
2007513631.tif 000020
【０１８２】
２つの式の比をとると：
【０１８３】
【数１８】
2007513631.tif 000021
【０１８４】
簡約化して、
【０１８５】
【数１９】
2007513631.tif 000022
【０１８６】
これにより、開始比および「濃縮係数」と呼ばれる係数に関して、濃縮後の２つの種の比が得られる：
【０１８７】
【数２０】
2007513631.tif 000023
【０１８８】
［Ｔ］がｋ値よりも小さく、その最大がｋｊ／ｋｉである場合に濃縮係数が最大となるが、［Ｔ］がｋ値よりも高い場合、濃縮は行われずに係数は１であることに注目されたい。これは、濃縮する能力はｋ値の比よりも大きくなり得ないことを意味する。
【０１８９】
ここで、親和性結合による分離または精製の実際の例を検討されたい。Ｘｕ他（１８）は、腫瘍壊死因子αに密に結合したタンパク質の単離に１４回の生成をかけた。それらのタンパク質のｋ値は〜１００ｐＭまたは１０-10Ｍであった。最初の分布をＬａｎｃｅｔ（１７）によるポアソン分布によって表した場合、問題は、選択ストリンジェンシーをもっと効率的にできたかどうかということになる。その答えは、できた、である。目標ｋ値よりも小さい［Ｔ］値を用いることによって、図１３に示したように、１４回ではなく４回の選択で、密に結合したタンパク質の高い精製度を成すことができる。
【０１９０】
上記の比較のために、本発明者らは、彼らの公表データから最初の分布を再構築した（不図示）。この例では、少数の高親和性タンパク質をより迅速に単離する方法が与えられている。しかし、多くの用途では結合が高い多数のタンパク質を進化させることが有利である。このような場合、ストリンジェンシーがより低い［Ｔ］値を突然変異ステップと組み合わせて用いる。たとえば、最も高い結合定数を有するタンパク質を選択するのではなく、結合定数が低いタンパク質集団、たとえば示したように赤線の間の結合定数を有するタンパク質を除外することができる。
【０１９１】
所定の分布内で最も高い結合親和性を有する数種のタンパク質を選択するよりも、異なる配列をより多くするためにストリンジェンシーがより低い選択を用い、また、高い結合親和性を有するタンパク質の大集団を進化させるためにストリンジェンシーを徐々に増して複数回の突然変異を用いることができる。
【０１９２】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示し、いかなる様式でも本発明を限定することを意図しない。
【０１９３】
実施例１：ウリジンを用いたＳＡＴＡの生成
当業者は、いくつかの異なる方法でＳＡＴＡを生成することができること理解するであろう。以下の実施例中に記載したプロトコルは、ｔＲＮＡ上にピューロマイシンおよび架橋剤をどちらも有するＳＡＴＡ、またはｔＲＮＡ上にピューロマイシンを有しｍＲＮＡ上に架橋剤を有するＳＡＴＡに用いることができる。架橋剤がｍＲＮＡ上にあるものは、以下の実施例４に指針が提供されている。また、以下のプロトコルは、連結ｔＲＮＡ類似体も好ましい実施形態ではｔＲＮＡ上に架橋剤を有するという意味で、連結ｔＲＮＡ類似体についても指示する。
【０１９４】
たとえば、好ましい実施形態では、３つの断片（図１）を市販源（たとえばＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入した。すべて市販されている、修飾された塩基、及びそれぞれその３’末端にピューロマイシンおよびＰＯ４を事前に結合させた断片３、が含まれる。３つの断片は、モノ付加体の形成において断片２の操作を容易にするために用いた。
【０１９５】
酵母ｔＲＮＡ  Ａｌａまたは酵母ｔＲＮＡ  Ｐｈｅを用いた。しかし、配列は、広く知られているｔＲＮＡから、またはｔＲＮＡ様の構造を形成する配列を選択することによって選択することができる。好ましくは、断片２に対応する部分中に限定数のＵ’しか有さない配列を用いる。ソラレンは優先的に５’ＵＡ３’配列に結合するので、わずかなＵ’しか有さない配列を用いることは必須ではない（本明細書中に参考として組み込まれているＴｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｆ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：１３６３）。しかし、そのような配列を用れば、精製して除去する二重に付加した生成物を減らすことになるだろう。
【０１９６】
断片２は、好ましくは、ソラレンの挿入を誘導するためにら旋構造で用いた。したがって、相補鎖が必要であった。ＲＮＡまたはＤＮＡを用い、モノ付加体の形成が成されたあとの分離および除去を容易にするために、配列、たとえば一方または両方の末端へのポリＣなど、を付加した。
【０１９７】
断片２およびｃＲＮＡを５０ｍＭの緩衝ＮａＣｌ溶液中で混合した。Ｔｍは濃色変化によって測定した。２つの分子を再度アニーリングさせ、選択されたソラレンと共に、Ｔｍよりも約１０℃低い温度で１時間インキュベーションした。ソラレンは用いた配列に基づいて選択した。より高い配列ストリンジェンシーを有するが補充する必要があるかもしれない、８ＭＯＰなどの比較的不溶性のソラレンが選択される可能性がある。ＡＭＴなどのより可溶性のあるソラレンは、ストリンジェンシーが低いが、ほとんどの部位を埋める。好ましくは、ＨＭＴを用いる。より多くの非標的物Ｕ’を含む断片２を選択した場合は、より高いストリンジェンシーが所望される。温度の低下、またはＭｇ＋＋を加えることによるイオン強度の上昇も、ストリンジェンシーを高めるために用いた。好ましい実施形態では、ＭＧ＋＋を除き、〜４００ｍＭのＮａＣｌ溶液を用いた。
【０１９８】
インキュベーションの後、ソラレンに約４００ｎｍよりも高い波長を照射した。照射は選択した波長および用いたソラレンに依存する。たとえば、ＨＭＴでは、好ましくは約４１９ｎｍ、２０〜１５０Ｊ／ｃｍ２を用いた。この過程は、ほぼ全部がフラン側鎖のモノ付加体をもたらす。
【０１９９】
モノ付加体の精製
その後、本明細書中に参考として組み込まれているＳａｓｔｒｙ他、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．、１４：６５〜７９に記載のＨＰＬＣによってモノ付加体を精製した。一般に２５量体以上のモノ付加体の精製は困難であるので、断片２が断片３から分離されることにより精製ステップが容易となった（本明細書中に参考として組み込まれているＳｐｉｅｌｍａｎｎ他、ＰＮＡＳ、８９：４５１４〜４５１８）。
【０２００】
断片２および３のライゲーション
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて断片２を断片３にライゲーションさせた。３’末端のピューロマイシンは保護基として役割を果たした。これは、本明細書中に参考として組み込まれているＲｏｍａｎｉｕｋおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００：５２〜５９（１９８３）のように行う。断片２＋３と断片１の３’末端との結合は、本明細書中に参考として組み込まれているＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：２７０５〜２７１２（１９８５）に記載の方法に従って行った。断片２＋３をポリヌクレオチドキナーゼによって５’リン酸化し、２つの半分子のアニーリングを行った。
【０２０１】
代替方法では、フラン側鎖のモノ付加体としたＵの有意量は、ポリＵＡをそれ自体にハイブリダイズさせて上述のように照射することによって形成した。その後、ポリＵＡを酵素消化して保護されているフラン側鎖のＵを得、ヌクレオシドホスホラミダイト方法によってｔＲＮＡ類似体内に組み込んだ。ソラレンモノ付加体を形成する他の方法には、すべて本明細書中に参考として組み込まれているＧａｍｐｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７：３４９（１９８７）；Ｇａｍｐｅｒ他、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４０：２９、１９８４；Ｓａｓｔｒｙ他、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．、１４：６５〜７９；Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ他、ＰＮＡＳ、８９：４５１４〜４５１８、米国特許第４，５９９，３０３号に記載の方法が含まれる。
【０２０２】
上述の方法によって生成したＳＡＴＡはＵＡＧ（アンチコドンＣＵＡ）を読み取る。さらに、ＵＡＡまたはＵＧＡも用いた。様々な実施形態では、「連結コドン」として選択されたストップコドンを有する任意のメッセージを用いた。
ソラレン化したフラン側鎖のモノ付加体の生成
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＵＶ露光
いずれも５０ｍＭのＮａＣｌを含む、等体積の３ｎｇ／ｍｌのＲＮＡ：ｃＲＮＡハイブリッドセグメントおよび１０μｇ／ｍｌのＨＭＴを新しい１．５ｍｌのキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移し、３７℃で３０分間、暗所でインキュベーションした。その後、これを新しい清浄な培養皿に移した。これを、照射量が〜６．５ｍＷ／ｃｍ２であるように約１２．５ｃｍの距離で光化学反応器（４１９ｎｍのピーク、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏ．）内に配置し、６０〜１２０分間照射した。
【０２０３】
低分子量の原産物（Ｐｒｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔ）の除去
１００μｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）をピペットで入れ、渦攪拌によって混合した。混合物をマイクロ遠心チューブ中で、５分間、１５０００×ｇで遠心分離した。クロロホルム−イソアミルアルコール層をマイクロピペットで除去した。クロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出を再度繰り返した。清浄なＲＮＡが溶液から沈殿した。
【０２０４】
アルコール沈殿
２倍体積（〜１０００μｌ）氷冷無水エタノールを混合物に加えた。チューブを１５分間、１５，０００×ｇで、マイクロ遠心機内で遠心分離した。上清をデカンテーションして廃棄し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣで処理した水に溶かし、その後、再度ＲＮＡ＋８−ＭＯＰに曝した。
【０２０５】
ＨＰＬＣを用いたソラレン化したＲＮＡ断片の単離
すべての成分、ガラス器具および試薬は、ＲＮＡａｓｅを含まないように調製した。ＨＰＬＣはＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡ  ＰＡ−１００パッケージカラムを用いてセットアップした。ソラレン化したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを４℃まで暖めた。ソラレン化したＲＮＡをＨＰＬＣにかけ、次いで「ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド解析」という表題の以下のセクションに記載のように、オリゴヌクレオチド解析を行った。採取された画分は以下を表した：
・５’ＣＵＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’（ここで、Ψは疑似ウリジンである）（配列番号１）
・フラン側鎖の５’ＣＵソラレンＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’モノ付加体（配列番号２）
・５’ＸＸＸＸＸＣＣＵＣＣＡＧＡＵＣＵＡＧＸＸＸＸＸ３’（配列番号３）
・５’ＸＸＸＸＸＣＣＵＣＣＡＧＡＵＣＵソラレンＡＧＸＸＸＸＸ３’（配列番号４）
画分を新しい、ＲＮＡａｓｅを含まないスナップ付マイクロ遠心チューブ中に４℃で貯蔵し、４週間を超える貯蔵が必要な場合は−２０℃で貯蔵した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いた、ＨＰＬＣによって採取された各ピーク画分に表されるＲＮＡ断片の同定
電気泳動ユニットを４℃の冷蔵庫内にセットアップした。２ｍｍのスペーサーを有するゲルを選択した。各ＨＰＬＣ画分の５μｌをローディングバッファーで１０μｌまで希釈した。１０μｌの各希釈した画分を適切に標識した試料ウェルに載せた。追跡用色素を別のレーンに載せ、「ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動を行った。電気泳動の実行が完了したあと、追跡用色素がゲルの端に達したら電気泳動を停止した。装置を解体した。ゲル−ガラスパネルのユニットをＵＶ光ボックス上に置いた。ＵＶ光を点けた。ＲＮＡのバンドを同定した。バンドはＵＶ光条件下でより濃い影として現れた。
【０２０６】
ゲルからのＲＮＡの抽出
各バンドを殺菌され、ＲＮＡａｓｅを含まない新しいメスの刃を用いて切り出し、新しい１．５ｍｌのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。１．０ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも２４時間、４℃で溶出させた。マイクロピペットを用いて溶出液を新しい０．５ｍｌのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移した。各チューブに新しいＲＮＡａｓｅを含まないピペットチップを用い、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。
【０２０７】
エタノール沈殿
２倍体積の氷冷エタノールを各溶出液に加え、マイクロ遠心機内で、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を排出し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣで処理した脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは必要時まで４℃でマイクロ遠心チューブに貯蔵した。貯蔵が２週間を超える場合、チューブは２−０℃で貯蔵した。以下が、各断片の移動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：
・５’ＣＵＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’（配列番号１）
・フラン側鎖の５’ＣＵソラレンＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’モノ付加体（配列番号２）
・５’ＸＸＸＸＸＣＣＵＣＣＡＧＡＵＣＵＡＧＸＸＸＸＸ３’（配列番号３）
・５’ＸＸＸＸＸＣＣＵＣＣＡＧＡＵＣＵソラレンＡＧＸＸＸＸＸ３’（配列番号４）
各画分の残りを含むチューブを標識し、−２０℃で貯蔵した。
【０２０８】
エタノール沈殿
ＲＮＡオリゴヌクレオチド断片を沈殿させ、ＲＮａｓｅの痕跡をすべて取り除くために、すべてのガラス器具を「装置上、消耗品上、および液剤中のＲＮａｓｅの不活性化」という表題の以下のセクションに記載のように清浄にした。すべての溶液はＲＮＡａｓｅを含まないガラス器具中で貯蔵し、ヌクレアーゼの導入が防がれた。無水エタノールは使用時まで０℃で貯蔵した。マイクロピペットを用いて、２倍体積の氷冷エタノールをマイクロ遠心チューブ内で沈殿させる核酸に加えた。キャップ付マイクロ遠心チューブをマイクロ遠心器内に入れ、１５，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿したＲＮＡを再度ＤＥＰＣで処理した脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは使用の準備ができるまでマイクロ遠心チューブ中に４℃で貯蔵した。
【０２０９】
ＲＮＡ断片２および３のライゲーション
ＲＮａｓｅの痕跡をすべて取り除くために、すべてのガラス器具を「装置上、消耗品上、および液剤中のＲＮａｓｅの不活性化」という表題の以下のセクションに記載のように清浄にした。１００〜１０００μｌのピペットを用いて以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加え、各溶液に新しい殺菌されたピペットチップを用いた：
断片２（３．０ｎＭ）                        １２５．０μｌ
断片３（３．０ｎＭ）                        １２５．０μｌ
反応バッファー                              ２５０．０μｌ
ＲＮＡ  Ｔ４リガーゼ（９〜１２Ｕ／ｍｌ）          ４２μｌ
反応バッファー
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水              ９０．００ｍｌ
トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）                      ０．７９ｇ
ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）                          ０．２０ｇ
ＤＴＴ（５ｍＭ）                              ０．０７８ｇ
ＡＴＰ（１ｍＭ）                                ０．５５ｇ
ＨＣＬを用いて、ｐＨは７．８
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水      ＱＳは１００．００ｍｌ
混合物を穏やかに混合し、混合物を温度制御した冷蔵チャンバ内で、１６℃で１時間インキュベートすることによってＲＮＡを融解させた。インキュベーション完了後、ＲＮＡをすぐに溶液から沈殿させた。
【０２１０】
アルコール沈殿
２倍体積（〜１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠心チューブを１５，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカンテーションして廃棄し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣで処理した水に溶かした。混合物を「ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各断片の移動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：
ａ）断片２
５’ＣＵＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’−ＯＨソラレン（配列番号５）
ｂ）断片３
５’ＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣ−ピューロマイシン（配列番号６）
ｃ）断片２＋３
ソラレン７５’ＣＵソラレンＡＧＡＹＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣピューロマイシン（配列番号７）
各画分をＵＶシャドーイングによって単離し、バンドを切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出させ、ＲＮＡ溶出液を「ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように沈殿させた。残留のライゲーションしていない断片２および３の画分すべてを用いてライゲーション手順を繰り返した。ライゲーションした画分２および３をプールし、少ない体積のＲＮａｓｅを含まない脱イオン水に４℃で貯蔵した。
ＲＮＡ断片１と断片２＋３とのライゲーション
ＲＮａｓｅの痕跡をすべて取り除くために、すべてのガラス器具を「装置上、消耗品上、および液剤中のＲＮａｓｅの不活性化」という表題の以下のセクションに記載のように清浄にした。以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加えた。各溶液に１００〜１０００μｌのピペットおよび新しいチップを用いた：
断片２＋３（３．０ｎＭ）                    １２５．０μｌ
反応バッファー                              ２５０．０μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（５〜１０Ｕ／ｍｌ）    １．７μｌ
反応バッファー
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水              ９０．００ｍｌ
トリス−ＨＣｌ（４０ｍＭ）                      ０．６３ｇ
ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）                          ０．２０ｇ
ＤＴＴ（５ｍＭ）                                ０．０８ｇ
ＡＴＰ（１ｍＭ）                              ０．００６ｇ
ＨＣＬを用いて、ｐＨは７．８
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水          ＱＳは１００．００ｍｌ
ＲＮＡを穏やかに混合し、その後、加熱ブロック内で、混合物を７０℃まで５分間加熱し、融解した。混合物を２時間かけて室温まで冷却し、ＲＮＡをｔＲＮＡの立体配置でアニーリングさせた。ＲＮＡを溶液から沈殿させた。
【０２１１】
アルコール沈殿
２倍体積（〜１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠心チューブを１５，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカンテーションして廃棄し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣで処理した水に溶かした。混合物を「ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各断片の移動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：
ａ）断片１
５’ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵ３’（配列番号８）
ｂ）断片２＋３
ソラレン
５’ＣＵソラレンＡＧＡＹＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣピューロマイシン（配列番号６）
ｃ）断片１＋２＋３
ソラレン
５’ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＵソラレンＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣピューロマイシン（配列番号９）
各画分をＵＶシャドーイングによって単離し、バンドを切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出させ、ＲＮＡ溶出液を「ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように沈殿させた。ライゲーションしていない断片１および２＋３画分を用いてライゲーション手順を繰り返した。ライゲーションした画分２＋３をプールし、少ない体積のＲＮａｓｅを含まない脱イオン水に４℃で貯蔵した。
【０２１２】
最終ＲＮＡライゲーション
以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加えた。各溶液に１００〜１０００μｌのピペットおよび新しいチップを用いた：
断片１＋２＋３（３．０ｎＭ）                ２５０μｌ
反応バッファー                              ２５０μｌ
ＲＮＡ  Ｔ４リガーゼ（４４μｇ／ｍｌ）        ２２μｇ
混合物を温度制御した冷蔵庫内で、１７℃で４．７時間インキュベーションした。インキュベーションの直後、上記ステップ６．２に記載のようにｔＲＮＡを沈殿させ、「ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載したように電気泳動によってｔＲＮＡを単離した。ｔＲＮＡを少ない体積のＲＮａｓｅを含まない水にプールし、２週間までは４℃で、または２週間より長い期間は−２０℃で貯蔵した。
ソラレン化したＲＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
アクリルアミドゲルの調製
すべての試薬およびガラス器具は、「装置上、消耗品上、および液剤中のＲＮａｓｅの不活性化」という表題の以下のセクションに記載のようにＲＮＡａｓｅを含まないようにした。ゲル装置を組み立てて厚さ４ｍｍの２０ｃｍ×４２ｃｍの四角いゲルを生成した。ＲＮＡａｓｅを含まない厚肉エルレンマイヤーフラスコ内で、２９部のアクリルアミドおよび１部のアンモニウム架橋剤と適切な量のアクリルアミド溶液とを室温で混合した。
【０２１３】
アクリルアミド溶液
尿素（７Ｍ）                                ４２０．４２ｇ
ＴＢＥ（１×）                              １ＬまでＱＳ
５×ＴＢＥ
０．４５５Ｍ  トリス−ＨＣｌ                ５３．９ｇ
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ                          ０．５Ｍを２０ｍｌ
ＲＮＡａｓｅを含まない脱イオン水            ９００ｍｌ
ｐＨはホウ酸を用いて                        ｐＨ９
ＱＳはＲＮＡａｓｅを含まない脱イオン水で    １Ｌ
混合物を真空圧で１分間脱気した。適切な量のＴＥＭＥＤを加え、穏やかに混合し、その後、ゲル混合物をガラスプレートの間に上部から０．５ｃｍ以内まで注いだ。すぐにガラスシートの間のゲル混合物内に櫛を挿入した。ＲＮＡａｓｅを含まないゲル用櫛を用いた。櫛により、５ｍｍ幅の色素レーンおよび１３５ｍｍの試料レーン用のウェルが生じた。ゲルを約３０〜４０分間重合させ、その後、注意しながら櫛を取り外した。新しいピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて試料ウェルをランニングバッファーですすいだ。その後、ウェルにランニングバッファーを満たした。
【０２１４】
試料の調製
試料のアリコートをスナップキャップ付マイクロ遠心チューブ中のローディングバッファーに懸濁させ、ボルテックスした。指示色素は試料に加えなかった。
【０２１５】
ローディングバッファー
尿素（７Ｍ）                                ４２０．４２ｇ
トリスＨＣｌ（５０ｍＭ）                        ７．８５ｇ
ＱＳはＲＮＡａｓｅを含まないＤ−Ｈ２Ｏで              １Ｌ
電気泳動の実行
最大体積のＲＮＡ／ローディングバッファー溶液を１３５ｍｍの試料ウェルに載せ、適切な体積の追跡用色素を５ｍｍの追跡用レーンに載せた。試料は５℃の冷蔵庫で電気泳動した。追跡用色素がゲルの端に達したら電気泳動を停止した。その後、装置を解体した。ガラスパネルはゲルから外さなかった。ゲル−ガラスパネルのユニットをＵＶ光ボックス上に置いた。ＵＶフィルタリングゴーグルを装着してＵＶ光を点けた。ＲＮＡのバンドを同定した。バンドはＵＶ光条件下でより濃い影として現れた。ＲＮＡをゲルから抽出した。各バンドを新しい無菌的かつＲＮＡａｓｅを含まないメスの刃を用いて切り出し、各バンドを新しい１．５ｍｌのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。１．０ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも２４時間、４℃で溶出させた。各チューブに新しいＲＮＡａｓｅを含まないピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて、溶出液を新しい０．５ｍｌのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移した。２倍体積の氷冷エタノールを各溶出液に加え、マイクロ遠心分離器内で、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣで処理した脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは必要時までマイクロ遠心チューブに４℃で貯蔵した。
【０２１６】
ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド解析
ＲＮＡオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行った。２’−保護または２’−脱保護の型のクロマトグラフィーのいずれも行い得る。２’−保護の型により、二次構造効果を最小限にし、ヌクレアーゼ耐性をもたらすという利点が提供された。ＲＮＡが完全に脱保護されていた場合は、精製中に無菌的な条件が必要であった。
【０２１７】
当業者は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを精製するために実施例２のＨＰＬＣ精製方法を改変し得ることを理解するであろう。ＨＰＬＣ勾配、温度、および他のパラメータを含めた実施例２のＨＰＬＣ精製方法の改変が必要であり得る。当業者はまた、１ステップのＨＰＬＣ精製方法も本発明のいくつかの実施形態に従って用い得ることを理解するであろう。
装置上、消耗品上、および液剤中のＲＮａｓｅの不活性化
ガラス器具は、１８０℃で少なくとも８時間ベーキングすることによって処理した。プラスチック器具は、クロロホルムですすぐことによって処理した。あるいは、すべてのものを０．１％のＤＥＰＣに浸した。
【０２１８】
０．１％のＤＥＰＣを用いた処理
０．１％のＤＥＰＣを調製した。脱イオン水を０．２μＭの膜フィルターで濾過した。水を１５ｐｓｉで１５分間、液体サイクルでオートクレーブした。１．０ｇ（ｗｔ／ｖ）のＤＥＰＣ／１リットルの無菌的な濾過水を加えた。
【０２１９】
ガラス器具およびプラスチック器具
すべてのガラス器具およびプラスチック器具は、２時間、３７℃で０．１％のＤＥＰＣに浸した。ガラス器具を無菌的な脱イオン水で少なくとも５回すすいだ。ガラス器具を１００℃まで１５分間加熱するか、または１５分間１５ｐｓｉで、液体サイクルでオートクレーブした。
ＲＮＡの電気泳動に用いる電気泳動タンク
タンクを洗剤で洗浄し、水、次いでエタノールですすぎ、空気乾燥させた。タンクに３％（ｖ／ｖ）の過酸化水素（３０ｍｌ／Ｌ）を満たし、１０分間室温で静置した。タンクをＤＥＰＣで処理した水で少なくとも５回すすいだ。
【０２２０】
溶液
すべての溶液は、Ｒｎａｓｅを含まないガラス器具、プラスチック器具、オートクレーブした水、ＲＮＡとの作業のために確保されている化学薬品、およびＲＮａｓｅを含まないヘラを用いて作製した。使い捨ての手袋を用いた。可能な場合は、溶液を０．１％のＤＥＰＣで少なくとも１２時間、３７℃で処理し、その後、１００℃まで１５分間加熱するか、または１５分間１５ｐｓｉで、液体サイクルでオートクレーブした。
【０２２１】
ＲＮＡの翻訳
２０μｌ／ｍｌの濃度の腸阻害ペプチド（ＧＩＰ）ｍＲＮＡ、２μｌを、２５０μｌのスナップキャップポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れた。３５μｌのウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）を加えた。メチオニンを含まないアミノ酸混合物（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）を１μｌ加えた。35Ｓメチオニンまたは非標識のメチオニンを１μｌ加えた。32Ｐ  ＧＩＰのｍＲＮＡまたは非標識のＧＩＰのｍＲＮＡを２μｌ加えた。任意選択で、対照として役割を果たすために２ｍｌのルシフェラーゼを一部のチューブに加えてもよい。好ましい実施形態では、ＧＩＰのｍＲＮＡの代わりにルシフェラーゼを用いた。当業者は、実際、適切な配列を含む任意のｍＲＮＡ断片を用い得ることを理解するであろう。
【０２２２】
ＳＡＴＡを実験チューブに加えた。ＳＡＴＡを含まない対照チューブも調製した。用いたＳＡＴＡの量は、約０．１μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．５μｇ〜５０μｇであった。４０単位／ｍｌのＲｎａｓｉｎを１μｌ加えた。ヌクレアーゼを含まない水を加えて全体積を５０μｌとした。
【０２２３】
約１５０個を超えるアミノ酸のタンパク質では、ｔＲＮＡの量を補充する必要があり得る。たとえば、約１０〜２００μｇのｔＲＮＡを加えてもよい。一般に、ＳＡＴＡの量は、ストップコドンまたは疑似ストップコドンを有効に抑制するのに十分高くあるべきである。天然ｔＲＮＡの量は、伸長因子の作用下で動的なプルーフリーディングを受けないＳＡＴＡとの競合に勝つのに十分高くなければならない。
【０２２４】
各チューブは、すぐにキャップを締め、パラフィルム処理し、翻訳反応のために３０℃で９０分間インキュベーションした。各反応チューブの内容物を毛細作用によって５０μｌの石英の毛細管に移した。Ｇａｓｐａｒｒｏ他（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：１００７（１９９３）、本明細書中に参考として組み込まれている）に記載のように、各チューブの内容物に２〜１０Ｊ／ｃｍ２、〜３５０ｎｍの波長の光を照射することによって、ＳＡＴＡをｍＲＮＡと架橋結合させた。光架橋結合ののち、各チューブの内容物を新しいスナップキャップマイクロ遠心チューブに移した。２μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを各チューブに加えることによってカルシウム陽イオンをキレート化することによって、リボソームを解離させた。各ステップの間に、各成分を加えた際にピペットチップで攪拌することによって各チューブを穏やかに混合した。
【０２２５】
最終的な実験を行う前に翻訳に最適なＲＮＡを決定した。ｍＲＮＡの最適濃度を見つけるためには、５〜２０μｇ／ｍｌの段階希釈を要してもよい。
【０２２６】
【表２】
2007513631.tif 000024
【０２２７】
上述のように、各試料でＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を行った。本明細書中に参考として組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載のように、ゲルのオートラジオグラフィーを行った。
【０２２８】
上記実施例は、ＳＡＴＡ（たとえばｔＲＮＡ上のピューロマイシン＋ｔＲＮＡ上の架橋剤）の生成および使用、ならびに連結ｔＲＮＡ類似体（たとえばピューロマイシンを有さないがｔＲＮＡ上に架橋剤を有する）の生成および使用を教示している。
【０２２９】
別の実施例では、ウリジンを疑似ウリジンで置き換えた以外は上記方法と同様の方法によってＳＡＴＡを生成した。疑似ウリジンによる置き換えは、架橋剤モノ付加体の形成の形成（ソラレンモノ付加体の形成など）を容易にするので、連結ｔＲＮＡ類似体でも用いることができる。この技術は以下の実施例２に記載する。
【０２３０】
実施例２：疑似ウリジンを用いたＳＡＴＡの生成
上述のように、当業者は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを多くの異なる方法によって生成することができることを理解するであろう。図５はウリジンおよび疑似ウリジンの化学構造を示す。疑似ウリジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である５−６二重結合を欠く、ｔＲＮＡ中に見つかる天然に存在する塩基である。本明細書中で用いる疑似ウリジンには、天然に存在する塩基および任意の合成類似体または修飾体が含まれる。好ましい実施形態では、疑似ウリジンを用いてＳＡＴＡを生成した。連結ｔＲＮＡ類似体も疑似ウリジンを用いて生成することができる。具体的には、好ましい実施形態では、３つの断片（図１）を市販源（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入した。それぞれの３’末端にピューロマイシンおよびＰＯ4を事前に結合させた、修飾された塩基および断片３（「断片３」）が含まれ、これらはすべて市販されている。３つの断片は、モノ付加体の形成において断片２（「断片２」）の操作を容易にするために用いた。一部の実施形態によれば、３つの断片の配列は以下のとおりである（各断片に２つずつの配列例を提供する）：
断片１
５’ＰＯ4ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＯＨ３’（配列番号１０）
５’ＰＯ4ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＯＨ３’（配列番号１６）
断片２
５’ＯＨΨＣＵＡＡＣΨＣＯＨ３’（配列番号１１）
５’ＯＨΨＣＵＡＡＡΨＣＯＨ３’（配列番号１７）
断片３
５’ＰＯ4ＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣピューロマイシン３’（配列番号１２）
５’ＰＯ4ＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣピューロマイシン３’（配列番号１８）
断片３に記載した上記配列はＳＡＴＡに適用可能である。連結ｔＲＮＡ類似体では、ピューロマイシンがアデノシンで置き換えられる以外は配列は類似している。
【０２３１】
修飾された酵母ｔＲＮＡ  Ａｌａまたは酵母ｔＲＮＡ  Ｐｈｅを本発明の一実施形態に従って用いた。しかし、当業者は、配列は、知られているｔＲＮＡから、またはｔＲＮＡ様の構造を形成する配列を選択することによって、広く選択することができることを理解するであろう。一部の実施形態において疑似ウリジンを用いる利点の１つは、断片２中に疑似ウリジンがあることで、非標的物Ｕ’のソラレンの標識化が回避されることである。ウリジンの代わりに疑似ウリジンを用いることにより、ｔＲＮＡ類似体に対するリボソームのＡ部位の結合力が減少するが、末端ウリジンとソラレンとの相互作用が排除される。Ｙａｒｕｓの「延長アンチコドン」の指針を用いることによりＡ部位の結合が増加する（本明細書中に参考として組み込まれているＹａｒｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６４６〜６５２、１９８２）。
【０２３２】
一実施形態では、ソラレンの挿入を誘導するために断片２をヘリックスコンホメーションで用いる。当業者は、本発明のいくつかの実施形態に従って他のコンホメーションも用いることができることを理解するであろう。相補鎖も用いた。ＲＮＡまたはＤＮＡを用い、また、モノ付加体の形成が成されたあとの分離および除去を容易にするために、Ｃがソラレンと相互作用する場合にポリＣまたはポリＧなどの配列を一方または両方の末端に付加した。相補体中でウリジンの代わりに疑似ウリジンを用いることにより、生成物の架橋結合を懸念せずに約３６５ｎｍなどの高効率の波長を用いることが可能となった。照射は好ましくは約３００〜４５０ｎｍの範囲、より好ましくは約３２０〜４００ｎｍの範囲、最も好ましくは約３６５ｎｍであった。さらに、Ｍａｆが架橋結合形成の主な第１のステップであるので、疑似ウリジンを使用することによりフラン側鎖のモノ付加体が断片２上の適所に配置された。
【０２３３】
疑似ウリジンを有する以下のｃＲＮＡ配列を本発明の好ましい実施形態に従って用いた。当業者は、これらの配列および本明細書中に記載の他の配列の置換体ならびに修飾体も、本発明のいくつかの実施形態に従って用いることができることを理解するであろう。たとえば以下に記載の配列番号１９では、配列は以下のものであることもできる。
５’ＸＸＸＸＸＸＧＡΨΨΨＡＧＡＸＸＸＸＸＸＸ３’（配列番号３０）：
ＣＣＣΨＣＣＡＧＡＧΨΨＡＧＡＣＣＣ（配列番号１３）
５’ＣＣＣＣＣＣＧＡΨΨΨＡＧＡＣＣＣＣＣＣＣ３’（配列番号１９）
ステップ１：断片２へのソラレンのフラン側鎖のモノ付加体
断片２の標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成を以下のように行った。
反応バッファーを以下のように調製した：
トリスＨＣＬ                              ２５ｍＭ
ＮａＣｌ                                １００ｍＭ
ＥＤＴＡ                              ０．３２ｍＭ
ｐＨ                                        ７．０
その後、４’ヒドロキシメチル−４，５’，８’−トリエチルソラレン（ＨＭＴ）を最終濃度０．３２ｍＭまで加え、等モル量の断片２およびｃＲＮＡを断片２：ｃＲＮＡ：ソラレンの最終モル比＝１：１：１０００まで加えた。合計１００μｌの体積を一度に照射した。
【０２３４】
相補的オリゴ、ＨＭＴ、ソラレンの混合物を以下のように処理した：
１）ＰＣＲサーモサイクラーを用いて、８５℃まで６０秒間加熱し、次いで４℃まで１５分間かけて冷却した。
【０２３５】
２）エッペンドルフＵＶｅｔｔｅプラスチックキュベット内で２０分間、４℃で照射し、上部をパラフィルムで覆い、ＵＶランプの上に置いた（１ｍＷ／ｃｍ2多波長ＵＶランプ（λ＞３００ｎｍ）（ＵＶ  Ｌ２１モデルλ３６５ｎｍ）。
【０２３６】
ＨＭＴを再挿入および照射するために上記ステップ１および２を４回繰り返した。第２の照射後、さらに１０μｌの１．６ｍＭのＨＭＴを加えて、合計１００μｌの反応体積とした。４サイクルの照射後、遊離ソラレンをクロロホルムで抽出し、すべてのオリゴ（標識したものおよび未標識のもの）をエタノールで終夜沈殿させた（沈殿ステップを参照）。少量のアリコートをゲルの同定用に保存した。
【０２３７】
ステップ２：ＨＰＬＣによるＨＭＴとコンジュゲートした断片２（２ＭＡ）オリゴの精製
１）反応混合物を高速真空（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃｕｕｍ）で１０分間乾燥させ、その後、２μｌの０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の緩衝液に溶かした。
０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の緩衝液
酢酸                                  ５．６ｍｌ
トリエチルアミン                  １３．８６ｍｌ
Ｈ2Ｏ（ＲＮＡａｓｅを含まない）        ９５０ｍｌ
酢酸でｐＨ７．０に調製
１Ｌまで水を加えた
２）試料を、バッファーＡ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０中５％ｗｔ／ｗｔのアセトニトリル）で事前に平衡化したＷａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８、２．５μｍ、４．５×５０ｍｍの逆相カラムに載せた。試料は、バッファーＡに対して０〜５５％のバッファーＢ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０中１５％ｗｔ／ｗｔのアセトニトリル）の勾配で、３５分間の時間フレームをかけて、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。カラム温度は６０℃であり、狭帯域フィルターによって設定した検出波長は３４０ｎｍであった。フラン側鎖のソラレンモノ付加体は３４０ｎｍで吸収するが、ＲＮＡおよび任意のピロン側鎖のモノ付加体は吸収しない。緩衝溶液は使用前に濾過および脱気した。
【０２３８】
２ＭＡは約２５〜２８分で、バッファーＢの濃度４０％により溶出された。後の採取した画分のゲル電気泳動分析に基づくと、ソラレン化していない断片２は８分間より前に溶出された。
【０２３９】
カラムを１００％のアセトニトリルで５分間洗浄し、バッファーＡで１５分間、再度平衡化した。すべての画分を高速真空で終夜乾燥させた。
【０２４０】
２ＭＡを含む画分は、２６０ｎｍ（ＲＮＡ）および３３０ｎｍ（フラン側鎖のソラレンモノ付加体としたＲＮＡ）での吸光レベルによって同定した。これは、乾燥した画分を再度１２０μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に溶かし、分光光度計を用いて２６０ｎｍおよび３３０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。両方の波長で吸光度の高い画分をプールし、その後、高速真空で乾燥させた。各画分からの少量のアリコートをゲル分析用に保存した。
【０２４１】
架橋結合した生成物を変性２０％ＴＢＥ−尿素ゲルで分析し、ゲルの銀染色によって可視化した。
【０２４２】
ステップ３：ＨＰＬＣによるＨＭＴとコンジュゲートした、ｃＲＮＡからの断片２オリゴの精製
乾燥した試料をプールし、その後、０．５×ＴＥ緩衝液に溶かした。約０．４吸光単位の試料を、バッファーＣ（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で事前に平衡化したＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）カラムに載せ、カラム温度は８５℃であった（陰イオン交換ＨＰＬＣ）。
【０２４３】
オリゴを１ｍｌ／分の流速で、４％〜５５％のバッファーＤの凹型（ｃｏｎｃａｖｅ）勾配で１５分間、次いで次の１５分間は５５％〜８０％のバッファーＤの凸型（ｃｏｎｖｅｘ）勾配で溶出させた。オリゴを１００％のバッファーＤで５分間および１００％のバッファーＣでさらに５分間、１．５ｍｌ／分の流速で洗浄した。２６０ｎｍの光を吸収した画分を採取した。２ＭＡの保持時間（ＲＴ）は１６．２分であり、５７％のバッファーＤによって溶出され、遊離断片２のＲＴは１６．６分未満であり、５５％のバッファーＤによって溶出され、遊離ｃＲＮＡのＲＴは１９．２分を超えていた。２５４または２６０ｎｍで吸光した画分を採取した。採取した画分を高速真空で終夜乾燥させた。すべての溶液は使用前に濾過および脱気した。
【０２４４】
用いた溶液は以下を含んでいた：
Ｃ：２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；
Ｄ：２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０の緩衝液中２５０ｍＭのＮａＣｌＯ４。
ＴＥ：１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭのＥＤＴＡ
ステップ４：精製した２ＭＡオリゴの脱塩、沈殿および採取
乾燥した画分を再度１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に溶かした。０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、混合物を手短にボルテックスした。その後、混合物を６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０℃で終夜貯蔵した。
【０２４５】
その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機内で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位置に注意し、上清をデカンテーションするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。ペレットが依然として塩を含んでいた場合は、このステップを繰り返した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。濡れたペレットを高速真空で１５分間乾燥させた。尿素ＰＡＧＥゲルにより、次のステップ用の正しい画分を同定した。
【０２４６】
ステップ５：２ＭＡオリゴの断片３オリゴへのライゲーション
以下のステップを行った。
【０２４７】
Ａ．以下の試薬および器具を用いた：
ヌクレアーゼを含まない水（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）４０％（水中のｗｔ／ｗｔ）
ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）
フェノール：クロロホルム
無菌的な１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ
１００％のエタノール
７０％のエタノール
ドライアイスまたは−２０℃の冷凍庫
室温および＋４℃のマイクロ遠心機
ＰＣＲサーモサイクラーまたは水浴
Ｂ．以下の反応条件を用いた：
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）
１０ｍＭのＭｇＣｌ２、
１０ｍＭのＤＴＴ
１ｍＭのＡＴＰ
１８〜２０％のＰＥＧ
Ｃ．以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築した：
断片３（ドナー）１μｌ（６μｇ）（必要な場合は、ドナーとして用いる前に精製した）２ＭＡ（アクセプター）１μｌ（１．５μｇ）。
【０２４８】
８μｌのＲｎａｓｅを含まないｄＨ２Ｏを８μｌ加えたあと、オリゴ二次構造を緩めるために反応物を８５℃で１分間インキュベーションし、その後、ＰＣＲ機械サーモサイクラーを用いて４℃までゆっくりと冷やした。冷蔵するために事前に加熱したチューブを氷上に置き、手短に遠心分離し、その後、以下のものを加えた：
１０×リガーゼ緩衝液                            ４μｌ
１０ｍＭのＡＴＰ                                ４μｌ
Ｒｎａｓｅ  ＯｕｔまたはＲｎａｓｉｎ（４０単位／μｌ）Ｐｒｏｍｅｇａ
０．５μｌ
ＰＥＧ、４０％（Ｓｉｇｍａ）                  ２０μｌ
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（１０単位／μｌ）（ＮＥＢ）  １μｌ
ヌクレアーゼを含まない水を最終体積４０μｌまで加えた。混合物を１６℃で終夜（１６時間）インキュベートした。混合物を手短に遠心分離し、その後、氷上に置いた。
【０２４９】
Ｄ．オリゴヌクレオチドの沈殿：
６０μｌのＤＥＰＣ  ＲＮａｓｅを含まない蒸留水を混合物に加え、その後、１５０μｌのフェノール／クロロホルムを加えた。混合物を３０秒間激しくボルテックスした。その後、沈殿物をマイクロ遠心分離機内で、最大速度で５分間、室温で遠心分離して除去した。水相を新しいマイクロ遠心チューブに移した（＞９５μｌ）。
【０２５０】
これに、３μｌの５ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン、および０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む５００μｌの事前に冷やした１００％のエタノールを加え、混合物を手短にボルテックスし、その後、６０分間ドライアイス上で凍結させた。この時点で、これを終夜−２０℃で貯蔵してもよい。乾燥した画分を再度１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に溶かし、０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、手短にボルテックスした。その後、これを６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０Ｃで終夜貯蔵した。その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機内で、最大速度で１５分間遠心分離し、上清をピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。ペレットが依然として塩を含んでいた場合は、このステップを１回繰り返した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールで数回洗浄した。その後、これをマイクロ遠心機内で、最大速度で５分間、４Ｃで遠心分離した。ピペットを用いてエタノールを丁寧に取り除いた。残ったエタノールを採取するために遠心分離を再度繰り返し、丁寧に取り除いた。濡れたペレットを高速真空で１０分間乾燥させた。少量のアリコートをゲル分析用に採取した。長期間の貯蔵には、ＲＮＡをエタノール中に−２０Ｃで貯蔵した。ＲＮＡをＤＥＰＣ水中で貯蔵しないように注意した。
【０２５１】
ステップ６：ライゲーションした断片３オリゴ複合体の精製
乾燥した試料を再度０．５×ＴＥ緩衝液に溶かし、バッファーＣで平衡化したＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００カラムに載せた。カラム温度は８５℃であり、検出器は、ＲＮＡを有する画分の同定には２５４ｎｍで作動させ、２ＭａＦを有する画分の同定には３４０ｎｍで作動させた。オリゴは、最初の２０分間は３０％〜７０％のバッファーＤの凸型勾配で、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させ、次いでさらに２０分間、７０％の〜９８％のＤの直線勾配で、同じ流速で溶出させた。溶出は、１００％のＤで７分間および１００％のＣでさらに１０分間、１．０ｍｌ／分の流速で洗浄することによって完了した。画分は２５４または２６０ｎｍの波長の光を用いて検出した。ライゲーションしたオリゴ（２ＭＡ−断片３）は３４分より後に、９０％を超えるバッファーＢで溶出された。２５４ｎｍでの吸光度を有する画分（Ａ254nm＞０．０１）を採取し、高速真空で終夜乾燥させた。
【０２５２】
ステップ７：精製した２ＭＡ−断片３の脱塩および沈殿
乾燥した画分を再度１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に溶かし、０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、混合物を手短に渦攪拌した。その後、混合物を６０分間ドライアイス上で凍結させるか、−２０Ｃで終夜貯蔵した。
【０２５３】
試料を４℃にし、マイクロ遠心機内で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位置に注意し、上清を傾瀉するか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。依然として塩を含んでいる場合は、このステップを繰り返した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。濡れたペレットを高速真空で１５分間乾燥させた。
【０２５４】
断片１を２ＭＡ−断片−３オリゴにライゲーションさせてＳＡＴＡリンカーを完成させる次のステップで用いる、ライゲーションした２ＭＡ−断片−３を同定するために、尿素ＰＡＧＥを行った。
【０２５５】
ステップ８：ＳＡＴＡ（または他のｔＲＮＡ分子）の調製
Ａ．ＲＮＡオリゴの５’リン酸化
１．試薬および器具：
・ヌクレアーゼを含まない水（カタログ番号Ｐ１１９３、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（カタログ番号Ｎ２５１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・フェノール：クロロホルム
・無菌的なマイクロ遠心チューブ
・１００％のエタノール
・７０％のエタノール
・室温および４℃のマイクロ遠心機
・ＰＣＲサーマルサイクラーまたは水浴
２．以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築する：
成分                                      体積
・アクセプターＲＮＡ                        ＜２００ｎｇ
・Ｔ４リガーゼ１０×反応バッファー＊        ４μｌ
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（４０単位／μｌ）
２０単位
・Ｔ４キナーゼ（９〜１２単位／μｌ）        ２μｌ
・１０ｍＭのＡＴＰ                          ４μｌ
・ヌクレアーゼを含まない水        最終体積４０μｌまで
３７℃で３０分間、ＰＣＲサーモサイクラーまたは水浴中でインキュベートする。非放射性のリン酸化には、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー、１ｍＭのＡＴＰおよび１０〜２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０〜４０μｌの反応で、３００ｐｍｏｌまでの５’末端を用いる。３７℃で３０分間インキュベートする。１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ反応バッファーは１ｍＭのＡＴＰを含み、非放射性のリン酸化において置き換えることができる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはこの緩衝液中で１００％の活性を示す）。最適な活性には新しい緩衝液が必要である（古い緩衝液では、酸化によるＤＴＴの減少が活性を低下させる。
【０２５６】
Ｂ．アニーリング断片１および２ＭＡ−断片３オリゴの複合体：
１．試薬および器具：
・ＰＣＲサーモサイクラー装置または水浴
・１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼを含まないアルブミン
・１００ｍＭのＭｇＣｌ２
２．以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築する：
・アクセプターＲＮＡオリゴ（１Ｅ）        ＜２００ｎｇ
・ドナーＲＮＡオリゴ（３Ｇ−２Ｇのライゲーションしたオリゴ）      ＜２００ｎｇ
・（ステップＡからの５’リン酸化されたオリゴ）
適切な比は、断片１の自己ライゲーションを回避するために、アクセプターオリゴ：ドナーオリゴ（断片１：２ＭＡ−断片３）のモル比が１：１．１であるべきである。ＭｇＣｌ2を最終濃度２０ｍＭまで、Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＡＴＰ）に加えた。Ｒｎａｓｅを含まないアルブミンを最終５μｇ／ｍｌまで加える。最終体積は１００μｌを超えないべきである。溶液を７０℃まで５分間加熱し、その後、７０℃から２６℃まで２時間かけて冷却し、２６℃から０℃まで４０分間かけて冷却した。ＰＣＲ装置を用いて１６℃で１６〜１７時間インキュベートする。
【０２５７】
Ｃ．アニーリングしたオリゴのライゲーション
・アニーリングしたオリゴ                        ＜１５μｌ
・１０ｍＭのＡＴＰ                                  ２μｌ
・４０％のＰＥＧ                                  １８μｌ
・Ｔ４リガーゼ１０×緩衝液                          ２μｌ
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（４０単位／μｌ）
０．５μｌ
・Ｔ４リガーゼ（９〜１２単位／μｌ）（ＮＥＢ）        １μｌ
・ヌクレアーゼを含まない水                最終体積４０μｌまで
Ｄ．ｔＲＮＡ断片の沈殿
ライゲーションの後、５０μｌのＤＥＰＣ水および１５０μｌのフェノール：クロロホルムを加え、３０秒間激しくボルテックスした。その後、これをマイクロ遠心機内で、最大速度で５分間、室温で遠心分離した。水相を新しいマイクロ遠心チューブ（〜１００μｌ）に移した。これに、２μｌの１０ｍｇ／ｍｌのイガイ（ｍｕｓｓｅｌ）グリコーゲン、１０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２を加えた。これをよく混合した。その後、２２０μｌの９５％のエタノールを加え、手短にボルテックスした。その後、混合物を３０分間ドライアイス上で凍結させた。この時点で、混合物を終夜−２０℃で貯蔵してもよいし、または先に進んでもよい。一実施形態では、ＲＮＡは好ましくはＤＥＰＣ水中に貯蔵すべきでなく、エタノール中に−２０℃で貯蔵すべきである。
【０２５８】
その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機内で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位置に注意し、上清をデカンテーションするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。エタノールを取り除いたあと、濡れたペレットを高速真空で１５分間乾燥させた。乾燥したペレットは、次のステップまで−２０℃で貯蔵した。
【０２５９】
ＲＮＡの翻訳
ＳＡＴＡのアンチコドンによって認識されるものに対応するストップコドン（今回の場合ＵＡＧ）を有するように修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡが、１μｌの濃度１μｇ／μｌを推奨する標準のＰｒｏｍｅｇａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳キットで用いられた。当業者は、実際、適切な配列を含む任意のｍＲＮＡ断片を用いてもよいことを理解するであろう。
【０２６０】
ＳＡＴＡを実験チューブに加えた。ＳＡＴＡを含まない対照チューブも調製した。用いたＳＡＴＡの量は約０．１μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．５μｇ〜５０μｇであった。４０単位／ｍｌのＲｎａｓｉｎを１μｌ加えた。ヌクレアーゼを含まない水を加えて全体積を５０μｌとした。
【０２６１】
約１５０個を超えるアミノ酸のタンパク質では、ｔＲＮＡ量の補充を要してもよい。たとえば、約１０〜２００μｇのｔＲＮＡを加えてもよい。一般に、ＳＡＴＡの量は、ストップコドンまたは疑似ストップコドンを有効に抑制するのに十分高いべきである。天然ｔＲＮＡの量は、伸長因子の作用下で動的なプルーフリーディングを受けないＳＡＴＡとの競合に勝つのに十分高くなければならない。
【０２６２】
各チューブは、すぐにキャップを締め、パラフィルム処理し、翻訳反応のために３０℃で９０分間インキュベーションした。各反応チューブの内容物を毛細管作用によって５０μｌの石英の毛細管に移した。Ｇａｓｐａｒｒｏ他（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５７：１００７（１９９３）、本明細書中に参考として組み込まれている）に記載のように、各チューブの内容物に２〜１０Ｊ／ｃｍ２、〜３５０ｎｍの波長の光を照射することによって、ＳＡＴＡをｍＲＮＡと架橋結合させた。光架橋結合ののち、各チューブの内容物を新しいスナップキャップマイクロ遠心チューブに移した。２μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを各チューブに加えることによってカルシウム陽イオンをキレート化することによって、リボソームを解離させた。各ステップの間に、各成分を加えた際にピペットチップで攪拌することによって各チューブを穏やかに混合した。
【０２６３】
最終的な実験を行う前に翻訳に最適なＲＮＡを決定した。ｍＲＮＡの最適濃度を見つけるためには、５〜２０μｇ／ｍｌの段階希釈を要してもよい。
【０２６４】
上述のように、各試料でＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を行った。本明細書中に参考として組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載のように、ゲルのオートラジオグラフィーを行った。
【０２６５】
上記実施例は、ＳＡＴＡ（ｔＲＮＡ上のピューロマイシンおよびｔＲＮＡ上の架橋剤）の生成および使用、ならびに連結ｔＲＮＡ類似体（ピューロマイシンを有さず、ｔＲＮＡ上に架橋剤を有する）の生成および使用を教示している。
【０２６６】
実施例３：架橋剤を形成するよう修飾したリボヌクレオチドを用いた連結ｔＲＮＡ類似体の生成：ソラレンおよび非ソラレン架橋剤の使用
上述のように、所望しないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限にするために、疑似ウリジンを一部の実施形態で用いることができる。一実施形態では、架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドを形成して用いる。架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドの１つの利点は、これが望ましくないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限にすることである。
【０２６７】
上述のように、当業者は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体、およびナンセンスサプレッサー類似体を多くの異なる方法によって生成することができることを理解するであろう。好ましい実施形態では、ソラレン化したウリジン５’モノヌクレオチド、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンもしくは２−クロロアデノシンを生成または購入し、ｔＲＮＡ類似体内に組み込むオリゴヌクレオチドと酵素的にライゲーションさせることができる。アリールアジドおよびアリールアジドの類似体、ならびにその任意の修飾体も、いくつかの実施形態において連結部分または作用物質として用いることができる。以下のプロトコルをｔＲＮＡ上に位置する架橋剤に用いることができる。当業者は、このプロトコルはｍＲＮＡ上に位置する架橋剤にも用いることができることを理解するであろう。したがって、以下の実施例は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体、およびナンセンスサプレッサー類似体の生成ならびに使用を教示している。
修飾されたヌクレオチドの生成
ピューロマイシンを有するまたは有さない４−チオＵ、５−ヨードおよび５−ブロモＵが８０塩基対までの長さのカスタムヌクレオチド内に既に組み込まれた状態で、購入することができる（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）。したがって、ＳＡＴＡ、およびこれらの架橋剤が既に適所に存在する連結ｔＲＮＡ類似体、ならびに類似の架橋剤を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから直接購入することができる。ナンセンスサプレッサー類似体もＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから購入することができる。
【０２６８】
２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンまたは２−クロロアデノシンはすべて架橋結合用に、ＲＮＡ内に組み込むためのＡｍｂｉｏｎ  ＭＯＤＩｓｃｒｉｐｔキットで使用するために、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から購入することができる。したがって、ＳＡＴＡおよび連結ｔＲＮＡ類似体は、これらの架橋剤および類似の架橋剤と共に、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃから直接購入することができる。
【０２６９】
ＰＯ4Ｕソラレンは以下のように生成することができる：
ＡＵＡＵＡＵＡＵＡＵＡＵＡＵＡＵＡＵＡＵＧＧＧＧＧＧ（配列Ａ１）（配列番号２０）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）
ＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ（配列Ａ２）（配列番号２１）（南カリフォルニア大学のサービスから入手可能）。
【０２７０】
標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成は、以下のように行う：
反応バッファーを調製する。ｐＨ７．０を有する反応バッファーは、２５ｍＭのトリスＨＣＬ、１００ｍＭのＮａＣｌ、および０．３２ｍＭのＥＤＴＡを含む。
【０２７１】
その後、４’ヒドロキシメチル−４，５’，８’−トリエチルソラレン（ＨＭＴ）を最終濃度０．３２ｍＭまで加え、等モル量の配列Ａ１および配列Ａ２を配列Ａ１：配列Ａ２：ソラレンの最終モル比＝１：１：１０００まで加える。合計１００μｌの体積を一度に照射する。
【０２７２】
相補的オリゴ、ＨＭＴ、トリメチルソラレンの混合物を以下のように処理する：１）ＰＣＲサーモサイクラーを用いて、８５℃まで６０秒間加熱し、次いで４℃まで１５分間かけて冷却する；ならびに２）冷却ファンおよび４１９ｎｍの波長を備えたＲＰＲ−２００Ｒａｙｏｎｅｔチャンバ反応器内で、上部をパラフィルムで覆ったエッペンドルフＵＶｅｔｔｅプラスチックキュベット内で２０〜６０分間４℃で照射する。これを、氷水浴上または−２０℃の冷凍庫内のどちらかに置く。
【０２７３】
ＨＭＴを再挿入および照射するために上記ステップ１および２を４回繰り返す。４サイクルの照射後、遊離ソラレンをクロロホルムで抽出し、すべてのオリゴ（標識したものおよび未標識のもの）をエタノールで終夜沈殿させる（沈殿ステップを参照）。少量のアリコートをゲルの同定用に保存する。
【０２７４】
非ソラレン架橋剤のＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃのキットを用いて匹敵する配列を生成することができる。
【０２７５】
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ消化
以下のステップを行う：（１）高速真空内でオリゴを乾燥させる；（２）ペレットを１０μＬの１×ハイブリッド混合物に再懸濁させる；（３）６８℃で１０分間加熱する；（４）ゆっくりと３０℃まで冷却する。律動的に遠心沈殿させる；（５）１０μＬの２×ＲＮａｓｅ  Ｈ緩衝液を加える。混合する。（６）３０℃で６０分間インキュベートする；（７）１３０μＬの停止混合液を加える。
【０２７６】
フェノール／クロロホルム抽出には、（１）１倍体積のフェノール／クロロホルムを加える；（２）よくボルテックスする；（３）２分間室温のマイクロ遠心機で遠心沈殿させる；（４）上層を新しいチューブに取り出す。
【０２７７】
クロロホルム抽出には、（１）１倍体積のクロロホルムを加える；（２）よくボルテックスする；（３）２分間室温のマイクロ遠心機で遠心沈殿させる；（４）上層を新しいチューブに取り出す。
【０２７８】
その後、（１）３７５μＬの１００％のエタノールを加える；（２）−８０℃で凍結させる；（３）１０分間室温のマイクロ遠心機で遠心沈殿させる；（４）ペレットを７０％のエタノールで洗浄する；（５）１０μＬのローディング色素に再懸濁させる；（６）載せる直前に１００℃で３分間加熱する。
【０２７９】
より長いｃＤＮＡから、およびより長いＲＮＡ断片からのモノリボヌクレオチドヌクレオチドの精製は、陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて成す。その後、ソラレンモノ付加体としたモノヌクレオチド（ＰＯ4Ｕソラレン）を、逆相ＨＰＬＣによってモノ付加体化されなかったモノヌクレオチド（ＰＯ4ＵおよびＰＯ4Ａ）から分離する。
【０２８０】
下述する類似の消化技法およびヌクレオチドの組み込みも、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃのキットを用いた非ソラレン架橋剤に用いることができる。
【０２８１】
ｔＲＮＡ成分オリゴリボヌクレオチド内への光感受性ヌクレオチドの組み込み
ｐＵ架橋剤をＣＵＡストップアンチコドン内に組み込むために以下のプロトコルを用いることができる。しかし、当業者は、本明細書中に記載の方法に従って、他のストップアンチコドンおよび疑似ストップアンチコドンを生成するために他のヌクレオチドも用いることができることを理解するであろう。
【０２８２】
一般に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼのプロトコルから適用させた方法を用いるが、一部の修飾では、修飾されたヌクレオチドの３’ＯＨの保護が欠けているために用いる。
【０２８３】
５’ＯＨ  ＣＵＣ  ＯＨ３’オリゴリボヌクレオチド（配列Ｂ１）はＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．から購入することができ、ライゲーションにおいてアクセプターとすることができる。Ｂ１対ソラレン化したモノヌクレオチドのモル比は、ＣＵＣ（Ｕ架橋剤）Nの形成が防がれるように、修飾されるＵ’の数が大きく下回るようになるために、好ましくは、１０：１〜５０：１を保つ。これにより、好ましい反応の１つが行われる：
ＣＵＣ＋ｐＵソラレン→ＣＵＣＵソラレン
一実施形態では、ソラレン化したＵおよびより長いソラレン化した７量体を確実に分離するために、逐次的な陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣによって生成物を精製する。その後、ｐＡｐとライゲーションすることによって７量体を３’保護してＣＵＣＵ架橋剤Ａｐ（断片２Ｂ）を得る。
【０２８４】
これを再度陰イオン交換ＨＰＬＣＦまたは次のライゲーションで精製する。
断片２Ｂと１Ｂもしくは１Ｂ１との第１のライゲーション
この２Ｂ断片は、安定したアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体または、天然のエステル化されたアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体において用いることができる。一実施形態では、天然のＡＡ−ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然の３’末端をアミノアシル化できることを保証するために、その類似体のバージョンにおいてアクセプター基部を修飾する。ＳＡＴＡのバージョンでは、一実施形態では、３’断片は市販の調製されたピューロマイシンをアクセプターとして維持する。したがって、一実施形態では、異なる２つの５’末端において以下を用いる：
５’ＯＨＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ３’配列１Ｂ（配列番号２２）（安定したピューロマイシンアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体と共に用いる）および
５’ＯＨＧＧＧＧＣＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ３’配列１Ｂ1（配列番号２３）（、天然のエステル化されたアクセプターと共に用いる）。
【０２８５】
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて再度ライゲーションを行い、長さによって精製する。配列１Ｂの式は以下のとおりである：
５’ＯＨＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ３’＋ＣＵＣＵ架橋給合剤ＡＰＯ4３’（配列番号２２）→
５’ＯＨＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＵ架橋給合剤ＡＰＯ4  ３’（配列番号２４）
配列１Ｂ1については：
５’ＯＨＧＧＧＧＣＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ＋ＣＵＣＵ架橋給合剤ＡＰＯ4３’（配列番号２３）→
５’ＯＨＧＧＧＧＣＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＵ架橋給合剤ＡＰＯ4３’（配列番号２５）
ｔＲＮＡ類似体の２つの半分子のライゲーション
３’リン酸を除去して５’リン酸を付加するために、上記生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて２つの個別のステップで処理する。
【０２８６】
その後、新しく調製した５’および３’の半分子末端を、一般に従前のプロトコルに従ってライゲーションした。それぞれの５’配列に対応する３’配列は以下のとおりである：
配列１Ｂ：（Ψ＝疑似ウリジン）
５’ＰＯ4ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＵ架橋剤Ａ３’（配列番号２４）、３’の半分に対応：
５’ＰＯ4ＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣＰｕｒ３’（配列番号３１）、３Ｂ
および配列１Ｂ１、
５’ＯＨＧＧＧＧＣＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＵ架橋給合剤ＡＰ０4（配列番号２５）
３’の半分に対応
５’ＰＯ4ＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＣＵＣＣＡＣＣＡ３’（配列番号３２）。
【０２８７】
後者は、大腸菌のアラニンのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって認識可能である。
【０２８８】
上述の実施例は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ、およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを作製および使用するために用いることができる。
【０２８９】
実施例４：ＳＡＴＡおよびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡのためのｍＲＮＡ上への架橋剤の配置
いくつかの実施形態では、架橋剤（ソラレンまたは非ソラレン架橋剤など）はｔＲＮＡ上に配置されず、ｍＲＮＡ上に位置する。たとえば、一実施形態では、ＳＡＴＡはｔＲＮＡ上に位置するピューロマイシンを含み、一方で架橋剤はｍＲＮＡ上にある。さらに別の実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを用い、これはピューロマイシンを有さないｔＲＮＡを含み、架橋剤はｍＲＮＡ上にある。架橋剤のメッセージ（ｍＲＮＡ）上への配置は、以下に示すように成すことができる。関連する配列は以下のとおりである：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＧＡＡＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧ  ＧＵＵ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  Ｕ架橋給合剤ＡＧ（配列番号２６）
利便上だけを考えると、一実施形態では、多数の35Ｓ標識のためのメチオニンコドンを有する、コザック配列およびシャインダルガノ配列をどちらも有するメッセージを用いる。
【０２９０】
４−チオウリジン、５−ブロモウリジンおよび５−ヨードウリジンには、メッセージを完全に作製された状態でＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから購入することができる。アリールアジドには、本明細書中に参考として組み込まれているＤｅｍｅｓｈｋｉｎａ，Ｎ他、ＲＮＡ、６：１７２７〜１７３６、２０００に記載の方法を用いることができる。
【０２９１】
２−チオシトシン、２−チオウリジン、５−ヨードシトシン、または２−クロロアデノシンには、修飾された塩基を５’モノリン酸ヌクレオチドとしてＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から購入することができる。ソラレンを架橋剤として用いる場合は、修飾された５’モノリン酸ヌクレオチドは上述のように作製する。
【０２９２】
精製を容易にするために、修飾された５’モノリン酸ヌクレオチドをまず六量体内に組み込む。架橋剤を含むウリジンの構築を示すが、いくつかの実施形態では、類似の技法を用いて他の塩基をストップコドンおよび疑似ストップコドンのどちらにも組み込むことができる：
ＡＵＧ＋ｐＵ架橋剤→ＡＵＧＵ架橋剤は、ｐＮ架橋剤の３’保護が存在しないことによるＡＵＧの優位点を用いたこと以外は上述したプロトコルと同様のプロトコルを用いて達成した。生成物を陰イオン交換ＨＰＬＣによって過剰のＡＵＧから精製した。その後、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて５’ｐＡＧビオチン３’を付加した。３’ビオチンは、単にＤｈａｒｍａｃｏｎから入手可能であった便利な３’ブロッキング基である。生じたＡＵＧＵ架橋剤ＡＧヒ゛オチンを再度精製し、次いで５’リン酸化し、
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＧＡＡＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＵＵＡＡＡＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＡ（配列  ＭＩ）（配列番号２７）
にライゲーションして以下を得た：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＧＡＡＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＮＮＡＡＡＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＡＡＵＧＵ架橋剤ＡＧヒ゛オチン*（配列番号２８）
収率は精製が不要となるほど十分に高い。したがって、上述のプロトコルを用いて、本発明のいくつかの実施形態に従ってＳＡＴＡおよびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを作製および使用することができる。
【０２９３】
実施例５：ピューロマイシンを必要としないｔＲＮＡ系の使用
本発明のいくつかの実施形態は、ピューロマイシン、ピューロマイシン類似体、または他のアミドリンカーを必要としない系および方法を提供する。一実施形態では、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはピューロマイシンを必要とせず、以下の例に従って作製および使用することができる。
【０２９４】
ピューロマイシンを用いない系では、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための翻訳系を用いることができる。他の実施形態では、化学的にアミノアシル化を成すことができる。当業者は、どのようにｔＲＮＡを化学的にアミノアシル化するかを理解するであろう。翻訳系を用いる場合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｓｉｔｕなどのアミノアシル化する任意の種類の翻訳系を用いることができる。一実施形態では、大腸菌の翻訳系を用いる。大腸菌翻訳系は、ａａＲＳAlaによって認識されるように修飾したｔＲＮＡを用いる系で使用する。一実施形態では、これは安定したアクセプター（たとえばピューロマイシン）を含まない系に好ましい。
【０２９５】
以下のｍＲＮＡのそれぞれ３ｍｃｇをそれぞれ４０マイクロリットルのＰｒｏｍｅｇａ  Ｓ３０大腸菌翻訳混合物中で翻訳する：
ａ）ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＧＡＡＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧ  ＧＵＵ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧＵ架橋給合剤ＡＧヒ゛オチン（配列番号２８）および
ｂ）ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＧＡＡＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧ  ＧＵＵ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＡＵＧＵＡＧ（配列番号２９）
上述のように生成した３ｍｃｇのアンバーサプレッサーｔＲＮＡを第１配列に加える。３ｍｃｇの、アンチコドン上に架橋剤を有するサプレッサーを第２配列に加える。３５Ｓ−メチオニンを両方に加え、その後、混合物を３７℃で３０分間インキュベーションする。その後、反応液を氷浴に入れることによって迅速に冷却し、平らなペトリ皿に移し、混合物が〜３５０ｎｍ光源から１．５ｃｍだけ下方にあるように氷浴中に浮かべる。これらを〜２０Ｊ／ｃｍ１５分間露光させる。
【０２９６】
照射後、混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿する。このようにして、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡなどの系をアミノアシル化し、本発明のいくつかの実施形態に従ってメッセージ（ｍＲＮＡ）をそのコードされたペプチドに結合させるために用いる。
【０２９７】
実施例６：代替配列
好ましい実施形態では、上述の実施例１に記載した断片１、２および３は、以下の代替配列を有する：
断片１（配列番号１３）：
５’ＰＯ４ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＮ３−メチル−Ｕ３’
断片２（配列番号１４）：
５’ＵＣＵＡＡＧΨＣΨＧＧＡＧＧ３’
断片３−上に記載した配列から変化なし（配列番号６）：
５’ＰＯ４ＵＣＣＵＧＵＧＴΨＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣピューロマイシン３’
上述の方法を用いると、代替断片１＋２＋３の配列は（配列番号１５）であった。
【０２９８】
実施例７：ＳＡＲＳへの応用
ＳＡＲＳウイルスの診断試験
一実施形態では、ＳＡＲＳウイルスの診断試験を提供する。ＳＡＲＳゲノムの配列は知られており、ゲノム上の関連する構造タンパク質であるスパイク（Ｓ）、膜（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）およびエンベロープ（Ｅ）の位置が知られている（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＭａｒｒａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／ｗｗｗ．．ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ／１Ｍａｙ２００３／Ｐａｇｅ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０８５９５３およびＲｏｔａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／ｗｗｗ．．ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ／１Ｍａｙ２００３／Ｐａｇｅ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０８５９５２））。
【０２９９】
「Ｓ」タンパク質は標的細胞への結合に関連しており、これは、コロナウイルス株のうちＳＡＲＳ−ＣｏＶに特有である（Ｒｏｔａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／ｗｗｗ．．ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ／１Ｍａｙ２００３／Ｐａｇｅ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０８５９５２）、本明細書中に参考として組み込まれている。現在のＲ−ＰＣＲ、ＥＭ、およびＦＥＩＡアッセイは、実施に時間がかかりすぎるか、または感度が低く、したがって疾患の初期段階において価値が限られているので不十分である（Ｔｓｉ他、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、９：９（２００３）およびＴｓａｎｇ他、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、９：１１（２００３））、すべて本明細書中に参考として組み込まれている。このウイルスは痰から容易に入手可能である（Ｈｓｕｅｈ他、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、９：９（２００３））、本明細書中に参考として組み込まれている。「Ｓ」タンパク質はＳＡＲＳ−ＣｏＶ株のすべてに存在する（ｔｏｒ２、Ｕｒｂａｎｉ、ＴＷ−１、ＨＫＵ−３９８４９、およびＣＵＨＫ−Ｗ１）。
【０３００】
現在利用可能な診断試験の１つは、ナノ粒子に基づいたバイオ−バーコード技術である（Ｎａｍ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：１８８４〜１８８６（２００３））、本明細書中に参考として組み込まれている。この方法は極度の感度を有すると考えられ、ＳＡＲＳ病の初期段階の痰に見つかる低いレベルのウイルス粒子の検出が可能となるはずである。リアルタイムで行うことができる実施がより速い他の方法が存在するが、これらは感度がより低い場合がある。本発明のいくつかの実施形態は、数週間または数カ月ではなく数日間のうちにアッセイに必要な試薬を開発することを容易にする。
【０３０１】
十分な量の純粋な「Ｓ」タンパク質を生成した後、本発明のいくつかの実施形態を用いて少なくとも２つの追加の試薬を作製することができる：「Ｓ」タンパク質上の異なる２つのタンパク質ドメインに結合する２つの特異性の高い結合タンパク質であり、一方は捕捉プローブとして用い、他方はシグナル伝達プローブとして用いる。
【０３０２】
一実施形態では、以下のようにプロトコルを行う。
試験試薬の調製
一実施形態では、以下のように試薬を調製する：
Ａ．精製した「Ｓ」タンパク質の調製
１．ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノム配列はＧｅｎｅｂａｎｋ（寄託番号ＡＹ２７４１１９−３）から得られ、ここから「Ｓ」タンパク質をコードする配列の一部分が得られる。
【０３０３】
５’ＰＯ４ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ（Ｎ３−メチルＵ）ＵＣＵソラレンＡＡＧΨＣΨＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＴＹＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧピューロマイシン３’（配列番号３３）のｃＤＮＡのプライマー
連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡには、上記配列が類似しているが、アデノシンを用いてピューロマイシンを置き換える。
【０３０４】
本発明の多くの好ましい実施形態およびその変形を詳述したが、当業者には他の改変および使用方法が容易に明らかであろう。上述のすべての実施形態において、方法のステップを逐次的に行う必要はない。したがって、本発明の精神または特許請求の範囲から逸脱せずに様々な応用、改変および置換を行い得ることが理解するであろう。
さらなる応用
現在まで、タンパク質のｍＲＮＡ配列の解読は、タンパク質のｍＲＮＡ配列の最良の推測を行うためのＮ末端解析を実施するために時間、労力、およびお金の非常に顕著な投資を伴うので、プロテオミクス業界において大きなボトルネックとなっていた。Ｎ末端解析は、タンパク質を化学的解離して、そのアミノ酸およびタンパク質中でのその順序を決定することを含む。一実施形態では、本発明は、翻訳過程中に正確なｍＲＮＡメッセージをその同族タンパク質と連結させ、これによりユーザにそのタンパク質をさらに生成するためのすぐに利用可能な設計図を提供し、Ｎ末端解析の必要性を不要とすることによって、このボトルネックの問題を解決する。たとえば、「Ｓ」タンパク質のプローブとして結合タンパク質を用いる一方法は、以下のように行うことができる：
１．最初のｍＲＮＡライブラリはコドンの反復によって作製する。
ａ）ストップコドンを含まないランダムコドンから、読み枠を作製するために用いる１組のメッセージを構築する、独自の方法。
ｂ）適切なストップコドンを付加する。３’および５’非翻訳領域も各オリゴに付加する。
ｃ）これにより、それぞれが平均１２８個のコドン以上の、＞１０14の桁数の異なるメッセージが作製される。
【０３０５】
２．タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで必要な場合、その特定のタンパク質をコードしている遺伝子が活性化されてそのタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列が産生される。その後、ｍＲＮＡがメッセージを核から細胞のリボソームまで運び、ここでアミノ酸がｍＲＮＡのコードに指示される順で所定のタンパク質へと組み立てられる。完了後、タンパク質およびｍＲＮＡはリボソームから、ならびに互いから酵素的に解離される。「Ｓ」タンパク質配列に関心が持たれている場合は、それが産生される。
【０３０６】
３．それのｃＤＮＡコピーおよびそれをさらに生成する要請、または配列を修飾する要望を行う。
【０３０７】
４．ＰＣＲを用いて大腸菌へ挿入するのに十分なｃＤＮＡを調製する。
【０３０８】
確立された方法（本明細書中に参考として組み込まれているＤｏｏｎａｎ編、第５９巻、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を用いて新しく産生された「Ｓ」タンパク質を大腸菌から収穫する。望ましい特性を増強するまたは望ましくない特性を排除するためには、タンパク質のｍＲＮＡコードが最初に知られていなければならない。
【０３０９】
本発明のさらなる実施形態は、「リンカー系」、すなわち科学者が急速かつ容易に、タンパク質とそれをコードしているｍＲＮＡとを化学的に連結させることを可能にする革命的な新規化合物および方法の系を含む（図１４を参照）。
【０３１０】
新規タンパク質
一実施形態では、特定の目的のための新規タンパク質は、連結系の実施形態を用いて上記図１４（Ｂ）示したようにｍＲＮＡライブラリの実施形態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳することによって迅速に作製することができる。生じたタンパク質−リンカー−ｍＲＮＡ複合体のライブラリの数は兆の桁数（１０14）のタンパク質変異体となり、ここから所望の特性を有するものを選択することができる。一実施形態では、その後、選択されたタンパク質−リンカー−ｍＲＮＡ複合体のｍＲＮＡを複合体から化学的に切断し、バイオリアクター培養によってまたは大量ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって大量のタンパク質を生成するために用いることができる。別の実施形態では、タンパク質のより優れた変異型が所望される場合は、ｍＲＮＡを確立された高速タンパク質進化技法に供することができ、その後、生じたｍＲＮＡライブラリをリンカー系で再度翻訳してタンパク質変異体の巨大なライブラリを迅速に進化させることができる。その後、増強された特徴を有するタンパク質を残りから選択してもよい。別の実施形態では、最良の候補タンパク質に対するｍＲＮＡはすべてその対応するタンパク質に結合しており、したがって、繰り返しサイクルのために容易に収穫することができるので（図１５）、その後、所望の特性を強化する、または追加の特性をタンパク質に加えるためにこの過程を複数回繰り返すことができる。したがって、好ましい実施形態は、好ましくは、まず目的のタンパク質をコードしている正確なｍＲＮＡ配列を同定する、現在当業界で用いられている高価かつ時間のかかる従来の手順を不要にする。
【０３１１】
天然タンパク質
一実施形態では、天然タンパク質もその同族ｍＲＮＡに連結させ、上述の新規タンパク質と同じ方法で容易に選択することができる。一実施形態では、任意の生物または未知の由来元から採取したｍＲＮＡを、上記図１４（Ａ）に示したように、ＳＡＴＡ試薬および連結系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳する。その後、目的のタンパク質を生じたタンパク質−リンカー−ｍＲＮＡ複合体のライブラリから選択する。
【０３１２】
特定のタンパク質のｍＲＮＡメッセージはそのタンパク質のｍＲＮＡコードを産生した遺伝子を反映するので、一実施形態では、この手法は、特定のタンパク質を司る遺伝子の同定に特に有用である。したがって、ｍＲＮＡメッセージは、その特定のｍＲＮＡをコードしている、したがってその特定のタンパク質をコードしている正確な遺伝子または遺伝子配列（およびゲノム上のそれらの位置）に戻ってそれを同定するための、プローブとして用いることができる。
【０３１３】
マイクロアレイに適応した別の実施形態では、これは、特定の病状に特徴的な遺伝子活性プロファイルを素早く導くことを可能にする。遺伝子活性プロファイルは、特定種類の癌の正確な診断を確立するために用いることが既に成功している。本発明のいくつかの実施形態は、このようなプロファイルを現在当業界で用いられている技法よりもはるかに速くかつより効率的に確立することを可能にする。さらに、好ましい実施形態ではタンパク質産物およびそれをコードしている遺伝子がいずれも同定されるので、これらの実施形態は、好ましくは、疾患に関連するタンパク質産物またはその疾患関連タンパク質を発現している遺伝子のどちらかを標的とするタンパク質を迅速に進化させるために用いることができる。
【０３１４】
本発明の一部の実施形態の利点を以下に要約する。
【０３１５】
新しいタンパク質の開発を速める能力：一実施形態では、タンパク質をそのｍＲＮＡに連結させる能力により、各タンパク質の正確なｍＲＮＡ配列を決定するために現在用いられている時間、価格、および労力集約型のＮ末端解析方法が不要となるので、タンパク質系の生成物の開発が非常に簡単になる。同定した後、本発明のいくつかの実施形態を利用して、ｍＲＮＡは、タンパク質を素早くさらに生成するために用いることができ、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異を導入することによって修飾して所望のタンパク質変異体を生成することができる。したがって、好ましい実施形態では、現在の方法によって必要とされる数カ月または数年ではなく、数週間で新規タンパク質を作製することができる。
【０３１６】
新しいタンパク質の開発を最適化する能力：一実施形態では、本発明は、巨大なｍＲＮＡライブラリを作製し、それからｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を用いてそのｍＲＮＡと連結した稀なタンパク質を選択することができることによって、所望の特性を有するタンパク質の開発を迅速に最適化することを可能にする。
【０３１７】
製造費用を大きく削減する能力：一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳手順および翻訳配合物を用いてタンパク質に基づいたヒトの治療剤ならびにワクチンを製造することは動物由来の試薬を含まず、したがって全体的な製造価格が大きく低下する。ヒトの治療剤の製造は、現在生成に血清などの動物性製品を必要とする。これは高価であり、また、用いた動物性製品がプリオン、ウイルス、または他の動物伝染汚染物質で治療剤製品を汚染しないように保証するためにさらなる費用が生じる。
【０３１８】
本発明の一部の実施形態の応用は、タンパク質が関与するすべての分野に事実上広がる。以下の分野は、このような分野および可能性のある製品の非限定的なさらなる例を提供する。
【０３１９】
ヒトの治療剤
一実施形態では、結合すると細胞死を誘発させる悪性細胞などの疾患細胞上に見つかるものを含めた任意の信頼性のある細胞表面マーカーに結合する結合タンパク質を素早くかつ容易に作製することができる。別の実施形態では、タンパク質結合によって失活するとＩ型糖尿病の発症を防ぐマクロファージ遊走阻害因子などの主要な生化学的標的対して結合タンパク質を作製することもできる。さらに、好ましい結合タンパク質は治療的細胞成長因子として用いることができ、たとえば潰瘍性大腸炎は、腸上皮の再増殖および治癒を刺激する表皮成長因子様タンパク質を用いて有効に治療することができる。
【０３２０】
一実施形態では、疾患を引き起こす生物上の確立された表面マーカーに結合して、それらを有効に失活させる結合タンパク質も、容易に作製することができる。さらに、好ましい結合タンパク質は、これらの生物を検出する診断試験で用いることができる。このような結合タンパク質の標的には、それだけには限定されないが、ＨＩＶ、肝炎、ヘルペス、天然痘、ウエストナイルウイルス、ＳＡＲＳ、ウイルス性肺炎、生殖器疣を引き起こすウイルスおよび任意の他のよく特徴づけられたウイルスが含まれる。また、好ましい結合タンパク質は、炭疽、腺ペスト、ボツリヌス中毒、薬剤耐性ブドウ球菌、コレラ、細菌性肺炎を引き起こす細菌および任意の他の細菌を標的とすることができる。病原性酵母などの真菌も、うまく好ましい結合タンパク質の標的にすることによって失活させることができる。別の実施形態では、感染生物が標的とする、またはその毒性のある代謝産物が標的とする宿主の細胞上の結合部位をブロッキングするタンパク質も、容易に選択することができる。このようにして、宿主が病原体およびその毒素から保護される。
【０３２１】
診断学
本発明の一実施形態は、高度に正確かつ安定した診断試験の作製に理想的に適している。好ましい実施形態は、病状または任意の目的条件を反映する最良の標的を同定するために用いることができ、後に、捕捉および／またはシグナル伝達試薬として用いる新規結合タンパク質を生成するために用いることができる。好ましい結合タンパク質は、この目的のために生成するモノクローナル抗体に関連する費用、時間および労力なしに、モノクローナル抗体よりも優れた感度、特異性および／または安定性の特性を有するように選択することができる。
【０３２２】
一実施形態では、好ましいタンパク質は、よく特徴づけられた癌標的、流体癌にはＣＤ−２２または固形腫瘍にはＣＤ−３３に結合する。また、免疫原性および／またはこれらの抗原に対するｍＡｂに関連する製造上の問題が実質的にないが、好ましくはそれでも市場で市販されているｍＡｂ製品と同じまたはさらに良好な結合、特異性ならびに／または感度の特性を保持している好ましい結合タンパク質も作製し得る。
【０３２３】
食品薬品局（ＦＤＡ）
全般的に、ＦＤＡはｍＡｂに基づいた保健医療製品の認可過程を早める試みを行っている。しかし、ｍＡｂおよびその標的の特徴づけが不十分であること、拡大した産生中にｍＡｂが変化すること、ならびにｍＡｂに免疫原性があることなど、ｍＡｂに問題があることが見つかる。免疫原性反応は、ネズミｍＡｂよりも低いが、キメラｍＡｂでは約８％に留まる。また、植物中で産生させたｍＡｂ由来の植物グリカンは免疫反応を引き起こすことができ、組織培養物で用いる動物血清および他の動物性製品は、狂牛病（プリオン）および口蹄病などに関連する汚染が原因でＦＤＡにとって特に重大な懸案事項である。その結果、安全性を実証する非常に高価な監視がＦＤＡによって必要とされる。これは、欧州の畜牛に関連する狂牛「プリオン」問題が原因で、ｍＡｂ製品のＦＤＡ認可を取得しようとしている欧州企業にとって特に重大な問題である。一実施形態では、この問題の解決法は、動物性製品を含まない合成によって配合した翻訳混合物を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いて生産量の好ましい結合タンパク質を生成する、好ましい方法を用いることである。これにより、ＦＤＡは、このような抗体代用物の認可過程はｍＡｂ製品よりも速くなる可能性が高いことを指摘している（私信、２００３年４月１３日）。このように、一実施形態では、結合タンパク質は、同じ標的に対する認可されたｍＡｂと比較した場合に安全かつ効果的でさえあればよい。
【０３２４】
同等の治療的価値を有するが、ｍＡｂに係る製造価格、高い費用、困難なＦＤＡのハードル、および副作用の問題、を有さない結合タンパク質の実施形態を生成することによって、ｍＡｂ代用製品の好ましい実施形態は、現在のｍＡｂ使用者および製造者から強い関心を受けるかもしれない。
【０３２５】
別の実施形態では、表面プラズモン共鳴技術を、稀なタンパク質を選択された特性を示すｍＲＮＡライブラリから単離および濃縮する好ましい方法と組み合わせて用いてもよい。
【０３２６】
一実施形態では、人工翻訳混合物を用いて、現在使用されている動物性網状赤血球に基づいた翻訳混合物を置き換える。好ましい実施形態を、大量の好ましいタンパク質産物を生成する大量翻訳系に適用させてもよい。
【０３２７】
別の実施形態では、ＣＨＯ細胞をバイオリアクター内で培養してもよい。好ましくは、選択されたタンパク質のｍＲＮＡがＣＨＯ細胞のゲノム内に組み込まれている。別の実施形態では、挿入したｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現する、バイオリアクター培養で増殖させたＣＨＯ細胞を選択する。さらなる実施形態では、好ましい標的タンパク質をＣＨＯ細胞または培地から単離してさらに精製してもよい。
【０３２８】
別の実施形態では、好ましい方法は、ＣＤ−２２またはＣＤ−３３などのよく特徴づけられた癌標的に結合する最初の結合タンパク質を生成する。好ましくはこれらの結合部位を標的とする現在市販されているモノクローナル抗体製品に関連するものと同じ負の副作用を有さないタンパク質を選択してもよい。
【０３２９】
セルラーゼ酵素
別の実施形態では、好ましい方法は、セルロースを十分にグルコースへと分解する酵素を生成する。食品および飲料の生産者らは、酵素アミラーゼを用いてトウモロコシの穀粒由来の食用コーンスターチをグルコースへと変換する。グルコースは食品およびソフトドリンクにおいて甘味料として用いられ、また、アルコール飲料またはガソリン添加剤として用いるエチルアルコールを生成するために発酵過程において用いられる。
【０３３０】
植物の食用でない部分は主にセルロースを含み、現在グルコースの生成に使用されていない。化学的には、セルロースはグルコース分子の長い鎖である。したがって、一実施形態では、植物のセルロース部分をグルコースへと消化するセルラーゼ酵素により、コーンスターチ成分のみだけでなく、実質的に植物全体をグルコースの生成に用いることが可能となる。このような好ましい酵素を用いれば、同じ量のバイオマスから相当に多い量のグルコースを生成することができる。さらに、これらの好ましい酵素を用いれば、事実上任意の植物材料を用いてグルコースを生成することができる。これは、より費用高価の高い最終製品へと変わり、したがって、これらの好ましい酵素は食品およびアルコール生産者らにとって非常に興味深いものとなるであろう。
【０３３１】
最新技術
セルラーゼは、現在デンマークの企業であるＮｏｖｏｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって研究目的で生成されている。彼らは２種の微生物、すなわちＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉから、液中発酵と呼ばれるバイオリアクター過程で酵素を単離している。Ｎｏｖｏｚｙｍｅは、植物の食用でない部分を大規模に有効に分解する、これら生物由来のセルラーゼの単離を試みているが、成功していない。好ましい実施形態では、本発明を用いて、任意のセルロースをグルコースへと消化するセルラーゼのファミリーを迅速に作製し得る。別の実施形態では、その後、好ましい酵素の遺伝子配列を任意の好都合の生物内に挿入して大量生成することができる。
【０３３２】
ｍＲＮＡライブラリ
一実施形態では、本発明を完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができ、また、巨大なｍＲＮＡライブラリを提供し得る。好ましい実施形態ではタンパク質アクセプターとして作用するリンカーを用い、連結はタンパク質が完全に合成されたあとにのみ起こる。したがって、好ましい実施形態では、正しいｍＲＮＡメッセージは正しいタンパク質に結合され、ｍＲＮＡメッセージ全体が翻訳されたあとにのみ合成が停止するので、正常よりも短いタンパク質または誤ったタンパク質上のメッセージが得られることは事実上不可能である。一実施形態では、本発明、好ましくは競合相手の技術の有用性を制限するものと同じ問題に苦労することはなく、したがって、はるかに高いかつ広範囲の応用性を有する。好ましい実施形態は、市販するため、ならびにマイクロアレイにおけるその潜在的な使用のためのタンパク質を作製および選択するはるかにより強力な技術である。
【０３３３】
一実施形態では、結合タンパク質の手法は従来のｍＡｂを越える顕著な利点を提供する。別の実施形態では、本発明はワクチンをより安全および／またはより有効にすることができ、その結果、好ましくは製造物責任にさらされることが少なくなる。別の実施形態では、好ましい方法は、たとえば、癌などの病状を反映する血清タンパク質プロファイルを確立するため、または治療行為のために遺伝子もしくは生化学的標的を同定するためにマイクロアレイを用いる企業で用いる、ｍＲＮＡライブラリを生成する。また、それだけには限定されないが、治療的価値を有する結合タンパク質を与えるｍＲＮＡのために市販されているｍＲＮＡライブラリを開発する企業も含まれる。また、それだけには限定されないが、診断試験を製造する主要な企業も含まれる。本発明の好ましい実施形態は、好ましくは、それだけには限定されないが、癌マーカー、肝炎、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳ、ピロリ菌、および陰部ヘルペスなどの感染症、ならびに大腸炎および自己免疫障害などの他の障害を含めた様々なものに対してより高い感度、特異性および／または精度を有する診断的アッセイをもたらす結合タンパク質を作製するためにも用いることができる。
【０３３４】
好ましい生物戦争の実施形態は、新興企業から確立された大企業にわたる広範囲の領域の企業や連邦政府に機会を与える。このような施設は、好ましい実施形態で用いることができる診断試験、抗毒素治療剤、中和剤およびワクチンの開発者である。
【０３３５】
農業分野では、好ましい実施形態には、それだけには限定されないが、動物の治療剤および診断学、ならびに植物病原体の治療が含まれる。
【０３３６】
本発明の好ましい実施形態の産業的使用者には、それだけには限定されないが、産業用に用いる酵素を設計および／または製造する企業、食品および石油添加剤の事業において製造費用を低減させるために酵素を適用させる最近の傾向に従っている企業、ならびにその環境廃棄物を管理および制御するために製紙、木材および石油産業が含まれる。
【０３３７】
実施例８−診断学の手法
標的の同定
最も広い意味で、好ましい実施形態は、単一の患者で、またはより広くは特定の疾患に罹患している患者のすべてもしくはほとんどによって過剰発現されている標的を同定するために用いることができる。好ましい実施形態は、好ましくは、ｍＲＮＡとそれがコードしているタンパク質とを連結させる能力を活用する。たとえば、標的を同定するためには、特定の癌に罹患している患者または複数の患者の血清から単離したすべてのｍＲＮＡを、標準の真核または原核ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系およびＳＡＴＡリンカー系を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳することができる。生じたｍＲＮＡ−ＳＡＴＡ−タンパク質の複合体のタンパク質プロファイルによって、正常な患者と比較して過剰発現されているタンパク質を同定することができる。このようなタンパク質プロファイルの確立は、現在治療的プロテオミクスで用いられているよく確立された技法である。この好ましい実施形態の手法の利点の１つは、ｍＲＮＡがタンパク質に結合しており、したがって、アッセイをさらに開発するために、これらを選択されたタンパク質から外して収穫できることである。拡大量の選択されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写および生じたｃＤＮＡのＰＣＲによって生成することができる。ｃＤＮＡを宿主生物（たとえば大腸菌、酵母、ＣＨＯ細胞など）内に形質転換させることができ、ここからタンパク質が収穫される。これらのタンパク質は標的であり、これから、疾患を最も良好に同定するものを経験的に選択し、アッセイの標準物質として用いる。
【０３３８】
捕捉結合タンパク質およびシグナル伝達結合タンパク質
一実施形態では、課題は、標的タンパク質（Ｔ）上にあって他の血清タンパク質上にはない２つの異なる結合部位に特異性の高く、また試験系の条件下で高度に安定している、２種の結合タンパク質を同定することである。
【０３３９】
以下のプロトコルは、これらの結合タンパク質をどのように生成することができるかを示すいくつかの実施形態を例示する：
１．最初のｍＲＮＡライブラリは、２つの方法のうち１つによって構築することができる。
【０３４０】
Ａ．第１の方法
開始配列
・ＡＵＧ開始コドンにつながる５’ＵＴＲ領域を含むＲＮＡオリゴは、市販の手段によって構築することができる。これは、ＲＮＡトリプレットのランダムな組立てから構築したｍＲＮＡライブラリと後にライゲーションさせる試薬として用いる。このオリゴ配列は翻訳の開始に必要である。
【０３４１】
ランダムｍＲＮＡライブラリ
・すべてのセンスコドンを構成する６１種までの一連のＲＮＡトリプレットは、企業用に商業的に合成することができる。合成物は、すべてのトリプレットの５’および３’末端の両方にＯＨ基を含む。
・すべてのオリゴを高度に精製して、潜在的な読み枠のシフトを排除する。
・これらのトリプレットオリゴの一部分を、市販されている３’保護基のうち任意のもので３’保護する。
・保護したオリゴの一部分を、ランダムな様式で保護していないオリゴの一部分と、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせる。
○この第１のライゲーションにより、最初の２つのコドン配列を含むオリゴが形成される。その後、この材料の半量を５’リン酸化し、残りの半量を３’脱保護する。その後、前述のようにＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いて２つのプールを互いにライゲーションさせる。
○この第２のライゲーションにより、４つのコドン配列を含むオリゴが形成される。この手順を７回繰り返した結果、１２８個までのランダムコドンを含むｍＲＮＡライブラリが生じる。
その後、ランダムな１２８個のコドンのオリゴを５’ＵＴＲ開始配列上にライゲーションさせることができる。この時点で、ストップコドンおよび３’ＵＴＲも結合させることができる。
【０３４２】
Ｂ．第２の方法
ランダムＤＮＡライブラリ
・この方法は、ランダムなＤＮＡライブラリを構築するために高度に精製したホスホロアミダイト三量体を用いることを含む。
・利用可能な三量体は以下のとおりである：ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＣＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＣＧ、ＣＧＴ、ＣＴＧ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＣＴ、ＧＧＴ、ＧＴＴ、ＴＡＣ、ＴＣＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＴＴＣ。
・高度に精製したホスホロアミダイト三量体は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、バージニア州Ｓｔｅｒｌｉｎｇなどの企業から購入することができる。
・ランダムなライブラリは上述と同じ原理を用いて構築することができ、読み枠も上述のようにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて５’および３’ＵＴＲの間に挿入することができる。
【０３４３】
２．ＳＡＴＡリンカーを用いたｍＲＮＡとその同族タンパク質との連結。
ａ）ライブラリは、市販されている原核または真核翻訳系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳する。
ｂ）ｍＲＮＡは、ＳＡＴＡリンカー技法および約３２０〜４００ｎｍのＵＶ照射の系を用いてそのペプチド配列と結合させる。
【０３４４】
３．ライブラリにコードされるタンパク質の親和性定数の分布を決定するために、上記で産生したＳＡＲＳ「Ｓ」タンパク質を、「Ｓ」タンパク質に結合させたビオチンリンカーによって、または膜に結合させた抗「Ｓ」抗体によって、または他の何らかの好都合な手段によって、アビジンでコーティングした膜に結合させる。
【０３４５】
ランダムライブラリからのタンパク質−ＳＡＴＡ−ｍＲＮＡの複合体を「Ｓ」タンパク質でコーティングした表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）膜と反応させる。タンパク質の組の親和性定数の分布は、図１６に示したように、様々な量の固定した標的をタンパク質集団に対して滴定することによって確立される。これにより、タンパク質ライブラリ−１の結合定数の分布が生じる。
【０３４６】
より高い結合定数を有するタンパク質を進化させるために、上記の分布を用いて、アッセイの捕捉（Ｐtrap）およびシグナル伝達（Ｐsig）プローブとして用いるために必要な最も高い親和性を有するタンパク質を選択するために必要な「ＳＴ」タンパク質の合計量、ならびに所要の親和性を得るために必要な選択の回数を計算する（詳細は付録２を参照）。上記によって決定された「ＳＴ」タンパク質の量は、前述のように固相として膜に結合し、タンパク質−ＳＡＴＡ−ｍＲＮＡのライブラリと反応させる。生じた「ＳＴ」−タンパク質−ＳＡＴＡ−ｍＲＮＡの複合体を回収し、３１３ｎｍの光で手短に照射してｍＲＮＡを複合体から解離させる。その後、ｍＲＮＡを逆転写し、変異性ＰＣＲを用いて増幅させる。最適な結合特性を有するタンパク質が進化されるまでこの過程を繰り返す。
【０３４７】
ｐtrapおよびｐsigプローブの調製。固有の感度は「ＳＴ」タンパク質に対する高い親和性に依存し、特異性は「ＳＴ」タンパク質以外のタンパク質に対する低い親和性に依存する。
【０３４８】
ａ）選択された高親和性結合タンパク質からのｍＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲで増幅し、各タンパク質の大量生産のために大腸菌内に挿入する。本明細書中に参考として組み込まれている確立された方法（Ｄｏｏｎａｎ編、第５９巻、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））を用いてタンパク質を収穫する。
【０３４９】
ｂ）ＳＰＲを用いて、タンパク質を他のコロナウイルス株、正常な患者由来の血清、同じ組織の良性疾患などからの「ＳＴ」タンパク質との交差反応性について試験する。アッセイ用の捕捉タンパク質およびシグナル伝達タンパク質を、実質的に交差反応しないタンパク質の集団から選択する。
【０３５０】
ｃ）ＳＰＲ膜上の「ＳＴ」または「Ｔ」タンパク質を、高親和性タンパク質（Ｐ１）のうち１つと、「ＳＴ」タンパク質上のＰ１の結合部位すべてを飽和させる濃度で反応させる。その後、最大の結合を示すものが同定されるまで、反応させた膜を他のタンパク質（Ｐ２、Ｐ３、Ｐｘ）の滴定により逐次的に反応させる。したがって、このタンパク質は、Ｐ１ドメイン以外の「ＳＴ」タンパク質上のドメインに結合する。これらのタンパク質は、図１７に示したようにＰtrapおよびＰsigプローブとなる。
【０３５１】
ｄ）捕捉タンパク質を磁気酸化鉄の核を有する１μｍのポリアミン微粒子に塗布することによってｐtrapプローブを官能化する（本明細書中に参考として組み込まれているＮａｍ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：１８８４〜１８８６（２００３）、たとえば図１８）。一実施形態では、その後、試薬を、試薬のすべてまたは任意の組合せを用いるように構成した任意の試験様式および試験装置に適用させることができる。
【０３５２】
ｅ）ｐsigプローブは、図１９示したように、シグナル伝達タンパク質およびバーコードオリゴヌクレオチドを３０ｎｍの金ビーズに塗布することによって機能化することができる。
【０３５３】
アッセイ
Ａ．一実施形態では、アッセイは以下のステップを含む：
・捕捉プローブ、患者の試料、およびシグナル伝達プローブをすべて一緒に反応ウェル内で反応させる。
・ＳＡＲＳウイルスが存在する場合は、捕捉プローブとシグナル伝達プローブとの間にＳＡＲＳウイルスが、曝された「Ｓ」タンパク質を介して挟まれたものからなる複合体が形成される。
・複合体を結合していない成分から磁気的に単離する。結合していない成分を０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水で洗い流す。
・一本鎖ＤＮＡバーコード配列を遊離するためにＮＡＮＯｐｕｒｅ水を用いて、ハイブリダイズしたＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイズを外す。
・バーコード配列の濃度は、スキャンを用いたＤＮＡ読取り機を使用して測定する。
・ウイルス力価は、「Ｓ」タンパク質の検量線からの外挿によって定量する。
・アッセイは、磁気ビーズを中心として設計した自動試験装置を用いた大量試験に適応させる。
・この試験系は、他者によって１０μｌの試験体積中３００ｆＭ〜３ａＭほど低い濃度のＰＳＡを検出するために用いられている。このアッセイに関連する極度の感度および特異性により、疾患の初期段階にあるＳＡＲＳに感染した患者の痰に見つかる低いウイルスレベルを検出することを可能にする。
【０３５４】
Ｂ．アッセイの反応を図２０に示す。
【０３５５】
Ｃ．診断が成功したかどうかを決定する試験。
１．付加価値および有効性を確立するために、ＳＡＴＡに基づいたアッセイを同じ試料のＲ−ＰＣＲアッセイと比較する。
２．臨床的設定における特異性を決定するために、Ａ型およびＢ型インフルエンザ、アデノウイルス呼吸器系合胞体ウイルスならびに１、２、および３型パラインフルエンザウイルスなどの一般的な呼吸器系ウイルスの感染症に罹患している患者由来の痰について試験を用いる。
【０３５６】
３．その後、アッセイの感度、特異性、精度の値を確立するため、ならびに「現実の世界」の臨床的設定における初期検出および管理でのその有用性を決定するために、ＳＡＲＳ患者由来の痰についてアッセイを用いる。
【０３５７】
ＳＡＲＳウイルス用のワクチン
一実施形態では、ＳＡＲＳウイルスに対するワクチンを提供する。本明細書中に記載するワクチンの産生方法は予言的である。一実施形態では、所定の分布内で最も高い結合親和性を有する数種のタンパク質を選択するよりも、異なる配列をより多くするためにストリンジェンシーがより低い選択を用い、また、高い結合親和性を有するタンパク質の大集団を進化させるためにストリンジェンシーを徐々に増して複数回の突然変異を用いることができる。このようなタンパク質はワクチンの作製において貴重である。その論理は、ただ１つの表面エピトープのみが免疫系と反応することができること以外は抗イディオタイプワクチンと類似している。タンパク質ファミリーによって免疫系に提示される「Ｓ」タンパク質の凝集濃度は、Ｔ細胞およびＢ細胞応答を刺激するのに必要な閾値レベルに達するほど十分に高い。しかし、ファミリー内の任意の単一のタンパク質の濃度は、そのタンパク質に対する応答を刺激するのに必要な閾値よりも低くなる。したがって、ワクチンは「Ｓ」エピトープに対する抗体産生のみを刺激し、タンパク質ファミリー上に存在する他のエピトープのどれに対する抗体産生も刺激しない。これにより、ワクチンを失活させる可能性のある抗体の産生が防がれる。別の実施形態では、ワクチンは、「Ｓ」エピトープおよび「Ｓ」エピトープの活性と中性または相乗の効果のどちらかを有する１つまたは複数の他のエピトープに対する抗体産生を刺激するように合成される。
【０３５８】
一実施形態では、このようにタンパク質を排除選択することを用いてＳＡＲＳウイルスに対するワクチンを生成する一方法は、以下のように行うことができる：
１．準備
ａ）主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）の配列をランダムｍＲＮＡライブラリのすべてのｃＤＮＡに付加する。ＭＨＣ  ＩＩ結合配列は、適切なＴ細胞、および最終的にはＢ細胞の応答を可能にする。
【０３５９】
ｂ）原核または真核翻訳系、ならびにタンパク質とその同族ｍＲＮＡとを連結させるためのＳＡＴＡリンカーを用いて、ライブラリをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳する。
【０３６０】
ｃ）「Ｓ」エピトープに特異的なプローブを用いてタンパク質をライブラリから選択する。プローブはＳＰＲ膜に化学的に連結している。
【０３６１】
ｉ．プローブが抗体である場合、図２１に示したように、除外するためにランダムイディオタイプをブランクとして用いて、抗体を使用する。
【０３６２】
ｉｉ．プローブが別の種類のアプタマーである場合、アプタマーをＳで飽和させる。
【０３６３】
ｄ）抗Ｓ抗体に対して高い親和性を有するタンパク質を選択する。３１３ｎｍのＵＶ光を用いてｍＲＮＡを複合体から解離させ、逆転写し、変異性ＰＣＲを用いてｃＤＮＡ内に突然変異を挿入する。突然変異させたｃＤＮＡライブラリを上記１．ｂに記載のように転写および翻訳し、最も高い親和性を有するタンパク質を前述のように選択する。抗Ｓ抗体に対する最大の親和性を有するタンパク質の集団が得られるまでこの過程を繰り返す。
【０３６４】
ｅ）３１３ｎｍのＵＶ光を用いてｍＲＮＡを複合体から解離させる。その後、各ｍＲＮＡについてｍＲＮＡを逆転写する。
【０３６５】
ｆ）バイオリアクター培養用に大腸菌内または酵母内のどちらかに挿入するため、あるいは拡大したｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で直接翻訳するため、あるいはヤギ乳由来の生成物を選択するためのヤギなどの動物ゲノム内に挿入するためのベクターに、配列を挿入するのに十分なｃＲＮＡをＰＣＲを用いて生成する。
【０３６６】
２．タンパク質ライブラリのワクチンに対する予測される免疫応答
図２２に示したスキームは、タンパク質上のＭＨＣ−ＩＩによって活性化される「Ｓ」受容体を有するＢ細胞を例示し、一実施形態では、それぞれの試薬の生産量のロットをバイオリアクター培養または任意の選択した宿主生物で生産することができる。関与する反応の迅速性により、好ましい試薬を数カ月または数年ではなく数週間で、またモノクローナル抗体のハイブリドーマの生成に必要であるよりも相当に低い費用で生産することができる。上記実施例ではＳＡＲＳについて述べているが、当業者は、上述の方法に従って他のワクチンも生成することができることを理解するであろう。
【０３６７】
別の実施形態では、現在使用されている腫瘍マーカーのいずれかのように、標的が既に知られている場合にアッセイを開発する課題は、課題が捕捉試薬およびシグナル伝達試薬として使用する最良の結合タンパク質の選択のみを含むので、はるかに容易かつ速いと予測される。
所望の結合特徴を有するタンパク質の大集団対小集団の増殖の選択戦略
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質進化を用いて新規タンパク質を開発する。いくつかの実施形態では、用いる方法は結合親和性による選択に基づく。一部の実施形態では、これは、標的リガンドとの結合に対するタンパク質分子間の競合に依存し、最も密に結合しているタンパク質が選択および複製される。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択のストリンジェンシーは、結合していない標的リガンドの濃度によって決定される：
【０３６８】
【数２１】
2007513631.tif 000025
【０３６９】
式中、Ｔは標的リガンドであり、ｋｉは任意の所定のタンパク質分子ｉであるＡｉの解離定数であり、［ＡｉＴ］は標的に結合しているそのタンパク質の濃度であり、［Ａｉ］ｔｏｔは結合しているおよび結合していない、すなわち全タンパク質Ａｉの濃度の和である。これにより、
【０３７０】
【数２２】
2007513631.tif 000026
【０３７１】
は、結合定数ｋｉを有する全タンパク質のうち、結合しているものの合計の分数となる。同様に、任意の２つのタンパク質間の、リガンドに結合することによる濃縮の量は［Ｔ］に依存し、それらの親和性の比は以下のとおりである：
【０３７２】
【数２３】
2007513631.tif 000027
【０３７３】
結合しているタンパク質の比は、開始または全タンパク質の比とは係数＊によって異なることに注目されたい。これは、標的への結合によって成すことができる濃縮の量であるので、濃縮係数と呼ぶことができる。この係数の値は、遊離標的リガンドの濃度［Ｔ］とｋ値との関係によって決定される。ｋ値が［Ｔ］］よりもはるかに小さい場合は、係数は１であり、濃縮は起こらない。ｋ値が［Ｔ］よりもはるかに大きい場合は、濃縮はｋ値の比で最大となる。
【０３７４】
［Ｔ］の規模を制御する方法が２つあることに注目されたい。１つは、すべてのタンパク質が結合した場合も全タンパク質濃度が［Ｔ］に影響を与えないほど十分に小さくなるように、十分な体積を用いることである：
［Ｔ］tot＝［Ｔ］＋Σ［ＡiＴ］
合計のＴがタンパク質濃度よりも十分に大きい場合は、これは結合していないＴと本質的に等価である。もう１つは、タンパク質のｋ値の分布を知ること、所望の［Ｔ］値を仮定すること、および上記式（１）を用いて必要な［Ｔ］ｔｏｔを見出すことである。用いる［Ｔ］値の選択は、所望する最終結果に依存する。一部の目的には、突然変異を有するまたは有さない非常にストリンジェントな選択（低い［Ｔ］値）が最も有用であり得る。これにより、少数の密に結合したタンパク質が所望される場合に希少な数のタンパク質が見つかる。別の極限は、突然変異と結びついたストリンジェンシーがはるかに低い選択を反復様式で用いることである。これにより、高親和性タンパク質の集団全体が増殖される。もちろん、実際にはおそらく組合せが用いられる。
【０３７５】
Ｌａｎｃｅｔ他と矛盾がない仮定のｋ分布を想定されたい：
ここで、１０-9対１０-12の［Ｔ］値の効果を用いて、
【０３７６】
【化２】
2007513631.tif 000028
【０３７７】
その同族ｍＲＮＡに結合している結合タンパク質を収穫し、その後、ｍＲＮＡのリバースＰＣＲを行って最初のものに等しい濃度を得、転写および翻訳を行うことを検討されたい：
【０３７８】
【化３】
2007513631.tif 000029
【０３７９】
開始集団が１０11種の異なるタンパク質を含む場合は、［Ｔ］＝１０-9の選択により、これらのうち百万種より少し低い数が回収され、［Ｔ］＝１０-12の選択により、数百種のみが回収される。親和性がより低い標的では、これはさらに少なくなる。赤色曲線を突然変異させ、次いでわずかに高い値のｐＴ値で収穫することにより、非常に大きな数の、安定してより高い結合親和性を有するタンパク質が生じる。
【０３８０】
このより時間のかかる戦略はどのような場合に好ましいのであろうか。その一例は、単に一つにとどまらない選択基準を用いてタンパク質を作製することを望む場合である。たとえば、酵素を作製するためには、触媒させる反応の遷移状態の類似体と密に結合するが、基質とははるかに緩く結合するタンパク質の選択を望むであろう（ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ）。これは、各基準において順々に多数の分子から選択されるようにステップを準備することによって、容易になる。
【０３８１】
これを用いるさらに別の方法は、ただ１つの共通する表面的特徴を有する多数のタンパク質を作製することである。
【０３８２】
【化４】
2007513631.tif 000030
【０３８３】
【化５】
2007513631.tif 000031
【０３８４】
これは、一次抗体応答の誘発および後の二次応答が濃度依存的であるので有意である：
【０３８５】
【化６】
2007513631.tif 000032
【０３８６】
他の共通表面エピトープが存在しないだけでなく、Ｔ細胞の認識に用いることができる共通のペプチド断片も存在しない。これにより、単一の共通表面エピトープに対する免疫化がさらに予防される。これは、血清病様の反応を生じさせずにＳＣＥＰＰをブロッキングタンパク質として直接用いることができることを意味する：
【０３８７】
【化７】
2007513631.tif 000033
【０３８８】
必要な場合は、結合した毒素をその生理的な受容体に曝し、再度ＳＣＥＰＰを曝す。結合したＳＣＥＰＰを廃棄し、結合していないものを収穫する。これにより、受容体をブロッキングしないタンパク質が除外される。明らかに、他の競合形態を用いることができる。これは、上述した結合の複数の基準の一例である。
【０３８９】
【化８】
2007513631.tif 000034
【０３９０】
ＳＣＥＰＰと表面エピトープを変化させないＭＨＣ  ＩＩ結合ペプチドとの組合せを用いて、唯一の表面エピトープを標的としたワクチンを作製することができる。一例として、以下を検討されたい：
【０３９１】
【化９】
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【０３９２】
【化１０】
2007513631.tif 000036
【０３９３】
ＳＣＥＰＰを別の生物由来の保護抗体の抗原結合領域に相補的であるように増殖した場合、その結果は、ワクチン接種した生物内において類似した抗体を再生産するワクチンとなる。これの論理は抗イディオタイプワクチンの論理に酷似している。ＳＣＥＰＰを細胞性ウイルス受容体を補完するように増殖した場合、産生された抗体は受容体に類似する。一部の実施形態では、この技法によって得られる一利点は、これにより、抗体が結合する、タンパク質上の特定のエピトープの選択が可能となることである。リポソーム内に、天然タンパク質は必要でないが、それを用いることにより親和性の成熟が可能となる。タンパク質の内部に維持されるが、ＡＰＣの酸プロテアーゼによって消化されると遊離してＭＨＣ  ＩＩに結合する配列を用いることなど、ＭＨＣ結合ペプチドを含める他の方法が存在する。
【０３９４】
生物戦争
一実施形態では、生物戦争の薬剤として用いられる毒素（感染性生物によって生成されたもの、または兵器化した生物戦争の薬剤として生成されたもののどちらに対しても）を中和する結合タンパク質も作製することができる。このような薬剤には、それだけには限定されないが、ボツリヌス毒素、リシン、および炭疽毒素が含まれてもよい。別の実施形態では、それだけには限定されないが、ソマン、ＶＸ、およびセリンを含めた神経ガスを中和する酵素タンパク質も作製することができる。好ましい中和タンパク質は、薬剤が身体と接触する前にそれを失活させるために衣類などの物品に組み込むことができ、また、表面上の薬剤および／または薬剤がまだ空気中にある間にそれを失活させるためにエアロゾルとして用いることができる。
【０３９５】
農業
別の実施形態では、ヒトの治療剤と同様、食用作物および家畜において疾患を引き起こす生物上の確立された表面マーカーに結合するタンパク質を作製することができる。好ましい実施形態は、たとえば、それだけには限定されないが、炭疽、畜牛の口蹄病および狂牛病、ならびに家禽のニューカッスル病を含めた疾患に対する安価な診断試験、治療的処置ならびにワクチンを作製するために用いることができる。さらに、口蹄病を引き起こすものなどの感染性の高い生物の別の実施形態では、納屋、畜舎、飼葉入れ、飼養場および輸送装置などの様々な表面を汚染除去して、好ましくは疾患の発症または他の動物もしくは部位への拡大を予防する、広範囲の用途において使用するために、好ましいタンパク質産物を安価に作製することができる。
【０３９６】
産業
別の実施形態では、好ましくは特定の産業反応に最適な温度、圧力および／または化学的条件で機能することによって最大の生産効率を提供する酵素タンパク質を作製することもできる。現在、より良好な酵素の選択肢の欠如により、産業は多くの場合最適未満の生産条件で機能する酵素を用いることを強いられている。たとえば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅはすべての形態のセルロースを消化する酵素を開発しようと試みている。しかし、彼らが販売している酵素は限定されたセルロース活性しか有さない。
【０３９７】
モノクローナル抗体の結合タンパク質代用物
一実施形態では、好ましい方法は、好ましくは現在臨床医学で用いられている既存のモノクローナル抗体よりも優れた、癌の治療剤として有用な新規の結合タンパク質をもたらす。これらのタンパク質の実施形態は、好ましくは従来の抗体を超える優れた結合および／または特異性の特性を実証し、好ましくは現在用いられているヒト化マウスモノクローナル抗体に関連するアレルギー性および／または毒性の特性を有さない。
【０３９８】
モノクローナル抗体に基づいた製品の理論的根拠
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を特効薬として用いることは、初期のｍＡｂは完全にネズミ由来であり、したがってヒトに注射した場合に問題を引き起こしたので（高熱、アレルギー反応、肝臓および腎臓毒性）、約１０年前に支持が下がった。また、これらはレシピエントによって産生される抗ｍＡｂ抗体によって急速に失活し、その結果、半減期が許容できないほど短かった。最近の技術的進歩により、マウス−ヒトキメラｍＡｂおよび数種の完全にヒト由来のｍＡｂの作製が可能となった。これらの進歩により初期のネズミ由来ｍＡｂに関連する問題が顕著に低減されており、それは現在、病状を治療する真の特効薬であるという最初の期待を実現し始めるまでになっている。したがって、臨床社会は現在、ｍＡｂに基づいた治療を用いることに非常に意欲的であるが、依然として副作用に悩まされてもいる。したがって、風潮は、好ましくはｍＡｂが標的とするものと同じ確立された癌エピトープに結合するが、好ましくは負の副作用を有さない、１つまたは複数の実施形態を用いて作製した好ましい結合タンパク質の許容に好都合である。
【０３９９】
癌の治療には、研究者らは、悪性細胞の表面上で発現されるエピトープに焦点を置いてきた。流体腫瘍上で最も標的とされるよく特徴づけられたエピトープが少なくとも８種存在する。安定した細胞表面抗原エピトープ（たとえばＣＤ−２０、２２）には、一般に好まれる現在のよく研究されている戦略は、裸のｍＡｂまたは同位体（たとえば90イットリウム、131ヨウ素または213ビスマス）で標識したｍＡｂを用いることである。裸のｍＡｂはアポトーシスを始動することができ、同位体は標的細胞および周辺の細胞を死滅させる。あるいは、固形腫瘍では、表面エピトープ（たとえばＣＤ−１９、３３）が、タンパク質ライブラリ上の「Ｓ」タンパク質ドメインと結合した際に内部に取り入れられる。ウイルス上の「Ｓ」タンパク質に対する抗体を産生および放出してｉｔｍＡｂを失活させるＢ細胞のクローンが形成する。これらに関しては、ｍＡｂを毒素で標識することが一般に好まれる戦略である。このエピトープのクラスはｍＡｂと結合した際に内部に取り入れられ、したがって、毒素も細胞内に引き込まれて細胞を死滅させる一方で周辺の細胞は免れる。ワクチンは、免疫原性を誘発させるために尿酸結晶または何らかの類似のアジュバントと共に注射する。
【０４００】
本発明のいくつかの好ましい実施形態およびその変形を詳述したが、当業者には他の改変および使用方法が容易に明らかであろう。したがって、本発明の精神または特許請求の範囲から逸脱せずに様々な応用、改変および置換を行ってもよいことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４０１】
【図１】ｍＲＮＡおよびそのタンパク質産物によって形成された複合体の一例を示す模式図である。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択および進化過程の一例を示す模式図である。
【図３】本発明のｔＲＮＡ分子を構築する一方法を例示する図である。
【図４】ｍＲＮＡをｔＲＮＡに連結することができるように架橋結合分子であるソラレンを配置することができる、２つの代替実施形態について記載した図である。
【図５】ウリジンおよび疑似ウリジンの化学構造を示す図である。
【図６】本発明の一部の実施形態を示す図である。
【図７】所定の長さのヌクレオチドが得られる確率を示す図である。
【図８】１２８個のアミノ酸のタンパク質のｍＲＮＡを生成する反応スキームを示す図である。
【図９】濃度ｐＴ＝６とｌｏｇ  ｋとの関係を示す図である。
【図１０】濃度とｌｏｇ  ｋとの関係を示す図である。
【図１１】同じ平均値を用いたＬａｎｃｅｔの経験分布とポアソンとの関係を示す図である。
【図１２】様々な［Ｔ］値によって結合される曲線のファミリーを示す図である。
【図１３】［Ｔ］＝１０-12を用いた４回の生成を示す図である。
【図１４】通常のタンパク質合成と非限定的な実施形態でのタンパク質合成方法との比較を示す図である。
【図１５】リンカー技術の非限定的な一実施形態を、開始ｍＲＮＡライブラリを作製するその独自の方法の一実施形態、及びその独自の選択手順の一実施形態と合わせる態様を示す図である。
【図１６】ＳＡＲＳ「Ｓ」タンパク質または他の標的「Ｔ」タンパク質（以降「ＳＴ」）でコーティングした表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）膜と連結させたランダムライブラリを示す図である。
【図１７】ＳＰＲ膜上の「Ｓ」または「Ｔ」タンパク質を示す図である。
【図１８】捕捉プローブでコーティングしたポリアクリルアミド磁気ビーズを示す図である。
【図１９】ｐｓｉｇタンパク質およびバーコードオリゴヌクレオチドでコーティングした金粒子を示す図である。
【図２０−１】ＳＡＲＳウイルスのアッセイを示す図である。
【図２０−２】ＳＡＲＳウイルスのアッセイを示す図である。
【図２０−３】ＳＡＲＳウイルスのアッセイを示す図である。
【図２１】抗Ｓ抗体によってＳＰＲ膜上に捕捉されたタンパク質−ＳＡＴＡ−ｍＲＮＡライブラリを示す図である。
【図２２】癌の治療を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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