(57)【要約】本発明は、構成成分Ａとして、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの少なくとも３個のモノマーと、構成成分Ｂとして、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマーを互いにリンクする少なくとも２個のペプチドリンカーとを含むポリペプチドに関する。本発明はまた、疾患の治療のための、および薬剤あるいはワクチンの製造のためのこれらのポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、これらのポリペプチドの製造および分離方法、これらポリペプチドをコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、これらのベクターによってトランスフェクトされる宿主細胞、およびこれら発明のオブジェクトを含む薬学的組成物に関する。最後に、本発明は、例えばアフェレーシス手段による、体液内に含まれる成分の体外での操作、枯渇、および／または除去の方法に関する。
2007530021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３個の構成成分Ａおよび少なくとも２個の構成成分Ｂを含むポリペプチドであって、
各構成成分Ａは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマーまたは機能性フラグメントおよび／またはこれに関しての機能性改変体であり、各構成成分Ｂは、ペプチドリンカーである、ポリペプチド。
【請求項２】
前記構成成分Ａは、同一あるいは異なる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記構成成分Ａは、同一の生物あるいは異なる生物に由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記構成成分Ａは、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＬ、ＬＴａｌｐｈａ、ＬＴｂｅｔａ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１−ＢＢ、４１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡ、ＶＥＧＩおよびＢＡＦＦからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記構成成分Ｂは、それぞれ、前記少なくとも３個の構成成分Ａの２個を互いに結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記構成成分Ｂの少なくとも１個は、アミノ酸配列（ＧＧＧＳ）３または（ＧＧＧＳ）４を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記構成成分Ａおよび構成成分Ｂは、三量体タンパク質構造を形成する、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記構成成分Ａおよび構成成分Ｂは、ホモ三量体タンパク質構造を形成する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記構成成分Ａおよび構成成分Ｂは、ヘテロ三量体タンパク質構造を形成する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記構成成分Ｂは、同一あるいは異なる、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記構成成分Ｂは、同一の生物あるいは異なる生物に由来する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端Ｔａｇ−配列、特にＨｉｓ−Ｔａｇ配列あるいはＦｌａｇ−Ｔａｇ配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端リーダーペプチド配列を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは少なくとも１個のさらなる構成成分Ｃを含み、該構成成分Ｃは、細胞表面上に特定の標的分子を選択的に認識する、抗体フラグメントあるいは他のタンパク質もしくはペプチドである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記構成成分Ｃは、哺乳類、特にマウスあるいはヒトに由来する抗体フラグメントであるか、あるいはヒト化した抗体フラグメントである、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記抗体フラグメントは、様々な抗体形態において、例えばｓｃＦｖ、特にｓｃＦｖ４０として、提供される、請求項１４または１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記構成成分Ｃは、細胞表面分子、特にサイトカインレセプター、増殖因子レセプター、インテグリン、あるいは細胞接着分子に対する特異性を有するタンパク質あるいはペプチドである、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記サイトカインレセプターは、ＴＮＦＲ遺伝子ファミリーの群から選択される、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸、および／または請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を製造する方法であって、
ａ．請求項１９に記載の核酸、あるいは請求項２０に記載のベクターを製造する工程と、
ｂ．工程（ａ）に従う核酸および／またはベクターを、細胞内に導入する工程と
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
ａ．請求項２１に記載の宿主細胞を、適正な条件下において培養する工程と、
ｂ．請求項１９に記載の核酸を、適正な条件下において発現させる工程と、
ｃ．該宿主細胞および／または該培養上清から該ポリペプチドを単離する工程と
を包含する、方法。
【請求項２４】
癌疾患、特に固形あるいはリンパ性の腫瘍、伝染病、代謝性疾患、炎症容態、過増殖性疾患、自己免疫疾患、特にリウマチ／関節炎疾患、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、ＧｖＨＤ、ウイルス性肝炎（ＨＢＶ，ＨＣＶ）、アルコール感応性肝炎、肝臓移植の際の拒絶反応、多発性アポトーシス反応に基づく疾患、退化性疾患、特に神経退化性疾患、の治療用の医薬品の製造のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドの、または請求項１９に記載の核酸の、または請求項２０に記載のベクターの、または請求項２１に記載の宿主細胞の、使用。
【請求項２５】
癌疾患、特に固形あるいはリンパ性の腫瘍、伝染病、代謝性疾患、炎症容態、過増殖性疾患、自己免疫疾患、特にリウマチ／関節炎疾患、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、ＧｖＨＤ、ウイルス性肝炎（ＨＢＶ，ＨＣＶ）、アルコール感応性肝炎、肝臓移植の際の拒絶反応、，多発性アポトーシス反応に基づく疾患、退化性疾患、特に神経退化性疾患、の治療のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドの、または請求項１９に記載の核酸の、または請求項２０に記載のベクターの、または請求項２１に記載の宿主細胞の、使用。
【請求項２６】
請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび／または請求項１９に記載の核酸および／または請求項２０に記載のベクターおよび／または請求項２１に記載の宿主細胞、ならびに、薬学的に安全な、補助物質、添加物質および／または担体物質を少なくとも含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
癌疾患、特に固形あるいはリンパ性の腫瘍、伝染病、代謝性疾患、炎症容態、過増殖性疾患、自己免疫疾患、特にリウマチ／関節炎疾患、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、ＧｖＨＤ、ウイルス性肝炎（ＨＢＶ，ＨＣＶ）、アルコール感応性肝炎、肝臓移植の際の拒絶反応、多発性アポトーシス反応に基づく疾患、退化性疾患、特に神経退化性疾患、の治療のための、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
血液の可溶性成分、懸濁された成分あるいは細胞性成分の、体外での操作、枯渇、および／または除去の方法であって、
ａ）必要に応じて、血液を、固体あるいは液体の成分を有する単一あるいは複数の分画に分離する工程と、
ｂ）該血液の可溶性成分、懸濁された成分あるいは細胞性成分を、請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドと連結された表面あるいは粒子に結合させる工程と、
ｃ）必要に応じて、該結合された血液の可溶性成分、懸濁された成分あるいは細胞性成分を分離する工程と
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記工程ａ）あるいは工程ｂ）の前に、患者において採血が行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記工程ｂ）あるいは工程ｃ）の後に、そのように処理された血液あるいは血液分画が、再注射される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構成成分Ａとして、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの少なくとも３個のモノマーと、構成成分Ｂとして、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマーを互いにリンクする少なくとも２個のペプチドリンカーとを含むポリペプチドに関する。本発明はまた、疾患の治療のための、および薬剤あるいはワクチンの製造のためのこれらのポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、これらのポリペプチドの製造および分離方法、これらポリペプチドをコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、これらのベクターによってトランスフェクトされる宿主細胞、およびこれら発明のオブジェクトを含む薬学的組成物に関する。最後に、本発明は、例えばアフェレーシス手段による、体液内に含まれる成分の体外での操作、枯渇、および／または除去の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーにおいては、プロ炎症性サイトカインが重要である。一般にサイトカイン、特にＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、体液性の（抗体−仲介の）免疫返答、アポトーシスの誘導、骨の構成、毛成長の、歯成長のおよび汗腺成長の素因の形成、リンパ腺の素因、ならびにその他の多くの（非特許文献１＝Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００３），Ｎａｔ，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７４５〜７５６）においてと同様に、先天的な免疫系の刺激および協調において、重要な役目を演じる。それに対して、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの誤った調節は、多数の病理学的状態に導く。それにはさらに、例えば、敗血性ショック、関節リウマチのような自己免疫疾患、または神経変性疾患が属する。
【０００３】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ホモ三量体としての生物学的活性形態において、その作用を含む（非特許文献２＝Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３，４３１〜４４５）。三量体構築物およびタンパク質のより高位目の凝集（例えば、オリゴマーまたは三量体の多量体）は、天然において数多く見出される。例えば、軟骨マトリクスタンパク質（ＣＭＰ）、結合組織タンパク質（非特許文献３＝Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５６，９０９〜９２３）、ＣＬｑ−ファミリー（ＣＬｑには、コラーゲンα１（Ｘ），α２（ＶII））のようなコラーゲンファミリーからなるタンパク質、冬眠タンパク質，ＡＣＲＰＲ３０、内耳構成タンパク質（セレブリンおよびマルチメリンが属する）（非特許文献４＝ＫｉｓｈｏｒｅおよびＲｅｉｄ、（１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４２、１５〜２１）、ならびに肺活面活性タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）およびマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）（非特許文献５＝Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ  ８  Ｎｏ．１、２９〜３５）のような、コレクチンファミリーのタンパク質がある。
【０００４】
三量体へのタンパク質の会合（Ｚｕｓａｍｍｅｎｌａｇｅｒｉｎｇ）は、三量体化タンパク質の溶液中において、そのタンパク質の表面において行われる。それは、疎水性交換作用、水素架橋結合、共有結合（例えば、ジスフィド架橋）および／またはクーロン力に基づき、または構造モチーフ、すなわち分子間の超二次構造の構成を生じさせる、特異的アミノ酸配列に基づいて行われる。ＴＮＦリガンドファミリーメンバーにおいては、ホモ三量体の３つのモノマーは、疎水性結合を介して非共有結合的に結合されている。それらの活性形態において、それらは、対応するＴＮＦレセプターファミリーメンバーを再び活性化する。レセプター自体は酵素活性を有しない。例えば、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーとしてのＴＮＦは、２つの膜レセプターＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に結合して、すでに三量体として存在し、シグナル不活性のレセプターに、三量体化あるいは活性化を仲介する。レセプターの複合体形成を介して、シグナルカスケードが導入され、とりわけ、細胞血漿アダプタタンパク質がそれに伴う（非特許文献６＝Ｗａｊａｎｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，Ｄｉｆｆｅｒ，１０，４５〜６５）。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の三量体構造は、レセプターがそれぞれＴＮＲホモ三量体の３つのＴＮＦモノマーのうちの２つの間の中間空間において、結合するように位置する（上記の非特許文献２＝Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））。このことから、ＴＮＦおよびＴＮＦリガンドファミリーの別のメンバーは、単にそれ／それらの構造において、ホモ三量体として生物的に活性でありことが、明らかである。
【０００５】
その機能に基づいて、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーあるいはその膜レセプターは、感染症、炎症疾患、代謝性疾患、アポトーシスの誤った調節に起因する疾患、神経退化疾患、および多くのさらなる疾患のような多数の疾患治療に、多種多様に使用されている。癌治療においてのその使用は、特に重要な役を演じる。なぜなら、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーにおいて、一般に、抗腫瘍作用物質が重要だからである。この関係において、ＴＮＦ自体（非特許文献７＝Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．およびｔｅｎ  Ｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｌ．（２００３），Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５，７９〜８０）、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦに関連するアポトーシスを誘導するリガンド）、またＡｐｏ  ２Ｌと呼ばれる（非特許文献８＝Ｗｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：６７３〜６８２；非特許文献９＝Ｐｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１２６８７〜１２６８９）およびＦａｓＬが、特に言及される。しかしながら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、ＴＮＦおよびＦａｓレセプターのアゴニストによる強いシステム的な副作用が示され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究においては、所定のＴＲＡＩＬ薬剤において同様の障害性作用が示された（非特許文献１０＝Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：５６４〜５６７，Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：９４５〜９６０；非特許文献１１＝Ｏｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：８０６〜８０９）。例えば、Ｆａｓに対するアゴニストの抗体は、ＦａｓＬのレセプターに極端な肝障害性作用を示した（上記の非特許文献１１＝Ｏｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））。そのため、Ｆａｓ活性リガンド／アゴニストの場合において、安全性の理由から、今日まで臨床的使用は除外されてきた。この分野におけるＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬおよび他のＴＮＦリガンドファミリーメンバーの大きな意味に基づき、また臨床的システマティックな投与の形態のその応用に伴う副作用に基づき、勿論、この副作用を最小限に抑えるために多くの手がかりが追求されてきた（非特許文献７＝Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．およびｔｅｎ  Ｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｌ．（２００３），Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５，７９〜８０）。
【０００６】
そのため、例えば特許文献１＝国際公開０２／２２６８０号パンフレットは、抗原−結合抗体を用いたサイトカインの融合を介して、指向された、および組織あるいは組織特異性のサイトカインの作用を可能にする、融合タンパク質を記述する。この方法によって、サイトカインが、この融合タンパク質と接触しない組織あるいは細胞への作用を含まないこと、およびこの組織または細胞への副作用が軽減されることが、得られる。
【０００７】
特許文献２＝独国特許出願公開ＤＥ  １０２  ４７  ７５５において、同様に、組織あるいは組織特異性のサイトカインの作用を可能にする、抗体−非依存の系が明らかにされた。ここでは、融合タンパク質が重要であり、そこにおいて、融合タンパク質の、さらなるタンパク質断片を表す細胞表面分子結合ドメインにおけるこの結合を介して、生物的機能を有する、その中に含まれるタンパク質断片の活性がなされる。非目標組織への副作用の低減と並んで、このシステムは、好都合にも、抗体あるいはより少ない特異性を有する抗体が存在しない標的細胞上の細胞表面分子に対して、導入される。
【０００８】
しかしながら、言及した副作用の他に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの活性ホモ三量体が、希釈において、すなわち生理学的に満足できる濃度においても解離する事実が、最も問題である。解離は基本的に可逆であるが、タンパク質はその生物的活性を急速に失う。なぜなら、それは変性するからである。この変性は、不安定なモノマーを介して行われると想定される（非特許文献１２＝Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．およびｂａｇｌｉｏｎｉ，Ｃ．（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，６９５１〜６９５４；非特許文献１３＝Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．およびＡｒａｋａｗａ，Ｔ．（１９８７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  １４７，７４０〜７４６）。
【０００９】
特定の不安定性を有するＴＲＡＩＬにおける、対応する観察に基づいて、タンパク質の安定性、三量体化モジュールとしてのロイシン−ジッパー（Ｚｉｐｐｅｒ）の添加物によって受け継ぐことが試みられた（非特許文献１４＝Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１１，２５３〜２６１）。自然状態において、ＴＲＡＩＬは、亜鉛イオンによって安定化される。亜鉛イオンは、三量体リガンドの中心に位置し、システイン残基によって調整される（非特許文献１５＝Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，６３３〜６４０）。しかしながら、ここでロイシン−ジッパーの付加によって、安定性が向上されるのみならず、他の特性、例えば構造変化のような構造特性、活性レート、または生理学的特性が損ねられ得るということは、不利な点である。
【００１０】
そのため、活性サイトカイン、特にＴＮＦリガンドファミリーメンバーの安定性を、その天然の特性がその構造の変化によって不利に影響されことなく、および治療的使用において強い細胞傷害性の、または他の副作用を示すことなく、向上させる必要性が存在する。
【００１１】
技術水準において、これを達成するシステム、すなわち、それによってＴＮＦリガンドファミリーメンバーが活性および安定形態において提供される系はなく、また、上記短所がなく、自体のまたは複雑な融合タンパク質の生物学的に活性な構成成分として、治療的使用に適する系は、知られていない。
【非特許文献１】Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００３），Ｎａｔ，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７４５〜７５６
【非特許文献２】Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３，４３１〜４４５
【非特許文献３】Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５６，９０９〜９２３
【非特許文献４】ＫｉｓｈｏｒｅおよびＲｅｉｄ、（１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４２、１５〜２１
【非特許文献５】Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ  ８  Ｎｏ．１、２９〜３５
【非特許文献６】Ｗａｊａｎｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，Ｄｉｆｆｅｒ，１０，４５〜６５
【非特許文献７】Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．およびｔｅｎ  Ｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｌ．（２００３），Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５，７９〜８０
【非特許文献８】Ｗｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：６７３〜６８２
【非特許文献９】Ｐｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１２６８７〜１２６８９
【非特許文献１０】Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：５６４〜５６７，Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：９４５〜９６０
【非特許文献１１】Ｏｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：８０６〜８０９）
【非特許文献１２】Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．およびｂａｇｌｉｏｎｉ，Ｃ．（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，６９５１〜６９５４
【非特許文献１３】Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．およびＡｒａｋａｗａ，Ｔ．（１９８７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  １４７，７４０〜７４６）
【非特許文献１４】Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１１，２５３〜２６１
【非特許文献１５】Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，６３３〜６４０）。
【特許文献１】国際公開０２／２２６８０号パンフレット
【特許文献２】独国特許出願公開１０２  ４７  ７５５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの安定性が向上される系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本課題は、特許請求の範囲において特徴付けられる本発明の実施形態によって解決される。特に、本課題は、請求項１の対象、すなわちポリペプチドの提供によって解決される。該ポリペプチドは、少なくとも３個の構成成分Ａおよび少なくとも２個の構成成分Ｂを含むポリペプチドであって、各構成成分Ａは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマーまたは機能性フラグメントおよび／またはこれに関しての機能性改変体であり、各構成成分Ｂは、ペプチドリンカーである。
【００１４】
本発明は、天然に存在する可溶性のＴＮＦリガンドファミリーのサイトカインメンバーは、その生物的活性を単にホモ三量体として展開し、他の局面において、そのモノマーにおける解離を介して変性する傾向にあるという認識に基づく。
【００１５】
そのため、モノマーにおけるこの三量体の解離を阻止することが重要である。本発明に従い、これは、少なくともＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのモノマー、特にＴＮＦが、そのＣ末端およびＮ末端を介して、短いペプチドリンカーを用いて、互いに共有結合によって「単鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）」−分子（以下、「ｓｃ」）に、特にｓｃＴＮＦに結合される。本発明に従い、それによって、全体の分子（２つのペプチドリンカーを有するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの少なくとも３つのモノマー）は、単一のタンパク質鎖（Ｓｔｒａｎｇ）から成り、その結果、モノマーにおける解離は、もはや行われない。本発明に従い、そのような本発明による分子は、ＴＮＦリガンドファミリーの対応する可溶性野生型メンバーと比べて、その生物的活性の損失はかなり少ない。本発明に従い、逆に、本発明によるポリペプチドは、その対応するＴＮＦリガンドファミリーの可溶性の野生型メンバーのように、同一の（定性の）活性を有するとともに、その著しい安定性に基づき、ある時点まで生物的活性を有することが立証された。その時点までに、ＴＮＦリガンドファミリーの野生型メンバーは、その活性はすでに失われ、すなわち解離あるいは変性される（これについては、以下に記載の様々な安定性試験において立証され、その試験は実施例および図において記載される）。
【００１６】
「ＴＮＦリガンドファミリーの可溶性野生型メンバー」のもとで、ＴＮＦリガンドファミリーの膜固定メンバーの可溶性細胞外断片が理解されるべきである。以下において、「可溶性野生型」の概念の同義語として、「野生型」、「ｗｔ」、「可溶性」および「ｓ」（「ｓｏｌｕｂｌｅ」に対して）が使用される。特に、可溶性野生型ＴＮＦ（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーとして）が重要であり、これに対応して、以下、同義概念「野生型ＴＮＦ」、「ｗｔＴＮＦ」、可溶性ＴＮＦおよび「ｓＴＮＦ」が使用される。
【００１７】
本発明に関して構成成分Ａとは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマー、または機能性フラグメントまたはこれに関する機能性改変体である。「モノマー」のもとで、共有結合の分離なしに、オリゴマータンパク質から分離され得る、最小のタンパク質またはポリペプチドユニットが理解される。
【００１８】
ポリペプチドまたは構成成分Ａまたはフラグメントまたはそれに関する改変体は、それが／それらが、その／それらの生物学的活性あるいは機能（特に、相互作用相手、例えば膜安定性レセプターにおけるその／それらの結合特異性およびその／それらの三量体特性）を有する限りにおいて、本発明に関して機能的である。本発明の機能性フラグメントおよび機能性改変体において、これら生物学的機能は、例えば、その特異性または選択性に関して変化し得るが、基本的な生物学的機能は保持される。
【００１９】
技術水準において、タンパク質およびポリペプチドあるいは分子の生物学的活性の測定のための数多くの方法が知られている。例えば、マーキングされた基質（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を使用するタンパク質アッセイ、ＨＰＬＣまたは薄膜―グラフィーのようなクロマトグラフィー法による基質分析、スペクトル測光等である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ  を参照）。
【００２０】
本発明に関してフラグメントのもとで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマーのフラグメントおよび本発明のポリペプチドあるいはタンパク質のフラグメントが理解される。ここにおいて、モノマー、ポリペプチドあるいはタンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端または内部配列の短縮アミノ酸配列が重要である。特に、ポリペプチドあるいはタンパク質の内部配列短縮において、３つのモノマーのうちの１個あるいは数個の配列の短縮が重要であり、その短縮はここでも、Ｎ−末端、Ｃ−末端または内部配列的に生じ得る。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施形態において、モノマーのフラグメントは、その細胞外ドメインを表す。そのドメインは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの可溶性野生型メンバーの全細胞外ドメインまたはそれに関する断片に適合する。特に、モノマーのフラグメントは、その細胞外ドメインを表し、該ドメインは、可溶性野生型ＴＮＦ（アミノ酸  ７７〜２３３）または細胞外ドメイン全体（アミノ酸  ５３〜２３３）に適合する。
【００２２】
そのような本発明によるフラグメントの製造は技術水準において良く知られており、標準的方法の使用のもとに、当業者によって実施され得る（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｌａｂｏｔａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。一般に、モノマー、ポリペプチド、あるいはタンパク質のフラグメントの製造は、天然のモノマー、ポリペプチド、あるいはタンパク質をコードする、ＤＮＡ配列の改変によって行われる。また、その製造は、ＤＮＡの改変がモノマー、ポリペプチド、あるいはタンパク質の機能的活性を損なわないという前提のもとに、このＤＮＡ配列の改変されたＤＮＡ配列のよる適正な宿主の形質転換および発現によって行われる。
【００２３】
本発明によるフラグメントの認識は、上記したように、その生物学的活性の測定によって、その機能性の検査を介して行われるか、またはフラグメントの配列化およびそれに続く、得られた配列と天然の配列との比較に基づいて行われる。その配列化は、技術水準において、数多くのまた良く知られた標準的方法に基づいて行われ得る。
【００２４】
本発明に関して、生物学的に活性なモノマー、ポリペプチドあるいはタンパク質またはそれに関するフラグメントまたは、構成成分Ａの改変体として、特に、対応する天然の配列に対する配列相異を有するような、モノマー、ポリペプチド、あるいはタンパク質またはそれに関するフラグメントが説明される。これらの配列相異において、アミノ酸の１個または数個の挿入、欠失および／または置換が重要である。そこにおいて、少なくとも６０％の、好ましくは７０％の、より好ましくは８０％の、さらにより好ましくは８５％の、さらになお、より好ましくは９０％、最も好ましくは９７％の配列相同性が存在する。
【００２５】
２つの核酸またはアミノ酸のパーセント同一性を決定するために、配列は、続いて互いに比較されるために、調整され得る。そのために、第１のアミノ酸配列あるいは核酸配列の配列内に、例えば、ギャップが導入され得、アミノ酸あるいはヌクレオチドは、対応する第２のアミノ酸配列あるいは核酸配列において、比較される。第１のアミノ酸配列の部位が、第２の配列においてそうであるように、同一のアミノ酸あるいは同一のヌクレオチドによって占められる場合、２つの配列は、この部位において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって区分された同一の部位数の関数である。
【００２６】
２つの配列のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムに基づいて実施される。好ましい、しかしながらそれに限定されない、２つの配列の比較に考慮され得る数学的アルゴリズムは、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：５８７３〜５８７７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴ−プログラムに統合され、それによって、本発明による配列への所望の同一性を有する配列が同定され得る。上記されたような、ギャップアラインメント（または「ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」）を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜３４０２に記載されているような、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ」−プログラムが使用され得る。
【００２７】
本発明に関して、モノマー、ポリペプチドあるいはタンパク質、またはそれに関するフラグメントの生物学的に活性な、従って機能性改変体は、好ましくは、レセプター結合特性を有し得る。その際、改変体は、その特異的な生物的活性、または他の特性、特にその安定性に関して、最適化され得る。
【００２８】
改変体の概念のもとに、生理学的な配列に対して保守的な置換（ｋｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を有する、特にそのようなアミノ酸配列が含まれる。保守的な置換として、同一クラスに由来するアミノ酸が互いに置換されるような置換が説明される。特に、脂肪族の側鎖、陽性または陰性に帯電された側鎖、側鎖内に芳香族の基を有するアミノ酸、または、例えば水酸基官能基を有する側鎖が水素架橋と結ばれ得るアミノ酸が存在する。例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、同様の極性側鎖を有する他のアミノ酸によって置換され、または、例えば疎水性側鎖によって特徴付けられるアミノ酸が、他の同様に疎水性側鎖を有するアミノ酸によって置換されることを（例えば、セリン（スレオニン）がスレオニン（セリン）によって、あるいはロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）によって）、それは意味する。挿入および置換は、特に、３次元構造の変更を引き起こさず、または結合領域に関係するような配列部位において可能である。挿入または欠失による３次元構造の変更は、例えばＣＤ−スペクトル（円偏光二色性−スペクトル）を用いることによって容易に検査可能である（Ｕｒｒｙ，１９８５，Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ＯＲＤ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｉｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｒｇｂ．），Ｅｌｓｅｖｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【００２９】
天然の配列に対して、置換を有するアミノ酸配列を有する、例えばモノマー、ポリペプチド、あるいはタンパク質またはそれに関するフラグメントの改変体の製造の適正な方法は、例えば、公開文献：米国特許第４，７３７，４６２号、米国特許第４，５８８，５８５号、米国特許第４，９５９，３１４号、米国特許第５，１１６，９４３号、米国特許第４，８７９，１１１号および米国特許第５，０１７，６９１号に開示されている。一般的な改変体の製造は、特に、また、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓによって記載されている。ここで、コドンは、省略され、補充され、または交換され得る。改変体は、特に、生理学的分解を免れるために安定化された、あるいは、アミド状結合の置換による、タンパク質バックボーンの安定化によって、あるいはβ−アミノ酸の導入によって安定化された、タンパク質またはポリペプチドであり得る。
【００３０】
本発明に関して改変体は、同様に、改変体のためのコード化された核酸において、例えば、１個のまたは数個のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換のような変更が導入されることによって、製造される。技術水準において、核酸配列のそのような変更のための数多くの方法が知られている。最も使用される技術の１つは、オリゴヌクレオチド指向の、部位特異的変異誘発（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｅ）である（Ｃｏｍａｃｋ  Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８．０１−８．５．９，Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１版を参照）。この技術において、オリゴヌクレオチドは合成化され、その配列は所定の変異を有する。このオリゴヌクレオチドは、次いで、野生型核酸配列を含む鋳型を用いてハイブリッド化される。好ましくは、この技術において、単鎖鋳型が使用される。オリゴヌクレオチドおよび鋳型のアニーリングの後に、鋳型−ＤＮＡ−鎖に相補的である、オリゴヌクレオチドの第２の鎖に合成するために、ＤＮＡ依存ＤＮＡ−ポリメラーゼが導入される。結果として、上記変異によってオリゴヌクレオチド内に発生する対合の欠如（Ｆｅｈｌｐａａｒｕｎｇ）を含むヘテロ二本鎖分子が得られる。オリゴヌクレオチド配列は、適正なプラスミド内に導入され、このプラスミドは宿主細胞内に導入され、この宿主細胞内において、オリゴヌクレオチドＤＮＡが模写される。この技術を用いて、目標の変形（変異）を有する核酸配列が得られる。その配列は、本発明による改変体の製造に使用され得る。
【００３１】
本発明のポリペプチドに含まれる構成成分Ａは、同一あるいは異なり得る。すなわち、構成成分Ａにおいて、ＴＮＦリガンドファミリーの同一のメンバーのモノマーまたはＴＮＦリガンドファミリーの異なるメンバーのモノマーであり得る。例えば、３つの異なる構成成分Ａの場合、ＴＮＦリガンドファミリーの３つの異なるメンバーの３つモノマーであり得、または、ＴＮＦリガンドファミリーの２つの同一のメンバーの２つのモノマーとＴＮＦリガンドファミリーの１つの別のメンバーの１つのモノマーとであり得る。これは、対応して、３つより多い構成成分Ａに当てはまる。例えば、本発明によるポリペプチドは、四量体、五量体、六量体等を形成する、４、５、６またはそれ以上の構成成分Ａを含み得る。同様に、特に好ましくは、本発明によるポリペプチドは、構成成分Ａの上記された三量体の整数倍のもの、例えば２個、３個、４個またはそれより多くの順次配置された三量体を含む。本発明によるポリペプチドに含まれる構成成分Ａは、リンカーによって互いに分離され得る（以下参照）。その際、上記されるように、構成成分Ａの２個、３個、４個またはそれより多くの三量体が順次配置され、そのため、異なる三量体を結合するリンカーは、構成成分Ａを１個の三量体に互いに結合するリンカーと比べて、必要に応じて、長くあり得る。
【００３２】
本発明の構成成分Ａは、同一または異なる生物に由来し得る。ここでは脊椎動物、特に哺乳類、例えばマウス、ラット、豚および、とりわけヒトが重要である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａにおいて、それぞれは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１個のモノマー、または機能性フラグメントまたはそれに関する機能性改変体が重要であり、それらは、ＦａｓＬ（GenBanｋ受託番号ＮＭ＿０００６３９）、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｎｄ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８１０）、Ａｐｏ２Ｌとも呼ばれる、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５９４）、ＬＴ  ａｌｐｈａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５９５）、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ  ｂｅｔａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３４１）、ＮＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５０６）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４４）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７４）、ＯＸ４０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３２６）、ＲＡＮＫＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３７０１）、ＴＷＥＡＫＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８０９）、ＬＴａｌｐｈａ、ＬＴｂｅｔａ、ＬＩＧＨＴ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８０７）、ＣＤ２７Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２５２）、４１ＢＢＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８１１）、ＧＩＴＲＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０９２）、ＡＰＲＩＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７２０８９）、ＥＤＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１３９９）、ＶＥＧＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１１８）およびＢＡＦＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６５７３）からなる群から選択される。
【００３４】
特に好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの上記規定の構成成分Ａにおいて、プロセシング酵素ＴＡＣＥに耐性を有する、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１個のモノマーが重要である。ＴＡＣＥは、ＡＤＡＭプロテアーゼファミリーのメンバーであり、当然ながら、細胞膜内に存在する、ＴＮＦの生理学的なＴＮＦ特異性のプロセシング酵素を表す。ＴＮＦは通常、細胞膜から分離され、周囲に放出される。開裂部位（Ｓｐａｌｔｓｔｅｌｌｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ（例えば、ヒトＴＮＦのためのＳＷＩＳＳＰＲＯＴ命名法によるｓｃＴＮＦにおいて、ＡＳ  ７６〜７７，Ｎｏ．ＰＯ１３７５）は、好ましくは、本発明による、ＴＡＣＥ耐性の構成成分Ａを欠く。開裂部位は、この場合、本発明に従い、重要なアミノ酸ＡｌａまたはＶａｌの１個または両方の欠失によって、取り除かれ得る。代替的にまたは付加的に、本発明に従い、ＴＡＣＥに対する認識配列（例えば、ヒトＴＮＦのためのＳＷＩＳＳＰＲＯＴ命名法によるｓｃＴＮＦにおいて、ＡＳ  ７７〜８８，Ｎｏ．ＰＯ１３７５）は、その全部または一部が欠失され得る。これは、好ましくは、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸、例えばＴＡＣＥ認識配列の全てのアミノ酸によって行われる。ｓｃＴＮＦに対して、例えばＴＡＣＥ耐性配列がアミノ酸８９〜２３３（ヒトＴＮＦのためのＳＷＩＳＳＰＲＯＴ命名法によるｓｃＴＮＦのＡＳ  ８９〜２３３，Ｎｏ．ＰＯ１３７５）の領域に存在する。構成成分Ａにおけるそのような欠失は、リンカー（構成成分Ｂ、以下を参照）の領域の構成成分Ａの結合部位の近傍のＴＡＣＥによる。構成成分Ａ（例えば、ｓｃＴＮＦ）の潜在的開裂を防ぎ、それによって、本発明によるポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が向上される。必要に応じて、欠失によって生じる配列の短縮が、対応するリンカー延長によって補償され得る。ｓｃＴＮＦに対して模範的に記載された、構成成分Ａの配列の欠失は、上記構成成分Ａの各々に対して使用され得る。ＴＡＣＥ配列が取り除かれるか、その一部が取り除かれる場合、本発明によるポリペプチド内での追加の構成成分Ｂまたは構成成分Ｃ（以下を参照）の使用によって、ＴＡＣＥ認識配列およびＴＡＣＥ開裂部位は、回復されないことに、好ましくは留意されたい。
【００３５】
さらなる特に好ましい実施形態において、上記規定された本発明のポリペプチドの構成成分Ａは、本発明によるポリペプチドは、その表面において共有結合され得るように、改変される。この結合は、好ましくは平らな表面において、または例えば磁気粒子（磁気ビーズ）のような球粒子において、またはナノ粒子／マイクロ粒子において、好ましくは細胞擬態として、膜結合されたＴＮＦ類似の特性を有する治療試薬において行われる。結合のために、結合基（Ｋｏｐｐｌｕｎｇｓｇｒｕｐｐｅ）、好ましくはシステイン残基のＳＨ−基が、本発明によるポリペプチドの少なくとも１個の構成成分ＡのＮ−末端領域に導入される。（さらなる本発明による好ましい結合基が、さらに以下において記載される）。これは、特に好ましくは、所望の部位における追加および／または置換という形態において、システイン残基の導入によって行われ得る。結合基は、構成成分ＡのＮ−末端領域の各部位、好ましくはＮ−末端の近傍に存在する。特に好ましくは、結合基は、最初の１〜１５のＮ−末端領域のアミノ酸、なおより好ましくは、最初の１〜１０のＮ−末端領域のアミノ酸に存在する。例えば、改変は、アミノ酸配列の初期メチオニン（部位２）の後の原核的に発現されたｓｃＴＮＦの場合に、またはリーダー配列直後の真核的に発現されたｓｃＴＮＦに導入され、そのため、それらは、構成成分ＡのＮ−末端アミノ酸を表す。代替的に、本発明に従い使用されるＴａｇ、あるいはＨｉｓ−Ｔａｇ、Ｆｌａｇ−Ｔａｇ（例えば、図１８を参照）の際に、本発明に従い、結合基が導入され得る。例えば、結果として、アミノ酸部位９にシステインを有するＣｙｓＨｉｓ−Ｔａｇに帰着する。さらなる代替は、１個あるいは２個の、本発明によるポリペプチドの構成成分Ｂ（リンカー）への結合基の導入を含む。
【００３６】
好ましくは、本発明によるポリペプチドにおいて、単に、Ｎ−末端にある構成成分Ａ、あるいはさらなるＮ−末端にあるＴａｇが、上記の結合基によって備えられる／改変される。さらなる実施形態において、３個の構成成分Ａを含む本発明によるポリペプチドの場合、例えば２個または３個の構成成分Ａがそれぞれ結合基によって改変され、その結果、全体の分子（本発明によるポリペプチド）は、２個または３個の共有結合を介して、それに適合したマトリクスに結合され得る。本発明による全ての構成成分Ａの１個または数個の結合基を介する、本発明によるポリペプチドの結合は、好ましくは、例えばＴＮＦの個々の構成成分Ａの機能を害することなく、むしろ、表面および粒子における、例えばｓｃＴＮＦの安定性の改良を可能にする。上述されたように、ｓｃＦａｓＬおよびｓｃＴＲＡＩＬ、またはｓｃ形態におけるＴＮＦファミリーの別のメンバーの場合と同様に、例えばｓｃＴＮＦの場合において、本発明によるポリペプチドの各々は、好ましくは、機能的に重要な配置にいて、生物学的機能に必要なサブユニット（構成成分Ａ）を含む。表面／粒子における、本発明によるポリペプチドの結合によって、例えば、結合されたＴＮＦ−ホモ三量体−またはヘテロ三量体、あるいは−ヘテロ多量体を有する表面あるいは粒子を製造することは、本発明によって可能である。これら表面／粒子上において、結合されたＴＮＦ−ホモ三量体−またはヘテロ三量体、あるいは−ヘテロ多量体は、安定しおよび生物活性において、固定される。本発明による単鎖（ｓｉｎｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ）原理によって、構成成分Ａの機能的に重要な三量体状態は、構成成分Ｂによって安定化され、それによって、表面／粒子への共有結合の後の、個々の構成成分Ａの解離が排除され、それによって、生物学的活性の損失の防止が保障される。
【００３７】
そのような本発明による、表面あるいは粒子に結合されたポリペプチドの好ましい特性は、ＴＮＦファミリーの膜安定リガンドに適合する、その生物擬似の活性である。例えば、本発明による固定化されたｓｃＴＮＦは、ＴＮＦＲ２に対する高い親和性およびそれによる高いシグナル伝達能力を獲得する。
【００３８】
上記されたように、結合基によって改変された構成成分Ａを含み、表面および／または粒子に結合された、本発明によるポリペプチドは、本発明に従い、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーおよびそれに関連付けられる結合の結合パターンの検出および操作、枯渇、および／または除去に、起用され得る。その際、例えば、アフェレーシス手段による、体液内に含まれる成分の体外での操作、枯渇、および／または除去の方法が、優先する関心事である。
【００３９】
本発明の対象に対する以下の実施形態は、特にＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＮＦに関係する。しかしながら、該実施形態は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの全ての別のメンバーに適用可能である。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、上記構成成分Ａ（ＴＮＦリガンドファミリーの少なくとも１個のメンバーのモノマー）の他に、ペプチドリンカーの特性を有する、少なくとも２個の構成成分Ｂを含む。
【００４１】
本発明に関してペプチドリンカーとして、生物学的系に発現可能な任意のペプチド配列が考え得る。ペプチドリンカーは、本発明によるポリペプチド構築物において、あるいは好ましくは、関係するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの本来的な三量体化特性にネガティブに影響しない、フレキシブルな結合として現れる。好ましくは、そのような特性、特に、フレキシビリティおよび長さを有するリンカーが選ばれ、そのリンカーは、各リガンド（誘導体）の自然発生的に形成されるホモ三量体の安定化を可能にする。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態においては、それゆえ、構成成分Ｂにおいて、２〜３個の間の、好ましくは４〜１６個の間の、特に好ましくは４〜１２個の間のアミノ酸からなるペプチドリンカーが重要であり、そのアミノ酸は、好ましくは、反復グリシン−セリン構築物、非常に好ましくは、反復配列におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−モジュール（ＧＧＧＳモジュール）を含む。
【００４３】
好ましくは、本発明のペプチドリンカーにおいて、それゆえ、グリシン（Ｇ）が豊富なペプチドリンカー、すなわちペプチドリンカーのアミノ酸配列が、好ましくは６０％〜８０％の、特に好ましくは７５％の高いグリシン部分を有することが、重要である。
【００４４】
好ましい実施形態においては、ペプチドリンカー(構成成分Ｂ)は、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（また、（ＧＧＧＳ）３またはＬｓｈｏｒｔと呼ばれる）、もしくはアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（また、（ＧＧＧＳ）４またはＬｌｏｎｇと呼ばれる）を含む。ペプチドリンカーは、本発明において、とりわけＬ１およびＬ２と示され、そのため、Ｌ１ｓｈｏｒｔ、Ｌ２ｓｈｏｒｔ、Ｌ１ｌｏｎｇおよび／またはＬ２ｌｏｎｇのような表記も生じる。三量体分子の安定化のために、２つの異なるリンカーが使用可能である。
【００４５】
本発明によるペプチドリンカー、すなわち構成成分Ｂは、それぞれ、少なくとも３個の構成成分Ａのうちの２個を互いに結合する。この結合は、構成成分ＡのＣ−末端およびさらなる構成成分ＡのＮ−末端を介して、共有結合によって行われる。本発明によるポリペプチドは、単鎖分子（ｓｃ分子とも呼ばれる）を表す。これは、本発明のポリペプチドが含む全体の構成成分Ａおよび構成成分Ｂが、単一のポリペプチド鎖あるいはタンパク質鎖上に位置することを意味する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、構成成分Ａおよび構成成分Ｂは、三量体タンパク質構築物を形成する。好ましくは、その際、ホモ三量体タンパク質構築物が重要であるが、ヘテロ三量体タンパク質構築物も本発明に含まれる。
【００４７】
この三量体タンパク質構築物の形成は、好ましくは構成成分Ｂによってもたらされ、および／またはそれによって増幅される。本発明によるポリペプチドの三量体化を導く構成成分Ｂあるいは三量体化を増幅する構成成分Ｂは、高い凝集を形成すべきではないため、典型的には、細胞内ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基を有さない。そのため、好ましくは、本発明によるポリペプチド内の構成成分Ｂは、酸化条件のもとで、別の三量体の融合タンパク質の少なくとも１個のシステイン残基との共有結合が出現し得ることを回避するために、システイン残基を有さず、または細胞内、すなわち本発明によるポリペプチド自身内においてジスルフィド架橋を有するようなシステイン残基を有さない。
【００４８】
天然のポリペプチドの、またはペプチドリンカーとして本発明によって導入されるこの天然のポリペプチドのフラグメントの配列は、本発明の主旨および上述の規定に従って、形態において、生物学的に活性な改変体と同一のものであり得る。
【００４９】
本発明による構成成分Ｂにおいて、同一のまたは異なる天然に存在するペプチド配列が重要である。それらは、同一または異なる生物に由来し得る。この生物において、脊椎動物、特に哺乳類、例えばマウス、ラット、豚および、とりわけヒトが重要である。
【００５０】
本発明によるポリペプチドは、構成成分Ａおよび構成成分Ｂの他に、追加の配列断片を有する。この関係において、いわゆるＴａｇ配列において、例えば少なくとも１個のＦｌａｇ−Ｔａｇ、そのためアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、および／または例えば、Ｈｉｓ−Ｔａｇ（数個の連続するヒスチジン、例えば少なくとも５個を含む）および／またはさらなるＴａｇ配列または抗原配列が好ましい。特に好ましい配列断片は、リーダーペプチド配列である。好ましくは、このリーダーペプチド配列は、酵素的細胞内において、ポリペプチドあるいはタンパク質の分泌に対するシグナルを表す。このリーダーペプチド配列は、好ましくはＮ−末端に配置される。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドは、さらなる構成成分Ｃを含む。ここにおいて、これは、相補的な細胞表面分子（「抗原」）を用いた特異的な置換作用によって特徴付けられる。例えば、構成成分Ａとして、アポトーシス誘導体ＴＲＡＩＬまたはＦａｓＬを有する本発明による構築物のような、本発明によるポリペプチド構築物の作用原理は、特に、所定のレセプターに対して独占的にまたは特に大きく、膜分子そして作用するような全てのＴＮＦリガンドファミリーメンバーに対して適切である。これに関して、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）、ＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）およびＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２）の他に、例えば免疫モジュレーターＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）およびＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）が属する。構成成分Ｃは、そのために、「標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」機能を有する。それに応じて、構成成分Ｃは、抗体フラグメント、好ましくは単鎖抗体フラグメント、いわゆるｓｃＦＶまたは細胞表面上の特異的な標的分子を認識する、抗体誘導体である。さらなる実施形態において、構成成分Ｃは、抗体に属さないタンパク質、あるいはペプチドである。しかしながら、それは、抗体−抗原−置換作用あるいはレセプター−リガンド置換作用に類似して、同様に、細胞表面上に特異的な標的分子を選択的に認識する。特に好ましい実施形態において、本発明は、上記本発明によるポリペプチド、構成成分Ａとして少なくとも１個の上記規定されたＴＮＦリガンドファミリーメンバー、および構成成分Ｃとして上記抗体フラグメント、例えばｓｃＦＶを含む。それによって、それぞれ、「標的ドメイン」を有するより小さい、本発明によるポリペプチドが生じる。そのようなより小さい、本発明によるポリペプチドは、有利にも、例えばより凝集化されにくい。
【００５２】
好ましくは、構成成分Ｃにおいて、抗原結合の抗体フラグメントまたは、哺乳類、特にマウスもしくはヒト起源の抗原結合抗体誘導体が重要であり、あるいはヒト化抗体フラグメント、または例えば哺乳類起源のヒト化抗体誘導体が重要である。誘導化および／またはヒト化の場合において、構成成分Ｃは、典型的には技術水準によって製造された単鎖Ｆｖ−誘導体マウスからなる。ＣＤＲグラフトによってヒト化された構成成分Ｃまたは、ｓｃＦｖ−誘導体に対応して移転された、完全ヒト起源の構成成分Ｃが重要である。
【００５３】
さらなる好ましい実施形態において、構成成分Ｃに関し、モノマーとして、膜レセプターに特異的に結合するタンパク質リガンドまたはペプチドリガンドが重要である。
【００５４】
さらなる好ましい実施形態において、構成成分Ｃに関し、特にサイトカインレセプター、増殖因子レセプター、インテグリン、または細胞接着分子である、細胞表面分子に特異性を有するタンパク質またはペプチドが重要である。特に好ましくは、ＴＮＦＲ−遺伝子ファミリーから選択されたサイトカインレセプターが重要である。
【００５５】
本発明によるポリペプチドの構成成分Ｃは、腫瘍組織内において選択的にあるいは優性に発現された抗原に対して、好ましくは、特異性を有する。そのような腫瘍抗原は、一般に悪性細胞上に発現され得、または腫瘍の非悪性部分、ストロマ細胞、または腫瘍内皮細胞に発現され得る。固形腫瘍（癌腫）の非悪性組織部分のそのような抗原は、一方では遺伝的に不変的であり、他方において様々な腫瘍存在において出現するものであり、そのため、全般的な腫瘍マーカーである。本発明のポリペプチドの構成成分Ｃが調整され得る腫瘍関連に対するそのようなリガンドの例は、ＶＥＧＦＲあるいはＶＥＧＦＲ／ＶＥＧＦ複合体、インテグリンａｖβ３およびフィブロネクチンアイソフォームβ（腫瘍内皮細胞のさらなる選択的な標的構築物として）および繊維芽細胞活性化タンパク質（腫瘍ストロマの選択的マーカーとして）である。上記実施例の全ては、特定のｓｃＦｖによって有効に捕らえられ得、そのため、そのようなｓｃＦｖ（「ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ」）は、本発明によるポリペプチドの構成成分Ｃとして、特に適する。また、ここにおいて、構成成分Ｃが調整される腫瘍マーカーとして、ガレクチンが考慮される。
【００５６】
従って、様々な抗体形態における抗体フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、特にｓｃＦｖ４０は、構成成分Ｃとして特に好ましい。
【００５７】
本発明の他の実施形態において、ポリペプチドは、構成成分Ｃを介して、特定の標的細胞として、好ましくは、構成成分ＡのＴＮＦリガンドファミリーメンバーとは異なるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞膜固定のレセプターを認識する。例えば、そのような可能なリガンドの全てではない例を挙げれば、ＴＮＦＳＦ１（ＬＴａｌｐｈａ）、ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂｅｔａ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１４３Ｂ（ＢＬＹＳ）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１６（ＣＤ３０Ｌ）およびＴＮＦＳＦ１８（ＡＩＴＲＬ）、そしてＥＤＡであり、それら、またはそれらの機能性フラグメント、もしくは天然配列またはフラグメントの機能性改変体は、同様に、本発明によるポリペプチド構造における構成成分Ａとして機能し得る。特にこれに関して、生物学的活性のための前提として、サブユニットの三量体構造を必要とする、その機能性フラグメントまたは機能性改変体の、全ての膜固定型II−タンパク質（細胞外Ｃ末端）が、明らかにされる。
【００５８】
本発明のさらなる対象は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸である。同様に、本発明によるポリペプチドに対してコードする配列断片、および１個または数個のさらなる配列断片を含む核酸構築物も含まれる。その様なさらなる配列断片において、例えばリーダーペプチドに対してコードする配列が重要である。そのリーダーペプチドは、ポリペプチドあるいは本発明によるタンパク質の分泌に対するシグナルとして、真核細胞に存在する。または、ｓｃＦｖ４０に対してコードする配列が重要である。すなわち、腫瘍ストロマ抗原ＦＡＰに対して特異的である、単鎖（ｓｃＦｖ）−抗体フラグメント４０の配列、または「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｚｙｔｏｋｉｎｅ」（ＡＭＡＩＺｅ）に対して、またはＨＩＳ／Ｆｌａｇ−Ｔａｇ、発現されたタンパク質あるいはポリペプチドの親和性精製へのペプチド配列に対してコードする配列が重要である。この提示は、単に例示であり全てではない。
【００５９】
核酸配列に含まれ得るさらなる配列は、同様に、例えば調節配列を含めて、非コード３´配列および５´配列のような非コード配列である。
【００６０】
本発明による核酸配列は、同様に、例えばマーカー配列に対してコードする、または例えば、本発明のポリペプチドの単離または精製を軽減するポリペプチドをコードする配列に対してコードする、核酸配列を用いて融合され得る。代表的な配列は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリヒスチジン（例えば、ＨＩＳ  ６）、血球凝集素またはＨＳＶ−Ｔａｇをコードするようなものを含む。しかしながら、この例示には決して限定されない。
【００６１】
本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、特にｍＲＮＡであり得る。核酸分子は、二重（二本）鎖または単（一本）鎖で存在し得る。単鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コードする（センス）またはコードしない（アンチセンス）鎖であり得る。
【００６２】
本発明による核酸は、好ましくは単離されて存在する。これは、核酸分子または核酸配列が、核酸配列によって両側に配置されないことを意味する。その核酸配列は、通常は、遺伝子または核酸配列の両側に位置し（ゲノム配列のように）および／または、全体あるいは部分的に精製される（例えば、ＤＮＡライブラリーまたはＲＮＡライブラリーのように）。例えば、本発明の単離された核酸は、それが天然に存在する細胞環境に関して、単離されて存在し得る。
【００６３】
好ましい一実施形態において、核酸は図１９〜図２６に示される核酸配列のうちの１個を含み、またはこれら核酸配列のうちの１個から成る。
【００６４】
本発明によれば、本発明による核酸あるいは核酸構築物の機能性フラグメントまたは機能性改変体が含まれ、その構築物の上に、上記の実施形態は、機能性フラグメントおよび改変体に対応した利用を見出す。
【００６５】
本発明による核酸、核酸構築物または機能性フラグメントもしくはそれに関する機能性改変体の製造は、当業者によって知られる（例えば、上記のＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．参照）標準的な方法を用いて行われ得る。特に、ＰＣＲ技術は、この関係において利用を見出す。本発明に従う、製造された核酸配列の検査は、同様に当業者によって知られた、配列決定方法またはハイブリダイゼーション方法に基づいて行われ得る。
【００６６】
同様に、本発明による核酸の遺伝子産物もまた、本発明に含まれる。好ましくは、この遺伝子産物は、図１９〜図２６に示されるアミノ配列のポリペプチドをコードする。本発明の遺伝子産物は、単に転写（ｍＲＮＡ）のみならず、好ましくは精製された形態でのポリペプチドおよびタンパク質にも関する。同様に、対立遺伝子、そのような遺伝子産物の機能性フラグメント、または機能性改変体も含まれる。これらの概念に対応する上記規定は、遺伝子産物の機能性フラグメント、または機能性改変体に対して有効である。
【００６７】
本発明のさらなる対象は、本発明によるポリペプチドに対してコードする核酸を含むベクターに関する。好ましくは、本発明によるベクターにおいて、発現ベクター、すなわち原核細胞および／または真核細胞内において、核酸の発現および／または増幅の能力を有するベクターが重要である。特に本発明は、プラスミドベクター、例えばｐＢＡＢＥｐｕｒｏ、ファージ、レトロウイルスベクター、特に、遺伝子治療法に利用可能な全てのベクター系（例えば、アデノウイルスベクター系にも）関する。そのため、本発明の範囲において、本発明によるベクターまたは核酸または核酸構築物を用いた、遺伝子治療的ベクター系が、本発明によって示された薬用適応のための治療法として示される。
【００６８】
本発明によるベクターは、好ましくは、本発明の核酸の発現を可能にし、あるいは増幅し、転写を調節するコントロール配列を有する。そのようなコントロール配列は、例えばポリアデニル化シグナル、プロモーター、例えば天然のまたは合成のプロモーター、転写作用のためのエンハンサー、転写調節のためのオペレータ配列、組織特異性転写のためのサイレンサー、ｍＲＮＡ上の適正なリボソーム結合部位をコードする配列、ｍＲＮＡを安定化する配列および転写および／または翻訳のターミネーション調節する配列を含む。これは、単に、可能なコントロール配列の例示的提示を示す。さらなる可能なコントロール配列は、技術水準において良く知られており、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０），Ｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されている。コントロール配列は、そのコントロール機能を増幅させるために、例えば、１個または数個の核酸の欠失、付加、または置換によって、改変され得る。
【００６９】
様々な生物に対する、特に数多くの様々なプロモーターが知られている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて使用されるベクターに対しての好ましいプロモーターはＡｐｒＥ−プロモーターであり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用される好ましいベクターはＴ７／Ｌａｃプロモーターであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおいて使用される好ましいプロモーターはＰＧＫ１であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおいて使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）において使用される好ましいプロモーターは、原核宿主細胞においての使用に適しているｃｂｈＩ．プロモーターである。例えば、ベータラクタマーゼ（ベクター  ｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］，レプリコンおよびベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）、ラクトース−プロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，２７５：６１５）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９），Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ），２８１：５４４）、アルカリホスファターゼ、ｔｒｐ−プロモーター（ベクター  ｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３７６９５］）、およびｔａｃ−プロモーター（プラスミドから単離可能  ｐＤＲ５４０［ＡＴＣＣ３７２８２］）のようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、そのヌクレオチド配列が一般に知られた他の細菌プロモーターは、当業者によって、それを本発明の核酸を用いて連結反応するために変更される。その際、所望の制限部位を生じさせるために、リンカーまたはアダプターが使用され得る。好ましくは、細菌系に使用されるプロモーターは、同様に、作動可能に核酸と結合されるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含む。
【００７０】
適正な発現ベクターは、例えば染色体、非染色体および合成ＤＮＡのセグメントから成り得る。これに関して、ＳＶ４０および細菌プラスミドの数多くの誘導体が知られている。例えば、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＢＫ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２，ｐＭｂ９、ｐＵＣ１９およびそれらの誘導体のような大腸菌からなるプラスミド、ＲＰ４のような、広い宿主領域に対して利用可能なプラスミド、および、例えばＮＭ９８９および他のＤＮＡファージ（例えばＭ１３）のような、ファージ−ラムダの数多くの誘導体のようなファージＤＮＡ、およびフィラメント単鎖ＤＮＡ−ファージ、補助プラスミド、酵素細胞内での使用に適したベクター、およびプラスミドとファージＤＮＡとの組合せから成るベクターである。技術水準において、本発明による発現ベクターの使用に対する数多くの発現技術が知られている。そのような技術は、例えば一般に、上記Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている。
【００７１】
本発明のさらなる対象は、本発明による核酸および／または本発明によるベクターを含む、宿主細胞に関する。
【００７２】
本発明による宿主細胞は、本発明による核酸またはベクターに対して、宿主および発現手段として機能可能な細胞である。ここで原核および真核宿主細胞が重要に成り得る。原核−細菌−宿主細胞は、例えば、Ｒ．ｍａｒｉｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。真核宿主細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母、Ｓｆｐのような昆虫細胞、およびＣＯＳ、ＣＨＯのような哺乳類細胞を含む。これらの例示は決して全てではない。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因に依存し、例えば宿主細胞へのベクターの導入においては、特に、使用される本発明によるベクターに依存する。
【００７３】
本発明のさらなる対象は、以下の工程を含む、本発明による宿主細胞の製造に関する：
ａ．本発明による核酸、または本発明によるベクターを製造する工程と、
ｂ．工程（ａ）に従う核酸および／またはベクターを、細胞内に導入する工程。
【００７４】
核酸、例えばベクターの製造は、本発明に従い、上記標準的な方法および例示的記載に従って行われ得る。本発明による核酸、例えば本発明によるベクターの宿主細胞への導入は、各適切な標準方法の下に行われ得る。それには、例えば塩化カルシウム、リポフェクション、感染、トランスダクション等の使用の下に、転換、エレクトロポレーション、トタンスフェクションが属する。様々な標準方法は、例えば、上記Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている。
【００７５】
本発明のさらなる対象は、本発明によるポリペプチドの製造方法に関し、ここで該方法は、典型的に以下の工程を含む：（ａ）本発明による宿主細胞を、適正な条件下において培養する工程と、（ｂ）本発明による核酸あるいは核酸構築物を、適正な条件下において発現させる工程と、（ｃ）宿主細胞および／または培養上清からポリペプチドを単離する工程。
【００７６】
宿主細胞の培養は、適正なＰＨおよび適正な温度の下で、適正な培養培地において宿主細胞の成長を可能にすることを意味する。そうような成長条件は、各使用される宿主細胞に依存し、当業者には良く知られている。細胞の培養の示唆は、また、上記Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）にある。
【００７７】
ポリペプチドの発現は、ここでは、典型的には技術水準に従って適正な発現系において行われ得る。好ましくは、安定なトランスフェクションの分泌生成物として、例えば、ＣＨＯ細胞、またはＣｏｓ７あるいはＳＦ９（昆虫細胞）のような他の動物細胞、または、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓであるさらなる真核細胞系。好ましくは、発現された本発明によるポリペプチドは、それぞれ、細胞系内の分泌に適正なリーダー配列を有する。そのため、発現に適正化された本発明によるベクターは、コードする断片を含む。その断片は、機能性リーダー配列に対してコードする。例えば、Ｂｒｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１７３〜１８４，１９９７）に、哺乳類および昆虫細胞に対して記載されたように、または、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中の発現および分泌に対する、例えばｐＰＩＣ−Ｚａｌｐｈａ−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスルーエ、ドイツ）の使用の下で。
【００７８】
宿主細胞からの本発明によるポリペプチドの単離は、ポリペプチドおよびタンパク質の精製に適正化された、クロマトグラフィー法、沈殿法等のような標準方法によって行われ得る（上記Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）参照）。
【００７９】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドまたは必要に応じて、核酸、核酸構築物、ベクターまたは宿主細胞（ここで、カテゴリー「本発明の物質」の下に統合される）は、医薬品として、または疾患治療に対する医薬品の製造に対して、考慮される。
【００８０】
本発明による物質が本発明による構成成分Ｃ（上記、抗体フラグメントまたは他の特異的に結合するタンパク質／ペプチドを参照）を含む場合には、特異的な、細胞膜−発現の標的分子へのポリペプチドあるいはタンパク質の結合の後に、物質が、ＴＮＦリガンドファミリメンバーに対応するレセプターを介して完全な生物学的作用を展開するときに、その使用が特に与えられる。標的構成成分Ｃの特異性の適正な選択を介して、本発明による物質の活性が、例えば腫瘍組織である治療組織へ向けられ、各適応症／腫瘍症に特定的に調整／最適化された治療剤が製造され得る。本発明によるポリペプチドは、例えば腫瘍治療剤としての使用の際、特に、固形腫瘍またはリンパ性腫瘍（良性または悪性の）治療への使用の際、標的構成成分Ｃによるｉｎ  ｖｉｖｏ投与の後に、まず、腫瘍自体または反応性腫瘍ストロマ／腫瘍血管系によって形成された膜マーカーを介して、腫瘍領域において、強化され、そこでＴＮＦレセプターファミリー−陽性腫瘍細胞、またはＴＮＦリガンドファミリーメンバーに対して感受的な、反応性の腫瘍育成正常組織の感受性細胞を提示する。
【００８１】
例えばＴＮＦレセプターファミリーによって引き起こされたシグナルカスケード、あるいはアポトーシスシグナルカスケードである、シグナルトランスダクション鎖の活性が引き起こされる場合、本発明による物質は、基本的に常に、治療的分野における使用が好ましい。そのため、本発明においては、物質の使用は、治療の際に、あるいは全ての過剰増殖性疾患の治療への医薬品の製造において考慮される。例えば、また、過剰免疫反応、例えば多発性硬化症、リウマチ性関節症、糖尿病およびＴＥＮのような自己免疫疾患の際に、または例えば、感染症（細菌（例えばマイコバクテリア）、ウイルス、または原生動物上の）において生じるような外部（Ｆｒｅｍｄ）抗原に対する誤誘導免疫反応の際の、免疫系細胞の、目標に適合された排除のために、考慮される。さらに、代謝性疾患の、または一般的な過炎症容態、特に慢性の炎症、例えばアレルギーの際の治療、および外部組織に対する患者の免疫系の拒絶反応の治療が考慮される。上記の場合、本発明によるポリペプチドは、好ましくはアポトーシスシグナルガスケードが細胞死の目標をもって引き起こされる標的細胞の表面上の、特定のマーカーを、例えば構成成分Ｃを介して認識せねばならない。また、外部組織の移植の後の治療の場合において、例えば、移植患者の免疫系の、拒否反応に対して責任のある、生体に適正な細胞が、標的細胞として働く。
【００８２】
一般に、本発明による物質あるいは医薬品は、癌疾患、特に固形あるいはリンパ性の腫瘍、伝染病、代謝性疾患、炎症容態、過増殖性疾患、自己免疫疾患、特にリウマチ／関節炎疾患、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、ＧｖＨＤ、ウイルス性肝炎（ＨＢＶ，ＨＣＶ）、アルコール感応性肝炎、肝臓移植の際の拒絶反応、，多発性アポトーシス反応に基づく疾患、退化性疾患、特に神経退化性疾患、の治療ために適する。
【００８３】
上記疾患の治療のための医薬品としての本発明の物質の使用において、好ましくは、組換え生成されたタンパク質が治療患者に投与される。代替的に、転換される細胞が患者から採取され、その細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本発明による（発現−）ベクターによって転換され、培養され、および次いで再移植体として患者内に移される。トランスフェクションは、好ましくは核酸、核酸構築物、または、調節可能プロモーターに発現を結合する（発現−）ベクターを介して行われる。転換された自身の移植体は、特定の患者および特定の標的細胞に依存して、局部的に、例えば注射される。局部的投与は、例えば腫瘍治療の場合に好ましい。その際、例えば、皮膚腫瘍（例えば、メラノーマ）、神経系腫瘍（例えば、膠芽腫）の治療に対して、患者から腫瘍細胞が採取され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転換され、続いて可能な限り、直接、腫瘍に注射される。
【００８４】
本発明のさらなる対象は、本発明による物質の、感染症、特にウイルス感染症に対する能動的または受動的免疫へのワクチンの製造、および風疹、はしか、小児麻痺、狂犬病、破傷風、ジフテリア、ＢＣＧ、マラリア、黄熱病、ＨＩＶ、またはインフルエンザに対するワクチン化のためのワクチンの製造に関する。
【００８５】
本発明による物質は、同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断に使用され得る。
【００８６】
本発明のさらなる対象は、例えば、上記規定された構成成分Ａまたはそれに結合する、もしくはそれに関連付けられる細胞の結合相手のような、体液に含まれる成分の、体外での（ｅｘ  ｖｉｖｏ）操作、枯渇、および／または除去の方法に関する。そのような体外での方法は、好ましくは、例えばアフェレーシス、特に、アフェレーシスの基本形態、血漿アフェレーシス、および血球アフェレーシスのような方法を含む。
【００８７】
本発明によれば、血漿アフェレーシスは、血液の血漿部分内の所定の可溶性または懸濁された成分の、体外での操作、枯渇、および／または除去、およびそのように処理された血液の患者への戻しを含む。そのために、患者から、好ましくはフェレーシス装置を用いて抹消血液が採血され、その血液に、随意の凝血防止剤が追加され、血液は、主成分−固形の（赤血球、白血球および血小板）および液状の部分（血漿）−に分離される。この主成分の分離の後に、そのように得られた血漿分画に含まれる、可溶性または懸濁された血液成分は、さらなる方法工程において、例えば、本発明によるポリペプチドの使用の下に、操作され、枯渇され、および／または除去され得る。続いて、そのように処理された血漿は、以前に分離された固形血液成分と一緒にされ、患者に再注入され得る。血漿アフェレーシスに起因する体積減少は、本発明による方法において、さらに、等浸透圧の食塩水によって補充され得る。血漿アフェレーシスは、本発明に従い、好ましくは、治療学的血漿交換（ＴＰＥ）、免疫吸着（ＩＡ）、沈殿（ＨＥＬＰ）、分別膜濾過、および他の手段のような方法を用いて行われる。例えば、ここで血漿濾過カラム（例えば、米国特許第４，６１９，６３９号，Ａｓａｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照、ここに参照を介して追加される）が挙げられる。同様に、膜濾過システム（ＭＤＦ）は、様々な粒子および表面、例えば、ＰｌａｓｍａＦｌｏ（登録商標）ＯＰ−０５（Ｗ）ＬおよびＲｈｅｏＦｉｌｔｅｒ（登録商標）ＡＲ２０００  血液フィルタ（日本のＡｓａｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．によって製造される）、のようなフィルタの使用の下に導入され得る。あるいは、本発明による血漿アフェレーシスにおいて、全ての適正な粒子および表面が使用され得る。
【００８８】
血球アフェレーシスにおいては、前記の血漿アフェレーシスとは異なり、本発明に従い、体外において、血液中を循環するおよび／または骨髄に結合される細胞成分（赤血球、白血球、幹細胞または血小板）またはこれら細胞の特定の亜集団が、臨床的効果を得るために操作され、枯渇され、および／または除去される。ここでまた、好ましくはフェレーシス装置を用いて患者から抹消血液が採血される。その後、随意に血液に凝血防止剤が追加され、血液は、主成分に分離される。続いて、細胞成分を含む血液分画中において、これらの細胞成分は、さらなる方法工程において、好ましくは、同様に本発明のポリペプチドの使用の下に、操作され、枯渇され、および／または除去され得る。好ましくは、本発明による血球アフェレーシにおいては、様々な分画への血液の分離は、必要に応じて、血液の所定の成分の分離と同様に、遠心分離法、分別膜濾過、または他の手段、のような方法を用いて行われる。さらに、膜濾過システム（ＭＤＦ）は、様々な粒子および表面、例えば、ＰｌａｓｍａＦｌｏ（登録商標）ＯＰ−０５（Ｗ）ＬおよびＲｈｅｏＦｉｌｔｅｒ（登録商標）ＡＲ２０００  血液フィルタ（日本のＡｓａｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．によって製造される）のようなフィルタの使用の下に導入され得る。
【００８９】
本発明による第３の代替において、上記血漿アフェレーシスと血球アフェレーシスとが互いに結合され得る。それは、例えば、血液の血漿部分内の可溶性または懸濁された部分、および、血液中を循環するおよび／または骨髄に結合される細胞成分（赤血球、白血球、幹細胞または血小板）またはこれら細胞の特定の亜集団が、臨床的効果を得るために、操作され、枯渇され、および／または除去されるためである。そのような、血漿アフェレーシスと血球アフェレーシスとから成る結合は、好ましくは、本発明によるポリペプチドの使用の下で製造される。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明は、血液の可溶性成分、懸濁された成分、または細胞性成分の、体外での操作、枯渇、および／または除去の（アフェレーシス）方法に関し、該方法は、
＊必要に応じて、血液を、固体あるいは液体の成分を有する単一あるいは複数の分画に分離する工程と、
＊該血液の可溶性成分、懸濁された成分、または細胞性成分を、本発明によるポリペプチドと連結された表面あるいは粒子に結合させる工程と、
＊必要に応じて、該結合された血液の可溶性成分、懸濁された成分、または細胞性成分を分離する工程とを含む。
【００９１】
本発明によるアフェレーシス方法の特定の実施形態において、必要に応じて行われる血液の分離の前に、随意的に、患者の採血が行われ得る。さらに随意的に、本発明による方法によって処理された血液、またはその様に処理された患者の血液分画は、再注射され得る。それに加えて、必要に応じて、以前に分離され、および事情によって様々に処理された血液分画が、他の処理されていない固形のおよび／または可溶性の血液成分と再統合される必要がある。本発明による方法によって生じた体積減少は、適正な液体、例えば等浸透圧の食塩水によって補充され得る。
【００９２】
血液の可溶性成分、懸濁された成分、または細胞性成分を、本発明によるポリペプチドと連結された表面あるいは粒子に結合させるための、本発明によるアフェレーシス方法に含まれる工程は、所望の選択性を得るために、１回または数回行われ得る。
【００９３】
本発明によるアフェレーシス方法において、上記規定されたような本発明によるポリペプチドと共有結合された表面および／または粒子が導入される。それに加え、好ましくは、本発明によるポリペプチドは、ポリペプチドに含まれる結合基Ａを介して、表面および／または粒子に共有結合される。
【００９４】
個々の構成成分Ａを介しての、本発明によって使用されるポリペプチドの結合は、好ましくは、ＤＥ  １０１  ４４  ２５２  Ａ１に記載されているように行われる。その際、本発明によって使用されるポリペプチドの結合は、好ましくは、まず、担体表面に存在する官能基と、ポリペプチド内において構成成分Ａ内に含まれる結合基との結合を介して、表面（担体）または粒子において行われる。これら結合基は、好ましくは、担体の官能基に対して相補的であり、これらと親和性結合、好ましくは共有結合し得る。構成成分Ａの官能基は、構成成分Ａの内部において、それが、本発明によるポリペプチドの生物学的活性に対して責任のあるドメインの外側において、配置されるように、位置される。このようにして、本発明に従い、ＴＮＦに調整され、その生物学的活性を保持して、担体上に固定することが可能となる。その固定の後に、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、生物学的活性に対して要求されるドメインに対して、固定化されていない本発明によるポリペプチドの３次元的構造が変更されないように、また、ドメインが、細胞性反応相手との接触の際に、それに対して自由に開放されているように、担体表面上に固定される。本発明の好ましい実施形態において、担体表面の官能基は、アミノ基、カルボキシ基、エポキシ基、マレインイミド基、アルキルケトン基、アルテヒド基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、チオール基、およびチオエステル基からなる群より選択される。
【００９５】
本発明によれば、本発明によるポリペプチドの固定される構成成分Ａの結合基は、担体表面の官能基に対するのと等しい種を有す基から選択される。本発明によるアポトーシス方法において、使用される表面／粒子（担体）は、そのため、その表面において、固定化される本発明によるポリペプチドと、結合基とを共有結合させる官能基を有する。その際、ポリペプチドの結合基は、担体の機能性タンパク質としての、別の基である。互いに結合状態にある結合基および官能基は、その際、互いに相補的でなければならない。それは、互いに共有結合の状態であることを意味する。本発明に従い、担体の官能基として、例えばアミノ酸基が使用される場合、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの結合基はカルボキシ基である。逆に、本発明に従い、カルボキシ基が担体の官能基として使用される場合、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの結合基はアミノ酸基である。本発明に従い、担体の官能基としてチオール基が使用される場合、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの相補的結合基はマレインイミド基である。逆に、本発明に従い、マレインイミド基が担体の官能基として使用される場合、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの相補的結合基はチオール基である。本発明に従い、担体の官能基としてアルキルケトン基、特にメチルケトン−またはアルテヒド基が使用される場合、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの機能的に相補的な結合基はヒドラジン−またはヒドラジド基である。逆に、本発明に従い、ヒドラジン−またはヒドラジド基が担体の官能基として使用される場合、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの機能的に相補的な結合基はアルキルケトン基、特にメチルケトン−またはアルテヒド基である。本発明に従い、特に好ましくは、担体表面上の官能基において、マレインイミド基が重要であり、本発明によるポリペプチドの構成成分Ａの結合基においては、チオール基が重要である。
【００９６】
その際、好ましくは、固定化が調整されて行われる。本発明に関連して、「調整されて固定化された（ｇｅｒｉｃｈｔｅｔ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｉｅｒｔ）」または「指向された固定（ｇｅｒｉｃｈｔｅｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｉｅｒｕｎｇ）」の概念は、本発明のポリペプチド、特にｓｃＴＮＦメンバーは、ｓｃＴＮＦメンバー内部の規定された位置に担体が固定されること、生物学的活性に必要なドメインの３次元的構造が、非固定状態に対して変更されないということ、このＴＮＦドメイン、例えば、細胞性反応相手の結合ポケットが、細胞性反応相手の接触の際に、これに対して自由に利用できることを意味する。「調整されて固定化された」は、また、担体表面の本発明によるポリペプチドの結合が、固定されたタンパク質が、細胞性のあるいは細胞類似の環境における後の使用において、タンパク質分解酵素によって分解されないか、またはかなりゆっくり分解され得るように、行われることを意味する。それは、固定された本発明によるＴＮＦ分子が、それが、できる限り、プロテアーゼに対する攻撃点を提供しないように、担体表面において合わせられることを意味する。追加的に、本発明によるポリペプチドは、分子生物学的方法による結合の前に、プロテアーゼに対して耐性があるように、なし得る（例えば、プロテアーゼＴＡＣＥの際のＴＮＦリガンドファミリーメンバーに対して上記されたように）。
【００９７】
本発明によるポリペプチドは、結合された構成成分Ａを介して、他の結合／物質と置換作用を結ぶ生物学的機能および能力を保持する。本発明によるポリペプチドが、例えば３個の構成成分Ａ（三量体）を含む場合、典型的には、３個の構成成分Ａのうちの２個または好ましくは１個は、それぞれ、表面上／粒子上に共有結合される。
【００９８】
全ての適正な表面および／または粒子は、本発明のポリペプチドが結合できる、結合に適した表面および／または粒子を含み得る。好ましくは、特に培養プレート、または、例えばＤｙｎａビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧＭＢＨ）、ナノ−ビーズ、ナノ粒子のようなマクロビーズ、または、例えばナイロンウール、セファローズ、セファデックス等のような固形相である。本発明に従い、さらに、本発明によって使用される担体系において、２５ｎｍ〜１０００ｎｍの大きさを有するコンパクトまたは中空のナノ粒子の考慮が見込まれる。これらは、有機または無機の粒子材料から成る。材料の種類は、本発明に従い、後の使用に対応して変化し得る。その際、ナノ粒子の担体は、好ましくは、生物学的に協調性のある、および／または生物学的に分解可能な材料からなる。本発明に関し、「ナノ粒子」の下に、化学的に反応性の官能基が配置される表面を有する担体を含む、結合鋳型が理解される。この官能基は、結合される分子、特に、本発明によるポリペプチドの相補的官能基と、親和性結合、そのため、共有結合および／または非共有結合する。この方法において、本発明によるポリペプチドが、その表面に安定して固定され得る。ナノ粒子の担体は、化学的に不活性な有機、または無機材料から成り、１μｍより小さい大きさ、好ましくは、２５ｎｍ〜５００ｎｍの大きさを有する。
【００９９】
本発明によるアフェレーシス方法の特定の実施形態は、例えば本発明によるポリペプチドｓｃＴＮＦを有する、生物学的に機能化された表面（平面状または粒子としての）を含む。そのｓｃＴＮＦは、上記された様式および方法において、表面に共有結合されておよび調整されて固定されている。例えば、数個の固定化されたｓｃＴＮＦ分子またはその改変体を含む、そのような生物学的に機能化された表面は、各々相補的な結合相手（例えばＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２）に対する高い親和性を可能にする。レセプターＴＮＦＲ１および特にＴＮＦＲ２は、腫瘍患者のまたは他の疾患における血液中の、プロセスされた可溶性分子として、非常に高められた濃度において見出される。腫瘍患者の血液からのＴＮＦＲの除去は、明白に、臨床的に文書化された腫瘍退縮を導き、それは生体固有の防御の復元に帰せられる（例えば、Ｌｅｎｔｚ  ＭＲ，（１９９９）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１）。本発明によるポリペプチド、例えばｓｃＴＮＦを用いたアフェレーシス方法は、好ましくは、２つのレセプターが、同時におよび有効的にサンプルから除去され得ることを可能にする。この方法のさらなる利点は、本発明によるポリペプチドの個々の構成成分Ａの解離が不可能であること、すなわち機能性表面の活性損失、および処理された血液の、分離された物質との汚染は見込まれないという、上記事実である。
【０１００】
本発明によるアフェレーシス方法は、連続した方法として、または非連続の方法として実施され得る。連続的方法として、本発明による方法は、好ましくは、採血あるいは採血の分画の直後であり、患者への血液の戻しの前において、血液のまたは得られた血液分画のその間の保存なしに実施される。それに対して、非連続的方法においては、採血あるいは採血の分画は、各工程の後に、所定の期間、保存され得る。
【０１０１】
本発明によるアフェレーシス方法における温度は、好ましくは０°Ｃ〜４０°Ｃの間にある。連続的方法においては、温度は、好ましくは２５°Ｃ〜４０°Ｃの間にあり、特に好ましくは、３６°Ｃ〜３８°Ｃの間の領域にある。非連続的方法においては、温度は、好ましくは０°Ｃ〜４０°Ｃの間にあり得る。
【０１０２】
上記されたような本発明によるアフェレーシス方法は、好ましくは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが関連する疾患の際の、診断、診療および／または予防に導入される。特に、腫瘍疾患、特に固形またはリンパ性の疾患の際に、体液性および細胞性の成分を有した免疫系のホメオスタシスの回復は、アフェレーシス方法の有効性の鍵として、見なされる。そのため、さらなる使用において、本発明によるアフェレーシスは、非悪性の疾患の際の、免疫ホメオスタシスの回復へも導入され得る。それには、炎症性疾患、関節炎のおよびリウマチ性の疾患、または免疫系疾患が属し、さらに、伝染病、代謝性疾患、炎症容態、過増殖性疾患、自己免疫疾患、特にリウマチ／関節炎疾患、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、ＧｖＨＤ、ウイルス性肝炎（ＨＢＶ，ＨＣＶ）、アルコール感応性肝炎、肝臓移植の際の拒絶反応、多発性アポトーシス反応に基づく疾患、退化性疾患、特に神経退化性疾患への治療が属する。
【０１０３】
腫瘍疾患においては、特に、結腸腫、メラノーマ、腎臓腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、胃腸腫瘍、神経膠腫、甲状腺腫瘍、乳房癌腫、前立腺腫瘍、肝腫瘍、例えば、乳頭腫ウイルス誘導腫（例えば、頚部腫）のような、様々なウイルス誘導腫瘍、アデノ腫、ヘルペスウイルス誘導腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘導Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎誘導腫瘍（肝細胞癌腫）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２誘導リンパ腫、聴神経腫、子宮頸部癌、肺癌、咽頭癌、肛門腫、膠芽腫、リンパ腫、直腸腫、星細胞腫、脳腫瘍、胃癌、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、膣癌、膵臓癌、精巣癌、メラノーマ、甲状腺腫、膀胱癌、ホジキン症候群、髄膜腫、雪山病（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ  Ｋｒａｎｋｈｅｉｔ）、気管支腫、下垂体腫瘍、菌状息肉症、食道癌、乳癌、カルチノイド、ノイリノーマ、脊髄腫、バーキットリンパ腫、咽頭癌、腎臓癌、胸腺腫、体（Ｃｏｒｐｕｓ）腫、骨癌、非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭頸部（Ｋｏｐｆ−Ｈａｌｓ）腫瘍、乏突起膠腫、外陰癌、腸癌、結腸腫、食道腫、いぼ状腫（Ｗａｒｚｅｎｂｅｔｅｉｌｉｇｕｎｇ）、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣腫、軟部腫瘍、卵巣癌、肝臓癌、膵腫、子宮頸部腫、子宮内膜腫、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆嚢癌、白血病、プラズマ細胞腫、子宮癌、まぶた腫瘍、前立腺癌等、が含まれる。
【０１０４】
関節炎の疾患は、特に、単一関節炎、稀発関節炎、多発関節炎、急性関節炎（とりわけ、敗血性、結晶誘導、反応性関節炎および急性類肉腫症（Ａｒｋｏｉｄｏｓｅ）、亜急性関節炎、慢性関節炎（とりわけ、リウマチ性関節炎、血清反応陰性の脊椎関節炎の際の関節炎）、感染性の関節炎、疑似または後感染性の関節炎、リウマチ性関節炎、若年性慢性関節炎、炎症性の結合組織疾患および血管関節炎、代謝性疾患と栄養起因障害との併合における関節炎、内分泌障害の際の関節炎、内芽腫疾患の際の関節炎、造血系の疾患の際の関節炎、血液凝固の障害に起因する関節出血の際の関節炎、腫瘍性の関節炎、疑似腫瘍性の関節炎、（後−）外傷性の関節炎、軟骨関節の疾患の際の関節炎、神経障害の際の関節炎、膿胞の化膿する、壊死する、または、組織富栄養を伴う皮膚病の際の関節炎、関節炎アレルギー、クラミジア誘導関節炎、赤痢関節炎、淋病関節炎、破壊性関節炎、乾癬症関節炎、眼球乾燥関節炎、梅毒関節炎、結核関節炎、尿酸関節炎のような、その他の関節外の原疾患の際の関節炎等、を含む。
【０１０５】
本発明のさらなる対象は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクターおよび／または本発明による宿主細胞、ならびに、薬学的に安全な、補助物質、添加物質および／または担体物質（例えば、溶解媒体も）を含む、薬学的組成物またはワクチンである。本発明による薬学的組成物またはワクチンは、好ましくは、癌疾患、特に固形あるいはリンパ性の腫瘍、伝染病、代謝性疾患、炎症容態、過増殖性疾患、自己免疫疾患、特にリウマチ／関節炎疾患、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、ＧｖＨＤ、ウイルス性肝炎（ＨＢＶ，ＨＣＶ）、アルコール感応性肝炎、肝臓移植の際の拒絶反応、，多発性アポトーシス反応に基づく疾患、退化性疾患、特に神経退化性疾患、の治療のために導入される。
【０１０６】
それとともに、本発明による物質と、薬学的に許容される補助物質、添加物質および／または担体物質との組合せも示される。対応する製造方法が、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）によって示され、それは、本発明による開示の要素である。非経口的投与のために、担体物質として、例えば殺菌水、殺菌食塩水、ポリアルキレングリコース，ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｅｒｔｅナフタリン、および特に生体適合のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが考慮される。そのような本発明による薬学的組成物は、上記に示された全ての医学的適応に対して考慮される。さらに、本発明による組成物は、ラクトース、マンニトール、例えば、本発明によるインヒビターへのポリエチレングリコールのような、ポリマーの共有結合への物質、例えば、ポリラクタート、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、または、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層ラメラーテ、多層ラメラーテ、ベシクル、赤血球フラグメントまたはスフェロプラストのようなポリマー結合の、特定の準備における、または対する材料を含めて、金属イオンとの複合物のような、充填物質または物質を含み得る。組成物の各々の実施形態は、物理的挙動に依存して、例えば可溶性、安定性、生体適合性または分解可能性を顧慮して、選択される。組成物内の本発明による作用物質の制御されたまたは一定の遊離は、親油性沈殿物（例えば、脂肪酸、ワックスまたはオイル）の基盤上の定式化を含む。本発明の範囲において、本発明による物質またはそのような物質を含む組成物の被膜加工、つまりポリマーを用いた被膜も示される。さらに、本発明による物質あるいは組成物は、保護被膜、例えばプロテアーゼインヒビター、または透過性増強剤を有する。
【０１０７】
基本的に、本発明による物質ならびに本発明による薬学的組成物またはワクチンに対する本発明の範囲において、全てが技術水準において知られている投与方法において示されており、好ましくは、非経口の、すなわち例えば皮下の、筋肉内の、または静脈内の、経口の、鼻腔内の、耳内、経皮的な、局部の（例えば、ゲル、軟膏、ローション、クリームを介して）、腹膜内の、肺内の（例えば、ＡＥＲｘ（登録商標）Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎｓ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、商業的に、Ａｒａｄｉｇｍ  よって入手可能、またはＩｎｈａｎｃｅＴＭ  Ｐｕｍｏｎａｌｅｓ  Ｕｅｂｅｒｔｒａｇｕｎｇｓｓｙｓｔｅｍ、商業的に、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓよって入手可能）膣内の、直腸内の、眼内の投与方法における上記疾患または障害の治療に対する医薬品あるいはワクチンの製造が行われる。典型的には、本発明による薬学的組成物は、大量生産または投与の様式に応じて、固形であり、液状であり、またはエアゾール状（例えば、スプレー）である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、患者の必要に応じて、本発明によるポリペプチドの治療上有効な量が投与される。正確な投与量は、通常、基礎をなす治療の目的に依存し、技術水準から知られた方法の引き合いのもとに、当業者によって決定される。技術水準において知られているように、本発明によるポリペプチドの代謝分解に関しての適合、系に対し局部の投与に関しての適合、また、年齢、体重、一般的な健康状態、性、食物、投与時間、作用物質の互いの相互作用、または疾患の重さへの適合が必要である。そのような適合は、技術水準において知られている方法を用いて、当業者によって行われ得る。
【０１０９】
好ましい実施形態において、アジュバントとしての使用に対する、本発明によるポリペプチドの組合せが示される。本発明に関してアジュバントは、特に、免疫源に対して特定の免疫応答を引き起こさないが、この免疫源に対する免疫応答を高めることのできる組成物である。換言すると、アジュバント単独での投与はこの免疫源に対する免疫応答を引き起こさないが、この免疫源を伴う投与は、免疫源単独での投与の後の免疫応答より高い免疫応答を生じさせる。アジュバントは、さらに、ここでワクチンおよび薬学的組成物に対して示されているように、薬学的に許容される補助物質、添加物質および／または担体物質を含み得、また投与され得る。さらに、アジュバントは、上記ワクチンまたは薬学的組成物とともに投与され得る。
【０１１０】
要約すると、本発明は向上された安定性を有するポリペプチドを提供し、それによって、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの全体の分子は、１個のタンパク質鎖あるいはポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＴＮＦ）からなり、その結果、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマー（構成成分Ａ）は、もはや分解し得ないということが、確認される。ＴＮＦリガンドファミリーの別のメンバーに関する、本発明によるポリペプチドと同様に、ｓｃＴＮＦは、その生物的活性の様式において、通常の可溶性ｓＴＮＦ（また、野生型ＴＮＦまたはｗｔＴＮＦ）と質的相違を示さず、しかしながら、はるかにより安定性があり、そのためより高い生物的活性を示し、その結果、より低い濃度において有効である。通常の可溶性ＴＮＦ（ｗｔＴＮＦ）と同様に、ｓｃＴＮＦは、感応性細胞アポトーシスにおいて反応可能であり、転写因子ＮＦ−κＢを活性化でき、レセプターＴＮＦＲ１を活性化でき（しかしＴＮＦＲ２は活性化できず）、またそれと反対に、所定の抗体（例えば、８０Ｍ２）内においてはレセプターＴＮＦＲ２も活性化できる。これは、ＴＮＦリガンドファミリーの別のメンバーに関する、本発明によるポリペプチドにも該当する。生物的に機能化された表面を製造するための、およびそれの、例えばアフェレーシスへの使用のための、結合基を有する本発明によるポリペプチドの使用の場合において、本発明によるポリペプチドの疲弊および悪影響を及ぼすリガンドの系への復帰は観察されない。
【０１１１】
さらに、本発明によるポリペプチド、例えばｓｃＴＮＦは、新しい、双−機能性分子の製造に対する開始材料である。一方において、本発明によるポリペプチド、例えばｓｃＴＮＦあるいはそれに関する機能性フラグメントは、細胞表面に共有結合し得る。それは、本発明に従い、ここでは、分子の安定な結合に対して、単一の共有結合のみが製造されればよい、という利点を有する。ＴＮＦリガンドファミリーの通常の可溶性野生型メンバー、例えば可溶性ｓＴＮＦの場合においては、個々のホモ三量体の全てのモノマーは、安定な構造を得るために、表面に共有結合されねばならない。さもないと、非共有結合されたモノマーは分離されるからである。本発明によるポリペプチドの本実施形態において、例えば、体液からのＴＮＦレセプターの除去への生物学的に機能的な作用物質としてのｓｃＴＮＦを用いた、アフェレーシスへの使用は、特に有利である。
【０１１２】
適合物が、融合タンパク質の製造の際に該当する。これは、ＴＮＦに融合された抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を用いて、ＴＮＦリガンドファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ）を、生体の対応する所望の部位に集中させる（いわゆる、「ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」戦略）ために、特に興味がある。通常の可溶性ＴＮＦ（ｗｔＴＮＦ）の場合、そのような融合タンパク質はホモ三量体から成らねばならず、その際、少なくとも３個のモノマーの各々は、抗体部分を有し、それによって大きく不安定な分子が生じ、それは再びそのモノマーに分離されおよび／または凝集に傾き、それによって不活性にされ得る。ｓｃＴＮＦによって導き出された融合タンパク質は、１個の分子抗体にのみ結合され、その結果、全体の融合タンパク質は、再び単一の安定なタンパク質鎖あるいはポリペプチド鎖から成る。ＴＮＦに対する上記の記載は、ＴＮＦリガンドファミリーの全てのメンバーに対して適用可能である。
【０１１３】
同様に、本発明によるポリペプチドのモノマー（構成成分Ａ）の共有結合に基づいて、的確に、変異を、少なくとも３個のモノマー（構成成分Ａ）のうちの１個のみ、または２個または数個内に安定して挿入することは、本発明によって可能である。そのため、例えば、レセプター選択性を強いる点変異（ポイントミューテーション）が知られている。すなわち、例えばＴＮＦの場合、２つのＴＮＦ−レセプター（ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２）のうちの１つにおいて結合が行われる。本発明によれば、的確に、１分子ＴＮＦＲ１および２分子ＴＮＦＲ２を同時に結合可能な、例えばＴＮＦ−変異体を、最初に製造すること、すなわち様々なレセプター複合体を発生することが可能となる。この方法によって、様々な可能なレセプターのうちの１つのみを的確に結合し活性化する、様々な、安定な単鎖ＴＮＦリガンドファミリーメンバーを製造することが、最初に可能となる。
【０１１４】
勿論、ＴＮＦの説明のための上記例示的な実施形態は、ＴＮＦリガンドファミリーの別のメンバーに対して転用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１５】
本発明は、以下の図面を参照してより詳細に説明される。
【０１１６】
図１〜図３は、様々な生物学的な細胞障害試験の結果を示す。そこでは、特性、特に、様々なｓｃＴＮＦ改変体の特異性が、典型的な可溶性の野生型−ＴＮＦ、すなわちヒトＴＮＦの可溶性細胞外ドメイン（ＮＣＢＩ  ｇｉ：２５９５２１１１，１７，０９  ｋＤａ  可溶性形態のモノマーとして、簡略して、ＴＨＦｈｕｍ  またはｓＴＮＦ，ＡＡ７９−１８１）のそれと、試験され比較された。
１１６
この試験に対して、転換されたマウス繊維芽細胞とともにヒトＫｙｍ１−細胞が使用された。分析結果が例示的に示され、そこでは、個々のＴＮＦのモジュール（すなわち、ＴＮＦモノマー）間に長いペプチド−リンカーを、様々に有するｓｃＴＮＦ改変体が試験された。ペプチド−リンカーは、それぞれ、３重あるいは４重のアミノ酸配列繰り返しＧＧＧＳ（または、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）（「単鎖ＴＮＦ３ｘ」または「単鎖ＴＮＦ４ｘ」として、もしくは「ｓｃＴＮＦ３ｘ」または「ｓｃＴＮＦ４ｘ」として示される）から成る。
【０１１７】
図１は、ＴＮＦの典型的な細胞障害性試験の結果を示す。標的細胞として、ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２ダブル−ノックアウト−マウスからのマウス繊維芽細胞（ＭＦ）が使用され、それは安定的にＴＮＦＲ１−レセプターキメラ（ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ）を発現させる（ＭＦ  ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ−細胞）。そのような細胞はハイブリッド分子を発現させ、そのハイブリッド分子は、細胞外においてＴＮＦＲ１の対応する部分からなり、それによってＴＮＦと結合し、細胞内において、Ｆａｓ−レセプターの強くアポトーシス作用をする細胞内ドメインを有する。これらＭＦ  ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ細胞は、ＴＮＦＲ１−特異刺激によって活性化され得、しかしながらＦａｓ−特異の死亡シグナルを仲介する。生存細胞数は、染料を用いた染色の２４時間後に、その吸収によって数量化された。ネガティブコントロールとしてコントロール−細菌溶解物が導入され、その際、同一に、組換えｓｃＴＮＦ−タンパク質にプロセスされる、非−ｓｃＴＮＦ発現化の細菌溶解物が重要である。結果において、従来のヒト可溶性ＴＮＦ（ＴＮＦｈｕｍ）も、組換えｓｃＴＮＦ−改変体も細胞死に導いたことが確認された。ＴＮＦｈｕｍあるいはｓｃＴＮＦの、匹敵する投与量依存の細胞障害性効果が確認される（グラフの下部の３つの曲線を参照）。その際、野生型−ＴＮＦのそれと比べて高くはないが、ｓｃＴＮＦの特異的活性は、少なくとも同等である。予期されたように、ネガティブコントロールは障害効果を示さない。
【０１１８】
さらなる試験アプローチにおいて、野生型ＴＮＦ（ＴＮＦｈｕｍ）あるいはｓｃＴＮＦの細胞障害性に対する、中和ＴＮＦ特異性抗体の作用が試験された。可溶性ヒトＴＮＦ（ＴＮＦｈｕｍ）の、あるいは上記された、３重（３ｘ）あるいは４重（４ｘ）グリシン−セリンペプチドリンカー（ｓｃＴＮＦ３ｘ：ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ／ｓｃＴＮＦ４ｘ：ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ）を有するｓｃＴＮＦ改変体の、新たに設定された希釈度が導入された。中和ＴＮＦ特異性抗体（αＴＮＦ−ＡＫ）［１μｇ／ｍｌ］の存在−不存在における、１：３の希釈を伴う濃度順序が導入された。ネガティブコントロールとして上記コントロール−細菌溶解物が導入された。結果として、可溶性ヒト野生型ＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦの細胞障害性効果が、中和ＴＮＦ特異性抗体によって、しかもさらなる濃度領域（０．０３〜１０ｎｇ／ｍｌ）において、向上され得ること（グラフの上部の３つの曲線を参照）、が確認される。３重ペプチドリンカーを有するｓｃＴＮＦと４重ペプチドリンカーを有するｓｃＴＮＦとの反応性の間の差異は確認されなかった。
【０１１９】
図２は、ＴＮＦＲ２−レセプターキメラ（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ）を発現させる細胞に対する、ｓＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ改変体の作用が試験される、細胞障害性試験の結果を示す。この試験アプローチにおいては、ＴＮＦＲ２およびよＦａｓ（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ、ここで、細胞外部分はＴＮＦＲ２に由来し、細胞内部分はＦａｓレセプターに由来する）から成るレセプターキメラを、安定に発現させる（ＭＦ  ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ細胞）、マウス繊維芽細胞が導入された。ＭＦ  ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ細胞（野生型ＴＮＦＲ２と同様に）は、適切なＴＮＦＲ２刺激によって、例えば膜固定ＴＮＦによって（しかし、可溶性ＴＮＦによってではなく）活性され得る。結果：予期されたように、可溶性ヒトＴＮＦ（ＴＮＦｈｕｍａｎ）も、３重ペプチドリンカーを有するｓｃＴＮＦおよび４重ペプチドリンカーを有するｓｃＴＮＦ（ｓｃＴＮＦ３ｘ、ｓｃＴＮＦ４ｘ）も、ＭＦ  ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ細胞に対する障害性効果を示さなかった。換言すれば、ｓＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ改変体は、同様に、ＴＮＦＲ２−キメラ（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ）発現細胞を活性化することができない、すなわち、それらは、これら細胞において細胞死を引き起こせない。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物（上記されたような）は、予期されたように、同様に障害性効果を示さなかった。
【０１２０】
図３は、ＴＮＦＲ２−キメラ（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ）を発現させる細胞に対する、特定のＴＮＦＲ２−特異性抗体，８０Ｍ２との組合せにおける、ヒト野生型−ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ改変体の作用が試験される、細胞障害性試験の結果を示す。試験アプローチは図２のそれに対応し、可溶性野生型−ＴＮＦあるいは３重ペプチド−リンカーを有するｓｃＴＮＦ（ｓｃＴＮＦ３ｘ）に、抗体８０Ｍ２が付け加わるという相違を有する。抗体８０Ｍ２は、通常の可溶性ＴＮＦに、膜結合ＴＮＦの特定のシグナル受容力を付与するということで知られる。結果は、可溶性野生型−ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦは、８０Ｍ２との組合せにおいて、ＴＮＦＲ２−Ｆａｓレセプターキメラを介して、強い障害性効果を得ることを示す。これに起因して、可溶性ＴＮＦは、例えば８０Ｍ２のような、所定のＴＮＦＲ２−特異性抗体との組合せにおいて、膜結合ＴＮＦの活性を拡張し得る。ＭＦ  ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ細胞は、そのようなリガンド−レセプター複合体−固定化抗体（８０Ｍ２−ＡＫ）の存在のもとにおける、可溶性ＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦを用いたインキュベーションの後に、死亡する。すなわち、この抗体の存在のもとに、ｓｃＴＮＦのような可溶性ＴＮＦは、通常、膜固定ＴＮＦにのみよって行なわれ得るのと同様に、ＭＦ  ＴＮＦＲ２／Ｆａｓ−細胞内において障害性効果を引き起こす。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物（上記図１に示されたような）は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２１】
図４〜図１０は、様々な安定性試験の結果を示し、それらは、本発明によるｓｃＴＮＦ改変体が、その構造に基づいて、可溶性野生型−ＴＮＦと比べて著しく改善された安定性を有することを実証する。
【０１２２】
ｓＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦ改変体が、血清含有の培養培地において、３．０から０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度において、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２のもとで、様々な時間においてインキュベーションされた。引き続き、ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞およびＫｙｍ１細胞に基づいて、ｓＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦ改変体（ｓｃＴＮＦ３ｘ、ｓｃＴＮＦ４ｘ）の機能性が、細胞障害性試験において検査された。この細胞障害性試験に対して、３．０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦサンプルに由来して、１：３の希釈度が使用された。ネガティブコントロールとして、上記されたコントロール−細菌溶解物が導入された（非−ｓｃＴＮＦ発現細菌溶解物であり、それは、同一に、組換えｓｃＴＮＦ−タンパク質にプロセスされた）。
【０１２３】
図４は、マウス繊維芽細胞ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞に対する安定性試験の、導入された分子ＶＯＲの生物的活性を示す。可溶性ヒト野生型ＴＮＦ（ＴＮＦｈｕｍ）およびｓｃＴＮＦの希釈度が新たに設定され、細胞上において希釈された。可溶性コントロールＴＮＦも、ｓｃＴＮＦ改変体も、ＭＦを用いたインキュベーションの後に、その細胞死に導いた。コントロール−細菌溶解物は、予期されたように障害性効果を示さなかった。ＥＤ５０−値（半最大作用濃度）は、可溶性ヒト野生型ＴＮＦに対しては約０．２ｎｇ／ｍｌにあり、２つの導入された異なるｓｃＴＮＦ改変体に対しては０．１ｎｇ／ｍｌであった。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２４】
図５は、マウス繊維芽細胞ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞を用いた安定性試験の結果を示す。図５に示される野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ希釈物は、サンプルの安定性が判定され得るために、ここでは、試験の実施の前に８日間、細胞インキュベーター内においてインキュベートされた。可溶性野生型ＴＮＦ（ＴＮＦｈｕｍａｎ）の生物的活性の明らかな低下が、３７°Ｃにおける８日後において測定され、一方、２つのｓｃＴＮＦ改変体（ｓｃＴＮＦ３ｘ、ｓｃＴＮＦ４ｘ）の活性は、変化しなかった。野生型ＴＮＦに対して、ＥＤ５０−値は、約２ｎｇ／ｍｌ（導入直後は０．２ｎｇ／ｍｌ、図４参照）であることが判明した。ｓｃＴＮＦ改変体は、約０．１ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０−値を有して、導入直後のサンプルと同様の活性を維持した（図４参照）。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２５】
図６は、マウス繊維芽細胞ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞を用いた安定性試験の結果を示す。野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ溶液は、図５において説明されたように、ここでは１４日間、細胞インキュベーター内においてインキュベートされた。可溶性野生型ＴＮＦの生物的活性の明らかなさらなる低下が、３７°Ｃにおける１４日後において測定され、一方、ｓｃＴＮＦ改変体の活性は、ほぼ同様に維持された。ｓＴＮＦに対して、ＥＤ５０−値は、約２．８ｎｇ／ｍｌ（導入直後は０．２ｎｇ／ｍｌ、図４参照）であることが判明し、ｓｃＴＮＦ改変体は、約０．１３ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０−値を有して、導入直後のサンプルと同様の活性を維持した（０．１ｎｇ／ｍｌ、図４参照）。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２６】
図７は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。Ｋｙｍ１細胞は、通常ヒト野生型ＴＮＦレセプターを発現させ、同様にＴＮＦと細胞障害的に反応する。試験は、図４〜図６に従うマウス繊維芽細胞を用いた安定性試験と類似して行われた。可溶性野生型ＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦ改変体（ｓｃＴＮＦ３ｘ、ｓｃＴＮＦ４ｘ）が、血清含有の培地内において、３．０から０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度において、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２のもとで、様々な時間においてインキュベーションされた。引き続き、Ｋｙｍ１細胞に対する、ｓＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦ改変体の機能性が、細胞障害性試験において検査された。この試験に対して、３．０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦサンプルに由来して、１：３の希釈度が使用された。ネガティブコントロールとして、上記されたコントロール細菌溶解物が導入された。可溶性野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦの希釈度が新たに設定され、導入された。可溶性野生型ＴＮＦも、ｓｃＴＮＦ改変体も、強い細胞障害性活性を有するという結果が示された。ＥＤ５０−値は、可溶性野生型ＴＮＦに対しては約０．１ｎｇ／ｍｌにあり、ｓｃＴＮＦ改変体に対しては０．０６ｎｇ／ｍｌであった。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２７】
図８は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ溶液は、ここでは、１６日間、細胞インキュベーター内においてインキュベートされた。ｓＴＮＦの活性の明らかな低下が、３７°Ｃにおける１６日後において測定され、それに対して、ｓｃＴＮＦ改変体の障害性、すなわち生物的活性は、変化しなかった。野生型ＴＮＦに対して、ＥＤ５０−値は、約１．２ｎｇ／ｍｌであることが判明した。ｓｃＴＮＦ改変体は、約０．０６ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０−値を有して、導入直後のサンプルと同様の活性を維持した。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２８】
図９は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。ｓＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ溶液は、ここでは２２日間、細胞インキュベーター内においてインキュベートされた。ｓＴＮＦの活性の明らかなさらなる低下が、３７°Ｃにおける２２日後において測定された。ｓｃＴＮＦ改変体の活性は、以前と変わらず安定していた。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１２９】
以下の表１は、図７および図９による安定性試験結果の比較を示す。
【０１３０】
【表１】
2007530021.tif 000003
図１０は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。３７°Ｃにおける１６日後において、３ｎｇ／ｍｌから希釈物が力価測定された。上記図４〜図９とは反対に、この試験においては、１６日間保存された３ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ希釈物に由来して、力価測定グラフが作成された。一方、上記示された力価測定グラフにおいては、各々の希釈物が製造され、続いて所定時間、保存された。図８（１６日間のインキュベーション期間の類似する試験）と図１０との比較から、本質的な相違がないことが確認される。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物は、予期されたように、障害性効果を示さなかった。
【０１３１】
図１１は、ヒト血清内における安定性試験の結果を示す。ヒト血清内における野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦの安定性を試験するために、最初の試験アプローチにおいては、１００％血清内に可溶性野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ４ｘ改変体が希釈され、その直後に力価測定された。結果として、野生型ＴＮＦに対しては０．００４ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０値が測定され、ｓｃＴＮＦ改変体に対しては０．００７ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０値が測定された。
【０１３２】
図１２は、ヒト血清内における安定性試験の結果を示す。ヒト血清内における野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦの安定性を試験するために、さらなる試験アプローチにおいては、野生型ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ４ｘ改変体が、１００％の新鮮な非熱不活性化された血清内に３７°Ｃにおいて８日間保存され、続いてＫｙｍ１細胞に対して力価測定された。結果として、野生型ＴＮＦに対しては０．４０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０値が測定され、ｓｃＴＮＦ改変体に対しては０．０３ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０値が測定された。１００％血清内での８日間の保存の効果は、以下に示される：直後に力価測定されたｓｃＴＮＦと比較して、８日間の保存されたｓｃＴＮＦは、約４．３倍の活性損失を示し、それに反して、可溶性ｓＴＮＦに対しては、１００％血清内での保存の間に、１００倍の劇的な活性損失が示された。そのため、ｓＴＮＦと比較して、本発明によるｓｃＴＮＦは、血清内における８日間のインキュベーションの後に、著しく高い生物的活性を示し、それによって、生理学的温度のもとにヒト血清内において非常に安定であることが明らかにされた。
【０１３３】
以下の表２において、図１１および図１２からの結果のデータが、明確にするために、再度示される。
【０１３４】
【表２】
2007530021.tif 000004
図１３は、還元および変性条件における、ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動法による分析結果を示す。精製された野生型ＴＮＦ、ならびに精製されたｓｃＴＮＦ改変体ｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘの銀染色ゲルが示される。サンプルは、それぞれβ−メルカプトエタノール（最終５％）を用いて、９５°Ｃにおいて５分間インキュベートされた。銀染色ゲル上に、形跡毎に、約５００ｎｇのｓＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ４ｘおよび約１５０ｎｇのｓｃＴＮＦ３ｘが提供された。１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ内に切り離されたｓｃＴＮＦ改変体の銀染色ゲルの結果は、２つのｓｃＴＮＦ改変体が、還元条件のもとで、その構造と一致する約５０ｋＤａの分子量を有することを示す。また、提供されたタンパク質ｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘの異なる量は、結果に影響を与えないことが確認された。これは、還元および変性条件における、本発明によるタンパク質あるいはポリペプチドの安定性を証明する。それに反して、ｓＴＮＦに対する結果は、タンパク質が、約１７ｋＤａのモノマーにおいて分解したことを示す。
【０１３５】
図１４は、還元および変性条件における、安定性試験の結果を示す。この試験アプローチにおいては、野生型ＴＮＦ、ならびにｓｃＴＮＦ改変体ｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘの、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ内に切り離されたサンプルのウエスタンブロット法が実施された。２つの並行するアプローチが実施され、一方のアプローチにおいては、サンプルは各々、β−メルカプトエタノール（最終５％）を用いて、９５°Ｃにおいて５分間インキュベートされ、他方のアプローチにおいては、β−メルカプトエタノール・インキュベーションは行われなかった。電気泳動法の経過の後の検出は、抗ＴＮＦ−抗体を用いて行われた。結果として、抗体は、２つのｓｃＴＮＦ改変体のタンパク質を、約５０ｋＤａにおける明瞭な帯において、特定的に検出したことが確認された。これは、ここでも、還元および変性条件における、本発明によるｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘの安定性を証明し、同様に本発明に従い、図１３の結果と一致する。
【０１３６】
図１５は、ＩｋａｐｐａＢ分解アッセイの結果を示す。ＩｋａｐｐａＢ（Ｉ−κＢ）は、転写因子、核酸因子ｋａｐｐａＢ（ＮＫ−κＢ）のインヒビターであり、周知のように、ＴＮＦによって分解に提供され、それによってＮＫ−κＢが活性化される。Ｉ−κＢの分解の立証のために、細胞溶解物は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌの野生型ＴＮＦ、ｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘを用いた０分、３０分、および６０分の刺激の後に製造され、その後、Ｉ−κＢに特定の抗体を用いてウエスタンブロット法において分析された。その結果は、Ｉ−κＢの過渡的な解析は、野生型ＴＮＦおよび２つのｓｃＴＮＦ改変体によって誘導され、その際、ｓｃＴＮＦ改変体の反応態様は、野生型ＴＮＦのそれに対応した。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物（上記されたように、同一に、組換えｓｃＴＮＦ−タンパク質にプロセスされる、非−ｓｃＴＮＦ発現化の細菌溶解物）は、予期されたように、Ｉ−κＢ分解に効果を示さなかった。
【０１３７】
図１６は、ＪＮＫ−アッセイの結果を示す。ＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ）は、周知のように、ＴＮＦによって強く活性化される、ストレス誘導キナーゼである。それぞれ１０ｎｇ／ｍｌの野生型ＴＮＦ、ｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘを用いた０分、３０分、および６０分の刺激の後に、細胞溶解物が製造され、ＪＮＫ活性は、ＪＮＫに特定の抗体を用いたＪＮＫの免疫沈澱物を介して、および後続の、基質としてＧＳＴ  ｃ−ｊｕｎを用いたキナーゼアッセイを介して検査された。ネガティブコントロールとして導入されたコントロール−細菌溶解物（上記されたような）は、予期されたように、ＪＮＫ−キナーゼの活性化を示さなかった。その結果は、ＪＮＫの活性化は、２つのｓｃＴＮＦ改変体および野生型ＴＮＦによって行われ、その際、ｓｃＴＮＦ改変体の反応態様は、野生型ＴＮＦのそれに対応した。
【０１３８】
図１７は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す。ＴＮＦの活性に対するさらなる典型的な証拠は、細胞核内の転写因子ＮＦ−κＢの、Ｉ−κＢ分解の生じた誘導の後に進行する転移を示す。それについで、非刺激ＫＹＭ−１コントロール細胞（ゼロ分の刺激）のあるいは刺激細胞（３０分および６０分の刺激）の細胞核調合が製造される。細胞の刺激は、それぞれの野生型ＴＮＦ、ｓｃＴＮＦ３ｘおよびｓｃＴＮＦ４ｘを用いて行われた。細胞核内に転座された転写因子ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢに特定の、放射性にマークされたオリゴヌクレオチドを用いて立証された。その結果は、ＮＦ−κＢが細胞核内に転座されたことを示す。その際、ｓｃＴＮＦ改変体の反応態様は、野生型ＴＮＦのそれに対応した。
【０１３９】
図１８は、ＴＮＦ（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーとして）に基づいて示された、本発明によるポリペプチドの例示的な構築物パターンを示す。記号は以下の意味を有する。
【０１４０】
構築物ＡI／ＡIIおよびＢI／ＢIIは、大腸菌内のタンパク質の発現に対して最適化されたコドン使用を有し、それぞれＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ−３重リンカーあるいは４重リンカーによって結合された分子を表す。全ての分子は、より簡易化された精製のためにＮ末端にヒスチジンＴａｇを有する。分子ＢI／ＢIIは、さらに、指向された共有結合に対するシステイン残基を有する短いアミノ酸鎖を有する。
【０１４１】
構築物ＣからＨは、真核細胞内におけるタンパク質の発現に対して適正化されており、Ｎ末端にリーダーペプチド配列を有する。
ｓｃ＝ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ（単鎖）の略語であり、
ｃｙｓ＝共有結合のための内部システインを有するＮ末端ペプチドリンカーを示し、
Ｌ１ｌｏｎｇあるいはＬ２ｌｏｎｇ＝それぞれアミノ酸配列（ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ）あるいは（ＧＧＧＳ）４を有するリンカー１あるいはリンカー２を示し、
Ｌ１ｓｈｏｒｔあるいはＬ２ｓｈｏｒｔ＝それぞれアミノ酸配列（ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ−ＧＧＧＳ）あるいは（ＧＧＧＳ）３を有するリンカー１あるいはリンカー２を示し、
リーダーペプチド配列＝真核（宿主）細胞からなるタンパク質の分泌に対するアミノ酸配列であり、
ｓｃＦｖ４０＝腫瘍ストロマ抗体ＦＡＰに対して特異的な、単鎖（ｓｃＦｖ）−抗体フラグメント４０を表し、
ＡＭＡＩＺｅ＝「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｎｅｄｉａｔｅｄ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｚｙｔｏｋｉｎｅ」の略語であり、
Ｈｉｓ／Ｆｌａｇ−Ｔａｇ＝発現タンパク質の親和性精製へのペプチド配列を表す。
【０１４２】
図１９は、ｓｃＴＮＦ−Ｌｓｈｏｒｔ（構築物Ａ−II）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ａ−IIの特徴
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＨｉｓ−Ｔａｇペプチド配列：アミノ酸（以下図１９から図２６において「ＡＡ」と略される）ＡＡ  ５〜１０、ヌクレオチド以下図１９から図２６において「ＮＴ」と略される）ＮＴ  １３〜３０
・  ヒトＴＮＦモジュール１の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン、ＡＡ  ７９〜１８１、適正化された大腸菌コドン使用を有する配列）：ＡＡ  １１〜１６９、ＮＴ  ３１〜５０７
・  （ＧＧＧＳ）３−リンカー１の配列：ＡＡ  １７０〜１８１、ＮＴ  ５０８〜５４３
・  ヒトＴＮＦモジュール２の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン、ＡＡ  ７９〜１８１、適正化された大腸菌コドン使用を有する配列）：ＡＡ  １８２〜３３５、ＮＴ  ５４４〜１００５
・  （ＧＧＧＳ）３−リンカー２の配列：ＡＡ  ３３６〜３４７、ＮＴ  １００６〜１０４１
・  ヒトＴＮＦモジュール３の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン、ＡＡ  ７９〜１８１、適正化された大腸菌コドン使用を有する配列）：ＡＡ  ３４８〜５０１、ＮＴ  １０４２〜１５０３
・  停止コドン：ＮＴ  １５０４〜１５０６
図２０は、ｃｙｓ−ｓｃＴＮＦ−Ｌｓｈｏｒｔ（構築物Ｂ−II）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｂ−IIの特徴
・  共有結合に対するアミノ酸システイン：ＡＡ  ９、ＮＴ  ２５〜２７
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＨｉｓ−Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  １５〜２０、ＮＴ  ４３〜６０
・  ヒトＴＮＦモジュール１の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン、適正化された大腸菌コドン使用を有する配列）：ＡＡ  ２１〜１８１、ＮＴ  ６１〜５４３
・  （ＧＧＧＳ）３−リンカー１の配列：ＡＡ  １８２〜１９３、ＮＴ  ５４４〜５７９
・  ヒトＴＮＦモジュール２の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン、適正化された大腸菌コドン使用を有する配列）：ＡＡ  １９４〜３４７、ＮＴ  ５８０〜１０４１
・  （ＧＧＧＳ）３−リンカー２の配列：ＡＡ  ３４８〜３５９、ＮＴ  １０４２〜１０７７
・  ヒトＴＮＦモジュール３の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン、適正化された大腸菌コドン使用を有する配列）：ＡＡ  ３６０〜５１３、ＮＴ  １０７８〜１５３９
・  停止コドン：ＮＴ  １５４０〜１５４２
図２１は、ｓｃＦａｓＬ（構築物Ｃ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｃの特徴
・  真核細胞内のタンパク質の分泌に対するリーダーペプチド配列：ＡＡ  １〜１５、ＮＴ  １〜４５
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＦｌａｇ  Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  １９〜２６、ＮＴ  ５５〜７８
・  ヒトＦａｓＬモジュール１の配列（天然のヒトＦａｓＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  １３９〜２８１）：ＡＡ  ３０〜１７３、ＮＴ  ９０〜５１９
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー１の配列：ＡＡ  １７４〜１８９、ＮＴ  ５２０〜５６７
・  ヒトＦａｓＬモジュール２の配列（天然のヒトＦａｓＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  １３９〜２８１）：ＡＡ  １９０〜３３２、ＮＴ  ５６８〜９９６
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー２の配列：ＡＡ  ３３３〜３４８、ＮＴ  ９９７〜１０４４
・  ヒトＦａｓＬモジュール３の配列（天然のヒトＦａｓＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  １３９〜２８１）：ＡＡ  ３４９〜４９１、ＮＴ  １０４５〜１４７３
・  停止コドン：ＮＴ  １４７４〜１４７６
図２２は、ｓｃＴＲＡＩＬ（構築物Ｄ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｄの特徴
・  真核細胞内のタンパク質の分泌に対するリーダーペプチド配列：ＡＡ  １〜１５、ＮＴ  １〜４５
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＦｌａｇ  Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  １９〜２６、ＮＴ  ５５〜７８
・  ヒトＴＲＡＩＬモジュール１の配列（天然のヒトＴＲＡＩＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ９５〜２８１）：ＡＡ  ３０〜２１６、ＮＴ  ８８〜６４８
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー１の配列：ＡＡ  ２１７〜２３２、ＮＴ  ６４９〜６９６
・  ヒトＴＲＡＩＬモジュール２の配列（天然のヒトＴＲＡＩＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ９５〜２８１）：ＡＡ  ２３３〜４１９、ＮＴ  ６９７〜１２５７
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー２の配列：ＡＡ  ４２０〜４３５、ＮＴ  １２５８〜１３０５
・  ヒトＴＲＡＩＬモジュール３の配列（天然のヒトＴＲＡＩＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ９５〜２８１）：ＡＡ  ４３６〜６２２、ＮＴ  １３０６〜１８６６
・  停止コドン：ＮＴ  １８６１〜１８６３
図２３は、ｓｃＴＮＦ（構築物Ｅ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｅの特徴
・  真核細胞内のタンパク質の分泌に対するリーダーペプチド配列：ＡＡ  １〜１５、ＮＴ  １〜４５
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＦｌａｇ  Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  １９〜２６、ＮＴ  ５５〜７８
・  ヒトＴＮＦモジュール１の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン）：ＡＡ  ３０〜１８４、ＮＴ  ８８〜５５２
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー１の配列：ＡＡ  １８５〜２００、ＮＴ  ５５３〜６００
・  ヒトＴＮＦモジュール２の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン）：ＡＡ  ２０１〜３５５、ＮＴ  ６０１〜１０６５
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー２の配列：ＡＡ  ３５６〜３７１、ＮＴ  １０６６〜１１１３
・  ヒトＴＮＦモジュール３の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン）：ＡＡ  ３７２〜５２６、ＮＴ  １１１４〜１５８１
・  停止コドン：ＮＴ  １７９９〜１５８１
図２４は、ｓｃＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（構築物Ｆ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｆの特徴
・  真核細胞内のタンパク質の分泌に対するリーダーペプチド配列：ＡＡ  １〜１９、ＮＴ  １〜５７
・  腫瘍ストロマ抗体ＦＡＰに対して特異的な、単鎖（ｓｃＦｖ）−抗体フラグメント４０の配列：ＡＡ  ２０〜２６７、ＮＴ  ５８〜８０１
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＦｌａｇ  Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  ２７８〜２８５、ＮＴ  ８３２〜８５５
・  ヒトＦａｓＬモジュール１の配列（天然のヒトＦａｓＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  １３９〜２８１）：ＡＡ  ２９０〜４３２、ＮＴ  ８６８〜１２９６
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー１の配列：ＡＡ  ４３３〜４４８、ＮＴ  １２９７〜１３４４
・  ヒトＦａｓＬモジュール２の配列（天然のヒトＦａｓＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  １３９〜２８１）：ＡＡ  ４４９〜５９１、ＮＴ  １３４５〜１７７３
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー２の配列：ＡＡ  ５９２〜６０７、ＮＴ  １７７４〜１８２１
・  ヒトＦａｓＬモジュール３の配列（天然のヒトＦａｓＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  １３９〜２８１）：ＡＡ  ６０８〜７５０、ＮＴ  １８２２〜２２５０
・  停止コドン：ＮＴ  ２２５１〜２２５３
図２５は、ｓｃＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（構築物Ｇ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｇの特徴
・  真核細胞内のタンパク質の分泌に対するリーダーペプチド配列：ＡＡ  １〜１９、ＮＴ  １〜５７
・  腫瘍ストロマ抗体ＦＡＰに対して特異的な、単鎖（ｓｃＦｖ）−抗体フラグメント４０の配列：ＡＡ  ２０〜２６７、ＮＴ  ５８〜８０１
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＦｌａｇ  Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  ２７８〜２８５、ＮＴ  ８３２〜８５５
・  ヒトＴＲＡＩＬモジュール１の配列（天然のヒトＴＲＡＩＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ９５〜２８１）：ＡＡ  ２８９〜４７５、ＮＴ  ８６５〜１４２６
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー１の配列：ＡＡ  ４７６〜４９１、ＮＴ  １４２７〜１４７６
・  ヒトＴＲＡＩＬモジュール２の配列（天然のヒトＴＲＡＩＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ９５〜２８１）：ＡＡ  ４９２〜６７８、ＮＴ  １４７７〜２０３４
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー２の配列：ＡＡ  ６７９〜６９４、ＮＴ  ２０３５〜２０８２
・  ヒトＴＲＡＩＬモジュール３の配列（天然のヒトＴＲＡＩＬ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ９５〜２８１）：ＡＡ  ６９５〜８８１、ＮＴ  ２０８３〜２６４３
・  停止コドン：ＮＴ  ２６４４〜２６４６
図２６は、ｓｃＴＮＦ−ＡＭＡＩＺｅ（構築物Ｈ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
構築物Ｈの特徴
・  真核細胞内のタンパク質の分泌に対するリーダーペプチド配列：ＡＡ  １〜１９、ＮＴ  １〜５７
・  腫瘍ストロマ抗体ＦＡＰに対して特異的な、単鎖（ｓｃＦｖ）−抗体フラグメント４０の配列：ＡＡ  ２０〜２６７、ＮＴ  ５８〜８０１
・  形成されたタンパク質の親和性精製へのＦｌａｇ  Ｔａｇペプチド配列：ＡＡ  ２７８〜２８５、ＮＴ  ８３２〜８５５
・  ヒトＴＮＦモジュール１の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ７９〜１８１）：ＡＡ  ２８９〜４４３、ＮＴ  ８６５〜１３２９
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー１の配列：ＡＡ  ４４４〜４５９、ＮＴ  １３３０〜１３７７
・  ヒトＴＮＦモジュール２の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ７９〜１８１）：ＡＡ  ４６０〜６１４、ＮＴ  １３７８〜１８４２
・  （ＧＧＧＳ）４−リンカー２の配列：ＡＡ  ６１５〜６３０、ＮＴ  １８４３〜１８９０
・  ヒトＴＮＦモジュール３の配列（天然のヒトＴＮＦ分子の細胞外ドメイン  ＡＡ  ７９〜１８１）：ＡＡ  ６３１〜７８５、ＮＴ  １８９１〜２３５５
・  停止コドン：ＮＴ  ２３５６〜２３５８
図２７は、ヒト野生型ＴＮＦおよびヒトｓｃＴＮＦ（実施例２参照）の薬物動態を示す。図２７のデータは、ｓｃＴＮＦ改変体のｉｎ  ｖｉｖｏ半値時間の明らかな増加を示す。それによって、ＴＮＦに比べてｓｃＴＮＦに対しての、ｉｎ  ｖｉｖｏでの作用期間の明らかな増加が期待され、それは、潜在的な治療剤として、ｓｃＴＮＦ、特にｓｃＴＮＦ−Ｌ２の価値を強調する。
【０１４３】
図２８は、粒子（シリカ）に共有結合されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦを示す。この共有結合されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦは、生物的活性であり、膜結合ＴＮＦの特別の活性化を有し、つまり、それはＴＮＦＲ２を活性化する。図２８は、構築物ＴＮＦＲ２−Ｆａｓを用いて転換され、挙げられた試薬の連続的な希釈度を用いて処理された、マウス繊維芽細胞から成る細胞は、可溶性ｗｔＴＮＦに対して十分に耐性であることを示す。定着されたプロトコル（ＤＰＡ，Ｎｏ．ＤＥ１０１４４２５２）に従った、シリカ−マイクロ粒子（ビーズ）への還元されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦの共有結合の後に、これらは、ＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦおよびＴＮＦＲ２に結合する抗体、ｍＡｋ  ８０Ｍ２（三角形）から成るポジティブコントロールと同様に、強い細胞障害性応答（円）を引き起こす。結合されないＣｙｓ−Ｈｉｓ  ｓｃＴＮＦは、予期されたように、ＴＮＦＲ２ポジティブ細胞に対して活性を示さない（四角形）。
【０１４４】
本発明は、以下において実施例によって示される。
（実施例）
実施例１：様々な本発明によるポリペプチド構築物の製造
全てのクローニングは、標準プロトコルに従って行われた。以下において、これらの条件が実施される。
【０１４５】
標準ＰＣＲ
６０ｎｇ鋳型、０．５μｌ  １００μＭプライマー、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび５μｌ  １０ｘ緩衝液および２Ｕ  Ｔａｑ−ポリメラーゼが、５０μｌの反応量において、以下のＰＣＲプログラムを用いて増幅された。変性：９４°Ｃ３分、１５サイクル：変性９４°Ｃ  ３０秒、アニーリング５５°Ｃ  ３０秒、エロンゲーション７２°Ｃ  ９０秒；最終エロンゲーション：７２°Ｃ７分。
【０１４６】
ＰＣＲ生成物の消化
ＰＣＲ生成物は、アガロースゲルを用いて精製され、溶離され、その後、それそれの制限酵素（正確な指示を参照）を用いて、４０μｌの反応堆積物中において、最適の開裂温度（製造者によって指定される）のもとで２時間、消化された。
【０１４７】
ベクターの消化
１μｇのベクターが、５Ｕの対応する制限酵素を用いて、２０μｌの反応量において、最適の開裂温度（これは使用される酵素に依存し、製造者によって指定される）のもとで２時間、消化された。ベクターの脱リン酸化のために、１０Ｕのアルカリ性ホスファターゼが、１時間の間、反応消化に与えられた。
【０１４８】
「Ｆｉｌｌ  ｉｎ」反応
ベクター消化の沈積物は、３３μＭ  ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡ−ポリメラーゼＩの１Ｕ／１μｇＤＮＡ  クレノウフラグメントを用いて置換され、２５°Ｃにおいて２５分間、インキュベートされた。この反応は、１０ｍＭのＥＤＴＡを用いて、７５°Ｃにおいて２０分間で停止した。
【０１４９】
連結反応
ベクターおよび挿入断片は、１：５のモル比率において、４００Ｕのリガーゼを用いて、１０μｌの反応量において、７５°Ｃのもとに一晩、連結された。
Ｉ．４重または３重のリンカーを有するｓｃＴＮＦｈｕｍａｎ（ｓｃＴＮＦ）の製造
個々の分子間において、ペプチド−リンカーの長さによって区別される２つのｓｃＴＮＦ改変体が製造された。４重または３重のペプチド−リンカー−配列を有するプライマーが導入された（（ＧＧＧＳ）４−配列を有するリンカーｌｏｎｇまたは（ＧＧＧＳ）３−配列を有するリンカーｓｈｏｒｔ）。そのため、生成された構築物は、２つの４重リンカー（「ｌｏｎｇ」と示された（ＧＧＧＳ）４−を有する、Ｌ１またはＬ２）または２つの３重リンカー（「ｓｈｏｒｔ」と示された（ＧＧＧＳ）３−を有する、Ｌ１またはＬ２）を含む。
【０１５０】
１．プライマーＶおよびＩあるいはII（リンカーｌｏｎｇに対して）、ならびに鋳型としてＴＮＦモジュール（ｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦ）を有するｐＱＥ９ベクターを用いて、標準ＰＣＲが実施された。
【０１５１】
２．得られたＰＣＲ生成物Ｉは、続いて、それぞれ２０Ｕの制限酵素ＳｔｕＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、３７°Ｃにおいて消化された。同様な消化および脱リン酸化反応が、ｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦベクターを用いて実施され、連結反応を介して、ＰＣＲ生成物ＩがｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦベクター内に提供された。この工程の結果は、リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇあるいは以下のｐＱＥ９ベクター内の構築物であった。
ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ−モジュール１−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＢａｍＨＩ
３．プライマーIIIおよびＩあるいはII（リンカーｌｏｎｇに対して）、ならびに鋳型としてｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦベクターを用いた、さらなるＰＣＲを介して、ＰＣＲ生成物IIが生成された。ＰＣＲ生成物IIは、続いて、それぞれ２０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて切断され、同一の酵素を用いて切断され、脱リン酸化されたｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦベクター内に提供された。このクローニングの結果は、以下に示されるようなｐＱＥ９ベクターであった。
ＴＮＦ  モジュール２−リンカー２ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＢａｍＨＩ
この構築物は、ＴＮＲ配列前のＨＩＳ−Ｔａｇに対する配列を有さない。
【０１５２】
４．工程３においてクローニングされたＰＣＲ生成物IIは、まず制限酵素ＨｉｎｄIIIを用いて、続いて部分的にＢａｍＨＩ（１Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）を用いて、ベクターから切り離された。ｐＱＥ９−ＨｉｓＴａｇ  ＴＮＦ  モジュール１−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ベクターは、同様に、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、順番に、切断され、脱リン酸化され、また、ＰＣＲ生成物IIは、このベクター内において連結反応された。結果は、以下の構築物を有するｐＱＥ９であった。
ＨｉｓＴａｇ  ＴＮＦ  モジュール１−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール２−リンカー２ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ
５．鋳型としてｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦ−ベクターおよびプライマーIIIおよびIVを用いて、さらなるＰＣＲが、標準条件の下に実施され、得られたＰＣＲ生成物IIIは、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、順番に、消化された。続いて、このフラグメントは、同様に、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩベクター内において連結反応された。このクローニングの結果は、リンカーを有さないＴＮＦ  モジュール３を含む、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩベクターであった。
【０１５３】
６．ＨｉｓＴａｇ  ＴＮＦ  モジュール１−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール２−リンカー２ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ構築物を有するｐＱＥ９−ベクターは、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて切断され、このベクターは、続いて、「ｆｉｌｌ  ｉｎ」を行うために、大腸菌からの、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて処理された。この工程の後に、酵素ＢａｍＨＩ（１Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）を用いて、部分的な制限消化が行われた。
【０１５４】
７．工程６と並行して、ＴＮＦ  モジュール３を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩベクターが、制限酵素ＸｂａＩを用いて切断され、続いて、このベクターは、「ｆｉｌｌ  ｉｎ」を行うために、大腸菌からの、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて処理された。この工程の後に、第２の制限消化が、追加の脱リン酸化を伴う標準条件の下に、酵素ＢａｍＨＩを用いて行われた。
【０１５５】
８．制限消化によって工程６から得られたフラグメントは、続いて、工程７において生成された線状ベクター内において連結反応された。構築物は、以下に示されるように、逆の配置にあった。
ＨｉｎｄIII−ＴＮＦ  モジュール３−リンカー２ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール２−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール１−Ｈｉｓ  Ｔａｇ−ＥｃｏＲＩ
９．工程８からの逆配置されたＴＮＦ構築物は、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩベクターから切り離され、同一の酵素を用いて処理され、脱リン酸化されたｐＱＥ９−ＨｉｓＴＮＦ−ベクター内において、連結反応された。これによって、正しい配置にある完全なｓｃＴＮＦを有する構築物が生じた。
ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ−ＴＮＦ  モジュール１−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール２−リンカー２ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール３−ＨｉｎｄIII
１０．Ｎ−末端システインを有するｓｃＴＮＦの製造のために、オリゴｃｙｓ−ｓｃＴＮＦ  VIおよびVIIがアニールされ（各々、２０μｌ  １００μＭ  オリゴ  VIあるいはVIIが、共に９５°Ｃにおいて５分間、加熱され、室温まで徐々に冷却された）、オリゴ１が形成された。９．からの構築物は、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｂｓＩを用いて消化され、同一の切断部位が利用可能なオリゴ１は、ベクター内において連結反応された。代替的に、システインは、ＰＣＲ−変異誘発を介して挿入される。このクローニングの結果は、以下の構築物であった。
ＥｃｏＲＩ−システイン−Ｈｉｓ  Ｔａｇ−ＴＮＦ  モジュール１−リンカー１ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール２−リンカー２ｓｈｏｒｔあるいはｌｏｎｇ−ＴＮＦ  モジュール３−ＨｉｎｄIII
全ての構築物は、配列化によって検証された。
【０１５６】
発現は、大腸菌株ＸＬ−１  ｂｌｕｅ内において行われた。発現されたｓｃＴＮＦ改変体の精製は、クロマトグラフィー法（ＨｉｓＴａｇ親和性−および陰イオン交換クロマトグラフィー法）を用いて行われた。
【０１５７】
以下に、使用されたプライマーの配列が挙げられる。
【０１５８】
タンパク質レベルでのペプチドリンカー配列
３重ＧＧＧＳリンカー（短）＝（ＧＧＧＳ）３；ＧＧＧＳ  ＧＧＧＳ  ＧＧＧＳ
４重ＧＧＧＳリンカー（長）＝（ＧＧＧＳ）４；ＧＧＧＳ  ＧＧＧＳ  ＧＧＧＳ  ＧＧＧＳ
核酸レベルでのペプチドリンカー配列
３倍ＧＧＧＳリンカー（短）：５’ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣ３’
４倍ＧＧＧＳリンカー（長）：５’ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣ３’
クローニングのためのプライマー
ｓｃＴＮＦプライマーＩ
【０１５９】
【化１】
2007530021.tif 000005
ｓｃＴＮＦプライマーＩＩ
【０１６０】
【化２】
2007530021.tif 000006
ｓｃＴＮＦプライマーＩＩＩ
【０１６１】
【化３】
2007530021.tif 000007
ｓｃＴＮＦプライマーＩＶ
【０１６２】
【化４】
2007530021.tif 000008
ｓｃＴＮＦプライマーＶ
【０１６３】
【化５】
2007530021.tif 000009
ＣｙｓＨｉｓ挿入のためのオリゴ
ｃｙｓ−ｓｃＴＮＦプライマーＶＩ
【０１６４】
【化６】
2007530021.tif 000010
ｃｙｓ−ｓｃＴＮＦプライマーＶＩＩ
【０１６５】
【化７】
2007530021.tif 000011
ＩＩ．ｐｃＤＮＡ３およびＡＭＡＩＺｅ構築物内のｓｃＦａｓＬの製造
以下のクローニングに対して、実施例１において挙げられた標準条件が使用された。
【０１６６】
Ａ．  ｐｃＤＮＡ３内でのＨＡシグナルの生成
１．ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いた消化
２．リーダーペプチド配列のためのプライマーＨＡ−ＩＦおよびＨＡ−ＩＩＲのアニーリングを介しての、ＫｐｎＩ−ＨＡ−シグナル−ＮｏｔＩ−配列を有するＨＡ−オリゴの製造
３．ｐｃＤＮＡ３−ベクター内でのＨＡ−オリゴ（ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ−切断部位を含む）の連結反応
Ｂ．  ｐｃＤＮＡ３（＋）−ベクター内でのｓｃＦａｓＬの製造
１．鋳型ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺＥ−ベクター上のＦａｓＬ＃１ＦおよびＦａｓＬ＃２Ｒを用いたＰＣＲ。この構築物様式の製造は、特許出願ＤＥ  １００４５５９１．３の中に記載されており、それに関しては、本発明の開示内容に完全に含まれる。このＰＣＲ１の生成物は、ＮｏｔＩ−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＦａｓＬモジュール１−リンカー１−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ構築物であった。
２．ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ−切断部位を介して、この構築物は、同一の酵素を用いて消化されたｐｃＤＮＡ３−ＨＡ配列ベクター内において、クローニングされ、その結果、以下の構築物が生じた。
ＨＡ配列−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＦａｓＬモジュール１−リンカー１−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
３．鋳型ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺＥ−ベクターならびにプライマーＦａｓＬ＃３およびＦａｓＬ＃１上のさらなるＰＣＲを用いて、以下のＰＣＲ生成物２が生成された。
平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）−ＦａｓＬモジュール２−リンカー２−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
４．次の工程において、２．からのｐｃＤＮＡ３ベクターは、ＢａｍＨＩを用いて消化され、この切断部位は、クレノウ酵素によって補填され、続いて、ＸｂａＩを用いて切断され、その結果、「平滑末端」および「粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ）」が生じた。このように改変されたベクター内において、続いて、ＰＣＲ生成物２がクローニングされ、以下の構築物が形成された。
ＨＡ配列−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＦａｓＬモジュール１−リンカー１−ＦａｓＬモジュール２−リンカー２−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
５．第３のモジュールのために、鋳型ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺＥ−ベクターならびにプライマーＦａｓＬ＃４およびＦａｓＬ＃５を用いたさらなるＰＣＲが実施された。形成されたＰＣＲ生成物は、続いて、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化され、同一の酵素を用いて切断された、４．からのベクター内において連結反応された。このクローニングの結果は、以下の、ｐｃＤＮＡ３ベクター内の構築物であった。
ＨＡ配列−ＮｏｔＩ−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＦａｓＬモジュール１−リンカー１−ＦａｓＬモジュール２−リンカー２−ＦａｓＬモジュール３−ｓｔｏｐ−ＸｂａＩ
ｓｃＦａｓＬ−あるいはｓｃＴＮＦ−ＡＭＡＩＺｅ構築物内の製造のために、それぞれ、ｓｃＦａｓＬ−あるいはｓｃＴＮＦは、制限酵素ＮｏｔＩあるいはＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて消化され、カセットとしての挿入断片が、対応するＡＭＡＩＺｅベクター（特許出願ＤＥ  １００４５５９１．３を参照）内に挿入され、その際、このベクターは、同様に、酵素ＮｏｔＩあるいはＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて切断された。それによって、以下の構築物が製造された。
リーダーペプチド−ｓｃＦｖ４０−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＦａｓＬモジュール１−リンカー１−ＦａｓＬモジュール２−リンカー２−ＦａｓＬモジュール３
リーダーペプチド−ｓｃＦｖ４０−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＴＮＦモジュール１−リンカー１−ＴＮＦモジュール２−リンカー２−ＴＮＦモジュール３
以下に、使用されたプライマーの配列が挙げられる。
【０１６７】
【化８】
2007530021.tif 000012
ＩＩＩ．  ｓｃＴＲＡＩＬ−クローニングおよびｓｃＴＲＡＩＬ  ＡＭＡＩＺｅ構築物内の製造
以下のクローニングに対して、実施例１において挙げられた標準条件が使用された。
１．鋳型ｐｃＤＮＡ３−ｓｃ４０−ＴＲＡＩＬ（特許出願ＤＥ  １００４５５９１．３を参照）上のＴＲＡＩＬ＃１およびＴＲＡＩＬ＃２を用いたＰＣＲ。ＰＣＲ生成物１は、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて切断され、同一の制限酵素を用いて消化されたｐｃＤＮＡ３−ｓｃＦａｓＬベクター内において連結反応された。この消化は、ＦａｓＬ配列を欠失し、それの際、ＨＡ−配列およびＦｌａｇ  Ｔａｇは保持され、以下の構築物が生じた。
ＨＡ配列−ＮｏｔＩ−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＴＲＡＩＬモジュール１−リンカー１−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
２．プライマーＴＲＡＩＬ＃１ＲおよびＴＲＡＩＬ＃２Ｆおよび鋳型ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（特許出願ＤＥ  １００４５５９１．３を参照）を用いて、ＰＣＲ生成物２が生成された。これは、ＸｂａＩを用いて切断され、その際、「平滑末端」および「粘着末端」が生じた。１．からの構築物は、ＢａｍＨＩを用いて消化され、続いて、クレノウ酵素を用いて処理され、その結果、末端が補填された。それに続いてＸｂａＩ消化が実施され、ＰＣＲ生成物２は、このベクター内においてクローニングされた。結果は以下の構築物であった。
ＨＡ配列−ＮｏｔＩ−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＴＲＡＩＬモジュール１−リンカー１−ＴＲＡＩＬモジュール２−リンカー２−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
３．ＴＲＡＩＬモジュール３のクローニングのために、プライマーＴＲＡＩＬ＃４およびＴＲＡＩＬ＃５を用いて、鋳型ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩｚｅ上において、ＰＣＲが実施され、生成物は、続いて、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化され、２．からの構築物において、同様に、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いてクローニングされ、それによって、以下の構築物が生じた。
ＨＡ配列−ＮｏｔＩ−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＴＲＡＩＬモジュール１−リンカー１−ＴＲＡＩＬモジュール２−リンカー２−ＴＲＡＩＬモジュール３−Ｓｔｏｐ−ＸｂａＩ
ｓｃＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ構築物内の製造のために、それぞれ、ｓｃＴＲＡＩＬベクターは、制限酵素ＮｏｔＩあるいはＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて消化され、カセットとしての挿入断片が、対応するＡＭＡＩＺｅベクター（特許出願ＤＥ  １００４５５９１．３を参照）内に挿入され、その際、このベクターは、同様に、酵素ＮｏｔＩあるいはＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて切断された。それによって、以下の構築物が製造された。
ＨＡ−ｓｃＦｖ４０−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ＴＲＡＩＬモジュール１−リンカー１−ＴＲＡＩＬモジュール２−リンカー２−ＴＲＡＩＬモジュール３
以下に、使用されたプライマーの配列が挙げられる。
ｓｃＴＲＡＩＬクローニングのためのプライマー
【０１６８】
【化９】
2007530021.tif 000013
実施例２：ヒト野生型ＴＮＦおよびヒトｓｃＴＮＦの薬物動態
生後６週間のＢａｌｂ／ｃマウスに、１２μｇＴＮＦあるいはｓｃＴＮＦ（それぞれ、３匹のマウスに）が静脈注射された。４５分毎に採血、採集され、血清内のＴＮＦ濃度が、ヒトＴＮＦに特定のＥＬＩＳＡ  ＫＩＴｓを用いて、決定された。図２７のデータは、ｓｃＴＮＦ改変体のｉｎ  ｖｉｖｏ半値時間の明らかな増加を示す。そのため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ｓｃＴＮＦの、明らかに増加された生物学的作用持続が期待され、それによって、潜在的な治療剤としてのｓｃＴＮＦの価値が強調される。
【０１６９】
実施例３：粒子（シリカ）に共有結合されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦ
構築物ＴＮＦＲ２−Ｆａｓを用いて転換されたマウス繊維芽細胞は、挙げられた試薬の連続的な希釈によって処理された。これら細胞は、可溶性ｗｔＴＮＦに対して全く耐性である。制定されたプロトコル（ＤＰＡ  ２００１，Ｎｏ．ＤＥ１０１４４２５２）に従った、シリカマイクロ粒子（ビーズ）への、還元されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦの共有結合の後に、これらは、ＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦおよびＴＮＦＲ２に結合する抗体、ｍＡｋ  ８０Ｍ２（三角形）から成るポジティブコントロールと同様に、強い細胞障害性応答（円）を引き起こす。結合されないＣｙｓ−Ｈｉｓ  ｓｃＴＮＦは、予期されたように、ＴＮＦＲ２ポジティブ細胞に対して活性を示さない（四角形）。共有結合されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦは、生物的活性であり、膜結合ＴＮＦの特別の活性化を有し、つまり、それはＴＮＦＲ２を活性化する。
【０１７０】
実施例４：標準組換えヒト（ｒｈ）ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦの、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍壊死モデルと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｌ９２９−細胞障害性―活性における比較
マウス：  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（雌）、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒの１７〜１９ｇ
腫瘍細胞：  マウス由来のＣ３Ｈ／ＨｅＮからの、ＣＦＳ−１  メチルコラントレ繊維肉腫細胞株（参照：Ｈａｆｎｅｒ  Ｍ．，Ｐ．Ｏｒｏｓｚ，Ａ．Ｋｒｕｅｇｅｒ，およびＤ．Ｎ．Ｍａｅｎｎｅｌ．１９９６  ＴＮＦ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｉｍｐａｉｒｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｔｅｒｎｅｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：３８８〜３９２）
腫瘍壊死実験：  マウスは、５０μｌ培地（ＲＰＭＩ，１０％ＦＣＳ）内の１．６ｘ１０７のＣＦＳ−１細胞を、背の外皮に有した。２００μｌのＰＢＳ内のＰＢＳＴＮＦ（マウス毎に１０μｇ）またはコントロールとしてのＰＢＳのみの、内腹膜への注射の以前に、約５〜６ｍｍの直径の大きさに達するまで、腫瘍は、１２日間、成長されられた。腫瘍の大きさは、毎日、計測され、巨視的に検査された。マウスは、処理の後、６日目に死亡し、腫瘍は組織学のために取り出された。腫瘍は、切り出され、４％ＰＢＳ−緩衝されたホルマリン内において一夜、固定され、パラフィン内にくるみ込まれた。赤道垂直スライス（４μｍ）が、ヘマトキシンおよびエオシンを用いて染色され、巨視的によって壊死が検査された（例えば、Ｌｕｃａｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＩｎｔＪ  Ｃａｎｃｅｒ，９１：５４３〜５４９）。
【０１７１】
ＴＮＦ：  ｒｈＴＮＦ  特異的活性  ６．６ｘ１０６Ｕ／ｍｇ（４８時間、Ａｃｔ．ＤなしにＬ９２９試験）ｓｃＴＮＦ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験、Ａｃｔ．Ｄを用いた、Ｌ２９２細胞障害性アッセイにおけるＬＤ５０活性
ｒｈＴＮＦ＝３９１ｐｇ／ｍｌ
ｓｃＴＮＦ＝３９ｐｇ／ｍｌ
（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に導入されたのと同一のＴＮＦサンプルを用いて試験された）
ｓｃＴＮＦは、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、１０倍の高い活性を示した。
【０１７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍壊死実験
【０１７３】
【表３】
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＊＝巨視的には明確に視認できる表面の壊死
＊＊＝中心の出血壊死の微視的な検査、腫瘍組織の＜５％または＞１０％
結論
単一投与の処理の４日後において、腫瘍の大きさにおいて差異は確認されなかった（腫瘍治療剤としてのＴＮＦの展望、例えばＥｇｇｅｒｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．４．４２９（２００３）参照）。
ｒｈＴＮＦは、出血性の壊死（腫瘍領域の＜５％）を誘導しなかった、巨視的に動物の単に３／７に認識。
ｓｃＴＮＦは、全ての腫瘍において、多くの出血性の壊死（腫瘍領域の＞１０％）を誘導した、巨視的にその５／７に認識。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腫瘍障害性試験および壊死の誘導に関して、ｓｃＴＮＦ＞＞ｒｈＴＮＦ
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、ＴＮＦの典型的な細胞障害性試験の結果を示す。
【図２】図２は、ＴＮＦＲ２−レセプターキメラ（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ）を発現させる細胞に対する、ｓＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ改変体の作用が試験される、細胞障害性試験の結果を示す。
【図３】図３は、ＴＮＦＲ２−キメラ（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ）を発現させる細胞に対する、特定のＴＮＦＲ２−特異性抗体，８０Ｍ２との組合せにおける、ヒト野生型−ＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ改変体の作用が試験される、細胞障害性試験の結果を示す。
【図４】図４は、マウス繊維芽細胞ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞に対する安定性試験の、導入された分子ＶＯＲの生物的活性を示す。
【図５】図５は、マウス繊維芽細胞ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞を用いた安定性試験の結果を示す。
【図６】図６は、マウス繊維芽細胞ＭＦ  ＴＮＦＲ１−ＦＡＳ細胞を用いた安定性試験の結果を示す。
【図７】図７は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。
【図８】図８は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。
【図９】図９は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。
【図１０】図１０は、ヒト細胞列Ｋｙｍ１を用いた安定性試験の結果を示す。
【図１１】図１１は、ヒト血清内における安定性試験の結果を示す。
【図１２】図１２は、ヒト血清内における安定性試験の結果を示す。
【図１３】図１３は、還元および変性条件における、ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動法による分析結果を示す。
【図１４】図１４は、還元および変性条件における、安定性試験の結果を示す。
【図１５】図１５は、ＩκＢ分解アッセイの結果を示す。
【図１６】図１６は、ＪＮＫ−アッセイの結果を示す。
【図１７】図１７は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦ（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーとして）に基づいて示された、本発明によるポリペプチドの例示的な構築物パターンを示す。
【図１９−１】図１９は、ｓｃＴＮＦ−Ｌｓｈｏｒｔ（構築物Ａ−II）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図１９−２】図１９の続き。
【図２０−１】図２０は、ｃｙｓ−ｓｃＴＮＦ−Ｌｓｈｏｒｔ（構築物Ｂ−II）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２０−２】図２０の続き。
【図２１−１】図２１は、ｓｃＦａｓＬ（構築物Ｃ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２１−２】図２１の続き。
【図２２−１】図２２は、ｓｃＴＲＡＩＬ（構築物Ｄ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２２−２】図２２の続き。
【図２２−３】図２２の続き。
【図２３−１】図２３は、ｓｃＴＮＦ（構築物Ｅ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２３−２】図２３の続き。
【図２４−１】図２４は、ｓｃＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（構築物Ｆ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２４−２】図２４の続き。
【図２４−３】図２４の続き。
【図２５−１】図２５は、ｓｃＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（構築物Ｇ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２５−２】図２５の続き。
【図２５−３】図２５の続き。
【図２５−４】図２５の続き。
【図２６−１】図２６は、ｓｃＴＮＦ−ＡＭＡＩＺｅ（構築物Ｈ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２６−２】図２６の続き。
【図２６−３】図２６の続き。
【図２７】図２７は、ヒト野生型ＴＮＦおよびヒトｓｃＴＮＦの薬物動態を示す。
【図２８】図２８は、粒子（シリカ）に共有結合されたＣｙｓＨｉｓ−ｓｃＴＮＦを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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