(57)【要約】  相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）を有するハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体、およびハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体を製造する方法を記載する。この均一な大きさの単分散ＩＰＮナノ粒子は逆熱ゲル化性を有し、治療薬剤が液体形態のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体に均一に分布されることを可能にする。そのような薬剤は、その後、時間に依存する様式で固体形態のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体から放出され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ＩＰＮナノ粒子が、第２ポリマーに相互貫入する第１ポリマーおよび水性媒質を含む、相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子を含むハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体であって、
ＩＰＮナノ粒子が、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まず、ハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体が、それに適用される刺激の変化に応答して可逆性ゲル化を起こし得るハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項２】
生物活性材料をさらに含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項３】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項２に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項４】
刺激が、温度の変化を含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項５】
ゲル化温度（「Ｔｇ」）を超える温度変化が、ＩＰＮナノ粒子の体積相転移を誘起し、ハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体の逆熱増粘性をもたらす請求項４に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項６】
逆熱増粘性が、Ｔｇ超に加熱されたときの低粘性流体からゲルへの変換である請求項５に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項７】
Ｔｇが、約３４℃である請求項５に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項８】
第１ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、またはヒドロキシプロピルセルロースを含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項９】
第２ポリマーが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１０】
第１ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２ポリマーが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１１】
単分散ナノ粒子が、均一な大きさの流体力学半径を有する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１２】
単分散ナノ粒子が、約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１３】
単分散ナノ粒子の第１ポリマーと第２ポリマーが、約１：１．８８の重量比を有する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１４】
第１ポリマーと第２ポリマーが、蒸留水中で約１．２５重量％から約５．２５重量％の濃度範囲を有する全ポリマーを形成する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１５】
単分散ナノ粒子の相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）を調製する方法であって、
（ａ）第１モノマー、界面活性剤、第１架橋剤、および第１開始剤を第１温度で混合することによって調製された第１単分散ポリマー・ナノ粒子を提供するステップ、
（ｂ）第１単分散ポリマー・ナノ粒子に、第２モノマー、第２架橋剤、第２開始剤、および活性化剤を添加して、ナノ粒子溶液を形成するステップ、
（ｃ）ナノ粒子溶液をある時間、第２温度で混合して、単分散ナノ粒子のＩＰＮを形成するステップ、および
（ｄ）単分散ナノ粒子のＩＰＮを単離するステップを含み、
第１モノマー、第１架橋剤、第２モノマー、および第２架橋剤が、実質的に溶解酸素ガスを含まない方法。
【請求項１６】
（ｅ）単離した単分散ナノ粒子のＩＰＮを、第３温度で生物活性材料と混合するステップをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第３温度が、水性混合物中の単分散ナノ粒子のＩＰＮのゲル化温度（「Ｔｇ」）未満である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｇが、約３３℃である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１単分散ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、またはヒドロキシプロピルセルロースを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第２モノマーが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
第１単分散ポリマー・ナノ粒子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２モノマーが、アクリル酸を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
第１架橋剤が、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含み、第２架橋剤が、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含み、第１開始剤が、過硫酸カリウムを含み、第２開始剤が、過硫酸アンモニウムを含み、界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）を含み、活性化剤が、ＴＥＭＥＤを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
単分散ナノ粒子のＩＰＮが、約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
時間が、１３０分未満である請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
時間が、１２０分未満である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１温度が、約７０℃である請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
第２温度が、約２１℃である請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
架橋相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子のナノクラスターを調製する方法であって、
（ａ）ＩＰＮナノ粒子の分散体を提供するステップ、
（ｂ）第１架橋剤および第２架橋剤をＩＰＮナノ粒子の分散体に添加して、ＩＰＮ架橋溶液を形成するステップ、および
（ｃ）ＩＰＮ架橋溶液をある時間、第１温度に加熱して、架橋ＩＰＮナノ粒子のナノクラスターを形成するステップ
を含み、単分散ＩＰＮナノ粒子が、均一な大きさを有し、第２ポリマーに相互貫入する第１ポリマーを含み、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まず、単分散ＩＰＮナノ粒子が、それに適用される刺激の変化に応答して可逆性ゲル化を起こし得る方法。
【請求項３０】
（ｄ）架橋ＩＰＮのナノクラスターを、第２温度で生物活性材料と混合するステップをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第２温度が、水性分散体中の架橋ＩＰＮナノ粒子のナノクラスターのゲル化温度（「Ｔｇ」）未満である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｔｇが、約３３℃である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２ポリマーが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
第１架橋剤が、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（「ＥＤＡＣ」）を含み、第２架橋剤が、アジピン酸ジヒドラジドを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
架橋ＩＰＮのナノクラスターが、約１５５ｎｍから約２５０ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
架橋ＩＰＮのナノクラスターが、約２２５ｎｍから約２４０ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
時間が、約２５分から約４５分である請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
時間が、約３３分から約３７分である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１温度が、約４４℃である請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
架橋基によって結合された少なくとも２つのＩＰＮナノ粒子を含む、架橋相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子のナノクラスターであって、各ＩＰＮナノ粒子が、均一な大きさを有し、第２ポリマーに相互貫入する第１ポリマーを含み、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まないナノクラスター。
【請求項４２】
生物活性材料をさらに含む請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４３】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項４２に記載のナノクラスター。
【請求項４４】
第１ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２ポリマーが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４５】
架橋基が、アジピン酸ジヒドラジドを含む請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４６】
均一な大きさのナノ粒子が、約１５５ｎｍから約２５０ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４７】
ナノ粒子が、約１８０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項４６に記載のナノクラスター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散液、および単分散相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子の製造方法に関する。より詳細には、このＩＰＮナノ粒子は、モノマー、架橋剤、および開始剤の第１混合物を重合して、第１ポリマー・ナノ粒子を形成することによって形成される第１ポリマーから製造される。この第１ポリマー・ナノ粒子を、モノマーと架橋剤の第２の組合せで膨潤させ、続いてそれを重合して、独特の熱誘起ゲル化性を有する単分散ＩＰＮナノ粒子を形成する。この熱誘起粘度変化およびｉｎ  ｓｉｔｕハイドロゲル形成により、治療薬剤を液体形態のナノ粒子に混合し、典型的に液体を凝固させるために用いられる過酷な化学的工程によって破壊されることなく、高温下で固体ハイドロゲルに均一に分布させることが可能になる。さらに、固体ハイドロゲルは、薬剤の制御時間放出を可能にする。本発明はさらに、いくつかの架橋ＩＰＮナノ粒子ビルディング・ブロックからなる軟性ナノクラスターを合成するための方法および組成物を含む。
関連出願
【０００２】
本出願は、その全体を参照により本明細書の一部とする、発明者として挙げられているＨｕ他による「Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｖｅｒｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｇｅｌａｔｉｏｎ」という名称の２００３年１２月９日出願の米国特許仮出願第６０／５２８，０８１号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
一般に、有効な薬物療法は通常（ａ）一定レベルの薬剤濃度（治療指数と称される）が（ｂ）一定の時間維持されることを必要とする。たとえば、全身投与された薬剤は、迅速に薬剤濃度を上昇させる可能性があるが、多くの送達系は非効率的であり、高用量に起因する毒性の副作用を伴う可能性がある。対照的に、制御放出製剤の全身投与は、副作用を低減することのできるより有効な薬剤送達によって、両方の目的を達成することができる。さらに、薬剤送達系の埋め込みは、局所特異薬剤利用の有効性をさらに向上させる可能性がある。
【０００４】
一般に、ハイドロゲルは、溶媒（水など）を吸収し、迅速に膨潤し、可逆的変形可能な三次元ネットワークを維持する材料である。ハイドロゲルは、非架橋または架橋であることができる。非架橋ハイドロゲルは、典型的に水を吸収することができるが、疎水性領域と親水性領域が存在するため溶解しない。水溶性ポリマーを含む、親水性ポリマーの共有結合架橋ネットワークは、慣例的に水和状態のハイドロゲルと称される。いくつかの水性ハイドロゲルが、ソフト・コンタクト・レンズおよび創傷管理などの、種々の生物医学的応用例で用いられている。さらに、ハイドロゲルは、これまで薬剤送達系として用いられてきており、たとえば２００３年１０月２８日にＰａｔｈａｋ他に発行された「Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」という名称の米国特許第６，６３９，０１４号（「‘０１４号特許」）、および２００３年１０月１４日にＳａｗｈｎｅｙに発行された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」という名称の米国特許第６，６３２，４５７号（「‘４５７号特許」）である。
【０００５】
２つのＩＰＮを含むハイドロゲルは、集中的な研究の対象となっている（Ｉｌｍａｉｎ，Ｆ．、Ｔａｎａｋａ，Ｔ．、Ｋｏｋｕｆｕｔａ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）１９９１、３４９、４００〜１）。これはＩＰＮハイドロゲルが通常、２種のモノマーのランダム共重合によるハイドロゲルが持たない特性を示すからである。たとえば、ポリ（アクリル酸）（「ＰＡＡｃ」）とポリアクリルアミド（「ＰＡＡＭ」）のＩＰＮは、水素結合に起因する分子間の協同的「ジッピング」相互作用による体積相転移を起こす（Ｉｌｍａｉｎ，Ｆ．、Ｔａｎａｋａ，Ｔ．、Ｋｏｋｕｆｕｔａ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）１９９１、３４９、４００〜１）。通常２つの相互貫入ネットワーク間の強化によってもたらされる改善された力学的特性に加えて（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，Ｌ．Ｈ．Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．１９９４、２３９、１２）、ＩＰＮハイドロゲルは、他方（ポリアクリルアミド（「ＰＡＡＭ」））のゲル化が起こる前に、一方（ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（「ＰＮＩＰＡＭ」））にプレストレスを与えることによって好ましい膨潤方向性を有することができる（Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｊ．、Ｈｕ，Ｚ．Ｂ．、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｙ．、Ｌｉ，Ｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９９、３２、１８２２〜１８２７）。適切に設計されたＩＰＮ構造を有するハイドロゲルは、体積変化することなく上部臨界完溶温度を示す（Ｃｈｅｎ，Ｌ．、Ｇｏｎｇ，Ｊ．、Ｏｓａｄａ，Ｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００２、２３（３）、１７１〜１７４）。ＩＰＮゲルの２つのポリマー鎖ネットワークは、独立して２つの異なる外部刺激に感受性であり得る。そのようなハイドロゲルは、薬剤の制御送達に用いられてきた（Ｋａｔｏｎｏ，Ｈ．、Ｓａｎｕｉ，Ｋ．、Ｏｇａｔａ，Ｎ．、Ｏｋａｎｏ，Ｔ．、Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．Ｐｏｌｙｍ  Ｊ  １９９１、２３、１１７９〜１１８９；Ｋａｔｏｎｏ，Ｈ．、Ｍａｒｕｙａｍａ，Ａ．、Ｓａｎｕｉ，Ｋ．、Ｏｇａｔａ，Ｎ．、Ｏｋａｎｏ，Ｔ．、Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ  １９９１、１６、２１５〜２２７  ２７３：４６４〜４７２；Ｇｕｔｏｗｓｋａ，Ｙ．Ｈ．、Ｂａｅ，Ｈ．、Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．、Ｆｅｉｊｅｎ，Ｓｕｎｇ  Ｗａｎ  Ｋｉｍ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９４、２７、４１６７；Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｇ．、Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｋ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８、１９、１６７〜１７２）。ＰＮＩＰＡＭゲルは、Ｔｃ＝３４℃で体積相転移を起こし、ＩＰＮゲルの一成分としてよく用いられている（Ｈｉｒｏｔｓｕ，Ｓ．、Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｙ．、Ｔａｎａｋａ，Ｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９８７、８７、１３９２；Ｗｕ，Ｃ．、Ｚｈｏｕ，Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９６、２９、１５７４；Ｂｅｎｅｅ，Ｌ．Ｓ．、Ｓｎｏｗｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈｏｗｄｈｒｙ，Ｂ．Ｚ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００２、１８、６０２５；Ｒｏｕｔｈ，Ａ．Ｆ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｂ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００２、１８、５３６６〜５３６９；Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｎ．Ｃ���、Ｃｈｏｗｄｈｒｙ，Ｂ．Ｚ．、Ｓｎｏｗｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｌｅｈａｒｎｅ，Ｓ．Ａ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｐ．Ｃ．、Ｗｉｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｌ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００３、１９、３２０２〜３２１１；Ｇａｏ，Ｊ．；Ｆｒｉｓｋｅｎ，Ｂ．Ｊ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００３、１９、５２１７〜５２２２）。ＰＮＩＰＡＭがＩＰＮマトリクスに組み込まれる場合、その相転移温度は変化しない。しかしながら、ランダム共重合は、コモノマーの親水性／疎水性に応じてＴｃを変化させる。
【０００６】
ＩＰＮマイクロゲル粒子は、農薬および医学的応用例において巨視的ゲルに比べて送達系として有効であるため、合成されてきた（Ｂｏｕｉｌｌｏｔ，Ｐ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｂ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００、２７８、７４〜７９）。ランダムＰ（ＡＡｃ−ｃｏ−Ａａｍ）粒子とＰＡＡｃ／ＰＡＡｍＩＰＮマイクロゲルの膨潤挙動の比較は、トリガーとして温度およびｐＨを用いて行われてきた（Ｂｏｕｉｌｌｏｔ，Ｐ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｂ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００、２７８、７４〜７９）。他方、ＪｏｎｅｓおよびＬｙｏｎは、弱く相互貫入しているポリマー・ネットワーク・コアとシェルからなる、多反応性コア／シェル・マイクロゲルを示した（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｄ．、Ｌｙｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０００、３３、８３０１〜８３０６）。これらのマイクロゲルは、水性媒体中７０℃で沈殿重合することによって調製された。シェル・ポリマーの合成において、崩壊した粒子はさらなる重合の核となり、それによって新しい粒子の核形成より優先的に存在する粒子の成長がもたらされる（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｄ．、Ｌｙｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０００、３３、８３０１〜８３０６）。本発明のＩＰＮナノ粒子は、上述の典型的な崩壊コア／シェル・ポリマーを実質的に含まない。
【０００７】
ＰＮＩＰＡＭ／ＰＡＡｃのＩＰＮマイクロゲルを合成する方法を本明細書に記載する。ＪｏｎｅｓおよびＬｙｏｎの方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｄ．、Ｌｙｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０００、３３、８３０１〜８３０６に記載）を、ＰＮＩＰＡＭポリマーの下部臨界完溶温度より低く反応温度を下げ、室温で相互貫入ポリマー・ネットワークが形成されると反応が停止するように反応時間を制御することによって拡張した。ＰＮＩＰＡＭと同じＴｃを示すが、Ｔｃを超えるとＰＮＩＰＡＭより縮小が少ない、これらのマイクロゲルの合成および光散乱性が示される。ＰＮＩＰＡＭ−ＰＡＡｃＩＰＮマイクロゲルの半希薄水溶液は、異例な逆熱可逆性ゲル化を示す。逆熱可逆性ゲル化性を有するポリ（ＮＩＰＡＭ−ｃｏ−ＡＡｃ）のポリマー溶液とは対照的に、開示される系は秩序構造に自己組織化され、明色を示すことができる（Ｔ．Ｋａｔｏ、Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ、Ａ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｃｏｌｌｏｉｄ＆Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９７８、２５６、１５；Ｍ．Ａｌｍｇｒｅｎ、Ｐ．Ｂａｈａｄｕｒ、Ｍ．Ｊａｎｓｓｏｎ、Ｐ．Ｌｉ、Ｗ．Ｂｒｏｗｎ、Ａ．Ｊ．Ｂａｈａｄｕｒ、Ｃｏｌｌｏｉｄ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１９９２、１５１、１５７；Ｐ．Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ、Ｔ．Ａ．Ｈａｔｔｏｎ、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ  １９９５、９６、１〜４６；Ｃ．Ｋ．Ｈａｎ、Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  １９９８、３９、２８０９〜２８１４；Ｂ．Ｊｅｏｎｇ、Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ、Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２００２、５４、３７〜５１）。
【０００８】
非常に狭い温度範囲（１〜２℃）で調整可能な急激な逆熱ゲル化性を有するＩＰＮナノ粒子水性分散体は、いくつかの生物医学的応用例において有用であり、それには組織工学骨格、生体接着、細胞培養マトリクス、および薬剤制御送達が含まれる可能性がある。より詳細には、本発明の焦点は、制御された薬剤充填および放出態様での利点に関する。熱応答性バルクゲルは通常、モノマーのフリーラジカル重合によって形成される（Ｒ．Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｋ．Ｕｃｈｉｄａ、Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ、Ｋ．Ｓａｋａｉ、Ａ．Ｋｉｋｕｃｈｉ、Ｙ．Ｓａｋｕｒａｉ、およびＴ．Ｏｋａｎｏ、Ｃｏｍｂ−ｔｙｐｅ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒａｐｉｄ  ｄｅ−ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｈａｎｇｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４（１９９５）２４０；Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ｔ．Ｏｋａｎｏ、およびＳ．Ｗ．Ｋｉｍ、Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｏｎ−ｏｆｆ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ、Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ８（１９８７）４８１；Ｔ．Ｏｋａｎｏ、Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ｈ．Ｊａｃｏｂｓ、およびＳ．Ｗ．Ｋｉｍ、Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｏｎ−ｏｆｆ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１（１９９０）２５５；Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ｔ．Ｏｋａｎｏ、およびＳ．Ｗ．Ｋｉｍ、“Ｏｎ−ｏｆｆ”ｔｈｅｒｍｏｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｏｌｕｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｉ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（１９９１）５３１；Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ｔ．Ｏｋａｎｏ、およびＳ．Ｗ．Ｋｉｍ、“Ｏｎ−ｏｆｆ”ｔｈｅｒｍｏｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｏｌｕｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．ＩＩ．Ｓｏｌｕｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（１９９１）６２４）。バルクゲルは、共有結合ポリマー鎖の永久的な構造を有する。対照的に、本発明で論じられるＩＰＮナノ粒子ネットワークは、熱可逆性構造を有し、隣接する粒子間の物理的結合は、ゲル化温度より高い温度または低い温度に切り替えることによってオンまたはオフにすることができる。さらに、薬剤分子は通常、薬剤をモノマー、開始剤、および架橋剤と混合することによって、またはバルクゲルを適切な薬剤溶液で平衡膨潤させることによって、バルクゲルに充填される（Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ、Ｔ．Ｏｋａｎｏ、Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ、Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ，Ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．９（１９９２）２８３）。最初のアプローチは、薬剤を損傷し得る副反応を受ける可能性があり、第２のアプローチは、タンパク���のような巨大分子をゲル・ネットワークから排除する可能性がある（Ｌ．Ｅ．Ｂｒｏｍｂｅｒｇ、Ｅ．Ｓ．Ｒｏｎ、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｌｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３１（１９９８）１９７）。対照的に、薬剤分子は室温でナノ粒子分散体に混合することができる。体温（３７℃）で、これらの粒子は物理的結合によって結合し、ゲルを形成して、薬剤がナノ粒子ネットワークからゆっくりと放散されることを可能にした。化学反応を伴わないので、薬剤分子を安全にナノ粒子ネットワークに封入することができた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
さらに、ＩＰＮマイクロゲルは、Ｔ＞３４℃で比較的希薄な環境下であっても強力な粒子間疎水性引力のために、単分散軟性ナノクラスターを構築する特別なビルディング・ブロックとして用いることができた。本開示において、単分散軟性モノクラスターは、ポリアクリル酸（「ＰＡＡｃ」）とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（「ＰＮＩＰＡＭ」）の相互貫入ネットワーク（「ＩＰＮ」）からなる一定数のマイクロゲルをゼロ距離共有結合することによって合成された。ナノクラスター形成の速度論は、反応時間の関数として粒子流体力学半径（「Ｒｈ」）変化を測定することによって得られた。動的光散乱および静的光散乱によって、個々のナノクラスターの特徴を明らかにし、そのビルディング・ブロックＩＰＮマイクロゲルと比較した。各ナノクラスターのＩＰＮマイクロゲル数は、反応持続期間を制御することによって、統計的に操作することができる。ナノクラスターは、温度変化に応答して可逆性体積相転移を起こすが、ｐＨに対しては明らかな感受性を持たない。そのビルディング・ブロックＩＰＮマイクロゲルとは対照的に、ナノクラスターは、温度の上昇によって、向上した脱膨潤能力を示した。この新規な軟性ナノ材料は、独特なザクロ様構造を有し、注射薬剤の充填および送達応用例に大きな潜在性を有する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の好ましい実施形態は、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とポリ（アクリル酸）の相互貫入構造を有する単分散ナノ粒子を合成するための方法および組成物に関する。好ましいＩＰＮナノ粒子マイクロゲルは、物理的に架橋したＩＰＮ、および可逆性ゲル形成性を有する。特定の架橋単分散ナノ粒子ＩＰＮマイクロゲルの物理的構造は、これらの材料が薬剤時限放出担体として用いられることを可能にする。当業者は、本明細書に記載の原理を利用して、同様の逆熱可逆性ゲル化性を有する他のハイドロゲル・ナノ／マイクロ粒子水分散体を設計および製造することができる。好ましいナノ粒子には、これに限定されるものではないが、ポリ（アクリル酸）／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ＩＰＮナノ粒子、ポリ（アクリル酸）／ヒドロキシプロピルセルロースＩＰＮナノ粒子、デキストラン／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ＩＰＮナノ粒子、およびデキストラン／ヒドロキシプロピルセルロースＩＰＮナノ粒子が含まれる。
【００１１】
本発明の第１の態様は、均一な大きさを有するハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体に関する。これらのナノ粒子は、相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）を形成する第２ポリマーに相互貫入する第１ポリマーを有する。好ましい実施形態において、第１ポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（「ＰＮＩＰＡＭ」）を含み、第２ポリマーは、ポリ（アクリル酸）（「ＰＡＡｃ」）を含む。好ましいＰＮＩＰＡＭ／ＰＡＡｃＩＰＮナノ粒子は、約１：１．８８の重量比を有し、総ポリマー濃度は、蒸留水中約１．２５重量％から約５．２５重量％の範囲である。本発明のＩＰＮナノ粒子は、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まない。さらに、ＩＰＮナノ粒子の水性分散体は、温度変化、ｐＨ変化、溶媒濃度変化、または変化の組合せなどの刺激に応答して、可逆性相転移を起こし得る。たとえば、ゲル化温度（「Ｔｇ」）を超えて温度を上昇させて、ＩＰＮナノ粒子の水性分散体を刺激することによって、体積相転移および可逆性逆熱増粘性が誘起され、これによりＴｇ超に加熱されたとき、ＩＰＮナノ粒子は低粘性流体からゲルに変換する。ＰＮＩＰＡＭ／ＰＡＡｃＩＰＮナノ粒子は、約３４℃のＴｇを有する。第２ポリマーのｐＫａより低くｐＨが変化すると、体積相転移が誘起される。好ましいハイドロゲルはさらに生物活性材料を含有し、これは薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸であってよい。単分散ナノ粒子は、約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の均一な大きさの流体力学半径を有する。
【００１２】
本発明の第２の態様は、単分散ナノ粒子の相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）を調製する方法に関する。この方法は、（ａ）第１単分散ポリマー・ナノ粒子を提供するステップ、（ｂ）第１単分散ポリマー・ナノ粒子に第２モノマー、第２架橋剤、第２開始剤、および活性化剤を添加して、ナノ粒子溶液を形成するステップ、（ｃ）ナノ粒子溶液をある時間、第２温度で混合して、単分散ナノ粒子のＩＰＮを形成するステップ、ならびに（ｄ）単分散ナノ粒子のＩＰＮを単離するステップを含む。第１単分散ポリマー・ナノ粒子は、第１モノマー、第１架橋剤、および第１開始剤を、実質的に酸素ガスを含まない環境下、第１温度で混合することによって調製された。好ましい実施形態において、実質的に酸素ガスを含まない環境は、第１ポリマー成分を窒素ガスでスパージングして、溶解酸素ガスを重合前に除去することを含んだ。同様に、第１モノマー、第１架橋剤、第２モノマー、第２架橋剤は、実質的に溶解酸素ガスを含まない。第１および第２ポリマー成分は、窒素ガスでスパージングして、溶解酸素ガスを除去した。この方法は、（ｅ）単離した単分散ナノ粒子のＩＰＮを、第３温度で生物活性材料（たとえば、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸）と混合するステップをさらに含む。好ましい実施形態において、第１単分散ポリマー・ナノ粒子は、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２モノマーは、アクリル酸を含み、第１架橋剤は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含み、第１開始剤は、過硫酸カリウムを含み、第２開始剤は、過硫酸アンモニウムを含み、活性化剤は、ＴＥＭＥＤを含み、時間は１３０分未満であり、第１温度は、約７０℃であり、第２温度は、約２１℃である。本発明の方法を用いて生成されたＩＰＮナノ粒子は、実質的にシェル／コア・ポリマー形状を含まず、約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の均一な大きさの流体力学半径を有する。
【００１３】
本発明の第３の態様は、架橋相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子のナノクラスターである。好ましいナノクラスターは、架橋基を介して第２ＩＰＮナノ粒子に架橋された第１ＩＰＮナノ粒子を含む。第１ＩＰＮナノ粒子および第２ＩＰＮナノ粒子はそれぞれ、第２ポリマーに相互貫入する第１ポリマーを含み、ナノ粒子は、上述の通り、実質的にシェル／コア・ポリマー形状を含まない。架橋基は、アジピン酸ジヒドラジドを含む。好ましい実施形態において、ナノクラスターは少なくとも、第１ＩＰＮナノ粒子および第２ＩＰＮナノ粒子に架橋している第３のＩＰＮナノ粒子を含む。さらに、ナノクラスターは、温度変化、ｐＨ変化、溶媒濃度変化、または変化の組合せなどの刺激に応答して、可逆性相転移を起こし得る。たとえば、ゲル化温度（「Ｔｇ」）を超えて温度を上昇させて、ナノクラスター溶液を刺激することによって、体積相転移および可逆性逆熱増粘性が誘起され、これによりＴｇ超に加熱されたとき、ナノクラスターは低粘性流体からゲルに変換する。ナノクラスターの平均流体力学半径は、約１５５ｎｍから約２５０ｎｍの範囲である。ナノクラスターはさらに、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸などの生物活性材料を含むことができる。
【００１４】
本発明の第４の態様は、架橋相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子のナノクラスターを調製する方法を含む。この方法は、ＩＰＮナノ粒子の分散体を提供するステップ、第１架橋剤および第２架橋剤をＩＰＮ単分散ナノ粒子に添加して、ＩＰＮ架橋溶液を形成するステップ、ならびに架橋溶液をある時間、第１温度に加熱するステップを含む。好ましいＩＰＮ単分散ナノ粒子は上に論じたが、均一な大きさを有し、第２ポリマーに相互貫入する第１ポリマーを含み、実質的にシェル／コア・ポリマー形状を含まない。第１架橋剤は、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（「ＥＤＡＣ」）を含み、第２架橋剤は、アジピン酸ジヒドラジドを含む。架橋ＩＰＮのナノクラスターの平均流体力学半径は、約１５５ｎｍから約２５０ｎｍの範囲であり、時間は、１３０分未満であり、第１温度は、約４４℃である。この方法はさらに、架橋ＩＰＮのナノクラスターを、第２温度で生物活性材料と混合するステップを含むことができ、生物活性材料には、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸を含むことができる。第２温度は、架橋ＩＰＮのナノクラスターのゲル化温度（「Ｔｇ」）未満であり、好ましい実施形態において約３３℃である。
【００１５】
以下の図面は本明細書の一部であり、本発明のいくつかの態様をさらに実証するために含むものである。本発明は、本明細書に示した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つまたは複数のこれらの図面を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）を有するハイドロゲル、およびハイドロゲルの製造方法に関する。より詳細には、第１ポリマーは、モノマー、架橋剤、および開始剤の第１混合物を重合して、第１ポリマー・ネットワーク・ナノ粒子を形成することによって形成される。この第１ポリマー・ネットワーク・ナノ粒子を、モノマーと架橋剤の第２の組合せで膨潤させ、重合して、独特の逆温度ゲル化性を有する単分散ＩＰＮナノ粒子を形成する。好ましい実施形態において、均一な大きさの単分散ＩＰＮナノ粒子はまた、時間に依存する様式で「ｉｎ  ｖｉｖｏ」において薬剤を放出するのに用いることのできる治療薬剤を含有する。
【００１７】
本発明は、ハイドロゲル、ナノクラスター、ハイドロゲルの製造方法、およびナノクラスターの製造方法を含む。本発明、および本発明を実施することのできる様式をさらに例示するために、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とポリ（アクリル酸）の相互貫入構造を有するハイドロゲル、ナノ粒子、およびナノクラスターを合成するために用いられる組成物、方法、技法、および装置を提供する。ＩＰＮおよびＰＮＩＰＡナノ粒子のレーザー光散乱研究、温度に誘起される体積相転移および熱増粘性、ならびにｐＨに誘起される体積相転移を含む、ＩＰＮマイクロゲル形成の反応速度論を実証する実施例を提供する。さらに、半希薄ＩＰＮナノ粒子溶液などのコロイド系の特性および相挙動を例示するために、リッチ相図を提供する。より詳細には、１００ｎｍ未満の流体力学半径を有する小さいＩＰＮナノ粒子の水性分散体は、室温（〜２１℃）から体温（〜３７℃）にナノ粒子を穏やかに加熱することによって、透明ナノ粒子ネットワークを形成することができる。この熱的に誘起される粘度変化、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイドロゲル形成によって、薬剤は液体形態のナノ粒子に混合され、液体を凝固させる化学的工程によって破壊されることなく、体温において固体ハイドロゲルに均一に分布されることが可能になる。さらに、固体ハイドロゲルは、薬剤の制御放出を可能にする。本発明はまた、ＩＰＮナノ粒子ビルディング・ブロックからなる軟性ナノクラスターを合成するための方法および組成物を含む。これに限定されるものではないが、ポリ（アクリル酸）／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）コア／シェル・ナノ粒子、ポリ（アクリル酸）／ヒドロキシプロピルセルロースコア／シェル・ナノ粒子、デキストラン／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）コア／シェル・マイクロ粒子、およびデキストラン／ヒドロキシプロピルセルロースコア／シェル・マイクロ粒子を含む、同様の逆熱可逆性ゲル化挙動を有する他のハイドロゲル・ナノ／マイクロ粒子分散体を設計する原理および製造する方法。
実施例
【００１８】
本発明、および本発明を実施することのできる様式をさらに例示するために、以下の実施例を提供する。しかしながら、実施例に記載される特定の詳細は、本発明を例示するために選択されたものにすぎず、本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。
【実施例１】
【００１９】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とポリ（アクリル酸）の相互貫入構造を有する単分散ＩＰＮナノ粒子を合成するための方法、技法、および装置を記載する。
【００２０】
１．１  材料：
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。硫酸ドデシル、ナトリウム塩９８％、過硫酸カリウム、アクリル酸９９％、およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド９９％を、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および過硫酸アンモニウムを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。試料調製用の水を蒸留し、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ装置で抵抗１８．２ＭΩに脱イオンし、０．２２μｍのフィルタを通して濾過し、粒子状物質を除去した。
【００２１】
１．２．ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルの調製：
マグネチック・スターラーと窒素供給装置を備えたフラスコでＮＩＰＡＭの重合［２０］を行った。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．８ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．０６６ｇ、およびドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）０．１５ｇを、１時間連続して攪拌しながら蒸留水２４０ｇに溶解した。この溶液を４０分間窒素パージし、その後７０℃の温浴に入れた。次いで、水２０ｍｌに溶解した過硫酸カリウム０．１６６ｇを添加して、エマルジョン重合を開始した。反応は窒素雰囲気下で４時間持続した。反応温度は（７０±０．５）℃に保持した。最終ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルの大きさは、異なる濃度の界面活性剤を添加することによって制御した。濃度が高いと、粒径は小さくなる。次のＩＰＮ合成ステップのために、ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルは２種の異なる大きさで調製した（流体力学半径Ｒｈは、それぞれ１２１ｎｍおよび１７０ｎｍである）。
【００２２】
すべてのＰＮＩＰＡＭ粒子を、室温で２週間、頻繁に交換する攪拌水に対して透析することによって精製した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７透析膜、ＭＷＣＯ１００００、ＶＷＲ）。最終ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルの濃度を、１．３５×１０−２ｇ／ｍｌに調整した。
【００２３】
１．３．ＩＰＮマイクロゲルの合成：
ＩＰＮマイクロゲルの調製は、上述のＰＮＩＰＡＭマイクロゲルをベースにして行った。ＰＮＩＰＡＭマイクロゲル溶液３５ｇを蒸留水で１０倍に希釈した。次いで、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．５ｇおよびアクリル酸２．３ｇを添加した。この溶液を１時間窒素ガスでバブリングした。開始剤（過硫酸アンモニウム０．２ｇ）および促進剤（ＴＥＭＥＤ０．２ｇ）を別々に水に溶解し、迅速に溶液に添加し、最終溶液体積を３７０ｍｌとした。反応は窒素雰囲気下で１２０分間持続し、温度は水浴で（２１±１）℃に適切に調整した。反応速度論の情報を収集するために、溶液１０ｍｌのアリコートを、反応開始から異なる時間に反応容器から採取した。すべてのアリコートを、さらなる動的光散乱分析のために透析した。得られたマイクロゲルは、ＰＮＩＰＡＭ−ＰＡＡｃコア／シェル構造ではなく、ＰＮＩＰＡＭ−ＰＡＡｃ相互貫入ポリマー・ネットワーク（ＩＰＮ）構造を有する。
【００２４】
１．４．濁度測定：
光学距離１ｃｍのクオーツ・セルを備えたＡｇｉｌｅｎｔ８４５３  ＵＶ／Ｖｉｓ分光計で吸収度の測定を行った（波長２００から１１００ｎｍ）。
【００２５】
１．５．ＩＰＮマイクロゲル形成の反応速度論：
図１に示したように、反応時間の関数として粒子の流体力学半径（Ｒｈ）を測定することによって、ＩＰＮ粒子形成の速度論を研究した。動的光散乱を分析するために、異なる反応時間に反応容器から溶液１０ｍｌのアリコートを取り、次いで透析によって精製し、蒸留水で最終的に５×１０−６ｇ／ｍｌに希釈した。この溶液の濃度はＰＮＩＰＡＭ固体含量に基づく。図１からわかるように、最初、シードとしてのＰＮＩＰＡＭマイクロゲルは２１℃で１２１ｎｍの平均流体力学半径を有する。Ｒｈの値は、最初の１時間はほとんど増加しないが、次の６０分で劇的に増加する。さらに１０分間反応させると沈殿が起こる。このデータは、方程式Ｒｈ＝１１９．１＋１．７７ｅｔ／τによって適切に説明され、式中、特性時間τ＝３１分である。反応温度が上昇するにつれ、粒子は速く成長する。
【００２６】
目視による観察によって、ＩＰＮ成長中、溶液が半透明から不鮮明な青色、白色に変わり、最終的に沈殿することが明らかとなった。図２に示したように、ＵＶ／Ｖｉｓ分光計を用いて時間に依存する濁度を測定することによって、この観察を定量化した。１３０分間の連続反応によって沈殿するため、反応は１２０分で停止した。
【００２７】
ＩＰＮの形成は、各ＰＮＩＰＡＭマイクロゲル内のアクリル酸の重合という点から理解することができる。ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルは、電解質効果のためにアクリル酸溶液でわずかに縮小するが、２１℃（ＬＣＳＴ（下部臨界完溶温度）未満）で充分に膨潤して、それらの内部にアクリル酸モノマーが拡散されることを可能にする。アクリル酸の−ＣＯＯＨ基とＰＮＩＰＡＭの−ＣＯＮＨ−基との相互作用は、単量体または二量体水素結合の形態で［１］、ＰＮＩＰＡＭネットワークの周囲に好ましいＰＡＡｃネットワークの成長をもたらす。ＰＮＩＰＡＭ骨格中の親水性ＰＡＡｃ濃度が徐々に上昇するにつれ、ＩＰＮ粒子はより多くの水を吸収することによってより膨潤する。後の反応は、はるかに多くの利用可能な未反応アクリル酸モノマーが存在するＩＰＮ粒子表面で主として起こり、粒径の速い成長をもたらした。したがって、この反応を通じて、粒子はＰＮＩＰＡＭからＩＰＮ、最終的にはＩＰＮ−ＰＡＡｃコア／シェルに構造が変化した。ＩＰＮ合成の機構を図２５に図式的に示す。ＩＰＮ形成および成長での水素結合の重要性を実証するために、相互貫入剤としてアクリル酸の代わりにアクリル酸ナトリウムを用いた。実際に、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法および動的光散乱によってモニターされた４時間以内の濁度にも粒径にも変化がないことが示された通り、水素結合を持たないＰＮＩＰＡＭ−アクリル酸ナトリウムはＩＰＮ構造を形成することができない。
【００２８】
１．６．２１℃でのＰＮＩＰＡＭとＩＰＮマイクロゲルの比較：
動的光散乱および静的光散乱を用いて、ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮマイクロゲルの特徴を明らかにし、それらを比較した。ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮナノ粒子を共に、ｐＨ値約６．５〜７．０を有する蒸留水で５．０×１０−６ｇ／ｍｌに希釈した。粒径および分布を図３に示すが、ここでＰＮＩＰＡＭマイクロゲルはＲｈ１２１ｎｍ前後の狭い範囲に分布し、ＩＰＮは２０２ｎｍ前後に分布する。ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮの算出された多分散性指数（ＰＤ．Ｉ）は、それぞれ１．０６８および１．０７である。ここでＰＤ．Ｉは、
【００２９】
【数１】
2007534644.tif 000003
として定義され、
【００３０】
【数２】
2007534644.tif 000004
であり、
【００３１】
【数３】
2007534644.tif 000005
である。粒径の増大と狭い分布は、ＰＡＡｃがＰＮＩＰＡＭ粒子に相互貫入し、ＩＰＮ合成中の新しいホモＰＡＡｃ粒子の形成は無視できることを実証している。
【００３２】
図４（ａ）は、試料濃度が２．５×１０−６ｇ／ｍｌから１．０×１０−５ｇ／ｍｌまで多様である、２５℃での純粋ＰＮＩＰＡＭ水溶液のジム・プロットを示す図である。ここで用いられる、屈折計によって測定されたｄｎ／ｄｃ値は０．１６６ｃｍ３／ｇである。Ｅｑ．１のＫＣ／Ｒｖｖ（ｑ）をゼロ角およびゼロ濃度に外挿することによって、モル質量ＭＷ、第２ビリアル係数Ａ２、および旋回半径＜Ｒｇ＞は、それぞれ８．１４×１０７ｇ／ｍｏｌ、８．９０×１０−５ｍｏｌ＊ｃｍ３／ｇ２、および９８ｎｍであると求められる。ＤＬＳ（動的光錯乱）とＳＬＳ（静的光散乱）の結果を組み合わせることによって、＜Ｒｇ＞／＜Ｒｈ＞の比は０．８０であることが見出され、これは一様な硬質球体の理論値（３／５）１／２に近い。水中の純粋ＰＮＩＰＡＭナノ粒子の密度（ρ）は、方程式４／３＊πＲｈ３ρ＝ＭＷ／ＮＡを用いて、水中２５℃で約１．８２×１０−２ｇ／ｃｍ３であると推定され、ここでＲｈおよびＭＷはそれぞれＤＬＳおよびＳＬＳから得られ、ＮＡはアボガドロ数である。
【００３３】
図４（ｂ）に示したように、水中ＩＰＮマイクロゲルの静的光散乱のジム・プロットから、モル質量ＭＷ、旋回半径＜Ｒｇ＞、および第２ビリアル係数Ａ２は、それぞれ２．３４×１０８ｇ／ｍｏｌ、１４４ｎｍ、および９．５０×１０−５ｃｍ３／ｇ２である。ここで用いられるｄｎ／ｄｃ値は０．１０２ｃｍ３／ｇである。ＩＰＮのＡ２値の増大は、中性ｐＨ環境下でＩＰＮがＰＮＩＰＡＭ前駆体より親水性であることを示す。結果として、ＩＰＮはＰＮＩＰＡＭより多くの水を含有する。ＤＬＳとＳＬＳの結果を組み合わせることによって、得られた＜Ｒｇ＞／＜Ｒｈ＞の比は０．７１であった。ポリマーは一様に分布されることが示唆される。このＩＰＮの平均密度（ρ）は、水中２５℃で約１．１３×１０−２ｇ／ｃｍ３であると推定される。ＰＮＩＰＡＭとＩＰＮマイクロゲルの詳細な比較を図２６に示す（表１）。
【００３４】
各ＩＰＮマイクロゲルのＰＡＡｃとＰＮＩＰＡＭの重量比は、ＩＰＮ（ＭＷ２．３４×１０８ｇ／ｍｏｌ）とＰＮＩＰＡＭ（８．１４×１０７ｇ／ｍｏｌ）のモル重量比を算出することにより、１．８８：１であると求められる。この値は、蒸発法によって測定された１．８２：１に非常に近い。反応がさらに長く持続した場合、重量比は相応して増大する。
【００３５】
１．７．温度によって誘起される体積相転移および熱増粘性：
図５に示したように、ＩＰＮマイクロゲルは、ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルと同じ３４℃で体積相転移を起こす。ランダムに共重合したＰＡＡｃ／ＰＮＩＰＡＭゲルでは、体積相転移温度は、ＰＡＡｃ濃度に伴って上昇する［８］。体積転移温度未満および温度超でのＩＰＮの体積変化は、ＰＮＩＰＡＭより小さい。これは、ＩＰＮ中のＰＡＡｃネットワークは温度変化に感受性ではなく、ＰＮＩＰＡＭネットワークの縮小を低減できるためである。
【００３６】
希薄ＩＰＮおよびＰＮＩＰＡＭ溶液（５．０×１０−６ｇ／ｍｌ）では、粒子間の相互作用は無視できる。しかしながら、ポリマー濃度が上昇するにつれ、粒子間の相互作用は重要な役割を果たし、温度変化につれて粘度を変化させる。具体的には、ポリマー濃度２．５％ｇ／ｍｌを有する半希薄ＩＰＮ水溶液が、ｐＨ５超で逆熱可逆性ゲル化を示すことが見出される。すなわち、系がゲル化温度Ｔｇ＝３４℃超に加熱されると、系は低粘性流体からゲルに変換する。この挙動は完全に可逆性である。図６は、室温（左）と４０℃（右）のＩＰＮ半希薄溶液の比較を示す。ＩＰＮマトリクス中のＰＮＩＰＡＭは、温度依存性粒子間ポテンシャルによって粒子間の物理的架橋結合を提供し［２５］、ＩＰＮ中のＰＡＡｃは中性ｐＨにおいて、温度非依存性であり、粒子の凝集体への崩壊を防ぐイオン電荷を提供する。メチルセルロース［１６］、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）トリブロックコポリマー［１７］、ＰＮＩＰＡＭ−ＰＡＡｃコポリマー［１８］、および分解性トリブロックコポリマー［１９］などの、逆熱可逆性ゲル化性を有するポリマー溶液と対照的に、この系の粒子は、秩序構造に自己集合して、ブラッグ回折による色を示すことができる［２６］。
【００３７】
１．８．ｐＨに誘起される体積相転移：
ＩＰＮマイクロゲルは、ＰＡＡｃの寄与により、ｐＨ感受性を有する。２１℃でのポリマー濃度５．０×１０−６ｇ／ｍｌを有するＩＰＮおよびＰＮＩＰＡＭマイクロゲルのＲｈ値を、ｐＨの関数として図７に示す。ｐＨ値は、溶液に塩酸または水酸化ナトリウムを添加することによって調整した。図７に示したように、ｐＨが５から４に低下するとき、ＩＰＮマイクロゲルのＲｈは２００ｎｍから１６５ｎｍに急激に減少する。ｐＨ５〜１０の範囲では、一定の散乱光強度によって実証される通り、凝集することなくＲｈは２００ｎｍ前後である。ｐＨがそのｐＫａ４．７を超えるとき、ＰＡＡｃはイオン状態であり、親水性である。しかしながら、ｐＨ＜４．７では、ＰＡＡｃは分子状態であり、疎水性となり、ネットワークから水をはじく。このため低いｐＨ値でＩＰＮは縮小する。ｐＨに誘起されるＩＰＮ縮小の程度は、温度に誘起されるＩＰＮ縮小の程度とほぼ同じであり、共に２００ｎｍから約１６０ｎｍであることに留意されたい。予期される通り、ｐＨ４〜１０の範囲では、ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルの粒径の変動は観察されない。ｐＨ＝２において、電解質効果のために、わずかな低下が起こる可能性がある。ｐＨ４と７でのＩＰＮマイクロゲルの粒径分布の比較を図８に示す。ｐＨ４および７でのＩＰＮマイクロゲルのＰＤ．Ｉは、それぞれ１．０２および１．０７である。ｐＨ４での縮小後、ＩＰＮは狭い粒径分布を有することが示される。
【実施例２】
【００３８】
２．半希薄ＩＰＮナノ粒子水溶液の相図：
ＩＰＮナノ粒子の水溶液は、目視検査、濁度および粘度測定の組合せによって求め、図９（ａ）に示したようにリッチ相挙動を示す。図９（ｂ）に示したように、相挙動は、典型的な視覚的外観を有する６つの領域に分割された。低いポリマー濃度では（＜２．２×１０−２ｇ／ｍｌ、領域Ａ）、ＩＰＮ分散体は半透明に見え、容易に流動する。ＩＰＮナノ粒子は、充分に膨潤している。温度が上昇すると、粒径は縮小し、分散体は相分離領域に入る（領域Ｂ）。中間のポリマー濃度範囲では（２．２から３．０×１０−２ｇ／ｍｌ、領域Ｃ）、ＩＰＮ分散体は室温でコロイド結晶流体である。これらの結晶は、ブラッグ回折による玉虫色模様のため、容易に観察される［２７］。２層膜周期構造による可視光のブラッグ回折に起因する玉虫色についても前に報告されている［２８］。ブラッグ条件、２ｎｄｓｉｎθ＝ｍλが満たされる場合、建設的干渉が起こるが、ここでｄ、θ、ｎ、λ、およびｍは、それぞれ格子間隔、回折角、ゲル媒質の屈折率、真空中の光の波長、および整数である。高いポリマー濃度範囲では（３．０×１０−２から４．０×１０−２ｇ／ｍｌ、領域Ｄ）、ＩＰＮ分散体は、粘性流体であり、短距離秩序のために均一な色を示すコロイドガラス流体である［２６］。非常に高いポリマー濃度では（＞４×１０−２ｇ／ｍｌ、領域Ｄ）、室温において、ＩＰＮ分散体はコロイドゲルになる。より高温では、ゲルは白色および不透明になる（領域Ｆ）。
【００３９】
この逆熱可逆性ゲル化は、２．５×１０−２ｇ／ｍｌ超の広範なポリマー濃度で起こる。すなわち、系がゲル化温度Ｔｇ超に加熱されるとき、系は低粘性流体からゲルに変換する。この挙動は完全に可逆性である。
【００４０】
Ｔ＞ＴｇでのＩＰＮ分散体のゲル化は、粒子間の引力相互作用によって起こる可能性がある。室温では、ＰＮＩＰＡＭ粒子は膨潤状態であり、９７体積％の水を含有する。コロイド粒子間のファン・デル・ワールス引力は、粒子と水のＨａｍａｋｅｒ定数が近似しているため無視できる［２９］。低減浸透第２ビリアル係数は体積転移温度で急激な変化を示し、それ以上でマイナスとなる。熱力学的計算は、２４℃から３６℃に温度が変化するにつれ、ナノ粒子間の低減相互作用ポテンシャル・エネルギーが６桁を超えて増大し、３４℃の体積転移温度近くでもっとも急激に増大することを示唆している［２９］。ゲル化は、ＩＰＮ粒子中のＰＮＩＰＡＭネットワーク間のファン・デル・ワールス相互作用とＰＡＡｃネットワークのイオン反発とのバランスによって達成される可能性がある。温度依存性粒子間ポテンシャルも、ＰＮＩＰＡＭ誘導体のコロイド系における可逆性または非可逆性凝集体の形成に関与することに留意されたい［１０］。Ｔ＞ＴｇでＩＰＮナノ粒子をネットワークに結合する引力の正確な起源を確定するための、より説得力のある証拠が必要とされている。
【実施例３】
【００４１】
３．ｉｎ  ｓｉｔｕ物理的架橋ＩＰＮナノ粒子ネットワークからの薬剤制御送達。
【００４２】
３．１．ＩＰＮナノ粒子ネットワークからの薬剤充填および放出：
ＩＰＮナノ粒子半希薄水性分散体０．５ｇを４０００ｐｐｍデキストラン溶液０．０２５ｇと混合し、室温で５分間、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｖｅｒｔｅｘで振とうした。バイアル容器を３７℃の温浴に入れると、この試料はすぐにゲル化した。このゲルは、針の長い注射器によってバイアルから押し出した後、その形状を保持した。２０ｍｌのスクリューキャップ・ガラスバイアルで、薬剤放出の研究を行った。薬剤充填ゲルをそれぞれ個別のバイアルに入れ、そこに３７℃でリン酸緩衝食塩水（ｐＨ＝７．４）１０ｍｌを添加した。様々な時間間隔でバイアルから溶液０．５ｍｌを採取し、放出された薬剤を紫外線可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３）で求めた。各測定後に試料溶液を戻すことによって、バイアル中の放出媒質の量を常に維持した。
【００４３】
３．２．ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮナノ粒子の特徴：
動的光散乱の特徴を明らかにするために、ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮ試料を共に蒸留水で５．０×１０−５ｇ／ｍｌに希釈し、ｐＨを約６．５〜７．５に調整した。ＩＰＮナノ粒子およびそれらの前駆体ＰＮＩＰＡＭナノ粒子の粒径分布を図１０に示す。図１０（ａ）において、ＰＮＩＰＡＭナノ粒子はＲｈ１２５ｎｍ前後の狭い範囲に分布し、ＩＰＮは１５５ｎｍ前後の狭い範囲に分布した。ＰＮＩＰＡＭ１２０およびＩＰＮ１５５の算出された多分散性（ＰＤ．Ｉ）は、それぞれ１．０３および１．０７であった。各ＩＰＮナノ粒子のＰＮＩＰＡＭとＰＡＡｃの重量比は、蒸発法を用いて、１：０．５０であると求められる。小さいＰＮＩＰＡＭナノ粒子をベースにして小さいＩＰＮナノ粒子を合成し、それらの粒径分布を図１０（ｂ）に示すが、ここでＰＮＩＰＡＭナノ粒子はＲｈ９０ｎｍ前後の狭い範囲に分布し、ＩＰＮは１１０ｎｍ前後に分布した。ＰＮＩＰＡＭ９０およびＩＰＮ１１０の算出された多分散性（ＰＤ．Ｉ）は、１．０５および１．０８であった。ＩＰＮ１１０とＩＰＮ１５５の詳細な比較を図２７（表２）に示す。
【００４４】
ポリマー濃度１．０×１０−５ｇ／ｍｌを有する希薄溶液中のＩＰＮおよびＰＮＩＰＡＭナノ粒子の流体力学半径（Ｒｈ）の変動を動的光散乱によって測定した。図１１に示したように、それらのナノ粒子は、約３４℃の同じ体積相転移温度で大幅な体積変化を起こす。具体的には、ＰＮＩＰＡＭナノ粒子のＲｈは、３４℃で１２５ｎｍから４５ｎｍに６４％縮小し、ＩＰＮナノ粒子のＲｈ値は、１５５ｎｍから１１７ｎｍに２４％のみ減少した。ＩＰＮ形成は、各ＰＮＩＰＡＭマイクロゲル内のアクリル酸の重合という点から理解することができる［３０〜３１］。ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルは、電解質効果のためにアクリル酸溶液でわずかに縮小するが、２１℃（ＬＣＳＴ未満）で充分に膨潤して、それらの内部にアクリル酸モノマーが拡散されることを可能にする。アクリル酸の−ＣＯＯＨ基とＰＮＩＰＡＭの−ＣＯＮＨ−基との相互作用は、単量体または二量体水素結合の形態で［３２］、ＰＮＩＰＡＭネットワークの周囲に好ましいＰＡＡｃネットワークの成長をもたらす。ＰＮＩＰＡＭ骨格中の親水性ＰＡＡｃ濃度が徐々に上昇するにつれ、ＩＰＮ粒子はより多くの水を吸収することによってより膨潤する。
【００４５】
３．３．ＩＰＮナノ粒子の水性分散体のレオロジー特性：
粘度（η）は、材料の変形に対する内部抵抗を表す流体特性であり、剪断応力（τ）と剪断速度（γ）の比、すなわちη＝τ／γとして定義される。ここでＩＰＮナノ粒子の水性分散体の温度依存性粘度を、種々のポリマー濃度において研究した。粘度は、剪断速度１００ｒｐｍでブルックフィールド粘度計を用いて測定した。ＩＰＮおよびＰＮＩＰＡＭマイクロゲル分散体の粘度に対する加熱速度の影響を調べるために、１から５℃／５分まで変化する種々の加熱速度を３．２７％のＩＰＮおよびＰＮＩＰＡＭ試料に適用した。得られた種々の粘度曲線は完全に重なった。これは会合事象がかなり急速であり、速度効果の可能性が低いことを示唆している。以下の実施例には、２℃／５分の中間加熱速度値を用いた。
【００４６】
図１２に示したように、１．２７から３．２７重量％のポリマー濃度を有する一連のＩＰＮ１５５ナノ粒子水分散体から粘度を測定した。臨界温度（Ｔｃ）約〜３３℃に到達する前、すべての試料の粘度は温度の上昇によって連続的な低下を示す。この粘度低下は、ナノ粒子体積の縮小に起因するものである。しかしながら、粘度曲線は、それぞれ５．２５、３．２７、３．０％、２．５％、１．９７、および１．２７重量％のポリマー濃度を有するＩＰＮ１５５ナノ粒子溶液に関して７．８５、６．８７、６．０２、３．９３、２．４３、および１．４４ｃｐの顕著な粘度最小値を示した後、Ｔｃで上昇に転じた。ＰＡＡｃ−ｇ−ＰＮＩＰＡＭのグラフト・コポリマー、および他の熱増粘系とは対照的に［３３］、この半希薄ＩＰＮマイクロゲル水性分散体では、粘度は段階的な上昇ではなく、かなり急激に上昇した。
【００４７】
低いポリマー濃度（Ｃ＜２．５×１０−２ｇ／ｍｌ）を有するＩＰＮ分散体は、ゲル化することなく、粘度上昇を示す。より高いポリマー濃度を有する分散体の場合、粘度は大幅に上昇し、粘度計の測定範囲を超えて急上昇した。目視検査によって、試験管の分散体は物理的にゲル化し、管を逆さまに置いても流動できないことが明らかとなった。このゲル化は、ナノ粒子間の引力相互作用によるものであり、各ＩＰＮナノ粒子中のＰＮＩＰＡＭは、温度依存性粒子間ポテンシャルによって粒子間の物理的架橋結合を提供し、各ＩＰＮ粒子中のＰＡＡｃは中性ｐＨにおいて、温度非依存性であり、粒子の凝集体への崩壊を防ぐイオン電荷を提供する。
【００４８】
３．４．ＩＰＮナノ粒子ネットワークからの薬剤放出：
種々の分子量のデキストラン・マーカーをモデル高分子薬剤として用い、ＩＰＮナノ粒子分散体と混合した。室温で、分散体は粘性流体であり、完全にデキストラン溶液と混合することができる。次いで、この薬剤−溶液混合物を３７℃に加熱したが、この時点で分散体はゲルとなった。次いで、このゲルを管から取り出し、３７℃でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浸漬した。
【００４９】
図１３に示したように、粒径１５５ｎｍおよびポリマー濃度５．２５重量％を有するＩＰＮ１５５ゲルからの蓄積薬剤放出を、紫外線可視分光光度計を用いて、時間の関数として測定した。小さい分子量を有する分子は、高い分子量の分子に比べて、速く拡散することが明らかである。放出速度は、それらの分子量の順に５００Ｋおよび２Ｍの薬剤類似体では徐々に減速した。ここで薬剤分子はＩＰＮナノ粒子間に封入されており、２Ｍという非常に大きい分子量の分子の放出を可能にした。放出実験に用いたポリマー濃度は、ポリマー溶液系に用いられる濃度の約４分の１であることに留意されたい［３４］。
【００５０】
薬剤放出速度に対するナノ粒子の大きさの影響を調べた。図１４に示したように、上述の実験と同じ手順に従って、より小さい粒径を有するが（１５５ｎｍではなく１１０ｎｍ）、同じポリマー濃度を有する（５．２５重量％）ＩＰＮゲルの放出プロファイルを測定した。図１３と１４を比較することによって、１５５ｎｍから１１０ｎｍへの粒径の減少は、５００Ｋより小さい分子量を有する分子の放出には著しい影響を与えないが、ブルー・デキストランなどの大きい分子量を有する分子には影響を及ぼすことがわかる。放出薬剤が１０ｐｐｍの総充填量の６０％に到達する時間を特性時間（τ）として用い、小さい粒径のナノ粒子ゲルが大きい分子（２Ｍブルー・デキストラン）の放出に影響を与えることが見出された。ＩＰＮ１１０ゲルはτ＝４０００分、ＩＰＮ１５５ゲルはτ＝１３００分。ＩＰＮ１１０ゲルの遅い放出は、ＩＰＮ１５５ゲルと比較して粒子間隔が小さいためである。
【００５１】
ＩＰＮ濃度がどのように薬剤放出速度に影響を与えるのか調べるために、図１５に示したように、それぞれ３．２９重量％および５．２５重量％ＩＰＮ１５５ナノ粒子溶液によって形成されたナノ粒子ネットワークからのブルー・デキストランの放出を比較した。ここでも放出薬剤が１０ｐｐｍの総充填量の６０％に到達する時間を特性時間（τ）として用い、３．２９重量％ゲルはτ＝２００分、５．２５重量％ゲルはτ＝１３００分であった。これはビルディング・ブロックとして利用可能なナノ粒子が少ないため、３．２９重量％ナノ粒子ネットワークでは大きいポアが形成されることに起因する。したがって、ブルー・デキストランの大部分はそのような大きいポアに封入され、放出速度は速くなる。ＩＰＮナノ粒子ネットワークの形成中に２種のポアが作られる可能性があり、図１６ａに示したように、一方は大型で、多くのナノ粒子に包囲されており、他方は小型で、密集した最近傍粒子に包囲されている。大型のポアの大きさは、周囲の粒子の数によって決定される。ポリマー濃度が減少すると、大型ポアの大きさと数の両方が増大する。それに対して、小型のポアの大きさは、粒径によってのみ決定され、球状ビルディング・ブロックが大きければ、粒子間ポアは大きくなる。初期の急激な放出は大型ポアに封入された薬剤によるものであり、後の緩慢な放出は小型ポアに封入された薬剤によるものである。３７℃で充填薬剤の６０％がＩＰＮマイクロゲル・ネットワークから放出されるのに要する特性時間（τ）を図２８（表３）に示す。「ポア」の電子的または光学的画像は得られていないが、図１６の概略図は薬剤放出プロファイルの理解に基づくものである。
【００５２】
そのような粒子間ポアの大きさを低減するストラテジーの１つは、小さいナノ粒子を用いて、大きいナノ粒子によって作られた粒子間ポアを埋めることである。このアプローチの有効性を試験するために、重量比１：１のＩＰＮ１５５とＩＰＮ１１０溶液の混合物を調製し、ＩＰＮの総濃度を５．２５重量％に保持した。ＩＰＮ１５５／ＩＰＮ１１０混合ナノ粒子ネットワークからのブルー・デキストランの放出プロファイルを、ＩＰＮ１５５ナノ粒子ネットワークからの放出と比較する。ＩＰＮ１５５／ＩＰＮ１１０ゲルの放出薬剤が総充填量の６０％に到達する特性時間は、ＩＰＮ１５５ゲルで要する１３００分よりはるかに長く、約４６００分である。図１５に記載したものと同じ実験を分子量５００Ｋのデキストランでも繰り返した。図１７に示したように、同様の結果が得られた。これは大きい粒子のネットワークのポアを埋めるために小さい粒子を用いることが、放出速度を低減する有効な方法であることを示唆している（図１６ｂ）。
【００５３】
モデルタンパク薬剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もＩＰＮナノ粒子ネットワークに充填した。図１８に示したように、より高いポリマー濃度（８重量％）のネットワーク、およびより小さい粒径のナノ粒子（Ｒｈ＝７５ｎｍ）を用いることによって、緩慢な放出速度が達成された。熱応答性ゲルの薬剤分配および膨潤挙動は以前に研究されている［２０、３５〜３６］。これらの研究を本系に拡大するのは興味深い実験となるであろう。
【実施例４】
【００５４】
４．ＩＰＮナノ粒子ビルディング・ブロックからなる軟性ナノクラスターの合成。
【００５５】
４．１．ナノクラスターの合成：
最初に、１．３．に記載の通りＩＰＮナノ粒子を調製したが、ここで第２ステップの相互貫入反応温度を、水浴を用いて２３℃に調整した。動的光散乱によって測定された、中性ｐＨ環境で得られるＩＰＮマイクロゲルのＲｈは１５５ｎｍである。次いで、このＩＰＮマイクロゲルを透析および超遠心分離で処理し、最終ポリマー含量を２．９０重量％に調整した。円筒試験バイアルにおいて、このＩＰＮ溶液０．１ｇを蒸留水で１０ｍｌに希釈した。架橋剤として、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）０．０１ｇおよびアジピン酸ジヒドラジド０．０１ｇを水１０ｍｌに溶解し、ＩＰＮ溶液に添加した。次いで、この混合溶液を（４４±１）℃の温浴に入れた。最初から３０分が経過した後、沈殿が生じるまで、５分毎に０．１ｍｌのアリコートを試験バイアルから採取した。
【００５６】
４．２．ナノクラスター形成の反応速度論：
１．７．に例示したように、ＰＡＡｃおよび熱感受性ＰＮＩＰＡからなるＩＰＮマイクロゲルの半希薄溶液（２．５重量％以上）は強い粒子間疎水相互作用を示し、溶液を３４℃超に加熱したとき、物理的に結合されたナノ粒子ネットワークを可逆的に形成することができた。同様に、温度を上昇させると、希薄溶液ではＩＰＮマイクロゲル間のさらに強い相互作用およびさらに高頻度の衝突が予期される。この研究では、一定数のＩＰＮマイクロゲルが、ＩＰＮナノ粒子衝突の過程で、ＰＡＡｃのカルボキシル基を介して化学的に結合する。反応時間の関数として粒子の流体力学半径（Ｒｈ）を測定することによって、ナノクラスター形成の速度論を研究した。ここで動的光散乱を分析するために、異なる反応時間に反応容器から溶液０．１ｍｌのアリコートを取り、蒸留水で５×１０−６ｇ／ｍｌに希釈した。図１９に示したように、ＩＰＮマイクロゲルは、反応前２１℃で１５５ｎｍの平均Ｒｈを有する。粒子間の架橋は、４４℃で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）およびアジピン酸ジヒドラジドを添加することによって開始された。粒径は、最初の３０分ではほとんど増加しないが、次の３０分で劇的に増加することがわかる。さらに１０分間反応させると沈殿が起こる。このデータは、方程式Ｒｈ＝１５５＋６．３８ｅｔ／τによって適切に説明され、式中、特性時間τ＝１２分である。目視による観察によって、ナノクラスター成長中、溶液が不鮮明な青色から白色に変わり、最終的に沈殿することが明らかとなった。温度の影響を調べるために、同じ反応を２３℃で行った。１週間を超える間、粒径の変化は観察されず、これは強い粒子間相互作用と頻発する衝突がこの種のナノクラスター形成の予備的条件であることを示している。
【００５７】
ＩＰＮマイクロゲル間の架橋機序を図２０に概略的に示すが、ここで１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジドは、カルボキシル基に対して一般に用いられる架橋試薬である［ＣａｒｂｏｄｉｉＧｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ］。ＥＤＣのＮ−置換カルボジイミド（ｂ）は、ＩＰＮマイクロゲルのカルボン酸（ａ）と反応して、極めて短寿命である非常に反応性の高いＯ−アシルイソ尿素誘導体（ｃ）を形成することができる。次いで、この活性種を、アジピン酸ジヒドラジドの２末端第一級アミン（ｄ）と反応させて、化学的に架橋している隣接ＩＰＮマイクロゲルを得る（ｅ）。制御可能な様式で単分散ナノ−ザクロ体（ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ）を製造するために、ビルディング・ブロックＩＰＮマイクロゲルを希薄溶液に分散して、大きなＩＰＮマイクロゲル凝集体またはネットワークの形成を回避することが必要である。他方、反応開始時には、強い粒子−粒子相互作用が望ましい。希薄条件において、ＩＰＮマイクロゲル間の相互作用は室温で非常に弱く、反応は観察されなかった。温度を４４℃に（ＰＮＩＰＡのＬＣＳＴより高く）上昇させると、各ＩＰＮマイクロゲルにおけるＰＮＩＰＡの相転移によって、より強い粒子間引力が存在する。大量のカルボキシル基、および希薄溶液中で充分に分離したＩＰＮマイクロゲル間距離、ならびにＩＰＮマイクロゲルの温度に対する感受性によって、ナノクラスターの制御可能な様式での成長が可能になる。
【００５８】
４．３．２１℃でのＩＰＮマイクロゲルとナノクラスターの比較：
動的光散乱および静的光散乱によって、ナノクラスターの特徴を明らかにし、前に研究したそれらのビルディング・ブロックＩＰＮ粒子と比較した。ナノクラスターおよびＩＰＮナノ粒子を共に、ｐＨ値約６．５〜７．０を有する蒸留水で５．０×１０−６ｇ／ｍｌに希釈した。粒径および分布を図２１に示すが、ここでＩＰＮマイクロゲルはＲｈ１５５ｎｍ前後の狭い範囲に分布する。Ｃｌｕｓｔｅｒ２およびＣｌｕｓｔｅｒ３は、ＩＰＮマイクロゲルのダイマーおよびトリプレットを指し、これらはそれぞれ粒子−粒子架橋を３３分間および３７分間続けることによって合成された。粒子流体力学半径Ｒｈとそれらの分子量ＭＷの関係によれば、４／３＊πＲｈ３ρ＝ＭＷ／ＮＡ、１５５ｎｍＩＰＮ粒子のダイマーは、約１５５×２１／３＝１９５ｎｍのＲｈを有するはずであり、トリプレットは、約１５５×３１／３＝２２３ｎｍのＲｈを有するはずである。図２１において、Ｃｌｕｓｔｅｒ２およびＣｌｕｓｔｅｒ３は、それぞれ１９５ｎｍおよび２３５ｎｍのＲｈを有し、それらがＩＰＮマイクロゲルのダイマーおよびトリプレットであると統計的に考えることは理にかなっている。ＩＰＮ、Ｃｌｕｓｔｅｒ２、およびＣｌｕｓｔｅｒ３の算出された多分散性指数（ＰＤ．Ｉ）は、すべて１．０７である。粒径の増大およびそれらの狭い分布によって、ナノクラスターが制御可能な様式で成長していることが実証される。
【００５９】
図２２は、試料濃度が２．５×１０−６ｇ／ｍｌから７．５×１０−６ｇ／ｍｌまで多様である、２１℃での純粋Ｃｌｕｓｔｅｒ３水溶液のジム・プロットを示す図である。ここで用いられる、屈折計によって測定されたｄｎ／ｄｃ値は０．１０２ｃｍ３／ｇである。Ｅｑ．１のＫＣ／Ｒｖｖ（ｑ）をゼロ角およびゼロ濃度に外挿することによって、モル質量ＭＷ、および旋回半径＜Ｒｇ＞は、それぞれ９．３×１０９ｇ／ｍｏｌ、１７８ｎｍであると求められる。ＤＬＳ（動的光錯乱）とＳＬＳ（静的光散乱）の結果を組み合わせることによって、＜Ｒｇ＞／＜Ｒｈ＞の比は０．７５であることが見出され、これは一様な硬質球体の理論値（３／５）１／２に近い。水中のＣｌｕｓｔｅｒ３の密度（ρ）は、方程式４／３＊πＲｈ３ρ＝ＭＷ／ＮＡを用いて、水中２５℃で約１．３６×１０−２ｇ／ｃｍ３であると推定され、ここでＲｈおよびＭＷはそれぞれＤＬＳおよびＳＬＳから得られ、ＮＡはアボガドロ数である。Ｃｌｕｓｔｅｒ３とＩＰＮマイクロゲルの詳細な比較を図２９（表４）に示すが、ここで分子量および粒径Ｒｈは共に、Ｃｌｕｓｔｅｒ３がＩＰＮマイクロゲルのトリプレットであることを実証している。反応がさらに長く持続した場合、ザクロ体の重量はそれに応じて増加し、Ｃｌｕｓｔｅｒ４、５などとなり、最終的には図２３に示したように、マイクロメートル・スケールの沈殿となる。
【００６０】
４．４．温度に誘起される体積相転移：
このナノクラスターは３３℃で体積相転移を起こし、これはＩＰＮマイクロゲルと同じである。Ｃｌｕｓｔｅｒ３およびそのビルディング・ブロック１５５ｎｍＩＰＮマイクロゲルの体積変化を温度の関数として図６に示す。図６は白黒図で示したものであり、ポリマー濃度２．５×１０−２ｇ／ｍｌを有するＩＰＮ半希薄水溶液の粘度変化を示している。〜３４℃未満では、分散体は流体であり、〜３４℃超で、分散体は固体となる。分散体の色は、水中のコロイド粒子秩序配列からのブラッグ回折によるものである。温度を上昇させると、ＩＰＮマイクロゲルのＲｈは、１５５ｎｍから１１７ｎｍに約２４％縮小し、Ｃｌｕｓｔｅｒ３は、２３５ｎｍから１２９ｎｍに約４５％縮小する。Ｃｌｕｓｔｅｒ３の向上した脱膨潤能力は、トリプレットの崩壊力は個々のＩＰＮマイクロゲルの縮小だけでなく、ナノクラスター内部のより強い粒子間ＰＮＩＰＡ崩壊にもかかわることを示している。カルボキシル基の大部分は架橋中に消費されるため、Ｃｌｕｓｔｅｒ３粒子の明らかなｐＨ感受性は観察されない。
【００６１】
同様の逆熱可逆性ゲル化挙動を有する他のハイドロゲル・ナノ／マイクロ粒子分散体を設計する原理および製造する方法は、当業者には明らかであろう。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して述べたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、方法、時間、および方法の段階または段階順序に変形例を適用できることは、当業者には明らかであろう。より詳細には、化学的および生理学的に関連するある種の物質を本明細書に記載の物質の代わりに用いることができ、同じかまたは同様の結果が得られることは明らかであろう。本明細書に記載の方法の産業的規模への拡大は本発明の精神および範囲内であると理解される。そのような類似の代替および変更は、当業者には、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
引用文献
【００６２】
以下の文献は、本明細書に記載の詳細を補う典型的な手順または他の詳細を提供する限り、参照により特に本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＩＰＮマイクロゲル形成中の時間に依存する粒子流体力学半径（「Ｒｈ」）を示す図である。ここでは動的光散乱を分析するために、異なる反応時間に反応容器から溶液１０ｍｌのアリコートを取った。すべての試料は、ＰＮＩＰＡＭ固体含量に対して５．０×１０−６ｇ／ｍｌの同じポリマー濃度を有する。ｐＨ値は、６．５から７．０に調整した。
【図２】ＵＶ／Ｖｉｓ（紫外線可視）分光計によって測定された、ＩＰＮマイクロゲル形成中の反応溶液の濁度変化を示す図である。ここでは異なる反応時間に反応容器から溶液１０ｍｌのアリコートを取ったが、各試料のＰＮＩＰＡＭ濃度は１．２７×１０−３ｇ／ｍｌである。吸収波長は、２９０ｎｍから５００ｎｍの範囲である。
【図３】動的光散乱によって測定された、２１℃でのＩＰＮマイクロゲルおよびその前駆体ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルの粒径分布を示す図である。散乱角は９０°である。
【図４】２１℃での（ａ）ＰＮＩＰＡＭマイクロゲルおよび（ｂ）ＩＰＮマイクロゲルの静的光散乱のジム（Ｚｉｍｍ）プロットを示す図である。ポリマー濃度は共に２．５×１０−６ｇ／ｍｌから１．０×１０−５ｇ／ｍｌまで多様である。
【図５】ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮマイクロゲルの温度に誘起される体積相転移を示す図である。これらは共に同じ体積相転移温度を示す。
【図６】ポリマー濃度２．５×１０−２ｇ／ｍｌを有するＩＰＮ半希薄水溶液の粘度変化を示す白黒の例示図である。〜３４℃未満で分散体は流体であり、〜３４℃超で分散体は固体となる。
【図７】ＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮマイクロゲルのｐＨに誘起される体積相転移を示す図である。
【図８】異なるｐＨ環境におけるＩＰＮマイクロゲルの粒径分布を示す図である。
【図９】水中のＰＮＩＰＡＭ−ＰＡＡｃＩＰＮナノ粒子の相挙動を示す図である。パネルＡ：温度−濃度相図。６つの領域があり、（Ａ）均一コロイド流体、（Ｂ）相分離コロイド流体、（Ｃ）コロイド結晶相、（Ｄ）コロイドガラス、（Ｅ）コロイドゲル、および（Ｆ）相分離コロイドゲルである。パネルＢ：各相の代表的な白黒写真を示すものであり、（Ａ）１．０重量％、２１℃、（Ｂ）１．０重量％、３６℃、（Ｃ）２．５重量％、２１℃、（Ｄ）３．５重量％、２１℃、（Ｅ）４．５重量％、２１℃、および（Ｆ）４．５重量％、３６℃である。２０℃でのＰＮＩＰＡＭおよびＩＰＮ粒子の流体力学半径はそれぞれ１２５ｎｍおよび１５５ｎｍであり、これらを図９〜１０に用い、ここで蒸発法および静的光散乱によって求められたＩＰＮ粒子内のＰＮＩＰＡとＰＡＡｃの重量比は２：１である。
【図１０】動的光散乱法によって測定された、２３℃水中でのＩＰＮナノ粒子およびそれらの前駆体ＰＮＩＰＡＭナノ粒子の流体力学半径分布を示す図である。（ａ）ＩＰＮ１５５およびＰＮＩＰＡＭ１２５ナノ粒子。（ｂ）ＩＰＮ１１０およびＰＮＩＰＡＭ９０ナノ粒子。両方の分散体のポリマー濃度およびｐＨを、それぞれ５．０×１０−５ｇ／ｍｌおよび約６．５〜７．５に調整した。
【図１１】水中のＰＮＩＰＡＭ１２５ナノ粒子およびＩＰＮ１５５ナノ粒子の温度依存性粒径を示す図である。両方の分散体のポリマー濃度は、１．０×１０−５ｇ／ｍｌである。点線は体積相転移温度を示し、これは両方の分散体とも同じである。
【図１２】異なるポリマー濃度、５．２５重量％、３．２７重量％、３．０重量％、２．５重量％、１．９７重量％、および１．２７重量％でのＩＰＮ１５５ナノ粒子水性分散体の温度依存性粘度を示す図である。点線は、粘度計の粘度の最大目盛りである。
【図１３】３７℃、ｐＨ７．４における５０ｍＭリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）中の５．２５重量％ＩＰＮ１５５ナノ粒子ネットワークからの薬剤放出プロファイルを示す図である。異なる分子量、４０Ｋ、７０Ｋ、５００Ｋ、および２Ｍを有するデキストラン・マーカーを、モデル高分子薬剤として用いた。蒸発法で求めた、各ＩＰＮナノ粒子のＰＮＩＰＡＭとＰＡＡｃの重量比は１：０．５０である。
【図１４】３７℃、ｐＨ７．４における５０ｍＭリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）中の５．２５重量％ＩＰＮ１１０ナノ粒子ネットワークからの薬剤放出プロファイルを示す図である。異なる分子量、４０Ｋ、７０Ｋ、５００Ｋ、および２Ｍを有するデキストラン・マーカーを、モデル高分子薬剤として用いた。各ＩＰＮナノ粒子のＰＮＩＰＡＭとＰＡＡｃの重量比は１：０．１３である。
【図１５】３．３９重量％および５．２５重量％のＩＰＮ１５５ナノ粒子ネットワーク、ならびに５．２５重量％のＩＰＮ１５５−ＩＰＮ１１０（１：１）混合ナノ粒子ネットワークからのブルー・デキストラン（分子量２Ｍ）の放出プロファイルを示す図である。
【図１６】ゲル化温度を超える温度で形成される物理的に結合したナノ粒子ネットワークの概略図である。（ａ）粒子間隔によって決定される大きさを有する小型のポアと周囲の粒子数によって決定される大きさを有する大型のポアがある。（ｂ）小さい粒子と大きい粒子の混合によって形成されたナノ粒子ネットワーク。小さい粒子は、粒子間の間隙または大型のポアを埋め、薬剤分子の放出を遅らせることができる。
【図１７】３７℃、５０ｍＭのＰＢＳ中での３．３９重量％および５．２５重量％のＩＰＮ１５５ナノ粒子ネットワーク、ならびに５．２５重量％のＩＰＮ１５５−ＩＰＮ１１０（１：１）混合ナノ粒子ネットワークからのデキストラン・マーカー（分子量５．０×１０５）の放出プロファイルを示す図である。
【図１８】３７℃、ＰＢＳ中での８重量％７５ｎｍＩＰＮナノ粒子ネットワークからのＢＳＡ（分子量６７ｋ）の累積放出と５．２５％１１０ｎｍＩＰＮナノ粒子ネットワークからのデキストラン（分子量７０ｋ）の放出を示す図である。
【図１９】ザクロ状（ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ）マイクロゲル形成工程中の反応時間に対する粒子流体力学半径（Ｒｈ）の変化を示す図である。ここでは動的光散乱を分析するために、異なる反応時間に反応容器から溶液０．１ｍｌのアリコートを採取した。動的光散乱の全試料の濃度は、ＩＰＮマイクロゲル固体含量に対して５．０×１０−６ｇ／ｍｌである。ｐＨ値は、６．５から７．０に調整した。
【図２０】軟性ナノクラスター合成スキームを示す図であり、ＩＰＮマイクロゲルのビルディング・ブロックは、カルボキシル−アミン反応を経て、ＥＤＡＣおよびアジピン酸ジヒドラジドによってゼロ距離架橋される。
【図２１】２１℃でのザクロ状マイクロゲルおよびビルディング・ブロックＩＰＮマイクロゲルの粒径分布を示す図であり、ＩＰＮ１５５、Ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ２、およびＮａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ３は、それぞれＰＮＩＰＡＭ／ＰＡＡｃ相互貫入ポリマー・ネットワーク・マイクロゲル、ダイマー（３３分間１９５ｎｍ）、トリプレット（３７分間２３５ｎｍ）を表す。動的光散乱の測定角度は、すべて３０°である。
【図２２】２１℃でのＮａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ３マイクロゲルの静的光散乱のジム・プロットを示す図である。ポリマー濃度は、それぞれ（ａ）２．５×１０−６ｇ／ｍｌ、（ｂ）５．０×１０−６ｇ／ｍｌ、（ｃ）７．５×１０−６ｇ／ｍｌである。
【図２３】光学顕微鏡で観察されたマイクロメートル・スケールのクラスター粒子の画像を示す図である。
【図２４】ナノクラスターの温度感受性を示す図である。
【図２５】ＩＰＮマイクロゲルの合成を示す図であり、（ａ）シードとしての純粋ＰＮＩＰＡＭマイクロゲル、（ｂ）電解質アクリル酸の影響下で縮小したＰＮＩＰＡＭマイクロゲル（赤い点はアクリル酸モノマーを表す）、（ｃ）アクリル酸の重合、（ｄ）得られたＰＮＩＰＡＭ−ＰＡＡｃのＩＰＮマイクロゲルであり、（ｅ）は図の通り点線で表したＰＮＩＰＡＭとアクリル酸との間の水素結合を有する（ｂ）の拡大化学式を示す。
【図２６】ＰＮＩＰＡＭとＩＰＮナノ粒子の比較を示す表１である。
【図２７】ＩＰＮナノ粒子の合成条件を示す表２である。
【図２８】３７℃で６０％の充填薬剤が放出されるのに要する時間を示す表３である。
【図２９】Ｃｌｕｓｔｅｒ３とＩＰＮマイクロゲルの詳細な比較を示す表４である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月3日(2005.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ＩＰＮナノ粒子が、第２ポリマーネットワークに相互貫入する第１ポリマーネットワークおよび水性媒質を含む、相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子を含むハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体であって、
ＩＰＮナノ粒子が、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まず、ハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体が、それに適用される刺激の変化に応答して可逆性ゲル化を起こし得るハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項２】
生物活性材料をさらに含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項３】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項２に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項４】
刺激が、温度の変化を含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項５】
ゲル化温度（「Ｔｇ」）を超える温度変化が、ＩＰＮナノ粒子の体積相転移を誘起し、ハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体の逆熱増粘性をもたらす請求項４に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項６】
逆熱増粘性が、Ｔｇ超に加熱されたときの低粘性流体からゲルへの変換である請求項５に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項７】
Ｔｇが、約３４℃である請求項５に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項８】
第１ポリマーネットワークが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、またはヒドロキシプロピルセルロースを含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項９】
第２ポリマーネットワークが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１０】
第１ポリマーネットワークが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２ポリマーネットワークが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１１】
単分散ナノ粒子が、均一な大きさの流体力学半径を有する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１２】
単分散ナノ粒子が、約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１３】
単分散ナノ粒子の第１ポリマーネットワークと第２ポリマーネットワークが、約１：１．８８の重量比を有する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１４】
第１ポリマーネットワークと第２ポリマーネットワークが、蒸留水中で約１．２５重量％から約５．２５重量％の濃度範囲を有する全ポリマーを形成する請求項１に記載のハイドロゲル・ナノ粒子の水性分散体。
【請求項１５】
単分散ナノ粒子の相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）を調製する方法であって、
（ａ）第１モノマー、界面活性剤、第１架橋剤、および第１開始剤を第１温度で混合することによって調製された第１単分散ポリマー・ナノ粒子を提供するステップ、
（ｂ）第１単分散ポリマー・ナノ粒子に、第２モノマー、第２架橋剤、第２開始剤、および活性化剤を添加して、ナノ粒子溶液を形成するステップ、
（ｃ）ナノ粒子溶液をある時間、第２温度で混合して、単分散ナノ粒子のＩＰＮを形成するステップ、および
（ｄ）単分散ナノ粒子のＩＰＮを単離するステップを含み、
第１モノマー、第１架橋剤、第２モノマー、および第２架橋剤が、実質的に溶解酸素ガスを含まない方法。
【請求項１６】
（ｅ）単離した単分散ナノ粒子のＩＰＮを、第３温度で生物活性材料と混合するステップをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第３温度が、水性混合物中の単分散ナノ粒子のＩＰＮのゲル化温度（「Ｔｇ」）未満である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｇが、約３３℃である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１単分散ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、またはヒドロキシプロピルセルロースを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第２モノマーが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
第１単分散ポリマー・ナノ粒子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２モノマーが、アクリル酸を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
第１架橋剤が、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含み、第２架橋剤が、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含み、第１開始剤が、過硫酸カリウムを含み、第２開始剤が、過硫酸アンモニウムを含み、界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）を含み、活性化剤が、ＴＥＭＥＤを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
単分散ナノ粒子のＩＰＮが、約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
時間が、１３０分未満である請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
時間が、１２０分未満である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１温度が、約７０℃である請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
第２温度が、約２１℃である請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
架橋相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子のナノクラスターを調製する方法であって、
（ａ）ＩＰＮナノ粒子の分散体を提供するステップ、
（ｂ）第１架橋剤および第２架橋剤をＩＰＮナノ粒子の分散体に添加して、ＩＰＮ架橋溶液を形成するステップ、および
（ｃ）ＩＰＮ架橋溶液をある時間、第１温度に加熱して、架橋ＩＰＮナノ粒子のナノクラスターを形成するステップ
を含み、単分散ＩＰＮナノ粒子が、均一な大きさを有し、第２ポリマーネットワークに相互貫入する第１ポリマーネットワークを含み、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まず、単分散ＩＰＮナノ粒子が、それに適用される刺激の変化に応答して可逆性ゲル化を起こし得る方法。
【請求項３０】
（ｄ）架橋ＩＰＮのナノクラスターを、第２温度で生物活性材料と混合するステップをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第２温度が、水性分散体中の架橋ＩＰＮナノ粒子のナノクラスターのゲル化温度（「Ｔｇ」）未満である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｔｇが、約３３℃である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１ポリマーネットワークが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２ポリマーネットワークが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
第１架橋剤が、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（「ＥＤＡＣ」）を含み、第２架橋剤が、アジピン酸ジヒドラジドを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
架橋ＩＰＮのナノクラスターが、約１５５ｎｍから約２５０ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
架橋ＩＰＮのナノクラスターが、約２２５ｎｍから約２４０ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
時間が、約２５分から約４５分である請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
時間が、約３３分から約３７分である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１温度が、約４４℃である請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
架橋基によって結合された少なくとも２つのＩＰＮナノ粒子を含む、架橋相互貫入ポリマー・ネットワーク（「ＩＰＮ」）ナノ粒子のナノクラスターであって、各ＩＰＮナノ粒子が、均一な大きさを有し、第２ポリマーネットワークに相互貫入する第１ポリマーネットワークを含み、シェル／コア・ポリマー形状を実質的に含まないナノクラスター。
【請求項４２】
生物活性材料をさらに含む請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４３】
生物活性材料が、薬剤、プロドラッグ、タンパク質、または核酸である請求項４２に記載のナノクラスター。
【請求項４４】
第１ポリマーネットワークが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、第２ポリマーネットワークが、ポリ（アクリル酸）を含む請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４５】
架橋基が、アジピン酸ジヒドラジドを含む請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４６】
均一な大きさのナノ粒子が、約１５５ｎｍから約２５０ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項４１に記載のナノクラスター。
【請求項４７】
ナノ粒子が、約１８０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲の平均流体力学半径を有する請求項４６に記載のナノクラスター。
【国際調査報告】
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2007534644.tif 000036
2007534644.tif 000037