(57)【要約】  ニックに変換可能な構造異常を含む核酸分子を選択的に検出するための方法であって、選択された核酸基質集団から線状核酸を生成し；前記線状核酸を変性およびリアニーリングして核酸二本鎖を形成し；前記核酸二本鎖の末端と内部の構造的異常とをマスキング成分でマスクし；マスクされた核酸を、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素を使用してその中にニックを導入することによって修飾し；修飾された核酸を、核酸ポリメラーゼ活性を呈する少なくとも１つの酵素による核酸ニックトランスレーションによって標識ヌクレオチドで標識化し；標識化された核酸を選択および同定することを含んでなる、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニックに変換可能な構造的特徴を含む核酸分子を選択的に検出するための方法であって、
ａ）選択された核酸基質集団から線状核酸を生成し、
ｂ）前記線状核酸分子を変性およびリアニーリングして核酸二本鎖を形成し、
ｃ）前記核酸二本鎖の末端と内部の構造的特徴とをマスキング成分でマスクし、
ｄ）マスクされた核酸を、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素を用いてその中にニックを導入することによって修飾し、
ｅ）修飾された核酸を、核酸ポリメラーゼ活性を呈する少なくとも１種の酵素による核酸ニックトランスレーションによって標識ヌクレオチドで標識化し、
ｆ）標識化された核酸を選択および同定する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記核酸基質集団が、天然供給源または合成供給源から得られるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸基質集団が、真核生物から得られるもの、例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ、原核生物から得られるもの、例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ、合成核酸、例えばプラスミドベクターもしくは合成ベクター、ペプチド核酸、またはＲＮＡウイルスもしくはＤＮＡウイルスサンプルから得られるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記マスキング成分が、５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有すると共に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いた少なくとも１種の酵素であり、且つ、該酵素によって認識可能な前記核酸二本鎖の核酸二本鎖末端およびその内部の構造的特徴への、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などのヌクレオチド成分の付加を触媒することができるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチド成分が、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）などのジデオキシヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である保護基の組み込みが、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性を有すると共に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いた２種以上の酵素により行われる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ酵素である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記マスキング工程が、３７℃〜６０℃の範囲の温度、例えば４５℃〜５５℃の範囲の温度、好ましくは４８℃〜５２℃の範囲の温度で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記マスキング工程が、約３０分〜１８時間、例えば４５分〜１０時間の時間間隔、好ましくは約６０分〜１２０分の時間間隔で行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
マスクされた核酸の認識および修飾が、少なくとも１種のミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素を使用して、短いインキュベーション期間で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素が、Ｃｅｌ１「ＳＵＲＶＥＹＯＲ」などのＣｅｌ１ミスマッチヌクレアーゼ、およびＳ１ヌクレアーゼまたはマングビーン・ヌクレアーゼなどの一本鎖特異的エンドヌクレアーゼからなる群から選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベーション期間が約２〜７分である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーション温度が約３７℃〜４５℃の範囲である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ヘテロ二本鎖ＮＡ分子の認識および修飾が化学反応によって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
修飾された核酸の標識化が、ＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて行われる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド標識がビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標識化された核酸の選択が、ストレプトアビジンで被覆した磁性粒子を用いて行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
標識化された核酸がＰＣＲを用いて同定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質集団がＲＮＡからなるものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質集団がＤＮＡからなるものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸基質集団が、非天然構造を有すると共に、天然の核酸分子と相互作用することができるペプチド核酸分子からなるものである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸基質集団が、真核生物、原核生物、ウイルスおよびプラスミド核酸のいずれかの混合物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記基質核酸分子が、直接抽出によって得られるか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅によって得られるか、または合成により得られるものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
線状化核酸分子の集団を調製するための手段；少なくとも一種のマスキング剤；少なくとも一種のマスキング成分；エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種のニッキング酵素；少なくとも１種の標識化剤；ならびに核酸ポリメラーゼ活性を有するか、またはこれを呈する少なくとも１種の酵素調製物を含んでなる、本発明による方法で使用するのに適したキット。
【請求項２５】
ｄｄＧＴＰなどのジデオキシヌクレオチドおよびＡＺＴなどの他のヌクレオチド類似体から選択されるマスキング剤をさらに含んでなる、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
酵素的マスキング成分または化学的マスキング調製物をさらに含んでなる、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有すると共に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いた少なくとも１種の酵素であり、且つ、該酵素によって認識可能な前記核酸二本鎖の核酸二本鎖末端およびその内部の構造的特徴への、ヌクレオチド類似体などのヌクレオチド成分の付加を触媒することができる酵素的マスキング成分を含む、請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種のニッキング酵素を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
標識化剤としてビオチンを含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
核酸ポリメラーゼ活性を呈する酵素調製物を含み、該酵素調製物が、ＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡターミナルデオキシヌレオチジルトランスフェラーゼから選択される、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、機能ゲノミクスおよびそこで使用される方法に関する。特に、核酸（ＮＡ）内の異型構造、例えば突然変異または多型の検出方法、およびそのためのキットを提供する。
【０００２】
背景技術
工業規模でのＤＮＡ配列決定などの最近の技術の進歩により、最も単純な生命体からヒトなどの最も複雑なものまで、多数のゲノムの全配列を特徴付けることが可能となっている。この情報により、例えば進化、疾患の遺伝学的分析および遺伝学的同定への見識が得られ始めている。これらの技術は、薬理学および予防医学や法医学などの分野で使用するべく、主たる進歩を遂げてきた。
【０００３】
ゲノム分析技術の適用における顕著な成長領域は、遺伝性および散発性の双方の疾患の診断である。多くの疾患は、多くの場合には遺伝子構造の変化を通じて、遺伝子機能の欠失または変性により引き起こされる。遺伝子の変性またはその機能の欠失をもたらし得る遺伝子の構造変化は、単一ヌクレオチドの変化または欠失から、数１００万ヌクレオチド長になることもあるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のセグメントの脱離まで様々である。
【０００４】
大きな変化は検出し易い。遺伝子構造に対する小規模な変化を分析するために多種多様な技術が開発されてきた。
【０００５】
小規模な突然変異および多型を検出するための多くの技術は、既知の突然変異を検出するための技術および未知の突然変異を検出するための技術という２つの群に分類される。
【０００６】
既知の突然変異を効率よく検出することは可能であるが、１つの実験で分析可能な個体数および標的配列数を有意に向上させる余地はある。
【０００７】
既知の突然変異を検出するための高感度な方法としては、ＴａｑＭＡＭＡ［Glaab W.E., Skopek T.R. A novel assay for allelic discrimination that combines the 5’ fluorogenic nuclease polymerase chain reaction (TaqMan) and mismatch amplification mutation assay. Mut. Res. 430:1-12]などの１つの所定の対立遺伝子に対して特異的なＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるＰＮＡ（ペプチド核酸）プライマー伸長反応の検出［Sun X., Hung K., Wu L., Sidransky D., B. Guo. Detection of tumour mutations in the presence of excess amounts of normal DNA. Nat. Biotech. 2002 Feb; 19:186-189］が挙げられる。
【０００８】
既知の突然変異を検出するように設計された方法と、新たな突然変異をスクリーニングする方法とを区別することは非常に重要である。
【０００９】
現在、新たな突然変異を探索する際に最も広く利用されている方法の１つは直接的な配列決定であり、これは、ＤＮＡ合成を終了させるためにジデオキシヌクレオシド三リン酸を利用している。
【００１０】
直接的な配列決定により、特異的プライマーで増幅したＮＡにおける変化を同定することが可能となる。しかしながら、直接的な配列決定は比較的高価であり、鋳型をプールする余地がほとんどなく、反応ごとに分析できるＤＮＡの長さがかなり制約される。通常、分析ごとの限界は、３００〜６００塩基対（ｂｐ）である。
【００１１】
それでもなお、巨額な費用にもかかわらず、この方法はヒトゲノムにおける一塩基多型（ＳＮＰ）のデータベースを構築する際に多数用いられてきた。
【００１２】
他の突然変異スクリーニング法は、ＤＮＡの二次構造および配列の相違によって生ずるＤＮＡ二次構造の変化の検出に基づくものである。
【００１３】
このような技術の一例はＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型）であり、これは、ポリアクリルアミドゲル（温度または変性剤勾配を有する）およびＨＰＬＣ分析（高速液体クロマトグラフィ）を用いてヘテロ二本鎖ＮＡ分子とホモ二本鎖ＮＡ分子とを識別できるという事実を活用している［McCallum et al, Targeted screening for induced mutations. Nat. Biotech. 2000 Apr; 18(4): 455-7］。
【００１４】
他の突然変異スクリーニング法は、化学薬剤および酵素を使用してヘテロ二本鎖ＮＡ分子を認識および処理するものであり、これにより識別能力を増大させることを目的としている。
【００１５】
ヘテロ二本鎖ＮＡ分子および異型ＮＡ構造におけるミスマッチの認識は通常２つの方法で行われる：
ａ）化学的には、例えば、Ｃｏｔｔｏｎらの研究［Cotton R.G.H. et al. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair base-mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. (1988) ; Proc Natl Acad Sci USA, 85, 4397-4401］におけるような、ミスマッチ（近接した塩基同士がワトソン・クリック塩基対合則に従っていないＤＮＡの領域）の化学的検出；
ｂ）酵素的には、例えば、ＤＮＡ損傷の部位［Harrison L. et al. (1999); In vitro repair of synthetic ionizing radiation-induced multiply damaged DNA sites. J Mol Biol, 290, 667-684]、およびＤＮＡ誤対合の部位［Oleykowski C.A et al. (1998); Mutation detection using a novel plant endonuclease NAR, 26, 4597-4602］における検出。
【００１６】
ヘテロ二本鎖または異型ＤＮＡ構造の処理により、一方のＤＮＡ鎖が切断される（ニッキング）か、または両方のＤＮＡ鎖が切断される（切断）。
【００１７】
かかる処理により生成した断片の分析は、ホモ二本鎖構造とヘテロ二本鎖構造とを直接識別するよりも容易であり、例えば、シーケンシングゲル中での電気泳動により行うことができる［Oleykowski CA, Bronson Mullins CR, Godwin AK, Yeung AT. Nucleic Acids Res. 1998 Oct 15; 26(20):4597-602; Colbert T, Till BJ, Tompa R, Reynolds S, Steine MN, Yeung AT, McCallum CM, Comai L, Henikoff S, 2001 Jun; 126(2):480-4］。
【００１８】
本発明の完成の日まで、大半の突然変異スクリーニング方法論はヘテロ二本鎖の処理から得られた産物の直接検出に基づくものであると考えられてきた。これは、事実上全ての場合において、変異体断片が、変異していない断片の存在下で分析され、これらの両断片はもとのサンプルにおけるのと同一組成比で存在していることを意味している。
【００１９】
突然変異スクリーニングと、高レベルの検出感度とを組み合わせた方法を説明する２つの特筆すべき例外がある。
【００２０】
第１の例外は、米国特許第６，１７４，６８０号に記載された手順である。この方法は、異型ＤＮＡ構造を脱塩基部位に変換し、次いでこれらの部位を、アフィニティ精製を可能とする分子に共有結合させることによるものである。変異体分子の検出レベルは１％である［Chakrabarti et al. (2000). Highly selective isolation of unknown mutations in diverse DNA fragments: toward new multiplex screening in cancer. Cencer Res. (60)3732-3737］。
【００２１】
第２の例外は、米国特許出願公開第２００３／０２２２１５号およびＷＯ０２／０８６１６９に記載された、ヘテロ二本鎖処理およびＤＮＡアダプターの連結により生成したＤＮＡ断片の増幅に基づく方法である。これらの文献に記載された手順は、認識および処理の後にヘテロ二本鎖分子を増幅することを含む。この手順を行うために、脱リン酸化された５’末端を有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。ヘテロ二本鎖分子をミスマッチ部位で切断すると、前から存在している末端とは対照的に、リン酸化された新たな末端が出現する。
【００２２】
合成アダプターは、これらの新たに生成された末端に特異的に連結される。処理されたヘテロ二本鎖分子は、ＰＣＲ反応において、合成アダプターに特異的なプライマーと、ＤＮＡ断片に特異的なプライマーとを用いて、増幅産物を得ることにより識別できる。この第２の方法を使用すると、混合物全体の１％に相当する変異体の検出が可能となる。［Zhang Y., Kaur M., Price B.D., Tetradis S., Makrigiorgos G.M., An amplification and ligation based method to scan for unknown mutations in DNA. Hum Mutat. 2002 Aug; 20(2):139-47］。
【００２３】
ＮＡ構造を幾つかの酵素の活性に対して不活性にさせることは、以前より他の突然変異検出法における特徴であった。
【００２４】
ＮＡ構造を不活性にさせるための、従来技術に記載された様々な方法は、基本的には本発明に記載された方法とは異なる。
【００２５】
米国特許出願公開第２００３／００２２２１５号（同様に、ＷＯ０２／０８６１６９）には、ＤＮＡのオリゴ／アダプターと、３’末端上のジデオキシヌクレオチドとを連結することにより、遊離ｄＮＴＰの不存在下でＤＮＡポリメラーゼによって行われるピロリン酸化プロセス（ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性）から断片を保護することが記載されている。
【００２６】
ＷＯ９６／４１００２には、連結を阻害するための脱リン酸化、ホモポリマーテイルの付加および修飾二本鎖ＤＮＡの連結によりＤＮＡ末端をブロックする可能性が教示されている。
【００２７】
ニックトランスレーションは、伝統的な分子生物学的方法であり、ＤＮＡを標識化するための一般的な手法として使用されており、Ｗｏｎｇが更に発展させたものである。Ｗｏｎｇ（米国特許出願公開第２００２／０１８７５０８号）には、ニックトランスレーションを使用して、（蛍光基、蛍光物質または放射性物質に連結可能な基などを組み込むことにより）検出可能な基でＤＮＡ分子を標識化し得ること、および分子を検出するために使用可能な器具が記載されている。
【００２８】
米国特許出願公開第２００２／０１８７５０８号の方法は、本発明の手順には適用できない。その理由は、標識分子は直接的に検出され、選択されないので、前記方法で用いられた酵素反応が作用すると考えられるからである。この方法は、本出願に記載されたものとは根本的に異なる手順である。米国特許出願公開第２００２／０１８７５０８号には、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ末端とは反応しないことが記載されている。
【００２９】
この記述は、本発明において行われ、記載された観察とは相応しないようである。
【００３０】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた「ＤＮＡニックトランスレーション」反応中、ｄｄＧＴＰを用いてＤＮＡ分子のＤＮＡ末端および損傷をブロックすることについて言及すると、本明細書で後述される一連の所定の態様が確立される必要がある。
【００３１】
酵素活性に対してＤＮＡ構造をブロックするための技術水準を構成する前述の方法は、本発明には適用できない。
【００３２】
米国特許出願公開第２００３／００２２２１５号（同様に、ＷＯ０２／０８６１６９）では、後に用いられる酵素の活性をブロックする分子を含有する合成ＤＮＡ断片の連結が採用されている。
【００３３】
ＤＮＡリガーゼの使用は、本発明による方法とは相容れないものである。本発明を実施可能とするには、核酸末端だけでなく、核酸分子内の内部損傷をもブロッキング（マスキング）することが必要である。典型的には、かかる核酸分子はＤＮＡを含む。
【００３４】
ＷＯ９６／４１００には、固体支持体に固着された対照サンプルに対して突然変異探索の対象となるサンプルをハイブリダイズさせることによって最初に形成されたヘテロ二本鎖分子を使用することが記載されている。その後、これらの分子は切断され、そのようにして生成した断片にアダプターが接合される。次いで、これらの断片は、アダプターに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて直接的に配列決定される。
【００３５】
幾つかの面では、ＷＯ９６／４１００のプロトコルは、米国特許出願公開第２００３／００２２２１５号（同様に、ＷＯ０２／０８６１６９）に記載されているプロトコルに類似している。いずれのプロトコルも、ヘテロ二本鎖領域を認識する際、ＤＮＡが切断された部位にアダプター分子を接合することを必要としている。
【００３６】
これら２つの従来技術の方法の差異は、ヘテロ二本鎖の切断が行われる前に存在するもとのＤＮＡ末端に対してアダプターを接合させないようにするための、ＷＯ９６／４１００が採用する追加のブロッキング工程から生じる。ＷＯ９６／４１００ではまた、ホモポリマーデオキシヌクレオチドテイルの追加、および修飾二本鎖ＤＮＡを用いた最初の連結工程も想定されている。
【００３７】
米国特許出願公開第２００３／００２２２１５号（同様に、ＷＯ０２／０８６１６９）では、５’リン酸基を欠いているために、連結反応に対する鋳型とはならないヘテロ二本鎖分子が使用されている。
【００３８】
ＷＯ９６／４１００に記載された手順では、連結工程後、ＤＮＡが変性され、固体基板に結合した部分が除去される。残りの断片は、アダプターに相補的なプライマーを使用して直接的に配列決定され、ヘテロ二本鎖分子に連結される。
【００３９】
最後に、配列決定反応は、標準のジデオキシヌクレオチド配列決定化学を用いて行われる。しかしながら、この方法を用いると、参照ＤＮＡのいずれかの鎖が、例えば非選択的な様式で固体支持体に結合する際、参照ＤＮＡはＷＯ９６／４１００に記載されているようにビオチン化プライマーで増幅されているため、二本の鎖はまとまりのない混合物として解読されるので、直接的な配列決定は不可能である。
【００４０】
Ｌｕｃｈｎｉａｋら［Biotech Histochem. 2002 Jan; 77(1):15-9］は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、植物中の全染色体（全細胞および染色体調製物の両方）のＤＮＡ内にある望ましくないニックのｉｎ  ｓｉｔｕニックトランスレーションを阻止することを報告している。
【００４１】
Ｌｕｃｈｎｉａｋらは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩよりもＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの方を好んで使用し、この手順を行っている。その理由は、ＤＮＡポリメラーゼＩに付随する３’−５’エンドヌクレアーゼ活性が、ブロッキング工程に組み込まれるｄｄＧＴＰを排除し得るからである。
【００４２】
Ｌｕｃｈｎｉａｋらによる研究では、ＤＮＡ末端は関連しない。その概念は、細胞壁の透過化処理のために用いられる酵素調製物に不可避的に付随する、ＤＮＡを分解する混入物の作用によってＤＮＡに生ずるニックをブロックするというものである。
【００４３】
これに対し、本発明では、核酸末端、典型的にはＤＮＡ末端が最も重要となる。故に、酵素活性を付与するためのＴａｑポリメラーゼの選択は、Ｌｕｃｈｎｉａｋらが記載したものと基本的に異なる論理的根拠に基づいている。
【００４４】
例えば、本発明において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’ＤＮＡエキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性に加え、ＤＮＡターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する。
【００４５】
よって、本発明では、ジデオキシヌクレオシド三リン酸を使用して、標識化反応中、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに付随する全ての触媒活性から、ＤＮＡ末端および前から存在しているあらゆるＤＮＡ損傷をマスクしてもよい。
【００４６】
Ｌｕｃｈｉａｋらの方法では、保護およびその後のニックトランスレーションは６２℃で行われる。本発明の実施例では、Ｌｕｃｈｎｉａｋらが記載する反応条件が本明細書に記載される方法においては機能的ではないことが明確に示されている。
【００４７】
異型構造の認識および処理が望ましい様式で進行するためには、本明細書で概説されるように、本発明による方法において複数のパラメータを規定しなければならない。例えば、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部位の認識は、Ｃｅｌ  Ｉヌクレアーゼ（ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）として市販されている）（または、マングビーン・ヌクレアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼファミリーの他のメンバーなどの一本鎖特異的ヌクレアーゼ）によって、本明細書に記載されるような短いインキュベーション時間などの好ましい条件下で行うことができる。
【００４８】
米国特許第６，３９１，５５７号および米国特許第５，８６９，２４５号には、Ｃｅｌ  Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に基づく突然変異検出法が記載されている。
【００４９】
本発明による方法では酵素Ｃｅｌ  Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））を使用することができるが、この酵素の使用は、ミスマッチ含有部位にニックを生成する一般的な方法の一例であることに着目すべきである。
【００５０】
本発明においてミスマッチエンドヌクレアーゼが機能するには、それらは一本鎖ニックを生成しなければならず、生成された３’ＯＨ（水酸化物）ＤＮＡ末端が相補鎖と完全に一致しなければならない。３’位にミスマッチがある場合、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、１００〜１００００００倍低減したポリメラーゼ活性を呈する［Huang MM et al., Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20(17):4567-73］。
【００５１】
本明細書に開示された手順において、Ｃｅｌ  Ｉ／ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）を適用してミスマッチを含有するＤＮＡにニックを生成する際、以前はこの酵素に起因すると考えられていなかった活性が使用される［Oleykowski CA, Bronson Mullins CR, Godwin AK, Yeung AT. Nucleic Acids Res. 1998 Oct 15; 26(20): 4597-602］。２つの形式的な可能性がある：（記載された３’エンドヌクレアーゼ活性に加えて）ミスマッチに対して有意な５’エンドヌクレアーゼ活性があるか、またはミスマッチに対する３’ニッキング活性と、その後に、（少なくとも）ミスマッチ部位を除去するヌクレアーゼ活性がある、というものである。
【００５２】
３’ニッキング活性しかない場合、その構造は、その後にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される標識化に適した基質を構成しない。
【００５３】
ＤＮＡのニックを生成するのに使用される薬剤は、それ自体は本発明の主題ではない。ＷＯ９７／４６７０１（同様に、米国特許第５，８６９，２４５号）に記載される手順では、Ｃｅｌ  Ｉ酵素によるミスマッチ認識活性の特異性が、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡへリカーゼ、３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼおよびＤＮＡ末端と結合するタンパク質のような他の酵素、またはかかる酵素の組み合わせと共にそれを使用することによって増大され得ることが記載されている。
【００５４】
このため、本発明者らは、ＷＯ９７／４６７０１（同様に、米国特許第５，８６９，２４５号）に記載の手順と、本発明に記載されるような、ニックを有する二本鎖ＤＮＡの生成の前におけるＤＮＡ保護手順との差異を重視している。
【００５５】
ＷＯ９７／４６７０１では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがＣｅｌ  Ｉの反応に添加されると、Ｃｅｌ  Ｉの特異性が高まることが一例として提示されている。その請求の範囲には、追加の酵素を添加する目的は、Ｃｅｌ  Ｉ酵素によって行われるニッキング反応の非特異的作用を低減するか、またはその回転率を増大することであると記載されている。
【００５６】
本発明の目的は、未知の突然変異を探索する能力と、かかる突然変異を検出するための向上した感度とを組み合わせた、今日までの既知の方法と比較して高感度な方法を提供することである。
【００５７】
本発明の更なる目的は、異型構造（非ワトソン・クリック塩基対合など）を含有する分子の特異的な標識および回収を可能とする方法を提供することである。故に、異型ＤＮＡ構造の検出は、今日までのその他のスクリーニング法よりもかなり高い感度で行うことができる。
【００５８】
本発明の更なる目的は、一本鎖の切れ目（ニック）に変換され得る任意のタイプの異型ＮＡ構造を検出するための高感度な手順を提供することである。
【００５９】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の説明および実施例から明白になろう。
【発明の開示】
【００６０】
ニックに変換可能な異型構造は、典型的にはヘテロ二本鎖ＮＡと、このＮＡが受ける任意のタイプの損傷である。本発明で開発された手順は、ヘテロ二本鎖などの異型ＮＡ構造を検出するための改良手法を提供する。
【００６１】
本発明による方法は、後に行われる標識化工程において望ましくない反応性部位を非反応性にするブロッキング基を組み込むことによってＮＡ上の当該部位をマスクするものであり、それにより本方法の特異性に寄与している。
【００６２】
本発明による方法は、従来技術に記載した方法を創意的に改良するものである。従来技術の方法を越える利点としては、ある集団における検出限界を１％未満に伸ばすこと、およびニックに変換可能な任意のタイプの異型ＮＡ構造を同定するための能力を提供することが挙げられる。かかる利点は、本明細書中で詳細に述べる。
【００６３】
本発明は、米国特許第６，３９１，５５７号および米国特許第５，８６９，２４５号に記載される方法を改良するものである。
【００６４】
本発明によれば、ニックに変換可能な構造的特徴を含む核酸分子を選択的に検出するための方法が提供され、この方法は、
ａ）選択された核酸基質集団から線状核酸を生成し、
ｂ）前記線状核酸を変性およびリアニーリングして核酸二本鎖を形成し、
ｃ）前記核酸二本鎖の末端と内部の構造的特徴とをマスキング成分でマスクし、
ｄ）マスクされた核酸を、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素を用いてその中にニックを導入することによって修飾し、
ｅ）修飾された核酸を、核酸ポリメラーゼ活性を呈する少なくとも１種の酵素による核酸ニックトランスレーションによって標識ヌクレオチドで標識化し、
ｆ）標識化された核酸を選択および同定する
ことを含む。
【００６５】
よって、工程ａ）について、核酸基質集団からの線状核酸集団の調製、例えばＤＮＡ基質集団からの線状ＤＮＡの調製は、例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなどの忠実性の高いＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行い、その後変性および再生を行い、従来の手順を用いてホモ二本鎖および／またはヘテロ二本鎖分子を形成することによって行うことができる［Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press］。核酸基質集団は、天然または合成のあらゆる核酸供給源に由来し、そこから選択され、またはそこから得られるものであってもよく、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成核酸（例えばｃＤＮＡ）、ペプチド核酸供給源、合成された非ウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ、天然のウイルスＲＮＡ、ミトコンドリアまたはプラスチド核酸などから得られるものであってもよい。あらゆる好適な供給源から得られた古代ＤＮＡなどの損傷したＤＮＡも鋳型として機能し得る。「ＲＮＡ」および「ＤＮＡ」は、文脈において別の意味を必要としない限り、天然および／または合成供給源の両方を指すものと理解すべきである。故に、核酸基質集団は、哺乳類、真菌類、酵母または植物（高次および／または低次の植物）供給源などの真核生物供給源、ウイルス供給源または原核生物供給源、即ち細菌供給源に由来し、そこから得られ、または採取することができる。基質核酸集団は、健康な組織または機能障害組織の生検サンプルからのような、あらゆる従来の手段によって得ることもできる。その後、核酸二本鎖内の核酸末端および内部異常はマスクされるか、または保護されて、その後の工程における非特異的な標識化が阻止される。マスキングは、本明細書中で規定されるようなマスキング成分として好適な酵素を使用して、ＤＮＡ鎖を終結させるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（ジデオキシヌクレオシド三リン酸またはアジドチミジン）の酵素的組み込みによって達成することができる。酵素的マスキングの代替手法は、その後の標識化手順においてＤＮＡ末端および内部異常を非反応性にするあらゆる直接的な従来型の化学的変換によるものであってもよい。
【００６６】
典型的なマスキング条件としては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーション反応において、ｄｄＧＴＰのようなジデオキシヌクレオチド類似体を付加することが挙げられ、インキュベーション期間は、３０分〜１８時間の範囲とすることができ、マスキングは、好ましくは４５分〜１０時間、より好ましくは６０〜１２０分の範囲で行われる。マスキング工程が行われる温度は、３７℃〜６０℃、好ましくは４５℃〜５５℃、より好ましくは４８℃〜５２℃の範囲とすることができる。
【００６７】
核酸二本鎖末端および／またはあらゆる内部の構造異常のマスキングが達成されると、マスクされた核酸分子は、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素、例えばＣｅｌ  Ｉ「ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）」、ミスマッチエンドヌクレアーゼのＣｅｌファミリーのヌクレアーゼ、マングビーン・ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼまたは他の一本鎖特異的エンドヌクレアーゼを用いて、その中にニックを導入することにより修飾される［Till BJ et al., Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases., Nucleic Acids Res. 2004 May 11; 32(8):2632-41］。好ましくは、修飾は、短時間（典型的には２〜７分の範囲）にわたって、低酵素濃度、例えば切断に必要とされる濃度の１０％で行われる（０．１ＴＩＬＬＩＮＧ単位［Till BJ et al., Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases., Nucleic Acids Res. 2004 May 11; 32(8):2632-41に定義される]）。
【００６８】
マスクされた核酸分子が修飾されると、これらの分子は、典型的には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて、核酸ニックトランスレーションにより標識ヌクレオチドで標識化することができる。修飾された核酸分子、例えばＤＮＡ分子の標識化は、元来、天然であれ合成であれ、本明細書に概説されるように修飾された核酸分子と、そのように修飾されていない核酸分子とを識別するために用いられる。次いで、標識化された核酸分子は、例えばストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズまたは粒子を用いて選択され、例えば従来の手順を用いたＰＣＲ増幅により同定される［Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press]。先に概説した個々の工程は既知であり、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を包含する突然変異検出方法論、および核酸分子中の突然変異を検出するための他の様々な方法［M, Iwahana H, Kanazana H, Hayashi K, Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Apr; 86(8): 2766-70]、ＴＩＬＬＩＮＧ突然変異検出システム［McCallum CM, Comai L, Greene EA, Henikoff S. Targeted screening for induced mutations. Nat. Biotechnol. 2000 Apr; 18(4):455-7, Henikoff S, Comai L. Single-nucleotide mutations for plant functional genomics. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 2003 Jun; 54: 375-401］の構成要素となるものである。
【００６９】
先に示したように、本発明者らは、Ｃｅｌ  Ｉヌクレアーゼの補助的な酵素活性を発見している。Ｃｅｌ  Ｉは、二本鎖領域と一本鎖領域との接合部での特異的な開裂によるか、または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により、線状ＤＮＡの３’末端から標識ヌクレオチドを除去する。Ｃｅｌ  Ｉの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の存在により、更なる５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を必要とすることなく、ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを付与する酵素で標識化反応を行うことができる。
【００７０】
しかしながら、本発明による方法を構成する工程の組み合わせおよび順序は、標識化工程の前に、固有の核酸異常または損傷のマスキングまたは保護、およびＤＮＡ末端などの核酸末端のマスキングまたは保護が行われるという点で、従来の方法を越える実質的な利点を有する。かかるマスキング（保護）は、標識化反応中のＤＮＡの無差別な標識化を阻止し、それにより、異型ＤＮＡ構造の認識および修飾によって出現した反応性部位の特異的標識化が可能となる。
【００７１】
本明細書に記載の手順は、大半の従来技術と共通して、ゲル電気泳動により得られた産物の直接分析、キャピラリー配列決定機での分析、またはｄＨＰＬＣ（変性高性能液体クロマトグラフィ）による分析に続いて行われる。
【００７２】
しかしながら、現在の最新技術には多くの欠点がある。例えば、標準の反応条件下で適用される酵素が示す特異性は低く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成および操作中にＤＮＡが損傷される。
【００７３】
本発明による方法工程の組み合わせは、従来技術には記載されておらず、さらには、本方法が実施され得る反応条件も記載されていない。結果として、本発明による方法の発明性は、手順における一連の工程に見出される。更に、かかる実施可能な方法を達成するにあたって、本発明が実施され得る幾つかの反応条件を確立することに注意を払った。かかる反応条件の確立は、従来技術の方法を上回る更に創意的な改良をもたらす。
【００７４】
本発明において、上述のような基本的手順を実質的に改良した様々な態様が特定された。本明細書に概説されるようなこれらの態様を考慮すると、これらの態様により、本方法は機能ゲノミクス化学で必要とされるように大規模分析に適するものとなる。
【００７５】
本発明者らは、以下の事項を確立した：
ａ）増幅により得られるＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子集団は、常に、損傷した分子を含有する。かかるＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ標識化を阻害するヌクレオチドまたは他の化合物（ジデオキシヌクレオチド、またはアザシチジンなどのヌクレオチド類似体）を組み込むことにより、後続の標識化工程から分子的にマスクされなければならない。
【００７６】
ｂ）全ての線状ＤＮＡ断片は、末端の存在に起因して、標識化反応中、活発に標識される。故に、ＤＮＡ末端は、ＤＮＡ標識化を阻害するヌクレオチドまたは他の化合物を組み込むことにより、後続の標識化工程から分子的にマスクされなければならない。
【００７７】
ｃ）特異的エンドヌクレアーゼによるミスマッチの処理条件は、両ＤＮＡ鎖の切断ではなく、一方のＤＮＡ鎖のニッキングを引き起こすよう、厳密に最適化されなければならない。
【００７８】
ｄ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが、単に５’−３’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性だけではなく、３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性も有することは既知である。にもかかわらず、平滑ＤＮＡ末端が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対して不活性であると広く考えられている。
【００７９】
ｅ）上述の広く確信されている事項に反駁して、本発明者らは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが、ＤＮＡ分子の先端にヌクレオチドを組み込むことができることを示した。これは、ミスマッチなどの異型構造の処理を通じて反応性部位が出現した分子だけでなく、全ての線状ＤＮＡ断片が標識化されることを意味している。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは５’−３’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性および５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて、３’末端デオキシヌクレオチジル活性を有する。故に、ＤＮＡ末端は、後続工程での標識化を阻止すべくマスクされる必要がある。
【００８０】
ｆ）最大活性温度である７２℃でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、マスキング効率が低下することが認められた。この正確な理由は明らかではないが、部分的なＤＮＡの変性または熱によるＤＮＡ損傷によるものと考えられる。
故に、最大の標識特異性と十分な収率とが組み合わされた温度間隔を規定することが必要であった。本発明のマスキング工程のための温度間隔は、３７℃〜６０℃の範囲、好ましくは４５℃〜５５℃の範囲、より好ましくは４８℃〜５２℃の範囲となるように規定される。
【００８１】
ｇ）エンドヌクレアーゼの作用などによりＤＮＡ内にニックを生成すべく使用されるプロセスは、ある程度の非特異性を有することがある。これにより、標識化可能な部位が生じるので、反応の特異性が低下し得る。例えば、ミスマッチエンドヌクレアーゼＣｅｌ  Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するので、ＤＮＡ末端を後の標識化工程に対して反応性にすることが認められた。突然変異検出プロセス中のあらゆるＤＮＡ操作、特に渦流と沈殿は、ＤＮＡに損傷を与えることが認められた。この分子の損傷は、後続の工程における標識化開始部位であることもあり、基質の調製中だけでなく、標識化前の全ての工程において損傷を最小限に抑えるべく全ての注意を払う必要がある。
【００８２】
ｈ）選択プロセスは単一チューブ反応である。これは、ＰＣＲにより同定され、且つ、突然変異に関してスクリーニングされている他の断片とは区別され得る（突然変異のない）ＤＮＡ断片により監視されなければならない汚染の危険があることを意味している。
【００８３】
上述の要件を全て考慮に入れると、突然変異検出に適用されるような手順のスキームは、基質核酸集団を用意し、該基質核酸集団から、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなどの忠実性の高いＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲなどによって、線状ＤＮＡを生成させ；ＤＮＡ断片を変性およびリアニーリングして二本鎖分子およびヘテロ二本鎖分子を形成し；典型的には３０分〜１８時間のインキュベーション時間および典型的には３７℃〜６０℃の範囲の温度でのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーション反応において、ｄｄＧＴＰなどを使用してＤＮＡ末端および内部ＤＮＡ損傷をブロック（マスク）し；異型ＤＮＡ構造をニックに変換する処理に好ましい条件を用いて、異型ＤＮＡ構造を認識および処理することを含む。かかる処理条件としては、典型的には約３７℃〜４５℃の温度で２〜７分の範囲、好ましくは４２℃で約５分間という短い反応時間と、低酵素濃度、例えば上述の切断に必要な酵素量の１０％を使用することとが挙げられる。
【００８４】
本明細書に記載されるようなマスキングプロセスに対する一連の利点がある。当然、当業者は、ＤＮＡに適用されるような本発明の利点が他の核酸分子（ＮＡ）にも適用できることを認識するであろう。故に、本発明は、もちろんＤＮＡに限定されるものではなく、あらゆるタイプの核酸に適用可能である。
【００８５】
ａ）保護手順の目的は、異型ＮＡ構造のニッキングの特異性を向上させることではなく、ニッキング反応においてＣｅｌ  Ｉ酵素（ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）として商業的に知られている）の回転率を増大させることでもない。マスキング工程の絶対要件は、（ＤＮＡ集団内の分子に固有の）ＤＮＡ損傷や（非環状ＤＮＡ分子に存在する）ＤＮＡ末端が後続の標識化反応の標的となることを阻止する必要性から生じる。
【００８６】
ｂ）保護反応で使用する酵素は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡへリカーゼ、３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたはＤＮＡ末端に結合するタンパク質のいずれでもあり得ない。前記酵素は、従来の公に利用可能な手順によって検出可能な３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、またはこの反応を行い得る酵素の組み合わせでなければならない。
【００８７】
本発明において、マスキングは単に様々な酵素による基質の酵素処理によって行われるものではないということを述べる必要がある。むしろ、この工程の極めて重要な部分は、異型ＤＮＡ構造の部位またはその近辺で二本鎖ＤＮＡにニックを導入するよりも前の工程において、酵素が、損傷したＤＮＡおよびＤＮＡ末端にヌクレオチド類似体などの成分を組み込むということである。次いで、この組み込まれた成分は、後続の標識化反応中、それが組み込まれた部位を標識化から効果的にブロックする。
【００８８】
しかしながら、Ｃｅｌ  Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））を使用してヘテロ二本鎖ＤＮＡ内にニックを生成する際、望ましくない部位での標識化を阻止するために本発明で使用する保護方法論は酵素性能をも向上させると言っているわけではない。
【００８９】
ｃ）修飾ＤＮＡの精製は、後続の工程のために緩衝液条件を変更する上で必要となる。ＤＮＡ精製は全て、後続の標識化反応において感知され得る損傷を生じさせる。ＤＮＡ精製のような標準の緩衝液変更手順は、許容しがたいほど大量のＤＮＡ損傷を生じさせる。
【００９０】
ｄ）正確に規定した時間および温度条件を用いた、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡニックトランスレーションによってビオチン化ヌクレオチドを組み込むことなどによる、修飾ＤＮＡの標識化。
【００９１】
ｅ）例えばストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズまたは粒子を用いた、ビオチン標識ＤＮＡの選択および同定、およびその後のＰＣＲによる検出。
【００９２】
ｆ）手順全体、つまり工程ａ）〜ｆ）では、その手順の選択性を監視するために、突然変異を有さない内部対照が組み込まれる。
【００９３】
本明細書に開示された本発明による方法、即ち、ニックに変換可能な構造異常を含む核酸分子を選択的に検出するための方法は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、通常のＮＡと同様の様式でＮＡと相互作用する、天然ＮＡとは化学的に異なる分子（例えばＰＮＡ）、およびこれら分子の組み合わせにも適用することができる。
【００９４】
鋳型および基質集団用のＮＡ供給源は、ウイルス、原核生物、真核生物、プラスミドＮＡ、またはこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。基質ＮＡ集団は、抽出によるか、または当技術分野で用いられる従来手段を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＡ増幅により生成させてもよいし、当技術分野で用いられる従来手段を使用して合成してもよい。
【００９５】
異型ＮＡ構造は、分子中に変異性を有する供給源から形成されるヘテロ二本鎖分子の結果であってもよい。この変異は、天然のものであってもよいし、物理的手段、化学的手段または生物学的手段によって誘発されたものであってもよい。
【００９６】
異型ＮＡ構造はまた、物理的薬剤、化学的薬剤または生物学的薬剤の悪影響の結果でもあり得る。これらの構造はまた、細胞内酵素活性の結果として生じ得るものでもあり、これらの活性により異型ＮＡ構造の一本鎖ニックへの変換が可能になる。
【００９７】
当業者は、本発明で使用したＰＣＲにより線状基質ＤＮＡを生成させるために使用されたＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、忠実性の高いポリメラーゼを使用してもよいことを認識するであろう。
【００９８】
同様に、当業者は、後続の標識化のための分子を生成させる際、Ｃｅｌ  Ｉ「Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）」ミスマッチエンドヌクレアーゼに代えて、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子におけるミスマッチを認識し、且つＤＮＡ分子にニックを導入することが可能なあらゆる薬剤［Mung bean nuclease, Kowalski D. et al. (1976) Biochemistry 15: 4457-4463, venom phosphodiesterase Pritchard AE et al. J. Biol. Chem. 1997; 252:8652-8659］を使用してもよいことを認識するであろう。かかる一例は、ＭｕｔＹ  ミスマッチグリコシラーゼ［Au KG et al. Escherichia coli mutY gene product is required for specific A-G----C.G mismatch correction Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Dec; 85(23):9163-6］と、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼ［Shaper NL, Grossman L, Purification and properties of the human placental apurinic/apyrimidinic endonuclease Methods Enzymol. 1980;65(1):216-24］との組み合わせ、または好適なグリコシラーゼと好適なＡＰエンドヌクレアーゼとのその他の組み合わせである。
【００９９】
本発明では、洗浄前のＮＡ保護工程は、異型ＮＡ構造を含むあらゆるタイプの二本鎖ＮＡ分子上で行われてもよく、この異型ＮＡ構造に対して、１つのＮＡ鎖を破断するための特定の処理を施すことができる。典型的には、二本鎖ＮＡまたは一本鎖ＮＡはＤＮＡである。例えば、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼ［Shaper NL, Grossman L, Purification and properties of the human placental apurinic/apyrimidinic endonuclease Methods Enzymol. 1980; 65(1): 216-24］と併用するＡｌｋＡ３メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ［P. Karran, T. Hjelmgren and T. Lindahl. Induction of a DNA glycosylase for N-methylated purines is part of the adaptive response to alkylating agents 1982 Nature 296: 770-773]、またはＡPエンドヌクレアーゼと併用するその他のＤＮＡ損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼ。
【０１００】
後続のビオチン標識化の前に、ｄｄＧＴＰ（ジデオキシグアノシン三リン酸）などのヌクレオチド類似体を使用して、前から存在しているＤＮＡ損傷を排除するか、またはマスクすることが重要であるということが確立されると、望ましくない部位の標識化を阻止するための修飾ヌクレオチドまたは他の成分を評価することが可能となる。
【０１０１】
同等成分の使用は常に、反応手順全体との関連において評価されるべきであるという点に着目すべきである。これは、本手順との関連においてその特性が完全には定義されていない新規成分を本手順において用いる場合、当該成分が、明白且つ完全に、以前使用していた成分の代わりに使用されるか、またはその成分を改良するものであるとしても、アッセイの結果全体に悪影響を及ぼすこともあるということを意味している。
【０１０２】
従って、ある成分の代わりに別の成分を代用する可能性を、この代用が行われるべき工程においてのみ評価するだけでは不十分である。むしろ、後続の工程も影響を受けないことを証明しなければならない。例えば、推定マスキング成分は、効果的なマスキングを行うが、標識化よりも前に行われる、異型ＤＮＡ構造を認識するように設計された後続の工程において除去（脱マスク）されることもある。あるいは、他方で、潜在的に有効なブロッキング成分は僅かしかＮＡ分子に組み込まれないこともある。
【０１０３】
マスキング反応で使用してもよいｄｄＧＴＰへの追加の化合物としては、ＡＺＴ（アジドチミジン）［Copeland WC et al. Human DNA polymerases alpha and beta are able to incorporate anti-HIV deoxynucleotides into DNA, J Biol Chem. 1992 Oct 25; 267(30):21459-64］、またはＤＮＡに組み込まれるとＤＮＡ合成を終了させることができるその他のヌクレオチド類似体［Lim SE, Copeland WC, Differential incorporation and removal of antiviral deoxynucleotides by human DNA polymerase gamma. J Biol Chem. 2001 Jun 29; 276(26): 23616-23］が挙げられる。
【０１０４】
また、本発明には、一本鎖に切断されるＤＮＡ分子が、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ触媒反応において、ビオチン化されたデオキシヌクレオシド三リン酸で標識化される工程も組み込まれる。この反応は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性および５’−３’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性により触媒される。
【０１０５】
当業者は、反応を阻害する更なる活性を付与することなく、かかる活性を組み合わせたいかなる酵素または酵素群も、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに代えて使用し得ることを認識するであろう。かかる酵素または酵素の組み合わせが特定され、使用される場合、それらの酵素はプロセス全体において予め評価されなければならない。
【０１０６】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの代わりに標識化反応中で使用することのできる酵素および酵素の組み合わせが存在する。例えば、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠いたＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体、または、５’−３’ＤＮＡエキソヌクレアーゼと組み合わせたＤＮＡ  Ｉポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠損クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、例えばＦｅｎ１ヌクレアーゼ。同様に、ビオチンの代わりに他の分子を用いてもよく、これらの分子は、自らが組み込まれた断片を、組み込みがなかった断片から直接的または間接的に分離させる。
【０１０７】
分離方法は、組み込まれたリガンドに結合されたビーズの磁気分離、組み込まれたリガンドに対するアフィニティクロマトグラフィ、フローサイトメトリー、および分子を分離するための他の非破壊的手段によるものであってもよい。
【０１０８】
当業者は、特定の選択工程後に増幅が行われるのは、アガロースゲル中で選択された断片を視覚化する必要があるためであることを認識するであろう。しかしながら、断片の選択は、質量分析法、あらゆるタイプの支持体（フィルター、ＤＮＡチップ、ビーズ）上でのハイブリダイゼーション、および原子間力顕微鏡検査を含む十分に高感度な方法を直接用いることにより確認されてもよい。
【０１０９】
本明細書に開示された本発明の原理を考慮し、保護されたＤＮＡ部位の標識化を特異的に阻止するＮＡ部位に、類似成分を添加することによりマスキング／保護を行う中間工程に主眼を置き、新規用途が開発された。
【０１１０】
本明細書に提示した手順の１つの新規用途は、同一酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓａｅの株などの、同一種の株間の差異を同定することに関与している。
【０１１１】
本発明による手順は、以下のものを同定するのに使用できる：
ａ）同一種の個体間の変異または差異。
ｂ）例えば、癌細胞と非癌細胞とを識別するための、同一個体の細胞間のＮＡにおける変異または差異。
ｃ）同一種の個体における目的の遺伝子における突然変異。
ｄ）例えば、特定遺伝子内で変異した癌細胞を同定するための、同一個体の細胞内の目的の遺伝子における突然変異。
ｅ）例えば、目的の配列におけるＤＮＡ損傷を選択的に検出するための、目的の配列におけるＤＮＡ損傷。
ｆ）全ゲノムレベルでのＤＮＡ損傷。
【０１１２】
本発明による方法を行うためのキットも本発明の範囲内に包含される。例えば、本発明による方法で使用するのに好適なキットは、１つ以上の線状化核酸分子集団を用意するための手段と、ｄｄＧＴＰ、ＡＺＴなどのマスキング剤と、化学的または酵素的マスキング成分と、エンドヌクレアーゼ活性を有するニッキング酵素と、ビオチンなどの標識化剤と、核酸ポリメラーゼ活性を有するか、またはこれを呈する酵素調製物とを含んでもよい。
【０１１３】
また、本発明の範囲内に包含されるのは、ニックに変換可能な異型ＮＡ構造を選択的に検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用；同一種の異なる変異体の核酸配列間の変異または差異を選択的に検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用；同一個体の異なる細胞の核酸配列間の変異または差異を選択的に検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用；核酸集団内の目的の遺伝子における突然変異を選択的に検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用；個体の異なる細胞内の目的の遺伝子における突然変異を選択的に検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用；目的の配列におけるＤＮＡ損傷を選択的に検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用；ゲノムレベルでのＤＮＡ損傷を検出するための、本明細書に記載された本発明による方法の使用である。
【０１１４】
ここで、本発明を例証する図面および実施例を以下に示す。これらの図面および実施例は、本発明をいかようにも制限するものとして解釈してはならないことを理解すべきである。
【実施例】
【０１１５】
以下の章に示す実験例は、本明細書に記載された本発明の特定の態様を支持するためにのみ記載される。
【０１１６】
以下の個々の実験には、ＳＡＭＰＡＤ（突然変異、多型およびＤＮＡ損傷の選択的検出および増幅）が本発明による方法に従ってどのように行われるかが示されている。
【０１１７】
実施例１〜８では、ＳＡＭＰＡＤの個々の構成要素を行う様々な方法が記載されている。
【０１１８】
実施例９〜１１では、ＤＮＡを標識化するための方法が示されている。
【０１１９】
標識化反応における背景ノイズを低減するための（実施例１２〜１７）、および個々の工程を組み合わせて（実施例１８〜２１）、全ＳＡＭＰＡＤプロセスを行うための（実施例２２）様々な効果的な方法が開発されてきた。実施例２３は技術的可能性を例証しており、実施例２４はＳＡＭＰＡＤの工業用途を例証している。
【０１２０】
実施例１：野生型モデル鋳型の生成
使用した鋳型は、唯一のＮｏｔＩ部位で消化されたプラスミドｐＵＣ１８をベースとした（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０Ｕ  ＮｏｔＩ（総容量２０μｌ）の存在下、３７℃、１時間）。消化産物を、配列番号１および配列番号２として特定された２つの合成オリゴヌクレオチドのアニーリング産物に連結した。
【０１２１】
ＤＮＡ連結反応は、１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、４０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのＡＴＰの存在下、３７℃で３時間行った。
【０１２２】
化学的に形質転換コンピテント大腸菌ＤＨ５αを、熱衝撃法において連結産物で形質転換した（湿った氷の上で３０分）。衝撃処理の後、３７℃で非選択的ＬＢブロス内にて細胞を培養した。続いて、形質転換体を、抗生物質に対するそれらの耐性について選択した。ＳＡＭＰＡＤ用のＤＮＡ基質を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅により生成した。
【０１２３】
実施例２：変異体モデル鋳型の生成
使用した鋳型は、唯一のＮｏｔＩ部位で消化されたプラスミドｐＵＣ１８をベースとした（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０Ｕ  ＮｏｔＩ（総容量２０μｌ）の存在下、３７℃、１時間）。消化産物を、配列番号３および配列番号４として特定された２つの合成オリゴヌクレオチドのアニーリング産物に連結した。
【０１２４】
これらのオリゴヌクレオチドは、実施例１のヌクレオチド由来のものであったが、ここではＴＡ挿入物を含有していた。
【０１２５】
ＤＮＡ連結反応は、１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、４０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのＡＴＰの存在下、３７℃で３時間行った。
【０１２６】
化学的に形質転換コンピテント大腸菌ＤＨ５αを、熱衝撃法において連結産物で形質転換した（湿った氷の上で３０分）。衝撃処理の後、３７℃で非選択的ＬＢブロス内にて細胞を培養した。続いて、形質転換体を、抗生物質に対するそれらの耐性について選択した。ＳＡＭＰＡＤ用のＤＮＡ基質を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅により生成した。
【０１２７】
実施例３：ＳＡＭＰＡＤ用基質の調製
標準の反応条件下でＰｆｕポリメラーゼを使用してモデル基質ＤＮＡ分子を増幅し、基質ＤＮＡを生成した。
【０１２８】
標準の条件は以下の通りであった。
ａ）反応容量：２０μｌ、
ｂ）２００ｐｇのモデル基質ＤＮＡ、
ｃ）２μｌの１０×Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液：２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）；１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１％  Ｔｒｉｔｏｎ×１００  １ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、
ｄ）５．１２μｌ  ｄＮＴＰ（各１２．５μＭ）、
ｅ）０．５μｌの各プライマー（配列番号５および配列番号６のＭ１３配列決定プライマー、濃度１０μＭ）、
ｆ）０．５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【０１２９】
アガロースゲル電気泳動によって基質を定量し、必要に応じて希釈し、規定の割合（１：０（＝マッチ）〜１：２５６）で混合した。
【０１３０】
混合物を、９５℃でのインキュベーションにより変性し、少なくとも９時間にわたって室温まで徐々に冷却することにより再生した。
【０１３１】
得られたヘテロ二本鎖分子は、９４４位に２つのらせん外（ｅｘｔｒａｈｅｌｉｃａｌ）塩基を有する１９００ｂｐの線状ＤＮＡ分子であった。
【０１３２】
二本鎖分子は、ミスマッチヌクレオチドを除いて同じであった。
【０１３３】
実施例４：ｄｄＧＴＰによるＤＮＡ分子のマスキング
マスキング反応は、５０℃の温度で２時間行った。
【０１３４】
反応組成は以下の通りである。
ｇ）２μｌのＤＮＡ（８．５ｎｇ／μｌ）、
ｈ）２μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液（１６０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；６７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）、
ｉ）０．７５μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
ｊ）５μｌのｄｄＧＴＰ混合物（２μｌ  １０ｍＭ  ｄＡＴＰ；２μｌ  １０ｍＭ  ｄＣＴＰ；２μｌ  １０ｍＭ  ｄＴＴＰ；２μｌ  １０ｍＭ  ｄｄＧＴＰおよび７２μｌ  蒸留Ｈ２Ｏ）、
ｋ）１０ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、
ｌ）１０μｌの蒸留Ｈ２Ｏ（最終容量２０μｌ）。
【０１３５】
実施例５：ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）によるヘテロ二本鎖ＤＮＡのニッキング
ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）（米国ネブラスカ州オマハ、トランスゲノミック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，  Ｏｍａｈａ，  ＮＥ，  ＵＳＡ）は、セロリから最初に得られたＳ１ヌクレアーゼメンバーのＣｅｌ  Ｉヌクレアーゼサブファミリーの酵素の商業名である。
【０１３６】
ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）反応は、容量２０μｌで行った。８．５ｎｇのＤＮＡを、４２℃で５分間、０．１μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）および２μｌの１０×ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）反応緩衝液でインキュベートした。
【０１３７】
実施例６：ビオチンによるＤＮＡの標識化
ＤＮＡ（８．５ｎｇ）を、ビオチン１１ｄＣＴＰの組み込みによって標識化した。反応は、３μｌの１０×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（１６０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、６７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）；０．７５μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５μｌのビオチン−ｄＮＴＰ混合物（２μｌ  １０ｍＭ  ｄＡＴＰ、２μｌ  １０ｍＭ  ｄＧＴＰ、２μｌ  １０ｍＭ  ｄＴＴＰ、１．９２μｌ  １０ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．８μｌ  ビオチン（ｂｉｏｔｉｎａ）１１ｄＣＴＰ）および１０ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、３０μｌの容量で行った。
【０１３８】
続いて、ビオチン標識断片を、ストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズまたは粒子によって選択した。ストレプトアビジンとビオチンは、互いに対して非常に高い結合親和性を有し、故にビオチン標識分子の選択を可能にする。
【０１３９】
実施例７：ビオチン標識ＤＮＡ分子の選択
最初に、ビーズ／粒子を、それらの原容量のＴＥＮ１００（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）で２回洗浄した。各洗浄後、磁石を適用し、上澄みを取り除いた。
【０１４０】
次いで、ビーズ／粒子を、それらの初期容量と等容量のＴＥＮ２００（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）中に再懸濁させた。
【０１４１】
次いで、７．５ｎｇの内部対照ＤＮＡおよび３０μｌの標識化反応物質を２０μｌの洗浄したビーズに添加した。
【０１４２】
この手順の第４工程では、混合物を室温で３０分間インキュベートし、ビーズ／断片が沈殿しないように繰り返し攪拌した。次いで、事前に洗浄したＰＣＲ用サンプルを採取し、残ったビーズを各４００μｌのＴＥＮ１０００（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で３回洗浄した。各洗浄後、磁石を用いてビーズを隔離し、上澄みを取り除いた。更なる洗浄サイクルが必要とされる場合には、この工程を繰り返した。最終的に、４０μｌのｄＨ２Ｏ内にビーズを再懸濁させ、ＰＣＲ用サンプルを採取した。
【０１４３】
アッセイ８：選択されたＤＮＡの同定
同定は、配列番号７および配列番号８の特定プライマーを用いたＰＣＲによって行った。
【０１４４】
１×ＴＡＥ緩衝液中でアガロースゲル電気泳動によって生成物を分離し、臭化エチジウム染色およびＵＶ透照法（transillumination）により視覚化した。
【０１４５】
実施例９：ＤＮＡの標識化、選択および同定のための方法の開発
標準のプラスミド少量調製技法を用いて、プラスミドを液状細菌培養物（選択的条件下に一晩置いた培養物２ｍｌ）から単離した。簡潔に説明すると、遠心分離によって細胞を収集し、再懸濁用緩衝液（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ＝８）および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁させ、第２の溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨおよび１％  ＳＤＳ）を添加することによって溶解させ、酢酸の添加により最終濃度１１．５％まで中和した。
【０１４６】
最終的に、ＤＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。
【０１４７】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１０×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液の代わりに、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよび１０×大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ反応緩衝液を使用し、３７℃で３０分間インキュベーションを行ったという変更を加え、実施例６におけるように、およそ２００ｎｇのこのように精製したプラスミドＤＮＡを標識化した。図１では、精製プラスミドＤＮＡが、ＤＮＡニックトランスレーションによる標識化にとって良好な基質であることを証明している。図１におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：ビオチン標識化を行わないプラスミドＡおよびＢの混合物のＰＣＲ。３ラウンドの選択後に同定。
ｃ）２：ビオチン標識化を行わないプラスミドＡおよびＢの混合物のＰＣＲ。６ラウンドの選択後に同定。
ｄ）３：プラスミドＡおよびＢの混合物のＰＣＲ。ここではＢではなくＡがビオチンで標識化されている。３ラウンドの選択後に同定。
ｅ）４：プラスミドＡおよびＢの混合物のＰＣＲ。ここではＢではなくＡがビオチンで標識化されている。６ラウンドの選択後に同定。
ｆ）５：プラスミドＡの陽性対照ＰＣＲ。
ｇ）６：プラスミドＢの陽性対照ＰＣＲ。
【０１４８】
実施例１０：ビオチンヌクレオチドによるＤＮＡの標識化
図２では、ビオチンヌクレオチドによるＤＮＡの標識化が３７℃で作用するが、５０℃でははるかに効率がよいことを示している。
【０１４９】
ＤＮＡ鋳型を実施例１におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製した。
【０１５０】
ＤＮＡを実施例６におけるように標識化し、アッセイ７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１５１】
この標識化の結果は図２に示されており、同図におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃、３０分間、ビオチン１１ｄＣＴＰで標識化したＤＮＡ。選択前。
ｃ）２：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃、３０分間、ビオチン１１ｄＣＴＰで標識化したＤＮＡ。３ラウンドの選択後にサンプルを採取。
ｄ）３：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて５０℃、３０分間、ビオチン１１ｄＣＴＰで標識化したＤＮＡ。選択前。
ｅ）４：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて５０℃、３０分間、ビオチン１１ｄＣＴＰで標識化したＤＮＡ。３ラウンドの選択後にサンプルを採取。
ｆ）５：ＤＮＡのない陰性対照ＰＣＲ。
【０１５２】
実施例１１：ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる標識化
ＤＮＡ鋳型を実施例１におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製した。
【０１５３】
続いて、以下のものを含む反応液中、ＤＮＡターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりＤＮＡを標識化した。
ａ）１７ｎｇのモデルＤＮＡ、
ｂ）１．５μｌの１ｍＭ  ビオチン１１ｄＣＴＰ、
ｃ）１０μｌの５×ターミナルジデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応緩衝液（１Ｍ  カコジル酸カリウム、１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００および５ｍＭ  ＣｏＣｌ２（２５℃でｐＨ７．２））、
ｄ）４０Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、
ｅ）蒸留したＨ２Ｏ（反応容量は合計で５０μｌ）。
【０１５４】
インキュベーションは３７℃で１５分間行った。
【０１５５】
ＤＮＡを実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１５６】
図３は、ＤＮＡ標識化におけるＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの効果を示している。これは、ＤＮＡニックトランスレーションとは完全に独立した代替の標識手順を提供する。
【０１５７】
図３におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）１：選択前の、ターミナルトランスフェラーゼ標識ＤＮＡの同定。
ｂ）２：３ラウンドの選択後の、ターミナルトランスフェラーゼ標識ＤＮＡの同定。
ｃ）３：ＤＮＡのない陰性対照ＰＣＲ。
ｄ）４：λＰｓｔマーカー。
【０１５８】
実施例１２：ＤＮＡリガーゼのＤＮＡニックトランスレーションへの干渉
図４には、ＤＮＡリガーゼが、ＳＡＭＰＡＤにとって望ましくなく、且つそれと不適合な様にＤＮＡニックトランスレーションへ干渉することを示している。
【０１５９】
ＤＮＡ鋳型を実施例１におけるように調製し、基質をアッセイ３におけるように調製する。
【０１６０】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが介在するＤＮＡ修復を、合計反応容量２０μｌ（２μｌ  １０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＡＴＰ、２５℃でｐＨ７．８）、５Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび蒸留Ｈ２Ｏ（合計で２０μｌ））中、合計３４０ｎｇのモデルＤＮＡ上で行った。インキュベーションを３７℃で３０分間行った。
【０１６１】
ＤＮＡを実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１６２】
ＤＮＡの糖リン酸主鎖内のニックはＤＮＡリガーゼによって修復され、それがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡニックを修復するための候補となり、それによりＳＡＭＰＡＤの背景ノイズが低減される。しかしながら、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡニックトランスレーションへ干渉し、背景ノイズを低減させるための潜在的な方法となるが、この手法が役に立たないことは当業者にとって明らかである。また、負の（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ニックトランスレーション（ヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の認識および修飾の前に行われる、ＤＮＡのニックトランスレーションによる標識化およびその選択の初回ラウンドを意味し、前から存在している損傷ＤＮＡ分子を除去するように設計されている）が背景ノイズを低減する上で実用的でないことも認められた。
【０１６３】
図４におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：連結修復後のプラスミド。選択前に同定。
ｃ）２：連結修復が行われていないプラスミド。選択前に同定。
ｄ）３：連結修復後のプラスミド。３ラウンドの選択後に同定。
ｅ）４：連結修復が行われていないプラスミド。３ラウンドの選択後に同定。
ｆ）５：連結修復後のプラスミド。６ラウンドの選択後に同定。
ｇ）６：連結修復が行われていないプラスミド。６ラウンドの選択後に同定。
ｈ）７：連結修復後のプラスミド。９ラウンドの選択後に同定。
ｉ）８：連結修復が行われていないプラスミド。９ラウンドの選択後に同定。
ｊ）９：連結修復後のプラスミド。１２ラウンドの選択後に同定。
ｋ）１０：連結修復が行われていないプラスミド。１２ラウンドの選択後に同定。
【０１６４】
実施例１３：ＤＮＡ末端の標識化
図５は、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性が如何にＤＮＡ末端の標識化を引き起こし得るかについての理論的考察を例証している。
【０１６５】
太線はＤＮＡポリメラーゼ活性の結果を示しており、即ち、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ標識化を示している。
【０１６６】
実施例１４：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによるＤＮＡのマスキング
図６は、ｄｄＧＴＰを用いた大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによるＤＮＡ損傷のマスキングが、如何にプラスミドニックトランスレーション反応における背景ノイズレベルを低減するかを示している。
【０１６７】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液の代わりに、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ反応緩衝液をそれぞれ使用し、且つ反応を３７℃で行ったことを除いて、プラスミドＤＮＡを実施例９におけるように調製し、実施例４におけるように標識化した。
【０１６８】
続いて、ＤＮＡを実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１６９】
２つの実験条件を比較した：一方では、ＤＮＡをｄｄＧＴＰでマスクし、次いでビオチン１１ｄＣＴＰで標識化した。他方では、マスキング工程なしでＤＮＡを標識化した。
【０１７０】
図６は、マスキングにより、行われた標識化の量が劇的に低減されることを明瞭に示している。
【０１７１】
図６におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：ｄｄＧＴＰマスキング。ビオチンで標識化。選択なし。
ｃ）２：ｄｄＧＴＰマスキングなし。ビオチンで標識化。選択なし。
ｄ）３：ｄｄＧＴＰマスキング。ビオチンで標識化。３ラウンドの選択。
ｅ）４：ｄｄＧＴＰマスキングなし。ビオチンで標識化。３ラウンドの選択。
ｆ）５：陰性対照ＰＣＲ。
ｇ）６：陽性対照ＰＣＲ。
ｈ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
【０１７２】
実施例１５：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩでの標識化
図７では、ＤＮＡがｄｄＧＴＰでマスクされたか否かにかかわらず、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが線状ＤＮＡ末端を無差別に標識化することを示している。
【０１７３】
ＤＮＡ鋳型を実施例１におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製した。マスキングを実施例９におけるように（実施例６で使用されるのと同じ量のＤＮＡを使用して）行い、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１７４】
ここで、線状ＤＮＡがそれよりも前にｄｄＧＴＰで処理されたか否かにかかわらず、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが線状ＤＮＡを標識化することを証明する。
【０１７５】
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを使用して、後続の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ標識化から環状ＤＮＡを首尾よくマスキングできることを本明細書で先に示した（図６）。ＤＮＡ合成用基質は、３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性により生成される（理論的考察については図５を参照のこと）。
【０１７６】
故に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼを使用しなければならない。
【０１７７】
図７におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。選択なし。
ｃ）２：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。選択なし。
ｄ）３：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。選択なし。
ｅ）４：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。選択なし。
ｆ）５：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。３ラウンドの選択後。
ｇ）６：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。３ラウンドの選択後。
ｈ）７：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。３ラウンドの選択後。
ｉ）８：ｄｄＧＴＰで処理し、ビオチンで標識化したＤＮＡ。３ラウンドの選択後。
ｊ）９：陰性ＰＣＲ対照。
ｋ）１０：陽性ＰＣＲ対照。
ｌ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
【０１７８】
アッセイ１６：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのマスキング
図８では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ損傷およびＤＮＡ末端をｄｄＧＴＰでマスクすることにより、線状ＤＮＡのＤＮＡニックトランスレーションにおける背景ノイズが最小限に抑えられることを示している。
【０１７９】
ＤＮＡ鋳型を実施例１におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製した。マスキングを実施例４におけるように行い、実施例６におけるようにビオチンで標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１８０】
このアッセイでは、２つの実験条件を比較した。ＤＮＡをｄｄＧＴＰでマスクし、ビオチン１１ｄＣＴＰで標識化し、選択し、同定し、マスクしたが別の方法で同じく処理したＤＮＡと比較した。
【０１８１】
明らかに、マスキングは、行われる標識化の量を劇的に低減する。
【０１８２】
図８におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：ｄｄＧＴＰでマスクしたＤＮＡ。選択なし。
ｃ）２：ｄｄＧＴＰでマスクしていないＤＮＡ。選択なし。
ｄ）３：ｄｄＧＴＰでマスクしたＤＮＡ。３ラウンドの選択。
ｅ）４：ｄｄＧＴＰでマスクしていないＤＮＡ。３ラウンドの選択。
【０１８３】
実施例１７：異なる温度でのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたマスキング
図９では、組み込み用Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたｄｄＧＴＰマスキングが５０℃で最適に作用することを示している。
【０１８４】
ＤＮＡ鋳型を実施例１におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製した。マスキングは、以下に特記される変更点を除いて実施例４におけるように行い、実施例６におけるようにビオチン標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１８５】
このアッセイにおいて、６０℃でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより行われたｄｄＧＴＰマスキングは、５０℃ほど効果的ではない。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性が３７℃では許容できない程緩慢であることを示している図２に提示したデータと合わせて、５０℃を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによりｄｄＧＴＰマスキングを行う最適温度とする。
【０１８６】
図９におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：５０℃でマスクしたＤＮＡ。選択なし。
ｃ）２：６０℃でマスクしたＤＮＡ。選択なし。
ｄ）３：５０℃でマスクしたＤＮＡ。選択なし。３ラウンドの選択後。
ｅ）４：６０℃でマスクしたＤＮＡ。選択なし。３ラウンドの選択後。
ｆ）５：陰性対照ＰＣＲ。
ｇ）６：陽性対照ＰＣＲ。
ｈ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
【０１８７】
実施例１８：マングビーン・ヌクレアーゼにより処理されたミスマッチの検出
図１０では、マングビーン・ヌクレアーゼにより処理されたミスマッチがＳＡＭＰＡＤにより如何に検出可能であるかを示している。
【０１８８】
ＤＮＡ鋳型を実施例１および２におけるように生成し、基質ＤＮＡを実施例３におけるように生成し、実施例４におけるようにマスクし、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を認識し、マングビーン・ヌクレアーゼにより処理し（簡潔に言えば、８．５ｎｇのマスクしたＤＮＡを、２μｌの１０×マングビーン・ヌクレアーゼ反応緩衝液（３００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  酢酸Ｚｎおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ×１００）および５０Ｕ  マングビーン・ヌクレアーゼを用い、全反応容量２０μｌにて３７℃で１５分間インキュベートした）、ヌクレアーゼ反応から直接ビオチンで標識化した。ＤＮＡを実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１８９】
ヌクレアーゼで処理したＤＮＡは、精製せずにビオチン標識化した。
【０１９０】
図１０におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）１：マッチＤＮＡ。マングビーン・ヌクレアーゼで処理。選択なし。
ｂ）２：ミスマッチＤＮＡ。マングビーン・ヌクレアーゼで処理。選択なし。
ｃ）３：ニックトランスレーション効率についての対照。選択なし。
ｄ）４：マッチＤＮＡ。マングビーン・ヌクレアーゼで処理。選択なし。３ラウンドの選択。
ｅ）５：ミスマッチＤＮＡ。マングビーン・ヌクレアーゼで処理。選択なし。３ラウンドの選択。
ｆ）６：ニックトランスレーション効率についての対照。３ラウンドの選択。
ｇ）７：陰性対照ＰＣＲ。
ｈ）８：陽性対照ＰＣＲ。
ｉ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
【０１９１】
実施例１９：ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼを用いた認識および修飾
図１１では、ミスマッチ認識および修飾のために低レベルのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼおよび短いインキュベーション時間（２〜７分）を使用することにより、ニックが入ったＤＮＡ（処理されたヘテロ二本鎖ＤＮＡ）が効果的に捕捉されることを示している。
【０１９２】
ＤＮＡ鋳型を実施例１および２におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製し、実施例４におけるようにマスキングを行い、ヘテロ二本鎖分子を（反応ごとにＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）の量を変更したことを除いて）実施例５におけるように同定した。それを実施例２０に示すように精製し、実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１９３】
ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ調製および常套の突然変異検出のための推奨適用条件（反応ごとに１μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ；４２℃で２０分間のインキュベーション時間）は、ミスマッチ切断（即ち、両鎖の開裂）効率を最大にするために設計されている。
【０１９４】
ここで、インキュベーション時間をより短くし、且つ酵素濃度を低減する（反応ごとに０．１μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ、４２℃で５分間のインキュベーション時間）ことにより、ニック（ＤＮＡニックトランスレーションにより効果的に標識可能）が効果的に生成された。
【０１９５】
また、標準のトランスゲノミック（ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ）ミスマッチ切断反応で使用したヌクレアーゼの半量を使用すると（即ち、反応ごとに０．５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ、４２℃で５分間のインキュベーション時間）、ニックが入ったＤＮＡ分子を捕捉できないことも示している。これは、おそらくは過剰な消化のケースであり、分子はニックされるのではなく、包括的な意味で切断される。
【０１９６】
ＤＮＡを、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ処理後にスピンカラムを用いて精製した。
【０１９７】
図１１におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。０．５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。選択なし。
ｃ）２：マッチＤＮＡ５０％。ミスマッチＤＮＡ５０％。０．５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。選択なし。
ｄ）３：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。０．５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。３ラウンドの選択。
ｅ）４：マッチＤＮＡ５０％。ミスマッチＤＮＡ５０％。０．５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。３ラウンドの選択。
ｆ）５：陰性ＰＣＲ対照。
ｇ）６：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。０．１μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。選択なし。
ｈ）７：マッチＤＮＡ５０％。ミスマッチＤＮＡ５０％。０．１μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。選択なし。
ｉ）８：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。０．１μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。３ラウンドの選択。
ｊ）９：マッチＤＮＡ５０％。ミスマッチＤＮＡ５０％。０．５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）。３ラウンドの選択。
【０１９８】
実施例２０：ＤＮＡの標準的なエタノール沈殿がマスキングに及ぼす効果
鋳型を実施例１におけるように調製し、基質を実施例３におけるように精製し、実施例４におけるようにマスクした。マスクしたＤＮＡを、標準的なエタノール沈殿により沈殿させた。ＤＮＡを実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０１９９】
ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ反応条件は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を完全に阻害し、以って標識化反応を阻害する。
【０２００】
マングビーン・ヌクレアーゼ反応条件は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを激しく劣化させ、故に効果的な標識化を妨げる。この問題を回避するために、反応条件を変更して、十分に機能的なアッセイを行う方法を調査した。
【０２０１】
ここで、マスキング反応後のＤＮＡの標準的なエタノール沈殿が好適であるか否かを試験する。それは好適ではない。エタノール沈殿は、ＤＮＡに多大な損傷を与えるのでマスキング反応の利点を完全に無効にすることが分かる。
【０２０２】
図１２におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１、２：標識化前にｄｄＧＴＰでマスクし、エタノールで沈殿させたＤＮＡ。選択なし。
ｃ）３、４：標識化前にｄｄＧＴＰでマスクせずに、エタノールで沈殿させたＤＮＡ。選択なし。
ｂ）５、６：標識化前にｄｄＧＴＰでマスクし、エタノールで沈殿させたＤＮＡ。３ラウンドの選択。
ｃ）７、８：標識化前にｄｄＧＴＰでマスクせずに、エタノールで沈殿させたＤＮＡ。３ラウンドの選択。
【０２０３】
実施例２１：スピンカラム精製がマスキングに及ぼす効果
より穏やかな精製手順の可能性を調査するために、ＤＮＡ鋳型を実施例２におけるように調製し、基質を実施例３におけるように生成し、実施例４におけるようにマスクし、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）モンタージュ遠心カラムを使用して（製造者の推奨を採用して）精製し、実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０２０４】
図１３では、スピンカラム精製が背景標識の増加をほとんど誘発しないことを示している。故に、スピンカラム精製は、ＳＡＭＰＡＤにとって十分に穏やかなＤＮＡ精製方法であると共に、今日常套的に用いられている。
【０２０５】
図１３におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：ｄｄＧＴＰによりマスクし、スピンカラム精製により精製したＤＮＡ。選択なし。
ｃ）２：ｄｄＧＴＰによりマスクせずに、スピンカラム精製により精製したＤＮＡ。選択なし。
ｄ）３：ｄｄＧＴＰによりマスクし、スピンカラム精製により精製したＤＮＡ。３ラウンドの選択。
ｅ）４：ｄｄＧＴＰによりマスクせずに、スピンカラム精製により精製したＤＮＡ。３ラウンドの選択。
【０２０６】
実施例２２：全ＳＡＭＰＡＤプロセス
図１４では、以前のアッセイにおいて決定されたパラメータを考慮に入れ、ＳＡＭＰＡＤを用いて突然変異を如何に効果的に検出できるかを示している。
【０２０７】
ＤＮＡ鋳型を実施例１および２におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製し、実施例４におけるようにマスクし、ヘテロ二本鎖構造を実施例５におけるように認識および修飾し、実施例２０におけるように精製し、実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０２０８】
ここで、ＳＡＭＰＡＤが２５５個の正常な分子の存在下で１つの変異体を同定する程十分に高感度であることを示している。
【０２０９】
図１４におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。選択なし。
ｃ）２：マッチＤＮＡ９９．２％。ミスマッチＤＮＡ０．８％。選択なし。
ｄ）３：マッチＤＮＡ９９．６％。ミスマッチＤＮＡ０．４％。選択なし。
ｅ）４：標識化反応についての対照。選択なし。
ｆ）５：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。選択なし。３ラウンドの選択。
ｇ）６：マッチＤＮＡ９９．２％。ミスマッチＤＮＡ０．８％。選択なし。３ラウンドの選択。
ｆ）７：マッチＤＮＡ９９．６％。ミスマッチＤＮＡ０．４％。３ラウンドの選択。
ｉ）８：標識化反応についての対照。３ラウンドの選択。
ｊ）９：１に対する内部対照。
ｋ）１０：２に対する内部対照。
ｌ）１１：３に対する内部対照。
ｍ）１２：４に対する内部対照。
ｎ）１３：５に対する内部対照。
ｏ）１４：６に対する内部対照。
ｐ）１５：７に対する内部対照。
ｑ）１６：８に対する内部対照。
【０２１０】
実施例２３：ＳＡＭＰＡＤ産物の精製および配列決定
ＳＡＭＰＡＤの生成物を精製し、（ＰＣＲ産物のクローニングを行わずに）直接配列決定した。実施例１に記載される特定のプライマーを使用したことを除いて、ＤＮＡ鋳型を実施例１および２におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製し、実施例４におけるようにマスクし、ヘテロ二本鎖構造を実施例５におけるように認識および修飾し、実施例２０におけるように精製し、実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０２１１】
検出生成物は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）キットを使用して、増幅プライマー（実施例１）の１つを用いて直接的に配列決定した。
【０２１２】
この可能性は、Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ[Makrigiorgos, Gerrasimos M., Methods for rapid screening of polymorphisms, mutations and methylation, US patent application US20030022215]の方法を超える明らかな利点である。これにより、突然変異の直ぐ隣に位置する断片の増幅が可能となるが、この突然変異に関する直接的な情報は、本手順の最終生成物に存在していないために失われる。これもまた、突然変異に関する位置情報を提供するＹｅｕｎｇによる方法を改良するものである（米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８７０５の請求項７および８を参照）が、その性質は明らかにされていない。
【０２１３】
実施例２４：同一酵母種の異なる株間の変異の同定
本明細書に開示される本発明の第２の工業的用途において、同一酵母種の異なる株間の変異を同定することができる。
【０２１４】
ゲノムＤＮＡを、酵母株Ａおよび酵母株Ｂから調製した。これらの酵母株はいずれも同一種Saccharomyces cerevisaeに属している。
【０２１５】
ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ（Fermentas）およびＭｓｅＩ（New England Biolabs）で消化した。１μｇのＤＮＡを、総容量４０μｌのＳａｃＩ＋緩衝液（Fermentas）中、１５単位のＳａｃＩで消化した。更に、これに４μｌのＮＥＢ２緩衝液および０．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ並びに１５単位のＭｓｅＩを二回目の消化のために補った。
【０２１６】
消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、標準的な連結反応条件下で合成アダプターを連結した：
−ＳａｃＩアダプター（配列番号９および配列番号１０）
−ＭｓｅＩアダプター（配列番号１１および配列番号１２）。
【０２１７】
ＳａｃＩアダプターをビオチン標識化した。
【０２１８】
続いて、ビオチン標識ゲノム断片を実施例７におけるように選択した。
【０２１９】
ここで、選択したＤＮＡを、実施例８におけるように増幅したが、配列番号１３および配列番号１４として特定したプライマー並びにＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０２２０】
株１の増幅からの産物、並びに株１および株２から増幅した産物の混合物を実施例３におけるように産生した基質に添加し、基質１（マッチ）および基質２（ミスマッチ）を作製した。
【０２２１】
この材料から、株間の相違を決定した。
【０２２２】
基質１により、複合ＤＮＡ混合物の存在が背景ノイズを許容しがたいレベルまで上昇させるかどうかを決定することが可能になる。基質２により、ＳＡＭＰＡＤが複合ＤＮＡ混合物の存在下で作用するかどうかを調査することが可能になる。
【０２２３】
実施例２０におけるようにＳＡＭＰＡＤを行った。図１６に示すように、複合ＤＮＡは、ＳＡＭＰＡＤが正しく機能することを妨げるものではない。
【０２２４】
ヘテロ二本鎖分子がＤＮＡ複合混合物から同定可能であるかどうかを確認するために、磁性粒子を蒸留Ｈ２Ｏに再懸濁させ、ビオチン標識プライマーを使用したこと以外は、実施例３におけるようにＰＣＲ増幅用基質として１μｌを使用した。これにより、ＰＣＲ産物１（株１由来）およびＰＣＲ産物２（２株混合物由来）が生成された。
【０２２５】
ＰＣＲ産物１および２を、アッセイ２０におけるように沈殿させ、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（１ＸＭＥＳ、２００μｌ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）に再懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートし、ハイブリダイゼーション混合物を使用する準備を行う。
【０２２６】
ハイブリダイゼーション用混合物を１２時間ＤＮＡチップにハイブリダイズさせた。チップは多様なゲノミックＳａｃＩ制限部位を認識できるオリゴヌクレオチドを含むものとした。
【０２２７】
株１由来のサンプルと、２株混合物由来のサンプルとに存在する断片を比較すると、２株間の配列差異が目を引く。
【０２２８】
図１５におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
ａ）Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｂ）１：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。株１酵母ＤＮＡで選択。選択前。
ｃ）２：マッチＤＮＡ５０％。ミスマッチＤＮＡ５０％。株１および株２の混合酵母ＤＮＡで選択。選択前。
ｄ）３：ＤＮＡニックトランスレーションについての陽性対照。選択前。
ｅ）４：マッチＤＮＡ１００％。ミスマッチＤＮＡ０％。株１酵母ＤＮＡで選択。３ラウンド選択。
ｆ）５：マッチＤＮＡ５０％。ミスマッチＤＮＡ５０％。株１および株２の混合酵母ＤＮＡで選択。３ラウンド選択後。
ｇ）６：ＤＮＡニックトランスレーションについての陽性対照。３ラウンド選択後。
【０２２９】
実施例２５：ＳＡＭＰＡＤスクリーニング実験
希少な突然変異のスクリーニングにおける本発明による方法の信頼性（robustness）を試験するために、盲検を行った。この実験は、どのサンプルにミスマッチＤＮＡが含有されているかを操作者に知らせずに、１０サンプルのうちの１つにあるミスマッチＤＮＡ分子を検出させることからなる。この状況は、完全に野生型の背景において希少な突然変異が検出される場合の、本方法の現実での用途を模したものである。１０個の別個の反応を行い、そのうちの１つには、１：１２８、即ち、１２８個の分子につき１個の変異体ＤＮＡ分子、の割合で変異体配列が包含されていた。
【０２３０】
また、この実験では、内部対照ＤＮＡを追加してアッセイの再現性を確認した。この内部対照はいかなる可変性も有さず、変異が探索されるＤＮＡと共に、反応の全工程を通して置いた。
【０２３１】
ＤＮＡ鋳型を実施例１および２におけるように調製し、基質を実施例３におけるように調製した。イネゲノムＤＮＡ上のプライマーＦｕｔ．Ｆ（配列番号１７）およびＦｕｔ．Ｒ（配列番号１８）の増幅産物を適切な制限酵素で消化し、適切に消化したプラスミドに挿入したことを除いて、内部対照の鋳型を実施例１と同様に調製した。内部対照基質を、実施例３と同様であるが、プライマーＦｕｔ．Ｆ（配列番号１７）およびＦｕｔ．Ｒ（配列番号１８）を用いて調製した。
【０２３２】
プライマーＣａＥｎｈ（配列番号１５）およびＧＦＰＲ（配列番号１６）をサンプルＤＮＡのために使用して９００ｂｐの断片を生成し、Ｆｕｔ．Ｆ（配列番号１７）およびＦｕｔ．Ｒ（配列番号１８）を内部対照ＤＮＡのために使用して、３２０ｂｐの断片を生成したことを除いて、実施例４におけるようにマスキングを行い、ヘテロ二本鎖構造を実施例５におけるように認識および修飾し、実施例２０におけるように精製し、実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択し、実施例８におけるように同定した。
【０２３３】
そして、図１６に示すように、この実験は、本発明による方法が１２８個の分子につき１個の変異体分子を効果的に同定するのに十分な程高感度であることを示している。
【０２３４】
図１６におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
Ｍ：λＰｓｔマーカー。
ｍ：１００ｂｐ  ラダー。
１：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
２：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
３：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
４：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
５：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
６：１／１２８ミスマッチ基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
７：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
８：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
９：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
１０：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
１１：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。選択前。
１２：標識対照。選択前。
１３：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
１４：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
１５：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
１６：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
１７：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
１８：１／１２８ミスマッチ基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
１９：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
２０：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
２１：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
２２：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
２３：マッチした基質。マッチした内部マスキング対照。９ラウンドの選択。
２４：標識対照。９ラウンドの選択。
２５：陽性ＰＣＲ対照。
２６：陰性ＰＣＲ対照。
【０２３５】
実施例２６：ＡＰＣ遺伝子における突然変異の検出
この実施例では、ヒト腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子における突然変異を分析した。これらの突然変異は、ヒトの結腸癌の発生と関連がある場合が多い。突然変異は、ＡＰＣ遺伝子のエクソン１５の突然変異クラスタ領域（ＭＣＲ）に最も頻繁に発現する。しかしながら、突然変異が典型的に発現する特徴的な特異的部位（「ホットスポット」）はない。むしろ、ＭＣＲはその全体が「ホット領域」であり、様々な突然変異がこの領域には頻繁に発現する。
【０２３６】
この特徴的な特異的突然変異が存在しないため、許容しがたい程低い診断アッセイのためのごく小さな異常としての特定の突然変異の検出に適合した方法論を適用することができず、原因の突然変異のサブセットが特定される。ＡＰＣのＭＣＲは、本発明による方法に適した標的である。
【０２３７】
図１７において認められるように、本実施例では、本発明による方法がかかる突然変異に対してヘテロ接合の患者におけるＡＰＣのＭＣＲにおけるフレームシフト突然変異の検出を可能とすることを示している。
【０２３８】
実験の概要
標準的な反応条件および熱サイクル条件（例えば、実施例３に記載されるような条件）下で、プライマーＡＰＣ１（配列番号１９）およびＡＰＣ２（配列番号２０）を使用して、患者のサンプルから得られたＡＰＣ遺伝子（配列番号２２）のエクソン１５のコドン１２３９〜１５６１を含むエクソン１３からのゲノムＤＮＡの増幅をＰｆｕポリメラーゼを用いて行った。
【０２３９】
実施例２５におけるように、内部対照ＤＮＡを添加し、アッセイの再現性を確認した。この対照ＤＮＡを増幅するのに使用したプライマーは、Ｆｕｔ．Ｆ（配列番号１７）およびＦｕｔ．Ｒ（配列番号１８）であった。
【０２４０】
マスキングを実施例４におけるように行い、ヘテロ二本鎖構造を実施例５におけるように認識および修飾し、実施例２０におけるように精製し、実施例６におけるように標識化し、実施例７におけるように選択した。ＰＣＲ分析による同定は、プライマー対ＡＰＣ２（配列番号２０）およびＡＰＣ３（配列番号２１）を用いて、実施例８におけるように行った。これは、このアッセイで突然変異について分析したＡＰＣＲのＭＣＲの一部分を増幅する。
【０２４１】
診断ＡＰＣの増幅により２８７ｂｐの産物（配列番号２３）が得られ、変異していない対照ＤＮＡは３５７ｂｐの産物（配列番号２４）を生成した。
【０２４２】
図１７におけるレーンは、左から右の順に以下のとおりである：
Ｍ：λＰｓｔマーカー。
１：フレームシフト突然変異のないＡＰＣ  ＤＮＡ。変異していない参照サンプル。選択前。
２：フレームシフト突然変異のあるＡＰＣ  ＤＮＡ。変異していない参照サンプル。選択前。
３：標識対照反応。ＡＰＣ  ＤＮＡおよび変異していない参照サンプル。選択前。
４：フレームシフト突然変異のないＡＰＣ  ＤＮＡ。変異していない参照サンプル。６ラウンドの選択。
５：フレームシフト突然変異のあるＡＰＣ  ＤＮＡ。変異していない参照サンプル。６ラウンドの選択。
６：標識対照反応。ＡＰＣ  ＤＮＡおよび変異していない参照サンプル。６ラウンドの選択。
７：陰性ＰＣＲ対照。
８：陽性ＰＣＲ対照。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】図１は、精製プラスミドＤＮＡのＤＮＡニックトランスレーションによる標識化を示している。
【図２】図２は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたビオチンヌクレオチドによるＤＮＡの標識化は３７℃で行われるが、５０℃ではるかに効果的であることを示している。
【図３】図３は、ＤＮＡニックトランスレーションとは完全に独立の代替の標識化方法を提供する、ＤＮＡ標識化におけるＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの有効性を示している。
【図４】図４は、ＤＮＡニックトランスレーションへのＤＮＡリガーゼの望ましくない干渉を示している。
【図５】図５は、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性が如何にＤＮＡ末端の標識化を引き起こし得るかについての論理的考察を例証している。太線は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の結果を示しており、即ち、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ標識化を示している。
【図６】図６は、ｄｄＧＴＰを用いた大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによるＤＮＡ損傷のマスキングが、行われた標識化の量を劇的に低減することを示している。
【図７】図７は、ＤＮＡがｄｄＧＴＰでマスクされたか否かにかかわらず、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが線状ＤＮＡ末端を無差別に標識化することを示している。
【図８】図８は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ損傷およびＤＮＡ末端をｄｄＧＴＰでマスクすることにより、線状ＤＮＡのＤＮＡニックトランスレーションにおける背景ノイズが最小限に抑えられることを示している。
【図９】図９は、異なる温度でのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたｄｄＧＴＰマスキングを示しており、組み込みが５０℃で最適に機能することを示している。
【図１０】図１０は、マングビーン・ヌクレアーゼにより処理されたミスマッチの検出を示している。
【図１１】図１１は、低レベルのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼを使用し、短いインキュベーション時間でミスマッチの認識および修飾を行うことにより、ニックを入れたＤＮＡ（処理されたヘテロ二本鎖ＤＮＡ）が効果的に捕捉されることを示している。
【図１２】図１２は、ＤＮＡの標準的なエタノール沈殿がマスキングに及ぼす有害作用を示している。
【図１３】図１３は、スピンカラム精製が背景標識の増加をほとんど誘発しないことを示している。
【図１４】図１４は、本発明による方法全体の結果を示しており、当該方法が２５５個の正常な分子の存在下で１つの変異体分子を効果的に検出するほど十分に高感度であることを示している。
【図１５】図１５は、本発明による方法を用いた同一酵母種の異なる株間の変異の同定を示している。
【図１６】図１６は、ＳＡＭＰＡＤスクリーニング実験において本発明による方法を使用することにより、１２８個の分子につき１つの変異体分子が効果的に同定されることを示している。
【図１７】図１７は、本発明による方法を用いたヒト腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子における突然変異の同定を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2007532120.tif 000019
2007532120.tif 000020
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