(57)【要約】  本発明は、ＰＣＲなどの核酸増幅とテンプレート・スイッチングの使用を組み合わせて、全ＲＮＡ集団を代表する増幅産物を生成する。ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列は、増幅されたアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）または相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）が、続く下流適用のために産生されるように、得られた増幅産物に対して、転写に基づく増幅が行われることを可能にする。
2007502610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にＲＮＡにハイブリダイズする第一鎖ｃＤＮＡ合成物を含むｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであって、該ｃＤＮＡが、増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含み、そして該第一鎖ｃＤＮＡの３’端の少なくとも１つの非テンプレート・ヌクレオチドが、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、前記ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項２】
ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項３】
ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターがバクテリオファージ・プロモーターである、請求項１または請求項２記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項４】
バクテリオファージ・プロモーターが、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６からなる群より選択される、請求項３記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項５】
ＲＮＡアニーリング領域がポリ（ｄＴ）を含む、請求項１から４のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項６】
オリゴ（Ｔ）領域が、長さ約１０〜約３０Ｔ残基である、請求項５記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項７】
ＲＮＡアニーリング領域の３’端がＶＮクランプを含み、ＶがＡ、ＧまたはＣであり、そしてＮがＡ、Ｇ、ＣまたはＴである、請求項１から６のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。
【請求項８】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも１つの非テンプレート・ヌクレオチドがデオキシシチジンである、請求項１から７のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項９】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドが、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項１から８のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１０】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドが、デオキシシチジン・ヌクレオチドである、請求項１から９のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１１】
テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドが、３’端に、少なくとも３つのグアニン残基を有する、請求項１から１０のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１２】
増幅配列、増幅プライマーおよびテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドが、同一配列を含有する、請求項１から１１のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１３】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに実質的に相補的であるように伸長される、請求項１から１２のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１４】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物が、逆転写酵素によって合成される、請求項１から１３のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１５】
逆転写酵素がＲＮアーゼＨ活性を欠くが、野生型ポリメラーゼ活性を保持する、請求項１４に記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１６】
逆転写酵素が、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはその突然変異体である、請求項１４または請求項１５記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド。
【請求項１７】
逆転写酵素が、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＨＮＡハイブリッド。
【請求項１８】
試料中のＲＮＡを増幅する方法であって：
（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；
（ｂ）ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を産生するのに適した条件下で、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡアニーリング領域をＲＮＡにアニーリングさせ；
（ｃ）ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体をインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成し；
（ｄ）前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；
（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に実質的に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、増幅プライマーを提供し；そして
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションする
工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを逆転写酵素とインキュベーションし、該酵素が、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端に、少なくとも１つのデオキシシチジン残基を付加する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドを、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる、請求項１８または請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドが、デオキシシチジン残基である、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
逆転写酵素がＲＮアーゼＨ活性を欠くが、野生型ポリメラーゼ活性を保持する、請求項１８〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
逆転写酵素が、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはその突然変異体である、請求項１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
逆転写酵素が、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である、請求項１８〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドが、少なくとも３つのリボヌクレオチド残基を含む、請求項１８〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドが、少なくとも３つのグアニン残基を含む、請求項１８〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅プライマーが、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの増幅配列と同じ配列を有する、請求項１８〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
反応物が１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む、請求項１８〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
二本鎖増幅産物がＰＣＲによって得られる、請求項１８〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲプライマーが同じ濃度を有する、請求項１８〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲ増幅を行う、請求項１８〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
二本鎖増幅産物を生成するのに最適な周期数を：
（ａ）既知の量のＲＮＡを含む複数の試料を提供し；
（ｂ）複数の試料に対して、設定した周期数で増幅を行い；
（ｃ）二本鎖増幅産物を精製し；
（ｄ）精製された増幅産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を提供し；そして
（ｅ）必要とされる、増幅されたＲＮＡの最小量を生じる増幅周期数を決定する
工程を含む方法によって決定する、請求項１８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
ＲＮＡ試料が、生検、顕微解剖組織、微細針吸引物、フロー選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）細胞、レーザー捕捉顕微解剖細胞または単細胞からなる群より選択される臨床試料である、請求項１８〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
細胞または細胞集団の発現ライブラリーを調製する方法であって：
（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；
（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡにハイブリダイズするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドと、前記細胞または細胞集団由来のｍＲＮＡ集団を接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；
（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体をインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；
（ｄ）前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；
（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと増幅プライマーを接触させ；そして
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションする
工程を含む、前記方法。
【請求項３５】
ｍＲＮＡ分子のコレクションからｃＤＮＡライブラリーを調製する方法であって：
（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；
（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡにアニーリングするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡのコレクションを接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；
（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体をインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；
（ｄ）前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；
（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドとＰＣＲプライマーを接触させ； 
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションして；そして
（ｇ）増幅されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する
工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを行う方法であって：
（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；
（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡのコレクションを、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドが前記ＲＮＡ試料中のｍＲＮＡにアニーリングするのを可能にする条件下で接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；
（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを、酵素、ｄＮＴＰおよび緩衝剤とインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；
（ｄ）前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；
（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと増幅プライマーを接触させ； 
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションして；
（ｇ）前記の増幅されたＲＮＡと、前記の増幅されたＲＮＡの反対のセンスの一本鎖核酸集団を接触させ；
（ｈ）増幅されたＲＮＡに存在する配列および一本鎖核酸集団のハイブリダイゼーションを提供し；そして
（ｉ）一本鎖のままである核酸集団を単離する
工程を含む、前記方法。
【請求項３７】
目的の遺伝子の発現を検出する方法であって：
（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し、ここでＲＮＡアニーリング領域は、目的の遺伝子に発現されるｍＲＮＡに実質的に相同な配列を含む；
（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡにアニーリングするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドと、細胞または細胞集団中のｍＲＮＡ集団を接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；
（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドをインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；
（ｄ）前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；
（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと増幅プライマーを接触させ； 
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションして；そして
（ｇ）増幅されたＲＮＡの存在または非存在を決定する、ここで増幅されたＲＮＡは、目的の遺伝子に対応するｍＲＮＡに相補的である
工程を含む、前記方法。
【請求項３８】
請求項１８〜３３のいずれか１つに記載の方法によって得られる、増幅されたＲＮＡ。
【請求項３９】
請求項３４記載の方法によって得られる、発現ライブラリー。
【請求項４０】
請求項３５記載の方法によって得られる、ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項４１】
ＲＮＡ増幅における、請求項１〜１７のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの使用。
【請求項４２】
ｃＤＮＡライブラリー調製における、請求項１〜１７のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの使用。
【請求項４３】
サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションにおける、請求項１〜１７のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの使用。
【請求項４４】
遺伝子発現を測定するための、請求項１〜１７のいずれか１つに記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの使用。
【請求項４５】
マイクロアレイを用いて遺伝子発現を測定する、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
試料中のＲＮＡを増幅するためのキットであって：
（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチド；
（ｂ）増幅配列と実質的に同じ配列を有する、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチド；および
（ｃ）テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドと実質的に同じ配列を有する、増幅プライマー
を含む、前記キット。
【請求項４７】
別個の容器中に逆転写酵素をさらに含む、請求項４６記載のキット。
【請求項４８】
逆転写酵素がＲＮアーゼＨ活性を欠くが、野生型ポリメラーゼ活性を保持する、請求項４７記載のキット。
【請求項４９】
逆転写酵素が、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはその突然変異体である、請求項４７または請求項４８記載のキット。
【請求項５０】
逆転写酵素が、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である、請求項４７〜４９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５１】
ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを、別個の容器中にさらに含む、請求項４７〜５０のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５２】
ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターから選択される、請求項４７〜５１のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５３】
増幅用緩衝剤および１以上の増幅用酵素をさらに含む、請求項４７〜５２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５４】
増幅用緩衝剤および増幅用酵素（単数または複数）が、ＰＣＲ増幅用緩衝剤およびＰＣＲ増幅用酵素（単数または複数）である、請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
対照の核酸をさらに含む、請求項４７〜５４のいずれか１つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、組換えＤＮＡ技術の分野に関する。
特に、本発明は、限られた量の出発ＲＮＡから増幅されたＲＮＡの異成分（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）集団を産生するための改善法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現プロファイリングの分野は、ここ数年で急躍進してきており、そして現在、ゲノム規模で実行可能である。示差発現される遺伝子の同定が医学的研究、臨床的研究および生物学的研究に用いられ、腫瘍形成などの疾患、分化および発生を含む、生物学的プロセスの根底にある分子機構を理解するのに役立っている。遺伝子発現プロファイリングを、広い範囲の適用に渡って、例えば療法介入のための新規ターゲットの同定、潜在的な診断マーカーおよび予後マーカーの同定に用いて、薬剤に対する臨床的反応および結果を理解し、そして毒性学的反応を同定するのに役立てることも可能である。異なる固体支持体（例えばナイロン膜、ガラススライドまたはシリコン／セラミックチップ）上、マクロアレイ、マイクロアレイまたは高密度オリゴヌクレオチド・アレイなどの多様なプラットホーム上の固定化遺伝子特異的配列（プローブ）のＤＮＡアレイは、ゲノミクス研究の異なる領域で広く適用可能である。
【０００３】
ＲＮＡ増幅に最も一般的に用いられる機構は、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら（１９９０）、Ｅｂｅｒｗｉｎｅら（１９９２）、並びにＰｈｉｌｉｐｓおよびＥｂｅｒｗｉｎｅ（１９９６）に最初に開発された、Ｔ７に基づく線形増幅法（ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）であり、そしてこの機構はＵＳ  ６，２９１，１７０、ＵＳ  ５，８９１，６３６、ＵＳ  ５，７１６，７８５、およびＵＳ  ５，５４５，５２２に記載されている。この方法では、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含有する合成ポリ（ｄＴ）プライマーを用いて、逆転写により、第一鎖ｃＤＮＡの合成をプライミングする。限定ＲＮアーゼＨ消化、その後、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いた第二鎖合成によって、第二鎖ｃＤＮＡを合成する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた二本鎖ｃＤＮＡテンプレートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写から、増幅されたアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を得る。
【０００４】
この方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐオリゴヌクレオチド・アレイの基礎であり、該アレイでは、ビオチン化リボヌクレオチドを、相補ＲＮＡとしても知られるａＲＮＡに取り込み（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現解析技術マニュアル、並びにＭａｈａｄｅｖａｐｐａおよびＷａｒｒｉｎｇｔｏｎ（１９９９）を参照されたい）、そしてこの方法はまた、ガラス・マイクロアレイの基礎でもある（Ｐａｂｏｎら（２００１））。
【０００５】
この方法は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた増幅工程を伴うが、典型的には、５〜２５μｇの総ＲＮＡを用いる。しかし、マイクロアレイ実験に十分な量の増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を得るため、研究者らは、Ｔ７増幅とカップリングさせた２周期以上のｃＤＮＡ合成に頼って、代表的なｍＲＮＡプロフィールを生成してきており、そしてこれによって、アレイ技術と顕微解剖の併用が可能になってきた（Ｌｕｏら（１９９９）、Ｏｈｙａｍａら（２０００）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術注記ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）真核生物少量試料ターゲットアッセイ、バージョンＩＩ、およびＬｕｚｚｉら（２００１））。
【０００６】
Ｗａｎｇら（２０００）は、全長二本鎖ｃＤＮＡを理論的に生成するのに用いられるＳＭＡＲＴＴＭテンプレート・スイッチング・プライマーで修飾した、Ｔ７に基づく増幅プロトコルを記載した。増幅されるａＲＮＡの忠実度は、一般的に用いられる投入ＲＮＡの１：１００００〜１：１０００００の発現プロフィールの間に匹敵し、そして慣用的ポリＡ＋ＲＮＡまたは総ＲＮＡで観察されるものに匹敵することが示された。Ｈｕおよび同僚ら（２００２）は、増幅された試料および増幅されていない試料を比較して、Ｗａｎｇらから採用したテンプレート・スイッチング機構を伴う、Ｔ７に基づく類似のプロトコルを評価した。彼らの結果は、増幅された試料および増幅されていない試料の間の一致を示し、そしてノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティング、並びに免疫組織化学アッセイを用いて、示差発現された２つの遺伝子が確認された。
【０００７】
２つの商業的に入手可能な増幅キットにおいてもまた、Ｔ７に基づく増幅技術の修飾が、用いられてきている。ＲｉｂｏＡｍｐＴＭ  ＲＮＡ増幅キット（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）は、専売の線形増幅法を用いて、高収率のＲＮＡ増幅を達成する。この方法は、出発材料の量に応じて、１周期または２周期のＴ７に基づく増幅を利用する。ＲｅａｌＡｒｔＴＭ  ｍＲＮＡ増幅キット（Ａｒｔｕｓ  ＧｍｂＨ）は、Ｔ７に基づく増幅技術を提供する。ｍＲＮＡを、アンカー付加されたポリ（ｄＴ）プライマーを含むｃＤＮＡに変換し、そして次いで、完全ｃＤＮＡのランダム提示を生じる、専売「ボックス／ランダム化プライマー・ミックス」を用いて、第二鎖合成を行う。ランダムにプライミングされたｃＤＮＡを変性させ、そしてＴ７プロモーター／ポリ（ｄＴ）プライマーを用いてプライミングする。これによって、一方の端にＴ７プロモーターを持つ二本鎖ｃＤＮＡが生じ、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のテンプレートとして使用することも可能である。
【０００８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＵＳ４，６８３，２０２およびＵＳ  ４，６８３，１９５に記載されるように、特定の核酸配列を増幅する、非常に強力な技術である。ＰＣＲは、典型的には、ターゲットＤＮＡの別個の相補鎖を２つのオリゴヌクレオチド・プライマーで処理して、両方の鎖上に、相補プライマー伸長産物を形成し、この産物が、望ましい核酸配列のコピーを合成するためのテンプレートとして作用しうる。熱安定性ポリメラーゼを用いた自動化された系で、分離工程および合成工程を反復し、ターゲット配列の本質的に指数関数的な複製を達成可能である。
【０００９】
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅には、ｃＤＮＡ両端にプライマー結合部位が存在する必要がある。ａ）第一鎖ｃＤＮＡの３’端へのホモポリマー・テールの付加（Ａｋｏｗｉｔｚ  ＆  Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ（１９８９）、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら（１９８９）、Ｄｏｍｅｃら（１９９０）、およびＢｒａｄｙら（１９９０））；ｂ）第一鎖ｃＤＮＡの３’端への一本鎖アンカー・オリゴヌクレオチドの連結（Ａｐｔｅ  ＆  Ｓｉｅｂｅｒｔ（１９９３））；ｃ）ｍＲＮＡの５’端への一本鎖アンカー・オリゴヌクレオチド配列の連結（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら（１９９３）、Ｋａｔｏら（１９９４）、Ｍａｒｕｙａｍａ  ＆  Ｓｕｇａｎｏ，  Ｓ．（１９９４））；ｄ）二本鎖ｃＤＮＡの５’端への二本鎖アダプターの連結（Ｆｒｏｈｍａｎ  ＆  Ｄｕｓｈ（１９８８））；およびｅ）テンプレート・スイッチング機構（Ｃｈｅｎｃｈｉｋら（１９９８）およびＺｈｕら（２００１）に記載されるような、ＲＮＡ転写物の５’端でのスイッチング機構である、ＳＭＡＲＴＴＭ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による、第一鎖合成反応における一本鎖ｃＤＮＡの５’端および３’端での増幅配列の付加を含むいくつかの方法によって、これらのプライマー部位を付着させることも可能である。テンプレート・スイッチングは、ＵＳ  ５，９６２，２７１およびＵＳ  ５，９６２，２７２にもまた、記載される。
【００１０】
単細胞由来のｍＲＮＡの包括的な増幅に関して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に基づく増幅技術が記載されてきている（Ｒａｐｐｏｌｅｅら（１９８９）、Ｂｒａｄｙら（１９９０）、Ｃｈｅｎｇら（１９９６）、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（１９９４））。包括的なｍＲＮＡ増幅後、ｃＤＮＡアレイ解析（Ｔｈｅｉｌｇａａｒｄ−Ｍｏｎｃｈら（２００１））によって遺伝子発現を調べるため、Ｂｒａｄｙら（１９９０）に記載されるものなどの、ＰＣＲに基づくアプローチもまた使用されてきている。しかし、この方法は、第一鎖ｃＤＮＡのサイズを約３００〜７００塩基に限定するよう設計されており、そしてしたがって、対応するアレイは、アレイ化クローンが各ｃＤＮＡの３’端を含有するように、設計されなければならない。
【００１１】
近年、迅速で、そして非常に最適化された包括的ＲＴ−ＰＣＲ法が記載されてきており（Ｉｓｃｏｖｅら（２００２））、これもまた、Ｂｒａｄｙら（１９９０）に先に記載された方法に基づく。該方法は、ポリ（ｄＴ）にプライミングされる第一鎖ｃＤＮＡを逆転写し、末端トランスフェラーゼを用いてポリ（ｄＡ）テールを付加し、そして続いて単一のポリ（ｄＴ）含有プライマーを用いて指数関数的に増幅することを伴う。デオキシヌクレオチド濃度および反応時間を制限することによって、逆転写は、ごく３’に近い配列の数百塩基のみに限定される。これらの条件は、個々のｍＲＮＡ転写物の試料採取がより均質になされる可能性、およびすべての周期に渡る、より均質な増幅効率を提供するよう意図された。この包括的ＲＴ−ＰＣＲアプローチは、増幅を通じて、存在量の関係を維持し、そして単細胞から得られる総ＲＮＡのピコグラム範囲から再現性がある結果を生じた。
【００１２】
ＰＣＲに基づく増幅法、３’端増幅ＰＣＲ（ＴＰＥＡ−ＰＣＲ）が開発されてきており、該方法は、試料中に存在するすべてのｍＲＮＡの３’端の包括的な増幅を生じる（Ｄｉｘｏｎら（１９９８））。ＰＣＲ増幅は、逆転写中に第一鎖ｃＤＮＡに取り込まれるプライマー、および部分的に縮重した３’端を有し、そして１キロ塩基ごとにアニーリングするように設計された第二鎖プライマーの間で生じる。
【００１３】
近年、ＰＣＲに基づく別の増幅法、「平衡ＰＣＲ」が、Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓら（２００２）に記載された。平衡ＰＣＲは、３回の連続したＰＣＲ周期後であっても、２つの複雑なＤＮＡ由来の断片の平衡増幅を可能にする。２つの別個のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ試料に、一般的なＤＮＡ配列およびユニークなＤＮＡ配列両方を含有するオリゴヌクレオチドをタグ付けする。試料をプールし、そして共通のＤＮＡタグを用いて、単一のＰＣＲ試験管中で増幅し、そしてしたがって増幅効率には相違がないはずである。各個々のゲノムＤＮＡ試料にユニークなＤＮＡタグを用いて、ＰＣＲ増幅したプール試料を分離することも可能である。この方法の原理は、マイクロアレイに適用した、合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡを用いて、確証されてきている。ＰＣＲの偏向を取り除くことによって、この平衡ＰＣＲアプローチは、微小レーザー顕微解剖組織、パラフィン包埋アーカイブ材料、または単細胞における遺伝子解析を可能にするはずである。しかし、生検由来のＲＮＡの増幅のための、この方法の日常的な使用は、まだ報告されてきていない。
【００１４】
逆転写後、ｃＤＮＡのランダムＰＣＲ増幅、そして生じたＰＣＲ産物のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づく、ＰＣＲ増幅法が、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって、マイクロアレイ・ターゲット増幅キット（カタログ番号３  ３１０  １９１）に記載されてきている。この方法では、ナノグラム量の総ＲＮＡを、修飾ポリ（ｄＴ）プライマー（ＴＡＳ−Ｔ７ポリ（ｄＴ）２４）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写する。ユニークなターゲット増幅配列（ＴＡＳ）は既知のヒト配列いずれにも相同性を持たず、続くＰＣＲ増幅のため、ｃＤＮＡ上に３’アンカーを生成する。Ｔ７プロモーター配列を付加して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による標識ｃＲＮＡターゲットの生成を可能にする。ｃＤＮＡ上に５’増幅配列を含ませるため、ＴＡＳ−（ｄＮ）１０プライマーを用い、そして第二鎖ｃＤＮＡ合成物の開始に用いる。次いで、ＴＡＳ−プライマーを用いてＰＣＲを行い、そして最適な周期数を決定しなければならない。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に用いる。
【００１５】
ＳＭＡＲＴＴＭで生成したｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリー構築、並びにｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドに基づくマイクロアレイのハイブリダイゼーションプローブとしてのものを含めて、いくつかの適用に用いられている。ＳＭＡＲＴＴＭ技術をＰＣＲとカップリングすると、用いる出発総ＲＮＡの量をより少なくすることが可能であったが、ｍＲＮＡ提示を維持することが重要なマイクロアレイ解析においては、この技術の有用性を支持するデータは限られたものでしかない［Ｓｐｉｒｉｎら（１９９９）、Ｇｏｎｚａｌｅｓら（１９９９）、Ｖｅｒｎｏｎら（２０００）、Ｌｉｖｅｓｅｙら（２０００）、Ｚｈｕｍａｂａｙｅｖａら（２００１）およびＦｉｎｋら（２００２）］。
【００１６】
これらの技術の限界は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）総ＲＮＡが比較的多量に必要なことである。例えば、典型的なマイクロアレイ標識法は、マイクロアレイあたり、０．５〜４μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは５〜５０μｇの総ＲＮＡを必要とする。このポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは総ＲＮＡ量は、５０〜１００ｍｇより多い重量の組織試料から得られうるが、多くの試料、例えば多くの臨床的生検は、これより有意に少ない。Ａｓｓｅｒｓｏｈｎら（２００２）による最近の予備的研究は、ヒト乳癌由来の微細針吸引物（ＦＮＡ）のわずか１５％のみが、発現アレイ解析に十分なｍＲＮＡを生じることを示した。
【発明の開示】
【００１７】
低効率、および時間がかかる複数回の工程に縛られず、そして少量のＲＮＡからの増幅を可能にする一方、感度、再現性を維持し、そして示差発現される遺伝子を有効に同定することも可能な、単純でそして頑強な方法が、当該技術分野において、非常に望ましい。
【００１８】
発明の概要の側面
本発明は、ＰＣＲなどの核酸増幅とテンプレート・スイッチングの使用を組み合わせて、全ＲＮＡ集団を代表する増幅産物を生成する。ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列は、後に続く下流適用のため、増幅されたアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）または相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）が産生されるように、得られた増幅産物に対して、転写に基づく増幅が行われるのを可能にする。
【００１９】
好適には、本発明にしたがって生成されるＲＮＡはアンチセンスであり、そしてしたがって、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチド・アレイ（スポットされたオリゴまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘなどの固相合成されたオリゴ）に対する使用に有用性を有する。商業的なアレイまたは「自家製」アレイは、ｃＤＮＡまたはオリゴいずれかに基づき（典型的にはセンスオリゴがアレイ化される）、そしてしたがって本明細書に記載するようなアンチセンスｃＲＮＡの産生は、どちらのセッティングでも有用性を有する。センスＲＮＡが生成されたならば、その使用はｃＤＮＡアレイに限定され、そして最新のオリゴヌクレオチド・アレイの大部分には使用されないであろう。
【００２０】
本発明はまた、限られた組織試料の障壁も克服する。
第一の側面において、本発明は、実質的にＲＮＡにハイブリダイズする第一鎖ｃＤＮＡ合成物を含むｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであって、該ｃＤＮＡが、増幅子（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含み、そして該第一鎖ｃＤＮＡの３’端の少なくとも１つの非テンプレート・ヌクレオチドが、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、前記ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関する。
【００２１】
第二の側面において、本発明は、試料中のＲＮＡを増幅する方法であって：（ａ）増幅（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；（ｂ）ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を産生するのに適した条件下で、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡアニーリング領域をＲＮＡにアニーリングさせ；（ｃ）ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体をインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成し；（ｄ）前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に実質的に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、増幅プライマーを提供し；そして（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションする工程を含む、前記方法に関する。
【００２２】
第三の側面において、本発明は、細胞または細胞集団の発現ライブラリーを調製する方法であって：（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡにハイブリダイズするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドと、前記細胞または細胞集団由来のｍＲＮＡ集団を接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体をインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；（ｄ）前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと増幅プライマーを接触させ；そして（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションする工程を含む、前記方法に関する。
【００２３】
第四の側面において、本発明は、ｍＲＮＡ分子のコレクションからｃＤＮＡライブラリーを調製する方法であって：（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡにアニーリングするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡのコレクションを接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体をインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；（ｄ）前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドとＰＣＲプライマーを接触させ； （ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションして；そして（ｇ）増幅されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する工程を含む、前記方法に関する。
【００２４】
第五の側面において、本発明は、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを行う方法であって：（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し；（ｂ）ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドが前記ＲＮＡ試料中のｍＲＮＡにアニーリングするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡのコレクションを接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを、酵素、ｄＮＴＰおよび緩衝剤とインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；（ｄ）前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと増幅プライマーを接触させ；（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションして；（ｇ）前記の増幅されたＲＮＡと、前記の増幅されたＲＮＡの反対のセンスの一本鎖核酸集団を接触させ；（ｈ）増幅されたＲＮＡに存在する配列および一本鎖核酸集団のハイブリダイゼーションを提供し；そして（ｉ）一本鎖のままである核酸集団を単離する工程を含む、前記方法に関する。
【００２５】
第六の側面において、本発明は、目的の遺伝子の発現を検出する方法であって：（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを提供し、ここでＲＮＡアニーリング領域は、目的の遺伝子に発現されるｍＲＮＡに実質的に相同な配列を含む；（ｂ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡにアニーリングするのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドと、細胞または細胞集団中のｍＲＮＡ集団を接触させて、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を産生し；（ｃ）前記ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドをインキュベーションして、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを生成し；（ｄ）前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの前記ｃＤＮＡがテンプレート依存性に伸長されるのを可能にする条件下で、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドのｃＤＮＡの３’端が、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドを接触させ；（ｅ）第一鎖ｃＤＮＡ合成物に対応する二本鎖増幅産物を生成する条件下で、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物が二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むように、前記ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドと増幅プライマーを接触させ；（ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、増幅されたＲＮＡを生成するのを可能にする条件下で、前記二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む、前記二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物をインキュベーションして；そして（ｇ）増幅されたＲＮＡの存在または非存在を決定する、ここで増幅されたＲＮＡは、目的の遺伝子に対応するｍＲＮＡに相補的である、工程を含む、前記方法に関する。
【００２６】
第七の側面において、本発明は、本発明の第二の側面に記載の方法によって得られる、増幅されたＲＮＡに関する。
好適に、増幅されたＲＮＡは、少量の限られた生物学的試料または臨床的試料、例えば限定されるわけではないが、生検、微細針吸引物、組織切片、気管支肺胞洗浄液、巨視的解剖組織または顕微解剖組織から出発する、診断試験、予後試験または予測試験で使用可能である。
【００２７】
第八の側面において、本発明は、本発明の第三の側面記載の方法によって得られる、発現ライブラリーに関する。
第九の側面において、本発明は、本発明の第四の側面記載の方法によって得られる、ｃＤＮＡライブラリーに関する。
【００２８】
第十の側面において、本発明は、ＲＮＡ増幅における、本発明の第一の側面記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの使用に関する。
第十一の側面において、本発明は、ｃＤＮＡライブラリー調製における、本発明の第一の側面記載のｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの使用に関する。
【００２９】
第十二の側面において、本発明は、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションにおける、本発明の第一の側面記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの使用に関する。
第十三の側面において、本発明は、遺伝子発現を測定するための、本発明の第一の側面記載のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドの使用に関する。
【００３０】
第十四の側面において、本発明は、試料中のＲＮＡを増幅するためのキットであって：（ａ）増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチド；（ｂ）増幅配列と実質的に同じ配列を有する、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチド；および（ｃ）テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドと実質的に同じ配列を有する、増幅プライマーを含む、前記キットに関する。
【００３１】
本発明の他の側面を、付随する請求項、並びに以下の説明および考察に示す。これらの側面を別個の節の見出しに示す。しかし、節の各見出し以下の解説は、その特定の節の見出しに必ずしも限定されないことを理解しなければならない。
【００３２】
好ましい態様
好ましくは、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡはｍＲＮＡである。
好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターはバクテリオファージ・プロモーターである。より好ましくは、バクテリオファージ・プロモーターは、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６からなる群より選択される。
【００３３】
好ましくは、ＲＮＡアニーリング領域はポリ（ｄＴ）を含む。より好ましくは、オリゴ（Ｔ）領域は、長さ約１０〜約３０Ｔ残基である。
好ましくは、ＲＮＡアニーリング領域の３’端はＶＮクランプ（ＶＮ−３’）を含み、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、そしてＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。
【００３４】
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも１つの非テンプレート・ヌクレオチドはデオキシシチジンである。
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００３５】
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドは、デオキシシチジン・ヌクレオチドである。
好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、３’端に、少なくとも３つのグアニン残基を有する。
【００３６】
好ましくは、増幅配列、増幅プライマーおよびテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、同一配列を含有する。
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端は、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに実質的に相補的であるように伸長される。
【００３７】
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物は、逆転写酵素によって合成される。
好ましくは、逆転写酵素はＲＮアーゼＨ活性を欠くが、野生型ポリメラーゼ活性を保持する。より好ましくは、逆転写酵素は、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはその突然変異体である。最も好ましくは、逆転写酵素は、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。
【００３８】
好ましくは、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを逆転写酵素とインキュベーションし、該酵素が、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端に、少なくとも１つのデオキシシチジン残基を付加する。
【００３９】
好ましくは、反応は１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む。
好ましくは、二本鎖増幅産物はＰＣＲによって得られる。
好ましくは、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲプライマーは同じ濃度を有する。
【００４０】
好ましくは、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲプライマーは約０．５μＭの濃度を有する。
好ましくは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲ増幅を行う。
【００４１】
好ましくは、二本鎖増幅産物を生成するのに最適な周期数を：（ａ）既知の量のＲＮＡを含む複数の試料を提供し；（ｂ）複数の試料に対して、設定した周期数で増幅を行い；（ｃ）二本鎖増幅産物を精製し；（ｄ）精製された増幅産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を提供し；そして（ｅ）必要とされる、増幅されたＲＮＡの最小量を生じる増幅周期数を決定する工程を含む方法によって決定する。
【００４２】
好ましくは、ＲＮＡ試料は、生検、顕微解剖組織、微細針吸引物、フロー選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）細胞、レーザー捕捉顕微解剖細胞または単細胞からなる群より選択される臨床試料である。
【００４３】
好ましくは、マイクロアレイを用いて遺伝子発現を測定する。
好ましくは、本発明の第十四の側面記載のキットは、別個の容器中に逆転写酵素をさらに含む。
【００４４】
好ましくは、キットは、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを、別個の容器中にさらに含む。
好ましくは、キットは、増幅用緩衝剤および１以上の増幅用酵素をさらに含む。より好ましくは、増幅用緩衝剤および増幅用酵素（単数または複数）は、ＰＣＲ増幅用緩衝剤およびＰＣＲ増幅用酵素（単数または複数）である。
好ましくは、キットは、対照核酸をさらに含む。
【００４５】
利点
本発明はいくつかの利点を有する。これらの利点は、以下の説明で明らかであろう。
例えば、本発明は、商業的に有用な方法を提供するため、好適である。
さらなる例として、本発明は、本発明の方法が、代替増幅法より技術的により単純でそしてより迅速であるが、こうした方法と同等かまたはこれらより改善された能力を有するため、好適である。
【００４６】
さらなる例として、本発明は、少量の総ＲＮＡ（典型的には５ｎｇ〜５０ｎｇ以下）、または５００〜５０００細胞にほぼ同等の量の細胞の、再現性があり、そして頑強な増幅法を提供し、なお少量で使用される、さらなる見通しがありうるため、好適である。
【００４７】
さらなる例として、本発明は、ｍＲＮＡの相対的な提示を維持しつつ、限られた量のＲＮＡを増幅するための新規方法を提供するため、好適である。
【００４８】
発明の詳細な説明
オリゴヌクレオチド
本発明記載のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物または誘導体、あるいは塩基部分、糖部分または主鎖で修飾された修飾型であることも可能であり、そして所望の反応において、なお機能可能である限り、他の付随する基または標識を含むことも可能である。
【００４９】
例えば、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドであることも可能である。
さらなる例として、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるテンプレート・スイッチングオリゴヌクレオチドであることも可能である。
【００５０】
非常に好ましい態様において、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、ＵＳ  ５，９６２，２７１および５，９６２，２７２に記載するテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドである。
【００５１】
さらなる例として、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるＰＣＲプライマーなどの増幅プライマーであることも可能である。
本発明記載のオリゴヌクレオチドは、所望の反応において、なお機能可能である限り、修飾されていることも可能である。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾されていることも可能であり、そして他の付随する基または標識を含むことも可能である。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リン酸主鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類似体を含むことも可能である。
【００５３】
オリゴヌクレオチドは、非特異的核酸切断化学薬品もしくは酵素、または部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いた、より大きい核酸断片の切断によって；あるいは当該技術分野に知られる標準法による合成によって、例えば商業的に入手可能な自動化ＤＮＡ合成装置および標準的ホスホロアミダイト化学反応の使用によって、得られることも可能である。
【００５４】
所望のオリゴヌクレオチドが合成されたら、当該技術分野に知られる方法によって、合成された固体支持体から切断して、そして処理し、存在するいかなる保護基も取り除く。次いで、抽出およびゲル精製を含む、当該技術分野に知られる方法いずれかによってオリゴヌクレオチドを精製することも可能である。例えば、アクリルアミドゲル上でオリゴヌクレオチドを調べることによって、ＨＰＬＣによって、または分光光度計において２６０ｎｍで光学密度を測定することによって、オリゴヌクレオチドの濃度および純度を決定することも可能である。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg(T)30VN-3’
式中、ＶはＡ、Ｇ、またはＣであり、そしてＮは塩基いずれかである
に示す配列を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドである。
【００５６】
別の態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号４：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTaatacgactcactatagggaga(T)24VN-3’
式中、ＶはＡ、Ｇ、またはＣであり、そしてＮは塩基いずれかである
に示す配列を含む、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドである。
【００５７】
本発明のさらに別の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２：
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'
に示す配列を含む、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドである。
【００５８】
さらに別の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号３：
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
に示す配列を含む、増幅プライマーである。
【００５９】
配列番号２および配列番号３に対応するオリゴヌクレオチドは、ＵＳ  ５，９６２，２７１および５，９６２，２７２に記載されている。
本発明において、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドは、増幅配列、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されたＲＮＡアニーリング領域を含む。
【００６０】
増幅配列（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
本発明における増幅配列とは、本明細書に記載するようなテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドおよび増幅プライマーと同じかまたは実質的に同じ配列を含有する、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの一部に関する。
【００６１】
増幅プライマーは、第二鎖ｃＤＮＡ合成物が、例えばＰＣＲによって増幅可能であるように、増幅配列の相補配列にハイブリダイズ可能である。
好ましくは、増幅配列は、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの５’端に位置し、そして一般的に、ＲＮＡに翻訳されない。
【００６２】
当業者は、増幅プライマーが増幅配列の相補配列にハイブリダイズ可能であるかまたは実質的にハイブリダイズ可能である限り、増幅配列にいかなる配列も使用可能であることを認識するであろう。
【００６３】
ｃＤＮＡ両端の実質的に同一のテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドおよび増幅配列は、ｃＤＮＡ集団の末端から末端の増幅の普遍的プライミング部位として働く。
【００６４】
好ましい態様において、増幅配列、増幅プライマーおよびテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、同一配列を含む領域などの、実質的に同じ配列を含有する。
別の好ましい態様において、増幅配列は、配列番号３に示す配列を含む。
【００６５】
ＲＮＡアニーリング領域
本明細書において、用語「ＲＮＡアニーリング領域」は、ＲＮＡにアニーリング可能なｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの一部を指す。
【００６６】
多くの適用には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）など、他の細胞性ＲＮＡに対して、１種類のＲＮＡが優先的に濃縮されることが望ましい。好適に、大部分のｍＲＮＡは、３’端にポリ（Ａ）テールを含有し、これによって、例えば、セルロースまたはＳｅｐｈａｄｅｘなどの固体支持体にカップリングしたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって濃縮されることが可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ニューヨーク）。
【００６７】
したがって、本発明の好ましい態様において、ＲＮＡアニーリング領域は、ポリ（ｄＴ）を含む。好ましくは、ポリ（ｄＴ）は、各ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）テールに結合する、約１０〜３０、好ましくは約１５〜２５、最も好ましくは約２０Ｔ残基を含む、ポリチミジレート領域である。
【００６８】
あるＲＮＡに関して、より多くの配列情報が入手可能である場合、ＲＮＡアニーリング領域を、ＲＮＡのより特異的な集団とハイブリダイズするように、より特異的に設計することも可能である。さらに、ＲＮＡアニーリング領域は、ＲＮＡアニーリング領域のコレクションを含むことも可能である。
【００６９】
また、配列情報にあいまい性がある場合、いくつかのＲＮＡアニーリング領域が存在することも可能である。したがって、例えば、タンパク質をコードするいくつかのありうる核酸配列を、タンパク質配列に基づいて修正可能である場合、ありうるコドン変異の大部分またはすべてに相当する配列を含有するＲＮＡアニーリング領域のコレクションを調製することも可能である。
【００７０】
所望のＲＮＡに関する配列情報が知られている場合、ＲＮＡアニーリング領域は、ＲＮＡの正確な配列を反映する必要はなく、そして「縮重」していることも可能である。ＲＮＡアニーリング領域が、増幅しようとする鎖の配列と十分な相補性を有し、ハイブリダイゼーションを可能にする限り、非相補塩基またはより長い配列がＲＮＡアニーリング領域中に散在することも可能である。
【００７１】
典型的には、ＲＮＡアニーリング領域は、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの３’端に位置し、そしてＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに作動可能であるように連結されている。
【００７２】
用語「作動可能であるように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、ＲＮＡアニーリング領域およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが、意図される方式で機能するのを可能にする関係にある、並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を指す。したがって、本発明において、ＲＮＡアニーリング領域およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターから、ＲＮＡアニーリング領域が発現されるのを可能にする関係にある。
【００７３】
好適に、ＲＮＡアニーリング領域の３’端は、ｍＲＮＡのプライミングを補助する１以上のヌクレオチドを含むことも可能である。好ましくは、ヌクレオチドは、ＶＮクランプを含み、ここでＶはＡ、ＧまたはＣであり、そしてＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。
【００７４】
ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター
プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに緊密に結合する領域であり、そして開始部位、およびＲＮＡ合成が開始するためのシグナルを含有する。
【００７５】
ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、通常、天然存在ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターまたはコンセンサス・プロモーター領域由来の約１５〜２５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜６０ヌクレオチド、最も好ましくは約１５〜４０ヌクレオチドを含むであろう（Ａｌｂｅｒｔｓら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  第２版中，  Ｇａｒｌａｎｄ，  ニューヨーク（１９８９））。天然の強いプロモーターは、典型的には、２つの非常に保存されたＤＮＡ配列を含有し、これらは各々、長さ約６ヌクレオチドの配列であり、そして開始部位の上流に位置し、無認識の約１７ヌクレオチドのＤＮＡによって互いに分離されている。
【００７６】
転写に用いられるＲＮＡポリメラーゼは、本発明記載のｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドに存在する、特定のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター領域に結合可能でなければならない。実際には、ポリメラーゼが、そのプロモーターに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始するのに十分な特異性を有する限り、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターのいかなる組み合わせを用いることも可能である。
【００７７】
プロモーターは、原核生物プロモーターまたは真核生物プロモーターであることも可能である。好ましくは、プロモーターは原核生物プロモーターである。より好ましくは、原核生物プロモーターは、ファージプロモーターまたはウイルスプロモーターである。最も好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、バクテリオファージ由来のプロモーター、例えばＴ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼ由来のプロモーターである（ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎおよびＲｙａｎ，  Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ中，  Ｐ．Ｂｏｙｅｒ監修（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）ｐｐ．８７−１０８（１９８２））。
【００７８】
Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの典型的な配列は：
5’ GCATTAACCCTCACTAAC 3’（配列番号５）
である。
【００７９】
いくつかの変異Ｔ３プロモーター配列もまた知られ、特に非テンプレート鎖（上に示す）の最初の３塩基がＡＡＡでなく５’ＴＴＡ３’であるものが知られる。例えばＵＳ  ５，０３７，７４５を参照されたい。
【００８０】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの典型的な配列は：
5' TAATACGACTCACTATA 3'（配列番号６）
である。
【００８１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのいくつかの変異型もまた当該技術分野に知られる。例としてのみであるが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターのさらなる変異体は：
5’ AATACGACTCACTATAGGGAGA 3’（配列番号７）
および
5’ ggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg 3’（配列番号８）
である。
【００８２】
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの典型的な配列は：
5' ATTTAGGTGACACTATA 3'（配列番号９）
である。
【００８３】
ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、ハイブリッド・プロモーターであることも可能である。
プロモーターは、発現を確実にするかまたは発現レベルを増加させる特徴をさらに含むことも可能である。
【００８４】
最も好ましいプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターである。プロモーター部位に対してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが非常に高い度合いの特異性を示す（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら，  Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ中，  Ｐ．  Ｂｏｙｅｒ監修（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）ｐｐ．８７−１０８（１９８２））ため、この酵素は、多様な組換えＤＮＡ技術において、広く用いられる試薬となってきた。天然Ｔ７プロモーターは、ＲＮＡ鎖の開始部位に対して、約−１７ｂｐ〜約＋６ｂｐの範囲に渡る、非常に保存された配列を共有する（ＤｕｎｎおよびＳｔｕｄｉｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６６：４７７−５３５（１９８３）、並びにＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７５：１１１−１１２（１９８４））。また、Ｔ７ポリメラーゼには効率的な終結シグナルがないため、該酵素がほぼすべてのＤＮＡから転写物を作成することが可能になる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，  Ｇｅｎｅ  ５６：１２５−１３５（１９８７）を参照されたい）。
【００８５】
ＲＮＡポリメラーゼは、いくつかの商業的供給源、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから広く入手可能である。
【００８６】
ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、一本鎖であることもまた二本鎖であることも可能である。好適に、本明細書記載の方法のＰＣＲ増幅工程にしたがうと、プロモーターは二本鎖になる。
【００８７】
非常に好ましい態様において、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの配向は、アンチセンスａＲＮＡが発現されるものである。好適には、アンチセンスａＲＮＡは、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチド・アレイ、例えばスポットされたオリゴヌクレオチドまたは固相合成されたオリゴヌクレオチド、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのもので使用可能である。商業的なアレイまたは「自家製」アレイは、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドいずれかに基づき（典型的にはセンスオリゴヌクレオチドがアレイ化される）、そしてしたがって本明細書に記載するようなアンチセンスｃＲＮＡの産生は、どちらのセッティングでも有用性を有する。
【００８８】
テンプレート・スイッチング
テンプレート・スイッチングは、ホスホジエステル結合によって互いに共有結合していない２つのテンプレートを、連続した順序で用いた、逆転写酵素などの酵素による相補鎖のテンプレート依存性合成のプロセスを指す。
【００８９】
テンプレート・スイッチングのプロセスは、Ｃｈｅｎｃｈｉｋら（１９９８）、Ｃｌａｒｋ（１９８８）およびＨｕ  ＆  Ｔｅｍｉｎ（１９９０）、ＵＳ  ５，９６２，２７１およびＵＳ  ５，９６２，２７２に記載される。
【００９０】
本発明において、テンプレート・スイッチングは、逆転写酵素の２つの固有の特性、すなわち第一鎖ｃＤＮＡの３’端に非テンプレート・ヌクレオチドを付加する能力、およびテンプレートをスイッチングする能力を利用することによって、達成される。
【００９１】
好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの３’端に付加される相補残基と塩基対を形成する、１より多い残基を、その３’端に含む。より好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの３’端に付加される相補残基と塩基対を形成する、少なくとも２つの残基を、その３’端に含む。最も好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの３’端に付加される相補残基と塩基対を形成する、少なくとも３つの残基を、その３’端に含む。
【００９２】
好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの３’端の少なくとも１つの残基は、デオキシグアニジン・ヌクレオチドを含む。より好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの３’端の少なくとも２つの残基は、デオキシグアニジン・ヌクレオチドを含む。より好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの３’端の少なくとも３つの残基は、デオキシグアニジン・ヌクレオチドを含む。最も好ましくは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの３’端の３つの残基は、デオキシグアニジン・ヌクレオチドを含む。
【００９３】
逆転写酵素は、ｍＲＮＡの５’端まで複製し、次いで、テンプレートを切り替えて、そしてテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの末端まで複製する。生じた第一鎖ｃＤＮＡ合成物は、ｍＲＮＡの完全５’端とともに、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含有する。
【００９４】
ｃＤＮＡ両端の実質的に同一のテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドおよび増幅配列は、ｃＤＮＡ集団の末端から末端のｃＤＮＡ増幅の普遍的プライミング部位として働く。
【００９５】
当業者は、増幅プライマーと同一であるかまたは実質的に同一である限り、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに、いかなる配列を用いることも可能であることを認識するであろう。したがって、本発明の好ましい態様において、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドは、増幅配列と実質的に同じ配列を有する。
【００９６】
第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端は、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的であるかまたは実質的に相補的であるように、伸長される。好適には、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズ可能な増幅プライマーを用いる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、ハイブリダイズしたかまたは実質的にハイブリダイズした増幅プライマーの３’末端から伸長することが可能であり、それによって第二鎖ｃＤＮＡ合成物が生じる。
【００９７】
ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
本発明において、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮＡおよび第一鎖ｃＤＮＡ合成物間で形成されるハイブリッドを指し、ここでｃＤＮＡは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物がＲＮＡに相補的であるかまたは実質的に相補的であるように伸長されている。
【００９８】
典型的には、第一鎖ｃＤＮＡの３’端の少なくとも１つのテンプレート・ヌクレオチドは、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００９９】
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも１つの非テンプレート・ヌクレオチドはデオキシシチジンである。より好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも２つの非テンプレート・ヌクレオチドは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。より好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドは、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【０１００】
好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも１つの非テンプレート・ヌクレオチドはデオキシシチジン・ヌクレオチドである。より好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも２つの非テンプレート・ヌクレオチドはデオキシシチジン・ヌクレオチドである。最も好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端の少なくとも３つの非テンプレート・ヌクレオチドはデオキシシチジン・ヌクレオチドである。
【０１０１】
好ましくは、ハイブリッドはｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドである。
典型的には、第一鎖ｃＤＮＡ合成物は、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡのＲＮＡをテンプレートとして用いる逆転写酵素によって、触媒される。
【０１０２】
ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体
ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体は、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチド間に形成される複合体を指し、該複合体中、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡアニーリング領域が、相補的なまたは実質的に相補的なＲＮＡにハイブリダイズしているかまたは実質的にハイブリダイズしている。
【０１０３】
ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがＲＮＡテンプレート依存性に伸長することによって、第一鎖ｃＤＮＡ合成物がＲＮＡに相補的であるかまたは実質的に相補的であるようなｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの伸長が生じ、こうしてｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドが形成される。
好ましくは、複合体はｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体である。
【０１０４】
試料
本発明において、試料は、ＲＮＡを含むいかなる実体であることも可能である。
目的のＲＮＡを含有するか、または含有すると推測されるならば、精製型または非精製型のいかなるＲＮＡも、本発明の方法で利用可能である。望ましいＲＮＡは、複合体混合物のより少ない部分であることも、またはより多い部分であることも可能である。したがって、本発明は、１つの特定の核酸配列を多量に産生するだけでなく、１以上の異なる特定の核酸配列を同時に増幅するのにも有用である。
【０１０５】
クローニングされたＲＮＡまたは総ＲＮＡなどのＲＮＡを、いかなる原核生物供給源または真核生物供給源、例えば細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、および植物または動物などのより高次の生物から得ることも可能である。Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記に記載されるものなどの多様な技術によって、ＲＮＡを血液、組織材料または細胞から抽出することも可能である。
【０１０６】
したがって、試料は、生物学的材料であることも可能であるし、または生物学的材料に由来することも可能である。
試料は、生検、顕微解剖組織またはレーザー捕捉細胞などの臨床試料であることも可能である。好ましくは、試料は、少量の試料、例えば少量の生検、微細針吸引物、巨視的解剖組織、フロー選別細胞、レーザー捕捉顕微解剖細胞または少数の細胞、例えば単一の細胞である。
【０１０７】
好適に、本発明は、再現性があり、そして頑強な、少量の総ＲＮＡの増幅法を提供する。好ましくは、本発明は、５〜５０ｎｇの総ＲＮＡを増幅可能であり、より好ましくは、本発明は、５〜２５ｎｇの総ＲＮＡを増幅可能であり、最も好ましくは、本発明は、５ｎｇ以下の総ＲＮＡを増幅可能であり、より少量のＲＮＡを用いるさらなる見通しがありうる。
【０１０８】
５〜５０ｎｇの総ＲＮＡは、５００〜５０００細胞とほぼ等量に相当する。
総細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、またはポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用可能である。総ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法は周知であり、そして一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），  Ｖｏｌ．１−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）およびＡｕｓｕｂｅｌら監修（１９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ニューヨーク）に記載される。
【０１０９】
好ましくは、総ＲＮＡは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９８７）、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），またはＦａｒｒｅｌｌ  Ｊｒ．（１９９３）に記載される技術によって調製され、そしていくつかの高品質な商業的キットもまた入手可能である。より好ましくは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９８７）のグアニジニウム・チオシアネート法を用いて、用いる総ＲＮＡを調製する。
【０１１０】
当該技術分野に知られる多様な方法を用いて、総ＲＮＡの完全性を確認することも可能である。例えば、ＲＮＡゲル電気泳動（例えばホルムアルデヒド／アガロースゲル）、またはＡｇｉｌｅｎｔ  ＬａｂＣｈｉｐを用いて、ＲＮＡを解析することも可能である。哺乳動物総ＲＮＡでは、およそ４．５ｋｂおよび１．９ｋｂの２つのバンドが可視であるはずであり；これらのバンドはそれぞれ、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡに相当し、そしてこれらのバンドの強度比は、典型的には１．５〜２．５：１でなければならない。
【０１１１】
マイクロスケールのＲＮＡ調製のためのＲＮＡ精製キットが、いくつかの商業的供給源から入手可能である（例えばＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡＴＭ  Ｎａｎｏｐｒｅｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＰｉｃｏＰｕｒｅＴＭ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ；ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ；ＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭ  Ｍｉｃｒｏｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）。
【０１１２】
一般的に、ＲＮＡ試料を液体窒素中で直ちに迅速凍結し、そして次いで、ＲＮＡ抽出まで、−８０℃で保存する。
典型的には、ＡｍｂｉｏｎのＤＮＡ−ｆｒｅｅＴＭキットなど、多様な製造者から得られうる、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩで、総ＲＮＡを処理する。
【０１１３】
ｃＤＮＡ合成
本発明にしたがって、別個の試験管中で、第一鎖および第二鎖ｃＤＮＡ合成を行うことも可能である。好適には、第一鎖および第二鎖合成は、同一の試験管中で行われ、この場合、合成法が増進され、ｃＤＮＡ回収が最大になり、そして方法を実行するのがより単純でそして迅速になる。
【０１１４】
第一鎖ｃＤＮＡ合成用のｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを、適切な緩衝液中、約６０℃〜９０℃の間の温度で、好ましくは約７０℃で、約５分間、ＲＮＡにハイブリダイズさせ、次いで、約４℃に冷却した後、逆転写酵素を添加する。
【０１１５】
ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドがＲＮＡにハイブリダイズした後、第一鎖ｃＤＮＡを合成する。この第一鎖ｃＤＮＡは、好ましくは、逆転写プロセスで産生され、このプロセスでは、当業者によく知られる方法にしたがって、逆転写酵素を利用して、ＤＮＡをＲＮＡから作成する。
【０１１６】
好適には、逆転写酵素が、伸長後に３’末端にデオキシリボヌクレオチドを付加し（Ｖａｒｍｕｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４２７−１４３５（１９８８））、そしてＲＮアーゼＨ活性を欠く限り、本発明において、いかなる逆転写酵素を用いることも可能である。
【０１１７】
好ましくは、逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性を欠くが、より長いｃＤＮＡが合成可能であるように、野生型ポリメラーゼ活性を保持する。より好ましくは、逆転写酵素は、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはその突然変異体である。最も好ましくは、逆転写酵素は、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。
【０１１８】
使用する逆転写酵素の量は、当業者に認識されるであろうように、多様であることも可能である。逆転写は、例えば、逆転写酵素と適切な温度でおよそ１時間インキュベーションすることによって行われ、該温度は、逆転写酵素が酵素活性を保持する温度範囲でなければならない。
【０１１９】
反応を、約３７℃〜５５℃の間で、好ましくは３７℃〜４２℃の間で行うことも可能である。
最も好ましくは、約４２℃のように、最適酵素活性で、反応を行う。
【０１２０】
反応混合物を９５℃に約５分間加熱して酵素を不活性化し、場合によって氷上で冷却することによって、逆転写反応を終結させることも可能である。
例えば７０℃に２分間加熱することによって、ＲＮＡがｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドにアニーリングする、方法の最初の工程において、１ｍＭ  ｄＮＴＰなどのｄＮＴＰを含むことによって、第一鎖ｃＤＮＡ合成工程を修飾することも可能である。このようにｄＮＴＰを含むことによって、別の適用、すなわちＲＴ−ＰＣＲ反応における効率が増加することが先に示されている（Ｈｕａｎｇら（２０００））。好適には、この修飾は、確定した少量の出発総ＲＮＡからのｃＲＮＡの収量を増加させることも可能である。この観察の機構は知られていないが、特定の理論いずれかに束縛されることは望ましくないものの、ＲＮＡ−プライマー・ハイブリダイゼーションの安定化による可能性もあり、そして／またはテンプレート・スイッチング機構の安定化を補助する可能性もある。
【０１２１】
好適には、この修飾は、限られた出発材料を用いた場合の、増幅（例えばＰＣＲ）周期数を減少させることを可能にし、そしてしたがって、ｍＲＮＡ配分のいかなるゆがみも最小限にするのを補助しうる。
【０１２２】
典型的には、１周期の逆転写を行う。１より多い周期の逆転写を行うことも可能である（周期間に変性を行う）。
【０１２３】
増幅
「増幅」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、核酸鎖を増加させる方法を指す。
非常に好ましい態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ鎖を増加させるため、本発明の増幅法を用いる。
典型的な技術は、核酸分子を指数関数的に増幅する、ＰＣＲである。
【０１２４】
ＰＣＲは、ＵＳ  ４，６８３，１９５およびＵＳ  ４，６８３，２０２に記載される。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼが生成するプライマー伸長反応の反復される周期からなる。ターゲットＤＮＡを熱変性し、そして増幅しようとするＤＮＡの相対する鎖上のターゲット配列をはさむ（ｂｒａｃｋｅｔ）、２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼとともに使用される、プライマーとなる。プライマー伸長によってＤＮＡをコピーし、両方の鎖の第二のコピーを作成する。熱変性、プライマー・ハイブリダイゼーションおよび伸長の周期を反復することによって、約２〜４時間で、ターゲットＤＮＡを百万倍以上に増幅することも可能である。ＰＣＲは、分子生物学ツールであり、検出技術と組み合わせて用いて、増幅結果を決定する必要がある。ＰＣＲの利点は、およそ４時間で、ターゲットＤＮＡ量を百万〜十億倍に増幅することによって、感度を増大させることである。
【０１２５】
以下のように、本発明の方法においてＰＣＲを用いることも可能である。ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの増幅配列と実質的に同じ配列を含む単一のＰＣＲプライマーに加えて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを反応に添加する。
【０１２６】
好ましい態様において、用いるポリメラーゼは、長距離ＰＣＲ（Ｂａｒｎｅｓ、１９９４）によるｃＤＮＡテンプレートの効率的でそして正確な増幅を可能にする、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックスは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ欠損Ｎ末端欠失体であるＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および少量の校正ポリメラーゼを含有する。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックスはまた、ＴａｑＳｔａｒｔＴＭ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）も含有して、自動化ホット・スタートＰＣＲ（Ｋｅｌｌｏｇｇら、１９９４）を提供し、そしてテンプレートの非特異的プライミングを減少させる。この組み合わせは、慣用的なＰＣＲのものより有意に低いエラー率で、全長ｃＤＮＡの効率的な増幅を可能にする（Ｂａｒｎｅｓ、１９９４）。
【０１２７】
単一ＰＣＲプライマーは、第一鎖ｃＤＮＡ合成物の３’端に実質的にハイブリダイズし（変性後）、これはテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの相補配列に相当する。ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲプライマーの３’端から伸長し、相補ｃＤＮＡ第二鎖合成を生じる。続くＰＣＲ周期において、単一ＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の第一鎖（および第一鎖の増幅されたコピーすべて）の３’端に、そしてｃＤＮＡ分子の第二鎖（および第二鎖の増幅されたコピーすべて）の３’端にハイブリダイズ可能であり、増幅を生じる。
【０１２８】
プライマーは、好ましくは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。プライマーは、複製酵素の存在下で、伸長産物を合成するテンプレートとして作用するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さ、および用いる量は、温度、相同性の度合いおよび他の条件を含む、多くの要因に応じるであろう。
【０１２９】
例えば、特定の配列を増幅する場合、オリゴヌクレオチド・プライマーは、典型的には、約１０〜５０ヌクレオチドの間、好ましくは１５〜２５以上のヌクレオチドを含有するが、場合によってはより少ないヌクレオチドを含有することも可能である。他の適用のため、オリゴヌクレオチド・プライマーは、必ずしもそうではないが、典型的にはより短く、例えば７〜１５ヌクレオチドである。こうした短いプライマー分子は、一般的に、十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに、より低い温度を必要とする。
【０１３０】
本発明の好ましい態様において、ＰＣＲプライマーおよびｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドを、反応中、同じ濃度で提供する。
別の好ましい態様において、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲプライマーは、例えば約０．５μＭの濃度を有する。
【０１３１】
適切な方法いずれかを用いて、例えば周知のホスホトリエステル法およびホスホジエステル法、またはその自動化態様などの、適切な方法いずれかを用いて、オリゴヌクレオチド・プライマーを調製することも可能である。修飾固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法が、ＵＳ  ４，４５８，０６６に記載される。生物学的供給源（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単離されたプライマーを用いることもまた可能である。
【０１３２】
好ましい態様において、ＰＣＲプライマーは、配列番号３に示す配列を含む。
当該技術分野に周知の方法を用いて、ＰＣＲ増幅を行う。例としてのみであるが、ＰＣＲ反応の熱周期パラメータは、ホット・スタートの９５℃６０秒間、次いで、９５℃１５秒間の変性、６５℃３０秒間のアニーリング、および６８℃６分間の伸長のあらかじめ決定した周期数の３工程サイクリングを含むことも可能である。次いで、精製まで、サーマルサイクラー中で、反応物を４℃で保持することも可能である。
【０１３３】
好適には、既定量の出発材料から必要な、最適な増幅周期数を決定するための改善法を利用することも可能である。ＰＣＲなどのいかなる増幅法に関しても、重要な要因の１つは、意図される下流適用に十分なターゲットを生じるであろう、最小の周期数（既定量の出発材料に関して）を実行することである。実行する周期数があまりに多いと、複合体混合物中の各ＲＮＡテンプレートに関して増幅反応が同一である可能性は低く、そしてまた増幅反応がプラトーに達する可能性もあるため、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの提示が偏向する可能性もある。実行する周期数があまりに少ないと、続く適用に十分な増幅産物を得ることが不能である。
【０１３４】
本明細書に記載する方法において、既定量の出発総ＲＮＡ（例えば５０ｎｇまたは５ｎｇ）に関し、全増幅産物を次にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応に用いてｃＲＮＡを生成した場合、意図される下流適用に十分なｃＲＮＡが得られるような、必要とされる最小の増幅周期数を決定する。これは、同一の反応を設定し、そして設定される周期数で増幅反応を行うことによって（または解析のため、増幅反応からアリコットを取り除き、そして増幅反応の残りに対して、さらなる周期を実行することによって）、既定量の総ＲＮＡ（例えば５ｎｇまたは５０ｎｇ）を用いて出発することにより、実行可能である。各反応（例えば９、１０、１１、１２、１３または１４周期のＰＣＲ熱周期を経た５０ｎｇ出発総ＲＮＡ）由来の全増幅産物を精製し、そしてＩＶＴに用いる。次いで、下流適用に十分なｃＲＮＡの最小量を生じる周期数を決定する。次いで、同じ出発濃度で他のＲＮＡを用いた類似の研究に、この周期数を日常的に用いることも可能である。
【０１３５】
好適には、ＲＮＡを７０℃で２分間加熱する、方法中の最初の工程において、ｄＮＴＰを添加することによって、増幅工程を増進することもまた可能である。
好ましい態様において、逆転写の前、試料を変性する際に、約１ｍＭのｄＮＴＰをＲＮＡ／プライマー・ミックスに添加する。
【０１３６】
これは、限られた量の出発材料で、より少ない増幅しか必要としないことを意味し、そしてしたがって、ｍＲＮＡ配分のいかなるゆがみも最小限にするのを補助する。
典型的には、得られる増幅産物は精製されるであろう。当該技術分野に知られる多様な方法を用いて、これを達成することも可能である。例えば、製造者の指示のとおりに、ＱＩＡＧＥＮ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムを用いて、ＰＣＲ産物を精製することも可能である。
【０１３７】
実質的に
用語「実質的に」は、アニーリングまたはハイブリダイゼーションに関して用いた場合、プライマーなどのオリゴヌクレオチドが、それぞれの核酸に、ハイブリダイズするかまたはアニーリングするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。
【０１３８】
オリゴヌクレオチド配列は、それぞれの核酸の正確な配列を反映している必要はなく、そして実際、「縮重」していることも可能である。オリゴヌクレオチド配列が、配列と十分な相補性を有し、ハイブリダイゼーションを可能にする限り、非相補塩基または他の配列がオリゴヌクレオチドまたは核酸中に散在することも可能である。したがって、例えば、増幅しようとする特定の配列に「実質的に」相補的であるように、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーを選択することも可能である。
【０１３９】
ハイブリダイゼーション
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、塩基対形成を通じて、核酸鎖が相補鎖と連結するプロセスとともに、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で行われるような増幅プロセスを指す。
本発明は、ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の使用を含む。
【０１４０】
転写
上述のＰＣＲ反応工程は、二本鎖ＤＮＡ配列に作動可能であるように連結された二本鎖Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを生じる。
【０１４１】
二本鎖Ｔ７プロモーターを利用することによって、作動可能であるようにプロモーターに連結されたＤＮＡ配列をＲＮＡに転写することも可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための多様な方法が当該技術分野に周知であり、そして多くの商業的キットが容易に入手可能である。
【０１４２】
例としてのみであるが、ＥＮＺＯ（登録商標）ＢｉｏＡｒｒａｙＴＭ  ＨｉｇｈＹｉｅｌｄＴＭ  ＲＮＡ転写物標識キット、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（９００１８２）を使用可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に必要な試薬をＰＣＲ反応物と合わせ、そして適切な時間および温度で、例えば３７℃で５時間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行う。インキュベーション時間は、どのくらい多くの転写物を生成することが望ましいかに応じて多様でありうる。
【０１４３】
ＲＮＡの最終的な使用に応じて、必要なリボヌクレオチド三リン酸が転写反応混合物に含まれるであろう。例えば放射標識、ビオチン等で、１以上のリボヌクレオチドを標識することも可能である。非常に多様な標識技術が当業者に周知であり、そして例えばＵＳ  ４，７５５，６１９に記載されるような標準法にしたがって使用可能である。
【０１４４】
ＲＮＡ転写物が得られたら、そのプロセシングに、多様な周知の方法を使用することも可能である。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（ＱＩＡＧＥＮ）など、当該技術分野に知られる多様な方法を、製造者の指示のとおりに用いて、転写物を反応混合物から取り除き、そして精製することも可能である。ａＲＮＡをｃＤＮＡ合成のテンプレートとして用いて、そして所望の配列をさらに増大させるためにＰＣＲに供することも可能である。さらなるクローニング、発現、プローブまたはサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションのドライバー核酸等としての使用のため、ａＲＮＡを未修飾で用いることも可能である。
【０１４５】
増幅されたＲＮＡ
本明細書において、用語、増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）は、用語、相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）と交換可能に用いられる。
【０１４６】
ａＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼを用いた二本鎖ｃＤＮＡテンプレートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写から得られる、増幅されたアンチセンスＲＮＡを指す。
【０１４７】
標識
本発明にしたがって、増幅されたＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中に標識されて、続く工程における検出／使用を容易にすることも可能である。
【０１４８】
限定されるわけではないが、放射標識、フルオロフォア、化学発光分子、または特定の化学反応を行うと検出可能なシグナルを生じるものなどの酵素マーカー等を含む、当該技術分野に知られるいかなる標識で、増幅されるＲＮＡを直接標識することも可能である。
【０１４９】
あるいは、例えばビオチン化ＣＴＰおよびＵＴＰで標識されたリボヌクレオチドを得ることも可能であり、この場合、増幅されるＲＮＡにこれらのリボヌクレオチドが取り込まれるであろう。次いで、検出を提供可能な適切な標識で標識されたアビジンに結合させるため、ビオチンを用いることも可能である。シアニン３およびシアニン５ＣＴＰおよびＵＴＰ、またはアミノアリルＵＴＰなどの他の修飾リボヌクレオチドが、増幅されるＲＮＡに容易に取り込まれることも可能である。当業者には、非常に多様な標識技術が周知である。
【０１５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応混合物において、１以上の標識ＮＴＰを含むことによって、ＲＮＡの標識を達成することも可能である。放射性同位体、例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈで、ＮＴＰを直接標識することも可能である。蛍光標識、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびローダミン１１０で、ＮＴＰを直接標識することも可能である。
【０１５１】
ハプテンに、または標識されたアビジン分子が結合可能なビオチンなどの分子に、または標識された抗ジゴキシゲニン抗体が結合可能なジゴキシゲニンに共有結合したヌクレオチドを取り込むことによって、ＲＮＡを間接的に標識することもまた可能である。化学合成中に、ＲＮＡを標識部分で標識することも可能であるし、または当該技術分野に知られる方法によって、合成後に標識を付着させることも可能である。
【０１５２】
しばしば、おそらく異なる組織由来の、またはおそらく異なる刺激に曝露された、２つの異なる細胞集団における遺伝子発現を比較することが望ましい。２つのフルオロフォアが別個の発光スペクトルを有する場合、一方の集団由来のＲＮＡを第一のフルオロフォアで標識し、そしてもう一方の集団由来のＲＮＡを第二のフルオロフォアで標識することによって、こうした比較が容易になる。ここでも、Ｃｙ３およびＣｙ５は、２つの異なる細胞集団間の遺伝子発現を比較する際に使用するのに、特に好ましいフルオロフォアである。
【０１５３】
ヌクレオチド配列
本明細書において、用語「ヌクレオチド配列」は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
【０１５４】
本発明の側面は、データベース中で入手可能なヌクレオチド配列の使用を伴う。
ヌクレオチド配列は、ゲノム起源または合成起源または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであることも可能である。ヌクレオチド配列は、二本鎖または一本鎖であることも可能であり、センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはその組み合わせに相当することも可能である。
【０１５５】
組換えＤＮＡ技術の使用によって、ヌクレオチド配列を調製することも可能である（例えば組換えＤＮＡ）。
ヌクレオチド配列は、天然存在型と同じであることも可能であるし、また天然存在型に由来することも可能である。
【０１５６】
変異体／相同体／誘導体
本発明において、核酸およびアミノ酸配列に対する言及には、その突然変異体、変異体、相同体、誘導体または断片が含まれる。さらに、特定のポリペプチドに対する言及には、天然存在ポリペプチドの活性を有する、その突然変異体、変異体、相同体、誘導体または断片が含まれ、そしてアミノ酸欠失、置換、および付加を有することによって、天然存在型と異なるポリペプチドが含まれる。
【０１５７】
したがって、本発明は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異体、相同体および誘導体の使用を含む。ここで、用語「相同体」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」と同等であることも可能である。
【０１５８】
本発明において、相同配列は、対象配列に少なくとも７５％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一であることも可能なアミノ酸配列を含むと解釈される。相同性はまた、類似性（すなわち類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点で考慮することも可能であるが、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１５９】
相同配列は、対象配列に少なくとも７５％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一であることも可能なヌクレオチド配列を含むと解釈される。
【０１６０】
相同性比較を目で行うことも可能であり、またはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの補助によって行うことも可能である。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２以上の配列間の相同性％を計算することも可能である。
【０１６１】
相同性％を隣接配列に渡って計算することも可能であり、すなわち一方の配列を他方の配列と並列させ、そして一方の配列中の各アミノ酸を、一残基ずつ、他方の配列中の対応するアミノ酸と直接比較する。これは、「非ギャップ」並列と呼ばれる。典型的には、比較的少数の残基に渡ってのみ、こうした非ギャップ並列を行う。
【０１６２】
非常に単純でそして一貫した方法であるが、これは、例えば１つの挿入または欠失以外は同一である配列対において、こうした挿入または欠失が、続くアミノ酸残基を並列から追い出し、したがって全体的な並列を行った際に相同性％の大きな減少を生じる可能性もあることを考慮に入れていない。したがって、大部分の配列比較法は、全体の相同性スコアに過度にペナルティを科すことなく、可能な挿入および欠失を考慮に入れて、最適並列を生じるように設計されている。これは、配列並列中に「ギャップ」を挿入して、局所相同性を最大にすることを試みることによって達成される。
【０１６３】
しかし、より複雑な方法は、同数の同一アミノ酸に関して、２つの比較配列間の関連性がより高いことを反映する、可能な限り少ないギャップしか持たない配列並列が、多くのギャップを持つものより高いスコアを獲得するであろうように、並列中で生じる各ギャップに「ギャップ・ペナルティ」を割り当てる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを科し、そしてギャップ中の続く残基各々にはより小さいペナルティを科す、「アフィン・ギャップ・コスト」が用いられる。これが最も一般的に用いられるギャップ・スコアリング系である。ギャップ・ペナルティが高ければ、もちろん、より少ないギャップを持つ最適化された並列が生じるであろう。大部分の並列プログラムは、ギャップ・ペナルティが修飾されることを可能にする。しかし、配列比較用のソフトウェアを用いた場合は、デフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いた際は、アミノ酸配列のデフォルト・ギャップ・ペナルティは、ギャップに関しては−１２、そして各延長に関しては−４である。
【０１６４】
したがって、最大相同性％の計算は、ギャップ・ペナルティを考慮に入れた、最適並列の産生をまず必要とする。こうした並列を行うのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学、米国；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，  １９８４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を実行可能な他のソフトウェアの例には、限定されるわけではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、同書、第１８章を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４０３−４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が含まれる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはどちらも、オフライン検索およびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、同書、７−５８ページ〜７−６０ページを参照されたい）。しかし、いくつかの適用に関しては、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称される新規ツールもまた、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７−８を参照されたい）。
【０１６５】
最後の相同性％を同一性に関して測定することも可能であるが、並列プロセス自体は、典型的には、全か無かの対比較には基づかない。その代わり、一般的に、段階的な類似性スコアマトリックスを用いて、化学的類似性または進化的距離に基づいて、各対比較にスコアを割り当てる。一般的に用いられるこうしたマトリックスの例は、プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルト・マトリックスである、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公的なデフォルト値、または供給される場合、カスタム・シンボル比較表いずれかを用いる（さらなる詳細に関してはユーザー・マニュアルを参照されたい）。いくつかの適用に関しては、ＧＣＧパッケージでは公的なデフォルト値を用いることが好ましく、または他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト・マトリックスを用いることが好ましい。
【０１６６】
ソフトウェアが最適な並列を生じたら、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、そして数値結果を生じる。
【０１６７】
配列はまた、サイレント変化を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し、そして機能的に同等な物質を生じることもまた可能である。物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことも可能である。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ；そして類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を持つアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【０１６８】
例えば以下の表にしたがって、保存的置換を作成することも可能である。第二列の同じブロック中のアミノ酸、そして好ましくは第三列の同じ行のものを互いに置換することも可能である。
【０１６９】
【表１】
2007502610.tif 000003
【０１７０】
相同置換（置換および交換は、本明細書においてどちらも、存在するアミノ酸残基を別の残基と入れ替えることを意味する）を行うことも可能であり、すなわち、塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性などの、同様のものに対する同様のものの置換を行うことも可能である。非相同置換、すなわち１つの種類の残基から別の種類の残基、あるいはオルニチン（本明細書においてこれ以降Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書においてこれ以降Ｂと称する）、ノルロイシン・オルニチン（本明細書においてこれ以降Ｏと称する）、ピリジルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴うものもまた行うことも可能である。
【０１７１】
置換はまた、非天然アミノ酸によって行うことも可能であり、これらには；アルファ＊およびアルファ二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＊、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＊、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が含まれる。記号＊は、上に論じる目的のため（相同置換または非相同置換に関する）、誘導体が疎水性であることを示すように利用され、一方、＃は、誘導体が親水性であることを示すように利用され、＃＊は、両親媒性を示すように利用されている。
【０１７２】
変異体アミノ酸配列には、配列の２つのアミノ酸残基いずれの間に挿入することも可能な、適切なスペーサー基が含まれることも可能であり、これらには、グリシンまたはβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基またはプロピル基などのアルキル基が含まれる。
【０１７３】
使用
本発明にしたがって産生される、増幅されたＲＮＡは、非常に多様な下流適用の有用な中間体に相当することが認識されるであろう。
【０１７４】
ｃＤＮＡライブラリー
増幅されたＲＮＡは、非常に限られた量の組織から、複雑なｃＤＮＡライブラリーを構築するのを容易にしうる。
【０１７５】
当該技術分野に周知の多様な方法を用いて、増幅されたＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに容易に変換することも可能である。
場合によって、生成された二本鎖ｃＤＮＡをベクターに挿入することも可能である。これによって、ｃＤＮＡライブラリーを含む組換えＤＮＡ分子を、真核宿主および原核宿主などの宿主細胞に導入することが可能になる。
【０１７６】
リボヌクレオチド・プローブ
あらかじめｃＤＮＡをリボプローブ・ベクターにクローニングすることなく、増幅されたＲＮＡを、特定のリボヌクレオチド・プローブの産生に使用することもまた可能である。
【０１７７】
サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション
さらに、増幅されたＲＮＡは、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションのドライバーとして使用するための、多量の一本鎖アンチセンス材料の供給源を提供する。例えば、１つのセンスおよび１つのアンチセンスの、２つの核酸集団を、モル過剰で存在する１つの集団（ドライバー）と混合するのを可能にすることも可能である。両方の集団に存在する配列はハイブリッドを形成し、一方、１つの集団にのみ存在する配列は、一本鎖のままである。その後、多様な周知の技術を用いて、示差発現された配列に相当する、ハイブリダイズしていない分子を分離する。したがって、増幅されたＲＮＡを適用して、異なる組織間または生理学的状態に応じた同一組織内のｍＲＮＡ発現を比較する際のように、異なる集団間で存在量が多様である核酸配列を検出し、そして単離する方法を改善することもまた、可能である。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション技術の例には、抑制サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション技術（ＵＳ  ５，５６５，３４０）、提示相違解析（ＵＳ  ５，４３６，１４２）；およびリンカー捕捉サブトラクション（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）２３７：１０９−１１４）が含まれる。
【０１７８】
アンチセンスＲＮＡ
アンチセンスＲＮＡは、解析研究および療法剤両方において、非常に多様な使用を有する。アンチセンスＲＮＡは、いくつかの原核生物系で機能して、遺伝子発現を制御する。同様に、アンチセンスＲＮＡは、多くの真核生物遺伝子の発現を制御可能である。これによって、望ましくない遺伝子の発現を遮断することが可能になる。したがって、アンチセンスＲＮＡの療法使用は、アンチセンスＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成とそれに続く被験者への導入を伴う（一般的には、Ｍｅｌｔｏｎ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）を参照されたい）。
【０１７９】
アレイ
かなりの量のＲＮＡがターゲット調製に必要であるため、アレイ技術の適用は、しばしば、限定される。したがって、本発明は、マイクロアレイ解析、特にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイなど、アレイ用のターゲットの生成に特に適している。
【０１８０】
アレイ技術、並びにそれに関連する多様な技術および適用が、一般に、多くの教科書および文献に記載されている。これらには、Ｌｅｍｉｅｕｘら，  （１９９８），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ４，  ２７７−２８９，  ＳｃｈｅｎａおよびＤａｖｉｓ．  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｉｐｓ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ中（Ｍ．  Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ｇｅｌｆａｎｄ，  Ｊ．  Ｓｎｉｎｓｋｙ監修），  ＳｃｈｅｎａおよびＤａｖｉｓ，  （１９９９），  Ｇｅｎｅｓ，  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｐｓ．  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ中（Ｍ．  Ｓｃｈｅｎａ監修），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  英国オックスフォード，  １９９９），  Ｔｈｅ  Ｃｈｉｐｐｉｎｇ  Ｆｏｒｅｃａｓｔ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｓｓｕｅ；Ｊａｎｕａｒｙ  １９９９  補遺），  Ｍａｒｋ  Ｓｃｈｅｎａ（監修），  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ），  Ｃｏｒｔｅｓ，  ２０００，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １４［１７］：２５，  ＧｗｙｎｎｅおよびＰａｇｅ，  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９９  Ａｕｇｕｓｔ  ６；並びにＥａｋｉｎｓおよびＣｈｕ，  １９９９，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １７，  ２１７−２１８が含まれる。
【０１８１】
検出
さらなる側面において、本発明の方法を用いて、増幅されたＲＮＡ中の増幅された配列を検出することによって、試料中の１以上の配列を同定することも可能である。
【０１８２】
示差増幅
さらなる側面において、本発明を示差発現された遺伝子の検出に用いることも可能である。したがって、本発明は、他の配列に比較して、既定の配列の相対的なレベルを決定するのに有用である。
【０１８３】
こうした方法は、例えば、分子診断であって、配列の存在または非存在に基づかず、既定の配列の相対的なレベルに基づく前記診断において、特に有用でありうる。
【０１８４】
キット
本発明の方法で使用する材料は、理想的にはキットの調製に適している。
こうしたキットは、各々、方法で利用する１以上の多様な試薬（典型的には濃縮型）を含む容器を含むことも可能であり、こうした試薬には、例えば、緩衝剤、適切なヌクレオチド三リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および１以上の本発明のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１８５】
容器中のオリゴヌクレオチドは、例えば凍結乾燥型または溶液（例えば蒸留水または緩衝溶液）中など、いかなる型であることも可能である。同じ増幅反応で使用する準備ができているオリゴヌクレオチドを単一の容器中で合わせることも可能であるし、または別個の容器中に入れることも可能である。キットは場合によって、別個の容器中に、該ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼ、および／またはＰＣＲ用の緩衝剤、および／またはＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。
【０１８６】
キットは場合によって、対照核酸をさらに含む。
典型的には、取扱説明書一式もまた含む。
【０１８７】
一般的な組換えＤＮＡ方法論技術
本発明は、別に示さない限り、一般の当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用技術を使用する。こうした技術は文献に説明されている。例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｂｏｏｋｓ  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的な補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第９章，  １３章および１６章，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク）；Ｂ．  Ｒｏｅ，  Ｊ．  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，  およびＡ．  Ｋａｈｎ，  １９９６，  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ（監修），  １９８４，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；並びにＤ．Ｍ．Ｊ．  ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．  Ｄａｈｌｂｅｒｇ，  １９９２，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的な教科書は各々、本明細書に援用される。
【０１８８】
ここで、本発明を実施例によってさらに記載するが、実施例は、当業者が本発明を実行するのを補助する役目をすることを意味し、そしていかなる意味でも本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【０１８９】
[実施例１]
材料および方法
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴＴＭ技術は、テンプレート・スイッチング機構を介して、５’端および３’端にプライミング部位を取り込むことによって、第一鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅を可能にする。ｃＤＮＡ合成をプライミングするのに、プライマー（配列番号１）：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg(T)30VN-3’
９４量体を用いる。５’端の大文字の領域は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット中に提供される５’ＰＣＲプライマーＩＩ  Ａと同一であり、そしてこの配列は、続くＰＣＲ増幅のため、ｃＤＮＡ上に３’アンカーを生成する。小文字の領域は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｃＤＮＡ合成プライマーで現在用いられているＴ７プロモーター配列と同一である。Ｔ７プロモーター配列を付加して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による標識ｃＲＮＡターゲットの生成を可能にする。（Ｔ）３０領域はメッセンジャーＲＮＡのポリＡテールに結合し、そして３’末端ＶＮクランプ（ＶはＡ、Ｇ、またはＣであり、そしてＮは塩基いずれかである）は、ｍＲＮＡのプライミングを確実にするのを補助する。使用前に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、このオリゴヌクレオチドを精製した。
【０１９０】
「ＳＭＡＲＴＴＭ  ＩＩ  Ａ」オリゴヌクレオチド（１０μＭ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（配列番号２）：
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'
および「５’ＰＣＲプライマーＩＩ  Ａ」（１０μＭ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（配列番号３）：
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キットのものと同一の配列である。
０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲ試験管中ですべての反応を行う。
【０１９１】
ＲＮＡ
ＲＮＡを取り扱う通常の警戒策をすべて行い、グアニジニウム・チオシアネート法［Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、（１９９７）］を用いて、これらの研究で用いるＲＮＡを調製した。細胞質ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡもまた、この技術において使用可能である。ＲＮＡゲル電気泳動（例えばホルムアルデヒド／アガロースゲル）またはＡｇｉｌｅｎｔ  ＬａｂＣｈｉｐ上で試料を解析することによって、総ＲＮＡの完全性を確認しなければならない。哺乳動物総ＲＮＡでは、およそ４．５ｋｂおよび１．９ｋｂの２つのバンドが可視であるはずであり；これらのバンドはそれぞれ、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡに相当し、そしてこれらのバンドの強度比は、１．５〜２．５：１でなければならない。マイクロスケールのＲＮＡ調製のためのＲＮＡ精製キットが、いくつかの商業的供給源から入手可能である（例えばＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡＴＭ  Ｎａｎｏｐｒｅｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＰｉｃｏＰｕｒｅＴＭ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ；ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ；ＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭ  Ｍｉｃｒｏｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）。
【０１９２】
本明細書に報告される研究のため、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、並びにキュリー研究所、パリ、およびアンリ・モンドール病院、パリ・クレテイユ間の社外協力から得た、２つのヒト膀胱腫瘍生検から総ＲＮＡを単離した。これらの膀胱移行細胞癌腫生検は、Ｔ３等級３（試料３８４）および表在性Ｔａ等級１（試料８４２）由来であった。アンリ・モンドール病院、パリ・クレテイユのＤｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｃｈｏｐｉｎが、経尿道切除術によって、膀胱生検を外科的に摘出した。液体窒素中で試料を直ちに迅速凍結し、そして次いで、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。キュリー研究所、パリで、グアニジニウム・チオシアネート抽出、その後、塩化セシウム勾配超遠心によって（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、（１９９７））、総ＲＮＡを精製し、Ａ２６０測定によって定量化し、そしてＲＮＡゲル電気泳動によって完全性を確認した。最終濃度が１μｇ／μｌになるように、製造者の指示にしたがって、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ、ＤＮＡ−ｆｒｅｅＴＭキット）で総ＲＮＡを処理した。対照として、同じ総ＲＮＡ  ９μｇから出発して、標準プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現解析技術マニュアル）にしたがってもまた、ターゲットを調製した。
【０１９３】
次いで、ＤＮアーゼＩ処理した総ＲＮＡを、ＲＮアーゼ不含水を用いて希釈し、そして次いで、５ｎｇまたは５０ｎｇの総ＲＮＡを各増幅反応に用いた。
枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ）のＬｙｓ、ＰｈｅおよびＴｈｒ、並びにカナマイシン陽性対照ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ｃ１３８１）からなる（２０ｘ）ストックを用いて、４つのＲＮＡ対照センスポリＡ＋スパイクを総ＲＮＡに添加した。Ｌｙｓ、ＰｈｅおよびＴｈｒのプラスミドをＡＴＣＣから得て［ｐＧＩＢＳ−Ｌｙｓ、ＡＴＣＣ  ８７４８２；ｐＧＩＢＳ−Ｐｈｅ、ＡＴＣＣ  ８７４８３；およびｐＧＩＢＳ−Ｔｈｒ  ＡＴＣＣ  ８７４８４］、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現解析技術マニュアル［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／］に記載されるように、センスＲＮＡ転写物を生成し、そして精製した。
【０１９４】
Ｌｙｓ  、Ｐｈｅ、Ｔｈｒおよびカナマイシン・スパイクを、増幅されていないＲＮＡ試料に、それぞれ最終濃度１、５、２０および１ｐＭで添加した。
表（１）は、合成したプローブおよびそれぞれのｃＲＮＡ収量の要約を提供する。慣用的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標準プロトコルでは、ＲＮＡ／Ｔ７（ｄＴ）２４アニーリングがｄＮＴＰの非存在下で行われ、続いて、ｄＮＴＰが第一鎖マスターミックスに添加されたことに注目されたい。
【０１９５】
ＳＭＡＲＴＴＭ第一鎖ｃＤＮＡ合成
第一鎖および第二鎖合成を、同一の試験管中で行うことで、合成法を増進し、そしてｃＤＮＡ回収を最大にする。本明細書に記載する方法は、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素の点突然変異体である、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる。ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭは、ＲＮアーゼＨ活性を欠くが、野生型ポリメラーゼ活性を保持し、したがって野生型ＭＭＬＶ  ＲＴより長いｃＤＮＡ断片が合成可能である。
【０１９６】
ＲＮＡを７０℃に２分間加熱する、方法の最初の工程において、１ｍＭ  ｄＮＴＰを含むことによって、推奨されるＳＭＡＲＴＴＭプロトコル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を修飾した。我々はここで、この修飾が限られた量の出発総ＲＮＡからのｃＲＮＡ収量を増加させることを示す（以下の表２を参照されたい）。この修飾は、限られた出発材料でのＰＣＲ周期数を減少させることを可能にし、そしてｍＲＮＡ配分のいかなるゆがみも最小限にするのを補助するはずである。
【０１９７】
５０ｎｇまたは５ｎｇの総ＲＮＡからｃＲＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成ミックスに加えて、１ｍＭ  ｄＮＴＰをＲＮＡ−プライマー・アニーリング工程で添加する［工程１および２においてｄＮＴＰ］か、またはｃＤＮＡ合成ミックス中でのみアニーリングした［工程２においてのみｄＮＴＰ］。〜２０μｇのｃＲＮＡを続いて生成するのに必要なＰＣＲ周期数を表２に示す。どちらも０．５μＭになるように、等量の１μＭ  ＳＭＡＲＴＴＭ−Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）３０ＶＮオリゴヌクレオチド・配列番号１および１μＭ  ＳＭＡＲＴＴＭ  ＩＩ  Ａオリゴヌクレオチド・配列番号２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を混合することによって、プライマー・ミックスを調製した。我々は、より少量のテンプレートＲＮＡを用いる際、オリゴｄＴプライマー濃度を減少させると、非特異的アーチファクトが減少すると報告される、減少した濃度で［Ｂａｕｇｈら（２００１）］両プライマーを用い、そして我々は、標準的ＳＭＡＲＴＴＭプロトコルで必要とされるより、はるかに少ない総ＲＮＡから出発するため、新規プライマーＳＭＡＲＴＴＭ−Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）３０ＶＮオリゴヌクレオチド・配列番号１およびＳＭＡＲＴＴＭ  ＩＩ  Ａオリゴヌクレオチド・配列番号２が減少した濃度であることが必要であると結論付けた。
【０１９８】
３μｌの総ＲＮＡを２μｌの０．５μＭプライマー・ミックスと混合した。サーマルサイクラー中、ＲＮＡ／プライマーを７０℃に２分間加熱し、次いで４℃で５分間置いた。
４℃で、５μｌの第一鎖マスターミックスを各反応に添加した。ＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、＃Ｋ１０５２−１）の構成要素から、第一鎖マスターミックスを調製し、そして２μｌの５ｘ第一鎖緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３０ｍＭ塩化マグネシウム、および３７５ｍＭ塩化カリウム）、１μｌの２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１μｌのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素を添加した。穏やかにピペッティングすることによって反応を混合し、次いでサーマルサイクラー中、４２℃で１時間加熱し、次いで４℃で５分間置いた。
【０１９９】
ＳＭＡＲＴＴＭで合成されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
本明細書に記載する方法は、長距離ＰＣＲ［Ｂａｒｎｅｓ、１９９４］によるｃＤＮＡテンプレートの効率的でそして正確な増幅を可能にする、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる。ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ２製品は、ＵＳ  ５，４３６，１４９に記載される。
【０２００】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックスは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ欠損Ｎ末端欠失体であるＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および少量の校正ポリメラーゼを含有する。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックスはまた、ＴａｑＳｔａｒｔＴＭ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）も含有して、自動化ホット・スタートＰＣＲ（Ｋｅｌｌｏｇｇら、１９９４）を提供し、そしてテンプレートの非特異的プライミングを減少させる。この組み合わせは、慣用的なＰＣＲのものより有意に低いエラー率で、全長ｃＤＮＡの効率的な増幅を可能にする（Ｂａｒｎｅｓ、１９９４）。
【０２０１】
ＳＭＡＲＴＴＭ  ｃＤＮＡ合成に関しては、同じ試験管を用いて、９０μｌのＰＣＲマスターミックスを各ｃＤＮＡ合成に添加した。５’ＰＣＲ  ＩＩＡプライマー・配列番号３は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴＴＭ  ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号Ｋ１０５２−１）で用いるものと同じ配列であった。このプライマーは、ＳＭＡＲＴＴＭ  ｃＤＮＡの両端に結合し、そしてＰＣＲ増幅を可能にするであろう。１０μｌの１０ｘＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２  ＰＣＲ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２、１５ｍＭ酢酸カリウム、３．５ｍＭ酢酸マグネシウム）、２μｌの５０ｘｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌの１０μＭ  ５’ＰＣＲプライマーＩＩ  Ａ  配列番号３、および２μｌの５０ｘＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・ミックスおよび７４μｌの水を含む、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ・キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号８４３０−１）由来の構成要素を用いて、ＰＣＲを設定した。
【０２０２】
ＰＣＲ反応の熱周期パラメータは、ホット・スタートの９５℃６０秒間、次いで、９５℃１５秒間の変性、６５℃３０秒間のアニーリング、および６８℃６分間の伸長のあらかじめ決定した周期数（例えば５０ｎｇの出発総ＲＮＡでは１１周期、または５ｎｇの総ＲＮＡでは１５周期）の３工程サイクリングであった。次いで、精製まで、サーマルサイクラー中で、反応物を４℃で保持した。５０ｎｇの反応物を、典型的には１０周期または１１周期サイクリングし、そして５ｎｇの反応物を１４周期または１５周期サイクリングした。
【０２０３】
我々は、既定の量の出発材料から必要な最適ＰＣＲ周期数を決定する改善法を考案した。ＰＣＲに基づくいかなる方法に関しても、重要な要因の１つは、意図される下流適用に十分なターゲットを生じるであろう、最小数のＰＣＲ周期（既定量の出発材料に関して）を実行することである。あまりに周期数が多いと、複合体混合物中の各ＲＮＡテンプレートに関してＰＣＲ反応が同一である可能性は低く、そしてまたＰＣＲがプラトーに達する可能性もあるため、ｍＲＮＡの提示が偏向しうる。周期数があまりに少ないと、続く適用に不十分な増幅産物しか得られない。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴＴＭ方法論は、異なる周期数後に生成された、増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動上で調べ、そして次いで、最適な増幅の視覚的概算を伴う最適化戦略を推奨する。本明細書に記載する方法において、既定量の出発総ＲＮＡ（例えば５０ｎｇまたは５ｎｇ）に関し、全ＰＣＲ産物を次にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応に用いてｃＲＮＡを生成した場合、意図される下流適用に十分なｃＲＮＡが得られるような、必要な最小のＰＣＲ周期数を実験で決定する。これは、同一の反応を設定し、そして設定される周期数でＰＣＲを行うことにより（または解析のため、ＰＣＲ反応からアリコットを取り除き、そしてＰＣＲ反応の残りに対して、さらなる周期を実行することにより）、既定量の総ＲＮＡ（例えば５ｎｇまたは５０ｎｇ）を用いて出発することによって、容易に実行可能である。各反応（例えば９、１０、１１、１２、１３または１４周期のＰＣＲ熱周期を経た５０ｎｇ出発総ＲＮＡ）由来の全ＰＣＲ産物を精製し、そしてＩＶＴに用いる。次いで、下流適用に十分なｃＲＮＡの最小量を生じるＰＣＲ周期数を決定する。次いで、同じ出発濃度で他のＲＮＡを用いた類似の研究に、この周期数を日常的に用いることも可能である。
【０２０４】
例えば、本明細書に報告する本研究において、我々は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイ上での下流使用を記載する。ＰＣＲ産物を別の下流適用に使用する場合、同一の戦略が使用可能である。このプロトコルでのサイクリングパラメータは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて最適化されている。しかし、異なる量の出発総ＲＮＡに必要な周期数は、異なるテンプレート、サーマルサイクラーで多様である可能性もあるため、あるいはｃＤＮＡ合成またはＰＣＲに異なる酵素を用いるのであれば、必要な周期数を最初の実験で実験的に決定する必要がある。特定の量の出発総ＲＮＡに関して、最適条件が決定されたら、同一条件下で、この量のＲＮＡを用いる、続く実験は、同様の産物収量を生じるはずである。
【０２０５】
このＰＣＲ工程はまた、ＲＮＡを７０℃に２分間加熱する、方法の最初の工程にｄＮＴＰを添加することによって、増進可能である（詳細に関しては上記を参照されたい）。これは、限られた出発材料で、減少したＰＣＲ周期しか必要とされず、そしてしたがってｍＲＮＡ配分のいかなるゆがみも最小限にするのを補助することを意味する。
【０２０６】
製造者の指示にしたがって、ＱＩＡＧＥＮ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムを用いて、ＰＣＲ産物を精製した。溶出のため、３０μｌの溶出緩衝液をカラムに適用し、そして遠心分離する前に２分間静置した。分子生物学等級の水で、溶出体積を３０μｌに調整した。他のＰＣＲ精製法または商業的キットを用いて、ＰＣＲ精製を行うことも可能である。
【０２０７】
増幅されたｃＤＮＡからのビオチン標識化ｃＲＮＡの合成（ＩＶＴ）
ＥＮＺＯ（登録商標）ＢｉｏＡｒｒａｙＴＭ  ＨｉｇｈＹｉｅｌｄＴＭ  ＲＮＡ転写物標識キット、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ９００１８２をＩＶＴに用いたが、これは、いくつかの他の供給者からも得られうる。各３０μｌの精製ＰＣＲに、２０μｌのマスターミックス［５μｌの１０ｘＨＹ反応緩衝液、５μｌの１０ｘビオチン標識化リボヌクレオチド、４μｌの１０ｘＤＤＴ、４μｌの１０ｘＲＮアーゼ阻害剤ミックス、２μｌの２０ｘＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ］を添加した。薄壁０．２ｍｌ  ＰＣＲ試験管を用いて、ＩＶＴ反応を３７℃で５時間インキュベーションした。
【０２０８】
試料あたり５０μｌの水を添加し、そして次いで、製造者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、全反応物を精製した。５０μｌのＲＮアーゼ不含水を２回連続して適用し、すなわち１００μｌの最終体積中に、精製されたＲＮＡを溶出した。
【０２０９】
５μｌの溶出されたＲＮＡを、９６ウェルＵＶプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３６３５）のウェルあたり９５μｌの水に添加し、そしてＡ２６０測定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）に用いて、ＲＮＡの量を定量化した。
【０２１０】
断片化およびハイブリダイゼーション
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現解析技術マニュアルに記載される指示にしたがった。
【０２１１】
データ解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ発現解析に関して、新規増幅プロトコルの有効性を評価するため、いくつかのアッセイ性能基準に関して、データを解析した。これらの基準は、標識されたｃＲＮＡ収量；ＲａｗＱ、バックグラウンド、スケーリング係数（ｓｃａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）値、存在するコールのパーセント、並びに対照プローブセットの３’および５’シグナル強度比を含む標準的アレイ品質測定基準；細菌ポリＡ対照のスパイクを用いて定量化されるような、増幅の直線性および感度；再現性；標準的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルおよび新規増幅プロトコル間の示差遺伝子発現の一致解析；独立技術（ＲＴ−ＰＣＲ）による遺伝子発現変化の確認であった。
【０２１２】
標識ｃＲＮＡ収量
下流適用、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイには、十分なターゲットが生成される必要があるため、標識ｃＲＮＡ収量は重要である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）に必要な標識ｃＲＮＡの量は各ゲノムアレイに関して１０〜１５μｇである。異なる量の出発材料を用いて、一連の実験を行った。Ｔ３等級３（試料３８４）および表在性Ｔａ等級１（試料８４２）移行細胞膀胱癌腫から総ＲＮＡを抽出し、そしてプローブを調製するテンプレートとして用いた。慣用的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルを用いて、９μｇの総ＲＮＡから、そして本明細書記載の新規増幅法を用いて５０ｎｇおよび５ｎｇの総ＲＮＡから、複製プローブを調製した。以下の表３は、合成されたプローブ、用いた熱周期数、およびそれぞれのｃＲＮＡ収量の要約を提供し、そして続く断片化およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐへのハイブリダイゼーションに、どのプローブを用いたかを示す。慣用的なプローブ合成オリゴｄＴアニーリングが、ｄＮＴＰの非存在下で行われたことに注目されたい。精製後、得られたｃＲＮＡの量を２６０ナノメートル（ｎｍ）の吸光度によって測定し、そしてプロットして（図２）、増幅反応の再現性を立証する。図２に示すように、５ｎｇまたは５０ｎｇの総ＲＮＡの試料から得られる標識ｃＲＮＡの量は、標準プロトコルから予期される範囲に匹敵した。
【０２１３】
標準的ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ品質測定基準
新規増幅プロトコルが、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ発現解析のターゲットを調製するのに適しているかどうかをさらに評価するため、先に記載する実験から生成した１０μｇのｃＲＮＡターゲットを、標準的条件下で、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒト・ゲノムＵ１３３Ａ（ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）アレイにハイブリダイズさせ、そしてＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４流体工学プロトコルを用いて洗浄した。スキャン後、過剰なバックグラウンドおよび染色アーチファクト存在に関して、チップを視覚的ＱＣチェックに供した。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（ＭＡＳ  ５．０）ソフトウェアを用いて、データを解析し、そして多様な品質管理測定基準を得た。
【０２１４】
表３は、．ＲＰＴファイルから得たＱＣ測定基準の要約を提供する。スケーリング係数はすべてのチップ・ハイブリダイゼーションに関して一貫しており、極端な値は観察されなかった。
【０２１５】
ＲａｗＱ、バックグラウンド、およびスケーリング係数値を調べて、２つのプロトコル（新規増幅プロトコルおよび標準プロトコル）にしたがって調製したターゲットを用いて、全体の試料品質を評価した（図３を参照されたい）。表４に示すように、３つのパラメータすべてに関して、匹敵する値を得た。例えば、バックグラウンド値は、典型的な実験に関して予期されるように、すべて約１００であった。スケーリング係数値はまた、新規増幅プロトコルで増幅した、５ｎｇの出発材料からのデータを比較した際であっても、３倍の範囲内であった。
【０２１６】
ｍＲＮＡのポリＡテールに隣接する、選択したプローブを主に用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを設計する。この設計戦略と、さらなる増幅からのより短い断片の固有の生成によって、３’端に片寄った（ｓｋｅｗｅｄ）ターゲットを生成することも可能である。この現象を調べるため、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘは、特定の維持遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ、アクチン）用のプローブセットを生成し、そしてこれらのプローブセットは、転写物の３’領域、中央領域、および５’領域に対して設計されている。次いで、３’プローブセットのシグナル強度を５’プローブセットのシグナル強度に比較して（３’／５’比）、転写反応の効率を評価することも可能である。図４（上部および中央）に示すように、本明細書記載の新規増幅プロトコルを用いた場合、５ｎｇおよび５０ｎｇの総ＲＮＡ試料は、ＧＡＰＤＨ遺伝子およびアクチン遺伝子に関して、およそ１の３’／５’比を生じ、これは標準プロトコルでプロセシングされた試料のものに同等であり、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘが推奨する３の範囲に十分収まる。アレイ上で提示されるアクチン転写物は、ＧＡＰＤＨ遺伝子より長く、１，７６１塩基であった（５’プローブセットでは１１７８〜１７１２塩基以内、そして中央部プローブセットでは５８９〜１１１７塩基以内）が、３’／５’比はなお維持されていた。我々はまた、ＧＡＰＤＨ遺伝子およびアクチン遺伝子の３’／中央部プローブセット比（３’／Ｍ）も計算した（データ未提示）が、これもまた、標準プロトコルでプロセシングした試料と非常に類似であった。
【０２１７】
存在するコールのパーセント比較を用いて、データ提示を広く評価した。図４（下部）に示すように、減少した量の出発材料を用いても、匹敵する存在コール・パーセント値が得られた。５ｎｇの出発総ＲＮＡであっても、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ５．０ソフトウェア・アルゴリズムによって、依然として約５０パーセントのプローブセットが、存在するとコールされた。
【０２１８】
直線性および感度
増幅プロトコルいずれかが、発現レベルにおいて、相違を正確に検出する能力は、アッセイの直線性および感度に非常に依存する。
【０２１９】
複雑な試料において、スパイクされたポリＡ対照転写物を解析することによって、両方のパラメータに関して、新規増幅プロトコルを評価した。４つのスパイク対照転写物を、多様な濃度で、複雑なヒト膀胱生検総ＲＮＡ試料にスパイクした。３つは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した細菌ポリＡ対照、ｌｙｓ、ｐｈｅ、およびｔｈｒであり、そして残りのスパイクは、カナマイシンの商業的に入手可能なポリＡ対照ＲＮＡであった。ｌｙｓ、ｐｈｅ、およびｔｈｒは、Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ上のプローブセットに提示され、そしてしたがって、これらのスパイクは、プロファイリングのため、ＲＮＡ試料に添加した際に検出可能である。カナマイシン・スパイク・ポリＡ対照転写物は、ＴａｑＭａｎアッセイに基づく特異的リアルタイムＰＣＲによって測定可能である。５ｎｇおよび５０ｎｇの総ＲＮＡを新規増幅プロトコルで標識し、ターゲットをＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイズさせ、そして対照のシグナル強度をプロットし（図５）、そして方法に関わらず、プローブすべてによって、３つの転写物が検出された。
【０２２０】
複製の再現性
再現性は、増幅プロトコルすべてに関して、重要な必要条件であり、そして信頼性がある結果を生成するのに必須である。新規増幅プロトコルを用いて、２つの異なる総ＲＮＡ（ＲＮＡ  ＩＤ  ３８４および８４２）の５ｎｇおよび５０ｎｇを用いた、２つの独立なターゲット調製物を、ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイズさせた。
【０２２１】
各試料由来の増幅されたプローブおよび増幅されないプローブに関して、ピアソン相関値（表５および表６）を計算した。ピアソン相関係数は、すべて＞０．９５であり、したがって、各複製セット間で非常に優れた一致を示した。しかし、標準的増幅プロトコルおよび新規増幅プロトコルは、異なる総ＲＮＡ量および異なるプロトコルを用いるため、増幅された試料および増幅されない試料から得た結果を、直接比較することは推奨されない。
【０２２２】
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（米国タルサ）を用いて、各チップ・ハイブリダイゼーションのデータセットをクラスター化した：Ｗａｒｄの方法を用いて作成した樹形図（図６）は、２つの試料が別個にクラスター化され、そして期待されるように、各試料内で、増幅されたプローブが、増幅されないプローブと区別可能であることを示す。
【０２２３】
複製のスキャッター・プロット
複製試料のｌｏｇスケール・スキャッター・プロットは、複製の優れた再現性を示すｘｙ対角線に関する典型的なプロフィールを示す。３８４  ５０ｎｇ  ｒｅｐ１対ｒｅｐ２の代表的なｌｏｇスケール・スキャッター・プロット（図７）は、典型的なプロフィールを例示する。大部分のスキャッターは、＜５００のシグナル値で認識可能であり；これは主に、技術プラットホームの限界のためであり、そしてプローブ合成法には依存しない。
【０２２４】
データ解析
Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア（スウェーデン・エーテボリ）を用いて、どちらの方向でも２倍より多く変化する遺伝子の数を同定し、そして表７および表８に要約した。ｌｏｇスケール・スキャッター・プロットによって、＞２倍変化する遺伝子が示される（｜ｌｏｇ１００．３｜に同等）。図８は、３８４対８４２の５０ｎｇ  ｒｅｐ１のｌｏｇスケール・スキャッター・プロットを示し、これは他のすべての比較のスキャッター・プロットの典型である。
【０２２５】
我々は、増幅されない試料対増幅された試料の対比較すべての全ｌｏｇ比セットのスキャッター・プロットを比較し、比較した試料に関する相対的遺伝子発現の測定値を得た。図９は、セットＤに比較したセットＡのｌｏｇ比を示す。すべてのｌｏｇ比セットは、セットＡに比較した際、ｘｙ対角線に沿って類似の分布を示す。定性的観察として、セットの比がすべて同様であると仮定することは合理的であり、実際、新規増幅法から得た比は、標準プロトコルを用いてすべてのデータを得た場合のセットＡ対セットＢの比較より異なることはなかった。ピアソン相関係数は、０．８１〜０．８７の範囲で多様であり、最高の数値は、増幅されないプローブ間の比較で報告され、そして０．８１の最低の数値はセットＡ対セットＦに関して報告された。これらはすべて、ｌｏｇ比比較に関して、優れた相関値である。図９に示すものを含めて、データは、ノイズ、すなわちいかなる既定の遺伝子に関しても、１２のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ハイブリダイゼーションに渡って、シグナルが＜１００であるものを除去するようにフィルターがかけられたことに注目されたい。表４は、この実験に関して報告される平均バックグラウンドシグナルが、１１０±２２ＳＤであったことを示す。
【０２２６】
表６は、プローブ合成法に関わりなく、試料３８４および８４２間の各比較に関して、＞２倍変化する遺伝子の数が類似であった（平均＝７８４４±４４４ＳＤ）ことを示す。これらの変化のうちどれだけが、各セットにおける同じ遺伝子に関するものであるかを決定するため、セットＡのデータが標準的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルを用いて得られたことから、このセットを参考として用いた。しかし、他のセットすべてに対するセットＡの比較を検討すると（表６）、共通の遺伝子の数が、上に報告する７８４４の数値より少なく、そしてこれには、標準的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルを用いてすべてのデータが得られた場合のセットＡ対セットＢが含まれることがわかる。さらに、セットＡに対する５つの比較すべてに渡って共通なのは、わずか２３８５遺伝子であることもわかる。この結果は、少なくとも部分的に、意図的なカットオフ値のセッティング限界のためである（この場合、＞２倍）。
【０２２７】
デフォルトセッティングでＳｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアを用いて、データセットに対してｋ平均法クラスター化を使用して、そして意図的に７０のクラスターを計算するように選択した。これらのデータセットは、バックグラウンドシグナルフィルターを伴わず、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ままであった。頻度ヒストグラム（図１０）は、各クラスター中の遺伝子数、および輪郭（白）で示す箇所で＞２倍変化したかどうかを示す。最大のクラスターが５４８８遺伝子を含有し、そして最初の４つのクラスターが、すべての遺伝子のおよそ６０％を含むことに注目されたい。下部のヒストグラムのクラスターは、まとめて、共通の＞２倍変化する２３８５遺伝子に相当する。表７を参照されたい。
【０２２８】
ここで、ＣＰＡ法を用いて、遺伝子転写物プロフィールを正確に捉えることも可能であることを例示するため、選択した代表的なクラスターに注目する。最初に、図１１、図１２および図１３に示すクラスターの解析に役立ついくつかの指針を示す。
【０２２９】
・試料名をｘ軸上に示す
・各クラスターのｙ軸はｌｏｇ１０スケールである
代表的なクラスターを詳細に見ていくと、図１１は、個々の遺伝子プロフィールがすべての試料に渡って水平型に見えるため、Ｔ３等級３（試料３８４）および表在性Ｔａ等級１（試料８４２）腫瘍間の有意に異なる遺伝子発現を示さないクラスターを示す。しかし、図１２および図１３に示すクラスターに例示されるように、示差的遺伝子発現が生じる場合、増幅されたプローブおよび増幅されないプローブが、同等のデータを生成し、そして観察可能な偏向がないことがわかる。
【０２３０】
先に述べたように、最初の４つのクラスターは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）上の遺伝子の約６０％を含み、そしてクラスター１の場合、すべての遺伝子が非常に低いシグナル強度（〜＜１００）を示す。これは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術の検出閾値に非常に近く、そしてこの領域のシグナルは、プローブ合成法に関わりなく、真の遺伝子発現のためである可能性も、またはない可能性もある。データセット中のクラスターすべてを検討すると、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標準プロトコルを用いて得た発現プロフィールとともに、新規増幅プロトコルを用いて得た発現プロフィールによって、示差発現が的確に提示されることが明らかである。
【０２３１】
この定性的解析は、ｌｏｇ比のスキャッター・プロットおよびＱＣ測定基準とともに、新規増幅プロトコルが、プロフィール完全性を許容可能に維持して、５〜５０ｎｇの総ＲＮＡから転写物プロフィールを生成可能であることを立証する。
【０２３２】
同じ総ＲＮＡ（３８４および８４２）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによっていくつかの遺伝子変化を確認してきており、そしてこれはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）結果と一致する（データ未提示）。
【０２３３】
結論
我々は、新規増幅プロトコルが、発現プロファイリングのため、５ｎｇ程度に少ない総ＲＮＡを頑強に増幅し、そして標識するのに適していることを見出した。アッセイは、優れたｃＲＮＡ収量、感度、および再現性を示した。本明細書に例示する研究において、我々は、新規増幅法を介して生成されたｃＲＮＡの、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイのための下流適用に重点を置いた。しかし、ｃＲＮＡは、他の遺伝子発現プロファイリング・プラットホームを含む、他の下流適用にも使用可能である。結果は、標準的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ法を緊密に近似し、したがって、転写物プロフィールの完全性が維持され、そしてＱＣ測定基準は、標準プロトコルを用いて得られるものに匹敵する。該プロトコルは、さらなる改善の見通しを提供し、特にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）へのハイブリダイゼーションに実際に必要な最小量がおよそ１０μｇであるため、ビオチン化ｃＲＮＡの最終収量がこの量になるように、熱周期数をさらに減少させることも可能である。
【０２３４】
本明細書に記載するように、より少ない量の総ＲＮＡを用いる見通しもある。
上記明細書に言及する刊行物はすべて、本明細書に援用される。当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することのない、本発明の記載する方法および系の多様な修飾および変型が明らかであろう。本発明は、特定の好ましい態様に関連して記載されてきているが、請求されるような本発明は、過度にこうした特定の態様に限定されるべきではないことが理解されなければならない。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実行するため記載する様式の多様な修飾が、請求項の範囲内であることが意図される。
【０２３５】
【表２】
2007502610.tif 000004
【０２３６】
【表３】
2007502610.tif 000005
【０２３７】
【表４−１】
2007502610.tif 000006
【０２３８】
【表４−２】
2007502610.tif 000007
【０２３９】
【表５】
2007502610.tif 000008
【０２４０】
標準プロトコルまたは新規増幅プロトコルで生成したターゲットを、標準的条件下で、Ｕ１３３Ａヒト・ゲノムＧｅｎｅｃｈｉｐにハイブリダイズさせ、そしてＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４流体工学プロトコルを用いて洗浄した。表２は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ５．０  ．ｒｐｔファイルから得たＱＣ測定基準の要約を提供する。測定基準はすべて、許容しうる範囲内の値であった。
【０２４１】
【表６】
2007502610.tif 000009
【０２４２】
【表７】
2007502610.tif 000010
【０２４３】
【表８】
2007502610.tif 000011
【０２４４】
【表９】
2007502610.tif 000012
【０２４５】
[配列]
配列番号1
5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg(T)30VN-3’
VはA、G 、またはCであり、そしてNは塩基いずれかである
配列番号2 (US 5,962,271およびUS 5,962,272に記載される)
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'
配列番号3 (US 5,962,271およびUS 5,962,272に記載される)
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
配列番号4
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTaatacgactcactatagggaga(T)24VN-3’
VはA、G 、またはCであり、そしてNは塩基いずれかである
配列番号5
5’ GCATTAACCCTCACTAAC 3’
配列番号6
5' TAATACGACTCACTATA 3' 
配列番号7
5’ Aatacgactcactatagggaga 3’ 
配列番号8
5’ ggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg 3’
配列番号9
5' ATTTAGGTGACACTATA 3'
【０２４６】
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【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】図１は、本発明記載の増幅法の説明を示す（Ａ＝ＲＴアーゼによる第一鎖合成およびｄＣ付加、Ｂ＝ＲＴアーゼによるテンプレート・スイッチングおよび伸長、Ｃ＝ＰＣＲ産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ｄｓ＝二本鎖、ａＲＮＡ＝増幅されたアンチセンスＲＮＡ）。  工程１  ＲＮＡにアニーリング可能なｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドの存在下で、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡまたは総ＲＮＡの試料をインキュベーションする。  このオリゴヌクレオチドは、５’端に、ＰＣＲプライマーなどの増幅プライマー、その後、Ｔ７プロモーター配列およびＲＮＡアニーリング領域を有する。増幅プライマーは、後に続く増幅のため、ｃＤＮＡ上に３’アンカーを生成し、そしてＴ７プロモーター配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、増幅されたＲＮＡターゲットの生成を可能にする。ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを生成するのに適した条件下で、逆転写酵素活性を所持する酵素が含まれ、そしてテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドをテンプレートとして用いて、逆転写酵素による全長ｃＤＮＡのＣＡＰ依存性伸長を提供可能であり、そしてそれによって全長ｃＤＮＡの３’端にテンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を付加する、前記テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドもまた含まれる。  工程２  工程１で生成された、アンカー付加されたｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド（すなわち全長ｃＤＮＡ集団）を、テンプレート・スイッチング・オリゴヌクレオチドの配列に実質的にまたは完全に対応する単一の増幅プライマーとインキュベーションする。  存在するｃＤＮＡ集団に対応する増幅産物を生成するのに適した条件を用いる。好適には、下流適用に十分な量の増幅された産物を生じる増幅条件をあらかじめ決定するが、いかなる増幅偏向も最小限にするため、最小の増幅周期数を用いる。次いで、標準法によって、増幅産物を精製する。  工程３  得られる、精製された増幅産物は、Ｔ７ポリメラーゼを用いた、転写に基づく増幅を経て、下流適用のため、相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）としても知られる、増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を生じる。ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドに取り込まれるＴ７プロモーター領域は、Ｔ７ポリメラーゼによる転写を誘導することが可能である。
【図２】図２は、プローブ合成ｃＲＮＡ収量の比較をμｇで示す。バー１７〜２０は、標準プロトコルにしたがって調製されたものである。
【図３】図３は、アレイに渡る品質管理測定基準を例示する。各ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションに関して、ＲａｗＱ、ＢＧ  ｌｏｇおよびスケーリング係数値を示す（Ａ＝ＲａｗＱ、Ｂ＝ＢＧ  ｌｏｇ、Ｃ＝スケーリング係数）。
【図４】上部：ベータ−アクチン（ｘ００３５１）プローブセットの３’対５’の比。中央：ＧＡＰＤＨ（ｍ３３１９７）プローブセットの３’対５’の比。下部：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ  ５．０アルゴリズムによって決定されるような「存在」とコールされるプローブセットの割合。
【図５】図５は、ポリＡ＋スパイクの５’端、中央部、および３’端の検出を示す。上部：１ｐＭでスパイクされたＬｙｓ転写物。中央：５ｐＭでスパイクされたＰｈｅ転写物。下部：２０ｐＭでスパイクされたＴｈｒ転写物。各グラフは、ポリＡ＋スパイクに関する、５’端、中央部、および３’端プローブセットのシグナルを示す。
【図６】図６は、Ｗａｒｄの方法を用いた、クラスター化系統樹を示す。ｙ軸に沿って、クラスター化変数を示し、そしてｘ軸に沿って関連距離を示す。
【図７】図７は、〜２２，０００遺伝子に関するスキャッター・プロット（ｌｏｇスケール）を示す。プロットは、すべての比較に関して得られるものを代表する。
【図８】図８は、試料間で２倍より多い（＞｜ｌｏｇ１００．３｜）遺伝子変化を示すＳｐｏｔｆｉｒｅスキャッター・プロットを示す。プロットは、すべての比較に関して得られるものを代表する。
【図９】図９は、セットＤに対するセットＡ（「９μｇ  ３８４非増幅ｒｅｐ１対９μｇ  ８４２非増幅ｒｅｐ１」）のｌｏｇ比を比較するスキャッター・プロットを示す。プロットからバックグラウンドノイズを取り除き、すなわち、すべてのチップ・ハイブリダイゼーションに渡って、特定の遺伝子に関して、＜１００のシグナルが報告されたものを取り除いた。比較のため、ピアソン相関値（Ｒ）を示す。セットＡ対セットＢを比較するスキャッター・プロット（Ｒ＝０．８７）、セットＡ対セットＣを比較するスキャッター・プロット（Ｒ＝０．８３）、セットＡ対セットＥを比較するスキャッター・プロット（Ｒ＝０．８２）、およびセットＡ対セットＦを比較するスキャッター・プロット（Ｒ＝０．８１）もまた作成したが、示していない。セットＡ対セットＤの分布は、他の比較に関するものを代表する。
【図１０】図１０は、クラスター・ヒストグラムを示し、ｘ軸はクラスターであり、そしてｙ軸は遺伝子数である。上部のヒストグラムは、すべてのクラスター中のすべての遺伝子を示す［黒＝＜２倍の遺伝子変化、輪郭（白）＝＞２倍の遺伝子変化］。下部のヒストグラムは、＞２倍の遺伝子変化のみを示す（ｙ軸を拡大している）。
【図１１】図１１は、試料間で示差遺伝子発現がないことを示す、５３遺伝子のクラスター例を示す。増幅されたプローブおよび増幅されないプローブが同様に振舞うことに注目されたい。
【図１２】図１２は、試料３８４において、遺伝子発現の下方制御を示す、２１遺伝子のクラスター例を示す。増幅されたプローブおよび増幅されないプローブが同様に振舞うことに注目されたい。
【図１３】図１３は、試料８４２において、遺伝子発現の上方制御を示す、９遺伝子のクラスター例を示す。増幅されたプローブおよび増幅されないプローブが同様に振舞うことに注目されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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