(57)【要約】より長い血清半減期またはより高い血清安定性を有するＥＰＭペプチド融合タンパク質を含めて、ＥＰＭペプチドが開示される。ＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物、および治療または予防を必要とする患者に治療上または予防上有効な量のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を投与することによって疾患を治療または予防する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ジスルフィド結合形成を実質的に低減させる、ＥＭＰ−１の少なくとも１つのシステイン残基の第１の改変と、
（ｂ）そのペプチドがＥＭＰ−１活性を示すようにする第２の改変と
を含むＥＰＭペプチド。
【請求項２】
第１の改変が、ＥＭＰ−１ペプチド配列からの少なくとも１つのシステイン残基の欠失を含む、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項３】
第１の改変が、ＥＭＰ−１ペプチド配列からの少なくとも１つのシステイン残基の置換を含む、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項４】
第２の改変が、ＥＭＰ−１のＣ末端アミノ酸に共有結合しているリンカー基の付加を含む、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項５】
第２の改変が、ＥＭＰ−１のＮ末端アミノ酸に共有結合しているリンカー基の付加を含む、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項６】
第２の改変が、Ｎ末端アミノ酸に共有結合している第１のリンカー基、およびＥＭＰ−１のＣ末端アミノ酸に共有結合している第２のリンカー基の付加を含む、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項７】
第１の改変が、少なくとも１つのシステイン残基の欠失を含み、第２の改変が、ＥＭＰ−１に共有結合している少なくとも１つのリンカー基の付加を含む、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項８】
第１の改変が、２つのシステイン残基の欠失を含む、請求項８に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項９】
少なくとも１つのシステイン残基を置換するアミノ酸により、ペプチドの環状化が可能となる、請求項３に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸がアスパラギン酸である、請求項１０に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項１１】
第２の改変をしない場合に、第１の改変がエリスロポエチン受容体へのペプチドの結合を低減させる、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項１２】
第２の改変が、エリスロポエチン受容体へのペプチドの検出可能な結合を回復させる、請求項１１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項１３】
活性が、エリスロポエチン受容体に結合することである、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項１４】
活性が、エリスロポエチン受容体を活性化することである、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項１５】
第２のペプチドまたはタンパク質に融合された請求項１に記載のＥＰＭペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１６】
ＥＰＭペプチドが、ＥＭＰ−１と比べて、より高い血清安定性またはより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期を示す、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
第２のペプチドまたはタンパク質が、トランスフェリン、メラノトランスフェリン、ラクトフェリン、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質、イムノグロブリン、免疫グロブリンのＦｃ断片、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
第２のペプチドまたはタンパク質がトランスフェリンである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
トランスフェリンタンパク質が低減したグリコシル化を示す、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
トランスフェリンタンパク質が低減した金属結合を示す、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
トランスフェリンタンパク質が低減した受容体結合を示す、あるいは、前記タンパク質がトランスフェリン受容体と結合しない、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ＥＰＭペプチドが、トランスフェリンのＣ末端に融合されている、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
ＥＰＭペプチドが、トランスフェリンのＮ末端に融合されている、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ＥＰＭペプチドが、トランスフェリンのＮ末端およびＣ末端に融合されている、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ＥＰＭペプチドが、トランスフェリンの少なくとも１つのループ中に挿入されている、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
ＥＰＭペプチドが、トランスフェリンの少なくとも２つのループ中に挿入されている、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
トランスフェリンタンパク質がトランスフェリン受容体に対する低減した親和性を有する、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
ＥＰＭペプチドが、リンカー基を介して第２のペプチドまたはタンパク質に融合されている、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
リンカー基がペプチド鎖である、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
リンカー基がポリグリシンストレッチである、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３２】
請求項１８に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３６】
コードされた融合タンパク質を発現させる条件下で、請求項３５に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項３７】
コードされた融合タンパク質を発現させる条件下で、請求項３５に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項３８】
細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
細胞が酵母細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
細胞が酵母細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
請求項３１に記載の核酸分子を含むトランスジェニック動物。
【請求項４３】
請求項４２に記載のトランスジェニック動物から融合タンパク質を単離することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
【請求項４４】
融合タンパク質が、トランスジェニック動物の生体液から単離される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１に記載のＥＰＭペプチドおよび薬学的にされる担体を含む医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１８に記載の融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４７】
請求項１に記載のＥＰＭペプチドの治療上または予防上有効な量を、治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、患者の疾患または疾患症状を治療または予防する方法。
【請求項４８】
請求項１８に記載の融合タンパク質の治療上または予防上有効な量を、治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、患者の疾患または疾患症状を治療または予防する方法。
【請求項４９】
患者が、多発性硬化症、脳腫瘍、皮膚癌、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎に罹患している、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
対象が、健常者と比べて赤血球産生の低下または不全を示している、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５１】
赤血球産生の低下または不全が、貧血、β−サラセミア、妊娠または月経障害、関節リウマチ、エイズ、および癌に関連している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
患者が、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の障害、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、あるいはアルツハイマー病に罹患している、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５３】
リンカーが（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）ｙ（配列番号３２）であり、ｙが１、２、３、４、５、６、７、または８である、請求項４、５または２８のいずれか一項に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項５４】
（ａ）疎水性のより低い残基による疎水性残基の置換を含むＥＭＰ−１の第１の改変と、
（ｂ）そのペプチドがＥＭＰ−１活性を示すような第２の改変と
を含む、ＥＰＭペプチド。
【請求項５５】
疎水性残基がＬｅｕ１１またはＶａｌ１４である、請求項５４に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項５６】
Ｌｅｕ１１またはＶａｌ１４が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＳｅｒからなる群から選択される親水性残基で置換されている、請求項５５に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項５７】
Ｌｅｕ１１が、ＧｌｕまたはＴｈｒで置換されている、請求項５６に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項５８】
Ｖａｌ１４が、ＧｌｕまたはＡｓｐで置換されている、請求項５６に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項５９】
アミノ酸配列がＥＭＰ−１の配列に対して逆転している、請求項１に記載のＥＰＭペプチド。
【請求項６０】
配列（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）ｙ（配列番号３２）を含み、ｙが１、２、３、４、５、６、７、または８であるペプチドリンカー。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]本出願は、２００３年８月２８日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８の一部継続出願であり、２００４年３月１０日に出願された米国仮出願第６０／５５１５５２号の特典を請求する。これらのいずれも、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【発明の分野】
【０００２】
[0002]本発明は、生物活性ペプチド、その調製、それらを含む医薬組成物、およびその使用方法に関する。具体的には、本発明は、ＥＰＯペプチドミメティック（「ＥＰＭ」）ペプチド、および本発明の融合タンパク質を生成するために第２のペプチドまたはタンパク質に融合または挿入された、改変されたＥＰＭペプチドに関する。本発明は、ＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物、および治療または予防を必要とする患者に治療上または予防上有効な量のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を投与することによって疾患を治療または予防する方法にも関する。
【発明の背景】
【０００３】
治療用タンパク質およびペプチド
[0003]天然の状態の、または組換えによって作製された治療用タンパク質またはペプチドは、通常、血清安定性が短期間であり、またはｉｎ  ｖｉｖｏの循環半減期が短い、不安定分子である。さらに、これらの分子は、調製する際、特に、診断目的および治療目的のために水溶液中で調製する際に、極めて不安定になることが多い。
【０００４】
[0004]タンパク質性の治療用分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性を高めまたは促進するための実用的な溶液はほとんど存在していない。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質に結合させて、より長く作用し、持続性のタンパク質活性をもたらすことができる物質である。ＰＥＧへの結合によりタンパク質活性が延長される場合は、そのタンパク質の投与の必要回数を減らすことができる。しかし、ＰＥＧ結合は、しばしば、タンパク質の治療活性を低減しまたは消失させる。一部の場合では、ＰＥＧ結合がタンパク質の免疫原性を低減し得るのに対し、他の場合では、ＰＥＧ結合が免疫原性を増大させることがある。
【０００５】
[0005]治療用タンパク質またはペプチドは、治療用タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期を伸ばすことができるタンパク質に融合させることによっても、安定化されている。例えば、アルブミンまたは抗体断片に融合された治療用タンパク質は、融合されていない状態の治療用タンパク質と比べると、より長いｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を示すことができる。米国特許第５８７６９６９号および第５７６６８８３号を参照のこと。
【０００６】
エリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ）
[0006]エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、有糸細胞分裂および赤血球前駆細胞の分化を刺激するために哺乳動物の腎臓で合成される糖タンパク質である。したがって、ＥＰＯは、赤血球の産生を刺激および調節する役割を果たす。ＥＰＯは、赤血球形成において役割を有するため、赤血球産生の低下または不全を特徴とする血液疾患の診断および治療の双方に有用である。
【０００７】
[0007]複数の研究により、血液学的に異常である様々な疾患状態、障害、および状態、例えば、β−サラセミア（Ｖｅｄｏｖａｔｏ他（１９８４年）Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．７１：２１１〜２１３頁）；嚢胞性線維症（Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ他（１９８４年）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  １０５：１５〜２１頁）；妊娠障害および月経障害（Ｃｏｔｅｓ他（１９８３年）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅａｃｏｌ．９０：３０４〜３１１頁）；未熟児早期貧血（Ｈａｇａ他（１９８３年）Ａｃｔａ  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｃａｎｄ．７２：８２７〜８３１頁）；脊髄損傷（Ｃｌａｕｓ−Ｗａｌｋｅｒ他（１９８４年）Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．６５：３７０〜３７４頁）；宇宙飛行（Ｄｕｎｎ他（１９８４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２：１７８〜１８２頁）；急性失血（Ｍｉｌｌｅｒ他（１９８２年）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５２：５４５〜５９０頁）；老化（Ｕｄｕｐａ他（１９８４年）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０３：５７４〜５８８頁）；異常な赤血球新生を伴う様々な新生物性疾患状態（Ｄａｉｎｉａｋ他（１９８３年）Ｃａｎｃｅｒ５：１１０１〜１１０６頁）；ならびに腎不全（Ｅｓｃｈｂａｃｈ他（１９８７年）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：７３〜７８頁）におけるＥＰＯ療法の有効性が示されている。ここ１５年間、ＥＰＯは、腎不全による貧血の治療、関節リウマチ、炎症性腸疾患、ＡＩＤＳ、および癌に関連する慢性疾患による貧血の治療、ならびに造血器悪性腫瘍、骨髄移植後、および自己血輸血の際の貧血の治療のために使用されている。
【０００８】
[0008]ＥＰＯの活性は、その受容体によって媒介されている。ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）は、リガンド誘導性のタンパク質２量体化によって活性化される増殖因子型受容体のクラスに属する。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびインスリンなど他のホルモンおよびサイトカインは、２つの受容体を架橋して、２つの細胞質尾部を接近させることができる。これら２量体化によって活性化される受容体の多くは、２量体化の直後に隣接した尾部をリン酸化するタンパク質キナーゼドメインを細胞質尾部内に有する。一部の細胞質尾部は、内因性のキナーゼ活性を欠いているが、これらは、タンパク質キナーゼと結合することによって機能する。ＥＰＯ受容体は、後者のタイプのものである。それぞれの場合において、リン酸化により、シグナル経路が活性化される。
【０００９】
[0009]ＥＰＯの効力を有する分子擬態に対する関心が高まってきている。例えば、天然のＥＰＯまたは合成のＥＰＯミメティックペプチド（ＥＭＰ）の存在下でのエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）の２量体化は、受容体および下流のシグナル伝達事象の活性化をもたらす細胞外事象である。一般に、ＥＰＯに等価な効力を有する模倣体を得ることに関心がもたれている。
【００１０】
[0010]Ｗｒｉｇｈｔｏｎ他（１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３頁）は、繊維状ファージのコートタンパク質上にランダムなペプチドを露出させるファージディスプレイを使用した。ランダムなペプチドファージのライブラリーをスクリーニング系のＥＰＯ受容体の細胞外ドメインに結合させ、続いて、それから溶離させた。彼らは、ＥＰＯのドメイン弱結合性の（Ｋｄ  １０ｍＭ）ＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣ（配列番号１４）をコンセンサス配列として最初に捜し出すために、弱結合系を用いた。その結果、ＥＰＯの場合は２００ｐＭであるのに対し、親和力（Ｋｄ）が２００ｎＭである、２０アミノ酸のペプチド、すなわちＥＭＰ−１（ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ、配列番号４）が単離された。このペプチドの配列は、天然のＥＰＯ中に実際には存在していない。ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインを有するこのミメティックアゴニストペプチドの複合体の解像度２．８Åでの結晶構造から、ペプチド２量体が、ほぼ完全な２部分からなる受容体２量体化を誘導することが明らかにされた（Ｌｉｖｎａｈ他、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３（２７４）：４６４〜４７１頁）。この２０アミノ酸ペプチドは、βシート構造を有し、Ｃ−Ｃジスルフィド結合によって安定化されている。
【００１１】
[0011]ＥＭＰ−１の生物活性は、ＥＭＰ−１がＥＰＯミメティックの役割を果たすことができることを示唆している。例えば、ＥＭＰ−１は、受容体結合アッセイでＥＰＯと競合して、ＥＰＯに反応するように改変された細胞系の細胞増殖を引き起こす（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ他、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３頁）。ＥＰＯもＥＭＰ−１も、ＥＰＯ応答性細胞においてリン酸化事象の類似したカスケードおよび細胞周期の進行を誘導する（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ他、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３頁）。さらに、ＥＭＰ−１は、新生赤血球産生を２種の異なるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより観察した際、マウスで有意な赤血球産生効果を示している（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ他、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３頁）。
【００１２】
[0012]Ｊｏｈｎｓｏｎ他（１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：３６９９〜３７１０頁）は、ＥＰＯミメティック作用を調べるアッセイで、活性を保持している最小のペプチドを同定した。彼らは、Ｎ末端およびＣ末端の欠失を利用して、最小の活性ペプチドが配列ＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ、すなわちＥＭＰ−１（配列番号４）の４番目から１６番目までのアミノ酸を有するＥＭＰ−２０であることを発見した。彼らは、ＥＭＰ−１のＴｙｒ４およびＴｒｐ１３がミメティック作用に重要であることも発見した。３番目および１２番目の２つのシステイン残基も、ペプチドの３次元構造を安定化するＣ−Ｃジスルフィド結合を担っているため、ペプチド活性には不可欠である。
【発明の概要】
【００１３】
[0013]本発明は、ＥＭＰ−１ペプチドのアミノ酸配列中に変異または変化を含む、改変されたエリスロポエチン（「ＥＰＯ」）ペプチドミメティック（「ＥＰＭ」）ペプチドを包含する。
【００１４】
[0014]本発明の別の実施形態は、第２のペプチドまたはタンパク質に融合された１種または複数のＥＰＭペプチドを含む融合タンパク質であって、このＥＰＭペプチドが、ＥＭＰ−１と比べて、より高い血清安定性またはより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期を示す融合タンパク質を包含する。
【００１５】
[0015]本発明の別の実施形態は、ＥＰＭペプチドまたはＥＰＭペプチドを含む融合タンパク質を含む、医薬製剤、組成物、および剤形を包含する。
【００１６】
[0016]本発明の別の実施形態は、治療または予防を必要とする患者にＥＰＭペプチドまたはＥＰＭペプチドを含む融合タンパク質を投与することを含む、疾患を治療または予防する方法を包含する。
【００１７】
[0017]本発明の別の実施形態は、ＥＰＭペプチドの血清安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期、および生物学的利用能を向上させる方法を包含する。
【詳細な説明】
【００１８】
定義
[0029]本明細書では、トランスフェリン配列中の「対応するアミノ酸」または「等価なアミノ酸」は、第１のトランスフェリン配列と少なくとも第２のトランスフェリン配列との間の同一性または類似性を最大にするアライメントによって特定する。第２のトランスフェリン配列中の等価なアミノ酸を特定するために使用する数は、第１のトランスフェリン配列中の対応するアミノ酸を特定するために使用する数に基づく。いくつかの場合では、ウサギ血清トランスフェリン中のいくつかの残基と比べてヒトトランスフェリン中のアミノ酸残基を記述するために、これらの語句を使用することがある。
【００１９】
[0030]本明細書では、「生物活性」という用語は、生物学的状況において（すなわち、生物またはそのｉｎ  ｖｉｔｒｏな模擬系中で）治療用の分子、タンパク質、またはペプチドによって果たされる機能または一連の活性を意味する。生物活性としては、それだけには限らないが、応答性細胞系からの細胞外マトリックス分泌の誘導、ホルモン分泌の誘導、走化性の誘導、有糸分裂誘発の誘導、分化の誘導、または応答性細胞の細胞分裂の阻害など、特許請求の範囲に記載の融合タンパク質の治療用分子部分の諸機能を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の融合タンパク質またはペプチドは、ＥＭＰ−１またはＥＰＯの１種または複数の生物活性を示す場合には、生体活性を有するとみなされる。
【００２０】
[0031]本明細書では、「結合剤」とは、粉末物質に粘着性の特質を与えるのに使用される作用物質である。結合剤、または時として知られる「造粒機」は、所望の硬さおよびサイズの顆粒を調製することによって易流動性の特質を改善するだけでなく、錠剤に粘着性を与えて、圧縮後も錠剤が完全なまま維持されることを確実にする。結合剤として一般に使用される材料としては、デンプン；ゼラチン；スクロース、グルコース、デキストロース、糖蜜、およびラクトースなどの糖；アカシア、アルギン酸ナトリウム、トチャカエキス、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガティガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）殻の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）、微結晶性セルロース、微結晶性デキストロース、アミロース、およびカラマツアラボガラクタンなど天然および合成のガムなどが挙げられる。
【００２１】
[0032]本明細書では、別段の定めがない限り、「生物学的に加水分解可能な（ｂｉｏｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ）アミド」、「生物学的に加水分解可能なエステル、」「生物学的に加水分解可能なカルバメート」、「生物学的に加水分解可能なカルボネート」、「生物学的に加水分解可能なウレイド」、「生物学的に加水分解可能なホスフェート」とは、１）化合物の生物活性を阻害しないが、取込み、作用の持続、または作用発現などｉｎ  ｖｉｖｏで有利な諸特性をその化合物に与えることができる、あるいは、２）生物学的に不活性であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏで生体活性のある化合物に変換される、化合物のそれぞれアミド、エステル、カルバメート、カルボネート、ウレイド、またはホスフェートを意味する。生物学的に加水分解可能なエステルの例としては、それだけには限らないが、低級アルキルエステル、低級アシルオキシアルキルエステル（アセトキシルメチル、アセトキシエチル、アミノカルボニルオキシ−メチル、ピバロイルオキシメチル、およびピバロイルオキシエチルのエステルなど）、ラクトニルエステル（フタリジルおよびチオフタリジルのエステルなど）、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル（メトキシカルボニルオキシ−メチル、エトキシカルボニルオキシエチル、およびイソプロポキシカルボニルオキシエチルのエステルなど）、アルコキシアルキルエステル、コリンエステル、ならびにアシルアミノアルキルエステル（アセトアミドメチルエステルなど）が挙げられる。生物学的に加水分解可能なアミドの例としては、それだけには限らないが、低級アルキルアミド、アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、およびアルキルアミノアルキル−カルボニルアミドが挙げられる。生物学的に加水分解可能なカルバメートの例としては、それだけには限らないが、低級アルキルアミン、置換型エチレンジアミン、アミノ酸、ヒドロキシアルキルアミン、複素環式および複素芳香族アミン、ならびにポリエーテルアミンが挙げられる。
【００２２】
[0033]本明細書では、「担体」という用語は、組成物がそれとともに投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような薬剤担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、石油、動物、植物、または合成由来のものを含めて、水や油など滅菌した液体でよい。
【００２３】
[0034]本明細書では、「着色剤」とは、錠剤の外観をより良くし、さらに、製造業者が製品を調製する間、その管理をしやすくし、また、使用者がその製品を確認する助けとなる作用物質である。承認取得済みの水溶性のＦＤ＆Ｃ色素、その混合物、またはそれらの対応するレーキを色付き錠剤に使用してよい。着色レーキとは、水溶性色素を重金属の水和酸化物に吸着させることにより、色素を不溶型にした化合物である。
【００２４】
[0035]本明細書では、「相補的」という用語は、１つの核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型またはフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型の塩基対合を意味し、「結合」という用語は、２つのポリペプチドもしくは化合物、結合されたポリペプチドもしくは化合物、またはその組合せ物の間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合には、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）性、疎水性の相互作用などが含まれる。物理的相互作用は、直接的なものも間接的なものもある。間接的な相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を通して、またはその作用を原因とすることがある。直接的な結合は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を通して、またはその作用を原因として起こらないが、その代わりに他の実質的な化学的介在物を伴わない、相互作用を意味する。
【００２５】
[0036]本明細書では、別段の定めがない限り、「本発明の組成物」という用語は、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、およびプロドラッグ、ならびに薬学的に許容されるビヒクルを意味する。
【００２６】
[0037]本明細書では、「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換を意味する。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で明確にされている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００２７】
[0038]本明細書では、「希釈剤」とは、錠剤を圧縮するのに実用的なサイズにするために製剤の体積を増大させる目的で加えられる不活性な物質である。一般に使用される希釈剤としては、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、粉糖、シリカなどが挙げられる。
【００２８】
[0039]本明細書では、「崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）」または「崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）」とは、投与後の錠剤の分解または崩壊を促進する物質である。崩壊剤としての機能を果たす物質は、化学的に、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、またはガムに分類されている。他の崩壊剤としては、ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）ＨＶ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材産物、天然海綿、陽イオン交換樹脂、アルギン酸、グアールガム、柑橘類果肉、架橋ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
【００２９】
[0040]本明細書では「血液学的に異常な障害および疾患状態」という語句は、血液および造血器官の疾患に関係する任意の障害を意味する。血液学的に異常な障害および疾患状態の例としては、それだけには限らないが、貧血、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠障害および月経障害、未熟児早期貧血、脊髄損傷、急性失血、老化、異常な赤血球新生を伴う新生物性疾患状態、ならびに腎不全が挙げられる。
【００３０】
[0041]「分散性」または「分散性の」という用語は、含水率が、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常は、約５重量％未満、好ましくは約３重量％未満であり、粒子サイズが約１．０〜５．０μｍの質量中央径（ＭＭＤ）、通常、１．０〜４．０μｍ  ＭＭＤ、好ましくは１．０〜３．０μｍ  ＭＭＤであり、送達用量が、約３０％より多く、通常４０％より多く、好ましくは５０％より多く、最も好ましくは６０％より多く、エアロゾル粒径分布が、１．０〜５．０μｍの空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）、通常、１．５〜４．５μｍ  ＭＭＡＤ、好ましくは１．５〜４．０μｍ  ＭＭＡＤである、乾燥粉末を意味する。
【００３１】
[0042]「乾燥」という用語は、エアロゾルを作るための吸入装置中で粒子が容易に分散するような含水率をその組成物が有していることを意味する。この含水率は、一般に、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常は、約５重量％未満、好ましくは約３重量％未満である。
【００３２】
[0043]本明細書では、「有効量」とは、任意の医学的治療に伴う妥当な利益／リスク比で、所望の局所的または全身的な効果および効能を与えるのに十分な、薬物または薬理学的に活性な作用物質の量を意味する。
【００３３】
[0044]本明細書では、「ＥＭＰ−１活性」とは、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質がタンパク質ホルモンＥＰＯの活性を模倣する能力を意味する。ＥＭＰ−１活性は、さらに、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）に対する本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質の親和性、および細胞ベースのアッセイにおける相応して高い効力も意味する。これには、さらに、例えば、受容体上の特定のリガンド結合ドメインへのＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質リガンドの結合によって誘導される、ＥＰＯ受容体の活性化も含まれる。ＥＭＰ−１活性には、さらに、それだけには限らないが、エリスロポエチンに類似した効力で赤血球形成を刺激することができる、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質と、赤血球前駆体上のエリスロポエチンに対する受容体との直接的な相互作用も含まれる。
【００３４】
[0045]本明細書では、「矯味剤」は、単純エステル、アルコール、およびアルデヒドから炭水化物および揮発性油複合物まで、その化学構造はかなり様々である。ほぼすべての所望のタイプの合成矯味剤が、現在、入手可能である。
【００３５】
[0046]本明細書では、「Ｔｆタンパク質の断片」もしくは「Ｔｆタンパク質」、または「Ｔｆタンパク質の部分」という用語は、天然のＴｆタンパク質またはその突然変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むアミノ酸配列を意味する。
【００３６】
[0047]本発明は、改変されたＥＰＭ融合物またはキメラ蛋白質も提供する。本明細書では、改変されたＥＰＭ「融合タンパク質」または「キメラ蛋白質」は、第２のペプチドまたはタンパク質に作動的に連結されているＥＰＭペプチドを含む。
【００３７】
[0048]本明細書では、「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連づけられているＤＮＡの任意のセグメントを意味する。したがって、遺伝子には、それだけには限らないが、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる制御配列が含まれる。遺伝子には、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含まれ得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または既知のもしくは予測される配列情報からの合成を含めて、様々な供給源から得ることができ、また、所望の条件を満たすように設計された配列を含んでよい。さらに、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＥＭＰ−１タンパク質、好ましくは哺乳動物のＥＭＰ−１タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを含む核酸分子も意味する。
【００３８】
[0049]本明細書では、「異種ポリヌクレオチド」もしくは「異種核酸」、「異種遺伝子」もしくは「異種配列」、または「外来性ＤＮＡセグメント」とは、特定の宿主細胞に対して外来性である供給源に由来し、または、同一供給源である場合はその原型から改変された、ポリヌクレオチド、核酸、またはＤＮＡセグメントを意味する。宿主細胞中の異種遺伝子には、その特定の宿主細胞に対して内在性であるが、改変されている遺伝子が含まれる。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種性であり、または、その細胞に対して同種であるが、そのエレメントが普通は存在しない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを意味する。例として、酵母細胞にとって天然であるがヒトＴｆ配列に結合されているシグナル配列は、異種性である。
【００３９】
[0050]本明細書では、「単離された」核酸配列とは、本質的に他の核酸配列を含まない、例えば、アガロースゲル電気泳動による測定で、少なくとも約２０％の純度、好ましくは少なくとも約４０％の純度、より好ましくは約６０％の純度、さらにより好ましくは約８０％の純度、最も好ましくは約９０％の純度、さらに最も好ましくは約９５％の純度を有する核酸配列を意味する。例えば、単離された核酸配列は、核酸配列をその天然の位置から複製が行われる予定の別の部位へと再配置するために遺伝子工学で使用される標準のクローニング手順によって得ることができる。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸断片の切出しおよび単離、その断片のベクター分子中への挿入、ならびにその核酸配列の多数のコピーまたはクローンが複製される場所となる宿主細胞中への組換えベクターの組込みを含んでよい。この核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、または合成由来のものでも、その任意の組合せ物でもよい。
【００４０】
[0051]本明細書では、２つ以上のＤＮＡコード配列は、それらのＤＮＡコード配列間でインフレームな融合が起こった結果として、そのＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳される際、「結合された」または「融合された」と呼ばれる。Ｔｆ融合物に関する「融合」という用語は、それだけには限らないが、ＴｆのＮ末端への少なくとも１つのＥＰＭペプチドの結合、ＴｆのＣ末端への結合、および／またはＴｆ内の任意の２つのアミノ酸間の挿入を含む。
【００４１】
[0052]本明細書では、「潤滑剤」とは、錠剤顆粒化の流速を改善すること、錠剤材料が金型および押し抜き具の表面へ付着するのを防止すること、粒子間摩擦を低減すること、金型キャビティから錠剤を抜き出すのを容易にすることなど、錠剤製造の際にいくつかの機能を果たす物質である。一般に使用される潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、および硬化植物油が挙げられる。潤滑剤の標準的な量は、約０．１％重量％〜約５重量％の範囲である。
【００４２】
[0053]本明細書では、「改変」または「改変された」という用語は、ＥＭＰ−１アミノ酸配列（すなわち、配列番号４）の少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するＥＰＭペプチドを意味する。さらに、「改変」または「改変された」という用語は、ＥＭＰ−１アミノ酸配列のＣ末端、Ｎ末端、または任意の内部アミノ酸への１種または複数のリンカーの付加を意味してもよい。ＥＭＰ−１に対する改変の例としては、それだけには限らないが、１つまたは複数のシステイン残基の欠失、あるアミノ酸による１つまたは複数のシステイン残基の置換、あるいは、Ｃ末端、Ｎ末端、または任意の内部アミノ酸への１種または複数のリンカー基の付加が挙げられる。別の例としては、親水性のより高い（または疎水性のより低い）残基によるいくつかの疎水性残基の置換が挙げられる。例えば、Ｌｅｕ１１またはＶａｌ１４を、例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒに変えてよい。好ましくは、Ｌｅｕ１１をＧｌｕに変え、または、Ｖａｌ１４をＧｌｕに変える。あるいは、Ｌｅｕ１１をＴｈｒに変え、Ｖａｌ１４をＡｓｐに変える。本発明のＥＭＰ−１ペプチドの改変には、ＥＭＰ−１のアミノ酸１〜３および１７〜２０の欠失は含まれない（すなわち、ＥＭＰ−２０は含まれない）。
【００４３】
[0054]本明細書では、「改変されたトランスフェリン」とは、野生型トランスフェリンと比べて、そのアミノ酸配列の少なくとも１つを改変されているトランスフェリン分子を意味する。
【００４４】
[0055]本明細書では、「改変されたトランスフェリン融合タンパク質」とは、少なくとも１分子の改変されたトランスフェリン（またはその断片もしくは変異体）を少なくとも１分子のＥＰＭ（またはその断片もしくは変異体）に融合することによって形成されるタンパク質を意味する。
【００４５】
[0056]本明細書では、「必須ではない」アミノ酸残基という用語は、その生物活性を変えることなく、ＥＭＰ−１の天然の配列から改変することができる残基を意味し、一方、「必須の」アミノ酸残基は、生物活性のために必要とされている（例えば、ＥＭＰ−１のＴｙｒ４およびＴｒｐ１３）。
【００４６】
[0057]本明細書では、「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖または２本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを意味する。特に限定されない場合は、これらの用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然のヌクレオチドに類似した様式で代謝される天然ヌクレオチドのアナログを含有する核酸を包含する。別段の定めがない限り、個々の核酸配列は、明示された配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換体は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって、実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ他（１９９１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１頁；Ｏｈｔｓｕｋａ他（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８頁；Ｃａｓｓｏｌ他（１９９２年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ他（１９９４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１〜９８頁）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされているｍＲＮＡと交換可能に使用される。本明細書では、「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチドのアナログを用いて作製したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにその誘導体、断片、およびホモログを含むものとする。
【００４７】
[0058]本明細書では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ひと続きの連結したヌクレオチド残基を意味し、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で使用するのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡの配列に基づいても、それらから設計してもよく、特定の細胞または組織中で、同一の、類似の、または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにするのに使用される。オリゴヌクレオチドは、長さが約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ヌクレオチド、好ましくは長さが約１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドである核酸配列の部分を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成することができ、また、プローブとして使用することができる。
【００４８】
[0059]本明細書では、ＤＮＡセグメントが別のＤＮＡセグメントと機能する関係に配置された際、「作動可能に連結された」または「作動的に連結された」と表現する。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、融合タンパク質の分泌に関与するプレタンパク質としてそれが発現されるときは、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されており、また、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写をそれが刺激する場合は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接しており、シグナル配列または融合タンパク質の場合は、近接し、かつリーディング相にある。しかし、エンハンサーは、それが転写を制御するコード配列と近接している必要はない。この場合は、都合の良い制限部位で、またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカー部位で連結することによって、連結が実現される。
【００４９】
[0060]本明細書では、「薬学的に許容される」とは、生理的に容認でき、また、ヒトに投与した際に、急性胃蠕動やめまいなどアレルギー性または類似した有害反応を通常は生じない物質および組成物を意味する。一般に、本明細書では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されていること、あるいは、動物、より具体的にはヒトで使用するための米国薬局方または他の一般的に知られている薬局方に記載されていることを意味する。
【００５０】
[0061]本明細書では、別段の定めがない限り、「薬学的に許容される包接化合物」という用語は、その内部に捕捉されたゲスト分子（例えば、溶媒または水）を有する空隙（例えば、溝（ｃｈａｎｎｅｌ））を含む結晶格子の形で存在する、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を意味する。
【００５１】
[0062]本明細書では、別段の定めがない限り、「薬学的に許容される水和物」という用語は、非共有結合性の分子間力によって結合された化学量論的または非化学量論的量の水をさらに含む、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を意味する。
【００５２】
[0063]本明細書では、別段の定めがない限り、「薬学的に許容される多形体」という用語は、いくつかの異なる形（例えば、結晶性または非晶質性）で存在する本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を意味し、本発明は、これらの形のすべてを包含する。多形体とは、結晶格子中の分子配列が原因で異なる物理的諸特性を有している同一分子の結晶と定義されている。多形体が示す物理的諸特性の差は、（調製および製品製造の際に重要な）保存安定性、圧縮性、および密度、ならびに（生物学的利用能を決定する際に重要な因子である）分解速度など薬剤のパラメータに影響を及ぼす。安定性の差は、化学的反応性の変化（例えば、ある多形体からなる剤形が、別の多形体からなるときよりも急速に変色するような、酸化の差異）、力学的変化（例えば、動力学的に好ましい多形体が、熱力学的により安定な多形体に変換すると、錠剤は保存時に粉々に砕ける）、またはその双方（例えば、ある多形体からなる錠剤は高湿度でより分解されやすい）の結果として生じ得る。溶解性／分解性の差が原因となって、極端な例では、いくつかの多形転移により効力が無くなることがあり、または、別の極端な例では、毒性を生じることがある。さらに、結晶の物理的諸特性は、加工の際に重要となることがある。例えば、ある多形体が、溶媒和化合物をより形成しやすいこともあれば、ろ過および洗浄を行って不純物を除くのが困難であることもある（すなわち、粒子の形状およびサイズ分布が、ある多形体と他の多形体とで異なることがある）。
【００５３】
[0064]本明細書では、別段の定めがない限り、「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、生物学的条件下（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）で、加水分解し、酸化し、あるいは別の方法で反応して化合物を生じることができる、ＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質の誘導体を意味する。プロドラッグの例としては、それだけには限らないが、生物学的に加水分解可能なアミド、生物学的に加水分解可能なエステル、生物学的に加水分解可能なカルバメート、生物学的に加水分解可能なカルボネート、生物学的に加水分解可能なウレイド、および生物学的に加水分解可能なホスフェートのアナログなど生物学的に加水分解可能な部分を含む化合物が挙げられる。プロドラッグの他の例としては、オリゴヌクレオチド、ペプチド、脂質、脂肪族基および芳香族基、またはＮＯ、ＮＯ２、ＯＮＯ、およびＯＮＯ２部分を含む化合物が挙げられる。プロドラッグは、一般に、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１７２  １７８，９４９  ９８２（Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編、第５版、１９９５年）およびＤｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、Ｅｌｓｅｌｖｉｅｒ、ニューヨーク  １９８５年）で記載されている方法など公知の方法を用いて調製することができる。
【００５４】
[0065]本明細書では、別段の定めがない限り、「薬学的に許容される塩」という語句には、それだけには限らないが、本発明の組成物中で使用されるＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質中で存在し得る酸性基または塩基性基の塩が含まれる。塩基性の性質を有する、本発明の組成物中に含まれるＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質は、様々な無機酸および有機酸との間で多種多様な塩を形成することができる。このような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するのに使用できる酸は、それだけには限らないが、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１、１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））を含めて、非毒性の酸付加塩（すなわち、薬理学的に許容される陰イオンを含む塩）を形成するものである。アミノ部分を含む、本発明の組成物中に含まれるＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質は、上述の酸の他に、様々なアミノ酸との間で薬学的に許容される塩を形成することができる。酸性の性質を有する、本発明の組成物中に含まれるＥＰＭペプチドまたはその融合タンパク質は、様々な薬理学的に許容される陽イオンとの間で塩基性塩を形成することができる。このような塩の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、特に、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム、および鉄の塩が挙げられる。
【００５５】
[0066]本明細書では、別段の定めがない限り、「薬学的に許容される溶媒和化合物」という用語は、非共有結合性の分子間力によって結合された、化学量論的または非化学量論的量の溶媒をさらに含む本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を意味する。好ましい溶媒は、揮発性、非毒性で、かつ／または極微量でヒトに投与することが許容されているものである。
【００５６】
[0067]本明細書では、「生理的に有効な量」とは、対象に送達されて所望の対症効果または治療効果を与える量を意味する。この量は、各薬物およびその最終的な承認された用量レベルに応じて固有である。
【００５７】
[0068]本明細書では、「粉末」という用語は、易流動性であり、吸入装置中で容易に分散されることができ、続いて、対象に吸入され、その結果、粒子が肺に届いて、肺胞に侵入することが可能になるような、微細に分散された固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、この粉末は、「呼吸に適する」と呼ばれる。好ましくは、平均粒子サイズは、直径約１０ミクロン（μｍ）未満であり、比較的均一なほぼ球形の形状分布を有する。より好ましくは、直径は約７．５μｍ未満であり、最も好ましくは約５．０μｍ未満である。通常、粒径分布は直径が約０．１μｍ〜約５μｍ、特に約０．３μｍ〜５μｍである。
【００５８】
[0069]「プローブ」とは、その用途に応じて、好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または、例えば約６，０００ｎｔほどの間の多様な長さの核酸配列を意味する。プローブは、同一の核酸配列、類似の核酸配列、または相補的核酸配列の検出に使用される。長さがより長いプローブは、通常、天然または組換による供給源から得られ、極めて特異的であり、ハイブリッド形成がオリゴマーよりはるかに遅い。プローブは、１本鎖でも２本鎖でもよく、ＰＣＲ、メンブレンハイブリダイゼーション法、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を示すように設計してもよい。
【００５９】
[0070]本明細書では、「プロモーター」という用語は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼと結合するのに関与するＤＮＡの領域を意味する。
【００６０】
[0071]本明細書では、別段の定めがない限り、「予防上有効な」という用語は、所与の疾患または障害に陥るリスクの低下をもたらす、ＥＰＭペプチドまたはその融合タンパク質、あるいは、薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグの量を意味する。一実施形態では、本発明の組成物が、本明細書で記述する障害に対する遺伝的素因を有する動物、好ましくはヒトに、予防措置として投与される。本発明の別の実施形態では、ＥＰＭペプチドまたはその融合タンパク質、あるいはＥＰＭペプチドまたはその融合タンパク質を含む組成物が、本明細書で開示される障害に対する遺伝的素因を持たない患者に、予防措置として投与される。したがって、本発明の組成物は、１つの疾患または障害を予防すると同時に、別の疾患または障害を治療するのに使用することができる（例えば、良性前立腺肥大症を予防すると同時に、尿失禁を治療する）。
【００６１】
[0072]本明細書では、「組換え」という用語は、遺伝子またはＤＮＡの新しい組合せにより形質転換をされた細胞、組織、または生物を意味する。
【００６２】
[0073]本明細書では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、その標的配列とはハイブリッド形成するが、他の配列とはハイブリッド形成しない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列に応じて変わり、また、様々な状況に応じて変わると考えられる。より長い配列の方が、より短い配列より高温で特異的にハイブリッド形成する。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、その特定の配列の融点温度（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％がその標的配列と平衡状態でハイブリッド形成する（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとでの）温度である。標的配列は一般に過剰に存在しているため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で使用されている。通常、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、一般に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）の場合は少なくとも約３０℃で、より長いプローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドの場合は少なくとも約６０℃である条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して実現してもよい。ストリンジェントな条件は、当業者には既知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６で確認することができる。これらの条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が、通常は互いにハイブリダイズされたままとなるような条件であることが好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、６５℃で、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩濃度の緩衝液中でハイブリダイゼーションを行い、その後に５０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中で１回または複数回洗浄することがある。
【００６３】
[0074]本明細書では、「実質的に低減させる」という用語は、ＥＰＭペプチドがジスルフィド結合を形成する能力を意味する。ジスルフィド結合形成の低減は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第５７７３５６９号で発表されているような生物学的アッセイによって測定される受容体結合の低下として示すことができる。本発明の化合物の活性を実証するのに使用できる他の生物学的アッセイは、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ他（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２９３１〜２９３５頁（ＥＰＯ依存性造血前駆細胞系）；ＱｕｅｌｌｅおよびＷｏｊｃｈｏｗｓｋｉ（１９９１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６０９〜６１４頁（Ｂ６ＳＵｔ．ＥＰ細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化）；Ｄｕｓａｎｔｅｒ−Ｆｏｕｒｔ他（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：１０６７０〜１０６７８頁（ヒトＥＰＯ応答性細胞におけるＥＰＯ受容体のチロシンリン酸化）；Ｑｕｅｌｌｅ他（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７０５５〜１７０６０頁（ＦＤＣ−ＥＲ細胞における細胞質内タンパク質（ｐｐ１００）のチロシンリン酸化）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ他（１９８７年）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５：８５〜９２頁（ヘモグロビンの比色アッセイ）；ＫａｉｈｏおよびＭｉｕｎｏ（１９８５年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：１１７〜１２０頁（２，７−ジアミノフルオレンによるヘモグロビン検出）；Ｐａｔｅｌ他（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１３００〜２１３０２頁（ｃ−ｍｙｂの発現）；Ｗｉｔｔｈｕｈｎ他（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７４：２２７〜２３６頁（ＪＡＫ２の会合およびチロシンリン酸化）；Ｌｅｏｎａｒｄ他（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ  ８２：１０７１〜１０７９頁（ＧＡＴＡ転写因子の発現）；Ａｎｄｏ他（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９５７１〜９５７５頁（サイクリングＤ２およびＤ３によるＧ１／３移行の調節）、ならびにカルシウム流出に開示されている。参照によりこれらの各文献を本明細書に組み込む。
【００６４】
[0075]本明細書では、「対象」という用語は、ヒト、哺乳動物、または動物を意味してよい。治療される対象は、治療を必要とする患者である。
【００６５】
[0076]本明細書では、ターゲティング物、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとは、特定の細胞型［正常な（例えばリンパ球）または異常な（例えば癌細胞）］に特異的に結合し、したがって、Ｔｆ融合タンパク質または化合物（薬物または細胞毒性薬）をその細胞型に特異的に導くのに使用することができる分子を意味する。
【００６６】
[0077]本明細書では、「錠剤」とは、適切な希釈剤とともにまたはそれ無しで薬物物質を含有し、当技術分野で公知の圧縮法または成形法によって調製される、固形の薬剤剤形である。錠剤は、１９世紀の後半から広く使用されており、その人気は続いている。錠剤は、製造業者（例えば、調製が平易であり経済的であること、安定であること、ならびに包装、運送、および調剤の際に便利であること）と患者（例えば、投与量が正確であること、小型であること、携帯性があること、味の刺激が少ないこと、および投与が容易であること）の双方に利点をもたらすため、剤形として依然として人気がある。錠剤の形状は円盤状であることが最も多いが、これらはまた、球形でも、楕円形でも、長方形でも、円柱状でも、三角形でもよい。これらは、含まれる薬物物質の量および所期の投与方法に応じて、サイズおよび重量が大きく異なることがある。これらは、２種の一般的なクラス、すなわち、（１）圧縮錠剤、および（２）成型錠剤または湿製錠剤に分けられる。１種または複数の有効成分または治療成分（すなわち、ＥＰＭペプチドまたはその断片）に加えて、錠剤は、いくつかの不活性物質または添加剤を含有する。このような添加剤の第１のグループには、希釈剤、結合剤、および潤滑剤を含めて、その製剤に十分な圧縮特性を与えるのに寄与する物質が含まれる。このような添加剤の第２のグループは、崩壊剤、着色剤、矯味剤、および甘味剤など、完成した錠剤に付加的な望ましい物理的特徴を与えるのに寄与する。
【００６７】
[0078]本明細書では、別段の定めがない限り、「治療上有効な」という用語は、ある疾患または障害、または少なくとも１種の識別可能なその症状の改善をもたらすことができる、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグの量を意味する。「治療上有効な」とは、必ずしも患者によって識別可能ではない少なくとも１種の測定可能な物理的パラメータの改善をもたらすための、本発明のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグの量を意味する。さらに別の実施形態では、「治療上有効な」という用語は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理的に（例えば、ある物理的パラメータの安定化）、またはその両方によって、ある疾患または障害の進行を抑制するための、ＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグの量を意味する。さらに別の実施形態では、「治療上有効な」という用語は、ある疾患または障害の発症を遅らせる、ＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグの量を意味する。「治療有効量」に相当する融合タンパク質の量は、使用されるＥＰＭペプチド、その病態または疾患の重症度、ならびに治療を受ける対象の年齢および体重に応じて変動すると考えられるが、当業者なら、彼／彼女自身の知識およびこの開示内容を考慮することにより、常法に従って決定することができる。
【００６８】
[0079]本明細書では、「治療用タンパク質」とは、１種または複数の治療活性および／または生物活性を有する、ＥＰＭペプチド、またはその断片もしくは変異体を意味する。ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドという用語は、本明細書では同義的に使用される。さらに、「治療用タンパク質」という用語は、ＥＰＭタンパク質の内在性または天然の相関物を意味してよい。「治療活性」を示すポリペプチド、または「治療的に活性」であるタンパク質とは、ＥＭＰ-１またはＥＰＯに関連した１種または複数の既知の生物活性および／または治療活性を有するＥＰＭペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、ある疾患、病態、または障害を治療、予防、または改善するのに有用なＥＰＭペプチドである。このような疾患、病態、または障害は、ヒトにおけるものでも、ヒト以外の動物、例えば獣医用途におけるものでもよい。
【００６９】
[0080]本明細書では、「形質転換」という用語は、細胞中への核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）の移入を意味する。本明細書では、「遺伝的形質転換」という用語は、細胞中へのＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移入および組込みを意味する。
【００７０】
[0081]本明細書では、「形質転換体」という用語は、形質転換を受けた細胞、組織、または生物を意味する。
【００７１】
[0082]本明細書では、「導入遺伝子」という用語は、その機能を保証する方法で、生物、宿主細胞、またはベクター中に挿入される核酸を意味する。
【００７２】
[0083]本明細書では、「トランスジェニック」という用語は、様々な形質転換法のうちの１つによって、外来遺伝子または改変遺伝子、特に、改変されたＴｆ融合タンパク質をコードする遺伝子を受け取った細胞、細胞培養物、生物、細菌、真菌、動物、植物、および前述したもののうちのいずれかの子孫を意味する。この場合、その外来遺伝子または改変遺伝子は、その外来遺伝子または改変遺伝子を受け取る生物の種と同一種または異なる種に由来するものである。
【００７３】
[0084]「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓまたはｖａｒｉａｎｔ）」とは、参照核酸またはポリペプチドと異なるが、その本質的な諸特性を保持しているポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。通常、変異体は全体的によく類似しており、多くの領域で、参照核酸またはポリペプチドと同一である。本明細書では、「変異体」とは、天然のＥＭＰ−１と配列が異なるが、本明細書の別の場所で記述し、またはそうでなければ当技術分野で知られている、少なくとも１種のその機能特性および/または治療特性を保持している、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のＥＰＭ部分を意味する。
【００７４】
[0085]本明細書では、「ベクター」という用語は、外来性核酸をコードしている任意のプラスミド、ファージミド、またはウイルスを広く意味する。この用語は、例えば、ポリリジン化合物などのような、ビリオンまたは細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド、非ファージミド、および非ウイルス性の化合物を含むとも解釈される。ベクターは、核酸、またはその突然変異体を細胞に運搬するための運搬体として適切なウイルスベクターでよく、または、ベクターは、同じ目的に適した非ウイルスベクターでもよい。細胞および組織にＤＮＡを運搬するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの例は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｍａ他（１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４〜１２７４６頁）で記載されている。ウイルスベクターの例としては、それだけには限らないが、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルスなどが挙げられる（Ｃｒａｎａｇｅ他、１９８６年、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７〜３０６３頁；１９９４年８月１８日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／１７８１０、１９９４年１０月２７日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／２３７４４）。非ウイルスベクターの例としては、それだけには限らないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられる。
【００７５】
[0086]本明細書では、「野生型」という用語は、天然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。
【００７６】
[0087]本明細書では、「野生型ＥＭＰ−１」および「天然のＥＭＰ−１」という用語は、同義的に使用され、以下の配列を有するＥＭＰ−１を意味する。
ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ、  配列番号４。
【００７７】
概要
[0088]本発明は、ＥＰＭペプチド、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを包含する。特定の実施形態では、このＥＰＭペプチドは、ＥＭＰ−１と比べて、より高い血清安定性またはより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期を有する。本発明のＥＰＭペプチドは、ＥＭＰ−１ペプチド配列の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、または置換によって、また、場合によっては、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸への少なくとも１つのリンカー基の付加によって、改変されている。特定の実施形態では、本発明のＥＰＭペプチドは、ＥＭＰ−１と比べて、その構造、活性、および機能を保持しており、また、好ましくは、ＥＭＰ−１と比べて、より高い血清安定性またはより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期を有する。
【００７８】
[0089]一実施形態では、ＥＰＭペプチドは、実質的にジスルフィド結合形成を低減させる、少なくとも１つのシステイン残基に対する第１の改変と、ペプチドがＥＭＰ−１活性を示すようにする第２の改変とを含む。特定の実施形態では、第１の改変は、ＥＭＰ−１ペプチドの構造、活性、および機能を維持しながら、ＥＭＰ−１アミノ酸配列から少なくとも１つのシステインを除去することを含む。別の特定の実施形態では、第１の改変は、以下のアミノ酸、すなわち、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、γカルボキシルグルタミン酸、ヒスチジン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、またはチロシンのうちのいずれか１つによる、少なくとも１つのシステインの置換を含む。別の特定の実施形態では、第１の改変は、少なくとも１つのシステインの保存的置換を含む。別の特定の実施形態では、第１の改変は、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、またはチロシンによる、少なくとも１つのシステインの保存的置換を含む。別の特定の実施形態では、第１の改変は、アスパラギン酸またはγカルボキシルグルタミン酸による、少なくとも１つのシステインの置換を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基が置換されることにより、ペプチドの環状化が可能になる。
【００７９】
[0090]本発明はまた、ＥＭＰ−１ペプチドへの少なくとも１つのリンカー基の付加を含む第２の改変を含むＥＰＭペプチドも包含する。一実施形態では、このリンカーは、ＥＭＰ−１ペプチドのＣ末端アミノ酸に共有結合している。別の実施形態では、このリンカーは、ＥＭＰ−１ペプチドのＮ末端アミノ酸に共有結合している。さらに別の実施形態では、このリンカーは、ＥＭＰ−１ペプチドの内部アミノ酸に共有結合している。さらに別の実施形態では、このリンカーは、ＥＭＰ−１ペプチドのＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸に共有結合している。特定の実施形態では、このリンカーは、アミノ酸リンカーである。下記により詳細に本発明のリンカーを説明する。
【００８０】
[0091]別の実施形態では、第２の改変がない場合、第１の改変がエリスロポエチン受容体へのペプチドの結合を低減させる。別の実施形態では、第２の改変が、エリスロポエチン受容体へのペプチドの検出可能な結合を回復させる。
【００８１】
[0092]別の実施形態では、本発明は、血液学的に異常な障害および疾患状態を治療または予防するのに有用な、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種のＥＰＭペプチド、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを含む医薬組成物を包含する。
【００８２】
[0093]別の実施形態では、本発明は、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種の改変されたＥＰＭペプチド、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを含む医薬組成物を包含する。これらの医薬組成物は、それだけには限らないが、貧血、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠障害および月経障害、未熟児早期貧血、脊髄損傷、急性失血、老化、異常な赤血球新生を伴う新生物性疾患状態、ならびに腎不全を含めて、障害を治療または予防するのに有用である。これらの医薬組成物は、それだけには限らないが、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の異常、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患を含めて、慢性または再発性の疾患を治療または予防するのにも有用である。これらのクラスの疾患のさらなる例示的な例としては、それだけには限らないが、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、およびアルツハイマー病が挙げられる。
【００８３】
[0094]別の実施形態では、本発明は、赤血球の産生を刺激または調節することによって治療または予防することができる障害を治療または予防する方法であって、治療または予防を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種のＥＰＭペプチド、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。
【００８４】
[0095]別の実施形態では、本発明は、貧血、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠障害および月経障害、未熟児早期貧血、脊髄損傷、急性失血、老化、異常な赤血球新生を伴う新生物性疾患状態、ならびに腎不全を治療または予防する方法であって、治療または予防を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種のＥＰＭペプチド、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。
【００８５】
[0096]別の実施形態では、本発明は、それだけには限らないが、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の異常、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、あるいはアルツハイマー病を含めて、慢性または再発性の疾患を治療または予防する方法であって、治療または予防を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種のＥＰＭペプチド、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。
【００８６】
[0097]別の実施形態では、本発明は、「融合タンパク質」を生成させるために第２のペプチドまたはタンパク質に融合された１種または複数のＥＰＭペプチドを包含する。特定の実施形態では、これらの融合タンパク質は、ＥＭＰ-１と比べて、より高い血清安定性またはより長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。特定の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質のＣ末端に融合されている。別の特定の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端に融合されている。別の特定の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのループ中に挿入されている。別の特定の実施形態では、融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のＮドメインの一部分、架橋ペプチド、および第２のペプチドまたはタンパク質のＣドメインの一部分を含み、この場合、架橋ペプチドが、ＥＰＭペプチドを第２のペプチドまたはタンパク質に連結している。別の特定の実施形態では、融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のＮドメインとＣドメインの間に挿入されたＥＰＭペプチドを含む。別の特定の実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質はヒンジ領域を含み、そのヒンジ領域では、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、または付加されている。別の特定の実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は少なくとも１つのループを含み、ＥＰＭペプチドが、第２のペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのループに置き換わる。
【００８７】
[0098]別の実施形態では、本発明は、血液学的に異常な障害および疾患状態を治療または予防するのに有用である、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種の融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを含む医薬組成物を包含する。
【００８８】
[0099]別の実施形態では、本発明は、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種の融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを含む医薬組成物を包含する。これらの医薬組成物は、それだけには限らないが、貧血、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠障害および月経障害、未熟児早期貧血、脊髄損傷、急性失血、老化、異常な赤血球新生を伴う新生物性疾患状態、ならびに腎不全を含めて、障害を治療または予防するのに有用である。これらの医薬組成物は、それだけには限らないが、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の異常、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患を含めて、慢性または再発性の疾患を治療または予防するのにも有用である。これらのクラスの疾患のさらなる例示的な例としては、それだけには限らないが、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、およびアルツハイマー病が挙げられる。
【００８９】
[00100]別の実施形態では、本発明は、赤血球の産生を刺激または調節することによって治療または予防することができる障害を治療または予防する方法であって、治療または予防を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種の融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。
【００９０】
[00101]別の実施形態では、本発明は、貧血、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠障害および月経障害、未熟児早期貧血、脊髄損傷、急性失血、老化、異常な赤血球新生を伴う新生物性疾患状態、ならびに腎不全を治療または予防する方法であって、治療または予防を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種の融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。
【００９１】
[00102]別の実施形態では、本発明は、それだけには限らないが、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の異常、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、あるいはアルツハイマー病を含めて、慢性または再発性の疾患を治療または予防する方法であって、治療または予防を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の少なくとも１種の融合タンパク質、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、水和物、包接化合物、多形体、またはプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。
【００９２】
[00103]別の実施形態では、本発明は、例えば、治療または治療以外の用途に使用でき、さらに、ラベル付きの容器も含む、１種または複数のＥＰＭペプチドまたは融合タンパク質を含むキットを包含する。
【００９３】
ＥＰＭペプチド
[00104]本発明は、エリスロポエチンミメティックペプチド（本明細書では、「ＥＰＭ」、「ＥＰＭペプチド」、または「ＥＰＭタンパク質」と呼ぶ。例えば、米国特許第５７７３５６９号を参照のこと）として機能するＥＭＰ−１ペプチド（「ＥＭＰ−１タンパク質」とも呼ぶ）の改変体または変異体を包含する。例えば、ＥＭＰ−１ペプチドは、エリスロポエチン受容体に結合し、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＴＷＸ７Ｘ８（配列番号３１）（配列中、各アミノ酸を標準的な１文字の略語で示す。すなわち、Ｘ６は、２０種の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸のうちのいずれか１種から独立に選択され、Ｘ３はＣであり、Ｘ４はＲ、Ｈ、Ｌ、またはＷであり、Ｘ５はＭ、Ｆ、またはＩであり、Ｘ７はＤ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ８はＣである）を含む、長さが１０〜４０アミノ酸残基の配列を含んでよい。ＥＰＭペプチドは、ＥＭＰ−１タンパク質の生物活性のほぼ同じものまたはサブセットを保持することができる。したがって、機能を限定されたＥＰＭペプチドを用いて治療することによって、特異的な生物学的効果を引き出すことができる。一実施形態では、天然型ＥＭＰ-１ペプチドの生物活性のサブセットを有するＥＰＭペプチドで対象を治療すると、天然型ＥＭＰ-１ペプチドを用いた治療と比べて、対象に与える副作用がより少なくなる。
【００９４】
[00105]本発明のＥＰＭペプチドまたはタンパク質は、実質的にジスルフィド結合形成を低減させる、少なくとも１つのシステイン残基に対する第１の改変と、ＥＰＭペプチドがＥＭＰ−１活性を示し、またはエリスロポエチンミメティックとして機能するようにする、第２の改変とを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の改変は、その改変が、実質的にシステインのジスルフィド結合形成を低減させ、かつ、ＥＰＭペプチドがなおＥＭＰ−１活性を示すような、同一または単一の改変でよい。
【００９５】
[00106]ＥＭＰ−１様の機能を維持する本発明のＥＰＭペプチドは、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸で置換されている任意の改変を含み、さらに、天然ＥＭＰ−１ペプチドの２つの残基間に追加の１つまたは複数の残基を挿入する可能性、ならびに、天然ＥＭＰ−１ペプチド配列から１つまたは複数の残基を欠失する可能性も含む。どんなアミノ酸置換、挿入、または欠失も、本発明に包含される。好ましい状況では、置換は、本明細書で定義済みの保存的置換である。
【００９６】
[00107]ＥＭＰ−１配列の改変体または変異体は、ＥＭＰ−１ヌクレオチド配列の少なくとも１つの位置に突然変異を起こし、それにより、ＥＭＰ−１ペプチドの機能的能力を変えることなく、コードされたＥＰＭペプチドのアミノ酸配列を変化させることにより、誘導することができる。例えば、不可欠ではないアミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１の配列または当技術分野で既知のプラスミドまたはベクターのＤＮＡ挿入物のＥＭＰ−１ヌクレオチド配列中で行うことができる。
【００９７】
[00108]特定の実施形態では、改変は、ＥＰＭペプチドの構造、活性、および機能が、ＥＭＰ−１と比べて保持されているようなものである。構造、活性、および機能の保持の例としては、それだけには限らないが、ＥＭＰ−１ペプチドに相関したβ−シート構造の安定化、ＥＭＰ−１ペプチドと比べた競合的受容体結合アッセイ、ならびにＥＰＯ応答性細胞におけるリン酸化事象の類似したカスケードおよび細胞周期進行が挙げられる。一実施形態では、ＥＰＭペプチドは、そのＥＰＭペプチドが構造、活性、および機能を保持するような、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を含んでいる。別の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、そのＥＰＭペプチドが構造、活性、および機能を保持することができるような、あるアミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含んでいる。別の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、Ｃ末端アミノ酸、Ｎ末端アミノ酸、もしくはその双方、または内部アミノ酸への１つまたは複数のアミノ酸の付加を含んでいる。別の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、Ｃ末端アミノ酸、Ｎ末端アミノ酸、または内部アミノ酸への１種または複数のリンカー基の付加を含んでいる。本発明の別の実施形態は、ＥＭＰ−１ペプチドと比べて、構造、活性、および機能を保持しまたは向上させている、ＥＰＭペプチド配列の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、または置換によって、あるいは、Ｃ末端アミノ酸、Ｎ末端アミノ酸、またはその双方への少なくとも１つのリンカー基の付加によって改変されたＥＰＭペプチドを包含する。本発明の別の実施形態は、その中のアミノ酸配列がＥＭＰ−１中の配列と比べて逆転しているＥＰＭペプチドを包含する。
【００９８】
[00109]ＥＭＰ−１は、通常、ジスルフィドを形成するシステイン−システイン結合を介して環状化する。一実施形態では、ＥＰＭペプチドは、実質的にジスルフィド結合形成を低減させる、少なくとも１つのシステイン残基に対する第１の改変と、ペプチドがＥＭＰ−１活性を示すようにする第２の改変とを含む。特定の実施形態では、本発明は、実質的にジスルフィド結合形成を低減させる一方で、ＥＰＭの環状化または環化を保存または維持し、かつ、ＥＭＰ−１と比べて治療活性または予防活性を保持しまたは高める、あるアミノ酸によるＥＭＰ−１の１つまたは複数のシステイン残基の置換を含む第１の改変を包含する。システイン残基を置換する一方で、ＥＰＭペプチドの環状化を回復させることができる例示的なアミノ酸としては、それだけには限らないが、ラクトンまたはラクタムを形成するアスパラギン酸が含まれる。別の特定の実施形態では、第１の改変は、ＥＭＰ−１から１つまたは複数のシステイン残基を欠失させて、実質的にジスルフィド結合形成を低減させ、一方で、ペプチドの環化を誘導する第２の改変によって、ＥＭＰ−１の治療活性または予防活性を保持しまたは高めることを含む。
【００９９】
[00110]前述の環化戦略に加えて、他の非ジスルフィドペプチド環化戦略を使用することもできる。このような代替の環化戦略には、例えば、アミド環化戦略、ならびにチオエーテル結合の形成を利用する環化戦略が含まれる。したがって、本発明の化合物は、例えば、分子内アミド結合または分子内チオエーテル結合により環化された形態で存在することができる。
【０１００】
[00111]別の実施形態では、本発明は、１つまたは複数のシステイン残基がＥＭＰ−１から除去され、第２の改変を含むＥＰＭペプチドを包含する。この第２の改変では、リンカーが、Ｃ末端アミノ酸および／またはＮ末端アミノ酸に付加されて、ＥＰＭペプチドの環状化を可能にし、あるいはＥＭＰ−１活性のために必要なペプチドの立体配座を誘導すると同時に、ＥＭＰ−１の治療活性または予防活性を保持しまたは高めている。別の実施形態では、本発明は、リンカーが、ＥＭＰ−１のＣ末端アミノ酸および／またはＮ末端アミノ酸に付加されて、ＥＰＭペプチドの環状化を可能にすると同時に、ＥＭＰ−１の治療活性または予防活性を保持しまたは高めている、ＥＰＭペプチドを包含する。例示的なリンカー基としては、それだけには限らないが、ＥＰＭと第２のペプチドまたはタンパク質など２つの分子を連結し、また、ＥＰＭペプチドが立体障害を最低限しか受けずに第２のペプチドまたはタンパク質と結合できるような好ましい立体配置にそれら２つの分子を配置するのに役立つ、１つの分子または複数の分子からなる基が挙げられる。例えば、第２のペプチドまたはタンパク質に融合しようとするＥＰＭペプチドは、リンカー分子、および当技術分野で既知のリンカー分子長を最適化する技術を用いて、化学的に架橋させることができる。したがって、本発明の融合タンパク質の第２のペプチドまたはタンパク質部分およびＥＰＭペプチドを、直接的に、または様々な長さのリンカーペプチドを用いて融合させて、物理的分離の程度を大きくし、また、融合タンパク質相互間の空間的可動性を高め、それにより、ＥＰＭペプチドの接近容易性、例えば同族受容体に結合するための接近容易性を最大化することができる。リンカーペプチドは、可動性またはより固定性の高いアミノ酸からなるものでよい。例えば、それだけには限らないが、ポリグリシンストレッチなどのリンカーである。リンカーは、約５０、４０、３０、２０、または１０未満のアミノ酸残基でよい。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部分およびＥＰＭペプチドに、また、それらの間に共有結合することができる。
【０１０１】
[00112]標準技術（例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ法による突然変異誘発）によって、ＥＭＰ−１ヌクレオチド配列中に改変または変異を導入することができる。これらの技術を用いて、１つまたは複数のシステイン残基を改変することができる。別の実施形態では、１つまたは複数の必須ではない予想アミノ酸残基の位置で、保存的アミノ酸置換が行われる。すなわち、ＥＭＰ−１中の必須ではない予想アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、（例えば、飽和突然変異誘発もしくは不連続的な点突然変異、またはＥＭＰ−１ペプチドのトランケーションによって）、ＥＭＰ−１コード配列のすべてまたは一部分に無作為に変異を導入することができ、また、得られた突然変異体がＥＭＰ−１生物活性を有するかスクリーニングして、活性を保持している突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、当技術分野で既知の任意の組換え技術によってＥＰＭタンパク質を発現させることができ、そのタンパク質の活性を測定することができる。さらに、当技術分野で既知の化学的技術により、ＥＭＰ−１のポリペプチド配列内に位置するアミノ酸残基間に１つまたは複数の分子内架橋を形成させて、ＥＰＭペプチドを生成させることもできる。あるいは、当技術分野で既知の遺伝子工学技術を用いて、本発明のＥＰＭペプチドを生成させてもよい。一実施形態では、本発明の融合タンパク質中に含まれるＥＰＭペプチドは、本明細書で記述し、またはそうでなければ当技術分野で既知である融合タンパク質技術により、組換えによって作製される。
【０１０２】
[00113]ＥＭＰ−１ペプチド活性について、ＥＭＰ−１ペプチドの突然変異体（例えば、トランケーション突然変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、ＥＰＭペプチドを同定することができる。一実施形態では、ＥＰＭペプチドの多様な（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリーは、核酸レベルでの突然変異誘発を組み合わせることにより作られ、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされている。ＥＰＭペプチドの多様なライブラリーは、例えば、潜在的なＥＰＭペプチド配列の縮重した組が、個々のポリペプチドとして、または、その中にＥＰＭペプチド配列の組を含む（例えば、ファージディスプレイ用の）より大型の融合タンパク質の組として発現され得るように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に結合させることによって、作製することができる。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的なＥＰＭペプチドのライブラリーを作製するのに使用できる様々な方法がある。縮重した遺伝子配列の化学合成は、ＤＮＡ自動合成機で実施することができ、その後、その合成遺伝子を適切な発現ベクター中に連結する。遺伝子の縮重した組を使用することによって、潜在的なＥＰＭペプチド配列の所望の組をコードする配列のすべてを１つの混合物中で提供することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９：３頁；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、５３：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８：１０５６頁；Ｉｋｅ他（１９８３年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１：４７７頁を参照のこと）。
【０１０３】
[00114]さらに、（１）第２のペプチドまたはタンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはその生物活性を有する部分とのタンパク質−タンパク質相互作用を起こす能力、（２）ＥＰＭペプチドとエリスロポエチン受容体の間の複合体形成、（３）別のタンパク質へのＥＰＭペプチドの結合能力についてＥＰＭペプチドを分析することができる。
【０１０４】
本発明の第２のタンパク質およびペプチド
[00115]本発明は、第２のペプチドまたはタンパク質に融合されまたはその中に挿入された１種または複数のＥＰＭペプチドまたはその断片を含む融合タンパク質を包含する。本発明の融合タンパク質を作製するのに、どんな第２のペプチドまたはタンパク質を使用してもよい。一実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、ＥＰＭタンパク質に実質的に相同なタンパク質（例えば、ＥＰＭタンパク質と同じタンパク質、または同一もしくは異なる生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。別の実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、ＥＰＭタンパク質に実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＥＰＭタンパク質と異なるタンパク質、または同一もしくは異なる生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
【０１０５】
[00116]一実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、１種または複数のＥＰＭペプチドであり、これらは２量体や３量体などを形成する。別の実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、ＥＰＭペプチドではない。本発明の融合タンパク質を形成することができる例示的な第２のペプチドまたはタンパク質としては、それだけには限らないが、１種または複数のＥＰＭペプチド、アルブミン、トランスフェリン（「Ｔｆ」）、メラノトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、あるいはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）が挙げられる。
【０１０６】
[00117]しかし、本発明の融合タンパク質は、任意の第２のペプチドまたはタンパク質、あるいは、その断片、ドメイン、または人工的に作られたドメインを用いて生成させることができる。例えば、天然の第２のペプチドまたはタンパク質のシグナル配列を用いてまたは用いずに、完全長の第２のペプチドまたはタンパク質配列（例えば、Ｔｆ配列）を使用して、融合タンパク質を作製することができる（例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、２００２年８月３０日に出願された米国特許出願第１０/２３１４９４号を参照のこと）。単一のＮドメインまたはＣドメインなど単一の第２のペプチドまたはタンパク質ドメイン、あるいは２つのＮドメインもしくは２つのＣドメインを含む改変型の第２のペプチドもしくはタンパク質を用いて、融合タンパク質を作製することもできる（例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、２００２年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／４０６９７７号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、グリコシル化を低減、抑制、または防止するように改変された単一のＣドメインにＥＰＭペプチドが融合した融合物が作製される。別の実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質のグリコシル化部位は、それ自体のＣドメインおよびＮドメイン中に存在しているため、単一のＮドメインを使用すると有利である。高レベルで発現される、単一のＮドメインを有する本発明の融合タンパク質の例示的な実施形態。
【０１０７】
[00118]別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の第２のペプチド部分は、スプライス変異体（例えば、トランスフェリンスプライス変異体、メラノトランスフェリンスプライス変異体、ラクトフェリンスプライス変異体）を含む。例示的な実施形態では、スプライス変異体は、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体でよい。特定の一実施形態では、ヒトトランスフェリンスプライス変異体は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号ＡＡＡ６１１４０のものでよい。別の例示的な実施形態では、第２のペプチドスプライス変異体は、好中球ラクトフェリンの新規なスプライス変異体でよい。特定の実施形態では、この好中球ラクトフェリンスプライス変異体は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号ＡＡＡ５９４７９のものでよい。別の特定の実施形態では、この好中球ラクトフェリンスプライス変異体は、スプライスが異なる新規な領域を含む以下のアミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号５）を含んでよい。
【０１０８】
本発明のリンカー
[00119]一実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーは、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する。すなわち、a）特に、第２のタンパク質から空間的に離れさせることによって、溶媒へのペプチドの効果的な提示を確実にすること、例えば、ＥＰＭペプチドアミノ酸配列および第２のペプチドまたはタンパク質アミノ酸配列が互いに対して回転することを可能にできること、ｂ）必要な場合は、プロテアーゼによる消化に対して耐性であること、ならびにｃ）ＥＰＭまたは第２のペプチドもしくはタンパク質と有害な相互作用を起こさないことである。
【０１０９】
[00120]好ましい実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、そのペプチドリンカーのアミノ酸長は、５〜６０、好ましくは１０〜３０である。ペプチドリンカーのアミノ酸長は２０であり、ペプチドリンカーのアミノ酸長は１７であり、ペプチドリンカー中のアミノ酸はそれぞれ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒエレメントを含む。
【０１１０】
[00121]他の好ましい実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、そのペプチドリンカーは、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ（式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である）で表される配列（配列番号２２）を含む。好ましくは、ペプチドリンカーは、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）３で表される配列（配列番号２３）を含む。好ましくは、ペプチドリンカーは、式（（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）で表される配列（配列番号２４）を含む。
【０１１１】
[00122]好ましい実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、そのペプチドリンカーは、式（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｙ（式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である）で表される配列（配列番号２５）を含む。好ましくは、ペプチドリンカーは、式（（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）で表される配列（配列番号２６）を含む。
【０１１２】
[00123]好ましい実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、そのペプチドリンカーは、式（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）ｙ（式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である）で表される配列（配列番号３２）を含む。
【０１１３】
[00124]好ましい実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、そのペプチドリンカーは、式Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒで表される、免疫グロブリンのヒンジ領域から誘導された配列（配列番号３４）を含む。さらに好ましい実施形態では、Ｃｙｓ残基が、Ｓｅｒなど他のアミノ酸に変えられる。
【０１１４】
[00125]他の好ましい実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、そのペプチドリンカーは、ポリグリシンストレッチである。
【０１１５】
ＥＰＭペプチド融合タンパク質
[00126]本発明は、より高い血清安定性およびより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期を有する融合タンパク質を生成させるために第２のタンパク質またはペプチドに融合された１種または複数のＥＰＭペプチドを包含する。ＥＰＭペプチドを作製し、それにより本発明の融合タンパク質を作製するために、どんなＥＰＭペプチド配列を使用してもよい。次に、これらの配列を第２のタンパク質またはペプチドのループ中に挿入して、融合タンパク質のＥＰＭ領域に３次構造を与えることができる。本発明は、それだけには限らないが、本明細書で記述するものなどＥＰＯに関連づけられている様々な疾患および病態を治療するために融合タンパク質を使用することを包含する。さらに、この融合タンパク質は、第２のタンパク質またはペプチドに融合されていないＥＭＰ−１と比べて、より高い血清安定性およびより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期を有する。
【０１１６】
[00127]本発明の方法および組成物によれば、どんなＥＰＭペプチド物も、第２のペプチドまたはタンパク質に対する融合相手として使用することができる。ＥＰＭペプチドは、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで有益な生物学的効果を発揮できるＥＰＭ−１の改変体（例えば、Ｃ末端の欠失または置換）であり、正常なホメオスタシス、生理機能、または疾患状態に対して有益な効果を発揮するタンパク質またはペプチドを含む。例えば、疾患状態に関係のある有益な効果としては、治療対象に有益な効果を生み出すための、疾患予防、疾患の安定化、疾患症状の緩和もしくは軽減、または潜在的な異常の調節、軽減、もしくは治癒を含めて、治療対象に有利な任意の効果が挙げられる。
【０１１７】
[00128]特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、例えば、遺伝子融合によって互いに結合している、ＥＰＭタンパク質の少なくとも１つの断片または変異体、および第２のペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの断片または変異体を含む。
【０１１８】
[00129]本発明の融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質に融合されたＥＰＭペプチドの１つまたは複数のコピーを含んでよい。特定の実施形態では、ＥＰＭ融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドの生体活性を有する少なくとも１つの部分を含む。別の特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドの生体活性を有する少なくとも２つの部分を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドの生体活性を有する少なくとも３つの部分を含む。ＥＰＭペプチドの融合は、それだけには限らないが、第２のペプチドまたはタンパク質の内部の位置、Ｎ末端、および／またはＣ末端を含めて、第２のペプチドまたはタンパク質のどの位置で起こってもよい。いくつかの実施形態では、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端とＣ末端の双方に結合しており、また、融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質の片方または双方の端に１種または複数のＥＰＭペプチドの等価物を含んでよい。別の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質の既知のドメイン中に、例えば、第２のペプチドまたはタンパク質の１つまたは複数のループ中に挿入される（例えば、Ａｌｉ他（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３頁を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ＥＰＭが結合する受容体またはターゲティング分子に対する親和性が高まった多価分子を作製するために、第２のペプチドまたはタンパク質のループのすべてにＥＰＭペプチドを挿入してよい。別の実施形態では、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質のＮドメインとＣドメインの間に挿入される。別法として、ＥＰＭペプチドは、第２のペプチドまたはタンパク質中の任意の場所に挿入または融合される。
【０１１９】
[00130]別の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸が、アミノ末端とカルボキシ末端の双方から除去され得るＥＰＭペプチド部分を含む。
【０１２０】
[00131]別の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で示す参照ＥＭＰ−１、またはその断片との同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％であるＥＰＭペプチド部分を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、前述したＮ末端およびＣ末端に欠失を含むアミノ酸配列を有する参照ＥＭＰ−１との同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％であるＥＰＭペプチド部分を含む。しかし、ＥＰＭペプチドは、ＥＭＰ−２０ではない。
【０１２１】
[00132]タンパク質のＮ末端から１つまたは複数のアミノ酸が欠失することにより、ＥＰＭペプチド部分の１種または複数の生物学的機能が変えられまたは失われる場合でも、他の治療活性および／または機能的活性（例えば、生物活性、多量体化する能力、リガンド結合能）が、なお保持されていることがある。例えば、Ｎ末端欠失を有するＥＰＭペプチドが、ＥＰＭペプチドの完全体または成熟型を認識する抗体を誘導し、かつ／またはそれらに結合する能力は、天然のＥＭＰ−１の残基の大多数に満たない部分しかＮ末端から除去されない場合は、一般に、保持されると考えられる。天然ＥＭＰ−１のＮ末端残基を欠く個々のＥＰＭペプチドがこのような免疫活性を保持しているかどうかは、本明細書で記述し、そうでなければ当技術分野で既知の常法によって分析することができる。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失した突然変異体は、おそらくは、いくつかの生物活性および免疫原活性を保持していないと考えられる。実際に、わずか６個のアミノ酸残基から構成されるペプチドが、免疫応答を誘発することがしばしばある。
【０１２２】
[00133]先にも述べたように、ＥＰＭペプチドのＮ末端またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸が欠失することにより、タンパク質の１種または複数の生物学的機能が変えられまたは失われる場合でも、他の機能的活性（例えば、生物活性、多量体化する能力、リガンド結合能）および／または治療活性が、なお保持されていることがある。例えば、Ｃ末端欠失を有するＥＰＭペプチドが、ＥＰＭペプチドの完全体または成熟型を認識する抗体を誘導し、かつ／またはそれらに結合する能力は、完全体または成熟型のポリペプチドの残基の大多数に満たない部分しかＣ末端から除去されない場合は、一般に、保持されると考えられる。天然ＥＭＰ−１のＮ末端残基および／またはＣ末端残基を欠く個々のＥＰＭペプチドが治療活性を保持しているかどうかは、本明細書で記述し、かつ／またはそうでなければ当技術分野で既知の常法によって容易に決定することができる。
【０１２３】
[00134]ＥＰＭペプチドのペプチド断片は、ＥＰＭペプチドのペプチド配列の治療活性および／または機能的活性（例えば生物活性）を示すアミノ酸配列であって、そのＥＰＭペプチドの断片であるアミノ酸配列を含み、あるいはそれらからなる断片でよい。
【０１２４】
[00135]ＥＰＭペプチドのペプチド断片は、タンパク質のＮ末端およびＣ末端のみを含んでよく、すなわち、ＥＰＭペプチドの中央の部分が欠失していてよい。あるいは、ＥＰＭペプチド断片は、ＥＭＰ−１ペプチドの中央部分の非隣接部分および／または隣接部分を含んでもよい。
【０１２５】
[00136]通常、本発明の融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質に由来する１つの領域と、１つのＥＰＭペプチド領域を有するものでよい。しかし、各タンパク質の複数の領域を用いて、本発明の融合タンパク質を作製してもよい。同様に、複数のＥＰＭペプチドを用いて、本発明の融合タンパク質を作製し、それにより、多機能性の改変された融合タンパク質を作製してもよい。
【０１２６】
[00137]別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端に融合されたＥＰＭペプチドを含む。ある代替実施形態では、本発明の融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のＣ末端に融合されたＥＰＭペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドのＮ末端に融合された第２のペプチドまたはタンパク質を含む。ある代替実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドのＣ末端に融合された第２のペプチドまたはタンパク質を含む。
【０１２７】
[00138]別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端およびＣ末端の双方に融合されたＥＰＭペプチドを含む。別の実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端が、同じＥＰＭペプチドと結合する。ある代替実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合されているＥＰＭペプチドは、様々なＥＰＭペプチド物である。別の代替実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合されたＥＰＭペプチドが、同じ疾患、障害、または病態を治療または予防するのに使用できる様々なＥＰＭペプチド物と結合する。別の実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合されたＥＰＭペプチド物は、一般に患者に同時に起こることが当技術分野で知られている様々な疾患または障害を治療または予防するのに使用できる様々なＥＰＭペプチドである。
【０１２８】
[00139]ＥＰＭペプチド部分が第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端領域および／またはＣ末端領域に融合されている本発明の融合タンパク質に加えて、本発明の融合タンパク質は、ＥＰＭペプチド（例えば、本明細書で開示するＥＰＭペプチド、またはその断片もしくは変異体）を第２のペプチドまたはタンパク質の内部領域に挿入することによって作製することもできる。第２のペプチドまたはタンパク質の内部領域としては、それだけには限らないが、鉄結合部位、ヒンジ領域、重炭酸結合部位、または受容体結合ドメインが挙げられる。
【０１２９】
[00140]第２のペプチドまたはタンパク質のタンパク質配列内部には、ジスルフィド結合によって安定化されたいくつかのループまたはターンが存在することがある。これらのループは、１種または複数のＥＰＭペプチド、あるいは治療上有効なペプチド、特に機能的になるため、または特異的な生物活性を有する改変されたトランスフェリン分子を生成させるための２次構造を必要とするものの挿入または内部融合に有用である。特定の実施形態では、ＥＰＭペプチドのＣ残基が、第２のペプチドまたはタンパク質ループ中への挿入または融合を促進できる保存的アミノ酸置換基で置換される。別の特定の実施形態では、ＥＰＭペプチドのＣ残基が、保存的アミノ酸置換基で置換され、第２のペプチドまたはタンパク質ループ中への挿入または融合を促進できるリンカーが付加される。別の特定の実施形態では、ＥＰＭペプチドのＣ残基は保存され、第２のペプチドまたはタンパク質ループ中への挿入または融合を促進できるリンカーが付加される。さらに、第２のペプチドまたはタンパク質のＣ末端またはＮ末端が、例えばジスルフィド結合によって、より深く埋もれ保護されているようである場合は、本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＭペプチドを第２のペプチドまたはタンパク質から離すために、例えば、ポリグリシンストレッチなどのリンカーまたはスペーサー部分をＣ末端またはＮ末端で使用してよい。別の実施形態では、Ｃ末端またはＮ末端のジスルフィド結合を除去して、Ｃ末端またはＮ末端を解放してもよい。
【０１３０】
[00141]第２のペプチドまたはタンパク質（例えばＴｆ分子）の少なくとも１つのループ中にＥＰＭペプチド物を挿入し、またはＥＰＭペプチド物でそれを置換する際は、第２のペプチドまたはタンパク質の他の領域に加えて、表面にさらされたループ領域のうちのいずれかの内部に挿入を行ってよい。例えば、Ｔｆアミノ酸の３２〜３３、７４〜７５、２５６〜２５７、２７９〜２８０、および２８８〜２８９を含むループ内部に挿入を行ってよい（Ａｌｉ他、前掲書）。先に説明したように、本明細書で記述した鉄および重炭酸結合部位、ヒンジ領域、ならびに受容体結合ドメインなど第２のペプチドまたはタンパク質の他の領域内部に挿入を行ってもよい。ランダムペプチド挿入物のスクリーニング可能なライブラリーを作るために、ＥＰＭペプチドの挿入に対して改変／置換を受けやすい第２のペプチドまたはタンパク質配列中のループを使用してもよい。第２のペプチドまたはタンパク質ドメイン中へのクローニングおよび／あるいは第２のペプチドまたはタンパク質の末端への融合を行う前に、入手可能なファージディスプレイ系およびバクテリアディスプレイ系を含めて、任意の手順を使用して、ペプチドライブラリーを作るための核酸挿入物を作製してよい。
【０１３１】
[00142]第２のペプチドまたはタンパク質のＣ末端またはＮ末端が自由な状態で、Ｃ末端またはＮ末端上のＥＰＭペプチドの分子融合物の本体から離れた方向を向いている場合が、好ましい実施形態となり得る。このような融合物は、それだけには限らないが、ＥＰＭペプチドを第２のペプチドまたはタンパク質から離れさせるポリグリシンストレッチなどのリンカー領域を含んでよい。
【０１３２】
[00143]例えば、一実施形態では、タンパク質は、目的の活性に関与していることが知られている第２のタンパク質の細胞外ドメインに作動可能に連結したＥＰＭペプチドドメインを含む。このような融合タンパク質は、ＥＰＭペプチド活性を調節する化合物のスクリーニングアッセイにもさらに利用することができる。
[00144]別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＥＰＭペプチドである。いくつかの宿主細胞（例えば、哺乳動物の宿主細胞）では、異種シグナル配列の使用によって、ＥＰＭペプチドの発現および／または分泌を増大させることができる。
【０１３３】
[00145]本発明のＥＰＭペプチド融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。例えば、様々なＥＰＭペプチド配列をコードしているＤＮＡ断片は、従来の技術によって（例えば、連結用の平滑末端または付着末端の使用、適切な末端を得るための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の平滑化、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結によって）、インフレームで相互に連結される。別の実施形態では、ＤＮＡ自動合成機を含めて、従来の技術により、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、後でアニールおよび再増幅してキメラの遺伝子配列を生じさせることができる２つの連続的な遺伝子断片の間に相補的な突出を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施することもできる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照のこと。さらに、予め融合タンパク質をコードしている多くの発現ベクターも、市販されている（例えばＧＳＴポリペプチド）。ＥＰＭペプチドをコードする核酸をこのような発現ベクター中にクローニングして、第２のペプチドまたはタンパク質がＥＰＭペプチドにインフレームで連結されるようにすることができる。
【０１３４】
ＥＰＭペプチド／トランスフェリン融合タンパク質
[00146]本発明のある例示的な実施形態では、融合タンパク質は、ヒトトランスフェリン（「Ｔｆ」）を含むが、ヒトＴｆ変異体、雌牛、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、ならびにその他のウシ亜科、イヌ科、および鳥類の種を含めて、任意の動物のＴｆ分子を、本発明の融合タンパク質を作製するのに使用してよい。これらのＴｆ配列はすべて、ジェンバンクおよび他の公的データベースから容易に入手できる。ヒトＴｆヌクレオチド配列は、入手可能であり（配列番号１、２および３を参照のこと。前述のアクセッション番号は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で入手可能である）、ＴｆまたはＴｆのドメインとＥＰＭペプチドとの遺伝的融合物を作製するのに使用できる。ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）（ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００２３４３）やメラノトランスフェリン（ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０１３９００、マウスメラノトランスフェリン）などの関連分子から融合物を作製してもよい。
【０１３５】
[00147]例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、遺伝子重複により生じると思われる２つの主要なドメイン、すなわちＮローブ（約３３０個のアミノ酸）およびＣローブ（約３４０個のアミノ酸）を有する、６７９個のアミノ酸からなる約７５ｋＤａのタンパク質（グリコシル化は計上していない）である。すべてその全体を参照により本明細書に組み込むジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１０６３、ＸＭ＿００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ＿０３９８４５、ＸＭ＿０３９８４７、およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ならびに配列番号１、２および３を参照のこと。これら２つのローブは、時間を経て分かれたが、かなりの程度の同一性／類似性を保持している（図１）。
【０１３６】
[00148]ＮローブおよびＣローブはそれぞれ、２つのサブドメイン、すなわちＮ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２にさらに分けられる。Ｔｆの機能は、体の細胞に鉄を輸送することである。このプロセスは、すべての細胞、特に活発に増殖している細胞上で発現されているＴｆ受容体（「ＴｆＲ」）によって媒介されている。ＴｆＲがＴｆの鉄結合型（受容体１つ当たり、２分子が結合される）を認識し、次いでエンドサイトーシスが起こり、それによってＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームに輸送され、その場所ではｐＨが局在的に低下するため、結合されていた鉄が遊離され、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体の細胞表面へのリサイクリングが起こり、Ｔｆ（鉄非結合型のアポＴｆとして知られている）が遊離される。受容体結合は、ＴｆのＣドメインを介している。グリコシル化されていない鉄結合型Ｔｆでも受容体と結合することから、Ｃドメイン中の２つのグリコシル化部位は、受容体結合に関与していないようである。
【０１３７】
[00149]各Ｔｆ分子は、２つの鉄イオン（Ｆｅ３＋）を運ぶことができる。これらは、Ｎ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２のサブドメイン間の空間で複合体を形成しており、これにより、分子の立体配座の変化が生じる。Ｔｆは、Ｔｆ受容体を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。
【０１３８】
[00150]ヒトトランスフェリンでは、鉄結合部位は、配列番号３のアミノ酸Ａｓｐ６３（天然のＴｆシグナル配列を含む配列番号２のＡｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４または５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）、およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）を少なくとも含む。ヒンジ領域は、配列番号３のＮローブアミノ酸残基の９４〜９６、２４５〜２４７、および／または３１６〜３１８、ならびにＣローブアミノ酸残基の４２５〜４２７、５８１〜５８２、および／または６５２〜６５８を少なくとも含む。炭酸結合部位は、配列番号３のアミノ酸Ｔｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）、およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧｌｙ４７８）を少なくとも含む。
【０１３９】
[00151]Ｎ様のドメインとして機能するように改変されたＣ末端ドメインまたはローブは、天然または野生型のＮドメインまたはローブと実質的に類似したグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変されている。例示的な実施形態では、Ｃドメインまたはローブは、関連性のあるＣドメイン領域またはアミノ酸を天然または野生型のＮドメインの対応する領域または部位に存在するものに置換することによって、グリコシル化されず、鉄と結合しないように改変される。
【０１４０】
[00152]２つのＮドメインまたはローブを含むＴｆ部分は、天然または野生型のＮドメインまたはローブで、あるいは改変されたＮドメインまたはローブで、天然のＣドメインまたはローブを置き換えるように改変され、あるいは、野生型または改変されたＮドメインと実質上同様に機能するように改変されているＣドメインを有する、Ｔｆ分子を含む。
【０１４１】
[00153]２つのドメインのオーバーレイ（Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  ３．７ｂ２、繰り返しマジックフィット（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ））およびアミノ酸の直接アライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアラインメント）による２つのドメインの分析から、これら２つのドメインは時間を経て分かれたことが明らかになっている。２つのドメイン間のアミノ酸アラインメントの同一性は４２％であり、類似性は５９％である。しかし、構造的等価性については、Ｎドメインの約８０％がＣドメインと一致している。Ｃドメインはまた、Ｎドメインと比べると、いくつかの余分なジスルフィド結合を有している。
【０１４２】
[00154]分子モデルのＮドメインおよびＣドメインのアライメントから、以下の構造的等価性が明らかになっている。
【０１４３】
【表１】
2007512001.tif 000002
【０１４４】
２つのドメインのジスルフィド結合は、以下のように並んでいる。
【０１４５】
【表２】
2007512001.tif 000003
【０１４６】
[00155]本発明の例示的な実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質はトランスフェリンである。トランスフェリンは、ＥＰＭペプチドの半減期または生物学的利用能を増大させ、かつ、一部の場合では、ＥＰＭペプチドを細胞内部へ、かつ／または血液脳関門を越えて送達させるためのキャリアタンパク質として機能することができる。ある代替実施形態では、融合タンパク質は、血液脳関門を通過する能力を保持していない改変されたトランスフェリン分子を含む。
【０１４７】
[00156]一実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む。
【０１４８】
[00157]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、およびＨｉｓ２４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含み、備え、またはそれらからなる。
【０１４９】
[00158]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリンのＮ末端ローブ突然変異体を含む。
【０１５０】
[00159]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、備え、またはそれらからなる。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含む。
【０１５１】
[00160]別の実施形態では、Ｃ末端ローブ突然変異体は、グリコシル化を起こさせない、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうちの少なくとも１つの変異をさらに含む。
【０１５２】
[00161]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、例えば、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５など少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、その際、この突然変異体は金属結合能を保持している。ある代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、その際、この突然変異体の金属結合能は低減されている。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、その際、この突然変異体は金属結合能を保持しておらず、実質上Ｎドメインと同様に機能する。
【０１５３】
[00162]いくつかの実施形態では、ＴｆまたはＴｆ部分は、融合されていない状態のＥＰＭペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期、血清安定性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの溶液安定性、または生物学的利用能と比べて、ＥＰＭペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期、血清安定性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの溶液安定性、または生物学的利用能を増大させるのに十分な長さのものとする。このような安定性、血清半減期、または生物学的利用能の増大は、融合されていないＥＰＭペプチドより約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増えていることがある。いくつかの場合では、改変されたトランスフェリンを含む融合タンパク質は、約１０〜２０日以上、約１２〜１８日、または約１４〜１７日の血清半減期を示す。
【０１５４】
[00163]ＴｆのＣドメインが融合タンパク質の一部分であるとき、２つのＮ結合グリコシル化部位、すなわち配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に対応するアミノ酸残基を、グリコシル化または過剰なマンノシル化を防ぎ、融合タンパク質および／またはＥＰＭペプチドの血清半減期を延ばすために酵母系で発現させるために突然変異させてよい。Ｎ４１３およびＮ６１１に対応するＴｆアミノ酸に加えて、グリコシル化を防ぎ、または実質上低減させるために、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基に突然変異を起こしてもよい。（例えば、ＰＣＴ  ＵＳ０２／２７６３７およびＦｕｎｋ他の米国特許第５９８６０６７号を参照のこと。どちらも、その全体を参照により本明細書に組み込む）。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現されたＴｆのＮドメインは、Ｓ３２で単一のヘキソースによってＯ結合グリコシル化され、これも、そのようなグリコシル化を防ぐように変異させまたは改変することができることも報告されている。
【０１５５】
[00164]したがって、本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、それだけには限らないが、Ｔｆのアシアロ型、モノシアロ型、およびジシアロ型を含めて、グリコシル化の低減を示す改変されたトランスフェリン分子を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐように変異させた組換えトランスフェリン突然変異体を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化された組換えトランスフェリン突然変異体を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうちの少なくとも１つが、グリコシル化を起こさせないアミノ酸に変えられている、グリコシル化を防ぐように変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぎ、または実質上低減させるように変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、その際、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基に突然変異を起こしてもよい。さらに、セリンまたはトレオニン残基を変えることによっても、グリコシル化を低減し、または防ぐことができる。さらに、Ｘをプロリンに変えることも、グリコシル化を抑制することが知られている。
【０１５６】
[00165]以下でより詳細に論じるように、本発明の融合タンパク質は、鉄と結合しないように、かつ／またはＴｆ受容体と結合するように人工的に設計することもできる。本発明の別の実施形態では、鉄結合が保持され、また、Ｔｆの鉄結合能力を使用して、細胞の内部へ、上皮または内皮の細胞膜を通過して、かつ／またはＢＢＢを通過してＥＰＭペプチドを送達させることができる。鉄および／またはＴｆ受容体と結合するこれらの実施形態は、しばしば、ＥＰＭペプチドの血清半減期を延ばすためにグリコシル化を低減させまたは防ぐように人工的に設計される。鉄が結合すると、ＮドメインだけがＴｆＲに結合せず、鉄が結合したＣドメインはＴｆＲと結合するが、分子全体と同じ親和性では結合しない。
【０１５７】
[00166]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、金属イオン結合能を保持していない。ある代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンより金属イオンに対する結合親和性が弱い。ある代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンより金属イオンに対する結合親和性が強い。
【０１５８】
[00167]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、トランスフェリン受容体への結合能を保持していない。ある代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりトランスフェリン受容体に対する結合親和性が弱い。別の代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりトランスフェリン受容体に対する結合親和性が強い。
【０１５９】
[00168]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、炭酸イオンへの結合能を保持していない。ある代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンより炭酸イオンに対する結合親和性が弱い。別の代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンより炭酸イオンに対する結合親和性が強い。
【０１６０】
[00169]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇ１ｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は金属イオン結合能を保持している。ある代替実施形態では、組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇ１ｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有し、この突然変異体は金属イオン結合能が低減されている。別の実施形態では、組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有し、この突然変異体は金属イオン結合能を保持していない。
【０１６１】
[00170]別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型ヒト血清トランスフェリンより金属イオンに対する結合親和性が強い。（その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第５９８６０６７号を参照のこと）。ある代替実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、野生型ヒト血清トランスフェリンより金属イオンに対する結合親和性が弱い。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、この突然変異体は、金属イオンと結合しない。
【０１６２】
[00171]配列番号３のＴｆＮドメイン残基のＡｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、ならびに／あるいはＣドメイン残基のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、および／またはＨｉｓ５８５のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基に対する欠失、置換、または挿入を含めて、変異によって、鉄結合および／または受容体結合を低減させ、または妨害することができる。配列番号３のアミノ酸Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、またはＡｒｇ６３２に変異を起こすことによっても、鉄結合に影響を及ぼすことができる。配列番号３のＴｆＮドメイン残基のＴｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａ１ａ１２６、Ｇｌｙ１２７、ならびに／あるいはＣドメイン残基のＴｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８、および／またはＧｌｙ４５９のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基に対する欠失、置換、または挿入を含めて、変異によって、炭酸結合を低減させ、または妨害することができる。炭酸結合の低減または妨害は、鉄および／または受容体の結合に悪影響を及ぼすことがある。
【０１６３】
[00172]鉄結合を担う前述のＴｆＮドメイン残基のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基に対する欠失、置換、または挿入を含めて、変異によって、Ｔｆ受容体への結合を低減させ、または妨害することができる。
【０１６４】
[00173]上で論じたように、Ｃドメイン残基のＮ４１３および／またはＮ６１１に対応するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位周辺のＴｆＣドメイン残基のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基に対する欠失、置換、または挿入を含めて、変異によって、グリコシル化を低減させまたは防ぐことができる（例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許第５９８６０６７号を参照のこと）。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１をＧｌｕ残基に変えてよい。
【０１６５】
[00174]本発明の融合タンパク質が、グリコシル化、鉄結合、炭酸結合および／または受容体結合を防ぐように改変されていない場合は、グリコシル化部位、鉄および／または炭酸イオンを融合タンパク質から剥ぎ取り、または切り取ってよい。例えば、入手可能なデグリコシラーゼを使用して、グリコシル化残基、特にＴｆ部分に結合した糖残基を融合タンパク質から切断してもよく、グリコシル化酵素を欠損した酵母を使用してグリコシル化を防いでもよく、かつ／またはグリコシル化を防ぐ作用物質、例えばツニカマイシンの存在下で組換え細胞を培養してもよい。
【０１６６】
[00175]融合タンパク質上の糖質も、融合タンパク質をデグリコシラーゼで処理することによって、酵素的に減らし、または完全に除去することができる。デグリコシラーゼは、当技術分野では公知である。デグリコシラーゼの例としては、それだけには限らないが、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、およびエンドＨデグリコシラーゼが挙げられる。
【０１６７】
[00176]それでもなお、ある種の状況では、融合タンパク質のＴｆ部分が完全にグリコシル化されていることが経口送達に好ましいことがある。
【０１６８】
[00177]鉄結合およびＴｆ受容体認識のために必要な立体配座変化を防ぐためにヒンジ領域を改変するなど、Ｔｆの３次元構造を改変するために、追加の変異をＴｆに加えてよい。例えば、Ｎドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７、および／または３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２、および／または６５２〜６５８中またはその周辺に変異を加えてよい。さらに、Ｔｆの構造および機能を改変するために、これらの部位のフランキング領域中またはその周辺に変異を加えてよい。
【０１６９】
[00178]別の実施形態では、融合タンパク質は、トランスフェリン受容体に結合し、細胞内部へＥＰＭペプチドを輸送する能力を保持している、改変されたトランスフェリン分子を含む。ある代替実施形態では、融合タンパク質は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持していないが、細胞内部へＥＰＭペプチドを輸送する能力は維持している、改変されたトランスフェリン分子を含む。
【０１７０】
[00179]別の実施形態では、融合タンパク質は、トランスフェリン受容体に結合し、細胞内部へＥＰＭペプチドを輸送する能力を保持し、かつ、血液脳関門を通過する能力を保持している、改変されたトランスフェリン分子を含む。ある代替実施形態では、融合タンパク質は、血液脳関門を通過する能力を保持しているが、トランスフェリン受容体に結合し、細胞内部へＥＰＭペプチドを輸送する能力を保持していない、改変されたトランスフェリン分子を含む。
【０１７１】
ＥＰＭペプチド/アルブミン融合タンパク質
[00180]それだけには限らないが、一般に利用可能な分子技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年で開示されているものを含めて、任意の利用可能な技術を使用して本発明の融合タンパク質を作製してよい。当技術分野で公知の、部位特異的な突然変異誘発を実現するための技術を用いてヌクレオチド置換を実施するとき、コードされているアミノ酸の変化は、軽度のもの、すなわち、保存的アミノ酸置換であることが好ましいが、特に、融合タンパク質の改変されたトラスフェリン部分、例えば、グリコシル化の低減、鉄結合の低減などを示す改変されたＴｆタンパク質を作製する際は、他の非保存的置換も同様に企図される。詳細には、通常１〜約３０個のアミノ酸置換、アミノ酸の小規模な欠失または挿入；トランスフェリンドメイン間の挿入；アミノ末端メチオニン残基など、小規模なアミノまたはカルボキシル末端の伸長、あるいは、トランスフェリンドメイン間の５０、４０、３０、２０もしくは１０残基未満の小型リンカーペプチド、またはトランスフェリンタンパク質およびＥＰＭペプチドの連結、または、ポリヒスチジン領域、抗原エピトープ、もしくは結合ドメインなど精製を容易にする小規模な伸長が企図される。
【０１７２】
[00181]本発明の別の例示的な実施形態では、本発明のＥＰＭペプチドを、直接的にまたはリンカーを介して、アルブミンに挿入または融合させることができる。具体的には、ＥＰＭペプチドは、融合タンパク質のＮ末端ならびにＣ末端を構成してよい。例示的な一実施形態では、ＥＰＭペプチドは、融合タンパク質のＣ末端部分を構成する。別の例示的な実施形態では、ＥＰＭペプチドは、融合タンパク質のＮ末端部分を構成する。別の例示的な実施形態では、ＥＰＭペプチド部分は、アルブミンの少なくとも１つの内部のループ（例えば、ジェンバンクアクセッション番号ＡＡＡ９８７９７のヒトアルブミン配列を参照のこと）を構成する。この配列中で、成熟アルブミンの配列は２５〜６０９番残基である。本発明のペプチドを挿入するためのアルブミン分子内部の位置の特定は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込むＲＣＢＳタンパク質データバンク（ＰＤＢ）のＩＤ＃１ＡＯ６で提供されているような分子の構造から決定することができる。本発明のペプチドの挿入に適した、分子内部の表面に露出したループは、以下のもの、すなわち５６〜５８、１７１〜１７３、２６７〜２７０、３１１〜３１４、３６２〜３６５、４３９〜４４２、５３８〜５４０、５６１〜５６４番残基を含む。この配列中で、１番残基は成熟アルブミンのＮ末端アミノ酸である。
【０１７３】
[00182]融合タンパク質のアルブミン部分には、それだけには限らないが、知られてはいるがまだ発見されていないアルブミンの多形型が含まれ、特定の実施形態では、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）である。例えば、アルブミンのナスカピ型は、Ｇｌｕ−３７２の代わりにＬｙｓ−３７２を有し、プロアルブミンのクライストチャーチ型は、プロ配列が改変されている。融合タンパク質のアルブミン部分は、１つまたは少数の残基を欠失した分子、残基の保存的置換または小規模な挿入を受けた分子、あるいはアミノ酸構造を少し変えられた分子など、配列に小規模な人工的変異を含んでもよい。したがって、本発明の融合タンパク質のアルブミン成分は、ＨＳＡに対して８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有し、変異体とみなされる。このような変異体が生理的にＨＳＡに等価であることも好ましい。すなわち、変異体が、少なくとも１種の薬理学的効用、例えば、脂肪酸もしくはビリルビンと結合すること、または血液の膨張力を高めることをＨＳＡと共有していることが好ましい。本発明のＥＰＭペプチド／アルブミン融合タンパク質は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第５３８０７１２号およびＥＰ  ３２２０９４Ｂに記載されているようなＨＳＡの切断型も包含する。さらに、薬理学的に使用する予定の推定変異体はすべて、治療される動物（例えば、ヒト）における免疫原性が低くなければならない。
【０１７４】
[00183]本発明のＥＰＭペプチド／アルブミン融合タンパク質は、ＨＳＡのＮ末端部分に対応する部分の範囲を超えて（Ｎ末端方向に）伸びるＮ末端アミノ酸を有してよい。例えば、ＨＳＡ部分が、成熟ＨＳＡのＮ末端部分に対応する場合、それに、プレ配列、プロ配列、またはプレプロ配列、例えば、酵母α因子のリーダー配列を付加してよい。参照により本明細書に組み込むＷＯ９０／０１０６３に記載されている、融合されるリーダー部分を使用してよい。同様に、ＨＳＡ部分とＥＰＭペプチドの間にリンカー（例えば、アミノ酸リンカー）を含むことも、本発明の範囲内である。
【０１７５】
[00184]別の実施形態では、ＨＳＡ分子のアミノ末端部分は、真核細胞における本発明のＥＰＭペプチドの特に効率的な移動および搬出を容易にするように構築される。
【０１７６】
[00185]本発明の特定の実施形態は、本明細書で記述する融合タンパク質を発現するように配列されたヌクレオチド配列を有する形質転換された宿主を包含する。「そのように配列された（ｓｏ  ａｒｒａｎｇｅｄ）」という用語は、例えば、適切なＲＮＡポリメラーゼ結合部位の下流にあり、翻訳開始配列を含む正確なリーディングフレーム中にあり、かつ、適切なプロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列を意味する。このプロモーターは、宿主と同種でも異種でもよい。必要なら、下流の（３'側）調節配列を含めてよいことが知られている。宿主は、酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）；ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属；またはシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ））が好ましいが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、哺乳動物細胞、植物細胞、または昆虫細胞など他の任意の適切な宿主でもよい。
【０１７７】
[00186]別の実施形態では、ＨＳＡ分子のアミノ末端部分は、真核細胞における本発明のＥＰＭペプチドの特に効率的な移動および搬出を容易にするように構築される。
【０１７８】
ＥＰＭペプチド／メラノトランスフェリン融合タンパク質
【０１７９】
[00187]他の例示的な実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、メラノトランスフェリンである。メラノトランスフェリンは、悪性の黒色腫細胞中に高レベルで存在するグリコシル化タンパク質であり、最初は、ヒト黒色腫抗原ｐ９７と名付けられていた（Ｂｒｏｗｎ他、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３頁）。これは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリン、およびニワトリトランスフェリンと高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎ他、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３頁；Ｒｏｓｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６年、８３：１２６１〜１２６５頁）。しかし、これらの受容体とは異なり、メラノトランスフェリンの細胞性受容体は１つも特定されていない。メラノトランスフェリンは、可逆的に鉄と結合し、２つの型で存在している。すなわち、１つの型はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって、細胞膜に結合されているのに対し、もう一方の型は、可溶性であり、かつ活発に分泌されている（Ｂａｋｅｒ他、１９９２年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２９８：２１５〜２１８頁；Ａｌｅｍａｎｙ他、１９９３年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１０４：１１５５〜１１６２頁；Ｆｏｏｄ他、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７０１１〜７０１７頁）。メラノトランスフェリン融合タンパク質は、前述のトランスフェリン融合タンパク質と同様に、生成させ、利用することができる。
【０１８０】
ＥＰＭペプチド／ラクトフェリン融合タンパク質
[00188]他の例示的な実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、ラクトフェリンである。ラクトフェリン（Ｌｆ）、すなわち天然の鉄結合性防御タンパク質は、抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性、および抗炎症活性を有することが判明している。このタンパク質は、一般に常在菌叢に触れている外分泌物、すなわち、乳汁、涙、鼻滲出液、唾液、気管支粘液、胃腸液、頚膣部粘液、および精液中に存在している。さらに、Ｌｆは、循環している多形核好中球（ＰＭＮ）の２次的な特殊顆粒の主要な構成成分でもある。敗血症の部位でＰＭＮの脱顆粒が起こるとアポタンパク質が遊離される。Ｌｆの重要な機能は、フリーラジカルによる損傷を抑制し、金属が微生物細胞および新生細胞に入り込む能力を低減させるために、体液および炎症部位中の遊離鉄を捕捉することである。成人で１２５Ｉ  Ｌｆの交代率を検査した研究では、Ｌｆが、肝臓および脾臓によって迅速に取り込まれ、放射能は肝臓および脾臓中で数週間持続し続けることが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔ他（１９７９年）、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）５７：４５３〜４６０頁）。ラクトフェリン融合タンパク質は、前述のトランスフェリンと同様に、生成させ、利用することができる。
【０１８１】
追加の例示的なＥＰＭペプチド／第２のペプチドまたはタンパク質融合タンパク質
[00189]本明細書で記述する技術を用いて、それだけには限らないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含めて、任意の所望の第２のペプチドまたはタンパク質に、ＥＰＭペプチドを融合し、またはその中に挿入できることが、当業者には容易に理解されよう。したがって、第２のペプチドまたはタンパク質は、本明細書で指定する実施形態に限定されない。したがって、別の例示的な実施形態では、融合タンパク質は、ＥＰＭペプチド配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている、ＧＳＴ−ＥＰＭペプチド融合タンパク質である。
【０１８２】
[00190]さらに別の例示的な実施形態では、融合タンパク質は、ＥＰＭペプチド配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている、改変された免疫グロブリン−ＥＰＭペプチド融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン−ＥＰＭペプチド融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドを媒介とするシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害または抑制するために、医薬組成物に組み入れ、対象に投与することができる。免疫グロブリン−ＥＰＭペプチド融合タンパク質は、増殖性の障害および分化誘導性の障害の治療と細胞の生存率の調節（例えば、促進または阻害）の双方のために、治療的に使用することができる。さらに、本発明の免疫グロブリン−ＥＰＭペプチド融合タンパク質は、対象において抗ＥＰＭペプチド抗体を産生させるための免疫原として使用することもできる。
【０１８３】
１種または複数の追加の治療物質を含む１種または複数のＥＰＭペプチドを含む融合タンパク質
[00191]本発明はまた、１種または複数のＥＰＭペプチドが第２のペプチドまたはタンパク質中に挿入され、またはそれに融合された融合タンパク質を包含し、さらに、その融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質に融合され、またはその中に挿入された１種または複数の追加の治療物質（例えば、神経用薬剤）を含む。別の実施形態では、この融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のアミノ末端で追加の治療物質（例えば、神経用薬剤）に連結されている、第２のペプチドまたはタンパク質のカルボキシル末端のＥＰＭペプチドを含む。ある代替実施形態では、この融合タンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のアミノ末端で結合されたＥＰＭペプチドと、第２のペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端の神経用薬剤とを含む。特定の実施形態では、この神経用薬剤は、神経成長因子または毛様体神経栄養因子である。
【０１８４】
[00192]別の実施形態では、この融合タンパク質は、ペプチド、ペプチド断片、またはタンパク質もしくは抗体のペプチド変異体である追加の治療物質であって、この変異体または断片が少なくとも１種の生物活性または治療活性を保持している追加の治療物質を含有することができる。融合タンパク質はまた、第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に融合され、その内部に挿入され、またはそのループ中に挿入された、アミノ酸長が少なくとも約４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５のペプチド断片またはペプチド変異体でよいＥＰＭペプチドも含有することができる。
【０１８５】
[00193]本発明の融合タンパク質は、１種または複数の追加の治療用ペプチドを含有してよい。特定の実施形態では、ペプチドの数を増やすことにより、第２のペプチドまたはタンパク質に融合されたペプチドの機能、および融合タンパク質全体の機能を増強することができる。このペプチドを使用して、複数の機能を有するペプチドまたはタンパク質ドメインを含めることにより、２機能性または多機能性の融合タンパク質を作製することができる。例えば、多機能性の融合タンパク質は、ＥＰＭペプチドと、特定の標的にその融合タンパク質を導くための第２のタンパク質とを用いて作製することができる。他のペプチドを使用して、細胞系の免疫応答を誘導しても、抗ウイルス性、抗菌性、または抗病原性の応答を誘導してもよい。特定の実施形態では、受容体を活性化し、免疫応答を誘導するために、少なくとも２種のＥＰＭペプチド部分が第２のペプチドまたはタンパク質に融合される。
【０１８６】
[00194]１種または複数のオリゴ糖基を結合することよって、本発明の融合タンパク質のＥＰＭペプチド部分に相当するＥＰＭペプチドを修飾することができる。グリコシル化と呼ばれる修飾は、タンパク質の物理的諸特性にかなり影響を及ぼすことができ、タンパク質の安定性、分泌、および局在化において重要となり得る。グリコシル化は、ポリペプチド主鎖に沿った特定の位置で起こる。通常、グリコシル化には２つの主要なタイプがある。すなわち、セリンまたはトレオニン残基に結合されるＯ−結合オリゴ糖を特徴とするグリコシル化、ならびに、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（Ｘは、プロリン以外のどのアミノ酸でもよい）中のアスパラギン残基に結合されるＮ−結合オリゴ糖を特徴とするグリコシル化である。タンパク質構造や細胞型などの変化は、様々なグリコシル化部位の鎖内部の糖単位の数および性質に影響を及ぼす。グリコシル化異性体も、所与の細胞型の内部の同じ部位でよくみとめられる。例えば、いくつかのタイプのヒトインターフェロンは、グリコシル化されている。
【０１８７】
[00195]ＥＰＭペプチドの他に、本発明の融合タンパク質の追加の治療用タンパク質部分に相当するタンパク質、ならびにその類似体および変異体は、それらが発現される宿主細胞によってその核酸配列を操作した結果として、またはそれらを他の条件で発現させることにより、１つまたは複数の部位のグリコシル化が改変されるように改変することができる。例えば、アスパラギンからグルタミンへの置換など（例えば、アミノ酸残基の置換または欠失により）グリコシル化部位を除去または導入することによってグリコシル化異性体を作製してもよく、あるいは、タンパク質をグリコシル化しないと考えられる宿主細胞中で、例えば、グリコシル化欠損酵母中でタンパク質を発現させることによって、非グリコシル化組換えタンパク質を作製してもよい。これらの手法は、当技術分野では既知である。
【０１８８】
[00196］別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本出願の別の場所で記述するＥＰＭペプチドの治療活性および／または生物活性に相当する治療活性および／または生物活性の能力を有する。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の治療上有効なタンパク質部分は、追加の治療的配列の断片または変異体である。
【０１８９】
[00197］一実施形態では、追加の治療物質は、融合タンパク質の生物活性のある構成要素である。追加の治療物質は、本発明で使用されるＥＰＭペプチドの活性に対して、相補的活性または相乗的活性を示すが、必ずしも同一ではない。追加の治療物質の生物活性としては、改善した所望の活性、または低減させた望ましくない活性を挙げることができる。
【０１９０】
核酸
[00198]本発明はまた、ＥＰＭペプチドまたはその断片に共有的に連結されまたは結合された第２のペプチドまたはタンパク質あるいは第２のペプチドまたはタンパク質の一部分を含む融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。
【０１９１】
[00199]本発明の別の実施形態は、本発明のＥＰＭペプチドをコードする単離核酸分子、またはその生物活性を有する部分、ならびにＥＰＭペプチドをコードする核酸（例えば、ＥＰＭペプチドのｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸断片、およびＥＰＭペプチド核酸分子を増幅または変異させるためのＰＣＲプライマーとして使用するための断片も包含する。核酸分子は、１本鎖でも２本鎖でもよいが、２本鎖ＤＮＡが好ましい。本発明の一実施形態は、活性を保持し、またはＥＭＰ−１より高い活性を有するＥＰＭペプチドを生成させるための遺伝コードの縮重が原因でＳＥＱＩＤ  ＮＯ：４に示すＥＭＰ−１ヌクレオチド配列と異なる１種または複数の核酸分子を包含する。
【０１９２】
[00200]本発明の別の態様は、活性のために不可欠ではないアミノ酸残基中に変化を含むＥＰＭペプチドをコードする核酸分子に関連する。これらのＥＰＭペプチドは、天然のＥＭＰ−１とはアミノ酸配列が異なるが、生物活性をなお保持している。一実施形態では、単離核酸分子は、ＥＭＰ−１アミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、この核酸分子にコードされるタンパク質は、ＥＭＰ−１アミノ酸配列に少なくとも約６０％相同であり、その所与のＥＮＰ−１ペプチドに対して、より好ましくは少なくとも約７０％相同であり、少なくとも約８０％相同であり、少なくとも約９０％相同であり、好ましくは少なくとも約９５％相同である。
【０１９３】
[00201]所与のＥＭＰ−１ペプチドに相同なＥＰＭペプチドをコードする単離核酸分子は、コードされるタンパク質に１種または複数のアミノ酸置換、付加、または欠失が導入されるように、対応するＥＭＰ−１ヌクレオチド配列中に１種または複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって、作製することができる。
【０１９４】
[00202]別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、少なくとも９ヌクレオチドの長さを有し、ストリンジェントな条件下で、少なくとも１つのＥＰＭペプチドヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。
【０１９５】
[00203]核酸分子を複製し、コードされた融合タンパク質を発現させるための宿主細胞およびベクターも提供される。原核性であれ真核性であれ、任意のベクターまたは宿主細胞を使用してよいが、真核細胞発現系、特に酵母発現系が好ましいことがある。このような目的のための多くのベクターおよび宿主細胞が、当技術分野で知られている。所望の用途に適切な一式を選択することは、十分に当業者が対応できる範囲内である。
【０１９６】
[00204]プローブに基づく方法によってＥＰＭペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離するための技術は、従来技術であり、当業者には公知である。このようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公開されているＤＮＡ配列またはタンパク質配列に基づいてよい（例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｇ．Ｓ．（１９９３年）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６Ｂ／１：２０３〜２１８頁、およびそれに引用されるすべての参考文献を参照のこと）。あるいは、参照により本明細書に組み込むＭｕｌｌｉｓ他（米国特許第４６８３１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４６８３２０２号）により開示されているポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いてもよい。これらのＤＮＡ配列を単離するためのライブラリーの選択およびプローブの選定は、当業者のレベルの範囲内である。
【０１９７】
[00205]当技術分野で知られているように、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の類似性は、一方のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列およびその保存的なヌクレオチドまたはアミノ酸置換体を、２つめのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定される。また、このような配列の２つの鎖の間の一致率を特定することにより決定される、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する「同一性」も当技術分野で知られている。同一性も類似性も、容易に算出することができ（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１年）。
【０１９８】
[00206]２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定するためにいくつかの方法が存在し、「同一性」および「類似性」という用語は、当業者に公知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１年；ならびに、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８年））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するのに一般に使用される方法には、それだけには限らないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９４年、ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３頁（１９８８年）に開示されているものが含まれる。
【０１９９】
[00207]同一性を決定するための好ましい方法は、試験する２つの配列間の一致率を最大にするように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、それだけには限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁（１９９０年））が含まれる。前述の類似性または同一性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として決定され、しばしば、第１の配列が第２の配列に由来していることを示唆する。２つの核酸配列間の同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されているＧＡＰなど当技術分野で既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁（１９７０年））。本発明のために２つの核酸配列間の同一性の程度を決定するために、以下の設定値、すなわち、ＧＡＰ生成ペナルティ５．０およびＧＡＰ伸長ペナルティ０．３でＧＡＰを使用する。
【０２００】
[00208]本発明はさらに、核酸分子を用いて本発明の融合タンパク質を作製するための方法も包含する。一般論として、組換え型のタンパク質の作製は、通常以下の工程を伴う。
【０２０１】
[00209]最初に、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を得る。次いで、好ましくは、上述したように適切な制御配列を含む作動可能な連鎖部分にその核酸分子を配置して、タンパク質のオープンリーディングフレームを含む発現単位を形成させる。この発現単位を用いて適切な宿主を形質転換し、その形質転換された宿主を、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。場合によっては、組換えタンパク質を培地または細胞から単離する。いくらかの不純物が許容され得る一部の場合では、タンパク質の回収および精製が必要ではないことがある。
【０２０２】
[00210]前述の各工程は、様々な方法で達成することができる。例えば、様々な宿主中で作動可能な発現ベクターの構築は、上述したように、適切なレプリコンおよび制御配列を用いて達成する。制御配列、発現ベクター、および形質転換法は、遺伝子を発現するのに使用される宿主細胞のタイプに依存し、これまでに詳細に論じられており、また、そうでなければ、当業者には既知である。一般には入手できない場合は、これらのベクター中に挿入するための切除可能な遺伝子を得るために、適切な制限部位をコード配列の末端に付加することができる。当業者なら、本発明の核酸分子とともに使用して所望の組換えタンパク質を作製するために、当技術分野で知られている任意の宿主／発現系を容易に適合させることができる。
【０２０３】
[00211]酵母系、細菌系、動物系、植物系、真核生物系、および原核生物系を含めて、任意の発現系を使用してよい。いくつかの実施形態では、酵母系、哺乳動物細胞培養系、およびトランスジェニック動物または植物の産生系が好ましい。別の実施形態では、天然の酵母グリコシル化、過剰なグリコシル化、またはタンパク質分解活性を低減するように改変された酵母系を使用してよい。
【０２０４】
コドン最適化
[00212]遺伝コードの縮重により、ＥＭＰ−１タンパク質のヌクレオチド配列を変え、その一方で天然のＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをなお産生させることが可能となる。「コドン最適化」として知られるこの手順（その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第５５４７８７１号で記載されている）により、このような改変されたＤＮＡ配列を設計する手段が提供される。コドン最適化遺伝子の設計は、生物中のコドン使用頻度、最近接頻度、ＲＮＡ安定性、２次構造を形成する可能性、合成経路、およびその後に予定されるその遺伝子のＤＮＡ操作を含めて、様々な要素を考慮すべきである。具体的には、酵母発現系が使用される際は、酵母によって最も容易に認識されるコドンを用いて、利用可能な方法を使用して所与の融合タンパク質をコードするコドンを改変してよい。
【０２０５】
[00213]遺伝コードの縮重により、同じアミノ酸配列が、多くの様々な方法でコードされ翻訳されることが可能となる。例えば、ロイシン、セリン、およびアルギニンはそれぞれ、６つの異なるコドンによってコードされており、バリン、プロリン、トレオニン、アラニン、およびグリシンはそれぞれ、４つの異なるコドンによってコードされている。しかし、このような同義コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物の間でゲノムによって異なる。例えば、哺乳動物間の同義コドン選択パターンは非常に類似しているが、酵母（Ｓ．セレヴィシエなど）、細菌（大腸菌など）、および昆虫（Ｄ．メラノガスター（ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）など）など進化的に離れた生物は、明らかに異なるパターンのゲノムコドン使用頻度を示している（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、８、４９〜６２頁（１９８０年）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、９、４３〜７４頁（１９８１年）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１４、１５１〜１９７頁（１９８６年）；Ａｏｔａ，Ｓ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１６、３１５〜４０２頁（１９８８年）；Ｗａｄａ，Ｋ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９補遺、１９８１〜１９８５頁（１９９１年）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９頁（１９９１年））。コドン選択パターンのこれらの差異は、ペプチド伸長速度を調節することにより、個々の遺伝子の全体的な発現レベルに影響を与えているようである。（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９頁（１９９１年）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３、２８９５〜２８９８頁（１９８４年）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０７、３６５〜３７７頁（１９８９年）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、３７５〜３７９頁（１９８０年）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．およびＹａｒｕｓ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０９、６５〜７７頁（１９８９年）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６頁（１９８４年）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６頁（１９８４年）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、４３、２１１〜２２５頁（１９７４年）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４６、１〜２１頁（１９８１年）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５１、３８９〜４０９頁（１９８１年））。
【０２０６】
[00214]合成遺伝子のために好ましいコドン使用頻度は、組換えタンパク質発現に使用する予定の細胞／生物のそれ自体の（または、できるだけ近縁の）ゲノム、特に酵母種のゲノムに由来する核遺伝子のコドン使用を反映すべきである。上述したように、好ましい一実施形態では、ヒトの第２のペプチドまたはタンパク質配列は、ＥＰＭペプチドヌクレオチド配列のように、本明細書で説明する酵母発現のための改変の前または後にコドンを最適化される。
【０２０７】
ベクター
[00215]本発明で使用するための発現単位は、一般に、５’側から３’側の向きに作動可能に連結された以下の要素、すなわち、転写プロモーター、分泌シグナル配列、ＥＰＭペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合された、第２のペプチドまたはタンパク質または第２のペプチドまたはタンパク質の一部分を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーターを含む。上述したように、ＥＭＰ−１部分にまたはその内部に融合されたＥＰＭペプチドの任意の配列を、本発明のベクターで使用してよい。適切なプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの選定は、選択された宿主細胞によって決定され、また、当業者には明らかであると考えられ、以下により詳細に論じる。
【０２０８】
[00216]本発明で使用するのに適した酵母ベクターは、米国特許第６２９１２１２号に記載されており、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５〜１０３９頁、１９７８年）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ他、Ｇｅｎｅ８：１２１〜１３３頁、１９７９年）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ２７５：１０４〜１０８頁、１９７８年）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４、およびそれらの誘導体が挙げられる。有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３〜４０６、ｐＲＳ４１３〜４１６、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ラホーヤ、ＣＡ９２０３７、米国から入手可能なピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ベクターも挙げられる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１．６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【０２０９】
[00217]このようなベクターは、一般に１つの選択マーカーを含む。この選択マーカーは、形質転換体の選別を可能にする表現型アッセイがそれに対して存在するような優性表現型を示す任意の数の遺伝子のうちの１つでよい。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完し、抗生物質耐性を与え、または細胞が特定の炭素供給源を利用することを可能にするものであり、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈ他、同書）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ他、Ｇｅｎｅ８：１７頁、１９７９年）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌ他、同書）、またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ、ＥＰ１７１１４２）が挙げられる。他の適切な選択マーカーとしては、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子が挙げられる。酵母で使用するのに好ましいプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子に由来するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５：１２０７３〜１２０８０頁、１９８０年；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９〜４３４頁、１９８２年；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４５９９３１１号）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇ他、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ他（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク、１９８２年；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２〜２０１頁、１９８３年）が挙げられる。なお、特に好ましいプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４５９９３１１号）、およびＡＤＨ２−４ｃ（米国特許第６２９１２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ３０４：６５２〜６５４頁、１９８３年）である。発現単位は、転写ターミネーターも含んでよい。好ましい転写ターミネーターは、ＴＰＩ１ターミネーターである（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、同書）。他の好ましいベクター、および酵母発現系のプロモーターやターミネーターなど好ましい構成要素は、欧州特許ＥＰ０２５８０６７、ＥＰ０２８６４２４、ＥＰ０３１７２５４、ＥＰ０３８７３１９、ＥＰ０３８６２２２、ＥＰ０４２４１１７、ＥＰ０４３１８８０、およびＥＰ１００２０９５；欧州特許公報ＥＰ０８２８７５９、ＥＰ０７６４２０９、ＥＰ０７４９４７８、およびＥＰ０８８９９４９；ＰＣＴ公報ＷＯ００／４４７７２およびＷＯ９４／０４６８７；ならびに米国特許第５７３９００７号；５６３７５０４号；５３０２６９７号；５２６０２０２；５６６７９８６号；５７２８５５３号；５７８３４２３号；５９６５３８６号；６１５０１３３号；６３７９９２４号；および５７１４３７７号に開示されている。これらの各文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
【０２１０】
[00218]酵母の他に、本発明の融合タンパク質は、糸状菌、例えば、真菌アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の系統で発現させることもできる。有用なプロモーターの例としては、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９頁、１９８５年）やｔｐｉＡプロモーターなどアスペルギルスニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）解糖系遺伝子に由来するものが挙げられる。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、同書）である。このような構成要素を利用する発現単位を、例えばアスペルギルスの染色体ＤＮＡ中に挿入することができるベクター中にクローニングしてよい。
【０２１１】
[00219]本発明の実施において使用するための哺乳動物発現ベクターは、融合タンパク質の転写を指示することができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。好ましいウイルスプロモーターとしては、アデノウイルス２由来の主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４〜１３１９９頁、１９８２年）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４頁、１９８１年）が挙げられる。好ましい細胞性プロモーターとしては、マウスメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２：８０９〜８１４頁、１９８３年）およびマウスＶκ（米国特許第６２９１２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｇｒａｎｔ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５４９６頁、１９８７年）が挙げられる。特に好ましいプロモーターは、マウスＶＨ（米国特許第６２９１２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｌｏｈ他、同書）である。このような発現ベクターは、プロモーターの下流、かつトランスフェリン融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置するＲＮＡスプライス部位のセットも含んでよい。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
【０２１２】
[00220]この発現ベクターには、目的のコード配列の下流に配置されたポリアデニル化シグナルも含まれる。ポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３７１９〜３７３０頁、１９８１年）が挙げられる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＶＨ（米国特許第６２９１２１２号を参照のこと）遺伝子ターミネーター（Ｌｏｈ他、同書）である。この発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位の間に配置された、アデノウイルス２の３分節リーダーなど非コード性のウイルスリーダー配列を含んでよい。好ましいベクターは、ＳＶ４０エンハンサーやマウスμ（米国特許第６２９１２１２号を参照のこと）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ  ３３：７１７〜７２８頁、１９８３年）などのエンハンサー配列も含んでよい。発現ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする配列も含んでよい。
【０２１３】
形質転換
[00221]真菌を形質転換するための技術は、文献中で公知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９〜１９３３頁、１９７８年）、Ｙｅｌｔｏｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１７４０〜１７４７頁、１９８４年）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ３０１：１６７〜１６９頁、１９８３年）によって記載されている。エレクトロポレーション（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２〜１８７頁、１９９１年）など、真菌細胞中にクローン化ＤＮＡ配列を導入するための他の技術も使用してよい。宿主細胞の遺伝子型は、一般に、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって補完される遺伝的欠陥を含むものとする。個々の宿主および選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【０２１４】
[00222]例えば、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ  １４：７２５頁、１９７８年；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：６０３頁、１９８１年；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６、１９７３年）によって、本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を含むクローン化ＤＮＡ配列を哺乳動物の培養細胞中に導入することができる。エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５頁、１９８２年）やリポフェクションなど、哺乳動物細胞中にクローン化ＤＮＡ配列を挿入するための他の技術も使用してよい。クローン化ＤＮＡを組み込んだ細胞を同定するために、通常、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに選択マーカーを細胞中に導入する。哺乳動物の培養細胞中で使用するのに好ましい選択マーカーには、ネオマイシン、ヒグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える遺伝子が含まれる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーでよい。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子である。特に好ましい増幅可能なマーカーは、ＤＨＦＲｒ（米国特許第６２９１２１２号を参照のこと）ｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２４９５〜２４９９頁、１９８３年）である。選択マーカーについては、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ストーンハム，マサチューセッツ州）にその総説があり、また、選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【０２１５】
宿主細胞
[00223]本発明は、本発明の融合タンパク質を発現するように形質転換された細胞、好ましくは酵母細胞も含む。形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明は、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナルな（クローンが均一な）培養物、またはモノクローナルな培養物由来の培養物も含む。ポリペプチドが分泌される場合は、この培地は、細胞を含むポリペプチド、または細胞がろ過もしくは遠心分離により除去されている場合は細胞を含まないポリペプチドを含有すると考えられる。
【０２１６】
[00224]本発明を実施する際に使用するための宿主細胞には、培養された哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、および細菌細胞など、外来性ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトし、培養で増殖させることができる、真核細胞、および一部の場合には原核細胞が含まれる。
【０２１７】
[00225]酵母（例えば、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピキア属）の種を含めて、真菌細胞を本発明の範囲の宿主細胞として使用してよい。本発明を実施する際に、本発明の融合タンパク質を発現させるための宿主として有用と考えられる酵母を含む真菌の例は、ピキア（一部の種は、以前はハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）として分類されていた）、サッカロマイセス、クルイベロマイセス、アスペルギルス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、シゾサッカロマイセス、シテロマイセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバロマイセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メツニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）などである。サッカロマイセス属の例としては、Ｓ．セレヴィシエ、Ｓ．イタリクス（ｉｔａｌｉｃｓ）、およびＳ．ルキシー（ｒｏｕｘｉｉ）がある。クルイベロマイセス属の例としては、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）がある。適切なトルラスポラ属は、Ｔ．デルブリッキ（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピキア属の例は、Ｐ．アングスタ（ａｎｇｕｓｔａ）（以前はＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、Ｐ．アノマラ（ａｎｏｍａｌａ）（以前はＨ．アノマラ）、およびＰ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【０２１８】
[00226]本発明の融合タンパク質を作製するのに特に有用な宿主細胞は、メチロトローフのピキアパストリスである（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ他、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．６：６１９〜６２４頁）。ピキアパストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離およびクローン化されたため、異種タンパク質を作製するための優れた宿主であることが明らかになった。その形質転換は、１９８５年に最初に報告された。Ｐ．パストリスは、グルコースが無くてもメタノールを炭素供給源として使用することができる。Ｐ．パストリス発現系は、メタノール代謝の初段階の触媒酵素であるアルコールオキシダーゼの発現をコードする遺伝子を制御するメタノール誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用することができる。このプロモーターは、特徴づけされており、一連のＰ．パストリス発現ベクターに組み入れられている。Ｐ．パストリス中で産生されるタンパク質は、通常正しく折り畳まれ、培地中に分泌されるため、遺伝的に改変したＰ．パストリスの発酵は、大腸菌発現系の優れた代替方法となる。破傷風毒素断片、ボルデテラ（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）百日咳パータクチン、ヒト血清アルブミン、およびリゾチームを含めて、いくつかのタンパク質がこの系を用いて作製されている。
【０２１９】
[00227]酵母サッカロマイセスセレヴィシエの系統は、別の好ましい宿主である。好ましい実施形態では、酵母細胞、より詳細には、糖タンパク質のアスパラギン結合型のグリコシル化に必要とされる遺伝子に遺伝的欠陥を有するサッカロマイセスセレヴィシエ宿主細胞を使用する。多くの入手可能な酵母系統が、グリコシル化または過剰なマンノシル化を防ぎまたは低減させるように改変されているが、変異および選択の標準技術を用いて、このような欠陥を有するＳ．セレヴィシエ宿主細胞を作製することもできる。Ｂａｌｌｏｕ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５９８６〜５９９１頁、１９８０年）は、アスパラギン結合型のグリコシル化に影響を及ぼす遺伝子に欠陥を有するマンノタンパク質生合成突然変異体の単離について説明している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ７：４８１〜４８６頁、１９９７年）は、酵母においてタンパク質のＯ−グリコシル化の最初の段階を司っている酵素をコードする少なくとも６つの遺伝子（ＰＭＴ１〜６）のファミリーについて説明している。これらの遺伝子の１つまたは複数に欠陥を有する突然変異体では、Ｏ−結合型のグリコシル化が減り、かつ／またはＯ−グリコシル化の特異性が変わっている。
【０２２０】
[00228]異種タンパク質の産生を最適化するためには、タンパク質分解活性の低下をもたらすＳ．セレヴィシエｐｅｐ４変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：２３〜３３頁、１９７７年）など、宿主株が変異を有することも好ましい。他のプロテアーゼコード領域に変異を有する宿主株は、本発明の融合タンパク質を大量に産生させるのに特に有用である。
【０２２１】
[00229]適切な増殖培地で、本発明のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を増殖させる。本明細書では、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、無機塩類、および増殖因子が含まれ得る。増殖培地は通常、例えば、薬物選択、またはＤＮＡ構築物上の選択マーカーによって補完され、もしくはそのＤＮＡ構築物ともにコトランスフェクトされる必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築物を含む細胞を選択する。例えば、酵母細胞は、炭素源、例えばスクロース、アミノ酸ではない窒素源、無機塩類、ビタミン、および必須アミノ酸補給物を含む、既知組成培地中で増殖させることが好ましい。培地のｐＨは、２より高く８未満、好ましくはｐＨ５．５〜６．５で維持することが好ましい。安定なｐＨを維持するための方法には、緩衝化および恒常的なｐＨ制御が含まれる。好ましい緩衝剤には、コハク酸およびＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ミズーリ州）が含まれる。アスパラギン結合型のグリコシル化に必要とされる遺伝子に欠陥を有する酵母細胞は、浸透圧安定剤を含有する培地で増殖させることが好ましい。好ましい浸透圧安定剤はソルビトールであり、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍの濃度で培地に補充する。
【０２２２】
[00230]哺乳動物の培養細胞は、一般に、市販の血清添加培地または無血清培地中で増殖させる。使用する個々の細胞系に適した培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。トランスフェクトされた哺乳動物細胞を一定期間、通常１〜２日増殖させて、目的のＤＮＡ配列の発現を開始させる。次に、安定的に選択マーカーを発現している細胞の増殖を選別するために、薬物選択を適用する。増幅可能な選択マーカーとともにトランスフェクトされている細胞の場合は、薬物濃度を段階的に高くしてコピー数が増えたクローン化配列を選別し、それによって発現レベルを高めることができる。
【０２２３】
[00231]バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を使用して本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を作製してもよい。「ＢａｃＰＡＫ（商標）」バキュロウイルス発現系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）は、昆虫宿主細胞中で、高レベルで組換えタンパク質を発現する。標的遺伝子は、直鎖状にしたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡとともに昆虫宿主細胞中にコトランスフェクトされるトランスファーベクター中に挿入される。ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムの必須の部分を欠いている。ＤＮＡがベクターと再結合すると、その必須のエレメントが回復され、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムに移入される。組換えの後、数個のウイルスプラークを採取および精製し、その組換え表現型を検証する。次いで、新しく単離された組換えウイルスを増幅させ、昆虫細胞培養物を感染させるのに用いて、所望のタンパク質を大量に産生させることができる。
【０２２４】
[00232]トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物を用いて、本発明の融合タンパク質を作製してもよい。例えば、ヒツジおよびヤギは、その乳中に融合タンパク質を作ることができる。あるいは、タバコ植物は、その葉の中に融合タンパク質を含むことができる。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物によるタンパク質作製のどちらも、その生物のゲノム中に融合タンパク質をコードする新しい遺伝子を加えることを含む。トランスジェニック生物は新しいタンパク質を産生できるだけでなく、その能力を子孫へと引き継ぐこともできる。
【０２２５】
分泌シグナル配列
[00233］「分泌シグナル配列」もしくは「シグナル配列」または「分泌リーダー配列」という用語は、交換可能に使用され、例えば、いずれもその全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第６２９１２１２号および米国特許第５５４７８７１号で記載されている。分泌シグナル配列もしくはシグナル配列または分泌リーダー配列は、分泌ペプチドをコードしている。分泌ペプチドは、細胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指示する働きをするアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、一般に、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、通常（それだけには限らないが）、新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に存在する。分泌ペプチドは、分泌が起こる間に成熟タンパク質から切断されることが非常に多い。分泌ペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過する際に、成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を起こさせるプロセシング部位を含んでよい。プロセシング部位は、シグナルペプチドの内部にコードされていても、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏな突然変異誘発によってシグナルペプチドに加えられてもよい。
【０２２６】
[00234]分泌ペプチドを用いて本発明の融合タンパク質の分泌を指示してよい。他の分泌ペプチドと組み合わせて使用できる１つのこのような分泌ペプチドは、α接合因子リーダー配列である。分泌シグナル配列もしくはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後処理段階に必要とされている。損傷のないシグナル配列が存在する場合は、発現されるタンパク質は、粗面小胞体の管腔に入り、次にゴルジ体を通って分泌小胞へ輸送され、最後に細胞外へ輸送される。一般に、シグナル配列は開始コドンのすぐ後ろにあり、分泌されるタンパク質のアミノ末端のシグナルペプヂドをコードしている。たいていの場合は、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切断される。ＴｆまたはヒトＴｆシグナル配列などの好ましいシグナル配列は、ウイルス、哺乳動物、または酵母の発現ベクターによる組換えタンパク質発現の処理および輸送効率を改善する。
【０２２７】
Ｔｆ融合タンパク質の検出
[00235]生物活性のある融合タンパク質を検出するためのアッセイとしては、ウェスタン転写、タンパク質ブロット、またはコロニーフィルター、ならびにＥＰＭペプチドと第２のペプチドまたはタンパク質とを含む融合タンパク質を検出する活性に基づくアッセイを挙げることができる。ウェスタン転写フィルターは、Ｔｏｗｂｉｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４３５０〜４３５４頁、１９７９年）によって記述されている方法を用いて調製することができる。簡潔に言うと、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中でサンプルを電気泳動させる。ゲル中のタンパク質は、電気泳動によりニトロセルロース紙に転写される。例えば、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社、キーン、ニューハンプシャー州）を用いてニトロセルロースフィルターを通して，上清サンプルまたは濃縮物をろ過することによって、タンパク質ブロットフィルターを調製することができる。適切な増殖培地の全体に敷かれたニトロセルロースフィルター上でコロニーを増殖させることによって、コロニーフィルターを調製することができる。この方法では、固形培地が好ましい。少なくとも１２時間、フィルター上で細胞を増殖させる。フィルターに結合したタンパク質は除去しない適切な緩衝液で洗浄することにより、フィルターから細胞を除去する。好ましい緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１９ｍＭグリシン、２０％メタノールを含み、ｐＨ８．３である。
【０２２８】
[00236]本発明の融合タンパク質は、ラジオアイソトープまたは他の造影剤で標識し、ｉｎ  ｖｉｖｏの診断目的に使用することができる。好ましいラジオアイソトープ造影剤としては、ヨウ素−１２５およびテクネチウム−９９が挙げられ、テクネチウム−９９が特に好ましい。タンパク質−アイソトープ結合体を作製する方法は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｅｃｋｅｌｍａｎ他（米国特許第４６５２４４０号）、Ｐａｒｋｅｒ他（ＷＯ８７／０５０３０）、およびＷｉｌｂｅｒ他（ＥＰ２０３７６４）によって記述されている。あるいは、融合タンパク質をスピン標識エンハンサーに結合させて、磁気共鳴（ＭＲ）画像法に用いてもよい。適切なスピン標識エンハンサーには、窒素酸化物など安定で立体障害性のフリーラジカル化合物が含まれる。ＭＲ画像法用にリガンドを標識するための方法は、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ他（米国特許第４６５６０２６号）によって開示されている。
【０２２９】
[00237]本発明の融合タンパク質の検出は、検出可能な物質にＥＰＭペプチドを結合させる（すなわち、物理的に連結する）ことによって、容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２３０】
[00238]本発明の融合タンパク質が抗体に結合する場合の結合する能力または抗原と競合する能力を分析する一実施形態では、それだけには限らないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素またはラジオアイソトープ標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ）、補体結合試験、免疫蛍光法、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動法などの技術を用いる競合および非競合アッセイ系を含めて、当技術分野で既知の様々なイムノアッセイを使用することができる。一実施形態では、融合タンパク質上の標識を検出することによって、融合タンパク質の結合を検出する。別の実施形態では、融合タンパク質と相互作用する２次抗体または試薬の結合を検出することによって、融合タンパク質を検出する。別の実施形態では、２次抗体または試薬を標識化する。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当技術分野で知られており、本発明の範囲内である。
【０２３１】
[00239]ＥＰＭペプチド部分の活性を検定することによっても、本発明の融合タンパク質を検出することができる。詳細には、当業者に既知のアッセイにより、本発明の融合タンパク質の機能的活性（例えば生物活性または治療活性）を検定することができる。さらに、当業者は、公知のアッセイにより、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当するＥＰＭペプチドの断片の活性を常法通り検定することもできる。さらに、当業者は、当技術分野で既知のアッセイにより、改変されたトランスフェリンタンパク質の断片の活性を常法通り検定することもできる。
【０２３２】
[00240]例えば、本発明の融合タンパク質が抗ＥＭＰ−１抗体および／または抗第２ペプチド抗体に結合する場合の結合する能力またはＥＰＭペプチドと競合する能力を検定する一実施形態では、それだけには限らないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素またはラジオアイソトープ標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ）、補体結合試験、免疫蛍光法、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動法などの技術を用いる競合および非競合アッセイ系を含めて、当技術分野で既知の様々なイムノアッセイを使用することができる。一実施形態では、１次抗体上の標識を検出することによって、抗体結合を検出する。別の実施形態では、２次抗体または試薬の１次抗体への結合を検出することによって、１次抗体を検出する。別の実施形態では、２次抗体を標識化する。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当技術分野で知られており、本発明の範囲内である。
【０２３３】
[00241]ＥＰＭペプチドの結合相手（例えば、受容体またはリガンド）を同定する別の実施形態では、そのＥＰＭペプチドを融合物の治療用タンパク質部分として含有する融合タンパク質によるその結合相手への結合は、例えば、還元性または非還元性のゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティクロマトグラフィー、およびアフィニティブロッティングなど当技術分野で公知の手段によって、検定することができる。他の方法は、当業者には既知であると考えられ、本発明の範囲内である。
【０２３４】
融合たんぱく質の単離／精製
[00242]分泌され生物活性のある融合タンパク質は、生物活性のある融合タンパク質の分泌を可能にする条件下で培養された宿主細胞の培地から単離することができる。細胞物質を培養培地から除去し、当技術分野で既知の単離技術を用いて、生物活性のある融合タンパク質を単離する。適切な単離技術には、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを含めて、様々なクロマトグラフィー法による沈降および分画が含まれる。
【０２３５】
[00243]特に好ましい精製方法は、鉄結合もしくは金属キレート化カラムによるアフィニティクロマトグラフィー、またはポリペプチド融合物のトランスフェリンまたはＥＰＭペプチドを標的とする抗体を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィーである。抗体は、固体支持体または固体担体に固定化または結合させることが好ましい。特に好ましい担体は、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）である。この方法では、結合を生じさせると考えられる条件下で、培地を抗体／担体と混合する。複合体を洗浄して結合していない物質を除去することができ、複合体形成に望ましくない条件を用いることにより、融合タンパク質を遊離または溶離させる。特に有用な溶離方法には、固定化された抗体が第１のｐＨで融合タンパク質に対して親和性が高く、第２の（より高いまたはより低い）ｐＨでは親和性が低くなるｐＨの変更、いくつかのカオトロピック剤の濃度変化、または界面活性剤の使用による方法が含まれる。
【０２３６】
細胞内部へ、かつ／または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する融合タンパク質の送達
[00244]本発明の範囲内で、融合タンパク質に複合化されたＥＰＭペプチドまたは追加の治療物質を、天然にもしくは人工的に設計されて対応する受容体を発現する任意の細胞型の細胞膜を通過することを含めて、細胞内部へ、または、血液脳関門もしくは他の障壁を通過して送達させるための担体として、融合タンパク質を使用することができる。これらの実施形態では、融合タンパク質は、通常、グリコシル化を阻害、防止、または除去して融合タンパク質および／またはＥＰＭペプチド部分の血清半減期を延長するように、人工的に設計し、または改変される。ターゲティングペプチドの付加は、さらに融合タンパク質を特定の細胞型、例えば癌細胞に対して標的化するために特に企図される。
【０２３７】
治療的／予防的投与および組成物
[00245]本発明の融合タンパク質（またはＥＰＭペプチド）は、標的組織中で効果的なレベルを実現するように投与される。例えば、本発明の融合タンパク質は、それだけには限らないが、局所、皮膚、皮下、経皮、非経口、経口、直腸を含めて多数の経路によって、あるいは、オリゴヌクレオチドもしくはリボザイム含有ポンプまたは他の徐放性製剤の外科的埋め込みを含む他の手段によって、投与することができる。融合タンパク質は、通常、適切な薬剤担体とともに医薬組成物の形で使用される。
【０２３８】
[00246]本発明の融合タンパク質は活性を有するため、動物用およびヒト用医薬品で有用である。前述したように、本発明の組成物は、それだけには限らないが、貧血、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠障害および月経障害、未熟児早期貧血、脊髄損傷、急性失血、老化、異常な赤血球新生を伴う新生物性疾患状態、腎不全、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、およびアルツハイマー病、それだけには限らないが、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の異常、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患を含む慢性または再発性の疾患を含めて、様々な疾患を治療または予防するのに有用である。
【０２３９】
[00247]本発明は、本発明の融合タンパク質を含む組成物の治療有効量を患者に投与することによる治療方法および予防方法を提供する。患者は、それだけには限らないが、雌牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの動物を含めた動物であり、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０２４０】
[00248]本発明の組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、経口的に、局所的に、静脈注射もしくはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収により、投与することができ、また、生物活性のある別の作用物質とともに投与することができる。本発明の組成物は、経口投与することが好ましい（例えば、下記のセクション５．１７．１を参照のこと）。投与は、全身的でも局所的でもよい。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入など、様々な送達系が知られており、本発明の組成物を投与するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、複数の本発明の組成物が、患者に投与される。投与方法としては、それだけには限らないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、大脳内、腟内、経皮、直腸内投与、吸入による投与、または特に耳、鼻、眼、頭皮、もしくは皮膚への局所投与が挙げられる。好ましい投与様式は、施術者の裁量に委ねられており、医学的症状の部位によってある程度変わると考えられる。ほとんどの場合、投与すると、細胞による取り込みが最大になるように本発明の組成物が放出される。
【０２４１】
[00249]特定の実施形態では、１種または複数の本発明の組成物を、治療を必要とする部分に局所的に投与することが望ましいことがある。これは、例えば、それだけには限らないが、局所塗布（例えば、クリームとして）により；外科手術中の局所注入により（例えば、手術後の創傷被覆材とともに）；注射により；カテーテルにより；坐剤により；シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜または繊維を含めて、多孔性、非多孔性、またはゼラチン質の物質であるインプラントにより実現することができる。一実施形態では、アテローム斑組織の部位（または以前そうであった部位）に直接注射することによって投与することができる。
【０２４２】
[00250]別の実施形態では、患部に直接適用するために、身体の表面に直接または間接的に投与するのに適した形態の組成物を調製する。この製剤は、それだけには限らないが、乾燥防止剤（例えば、パンテチン）、浸透促進剤（例えば、ジメチルイソソルビド）、促進剤（例えば、ミリスチン酸イソプロピル）、またはこの業界で知られており局所適用に使用されている他の一般的な添加剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチルアルコール、リポソーム、脂質、油、クリーム、または皮膚軟化剤）を含む。
【０２４３】
[00251]大半の薬物は、角質層を通過することができない。しかし、まとめて「浸透促進剤」として知られている化合物のクラスを用いて、浸透を促進させることができる。アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、アゾン（Ａｚｏｎｅ）、ピロリドン、尿素およびポリオールは、このクラスの化合物のメンバーの一部にすぎない（Ｋａｌｂｉｔｚ他、１９９６年）。これらの浸透促進剤の目的は、角質層中の薬物の溶解性および拡散率を変えることであり、したがって、脂質経路を通じてその効果を調節するものもあれば、極性経路を介して拡散を変えるものもある。
【０２４４】
[00252]角質層を通過して組成物を送達させる局所製剤の有効性をさらに改善するために、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用してよい。ホスホロチオエートで改変されたオリゴヌクレオチドは、これらの改変体が、未改変のオリゴヌクレオチドと比較したときにオリゴヌクレオチドの生物学的半減期の著しい向上を示すことが知られているため、使用されている。通常、ホスホロチオエートで改変されたオリゴヌクレオチドは、天然ＤＮＡ分子と同じ特質を示す。長さが同じ天然ＤＮＡオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートベースのＤＮＡのどちらもほぼ同じ大きさであり、同じ２次構造および３次構造を形成し、各ヌクレオシド間の結合の１つの負電荷によって、大きな正味の負電荷を有する。しかし、ホスホロチオエートで改変されたオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルのヌクレオシド間の結合の非架橋酸素原子に置き換わった硫黄原子が存在するため、核酸分解に対する耐性がより強い。
【０２４５】
[00253]様々な濃度の促進剤グリセリンを加えると、シクロスポリンの浸透が促進されることが示されている（Ｎａｋａｓｈｉｍａ他、１９９６年）。水性プロピレングリコールとテルペンベースの浸透促進剤の併用も、５-フルオロウラシルの局所送達速度を速める能力を示している（Ｙａｍａｎｅ他、１９９５年）。５-フルオロウラシル、すなわち５−ＦＵは、皮膚浸透の研究において親水性化合物の特質を検査するためのモデル化合物である。例えば、テルペンをポリレングルコール中に加えると（最大８０％）、皮膚中への流入速度を速めることができた。
【０２４６】
[00254]ジメチルイソソルビド（ＤＭＩ）は、医薬製剤に使える見込みがある別の浸透促進剤である。ＤＭＩは、比較的粘度の低い水溶性の液体である（Ｚｉａ他、１９９１年）。ＤＭＩは、水およびポリレングリコールと複合体を形成するが、ポリエチレングリコールとは形成しない。水と複合体を形成するＤＭＩのこの能力により、様々なステロイドの浸透を高める能力がこのビヒクルに与えられる。ＤＭＩ：水の比が１：２のときに最大の効果がみとめられた。文献の内容は、様々な製剤でＤＭを使用する際、ＤＭに対するｐＨの影響が考慮すべき重要な事柄であることを示唆している（Ｂｒｉｓａｅｒｔ他、１９９６年）。
【０２４７】
[00255]肺投与も使用してよい（例えば、吸入器またはネブライザー）、およびエアロゾル化剤を含む製剤により、あるいは、フルオロカーボンまたは合成の肺表面活性物質における潅流により。いくつかの実施形態では、トリグリセリドなど従来の結合剤およびビヒクルを用いて、坐剤として本発明の化合物を調製することができる。
【０２４８】
[00256]別の実施形態では、小胞、特にリポソーム中に入れて本発明の組成物を送達させることができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３頁；Ｔｒｅａｔ他、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、３５３〜３６５頁  １９８９年；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、３１７〜３２７頁を参照のこと。一般に同書を参照のこと。）
【０２４９】
[00257]さらに別の実施形態では、制御放出系で本発明の組成物を送達させることができる。一実施形態では、ポンプを使用してよい（Ｌａｎｇｅｒ、前掲書；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄ他、１９８０年、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７頁  Ｓａｕｄｅｋ他、１９８９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４頁を参照のこと）。別の実施形態では、高分子物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、ボカラトン、フロリダ州（１９７４年）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク（１９８４年）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３年、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１頁を参照のこと。Ｌｅｖｙ他、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇ他、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１頁；Ｈｏｗａｒｄ他、１９８９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５頁も参照のこと）。さらに別の実施形態では、治療しようとする標的部分（例えば、肝臓）の近くに制御放出系を配置することができ、そのため、全身投与量をごくわずかしか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、上述のＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２巻、１１５〜１３８頁（１９８４年）を参照のこと）。Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜Ｉ５３３頁による総説で論じられている他の制御放出系も使用してよい。
【０２５０】
[00258]本発明の組成物は、場合によっては追加の治療物質を含む好ましくは精製された形態である治療有効量の本発明の融合タンパク質、ならびに患者に適切な投与を行うための形態を与える適切な量の薬学的に許容されるビヒクルを含む。
【０２５１】
[00259]「ビヒクル」という用語は、本発明の組成物がそれとともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または担体を意味する。このような薬剤ヒビクルは、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など石油、動物、植物、合成由来のものを含めて、水や油などの液体でよい。薬剤ヒビクルは、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などでよい。さらに、佐剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤も使用してよい。患者に投与されるとき、本発明の組成物および薬学的に許容されるビヒクルは無菌状態であることが好ましい。本発明の化合物が静脈内に投与されるときは、水が好ましいビヒクルである。生理食塩水溶液ならびに水溶性デキストロースおよびグリセロールの溶液も、特に注射用液剤に、液体ビヒクルとして使用することができる。適切な薬剤ヒビクルとしては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も挙げられる。本発明の組成物は、必要なら、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。核酸ベースの化合物用の有効な送達ビヒクルの上記の組成物に対する濃度の好ましい範囲は、以下のとおりである。すなわち、エチルアルコール１５〜４０％；プロピレングリコール０．５〜５．０％；グリセリン０．５〜５．０％；ジメチルイソソルビド０．１〜２．０％；ポリエチレングリコールエステル（ラウレス（Ｌａｕｒｅｔｈ）−４として）０．１〜２．０％；ＥＤＴＡ二ナトリウム０．０１〜０．５％；パンテチン０．０１〜０．２％、２価の陽イオン（銅、マグネシウム、マンガン、亜鉛、銅リチウムなど）０．０１〜２％であり、水を加えて１００％とする。
【０２５２】
[00260]本発明の組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体含有カプセル剤、散剤、徐放剤、坐剤、乳濁液、エアロゾル、スプレー、懸濁液、または使用に適した他の任意の形態をとることができる。一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルはカプセルである（例えば、米国特許第５６９８１５５号を参照のこと）。適切な薬剤ヒビクルの他の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【０２５３】
[00261]例示的な実施形態では、常用の手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として本発明の組成物を調製する。通常、静脈内投与用の本発明の組成物は、無菌の等張性水性緩衝液に溶かした液剤である。必要であれば、この組成物は、可溶化剤も含んでよい。静脈内投与用の組成物は、場合によっては、注射部位の痛みを緩和するリグノカインなど局所麻酔薬を含んでよい。一般に、これらの成分は、例えば、活性な作用物質の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉容器中の凍結乾燥された乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位投与形態で別々にまたは混合して提供される。本発明の組成物を点滴によって投与しようとする場合、例えば、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する点滴瓶を用いて、これを投薬することができる。本発明の化合物を注射によって投与する場合は、投与前に成分を混合できるように、無菌の注射用水または生理食塩水入りのアンプルを提供してよい。
【０２５４】
[00262]経口送達用の本発明の組成物は、錠剤、ロゼンジ、水性または油性の懸濁剤、顆粒剤、散剤、乳剤、カプセル剤、シロップ、またはエリキシル剤の形態でよい。経口送達用の本発明の化合物および組成物は、食品および食品混合物に配合することもできる。経口投与される組成物は、薬剤として味が良い調製物を提供するために、１種または複数の任意選択の作用物質、例えば、フルクトース、アスパルテーム、またはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはサクランボなどの矯味剤、着色剤、および保存剤を含有してよい。さらに、錠剤または丸剤の形の場合は、胃腸管での崩壊および吸収を遅らせて、それにより、より長い期間にわたる持続作用を提供するために、これらの組成物をコーティングしてもよい。浸透圧的に活性な押出し作用のある（driving）化合物を取り囲む選択的透過性の膜も、経口投与される本発明の組成物に適している。これら後者のプラットフォームでは、カプセルを取り囲む周辺からの液体が、膨張して薬剤または医薬組成物をすき間の外へ追い出す押出し作用のある化合物により吸収される。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤の鋭いピークのあるプロファイルとは対照的に、ほぼゼロ次の送達プロファイルを与えることができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延物質も使用してよい。経口用組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど標準的なビヒクルを含んでよい。このようなビヒクルは、医薬品グレードであることが好ましい。
【０２５５】
[00263]本明細書で開示する個々の障害または病態の治療に有効と考えられる本発明の組成物の量は、その障害または病態の性質に応じて変わると考えられ、標準の臨床的技術によって決定することができる。さらに、最適な用量域を確定するのを助けるために、場合によっては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを使用してよい。組成物中で使用する正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重症度に応じても変わると考えられ、施術者の判断および各患者の状況によって決定すべきである。しかし、経口投与に適した用量域は、一般に、体重１キログラム当たり約０．０１ナノモル（「ｎｍｏｌ」）〜２００ミリモル（「ｍｍｏｌ」）の本発明の融合タンパク質である。本発明の特に好ましい実施形態では、経口用量は、体重１キログラム当たり０．０１ｎｍｏｌ〜７０ｍｍｏｌ、より好ましくは体重１キログラム当たり０．１ｎｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、より好ましくは体重１キログラム当たり０．５ｎｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌ、さらにより好ましくは体重１キログラム当たり１ｎｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌである。最も好ましい実施形態では、経口用量は、体重１キログラム当たり５ｎｍｏｌの本発明の組成物である。本明細書で記述する投与量は、投与される合計量を意味する。すなわち、複数の本発明の組成物が投与される場合は、好ましい投与量は、投与される本発明の化合物の合計量に相当する。経口用組成物は、１０重量％〜９５重量％の有効成分を含有することが好ましい。
【０２５６】
[00264]静脈内（ｉ．ｖ．）投与に適した用量域は、体重１キログラム当たり０．０１ｎｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌ、体重１キログラム当たり０．１ｎｍｏｌ〜３５ｍｍｏｌ、体重１キログラム当たり１ｎｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌである。鼻腔内投与に適した用量域は、一般に、約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重である。坐剤は、通常、体重１キログラム当たり０．０１ｎｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌの本発明の組成物を含有し、０．５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含む。皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下、大脳内、腟内、経皮投与または吸入による投与に推奨される投与量は、体重１キログラム当たり０．００１ｎｍｏｌ〜２００ｍｍｏｌの範囲である。本発明の化合物の局所投与に適した用量は、化合物が投与される部分によって、０．００１ｎｍｏｌ〜１ｍｍｏｌの範囲である。有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系から誘導した用量反応曲線から推定することができる。このような動物モデルおよび系は、当技術分野では公知である。
【０２５７】
[00265]（例えば、良性前立腺肥大症などの治療のための）非経口投与の場合は、標的細胞選択性を与えるために、ヒト前立腺に特異的なタンパク質を標的とする抗体に結合されているリポソーム「膜」中に、本発明の組成物を封入してよい。製剤の個々の性質は、所望の投与経路、例えば、局所、非経口、経口、直腸、外科的埋め込みによって、または他の局所（前立腺内への）送達の手段に応じて決定する。用量は、投与経路に対して決定する。組成物中のオリゴヌクレオチドまたはリボザイムの量は、組成物の約０．０１〜９９重量％の範囲でよい。前立腺の直接治療は、超音波検査による管理下で少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる適切な調製物を会陰投与することを含んでよい。過形成の部位または外腺中に注射を行ってよい。同様の手法が、抗生物質を前立腺内に注射することによる、慢性前立腺炎の治療について報告されている（Ｊｉｍｅｎｅｚ他、１９８８年）。これらの研究では、注射中および注射後の疼痛とともに、注射後の一過性の血精液症だけが、この治療法で認められる有害事象であった。
【０２５８】
[00266]直腸投与用の組成物は、例えば、結合剤、潤滑剤、および崩壊剤を含めて、通常の薬剤賦形剤の任意のものを用いて調製する。この組成物は、脂肪族スルホキシドなどの細胞浸透促進剤も含んでよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、坐剤の形である。
【０２５９】
[00267]本発明は、セクション５．２０で論じたように、１種または複数の本発明の化合物を詰めた１種または複数の容器を含む薬剤パックまたはキットも提供する。場合によっては、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって規定された形式の注意書きをこれらの容器に付けてよい。この注意書きは、ヒトへの投与を目的とする製造、使用、または販売をその機関に承認されていることを示すものである。
【０２６０】
[00268]ヒトでの使用に先立って、所望の治療活性または予防活性があるかｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の化合物を検定することが好ましい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、本発明の個々の組成物、または本発明の組成物の組合せ物が、本明細書で記述する疾患または障害を治療または改善するのに好ましいかどうか決定することができる。動物モデル系によっても、本発明の組成物が有効かつ安全であることを実証することができる。
【０２６１】
経口投与
[00269]特定の実施形態では、経口送達用に融合タンパク質を調製することができる。具体的には、ある種のクラスの疾患または病態を治療するのに使用されるいくつかの本発明の融合タンパク質は、特に経口製剤および経口送達に応ずべきことがある。このようなクラスの疾患または病態としては、それだけには限らないが、急性疾患、慢性疾患、および再発性疾患が挙げられる。慢性疾患または再発性疾患としては、それだけには限らないが、ウイルス性の疾患または感染症、癌、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、貧血、心血管疾患、精神異常、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の異常、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸管疾患が挙げられる。これらのクラスの疾患の例としては、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、およびアルツハイマー病が挙げられる。多くの慢性疾患では、本発明の融合タンパク質の経口製剤および投与方法は、注射治療または薬剤プロトコールに依拠しない自宅での経口投与による長期の患者看護および治療を可能とするため、特に有用である。
【０２６２】
[00270]本発明の融合タンパク質を含む経口製剤および送達方法は、一部には、様々な受容体を介した、胃腸管（ＧＩ）上皮を通過するトランスサイトーシスを利用している。例えば、トランスフェリン受容体は、ヒトＧＩ上皮中に極めて高密度で存在しており、トランスフェリンは、トリプシンおよびキモトリプシンの消化に対する耐性が極めて高く、Ｔｆの化学結合体は、ＧＩ上皮を通過してタンパク質およびペプチドを成功裡に送達するのに使用されている（Ｘｉａ他、（２０００年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ、Ｔｈｅｒａｐ．、２９５：５９４〜６００頁；Ｘｉａ他（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．、１８（２）：１９１〜１９５頁；およびＳｈａｈ他（１９９６年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．、８５（１２）：１３０６〜１３１１頁、これらすべての全体を参照により本明細書に組み込む）。ＧＩ上皮を通過して輸送された後、本発明の融合タンパク質は、より長い血清半減期を示す。すなわち、第２のペプチドまたはタンパク質に結合されまたは挿入されたＥＰＭペプチドは、融合されていない状態のＥＰＭペプチドと比べると、より長い血清半減期を示す。例えば胃の酵素により消化されるために、経口投与に適さない本発明の融合タンパク質は、本明細書で記述し、または当業者には既知の他の技術によって投与することができる。
【０２６３】
[00271]本発明の融合タンパク質の経口製剤は、ＧＩ上皮への輸送ならびに胃における融合タンパク質成分および他の有効成分の保護に適するように調製することができる。このような製剤は、担体成分および分散剤成分を含んでよく、また、咀嚼錠、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁剤、乳剤、カシェ剤もしくはペレット顆粒剤、および分散性の散剤を含めて、エアロゾル（経口送達または肺送達用）、シロップ、エリキシル剤、錠剤を含めて、任意の形態でよい。正確な用量を簡単かつ好ましくは経口的に投与するのに適した固体剤形で融合タンパク質製剤を使用することが好ましい。経口投与用の固体剤形は、錠剤、カプセル剤などが好ましい。
【０２６４】
[00272]錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与する場合は、その組成物が、有効な応答を生じさせるために十分な量の有効成分を宿主が吸収できるようにすることを確実にするように注意をすべきである。したがって、例えば、理論的に必要とされる量より多く融合タンパク質の量を増やしてもよく、あるいは、胃の中で酵素作用からポリペプチドを保護するためにコーティングまたはカプセル化など他の既知の手段を用いてもよい。
【０２６５】
[000273]従来、ペプチド薬物およびタンパク質薬物は、非経口的ではない方法で、特に経口的に投与すると生物学的利用能が低いため、注射によって投与されてきた。これらの薬物は、化学的に、かつ立体配座的に不安定になりやすく、しばしば、胃の中の酸性条件、ならびに胃および胃腸管中の酵素によって分解される。これらの送達時の問題に対応して、疎水性主鎖および親水性分枝を有するポリマーから構成される薬物担体としてのナノ粒子へのカプセル化、微粒子へのカプセル化、乳濁液中のリポソームへの組入れ、ならびに他の分子への結合など、経口送達するためのいくつかの技術が開発されている。これらはすべて、本発明の融合タンパク質とともに使用することができる。
【０２６６】
[00274]ナノ粒子の例としては、キトサンおよびカーボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）でコーティングされた粘膜付着性ナノ粒子（Ｔａｋｅｕｃｈｉ他、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４７（１）：３９〜５４頁、２００１年）、ならびに帯電した組合せポリエステル、すなわちポリ（２−スルホブチル−ビニルアルコール）およびポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を含有するナノ粒子（Ｊｕｎｇ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１４７〜１６０頁、２０００年）が挙げられる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド部分および陽イオン性のポリビニルアミン基を有する表面ポリマーを含有するナノ粒子は、ラットに経口投与した際、サケカルシトニン吸収の上昇を示した。
【０２６７】
[00275]ポリリジンで強化した、アルギネートおよびペクチンから構成される薬物送達粒子は、酸および塩基に比較的耐性があり、薬物用の担体として使用することができる。これらの粒子は、生体接着性、吸収の促進、および徐放の利点を組み合わせている（Ｌｉｕ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１（２）：１４１〜１４９頁、１９９９年）。
【０２６８】
[00276]さらに、合成ソマトスタチンなどのペプチドのＮ末端およびＣ末端に結合されたリポアミノ酸基およびリポサッカライド基は、両親媒性の界面活性剤を生じ、生物活性の保持された組成物を生じることが示された（Ｔｏｔｈ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２（１９）：４０１０〜４０１３頁、１９９９年）。
【０２６９】
[00277]他のペプチド送達技術の例としては、目的のペプチドと、ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンおよびカーボポルまたはタウロコラートおよびカーボポルとを含有する、カーボポルでコーティングした粘膜付着性乳剤が挙げられる。これらは、血清カルシウム濃度を低下させるためにラットに経口投与した際、有効であることが示された（Ｏｇｉｓｏ他、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４（６）：６５６〜６６１頁、２００１年）。ホスファチジルコリンから誘導したホスファチジルエタノールが、インスリンの担体としてホスファチジルエタノールを含有するリポソームを調製するのに使用された。これらのリポソームは、ラットに経口投与された際、活性であることが示された（Ｋｉｓｅｌ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２１６（１〜２）：１０５〜１１４頁、２００１年）。
【０２７０】
[00278]インスリンは、インスリンとアプロチニンやバシトラシンなどのプロテアーゼ阻害剤とを含有するポリ（ビニルアルコール）ゲル球体中にも配合されている。これらのゲル球体のグルコースを低下させる特性は、腸管下部で多量にインスリンが放出されるラットにおいて実証されている（Ｋｉｍｕｒａ他、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９（６）：８９７〜９００頁、１９９６年）。
【０２７１】
[00279]界面活性剤を用いて油相中に分散された、ポリ（アルキルシアノアクリレート）で作製されたナノ粒子を用いて（Ｄａｍｇｅ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（１２）：１４０３〜１４０９頁、１９９７年）、また、キトサンでコーティングしたアルギン酸カルシウムビーズを用いても（Ｏｎａｌ他、Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（３）：２２９〜２３７頁、２００２年）、インスリンの経口送達が研究されている。
【０２７２】
[00280]他の方法では、ペプチドのＮ末端およびＣ末端がポリエチレングリコール、次にアリル鎖に連結されて、酵素分解に対する耐性が高まり、ＧＩ壁を通過する拡散性が高まった結合体が形成される（ｗｗｗ．ｎｏｂｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。
【０２７３】
[00281]「ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）」は、ペプチドと非共有結合的に相互作用して、保護性の被膜または層を作り出す陽イオン性の脂質混合物である。このペプチド−脂質複合体は、細胞の原形質膜と融合することができ、そのペプチドは、細胞中に内在化される（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）。
【０２７４】
[00282]リポソームを出発原料として使用する方法では、渦巻形の粒子が薬剤ヒビクルとして開発されている。主として負に帯電した脂質を含有するリポソームの懸濁液にペプチドを加える。カルシウム添加により、リポソームの崩壊および融合が起こり、脂質二重層から構成される大きな薄い層が生じ、次いで、この二重層が自然発生的にくるまり、または積み重なって渦巻形になる（米国特許第５８４０７０７号；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｌｉｖｅｒｙｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）。
【０２７５】
[00283]経口使用するための融合タンパク質を含む組成物は、医薬組成物を製造するための当技術分野で知られている任意の方法に従って調製してよく、これらの組成物は、それだけには限らないが、薬剤として質が良く味が良い調製物を提供するための甘味剤を含めて、１種または複数の作用物質を含有してよい。例えば、経口的に送達可能な錠剤を調製するために、融合タンパク質を少なくとも１種の薬剤賦形剤と混合し、既知の方法により固体配合物を圧縮して胃腸管へ送達させるための錠剤を形成させる。錠剤組成物は、通常、添加剤、（例えば、サッカライドまたはセルロースの担体）、デンプン糊やメチルセルロースなどの結合剤、増量剤、崩壊剤、あるいは医薬品調製物の製造で通常一般に使用される他の添加剤と配合する。経口的に送達可能なカプセル剤を調製するために、ＤＨＥＡを少なくとも１種の薬剤賦形剤と混合し、固体配合物を胃腸管へ送達させるのに適したカプセル容器中に入れる。参照により本明細書に組み込むＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  １９９０年（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２）８９章で一般的に記載されているようにして、融合タンパク質を含む組成物を調製することができる。
【０２７６】
[00284]前述したように、本発明の経口製剤の多くは、胃の環境からの保護および腸内での生物活性物質の放出を可能にさせる不活性成分を含有してよい。このような製剤、または腸溶コーティングは、当技術分野で公知である。例えば、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合した、融合タンパク質を含有する錠剤を使用してよい。これらの賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど不活性な希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、またはアカシア、ならびに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクでよい。
【０２７７】
[00285]錠剤は、コーティングされていなくてもよく、あるいは、胃腸管での崩壊および吸収を遅らせ、それによってより長い期間にわたる持続作用を提供するために、既知の技術を用いてコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルやジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を、単独でまたはワックスとともに使用してよい。
【０２７８】
[00286]経口使用用製剤は、有効成分が不活性な固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセル剤として、または、有効成分が水溶性溶媒または油性溶媒、例えば、ラッカセイ油、ピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセル剤として、提供してもよい。
【０２７９】
[00287]水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合して融合タンパク質を含有してよい。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアガムであり、分散剤または湿潤剤は、天然のリン脂質、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアラート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えば、ヘプタデシルエチルオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートなど、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導した部分エステルとの縮合生成物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導した部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートでよい。水性懸濁剤は、１種または複数の保存剤、例えば、エチルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種または複数の着色剤、１種または複数の矯味剤、およびスクロースやサッカリンなど１種または複数の甘味剤を含有してもよい。
【０２８０】
[00288]油性懸濁剤は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油中に、または、流動パラフィンなどの鉱物油中に有効成分を懸濁させることによって調製することができる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば、蜜蝋、硬パラフィン、またはセチルアルコールを含有してよい。味が良い経口用調製物を提供するために、前述したものなどの甘味剤、および矯味剤を加えてよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって、保存することができる。
【０２８１】
[00289]水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散性の散剤および顆粒剤は、有効成分、ならびに分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および１種または複数の保存剤との混合物を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、既に上述したものによって例示されている。追加の賦形剤、例えば、甘味剤、矯味剤、および着色剤も存在してよい。
【０２８２】
[00290]融合タンパク質を含有する医薬組成物は、水中油型乳剤の形でもよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱物油、例えば、アカシアガムもしくはトラガカントガム、天然のリン脂質、例えば大豆レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導したエステルもしくは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレアート、および同じ部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートでよい。乳剤は、甘味剤および矯味剤を含有してもよい。
【０２８３】
[00291]融合タンパク質を含有するシロップおよびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトール、またはスクロースと配合してよい。これらの製剤は、粘滑剤、保存剤、ならびに矯味剤および着色剤を含有してもよい。医薬組成物は、無菌の注射用調製物の形態、例えば無菌の注射用の水性または油性懸濁液であってよい。この懸濁液は、前述した適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いる既知の技術に従って調製することができる。無菌の注射用調製物は、非毒性の非経口的投与が許容される希釈剤または溶媒和化合物に溶かした無菌の注射用溶液または懸濁液、例えば、１，３-ブタンジオール溶液であってもよい。使用してよい許容されるビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、従来、溶媒または懸濁溶媒として使用されている。この段階では、合成のモノまたはジグリセリドを含めて、任意の無刺激性の不揮発油を使用してよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製で使用される。
【０２８４】
[00292]医薬組成物は、ポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、プロテイノイドマイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェア、および脂質ベースの系を用いて、経口送達用に調製することもできる（例えば、ＤｉＢａｓｅおよびＭｏｒｒｅｌ、Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳａｎｄｅｒｓおよびＨｅｎｄｒｅｎ（編）、２５５〜２８８頁（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７年）を参照のこと）。
【０２８５】
[00293]薬剤として活性な融合タンパク質の担体および／または他の物質に対する比率は、約０．５〜約１００重量％（重量パーセント）に変動してよい。経口的に使用する場合、医薬製剤は、一般に、約５〜約１００重量％の活性物質を含有する。他の用途の場合、製剤は、一般に約０．５〜約５０重量％の活性物質を有する。
【０２８６】
[00294]本発明で使用する融合タンパク質製剤は、個体に投与すると、疾患の症状を改善するための治療有効量の融合タンパク質を与える。
【０２８７】
[00295]本発明の融合タンパク質組成物は、必ずしもそうではないが、症状を改善するための有効量を毎日投与してよい。一般に、合計日用量は、経口投与で、１日当たり少なくとも約１ｍｇ、好ましくは少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０ｍｇ、好ましくは少なくとも約２５ｍｇ、好ましくは少なくとも約５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約１００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約２００ｍｇ、好ましくは５００ｍｇ以下である。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質組成物は、必ずしもそうではないが、毎日、１日１回以上（例えば、それぞれ融合タンパク質５０ｍｇを含有する４つのカプセル剤または錠剤を６時間毎）投与してよい。経口送達用のカプセル剤または錠剤は、好都合なことに、経口投与する１日量の全量まで、例えば２００ｍｇ以上を含有することができる。
【０２８８】
[00296]特に好ましい一実施形態では、融合タンパク質を含む経口用医薬組成物を緩衝化した液体の形態に調製し、次いでそれらを軟質または硬質のコーティングをしたゼラチンカプセル中に封入し、次いで適切な腸溶コーティングでコーティングする。本発明の経口用医薬組成物の場合、放出場所は、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）、または大腸を含めて、ＧＩ系のどこでもよい。
【０２８９】
[00297]別の実施形態では、既知の放出遅延剤形により、本発明の融合タンパク質を含めて有効成分をＧＩ系に緩徐に放出するように本発明の経口用組成物を調製する。
【０２９０】
[00298]本発明の医薬製剤のいくつかでは、ＥＰＭペプチドと第２のペプチド部分の間に切断部位を含むように、融合タンパク質を人工的に設計する。このような切断可能な部位またはリンカーは、当技術分野では既知である。
【０２９１】
[00299]本発明の医薬組成物および本発明の方法は、融合タンパク質がＧＩ上皮を通過して移動するのを促進するためにトランスサイトーシス促進剤を添加することを含んでよい。このような促進剤は、当技術分野で既知である。Ｘｉａ他、（２０００年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．、２９５：５９４〜６００頁；およびＸｉａ他（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．、１８（２）：１９１〜１９５頁を参照のこと。
【０２９２】
[00300]本発明の好ましい実施形態では、経口用医薬製剤は、前述したような、Ｎ末端でＥＰＭペプチドに融合され、グリコシル化が低減されまたはされていない第２のペプチド部分を含む融合タンパク質を含む。このような医薬組成物は、有効量の融合タンパク質を含む医薬組成物を経口投与することによって、糖尿病などグルコースのバランスが異常な疾患を治療するのに使用することができる。
【０２９３】
[00301]融合タンパク質の有効量は、糖尿病の症状など、患者の個々の疾患状態に付随する症状を軽減するために計算される投与量を含めて、いくつかの方法で測定することができる。他の製剤では、患者の血中グルコースレベルに検出可能な変化を起こす有効量の融合タンパク質を含むように、投与量を計算する。このような血中グルコースの検出可能な変化には、約１％〜９０％、または約５％〜約８０％の血中グルコースレベルの低下が含まれ得る。これらの血中グルコースレベルの低下は、治療する疾患の状態に応じて変わると考えられ、各患者に対して望ましい結果を実現するように、医薬組成物または投与方法を変えることができる。他の事例では、患者のＥＰＭペプチドの活性レベル上昇を検出するために、医薬組成物を調製し、投与方法を変える。このような製剤および方法は、約１ｐｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１００ｎｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１００μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１μｇ〜約１ｇの融合タンパク質、約１０μｇ〜約１００ｍｇの融合タンパク質、または約１ｍｇ〜約５０ｍｇの融合タンパク質を送達することができる。改変されたＥＭＰ−１活性の単位測定法によって製剤を計算してもよい。重量または活性の測定値は、既知の基準を用いて、Ｔｆに融合された各ＥＰＭペプチドについて計算することができる。
【０２９４】
[00302]本発明は、本発明の医薬組成物を経口投与する方法も含む。これらの方法は、それだけには限らないが、患者または介護者が組成物を経口投与するステップを含む。このような投与ステップは、融合タンパク質、疾患もしくは患者の病態、または個々の患者に応じて、１日に１回または２回などの間隔で投与することを含んでよい。このような方法は、個々の融合タンパク質を様々な投与量で投与することも含んでよい。例えば、医薬組成物の初回投与量は、血中グルコースレベルの低減など所望の効果を誘導するためにはより高いレベルでよい。次いで、所望の効果が達成された後で、その後の投与量を減らしてよい。投与プロトコールのこのような変更または修正は、主治医または健康管理者が行ってよい。患者が血中グルコースレベルを測定し、本発明の融合タンパク質経口用組成物を投与しているような場合には、投与プロトコールの変更は、個々の患者が行ってよい。
【０２９５】
[00303]本発明は、本発明の融合タンパク質を経口投与の可能な形態に調製することを含む、本発明の経口用組成物または医薬組成物を作製する方法も含む。他の事例では、本発明は、本発明の融合タンパク質を経口投与に適した形態に調製することを含む、本発明の組成物または医薬組成物を作製する方法を含む。
【０２９６】
[00304]さらに、本発明は、融合タンパク質製剤の肺送達も含む。肺送達は、特に、他の投与経路によって送達するのが困難な高分子の送達に有望である。肺に送達された薬物は肺胞部分を通って直接血液循環中へ容易に吸収されるため、このような肺送達は、全身的送達にも、肺疾患を治療するための局所的送達にも有効となり得る。
【０２９７】
[00305]本発明は、様々な病態または疾患を治療するための経口吸入（肺送達）用の薬物分散系を形成するのに適した組成物を提供する。融合タンパク質製剤は、液体ネブライザー、エアロゾルによる計量吸入器（ＭＤＩ）、および乾燥粉末散布装置など様々な手法によって送達することができる。肺送達用の組成物を調製する際、安定性、分散性、粘度、および／または膨張性を与えて対象の肺に均一に組成物が送達されるのを促進するために、表面活性剤または界面活性剤およびバルク担体を含めて、薬学的に許容される担体が一般に加えられる。
【０２９８】
[00306]表面活性剤または界面活性剤は、粘膜または粘膜層を通過してのポリペプチドの吸収を促進する。有用な表面活性剤または界面活性剤としては、脂肪酸およびその塩、胆汁酸塩、リン脂質、またはアルキルサッカライドが挙げられる。脂肪酸およびその塩の例としては、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、およびミリスチン酸（Ｃ１４）のナトリウム、カリウム、およびリシン塩が挙げられる。胆汁酸塩の例としては、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、およびウルソデオキシコール酸が挙げられる。
【０２９９】
[00307]リン脂質の例としては、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、およびリゾホスファチジルセリンなどの１本鎖リン脂質、またはジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルイノシトール、およびジアシルホスファチジルセリンなどの２本鎖リン脂質が挙げられる。アルキルサッカライドの例としては、デシルグルコシドやドデシルマルトシドなどのアルキルグルコシドまたはアルキルマルトシドが挙げられる。
【０３００】
[00308]担体として有用な薬剤賦形剤としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）や組換えヒトアルブミンなどの安定化剤；糖質、アミノ酸、およびポリペプチドなどの増量剤；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩などが挙げられる。これらの担体は結晶質でも非晶質でもよく、または、それら２種の混合物でもよい。
【０３０１】
[00309]増量剤として使用する糖質の例としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、トレハローズなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン;ならびにラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖類;マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが挙げられる。増量剤として使用するポリペプチドの例としては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニンおよびグリシンが挙げられ、グリシンが好ましい。
【０３０２】
[00310]噴霧乾燥する間、立体配座を安定させるために、また、散剤の分散性をより良くするために、組成物の微量成分である添加剤を含めてよい。これらの添加剤としては、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸が挙げられる。
【０３０３】
[00311]適切なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなど、有機の酸および塩基から調製した有機塩が挙げられ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０３０４】
[00312]肺送達用の融合タンパク質組成物は、単位用量で包装してよく、その場合、治療有効量の組成物がブリスター包装、ゼラチンカプセル剤など単位用量の容器中に入れられる。ブリスター包装またはゼラチンカプセル剤の製造は、通常、包装技術分野で一般に公知である方法によって実施される。
【０３０５】
[00313]米国特許第６５２４５５７号は、（ａ）ＨＦＡ噴霧剤；（ｂ）噴霧剤中に分散する薬剤として活性なポリペプチド；および（ｃ）気道下部でのポリペプチドの全身的吸収を高める、Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸もしくはその塩、胆汁酸塩、リン脂質、またはアルキルサッカライドである界面活性剤を含む、医薬用エアロゾル製剤を開示している。本発明は、このような製剤の製造方法、および患者の治療におけるこれらの製剤の使用も提供する。
【０３０６】
[00314]乾燥散剤を肺に送達するための１つの方法は、圧縮ガスの供給源を提供するための手動ポンプがついた手持形装置を利用する。加圧ガスが、ベンチュリノズルなどの粉末散布装置を通して急激に放出され、分散された散剤を患者が吸入に利用できるようになる。
【０３０７】
[00315]乾燥散剤分散装置は、いくつかの特許で記載されている。米国特許第３９２１６３７号では、粉末状の医薬品入りの１つのカプセルを突き抜くための針が付いた手動ポンプを記載している。医薬品入りの複数のディスクまたはストリップ容器の使用は、欧州特許出願ＥＰ０４６７１７２；国際特許公報ＷＯ９１／０２５５８；およびＷＯ９３／０９８３２；米国特許第４６２７４３２号；第４８１１７３１号；第５０３５２３７号；第５０４８５１４号；第４４４６８６２号；第５０４８５１４号、および第４４４６８６２号に記載されている。
【０３０８】
[00316]タンパク質治療物質のエアロゾル投与は、欧州特許出願ＥＰ０２８９３３６で開示されている。治療用エアロゾル製剤は、国際特許公報ＷＯ９０／０９７８１で開示されている。
【０３０９】
[00317]本発明は、経口吸入用に融合タンパク質を調製することを提供する。この製剤は、融合タンパク質および肺送達をするのに適した薬剤賦形剤を含む。本発明は、融合タンパク質組成物を必要とする対象に、経口吸入によってそれを投与することも提供する。
【０３１０】
経皮送達
[00318]本発明は、経皮送達用の融合タンパク質を調製することも提供する。経皮系は、皮膚を通して治療用製剤を血流中へ送達させ、それらを投与しやすくする。受動および能動的な経皮送達系は、痛みが無く、副作用をほとんど生じないように、一定の濃度で医薬品を送達するのに使用される。融合タンパク質は、微細針、および皮膚パッチなど他の手段を用いて、経皮的に送達することができる。Ｈｅｎｒｙ他は、試験薬物に対する皮膚の透過性を高めるために、微細針で皮膚を機械的に刺す方法を論じている（参照により本明細書に組み込む、Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｎｅｅｄｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ、ＩＥＥＥ  １１ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒａ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９８年）、４９４〜４９８頁）。
【０３１１】
トランスジェニック動物
[00319]血清半減期がより長く、血清安定性がより高く、または生物学的利用能がより大きい本発明の融合タンパク質を含む、トランスジェニック非ヒト動物の作製が、本発明の一実施形態で企図される。
【０３１２】
[00320]トランスジェニック非ヒト動物の成功裡な作製が、例えば、米国特許第６２９１７４０号（２００１年９月１８日発行）；米国特許第６２８１４０８号（２００１年８月２８日発行、）；および米国特許第６２７１４３６号（２００１年８月７日発行）などいくつかの特許および出版物で記載されている。これらの内容の全体を、参照により本明細書に組み込む。
【０３１３】
[00321]雌牛、ブタ、ヤギ、ウマ、畜牛、およびヒツジを含めて、家畜哺乳動物などの動物の遺伝的性質を改変することができると、いくつかの商業的な応用が可能となる。これらの応用には、大量の外来性タンパク質を容易に回収できる形態で発現する（例えば、乳汁または血液中への発現）動物の作製、体重増加、飼料効率、枝肉構成、乳汁産生量または含有量、耐病性、および特定の微生物による感染に対する抵抗性を向上させた動物の作製、ならびに、成長速度または生殖能力が高められた動物の作製が含まれる。ゲノム中に外来性ＤＮＡ配列を有する動物は、トランスジェニック動物と呼ばれる。
【０３１４】
[00322]トランスジェニック動物を作製するために最もよく使用される方法は、受精した胚の前核中へのＤＮＡのマイクロインジェクションである（Ｗａｌｌ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３頁［１９９２年］）。トランスジェニック動物を作製するための他の方法には、胚にレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを感染させることが含まれる。野生型または組換えレトロウイルスによる、着床前および着床後マウス胚の双方の感染が報告されている（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：１２６０頁［１９７６年］；Ｊａｎｅｎｉｃｈ他、Ｃｅｌｌ  ２４：５１９頁［１９８１年］；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７１５１頁［１９８４年］；Ｊａｈｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６９２７頁［１９８５年］；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６１４８〜６１５２頁［１９８５年］；Ｓｔｅｗａｒｔ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３８３〜３８８頁［１９８７年］）。
【０３１５】
[00323]胚をレトロウイルスに感染させるための代替手段は、マウス胚の分割腔中にウイルスまたはウイルス産生細胞を注入することである（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ２９８：６２３頁［１９８２年］）。妊娠中期のマウス胚の子宮内レトロウイルス感染による、マウスの生殖細胞系への導入遺伝子の導入が報告されている（Ｊａｈｎｅｒ他、前掲書［１９８２年］）。トランスジェニック動物を作り出すためにウシ胚およびヒツジ胚をレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターで感染させることが報告されている。これらのプロトコールは、レトロウイルス粒子、または受精卵もしくは初期胚の囲卵腔中にレトロウイルス粒子を放出する、増殖を停止させた（すなわち、マイトマイシンＣ処理した）細胞のマイクロインジェクションを含む（ＰＣＴ国際出願ＷＯ  ９０／０８８３２［１９９０年］；ならびにＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、４０：３８６頁［１９９５年］）。ＰＣＴ国際出願ＷＯ９０／０８８３２は、２〜８細胞期のヒツジ胚の囲卵腔中への野生型ネコ白血病ウイルスＢの注入について記載している。注入を受けた胚に由来する胎児は、複数の組込み部位を有することが示された。
【０３１６】
[00324]米国特許第６２９１７４０号（２００１年９月１８日発行）は、分裂細胞に形質導入するレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルスに由来するベクター［ＭＬＶ］）を用いて、成熟前の卵母細胞および未受精の成熟卵母細胞（すなわち、受精前卵母細胞）中に外来性ＤＮＡを導入することによって、トランスジェニック動物を作製することを記載している。この特許では、サイトメガロウイルスプロモータ、ならびにマウス乳がんＬＴＲによって駆動して様々な組換えタンパク質を発現するための方法および組成物も記載している。
【０３１７】
[00325]米国特許第６２８１４０８号（２００１年８月２８日発行）は、胚性幹細胞を用いてトランスジェニック動物を作製するための方法を記載している。簡潔に言うと、桑実胚との混合細胞共培養で胚性幹細胞を用いて、トランスジェニック動物を生じさせる。例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはレトロウイルス送達によって、共培養の前に、胚性幹細胞中に外来の遺伝物質を導入する。ネオマイシンなどの選択マーカーにより遺伝子の組込みを調べて、このようにしてトランスフェクトされたＥＳ細胞を選別する。
【０３１８】
[00326]米国特許第６２７１４３６号（２００１年８月７日発行）は、始原生殖細胞の単離、始原生殖細胞由来の細胞系を作製するためにこれらの細胞を培養すること、始原生殖細胞と培養した細胞系の双方を形質転換すること、これらの形質転換された細胞および細胞系を用いてトランスジェニック動物を生じさせることを含む方法を用いたトランスジェニック動物の作製について記載している。トランスジェニック動物が生じる効率は大きく上昇し、それによって、非げっ歯類のトランスジェニック動物種を作製する際に相同組換えを使用することが可能になる。
【０３１９】
遺伝子療法
[00327]第２のペプチドドメインがＥＰＭペプチドに結合されている融合タンパク質の遺伝子療法への利用が、本発明の一実施形態で企図される。血清半減期または血清安定性が向上した本発明の融合タンパク質は、遺伝子療法の治療に申し分なく適している。
【０３２０】
[00328]遺伝子療法を用いて可溶性の融合タンパク質を発現させるのに成功したことが、説明されている。簡潔に言うと、細胞障害性リンパ球抗体４（ＣＴＬＡ４）およびヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ部分からなる可溶性の融合タンパク質をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターを注入することによる遺伝子療法が、最近、Ｉｊｉｍａ他（２００１年６月１０日）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（米国）１２／９：１０６３〜７７頁で示された。遺伝子療法のこの応用例では、ベクターを関節内注射することによって、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎のマウスモデルを治療するのに成功した。
【０３２１】
[00329]遺伝子療法は、米国特許第６２２５２９０号（２００１年５月１日発行）、米国特許第６１８７３０５号（２００１年２月１３日発行）、および米国特許第６１４０１１１号（２０００年１０月３１日発行）を含めて、いくつかの米国特許でも記載されている。
【０３２２】
[00330]米国特許第６２２５２９０号は、それによって哺乳動物対象の腸上皮細胞が、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を作動的に組み込むように遺伝的に改変される、方法および構築物を提供する。腸細胞の形質転換は、主として裸のＤＮＡからなる製剤を投与することによって行い、このＤＮＡは経口投与することができる。経口または他の胃腸内の投与経路は、簡単な投与方法であると同時に、裸の核酸の使用により、遺伝子療法を行うためのウイルスベクターの使用に付随する合併症が回避される。発現されたタンパク質は、胃腸管および／または血流中に直接分泌されて、タンパク質が治療効果のある血中レベルになり、それによって、そのタンパク質を必要とする患者を治療する。形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠乏に関連した疾患またはタンパク質の過剰発現による治療の影響を受けやすい疾患に対する短期または長期の治療看護を与える。
【０３２３】
[00331]米国特許第６１８１３０５号は、脊椎動物、特に哺乳動物由来の細胞における遺伝子またはＤＮＡ標的化の方法を提供する。簡潔に言うと、相同組換え、または予め選択した部位の１次細胞もしくは２次細胞のゲノムＤＮＡ中に導入されるＤＮＡの標的化によって、ＤＮＡを脊椎動物由来の１次もしくは２次細胞中に導入する。
【０３２４】
[00332]米国特許第６１４０１１１号（２０００年１０月３１日発行）は、遺伝子療法用のレトロウイルスベクターを記載している。開示されているレトロウイルスベクターは、目的遺伝子の挿入部位を含み、多種多様のトランスフェクトされた細胞型において、目的遺伝子に由来するタンパク質を高レベルで発現することができる。選択マーカーを欠き、したがって、抗生物質などのマーカー産物を同時発現させずに様々な疾患状態を治療する上でヒト遺伝子療法に適切になっている、レトロウイルスベクターも開示されている。これらのレトロウイルスベクターは、ある種のパッケージング細胞系で使用するのに特に適している。レトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞のゲノム中に入り込む能力を有するため、ヒトおよび動物の遺伝病の遺伝子療法で使用するための特に有望な候補となっている。遺伝子療法は、通常、（１）新しい遺伝物質を患者細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで加えること、または（２）体から患者の細胞を取り出し、新しい遺伝物質をその細胞に加え、それらの細胞を体に再導入すること、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子療法を含む。レトロウイルスベクターを用いて様々な細胞で遺伝子療法を実施する方法の考察は、例えば、参照によりその開示内容を本明細書に組み込む、１９８９年９月１９日発行の米国特許第４８６８１１６号および１９９０年１２月２５日発行の米国特許第４９８０２８６号（上皮細胞）、１９８９年８月１０日公開のＷＯ８９／０７１３６（肝細胞）、１９９０年７月２５日公開のＥＰ３７８５７６（線維芽細胞）、ならびに１９８９年６月１５日公開のＷＯ８９／０５３４５および１９９０年６月２８日公開のＷＯ／９０／０６９９７（内皮細胞）で確認することができる。
【０３２５】
融合タンパク質を含むキット
[00333]別の実施形態では、本発明は、例えば、治療用途または非治療的用途に使用できる、融合タンパク質を含むキットを提供する。キットは、ラベル付きの容器を含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスやプラスチックなど様々な物質から作ってよい。容器は、本明細書で記述したような治療用途または非治療的用途に有効な融合タンパク質を含む組成物を入れている。組成物中の活性な作用物質は、ＥＰＭペプチドである。容器表面のラベルは、その組成物が特定の療法または非治療的な用途に使用されることを示し、また、前述したもののような、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に対する指示を示してもよい。
【０３２６】
[00334]本発明のキットは、通常、前述の容器、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱い説明書付きの添付文書を含めて、商業的観点および使用者の立場から望ましい物質を含む１種または複数の他の容器を含む。
【０３２７】
[00335]さらに記述せずとも、当業者なら、上記の説明および以下の例示的な実施例を用いて、本発明を行い利用し、特許請求の範囲の方法を実施できると考えられる。例えば、当業者なら、本発明の融合タンパク質構築物の生物活性を、融合されていない状態での治療効果のある部分の比較可能な活性と比べて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも容易に測定することができるはずである。同様に、当業者なら、本発明による構築体の血清半減期および血清安定性を容易に測定できるはずである。したがって、以下の実践的な実施例は、本発明の例示的な実施形態を特に指摘するものであり、決して、開示内容の残りの部分を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０３２８】
実施例１:ＥＰＭペプチド／トランスフェリン融合タンパク質
[00336]ＥＭＰ−１（配列番号４）が、ＥＰＯ受容体の２量体化を引き起こすことによってＥＰＯ活性を模倣することが示されている。このペプチドは、環状であり、ＥＰＯに相同ではない。活性になるためには、このペプチドは、受容体の２つのコピーが活性な複合体を形成するのに十分な近距離に近づけられるように、もう１つのペプチドと協力して、すなわち２量体として作用しなければならない。多くのペプチドと同様に、ペプチド２量体は、半減期が短いという欠点があり、トランスフェリンとの融合が与えると考えられる長寿命によって利益を受けるはずである。本発明は、ＥＰＯミメティック活性を有する融合タンパク質を提供する。例示的な例としては、本発明の融合タンパク質は、より長い半減期を有するＥＰＭペプチドおよび改変されたトランスフェリン（ｍＴｆ）を含む。本発明は、赤血球産生の低下または不全を伴う疾患を治療するための、このような融合タンパク質の医薬組成物も包含する。
【０３２９】
ＥＰＭペプチドの融合および挿入
[00337]ｍＴｆへの最初の融合は、ｍＴｆのＮ末端、Ｃ末端、ならびにＮ末端およびＣ末端への融合を含む。個々の融合物は受容体と結合するが、受容体の活性化は引き起こさないと考えられる。２部分からなる融合物が、受容体への結合を可能にし、活性化を引き起こすと考えられる。その際、一方の部分は、組換えを防ぐために、好ましくはもう一方と異なるコドン構成のものであるべきである。
【０３３０】
[00338]ヒトＴｆ（ＰＤＢ識別子１Ａ８Ｅ）のＮローブ、および鋳型としてウサギモデル１ＪＮＦを用いＥｘＰａｓｙ  Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｅｒｖｅｒによって作製した完全なＴｆモデルＡＡＡａｏＴｆｗｏの調査により、直接的に、またはいくつかの残基を置換することによって、ペプチドを挿入できるいくつかの潜在的な部位が明らかになっている。これらの部位は、Ｃローブ中でもそれらの等価な部位によって同様に存在している。
【０３３１】
【表３】
2007512001.tif 000004
【０３３２】
[00339]これらのループのうちの２つが、ＥＰＭペプチドを挿入することができる好ましい部位である。すなわち、Ｎ１Ｈｉｓ２８９（すなわち、２８６〜２９２番残基の領域への挿入。ＥＭＰペプチドによる１種または複数の残基の効果的な置換を含んでよい）およびＮ２Ａｓｐ１６６（すなわち、１６２〜１７０番残基の領域への挿入。ＥＭＰペプチドによる１種または複数の残基の効果的な置換を含んでよい）である。これらの位置は、ＥＰＯ受容体の両半分に結合するために必要とされる正確な向きを与える。挿入部位は、ＮローブのＮ１ドメインおよびＮ２ドメイン上にあるため、これら２つのサブドメイン間のヒンジによる可動性を有する。
【０３３３】
[00340]ＮローブとＣローブの間には構造の類似性があることから、分子を多価性にするために、Ｃローブ上の等価な挿入部位（Ｃ１４８９〜４９５、Ｃ２６２３〜６２８）を用いてもよい。これは、ＮローブのみまたはＣローブのみの前述した様々な潜在的な挿入部位を用いて、あるいは、双方のローブ上の部位を併用することによって、実施する。
【０３３４】
【表４】
2007512001.tif 000005
【０３３５】
ＥＰＭペプチド／ｍＴｆ融合タンパク質を作製するためのステップ
[00341]この実施例では、ペプチドおよびｍＴｆのコード核酸を用いて、トランスフェリン足場中に２つのＥＰＭペプチドを人工的に設計する。
【０３３６】
【表５】
2007512001.tif 000006
【０３３７】
[00342]ｍＴｆのＨｉｓ２８９とＧ１ｙ２９０の間にＥＰＭペプチドを人工的に設計する。トランスフェリン分子には特有の類似性があり、２つのローブが互いによく似ているため、Ｃローブの極めて類似した領域、すなわちＧ１ｕ６２５とＴｈｒ６２６の間に第２のＥＰＭペプチドを人工的に設計することが可能となる。
【０３３８】
【表６】
2007512001.tif 000007
【０３３９】
[00343]重複しているプライマー配列、すなわちペプチドおよび隣接しているｍＴｆ配列をコードするＰ０１４１およびＰ０１４２を用いて、２８９位のＮ１  ＥＰＭグラフトをｍＴｆ中に挿入した。
【０３４０】
[00344]ｍＴｆ中のＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ部位の５’および３’プライマーとともにこれらのプライマーを用いて、すなわちＰ００１１とともにＰ０１４１、Ｐ００３１とともにＰ０１４１を用いて、ＰＣＲ生成物を得た。次に、さらなるＰＣＲ反応でアウタープライマーＰ００１１およびＰ００３１を用いて、これらのＰＣＲ反応の生成物を結合させた。この生成物をＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで消化し、ｍＴｆベクターｐＲＥＸ００５２中にクローニングし（本明細書にその全体を組み込むＷＯ  ０４／０２０４０５を参照のこと）、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで切断してｐＲＥＸ０３８７を作製した。
【０３４１】
【表７】
2007512001.tif 000008
【０３４２】
[00345]前述の方法を用いて、１６６位のＮ２グラフトを挿入した。
【０３４３】
[00346]２回目のＰＣＲにより、プライマーセットＰ０１４３およびＰ０１０１のＰＣＲ生成物を、Ｐ０１４４およびＰ００９０の生成物に結合させた。この生成物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｍＴｆベクターｐＲＥＸ００５２中にクローニングして、ｐＲＥＸ０１５５を作製した。
【０３４４】
【表８】
2007512001.tif 000009
【０３４５】
【表９】
2007512001.tif 000010
【０３４６】
[00347]双方のＥＰＭグラフトを有するプラスミドを作製するために、ＸｈａＩおよびＥｃｏＲＩでｐＲＥＸＯ１５５を消化し、得られた断片を予めＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＲＥＸ０３８７中にクローニングして、プラスミドｐＲＥＸ０３４１を作製した。
【０３４７】
[00348]ＥＰＭループ中の２８９位のシステイン残基をグリシン残基に変異させるために、グリシンコドンＧＧＴでシステインコドンを置換した突然変異誘発性のプライマーを作製した。突然変異誘発性のプライマーＰ０２２６とＨｐａＩ部位の３’プライマー（Ｐ００１１）との生成物を、プライマーＰ０２２７と前述のＥｃｏＲＩ部位の５’プライマー（Ｐ００３１）との生成物に結合させた。この生成物をＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで制限消化し、ＨｐａＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＲＥＸ００５２中に連結させてプラスミドｐＲＥＸ０６０７を作製した。
【０３４８】
【表１０】
2007512001.tif 000011
【０３４９】
[00349]ＥＰＭループ中の１６６位のシステイン残基をグリシン残基に変異させるために、グリシンコドンＧＧＴでシステインコドンを置換した突然変異誘発性のプライマーを作製した。突然変異誘発性のプライマーＰ０２２８とＥｃｏＲＩ部位の３’プライマー（Ｐ０１０１）との生成物を、プライマーＰ０２２９とＸｂａＩ部位の５’プライマー（Ｐ００９０）との生成物に結合させた。この生成物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで制限消化したｐＲＥＸ００５２と連結させてプラスミドｐＲＥＸ０２４２を作製した。
【０３５０】
【表１１】
2007512001.tif 000012
【０３５１】
【表１２】
2007512001.tif 000013
【０３５２】
[00350]変異したシステイン残基を含む双方のＥＰＭグラフトを有するプラスミドを作製するために、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩでｐＲＥＸ０６０７を消化し、その断片を、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで消化したｐＲＥＸ０２４２中に連結して、ｐＲＥＸ０３１７を作製した。
【０３５３】
[00351]酵母宿主細胞に形質転換するための最終的な発現ベクターを作製するために、ＮｏｔＩでｐＲＥＸ０３４１およびｐＲＥＸ０３１７を消化し、それらをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５中に連結して（Ｓｌｅｅｐ他、１９９１年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９、１８３〜１８７頁およびＥＰ４３１８８０Ｂ）、それぞれｐＲＥＸ０４１３およびｐＲＥＸ０３１８を作製した。
【０３５４】
[00352]タンパク質発現のために、得られたプラスミドを酵母中に形質転換する。
【０３５５】
[00353]ＥＰＭペプチドまたは他の任意のペプチドを挿入するための代替の位置は、トランスフェリンＣローブ上の２箇所のグリコシル化部位のＮ４１３およびＮ６１１である。これらの部位の利点は、挿入が行われた後は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の破壊によってグリコシル化が防がれることである。
【０３５６】
実施例２：鉄親和性を高めた治療用トランスフェリン融合タンパク質の調製
[00354]鉄親和性を高めた治療用融合タンパク質を調製することができる。例として、鉄結合能力を高めた、改変されたトランスフェリン融合タンパク質を調製するために、上記の実施例１の手順を以下の変更を加えて実施することができる。胃腸管上皮を通過しての融合タンパク質の取込みおよび移動を促進するために、これらの融合タンパク質を使用することができる。
【０３５７】
[00355]１つの制限酵素、または１対の制限酵素でｍＴｆ配列を含むクローニングベクターを切断して、ｍＴｆ遺伝子の部分を取り除く。次いで、当技術分野の標準技術により、配列番号１のヌクレオチド７２３に対応する位置に変異を導入して、コドンＡＡＧ（Ｌｙｓ）をＣＡＧ（Ｇｌｎ）またはＧＡＧ（Ｇｌｕ）に変換させるプライマーを用いて、この断片に部位特異的突然変異誘発を施す。同様に、配列番号１のヌクレオチド７２６および７２８に対応する位置に変異を導入して、コドンＣＡＣ（Ｈｉｓ）をＣＡＧ（Ｇｌｎ）またはＧＡＧ（Ｇｌｕ）に変換させるプライマーも使用する。隣接したコドンに変異を導入して、コードされているアミノ酸の置換を生じさせるプライマーも使用してよい。これらのヌクレオチド位置は、リーダー配列でコードされたタンパク質のアミノ酸２２５および２２６、ならびに成熟タンパク質のアミノ酸２０６および２０７に対応している。次に、成熟した断片をＰＣＲによって増幅し、クローニングベクター中に再連結する。ＥＰＭペプチドをコードしているＤＮＡ分子を導入するための後続のステップで、１種または複数の変異を有するこのベクターを使用する。ｍＴｆ融合タンパク質配列は、酵母発現ベクター中に導入し、タンパク質産生用のサッカロマイセスまたは他の酵母に形質転換させることができる。
【０３５８】
[00356]鉄親和性を高めた治療用融合タンパク質を得るために他のアミノ酸を変異させてもよい。
【０３５９】
実施例３：生産性を高めたＥＭＰ１融合タンパク質の調製
[00357]本実施例は、ＥＭＰ１ペプチドの疎水性の性質を変えることによって生産性を高めたＥＭＰ１融合タンパク質を生成させる方法を提供する。
【０３６０】
[00358]ｍＴｆ中に挿入されたＥＭＰ−１ペプチドのカイト・ドリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）法による疎水性グラフは、ＥＭＰ１ペプチドのコアに疎水性（スコア＞０）のストレッチがあることを示している。この疎水性コアは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ残基（配列番号４、２８、３４、および３５の９〜１３番残基）（下記の表のボールド体部分）から構成されている。
【０３６１】
【表１３】
2007512001.tif 000014
【０３６２】
[00359]ＥＭＰ−１ペプチドをｍＴｆ表面に導入すると、その表面から疎水性部分が突出する。標的への結合能を実質的に低下させずに、ペプチド挿入物の疎水性の性質を変えると、生産性を改善することができる。
【０３６３】
[00360]上記の表においてボールド体で強調した、疎水性コア中の９、１０、１２、および１３位の残基は、受容体結合に必要なモチーフに含まれている。疎水性コア中の関与していない唯一の残基は、１１位のロイシンである。この残基を置換することは、疎水性コアの疎水性値を低減し、コアの親水性を高める（スコア＜０）効果を有し得る。ロイシン残基をグルタミン酸残基で置換した例を以下に示す。
【０３６４】
【表１４】
2007512001.tif 000015
【０３６５】
[00361]１４位のバリン残基も、受容体結合に関与しておらず、十分に近くに近接して疎水性コアと隣接しているため、その置換も疎水性コアに影響を及ぼし得る。バリンをグルタミン酸で置換した例を以下に示す。
【０３６６】
【表１５】
2007512001.tif 000016
【０３６７】
[00362]ロイシン残基とバリン残基の双方の置換は、疎水性値を低減する上で複合効果を有する。ロイシンとバリンの双方をグルタミン酸で置換した例を以下に示す。
【０３６８】
【表１６】
2007512001.tif 000017
【０３６９】
[00363]ロイシンをトレオニンで、また、バリンをアスパラギン酸残基で置換した追加の例を以下に示す。
【０３７０】
【表１７】
2007512001.tif 000018
【０３７１】
[00364]上記に概説した残基の置換は、先に説明したようにジスルフィド結合を取り除くためにＥＭＰ中のシステイン残基をグリシンで置換するのに使用したのと本質的に同じ突然変異誘発の方法によって実施した。
【０３７２】
[00365]上記の実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な変更を加えられることが理解されよう。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願で参照される引用したすべての特許、特許出願、および論文の全体を、参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０３７３】
【図１】ヒト（Ｈｕ）トランスフェリン（Ｔｆ）（配列番号３）のＮドメインおよびＣドメインのアライメントを示す図である。類似箇所および同一箇所を強調している。
【図２】Ａ及びＢは様々な種のトランスフェリン配列のアライメントを示す図である。薄い陰の部分は類似箇所を示し、濃い陰の部分は同一箇所を示す（配列番号１５〜２１）。
【図３】治療用のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに対する、Ｔｆ表面に露出された多くの挿入部位の位置を示す図である。
【図４】ｐＲＥＸ００５２を示す図である。
【図５】ｐＲＥＸ０３８７を示す図である。
【図６】ｐＲＥＸ０１５５を示す図である。
【図７】ｐＲＥＸ０３４１を示す図である。
【図８】ｐＲＥＸ０６０７を示す図である。
【図９】ｐＲＥＸ０２４２を示す図である。
【図１０】ｐＲＥＸ０３１７を示す図である。
【図１１】ｐＲＥＸ０４１３を示す図である。
【図１２】ｐＲＥＸ０３１８を示す図である。
【図１】
2007512001.tif 000019
【図２Ａ−１】
2007512001.tif 000020
【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
2007512001.tif 000023
【図３】
2007512001.tif 000024
【図４】
2007512001.tif 000025
【図５】
2007512001.tif 000026
【図６】
2007512001.tif 000027
【図７】
2007512001.tif 000028
【図８】
2007512001.tif 000029
【図９】
2007512001.tif 000030
【図１０】
2007512001.tif 000031
【図１１】
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【図１２】
2007512001.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
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2007512001.tif 000035
2007512001.tif 000036
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