(57)【要約】本発明は、光合成細菌を用いて非光合成カロテノイドを合成する方法であって、該細菌は、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体の一つはリコペンである方法に関する。本発明の方法は、複数の工程：特定の遺伝子の除去および挿入；細菌の培養；およびカロテノイドの抽出を包含することを特徴とする。本発明はまた、上記方法に用いられる細菌または変異体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−カロテン、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンから選ばれる非光合成カロテノイドを合成する方法であり、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体がリコペンである光合成細菌を用いる方法であって、
i）該細菌において、リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部を除去して、リコペンのレベルで該合成を停止させる工程と、
ii）下記いずれかの遺伝子を挿入する工程：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW、または、
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW：と、
iii）このように改変された細菌を培養する工程と、
iv）細菌に含まれるカロテノイド（単数または複数）を抽出する工程と
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを合成するために、培養条件が逐次的（sequential）であり、かつ、
ｃ）前記のように改変された細菌を、最初は光下に嫌気条件下で培養する工程と、
ｄ）次いで、第２に、好気条件下に暗所で培養する工程と
を包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−カロテンを合成するために、培養条件が
ｂ）前記のように改変された細菌を、光下で嫌気条件下に培養すること
であること特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）および／またはｂ）は、光下で微好気条件下に行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
微好気条件下に、二原子酸素の百分率が１〜１０％、好ましくは３〜８％（限界値を含む）であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）およびｂ）が連続的に繰り返されることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
β−カロテン、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンから選ばれる非光合成カロテノイドを合成する方法であり、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体の一つがリコペンである光合成細菌を用いる方法であって、
i）二原子酸素によって光合成がもはや抑制されない光合成細菌の変異体を用いる工程と、
ii）細菌において、リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部を除去してリコペンのレベルで該合成を停止させる工程と、
iii）下記遺伝子のいずれかを挿入する工程：
−  合成されるべきカロテノイドがβカロテンである場合にはcrtY、
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW、または、
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW：と、
iv）カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを合成するためにこのように改変された該細菌を好気性または微好気性条件下に培養するか、または、β−カロテンを合成するために嫌気性条件下に培養する工程と、
v）細菌に含まれるカロテノイド（単数または複数）を抽出する工程と
を包含することを特徴とする方法。
【請求項８】
二原子酸素によって光合成がもはや抑制されない変異体は、PpsR転写因子をエンコードする遺伝子の除去によって得られることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細菌は、Rhodopseudomonas genus、好ましくはRhodopseudomonas palustrisの種であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体の一つはリコペンである前記光合成細菌は、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体の一つは、フィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテンまたはニューロスポレンである光合成細菌から得られ、該細菌は、場合によっては、内因性crtI遺伝子の除去または崩壊、続いて、４の連続するフィトエン不飽和化工程を確実に行うフィトエン・デサチュラーゼをエンコードする外因性crtIの挿入を経ることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
crtY、crtZおよび／またはcrtW遺伝子の挿入は、少なくとも部分的に除去された遺伝子の区域において行われることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
交互または同時の方法で、少なくともリコペンと、β−カロテンと、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンとを産生する光合成細菌であって、請求項１または請求項１に関連する請求項９に記載の方法によって得られ得ることを特徴とする光合成細菌。
【請求項１３】
i）少なくとも１種の光合成カロテノイドを合成し、その合成中間体がリコペンである光合成細菌を培養する工程と、
ii）リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部を除去して、リコペンのレベルで該合成を停止させる工程と、
iii）次のいずれかの遺伝子を挿入する工程：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY；
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW；または
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW；と、
を包含する方法により得られることを特徴とする光合成細菌。
【請求項１４】
光合成細菌の変異体であって、
i）少なくとも１種の光合成カロテノイドを合成し、その合成中間体がリコペンである光合成細菌の変異体であって、光合成は、二原子酸素によってもはや抑制されず、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを産生するものを用いる工程と、
ii）リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部を除去して、リコペンのレベルで該合成を停止させる工程と、
iii）次のいずれかの遺伝子を挿入する工程：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY；
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW；または
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW；と
を包含する方法により得られることを特徴とする光合成細菌の変異体。
【請求項１５】
少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体はフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテンまたはニューロスポレンである細菌または変異体であって、場合によっては、内因性crtI遺伝子の除去または崩壊、続いて、４の連続するフィトエン不飽和化ステップを確実に行うフィトエン・デサチュラーゼをエンコードする外因性crtI遺伝子の挿入を経るものからそれぞれ得られることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の細菌または請求項１４に記載された変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成細菌、特に、Rhodopseudomonas palustrisにより、カロテノイド、特に非光合成カロテノイドを合成する方法およびこの方法に用いられる細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
６００種超のカロテノイドが、自然界において確認された。それらは、非常に大多数の生物において広まっているが、限られた数の生物（植物、細菌、酵母）によってのみde novo合成される。これらのカロテノイドのいくつか（リコペン、β−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチン）は、農業食品産業において、それらの着色特性（リコペンについては赤、β−カロテンについては黄色、カンタキサンチンについてはオレンジ色、アスタキサンチンについてはオレンジがかったピンク色）のために、集中的に、かつ、非常に多様な方法で用いられる。アスタキサンチンおよびカンタキサンチンの使用は、特に、サケおよびマスの飼育のための水産養殖において魚肉のオレンジがかったピンク色を強化するために、鳥類の飼育において卵のオレンジがかった黄色を強調するために見出され、こうしたことは、両方の事例において、消費者の目を引く。
【０００３】
さらに、それらの抗酸化剤特性およびそれらの光保護作用のおかげで、それらは、医薬および化粧品産業において、とりわけ日焼け止めクリームおよび日焼け用製品を得るために用いられる。所定の国では、カンタキサンチン、β−カロテンおよびリコペンから誘導される製品の全シリーズが既に存在し、これらの製品は、美容およびボディービルディング協会において販売される。これらのカロテノイドはまた、抗ガン特性を有するように記載される。事実、これらの分子は、ガン細胞の形成の一因であると考えられているフリー・ラジカルの活性を低下させることができる。
【０００４】
これらのカロテノイドの現在の合成は、主として、化学的に行われる。消費者が天然起源の製品を好む傾向を考えると、それ故に植物または微生物起源のカロテノイドの潜在的な市場がある。さらに、化学的に生産される所定のカロテノイドの異性体配置が天然に見出される主たる異性体に対応しないようである。この相違は非常に重要であることが判明し得る。それは、結果として、化学合成由来のカロテノイドと比較して天然起源のカロテノイドのより大きな生体同化をもたらしがちであるからである。
【０００５】
これらの４種の主要なカロテノイド（リコペン、β−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン）の生合成経路が、図１に提示される。CrtE、CrtBおよびCrtI酵素の連続した作用によって合成されるリコペンは、他の３種のカロテノイドに共通する中間体である。このため、β−カロテンの合成はCrtY酵素によって、カンタキサンチンの合成はCrtYおよびCrtW酵素によって、アスタキサンチンの合成はCrtY、CrtWおよびCrtZ酵素によって、リコペンから行われ得る。
【０００６】
いくつかの細菌は、これらの４種のカロテノイドの一つを生産するそれらの能力について記載されている（Brevibacterium、Agrobacterium auriantiacum、 Erwinia uredovora、 Erwina herbicola、 Myxococcus xanthus、 Flavobacterium、 Alcaligenes、 Bradyrhizobium等.）。
【０００７】
特に、本発明者らによる先行する研究（これは、米国において出願された特許文献１の主題であった）は、Bradyrhizobium ORS278株に関連していた。これらの研究は、カンタキサンチン生合成経路に必要とされる一群の遺伝子（crtE、crtY、crtI、crtB、crtW）の存在を証明した。これらの種々の遺伝子は、一旦大腸菌に導入されて、機能的であることが分かった。
【特許文献１】米国特許出願公開第６０／２９７２４７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Bradyrhizobium属（これは、少量の光化学系を合成する）を除いては、これらの細菌は、一般に、非光合成細菌であり、少量の産物を蓄積し、かつ、高い頻度で、制限された成長速度を有する。このため、産生株の性質は、工業会社にとって十分に有利である生産性を提供することに対して主要な障害を構成する。
【０００９】
さらに、これらの細菌は、一般に、これらの４種のカロテノイドのうちの一種のみを産生する。これは、これらの４種の主要なカロテノイドの一団を生産することを望む工業会社がそれぞれ全く特定の培養および生産条件を必要とする種々の細菌株を用いなければならないことを意味する。さらに、同一場所上での種々の株の培養により、汚染問題に関連する多くの事業計画上の困難が生じ得る。
【００１０】
最後に、カロテノイドは疎水性化合物であり、細胞内の親油性の環境（一般的には、膜の区画）中にのみ貯蔵され得る。工業的に興味があるカロテノイドを産生する細菌は、一般に、十分に発達されていない内膜を有している。この特性（これは、それ故に、これらの細胞中に蓄積され得るカロテノイドの量を制限する）は、これらの細菌の工業的使用にとっての主要な問題の一つを構成する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このため、本発明者らによる研究は、培養条件および／または細菌に導入されるカロテノイド遺伝子にしたがって、他の細菌の欠陥を克服することによってこれらの４種の主要カロテノイドの全てを合成し得る細菌を探索することに至った。
【００１２】
光合成細菌は、主要な効果：非常に迅速な成長速度および非常に高い光合成能を呈する。光合成細菌中のカロテノイドは、光化学系と関連し、その機能化において必須の役割を果たす。強い光合成能は、カロテノイドのための実質的な貯蔵帯域を構成する細胞質内膜の多量の取込みに関係がある大量の光合成カロテノイドの合成によって達成される。
【００１３】
それにもかかわらず、これらの細菌は、一般的に、１種の色素であるスピリロキサンチンまたはスフィロイデンのみを合成し、これは、現時点において、工業的に興味深いことではない。
【００１４】
リコペン、β−カロテン、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを産生する微生物を得るために、本発明者らは、これらの細菌において、光合成カロテノイドの内因性合成の経路を非光合成（すなわち、光化学系に関係しない）カロテノイド：β−カロテン、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンの合成に転換することによって、光合成細菌により示される潜在性を十分に引き出した。
【００１５】
本発明は、このように、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体の一つがリコペンである光合成細菌を用いて、β−カロテン、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンから選ばれる非光合成カロテノイドを合成する方法であって、
i）細菌において、リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部を除去して、リコペンのレベルで合成を停止させる工程と、
ii）次のいずれかの遺伝子を挿入する工程：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY；
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW；または、
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW；と、
iii）上記のように改変された細菌を培養する工程と、
iv）細菌に含まれるカロテノイド（単数または複数）を抽出する工程と
を包含することを特徴とする方法に関する。
【００１６】
驚くべきことに、光合成カロテノイド（すなわち、光合成に必要とされるカロテノイド）を合成する細菌は、カロテノイドの内因性合成の経路が非光合成カロテノイドの合成に転換された場合に、光合成性のままであることが留意された。
【００１７】
これは、残余の方法で細菌がリコペン（光合成カロテノイド）を合成し続け、このことが、光化学系の中で内因的に光合成された合成カロテノイドを置き換えることにより該細菌がその光合成活性を維持することを可能にするからである。
【００１８】
少なくとも部分的に除去される遺伝子は、一般に、crtC、crtDおよび／またはcrtFである。好ましくは、crtCおよびcrtD遺伝子が、少なくとも部分的に除去されることになる。これらの遺伝子は、事実、リコペンからのスピリロキサンチンの合成において用いられる最初のものである（図１参照）。
【００１９】
さらに、所定の細菌中のcrtAを除去することも必要であり得る。これは、リコペン２−オンを合成する細菌の場合であるだろう（図１参照）。
【００２０】
好ましくは、光合成細菌は、Rubrivivax gelatinosus、Rhodospirillum rubrum、Rhodospirillum moliscianum、Rhodospirillum salinarum、Rhodospirillum mediosalinum、Rhodospirillum sodomense、Rhodocista centenaria、Rhodospira trueperi、Rhodopseudomonas palustris、Rhodopseudomonas acidophila、Rhodopseudomonas julia、Rhodopseudomonas cryptolactis、Rhodomicrobium vannielii、Rhodoplanes roseus、Rhodoplanes elegans、Rhodobium crientis、Rhodobium marinum等である。
【００２１】
より詳細には、本発明による方法は、これらの種々のカロテノイドの生産を満足なレベルで確実に行う培養条件を提供する。特に、それは、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを合成する方法であって、細菌を培養する条件が逐次的であり、かつ、
ａ）最初に、嫌気条件下、光の下に、上記のように改変された細菌を培養する工程と、
ｂ）次いで、第二に、好気または微好気条件下、暗所で、上記のように改変された細菌を培養する工程と
を包含することを特徴とする方法である。
【００２２】
事実、光合成細菌では、リコペン生合成経路のcrtE、crtBおよびcrtI遺伝子を含む光合成遺伝子は、酸素および光の制御下にある。特に、所定の株では、これらの遺伝子は暗所で発現されず、酸素の存在（＞８％）によって阻害される。この酸素による抑制は、PpsRと呼ばれる転写因子の結果であり、これは、高い酸素分圧で、crt遺伝子群を含む光合成遺伝子のプロモーター領域に結合し、それ故に、転写自体を妨げる。
【００２３】
他方、二原子酸素（dioxygen）の欠如は、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンの生産にとって好ましくない。これは、これらの２種のカロテノイドの生合成経路に必要とされるCrtW（β−カロテン・ケトラーゼ）またはCrtZ（β−カロテン・ヒドロキシラーゼ）酵素によって触媒される酵素反応が酸素を必要とするからである（図１参照）。このため、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの合成を可能にするため、第一にリコペン中間体の合成、第二に、それのカンタキサンチンまたはアスタキサンチンへの転換を確実に行うための培養条件の点で妥協案を見出すことが必要である。
【００２４】
有利には、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを優先的に得ることを可能にする培養条件の工程ａ）およびｂ）は、連続的に繰り返される。このような繰り返しは、カロテノイドが細胞中に蓄積することを可能にする。
【００２５】
あるいは、培養条件が改変されれば、本発明による方法は、β−カロテンの生産を可能にする。これらの光合成培養条件は、
ａ）上記のように改変された該細菌を、嫌気条件下に光の下で培養すること
である。
【００２６】
これは、リコペンのβ−カロテンへの転換を可能にするCrtY酵素（リコペン・シクラーゼ）の機能化が酸素依存性でないので、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンの培養条件の工程ｂ）の欠如により、β−カロテンの段階で合成を停止させることが可能になるからである。
【００２７】
このため、単一の細菌は、導入される遺伝子および培養条件により、リコペンと、優先的にはβ−カロテンまたはカンタキサンチンまたはアスタキサンチンのいずれかとの両方を合成することを可能にする。
【００２８】
あるいは、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを優先的に得ることを可能にする培養条件は、微好気性条件下に光の下で単一工程により行われ得る。
【００２９】
微好気条件の下、二原子酸素の百分率は、好ましくは１〜１０％、より特定的には３〜８％（限界値を含む）である。
【００３０】
二原子酸素による合成の調節に起因する制限をなくすために、本発明はまた、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産生し、その合成中間体の一つはリコペンである光合成細菌を用いて、β−カロテン、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンから選ばれる非光合成カロテノイドを合成する方法であって、
i）二原子酸素によって光合成がもはや抑制されない光合成細菌の変異体を用いる工程と、
ii）細菌において、リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１種以上の遺伝子の少なくとも一部を除去して、リコペンのレベルで合成を停止させる工程と、
iii）下記いずれかの遺伝子を挿入する工程：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY；
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW；または
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW；と、
iv）カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを合成するためにこのように改変された細菌を好気または微好気条件下に培養するか、または、β−カロテンを合成するために嫌気条件下に培養する工程と、
v）細菌に含まれるカロテノイド（単数または複数）を抽出する工程と
を包含することを特徴とする方法を提供する。
【００３１】
二原子酸素によって光合成がもはや抑制されない変異体は、特に、PpsR転写因子をエンコードする遺伝子の除去によって得られ、該因子は、高い二原子酸素分圧で所定のcrt遺伝子群の発現を抑制する。
【００３２】
有利には、本方法において用いられる細菌は、Rhodospeudomonas genusのもの、好ましくは、Rhodopseudomonas palustris種のものである。
【００３３】
所定の細菌はリコペンを合成しないが、カロテノイド合成経路のさらに上流の中間体を合成する。それらがリコペンを合成するようにさせるようにこれらの細菌を改変することが可能である。
【００３４】
本発明による方法の光合成細菌は、少なくとも１種の光合成カロテノイドを産出し、その合成中間体の一つがフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテンまたはニューロスポレンである光合成細菌から得られ、該細菌は、場合によっては、内因性crtI遺伝子の除去または崩壊、続いて、４つの連続するフィトエン脂肪酸不飽和化工程を確実に行うフィトエン・デサチュラーゼをエンコードする外因性のcrtI遺伝子の挿入を経る。
【００３５】
細菌は、優先的には、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter veldkampii、Rhodobacter sphaeroides、Rhodobacter azeotoformans、Rhodobacter blasticus、Rhodovulum sulfidophilum、Rhodovulum adriaticum、Rhodovulum euryhalinum、Rhodovulum stricturm等である。
【００３６】
このような状況において、除去されるべき遺伝子は、上記の遺伝子と同一である。事実、スペロイデン誘導体は、ニューロスポレンから得られる（内因性crtIは、３の連続するフィトエン脂肪酸不飽和化工程のみを確実に行うフィトエン・デサチュラーゼをエンコードする）。続いて必要とされる第１の酵素をエンコードする遺伝子は、crtC、crtDおよび／またはcrtFである（図１参照）。
【００３７】
さらに、所定の細菌においてcrtAを除去することも必要であり得る。これは、ζ−カロテン−２−オンまたはニューロスポレン−２−オンを合成する細菌についての場合であろう（図１参照）。
【００３８】
有利には、本発明による方法のcrtY、crtZおよび／またはcrtW遺伝子の挿入は、少なくとも部分的に除去された遺伝子の区域において行われる。
【００３９】
あるいは、crtY、crtZおよび／またはcrtW遺伝子も、プラスミドに挿入され得る。
【００４０】
本発明は、交互または同時の方法で、少なくともリコペンと、β−カロテンと、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンとを産生する光合成細菌であって、本発明による方法によって得られ得ることを特徴とする光合成細菌にも及ぶ。
【００４１】
特に、少なくとも１種のカロテノイドを合成し、その合成中間体がリコペンであるこれらの光合成細菌は、
i）リコペンのレベルで合成を停止させるための、リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部の除去；
ii）下記いずれかの遺伝子の挿入：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY；
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW；または
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW：
の変異を包含することを特徴とする。
【００４２】
あるいは、それは、少なくとも１種のカロテノイドを合成し、その合成中間体がリコペンであり、二原子酸素により光化学系の合成がもはや抑制されず、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを産生する光合成細菌の変異体であって、
i）リコペンのレベルで合成を停止させるための、リコペンの合成経路に続く内因性合成経路に必要とされる１以上の遺伝子の少なくとも一部の除去、
ii）下記いずれかの遺伝子の挿入：
−  合成されるべきカロテノイドがβ−カロテンである場合にはcrtY；
−  合成されるべきカロテノイドがカンタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtYおよびcrtW、または
−  合成されるべきカロテノイドがアスタキサンチンまたはβ−カロテンである場合にはcrtY、crtZおよびcrtW：
の変異を包含することを特徴とする変異体である。
【００４３】
これらの細菌または変異体は、少なくとも１種のカロテノイドを産生し、その合成中間体の一つがフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテンまたはニューロスポレンである細菌または変異体から得られ得、該細菌または変異体は、場合によっては、内因性のcrtI遺伝子の除去または崩壊、次いで、４の連続するフィトエンの不飽和化工程を確実に行うフィトエン・デサチュラーゼをエンコードする外因性crtI遺伝子の挿入を経る。
【００４４】
驚くべきことに、これらの光合成細菌または光合成細菌変異体は、それらの内因性光合成カロテノイドの合成経路が関心のある非光合成カロテノイドの合成に変更されたにもかかわらず、それらの光合成活性を維持することが留意される。
【００４５】
本発明の他の特徴および利点は、実施例において添付の図面を参照しながら明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（実施例１：リコペンを産生するRhodopseudomonas palustrisの変異体株の構築）
スピリロキサンチンの合成に必要とされるR. palustrisのcrt遺伝子クラスターの配列は、下記アドレスでインターネットにアクセス可能である：http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Acc Number: BX572597)。
【００４７】
Bradyrhizobium ORS278などの場合、crtE、crtI、crtB、crtC、crtDおよびcrtF遺伝子が存在し、３つのオペロンから組織される。
【００４８】
この変異体株を構築するための一般的な戦略は、crtDおよびcrtC遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子（aphA-3遺伝子）をエンコードするカセットをそこに挿入することによって崩壊させることにある。
【００４９】
（第１工程：R. palustrisのcrtDC遺伝子の単離およびクローニング）
R. palustrisのcrtDC遺伝子の部分に対応する領域は、プライマーの対：
crtD.R.palu.XhoI.f: GAGCTCGAGTTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC（配列番号１）
CrtC.R.palu.XhoI.r: CTGCTCGAGAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC(配列番号２)
を用いて増幅させられた。
【００５０】
プライマーは、ＰＣＲ産物のいずれかの側上にXhoI制限サイトを挿入するように設計された。
【００５１】
増幅は、Invitrogen（登録商標）によって販売されている高正確性（high fidelity）ＤＮＡポリメラーゼ（プラチナPfx  ＤＮＡポリメラーゼ）により行われた。
【００５２】
増幅条件は次の通りである：９５℃で５分にわたる最初のＤＮＡ変性工程後、３５のＰＣＲサイクルが行われ（９４℃で１５秒、次いで、５５℃で３０秒、次いで、６８℃で３分）、次いで、最終の伸長工程（６８℃で７分）が行われ、その最中に、増幅フラグメントの３’末端にデオキシアデノシン残基を挿入するために１μＬの従来のTaqポリメラーゼ（GoTaq，Promega（登録商標））がＰＣＲチューブに加えられる（この工程は、次に用いられるベクターpGEM-Tへのクローニングを可能にするために必須である）。
【００５３】
このようにして得られるＰＣＲ産物は、供給元のプロトコールにしたがい、クローニングベクターpGEM-T（会社Promega（登録商標）によって販売）にクローニングされる。得られたプラスミドは、pGEM-T/crtDC.XhoIと呼ばれる。
【００５４】
（第２工程：プラスミドpJQ200mp18/crtDCの構築）
R. palustrisのcrtDC遺伝子に対応する領域は、プラスミドpGME-T/crtDC.XhoIのXhoI消化によって放出され、次いで、SalI消化によって線状にされた自殺ベクターpJQ200mp18にライゲートされる。このプラスミドは、二重交差事象（double clossing over event）が実際に起こったクローンをショ糖上で選択することを可能にするsacB自殺遺伝子を含む（Quandt, J. & Hynes, M. F. 「Versatile suicide vectors which allow direct selection for gene replacement in gram-negative bacteria」: Gene 127, 15-21, 1993）。
【００５５】
（第３工程：プラスミドpJQ200mp18/crtDC:aphA-3の構築）
カナマイシン耐性をエンコードするaphA-3遺伝子は、会社Amersham（登録商標）によって販売されるプラスミドpUC4KからSalI酵素による消化によって放出される。それは、次いで、SalIにより線状にされたプラスミドpJQ200mp18/crtDCに挿入される。後のSalI消化により、crtD遺伝子の５’末端およびcrtC遺伝子の３’末端に対応する６１８ｂｐのフラグメントが除去されることになることが留意されるべきである。
【００５６】
プラスミドpJQ200mp18/crtDC::aphA-3は、最終的には、エレクトロポレーションによって接合性大腸菌（Escherichia coli）S17.1株に移される。
【００５７】
（第４工程：crtD、crtC遺伝子にapha3カセットを含むR. palustrisの変異体株の構築）
前記のプラスミドpJQ200mp18/crtDC::aphA-3は、構築物を含有する前記の大腸菌S17.1株との接合によって野生型R. palustris株（CEA001）に伝達される。接合クローンは、１５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するHutner媒体（R. K. Clayton “Towards the isolation of a photochemical reaction center in Rhodopseudomonas sphaeroides”; Biochim. Biophys. Acta 75:312-318, 1963）上で選択される。二重組み換えクローンは、５％のショ糖およびカナマイシン（１５０μｇ／ｍＬ）を含有するHutner培地上で接合クローンを二次培養した後に選択される。ＰＣＲ検査は、apha3カセットのR. palustrisのcrtDおよびcrtC遺伝子への挿入を確かめるために複数の組み換えクローンについて行われる。
【００５８】
このようにして変異させられた細菌において大量のリコペンの産生が記録された。さらに、細菌の光合成の性質は保存された。
【００５９】
（実施例２：β−カロテンまたはカンタキサンチンを産生するRhodopseudomonas palustris変異体株の構築）
（構築スキーム）
この変異体株を構築するための戦略は、図２に要約される。
【００６０】
この図において、工程の説明文は次の通りである。
【００６１】
第１工程：Bradyrhizobium ORS278のcrtYおよびcrtW遺伝子さらにはR. palustrisのcrtDC遺伝子の増幅。ＰＣＲ産物のプラスミドp-GEMT（Promega）へのクローニング。
【００６２】
第２工程：SalIによる、Amershamにより販売されるプラスミドpuc4Kからのapha3カセットの放出。crtWの下流に存在する独自のXhoIサイトにおける挿入。
【００６３】
第３工程：KpnI/EcoRIによるcrtWおよびapha3遺伝子の放出。同じ酵素により線状にされたプラスミドpGEM-T/crtYへの挿入。
【００６４】
第４工程：BglII/EcoRIによるcrtY、crtWおよびapha3遺伝子の放出。同じ酵素により線状にされたプラスミドpGEM-T/crtDCへの挿入。
【００６５】
第５工程：XbaIによるcrtDC、crtY、crtWおよびapha3遺伝子の放出。同じ酵素により線状にされたプラスミドpJQ200mp18への挿入。
【００６６】
（Ａ．構築の戦略）
β−カロテンまたはカンタキサンチンのいずれかを産生するR. palustris変異体株を構築するための全体的な戦略は、R. palustrisのcrtD、crtC遺伝子を、Bradyrhizobium ORS278のcrtYおよびcrtW遺伝子さらにはカナマイシン耐性をエンコードするaphA-3遺伝子をそこに挿入することによって崩壊させることにあった。
【００６７】
培養の酸化条件次第で（実施例３を参照）、β−カロテンをカンタキサンチンに転化したCrtW酵素は機能的になったりならなかったりし、その結果、選択に応じて、β−カロテンまたはカンタキサンチンが蓄積する。
【００６８】
（第１工程：R. palustrisのcrtDCおよびBradyrhizobium ORS278のcrtYおよびcrtW遺伝子の単離およびクローニング）
R. palustrisのcrtDC遺伝子の部分に対応する領域は、プライマーの対：
crtD.R.palu.XbaI.f: GAGTCTAGATTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (配列番号３)
CrtC.R.palu.XbaI.r: CTGTCTAGAAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC (配列番号４)
を用いて増幅させられた。
【００６９】
プライマーは、ＰＣＲ産物のいずれかの側上にXbaI制限サイトを挿入するように設計された。
【００７０】
Bradyrhizobium ORS278のcrtY遺伝子は、プライマーの対：
crtY.278.f: TGAGATCTGGAGGCTGTCGTCATGAGTCGAGATGCCGACGTCATCGTC (配列番号５)
crtY.278.r: GTTGAATTCCTGGTACCTCATGGGGTCTTGAAGGCGTCGCCTCA (配列番号６)
を用いて増幅させられた。
【００７１】
プライマーは、ＰＣＲ産物の５’位にRBS（ribosomal binding site：リボソームバインディングサイト）およびBglII制限サイトを、さらには、３’位にKpnIおよびEcoRI制限サイトを挿入するように設計された。
【００７２】
Bradyrhizobium ORS278のcrtW遺伝子は、プライマーの対：
crtW.ORS278.f: CGGTACCGGGAGCTTTGCCAATGCATGCAGCAACCGCCAAGGCTAC (配列番号7)
crtW.ORS278.r: GTGAATTCCATGCTCGAGCGGGTTTAGTCACGCCTTTCCAG (配列番号８)
を用いて増幅させられた。
【００７３】
プライマーは、ＰＣＲ産物の５’位にRBS（リボソームバインディングサイト）およびKpn I制限サイトを、さらには、３’位にXho IおよびEcoR I制限サイトを挿入するように設計された。
【００７４】
増幅は、Invitrogen（登録商標）によって販売される高正確性ポリメラーゼ（プラチナPfx  ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて行われた。
【００７５】
増幅条件は、次の通りである：９５℃での５分にわたる最初のＤＮＡ変性工程後に、３５のＰＣＲサイクルが行われ（９４℃で１５秒、次いで、５５℃で３０秒、次いで、６８℃で３分）、最終の伸長工程（６８℃で７分）が続けられ、その最中に、増幅フラグメントの３’末端にデオキシアデノシン残基を挿入するために、１μＬの従来のTaqポリメラーゼ（GoTaq，Promega（登録商標））がＰＣＲチューブに加えられる（この工程は、次に用いられるベクターpGEM-Tへのクローニングを可能にするために必須である）。
【００７６】
このようにして得られる３種のＰＣＲ産物は、供給元のプロトコールにしたがってクローニングベクターpGEM-T（会社Promega（登録商標）によって販売される）にクローニングされる。得られるプラスミドは、pGEM-T/crtDC.XbaI；pGEM-T/crtＹ；pGEM-T/crtWと呼ばれる。
【００７７】
（第２工程：プラスミドpGEM-T/crtW::aphA-3の構築）
カナマイシン耐性をエンコードするaphA-3遺伝子は、会社Amershamによって販売されるプラスミドpUC4Kから、SalI酵素による消化によって放出される。それは、次いで、XhoIにより線状にされたプラスミドpGEM-T/crtWに挿入される。
【００７８】
（第３工程：プラスミドpGEM-T/crtY::crtW::aphA-3の構築）
crtWおよびaphA-3遺伝子を含む前記の構築物は、KpnI/EcoRIの二重消化によって放出され、次いで、同一対の制限酵素により線状にされたプラスミドpGEM-T/crtYに挿入される。
【００７９】
（第４工程：プラスミドpGEM-T/crtDC::crtY::crtW::aphA-3の構築）
crtY、crtWおよびaphA-3遺伝子を含む前記の構築物は、BglII/EcoRIの二重消化によって放出され、次いで、同一対の制限酵素により線状にされたプラスミト゛pGEM-T/crtDCに挿入される。BglII/EcoRIによるpGEM-T/crtDCの消化により、結果として、crtDおよびcrtC遺伝子のかなりの部分に対応する１２３２ｂｐのフラグメントが除去される。
【００８０】
（第５工程：プラスミドpJQ200mp18/crtDC::crtY::crtW::aphA-3の構築）
crtDC、crtY、crtWおよびaphA-3遺伝子を含む前記の構築物は、XbaI消化によって放出され、次いで、XbaIにより線状にされた自殺プラスミドpJQ200mp18に挿入される。プラスミドpJQ200mp18/crtDC::crtY::crtZ::crtW::aphA-3は、最終的には、エレクトロポレーションによって接合性大腸菌S17.1株に移される。
【００８１】
（第６工程：Bradyrhizobium ORS278のcrtYおよびcrtW遺伝子を含むR. palustrisの変異体株の構築）
前記のプラスミドpJQ200mp18/crtDC::crtY::crtW::aphA-3は、構築物を含む前記の大腸菌S17.1株との接合によってR. palustris CEA001株に伝達される。接合クローンは、１５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むHutner培地上で選択される。二重組み換えクローンは、接合クローンを二次培養した後に５％のショ糖およびカナマイシン（１５０μｇ／ｍＬ）を含むHutner培地上で選択される。crtYおよびcrtW遺伝子が実際にcrtDおよびcrtC遺伝子に挿入されることを確実に行うために、ＰＣＴ検査がいくつかの組み換えクローンについて行われる。変異体：R. palustris CEA001ΔcrtDC::crtY::crtWは、以下の実験のために選択される。
【００８２】
（Ｂ．R. palustris変異体株CEA001ΔcrtDC::crtY::crtWによって産生されるカロテノイドの分析−種々の培養条件下での試み）
R. palustris変異体株CEA001ΔcrtDC::crtY::crtWがβ−カロテンおよびカンタキサンチンを過剰産生する潜在性を測定するために、種々の培養条件が試験される一連の予備的な試行が行われた。
【００８３】
Ａ：１００ｍＬのHutner培地を含み、３０℃の１２０ｍＬのフラスコ（全ての痕跡量の酸素を除去するために脱気された）が、１００ワットの白熱灯下に配置された（光、嫌気条件）；
Ｂ：５０ｍＬのHutner培地で満たされ、３０℃の２５０ｍＬのフラスコ（１７０ｒｐｍで振とうしている）が、酸素含有量が１、５または８％（光、微好気条件）または２１％（光、好気条件）に調整され得る雰囲気中に配置された；
Ｃ：条件Ａにしたがって嫌気条件下に２日間にわたり培養した後に、５０ｍＬがバッフル付きエルメンマイヤーフラスコに移され、次いで、培地を高度に酸化するために暗所中１７０ｒｐｍで終夜振とうされる。
【００８４】
３日にわたり種々の試験条件下に培養した後、産生されたカロテノイドは、ＨＰＬＣによって分析される。得られた結果は、下記表１に与えられる。
【００８５】
【表１】
2007517516.tif 000002
【００８６】
カロテノイドの産生および株の生育について通気および光条件が非常に大きい効果を有することが明らかに現れている。光下の嫌気条件下に大量のβ−カロテンが得られ得る（４．７ｍｇ／Ｌ）；他方で、酸素による光合成装置の合成の抑制のため、好気条件（２１％）下に細菌が培養された場合には低濃度のカロテノイド（リコペンおよびβ−カロテン）が得られたに過ぎない。光を伴う嫌気条件下での大量のβ−カロテンの存在は、リコペンのβ−カロテンへの転換を可能にするORS278のcrtY遺伝子が完全に機能的であることを明らかに示す。他方、カンタキサンチンの産生の欠如が、これらの同一の条件下に観察される。これは、β−カロテンのカンタキサンチンへの転換を可能にするCrtW酵素が、オキシゲナーゼであり、それ故に機能化のために酸素を必要とするという事実に起因する。この説明と一致するように、酸素含有量が５から８％に高くなる場合に、β−カロテンの減少に伴ってカンタキサンチンの濃度は（０．３２から０．４１ｍｇ／Ｌに）徐々に高くなる（表１）。この実験は、第一に、β−カロテンからのカンタキサンチンの形成のために酸素の存在が必要であること、第二に、ORS278のCrtW酵素もこの変異体の中で機能的であることを証明する。酸素含有量によるβ−カロテンのカンタキサンチンへの転換も図４に示されるクロマトグラムによって証明される。酸素存在下の等モルの方法でのβ−カロテンのカンタキサンチンへの転換を支持する別の議論は、条件Ｃ（すなわち、嫌気条件下に生育後に培地を酸化することによる）下で提示され、この場合、このβ−カロテンの一部をカンタキサンチンに転換することが可能である。
【００８７】
これらの最初の試行は、R. palustris中でカンタキサンチンを生じさせることが可能であることを明らかに示す。さらに、通気条件を調整することによって、β−カロテンの量が約５ｍｇ／Ｌ、すなわち、液体培地中でBradyrhizobium ORS278株により得られるカンタキサンチンの量（０．８ｍｇ／Ｌ）の６倍より多くカンタキサンチンに転換され得る。さらに、培養時間は、半分より短く短縮され、すなわち、生産性は、同比率だけ増大した。
【００８８】
（実施例３：アスタキサンチンを産生するRhodopseudomonas palustrisの変異体株を構築するための戦略）
（構築スキーム）
この変異体株を構築するための戦略は、図３に要約される。
【００８９】
この図において、工程の説明文は次の通りである。
【００９０】
第１工程：Pseudomonas putidaのcrtZ遺伝子の増幅。プラスミドp-GEMT（Promega）におけるＰＣＲ産物のクローニング。
【００９１】
第２工程：KpnIによるcrtZ遺伝子の放出。プラスミドpGEM-T/crtY::crtW::apha3の独自のKpnIサイトへの挿入。
【００９２】
第３工程：BglII/EcoRIによるcrtY、crtZ、crtWおよびapha3遺伝子の放出。同じ酵素により線状にされたプラスミドpGEM-T/crtDCへの挿入。
【００９３】
第４工程：XbaIによるcrtDC、crtY、crtZ、crtWおよびapha3遺伝子の放出。同じ酵素により線状にされたプラスミドpJQ200mp18への挿入。
【００９４】
（構築）
一般的な戦略は、Pseudomonas putidaの遺伝子を、前に構築された、Bradyrhizobium ORS278のcrtYおよびcrtW遺伝子を含むR. palustris変異体株に挿入することにある。挿入は、crtYおよびcrtW遺伝子間に存在する独自のKpnI制限サイトに行われる。
【００９５】
（第１工程：プラスミドpGEM-T/crtZの構築）
Pseudomonas putidaのゲノムは、完全に配列決定された。crtZ遺伝子の配列は、遺伝子バンク（Genbank ACC：NC 00297）において入手可能である。遺伝子は、Pseudomonas putidaのゲノムＤＮＡから、プライマーの対：
crtZ.Ps.putida.f:CCTTTTGGTACCGGAGGACCGTTCCATGCTGTTCAATCTCGCCATATT (配列番号９)
crtZ.Ps.putida.r: GGGGTACCTCACGATTGGCTGCGCCTGCTGCGCAATTG（配列番号１０）
を用いて増幅させられる。
【００９６】
プライマーは、ＰＣＲ産物の５’位にＲＢＳ（リボソーム・バインディング・サイト）を、５’位および３’位にKpnI制限サイトを挿入するように設計された。
【００９７】
増幅は、Invitrogen（登録商標）によって販売される高正確性ＤＮＡポリメラーゼ（プラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ）により行われる。
【００９８】
増幅条件は次の通りである：９５℃で５分にわたる最初のＤＮＡ変性工程後、３５のＰＣＲサイクルが行われ（９４℃で１５秒、次いで、５５℃で３０秒、次いで、６８℃で１分）、続いて、最終的な伸長工程（６８℃で７分）が行われ、その最中に、増幅フラグメントの３’末端にデオキシアデノシン残基を挿入するために、１μＬの従来のTaqポリメラーゼ（GoTaq，Promega（登録商標））がＰＣＲチューブに加えられる（この工程は、次に用いられるベクターｐＧＥＭ−Ｔへのクローニングを可能にするために必須である）。
【００９９】
このようにして得られるＰＣＲ産物は、供給元のプロトコールにしたがって、クローニングベクターpGEM-Tにクローニングされる。得られたプラスミドは、pGEM-T/crtZと呼ばれる。
【０１００】
（第２工程：プラスミドpGEM-T/crtDC::crtY::crtZ::crtW::aphA-3の構築）
R. palustrisのcrtDC遺伝子に挿入されたBradyrhizobium ORS278のcrtWおよびcrtY遺伝子およびaphA-3  カナマイシン耐性遺伝子を含む、前に得られた構築物pGEM-T/crtDC::crtY::crtW::aphA-3が、KpnI酵素により線状にされ、その制限サイトは、crtWおよびcrtY遺伝子間に位置する。ベクターpGEM-T/crtZにクローニングされたcrtZ遺伝子は、KpnIにより放出され、次いで、線状にされた前記の構成物へのライゲーションによって挿入される。
【０１０１】
（第３工程：プラスミドpJQ200mp18/crtDC::crtY::crtZ::crtW::aphA-3の構築）
crtDC、crtY、crtZ、crtWおよびaphA-3遺伝子を含む前記の構築物は、XbaI消化によって放出され、次いで、ライゲーションによって、XbaIにより線状にされた自殺プラスミドpJQ200mp18に挿入される。プラスミドpJQ200mp18/crtDC::crtY::crtZ::crtW::aphA-3は、エレクトロポレーションによって接合性大腸菌S17.1株に移される。
【０１０２】
（第４工程：Bradyrhizobium ORS278のcrtYおよびcrtW遺伝子およびPseudomonas putidaのcrtZ遺伝子を含むR. palustris CEA001の変異体株の構築）
前記のプラスミドpJQ200mp18/crtDC::crtY::crtZ::crtW::aphA-3は、構築物に含まれる前記の大腸菌S17.1株との接合によってR. palustris株CEA001に伝達される。接合クローンは、１５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むHutner培地上で選択される。二重組み換えクローンは、５％のショ糖およびカナマイシン（１５０μｇ／ｍＬ）を含むHutner培地上で接合クローンを二次培養した後に選択される。crtY、crtZおよびcrtW遺伝子が実際にcrtDおよびcrtC遺伝子に挿入されることを確実に行うために、ＰＣＲ検査がいくつかの組み換えクローンについて行われる。
【０１０３】
微好気条件下に、このようにして変異が生じた細菌においてアスタキサンチンの産生が観察された。
【０１０４】
（実施例４：アスタキサンチンを産生するRhodopseudomonas palustrisの変異体株を構築するための代替の戦略）
実施例３に記載された構築戦略と比較すると、アスタキサンチンの産生に必須のcrtZ遺伝子は、Pseudomonas putidaではなくErwinia uredovoraの株から単離された。ＰＣＲによるcrtZ遺伝子の単離のために用いられたプライマーの対以外は、構築戦略は実施例３に記載された構築戦略と同一のままである。新しいプライマーは、
crtZ.Er.uredovora.f:
GACGGTACCACCGGAGAAATTATGTTGTGGATTTGGAATGCCCTGATC
crtZ. crtZ.Er.uredovora.r: GTCGGTACCTTACTTCCCGGATGCGGGCTCATCCT
である。
【０１０５】
用いられたプライマーはまた、ＰＣＲ産物の５’位にＲＢＳ（リポソーム・バインディング・サイト）を、５’位および３’位にKpnI制限サイトを挿入するように規定された。
【０１０６】
構築後、R. palustris変異体株CEA001ΔcrtCD::crtY::crtZ::crtW::apha3のアスタキサンチンを産生する能力は、種々の酸素条件下での培養後にＨＰＬＣによって確認された［５０ｍＬのHutner培地により満たされた２５０ｍＬのフラスコが、３０℃で、１７０ｒｐｍで振とうしながら、酸素含有量が１、５または８％（光、微好気条件）または２１％（光、好気条件）に調整され得る雰囲気中に配置され、培養時間が３日である］。
【０１０７】
得られた結果は、下記表に与えられる。
【０１０８】
【表２】
2007517516.tif 000003
【０１０９】
すでに記載されたように、産生されるカロテノイドの量および種類についての酸素含有量の非常に大きな効果が留意される。酸素含有量が５％に固定される場合、産生される主要なカロテノイドはアスタキサンチンである。このため、これらの試行は、R. palustrisにおいてアスタキサンチンを過剰産生することが可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、本発明がターゲットにする種々のカロテノイドを要約するスキームを示す。
【図２】図２は、プラスミド：pJG200mp18/crtDC::crtY::crtW::apha3を構築するための戦略を要約するスキームを示す。
【図３】図３は、プラスミド：pJQ200mp18/crtDC::crtY::crtZ::crtW::apha 3を構築するための戦略を要約するスキームを示す。
【図４】図４は、種々の培養条件の下にR. palustrisの変異体株CEA001ΔcrtDC::crtY::crtWによって合成されたカロテノイドのＨＰＬＣ分析である。
【図１】
2007517516.tif 000004
【図２】
2007517516.tif 000005
【図３】
2007517516.tif 000006
【図４】
2007517516.tif 000007
【配列表】
2007517516000001.xml
【国際調査報告】
2007517516.tif 000011
2007517516.tif 000012
2007517516.tif 000013
2007517516.tif 000014
2007517516.tif 000015
2007517516.tif 000016