(57)【要約】  本発明は結晶性血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）、および特に、結晶性ヒトＶＡＰ-１の構造情報の、リガンドおよび／または阻害剤の同定、設計および製造のため、ならびに該リガンドおよび／または阻害剤の検出のためのスクリーニングアッセイのための用途に関する。本発明はさらに、本発明のアッセイにより同定される阻害剤に関する。
2007509605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性ヒト血管接着タンパク質１（ＶＡＰ-１）。
【請求項２】
前記結晶が、二つの分子を非対称ユニットにもち、ａ＝ｂ＝２２５．９Å、ｃ＝２１８．７Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°のユニットディメンションをもつ、空間群Ｐ６5２２の結晶として定義される、請求項１に記載の結晶性ヒトＶＡＰ-１。
【請求項３】
アミノ酸配列、配列番号３、配列番号４および配列番号５によって各々特徴づけられる、ドメインＤ２、Ｄ３、およびＤ４を含んでいる、請求項２に記載の結晶性ＶＡＰ-１、またはその同族体。
【請求項４】
表面において幅約２０Å×約１０Å、かつ深さ約１５Åである活性部位キャビティを含んでいる、請求項３に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項５】
前記活性部位キャビティが、ヒトＶＡＰ-１の一つのモノマーに由来する配列番号２のアミノ酸８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１および７５８-７６１、およびヒトＶＡＰ-１の別のモノマーに由来する配列番号２のアミノ酸４３３-４４９および４５１を含んでいる、請求項４に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項６】
前記活性部位が、前記キャビティの底の狭い約４．５Å×約４．５Åのキャビティの上端に、アミノ酸Ｌｅｕ４６９をさらに含む、請求項５に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項７】
前記活性部位キャビティの底部が、アミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１およびＴｙｒ４７３によって裏打ちされた、請求項６に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の結晶性ＶＡＰ-１を含んでいる組成物。
【請求項９】
ヒトＶＡＰ-１を結晶化するための方法であって、
ａ）ヒトＶＡＰ-１タンパク質を含んでいる水溶液を供給すること；
ｂ）沈殿剤を含んでいる貯蔵溶液を供給すること；
ｃ）ある体積の前記水溶液とある体積の前記保存溶液と混合して、混合液を形成すること；および
ｄ）前記混合液の少なくとも一部を結晶化すること、
の段階を含む方法。
【請求項１０】
段階ａ）で供給された前記水溶液が、１ｍｇ／ｍｌのＶＡＰ-１濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記沈殿剤が酒石酸Ｋ／Ｎａである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
段階ｄ）を蒸気拡散によって行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトＶＡＰ-１タンパク質の三次元構造を規定する原子座標／X線回折データをその上に記憶した、機械可読データをコードしたデータ記憶装置を含んでいるコンピュータ可読媒体であって、分子構造を決定するための適当な機械によって読取られかつコンピュータプログラムによって処理されたとき、ヒトＶＡＰ-１タンパク質のフラグメントを含んでいる分子の結晶の三次元表現をディスプレイすることができる媒体。
【請求項１４】
前記データが、ダイマーのヒトＶＡＰ-１タンパク質の活性部位キャビティを規定する、請求項１３に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１５】
前記活性部位キャビティが、表面では幅約２０Å×約１０Åかつ深さ約１５Åである、請求項１４に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１６】
前記活性部位キャビティが、ヒトＶＡＰ-１の一つのモノマーに由来するアミノ酸８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１、および７５８-７６１、およびヒトＶＡＰ-１の別のモノマーに由来するアミノ酸４３３-４４９、および４５１を含んでいる、請求項１５に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１７】
前記活性部位が、前記部位の底の狭い約４．５Å×約４．５Åのキャビティの上端に、アミノ酸Ｌｅｕ４６９をさらに含む、請求項１６のコンピュータ可読媒体。
【請求項１８】
前記活性部位キャビティの底部が、アミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１およびＴｙｒ４７３によって裏打ちされた、請求項１７に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１９】
ヒトＶＡＰ-１タンパク質と相互作用する化合物を同定するための方法であって：
ａ）コンピュータ可読媒体上に前記タンパク質の原子座標を供給すること、およびｂ）コンピュータを用いて、前記座標に分子モデリング技術を適用すること、
の段階を含む方法。
【請求項２０】
前記原子座標が、ヒトＶＡＰ-１の一つのモノマーに由来するアミノ酸８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３３４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１、および７５８-７６１、およびヒトＶＡＰ-１の別のモノマーに由来するアミノ酸４３３-４４９、および４５１のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記原子座標が、アミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１およびＴｙｒ４７３のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子モデリング技術が、ｄｅ  ｎｏｖｏの化合物設計を含んでいる、請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｄｅ  ｎｏｖｏの化合物設計が、（i）ＶＡＰ-１の活性部位内の箇所と相互作用することができる官能基または低分子フラグメントの同定、および（ｉｉ）これらを一つの化合物中に結合すること、を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子モデリング技術が、ＶＡＰ-１のファーマコフォアを使用する、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記分子モデリング技術が、自動化されたドッキングアルゴリズムを使用する、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
更なる段階（ｃ）前記分子モデリング技術により同定された化合物を供給すること；および（ｄ）前記化合物をヒトＶＡＰ-１と接触させること、およびＶＡＰ-１のＳＳＡＯ活性に対する前記化合物の阻害効果を検出すること、を含む請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法によって同定可能なヒトＶＡＰ-１阻害剤。
【請求項２８】
式：
【化１】
2007509605.tif 000008
［式中、
Ｒ1は水素、低級アルキルまたは任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ2は水素または低級アルキルであるか、または
Ｒ1およびＲ2は、それらが結合している窒素原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく；
Ｒ3-Ｒ5は各々独立して水素、低級アルキル、アラルキル、任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基を表しているか、または
Ｒ2およびＲ3は、それらが結合している原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく、あるいは
Ｒ3およびＲ5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって飽和炭素環を形成してもよく；
Ｒ6はナフチル、フェニル、置換フェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ7は水素、低級アルキルまたはアラルキルであり；
nは１、２または３であり；かつ
X＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2またはＮＲ2である］
を特徴とする、請求項２７に記載の阻害剤。
【請求項２９】
慢性関節炎、炎症性腸疾患、および皮膚疾患及び多発性硬化症のような、急性および慢性の炎症症状または疾患、糖尿病および糖尿病から結果として生じる、たとえば網膜症、神経障害、腎症といった血管症のような合併症を含めた、糖質代謝に関連した疾患、脂肪細胞の分化または機能、および平滑筋細胞の機能、特にアテローム硬化症における異常、および種々の血管性疾患からなる群より選ばれる疾病の治療における使用のための薬剤製造のための、請求項２７〜２８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項３０】
請求項２７〜２８のいずれか１項に記載の化合物を含んでいる薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶性ヒト血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）、および特に、結晶性ヒトＶＡＰ-１の構造情報の、リガンドおよび／または阻害剤の同定、設計および製造のため、ならびに、かかるリガンドおよび／または阻害剤の検出のための、インシリコおよびインビトロのスクリーニングアッセイのための用途に関する。本発明はさらに、本発明のアッセイにより同定される阻害剤であって、急性および慢性の炎症性症状、糖質代謝関連疾患、脂肪細胞または平滑筋細胞機能における異常、および種々の血管疾患の治療において有用な阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
生理的免疫監視機構は、血液と、種々のリンパ器官との間のリンパ球の継続的な監視に依存している。正常な非リンパ組織には、リンパ球は存在しないか、または非常に低レベルに存在するが、多くの炎症性性の疾病状態においては、莫大な数のリンパ球が種々の冒された組織および器官中に集積することがある。血管からのリンパ球の退出を制御している重要な分子の一つは、米国特許第５，５８０，７８０号に開示された血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）である。ＶＡＰ-１は、ホモダイマーの１７０〜１８０ｋＤａの内皮糖タンパク質である。ＶＡＰ-１は、ヒトの組織切片において、細静脈へのリンパ球の結合を仲介する。ＶＡＰ-１は、重度にグリコシル化されており、糖部分は接着機能にとり重要である（サルミ（Salmi）ら、１９９６年）。ＶＡＰ-１の接着機能を阻止すると、炎症性組織に浸潤する細胞の数が減少して炎症を散らすことができる。ＶＡＰ-１はしたがって、抗炎症薬開発のターゲットである。
【０００３】
ヒトの血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）は、接着性および酵素的性質の双方をもつ、膜結合多機能糖タンパク質である。ＶＡＰ-１のクローニングは、驚いたことに、それがセミカルバジド感受性モノアミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ；ＥＣ  １．４．３．６）に属することを明らかにした（国際特許公開  ＷＯ  ９８／５３０４９）。ＶＡＰ-１は、触媒活性のある大きい細胞外ドメインをもつＩＩ型の主要膜タンパク質である。したがって、ＶＡＰ-１は細胞外酵素である。白血球-内皮相互作用におけるＳＳＡＯ活性の役割も、その生理的基質も、どちらも充分には定義されていない。ＶＡＰ-１は、哺乳類におけるこの酵素群のうちで初めて分子的に定義された膜貫通メンバーであり、細胞のＳＳＡＯ活性の９０％を占めている。とりわけ、ＳＳＡＯは、細胞内局在、基質、補因子、阻害剤、およびタンパク質配列の点において、充分に特徴づけされたモノアミンオキシダーゼＡおよびＢとは異なっている。
【０００４】
ＳＳＡＯ反応は生化学用語においては、１９５０年代から知られているが、これらの酵素の生理的機能は謎のままであった。ＳＳＡＯの生理的基質は分かっていない。しかしながら二つの可能性のある候補、メチルアミンおおよびアミノアセトンは、ヒトでは中間代謝を通じて形成され、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＳＳＡＯにより脱アミノ化されることが可能である。
【０００５】
ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性は、白血球の表面に発現されたＶＡＰ-１リガンド上に呈示されたアミン基質との直接的な相互作用を含む新規な機構により、内皮細胞への白血球接着の経路に直接的に関与していると提案されていた（サルミ（salmi）ら、２００１年）。この発表は、内皮への白血球の接着プロセスにおける、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性の直接的な関与を述べている。したがって、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性の阻害剤は、炎症領域における白血球接着を減少させ、それにより炎症領域内への白血球の通行を、それゆえ炎症プロセスそのものを低減することが期待できた。
【０００６】
ヒトの臨床組織サンプルにおいては、ＶＡＰ-１の発現は炎症の部位において誘導される。この増大されたＶＡＰ-１レベルは、血中に存在するモノアミンに対する、ＶＡＰ-１ＳＳＡＯ細胞外ドメインの作用から発生される、Ｈ2Ｏ2の増大された産生をもたらすことが可能である。内皮細胞という局部的な環境におけるこのＨ2Ｏ2の発生は、別の細胞事象を開始することも可能であろう。Ｈ2Ｏ2は、他の接着性分子をアップレギュレートすることができるシグナリング分子として知られており、この増大された接着分子の発現が、ＶＡＰ-１の発現されている領域内への白血球の交通の増強をもたらすのかもしれない。他のＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ反応産物もまた、炎症プロセスにも寄与する生物学的作用を有しているのかもしれない。したがって、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性の産物は、炎症プロセスのエスカレーションに関与してよく、それは特異的なＳＳＡＯ阻害剤によって阻止されることも可能である。
【０００７】
ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯは、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯの循環性アミン基質の増大されたレベルに関連する多くの他の病的症状に関係し得る。これらの基質の酸化的脱アミノ化は、内皮細胞という局所環境における毒性アルデヒドおよび酸素ラジカルのレベルの上昇をもたらすこととなり、そのことが細胞を損傷して血管損傷をもたらすことも可能であろう。メチルアミンおよびアミノアセトンの増大されたレベルは、Ｉ型およびＩＩ型の糖尿病をもつ患者において報告されており、後期糖尿病に見られる網膜症、神経障害、腎症のような血管症は、ＶＡＰ-１ＳＳＡＯの特異害剤を用いて治療されることも可能である。
【０００８】
ＶＡＰ-１活性を調整する特異的なＶＡＰ-１ＳＳＡＯ阻害剤の開発は、慢性関節炎、炎症性腸疾患、および皮膚疾患のような、急性および慢性の炎症症状または疾患、ならびに糖質代謝に関連した疾患（糖尿病および、糖尿病から結果として生じる血管症のような合併症を含めて）の治療に有用であろう。加えて、脂肪細胞の分化または機能、および平滑筋細胞の機能（特にアテローム硬化症における）、および種々の血管性疾患における異常は、ＶＡＰ-１ＳＳＡＯ阻害剤による治療に適している可能性がある。
【０００９】
国際特許公開ＷＯ  ０３／００６００３は、炭素環式ヒドラジノ化合物、ならびにそれらの、ヒト血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）を含めた、セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）阻害剤としての用途を開示している。
【００１０】
銅含有アミンオキシダーゼ（ＣＡＯ；ＥＣ１．４．３．６）は、機能的に多様なアミンオキシダーゼのスーパーファミリーに属する（ドークス（Dawkes）ら、２００１年）。それらはまた、その酵素活性がカルボニル反応性化合物、セミカルバジドにより阻止され得ることから、セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼとしても知られている。それらは、第一級アミンの、対応するアルデヒドへの酸化的脱アミノ化を銅依存性の反応において触媒し、分子状酸素が消費され、かつアンモニアが放出される。すべてのＣＡＯに特徴的な性質は、２，４，５-トリヒドロキシフェニルアラニルキノン、トパキノン（ＴＰＱ）の酸化還元補因子としての使用である。ＣＡＯは、細菌、真菌、植物、および哺乳類を含めたいくつかの異な生物から単離されている。植物においては、ＣＡＯは、たとえば損傷治癒に関与しており、一方原核生物においては、ＣＡＯはその生物が窒素および炭素の供給源として種々のアミンを代謝的に利用できるようにする。より高等な真核生物では、生体アミンおよび他のアミンの代謝におけるそれらの役割の他には、ＣＡＯの生物学的機能についてはほとんどわかっていない。
【００１１】
シェパード（Shapard）ら、２００２年、は、６つの既知の銅含有アミンオキシダーゼに対して阻害剤を検査した際の、選択性および不活性化の速度における著しい差異を報告している。
【００１２】
ＣＡＯの結晶構造は、４つの異なる種：大腸菌（ＥＣＡＯ：たとえば、タンパク質データバンク（Protein Data Bank）、ＰＤＢコード１ｏａｃ）（パーソンズ（Parsons）ら、１９９５年）、エンドウ（Pisum sativum）（ＰＳＡＯ；ＰＤＢコード１ｋｓｉ）（クマー（Kumar）ら、１９９６年）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（ＨＰＡＯ；たとえば、ＰＤＢコード１ａ２ｖ）（リ（Li）ら、１９９８年）、およびアルスロバクター・グロビフォルミス（Arthobacter globiformis）(ＡＧＡＯ；ＰＤＢコード１ａｖ４)（ウィルス（Wilce）ら、１９９７年）から解明されてきた。これらのホモダイマー構造はすべて、一つの類似した全体的な基本構造を有しており、それはドメインＤ１-Ｄ４に分けられることが可能であり、そのうちのＤ１ドメインは大腸菌においてのみ見出されている。ドメインＤ２およびＤ３は、各々〜１００アミノ酸であって、α／β型の基本構造を有しており、一方最大のＣ末端ドメインＤ４は、〜４００アミノ酸長であって、ダイマー化に必要な独特のβ-サンドイッチ基本構造を有する。Ｄ４ドメイン中に局在する活性部位は、ＣＡＯファミリー中に高度に保存されている。それはタンパク質内に深く埋められており、主としてＤ３およびＤ４ドメインからのアミノ酸によって囲まれた長いチャンネルを通してのみ接近することが可能である。Ｄ３ドメインのアミノ酸残基は、実際の活性部位よりも軽度に保存されており、活性部位へ導くキャビティがＣＡＯの基質特異性の決定において非常に重要であることを示唆している。
【００１３】
既知のＣＡＯタンパク質の構造が全く類似しているとはいえ、アミノ酸レベルでの配列同一性はわずか２５〜３５％である。構造が分かっているＣＡＯファミリーのメンバーに対するＶＡＰ-１の進化的関係は特徴づけられていないが、ＶＡＰ-１のＮ-末端における膜貫通ドメインの存在は、可溶性ＣＡＯからの実質的な相違を示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明はヒトＶＡＰ-１の結晶化およびX線分析を提供する。これは結晶化された最初の哺乳類のＣＡＯである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、結晶性血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）、特にヒトＶＡＰ-１に関する。
【００１６】
本発明は、精製されたＶＡＰ-１を結晶化し、得られたＶＡＰ-１結晶を分析し、結晶パラメータおよびX線回折データを得るための、手段および方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、結晶性ＶＡＰ-１を含んでいる組成物、およびかかる組成物の用途に関する。
【００１８】
本発明はさらに、結晶性のヒトＶＡＰ-１の構造情報、より具体的には、ヒトＶＡＰ-１の活性部位キャビティについての情報を提供しており、前記キャビティは、表面では幅約２０Å×約１０Åであり、かつ深さ約１５Åであり、そしてアミノ酸８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１、および７５８-７６１はヒトＶＡＰ-１の一つのモノマーに由来し、アミノ酸４３３-４４９、および４５１はヒトＶＡＰ-１の別のモノマーに由来する。さらに具体的には、前記活性部位は、アミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１、およびＴｙｒ４７３によって裏打ちされた、該部位の底の狭い約４．５×約４．５のキャビティの上端にアミノ酸Ｌｅｕ４６９をさらに含む。
【００１９】
本発明はさらに、ヒトＶＡＰ-１タンパク質の三次元構造を規定する原子座標／X線回折データをその上に記憶した、コンピュータ可読媒体であって、適当な機械によって読取られ、かつ分子構造を決定するためのコンピュータプログラムによって処理されたとき、ヒトＶＡＰ-１タンパク質のフラグメントを含んでいる分子の結晶の三次元表現をディスプレイすることができる媒体を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、リガンドおよび／または阻害剤のｄｅ ｎｏｖｏ設計のためのｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏアッセイであって、（ｉ）ＶＡＰ-１の活性部位内の箇所と相互作用することができる官能基または低分子フラグメントの同定、および（ｉｉ）これらを一つの化合物中に結合すること、を含むアッセイを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、既知の化合物および化合物ライブラリを、ＶＡＰ-１活性を阻害する能力についてスクリーニングするための、ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏのアッセイを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、慢性関節炎、炎症性腸疾患、および皮膚疾患、多発性硬化症といった、急性および慢性の炎症性症状および疾患、ならびに糖質代謝に関連した疾患（糖尿病および、糖尿病から結果として生じる血管症のような合併症を含めて）の治療に有用な、新規ＶＡＰ-１阻害剤を提供する。加えて、かかる阻害剤は、脂肪細胞の分化または機能、および平滑筋細胞の機能（特にアテローム硬化症における）、および種々の血管性疾患における異常を治療するために有用であってよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下において、本発明は、好ましい態様により、添付の図面を参照して、さらに詳細に記述される。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類の銅含有アミンオキシダーゼ、ＣＡＯの結晶、特にヒトＶＡＰ-１の結晶を提供する。
【００２５】
本発明の結晶を成長させるためには、Ｎ-末端膜貫通領域を含めた完全長タンパク質は、全タンパク質の８０％を超え、さらに好ましくは全タンパク質の９０％を越え、最も好ましくは全タンパク質の９５％を超えるように精製されねばならない。発現および精製目的のためには、完全長ＶＡＰ-１をコードしている配列（配列番号１）が使用される。選んだ精製法は、精製されたタンパク質がそのＣＡＯ活性を保持しているようにすることが重要であり、それはベンジルアミンを基質として用いることにより測定されてよい。
【００２６】
当業界で公知の多くのベクター-宿主系は、結晶化プロセスのためのタンパク質の組換え体産生に使用されてよい。可能なベクターは、これに制限されないが、プラスミドまたは修飾されたウイルスを含むが、ベクター系は用いた宿主細胞と適合性でなければならない。ヒトＶＡＰ-１は重度にグリコシル化されているため、酵母または動物細胞の宿主のような、真核生物の宿主が好ましい。チャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞は、最も好ましい宿主細胞を形成しており、これらの細胞は完全なグリコシル化が可能である。
【００２７】
本発明の結晶を得るためには、これに制限されないが、バッチ晶析法、蒸気拡散法、およびマイクロ透析法を含めて、この技術において周知の任意の結晶化技術が使用されてよい。X線用の品質の結晶を得ることが必要な場合には、標準的なミクロおよび／またはマクロの種晶の添加が使用されて良い。
【００２８】
本発明の結晶は、非対称ユニット中に二つの分子をもち、ａ＝ｂ＝２２５．９Å、ｃ＝２１８．７Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°のユニットディメンションをもつ空間群Ｐ６5２２を作る（以下の実施例２を参照）。しかしながら、本発明はＰ６5２２を含むがこれに制限されない任意の空間群を形成する結晶を検討している。結晶は、４Åを超える、好ましくは３Åを超える、最も好ましくは２．８Åを超える分解能までを回折する。
【００２９】
本発明の結晶から回折データを収集するべく、結晶は、グリセロールのような凍結保護物質、および窒素流中での瞬間凍結を用いて保護されてよい。X線回折データは、ＸＤＳプログラム（カブシュ（Kabsch）ら、１９９３年）により処理されてよいが、当業者に周知の任意の方法がX線回折データの処理に使用されてもよい。
【００３０】
本発明によるヒトＶＡＰ-１の原子構造を決定するためには、分子置換（ＭＲ）、モデル構築、およびリファインメントが行なわれてもよい。
【００３１】
ＶＡＰ-１構造の決定には、当業界で公知のＣＡＯの既知の構造または、上記および以下の実施例３のように決定され得る他のＣＡＯ構造を用いた、分子置換が使用されてよい。
【００３２】
当業者には周知の任意の方法が、本発明のタンパク質の三次元構造を分子置換により決定するべく使用されてよい。たとえば、ＣＣＯ４ｉプログラムスイートのプログラムＡＭＯＲＥは、ヒトＶＡＰ-１の構造を、本文に記述されたように導出された原子座標表を用いて決定するべく使用されてよい。
【００３３】
原子座標は、コンピュータ可読媒体上に与えられてよい。かかる記憶媒体は、好ましくはランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（たとえば、ＣＤ-ＲＯＭ）、またはディスケットである。記憶媒体は、ローカルアクセス可能なコンピュータ上か、またはインターネットを通じたリモートアクセス可能なものでよい。
【００３４】
三次元構造の最初のモデルは、プログラムＯ（ジョーンズ（Jones）ら、１９９１年）を用いて構築されてよく、たとえばＣＣＰ４ｉプログラムスイートのＲＥＦＭＡＣプログラムを用いてリファインされる。
【００３５】
リファインされた三次元の本発明のＶＡＰ-１構造は、表１に示された原子座標および構造決定統計学によって表される。リファインされたＶＡＰ-１ダイマーのX線構造は、モノマーＡ中にはモデリングされない残基Ａ１-Ａ５４、Ａ２０２-Ａ２０４、およびＡ７６２-Ａ７６３をもつ残基Ａ５５-Ａ７６１と、モノマーＢ中にはモデリングされない残基Ｂ１-Ｂ５６、Ｂ２０３、Ｂ７４２-Ｂ７４６、およびＢ７６２-Ｂ７６３をもつ残基Ｂ５７-Ｂ７６１からなる。残基Ａ４７１およびＢ４７１は、トパキノン（Ｔｐｑ４７１）であり、それらは内在性チロシン残基の翻訳後修飾によって形成され、触媒反応に関係する。双方のモノマーは、活性部位に一つの銅イオンを含有する。
【００３６】
本発明の三次元構造から得られる情報は、ヒトＶＡＰ-１の活性部位（基質結合部位）が（１）銅イオンを配位している３つのヒスチジン、Ｈｉｓ５２０、Ｈｉｓ５２２、およびＨｉｓ６８４、（２）触媒ベース、Ａｓｐ３８６、ならびに（３）Ｔｐｑ４７１のポジショニングに関係する、Ｔｙｒ３７２およびＡｓｎ４７０、および（４）活性部位ゲート残基、Ｔｙｒ３８４を含んでいることを示している。Ｔｐｑ４７１は、ＶＡＰ-１のX線構造では「オン・カッパー（on-copper）」（不活性な）立体配座にある。ヒトＶＡＰ-１構造の三次元表示は図２および３に示されている。
【００３７】
ＶＡＰ-１活性部位は深く埋められており、Ｔｐｑ４７１は分子の表面から約２２Åに位置している。この活性部位キャビティは、表面において幅約２０Å×約１０Åであり、深さ約１５Åである。ＶＡＰ-１のX線構造においては、キャビティの底では、Ｔｐｑ４７１の上部に位置するＬｅｕ４６９が活性部位への入口をブロックしている。キャビティの一つの壁は、たとえば８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０，１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、および２３６-２３９を含んでいるより小さなＤ２およびおＤ３ドメインに由来する残基と、４４３-４４９、および４５１を含んでいる他のモノマーから突出た長いβヘアピンアームに由来する残基とからなる。チャンネルの別の壁は、たとえば３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１，４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１、７５８-７６１を含んでいる触媒Ｄ４ドメインに由来する残基からなる。活性部位チャンネルの入口において、Ａｓｎ２３２に付着したＮ-グリカンの一つの糖単位がX線構造中で見られる。Ｌｅｕ４６９の下では、約７Å長の活性部位キャビティは表面におけるよりもずっと狭く、約４．５×４．５Åのディメンションをもつほぼ円形である。チャンネルのこの部分は、残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１、およびＴｙｒ４７３によって裏打ちされている。
【００３８】
ＶＡＰ-１X線構造は、驚いたことに、活性部位キャビティの独特の構造を明らかにしている。キャビティは、ＥＣＡＯ、ＨＰＡＯ、ＰＳＡＯ、およびＡＧＡＯ構造内の狭い活性部位チャンネルに比較して、極めて幅広にマウントされかつオープンである。それゆえＶＡＰ-１の活性部位キャビティは、ＥＣＡＯ、ＨＰＡＯ、ＰＳＡＯ、およびＡＧＡＯの活性ＶＡＰ-１キャビティよりもはるかに大きいリガンドおよび阻害剤構造物を収容することが可能である。ＶＡＰ-１においてＬｅｕ４６９に相当する残基は、グリシン（ＥＣＡＯ、ＨＰＡＯ、およびＡＧＡＯ）またはアラニン（ＰＳＡＯ）であり、したがって、それはＥＣＡＯ、ＨＰＡＯ、ＰＳＡＯ、およびＡＧＡＯ構造物においては活性部位をブロックすることができない。この独特の構造についての知見は、ヒトＶＡＰ-１のファーマコフォアおよび、このキャビティにフィットする特異的リガンドおよび阻害剤構造物の設計に必要である。
【００３９】
この情報は、ヒトＶＡＰ-１のファーマコフォア、すなわち生物活性に必要な特別の機能を表している化学的特徴および三次元的制約のコレクション、を定義するべく使用されることが可能である。ファーマコフォアは、好ましくは、水素結合供与体および受容体、荷電基、または疎水性部位といった、表面でアクセス可能な特徴を含む。かかる特徴は、生物活性に対するそれらの相対的重要性に基づき、ファーマコフォアモデルに包含されてよい。
【００４０】
ファーマコフォアは、ＣＡＴＡＬＹＳＴ、ＣＥＲＩＵＳといった可用性のコンピュータソフトウエアを用いるか、またはリード化合物についての既知の立体配座に基づく手動モデリングを使用することにより決定されてよい。ファーマコフォアは、以下にさらに詳細に記述されるような、可用性のコンピュータソフトウエアを用いて、ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏの化合物ライブラリをスクリーンするべく使用されてよい。
【００４１】
したがって、本発明の一つの態様においては、分子モデリング技術がｄｅ  ｎｏｖｏの化合設計に使用される。デノボ化合物設計は、ＶＡＰ-１のようなターゲット高分子の結合表面または活性部位が決定され、かつ、前記結合表面または活性部位と相互作用する化合物の合理的な設計のためのベースとして使用されるプロセスを指す。本発明による分子モデリングの段階は、ヒトＶＡＰ-１の原子座標および活性部位のモデルを利用する。好ましい態様においては、ｄｅ  ｎｏｖｏの薬物設計は、ヒトＶＡＰ-１の結合表面における活性部位と相互作用することができる官能基または小さい分子フラグメントの同定、およびこれらの基またはフラグメントを結合して単一の化合物にすることを含む。ヒトＶＡＰ-１の特異的活性部位と相互作用する官能基または小さい分子フラグメントがひとたび同定されれば、好適なサイズを有するフラグメントをブリッジングすること、および活性部位にフィットするためのジオメトリの双方を用いて、単一の化合物へ結合されることが可能である。
【００４２】
適切な官能基およびフラグメントの結合は手動で行なわれてもよいが、ＱＵＡＮＴＡまたはＳＹＢＹＬといった適当なソフトウエアを使用することが好ましい。この技術において周知のさらなるソフトウエアは、たとえば、多数の官能基をデータベースからの分子鋳型と結びつけるＨＯＯＫ、および制約された非環式分子に対して連結ユニットを設計するためのＣＡＶＥＡＴである。ｄｅ  ｎｏｖｏの化合物設計のための、他のコンピュータ・ベースのアプローチは、ＬＵＤＩ、ＳＰＲＯＵＴ、およびＬＥＡＰ-ＦＲＯＧを含む。
【００４３】
本発明は、阻害性化合物を含め、ヒトＶＡＰ-１の活性部位に対して結合することが可能な、化学的実体および化合物を設計、同定、および合成するための、分子設計技術の使用を可能にする。ヒトＶＡＰ-１の原子座標は、ヒトＶＡＰ-１の潜在的な阻害剤を同定するべく、たとえば、ＧＯＬＤ、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、またはＡＵＴＯＤＯＣＫといったドッキングプログラムを用いたコンピュータモデリングと一緒に使用されてよい。この手法は、潜在的阻害剤の形状および化学構造が、いかに充分に活性部位に相補的であるかを確認するための、ＶＡＰ-１の活性部位に対する潜在的阻害剤のコンピュータフィッティングを含むことが可能である。ドッキングプログラムを用いたモデリングにより設計された潜在的阻害剤の実例は、以下に記述される一般式（Ｉ）に適合してもよい。
【００４４】
本発明はさらに、ヒトＶＡＰ-１の活性部位と相互作用する化合物を同定するためのｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏの方法であって、（ａ）ヒトＶＡＰ-１のリガンド結合ドメインの原子座標をコンピュータの記憶媒体に供給すること、および（ｂ）該コンピュータを使用して分子モデリング技術を該座標に適用すること、の段階を含む方法を提供する。
【００４５】
上記の構造モデルはさらに、構築された分子のライブラリおよびＳｙｂｙｌ  ｖ．６．９による最小化されたエネルギーの検査に使用され、ＶＡＰ-１阻害剤として作用するそれらの能力について評価された。ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏスクリーニングに先立ち、ＶＡＰ-１のX線構造は実施例４に記述されたように、ＣＡＯの「オフ・カッパー（off-copper）」の活性のある立体配座を模すべく修飾された。
【００４６】
本発明のさらなる態様においては、ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏ法はヒトＶＡＰ-１の酵素活性を特異的に阻害する化合物の同定に使用されており、以下の段階：前記分子モデリング技術により同定される化合物を提供すること、前記化合物をヒトＶＡＰ-１と接触させること、および、相互作用を検出すること、を特徴とする。
【００４７】
三次元構造情報および、ＶＡＰ-１の前記構造情報に関連した原子座標は、合理的な薬物設計において有用であり、ＶＡＰ-１に結合しかつＶＡＰ-１の酵素活性を阻害する阻害性化合物の同定法を提供する。ＳＳＡＯ活性を有する酵素のための、前記潜在的阻害剤を同定するための方法は、（ａ）表１にリストされたその原子座標をベースとしたＶＡＰ-１の三次元構造を用いること；（ｂ）前記三次元構造を用いて前記潜在的阻害剤を設計または選択すること；（ｃ）前記潜在的阻害剤を合成すること；（ｄ）前記潜在的阻害剤を前記酵素と接触させること；および（ｅ）前記ＳＳＡＯ活性を阻害する前記阻害剤の能力を測定すること、の段階を含む。
【００４８】
本発明はさらに、ヒトＶＡＰ-１の酵素活性を阻害する化合物か、またはＶＡＰ-１の活性部位と相互作用する化合物を同定するための、本発明のｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏ法を用いて同定された化合物を包含する。
【００４９】
本発明の方法により同定可能な潜在的ＶＡＰ-１阻害剤の実例は、式（Ｉ）：
【化１】
2007509605.tif 000003
［式中、Ｒ1は水素、低級アルキル、または任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ2は水素または低級アルキルであるか、または
Ｒ1およびＲ2は、それらが結合している窒素原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく；
Ｒ3-Ｒ5は各々独立して水素、低級アルキル、アラルキル、任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基を表しているか、または
Ｒ2およびＲ3は、それらが結合している原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく、あるいは
Ｒ3およびＲ5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって飽和炭素環を形成してもよく；
Ｒ6はナフチル、フェニル、置換されたフェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ7は水素、低級アルキルまたはアラルキルであり；
nは１、２または３であり；かつ
X＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2またはＮＲ2である］
により表されてよい。
【００５０】
他のタイプの化合物も同様に、本発明による方法およびモデルを用いて充分に同定されてよい。当業者は、本文に記述された原子座標およびファーマコフォアに基づき、ヒトＶＡＰ-１の活性部位と相互作用する化合物を同定してよい。一般に、かかる潜在的阻害剤化合物は、前文に例示されたような、アミンまたはヒドラジンのようなカルボニル基反応因子によって特徴づけられてよいが、活性部位キャビティの４．５×４．５Åの底部分にはまりかつ活性部位の底部においてＴＰＱに結合することが可能な、細い突出した部分をもつ他の構造物も、同様に潜在的阻害剤である。本発明の化合物のこの突出した部分は、この化合物の約７Å長の比較的疎水性の中央部分へ連結され、ともに「リンカー」として作用して、突出部分が活性部位へアクセスすることを可能にし、キャビティを裏打ちするアミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１、およびＴｙｒ４７３と相互作用する。最後に、本発明の化合物は、広いキャビティをふさぎ、かつ活性部位キャビティーの壁の代表的なアミノ酸残８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１、７５８-７６１、４４３-４４９、および４５１と相互作用する、よりかさばった部分を含む。
【００５１】
さらに、本発明は同定された化合物の予想された活性を確かめるためのアッセイおよび手段を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、本発明のスクリーニングアッセイにより同定された化合物の、慢性関節炎、炎症性腸疾患、皮膚疾患、および多発性硬化症、のような慢性または急性の炎症性症状または疾患、ならびに糖質代謝に関連した疾患（糖尿病および、糖尿病から結果として生じる合併症、たとえば網膜症、腎症、および神経障害のような血管症を含めて）の治療のための薬の調製のための用途を包含する。加えて、かかる阻害剤は、脂肪細胞の分化または機能、および平滑筋細胞の機能（特にアテローム硬化症における）、および種々の血管性疾患における異常の治療に有用であってよい。
【００５３】
本発明はさらに、本スクリーニングアッセイによって同定された化合物を含有する薬剤組成物を包含する。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を例証する。
【実施例１】
【００５５】
ヒトＶＡＰ-１の産生および精製
Ｎ-末端膜貫通ドメインをもつ完全長のタンパク質は、スミス（Smith）ら、１９９８年、において記述されたように、グリコシル化コンピテントＣＨＯ細胞において発現された。収穫された細胞は、溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス塩基ｐＨ７．２、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１％ＮＰ４０）を用いて溶解された。浄化された細胞溶解物は、モノクローナル抗体アフィニティカラムに基づき、かつＡＫＴＡTM精製システム（アマシャム・バイオテック（Amersham Biotech））を用いた、ＨＶＡＰ-１の精製に使用された。タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーを用いて均一（＞９５％）まで精製され、精製の後、ＶＡＰ-１タンパク質の存在、９０-および１７０〜１８０ｋＤのバンドは、スミスら、１９９８年、により記述されたように、銀染色ＳＤＳ-ｐａｇｅによって確認された。
【００５６】
精製されたタンパク質は、基質としてベンジルアミンを用いて測定されるような、そのＣＡＯ活性を保持していた。アミンオキシダーゼ活性は、記載のスペクトロメトリー法（Haltら、１９９７）、基質として２００μｌ体積及び１ｍＭのベンジルアミンを使用することで測定された。吸光度の変化は、４９０ｎｍにおいて、ＶｉｃｔｏｒTMマルチラベルプレートカウンタ（パーキンエルマー・ライフ・サイエンシズ（PerkinElmer Life Sciences））においてモニターされた。
【００５７】
ヒトＶＡＰ-１のコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号１として列挙されている配列に示されており、そして配列番号２のようなアミノ酸配列（７６３アミノ酸）に相当する。
【実施例２】
【００５８】
結晶化および予備的分析
ｈＶＡＰ-１の最初の結晶化条件は、ウィザード（Wizard）Ｉランダムスパース行列結晶化スクリーン（エメラルド・バイオストラクチャーズ・インク（Emerald BioStructures, Inc., USA））および蒸気拡散法を用いて、室温でスクリーンされた。小さい六方晶の結晶が、１．０Ｍ酒石酸Ｋ／Ｎａ、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）、および２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する条件において、数ヶ月間のインキュベーションの後に得られた。懸滴は、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の２μｌのタンパク質試料（１．０ｍｇ／ｍｌ）、および２μｌの貯蔵溶液を含有していた。最適化の後、１．０Ｍ酒石酸Ｋ／Ｎａ、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．８）、および沈殿剤としての１５０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる貯蔵溶液を用いて、最良の結晶が得られた。結晶は数日間で形成され、約０．１５×０．１５×０．１ｍｍの最終サイズに成長した（図１）。
【００５９】
一つの結晶がキャピラリーにマウントされ、予備的X線分析が、回転陽極放射線源（Ｃｕ  Ｋα放射線、５０ｋＶ、１５０ｍＡ）、およびＭＡＲ３４５イメージングプレート検出器を用いて、インハウスで行なわれた。結晶は、しかしながら、８Åまでの分解能しか回折せず、空間群は正確には測定できなかった。さらなるX線分析ならびにデータ収集はすべて、ＭＡＲリサーチＣＣＤ検出器を具備したビームライン（beamline）X１１（ＥＭＢＬ／ＤＥＳＹ、ドイツ、ハンブルグ）において、シンクロトロン照射を用いて行なわれた。データ収集には、結晶は２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いて凍結保護され、１００Ｋの窒素流中で瞬間凍結された。３つの異なる結晶から収集された回折データは、プログラムＸＤＳにより処理された。溶媒含有率およびマシューズ（Matthews）係数は、分子量をモノマーあたり９０ｋＤと仮定し、ＣＣＰ４スイートを用いて計算された。
【００６０】
最良に見える六方晶結晶は、１．０Ｍ酒石酸Ｋ／Ｎａ、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．８）、および沈殿剤として１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌを用いて得られた。結晶は、ａ，ｂ＝２２５．９Å、Ｃ＝２１８．７Å、α，β＝９０°、およびγ＝１２０°のユニットセルディメンションセルをもつ、典型的なサイズ０．１５×０．１５×０．１ｍｍに成長した（図１ａ）。回折データ統計（表１）によれば、いくつかのフレームでは３．０Åをこえる分解能に相当する反射が観察されたにもかかわらず、ＶＡＰ-１触媒の回折限界は、３．２Åであった（図１ｂ）。結晶は、空間群Ｐ６5２２に属する。非対称ユニットあたり一つのダイマー（１８０ｋＤ）の存在を仮定すると、マシューズ係数は４．５Å3／Ｄａ、および溶媒含有率は７２％である。結晶パラメータおよび回折データ統計は、表１に要約されている。
【００６１】
【表１】
2007509605.tif 000004
【実施例３】
【００６２】
構造決定
ＶＡＰ-１の構造は、ＣＣＰ４ｉプログラムスイート（コラボラティブ・コンピュテイショナル・プロジェクト（Collaborative Computational Project（共同計算プロジェクト））、１９９４年）のプログラムＡＭＯＲＥ（ナバザ（Navaza）、１９９４年）を用いた分子置換により解明された。この方法は、ＶＡＰ-１の空間群が、非対称ユニットあたり一つの生物学的単位である一つのダイマーをもつ、Ｐ６5２２であったことを立証した。分子置換において検査された大腸菌（Escherichia coli）ＣＡＯ（残基９３-７２０；ＰＤＢコード１０ＡＣ）、エンドウ（Pisum sativum）ＣＡＯ（残基７-６３４；ＰＤＢコード１ＫＳＩ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）ＣＡＯ（残基２２-６５５；ＰＤＢコード１Ａ２Ｖ）、およびアルスロバクター・グロビフォルミス（Arthobacter globiformis）ＣＡＯ（残基９-６２３；ＰＤＢコード１ＡＶ４）の二量体ポリアラニン主鎖のうち、エンドウの構造は最良の相関係数（４４．１％）およびＲ因子（５３．４％）を与え、サーチモデルが使用された。
【００６３】
電子密度マップはＣＣＰ４ｉスイートのＦＦＴを用いて計算され、構築の初期においてであっても、いくつかのフラグメントにおいては、ＶＡＰ-１ポリペプチドをトレースするのに充分に予測可能であった。モデルはプログラムＯを用いて手動により構築され、ＣＣＰ４ｉスイートのＲＥＦＭＡＣ５．１．２４（ムルシュドフ（Murshudov）ら、１９９７年）により、分解能３．２Åまでリファインされた。
【００６４】
リファインメントの多数のサイクルの間に、構造に側鎖が逐次的に加えられた。最終モデルにおいては、以下のアミノ酸だけはトレースできず、したがって、この構造には含まれていない：Ａ１-Ａ５４、Ａ２０２-Ａ２０４、Ａ７６２-Ａ７６３、Ｂ１-Ｂ５６、Ｂ２０３、Ｂ７４２-Ｂ７４６、およびＢ７６２-Ｂ７６３。トパキノン残基のための座標は、ヘテロコンパウンド・インフォメーションセンター（Hetero-compoun Information Centre）、ウプサラ（クレイウェグト＆ジョーンズ（Kleywegt and Jones）、１９９８年）から取得され、そのための辞書はプログラムＰＲＯＤＲＧ（ヴァンアールテン（van Aalten）ら、１９９６年）を用いて生成された。最終的なＶＡＰ-１モデルの立体化学的な質は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（ラスコウスキー（Laskowski）ら、１９９３年）を用いて査定され、モデル中の１４０１個のアミノ酸のうち、８４．０％がラマチャンドラン・プロット（ラマチャンドラン＆サジーセクハラン（Ramachandran and Sasisekharan）、１９６８年）中の最も好ましい領域に生じ、わずか０．５％が寛大に許されるか、または許されない領域に生じた。構造決定統計の要約は、表１に呈示されている。ヒトＶＡＰ-１結晶構造の原子座標（および構造因子）は、ＰＤＢに登録コード１ＰＵ４および１ＵＳ１で寄託されている。
【００６５】
ヒトＶＡＰ-１の結晶形状はホモダイマーであり、各サブユニットはドメインＤ２、Ｄ３、およびＤ４を含有している。ＶＡＰ-１構造の概略説明図は、図２に示されている。結晶構造に見られるＤ２、Ｄ３、およびＤ４ドメインは、各々残基約５５-１６９、１７０-３００、および３０１-７６１（各々、配列番号３、配列番号４、および配列番号５）からなる。他の既知のアミンオキシダーゼの構造に比較しての、ヒトＶＡＰ-１の構造における主要な差異は、ドメインＤ４にも差異は存在するが、ドメインＤ２およびＤ３において見られる。
【実施例４】
【００６６】
潜在的阻害剤のインシリコスクリーニング法
本実施例は、アリールオキシメチル置換ヒドラジンアルコール化合物のライブラリが、実施例３に記述されたＶＡＰ-１の結合キャビティ内へドッキングすることにより、ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏにおいていかにしてスクリーンされるかを示している。スクリーンされた化合物は、式
【化２】
2007509605.tif 000005
［式中、Ｒ1は水素、低級アルキルまたは任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ2は水素または低級アルキルであるか、または
Ｒ1およびＲ2は、それらが結合している窒素原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく；
Ｒ3-Ｒ5は各々独立して水素、低級アルキル、アラルキル、任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基を表しているか、または
Ｒ2およびＲ3は、それらが結合している原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく、あるいは
Ｒ3およびＲ5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって飽和炭素環を形成してもよく；
Ｒ6はナフチル、フェニル、置換フェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ7は水素、低級アルキルまたはアラルキルであり；
nは１、２または３であり；かつ
X＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2またはＮＲ2である］
を有する。
【００６７】
合成および／または構築され、かつｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏでスクリーンされた化合物の実例は、表２に示されている。
【００６８】
【表２】
2007509605.tif 000006
【００６９】
Ｘ線構造の修飾およびリガンドドッキング
ＶＡＰ-１X線構造は、以下に記述されたように、ＣＡＯの「オフ・カッパー（off-copper）」の活性のある立体配座を模すべく修飾された。最初に、トパキノンは、ＥＣＡＯ構造（ＰＤＢコード１Ｄ６Ｚ（ウィルモット（wilmot）ら、１９９９年）にしたがって、活性のあるイミノキノン形へ修飾された。第二に、ＶＡＰ-１構造の活性部位キャビティは、ドッキング研究に先立ち、ボディル（Bodil）モデリングパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ａｂｏ．ｆ／／ｆａｋ／ｍｎｆ／ｒｅｓｅａｃｈ／ｊｏｎｎｓｏｎ／ｂｏｄｉｌ．ｈｔｍｌ）において側鎖ロータマー（Ｐｈｅ３８９、Ｔｙｒ３９４、Ａｓｐ３８６、およびＬｅｕ４６９）を選ぶことにより修飾され、それにより活性部位のイミノキノンをリガンドに関してさらに近づきやすくした。水素原子は、スクリーニングおよびドッキングに使用されたＶＡＰ-１構造に対し、何ら側鎖調整なしに、プログラムＲｅｄｕｃｅ  ｖ．２．１５を用いて付加された（ワード（Word）ら、１９９９年）。
【００７０】
潜在的リガンドのＲ-およびＳ-エナンチオマーが構築され、Ｓｙｂｙｌ  ｖ．６．９（トリポス・アソシエイツ（Tripos Associates）、米国、セントルイス）によりエネルギー最小化された。リガンドはイミノキノン残基へ共有結合により結合され、手動により結合キャビティ内へドッキングされた。
【００７１】
リガンド結合モード
図４は、スクリーンされたリガンドの実例を示している。ボディル・モデリングパッケージを用いて作成された図３には、ＢＴＴ-２０７１（化合物９）のＳ-エナンチオマーの結合モードが存在する。ＢＴＴ-２０７１（化合物９）のＳ-エナンチオマーは、ドッキングシミュレーションに基づけば、ＶＡＰ-１構造と最も広範囲な相互作用を形成することができることから、図中の実例リガンドとなるべく選ばれた。
【００７２】
ＶＡＰ-１構造に基づけば、Xが酸素原子のかわりに硫黄原子であるリガンドは、ＶＡＰ-１の相互作用表面が疎水性であることから、より有利にＶＡＰ-１と相互作用する。
【００７３】
硫黄原子を含んでいるリガンドの疎水性部分は、親水性残基（Ｌｅｕ４６８、Ｌｅｕ４６９、Ｐｈｅ３８９、およびＭｅｔ２１１）に対して固く締まる（ｐａｃｋ）。リガンドのパラメトキシ基中の酸素原子は、側鎖のＴｈｒ２１２の酸素に対して水素結合距離にあり、一方、リガンドのメタメトキシル基中の酸素原子は、側鎖のＴｙｒ３９４の水酸基に対して水素結合距離にある。Ｐｈｅ３８９は、リガンドの芳香環と容易に相互作用することができる位置に局在する。パラ-およびメタ-メトキシル基中のメチル基は、各々Ｔｙｒ４４８およびＴｙｒ１７６と接触している。Ｓ-エナンチオマー中の水酸基は、Ａｓｐ３８６と最適な水素結合を形成することが可能であるのに対し、Ｒ-エナンチオマーにおいては、水素結合距離およびジオメトリは最適ではない。
【実施例５】
【００７４】
同定された潜在的阻害剤のＶＡＰ-１阻害効果を立証するためのインビトロアッセイ
ＶＡＰ-１ＳＳＡＯ活性は、本質的にはモノアミンオキシダーゼおよび類縁酵素について記述されたような組合わされた比色法を用いて測定された。チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）において発現された細胞組換えヒトＶＡＰ-１  ＳＳＡＯが、活性測定のためのＶＡＰ-１  ＳＳＡＯの供給源として使用された。天然のＣＨＯ細胞は、無視できる程度のＳＳＡＯ活性を有する。これらの細胞およびその培養物は、従来に記述されている（スミス（Smith D J）ら、１９９８年）。
【００７５】
細胞溶解物は、約３．６×１０8個の細胞を２５ｍｌの溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス-塩基  ｐＨ７．２、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１％ＮＰ４０）中に懸諾すること、および回転台の上で４℃において一晩インキュベートすることにより調製された。溶解物は、室温において１８０００gで５分間遠心分離することにより透明にされ、上清はアッセイに直接使用された。
【００７６】
ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯアッセイは、９６穴マイクロタイタープレートにおいて、以下のように行なわれた。各ウェルに対し、必要であれば、あらかじめ決められた量の阻害剤が添加された。阻害剤の量は各アッセイで異なったが、全般的には１ｎＭ〜５０μＭの濃度であった。対照は阻害剤を欠いていた。阻害剤は、水中で、全体積中に２０：１であった。次に、以下の試薬が添加された。全反応体積２００μｌに対し、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．６、１ｍＭの２，４-ジクロロフェノール、５００μＭの４-アミノアンチピリン、および４Ｕ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する、４５μｌの新たに作成された色素溶液、および、１時間当たり０．６のＡ４９０の変化を引き起こした量の、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯを含有しているＣＨＯ細胞溶解物。
【００７７】
プレートは３７℃で３０分間インキュベートされ、バックグラウンド吸光度は、ウォラク・ビクター（Walac Victor）ＩＩマルチラベルカウンタを用いて、４９０ｎｍにおいて測定された。酵素反応を開始するためには、２０μｌの１０ｍＭベンジルアミン（最終濃度＝１ｍＭ）が添加され、そしてプレートは３７℃において１時間インキュベートされた。
【００７８】
ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性を反映する吸光度の増大は、４９０ｎｍにおいて測定された。阻害は、バックグラウンド吸収について補正した後に、対照と比較されたパーセント阻害として表され、ＩＣ５０値はグラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）を用いて計算された。
【実施例６】
【００７９】
ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性対全ラットＭＡＯ活性の比較
ラットＭＡＯは、ラット肝より、１gの肝試料を１４ｍｌのＫＣｌ-ＥＤＴＡ溶液中で数回洗浄して血液をすべて除去することにより調製された。次いで、１gの肝試料は、４ｍｌの氷冷リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中で、ウルトラ・トラックス（Ultra-Turrax）ホモジナイザ（設定１１０００ｒｐｍ、４×１０秒）によりホモジナイズされた。４℃において５００gで１０分間の遠心分離の後、上清は注意深く取出され、４℃において１２３００gで１５分間遠心分離された。上清は排出され、沈降されたミトコンドリアは４ｍｌの新鮮なリン酸緩衝液中に再懸濁され、前と同様に遠心分離された。ミトコンドリアは４ｍｌの辛酸緩衝液中に懸濁され、ウルトラ・トラックス（Ultra-Turrax）ホモジナイザ（設定１１０００ｒｐｍ、２×１０秒）によりホモジナイズされた。ミトコンドリアプレパラートはアリコートに分けられ、-７０℃に貯蔵された。
【００８０】
全ＭＡＯ活性は、２，４-ジクロロフェノールが１ｍＭバニリン酸で置換えられたこと以外は、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯと類似の方法で測定された。各ウエルに対し、必要な場合には、あらかじめ決められた量の阻害剤が添加された。阻害剤の量は各アッセイで異なったが、全般的には１０ｎＭ〜８００ｍＭの濃度であった。対照は阻害剤を欠いていた。阻害剤は、水中で、全体積中に２０：１であった。次に、以下の試薬が添加された。全反応体積３００μｌに対し、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．６、５０μｌの新たに作成された色素溶液（上記と同じ）、および５０μｌのＭＡＯ標品。
【００８１】
プレートは３７℃で３０分間インキュベートされ、バックグラウンド吸光度は、ウォラク・ビクター（Walac Victor）ＩＩマルチラベルカウンタを用いて、４９０ｎｍにおいて測定された。酵素反応を開始するためには、２０μｌの５ｍＭトリアミン（最終濃度＝０．５ｍＭ）が添加され、プレートは３７℃において１時間インキュベートされた。ＭＡＯ活性を反映する吸光度の増大は、４９０ｎｍにおいて測定された。阻害は、バックグラウンド吸収について修正した後に、対照と比較されたパーセント阻害として表され、ＩＣ５０値はグラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）を用いて計算された。ＭＡＯ阻害のための陽性対照として、クロルギリンおよぎパルギリン（各々ＭＡＯ-ＡおよびＭＡＯ-Ｂの阻害剤）が０．５μＭにて、いくつかのウエルに添加された。
【００８２】
表３の化合物の、ＶＡＰ-１  ＳＳＡＯに対してＭＡＯを超える特異性をもってＶＡＰ-１  ＳＳＡＯを阻害する能力は、表２に示されている。結果は、本発明の化合物がヒトＶＡＰ-１  ＳＳＡＯ活性の特異阻害剤であることを示している。本発明の化合物は、そえ故、ヒトの接着性分子ＶＡＰ-１のＳＳＡＯ活性が役割を果たしている疾病および症状の治療において、治療上の有用性をもつことが期待される。
【００８３】
【表３】
2007509605.tif 000007
【００８４】
当業者には、技術が進歩するにつれて、発明の概念が様々な方法で遂行され得ることが明らかであろう。本発明およびその態様は、上記の実施例に制限されず、特許請求の範囲内で変更されてよい。
【００８５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】パネルＡにおいて六方晶のＶＡＰ-１結晶を、そしてパネルＢにおいて典型的な回折パターンを示している。
【図２】ヒトＶＡＰ-１ダイマーの結晶構造を示しており、糖単位は区間充填モデルとして描かれており、双方のモノマー中のＴｐｇ４７１はＤ４ドメイン中の球として示されている。
【図３】ＶＡＰ-１ダイマーの結晶構造の一つのモノマーを示している。
【図４】ＶＡＰ-１構造におけるＶＡＰ-１阻害剤の結合モードを示している。視点は、表面から活性部位へ下っている。
【図１Ａ】
2007509605.tif 000009
【図１Ｂ】
2007509605.tif 000010
【図２】
2007509605.tif 000011
【図３】
2007509605.tif 000012
【図４】
2007509605.tif 000013
【配列表】
2007509605000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月22日(2005.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記結晶が、二つの分子を非対称ユニットにもち、ａ＝ｂ＝２２５．９Å、ｃ＝２１８．７Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°のユニットディメンションをもつ、空間群Ｐ６5２２の結晶として定義される、結晶性ヒト血管接着タンパク質１（ＶＡＰ-１）。
【請求項２】
アミノ酸配列、配列番号３、配列番号４および配列番号５によって各々特徴づけられる、ドメインＤ２、Ｄ３、およびＤ４を含んでいる、請求項１に記載の結晶性ＶＡＰ-１、またはその同族体。
【請求項３】
表面において幅約２０Å×約１０Å、かつ深さ約１５Åである活性部位キャビティを含んでいる、請求項２に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項４】
前記活性部位キャビティが、ヒトＶＡＰ-１の一つのモノマーに由来する配列番号２のアミノ酸８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１および７５８-７６１、およびヒトＶＡＰ-１の別のモノマーに由来する配列番号２のアミノ酸４３３-４４９および４５１を含んでいる、請求項３に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項５】
前記活性部位が、前記キャビティの底の狭い約４．５Å×約４．５Åのキャビティの上端に、アミノ酸Ｌｅｕ４６９をさらに含む、請求項４に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項６】
前記活性部位キャビティの底部が、アミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１およびＴｙｒ４７３によって裏打ちされた、請求項５に記載の結晶性ＶＡＰ-１タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶性ＶＡＰ-１を含んでいる組成物。
【請求項８】
ヒトＶＡＰ-１を結晶化するための方法であって、
ａ）ヒトＶＡＰ-１タンパク質を含んでいる水溶液を供給すること；
ｂ）沈殿剤を含んでいる貯蔵溶液を供給すること；
ｃ）ある体積の前記水溶液とある体積の前記保存溶液と混合して、混合液を形成すること；および
ｄ）前記混合液の少なくとも一部を結晶化すること、
の段階を含む方法。
【請求項９】
段階ａ）で供給された前記水溶液が、１ｍｇ／ｍｌのＶＡＰ-１濃度を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記沈殿剤が酒石酸Ｋ／Ｎａである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｄ）を蒸気拡散によって行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトＶＡＰ-１タンパク質の三次元構造を規定する原子座標／X線回折データをその上に記憶した、機械可読データをコードしたデータ記憶装置を含んでいるコンピュータ可読媒体であって、分子構造を決定するための適当な機械によって読取られかつコンピュータプログラムによって処理されたとき、ヒトＶＡＰ-１タンパク質のフラグメントを含んでいる分子の結晶の三次元表現をディスプレイすることができ、ここで前記データが、ダイマーのヒトＶＡＰ-１タンパク質の活性部位キャビティを規定し、そして前記活性部位キャビティが、表面では幅約２０Å×約１０Åかつ深さ約１５Åであり、前記活性部位が、前記部位の底の狭い約４．５Å×約４．５Åのキャビティの上端に、アミノ酸Ｌｅｕ４６９をさらに含む、媒体。
【請求項１３】
前記活性部位キャビティが、ヒトＶＡＰ-１の一つのモノマーに由来するアミノ酸８６-８７、９７、１６８-１７３、１７６-１７７、１８０、１８４、２０５-２１２、２１６、２２７、２３２-２３４、２３６-２３９、３４４、３８８-３９０、３９３-３９７、４１５-４１９、４２１、４２１-４２６、４６７-４７０、６４７-６５１、および７５８-７６１、およびヒトＶＡＰ-１の別のモノマーに由来するアミノ酸４３３-４４９、および４５１を含んでいる、請求項１２に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１４】
前記活性部位キャビティの底部が、アミノ酸残基Ａｌａ３７０、Ｔｙｒ３８４、Ａｓｐ３８６、Ａｓｎ４７０、Ｔｐｑ４７１およびＴｙｒ４７３によって裏打ちされた、請求項１３に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１５】
ヒトＶＡＰ-１タンパク質と相互作用する化合物を同定するための方法であって：
ａ）請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のコンピュータ可読媒体上に前記タンパク質の原子座標を供給すること、およびｂ）コンピュータを用いて、前記座標に分子モデリング技術を適用すること、
の段階を含む方法。
【請求項１６】
前記分子モデリング技術が、ｄｅ  ｎｏｖｏの化合物設計を含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｄｅ  ｎｏｖｏの化合物設計が、（i）ＶＡＰ-１の活性部位内の箇所と相互作用することができる官能基または低分子フラグメントの同定、および（ｉｉ）これらを一つの化合物中に結合すること、を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分子モデリング技術が、ＶＡＰ-１のファーマコフォアを使用する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分子モデリング技術が、自動化されたドッキングアルゴリズムを使用する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
更なる段階（ｃ）前記分子モデリング技術により同定された化合物を供給すること；および（ｄ）前記化合物をヒトＶＡＰ-１と接触させること、およびＶＡＰ-１のＳＳＡＯ活性に対する前記化合物の阻害効果を検出すること、を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法によって同定可能な合成の、小分子ヒトＶＡＰ-１阻害剤。
【請求項２２】
式：
【化１】
2007509605.tif 000022
［式中、
Ｒ1は水素、低級アルキルまたは任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ2は水素または低級アルキルであるか、または
Ｒ1およびＲ2は、それらが結合している窒素原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく；
Ｒ3-Ｒ5は各々独立して水素、低級アルキル、アラルキル、任意に置換されたフェニルまたはヘテロアリール基を表しているか、または
Ｒ2およびＲ3は、それらが結合している原子と一緒になって飽和複素環を形成してもよく、あるいは
Ｒ3およびＲ5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって飽和炭素環を形成してもよく；
Ｒ6はナフチル、フェニル、置換フェニルまたはヘテロアリール基であり；
Ｒ7は水素、低級アルキルまたはアラルキルであり；
nは１、２または３であり；かつ
X＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2またはＮＲ2である］
を特徴とする、請求項２１に記載の阻害剤。
【請求項２３】
慢性関節炎、炎症性腸疾患、および皮膚疾患及び多発性硬化症のような、急性および慢性の炎症症状または疾患、糖尿病および糖尿病から結果として生じる、たとえば網膜症、神経障害、腎症といった血管症のような合併症を含めた、糖質代謝に関連した疾患、脂肪細胞の分化または機能、および平滑筋細胞の機能、特にアテローム硬化症における異常、および種々の血管性疾患からなる群より選ばれる疾病の治療における使用のための薬剤製造のための、請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の化合物を含んでいる薬剤組成物。
【国際調査報告】
2007509605.tif 000023
2007509605.tif 000024
2007509605.tif 000025
2007509605.tif 000026
2007509605.tif 000027
2007509605.tif 000028
2007509605.tif 000029