(57)【要約】本発明は、インビトロにおいて神経変性を評価するためのシステムおよび方法に関する。多電極プローブを使用して、種々の化合物の存在下、および神経の損傷を誘導し得るか、または神経の損傷から保護し得る種々の培養条件下で、神経サンプルを培養し、そして、シナプス伝達を測定する。本発明はさらに、神経サンプルにおいて、ニューロン間のシナプス伝達の変化、またはインビトロでの神経変性の変化を評価するためのシステムであって、システムは、基板上の複数の微小電極および培養チャンバを備え、神経サンプルの該シナプス伝達を比較することによって、シナプス伝達の変化を評価するように構成される、システムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおいてニューロン間のシナプス伝達における変化を誘導するか、または神経変性を誘導する化合物を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）神経サンプルと接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された、基板上に複数の微小電極を有するデバイスを提供する工程；
ｂ）該複数の微小電極に該神経サンプルを接触させる工程；
ｃ）該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定する工程；
ｄ）該神経サンプルにおいて酸化的損傷を誘導する酸化的化合物に、該神経サンプルを接触させる工程；
ｅ）工程（ｄ）の後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの第１の結果として生じるシナプス伝達を測定する工程；および
ｆ）該第１の結果として生じるシナプス伝達と、該ベースラインシナプス伝達とを比較する工程
を包含し、該第１のシナプス伝達とベースラインシナプス伝達との間のシナプス伝達の減少により、該酸化的化合物が該神経サンプルにおいて神経変性を誘導することが示される、方法。
【請求項２】
前記酸化的化合物が、過酸化水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、以下：
ｇ）前記神経サンプルを候補化合物に接触させる工程；
ｈ）工程（ｇ）の後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの第２の結果として生じるシナプス伝達を測定する工程；
ｉ）該第２の結果として生じるシナプス伝達を、前記第１のシナプス伝達と比較する工程
をさらに包含し、該第２のシナプス伝達と第１のシナプス伝達との間のシナプス伝達における増加により、該候補化合物が該神経サンプルにおける神経変性に対して保護することが示される、方法。
【請求項４】
前記候補化合物が、グルタミン酸レセプターアンタゴニストを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グルタミン酸レセプターアンタゴニストが、ＭＫ−８０１を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グルタミン酸レセプターアンタゴニストが、メマンチンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記候補化合物が抗酸化物質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記抗酸化物質がビタミンＥを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化的化合物および候補化合物が、前記神経サンプルに同時に接触する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化的化合物および候補化合物が、前記神経サンプルに連続して接触する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定する工程の１つ以上が、前記神経サンプルにより生成される電気波形の振幅を測定する工程を包含する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
インビトロにおいて、ニューロン間のシナプス伝達における変化を誘導するか、または、神経変性を誘導する培養条件を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）神経サンプルと接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極および第１の培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイスを提供する工程；
ｂ）該複数の微小電極に該神経サンプルを接触させる工程；
ｃ）該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定する工程；
ｄ）該神経サンプルを虚血誘導条件に曝露することによって、該第１の培養条件を変更して、第２の培養条件を生成する工程；
ｅ）工程（ｄ）の後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの第１のシナプス伝達を測定する工程；ならびに
ｆ）該第１のシナプス伝達と該ベースラインシナプス伝達とを比較する工程
を包含し、該第１のシナプス伝達とベースラインシナプス伝達との間のシナプス伝達の減少により、該第２の培養条件が該神経サンプルにおいて神経変性を誘導することが示される、方法。
【請求項１３】
前記第１の培養条件を変更する工程が、前記神経サンプルを、完全に希ガスから構成される外気に曝露する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の培養条件を変更する工程が、前記神経サンプルを、完全にアルゴンから構成される外気に曝露する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、該方法は、以下：
ｇ）前記第２の培養条件を変更する工程；
ｈ）工程（ｇ）の後の１つ以上の時点で、前記神経サンプルの第２の結果として生じるシナプス伝達を測定する工程；
ｉ）該第２の結果として生じるシナプス伝達を、前記第１のシナプス伝達と比較する工程
をさらに包含し、該第２のシナプス伝達と第１のシナプス伝達との間のシナプス伝達の増加により、該変更された第２の培養条件が該神経サンプルにおける神経変性に対して保護することが示される、方法。
【請求項１６】
前記第１の培養条件および第２の培養条件が、同時に変更される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の培養条件および第２の培養条件が、連続して変更される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定する工程の１つ以上が、前記神経サンプルにより生成される電気波形の振幅を測定する工程を包含する、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
インビトロにおいて、ニューロン間のシナプス伝達における変化を誘導するか、または神経変性を誘導する培養条件を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）神経サンプルと接触して、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極および第１の培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイスを提供する工程；
ｂ）該複数の微小電極に該神経サンプルを接触させる工程；
ｃ）該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定する工程；
ｄ）該神経サンプルを放射線に曝露することによって該第１の培養条件を変更して、第２の培養条件を生成する工程；
ｅ）工程（ｄ）の後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの第１のシナプス伝達を測定する工程；ならびに
ｆ）該第１のシナプス伝達を、該ベースラインシナプス伝達と比較する工程、
を包含し、該第１のシナプス伝達とベースラインシナプス伝達との間のシナプス伝達における減少により、該第２の培養条件が該神経サンプルにおいて神経変性を誘導することが示される、方法。
【請求項２０】
ニューロン間のシナプス伝達における変化を誘導するか、またはインビトロで神経変性を誘導する培養条件を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）神経サンプルに接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極および第１の培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイスを提供する工程；
ｂ）該複数の微小電極に該神経サンプルを接触させる工程；
ｃ）該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定する工程；
ｄ）該神経サンプルを温度変化に曝露することによって該第１の培養条件を変更して、第２の培養条件を生成する工程；
ｅ）工程（ｄ）の後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの第１のシナプス伝達を測定する工程；ならびに
ｆ）該第１のシナプス伝達を、該ベースラインシナプス伝達と比較する工程
を包含し、該第１のシナプス伝達とベースラインシナプス伝達との間のシナプス伝達における減少により、該第２の培養条件が該神経サンプルにおいて神経変性を誘導することが示される、方法。
【請求項２１】
神経サンプルにおいて、ニューロン間のシナプス伝達の変化、またはインビトロでの神経変性の変化を評価するためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ）神経サンプルに接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極および培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイス；ならびに
ｂ）酸化的化合物の供給源
を備え、該デバイスは、該神経サンプルを該複数の微小電極と接触させて、該神経サンプルの該酸化的化合物への曝露後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの該シナプス伝達を比較することによって、シナプス伝達の変化を評価するように構成される、システム。
【請求項２２】
前記酸化的化合物が、過酸化水素を含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記デバイスが、前記神経サンプルを前記酸化的化合物に曝露する前に、該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定するように適合される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
神経サンプルにおいて、ニューロン間のシナプス伝達の変化、またはインビトロでの神経変性の変化を評価するためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ）神経サンプルに接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極を有するデバイス；および
ｂ）虚血誘導性の培養条件を提供するように適合された、培養チャンバ；
を備え、該デバイスは、該神経サンプルを該複数の微小電極と接触させて、該神経サンプルの該虚血誘導性の培養条件への曝露後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの該シナプス伝達を比較することによって、シナプス伝達の変化を評価するように適合される、システム。
【請求項２５】
前記神経サンプルが、完全に希ガスから構成される大気に曝露される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記神経サンプルが、完全にアルゴンから構成される大気に曝露される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
前記神経サンプルが、酸素を含まない気体に曝露される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
前記デバイスが、前記神経サンプルを前記虚血誘導性の培養条件に曝露する前に、該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定するように適合される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２９】
神経サンプルにおいて、ニューロン間のシナプス伝達の変化、またはインビトロでの神経変性の変化を評価するためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ）神経サンプルに接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極および培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイス；ならびに
ｂ）照射源；
を備え、該デバイスは、該神経サンプルを該複数の微小電極と接触させ、該神経サンプルの照射への曝露後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの該シナプス伝達を比較することによって神経損傷を評価するように適合される、システム。
【請求項３０】
前記デバイスが、前記神経サンプルを照射に曝露する前に、該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定するように適合される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
神経サンプルにおいて、ニューロン間のシナプス伝達の変化、またはインビトロでの神経変性の変化を評価するためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ）神経サンプルに接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極を有するデバイス；および
ｂ）培養チャンバであって、該培養チャンバ内の温度変化を誘導することによって、培養条件を変更するように適合された、培養チャンバ
を備え、該デバイスは、該神経サンプルを該複数の微小電極と接触させ、該神経サンプルの該温度変化への曝露後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの該シナプス伝達を比較することによって、神経損傷を評価するように適合される、システム。
【請求項３２】
前記デバイスが、前記神経サンプルを前記温度変化に曝露する前に、該神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定するように適合される、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
神経サンプルにおいて、ニューロン間のシナプス伝達の変化、またはインビトロでの神経変性の変化を評価するためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ）神経サンプルに接触し、該神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極およびある培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイス；ならびに
ｂ）該神経サンプルへの酸化的損傷を防止するように適合された、化合物の供給源；
を備え、該デバイスは、該神経サンプルを該複数の微小電極と接触させ、該神経サンプルを酸化的化合物、または神経変性に対して保護する培養条件への曝露後の１つ以上の時点で、該神経サンプルの該シナプス伝達を比較することによって、シナプス伝達の変化を評価するように適合される、システム。
【請求項３４】
前記化合物が、抗酸化物質を含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記抗酸化物質がビタミンＥを含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
前記デバイスが、さらに、前記神経サンプルを酸化的化合物に接触させるように適合される、請求項３３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００３年１０月１５日に出願された、米国仮特許出願第６０／５１１，９４８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（分野）
本明細書で記載されるのは、神経変性のインビトロ評価のためのシステムおよび方法である。より具体的には、選択された化合物が、神経変性を誘導するか、または神経変性を保護するのかを評価するためのシステムおよび方法が記載される。このシステムおよび方法はまた、選択された培養条件が、神経変性または神経保護作用を誘導するかどうかを評価するために使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
神経細胞死（例えば、興奮毒性に続く神経変性）の機構のインビトロ研究は、伝統的に、神経細胞の完全性の種々の局面を検出する蛍光マーカーを使用して、初代神経培養、または海馬薄切の器官培養において、実施されている（非特許文献１；非特許文献２；ならびに特許文献３）。これらの方法は、代表的に、標的分子（例えば、遺伝子またはタンパク質）に結合するマーカー、または細胞膜に結合するマーカーを使用する。これらの従来の方法は、神経自体の活性における変化を測定せず、むしろ、ニューロンの死により影響を受ける分子および／または細胞の変化を測定する。一般に、これらの方法は、実行するのが容易であり、そして、可能性のある神経保護化合物の大規模スクリーニングに受け入れられる。しかしこれらは、細胞死をもたらす事象の詳細な時間経過を提供しない上に、ニューロン（またはグリア細胞）の異なる集団の運命を識別しない。
【０００４】
原則として、電気生理学的な技術は、神経変性についての情報を提供するためにより適している。しかし、近年まで、市販の電気生理学的記録デバイスは、わずか１つまたは２〜３のニューロンの活性を記録するに限られていた。さらに、これらは、最大でも６〜１０時間の電気生理学的活性を記録し得たのみであった。
【０００５】
現在、神経培養において（非特許文献４、および非特許文献５）、器官培養において（非特許文献６、および非特許文献７）、および急性期スライス（ａｃｕｔｅ  ｓｌｉｃｅ）において（非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０）、複数のニューロンの活性を同時に記録する平面電極アレイが開発中である。脳スライス内に均一に分配された６４もの電極から記録するデバイスがまた、Ｓｕｇｉｈａｒａらに対する特許文献１および特許文献２に記載されており、これらの特許文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。代表的な海馬スライスにおいて、これらのアレイは、全ての海馬亜領域におけるニューロンの電気生理学的状態をモニターし得る（非特許文献１１および非特許文献９）。しかし、これらの文献のいずれもが、損傷されたかまたは死につつあるニューロンの電気活性に対する、化合物または他の実験操作の慢性的な効果を研究するための方法を記載していない。
【０００６】
神経変性は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、血管性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、虚血およびダウン症候群のような状態の病態生理に関与している。これらの状態についての神経損傷の病因学は、興奮毒性による神経損傷（興奮毒性）または酸化的損傷のような病理的機構に起因している。従って、神経損傷を評価および予防するためのシステムおよび方法は、優位な医療上の利益を提供し得る。
【特許文献１】米国特許第６，２９７，０２５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１３２，６８３号明細書
【非特許文献１】Ｖｏｒｎｏｖ  Ｊ．Ｊ．およびＣｏｙｌｅ  Ｊ．Ｔ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９１）５６：９９６−１００６
【非特許文献２】Ｃｈｏｉ  Ｄ．Ｗ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，（１９９２）２３：１２６１−１２７６
【非特許文献３】Ｂｒｕｃｅら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９５）１３２：２０９−２１９
【非特許文献４】Ｐｉｎｅ  Ｊ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９８０）２：１９−３１
【非特許文献５】Ｇｒｏｓｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９８２）５：１３−２２
【非特許文献６】Ｓｔｏｐｐｉｎｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９７）７２：２３−３３
【非特許文献７】Ｅｇｅｒｔら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．，（１９９８）２：２２９−２４２
【非特許文献８】Ｎｏｖａｋ  Ｊ．Ｌ．およびＷｈｅｅｌｅｒ  Ｂ．Ｃ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９８）２３：１４９−１５９
【非特許文献９】Ｏｋａら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９９）９３：６１−６７
【非特許文献１０】Ｇｈｏｌｍｉｅｈら，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，（２００１）１６：４９１−５０１
【非特許文献１１】Ｓｔｏｐｐｉｎｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９７）７２：２３−３３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、神経変性を評価するためのシステムおよび方法を提供する。具体的には、候補化合物または培養条件が、神経損傷を誘導するか、または神経損傷に対して保護するかを評価するためのシステムおよび方法が記載される。
【０００８】
１つのバリエーションにおいて、選択された化合物がインビトロにおいて神経変性を誘導するかどうかを評価するための方法は、以下の工程を包含する：１）神経サンプルと接触し、神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極を有するデバイスを提供する工程；２）神経サンプルを複数の微小電極に接触させる工程；３）神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定する工程；４）神経サンプルを第１の候補化合物に接触させる工程；５）神経サンプルを第１の候補化合物に接触させた後の１つ以上の時点で、神経サンプルの第１の結果として生じるシナプス伝達を測定する工程；および６）この第１の結果として生じるシナプス伝達をベースラインシナプス伝達と比較する工程。第１のシナプス伝達とベースラインシナプス伝達との間のシナプス伝達の減少は、一般に、候補化合物が神経サンプルにおいて神経変性を誘導することを示す。
【０００９】
あるいは、この手順は、上記の工程１〜５を実施した上で、さらに、神経サンプルを第２の候補化合物に接触させ；神経サンプルを第２の候補化合物に接触させた後の１つ以上の時点で、神経サンプルの第２の結果として得られるシナプス伝達を測定し；そして、第２の結果として得られるシナプス伝達と第１のシナプス伝達とを比較することによって、候補化合物が神経損傷に対して保護するかどうかを決定するために使用され得る。第２のシナプス伝達と第１のシナプス伝達との間のシナプス伝達の増加は、一般に、第２の候補化合物が、神経サンプルにおいて神経変性に対して保護するいくつかの基準を提供することを示す。
【００１０】
本明細書中に記載されるシステムおよび方法は、神経損傷を誘導する培養条件を検出または評価するために使用され得る。この方法は、以下の工程を包含し得る：
１）神経サンプルと接触し、神経サンプルに電気刺激を適用するように構成された基板上の複数の微小電極および第１の培養条件を提供する培養チャンバを有するデバイスを提供する工程；２）神経サンプルを複数の微小電極に接触させる工程；３）神経サンプルのベースラインシナプス伝達を測定する工程；４）第１の培養条件を変更して、第２の培養条件を生成する工程；５）第１の培養を変更して第２の培養条件を生成した後の１つ以上の時点で神経サンプルの第１のシナプス伝達を測定する工程；ならびに６）第１のシナプス伝達をベースラインシナプス伝達と比較する工程。第１のシナプス伝達とベースラインシナプス伝達との間のシナプス伝達の減少は、一般に、第２の培養条件が、神経サンプルにおいて神経変性を誘導することを示す。
【００１１】
さらなるバリエーションにおいて、神経損傷に対して少なくとも部分的な保護をもたらす培養条件は、上記の工程１〜５を実施した上で、さらに、第２の培養条件を変更し；第２の培養条件を変更した後の１つ以上の時点で神経サンプルの第２の結果として生じるシナプス伝達を測定し；そして、第２の結果として生じるシナプス伝達と第１のシナプス伝達とを比較することによって、評価され得る。第２のシナプス伝達と第１のシナプス伝達との間のシナプス伝達の増加は、一般に、変更された第２の培養条件が、神経サンプルにおいて、神経変性に対して保護することを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
インビトロで神経変性を評価するためのシステムおよび方法が本明細書中に記載される。「神経変性」または「神経損傷」とは、ニューロン間のシナプス伝達における変化（しばしば、ニューロン間のシナプス伝達が減少するような、１つ以上のニューロンの損傷または死）を意味する。このシステムおよび方法は、以下にさらに記載される多電極デバイスを使用して、神経サンプルのシナプス伝達活性を測定し得る。本明細書中で使用される場合、用語「神経サンプル」とは、文脈内において、多様に、個々のニューロン、神経細胞の凝集体、神経細胞の１つ以上の層、および神経組織スライスを指す。具体的には、いくつかの型のパラメータ（例えば、電気波形）が測定されるとき、この「文脈」とは、「神経サンプル」が測定可能なパラメータ値を生成するのに十分な大きさであることであり得る。多電極デバイスがシナプス伝達を測定する１つの方法は、神経サンプルの特定の部分により生成された電気波形の振幅を測定することによるものである。例えば、電気波形の振幅における減少は、代表的に、シナプス伝達の減少を示し、そして、電気波形の振幅における増加は、代表的に、シナプス伝達の増加を示す。
【００１３】
（神経変性を評価するための多電極デバイス）
本明細書中に記載されるシステムおよび方法は、Ｓｕｇｉｈａｒａらに対する米国特許第６，１３２，６８３号において以前に記載された、多数の細胞電位測定電極を備えるデバイスを使用して、ニューロンおよび神経サンプルの電気活性を得、そして、記録し得る。Ｓｕｇｉｈｒａらのデバイスは、その公開されたバリエーションの全てにおいて、一般にＭＥＤプローブと呼ばれる。以下に記載されるシステムおよび手順に必要とされる程度に議論される、神経電位活性を測定して、特定の様式で電気的興奮を提供するのに適した複数の電極部位を有する他のデバイスがまた、記載されるシステムおよび手順の実施に適している。特定の例において、本発明者らは、他の機能的に類似するか、またはその他の点で適切なデバイスが選択され得る場合には、ＭＥＤプローブの使用について言及し得る。
【００１４】
簡単に述べると、ＭＥＤプローブは、おそらく絶縁基板上に物理的に隔離された複数の微小電極を備え、そして、一般に、この微小電極領域の外のいくつかの領域に微小電極を接続するための導電パターンを有する。特定の様式として、このデバイスはまた、導電パターンの終端に接続された電気接点（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｃｏｎｔａｃｔ）を有し得、絶縁フィルムがこの導電パターンの表面を覆い得、そして、壁がこの絶縁フィルムの表面上において、微小電極を備える領域を取り囲み得る。ＭＥＤのいくつかのバリエーションにおいて、測定用微小電極のインピーダンスよりも比較的低いインピーダンスを有する参照電極が、壁によって囲まれた領域内の複数の位置に、そして、しばしば、微小電極から特定の距離で配置される。この電気接点は、さらに、通常、各参照電極の配線のための導電パターンと、導電パターンの終端との間で接続される。参照電極の配線のための導電パターンの表面は、代表的には、絶縁フィルムで覆われる。さらに、ＭＥＤプローブの多くのバリエーションは、プローブ上に置かれた神経サンプルを光学的に測定または観察するための光学式観察デバイス（例えば、倒立顕微鏡）、サンプルに対して刺激信号を与え、そして、サンプルからの出力信号を処理するためのコンピュータ、およびサンプルの周りの培養環境を維持するための培養チャンバを備える。
【００１５】
コンピュータは、代表的には、測定用／刺激用ソフトウェアがインストールされたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）である。このコンピュータおよび多電極デバイスは、測定のために、Ｉ／Ｏ基板を通じて全体的に接続される。このＩ／Ｏ基板は、代表的には、Ａ／ＤコンバータとＤ／Ａコンバータの両方を備える。Ａ／Ｄコンバータは、通常、得られる電位を測定および変換するためのものであり；Ｄ／Ａコンバータは、サンプルに対して刺激信号を送るためのものである。例えば、Ａ／Ｄコンバータは、１６ビット、６４チャネルを有し得、そして、Ｄ／Ａコンバータは、１６ビット、８チャネルを有し得る。この場合、手順の間にシナプス伝達の時間に関する変動を決定し得るソフトウェアが、ＰＣにインストールされ得る。
【００１６】
サンプルに刺激を提供するための１つの代表的な手順は、以下である：刺激信号がコンピュータから発行されると、刺激信号が、Ｄ／Ａコンバータおよびアイソレーターを通って多電極デバイスに送信される。各微小電極と参照電位との間に生じる、誘導的、誘発的、または自然発生的な電位が、６４チャネルの高感度増幅器およびＡ／Ｄコンバータを通って、コンピュータへと通過する。この増幅器の増幅係数は、例えば、約０．１〜１０ｋＨｚ、または約０．１〜２０ｋＨｚの周波数帯において、例えば、約８０〜１００ｄＢであり得る。しかし、低域遮断フィルタを用いて、刺激信号により誘導される電位を測定する場合、周波数帯は、１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚである。自然発生的な電位は、通常、１００Ｈｚ〜２０Ｈｚの範囲である。
【００１７】
データの分析または処理のために、フーリエ関数変換（ＦＦＴ）分析、コヒーレンス分析、および相関分析が採用され得る。有用な関数としては、波形の識別を使用する単一スパイク分離関数、時間プロフィール表示関数、トポグラフィー表示関数、および電流源密度分析関数が挙げられ得る。
【００１８】
培養チャンバは、一般に、温度制御装置、培養流体循環デバイス、および、例えば、空気と二酸化炭素の混合ガスを供給するためのフィーダーを備える、培養システムの一部であり得る。この培養システムは、代わりに、市販のマイクロインキュベーター、温度制御装置、およびＣＯ２シリンダーから構成され得る。マイクロインキュベーターは、ペルチエの要素を使用して、０℃〜５０℃の範囲の温度を制御するために使用され得、そして、３ｍｌ／分以下の液体供給速度、および１Ｌ／分以下の気体流速に適用可能である。あるいは、他の設計の温度制御装置を組み込んだマイクロインキュベーターが使用され得る。
【００１９】
（神経変性を評価するための方法）
代表的に、神経変性を評価するための方法は、それぞれ、実施例１、２および３に記載されるような、ＭＥＤプローブおよび神経サンプル調製物、ならびにベースライン電気波形の記録を必要とする。神経サンプルは、脳または脊髄のあらゆる領域（海馬、黒質、小脳、視床、視床下部などが挙げられるがこれらに限定されない）から採取され得る。
【００２０】
本発明者らは、「検出する」および「評価する」との用語を、多数の方法で使用する。本明細書中に記載される手順は、化合物の有無を「検出する」ため、そしてまた、影響を受けたパラメータを測定し得るデバイスまたは手順を用いて測定可能な、神経サンプルのパラメータに対する変化を生じるという観点で、化合物の相対的効力を「検出」するために使用される。用語「評価する」は、同様に使用される。
【００２１】
１つのバリエーションにおいて、上記方法は、神経損傷を誘導し得る化合物を検出する。ベースラインシナプス伝達が記録された後に、候補化合物が培養培地に添加され、その結果、候補化合物がサンプルと接触する。次いで、シナプス伝達が、研究者の好みにより、候補化合物の導入後の種々の時点（例えば、３時間、１日、２日もしくは３日、またはそれ以上）で記録される。一般に、ベースライン（コントロール）シナプス関数と比較してシナプス伝達の減少が観察されることは、実施例４にさらに例示されるように、神経損傷が生じていることを示している。
【００２２】
神経変性を誘導し得る化合物としては、グルタミン酸レセプターアゴニストのような興奮毒性分子が挙げられ得る。グルタミン酸レセプターアゴニストの例としては、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）が挙げられる。
【００２３】
神経変性を誘導し得る他の化合物としては、酸化的損傷を生じる酸化的化合物が挙げられ得る。本明細書中で使用される場合、「酸化的損傷」とは、酸化的化合物によって生じた、神経細胞または組織に対する損傷をいう。用語「酸化的化合物」とは、一般に、物質を酸化する能力を有する化合物をいう。酸化的損傷を誘導し得る酸化的化合物の例としては、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のような反応性酸素種、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、一酸化窒素、オゾン、チイルラジカル（ｔｈｉｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ）および炭素中心ラジカル（例えば、トリクロロメチルラジカル）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
別のバリエーションにおいて、この方法は、神経損傷に対して保護し得る候補化合物（神経保護物質または神経保護化合物）を検出する。ベースラインシナプス伝達が記録された後、候補化合物が培養培地に添加され、その結果、候補化合物がサンプルと接触する。次いで、研究者の好みにより、候補化合物の導入後の種々の時点（例えば、３時間、１日、２日もしくは３日、またはそれ以上）でシナプス伝達が記録される。ベースライン（コントロール）シナプス関数と比較して、シナプス伝達の増加が観察されることは、一般に、実施例５〜７にさらに例示されるように、神経損傷に対する保護が生じていることを示す。
【００２５】
神経損傷に対して保護し得る候補化合物としては、グルタミン酸レセプターアンタゴニストおよび抗酸化物質が挙げられ得る。グルタミン酸レセプターアンタゴニストの例としては、ＭＫ−８０１およびメマンチンが挙げられる。ビタミンＥ、ビタミンＣおよびグルタチオンが、抗酸化物質として使用され得る。
【００２６】
さらなるバリエーションにおいて、この方法は、神経損傷を誘導する培養条件を検出する。代表的には、ベースラインシナプス関数を得るために使用される培養条件が、培養培地の温度変化もしくはｐＨの変化のような操作によってか、神経変性誘導性化合物の供給源を導入することによってか、神経サンプルを照射に曝露することによってか、または、酸素もしくはサンプルの生存度を維持するために必要とされる他の因子をサンプルから取り除くことによって変更される。なおさらなるバリエーションにおいて、この方法は、神経損傷に対して保護する培養条件を検出する。保護的な培養条件としてはまた、培養培地の特定の温度またはｐＨ範囲、神経保護化合物の供給源の導入、または照射への曝露が挙げられ得る。
【００２７】
別のバリエーションにおいて、神経保護物質を検出するために、予め存在する欠点を有する神経サンプルを使用することが好ましくあり得る。例えば、この欠点は、遺伝的に改変された動物において見られるように、遺伝的に誘導され得る。欠点はまた、機械的に作製され、その結果、物理的な外傷が神経サンプルにおいて生成され得る。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例は、本明細書中に記載される発明を使用する様式をより完全に記載するのに役立つ。これらの実施例は、決して、本発明の範囲を限定するためのものではなく、例示的な目的で提示されるものであることが理解される。
【００２９】
（実施例１  ＭＥＤプローブの調製）
使用前に、ＭＥＤプローブ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ，型番ＭＥＤ−Ｐ５３０ＡＰ、各電極：５０×５０μｍ、極間距離：３００μｍ）を、７０％エタノール中に１５分間浸漬し、乾燥させ、次いで、ＵＶ照射で１５分間滅菌した。このプローブ表面を、室温にて一晩、０．１％ポリエチレンイミンおよび２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）で処理した。次いで、このプローブ表面を、乾燥させ、滅菌蒸留水で３回リンスした。最後に、このプローブを培養培地で満たし、使用まで（少なくとも１時間）ＣＯ２インキュベーター内で保存した。培養培地は、基礎培地であるイーグル培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ９６３８）およびアール平衡化塩溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ７５１０）の２：１混合物に、以下の化合物（ｍＭ）：ＮａＣｌ（２０）、ＮａＨＣＯ３（５）、ＣａＣｌ２（０．２）、ＭｇＳＯ４（１．７）、グルコース（４８）、ＨＥＰＥＳ（２６．７）；５％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２６０５０）および１０ｍｌ／Ｌペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１０３７８）を補充したものであった。次いで、培養培地のｐＨを、７．２に調整した。
【００３０】
（実施例２  神経サンプルの調製）
培養物調製のための全ての手順を、無菌ベンチ内で行なった。１１日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、まず、７０％エタノールで滅菌して、麻酔した後に断頭により屠殺し、脳全体を取り出した。この脳を、直ちに、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、Ｔｒｉｓベース（１０ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（３ｍＭ）を補充した滅菌氷冷ＭＥＭ（ｐＨ７．２；ＧＩＢＣＯ、カタログ番号６１１００）に浸漬した。次いで、脳の適切な部分を、手で切り取って、残りの脳の塊を、振動組織薄切機（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｌｉｃｅｒ）（Ｌｅｉｃａ、型番Ｖｔ１０００Ｓ）の氷冷ステージの上に置いた。スライスの厚みは、２００μｍに設定した。このスライスを、ピペットを用いてそっと刃から取り外した。各スライスを切り取り、予め上記のようにコーティングしたＭＥＤプローブの中心に置き、そして、８×８微小電極アレイを覆うように位置決めした。
【００３１】
ＭＥＤプローブ上に切片を位置決めした後、切断用溶液を除去し、界面レベルまで培養培地をスライスに添加した（約２５０μｌ）。滅菌蒸留水をプローブの周りに添加して、湿度を高め、ＭＥＤプローブ内の培養培地が乾燥し過ぎることを防止した。次いで、ＭＥＤプローブ上のスライスを、ＣＯ２インキュベーター内で３４℃にて保存した。培地を、毎日半量ずつ交換した。
【００３２】
図１Ａは、ＭＥＤプローブ上で１週間培養した海馬スライス、および電極の位置を示す。実験条件下では、ＭＥＤプローブ上での培養において少なくとも２週間の間には、明らかな形態学的な変化は認められなかった。スライスからの細胞のわずか〜中程度の移動が観察された。これは、通常、１４〜２０日後に始まった。スライスのいくつかの平坦化がまた、インビトロでの２週間後に生じ、これは、誘発される興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）の記録を妨害しなかった。
【００３３】
最初の７日のインビトロ培養の間に、ｆＥＰＳＰの振幅にいくらかの増加が観察された；しかし、７〜１０日後、応答は安定し、その後の記録期間にわたって安定なままであった。これらの結果は、Ｍｕｌｌｅｒら（Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１：９３−１００（１９９３））の知見と一致する。結果として、本明細書中に記載される全ての実験は、ＭＥＤプローブ上でスライスを少なくとも１０日培養した後に行なった。
【００３４】
（実施例３  ベースライン電気生理学的記録）
海馬サンプルにおけるベースライン電気生理学的記録のために、サンプルを含むＭＥＤプローブを、インキュベーターから取り出し、３４℃にてより小さなＣＯ２インキュベーター内に置き、プローブの刺激／記録コンポーネントに接続した。培養培地を、以下の組成（ｍＭ）の滅菌人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）と置き換えた：ＮａＣｌ（１２４）、ＮａＨＣＯ３（２６）、グルコース（１０）、ＫＣｌ（３）、ＮａＨ２ＰＯ４（１．２５）、ＣａＣｌ２（２）、ＭｇＳＯ４（１）、およびＨＥＰＥＳ（１０）。
【００３５】
次いで、６４の全ての部位における誘発場電位を、多チャネル記録システム（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、ＭＥＤ６４システム）を用いて、２０ｋＨｚのサンプリング速度で同時に記録した。６４の利用可能な平面微小電極の１つを、カソード刺激のために使用した。次いで、双極性定電流パルス（１０〜４５μＡ、０．１ミリ秒）を生成した。場ＣＡ１における代表的な応答を集めるために、シャファー側枝繊維内の電極の１つを、刺激電極として選択し、放射線維層にあるもう一方の電極を、記録電極として選択した。シナプスの応答を、８段階の刺激強度（１０〜４５μＡ、５μＡ段階）で記録した。各記録セッションの後、ＡＣＳＦを、培養培地で置き換え、プローブ内のサンプルをＣＯ２インキュベーターに戻した。
【００３６】
ｆＥＰＳＰを、５０ミリ秒のパルス間隔を有するペアドパルス刺激パラダイム（ｐａｉｒｅｄ−ｐｕｌｓｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｄｉｇｍ）を使用して、２０秒間隔で記録した。図１Ｂに示されるように、ペアドパルスによる促進が代表的に観察された。応答の勾配および減衰時間は、同じシステムを用いて急いで調製したスライスにおいて記録されたものと著しく類似した（図２Ｃ）。しかし、一般に、刺激のアーチファクト後の減衰が、培養条件において観察され、これは、以前に報告された（Ｂｕｃｈｓら、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１：８１−９１（１９９３））ように、培養したスライスにおける軸索の有髄化の欠如によるものである可能性がある。
【００３７】
試験される化合物により生成される効果の良好な評価を得るために、コントロール（ベースライン）実験を、試験化合物を含む実験と平行して行なった。全ての実験において、コントロールサンプルにおけるｆＥＰＳＰの振幅を、健常な組織から生成された振幅であるものとみなした。種々の刺激電流（１０〜４５μＡの範囲）を使用して、対応するｆＥＰＳＰを得た（図２Ａ）。ｆＥＰＳＰのピークで測定した振幅を、刺激電流の関数としてプロットし、従って、入出力（Ｉ／Ｏ）曲線を提供し（図２Ｂ）、これはまた、急性期の海馬スライスにおいて得られたものと非常に類似していた（図２Ｄ）。
【００３８】
（実施例４  ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡにより誘導される神経変性）
一般に、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡのいずれかに慢性的に曝露された、培養海馬サンプルのインキュベーションは、シナプス応答の用量依存的な減少をもたらした。ＮＭＤＡ（１０μＭ）またはＡＭＰＡ（１μＭ）の存在下でのインキュベーション前、およびその後の種々の時間における代表的なＩ／Ｏ関係およびｆＥＰＳＰ記録を、図３に示す。
【００３９】
１０μＭのＮＭＤＡの存在下でのインキュベーションの３時間後、シナプス応答の最大振幅は、コントロール値の１８±４％（ｎ＝３）まで減少し、そしてこの減少は、その後のインキュベーション期間の間に有意に変化しなかった（図３Ａ、代表的な記録を図３Ｃに示す）。
【００４０】
１μＭのＡＭＰＡを３時間適用したとき、シナプス応答における減少はより小さく、この応答は、その後の時点で減少し続け、１日後に安定した（図３Ｂ、代表的な記録を図３Ｄに示す）。
【００４１】
これらの２つの興奮毒とのインキュベーションにより生成されたシナプス応答の振幅における減少の裏側にある機構を、種々の濃度のＮＭＤＡおよびＡＭＰＡを組織サンプルに適用することによってさらに研究した。コントロール実験において、各々のＩ／Ｏ曲線のプラトー値を分析のために使用した（図４Ａおよび４Ｂ）。用量応答曲線をＨｉｌｌ関数にフィットさせると、それぞれ、１．７±０．２および２．６±０．８のＨｉｌｌ係数で、ＮＭＤＡについて５．２±０．５μＭおよびＡＭＰＡについて０．８１±０．１μＭのＥＣ５０値を生じた。比較のために、ＰＩ取り込み法により得た用量応答曲線を同じ図面にプロットした（図４Ａおよび４Ｂ、白丸および点線）。ＰＩ取り込み法からのＥＣ５０値は、ＮＭＤＡについて２１．６±３．４μＭ、そして、ＡＭＰＡについて３．８７±０．１μＭであり、Ｈｉｌｌ係数は、それぞれ、３．７±１．０および２．０±０．１であった。電気生理学により得られた用量応答曲線は、左にむかってシフトし、そしてまた、ＰＩ法で観察されたものよりも全体的に勾配が少なく（少なくともＮＭＤＡについては）、これらの２つの方法が、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡにより活性化される異なる細胞機構を明らかにすることを示唆した。
【００４２】
この疑問にさらに対処するために、アゴニスト除去後のシナプス応答の回復についての経時変化を調べた。１０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での４０分間、３時間、１日、および３日のインキュベーションの終了時において、シナプス応答の振幅は、それぞれ、コントロール値の４８±１２％、２２±７％、１３±３％および１１±３％であった（ｎ＝３）。しかし、図５に示されるように、同じ条件下でＮＭＤＡを洗い流した１時間後には、シナプス応答は、それぞれ、最初の振幅の１０９±４％、６６±５％、５２±２％、および１８±３％であり、これは、シナプス応答が、実際に次第に減少し、ＮＭＤＡでの連続処理の３日後にのみ、不可逆的に消失することを示す。類似の結果が、ＡＭＰＡについても得られた：３μＭのＡＭＰＡの存在下での４０分のインキュベーションが、シナプス応答の振幅の大きな減少（コントロール値の１２±５％）をもたらし、ＡＭＰＡを除去後の１時間で、応答がコントロールの９３±２％まで回復し（ｎ＝３）；１μＭのＡＭＰＡの存在下での３日間のインキュベーションによって、４６±４％（ｎ＝３）までシナプス応答の振幅を減少し、ＡＭＰＡの除去の２４時間後でさえ、回復が観察されなかった（結果は示さず）。
【００４３】
従って、本発明者らの実験の早い時点でのシナプス応答の部分的な回復は、神経変性のみが、シナプス伝達の減少に寄与するという可能性は低いということを示唆する。シナプス伝達のさらなる抑制は、グルタミン酸レセプターチャネルのアゴニスト誘導性の開口、およびその後の神経脱分極に起因して起こり得る。さらに、神経蘇生が可能であり得る手段の同定を可能にするので、このデータは有用である。
【００４４】
（実施例５  神経保護物質を検出するための方法）
神経保護物質を同定するためのアッセイは、第１に、実験の最初に測定されたｆＥＰＳＰ振幅を、後（例えば、同じ刺激強度で、少なくとも３時間、２４時間、４８時間、および７２時間後）に測定されたｆＥＰＳＰ振幅と比較することによって、記録の安定性を試験することを必要とする（図１Ｃ）。データ分析のために、Ｉ／Ｏ曲線の最大（プラトー）値の振幅を使用して、記録の安定性を決定する。代表的には、これは、３０〜４０μＡの刺激強度により得られる応答に相当する（図２Ｂ）。２３のコントロール実験から得られた記録は、慢性記録の３日後のｆＥＰＳＰの相対振幅が、コントロール値の１０７±４％（ｎ＝２３）であったことを示し、これは、測定期間全体にわたる振幅のわずかな増加を示す（インビトロ（ＤＩＶ）で１０〜１３日、データ示さず）。
【００４５】
より長いインキュベーション期間（すなわち、２０日のＤＩＶ）について、応答の振幅は、コントロール値の１０７±４％であることが分かった（ｎ＝２）。１つのサンプルにおいて、記録は、４５日のＤＩＶ後でさえ可能であったが、振幅が約５０％減少していた。しかし、本研究において、全ての結果が、２０日のＤＩＶまでの培養サンプルについて示される。
【００４６】
（実施例６  ＭＫ−８０１の神経保護作用）
実施例６は、ＭＫ−８０１が神経保護物質であることを実証する。ＮＭＤＡを興奮毒として選択した。上記の用量応答分析（図４Ａ）に基づいて、１０μＭのＮＭＤＡを、この神経保護物質アッセイにおいて使用するためのアゴニストの濃度として選択した。本発明者らは、慢性的にＮＭＤＡに曝露された神経サンプルに対するＭＫ−８０１の神経保護作用を評価することに関心があったので、本発明者らは、もしあったとしても、アッセイの最初の３時間内に得られた結果については分析しなかった。神経サンプルおよびＭＥＤプローブを、上に記載されたように調製した。
【００４７】
コントロールの測定を行なった後、神経サンプルを、１０μＭのＮＭＤＡおよび１μＭのＭＫ−８０１を含む培養培地中で、種々の期間にわたってインキュベートした。これらの条件下で、シナプス応答は、インキュベーションの３時間〜３日でわずかに抑制されたのみであり（図６Ａ）、１μＭのＭＫ−８０１が、ほぼ完全に、ＮＭＤＡ媒介性の神経毒性に対してシナプス伝達を保護したことを示し、この結果は、異なるシナプス損傷のマーカーを使用した以前の研究（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，１９８９；Ｐｒｉｎｇｌｅら；Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，２００１）とも一致している。インキュベーションの３日後のＩ／Ｏ曲線のプラトーに対応する刺激強度で測定したシナプス応答の相対振幅は、コントロールの９１±６％（ｎ＝３）であった。
【００４８】
さらに、１μＭのＭＫ−８０１のみの存在下での神経サンプルのインキュベーションは、１日後にシナプス応答の減少を生じた。興味深いことに、シナプス応答は、インキュベーションの３時間後には影響を受けなかった（図７Ａ）。しかし、インキュベーションの１日後、２日後および３日後には、応答の振幅は、それぞれ、コントロールの８３±６％、７９±１１％、および７６±１０％まで減少した（ｎ＝３）。これらの振幅の減少は、１０μＭのＮＭＤＡの存在下で１μＭのＭＫ−８０１により生成された振幅の減少とは有意には異ならなかった（図６Ａ）。
【００４９】
（実施例７  メマンチンの神経保護作用）
実施例７は、メマンチンが神経保護物質であることを実証する。ＮＭＤＡを、興奮毒として選択した。上記の用量応答分析（図４Ａ）に基づいて、１０μＭのＮＭＤＡを、この神経保護物質アッセイにおいて使用するためのアゴニストの濃度として選択した。本発明者らは、慢性的にＮＭＤＡに曝露された神経サンプルに対するメマンチンの神経保護作用を評価することに関心があったので、本発明者らは、もしあったとしても、アッセイの最初の３時間内に得られた結果については分析しなかった。神経サンプルおよびＭＥＤプローブを、上に記載されたように調製した。
【００５０】
コントロールの測定を行なった後、神経サンプルを、１０μＭのＮＭＤＡおよび３０μＭのメマンチンを含む培養培地中で、種々の期間にわたってインキュベートした。図６Ｂに示されるように、シナプス応答は、インキュベーションの３日までは有意に保護されたので、保護のパターンは、ＭＫ−８０１のものと比較的類似していることが分かった。しかし、保護の程度は、ＭＫ−８０１により提供されるものよりもかなり小さく、最初の振幅の７８±５％（ｎ＝３）のみが、これらの条件下で保護された。メマンチンの保護の濃度依存性について、１０μＭのＮＭＤＡおよび種々の濃度のメマンチンを用いて研究した。図６Ｃに示されるように、用量応答曲線をＨｉｌｌ方程式に当てはめ、６．９±１．６μＭのＩＣ５０値を提供し、Ｈｉｌｌ係数は１．１±３であった。
【００５１】
ＭＫ−８０１とは対照的に、メマンチンのみの存在下での神経サンプルの長期インキュベーションは、３０μＭであってもシナプス伝達の有意な減少を生じなかった（図７Ｂ）。
【００５２】
（実施例８  虚血により誘導される神経変性）
神経サンプルの調製、およびベースライン電気生理学的記録の測定を、それぞれ、実施例２および３に記載したように行なう。サンプルを、１２６ｍＭ  ＮａＣｌ；３ｍＭ  ＫＣｌ；１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；１ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；１０ｍＭ  Ｄ−グルコース；および２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む記録用溶液中で洗浄する。次いで、ｐＨを約７．３に調整する。次いで、このサンプルを、気密プラスチックチャンバ内に入れ、完全にアルゴンからなる大気に曝露する。スライスをこのチャンバ内で約６０〜９０分間インキュベートする。次いで、シナプス伝達を、実施例４に記載されるように測定する。
【００５３】
この実施例は、完全にアルゴンからなる大気を使用して組織の虚血を誘導するが、他の希ガス（例えば、クリプトン、キセノンおよびラドン）または他の適切な酸素を含まない気体もまた使用され得る。
【００５４】
（実施例９  酸化的損傷により誘導される神経変性）
神経サンプルの調製、およびベースライン電気生理学的記録の測定を、それぞれ、実施例２および３に記載したように行なう。
【００５５】
次いで、１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を、約２５μＭと７５μＭとの間の濃度でこの培養培地に加える。サンプルを、Ｈ２Ｏ２と共に約１時間インキュベートする。次いで、シナプス伝達を、実施例４に記載されるプロトコールと同様に、２４時間後に測定する。
【００５６】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されることが示されるのと同じ程度まで、その全体が、あらゆる目的のために、参考として本明細書により援用される。上記の発明は、理解を明確にする目的で説明および例示のために、いくらか詳細に説明してきたが、特定の改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることは、本発明の教示に鑑みて、当業者に容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１Ａは、ＭＥＤプローブ上で培養した海馬サンプルのデジタル画像である。図１Ｂは、ペアドパルス刺激パラダイムを使用して得られた電気波形を示す。図１Ｃは、候補化合物のスクリーニングアッセイにおいて取られた電気波形の振幅測定のタイムラインを示す。
【図２】図２Ａは、種々の電流強度での刺激の後に得られた電気波形を示す。図２Ｂは、刺激強度の関数として、電気波形のピーク振幅を示す、入出力（Ｉ／Ｏ）曲線である。図２Ｃは、急性期および長期の培養物における、神経組織スライスから得られる電気波形の、勾配および減衰時間を比較する。図２Ｄは、実験コントロール（急性期海馬サンプル）について得られたＩ／Ｏ曲線である。
【図３】図３Ａは、ＮＭＤＡへの曝露後の電気波形の振幅の減少を示す、Ｉ／Ｏ曲線である。図３Ｂは、ＡＭＰＡへの曝露後の電気波形の振幅の減少を示す、Ｉ／Ｏ曲線である。図３Ｃは、図３Ａからの代表的な電気波形を示す。図３Ｄは、図３Ｂからの代表的な電気波形を示す。
【図４】図４Ａは、電気波形の振幅に対する、ＮＭＤＡ濃度の増加の影響を示す。図４Ｂは、電気波形の振幅に対する、ＡＭＰＡ濃度の増加の影響を示す。
【図５】図５は、ＮＭＤＡ除去後の種々の時点でのシナプス応答の回復の量を示す。
【図６】図６Ａは、ＮＭＤＡと共にインキュベートした神経組織に対するＭＫ−８０１の保護作用を示すＩ／Ｏ曲線である。図６Ｂは、ＮＭＤＡと共にインキュベートした神経組織に対するメマンチンの保護作用を示すＩ／Ｏ曲線である。図６Ｃは、メマンチンの濃度と、神経保護の程度との間の直接的な相関を示す。
【図７】図７Ａは、シナプス応答に対するＭＫ−８０１の効果を示す。図７Ｂは、シナプス応答に対するメマンチンの効果を示す。
【図８】図８は、シナプス応答に対する、ＮＭＤＡレセプターアゴニストおよび／またはアンタゴニストへの慢性曝露の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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