(57)【要約】  本発明の主題は、XIII因子調製物の、一時的または永続的な虚血の後の組織の血液潅流の障害と関連した疾患の治療のための、好ましくは注射可能な形態での使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性組織の潅流の刺激に適した、調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【請求項２】
新しい血管の増殖による虚血性組織の潅流の刺激に適した、調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【請求項３】
XIII因子がインビトロまたはインビボで活性化されている、請求項１または２に記載のXIII因子の使用。
【請求項４】
注射可能な、請求項１〜３のいずれかに記載の調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【請求項５】
心筋梗塞症の治療に適した、請求項１〜４のいずれかに記載の調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【請求項６】
虚血性脳卒中または一時的な虚血性発作の治療に適した、請求項１〜４のいずれかに記載の調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【請求項７】
血管性もしくは静脈性閉塞疾患または微小循環の閉塞の治療に適した、請求項１〜４のいずれかに記載の調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【請求項８】
局所適用のための、請求項１〜３のいずれかに記載の調製物の製造のためのXIII因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、XIII因子調製物の、一時的または永続的な虚血の後の血液潅流の障害と関連した疾患の治療のための、好ましくは注射可能な形態での使用である。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から新しい毛細血管が形成される過程であり、そして、胎児の発達、正常な生理的成長、創傷治癒および腫瘍拡張における必須の過程である。血管新生の過程はいくつかの段階より成っており、それには成長因子による内皮細胞の刺激、タンパク分解酵素による細胞外マトリクスの分解、内皮細胞の移動および増殖、ならびに、最終的には毛細血管の形成が含まれる。細胞生存を促進する内皮細胞アポトーシスの阻害は、血管新生において必須であるとも考えられている。内皮細胞の移動および増殖は、血管新生の過程において決定的な段階である。
【０００３】
XIII因子（FXIII）は、血液凝固の最終段階でフィブリン塊を安定化させる血漿トランスグルタミナーゼである。トロンビンで活性化したXIII因子は、隣接するフィブリン単量体のγ−グルタミルとε−リシル残基の間の共有結合型架橋形成を触媒し、成熟した塊を与える。XIII因子は、２個のＡ−サブユニットおよび２個のＢ−サブユニットから構成されたヘテロ四量体として、血漿中を循環している。Ａ−サブユニットはこの酵素の活性部位を含み、そして肝細胞、単球および巨核球により合成される。Ｂ−サブユニットは血漿中で触媒性Ａ−サブユニットの担体として働き、肝臓で合成される。
【０００４】
XIII因子のＡ−サブユニット遺伝子は、少なくとも８個の組織トランスグルタミナーゼを含む、トランスグルタミナーゼ・ファミリーに属している。これらの酵素は種々のタンパク質を架橋し、そして多くの生理学的および病理学的過程、例えば、止血、創傷治癒、腫瘍増殖、皮膚形成およびアポトーシスに関与している。組織トランスグルタミナーゼと同じように、XIII因子は、遺伝的XIII因子欠損症の患者で観察される創傷治癒の不調から推察できるように、組織改造および創傷治癒に関与する。XIII因子はまた正常な妊娠の間の胚の着床にも関与し、XIII因子欠損の同型接合的な女性は再発性の流産を経験する。
【０００５】
胚着床と同様に創傷治癒も、細胞の増殖および血管新生を伴う、複雑な過程である。
【０００６】
活性化XIII因子（FXIIIa）が、内皮細胞の移動、増殖および生存を亢進させることで、血管新生を支持していることも知られている。血管新生のインビトロのモデルにおいて、活性化XIII因子は、マトリゲル（Matrigel）中での脈管形成を著しく増強する。さらに、インビボのモデルにおいて、活性化XIII因子はウサギ角膜中に新しい血管形成を誘導する。活性化XIII因子の血管新生促進作用（proangiogenic effect）は、トロンボスポンジン（TSP-1）のダウンレギュレーションと関連している（Dardik R., Solomon A., Loscalzo J., Eskaraev R., Bialik A., Goldberg I., Schiby G., Inbal A. Novel proangiogenic effect of Factor FXIII (FXIII) associated with suppression of thrombospondin 1 (TSP-1) expression. Arteriose Thromb Vasc Biol 2003; 23: 1472-1477）。
【０００７】
XIII因子が虚血組織における血管新生に関与しているかどうかは、確実には知られていない。ヒト組換え組織トランスグルタミナーゼが、ラット背部皮膚フラップチャンバー（flap chamber）において血管新生を増強させることが示されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、解決すべき課題は、虚血組織における新しい血管の増殖に対するXIII因子の作用を解析することであり、そしてそうした作用が新しい治療用調製物のために使用できるかどうか検討することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
今回、注射可能なXIII因子調製物が、この新しい血管の増殖による虚血組織の潅流を刺激するために使用できることがわかった（そこでは、XIII因子がインビトロで、トロンビンの添加によって活性化され活性化XIII因子を産生している）。XIII因子はまたインビボで投与した後に、生理的なトロンビン経路を介しても（血液凝固系の活性化を意味する）活性化できる。その代わりに、XIII因子調製物を創傷または虚血領域へ局所適用することも可能である。
【００１０】
心筋梗塞症、末梢性血管疾患、虚血性脳卒中および非治癒性創傷の治療のための、顕著な治療効果が、該XIII因子濃縮物を使用することで期待できるだろう。
【００１１】
したがって、XIII因子調製物は、一時的または永続的虚血の後の組織の血液潅流が障害を受けたことに関連する全ての疾患で使用できるだろう。これには動脈性もしくは静脈性閉塞または微小循環の障害による虚血が含まれる。
【００１２】
該XIII因子濃縮物の治療結果は、以下の方法および実験で示されるであろう。
【００１３】
XIII因子活性化
XIII因子の材料はXIII因子濃縮物であるフィブロガミン−Ｐ(R)（アベンテス・ベーリング社）である。活性化XIII因子（FXIIIa）を得るために、再構成した100Ｕ／ml（約1000μg／ml）のXIII因子の２mlを、アフィ−ゲル１０（Affi-gel 10）ビーズ上で固定化したトロンビンと共にインキュベートした。１mlのパックしたビーズ容積にはトロンビン200Ｕが含まれていた。１０ミリモルのＣａＣｌ2を加え、そしてこの混合物を３７℃で２時間インキュベートした。XIII因子の活性化は、発色性アッセイ法（ベリクローム、デードベーリング社）を用いてXIII因子活性を測定することでモニターした。ビーズからXIII因子溶液へのトロンビンの漏出は、トロンビン特異的な発色性基質（S2238、クロモゲニックス、スエーデン）の添加による発色の無いことから、除外された。活性化XIII因子は、３ミリモル／Lのヨードアセトアミド（シグマ社）で、２２℃で３０分間処理し、トランスグルタミナーゼ活性を阻止することによって不活性化された。次いで、遊離のヨードアセトアミドは透析で除去された。
【００１４】
１．ウサギ角膜脈管形成のインビボのモデル
ニュージーランドアルビノ雄性ウサギ（体重3.0kg）をこの試験に使用した。全身性麻酔をキシラジン２％および塩酸ケタミンを筋肉内注射することで行った。２０μgの活性化XIII因子または生理食塩緩衝液（PBS）のいずれかを含む２μLを、ハミルトンシリンジを用いてウサギの角膜に上皮下（subepithelially）注射した。注射部位は、角膜輪部から２mmほど離れた、上部直筋肉の接合部位である。試験した４匹のウサギのそれぞれについて、活性化XIII因子を右角膜中に、そして等容積の生理食塩緩衝液（陰性対照群）を左角膜中に注射した。角膜の臨床検査を、注射前、注射直後、そして次に、最大効果が観察されてから２４時間毎に９６時間まで、実施した。この段階で、ウサギをペントバルビタールの致死量注射でと殺した。角膜を切除し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして、光学顕微鏡による組織学的観察のためにヘマトキシリン−エオジンで染色し、血管の観察のためにGSLI−イソレクチンB4で染色した。
【００１５】
正常な角膜には血管は全く見られない（図１Ａ）。生理食塩緩衝液で処置した左眼とは対照的に、活性化XIII因子を注射してから４８時間後の４匹の全てのウサギの右眼において血管形成が明らかだった（図１Ｂ）。７２時間後には、右眼に、中心部に向かって４ｍｍまで角膜内に進入した、密な血管網構造が観察された（図１Ｃ）。血管網構造の成長は活性化XIII因子注射後９６時間まで継続した。同様な結果が、bFGFで処置したウサギで観察された。図２Ｂで示された角膜の組織学的切片は、生理食塩緩衝液で処置したもの（図２Ａ）とは反対に、XIII因子で処置した眼の角膜中で成長した、密な毛細血管の網構造を証明している。角膜の活性化XIII因子処置切片を、内皮細胞マーカーのイソレクチンB4により染色することにより、血管の陽性染色（図２Ｃ）が示された。
【００１６】
２．XIII因子ノックアウトマウスにおける血管新生
対照群（６匹）、XIII因子ノックアウトマウス（６匹）およびXIII因子で処置したXIII因子ノックアウトマウス（６匹）をペントバルビタール（50mg／kg）の腹腔内注射により麻酔した。マトリゲル（ベクトン・デキンソン社）（0.5mL）、ヘパリン（20単位／ml）、およびｂFGF（200ng／ml）と、活性化XIII因子（フィブロガミン(R)、10〜20単位）を含むかまたは含まない無菌性混合物を、皮下に注射した。２週間経過後、マウスを安楽死させた。マトリゲルプラグを皮下組織から切り出し、そして光学顕微鏡による組織学的検査のためにはヘマトキシリン−エオジンにより、および血管の検査のためにはGSLI−イソレクチンB4により染色した後、解析した。さらに、マトリゲルプラーク中に成長した血管のヘモグロビンを測定した。
【００１７】
ベリクロムアッセイ法により測定された、FXIII -/- マウスの血漿中のXIII因子活性は検出不可能であった。マトリゲル切片の組織学的検査で、対照マウスではノックアウトマウスと比べると、著しい新生血管の数の増加が見られた。図３に示された代表的な写真において、対照動物で形成された新しい血管の量は著しく増加していた。FXIII -/- マウスの群全体の新しい血管の数は、対照マウスに比べて著しく減少して、5.9±1.9対8.8±2.4であり、そしてXIII因子処置後はその数は7.4±2.9、ｐ＝0.004まで増加していた（表１）。血管／マトリゲル組織から測定したヘモグロビンの値（赤血球を含んでいる血管の数を反映している）は、対照群で4.6±2.5μg／mgマトリゲルと、XIII因子ノックアウトマウスでの1.3±1.0μg／mgマトリゲルに対して著しく増加しており、そしてこのヘモグロビンはXIII因子濃縮物で処置したXIII因子ノックアウトマウスでは約２倍増加していた、ｐ＝0.001（表１）。
【００１８】
３．虚血組織（心筋梗塞症）におけるXIII因子の血管新生促進作用
ラットの冠動脈の結紮の後、生理食塩水、bFGFまたは活性化XIII因子の５単位を、先に記載したように、結紮した血管により提供された組織中へカニューレで７日毎に局所注射した。３週間後に動物をと殺して、心臓組織を組織学的検査と血管数の定量検査に付した。この組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、光学顕微鏡による組織学的検査のためにはヘマトキシリン−エオジンにより、および血管の検査のためにはGSLI−イソレクチンB4により染色した。
【００１９】
９匹のラット（活性化XIII因子で処置した３匹、bFGFで処置した３匹、および生理食塩水で処理した３匹）で行った実験において、活性化XIII因子を注射したラットでは、生理食塩水を注射したラットに比べて、心筋虚血後の新しい血管形成の著しい増加が見られた：それぞれ142±15／mm2対64±15／mm2、ｐ＝＜0.001（表２）。bFGF処置動物（陽性対照群）における新しい血管形成の増加は、活性化XIII因子処置マウスで観察されたものに類似していた（144±22／mm2、ｐ＝0.6、表２）。活性化XIII因子、bFGFまたは生理食塩水で処置した動物の血管新生の代表的な写真を図４に示す。副作用が表れた動物は全くいなかった。
【００２０】
４．同系のマウスに移植した新生児心臓の血管新生に対するXIII因子の作用
24時間齢のC57BL／6N新生児マウスの心臓を、同系の宿主マウスの羽状耳に移植した。活性化XIII因子処置群（15匹）または対照群（生理食塩水処置、17匹）を、１−ＥＣＧ；２−心臓の鼓動領域の計測；３−新しい血管形成の数、により移植の１週間後に検査した。
【００２１】
１０日目にマウスをと殺し、移植した心臓組織の組織学的解析を、光学顕微鏡による組織学的検査のためにはヘマトキシリン−エオジンにより、および血管の検査のためにはGSLI−イソレクチンB4により行った。
【００２２】
３２匹の老齢マウスに新生児心臓を移植した：１５匹は活性化XIII因子で処置し、１７匹は生理食塩水を注射された。表３に示したように、移植した心臓の鼓動領域の％は、活性化XIII因子で処置された動物で著しく増加した：それぞれ64.7±32対40.3±29.9、ｐ＜0.001。同様に、活性化XIII因子処置群で、新しい血管の数は著しく多かった：31.7±3.3対21.1±5.7、ｐ＜0.01。
【００２３】
さらに、８０％を超える鼓動領域を有するマウスの数は、活性化XIII因子処置群で、対照群に比べて有意に多かった：それぞれ４６％対１７％、ｐ＝0.038。活性化XIII因子で処置した心臓の生理食塩水中で形成された新しい血管の代表的な写真を図５に示す。活性化XIII因子の投与後に副作用は観察されなかった。
【００２４】
以下の結論がこれらの実験から得られる：
ａ）正常および虚血組織で活性化XIII因子は実質的な血管新生促進作用を示す。
ｂ）虚血組織での活性化XIII因子による新しい血管形成は、新しい血管の成長を介した潅流が重要な臨床症状に関して、一般的な用語では、静脈性および動脈性閉塞ならびに微小循環の障害による一時的または永続的な虚血の後の、組織の血液潅流障害に関連した全ての疾患のための、この化合物の新しい治療の選択肢を開くものである。これには、急性心筋梗塞症、末梢性血管疾患、虚血性脳卒中、一時的な虚血性発作、および非治癒的な虚血性創傷の治療のためのものが含まれる。
ｃ）XIII因子は濃縮フィブロガミン(R)（アベンテス・ベーリング）として市販されている。注射後、XIII因子は内因性トロンビンにより活性化でき、そうでなければ、インビトロで活性化後にその活性型として、局所的に注射できる。したがって、実施可能性のあること、および、副作用のないことが、XIII因子を魅力的な治療薬の候補にしている。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
【表２】
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【００２７】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】生理食塩緩衝液で処理した角膜には血管は全く見られないこと（図１Ａ）、活性化XIII因子を注射してから４８時間後のウサギの右眼において血管形成が認められること（図１Ｂ）、７２時間後には右眼に密な血管網構造が観察されること（図１Ｃ）を示す。
【図２】生理食塩緩衝液で処理した角膜の組織学的切片（図２Ａ）、とは反対に、XIII因子で処理した角膜中に成長した密な毛細血管の網構造（図２Ｂ）が示された。角膜の活性化XIII因子処置切片を、イソレクチンB4で染色して血管の陽性染色（図２Ｃ）が示された。
【図３】マトリゲル切片の組織学的検査で、対照群のマウスではノックアウトマウスに比べて著しい新生血管の増加が見られた。
【図４Ａ】生理食塩水で処置したラット、bFGFで処置したラットおよび活性化XIII因子で処置したラットの血管新生の代表的な写真を示す。
【図４Ｂ】生理食塩水で処置したラット、bFGFで処置したラットおよび活性化XIII因子で処置したラットの血管新生の代表的な写真を示す。
【図５】生理食塩水で処置したマウスの心臓および活性化XIII因子で処置したマウスの心臓の生理食塩水中で形成された新しい血管の写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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