(57)【要約】  配列：ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）を有する２６残基のペプチド（Ａｍ２７６６）は、インド南東の海岸で採取された軟体動物摂食性の巻貝、コヌス・アマジス（Conus amadis）の毒から単離及び精製された。化学改変及び質量分析研究により、Ａｍ２７６６が３個のジスルフィド結合を有するということが認められた。Ｃ末端のアミド化は、タンパク質分解により得られたＣ末端断片について質量計測することにより示された。配列比較により、Ａｍ２７６６が、δ−コノトキシン・ファミリーに属することが認められた。Ａｍ２７６６は、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現される脳ｒＮａｖｌ.２ａ電位依存性Ｎａ＋チャネルにおいて、ナトリウム電流の減衰を阻害する。以前に軟体動物摂食性の巻貝から単離されたδ−コノトキシンとは異なって、Ａｍ２７６６は、哺乳動物ナトリウム・チャネルの不活性化を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）を有する実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、ナトリウム・チャネル調節物質として使用される、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法であって、以下の：
（ｉ）前記ペプチドを単離し、そして
（ｉｉ）クロマトグラフィー方法により当該ペプチドを精製する
を含む、前記方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）のペプチドが、軟体動物摂食性の巻貝の毒から単離される、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記軟体動物摂食性の巻貝が、コヌス・アマジス（Conus amadis）である、請求項４に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記精製ステップ（ii）が、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により行われる、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記ペプチドが神経生理的障害及び神経障害の治療のために使用される、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群を含む神経生理的障害及び神経障害の治療のために使用される、請求項７に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
以下のアミノ酸配列：
ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）を有するペプチドを、医薬として許容される単体を伴うか又は伴わずに含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナトリウム・チャネルを調節する薬理学的に有用な化合物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
コノトキシン類は、多様なコヌス（Conus）種の巻貝により産生される薬理学的に活性なペプチドの群であり、興奮細胞における異なるクラスのチャネル及びレセプターに高い特異性で作用する（Myers, R. A., Cruz, L. J., River, J.E. and Olivera, B.M.(1993) Chem. Rev. 93, 192-1936; Olivera, B. M.,River, J., Clark, C., Ramilo, C. A., Corpuz, G.P., Abogadie, F.C., Mena, E.E., Woodward, S. R., Hillyard, D.R. and Cruz, L.J. (1990) Science249, 257-263)。捕食者である巻貝の毒中のコノトキシンの進化は、餌の性質により加えられる選択圧により影響されているようであり、軟体動物摂食性の巻貝、魚摂食性の巻貝、及び虫摂食性の巻貝由来のペプチド混合物は違いを示す（Olivera, B.M. (1997) Mol. Biol. Cell 8, 2101-2109)。コノトキシン混合物における全ての構成要素についての構造活性関係を系統立てて説明することは、個々のペプチド全ての単離及び同定が困難なことによって妨げられている。コノトキシン類は、複数のジスルフィド結合により特徴付けられており、それにより比較的硬いペプチド骨格フレームワークが提供され、それに基づいて薬理学的レセプターと相互作用するために重要なアミノ酸側鎖が配置されている（Wakamatsu, K., Kohda, D., Hatanaka, H., Lancelin, J.M., Ishi-da, Y., Oya, M., Nakamura, H., Inagaki, F. and Sato, K.)。コノトキシンの分類は、一次配列中におけるＣｙｓ残基の分布、ジスルフィド対形成トポロジーの性質、及びペプチドの機能的属性に基づいている（McIntosh, J.M., Olivera, B.M. and Cruz, L.J.(1999) Methods Enzymol. 294, 605-624; Gray, W.R. and Olivera, B.M. (1998) Annu. Rev. Biochem. 57, 665-700)。こうして最大で１４のクラスのコノトキシンが同定されてきた（α、αＡ、δ、ε、γ、κ、λ、λ/χ、μ、μＯ、ρ、σ、ω、及びΨ）。δ-コノトキシンは、電位依存性Ｎａ+チャネルの不活性化を阻害することが示された。Ｋ+チャネル・アンタゴニストκＰＶＩＩＡと組合せたペプチドκＰＶＩＡの具体的役割は、魚を捕食する巻貝（コヌス・プルプラセンス（Conus purpurascens））において餌の捕獲に重大であることが示された。異なる標的部位において協調して作用するペプチドの組合せ（カバルス（cabals））は、餌を即座に動けなくするために重要である（Terlau, H., Shon, K. J., Grilley, M., Stocker, M., Stuhmer, W. and Olivera, B.M.(1996) Nature 381, 148-151)。こうして同定されたδ-コノトキシンは、２７〜３２個のアミノ酸鎖長のポリペプチドをさらに有し、そしてあるパターン（１-４；２-５；３-６）の３個のジスルフィド結合を有する。ここで１〜６は、Ｎ末端から始めた６個のＣｙｓ残基を指す。Ｎａ+チャネルを標的する他のクラスのコノトキシンは、いままでのところδ-コノトキシンだけであり、δ-コノトキシンは、類似したジスルフィド結合パターンを有するが、１７〜２２アミノ酸鎖長の比較的短いポリペプチドである。複合混合物からδ-コノトキシンを単離することは、その疎水性のため難しい。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の要約
ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ-ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2の配列を有する２６個のペプチド（Ａｍ２７６６）は、インド南東の海岸で採取された軟体動物摂食性の巻貝、コヌス・アマディス（Conus amadis)の毒から単離及び精製された。化学改変及び質量分析研究により、Ａｍ２７６６は３個のジスルフィド結合を有することが認められた。Ｃ-末端のアミド化は、タンパク質分解におり得られたＣ-末端断片についての質量計測により示された。配列比較により、Ａｍ２７６６がδ-コノトキシン・ファミリーに属することが認められた。Ａｍ２７６６はチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定して発現された脳ｒＮａｖ１.２ａ電圧依存性Ｎａ+チャネルにおいてナトリウム電流の減衰を阻害する。以前に軟体動物摂食性の巻貝から単離されたδ-コノトキシンとは異なって、Ａｍ２７６６は、哺乳動物ナトリウム・チャネルの不活性化を阻害する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なペプチドを開示する。
当該ペプチドは、ナトリウム・チャネル調節物質として使用される。
実質的に純粋なペプチドを調製する方法は、以下の：
（i）  当該ペプチドを単離し、そして
（ii）  クロマトグラフィー法により当該ペプチドを精製する
を含む。
【０００５】
ステップ（i）におけるペプチドは、コヌス・アマジス（Conus amadis）の毒から単離される。
精製ステップ（ii）は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により行われる。
当該ペプチドは、神経生理的障害及び神経障害の治療に使用される。
当該ペプチドは、神経生理的障害及び神経障害、例えば、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群の治療に使用される。
【０００６】
ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドを、医薬として許容される担体を伴うか又は伴わずに含む医薬組成物に関する。
本発明は下記の実施例に開示されるが、制限するものとして考えるべきではない。
【実施例】
【０００７】
実施例１
ペプチドの単離
コヌス種のコヌス・アマジス（Conus amadis）は、インド南東の海岸から採取した。解剖した後に分泌腺を１００％エタノール中に貯蔵し、そして抽出された疎水性ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製にかけた。アルコール抽出された毒を先ずＨＰ１１００シリーズＨＰＬＣシステムで、Ｃ１８逆相カラム（Zobax、４.６×２５０ｍｍ、粒径５μＭ、孔径３００Å）を使用して精製した。さらなる精製を、Ｃ１８逆相カラムで行い、高分解能の分離を与えた（Jupiter, Phenomenex、10×250mm、粒径４μＭ、孔径９０Å）。０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水及びアセトニトリルを移動相として使用し、そして１.５ｍｌ/分の流速を維持した。２０％〜９８％アセトニトリルの直線勾配を実行した。吸光度を２２５ｎｍでモニターした。多数のピークを観測し、その中でＡｍ２７６６が主要ピークであり、そしてＣ１８カラム上への保持時間から明らかであるように極めて疎水性である。Ａｍ２７６６をさらなる化学同定に供した。
【０００８】
実施例２
化学改変
還元及びアルキル化：
精製されたペプチドを３０ｍｌの０.１Ｍ・ＮＨ4ＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８.０中に溶解した。還元については、２００ｍＭのストック・ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を終濃度８ｍＭになるように加え、そして３７℃で１.５時間インキュベーションした。この溶液に、ヨードアセトアミド・ストック溶液を、終濃度４０ｍＭになるように加え、そして混合液を暗室中室温で４５分インキュベーションした。反応混合液を、Ｃ１８カラムを通してエレクトロスプレー・イオン化質量分析計により分析した。
【０００９】
アセチル化：
ストック・アセチル化試薬を、２０ｍｌ無水酢酸と６０ｍｌメタノールを混合することにより調製した。３０ｍｌ、０.１Ｍ・ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８.０中に溶解したペプチドを、１ｍｌのストック・アセチル化試薬と混合し、そして室温で１時間インキュベーションした。反応混合液を、Ｃ１８逆相カラムを使用して、ＬＣ-ＥＳＩＭＳにより分析した。
【００１０】
タンパク質分解：
還元されそしてアルキル化されたペプチドの精製サンプルを、ＴＰＣＫで処理されたトリプシンとＴＬＣＫ処理されたキモトリプシン（Sigma、USA）を１０ｍｇの酵素量で含む５０ｍｌのＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８.０で３７℃にて３時間分解した。分解物をオンラインＬＣ-ＥＳＩＭＳにより直接分析した。
【００１１】
質量分析（ＭＳ）：
エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを、Hewlett Packardシングル４重極質量分析計（ＨＰ１１００ＭＳＤシリーズ）を使用して記録した。サンプルを、溶媒Ａ（０.１％酢酸）及び溶媒Ｂ（０.１％酢酸を伴うアセトニトリル）を用いて流速０.２５ｍｌ/分で逆相Ｃ１８カラム（Zorbax、４.６×１５０ｍｍ）を通して質量分析計に注いだ。陽イオンモードにおいて、ｍ/ｚ５０〜３０００の範囲にわたりデーターを得て、そしてＨＰ ＬＣ/ＭＳＤケムステーション（Chemstation）ソフトウェアを使用して分析した。
【００１２】
マトリックス支援レーザー脱離及びイオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）ＭＳ分析を、波長３３７ｎｍの窒素レーザーを備えるKompact SEQ（Kratos Analytical, Manchester, UK)質量分析計を使用して行った。等量のペプチド（０.５μｌ）を、０.１％ＴＦＡ及びアセトニトリル中に飽和されたマトリックス溶液（α-シアノ-４-ヒドロキシ桂皮酸）と混合することにより調製した（１：１）。
【００１３】
無傷のペプチドの分子量は、ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ-ＭＳを使用して測定された。ＥＳＩ-ＭＳは、[Ｍ+２Ｈ]2+（１３８４Ｄａ）及び[Ｍ+３Ｈ]3+（９２３Ｄａ）種の存在を明らかにし、これにより２７６６Ｄａの分子量を与えた。ＭＡＬＤＩ-ＭＳを使用して質量を同時に検出することにより、Ｎａ+及びＫ+に加えて、一ヶ所プロトン化された分子（２７６７Ｄａ）を明らかにした。Ｃｙｓ残基の数を測定するために、ＤＴＴで還元し、そして続いてヨードアセトアミドでアルキル化した。カルボキシアミドメチル化は、各Ｃｙｓ残基について５８Ｄａの追加質量を与える。ＥＳＩＭＳは、誘導体化されたＡｍ２７６６の分子量が、３１１４Ｄａであることを観測し、６個のＣｙｓ残基の存在に対応する３４８Ｄａの質量増加を示した。アセチル化されると、８４Ｄａの質量増加が検出され、２個の一級アミノ基が存在することを示唆し、これらは暫定的に遊離Ｎ末端と１つのリジン残基に割り当てることができる。慣用のエドマン配列決定に基づく還元された及びピリジルエチル化されたペプチドは、以下の配列：
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕを与える。ＥＳＩＭＳにより検出される正確な分子量は、２７６６Ｄａであり、一方エドマン・シーケンスの結果は、分子内に３個のジスルフィド結合を想定する場合、２７６７Ｄａの分子量に相当する。この１Ｄａの相異は、ペプチドのＣ末端アミド化、多くのコノトキシン類において見られる一般的な翻訳後修飾、のため生じているのかもしれない。
【００１４】
配列の特定：ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）
アミノ酸配列：
サンプルをトリ−ｎ‐ブチル・ホスフィンで還元し、そして４‐ビニル・ピリジンでアルキル化した。ピリジルエチル化ペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより再精製し、そしてアミノ酸配列を、Shimadzu PPSQ‐10シーケンサーにおいて自動化エドマン分解により分析した。
電気生理学：
チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で安定して発現されるラット脳ＩＩＡナトリウム・チャネル□−サブユニット（ｒＮａｖ１.２ａ）から、絶縁ナトリウム電流（isolated sodium currents)が計測される（Sarkar, S.N., Adhikari, A. and Sikdar, S.K. (1995) J. Physiol. 488, 633-645)。この電流を、ＥＰＣ‐８増幅器（Ｈｅｋａ）を使用する全細胞モードで、パッチクランプ技術を使用して記録した。パッチクランプ実験用のピペットを、ホウケイ酸ガラスから製造した（Clark electromedical Instrument, UK)。ピペットを磨いて、１〜３ＭΩの抵抗性を与えた。パッチクランプ記録用の溶液は、ピペット溶液及び浴槽溶液について：それぞれ１１６ｍＭ・ＣｓＣｌ、１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭエチレングリコール−ビス−（Ｌ‐アミノエチルエーテル）‐Ｎ，Ｎ,ＮＰ,ＮＰ‐４酢酸（ＥＧＴＡ）、０.５ｍＭ・ＣａＣｌ2；と１３５ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ・ＭｇＣｌ2、及び１.５ｍＭ・ＣａＣｌ2であり、ＮａＯＨでｐＨ７.４に調節したものであった。データの取得とパルス・プロトコルは、ｐＣｌａｍｐ８ソフトウェア、及びDigidata1320アナログ・トゥ・デジタル・コンバーター（Axon Instruments Inc.）で制御された。データーを３ｋHｚでローパスフィルターし、そして２０ｋＨｚでサンプリングした。１５℃で記録を行った。細胞を３８０ｍＶに維持した。トキシンを５０％エタノール中に溶解し、そして終濃度２００ｎＭを達成するように、ボーラスで浴槽に使用した。ナトリウム電流の変化は、トキシン添加の約４分後に見られた。アルコールの終濃度０.５％は、他の実験においてナトリウム電流の波形に影響を与えなかった。コヌス・ペプチド（２００ｎＭ）の使用は、＋４５ｍＶより大きい脱分極電位においてナトリウム電流の減衰の目立った遅延をもたらし、ナトリウム電流のピークのわずかな増加を伴った。
【００１５】
トリプシン及びキモトリプシンでの分解：
Ｃ末端のアミド化を確かめるために、還元されそしてアルキル化されたペプチドを、シーケンス品質のトリプシン及びキモトリプシンで分解した。観察された断片の質量は、予期された質量と比較された。Ｃ末端ペプチド（ＩＣＩＥ）の質量が５３２Ｄａであることが観察され、一方テトラペプチドの予期値は５３３Ｄａであり、Ｃ末端のアミド化を確認した。
【００１６】
実施例３
Ａｍ２７６６ペプチド：
巻貝摂食性の巻貝及び魚摂食性の巻貝の両方から由来するδ−コノトキシンの配列、並びにＮａ＋チャネルに活性を示すコヌス（Ｃｏｎｕｓ）のペプチドの幾つかの選択された配列が比較される（Shon, K. J., Hasson, A., Spira, M.E., Cruz, L.J., Gray. W.R. and Olivera, B.M.(1994) Biochemistry 33, 11420-11425; Fainzilber, M., Lodder, J.C., Kits, K.S., Kofman, O., Vinnitsky, I., Van Rietschoten, J., Zlotkin, E. and Gordon, D. (1995) J. Biol. Chem. 270, 1123-1129; Fainzilber, M., Kofman, O., Zlotkin, E. and Gordon, D. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2574-2580; McIntosh, J.M., Hasson, A., Spira, M.E., Gray, W.R., Li, W., Marsh, M., Hillyard, D.R. and Olivera, B.M. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16796-16820; Fainzilber, M., Nakamura, T., Gaathon, A., Lodder, J.C., Kits, K.S., Burlingame, A.L. and Zlotkin, E. (1995) Biochemistry 34, 8649-8656; Faintzilber, M., Gordon, D., Hasson, A., Spira, M.E. and Zlotkin, E. (1991) Eur. J. Biochem. 202, 589-595; Bulaj, G., DeLaCruz, R., Azimi-Zonooz, A., West, P., Watkins M., YOshikami, D. and Olivera, B.M. (2001) Biochemistry 40, 13201-13208; Hill, J.M., Alewood, P.F. and Craik, D.J. (1996) Biochemistry 35, 8824-8835; Cruz, L. J., Gray, W.R., Olivera, B.M., Zeikus, R.D.,Kerr, L., Yoshikami, D. and Mozydlowski, E. (1985) J. Biol. Chem. 260, 9280-9288).
【００１７】
この結果から、Ｃｙｓフレームワークがδ−コノトキシンに渡って完全に保存されている一方で、配列の明確なグループが存在し、軟体動物摂食性の巻貝と魚摂食性の巻貝由来のペプチドは、異なるクラスへ分けられるということが明らかになった。特に注目すべきは、魚摂食性の巻貝由来の配列における配列中の第二Ｃｙｓ残基と第三Ｃｙｓ残基との間のアミノ酸配列の保存と、軟体動物摂食性の巻貝由来の配列における第四Ｃｙｓ残基と第五Ｃｙｓ残基との間に存在する変化しないＧｌｙ残基である。標的チャネルの性質が、捕食者である巻貝におけるコノトキシン配列の選別に影響を与えうるということが考えられる。荷電残基及び疎水性残基の両者の全体における分布の違いは、δ−コノトキシン・サブグループ内でさえ観察される。コヌス・ゲオグラフス（Conus Geographus）から単離されたδ−コノトキシンは、正電荷がずっと多く分布し、短いポリペプチド鎖長を有し、そして配列にわたって、明らかに異なるＣｙｓ残基の分布パターンを有する。コヌス・マルモレウス（Coonus marmoreus）から単離されたμＯ‐コノトキシンＭｒ ＶＩＡは、アメフラシの神経のＮ+チャネルの強力なブロッカーであることが示されてきた（McIntosh, J.M., Hasson, A., Spira, M.E., Gray, W.R., Li, W. Marsh, M., Hillyard, D.R. and Olivera, B.M. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16796-16802)。シーケンス実験により、μＯ‐コノトキシンのＣｙｓフレームワークが、δ−コノトキシンのフレームワークに似ているということが示された。さらに、μＯ‐コノトキシンが、δ−コノトキシンに比較してずっと低い総正電荷密度を有しており、その全体としての総電荷の点でδ−コノトキシンに似ている。かなり短いコノトキシンＰｎ ＩＶＢが、コヌス・ペナセウス（Conus pennaceus）種から単離された。このペプチドは、特徴的なＮ末端ＣＣダブレットを有するが、Ｃ‐末端Ｃｙｓ残基が、δ−又はμ−コノトキシンのいずれかについて観測されるパターンに一致するようには見えない。当該ペプチドはまた、ナトリウム・チャネル阻害性質を有することが示された（Fainzilber, M., Nakamura, T., Gaathon, A., Lodder, J.C., Kits, K.S., Burlingame, A.L. and Zlotkin, E. (1995) Biochemistry 34, 8649-8656.)。様々なＮ+チャネルを標的するコヌス・ペプチドは、詳細な立体化学及び表面荷電分布の点でかなり変化するようである。当該構造の多様性は、当該生物の天然の餌のＮ＋チャネルの様々なサブタイプを特異的に標的する点で、当該生物体にとって確かに有利である。詳細な構造機能研究は、ペプチド配列と生理学的機能との間の確かな相関を確立するために、３次元構造の決定と共に特異的アミノ酸置換に関する詳細な構造機能研究が必要とされる。
【００１８】
実施例４
Ａｍ２７６６の製造方法
コヌス・アマジス（Conus amadis）からの精製：
コヌス種のコヌス・アマジス（Conus amadis）は、インド南東の海岸から採取された。解剖後の分泌腺を１００％エタノール中で貯蔵し、そして抽出された疎水性ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製にかけた。アルコール抽出された毒を、Ｃ１８逆相カラム（Zorbax, 4.6μ250mm,粒径5WM、孔径300AH）を使用して、HP1100シリーズ・ＨＰＬＣシステムで先ず精製した。更なる精製を、Ｃ１８逆相カラムで行って、高分解能の分離を与えた（Jupiter, Phenomenex, 10μ２５０ｍｍ、粒径４ｍM、AH孔径）。０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水及びアセトニトリルを移動相として使用し、そして１.５ｍｌ／分の流速を維持した。直線勾配を２０〜９８％アセトニトリルで実行した。吸光度を２２６ｎｍでモニターした。多くのピークを観測し、そのうちでＡｍ２７６６は、主要ピークであり、そしてＣ１８カラムへの保持時間から明らかであるように、極めて疎水性である。当該分画を回収し、そしてＨＰＬＣにより均一になるまで精製した。精製されたペプチドは、既知の方法により定量され、電気生理的活性について試験され、そして＋４℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【００１９】
ペプチドは、ペプチドを合成するために知られている方法を介して取得されてもよい。本発明がペプチド配列を記載し、そしてそれに基づき、各アミノ酸についての既知のトリプレット・コードからＤＮＡ配列が派生されるという事実を利用して、組換えＤＮＡ技術により当該ペプチドを製造することも可能である。こうして得られたＤＮＡ配列を合成することもでき、関連する遺伝子配列を、係るｃＤＮＡクローニング、ポリメラーゼ・チェーン反応などを使用して巻貝ＤＮＡから得ることができ、そして原核又は真核システムのいずれかにおいて、発現ベクター中にクローニングすることができる。こうして得られたクローンは、既知の方法によりペプチドＡｍ２７６６を産生するように遺伝子操作され、そして既知の方法によって均一になるまで精製することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月20日(2006.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）を有する実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、ナトリウム・チャネル調節物質として使用される、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法であって、以下の：
（ｉ）前記ペプチドを単離し、そして
（ｉｉ）クロマトグラフィー方法により当該ペプチドを精製する
を含む、前記方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）のペプチドが、軟体動物摂食性の巻貝の毒から単離される、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記軟体動物摂食性の巻貝が、コヌス・アマジス（Conus amadis）である、請求項４に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記精製ステップ（ii）が、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により行われる、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記ペプチドが神経生理的障害及び神経障害の治療のために使用される、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群を含む神経生理的障害及び神経障害の治療のために使用される、請求項７に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
以下のアミノ酸配列：
ＣＫＱＡＧＥＳＣＤＩＦＳＱＮＣＣＶＧ−ＴＣＡＦＩＣＩＥ−ＮＨ2（配列番号１）を有するペプチドを、医薬として許容される担体を伴うか又は伴わずに含む、医薬組成物。
【請求項１０】
統合失調症、てんかん、双極性障害、及び神経系に影響する症候群を含む神経生理的障害及び神経障害の治療用医薬組成物であって、医薬として許容される担体を伴うか又は伴わずに医薬として有効な量の配列番号１に記載のペプチドを含む、前記組成物。
【請求項１１】
統合失調症、てんかん、双極性障害、及び神経系に影響する症候群を含む神経生理的障害及び神経障害の治療用の医薬の製造における、配列番号１のペプチドの使用。
【国際調査報告】
2007530432.tif 000002
2007530432.tif 000003
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