(57)【要約】Ｋ−ｒａｓ突然変異を高感度、高速、及び高效率で検出することができるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供することを目的とする。固形マトリックスの表面上に固定された複数個のオリゴヌクレオチドを含むＫ−ｒａｓ突然変異検出用Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、前記オリゴヌクレオチドはＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）でミスセンス変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出するように考案され、コドン１２に対しては配列番号１のヌクレオチド配列からなる野生型オリゴヌクレオチド及び配列番号２ないし１０のヌクレオチド配列からなるミスセンス変異型オリゴヌクレオチドと、コドン１３に対しては配列番号１１のヌクレオチド配列からなる野生型オリゴヌクレオチド及び配列番号１２ないし２０のヌクレオチド配列からなるミスセンス変異型オリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする。
2007534331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形マトリックスの表面上に固定された複数個のオリゴヌクレオチドを含むＫ−ｒａｓ突然変異検出用Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、前記オリゴヌクレオチドはＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）でミスセンス変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出するように考案され、コドン１２に対しては配列番号１のヌクレオチド配列からなる野生型オリゴヌクレオチド及び配列番号２ないし１０のヌクレオチド配列からなるミスセンス変異型オリゴヌクレオチドと、コドン１３に対しては配列番号１１のヌクレオチド配列からなる野生型オリゴヌクレオチド及び配列番号１２ないし２０のヌクレオチド配列からなるミスセンス変異型オリゴヌクレオチドとを含む、Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがそれぞれ５’アミノ変形（５’ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とともに１２個のカーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ  ｓｐａｃｅｒ）を有し、固形マトリックスがアルデヒドまたはアミンでコーティングされたことを特徴とする請求項１に記載のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドのアミン基と固形マトリックスのアルデヒド基との間にシッフ塩基反応（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ  ｂａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて共有結合を形成する方法により固形マトリックス表面に固定されていることを特徴とする請求項２に記載のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項４】
下記段階を含む、請求項１記載のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてＫ−ｒａｓ突然変異を検出する方法：
１）蛍光染料で標識されたＤＮＡ試料を準備する段階；
２）前記標識ＤＮＡ試料とＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドスポット（ｓｐｏｔ）とを反応させる段階；
３）前記反応したマイクロアレイを洗浄して結合されないＤＮＡ試料を除去する段階；
４）蛍光リーダー（ｒｅａｄｅｒ）を用いて特定のオリゴヌクレオチドスポットのハイブリダイゼーションの様相を検出する段階；及び
５）遺伝子突然変異の存在有無を確認する段階。
【請求項５】
前記混成反応試料が、対象患者から得られた腫瘍の標本や血液であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記が、競争的ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＣＤＨ）法によって行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記競争的ＤＮＡハイブリダイゼーション方法が、互いに異なる蛍光染料で標識されたｄＮＴＰで増幅させた少なくとも二つの試料を混合する段階；前記段階に得られた試料混合物をマイクロアレイ表面上の一つのスポットされた（ｓｐｏｔｔｅｄ）オリゴヌクレオチドに滴下させる段階；及び前記試料らを制限された量のスポットされたオリゴヌクレオチド内でのハイブリダイゼーション反応における互いに競争的に反応させる段階を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光染料がＣｙ５、Ｃｙ３、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及びリサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーション反応が水蒸気で飽和された４５ないし６０℃のインキュベーター内で３ないし９時間行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔ  ｒｅｇｉｏｎ）での突然変異を検出するためのＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ｋ−ｒａｓ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、それの製造方法、及びそれを用いてＫ−ｒａｓ突然変異を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、各種の癌で突然変異になるｒａｓ遺伝子のうち一つである。Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３の突然変異は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の産物であるｐ２１−ｒａｓタンパク質の機能変化をもたらすことによって、結果的に細胞核に過度の成長信号を伝達して細胞の成長及び分裂を促進するようになる、腫瘍化（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）に関与する。Ｋ−ｒａｓ突然変異は膵膓癌の約９０％、大膓癌の約５０％、また非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ）の約３０％で発生すると知られており、その突然変異のプロファイルでは、この突然変異の８５％がコドン１２及び１３で発生することが明らかになった（Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ＷＳ，ｅｔ ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ. Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ.９：１１９３−７，２０００）。従って、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異の検査は、癌診断、例えば膵膓癌、大膓癌及び非小細胞肺癌などの診断において有用な道具として広範囲に用いられており、多くの研究でＫ−ｒａｓ遺伝子が一部の腫瘍の表現型と関連されていることを提示している（Ｓａｍｏｗｉｔｚ ＷＳ, ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．９：１１９３−７，２０００；Ａｎｄｒｅｙｅｖ ＨＪ、ｅｔ ａｌ.,Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：６９２−６，２００１；Ｂｒｉｎｋ Ｍ,ｅｔ ａｌ.,Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：７０３−１０，２００３）。しかし、上記研究は一般的にＫ−ｒａｓ突然変異と特異的な臨床的特徴との間の有意味な相関関係を明らかにするために多量の試料を必要とし（Ａｎｄｒｅｙｅｖ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８５：６９２−６，２００１）、疾病疫学（ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）分野でも高效率の技術、例えば、正確で迅速に多量の試料を処理することができるオリゴヌクレオチドマイクロアレイが求められている。
【０００３】
突然変異多発部位（コドン１２及び１３）を有するＫ−ｒａｓ遺伝子は、“ＤＮＡチップ”などの新規な突然変異検出技法を検証するための標的遺伝子として用いられてきている。しかし、既存の研究は特定化されたシリコン装置またはそのシステムを向上させるために複雑なプロトコルを用いるので（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１８６−９４，２００１；Ｐｒｉｘ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：４２８−３５，２００２）、大量の試料を正確でかつ費用効率で検査することは不適切であった。
【０００４】
よって、本発明者らはＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位で多様な突然変異を検出できるように考案されたオリゴヌクレオチドを、自動化されたマイクロアレイヤ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）を用いて固形マトリックスの表面上に固定させて製造された、Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、及び競争的ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＣＤＨ）法という、效率性及び収容力（ｃａｐａｃｉｔｙ）が増大された新規したハイブリダイゼーション法を開発した。本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイはＫ−ｒａｓ突然変異を検出し、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と関連された信号伝達機構（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）及び腫瘍化（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）を糾明する研究などに用いられることができる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ＷＳ，ｅｔ ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ. Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ. ９：１１９３−７，２０００
【非特許文献２】Ｓａｍｏｗｉｔｚ ＷＳ，ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．９：１１９３−７，２０００
【非特許文献３】Ａｎｄｒｅｙｅｖ ＨＪ，ｅｔ ａｌ.,Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：６９２−６，２００１
【非特許文献４】Ｂｒｉｎｋ Ｍ,ｅｔ ａｌ.,Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：７０３−１０，２００３
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅｙｅｖ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８５：６９２−６，２００１
【非特許文献６】Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１８６−９４，２００１
【非特許文献７】Ｐｒｉｘ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：４２８−３５，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異の検出のみならず、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に関する信号伝達機構及び腫瘍化の研究のために、迅速でかつ信頼性のある診断道具として使用できるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、固形マトリックスの表面上に固定された複数個のオリゴヌクレオチドを含むＫ−ｒａｓ突然変異検出用Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、前記オリゴヌクレオチドはＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）でミスセンス変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出するように考案され、コドン１２に対しては配列番号１のヌクレオチド配列からなる野生型オリゴヌクレオチド及び配列番号２ないし１０のヌクレオチド配列からなるミスセンス変異型オリゴヌクレオチドと、コドン１３に対しては配列番号１１のヌクレオチド配列からなる野生型オリゴヌクレオチド及び配列番号１２ないし２０のヌクレオチド配列からなるミスセンス変異型オリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とするＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供する。
また、本発明では前記Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてＫ−ｒａｓ突然変異を検出する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、既存の突然変異の検出方法とは異なり固形マトリックスの表面上に固定されたオリゴヌクレオチドに競争的ＤＮＡハイブリダイゼーション法を適用いて突然変異を検出することによって、時間、費用及び正確性の点で優れた效果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、自動化されたマイクロアレイヤ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）を用いて固形マトリックスの表面上に固定させたオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドがＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位での多様な突然変異を検出することができることを特徴とする、Ｋ−ｒａｓ突然変異の検出用Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供する。
【００１０】
まず、前記オリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位であるコドン１２及び１３での全ての発生可能なミスセンス変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出できるように考案された。
【００１１】
具体的に、コドン１２に対しては、ＧＧＴ（グリシン）をＴＧＴ（システイン）、ＡＧＴ（セリン）、ＣＧＴ（アルギニン）、ＧＡＴ（アスパラギン酸）、ＧＣＴ（アラニン）、ＧＴＴ（バリン）、ＧＧＡ（グリシン）、ＧＧＧ（グリシン）またはＧＧＣ（グリシン）にそれぞれ置換させて得られた９類型の置換されたオリゴヌクレオチドが用いられ、コドン１３に対しては、ＧＧＣ（グリシン）をＣＧＣ（アルギニン）、ＡＧＣ（セリン）、ＴＧＣ（システイン）、ＧＣＣ（アラニン）、ＧＡＣ（アスパラギン酸）、ＧＴＣ（バリン）、ＧＧＴ（グリシン）、ＧＧＡ（グリシン）またはＧＧＧ（グリシン）に置換させて得られた９類型の置換されたオリゴヌクレオチドが用いられる。
【００１２】
本発明の一実施様態によって、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは固形マトリックスの表面上にスポット（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）され、固定された１８類型のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の二つの突然変異多発部位コドンでの多様なミスセンス変異を検出することができる。９つのオリゴヌクレオチド（Ｍ）は各突然変異多発部位コドンでのあらゆる置換を検出できるように考案されており、一つのオリゴヌクレオチド（Ｗ）は野生型に対するものである。従って、総１８個のオリゴヌクレオチドはコドン１２及び１３に対するミスセンス変異を検出するために考案されている。
【００１３】
一つの野生型オリゴヌクレオチド（Ｗ）は、各コドンに対して突然変異類型と直接的に比較されることができ、ホモ接合変異（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）及び異型接合変異（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を両方とも検出できるように考案されている。例えば、コドン１２に対して１０個のオリゴヌクレオチドがスポットされるが、この場合、一つは正常塩基配列を、その残り（９個）は変異された塩基配列を有する。全体として、１８個の変異オリゴヌクレオチドは、二つの突然変異多発部位コドンの１８個のミスセンス変異類型を検出できるように考案され、２個のオリゴヌクレオチドは野生型及び陽性対照群として考案されている。各オリゴヌクレオチドは、測定された検査信号の正確性を増大させるために一直線上に４回スポットされ、これにより総８０個のオリゴヌクレオチドがスポットされる。本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、このように固形マトリックスの表面上に個別的にスポットされた８０個のオリゴヌクレオチドの三つのセットを含むことによって、三つの互いに異なる試料を同時にハイブリダイゼーション(ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)させることができる。
【００１４】
本発明は、検査された全ての場合において８５％以上の頻度を示した前記のＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位であるコドン１２及び１３でのあらゆる突然変異の検出に用いられることができるオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイに用いられる上記オリゴヌクレオチドは、前記二つのコドンドであらゆるミスセンス変異を検出するように考案されるので、いまだに発見されていないいかなるミスセンス変異も検出することができる。即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異多発部位における突然変異を検出するように特別に遺伝子の特性を考慮して考案されたので、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子突然変異の検出に当って、向上した正確性及び效率性を提供する。
【００１５】
本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、
１）オリゴヌクレオチドをそれぞれマイクロスポット溶液（ｍｉｃｒｏ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と混合してウェルプレートに分配する段階；
２）マイクロアレイヤ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）を用いて前記オリゴヌクレオチドを固形マトリックスの表面上にスポットする段階；
３）前記固形マトリックス上にオリゴヌクレオチドを固定させて洗浄する段階；
４）前記固形マトリックスを９５℃の水に浸して固定されたオリゴヌクレオチドを変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させた後、固形マトリックスを水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）溶液で処理する段階；
５）前記固形マトリックスを洗浄して乾燥させる段階
を含む工程によって、自動化されたマイクロアレイヤを用いて固形マトリックス上に８０個のオリゴヌクレオチドを固定させて製造することができる。
【００１６】
前記段階１）で用いられる各オリゴヌクレオチドは、固形マトリックス表面と安定した結合を形成することができる官能基を有することが好ましい。例えば、各オリゴヌクレオチドは５’アミノ変形（５’ａｍｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とともに１２個の炭素スペーサー（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）と連結された、例えばＨ２Ｎ−（ＣＨ２）１２−オリゴヌクレオチドが挙げられる。前記アミン基は、固形マトリックス上のアルデヒド基とシッフ塩基反応（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｂａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を引き起こして両者間の堅固な結合を形成する。また、１２個の炭素スペーサーは、オリゴヌクレオチドと蛍光染料で標識された標的ＤＮＡとの間の接触を容易にすることでハイブリダイゼーション反応の速度を向上させる。
【００１７】
前記段階１）で用いられるマイクロスポット溶液は、固形マトリックス上のオリゴヌクレオチドの適用を容易にする適切な塩及びポリマーを含むことができる。
【００１８】
前記段階２）で用いられる固形マトリックスは、ガラス、変形シリコン、プラスチックカセット、またはポリカーボネートまたはそのゲル（ｇｅｌ）のようなポリマーからなるものでもよい。前記固形マトリックスの表面は、オリゴヌクレオチドがマトリックスの基材に安定的に結合できるようにする化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）でコーティングされることができる。このようなコーティングに用いられる化合物は、好ましくは、アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）またはエポキシ基（ｅｐｏｘｙ ｇｒｏｕｐ）などの官能基を有する。好適な一実施態様に、本発明はアルデヒドでコーティングされたスライドガラス（ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）を用いる。
【００１９】
前記段階１）及び段階２）の好適な一実施態様によると、総８０個のオリゴヌクレオチドは自動化されたピン（ｐｉｎ）マイクロアレイヤを用いて固形マトリックス上に精密に配列される。各オリゴヌクレオチドスポット（ｓｐｏｔ）は、１００ないし５００μｍ範囲の直径を有する円形が好ましい。固形マトリックスとしては、チップ（ｃｈｉｐ）当たり約１００ないし１０，０００個のスポットを収容することができる３．７ｃｍ×７．６ｃｍ寸法のスライドガラスが好ましい。それぞれ１３０μｍの直径を有する総８０個のオリゴヌクレオチドスポットが２００ないし８００μｍ、好ましくは３００μｍの間隔をおいた多数の行及び列で配列することができる。
【００２０】
前記段階３）では、オリゴヌクレオチドのアミン基と固形マトリックスのアルデヒド基との間にシッフ塩基反応（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｂａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて共有結合を形成する方法によってオリゴヌクレオチドを固形マトリックス表面上に固定させる。固形マトリックスをＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＳＰＥ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＥＤＴＡ）などで洗浄することにより、未反応の遊離オリゴヌクレオチドを取り除く。
【００２１】
前記段階４）では、固定されたオリゴヌクレオチドを変性させた後、固形マトリックス上に残存する未反応のアルデヒド基を水素化ホウ素化ナトリウム処理によって、還元させて不活性化させる。
【００２２】
前記工程により製造された本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、遺伝子突然変異の検出に有用に用いられることができ、本発明の方法は非常に簡単でかついかなる通常の遺伝子突然変異の検出方法に比べてもはるかに経済的である：ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＴＴ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、クローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）、直接シーケンス法（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの通常の方法を用いて遺伝子突然変異の存在の有無を検査する場合、平均的に数日ないし数ヶ月がかかる。しかし、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いる場合、Ｋ−ｒａｓ遺伝子突然変異に対するＤＮＡ試料の分析の際に１０ないし１１時間未満がかかる。また、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは従来のチップ（ｃｈｉｐ）に比べてさらに簡単でかつ低コストで製造することができる。一応、目的とするオリゴヌクレオチドが合成されると、本発明のスライドを大量生産することができる。また、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイが用いられる場合、試薬の必要量が通常的なの方法におけるそれに比べてさらに少なく済む。
本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ピンマイクロアレイヤを用いて容易に製造することができるが、これに対し既存のアフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ）製のオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、複雑で高価であるフォトリソグラフィ技術を用いて製造しなければならない。
【００２３】
また、アフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ）製のオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、固形マトリックスの表面上で直接オリゴヌクレオチドを合成して製作するので、オリゴヌクレオチドを精製するか、または変形させることができなかったが、これに対し本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイでは、オリゴヌクレオチドを精製して変形させることができる。本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイでは、純度を高めるためにオリゴヌクレオチドを精製することにより、高品質のオリゴヌクレオチドをスポットすることができ、実験的誤差を減らすためにオリゴヌクレオチドを容易に変形させることができる。オリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、スポットされるオリゴヌクレオチドの品質が全体としての反応の正確性を決定するという事実を考慮してみるとき、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは従前よりも高い実験の正確性を提供することができる。
【００２４】
さらに、本発明は、
１）蛍光染料で標識されたＤＮＡ試料を準備する段階；
２）標識されたＤＮＡ試料とＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドスポットとを反応させる段階；
３）前記反応されたマイクロアレイを洗浄して結合されないＤＮＡ試料を除去する段階；
４）蛍光リーダー（ｒｅａｄｅｒ）を用いて特定オリゴヌクレオチドスポットのハイブリダイゼーション様相を検出する段階；及び
５）遺伝子突然変異の有無を確認する段階
を含む、前記Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてＫ−ｒａｓ突然変異を検出する方法を提供する。
【００２５】
前記段階１）では、対象患者の腫瘍標本または血液から抽出したＤＮＡを、ＰＣＲを用いて蛍光染料でＤＮＡ試料を標識させて準備することができる。蛍光染料で標識されたＤＮＡとオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上の特定オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、適切なソフトウェア（ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いる蛍光リーダー（ｒｅａｄｅｒ）で分析することができる。蛍光染料としては、特別に制限されないが、Ｃｙ５、Ｃｙ３、アレクサフルオルＴＭ５９４（ＡｌｅｘａｆｌｕｏｒＴＭ ５９４）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及びリサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）などが好ましい。
【００２６】
前記段階２）では、前記段階１）で準備した蛍光染料で標識されたＤＮＡ試料をハイブリダイゼーション溶液と混合させた後、各オリゴヌクレオチドに伝達する。この時、ハイブリダイゼーション反応は、患者からそれぞれ増幅させた蛍光染料で標識されたＤＮＡが制限された量のスポットされたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応で互いに競争的に作用する原理に基づいた,競争的ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＣＤＨ）法によって行うことができる。
【００２７】
ＣＤＨ法の場合、ＤＮＡ試料は前記段階１）で用いられた蛍光染料に二つの追加の蛍光染料を添加してさらに追加で標識できる。この段階で用いられる追加の蛍光染料としては、前記段階１）で用いられた蛍光染料を除いて商業的に利用できる全ての蛍光染料を用いることができる。本発明の好適な実施態様では、三つの蛍光染料、即ちＣｙ３−、Ｃｙ５−及びアレクサフルオルＴＭ５９４で標識されたｄＮＴＰをそれぞれ用いて各ＤＮＡ試料を増幅させることによって、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びアレクサフルオルＴＭ５９４をＤＮＡ内に導入させた。それぞれのＣｙ５−、Ｃｙ３−及びアレクサフルオルＴＭ５９４で標識されたＤＮＡは、互いに混合してマイクロアレイの一つのスポットされた領域で一緒にハイブリダイゼーションされる。前記ハイブリダイゼーション反応は、水蒸気で飽和された４５ないし６０℃の培養器内で３時間行うことができる。
【００２８】
その後、前記マイクロアレイを洗浄して結合されない試料ＤＮＡを取り除いた後、乾燥させ（段階３）、適切なソフトウェアを用いる蛍光リーダーで蛍光結果を分析する（段階４）。各蛍光染料の励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）によって、ハイブリダイゼーションされたマイクロアレイはＣｙ３、Ｃｙ５及びアレクサフルオルに対するそれぞれ６３２．８ｎｍ、５４３．８ｎｍ及び５９４ｎｍ波長でスキャンされる（Ｌｏｖｍａｒ Ｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ１２９，２００３）。
【００２９】
前記段階５）では、９９％信頼区間での最大値をしきい値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として設定し、しきい値より高い蛍光水準を示す任意の信号を突然変異の存在に対する陽性信号と見なす。
【００３０】
本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは大膓癌、膵膓癌、非小細胞肺癌、腺癌、扁平上皮癌などのような癌の診断の際に效果的に用いることができる。また、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と関連した信号伝達機構及び腫瘍化の研究のための效果的な診断道具として用いることができる。
【００３１】
ＣＤＨ法が適用されたＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてＫ−ｒａｓ突然変異を検出する方法は、次のような長所を有する：
１）スポットされたオリゴヌクレオチドと相同性を有し、ハイブリダイゼーションにおいて競争する小さな断片化されたＤＮＡによって引き起こされる非特異的結合からの信号を減少させることができる；
２）突然変異の分析は、突然変異の信号値を野生型の信号値で割った比率で計算されて行われる（Ｋｉｍ ＩＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｄｉｍａｎ Ｇ ｅｄ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−ｎｕｔｓ ＆ ｂｏｌｔｓ．Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ，ＤＮＡ ｐｒｅｓｓ，２４９−７２，２００３；Ｐｒｉｘ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：４２８−３５，２００２）。本発明の方法は、しきい値以上の比率を有するものを突然変異と見なす。従って、この比率が大きいほどさらに正確な分析が可能である。
３）三つの互いに異なる蛍光染料で標識された三つの試料を混合することによって、本発明の方法は、検出にかかる所要費用及び時間を減らすことができる。また、Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは三つに分離されたオリゴヌクレオチドセットを有するように考案されたので、一つのマイクロアレイ当り総９個（３×３）の試料を検査することができる。
【００３２】
多数の蛍光染料（fluorophore）が遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）及びこれと並行するＤＮＡプーリング（ＤＮＡ ｐｏｏｌｉｎｇ）に適用されたけれども（Ｌｏｖｍａｒ Ｌ，ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ１２９、２００３；Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１２１６４−９，２０００；Ｌｉｎｄｒｏｏｓ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０：ｅ７０、２００２）、本発明は多数の蛍光染料で標識された複数個のＤＮＡ試料を用いるだけでなく、これらが互いに競争させる。また、本発明は一つの蛍光染料からの信号が一つ以上の波長で検出される現象である“クロース−トーク”(ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ)の問題が減少されるようにした（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ ＪＮ, ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９７：１２１６４−９, ２０００）。一部蛍光物質の励起及び放出スペクトルは互いに重複され得るので、その信号が他の波長から励起されて放射することができる。このような現象を予防するために、本発明は三つの互いに異なる蛍光染料で標識されたｄＮＴＰｓ、即ち互いに区別される領域のスペクトルを有するＣＹ５−ｄＣＴＰ，Ｃｙ３−ｄＣＴＰ及びアレクサフルオル−ｄＵＴＰを用いてＣＤＨ法を行う。その結果、本発明のＣＤＨ法は非特異的なハイブリダイゼーションからの信号を減少させることによって、マイクロアレイより鮮明なイメージを得ることができる(図１ａないし図１ｅ参照)。また、野生型(コドン１２及び１３)の二つの信号は、少し減少することが検出される。これは各試料からの断片化された野生型ＤＮＡがハイブリダイゼーション時、互いに競争的に反応しなければならないからである。しかし、突然変異ＤＮＡの場合、三つの混合された試料内で同一の形態で発見される場合がほとんどないので、競争的に反応せず、その固有な信号を保つ。その結果、試料が突然変異を有する場合、突然変異と野生型間の信号比率が０．９１から１．６６(図１ａないし図１ｅ参照)に、また０．２８から０．５６（図１ｃないし図１ｄ参照）に増大する。
【００３３】
２０４名の大膓癌の患者が体内（ｓｏｍａｔｉｃ）Ｋ−ｒａｓ突然変異の存在有無を確認するために調査された。その結果、総５０種の突然変異がＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて大膓癌で検出された（５０／２０４、２４．５％）。このうち、２８個は近位大腸癌（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）から発見され（２８／１０３，２７．２％）、２２個の突然変異は遠位大腸癌（ｄｉｓｔａｌ ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ）から発見された（２２／１０１、２１．８％）。前記で検出された突然変異は、コドン１２または１３でのアミノ酸変異による４タイプのミスセンス変異に分類された。最も頻繁な突然変異の形態はコドン１３でのＧＧＣ（Ｇｌｙ）→ＧＡＣ（Ａｓｐ、２１／５０）変異であった。残りはＧＧＴ（Ｇｌｙ）がＧＡＴ（Ａｓｐ，１６／５０）、ＧＴＴ（Ｖａｌ，８／５０）及びＴＧＴ（Ｃｙｓ，５／５０）に変形されたものである。
【００３４】
このような突然変異の結果は直接配列決定と１００％一致することが確認され、偽陽性（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）及び偽陰性（ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）は全く示していない。突然変異のプロファイル（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）と表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）と間のどのような有意的な差があるかを調査するために、ＳＰＳＳソフトウェアを通じるカイ自乗検定（χ２ｔｅｓｔ）またはフィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）を用いて統計分析を行った。α＝０．０５を有意水準（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ）と設定した。ＧＧＴ→ＧＡＴの形態は、従来の報告（Ｓａｎｏｗｉｔｚ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｒｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．９：１１９３−１１９７，２０００；Ｂｒｉｎｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：７０３−７１０,２００３）と同様に遠位大腸癌（３／２２、ｐ＝０．０１４）より近位大腸癌（１３／２８）の方がもっと優勢であった。しかし、Ｋ−ｒａｓ突然変異と性別、年齢、腫瘍の大きさ、分化程度及び癌の進行段階（ＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ，ｎｏｄｅ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）ｓｔａｇｅ）間の有意的関係はまだ発見されていない。
【００３５】
要約すると、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイの結果は、通常の自動配列決定と正確に一致し、本発明によってＣＤＨ法を適用したＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、多数の試料の分析時、效率を増大させることができることが確認された。本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、高感度、高速、及び高効率（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）システムであるので、個体群−基礎研究（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ）のような多量の試料分析を要求する研究にも適する。
【００３６】
次に本発明を下記の実施例によりさらに詳細に例示する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を制限することはない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイの製造
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の二つの突然変異多発部位（コドン１２及び１３）でのあらゆる可能な置換を検出するように１８個のオリゴヌクレオチドを製作し、野生型の対する２個のオリゴヌクレオチドを製作した。下記の表１に示すように、すべてのオリゴヌクレオチドは２１ｂｐの長さを有し、各ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）配列はオリゴヌクレオチドの中間に位置した。突然変異多発部位のコドン中一つに対するミスセンス変異の配列からなるオリゴヌクレオチドでは：コドン１２では、配列番号２ないし１０の配列からなるオリゴヌクレオチド；またコドン１３では、配列番号１２ないし２０の配列からなるオリゴヌクレオチドが該当する。また、配列番号１及び１１の配列からなるオリゴヌクレオチドは野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）の配列に該当する。
【表１】
2007534331.tif 000003
【００３８】
すべての２０個のオリゴヌクレオチドは、それぞれアルデヒド基とシッフ塩基反応（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｂａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を引き起こすことができる、アミン残基で変形された５’−末端とともに１２個の炭素スペーサー（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）を有するものであって、メタビオン（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、ドイツ）から入手して、ＨＰＬＣに精製された。
【００３９】
本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイは通常的な方法（Ｋｉｍ ＩＪ,ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｄｉｍａｎ Ｇ ｅｄ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−ｎｕｔｓ ＆ ｂｏｌｔｓ．Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ，ＤＮＡ ｐｒｅｓｓ，２４９−７２，２００３）によって製造した。具体的に、各オリゴヌクレオチドをマイクロスポット溶液（ｍｉｃｒｏ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カナダ）と１：１の比率で混合した後、４０μｌずつ９６ウェルプレートに移された。４０ｐｍｏｌ／μｌのオリゴヌクレオチドがコドン１２及び１３に対してスポットされた。前記チャージされた９６ウェルプレートをピンマイクロアレイヤ（ｐｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ；Ｍｉｃｒｏｓｙｓ ５１００ Ｃａｒｔｅｓｉａｎ，Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ）内に装着した後、各オリゴヌクレオチドはアルデヒドコーティングされたスライドガラス（ａｌｄｅｈｙｄｅ−ｃｏａｔｅｄ ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅ；２６×７６×１ｍｍ，ＣＥＬ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）上にプリント（ｐｒｉｎｔｉｎｇ）された。スポットはそれぞれ１３０μｍ大きさの直径を有し、３００μｍで離隔された多数の行と列で配列させた。総８０個（２０×４）のオリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３に対する２個の野生型及び１８個のミスセンス変異型で構成されたものであって、４回重複された形式で配列された。三つの互いに異なる試料が一つのマイクロオレとハイブリダイゼーションできるように、前記オリゴヌクレオチドセットを一つのスライド上に個別的にスポットした。
【００４０】
オリゴヌクレオチドでスポットされたスライドガラスを０．２％ＳＤＳで２回洗浄した後、蒸留水で１回洗浄した。これを熱水（９５℃）に浸してオリゴヌクレオチドを変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させた後、水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）溶液に５分間浸して、未反応アルデヒド基を不活性化した。その後、前記スライドガラスを０．２％ＳＤＳで２回洗浄した後、蒸留水で１回洗浄し、遠心分離して乾燥させた。
【００４１】
実施例２
Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いたＫ−ｒａｓ突然変異の検査
（段階１）ＤＮＡ試料の準備
韓国のソウル大学病院及び国立癌センターから総２０４名の大膓癌患者を対象として体内Ｋ−ｒａｓ突然変異の存在有無を検査した。すべての患者から書面による同意書（ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎｆｏｒｍｅｄ ｃｏｎｓｅｎｔｓ）を得た。この２０４種の大膓癌中、１０３種は大膓近位大腸（盲膓（ｃｅｃｕｍ）から脾湾屈曲部（ｓｐｌｅｎｉｃ ｆｌｅｘｕｒｅ）まで）から、また１０１種は大膓遠位大腸（脾臓屈曲部から直腸（ｒｅｃｔｕｍ）まで）から得られた。また、大膓癌患者の正常組職を陰性対照群として用いた。
【００４２】
前記組職の冷凍標本からＴＲＩ試薬（ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）を用いて通常的な方法（Ｋｉｍ ＩＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：２９２０−５，２００３）によってゲノムＤＮＡを抽出した。蛍光染料で標識されたＤＮＡ試料を得るために、抽出されたＤＮＡ鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）及びそれぞれ配列番号２１及び２２の配列からなる一対のプライマー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて通常的な方法（Ｋｉｍ ＩＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：４５７−６３，２００２；Ｋｉｍ ＩＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：２９２０−５，２００３）によってＰＣＲ増幅を行った。
【００４３】
前記ＰＣＲ反応溶液（２５μｌ）にはゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）各５０μＭ、及び蛍光染料で標識されたＣｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びｄＣＴＰ各１０μＭが含まれている。反応はプログラム可能サーマルサイクラー（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ９６００；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で９４℃で５分間変性させることから始めた。ＰＣＲの条件は９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で１分の３５サイクル（ｃｙｃｌｅ）の繰り返しと７２℃で７分間の最終延長反応（ｆｉｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）からなる。
【００４４】
ＣＤＨ反応のために、ＤＮＡ試料は追加の蛍光染料で標識されたｄＮＴＰでＣｙ３−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはクロマチドＴＭ−ｄＵＴＰ−アレクサフルオル５９４（ＣｈｒｏｍａｔｉｄｅＴＭ−ｄＵＴＰ−Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と標識した。ＣＤＨのためのＰＣＲ反応において、各試料を前記蛍光染料で標識されたｄＮＴＰで増幅させて蛍光染料をＤＮＡに結合させた。
【００４５】
このようなＰＣＲ増幅後、Ｃｙ５、Ｃｙ３及びアレクサフルオルＴＭ５９４で標識されたＰＣＲ産物をそれぞれＤＮＡ精製用キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、０．０５ＵのＤＮａｓｅ Ｉ（株式会社タカラ製日本）で２５℃で３分間処理して、分解した。これを８０℃で１０分間処理して残余酵素を不活性させ、それぞれＣｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４プルーアが標識されたＤＮＡ試料を回収した。
【００４６】
（段階２）ハイブリダイゼーション反応及び分析
前記段階１で準備された各Ｃｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４で標識されたＤＮＡ試料を混合し、５×ハイブリダイゼーション溶液（Ｈｙｂｉｔ、ＴｅｌｅＣｈｅｍ社）に２〜４μｌ体積で懸濁させた。混合されたＤＮＡ試料の２μｌを実施例１で得られたスライドガラスに滴加した後カバースライド（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｄｅ）で覆った。飽和蒸気管（ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｖａｐｏｒ ｔｕｂｅ）の中に前記のスライドガラスを入れたまま５６℃で２．５時間ハイブリダイゼーション反応を行った。このような工程は、患者からそれぞれ増幅されて特定の蛍光染料標識を有するＤＮＡ試料が制限された量のスポットされたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応において互いに競争するようにした。
【００４７】
ハイブリダイゼーション反応させたスライドガラスを０．２％ＳＤＳ＋０．５×ＳＳＣ混合溶液で室温で１５ないし３０分間洗浄した後、蒸留水で５分間洗浄し、遠心分離して乾燥させた。得られたスライドガラスをスキャンしてイメージ分析スキャナであるスキャンアレイライト（Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｌｉｔｅ，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）と定量的な微細配列の分析ソフトウェアであるクアントアレイ（Ｑｕａｎｔ Ａｒｒａｙ；ｖｅｒｓｉｏｎ２．０，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）で腫瘍ＤＮＡとのハイブリダイゼーションされた程度を意味する各スポットの強度を計算した。各蛍光染料の励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ）によって、ハイブリダイゼーションされたマイクロアレイをＣｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４に対してそれぞれ６３２．８ｎｍ、５４３．８ｎｍ及び５９４ｎｍでスキャンした（Ｌｏｖｍａｒ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ１２９，２００３）。
【００４８】
２個の野生型信号を互いに比較し、信号の標準化（ｓｉｇｎａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）によって同一に調整した。各コドンにおける残りの１８個信号は野生型信号と同一の方法に調整された。信号標準化後、すべての信号を通常的な方法（Ｋｉｍ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：４５７−４６３，２００２）によって再分析した。背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌｓ）の平均（ＢＡ）及び標準偏差（ＢＳＤ）を計算した後、カットオフレベル（ｃｕｔｏｆｆ ｌｅｖｅｌ）を（ＢＡ＋２．５８ＢＳＤ）と決定した。（ＢＡ＋２．５８ＢＳＤ）は９９％信頼区間の上限線を意味し、このような値以上の信号は有意的な信号と見なした。すべての結果分析はシグマプロットＴＭ（Ｓｉｇｍａ ＰｌｏｔＴＭ、ＳＰＳＳ社）を用いて行われ、平均及び標準偏差はマイクロソフトアクセルプログラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて算出した。
【００４９】
その結果、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイによって総５０種の突然変異（５０／２０４、２４．５％）が大腸癌試料で確認された。このうち、２８個は近位大腸癌（２８／１０３、２７．２％）から、また２２個は遠位大腸癌（２２／１０１、２１．８％）から得られた。コドン１２または１３におけるアミノ酸の変異によるミスセンス変異は総４種の形態で検出された。最も頻繁に検出された突然変異は、コドン１３におけるＧＧＣ（Ｇｌｙ）→ＧＡＣ（Ａｓｐ，２１／５０）の変異であった。その残りは、ＧＧＴ（Ｇｌｙ）がＧＡＴ（Ａｓｐ，１６／５０）、ＧＴＴ（Ｖａｌ，８／５０）及びＴＧＴ（Ｃｙｓ、５／５０）に変異されたものであった。しかし、癌患者の正常組職では検出されなかった。
【００５０】
図１ａないし図１ｅは、本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイにＣＤＨ法を適用するか（ＣＤＨ群）または適用しない場合（対照群）のスキャンされたイメージ及びと各信号強度を示す。図１ａはＣｙ５で標識されたｄＣＴＰ（Ｄ２３１−対照群）で増幅させたＤ２３１試料と通常的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２３１−対照群）であり；図１ｂはＣｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４で標識されたｄＣＴＰで増幅させたＤ２３１試料と競争的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２３１−ＣＤＨ）であり；図１ｃはＣｙ３で標識されたｄＣＴＰで増幅させたＤ２８１試料と通常的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２８１−対照群）であり；図１ｄはＣｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４で標識されたｄＣＴＰで増幅させたＤ２８１試料と競争的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２８１−ＣＤＨ）である。コドン１３でのミスセンス変異（ＧＧＣ→ＧＡＣ）はＣｙ５−標識されたｄＣＴＰを利用してＤ２３１試料で検出され、コドン１２でのミスセンス変異（ＧＧＴ→ＧＡＴ）はＣｙ３で標識されたｄＣＴＰを用いてＤ２８１試料で検出した。図１ｅは癌患者の正常組職（陰性対照群）と競争的にハイブリダイゼーションさせた結果を示し、Ｋ−ｒａｓ突然変異は検出されなかった。突然変異は矢印で表示され、スポットされたオリゴヌクレオチドの信号の強度は、野生型信号に基づいて標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）した後にプロットされた。一部の非特異的結合も検出された（＊）。ＣＤＨ群（図１ｂ及び図１ｄ）をその対照群（図１ａ及び図１ｃ）と比較した結果、非特異的結合による信号が減少したことが、これに対し突然変異と野生型と間の信号の割合（Ｒ）は増加したこと（Ｄ２３１：０．９１→１．６６、Ｄ２８１：０．２８→０．５６）を発見した。また、二つの野生型信号（コドン１２及び１３）は少し減少した。これはそれぞれの試料から断片化された野生型ＤＮＡがハイブリダイゼーション時互いに競争したためである。しかし、突然変異ＤＮＡの場合、三つの混合試料内ではほとんど同一の配列を有しないので、互いに競争せずその固有の信号を保った。
【００５１】
突然変異のプロファイルと表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）間に有意的な差があるか否かを調査するために、ＳＰＳＳソフトウェアを通じたχ２またはフィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）を用いて統計学的な分析を行った。この時、α＝０．０５を有意的な水準に設定した。その結果、ＧＧＴ→ＧＡＴ形態は遠位大腸癌（３／２２，ｐ＝０．０１４）より近位大腸癌（１３／２８）でもっと優勢であることを発見し、これは従前の報告と一致するものである（Ｓａｍｏｗｉｔｚ ＷＳ，ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．９：１１９３−７，２０００；ＢｒｉｎｋＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：７０３−１０，２００３）。しかし、Ｋ−ｒａｓ突然変異と性別、年齢、腫瘍の大きさ、分化程度及び癌の進行段階（ＴＮＭ ｓｔａｇｅ）と間には何らの有意的差異も検出されなかった。
【００５２】
実施例３
Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイによって検出された突然変異の確認
本発明のＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイによって検出されたＫ−ｒａｓ突然変異を確認するために、２０４種の大膓癌試料を対象として通常的な方法（Ｐａｒｋ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６４：４８−５３，２００３）によって両方向の配列決定（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。配列決定のために、配列番号：２３及び２４の公知の配列を有するプライマー（Ｌａｇａｒｄａ Ｈ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９３：１９３−９，２００１）を用いた。ＰＣＲは、通常的なｄＮＴＰ混合物を用いることを除いては、実施例２の段階１と同一に行った。
【００５３】
両方向配列決定はＴａｑジデオキシターミネーターサイクルシーケンスキット（Ｔａｑｄｉｄｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ ３１００ ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ３１００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【００５４】
その結果、前記突然変異の結果は直接配列決定とも１００％一致することが確認され、偽陽性（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）及び偽陰性（ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）は全く示していないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１ａ】ＣＤＨ法を用いるか、または用いない、本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて大膓癌でＫ−ｒａｓ突然変異を検出した結果を示す図である。Ｃｙ５で標識されたｄＣＴＰ（Ｄ２３１−対照群）で増幅させたＤ２３１試料と通常的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２３１−対照群）である。
【図１ｂ】ＣＤＨ法を用いるか、または用いない、本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて大膓癌でＫ−ｒａｓ突然変異を検出した結果を示す図である。Ｃｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４で標識されたｄＣＴＰで増幅させたＤ２３１試料と競争的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２３１−ＣＤＨ）である。
【図１ｃ】ＣＤＨ法を用いるか、または用いない、本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて大膓癌でＫ−ｒａｓ突然変異を検出した結果を示す図である。Ｃｙ３で標識されたｄＣＴＰで増幅させたＤ２８１試料と通常的にハイブリダイゼーションさせた結果（Ｄ２８１−対照群）である。
【図１ｄ】ＣＤＨ法を用いるか、または用いない、本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて大膓癌でＫ−ｒａｓ突然変異を検出した結果を示す図である（Ｄ２８１−ＣＤＨ）。Ｃｙ５、Ｃｙ３及びアレクサＴＭ５９４で標識されたｄＣＴＰで増幅させたＤ２８１試料と競争的にハイブリダイゼーションさせた結果である。
【図１ｅ】ＣＤＨ法を用いるか、または用いない、本発明によるＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて大膓癌でＫ−ｒａｓ突然変異を検出した結果を示す図である。癌患者の正常組職（陰性対照群）と競争的にハイブリダイゼーションさせた結果を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
2007534331.tif 000006
【図１ｄ】
2007534331.tif 000007
【図１ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月26日(2006.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007534331.tif 000017
2007534331.tif 000018