(57)【要約】  プロテナーゼK水溶液に、5分当り0.1〜0.2M量の硫酸アンモニウムを、1時間後の最終量が1.5〜2.0Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することにより得られる、水に不溶な固形のプロテナーゼK調製物は高い純度を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテナーゼKの水溶液に、5分当り0.1〜0.2M量の硫酸アンモニウムを、1時間後の最終量が1.5〜2Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することによって得られる、水に不溶な固体のプロテナーゼK製剤。
【請求項２】
プロテナーゼKが沈殿するような条件下で、プロテナーゼKの水溶液を硫酸アンモニウムの飽和水溶液または固体の硫酸アンモニウム結晶で処理することを特徴とし、前記溶液中の硫酸アンモニウム濃度が、5分当り0.1〜0.2Mの量で増加し、1時間後の最終濃度が1.5〜2Mになるまで、硫酸アンモニウムを前記プロテナーゼKの水溶液に添加し、形成したプロテナーゼK沈殿を単離することを特徴とする、硫酸アンモニウム沈殿による固形のプロテナーゼKの調製方法。
【請求項３】
a)  プロテナーゼKの水溶液に、5分当り0.1〜0.2M量の硫酸アンモニウムを、1時間後の最終量が1.5〜2Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することによって得られる、水に不溶な固体のプロテナーゼK製剤を提供する工程；
b)  工程(a)で沈殿したプロテナーゼKを水または水性緩衝溶液に再懸濁する工程；
c)  工程(b)の固体のプロテナーゼKを単離する工程
を含む、プロテナーゼKの精製方法。
【請求項４】
グリセロール水溶液を40％から60％(w/v)の濃度で添加することによって可溶化を行うことを特徴とする、請求項２によって得られる固形のプロテナーゼKの可溶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、高度に精製された固体のプロテナーゼK製剤、水不溶性の形状のプロテナーゼK；その生成方法および水不溶性の形状のプロテナーゼKの用途に関する。
【０００２】
（発明の背景）
プロテナーゼK（EC3.4.21.64）は、菌類トリチラチウム・アルブム リンバー（Tritirachium album limber）から単離され得るセリンプロテアーゼである（Ebeling, W.ら, Eur. J. Biochem. 47(1974)91-97; およびドイツ国特許第DE19 65 281号）。プロテナーゼKは天然のケラチンを切断することができ、低濃度のSDSの存在下で活性であり続ける。従って、プロテナーゼKは高収率で天然のRNAを単離するのに非常に有用である（Wiegers, U.およびHilz, H., Biochem. Biophys. Res. Commun. 44(1971)513-519）。
【０００３】
プロテナーゼKはまた、PCRの分野で広く用いられている。かかる方法において、中間の工程で、制限エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびDNA修飾酵素等の、特定の酵素が用いられる。次のPCR工程を行なう前に、しばしばこれらの酵素を不活性化する必要がある。かかる不活性化は、好ましくはプロテナーゼKを用いて行なわれる。従って、プロテナーゼKは高純度であり、特にデオキシリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼおよびDNAにより汚染されていないことが必要である。
【０００４】
（発明の概要）
驚くべきことに、プロテナーゼKの時間制御された沈殿により、緩衝液A（10mM TrisHCl pH7.5）または緩衝液B（5mM Ca-アセテート）中で溶解度が0％、および50％グリセロールを含有する緩衝液A中で溶解度が100％であることを特徴とする水不溶性産物が生じることが見出された。
【０００５】
本発明は従って、プロテナーゼKの水溶液に5分当り0.1〜0.2M量の硫酸アンモニウムを、1時間後の最終量が1.5〜2Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することによって得られる、水に不溶な固体のプロテナーゼK製剤を含む。
【０００６】
本発明はまた、プロテナーゼKが沈殿するような条件下で、プロテナーゼKの水溶液を硫酸アンモニウムの飽和水溶液または固体の硫酸アンモニウム結晶で処理することを特徴とし、前記溶液中の硫酸アンモニウム濃度が、5分当り0.1〜0.2Mの量で増加し、1時間後の最終濃度が1.5M〜2Mになるまで、硫酸アンモニウムを前記プロテナーゼK水溶液に添加して、形成したプロテナーゼK沈殿物を単離することを特徴とする、硫酸アンモニウム沈殿による固形のプロテナーゼKの調製方法も含む。
【０００７】
本発明の好ましい態様において、水または水性緩衝溶液（pH5.5〜7.5）、好ましくはTrisまたはアセテート緩衝液により、沈殿物の洗浄を行なう。
【０００８】
プロテナーゼK沈殿物を遠心分離により、好ましくはAS溶液から5,500〜8,500xg値で単離することもまた好ましい。
【０００９】
好ましくは、硫酸アンモニウムを加える前に、プロテナーゼK溶液は20mg/mlの濃度を有する。
【００１０】
好ましくは、添加される硫酸アンモニウム結晶は粉状である。例えば、p.a.（「本職解析用（pro analysi）」）品質で市販されている粉状の硫酸アンモニウム結晶を使用し得る。かかる結晶はMallinckrodt Baker等の化学物質の供給業者より入手可能である。
【００１１】
驚くべきことに、本発明によって調製された固形のプロテナーゼKが、多量では水に溶け得ないことが見出された。従って、本発明のさらなる目的は、水不溶性である、固体のプロテナーゼK製剤の調製である。しかしながら、該製剤は、40〜60％グリセロール（w/v）含有水溶液に可溶である。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、40〜60％グリセロール（w/v）含有水溶液で前記製剤を処理することにより本発明によって得られる、プロテナーゼKの固体製剤の可溶化方法である。
【００１３】
固体のプロテナーゼKは沈殿した際に結晶状または粉状であり得る。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プロテナーゼK水溶液に、5分当り0.1〜0.2M量の硫酸アンモニウムを、1時間後の最終量が1.5〜2.0Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することにより得られる、水に不溶な、固体のプロテナーゼK製剤を提供する。
【００１５】
硫酸アンモニウムを用いたプロテナーゼK等のタンパク質の沈殿は、当該技術分野で周知である。それはタンパク質の分離および精製の一般的な方法である。該方法は塩析として一般に公知である。硫酸アンモニウムの高い溶解度のために、硫酸アンモニウムはかかる方法に最も広く用いられてきた塩である。当該技術分野に従って、飽和塩溶液または粉状の塩の結晶をタンパク質混合物に添加し、混合物の塩濃度を上げる。
【００１６】
本発明は、プロテナーゼKが沈殿するような条件下で、プロテナーゼKの水溶液を硫酸アンモニウムの飽和水溶液または固体の硫酸アンモニウム結晶で処理することを特徴とし、前記溶液中の硫酸アンモニウム濃度が、5分当り0.1M〜0.2Mの量で増加し、1時間後の最終濃度が1.5M〜2Mになるまで、硫酸アンモニウムを前記のプロテナーゼKの水溶液に添加して、形成したプロテナーゼK沈殿物を単離することを特徴とする、硫酸アンモニウム沈殿による固形のプロテナーゼKの調製方法を提供する。
【００１７】
通常、沈殿が形成され始めるまで、攪拌しながら、硫酸アンモニウム溶液はタンパク質溶液に滴下される。通常、タンパク質の沈殿は平衡化のために15〜20分から約1時間まで要する。沈殿を行なった後、混合物を通常10,000gで15分間遠心分離し、沈殿物を回収する。通常硫酸アンモニウム沈殿は、0℃〜40℃の間の温度で行なわれる。本発明によると、約4℃〜8℃で作業をすることが好ましい。
【００１８】
硫酸アンモニウム沈殿の間、pH値は好ましくは約pH7.5である。沈殿、遠心分離および水による洗浄の後、固体のプロテナーゼK製剤は、保管されるか、または水性グリセロール溶液中に溶解されるかのいずれかでもよい。可溶化は、好ましくはかかるグリセロール含有水溶液に対する透析により行なわれる。
【００１９】
結晶状または分離水溶液（separate aqueous solution）としてのいずれかの硫酸アンモニウムの添加により、該溶液の容積は多量には増加しない。分離水溶液として硫酸アンモニウムを添加する場合、容積は通常約5％増加する。
【００２０】
本発明に従って、全ての所望の量、例えば1mg以上から、好ましくは500g以上までで、本発明による水不溶性のプロテナーゼKを生成することが可能である。
【００２１】
本発明による水不溶性のプロテナーゼKの結晶は、水に溶解した塩を含有する緩衝液を用いて、または純水で洗浄され得る。それにより、水不溶性のプロテナーゼKから水溶性の不純物が除去される。洗浄工程は繰り返され得る。従って、本発明の別の態様は、（a）プロテナーゼK水溶液に、5分当り0.1〜0.2M量の硫酸アンモニウムを、1時間後の最終量が1.5〜2Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することによって得られる、水に不溶な固体のプロテナーゼK製剤を提供する工程；（b）工程（a）で沈殿したプロテナーゼKを水または水性緩衝溶液（pH5.5〜7.5）に再懸濁する工程；（c）工程（b）の固体のプロテナーゼKを単離する工程、を含むプロテナーゼKの精製方法である。水性緩衝液が緩衝塩を含むことが好ましい。好ましくは、該緩衝塩はTris塩である。該緩衝液がアセテート緩衝液であることもまた好ましい。好ましいアセテート緩衝液はCaアセテート緩衝液である。
【００２２】
プロテナーゼKの結晶化は、X線結晶解析研究、例えばPaehler, A. EMBO J. 3(1984）1311-1314；Betzel, C.ら, Biochemistry 40(2001)3080-3088）に関係のある当該技術分野において公知である。しかしながら、かかるプロテナーゼK結晶は、X線結晶の通常の生産方法である、冷凍冷却（cryo-cooling）または微小透析法によって調製される。かかる結晶はさらに精製はされず、そのままX線調査に用いられる。また、かかる結晶化方法は、高純度品質の大量のプロテナーゼK結晶の生産には有用ではない。
【００２３】
本発明はさらに、本発明の方法により得られる、すなわちプロテナーゼK水溶液に、5分当り0.1M〜0.2M量の硫酸アンモニウムを1時間後の最終量が1.5M〜2Mになるまで添加し、沈殿したプロテナーゼKを単離することにより得られる、固形のプロテナーゼKの可溶化方法を提供し、可溶化は40％〜60％（w/v）の濃度のグリセロール水溶液を添加することにより行なわれることを特徴とする。
【００２４】
固体のプロテナーゼKの水への不溶性のために、本発明による固体のプロテナーゼK製剤は、プロテナーゼK溶液の添加の代わりに、試薬中の位置可溶化（situ solubilization）に用いられ得る。従って、本発明のさらなる目的は、水溶液中にタンパク質を含む装置において前記タンパク質を不活性化する方法であり、ここで前記タンパク質を不活性化するための量のプロテナーゼKを溶解するような量で、本発明による固体のプロテナーゼKおよびグリセロールを添加する。好ましくは、グリセロールの最終濃度は45％〜55％の間である。不活性化とは、タンパク質がポリメラーゼ活性またはヌクレアーゼ活性のような検出可能で特徴的な活性を示さないことを意味する。好ましくは、該タンパク質はポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼである。タンパク質の量は、好ましくは14〜20mg/mlの間である。
【００２５】
以下の実施例および参考文献は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の意図を逸脱することなく、示された手順において修正を行なうことができると理解される。
【実施例】
【００２６】
実施例１
溶解したプロテナーゼKの結晶化
水中で5mM CaCl2、5mM Ca-アセテート、1mM EDTA、pH7.5の 10mM TrisHClからなる緩衝液Iを調製する。緩衝液Iを４℃から８℃の間の温度に冷却する。市販のトリチラチウム・アルブム(Tritirachium album)由来のプロテナーゼK (EC-No. 3.4.21.14d)を凍結乾燥物として提供する。タンパク質濃度が19〜20mg/mlとなるように凍結乾燥物を緩衝液Iに溶解する。そのために、撹拌しながら凍結乾燥物を緩衝液にゆっくりと添加する。凍結乾燥物が完全に溶けるまで、緩衝液を撹拌する。混合物のpHを測定し、必要であればHClを用いてpH7.5の値に再調整する。
【００２７】
続いて、固体粉末状の硫酸アンモニウム塩結晶をゆっくりと継続的に混合物に添加する。硫酸アンモニウム塩結晶の混合物への添加速度は、混合物中の硫酸アンモニウム濃度が１時間以内に1.8M (290mg/ml)まで上がるように調節する。硫酸アンモニウムを混合物に添加する間、混合物を撹拌する。撹拌は硫酸アンモニウム濃度が1.8Mになる１時間の間続ける。
【００２８】
沈殿部分、すなわち得られた懸濁液の結晶化した物質を、遠心分離によって沈殿させる。上清は除く。
【００２９】
実施例２
プロテナーゼK結晶の洗浄
実施例１の手順で得られた結晶を、４℃から８℃の間の温度で緩衝液Iに再懸濁する。結晶を再懸濁する緩衝液Iの容量は実施例１の混合物の容量と同量程度にする。より少ない容量でもよい。続いて結晶を遠心分離によって沈殿させる。上清は除く。
【００３０】
あるいは、実施例１の手順で得られた結晶を、４℃から８℃の間の温度で水に再懸濁する。結晶を再懸濁する水の容量は実施例１の混合物の容量と同量程度にする。より少ない容量でもよい。続いて結晶を遠心分離によって沈殿させる。上清は除く。
【００３１】
実施例３
プロテナーゼK結晶の溶解
水中で5mM CaCl2、5mM Ca-アセテート、1mM EDTA、pH7.5の10mM TrisHCl、50％グリセロールからなる緩衝液IIを調製する。プロテナーゼK結晶を実施例１または実施例２の手順で得る。結晶を一定分量の緩衝液Iに再懸濁する。懸濁液を透析チューブに移し、緩衝液IIで透析する。
【００３２】
あるいは、実施例１の手順または実施例２の手順で得た結晶に多量の緩衝液IIを添加する。
【００３３】
実施例４
酵素活性
実施例１に記載した通り、最終濃度が19〜20mg/mlとなるようにプロテナーゼK凍結乾燥物を多量の緩衝液Iに溶解する。硫酸アンモニウム塩を添加する前に試料を溶液から取り、タンパク質分解活性を容量当りの活性として測定する。タンパク質分解活性はヘモグロビンを基質として用いて測定する。
【００３４】
沈殿工程後、上清中のタンパク質分解活性を測定する。水中または緩衝液I中の沈殿の再懸濁および懸濁液の遠心分離を含む各洗浄工程で、プロテナーゼK結晶を含む沈殿を3回洗浄する。結晶を再懸濁する液体の容量は、始めに凍結乾燥物を溶解した緩衝液Iの容量と等しい。各遠心分離工程後、試料を上清から取り、上清中のタンパク質分解活性を測定する。最後の洗浄工程後、凍結乾燥物を溶解した緩衝液Iの容量（上記参照）と同じ容量の緩衝液IIにプロテナーゼK結晶を溶解する。この工程中、結晶を完全に溶解し、澄んだ溶液を得る。再び、タンパク質分解活性を測定する。
【００３５】
上記のように得た試料で検出したタンパク質分解活性を、表１に要約する。緩衝液Iに溶解した凍結乾燥物から得られた容量当りの活性（Aactivity）に相対して、各試料の容量当りの活性を得る。
2007530061.tif 000002
【００３６】
参考文献一覧
Betzel, C. ら, Biochemistry 40 (2001) 3080-3088
DE 19 65 281
Ebeling, W.ら, Eur. J. Biochem. 47 (1974) 91-97
Paehler, A., EMBO J. 3 (1984) 1311-1314
Wiegers, U.およびHiIz, H., Biochem. Biophys. Res. Commun. 44 (1971) 513-519
【国際調査報告】
2007530061.tif 000003
2007530061.tif 000004
2007530061.tif 000005