(57)【要約】  シス・エレメントに動作可能に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターを初代培養細胞にトランスフェクトする。細胞培養物中で候補調節タンパク質の発現を誘導し、シス・エレメントにおけるその影響をアッセイする。
2007512839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組換えアデノウイルスで免疫細胞をトランスフェクトする工程であって、該組換えアデノウイルスが候補シス作用調節エレメントに動作可能に連結されたレポーター遺伝子を含む工程と、
（ｂ）レポーター遺伝子活性の基礎レベルを測定する工程と、
（ｃ）該免疫細胞に刺激を付与する工程と、
（ｄ）該刺激に反応したレポーター遺伝子活性を測定する工程
とを含み、該シス作用調節エレメントが少なくとも１つの転写因子またはエンハンサーで調節され、かつ該刺激はシグナル経路の発現を調節することが知られている、免疫細胞において刺激が候補シス作用調節エレメントを活性化することができるかどうかを決定する方法。
【請求項２】
刺激が調節タンパク質の発現を調節することを含み、かつ付与工程（ｃ）が該調節タンパク質の発現を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調節タンパク質のための発現系で免疫細胞をコトランスフェクトする工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
付与工程（ｃ）が候補調節化合物を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、β−ガラクトシダーゼ（「ＧＡＬ」）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子がサプレッサー遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サプレッサー遺伝子がＩκＢｓｄである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シス作用調節エレメントが炎症に関連する調節タンパク質で調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
シス作用調節エレメントが、ＡＰ−１、ＣＲＥ、ＩＳＲＥ、ＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、およびＳＲＥから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
免疫細胞が、マクロファージ、ＣＤ４+Ｔ細胞、および未成熟樹状細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）組換えアデノウイルスで免疫細胞をトランスフェクトする工程であって、該組換えアデノウイルスがシス作用調節エレメントに操作可能に連結されたサプレッサー遺伝子を含み、該シス作用調節エレメントがシグナル経路に属する工程と、
（ｂ）該サプレッサー遺伝子の発現を誘導する工程
とを含む、免疫細胞のシグナル経路の発現を阻害する方法。
【請求項１２】
シグナル経路がＮＦκＢシグナル経路である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サプレッサー遺伝子がＩκＢｓｄである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫細胞が、マクロファージ、ＣＤ４+Ｔ細胞、および未成熟樹状細胞から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経路マッピングの分野に関し、詳細には不死細胞系ではない免疫細胞の経路マッピングに関する。本発明はさらに細胞内シグナル経路の発現調節の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内シグナル経路は、初期刺激により開始する遺伝子間相互作用のカスケードによりその発現が制御される一連の遺伝子である。すなわち、細胞内シグナル経路の初期刺激が、直接的にまたはその経路上の別の遺伝子を介して間接的に経路上の各遺伝子の発現を制御する。既知のシグナル経路は、免疫応答、発生、有糸分裂、および炎症など広範囲の生物活性に関与し、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（「ＭＡＰＫ」）経路、タンパク質キナーゼＡ（「ＰＫＡ」）シグナル経路、タンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）シグナル経路、Ｉ型インターフェロンシグナル経路、カルシニューリン（「ＣａＮ」）シグナル経路、シス作用κＢ細胞核因子（「ＮＦκＢ」）シグナル経路、およびＩκＢキナーゼ（「ＩＫＫ」）シグナル経路などがあるが、これらに限定されない。シグナル経路の障害はさまざまな病状に関与しているが、多くの場合、初期刺激と最終的な細胞応答との間のシグナル経路についてはあまり知られていない。
【０００３】
一般的に、経路マッピングは経路の初期刺激と最終的な応答との間の諸段階の解明を指す。本発明の目的では、「経路マッピング」とは、所与のシグナル経路が、直接的または間接的に候補シス作用調節エレメントを制御するかどうかを決定することを指す。既知の経路マッピング法は、試験される調節エレメントに動作可能に連結されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした培養細胞系由来の宿主細胞を用いる。レポーター遺伝子の使用は、Ｋａｉｎ，ＳＲ、およびＧａｎｇｕｌｙ，Ｓ、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕｎｉｔ  ９．６  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら編（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９５年）の技術で確立されている。
【０００４】
トランスフェクションは培養哺乳動物細胞などの宿主細胞に外来ＤＮＡを導入することを指す。トランスフェクションは、遺伝子およびその個々の遺伝子産物の機能、調節および相互作用を分析する強力なツールであることがわかっている。細胞をトランスフェクトする手順は、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｆｏｘ  ＲＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｃｔ  ４；１６（２０）、４４７０〜４４７７頁、ＰＭＩＤ  ９１１７６９（１９７７年））、リン酸カルシウム法（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．、Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．、およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、８３９２頁（１９９３年））、リポソーム媒介トランスフェクション（Ｚｈａｎｇ  ＷＷら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｎｏｖ；１５（５）、８６８〜８７２頁（１９９３年））、マイクロインジェクション（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  Ｆ、およびＧａｒａｐｉｎ  ＡＣ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ；５５、２６７〜２７１頁、ＰＭＩＤ：６３２９８５７（１９８３年））およびエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ＥおよびＫａｋｏｒｉｎ  Ｓ、Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．  Ｏｃｔ；１（５）、３２９〜３４０頁（２００２年））などの化学的および物理学的なトランスフェクション法技術で確立されている。トランスフェクションのための組換えアデノウイルスベクターの使用も、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬおよびＳｈａｒｐ，ＰＡ、Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１、６００３〜６０２０頁（１９８３年）、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬおよびＳｈａｒｐ，ＰＡ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６、６１６〜６２９頁（１９８８年）、Ｂｅｔｔ，ＡＪ、Ｈａｄｄａｒａ，Ｗ、Ｐｒｅｖｅｃ，ＬおよびＧｒａｈａｍ，ＦＬ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１、８８０２〜８８０６頁（１９９４年）、Ｈｉｔｔ，Ｍ、Ａｄｄｉｓｏｎ，ＣＬ、およびＧｒａｈａｍ，ＦＬ、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、１３７〜２０６頁（１９９７年）の技術で確立されている。組換えアデノウイルスは、とりわけ心臓組織（Ａｒｄｅｈａｌｉ，Ａ．Ｊ、Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓ．Ｓｕｒｇ．１１１、２４６〜２５２頁（１９９６年））、およびリンパ球（Ｌｅｏｎ，ＲＰ、Ｈｅｄｌｕｎｄ，Ｔ，Ｍｅｅｃｈ，ＳＪ、Ｌｉ，Ｓ、Ｓｃｈａａｃｋ，Ｊ、Ｈｕｎｇｅｒ，ＳＰ、Ｄｕｋｅ，ＲＣ、およびＤｅＧｒｅｇｏｒｉ、Ｊ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５、１３１５９〜１３１６４頁（１９９８年））をトランスフェクトするのに用いられてきた。ヒトアデノウイルスは、レセプター媒介エンドサイトーシスにより細胞に入る二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、増殖および操作が容易であり、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて広範な宿主範囲を示すため、遺伝子導入に適すると考えられている。アデノウイルスは複製中の標的細胞および静止状態の標的細胞にも感染することができ、宿主ゲノムに一体化せずに染色体外に存在する。組換えアデノウイルスは比較的大きなセグメントの外来ＤＮＡ（約７ｋｂ）を取り込むことができ、高感染価ウイルスを産生するという利点を有する。
【非特許文献１】Ｋａｉｎ，ＳＲ、およびＧａｎｇｕｌｙ，Ｓ、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕｎｉｔ  ９．６  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら編（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９５年）
【非特許文献２】Ｆｏｘ  ＲＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｃｔ  ４、１６（２０）、４４７０〜４４７７頁、ＰＭＩＤ  ９１１７６９（１９７７年）
【非特許文献３】Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．、Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．、およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、８３９２頁（１９９３年）
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ  ＷＷら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｎｏｖ；１５（５）、８６８〜８７２頁（１９９３年）
【非特許文献５】Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  Ｆ、およびＧａｒａｐｉｎ  ＡＣ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ；５５、２６７〜２７１頁、ＰＭＩＤ：６３２９８５７（１９８３年）
【非特許文献６】Ｎｅｕｍａｎｎ  ＥおよびＫａｋｏｒｉｎ  Ｓ、Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．  Ｏｃｔ；１（５）、３２９〜３４０頁（２００２年）
【非特許文献７】Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬおよびＳｈａｒｐ，ＰＡ、Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１、６００３〜６０２０頁（１９８３年）
【非特許文献８】Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬおよびＳｈａｒｐ，ＰＡ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６、６１６〜６２９頁（１９８８年）
【非特許文献９】Ｂｅｔｔ，ＡＪ、Ｈａｄｄａｒａ，Ｗ、Ｐｒｅｖｅｃ，ＬおよびＧｒａｈａｍ，ＦＬ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１、８８０２〜８８０６頁（１９９４年）
【非特許文献１０】Ｈｉｔｔ，Ｍ、Ａｄｄｉｓｏｎ，ＣＬ、およびＧｒａｈａｍ，ＦＬ、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、１３７〜２０６頁（１９９７年）
【非特許文献１１】Ａｒｄｅｈａｌｉ，Ａ．Ｊ、Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓ．Ｓｕｒｇ．１１１、２４６〜２５２頁（１９９６年）
【非特許文献１２】Ｌｅｏｎ，ＲＰ、Ｈｅｄｌｕｎｄ，Ｔ，Ｍｅｅｃｈ，ＳＪ、Ｌｉ，Ｓ、Ｓｃｈａａｃｋ，Ｊ、Ｈｕｎｇｅｒ，ＳＰ、Ｄｕｋｅ，ＲＣ、およびＤｅＧｒｅｇｏｒｉ、Ｊ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５、１３１５９〜１３１６４頁（１９９８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
経路マッピングに使用されるレポーター・コンストラクトのための既知のベクターには、ＢＤバイオサイエンス・クロンテックから市販されているｐＣＲＥ−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドがある。このプラスミドは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）レポーター遺伝子に動作可能に連結された環状ＡＭＰ応答エレメント（「ＣＲＥ」）を含み、Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（「ＪＮＫ」）シグナル経路、ｐ３８  ＭＡＰＫシグナル経路、およびタンパク質キナーゼＡ（「ＰＫＡ」）シグナル経路などの経路における活性の測定に使用することができる。このプラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖のためにｐＵＣ複製起点を使用し、一本鎖ＤＮＡの産生のためにウイルスのｆ１起点を使用する。このプラスミドは、アデノウイルスベースのベクターよりかなり低い効率で真核細胞にトランスフェクトされ、培養真核細胞系で使用されるのに十分な効率しか示さず、初代真核細胞培養物では効率的ではない。免疫細胞の経路マッピングに関する既知のベクターが初代免疫細胞での使用に実用的な十分な効率を示さないので、現在、従来技術の方法を用いた経路マッピングは培養細胞系においてのみ実施できるに過ぎない。しかし、不死化培養細胞系は、不死化されていないものと大きく異なるタンパク質発現パターンを示す傾向がある。細胞の正常な発現パターンを不必要に乱さずに、高等生物の初代宿主細胞において経路マッピングを実施できることが望ましい。不死化細胞系に変換する必要がなく、初代免疫細胞において経路マッピングを実施できることが特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、免疫細胞のシグナル経路の発現を調節することで知られる刺激が、候補シス・エレメントの発現を調節することができるかどうかを決定する方法であって、その候補シス・エレメントに動作可能に連結されたレポーター遺伝子を有する組換えアデノウイルスで免疫細胞をトランスフェクトする工程、レポーター遺伝子活性の基礎レベルを測定する工程、免疫細胞に刺激を付与する工程、および前記刺激に反応したレポーター遺伝子活性を測定する工程を有する方法に関する。別の態様では、刺激が調節タンパク質の発現を調節することである。さらに別の態様では、その方法が、その調節タンパク質の発現系でのコトランスフェクションをさらに含む。別の態様では、刺激が候補調節化合物を導入することである。別の態様では、レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、β−ガラクトシダーゼ（「ＧＡＬ」）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）、またはＩκＢｓｄなどのサプレッサー遺伝子である。別の態様では、このシス・エレメントが炎症に関連する。別の態様では、このシス・エレメントがＡＰ−１、ＣＲＥ、ＩＳＲＥ、ＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、またはＳＲＥである。別の態様では、免疫細胞がマクロファージ、ＣＤ４+Ｔ細胞、または未成熟樹状細胞である。
【０００７】
一態様では、本発明は免疫細胞のシグナル経路の発現を阻害する方法に関し、そのシグナル経路に属するシス・エレメントに動作可能に連結されたサプレッサー遺伝子を含む組換えアデノウイルスでその免疫細胞をトランスフェクトする工程と、サプレッサー遺伝子の発現を誘導する工程とを有する方法に関する。別の態様では、そのシグナル経路がＮＦκＢシグナル経路である。さらに別の態様では、そのサプレッサー遺伝子がＩκＢｓｄである。別の態様では、免疫細胞がマクロファージ、ＣＤ４+Ｔ細胞、または未成熟樹状細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、初代免疫細胞のシグナル経路のシス作用調節エレメントの役割を決定するための方法および組成物を提供する。この発明の目的で、「シス作用調節エレメント」は「シス・エレメント」と同義的に用いられ、コード配列に動作可能に連結し、そのコード配列の発現を調節するポリヌクレオチド調節エレメントを指す。本発明の目的では、「細胞内シグナル経路」は「シグナル伝達経路」、「シグナル経路」および「経路」と同義的に用いられ、所与の初期刺激により直接的または間接的にその調節が変えられる一群の遺伝子を指す。一般的なシグナル経路では、初期刺激は、対応する第１の調節タンパク質の産生を活性化する第１のシス・エレメントを活性化する。その後、この第１の調節タンパク質は、経路の第２のシス・エレメントを活性化し、同様に第２の調節タンパク質の産生を活性化する。その後、この第２の調節タンパク質は、第３のシス・エレメントなどを活性化する。この例では、初期刺激は第３のシス・エレメントを間接的に調節する。本発明の目的では、シス・エレメントは、経路の初期刺激により直接的または間接的に調節される場合、経路の一部であるとみなされる。本発明の目的では、「初期刺激」は経路の活性を調節する任意の現象を指す。初期刺激には、調節タンパク質の発現の増加または減少、ウイルス感染、アレルゲンとの接触、ＤＮＡ損傷、および細胞外ストレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。細胞外ストレスの例には、熱ショック、浸透ストレス、ｐＨストレス、および電離放射線などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
多くのヒト疾患は、マクロファージ、Ｔ細胞および樹状細胞などの免疫細胞のシグナル経路における１つまたはそれ以上の障害により生じる。例えば、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（「ＭＡＰＫ」）経路における障害は、とりわけ、関節炎、敗血症、およびヒト免疫不全ウイルス感染の原因として関与している。同様に、Ｉ型インターフェロンシグナル経路の障害により、ウイルス感染に対する不適切な応答が起こる。数種の既知のシグナル経路およびその既知の構成シス・エレメントについて以下に述べる。
【００１０】
シス作用調節エレメントおよびその経路
シス・エレメントとしても知られるシス作用調節エレメントは、コード配列に動作可能に連結されたポリヌクレオチド調節エレメントであり、その調節エレメントはそのコード配列の発現を調節する。シス作用調節エレメントの例として、活性化タンパク質１（「ＡＰ−１」）、環状ＡＭＰ応答エレメント（「ＣＲＥ」）、インターフェロン刺激応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）、核因子活性化Ｔ細胞（「ＮＦＡＴ」）、κＢ細胞核因子（「ＮＦκＢ」）、および血清応答エレメント（「ＳＲＥ」）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓは、シス作用活性化タンパク質１（「ＡＰ−１」）エンハンサー・エレメントを調節する。このシス作用ＡＰ−１エンハンサー・エレメントは、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端タンパク質キナーゼ（「ＪＮＫ」）シグナル経路に含まれる。ＪＮＫシグナル経路は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（「ＭＡＰＫ」）経路の類であり、ＭＡＰＫシグナル経路は、アポトーシスに対する細胞感受性と同様に、数種の細胞外ストレスに対する細胞応答にも関与している。
【００１２】
転写因子ＡＴＦ２およびＣＲＥＢは、シス作用環状ＡＭＰ応答エレメント（「ＣＲＥ」）エンハンサー・エレメントを調節する。シス作用ＣＲＥエンハンサー・エレメントは、ＪＮＫシグナル経路、ｐ３８シグナル経路、およびタンパク質キナーゼＡ（「ＰＫＡ」）シグナル経路に含まれる。ＪＮＫシグナル経路のように、ｐ３８シグナル経路はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（「ＭＡＰＫ」）経路の類であり、数種の細胞外ストレスおよび炎症性サイトカインに対する細胞応答に関与している。ＰＫＡシグナル経路は有糸分裂に関与している。
【００１３】
転写因子ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２は、シス作用インターフェロン刺激応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）エンハンサー・エレメントを調節する。シス作用ＩＳＲＥエンハンサー・エレメントはＩ型インターフェロンシグナル経路に含まれる。Ｉ型インターフェロンシグナル経路は、ウイルス感染に対する細胞応答に関与している。
【００１４】
転写因子ＮＦＡＴは、シス作用核因子活性化Ｔ細胞（「ＮＦＡＴ」）エンハンサー・エレメントを調節する。シス作用ＮＦＡＴエンハンサー・エレメントは、カルシニューリン（「ＣａＮ」）シグナル経路のみならずタンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）シグナル経路にも含まれる。ＰＫＣシグナル経路は、血管収縮におけるヒスタミンの作用に関与している。ＣａＮシグナル経路は、心臓肥大に関与している。
【００１５】
転写因子ＮＦκＢは、シス作用κＢ細胞核因子（「ＮＦκＢ」）エンハンサー・エレメントを調節する。シス作用ＮＦκＢエンハンサー・エレメントは、ＮＦκＢシグナル経路のみならずＩκＢキナーゼ（「ＩＫＫ」）シグナル経路にも含まれる。ＩＫＫシグナル経路およびＮＦκＢシグナル経路は、数種の細胞外ストレスに対する細胞応答に関与している。
【００１６】
転写因子Ｅｌｋ−１およびＳＲＦは、シス作用血清応答エレメント（「ＳＲＥ」）エンハンサー・エレメントを調節する。シス作用ＳＲＥエンハンサー・エレメントは、ＪＮＫシグナル経路のみならずＭＡＰＫシグナル経路にも含まれる。
【００１７】
上記のシス・エレメントは、それぞれの経路または上記の経路に属することが知られている。しかし、多くのシス・エレメントは、シグナル経路におけるそのメンバーシップが決定されていない。本発明の一実施形態は、候補シス・エレメントが所与の経路に属するか否かを決定するための方法を提供するものである。この実施形態では、最初に、レポーター遺伝子に動作可能に連結された候補シス・エレメントを含むレポーター・コンストラクトで免疫細胞などの宿主初代細胞をトランスフェクトする。そして、当該経路を活性化する方法で宿主細胞に刺激を付与する。その後、レポーター遺伝子の活性を測定する。その刺激に反応してそのレポーター遺伝子の活性が調節される場合、候補シス・エレメントが当該経路に属すると決定される。
【００１８】
レポーター・コンストラクトの構築および運搬
本発明の一実施形態は、候補シス・エレメントに動作可能に連結されたレポーター遺伝子を含む組換えレポーター・コンストラクトを用いる。一実施形態では、アデノウイルスベースのベクターがこの組換えレポーター・コンストラクトを宿主細胞に運搬する。図４は組換えアデノウイルスベースのベクターを示す概略図である。一実施形態では、このベクターはアデノウイルス５型ゲノム由来であり、例えば市販のＢＤ  ＡＤＥＮＯ−Ｘ  ＤＮＡであり、これは約３３ｋｂ長であり、Ｅ１およびＥ３領域の大部分を取り除くことにより改変されている。この組換えレポーター・インサートは、候補シス・エレメント、候補シス・エレメントの上流に転写ブロッカー、および候補シス・エレメントの下流にレポーター遺伝子を含む。
【００１９】
上流の転写ブロッカー（「ＴＢ」）エレメントはレポーター遺伝子の背景転写レベルを減少させ、１つまたはそれ以上の転写休止エレメントまたはポリアデニル化部位を含んでいてもよい。一般的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（「ＧＡＬ」）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、および、不安定化変異体に限定されないそれらの変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、以下に詳細に記載するが、レポーター遺伝子はシグナル経路の発現を阻害する能力を持つ超優性変異体である。
【００２０】
一実施形態では、組換えレポーター・インサートをＩ−Ｃｅｕ  Ｉ制限部位とＰＩ−Ｓｃｅ  Ｉ制限部位と隣接させ、あらかじめＩ−Ｃｅｕ  ＩおよびＰＩ−Ｓｃｅ  Ｉで切断した直線化ＢＤ  ＡＤＥＮＯ−Ｘ  ＤＮＡにｉｎ  ｖｉｔｒｏで連結させる。生じたＤＮＡを大腸菌において増殖させ、精製プラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトする。全長組換えアデノウイルスＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトして組換えウイルスを回収し、増幅して高力価ストックを生成する。
【００２１】
候補シス・エレメントが経路に属するかどうかの決定
候補シス・エレメントを含むレポーター・コンストラクトを、アデノウイルスベースのベクターにクローニングし、そのベクターを十分な感染効率（「ＭＯＩ」）で宿主細胞に接触させ、十分な時間インキュベートすることにより、そのレポーター・コンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトする。適切なＭＯＩおよびインキュベーション時間の例を、下記の実施例で提供する。
【００２２】
候補シス・エレメントを含むレポーター・コンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトし、レポーター遺伝子活性の基礎レベルを測定する。その後、当該経路を活性化することで知られる刺激を細胞に付与する。例えば、当該経路がｐ３８ＭＡＰＫ経路である場合、付与する刺激は炎症性サイトカイン、または熱ショックもしくは高浸透圧培地などの細胞ストレスであり得る。刺激を付与した後、レポーター遺伝子の活性を再度測定し、基礎レベルの活性と比較する。刺激の付与によりレポーターの活性が調節される場合、候補シス・エレメントが当該経路に属すると決定される。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は限定的なものではない。例えば、ここに記載するもの以外のレポーター遺伝子および調節遺伝子の使用と同様に、ここに記載するもの以外のシス・エレメントの使用が予期される。本発明の目的では、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、不死化細胞系の使用とは対照的な初代細胞培養物の使用を指す。
【００２４】
実施例：初代ヒト免疫細胞における組換えアデノウイルス感染
本実施例では、緑色蛍光タンパク質を構成的に発現する能力を持つ組換えアデノウイルス（「ＡｄＶ：ＧＦＰ」）を用いて、すべての主な細胞型の初代ヒト免疫細胞におけるアデノウイルスの感染しやすさを調べた。そのような組換えアデノウイルスは、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｌｏｇｙから市販されている。本実施例で、ＡｄＶ：ＧＦＰによりうまくトランスフェクトされた初代ヒト免疫細胞の型は、骨髄マクロファージ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化型未成熟樹状細胞（「ｉＤＣ」）、および末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）などであった。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦによりＰＢＭＣから負の選択を受けたＣＤ１４+細胞から、ｉＤＣを調製した。１０〜３３０／細胞にわたる感染効率でＡｄＶ：ＧＦＰをマクロファージおよびｉＤＣに感染させ、１６〜２４時間インキュベートした。その後、その細胞について蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を調べた。
【００２５】
図１Ａは、トランスフェクトされた骨髄マクロファージにおけるＧＦＰ発現を示し、図１Ｂは、１００ＭＯＩでトランスフェクトされたｉＤＣにおけるＧＦＰ発現を示す。このＭＯＩでは、最大９０％までの細胞が、検出可能なＧＦＰ発現を示す。
【００２６】
１００〜１０００／細胞にわたるＭＯＩでＡｄＶ：ＧＦＰを新鮮末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）に感染させた。感染２４時間後に、感染細胞をＣＤ４およびＣＤ１９に特異的なモノクローナル抗体で標識化した。
【００２７】
図１Ｃは、ＣＤ４+Ｔリンパ球におけるＧＦＰの発現を示し、図１Ｄは、３００ＭＯＩでＡｄＶ：ＧＦＰが感染したＣＤ１９+Ｂリンパ球におけるＧＦＰの発現を示す。両方の図で、ＢＤバイオサイエンスから市販されているＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒアナライザを用いて、５１５ｎｍでセットされたＦＬ１でＧＦＰの発現を測定した。これら両方の図で示す蛍光度の変化は、両培養物において大部分の細胞が検出可能なＧＦＰの発現を示していることを表す。
【００２８】
実施例：ＡｄＶ：ＩκＢｓｄを用いたマクロファージにおけるＮＦκＢシグナル経路の阻害
本実施例では、構成的に超優性ＩκＢ変異体を発現する能力を持つ組換えアデノウイルス（「ＡｄＶ：ＩκＢｓｄ」）を構築した。ＩκＢｓｄ変異体は、ヒトＩκＢａにおいて、セリン３２とセリン３６がアラニンに変わっている２つの点変異を含む。したがって、ＩκＢキナーゼ−ｂはＩκＢｓｄ変異体をリン酸化することができない。このように、ＩκＢｓｄ変異体は、プロテアソームを介したＩκＢａの分解を防ぐことにより、ＮＦκＢシグナル経路を阻害することができる。ＮＦκＢシグナル経路を欠く場合、例えば超優性ＩκＢ変異体により阻害されるとき、ＴＮＦ−α処理は、マクロファージなどの様々な細胞型においてアポトーシスを誘導する。
【００２９】
本実施例では、対照としてＡｄＶ：ＧＦＰ、またはＡｄＶ：ＩκＢｓｄを骨髄マクロファージに感染させた。その後、マクロファージの両セットにＴＮＦ−αを１０ｎＭで処理した。細胞浸透性を欠如させてＤＮＡを染色するヨウ化プロピジウム（「ＰＩ」）染色によりアポトーシスを測定した。
【００３０】
図２で示すように、ＮＦκＢシグナル経路が無傷のままである対照群ＡｄＶ：ＧＦＰは、全細胞の５％未満という最小のアポトーシスの誘導を示した。（非感染対照細胞およびＴＮＦ−α処理しない感染細胞も、５％未満のアポトーシスの誘導を示した。）対照的に、ＡｄＶ：ＩκＢｓｄ細胞は７５％を超える細胞においてアポトーシスの誘導を示した。したがって、ＡｄＶ：ＩκＢｓｄがマクロファージにおいてＮＦκＢシグナル経路を効果的に阻害することが示される。
【００３１】
実施例：ＡｄＶ：ＩκＢｓｄを用いた樹状細胞におけるＮＦκＢシグナル経路の阻害
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化型ヒト樹状細胞（「ｉＤＣ」）のＮＦκＢシグナル経路の阻害作用を測定した。図３Ａは、ＩκＢｓｄにＮＦκＢシグナル経路を阻害させ、リポ多糖体（「ＬＰＳ」）またはＣＤ４０リガンド（「ＣＤ４０Ｌ」）で活性化したときのｉＤＣのシグナル経路を示す概略図である。ＬＰＳはＴＬＲ４を活性化し、ＣＤ４０ＬはＣＤ４０を活性化する。
【００３２】
本実施例では、以下の通りにしてｉＤＣを得た。最初に、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を得た。密度勾配遠心分離培地の１つはＦＩＣＯＬＬ  ＰＡＱＵＥであり、アマシャムバイオサイエンスから市販されている。その後、非単球の磁気減少（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により単球をＰＢＭＣから単離した。最後に、ＩＬ４およびＧＭ−ＧＳＦで６日間単球を処理することにより、単球からｉＤＣを単離した。
【００３３】
本実施例では、単離したｉＤＣの静止培養物を、（１）偽感染させるか、（２）対照として１００ＭＯＩでＡｄＶ：ＧＦＰに感染させるか、または（３）１００ＭＯＩでＡｄＶ：ＩκＢｓｄに感染させた。（本発明の目的では、「感染効率」（「ＭＯＩ」）は、感染させた細胞に対する感染単位の割合を指す。特に特定しない場合、感染効率はＨＥＫ２９３  Ｔ細胞に対する感染単位の割合として表す。）１６〜２４時間インキュベート後、ｉＤＣの各セットを、（１）偽活性化するか、（２）１μｇ／ｍｌ濃度のＬＰＳで活性化するか、または（３）１μｇ／ｍｌ濃度のＣＤ４０Ｌで活性化させた。ｉＤＣ成熟の間の炎症性サイトカイン発現におけるＮＦκＢ活性化の阻害作用を、様々なサイトカイン分泌に関するサイトメトリ・ビーズ・アッセイだけでなく、選択的サイトカインおよびケモカインのリアルタイムＰＣＲ分析でも試験した。活性化の４〜８時間後に、ＲＮＡを抽出し、様々なサイトカインおよびケモカインのサイトカイン発現レベルをＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲで測定した。また、活性化の８時間後に上清を集め、サイトメトリ・ビーズ・アッセイでサイトカイン分泌を調べた。
【００３４】
図３Ｂは、ＡｄＶ：ＧＦＰ感染細胞と比較した、ＡｄＶ：ＩκＢｓｄ感染細胞における選択的サイトカインの発現を示す図である。本実施例では、ＡｄＶ：ＩκＢｓｄが、活性化樹状細胞においてＮＦκＢシグナル経路を効果的に阻害することを示している。特に、この図は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６発現の顕著な減少を示している。
【００３５】
実施例：ＡｄＶ：ＩκＢｓｄとＳ０１０１６２７の比較
本実施例では、超優性ＩｋＢまたは既知のＩｋＢキナーゼ・ベータ阻害化合物のＳ０１０１６２７のいずれかの発現による阻害の並列比較により、ＬＰＳまたはＣＤ４０リガンドによる樹状細胞活性化の間のＮＦｋＢシグナル経路の阻害について包括的研究を行った。本実施例では、ｉＤＣを、（１）偽感染させるか、（２）対照としてＡｄＶ：ＧＦＰに感染させるか、または（３）ＡｄＶ：ＩｋＢｓｄに１２時間感染させて、次いでＬＰＳまたはＣＤ４０Ｌによる刺激を付与した。刺激時、非感染ｉＤＣをＳ０１０１６２７で処理した。刺激の８時間後に、上清および細胞を集め、それぞれに炎症性サイトカインに関するサイトメトリ・ビーズ・アッセイおよび選択的サイトカイン／ケモカイン発現に関するリアルタイムＰＣＲのための処理を行う。サイトカインおよびケモカインの発現について、リアルタイムＰＣＲデータをそれぞれ表１および表２に示す。
【００３６】
【表１】
2007512839.tif 000003
【００３７】
【表２】
2007512839.tif 000004
【００３８】
これらの結果は、化合物Ｓ０１０１６２７と比較して、高効率のＮＦκＢシグナル経路の阻害およびトランスフェクションを示している。
【００３９】
実施例：選択的炎症関連シス・エレメントの制御下でレポーター遺伝子または調節遺伝子を発現する能力を持つ組換えアデノウイルスの産生
本実施例では、炎症に関連するシグナル経路のマッピングのための組換えアデノウイルス・コンストラクトの構築について説明する。後の実施例でその使用について述べる。本実施例では、ＢＤバイオサイエンス・クロンテックから市販されているＢＤ  ＡＤＥＮＯ−Ｘポリヌクレオチドを基に組換えアデノウイルスを構築する。他の組換えアデノウイルスの使用は予期され、ＡＤＥＮＯ−Ｘの使用に限定されると考えるべきではない。ＡＤＥＮＯ−ＸウイルスＤＮＡは約３３ｋｂ長である。アデノウイルス５型ゲノム由来であり、アデノウイルスのＥ１領域およびＥ３領域の大部分を取り除くことにより改変されている。図４は、組換えアデノウイルスベクターおよびそこに挿入されたプロモーター／レポーター・システムの概略図である。
【００４０】
図４に示すように、インサートは、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子に動作可能に連結されたシス作用エンハンサー・エレメントの上流に転写ブロッカーを含む。図４に示した６つのシス・エレメントは例であり、これらに限定されない。ここに記載していない他のシス・エレメントを利用してもよいことは予期される。他のレポーター遺伝子をルシフェラーゼの代わりに利用してもよいことは予期される。このインサートがレポーター遺伝子の代わりにＩκＢｓｄ超優性変異体などの調節遺伝子を含むことも予期される。
【００４１】
図４に示すように、インサートを組換えアデノウイルスのＥ１領域でクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることにより、この組換えアデノウイルス・コンストラクトを回収し、増幅して高力価のアデノウイルス・ストックを生成した。２サイクルの増幅で、ＨＥＫ２９３において約１×１０9ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価が常に得られた。
【００４２】
実施例：レポーター組換えアデノウイルスによる初代ヒト免疫細胞の感染
本実施例では、特定のシス・エレメントの制御下でレポーター遺伝子を発現する能力を持つ組換えアデノウイルスを、特定のシグナル経路のマッピングに用いた。表３にこれらの組換えアデノウイルスを産出するのに使用する炎症関連シス・エレメントを、それぞれの転写因子およびシグナル経路とともに記載する。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
本実施例では、前の実施例のレポーター組換えアデノウイルスを初代ヒト免疫細胞の感染に用いた。その後、感染細胞に刺激を与え、その刺激に応じたレポーター活性を観察した。
【００４５】
感染細胞に付与する刺激は、感染細胞の型により決まる。例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞には、ＰＭＡ／イオノマイシン（「ＰＩ」）、またはタンパク質Ｇの存在下のＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体のいずれかを用いて刺激を与える。また、ＣＤ１４+単球由来プレート付着マクロファージなどのマクロファージには、リポ多糖体（「ＬＰＳ」）を用いて刺激を与える。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化型樹状細胞などの樹状細胞には、ＬＰＳを用いて刺激を与える。
【００４６】
刺激の一定時間後、細胞を集め、ルシフェラーゼ活性を測定した。光子発生基質を用いてルミノメーターで光子検出を行う酵素アッセイにより、ルシフェラーゼ活性の測定が可能である。
【００４７】
本実施例では、ＣＤ４+Ｔ細胞を以下の通りに調製した。最初に、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を得た。密度勾配遠心分離培地の１つはＦＩＣＯＬＬ  ＰＡＱＵＥであり、アマシャムバイオサイエンスから市販されている。その後、ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＣＤ８+Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の磁気減少によりＰＢＭＣから単離した。
【００４８】
本実施例では、単離したＣＤ４+Ｔ細胞の静止培養物を、特定のシス・エレメントの制御下で転写されるルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させた。本実施例では、各コンストラクトが４つのシス・エレメント：ＣＲＥ、ＡＰ−１、ＮＦκＢ、およびＩＳＲＥのうちの１つを含む、４種の組換えアデノウイルス・コンストラクトを、４つの別々の休止ＣＤ４+Ｔ細胞培養物に感染させるのに使用した。感染後１６時間インキュベーションした後、細胞に（１）偽刺激を与える（「Ｃ」）か、（２）２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび０．５ｕｇ／ｍｌのイオノマイシンで刺激を与える（「ＰＩ」）か、または（３）１０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂ、５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ｍＡｂ、および１０ｕｇ／ｍｌのタンパク質Ｇ（「３−２８」）で刺激を与えた。刺激後８時間、２４時間、および４８時間で細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルミノメーターでルシフェラーゼ活性を測定することができる。図５Ａは、ＣＲＥシス・エレメントを含む組換えアデノウイルスに感染させたＣＤ４+Ｔ細胞のルシフェラーゼ活性を示す図である。図５Ｂは、ＡＰ−１シス・エレメントを含む組換えアデノウイルスに感染させたＣＤ４+Ｔ細胞のルシフェラーゼ活性を示す図である。図５Ｃは、ＮＦκＢシス・エレメントを含む組換えアデノウイルスに感染させたＣＤ４+Ｔ細胞のルシフェラーゼ活性を示す図である。図５Ｄは、ＩＳＲＥシス・エレメントを含む組換えアデノウイルスに感染させたＣＤ４+Ｔ細胞のルシフェラーゼ活性を示す図である。これらの図により、ＰＩ刺激４８時間後のＣＲＥシス・エレメントおよびＡＰ−１シス・エレメントの顕著な活性化が示され、ならびにシス・エレメントと刺激の他の組合せでは、顕著な活性化がまったく見られない。
【００４９】
ＣＤ１４+プレート付着マクロファージで同様の試験を行った。本実施例では、マクロファージを以下の通りにして得た。最初に、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を得た。密度勾配遠心分離培地の１つはＦＩＣＯＬＬ  ＰＡＱＵＥであり、アマシャムバイオサイエンスから市販されている。その後、非単球の磁気減少によりＰＢＭＣから単球を単離した。最終的に、ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）不在下で組織培養平板にこの単球を付着させ、この単球からマクロファージを単離した。
【００５０】
本実施例では、単離したマクロファージの静止培養物を、特定のシス・エレメントの制御下で転写されるルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させた。本実施例では、各コンストラクトが４つのシス・エレメント：ＣＲＥ、ＡＰ−１、ＮＦκＢ、およびＩＳＲＥのうちの１つを含む、４種の組換えアデノウイルス・コンストラクトを、４つの別々のマクロファージ培養物に感染させるのに使用した。１００／細胞ＭＯＩでマクロファージを感染させた。感染後１６時間インキュベーションした後、マクロファージに偽刺激を与える（「対照」）か、１μｇ／ｍｌ濃度のリポ多糖体（「ＬＰＳ」）で刺激を与えた。刺激後２４時間で細胞を収集し、ルミノメーターでルシフェラーゼ活性を測定した。図６Ａは、ＡＰ−１シス・エレメント、ＣＲＥシス・エレメント、ＩＳＲＥシス・エレメント、およびＮＦκＢシス・エレメントをそれぞれ含む４種の組換えアデノウイルスのうちの１種に感染させたマクロファージの４つの群のルシフェラーゼ活性を示す図である。この図により、ＡＰ−１シス・エレメントおよびＣＲＥシス・エレメントにおける顕著な刺激による活性化とともに顕著な基礎レベルの活性化が示される。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化型樹状細胞（「ｉＤＣ」）で同様の試験を行った。本実施例では、ｉＤＣを以下の通りにして得た。最初に、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を得た。密度勾配遠心分離培地の１つはＦＩＣＯＬＬ  ＰＡＱＵＥであり、アマシャムバイオサイエンスから市販されている。その後、非単球の磁気減少によりＰＢＭＣから単球を単離した。最終的に、ＩＬ４およびＧＭ−ＧＳＦで６日間単球を処理することにより、この単球からｉＤＣを単離した。
【００５２】
本実施例では、単離したｉＤＣの静止培養物を、特定のシス・エレメントの制御下で転写されるルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させた。本実施例では、各コンストラクトが３つのシス・エレメント：ＡＰ−１、ＮＦκＢ、およびＩＳＲＥのうちの１つを含む、３種の組換えアデノウイルス・コンストラクトを、３つの別々のｉＤＣ培養物に感染させるのに使用した。１００／細胞ＭＯＩでｉＤＣを感染させる。感染後１６時間インキュベーションした後、ｉＤＣに偽刺激を与える（「Ｃ」）か、１μｇ／ｍｌ濃度のリポ多糖体（「ＬＰＳ」）で刺激を与えた。刺激後２時間、４時間、８時間、および２４時間で細胞を収集し、ルミノメーターでルシフェラーゼ活性を測定する。図６Ｂには、ＡＰ−１、ＮＦκＢ、およびＩＳＲＥ刺激の経時変化をそれぞれ示す３つの図がある。これらの図により、３種すべてのシス・エレメントに関して顕著な刺激が示される。これらの図により、活性の様々な経時変化も示される。
【００５３】
実施例：創薬プロセスで可能な標的バリデーションおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ化合物に関するアデノウイルス・レポーター・システムの使用
前の実施例で、特定の刺激時の初代ヒト免疫細胞における転写因子の経時的な活性化とともに選択的な活性化が示された。これらの結果は、創薬プロセスで可能な標的バリデーションおよび化合物に関して、アデノウイルスベースの転写因子活性化レポーター・システムの使用を可能にする。図７Ａおよび図７Ｂは、このプロセスを示す概略図である。
【００５４】
本実施例では、標的細胞を、図７Ａおよび図７Ｂの１〜６列に示す様々な組換えアデノウイルス・レポーターに感染させる。その後、培養物に刺激を加える。特定時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性を測定する。塗りつぶした円は仮定上のルシフェラーゼ活性を表す。刺激による処理がないと、ルシフェラーゼ活性はまったく示されないか、または検出限界を下回る。その応答エレメントに対する転写因子の結合、例えばＡＰ−１エンハンサー・エレメントに対するｃ−ｊｕｎの結合を刺激が活性化する場合、転写が誘導され、ルシフェラーゼ活性の検出が可能である。図７ＡのＡ行およびＢ行で表される異なる刺激は、異なるシグナル経路を活性化し得る。
【００５５】
これを確立すれば、レポーター・アデノウイルスと併せて、標的遺伝子のドミナント・ネガティブ変異体、例えばＩκＢｓｄの重感染を起こすことができる。標的が潜在的に関与する特定のシグナル経路を活性化すると、特定の刺激時にその活性が減少する（そして、ルシフェラーゼ活性の減少として示される）ことがある。図７Ｂは、ドミナント・ネガティブ変異体の重感染の有無における組換えアデノウイルス・レポーター活性を示す概略図である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ａは緑色蛍光タンパク質を発現する能力がある組換えアデノウイルス（「ＡｄＶ：ＧＦＰ」）でトランスフェクトされたマクロファージを示す図であり、Ｂは緑色蛍光タンパク質を発現する能力がある組換えアデノウイルス（「ＡｄＶ：ＧＦＰ」）でトランスフェクトされた樹状細胞を示す図であり、ＣはＴリンパ球における緑色蛍光タンパク質の発現を示す図であり、ＤはＢリンパ球における緑色蛍光タンパク質の発現を示す図である。
【図２】２種の別々の細胞培養物の細胞を示し、一方はＩκＢ超優性変異体を発現する能力のある組換えアデノウイルス（「Ａｄｖ：ＩκＢｓｄ」）でトランスフェクトされた細胞、もう一方は緑色蛍光タンパク質を発現する能力のある組換えアデノウイルス（「ＡｄＶ：ＧＦＰ」）でトランスフェクトされた細胞であり、それぞれを位相コントラストおよびヨウ化プロピジウム染色で表す図である。
【図３】ＡはＮＦκＢシグナル経路を阻害するＩκＢ超優性変異体（「ＩκＢｓｄ」）を示す概略図であり、Ｂは樹状細胞が成熟する間の炎症性サイトカイン発現におけるＮＦκＢ活性化の阻害作用を示す図である。
【図４】組換えアデノウイルスベースのプロモーター／レポーター・システムを示す概略図である。
【図５】Ａは刺激時のＣＤ４+Ｔ細胞のＣＲＥシス・エレメントの活性化を示す図であり、Ｂは刺激時のＣＤ４+Ｔ細胞のＡＰ−１シス・エレメントの活性化を示す図であり、Ｃは刺激時のＣＤ４+Ｔ細胞のＮＦκＢシス・エレメントの活性化を示す図であり、Ｄは刺激時のＣＤ４+Ｔ細胞のＩＳＲＥシス・エレメントの活性化を示す図である。
【図６】Ａはマクロファージのシス・エレメントの活性化を示す図であり、Ｂは樹状細胞のシス・エレメントの活性化を示す図である。
【図７Ａ】仮定上の経路マッピング試験の結果を示す概略図である。
【図７Ｂ】仮定上の経路マッピング試験の結果を示す概略図である。
【図１】
2007512839.tif 000006
【図２】
2007512839.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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