(57)【要約】本発明は、炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置する新規な方法、ならびに炎症性疾患およびその臨床的症状の処置に有用な薬物を同定およびスクリーニングする新規な方法を包含する。本発明者らは、いくつかの癌に影響を有することが公知の転写調節因子であるＨＩＦ−１αの活性が、慢性関節リウマチの病態生理学に顕著な影響を有するということを見出した。炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）の症状は、ＨＩＦ−１αの活性を阻害する化合物を投与することによって緩和され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和する方法であって、該方法は、
ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの治療有効量を慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、アンチセンスインヒビターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＩＦ−α活性のアンタゴニストが、低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、少なくとも４５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アンタゴニストが、少なくとも８５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニストが、少なくとも９５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断ノンレスポンダーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
関節において滑膜細胞の密度を低下させる方法であって、該方法は、
異常に上昇した滑膜細胞密度に関連する状態を有する患者に、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、核酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸が、アンチセンスインヒビターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、低分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンタゴニストが、少なくとも４５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンタゴニストが、少なくとも８５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンタゴニストが、少なくとも９５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断ノンレスポンダーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
関節において軟骨分解を減少させる方法であって、該方法は、
異常に高い率の軟骨分解に関連する状態を有する患者に、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、核酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、アンチセンスインヒビターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＩＦ−α活性のアンタゴニストが、低分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記アンタゴニストが、少なくとも４５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アンタゴニストが、少なくとも８５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンタゴニストが、少なくとも９５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断ノンレスポンダーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
滑膜組織においてＩＬ−６濃度を低下する方法であって、該方法は、
滑膜組織における異常に高い濃度のＩＬ−６に関連する状態を有する患者に、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、核酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸が、アンチセンスインヒビターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストが、低分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記アンタゴニストが、少なくとも４５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが、少なくとも８５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンタゴニストが、少なくとも９５％ＨＩＦ−１α活性を低下させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断ノンレスポンダーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
慢性関節リウマチの処置に使用するための薬物を製造する方法であって、該方法は、
（ａ）以下の工程：
（ｉ）化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量を該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量と比較する工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも低い場合に、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用なものとして同定する工程
によって、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用なものとして同定する工程；ならびに
（ｂ）ヒトでの消費のために該化合物を処方する工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記化合物の存在化におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも４５％低い、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物の存在化におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも８５％低い、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物の存在化におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも９５％低い、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、低酸素条件下で測定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＨＩＦ−１α活性の量を測定する工程が、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）に結合されたＨＩＦ−１αの量を測定する工程を包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＨＲＥが、配列５’−ＴＡＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１）を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＨＩＦ−１α活性の量を測定する工程が、ＨＩＦ−１α応答性遺伝子からの転写の量を測定する工程を包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＨＩＦ−１α応答性遺伝子が、サイクリンＧ２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−２、ＩＧＦ結合タンパク質１／２／３、ＷＡＦ１、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β３、アドレノメデュリン、エリスロポエチン、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ結合タンパク質１／２／３、一酸化窒素シンタテーゼ−２、ＴＧＦ−α、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＲＴＰ８０１、自己分泌型運動因子／ＧＰＩ、ｃ−ＭＥＴ、ＬＤＬレセプター関連タンパク質１、ＴＧＦ−α、ケラチン１４／１８／１９、ビメンチン、ＭＩＣ２／ＣＤ９９、エリスロポエチン、内分泌腺由来型ＶＥＧＦ、エンドグリン、レプチン、ＬＤＬレセプター関連性タンパク質１、ＴＧＦ−β３、α１Ｂ−アドレナリン作用性レセプター、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ−１、一酸化窒素シンタテーゼ−２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、ＥＴＳ−１、ＮＵＲ７７、カルボニックアンヒドラーゼ９、腸三葉型因子、多剤耐性１、アデニレートキナーゼ３、Ｅｃｔｏ−５’−ヌクレオチダーゼ、セルロプラスミン、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター、ヘキソキナーゼ１／２、自己分泌型運動因子／ＧＰＩ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、ＧＡＰＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ−３、ホスホフルクトキナーゼＬ、ホスホグリセレートキナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、カテプシンＤ、Ｖ型コラーゲン（α１）、フィブロネクチン１、マトリックスメタロプロテアーゼ２、プラスミノゲン活性化因子インヒビター１、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα（Ｉ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子レセプター、レプチン、およびトランスグルタミナーゼ２からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＩＦ−１α応答性遺伝子が、ＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ−１、エノラーゼ１、アルドラーゼＡからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、以下：
（ａ）前記化合物の存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量を、該化合物の非存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量と比較する工程
を包含するプロセスによって測定され、そしてここで、該移動する白血球の量は、該ＨＩＦ−１α活性の量を表す、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物は、該化合物の存在下において移動する白血球の量が、該化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも３０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記化合物は、該化合物の存在下において移動する白血球の量が、該化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも４０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記化合物は、該化合物の存在下において移動する白血球の量が、該化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも５０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記内皮細胞が、培養ヒト臍静脈内皮細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記内皮細胞が、腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１によって刺激される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの層の内皮細胞が、単層の内皮細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記白血球が、単球である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、正常酸素条件下で測定される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物の存在化におけるＨＩＦ−１α活性の低下が、該化合物の非存在下における白血球のアポトーシスの量よりも多い、該化合物の存在下における白血球のアポトーシスの量を観察することによって同定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項６１】
前記白血球が、マクロファージである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、該化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．２５倍多い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、該化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．５倍多い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、該化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．７倍多い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記マクロファージのアポトーシスの量が、以下：
（１）前記化合物の存在下か、もしくは該化合物の非存在下において、アポトーシスの誘発因子に細胞の集団を曝す工程；および
（２）ＤＮＡ分断を有する該集団において細胞の割合を測定する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで該ＤＮＡ分断を有する細胞の割合は、マクロファージのアポトーシスの量を表す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記アポトーシスの誘発因子が、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−αまたはアゴニスト性抗デスレセプター抗体からなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記アゴニスト性抗デスレセプター抗体が、抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体、抗Ｆａｓ抗体、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体、または抗ＤＲ６抗体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＤＮＡ分断を有する細胞の割合が、細胞のプロピジウム取込みのＦＡＣＳ分析によって測定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＮＡ分断を有する細胞の割合が、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記マクロファージのアポトーシスの量が、以下：
（１）前記化合物の存在下か、もしくは該化合物の非存在下において、アポトーシスの誘発因子に細胞の集団を曝す工程；および
（２）細胞膜の細胞外表面上にホスファチジルセリンを発現する集団において、細胞の割合を測定する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで、該細胞膜の細胞外表面上にホスファチジルセリンを発現する細胞の割合は、マクロファージのアポトーシスの量を表す、請求項６１に記載の方法。
【請求項７１】
前記アポトーシスの誘発因子が、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α、またはアゴニスト性抗デスレセプター抗体からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記アゴニスト性抗デスレセプター抗体が、抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体、抗Ｆａｓ抗体、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体、または抗ＤＲ６抗体である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
細胞質膜の細胞外表面上に存在するホスファチジルセリンを発現する細胞の割合が、該ホスファチジルセリンへのアネキシンＶの結合によって測定される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記アネキシンＶが、蛍光マーカーに結合体化される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、以下：
（ａ）前記化合物の存在下における新脈管形成の量を該化合物の非存在下における新脈管形成の量と比較する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで該新脈管形成の量は、ＨＩＦ−１α活性の量を表す、請求項４１に記載の方法。
【請求項７６】
前記化合物は、該化合物の存在下における新脈管形成の量が、該化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも２５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物は、該化合物の存在下における新脈管形成の量が、該化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも３５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記化合物は、該化合物の存在下における新脈管形成の量が、該化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも５０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記新脈管形成の量が、以下：
（１）基底タンパク質の層を提供する工程；
（２）前記化合物の存在下もしくは該化合物の非存在下において、該基底膜の層上の内皮細胞の集団を培養する工程；
（３）形成された毛細管の量を定量する工程
を包含するプロセスによって測定される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記形成された毛細管の量が、細胞の管を可視化する工程、分枝点を計数する工程、または視野における全毛細管の長さを計算する工程によって同定される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
慢性関節リウマチの処置において有用な化合物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量を、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１αの化合物の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１αの化合物の量よりも低い場合に、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用なものとして選択する工程
を包含する、方法。
【請求項８２】
化合物の収集物をスクリーニングするための請求項８１に記載の方法であって、該方法は、該収集物の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程をさらに包含し、ここで該収集物のうちの少なくとも１つの化合物は、慢性関節リウマチの処置に有用なものとして選択される、方法。
【請求項８３】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも４５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置において有用なものとして選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも８５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置において有用なものとして選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも９５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置において有用なものとして選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、低酸素条件下で測定される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）に結合されたＨＩＦ−１αの量によって測定される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＨＲＥが、配列５’−ＴＡＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１）を有する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、ＨＩＦ−１α応答性遺伝子からの転写の量によって測定される、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＨＩＦ−１α応答性遺伝子が、サイクリンＧ２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−２、ＩＧＦ結合タンパク質１／２／３、ＷＡＦ１、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β３、アドレノメデュリン、エリスロポエチン、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ結合タンパク質１／２／３、一酸化窒素シンテターゼ−２、ＴＧＦ−α、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＲＴＰ８０１、自己分泌型運動因子／ＧＰＩ、ｃ−ＭＥＴ、ＬＤＬレセプター関連タンパク質１、ＴＧＦ−α、ケラチン１４／１８／１９、ビメンチン、ＭＩＣ２／ＣＤ９９、エリスロポエチン、内分泌腺由来型ＶＥＧＦ、エンドグリン、レプチン、ＬＤＬレセプター関連タンパク質１、ＴＧＦ−β３、α１Ｂ−アドレナリン作用性レセプター、アドレノメデュリン、エンドセリン−ｌ、ヘムオキシゲナーゼ−１、一酸化窒素シンテターゼ−２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、ＥＴＳ−１、ＮＵＲ７７、カルボニックアンヒドラーゼ９、腸三葉型因子、多剤耐性１、アデニレートキナーゼ３、Ｅｃｔｏ−５’−ヌクレオチダーゼ、セルロプラスミン、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター、ヘキソキナーゼ１／２、自己分泌型運動因子／ＧＰＩ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、ＧＡＰＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ−３、ホスホフルクトキナーゼＬ、ホスホグリセレートキナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、カテプシンＤ、Ｖ型コラーゲン（α１）、フィブロネクチン１、マトリックスメタロプロテアーゼ２、プラスミノゲン活性化因子インヒビター１、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα（１）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子レセプター、レプチン、およびトランスグルタミナーゼ２からなる群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＨＩＦ−１α応答性遺伝子が、ＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ−１、エノラーゼ１、アルドラーゼＡからなる群より選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＨＩＦ−１α応答性遺伝子が、検出可能なマーカーに結合される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記検出可能なマーカーが、蛍光マーカーである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、以下：
（ａ）前記化合物の存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量を、該化合物の非存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量と比較する工程
を包含するプロセスによって測定され、そしてここで、該移動する白血球の量は、ＨＩＦ−１α活性の量を表す、請求項８１に記載の方法。
【請求項９５】
前記化合物は、該化合物の存在下において移動する白血球の量が、該化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも３０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であるものと選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記化合物は、該化合物の存在下において移動する白血球の量が、該化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも４０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であるものと選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記化合物は、該化合物の存在下において移動する白血球の量が、該化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも５０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であるものと選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記内皮細胞が、培養ヒト臍静脈内皮細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記内皮細胞が、腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１によって刺激される、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
前記内皮細胞の少なくとも１つの層が、内皮細胞の単層である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
前記白血球が、単球である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、正常酸素条件下で測定される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記化合物の存在化におけるＨＩＦ−１α活性の低下が、該化合物の非存在下における白血球のアポトーシスの量よりも多い、該化合物の存在下における白血球のアポトーシスの量を観察することによって同定される、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記白血球が、マクロファージである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、該化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．２５倍多い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であるものと選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、該化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．５倍多い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であるものと選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、該化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．７倍多い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であるものと選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記マクロファージのアポトーシスの量が、以下：
（１）前記化合物の存在下か、もしくは該化合物の非存在下において、アポトーシスの誘発因子に細胞の集団を曝す工程；および
（２）ＤＮＡ分断を有する集団において細胞の割合を測定する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで該ＤＮＡ分断を有する細胞の割合は、マクロファージのアポトーシスの量を表す、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記アポトーシスの誘発因子が、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−αまたはアゴニスト性抗デスレセプター抗体からなる群より選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記アゴニスト性抗デスレセプター抗体が、抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体、抗Ｆａｓ抗体、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体、または抗ＤＲ６抗体である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＤＮＡ分断を有する細胞の割合が、細胞のプロピジウム取込みのＦＡＣＳ分析によって測定される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＤＮＡ分断を有する細胞の割合が、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記マクロファージのアポトーシスの量が、以下：
（１）前記化合物の存在下か、もしくは該化合物の非存在下において、アポトーシスの誘発因子に細胞の集団を曝す工程；および
（２）細胞膜の細胞外表面上にホスファチジルセリンを発現する集団において、細胞の割合を測定する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで、該細胞膜の細胞外表面上にホスファチジルセリンを発現する細胞の割合は、マクロファージのアポトーシスの量を表す、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１４】
前記アポトーシスの誘発因子が、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α、またはアゴニスト性抗デスレセプター抗体からなる群より選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記アゴニスト性抗デスレセプター抗体が、、抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体、抗Ｆａｓ抗体、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体、または抗ＤＲ６抗体である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
細胞質膜の細胞外表面上に存在するホスファチジルセリンを発現する細胞の割合が、該ホスファチジルセリンへのアネキシンＶの結合によって測定される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記アネキシンＶが、蛍光マーカーに結合体化される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、以下：
（ａ）前記化合物の存在下における新脈管形成の量を該化合物の非存在下における新脈管形成の量と比較する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで該新脈管形成の量は、ＨＩＦ−１α活性の量を表す、請求項８１に記載の方法。
【請求項１１９】
前記化合物は、該化合物の存在下における新脈管形成の量が、該化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも２５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記化合物は、該化合物の存在下における新脈管形成の量が、該化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも３５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記化合物は、該化合物の存在下における新脈管形成の量が、該化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも５０％低い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記新脈管形成の量が、以下：
（１）基底タンパク質の層を提供する工程；
（２）前記化合物の存在下もしくは該化合物の非存在下において、該基底膜の層上の内皮細胞の集団を培養する工程；
（３）形成された毛細管の量を定量する工程
を包含するプロセスによって測定される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記形成された毛細管の量が、細胞の管を可視化する工程、分枝点を計数する工程、または視野における全毛細管の長さを計算する工程によって同定される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和する方法であって、該方法は、
ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび抗リウマチ薬を、慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１２５】
前記抗リウマチ薬が、症状を軽減する抗リウマチ薬である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗リウマチ薬が、疾患を改変する抗リウマチ薬である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗リウマチ薬が、メトトレキサート、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、およびステロイドからなる群より選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者であり、そして前記抗リウマチ薬が、メトトレキサート、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたはステロイドである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断耐性患者であり、そして前記抗リウマチ薬が、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたはステロイドである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断過形成ノンレスポンダーである、請求項１２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．導入）
（Ａ．関連出願）
本出願は、２００３年１１月２６日に出願された米国仮特許出願番号６０／５２５，３６３の利益を主張する。米国仮特許出願番号６０／５２５，３６３は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（Ｂ．発明の分野）
本発明は、慢性関節リウマチを処置する新規な方法および慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（Ｃ．発明の背景）
１００を超える種類の関節炎があり、そのうち慢性関節リウマチは最も痛く有害な種類である。関節の一般的な疾患である慢性関節リウマチは、２００万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼしている自己免疫疾患であり、男性よりも女性の間で発生率が著しく高い。慢性関節リウマチでは、関節を裏打ちする膜または組織（滑膜）が炎症（滑膜炎）を起こすようになる。時間と共に、この炎症は関節組織を破壊し得、障害を引き起こす。慢性関節リウマチは身体の複数の器官に影響を及ぼしうるため、慢性関節リウマチは全身病と呼ばれ、時にはリウマチ様疾患と呼ばれる。リウマチ様疾患の発症は、通常は中年においてであるが、その２０代または３０代においても頻繁に発生する。さらなる議論については、非特許文献１を参照のこと。
【０００４】
リウマチ様疾患に関連する疼痛および全身（全身性）症状は、身体に障害を引き起こし得る。時間と共に、慢性関節リウマチは、重大な関節破壊を生じ得、変形および日常活動の困難につながる。慢性関節リウマチを患った人々が、疼痛および進行性障害によって引き起こされ得るある程度の鬱病に苦しむことは珍しいことではない。ある研究は、慢性関節リウマチを有する人々の４分の１が、その診断の６〜７年後までには働くことができず、２０年後には半分が働くことができないということを報告している（非特許文献２）。慢性関節リウマチのような筋骨格状態は、医療ケアならびに逸失賃金および生産などの間接的出費として、米国経済に毎年６５０億ドル近くを費やさせている。
【０００５】
滑膜炎症、軟骨の急速な破壊および罹患関節における骨の侵食が、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の特徴である。近年の証明により、骨格組織の破壊および炎症がリウマチ関節において重複しているが同一でない生物学的プロセスによって調節されることと、これらの２つの局面に対する治療効果が相関する必要がないこととが示されている。関節における生物学的プロセスの複雑さのために、数学およびコンピュータモデルの使用は、種々の組織対応物、細胞タイプ、メディエータ、ならびに関節疾患および健全なホメオスタシスに関与する他の因子間の相互作用をよりよく理解するのに役立つ。複数の研究者が、慢性関節リウマチの生物学的プロセスではなくむしろ、関節の機械的環境の簡単なモデルを構築して、その結果を軟骨および骨の疾患および発育のパターンと比較した（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。コンピュータで扱うことができる関節疾患の数学モデルは、滑膜を含む複数のコンパートメントを含み、これらのコンパートメントの相互作用は、２００２年１２月５日に公開された特許文献１および２００３年４月２４日に２００３−００７８７５９として公開された特許文献２に述べられている。どちらの刊行物も参考としてその全体が、本明細書において援用される。
【０００６】
慢性関節リウマチは、現在、制御され得るが治癒できない慢性疾患である。処置の目標は、症状の軽減および疾患を悪化させないことである。慢性関節リウマチの大半の処置の目標は、疼痛を軽減し、炎症を減少させ、関節損傷の進行を遅延または停止させて、人の機能する能力を改善することである。処置への現在のアプローチは、ライフスタイルの変化、薬剤、外科手術、ならびに日常的モニタリングおよびケアを含む。慢性関節リウマチの処置に使用される薬剤は、この疾患の進行に影響を与える方法に基づいて２つの群（（１）症状緩和薬および（２）疾患改変薬）に分類され得る。
【０００７】
症状、例えば、疼痛、硬直、および腫脹を軽減するための薬剤が使用され得る。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセン）は、疼痛を制御するために使用され、炎症を減少させるのに役立ち得る。これらの抗炎症薬は、疾患を制御せず、または疾患が悪化するのを停止しない。コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン（メドロール）は、疼痛を制御して、炎症を減少させるために使用される。それらは疾患を制御して、疾患が悪化するのを停止させる；しかしながら、コルチコステロイドを長期に亘る唯一の療法として使用することは、最良の処置とは見なされない。コルチコステロイドは、多くの場合、最大６ヶ月かかりうる抗リウマチ薬がその全有効性に達するときまで、関節炎症の症状および拡大を制御するために使用される。非処方薬剤（例えば、アセトアミノフェン）および局所用薬剤（例えば、カプサイシン）は疼痛を制御するために使用されるが、通常、関節腫脹または疾患の悪化に影響を及ぼさない。
【０００８】
疾患改変抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）は、慢性関節リウマチの進行を制御し、関節破壊および身体障害の予防を試みるために使用される。これらの抗リウマチ薬は、他の抗リウマチ薬と、または他の薬剤、例えば、非ステロイド性抗炎症薬と組合せて投与されることが多い。慢性関節リウマチに一般に処方される疾患改変抗リウマチ薬としては、抗マラリア薬剤、例えば、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）またはクロロキン（Ａｒａｌｅｎ）、メトトレキサート（例えば、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、スルファサラジン（Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ）、レフルノミド（Ａｒａｖａ）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）およびアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）が挙げられる。慢性関節リウマチにはあまり一般的に処方されないＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、ペニシラミン（例えば、ＣｕｐｒｉｍｉｎｅまたはＤｅｐｅｎ）、金塩（例えば、ＲｉｄａｕｒａまたはＡｕｒｏｌａｔｅ）、ミノサイクリン（例えば、ＤｙｎａｃｉｎまたはＭｉｎｏｃｉｎ）、シクロスポリン（例えば、ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）、およびシクロホスファミド（例えば、ＣｙｔｏｘａｎまたはＮｅｏｓａｒ）を含む。これらの抗リウマチ薬の一部は、作用するまで最大６ヶ月かかることがある。多くは重篤な副作用を有する。
【特許文献１】国際公開第０２／０９７７０６号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第１０／１５４，１２３号明細書
【非特許文献１】Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，第１６版，第１０６節
【非特許文献２】Ｏ’Ｄｅｌｌ  ＪＲ（２００１）．Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｉｃｔｕｒｅ．ＷＪ  Ｋｏｏｐｍａｎ（編），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，第１４版，第１巻，第５８章，ｐｐ．１１５３−１１８６．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ
【非特許文献３】ＷｙｎａｒｓｋｙおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ，「Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．」１９８３年，第１６巻：２４１−２５１
【非特許文献４】ＰｏｌｌａｔｓｃｈｅｋおよびＮａｈｉｒ，「Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．」１９９０年，第１４３巻：４９７−５０５
【非特許文献５】Ｂｅａｕｐｒｅら，「Ｊ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．」２０００年，第３７巻：１４５−１５１
【非特許文献６】Ｓｈｉら，「Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ」１９９９年，第１７巻：６４６−６５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ慢性関節リウマチの処置のための新しい、治療的に有効な薬物への要求はもちろんのこと、そのような薬物を同定するための新しい方法への要求も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（Ｄ．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、慢性関節リウマチを有する患者に低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ）１α（ＨＩＦ−１α）活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減するための方法を提供する。好ましい実施形態において、上記アンタゴニストは、ＨＩＦ−１α活性を、少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも８５％、そして最も好ましくは少なくとも９５％減少する。ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストは、タンパク質、核酸または低分子インヒビターでありうる。「低分子」は、本明細書では、１０００ダルトン未満の分子量を有する分子として定義される。好ましいアンタゴニストとしては、ＹＣ−１刺激物質（ｓＧＣ）、２−メトキシエストラジオール、タキソール、ビンクリスチン、１−メチルプロピル−２−イミダゾリルジスルフィド、プレウロチン（ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ）、ラパマイシン／ＣＣＩ７７９、ＬＹ２９４００２、ワートマニン、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、カンプトセシン（およびアナログ（例えば、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ））、ＰＤ９８０５９、キノカマイシン（ｑｕｉｎｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（およびアナログ（例えば、ＮＣＳ−６０７０９７（ＤＸ−５２−１）））、ならびにホスフェートアンドテンションホモログ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（ＰＴＥＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、患者は、メトトレキサート耐性患者、ＴＮＦ−α遮断軟骨ノンレスポンダー（ＣＮＲ）、ＴＮＦ−α遮断過形成ノンレスポンダー（ＨＮＲ）、またはＴＮＦ−α遮断二重ノンレスポンダー（ＤＮＲ）である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、異常に上昇した滑膜細胞密度に関連する状態を有する患者にＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、関節内の滑膜細胞の密度を低下させるための方法を提供する。好ましい実施形態において、このアンタゴニストは、ＨＩＦ−１α活性を、少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも８５％、そして最も好ましくは少なくとも９５％減少させる。
【００１２】
本発明はまた、異常に高い割合の軟骨破壊に関連する状態を有する患者にＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、関節内の軟骨破壊を減少させるための方法も提供する。好ましい実施形態において、このアンタゴニストは、ＨＩＦ−１α活性を、少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも８５％、そして最も好ましくは少なくとも９５％減少させる。
【００１３】
本発明のさらに別の局面は、滑膜組織中のＩＬ−６の異常に高い濃度に関連する状態を有する患者にＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させるための方法を提供する。好ましい実施形態において、このアンタゴニストは、ＨＩＦ−１α活性を、少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも８５％、そして最も好ましくは少なくとも９５％減少させる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、炎症性疾患を罹患する患者にＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。好ましい実施形態において、上記アンタゴニストは、ＨＩＦ−１α活性を、少なくとも４５％まで、より好ましくは少なくとも８５％まで、そして最も好ましくは少なくとも９５％まで減少させる。好ましい実施形態において、炎症性疾患は、糖尿病、動脈硬化症、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流障害、糸球体腎炎、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤内炎症性疾患、多発性硬化症、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎（ｏｌｉｇｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、および炎症性皮膚疾患からなる群より選択される。さらに好ましくは、炎症性疾患は、関節炎、例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、股関節炎、骨関節炎、または多発性関節炎である。最も好ましくは、炎症性疾患は慢性関節リウマチである。
【００１５】
本発明のさらに別の局面は、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和する方法を提供し、この方法は、ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび抗リウマチ薬を慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を包含する。この抗リウマチ薬は、ＨＩＦ−１αのアンタゴニスト作用と組み合わせて、ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用または抗リウマチ薬単独での処置よりもより良好な臨床結果を提供する、任意の薬物である得る。この抗リウマチ薬は、症状を緩和する抗リウマチ薬であっても、疾患を改変する抗リウマチ薬であってもよい。例示的な症状を緩和する抗リウマチ薬としては、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、およびコルチコステロイド（例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン（Ｍｅｄｒｏｌ））が挙げられる。例示的な疾患を改変する抗リウマチ薬としては、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）、クロロキン（Ａｒａｌｅｎ）、メトトレキサート（例えば、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、スルファサラジン（Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ）、レフルノミド（Ａｒａｖａ）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、インフレキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、ペニシラミン（例えば、ＣｕｐｒｉｍｉｎｅまたはＤｅｐｅｎ）、金塩（例えば、ＲｉｄａｕｒａまたはＡｕｒｏｌａｔｅ）、ミノサイクリン（例えば、ＤｙｎａｃｉｎまたはＭｉｎｏｃｉｎ）、シクロスポリン（例えば、ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）、およびシクロホスファミド（例えば、ＣｙｔｏｘａｎまたはＮｅｏｓａｒ）が挙げられる。好ましい実施形態において、上記抗リウマチ薬は、メトトレキサート、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（例えば、Ａｎａｋｉｎｒａ）、またはステロイド（例えば、メチルプレドニゾン）である。
【００１６】
本発明の別の局面は、炎症性疾患の処置において使用するための薬物を製造するための方法を提供し、この方法は、（ａ）炎症性疾患の処置において有用なものとして化合物を同定する工程、および上記化合物をヒトが消費するために処方する工程を包含する。この化合物は、（ｉ）上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量を上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量と比較する工程；および（ｉｉ）上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも低い場合に、上記化合物を慢性関節リウマチの処置に有用なものとして同定する工程によって、同定される。好ましくは、炎症性疾患は、慢性関節リウマチである。好ましくは、上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量は、上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも４５％低い。より好ましくは、上記化合物は、ＨＩＦ−１α活性を少なくとも８５％まで減少させる。最も好ましくは、上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量は、上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも９５％低い。
【００１７】
本発明の別の局面は、炎症性疾患の処置において有用な化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量を上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量と比較する工程；および（ｂ）上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも低い場合に、その化合物を炎症性疾患の処置に有用なものとして選択する工程、を包含する。好ましくは、炎症性疾患は、慢性関節リウマチである。１つの実施形態において、化合物の収集物は、化合物の収集物中の各化合物について、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返すことによってスクリーニングされ得る。ここで、上記収集物の少なくとも１つの化合物は、炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）の処置のために有用なものとして選択される。
【００１８】
ＨＩＦ−１α活性の量は、種々の方法によって決定され得る。本発明の１つの方法は、低酸素応答性エレメント（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＨＲＥ）に結合されたＨＩＦ−１αの量を測定する工程、またはＨＩＦ−１α応答性遺伝子からの転写の量を測定する工程を包含する。好ましいＨＩＦ−１α応答性遺伝子としては、ＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ−１、エノラーゼ１、およびアルドラーゼ１が挙げられる。
【００１９】
ＨＩＦ−１α活性を測定するための代替的な方法は、上記化合物の存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量を、上記化合物の非存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量と比較する工程を包含する。好ましくは、この白血球は、Ｔ細胞または単球であり、そして最も好ましくは、単球である。本発明の好ましい実施形態において、化合物は、上記化合物の存在下において移動する白血球の量が、上記化合物の非存在下において移動する白血球の量よりも少なくとも３０％低い場合に、炎症性疾患（好ましくは、慢性関節リウマチ）の処置に有用であると同定または選択される。より好ましくは、上記化合物は、少なくとも４０％まで、そして最も好ましくは少なくとも５０％まで、白血球の移動を減少させる。
【００２０】
ＨＩＦ−１α活性の減少を測定するためのさらに別の方法は、上記化合物の非存在下における白血球のアポトーシスの量よりも高い、上記化合物の存在下における白血球のアポトーシスの量を観察する工程を包含する。好ましくは、炎症性疾患（好ましくは、慢性関節リウマチ）の処置に有用な化合物は、マクロファージのアポトーシスの増加を生じる。本発明の好ましい実施形態において、上記化合物は、上記化合物の存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量が、上記化合物の非存在下におけるマクロファージのアポトーシスの量よりも少なくとも１．２５倍高い場合に、慢性関節リウマチの処置に有用であると同定または選択される。より好ましくは、上記化合物は、マクロファージのアポトーシスを少なくとも１．５倍まで、そして最も好ましくは少なくとも１．７倍まで増加する。
【００２１】
マクロファージのアポトーシスの量は、現在公知であるか、または将来見出される、あらゆるアポトーシス測定技術によって決定され得る。本発明の１つの実施形態は、上記化合物の存在下か、もしくは上記化合物の非存在下において、アポトーシスの誘発因子に細胞の集団を曝す工程；およびＤＮＡ分断を有する細胞の割合を測定する工程を包含するプロセスによって、マクロファージのアポトーシスの量を測定する。ここでＤＮＡ分断を有する細胞の割合は、マクロファージのアポトーシスの量を表す。ＤＮＡ分断を有する細胞の割合は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。これらの方法としては、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）の取り込みまたはＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート−ビオチンニック末端標識）アッセイが挙げられる。本発明のさらに別の実施形態において、マクロファージのアポトーシスの量は、上記化合物の存在下か、もしくは上記化合物の非存在下において、アポトーシスの誘発因子に細胞の集団を曝す工程；および細胞膜の細胞外表面上にホスファチジルセリンを発現する細胞の割合を測定する工程を包含するプロセスによって測定され、ここで、上記細胞膜の細胞外表面上にホスファチジルセリンを発現する細胞の割合は、マクロファージのアポトーシスの量を表す。好ましくは、細胞質膜の細胞外表面上のホスファチジルセリンの発現は、上記ホスファチジルセリンへのアネキシンＶの結合によって測定される。好ましいアポトーシスの誘発因子としては、ｓＦａｓリガンド、抗Ｆａｓ、またはＴＲＡＩＬまたは低酸素状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明のさらに別の局面において、ＨＩＦ−１α活性の量を測定する工程は、上記化合物の存在下における新脈管形成の量を上記化合物の非存在下における新脈管形成の量と比較する工程を包含し、ここで上記新脈管形成の量は、ＨＩＦ−１α活性の量を表す。好ましくは、上記化合物は、上記化合物の存在下における新脈管形成の量が、上記化合物の非存在下における新脈管形成の量よりも少なくとも２５％低い場合に、炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）の処置に有用であると同定または選択される。より好ましくは、上記化合物は、新脈管形成の量を少なくとも３５％まで、そして最も好ましくは少なくとも５０％まで減少させる。新脈管形成の量は、現在公知であるか、または将来において発見されるあらゆる新脈管形成測定技術によって決定され得る。本発明の好ましい実施形態において、新脈管形成の量は、（１）基底タンパク質の層を提供する工程、（２）上記化合物の存在下もしくは上記化合物の非存在下において、その基底膜の層上で内皮細胞の集団を培養する工程、および（３）形成された毛細管の数を定量する工程によって測定される。毛細管形成は、細胞の管を可視化する工程、分枝点を計数する工程、または視野における全毛細管の長さを計算する工程によって定量され得る。
【００２３】
上記に要約された実施形態を任意の適切な組み合わせと一緒に使用して、上記に明白には列挙されていないさらなる実施形態を作製すること、そしてそのような実施形態は、本発明の一部であると考えられることが、当業者によって認識される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の性質および目的をよりよく理解するために、添付の図面と組み合わせて考慮される以下の詳細な説明への参照が、なされるべきである。
【００２５】
（ＩＩＩ．詳細な説明）
（Ａ．概要）
一般に本発明は、炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置する新規な方法、および炎症性疾患およびその臨床症状の処置に有用な薬物を同定およびスクリーニングする新規な方法を包含するとして考察され得る。ヒトリウマチ関節のコンピュータモデルの使用を通して、本発明者らは、一部の癌に対して効果を有することが既知である転写調節因子であるＨＩＦ−１αの活性が、慢性関節リウマチの病態生理学に著しい影響を有することを発見した。炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）の症状は、ＨＩＦ−１αの活性を阻害する化合物を投与することによって、軽減され得る。
【００２６】
（Ｂ．定義）
用語「異常に高い滑膜細胞密度」は、本明細書において使用される場合、正常な（すなわち、非罹患）関節で見られる滑膜細胞の数より少なくとも１０倍多い、多くの滑膜細胞を含む関節の滑膜組織における状態をいう。
【００２７】
用語「異常に高い割合の軟骨破壊」は、本明細書において使用される場合、標準Ｘ線撮影方法によって決定される、検出可能な関節空間の狭窄をいう。非罹患関節では、狭窄は検知できない。
【００２８】
用語「滑膜組織におけるＩＬ−６の異常に高い濃度」は、本明細書において使用される場合、正常な非罹患関節において見出されるよりも、標準偏差の少なくとも３倍高い罹患関節の滑膜組織におけるＩＬ−６のレベルをいう。
【００２９】
「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、当業者に公知の薬学的組成物を投与する標準方法のいずれかを意味する。例としては、静脈内投与、筋肉内投与または腹腔内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
用語「ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニスト」は、本明細書において使用される場合、慢性関節リウマチに関連することが示されたＨＩＦ−１αの３つ生物学的活性（（１）単球／マクロファージおよびＴ細胞の動員、（２）マクロファージおよびＴ細胞のアポトーシス、ならびに（３）マクロファージのサイトカイン産生）のいずれか１つを阻害する特性をいう。アンタゴニスト性であるために、阻害は、１００％有効である必要はない。さらに、ＨＩＦ−１α活性の阻害は、ＨＩＦ−１αの発現を減少させることによってか、ＨＩＦ−１αのユビキチン化およびタンパク質分解を増加させることによってか、またはＨＩＦ−１応答性遺伝子の転写活性を干渉することによって、達成され得る。
【００３１】
用語「薬物」は、既知または未知の生物学的機構によって生体系に影響を及ぼしうる、治療的に使用されるかまたは使用されない、いずれかの程度の複雑さを有する化合物をいう。薬物の例は、研究または治療上の興味がある代表的な低分子（１０００ダルトン未満の分子量を有する分子）；天然に存在する因子（例えば、エンドクリン、パラクリン、または自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）因子）、抗体、あるいはいずれかの種類の細胞レセプターと相互作用する因子；細胞内因子（例えば、細胞内シグナル伝達経路のエレメント；他の天然源から単離された因子）；農薬；除草剤；および殺虫剤を含む。薬物は、遺伝子療法で使用される薬剤、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡも含み得る。また抗体、ウィルス、細菌、ならびに細菌およびウィルスによって産生された生物活性剤（例えば、毒素）も薬物とみなされ得る。薬物に対する応答は、例えば、１つ以上の種のＲＮＡの転写または分解の速度における薬物媒介性変化、１つ以上のポリペプチドの翻訳または翻訳後処理の速度または程度における薬物媒介性変化、１つ以上のタンパク質の分解の速度または程度における薬物媒介性変化、１つ以上のタンパク質の作用または活性の薬物媒介性の阻害または刺激などの結果でありうる。ある例において、薬物は、タンパク質と相互作用することによってその効果を働かせることができる。ある用途では、薬物は例えば、１つ以上の薬物を含む組成物または１つ以上の薬物および１つ以上の賦形剤を含む組成物を包含し得る。
【００３２】
「炎症性疾患」は、以下のいずれか１つ：炎症性応答のトリガ（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）；炎症性カスケードのいずれかのメンバーのアップレギュレーション；炎症性カスケードのいずれかのメンバーのダウンレギュレーションを特徴とする、さまざまな疾患および障害のクラスをいう。炎症性疾患としては、糖尿病、動脈硬化症、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再潅流障害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、および炎症性皮膚疾患が挙げられる。単数形の用語「炎症性疾患」は、炎症性疾患のクラスから選択されるいずれかの１つ以上の疾患を含み、そして任意の複合体または複合疾患状態を含み、ここで疾患状態の構成成分としては、炎症性疾患のクラスから選択される疾患を含む。
【００３３】
用語「関節」は、本明細書において使用される場合、滑膜組織、滑膜液、関節軟骨、骨組織、ならびにその細胞組成物および細胞外組成物、そしてそれらが含有する可溶性メディエータを含む。
【００３４】
用語「メトトレキサート耐性患者」は、メトトレキサート処置に効果的に応答しないか、またはメトトレキサートに最初は応答するが、時間が経つにつれて不応となる慢性関節リウマチ患者をいう。
【００３５】
本明細書において使用する場合、「正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）状態」は、組織酸化の生理学的状態をいう（組織に依存して、ＰＯ２は、４０〜１５０ｍｍＨｇに変動する）。語句「低酸素状態」は、生理学的レベルよりも低い組織酸化のレベル（すなわち、４０ｍｍＨｇ以下）をいう。
【００３６】
用語「患者」は、任意の温血動物（好ましくは、ヒト）をいう。慢性関節リウマチを有する患者は、例えば、慢性関節リウマチと診断された患者、慢性関節リウマチに関連する症状の１つ以上を示す患者、あるいは慢性関節リウマチを発症するリスクに向かって進行している、またはリスクに瀕している患者を含み得る。
【００３７】
本明細書において使用される場合、本発明の薬物の「治療有効量」は、リウマチ関節において滑膜細胞の増加を阻害する化合物の量か、またはリウマチ関節において軟骨破壊の割合を低下される化合物の量か、または滑膜組織においてＩＬ−６濃度を低下させる化合物の量であり、それによって慢性関節リウマチに関連する疼痛および炎症の後退および緩和を引き起こす、化合物の量を意味することが意図される。
【００３８】
用語「ＴＮＦ−α遮断耐性患者」は、ＴＮＦ−α遮断に効果的に応答しないか、またはＴＮＦ−α遮断に最初は応答するが、時間が経つにつれて不応となる慢性関節リウマチ患者をいう。
【００３９】
用語「ＴＮＦ−α遮断軟骨ノンレスポンダー」は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、低下した滑膜過形成を示すが、軟骨破壊の最小限の低下を示す、低い初期ＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者をいう。
【００４０】
用語「ＴＮＦ−α遮断過形成ノンレスポンダー」は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、軟骨破壊の改善を生じるが、滑膜過形成のわずかな低下を生じる、異常に高いまたは耐性レベルのＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者をいう。
【００４１】
用語「ＴＮＦ−α遮断二重ノンレスポンダー」は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、滑膜過形成および軟骨破壊の両方で低い応答を示す、無視できる初期ＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者をいう。
【００４２】
（Ｃ．炎症性疾患の処置に有用な化合物の同定）
本発明の１つの局面は、炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であり、この方法は、（ａ）上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量を上記化合物の非存在下における化合物の量と比較する工程；および（ｂ）上記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、上記化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも低い場合に、その化合物を炎症性疾患の処置に有用であると選択する工程を包含する。好ましくは、この炎症性疾患は、慢性関節リウマチである。慢性関節リウマチに冒されたヒト関節の生物学的状態に関連する動的なプロセスは、軟骨代謝、組織炎症、および組織過形成に関連するプロセスに関する種々の生物学的な変化物を含む。これらとしては、以下が挙げられる：
・マクロファージ集団の動力学（動員、活性化、増殖、アポトーシスおよびその調節が挙げられる）
・Ｔ細胞集団の動力学（動員、抗原依存的活性化および抗原非依存的活性化、増殖、アポトーシスおよびそれらの調節が挙げられる）
・繊維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）集団の動力学（組織における流入、増殖、およびアポトーシスおよびそれらの調節が挙げられる）
・軟骨細胞集団の動力学（増殖およびアポトーシスが挙げられる）
・種々のタンパク質（増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質分解酵素、およびマトリックスタンパク質が挙げられる）の、表された異なる細胞型（マクロファージ、ＦＬＳ、Ｔ細胞、軟骨細胞）による合成および調節
・内皮細胞による接着分子の発現
・滑膜組織と軟骨との間の媒介因子の移動
・サイトカインまたはプロテアーゼと、それらの天然のインヒビターとの間の相互作用、抗原提示、ならびに
・治療剤の細胞媒介因子への結合（ＴＮＦ−αアンタゴニスト（例えば、エタネルセプトおよびインフリキシマブ）およびＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（例えば、アナキンラ））。
慢性関節リウマチに冒されたヒト関節の機械的再現を提供するインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）モデルでの観察に基づいて、本発明者らは、ＨＩＦ−１αのアンタゴニストが、慢性関節リウマチの症状を緩和することを見出した。この緩和は、特に、滑膜細胞の密度の低下、軟骨分解の低減、骨侵食の低減、および滑膜組織におけるＩＬ−６濃度の減少である。これらの観察はまた、血管容積と治療剤（例えば、メトトレキサート、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬、可溶性ＴＮＦ−αレセプター、ＴＮＦ−α抗体、およびインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト）の効果とを考慮に入れる。
【００４３】
インシリコのモデリングは、関連する生物学的データ（ゲノムデータ、プロテオミクスデータ、および生理学的データ）を、コンピュータベースのプラットフォームに統合し、システムのコントロールの原理を再生する。規定された疾患状態を表現する初期状態の設定を与えると、これらのコンピュータベースのモデルは、システム上の将来の生物学的挙動（バイオシミュレーション（ｂｉｏｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）と呼ばれるプロセス）を刺激する。本発明は、これらの状態の観察から生まれた。
【００４４】
慢性関節リウマチを暗示する、挙動の一般的セットを規定することによって開始する「トップ−ダウン」アプローチを使用して、これらの挙動は、このシステム上の制約として使用される。ネスティングされたサブシステムのセットを開発して、基礎にある詳細の次のレベルを規定する。例えば、慢性関節リウマチにおける軟骨分解のような挙動を与えると、特定の機構は、その挙動が順番に各々モデリングされ、サブシステムの設定を生じるように誘導し、サブシステムそれ自体は、分解され詳細にモデリングされる。従って、これらのサブシステムの制御とコンテクストは、全体としてこのシステムの動力学を特徴付ける挙動によって既に規定されている。この分解プロセスは、慢性関節リウマチの既知の生物学的挙動を複製するのに十分に詳細になるまで、トップダウンから、ますます生物学をモニタリングし続ける。
【００４５】
トップダウンアプローチを使用する場合、２つの特定の目的（（１）基本的な生物学を説明する、および（２）全体の系の生理学的な機能または挙動を説明する）を支持するために、データは同定されて収集される。全体の系の生理学的機能または挙動を説明するデータは、モデルの開発の初期に選択される。これらのデータは、モデル系の広い範囲の挙動（すなわち、慢性関節リウマチ患者の測定（挙動）としての軟骨分解）を表す。これらのデータは、十分に確立された臨床試験に基づいた、ヒトのインビボのデータである。基礎生物学を説明するデータは、選択された挙動を刺激するために必要とされるサブシステムを十分にモデリングするように選択される。これらのデータは、基礎となる生物学の理解を提供する、ヒトまたは動物（ヒトが好ましいが、利用可能でない場合）のインビボデータ、インビトロデータ、もしくはエキソビボデータであり得る。
【００４６】
トップダウンアプローチは、ヒト関節における慢性関節リウマチのモデルを開発するのに使用された。同様のモデルは、２００３年４月２４日に２００３−００７８７５９として公開された、同時係属の米国特許出願第１０／１５４，１２３号で記載されている。現在のモデルでは、３つの重要な臨床結果：滑膜細胞密度、軟骨破壊の割合、滑膜組織中のＩＬ−６のレベルが特に興味深い。慢性関節リウマチは、末梢血中の炎症誘発性サイトカイン（特に、ＩＬ−６）のレベル上昇を伴う全身性炎症性疾患である。Ｃ応答性タンパク質（ＣＲＰ）は、血漿中で日常的に測定される、炎症の一般的なマーカーであり、複数の研究が慢性関節リウマチ患者でのＩＬ−６濃度とＣＲＰ濃度との相関を示している。したがって、関節中または血漿中のどちらかのＩＬ−６濃度は、炎症の良好なマーカーとなる。
【００４７】
疾患の基礎にある生物学の明示的な表現は、特定の臨床結果（例えば、軟骨破壊または滑膜細胞密度）に対して最も影響のあるサブシステムを識別するために、単独または組合された各サブシステムの調節を可能にする。慢性関節リウマチの表現型開始および進行に最大の影響を持つこれらのサブシステムのモデル化およびデータ収集作業に集中することによって、このアプローチは、システムの複雑さをさらに明確に表現して、慢性関節リウマチの病態生理学の基礎にある原因因子を同定するのに役立つ。インシリコで各システムを調節する（例えば、１つの細胞型または細胞間媒介因子をノックアウトする、あるいは１つの特定の生物学的プロセスを遮断する）ことによって、慢性関節リウマチを促進する生物学的現象をよりよく理解し、それゆえ最良の、最も関連する標的を識別するために、疾患病態生理学全体へのその寄与を評価することができる。
【００４８】
慢性関節リウマチの場合において、疾患状態は、例えば、その疾患状態を引き起すか、影響を及ぼすか、またはその疾患状態によって改変される１つ以上の生物学的プロセスを示し得る酵素活性、生成物形成動態および細胞機能に関連するアウトプットとして表現され得る。代表的には、コンピュータモデルのアウトプットは、生物学的構成要素のレベルまたは活性あるいは疾患状態の他のいずれかの挙動を示す値のセットを含む。これらのアウトプットに基づいて、１つ以上の生物学的プロセスを重要な生物学的プロセスと呼ぶことができる。
【００４９】
コンピュータモデルは、２００４年９月１０日に出願された同時係属の米国特許番号１０／９３８，０７２に詳細に記載されたように、１つ以上の生物学的プロセスへの改変を表すために実行され得る。特に、生物学的プロセスへの改変は、生物学的プロセスと慢性関節リウマチとの間の関連度（例えば、相関度）を同定するためにコンピュータモデルにて表現され得る。例えば、生物学的プロセスへの改変は、生物学的プロセスが慢性関節リウマチを引き起こすか、影響を及ぼすか、または慢性関節リウマチによって改変される程度を同定するために、コンピュータモデルにて表現され得る。生物学的プロセスは、この生物学的プロセスに対する改変が、慢性関節リウマチに関連する症状（すなわち、滑膜組織における細胞密度の増加、軟骨破壊、骨侵食、およびＩＬ−６レベルの上昇）を生じさせると観察された場合に、慢性関節リウマチを引き起こすとして同定され得る。ある例において、生物学的プロセスへの改変は、他の生物学的プロセスと慢性関節リウマチとの間の関連度を同定するために、コンピュータモデルにて表現され得る。
【００５０】
いくつかの例において、生物学的プロセスのセットを同定することは、感受性分析を包含し得る。感受性分析は、疾患状態に関連する生物学的プロセスの優先順位決定を含むことができる。感受性分析は、この優先順位決定のエラー強さを判定するために、コンピュータモデルの異なる構成を用いて実施され得る。いくつかの例において、感受性分析は、疾患状態との関連度に基づいた生物学的プロセスの順位序列を含み得る。感受性分析によって、ユーザは疾患状態の状況における生物学的プロセスの重要性を決定できる。非常に重要な生物学的プロセスの例は、疾患状態の重篤度を上昇させる生物学的プロセスである。それゆえ、この生物学的プロセスの阻害は、疾患状態の重篤度を低下させ得る。生物学的プロセスの重要性は、その生物学的プロセスと疾患状態との間の関連の存在だけでなく、疾患状態の重篤度において変更を達成するために生物学的プロセスを改変しなければならない程度にも依存しうる。順位序列において、疾患状態においてより重要な役割を果たす生物学的プロセスは、代表的には、より高い順位を得る。順位序列は、疾患状態においてより重要な役割を果たす生物学的プロセスがより低い順位を得るような逆の様式でも実施され得る。代表的には、生物学的プロセスのセットは、疾患状態においてより重要な役割を果たすとして同定される生物学的プロセスを含む。
【００５１】
慢性関節リウマチの感受性分析の処理の間に、これらに限定されるわけではないが、単球動員、Ｔ細胞動員、細胞アポトーシス、およびサイトカイン産生などの生物学的プロセスの活性は、コンピュータモデルで一度に１つずつ調節される（増加または減少する）。次にバイオシミュレーションが実施され、刺激または阻害の異なるレベルでの１つの生物学的プロセスの調節の結果が、これらに限定されるわけではないが、軟骨破壊、滑膜細胞密度、骨侵食、およびＩＬ−６レベルなどの臨床結果を測定することによって評価される。この分析の結果は、臨床結果に著しい影響を有する生物学的プロセスを同定した。
【００５２】
本発明において、感受性分析は、疾患病態生理学に著しい影響を有する慢性関節リウマチの生物学の３つの分野（（１）単球／マクロファージおよびＴ細胞の動員、（２）単球／マクロファージおよびＴ細胞のアポトーシス、および（３）マクロファージのサイトカイン産生（特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、およびＩＬ−１０））を識別した。
【００５３】
（１．標的の同定）
上述のモデルによるＨＩＦ−１α活性阻害の効果に基づいて、本発明者らは、ＨＩＦ−１α活性の遮断が、慢性関節リウマチの効果的な療法であることが予測されることを発見した。
【００５４】
単球／マクロファージおよびＴ細胞の動員、マクロファージおよびＴ細胞のアポトーシス、ならびにマクロファージのサイトカイン産生（特に、ＴＮＦα、ＩＬ−１、およびＩＬ−１０）に対するＨＩＦ−１α活性の効果は、慢性関節リウマチのコンピュータモデルにおいて定量され、明示的に表現された。これらの各生物学的プロセスに対するＨＩＦ−１α活性の寄与が正確に定量されていないので、ＨＩＦ−１α活性の寄与を特徴付けるために一連の効果を定義した（表１）。「より低い最大効果」の値は、他のタンパク質との考えられる重複を考慮して記録された最も低い効果を表し、「より高い最大効果」は、各生物学的プロセスに対するＨＩＦ−１α活性の最大効果であり、そして「最も有望な最大効果」は、インビボ環境および他のタンパク質との重複を考慮した、各生物学的プロセスにおけるＨＩＦ−１α活性の現実的な寄与の概算である。
【００５５】
（表１．関節モデルに対するＨＩＦ−１α活性の効果）
【００５６】
【表１】
2007512369.tif 000002
次に、慢性関節リウマチに対するＨＩＦ−１α活性の効果のシミュレーションを、関連する生物学的プロセスすべてにおいていっせいにか、または一度に１つの生物学的プロセスでか、またはいくつかの生物学的プロセスを組合せて、ＨＩＦ−１αを遮断することによって実施した。シミュレーションの結果は、６ヶ月間のＨＩＦ−１α活性の遮断が、軟骨破壊を１２〜４５％、滑膜細胞過形成を１２〜５７％、そして滑膜組織中のＩＬ−６レベルを１４〜６５％低下させることによって、慢性関節リウマチの臨床結果を改善することを示した。図１は、滑膜細胞密度に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を示す。図２は、軟骨破壊に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を示す。図３は、滑膜組織中のＩＬ−６レベルに対するＨＩＦ−１α遮断の効果を示す。
【００５７】
１つの生物学的プロセスにおいて同時にＨＩＦ−１α遮断をシミュレーションすることは、臨床結果に対してＨＩＦ−１α遮断の影響を与える（ｄｒｉｖｅ）主要な生物学的プロセスが、単球動員に対して効果的であることを実証した。マクロファージのアポトーシスに対するＨＩＦ−１α遮断の影響はまた、慢性関節リウマチの臨床的マーカーの改善に重要な役割を果たす。図４は、それぞれ、単球およびＴ細胞の動員、単球／マクロファージおよびＴ細胞のアポトーシス、ならびにマクロファージのサイトカイン産生に対する、ＨＩＦ−α遮断の効果のシミュレーションの際の、代表的な慢性関節リウマチ患者における３つの重要な治療指標の応答を提供する。
【００５８】
メトトレキサートは、慢性関節リウマチには一般的な処置である。メトトレキサート処置は、滑膜細胞密度をおおよそ３０％まで低下させ、軟骨破壊の割合をおおよそ１５％まで低下させ、滑膜組織におけるＩＬ−６の濃度を９３％まで低下させることが既知である。１００％有効性では、コンピュータモデルは、ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用が、これらの３つの治療指標においてメトトレキサートよりも大きな改善を誘発する可能性が最も高いことを予測する。このモデルは、ＨＩＦ−１α活性の８０％の阻害のみを引き起こす化合物が、滑膜細胞密度および軟骨破壊の割合の低下において、メトトレキサートよりも優れていることを予測している。
【００５９】
一部の慢性関節リウマチ患者は、メトトレキサート処置に効果的に応答しない（初期ノンレスポンダー）が、メトトレキサートに最初は応答した他の患者は、時間が経つにつれて不応となる（漸進的ノンレスポンダー）。両方の型の患者は、メトトレキサート耐性患者といわれる。メトトレキサート耐性患者でのＨＩＦ−１α活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者と類似した応答パターンを明らかにする。図５は、単球およびＴ細胞の動員、単球／マクロファージおよびＴ細胞のアポトーシス、ならびにマクロファージのサイトカイン産生に対する、ＨＩＦ−１α遮断の効果をシミュレーションする際に、メトトレキサート耐性患者における３つの主要な治療指標の応答を提供する。メトトレキサート耐性患者において、６ヶ月間ＨＩＦ−１α活性を遮断することは、軟骨破壊を８〜４７％まで、滑膜細胞過形成を５〜５２％まで、そしてＩＬ−６濃度を１３〜７３％まで低下されることによって慢性関節リウマチの臨床結果を改善する。図６は、メトトレキサート耐性患者における滑膜細胞密度に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を実証する。図７は、メトトレキサート耐性患者における軟骨破壊に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を実証する。図８は、メトトレキサート耐性患者におけるＩＬ−６濃度に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を実証する。
【００６０】
慢性関節リウマチのインシリコモデルの適用は、ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニスト作用が、慢性関節リウマチを罹患する患者のための有望な治療的ストラテジーであるという驚くべき結果を提供した。
【００６１】
（２．閾値）
ＨＩＦ−１α阻害の量は、単球／マクロファージの動員の減少およびマクロファージのアポトーシスの増加に相関しているが、動員率およびアポトーシス率の変化は、ＨＩＦ−１α阻害に直線的には関連しない。図９は、ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用の「より高い最大効果」における、ＨＩＦ−１α阻害の、マクロファージのアポトーシスの割合の増加と単球動員の割合の減少とから予測した比較を提供する。これらの割合の各々は、滑膜細胞密度の治療指標と比較される。このモデルは、参照患者において慢性関節リウマチの症状の有意な改善（すなわち、滑膜細胞密度のすくなくとも３０％の減少）を達成するために、マクロファージのアポトーシスが、ＨＩＦ−１α遮断の２４時間後に少なくともおよそ１．７倍まで増加しなければならないこと、および単球動員率が、少なくともおよそ３０％まで減少しなければならないことを見出した。ＨＩＦ−１α遮断のこのようなレベルは、新脈管形成のおよそ２５％の低下を生じるべきである。
【００６２】
図１０は、ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用の「最も有望な最大効果」における、ＨＩＦ−１α阻害の、マクロファージのアポトーシスの割合の増加と単球動員の割合の減少とから予測した比較を提供する。これらの割合の各々は、滑膜細胞密度の治療指標と比較される。このモデルは、参照患者において慢性関節リウマチの症状の有意な改善（すなわち、滑膜細胞密度の少なくとも３０％の減少）を達成するために、ＨＩＦ−１α遮断の２４時間後にマクロファージのアポトーシスが、少なくともおよそ１．２５倍まで増加しなければならないこと、および単球動員率が、少なくともおよそ５０％まで減少しなければならないことを見出した。両方の仮説を考慮して、ＨＩＦ−１α活性の治療的アンタゴニスト作用に対する全体的な閾値は、結果として、マクロファージのアポトーシスで少なくとも１．５倍の増加となり、滑膜への単球動員で少なくとも４０％の減少となる。ＨＩＦ−１α遮断のこのようなレベルは、新脈管形成においておよそ５０％の減少を生じるべきである。
【００６３】
（Ｄ．ＨＩＦ−１α）
ＨＩＦ−１αは、低酸素状態（例えば、リウマチ性関節において生じる）への細胞適合の制御において中心的な役割を果たす転写因子である。滑膜は、生理学的には低酸素環境である。高レベルの乳酸によって、そしていくぶん驚くべきことに、高レベルのＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬによって特徴付けられる慢性関節リウマチ炎症の間、酸素レベルは関節においてさらに低くなる。ＴｒｅｕｈａｆｔおよびＭｃＣａｒｔｙ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１４：４７５−８４（１９７１）；ならびにＮａｕｇｈｔｏｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３３２：２２１−２２５（１９９３）。この環境への細胞適合は、持続的な炎症を促進すると考えられる。
【００６４】
低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）は、２つのサブユニット（ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１β）からなるヘテロダイマータンパク質である。ＨＩＦ−１αは、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス−ＰＡＳ転写因子ファミリーのメンバーである。ＨＩＦ−１αは、６９５９ｄａの分子量を有し、８２６個のアミノ酸残基、そして４つの機能的ドメインから構成される。ＨＩＦ−１は、新脈管形成、グルコース代謝、細胞増殖／細胞生存および浸潤／転移に関連するタンパク質をコードする多くの遺伝子の転写を活性化する。低酸素は、ユビキチン媒介性分解を阻害することによって、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルを調節する（図１１）。Ｓｅｍｅｎｚａ，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＩＦ−１  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：７２１−７３２（２００３年１０月）を参照のこと。
【００６５】
２０年前にエリスロポエチンの低酸素誘導発現の調節因子として最初に記載されてから、転写因子ＨＩＦ−１は、組織酸化における変化に応答して、そしてまた増殖因子の刺激に応答して、遺伝子の数の増加を調節することが示されている（表２）。Ｓｅｍｅｎｚａ（２００３）。
【００６６】
（表２：ＨＩＦ−１によって転写活性された遺伝子）
【００６７】
【表２】
2007512369.tif 000003
ＨＩＦ−１αタンパク質合成は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路およびＥＲＫマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化によって調節される。これらの経路は、レセプターチロシンキナーゼ、非レセプターチロシンキナーゼ、またはＧタンパク質連結型レセプターを介したシグナル伝達によって活性化され得る。
【００６８】
低酸素は、ＨＩＦ−１αのユビキチン媒介性分解を阻害することによって、ＨＩＦ−１αをタンパク質安定性のレベルで調節する。ＨＩＦ−１αタンパク質分解は、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼによるユビキチン化についてタンパク質を標的にする、Ｏ２依存性プロリルヒドロキシル化によって調節される。プロリルヒドロキシラーゼは、基質として分子酸素を使用し、従って酸素のアベイラビリティーの直接測定を提供する。このＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼは、ヒドロキシル化ＨＩＦ−１αに特異的に結合するｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ腫瘍抑制タンパク質（ＶＨＬ）を含む。ユビキチン化ＨＩＦ−１αは、プロテアソームによって迅速に分解される。
【００６９】
ＨＩＦ−１αは、腫瘍内低酸素および遺伝的変更（例えば、癌遺伝子（すなわち、ＥＲＢＢ２）中の機能獲得変異（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）および腫瘍抑制遺伝子（すなわち、ＶＨＬおよびＰＴＥＮ）中の機能喪失変異（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ））の結果として、多くのヒト癌において過剰発現されることが公知である。ＨＩＦ−１αの活性が腫瘍生存に相関している一方で、ＨＩＦ−１α活性（特に、本発明によって規定された閾値での活性）のアンタゴニスト作用は、慢性関節リウマチの病理学に関連していない。
【００７０】
（Ｅ．ＨＩＦ−１αアンタゴニストおよび抗リウマチ薬を同定する方法）
（１．単球動員）
上記に記載されたように、単球／マクロファージの動員は、ＨＩＦ−１α遮断の利益へ主要に貢献するものである。ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを同定するための１つの好ましいアッセイは、代表的な遊出アッセイの改変である。単球は、内因性（内皮によって作製された）または外因性の化学誘引物質の下部ウェル上の多孔性支持体で増殖する内皮層の上に懸濁している。アッセイ終了時に下部チャンバに達した単球は、遊出したものとしてカウントされる。ＨＩＦ−１αの活性を阻害する化合物は、内皮層を通過して移動する細胞の数を減少させる。
【００７１】
１つの好ましいアッセイにおいて、内皮細胞は、フィブロネクチンを重ねた水和Ｉ型コラーゲンゲル上で培養される。培養培地の成分は、多孔性ゲル中に浸透する。あるいは、内皮細胞は、下部チャンバ上に吊るされた多孔性フィルタの上表面で培養され得る。培養培地は、上部チャンバおよび下部チャンバに配置されて、単層の先端面および基底面に達する。単球は、上部チャンバに添加される。「移動した」とカウントするためには、単球は、（１）内皮細胞の先端表面に付着し、（２）細胞内接合点まで移動して、（３）内皮細胞間で漏出し、（４）内皮細胞から分離して、基底膜に浸透し、（５）フィルタまたはゲルを通過して、（６）フィルタまたはゲルから分離して、下部チャンバに入る必要がある。
【００７２】
健常ドナーまたはリウマチドナーの末梢血から新たに単離された単球または好中球は、試験化合物の存在下または非存在下でコンフルエントな内皮単層上に３７℃にて静置する。アッセイは、これに限定されるわけではないが、必要に応じてヒト血清アルブミンを添加した完全培地、培地１９９、またはＲＰＭＩ１６４０を含む種々の培地中で実施され得る。経内皮移動のための十分な時間（一般に１時間）の後、単層をＥＧＴＡなどのキレート化剤で洗浄して、先端表面になお結合している単球または好中球を除去する。コラーゲンゲルを基材として使用する場合、次に単層を、２価カチオンを含むリン酸緩衝生理食塩水でリンスして、グルタルアルデヒド中で一晩固定する。固定はコラーゲンゲルを強化するので、ゲルが操作しやすくなる。単層は、好ましくはＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、好ましくはノマルスキー顕微鏡下で直接観察するためにスライドに載せる。ノマルスキー顕微鏡を使用すると、焦点面によって、単層の先端表面に付着した単球または好中球を遊出したものから識別することができる。遊出の定量化できる測定は、単層の下に移動した、単層に関連するこれらの単球または好中球の割合である。したがって、遊出の測定は、単層への接着の程度とは独立している。
【００７３】
ＨＩＦ−１αは、低酸素状態および正常酸素状態の両方の下で、マクロファージ中の低酸素応答性遺伝子の発現レベルを調節することが実証されている。Ｃｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１２：６４５〜６５７（２００３）。従って、単球移動率は、低酸素状態または正常酸素状態のいずれかのもとで評価され得る。好ましくは、このアッセイは、低酸素状態のもとで実施される。
【００７４】
単球または好中球の移動は、内皮のサイトカイン刺激の存在下または非存在下で決定され得る。内皮細胞の活性化は、刺激メディエータとの接触から生じ得、代表的には、内皮を通過する単球または好中球の移動を促進する。本発明の目的のためには、内皮細胞の活性化は、好ましくは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）などのサイトカインとの接触から生じる。
【００７５】
用語「内皮細胞」は、当該分野での普通の意味を有する。内皮細胞は、体全体にわたって、特に血管組織（静脈、動脈、および毛細血管）の管腔に見出される内皮を構成する。関節炎においては、白血球が循環血から関節に移動して、そこで炎症に関与する。
【００７６】
（２．単球／マクロファージおよびＴ細胞のアポトーシス）
上記に記載のように、単球／マクロファージのアポトーシスの阻害は、ＨＩＦ−１α遮断の予想される利益に対する第二の貢献因子である。アポトーシスの測定は、細胞の型と使用するアッセイとに依存して、異なり得る。標準的なアポトーシスアッセイ（例えば、アネキシンＶおよびＴＵＮＥＬアッセイ）の組み合わせを使用して、アポトーシスを起こした単球／マクロファージの割合を測定すること、および定量的な抗ヒストンＥＬＩＳＡを使用して、アポトーシスに対するＨＩＦ−１α遮断の全体的な効果を測定することは、有利であり得る。マクロファージのアポトーシスの量は、低酸素状態または正常酸素状態のいずれのもとでも評価され得る。好ましくは、上記アッセイは、低酸素状態のもとで実施され得る。
【００７７】
（ａ．ＤＮＡ分断アッセイ）
ＤＮＡの完全性の喪失が、アポトーシスの特徴である。アポトーシス細胞から抽出されたＤＮＡがゲル電気泳動を使用して分析される場合、ＤＮＡ分断の特徴的な「ラダー」がみられる。しかし、細胞からのＤＮＡの抽出は、時間を消費するプロセスであり、そして代替的な方法は、アポトーシス細胞におけるＤＮＡの特徴的な分断を検出するために同等に適切である。ＤＮＡ分断は、種々のアッセイによって検出され得る。これらのアッセイとしては、ヨウ化プロピジウムアッセイ、アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド二重染色、ＴＵＮＥＬ技術およびＩＳＮＴ技術、ならびに変性に対するＤＮＡ感受性のアッセイが挙げられる。
【００７８】
（ｂ．アネキシンＶアッセイ）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルエタノールアミンの外面化（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、アポトーシスの間の細胞表面の変化の証明である。アネキシンＶは、３５〜３６ｋＤａのＣａ２＋依存性リン脂質結合タンパク質であり、アネキシンＶは、ＰＳに対して高い親和性を有し、露出されたＰＳを有する細胞に結合する。アネキシンＶは、種々のマーカーのうちのいずれかに結合対化され得て顕微鏡またはフローサイトメトリーによって検出されることを可能にする。ＨＩＦ−１α活性を阻害する化合物を同定する方法での使用またはＨＩＦ−１α活性を阻害する化合物についてスクリーニングする方法において使用するためには、フローサイトメトリーによって検出される蛍光的に標識されたアネキシンＶを使用することが好ましい。
【００７９】
マクロファージは、リウマチの被験体または健常な被験体のいずれかから、上で議論されたように得られる。細胞は、必要に応じてアポトーシスのデスレセプター依存性誘導因子の存在下において、１時間〜２４時間の間、試験化合物とともにインキュベートされる。アポトーシスを起こす細胞の数は、標識されたアネキシンＶおよびバイタル色素（例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ））での染色によって決定される。ＰＳの外面化はアポトーシスの初期段階で起こるので、アネキシンＶ染色は、アポトーシスプロセスまたはネクローシスプロセスのいずれかから生じる、細胞死の最後の段階に伴って起こる膜の完全性の喪失に先行する。従って、バイタル色素（例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ））と組み合わせたアネキシンＶでの染色は、初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性かつバイタル色素陰性）の同定を可能にする。
【００８０】
（３．ＨＩＦ−１α発現）
ＨＩＦ−１αの活性は、ＨＩＦ−１αの発現を減少させることか、または発現されたＨＩＦ−１αのタンパク質分解性分解を増加させることによって、アンタゴナイズされ得る。タンパク質の発現レベルを決定する方法は、当該分野で周知である。現在公知であるか、または将来見出される任意の測定技術が、細胞において発現されるか、または存在するＨＩＦ−１αタンパク質の量を決定するために使用され得る。本明細書において例示された方法は、ＨＩＦ−１α発現レベルを測定するための多くの受容可能な方法のうちの１つにすぎない。
【００８１】
単球またはマクロファージは、ＰｅｒｃｏｌｌもしくはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）勾配遠心分離、または向流遠心エルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）のいずれかによって、慢性関節リウマチ患者もしくは健常なドナー由来の滑液または末梢血単核細胞から単離され得る。単球は、２０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１μｇ／ｍｌポリミキシンＢ硫酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含むＲＰＭＩを用いて、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中でマクロファージに分化され得る。このマクロファージは、本発明の化合物と共に１時間〜数日間の範囲の期間の間インキュベートされる。インキュベーションの後、これらの細胞は、任意の適切な方法によって溶解されて、細胞溶解物を生成する。ＨＩＦ−１α発現の量は、ウエスタンブロット、免疫沈降、または抗ＨＩＦ−１α抗体を利用した任意の他の定量手順を介して決定され得る。適切な抗ＨＩＦ−１α抗体としては、ポロクローナル抗体およびモノクローナル抗体（クローン  ＯＺ１２、ＯＺ１５、Ｈ１α６７、ＥＳＥＥ１２２）が挙げられる。ＨＩＦ−１αに特異的な任意の抗体もしくは抗体フラグメント、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体が、ＨＩＦ−１α発現を定量するために使用され得る。適切なネガティブコントロール（試験化合物に曝露されたことを除いて試験細胞と同様に処置された細胞が挙げられる）は、実験の間の細胞の操作よりも上記化合物に曝露されたことに起因する、ＨＩＦ−１α発現の変更を同定するために実施されるべきである。
【００８２】
当該分野で周知の種々の手順は、ＨＩＦ−１αに対するポリクローナル抗体の産生のために使用され得る。例えば、ポリクローナル抗体を産生するために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるがこれに限定されない）が、ＨＩＦ−１αまたはその誘導体を用いた注射によって免疫され得る。種々のアジュバントが、宿主の種に依存して、免疫応答を増加させるために使用され得る。このアジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全アジュバントおよび不完全アジュバント）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用なヒトアジュバントの可能性のあるもの（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントもまた、当該分野で周知である。
【００８３】
ＨＩＦ−１αに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当該分野で公知の任意の技術を使用して調製され得る。この技術は、培養における連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する。これらの技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７９））により最初に記載されたハイブリドーマ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤ任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスの抗体であり得る。本発明において用いるｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロで培養されてもインビボで培養されてもよい。
【００８４】
（４．ＨＩＦ−１α転写活性）
本発明の方法はまた、ＨＩＦ−１αの転写活性化活性の直接的な阻害を企図する。ＨＩＦ−１αの転写活性化活性は、標的の低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）に結合したＨＩＦ−１αタンパク質の量を試験することによるか、または低酸素応答性遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）のＨＩＦ−１α誘導性発現の量を試験することのいずれかにより決定され得る。ＨＩＦ−１αとＨＲＥとの間の相互作用は、現在公知かまたは将来見出される任意の標準的なタンパク質−ＤＮＡ相互作用アッセイによって決定され得る。ＨＲＥの好ましい配列は、配列５’−ＴＡＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１）である。好ましい方法において、ＨＩＦ−１α応答性遺伝子からの転写の量は、ＨＩＦ−１α応答性遺伝子産物（例えば、ＶＥＧＦまたはエリスロポエチン）の量を決定することによって直接測定され得る。あるいは、ＨＩＦ−１α応答性遺伝子のプロモーターは、容易に検出可能なタンパク質（例えば、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）の発現を制御するように配置され得る。
【００８５】
（５．新脈管形成）
ＨＩＦ−１αの活性は、新脈管形成において重要な役割を果たす。従って、ＨＩＦ−１α活性の阻害は、新脈管形成の阻害によって実証され得る。新脈管形成活性を決定するいくつかの方法が、当該分野で公知である。現在公知であるか、または将来見出される任意の測定技術を使用して、新脈管形成に対するＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの効果が測定され得る。例示的方法において、内皮細胞は、基底タンパク質の固体ゲル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔｌ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡからのＥＣＭａｔｒｉｘＴＭとして利用可能）上でインキュベートされる。上記基底膜は、多くの関連タンパク質（例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ニドジェン、増殖因子（例えば、ＴＧＦβおよびＦＧＦ）、ならびにタンパク質分解酵素（例えば、プラスミノゲン、ｔＰＡ、およびＭＭＰ））を含み得る。内皮細胞の任意の供給源が使用され得る。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、本発明のアッセイのための内皮細胞の好ましい供給源である。この内皮細胞は、試験化合物の存在下または非存在下において４〜１８時間、基底タンパク質とともにインキュベートされる。毛細管形成の指標である細胞ネットワークの形成は、種々の方法によって同定され得る。これらの方法は、細胞管を可視化する工程、分枝点をカウントする工程、または規定された視野領域での全毛細管の長さを計算する工程を包含する。クリスタルバイオレットなどの薬剤を用いた細胞の染色は、毛細管形成の同定を容易にし得る。
【００８６】
（Ｆ．処置の方法）
一つの局面において、本発明は、炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）の少なくとも１つの症状を緩和する方法を提供し、この方法は、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを炎症性疾患を有する患者に投与する工程を包含する。本発明はまた、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和するための方法を提供し、この方法は、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を包含する。ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストは、タンパク質であっても、核酸であっても、低分子インヒビターであってもよい。好ましいタンパク質アンタゴニストは抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。好ましい核酸アンタゴニストとしては、ＨＩＦ−１αをコードする遺伝子のアンチセンスインヒビターが挙げられる。本発明はまた、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを投与することによって滑膜細胞密度を低下させる方法、軟骨分解を減少させる方法、および滑膜組織におけるＩＬ−６濃度を減少させる方法を包含する。
【００８７】
アンチセンスインヒビターは、標的タンパク質の発現を干渉し得ることが示されている。Ｃｏｈｅｎ，「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ」，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．１０：４３５−７（１９８９）およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉ  Ａｍ．２６２：４０−６（１９９０）（両方とも、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。ＨＩＦ−１αのアンチセンスインヒビターは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ０３／０８５１１０（本明細書において参考として援用される）において詳細に記載される。
【００８８】
低分子はまた、抗癌療法の文脈においてＨＩＦ−１α活性を阻害し得ることが示されている。例えば、低分子は、タンパク質分解のためにＨＩＦ−１αを標的にするプロリルヒドロキシラーゼ酵素の活性を増加させ得る。例示的な化合物は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ０２／０７４９８１（本明細書において参考として援用される）に記載されている。ＨＩＦ−１α活性を阻害することが公知の他の化合物としては、ＹＣ−１刺激物質（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール）、２−メトキシエストラジオール、タキソール、ビンクリスチン、１−メチルプロピル−２−イミダゾリルジスルフィド、プレウロチン（ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ）、ラパマイシン／ＣＣＩ７７９、ＬＹ２９４００２、ワートマニン、ゲルダナマイシン、カンプトテシン（およびアナログ（例えば、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ））、ＰＤ９８０５９、ならびにキノカマイシン（ｑｕｉｎｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（およびアナログ（例えば、ＮＣＳ−６０７０９７（ＤＸ−５２−１）））が挙げられる。ＨＩＦ−１α活性の例示的なタンパク質インヒビターは、ホスフェートアンドテンションホモログ（ＰＴＥＮ）である。
【００８９】
本発明において有用な化合物は、医療的に受容可能な投与経路によって、治療有効量で患者に投与される。このような経路は、例えば、経口経路、非経口経路（例えば、筋肉内経路、静脈内経路、皮下経路、腹腔内経路）、経皮経路、直腸経路、吸入による経路などである。採用される投薬量範囲は、投与の経路ならびに処置される患者の年齢、体重および状態に依存する。
【００９０】
種々の送達系が公知であり、種々の送達系を使用して本発明の組成物（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒介性エンドサイトーシス中の被包物（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物など）を投与し得る。導入の方法としては、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。上記化合物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によってか、上皮の裏打ちもしくは粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与され得る。そして上記化合物は、他の生物学的活性因子と一緒に投与され得る。投与は、全身投与であっても局所投与であってもよい。さらに、本発明の組成物を任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射が挙げられる）によって中枢神経系に導入することが所望され得る。脳室内注射は、例えば、リザーバー（例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバー）に取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にされ得る。肺投与はまた、例えば、吸入器または噴霧器の使用と、エアロゾル化因子との処方とによって適用され得る。
【００９１】
（Ｇ．組み合わせ療法）
１つの局面において、本発明は、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和する方法を提供し、この方法は、ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび抗炎症薬を慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を包含する。好ましくは、抗炎症薬は、メトトレキサート、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、およびステロイドの群より選択される。より好ましくは、抗炎症薬は、メトトレキサート、アナキンラ、またはプレドニゾンである。本発明の１つの実施形態において、上記患者は、メトトレキサートまたはＴＮＦ−α遮断に対して耐性である。
【００９２】
種々の処置プロトコルが、単独か、またはＨＩＦ−１α活性のアンタゴニスト作用と組み合わせてシミュレートされた。いくつかの治療の効果は、モデルにおいて表されている。上記モデルは、以下（１）〜（４）を用いた処置の影響を再現する：（１）非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ；例えば、インドメタシン）、（２）Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（可溶性ＩＩ型ＴＮＦ−αレセプター）、（３）メトトエレキサート（ＭＴＸ）、（４）糖質コルチココイド（例えば、メチルプレドニゾロン）、および（５）Ａｎａｋｉｎｒａ（ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ））。
【００９３】
各治療は、その作用の様式、分子活性、および薬物動態学的特徴、ならびにその推奨される臨床的投与レジメンに基づいて実施される。臨床的に推奨される定期的な薬物投与に関連する薬物曝露における、時間依存的バリエーションの重要性を決定するために、本発明者らは、臨床的スケジュールに基づいたシミュレーション結果を一定濃度の持続的用量に対する結果と比較した。この持続的用量は、血清濃度時間曲線下面積（ｓｅｒｕｍ  ａｒｅａ−ｕｎｄｅｒ−ｔｈｅ−ｃｕｒｖｅ）（ＡＵＣ）の正味の薬物曝露と同等である。２種の異なる投与スケジュールに対するシミュレーションの結果は、最小限にのみ異なった。定期的な投与に起因する一過性の効果を排除することによって結果の提示を単純化するために、本明細書において議論される結果は、持続的用量療法のシミュレーションに基づく。
【００９４】
シミュレートされた処置の影響は、現実の分子活性から生じる。例えば、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔは、ＴＮＦ−αへの結合および中和としてモデル化される；過形成における任意の引き続く変化、軟骨分解、または他の測定は、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔの直接的効果または特定の効果ではなく、遊離した活性ＴＮＦ−αのこの減少の二次的な結果である。各治療について直接実現された効果は、以下のとおりである。
【００９５】
本来のＮＳＡＩＤの作用の共通様式は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）経路およびそれらの下流の生成物（特に、プロスタグランジン−Ｅ２（ＰＧＥ２））の合成の阻害である。このＮＳＡＩＤのモデル実行は、マクロファージ、ＦＬＳ、および軟骨細胞におけるＰＧＥ２合成のＮＳＡＩＤによる用量依存的阻害に関するインビトロデータに基づく。提示されたシミュレーション結果は、１日に３回５０ｍｇのインドメタシンを経口投与される投与スケジュールによって達成されたものと等しい血清ＡＵＣ薬物曝露である、一定持続的用量のためのものである。
【００９６】
ＥｔａｎｅｒｃｅｐｔおよびＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ（それぞれ、外因性ｓＴＮＦ−ＲＩＩおよび抗ＴＮＦ−α抗体）は、可溶性ＴＮＦ−αの結合および中和としてモデル化される。これらの因子のＴＮＦ−αへの結合は、各分子の結合率のパラメータについての適切な値を使用してモデル化される。ＴＮＦ−αへの可溶性レセプター（または抗ＴＮＦ−α）の正味の結合率は、以下のように結合率と解離率との間の差異として計算される：
【００９７】
【化１】
2007512369.tif 000004
提示されたシミュレーション結果は、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔの一定の持続的用量についてのものである。この用量は、週に２回２５ｍｇを皮下投与する投与スケジュールで達成されたものと同程度の血清ＡＵＣ薬物曝露である。
【００９８】
メトトレキサート療法は、特定の細胞機能に対する直接的効果を定量するインビトロデータに基づいて実施される。この細胞機能としては、Ｔ細胞増殖およびＦＬＳ増殖の用量依存的阻害、媒介因子の合成、およびアポトーシスが挙げられる。さらに、血管増殖および血管新生に対するメトトレキサートの阻害効果を説明するために、内皮接着分子の全発現の減少がまた、実施される。提示されたシミュレーション結果は、１週あたり１２．５ｍｇを経口投与される投与スケジュールのものと同程度の血清ＡＵＣ薬物曝露の一定の持続的用量についてのものである。
【００９９】
メチルプレドニゾロンは、インビトロデータに従う種々の細胞性媒介因子合成の割合を用量依存的に調節することによって再現される。他の細胞機能に対する効果は、直接的にはモデル化されないが、変更された媒介因子依存的な調節から生じ得る。提示されたシミュレーション結果は、１日１回５ｍｇのメチルプレドニゾンを経口投与される投与スケジュールのものと同程度の血清ＡＵＣ薬物曝露の一定の持続的用量についてのものである。
【０１００】
Ａｎａｋｉｎｒａは、内因性ＩＬ−ＩＲａと同様に、全ての細胞機能に対するＩＬ−１βの影響を減少させるものとしてモデル化される。これは、レセプターアンタゴニストの即効濃度の存在下においてレセプター結合の減少の影響を説明するように適応されている「有効な」ＩＬ−１βの濃度を計算することによって実施される。提示されたシミュレーション結果は、１日１回１００ｍｇのＡｎａｋｉｎｒａを皮下投与される投与スケジュールのものと同程度の血清ＡＵＣ薬物曝露の一定の持続的用量についてのものである。
【０１０１】
仮想的な患者におけるリウマチ疾患の進行に対する処置の効果のシミュレーションは、このモデルにおいて基線を確立するための１年間処置をしない仮想的な患者において慢性関節リウマチをシミュレートすることによって実施された。次いで、処置なし、現在の処置プロトコル、またはＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用と組み合わせた現在のプロトコルのいずれかが、モデル化された。ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）を有するＨＩＦ−１α活性の１００％阻害を想定してモデル化された：（ｉ）各生物学的プロセスに対するＨＩＦ−１α活性の最大の予想効果を表す「より高い最大効果」、（ｉｉ）ＨＩＦ−１α活性の現実的な寄与の見積もりである「最も有望な最大効果」（これは、インビボ環境および重複性を考慮する）；および（ｉｉｉ）最も低い実証された効果を表す「より低い最大効果」（これは、他のタンパク質との起こり得る重複を考慮する）。滑膜細胞密度および軟骨分解の割合に対して６ヶ月間、代表的な患者においてシミュレーションされた処置（または処置を欠く）の効果は、表３に示される。
【０１０２】
【表３】
2007512369.tif 000005
代表的な慢性関節リウマチ患者におけるシミュレーションの結果は、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（例えば、Ａｎａｋｉｎｒａ）の投与に加えたＨＩＦ−１α活性の遮断は、軟骨分解を５６％〜７６％まで、そして滑膜細胞過形成を３５％〜７１％まで減少することによって、慢性関節リウマチの臨床的結果を改善し得ることを示した。同様に、メトトレキサート、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔまたはステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）と組み合わせたＨＩＦ−１α阻害での処置は、単独療法で達成することができない滑膜細胞過形成の減少および軟骨分解の減少を示す。
【０１０３】
メトトレキサート耐性患者における標準的な抗リウマチ処置と組み合わせたＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用のシミュレーションは、正常なメトトレキサート応答性患者においての応答パターンと類似した応答パターンを明らかにした。滑膜細胞密度に対して６ヶ月間、メトトレキサート耐性患者においてシミュレートされた処置（または処置を欠いた）の効果は、表３に要約される。シミュレーションの結果は、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（例えば、Ａｎａｋｉｎｒａ）の投与に加えたＨＩＦ−１α活性の遮断は、軟骨分解を５５％〜７１％まで、そして滑膜細胞過形成を２７％〜５７％まで減少することによって、慢性関節リウマチの臨床的結果を改善し得ることを示した。興味深いことに、メトトレキサート耐性患者へのＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用とメトトレキサートの投与とを含む組み合わせ療法は、ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用またはメトトレキサート処置単独によって達成されたものよりも大きな程度まで、軟骨分解および滑膜細胞過形成を減少することによって慢性関節リウマチの臨床的結果を改善し得る。代表的な慢性関節リウマチ患者と同様に、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔまたはステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）と組み合わせたＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用での処置は、単独療法では達成することができない滑膜細胞過形成および軟骨分解の減少を示す。
【０１０４】
ＴＮＦ−α中和療法は、慢性関節リウマチ患者の処置においてますます重要になっている。しかし、全ての慢性関節リウマチ患者のおおよそ３分の１は、ＴＮＦ−α中和療法に対して臨床的に顕著な応答を達成しない。ＴＮＦ−α遮断耐性患者の３つの潜在的なクラスは、上に記載されたモデルにおいて規定された。滑膜細胞過形成および軟骨分解は、ＴＮＦ−αが、異なる範囲内で変動する場合、差次的に影響され、現在のモデル内の３つのノンレスポンダーのクラスの同定につながる。具体的には、初期のＴＮＦ−α活性が低い患者は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、滑膜細胞過形成の減少を示すが、軟骨分解においては最小限の減少を示す（軟骨ノンレスポンダー、すなわちＣＮＲ）一方、初期のＴＮＦ−α活性が無視できる患者は、滑膜細胞過形成および軟骨分解の両方において弱い反応しか示さない（二重ノンレスポンダー、すなわちＤＮＲ）。あるいは、異常に高いレベルまたは耐性レベルのＴＮＦ−α活性を有する患者においてＴＮＦ−αの中和が不十分なことは、軟骨分解の改善を生じるが、過形成においては弱い応答しか生じない（過形成ノンレスポンダー、すなわちＨＮＲ）。機構的に、低レベルのＴＮＦ−αを有する患者において、リウマチ疾患は、代替的なマクロファージ活性化経路(例えば、ＣＤ−４０−ライゲーション)の活性の増加、抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の活性の減少、および分解を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ−１β）の活性の増加によって永続された。ノンレスポンダーの患者はまた、他の治療（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）に対する変更された応答を示した（データは示さず）。
【０１０５】
ＴＮＦ−α遮断に対して顕著な臨床的応答を達成しない患者は、慢性関節リウマチの集団の相当のサブセットを表す。ＴＮＦ−α過形成ノンレスポンダーにおける標準的な抗リウマチ処置と組み合わせたＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用のシミュレーションは、正常なメトトレキサート応答性患者においてよりもわずかに異なるパターンの応答を明らかにした。滑膜細胞密度および軟骨分解に対して６ヶ月間、ＴＮＦ−α過形成ノンレスポンダーにおいてシミュレートした処置（または処置を欠いた）の効果は、表３に示される。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断耐性患者に対するＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用およびメトトレキサートの投与を含む組み合わせ療法が、ＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用単独と比較して臨床的な結果に改善はないことを示した。しかし、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、ＩＬ−１Ｒａまたはステロイドの処置とのＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用の組み合わせは、単独療法またはＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用単独と比較して、滑膜細胞過形成が少なく、より低い軟骨分解の割合を生じ得る。インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（例えば、Ａｎａｋｉｎｒａ）の投与に加えたＨＩＦ−１α活性の遮断は、軟骨分解を５５％〜７６％まで、そして滑膜細胞過形成を３２％〜７１％まで減少させることによって慢性関節リウマチの臨床的結果を改善する。
【０１０６】
ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび別の抗リウマチ薬は、同時に投与される。「同時投与」および「同時に投与する」とは、本明細書において使用される場合、ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストと別の疾患を改変する抗リウマチ薬とを、混合物（例えば、１つの薬学的組成物または溶液）、あるいは連続的に、同時に、または異なる時期であるがＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストと他の疾患を改変する抗リウマチ薬とが相互作用ができないような時間ほどは時間が隔てていない時期に投与される別個の化合物として（例えば、別個の薬学的組成物または溶液）、投与する工程を包含する。
【０１０７】
選択される投与の経路に関わらず、ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび他の抗リウマチ薬は、薬学の分野で公知の従来の方法によって薬学的に受容可能な単位投薬形態に処方される。ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび他の抗リウマチ薬の有効であるが、毒性のない量が、処置に使用される。ＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストおよび他の抗リウマチ薬は、混合物でか、もしくは別個に、経腸的および／または非経口的に、同時に投与され得る。非経口投与としては、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与、関節への直接注射、および当該分野で公知の他の投与方法が挙げられる。経腸投与は、錠剤、徐放性錠剤、腸溶性錠剤、カプセル剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、などを含む。
【０１０８】
（２．薬学的組成物）
本発明の局面は、温血動物の慢性関節リウマチを処置するのに有用な薬物を製造する方法を提供する。薬物は、経口投与、局所投与、経皮投与、経直腸投与、吸入投与、非経口（静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与などに適した組成物を提供するために、既知の処方技術に従って調製される。本発明の組成物を調製するための詳細な指針は、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １８０４０によって出版されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓの第１８版または第１９版を参照することによって見出される。関連する部分は、参考として本明細書に援用される。
【０１０９】
単位用量または複数回用量の様式が考慮され、それぞれ特定の臨床状況において利点を提供する。単位用量は、慢性関節リウマチを処置する状況において、所望の効果を生じるように計算されたＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの所定量を含有する。複数回用量様式は、所望の結果を達成するために、複数の１回用量、または分別用量が必要なときに、特に有用であり得る。これらの投薬様式のどちらも、特定の化合物の独自の特徴、達成されるべき特定の治療効果、および炎症性疾患の処置のための特定の化合物を調製する当該分野に固有の任意の制限によって、決定されるか、またはそれらに直接依存する仕様を有し得る。
【０１１０】
単位用量は、被験体において慢性関節リウマチを処置するのに十分な治療有効量を含有し、化合物を約１．０〜１０００ｍｇ（例えば、約５０〜５００ｍｇ）含有し得る。
【０１１１】
好ましい実施形態において、本発明の薬物は、ヒトへの静脈内投与に適した薬学的組成物として、日常的な手順に従って処方される。通例、静脈内投与用の薬学的組成物は、滅菌等張水性緩衝液による溶液である。必要な場合に、薬学的組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は、活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェなどの密封容器内に、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別に、または共に混合されて単位投薬様式で供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌製薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配され得る。組成物を注射によって投与する場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。
【０１１２】
本発明の薬物は、中性または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、アニオンを用いて形成された塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩）、およびカチオンを用いて形成された塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩）が挙げられる。
上記化合物は好ましくは、摂取錠剤、口腔錠、カプセル剤、カプレット剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、トローチ剤、カシェ剤、ロゼンジなどとして、適切な処方物で経口投与される。一般に、最も容易な処方物は、錠剤またはカプセル剤である（個別にまたは集合的に「経口投薬単位」と呼ばれる）。適切な処方物は、化合物の特徴を適切な組成物を処方するために利用可能な賦形剤に適合させる、利用可能な標準的処方技術に従って調製される。
【０１１３】
その形態は、化合物を迅速に送達し得るか、または持続放出性調製物であり得る。化合物は、硬カプセルまたは軟カプセルに封入され得るか、錠剤に圧縮され得るか、または飲料、食品もしくは他の食物に組み入れられ得る。最終組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん変化し得、好都合には最終形態（例えば、錠剤）の重量の１％と９０％との間の範囲であり得る。このような治療的に有用な組成物の量は、適切な投薬量が得られる量である。本発明による好ましい組成物は、経口投薬単位形態が５ｍｇと１０００ｍｇとの間の重さの投薬単位中で約５．０重量％〜約５０重量％（％ｗ）を含有するように調製される。
【０１１４】
経口投薬単位の適切な処方物は、バインダー（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン）；甘味剤（例えば、ラクトースまたはスクロース）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；または着香料（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油など）も含み得る。種々の他の物質が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ経口投薬単位の物理的形態を改変するために存在し得る。経口投薬単位は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、染料および着香料を含有し得る。利用されるいずれの物質も、薬学的に受容可能で、かつ実質的に非毒性でなければならない。有用な賦形剤の種類の詳細は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」の第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ    Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出され得る。特に、より完全な議論については９１−９３章を参照のこと。
【０１１５】
本発明の薬物は、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、静脈内、皮下、または腹腔内）に投与され得る。キャリアまたは賦形剤もしくは賦形剤混合物は、溶媒、あるいは例えば、種々の極性または非極性溶媒、その適切な混合物、または油を含有する分散媒体でありうる。本明細書で使用される場合、「キャリア」または  「賦形剤」は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を意味し、ありとあらゆる溶媒、分散剤または媒体、コーティング剤、抗菌剤、等張剤／低張剤／高張剤、吸収改変剤などを含む。そのような物質および薬剤の製薬活性物質への使用は、当該分野で周知である。従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物での使用が企図される。さらに、他の活性成分または補助活性成分も最終組成物に組み入れられ得る。
【０１１６】
化合物の液剤は、適切な希釈剤（例えば、水、エタノール、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、種々の油および／またはその混合物、および当業者に既知のその他のものに、調製され得る。
【０１１７】
注射用途に適切な薬学的形態は、滅菌液剤、分散剤、乳剤、および滅菌粉剤を含む。最終形態は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならない。その上、最終の薬学的形態は、汚染に対して防御されなければならず、したがって細菌または真菌などの微生物の増殖を阻害できなければならない。単回静脈内用量または単回腹腔内用量が投与され得る。あるいは、通例１〜８日間続く、低速の長期注入または複数回の短期１日注入が利用され得る。別の日数または数日に一回の投薬もまた利用され得る。
【０１１８】
滅菌注射用液剤は、必要な量の化合物を１つ以上の適切な溶媒に組み入れ、必要な場合、挙げた他の成分または当業者に既知である他の成分をそれに添加することによって、調製される。滅菌注射用液剤は、必要な量の化合物を必要に応じた種々の他の成分と共に適切な溶媒に組み込むことによって調製される。濾過などの滅菌手順が次に続く。通例、分散剤は、分散媒体および上で示した必要な他の成分も含む滅菌ビヒクルに、化合物を組み入れることによって作製される。滅菌粉剤の場合、好ましい方法は真空乾燥または凍結乾燥を含み、それに任意の必要な成分が添加される。
【０１１９】
いずれの場合でも、上記の最終形態は、滅菌されなければならず、中空針などの注射用デバイスを簡単に通過できなければならない。適正な粘度は、溶媒または賦形剤の適正な選択によって、達成および維持され得る。その上、レクチンなどの分子または粒子コーティングの使用、分散剤中の粒径の適正な選択、または界面活性剤特性を備えた物質の使用が、利用され得る。
【０１２０】
微生物の増殖の防止または阻害は、１つ以上の抗菌剤（例えば、クロロブタノール、アスコルビン酸、パラベン、テルメロサール（ｔｈｅｒｍｅｒｏｓａｌ）などの添加によって達成され得る。張性を変化させる薬剤（例えば、糖または塩）を含むことも好ましい。
【０１２１】
特定の実施形態において、本発明の組成物を処置の必要な領域に局所的に投与することが所望され得る；これは例えば、これに限定されるわけではないが、外科処置中の局所注入、外科処置後の例えば、創傷被覆材と併せた局所塗布によってか、注射、カテーテル、坐剤によってか、またはシラスティック膜などの膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料の移植によって、達成され得る。
【０１２２】
別の実施形態において、組成物は、小胞（特に、リポソーム）中で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ    Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照；一般に同書を参照のこと）。
【０１２３】
なお別の実施形態において、組成物は制御放出系、または持続放出系において送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：  ５０７；Ｓａｕｄｅｋら，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態においては、ポリマー材料が、制御放出系に使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。なお別の実施形態において、制御放出系は、治療標的（例えば、脳、腎臓、胃、膵臓、および肺）に近接して配置され得、従って全身用量の画分のみを必要とし得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，第２巻，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）による総説に述べられている。
【０１２４】
本発明の薬物がタンパク質をコードする核酸である特定の実施形態において、その核酸は、そのコードされたタンパク質の発現を促進するために、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築して、それが細胞内となるように投与することによって、インビボで投与され得る。例えば、この投与は、レトロウィルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注入、または微粒子銃（例えば、遺伝子ガン；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用、あるいは脂質または細胞表面レセプターまたは形質移入剤を用いたコーティング、あるいは核に入ることが既知であるホメオボックス様ペプチドへの結合しての投与など（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８を参照のこと）による。あるいは、核酸は相同組換えによって、細胞内に導入され、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例を、当業者の指針として提供する。これらの実施例は、単に本発明の実施形態の理解および実施において有用な特定の方法論を提供するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１２６】
（Ａ．実施例１：単球／Ｔ細胞の動員）
ヒトＰＢＬを、健常ドナーまたは慢性関節リウマチ患者のクエン酸塩抗凝固処理全血から、デキストラン沈降およびＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上での密度分離によって単離する。この単核細胞を洗浄して、以前に記載されているように（Ｃａｒｒ  １９９６）、ナイロンウール上およびプラスチック接着によってさらに精製する。得られたＰＢＬ（＞９０％ＣＤ３＋Ｔリンパ球）は、使用前にＬＰＳを含まないＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で１５〜１８時間培養する。メモリーＣＤ４＋Ｔリンパ球サブセットおよびナイーブなＣＤ４＋Ｔリンパ球サブセット（それぞれＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋）は、製造者の説明書に従って磁気細胞分離（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して、ネガティブセレクションによって単離する。ＨＵＶＥＣを、臍帯静脈から単離して（ｊａｆｆｅ  １９７３）、１０％ＦＣＳ、８％プールヒト血清、５０μｇ／ｍｌ  内皮細胞成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０Ｕ／ｍｌブタ腸ヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および抗生物質を含有するＭ１９９中で一次培養物として確立する。実験を、９６ウェル培養プレート内で水和Ｉ型コラーゲンゲル上に培養された２代継代の細胞に対して実施する（Ｍｕｌｌｅｒ  １９８９）。特定の実験において、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌおよび１０Ｕ／ｍｌの最終濃度）あるいは健常ドナーまたは慢性関節リウマチ患者からの希釈滑膜液を、最後の４〜２４時間に亘って培養培地に添加する。
【０１２７】
内皮細胞の層を通過する単球またはＴ細胞の移動を、測定する。このアッセイの詳細は、Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６：８１９−８２８（１９９２）およびＭｕｌｌｅｒら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：４４９−４６０（１９９３）において記載される。経内皮移動を、Ｌｉａｏら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：１３３７−１３４３（１９９５）およびＭｕｌｌｅｒら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：４４９−４６０（１９９３）において記載されるＮａｍａｒｓｋｉ光学によって定量する。水和コラーゲンゲル上で増殖させたＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層に、白血球を添加する。インキュベーション（１時間）後、非接着細胞を洗浄によって除去し、そして残った接着細胞および遊出した細胞を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒド中で一晩インキュベートすることによって、内皮の単層上の適当な位置に固定する。複数の倍率の高い視野を顕微鏡下で観察し、記録する。遊出のデータを、内皮の下にある単層と一緒に残った全細胞の割合として表す。
【０１２８】
経内皮移動をまた、パラフィン包埋した単層の断面上で定量する。これらの標本を、複製したサンプルの単層を注意深く除き、外側を向いたコラーゲンゲル側と互いに対して内皮表面を配置することによって調製する。このことは、包埋プロセスの間に細胞が機械的に除かれることを防止する。ワックス中に置換した後、その標本が４つの単層サンプル（各々２つの単層の２つの異なる部分）の断面を作製するようにその標本を切断して、二等分する。標本の異なる領域をサンプリングして、同じ細胞を２度数えることがないように、少なくとも５０μｍ離れた標本の３つのレベルに対して定量を行う。
【０１２９】
（Ｂ．実施例２：アポトーシスの活性化およびアネキシンＶアッセイ）
単離した慢性関節リウマチの滑液ＭＮＣおよびマクロファージを、１μｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ抗体（クローンＣＨ１１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）または無関係のＩｇＭモノクローナル抗体のコントロールとともに２４時間インキュベートする。冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、次いで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２中に、約１×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。１００μｌの溶液（約１×１０５個の細胞）を５ｍｌ培養チューブに移す。５μｌの２．５μｇのアネキシンＶ−フィコエリトリンおよび２．５μｇのバイタル色素の７−ＡＡＤを各チューブに添加し、穏やかに混合して、暗所において室温で１５分間インキュベートする。４００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を各チューブに添加し、次いでその細胞を出来るだけ早く（１時間以内）細胞サイトメトリーによって分析する。アネキシンＶ陽性細胞の割合によって、アポトーシス細胞の割合を測定する。
【０１３０】
（Ｃ．実施例３：ＴＵＮＥＬアッセイ）
細胞を２４時間、組換えＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、または１μｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、抗ＴＮＦ−Ｒ１もしくは抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体とともにインキュベートすることによって、滑膜ＭＮＣおよびマクロファージにアポトーシスを誘導した。１〜２×１０６個の単球を４００×Ｇで数分間遠心分離し、上清を廃棄して、その細胞を０．５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁する。５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）に細胞懸濁液を添加し、１５分間氷上に配置し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄し、そして最後に０．５ｍｌのＰＢＳ中に懸濁した細胞を５ｍｌの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールと合わせることによって、細胞を固定する。この細胞を最小限３０分間、氷上またはフリーザーに静置して、次の染色工程に進める。
【０１３１】
このチューブを回転させて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液の１．０ｍｌアリコート（約２〜４×１０５細胞／ｍｌ）を取り出して１２×７５ｍｍ遠心チューブに配置する。この細胞懸濁液を、５分間３００×ｇで遠心分離して、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを吸引によって除去する。遠心分離およびＰＢＳ＋０．０５％アジ化ナトリウム中への再懸濁によって、この細胞を２回洗浄し、沈殿させ、次いで５０μｌの染色溶液（カコジル酸緩衝化食塩水中、ＴｄＴ酵素／ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ）に再懸濁する。この細胞を、少なくとも１時間３７℃でインキュベートする。１．０ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％アジ化ナトリウムを添加することによって、染色を停止する。３００×ｇ、５分間の遠心分離によって細胞をペレット化し、ＰＢＳ＋０．０５％アジ化ナトリウム中に再懸濁し、そして再びペレット化する。吸引によって上清を除去し、ペレットを暗所において室温で３０分間インキュベートする。この細胞を、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１３２】
（Ｄ．実施例４：ヨウ化プロピジウム染色）
試験化合物の存在下もしくは非存在下において、９日目の接着性滑液マクロファージを、抗Ｆａｓ抗体またはコントロールＩｇＭとともに２４時間インキュベートする。次いで、０．０２％  ＥＤＴＡにより培養物を回収し、７０％エタノール中に一晩固定し、ヨウ化プロピジウム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で染色する。そして、Ｇ０／Ｇ１ピーク（２Ｎ）の直後のサブ２倍体（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）のピークを、フローサイトメトリーによって決定する。残骸を表す可能性の高い最小限の光散乱を有する対象を除くことが必要であり得る。この残骸は、サブ２倍体集団の推定値を人工的に増加させる。代表的には、アポトーシスを起こす滑膜マクロファージ（サブ２倍体集団）の割合は、ＨＩＦ−１αアンタゴニストの非存在下における２〜５％から、ＨＩＦ−１α活性が完全に抑制される場合の３５〜４０％まで増加する。
【０１３３】
（Ｅ．実施例５：抗ヒストンサンドイッチアッセイ）
１０４個の滑膜ＭＮＣまたはマクロファージを、１μｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ１１）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに２４時間インキュベートすることによって、アポトーシスを誘導する。インキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、そして上清（インキュベーションの間、膜を通って漏れ出たネクローシス細胞からのＤＮＡを含む）を捨てる。この細胞を溶解緩衝液中に再懸濁し、３０分間室温においてインキュベートする。溶解の後、細胞核および断片化されていないＤＮＡを、２００００×ｇで１０分間遠心分離することによってペレット化する。
【０１３４】
上清のアリコート（すなわち、細胞質画分）を、マイクロタイタープレートの抗ヒストン抗体のウェルに移す。複合体は、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を介してプレートに結合される。固定化抗体−ＤＮＡ抗体の複合体を３回洗浄し、免疫反応性でない全ての成分を除く。結合した複合体を、ペルオキシダーゼ基質によって明らかにした抗ＤＮＡ（ペルオキシダーゼ結合体化）モノクローナル抗体を用いて検出し、着色生成物の量（従って、固定化抗体−ヒストン複合体の量）を分光光度法的に決定する。ＤＮＡ−ヒストン複合体の定量的な比色分析的測定は、試験する細胞集団中に存在する、アポトーシス細胞の総量に比例する。
【０１３５】
（Ｆ．実施例６：ＨＩＦ−１α発現のウエスタンブロット分析）
０．１％ＮＰ−４０溶解緩衝液中への溶解によって、全細胞抽出物を滑膜ＭＮＣおよびマクロファージから調製する。２５〜５０μｇの抽出物を、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、半乾燥ブロッティング（ｓｅｍｉｄｒｙ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によってＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーする。ＰＢＳ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／５％無脂肪粉乳中で、室温で１時間フィルターをブロッキングする。ＰＢＳ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／２％無脂肪粉乳中で、４℃において、ウサギ抗ＨＩＦ−１α抗体を用いてフィルターをブロットする。ＰＢＳ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／２％無脂肪粉乳中で、フィルターを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に結合体化するロバ抗ウサギ二次抗体または抗マウス二次抗体（１：２，０００希釈）とともにインキュベートする。Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｌｕｓキット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、免疫複合体の可視化を実施する。
【０１３６】
（Ｇ．実施例７：毛細管形成アッセイ）
基底タンパク質のゲルを、製造者の指示書に従いＥＣＭａｔｒｉｘＴＭシステム（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｌ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから利用可能）を利用して、９６ウェル組織培養プレートの底に適用する。ＨＵＶＥＣを臍帯静脈から単離し、１０％  ＦＣＳ、８％プール化ヒト血清、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０Ｕ／ｍｌブタ腸ヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および抗生物質を含むＭ１９９中で、初代培養物として確立する。９６ウェル培養プレート中で水和Ｉ型コラーゲンゲル（Ｍｕｌｌｅｒ  １９８９）上で培養した２代継代の細胞に対して、実験を行う。このＨＵＶＥＣ細胞を５％胎児ウシ血清を補充した増殖培地中に再懸濁する。重合化ＥＣＭａｔｒｉｘの表面に、５×１０３個の細胞を適用する。この細胞を、試験化合物の存在下または非存在下において、一晩インキュベートする。一晩のインキュベーションの後に、新脈管形成の進行を、形成された毛細管の分枝点を計数することによって定量する。少なくとも３箇所の別個の視野を計測して、別個の視野に関連する計数の平均として実験値を決定する。
【０１３７】
上記の明細書において言及された全ての刊行物および特許は、本明細書において参考として援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変ならびに変化物は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、本発明を実施するための、記載された様式の種々の改変は、当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、代表的な慢性関節リウマチ患者における、滑膜細胞密度に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を説明する。
【図２】図２は、代表的な慢性関節リウマチ患者における、軟骨分解に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を説明する。
【図３】図３は、代表的な慢性関節リウマチ患者における、滑膜組織中のＩＬ−６に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を説明する。
【図４】図４は、代表的な慢性関節リウマチ患者における、個々の有意な生物学的プロセスに対するＨＩＦ−１α遮断のシミュレーションを説明する。
【図５】図５は、メトトレキサート耐性患者における、個々の有意な生物学的プロセスに対するＨＩＦ−１α遮断のシミュレーションを説明する。
【図６】図６は、メトトレキサート耐性患者における、滑膜細胞密度に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を説明する。
【図７】図７は、メトトレキサート耐性患者における、軟骨分解に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を説明する。
【図８】図８は、メトトレキサート耐性患者における、滑膜組織中のＩＬ−６に対するＨＩＦ−１α遮断の効果を説明する。
【図９】図９は、ＨＩＦ−１α阻害の比較を提供する。この比較は、代表的な慢性関節リウマチ患者におけるＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用の「より高い最大効果（ｕｐｐｅｒ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｆｆｅｃｔ）」での、マクロファージのアポトーシスの割合の増加および単球漸増割合の減少から予測した比較である。
【図１０】図１０は、ＨＩＦ−１α阻害の比較を提供する。この比較は、代表的な慢性関節リウマチ患者におけるＨＩＦ−１αアンタゴニスト作用の「最も可有望な最大効果（ｍｏｓｔ  ｌｉｋｅｌｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｆｆｅｃｔ）」での、マクロファージのアポトーシスの割合の増加および単球漸増の割合の減少から予測した比較である。
【図１１】図１１は、低酸素レベルでの炎症部位における低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を制御するか、またはこれによって制御される因子を説明する。左上のボックス：低酸素は、ＨＩＦ−１αを分解するプロリルヒドロキシラーゼ酵素を阻害する。右上のボックス：ＨＩＦ−１αは、炎症のいくつかの局面（すなわち、損傷組織の赤みおよび腫れ、ならびに糖分解酵素を介した損傷領域への白血球の移動）に対して必要とされる；ＨＩＦ−１αはまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を誘導する。下のボックス：ＨＩＦ−１αは、一酸化窒素（ＮＯ）の産生を増加させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月26日(2006.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性関節リウマチを罹患する患者における慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和するための医薬の調製における、治療有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストの使用。
【請求項２】
前記慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状が、異常に上昇した滑膜細胞密度、異常に高い割合の軟骨分解、滑膜組織における異常に高い濃度のＩＬ−６からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者またはＴＮＦ−α遮断ノンレスポンダーである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬が、メトトレキサート、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、およびステロイドの群から選択される抗リウマチ薬をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断耐性患者であり、そして前記抗リウマチ薬が、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたはステロイドである、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量を、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも低い場合に、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用なものとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項８】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも４５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置において有用なものとして同定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも８５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置において有用なものとして同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物は、該化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量が、該化合物の非存在下におけるＨＩＦ−１α活性の量よりも少なくとも９５％低い場合に、慢性関節リウマチの処置において有用なものとして同定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、低酸素条件下で測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）に結合されたＨＩＦ−１αの量を測定する工程を包含するプロセスによって測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、ＨＩＦ−１α応答性遺伝子からの転写の量を測定する工程を包含するプロセスによって測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、以下：
（ａ）前記化合物の存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量を、該化合物の非存在下において内皮細胞の少なくとも１つの層を通って移動する白血球の量と比較する工程
を包含するプロセスによって測定され、そしてここで、該移動する白血球の量は、該ＨＩＦ−１α活性の量を表す、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物の存在下におけるＨＩＦ−１α活性の低下が、該化合物の非存在下における白血球のアポトーシスの量よりも多い、該化合物の存在下における白血球のアポトーシスの量を観察することによって同定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＩＦ−１α活性の量が、以下：
（ａ）前記化合物の存在下における新脈管形成の量を該化合物の非存在下における新脈管形成の量と比較する工程
を包含するプロセスによって測定され、ここで該新脈管形成の量は、該ＨＩＦ−１α活性の量を表す、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
慢性関節リウマチの処置において使用するための薬物を製造する方法であって、該方法は、
請求項７〜１６のいずれか１項に記載の化合物を同定する工程、および
該化合物をヒトでの消費のために処方する工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
慢性関節リウマチの処置において使用するための化合物の収集物をスクリーニングする方法であって、該方法は、該収集物の各化合物について請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法を繰り返す工程を包含し、ここで該収集物のうちの少なくとも１つの化合物は、慢性関節リウマチの処置に有用なものとして同定される、方法。
【請求項１９】
慢性関節リウマチを罹患する患者において慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を緩和するための組成物であって、該組成物は、有効量のＨＩＦ−１α活性のアンタゴニストを含有する、組成物。
【請求項２０】
前記慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状が、異常に上昇した滑膜細胞密度、異常に高い割合の軟骨分解、滑膜組織における異常に高い濃度のＩＬ−６からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者またはＴＮＦ−α遮断ノンレスポンダーである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
メトトレキサート、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストおよびステロイドの群から選択される坑リウマチ薬をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断耐性患者であり、そして前記抗リウマチ薬が、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたはステロイドである、請求項２２に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月25日(2006.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007512369000001.app
【国際調査報告】
2007512369.tif 000018
2007512369.tif 000019
2007512369.tif 000020
2007512369.tif 000021
2007512369.tif 000022
2007512369.tif 000023