(57)【要約】  本発明は、血液流のような流れの中で移動している赤血球のような粒子の速度を光走査顕微鏡を用いて測定する方法に関するもので、この方法は以下の工程を包含する：前記物体を含む平面をｘおよびｙ方向に光走査することにより画像を収集すること；前記画像収集時に前記物体の移動によって生じた筋を平面（ｘ、ｙ）上で検出すること；平面（ｘ、ｙ）上での前記筋の傾斜を決定すること；斯く決定した傾斜に基づいて物体の速度ｖｇを評価すること。【選択図】      図４
2007530197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液流のような流れの中で移動している顕微鏡的物体の速度を光走査顕微鏡を用いて測定する方法であって、以下の段階を包含することからなる方法：
−前記物体を含む平面をｘおよびｙ方向に光走査することにより画像を収集すること；
−前記画像収集時に前記物体の移動によって生じた筋を平面（ｘ、ｙ）上で検出すること；
−平面（ｘ、ｙ）上の前記筋の傾斜を決定すること；および、
−斯く決定した傾斜に基づいて前記物体の速度Ｖｇを評価すること。
【請求項２】
筋を検出する前記段階は以下の段階を包含することを特徴とする請求項１に基づく方法：
−フィルターを適用することにより画像の一組の筋を強調すること；
−閾値を適用することにより最も重要な筋を保存すること；
−これらの筋の各々に直線又は楕円を合わせること；および、
−前記筋を特定すること。
【請求項３】
前記物体の速度Ｖｇは次式によって与えられることを特徴とする請求項１又は２に基づく方法：
Ｖｇ・cos（θ）＝Ｖｙ／tan（α）
ここで、 Ｖｙは走査に用いる光スポットの垂直速度であり、“α”は水平軸“ｘ”と筋との間の角度である。
【請求項４】
角度θは前記物体を搬送する血管の縁を検出することにより得られることを特徴とする請求項３に基づく方法。
【請求項５】
角度θを得るため、前記物体を有限高さＤを有する垂直な棒と同視すると共に、角度θを次式に基づいて計算することを特徴とする請求項３に基づく方法：
【数１】
2007530197.tif 000016
【請求項６】
Ｖｇ・sin（θ）＜Ｖｙの場合には：
【数２】
2007530197.tif 000017
を特徴とする請求項５に基づく方法。
【請求項７】
Ｖｇ・sin（θ）＞Ｖｙの場合には：
【数３】
2007530197.tif 000018
を特徴とする請求項５に基づく方法。
【請求項８】
同じ平面の第２の画像を、但し逆走査において収集し、かつ、次式を使用することを特徴とする請求項３に基づく方法：
【数４】
2007530197.tif 000019
【請求項９】
｜Ｖｇ・sin（θ）｜＜｜Ｖｙ｜の場合には：
【数５】
2007530197.tif 000020
（ここで、 Ｌは第１方向の走査における筋の長さであり、 Ｌ’は逆走査時の筋の長さである）
を特徴とする請求項８および５に基づく方法。
【請求項１０】
｜Ｖｇ・sin（θ）｜＞｜Ｖｙ｜の場合には：
【数６】
2007530197.tif 000021
を特徴とする請求項５および８に基づく方法。
【請求項１１】
Ｖｇ・sin（θ）＝Ｖｙの場合には、Ｖｇおよびθを決定するには更に次式を使用することを特徴とする請求項３に基づく方法：
【数７】
2007530197.tif 000022
【請求項１２】
前記物体は赤血球であり、収集した画像上のその形状を曲率半径Ｒの楕円と同視し、前記楕円のうち前記筋と軸“ｘ”との間の角度αは次によって与えられ：
【数８】
2007530197.tif 000023
主軸の長さは：
【数９】
2007530197.tif 000024
によって与えられることを特徴とする請求項３に基づく方法。
【請求項１３】
共焦点顕微鏡を使用することを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項１４】
ファイバモードの光走査顕微鏡を使用することを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項１５】
非ファイバ式の光走査顕微鏡を使用することを特徴とする請求項１から１３のいづれかに基づく方法。
【請求項１６】
血液流のような流れの中で移動している顕微鏡的物体の速度を測定するために使用する光走査顕微鏡装置であって、この装置は前記請求項のいづれかに基づく方法を実施するもので、この装置は：
−前記物体を含む平面をｘおよびｙ方向に光走査することにより画像を収集する手段と；
−前記画像収集時に前記物体の移動によって生じた筋を平面（ｘ、ｙ）上で検出する手段と；
−平面（ｘ、ｙ）上での前記筋の傾斜を決定する手段と；
−斯く決定した傾斜に基づいて前記物体の速度Ｖｇを評価する手段、
とを備えていることからなる装置。
【請求項１７】
筋の検出の際には、この装置は：
−フィルターを適用することにより画像の一組の筋を強調する手段と；
−閾値を適用することにより最も重要な筋を保存する手段と；
−これらの筋の各々に楕円を合わせる手段と；
−前記筋を特定する手段、
とを備えていることを特徴とする請求項１６に基づく装置。
【請求項１８】
共焦点顕微鏡を使用することを特徴とする請求項１６又は１７に基づく装置。
【請求項１９】
ファイバモードの光走査顕微鏡を使用することを特徴とする請求項１６から１８のいづれかに基づく装置。
【請求項２０】
非ファイバ式の光走査顕微鏡を使用することを特徴とする請求項１６から１８のいづれかに基づく装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液流のような流れの中で移動している顕微鏡的物体の速度を光走査顕微鏡を用いて測定する方法に関する。
【０００２】
本発明は、特に、但し非排他的に、移動中の赤血球又は白血球のような粒子を検出し、これらの粒子の移動方向並びにそれらの速度を評価するのが困難であるような、微小循環の研究に利用される。
しかし、本発明は、ミクロ流体学のような他の分野にも適用することができる。
【背景技術】
【０００３】
イメージング装置を用いて物体の移動速度を評価することは、従来、この移動中の物体を表す画像のシーケンスを用いて行われている。基本的な仮定は、イメージング装置の画像収集レートは物体が１つの画像から次の画像へと小さな変位を行うようなものである、ということである。画像の時系列上の複数の異なる位置に物体が存在することは、画像収集装置の較正により、物体の速度を求めるのを可能にする。
【０００４】
２スリット式測光法を記述したH. WaylandおよびRC. Johnsonの文献「２スリット式測光法による微小血管内における赤血球の速度の測定」（J. Appl. Physio. 22(2): 333-337, 1967）が知られている。２スリット式測光法による測定はおそらく最も古い血液流速度自動測定技術である。この方法は赤血球の速度を測定するもので、好ましくは孤立した又は小さな凝塊となった血球が一列に循環するような毛細血管および小静脈に適用される。測定はシーケンスを映すスクリーン上に配置した２つのスリットを用いてビデオシーケンスについて行われる。２つのスリットは平行で、測定を行う血管に垂直に配置してある。１つのフォトダイオードが２つのスリットの各々の前に配置してある。使用される装置は２つの測定モードを提案している。第１のモードでは、２つのスリットは（組織に対して等価的な距離だけ）４５μｍ〜７０μｍ離間してある。速度の測定は２つのフォトダイオードから出力された２つの信号の相関関係を計算することによって行われる。第２の測定モードでは、２つのスリットは非常に近づけてある：組織と等価的な距離の７.４μｍ、即ち、赤血球の平均直径よりも僅かに小さな距離。その結果、上流側のダイオードと下流側のダイオードとによって夫々発生された前後２つの信号は同一の血球によって生じたものであり、従って、この血球の速度を計算することができる。しかしながら、この方法の制約は、観察を１つの赤血球に限定するために非常に細い血管に対して測定を行う必要があるということであり、かつ、測定された速度は、毎秒３０画像という画像頻度の故に、２ｍｍ／ｓを超えることが出来ないということである。
【０００５】
また、時空間投影法（“ライン・シフト・ダイアグラム”）が知られている。この方法は前記方法の延長である。信号を２点でサンプリングする代わりに、ユーザは関心のある領域（血管に内接する矩形）を選ぶ。各画像毎に、血管の軸の各点において血管の幅にわたってグレーレベルの平均を計算し、関心のある領域の信号を一次元で血管の軸上に投影する。次に、各画像毎に得られた単次元の信号を垂直方向に整列させて、血球の軌跡を示す時空間画像を生成する。速度は隣り合う信号を相関させることにより評価される。この方法は、画像収集装置Cytoscan（登録商標）と組み合わせて、ソフトウェアCapImage（登録商標）およびCapiscope（登録商標）に使用されている。このような方法は、特に、 W. Groner、I.W. Winkelman、A.G. Harris、G. Inde、G.I. Bouma、K. Messmar、およびR.G. Nadeauの文献「直交偏光分光イメージング：微小循環の研究のための新たな方法」（Nature Medecine、5、1209-1213、1999）に記載されている。主な制約は、測定された速度範囲が、画像頻度（ビデオフローの織りまぜた２つの視野について測定を交互に行う場合には、毎秒２５画像又は毎秒５０画像）の故に、２ｍｍ／ｓを超えることが出来ないということである。
【０００６】
SLO（Scanning Laser Ophtalmoscope。レーザ走査検眼鏡）は非ファイバー式共焦点顕微鏡の原理に基づく装置である。画像は織りまぜ画像毎秒５０のレートで取得される。この装置で使用されている速度測定方法は細胞追尾に基づいている。１つの同一の画像は２０ｍｓだけ隔たった２つの瞬間に対応する織りまぜた視野からなり、従って、移動中の１つの血球は画像上で２つの異なる領域（一度は偶数ラインに、次は奇数ラインに）に現れる。一旦、血球の２つの画像が特定されたならば、速度の測定は直ぐである。装置の大きな視野（1200μｍまで）は数ｃｍ／ｓの速度の測定を可能にする。この装置の制約は主として血球の追尾に因る：即ち、マークした血球はサイズが大きく（白血球の場合１２μｍ）、数が少ないことが必要である。このような方法は、サイズが小さく（７〜８μｍ）、濃度が遥かに大きな（白血球の濃度より1000倍大きい）、マークするのがより困難な、赤血球の速度の測定には適用できないように見受けられる。
【０００７】
従来Cytoscan（登録商標）又はSLOとリンクされている他の測定方法は、ドップラー効果による赤血球速度の測定である。ドップラー効果は、観察者に対して移動している物体によって反射された波が受ける周波数のずれを説明する。血液流の場合には、移動している物体は赤血球である。所与の波長の単周波数の波（例えばレーザ）が血管に発射される。ドップラー効果による速度測定は非常に迅速かつ精密であるという利点がある。使用するハードウェアと分析用ソフトウェアに応じ、測定可能な最大速度は１ｍｍ／ｓから数ｃｍ／ｓまでである。ドップラー方式の不都合は、速度を測定している領域（特に、深度）を精密に特定するのが困難であるということである。反射光は血液が異なる速度で流れている異なる血管から来ることがある。
【０００８】
更に、時空間分析による方法も知られている。白血球の速度を測定するためのこの方法は佐藤よしのぶ等の文献「時空間画像分析を用いた微小循環の測定」（CVRMed、302-308頁、1995）に記載されている。この分析は３つの主要段階からなる： i）先ず、シーケンスのフレームのピクセルの時間的分散量のヒストグラムに対して行うセグメンテーションによって画像から血管を抽出する。 ii）それから、血管の相継ぐ複数の画像から時空間画像を形成する。この画像は、シーケンスの各画像が血管の軸又は輪郭上に投影される場合には、三次元又は二次元であり得る。 iii）白血球の移動によって時空間画像内に残された軌跡は次いで選択的な向きのフィルター群（例えば、ゲイバー・フィルター群）を適用することによって増強される。これらの軌跡は最良の応答のカットオフによって抽出される。最後の段階は複数の軌跡を互いに接続して、白血球の全軌跡を再構成することからなる。これらの軌跡を得れば、次いでそれらの接線を計算することにより、白血球軌跡上の白血球の速度を評価することが可能になる。
【０００９】
同じく時空間分析の分野においては、以下の文献が知られている：
−「新皮質微小循環の２光子イメージング」D. KleinfeldおよびW. Denk; Imaging Neurons誌: A Laboratory Manual (R. Yuste, F. Lanni, および A. Konnerth,編集) , 1999, CoId Spring Harbor Laboratory Press, NY, pp. 23.1-23.15; インターネット上で次のアドレスでアクセス可能:  http://physics .ucsd.edu/neurophysics/publications/kleinfeld_denk_c shl_2003.pdf; および、
−「嗅覚糸球体における毛管血液流の２光子イメージング」E. Chaigneau等, PNAS, 28 Octobre, 2003; 100(22): 13081 - 13086; インターネット上で次のアドレスでアクセス可能: http://www.pnas.org/cgi/content/full/100/22/13081。
【００１０】
これらの文献は、非ファイバー式顕微鏡を用いて血管の軸に沿って相継いで複数の走査を行いながら速度を測定する方法を記載している。こうして相継ぐ異なる瞬間における同一のセグメントの複数の“単次元”画像が得られる。これらの画像は縦座標が時間マークであるような全体可視像を形成するべく端−端突き合わせで配置される。血管中の粒子の移動は斜めの帯の形で示される。全体可視像上の夫々の帯の傾斜を計算することにより瞬間速度を計算する。しかしながら、この方法の不都合は、画像収集装置を血管の軸に対して平行に位置決めすることが不可欠であるということである。更に、全体可視像を構成するには同一のセグメントの複数の画像の収集が必要である。
【００１１】
前述した技術の大部分においては、速度の測定は１回の画像収集の相継ぐ少なくとも２つの画像相互の分析に基づいている；これは、更に、ぶれの問題と画像相互を対応させる問題を生じる。従って、これらの技術によって測定可能な速度範囲は視野に依存していると共に画像頻度に依存している。ところが、視野が小さく（例えば、166μｍ×118μｍ程度）、かつ、画像収集レートが例えば毎秒１２画像のオーダーの走査式イメージング装置の場合には、１.８ｍｍ／ｓより大きな速度で移動している粒子は相継ぐ２つの画像の間の観察視野を通過するであろう。これは前述した技術の大部分の使用を不可能にする。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、特に赤血球の速度を測定することの可能な方法を提供することにより、叙上の不都合を改善することを目的とするものである。
本発明の目的は、走査式イメージング装置を用いて、急速に移動している粒子の速度を測定することである。急速な移動とは、約２ｍｍ／ｓを超える速度を言う。
【００１３】
上記目的は、血液流のような流れの中で移動している例えば赤血球や白血球のような顕微鏡的物体の速度を光走査顕微鏡を用いて測定する方法によって達成される。本発明によれば、この方法は以下の段階を包含する：
−前記物体を含む平面をｘおよびｙ方向に光走査することにより画像を収集すること（この平面は、検体又は生物組織内の数μｍのところに位置する表面下イメージングフィールドとも言われる）；
−前記画像収集時に前記物体の移動によって生じた筋を平面（ｘ、ｙ）上で検出すること；
−平面（ｘ、ｙ）上の前記筋の傾斜を決定すること；および、
−斯く決定した傾斜に基づいて前記物体の速度Ｖｇを評価すること。
【００１４】
共焦点式の又はそうでない、光走査式の、特にレーザ走査式の、ファイバモードの又は非ファイバ式の、顕微鏡を使用することができる。非ファイバ式の実施例を実施するためには、電子処理機器を応用することにより、SLOタイプの装置、又は、（ｘ、ｙ）走査式の他のあらゆる画像収集装置を使用することができ、後者の走査速度は本発明の方法の実施に適合せられる。
【００１５】
以上に加えて、非限定的に、共焦点式の又はそうでない、レーザ式の、ファイバ付きの、特に単ファイバ式の、遠位端走査式の顕微鏡を使用することができる。この遠位端走査はマイクロミラーによって、レンズ若しくは光学素子の変位によって、分光走査等によって行うことができる。また、光走査が被観察物体に近い光学ヘッド内での光ファイバの一端の偏向によって得られるような近位端走査式の単ファイバ式装置を使用することができる。
【００１６】
血管の軸上の同一のセグメントの一連の“単次元”画像を得るようになったKleinfeldおよびChaigneauの時空間分析法とは異なり、本発明においては、二次元平面走査によって収集した唯一の画像を使用する。
【００１７】
従来技術において時空間画像（ｔ＝ｆ（ｘ））上で筋を測定するのに対して、本発明では、筋は平らな画像（ｙ＝ｆ（ｘ））から出力されるので、筋は完全に異なっており、時間の概念は点から点へと“Ｚ”状に走査する装置内で生じる。好ましくは、形態論的な画像を使用する。例えば、従来技術の佐藤よしのぶの文献においては、筋を得るために、複数の画像を形成し、各画像内で唯一本の線を抽出し、こうして最終画像（ｔ＝ｆ（ｘ））を作り上げる。
【００１８】
走査式イメージング装置においてはイメージ生成時間（フレーム走行時間）の間は移動中の物体が観察されるので、走査式イメージング装置を使用すれば筋が現れることになり、１つだけの画像に基づいて移動中の物体の速度を評価することが可能になる。これらの筋は、従って、運動中の物体と走査装置との相互作用から生じる。当業者は一般にこれらの筋は走査式イメージング装置においては除去すべきノイズであると考えているので、本発明は特に注目すべきである。即ち、レーザ走査顕微鏡（特にファイバモードのもの）において収差と考えられている要素を利用する。このため、本発明は筋を検出する段階を包含し、この段階では以下の工程を実施する：
−フィルターを適用することにより画像の一組の筋を強調すること；
−閾値を適用することにより最も重要な筋を保存すること；
−これらの筋の各々に直線又は楕円を合わせること；および、
−前記筋を特定すること。
【００１９】
本発明によれば、走査速度の大きさの程度と被観察物体の速度の大きさの程度とを考慮すれば、光スポットの軌跡のモデルを簡素化することができる。第１の簡素化は、スポットの軌跡は画像収集ウインドウ上の水平線であると考えることからなる。この簡素化は、スポットの水平速度と垂直速度との間に存在する比が１０００であることによって正当化されるもので、計算によればスポットの垂直位置は画像収集ウインドウ上で０.１μｍ以下で変動することが確認された。
【００２０】
第２の近似化は、スポットが画像収集ウインドウを水平方向にカバーするために要する時間は無視できると考えること、即ち、１本の走査線が走行する間は物体は動かないと考えることである。スポットの水平速度（＞１ｍ／ｓ）に対する被観察物体の速度（検討中の血管においては、赤血球は２０ｍｍ／ｓより小さい速度を有する）はこの近似を正当化する。
【００２１】
最後に、走査は空間的に距離Ｖｙ／ｆｘ（ｆｘは“ｘ”走査の周波数）だけ離間された瞬間水平走査線によってモデル化される。
【００２２】
一旦、走査がモデル化されると、運動中の物体（例えば、赤血球）をモデル化しなければならない。赤血球を記述するために幾つかのモデルが考えられた：単純な棒からリアルな三次元モデルまで。
【００２３】
観察された変形を考慮することの可能な最も簡単なモデルは、垂直な棒によって赤血球を表すことからなる。このモデルを使用する場合には、観察された筋の角度α（“ｘ”軸に対する）を垂直走査速度Ｖｙと血球の水平移動速度とに結びつける簡単な式を得る：
【数１０】
2007530197.tif 000003
式中、Ｖｙは走査に用いる光スポットの垂直速度、Ｖｇは求める血球速度、θはベクトルＶｇと迅速走査のｘ軸との間の角度である。tan（α）は筋の傾斜である。
【００２４】
血球の軌跡が物体を搬送する血管の縁に対して共線的であると仮定される場合には、血管の縁を検出することによりθを知ることができ、従って、血球の速度Ｖｇにアクセスすることができる。
【００２５】
θが未知であるが筋の長さＬが既知であるような一般的な場合には、２つの可能性が考えられる。
【００２６】
１）血球のサイズＤが既知である。
この場合には、ｔｖは血球の視認可能性の時間であると考えられ、これは軌跡の最初の交差と最後の交差との間で流れる時間として定義される。血球は垂直速度Ｖｇsin（θ）と垂直方向広がりＤを有する。従って、物体を、複数の水平走査線にわたって広がるべく充分に大きな有限長さを有する、流れの方向に対して垂直な棒と同視する。スポットは点状であって、垂直速度Ｖｙを有し、従って、ｔｖはスポットおよび血球の垂直速度と、次式によるＤとの差のみに依存している：
【数１１】
2007530197.tif 000004
【００２７】
観察中の筋の垂直方向広がりＬ｜sin（α）｜および水平方向広がりＬ｜cos（α）｜は、次式によりｔｖとスポットの垂直速度および血球の水平速度に直接に関連している：
【数１２】
2007530197.tif 000005
【００２８】
式（２）および（３）は次のように記述することができる：
【数１３】
2007530197.tif 000006
【００２９】
これは、式（１）と組合わさって、２つの未知数θとＶｙをもった２式系を与える。解はＶｙ−Ｖｇsin（θ）の符号に基づいて（即ち、スポットが血球よりも垂直方向により速く移動するかより遅く移動するかに基づいて）行われなければならない。
【００３０】
２つの速度が等しい場合には、視認可能性の時間は無限になり、筋は無限に長くなる。その場合にはＶｇsin（θ）＝ Ｖｙになり、式（１）に代入することにより、tan（α）＝ tan（θ）となる。従って、筋は正確に血球の軌跡であり、速度Ｖｇは次によって与えられる：
【数１４】
2007530197.tif 000007
【００３１】
光スポットが血球よりも速く垂直方向に移動する場合（Ｖｙ＞Ｖｇsin（θ））には、系（３）の解は次によって与えられる：
【数１５】
2007530197.tif 000008
【００３２】
光スポットが血球よりも遅く垂直方向に移動する場合（Ｖｙ＜Ｖｇsin（θ））には、系（３）の解は次式によって与えられる：
【数１６】
2007530197.tif 000009
【００３３】
２）逆走査が使用できる場合：
前述したものとは逆（即ち、垂直速度が−Ｖｙ）の、他の走査を使用する場合には、角度が−αで長さがＬ’の筋が観察されるであろう。Ｌ’は次により与えられる：
【数１７】
2007530197.tif 000010
【００３４】
式（４）と式（８）との比は次のように記述することができる：
【数１８】
2007530197.tif 000011
２つのケースは区別されなければならない：即ち、｜Ｖｙ｜＞｜Ｖｇsin（θ）｜と｜Ｖｙ｜＜｜Ｖｇsin（θ）｜（もしＶｙ＝Ｖｇsin（θ）ならば、式（５）が適用される）。
【００３５】
もし｜Ｖｙ｜＞｜Ｖｇsin（θ）｜ならば、解は次を与える：
【数１９】
2007530197.tif 000012
【００３６】
もし｜Ｖｙ｜＜｜Ｖｇsin（θ）｜ならば、解は次を与える：
【数２０】
2007530197.tif 000013
【００３７】
前述したすべてにおいて、赤血球のような物体は長さＤの垂直な棒と同視される。当業者は、この仮定をよりリアルな球（又は、円盤）又は楕円又はもっと複雑な構造の仮定と置換することができること、および、この場合に観察された状態と単純な場合に観察された状態との間のずれを評価することができることを、容易に理解できるであろう。求める精度に応じて、このずれを考慮することができるであろうし、考慮しないこともできる。
【００３８】
例として、赤血球は中実の球又は回転対称を有する両凹形状の形で表すことができる。これら２つの場合において、観察平面における直交投影は曲率半径Ｒの円盤と同視される。収集した画像上では、この運動中の円盤は楕円として現れ、この楕円の筋と“ｘ”軸との間の角度αは次式で与えられる：
【数２１】
2007530197.tif 000014
【００３９】
主軸の長さは次式で与えられる：
【数２２】
2007530197.tif 000015
【００４０】
赤血球を表すより複雑なモデル（トロイダル表面）を用いて数値シミュレーションを行ったところ、円盤のモデルは赤血球を表すのに充分であることが分かった。
【００４１】
血球の軌跡の向きθが未知であるが、筋の長さＬが利用できる場合には、速度情報を部分的に計算することができる。式（１２）および（１３）は、画像収集時に観察可能なパラメータである対（α、Ｌ）を、求めるパラメータである対（θ、Ｖｇ）に結びつける系を形成する。
【００４２】
本発明の他の観点によれば、本発明は、血液流のような流れの中で移動している顕微鏡的物体の速度を測定するために使用するファイバモードの光走査式共焦点顕微鏡装置を提供するもので、この装置は：
−前記物体を含む平面をｘおよびｙ方向に光走査することにより画像を収集する手段と；
−前記画像収集時に前記物体の移動によって生じた筋を検出する手段と；
−前記筋の傾斜を決定する手段と；
−斯く決定した傾斜に基づいて前記物体の速度Ｖｇを評価する手段、
とを備えている。
【００４３】
本発明の他の利点や特徴は非限定的な実施例の詳細な説明と添付図面から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
次に、ファイバモードのレーザ走査式共焦点顕微鏡において実施する本発明の方法を説明するが、本発明はこれに限定されない。この方法は以下のようなオーダーの大きさをもった微小循環の分野に適用される：
−細動脈は５０μｍ〜１００μｍの直径を有する；毛細血管は遥かにより細く、直径は３μｍ 〜８μｍである；最後に、小静脈は３０μｍ〜５０μｍの直径を有する；
−血管中の赤血球の速度は、最も小さな血管の場合の１ｍｍ／ｓ以下から動脈の場合の数拾ｍｍ／ｓまでの範囲に含まれる；
−赤血球は、白血球の直径１０μｍ〜１５μｍに比較して、平均直径が約７μｍの細胞である。
【００４５】
一般に、本発明を実施するためには、文献WO 2004/008952A1「光ファイバによる特に共焦点イメージング式の高解像度蛍光イメージング方法および装置」（マウナ  ケア  テクノロジーズ）に記載された装置に基づくことができる。この装置においては、数千本の光ファイバからなるイメージガイドが使用され、励起信号は１つの光源から発射され、偏向され、イメージガイドのいづれかの光ファイバに交わる交わる導入され、組織の各励起点はファイバを出たところで戻りに蛍光信号を発光し、この蛍光信号は当該ファイバによって回収され、次いで検出され、デジタル化されて、画素を形成する。第１の観点によれば、文献WO 2004/008952A1に記載された方法は、ファイバから出たビームを集束させて、表面下の平面を励起すると共に共焦点画像を形成する。第２の観点によれば、この方法は、ファイバを出たところで表面から組織のマイクロボリュームを励起することの可能な拡散ビームを生成する。励起信号はリアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の取得に対応する速度で偏向され、蛍光信号はファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に対応する検出周波数で検出される。
【００４６】
図１には、イメージガイド１を構成する整頓された可撓性光ファイバの束が示してあり、その近位端には光源２とファイバを１本づつ照射するためのファイバ導入装置とがあり、その遠位端には照射されたファイバから出るビームを観察中の物体４の所与の深さのところに位置する点に集束するための光学ヘッド３がある。導入装置は、ファイバを１本づつ非常に高速で走査することの可能な偏向器のようなファイバ走査装置６が前置された複数の光学素子５からなる。夫々のファイバは、照射用ビームと、観察中の物体から来る対応する戻りビームとを伝送するために、交わる交わる使用される。空間的解像度は、レーザ光を一点に集束させることと、照射に使用したのと同じファイバによって観察中の物体の空間的濾過が行われるという共焦点特性により得られる。これは、フォトセンサ９によって、観察中の物体から来る信号のみを受け取り、点から点へと１つの画像を形成するのを可能にする。
【００４７】
イメージガイド１は直径が２μｍで３.３μｍだけ離間された非常に多数の可撓性光ファイバ（例えば30,000ファイバ）からなる。実際には、イメージガイドのファイバの全部を使用することもできるし、或いは、これらのファイバの選ばれた例えばセンタリングされたサブアッセンブリを使用することもできる。
【００４８】
検出された信号を制御し、分析し、デジタル処理して、表示するための電子情報処理手段７は、次のようなカードを有する：
−次の機能を有する同期カード８：
−走査を同期方式で制御する機能；
−このように走査されたレーザスポットの位置をあらゆる瞬間において知る機能；および、
−マイクロコントローラ（それ自身も制御され得る）を介して他のすべてのカードを管理する機能；
−特にインピーダンスの適合を行うアナログ回路と、アナログ・デジタル変換器と、次に信号を成形するプログラム可能な論理回路（例えば、FPGA回路）とを備えた検出カード９；
−可変周波数のデジタルデータの流れを処理してスクリーン１１に表示することの可能なデジタル収集カード１０；
−グラフィックカード１２。
変化形として、これらの異なるカードの機能を集積した単一のカードを使用することができる。
【００４９】
これらの電子情報処理手段７は、本発明の方法の諸段階を実行することが可能であって、赤血球速度の計算に必要な処理手段を備えたマイクロコンピュータの形で提供することができる。
【００５０】
図２は図１のイメージング装置の走査態様を示す非常に簡素化した図である。走査用レーザスポットは破線１３で表してあり、矩形の走査ウインドウ１４内で従来型の走査軌跡を描く。レーザスポット１３の軌跡は上から下へと“Ｚ”形である。水平軸Ａｘに沿った水平速度Ｖｘは、軸Ａｙに沿った速度Ｖｙに比較して非常に大きいと仮定される。この仮定は、２つの水平走査の間でスポットが血球を再捕捉するに要する時間を無視することになる。これは、また、偶数線上で観察された効果を奇数線上で観察されたものと混同させる。例として、速度Ｖｙは３ｍｍ／ｓであり得るのに対して、速度Ｖｘは５ｍ／ｓであり得る。
【００５１】
図２においては、また、走査ウインドウ１４の内側に、イメージガイド１が横断方向断面図で示してある。光ファイバは整頓された円の形で示してある。イメージング領域１５は矩形の内側に位置する限られた数の光ファイバにしか対応しない。レーザビームは各光ファイバ内に相継いで導入される。図３に示した画像は、１つの画像収集をシミュレーションしたものである（即ち、各ファイバにはビームがたった一度しか導入されていない）。この画像には走査装置と移動中の粒子との相互作用に対応する斜めの筋が現れる。
【００５２】
これらの筋の発現は、赤血球の画像と画像形成メカニズムとの相互作用によって説明される。レーザスポットはＺ形の軌跡に沿って走査を行い、測定はレーザの全位置について行われる（例えば、640ラインのライン毎に896測定）。移動中の１つの赤血球は走査ライン上で所与の位置で交差せられるであろう。次のラインでは、この赤血球は再び交差されるが、前回のラインに対してずれている。この現象は走査ラインと血球との交差が存在する限り続く。この現象は、こうして、筋の傾斜が赤血球の速度の関数であるような１本の筋を生成する。
【００５３】
図４には、１つの画像を収集した後の筋が示してある。カットオフは最も重要な筋しか保存しないことを可能にする。次に、傾斜を画定することの可能な楕円で夫々の筋を取り囲む。電子情報処理手段７はそれから夫々の筋の傾斜を決定して、各赤血球の速度を計算する。
【００５４】
本発明は、従って、１つの画像だけに基づいて速度を決定するのを可能にする。これは特にぶれの問題と画像を対応させる問題を回避するのを可能にする。本発明は、有利なことに、視野および画像収集頻度に比べて大きな速度を検出するのを可能にする。例として、１１Hzの画像収集装置は５〜２５ｍｍ／ｓのオーダーの速度（則ち、従来技術の大部分では評価することが不可能な速度）を検出するのを可能にする。
【００５５】
好ましくは、垂直移動がスポットに達しないような血球の速度を測定する。一般に、軌跡の角度は、水平と、血球の垂直速度がスポットの垂直速度に等しくなるような臨界角との間に位置しなければならない。
【００５６】
勿論、本発明は前記実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を加えることができる。特に、精度を高めるために複数の筋について、即ち、複数の画像について測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は本発明の方法を実施するファイバ式共焦点イメージング装置の実施例の概略図である。
【図２】図２は図１のイメージング装置の走査態様を示す非常に簡素化した図である。
【図３】図３は筋を表す概略的画像であり、この画像はシミュレーションによるデータ収集から出力されたものである。
【図４】図４は筋を選択する段階の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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