(57)【要約】  培養中の多分化能性細胞の自己再生は、Ｉｄ遺伝子産物とｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターとの組み合わせを用いて促進される。
2007508026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進におけるＩｄ遺伝子産物の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記Ｉｄ遺伝子産物とｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターとの組み合わせの使用。
【請求項３】
培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進における、
（ｉ）Ｉｄタンパク質の発現または活性を増大させる薬剤；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせの使用。
【請求項４】
前記ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターがＬＩＦである、請求項１から３のいずれかの項に記載の使用。
【請求項５】
前記多分化能性細胞が胚性幹細胞である、請求項１から４のいずれかの項に記載の使用。
【請求項６】
前記胚性幹細胞がマウス細胞またはヒト細胞である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤（ｉ）が、フィブロネクチン、フィブロネクチンレセプターのアゴニスト、インテグリンシグナル伝達のアクチベーター、ｎａｎｏｇ、およびＩｄ遺伝子発現またはＩｄタンパク質活性を誘導する上記の全てのホモログから選択される、請求項３から６のいずれかの項に記載の使用。
【請求項８】
Ｉｄ遺伝子の発現を誘導することを含む、請求項１から７のいずれかの項に記載の使用。
【請求項９】
多分化能性細胞を遺伝子操作してＩｄ遺伝子を発現させることを含む、請求項１から８のいずれかの項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｉｄ遺伝子を含むベクターを多分化能性細胞に導入することを含む、請求項１から９のいずれかの項に記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｉｄ遺伝子産物がＩｄタンパク質である、請求項１から１１のいずれかの項に記載の使用。
【請求項１２】
培養中の多分化能性細胞の自己再生を促進する方法であって、（１）該細胞においてＩｄ遺伝子を発現させるかもしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導する、またはＩｄタンパク質を含む培地中で該細胞を培養する、工程、および（２）ＧＰ１３０下流シグナル伝達を活性化する工程、を含む、方法。
【請求項１３】
前記細胞においてエピソームによってＩｄ遺伝子を発現させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
誘導性プロモーターを含むエピソームベクターからＩｄ遺伝子を発現させる工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインを含む培地中で前記細胞を培養することにより、ｇｐ１３０下流シグナル伝達を刺激する工程を含む、請求項１２から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインが、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、カルジオトロピン、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−６とｓＩＬ−６レセプターとの組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進における、
（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせの使用。
【請求項１８】
ＥＳ細胞自己再生を促進するようにＥＳ細胞を培養する方法であって、
（ａ）Ｉｄタンパク質、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地中で、該ＥＳ細胞を維持する工程を含む、方法。
【請求項１９】
ＥＳ細胞を培養する方法であって、
（ａ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよび血清もしくは血清抽出物の存在下で、必要に応じてフィーダー上で、該ＥＳ細胞を培養中に多分化能状態で維持する工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞を少なくとも１回継代させる工程；
（ｃ）該血清もしくは該血清抽出物を該培地から除去し、そして存在する場合は該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清、および血清抽出物を含まないようにする工程；および
（ｄ）引き続き、
（ｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の存在下で、該ＥＳ細胞を多分化能状態で維持する工程；
を含む、方法。
【請求項２０】
ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
（ａ）ＥＳ細胞を、ＥＳ細胞において優先的に選択マーカーを発現するプロモーターに作動可能に連結した該選択マーカーをコードする構築物でトランスフェクトする工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞を播種する工程；
（ｃ）
（ｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用する１つのアクチベーターを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の存在下で、該ＥＳ細胞を培養する工程；および
（ｄ）該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程；
を含む、方法。
【請求項２１】
ＥＳ細胞を培養する方法であって、
個々のＥＳ細胞を培養容器に移す工程、および
該ＥＳ細胞を、
（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の存在下で培養する工程を含み、
それによって全てが単一のＥＳ細胞からの子孫であるＥＳ細胞のクローン集団を得る、方法。
【請求項２２】
ＥＳ細胞の分化を非神経外胚葉運命に導く方法であって、
（ａ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクターの存在下で、該ＥＳ細胞を維持する工程；ならびに
（ｂ）該サイトカインを除去しながら、
（ｃ１）Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクターを維持する工程；および／または
（ｃ２）分化を導き得るさらなるシグナル伝達分子を添加する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
ＥＳ細胞の自己再生用の培地であって、
（１）基本培地；
（２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；
（３）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター；および
（４）鉄輸送因子
を含み、ここで該培地が血清もしくは血清抽出物を含まない、培地。
【請求項２４】
胚盤胞から多分化能性細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ｇｐ１３０下流シグナル伝達のアクチベーターの存在下で該胚盤胞を培養し、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から細胞を単離する工程；および
（５）該単離した細胞を、ｇｐ１３０下流シグナル伝達のアクチベーター、およびＩｄ遺伝子発現のアクチベーターもしくはＩｄ遺伝子発現の産物の存在下で、培養する工程
を含む、方法。
【請求項２５】
前記胚盤胞をＬＩＦ中で培養する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記単離した細胞を、ＬＩＦとＢＭＰレセプターのアゴニストとの組み合わせ中で培養する工程を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記胚盤胞を２〜４日間培養する工程を含む、請求項２４から２６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離した細胞を無血清培地中で培養する工程を含む、請求項２４から２７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２９】
前記胚盤胞を無血清培地中で培養する工程を含む、請求項２４から２８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３０】
前記胚盤胞を、ＢＭＰレセプターのアゴニストの不在下で培養する工程を含む、請求項２４から２９のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３１】
プロモーターに作動可能に連結したＩｄ遺伝子を含む、ベクター。
【請求項３２】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
エピソームベクターである、請求項３１または３２に記載のベクター。
【請求項３４】
ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーのレセプターを介して作用する薬剤以外の、Ｉｄタンパク質発現を誘導する薬剤を含む培養培地。
【請求項３５】
Ｉｄタンパク質を含む培養培地。
【請求項３６】
多分化能性細胞の細胞膜を横断する前記Ｉｄタンパク質のトランスロケーションを容易にするようにトランスロケーションドメインに連結した該Ｉｄタンパク質を含む、請求項３５に記載の培養培地。
【請求項３７】
ＴＡＴ、ＶＰ２２、またはペネトラチンに連結したＩｄタンパク質を含む、請求項３５または３６に記載の培養培地。
【請求項３８】
Ｉｄタンパク質およびトランスロケーションドメインを含む、組成物。
【請求項３９】
融合タンパク質を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記トランスロケーションドメインがＴＡＴ、ＶＰ２２、またはペネトラチンを含む、請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項４１】
多分化能性細胞の自己再生の促進における、該多分化能性細胞でＩｄタンパク質活性を増大させる薬剤の使用。
【請求項４２】
前記薬剤が、前記細胞中のＩｄタンパク質の量を増大させる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記薬剤が、請求項３８から４０のいずれかの項に記載の組成物を含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４４】
ｇｐ１３０シグナル伝達ならびにＩｄタンパク質の活性化および／または発現の存在下での多分化能性細胞のインビトロ培養により得られる細胞。
【請求項４５】
分化した細胞を得る方法であって、
（１ａ）細胞においてＩｄ遺伝子を発現させもしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導し、そして
（１ｂ）該細胞においてＧＰ１３０下流シグナル伝達を活性化させる工程；
（２）該細胞を分化させる工程；ならびに
（３）分化した細胞を得る工程
を含む、方法。
【請求項４６】
工程（１）の細胞が、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列が、所望の細胞において該選択マーカーを優先的に発現するプロモーターに作動可能に連結されている構築物を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記選択マーカーを発現する細胞を選択する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４５から４７のいずれかの項に記載の方法により得られる細胞。
【請求項４９】
多分化能性細胞を得る方法であって、
細胞においてＩｄ遺伝子を発現させもしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導するか、またはＩｄタンパク質を含む培地中で細胞を培養する工程、および該細胞においてｇｐ１３０下流シグナル伝達を活性化する工程を含み、ここで該細胞が、胎児または成体の体細胞または組織から得られる、方法。
【請求項５０】
前記多分化能性細胞が、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ４、およびｎａｎｏｇに対して陽性であることにより特徴付けられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４９から５０のいずれかの項に記載の方法により得られる細胞。
【請求項５２】
Ｉｄタンパク質に代わる活性を有する因子のアッセイであって、
（１）Ｉｄタンパク質活性およびｇｐ１３０下流シグナル伝達の存在下で細胞を培養し、それにより該細胞を多分化能状態で維持する工程；
（２）該Ｉｄタンパク質活性を除去するまたは低下させる工程；
（３）該因子を該細胞に導入する工程；および
（４）該細胞が多分化能を保持しているかまたは分化しているかを決定する工程
を含む、アッセイ。
【請求項５３】
（１）においてＩｄタンパク質活性の存在下で前記細胞を培養する工程が、（ａ）Ｉｄ遺伝子を発現させる工程、（ｂ）Ｉｄ遺伝子の発現を誘導する工程、または（ｂ）該細胞が培養される培地にＩｄタンパク質を添加する工程を含む、請求項５２に記載のアッセイ。
【請求項５４】
前記因子を前記細胞に導入する工程が、（ａ）該因子を発現させる工程、または（ｂ）該細胞が培養される培地に該因子を添加する工程を含む、請求項５２または５３に記載のアッセイ。
【請求項５５】
請求項５２から５４のいずれかの項に記載の方法により得られる因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞自己再生を促進するため、および幹細胞の分化を抑制もしくは制御するための、多分化能性幹細胞の培地、培養条件、および培養方法に関する。本発明はさらに、多分化能性幹細胞の均質な調製物の誘導、単離、および維持のための方法を提供する。提供される方法および組成物は、多分化能性幹細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞）、特に、哺乳動物（ヒトを含む）幹細胞の培養および単離に適している。
【背景技術】
【０００２】
血清および白血病阻止因子（ＬＩＦ）を含む培地の存在下でのインビトロでの多分化能性幹細胞培養物の樹立および維持は、周知である（Smithら (1988) Nature 336: 688-90）。この方法は、許容マウスの系統由来の多分化能性胚性幹（ＥＳ）細胞を、多くの継代にわたって維持するために使用されてきた。多分化能性幹細胞培養物の維持および自己再生は、幹細胞がフィーダー細胞またはそれらの抽出物（通常、マウス線維芽細胞）の存在下で培養される場合、さらに支持される。このような条件下で、培養中、多くの継代にわたって多分化能状態でヒトＥＳ細胞を維持することが可能である。
【０００３】
この分野において未だ続いている課題は、懸命な努力にもかかわらず、ＥＳ細胞の多分化能性培養物が長期にわたっては、数種からしか、さらにこれらの種においてさえも全ての胚からは未だに誘導および維持できない場合が残っていることである。いくつかの場合、多分化能性細胞が同定され得るが、これらは次いで、細胞またはそれらの遺伝子操作の研究を可能にするのに十分な時間、培養中で維持できない。このことは、げっ歯類（いくつかの系統のマウス以外の）細胞にとって特に問題である。
【０００４】
近年まで、さらなる課題は、実に多くの継代にわたって培養中で多分化能状態で維持され得たＥＳ細胞が、血清もしくは血清抽出物を含み、このため非限定であるか、または他の細胞（例えば、ヒトＥＳ細胞を維持するために使用される線維芽細胞フィーダー細胞）の存在を必要とする細胞培養条件を用いる培地を用いてのみ、そのように維持され得たことであった。しかし、ＥＳ細胞が、引き続き、所望の細胞型への制御された分化に供せられることが意図される場合、非限定培養培地を用いることまたは異種細胞が存在することは望ましくない。
【０００５】
多分化能性幹細胞の培養に代表的に使用される血清は、ウシ胎児血清であり、これは、サイトカインと他のシグナル伝達分子との複合混合物を含むことが知られる。分化経路を制御するために、培養培地に未知のサイトカインを導入することは望ましくない。なぜなら、分化の最終結果に対するそれらの影響は定量可能でなく、そして潜在的に有害であり得るからである。さらに、各血清バッチは独自であり、そして培養プロトコルに変動を導入する。
【０００６】
結果として、このような複合培地での培養により得られるＥＳ細胞は、およびそれらのいかなる分化子孫も、培地の成分および／またはＥＳ細胞を維持するために必要なフィーダー細胞のような細胞により汚染される危険性を有する。これらの因子は、ＥＳ細胞およびそれらの子孫の治療への応用および他の応用のための適正な製造基準の開発を緩和する。
【０００７】
ＥＳ細胞培養物から分化細胞集団を誘導する場合、ＥＳ細胞を高い割合で同じ型の子孫に転換（すなわち、できるだけ均質な細胞集団を維持）し得ることが望ましい。しかし、実際には、分化後に、不均質な細胞混合物を含む細胞集団が得られることが観察される。したがって、より純粋な子孫集団を得るような様式で、またはそのような因子を用いて、ＥＳ細胞集団の分化を実施し得ることが望ましい。
【０００８】
出願人による先願WO-A-03/095628では、ｇｐ１３０（例えば、ＬＩＦ）シグナル伝達経路およびＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ４）シグナル伝達経路のアゴニストを含む無血清培地中での多分化能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）の培養が、複数継代にわたって幹細胞の自己再生を促進するために使用される。ｇｐ１３０シグナル伝達の存在下で、ＴＧＦ−βスーパーファミリーシグナル伝達経路のアゴニストは、驚くべきことに、分化前シグナルではなく自己再生刺激を提供した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多分化能性幹細胞を培養するための代替（好ましくは、改善）方法およびそれに適した培養培地を提供することである。これらは、多くの継代にわたって未分化状態で該幹細胞の自己再生を支持し得る。本発明のさらなる目的は、細胞の分化が制御された様式で誘導されるまで、インビトロで多分化能性幹細胞培養物を維持させ得る代替の培養システムを提供することである。本発明のなおさらなる目的は、多分化能性幹細胞の誘導および単離を増強し、そしてＥＳ細胞単離が難しい生物からの、または多分化能性幹細胞が未だ単離されていなかった生物からのそれらの誘導および単離を容易にする方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、ｇｐ１３０シグナル伝達の存在下で多分化能性細胞においてＩｄタンパク質を提供することは、分化を抑制し、そして自己再生を促進する。
【００１１】
本発明では、多分化能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）が、（例えば、（ｉ）Ｉｄ遺伝子を発現するＳｍａｄ経路もしくはＩｄ遺伝子の発現の直接的な活性化、または（ii）細胞中にＩｄ遺伝子産物もしくは等価なシグナルの存在による）Ｉｄ遺伝子発現と同時に起こるｇｐ１３０（例えば、ＬＩＦ）シグナル伝達経路のアゴニストを含む無血清培地中で培養される。それにより、複数継代にわたる幹細胞の自己再生が促進される。したがって、ｇｐ１３０シグナル伝達の存在下で、多分化能性細胞におけるＩｄ遺伝子活性は、自己再生刺激を提供する。
【００１２】
したがって、本発明は、培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進におけるＩｄ遺伝子産物の使用を提供する。本発明に従って、Ｉｄ遺伝子産物が目的にかなって細胞中に提供され、かつ／またはＩｄ遺伝子もしくは等価物が目的にかなって活性化される。ｇｐ１３０シグナル伝達（特に、サイトカイン（例えば、ＬＩＦ）を用いる）と一致して、多分化能性細胞の自己再生が得られた。
【００１３】
ＬＩＦを用いる自己再生およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達の活性化を促進することは、本発明者らの先願から公知である。本発明では、Ｉｄ遺伝子活性は、ＬＩＦとの組み合わせで、ＥＳ細胞の自己再生を生じる。したがって、本発明は、その自己再生シグナルを提供するさらなる手段、すなわち、
（ｉ）Ｉｄタンパク質またはＩｄタンパク質活性を増大させる薬剤（ここで該薬剤は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを除く）；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせによる手段、を提供する。
【００１４】
Ｉｄタンパク質という場合、Ｉｄタンパク質と他のタンパク質（例えば、トランスロケーションドメイン）との融合物、および以下に記載のようなＩｄタンパク質を含む組成物を含む。（ｉ）の薬剤は、適切には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介する作用なしに、Ｉｄ遺伝子発現を誘導するかつ／またはＩｄタンパク質活性を誘導する外部因子である。例としては、フィブロネクチン、フィブロネクチンレセプターのアゴニスト、インテグリンシグナル伝達のアクチベーター、ｎａｎｏｇ、およびＩｄ遺伝子発現またはＩｄタンパク質活性を誘導する上記の全てのホモログが挙げられる。本発明の方法は、多分化能性幹細胞（特に、胚性幹細胞）の培養に適している。
【００１５】
以下の実施例で、本発明者らは、自己再生を促進するようにＩｄ遺伝子の発現を誘導した。本発明の別の実施形態では、以下にも記載するように、本発明者らは、例えば、Ｉｄ遺伝子を含むベクターを多分化能性細胞に導入することにより、該多分化能性細胞がＩｄ遺伝子を発現するように、多分化能性細胞を遺伝子操作した。ベクター中の誘導性プロモーターを使用して、精密な制御が達成され得る。このタイプの遺伝子改変は、薬物スクリーニングについて細胞を用いる場合には許容され得るが、細胞または子孫が治療に用いられる場合はそうとはいえず、この場合、自己再生を促進するには外部因子の使用が好ましい。
【００１６】
より詳細に以下に記載する特定の方法では、培養中の多分化能性細胞の自己再生を促進する方法は、（ｉ）Ｉｄ遺伝子を発現もしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導する工程、および（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達を活性化する工程を含む。Ｉｄ遺伝子は、好都合には、エピソームにより発現され得る。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進における、
（ａ）Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄ遺伝子の発現を生じるＩｄタンパク質活性のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせの使用を提供する。
【００１８】
本発明の代替の局面は、培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進における、
（ａ）Ｉｄ遺伝子産物；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせの使用を提供する。
【００１９】
以下により詳細に記載する本発明の特定の実施形態では、Ｉｄ１を構成的に発現するＥＳ細胞が培養される培地中に、ＬＩＦが含まれる。自己再生は増強され、これは、ＬＩＦと発現されたＩｄ遺伝子との相乗作用を示す。
【００２０】
本発明の利点は、自己再生の促進において、Ｉｄ遺伝子産物を細胞中に直接提供することである。自己再生を直接誘導することで自己再生の制御がより大きくなると共に、例えば、自己再生機構の作用因から離れたいくつかの段階での経路の活性化に起因し得る副作用が低減される。
【００２１】
Ｉｄ遺伝子という場合、文献で定義されるような遺伝子（例えば、Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、およびＩｄ４）を含むことが意図され、そしてＩｄ遺伝子産物の特性（すなわち、ｍｙｏＤおよびｍａｓｈ１のようなｂＨＬＨ因子の転写活性を阻害する特性）を示すそれらの模倣物（機能的フラグメントおよび誘導体を含む）を含むことが意図される。特定のマウス、ラット、イヌ、およびヒトＩｄタンパク質配列を、配列番号１〜４に示す。他の特定のＩｄタンパク質配列は、公共の利用可能な配列データベースを介して入手可能である。Ｉｄ遺伝子活性は、ｂＨＬＨ遺伝子の発現もしくは活性を抑制もしくは減少させることにより、またはＥタンパク質の発現もしくは活性を抑制もしくは減少させることにより、適切に模倣され得る。これは、遺伝子ノックアウトもしくは阻害ＲＮＡストラテジーを用いて、または外部誘導因子を排除することにより、達成され得る。ある種のＲＮＡターゲティング法においてアンチセンスＲＮＡが用いられ得るか、またはｓｉＲＮＡに基づくアプローチが用いられ得る。
【００２２】
増大したＩｄタンパク質活性に等価なシグナルが、（ｉ）ｂＨＬＨ遺伝子のインヒビター、（ii）ｍｙｏＤのインヒビター、（iii）ｍａｓｈ１のインヒビター、（iv）増大したｈｅｓ遺伝子活性、（ｖ）増大したｈｅｓタンパク質活性、および（vi）上記全てのうちの１つ以上の組み合わせにより提供され得る。
【００２３】
従来技術では、ＢＭＰのような因子が、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路を活性化するために用いられる。本発明は、それが細胞におけるＩｄ遺伝子活性の直接の提供（例えば、Ｉｄ遺伝子を発現するベクターを介して）に依存するか、またはそれがＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介する以外の、Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の活性化に依存する、すなわち、このような活性化の効果を直接的に模倣する点で、上記とは異なる。本発明は、従来技術よりも目的を明確とし、そしてこれまでよりも自己再生表現型の維持においてより高い精密性を可能にする。
【００２４】
１つ以上のｇｐ１３０下流シグナル経路の活性化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン（例えば、ＬＩＦレセプターのサイトカインもしくは他のアゴニスト）の使用により達成され得る。
【００２５】
ｇｐ１３０を介して作用し得、そしてこのためｇｐ１３０シグナル伝達を活性化し得るサイトカインとしては、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、カルジオトロピン、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−６とｓＩＬ−６レセプター、ならびにハイパーＩｌ−６が挙げられる。適切なサイトカインには、ｇｐ１３０に結合し得る、および／またはｇｐ１３０を介するシグナル伝達を活性化し得る模倣物、融合タンパク質、またはキメラが含まれる。ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインの血清の存在下における役割は、十分に確立されているが、これらのサイトカインが血清の不在下で未分化細胞を維持する能力は制限される。
【００２６】
したがって、本発明は、１つの実施形態で、血清、血清抽出物、フィーダー細胞、およびフィーダー細胞抽出物を含まない培地におけるＥＳ細胞の代替および／または改善された培養を提供する。ＬＩＦと、本発明の特定の実施形態の直接的Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性を活性化する培地とを用いる場合、ＥＳ細胞の長期の継代が可能である。
【００２７】
本発明の培養システムの別の利点は、血清の存在下での培養に比較してＥＳ細胞の分化が低下することである。このことは、しばしば、ほとんどの多分化能性ＥＳ細胞が、血清中で著しく分化する傾向があり、それらの操作および拡張が問題となるから重要である。この結果は、本発明の培養条件により、血清の不在下でＥＳ細胞が自己再生できることを示す。
【００２８】
マウス（Bradleyら (1984) Nature 309: 255-56）、アメリカミンク（Mol Reprod Dev (1992) 12月; 33 (4): 418-31）、ブタおよびヒツジ（J Reprod Fertil Suppl (1991); 43: 255-60）、ハムスター（Dev Biol (1988) 5月;127 (1) : 224-7）、およびウシ（Roux Arch Dev Biol (1992); 201:134-141）を含む多数の哺乳動物供給源由来の胚性幹細胞が、報告されている。本発明の方法および組成物は、他の哺乳動物の多分化能性細胞培養物（霊長類（特に、ヒト）、げっ歯類（特に、マウスおよびラット）を含む）および鳥類ＥＳ細胞の培養への適用に適していることが理解される。
【００２９】
詳細には、ヒトＥＳ細胞に関して、ヒトＥＳ細胞は、ＬＩＦに応答することが公知であり、したがって本発明の培地および方法では、自己再生刺激がＬＩＦおよびＩｄタンパク質の組み合わせに応じて得られ、これらは、ヒトＥＳ細胞に対して適用される。
【００３０】
本発明の方法に適した細胞密度は、用いられている多分化能性幹細胞および所望の子孫の性質に従って変動する。単層培養で胚性幹細胞を培養し、該胚性幹細胞を解離し、そして続いて0.2〜2.5×104細胞／cm2の密度、より特定すると、0.5〜1.5×104細胞／cm2の密度で培養表面上の単層培養で胚性幹細胞を培養することにより、良好な結果が得られている。細胞は、接着単層として増殖し、そしてＬＩＦと共に血清含有培地中で増殖したＥＳ細胞に匹敵する倍加時間を有することが観察されている。
【００３１】
本発明によるＥＳ細胞およびそれらの子孫の培養のための代表的な表面は、細胞培養に有用であるとしてこの分野で認識されている培養表面であり、そしてこれらには、プラスチック製表面、金属製表面、複合材製表面が含まれるが、通常は、広く市販されているプラスチック製組織培養プレートのような表面が用いられる。このようなプレートは、しばしば、直径数センチメートルである。スケールアップのために、このタイプのプレートは、ずっとより大きい直径で用いられ得、そして多くの繰り返しプレート単位が用いられ得る。
【００３２】
さらに通常には、培養表面は、細胞接着タンパク質を含み、これは、通常、表面上にコーティングされる。細胞上のレセプターもしくは他の分子が、該タンパク質または他の細胞培養基材に結合し、そしてこれは、表面への接着を促進し、そしてそのことが増殖を促進することが示唆される。ゼラチンでコーティングしたプレートが一般に利用可能であり、そして本発明に適しており、そして他のタンパク質もまた用いられ得る。
【００３３】
本発明の実施形態では、培養期間の少なくとも一部の期間に、分化を抑制する薬剤（例えば、ＦＧＦレセプターもしくはＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達のインヒビター）を培養培地中に含むことが、ＥＳ細胞が分化する傾向を抑制することが見出される。１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、特定の期間、ＬＩＦとＦＧＦレセプターインヒビターとを含む所定の無血清培地中で培養され、次いで、ＦＧＦレセプターインヒビターが除去され、そしてＳｍａｄシグナル伝達の直接アクチベーターと置き換えられる。ＦＧＦレセプターインヒビターは、特に、ヒト細胞以外の細胞に用いられ、そして例としては、化合物ＳＵ５４０２およびＰＤ１７３０７４が挙げられる。あるいは、ＦＧＦレセプターの競合インヒビターが用いられ得、適切には、レセプターの可溶性形態である。適切なＭＥＫ／Ｅｒｋインヒビターとしては、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、およびＰＤ１８４３５２が挙げられる。
【００３４】
別の実施形態では、必要に応じて、ＦＧＦレセプターもしくはＭＥＫ／Ｅｒｋインヒビターを除去しない。したがって、これらのインヒビターは、Ｉｄタンパク質のインデューサーの存在下または不在下のいずれでも、長期にわたって培養培地中に存在する。これにより、ＥＳ細胞は、ＬＩＦおよびＦＧＦインヒビターの存在下、Ｎ２Ｂ２７培地中で、少なくとも20継代にわたって培養中で増殖され得る。インヒビターが培地から除去されない場合、該インヒビターは特異的なインヒビターであり、そして他のレセプターに対してほとんどまたは全く活性を有しないことが好ましい。
【００３５】
本発明の第二の局面は、ＥＳ細胞自己再生を促進するようにＥＳ細胞を培養する方法を提供し、この方法は、
（１）（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するもの以外の、Ｉｄ遺伝子の発現を生じる細胞内シグナル伝達経路のアクチベーター、または（ｂ）Ｉｄ遺伝子産物；および
（２）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地中で、該ＥＳ細胞を維持する工程を含む。
【００３６】
本発明の方法は、血清を含まず、かつ血清抽出物も含まない培地中で、以前に血清もしくは血清抽出物の存在下で継代されているＥＳ細胞の自己再生を刺激するために使用され得る。好ましくは、このような方法は、フィーダー細胞および／もしくはフィーダー細胞抽出物の不在下でも実施される。例えば、以下の工程を含むＥＳ細胞の培養が実施され得る：
−ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよび血清もしくは血清抽出物の存在下で、必要に応じてフィーダー上で、培養中、多分化能状態で該ＥＳ細胞を維持する工程；
−少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代させる工程；
−該血清もしくは該血清抽出物を該培地から除去し、（存在する場合には）該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清、および血清抽出物を含まないようにする工程；および
−引き続き、（ＴＧＦ−βレセプターを介して作用するもの以外の）Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；およびｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で、多分化能状態で該ＥＳ細胞を維持する工程。
【００３７】
血清もしくは血清抽出物が培地から除去される時点のあたりで、必要に応じて、分化を抑制する薬剤（例えば、ＦＧＦレセプターインヒビター）を培地に添加する。Ｉｄタンパク質の存在下で細胞を維持するのと同時に、またはその後に、必要に応じて、分化のインヒビターが除去される。血清もしくは抽出物は、フィーダー細胞もしくは抽出物の除去と同時、またはその前に、またはその後に、除去され得る。
【００３８】
本発明はまた、ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法を提供し、この方法は、
−ＥＳ細胞を、選択マーカーをコードする構築物でトランスフェクトする工程；
−該ＥＳ細胞を播種する工程；
−Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；およびｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で、該ＥＳ細胞を培養する工程；および
−該選択マーカーを発現する細胞について選択する工程；
を含む。
【００３９】
選択マーカーは、抗生物質耐性、細胞表面マーカー、もしくは例えば、EP-A-0695351に記載されるような別の選択マーカーをコードし得、そして好ましくは、所望の細胞で選択マーカーを優先的に発現するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
さらなる実施形態では、本発明は、ＥＳ細胞を培養する方法を提供し、この方法は、個々のＥＳ細胞を培養容器（例えば、プレート上の個々のウェル）に移す工程、ならびに該ＥＳ細胞を、Ｓｍａｄシグナル伝達経路の直接アクチベーターもしくはエフェクターおよびｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で培養する工程を含み、それによって全てが単一のＥＳ細胞からの子孫であるＥＳ細胞のクローン集団を得る。
【００４１】
ＥＳ細胞の安定した均一な培養が得られると、培養条件は、外胚葉、中胚葉、または内胚葉の細胞運命から選択される１つ以上の細胞型への細胞の分化を導くように変更され得る。サイトカインおよびシグナル伝達因子の添加または除去が、高効率での特定の分化細胞集団の誘導を可能とし得る。非神経外胚葉運命へのＥＳ細胞の分化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよびＳｍａｄシグナル伝達経路の直接アクチベーターもしくはエフェクターの存在下でＥＳ細胞を維持し、次いでサイトカインを除去しながら、Ｓｍａｄシグナル伝達経路の直接アクチベーターもしくはエフェクターを維持すること、および／または分化を導き得るさらなるシグナル伝達分子を添加することにより、達成され得る。上記の方法は全て、必要に応じて、プロセスの産物である分化細胞を得る工程および／または単離する工程を含む。
【００４２】
例えば、ＬＩＦの不在下でのＢＭＰ４への曝露は、中胚葉細胞型および内胚葉細胞型の誘導に至る。ｇｐ１３０シグナル伝達経路のアゴニストおよびＴＧＦ−βシグナル伝達経路のアゴニストを除去し、かつ／または両経路を遮断することにより、神経外胚葉表現型の誘導に至る。あるいは、他のシグナル伝達因子が培養条件に添加されて、他の分化経路に導き得る（例えば、アクチビン、ソニックヘッジホッグ（shh）、Wnt、およびＦＧＦ）。
【００４３】
使用の際、ＥＳ細胞培養の終わりに向けて、シグナルが弱まり、そしてその後の分化の間にシグナルの遺物がなくなることを確実にするために、分化を開始する少なくとも１継代前に、Ｓｍａｄシグナルを除去することが望ましい。１つの実施形態では、Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクターを除去しながら、ＦＧＦレセプターアンタゴニストが、１〜２継代にわたって培養物に添加される。
【００４４】
本発明のさらなる局面は、ＥＳ細胞の自己再生用の細胞培養培地を提供する。１つのこのような培地は、
−基本培地；
−Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；
−ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター；および
−鉄輸送因子
を含み、ここで該培地は、必要に応じて、血清および血清抽出物を含まない。
【００４５】
ヒト多分化能性幹細胞に好ましい培地は、Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター；およびＦＧＦレセプターのアゴニストを含む。ヒト幹細胞以外の多分化能性幹細胞に好ましい培地は、Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター；およびＥＳ細胞分化のインヒビターを含む。
【００４６】
基本培地は、ＥＳ細胞に炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルの必須供給源を供給する培地である。一般的に、基本培地は、タンパク質を含まず、それ自体はＥＳ細胞の自己再生を支持できない。鉄輸送因子は、鉄の供給源を提供するか、または培養培地から鉄を取り込む能力を提供する。適切な鉄輸送因子としては、トランスフェリンおよびアポトランスフェリンが挙げられる。
【００４７】
培地は、インスリンもしくはインスリン様増殖因子およびアルブミン（好ましくは組換え体）の１つ以上をさらに含み、そしてフィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物を含まないことが好ましい。
【００４８】
本発明の特定の培地は、追加的な基本培地と共にまたは追加的な基本培地なしで、ＬＩＦ、ＢＭＰ、インスリン、アルブミン、およびトランスフェリンを含む。
【００４９】
本発明はまた、細胞培養培地を提供し、この培地は、
−Ｉｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
−ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン
を含む。
【００５０】
培養培地は、必要に応じて、上記のようなＥＳ細胞の分化のインヒビター、または分化を所望する場合、特定の表現型へのＥＳ細胞の分化を導くシグナル伝達因子が補充される。
【００５１】
培地は、血清もしくは血清抽出物を含まないことが好ましい。最も好ましくは、培地は、完全に限定されている。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、培養培地は、10U/mlと1000U/mlとの間の濃度で、より好ましくは、50U/mlと500U/mlとの間の濃度で、なおより好ましくは、ほぼ100U/mlで、ｇｐ１３０レセプター結合サイトカインであるＬＩＦを含む。
【００５３】
特定のヒト多分化能性幹細胞培地は、（ａ）ＬＩＦ、（ｂ）ＢＭＰ、および（ｃ）ＦＧＦを含む。非ヒト多分化能性幹細胞のための特定の培地は、（ａ）ＬＩＦ、（ｂ）ＢＭＰ、および（ｃ）ＦＧＦのインヒビターを含む。培地成分の置換は、本明細書中に記載するように行われ得る。
【００５４】
本発明はさらに、胚盤胞から多分化能性細胞を誘導する方法を提供し、この方法は、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ｇｐ１３０下流シグナル伝達のアクチベーターの存在下で該胚盤胞を培養し、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１つまたは複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１つまたは複数の細胞を、ｇｐ１３０下流シグナル伝達のアクチベーター、およびＩｄ遺伝子発現のアクチベーターもしくはＩｄ遺伝子発現の産物の存在下で、培養する工程
を含む。
【００５５】
好ましくは、この方法は、ＬＩＦ中で、より好ましくは２〜４日間、胚盤胞を培養する工程を含む。
【００５６】
単離した１つまたは複数の細胞は、好ましくは、無血清培地中で培養される。代表的には、これらの細胞は、クランプとして再播種される。以下の実施例で、本発明者らは、ＬＩＦとＢＭＰレセプターのアゴニストとの組み合わせを用いて、良好な結果を得ている。
【００５７】
胚盤胞もまた、好ましくは無血清培地中で、必要に応じてＢＭＰレセプターのアゴニストの不在下で、培養される。
【００５８】
なおさらなることに、本発明では、プロモーターに作動可能に連結したＩｄ遺伝子を含む、ベクターが提供される。
【００５９】
プロモーターは、適切には、誘導性プロモーターであり、外部因子を用いて発現が制御される。これは、例えば、以下の実施例に記載のようなエピソームベクターであり得る。
【００６０】
本発明のさらなる培養培地は、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーのレセプターを介して作用する薬剤以外の、Ｉｄタンパク質発現を誘導する薬剤を含むものである。例としては、フィブロネクチン、フィブロネクチンレセプターのアゴニスト、インテグリンシグナル伝達のアクチベーター、ｎａｎｏｇ、およびＩｄ遺伝子発現またはＩｄタンパク質活性を誘導する上記の全てのホモログが挙げられる。
【００６１】
培地は、Ｉｄタンパク質（例えば、多分化能性細胞の細胞膜を横断するＩｄタンパク質のトランスロケーションを容易にするために、トランスロケーションドメインに連結されたＩｄタンパク質）を含み得る。
【００６２】
「トランスロケーションドメイン」とは、膜もしくは脂質二層を横断するそれ自体および／または他のタンパク質および物質の輸送を引き起こす、タンパク質のドメインもしくはフラグメントを意味し、そして天然のドメイン、ならびにこの結合機能を保持するフラグメント、改変体、および誘導体を包含する。後者の膜は、レセプター媒介エンドサイトーシスのプロセスの間にトランスロケーションが生じるエンドソームの膜であり得る。トランスロケーションドメインは、しばしば、低ｐＨで脂質膜中に測定可能な程度の孔を形成し得る特性によって、同定され得る（Shoneら (1987） Eur J. Biochem. 167,175-180は適切な試験を記載する）。したがって、トランスロケーションドメインの後者の特性は、本発明の構築物内でトランスロケーションドメインとして機能し得る他のタンパク質ドメインを同定するために用いられ得る。細菌神経毒素に由来するトランスロケーションドメインの例は、以下の通りである：
ボツリヌス菌Ａ型神経毒素−アミノ酸残基（449〜871）
ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素−アミノ酸残基（441〜858）
ボツリヌス菌Ｃ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜866）
ボツリヌス菌Ｄ型神経毒素−アミノ酸残基（446〜862）
ボツリヌス菌Ｅ型神経毒素−アミノ酸残基（423〜845）
ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素−アミノ酸残基（440〜864）
ボツリヌス菌Ｇ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜863）
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基（458〜879）。
【００６３】
他の適切なトランスロケーションドメインは、ＴＡＴ（例えば、ＨＩＶ−１由来）およびペネトラチンであり、共有結合ペプチドをインターナライズし、そして核にそれらを運搬するかもしくは運搬されることを可能にする、アミノ酸からなる短い配列である。タンパク質導入ドメインと呼ばれるさらなる適切なドメイン（例えば、ＶＰ２２、アンテナペディアおよび他の誘導体）は、Wadiaら, 2002に記載されている。これらのドメインが化学的に（例えば、チオール官能基を介して）Ｉｄタンパク質に連結され得るか、またはＩｄタンパク質および該ドメインを含む融合物が発現され得る。特定のドメインを配列番号５〜６に示し、そしてＩｄタンパク質およびタンパク質導入ドメインを含む特定の融合タンパク質を配列番号７〜９に示す。連結した分子、融合物、および組成物は、本発明の別の局面からのものと同じものを含む。これらは、Ｉｄ遺伝子で細胞をトランスフェクトする代替として、例えば、培養培地への添加剤として、使用され得る。
【００６４】
トランスロケーションドメインに関して「トランスロケーション」とは、細胞表面への結合後に生じるインターナライゼーション事象を意味する。これらの事象は、細胞のサイトゾルへの物質の輸送に至る。
【００６５】
したがって、ＥＳ細胞への因子の送達のための組成物は、
該因子、および
ＥＳ細胞に該因子をトランスロケートするトランスロケーションドメイン（適切には、クロストリジウム菌毒素のＨＮドメイン）
を含む。
【００６６】
トランスロケーションドメインはまた、（１）ジフテリア菌毒素のＨＮドメイン、（２）ジフテリア菌毒素のＨＮドメインのトランスロケート活性を実質的に保持する（１）のフラグメントもしくは誘導体、（３）融合性ペプチド、（４）膜破壊ペプチド、および（５）（３）および（４）のトランスロケートフラグメントおよび誘導体から選択され得る。
【００６７】
なおさらなることに、本発明において、多分化能性細胞の自己再生の促進における、該多分化能性細胞でＩｄタンパク質活性を増大させる薬剤の使用が提供される。
【００６８】
この薬剤は、適切には、本明細書の他の箇所に記載されるとおりであり、そして、細胞中のＩｄタンパク質の量を増加させるか、または細胞中のＩｄタンパク質の活性を増強するものであり得る。
【００６９】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路の活性化が、ＴＧＦ−βレセプターの上流アゴニスト（例えば、レセプターリガンド）、構成的に活性なレセプター、またはシグナル伝達経路の活性化した下流成分（例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達分子）のいずれによってももたらされ得ることが当業者により理解される。同様に、ｇｐ１３０シグナル伝達経路の上流エフェクター（例えば、サイトカイン）および下流エフェクター（例えば、Ｓｔａｔ）も、この経路を活性化し得る。したがって、ＴＧＦ−βレセプターの下流のシグナル伝達の活性化に関する本発明の実施形態（例えば、ＥＳ細胞誘導の方法）は、多分化能性幹細胞の自己再生を促進するために、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーシグナル伝達経路を活性化し得る（好ましくは、ＢＭＰレセプターを介して作用する）分子を含む全ての組成物を包含する。ＢＭＰレセプターに対して適切なリガンドとしては、ＢＭＰおよびＧＤＦが挙げられる。
【００７０】
本発明によれば、細胞の培養は、接着培養で実施されることがさらに好ましく、そして本発明の実施例において、多分化能状態で細胞を維持した後、高度の均一性で、そして高い細胞生存度で、分化が誘導され得ることが見出されている。接着培養は、細胞接着タンパク質を含有させることにより促進され得、そして本発明の特定の実施例においては、ゼラチンが、培養基材用のコーティングとして用いられている。
【００７１】
本発明によれば、多分化能性細胞を単層培養で培養することもまた好ましいが、必要に応じて、細胞は、懸濁培養でまたはプレ細胞凝集体として増殖され得る。細胞はまた、ビーズ上、またはメンブレンもしくは他の三次元構造体のような他の適切な足場上でも増殖され得る。
【００７２】
本発明による多分化能性細胞の培養のための培地のさらなる成分であって、存在することが好ましい成分は、細胞の生存および／または代謝を促進する因子である。本発明の特定の実施形態では、インスリンの存在下で、細胞が培養される。代替因子は、インスリン様増殖因子であり、そして他のこのような生存および／または代謝促進因子が代替的に用いられ得る。
【００７３】
本発明の実施例で使用される培養培地はまた、好ましくは、血清アルブミンを含む。これは、精製形態または組換え形態で用いられ得、そして組換え形態である場合、これは、夾雑の可能性のある因子、サイトカインなどを含まないという利点を有する。培養培地は、血清アルブミンを含む必要はない。この成分は、省かれ得、または、Wilesらにより記載されるように、別のバルクタンパク質もしくは合成ポリマー（ポリビニルアルコール）に置き換えられ得る。
【００７４】
本発明の特に好ましい培地は、完全に規定されている培地である。この培地は、非限定である成分（いわゆる、含有量が不明な成分、または特定されていない非限定または変動のある因子を含み得る成分）を含まない。完全限定培地を用いる利点は、多分化能性細胞の培養およびそれに続く操作のために、効率的かつ一貫したプロトコルが導かれ得ることである。さらに、多分化能状態での細胞の維持が、より高い効率およびより大きな予測可能性で達成可能であり、そして限定培地を用いて培養した細胞で分化が誘導される場合、分化シグナルに対する応答は、非限定培地を用いた場合よりも均一であることが見出されている。
【００７５】
本発明の培地は、任意の成体組織に由来する多分化能性幹細胞の培養に用いられ得る。
【００７６】
本発明の方法はまた、分化した細胞を得る方法も包含する。この方法は、記載のように多分化能性細胞を培養する工程、および該細胞に分化を可能にするかもしくは分化を生じさせる工程を含む。ここで細胞は、他の細胞型（多分化能性幹細胞を含む）と比較して所望の分化細胞において分別発現が可能な選択マーカーを含む。これにより、選択マーカーの分別発現が、所望の分化細胞の優先的な単離および／または生存および／または分割を生じる。
【００７７】
分化細胞は、組織幹細胞または前駆細胞であり得、そして終末分化細胞であり得る。
【００７８】
本発明はまた、多分化能性幹細胞またはＥＧもしくはＥＣ細胞を単離する方法も提供し、この方法は、胚由来の細胞もしくは組織、または胎児もしくは成体由来の体細胞を、
−ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン；および
−Ｉｄタンパク質、またはＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および／または
−ＦＧＦレセプターのインヒビターまたはＭＥＫ／Ｅｒｋのインヒビター
を含む培地中で培養する工程を含む。
【００７９】
好ましくは、培地は、完全に限定された培地である。
【００８０】
また概して、本発明は、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従うことにより得られる細胞にまで拡張される。本発明の細胞は、薬物発見のためのアッセイにおいて用いられ得る。本発明の細胞はまた、細胞治療のために使用され得、したがって本発明の方法は、本発明のｇｐ１３０シグナル伝達とＩｄタンパク質活性および／または発現との組み合わせを用いて、多分化能性細胞を誘導および／維持する工程、それから細胞治療用に細胞を誘導する工程、および細胞治療にそれらの細胞を用いる工程を含む。
【００８１】
本発明によって、細胞を再プログラミングする方法が提供され、これは、非多分化能性細胞から多分化能性細胞を生じる。したがって、多分化能性細胞を得る方法は、細胞においてＩｄ遺伝子を発現させもしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導する工程か、またはＩｄタンパク質を含む培地中で細胞を培養する工程、および該細胞においてｇｐ１３０下流シグナル伝達を活性化する工程を含み、ここで該細胞は、胎児または成体の体細胞または組織から得られる。得られる多分化能性細胞は、好ましくは、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ４、およびｎａｎｏｇに対して陽性であることにより特徴付けられる。
【００８２】
本発明によって、Ｉｄタンパク質に代わる活性を有する因子についてのアッセイが提供され、このアッセイは、
（１）Ｉｄタンパク質活性およびｇｐ１３０下流シグナル伝達の存在下で細胞を培養し、それにより該細胞を多分化能状態で維持する工程；
（２）該Ｉｄタンパク質活性を除去するまたは低下させる工程；
（３）該因子を該細胞に導入する工程；および
（４）該細胞が多分化能を保持しているかまたは分化しているかを決定する工程
を含む。
【００８３】
（１）におけるＩｄタンパク質活性の存在下で細胞を培養する工程は、適切には、（ａ）Ｉｄ遺伝子を発現させる工程、（ｂ）Ｉｄ遺伝子の発現を誘導する工程、または（ｂ）該細胞が培養される培地にＩｄタンパク質を添加する工程を含み、そして因子を細胞に導入する工程は、適切には、（ａ）該因子を発現させる工程、または（ｂ）該細胞が培養される培地に該因子を添加する工程を含む。本発明のさらなる局面は、それにより得られる因子にまで拡張される。
【００８４】
Ｉｄ遺伝子は、未分化ＥＳ細胞におけるＢＭＰ／Ｓｍａｄシグナル伝達の卓越した標的である。Ｉｄは、ｂＨＬＨ因子（例えば、ｍｙｏＤおよびｍａｓｈ１）の転写活性を妨害するようにＥタンパク質を隔離するネガティブヘリックスループヘリックス型因子であり（Jenら, 1992；Lydenら, 1999）、そして造血のネガティブレギュレーターの候補である（Nogueiraら, 200）。それらはまた、ＰａｘおよびＥｔｓ転写因子と相互作用し得、そしてこれらを阻害し得る（Norton, 2000）。本発明の特定の実施形態では、ＩｄでトランスフェクトしたＥＳ細胞は、ＬＩＦ単独の添加の際に無血清培養で自己再生し、ＢＭＰ／Ｓｍａｄの重要な寄与がＩｄ発現を誘導することであることを確立する。
【００８５】
ＬＩＦを除去した際に、Ｉｄ発現ＥＳ細胞は容易に分化するが、神経前駆体を生じない。このように、Ｉｄタンパク質は系統特異的に作用し、中胚葉または原内胚葉への方向付けに対してほとんどまたは全く影響を与えることなく神経決定を抑制する。したがって、Ｉｄは、ＳＴＡＴ３による他の系統の遮断を補完することにより、自己再生に寄与する（図７）。Ｉｄ機能の少なくとも一部は、成熟前発現プロ神経因子の作用をブロックすることであり得る。このように、Ｉｄは、系統プライミングの機能結果から幹細胞を隔離するように作用し得る（Huら, 1997）。
【００８６】
したがって、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３およびＢＭＰ／Ｓｍａｄは、組み合わせで作用して、ＥＳ細胞の自己再生を持続する。また、これらの２つの経路は、アフリカツメガエル（Xenopus）胚の腹側化を媒介する（Nishinakamuraら, 1999）。その場合、各々、他方の活性とは十分に独立しているようであり、ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１との間に交差調節の証拠はない。
【００８７】
ホメオドメインタンパク質Ｎａｎｏｇは、血清含有培地においてＳＴＡＴ３の活性化の要求を迂回し得る（Chambersら, 2003）。また、Ｎａｎｏｇは、少なくとも一部にはＩｄの構成性発現を与えることにより、ＢＭＰ／血清刺激の要求に取って代わるように用いられ得る。
【００８８】
以下に、本発明の説明のための例を、添付の図面と共に示す。
【００８９】
より詳細に、かつ以下に示す実施例に言及して、各図を説明する。図１は、ＬＩＦ＋ＢＭＰが無血清培地中でＥＳ細胞自己再生を持続することを示す：
Ａ．示した因子を添加したＮ２Ｂ２７中で培養したＯｃｔ４−ＧｉＰ細胞の位相差画像および蛍光画像。ＴｕＪ１免疫染色はニューロン分化を検出し、緑色蛍光は未分化ＥＳ細胞におけるＯｃｔ４プロモーターの活性を反映する。バー：50μm。
Ｂ．ＦＣＳ＋ＬＩＦを添加した従来の培地またはＬＩＦ（10ng/ml）＋ＢＭＰ４（10/ng/ml）を添加したＮ２Ｂ２７中で継代を進行させた間のＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性未分化ＥＳ細胞の累積数のプロット。細胞解離緩衝液を用いて４８時間ごとに培養物を継代し、10cm2ウェル当たり4×10５細胞で再播種した。ＧＦＰ陽性細胞の数を各継代でＦＡＣＳ分析により決定した。
Ｃ．Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｔ（短尾奇形）、およびＳｏｘ１のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析：（１）ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７中で６継代間のＥＳ細胞、（２）ＬＩＦを含む血清で培養したＥＳ細胞、（３）８日目の胚様体、（４）レチノイン酸処理した８日目の胚様体。
【００９０】
図２は、ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７中でのＥＳ細胞のクローン形成性、潜在能、および誘導を示す：
Ａ．Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞のエレクトロポレーションおよびピューロマイシンでの選択により単離したＣＡＧ−ｔａｕｇｆｐトランスフェクタントコロニー。
Ｂ．単一ＣＡＧ−ｔａｕｇｆｐトランスフェクタントＥＳ細胞および誘導コロニー。
Ｃ．ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７における６継代後のＴＰ６．３  ＥＳ細胞から生成された妊娠中期胎児キメラ。ＧＦＰ蛍光は、ＥＳ細胞子孫を示す。
Ｄ．C57Bl/6交配によるＣＡＧ−ｔａｕｇｆｐトランスフェクトＥＳ細胞からの雄性キメラおよび子孫。アグーチ（agouti）の毛色は、子孫のＥＳ細胞起源を示す。
Ｅ．ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７中で誘導された第一の継代のＳＦ１  ＥＳ細胞のコロニー。キメラはＳＦ１  ＥＳ細胞から生じた。
バー：50μm。
【００９１】
図３は、ＥＳ細胞におけるＢＭＰシグナル伝達を示す：
Ａ．Ｏｃｔ−ＧｉＰ細胞由来のＲＮＡサンプルの逆転写ＰＣＲ分析：（１）ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７中で、６継代目、（２）血清＋ＬＩＦ中、逆転写酵素なしのコントロール、（３）血清＋ＬＩＦ中、（４）ＬＩＦまたはＢＭＰを添加しないＮ２Ｂ２７中で播種後１日目、（５）ＬＩＦまたはＢＭＰを添加せず５日目。
Ｂ．Ｎ２Ｂ２７中で終夜培養後、偽処理（ｎｏｎ）またはＬＩＦ、ＢＭＰ、もしくはＬＩＦ＋ＢＭＰによる15分間もしくは１時間の刺激に対するＳｍａｄ１、ｅｒｋ、およびｐ３８応答を示す免疫ブロット。
Ｃ．ＬＩＦ、ＢＭＰ、およびＬＩＦ＋ＢＭＰに対するＳＴＡＴ３チロシンリン酸化応答を示す免疫ブロット。
Ｄ．Ｓｍａｄ７エピソームトランスフェクタントは、血清およびＬＩＦの存在下で分化し、そして神経前駆体マーカー（Ｓｏｘ１−ＧＦＰ）およびニューロンマーカー（ＴｕＪ）を発現する。
Ｅ．ＳＢ２０３５８０（30μM）ｐ３８インヒビターは、ＬＩＦ＋ＢＭＰ中で自己再生を抑制せず、またはＬＩＦ単独中で神経分化を抑制しない。Ｏｃｔ４−ＧＦＰは未分化ＥＳ細胞を示し、そしてＴｕＪ１免疫染色はニューロンを同定する。
Ｆ．ＥＳ細胞における活性Ｓｍａｄ１およびＳＴＡＴ３の同時免疫沈降。左のパネル：ＦＬＡＧはＦＬＡＧタグ化Ｓｍａｄ１によるトランスフェクション後に免疫沈降する。右のパネル：ＳＴＡＴ３は非操作ＥＳ細胞から免疫沈降する。細胞を、示したように１時間刺激した。
バー：50μm。
【００９２】
図４は、ＥＳ細胞におけるＩｄ類の発現および機能を示す：
Ａ．ＬＩＦ、ＢＭＰ、またはＬＩＦ＋ＢＭＰに応答した遺伝子誘導のLightCycler逆転写ＰＣＲ分析。ＥＳ細胞をＮ２Ｂ２７単独中で終夜培養し、次いで45分間刺激した。
Ｂ．Ｏｃｔ４−ＧｉＰ細胞におけるＩｄのｍＲＮＡ発現のノーザンハイブリダイゼーション。Con：血清含有培地＋ＬＩＦ中で維持した定常状態ＥＳ細胞。レーン２〜11、因子を含まないＮ２Ｂ２７中で終夜培養し、次いで示したように45分間刺激した細胞。Ｆｎ、フィブロネクチン。
Ｃ．ベクター単独でトランスフェクトし、そしてＬＩＦを添加した血清含有培地中で培養した４６Ｃ  ＥＳ細胞におけるＩｄ１タンパク質の定常状態レベル、ならびにＩｄ１およびｆＩｄ１安定組み込みクローンにおける、および４６Ｃ／Ｔ細胞のエピソームスーパートランスフェクション後の過剰発現。後者のブロットは、10秒間しか曝露しなかった。トランスフェクトしたＩｄ１は、ＦＬＡＧタグ化されており、その結果、内因性のＩｄ１と比較して移動が遅延した。
Ｄ．Ｎ２Ｂ２７＋ＬＩＦ中で培養したId1安定組み込みＥＳ細胞コロニーにおけるＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４のｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション。Ｉｄ２トランスフェクタントおよびＩｄ３トランスフェクタントで等しい結果が得られた。バー：50μm。
【００９３】
図５は、Ｉｄが神経分化を抑制し、そしてＥＳ細胞自己再生に必要であることを示す：
Ａ．因子を含まないＮ２Ｂ２７中の分化６日後のベクターおよびＩｄ３安定組み込み４６Ｃクローンの位相差画像およびＧＦＰ蛍光画像。Ｉｄ１トランスフェクタントおよびＩｄ２トランスフェクタントは、神経分化の同様の抑制を示した。
Ｂ．上のパネル：ｆＩｄ１トランスフェクタント４６Ｃ細胞は、ＬＩＦ単独を添加したＮ２Ｂ２７中で自己再生コロニーを形成する。中のパネル：Ｃｒｅ切り出し後、ｆＩｄ１Ｃ細胞は、ＬＩＦ中で分化し、そしてＥＳコロニー形成のためにＬＩＦ＋ＢＭＰを必要とする。下のパネル：ｆｌｏｘ化したＩｄ１−ＳＴＯＰカセットの切り出し後に構成性ＣＡＧ単位により駆動されたｆＩｄ１ＣコロニーにおけるＧＦＰ発現。
Ｃ．ｆＩｄ１細胞は、Ｎ２Ｂ２７においてＬＩＦの除去の際に非神経分化を受け、そしてＳｏｘ１−ＧＦＰを活性化せず、ＴｕＪを発現しない。Ｃｒｅ切り出し後、ｆＩｄ１Ｃ細胞は、ＴｕＪ陽性神経細胞の回復した分化を示す。（Ｓｏｘ１−ＧＦＰは、ＧＦＰの構成性活性化のために、ｆＩｄＣ細胞において特異的に検出され得ない）
Ｄ．ＥＳ細胞におけるおよび神経分化の間のｍａｓｈ１およびｎｇｎ２発現の逆転写ＰＣＲ分析。サンプルは図３Ａに示すとおり。
Ｅ．Ｅ４７の過剰発現はＥＳ細胞自己再生をブロックするが、これは、Ｉｄ１の増加により救済され得る。４６Ｃ／Ｔ  ＥＳ細胞をＥ４７でスーパートランスフェクトするか、またはＥ４７エピソーム発現ベクター＋Ｉｄ１エピソーム発現ベクターで同時スーパートランスフェクトし、そしてＬＩＦを添加した血清含有培地中で、ピューロマイシンおよびゼオシンの二重選択下で６日間培養した。
Ｆ．Ｅ４７の増加は、神経分化のＩｄ１抑制を克服する。４６Ｃ／Ｔ  ＥＳ細胞を、Ｅに示すようにスーパートランスフェクトし、次いでトランスフェクションの２４時間後に、Ｎ２Ｂ２７（因子添加なし）に移し、そして二重選択下で６日間培養した。
バー：50μm。
【００９４】
図６は、ＮａｎｏｇがＢＭＰ／血清要求性を迂回してＩｄを誘導することを示す：
Ａ．ＥＦ４Ｃ細胞を、Ｎ２Ｂ２７中で、またはＮ２Ｂ２７＋ＢＭＰ中で６日間培養した。ＥＦ４  Ｎａｎｏｇトランスフェクタントを、６継代の間、示した条件下で培養し、次いで写真撮影した。バー：50μm。
ＢおよびＣ．血清＋ＬＩＦ（Con）中で、または因子を含まないＮ２Ｂ２７中で終夜における、Ｅ１４Ｔｇ２ａ親ＥＳ細胞およびＥＦ４  ＮａｎｏｇトランスフェクタントのＩｄ１およびＩｄ３のｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション、ならびにｍＲＮＡレベル。
【００９５】
図７は、ＢＭＰ／ＩｄおよびＬＩＦ／ＳＴＡＴ３による協同的な系統制限を模式的に示す：
ＥＳ細胞自己再生は、系統方向付けの抑制を必要とする。ＢＭＰもしくは他のシグナルにより誘導されたＩｄ遺伝子は、神経系統への進入を遮断する。このような神経系統への進入は、それ以外には、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３によって部分的にのみ妨害される。並行して、ＢＭＰが中胚葉および内胚葉の分化を誘導する能力は、ＳＴＡＴ３によって拘束される。これは、おそらく直接的ならびに間接的な機構が関与する。したがって、ＬＩＦの除去により、自己再生の支持から系統方向付けの促進へとＢＭＰ作用が切り替わる。
【００９６】
本発明の配列表において、以下の配列番号は、以下に対応する：
１  マウスＩｄ３のアミノ酸配列
２  ラットＩｄ３のアミノ酸配列
３  イヌＩｄ３のアミノ酸配列
４  ヒトＩｄ３のアミノ酸配列
５  Ｔａｔ由来のタンパク質形質導入ドメイン
６  アンテナペディア由来のタンパク質形質導入ドメイン
７  Ｔａｔ−ヒトＩｄ３融合物
８  アンテナペディア−ヒトＩｄ３融合物
９  マウスＩｄ３−アンテナペディア融合物。
【実施例】
【００９７】
ウシ胎児血清は、最小培地における未分化ＥＳ細胞の生存のために重要である（WilesおよびJohansson, 1999）。しかし、Ｎ２およびＢ２７添加物を含む富化された基本培地中で、ＥＳ細胞生存度は依然として高い（YingおよびSmith, 2003）。このことから、本発明者らは、血清因子が存在しない場合、ＬＩＦが、連続的な周期の自己再生を駆動し得るか否かを調べた。
【００９８】
Ｎ２Ｂ２７培地単独中では、接着ＥＳ細胞は、効率的にＳｏｘ１陽性神経前駆体へ転換する（Yingら, 2003）。ＬＩＦは、これらの条件下で神経分化を減少させるが、排除しない。Ｎ２Ｂ２７培地＋ＬＩＦ中で連続的に継代する際、本発明者らは、未分化ＥＳ細胞の数が、初めに増大した後プラトーに達し、次いで２〜３の継代後、減少し始めることを見出した。この所見は、いくつかの異なるＥＳ細胞株を用いて再現された。これらの培養物中の多くの細胞は、神経前駆体または未熟ニューロンの形態を有した。神経分化を、４６Ｃ  ＥＳ細胞におけるＳｏｘ１−ＧＦＰ神経レポーターの活性化によって確認した（Yingら, 2003）。これらの観察は、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３へのさらなるシグナル伝達経路が、ＥＳ細胞自己再生を促進するために、および特に、神経決定を抑制するために必要とされることを示している。
【００９９】
ＢＭＰは、脊椎動物胚における周知の抗神経因子であり（WilsonおよびHemmati-Brivanlou, 1995；WilsonおよびEdlund, 2001）、そしてＥＳ細胞の神経分化に拮抗することが示されている（Tropepeら, 2001；Yingら, 2003）。ＢＭＰは単独で、非神経運命へのＥＳ細胞の分化を促進し（JohanssonおよびWiles, 1995；WilesおよびJohansson, 1999；Yingら, 2003）、このため、初めは、自己再生因子の候補とは思われないようであった。しかし、本発明者らは、ＢＭＰの添加が、ＬＩＦによる同時刺激と共に、分化の阻害に寄与し得るか否かを調べた。本発明者らは、ＬＩＦ＋ＢＭＰ４（もしくはＢＭＰ２）の組み合わせが自己再生を増強し、Ｎ２Ｂ２７中で２または３の継代後に未分化ＥＳ細胞の純度の高い集団を生じることを見出した（図１Ａ）。これらの培養物は、続いて、増殖率または生存度に悪化を生じたり、神経分化を生じたりすることなく、複数継代にわたって拡張され得た（図１Ａ、Ｂ）。この応答は、１１の異なるＥＳ細胞株の各々において、３つの独立した誘導から発生することが観察された。Ｏｃｔ４陽性の未分化細胞の提示および集団倍加時間は、血清＋ＬＩＦにおいて得られるよりもわずかに高かった（図１Ｂ）。ＥＳ細胞状態は、ＳＳＥＡ−１およびアルカリホスファターゼの発現（図示せず）、ならびにＥＳ細胞特異的転写因子ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４のｍＲＮＡの発現と、中胚葉のマーカー（Ｔ）および神経外胚葉のマーカー（Ｓｏｘ１）がないこと（図１Ｃ）とにより確認した。
【０１００】
Ｎ２の成分およびＢ２７の成分は、生存度を改善するが、自己再生には必須ではない。トランスフェリンのみを添加した基本培地では、ＬＩＦ＋ＢＭＰによって、自己再生および未分化ＥＳ細胞拡張が、複数継代にわたって持続され得るが、ＬＩＦ単独によっては持続されない。したがって、ＢＭＰ要求性は、Ｂ２７中の成分によって誘導されない。
【０１０１】
本発明者らは、ＢＭＰの相対的な増殖分化因子−６（growth and differentiation factor-6）（ＧＤＦ−６）を試験し、そしてＧＤＦ−６が、同様に、ＬＩＦの存在下でＥＳ細胞自己再生を支持することを見出した（図１Ａ）。しかし、これは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの一般的な特徴ではなく、ＢＭＰレセプターリガンドに制限される。ＴＧＦ−β１は、ＥＳ細胞に対して認知できる効果を有さなかった。一方、アクチビンは、生存度および／または増殖を増大したが、分化を抑制しなかった。
【０１０２】
ＬＩＦ＋ＢＭＰにより支持されるＥＳ細胞増殖の効率を試験するために、本発明者らは、安定トランスフェクタントのエレクトロポレーションおよび選択に着手した。ｔａｕＧＦＰを安定に発現するコロニーが容易に単離され（図２Ａ）、そしてバルク培養にまで増幅され得た。このことは、遺伝子操作プロトコルにおいてこの無血清系を用いる実行可能性を示している。
【０１０３】
次いで、単離されたＥＳ細胞の自己再生を調べた。単一ＥＳ細胞を、ＬＩＦのみまたはＬＩＦ＋ＢＭＰ４を添加したＮ２Ｂ２７において、９６ウェルプレートに移した（図２Ｂ）。ＬＩＦ単独の存在下で形成した単一コロニーは、高い割合で分化細胞を含み、そしてそれ以上に拡張され得なかった。対照的に、ＬＩＦ＋ＢＭＰ４では、１９２ウェルのうち１２ウェルにおいて未分化コロニーが形成され、これらのうち１０は、無血清下で増幅された（表）。
【０１０４】
ＬＩＦ＋ＢＭＰにおいて培養したＥＳ細胞は、複数世代後、二倍体染色体補完を維持した。それらは、分化能もまた保持した。ＬＩＦおよびＢＭＰの両方の除去により、神経分化が生じた。ＢＭＰを保持したままＬＩＦを除去すると、扁平上皮様細胞のシートへの分化が引き起こされた。したがって、ＢＭＰに対する自己再生応答は、依然として、連続的なＬＩＦシグナル伝達に依存している。
【０１０５】
マウスＥＳ細胞の決定的な機能的特質は、それらが胚発生に再度進み、そしてキメラマウスにおける分化組織の全レパートリーに寄与する能力である。本発明者らは、ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７で３週間の増殖後、ＧＦＰレポーターＥＳ細胞をマウス胚盤胞に注入した。妊娠中期での分析は、種々の組織へのＥＳ細胞寄与が高いいくつかのキメラを同定した（図２Ｃ）。より厳密な試験として、本発明者らは、ｔａｕｇｆｐでトランスフェクトしたＥＳ細胞を用い、ＬＩＦ＋ＢＭＰにおいて選択および拡張した。新生児キメラを得、２匹の雄の動物は、ＥＳ細胞ゲノムを受け継いだ（図２Ｄ）。
【０１０６】
（フィーダーもしくは血清なしでのＥＳ細胞の誘導）
本発明者らは、ＢＭＰに対する応答が、樹立ＥＳ細胞の培養への適合であり得るか、またはＥＳ細胞誘導の初期段階の間の形質発現であるのかを調べた。本発明者らは、ＢＭＰ＋ＬＩＦを添加したＮ２Ｂ２７中に胚盤胞を播種した。数日後、拡張した内部細胞塊（ＩＣＭ）を解離し、そして同じ培養条件で再播種した。初期の試みでは、ＥＳ細胞分化の標準的な時間である培養５〜６日後のＩＣＭ解離後には、ＥＳ細胞コロニーが得られなかった（Nicholsら, 1990；Robertson, 1987）。しかし、血清が存在せず、かつＢＭＰが存在する場合、ＩＣＭは、増殖の減少、およびより早い明白な分化開始を示す。したがって、本発明者らは、続いて、ＬＩＦのみにおける４日のみの胚盤胞培養後にＩＣＭを解離し、そして再播種の際にＢＭＰ４を添加した。これらの条件下で、一次ＥＳ細胞コロニーが形成した（図２Ｅ）。これらは、形態学的に未分化のＥＳ細胞として継代および拡張され得た。１つの株（ＳＦ１）をさらに特徴付けた。ＬＩＦおよびＢＭＰを除去した際、ＳＦ１  ＥＳ細胞は、インビトロで神経分化を受けた。さらに、ＳＦ１細胞は、広範囲にキメラのマウスを生成した（図２Ｆ）。１２のキメラは全て雄であった。このことは、高度に寄与するXY ＥＳ細胞による性転換（Bradleyら, 1984）を示している。
【０１０７】
したがって、本発明者らは、ｇｐ１３０シグナル伝達と、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達のアクチベーターとの存在下で再播種した細胞を培養することにより、本発明に従ってＥＳ細胞を誘導した。
【０１０８】
（未分化ＥＳ細胞は機能的ＢＭＰシグナル伝達機構を発現する）
ＬＩＦ＋ＢＭＰ培養において、単一細胞がクローン化されて、分化がほぼ完全にないことは、ＢＭＰの効果は、分化した子孫を介して媒介されるよりもむしろ、ＥＳ細胞に対して直接的であると思われることを、本発明者らに示唆した。しかし、ＢＭＰレセプター発現およびＥＳ細胞分化の間のＢＭＰ応答性を報告している、以前の研究（Adelmanら, 2002；Hollnagelら, 1999）は、未分化状態でのＥＳ細胞が実際にＢＭＰに対して応答し得るか否かを確立していない。このことを確認するために、本発明者らは、Ｏｃｔ４トランスジーンの活性に対する選択（Yingら, 2002）を用い、ＲＮＡおよびタンパク質分析のために未分化細胞を精製した。
【０１０９】
ＢＭＰは、１型およびII型のセリン／トレオニンキナーゼレセプターのヘテロダイマーを介して作用する（ShiおよびMassague, 2003）。未分化ＥＳ細胞は、Ｉ型のＢｍｐｒＩｂ  ｍＲＮＡをほとんどまたは全く示さないが、Ｉ型のＢｍｐｒＩａおよびII型のＢｍｐｒＩＩレセプターｍＲＮＡの両方を発現する（図３Ａ）。未分化ＥＳ細胞において、ＢＭＰ４およびＧＤＦ６転写物もまた容易に検出可能である。ＢＭＰレセプターの下流の主要なエフェクターは、Ｓｍａｄ転写因子である（AttisanoおよびWrana, 2002；von BubnoffおよびCho, 2001）。Ｒ−Ｓｍａｄ１、５、および８が、活性ＢＭＰレセプター複合体に補充されてリン酸化され、次いでＳｍａｄ４と結合して核に転位する。本発明者らは、活性セリンリン酸化形態のＳｍａｄ１に特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングにより、Ｓｍａｄ活性化を調べた。ＢＭＰ４添加後、未分化ＥＳ細胞においてＳｍａｄ１リン酸化の増大がみられる（図３Ｂ）。ＢＭＰ刺激はまた、ｐ３８の基礎活性化、および１時間までに、ｅｒｋマイトジェン活性化プロテインキナーゼの基礎活性化も増強する（図３Ｂ）。これらのデータは、未分化ＥＳ細胞が、ＢＭＰ刺激に対する応答性のためにシグナル伝達機構を保有すること、そしてさらに、それらが、ＢＭＰ４およびＧＤＦ生成を介して自己分泌刺激する可能性を有し得ることを確立する。
【０１１０】
（ＢＭＰはＳｍａｄ活性化を介する自己再生を支持する）
ＬＩＦの自己再生作用は、転写因子ＳＴＡＴ３を介して媒介される（Matsudaら, 1999；Niwaら、1998）。ＢＭＰは単独では、チロシン７０５のリン酸化により測定されるＳＴＡＴ３を活性化しない（図３Ｃ）。しかも、ＬＩＦによるＳＴＡＴ３活性化も増大しない。ｇｐ１３０の下流のｅｒｋ活性化は、ＥＳ細胞自己再生に必要ではないが、プロ分化シグナルであるようである（Burdonら, 1999a）。このように、低下したｅｒｋ活性は、ＥＳ細胞誘導を容易にし（BuehrおよびSmith, 2003）、そして自己再生を促進する（Burdonら, 1999b）。しかし、ＬＩＦに応じたｅｒｋ活性化は、ＢＭＰの存在によって、認められるほどには阻害されなかった（図３Ｂ）。これらのデータは、ＢＭＰがＥＳ細胞においてｇｐ１３０シグナル伝達を調整しないことを示しており、ＢＭＰシグナル伝達経路が自己再生に直接的に寄与することが示唆される。
【０１１１】
本発明者らは、阻害性のＳｍａｄファミリーメンバーであるＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７（ShiおよびMassague, 2003；von BubnoffおよびCho, 2001）をＥＳ細胞に導入し、ＢＭＰシグナル伝達に拮抗させた。細胞をトランスフェクトし、血清およびＬＩＦの存在下、ピューロマイシン選択下で増殖させた。Ｓｍａｄ６またはＳｍａｄ７の発現ベクターは、空ベクターでのトランスフェクションと比較して、より少なくかつ小さなＥＳ細胞コロニーを生じた。さらに、Ｓｍａｄ６トランスフェクタント、およびより多くにはＳｍａｄ７トランスフェクタントは、継代後、あまり拡張しなかった。これらのトランスフェクト細胞集団では、高レベルで分化することが明らかであった。神経分化は、通常、接着培養においては血清によって抑制されるが、Ｓｍａｄ７トランスフェクション後は容易に見られた（図３Ｄ）。
【０１１２】
Ｓｍａｄ活性をブロックすることに加えて、Ｓｍａｄ６／７はまた、ＢＭＰＲの下流のＴＡＫ／ｐ３８経路を阻害し得る（Kimuraら, 2000）。ＥＳ細胞におけるｐ３８の寄与の可能性を評価するために、本発明者らは、特異的インヒビターＳＢ２０３５８０を用いた（Cuendaら, 1995）。この試薬は、ＢＭＰが自己再生を支持する能力に対して目立った効果を有さなかった（図３Ｅ）。ＬＩＦのみでは、ＳＢ２０３５８０は、自己再生と神経分化との間の平衡を変化させなかったが、全細胞生存度を増強するようであった。このことは、他の細胞型と同様にＥＳ細胞においても、ｐ３８がプロアポトーシス性であることを示唆する（Kimuraら, 2000）。したがって、Ｓｍａｄ経路は、自己再生シグナルの有望なトランスデューサーである。
【０１１３】
ＳｍａｄとＳＴＡＴ３との間の協同転写調節のメカニズムが、神経上皮細胞において特徴付けられている（Nakashimaら, 1999；Sunら, 2001）。これは、遍在性転写共アクチベーターｐ３００により架橋された三元複合体の形成を包含し、そして神経膠特異的プロモーターの相乗的な活性化を生じる。本発明者らは、ＳＴＡＴ３およびＳｍａｄを含む複合体が、ＬＩＦ＋ＢＭＰで刺激したＥＳ細胞において形成され得るか否かを調べた。ＦＬＡＧタグ化Ｓｍａｄ１でのトランスフェクション後の免疫沈降は、活性化したＳＴＡＴ３およびＳｍａｄ１が共局在し得ることを示した（図３Ｆ）。この結論は、ＬＩＦ＋ＢＭＰ刺激後の内因性リン酸化Ｓｍａｄ１およびＳＴＡＴ３の同時免疫沈降によって立証された（図３Ｆ）。
【０１１４】
（ＢＭＰはＥＳ細胞において遺伝子をターゲティングする）
ＥＳ細胞自己再生を生じるために、ＢＭＰ／ＳｍａｄおよびＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、例えば、ｐ３００との三元複合体を介して、別個の標的遺伝子に対して並行して作動し得、および／または共通の標的遺伝子に収束し得る。本発明者らは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｏｃｔ選択ＥＳ細胞におけるＬＩＦ、ＢＭＰ、またはＬＩＦ＋ＢＭＰによる誘導について候補遺伝子を調べた（図４Ａ）。２つの公知のＬＩＦ標的であるｔｉｓ１１およびｃ−ｆｏｓは、ＢＭＰに対して何の応答も示さなかった。２つの他のもの（ｊｕｎＢおよび特にｓｏｃｓ３）は、ＢＭＰの存在下でＬＩＦによってより高度に誘導されるようであった。これらのデータは、ＳＴＡＴ３標的遺伝子のサブセットがＢＭＰによる同時刺激に対して応答性であり得ることを示唆する。しかし、ＪｕｎＢもＳｏｃｓ３も自己再生のエフェクターの候補ではない：ｊｕｎＢヌルＥＳ細胞は、何の欠陥も示さず（Schorpp-Kistnerら, 1999）、そしてＳＯＣＳ３は、過剰発現された場合に自己再生をブロックするｇｐ１３０シグナル伝達のネガティブフィードバックレギュレーター（Schmitzら, 2000）として機能する。
【０１１５】
本発明者らはまた、Ｉｄ遺伝子の発現を調べた。この遺伝子は、ネガティブｂＨＬＨ因子をコードし、そして神経上皮細胞（Nakashimaら, 2001）およびＣ２Ｃ１２筋芽細胞（Lopez-Roviraら, 2002）においてＢＭＰ／Ｓｍａｄにより誘導されることが示されている。ＢＭＰによるＩｄ  ｍＲＮＡ誘導はまた、ＥＳ細胞培養物の分化においても報告されている（Hollnagelら, 1999）。本発明者らは、Ｉｄ１およびＩｄ３が、ＢＭＰにより（およびＧＤＦにより、データは示さず）強く誘導されるが、ＬＩＦによっては誘導されないことを見出した（図４Ａ）。ノーザンハイブリダイゼーションは、これらの知見を確認し、そしてそれらをＩｄ２にまで拡張した（図４Ｂ）。アクチビン（データは示さず）もＴＧＦ−β１もＩｄ遺伝子発現を誘導せず、このことは、この応答がＢＭＰレセプターの下流のＳｍａｄに対して特異的であることを示している。
【０１１６】
Ｉｄ遺伝子は、ウシ胎児血清によっておよびフィブロネクチンによっても誘導されるが、ＢＭＰによって誘導されるほどには程度は高くない（図４Ｂ）。血清中で培養したＥＳ細胞は、容易に検出可能な定常状態量のＩｄのｍＲＮＡを示す。本発明者らは、Ｉｄ２およびＩｄ３を誘導するフィブロネクチンが、Ｎ２Ｂ２７培養物中でＢＭＰの代わりとなり得るか否かを調べた。可溶性フィブロネクチンは、ＬＩＦと組み合わせて、少なくとも１０継代にわたって、未分化Ｏｃｔ４−ＧｉＰ細胞を拡張し得たが、ＢＭＰにおけるよりも分化が多く、そして集団拡張は遅かった。
【０１１７】
（構成性ＩｄはＥＳ細胞自己再生のＢＭＰまたは血清要求性を迂回する）
本発明者らは、Ｉｄ誘導が、神経分化の特定の制限を提供し、ＳＴＡＴ３の自己再生活性を補完し得ると仮定した。したがって、本発明者らは、Ｉｄ１、Ｉｄ２、およびＩｄ３について発現構築物を調製し、そしてこれらをＥＳ細胞に導入した。コロニーは、エピソームスーパートランスフェクションおよび従来の安定組み込みの両方によって容易に回収された。Ｉｄ１については、高いタンパク質発現が免疫ブロッティングによって確認された（図４Ｃ）。トランスジーンの過剰発現は、内因性Ｉｄ１タンパク質の減少と関連しているようであり、フィードバックまたは自己調節性ループの作動が示される。
【０１１８】
Ｉｄ発現が強められても、血清の存在下で、ＥＳ細胞自己再生は損なわれず、そして分化もブロックされなかった。これらの条件下で、これらのトランスフェクタントは、親ＥＳ細胞または空ベクタートランスフェクタントとは明らかに異なっていた。対照的に、無血清Ｎ２Ｂ２７では、Ｉｄトランスフェクタントは、依然としてＬＩＦ依存性ではあるが、ＢＭＰ要求性から解放された。これらの細胞は、ＬＩＦ単独において、ＬＩＦ＋ＢＭＰにおける親ＥＳ細胞と同程度に迅速に増殖し、そして同程度に分化が少なかった。培養物は、未分化形態または因子依存性になんら変更なく、複数回継代され得た。ＥＳ細胞表現型は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのｍＲＮＡの発現によって確認された（図４Ｄ）。Ｉｄ発現が血清またはＢＭＰ／ＧＤＦの代わりとなる能力についての厳密な試験として、本発明者らは、Ｎ２Ｂ２７中に単一細胞を播種した。ＬＩＦ単独において、未分化の継代可能なコロニーが、ＬＩＦ＋ＢＭＰにおける単離細胞からのコロニー形成に匹敵し得る頻度（10%）で形成した（表）。
【０１１９】
（Ｉｄタンパク質はＥＳ細胞分化に系統特異的ブロックを及ぼす）
本発明者らの培養では、ＬＩＦは、Ｉｄトランスフェクタントの自己再生に必須である。なぜなら、Ｉｄ類は、ＥＳ細胞分化を完全にブロックすることはないからである。ＬＩＦが血清含有培地において除去された場合、Ｉｄトランスフェクタント細胞は、親ＥＳ細胞と同様に分化する。接着培養では、それらは、いくつかの線維芽細胞とともにほとんどが扁平上皮様細胞を生じた。凝集の際に、それらは、中胚葉（Ｔ）および内胚葉（Ｈｎｆ４）マーカー発現の活性化（データは示さず）と共に胚様体を形成し、そして心筋細胞分化を示す自発収縮性を発生した。しかし、ＬＩＦが存在しないＮ２Ｂ２７においては、Ｉｄトランスフェクタントは、他のＥＳ細胞とは異なって挙動した。神経分化は、形態およびＳｏｘ１−ＧＦＰの活性化により評価したところ、最小限であった（図５Ａ）。代わりに、トランスフェクタントは、ＢＭＰ単独に曝露された親ＥＳ細胞と同様に、扁平上皮様細胞のシートに分化した（図１Ａ参照）。
【０１２０】
本発明者らは、復帰型の発現構築物を調製し、自己再生および神経分化の遮断が連続的なＩｄ発現に依存しているか否かを試験した。本発明者らは、ｆｌｏｘ化したＩｄ１を発現する４６Ｃ  ＥＳ細胞（ｆＩｄ１細胞）、および続いてＩｄ１トランスジーンを切り出したＣｒｅ処理誘導クローン（ｆＩｄ１Ｃ）を生成した。Ｃｒｅ切り出し後、ｆＩｄ１Ｃ細胞は、ＦＬＡＧ−Ｉｄ１の不在および内因性Ｉｄ１のレベル回復を示す（図４Ｃ）。ｆＩｄ１細胞およびｆＩｄ１Ｃ細胞を、ＬＩＦまたはＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７においてクローン密度で播種した。ｆＩｄ１細胞は、ＬＩＦ単独において効率的に幹細胞コロニーを形成したが、この能力は、ｆＩｄ１Ｃ細胞においては失われ、ｆＩｄ１Ｃ細胞は、ＢＭＰを含まないＬＩＦにおいては、分化した細胞のみを生成した（図５Ｂ）。Ｎ２Ｂ２７単独中で、ｆＩｄ１細胞は、非神経分化を受けたが、ｆＩｄ１Ｃ細胞は、親ＥＳ細胞と同一の様式で挙動し、高い割合のＴｕＪ陽性ニューロンを生成した（図５Ｃ）。
【０１２１】
これらの所見は、Ｉｄ発現が、ＬＩＦの不在下でのＢＭＰ処理で多く観察されるように（Yingら, 2003）、神経系統方向付けを特異的にブロックし、そして分化中のＥＳ細胞を別の運命に向けることを示している。したがって、Ｉｄを発現するＥＳ細胞は、非神経系統方向付けの阻害および多分化能の維持について、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３に全体的に依存性である。
【０１２２】
神経性ｂＨＬＨ転写因子は、発生中のＣＮＳにおいてＩｄタンパク質によって拮抗されることが知られている（Lydenら, 1999）。インビボでは、神経胚形成の前、これらのｂＨＬＨ因子は報告されていない。しかし、培養したＥＳ細胞は、分化する系統においてのみ見出されることが予期されるｍＲＮＡの発現を示す（Ramalho-Santosら, 2002）。したがって、本発明者らは、Ｏｃｔ４選択ＥＳ細胞における２つのｂＨＬＨ遺伝子、ｍａｓｈ１およびニューロゲニン２、の発現可能性を調べた。ニューロゲニン２のｍＲＮＡは、バックグラウンドレベルを上回るレベルで検出可能ではないが、ｍａｓｈ１のｍＲＮＡは、比較的豊富であるようである（図５Ｄ）。したがって、本発明者らは、Ｉｄ発現が、ｍａｓｈ１および他のプロ神経ｂＨＬＨ因子の早期発現により引き起こされるＥＳ細胞の連続的な神経分化を妨害するのに必要であり得ると提唱する。このような作用はまた、ＰａｘおよびＥｔｓ因子などの非ｂＨＬＨパートナー（Norton, 2000）も包含し得る。
【０１２３】
Ｉｄタンパク質は、遍在性ＨＬＨ因子であるＥタンパク質に高い結合活性で結合する（Norton, 2000）。いずれかの過剰発現が、他方を隔離し、そしてその活性をブロックする。Ｉｄタンパク質が通常ＥＳ細胞増殖に必要とされ得るか否かを評価するために、本発明者らは、単独でまたはＩｄ１もしくはＩｄ３との同時トランスフェクションでのいずれかで、エピソームスーパートランスフェクションによって、Ｅ４７タンパク質を過剰発現した。Ｅ４７は、単独でまたは空ベクターとの同時トランスフェクションでは、少数の非常に小さく弱いコロニーを生じた（図５Ｅ）。対照的に、Ｅ４７ベクターおよびＩｄベクターの同時トランスフェクションからは、健常なＥＳ細胞コロニーが生成された。同時トランスフェクタントコロニーは、Ｉｄ単独または空ベクターでトランスフェクトした細胞からは、血清含有培地において識別不能であるようであった。このことは、Ｅ４７の増大が、本質的に毒性ではないが、Ｉｄの隔離に起因して特異的増殖阻害作用を有することを示唆する。他の細胞型で観察される（Norton, 2000）ように、あるレベルの遊離ＩｄがＥＳ細胞増殖に必要とされ得る。ＬＩＦもしくはＢＭＰを含まないＮ２Ｂ２７に移した場合、同時トランスフェクタントは、非神経分化よりもむしろ神経分化を受けた（Ｓｏｘ１−ＧＦＰの活性化により示す）（図５Ｆ）。したがって、Ｅ４７は、Ｉｄの神経抑制効果を中和する。これは、Ｉｄが、プロ神経ｂＨＬＨ因子とのパートナー形成について、Ｅタンパク質の利用可能性を制限するように作用するとの示唆と一致する。
【０１２４】
（ＮａｎｏｇはＢＭＰまたは血清要求性を迂回し得る）
改変体ホメオドメインタンパク質Ｎａｎｏｇの増大したレベルは、ＥＳ自己再生を血清の存在下でＬＩＦ／ＳＴＡＴ３とは独立したものとする（Chambersら, 2003）。本発明者らは、ＬＩＦおよび／またはＢＭＰが、Ｎ２Ｂ２７中でＮａｎｏｇ過剰発現ＥＳ細胞の自己再生に必要であるか否かを検討した。図６Ａは、ｆｌｏｘ化Ｎａｎｏｇトランスジーンを発現するＥＦ４細胞が、ＬＩＦまたはＢＭＰのいずれも添加しないＮ２Ｂ２７中で増殖され得ることを示す。この挙動は、Ｎａｎｏｇに直接起因し得る。なぜならＮａｎｏｇトランスジーンがＣｒｅリコンビナーゼにより切り出された誘導ＥＦ４Ｃ細胞は、迅速に神経分化を受けるからである。ＢＭＰ単独の添加は、いくらかの分化が明らかになる６日よりも長い間、培養物を継代せずに維持しない限り、ＥＦ４細胞に対して明らかな影響を有さない（考察を参照のこと）。ＬＩＦを添加した際、ＢＭＰを添加してもしなくても、ＥＦ４細胞は、培養皿に対してより均一に接着し（図６Ａ）、そして集団倍加速度は増大する。このことは、以前に示されたＥＳ細胞におけるＬＩＦ／ＳＴＡＴ３とＮａｎｏｇとの組み合わせ効果（Chambersら, 2003）と一致する。
【０１２５】
ＮａｎｏｇはＢＭＰまたは血清刺激を過剰にするので、本発明者らは、ＥＦ４細胞がＩｄを発現するか否かを問題とした。ＬＩＦまたはＢＭＰを含まないＮ２Ｂ２７中で終夜培養した後、Ｉｄ１およびＩｄ３の発現は、親Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞において顕著にダウンレギュレートされた。対照的に、ＥＦ４細胞においては、Ｉｄ１のｍＲＮＡは、減少したがなお認められる程度であり、そしてＩｄ３のｍＲＮＡは実際に増大した（図６Ｂ）。したがって、Ｎａｎｏｇの過剰発現は、実質的なレベルのＩｄ発現を構成的に維持するために使用され得る。
【０１２６】
（実験手順）
（ＥＳ細胞培養）
ＥＳ細胞をフィーダー細胞を添加することなく維持した。無血清培養のために、ＥＳ細胞を、10ng/ml ＬＩＦ（Sigma）および10ng/ml ＢＭＰ４もしくは200ng/ml ＧＤＦ６（R & D Systems）を添加したＮ２Ｂ２７培地（YingおよびSmith, 2003）中で、ゼラチンコーティングしたプレート上に播種した。細胞を、酵素を含まない細胞解離緩衝液（Invitrogen）または0.025%トリプシン／1%トリ血清のいずれかを用いて、２〜４日毎に継代した。解離した細胞を、Ｎ２Ｂ２７中に回収し、そしてペレット化した。上清を吸引し、そして細胞ペレットをＮ２Ｂ２７中に再懸濁し、そして直接再播種した。単一細胞クローン化のために、Ｎ２Ｂ２７を予め入れた微量注入パスツールピペットを用いて、個々の細胞を10μl滴中に採取し、次いで、１ウェル当たり150μlのＮ２Ｂ２７をＬＩＦまたはＬＩＦ＋ＢＭＰ４と共に予め入れた９６ウェルプレートに別々に滴下した。８日後、ＥＳ細胞コロニーを同定し、そして継代した。キメラを生成するために、ＥＳ細胞をC57Bl/6胚盤胞に注入した。生殖細胞系列伝達を、雄キメラをC57Bl/6雌と交配することにより試験した。
【０１２７】
（無血清培地におけるＥＳ細胞の誘導）
１２９系統マウスを妊娠第三日に卵巣切除し、そして休眠中の胚を４日後に洗い流した（Nicholsら, 1990）。無傷の胚盤胞を、ＬＩＦ（10ng/ml）を添加したＮ２Ｂ２７において、ゼラチンコーティングしたプラスチック上に播種した。３〜６日後、各外植片の中心塊を採取し、ＰＢＳ中でリンスし、そして数分間トリプシン滴中に配置した。細胞塊を、培地を予め入れた微量注入パスツールピペットで吸い上げてトリプシンのキャリーオーバーを最小とし、そしてＬＩＦおよびＢＭＰ４（10ng/ml）を添加したＮ２Ｂ２７において新鮮なウェル中に、穏やかに粉砕しながら排出した。得られた一次ＥＳ細胞コロニーを、９６ウェルプレートのウェル中に個々に継代した。その後、細胞を、遠心分離および吸引を用いる全培養物のトリプシン処理によって拡張し、再播種した。
【０１２８】
（ＲＮＡ分析）
Ｏｃｔ４ＧｉＰ  ＥＳ細胞（Yingら, 2002）を４〜６日間ピューロマイシンの存在下で培養し、分化した細胞を除去した。精製したＥＳ細胞を、ＬＩＦを加えた完全培地中で２４時間培養し、次いでＰＢＳで一度洗浄し、そして一晩Ｎ２Ｂ２７培地に移し、その後、20ng/ml ＬＩＦ、50ng/ml ＢＭＰ４、ＬＩＦ＋ＢＭＰ４、10ng/ml ＴＧＦ−β1（全てR & D Systems）または15% ＦＣＳで４５分間刺激した。定量的ＲＴ−ＰＣＲをLightCycler Instrument（Roche）を用いて実施した。データをＯｃｔ４増幅に対して標準化した。プライマー対および反応条件は、必要に応じて入手可能である。ノーザンハイブリダイゼーションを全ＲＮＡの５μgアリコートで実施した。
【０１２９】
（プラスミド構築およびトランスフェクション）
Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７プラスミドをHitoshi Niwaにより、そしてＦＬＡＧタグ化Ｉｄ１をTetsuya Tagaから好意により提供された。マウスＩｄ２、Ｉｄ３、およびＥ４７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ２．１にクローニングし、そして配列分析により変異がないことを確認した。発現ベクターをＥＳ細胞にエピソームによりまたは安定組み込みにより導入した。Ｆｌｏｘ化したＩｄ１およびＣｒｅ切除した誘導ＥＳ細胞株をChambersら, 2003により記載のストラテジーを用いて誘導した。
【０１３０】
（免疫化学）
予備選択したＯｃｔ４ＧｉＰ  ＥＳ細胞をＮ２Ｂ２７培地に一晩移し、その後ＬＩＦ（20ng/ml）、ＢＭＰ４（50ng/ml）、またはＬＩＦ＋ＢＭＰ４で１５分間または１時間刺激した。リン酸化したｓｔａｔ３、ｓｍａｄ１、ｅｒｋ１／２およびｐ３８を、免疫ブロッティング（Cell Signaling Technology）により検出した。細胞溶解および免疫沈降（Nakashimaら, 1997）は、抗ＦＬＡＧ（Sigma）または抗Ｓｔａｔ３（Transduction Labs）を用いた。免疫染色は、既報（Yingら, 2003）通りに実施した。
【０１３１】
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【０１３２】
【表１】
2007508026.tif 000003
【０１３３】
（配列表）
本発明の特定の実施形態で使用される配列および本発明の特定の融合タンパク質を以下に記載する：
配列番号
１  マウスＩｄ３のアミノ酸配列
２  ラットＩｄ３のアミノ酸配列
３  イヌＩｄ３のアミノ酸配列
４  ヒトＩｄ３のアミノ酸配列
５  Ｔａｔ由来のタンパク質形質導入ドメイン
６  アンテナペディア由来のタンパク質形質導入ドメイン
７  Ｔａｔ−ヒトＩｄ３融合物
８  アンテナペディア−ヒトＩｄ３融合物
９  マウスＩｄ３−アンテナペディア融合物
（配列番号１−マウスＩｄ３）
MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSTEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVISKDKRSFCH
（配列番号２−ラットＩｄ３）
MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVISKDKRSFCH
（配列番号３−イヌｄ３）
MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCH
（配列番号４−ヒトＩｄ３）
MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCH
（配列番号５−Ｔａｔ由来のタンパク質形質導入ドメイン）
YGRKKRRQRRR
（配列番号６−アンテナペディア由来のタンパク質形質導入ドメイン）
RQIKIWFQNRRMKWKK
（配列番号７−Ｔａｔ−ヒトＩｄ３融合物）
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（配列番号８−アンテナペディア−ヒトＩｄ３融合物）
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（配列番号９−マウスＩｄ３−アンテナペディア融合物）
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【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ＬＩＦ＋ＢＭＰが無血清培地においてＥＳ細胞自己再生を持続することを示す。
【図２】ＬＩＦ＋ＢＭＰを添加したＮ２Ｂ２７におけるＥＳ細胞のクローン形成性、潜在能、および誘導を示す。
【図３】ＥＳ細胞におけるＢＭＰシグナル伝達を示す。
【図４】ＥＳ細胞におけるＩｄの発現および機能を示す。
【図５】Ｉｄが神経分化を抑制し、そしてＥＳ細胞自己再生に必要であることを示す。
【図６】ＮａｎｏｇがＢＭＰ／血清要求性を迂回し、Ｉｄを誘導することを示す。
【図７】ＢＭＰ／ＩｄおよびＬＩＦ／ＳＴＡＴ３による協同的な系統制限を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月13日(2005.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進におけるＩｄ遺伝子産物の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記Ｉｄ遺伝子産物とｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターとの組み合わせの使用。
【請求項３】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中での培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進における、
（ｉ）Ｉｄタンパク質の発現または活性を増大させる薬剤；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせの使用。
【請求項４】
前記ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーターがＬＩＦである、請求項１から３のいずれかの項に記載の使用。
【請求項５】
前記多分化能性細胞が胚性幹細胞である、請求項１から４のいずれかの項に記載の使用。
【請求項６】
前記胚性幹細胞がマウス細胞またはヒト細胞である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤（ｉ）が、フィブロネクチン、フィブロネクチンレセプターのアゴニスト、インテグリンシグナル伝達のアクチベーター、ｎａｎｏｇ、およびＩｄ遺伝子発現またはＩｄタンパク質活性を誘導する上記の全てのホモログから選択される、請求項３から６のいずれかの項に記載の使用。
【請求項８】
Ｉｄ遺伝子の発現を誘導することを含む、請求項１から７のいずれかの項に記載の使用。
【請求項９】
多分化能性細胞を遺伝子操作してＩｄ遺伝子を発現させることを含む、請求項１から８のいずれかの項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｉｄ遺伝子を含むベクターを多分化能性細胞に導入することを含む、請求項１から９のいずれかの項に記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｉｄ遺伝子産物がＩｄタンパク質である、請求項１から１１のいずれかの項に記載の使用。
【請求項１２】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中で培養中の多分化能性細胞の自己再生を促進する方法であって、（１）該細胞においてＩｄ遺伝子を発現させるかもしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導する、またはＩｄタンパク質を含む培地中で該細胞を培養する、工程、および（２）ＧＰ１３０下流シグナル伝達を活性化する工程、を含む、方法。
【請求項１３】
前記細胞においてエピソームによってＩｄ遺伝子を発現させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
誘導性プロモーターを含むエピソームベクターからＩｄ遺伝子を発現させる工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインを含む培地中で前記細胞を培養することにより、ｇｐ１３０下流シグナル伝達を刺激する工程を含む、請求項１２から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインが、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、カルジオトロピン、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−６とｓＩＬ−６レセプターとの組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中での培養中の多分化能性細胞の自己再生の促進における、
（ａ）ＴＧＦ-βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の組み合わせの使用。
【請求項１８】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中で、ＥＳ細胞自己再生を促進するようにＥＳ細胞を培養する方法であって、
（ａ）Ｉｄタンパク質、あるいはＴＧＦ-βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地中で、該ＥＳ細胞を維持する工程を含む、方法。
【請求項１９】
ＥＳ細胞を培養する方法であって、
（ａ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよび血清もしくは血清抽出物の存在下で、必要に応じてフィーダー上で、該ＥＳ細胞を培養中に多分化能状態で維持する工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞を少なくとも１回継代させる工程；
（ｃ）該血清もしくは該血清抽出物を該培地から除去し、そして存在する場合は該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清、および血清抽出物を含まないようにする工程；および
（ｄ）引き続き、
（ｉ）ＴＧＦ-βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の存在下で、該ＥＳ細胞を多分化能状態で維持する工程；
を含む、方法。
【請求項２０】
ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
（ａ）ＥＳ細胞を、ＥＳ細胞において優先的に選択マーカーを発現するプロモーターに作動可能に連結した該選択マーカーをコードする構築物でトランスフェクトする工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞を播種する工程；
（ｃ）
（ｉ）ＴＧＦ-βスーパーファミリーのレセプターを介して作用する１つのアクチベーターを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ii）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の存在下で、該ＥＳ細胞を培養する工程；および
（ｄ）該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程；
を含む、方法。
【請求項２１】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中でＥＳ細胞を培養する方法であって、
個々のＥＳ細胞を培養容器に移す工程、および
該ＥＳ細胞を、
（ａ）ＴＧＦ-βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター
の存在下で培養する工程を含み、
それによって全てが単一のＥＳ細胞からの子孫であるＥＳ細胞のクローン集団を得る、方法。
【請求項２２】
ＥＳ細胞の自己再生用の培地であって、
（１）基本培地；
（２）ＴＧＦ-βスーパーファミリーのレセプターを介して作用するものを除くＩｄ遺伝子発現および／またはＩｄタンパク質活性の直接アクチベーターもしくはエフェクター；
（３）ｇｐ１３０下流シグナル伝達経路のアクチベーター；および
（４）鉄輸送因子
を含み、ここで該培地が血清もしくは血清抽出物を含まない、培地。
【請求項２３】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中での多分化能性細胞の自己再生の促進における、該多分化能性細胞でＩｄタンパク質活性を増大させる薬剤の使用。
【請求項２４】
前記薬剤が、前記細胞中のＩｄタンパク質の量を増大させる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が、Ｉｄタンパク質およびトランスロケーションドメインを含む組成物を含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記組成物が、前記Ｉｄタンパク質および前記トランスロケーションドメインの融合タンパク質を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記トランスロケーションドメインがＴＡＴ、ＶＰ２２、またはペネトラチンを含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
血清を含まずそして血清抽出物を含まない培地中で多分化能性細胞を得る方法であって、
細胞においてＩｄ遺伝子を発現させもしくはＩｄ遺伝子の発現を誘導するか、またはＩｄタンパク質を含む培地中で細胞を培養する工程、および該細胞においてｇｐ１３０下流シグナル伝達を活性化する工程を含み、ここで該細胞が、胎児または成体の体細胞または組織から得られる、方法。
【請求項２９】
前記多分化能性細胞が、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ４、およびｎａｎｏｇに対して陽性であることにより特徴付けられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８から２９のいずれかの項に記載の方法により得られる細胞。
【国際調査報告】
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