(57)【要約】  クリプトスポリジウムパルブム抗原（１種又は複数）若しくは対象のエピトープ（１種又は複数）と、腸管感染症及び／又は腸管症状を引き起こす病原体由来の他の少なくとも１種の抗原若しくは対象のエピトープ、及び／又はこのような抗原（１種又は複数）若しくは対象のエピトープ（１種又は複数）を発現する組換体（１種又は複数）及び／又はベクター（１種又は複数）及び／又はプラスミド（１種又は複数）とを含む混合組成物、並びに妊娠中の哺乳動物及び／又は新生若しくは幼若の哺乳動物、例えば妊娠中の雌牛及び／又は生後１カ月以内などの子牛などに対するこのような組成物の投与が開示され請求される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）由来の第１抗原若しくはエピトープ及び／又は第１抗原若しくはエピトープを発現する第１ベクターと、他の腸管病原体由来の第２抗原若しくはエピトープ、及び／又は第１抗原若しくはエピトープを発現し第２抗原若しくはエピトープも発現する第１ベクター、及び／又は第２抗原若しくはエピトープを発現する第２ベクターと、製薬上許容されるビヒクルとを含む、腸管の混合免疫組成物、混合免疫原性組成物、又は混合ワクチン組成物。
【請求項２】
クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）由来の抗原と、他の腸管病原体由来の抗原とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
クリプトスポリジウム由来の抗原と、ウシ種の他の腸管病原体由来の抗原とを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
クリプトスポリジウム由来の抗原と、イヌ種の腸管病原体由来の抗原とを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
クリプトスポリジウム由来の抗原と、ネコ種の腸管病原体由来の抗原とを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
クリプトスポリジウム由来の抗原と、ウマ種の腸管病原体由来の抗原とを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
腸管病原体由来の抗原が、大腸菌、ロタウイルス、コロナウイルス、クロストリジウム属菌、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
腸管病原体が大腸菌を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
大腸菌由来の抗原が、Ｋ９９抗原を有する不活化大腸菌、Ｆ４１抗原を有する不活化大腸菌、Ｙ抗原を有する不活化大腸菌、３１Ａ抗原を有する不活化大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択される抗原を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
大腸菌抗原が、Ｋ９９抗原を有する不活化大腸菌、Ｋ９９抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択されるＫ９９抗原；及び／又はＦ４１抗原を有する不活化大腸菌、Ｆ４１抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択されるＦ４１抗原を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
腸管病原体がウシコロナウイルスを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
腸管病原体がウシロタウイルスを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
腸管病原体がウェルシュ菌を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１４】
腸管病原体の抗原が、ウェルシュ菌Ｃ型及び／又はＤ型のトキソイドを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
腸管病原体が、大腸菌と、ウシロタウイルスと、ウシコロナウイルスと、ウェルシュ菌とを含む、或いは大腸菌と、ウシロタウイルスと、ウシコロナウイルスとを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１６】
腸管病原体の抗原が、Ｋ９９抗原を有する不活化大腸菌、Ｆ４１抗原を有する不活化大腸菌、Ｙ抗原を有する不活化大腸菌、３１Ａ抗原を有する不活化大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択される大腸菌抗原と、ウシ不活化コロナウイルスと、ウシ不活化ロタウイルスと、ウェルシュ菌Ｃ型及び／又はＤ型のトキソイドとを含み、或いはＫ９９抗原を有する不活化大腸菌、Ｆ４１抗原を有する不活化大腸菌、Ｙ抗原を有する不活化大腸菌、３１Ａ抗原を有する不活化大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択される大腸菌抗原と、ウシ不活化コロナウイルスと、ウシ不活化ロタウイルスとを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
大腸菌抗原が、Ｋ９９抗原を有する不活化大腸菌、Ｋ９９抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択されるＫ９９抗原、並びに／或いはＦ４１抗原を有する不活化大腸菌、Ｆ４１抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択されるＦ４１抗原を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｐ２１、Ｃｐ２３、Ｃｐ１５／６０、ＣＰ４１、及びそれらの混合物からなる群から選択される、サブユニットのクリプトスポリジウム・パルブム抗原を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｐ２１、Ｃｐ２３、Ｃｐ１５／６０、ＣＰ４１、及びそれらの混合物からなる群から選択される、サブユニットのクリプトスポリジウム・パルブム抗原を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｐ２１、Ｃｐ２３、Ｃｐ１５／６０、ＣＰ４１、及びそれらの混合物からなる群から選択される、サブユニットのクリプトスポリジウム・パルブム抗原を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｐ２１とＣｐ１５／６０を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
アジュバントがサポニンを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
アジュバントが水酸化アルミニウムを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が水中油型エマルジョンの形である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
Ｐ２１若しくはＣｐ２３抗原又はそれらのエピトープ、又は第１抗原を発現する第１ベクターを含む第１抗原と、Ｃｐ１５／６０抗原又はそのエピトープ、又は第１抗原及び第２抗原の両方を発現する第１ベクター、又は第２抗原を発現する第２ベクターを含む第２抗原と、製薬上許容されるビヒクルとを含む、クリプトスポリジウム・パルブムに対する免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物。
【請求項３１】
Ｐ２１若しくはＣｐ２３抗原とＣｐ１５／６０抗原とが、別々の融合タンパク質の形である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｐ２１とＣｐ１５／６０を発現するベクターを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｐ２１発現する組換えベクターと、Ｃｐ１５／６０を発現する組換えベクターとを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
アジュバントをさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
Ｐ２１、Ｃｐ２３、Ｃｐ１５／６０若しくはＣＰ４１抗原又はそれらのエピトープ或いはこの第１抗原を発現する第１ベクターを含む第１抗原と、クリプトスポリジウム・パルブム由来の第２抗原又はそのエピトープ或いは第１抗原及び第２抗原を両方発現する第１ベクター又は第２抗原を発現する第２ベクターを含む第２抗原と、製薬上許容されるビヒクルとを含み、第１抗原と第２抗原は互いに異なる抗原である、クリプトスポリジウム・パルブムに対する免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物。
【請求項３７】
腸管疾患に対する新生子牛のウシ免疫化方法であって、新生子牛がクリプトスポリジウム・パルブムに対する移行抗体を有するように、請求項１に記載の組成物を出産前の妊娠中の雌牛に投与することを含む方法。
【請求項３８】
組成物を妊娠中に投与された雌牛の初乳及び／又はミルクを新生子牛に与えることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
成牛及び新生子牛の能動免疫方法であって、該ウシに請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項４０】
組成物を新生子牛に投与することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
組成物を新生子牛に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
雌牛に投与する前記組成物が抗原若しくはそのエピトープを含み、子牛に投与する前記組成物がベクターを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
雌牛に投与する前記組成物が抗原若しくはそのエピトープを含み、子牛に投与する前記組成物がベクターを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１に記載の組成物を調製する方法であって、抗原若しくはエピトープ又はベクター、及び担体を混合することを含む方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の組成物を調製するためのキットであって、それぞれ別々の容器（１種又は複数）に入れた、抗原、エピトープ、又はベクターを含み、場合によっては一緒にパッケージに入れ、さらに場合によっては混合及び／又は投与に関する説明書を含むキット。
【請求項４６】
請求項１に記載の組成物を妊娠中の雌牛に投与し、その後前記雌牛から初乳及び／又はミルクを採取することによって得られる高度免疫初乳及び／又はミルク組成物。
【請求項４７】
組成物が、初乳及び／又はミルクを凝固させ免疫グロブリンを回収することによって得られる濃縮免疫グロブリンを含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
腸管疾患、腸管症状（１種又は複数）、及び／又は腸管の状態（１種又は複数）、及び／又はこのような疾患、症状（１種又は複数）及び／又は状態（１種又は複数）の原因となっている腸管病原体（１種又は複数）及び／又はクリプトスポリジウム・パルブムを予防し、治療し、且つ／又は制御するための方法であって、請求項４６に記載の組成物を新生子牛に投与することを含む方法。
【請求項４９】
腸管疾患、腸管症状（１種又は複数）、及び／又は腸管の状態（１種又は複数）、及び／又はこのような疾患、症状（１種又は複数）及び／又は状態（１種又は複数）の原因となっている腸管病原体（１種又は複数）及び／又はクリプトスポリジウム・パルブムを予防し、治療し、且つ／又は制御するための方法であって、請求項４７に記載の組成物を新生子牛に投与することを含む方法。
【請求項５０】
投与が経口投与である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
投与が経口投与である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
経口投与が、雌牛から新生子牛への授乳によるものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
高度免疫初乳及び／又はミルク組成物を調製する方法であって、請求項１に記載の組成物を妊娠中の雌牛に投与すること、及びその後前記雌牛から初乳及び／又はミルクを採取することを含む方法。
【請求項５４】
初乳及び／又はミルクを凝固させ免疫グロブリンを回収することにより雌牛から得られるミルク及び／又は初乳中の免疫グロブリンを濃縮することをさらに含み、この濃縮により組成物が前記免疫グロブリンを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
クリプトスポリジウム由来の第１抗原若しくはエピトープ及び／又はこのような抗原若しくはエピトープを発現するベクターと、他の腸管病原体由来の第２抗原若しくはエピトープ及び／又はこのような抗原若しくはエピトープを発現するベクターとを使用して、腸管感染症に対する免疫原性組成物又はワクチン組成物を調製する方法であって、第１抗原若しくはエピトープ及び／又はベクターと、第２抗原若しくはエピトープ及び／又はベクターとを混合することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９９年１２月２１日出願の米国特許仮出願第６０／１７１３９９号の優先権を主張する、２０００年１２月２０日出願の米国特許出願第０９／７４２５１２号の一部継続出願である。本出願はまた、２００３年８月１４日出願の米国特許仮出願第６０／４９５０４５号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本明細書で引用する各出願及び特許、並びにその各出願及び特許で引用されている各文献又は参考文献（係争中の各特許を含む；「出願引用文献」）、並びにこうした出願及び特許のいずれにも対応する、且つ／又はそれらの優先権を主張するＰＣＴ及び外国の各出願又は特許、並びに各出願引用文献で引用又は参照されている各文献を、参照により本明細書に組み込む。より一般的に、文献又は参考文献を、本明細書、つまり特許請求の範囲の前にある参考文献リスト又は明細書自体のいずれかで引用するが、こうした各文献又は参考文献（「本明細書で引用する参考文献」）、並びに本明細書で引用する各参考文献で引用されている各文献又は参考文献（製造元の仕様書、使用説明書なども含む）を参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
本発明は、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）及び／又は腸管病原体（他の腸管病原体など）の抗原（１種又は複数）／エピトープ（１種又は複数）、並びにクリプトスポリジウム・パルブム及び／又は腸管感染症に対する免疫応答を誘発するための、或いはそれらを予防、治療、又は制御するためのその抗原（１種又は複数）／エピトープ（１種又は複数）を含む、又は使用する組成物及び方法、並びにそれらの使用に関する。
【０００４】
本発明はさらに、動物、例えば、ウシ、ネコ、イヌ若しくはウマ又はそれらの種などの哺乳動物における腸管感染症に対する免疫応答を誘発し、且つ／又はその感染症を予防し、且つ／又は治療し、且つ／又は制御するための方法及び／又は組成物及び／又はこのような組成物の使用若しくはこのような組成物を配合する際のその成分の使用に関する。
【０００５】
本発明はまた、クリプトスポリジウム・パルブムによる感染に対する免疫応答を誘発し、且つ／又はその感染を予防し、且つ／又は治療し、且つ／又は制御するための、方法及び／又は組成物及び／又はこのような組成物の使用若しくはこのような組成物を配合する際の成分の使用に関する。
【０００６】
本発明はまた、単価のクリプトスポリジウム・パルブムワクチンと、腸管病原体、例えばウシの腸管病原体（例えば、ロタ／コロナウイルス、大腸菌（E. coli））ワクチンとの同時使用、及び／又はクリプトスポリジウム・パルブムと、ロタ／コロナウイルス若しくは大腸菌とを含む混合ワクチンの使用、並びに腸管疾患、例えばウシの腸管疾患の、クリプトスポリジウム・パルブムとの重感染による増悪を予防、制御、又は治療すること、或いは免疫応答を誘発してそれを減少させることに関するものであり得る。クリプトスポリジウム・パルブムに対するワクチン接種によって誘発される免疫により、本明細書に記載の腸管病原体によって誘発される疾患の重篤度が有意に軽減され得る。クリプトスポリジウム・パルブムを含む混合ワクチンは、ロタ及びコロナウイルス、並びに大腸菌Ｋ９９やＦ４１によって引き起こされる、子牛などの新生動物の多病因性の腸管疾患のより完全な予防に有用である。
【０００７】
本発明はまた、他の腸管病原体、例えばウシ腸管病原体に対するクリプトスポリジウム・パルブムの重感染の影響に関する。クリプトスポリジウム・パルブムは通常、哺乳動物、例えば子牛などの新生動物の糞便に存在する。クリプトスポリジウム・パルブムは、他の潜在的に病原性のあるウイルス及び細菌の腸管での有無にかかわらず、それ自体で腸管疾患の臨床症状を生じさせることができる。コロナウイルスなどのウイルス、及び大腸菌、例えばＦ４１などの細菌は、現場では非常に病原性の高いものとして認識されているが、実験的チャレンジモデルでは疾患の重大な臨床症状を引き起こすことはできない。したがって、重感染によりコロナウイルス、ロタウイルス、及び大腸菌、例えばＦ４１など、他の病原体によって引き起こされる疾患が増悪するので、本発明は、クリプトスポリジウム・パルブムとのウシの重感染に対処することに関するものであり得る。
【背景技術】
【０００８】
ウシの腸管疾患は、なんらかの下痢という形で現れることが多い、腸管病原体による腸管感染の結果である。この疾患は、一般に新生子牛下痢症とも称し、農業における実質的な経済損失の原因となっている。子牛の疾病率は、その治療的介入の必要性、及び動物に対するその長期間の有害な影響と共に農場経営者の経済的負担の原因となる主要な要素である。ある推定では、３週齢未満の乳用子牛の死因の約７５％が新生子牛下痢症であるとされている。Radostits, OM, et al., Herd Health Food Animal Production Medicine, 2nd ed., Sounders, Philadelphia, pp. 184-213, 1994。新生子牛下痢症の管理は多くの理由から困難であり、その最も重要な理由には、（１）疾患の発生機序に対する複数の病因の関与、（２）臨床症状の非特異性、（３）感染症には無症候性のものがあり得るという知見、及び（４）栄養及び内因性免疫など宿主要因の関与が含まれる。Moon, HW, et al., JAVMA 173 (5): 577-583 (1978)。Viring, S. et al., Acta Vet. Scand. 34: 271-279 (1999)。
【０００９】
感染中に複数の腸管病原体が存在することが知られているが、どの病原体又はどの病原体の組合せが実際にその疾患の原因となっているのかが分からないため、ウシの腸管疾患を予防又は治療する戦略を構築することは非常に困難となっている。米国並びに世界の他の国々における疫学的研究から、新生子牛下痢症に関連する最も流行している腸管病原体には、それだけには限らないが、クリプトスポリジウム・パルブム、ロタウイルス、コロナウイルス、及び大腸菌が含まれることが分かっている。ほとんどの場合、こうした腸管病原体の数種は疾患の大発生から分離されているが、各病茵の有病率は、単一の罹患集団内で、又は複数の感染群間で一致しない。
【００１０】
従来の研究では、ロタウイルスが下痢の子牛において最も流行している腸管病原体であることが発見された。例えば、英国における下痢の子牛に関する研究では、集団中の４２％及び２３％でロタウイルス及びクリプトスポリジウム・パルブムがそれぞれ検出された。この集団の子牛の２０％が複数の病原体に感染していた。しかし、より最近の報告では、クリプトスポリジウム・パルブムがウシの腸管感染症において主要な病原体となっている。クリプトスポリジウム・パルブム、及び新生子牛の他の主要な腸管病原体による同時感染を評価したより最近の研究では、クリプトスポリジウム・パルブムが集団中の５２．３％に見られた唯一の腸管病原体であり、続いてロタウイルスによる単独感染が４２．７％に見られた。de la Fuente et al., Preventive Veterinary Medicine 36: 145-152 (1998)。２種の病因による同時感染はこの研究群の２１．６％で生じたが、３種及び４種の病原体による感染はそれぞれ６％及び０．５％で見られた。この研究における最も一般的な混合感染は、クリプトスポリジウムとロタウイルスの組合せであった。新生子牛下痢症における個々の腸管病原体の役割に関して入手できる情報は限られている。さらに、新生動物におけるウシの腸管疾患の発症の基礎となる、ウイルス、細菌、及び原生動物病因の複合機序についてはなおさら理解されていない。しかし、この病因の機序の理解に欠けているかどうかに関係なく、複数の病原体による感染は、単一の腸管病原体による感染よりも重篤な臨床結果をもたらす傾向にある。
【００１１】
現在、新生子牛下痢症に対して十分に防御できる治療方法はない。この疾患の治療に有用な単一の薬物、又は化学治療剤の組合せもない。ウシの腸管疾患を標的とするワクチンは入手可能であるが、成功し受け入れられているものは限られている。現在入手可能なワクチンは、この疾患に関連していることが分かっている３種の腸内病原体、即ちロタウイルス、コロナウイルス、及び大腸菌の抗原を含むものである。これら市販のウシ腸管病原体ワクチン（ロタ／コロナ、大腸菌）の個々の成分は、実験的チャレンジモデルで防御効果があることが示されている。このようなワクチンが入手可能であるにもかかわらず、現場の条件下で、新生子牛下痢症、子牛下痢症、及び冬季赤痢は、肉牛、フィードロット、及び乳用子牛の事業に影響を与え続けている。米国市場での腸管病原体用混合ワクチンの使用量が少ないこと（この製品を毎年ワクチン接種しているのは妊娠した動物の４％だけである）によって反映されるように、大腸菌Ｋ９９、ロタウイルス、及びコロナウイルスを含む現在の腸管病原体ワクチンの実地条件下での有効性に生産者らは疑問を持ち続けている。
【００１２】
より最近では、クリプトスポリジウム・パルブムに対する実験的な単価ワクチンが開発されており、クリプトスポリジウム・パルブムの実験的チャレンジに対して防御することが示されている。しかし、腸管疾患に関与する多数の腸管病原体を、クリプトスポリジウム・パルブムワクチン単独での治療によって克服することはできない。また、腸管病原体による感染症は普遍的であり、即ち世界中で発見されており、さらに大部分の脊椎動物がこのような感染症を起こしやすい。したがって、腸管病原体による感染症と闘う必要性は、ウシ種に限られたものではない。さらに、腸管疾患は、制御することが困難で、おそらく多因性である可能性が高い。即ち、クリプトスポリジウム・パルブムは一因子となり得るが、これまでクリプトスポリジウム・パルブムが実際に腸管疾患を増悪すること、又はクリプトスポリジウム・パルブムを混合免疫原性組成物、混合免疫組成物、又は混合ワクチン組成物に使用すると腸内疾患の予防が増強されることを示した決定的なものはない。
【００１３】
さらに、混合ワクチンを調製及び使用する際に直面する問題は、「有効性干渉（efficacy interference）」と呼ばれる現象で、組合せのうちの一方の抗原の有効性が低下又は減少することである。これは混合ワクチンの一方の抗原が優勢になるためと考えられている。Paolettiらの米国特許第５８４３４５６号を参照のこと。この現象は、大腸菌の１種又は複数の抗原を使用する混合ワクチンに認められ、例えば、単数又は複数の細菌の抗原が混合ワクチンの他の抗原に干渉する。
【特許文献１】米国特許第５８４３４５６号
【非特許文献１】Radostits, OM, et al., Herd Health Food Animal Production Medicine, 2nd ed., Sounders, Philadelphia, pp. 184-213, 1994
【非特許文献２】Moon, HW, et al., JAVMA 173 (5): 577-583 (1978)
【非特許文献３】Viring, S. et al., Acta Vet. Scand. 34: 271-279 (1999)
【非特許文献４】de la Fuente et al., Preventive Veterinary Medicine 36: 145-152 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、クリプトスポリジウム・パルブムが腸管感染症及び腸管症状の一因となる問題、又はこの問題に対するここでの対処の仕方、例えば、目的の（of interest）クリプトスポリジウム・パルブム抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）と、腸管感染症及び／又は腸管症状を引き起こす病原体由来の他の少なくとも１種の目的の抗原若しくはエピトープ、及び／又は目的となるこのような抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を発現する組換体（１種又は複数）及び／又はベクター（１種又は複数）及び／又はプラスミド（１種又は複数）とを含む混合組成物、並びに妊娠中の雌牛など妊娠中の哺乳動物及び／又は生後１カ月以内の子牛など新生若しくは幼若の哺乳動物に対するこのような組成物の投与、並びに有効性干渉の潜在的なあらゆる問題に対する取り組みはこれまで開示又は示唆されていないと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一目的は、腸管病原体の改良された免疫組成物又はワクチン組成物、特に、獣医学の分野で、例えば、ウシ、イヌ、ネコ若しくはウマ又はそれらの種などの哺乳動物において使用することができる組成物とすることができる。
【００１６】
本発明の別の目的は、新生動物、例えば哺乳動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ若しくはウマ又はそれらの種、有利にはウシに受動免疫を与えるなど、新生動物及び／又は幼若動物を免疫するのに効果的に使用することができるこのような免疫組成物或いはワクチン組成物とすることができる。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、クリプトスポリジウム・パルブムに対する改良された免疫組成物又はワクチン組成物、例えば、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ若しくはウマ又はそれらの種、特にウシ又はそれらの種で使用するなどのための、特に獣医学の分野で使用する組成物とすることができる。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、新生動物、例えば、イヌ、ネコ若しくはウマ又はそれらの種、特にウシ又はそれらの種などの哺乳動物に受動免疫を与えるなど、新生動物及び／又は幼若動物を免疫するための改良方法とすることができる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、クリプトスポリジウム・パルブム、又はクリプトスポリジウム・パルブムを含めた腸管病原体に対する免疫応答を誘発する方法、又はクリプトスポリジウム・パルブムを含めた腸管感染症及び／又は腸管症状を制御、予防、及び／又は治療する方法、例えば、本発明の組成物を投与することを含む方法、並びにこのような組成物を調製する方法、とりわけこのような組成物を配合するためのこのような組成物の成分の使用を含むものとすることができる。
【００２０】
クリプトスポリジウム・パルブムを含めた腸管病原体など、腸管病原体に対するワクチン接種又は免疫化は、少なくとも２種のクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはそのエピトープ、及び／又は少なくとも２種のクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはそのエピトープを発現するベクター（１種又は複数）の組合せ、例えば、Ｐ２１若しくはそのエピトープ及び／又はＰ２１若しくはそのエピトープを発現するベクターと、或いはＣｐ２３若しくはそのエピトープ及び／又はＣｐ２３若しくはそのエピトープを発現するベクターと、Ｃｐ１５／６０若しくはそのエピトープ及び／又はＣｐ１５／６０を発現するベクターとの組合せを含めた、免疫組成物又はワクチン組成物（例えば、Ｃｐ２３の少なくとも１種のエピトープと、Ｃｐ１５／６０の少なくとも１種のエピトープとを含む組成物；ここで、Ｃｐ２３抗原若しくはタンパク質にはＰ２１が含まれ得ることに留意されたい）を使用することによって大きく予想外に改良される。
【００２１】
２種の抗原（若しくは目的のエピトープ（１種又は複数）、及び／又はこの抗原及び／又はエピトープ（１種又は複数）を発現するベクター）を混合することにより、クリプトスポリジウム・パルブムに対する抗体が非常に多く産生されるなど、クリプトスポリジウム・パルブム及び／又は腸管感染症、又は腸管病原体、又は腸管症状に対する免疫応答、例えば抗体、細胞性応答、又はその両方が改善され有用に生じるという相乗効果がもたらされる。また、この組合せにより、新生動物若しくは幼若動物、又は哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ若しくはウマ又はそれらの種、特にウシを防御するのに有用である効率的な免疫組成物或いはワクチン組成物を調製することができる。例えば、有利には、目的とする抗原及び／又はエピトープ（１種又は複数）を含む組成物を、例えば、まだ生まれていない子孫に、また新生動物若しくは幼若動物に離乳期のミルク又は初乳を介して伝えられる免疫応答を誘発するために、母獣又は妊娠中の雌に接種するのに使用することができ、有利には、目的とする抗原及び／又はエピトープ（１種又は複数）を発現するベクター（１種又は複数）を含む組成物を、あらゆる年齢の雄及び雌、例えば、妊娠していない雌及び／又は新生動物若しくは幼若動物の雄及び雌に接種するのに使用することができ、また、例えば、幼若動物若しくは新生動物が授乳期のミルク又は初乳を介して抗体又は他の免疫作用物質を受け取る間この動物に免疫応答を生じさせるために、新生動物若しくは幼若動物への接種を単独で、又は有利には母獣又は妊娠中の雌への接種と組み合わせて実施することができる。
【００２２】
免疫組成物又はワクチン組成物において、クリプトスポリジウム・パルブムに対する目的の抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）を、動物種の他の少なくとも１種の腸管病原体に対する他の少なくとも１種の目的の抗原若しくはエピトープ（有利には、複数の病原体、例えば腸管病原体由来の複数の抗原及び／又は対象（of interest）のエピトープ）を組み合わせると、腸管疾患に対する防御を有意に増大させることができる。
【００２３】
特に有利な本発明の免疫組成物又はワクチン組成物は、クリプトスポリジウム・パルブムを防御するものとすることができ、（ｉ）目的となる少なくとも１種のＣｐ２３抗原若しくはエピトープ及び／又は目的となる少なくとも１種のＣｐ２３抗原若しくはエピトープを発現する少なくとも１種のベクター、或いは目的となる少なくとも１種のＰ２１抗原若しくはエピトープ及び／又は目的となる少なくとも１種のＰ２１抗原若しくはエピトープを発現する少なくとも１種のベクターと、（ii）目的となる少なくとも１種のＣｐ１５／６０抗原若しくはエピトープ及び／又は少なくとも１種のＣｐ１５／６０を発現する少なくとも１種のベクターとを含むことができる。有利には、この組成物はさらに、別の腸管病原体由来の目的となる追加の少なくとも１種の抗原若しくはエピトープ及び／又は追加の少なくとも１種の抗原を発現するベクター（これは、目的となるＣｐ２３若しくはＰ２１抗原又はエピトープ、及び／又は目的となるＣｐ１５／６０抗原若しくはエピトープを発現する同じベクターとすることができ、例えば、この組成物は、目的となるＣｐ２３若しくはＰ２１抗原又はエピトープと、目的となるＣｐ１５／６０抗原若しくはエピトープと、場合によっては追加の任意の目的とする抗原若しくはエピトープとを共発現するベクターを含むことができる）を含むことができる。
【００２４】
別のクリプトスポリジウム・パルブム抗原は、Mark C. Jenkins et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Nov. 1999, 6, 6: 912-920に記載するＣＰ４１抗原である。本発明による免疫組成物又はワクチン組成物は、この目的となる抗原若しくはエピトープ、及び／又は前記抗原若しくはそのエピトープを発現するベクターを、場合によっては好ましくは、Ｃｐ２３、Ｐ２１、及びＣｐ１５／６０など本明細書に記載の他の少なくとも１種のクリプトスポリジウム・パルブムと組み合わせて、例えば、Ｃｐ２３若しくはＰ２１、及び／又はＣｐ１５／６０と組み合わせて含むことができる。この抗原を発現させるために、本明細書の図２で表すヌクレオチド配列の上流に開始コドンを、この配列の下流に終止コドンを付加することができる。
【００２５】
また、目的とするクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはエピトープとして、Ｃｐ２３若しくはそのエピトープ又はこの抗原若しくはエピトープを発現するベクター、或いはＰ２１若しくはそのエピトープ又はこの抗原若しくはエピトープを発現するベクター、或いはＣｐ１５／６０若しくはそのエピトープ又はこの抗原若しくはエピトープを発現するベクター、或いはＣＰ４１若しくはそのエピトープ又はこの抗原若しくはエピトープを発現するベクターのうちの１種だけを、有利には、目的となる他の少なくとも１種のクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはエピトープ又は目的となる抗原若しくはエピトープを発現するベクターと組み合わせて使用することにより、腸炎に対して有効な免疫組成物又はワクチン組成物が産生される。この組成物はさらに、別の腸管病原体由来の追加の目的となる少なくとも１種の抗原若しくはエピトープ、及び／又は追加の少なくとも１種の抗原を発現するベクター（このベクターは抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）を共発現することができる）を含むことができる。
【００２６】
本発明はさらに、クリプトスポリジウム・パルブムを含めた腸管病原体若しくは腸管感染症若しくは腸管症状に対する免疫応答又は防御（ワクチン）応答を誘発し、或いはこれらを制御、予防、及び／又は治療する方法を包含するものであり、例えば、この方法は、本発明の組成物を投与することを含む。
【００２７】
本発明の組成物は、未経産雌牛又は雌牛（以下雌牛と称する）、イヌ、ネコ、ウマなどの妊娠中の哺乳動物に、その妊娠期間、例えば一般的な妊娠期間（雌牛の妊娠期間は一般的に９カ月又は１７０日）中に１回又は２回投与することができる。例えば、出産の約１〜約２．５又は３カ月前に１回目の投与、出産近く、例えば出産前の３週間、好ましくは出産の約３〜１５日前に２回目又は単独の投与を実施する。このようにすると、この雌は、新生仔、例えば出生後の子牛にミルク又は初乳を介して受動免疫を伝えることができる。有利には、妊娠中の哺乳動物には、抗体応答が誘発されることが望ましいので、抗原（１種又は複数）及び／又はそのエピトープ（１種又は複数）を含む組成物（ベクター（１種又は複数）、組換え体（１種又は複数）、及び／又はＤＮＡプラスミド（１種又は複数）を含む組成物ではなく）を投与する。また、有利には、これとは対照的に、新生動物及び／又は非常に幼若な動物の腸管の状態、腸管感染症、及び／又は腸管症状を予防、治療、及び／又は制御するのには細胞性応答及び／又は抗体応答が有用であるので、新生の、若しくは非常に幼若な哺乳動物（例えば、生後約１カ月以内のウシなど、腸管疾患に感染しやすい哺乳動物、及び類似の生後の期間の他の哺乳動物）には、抗原（１種又は複数）及び／又はそのエピトープ（１種又は複数）をin vivoで発現するベクター（１種又は複数）、組換え体（１種又は複数）及び／又はＤＮＡプラスミド（１種又は複数）を含む組成物を投与する。新生動物及び／又は非常に幼若な動物は、感染しやすい期間に抗原組成物及び／又はエピトープ組成物及び／又はベクター／組換え体／ＤＮＡプラスミド組成物の追加投与を受けることができ、またその母獣も、場合によってはまた有利には、新生動物及び／又は非常に幼若な動物が直接的且つ受動的な投与で免疫応答を受けることができるように、本明細書に記載の通り妊娠中にワクチン接種を受けることができる。
【００２８】
本発明の特定の組成物は、１種又は複数の大腸菌抗原（例えば、Ｋ９９、Ｙ、３１Ａ及び／又はＦ４１などの線毛を有する不活化大腸菌、及び／又はサブユニットの形の、又は組換え体によりin vivoで発現されるこうした線毛）、及び／又は１種又は複数のロタウイルス抗原（例えば、有利には不活化ロタウイルス）、及び／又はコロナウイルス抗原（例えば、ウシコロナウイルス抗原、有利には不活化コロナウイルスなど）を、Ｐ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０など１種又は複数のクリプトスポリジウム・パルブム抗原と組み合わせて含むことができる（また先に述べたように、このような抗原のうち１種又は複数は、この目的とする抗原内に含まれるエピトープとすることもでき、このような目的となる抗原若しくはエピトープのうち１種又は複数を組換え体又はプラスミドによりin vivoで発現させることもできる）。
【００２９】
したがって、本発明の特定の組成物は、（ｉ）Ｐ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、有利にはＰ２１及び／又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０など１種又は複数のクリプトスポリジウム・パルブム抗原と、（ii）少なくとも１種の大腸菌抗原（例えば、Ｋ９９、Ｙ、３１Ａ、Ｆ４１、及び／又は不活化大腸菌の有する他の線毛、又はサブユニットの、又はin vivoで発現される他の線毛のうち少なくとも１種又はすべて；Ｋ９９及び／又はＦ４１が存在することが好ましく、Ｙ及び／又は３１Ａも存在することが有利である）、及び／又はコロナウイルス抗原、及び／又はロタウイルス抗原とを含むことができる。例えば、Ｐ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、有利にはＰ２１及び／又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０などの１種又は複数のクリプトスポリジウム・パルブム抗原と、不活化ロタウイルスなどの１種又は複数のロタウイルス抗原とを含む、或いはＰ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、有利にはＰ２１及び／又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０などの１種又は複数のクリプトスポリジウム・パルブム抗原と、不活化コロナウイルス、例えばウシ不活化コロナウイルスなどの１種又は複数のコロナウイルス抗原とを含む、或いはＰ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、有利にはＰ２１及び／又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０などの１種又は複数のクリプトスポリジウム・パルブム抗原と、Ｋ９９、Ｙ、３１Ａ、Ｆ４１、及び／又は不活化大腸菌の有する他の線毛、又はサブユニットの、又はin vivoで発現される他の線毛などの１種又は複数の大腸菌抗原、例えば、Ｋ９９、Ｙ、３１Ａ、及び／又はＦ４１の組合せとを含むことができる。大腸菌の線毛が有効性干渉を避けることができるため、本発明で有用である例示的な大腸菌抗原は線毛とすることができる。例示的な組成物は、Ｐ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、有利にはＰ２１及び／又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０などの１種又は複数のクリプトスポリジウム・パルブム抗原と、少なくとも１種の大腸菌抗原と、少なくとも１種のコロナウイルス抗原と、少なくとも１種のロタウイルス抗原とを含むことができる。例えば、Ｐ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、有利にはＰ２１及び／又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０と、不活化ロタウイルスと、不活化コロナウイルスと、少なくとも１種の大腸菌抗原、有利には線毛、又は好ましくはＫ９９、Ｙ、３１Ａ及びＦ４１のうち少なくとも１種又は複数、又はＫ９９、Ｙ、３１Ａ及びＦ４１の組合せとを含むことができる（また先に述べたように、このような抗原のうち１種又は複数を、この抗原内に含まれる目的となるエピトープとすることもでき、このような目的となる抗原若しくはエピトープのうち１種又は複数を組換え体又はプラスミドによりin vivoで発現させることもできる）。単数又は複数の細菌による潜在的な有効性干渉に関して、本発明者らは、混合ワクチンに存在する他の抗原の量を増加させることにより、潜在的などんな有効性干渉も避けられ、また大腸菌抗原として線毛を使用しても���効性干渉を避けられることを発見した。
【００３０】
本発明のこのような組成物では、単一用量は、腸管病原体に対するワクチンに通常見られる量、例えばモルモットで少なくとも０．９ｌｏｇ１０の血清力価が得られる量で存在する大腸菌抗原（又は、複数の大腸菌抗原の場合、各大腸菌抗原）を有し、ロタウイルス抗原は、腸管病原体に対するワクチンに通常見られる量、例えばモルモットで少なくとも２．０ｌｏｇ１０の血清力価が得られる量で存在することができ、コロナウイルス抗原は、腸管病原体に対するワクチンに通常見られる量、例えばモルモットで少なくとも１．５ｌｏｇ１０の血清力価が得られる量で存在することができる。また、本発明の組成物は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントを含むことができ、これは、単一用量中に、好ましくは約０．７〜約０．９ｍｇなどワクチンで通常見られる量で存在することができる。
【００３１】
したがって、一態様では、本発明は、クリプトスポリジウム・パルブム由来の目的となる第１抗原若しくはエピトープ及び／又は目的となる第１抗原若しくはエピトープを発現する第１ベクターと、目的となる他の腸管病原体由来の第２抗原若しくはエピトープ、及び／又は目的となる第１抗原若しくはエピトープを発現し目的となる第２抗原若しくはエピトープも発現する第１ベクター、及び／又は目的となる第２抗原若しくはエピトープを発現する第２ベクターと、製薬上許容されるビヒクルとを含む腸管の混合免疫組成物、混合免疫原性組成物、又は混合ワクチン組成物を提供する。
【００３２】
この組成物は、クリプトスポリジウム・パルブム由来の抗原と、他の腸管病原体由来の抗原とを含むことができる。この組成物は、クリプトスポリジウム・パルブム由来の抗原と、ウシ種、イヌ種、ネコ種、又はウマ種の他の腸管病原体由来の抗原とを含むことができる。この腸管病原体由来の抗原は、大腸菌、ロタウイルス、コロナウイルス、クロストリジウム属菌（Clostridium spp.）、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。この腸管病原体は大腸菌とすることができる。大腸菌由来の抗原は、Ｋ９９抗原を有する大腸菌、Ｆ４１抗原を有する大腸菌、Ｙ抗原を有する大腸菌、３１Ａ抗原を有する大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００３３】
この腸管病原体は、ウシコロナウイルス及び／又はウシロタウイルス及び／又はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）を含むことができる。この腸管病原体の抗原は、ウェルシュ菌Ｃ型及びＤ型のトキソイドを含むことができる。いくつかの実施形態では、この腸管病原体は、大腸菌と、ウシロタウイルスと、ウシコロナウイルスと、ウェルシュ菌とを含む、或いは大腸菌と、ウシロタウイルスと、ウシコロナウイルスとを含むことができる。
【００３４】
さらに、いくつかの態様では、本発明は、この腸管病原体の抗原が、Ｋ９９抗原を有する大腸菌、Ｆ４１抗原を有する大腸菌、Ｙ抗原を有する大腸菌、３１Ａ抗原を有する大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択される大腸菌抗原と、ウシ不活化コロナウイルスと、ウシ不活化ロタウイルスと、ウェルシュ菌Ｃ型及びＤ型のトキソイドとを含む組成物、或いはＫ９９抗原を有する大腸菌、Ｆ４１抗原を有する大腸菌、Ｙ抗原を有する大腸菌、３１Ａ抗原を有する大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの混合物からなる群から選択される大腸菌抗原と、ウシ不活化コロナウイルスと、ウシ不活化ロタウイルスとを含む、組成物を含むことができる。
【００３５】
有利には、本発明の組成物は、Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０、又はＰ２１とＣｐ１５／６０など、Ｐ２１、Ｃｐ２３、Ｃｐ１５／６０、ＣＰ４１、及びそれらの混合物からなる群から選択されるサブユニットのクリプトスポリジウム・パルブム抗原を含むことができる。
【００３６】
クリプトスポリジウム・パルブムと他の少なくとも１種の腸管病原体由来の抗原とを組み合わせた本発明の組成物では、このクリプトスポリジウム・パルブム抗原はまた、不活化若しくは弱毒生オーシスト、又はオーシストから得られるサブユニットを含む、又はこれらから構成することができる。
【００３７】
本発明の組成物は、サポニンや水酸化アルミニウムなどのアジュバントを含むことができ、また本発明の組成物は、水中油型エマルジョンの形とすることができる。
【００３８】
本発明はさらに、クリプトスポリジウム・パルブムに対する免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物を想定したものであり、この組成物は、Ｐ２１若しくはＣｐ２３抗原又はそれらのエピトープ、又はこの第１抗原を発現する第１ベクターを含む第１抗原と、Ｃｐ１５／６０抗原又はそのエピトープ、又は第１抗原及び第２抗原の両方を発現する第１ベクター、又は第２抗原を発現する第２ベクターを含む第２抗原と、製薬上許容されるビヒクルとを含む。この組成物は、別々の融合タンパク質の形である、Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０抗原を含むことができる。この組成物は、Ｃｐ２３とＣｐ１５／６０とを発現するベクターを含むことができる。この組成物は、Ｃｐ２３を発現する第１組換えベクターと、Ｃｐ１５／６０を発現する第２組換えベクターとを含むことができる。また、この組成物は、Ｐ２１とＣｐ１５／６０を含むことができる。こうした組み換え体はさらに、アジュバントを含むこともできる。
【００３９】
さらに、本発明は、クリプトスポリジウム・パルブムに対する免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物を包含するものであり、この組成物は、Ｐ２１、Ｃｐ２３、Ｃｐ１５／６０若しくはＣＰ４１抗原又はそれらのエピトープ或いはこの第１抗原を発現する第１ベクターを含む第１抗原と、クリプトスポリジウム・パルブム由来の第２抗原又はそのエピトープ或いは第１抗原及び第２抗原を両方発現する第１ベクター又は第２抗原を発現する第２ベクターを含む第２抗原と、製薬上許容されるビヒクルとを含む。ただし、第１抗原と第２抗原は互いに異なる抗原である。
【００４０】
本発明はまた、腸管疾患に対する新生子牛の免疫化方法を包含するものであり、この方法は、新生子牛が初乳及び／又はミルクを介してクリプトスポリジウム・パルブムに対する移行抗体を受け取るように、本発明の組成物を出産前の妊娠中の雌の子牛に投与することを含む。この方法はさらに、妊娠中にこの組成物を投与された雌牛（１種又は複数）の初乳及び／又はミルクを新生子牛に与えることを含む。この方法は、この組成物を新生子牛に投与することを含むことができる。妊娠中の雌に投与する組成物は、抗原若しくはそのエピトープを含むことができ、子牛に投与する組成物はベクターを含むことができる。したがって、本発明はまた、成牛及び新生子牛の能動免疫法を想定したものであり、この方法は、子牛に本発明の組成物を投与することを含む。
【００４１】
本発明はまた、新生子牛の免疫化方法を包含するものであり、この方法は、妊娠中にこの組成物を投与された雌牛の初乳及び／又はミルクを新生子牛に与えることを含む。同様に、より広義には、本発明は、新生哺乳動物の免疫化方法を包含するものであり、この方法は、妊娠中にこの組成物を投与された雌の哺乳動物の初乳及び／又はミルクをその新生仔に与えることを含み、有利には、この哺乳動物は、ウシ、ネコ、イヌ、又はウマである。さらに、本発明は、本発明の組成物を調製する方法を包含するものであり、この方法は、抗原若しくはエピトープ又はベクター、及び担体を混合することを含む。
【００４２】
さらに、本発明は、それぞれ別々の容器（１種又は複数）に入れた、抗原、エピトープ、又はベクターを含む本発明の組成物を調製するためのキットを含み（クリプトスポリジウム・パルブムの抗原、エピトープ、又はベクターなど、抗原、エピトープ、又はベクターを１つの容器に一緒に入れることができるものもあれば、抗原、エピトープ、又はベクターを１つ又は複数の容器に入れることができるものもあり、或いは担体、希釈剤、及び／又アジュバントを別々の容器に入れることができる）、このキットは、場合によっては１つのパッケージにし、さらに場合によっては混合及び／又は投与に関する説明書を含むことができる。
【００４３】
本開示では、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（containing）」、「有する（having）」などは、米国特許法においてそれぞれに付与されている意味を有し、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」などを意味することができる。「本質的に〜からなっている（consisting essentially of）」又は「本質的に〜からなる（consists essentially）」も同様に、米国特許法においてそれぞれに付与されている意味を有し、この用語はオープンエンド型であり、したがって記載されているものの基本的且つ新規な特徴が、記載されているもの以外のものの存在によって変更されず、従来技術の実施形態を排除する限りにおいて、記載されているもの以外のものの存在が許容される。
【００４４】
本発明の他の態様は、以下の開示において記載されており、或いは以下の開示から自明である（また本発明の範囲に含まれる）。
【００４５】
以下の詳細な説明は、例として挙げたものであり、本発明を特定の実施形態に限定するものではなく、参照により本明細書に組み込む添付の図面と併せ読めば理解されよう。次に、本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を、添付の図面を参照しながら非限定的な例として説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
したがって、本発明の一態様は、好ましくはクリプトスポリジウム・パルブムを含めた少なくとも１種のクリプトスポリジウム属原虫由来の少なくとも１種の目的となる抗原若しくはエピトープと、他の少なくとも１種の腸管病原体、有利にはイヌ、ネコ、ウマ、ウシの種、より有利にはウシ種などの防御すべき動物種に感染する病原体由来の目的となる少なくとも１種の抗原、並びに／或いはクリプトスポリジウム属原虫抗原若しくはエピトープ及び／又は目的となる他の少なくとも１種の腸管病原体の抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を発現するベクター（１種又は複数）及び／又は組換え体（１種又は複数）及び／又はプラスミド（１種又は複数）と、製薬上許容されるビヒクルとを含む腸管病原体の混合免疫組成物、混合免疫原性組成物、又は混合ワクチン組成物である。また、腸管病原体は数種（複数）の動物種に感染することが多いため、万能の免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物が想定される。
【００４７】
免疫組成物は、局所又は全身の免疫応答を誘発する。免疫原性組成物も同様に、局所又は全身の免疫応答を誘発する。ワクチン組成物は、局所又は全身の防御応答を誘発する。したがって、用語「免疫組成物」及び「免疫原性組成物」は、「ワクチン組成物」を含む（前者の２つの用語は防御組成物とすることができるため）。
【００４８】
本発明で使用することができるクリプトスポリジウム・パルブム抗原は、好ましくは、（１）Ｃｐ１５／６０と呼ばれる１４８アミノ酸のタンパク質（例えば米国特許第５５９１４３４号を参照のこと。このタンパク質は、米国特許第５５９１４３４号では、メチオニン（Ｍｅｔ）の上流の５’末端に１０個のアミノ酸がさらに付加された配列番号２で表される。そのエピトープ、有利には防御を誘発するエピトープ、又は配列全長が免疫原性を有するエピトープを含む、ＣＰ１５／６０の１４８アミノ酸配列、又はこれら１４８アミノ酸を含むより長いアミノ酸配列、例えば米国特許第５５９１４３４号の配列番号２で表される配列全体、又は１４８若しくは１５８アミノ酸配列の断片を含む任意のポリペプチドを含む、或いは本質的にそれらからなる抗原を使用することは本発明の範囲内である。）、及び／又は（２）Ｃｐ２３及び／又はＰ２１（Ｃｐ２３は約２３ｋＤａの抗原である。Perryman et al., Molec Biochem Parasitol 80:137-147 (1996)、国際公開第９８０７３２０号、及びL. E. Perryman et al., Vaccine 17 (1999) 2142-2149を参照のこと。このタンパク質（１８７アミノ酸）の主要部分は、本明細書においてＰ２１と称し、国際公開第９８０７３２０号で配列番号１２として開示されているタンパク質Ｃ７のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有する。発現させるために、Ｍｅｔ−、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−、又は同様のアミノ酸など、１種又は２種以上のアミノ酸をＰ２１の末端に添加することができる。そのエピトープ、有利には防御を誘発するエピトープ、又は配列全長が免疫原性を有するエピトープを含む、１８７アミノ酸配列、又はより長いアミノ酸配列、又は１８７アミノ酸配列の断片を含むポリペプチドを含む、或いは本質的にそれらからなる、或いはそれらからなる抗原を使用することは本発明の範囲内である。Ｃｐ２３のアミノ酸配列全体、及び相当するヌクレオチド配列は容易に入手可能である。Ｐ２１タンパク質は、Ｃｐ２３の主要部分及びＣ末端である。Ｐ２１のヌクレオチド配列は、ＤＮＡライブラリー、例えば実施例１で開示するライブラリーをスクリーニングするためのプロープとして使用することができる。この方法は当分野の技術者に周知である。Ｃｐ２３の分子量に基づくと、Ｃｐ２３のアミノ酸配列を完全なものとするには、Ｐ２１のＮ末端に約２５〜３５アミノ酸が欠けていると断言することができる。当分野の技術者であれば、この情報から開始コドンを、したがってＣｐ２３のヌクレオチド配列の５’末端及びアミノ酸配列のＮ末端を容易に見いだす手段を得る。）を含む。
【００４９】
本発明の組成物中で目的となる諸抗原若しくはエピトープを個別に、又は混合して使用することができる。例えば、本発明の組成物は、（１）又は（２）、或いは（１）及び（２）の両方を含むことができる。
【００５０】
他の使用可能な抗原は、先に開示したＣＰ４１抗原である。
【００５１】
好ましい実施形態によれば、これらの目的となる抗原若しくはエピトープをタンパク質、即ちサブユニット抗原として本発明の組成物中に組み込む。こうした抗原は、化学合成又はin vitro発現によって産生することができる。Ｃｐ１５／６０及びＰ２１をコードする配列を獲得する方法、及びそれらを発現するベクターを構築する方法については、実施例で説明する。これらの配列を適切なクローニングベクター又は発現ベクター中にクローニングすることができる。次いで、これらのベクターを使用して適切な宿主細胞にトランスフェクトする。このベクター中に挿入するヌクレオチド配列によってコードされる抗原、例えばＣｐ２３及び／又はＰ２１及び／又はＣｐ１５／６０は、この抗原が産生されるような条件下で、この発現ベクターによって形質転換させた宿主細胞を増殖させることによって産生する。この方法は当分野の技術者に周知である。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母、動物細胞、特に動物細胞系でもよい。所与の宿主細胞と一緒に使用することができるベクターは、当分野の技術者に知られている。融合タンパク質を産生するようなベクターを選択すると、次いでこの融合タンパク質を使用して抗原を容易に回収することができる。
【００５２】
さらに、配列に関しては、目的となるクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはエピトープを発現させるのに有用な核酸配列には、高いストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成することができる核酸配列、又は本発明に使用する核酸分子との高い相同性を有する核酸配列（例えば本明細書に記載する文献中の核酸分子）が含まれ得る。「高いストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する」とは、当技術分野で周知である用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」と同義であり得る。例えば、ともに参照により本明細書に組み込む、Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989及び"Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Flames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985を参照のこと。
【００５３】
本発明の実施に使用することができる核酸分子及びポリペプチドに関しては、この核酸分子及びポリペプチドが、本明細書で引用する文献に記載の配列（本明細書に記載のそれらの部分配列を含む）に対して、少なくとも約７５％以上の相同性又は同一性、有利には８０％以上の相同性又は同一性、より有利には、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％の相同性又は同一性など８５％以上の相同性又は同一性、例えば、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％の相同性又は同一性など少なくとも約９０％以上の相同性又は同一性、より有利には、少なくとも約９５％以上の相同性又は同一性など少なくとも約９５％〜９９％の相同性又は同一性、例えば、少なくとも約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、さらには約１００％の相同性又は同一性、或いは約７５％〜約１００％、有利には約８５％〜約１００％、或いは約９０％〜約９９％若しくは約９０％〜約１００％、或いは約９５％〜約９９％若しくは約９５％〜約１００％の相同性又は同一性を有することが有利である。したがって、本発明は、クリプトスポリジウム・パルブム分離株のエピトープ若しくはエピトープ領域をコードするベクター、或いはこのようなエピトープを含む組成物又はクリプトスポリジウム・パルブム分離株のエピトープ若しくはエピトープ領域を含む組成物、並びにこのようなベクター及び組成物を生成し使用する方法を包含する。例えば、本発明はまた、こうした核酸分子及びポリペプチドが、本明細書に記載の核酸分子とそれらの断片及びポリペプチドと同じ方法で使用することができることを包含する。
【００５４】
ヌクレオチド配列の相同性は、ＮＣＢＩで入手可能である、MyersとMillerによる「整列」プログラム（参照により本明細書に組み込む"Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988）を使用して決定することができる。その代わりに、又はそれに加えて、例えばヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する用語「相同性」又は「同一性」は、２種の配列間の相同性の定量的測度を示すことができる。この配列相同率（percent sequence homology）は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆとして計算することができ、ここで、Ｎｄｉｆは、２種の配列を整列した際の同一でない残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、両配列のうち一方の残基数である。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列類似性を有する（Ｎｒｅｆ＝８、Ｎｄｉｆ＝２）。
【００５５】
その代わりに、又はそれに加えて、配列に関する「相同性」又は「同一性」とは、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を、２種の配列のうち短いほうの配列中のヌクレオチド数又はアミノ酸数で割って表す。ここで、２種の配列のアラインメントをWilburとLipmanのアルゴリズム（参照により本明細書に組み込むWilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726）に従って、例えば２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドの語長、及び４のギャップペナルティを使用して決定することができ、好都合には、市販のプログラム（例えば、Intelligenetics（商標）スート、Intelligenetics社製、カリフォルニア州）を使用して、アラインメントを含む配列データのコンピュータ支援の解析及び解釈を行うことができる。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と類似であるか、又はある程度配列同一性若しくは配列相同性を有するといわれる場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいとみなされる。本発明の範囲に含まれるＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいとみなすことによりＤＮＡ配列から導き出すことができる。
【００５６】
その代わりに、又はそれに加えて、アミノ酸配列の類似性、同一性、又は相同性は、ＮＣＢＩ（付録Iに示すように配列相同性を決定する際に使用する。実施例も参照のこと。）で入手可能であるBlastPプログラム（参照により本明細書に組み込むAltschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402）を使用して決定することができる。以下の文献（それぞれ参照により本明細書に組み込む）も、２種のタンパク質のアミノ酸残基の相対的な同一性又は相同性を比較するためのアルゴリズムを提供し、前述のことの代わりに、又はそれに加えて、こうした文献中の教示を用いて、相同率又は同一率を決定することができる。Needleman SB and Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)、Smith TF and Waterman MS, "Comparison of Biosequences," Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)、Smith TF, Waterman MS and Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res., 11:2205-2220 (1983)、Feng DF and Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J. of Molec. Evol., 25:351-360 (1987)、Higgins DG and Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer," CABIOS, 5: 151-153 (1989)、Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res., 22:4673-480 (1994)、及びDevereux J, Haeberlie P and Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984)。
【００５７】
さらに、本発明で使用する核酸分子（例えば本発明で引用する文献中にある）に関して、本発明は、コドンが対応する核酸分子の使用を包含する。例えば、本発明が、アミノ酸配列「Ａ」を有し核酸分子「Ｎ」によってコードされる「Ｘ」タンパク質（例えば、Ｐ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１）を包含する場合、本発明は、核酸分子Ｎ中のコドンとは異なる１種又は複数のコドンによりタンパク質Ｘをコードする核酸分子も包含する。
【００５８】
本発明を実施する際に使用する目的となる抗原若しくはエピトープは、特定の抗原（１種又は複数）、例えば、クリプトスポリジウム・パルブム、大腸菌、ロタウイルス、コロナウイルスなどから獲得することができ、或いは遺伝子（１種又は複数）若しくはそれらの一部のin vitro及び／又はin vivo組換え発現から獲得することもできる。発現用のベクター（若しくは組換え体）を使用及び／又は作成する方法は、以下に開示する方法によるもの、又はそれらに類似するものとすることができる。米国特許第４６０３１１２号、第４７６９３３０号、第５１７４９９３号、第５５０５９４１号、第５３３８６８３号、第５４９４８０７号、第４７２２８４８号及び第５９４２２３５号、ＰＣＴ国際公開第９４／１６７１６号及び第９６／３９４９１号、Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update," PNAS USA 93:11349-11353, October 1996、Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93:11341-11348, October 1996、Smithらの米国特許第４７４５０５１号（組換えバキュロウイルス）、Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)、Smith et al., "Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector," Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165、Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector," Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406、欧州特許出願公開第０３７０５７３号、１９８６年１０月１６日出願の米国特許出願第９２０１９７号、欧州特許出願公開第２６５７８５号、米国特許第４７６９３３１号（組換えヘルペスウイルス）、Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996、Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93:11313-11318, October 1996、Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes," PNAS USA 93:11334-11340, October 1996、Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93:11371-11377, October 1996、Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991、米国特許第５５９１４３９号、５５５２１４３号、１９９６年７月３日出願の特許査定済み米国特許出願第０８／６７５５５６号及び米国特許出願第０８／６７５５６６号（組換えアデノウイルス）、Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993、Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990、Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 429-434、ＰＣＴ国際公開第９１／１１５２５号、Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561、Science, 259:1745-49, 1993、並びにMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease," PNAS USA 93:11414-11420, October 1996、並びにＤＮＡ発現ベクターに関する米国特許第５５９１６３９号、第５５８９４６６号及び第５５８０８５９号など。国際公開第９８／３３５１０号、Ju et al., Diabetologia, 41:736-739, 1998（レンチウイルス発現系）、Sanfordらの米国特許第４９４５０５０号、Fischbachら（Intracel社）の国際公開第９０／０１５４３号、Robinson et al., seminars in IMMUNOLOGY, vol. 9, pp.271-283 (1997)（ＤＮＡベクター系）、Szokaらの米国特許第４３９４４４８号（ＤＮＡを生細胞に挿入する方法）、McCormickらの米国特許第５６７７１７８号（細胞変性ウイルスの使用）、米国特許第５９２８９１３号（遺伝子導入用ベクター）、及びTartagliaらの米国特許第５９９００９１号（増強発現を有するベクター）、並びに本明細書で引用する他の文献も参照のこと。本発明を実施する際、特にin vivo発現の場合には、例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、又はカナリア痘ウイルスから選択されるウイルスベクター、並びにＤＮＡベクター（ＤＮＡプラスミド）を使用することが有利である（in vitro発現の場合には、細菌系及び酵母系を使用することが有利である）。
【００５９】
宿主とベクターの組合せにより抗原が排出なしに産生される場合、抗原の産生及びその回収の便宜上、こうした抗原を融合タンパク質の形（ＨＩＳタグ）にすることが好ましい。即ち、この抗原は、抗原自体と外来のアミノ酸を含むことができる。
【００６０】
本発明を実施する際、とりわけ本開示及び本明細書で引用する文献による、タンパク質を精製及び／又は単離するための技法を、当分野の技術者であれば過度の実験なしで使用して、組換え体又はベクターの発現産物及び／又は抗原（１種又は複数）を精製し且つ／又は単離することができ、このような技法には通常、とりわけ、様々な塩濃度における目的となるタンパク質の溶解度を利用する沈殿、有機溶剤、ポリマー及び他の材料を用いた沈殿、アフィニティー沈殿及び選択的変性；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、又は色素−リガンドクロマトグラフィーを含めたカラムクロマトグラフィー；免疫沈降、並びにゲル濾過法、電気泳動法、限外濾過法、及び等電点電気泳動法の使用が含まれ得る。
【００６１】
本明細書に記載の通り、別の態様によれば、本発明は、目的となる抗原及び／又はエピトープをサブユニットとして組成物中に組み込まずにin vivoで発現させることを包含する。例えば、本発明は、この組成物が、動物に投与すると諸抗原をin vivoで発現する組換えベクター（１種又は複数）を含むことを包含する。このベクターは、ＤＮＡプラスミド、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、又はワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、豚痘ウイルスなどを含めたポックスウイルスを含むことができる。ベクターベースの諸組成物は、発現すべき抗原、例えばクリプトスポリジウム・パルブムのＣｐ１５／６０及び／又はＣｐ２３のヌクレオチド配列を含み発現するベクターを含むことができる。
【００６２】
プラスミドという用語は、発現すべき配列を含むポリヌクレオチド配列の形の任意のＤＮＡ転写単位を含むものとする。有利には、このプラスミドは、その発現、例えばin vivo発現に必要な要素を含む。スーパーコイル状のものであれそうでないものであれ、環状プラスミドの形が有利である。直鎖状のものも本発明の範囲に含まれる。このプラスミドは、裸のプラスミドでも、例えば脂質又はリポソーム、例えばカチオン性リポソーム内部に配合されたプラスミドでもよい（例えば、国際公開第９０／１１０８２号、第９２／１９１８３号、第９６／２１７９７号及び第９５／２０６６０号を参照のこと）。プラスミドの免疫組成物又はワクチン組成物は、遺伝子銃を用いて、又は筋肉内に、又は経鼻的に、又はin vivo発現を、有利には免疫応答若しくは防御応答を可能にする他のどんな手段によっても投与することができる。また、それぞれ１９９９年１月１５日出願の（参照により本明細書に組み込む）、米国特許出願第０９／２３２２７８号、第０９／２３２４６８号、第０９／２３２４７７号、第０９／２３２２７９号、第０９／２３２４７８号、及び第０９／２３２４６９号、並びにそれぞれ１９９９年６月１０日出願の（参照により本明細書に組み込む）、米国特許出願第６０／１３８，３５２号及び第６０／１３８，４７８号も参照のこと。こうした出願は、ネコ、イヌ、ウシ及びウマ用のＤＮＡ及び／又はベクターのワクチン組成物、免疫組成物、或いは免疫原性組成物を含むため、本発明の組成物は、こうした出願のＤＮＡ及び／又はベクターのワクチン組成物、免疫原性組成物、或いは免疫組成物を含むことができ、且つ／或いは本発明の組成物は、こうした出願の組成物に類似の形で調製及び／又は配合及び／又は投与することができる。
【００６３】
本発明で使用する組成物は、獣医学、薬学又は医学の分野の技術者に周知の標準的な技法に従って調製することができる。このような組成物は、動物の年齢、性別、体重、状態及び特定の治療、並びに投与経路などの要素を考慮に入れて、獣医学分野の技術者に周知の用量及び技法によって投与することができる。本発明の組成物の諸成分は、単独投与することができ、或いは他の組成物と、又は他の予防用組成物若しくは治療用組成物（例えば、他の免疫原性組成物、免疫組成物、又はワクチン組成物）と同時投与又は順次投与することができる（例えば、クリプトスポリジウム・パルブム抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）を単独投与し、続いて他の腸管病原体の抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）を順次投与することができ、或いは腸管病原体の抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を含む諸組成物に、同じ、若しくは異なる腸管病原体抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を発現するベクター又は組換え体又はプラスミドを含めることもできる）。したがって、本発明は、多価組成物、「カクテル」組成物又は混合組成物、及びそれらの組成物を使用する方法を提供する。投与成分及び投与方法（順次投与、例えば、プライム−ブーストレジメン（prime-boost regimen）の一環として、又は年１回、季節毎、年２回などのブースタープログラムなど、免疫原性組成物、免疫組成物若しくはワクチン組成物を動物の生涯の間に定期的に投与するブースタープログラムの一環として、或いは同時投与）、並びに投与量は、動物、例えば雌牛の年齢、性別、体重、状態及び特定の治療、並びに投与経路などの要素を考慮に入れて決定することができる。このことに関しては、参照により本明細書に組み込む、狂犬病用の組成物及び混合組成物、並びにそれらの使用を対象とする米国特許第５８４３４５６号を参照のこと。
【００６４】
本発明の組成物は、非経口投与又は粘膜投与に、好ましくは、皮内、皮下、又は筋肉内経路で使用することができる。粘膜投与を用いる場合、経口経路、経鼻経路、又は経膣経路を用いることができる。
【００６５】
このような組成物では、ベクター（１種又は複数）、抗原（１種又は複数）、又は対象（１種又は複数）のエピトープ（１種又は複数）を、滅菌水、生理食塩水、グルコースなど、適当な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することができる。これらの組成物はまた、凍結乾燥することもできる。これらの組成物は、所望の投与経路及び調製方法に応じて、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、保存剤、粘膜経路に使用されるポリマー賦形剤などの補助剤を含むことができる。
【００６６】
参照により本明細書に組み込む"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985など標準のテキストを参考にして、過度の実験なしに適当な製剤を調製することができる。適当な投与量も、このテキスト及びそこで引用する文献に基づくものとすることができる。
【００６７】
アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する物質である。アジュバントには、とりわけ、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン類、例えばQuil A、鉱油エマルジョン；鉱油エマルジョン又は代謝可能な油エマルジョンを含むプルロニックポリマー；油中水型アジュバント、水中油型アジュバント、合成ポリマー（例えば、抗原をカプセル化したマイクロスフェア、例えば生分解性マイクロスフェアを生成するのに使用されている、乳酸及びグリコール酸のホモポリマー及びコポリマー、Eldridge et al., Mel. Immunol. 28:287-294 (1993)を参照のこと）、非イオン性ブロックコポリマー、油ベースのエマルジョン中の低分子量コポリマー（Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)を参照のこと）、水性製剤中の高分子量コポリマー（Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)）、ＩＬ−２及びＩＬ−１２などのサイトカイン（例えば米国特許第５３３４３７９号参照）、並びにＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子；一般に米国特許第４９９９２９１号及び第５４６１６６３号を参照、Clark et al., Science 1987, 230:1229、Grant et al., Drugs, 1992, 53:516も参照）、有利にはワクチン接種すべき動物種由来のＧＭ−ＣＳＦが含まれる。ある種のアジュバント、例えば、サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦは、抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）と共にin vivoで発現させることができる（例えば、ウシＧＭ−ＣＳＦに関するC. R. Maliszewski et al. Molec Immunol 25(9): 843-50 (1988)、S.R. Leong, Vet Immunol and Immunopath 21:261-78 (1989)を参照のこと。ＧＭ−ＣＳＦをコードするプラスミドは、本発明によるウシの病原体由来の抗原及び／又はそのエピトープをコードするＤＮＡを、場合によっては他のウシ病原体の抗原及び／又はエピトープをコードするＤＮＡも共に含み発現するように改変することができ、或いはこのようなプラスミドと組み合わせて使用することもできる。）。
【００６８】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に、糖若しくは多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋された、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマーである。このような化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当分野の技術者であれば、このようなアクリル酸ポリマーを記載する米国特許第２９０９４６２号（参照により本明細書に組み込む）も参照することができ、それらは、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、その少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されたポリヒドロキシル化化合物で架橋されている。好ましい基は、２〜４個の炭素原子を含むもの、例えば、ビニル基、アリル基、及び他のエチレン性不飽和基である。この不飽和基は、それ自体メチル基など他の置換基を含むことができる。特に、Carbopol（登録商標）（BF Goodrich社製、米国オハイオ州）という名称で市販されている製品は適切である。これらの製品は、アリルスクロース又はアリルペンタエリトリトールで架橋されている。その例として、Carbopol（登録商標）974P、934P及び971Pを挙げることができる。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーには、線状の又は架橋された、例えばジビニルエーテルで架橋された、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーであるコポリマーEMA（登録商標）（モンサント社製）が好ましい。参照により本明細書に組み込むJ. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 June 1960を参照することができる。
【００６９】
それらの構造の点から、アクリル酸若しくはメタクリル酸のポリマー、及びコポリマーEMA（登録商標）は、次式の基本単位
【００７０】
【化１】
2007502292.tif 000003
で形成することが好ましく、上式で、Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、Ｈ又はＣＨ３を表し、
ｘ＝０又は１、好ましくはｘ＝１であり、且つ
ｙ＝１又は２であり、但しｘ＋ｙ＝２である。
【００７１】
コポリマーEMA（登録商標）では、ｘ＝０及びｙ＝２である。カルボマーでは、ｘ＝ｙ＝１である。
【００７２】
こうしたポリマーを水に溶解すると酸性溶液となるが、これを好ましくは生理的ｐＨまで中和してアジュバント溶液にし、その中に免疫原性組成物、免疫組成物、又はワクチン組成物自体を含める。このとき、このポリマーのカルボキシル基は一部がＣＯＯ−の形である。
【００７３】
好ましくは、本発明によるアジュバント、特にカルボマーの溶液を、好ましくは塩化ナトリウムの存在下、蒸留水中で調製し、得られる溶液は酸性ｐＨとなる。この原液を、（所望の最終濃度を得るため）所望の量又はほぼ所望の量の、ＮａＣｌを加えた水、好ましくは生理食塩水（ＮａＣｌ９ｇ／ｌ）に一度に、数回に分け添加して希釈し、同時若しくは後に好ましくはＮａＯＨで中和する（ｐＨ７．３〜７．４）。この生理的ｐＨの溶液をそのまま使用してワクチンと混合し、このワクチンは特に、凍結乾燥、液体、又は凍結の形で保存することができる。
【００７４】
最終ワクチン組成物中のポリマー濃度は、０．０１％〜２％（ｗ／ｖ）、例えば０．０６〜１％（ｗ／ｖ）、０．１〜０．６％（ｗ／ｖ）などとすることができる。
【００７５】
本発明による、アジュバントを含む免疫原性組成物及びワクチン組成物はまた、エマルジョン、特に水中油型エマルジョン、例えば"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の１４７頁に記載するSPTエマルジョンなどのエマルジョン、又は同書の１８３頁に記載するエマルジョンMF59の形にそれらを配合して生成することができる。具体的には、水中油型エマルジョンは、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方による）；スクアラン、スクアレンなどのイソプレノイド；アルケンの、特に、イソブチレン又はデセン（decene）のオリゴマー化によって得られる油；線状のアルキル基を有する酸若しくはアルコールエステル、特に、植物油、オレイン酸エチル、ジ（カプリル酸／カプリン酸）プロピレングリコール、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセロール、又はジオレイン酸プロピレングリコール；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づくものとすることができる。この油を乳化剤と組み合わせて使用してエマルジョンを形成させる。乳化剤は、非イオン界面活性剤、特にソルビタンエステル、マンニドエステル（mannide ester）、グリセロールエステル、ポリグリセロールエステル、プロピレングリコールエステル、或いはオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、又はヒドロキシステアリン酸のエステル、場合によってはエトキシ化されたもの、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンなどのブロックコポリマー、特にPluronic（プルロニック）と呼ばれる製品、即ちPluronic L121であることが好ましい。
【００７６】
本開示及び当技術分野の知識があれば、当業者は過度の実験なしに、必要に応じて本発明による免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物中に使用するのに適したアジュバント及びその量を選択することができる。
【００７７】
本発明による免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物を、少なくとも１種の弱毒生ワクチン、不活化ワクチン、又はサブユニットワクチン、或いは他の病原体由来の目的となる少なくとも１種の免疫原、抗原、又はエピトープを発現する組換えワクチン（例えば、ベクター又はＤＮＡプラスミドとしてのポックスウイルス）と組み合わせることができる。
【００７８】
様々な投与経路用の形の組成物は、本発明によって想定される。さらに、有効な投与量及び投与経路は、年齢、体重など既知の要素によって決まる。各有効薬剤、例えば、目的となる各クリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはエピトープ、及び／又は各腸管病原体由来の各抗原若しくはエピトープの投与量は、本明細書で引用する文献、又は本明細書にその他の形で記載する文献の通りにすることができ、且つ／又は１又は数マイクログラム〜数百又は数千マイクログラムの範囲、例えば、サブユニットの免疫原性組成物、免疫組成物、又はワクチン組成物の場合には１μｇ〜１ｍｇ、不活化免疫原性組成物、不活化免疫組成物、又は不活化ワクチン組成物の場合には、不活化前で１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０、有利には１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０の範囲とすることができる。
【００７９】
組換え体又はベクターを、本明細書及び／又は本明細書で引用する文献に記載の投与に対応するin vivo発現を得るのに適した量で投与することができる。例えば、ウイルス懸濁液に適した範囲は経験的に決めることができる。本発明のウイルスベクター又は組換え体を、少なくとも約１０３ｐｆｕ、より好ましくは約１０４ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、例えば約１０５ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕ、例えば約１０６ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕの量で動物に投与し、又は細胞中に感染させる若しくはトランスフェクトすることができる。用量は通常、約１０６〜約１０１０の範囲、好ましくは約１０１０ｐｆｕの単位投与量であり、有利には、約１ｍｌ〜約５ｍｌ、有利には約２ｍｌの投与量につき約１０８ｐｆｕである。複数の遺伝子産物を複数の組換え体によって発現させる場合、このような量で各組換え体を投与することができ、或いは組み合わせる際には、組換え体の総量がこのような量となるように各組換え体を投与することもできる。本発明に使用するプラスミド組成物の投与量は、本明細書に引用する文献又は本明細書に記載の通りにすることができる。有利なことには、この投与量は、目的となる抗原（１種又は複数）若しくはエピトープが直接に存在している組成物と類似の応答を誘発する、或いはこのような組成物の投与に類似の発現を生じる、或いは組換え組成物によりin vivoで得られる発現に類似の発現を生じるのに十分な量のプラスミドとすべきである。例えば、プラスミド組成物中の各プラスミドＤＮＡの適当な量は、１μｇ〜２ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１ｍｇとすることができる。当分野の技術者であれば、本明細書で引用する、ＤＮＡプラスミドベクターに関する文献を参考にして、過度の実験なしに、本発明のＤＮＡプラスミドベクター組成物に適した他の投与を確定することができる。
【００８０】
しかし、適当な免疫応答を誘発する、組成物（１種又は複数）の投与量、その成分の濃度、及び組成物（１種又は複数）を投与するタイミングは、血清の抗体価測定、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又は血清中和（seroneutralization）及び／又はセロプロテクション試験分析（seroprotection assay analysis）などの方法によって決定することができる。当分野の技術者の知識、本開示、及び本明細書で引用する文献があれば、このような決定に過度の実験は必要ない。さらに、順次投与についての時間も同様に、本開示、及び当技術分野の知識から確定可能な方法により過度の実験なしに確定することができる。
【００８１】
腸管病原体の混合免疫組成物、混合免疫原性組成物、又は混合ワクチン組成物は、両方の成分が前記で定義したクリプトスポリジウム・パルブム抗原を含むことが好ましい。
【００８２】
クリプトスポリジウム抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）（有利には、Ｐ２１又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０などＰ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１、或いはそれらのエピトープ（１種又は複数））と組み合わせることが有利な、腸管病原体の抗原若しくはエピトープは、大腸菌及び／又はロタウイルス及び／又はコロナウイルス及び／又はウェルシュ菌などのクロストリジウム属菌由来の１種又は複数の抗原若しくは対象のエピトープを含むことが好ましい。好ましくは、大腸菌由来の抗原は、Ｋ９９、Ｆ４１、Ｙ、３１Ａと呼ばれる抗原及び／又はそのエピトープのうちの１種、好ましくは数種（複数）、より好ましくはすべてを含む。好ましい抗原はＫ９９及びＦ４１である。したがって、組成物は、Ｋ９９及びＦ４１のうちの一方、好ましくはその両方を含むことが有利である。組成物はまた、Ｙ及び／又は３１Ａ、有利にはＹ及び３１Ａも含むことが好ましい。例えば、こうした抗原は、サブユニットとして組み込むか、或いは大腸菌が有するものでもよい。好ましくは、本発明による組成物は、Ｋ９９抗原を有する大腸菌、Ｆ４１抗原を有する大腸菌、Ｙ抗原を有する大腸菌、３１Ａ抗原を有する大腸菌、Ｋ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、３１Ａ抗原、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される少なくとも１種の抗原を含む。
【００８３】
本明細書に記載の通り、大腸菌を使用してクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはエピトープを産生することができる。大腸菌抗原及びクリプトスポリジウム・パルブム抗原が同時発現するように、このクリプトスポリジウム・パルブム抗原若しくはエピトープを、大腸菌の諸抗原のうちの少なくとも１種を発現する大腸菌株中で発現させることができる。in vitro発現の場合には、次いで、細胞を通常通りに分裂させ、大腸菌抗原及びクリプトスポリジウム・パルブム抗原、又はエピトープを回収することができる。有利なことには、抗原若しくはエピトープが内部即ち表面以外で発現する場合、抗原若しくはエピトープを融合タンパク質として、又はタグ、例えばＨＩＳタグ付で発現させる。in vivo発現の場合には、抗原若しくはエピトープが細胞外で発現するように、発現抗原若しくはエピトープを発現する核酸分子をシグナル配列と連結させることが有利であり、この大腸菌は、非病原性であることが有利である。したがって、いくつかの実施形態では、大腸菌をベクター及び抗原若しくはそのエピトープとすることができる。
【００８４】
ウェルシュ菌由来の抗原は、Ｃ型及び／又はＤ型のトキソイド、より好ましくはＣ型及びＤ型のトキソイドであることが好ましい。
【００８５】
本発明の具体的な一態様は、ウシ種の腸管病原体の混合免疫組成物、混合免疫原性組成物、又は混合ワクチン組成物であり、この組成物は、好ましくはクリプトスポリジウム・パルブムを含めた少なくとも１種のクリプトスポリジウム属原虫由来の少なくとも１種の抗原若しくはエピトープ、有利にはＰ２１又はＣｐ２３及びＣｐ１５／６０などＰ２１及び／又はＣｐ２３及び／又はＣｐ１５／６０及び／又はＣＰ４１及び／又はその対象のエピトープと、好ましくは、大腸菌、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス及びウェルシュ菌の各病原体由来の少なくとも１種の抗原若しくはエピトープ、或いは大腸菌、ロタウイルス、及びコロナウイルス由来の少なくとも１種の抗原若しくはエピトープを含めて、こうした病原体又はそれらの組合せなど、追加の少なくとも１種のウシ腸管病原体由来の少なくとも１種の抗原若しくはエピトープとを含む。所望の目的となる抗原のエピトープ、及び抗原のどの部分が目的となるエピトープであるかを決定する方法に関しては、米国特許第５９９００９１号、及び米国特許出願第０８／６７５５６６号、第０８／６７５５５６号、並びに本明細書で引用する他の文献を参照のこと。本明細書で引用する文献など、本明細書の開示及び当技術分野の知識があれば、目的となるエピトープを確定し、或いは抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）、及び／又は抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）を発現するベクター（１種又は複数）を含む本発明の組成物を配合するのに過度の実験は必要ない。
【００８６】
好ましい実施形態によれば、本発明は、ウシの腸管病原体の免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物を提供するものであり、この組成物は、抗原Ｋ９９、Ｆ４１、Ｙ、及び３１Ａ、並びにウシ不活化コロナウイルス、ウシ不活化ロタウイルスなど、本明細書に記載の大腸菌抗原を含む。この組成物はさらに、ウェルシュ菌Ｃ型及びＤ型のトキソイドを含むこともできる。好ましくは、この大腸菌結合価は、Ｋ９９抗原を有する不活化大腸菌、Ｆ４１抗原を有する不活化大腸菌、Ｙ抗原を有する不活化大腸菌、及び３１Ａ抗原を有する不活化大腸菌、或いはＫ９９抗原、Ｆ４１抗原、Ｙ抗原、及び３１Ａ抗原のいずれかを含む。
【００８７】
本発明の別の態様は、クリプトスポリジウム・パルブムに対する免疫組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物であり、この組成物は、Ｃｐ２３又はＰ２１及びＣｐ１５／６０抗原或いはそれらのエピトープと、製薬上許容されるビヒクルとを含む。
【００８８】
有利な実施形態によれば、こうした抗原をタンパク質又はサブユニット抗原としてこの組成物中に組み込む。こうした抗原は、化学合成又はin vitro発現によって産生することができる。適当な宿主中での発現による産生、及びその抗原の回収の便宜上、こうした抗原を融合タンパク質（例えばＨＩＳタグ付き）の形にすることが好ましい。即ち、この抗原は、抗原自体と外来のアミノ酸を含むことができる。
【００８９】
他の実施形態によれば、こうした抗原をサブユニットとして組成物中に組み込まず、この組成物は、動物に投与すると抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）をin vivoで発現するような、Ｃｐ２３若しくはＰ２１及びＣｐ１５／６０又はそれらのエピトープを発現する組換えベクター、或いはＣｐ２３若しくはＰ２１又はそのエピトープを発現する組換えベクターと、Ｃｐ１５／６０又はそのエピトープを発現する組換えベクターとを含む。この組成物は、ある抗原若しくはエピトープと、他の抗原若しくはエピトープとを発現するベクターを含むことができる。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、標的動物に、本発明による、クリプトスポリジウム・パルブムに対する腸管病原体の混合免疫組成物、混合ワクチン組成物、混合免疫組成物、又は混合ワクチン組成物を投与するというワクチン接種の方法である。本発明は、腸管疾患に対する新生子牛の免疫化方法に関するものとすることができ、この方法は、新生子牛がクリプトスポリジウム・パルブムに対する移行抗体を有するように、Ｃｐ２３若しくはＰ２１及びＣｐ１５／６０クリプトスポリジウム・パルブム抗原又はそれらのエピトープと、製薬上許容されるビヒクルとを含む免疫組成物又はワクチン組成物を、出産前の妊娠中の雌牛又は妊娠中の未経産雌牛に投与することを含む。好ましくは、この方法は、そのようにワクチン接種された雌牛、例えば母獣から初乳及び／又はミルクを新生子牛に与えることを含む。腸管疾患に対するワクチン接種又は免疫化では、様々な結合価を含む、混合ワクチン組成物、混合免疫原性組成物、又は混合免疫組成物を使用するだけでなく、ワクチン組成物、免疫原性組成物、又は免疫組成物を分けて、別々に投与、例えば順次投与することもでき、或いは使用前に混合することもできる。
【００９１】
本発明の組成物及び方法に有用な目的となる抗原及びエピトープは、当分野の技術者が利用可能ないずれかの方法を使用して、例えば、米国特許第５５９１４３４号及び国際公開第９８／０７３２０号における方法を使用して産生することができる。さらに、他の腸管病原体の抗原は、TRIVACTON（登録商標）6など市販の供給源から入手することができる。例えば、Ｃｐ２３及び／又はＰ２１及び／又はＣｐ１５／６０或いはそれらのエピトープ、例えば、Ｐ２１若しくはＣｐ２３及びＣｐ１５／６０又はそれらのエピトープ、或いはこうした抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を発現するベクターを本明細書で指定する量で、TRIVACTON（登録商標）6に添加することができる。有利には、ウェルシュ菌Ｃ型及びＤ型のトキソイドをTRIVACTON（登録商標）6に添加することができる。また、TRIVACTON（登録商標）6中で、線毛を有する不活化大腸菌を分離された線毛で置き換えることができる。また、クリプトスポリジウム・パルブム抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）、及び／又はウェルシュ菌抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を添加したこのようなワクチン組成物、免疫原性組成物、又は免疫組成物（不活化大腸菌又は分離された線毛を有する）、並びにこのような組成物及びそのキットを生成し使用する方法も本発明に含まれる。
【００９２】
さらに、本発明を実施するのに有用な大腸菌結合価及び／又は抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）については、欧州特許出願公開第８０４１２号、欧州特許出願公開第６０１２９号、英国特許出願公開第２０９４３１４号、並びに米国特許第４２９８５９７号、第５８０４１９８号、第４７８８０５６号、第３９７５５１７号、第４２３７１１５号、第３９０７９８７号、第４３３８２９８号、第４４４３５４７号、第４３４３７９２号、第４７８８０５６号及び第４３１１７９７号を参照のこと。ロタウイルス抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）については、P.S. Paul and Y.S. Lyoo, Vet Microb 37:299-317 (1993)、並びに米国特許第３９１４４０８号及び第５６２０８９６号を参照のこと。コロナウイルス抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）に関しては、国際公開第９８／４００９７号、国際公開第９６／４１８７４号、並びに米国特許第３９１４４０８号及び第３９１９４１３号を参照のこと。クロストリジウム属菌、例えばウェルシュ菌抗原（１種又は複数）及び／又はエピトープ（１種又は複数）については、国際公開第９４／２２４７６号、欧州特許出願公開第７３４７３１号、国際公開第９８／２７９６４号、英国特許出願公開第２０５０８３０号、英国特許出願公開第１１２８３２５号、D. Calmels and Ph. Desmettre, IV Symposium of the Commission for the study of animal diseases caused by anaerobes, Paris, Nov. 16-18, 1982、米国特許第５１７８８６０号、第４９８１６８４号及び第４２９２３０７号、さらにIMOTOXAN（登録商標）（MERIAL社製、仏国リヨン）（Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型ウェルシュ菌、悪性水腫菌（Cl. septicum）、ノビイ菌（Cl. novyi）、破傷風菌（Cl. tetani）、及び気腫疽菌（Cl. chauvoei）培養物のトキソイドを含む）を参照されたい。さらに、TRIVACTON（登録商標）6に加えて、本発明に従ってクリプトスポリジウム・パルブム結合価を加えることができる他の市販の混合ワクチン、例えば、ウシ不活化ロタウイルス及びコロナウイルス、Ｋ９９大腸菌Bacterin（バクテリン）、並びにウェルシュ菌Ｃ型トキソイドを含むSCOURGUARD 3 (K)/C（登録商標）（SmithKline Beecham社製）を使用することもできる。
【００９３】
目的となる抗原若しくはエピトープを獲得する好ましい方法は、目的となる抗原若しくはエピトープをコードするＤＮＡ配列を融合若しくは非融合プラスミド中にクローニングし、それを大腸菌中で発現させることである。融合プラスミド（例えば、Ｈｉｓタグなど、タグ付きの抗原（１種又は複数）若しくはエピトープ（１種又は複数）を発現する）は、産生した抗原を容易に回収できるようにするので好ましい。適当なプラスミドを実施例に記載する。化学合成による抗原の生成も本発明の範囲に含まれる。
【００９４】
本発明はさらに、本明細書に記載の、抗原若しくはエピトープ又はこのような抗原若しくはエピトープを発現するベクターを使用して、例えば、この抗原、エピトープ、又はベクターを、適当な、若しくは許容される担体又は希釈剤と、場合によってはアジュバントとも混合することにより、例えばクリプトスポリジウム・パルブム又は腸管疾患に対するワクチン組成物、免疫組成物、又は免疫原性組成物を調製する方法を包含する。この組成物は、凍結乾燥して溶解することもできる。本発明はさらに、本発明の組成物を調製するためのキットを包含する。このキットは、抗原（１種又は複数）、エピトープ（１種又は複数）、及び／又はベクター（１種又は複数）、担体、及び／又は希釈剤、並びに場合によってはアジュバントを含むことができる。その諸成分を別々の容器に入れることができる。その諸成分を含むこの容器は、１種又は複数のパッケージにすることができ、さらに、このキットは、諸成分を混合し、且つ／又はワクチン組成物、免疫原性組成物、若しくは免疫組成物を投与するための説明書を含むことができる。
【００９５】
本発明の他の態様は、例えば、本発明の組成物（１種又は複数）（例えば、本発明による、クリプトスポリジウム・パルブム組成物又は腸管病原体の混合組成物）を少なくとも１回、有利には少なくとも２回、より有利には少なくとも３回投与することによる、妊娠中の雌の動物（雌牛など）の高度免疫化により高度免疫初乳及び／又はミルクを産生することである。場合によっては、ただし有利には、次いで、このようにして産生された初乳及び／又はミルクを処理して、免疫グロブリンを濃縮し、所望の免疫応答、免疫原性応答、及び／又はワクチン応答、或いは初乳又はミルクの栄養価に寄与しない、初乳又はミルクの諸成分を除去することができる。有利には、この処理は、例えば、レンネットと、回収した免疫グロブリンを含有する液相とを使用して、初乳又はミルクを凝固させることを含むことができる。本発明はまた、高度免疫初乳若しくはミルク又はそれらの混合物、及び／又は高度免疫初乳若しくはミルク又はそれらの混合物を含む組成物を包含する。さらに、本発明は、高度免疫初乳若しくはミルク又はそれらの混合物、或いはそれを含む組成物を使用して、新生仔などの幼若動物、例えば子牛のクリプトスポリジウム・パルブム及び／又は腸管感染症を予防又は治療することを想定したものである。
【００９６】
以下の実施例は、本発明の諸細胞を生成及び使用する方法の完全な開示及び説明を当分野の技術者に提供するように述べたものであり、本発明者が本発明とみなすものの範囲を限定するものではない。
[実施例]
【００９７】
配列リスト：
配列番号１    オリゴヌクレオチドJCA295
配列番号２    オリゴヌクレオチドJCA296
配列番号３    オリゴヌクレオチドJCA297
配列番号４    オリゴヌクレオチドJCA298
配列番号５    オリゴヌクレオチドJCA299
配列番号６    オリゴヌクレオチドJCA300
配列番号７    オリゴヌクレオチドJCA301
配列番号８    オリゴヌクレオチドJCA302
配列番号９    オリゴヌクレオチドJCA303
配列番号１０  オリゴヌクレオチドJCA304
【００９８】
プラスミド構築体はすべて、Sambrook J. et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989）に記載の通り、標準的な分子生物学的技法（クローニング、制限消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して作成した。本発明のために生成し使用するＤＮＡ制限断片、並びにＰＣＲ断片はすべて、「Geneclean（登録商標）」キット（BIO101社製、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して単離及び精製した。
【実施例１】
【００９９】
クリプトスポリジウム・パルブムＰ２１及びＣｐ１５／６０遺伝子のクローニング
Sagodira S.らによる記載（Vaccine. 1999. 17. 2346-2355）の通り、クリプトスポリジウム・パルブムのオーシストを、感染させた子牛から単離し、ウシの糞便試料から精製する。次いで、精製したオーシストを蒸留水中で＋４℃で保存する。ＰＣＲ反応のための鋳型として使用するため、Iochmann S.らによる記載（Microbial Pathogenesis 1999. 26. 307-315）の通り、精製したオーシストからゲノムＤＮＡを放出させる。
【０１００】
クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡの代替の供給源は、ＡＴＣＣ（American Tissue Culture Collection米国組織培養株保存機構）から入手可能なクリプトスポリジウム・パルブムのＩｏｗａ（Ａ）、Ｉｏｗａ（Ｉ）、ＫＳＵ−１、及びＫＳＵ−２分離株（ＡＴＣＣ番号はそれぞれ８７６６７、８７６６８、８７４３９及び８７６６４）のEcoRIゲノムライブラリーによって構成されている。特定のＰ２１及びＣｐ１５／６０遺伝子を以下の通りに単離する。
【０１０１】
クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA295（３５ｍｅｒ）配列番号１
5' TTT TTT CCA TGG GGC TCG AGT TTT CGC TTG TGT TG 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA296（３３ｍｅｒ）配列番号２
5' TTT TTT GAA TTC TTA GGC ATC AGC TGG CTT GTC 3'
を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＰ２１タンパク質をコードする配列を増幅する。
【０１０２】
このＰＣＲにより約５８５ｂｐのＰＣＲ断片の断片が生成される。次いで、このＰＣＲ断片を制限酵素NcoI及びEcoRIで消化して、アガロースゲル電気泳動後、GeneCleanキット（BIO101社製）を用いて５７５ｂｐのNcoI-EooRI制限断片（＝断片Ａ）を単離し回収する。この断片の配列は、国際公開第９８／０７３２０号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４８３４）中の配列番号１２として記載する配列と相同なタンパク質をコードしている。
【０１０３】
第２のＰＣＲを実施して、Ｃｐ１５／６０タンパク質をコードする配列を増幅し、後のクローニングのために５’及び３’末端に制限部位を付加する。クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA297（３５ｍｅｒ）配列番号３
5' TTT TTT CTC GAG ATG GGT AAC TTG AAA TCC TGT TG 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA298（４２ｍｅｒ）配列番号４
5' TTT TIT GAA TTC TTA GTT AAA GTT TGG TTT GAA TTT GTT TGC 3'
を使用してこのＰＣＲを実施する。
【０１０４】
このＰＣＲにより約４６５ｂｐの断片が生成される。この断片を精製し、次いで、XhoI及びEcoRIで消化して、アガロースゲル電気泳動後、GeneCleanキット（BIO101社製）を用いて４５３ｂｐのXhoI-EcoRI断片（＝断片Ｂ）を採取し回収する。この増幅配列は、米国特許第５５９１４３４号中の配列番号１のヌクレオチド＃３１〜＃５２８で定義される配列、並びにＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｕ２２８９２及びＡＡＣ４７４４７として寄託されている配列と相同である。
【実施例２】
【０１０５】
プラスミドpJCA155の構築（ベクターpBAD/HisAにおけるＧＳＴ−Ｐ２１融合タンパク質）
ＧＳＴ−Ｐ２１融合タンパク質を発現するのに必要な配列をＰＣＲによって増幅して、pBAD/HisA発現プラスミドベクター（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製、92008米国カリフォルニア州カールズバッド）中に容易にクローニングすることができる２種の断片を生成する。プラスミドpGEX-2TK（カタログ番号２７−４５８７−０１、Amersham-Pharmacia Biotech社製）、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA299（３５ｍｅｒ）配列番号５
5' TTT TTT CCA TGG GGT CCC CTA TAC TAG GTT ATT GG 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA300（４５ｍｅｒ）配列番号６
5' TTT TTT CTC GAG CCT GCA GCC CGG GGA TCC AAC AGA TGC ACG ACG 3'
を使用して第１のＰＣＲを実施する。
【０１０６】
このＰＣＲにより、pBAD/HisA中にクローニングする目的で５’末端にNcoI制限部位を付加した、ＧＳＴ部分をコードする約７２０ｂｐの断片が生成される。この修飾によりグリシンコドンがＧＳＴ−Ｐ２１融合タンパク質に付加される）。次いで、このＰＣＲ断片をNcoI及びXhoIで消化して、アガロースゲル電気泳動後、GeneCleanキット（BIO101社製）を用いて７１０ｂｐのNcoI-XhoI断片（＝断片Ｃ）を採取し回収する。
【０１０７】
クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA301（３３ｍｅｒ）配列番号７
5' TTT TTT CTC GAG TTT TCG CTT GTG TTG TAC AGC 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA296（３３ｍｅｒ）配列番号２
を使用して第２のＰＣＲを実施する。
【０１０８】
このＰＣＲにより、５’及び３’末端にXhoI及びEcoRI制限部位をそれぞれ付加した、Ｐ２１部分をコードする約５８０ｂｐの断片が生成される。次いで、このＰＣＲ断片をXhol及びEcoRlで消化して、アガロースゲル電気泳動後、GeneCleanキット（BIO101社製）を用いて５７２ｂｐのXhoI-EcoRI断片（＝断片Ｄ）を採取し回収する。
【０１０９】
プラスミドpBAD/HisA（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製）をNcoI及びEcoRIで消化する。この消化断片をアガロースゲル電気泳動によって分離して、＃３９６０ｂｐのNcoI-EcoRI制限断片（＝断片Ｅ）を回収する（GeneCleanキット、BIO101社製）。
【０１１０】
次いで、断片Ｃ、Ｄ及びＥを連結してプラスミドpJCA155を作成する。このプラスミドは、全サイズが５２４３ｂｐであり（図１）、４２５アミノ酸のＧＳＴ−Ｐ２１融合タンパク質をコードしている。
【実施例３】
【０１１１】
プラスミドpJCA156の構築（ベクターpBAD/HisAにおけるＨｉｓ６−Ｐ２１融合タンパク質）
ベクターpBAD/HisA（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製）をNcoI及びEcoRIで消化し、実施例２に記載の通り、＃３９６０ｂｐのNcoI-EcoRI制限断片（＝断片Ｅ）を回収し単離する。
【０１１２】
ＰＣＲを実施して、Ｈｉｓ６−Ｐ２１融合物をコードする配列を増幅し、５’及び３’末端にNcoI及びEcoRI制限部位をそれぞれ付加して、このＰＣＲ断片をプラスミドベクターpBAD/HisA中にサブクローニングする。
【０１１３】
クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA302（６５ｍｅｒ）配列番号８
5' TIT TTT CCA TGG GGG GTT CTC ATC ATC ATC ATC ATC ATG GTC TCG AGT TTT CGC TTG TGT TGT AC 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA296（３３ｍｅｒ）配列番号２
を使用してＰＣＲを実施する。
【０１１４】
このＰＣＲにより約６１０ｂｐの断片が生成される。この断片を精製し、次いでNcoI及びEcoRIで消化して、アガロースゲル電気泳動後、GeneCleanキット（BIO101社製）を用いて６００ｂｐのNcoI-EcoRI断片（＝断片Ｆ）を単離し回収する。
【０１１５】
断片Ｅ及びＦを連結してプラスミドpJCA156を作成する。このプラスミドは、全サイズが４５６２ｂｐであり（図２）、１９９アミノ酸のＨｉｓ−６／Ｐ２１融合タンパク質をコードしている。
【実施例４】
【０１１６】
プラスミドpJCA157の構築（ベクターpBAD/HisAにおける単独のＰ２１タンパク質）
ベクターpBAD/HisA（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製）をNcoI及びEcoRIで消化し、実施例３に記載の通り、＃３９６０ｂｐのNcoI-EcoRI制限断片（＝断片Ｅ）を回収し単離する。
【０１１７】
ＰＣＲを実施して、Ｐ２１タンパク質をコードする配列を増幅し、５’及び３’末端にNcoI及びEcoRI制限断片をそれぞれ付加して、このＰＣＲ断片をプラスミドベクターpBAD/HisA中にサブクローニングする。クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA295（３５ｍｅｒ）配列番号１
及びオリゴヌクレオチドJCA296（３３ｍｅｒ）配列番号２
を使用してＰＣＲを実施して、実施例１に記載の通り５７５ｂｐのNcoI-EcoRI断片（断片Ａ）を獲得する。
【０１１８】
断片Ｅ及びＡを連結してプラスミドpJCA157を作成する。このプラスミドは、全サイズが４５３５ｂｐであり（図３）、Ｐ２１タンパク質を含む１８９アミノ酸をコードしている。
【実施例５】
【０１１９】
プラスミドpJCA158の構築（ベクターpBAD/HisAにおけるＧＳＴ−Ｃｐ１５／６０融合タンパク質）
ＰＣＲを実施して、ＧＳＴタンパク質をコードする配列を増幅し、５’及び３’末端に好都合な制限部位を付加して、このＰＣＲ断片を、最後のプラスミドベクターpBAD/HisA中にサブクローニングする。このＰＣＲでは、鋳型としてのプラスミドpGEX-2TK（カタログ番号２７−４５８７−０１、Amersham-Pharmacia Biotech社製）のＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA299（３５ｍｅｒ）配列番号５
及びオリゴヌクレオチドJCA300（４５ｍｅｒ）配列番号６
を使用して、実施例２に記載の通り７１０ｂｐのNcoI-XhoI断片（＝断片Ｃ）を獲得する。
【０１２０】
ベクターpBAD/HisA（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製）をNcoI及びEcoRIで消化し、実施例２に記載の通り＃３９６０ｂｐのNcoI-EcoRI制限断片（＝断片Ｅ）を回収し単離する。
【０１２１】
断片Ｃ、Ｅ及びＢ（実施例１）を連結してプラスミドpJCA158を作成する。このプラスミドは、全サイズが５１３２ｂｐであり（図４）、３８８アミノ酸のＧＳＴ−Ｃｐ１５／６０融合タンパク質を発現する。
【実施例６】
【０１２２】
プラスミドpJCA159（ベクターpBAD/HisAにおけるＨｉｓ６−Ｃｐ１５／６０融合タンパク質）の構築
ベクターpBAD/HisA（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製）をNcoI及びEcoRIで消化し、実施例２に記載の通り＃３９６０ｂｐのNcoI-EcoRI制限断片（＝断片Ｅ）を回収し単離する。
【０１２３】
ＰＣＲを実施して、Ｈｉｓ６−Ｃｐ１５／６０融合をコードする配列を増幅し、５’及び３’末端に好都合な制限部位を付加して、このＰＣＲ断片をプラスミドベクターpBAD/HisA中にサブクローニングする。クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA303（６４ｍｅｒ）配列番号９
5' TTT TTT CCA TGG GGG GTT CTC ATC ATC ATC ATC ATC ATG GTA TGG GTA ACT TGA AAT CCT GTT G 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA298（４２ｍｅｒ）配列番号４
をいずれも使用してＰＣＲを実施する。
【０１２４】
このＰＣＲにより約４９５ｂｐの断片が生成される。この断片を精製し、次いでNcoI及びEcoRIで消化して、アガロースゲル電気泳動後４８３ｂｐのNcoI-EcoRI断片（＝断片Ｇ）が得られ、この断片をGeneCleanキット（BIO101社製）で回収する。
【０１２５】
断片Ｅ及びＧを連結してプラスミドpJCA159を作成する。このプラスミドは、全サイズが４４４５ｂｐであり（図５）、１５９アミノ酸のＨｉｓ−６／Ｃｐ１５／６０融合タンパク質を発現する。
【実施例７】
【０１２６】
プラスミドpJCA160（ベクターpBAD/HisAにおける単独のＣｐ１５／６０タンパク質）の構築
ベクターpBAD/HisA（カタログ番号Ｖ４３０−０１、InVitrogen社製）をNcoI及びEcoRIで消化し、実施例２に記載の通り＃３９６０ｂｐのNcoI-EcoRI制限断片（＝断片Ｅ）を回収し単離する。
【０１２７】
ＰＣＲを実施して、Ｃｐ１５／６０タンパク質をコードする配列を増幅し、５’及び３’末端に好都合な制限部位を付加して、このＰＣＲ断片をプラスミドベクターpBAD/HisA中にサブクローニングする。
【０１２８】
クリプトスポリジウム・パルブムＤＮＡ、並びにプライマー、即ち
オリゴヌクレオチドJCA304（３１ｍｅｒ）配列番号１０
5' TTT TTT CCA TGG GTA ACT TGA AAT CCT GTT G 3'
及びオリゴヌクレオチドJCA298（４２ｍｅｒ）配列番号４
を使用してＰＣＲを実施する。
【０１２９】
このＰＣＲにより約４６０ｂｐの断片が生成される。この断片を精製し、次いでNcoI及びEcoRIで消化して、アガロースゲル電気泳動後４５０ｂｐのNcoI-EcoRI断片（＝断片Ｈ）が得られ、この断片をGeneCleanキット（BIO101社製）で回収する。
【０１３０】
断片Ｅ及びＨを連結してプラスミドpJCA160を作成する。このプラスミドは、全サイズが４４１２ｂｐであり（図６）、１４８アミノ酸のＣｐ１５／６０タンパク質を発現する。
【実施例８】
【０１３１】
大腸菌組換えクローンの培養及び組換えタンパク質の誘発
プラスミドＤＮＡ（実施例２〜７）で大腸菌ＤＨ５α（又は大腸菌ＴＯＰ１０（カタログ番号Ｃ４０４０−０３、InVitrogen社製）など、当分野の技術者に周知の他のいずれかの適当な大腸菌Ｋ１２株）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（Luria-Bertani）寒天培地プレート上で増殖させる。大腸菌集団を形質転換した各プラスミドにつき１個のコロニーを採取し、アンピシリン（又は他の適切な抗生物質）を含む１０ｍｌのＬＢ培地中に置き、一晩増殖させる。一晩置いた培養物のうち１ｍｌを１リットルのＬＢ培地に添加し、ＯＤ６００ｎｍが約３．０に達するまで＋３０℃で増殖させる。
【０１３２】
様々な終濃度（０．００２％〜０．２％の範囲で最適の収量を得るための濃度を決定する）のＤＬ−アラビノース（カタログ番号Ａ９５２４、Sigma社製、ミズーリ州セントルイス）を培養物に添加し、＋３０℃で４〜６時間インキュベートして、タンパク質の産生を誘発する。
【実施例９】
【０１３３】
組換え融合タンパク質の抽出及び精製
この誘発（実施例８）の最後に、細胞を遠心分離（３０００ｇ、＋４℃で１０分間）によって回収し、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１μＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム）中で再懸濁させ、超音波処理により破砕を３０秒間ずつ、１分間の休止を挟み２５回行う。Triton X-100を終濃度０．１％になるように添加する。遠心分離によって細片を除去する。
【０１３４】
必要に応じて、代替の技法（当分野の技術者に知られている）を使用して細菌細胞を溶解することもできる。
【０１３５】
９．１．ＧＳＴ−融合組換えタンパク質
グルタチオン−アガロース（カタログ番号Ｇ４５１０、Sigma社製）又はグルタチオン−セファロース４Ｂ（カタログ番号１７−０７５６−０１、Amersham-Phharmacia Biotech社製）を使用して、実施例８に記載の通り調製した細菌ライセートから組換えＧＳＴ−融合タンパク質（プラスミドpJCA155若しくはpJCA158で形質転換させた大腸菌によって産生される）をアフィニティー精製した。細菌ライセート及びグルタチオン−アガロースを＋４℃で４時間インキュベートした。次いで、１０ｍＭ還元型グルタチオン（カタログ番号Ｇ４７０５、Sigma社製）を用いて、温和な条件下でアガロースからＧＳＴ−融合タンパク質をバッチ式で溶出した（K. Johnson and D. Smith Gene. 1988. 67. 31-40）（Anonymous. GST gene fusion system : technical manual. 3rd edition. Arlington Heights, IL: Amersham-Pharmacia Biotech, 1997を参照のこと）。当分野の技術者なら、本開示及び当技術分野の知識があれば過度の実験なしに、大量のＧＳＴ−融合タンパク質を精製するこの方法をスケールアップすることができよう。
【０１３６】
９．２．Ｈｉｓ６−融合組換えタンパク質
ProBond（商標）ニッケル−キレート樹脂（カタログ番号Ｒ８０１−１５、InVitrogen社製）を製造元の使用説明書に従って使用して、組換えＨｉｓ６−融合タンパク質をすべて調製及び精製した。
【０１３７】
ネイティブな大腸菌細胞ライセートの調製（可溶性組換えタンパク質）
１リットルの大腸菌（プラスミドpJCA156若しくはpJCA159で形質転換させた）培養物から遠心分離（３０００ｇ、５分間）により大腸菌細胞を回収する。このペレットを２００ｍｌのNative Binding Buffer（ネイティブ結合緩衝液）（２０ｍＭのリン酸塩、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で再懸濁させる。次いで、再懸濁させたペレットを、卵のリゾチームと一緒に終濃度１００μｇ／ｍｌで氷上で１５分間インキュベートする。次いで、この懸濁液を氷上に置いたまま、この混合物を、超音波処理により中程度の強度で破砕を１０秒間ずつ、２〜３回行う。次いで、この混合物を、一連の凍結／解凍サイクルに供して溶解を完了させ、最後に不溶性の細片を３０００ｇ、１５分間の遠心分離によって除去する。このライセートを０．８μｍフィルターで濾過して清澄化させ、精製まで氷上又は−２０℃で保存する。
【０１３８】
清澄化ライセートのアリコート１００ｍｌを２つ使用して、このライセート中に存在する可溶性の組換えＨｉｓ６−融合タンパク質を、事前に平衡化した５０ｍｌのProBond（商標）樹脂カラム（カタログ番号Ｒ６４０−５０及びＲ８０１−１５、InVitrogen社製）にバッチ式で結合させる。カラムを静かに１０分間振盪して樹脂を再懸濁させ、ポリヒスチジンタグ付きのタンパク質を十分に結合させる。この樹脂を重力又は低速遠心分離（８００ｇ）によって沈殿させ、その上清を注意深く吸引する。第２のアリコートを用いて同じサイクルを繰り返す。
【０１３９】
カラム洗浄及び溶出
製造元の使用説明書（Anonymous. Xpresss（商標）System Protein Purification-A Manual of Methods for Purification of Polyhistidine-Containing Recombinant Proteins. InVitrogen Corp. Editor. Version D. 1998）に従って、４つの連続するステップを実施する。
１．カラムを１００ｍｌのNative Binding Buffer、ｐＨ７．８で洗浄した後、樹脂を再懸濁させ、２分間振盪し、次いで重力又は遠心分離により樹脂と上清に分離する。この手順をもう２回繰り返す（全部で３回の洗浄）。
２．カラムを１００ｍｌのNative Wash Buffer（ネイティブ洗浄緩衝液）、ｐＨ５．５で洗浄した後、樹脂を再懸濁させ、２分間振盪し、次いで重力又は遠心分離により樹脂と上清に分離する。この手順を、ＯＤ２８０が０．０１未満になるまで少なくとも３回繰り返す。
３．カラムを１００ｍｌのNative Wash Buffer（ネイティブ洗浄緩衝液）、ｐＨ５．５で洗浄した後、樹脂を再懸濁させ、２分間振盪し、次いで重力又は遠心分離により樹脂と上清に分離する。この手順を、もう１回繰り返す（全部で２回の洗浄）。
４．次いで、カラムを垂直位に固定し、その下端キャップを取り外す。１５０ｍｌのNative pH Elution Buffer（ネイティブｐＨ溶出緩衝液）を用いて、組換えタンパク質を溶出させる。１０ｍｌの画分を回収する。その画分のＯＤ２８０値を測定することにより溶出をモニターする。
必要に応じて、溶出したこの組換えタンパク質を、透析、又は硫酸アンモニウムによる沈殿のいずれかによって濃縮することができる。
【０１４０】
組換えタンパク質のバッチの終濃度をＯＤ２８０値によって測定する。
【０１４１】
当分野の技術者なら、本開示及び当技術分野の知識があれば過度の実験なしに、大量のＨｉｓ６−融合タンパク質を精製するこの方法をスケールアップすることができよう。
【実施例１０】
【０１４２】
クリプトスポリジウム・パルブムＰ２１及びＣｐ１５組換え非融合タンパク質の抽出及び精製
大腸菌の細胞（プラスミドpJCA157若しくはpJCA160で形質転換させた）を、４リットルのＭ９最小培地（適切なアミノ酸を補充した）中でＯＤ６００ｎｍがおよそ３．０に達するまで３０℃で培養し（Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989)、実施例８に記載の通り誘発を行う。次いで、この細菌の細胞を、最大流量毎時１０リットル、使用圧力０〜１０００バールの、高圧のRANNIEホモジナイザーMini-Lab、8.30H型に通して粉砕する。このライセートをCUNOフィルターZeta plus、LP型で濾過することにより清澄化させ、次いで、限外濾過器PALL Filtron（参照番号ＯＳ０１０Ｇ０１）ＵＦ（限外濾過量）１０ｋＤａで５０倍に濃縮する。このタンパク質懸濁液の濃縮物を、カラム容量の２〜３％に相当する量のHigh Resolution Sephacryl（高分解能セファクリル）S-100ゲルを用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーのカラムにロードする。ＰＢＳ緩衝液を用いて溶出させる。サブユニットワクチンタンパク質の予想の分子量に相当する回収画分を、中空繊維カートリッジA/G Technology、Midgeカートリッジ型、UFP-10-B-MB01モデル（又はUFP-10-C-MB01モデル又はUFP-10-E-MB01モデル）で１０倍に濃縮する。この濃縮試料を、使用するまで−７０℃で保存する。次いで、特定のクリプトスポリジウム・パルブム組換えタンパク質を、最終的に組み合わせたワクチンに対して適切な比率で混合することができる（実施例１１参照）。
【実施例１１】
【０１４３】
ワクチンの配合、妊娠中の雌牛へのワクチン接種、並びに新生子牛における受動免疫化及びチャレンジ実験
産生物（アジュバントを含む、又は含まない）を、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＱ）又は皮内（ＩＤ）に投与して、クリプトスポリジウムパルバムに対する血清抗体反応を誘発する。これを妊娠中の動物に２回投与すると、血清抗体反応が誘発され、これはその新生仔に初乳及びミルクを介して受動的に伝達される。妊娠中の動物に対するワクチン接種プロトコルは、処置慣行に応じて（ただし、以下のスケジュールは最大の有効性に有利に働く）、妊娠と診断された時から出産までの間に、例えば出産の１カ月前と出産の約３〜５日前に２回投与すること、或いは出産の２カ月前（乳牛の乾乳期と一致する）に投与し、さらに出産前（例えば出産の１〜３週間前のいつか）に追加免疫することを含むことができる。現在の処置慣行では、出産前の３カ月間に産生物を投与することが好ましい。産生物の量は１〜５ｍｌ、例えば２ｍｌとすることができる。混合ワクチンは、凍結乾燥部分及び液体部分を有し、注入前にこれらを混合することができる。現場条件下で最大の防御をもたらすために、クリプトスポリジウム抗原を大腸菌／ロタ／コロナ混合ワクチンの成分として添加することができる。
【０１４４】
下記の試験を実施する。
【０１４５】
試験Ａ：クリプトスポリジウム・パルブムは、腸管ウイルス及び／又は腸管細菌の病原性を増悪させる。
実験的チャレンジは下記の各群につき３頭の新生子牛を使用する。
１．コロナウイルスのみ
２．コロナウイルス＋クリプトスポリジウム・パルブム
３．大腸菌Ｆ４１のみ
４．大腸菌Ｆ４１＋クリプトスポリジウム・パルブム
５．クリプトスポリジウム・パルブムのみ
６．未処置の対照群
【０１４６】
生後２４時間以内の子牛に経口経路でチャレンジする。使用するチャレンジ材料の量は、臨床症状（機能低下、下痢、脱水など）を引き起こすのに必要な量とし、動物の種類（純粋隔離群の人工哺育子牛又は母獣からの授乳で育つ通常の子牛）によって変わり得る。一般的な臨床症状（体温、様子、脱水、下痢の臨床スコアなど）を収集する。さらに、血清及び排泄の情報も収集する。
【０１４７】
結果
コロナウイルス又は大腸菌Ｆ４１の単価による実験的チャレンジでは、新生子牛における腸管疾患の臨床症状は生じない。コロナウイルス又は大腸菌Ｆ４１とクリプトスポリジウム・パルブムとを、通常臨床疾患を引き起こさないクリプトスポリジウム・パルブムの用量で２重投与すると、腸管疾患の重大な臨床症状を引き起こす。
【０１４８】
試験Ｂ：クリプトスポリジウム・パルブムを含む混合ワクチン（大腸菌Ｋ９９／Ｆ４１、ロタウイルス及びコロナウイルス）は、新生子牛における複数の腸管ウイルス及び／又は腸管細菌の同時感染による腸管疾患の病因に対する防御を増強する。
処置群は、下記の通りワクチン接種された３０頭の妊娠中の雌牛である。
１．混合（ロタ及びコロナウイルス、大腸菌Ｋ９９及びＦ４１）、８頭
２．混合＋クリプトスポリジウム、８頭
３．未処置の対照群、１４頭
実験的チャレンジは下記の通りである。
１．多回チャレンジ（コロナウイルス及びＦ４１＋無症状レベルのクリプトスポリジウム・パルブム）
２．歩哨動物
３．未処置
【０１４９】
子牛に初乳（人工哺乳によるか、又は母獣から授乳される）を与え、チャレンジすべき子牛に生後２４時間以内に経口経路でチャレンジする。チャレンジ材料の量は、臨床症状を引き起こすのに必要な量（例えば試験Ａで決定した通り）であり、試験Ａに記載の通り、使用する動物の種類（純粋隔離群の人工哺育子牛又は母獣からの授乳で育つ通常の子牛）によって変わり得る。一般的な臨床症状（体温、様子、下痢のスコアなど）を収集する。さらに、血清及び排泄の情報も収集する。
計画
ワクチン接種した（混合、混合＋クリプトスポリジウム）雌牛、又は対照群の雌牛から生まれた６頭の子牛に、３種の成分（コロナウイルス及びＦ４１＋クリプトスポリジウム・パルブム）を含むチャレンジ材料を投与し、３頭の子牛（ワクチン接種していない対照群の雌牛から生まれた）を歩哨動物として残しておく。
【０１５０】
結果
多回チャレンジ（コロナウイルス及び大腸菌Ｆ４１＋無症状用量のクリプトスポリジウム・パルブム）の状況下で、クリプトスポリジウム・パルブムを含む混合ワクチンを使用すると、混合ワクチン単独よりも優れた防御が得られる。
【実施例１２】
【０１５１】
新生子牛の実験的チャレンジモデルにおけるクリプトスポリジウム・パルブム及びウシロタウイルスによる２重感染の影響
クリプトスポリジウム・パルブム又はウシロタウイルスを単価でチャレンジした後の子牛の臨床症状の重篤度並びに糞便中排泄を、ウシロタウイルス及びクリプトスポリジウム・パルブムで２重チャレンジした後の子牛と比較するようにこの試験を計画する。
【０１５２】
６頭の子牛からなる４つの群を使用して、４つの群間の臨床症状の発生率の違いを検出することができる十分なデータを収集する。
【０１５３】
雌牛は、牛舎又は小放牧地内に個別に収容する。新生子牛は、生後できるだけ早くその母獣から引き離し、検査して子牛に付いた糞便又は汚れを除去し、臍の緒を約７％のヨードチンキに浸漬する。次いで、これらの子牛をすぐに収容施設に移し、代謝枠箱（metabolic crate）に個別に収容する。生後６時間以内に子ウシにチャレンジする。
【０１５４】
子牛に、３０％の初乳代用物を含む市販の子牛用ミルクリプレイサーを、全試験について授乳毎に１〜２クォート又は体重の１０％の量で１日２回与える。チャレンジの前後２時間以内にミルクを投与することは避けるよう特に注意する。
【０１５５】
自然の感染経路は経口であるため、チャレンジ物質はすべて食道管を使用して経口投与する。
【０１５６】
Ａ群：未処置の対照子牛。
Ｂ群：抗生物質なしの市販の豆乳６０ｍｌで希釈した１〜３×１０５個のクリプトスポリジウムパルバムオーシスト（Beltsville菌株）。
Ｃ群：抗生物質なしの市販の豆乳６０ｍｌで希釈した１〜３×１０５個のクリプトスポリジウムパルバムオーシスト（Beltsville菌株）と、ＰＢＳ４０ｍｌで希釈した１０ｍｌのウシロタウイルス接種菌（IND BRV G6P5菌株）との同時接種。
Ｄ群：ＰＢＳ４０ｍｌで稀釈した、ウシロタウイルス（IND BRV G6P5菌株）を感染させた子ウシ由来の１０ｍｌの糞便濾過物。
【０１５７】
糞便試料は、代表的な試料が得られるように完全に混合した後、回収用便器から１日１回回収する。
【０１５８】
スクロースクッション上での遠心分離により、オーシストを子ウシの糞便から分離し、顕微鏡下で細胞計数板（血球計）を使用して計数する。ロタウイルスの排泄については、その糞便を緩衝液で希釈し、Le Centre d'Economie Rurale（ＣＥＲ）社、1 rue du Carmel, B6900 Marloie, BelgiumのＥＬＩＳＡキットを使用してロタウイルス抗原を定量する。
【０１５９】
子牛の臨床症状を、チャレンジ前に、次いでチャレンジ後１０日間１日２回観察する。観察項目には、直腸温、全身状態、食欲不振、下痢、脱水、及び死亡が含まれる。
【０１６０】
機能低下、下痢、及び脱水症状は下記のように分類する。
【０１６１】
【表１】
2007502292.tif 000004
【０１６２】
【表２】
2007502292.tif 000005
【０１６３】
【表３】
2007502292.tif 000006
【０１６４】
食欲不振は、子牛が２リットル未満しかミルクを飲まないかどうかに基づいて判定する。生後の最初の４８時間は、食道管経由で子牛に給餌することができる。各疾患範疇毎に臨床症状がある（１と定める）か、又はない（０と定める）かに基づいて毎日各子牛のスコアを導き出す。直腸温は華氏温度で記録する。
【０１６５】
死亡した子牛は、Ｃ群では７日目と８日目に２頭、Ｂ群では７日目に２頭、Ｄ群では０頭、Ａ群では３日目に１頭みられた。結果は図７〜１３に示される。２種の微生物を投与すると、１種の投与と比べて、臨床的症状及び糞便中の微生物排泄に対する相乗効果が観察される。
【実施例１３】
【０１６６】
大腸菌によって発現されたクリプトスポリジウム・パルブムサブユニットタンパク質Ｃ７（Ｐ２１）及び／又はＣＰ１５／６０に対する抗体を含むウシ初乳の産生
４つの異なる群れからの妊娠中の乳用子牛を、６つのワクチン接種群、即ちＧＳＴ−Ｐ２１、６Ｈｉｓ−Ｐ２１、ＧＳＴ−ＣＰ１５／６０、６Ｈｉｓ−ＣＰ１５／６０、ＧＳＴ−Ｐ２１＋ＧＳＴ−ＣＰ１５／６０、及びプラセボ対照のうちの１つに無作為に割り当てた。乾乳期に入ると、各雌牛に、割り当てられたワクチンを５ｍｌの用量で１４日置きに３回皮下投与した。初乳を各雌牛から出産後最初の２４〜３６時間に３回採取し、標識した。１０〜２０ｍｌの試料を回収し、その残りを各採取時に個々の容器中で凍結させた。ＲＩＤＡにより初乳の全ＩｇＧレベルを試験した。ＥＬＩＳＡによりＰ２１とＣｐ１５／６０のサブユニットタンパク質の抗体を試験した。ワクチン接種の直後と出産時の両方に、同じサブユニットタンパク質抗体についてＥＬＩＳＡによる血清分析を行った。ワクチン接種前に糞便を採取し、ProSpect試験キットを用いてクリプトスポリジウム・パルブムの有無について試験した。試験された試料はすべて、クリプトスポリジウム・パルブムに対して陰性であった。
【０１６７】
Ｐ２１に対する初乳抗体
Ｐ２１抗原を接種したすべての群でＰ２１に特異的な抗体応答が検出された。それとは対照的に、ＣＰ１５／６０を接種した群、及びプラセボ群では、Ｐ２１に対する抗体応答は検出できなかった（図１４参照）。興味深いことに、「混合」群（０．２５ｍｇのＧＳＴ−Ｐ２１を０．２５ｍｇのＧＳＴ−ＣＰ１５／６０と組み合わせてワクチン接種する）は、ＧＳＴ−Ｐ２１単価の群（０．５ｍｇのＧＳＴ−Ｐ２１をワクチン接種する）と比較したとき、非常に類似するＰ２１応答を示した。０．５ｍｇのＨｉｓ−Ｐ２１を投与した群は、０．５ｍｇのＧＳＴ−Ｐ２１を投与した群よりもわずかではあるが常に低いＰ２１応答を有し、最も大きな差は搾乳２回目で見られた。個々の値をさらに分析すると、Ｈｉｓ−Ｐ２１群では、２頭の非応答雌牛（Ｇ４１８及びＭ２６）、及び搾乳２回目で異常値（搾乳１回目＝０．０５５、搾乳２回目＝０．２９６、搾乳３回目＝０．０５５）を示す雌牛Ｊ５４を含むことが示された。非応答雌牛はいずれも非常に低い全ＩｇＧレベルを有することにも留意されたい。非応答動物に対応する値、及び異常値をこの分析から除外すると、Ｈｉｓ−Ｐ２１群の群平均は、ＧＳＴ−Ｐ２１群と非常に類似するものとなる。
【０１６８】
ＣＰ１５／６０に対する初乳抗体
ＣＰ１５／６０抗原を含むすべての群でＣＰ１５／６０に特異的な抗体応答が検出された（図１５）。それとは対照的に、Ｐ２１を接種した群、又はプラセボ群では、Ｃｐ１５／６０に対する抗体応答は検出できなかった。Ｈｉｓ−ＣＰ１５／６０群、及び０．２５ｍｇのＧＳＴ−Ｐ２１を０．２５ｍｇのＧＳＴ−ＣＰ１５／６０（混合群）と組み合わせて含む群は、非常に類似する応答を示した。ＧＳＴ−ＣＰ１５／６０単価の群は、そのＧＳＴ−ＣＰ１５／６０抗原の量が混合群の２倍（０．５ｍｇ対０．２５ｍｇ）であるが、その応答は混合群よりも常に低かった。単価のＧＳＴ−ＣＰ１５／６０を接種した雌牛は混合群と比べて質の低い初乳を産生するが、この予想外の結果はこうした２群間の遺伝的な差が原因であると想定される。
【０１６９】
Ｐ２１に対する血清抗体
０日目ではすべての群は血清陰性であった。Ｐ２１をワクチン接種した群は、１４日目に抗体レベルがＧＳＴ−Ｐ２１群よりも有意に低くなるＨｉｓ−Ｐ２１群を除きすべて、Ｐ２１に特異的な類似の抗体応答を示した（図１６参照）。それとは対照的に、ＣＰ１５／６０を接種した群、及びプラセボ群では、Ｐ２１に対する抗体応答は検出できなかった。初乳の場合に見られたのと同様に、０．２５ｍｇのＧＳＴ−Ｐ２１を含む混合ワクチンは、０．５ｍｇのＧＳＴ−Ｐ２１を含むＧＳＴ−Ｐ２１単価のワクチンとちょうど同じような結果を示した。各ＧＳＴ−Ｐ２１ワクチンを投与したそれらの各群は、最初の注射の後、１４日目と２８日目の値が非常に類似しており安定状態に達した。しかし、Ｈｉｓ−Ｐ２１群は２８日目までその最高値に達しなかった。初乳の場合に見られたのと同様に、個々の値をさらに分析すると、雌牛Ｇ４１８及びＭ２４は低応答動物であることが示された。対応するその値をこの分析から除外すると、Ｈｉｓ−Ｐ２１群の群平均は、ＧＳＴ−Ｐ２１群と非常に類似するものとなる。最後に、すべてのＰ２１群の出産時に抗体価の類似の減少が観察された。これは、初乳中の免疫グロブリンの活発な移出、及び周産期の免疫抑制が原因である可能性が高い。
【０１７０】
Ｃｐ１５／６０に対する血清抗体
０日目ではすべての群は血清陰性であった。プラセボ対照はこの試験を通じて陰性のままであった。Ｐ２１をワクチン接種した群は１４日目及び２８日目で弱い陽性であった。これは、実験の誤差を反映している可能性が高い（非特異的なバックグラウンド）。Ｃｐ１５／６０をワクチン接種した群は、１回目のワクチン接種後セロコンバージョンを起こした（図１７）。第２の注射により抗体応答を高めた。Ｈｉｓ−Ｃｐ１５／６０群は類似の抗体応答を示した。最後に、すべてのＣｐ１５／６０群の出産時に抗体価の類似の減少が観察された。これは、初乳中の免疫グロブリンの活発な移出、及び周産期の免疫抑制が原因である可能性が高い。
【実施例１４】
【０１７１】
新生子牛におけるクリプトスポリジウム・パルブムの実験的チャレンジ
分娩を誘発することによって得られた、初乳を与えなかった８頭の肉用子牛を２群に均等に分割し、６日間の試験中各群を隔離室に入れた。各子牛はそれぞれ１つの代謝枠箱に住まわせた。各群に２パイント（約９６０ｍｌ）の初乳を出産の３時間後と１２〜１５時間後に哺乳瓶で与えた。出産２４時間後、子牛はすべて、ＲＩＤＡ（放射免疫拡散法）によって検出された血中ＩｇＧレベルが１０００ｍｇ／ｄＬより大きくなった。チャレンジ群の各子牛にクリプトスポリジウム・パルブムの１０８個のオーシストを経口投与した。血液試料を毎日採取し、クリプトスポリジウム・パルブムＰ２１及びＣｐ１５／６０抗原に対する血清抗体、ヘマトクリット、及び全タンパク質について試験した。糞便を１日３回（直腸より）採取し、乾物含有率を測定した。ＥＬＩＳＡキットProSpecTにより、糞便中のオーシスト排泄を毎日測定した。体温、全身状態（機能低下など）、食欲不振、脱水状態、糞便の硬さ（下痢など）、及び死亡を含めた臨床症状を毎日評価した（臨床症状のスコアの付け方については実施例１２参照）。死亡した、又は安楽死させた子牛はすべて、検死、腸管の分析、並びに腸管のウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、大腸菌、サルモネラ属菌（Salmonella spp.）、及びクリプトスポリジウム・パルブムの含有量の分析にかけた。
【０１７２】
オーシスト排泄
表１は、全オーシストのＥＬＩＳＡによるクリプトスポリジウム・パルブムオーシストの排泄の検出を示す。
【０１７３】
【表４】
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【０１７４】
臨床症状
未処置の対照はすべて、試験期間中健常のままであった。チャレンジ群の子牛はすべて、チャレンジ後４日目までにクリプトスポリジウム症と一致する臨床症状を示した。チャレンジ群中の３頭の子牛が試験の終わる前に死亡した（４日目に１頭、５日目に２頭）。チャレンジ群中の４頭目の子牛は、以前に確立された安楽死の基準を満たしたため試験の最後に（６日目）安楽死させた。体温、機能低下、下痢、食欲不振、及び脱水をモニターし、実施例１５に記載の通り特徴付けた。
【０１７５】
各群の平均体温は、その差がどの時点でも１°Ｆ未満であり、チャレンジ群では１０１．５７〜１０３．５°Ｆ、未処置群では１０１．５３〜１０２．７８°Ｆの範囲にあり、すべて臨床的に正常の範囲内であった。
【０１７６】
未処置の子牛はすべて、元気で機敏なままであった。チャレンジした子牛は２日目（２／４）に機能低下を示し始め、チャレンジ群中の残りの３頭の子牛が２〜５日目の間機能低下を示し続けた。残りの１頭の子牛が試験の終わりである６日目にまだ機能低下を示していた。
【０１７７】
チャレンジ群の子牛はすべて、クリプトスポリジウム症と一致する下痢の症状、即ち糞便が黄色がかり、泡立っており、水分が多く、大量であるなどの症状を示した。この群の下痢は２日目に始まり、この実験が終わるまで続いた。未処置の子牛のうち１頭が、一時的な下痢を３日目と、５日目に再び起こしたが、これは試験が終わるまでに解決した。この子牛はクリプトスポリジウム症の他の症状を示さなかったため、この下痢は栄養摂取の結果であった可能性が高かった。
【０１７８】
３日目の１頭を除き、未処置群の子牛はすべて、食欲旺盛であり、積極的に授乳していた（哺乳瓶）。３日目（その下痢の初日に相当する）に食欲不振となった子牛に、その日だけ食道管付き哺乳瓶（esophageal feeder）を用いて授乳し、次いで通常の哺乳瓶による授乳に戻した。チャレンジ群の子牛はすべて、３日目までに食欲不振となり、試験が終わるまで食欲不振であり続けた。
【０１７９】
未処置群の子牛はいずれも臨床的脱水を示さなかった。チャレンジ群の１頭の子牛が２日目に臨床的脱水を示し始め、３日目までにこの群の子牛はすべて臨床的脱水となり、試験が終わるまでその状態のままであった。脱水を示す血液パラメータ（ヘマトクリット）の結果を図１８に示す。
【０１８０】
未処置の子牛のヘマトクリットレベルは、１日目の後一定のままであったが、チャレンジした子牛のヘマトクリットは２日目に増加し、４日目、５日目、及び６日目では対照子牛よりも高いままであった。誕生した日（−１日目）における未処置の子牛の平均ヘマトクリットは４１．０％であった。それは０日目に低下し、試験の残りの期間では３２．０〜３７．５％のレベルを維持した。チャレンジした子牛は、誕生した日（−１日目）の平均ヘマトクリットが３７．８％であり、次いで０〜３日目に２９．５〜３５．０％に低下した。チャレンジ後４日目に、平均ヘマトクリットが臨床的に有意な４１．７％まで増加した。図１８は、ヘマトクリットの毎日の群間の違いを示す。５日目と６日目の値は１頭の子牛についての結果を表す。
【０１８１】
未処置の子牛の全血漿タンパク質（ＴＰ）は、試験を通じて一定のままであり、−１日目（プレチャレンジ）の平均６．４５から０日目（チャレンジ２４時間後の時点）の５．８５の低い値までの範囲であった。チャレンジした子牛では、−１日目の６．４に始まり、２日目（７．０）で最高レベルに達し、試験期間を通じて対照子牛よりも高いままであった。
【０１８２】
容量パーセント濃度（% of volume）として表した、糞便の乾物含有率は、対照子牛でほぼ一定のままであったが、チャレンジした子牛では２日目に低下傾向（下痢に匹敵するより低い乾物含有率）が始まり、それは試験が終わるまで続いた。チャレンジした子牛は、対照の子牛よりも乾物含有率が６〜３９％常に低かった。未処置の子牛の糞便の平均乾物含有率は、出産２４時間後の時点での３９．９％から２日目朝の試料回収時での５１．７％までの範囲であった。チャレンジした子牛の糞便の平均乾物含有率は、出産２４時間後の時点での２８．４％から２日目朝の試料回収時での４１．０％までの範囲であり、その後４日目夕方の試料回収時での９．６％という低い平均値まで徐々に低下した。図１９は、糞便乾物含有率の毎日の群間の違いを示す。
【０１８３】
対照の子牛は、試験期間を通じてクリプトスポリジウム・パルブムの感染に対して陰性のままであった。チャレンジした子牛は、クリプトスポリジウム・パルブムのオーシストを排泄し、クリプトスポリジウム・パルブムをチャレンジした子牛は、クリプトスポリジウム症の臨床症状を示した。未処置の対照は健常のままであった。
【実施例１５】
【０１８４】
子牛へのチャレンジによる様々なクリプトスポリジウム・パルブムのサブユニットタンパク質ワクチンの有効性の実証
対照の雌牛の初乳を与えた子牛に対する、接種した雌牛の初乳を与えた子牛において観察される臨床症状の重篤度の有意な低下に基づいて、６つの群、即ちＧＳＴ−Ｐ２１（第１群）、Ｈｉｓ−Ｐ２１（第２群）、ＧＳＴ−１５／６０（第３群）、Ｈｉｓ−１５／６０（第４群）、ＧＳＴ−Ｃ＆＋ＧＳＴ−Ｃ１５／６０（第５群）、プラセボワクチン（第６群）の子牛を選択した。各処置群におよそ８頭の動物を割り当てた。第１の初乳摂取の前に、血清を得るために新生子牛の血液を採取し、体重、体温、糞便、及びその他の臨床観察項目（即ち、食欲不振、機能低下、下痢など）を観察した。およそ３時齢で第１の初乳を哺乳瓶又は食道管によって与えた。約１２時間後に第２の初乳を投与した。約２４時齢でクリプトスポリジウム・パルブム（１０７個のオーシスト）をチャレンジした。子牛の観察を１日４回行い、その間に血液試料を採取し、体温及び臨床観察項目をモニターし、また糞便の回収を行った。
【０１８５】
生後２４時間後のすべての子牛にクリプトスポリジウム・パルブムの１０８個のオーシストを経口投与によりチャレンジした。チャレンジの直前に、清潔な哺乳瓶、又は清潔な食道管を用いて子牛に６０〜１００ｍｌの子牛用ミルクリプレイサーを投与した。これに続いて、チャレンジ材料を投与し、次いでその後４０〜１００ｍｌの水又は子牛用ミルクリプレイサーで濯いだ。
【０１８６】
チャレンジの直前に、次いでチャレンジ後の６日間は毎日ほぼ同じ時間に４回、子牛の臨床症状を観察した。臨床観察項目には直腸温、全身状態、食欲不振、下痢、脱水、及び死亡が含まれた。
【０１８７】
血清
図２０に示すグラフのデータを生成するのに使用する、Ｐ２１抗体を検出するためのＥＬＩＳＡは、間接競合ＥＬＩＳＡであり、これはＯＤ値が高くなるほど抗体レベルは低くなり、ＯＤ値が低くなるほど抗体レベルが高くなる。この試験の子牛は、−１日目は未感作であったが、Ｐ２１抗体（ＧＳＴ−Ｐ２１、Ｈｉｓ−Ｐ２１、及び混合ワクチン）を含む試験初乳を授乳した後でセロコンバージョンを示した。ＧＳＴ−１５／６０、Ｈｉｓ−１５／６０、及びプラセボ抗体をすべて含む初乳を授乳した子牛では、６日の観察期間を通じてＰ２１抗体に陽性のままであった。
【０１８８】
Ｃｐ１５／６０抗体を検出するためのＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡであり、これは高いＯＤ値は高い抗体レベルに対応し、低いＯＤ値は低い抗体レベルに対応する（図２１）。すべての子牛は−１日目では未感作であった。１５／６０抗体（ＧＳＴ−１５／６０、Ｈｉｓ−１５／６０、及び混合ワクチン）をすべて含む初乳を授乳した子牛は、急速なセロコンバージョンを示した。Ｐ２１及びプラセボ抗体を含む初乳を授乳したウシの値のわずかな上昇は、よく起こるが、交差反応によるバックグラウンドと想定され、ＥＬＩＳＡの限界である。それにかかわらず、Ｐ２１及びプラセボ抗体を含む初乳を授乳した子牛は、６日の観察期間を通じて陰性のままであった。
【０１８９】
総疾患スコアのグラフ
総疾患スコアは、この試験で６日間にわたって観察される（１日４回の観察）あらゆる臨床症状（下痢、食欲不振、及び機能低下）の累計である。他のデータと併せると、このグラフからＧＳＴ−Ｐ２１ワクチン及びＨｉｓ−Ｐ２１ワクチンは防御効果がないことが示された。しかし、ＧＳＴ−１５／６０ワクチンでは、わずかではあるが臨床症状の有意な減少が示される。この防御は、図２２でより明確に分かる。他のワクチンのデータを除外すると、６日の観察期間のほとんどを通じて、ＧＳＴ−１５／６０抗体を含む初乳を授乳した子牛は、常に疾患に罹りにくい（即ち臨床症状がより少ない）ことが明らかである（図２３）。
【０１９０】
下痢
子牛で観察される下痢の種類に関するスコアを１日に４回つけた。観察時点１０では、下痢スコアが１のプラセボ群の子牛が４頭いたため、この観察の全スコアは４となった。どの群の子牛であるかにかかわらず、すべての子牛が下痢の症状を示したが、６日間の試験のほとんどの間で、ＧＳＴ−１５／６０群では、プラセボ群よりも小さいスコアとなった。群間の差は、特に観察時点６〜１１で明らかであった。
【０１９１】
図２４は、この試験のすべての子牛に関する下痢の相対分布を示すクラウドダイヤグラム（cloud diagram）である。このクラウドダイヤグラムは、すべての子牛の相対分布を示し、各子牛の２４個の疾患スコアを平均し（各黒塗りの丸は処置群中の１頭の子牛を表す）、次いでそれらの値を平均して処置群の平均を得る（紫塗りの四角で表す）ことによって作成した。複数のデータポイントが同じスペースを占める場合、重なるデータポイントの数を上付き数字によって表す。ＧＳＴ−１５／６０の平均はプラセボよりも低く、ＧＳＴ−１５／６０値はより密に集まっている（４個のデータポイントがその群の平均と重なっている）。また、Ｈｉｓ−１５／６０群は、その値のすべての集まりがＧＳＴ−１５／６０ほど密ではないが、平均がプラセボ群又は他の群よりもずっと低く良い成績であった。
【０１９２】
食欲不振
試験の２日目の後、２リットル未満のミルクしか授乳せず、食道管を必要とした子牛はいずれも、食欲不振としてスコアを付けた（生後最初の２日間に食欲不振の観察が記録されたが分析せず）。ＧＳＴ−１５／６０群の子牛は、２頭又は３頭の食欲不振の子牛を含むことが多いプラセボ群と対照的に、試験のほとんどを通じて食欲不振を示さなかった。図２５は、すべてのワクチンについてすべての子牛の総食欲不振スコアの相対分布を示すクラウドダイヤグラムを示す。ＧＳＴ−１５／６０は、最も密な集まり、並びにこの試験におけるすべての群の中で最も低い平均を有する。
【０１９３】
機能低下
子牛を１日４回観察し、その状態に関するスコアをつけた。ＧＳＴ−１５／６０群中の健常な子牛の数はプラセボ群よりも多かった。いずれの群の子牛もどの観察においても状態スコア１（無感心）より高いスコアを示さなかったことに留意されたい。即ち、プラセボ群の観察時点２１におけるスコア３は、スコア３の子牛１頭ではなく、スコア１の子牛３頭を示す。図２６は、各子牛についての総全身状態スコアの分布を示す。ＧＳＴ−１５／６０群は、その他のワクチン群よりもずっと接近した集合を示し、またプラセボと比べて非常に低い平均を有する。興味深いことに、ＧＳＴ−Ｐ２１ワクチンのみの結果はプラセボと類似しているが、混合ワクチン群（ＧＳＴ−Ｐ２１及びＧＳＴ−１５／６０からなる）は良い成績であった。この結果から、ＧＳＴ−１５／６０ワクチンは全身状態を改善することが示唆される。
【０１９４】
糞便の乾物
全糞便を採取し（毎日４回）、溜め、その日の間に乾燥させた。ＧＳＴ−１５／６０群の糞便の乾物量は、試験のほとんどの間プラセボ群よりもわずかに多く、すべての動物で症状が現れたが、ＧＳＴ−１５／６０群で下痢の発生が減少することが示された。図２７は、すべてのワクチンについての各子牛の平均糞便乾物スコアを示すクラウドダイヤグラムである。１５／６０を含むワクチン群はすべて、密な集まり、及びプラセボ群よりも多い平均量を示す。
【０１９５】
オーシスト排泄
図２８は、ＥＬＩＳＡキットProSpectによって判定したオーシスト排泄を示す（顕微鏡で直接観察したオーシスト数ではない）。これまでの他の臨床症状（下痢など）において見られたのと同様に、この試験におけるすべての動物で症状が現れた。ただし、Ｈｉｓ−１５／６０群のオーシスト排泄はプラセボ群と比べて遅れるように思われる。
【実施例１６】
【０１９６】
ロタウイルス、コロナウイルス、並びに大腸菌Ｋ９９及びＦ４１を含み、またクリプトスポリジウム・パルブムのＧＳＴ−ＣＰ１５／６０抗原を含むワクチンの免疫原性及び安全性
この試験の目的は、感染を受けやすい子牛におけるその安全性、及び２種の混合ワクチンによって誘発される抗体応答を評価することであった。この試験の具体的な目的は、クリプトスポリジウム・パルブムのサブユニット抗原の追加により、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、並びに大腸菌抗原Ｋ９９及びＦ４１などの他の抗原に対する免疫応答が干渉されるかどうかを判定することであった。こうした疑問に答えるため、２種のワクチンを試験した。両方ともに、アルミニウム／サポニンアジュバントを含め、不活化抗原、即ちウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、大腸菌Ｋ９９及び大腸菌Ｆ４１を含めた。さらに、ワクチンのうちの１つに、大腸菌中で産生させた、生のクリプトスポリジウム・パルブムのＧＳＴ−ＣＰ１５／６０サブユニット抗原を含めた。子牛の２つの群にそれらのワクチンをそれぞれ５ｍｌ処置するワクチン接種を２８日間隔で２回行った。別の２頭の子牛は環境対照として役立った。
【０１９７】
直腸温
図２９は、ワクチン接種群及び対照群における１回目及び２回目のワクチン接種に続いて起こる平均直腸温の変化を示す。２つのワクチン接種群で高体温の遷移相が観察され、これは１回目及び２回目のワクチン接種後２４時間以内のピークを有する。１回目のワクチン接種後の直腸温の平均最大上昇（Δｍａｘ１＝ピーク１のＴ°−Ｄ０のＴ°）は、混合＋クリプトスポリジウム、及び混合のみでそれぞれ１．４℃及び１．３℃であった。Δｍａｘ≧２．０℃の子牛はいなかった。２回目のワクチン接種後の直腸温の平均最大上昇（Δｍａｘ２＝ピーク２のＴ°−Ｄ２８のＴ°）は１．４℃及び１．１℃であった。Δｍａｘ≧２．０℃の子牛はいなかった。
【０１９８】
興味深いことに、対照の子牛もワクチン接種に続いて体温が上昇した。この上昇は限定的であり（平均０．４〜０．５℃）、動物の取り扱いが原因である可能性が高かった。このことから、特にワクチンに帰される最大高体温はおよそ１．０℃であった。
【０１９９】
局所反応（in vivo）
図３０は、１回目のワクチン接種に続いて起こる局所反応の平均サイズの変化を示す。図３１は、２回目のワクチン接種に続いて起こる局所反応の平均サイズの変化を示す。混合＋クリプトスポリジウムを投与した子牛の１回目のワクチン接種を除いて、すべてのワクチン接種において両方の注射の直後に局所反応が見られた。局所反応は、ワクチン接種後およそ２４〜４８時間で最大となり、１週間強いままであった。次いで、応答サイズの急速な縮小が観察された。すべての場合において、局所反応は、ワクチン接種後３週間で消失し、又は非常に限定的になった。局所反応は、排出したリンパ節の一時的でわずかな増大を伴うことがあった。ＡＮＯＶＡにより異なる時点での局所反応についてワクチン接種群を比較した（１回目の注射Ｄ１、Ｄ２１；２回目の注射Ｄ２９、Ｄ４９）。有意な差は見られなかった。
【０２００】
血清
クリプトスポリジウム・パルブムの平均抗体価を図３２で示す。予想されるように、クリプトスポリジウムではないワクチンを接種した子牛はすべて、クリプトスポリジウム・パルブムに対する抗体に対して陰性のままであった。１回目のワクチン接種後に、クリプトスポリジウムを接種した６頭のうち３頭でセロコンバージョンが観察された。２回目のワクチン接種後１４日目に、ワクチン接種したすべての子牛で強いセロコンバージョンが観察された。Ｃｐ１５／６０の平均抗体価は、Ｄ４２で２．６６であった。１頭の子牛は抗体価１．４の弱応答動物であった。
【０２０１】
ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）に対する抗体応答のＥＬＩＳＡ結果を図３３に示す。１回目のワクチン接種後１４日目に、ワクチン接種したすべての子牛でセロコンバージョンが観察された。ワクチン接種したすべての子牛で、Ｄ４２（追加のワクチン接種後１４日目）のＥＬＩＳＡ抗体価が非常に高かった。血清中和試験では、ほとんどすべての子牛の血清により、試験したすべての希釈液でウイルスが中和された（抗体価＞３．８４（ｌｏｇ  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）（図３４）。ＢＣＶに対するＥＬＩＳＡ平均抗体価は、混合＋クリプトスポリジウムワクチンのほうが混合ワクチンのみと比べて各時点でおよそ１０％低かった。Ｄ４９でのこの差は有意（ｐ＝０．０１）であった。
【０２０２】
ウシロタウイルス（ＢＲＶ）に対する抗体応答のＥＬＩＳＡ結果を図３５に示す。Ｄ２８で、混合＋クリプトスポリジウム群及び混合群のワクチン接種したものにおいてそれぞれ４／６及び５／５でセロコンバージョンを検出することができた。ワクチン接種したすべての子牛で、Ｄ４９のＥＬＩＳＡ抗体価が高かった。Ｄ４９のＥＬＩＳＡ抗体価は、混合群（ＳｔＤ＝０．１２）の方が混合＋クリプトスポリジウム群（ＳｔＤ＝０．４６）よりも均一であり、平均ＥＬＩＳＡ抗体価はおよそ１５％高かった。群間の差（ＡＮＯＶＡを繰り返して測定）は有意であった（ｐ＝０．０５）。ＢＲＶについての中和抗体価の変化を図３６に示す。ワクチン接種したすべての子牛で、Ｄ１４で抗体価が異常に上昇した。これらの抗体価は、Ｄ２８でより正常な値に低下したが、その時すべての子牛がセロコンバージョンを起こした。Ｄ４９の平均抗体価（ｌｏｇ  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）は、混合＋クリプトスポリジウム群で１．９であり、混合群のみで２．２であった。このおよそ１８％の差は有意であった（ｐ＝０．０１）。
【０２０３】
大腸菌Ｆ５−Ｋ９９についてのＥＬＩＳＡ抗体価の変化を図３７に示す。Ｄ２８で、混合＋クリプトスポリジウム群及び混合群のワクチン接種したものにおいてそれぞれ４／６及び３／５でセロコンバージョンを検出することができた。しかし、セロコンバージョンを起こした子牛のＥＬＩＳＡ抗体価は、混合群よりもずっと高かった。Ｄ４９の平均抗体価（ｌｏｇ  ＯＤ５０％）は、混合＋クリプトスポリジウム群で２．５６であり、混合群のみで３．９１であった。このおよそ４０％の差は非常に有意であった（ｐ＝０．００２）。
【０２０４】
大腸菌Ｆ４１についてのＥＬＩＳＡ抗体価の変化を図３８に示す。Ｄ２８で、両群のワクチン接種したものすべてにおいてセロコンバージョンを検出することができた。Ｄ４９の抗体価は、混合群のみでさらに均一となり高くなった。Ｄ４９の平均抗体価（ｌｏｇ  ＯＤ５０％）は、混合＋クリプトスポリジウム群で２．５７であり、混合群のみで３．６７であった。このおよそ４０％の差は非常に有意であった（ｐ＝０．００５）。
【０２０５】
平均して、両方のワクチンは、そのそれぞれの注射後、一時的で、中程度の高体温を誘発した。他に観察された全身反応はなかった。両方のワクチンは、強い局所反応を誘発したが、２週間以内にかなり許容されるサイズにまで縮小した。ワクチンの性質と関係なく、２回目のワクチン接種の後に反応がより顕著であった。
【０２０６】
両方のワクチンは、それぞれのすべての抗原成分に対する抗体の産生を誘発した。クリプトスポリジウム・パルブムに対する抗体を除いて、抗体応答は常に、混合ワクチンのみのほうが混合＋クリプトスポリジウムワクチンよりも高くなった。特に、大腸菌Ｋ９９及び大腸菌Ｆ４１に対する抗体をみるとこの差は明確であり、したがって、ワクチン中へのクリプトスポリジウム抗原の添加は、抗体応答が４０％（ｌｏｇ）低下することに関係している。
【０２０７】
こうした結果から、クリプトスポリジウム抗原の干渉（特に、大腸菌Ｋ９９及びＦ４１、場合によってはＢＲＶ抗体応答に対する）は重要で、防御に影響を与える恐れがあることが明確に示唆される。したがって、この添加は、大腸菌Ｋ９９、Ｆ４１及びＢＲＶ画分の抗原用量の再定義を必要とするかもしれない。
【０２０８】
上記の発明は、例示及び実施例により明確にし且つ理解する目的で詳細に説明したものであり、いくつかの変形形態及び変更形態を実施することができることは当分野の技術者には明らかであろう。したがって、説明及び実施例は、添付の特許請求の範囲によって記述された本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
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【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】プラスミドpJCA155の物理的制限地図を示す図である。
【図２】プラスミドpJCA156の物理的制限地図を示す図である。
【図３】プラスミドpJCA157の物理的制限地図を示す図である。
【図４】プラスミドpJCA158の物理的制限地図を示す図である。
【図５】プラスミドpJCA159の物理的制限地図を示す図である。
【図６】プラスミドpJCA160の物理的制限地図を示す図である。
【図７】クリプトスポリジウム・パルブム若しくはウシロタウイルスのいずれか、又は両方をチャレンジした、或いは未処置の子ウシの糞便中オーシスト数の比較（実施例１２）を示す図である。
【図８】実施例１２による、子ウシの糞便中のロタウイルス排泄の比較を示す図である。
【図９】実施例１２による、子ウシの全身状態の比較を示す図である。
【図１０】実施例１２による、子ウシの脱水状態の比較を示す図である。
【図１１】実施例１２による、子ウシの液状糞便の回数の比較を示す図である。
【図１２】実施例１２による、子ウシの食欲不振状態の比較を示す図である。
【図１３】実施例１２による、子ウシの直腸温変化の比較を示す図である。
【図１４】ワクチン群毎の平均Ｐ２１（Ｐ２１）初乳抗体レベルを示す図である。
【図１５】ワクチン群毎の平均ＣＰ１５／６０初乳抗体レベルを示す図である。
【図１６】ワクチン群毎の平均Ｐ２１（Ｐ２１）血清抗体レベルを示す図である。
【図１７】ワクチン群毎の平均ＣＰ１５／６０抗体レベルを示す図である。
【図１８】チャレンジした動物と未処置の動物とを比較したヘマトクリットレベルを示す図である。
【図１９】群間及び毎日の採取時毎の糞便の乾物含有率の毎日の違いを示す図である。
【図２０】間接ＥＬＩＳＡによるＰ２１の抗体検出アッセイの結果を示すグラフである。
【図２１】ＥＬＩＳＡによるＣＰ１５／６０の抗体検出アッセイの結果を示す図である。
【図２２】すべてのワクチンについての長期間の動物の総疾患を示すスコアグラフである。
【図２３】ＧＳＴ−１５／６０及びプラセボワクチンのみについての動物の総疾患を示すグラフである。
【図２４】すべてのワクチンについての下痢スコアを示すクラウドダイヤグラムである。
【図２５】すべてのワクチンについての食欲不振スコアを示すクラウドダイヤグラムである。
【図２６】すべてのワクチンについての機能低下スコアを示すクラウドダイヤグラムである。
【図２７】すべてのワクチンについての糞便の乾物を示すクラウドダイヤグラムである。
【図２８】この試験で使用するすべてのワクチンについてのオーシスト排泄を示す図である。
【図２９】直腸温の変化の平均を示すグラフである。
【図３０】１回目のワクチン接種に対する平均局所反応（クリプトスポリジウム＋混合、混合のみ）を示す図である。
【図３１】２回目のワクチン接種に対する平均局所反応（クリプトスポリジウム＋混合、混合のみ）を示す図である。
【図３２】ＣＰ１５／６０の平均ＥＬＩＳＡ抗体価を示すグラフである。
【図３３】ウシコロナウイルスに対するＥＬＩＳＡ抗体価を示す図である。
【図３４】ウシコロナウイルスに対するウイルス中和抗体価を示す図である。
【図３５】ウシロタウイルス対するＥＬＩＳＡ抗体価を示す図である。
【図３６】ウシロタウイルスに対するウイルス中和抗体価を示す図である。
【図３７】大腸菌Ｋ９９抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価を示す図である。
【図３８】大腸菌Ｆ４１抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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