(57)【要約】  この発明は、ホジキン病の治療のための方法および組成物を提供し、この方法および組成物は、CD30へ結合する能力、またはCD30への結合についてモノクローナル抗体AC10もしくはHeFi-1と競合する能力、およびエフェクター細胞もしくは補体の不在下でホジキン病細胞に対して細胞静止効果もしくは細胞傷害効果を発揮する能力によって特徴付けられるタンパク質を投与することを含む。そのようなタンパク質はモノクローナル抗体AC10およびHeFi-1の誘導体を含む。この発明のタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうるし、さらに、それらは化学療法剤などの細胞傷害剤とコンジュゲートされ得る。この発明はさらに、この発明のタンパク質をコードする核酸に関する。この発明はさらに、ホジキン病の治療または予防に有用な抗CD30抗体を同定する方法に関する。【選択図】図１
2007500236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるホジキン病の治療方法であって、被験者に抗体−薬剤コンジュゲートを該治療に有効な量で投与することを含み、ここで、該抗体がCD30と免疫特異的に結合し、かつ該薬剤がAEFP、MMAE、AEBまたはAEVBである、上記方法。
【請求項２】
被験者におけるホジキン病の治療方法であって、抗体−薬剤コンジュゲートを該治療に有効な量で投与することを含み、ここで、該抗体がCD30と免疫特異的に結合し、該薬剤がCD30発現細胞においてドキソルビシンよりも少なくとも40倍の効能がある、上記方法。
【請求項３】
抗体がホジキン病の細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、細胞静止効果または細胞傷害効果が、補体に非依存的でありかつ(i)細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションおよび(ii)エフェクター細胞の不在下で達成される、上記方法。
【請求項４】
(a)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに抗体を固定化すること；
(b)10％のウシ胎児血清または20％のウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ホジキン病細胞系の5000個の細胞を前記ウェルに添加すること；
(c)前記抗体と、10％のウシ胎児血清または20％のウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、72時間、前記細胞を培養して、ホジキン病細胞培養物を形成すること；
(d)ホジキン病細胞培養物を、前記72時間の最後の8時間の間に、ウェル当たり0.5μCiの3H−チミジンに曝露すること；ならびに
(e)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H−チミジンの取り込みを測定すること、を含む方法を実施する際に、前記抗体の細胞静止効果または細胞傷害効果が示される、ここで、ホジキン病細胞培養物の細胞が、同一の条件下で培養されているが抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H−チミジンの取込みを低減している場合に、抗体がホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
抗体がリンカーを介して薬剤と結合される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
リンカーが、下記の式： 
【化１】
2007500236.tif 000041
（式中、−T−はストレッチャーユニットであり；aは0または１であり；各−W−は独立的にアミノ酸ユニットであり；wは独立的に2〜12の範囲の整数であり；−Y−はスペーサーユニットであり；そしてyは0、1または2である）のリンカーである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
抗体がcAC10である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
薬剤がドラスタチンである、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
ドラスタチンがアウリスタチンである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がヒト定常ドメインを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１１】
抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
抗体−薬剤コンジュゲートが精製される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１３】
抗体がリンカーを介して薬剤とコンジュゲートされている抗体−薬剤コンジュゲートであって、前記抗体が、
(a)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、
(b)補体に依存せずかつ(i)細胞静止剤または細胞傷害剤へのコンジュゲーションおよび(ii)エフェクター細胞の不在下で達成される、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、かつ、
(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1でなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断によって生じるものではない、抗体であり、ならびに、
前記リンカーが、下記の式：
【化２】
2007500236.tif 000042
（式中、−T−がストレッチャーユニットであり；aが0または1であり；各−W−が独立的にアミノ酸ユニットであり；wが独立的に2〜12の範囲の整数であり；−Y−がスペーサーユニットであり；そしてｙが0、1または2である）のリンカーである、上記抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１４】
抗体がヒト定常ドメインを含む、請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１５】
抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項13に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１６】
精製されている、請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１７】
抗体が、抗体ではない第2のタンパク質のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質である、請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１８】
請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲートの治療上の有効量と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
被験者におけるホジキン病の治療方法であって、請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲートを、前記治療に有効な量で被験者に投与することを含む、上記方法。
【請求項２０】
抗体がcAC10である、請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項２１】
薬剤がドラスタチンである、請求項12に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項２２】
ドラスタチンがアウリスタチンである、請求項21に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項２３】
アウリスタチンがMMAE、AEB、AEVBおよびAEFPよりなる群の少なくとも1つから選択される、請求項22に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1．発明の分野
本発明は、CD30に結合する抗体を投与することを含んでなるホジキン病を治療するための方法および組成物に関する。かかるタンパク質として、モノクローナル抗体AC10およびHeFi-1の組換え体/変異体形態、ならびにその誘導体が含まれる。本発明は、未修飾形態で、エフェクター細胞の不在下でかつ補体非依存的様式で、CD30を発現するホジキン病細胞の増殖を阻害することができる、CD30レセプターに対する新規の種類のモノクローナル抗体に関する。本発明はさらに、抗CD30抗体−薬剤コンジュゲートを投与することを含んでなるホジキン病の治療のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
2．発明の背景
ホジキン病用の治効のある化学療法レジメンは、臨床腫瘍学における主たる躍進の1つを代表する。多剤（multi-agent）化学療法レジメンは、これらの患者について80％以上にまで治癒率を増加してきた。それにも関わらず、3％の患者は治療に関連する原因により死亡しており、標準的な治療に反応しないかまたは第1線の治療後に再発する患者のために唯一利用可能な療法は幹細胞移植と組合わせた高用量の化学療法である。この治療は、死亡率の80％発生、有意な罹患率、および50％未満の5年生存率と関連する（例えばEngertら, 1999, Seminars in Hematology 36: 282-289を参照されたい）。
【０００３】
腫瘍の再発の主な原因は、化学療法剤に耐性の腫瘍細胞クローンの発生である。免疫療法は耐性を潜在的に回避することができる代替的な戦術を代表する。悪性腫瘍細胞に特異的にターゲティングするモノクローナル抗体は、多くの免疫療法アプローチの焦点となってきた。幾つかの悪性疾患については、現在、抗体を主体とする治療法が標準的な治療の一部として承認されている。例えば、操作された抗CD20抗体であるRituxan（登録商標）が、1997年末に再発した軽度のNHLの治療用に承認された。
【０００４】
CD30は120キロダルトンの膜糖タンパク質であり（Froeseら, 1987, J. Immunol. 139: 2081-87）、かつTNFレセプタースーパーファミリーの構成メンバーである。このファミリーには、とりわけTNF-RI、TNF-RII、CD30、CD40、OX-40およびRANKが含まれる。
【０００５】
CD30は、ホジキン病（HD）および未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、非ホジキン（NHL）リンパ腫のサブセットにおける悪性細胞の証明されたマーカーである（Diirkopら, 1992, Cell 88: 421-427）。当初、モノクローナル抗体Ki-1（Schwabら, 1982, Nature 299:65-67）を用いて培養したホジキン−リード・スタインバーグ（Hodgkin’s-Reed Steinberg）(H-RS)細胞上で同定されたCD30は、全てのHDリンパ種および大部分のALCLの細胞表面上で高度に発現されるが、正常な組織における発現は、毛包周囲領域中の少数のリンパ系細胞に極めて限定されている（Josimovic-Alasevicら、1989, Eur. J. Immunol. 19:157-162）。CD30抗原に特異的なモノクローナル抗体は、前臨床モデルおよび臨床研究において、細胞静止薬、植物毒素およびラジオアイソトープの送達のためのビヒクルとして検討されてきた（Engertら, 1990, Cancer Research 50: 84-88; Barthら, 2000, Blood 95: 3909-3914）。HDの患者において、CD30抗原を標的化することは、低用量の抗CD30 mAb、BerH2を用いて達成することができた（Faliniら, 1992, British Journal of Haematology 82: 38-45）。それでも、悪性腫瘍細胞へのin vivoでのターゲティングが成功しているにも関わらず、腫瘍の緩解を経験した患者はいない。後の臨床試験において、毒素（サポリン）が抗体BerH2と化学的にコンジュゲートされ、4人の患者全てで腫瘍塊の急速かつ実質的な縮小が示された（Faliniら, 1992, Lancet 339: 1195-1196）。
【０００６】
これらの観察は、標的抗原としてのCD30レセプターの有効性を明確に示す。しかし、mAb-毒素コンジュゲートで治療された全ての患者は、毒素に対する抗体を発現させた。免疫毒素の主な制限の一つは、毒素分子に対する抗体の発生に導き、その効果を中和する、その固有の免疫原性である（Tsutsumiら, 2000, Proc.Nat'1 Acad. Sci. U.S.A. 97 : 8545-8553）。さらに、免疫毒素と関連する血管漏出症候群および肝臓毒性は、これらの薬剤の治癒量を送達する能力を制限する（Tsutsumiら, 2000, Proc.Nat'1 Acad. Sci. U.S.A. 97: 8545-8553）。
【０００７】
2.1  CD30モノクローナル抗体
CD30は元々モノクローナル抗体Ki-1によって同定され、最初はKi-1抗原と称されていた（Schwabら, 1982, Nature 299: 65-67）。このmAbは、ホジキン−リード・スタインバーグ（H-RS）細胞、ホジキン病（HD）の悪性細胞に対して開発された。ホルマリン耐性エピトープに結合することができ、Ki-1によって認識されるものとは異なる第2のmAbがその後に記載された（Schwartingら, 1989 Blood 74: 1678-1689）。4種の更なる抗体の同定により、1986年にThird Leucocyte Typing WorkshopでCD30クラスターの作製がなされた（McMichael, A.編, 1987, Leukocyte Typing III (Oxford: Oxford University Press)）。
【０００８】
2.2  CD30モノクローナル抗体を主体とする治療
HDの診断および病期（staging）におけるCD30 mAbの有用性は、免疫療法用の潜在的なツールとしてのその評価をもたらした。HDの患者において、CD30抗原への特異的ターゲティングは、低用量（30〜50mg）の抗CD30 mAb BerH2を用いて達成された（Faliniら, 1992, British Journal of Haematology 82: 38-45）。悪性H-RS腫瘍細胞へのin vivoでのターゲティングが成功しているにも関わらず、腫瘍の緩解を経験した患者はいない。
【０００９】
これらの結果に基づき、CD30 mAbをターゲティングする免疫療法による効能は、未修飾の抗体を用いることによっては達成することができないと結論付けられた（Faliniら, 1992, Lancet 339: 1195-1196）。後の臨床試験において、mAb BerH2と化学的にコンジュゲートされた毒素（サポニン）を用いた、難治性のHDに罹患した4人の患者の治療によって、一時的ではあるが腫瘍塊の急速かつ実質的な縮小が示された（Faliniら, 1992, Lancet 339: 1195-1196）。近年、研究者らは、CD30を発現する新生物細胞を治療するためのアプローチを改良するために研究を行ってきた。具体例には、組換え単鎖免疫毒素（Barthら, 2000, Blood 95:3909-3914）、抗CD16/CD30二重特異性mAb（Rennerら, 2000, Cancer Immunol. Immunother. 49: 173-180）の開発、および細胞表面からのCD30分子の放出を妨げる新規抗CD30 mAbの同定（Horn-Lohrensら, 1995, Int. J. Cancer 60: 539-544）が含まれる。この目標は、ホジキン病の治療においてシグナル伝達活性を有する抗CD30 mAbの可能性を退けてきた。
【００１０】
2.3  アゴニスト活性を有する抗CD30モノクローナル抗体の同定
ヒトCD30リガンド（CD30L）の生物活性のクローニングおよび特徴付けにおいて、CD30L誘導性レセプター架橋の活性を模倣する2つのmAb  M44およびM67が記載された（Grussら, 1994, Blood 83: 2045-2056）。in vitroアッセイでは、固定化形態のこれらのmAbは、活性化T細胞ならびにT細胞起源のホジキン病細胞系であるL540およびHDLM-2の増殖を刺激することが可能であった。反対に、これらのmAbはB細胞起源のホジキン細胞系であるL428およびKM-H2に対してほとんど効果を有さなかった（Grussら, 1994, Blood 83: 2045-2056）。これらのアッセイの全てにおいて、抗CD30 mAb Ki-1によるCD30レセプターの結合はほとんど効果を有さなかった。
【００１１】
ホジキン細胞系におけるこれらの抗CD30mAbアゴニストの増殖活性は、抗CD30 mAbが保有するシグナル伝達活性が、HDの治療にいかなる有用性も有しないであろうことを示唆した。
【００１２】
対照的に、近年、抗CD30 mAbがKarpas-299を含むALCL細胞の増殖を、細胞周期停止の誘導を介してかつアポトーシスを誘導することなく阻害することができることが示されている（Hubingerら, 2001, Oncogene 20: 590-598）。さらに、固定化M44およびM67の存在は、CD30発現性ALCLを表す細胞系の増殖を強力に阻害する（Grussら, 1994, Blood83 : 2045-2056）。ALCL細胞系に対する阻害活性は、in vivoでの動物研究にさらに展開された。ALCL腫瘍異種移植片をもつSCIDマウスの生存は、mAb M44の投与後に有意に増加された。さらに、M44のエピトープと類似のエピトープを認識する抗CD30 mAb HeFi-1もまた、このモデル動物の生存を延長した（Tianら, 1995, Cancer Research 55: 5335- 5341）。
【００１３】
2.3.1  モノクローナル抗体AC10
当技術分野で公知のマウス抗CD30 mAbの大半は、HD細胞系または精製CD30抗原によるマウスの免疫によって生成されてきた。当初はC10と呼ばれたAC10（Bowenら, 1993, J. Immunol. 151: 5896-5906）は、この抗CD30 mAbがヒトNK様細胞系であるYTに対して作製されたという点で異なる（Bowenら, 1993, J. Immunol. 151:5896-5906）。当初、このmAbのシグナル伝達活性は、CD28およびCD45分子の細胞表面発現のダウンレギュレーション、細胞表面CD25発現のアップレギュレーション、ならびにC10およびYT細胞の結合後の同型接着（homotypic adhesion）の誘導によって立証された。
【００１４】
2.3.2  モノクローナル抗体HeFi-1
HeFi-1は、マウスをL428ホジキン病細胞系で免疫化することによって作製された（Hechtら, 1985, J. Immunol. 134: 4231-4236）。HeFi-1とホジキン病細胞系L428またはL540との共培養は、これらの細胞系の生存性に対するmAbのあらゆる直接的効果を明らかにしえなかった。Karpas 299 ALCL細胞系に対するHeFi-1のin vitroおよびin vivo抗腫瘍活性はTianらによって記載された（Tianら, 1995, Cancer Research 55: 5335-5341）。
【００１５】
2.4  シグナル伝達性CD30抗体の直接的な抗腫瘍活性
モノクローナル抗体は、in vivoで細胞の特定の集団にターゲティングする魅力的なアプローチを表す。天然のmAbおよびその誘導体は、非限定的に補体活性化、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、細胞周期進行の阻害、およびアポトーシスの誘導を含む、多くの機構によって腫瘍細胞を排除し得る（Tuttら, 1998, J. Immunol. 161: 3176-3185）。
【００１６】
上述されるように、Ki-1およびBer-H2などのCD30抗原に対するmAbは、直接的な抗腫瘍活性を証明しえなかった（Faliniら, 1992, British Journal of Haematology 82: 38-45; Grussら, 1994, Blood83 : 2045-2056）。M44、M67およびHeFi-1を含む、CD30に対するいくつかのシグナル伝達性mAbは、in vitro（Grussら, 1994, Blood 83: 2045-2056）またはin vivo（Tianら, 1995, Cancer Res. 55: 5335-5341）でALCL系の増殖を阻害することが示されてきたが、既知の抗CD30抗体が培養中のHD細胞の増殖を阻害するのに効果的であることは示されていない。実際に、ALCL系Karpas 299の増殖を阻害した2つのシグナル伝達性抗CD30 mAbであるM44およびM67は、in vitroでT細胞様HD系の増殖を高めること示されたが、B細胞様HD系に対する効果はまったく示されていない（Grussら, 1994, Blood 83: 2045-2056）。
【００１７】
抗体Ki-1とリシンA鎖とのコンジュゲートが、かなり効果のない免疫毒素用に作製され、この無効果性は、抗体Ki-1の親和性がかなり低いことに起因するものと結論付けられた（Engertら, 1990, Cancer Research 50: 84-88）。a)抗体Ki-1が、ホジキン由来の細胞系L428およびL540、ならびにCD30＋非ホジキンリンパ腫細胞系Karpas 299、からのsCD30の放出を高めた（Hansenら, 1991,Immunobiol. 183 : 214）およびb)細胞膜からのKi-1エピトープの比較的大きな距離も強力な免疫毒素の構築に有利でない（Pressら, 1988, J. Immunol. 141: 4410-4417 ; Mayら, 1990, J. Immunol. 144:3637-3642）という他の2つの理由もまたKi-1-リシンA鎖コンジュゲートの弱毒性を説明し得る。
【００１８】
1989年2月、ウィーンのLeukocyte Differentiation Antigensの第4回ワークショップで、モノクローナル抗体が3つの異なる研究所によって提示され、最終的にCD30群に属するものとして特徴付けられた。当業界の技術状態に従った、発明者による様々な抗体を加えたL540細胞の共培養実験、それに続く培養上清液からのsCD30の単離により、sCD30の放出は、抗体Ki-1によって最も強力に増加され、抗体HeFi-1によって弱く高められるが、抗体Ber-H2によってより強力に阻害されることが明らかになった。しかし、抗体Ber-H2も形質細胞の亜集団を標識化し（Schwartingら, 1988, Blood 74: 1678-1689）、G. Pallesen（G. Pallesen, 1990, Histopathology16 : 409-413）は411頁にBer-H2がホルムアルデヒドで改変された無関係の抗原のエピトープと交差反応することを記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ホジキン病を治療または予防する効能が高められた治療法に対するニーズが当業界にあり、それは本発明によって提供される。臨床試験および多くの前臨床評価は、ホジキン病を示す細胞に対する多くの未修飾形態の抗CD30 mAbの抗腫瘍活性を証明しえなかった。mAb Ki-1、M44およびM67の評価においてGrussらによって利用されたもの（Grussら, 1994, Blood 83: 2045-2056）と類似する条件下で、本発明者らは以前に記載されたものと機能的に異なる種類のCD30 mAbを証明する。この種の抗CD30 mAbは、試験される全てのホジキン細胞系のin vitro増殖を阻害することができる。さらに、これらの未修飾のmAbはHD腫瘍異種移植片に対するin vivoでの抗腫瘍活性を有する。
【００２０】
本明細書中のあらゆる参考文献の引用または認定は、かかる参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの容認として解釈すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
3．発明の概要
本発明は、AC10およびHeFi-1を含む特定の種類の抗CD30抗体と関連する新規活性の驚くべき発見、すなわち、エフェクター細胞の不在下でかつ補体に非依存的な様式で、T細胞様およびB細胞様ホジキン病（HD）細胞の両者の増殖を阻害する前記抗体の能力、に基づいている。
【００２２】
本発明は、モノクローナル抗体AC10またはHeFi−1と、CD30への結合について競合し、かつホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質を提供する。本発明はさらに、CD30に免疫特異的に結合し、かつホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する抗体を提供する。一般的に、本発明の抗体は、それぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしに、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮することができる。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球）の不在下でかつ補体に非依存的な様式で、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮することができる。
【００２４】
したがって、本発明は、（a）CD30と免疫特異的に結合し、(b)ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を、補体非依存的に、細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなく、そしてエフェクター細胞の不在下で達成し、かつ(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない、抗体を提供する。特定の実施形態では、この抗体はヒト定常ドメインを含む。
【００２５】
本発明はさらに、(a)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、(b)ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を、補体非依存的に、細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなく、そしてエフェクター細胞の不在下で達成し、かつ(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない、抗体を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、(a)CD30と免疫特異的に結合し、(b)それぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしに、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、かつ(c)モノクローナル抗体AC30またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体であって、(i)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに該抗体を固定化すること；(ii)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(iii)該抗体と10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養してホジキン病細胞培養物を作製すること；(iv)該72時間の最後の8時間の間、ホジキン病細胞培養物をウェル当たり0.5μCiの3H−チミジンに曝露すること；ならびに(v)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H−チミジンの取り込みを測定すること、を含む方法を実施する際に、細胞静止効果または細胞傷害効果が示される、上記抗体を提供する。ここで、ホジキン病細胞培養物の細胞が同一の条件下で培養されるが前記抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して3H−チミジンの取込みを低減している場合に、該抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。特定の実施形態では、この抗体はヒト定常ドメインを含む。
【００２７】
本発明の抗体は、例えばCD30抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、精製することができる。特定の実施形態では、この抗体は少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％または少なくとも80％の純度である。別の実施形態では、この抗体は85％以上の純度、90％以上の純度、95％以上の純度または99％以上の純度である。
【００２８】
本発明はさらに、被験者におけるホジキン病の治療または予防のための方法であって、被験者に本発明の抗CD30抗体を該治療または予防に有効な量で投与することを含む、上記方法を提供する。治療に使用される抗体は、該抗体と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物の形態であってもよい。
【００２９】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、被験者におけるホジキン病の治療または予防のための方法であって、被験者に、(a)CD30と免疫特異的に結合し、(b)補体非依存的であり、かつ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしに、エフェクター細胞の不在下で達成される、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、ならびに(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体を、該治療または予防に有効な量で投与することを含む、上記方法を提供する。この抗体は、該抗体と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物の形態であってもよい。
【００３０】
別の特定の実施形態において、本発明は被験者におけるホジキン病の治療または予防のための方法であって、被験者に、(a)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、(b)補体非依存的であり、細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしに、エフェクター細胞の不在下で達成される、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、ならびに(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体を、該治療または予防に有効な量で投与することを含む、上記方法を提供する。この抗体は、該抗体と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物の形態であってもよい。
【００３１】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は被験者におけるホジキン病の治療または予防のための方法であって、被験者に、(a)CD30と免疫特異的に結合し、(b)それぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなく、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、かつ(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体を、該治療または予防に有効な量で投与することを含み、ここで、(i)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに該抗体を固定化すること；(ii)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(iii)該抗体と10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養してホジキン病細胞培養物を作製すること；(iv)該72時間の最後の8時間の間、ホジキン病細胞培養物をウェル当たり0.5μCiの3H−チミジンに曝露すること；ならびに(v)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H−チミジンの取り込みを測定すること、を含む方法を実施する際に、細胞静止効果または細胞傷害効果が示される、上記方法を提供する。ここで、ホジキン病細胞培養物の細胞が同一の条件下で培養されているが前記抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H−チミジンの取込みを低減している場合に、該抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。この抗体は、前記抗体と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物の形態であってもよい。
【００３２】
本発明はさらに、被験者におけるホジキン病の治療または予防のための方法であって、CD30と免疫特異的に結合し、かつそれぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしにホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する抗体と、製薬上許容される担体とを、該治療または予防に有効な量で被験者に投与することを含む、上記方法を提供する。
【００３３】
本発明は、被験者におけるホジキン病の治療または予防のための方法であって、被験者に、モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、かつホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質の有効量を投与することを含み、その量がホジキン病の治療または予防に有効である、上記方法を提供する。
【００３４】
したがって、特定の態様では、本発明は、(a)CD30と免疫特異的に結合し、(b)補体非依存的であり、かつ(i)細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションおよび(ii)エフェクター細胞の不在下で達成される、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、ならびに(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない、抗体を提供する。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合する。したがって、かかる実施形態では、本発明は、(a)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、(b)補体非依存的であり、かつ(i)細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションおよび(ii)エフェクター細胞の不在下で、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、(c)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、パパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体を提供する。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明の抗体の細胞静止効果または細胞傷害効果は、(a)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに該抗体を固定化すること；(b)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(c)該抗体と10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養してホジキン病細胞培養物を作製すること；(d)該72時間の最後の8時間の間、ホジキン病細胞培養物をウェル当たり0.5μCiの3H−チミジンに曝露すること；ならびに(e)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H−チミジンの取り込みを測定することを含む方法を実施する際に示される。ここで、前記抗体は、ホジキン病細胞培養物の細胞が同一の条件下で培養されるが該抗体に接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H-チミジンの取込みを低減している場合に、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【００３７】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、(a)CD30と免疫特異的に結合し；(b)それぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしにホジキン病細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し；かつモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、さらにパパインまたはペプシンによるAC10またはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体であって、(i)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに該抗体を固定化すること；(ii)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(iii)該抗体と、10%ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養して、ホジキン病細胞培養物を作製すること；(iv)該72時間の最後の8時間の間、ホジキン病細胞培養物をウェル当たり0,5μCiの3H−チミジンに曝露すること；および(v)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H−チミジンの取り込みを測定すること、を含む方法を実施する際に細胞静止効果または細胞傷害効果が示される、上記抗体を提供する。ここで、ホジキン病細胞培養物の細胞が同一の条件下で培養されるが前記抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して3H−チミジンの取込みを低減している場合に、該抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。本発明の抗体は、3H−チミジンの取り込みを少なくとも15％だけ、より好ましくは20％だけ、さらにより好ましくは少なくとも20％だけ阻害することが好ましい。特定の実施形態では、前記抗体は、3H−チミジンの取り込みを、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、60％または70％だけ阻害する。
【００３８】
本発明の抗体がヒト定常ドメインを含むことが好ましい。特定の実施形態では、前記抗体はヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。特定の実施形態では、本発明の抗体は細胞傷害剤とコンジュゲートされる。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体ではない第2のタンパク質のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質である。
【００３９】
本発明の抗CD30抗体は、細胞傷害剤とコンジュゲートされてもよい。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体−細胞傷害剤コンジュゲートの抗CD30抗体は、リンカーを介して細胞傷害剤とコンジュゲートされ、ここで、該リンカーはpH5.5未満で加水分解可能である。特定の実施形態では、前記リンカーはpH5.0未満で加水分解可能である。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体−細胞傷害剤コンジュゲートの抗CD30抗体は、リンカーを介して細胞傷害剤とコンジュゲートされ、ここで、該リンカーはプロテアーゼで切断可能である。特定の実施形態では、プロテアーゼはリソソームプロテアーゼである。別の特定の実施形態では、プロテアーゼは、とりわけ膜関連プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼである。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体−細胞傷害剤コンジュゲートは、抗CD30−バリン−シトルリン−MMAE（抗CD30−val−citMMAEまたは抗CD30-vcMMAE）または抗CD30−バリン−シトルリン−AEFP（抗CD30−val−citAEFPまたは抗CD30−vcAEFP）である。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体−細胞傷害剤コンジュゲートは、AC10−バリン−シトルリン−MMAE（AC10−val−citMMAEまたはAC10-vcMMAE）またはAC10−バリン−シトルリン−AEFP（AC10−val−citAEFPまたはAC10-vcAEFP）である。
【００４２】
ある特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体−細胞傷害剤コンジュゲートは、抗CD30−フェニルアラニン−リシン−MMAE（抗CD30−phe−lysMMAEまたは抗CD30−fkMMAE）または抗CD30−フェニルアラニン−リシン−AEFP（抗CD30−phe-lysAEFPまたは抗CD30−fkAEFP）である。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体−細胞傷害剤コンジュゲートは、AC10−フェニルアラニン−リシン−MMAE（AC10−phe−lysMMAEまたはAC10−fkMMAE）またはAC10−フェニルアラニン−リシン−AEFP（AC10−phe-lysAEFPまたはAC10−fkAEFP）である。
【００４３】
上述のコンジュゲート中のAC10抗体は、キメラAC10（cAC10）またはヒト化AC10(hAC10)抗体であることが好ましい。したがって、特定の実施形態では、本発明は以下のコンジュゲートを提供する：hAClO−バリン−シトルリン-MMAE（hAClO-val-citMMAEまたはhAC1O-vcMMAE）、cAClO−バリン−シトルリン-MMAE（cAC1O−val−citMMAEまたはcAC10−vcMMAE)、hAC10−バリン−シトルリン−AEFP（hAC10-val-citAEFPまたはhAC10-vcAEFP)あるいはcAC10-バリン−シトルリン−AEFP（cAC10-val-citAEFPまたはcAClO-vcAEFP）。別の特定の実施形態では、本発明は以下のコンジュゲートを提供する：hAC10−フェニルアラニン−リシン−MMAE（hAC10−phe−lysMMAEまたはhAC10−fkMMAE）、cAClO−フェニルアラニン−リシン−MMAE（cAClO−phe−lysMMAEまたはcAClO−fkMMAE)、hAC10−フェニルアラニン−リシン−AEFP（hAC10−phe−lysAEFPまたはhAC10−fkAEFP）、あるいはcAClO−フェニルアラニン−リシン−AEFP（cAClO−phe−lysAEFPまたはcAClO−fkAEFP)。
【００４４】
本発明は、被験者におけるホジキン病の治療のための方法であって、被験者に本発明の抗体−薬剤コンジュゲートを該治療に有効な量で投与することを含む、上記方法を提供する。したがって、本発明は、被験者におけるホジキン病の治療のための方法であって、抗体−薬剤コンジュゲートを該治療に有効な量で投与することを含み、ここで、該抗体がCD30と免疫特異的に結合する、上記方法を提供する。
【００４５】
ある好ましい実施形態において、抗体とコンジュゲートされる薬剤は、AEFP、MMAE、AEBまたはAEVBである、および/またはCD30発現細胞に対してドキソルビシンよりも少なくとも40倍の効能がある。場合により、薬剤は、（例えばリソソーム中で）加水分解可能なリンカーおよび/またはホジキン病細胞への薬剤のインターナリゼーションを促進するリンカーを介して、薬剤とコンジュゲートされる。特定の実施形態では、前記リンカーはval-citリンカーまたはphe-lysリンカーである。
【００４６】
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートの抗体が、(i)細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションおよび(ii)エフェクター細胞の不在下で達成される、ホジキン病細胞系に対する補体非依存的な細胞静止効果または細胞傷害効果を示すことが好ましい。この抗体の細胞静止効果または細胞傷害効果は、(a)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに該抗体を固定化すること；(b)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(c)該抗体と、10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養してホジキン病細胞培養物を作製すること；(d)該72時間の最後の8時間の間、ホジキン病細胞培養物をウェル当たり0.5μCiの3H−チミジンに曝露すること；ならびに(e)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H−チミジンの取り込みを測定すること、を含む方法を実施する際に確認し得る。その際、ホジキン病細胞培養物の細胞が、同一の条件下で培養されるが前記抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H−チミジンの取り込みを低減している場合に、該抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【００４７】
本発明は、ブリオジンまたはプロドラッグ変換酵素などの第2タンパク質のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質である抗CD30抗体を包含する。
【００４８】
コンジュゲートおよび融合タンパク質を含む本発明の抗CD抗体は、放射線療法、化学療法、ホルモン療法および/または免疫療法と併用して用いることができる。特定の実施形態では、化学療法剤は細胞静止剤、細胞傷害剤および/または免疫抑制剤である。
【００４９】
ある特定の実施形態では、免疫抑制剤はガンシクロビル、アシクロビル、エタネルセプト、ラパマイシン、シクロスポリンまたはタクロリムスである。別の実施形態では、免疫抑制剤は、代謝拮抗剤、プリンアンタゴニスト（例えば、アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、グルココルチコイド（例えば、コルチゾールまたはアルドステロン）またはグルココルチコイド類似体（例えば、プレドニゾンまたはデキサメタゾン）である。さらに別の実施形態では、免疫抑制剤はアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）である。さらに別の実施形態では、免疫抑制剤は抗炎症剤であり、これには非限定的に、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、5−リポキシゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン受容体アンタゴニストが含まれる。
【００５０】
本発明はさらに、(i)CD30と免疫特異的に結合し、(ii)ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、かつ(iii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10もしくはHeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10もしくはHeFi-1の切断により生じるものではない、抗体を提供する。最も好ましくは、この抗体は、それぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしに、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮することができる。さらに、本発明の抗体は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞など）の不在下で、かつ補体非依存的な様式で細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮することが可能である。
【００５１】
本発明はさらに、(i)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、(ii)ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、さらに(iii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10もしくはHeFi-1の切断により生じるものではない、タンパク質を提供する。
【００５２】
最も好ましくは、本発明のタンパク質および抗体は、それぞれ細胞静止剤または細胞傷害剤とのコンジュゲーションなしに、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮することができる。さらに、本発明のタンパク質は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞など）の不在下で、かつ補体非依存的な様式で細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮することが可能である。
【００５３】
本発明はさらに、配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号12；配列番号14または配列番号16を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10の切断により生じるものではない、上記抗体を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、配列番号20；配列番号22；配列番号24；配列番号28；配列番号30または配列番号32を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体HeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるHeFi-1の切断により生じるものではない、上記抗体を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、配列番号2または配列番号10と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10の切断により生じるものではない、上記タンパク質を提供する。
【００５６】
本発明はさらに、配列番号18または配列番号26と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体HeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるHeFi-1の切断により生じるものではない上記タンパク質を、ホジキン病の治療または予防に有効な量で提供する。
【００５７】
本発明はさらに、本発明のいずれかの抗CD30抗体の治療上の有効量と製薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００５８】
本発明はさらに、(a)(i)CD30と免疫特異的に結合し、(ii)ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、さらに(iii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10もしくはHeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10もしくはHeFi-1の切断により生じるものではない抗体の、ホジキン病の治療または予防に有効な量と、(b)製薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、(a)(i)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と、CD30への結合について競合し、(ii)ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮し、さらに(iii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10もしくはHeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10もしくはHeFi-1の切断により生じるものではないタンパク質の、ホジキン病の治療または予防に有効な量と、(b)製薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００６０】
本発明はさらに、(a)配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号12、配列番号14または配列番号16を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10の切断により生じるものではない上記タンパク質の、ホジキン病の治療または予防に有効な量と、(b)製薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００６１】
本発明はさらに、(a)配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号28、配列番号30または配列番号32を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体HeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるHeFi-1の切断により生じるものではない上記タンパク質の、ホジキン病の治療または予防に有効な量と、(b)製薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００６２】
本発明はさらに、(a)配列番号2または配列番号10と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体AC10ではなくかつパパインもしくはペプシンによるAC10の切断により生じるものではない上記タンパク質の、ホジキン病の治療または予防に有効な量と、(b)製薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００６３】
本発明はさらに、(a)配列番号18または配列番号26と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、(i)CD30と免疫特異的に結合し、さらに(ii)ヒト定常ドメインを含むか、またはモノクローナル抗体HeFi-1ではなくかつパパインもしくはペプシンによるHeFi-1の切断により生じるものではない上記タンパク質の、ホジキン病の治療または予防に有効な量と、(b)製薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化キメラ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、グリコシル化抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fd、単鎖Fv、ジスルフィド結合したFv、VLドメインを含んでなるフラグメントまたはVHドメインを含んでなるフラグメントである。特定の実施形態では、この抗体は二重特異性抗体である。別の実施形態では、この抗体は二重特異性抗体ではない。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、このタンパク質または抗体は細胞傷害剤とコンジュゲートされる。さらに別の好適な実施形態では、このタンパク質または抗体は、抗体ではない第2のタンパク質のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質である。
【００６６】
1つの特定の実施形態では、この抗体は、ヒト定常ドメイン（例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）を含み、かつさらに細胞傷害剤または細胞静止剤とコンジュゲートされている。
【００６７】
抗体を含む本発明のタンパク質のホジキン病細胞系に対する細胞静止効果を測定する際には、ホジキン病細胞系の培養物は該タンパク質に接触され（該培養物は約0.33cm2の培養面積中、約5000個の細胞であり、該接触は72時間なされる）；該72時間の細胞の8時間の間、0.5μCiの3H−チミジンに曝露され；そして該培養物の細胞への3H−チミジンの取込みが測定される。培養物の細胞が、同一の条件下で培養されているが前記タンパク質と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H−チミジンの取り込みを低減している場合には、該タンパク質はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【００６８】
一実施形態では、本発明の抗体の細胞静止効果または細胞傷害効果についてのアッセイは、(i)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに該抗体を固定すること；(ii)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(iii)該抗体と、10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養して、ホジキン病細胞培養物を作製すること；(iv)該72時間の最後の8時間の間、ウェル当たり0.5μCiの3H−チミジンにホジキン病細胞培養物を暴露すること；ならびに(v)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定すること、を含む方法を実施する際に示される。ここで、ホジキン病細胞培養物の細胞が、同一の条件で培養されているが前記抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して3H-チミジンの取り込みを低減している場合に、該抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【００６９】
このアッセイの特定の実施形態では、10％または20％血清の代わりに、0％、5％、7.5％または15％血清がウェルに添加される。当業者間で標準的技法である通り、血清は培養物への添加前に加熱により不活化される。
【００７０】
本発明のタンパク質の細胞静止効果または細胞傷害効果を測定するのに適当なホジキン病細胞系は、L428,L450、HDLM2またはKM-H2である。
【００７１】
当業者は、ホジキン病細胞培養物間に細胞増殖および/またはチミジンの取込みにおけるわずかな変動が存在することがあり、これが抗CD30抗体の存在とは関係がないということを理解するだろう。本明細書で用いられる、「3H−チミジンの取り込みを低減する」という用語は、3H-チミジンの取り込みにおける統計的に有意な低減、または3H−チミジンの取込みにおける少なくとも約10％の低減をいう。好ましい実施形態において、3H−チミジンの組込みにおける低減は、少なくとも15％、20％または25％の低減である。この実施形態の具体的な形式では、「3H−チミジンの取り込みを低減する」という用語は、3H−チミジンの取り込みの、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％または95％の低減をさす。
【００７２】
本発明の抗CD30抗体は、CD30発現細胞表面からの可溶性CD30（「sCD30」）の放出に対する作用を有していてもいなくてもよい。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体は、25％より大きくsCD30の放出を阻害せず、より好ましくは15％以下で、そして最も好ましくは5％以下である。別の実施形態では、本発明の抗CD30抗体は、sCD30の放出を、例えば少なくとも5％、10％、15％または20％増加する。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体はsCD30の放出を、わずかに−10％〜＋10％または−5％〜＋5％だけ変化させる。
【００７３】
本発明のタンパク質は抗体である場合、この抗体はモノクローナル抗体、好ましくは組換え抗体、そして最も好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００７４】
本発明はさらに、本発明の任意の抗CD30抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたおよび/または精製された核酸を提供する。特定の実施形態では、この核酸は本発明の抗CD30抗体の軽鎖をさらにコードする。
【００７５】
本発明はさらに、本発明の任意の抗CD30の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸を含有する、組換え細胞を提供する。この細胞は、重鎖をコードするものと同一のまたは別の核酸中に、本発明の任意の抗CD30抗体の軽鎖をコードする核酸をさらに含んでもよい。重鎖および/または軽鎖コード配列がプロモーターと機能的に連結されることが好ましい。
【００７６】
抗体（または重鎖もしくは軽鎖）が発現される条件下で本発明の組換え細胞を増殖すること、および発現したタンパク質を回収することを含む、本発明の抗CD30抗体（またはその重鎖もしくは軽鎖）の製造方法も提供される。
【００７７】
本発明はさらに、タンパク質をコードする単離された核酸を提供し、これには非限定的に、モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1とCD30への結合について競合し、かつホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する抗体が含まれる。本発明はさらに、CD30と免疫特異的に結合し、かつホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する抗体をコードする核酸を単離する方法を提供する。上述の核酸のいずれかによってコードされるタンパク質または抗体も提供される。
【００７８】
本発明はさらに、モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1とCD30への結合について競合し、かつホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質の製造方法であって、該タンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでなる細胞を該タンパク質が該細胞によって発現されるように増殖すること、および発現されたタンパク質を回収することを含む、上記方法を提供する。
【００７９】
本発明はさらに、ホジキン病の治療または予防に有用な抗CD30抗体を同定する方法であって、抗CD30抗体がホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するか否かを、ホジキン病細胞系の培養物と前記タンパク質と接触させること（ここで、該培養物は約0.33cm2の培養面積中の約5000個の細胞であり、該接触は72時間でなされる）；該72時間の最後の8時間の間、0.5μCiの3H-チミジンへ該培養物を曝露すること；ならびに該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定することによって判定することを含む、上記方法を提供する。前記培養物の細胞が、同一の条件下で培養されるが抗CD30抗体に接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して3H−チミジンの取り込みを低減している場合に、抗CD30抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有し、かつホジキン病の治療または予防に有用である。
【００８０】
この実施形態の1つの特定の形態では、この方法は、(i)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに前記抗体を固定すること；(ii)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、ウェルにホジキン病細胞系の5000個の細胞を添加すること；(iii)該抗体と、10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で、該細胞を72時間培養して、ホジキン病細胞培養物を作製すること；(iv)該72時間の最後の8時間の間、ウェル当たり0.5μCiの3H-チミジンにホジキン病細胞培養物を暴露すること；ならびに(v)ホジキン病細胞培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定することを含み、その際、ホジキン病細胞培養物の細胞が、同一の条件下で培養されるが該抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H−チミジンの取り込みを低減している場合に、該抗体がホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【００８１】
この方法の特定の実施形態では、10％または20％血清の代わりに、0％、5％、7.5％または15％血清がウェルに添加される。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体AC10、HeFi-1、BerH2および/またはHRS-4の1つ、２つ、３つまたは４つの全てに該当せず、ならびに/あるいはパパインまたはペプシンによるモノクローナル抗体AC10、HeFi-1、Ber-H2および/またはHRS-4の1つ、2つ、3つまたは4つ全ての切断により生じたものではない。別の実施形態では、本発明の抗体は、クラスターAおよび/またはクラスターBの抗CD30抗体ではない（例えば、Horn-Lohrensら, 1995, Int. J. Cancer 60: 539-544）。別の実施形態では、本発明の抗体は、Horn-Lohrensら, 1995, Int. J. Cancer 60:539-544に記載されているように細胞表面からのCD30分子の放出を妨げない。
【００８３】
3.1  略語
略語「AEFP」は、ジメチルバリン-バリン-ドライソロイシン（dolaisoleuine）-ドラプロリン（dolaproine）-フェニルアラニン-p-フェニレンジアミンである、アウリスタチン（auristatin）を指す。
【化１】
2007500236.tif 000003
【００８４】
略語「MMAE」は、モノメチルアウリスタチンEを指し、アウリスタチンE誘導体が下記に示される：
【化２】
2007500236.tif 000004
【００８５】
略語「AEB」は、アウリスタチンEとパラアセチル安息香酸と反応させることによって生じるエステルを指し、その構造が以下に示される：
【化３】
2007500236.tif 000005
【００８６】
略語「AEVB」は、アウリスタチンEとベンゾイル吉草酸を反応させることによって生じるエステルを指し、その構造が以下に示される：
【化４】
2007500236.tif 000006
【００８７】
略語「fk」および「phe-lys」は、フェニルアラニン−リシンリンカーを指す。
【００８８】
略語「vc」および「val-cit」は、バリン−シトルリンリンカーを指す。
【００８９】
4.図面の簡単な説明
（後述の「図面の簡単な説明」の項を参照のこと）
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
5．発明の詳細な説明
本発明は、CD30に結合しかつHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質に関する。本発明はさらに、CD30への結合についてAC10またはHeFi-1と競合し、かつHD細胞への細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質に関する。一実施形態では、タンパク質は抗体である。この実施形態の好適な形式では、この抗体はAC10またはHeFi-1であり、最も好ましくはヒト化またはキメラAC10またはHeFi-1である。
【００９１】
本発明はさらに、AC10およびHeFi-1遺伝子のあらゆるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に関する。本発明はさらに、かかるAC10およびHeFi-1タンパク質の断片、他の誘導体および類似体に関する。かかる断片または誘導体をコードする核酸も本発明の範囲内である。例えば組換え方法による、上述のタンパク質の製造も提供される。
【００９２】
本発明はまた、機能的に活性である、すなわちCD30への結合およびHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果の発揮を示すことが可能な、融合/キメラタンパク質を含む、AC10およびHeFi-1タンパク質ならびに誘導体に関する。
【００９３】
本発明に包含されるCD30に対する抗体には、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体が含まれ、かかる抗体は化学療法剤などの細胞傷害剤とコンジュゲートされる。
【００９４】
本発明はさらに、HDを治療しまたは予防する方法であって、本発明のタンパク質もしくは核酸を含んでなる組成物を単独でまたは非限定的に化学療法剤を含む細胞傷害剤と組み合わせて投与することを含む、上記方法を提供する。
【００９５】
開示を明確にするため、かつ限定目的ではなく、発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分けて説明する。
【００９６】
5.1  本発明のタンパク質
本発明は、CD30に結合しかつHD細胞に対する細胞静止効果および/または細胞傷害効果を発揮するタンパク質（非限定的に抗体を含む）を包含する。本発明はさらに、CD30への結合についてAC10またはHeFi-1と競合し、かつHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質に関する。本発明のタンパク質の細胞静止効果または細胞抑制効果は、補体またはエフェクター細胞に依存的でないことが好ましい。
【００９７】
本発明は、HeFi-1（配列番号20；配列番号22；配列番号24；配列番号28；配列番号30もしくは配列番号32）またはAC10（配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号12；配列番号14；または配列番号16）のCDRを含むか、あるいは該CDRからなる、タンパク質をさらに包含する。
【００９８】
本発明は、HeFi-1（配列番号18もしくは配列番号26）またはAC10（配列番号2もしくは配列番号10）の可変領域を含むか、あるいは該可変領域からなる、タンパク質をさらに包含する。各配列番号に対応するAC10またはHeFi-1の領域を示す表が下記に示される：
【表１】
2007500236.tif 000007
【００９９】
本発明はさらにAC10およびHeFi-1の機能的な誘導体または類似体を含む。本明細書で用いられる「機能的な」という用語は、本発明のペプチドまたはタンパク質に関連して、該ペプチドまたはタンパク質が1)CD30に結合することが可能であり、かつ2)HD細胞に対する細胞静止効果および/または細胞傷害効果を発揮することを示す。
【０１００】
一般的に、本発明の抗体は、CD30に免疫特異的に結合しかつHD中の悪性細胞に対する細胞静止効果および細胞傷害効果を発揮する。本発明の抗CD30抗体の細胞静止効果または細胞傷害効果が、補体非依存的および/またはエフェクター細胞非依存的であることが好ましい。
【０１０１】
本発明の抗CD30抗体は、ホジキン病細胞などのCD30発現細胞の表面からの可溶性CD30（「sCD30」）の放出に対する作用を有しても有しなくてもよい。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体は、25％より多くsCD30の放出を阻害せず、より好ましくは15％以下、そして最も好ましくは5％以下で阻害する。別の実施形態では、本発明の抗CD30抗体は、例えば少なくとも5％、10％、15％または20％だけ、sCD30の放出を増加する。特定の実施形態では、本発明の抗CD30抗体は、わずか−10％〜＋10％または−5％〜＋5％だけ、sCD30の放出を変化させる。sCD30の放出に対する抗CD30抗体の効果を判定するために、CD30発現細胞系（例えばL540）は35S−メチオニンにより10分間パルス標識され、洗浄され、そして新鮮な培地中で再懸濁される。パルス標識された細胞のアリコート（例えば、2ｘ105個の細胞）は、抗CD30抗体と共に、該抗体なしにまたは対照抗体と共に、16時間の追跡時間で培養される。Hansenら（1989, Biol. Chem. Hoppe Seyler 370:409-16）に記載されるようにsCD30は単離され、SDS-PAGE（還元条件下、7.5％〜15％の濃度勾配ゲル）で分析され、そしてオートラジオグラフィーで可視化される。sCD30の量は濃度計測または定量的phorphorimager分析によって量ることができる。
【０１０２】
本発明の抗体はモノクローナル抗体であることが好ましく、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、単一鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、Fab発現ライブラリーから作製されるフラグメント、および上述のいずれかのCD30結合フラグメントであってもよい。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちCD30に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAlおよびIgA2）またはサブクラスのいずれかであり得る。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態では、この抗体は本発明のヒト抗原結合性抗体フラグメントであり、非限定的に、Fab、Fab'およびF(ab)'2、Fd、単一鎖Fvs（scFv）、単一鎖抗体、ジスルフィド結合したFvs（sdFv）、ならびにVLまたはVHドメインのいずれかを含んでなるフラグメントが含まれる。単一鎖抗体を含む抗原結合性抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の、すなわちヒンジ領域、CH1、CH2、CH3およびCLドメインの全体または一部との組み合わせで含んでもよい。また本発明には、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、CH3およびCLドメインとの任意の組合せを含んでなる、抗原結合性フラグメントも含まれる。この抗体は、ヒト、ネズミ（例えばマウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ラビット、ヤギ、モルモット、ラクダ科の動物、ウマまたはニワトリであるのが好ましい。本明細書で使用される「ヒト」抗体には、以下にまたは例えばKucherlapatiらによる米国特許第5,939,598中に記載されるように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリー、ヒトB細胞、または1以上のヒト免疫グロブリンがトランスジェニックされた動物から単離される抗体が含まれる。
【０１０４】
本発明の抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性またはより多くの多特異性のものであり得る。多特異性抗体はCD30の異なるエピトープに特異的であってもよいし、またはCD30および異種タンパク質の両方に特異的であってもよい。例えば、国際公開WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tuttら, 1991, J. Immunol. 147：60-69；米国特許第4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelnyら, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。
【０１０５】
本発明の抗体は、これらが含む特定のCDRについて記載または特定することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、AC10および/またはHeFi-1のCDRの1以上を含む。本発明は、重鎖または軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその誘導体であって、該可変ドメインが、(a)モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1由来の3つのCDRのセットと、(b)それぞれモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1中のフレームワーク領域のセットと異なる4つのフレームワーク領域のセットとを含み、ここで該抗体またはその誘導体はCD30と免疫特異的に結合する、上記抗体またはその誘導体を包含する。
【０１０６】
1つの特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその誘導体であって、該可変ドメインが、(a)配列番号4、6または8を含む3つのCDRのセットと、(b)モノクローナル抗体AC10中のフレームワーク領域のセットと異なる4つのフレームワーク領域のセットとを含み、かつ該抗体またはその誘導体がCD30と免疫特異的に結合する、上記抗体またはその誘導体を包含する。
【０１０７】
1つの特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその誘導体であって、該可変ドメインが、(a)配列番号20、22または24を含む3つのCDRのセットと、(b)モノクローナル抗体HeFi-1中のフレームワーク領域のセットと異なる4つのフレームワーク領域のセットとを含み、該抗体またはその誘導体がCD30と免疫特異的に結合する、上記抗体またはその誘導体を包含する。
【０１０８】
1つの特定の実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその誘導体であって、該可変ドメインが、(a)配列番号12、14または16を含む3つのCDRのセットと、(b)モノクローナル抗体AC10中のフレームワーク領域のセットと異なる4つのフレームワーク領域のセットとを含み、該抗体またはその誘導体がCD30と免疫特異的に結合する、上記抗体またはその誘導体を包含する。
【０１０９】
1つの特定の実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその誘導体であって、該可変ドメインが、(a)配列番号28、30または32を含む3つのCDRのセットと、(b)モノクローナル抗体HeFi-1中のフレームワーク領域のセットと異なる4つのフレームワーク領域のセットとを含み、該抗体またはその誘導体がCD30と免疫特異的に結合する、上記抗体またはその誘導体を包含する。
【０１１０】
さらに、本発明の抗体は、その一次構造について記載または特定することもできる。可変領域およびAC10またはHeFi-1に対して、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、そして最も好ましくは98％の同一性（当業界で公知のおよび本明細書に記載される方法を用いて算出される）を有する抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、CD30へのその結合親和性について記載または特定することもできる。好適な結合親和性には、5X10-2 M、10-2 M、5X10-3 M、10-3 M、5Xl0-4 M、10-4 M、5X10-5 M、10-5 M、5Xl0-6 M、10-6 M、5X10-7 M、10-7 M、5X10-8 M、10-8 M、5X10-9 M、10-9 M、5X10-10 M、10-10 M、5X10-11 M、10-11 M、5X10-12 M、10-12 M、5X-13 M、10-13 M、5X10-14 M、10-14 M、5X10-15 Mまたは10−15 M以下の解離定数またはKdを有するものが含まれる。
【０１１１】
本発明の抗体およびタンパク質は、例えばCD30抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。特定の実施形態では、この抗体は少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％または少なくとも80％の純度である。別の実施形態では、この抗体は85％以上の純度、90％以上の純度、95％以上の純度または99％以上の純度である。
【０１１２】
本発明の抗体には、修飾されている誘導体、すなわち該抗体のCD30への結合またはHD細胞に対する細胞静止効果もしくは細胞傷害効果を妨げない任意のタイプの分子と該抗体との共有結合によって、修飾されている誘導体が含まれる。例えば、限定目的ではないが、抗体の誘導体には、例えば、既知の保護/ブロック基、タンパク質分解切断、リガンドもしくは他のタンパク質等への結合による、グリコシル化、アセチル化、peg化、リン酸化、アミド化、誘導体化によって修飾されている抗体が含まれる。多くの化学的修飾のいずれかを、非限定的に特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む、公知の方法によって実行してもよい。さらに、この誘導体は1以上の非古典的なアミノ酸を含んでもよい。
【０１１３】
本発明の抗体は、当業界で公知のあらゆる適当な方法によって作製し得る。CD30に対するポリクローナル抗体は、当業界で周知の様々な手順によって製造することができる。例えばCD30を、非限定的にウサギ、マウス、ラット等を含む様々な宿主動物に投与して、前記タンパク質に対する特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。宿主に応じて、様々なアジュバントを用いて免疫応答を増加してもよく、該アジュバントには非限定的に、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール（pluronic polyols）、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG（バチルスのカルメット-ゲラン）およびコリネバクテリウム・パルバム（corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。かかるアジュバントも当業界で周知である。
【０１１４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術、あるいはその組合せの使用を含む、当業界で公知の広範囲の技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当業界で公知であり、例えばHarlowらAntibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版, 1988); Hammerlingら: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681（Elsevier, N. Y.,1981）（該参考文献は参照によりその全体を組み入れる）に教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、非限定的にハイブリドーマ技術を介して製造される抗体である。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核、原核またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体をいい、抗体が製造される方法を指すものではない。
【０１１５】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を製造およびスクリーニングする方法は当業界で慣用かつ周知である。非限定的な例では、マウスをCD30もしくはCD30を発現する細胞またはそのフラグメントもしくは誘導体で免疫処理することができる。一度免疫応答が検出されれば（例えばCD30に特異的な抗体がマウス血清中で検出されれば）、マウスの脾臓が回収され、脾細胞が単離される。次いで脾細胞は、任意の適当なミエローマ細胞、例えばATCCから入手可能な細胞系SP20由来の細胞と、周知の技術によって融合される。ハイブリドーマは限界希釈によって選択され、クローニングされる。次いで、ハイブリドーマクローンは当業界で公知の方法によって、CD30へ結合することが可能な抗体を分泌する細胞についてアッセイされる。一般的に高レベルの抗体を含む腹水液を、マウスに陽性ハイブリドーマクローンを注射することによっ作製することができる。
【０１１６】
したがって、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含むモノクローナル抗体の作製方法であって、好ましくは、該ハイブリドーマが本発明の抗原で免疫処理されたマウスから単離された脾細胞とミエローマ細胞とを融合すること、およびその後、融合により生じるハイブリドーマをCD30に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることによって作製される、上記方法ならびに該方法によって作製される抗体を提供する。
【０１１７】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを公知の技術によって作製してもよい。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2フラグメントは、パパイン（Fabフラグメントを産生する）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを産生する）などの酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって作製し得る。F(ab')2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。
【０１１８】
例えば、本発明の抗体は、当業界で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、抗体ドメインはそれをコードする核酸配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。ある特定の実施形態では、かかるファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインは、それをコードする核酸配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列は、動物のcDNAライブラリー（例えばヒトまたはマウスのリンパ組織のcDNAライブラリー）から増幅される。VHおよびVLドメインをコードするDNAは、PCRによってscFvリンカーと共に組み込まれ、ファージミドベクター（例えば、pCANTAB6またはpComb 3 HSS）にクローニングされる。ベクターは大腸菌にエレクトロポレートされ、そしてこの大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法に用いられるファージは、典型的に、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかと組換え的に融合されたFab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現されるfdおよびM13を含む、線状ファージである。CD30に結合する抗原結合ドメインまたはそのAC10もしくはHeFi-1結合部分を発現するファージは、抗原を用いて、例えば標識化抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を用いて、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに用いることができるファージディスプレイ法の例には、Brinkmanら, 1995, J. Immunol. Methods 182 : 41-50 ; Amesら, 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186 ; Kettleboroughら, 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persicら, 1997, Gene 187: 9-18 ; Burtonら, 1994, Advances in Immunology, 191-280; PCT出願第PCT/GB91/O1 134; PCT国際公開WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401;ならびに米国特許第5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743および5,969,108（それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み入れる）に開示されるものが含まれる。
【０１１９】
上述の参考文献に記載されるように、ファージ選択後に、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、これを、ヒト抗体を含む完全抗体または他のあらゆる所望の結合フラグメントを作成することに用いたり、例えば下記に詳細に記載されるように、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含むあらゆる所望の宿主中で発現させることができる。例えばFab、Fab'およびF(ab')2、フラグメントを組換え的に作製する技術は、PCT公開WO 92/22324; Mullinaxら, BioTechniques 1992,12 (6) : 864-869 ;およびSawaiら, 1995, AJRI 34: 26-34;およびBetterら, 1988, Science 240: 1041-1043（該参考文献は参照によりその全体を組み入れる）に開示されるもの等、当業界で既知に方法を用いて使用することができる。
【０１２０】
単一鎖Fvおよび抗体を作製するのに用いることができる技術の例として、米国特許4,946,778および5,258, 498; Hustonら, 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88; Shuら, 1993, PNAS 90: 7995-7999;ならびにSkerraら, 1988, Science 240: 1038-1040に記載されるものが含まれる。ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro増幅または細胞毒性アッセイを含む一部の使用のために、キメラ、ヒト化またはヒト抗体の使用が好ましい。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、例えばマウスのモノクローナル抗体由来およびヒト免疫グロブリン定常領域由来の可変領域を含む抗体など、異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は当業界で既知である。例えば、参照により本明細書にその全体を組み入れるMorrison, Science, 1985, 229 : 1202; Oiら, 1986, BioTechniques 4:214; Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202 ;米国特許第5,807,715; 4,816,567;および4,816, 397を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1以上のCDRならびにヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワークおよび定常領域を含む所望の抗原に結合する、非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体由来の対応の残基で置換され、抗原結合が改変、好ましくは改善されるだろう。これらのフレームワーク置換は、当業界で周知の方法、例えばCDRおよびフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（Queenら,米国特許第5,585,089; Riechmannら, 1988, Nature 332: 323、これらは参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。抗体は、例えばCDRグラフティング（EP 239,400 ; PCT公開WO 9 1/09967;米国特許第5,225,539; 5,530,101;および5,585, 089）、ベニアリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)（EP 592,106 ; EP 519,596 ; Padlan, Molecular Immunology, 1991,28(4/5) : 489-498 ; Studnickaら, 1994, Protein Engineering7 (6) : 805-814; Roguskaら, 1994, PNAS91 : 969-973）、および鎖シャッフリング（米国特許第5,565, 332）を含む当業界で公知の様々な技術を用いてヒト化することができる。
【０１２１】
完全なヒト抗体がヒト患者の治療上の処置に特に望まれる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いて、上述されるファージディスプレイ方法を含む当業界で公知の様々な方法によって作ることができる。例えば、米国特許第4,444,887および4,716,111;ならびにPCT公開WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735,およびWO 91/10741（それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み入れる）も参照されたい。
【０１２２】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを用いて作製することもできる。例えば、ヒト重鎖およい軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムにまたは相同的組換えによってマウスの胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって別々にまたは同時に非機能的にしてもよい。特に、JH領域のホモ接合体欠失は内生的抗体産生を防止する。改変された胚幹細胞は増殖され、胚盤胞に微量注入されてキメラマウスが作製される。次いで、キメラマウスが交配され、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫が作製される。トランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えばCD30の全部または一部）で、通常の様式で免疫化される。この抗原に対するモノクローナル抗体は、慣用のハイブリドーマ技術を用いて、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再配列され、続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を行う。したがって、かかる技術を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術の詳細な議論ならびにかかる抗体を作製するためのプロトコールについては、例えばPCT公開WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 欧州特許第0 598 877;米国特許第5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771;および5,939, 598（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc.（Freemont, CA）およびGenpharm(San Jose, CA)などの企業は、上述されるものと類似する技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体の供給を保証することができる。
【０１２３】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択（guided selection）」と称する技術を用いて作製することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同一のエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する（Jespersら., 1994, Bio/technology 12:899-903）。
【０１２４】
さらにCD30に対する抗体は、次いで、当業者に周知の技術を用いることにより、本発明のタンパク質を「模倣」する抗イディオタイプ抗体を作製することに利用することができる（例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J.7 (5) : 437-444 ; and Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438を参照されたい）。かかる抗イディオタイプのFabフラグメントは治療レジメンにおいて使用して、CD30およびHD細胞に対する個体自身の免疫応答を引き出すことができる。
【０１２５】
上で言及されるように、HDに対して治療上または予防上有用なタンパク質は抗体であることを要しない。したがって、本発明のタンパク質は、CD30に結合しかつHD細胞に対する細胞静止効果および/または細胞傷害効果を発揮する抗体由来のCDRの1以上を含んでもよい。好ましくは本発明のタンパク質は多量体であり、最も好ましくは二量体である。
【０１２６】
本発明はまた、競合的な結合を測定するための当業界で公知のあらゆる方法（例えば本明細書に記載されるイムノアッセイ）によって測定される、CD30へのAC10またはHeFi-1の結合を競合的に阻害するタンパク質（非限定的に抗体を含む）を提供する。好ましい実施形態において、このタンパク質は、CD30へのAC10またはHeFi-1の結合を、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、さらにより好ましくは少なくとも70％、そして最も好ましくは少なくとも75％まで競合的に阻害する。別の実施形態では、このタンパク質はCD30へのAC10またはHeFi-1の結合を、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％まで競合的に阻害する。
【０１２７】
下記でより詳細に議論されるように、HDの予防または治療において、本発明のタンパク質は単独でまたは他の組成物との組合せで使用し得る。このタンパク質はさらに、異種タンパク質とN-またはC-末端で組換え的に融合してもよいし、あるいは細胞傷害剤、タンパク質または他の組成物と化学的にコンジュゲート（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーションを含む）してもよい。例えば、本発明の抗体は、化学療法もしくは毒素として有用な分子と組換え的に融合またはコンジュゲートしてもよく、または放射線治療として使用するための放射性核種を含んでよい。例えば、PCT公開WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 米国特許第5,314, 995; およびEP 396,387を参照されたい。
【０１２８】
本発明のタンパク質は、本発明の抗体のCDRの1以上のコード領域と、異種タンパク質をコードする配列とをインフレームで融合することによって、組換え的に作製してもよい。異種タンパク質は以下の特性：治療上の利益の追加；本発明のタンパク質の安定的な発現を促進する；本発明のタンパク質の高収量の組換え発現を容易にする方法を提供する；または多量体化ドメインを提供する；の1以上を提供し得る。
【０１２９】
本発明の抗体のCDRの1以上を含むタンパク質に加えて、本発明のタンパク質をタンパク質−タンパク質相互作用のためのスクリーニングに適したあらゆる方法を用いて同定してもよい。最初に、CD30に結合するタンパク質が同定され、次いでHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するその能力が判定され得る。従来方法の中で使用することができるものは、λgt11の抗体プロービングの技術に類似した方法において標識化CD30による発現ライブラリーのプロービングを引き起こすことができる「相互作用クローニング」技術である（前掲）。例示かつ非限定的な目的で、これは以下のように達成することができる：CD30（またはそのAC10もしくはHeFi-1結合ドメイン）をコードするcDNAクローンをその末端で、心筋キナーゼ（HMK）用のリン酸化部位を挿入することによって修飾する（Blanar & Rutter, 1992, Science 256: 1014-1018）。組換えタンパク質を大腸菌中で発現し、GDPアフィニティーカラム上で均一に精製し（Ederyら, 1988, Gene 74: 517- 525）、１x108cpm/μgの比活性のウシ心筋キナーゼ（Sigma）およびγ32P-ATPを用いて標識し、そして「ファーウエスタンアッセイ」においてヒト胎盤λgt11 cDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いる（Blanar & Rutter, 1992, Science 256: 1014-1018）。CD30プローブと相互作用するプラークを単離する。陽性λプラークのcDNAインサートを切り離し、pBluescript KS（Stratagene）など、配列決定に適当なベクター中にサブクローニングする。
【０１３０】
タンパク質相互作用をin vivoで検出する1つの方法であるツーハイブリッド（two-hybrid）系が、説明のみを目的とし、かつ限定目的でなく詳細に記載される。この系の1種類が記載されており（Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582）、かつClontech(Palo Alto, CA)から商業的に購入可能である。
【０１３１】
簡潔に言うと、かかる系を利用して、2つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される。1つはCD30と融合された転写アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインからなり、他方はこのプラスミドにcDNAライブラリーの一部として組替えられているcDNAによってコードされる未知のタンパク質と融合されたアクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる。その調節領域に転写アクチベーターの結合部位を含むレポーター遺伝子（例えばlacZ）を含む酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の株にこのプラスミドが形質転換される。ハイブリッドタンパク質単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化することができない、すなわち、DNA結合ドメインハイブリッドは活性化機能を与えないためにレポーター遺伝子の転写を活性化することができず、また、活性化ドメインハイブリッドはアクチベーターの結合部位に局在化することができないためにレポーター遺伝子の転写を活性化することができない。ツーハイブリッドタンパク質の相互作用が機能的アクチベータータンパク質を再構築し、そしてレポーター遺伝子産物についてのアッセイにより検出されるレポーター遺伝子の発現を生じさせる。
【０１３２】
ツーハイブリッド系またはその関連の方法論を用いて、CD30と相互作用するタンパク質（この関連で「餌（bait）遺伝子産物」）について、活性化ドメインライブラリーをスクリーニングすることができる。全ゲノムまたはcDNA配列は活性化ドメインをコードするDNAと融合される。DNA結合ドメインと融合されたCD30コード領域（例えば、HeFi-1またはAC10と相互作用することが既知のCD30ドメインをコードするヌクレオチド配列）のハイブリッドをコードするプラスミドおよびこのライブラリーが酵母レポーター株中に同時転換され、生じる形質転換体がレポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングされる。例えば、限定を目的とするものではないが、CD30コード領域は、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするDNAと翻訳的に融合されるようにベクターにクローニングすることができる。これらのコロニーが精製され、レポーター遺伝子の発現を引き起こすライブラリープラスミドが単離される。次いで、DNAの配列決定を用いてこのライブラリープラスミドによってコードされるタンパク質が同定される。
【０１３３】
一度CD30結合性タンパク質が同定されれば、HD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するその能力（単独でのあるいは二量体化ドメインもしくは多量体化ドメインと多量体化または融合された際の）が、L428、L450、HDLM2またはKM-H2などのHD細胞系の培養物を該タンパク質と接触させることによって判定される。培養条件は、約0.33cm2の培養面積中約5000個の細胞で、接触時間が約72時間であることが最も好ましい。次いでこの培養物が72時間の最後の8時間の間、0.5μCiの3H−チミジンに曝露され、該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みが測定される。前記培養物の細胞が同一の条件下で培養されているが前記タンパク質と接触されていない同一の細胞系の細胞と比較して3H−チミジンの取り込みを低減している場合に、該タンパク質はHD細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【０１３４】
本発明のタンパク質が、作用の機構を制限することなく、2以上のCD30結合部位を有し、それによりCD30分子と交差結合する能力を有することが好ましい。CD30と結合するかまたはCD30への結合についてAC10もしくはHeFi-1と競合するタンパク質は、二量体化または多量体化される際にHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を誘導する能力を獲得することができる。CD30結合性タンパク質が単量体タンパク質である場合、タンデムに発現され得、それによって複数のCD30結合部位を有するタンパク質を生じ得る。CD30結合部位はフレキシブルなリンカー領域によって分けることができる。別の実施形態において、CD30結合性タンパク質は、例えばグルタルアルデヒドを用いて、投与前に化学的に交差結合させることができる。好ましい実施形態において、CD30結合領域は、二量体化および多量体化ドメインを含む異種タンパク質と融合される。HDの治療または予防目的で、本発明のタンパク質の被験者への投与前に、かかるタンパク質はホモダイマーまたはヘテロダイマーの形成を可能にする条件にかけられる。本明細書で使用されるヘテロダイマーは、同一の二量体化ドメインを含むが異なるCD30結合領域を含んでもよく、同一のCD30結合領域を含むが異なる二量体化ドメインを含んでもよく、また異なるCD30結合領域と二量体化ドメインを含んでもよい。
【０１３５】
特に好ましい二量体化ドメインは転写因子が起源であるものである。
【０１３６】
一実施形態において、二量体化ドメインは塩基性領域ロイシンジッパー（「bZIP」）のものである。bZIPタンパク質は、「フォーク（fork）」ドメインで分けられた2つのドメイン、すなわちロイシンジッパー構造ドメインと塩基性アミノ酸に富む塩基性ドメインとを特徴的に保有する（C. Vinsonら, 1989, Science, 246: 911-916）。2つのbZIPタンパク質はロイシンジッパードメインが二量体化されるコイル状コイル領域を形成することによって二量体化される。したがって、これらのコイル状コイル領域を前記タンパク質および本発明用の融合パートナーとして用い得る。
【０１３７】
特に有用なロイシンジッパードメインは酵母転写因子GCN4、哺乳類転写因子CCAAT/エンハンサー結合タンパク質C/EBP、および癌遺伝子産物であるFosおよびJunにおける核トランスフォーム（nuclear transform）のものである（Landschultzら, 1988, Science 240: 1759-1764; BaxevanisおよびVinson, 1993, Curr. Op. Gen. Devel., 3: 278-285;ならびにO'Sheaら, 1989, Science, 243: 538-542）。
【０１３８】
別の実施形態では、二量体化ドメインは塩基性領域へリックス−ループ−へリックス（「bHLH」）タンパク質（Murreら, 1989, Cell, 56: 777-783）のものである。bHLHタンパク質も独立したドメインからなり、その構造によりDNAの特定の配列を認識し、これと相互作用することを可能にする。へリックス−ループ−へリックス領域は、その両親媒性へリックスを介して、bZIPタンパク質のロイシンジッパー領域のものと類似した様式で二量体化を促進する（Davisら, 1990 Cell, 60: 733-746; VoronovaおよびBaltimore, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4722-4726）。特に有用なhHLHタンパク質はmyc、maxおよびmacである。
【０１３９】
ヘテロダイマーは、FosおよびJunの間で（Bohmannら, 1987, Science, 238: 1386-1392）、ATF/CREBファミリーのメンバー間で（Haiら,1989, Genes Dev., 3: 2083-2090）、C/EBPファミリーのメンバー間で（Caoら, 1991, Genes Dev. , 5: 1538-1552; Williamsら, 1991, Genes Dev., 5: 1553-1567;およびRomanら, 1990, Genes Dev.,4 : 1404-1415）、ならびにATF/CREBおよびFos/Junファミリーのメンバー間で（HaiおよびCurran, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3720-3724）形成されることが知られている。したがって、本発明のタンパク質が異なる二量体化ドメインを含むヘテロダイマーとして被験者に投与される際には、上述の任意の組合せを用いてもよい。
【０１４０】
5.2  結合アッセイ
上述されるように、本発明のタンパク質（抗体を含む）はCD30に結合しかつHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する。本発明のタンパク質のCD30への結合能力を立証する方法が本明細書に記載される。
【０１４１】
本発明の抗体は、当業界で公知のいずれかの方法によってCD30への免疫特異的結合についてアッセイしてもよい。用いることができるイムノアッセイには、非限定的に少し名前を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体−結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイが含まれる。かかるアッセイは当業界で慣用かつ周知である（参照によりその全体を本明細書に組み入れるAusubelら, 編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc. , New York）。例示的なイムノアッセイは下記に簡単に記載される（が限定を意図するものではない）。
【０１４２】
免疫沈降プロトコールは一般的に、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤（例えばEDTA、PMSF、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補充したRIPAバッファー（1％ NP40またはTriton X-100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ SDS、0.15M NaCl、0.01 Mリン酸ナトリウム（pH 7.2）、1% Trasylol）などの溶解バッファー中で細胞集団を溶解すること、細胞溶解物に抗体を添加すること、一定時間（例えば1〜4時間）40℃でインキュベートすること、細胞溶解物にプロテインAおよび/またはプロテインGセファロースビーズを添加すること、約1時間以上40℃でインキュベートすること、溶解バッファー中でビーズを洗浄すること、ならびにSDS/サンプルバッファー中でビーズを再懸濁することを含む。免疫沈降物CD30に対する抗体の能力は、例えばウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗体のCD30への結合を増加させ、かつバックグラウンドを低減させる（例えば細胞溶解物をセファロースビーズにより澄明にする）ために改変し得るパラメーターについてよく知っているであろう。免疫沈降プロトコールに関する更なる議論については、例えばAusubelら,編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York 10.16.1.を参照されたい。
【０１４３】
ウエスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製すること、このタンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル（例えば抗原の分子量に依存して8％〜20％ SDS PAGE）中での電気泳動、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDFまたはナイロンなどの膜へタンパク質を転写すること、ブロッキング溶液（3％BSAまたは脱脂乳を含むPBS）中で膜をインキュベートすること、洗浄バッファー（例えばPBS-Tween 20）中で膜を洗浄すること、ブロッキングバッファー中で希釈された一次抗体（すなわち、推定の抗CD30抗体）と一緒に膜をブロッキングすること、洗浄バッファー中で膜を洗浄すること、ブロッキングバッファー中で希釈された酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば32Pまたは125I）とコンジュゲートされた二次抗体（第1抗体、例えば抗ヒト抗体を認識する）と一緒に膜をインキュベートすること、洗浄バッファー中で膜を洗浄すること、ならびに二次抗体の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増加し、かつバックグラウンドのノイズを低減させるために改変し得るパラメーターについてよく知っているであろう。ウエスタンブロットプロトコールに関する更なる議論については、例えばAusubelら,編., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York 10.8.1.を参照されたい。
【０１４４】
ELISAは、抗原（すなわちCD30）を調製すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルをCD30でコートすること、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物とコンジュゲートされた抗体をウェルに添加して一定時間インキュベートすること、ならびに抗体の存在を検出することを含む。ELISAにおいて、抗体は検出可能な化合物とコンジュゲートされる必要はなく、代わりに検出可能な化合物とコンジュゲートされた二次抗体（目的の抗体を認識する）をウェルに添加してもよい。さらに、ウェルを抗原でコートする代わりに、抗体をウェルにコートしてもよい。この場合、検出可能な化合物とコンジュゲートされた二次抗体を、コートされたウェルへのCD30タンパク質の添加後に添加してもよい。当業者は、検出されるシグナルを増加させるために改変し得るパラメーターならびに当業界で公知のELISAの他の変形についてよく知っているであろう。ELISAに関する更なる議論については、例えばAusubelら,編., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc. , New York 11.2.1.を参照されたい。
【０１４５】
抗体のCD30への結合親和性および抗体CD30相互作用のオフレートは、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの一例は、標識したCD30（例えば3Hまたは125I）と目的の抗体との増加量の非標識化CD30の存在下におけるインキュベーション、および標識化CD30と結合した抗体の検出を含む、ラジオイムノアッセイである。次いで、CD30に対する抗体の親和性および結合オフレートを、スキャッチャード・プロット（Scatchard plot）分析によるデータから測定することができる。二次抗体（AC10またはHeFi-1等）との競合もラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合、CD30が標識化化合物（例えば3Hまたは125I）とコンジュゲートされた目的の抗体と共に、増加量の非標識化二次抗体の存在下でインキュベートされる。
【０１４６】
本発明のタンパク質も、CD30へ結合するその能力について、当業界で公知の標準的なアッセイによってアッセイし得る。かかるアッセイには、ファーウエスタンおよび酵母ツーハイブリッド系が含まれる。これらのアッセイは5.2節（前掲）に記載される。上述されるファーウエスタン技術における別の方法は、ウエスタンブロットにおいて標識した候補タンパク質のCD30に結合する能力を測定することを必要とする。ファーウエスタンブロットの非限定的な一例において、目的のCD30またはその断片は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）およびタンパク質セリン/トレオニンキナーゼ認識部位（cAMP依存性キナーゼ認識部位等）をさらに含む融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質はグルタチオン−セファロースビーズ（Pharmacia Biotech）上で精製され、かつウシ心臓キナーゼ（Sigma）および100μCiの32P-ATP（Amersham）で標識される。目的の試験タンパク質はSDS-PAGEで分離され、ニトロセルロース膜にブロットされ、次いで標識化CD30と一緒にインキュベートされる。その後、膜を洗浄して、放射能が定量される。反対に、目的のタンパク質を同一の方法で標識し、CD30がブロットされているニトロセルロース膜を精査することに用いることができる。
【０１４７】
5.3  細胞静止活性および細胞傷害活性についてのアッセイ
定義により、本発明のタンパク質はHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する必要がある。この目的に適切なHD細胞系には、L428、L450、HDLM2およびKM-H2が含まれる（これら全てはGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DMSZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から入手可能である）。
【０１４８】
タンパク質が細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するか否かを判定する多くの方法が当業者に知られており、特定のタンパク質が本発明のタンパク質であるか否かを明らかにすることに用いることができる。かかる方法の実例が下記に記載される。
【０１４９】
CD30に結合するタンパク質がHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮しない場合、このタンパク質は5.1節（前掲）に記載される方法に従って多量体化することができ、この多量体をHD細胞に対して細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するその能力についてアッセイすることができる。
【０１５０】
一旦(i)CD30に結合しかつ(ii)HD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するタンパク質が同定されれば、その治療上の価値は、6節（以下）に記載されるように、モデル動物において確認される。
【０１５１】
好適な実施形態において、タンパク質がHD細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮するか否かを判定することは、約0.33cm2の培養面積中でHD細胞系の5000個の細胞培養物を該タンパク質と72時間接触させることによって成すことができる。72時間の最後の8時間の間は、培養物は0.5μCiの3H-チミジンに曝露される。次いで、培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みが測定される。前記タンパク質に接触された培養物の細胞が、同一の条件下で培養されるが抗CD30抗体と接触されていない同一のHD細胞系の細胞と比較して3H-チミジンの取り込みを低減している場合に、このタンパク質はHD細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有し、HDの治療または予防に有用である。
【０１５２】
この実施形態の特定の形態において、この方法は、(i)約0.33cm2の培養面積を有するウェルに前記抗体を固定化すること；(ii)10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下でホジキン病細胞系の5000個の細胞を該ウェルに添加すること；(iii)該抗体と、10％ウシ胎児血清または20％ウシ胎児血清を含むRPMIのみの存在下で該細胞を72時間培養して、ホジキン病細胞培養物を作製すること；(iv)該72時間の最後の8時間の間、ホジキン病細胞培養物をウェル当たり0.5μCiの3H-チミジンに曝露すること；ならびに（v）ホジキン病細胞培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定することを含む。その際、ホジキン病細胞培養物の細胞が、同一の条件下で培養されるが前記抗体と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して、3H-チミジンの取込みを低減している場合に、該抗体はホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有する。
【０１５３】
本発明の抗CD30抗体の細胞静止効果または細胞傷害効果を判定する方法における特定の実施形態では、10％または20％血清の代わりに、0％、5％、7.5％または15％血清がウェルに添加される。当業者間で標準的技法である通り、血清は培養物への添加前に加熱により不活化される。
【０１５４】
当業者に公知の他の多くの細胞傷害アッセイが存在する。これらのアッセイの一部はネクローシス（壊死）を測定するが、他のアッセイはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を測定する。ネクローシスは、形質膜の透過性の増加を伴い、数分以内に細胞が膨張し、形質膜が破裂する。他方、アポトーシスは膜のブレッビング（blebbing）、細胞質の凝縮および内因性エンドヌクレアーゼの活性化により特徴付けられる。HD細胞に対するこれらの効果のわずか１つでも、上述される細胞静止効果または細胞傷害効果を測定するアッセイに代わるものとしてCD30結合性タンパク質がHDの治療または予防に有用であることを示すのに十分である。
【０１５５】
一実施形態において、ネクローシスは、細胞がニュートラルレッド、トリパンブルーまたはALAMARTMブルーなどの染料を取り込む能力または不能性によって測定された（Pageら, 1993, Intl. J. of Oncology3 : 473-476）。かかるアッセイにおいて、細胞は染料を含有する培地中でインキュベートされ、細胞が洗浄され、染料の細胞取り込みを反映する残存ダイが分光測光法で測定される。
【０１５６】
別の実施形態では、染料はスルホローダミンB（SRB）であり、そのタンパク質への結合を細胞障害性の尺度として用いることができる（Skehanら, 1990, J.Nat'1 Cancer Inst. 82: 1107-12）。
【０１５７】
さらに別の実施形態では、MTTなどのテトラゾリウム塩が、生きた（死んでいない）細胞を検出することによる哺乳類細胞の生存および増殖用の定量的比色アッセイにおいて用いられる（例えばMosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63を参照されたい）。
【０１５８】
さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞が培養物の付着されたおよび「浮遊する」コンパートメントの両方において測定される。いずれのコンパートメントも、上清を除去し、付着した細胞をトリプシンで処理し、そして遠心分離洗浄工程（10分、2000rpm）後に両方の調製物をひとつに合せることによって収集される。腫瘍細胞培養物をスリンダックおよびその関連の化合物で処理してかなりの量のアポトーシスを得るためのプロトコールが文献に記載されている（例えばPiazzaら, 1995, Cancer Research 55: 3110-16を参照されたい）。この方法の特徴として、浮遊する細胞および付着された細胞の両方を収集すること、アポトーシスを観察するための最適な処理時間および用量範囲の同定、ならびに最適な細胞培養条件の同定が含まれる。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、アポトーシスは、DNA断片化を測定することによって定量される。DNA断片化の定量的in vitro測定のための光度測定法も商業上利用することができる。かかるアッセイの例としてTUNEL（断片化DNA中の標識化ヌクレオチドの組込みを検出する）およびELISAに基づくアッセイを含み、Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37（Roche Molecular Biochemicals）に記載される。
【０１６０】
さらに別の実施形態では、アポトーシスは形態学的に観察することができる。試験タンパク質または核酸による処理後に、培養物をアポトーシスおよびネクローシスについて、アクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイドによる標識後の蛍光顕微鏡検査法によってアッセイすることができる。アポトーシス細胞数を測定する方法は、既にDuke & Cohen, 1992, Current Protocols In Immunology, Coliganら,編., 3.17. 1-3.17.16によって記載されている。この実施形態の別の形態では、細胞をDNA染料のヨウ化プロピジウムで標識し、細胞をクロマチン濃縮および核内膜に沿った辺緑化、細胞質濃縮、膜ブレッビングの増加ならびに細胞収縮などの形態学的変化について観察することができきる。
【０１６１】
さらに別の実施形態では、細胞静止効果および/または細胞傷害効果は、ブロモデオキシウリジンの取り込み率を測定することによって測定することができる。細胞は試験タンパク質または核酸を含む完全培地中で培養される。異なる時間で、細胞はブロモデオキシウリジンで標識されて初期の(nascent)DNA合成が検出され、ヨウ化プロピジウムで標識されて総DNA量が検出される。標識された細胞は、既に記載されるBecton - Dickinson Cellfitプログラムを用いたフローサイトメトリーによって細胞周期位置について分析される（Donaldsonら, 1997, J. Immunol. Meth. 203: 25-33）。ブロモデオキシウリジンの取り込みを用いて本発明の抗CD30抗体の細胞静止効果および/または細胞傷害効果を測定する一例が9節（下記）に記載される。
【０１６２】
5.4  シグナル伝達活性のアッセイ
ある好適な実施形態では、本発明のタンパク質は、CD30発現性リンパ球に結合する際に、CD30を介したシグナル伝達の1以上の特徴を誘導することが可能である。CD30結合性タンパク質のシグナル伝達効果についてアッセイすることができるCD30発現性リンパ球は培養された細胞系（例えば、JurkatおよびCESS、いずれもATCCから入手可能である；もしくはKarpas 299およびL540、いずれもDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHから入手可能である）または新鮮な血液サンプルから調製されたリンパ球であり得る。
【０１６３】
好適な実施形態では、本発明のタンパク質は活性化リンパ球上でその活性を評価する前に交差結合される。典型的な実施形態では、本発明のタンパク質が抗CD30抗体である場合、抗CD30抗体は溶液状態で交差結合することができる。簡潔に言うと、抗CD30抗体の1以上の希釈液を、二次抗体の不在または存在下で、96ウェルの平底組織培養プレートに滴定することができる。次いで、リンパ球がウェル当たり約5000個の細胞でプレートに添加される。その後、抗体のシグナル伝達活性は本明細書に記載されるように評価することができる。
【０１６４】
タンパク質がCD30を介したシグナル伝達の1以上の特徴を誘導するか否かを判定する多くの方法が当業者に知られている。かかる方法の実例が下記に記載される。
【０１６５】
5.4.1  カルシウム放出
一実施形態において、本発明のタンパク質は、例えば二次抗体と交差結合する際に、Jurkat細胞中の細胞内遊離Ca2＋の放出を誘導することができる。細胞内遊離Ca2＋の放出はEllisら（1993, J. Immunol. , 151,2380-2389）またはMondおよびBrunswick（1998, Current Protocols in Immunology, Unit 3.9, Wiley）によって記載されるように測定することができる。
【０１６６】
5.4.2  TRAFの局在
TRAF1、TRAF2、TRAF3およびTRAF5を含む4つのTNFレセプター関連因子（TRAF）がCD30の細胞質尾部と相互作用することが証明されている（Gedrichら, 1996, J. Biol. Chem. , 271,12852-12858 ; Leeら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 93,9699-9703 ; Ansieauら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93,14053-14058 ; Aizawaら, 1997, J. Biol. Chem. , 272,2042-2045 ; Tsitsikovら,1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 94,1390-1395 ; Leeら, 1997, J. Exp. Med., 185, 1275-1285; DuckettおよびThompson, 1997, Genes Dev.,11, 2810-2821）。同時トランスフェクション研究、酵母ツーハイブリッドスクリーニングおよびGST融合タンパク質を用いて、TRAF相互作用部位がCD30の細胞質尾部のカルボキシル末端にマッピングされており、CD30とサイトゾル相中のTRAFとの関連性が、CD30に仲介されるシグナルカスケードにおける鍵となる事象であると仮定されている。CD30とTRAFとの間の相互作用がCD30結合を必要とするとは考えられていない（Ansieauら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 93,14053-14058 ;Aizawaら, 1997, J. Biol. Chem. , 272,2042-2045）。しかし、CD30の交差結合は細胞溶解物の界面活性剤可溶性画分からのTRAF1およびTRAF2の消失をもたらす（DuckettおよびThompson, 1997, Genes Dev., 11,2810-2821 ; Archら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 272,936-945）。TRAF2の消失は、核を含む界面活性剤不溶性画分中で検出可能なTRAF2の量における対応増加を伴う（Archら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 272, 936-945）。さらに細胞下の局在研究により、CD30の交差結合がTRAF2のサイトゾルから細胞の核周囲領域への輸送を誘導することが確認されている（Archら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 272, 936-945）。かかるCD30によって仲介されるTRAF2の輸送が、細胞の感受性を調節して、TNFレセプタースーパーファミリーの他のTRAF結合メンバーによって誘導されるアポトーシスを行うことによって、細胞の生存をモジュレートすると仮定されている（DuckettおよびThompson, 1997, Genes Dev.,11, 2810-2821 ; Archら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 272,936-945）。
【０１６７】
本発明の抗体がTRAF2の核輸送を誘導するか否かを決定するために、本発明の抗体をCD30＋細胞および交差結合剤（二次抗体など）と接触させる。次いで、共焦点顕微鏡を用いて、本発明の抗体と共にインキュベートされない細胞に対する、本発明の抗体とインキュベートされた細胞中のTRAF2の局在が比較される。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明の抗体がTRAF2の核局在を誘導するか否かは、様々な細胞画分中のTRAF2の量を（例えばウエスタンブロットで）測定することによってアッセイすることができる。例えば2μg/mlの本発明の抗体を20μg/mlの二次抗体（例えば、本発明の抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、ヤギ抗マウスIgG Fc特異的抗体（Jackson ImmunoReseach, West Grove, PA）を二次抗体として使用することができる）と37℃、5％CO2下で交差結合させる。指定の時点（例えば2〜24時間）で、5ｘ106個の細胞が除かれ、遠沈される。氷冷したPBSで2回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnositc GmBH, Mannheim, Germany）を補充した溶解バッファー（0.15 M NaCl、0.05 MTris-HCI、pH 8.0、0.005 M EDTA、および0.5% NP-40またはTritonX-100）中、100ｘ106/mlで細胞溶解される。溶解は一定に混合しながら4℃で2時間なされる。溶解後、界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性画分を14000xgで20分間遠心分離によって分離する。次いで、界面活性剤可溶性画分を別個のチューブに移し、それに等量の2X SDS-PAGE還元性サンプルバッファーが添加される。等量の１X SDS-PAGE還元性サンプルバッファーは界面活性剤不溶性画分、すなわち遠心後のペレットにも添加される。いずれの画分も100℃まで2分間加熱される。次いで、各時点からの約10μlの画分が12％ Tris-glycine SDS-PAGE（Invitrogen, Carlsbad, CA）で分離される。分離したタンパク質はPVDF膜（Invitrogen）上にウエスタン転写され、0.05％ Tween 20および5％ BSAを補充したTrisバッファー生理食塩水（0.05M Tris-HCl、pH 8.0、0.138M NaCl, 0.0027M KCl）でブロックされる。ブロットは抗TRAF2抗体（Santa Cruz, San Diego, CA）によりイムノブロットされる。異なる画分中のTRAF2タンパク質の存在は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）−コンジュゲート化F(ab')2ヤギ抗ウサギIgG Fc（Jackson ImmunoResearch）およびペルオキシダーゼ基質キットDAB（Vector Laboratories, Burlingame, CA）によって検出される。あるいは、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate kit (Pierce, Rockford, IL)を検出に使用することもできる。
【０１６９】
5.4.3  NF-κB 活性化
本発明の特定の抗体によって誘導することができる別の明らかな情報伝達事象はNF-κBの活性化である。M44、M67およびBer-H2を含む抗CD30 mAbは、標準的な移動度シフトDNA結合アッセイ（McDonaldら, 1995, Eur. J. Immunol., 25,2870-2876 ; Ansieauら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 93,14053-14058 ; Horieら, 1998, Int. Immunol., 10,203-210）によって検出されるように、NF-κBを活性化することができる。かかる効果は、ホジキン細胞、T細胞およびCD30を発現する形質移入体において観察することができる（McDonaldら, 1995, Eur. J. Immunol., 25, 2870-2876 ; Biswasら, 1995, Immunity, 2, 587-596 ; Ansieauら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 14053-14058; Horieら, 1998, Int. Immunol., 10,203-210）。初期のマッピング研究は、TRAF1、TRAF2およびTRAF5とCD30の細胞質尾部との相互作用がCD30に仲介されるNF-κBの活性化のために必要とされることを明らかにした（Leeら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 9699-9703 ; Ansieauら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 14053-14058 ; Aizawaら, 1997, J. Biol. Chem. , 272, 2042-2045 ; Duckettら, 1997, Mol. Cell. Biol., 17, 1535-1542）。つい最近、アゴニスト（agonistic）mAbによるCD30の結合もTRAF2/5非依存的経路を介してNF-κBを活性化することができる証拠が利用可能になっている（Horieら, 1998, Int. Immunol., 10, 203-210）。CD30によって仲介されるNF-κB活性化の生物学的結果の一部には、遺伝子転写の活性化（Biswasら, 1995, Immunity, 2, 587-596 : Maggiら, 1995, Immunity, 3, 251-255）および細胞生存の調節（Mirら, 2000, Blood, 96, 4307-4312; Horieら, 2002, Oncogene, 21, 2439-2503）が含まれる。これらのNF-κBの特性のいずれかをアッセイして、本発明の抗体がCD30シグナル伝達の特徴の1以上を誘導するか否かを決定することができる。
【０１７０】
本発明の抗体によってNF-κBの活性化がCD30＋細胞中で誘導されるか否かは、例えば、CD30＋細胞（3ｘ106/ml）を該抗体（2μg/ml）と共にインキュベートすること、次いで該抗体を交差結合させること（例えば、この抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、該抗体は20μg/mlのヤギ抗マウスIgG Fc特異的抗体（Jackson ImmunoReseach, West Grove, PA）により交差結合され得る）、そして培養物を37℃ 5％CO2下で1時間、一定に振とうしながらインキュベートすることによって測定することができる。細胞密度は1.2ｘ106/mlに調整され、振とうしながらのインキュベーションは更なる時間続けられる。その後、細胞密度はさらに0.6ｘ106/mlまで引き下げられ、細胞は更に46時間、37℃そして5％CO2下で一切の追加の振とうなしにインキュベートされる。インキュベーションの終了後に、刺激された細胞から核抽出物を調製することができ、NF-κB活性化について分析される。
【０１７１】
NF-κBの活性化は、細胞を1850xgで20分間の遠心分離によって収集すること、次いでそれらを5圧縮細胞体積のPBS中で1回洗浄することによってアッセイされる。細胞ペレットは5圧縮細胞体積の低張バッファー（0.01M Hepes、pH 7.9、0.0015M MgCl2、0.01M KCI、0.0002M フェニルメチルスルホニルフッ化物、0.0005M ジチオトレイトール）中で再懸濁される。細胞は1850xgで5分間の遠心分離によって収集される。次いで、ペレットは3圧縮細胞体積の低張バッファー中で再懸濁されて、氷上で10分間膨潤される。その後、膨潤した細胞はDounce homogenizer中できつめのB-ペストルを用いてゆっくりと上げ下げを交互に繰り返しながらホモジナイズされる。細胞溶解はトリパンブルー排除によりモニターされ、十分なストロークが80％以上の細胞溶解を達成するために適用されるものとする。核は3300ｘgで15分間の遠心分離によってペレット化される。上清（細胞抽出物）は除去される。次いで、核ペレットは1/2圧縮細胞体積の低塩バッファー（0.02M Hepes、pH 7.9、25% v/v グリセロール、0.0015M MgCl2、0.02M KCl、0.0002M EDTA、0.0002M フェニルメチルスルホニルフッ化物、0.0005M ジチオトレイトール）中で再懸濁される。次いで、等量の高塩バッファー（0.02M Hepes、pH 7.9、25% v/vグリセロール、0.0015M MgCl2、1.2M KCl、0.0002M EDTA、0.0002M フェニルメチルスルホニルフッ化物、0.0005M ジチオトレイトール）を核懸濁液に穏やかにかき混ぜながらゆっくり添加して、およそ0.3Mの最終KCl濃度とする。抽出は穏やかにかき混ぜながら約30分間継続する。抽出後、核は25000xgで30分間の遠心分離によって除去される。次いで、核抽出が50容量の透析バッファー（0.02M Hepes、pH 7.9、20% v/v グリセロール、0.1M KCl、0.0002M EDTA、0.0002M フェニルメチルスルホニルフッ化物、0.0005M ジチオトレイトール）に対して、核抽出物の伝道度が透析バッファーと同じになるまで透析される。核抽出物は25000xgで20分間1回以上遠心分離されて残りの破片が除去され、上清のタンパク質濃度がマイクロBCAアッセイ（Pierce）によって測定される。
【０１７２】
抗CD30で刺激された細胞の核抽出物におけるNF-κBの存在は、Gel Shift Assay System (Promega, Madison, WI)を用いた標準的な移動度シフトDNA結合アッセイによって検出することができる。配列5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'（配列番号33）を有するコンセンサスNF-κB結合モチーフを含む二重鎖オリゴヌクレオチドプローブ（LenardoおよびBaltimore, 1989, Cell, 58,227-229）を特異的プローブとして用いて、核抽出物中のNF-κBを検出する。このプローブはT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[α−32P]ATPによってリン酸化される。リン酸化されたプローブはTEバッファー（0.01M Tris-HCl、pH8.0、0.001M EDTA）で平衡化されたセファロースG25スピンカラムによって精製される。次いで、精製したプローブは酢酸アンモニウムとエタノールによって沈殿され、その後100μlのTEバッファー中で再懸濁される。抗CD30で処理された細胞および対照の処理細胞からの核抽出物を含む反応混合液を、Gel Shift Bindingバッファー、水および未標識の競合プローブと製品使用説明書に従って別々に混合される。NF-κBコンセンサスを含む未標識のオリゴヌクレオチドと未標識の無関係なオリゴヌクレオチドが、配列特異的および配列非特異的競合物質として反応混合液に含まれる。室温で10分間のインキュベーション後、1μlの32P標識化NF-κBコンセンサスオリゴヌクレオチドが各反応液に添加される。反応は室温でさらに20分間継続することができる。インキュベーションの終了後に、1μlの10Xローディングバッファー（0.25M Tris-HCl、pH7.5、40% v/vグリセロール、0.2% ブロモフェノール・ブルー）が反応液に添加される。その後、反応液は6％DNA遅延（retardation）ゲル（Invitrogen）の個々のウェルにロードされ、0.5X TBE（0.045M Tris-HCl、0.045M ホウ酸、0.001M EDTA）中、100ボルトで90分間分離される。電気泳動後、ゲルをプラスチックラップで覆い、−70℃でX線フィルムに露光してNF-κBとNF-κB結合配列を含むオリゴヌクレオチドとの間の特異的相互作用を検出する。
【０１７３】
5.5  本発明の核酸
本発明はさらに、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、これには非限定的に本発明のタンパク質およびその断片が含まれる。本発明の核酸がCD30と結合し、かつHD細胞に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を発揮する抗体のCDRの1以上をコードすることが好ましい。本発明の例示的な核酸は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29または配列番号31を含む。本発明の好ましい核酸は、配列番号1、配列番号9、配列番号17または配列番号25を含む（これらの配列確定物が対応するAC10またはHeFi-1のドメインを同定するため、頁9〜10の表1（前掲）を参照されたい）。
【０１７４】
本発明は、ストリンジェントな、中程度のまたは低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸、好ましくは本発明の抗体をコードする核酸にハイブリダイズする核酸をも包含する。
【０１７５】
例示目的でかつ非限定的に、90ヌクレオチドを超えるハイブリダイゼーション領域に対する低ストリンジェントな条件を用いた手順は以下の通りである（ShiloおよびWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 6789-6792も参照されたい）。DNAを含むフィルターを、35%ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSA、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中、40℃で6時間前処理する。0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100μg/ml サケ精子DNA、10% (wt/vol)硫酸デキストランおよび5〜20X 106cpm 32P標識化プローブを用いることの変更を含む同一の溶液中でハイブリダイゼーションを実施する。フィルターをハイブリダイゼーション混合液中、40℃で18〜20時間インキュベートし、その後、2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTAおよび0.1% SDSを含む溶液中、55℃で1.5時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と取替え、さらに1.5時間60℃でインキュベートする。フィルターにブロットして、それを乾燥し、オートラジオグラフィーのために露光させる。必要であれば、フィルターを65〜68℃で3回洗浄し、フィルムに再び露光する。使用し得る低ストリンジェントな他の条件は当業界で周知である（例えば、交雑種ハイブリダイゼーションに使用されるもの）。
【０１７６】
さらに例示目的でかつ非限定的に、90ヌクレオチドを超えるハイブリダイゼーション領域に対する高ストリンジェントな条件を用いた手順は以下の通りである。DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションは、6X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSAおよび500μg/mlの変性サケ精子DNAからなるバッファー中、65℃で8時間から一晩の間実施される。フィルターは、100μg/mlの変性サケ精子DNAおよび5〜20X 106 cpmの32P標識化プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中、65℃で48時間ハイブリダイズされる。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.01% PVP、0.01% Ficollおよび0.01% BSAを含む溶液中、37℃で1時間なされる。これにオートラジオグラフィー前の0.1X SSC中、50℃45分間の洗浄が続く。
【０１７７】
使用し得る高ストリンジェントな別な条件は、核酸の性質（例えば長さ、GC含量など）およびハイブリダイゼーションの目的（検出、増幅等）に依存し、これは当業界で周知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における約15〜40塩基の核酸の相補配列へのストリンジェントなハイブリダイゼーションは以下の条件下でなされる：50mM KClの塩濃度、10mM Tris-HClのバッファー濃度、1.5mMのMg2＋濃度、7〜7.5のpHおよび55〜60℃のアニーリング温度。
【０１７８】
別の特定の実施形態では、中程度のストリンジェンシー条件下で本発明の核酸またはその相補鎖とハイブリダイズ可能な核酸が提供される。かかるストリンジェンシーに適当な条件の選択は当業界で周知である（例えばSambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;またAusubelら,編.,the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals,987-1997,Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照されたい）。
【０１７９】
本発明の核酸を、当業界で公知のいずれかの方法によって得てもよく、核酸のヌクレオチド配列を決定してもよい。例えば、タンパク質のヌクレオチド配列が知られている場合、抗体をコードする核酸は、簡潔に言って該タンパク質をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングと連結、およびその後のPCRによる連結オリゴヌクレオチドの増幅を含む、化学合成されたオリゴヌクレオチドから（Kutmeierら, 1994, BioTechniques 17: 242に記載されるように）組み立てることができる。
【０１８０】
あるいは、本発明のタンパク質をコードする核酸は、適当な供給源由来の核酸から作製し得る。特定のタンパク質分子の配列が知られているが、該タンパク質をコードする核酸を含むクローンが入手可能でない場合、該タンパク質をコードする核酸は化学合成してもよいし、適当な供給源（例えば、抗体cDNAライブラリーあるいは該タンパク質を発現している任意の組織または細胞から単離された核酸、好ましくはポリA＋RNAから作製されたcDNAライブラリーなどの、cDNAライブラリー。タンパク質が抗体である場合、ライブラリー供給源は本発明の抗体を発現する選択されたハイブリドーマ細胞であり得る）から、この配列の3'および5'末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたPCR増幅、あるいは、例えばこのタンパク質をコードするcDNAライブラリー由来のcDNAクローンを同定するための、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって得てもよい。次いで、PCRによって作製された増幅核酸を当業界で周知のいずれかの方法を用いて複製可能なクローニングベクター中にクローニングしてもよい。
【０１８１】
一旦抗体のヌクレオチド配列および対応のアミノ酸配列が決定されれば、このタンパク質のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の操作のための当業界で周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCR等（例えば、いずれも参照によりその全体を本明細書に組み入れるSambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら,編., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載される技術を参照されたい）を用いて操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製してもよく、例えばアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を生じさせてもよい。
【０１８２】
1つの特定の実施形態では、このタンパク質は抗体であり、そして重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を当業界で周知の方法、例えば配列の超可変領域を決定するための他の既知の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列との比較によって同定し得る。上述されるように、慣用の組換えDNA技術を用いて、1以上のCDRをフレームワーク領域、例えばヒトフクレームワーク領域内に挿入して、非ヒト抗体をヒト化してもよい。フレームワーク領域は天然のまたはコンセンサスなフレームワーク領域であってもよく、ヒトフレームワーク領域であることが好ましい（例えばヒトフレームワーク領域の列挙のためにChothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479参照されたい）。このフレームワーク領域およびCDRの組合せから作製された核酸は、CD30に特異的に結合しかつHD細胞に対する細胞静止効果および/または細胞傷害効果を発揮する抗体をコードする。上述されるように、フレームワーク領域内で1以上のアミノ酸置換がなされることが好ましく、かつ該アミノ酸置換が、CD30に対する抗体の結合を改善する、ならびに/あるいは抗体の細胞静止効果および/または細胞傷害効果を増強することが好ましい。さらに、かかる方法を使用により鎖内ジスルフィド結合中に関与する1以上の可変領域のシステイン残基をアミノ酸置換または欠失し、1以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製することもできる。核酸に対する別の改変も本発明に包含され、かつ当業者の技術範囲内である。
【０１８３】
さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生用に開発された技術（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neubergerら,1984, Nature 312: 604-608; Takedaら, 1985, Nature 314: 452-454）を使用することもできる。上述されるように、キメラ抗体は、個々の部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するもの、例えばヒト化抗体である。
【０１８４】
あるいは、単一鎖抗体の産生のために記載される技術（米国特許第4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; およびWardら, 1989, Nature 334: 544-54）を用いて単一鎖抗体を製造することもできる。単一鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結して単一鎖タンパク質を生じさせることによって形成される。大腸菌における機能的Fvフラグメントの構築のための技術を使用してもよい（Skerraら, 1988, Science 242: 1038-1041）。
【０１８５】
5.6  AC10およびHeFi-1に関する配列
本発明は、それぞれAC10およびHeFi-1のCDRと相同な領域、またはこれをコードする領域を含んでなるタンパク質ならびに核酸をさらに包含する。幾つかの実施形態では、相同な領域は、AC10またはHeFi-1の対応領域と少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも98％の同一性によって特徴付けられる。
【０１８６】
一実施形態において、本発明はHeFi-1のCDRと相同な領域（配列番号20、配列番号22；配列番号24；配列番号28；配列番号30または配列番号32）を含むタンパク質を提供する。別の実施形態において、本発明はAC10のCDRと相同な領域（配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号12；配列番号14;または配列番号16）を含むタンパク質を提供する。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明はHeFi-1のCDRコード領域と相同な領域（配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29または配列番号31）を含む核酸を提供する。さらに別の実施形態では、本発明はAC10のCDRコード領域と相同な領域（配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号11、配列番号13、配列番号15）を含む核酸を提供する。
【０１８８】
本発明は、それぞれAC10およびHeFi-1の可変領域と相同な領域、またはそれをコードする領域を含んでなるタンパク質ならびに核酸を包含する。幾つかの実施形態において、相同な領域は、AC10またはHeFi-1の対応領域と少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも98％の同一性によって特徴付けられる。
【０１８９】
一実施形態において、本発明はHeFi-1の可変領域（配列番号18または配列番号26）と相同な領域を含むタンパク質を提供する。別の実施形態において、本発明はAC10の可変領域（配列番号2または配列番号10）と相同な領域を含むタンパク質を提供する。
【０１９０】
一実施形態において、本発明はHeFi-1の可変領域をコードする領域（配列番号17または配列番号25）と相同な領域を含む核酸を提供する。別の実施形態では、AC10の可変領域をコードする領域（配列番号1または配列番号9）と相同な領域を含む核を提供する。
【０１９１】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸、例えばAC10またはHeGi-1可変領域の配列と、AC10またはHeFi-1可変領域と相同な領域を含む他のタンパク質からの配列との間、の同一性％を決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、第2のアミノ酸または核酸配列との最適アライメントのために、第1のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応のアミノ酸位置またはヌクレオチド位置で、アミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第1配列中の位置が第2配列中の対応位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドでしめられている場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性％は、配列により共有される同一位置数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数/位置（例えば重複位置）の総数×100）。一実施形態では、2つの配列は同一の長さである。
【０１９２】
2つの配列間の同一性％の決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な好ましい例は、KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877で改変されたKarlinおよびAltschul（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムはAltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラム（1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410）中に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア＝100、断片長＝12により実行して、SCA-1変更タンパク質をコードする核酸と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア＝50、断片長＝3により実行して、SCA-1変更タンパク質と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップが与えられたアライメントを得るために、Gapped BLASTをAltschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されるように利用することができる。あるいは、PSI-Blastを用いて分子間の距離関係（Id）を検出する反復検索が実行される。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトのパラメーターを利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。配列比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な別の好ましい例は、MyersおよびMillerのアルゴリズムであるCABIOS（1989）である。かかるアルゴリズムはGCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM120重み残基表（weight residue table）、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いることができる。配列分析用の更なるアルゴリズムは当業界で公知であり、TorellisおよびRobotti（1994, Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5）に記載されるADVANCEおよびADAM；ならびにPearsonおよびLipman（1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8）に記載されるFASTAが含まれる。FASTAの中で、ktupは検索の感度と速度を設定する制御オプションである。ktupが2の場合、比較されている2つの配列中の類似領域は、整列された残基対を調べることによって見つけられる;ktupが1の場合、単一の整列されたアミノ酸が調査される。ktupはタンパク質配列用に2または1に、あるいはDNA配列用に1〜6に設定することができる。ktupが指定されない場合、タンパク質用のデフォルトは2であり、DNA用のデフォルトは6である。FASTAパラメーターの更なる記載についてはhttp://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.l.html#sect2（その内容を参照により本明細書に組み入れる）を参照されたい。
【０１９３】
あるいは、タンパク質配列アライメントを、Higginsら, 1996, Methods Enzymol. 266 : 383-402に記載されるCLUSTAL Wアルゴリズムを用いて実行してもよい。
【０１９４】
2つの配列間の同一性％は、ギャップの許容を伴うかまたは伴わない上述に記載されるものと類似する技術を用いて決定することができる。同一性％を算出する際、正確な一致のみがカウントされる。
【０１９５】
5.7  本発明のタンパク質を作製する方法
抗体を含む本発明のタンパク質は、タンパク質の合成のための当業界で公知のあらゆる方法によって、特に化学合成または好ましくは組換え発現技術によって、作製することができる。
【０１９６】
本発明のタンパク質（そのフラグメント、誘導体または類似体（例えば本発明の抗体の重鎖または軽鎖））の組換え発現は、このタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターの構築を必要とする。一旦本発明のタンパク質をコードする核酸が得られていれば、このタンパク質分子の産生用のベクターを当業界で周知の技術を用いた組換えDNA技術によって作製し得る。したがって、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現することによるタンパク質の製造方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、コード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えばin vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組み換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターと機能的に連結された本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このタンパク質が抗体である場合、ヌクレオチド配列はプロモーターと機能的に連結されたその重鎖もしくは軽鎖または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードしてもよい。かかるベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えば、PCT公開WO 86/05807; PCT公開WO 89/01036;および米国特許第5,122,464を参照されたい）、抗体の可変ドメインは完全な重鎖または軽鎖の発現のためにそのようなベクター中にクローニングし得る。
【０１９７】
発現ベクターは従来の技術によって宿主細胞中に移入され、その後トランスフェクトされた細胞は従来の技術によって培養されて本発明のタンパク質を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターと機能的に連結された本発明のタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態において、完全な免疫グロブリン分子の発現のために、下記に記載されるように重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞中で同時に発現させることもできる。
【０１９８】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のタンパク質分子を発現させることもできる。そのような宿主発現系は、それによって目的のコード配列を産生し、その後精製し得るビヒクルを表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた際にin situで本発明のタンパク質を発現し得る抗体をも表す。これらには非限定的に、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌、枯草菌）等の微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスであるCaMV；タバコモザイクウイルスであるTMV）で感染させた植物細胞系または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスから誘導されるプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を内部に持つ哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞）が含まれる。好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)などの細菌細胞、そしてより好ましくは特に完全組換え抗体分子用の真核細胞が本発明の組換えタンパク質の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な即時型初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと組合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳類細胞が、本発明のタンパク質に効果的な発現系である（Foeckingら, 1986, Gene 45:101 ; Cockettら, 1990, Bio/Technology 8: 2）。
【０１９９】
細菌系において、発現されるタンパク質の折り畳み条件および翻訳後修飾条件に適した使用に応じて都合よく選択し得る。可能であれば、本発明のタンパク質を含む医薬組成物の生成のために上記タンパク質を大量に製造すべき場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましいかもしれない。そのようなベクターには、非限定的に、融合タンパク質を作製するために抗体コード配列をlac Zコード領域と共にインフレームで別々にベクターに連結し得る大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EMBO 1.2:1791）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509）などが含まれる。pGEXベクターを用いてグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）を含む融合タンパク質を発現することもできる。一般的に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、吸着およびグルタチオンアガロースビーズマトリックスへの結合に続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むことで、クローン化標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るように設計される。
【０２００】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多核体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて外来遺伝子を発現させる。スポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda）細胞中でウイルスは増殖する。抗体コード配列は、個々にウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングして、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置させてもよい。
【０２０１】
哺乳類宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして利用される場合、本発明のタンパク質のコード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三つ組みのリーダー配列（tripartite leader sequence）に連結し得る。次いで、このキメラ遺伝子はin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域E1またはE3）中の挿入は、感染した宿主中で生存可能かつ本発明のタンパク質を発現することが可能な組換えウイルスを生じさせる（例えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1 : 355-359参照されたい）。特定の開始シグナルも挿入されたコード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、完全なインサートの翻訳を保証するために所望のコード配列の読み枠と同じ位相内になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは様々な起源であり得、天然および合成のものであり得る。発現の効率は適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を包含させることによって増進し得る（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい）。
【０２０２】
さらに、挿入された配列の発現をモジュレートするかまたは特定の望まれる様式で遺伝子産物を修飾しかつプロセシングする宿主細胞株を選択し得る。タンパク質産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は本発明のタンパク質の機能にとって重要であり得る。個々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングならびに修飾について特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証することができる。このために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を選択し得る。かかる哺乳類宿主細胞には非限定的にCHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3およびW138が含まれる。
【０２０３】
組換えタンパク質の長期にわたる高収量の産出のために、安定的な発現が好ましい。例えば、本発明のタンパク質を安定的に発現する細胞系を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）および選択可能なマーカーで制御されたDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後に、操作した細胞を富化培地中で1〜2日間増殖させてもよく、その後、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体中に組み入れること、および増殖して次にクローン化し、細胞系に増殖され得る細胞増殖巣を形成することを可能にする。この方法を用いて本発明のタンパク質を発現する細胞系を都合よく操作し得る。
【０２０４】
多くの選択系が用いられ得、非限定的に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11 : 223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22: 8-17）遺伝子が含まれ、それぞれtk-, hgprt-またはaprt-細胞中で使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子についての選択のベースとして用いることができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Clinical Pharmacy 12:488-505 ; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932 ;ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215）；ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら, 1984, Gene 30: 147）。組換えDNA技術の分野で共通して知られる方法を所望の組換えクローンを選択することに慣用的に適用してもよく、そのような方法は、例えば参照によりその全体を本明細書に組み入れるAusubelら (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);およびDracopoliら(編), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994), 12および13章; Colberre-Garapinら,1981, J. Mol. Biol. 150: 1に記載される。
【０２０５】
本発明のタンパク質の発現レベルはベクター増幅によって増加することができる（総説については、BebbingtonおよびHentschel, 「The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNY Cloning」, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害物質のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加するだろう。増幅した領域は抗体遺伝子と関連するため、本発明のタンパク質の産生も増加されるだろう（Crouseら, 1983, Mol. Cell Biol. 3 : 257）。
【０２０６】
本発明のタンパク質が抗体である場合、宿主細胞は本発明の2つの発現ベクター、すなわち重鎖に由来するタンパク質をコードする第1のベクターおよび軽鎖に由来するタンパク質をコードする第2のベクターで、同時にトランスフェクトし得る。この2つのベクターは同一の選択可能なマーカーを含んでもよく、これは重鎖および軽鎖タンパク質の均等な発現を可能にする。あるいは、重鎖および軽鎖タンパク質の両方をコードし、かつその発現が可能な単一のベクターを用いてもよい。このような状況においては、軽鎖が重鎖の前に置かれることで毒性のない重鎖が過剰になるのを回避すべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322: 52 (1986); Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2 197）。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAおよびゲノムDNAを含んでもよい。
【０２０７】
一旦本発明のタンパク質分子が動物、化学合成または組換え発現によって作製されていれば、タンパク質精製のための当業界で公知のあらゆる方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー；親和性、特に特異的抗原、プロテインA（抗体分子用）に対する親和性またはタンパク質が融合タンパク質である異種融合パートナーに対する親和性による、アフィニティークロマトグラフィー；および分子ふるい(sizing)カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差、またはタンパク質の精製のための他のあらゆる標準的な技術によって精製し得る。
【０２０８】
本発明は、融合タンパク質を生じるために本発明の（好ましくは少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または少なくとも100アミノ酸の）異種タンパク質と組換え的に融合されたまたは化学的にコンジュゲートされた（共有および非共有コンジュゲーションの両者を含む）CD30結合性タンパク質を包含する。この融合は必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。
【０２０９】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインと融合またはコンジュゲートされた本発明のタンパク質を含む組成物を含む。例えば、本発明のタンパク質は、抗体Fc領域またはその一部と融合またはコンジュゲートし得る。本発明のタンパク質と融合される抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CR2ドメインおよびCH3ドメイン、または全てのドメインもしくはその一部のあらゆる組合せを含んでもよい。このタンパク質はまた、上記抗体の一部と融合またはコンジュゲートされて多量体を形成することもできる。例えば、本発明のタンパク質と融合されたFc部分は、Fc部分の間のジスルフィド結合を介して二量体を形成することができる。高多重体形態は、タンパク質とIgAおよびIgMの一部とを融合することによって作製することができる。本発明のタンパク質を抗体の一部と融合またはコンジュゲートする方法は当業界で公知である。例えば米国特許第5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851 ; 5,112,946; EP 307,434 ; EP 367,166; PCT公開WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenaziら, 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zhengら, 1995, J. Immunol. 154: 5590-5600 ;ならびにVilら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11337-11341を参照されたい（該参考文献はその全体を参照により組み入れる）。
【０２１０】
5.8  コンジュゲートおよび融合タンパク質
上で議論されているように、本発明のタンパク質は、CD30と結合しかつHD細胞に対する細胞静止効果および/または細胞傷害効果を発揮し、そして異種タンパク質または細胞傷害剤とさらに融合またはコンジュゲートされているタンパク質を包含する。
【０２１１】
したがって、本発明は、本発明のタンパク質または核酸の投与によるホジキン病の治療を提供する。本発明のタンパク質は、非限定的にAC10およびHeFi-1タンパク質、抗体ならびにその類似体および誘導体（例えば本明細書に上述される）を含み；本発明の核酸は、非限定的にかかるAC10およびHeFi-1タンパク質、抗体ならびに類似体または誘導体（例えば本明細書に上述される）をコードする核酸を含む。
【０２１２】
本発明の特定の実施形態において、本発明のタンパク質または核酸は化学的に修飾されてその細胞静止特性および/または細胞傷害特性を改善し得る。例えば、本発明のタンパク質はコンジュゲートとして投与することができる。本発明のタンパク質とのコンジュゲーションに特に適した成分は、化学療法剤、プロドラック変換酵素、放射性同位体または化合物、あるいは毒素である。あるいは、本発明の核酸を修飾して、プロドラッグ変換酵素のコード配列を本発明のタンパク質のコード配列と機能的に結合させてもよく、その結果、機能的に活性なプロドラッグ変換酵素と本発明のタンパク質とを含む融合タンパク質が、5.7節（下記）に記載される遺伝子治療による核酸の投与時に被験者において発現される。
【０２１３】
一実施形態において、本発明のタンパク質はペプチド等のマーカー配列と融合されて精製が促進される。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、pQEベクター中に提供されるタグ（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）等、中でも、その多くが市販されているヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Gentzら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 : 821-824に記載されるように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグには、非限定的に、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当する「HA」タグ（Wilsonら, 1984, Cell 37: 767）および「フラッグ」タグが含まれる。かかる融合タンパク質は当業者に公知の標準的な組換え方法によって作製することができる。
【０２１４】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は治療剤と融合またはコンジュゲートされる。例えば、本発明のタンパク質は、化学療法剤、毒素（例えば細胞静止剤もしくは殺細胞剤（cytocidal agent））、または放射性核種（例えば、212Bi、211Atなどのα放射体または131I、90Yもしくは67Cuなどのβ放射体）などの細胞傷害剤とコンジュゲートし得る。
【０２１５】
メトトレキサート（Endoら, 1987, Cancer Research 47: 1076-1080）、ダウノマイシン（Gallegoら, 1984, Int. J. Cancer. 33: 737-744）、マイトマイシンC（MMC）（Ohkawaら, 1986, Cancer Immunol. Immunother. 23 : 81-86）およびビンカアルカロイド（Rowlandら, 1986, Cancer Immunol Immunother. 21: 183-187）などの薬剤が抗体と結合されており、誘導化コンジュゲートが抗腫瘍活性について調査されている。コンジュゲーション処理の結果として薬剤および/またはタンパク質の活性が減少しないことを保証するために、化学療法剤コンジュゲートの作製には注意が払われるべきである。
【０２１６】
化学療法剤の例には、以下の化学療法剤の非相互排他的なクラスが含まれる：アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、抗チュブリン剤、アウリスタチン、化学療法増感剤、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エトポシド、フッ化ピリミジン、レキシトロプシン（lexitropsin）、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤およびビンカアルカロイド。本発明の核酸またはタンパク質とコンジュゲートすることができる個々の化学療法剤の例として、非限定的に、アンドロゲン、アントラマイシン（AMC）、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン（BSNU）、CC-1065、クロラムブチル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（CCNU）、メクロレタミン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン（procarbizine）、ストレプトゾトシン、テノポシド（tenoposide）、6−チオグアニン、チオTEPA、トポテカン（topotecan）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16およびVM-26が含まれる。好ましい実施形態において、化学療法剤はアウリスタチンEである。さらに好ましい実施形態において、化学療法剤は（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許出願09/845,786（出願日2001年4月30日）に記載される）アウリスタチンE誘導体AEBである。
【０２１７】
本発明のタンパク質の治療効果を増強するために使用される本発明のコンジュゲートは、毒素などの非古典的な治療剤を含む。そのような毒素には、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素が含まれる。
【０２１８】
かかる治療成分とタンパク質、そして特に抗体とをコンジュゲートするための技術は周知であり、例えばArnonら,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら（編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstromら,「Antibodies For Drug Delivery」, in Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, in Monoclonal Antibodies'84 : Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編), pp. 475-506 (1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), pp.303-16 (Academic Press1985),およびThorpeら, 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58.を参照されたい。
【０２１９】
あるいは、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第4,676,980においてSegalによって記載されるように、本発明の抗体は第2の抗体とコンジュゲートさせて抗体異種コンジュゲートを形成させることもできる。
【０２２０】
上で議論されているように、本発明の特定の実施形態において、本発明のタンパク質をプロドラッグ変換酵素と同時に投与することができる。プロドラッグ変換酵素は、本発明のタンパク質を含むかまたはこれとコンジュゲートされた融合タンパク質として発現することができる。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼG2、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−V−アミダーゼ、ペニシリン−G−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼAである。
【０２２１】
5.9  抗CD30抗体−薬剤コンジュゲート
本発明は、免疫学的疾患の治療または予防のための、抗CD30抗体−薬剤コンジュゲート(抗CD30 ADC)の使用を包含する。本発明のACDは、CD30発現性細胞を含む免疫疾患の患者に投与される際、好ましくは、単独だけでなく他の治療剤との組合せで投与される際に、CD30発現性細胞に対する臨床的に有益な細胞静止効果または細胞傷害効果を生み出すように作製される。
【０２２２】
そのような薬剤とタンパク質、そして特に抗体とをコンジュゲートする技術は周知であり、例えばArnonら,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstromら,「Antibodies For Drug Delivery」, in Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, in Monoclonal Antibodies'84 : Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編), pp. 475-506 (1985);「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), pp. 303-16 (Academic Press 1985),ならびにThorpeら, 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58.を参照されたい。
【０２２３】
本発明の治療方法に包含される多くの疾患状態において、有意な量の可溶性CD30が活性化リンパ球から放出されるため、薬剤（例えば細胞傷害剤または免疫抑制剤）またはプロドラッグ変換酵素とコンジュゲートされている抗CD30抗体を用いる際に、薬剤またはプロドラッグ変換酵素は可溶性CD30を見つけ得る身体のあらゆる場所というよりむしろ、活性化リンパ球の付近で活性である。
【０２２４】
本発明の抗CD30抗体によってターゲティングされる活性化リンパ球の外側での薬剤活性を最小にするために2つの方法を取り得る。まず、細胞膜に結合するが可溶性CD30には結合しない抗体を用いることによって、薬剤（プロドラッグ変換酵素の作用によって生じる薬剤を含む）を活性化リンパ球の細胞表面に集中させ得ることである。本発明の抗体に結合した薬剤の活性を最小にするさらに好ましい方法は、該薬剤が加水分解されまたは抗体から切り離されてもその活性を低減しないように薬剤をコンジュゲートすることである。かかる方法は、活性化リンパ球の細胞表面の環境（例えば活性化リンパ球の細胞表面に存在するプロテーゼ活性）または前記コンジュゲートが活性化リンパ球に受け取られる際に遭遇する活性化リンパ球内の環境（例えば、エンドソーム環境またはpH感受性またはプロテアーゼ感受性による、リソソーム環境）に対して感受性のあるリンカーによる、薬剤と抗体との結合を用いる。
【０２２５】
一実施形態において、リンカーはリソソーム内で加水分解される酸不安定性ヒドラゾンまたはヒドラジド基である（例えば、米国特許第5,622,929を参照されたい）。別の実施形態において、薬剤はcis-アコニチン酸アミド（aconitic amide）、オルトエステル、アセタールおよびケタールなどの、他の酸不安定性リンカーを介して抗CD30抗体に結合することができる（DubowchikおよびWalker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Nevilleら, 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661）。そのようなリンカーは、血中条件などの中性pH条件下では比較的安定であるが、pH 5以下、すなわち、リソソームに近いpHでは不安定である。
【０２２６】
別の実施形態では、薬剤は細胞内プロテアーゼによって切断されるペプチドスペーサーを用いて本発明の抗CD30抗体と結合される。標的酵素にはカテプシンBおよびDならびにプラスミンが含まれ、これら全てはジペプチドドラッグ（dipeptide drug）誘導体を加水分解して、標的細胞の内側で活性の薬剤の放出をもたらすことが知られている（DubowchikおよびWalker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123）。細胞内プロテアーゼ分解薬剤放出を用いることの利点は、コンジュゲートされた際に薬剤がかなり弱毒化されること、およびコンジュゲートの血清安定性が極めて高くなりうることである。
【０２２７】
さらに別の実施形態では、このリンカーはマロネートリンカー（Johnsonら, 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lauら, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10) : 1299-1304）または3−N-アミド類似体（Lauら, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1305-12）である。
【０２２８】
本発明の抗CD30抗体とのコンジュゲーションに使用される薬剤は、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンC、エトポシドなどの従来の化学療法剤が含まれ得る。さらに、CC-1065類似体、カリキアマイシン（calichiamicin）、メイタンシン、ドラスチン10の類似体、リゾキシンおよびパリトキシンを、従来の安定なリンカーを用いて抗CD30抗体と連結して、有力なイムノコンジュゲートを作製することができる。本発明の抗CD30抗体とのコンジュゲーションに適切な他の薬剤は、5.12.1節（下記）で提供される。
【０２２９】
5.9.1  リンカー
上記5.6節で議論されているように、ADCは一般的にはリンカーを介して薬剤と抗体とをコンジュゲートすることにより作製される。したがって、抗CD30抗体と高い効能の薬剤および/または内在化促進剤とを含む本発明のADCの大多数はさらにリンカーを含む。例えば、二官能性剤（ジアルデヒドもしくはイミドエステルなど）または分岐状ヒドラゾンリンカー（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第5,824,805を参照されたい）など、当業界で公知のあらゆるリンカーを本発明のADCにおいて使用してもよい。
【０２３０】
本発明の特定の非制限的な実施形態では、抗CD30 ADCの薬剤部分と抗体部分との間のリンカー領域は、特定の条件下で切断または加水分解可能であり、その際、リンカーの切断または加水分解により、抗体部分から薬剤部分が放出される。このリンカーが細胞内条件下で切断または加水分解に対して感受性であることが好ましい。
【０２３１】
好ましい実施形態において、抗CD30 ADCの薬剤部分と抗体部分との間のリンカー領域は、pHが特定の値に変化するかまたは特定の値を超える場合に加水分解可能である。本発明の特に好ましい実施形態では、リンカーはリソソームの環境において、例えば酸性条件下（すなわち約5〜5.5以下のpH）で加水分解可能である。別の実施形態において、このリンカーは、非限定的にリソソームプロテアーゼ酵素、膜関連プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含む、ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーである。このリンカーは少なくとも2アミノ酸の長さであるのが好ましく、少なくとも3アミノ酸の長さであるのがより好ましい。CD30を発現する癌に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーが好ましい。例えば、カテプシンBによって切断可能なペプチジルリンカー（例えばGly-Phe-Leu-Glyリンカー）、癌性細胞で高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼを使用することができる。そのようなリンカーとは別のリンカーが、例えば参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第6,214,345に記載されている。
【０２３２】
本発明のその他の非相互排他的な実施形態において、本発明のADCの抗CD30抗体および薬剤がコンジュゲートされるリンカーは細胞内在化を促進する。特定の実施形態では、ADCのリンカー−薬剤部分が細胞内在化を促進する。特定の実施形態では、ADC全体の構造が細胞内在化を促進するようにリンカーが選択される。
【０２３３】
本発明の1つの特定の実施形態において、バリン−シトルリンの誘導体（val-citリンカー）がリンカーとして使用される。ドキソルビシンとval-citリンカーとの合成が既に記載されている（DubowchikおよびFirestone、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第6,214,345）。
【０２３４】
別の特定の実施形態では、このリンカーはphe-lysリンカーである。
【０２３５】
別の特定の実施形態では、このリンカーはチオエーテルリンカー（例えば、Willnerら、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第5,622,929を参照されたい）である。
【０２３６】
さらに別の特定の実施形態において、このリンカーはヒドラゾンリンカー（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Greenfieldら米国特許第5,824,805およびKingら5,824,805を参照されたい）である。
【０２３７】
さらに別の特定の実施形態において、このリンカーはジスルフィドリンカーである。様々なジスルフィドリンカーが当業界で知られており、非限定的に、SATA（N-スクシンイミジル−S−アセチルチオアセテート）、SPDP（N−スクシンイミジル−3−（2−ピリジルジチオ）プロピオナート）、SPDB（N−スクシンイミジル−3−（2−ピリジルジチオ）ブチラート）およびSMPT（N−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（2−ピリジルジチオ）トルエン）を用いて形成することができるものが含まれる。SPDBおよびSMPT（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Thorpeら, 1987, Cancer Res., 47:5924-5931 ; Wawrzynczakら, l987, In Immunoconjugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer,編. C. W. Vogel, Oxford U. Press, pp.28-55；Thorpeらの米国特許第4,880,935参照）。
【０２３８】
本発明の組成物および方法と共に用いることができる様々なリンカーが、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、発明者：Peter D. Senter、Svetlana DoroninaおよびBrian E. Tokiによる米国仮特許出願第60/400,403、名称「Drug Conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease」（2002年7月31日出願）に記載されている。
【０２３９】
本発明のさらに別の実施形態において、抗CD30抗体−リンカー−薬剤コンジュゲート（抗CD30 ADC）のリンカーユニットは、細胞静止剤または細胞傷害剤（薬剤ユニット；−D）および抗CD30抗体ユニット（−A）と結合する。本明細書で使用されるように、抗CD30 ADCという用語は、リンカーユニットを含む抗CD30抗体薬剤コンジュゲートおよびリンカーユニットを含まない抗CD30抗体薬剤コンジュゲートを包含する。リンカーユニットは一般式：
【化５】
2007500236.tif 000008
【０２４０】
を有し、ここで-T-はストレッチャー(stretcher)ユニットであり；aは0または1であり；各-W-は独立的にアミノ酸ユニットであり；wは独立的に2〜12の範囲の整数であり；-Y-はスペーサーユニットであり；そしてyは0、1または2である。
【０２４１】
5.9.2  ストレッチャーユニット
存在する場合、ストレッチャーユニット（-T-）は、抗CD30抗体ユニットをアミノ酸ユニット（-W-）と結合する。天然にまたは化学操作を介して抗CD30抗体上に存在することができる有用な官能基には、非限定的に、スルフヒドリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシル基が含まれる。好ましい官能基はスルフヒドリル基とアミノ基である。スルフヒドリル基は、抗CD30抗体の分子内ジスルフィド結合の還元によって生じ得る。あるいはスルフヒドリル基は、抗CD30抗体のリシン部分のアミノ基の、2−イミノチオラン（Traut試薬）または他のスルフヒドリル生成試薬との反応によって生じ得る。特定の実施形態において、抗CD30抗体は組換え抗体であり、1以上のリシンを持つように操作される。別の実施形態では、組換え抗CD30抗体は追加のスルフヒドリル基、例えば追加のシステインを持つように操作される。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、ストレッチャーユニットは、抗CD30抗体ユニットの硫黄原子との結合を生じる。硫黄原子は、還元された抗CD30抗体（A）のスルフヒドリル（−SH）基から誘導することができる。これらの実施形態の代表的なストレッチャーユニットは、式（Ia）および（Ib；下記参照）の角カッコ内に記載されており、ここでA-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは上で定義されたものであり、そしてR1は、-C1-C10アルキレン-、-C3-C8カルボシクロ-、-O-(C1-C8アルキル)-、-アリーレン-、-C1-C10アルキレン-アリーレン-、-アリーレン-C1-C10アルキレン-、-C1-C10アルキレン-(C3-C8カルボシクロ)-、-(C3-C8カルボシクロ)-C1-C10アルキレン-、-C3-C8ヘテロシクロ-、-C1-C10アルキレン-(C3-C8ヘテロシクロ)-、-(C3-C8ヘテロシクロ)-C1-C10アルキレン-、-(CH2CH2O)r-および-(CH2CH2O)r-CH2-から選択され；そしてrは1〜10の範囲の整数である。
【化６】
2007500236.tif 000009
【化７】
2007500236.tif 000010
【０２４３】
例示的なストレッチャーユニットは、R1が-(CH2)5-である、式（Ia）のものである：
【化８】
2007500236.tif 000011
【０２４４】
別の例示的なストレッチャーユニットは、R1が-(CH2CH2O)r-CH2-であり、rが2である、式（Ia）のものである：
【化９】
2007500236.tif 000012
【０２４５】
さらに別の例示的なストレッチャーユニットは、R1が-(CH2)5-である、式（Ib）のものである：
【化１０】
2007500236.tif 000013
【０２４６】
ある別の特定の実施形態において、ストレッチャーユニットは、抗CD30抗体ユニットの硫黄原子とストレッチャーユニットの硫黄原子との間のジスルフィド結合を介してCD30抗体ユニット（A）と連結される。この実施形態の代表的なストレッチャーユニットは、式（II）の角カッコ内に記載されており、R1、A-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは上で定義されるとおりである。
【化１１】
2007500236.tif 000014
【０２４７】
さらに別の特定の実施形態において、ストレッチャーの反応基は、抗CD30抗体のアミノ基に対して反応性であり得る反応部位を含む。アミノ基はアルギニンまたはリシンのものであり得る。適当なアミン反応部位には、非限定的に、スクシンイミドエステル、4−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、酸無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネートおよびイソチオシアネートなどの、活性化エステルが含まれる。これらの実施形態の代表的なストレッチャーユニットは、式（IIIa）および（IIIb）の角カッコ内に記載されており、R1、A-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは上で定義されるとおりである；
【化１２】
2007500236.tif 000015
【化１３】
2007500236.tif 000016
【０２４８】
本発明のさらに別の態様において、ストレッチャーの反応性官能基は、抗CD30抗体上に存在し得る修飾された炭水化物基に対して反応性である反応部位を含む。1つの特定の実施形態において、抗CD30抗体は酵素によってグリコシル化されて炭水化物部分を与える。炭水化物は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬によって穏やかに酸化させることもでき、生じた酸化炭水化物のカルボニルユニットを、ヒドラジン、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、および例えばKaneko, Tら（Bioconjugate Chem 1991, 2, 133-41）によって記載されるアリールヒドラジン等の官能性を含むストレッチャーで縮合することができる。この実施形態の代表的なストレッチャーユニットは、式（IVa）〜（IVc）の角カッコ内に記載されており、R1、A-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは上で定義されるとおりである。
【化１４】
2007500236.tif 000017
【化１５】
2007500236.tif 000018
【化１６】
2007500236.tif 000019
【０２４９】
5.9.3  アミノ酸ユニット
スペーサーユニットが存在する場合、アミノ酸ユニット(-W-)はストレッチャーユニット（-T-）とスペーサーユニット（-Y-）とを連結し、そしてスペーサーユニットがない場合にはストレッチャーユニットと細胞静止剤または細胞傷害剤（薬剤ユニット；D）とを連結する。
【０２５０】
-Ww-は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチドユニットである。各-W-ユニットは独立的に下記の角カッコ中に示された式：
【化１７】
2007500236.tif 000020
【０２５１】
を有し、wは2〜12の範囲の整数であり、式中、R2は水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、ベンジル、p-ヒドロキシベンジル、-CH20H、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-ピリジルメチル-、3-ピリジルメチル-、4-ピリジルメチル-、フェニル、シクロヘキシル、
【化１８】
2007500236.tif 000021
【０２５２】
である。
【０２５３】
リンカーユニットのアミノ酸ユニットは、非限定的に腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素によって酵素切断されて、in vivoでプロトン化された薬剤ユニット（-D）を放出し、放出時に細胞傷害剤（D）を与える。例示的なWwユニットは式（V）〜（VII）によって示される：
【化１９】
2007500236.tif 000022
【０２５４】
ここで、R3およびR4は以下の通りである：
【化２０】
2007500236.tif 000023
【化２１】
2007500236.tif 000024
【０２５５】
ここでR3、R4およびR5は以下の通りである：
【化２２】
2007500236.tif 000025
【化２３】
2007500236.tif 000026
【０２５６】
ここでR3、R4、R5およびR6は以下の通りである：
【化２４】
2007500236.tif 000027
【０２５７】
好ましいアミノ酸ユニットには、非限定的に、R3がベンジルであり、R4が-(CH2)4NH2である式（V）のユニット；R3がイソプロピルであり、R4が-(CH2)4NH2である式（V）のユニット；R3がイソプロピルであり、R4が-(CH2)3NHCONH2である式（V）のユニットが含まれる。別の好ましいアミノ酸ユニットは、R3がベンジルであり、R4がベンジルであり、そしてR5が-(CH2)4NH2である式（VI）のユニットである。
【０２５８】
本発明に有用な-Ww-ユニットを、特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素切断についてのこれらの選択性において設計しかつ最適化することができる。好ましい-Ww-ユニットは、その切断がプロテアーゼ、カテプシンB、CおよびDならびにプラスミンによって触媒されるものである。
【０２５９】
一実施形態において、-Ww-はジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドユニットである。
【０２６０】
R2、R3、R4、R5またはR6が水素以外である場合、R2、R3、R4、R5またはR6と結合される炭素原子はキラルである。
【０２６１】
R2、R3、R4、R5またはR6に結合される各炭素原子は、独立的に（S）または（R）配置である。
【０２６２】
好ましい実施形態において、アミノ酸ユニットはフェニルアラニン−リシンジペプチド（phe-lysまたはFKリンカー）である。別の好ましい実施形態において、アミノ酸ユニットは、バリン−シトルリンジペプチド（val-citまたはVCリンカー）である。
【０２６３】
5.9.4  スペーサーユニット
存在する場合、スペーサーユニット（-Y-）は、アミノ酸ユニットと薬剤ユニットとを連結する。スペーサーユニットは2つの一般的な型：自壊型（self-immolative）および非自壊型(non self-immolative)をもつ。非自壊型のスペーサーユニットは、スペーサーユニットの一部または全てが、抗CD30抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートまたは薬剤−リンカー化合物からアミノ酸ユニットが酵素切断された後に薬剤と結合したままであるものである。非自壊型のスペーサーユニットには、非限定的に、（グリシン−グリシン）スペーサーユニットおよびグリシンスペーサーユニット（いずれも図式1に記載される）が含まれる。グリシン−グリシンスペーサーユニットまたはグリシンスペーサーユニットを含む本発明の抗CD30抗体−リンカー薬剤コンジュゲートが腫瘍細胞関連プロテアーゼを介した酵素切断を受ける場合、グリシン−グリシン−薬剤部分またはグリシン−薬剤部分がA-T-Ww-から切断される。薬剤を放出するためには、独立の加水分解反応が標的細胞中で生じてグリシン−薬剤ユニットの結合を切断しなくてはならない。
【０２６４】
好ましい実施形態において、-Yy-はQmで置換することができるp-アミノベンジルエーテルであり、ここでQは-C1-C8アルキル、-C1-C8アルコキシ、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり、mは0〜4の範囲の整数である。
【化２５】
2007500236.tif 000028
【０２６５】
一実施形態において、非自壊型スペーサーユニット（-Y-）は-Gly-Gly-である。
【０２６６】
別の実施形態において、非自壊型スペーサーユニット（-Y-）は-Gly-である。
【０２６７】
一実施形態において、薬剤−リンカー化合物または抗CD30抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートはスペーサーユニットを欠いている（y=0）。
【０２６８】
あるいは、自壊型スペーサーユニットを含む本発明の抗CD30抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートは、別個の加水分解ステップの必要なしに薬剤（D）を放出することができる。これらの実施形態において、-Y-は、p-アミノベンジルアルコール（PAB）群の窒素原子を介して-Ww-と連結し、かつカルボネート、カルバメートまたはエーテル基を介して-Dと直接連結するPABユニットである（図式2および図式3）。
【化２６】
2007500236.tif 000029
【０２６９】
ここで、Qは-C1-C8アルキル、-C1-C8アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり、mは0〜4の範囲の整数であり、そしてpは1〜20の範囲の整数である。
【化２７】
2007500236.tif 000030
【０２７０】
ここで、Qは-C1-C8アルキル、-C1-C8アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり、mは0〜4の範囲の整数であり、そしてpは1〜20の範囲の整数である。
【０２７１】
自壊型スペーサーの別の例として、非限定的に、2−アミノイミダゾール−5−メタノール誘導体（例えばHayら, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2237を参照されたい）およびオルトまたはパラアミノベンジルアセタールなどのPAB群と電子的に等価な芳香族化合物が含まれる。置換のおよび未置換の4−アミノ酪酸アミド（Rodriguesら, Chemistry Biology, 1995, 2, 223）、適切に置換されたビシクロ[2.2.1]およびビシクロ[2.2.2]環系（Stormら, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815）および2−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberryら, J. Org. Chem., 1990, 55, 5867）など、アミド結合の加水分解時に簡単な環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシンのα位置が置換されているアミン含有薬剤の脱離も、本発明の抗CD30抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートに適用し得る自壊型スペーサー戦略の例である。
【０２７２】
別の実施形態において、スペーサーユニットは追加の薬剤を組み込むことに使用し得る分岐状ビス（ヒドロキシメチル）スチレン（BHMS）ユニット（図式4）である。
【化２８】
2007500236.tif 000031
【０２７３】
ここで、Qは-C1-C8アルキル、-C1-C8アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり、mは0〜4の範囲の整数であり、nは0または1であり、そしてpは1〜20の範囲の整数である。
【０２７４】
一実施形態において、2つの-D部分は同一である。
【０２７５】
別の実施形態において、2つの-D部分は異なる。
【０２７６】
好ましいスペーサーユニット（-Yy-）は式（VIII）〜（X）で表される：
【化２９】
2007500236.tif 000032
【０２７７】
ここで、Qは-C1-C8アルキル、-C1-C8アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノであり、mは0〜4の範囲の整数である；
【化３０】
2007500236.tif 000033
【０２７８】
5.10  薬剤
本発明は、免疫学的疾患の治療または予防のための、抗CD30 ADCの使用を包含する。本明細書で使用される「薬剤」または「細胞傷害剤」という用語は、本発明の抗CD30 ADCとの関連で使用される場合には放射性同位体を含まない。あるいは、当業者に知られるあらゆる薬剤を本発明のADCと共に使用することができる。
【０２７９】
本発明の抗CD30抗体とのコンジュゲーションに使用される薬剤は、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンC、エトポシドなどの従来の化学療法剤を含み得る。さらに、CC-1065類似体、カリキアマイシン、メイタンシン、ドラスタチン10の類似体、リゾキシンおよびパリトキシンなどの強力な薬剤を、条件付きの安定なリンカーを用いて抗CD30抗体と連結して、強力なイムノコンジュゲートを形成させることができる。本発明の抗CD30抗体とのコンジュゲーションに適切な他の薬剤の例は、下記の5.12.1節で提供される。
【０２８０】
ある実施形態において、本発明のADCは、CD30発現性細胞において、ドキソルビシンよりも少なくとも40倍の効能がある薬剤を含む。そのような薬剤には、非限定的に、エネジン（enediyne）およびレキシトロプシンを含むDNA副溝結合剤、デュオカルマイシン、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルを含む）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン（combretastatin）、ネトロプシン、エポシロンAおよびB、エストラムスチン、クリプトフィジン（cryptophysin）、セマドチン、メイタンシノイド、ドラスタチン、例えばアウリスタチンE、ドラスタチン10、MMAE、ディスコダーモリド（discodermolide）、エリューテロビン（eleutherobin）ならびにミトキサントロンが含まれる。
【０２８１】
ある特定の実施形態において、本発明の抗CD30 ADCはエンジイン部分を含む。1つの特定の実施形態において、エンジイン部分はカリケアマイシンである。エンジイン化合物は、Bergman環化を介してジラジカルを生成することによって二本鎖DNAを切断する。
【０２８２】
本発明の組成物および方法と共に使用することができる様々な細胞傷害剤および細胞静止剤が、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国仮特許出願第60/400,403、名称「Drug Conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease」（発明者：Peter D. Senter、Svetlana DoroninaおよびBrian E. Toki、出願日2002年7月31日）に記載されている。
【０２８３】
別の特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞静止剤はアウリスタチンEまたはその誘導体である。
【０２８４】
好ましい実施形態において、アウリスタチンE誘導体は、アウリスタチンEとケト酸との間で形成されたエステルである。例えば、アウリスタチンEは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれAEBとAEVBを生成することができる。別の好ましいアウリスタチン誘導体にはMMAEおよびAEFPが含まれる。
【０２８５】
アウリスタチンEの合成および構造も、ドラスチン10およびその誘導体が、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許出願第09/845,786および10/001,191;国際特許出願第PCT/US02/13435、米国特許第6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444;および4,486,414に記載されるように、当業界で公知である。
【０２８６】
特定の実施形態において、薬剤はDNA副溝結合剤である。そのような化合物およびその合成の例は、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第6,130,237に開示されている。ある実施形態において、薬剤はCBI化合物である。
【０２８７】
本発明のある実施形態において、本発明のADCは抗チュブリン剤を含む。抗チュブリン剤は癌治療化合物の十分に確立されたクラスである。抗チュブリン剤の例として、非限定的に、タキサン（例えば、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、ドセタキセル）、T67（Tularik）、ビンカ、およびアウリスタチン（例えば、アウリスタチンE、AEB、AEVB、MMAE、AEFP）が含まれる。ビンクリスチンおよびビンブラスチンを含むビンカアルカロイド、ビンデシンならびにビノレルビン（vinorelbine）；パクリタキセルやドセタキセルなどのタキサンおよびバッカチン（baccatin）誘導体、エピシロンAおよびB、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルシミド（colcimid）、エストラムスチン、クリプトフィジン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ドラスチン、ディスコダーモリドならびにエリューテロビンもこのクラスに含まれる抗チュブリン剤である。
【０２８８】
1つの特定の実施形態において、薬剤は抗チュブリン剤の群であるメイタンシノイドである。1つのより特定の実施形態では、薬剤はメイタンシンである。さらに、1つの特定の実施形態では、細胞傷害剤または細胞静止剤はDM-1（ImmunoGen, Inc.; Chariら, 1992, Cancer Res 52:127-131も参照されたい）である。天然物であるメイタンシンは、有糸分裂ブロックおよび細胞死を生じさせるチュブリン重合を阻害する。したがって、メイタンシンの作用機構は、ビンクリスチンおよびビンブラスチンのものに類似しているように思われる。しかし、メイタンシンはビンカアルカロイドよりもin vitroで200〜1000倍細胞傷害性を有する。
【０２８９】
別の特定の実施形態において、薬剤はAEFPである。
【０２９０】
本発明のある特定の実施形態において、薬剤は50、100または200アミノ酸よりも大きいポリペプチド、例えば毒素ではない。本発明の1つの特定の実施形態において、薬剤はリシンではない。
【０２９１】
本発明の別の特定の実施形態において、本発明のADCは、細胞傷害剤または細胞静止剤、以下の薬剤の非相互排他的なクラスを含まない：アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、抗チュブリン剤、アウリスタチン、化学療法増感剤、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、プリンアンタゴニストおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤。より特定の実施形態において、高い効能の薬剤は、アンドロゲン、アントラマイシン（AMC）、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン（BSNU）、CC-1065、クロラムブチル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（CCNU）、メクロレミタン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、6−チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16、VM-26、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨウ化デオキシウリジン、ポスカーネット（poscarnet）およびトリフルウリジンの1以上ではない。
【０２９２】
5.10  ドラスタチン剤
ある実施形態では、細胞傷害剤または細胞静止剤はドラスタチンである。より特定の実施形態では、ドラスタチンはアウリスタチンのクラスである。本発明の1つの特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞静止剤はMMAE（MMAE；式XI）である。本発明の別の特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞静止剤はAEFP（式XVI）である。
【化３１】
2007500236.tif 000034
【０２９３】
本発明のある実施形態では、細胞傷害剤または細胞静止剤は式XII〜XVIIIのドラスタチンである。
【化３２】
2007500236.tif 000035
【化３３】
2007500236.tif 000036
【０２９４】
5.10.2  抗CD30抗体−薬剤コンジュゲートの製剤化
抗CD30抗体薬剤コンジュゲート（ADC）の生成は、当業者に公知のあらゆる技術によって達成することができる。簡潔に言うと、抗CD30 ADCは、抗CD30抗体、薬剤、および薬剤と抗体とを連結するリンカーを含む。多くの異なる反応が薬剤と抗体との共有結合に利用可能である。これは大抵、抗体分子のアミノ酸残基の反応によって達成され、これにはリシンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な部分が含まれる。共有結合の最も一般的に使用される非特異的方法の一つは、化合物のカルボキシル（またはアミノ）基と抗体のアミノ（またはカルボキシル）基とを連結するカルボジイミド反応である。さらに、ジアルデヒドもしくはイミドエステルなどの二官能性剤が、化合物のアミノ基と抗体分子のアミノ基とを連結することに使用されてきた。シッフ塩基反応も薬剤と抗体の連結に利用可能である。この方法は、グリコール基またはヒドロキシ基を含む薬剤の過ヨウ素酸酸化を含み、その結果アルデヒドを生じて、その後抗体分子と反応する。連結は抗体分子のアミノ基を有するシッフ塩基の形成を介して生じる。イソチオシアネートを薬剤と抗体とを共有結合させるためのカップリング剤として使用することもできる。別の技術も当業者に知られかつ本発明の範囲内である。そのような技術の非限定的な例は、例えば参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第5,665,358、5,643,573および5,556,623に記載されている。
【０２９５】
ある実施形態において、リンカーの前駆体である中間体を適切な条件下で薬剤と反応させる。ある実施形態では、反応基が薬剤および/または中間体上で使用される。薬剤と中間体との間の反応産物、または誘導体化薬剤をその後適切な条件下で抗CD30抗体と反応させる。誘導体化薬剤と抗体との間の反応のために選択された条件下において抗体の安定性を維持することに注意すべきである。
【０２９６】
5.11  遺伝子治療
1つの特定の実施形態において、本発明の核酸はHDの治療、阻害または予防のために投与される。遺伝子治療とは、被験者への発現されたまたは発現可能な核酸の投与によって達成される治療を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は治療効果を仲介するそのコードタンパク質を産生する。
【０２９７】
当業界で利用可能な遺伝子治療のためのあらゆる方法が本発明に従って使用可能である。例示的な方法は以下に記載される。
【０２９８】
遺伝子治療の一般的な総説については、Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505 ; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3 : 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; MorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 1,1(5): 155-215を参照されたい。使用可能な組換えDNA技術の分野で一般的に知られる方法はAusubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)に記載される。
【０２９９】
1つの好ましい態様では、治療剤は、抗体をコードする核酸であって、該核酸配列が適当な宿主中で抗体、フラグメント、キメラタンパク質またはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である、上記核酸を含む。特に、そのような核酸配列は、抗体コード領域と機能的に連結されたプロモーターであって、該プロモーターが誘導性または構成性であり、かつ場合により組織特異的である、上記プロモーターを有する。他の特定の実施形態では、抗体コード配列および別のあらゆる所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同的組換えを促す領域がフランキングする核酸が使用され、その結果、抗体コード核酸の染色体内発現を与える（KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstraら, 1989, Nature 342: 435-438）。特定の実施形態において、発現された抗体分子は単一鎖抗体であり、あるいは、核酸配列は、抗体の重鎖および軽鎖の両方、またはそのフラグメントをコードする配列を含む。
【０３００】
患者への核酸の送達は直接的（この場合は、患者が核酸または核酸を運ぶベクターに直接的に曝される）または間接的（この場合は、最初に細胞がin vitroで核酸によって形質転換され、その後患者に移植される）のいずれかであってよい。
【０３０１】
1つの特定の実施形態において、核酸配列が発現されてコード産物を産生する場合は、核酸配列がin vivoで直接投与される。これは当業界で公知の非常に多くの方法のいずれかで達成することができ、例えば細胞内の核酸配列とすべく、核酸配列を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、該ベクターを投与することによって達成される。遺伝子治療ベクターは、不完全なもしくは弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（例えば米国特許第4,980,286）を用いたインフェクション；裸のDNAの直接的な注入、微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）；脂質もしくは細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤によるコーティング；リポソーム、微粒子またはマイクロカプセル中でのカプセル化；核酸を導入することが知られるペプチドとの結合における投与；レセプター仲介エンドサイトーシスの対象となるリガンドとの結合における投与等によって投与することができる(例えばWuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)(これらを用いてレセプターを特異的に発現する細胞型にターゲティングすることができる。)。別の実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含むことで、核酸がリソソーム分解を回避することができる、核酸−リガンド複合体を形成させることができる。さらに別の実施形態では、細胞特異的な取り込みおよび発現のために、特定のレセプターにターゲティングすることによって核酸をin vivoでターゲティングすることができる（PCT公開WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188およびWO 93/20221）。あるいは、発現のために、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって宿主細胞DNA内に組み込むことができる（KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstraら, 1989, Nature 342: 435-438）。
【０３０２】
1つの特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol.217 : 581-599を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターはウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞DNA内への組込みに必要な成分を含む。遺伝子治療に使用されるべき抗体をコードする核酸配列は1以上のベクターにクローニングされ、それによって患者への遺伝子の送達を促進する。レトロウイルスベクターについての更なる詳細はBoesenら, 1994, Biotherapy 6: 29 1-302中に見出すことができ、これはmdr 1遺伝子を造血幹細胞に送達して幹細胞を化学療法に対してより耐性を有するものとするためのレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する別の参考文献はClowesら, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651 ; Kleinら, 1994, Blood 83: 1467-1473; SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4 : 129-141;ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114である。
【０３０３】
遺伝子治療に対する別のアプローチには、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションまたはウイルス感染等の方法による、細胞培養物中の細胞へ遺伝子（例えばAC10またはHeFi-1遺伝子）を導入することが含まれる。通常は、導入の方法として選択可能なマーカーの細胞への導入が含まれる。次いで細胞は選択下に置かれて導入遺伝子を取り込み、これを発現している細胞が単離される。その後、これらの細胞が患者に送達される。
【０３０４】
この実施形態では、核酸は生じた組換え細胞のin vivo投与前に細胞に導入される。そのような導入は、非限定的にトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージべクターによる感染、細胞融合、染色体仲介遺伝子導入、ミクロセル仲介遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含む、当業界で公知のあらゆる方法によって実施することができる。外来遺伝子の細胞への導入のための非常に多くの方法が当業界で知られており（LoefflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohenら, 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644 ; Cline, 1985,Pharmac. Ther 29: 69-92）、レシピエント細胞に必要な発生および生理機能が崩壊しないことを条件として、本発明に従って使用され得る。核酸が細胞によって発現可能であり、かつ好ましくはその細胞子孫に遺伝し、発現可能であるために、この技術は細胞への核酸の安定な導入を与えるべきである。
【０３０５】
生じた組換え細胞は、当業界で公知の様々な方法によって患者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）が静脈内投与されることが好ましい。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に左右され、かつ当業者によって決定することができる。
【０３０６】
遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞には、あらゆる所望の、利用可能な細胞型が含まれ、非限定的に、繊維芽細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核細胞、顆粒球等の血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば骨髄から得られる）、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などが含まれる。
【０３０７】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は患者に対して自己由来のものである。
【０３０８】
遺伝子治療に組換え細胞が用いられる実施形態において、抗体をコードする核酸配列は、これらが細胞またはその子孫によって発現可能であるように細胞に導入されて、次いで、組換え細胞が治療効果のためにin vivoで投与される。1つの特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が用いられる。in vitroで単離し、維持することができるあらゆる幹細胞および/または前駆細胞が、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用可能である（PCT公開WO 94/08598; StempleおよびAnderson, 1992, Cell 71: 973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A : 229;ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771）。
【０３０９】
1つの特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、適当な転写誘導因子の存在または不在下で制御することによって核酸の発現が制御可能であるようにコード領域と機能的に連結された誘導性プロモーターを含む。
【０３１０】
本発明の化合物または医薬組成物がヒトにおける使用前に所望の治療または予防活性についてin vitroで試験され、その後in vivoで試験されることが好ましい。例えば、タンパク質または医薬組成物の治療上のまたは予防上の有用性について明らかにするためのin vitroアッセイは、ホジキン病患者由来のホジキン細胞系または組織サンプルに対するタンパク質または医薬組成物の効果を判定することを含む。ホジキン病細胞系および/または組織サンプルに対するタンパク質または組成物の細胞傷害効果および/または細胞静止効果は、当業者に公知の技術を利用して判定することができる。下記の6節に記載される好ましい方法は、0.33cm2の培養面積中約5000個の細胞の密度で72時間増殖されるホジキン病細胞系の培養物をタンパク質または医薬組成物と接触させること、前記72時間の最後の8時間の間に0.5μCiの3H-チミジンに曝露すること、および該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定すること、を必要とする。培養物の細胞が同一の条件下で培養されているがタンパク質または医薬組成物と接触されていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して3H-チミジンの取り込みを低減している場合、タンパク質または医薬組成物は、ホジキン病細胞系に対する細胞静止効果または細胞傷害効果を有し、かつホジキン病の治療または予防に有用である。あるいは、特定のタンパク質または医薬組成物の投与が望ましいかどうかを判定するのに使用することができるin vitroアッセイには、ホジキン病患者由来の組織サンプルが培地中で増殖され、タンパク質または医薬組成物に曝露され、そしてホジキン組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される、in vitro細胞培養アッセイが含まれる。
【０３１１】
5.12  治療上の/予防上の投与および組成物
本発明は、ホジキン病細胞に対する細胞傷害効果または細胞静止効果を有するCD30結合性タンパク質（すなわち、本発明のタンパク質）、該CD30結合性タンパク質をコードする核酸（すなわち、本発明の核酸）または本発明のタンパク質または核酸を含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物）、の有効量を被験者に投与することによる治療および予防方法を提供する。本発明によれば、任意の臨床的段階のHDであると予め診断された患者の治療を包含し、かかる治療は腫瘍増殖の遅延および/または腫瘍退行の促進をもたらす。
【０３１２】
好ましい実施形態において、本発明のタンパク質はモノクローナル抗体AC10もしくはHeFi-1またはそのフラグメントもしくは誘導体である。好ましい態様において、本発明の医薬は、本発明の実質的に精製された（例えば、その効果を制限するかまたは所望でない副作用を生み出す物質を実質的に含まない）タンパク質または核酸を含む。様々な実施形態において、タンパク質または核酸は少なくとも50％、60％、70％、80％または90％の純度である。
【０３１３】
被験者は、非限定的にウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であることが好ましく、また哺乳動物であることが好ましく、そしてヒトであることが最も好ましい。
【０３１４】
採用することができる投与形式および方法は上述される。更なる投与形式および経路は本明細書の下記に記載されるものの中から選択することができる。
【０３１５】
様々な送達システムが知られ、かつ本発明の核酸またはタンパク質の投与に使用することができる（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおけるカプセル化、化合物を発現可能な組換え細胞、レセプター仲介エンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432を参照されたい）、レトロウイルスまたは別のベクターの一部としての核酸の構築等）。導入方法は、非限定的に皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれる。本発明の核酸およびタンパク質は、あらゆる好都合な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜）を介した吸収によって投与してもよく、そして化学療法剤（節を参照）などの他の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は全身的または局所的であり得る。
【０３１６】
1つの特定の実施形態において、本発明の核酸またはタンパク質を、注射、カーテル、座薬または移植片（該移植片は、多孔性、非多孔性またはゲル状の物質であり、例えばシリコン膜などの膜、または繊維を含む）によって投与することが望ましいかもしれない。本発明の抗体を含む、タンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない物質を使用することに注意すべきことが好ましい。
【０３１７】
別の実施形態では、化合物または組成物はビヒクル、特にリポソームで送達することができる（Langer, 1990, Science 249: 1527-1533 ; Treatら, 1989, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (編), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, 同書, pp.317-327 ;全般的に同書を参照されたい）。
【０３１８】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプが用いられ得る（Langer, stipra ; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 : 201; Buchwaldら, 1980, Surgery 88: 507; Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release, 1974, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York; RangerおよびPeppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61参照;またLevyら, 1985, Science 228: 190; Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howardら, 1989, J. Neurosurg. 71: 105も参照されたい）。
【０３１９】
別の制御された放出システムは、Langer, 1990, Science 249: 1527-1533により総説中で議論されている。
【０３２０】
本発明の核酸が投与される1つの特定の実施形態では、適当な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築すること、および核酸が細胞内のものとなるように投与すること（例えばレトロウイルスベクターの使用（米国特許第4,980,286を参照されたい）、直接的な注入、微粒子衝撃の使用（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）、脂質もしくは細胞表面レセプターまたはトランスフェクション剤によるコーティング、あるいは拡散を導入することが知られるホメオボックス様ペプチドとの結合における核酸の投与（例えばJoliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868を参照されたい）等）によって、核酸がin vivoで投与されてそのコードタンパク質の発現を促進することができる。あるいは発現のために核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって宿主細胞DNA内に組み込むことができる。
【０３２１】
上で暗に示されるように、本発明は医薬組成物（本発明の医薬）も提供する。かかる組成物は、本発明の核酸またはタンパク質の治療上の有効量と、製薬上許容される担体とを含む。1つの特定の実施形態において、「製薬上許容される」という用語は、米国連邦取り締まり機関または州政府によって承認されているか、あるいは米国薬局方または動物、より詳細にはヒトにおける使用について一般的に認められた他の薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、医薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをいう。かかる製薬上の担体は、水や油などの滅菌の液体であることができ、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油など、石油、動物、野菜または合成起源のものが含まれる。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましい担体である。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注入可能な溶液のための、液体担体として採用することができる。適当な製薬上の賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望であれば少量の湿潤剤、乳化剤またはpH緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は溶液、懸濁液、乳剤、タブレット、錠剤、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態を採り得る。組成物はトリグリセリドなどの従来の結合剤および担体と共に、座薬として製剤化することができる。経口製剤は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、本発明の核酸またはタンパク質の治療上の有効量を、好ましくは精製された形態で、適当な量の担体と共に含み、患者への適切な投与形態を提供する。製剤は投与の様式に適したものとすべきである。
【０３２２】
好ましい実施形態において、本発明の医薬は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、慣用の手順に従って製剤化される。典型的に、静脈内投与用の組成物は、滅菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、本発明の医薬は可溶化剤、およびリグノカインなどの局所麻酔薬をも含み、注入部位の痛みを軽減してもよい。一般的に、成分は別々にまたは単位投薬剤型に一緒に混合して、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。本発明の医薬が注入によって投与されるべき場合、滅菌の医薬等級水または生理食塩水を含む注入ボトルによって施行することができる。本発明の医薬が注射によって投与される場合、成分を投与前に混合し得るように注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３２３】
HDの治療または予防に有効であろう本発明の核酸またはタンパク質の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、場合によりin vitroアッセイを用いて、最適な用量範囲の同定を補ってもよい。製剤において採用されるべき正確な用量は、投与経路およびHDの段階によっても左右され、医師の判断および各患者の状況に従って判断すべきである。有効な用量は、in vitroまたはモデル動物試験システム由来の用量応答曲線から推定してもよい。
【０３２４】
5.13  キット
本発明はまた、本発明の核酸またはタンパク質で満たされた1以上の容器および場合によって1以上の医薬担体を含んでなる、医薬パックまたはキットを提供する。場合により、そのような容器に医薬または生物学的製剤の製造、使用を規制する政府機関によって定められた様式の注意書きを含めることができ、その注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用または販売について機関による承認を反映する。
【０３２５】
一実施形態において、キットは本発明の精製されたタンパク質を含む。この実施形態の好ましい様式では、タンパク質は抗体である。タンパク質は放射性核種または化学療法剤とコンジュゲートされてもよい。場合により、キットはさらに医薬担体を含む。
【０３２６】
別の実施形態において、本発明のキットは、組換え発現用のプロモーターと機能的に連結された本発明の核酸または本発明の核酸を含む宿主細胞を含む。
【０３２７】
5.14  有効量
本発明のタンパク質の毒性および治療効果は、例えばLD50（集団の50％致死量）およびED50（集団の50％における治療上の有効量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な製薬的手順によって判定することができる。毒性および治療効果間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。大きな治療指数を示すタンパク質が好ましい。毒性の副作用を示すタンパク質が用いられ得る場合、作用しない細胞に対する潜在的な損傷を最小にすべく、そのようなタンパク質を作用する組織部位に向ける送達システムを構築して、その結果、副作用を低減するように注意すべきである。
【０３２８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方するのに用いることができる。そのようなタンパク質の用量は、ほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。用量は採用される剤型および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用されるあらゆる化合物について、初めに治療上の有効量は細胞培養アッセイから評価することができる。一用量をモデル動物において処方して、細胞培養物において決定されたIC50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルを例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０３２９】
一般的に、ホジキン病患者に投与される本発明の医薬における本発明のタンパク質の用量は、典型的には患者の体重1kg当たり0.1mg〜100mgである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重1kg当たり0.1mg〜20mgであり、より好ましくは患者の体重1kg当たり1mg〜10mgである。一般的に、外来タンパク質に対する免疫応答によってヒト抗体は他種由来の抗体よりもヒトの体内でより長い半減期を有する。したがって、低用量のヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体の投与および低頻度の投与がしばしば可能である。
【０３３０】
5.15  製剤化
本発明による使用のための医薬組成物は、1以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて、従来の方法で製剤化し得る。
【０３３１】
したがって、タンパク質ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物を、吸入もしくはガス注入（口または鼻のいずれかを介する）または経口、頬粘膜、非経口もしくは直腸投与による投与のために製剤化してもよい。
【０３３２】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）などの製薬上許容される賦形剤と共に、従来の方法によって調製された錠剤あるいはカプセルの形態を採り得る。錠剤は当業界で周知の方法によってコーティングし得る。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を採ってもよく、あるいはこれらは使用前に水または適当なビヒクルと一緒に構成するための乾燥物として存在してもよい。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化した食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油）；ならびに防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬上許容される添加剤と共に、従来の方法によって調製し得る。この製剤はまた、必要に応じて緩衝剤塩、芳香剤、着色剤および甘味剤を含み得る。
【０３３３】
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を行うよう適切に製剤化し得る。
【０３３４】
頬粘膜投与のために、組成物は従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態を採り得る。
【０３３５】
吸入による投与のために、本発明に従って使用するためのタンパク質は、適当な噴霧剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体）の使用による、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬ユニットは、調整された量を送達するためのバルブを備えることによって決定し得る。例えば吸入器または通気器において使用するためのゼラチンの、カプセルおよび薬包は、化合物の粉末混合物とラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤を含ませて製剤化し得る。
【０３３６】
タンパク質は、注射、例えばボーラス注射または継続的な点滴による非経口投与用に製剤化し得る。注射用の製剤は、例えばアンプルまたは頻回投与容器において、添加された防腐剤と共に単位投与剤型で存在し得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中で、懸濁液、溶液または乳剤としてそのような形態をとり得、懸濁化剤、安定剤および/または分散剤などの処方剤（formulatory agent）を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前の適当なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水との構成のために粉末形態で存在し得る。
【０３３７】
タンパク質はまた、例えばココア緩衝液（cocoa buffer）または他のグリセリド等の従来の座剤基剤を含む座薬または補足性浣腸剤などの直腸組成物に製剤化してもよい。
【０３３８】
先に記載された製剤に加えて、タンパク質はデポ製剤として製剤化してもよい。かかる長期作用性の製剤は、移植（例えば皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与し得る。したがって、例えばタンパク質は、適当なポリマー材料もしくは疎水性物質（例えば許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として、製剤化してもよい。
【０３３９】
所望であれば、組成物は活性成分を含む1以上の単位投薬剤型を含み得るパックまたは調剤装置中に存在し得る。パックは、例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含み得る。パックまたは調剤装置は、好ましくはヒトへの投与のための、説明書が添付され得る。
【０３４０】
5.16  ホジキン病の治療のための併用治療
本発明の核酸およびタンパク質は、放射線照射または1以上の化学療法剤による治療と一緒に施すことができる。特定の実施形態では、化学療法剤は細胞静止剤、細胞傷害剤および/または免疫抑制剤である。
【０３４１】
ある特定の実施形態では、免疫抑制剤はガンシクロビル、アシクロビル、エタネルセプト、ラパマイシン、シクロスポリンまたはタクロリムスである。別の実施形態では、免疫抑制剤は代謝拮抗剤、プリンアンタゴニスト（例えば、アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、グルココルチコイド（例えば、コルチゾールまたはアルドステロン）、あるいはグルココルチコイド類似体（例えば、プレドニゾンまたはシクロホスファミド）である。さらに別の実施形態では、免疫抑制剤はアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）である。さらに別の実施形態では、免疫抑制剤は、非限定的にシクロオキシゲナーゼ阻害剤、5−リポキシゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン受容体アンタゴニストを含む、抗炎症剤である。
【０３４２】
放射線照射治療について、放射線照射はγ線またはX線であり得る。放射線治療の全般的な概要については、Hellman, 12章: Principles of Radiation Therapy Cancer, in: Principles and Practice of Oncology, DeVitaら編, 第2版, J. B. Lippencott Company, Philadelphiaを参照されたい。
【０３４３】
化学療法剤の有用な種類には、非限定的に以下の非相互排他的な薬剤が含まれる：アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、抗チュブリン剤、アウリスタチン、化学療法増感剤、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤およびビンカアルカロイド。本発明に包含される個々の化学療法薬には、非限定的にアンドロゲン、アントラマイシン（AMC）、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン（BSNU）、CC-1065、クロラムブチル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、デカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（CCNU）、メクロレミタン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テポシド、6−チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16およびVM-26が含まれる。
【０３４４】
1つの特定の実施形態において、本発明の核酸またはタンパク質は、放射線治療または1以上の化学療法剤と同時に投与される。別の特定の実施形態では、化学療法または放射線治療は、本発明の核酸もしくはタンパク質の投与の少なくとも1時間〜最大数ヶ月前または後に投与され、例えば、本発明の核酸またはタンパク質の投与前または投与後、少なくとも1時間、5時間、12時間、1日、1週間、1ヶ月または3ヶ月で投与される。
【０３４５】
本発明のタンパク質がプロドラッグ変換酵素とコンジュゲートされるか、または本発明の核酸がプロドラッグ変換酵素を含む融合タンパク質をコードする1つの特定の実施形態において、タンパク質または核酸はプロドラッグと共に投与される。プロドラッグの投与は、本発明のタンパク質もしくは核酸の投与と同時に行うことができ、またはより好ましくは、本発明の核酸もしくはタンパク質の投与後、少なくとも1時間〜最大1週間までに、例えば約5時間、12時間または1日までに投与される。投与されるプロドラッグ変換酵素に応じて、プロドラッグは安息香酸マスタード、アニリンマスタード、フェノールマスタード、p-ヒドロキシラニンマスタード−グルクロニド、エピルビシン−グルクロニド、アドリアマイシン−Nフェノシキアセチル、N-(4'-ヒドロキシフェニルアセチル)-パリトキシンドキソルビシン、メルファラン、窒素マスタード-セファロスポリン、β-フェニレンジアミン、ビンブラスチン誘導体-セファロスポリン、セファロスポリンマスタード、シアノフェニルメチル-β-D-グルコ-ピラノシドウロン酸（pyranosiduronic acid）、5-(アダリジン(adaridin)-1-yl-）2,4-ジニトロベンズアミドまたはメトトレキサート-アラニンであり得る。
【０３４６】
本発明は本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて、上述の記載および添付の図面から本発明の様々な改変が当業者に明らかになるだろう。そのような改変も添付された特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０３４７】
本発明は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない以下の実施例でさらに記載される。
【実施例】
【０３４８】
6.  実施例：抗CD30モノクローナル抗体AC10およびHeFi-1がCD30発現性ホジキン病細胞系の増殖を阻害する。
6.1  材料と方法
細胞および培養条件：  CD30発現細胞系であるL540、HDLM2、L428、KM-H2およびKarpas 299をBraunschweig（Germany）のGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures/DSMZから取得した。ホジキン細胞系L540cyはUniversity of Cologne, Cologne, GermanyのV. Diehl博士から提供された。この細胞系を推奨される培地調合物中で維持し、3〜4日ごとに二次培養した。
【０３４９】
試薬および抗体：  抗AC30モノクローナル抗体のハイブリドーマ系統AC10はBowenら(Bowenら, 1993, J. Immunol. 151: 5896-5906)によって記載されたものであり、E. Podack博士（University of Miami）から提供された。精製された抗体を血漿を含まない上清からプロテインG免疫親和性カラムを用いて単離した。サイズ排除クロマトグラフィーによって、得られたAC10抗体の97％以上が単量体であると測定された。モノクローナル抗体HeFi-1はT. Hecht博士（NCI, Bethesda, MD）により先に記載されかつ提供されたものである。HeFi-1 mAbはサイズ排除クロマトグラフィーによって98％以上が単量体であることが示された。
【０３５０】
増殖アッセイ：  CD30発現性細胞系を96ウェルの平底プレート中、ウェル当たり50000または5000個の細胞密度で、細胞系L428、KM-H2およびKarpas 299については増殖培地（10％（加熱により不活性化した）ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI）中で、細胞系HDLM-2およびL540についてはRPMI/20%（加熱により不活性化した）FBS中で培養した。細胞系を、下記に記載されるように、交差結合された可溶性抗CD30 mAbまたは固定化された抗CD30 mAbの不在または存在下で培養した。
【０３５１】
溶液中での抗体の交差結合：  溶液中で抗CD30抗体を交差結合するために、様々な希釈のAC10またはHeFi-1を、20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の不在または存在下で、96ウェルの平底組織培養プレートに滴定した。次いで、ホジキン病細胞系をウェル当たり50000または5000個の細胞でプレートに添加した。プレートを37℃で72時間インキュベートし、最後の5時間の間、ウェル当たり1μCiの3H-チミジンで標識した。
【０３５２】
抗体の固定化：  抗体の固定化は、ウェルを50mmol/L Trisバッファー（pH 8.5）中の抗体を用いて4℃で18時間コーティングすることによって行った。細胞の添加前に、ウェルをPBSで2回洗浄して、未結合のmAbを除去した。200μlの総容量中50000または5000個の細胞を各ウェルに添加した。増殖は、72時間の培養時間の最後の8時間の間の3H-チミジン（0.5μCi/ウェル）の取り込みによって判定した。
【０３５３】
6.2  結果
抗CD30 mAbの生物活性を評価するため、CD30発現性HD細胞系（50000細胞/ウェル）を固定化した抗CD30 mAb AC10の存在下で培養した。mAb AC10がT細胞様（L540およびHDLM-2）またはB細胞様（L428およびKM-H2）HD系の細胞増殖を阻害することが立証された（図１）。既にHD細胞系に対する効果を有さないことが示されているKi-1（Grussら, 1996, Blood 83: 2045- 2056）を対照として用いた。
【０３５４】
AC10の活性をさらに評価するために、第2系列のアッセイを実施した。腫瘍細胞の対数増殖期の間のAC10の活性を評価するために、培養物の細胞密度を低減してより最適な増殖条件を与えた。そのために、HD細胞系を96ウェルの平底プレート中、ウェル当たり5000個の細胞密度で、mAb AC10の存在または不在下で培養した。AC10が試験された4種全てのHD細胞系（L540、HDLM-2、L428およびKM-H2）の増殖を阻害することが立証された（図2）。
【０３５５】
別セットの実験において、可溶性ヤギ抗マウスIgG抗体の添加によって溶液中で交差結合した可溶性AC10またはHeFi-1と共に、HD細胞系をインキュベートした。これらの交差結合条件下で、5x104細胞/ウェルで平板培養した際に、4種全てのHD細胞系はAC10およびHeFi-1によって増殖が阻害された（図3）。細胞を5x103細胞/ウェルで平板培養した場合、AC10はHDLM-2、L540およびL428の増殖を阻害し、ならびに細胞系KM-H2の増殖をほとんど阻害せず、一方、HeFi-1は細胞系HDLM-2、L540およびL428の増殖を阻害した（図4）。CD30発現性腫瘍細胞系に対するAC10およびHeFi-1の効果を試験する実験から生じるデータは、以下の表2に要約されている。表2はAC10およびHeFi-1の抗腫瘍活性とmAb M44の抗腫瘍活性との比較をさらに提供する。
【表２】
2007500236.tif 000037
【０３５６】
総合すれば、これらのデータは、mAB AC10およびHeFi-1が、CD30発現性HD系の増殖を阻害するその能力によって、以前に記載された抗CD30 mAbから区別されることを示している。Hubingerらが近年、5000細胞/ウェルを利用する増殖アッセイにおいて固定化形態の抗CD30 mAb M44の活性を評価したことに注目することは興味深い。これらの条件下では、M44はCD30発現性ALCL系、Karpas 299の増殖を阻害したが、HD細胞系HDLM-2の増殖を阻害しなかった（Hubingerら, 1999, Exp. Hematol. 27 (12) : 1796-805）。
【０３５７】
7.  AC10がホジキン病細胞系に対する化学療法剤の細胞傷害効果を増強する
7.1  材料と方法
20μg/mlのヤギ抗マウスIgG抗体の添加によって交差結合させた0.1μg/mlの抗CD30抗体、AC10の存在または不在下でL428細胞を24時間培養した。24時間の培養期間の後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。次いで、細胞を96ウェルの平底組織培養プレートに5x103細胞/ウェルでプレーティングし、様々な希釈の化学療法剤と混合した。薬剤への1時間の曝露後に、細胞を2回洗浄し、次いで新鮮な培養培地を添加した。その後、プレートを37℃で72時間インキュベートし、次いで0.5μCi/ウェルの3H-チミジンと共に4時間インキュベートした。増殖の阻害は、処理細胞に取り込まれた3H-チミジンの量を未処理の対照細胞に取り込まれた量と比較することによって判定した。
【０３５８】
7.2  結果
化学療法剤との組み合わせにおける抗CD30 mAbの効果を評価するために、抗体の不在下、または一次抗体に対する交差結合を与える20μg/mlのヤギ抗マウスIgGを伴うAC10（0.1μg/ml）の存在下のいずれかで、L428細胞を24時間インキュベートした。このインキュベーション後、ドキソルビシン、シスプラチンおよびエトポシドを含む化学療法剤の存在下、5x103細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレートに細胞をプレーティングした（表３）。次いで、未処理の対照細胞と比較して3H-チミジンの取り込みを50％阻害することに必要な薬剤の濃度であるEC50を、薬剤のみでまたは薬剤と抗体との組合せで処理した細胞について決定した。ドキソルビシンについては、AC10とのインキュベーションにより、L428細胞に対するEC50を約45nM（ドキソルビシンのみ）〜約9nM低減し（すなわち、DNA合成の50％を阻害するのに必要な薬剤の量を低減する）、シスプラチンについては、AC10はEC50を約1500nM〜約500nM低減し、エトポシドについては、AC10はEC50を約1500nM〜約600nM低減した。
【表３】
2007500236.tif 000038
【０３５９】
8.  散在性および限局性（皮下）L540cyホジキン病異種移植片におけるAC10およびHeFi-1の抗腫瘍活性
8.1  材料と方法
ヒト腫瘍異種移植片モデル：  4〜6週齢のTaconic(Germantown, NY)から得たメスのC.B-17 SCIDマウスを全ての効能研究に用いた。ホジキン病の異種移植片モデルを樹立するために、L540cy(HD)細胞を細胞培養物から回収し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で洗浄し、PBS中に再懸濁し、そして移植まで氷上で維持した。散在性疾患モデルのために、マウスに尾静脈を介して107個の540cy細胞を静脈内注射した。固形腫瘍異種移植片は、2x107個のL540cy細胞をマウスに皮下注射（s.c.）することによって定着させた。治療上の評価のために、示された処置用量およびスケジュールを用いた。
【０３６０】
AC10およびHeFi-1の投与：  散在性L540cy腫瘍を保有するマウスは0日目（d0）で尾静脈を介して107個の細胞を得て、その後1日目（d1）で処置が開始される。処置マウスは2日間の間隔でAC10またはHeFi-1のいずれかの腹腔内注射を合計10回（q2dx10、1mg/kg/注射）受けた。
【０３６１】
皮下L540cyモデルについては、マウスに2x107個の細胞を皮下注射し、固形腫瘍形成を絶えず観察した。腫瘍が触知で来た際に、動物を無作為にグループ分けし、AC10またはHeFi-1のいずれかを投与した（q2dx10、2mg/kg/注射）。
【０３６２】
8.2  結果
L540cyホジキン病異種移植片が移植されたSCIDマウスにおいて、上述されるようにAC10およびHeFi-1を試験した。散在性L540cy腫瘍を有するマウス集団において、未処理の全ての対照動物は、後肢麻痺または固形腫瘍塊の形成など、重い散在性疾患の徴候を発病し、屠殺せざるを得なかった（平均生存時間＝37日）。対照的に、AC10またはHeFi-1のいずれかが投与された全てのマウスは、疾患の徴候なく、46日より長く生存した（図5A）。
【０３６３】
皮下L540cy腫瘍を有するマウス集団に関して、未処理の対照腫瘍は450mm3を上回る大きさに急速に増殖したが、図5Bに示されるように、mAbが有意に腫瘍の増殖を遅らせた。
【０３６４】
本発明者らは、ヒトCD30レセプターを標的とし、かつ他の抗CD30 mAbについては以前に記載されていない活性の特徴を示す、マウスモノクローナル抗体（mAb）を同定した。未修飾の形態で、これらの抗体AC10およびHeFi-1は、HDおよびALCL系Karpas 299の増殖を阻害し、ホジキン病の腫瘍異種移植片モデルにおいてin vivo抗腫瘍活性を示した。
【０３６５】
9.  キメラAC10のin vitro活性
9.1  材料と方法
細胞および試薬：  AC10ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640培地（Life Technologies Inc.. Gaithersburg, MD）中で増殖させた。抗体をプロテインAクロマトグラフィーによって培養液上清から精製した。CD30陽性HD系L540,KM-H2、HDLM-2およびL428、ならびにALCL系Karpas-299を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Germany)から得た。L540cyはV. Diehl博士から提供された。HL-60およびDaudiはATCC(Manassas, VA)から得た。DG44 CHO細胞はLawrence Chasm (Columbia University, New York, NY)から得た。ヤギ抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITCはJackson Immunoresearch（West Grove, PA）からのものであった。抗CD30 mAb Ki-1はAccurate Chemicals (Westbury, NY)からのものであった。
【０３６６】
FACSアッセイ：  細胞系に対するCD30発現を評価するために、3x105個の細胞を、氷冷した2％FBS/PBS（染色培地）中、氷上で20分間飽和レベル（4μg/ml）のAC10またはキメラAC10（cAC10）のいずれかと混合し、氷冷した染色培地で2回洗浄して未結合のmAbを除いた。次いで、細胞を氷冷した染色培地中、1：50に希釈された二次mAb（AC10についてはヤギ抗マウスFITCもしくはcAC10についてはヤギ抗ヒトFITC）で染色し、氷上で20分間インキュベートし、上述されるように洗浄し、そして5μg/mLのヨウ化プロピジウム（PI）中に再懸濁した。標識した細胞は、Becton Dickinson FACScanフローサイトメーターによるフローサイトメトリーによって調査し、ゲートして（gated）非生存細胞を排除した。データをBecton DickinsonCellQuestソフトウェアバージョン3.3を用いて分析し、バックグラウンドを補正した平均蛍光強度を各細胞型について調査した。
【０３６７】
抗体の飽和結合のために、3x105個のKarpas 299細胞を、氷冷した染色培地中で希釈した増加濃度のAC10またはcAC10と氷上で20分間混合し、氷冷した染色培地で2回洗浄して遊離のmAbを除去し、それぞれ1：50のヤギ抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITCと共にインキュベートした。標識された細胞を上述されるように洗浄し、P1中に再懸濁し、分析した。得られた平均蛍光強度をmAb濃度に対してプロットした。
【０３６８】
細胞周期位置の分析のために、細胞を完全培地中で培養し、示された時間でブロモデオキシウリジン（BrdU）（10μM最終；Sigma, St. Louis, MO）を用いて20分間標識して初期のDNA合成を検出し、そして既に記載されるようにPIによって総DNA量を検出した（Donaldsonら, l997, J. Immunol. Meth. 203:25-33）。標識された細胞は、既に記載されるように、Becton DickinsonCellQuestプログラムを用いたフローサイトメトリーによって細胞周期位置およびアポトーシスについて分析した（Donaldsonら, l997, J. Immunol. Meth. 203:25-33）。
【０３６９】
in vitro増殖阻害：  マウスmAbによる増殖阻害の評価は、50mM Tris-HCl pH 8.5中のmAb（10μg/mL）を、96ウェルのプラスチック組織培養プレートに4℃で一晩固定することによって実行した。プレートをPBSによって2回洗浄して未結合のmAbを除去し、その後、100μlの完全培地中の細胞を5000細胞/ウェルで添加した。37℃、5％CO2で48時間のインキュベーション後、細胞を0.5μCiの3H-TdRを含む50μlの完全培地の添加により、3H-TdRで2時間標識し、DNA合成のレベルを未処理の対照ウェル中の細胞に対して測定した。cAC10による増殖阻害の評価は、可溶性mAbおよび二次交差反応物質を用いて実施した。細胞を96ウェル形式で180μlの完全培地中5000細胞/ウェルでプレーティングした。10倍過剰に相当するヤギ抗ヒトIgGを含む完全培地中のcAC10を20μl中に記載される濃度で添加した。インキュベーションの96時間目に、細胞を3H-TdRを用いて4時間で標識し、続いて細胞を回収し、シンチレーションカウントして初期のDNA合成のレベルを定量した。未処理の対照ウェルに対する阻害率をcAC10濃度に対してプロットした。
【０３７０】
キメラAC10（cAC10）の構築と発現：  cAC10の構築のために、重鎖および軽鎖可変領域をGillilandら（1996, Tissue Antigens 47: 1-20）の方法を用いてAC10ハイブリドーマからクローニングした。総RNAをAC10ハイブリドーマから単離し、可変領域のcDNAをマウスκおよびIgG2b遺伝子特異的プライマーを用いて作製した。AC10重鎖可変領域（VH）をコードするDNAを、クローニングベクター中のヒトγI定常領域（huCγl、SwissProt受託番号P01857）をコードする配列と連結し、AC10軽鎖可変領域（VL）を同様に別のクローニングベクター中のヒトκ定常領域（huCκ、PID G185945）と連結した。CHO細胞における完全なキメラモノクローナル抗体の発現のために、重鎖および軽鎖キメラ配列の両方をpDEF14中にクローニングした。プラスミドpDEF14は、遺伝子増幅の必要なく組換えタンパク質の高レベル発現に導く異種遺伝子の転写を駆動する（米国特許5,888,809）、チャイニーズハムスター伸長因子1α遺伝子プロモーターを利用する。生じたプラスミドはpDEFl4-C3と称した（図６）。
【０３７１】
cAC10発現細胞系の作製のために、pDEFl4-C3を線状化し、エレクトロポレーションによってDG44 CHO細胞にトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を10％FBSを含むDMEM/F12完全培地中2日間で回収し、その後培地をヒポキサンチンおよびチミジンを含まない選択培地に取り替えた。DLIFR遺伝子を含むプラスミドDNAを組み込んだ細胞のみがヒポキサンチンおよびチミジンの不在下で増殖できた。高力価のクローンを選択し、バイオリアクター中で培養した。最終産物の99％より多くが単量体の抗体であることをHPLC-SECによって判定しながら、プロテインA、イオン交換および疎水的相互作用クロマトグラフィーによってcAC10抗体を精製した。
【０３７２】
9.2  結果
ホジキン病細胞系へのマウスAC10およびキメラAC10の結合：  AC10は元々マウスをCD30陽性大リンパ腫細胞系YTで免疫処理することによって作製され、これはCD30に対して特異的であることが示された（Bowenら, 1993, J. Immunol. 151: 5896-5906）。HD細胞の増殖に対するAC10およびcAC10の効果を評価する前に、様々な培養細胞系におけるCD30発現のレベルを比較した。試験された4種全てのHD系は、フローサイトメトリーの蛍光比に基づいてCD30陽性であった（表４）。T細胞様HD細胞系HDLM-2およびL540ならびにALCL系Karpas-299は、質的に類似した高レベルのCD30を発現したが、2つのB細胞様HD系KM-H2およびL428における発現は幾分低いものであった。L540のサブクローンであるL540cyは、中位レベルのCD30発現を示した。これらの細胞系に対するcAC10およびAC10の結合を、それぞれヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスとコンジュゲートした異なる二次抗体-FITCを用いて検出したが、これらのデータはキメラ工程が細胞表面CD30に対するcAC10特異的結合を減少させないことを立証している。前骨髄球性白血病系HL60およびバーキットリンパ腫系DaudiはいずれもCD30陰性であり、次の研究における対照として使用した。
【０３７３】
マウス抗体およびキメラ抗体の結合活性をさらに比較するため、Karpas-299細胞をAC10またはcAC10の滴定量と一緒にインキュベートし、その後、それぞれヤギ抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITC（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）で標識して飽和に必要なレベルを決定した。標識した細胞をフローサイトメトリーで調査し、平均蛍光強度をmAbに対してプロットした。両形態のmAbに対する結合の飽和は約0.5μg/mlで生じた（図7）。飽和は調査した全てのCD30陽性細胞系で一致し（データは示されない）、さらにcAC10が親マウス抗体の結合活性を保持していたことを立証した。
【０３７４】
単離された新鮮な末梢血単核細胞はこのアッセイにおいてcAC10と反応せず、かつバックグラウンドを超えるシグナルを示さなかった。同様に、単離されたヒト初代B細胞
およびT細胞はcAC10と結合しなかった。抗CD3および抗CD28で活性化された初代ヒト末梢T細胞、ならびにヤマゴボウマイトジェンによって活性化されたB細胞は、いずれも活性化後72時間でcAC10の一過性の低レベルの結合を示し、これはその後減少した（データは示されない）。
【０３７５】
AC10およびcAC10のin vitro活性：  M44およびM67などの抗CD30抗体は、ALCL系に対する抗増殖効果を有するが、HD系の増殖に対する効果を有さないかまたはHD系の増殖を刺激することが示されてきた（Grussら, 1994, Blood 83: 2045-2056; Tianら, 1995, Cancer Res. 55: 5335-5341）。最初にHD細胞増殖に対するmAb AC10の効果を評価するために、既に報告された固相条件下でAC10をmAb Ki-1と比較した（Grussら, 1994, Blood 83 : 2045-2056）。これらの研究のために、材料と方法に記載されるようにmAbをHD細胞の添加前にプラスチック組織培養プレート上に固定した。37℃で48時間のインキュベーション後、細胞を3H-TdRで標識し、未処理の対照ウェル中の細胞に対するDNA合成のレベルを測定した。図3Aは、固定化mAb Ki-1の存在がHD系の増殖に対するほんのわずかな効果を有することを示す。対照的に、固定化AC10の存在は有意な増殖阻害をもたらした。
【０３７６】
キメラ化後、cAC10の滴定をHD細胞系L540、L540cyおよびL428、ならびにALCL系Karpas-299で実施した。10倍過剰のヤギ抗ヒトIgGの存在下で、cAC10を溶液に記載される濃度で添加した。交差結合した抗体を添加することで、cAC10の効果を強化し、in vivoで生じ得るFcR仲介交差結合の効果に近づけた。CD30陽性ALCL系は、cAC10に対して非常に感受性であり、2ng/mlのanlC50（細胞増殖を50％阻害したmAbの濃度）であった。HD系L428、L540およびL540cyはそれぞれ、cAC10に対する100ng/ml、80ng/mlおよび15ng/mlのIC50感度を示した。平行した研究においては、これらの細胞を非結合性の対照mAbで処理し、そして交差結合物質は試験した濃度範囲にわたってDNA合成の低下を示さず（データは示されない）、CD30陰性系HL-60は、試験した最高レベルのcAC10によってわずかな阻害のみを示した（図8）。
【０３７７】
cAC10の細胞周期作用：  Hubingerらは近年、抗CD30 mAbがKarpas-299を含むALCL細胞の増殖を、細胞周期の停止を誘導しながらかつアポトーシスを誘導することなく阻害することができることを示してきた（Hubingerら, 2001, Oncogene 20: 590-598）。しかしこれらの抗体は、HD細胞に対する阻害効果を有さず、一部の場合にはこれらが増殖を刺激した。in vitroでcAC10の細胞周期作用をより詳しく調査するために、HD細胞系L540cyをヤギ抗ヒトIgG（10μg/ml）と複合体化された10μg/mlのcAC10を含む完全培地中で培養した。示された時間で細胞をブロモデオキシウリジンで20分間標識して、初期のDNA合成を検出し、ヨウ化プロピジウムで標識して総DNA量を検出した。標識した細胞を、既に記載したようにBecton-Dickinson Cellfitプログラムを用いたフローサイトメトリーによって細胞周期位置について分析した（Donaldsonら, 1997, J. Immunol. Meth. 203: 25-33）。
【０３７８】
図9は、cAC10への曝露後の、L540cy HD細胞中のDNA含量およびDNA合成における典型的な変動を示す。各領域における集団の割合は、9.1節に記載されるように定量し、表5に示された。L540cyのcAC10への曝露は、未処理の集団において、曝露後2日目に40％から13％へのS期細胞の時間依存的欠失をもたらした。協調して、この集団のG1含量は、未処理の細胞において、曝露後3日目に40％から65％へ増加した。G1含量未満の領域は、DNAの断片化を経ているアポトーシス細胞の正確な徴候を与え（Donaldsonら., 1997, J. Immunol. Meth. 203: 25-33）、この集団は、未処理の集団において、cAC10曝露後48時間で6％から29％へ増加した。これらのフローサイトメトリーの研究は、ヘモサイトメーターを用いた並行して行った色素排除アッセイ（parallel dye exclusion assay）によって確認した。色素排除によって測定されたように、未処理のL540cy細胞は93％が生存可能であり、これはcAC10曝露後48時間で72％に減少した。cAC10で処理したKarpas細胞は、cAC10処理後48時間でS期を40％から11％まで同様に減少したことを示した（表５）。対照研究において、CD30陰性B細胞系Daudiは、cAC10により処理後、細胞周期のほんのわずかなモジュレーションのみを示し、アポトーシスの増加がないことを示した（表５）。CD30に対する固定化mAbがALCL細胞におけるアポトーシスを誘導した以前の研究と異なり（Mirら, 2000, Blood 96: 4307-4312.）、可溶性cAC10および交差結合した二次抗体を含むこれらの細胞におけるアポトーシスがほとんど観察されなかった。総合すると、これらのデータは、cAC10が、いずれのCD30陽性系においてもG1集団の増殖阻止および蓄積を誘導したこと、ならびにL540cy HD細胞におけるin vitroでのアポトーシスの誘導を証明した。
【表４】
2007500236.tif 000039
【表５】
2007500236.tif 000040
【０３７９】
10．ホジキン病異種移植片に対するキメラAC10のin vivoでの効力
10.1  材料と方法
ヒトホジキン病の異種移植モデル：  散在性HDモデルのために、1x107個のL540cy細胞を尾静脈を介してC.B-17 SCIDマウスに注射した。cAC10による処理を示された時間で開始し、4日毎の腹腔内注射を合計5回施した。動物を散在性疾患、特に後肢麻痺の徴候を毎日評価した。その後、疾患のこれらのまたは別の徴候が発症したマウスを犠牲にした。HDの局所モデルのために、2x107個のL540cy細胞をSCIDマウスの右わき腹に移植した。各群の5個体の動物における腫瘍サイズが約50mm3の平均を示した時にcAC10による治療を開始した。治療は4日毎、5回のcAC10の腹腔内注射であった。腫瘍サイズを式（LxW2）/2を用いて決定した。
【０３８０】
10.2  結果
cAC10のin vivo活性をL540cyを用いてSCIDマウスにおいて評価した。マウスにおけるヒトHDモデルの樹立は困難であることが証明されてきた。免疫不全マウスにおいて非常に乏しい生着（engraftment）を生じる別のHD由来の細胞系とは異なり、L540cy HD腫瘍細胞モデルは、SCIDマウスにおいて首尾よく樹立することができる（Kappら, 1994, Ann Oncol. SSuppl 1: 121-126）。L540cy細胞を用いる2つの別個の疾患モデル（散在性モデルおよび局所化された皮下腫瘍モデル）を用いてcAC10のin vivoでの効力を評価した。
【０３８１】
先の研究により、SCIDマウスへ静脈内注射されたL540cy細胞がヒトHDの散在と比較可能な様式で広がること、およびリンパ節への優先的な局在化を示すことが示されてきた（Kappら, 1994, Ann Oncol. 5Suppl 1: 121-126）。この散在性HDモデルにおいてcAC10を評価するために、1x107個のL540cy細胞を尾静脈を介してC.B-17 SCIDマウスに注射した。未処理のマウスまたは非結合の対照mAbで処理したマウスは、腫瘍細胞注射から30〜40日以内に散在性疾患、特に後肢麻痺の徴候が発症した（図10A）。その後、疾患のこれらのまたは他の徴候が発症したマウスをIACUCガイドラインに従って犠牲にした。cAC10による治療は腫瘍細胞の注射後1日目に開始し、４日毎、合計5回の注射を腹腔内注射を介して施した。4mg/kg/注射の投与療法を受けた全ての動物（5/5）および1mg/kg/注射または2mg/kg/注射を受けた4/5の動物は、疾患の徴候なく120日（実験期間）より長く生存した。
【０３８２】
後の実験において、cAC10の効力を、治療の開始日を変えることによってさらに評価した。この研究のために、L540cy細胞を0日目に尾静脈を介してSCIDマウスに注射して、1日、5日目または9日目に治療を開始した（図10B）。全ての処置群において、cAC10をq4dx5のスケジュールを用いて、4mg/kgで投与した。以前の研究と一致して、cAC10は1日目に治療を開始した動物の生存に有意に影響し、4/5の動物が140日後に無疾患状態であった。治療の開始が遅れた場合でも、cAC10は有意な効力を証明した。すなわち、5日目に治療を開始した3/5の動物および9日目に治療を開始した2/5が、実験期間中に無疾患状態を維持した。
【０３８３】
cAC10は皮下L540cy HD腫瘍モデルにおける効力も立証した。SCIDマウスの脇腹に2x107個の細胞を移植した。各群の5個体の動物における腫瘍サイズが50mm3の平均を示した時、cAC10による治療を開始した。治療は、散在性モデルのものと同じ投与量、すなわち1、2および4mg/kg/注射を用いて、4日毎、S回の腹腔内注射であった。未処理の動物における腫瘍は急速に増殖し、34日で800mm3を超える平均に達した。cAC10は、用量依存的に、試験された全ての濃度で腫瘍増殖における優位な遅延を引き起こした（図10C）。
【０３８４】
11.  皮下L540cyホジキン病異種移植片に対するハイブリドーマ細胞系で産生されたキメラAC10の抗腫瘍活性
11.1  材料と方法
キメラAC10（cAC10）を本質的には既に記載されるようにヒトIgG1-κ重鎖および軽鎖変換ベクターを用いた相同的組換えを介して作製した（YarnoldおよびFell, 1994, Cancer Res. 54: 506-512）。これらのベクターは、マウスの免疫グロブリン重鎖および軽鎖定常領域遺伝子座が、相同的組換えを介してヒトγ1およびκ定常領域遺伝子座によって切除されかつ置換されるように構築した。得られたキメラハイブリドーマ細胞系は、元々のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにヒトγ1およびκ定常領域からなるキメラ抗体を発現する。
【０３８５】
11.2  結果
in vivoでのcAC10の効力を評価するため、SCIDマウスにL540cy細胞を上述されるように皮下移植した。腫瘍が150mm3より大きな平均サイズに達した時に、マウスを未処理の群または1週間に2回、計5回の2mg/kg cAC10で処置した群に分けた。未処理のマウスにおける腫瘍は、600mm3より大きな平均サイズまで急速に増殖した（図11）。対照的に、cAC10で処理された動物における平均腫瘍サイズはほぼ同一のサイズを維持した。
【０３８６】
12.  キメラAC10-薬剤コンジュゲートのin vitro活性
cAC10を用いて細胞傷害剤をCD30陽性細胞に選択的に送達することができる。図12に示されるように、CD30陽性Karpas(ALCL)およびL540cy（HD）ならびにCD30陰性B細胞系Daudiを、cAC10抗体薬剤コンジュゲート（ADC）を介して送達された細胞傷害剤に対する相対的感度について調査した。細胞を細胞傷害剤AEBとコンジュゲートされたcAC10（cAC10-AEB）に2時間曝露し、洗浄して遊離のADCを除去し、96時間細胞の生存度を測定した。テトラゾリウム染料（XTT）減退アッセイ（reduction assay）によって細胞傷害性を測定した。Karpas 299およびL540cyのいずれもがcAC10-AEBコンジュゲートに対して感受性であり、0.1μg/ml未満のIC50値（細胞の50％を殺す濃度）であった。対照的に、Daudi細胞におけるIC50値は10μg/mlより大きいものであった。3種全ての細胞系は、コンジュゲートされていないアウリスタチンEのみに対して等しく感受性であった（データは示されない）。
【０３８７】
13．  キメラAC10−薬剤コンジュゲートの抗腫瘍活性
アウリスタチンE誘導体AEB（その全体を参照により本明細書に組み入れる米国出願第09/845,786（出願日2001年4月30日）に記載される）とコンジュゲートされたキメラAC10の抗腫瘍活性を、L540cyホジキン病異種移植片をもつSCIDマウスにおいて評価した（図13）。マウスにL540cy細胞を皮下移植し、腫瘍が約75mm3の平均体積に達した際に治療を開始した。治療は、3mg/kg/量または10mg/kg/量のcAC10-AEBの、4日間の間隔で合計4回の投与（q4dx4）から構成された。いずれかの用量でcAC10-AEBを受けた全てのマウスにおける腫瘍は完全に退行し、そして腫瘍の移植後18日目まで、治療の開始後9日目まで治療した。これらの完全な退行は実質的に実験期間の間維持された。これらの結果は、アウリスタチンE等の化学療法剤とコンジュゲートされたキメラ抗CD30抗体が、ホジキン病において有意な効力を有し得ることを立証している。
【０３８８】
14．  特定の実施形態、参考文献の引用
本発明は本明細書に記載される特定の実施例によってその範囲が限定されるべきものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が、上述の記載および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更も添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０３８９】
特許出願、特許および科学刊行物を含む様々な参考文献が本明細書で引用され、その開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０３９０】
【図１】ホジキン病細胞系の増殖阻害を示す。5ｘ104細胞/ウェルのホジキン病細胞系HDLM−2、L540、L428およびKM-H2を、10μg/mlの固定化AC10の存在または不在下で培養した。これらのアッセイにおいてKi-1を対照として用いた。増殖は72時間の培養後の3H-チミジンの取り込みによって測定した。
【図２】ホジキン病細胞系の増殖阻害を示す。5ｘ103細胞/ウェルのホジキン病細胞系HDLM−2、L540、L428およびKM-H2を、10μg/mlの固定化AC10の存在または不在下で培養した。これらのアッセイにおいてKi-1を対照として用いた。増殖は72時間の培養後の3H-チミジンの取り込みによって測定した。
【図３】ホジキン病細胞系の増殖阻害を示す。5ｘ104細胞/ウェルのホジキン病細胞系HDLM−2、L540、L428およびKM-H2を、20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加によって交差結合された0.1μg/mlのAC10またはHeFi-1の存在または不在下で培養した。増殖は72時間の培養後の3H-チミジンの取り込みによって測定した。
【図４】ホジキン病細胞系の増殖阻害を示す。5ｘ10３細胞/ウェルのホジキン病細胞系HDLM−2、L540、L428およびKM-H2を、20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加によって交差結合された0.1μg/mlのAC10またはHeFi-1の存在または不在下で培養した。増殖は72時間の培養後の3H-チミジンの取り込みによって測定した。
【図５】散在性（A）および皮下（B）のL540cyホジキン病異種移植片におけるAC10（白丸）およびHeFi-1（白四角）の抗腫瘍活性を示す。A)0日目に、1ｘ107個の細胞を尾静脈を介してマウスに移植し、q2dx10の投与計画を用い、注射あたり1mg/kgでの抗体の腹腔内注射を施した。B)マウスに2ｘ107個のL540cy細胞を皮下移植した。腫瘍が触知できた際に、マウスをAC10またはHeFi-1の腹腔内注射（注射あたり2mg/kg のq2dx10）で処理した。いずれの実験も、未処理のマウス（X）にはいかなる治療も施さなかった。
【図６】キメラAC10発現ベクターを示す。別々のクローニングベクター中で、mAb AC10の重鎖可変領域（Vp）をコードするDNAをヒトγ1定常領域をコードする配列と連結し、AC10軽鎖可変領域（VL）を同様にヒトκ定常領域と連結した。重鎖および軽鎖キメラ配列を、CHO細胞中で無傷のキメラモノクローナル抗体の発現用プラスミドpDEF14にクローニングした。pDEF14は異種遺伝子の転写を誘導するチャイニーズハムスター伸長因子1α遺伝子プロモーターを利用する（米国特許第5,888,809）。
【図７】CD30陽性Karpas-299に対するAC10およびキメラAC10(cAC10)の結合飽和度を示す。細胞を増加濃度のAC10またはcAC10と20分間合一し、2％PBS/PBS（染色培地）で洗浄して遊離のmAbを除去し、それぞれヤギ−抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITCと一緒にインキュベートした。標識した細胞を染色培地で再び洗浄し、フローサイトメトリーで調べた。9.1節に記載されるように、生じた平均蛍光強度をmAb濃度に対してプロットした。
【図８】キメラAC10（cAC10）によるin vitro増殖阻害を示す。CD30陽性系およびCD30陰性系HL-60をウェル当たり5000個の細胞で平板培養した。キメラAC10を、対応する10倍過剰のヤギ抗ヒトIgGの存在下、示された濃度で添加した。未処理の対照ウェルに対する阻害率（％）をcAC10濃度に対してプロットした。
【図９】L540cy HD細胞に対するキメラAC10の細胞周期作用を示す。細胞を1pg/mlのcAC10および10pg/mlのヤギ抗ヒト二次抗体で処理した。示された時間で細胞をBrdUで標識し、透過可能にし、抗BrdUで染色して初期の（nascent）DNA合成を検出し（下のパネル）、かつヨウ化プロピジウムで染色して総DNA量（上のパネル）を検出した。上のパネルにはP1染色によるG1、S期およびG2含有量を記載し、下のパネルはBrdUの取り込みによって検出された含有量およびDNA合成を示す。領域2、5および3は、それぞれG1、S期およびG2を示す。領域4はDNA合成を行っていない亜G2期の含量のDNAを含み、領域6は亜G1期の含量のDNAを含み、これらの領域は、アポトーシスによるDNA断片化が生じた細胞を示す（Donaldsonら, 1997, J. Immunol. Meth. 203: 25-33）。
【図１０Ａ】HDモデルにおけるキメラAC10の効能を示す。(A)SCIDマウスにおける散在性L540cyホジキン病に対するcAC10の抗腫瘍活性を示す。マウス群（5匹/群）は未処理のまま（x）か、または腫瘍接種後1日目に、1（白四角）、2（白三角）もしくは4（黒丸）mg/kgのcAC10(q4dx5)を施されたものである。
【図１０Ｂ】HDモデルにおけるキメラAC10の効能を示す。(B)マウス群（5匹/群）が、未処理のまま（x）か、またはq4dx5の計画を用いた4mg/kgのaAC10投与による1日目（白四角）、5日目（白三角）もしくは9日目（黒丸）のいずれかに開始される治療を施されたSCIDマウスにおける散在性L540cyホジキン病を示す。
【図１０Ｃ】HDモデルにおけるキメラAC10の効能を示す。（C）SCIDマウスにおける皮下L540cy HD腫瘍モデルを示す。マウスの右側腹部に2ｘ107個のL540cyホジキン病細胞を移植した。マウス群（5匹/群）は、未処理のまま（x）か、または各群の5匹の動物における腫瘍サイズの平均が約50mm3の時に開始する、1（白四角）、2（白三角）または4（黒丸）mg/kgのキメラAC10（q4dx5；黒三角）を施されたものである。
【図１１】皮下L540cyホジキン病異種移植片におけるキメラAC10（cAC10）の抗腫瘍活性を示す。SCIDマウスにL540cy細胞を皮下移植し、腫瘍の平均サイズが150mm3を超えた時、マウスを未処理のまま（x）にするか、または2mg/kgのcAC10（白四角）を１週間に2回、計5回の注射で処理した。
【図１２】キメラAC10を介したCD30陽性細胞へのAEBの送達を示す。示された細胞系の細胞をアウリスタチンEの誘導体である細胞傷害剤AEBとコンジュゲートしたキメラAC10に曝露した（このコンジュゲートは、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第09/845,786（出願日2001年4月30日）に記載されている）。対照の％としての細胞の生存率は、投与されたcAC−薬剤コンジュゲートの濃度に対してプロットされている。
【図１３】L540cyホジキン病異種移植片を有するマウスにおけるキメラAC10-AEBコンジュゲートの活性を示す。マウスにL540cy細胞を皮下移植した。アウリスタチンEの誘導体である細胞傷害剤AEBとコンジュゲートしたキメラAC10を、40日の間隔で合計4回、示された用量で投与した。腫瘍の体積（mm3）が、腫瘍移植後の日数に対してプロットされている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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