(57)【要約】  本発明は，容易に加工して適切なＮ末端を有するＩＧＦを与える高レベルの融合蛋白質を生じさせる融合コンストラクトを用いて，成熟インスリン様成長因子（ＩＧＦ）を製造するための核酸配列，発現系，宿主細胞，ポリペプチドおよび方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
MQIFVKTLTGK[X1]0-30LE[X2]LFQ[IGF]
［式中，Ｘ1は，０−３０個のアミノ酸の配列を有するペプチドであり；Ｘ2はＶまたはＴであり；およびＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−１である］
を含むポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項２】
Ｘ1が，（Ａ）０個のアミノ酸，（Ｂ）配列ＴＩＴＬＥＶの６個のアミノ酸，および（Ｃ）配列TITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQ
の３０個のアミノ酸からなる群より選択される，請求項１記載の核酸。
【請求項３】
以下の蛋白質：
MQIFVKTLTGK[X1]0-30LE[X2]LFQ[IGF]
［式中，Ｘ1は，０−３０個のアミノ酸を有するペプチドであり；Ｘ2はＶまたはＴであり；およびＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−１である］
をコードする蛋白質発現ベクターを含む蛋白質発現系。
【請求項４】
Ｘ1が，（Ａ）０個のアミノ酸，（Ｂ）配列ＴＩＴＬＥＶの６個のアミノ酸，および（Ｃ）配列TITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQの３０個のアミノ酸からなる群より選択される，請求項３記載の蛋白質発現系。
【請求項５】
宿主細胞，および
以下のポリペプチド：
MQIFVKTLTGK[X1]0-30LE[X2]LFQ[IGF]
［式中，Ｘ1は，０−３０個のアミノ酸のペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；およびＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−１である］
をコードする蛋白質発現ベクター，
を含む蛋白質発現系。
【請求項６】
Ｘ1が，（Ａ）０個のアミノ酸，（Ｂ）配列ＴＩＴＬＥＶの６個のアミノ酸，および（Ｃ）配列TITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQの３０個のアミノ酸からなる群より選択される，請求項５記載の蛋白質発現系。
【請求項７】
宿主細胞が原核生物である，請求項５記載の蛋白質発現系。
【請求項８】
宿主細胞が真核生物である，請求項５記載の蛋白質発現系。
【請求項９】
Ｎ末端ＩＧＦを発現させる方法であって，
（Ａ）宿主細胞を，以下のポリペプチド：
MQIFVKTLTGK[X1]0-30LE[X2]LFQ[IGF]
［式中，Ｘ1は，０−３０個のアミノ酸を有するペプチドであり；Ｘ2はＶまたはＴであり；およびＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−１である］
をコードする発現ベクターでトランスフェクトし；
（Ｂ）前記宿主細胞を前記ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養し；そして
（Ｃ）ポリペプチドを単離する，
の各工程を含む方法。
【請求項１０】
Ｘ1が，（Ａ）０個のアミノ酸，（Ｂ）配列ＴＩＴＬＥＶの６個のアミノ酸，および（Ｃ）配列TITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQの３０個のアミノ酸からなる群より選択される，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が原核生物である，請求項９記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が真核生物である，請求項９記載の方法。
【請求項１３】
組換えＮ末端ＩＧＦを製造する方法であって，
（Ａ）（１）約１Ｍ−約３Ｍのカオトロピック剤，ここで，前記カオトロピック剤は尿素またはグアニジン塩酸塩であり；
（２）３Ｃプロテアーゼ；および
（３）以下の配列:
MQIFVKTLTGK[X1]0-30LE[X2]LFQ[IGF]
［式中，Ｘ1は，０−３０個のアミノ酸を有するペプチドであり；Ｘ2はＶまたはＴであり；およびＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−１である］
を含むポリペプチド，
の切断混合物を調製し；
（Ｂ）切断混合物を約４℃−約３７℃の温度でプロテアーゼがポリペプチドを切断するのに十分な時間インキュベートし；そして
（Ｃ）Ｎ末端ＩＧＦを単離する，
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
Ｘ1が，（Ａ）０個のアミノ酸，（Ｂ）配列ＴＩＴＬＥＶの６個のアミノ酸，および（Ｃ）配列TITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQの３０個のアミノ酸からなる群より選択される，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下のポリペプチド配列：
MQIFVKTLTGK[X1]0-30LE[X2]LFQ[IGF]
［式中，Ｘ1は，０−３０個のアミノ酸のペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；およびＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−１である］
を含むポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ1が，（Ａ）０個のアミノ酸；（Ｂ）配列"ＴＩＴＬＥＶ"の６個のアミノ酸；および（Ｃ）配列"TITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQ"の３０個のアミノ酸からなる群より選択される，請求項１５記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は，米国特許仮出願６０／４７７，９４１（２００３年６月１３日出願）に基づく優先権を主張する。この出願は，本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】
本発明は，高レベルの生成物が得られ，これを容易に加工してヒトで使用するのに適切なＮ末端を有するＩＧＦを得ることができる，組換えインスリン様成長因子（ＩＧＦ）発現系を提供する。
【背景技術】
【０００３】
組換え製造は，治療用の蛋白質を，天然の起源から蛋白質を精製するうえでの困難性および危険性を回避しながら，大量に製造することを可能とする。ヒト蛋白質の場合，組換え製造は，しばしば治療用製品の商業的な販売に必要な量の蛋白質を製造する唯一の実用的な方法である。組換え製造はまた，労働者がヒト体液および組織に曝露されることをなくし，ウイルスなどの感染性病原体に曝露される可能性を回避する。
【０００４】
組換え製造は，組換え宿主細胞において所望の蛋白質をコードするＤＮＡコンストラクトを発現させることを含む。宿主細胞は原核生物（例えば，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の細菌）であっても真核生物（例えば酵母または哺乳動物細胞株）であってもよい。大規模組換え製造においては，細菌または酵母宿主細胞が最も一般に用いられている。これは，これらの生物の操作および増殖が簡単であること，およびこれらの生物が比較的単純な成長培地を必要とするためである。
【０００５】
しかし，組換え製造には困難も伴う。特定の蛋白質に，および特定の宿主細胞について，発現コンストラクトを最適化しなければならない。宿主細胞において組換え蛋白質を発現させることは，組換え蛋白質を新たな組の宿主細胞酵素，例えばプロテアーゼに曝露することであり，これらの酵素は，組換え蛋白質を改変する可能性があり，分解することもできる。組換え蛋白質の改変および分解は，収率を低下させ，組換え蛋白質の精製を複雑なものにする場合があるため，望ましくない。細菌の細胞質で過剰発現されたポリペプチドは，しばしば不溶性の"インクルージョンボディー"として蓄積する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：６８７−６８８（１９８２）；Ｓｃｈｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１５１−１５４（１９８５））。インクルージョンボディーの形で蓄積されたポリペプチドはあまり役にたたない。この不溶性物質を活性な可溶性のポリペプチドに変換するためには，遅くかつ困難な可溶化および再フォールディングのプロトコルが必要であり，これはしばしば生物学的に活性なポリペプチドの正味収率を低下させる。この問題はＩＧＦの製造に特に影響を与えており，“再フォールディング問題”を解決するために多くの試みがなされてきた。ポリペプチドが細菌の細胞質中で可溶性の形で発現された場合であっても，これらはしばしば宿主プロテアーゼによる分解のためにほとんど蓄積されない。さらに，蓄積されたポリペプチドはしばしば所望のアミノ末端を欠失している。この問題は一般に，所望のポリペプチドのＮ末端をキャリア蛋白質に融合させた融合蛋白質の発現による取り組みがされている。
【０００６】
しかし，融合ポリペプチドの使用には欠点がある。酵素的または化学的手段により所望のポリペプチドを融合パートナーから切り離すことがしばしば必要である。これは，融合パートナーと所望のポリペプチドとの間に切断用の適当な標的配列を配置することにより達成することができる。残念ながら，ポリペプチド切断に最も広く使用されている酵素は高価であるか，その切断が不十分または不正確であり，ほとんどの融合コンストラクトに首尾良く適用することができない。例えば，哺乳動物酵素であるエンテロキナーゼおよび第Ｘａ因子は，製造が高価であり切断効率に大きな変動を示す。一方，ズブチリシンなどの酵素は，製造は比較的安価であるが，その正確性は現在の"適正製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）"（ＧＭＰ）の元での商業的な規模のプロセスでは許容しえないものである。ヒトライノウイルス１４プロテアーゼ（３Ｃプロテアーゼと称される）は，グリシン残基のすぐＮ末端側のアミノ酸配列Ｅ−（ＶまたはＴ）−Ｌ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｐを切断する，丈夫な，正確な，安価な酵素である。３Ｃプロテアーゼは，ｄｓｂＡ−ＩＧＦ融合コンストラクトからＩＧＦを切断するのに用いられている（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．１４：１６０−１６６（１９９８））。しかし，ｄｓｂＡ−ＩＧＦの実質的な部分は切断に抵抗性であるため，３Ｃプロテアーゼは，３Ｃ部位を含有するＩＧＦ融合コンストラクトに普遍的に適用することはできない。
【０００７】
特許文献は，ＩＧＦの製造のための多数の融合系を記述し，そのそれぞれはある種の利点および欠点を有する。例えば，天然の成熟ＩＧＦ−１をコードするコンストラクト（追加のメチオニンを含む）の発現レベルは低い。発現を増強するために様々な方法が開発された。これには，例えば，融合パートナーの使用（Ｓｃｈｕｌｚ  Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１６９：５８５−５３９２１（１９８７）），および多数のプロテアーゼの欠損宿主の使用（Ｂｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：１９２３−１９３８（１９８５））が含まれる。しかし，これらのプロテアーゼ欠損宿主の成長特性は，高強度発酵には理想的ではない。また，単にＮ末端にＭｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓを付加することにより良好な発現が得られることが見いだされているが，この方法によっては真正のＩＧＦ−１を製造することができない（Ｂｅｌａｇａｊｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：１９５３−１９６２３（１９９７））。
【０００８】
ＩＧＦ融合コンストラクトを設計する際にしばしば見逃される別の問題点は，融合パートナーは本質的には無駄な生成物であるということである。原核生物は限定された量の組換え蛋白質しか発現することができず，典型的には，細胞の乾燥重量の４０％までである。融合パートナーがＩＧＦと比較して大きい蛋白質であれば，ＩＧＦの有効量は減少する。例えば，ｄｓｂＡ−ＩＧＦ融合蛋白質は約３１，５００ダルトンであり，このうちＩＧＦは約７，５００ダルトン，すなわち，総融合蛋白質の約２４パーセントである。米国特許５，６２９，１７２を参照。すなわち，比例して小さい融合パートナーを用いることによりＩＧＦ蛋白質製造の効率を増強することができる。
【０００９】
効率的な融合パートナーを同定することは，典型的には多くの試行錯誤を伴う困難な課題である。したがって，組換えＩＧＦの産生を高めるためには，より効率的な融合パートナーを用いる改良されたコンストラクトが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって，本発明の種々の観点においては，核酸配列，発現系，宿主細胞，ポリペプチド，および組換えインスリン様成長因子（ＩＧＦ）を製造する方法が提供される。
【００１１】
１つの態様においては，本発明は，以下のポリペプチド配列：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫ［Ｘ1］0-30ＬＥ［Ｘ2］ＬＦＱ［ＩＧＦ］
［式中，Ｘ1は０−３０アミノ酸のポリペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；ＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−Ｉである］
をコードする核酸配列を提供する。別の態様においては，本発明は，式中，Ｘ1がＴＩＴＬＥＶまたはＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱ，またはアミノ酸なし（すなわちゼロ）を表す，上述のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１２】
別の態様においては，本発明は，以下のポリペプチド配列：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫ［Ｘ1］0-30ＬＥ［Ｘ2］ＬＦＱ［ＩＧＦ］
［式中，Ｘ1は０−３０アミノ酸のポリペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；ＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−Ｉである］
をコードする蛋白質発現ベクターを提供する。別の態様においては，本発明は，式中，Ｘ1がＴＩＴＬＥＶまたはＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱ，またはアミノ酸なし（すなわちゼロ）を表す，上述のポリペプチドをコードする蛋白質発現ベクターを提供する。
【００１３】
別の態様においては，本発明は，以下の配列：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫ［Ｘ1］0-30ＬＥ［Ｘ2］ＬＦＱ［ＩＧＦ］
［式中，Ｘ1は０−３０アミノ酸のポリペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；ＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−Ｉである］
の蛋白質を提供する。別の態様においては，本発明は，式中，Ｘ1がＴＩＴＬＥＶまたはＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱ，またはアミノ酸なし（すなわちゼロ）を表す，上述の配列の蛋白質を提供する。
【００１４】
さらに別の態様においては，本発明は以下の配列：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫ［Ｘ1］0-30ＬＥ［Ｘ2］ＬＦＱ［ＩＧＦ］
［式中，Ｘ1は０−３０アミノ酸のポリペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；ＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−Ｉである］
の蛋白質を発現する組換え宿主細胞を提供する。別の態様においては，本発明は，式中，Ｘ1がＴＩＴＬＥＶまたはＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱ，またはアミノ酸なし（すなわちゼロ）を表す，上述の配列の蛋白質を提供する。１つの態様においては，宿主細胞は原核生物である。別の態様においては，宿主細胞は真核生物である。
【００１５】
別の態様においては，本発明はＩＧＦを発現させる方法を提供し，この方法は，宿主細胞を上述の発現ベクターでトランスフェクトし，これらの細胞を蛋白質発現を可能とする条件下で培養し，細胞，上清または培養液から蛋白質を単離することを含む。１つの態様においては，発現ベクターは，式中，Ｘ1がＴＩＴＬＥＶまたはＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱ，またはアミノ酸なし（すなわちゼロ）を表す，上述の配列の蛋白質をコードする。１つの態様においては，宿主細胞は原核生物であり，別の態様においては，宿主細胞は真核生物である。
【００１６】
本発明はまた，Ｎ末端ＩＧＦを製造する方法を提供し，ここで，切断混合物は，カオトロピック溶液，３Ｃプロテアーゼ，および以下の配列：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫ［Ｘ1］0-30ＬＥ［Ｘ2］ＬＦＱ［ＩＧＦ］
［式中，Ｘ1は０−３０アミノ酸のポリペプチド配列であり；Ｘ2はＶまたはＴであり；ＩＧＦはＮ末端ＩＧＦ−Ｉである］
のポリペプチドを含むよう調製される。１つの観点においては，本発明の方法は，式中，Ｘ1がＴＩＴＬＥＶまたはＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱであるか，またはアミノ酸なし（すなわちゼロ）を表す，上述の配列の蛋白質を含む切断混合物を用いる。切断混合物はさらに還元剤，例えばジチオスレイトールを含み，溶液／液体の形でありうる。
【００１７】
本発明の他の目的，特徴および利点は，以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。詳細な説明および特定の実施例は，好ましい態様を示すが，例示のためにのみ提供されるものであり，当業者にはこの詳細な説明から本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が明らかとなるであろう。さらに，実施例は本発明の原理を示しており，従来技術の分野の当業者に明らかに有用なすべての例に対する本発明の適用を特定的に例示していると期待することはできない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
図面の説明
図１は，ヒトＩＧＦの核酸配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号２１）を提供する。
【００１９】
図２は，本明細書に記載される７つのＩＧＦ−Ｉ融合コンストラクトのアミノ酸配列（配列番号１４から配列番号２０）を提供する。
【００２０】
図３は，本明細書に記載される７つのＩＧＦ−Ｉ融合コンストラクトの分子量，発現の特性，発現収率，およびプロテアーゼ切断の比較を記載する。
【００２１】
図４は，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ蛋白質の可溶性および不溶性の特性を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに以下を負荷した：（Ｍ）分子量標準；（１）ユビキチン−ＩＧＦ標準物質；（２）空レーン；（３）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ総細胞抽出物；（４）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ可溶性細胞抽出物；（５）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ不溶性細胞抽出物；（６）空レーン；（７）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ総細胞抽出物；（８）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ可溶性細胞抽出物；および（９）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ不溶性細胞抽出物。
【００２２】
図５は，ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ１７  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ蛋白質の可溶性および不溶性の特性を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに以下を負荷した：（Ｍ）分子量標準；（１）空レーン；（２）ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ総細胞抽出物；（３）ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ可溶性細胞抽出物；（４）ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ不溶性細胞抽出物；（５）空レーン；（６）空レーン；（７）ＴＲ１７  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ総細胞抽出物；（８）ＴＲ１７  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ可溶性細胞抽出物；および（９）ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ不溶性細胞抽出物。
【００２３】
図６は，ｄｓｂａ−３Ｃ−ＩＧＦ，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ，およびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦの相対的分子量，およびこれらの蛋白質の切断産物，例えば，成熟ＩＧＦを表す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに以下を負荷した：（Ｍ）分子量標準；（１）ＩＧＦ標準物質；（２）ＩＧＦ標準物質；（３）ｄｓｂＡ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物；（４）ｄｓｂＡ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（５）ｄｓｂＡ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（６）ｄｓｂＡ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（７）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物；（８）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（９）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（１０）全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（１１）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物；（１２）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；（１３）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断；および（１４）ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ細胞抽出物／３Ｃ切断。
【００２４】
詳細な説明
ＩＧＦを製造するためのＤＮＡコンストラクトが提供される。本発明のコンストラクトは，ユビキチン由来ペプチド，３Ｃプロテアーゼ切断部位，およびＮ末端ＩＧＦを含む融合コンストラクトを用いる発現系の収率を劇的に改善することにより，ＩＧＦの産生を高める。
【００２５】
１つの態様においては，約１１個の連続するアミノ酸からなる蛋白質ユビキチンからの短いペプチド配列を用いて，Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＧＦの高レベル発現を与える。別の態様においては，３Ｃ蛋白質からのプロテアーゼ切断部位をＩＧＦ融合コンストラクト中に組み込むことができる。別の態様においては，配列Ｅ−Ｖ／Ｔ−Ｌ−Ｆ−ＱのＣ末端を有する小さい蛋白質をＩＧＦとインフレームで融合させることができる。ＩＧＦのＮ末端はアミノ酸Ｇ−Ｐで始まるため，得られる融合蛋白質はプロテアーゼ切断部位Ｅ−Ｖ／Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｑ／／Ｇ−Ｐを含む。３Ｃプロテアーゼはこの切断部位（本明細書においては“／／”で表す）を認識し，コンストラクトからＩＧＦを放出する。すなわち，本発明の１つの観点においては，ヒトＩＧＦを効率よく製造するための原核生物発現系が提供される。さらに，本発明のコンストラクトおよび方法は，組換えＩＧＦの収率を劇的に改善する。
【００２６】
定義
特に定義しない限り，本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は，本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。同様に，本明細書において用いられる術語は特定の態様を記述するのみであり，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２７】
核酸コードおよびアミノ酸コードは，ＩＵＢ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：１−５（１９８５），本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている１文字表記により表すことができる。同様に，遺伝子および蛋白質，例えば制限エンドヌクレアーゼは，当該技術分野においてよく認識されている短縮形で表現することができる（ＫｏｔｙｋＡ．，ｅｄ．，Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ，Ｓｙｍｂｏｌｓ，Ｕｎｉｔｓ，ａｎｄ  Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｕｔｈｏｒｓ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９））。
【００２８】
本明細書において用いる場合，“Ｎ末端ＩＧＦ”とは，ＩＧＦ−Ｉ，特にヒトＩＧＦ−Ｉをコードするポリペプチドであって，Ｎ末端の最初の２つのアミノ酸がそれぞれグリシン（Ｇ）およびプロリン（Ｐ）であるものを表す。Ｎ末端ＩＧＦとしては，限定されないが，全長ＩＧＦ，Ｃ末端トランケート型のＩＧＦ，Ｎ末端ＩＧＦのキメラ，およびＮ末端アミノ酸ＧおよびＰが改変されていないＩＧＦの点突然変異体が挙げられる。Ｎ末端ＩＧＦの特定の例は，図に単独でまたは完全な融合コンストラクトのメンバーとして示されている。さらなる例として，“Ｎ末端ＩＧＦ”は，Ｎ末端の最初の３アミノ酸が欠失した天然に生ずるトランケート型のＩＧＦ−Ｉ（以下“ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ”と称する）を包含しない。Ｈｅｄｉｎｇら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１３９４８−１３９５２（１９９６））を参照。
【００２９】
本明細書において用いる場合，“ＧＰ−ＩＧＦ”とは，融合コンストラクトから切断されてヒトＩＧＦの適切なアミノ末端配列を有するポリペプチドとして得られたＩＧＦを表す。
【００３０】
本明細書において用いる場合，“成熟ＩＧＦ”とは，有用な生物学的特性を示すように再フォールディングされ任意に単離されているＧＰ−ＩＧＦを表す。当該技術分野においては，細胞または同化成長を刺激する（アゴニスト活性により）ＩＧＦ分子，細胞または同化成長をアンタゴナイズする（アンタゴニスト活性により，またはアゴニストＩＧＦを置き換えることにより［いわゆる“ヌルＩＧＦ”］）ＩＧＦ分子，および１またはそれ以上のインスリン様成長因子結合蛋白質に結合するＩＧＦ分子における有用性が認識されている。
【００３１】
本明細書において用いる場合，“発現系”とは，標的核酸の発現またはポリペプチドの産生および／または組立てを指示するために用いられる単一の核酸または複数の核酸を表す。本発明の発現系は，その形態において特に制限はなく，プラスミドに基づく形であってもよく，標的配列の染色体インテグレーションを指示する形であってもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））；米国特許５，４７０，７２７を参照。
【００３２】
本明細書において用いる場合，“宿主細胞”とは，１つの態様においては，細菌，特にＥ．ｃｏｌｉ宿主株を表し，これには，Ｋ株およびＢ株およびこれらの誘導体，例えばプロテアーゼ欠損株が含まれる。別の態様においては，この用語は，真核生物細胞，例えば酵母または実験室において繁殖するよう不死化されている組織培養細胞株を表す。さらに別の態様においては，この用語は，動物，植物，菌類，または昆虫組織に由来する細胞を表す。
【００３３】
本明細書において用いる場合，“３Ｃプロテアーゼ”とは，アミノ酸配列Ｅ−（ＶまたはＴ）−Ｌ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｐを認識するプロテアーゼを表す。プロテアーゼはグリシンのＮ末端側の配列を切断する。“３Ｃプロテアーゼ”との命名は，ヒトライノウイルス１４プロテアーゼに由来し，当業者には３Ｃとして知られている。Ｓｔａｎｗａｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７８５９−７５（１９８４））を参照。
【００３４】
以下の実施例は，本発明の種々の態様を例示するために提供され，いかなる意味においても本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１．  Ｕｂｉｑ−３Ｃ−ＩＧＦ−１発現ベクターの製造
５’３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むヒトＩＧＦ−１遺伝子（以下３Ｃ−ＩＧＦ−１と称する）を３つの発現ベクター中にクローン化した。
【００３６】
Ａ．発現ベクターのクローニングおよび確認
ヒトＩＧＦ−１（Ｃｅｌｔｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  Ａｌｌｅｎ，ＶＡ）（そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が図１に示される）を，３Ｃプロテアーゼ切断部位の６個のアミノ酸およびメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドとともにベクターｐＥＴ２９ａおよびｐＰｏｐにクローニングした。この融合戦略は，ＩＧＦ−１の可能な最も小さい融合パートナーを表し，これを用いて蛋白質の蓄積および分解を研究した。
【００３７】
３Ｃ−ＩＧＦ−１を，ｐＵＣ１９のＬａｃＺ遺伝子（２３アミノ酸）の下流にクローニングして，２番目に小さい融合遺伝子を作成した。
【００３８】
それぞれの例において，ＩＧＦ遺伝子は，プラスミドｐ１０７２３（Ｃｅｌｔｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  Ａｌｌｅｎ，ＶＡ）中に存在するＥ．ｃｏｌｉコドン最適化ＩＧＦ配列からＰＣＲを用いて増幅した。ｐＰｏｐおよびｐＥＴ２９ａ−ＰＣＲプライマーは，ベクターへのクローニングを容易にするために，それぞれ５’末端および３’末端にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を組み込むように設計した。３Ｃプロテアーゼ切断部位は５’ＮｄｅＩ部位のすぐ下流にＩＧＦ配列とインフレームになるように組み込んだ。ｐＵＣ１９−ＰＣＲプライマーは，ベクターへのクローニングを容易にするため，それぞれ５’末端および３’末端にＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ部位を組み込むように設計した。３Ｃプロテアーゼ切断部位はＳａｃＩ部位の下流に組み込んだ。ＰＣＲプライマーは下記の表に示される。
【００３９】
【表１】
2007530010.tif 000002
【００４０】
各３Ｃ−ＩＧＦコンストラクトについて，ＩＧＦ遺伝子をＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて製造元の指針にしたがって増幅した。典型的なＰＣＲ反応においては，２μｌのプラスミドＤＮＡを，５μｌのＭｇＣｌ2を含む１０ｘＥｘｐａｎｄバッファ，１μｇ／μｌの各プライマー１μｌ，２μｌの１０ｍＭヌクレオチドミックスと混合し，滅菌脱イオン水で最終容量５０μｌとした。
【００４１】
ＰＣＲサイクルは，サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅｒ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）で行い，変性，アニーリングおよび重合を含むものであった。各ＰＣＲについて同じサイクルを用いた。ＰＣＲの第１段階では，テンプレートＤＮＡを９４℃で２分間加熱することにより変性させた。反応混合物にＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼを加えた。第２段階においては，反応液を９４℃で１分間変性させ，６０℃で３０秒間冷却してプライマーをアニーリングさせ，７２℃で１分間加熱してＤＮＡ伸長を行わせた。続いて３５サイクルを行った。３５サイクルの後，７２℃で最終の１０分間の加熱工程を行った後，サンプルを４℃に冷却した。
【００４２】
得られた３Ｃ−ＩＧＦＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析した。ＰＣＲ産物が正しいサイズの約２３０ｂｐであることを確認した後，これをＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて製造元の指針にしたがってベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングした。ライゲーションの後，ｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１をＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にトランスフォームした。トランスフォーマントはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天上で選択した。
【００４３】
推定３Ｃ−ＩＧＦ−１ＰＣＲクローンは，まず全細胞溶解調製物を用いて分析して，プラスミドＤＮＡの存在およびそのおよそのサイズを決定した。クローンを制限酵素で消化して，３Ｃ−ＩＧＦ−１遺伝子を切り出し，その存在を確認した。ｐＰｏｐへのライゲーションを意図して，３Ｃ−ＩＧＦ−１をサブクローンから切り出すためにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた。典型的には，１８μｌのプラスミドＤＮＡを１μｌの各酵素で２μｌの１０Ｘ酵素特異的バッファの存在下で消化した。消化産物は３７℃の水浴中で４時間放置し，アガロースゲルで電気泳動を行った。
【００４４】
上で同定された３Ｃ−ＩＧＦ−１を有するクローンは，Ｔｏｐ１０Ｆ’：：ｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１，およびＴｏｐ１０Ｆ’：：ｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１（ＬａｃＺ）と名付け，これをｐＰｏｐ，ｐＥＴ２９ａおよびｐＵＣ１９中にライゲーションするための３Ｃ−ＩＧＦ−１の起源として用いた。
【００４５】
Ｂ．ｐＰｏｐおよびｐＥＴ２９ａへの３Ｃ−ＩＧＦ−１のライゲーション
プラスミドＤＮＡは，Ｔｏｐ１０Ｆ’：：ｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１，ＭＳＤ３３６３ｐＰｏｐおよびＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ：：ｐＥＴ２９ａの５ｍｌ一晩培養物から，ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造元の指針にしたがって単離した。ベクターｐＰｏｐおよびｐＥＴ２９ａは，ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化することにより，３Ｃ−ＩＧＦへのライゲーション用に用意した。同様に，３Ｃ−ＩＧＦ遺伝子は，ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化することによりｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１から直接切り出した。次に，３Ｃ−ＩＧＦ−１遺伝子をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてリン酸化ｐＰｏｐおよびｐＥＴ２９ａに１７℃で一晩ライゲーションした。得られたコンストラクトであるｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１およびｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦ−１をＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）に製造元の指針にしたがってトランスフォームした。トランスフォーマントは，ｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１についてはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ），およびｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦ−１についてはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性を用いて選択した。
【００４６】
トランスフォーマントは，ｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１についてはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ），ｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦについてはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に格子状に播種し，３７℃で一晩インキュベートした。クローンは，全細胞溶解調製物を用いてＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでの制限酵素消化により分析した。３Ｃ−ＩＧＦ−１を有することが示された得られたコンストラクトは，ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ：：ｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１およびＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ：：ｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦ−１と名付けた。
【００４７】
Ｃ．３Ｃ−ＩＧＦ−１のｐＵＣ１９へのライゲーション
プラスミドＤＮＡは，ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造元の指針にしたがってＴｏｐ１０Ｆ’：：ｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１（ＬａｃＺ）の５ｍｌの一晩培養物から単離した。ベクターｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化することにより３Ｃ−ＩＧＦ−１へのライゲーション用に用意した。同様に，３Ｃ−ＩＧＦ−１遺伝子は，ｐＣＲ２．１／３Ｃ−ＩＧＦ−１（ＬａｃＺ）からＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化することにより直接切り出した。次に，３Ｃ−ＩＧＦ−１遺伝子をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてリン酸化ｐＵＣ１９に１７℃で一晩ライゲーションさせた。得られたコンストラクトｐＵＣ１９／３Ｃ−ＩＧＦ−１を，製造元の指針にしたがってＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にトランスフォームした。トランスフォーマントはアンピリシン耐性（１００μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。
【００４８】
トランスフォーマントは，アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に格子状に播種して，３７℃で一晩インキュベートした。クローンは，全細胞溶解調製物を用いてＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩでの制限酵素消化により分析した。３Ｃ−ＩＧＦ−１を有することが示された得られたコンストラクトは，ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ：：ｐＵＣ１９／３Ｃ−ＩＧＦ−１と名付けた。
【００４９】
Ｄ．ｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１およびｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦ−１のＥ．ｃｏｌｉ宿主株へのエレクトロポレーション
発現ベクターを有するそれぞれのＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株から得た各１μｌのｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１およびｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦ−１を，５つのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＥ３エレクトロポレーション可能宿主株，すなわちＢＬ２１，ＭＳＤ６８，ＭＳＤ２２５２，ＵＴ５６００およびＭＳＤ２２５４ｐＬｙｓＳにエレクトロポレーションした。
【００５０】
宿主は，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いて製造元の指針にしたがってエレクトロポレーションした（パラメータ：２５μＦ，２００Ω，２．５ｋＶ）。ｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１を有するトランスフォーマントは，１０μｌ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天上で選択した。ｐＥＴ２９ａ／３Ｃ−ＩＧＦ−１を有するトランスフォーマントは，５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天上で選択した。トランスフォーマントを適当な抗生物質を含むＬＢ寒天上に格子状に播種し，４℃で保存した。それぞれの株のグリセロールストックを作成し，−７０℃で保存した。
【００５１】
Ｅ．ｐＰｏｐからの３Ｃ−ＩＧＦ−１の発現
最初に，実験室規模の振盪フラスコを用いて，ｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１をエレクトロポレーションしたそれぞれのＥ．ｃｏｌｉ宿主株から，３Ｃ−ＩＧＦ−１が細胞内プロテアーゼにより分解されずに（分子のサイズが小さいため）発現されるか否かを調べた。
【００５２】
１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む５ｍｌのＬＢ培地にｐＰｏｐ／３Ｃ−ＩＧＦ−１を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主株を接種した。細胞は旋回インキュベータで良好な通気条件で（２００ｒｐｍ）３７℃で一晩増殖させた。次に各０．５ｍｌの一晩培養物を用いて，１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。  培養物を３７℃でＯＤ６００が約０．４−０．６となるまでインキュベートした。この時点で，培養物を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２．５時間誘導した。
【００５３】
誘導の後，誘導前および誘導後のサンプルを，製造元の指針にしたがって還元変性条件下で，４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルに等量負荷し，電気泳動した。
【００５４】
ゲルではいずれの宿主細胞（ＢＬ２１，ＭＳＤ６８，ＭＳＤ２２５２，ＵＴ５６００およびＭＳＤ２２５４ｐＬｙｓＳ）からも３Ｃ−ＩＧＦ−１の発現が見られなかった。この結果は，（ａ）蛋白質が発現されなかったか，または（ｂ）融合蛋白質は発現されたが，融合蛋白質のサイズが小さいために細胞内プロテアーゼにより分解されたことを示唆する。プロモーター／誘導の強さから，蛋白質が発現されなかったことはほとんどありそうにないため，蛋白質が分解されたことが示唆される。
【００５５】
Ｆ．ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ融合遺伝子の構築
ＳＯＥ−ＰＣＲ手法（Ｗａｒｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８６：２９−３５（１９９７））を用いて，現存するユビキチンＩＧＦ−Ｉコンストラクト（ｐＥＲ１００８８；Ｃｅｌｔｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  Ａｌｌｅｎ，ＶＡ）をｐＰＯＰ発現ベクター中にクローン化し，同時にユビキチンとＩＧＦ遺伝子との間に３Ｃ切断配列を導入した。融合蛋白質のアミノ酸配列は図２に示される。
【００５６】
４つのプラスミドを構築した。全長ユビキチン（ＦＬ）は，ｐＥＲ１００８８に見いだされるユビキチン融合パートナーと正確に同じものを有していたが，ただし，ユビキチンと成熟ＩＧＦ−１のＮ末端との間に挿入された６アミノ酸の３Ｃ認識部位を有する。
【００５７】
ＴＲ４１（４１位トランケート型）は，ユビキチンの最初の４１アミノ酸，続いて３Ｃ認識部位およびＩＧＦ−１から構成され；ＴＲ１１（４１位トランケート型）は，ユビキチンの最初の１１アミノ酸，続いて３Ｃ認識部位およびＩＧＦ−１から構成され；ＴＲ１７（４１位トランケート型）は，ユビキチンの最初の１１アミノ酸，続いて３Ｃ認識部位およびＩＧＦ−１から構成された。
【００５８】
プライマーは，ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＰｏｐまたはｐＥＴベクターへのクローニングを可能とするよう設計し，商業的な合成者から購入した。
【００５９】
表２に示されるプライマーを用いて，ＵＱ１およびＵＱ２から３Ｃ−ＩＧＦオーバーハングを有する全長ユビキチンを得た。ＵＱ１およびＵＱ５から３Ｃ−ＩＧＦオーバーハングを有するトランケート型（４１ａａ）ユビキチンを得た。ＵＱ３およびＵＱ４から全長ユビキチンオーバーハングを有する３Ｃ−ＩＧＦを得た。ＵＱ６およびＵＱ４からトランケート型ユビキチンオーバーハングを有する３Ｃ−ＩＧＦを得た。ＵＱ１３およびＵＱ４から３Ｃ−ＩＧＦオーバーハングを有するトランケート型（１１ａａ）ユビキチンを得た。ＵＱ１６およびＵＱ４から３Ｃ−ＩＧＦオーバーハングを有するトランケート型（１１ａａ）ユビキチンを得た。
【００６０】
【表２】
2007530010.tif 000003
【００６１】
上述のプライマー対を用いて，Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムを用いて製造元の指針にしたがってＰＣＲを行った。各ＰＣＲ反応において，２μｌのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＲ１００８８またはｐ１０７２４）を，ＭｇＣｌ2を含む５μｌの１０ｘＥｘｐａｎｄバッファ，１μｇ／μｌの各プライマー１μｌ，２μｌの１０ｍＭヌクレオチドミックスと混合し，滅菌脱イオン水で最終容量５０μｌとした。
【００６２】
サーモサイクラーで変性，アニーリングおよび重合を含むＰＣＲサイクルを行った。各ＰＣＲについて同じサイクルを用いた。ＰＣＲの最初の工程では，テンプレートＤＮＡを９４℃で２分間加熱することにより変性した。次にＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼを加えた。第２工程においては，反応液を９４℃で１分間変性し，６８℃で４５秒間冷却してプライマーをアニーリングさせ，次に７２℃で１分間加熱してＤＮＡを伸長させた。続いて３３サイクルを行った。次に，７２℃で最終の１０分間の加熱工程を行い，サンプルを４℃に冷却した（この温度で保持）。
【００６３】
ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で分析した。ゲルからバンドを切り出し，市販の抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＤＮＡを抽出し，ＤＮＡを３０μｌのバッファ中に溶出した。
【００６４】
第２ラウンドのＰＣＲは，これらのＰＣＲ産物をテンプレートとして用い，ＵＱ１およびＵＱ４をプライマーとして用いて行った。ＰＣＲ反応は先に用いたものと同じであったが，ただし，１μｌのＤＮＡを用い，アニーリング温度は６５℃であった。
【００６５】
ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析した。ゲルからバンドを切り出し，市販の抽出キットを用いてＤＮＡを抽出し，ＤＮＡを３０μｌのバッファ中に溶出した。
【００６６】
３μｌの精製ＰＣＲ産物を，ＴＯＰＯＴＡクローニングキットを用いて製造元の指針にしたがってベクターｐＣＲ２．１にサブクローニングした。ライゲーションの後，プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞にトランスフォームした。トランスフォーマントはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天上で選択した。
【００６７】
ＰＣＲクローンはまず，全細胞溶解調製物を用いて分析して，プラスミドＤＮＡの存在およびそのおよそのサイズを検出した。クローンを制限酵素で消化して，３Ｃ−ＩＧＦ−１遺伝子を切り出してその存在を確認した。
【００６８】
ｐＰｏｐ中にライゲーションするために，ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてサブクローンから３Ｃ−ＩＧＦ−１を切り出した。典型的には，２μｌの１０Ｘ酵素特異的バッファの存在下で１８μｌのプラスミドＤＮＡを１μｌの各酵素を用いて消化した。切断産物は３７℃の水浴中に４時間放置し，アガロースゲルで電気泳動を行った。
【００６９】
ベクターｐＰｏｐをＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化してライゲーション用に準備した。次に，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて３Ｃ−ＩＧＦ１融合遺伝子をリン酸化ｐＰｏｐに１７℃で一晩ライゲーションさせた。得られたコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株に製造元の指針にしたがってトランスフォームした。トランスフォーマントはテトラサイクリン耐性（１０μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。
【００７０】
トランスフォーマントをテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に格子状に播種し，３７℃で一晩インキュベートした。クローンは全細胞溶解調製物を用いて，ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いる制限酵素消化により分析した。
【００７１】
実施例２．  エレクトロポレーションによるＥ．ｃｏｌｉストックの作成
この実施例においては，エレクトロポレーションにより発現ベクターを有するＥ．ｃｏｌｉストック株を作成した。
【００７２】
エレクトロポレーション可能株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０およびＢＬ２１を，発現ベクターを有するそれぞれのＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株から単離した１μｌのプラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションした。宿主は，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いて，製造元の指針にしたがってエレクトロポレーションした（パラメータ：２５μＦ，２００(，２．５ｋＶ）。トランスフォーマントは１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天上で選択した。トランスフォーマントを適当な抗生物質を含むＬＢ寒天上に格子状に播種し，４℃で保存した。各株のグリセロールストックを作成し，−７０℃で保存した。
【００７３】
実施例３．  ＩＧＦ１の発現
実験室スケールの撹拌フラスコを用いて，種々の宿主株における３７℃での発現を調べた。
【００７４】
Ａ．発現ベクターを有するＥ．ｃｏｌｉストック株の増殖
発現ベクターを含む宿主株を適当な抗生物質を含む５ｍｌのＬＢ培地に接種した。細胞は旋回インキュベータで良好な通気条件で３７℃で一晩増殖させた。各０．５ｍｌの一晩培養物を適当な抗生物質を含む５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。培養物を３７℃でＯＤ６００が約０．４−０．６となるまでインキュベートした。この時点で培養物を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２．５時間誘導した。
【００７５】
誘導の後，誘導前および誘導後の両方のサンプルを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルで製造元の指針にしたがって還元変性条件下で電気泳動した。それぞれ１．５ｍｌの誘導前および誘導後のサンプルを実験ベンチマイクロ遠心器で１３，０００ｒｐｍで２分間回収した。上清をデカントし，ペレットを脱イオン水に再懸濁した。各ペレットを再懸濁した水の量は様々であり，ゲルのトラック間の比較を意味のあるものとするために，同等の光学密度の懸濁液を与えるように計算した。ゲルへの負荷量はサンプルレーンの後の括弧内に示される。各ゲルはデンシトメトリを用いて定量した。
【００７６】
Ｂ．可溶性および不溶性蛋白質の分画
約２，５００ｇで１０分間の遠心分離により細胞ペレットを回収し，元の体積の１／４の１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞懸濁液を，Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＸＬ  ２０２０超音波照射器で間に３０秒間の冷却を挟み７ｘ３０秒間で超音波処理した。
【００７７】
超音波処理産物をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心器で１２，０００ｒｐｍ（４(Ｃ），１５分間の遠心分離により回収した。上清（可溶性画分）をデカントし，氷上に保存した。ペレット（不溶性画分）を１０ｍｌの滅菌脱イオン水に再懸濁した。それぞれのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。
【００７８】
Ｃ．ユビキチン−ＩＧＦポリペプチドの３Ｃプロテアーゼによる切断
上述のようにして構築した種々のＵｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ−１融合物およびＤｓｂ−３Ｃ−ＩＧＦ融合物（ｐ１０７２３；Ｃｅｌｔｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  ｌｅｎ，ＶＡ）を，３つの異なる起源の３Ｃプロテアーゼで処理した。
【００７９】
２つの異なるＤｓｂ３Ｃプロテアーゼ含有株から振盪フラスコ調製物を作成した。一方の株は染色体にインテグレートした３Ｃプロテアーゼ遺伝子を含み，他方の株はプラスミド上に３Ｃプロテアーゼを有する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．１２：１５９−１６５（１９９８））。超音波処理および続く遠心分離により無細胞溶解物を調製した。３Ｃプロテアーゼの第３の供給源は，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商品名ＰＲＥＣＩＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＡＳＥで市販されているものであった。
【００８０】
以下をチューブ内で混合し室温で一晩インキュベートした：ＩＧＦ融合を含む２ｍｌの無細胞抽出物，３Ｃプロテアーゼを含む０．４ｍｌの無細胞抽出物，または５μｌのＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ，４．８μｌの０．５Ｍ  ＤＴＴ，および２．４μｌの１Ｍ  ＥＤＴＡ。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００８１】
Ｄ．ＩＧＦ１の発現
１．ユビキチンのアミノ末端はＩＧＦ融合蛋白質の高レベル発現を与える
本発明において設計したコンストラクトは，Ｅ．ｃｏｌｉ株において高レベルの発現を与える，３Ｃプロテアーゼ切断部位を組み込んだ最小のＩＧＦ融合コンストラクトを見いだすことを意図したものである。図３に示されるように，Ｍｅｔ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＬａｃＺ−３Ｃ−ＩＧＦは発現の際に有意な程度には蓄積しなかったが，全ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦコンストラクトは大量に発現された。図４はまた，ユビキチン−ＩＧＦ，ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ，およびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦの相対的発現レベルを示す。さらに，トランケート型ユビキチン−３Ｃコンストラクトは，全長ユビキチン−３Ｃコンストラクトと同等にまたはそれより高く発現された。すなわち，Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒトＩＧＦの高レベル発現を与えるためには，Ｎ末端の１１アミノ酸で十分である。
【００８２】
２．ＩＧＦのトランケート型ユビキチンコンストラクトはＩＧＦ蛋白質の収率を増加させる
図３に示されるように，トランケート型ユビキチンコンストラクトはＩＧＦのより高い収率を与えた。これは，（１）総融合蛋白質と比較してＩＧＦの相対的パーセンテージが増加した，および（２）クローンは親のユビキチン−ＩＧＦコンストラクトより蛋白質発現の効率が高いためである。さらに，これらはもっぱら不溶性蛋白質として単離されるため，これらのコンストラクトは下流のプロセシングの量を減少させることによりＩＧＦの収率を効率よく増加させる。当該技術分野においてよく知られているように，それぞれのプロセシング工程は，それに伴う損失ならびにプロセシングに伴う対応するコストを有している。蛋白質をもっぱら１つの形で局在させることにより，可溶性蛋白質を追加の沈殿工程により細胞抽出物から加工する必要性がなくなる。
【００８３】
３．トランケート型ユビキチンコンストラクトはユビキチン可溶化特性を有しない
図４は，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦが比較的可溶性であり，蛋白質の約５０％が可溶性細胞抽出物中に存在し，蛋白質の約５０％が不溶性型として単離されたことを示す。反対に，図５は，ＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦがもっぱら不溶性の形で単離されたことを示す。このことにより，蛋白質の特性が細胞抽出物中でもっぱら１つの形であるため，蛋白質の有利な単離が可能となる。３つのトランケート型蛋白質はすべて比較的不溶性であり，これらを可溶化するためには高濃度（＞４Ｍ尿素）のカオトロピック剤を必要とする。特に，ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ１７  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦはＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦよりも不溶性であり，これらはいずれも，蛋白質を実質的に可溶化するためには非常に高いレベル（＞８Ｍ尿素）のカオトロピック剤を必要とする。
【００８４】
４．ＩＧＦのトランケート型ユビキチンコンストラクトは３Ｃプロテアーゼにより切断されて，正しいＮ末端を有する成熟ＩＧＦが生ずる
図６は，３つの異なる起源の３Ｃプロテアーゼ（上述の実施例３Ｃにおいて記載されるように）による，ｄｓｂＡ−３Ｃ−ＩＧＦ，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ，およびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦの切断を示す。それぞれの場合において，ＩＧＦ標準物質と同じ分子量に相当するバンドの比較により見られるように，ＩＧＦが遊離される。ｄｓｂＡ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦの切断は本質的に定量的であるが，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦはいくらかの未切断産物を有することに注意されたい。実験は，切断条件については最適化しなかった。すなわち，定量的切断がなかったことは，コンストラクトの質に負の影響を与えない。ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ１７  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦの１回の実験においては，これらのコンストラクトは３Ｃプロテアーゼにより全く切断されなかった。しかし，本発明者らは，反応液中のカオトロピック剤の量が酵素を不活性化したと判定した。妨害するカオトロピック剤が基本溶液から十分に除かれていれば，これらのコンストラクトは３Ｃプロテアーゼにより切断されたであろうと考えられる。
【００８５】
３Ｃプロテアーゼで切断されたＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦから単離されたＩＧＦおよび成熟ＩＧＦについてＮ末端アミノ酸配列決定を行ったところ，ヒトＩＧＦの正しいＮ末端配列が示された。
【００８６】
上述の代表的な態様を参照して本発明を広く開示し例示してきたが，当業者は本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に種々の改変をなしうることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は，ヒトＩＧＦの核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図２】図２は，本明細書に記載される７つのＩＧＦ−Ｉ融合コンストラクトのアミノ酸配列を提供する。
【図３】図３は，本明細書に記載される７つのＩＧＦ−Ｉ融合コンストラクトの分子量，発現の特性，発現収率，およびプロテアーゼ切断の比較を記載する。
【図４】図４は，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ蛋白質の可溶性および不溶性の特性を示す。
【図５】図５は，ＴＲ１１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦおよびＴＲ１７  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦ蛋白質の可溶性および不溶性の特性を示す。
【図６】図６は，ｄｓｂａ−３Ｃ−ＩＧＦ，全長ユビキチン−３Ｃ−ＩＧＦ，およびＴＲ４１  Ｕｂｉ−３Ｃ−ＩＧＦの相対的分子量，およびこれらの蛋白質の切断産物，例えば，成熟ＩＧＦを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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