(57)【要約】  本発明は、薬理学、獣医学、農業、診断、標的評価、及び遺伝的発見での使用を含む様々な用途において、遺伝子発現を調節するのに有用な方法及び核酸系試薬に関する。特に、細胞、組織又は器官のような生物学的システムにおける一以上の遺伝子の発現を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して、調節する多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子に関する。本発明の二機能性短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子は、単一の標的核酸分子における核酸配列の１つ以上の領域をターゲットでき、又は、異なる標的核酸分子における領域をターゲットできる。自己多機能ｓｉＮＡ分子は、細胞、組織、又は器官における遺伝子発現又は活性に応答する任意の疾患又は症状の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2007523649.tif 000025
［式中、５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’の各々は、独立して約２４ヌクレオチドと約３８ヌクレオチドとの間の長さのオリゴヌクレオチドを含み、ＸＺは、第一の標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、ＹＺは、第二の標的核酸配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む核酸配列を含み、Ｚは、領域ＸＺ及びＹＺとの間で相補的である約１〜約２４ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、Ｘは、領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１〜約２１ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１〜約２１ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、ｐは、独立して存在しても存在しなくてもよい末端リン酸基を含み、前記ＸＺ及び前記ＹＺの各々は、独立して、前記第一及び前記第二の標的核酸配列の各々又はこれらの一部と、安定に相互作用するのに十分な長さである］
の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項２】
式ＩＩ：
【化２】
2007523649.tif 000026
［式中、５’−ｐ−ＸＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＹ’−３’の各々は、独立して約２４ヌクレオチドと約３８ヌクレオチドとの間の長さのオリゴヌクレオチドを含み、Ｘは、第一の標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、Ｙは、第二の標的核酸配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む核酸配列を含み、前記Ｘは、領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１〜約２１ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記Ｙは、領域Ｘ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１〜約２１ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、ｐは、独立して存在しても存在しなくてもよい末端リン酸基を含み、前記Ｘ及び前記Ｙの各々は、独立して、前記第一及び前記第二の標的核酸配列の各々又はこれらの一部と安定に相互作用するのに十分な長さである］
の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子は３’末端キャップ部分を含むｓｉＮＡ分子。
【請求項４】
請求項３記載のｓｉＮＡ分子であって、前記末端キャップ部分は反転デオキシ脱塩基部分であるｓｉＮＡ分子。
【請求項５】
請求項３記載のｓｉＮＡ分子であって、前記末端キャップ部分は反転デオキシヌクレオチド部分であるｓｉＮＡ分子。
【請求項６】
請求項３記載のｓｉＮＡ分子であって、前記末端キャップ部分はジヌクレオチド部分であるｓｉＮＡ分子。
【請求項７】
請求項６記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ジヌクレオチドはジチミジン（ＴＴ）であるｓｉＮＡ分子。
【請求項８】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子は３’末端キャップ部分を含むｓｉＮＡ分子。
【請求項９】
請求項８記載のｓｉＮＡ分子であって、前記末端キャップ部分は反転デオキシ脱塩基部分であるｓｉＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項８記載のｓｉＮＡ分子であって、前記末端キャップ部分は反転デオキシヌクレオチド部分であるｓｉＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項８記載のｓｉＮＡ分子であって、前記末端キャップ部分はジヌクレオチド部分であるｓｉＮＡ分子。
【請求項１２】
請求項１１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ジヌクレオチドはジチミジン（ＴＴ）であるｓｉＮＡ分子。
【請求項１３】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まないｓｉＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まないｓｉＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子中の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子中の任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項１９】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子中の任意のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子は３’−ヌクレオチド突出を含むｓｉＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項２４記載のｓｉＮＡ分子であって、前記３’−突出は約１〜約４ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項２５記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子。
【請求項２３】
請求項２６記載のｓｉＮＡ分子であって、前記デオキシヌクレオチドはチミジンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項２４】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子中の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項２５】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子中の任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項２６】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子中の任意のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項２７】
請求項２記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ｓｉＮＡ分子は３’−ヌクレオチド突出を含むｓｉＮＡ分子。
【請求項２８】
請求項２７記載のｓｉＮＡ分子であって、前記３’−突出は約１〜約４ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子。
【請求項２９】
請求項２８記載のｓｉＮＡ分子であって、前記ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子。
【請求項３０】
請求項２９記載のｓｉＮＡ分子であって、前記デオキシヌクレオチドはチミジンヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子。
【請求項３１】
許容できる担体又は希釈剤中に、請求項１記載のｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物。
【請求項３２】
許容できる担体又は希釈剤中に、請求項２記載のｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年２月１０日に出願された米国仮出願６０／５４３，４８０の利益を享受し、２００４年５月２４日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／０１６３９０の一部継続である。これらの出願はいずれも、参照して全体が取り込まれる。
【０００２】
本発明は、治療的、獣医学的、農業的、診断的、標的バリデーション及びゲノム的発見の適用における使用を含む種々の適用において、遺伝子発現を調節する際に有用な方法及び試薬に関する。具体的には、本発明は、複数の遺伝子の発現を調節する多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子及びこのようなｓｉＮＡ分子を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下は、遺伝子発現を調節する核酸分子に関する関連分野の議論である。これらの議論は、後に示す本発明の理解に供することのみを目的とする。要約は、ここで述べる研究のいずれかが本出願に係る発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
現在、生物活性を有する種々の一本鎖、二本鎖及び三本鎖核酸分子が知られている。遺伝子発現の変化を媒介するような生物学的活性を有する一本鎖核酸分子の例は、アンチセンス核酸分子、酵素核酸分子又はリボザイム、及び２’−５’−オリゴアデニレート核酸分子を含む。遺伝子発現の変化を媒介するような生物学的活性を有する三本鎖核酸分子の例は、三重鎖形成オリゴヌクレオチドを含む。遺伝子発現の変化を媒介するような生物学的活性を有する二本鎖核酸分子の例は、二本鎖ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを含む。たとえば、プロテインキナーゼＰＫＲのインターフェロンを媒介した誘導は、長い二重鎖ＲＮＡによって非配列特異的な様式で活性化することが公知である（たとえば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，  １９９７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  １９２１−６を参照されたい）。この経路は、ＲＮａｓｅＬを経てＲＮＡ切断を媒介する際の２’，５’連結された少アデニル（２−５Ａ）系と共通の特色を共有する（たとえば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  １９１８７−９２を参照されたい）。ところが、これらの反応は、本質的に配列非特異的であり、短鎖干渉ＲＮＡを媒介したＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を経た遺伝子発現の阻害は、高度に配列特異的であることが公知である（たとえば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−４９８を参照されたい）。
【０００５】
ＲＮＡ干渉とは、動物において短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的な転写後遺伝子抑制の過程をいう（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｅｌｌ，  １０１，  ２５−３３；  Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ８０６；  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８６，  ９５０−９５１）。植物における対応する過程（Ｈｅｉｆｅｔｚ他，ＷＯ９９／６１６３１号国際公開公報）は、一般に転写後遺伝子抑制又はＲＮＡ抑制と呼ばれており、菌類においてはクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれている。転写後遺伝子抑制の過程は、外来遺伝子の発現を阻止するための進化的に保存された細胞の防御機構であると考えられており、多様な植物及び種族の間で広く共有されている（Ｆｉｒｅ他，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。このような外来遺伝子からの防御は、ウイルスの感染又はトランスポゾンエレメントの宿主ゲノム内へのランダムインテグレーションにより誘発された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に対応して、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して進化したものであるかもしれない。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、未だ完全に解明されていないメカニズムによってＲＮＡｉ応答が引き起こされる。このメカニズムは、ｄｓＲＮＡに媒介されたプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素の活性化により、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的分解を引き起こす、インターフェロン応答等の既知のメカニズムとは異なっているようである。
【０００６】
長鎖のｄｓＲＮＡが細胞内に存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片に切断するプロセシングに関与している（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；  Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｅｌｌ，  １０１，  ２５−３３；  Ｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９，  ３６３）。ダイサーの活性により生じた短鎖干渉ＲＮＡは、通常約２１〜２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を有する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；  Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  １８８）。ダイサーは、翻訳制御に関与している保存構造の前駆体ＲＮＡからの、２１及び２２ヌクレオチドの短鎖一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除にも関与している。（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、通常ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれ、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体によっても特徴づけられる。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
【０００７】
ＲＮＡｉは、多くの系について研究されている。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は、線虫（Ｃ．  Ｅｌｅｇａｎｓ）において最初にＲＮＡｉを観測した。ＢａｈｒａｍｉａｎとＺａｒｂｌ（１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３）及びＷｉａｎｎｙとＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０）は、哺乳類系においてｄｓＲＮＡに媒介されたＲＮＡｉについて記述している。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡを導入されたショウジョウバエの細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡを導入されたショウジョウバエの細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）及びＴｕｓｃｈｌら（ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報）は、ヒト胎児腎臓細胞及びＨｅＬａ細胞を含む培養された哺乳類細胞へ合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖を導入することにより誘起されるＲＮＡｉについて記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ，２０，６８７７）は、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成、及び配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖は、３’末端ジヌクレオチド突出を含む場合に最も活性であることを示した。さらに、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが、３’末端ｓｉＲＮＡ突出ヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心における単一のミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに、これらの研究はまた、標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ｓｉＲＮＡの５’−リン酸部分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎ他，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。
【０００８】
２ヌクレオチドの３’−突出を有する２１量体ｓｉＲＮＡ二本鎖中の、３’−末端ヌクレオチドが突出したセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、ＲＮＡｉ活性に有害な影響を与えないことが研究によって明らかにされた。ｓｉＲＮＡの各末端のヌクレオチドを４つまでデオキシヌクレオチドに置換することは十分許容されることが報告されているが、完全にデオキシヌクレオチドに置換するとＲＮＡｉ活性は失われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７、及びＴｕｓｃｈｌ他，ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報）。さらに、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（上掲）は、ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換すると、ＲＮＡｉ活性が完全に破壊されたことについても報告している。Ｌｉら（ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報）、及びＢｅａｃｈら（ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報）は、ｓｉＲＮＡが、リン酸エステル−糖骨格又はヌクレオチドのいずれかについて少なくとも１つの窒素又は硫黄へテロ原子を含める修飾を行いうることを予備的に示唆しているが、いずれの出願も、ｓｉＲＮＡ分子においてどの程度そのような修飾が許容されるかについて仮定しておらず、そのような修飾ｓｉＲＮＡについてそれ以上の指針又は実施例も示されていない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（カナダ特許出願第２，３５９，１８０号）もまた、ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて二本鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼＰＫＲの活性化を妨げる目的で用いるための化学的修飾、特に２’−アミノ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び２’−Ｏ又は４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドについて記述している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（カナダ特許出願第２，３５９，１８０号）もまた、ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて二本鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼＰＫＲの活性化を妨げる目的で用いるための化学的修飾、特に２’−アミノ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び２’−Ｏ又は４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドについて記述している。しかし、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらも同様に、ｓｉＲＮＡ分子においてこれらの修飾がどの程度許容されるかについての実施例又は指針を提供していない。
【０００９】
Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７）は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的として、長鎖の（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写産物を用いたある種の化学修飾を試みた。著者は、Ｔ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてチオリン酸ヌクレオチドアナログを取り込ませることにより、これらのｓｉＲＮＡ転写産物にチオリン酸エステル残基を導入し、２つのホスホロチオアートで修飾した塩基を有するＲＮＡも、ＲＮＡｉとしての有効性を大幅に低下させることを観測したことについて記述している。さらに、Ｐａｒｒｉｓｈらは、２残基よりも多くホスホロチオアートで修飾すると、インビトロでＲＮＡが大幅に不安定化され、干渉活性がアッセイできなくなることを報告した（同上、１０８１ページ）。著者は、長鎖ｓｉＲＮＡ転写物中のヌクレオチドの糖の２’位における化学修飾を試み、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置換すると、特にウリジンをチミジンに、かつ／又はシチジンをデオキシシチジンに置換した場合に、干渉活性が大幅に減少することを見出した（同上）。さらに、著者は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖における、ウラシルの４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、及び３−（アミノアリール）ウラシルへの置換、並びにグアノシンのイノシンへの置換を含む、置換等の塩基の修飾を試みた。４−チオウラシル及び５−ブロモウラシルへの置換は許容されるようであるが、Ｐａｒｒｉｓｈは、イノシンがどちらのＲＮＡに取り込まれた場合にも干渉活性を大幅に低下させることを報告した。Ｐａｒｒｉｓｈは、５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリール）ウラシルがアンチセンス鎖に取り込まれた場合にも、ＲＮＡｉ活性が大幅に低下することについても報告した。
【００１０】
長鎖のｄｓＲＮＡの使用についても記述されている。例えば、Ｂｅａｃｈら（ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報）は、内部由来のｄｓＲＮＡを用いて遺伝子の発現を減少させる特異的な方法について記述している。Ｔｕｓｃｈｌら（ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報）は、ショウジョウバエのインビトロのＲＮＡｉ系及びある種の機能的ゲノム用途並びにある種の治療用途に特定のｓｉＲＮＡ分子を用いることを記述している。しかし、Ｔｕｓｃｈｌ（２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５）は、インターフェロン応答の活性化の危険性のため、遺伝的疾患又はウイルス感染の治療のためにＲＮＡｉを用いることができるか否かは疑わしいと述べている。Ｌｉら（ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報）は、ある種の標的遺伝子の発現を弱めるために特定のｄｓＲＮＡを用いることを記述している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら（ＷＯ０１／３６６４６号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡ分子を用いて、哺乳動物細胞において特別の遺伝子の発現を阻害する方法を記述している。Ｆｉｒｅら（ＷＯ９９／３２６１９号国際公開公報）は、遺伝子発現の阻害に用いるためにある種のｄｓＲＮＡ分子を細胞内に導入するための特別の方法を記述している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら（ＷＯ００／０１８４６号国際公開公報）は、特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて細胞において特別の表現型を与える原因である特定の遺伝子を同定するある種の方法を記述している。Ｍｅｌｌｏら（ＷＯ０１／２９０５８号国際公開公報）は、ｄｓＲＮＡが媒介するＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定を記述している。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ  Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅら（ＷＯ９９／０７４０９号国際公開公報）は、ある種の抗ウイルス剤と組み合わせた特別のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記述している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＷＯ９９／５３０５０号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、植物細胞における核酸の表現型の発現を減少させるある種の方法を記述している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌら（ＷＯ０１／４９８４４号国際公開公報）は、標的生物において遺伝子サイレンシングを促進するのに用いるための特定のＤＮＡコンストラクトについて記述している。
【００１１】
ＲＮＡｉ及び遺伝子抑制系については、他にも多くの報告がなされている。例えば、Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．，６，１０７７−１０８７）は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的にした特定の化学修飾ｄｓＲＮＡコンストラクトについて記述している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ（ＷＯ０１／３８５５１号国際公開公報）は、植物におけるある種のｄｓＲＮＡを用いたポリコーム遺伝子の発現を制御するある種の方法について記述している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖら（ＷＯ０１／４２４４３号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて生物の遺伝的特性を改変するある種の方法について記述している。Ｃｏｇｏｎｉら（ＷＯ０１／５３４７５号国際公開公報）は、アカパンカビの抑制遺伝子を単離するある種の方法及びその使用について記述している。Ｒｅｅｄら（ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報）は、植物における遺伝子を抑制するある種の方法について記述している。Ｈｏｎｅｒら（ＷＯ０１／７０９４４号国際公開公報）は、パーキンソン病のモデルとしてトランスジェニックな線虫を用い、ある種のｄｓＲＮＡを用いたある種の薬剤のスクリーニング方法について記述している。Ｄｅａｋら（ＷＯ０１／７２７７４号国際公開公報）は、ショウジョウバエにおけるＲＮＡｉに関連するかもしれないある種のショウジョウバエ由来遺伝子産物について記述している。Ａｒｎｄｔら（ＷＯ０１／９２５１３号国際公開公報）は、ＲＮＡｉを増強する因子を用いて遺伝子抑制を媒介するある種の方法について記述している。Ｔｕｓｃｈｌら（ＷＯ０２／４４３２１号国際公開公報）は、ある種の合成ｓｉＲＮＡコンストラクトについて記述している。Ｐａｃｈｕｋら（ＷＯ００／６３３６４号国際公開公報）及びＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎら（ＷＯ０１／０４３１３号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡを用いてある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するためのある種の方法及び組成物について記述している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉら（ＷＯ０２／３８８０５号国際公開公報）は、ＲＮＡｉにより同定されたある種の線虫遺伝子について記述している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（ＷＯ０２／０５５６９２号国際公開公報、ＷＯ０２／０５５６９３号国際公開公報、及び欧州特許第１１４４６２３号公報）は、ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現を阻害するある種の方法について記述している。Ｇｒａｈａｍら（ＷＯ９９／４９０２９号国際公開公報及びＷＯ０１／７０９４９号国際公開公報、及びオーストラリア特許第４０３７５０１号明細書）は、ベクターから発現されるある種のｓｉＲＮＡ分子について記述している。Ｆｉｒｅら（米国特許第６，５０６，５５９号明細書）は、ＲＮＡｉを媒介するある種の長い（２５ヌクレオチドより長い）ｄｓＲＮＡコンストラクトを用いてインビトロで遺伝子発現を阻害するためのある種の方法について記述している。Ｍａｒｔｉｎｅｚら（２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４）は、Ｈｅｌａ細胞中でＲＮＡ干渉を媒介する、５’位がリン酸化されたある種の一本鎖ｓｉＲＮＡを含むある種の一本鎖ｓｉＲＮＡコンストラクトについて記述している。これらの参考文献はすべて、日本鎖のうち一方（アンチセンス鎖）が標的ＲＮ���に相補的であり、他方（センス鎖）がアンチセンス鎖に相補的である二本鎖核酸コンストラクトについて記述している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、細胞のＲＮＡ機能及び／又は遺伝子発現を調節する際に有用な核酸に基づいた化合物、組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、細胞、組織又は生物体などの生物学的系において１つ又は複数の遺伝子の発現を調節する多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。本発明の多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子は、標的核酸配列の複数の領域を標的とすることができ、又は複数の異なる標的核酸分子の配列を標的とすることができる。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、化学的に合成することができ、又は転写ユニット及び／又はベクターから発現することができる。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、種々の薬理学、獣医学、農業、診断、標的評価及び遺伝的発見の適用に有用な試薬及び方法を提供する。
【００１３】
出願人は、本明細書において、便宜上、多機能短鎖干渉核酸又は多機能ｓｉＮＡ分子と呼ばれる（しかし、限定されるわけではない）一定のオリゴヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的な制御の強力なメディエーターであることを、本明細書において証明する。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、これらが、多機能ｓｉＮＡコンストラクトのそれぞれの鎖が１つ又は複数の標的核酸分子中の異なる核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むようにデザインされたある種のポリヌクレオチド分子であるという点において、当技術分野において公知のその他の核酸配列（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、その他）とは異なる。従って、本発明の単一の多機能ｓｉＮＡ分子は、複数（たとえば、２、３、４、５又はそれ以上）の異なる標的核酸標的分子を標的とすることができる。また、本発明の核酸分子は、同じ標的核酸配列の複数（たとえば、２、３、４、５又はそれ以上）の領域を標的とすることができる。従って、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、１つ又は複数の標的核酸分子の発現をダウンレギュレートするか、又は阻害する際に有用である。たとえば、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、サイトカイン及びその対応する受容体をコードする核酸分子、ウイルスの感染及び／又は複製に必要とされるウイルスもしくはウイルスタンパク質および対応する細胞タンパク質をコードする核酸分子、又は特定のウイルスの異なる株を標的とすることができる。１つの多機能ｓｉＮＡコンストラクトで複数の標的核酸分子の発現を減少させ、又は阻害することよって、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、疾患に関連した経路内の複数の標的の同時阻害を行うことができるある種の強力な治療薬である。このような同時阻害により、別々の前臨床及び臨床開発の努力又は複雑な法的認可過程を必要とすることなく、相乗的な治療的処置ストラテジーを提供することができる。
【００１４】
標的核酸分子（たとえば、メッセンジャーＲＮＡ）の複数の領域を標的とする多機能ｓｉＮＡ分子の使用により、遺伝子発現の強力な阻害をもたらすことが予想される。たとえば、本発明の一本鎖多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、標的核酸分子の保存領域と可変領域との両方をターゲットして、これにより単一遺伝子によってコードされる種々のスプライスバリアントのダウンレギュレーションが可能であるか、又は標的核酸分子のコード領域と非コード領域との両方のターゲティングもしくは阻害が可能である。
【００１５】
一般に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、一つの鎖のオリゴヌクレオチド配列が第二の鎖のオリゴヌクレオチド配列に対して相補的である２つの異なったオリゴヌクレオチド配列の構築によって形成され、このような二本鎖オリゴヌクレオチドは、一般に２つの別々のオリゴヌクレオチド（たとえば、ｓｉＲＮＡ）から、又はそれ自体が折り重なって二本鎖構造を形成する単一分子（たとえば、ｓｈＲＮＡ又は短鎖ヘアピンＲＮＡ）から構築される。当技術分野において公知のこれらの二本鎖オリゴヌクレオチドは、二重鎖のそれぞれが異なったヌクレオチド配列を有し、１つのヌクレオチド配列領域（ガイド配列又はアンチセンス配列）だけが、標的核酸配列に対して相補性を有し、かつその他の鎖（センス配列）は、標的核酸配列に対して相同的であるヌクレオチド配列を含むという点で、全て共通の特色を有する。一般に、アンチセンス配列は、活性ＲＩＳＣ複合体に保持されており、配列特異的ＲＮＡ干渉を媒介するための標的配列とアンチセンス配列の相補的塩基対形成により、ＲＩＳＣを標的ヌクレオチド配列に誘導する。いくつかの細胞培養系では、一定のタイプの無修飾ｓｉＲＮＡが「オフ・ターゲット」効果を示し得ることが、当技術分野において公知である。このオフ・ターゲット効果には、ＲＩＳＣ複合体においてｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の代わりにセンス配列の参加が関与すると仮定される（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｃｅｌｌ，  １１５，  １９９−２０８を参照されたい）。この場合、センス配列は、ＲＩＳＣ複合体を企図される標的配列とは異なる配列（オフ・ターゲット配列）に向けて、オフ・ターゲット配列の阻害を生じると考えられる。これらの二本鎖核酸分子において、それぞれの鎖は、別の標的核酸配列に対して相補的である。しかし、これらの二本鎖ＲＮＡによる影響を受けるオフ・ターゲットは、完全に予測可能であるというわけではなく、非特異的である。
【００１６】
当技術分野において公知の二本鎖核酸分子とは異なり、本出願人は、一本鎖多機能ｓｉＮＡコンストラクトを使用する、複数の標的核酸配列の発現をダウンレギュレートし、又は阻害する新規の潜在的に費用効果的かつ単純化された方法を開発した。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖又は領域の一部が選択された標的核酸配列に対して相補的であるようにデザインされる。従って、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、互いに相補的な標的配列に限定されるわけではなく、任意の２つの異なる標的核酸配列である。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、所与の標的核酸配列に対して相補的な多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖又は領域が標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介する際に適した長さ（たとえば、約１６〜約２８ヌクレオチドの長さに、好ましくは約１８〜約２８ヌクレオチドの長さ）であるようにデザインされる。本発明の多機能ｓｉＮＡは、（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，前記）に記述されたものなどの一定のｓｉＲＮＡ配列に見られるオフ・ターゲット効果を最小にすることが予想される。
【００１７】
２９塩基対〜３６塩基対の間の長さの二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介しないことが報告されていた（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ公開番号国際公開公報第０２／４４３２１号）。これらの二本鎖ＲＮＡが不活性である一つの理由は、標的ＲＮＡ配列と相互作用する鎖の代謝回転又は解離を欠いており、その結果ＲＩＳＣ複合体が標的ＲＮＡの複数のコピーと効率的に相互作用することができずに、ＲＮＡｉプロセスの能力及び効率に有意な減少を生じるためであろう。出願人は、驚くべきことに、本発明の多機能ｓｉＮＡにより、このハードルを克服することができ、ＲＮＡｉプロセスの効率及び能力を増強することができることを見いだした。従って、本発明のある態様において、多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖の一部が効率的にＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（たとえば、約１５〜約２３塩基対）の標的核酸に対して相補的であるヌクレオチド配列領域と、標的核酸に対して相補的でないヌクレオチド配列領域とを含む約２９〜約３６塩基対の間の長さの多機能ｓｉＮＡをデザインすることができる。多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖に相補的及び非相補的な部分の両方を有することによって、多機能ｓｉＮＡは、代謝回転又は解離に抑制的となることがなく、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することができる（たとえば、それぞれの鎖の長さが、あまりに長くて、それぞれの標的核酸配列に対してＲＮＡｉを媒介できない場合）。さらに、内部に重複領域をもつ本発明の多機能ｓｉＮＡ分子のデザインにより、ＲＮＡ干渉を媒介するための有利な（減少した）サイズで、かつ治療薬として使用するために十分に適したサイズである多機能ｓｉＮＡ分子が可能となる（たとえば、それぞれの鎖が、独立して約１８〜約２８ヌクレオチドの長さである場合）。非限定の例を添付の図１〜６に例証する。
【００１８】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、第一の領域と第二の領域とを含み、多機能ｓｉＮＡの第一の領域は、第一の標的核酸分子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ多機能ｓｉＮＡの第二の領域は、第二の標的核酸分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含む。一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、第一の領域と第二の領域とを含み、多機能ｓｉＮＡの第一の領域は、標的核酸分子の第一の領域の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ多機能ｓｉＮＡの第二の領域は、標的核酸分子の第二の領域の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡの第一の領域及び第二の領域は、ある程度の相補性を共有する別々の核酸配列（たとえば、約１〜約１０個の相補的ヌクレオチド）を含むことができる。ある態様において、別々の核酸配列を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、当技術分野において公知の方法及び試薬によって合成後に容易に連結することができ、このような連結されたコンストラクトは、本発明の範囲内である。あるいは、多機能ｓｉＮＡの第一の領域及び第二の領域は、ヘアピン又はステム−ループ構造のものなど、ある程度の自己相補性を有する単一の核酸配列を含むことができる。このような二重鎖及びヘアピン多機能短鎖干渉核酸の非限定の例をそれぞれ図１及び２に図示する。これらの多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、任意に一定の重複ヌクレオチド配列を含むことができ、このような重複ヌクレオチド配列は多機能ｓｉＮＡの第一の領域と第二の領域との間に存在する（たとえば、図３及び４を参照されたい）。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であって、多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖が、独立して、別の標的核酸配列に対して相補的である核酸配列の第一の領域と、標的配列に対して相補的ではないヌクレオチド配列の第二の領域とを含む多機能短鎖干渉核酸分子を特徴とする。それぞれの鎖の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子中にあってもよく、又は異なる標的核酸分子中にあってもよい。
【００２０】
もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡは、２つの鎖を含み、（ａ）第一の鎖は、標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補的領域１）と標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を有さない領域（非相補的領域１）とを含み、（ｂ）多機能ｓｉＮＡの第二の鎖は、第一の鎖のヌクレオチド配列に対して相補的な標的ヌクレオチド配列とは異なった標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補的領域２）と相補的領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を有さない領域（非相補的領域２）とを含み、（ｃ）第一の鎖の相補的領域１は、第二の鎖の非相補的領域２のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつ第二の鎖の相補的領域２は、第一の鎖の非相補的領域１のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。相補的領域１及び相補的領域２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子中にあるか又は異なる標的核酸分子中にある。
【００２１】
もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡは、２つの鎖を含み、（ａ）第一の鎖は、遺伝子（たとえば、哺乳類遺伝子、ウイルス遺伝子又はゲノム、細菌遺伝子又は植物遺伝子）由来の標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補的領域１）と相補的領域１の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を有さない領域（非相補的領域１）とを含み、（ｂ）多機能ｓｉＮＡの第二の鎖は、相補的領域１の遺伝子とは異なる遺伝子に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補的領域２）と相補的領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を有さない領域（非相補的領域２）とを含み、（ｃ）第一の鎖の相補的領域１は、第二の鎖の非相補的領域２のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつ第二の鎖の相補的領域２は、第一の鎖の非相補的領域１のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡは、２つの鎖を含み、（ａ）第一の鎖は、遺伝子（たとえば、哺乳類遺伝子、ウイルス遺伝子又はゲノム、細菌遺伝子又は植物遺伝子）由来の標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補的領域１）と相補的領域１の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を有さない領域（非相補的領域１）とを含み、（ｂ）多機能ｓｉＮＡの第二の鎖は、相補的領域１の標的核酸配列とは異なる標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補的領域２）（ただし、相補的領域１のための標的核酸配列及び相補的領域２のための標的核酸配列は、両方とも同じ遺伝子に由来することを条件とする）と、相補的領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を有さない領域（非相補的領域２）とを含み；（ｃ）第一の鎖の相補的領域１は、第二の鎖の非相補的領域２のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつ第二の鎖の相補的領域２は、第一の鎖の非相補的領域１のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であって、多機能ｓｉＮＡは、２つの相補核酸配列を含み、その中の第一の配列は、標的核酸分子内のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含み、かつその中の第二の配列は、同じ標的核酸分子内の異なるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含む多機能短鎖干渉核酸分子を特徴とする。好ましくは、第一の配列の第一の領域は、また、第二の配列の第二の領域のヌクレオチド配列に対して相補的であり、第二の配列の第一の領域は、第一の配列の第二の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である。
【００２４】
一つの態様において、本発明は、多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であって、多機能ｓｉＮＡは、２つの相補核酸配列を含み、その中の第一の配列は、第一の標的核酸分子内のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含み、かつその中の第二の配列は、第二の標的核酸分子内の異なるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含む機能性短鎖干渉核酸分子を特徴とする。好ましくは、第一の配列の第一の領域は、また、第二の配列の第二の領域のヌクレオチド配列に対して相補的であり、第二の配列の第一の領域は、第一の配列の第二の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である。
【００２５】
一つの態様において、本発明は、第一の領域と第二の領域とを含む多機能ｓｉＮＡ分子であって、第一の領域は、第一の標的核酸分子内の核酸配列に対して約１８〜約２８ヌクレオチドの間の相補性を有する核酸配列を含み、かつ第二の領域は、第二の標的核酸分子内の異なる核酸配列に対して約１８〜約２８ヌクレオチドの間の相補性を有するヌクレオチド配列を含む多機能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００２６】
一つの態様において、本発明は、第一の領域と第二の領域とを含む多機能ｓｉＮＡ分子であって、第一の領域は、標的核酸分子内の核酸配列に対して約１８〜約２８ヌクレオチドの間の相補性を有する核酸配列を含み、かつ第二の領域は、同じ標的核酸分子内の別の核酸配列に対して約１８〜約２８ヌクレオチドの間の相補性を有するヌクレオチド配列を含む多機能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００２７】
一つの態様において、本発明は、二本鎖多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であって、多機能ｓｉＮＡの１つの鎖は、第一の標的核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含み、かつ第二の鎖は、第二の標的核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含む二本鎖多機能短鎖干渉核酸分子を特徴とする。第１及び第２の標的核酸配列は、別々の標的核酸分子中に存在することができ、又は同じ標的核酸分子内の異なる領域であることができる。従って、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、異なる遺伝子、同じ遺伝子のスプライスバリアント、１つ又は複数の遺伝子転写物の変異体及び保存された領域の両方、又は同じかもしくは異なる遺伝子もしくは遺伝子転写物のコード配列及び非コード配列の両方の発現を標的とするために使用することができる。
【００２８】
一つの態様において、本発明の標的核酸分子は、単一タンパク質をコードする。もう一つの態様において、標的核酸分子は、複数のタンパク質（たとえば、１、２、３、４、５又はそれ以上のタンパク質）をコードする。従って、本発明の多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、いくつかのタンパク質の発現をダウンレギュレートするか、又は阻害するために使用することができる。たとえば、１つのタンパク質（たとえば、血管内皮の成長因子又はＶＥＧＦなどのサイトカイン）をコードする遺伝子に由来する第一の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する１つの鎖内の領域と、２つのタンパク質（たとえば、ＶＥＧＦ受容体１及びＶＥＧＦ受容体２などの、ＶＥＧＦなどの単一のサイトカインに対する２つの異なる受容体）をコードする遺伝子に由来する標的核酸分子に存在する第二の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性をもつ領域を含む第二の鎖とを含む多機能ｓｉＮＡ分子を使用して、たとえばサイトカインとサイトカインのための受容体又はリガンドとリガンドのための受容体を標的とすることにより、特定の生物学的経路をダウンレギュレートし、阻害し、又はシャットダウンすることができる。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、サイトカインとサイトカインのための受容体又はリガンドとリガンドのための受容体の異なるアイソフォームに存在する保存されたヌクレオチド配列を利用する。一方の鎖がサイトカインの種々のアイソフォームに保存された標的核酸配列に対して相補的である配列を含み、かつ他方の鎖がサイトカインのための受容体間で保存された標的核酸配列に対して相補的である配列を含む様式で多機能ｓｉＮＡをデザインすることによって、単一の多機能ｓｉＮＡを使用して、生物学的経路又は生物学的経路の複数の遺伝子を、選択的かつ効率的に調節し、又は阻害することができる。
【００３０】
もう一つの非限定の例において、２つのタンパク質（たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及び／又はＶＥＧＦ−Ｄのいずれかを含むＶＥＧＦなどのサイトカインの２つのアイソフォーム）をコードする標的核酸分子に存在する第一の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する１つの鎖の領域と、２つのさらなるタンパク質（たとえば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３などのサイトカインのための２つの異なる受容体）をコードする標的ヌクレオチド分子に存在する第二の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性をもつ領域を含む第二の鎖とを含む多機能ｓｉＮＡ分子を使用して、サイトカイン及びこのようなサイトカインのための受容体の異なるアイソフォームを標的とすることによって、特定の生物学的経路をダウンレギュレートし、阻害し、又はシャットダウンすることができる。
【００３１】
もう一つの非限定の例において、ウイルス又はウイルスタンパク質（たとえば、ＨＩＶ）をコードする標的核酸分子に由来する第一の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する１つの鎖の領域と、細胞のタンパク質（たとえば、ＨＩＶのためのＣＣＲ５受容体などのウイルスのための受容体）をコードする標的核酸分子に存在する第二の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を含む第二の鎖とを含む多機能ｓｉＮＡ分子を使用して、ウイルス感染又は複製のために必要なウイルス及び細胞のタンパク質を標的とすることによって、ウイルス感染又は複製をダウンレギュレートし、阻害し、又はシャットダウンすることができる。
【００３２】
もう一つの非限定の例において、１つの鎖にウイルスゲノム（たとえば、ＨＩＶゲノムのＲＮＡ）などの標的核酸分子に存在する第一の標的核酸配列（たとえば、保存配列）に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を有し、ウイルスタンパク質（たとえば、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＥＮＶ又はＮＥＦなどのＨＩＶタンパク質）をコードする遺伝子に由来する標的核酸分子に存在する第二の標的核酸配列（たとえば、保存配列）に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を含む第二の鎖とを含む多機能ｓｉＮＡ分子を用いて、ウイルス感染又は複製のために必要なウイルスゲノム及びウイルスでコードされるタンパク質を標的とすることによって、ウイルスの複製及び感染をダウンレギュレートし、阻害し、又はシャットダウンすることができる。
【００３３】
一つの態様において、本発明は、ウイルスの異なる株、アイソタイプ又は形態、並びにこれらのウイルスの異なる株、アイソタイプ及び形態によってコードされる遺伝子に存在する保存されたヌクレオチド配列を利用する。一方の鎖がウイルスの種々の株、アイソタイプ又は形態において保存された標的核酸配列に対して相補的である配列を含み、他方の鎖がウイルスによってコードされるタンパク質において保存された標的核酸配列に対して相補的である配列を含む様式で多機能ｓｉＮＡをデザインすることによって、一本鎖多機能ｓｉＮＡを使用して、ウイルスの複製又は感染を選択的かつ効率的に阻害することができる。
【００３４】
一つの態様において、本発明の多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、それぞれの鎖内にある領域を含み、一方の鎖の領域は、サイトカインに対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二の鎖の領域は、サイトカインのための対応する受容体に相補的なヌクレオチド配列を含む。サイトカインの非限定の例は、血管内皮の成長因子（たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、腫瘍壊死因子（たとえば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、コロニ−刺激因子（たとえば、ＣＤＦ）、インターフェロン（たとえば、ＩＦＮ−γ）、成長因子（たとえば、ＮＧＦ）、上皮細胞成長因子（たとえば、ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（たとえば、ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（たとえば、ＦＧＦ）、トランスフォ−ミング成長因子（たとえば、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、エリスロポエチン（たとえば、Ｅｐｏ）及びインスリン様成長因子（たとえば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）を含み、サイトカイン受容体の非限定の例には、上記サイトカインのそれぞれのため受容体を含む。
【００３５】
一つの態様において、本発明の多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、第一の領域と第二の領域とを含み、第一の領域は、第一のウイルス株のウイルスＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二の領域は、第二のウイルス株のウイルスＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。一つの態様において、第１及び第２の領域は、異なるウイルス株もしくはクラスもしくはウイルス株において共有されたか、又は保存されたＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。ウイルスの非限定の例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全症ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウィルス、ライノウイルス、乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス及びＨＴＬＶなどのその他のウイルスを含む。
【００３６】
一つの態様において、本発明の多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、第一の領域と第二の領域とを含み、第一の領域は、１つ又は複数のウイルス（たとえば、１つ又は複数のウイルス株）をコードするウイルスＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二の領域は、１つ又は複数のインターフェロン・アゴニスト・タンパク質をコードするウイルスＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。一つの態様において、第一の領域は、異なるウイルス株もしくはクラスもしくはウイルス株において共有されたか、又は保存されたＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。ウイルスの非限定の例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全症ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウィルス、ライノウイルス、乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス及びＨＴＬＶなどのその他のウイルスを含む。インターフェロン・アゴニスト・タンパク質の非限定の例は、ＲＮＡサイレンシングを阻害するか、又は抑制することができる任意のタンパク質を含む（たとえば、Ｅ３Ｌ又はＮＳ１などのＲＮＡ結合タンパク質又はこれらの同等物、たとえばＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４、ＰＮＡＳ、１０１、１３５０〜１３５５を参照されたい）。
【００３７】
一つの態様において、本発明の多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、第一の領域と第二の領域とを含み、第一の領域は、ウイルスＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二の領域は、ウイルス感染及び／又は複製に関与する細胞ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。ウイルスの非限定の例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全症ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウィルス、ライノウイルス、乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス及びＨＴＬＶなどのその他のウイルスを含む。ウイルス感染及び／又は複製に関与する細胞ＲＮＡの非限定の例は、以下を含む。細胞受容体、細胞表面分子、細胞性酵素、細胞の転写因子、及び／又はサイトカイン、二次メッセンジャー、及びインターフェロン・アゴニスト・タンパク質（たとえば、Ｅ３Ｌ又はＮＳ１又はこれらの同等物、たとえばＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４、ＰＮＡＳ、１０１、１３５０〜１３５５を参照されたい）、インターフェロン制御因子（ＩＲＦｓ）を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）細胞アクセサリー分子；細胞のＰＫＲプロテインキナーゼ（ＰＫＲ）；ヒト成熟核翻訳開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂγ及び／又はｅｌＦ２γ）；ヒトＤＥＡＤ  ボックスタンパク質（ＤＤＸ３）；並びにポリ・ピリミジン管結合タンパク質などのＨＣＶ  ３’−ＵＴＲポリ（Ｕ）管と結合する細胞タンパク質、ＣＤ４受容体、ＣＸＣＲ４（Ｆｕｓｉｎ；ＬＥＳＴＲ；ＮＰＹ３Ｒ）；ＣＣＲ５（ＣＫＲ−５、ＣＭＫＲＢ５）；ＣＣＲ３（ＣＣ−ＣＫＲ−３、ＣＫＲ−３、ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ２（ＣＣＲ２ｂ、ＣＭＫＢＲ２）；ＣＣＲ１（ＣＫＲ１、ＣＭＫＢＲ１）；ＣＣＲ４（ＣＫＲ−４）；ＣＣＲ８（ＣｈｅｍＲ１、ＴＥＲ１、ＣＭＫＢＲ８）；ＣＣＲ９（Ｄ６）；ＣＸＣＲ２（ＩＬ−８ＲＢ）；ＳＴＲＬ３３（Ｂｏｎｚｏ；ＴＹＭＳＴＲ）；ＵＳ２８；Ｖ２８（ＣＭＫＢＲＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１３）；ＧＰＲ１；ＧＰＲ１５（ＢＯＢ）；Ａｐｊ（ＡＧＴＲＬ１）；ＣｈｅｍＲ２３受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＨＳＰＧ２；ＳＤＣ２；ＳＤＣ４；ＧＰＣ１；ＳＤＣ３；ＳＤＣ１；ガラクトセラミド；赤血球に発現された糖脂質；Ｎ−ミリストイルトランスフェラ−ゼ（ＮＭＴ、ＮＭＴ２）；グリコシル化酵素；ｇｐ−１６０  プロセシング酵素（ＰＣＳＫ５）；リボヌクレオチドレダクタ−ゼ；ポリアミン生合成酵素；ＳＰ−１；ＮＦ−κＢ（ＮＦＫＢ２、ＲＥＬＡ及びＮＦＫＢ１）；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；インターロイキン１α（ＩＬ−１α）；インターロイキン６（ＩＬ−６）；ホスホリパ−ゼＣ（ＰＬＣ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、サイクロフィリン（ＰＰＩＤ、ＰＰＩＡ、ＰＰＩＥ、ＰＰＩＢ、ＰＰＩＦ、ＰＰＩＧ及びＰＰＩＣ）；分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰＫ１）；並びに細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ−キナーゼ）（たとえば、Ｓｃｈａｎｇ，  ２００２，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ５０，  ７７９−７９２  ａｎｄ  Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ９，  ４６−５２を参照されたい）。
【００３８】
一つの態様において、本発明の二本鎖多機能ｓｉＮＡ分子は、以下の式Ｉ（ａ）を有する構造を含む：
【化３】
2007523649.tif 000002
式中、それぞれの５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’は、独立して約２０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチドの間、好ましくは約２０〜約２００ヌクレオチド、約２０〜約１００ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２４〜約３８ヌクレオチド又は約２６〜約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸＺは、第一の標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、ＹＺは、第二の標的核酸配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む核酸配列であり、Ｚは、領域ＸＺとＹＺとの間で相補的である約１〜約２４ヌクレオチド（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、Ｘは、領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（たとえば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、ｐは、末端リン酸基（これは独立して存在するか、又は存在しないことができる）を含み、それぞれのＸＺ及びＹＺは、独立して、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はこれらの一部と安定に相互作用（すなわち、塩基対形成）するのに十分な長さである。たとえば、それぞれ、配列Ｘ及びＹは、独立して、標的ＲＮＡ又はこれらの一部などの異なる標的核酸分子の標的ヌクレオチド配列に対して相補的である、長さが約１２〜約２１又はそれ以上のヌクレオチド（たとえば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれ以上）のヌクレオチド配列を含むことができる。もう一つの非限定の例において、共に第一の標的核酸配列（たとえば、ＲＮＡ）又はこれらの一部に対して相補的であるＸ及びＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２〜約２１又はそれ以上（たとえば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれ以上）のヌクレオチドである。もう一つの非限定の例において、共に第二の標的核酸配列（たとえば、ＲＮＡ）又はこれらの一部に対して相補的であるＹ及びＺヌクレオチド配列の長さは、約１２〜約２１又はそれ以上（たとえば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれ以上）のヌクレオチドである。一つの態様において、第一の標的核酸配列と第二の標的核酸配列とは、同じ標的核酸分子に存在する。もう一つの態様において、第一の標的核酸配列と第二の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子に存在する。一つの態様において、Ｚは、回文構造又は反復配列を含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、同じである。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、同じではない。一つの態様において、オリゴヌクレオチドＹ及びＹ’の長さは、同じである。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチドＹ及びＹ’の長さは、同じではない。一つの態様において、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、１つ又は複数の、具体的には１、２、３又は４つのミスマッチを、このようなミスマッチが、二本鎖オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害する能力を有意に減弱させない程度に含む。
【００３９】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＩＩ（ａ）を有する構造を含む：
【化４】
2007523649.tif 000003
式中、それぞれの５’−ｐ−ＸＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＹ’−３’は、独立して約２０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチドの間、好ましくは約２０〜約２００ヌクレオチド、約２０〜約１００ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２４〜約３８ヌクレオチド又は約２６〜約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、第一の標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、Ｙは、第二の標的核酸配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む核酸配列であり、Ｘは、領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である、約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である、約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、ｐは、末端リン酸基（これは独立して存在するか、又は存在しないことができる）を含み、それぞれのＸ及びＹは、独立して、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はこれらの一部と安定に相互作用（すなわち、塩基対形成）するのに十分な長さである。たとえば、それぞれ配列Ｘ及びＹは、独立して、標的ＲＮＡ又はこれらの一部などの異なる標的核酸分子の標的ヌクレオチド配列に対して相補的である、長さが約１２〜約２１又はそれ以上のヌクレオチド（たとえば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれ以上）のヌクレオチド配列を含むことができる。一つの態様において、第一の標的核酸配列と第二の標的核酸配列とは、同じ標的核酸分子に存在する。もう一つの態様において、第一の標的核酸配列と第二の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子に存在する。一つの態様において、Ｚは、回文構造又は反復配列を含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、同じである。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、同じではない。一つの態様において、オリゴヌクレオチドＹ及びＹ’の長さは、同じである。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチドＹ及びＹ’の長さは、同じではない。一つの態様において、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、１つ又は複数の、具体的には１、２、３又は４つのミスマッチを、このようなミスマッチが、二本鎖オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害する能力を有意に減弱させない程度に含む。
【００４０】
一つの態様において、本発明の（たとえば、式Ｉ又はＩＩのいずれかを有する）多機能ｓｉＮＡ分子の領域Ｘ及びＹは、同じ標的核酸分子の一部である異なる標的核酸配列に対して相補的である。一つの態様において、標核酸配列的などは、ＲＮＡ転写物のコード領域内の異なる位置にある。一つの態様において、このような標的核酸配列は、同じＲＮＡ転写物のコード領域及び非コード領域を含む。一つの態様において、このような標的核酸配列は、選択的にスプライスされた転写物の領域又はこのような選択的にスプライスされた転写物の前駆体を含む。
【００４１】
一つの態様において、式Ｉ又はＩＩのいずれかを有する多機能ｓｉＮＡ分子は、限定されるわけではないが、たとえば、本明細書に記述された式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれかを有するヌクレオチド、表ＶＩＩＩに記載されているような安定化化学又は本明細書において種々の態様に記載したような修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドの任意のその他の組み合わせのなどの、本明細書に記述されたような化学修飾を含むことができる。
【００４２】
一つの態様において、式Ｉ（ａ）又はＩ（ｂ）を有する多機能ｓｉＮＡコンストラクトのＺにおける回文構造又は反復配列又は修飾されたヌクレオチド（たとえば、２−アミノプリン又は汎用塩基などの、修飾塩基をもつヌクレオチド）は、標的核酸配列の一部と相互作用することができる化学的に修飾されたヌクレオチドを含む（たとえば、ワトソン・クリック塩基対又は非ワトソン・クリック塩基対を形成することができる修飾された塩基類似体）。
【００４３】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子、たとえば式Ｉ又はＩＩを有する多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖は、独立して約１５〜約４０ヌクレオチド（たとえば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド）を含む。１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。非限定的な例において、化学修飾されたヌクレオチドを核酸分子中に導入すると、体外から投与された天然のＲＮＡ分子に固有の、インビボでの安定性及び生体利用性に関する潜在的な制限を克服した強力なツールがもたらされる。例えば、化学修飾された核酸分子は、血清中でより長い半減期を有する傾向にあるため、化学修飾された核酸分子の使用により、所定の治療効果のために必要な特定の核酸分子の投与量を減少させることが可能になる。さらにまた、一定の化学修飾は、半減期を増強するだけでなくて、特定の器官、細胞又は組織に対する核酸分子のターゲティングを容易にし、及び／又は核酸分子の細胞取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能及び／又は能力を改善することができる。したがって、化学修飾された核酸分子の活性が、インビトロで、天然／非修飾の核酸分子と比較して、例えば、非修飾ＲＮＡ分子と比較して低い場合であっても、修飾された核酸分子の全体としての活性は、改善された安定性及び／又は分子の取り込み量、効果の継続性、生物学的利用能、及び／又は分子輸送のために、天然又は非修飾の分子のそれよりも高くなることもありうる。
【００４４】
一つの態様において、本発明は、インビトロでの系、細胞又は生物体になどの、複数の標的核酸分子に対して特異性を有する化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。そのような化学的修飾の非限定的な例には、ホスフェート骨格修飾（例えば、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合）、ヌクレオチド糖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−Ｏ−アリールヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−リボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド）、ヌクレオチド塩基修飾（例えば、ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチを含む「万能塩基」ヌクレオチド）、及び非ヌクレオチド修飾（例えば、脱塩基ヌクレオチド、反転デオキシ脱塩基残基）、又はこれらの修飾の組合せが含まれる。これらの、及び他の化学修飾は、種々の多機能ｓｉＮＡコンストラクトに使用したときに、インビボでの多機能ｓｉＮＡの生物活性を保存することができ、一方で同時に、これらの化合物の血清安定性、能力、作用期間及び／又は特異性を劇的に増大する。
【００４５】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、一般に、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）を含んでいてもよい。所定の多機能ｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、多機能ｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数によって異なるであろう。多機能ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合、修飾率は一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。多機能ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合、修飾率は一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。加えて、たとえば、所与の多機能ｓｉＮＡ分子に存在する修飾されたヌクレオチドの実際の割合は、たとえば多機能ｓｉＮＡ分子に存在する全てのピリミジンヌクレオチド及び／又は全てのプリンヌクレオチドが修飾される場合、多機能ｓｉＮＡに存在するプリン及びピリミジンヌクレオチドの総数にも依存する。
【００４６】
一つの態様において、多機能ｓｉＮＡ二重鎖分子は、たとえば、多機能ｓｉＮＡ分子が遺伝子発現の阻害を媒介する能力を調整し、又は調節するために、ミスマッチ（たとえば、１、２、３、４又は５つのミスマッチ）、隆起、ループ又はゆらぎ塩基対を含むことができる。ミスマッチ、隆起、ループ又はゆらぎ塩基対は、多機能ｓｉＮＡが標的遺伝子発現の阻害を媒介する能力を、このようなミスマッチ、隆起、ループ又はゆらぎ塩基対を有意に障害しない程度に、多機能ｓｉＮＡ二重鎖分子に導入することができる。このようなミスマッチ、隆起、ループ又はゆらぎ塩基対は、このような多機能ｓｉＮＡが遺伝子発現の阻害を媒介する能力を有意に障害しない多機能ｓｉＮＡ二重鎖の領域に存在することができ、たとえば、ミスマッチは、二重鎖の末端領域に、又は二重鎖の内部領域の１つ又は位置に存在することができる。同様に、ゆらぎ塩基対は、たとえば、二重鎖の末端塩基対の領域に、又は内部領域内に、又は多機能ｓｉＮＡ内に自己相補的な、回文構造又は反復配列が存在する領域にあることができる。
【００４７】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端にて、１つ又は複数（たとえば、約１、２、３、４又は５）のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。
【００４８】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、３’ヌクレオチド突出領域を含み、これは、多機能ｓｉＮＡが二重鎖形態であるときに、１つ又は複数の（たとえば、約１、２、３、４つの）不対ヌクレオチドを含む。非限定の例において、突出をもつ多機能ｓｉＮＡ二重鎖は、多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖に存在するヌクレオチドの数よりも少ない塩基対の数を含む（たとえば、３’末端にて２つヌクレオチド突出をもつ１６塩基対の二重鎖を形成する長さが１８ヌクレオチドの多機能ｓｉＮＡ）。このような平滑断端多機能ｓｉＮＡ二重鎖は、任意に１つ又は複数のミスマッチ、ゆらぎ塩基対又はヌクレオチド隆起を含んでいてもよい。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端ヌクレオチド突出は、核酸糖、塩基又はリン酸塩骨格に化学修飾があるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。３’−末端ヌクレオチド突出は、１つ又は複数の汎用塩基ヌクレオチドを含むことができる。３’−末端ヌクレオチド突出は、１つ又は複数の非環式ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができる。
【００４９】
一つの態様において、二重鎖形態の本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、平滑断端を含み、すなわち、末端はいずれの突出ヌクレオチドも含まない。たとえば、本明細書に記述した修飾（たとえば、式ＩＩＩ〜ＩＸを有する修飾もしくはＳｔａｂ１−Ｓｔａｂ２２を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクト又はこれらの任意の組み合わせを含む）及び／又は本明細書に記述される任意の長さを含む本発明の多機能ｓｉＮＡ二重鎖分子は、平滑断端か、又は突出ヌクレオチドのない末端を有する。
【００５０】
一つの態様において、本発明のいずれの多機能ｓｉＮＡ二重鎖も、１つ又は複数の平滑断端を含むことができ、すなわち平滑断端がいずれの突出ヌクレオチドも有さない。非限定の例において、平滑断端多機能ｓｉＮＡ二重鎖は、多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖に存在するヌクレオチド数と同じ塩基対の数を含む（たとえば、１８塩基対二重鎖を形成する長さ１８ヌクレオチドの多機能ｓｉＮＡ）。このような平滑断端多機能ｓｉＮＡ二重鎖は、１つ又は複数のミスマッチ、ゆらぎ塩基対又はヌクレオチド隆起を任意に含んでいてもよい。
【００５１】
「平滑末端」とは、対称的な末端又は突出ヌクレオチドを有しない多機能二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖多機能ｓｉＮＡ分子中の２本の分子鎖は、末端に突出ヌクレオチドを生じないように互いに配置されている。例えば、平滑末端を有する多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、前記多機能ｓｉＮＡ分子の２本の鎖の間で相補的な末端ヌクレオチドを有している。
【００５２】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含まず、かつインビトロで、又はインビボで、複数の標的遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる。
【００５３】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ配列に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。別の態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ配列に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。このような多機能ｓｉＮＡ配列は、デオキシヌクレオチド、反転されたヌクレオチド、無塩基部分、反転された無塩基部分及び／又は図１０に示した任意のその他の修飾もしくは核酸分子に導入することができる当技術分野において一般に公知の修飾などの本明細書に記述した種々のヌクレオチド又は非ヌクレオチド・キャップを、多機能ｓｉＮＡに対するいずれの修飾も、多機能ｓｉＮＡ分子が遺伝子発現の阻害を媒介する能力を有意に損なわない程度にさらに含むことができる。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、この多機能ｓｉＮＡ分子に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが２’−糖修飾プリン（例えば、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−Ｏ−アリールプリンヌクレオチド、又は２’−メトキシ−エトキシプリンヌクレオチド）である配列を含む。別の態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、この多機能ｓｉＮＡ分子に存在するすべてのプリンヌクレオチドが、２’−糖修飾プリン（２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−Ｏ−アリールプリンヌクレオチド、又は２’−メトキシ−エトキシプリンヌクレオチド）である配列を含む。
【００５５】
異なる実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、この多機能ｓｉＮＡ分子に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである配列を含む。別の態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、この多機能ｓｉＮＡ分子に存在するすべてのプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである配列を含む。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、この多機能ｓｉＮＡ配列中に存在するプリンヌクレオチドの一つ以上が、２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドである配列を含む。他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、この多機能ｓｉＮＡ配列に存在する全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドである配列を含む。
【００５７】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ配列が多機能ｓｉＮＡ配列の一方又は両方に３’−末端に末端キャップ部分を含む以下を含む配列を含む。もう一つの態様において、末端キャップ部分は、多機能ｓｉＮＡに対するいずれの修飾も多機能ｓｉＮＡ分子が遺伝子発現の阻害を媒介する能力を有意に損なわない程度の、反転されたデオキシ無塩基部分か、又は図９に示した任意のその他の修飾もしくは核酸分子に導入することができる一般に当技術分野において公知の修飾である。
【００５８】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ配列が多機能ｓｉＮＡ配列の３’末端の末端キャップ部分を含む配列を含む。もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡに対するいずれの修飾も多機能ｓｉＮＡ分子が遺伝子発現の阻害を媒介する能力を有意に損なわない程度の末端キャップ部分は、反転されたデオキシ無塩基部分か、又は、図９に示した任意のその他の修飾もしくは核酸分子に導入することができる一般に当技術分野において公知の修飾である。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つの遺伝子にコードされたＲＮＡの発現を調節する活性を有する。変異体遺伝子は互いにある程度の配列相同性を共有することができるため、異なる遺伝子標的の間で共有されている、又は特定遺伝子にユニークである配列を選択することにより、一群の遺伝子（及び関連する受容体又はリガンドの遺伝子）又は特定遺伝子を標的とするよう多機能ｓｉＮＡ分子を設計することができる。従って、一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの相補的領域は、１つの多機能ｓｉＮＡ分子によっていくつかの遺伝子又は遺伝子ファミリー（たとえば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異遺伝子その他）を標的とするために、いくつかの遺伝子又はゲノム（たとえば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＳＡＲＳその他などのウイルスゲノム）間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存された領域を標的とするようにデザインすることができる。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの相補的領域は、特定の遺伝子又はゲノム（たとえば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＳＡＲＳその他などのウイルスゲノム）の特定のＲＮＡ配列に対して独特の配列を標的とするようにデザインすることができる。公知の配列を有するいずれの標的核酸の発現も、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子によって調節することができる（たとえば、哺乳類及びウイルスの標的の一覧については、本明細書にその全体が参照により援用されるＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開公報第０３／７４６５４号を参照されたい）。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。
【００６１】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、いずれの化学修飾も含まない。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、化学修飾を含んでいないＲＮＡである。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、３’−末端に２つのデオキシリボヌクレオチドを含むＲＮＡである。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、３’−キャップ構造（たとえば、反転デオキシヌクレオチド、反転デオキシ無塩基部分、チミジンジヌクレオチド残基又はホスホロチオアートヌクレオチド間結合もつチミジンジヌクレオチドなど）を含むＲＮＡである。
【００６２】
本発明の１つの態様において、多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの配列は、独立して約１８〜約３００ヌクレオチドの長さ、特定の態様において、約１８〜２００の長さ、好ましくは１８〜１５０ヌクレオチドの長さ、より具体的には１８〜１００ヌクレオチドの長さのヌクレオチドである。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ二重鎖は、独立して約１８〜約３００塩基対（たとえば、約１８〜２００、１８〜１５０、１８〜１００、１８〜７５、１８〜５０、１８〜３４又は１８〜３０塩基対）を含む。
【００６３】
一つの態様において、本発明は、ウイルス（たとえば、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、又はＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ又はインフルエンザウィルスなどの哺乳類ウイルスとして）の複製を阻害する多機能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００６４】
一つの態様において、本発明は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含む医薬を特徴とする。
【００６５】
一つの態様において、本発明は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含む活性成分を特徴とする。
【００６６】
一つの態様において、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするための、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の使用を特徴とする。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を薬理学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む組成物を特徴とする。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明は、多機能ｓｉＮＡ分子に少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを導入することを含み、前記修飾されたヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、リボヌクレアーゼによる分解に対する多機能ｓｉＮＡ分子の安定性を向上させる方法を特徴とする。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中に存在する全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中の収縮されたヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。他の実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中の修飾されたヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジン及び２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中に存在する全てのウリジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中に存在する全てのシチジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中に存在する全てのアデノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ中に存在する全てのグアノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。多機能ｓｉＮＡは、少なくとも１つの、ホスホロチオアート結合又はホスホロジチオエート結合のような修飾ヌクレオチド間結合をさらに有していてもよい。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド又は末端ヌクレオチドを有する部位等の、リボヌクレアーゼその他のヌクレアーゼによる切断を受けやすい、多機能ｓｉＮＡ中の特に選択された部位に存在する。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、一般に当技術分野において公知の方法（たとえば、図面を含むその全体が本明細書に参照により援用されるＢｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開公報第０３／７０９１８号を参照されたい）によって、安定性、薬物動態学的特性、インビトロで又はインビボでの送達、局在化及び／又は能力を改善するために修飾することができる。
【００６９】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、標的核酸又はこれらの一部によってコードされるＲＮＡヌクレオチド配列又はこれらの一部に対して相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
一つの態様において、本発明は、第一の領域及び第二の領域を有する多機能ｓｉＮＡ分子であって、第二の領域は、第一の領域ヌクレオチド配列の逆位反復配列であるヌクレオチド配列を含み、第一の領域は、標的核酸（たとえば、ＲＮＡ）ヌクレオチド配列又はこれらの一部に対して相補的である多機能ｓｉＮＡ分子を特徴とする（たとえば、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定の例の例証については、図１及び２を参照されたい）。
【００７１】
本発明の１つの実施形態は、少なくとも１つの本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を、多機能ｓｉＮＡ配列が発現可能な態様でコードした核酸配列を有する発現ベクターを提供する。本発明の他の実施形態は、そのような発現ベクターを有する哺乳類細胞を提供する。前記哺乳類細胞はヒト細胞であってもよい。
【００７２】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＩＩＩを有する化学修飾されたヌクレオチド間結合を含む１つ又は複数の（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の）ヌクレオチドを含む：
【化５】
2007523649.tif 000004
式中、それぞれのＲ１及びＲ２は、独立して、天然に存在するか、又は化学修飾されていることができる任意ヌクレオチド、非ヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、それぞれのＸ及びＹは、独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル又は置換されたアルキルであり、それぞれのＺ及びＷは、独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換されたアルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ａｌｋアリール又はアラルキルであり、式中Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺは、任意に全てＯ以外である。もう一つの態様において、本発明の骨格修飾は、ホスホノアセテート及び／又はチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合（たとえば、Ｓｈｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３１，  ４１０９−４１１８を参照されたい）。
【００７３】
たとえば、式中、いずれのＺ、Ｗ、Ｘ及び／又はＹも、独立して硫黄原子を含む式ＩＩＩを有する化学修飾のヌクレオチド間結合は、多機能ｓｉＮＡ配列のどこに存在することもできる。このようなリン酸骨格修飾の非限定の例は、ホスホロチオアート及びホスホロジチオアートである。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は多機能ｓｉＮＡ配列の、３’−末端、５’−末端又は３’及び５’−末端の両方ともに式ＩＩＩを有する１つ又は複数の（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の）化学修飾されたヌクレオチド間結合を含むことができる。もう一つの非限定の例において、本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＩＩＩを有する化学修飾のヌクレオチド間結合をもつ、１つ又は複数の（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の）ピリミジンヌクレオチドを含むことができる。さらにもう一つの非限定の例において、本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＩＩＩを有する化学修飾のヌクレオチド間結合をもつ、１つ又は複数の（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の）プリンヌクレオチドを含むことができる。もう一つの態様において、式ＩＩＩのヌクレオチド間結合を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、また、式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれかを有する化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。
【００７４】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＩＶを有する一以上（例えば、約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０、又はそれ以上）のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み：
【化６】
2007523649.tif 000005
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキニルアミノ、置換シリル、又は式ＩＩＩ又はＩＶで表される基を表し、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２を表し、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の非天然塩基等のヌクレオチド塩基又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の万能塩基等の非ヌクレオチド塩基を表す。
【００７５】
式ＩＶの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、多機能ｓｉＮＡ配列のどこに存在することもできる。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ配列の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に、１又は複数の式ＩＶで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子は、約１〜約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式ＩＶで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、多機能ｓｉＮＡ配列の５’末端に有することができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子は、約１〜約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式ＩＶで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、多機能ｓｉＮＡ配列の３’末端に含んでいてもよい。
【００７６】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式Ｖを有する一以上（例えば、約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０、又はそれ以上）のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み：
【化７】
2007523649.tif 000006
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキニルアミノ、置換シリル、又は式ＩＩＩ又はＩＶで表される基を表し、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２を表し、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の非天然塩基等のヌクレオチド塩基又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の万能塩基等の非ヌクレオチド塩基を表す。
【００７７】
式Ｖの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、多機能ｓｉＮＡ配列のどこに存在することもできる。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に、１又は複数の式Ｖで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の５’末端に、約１−約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式Ｖで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’末端に、約１−約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式Ｖで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７８】
他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＩＶ又はＶで表されるヌクレオチドを含み、ここで、式ＩＶ又はＶで表されるヌクレオチドは反転のコンフィギュレ−ションである。例えば、式ＩＶ又はＶを有するヌクレオチドは、多機能ｓｉＮＡコンストラクトに３’−３’、３’−２’、２’−３’、又は５’−５’コンフィギュレ−ションで、例えば、多機能ｓｉＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に結合させることができる。
【００７９】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＶＩを有する５’末端リン酸基を含み：
【化８】
2007523649.tif 000007
式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、又はアルキルハロを表し、Ｚ及びＷは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、又はアセチルを表し、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺの全てがＯでない。
【００８０】
別の態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）の２’−５’ヌクレオチド間結合を有する。２’−５’ヌクレオチド間結合は、多機能ｓｉＮＡのどこの配列であることもできる。さらに、２’−５’ヌクレオチド間結合は、多機能ｓｉＮＡ配列内の種々の他の位置に存在することができ、例えば、多機能ｓｉＮＡ分子のピリミジンヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上、例えば全てのヌクレオチド間結合は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むことができ、又は多機能ｓｉＮＡ分子のプリンヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上、例えば全てのヌクレオチド間結合は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の脱塩基部分、例えば、式ＶＩＩＩで表される化合物を含み：
【化９】
2007523649.tif 000008
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキニルアミノ、置換シリル、又は式ＩＩＩ又はＩＶで表される基を表し、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２を表す。
【００８２】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の反転核酸又は脱塩基部分、例えば、式ＶＩＩＩで表される化合物を含み：
【化１０】
2007523649.tif 000009
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は式ＩＩＩ又はＩＶで表される基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８又はＲ１３のいずれかは、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子への結合の点として作用する。
【００８３】
他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の置換ポリアルキル部分、例えば、式ＩＸで表される化合物を含み：
【化１１】
2007523649.tif 000010
式中、ｎは、それぞれ独立して、１〜１２の整数であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は式ＩＩＩで表される基であり、Ｒ１、Ｒ２又はＲ３は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子への結合の点として作用する。
【００８４】
他の実施形態において、本発明は、Ｒ１及びＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）基であり、ｎは１であり、Ｒ３はＯを含み、かつ本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方への、又は本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子への結合の点である、式ＩＸで表される化合物を特徴とする。この修飾は、本明細書において「グリセリル」と称される（例えば、図９の修飾６を参照）。
【００８５】
他の実施形態において、本発明の式ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸのいずれかを有する部分は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端、５’−末端、又は３’及び５’−末端の両方に存在する。もう一つの態様において、本発明の式ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸのいずれかを有する部分は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端にある。
【００８６】
他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩを有する脱塩基残基を含み、ここで、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩを有する脱塩基残基は、３’−３’、３’−２’、２’−３’、又は５’−５’コンフィギュレーションで、例えば、多機能ｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方で多機能ｓｉＮＡコンストラクトに結合している。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、無塩基残基を有する式ＶＩＩ又はＶＩＩＩであって、式中、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩを有する無塩基残基は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端にて、３−３’又は３−２’配置で多機能ｓｉＮＡコンストラクトに接続されているものを含む。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、例えば、多機能ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’末端及び３’末端の両方、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）のロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
【００８８】
他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、例えば、多機能ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’末端及び３’末端の両方、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の非環状ヌクレオチドを含む。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端にて、１つ又は複数の（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の）非環式ヌクレオチドを含む。
【００８９】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の３’末端にて、反転されたデオキシ無塩基部分又は反転されたヌクレオチドなどの末端キャップ部分（たとえば、図９を参照されたい）を含む。
【００９０】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡに存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、多機能ｓｉＮＡに存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）配列を含む。多機能ｓｉＮＡは、本明細書に記述したような末端キャップ修飾をさらに含むことができる。
【００９１】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡは、多機能ｓｉＮＡに存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、多機能ｓｉＮＡに存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）配列を含む。多機能ｓｉＮＡは、本明細書に記述したような末端キャップ修飾をさらに含むことができる。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡは、多機能ｓｉＮＡに存在する任意の（例えば１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、かつ、多機能ｓｉＮＡに存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選ばれ、あるいは複数のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選ばれる）配列を含む。
【００９３】
もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、天然に存在するリボヌクレオチドと同様の特性又は特徴を有する修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ノーザンこんフォメーション（例えば、ノーザン偽回転サイクル、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含む多機能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子に存在する化学修飾されたヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する能力を維持していると同時に、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を有している。ノーザンコンフィギュレーションを有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
【００９４】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ分子に付着された抱合体を含む。たとえば、抱合体は、共有結合を経て多機能ｓｉＮＡ分子に付着することができる。一つの態様において、抱合体は、生体分解性リンカーを経て多機能ｓｉＮＡ分子に付着される。一つの態様において、抱合体分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’末端にて付着される。もう一つの態様において、抱合体分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の５’末端にて付着される。さらにもう一つの態様において、抱合体分子は、多機能ｓｉＮＡ分子の３’−末端及び５’−末端の両方、又はこれらの任意の組み合わせにて付着される。１つの実施形態においては、本発明のコンジュゲート分子は、化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子の生物学的システム（例えば細胞）へのデリバリーを促進する分子を含む。他の実施形態においては、化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は細胞取り込みを媒介することができる細胞受容体のリガンドである。化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子に結合させることができる、本発明により企図される特定のコンジュゲート分子の例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載され、参照として本明細書に組み込まれる。用いられるコンジュゲートのタイプ及び本発明の多機能ｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は、同時に多機能ｓｉＮＡが遺伝子発現を調節する能力を維持しながら、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの改良された薬物動態学プロファイル、生物利用性、及び／又は安定性について評価することができる。このように、当業者は、例えば、当該技術分野において一般的に知られる動物モデルにおいて、種々のコンジュゲートで修飾された多機能ｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングして、多機能ｓｉＮＡコンジュゲート複合体が遺伝子発現を調節する能力を維持しながら改良された特性を有するかを判定することができる。
【００９５】
さらに別の実施形態においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他のポリマー性化合物（例えば、ポリエチレングリコール、例えば２〜１００個のエチレングリコール単位を有するもの）のような非ヌクレオチドリンカーを含む。特定の例としては、Ｓｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，７５，６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，７５，３１１３、Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１７３，６３２４、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，７７３，５１０９、Ｍａ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２７，２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３、３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，７５，６３５３、ＭｃＣｕｒｄｙ他．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９１，１０，２８７、Ｊｓｃｈｋｅ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，３０１、Ｏｎｏ他．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，９９１４、Ａｒｎｏｌｄ他、ＷＯ８９／０２４３９号国際公開公報、Ｕｓｍａｎ他，ＷＯ９５／０６７３１号国際公開公報、Ｄｕｄｙｃｚ他．、ＷＯ９５／１１９１０号国際公開公報、及びＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，７７３，４０００（すべて参照として本明細書に組み込まれる）に記載されたものが挙げられる。「非ヌクレオチド」はさらに、１又は複数のヌクレオチドユニットの代わりに糖及び／又はリン酸置換のいずれかにより核酸鎖中に取り込むことができ、残りの塩基がその酵素活性を発揮することを可能とする任意の基又は化合物を意味する。基又は化合物は、一般に認識されているヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンを、例えば糖のＣ１位に含まない場合、脱塩基であってもよい。
【００９６】
一つの態様において、本発明は、標的核酸の遺伝子発現の阻害又は調製のために、多機能ｓｉＮＡ分子内に存在するように２’−ＯＨ基（リボヌクレオチド）基が存在することを必要としない、多機能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００９７】
１つの実施形態において、本発明は、細胞中において標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもしなくてもよく、多機能ｓｉＮＡはその遺伝子のＲＮＡに相補的な配列又はその一部を有すること、（ｂ）細胞中における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で多機能ｓｉＮＡを細胞に導入することを含む。
【００９８】
一つの態様において、本発明は、以下を含む細胞内での遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部の第１部分に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部の第２部分に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で多機能ｓｉＮＡ分子を細胞に導入すること。ＲＮＡの第１及び第２の部分は、たとえば遺伝子のコード領域及び／又は非コード配列を含むことができる。
【００９９】
一つの態様において、本発明は、以下を含む細胞内での遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部の第一の部分に対する配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、遺伝子の発現を調節する第二のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を細胞に導入すること。第一のＲＮＡは、たとえば遺伝子のコード領域又は非コード配列を含むことができる。第二のＲＮＡは、たとえばエンハンサー領域、ｔＲＮＡ、エンハンサーエレメントをコードするＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ又は標的遺伝子の発現に関与するその他の非コードＲＮＡを含むことができる。
【０１００】
一つの態様において、本発明は、以下を含む細胞内での複数の遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、第一の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、第二の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を細胞に導入すること。第１及び第２の遺伝子のＲＮＡは、独立して遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。一つの態様において、第一の遺伝子は、１つ又は複数のサイトカインをコードし、及び第二の遺伝子は、サイトカインの１つ又は複数の受容体をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、同じウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、異なるウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、ウイルスの感染又は複製に関与する１つ又は複数の細胞因子をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、共通の生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、多岐にわたる生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。
【０１０１】
１つの実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、ｅｘ  ｖｉｖｏ用途における試薬として用いられる。例えば、多機能ｓｉＮＡ試薬は、治療効果のために被験者の中に移植される組織又は細胞に導入される。細胞及び／又は組織は、その後に外植片を受ける生物又は被験者由来、又は移植前の別の生物又は被験者由来であってもよい。多機能ｓｉＮＡ分子を用いて、インビボ移植された場合に細胞又は組織が所望の表現型を獲得し、又は機能を実行しうるように、細胞又は組織における１つ以上の遺伝子の発現を調節することができる。１つの実施形態においては、ある種の標的細胞が患者から抽出される。これらの抽出細胞は、これらの細胞による多機能ｓｉＮＡの取込みに適した条件下に（例えば、陽イオン脂質、リポソーム等などのデリバリー試薬を用い、又はエレクトロポレーションなどの方法を用いて、細胞への多機能ｓｉＮＡのデリバリーを促進することにより）細胞内の特定のヌクレオチド配列をターゲティングする多機能ｓｉＮＡと接触させる。次いで、細胞は同じ患者又は他の患者に再導入されて戻される。エキソビボ適用の非限定の例は、器官／組織移植、組織移植又は肺疾患（たとえば、再狭窄）の治療又は静脈移植における新生内膜過形成及びアテローム性動脈硬化症の予防における使用を含む。このようなエキソビボ適用は、たとえば、冠状血管と関連する状態及び末梢バイパス移植不全を治療するためにまた使用してもよく、このような方法は、末梢血管バイパス移植術及び冠状動脈バイパス移植片術と組み合わせて使用することができる。さらなる適用は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、痴呆、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性状態の治療における使用を含む、ＣＮＳ病変又は傷害を治療するための移植を含む。
【０１０２】
１つの実施形態においては、本発明は、組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもしていなくてもよく、多機能ｓｉＮＡは標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列又はその一部を有すること、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入することを含む。他の実施形態においては、この方法はさらに、その生物における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、組織外植片をその組織が由来する生物に戻すか又は別の生物に導入することを含む。
【０１０３】
一つの態様において、本発明は、以下を含む組織外植片における遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第一の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第二の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を特定の生物体に由来する組織外植片細胞に導入すること。もう一つの態様において、本方法は、生物体における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、組織外植片を、組織が由来する生物体に、又は別の生物体に導入し戻すことをさらに含む。ＲＮＡの第１及び第２の部分は、たとえば遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。
【０１０４】
もう一つの態様において、本発明は、以下を含む組織外植片における複数の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、第一の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、第二の遺伝子に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を特定の生物体に由来する組織外植片の細胞に導入すること。もう一つの態様において、本方法は、生物体における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、組織外植片を、組織が由来する生物体に、又は別の生物体に導入し戻すことをさらに含む。ＲＮＡの第１及び第２の部分は、たとえば遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。一つの態様において、第一の遺伝子は、１つ又は複数のサイトカインをコードし、及び第二の遺伝子は、サイトカインの１つ又は複数の受容体をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、同じウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は異なるウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、ウイルスの感染又は複製に含まれる１つ又は複数の細胞因子をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、共通の生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、多岐にわたる生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。
【０１０５】
一つの態様において、本発明は、以下を含む生物体内での１つ又は複数遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、遺伝子の１つもしくは複数のＲＮＡ又はこれらの一部に対して相補的な配列を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）生物体における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を生物体に導入すること。
【０１０６】
一つの態様において、本発明は、以下を含む生物体内での遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第一の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第二の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を生物体に導入すること。ＲＮＡの第１及び第２の部分は、たとえば、遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。
【０１０７】
一つの態様において、本発明は、以下を含む生物体内での遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第一の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、遺伝子の発現を調節する第二のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）生物体における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を生物体に導入すること。第一のＲＮＡは、たとえば遺伝子のコード配列又は非コード配列を含むことができる。第二のＲＮＡは、たとえばエンハンサー領域、ｔＲＮＡ、エンハンサーエレメントをコードするＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ又は標的遺伝子の発現に関与するその他の非コードＲＮＡを含むことができる。
【０１０８】
一つの態様において、本発明は、以下を含む生物体内での複数の遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、第一の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、第二の遺伝子又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）生物体における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を生物体に導入すること。第１及び第２の遺伝子のＲＮＡは、独立して遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。一つの態様において、第一の遺伝子は１つ又は複数サイトカインをコードし、及び第二の遺伝子は、サイトカインの１つ又は複数の受容体をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、同じウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、異なるウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、ウイルスの感染又は複製に含まれる１つ又は複数の細胞因子をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、共通の生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、多岐にわたる生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。
【０１０９】
一つの態様において、本発明は、以下を含む組織又は器官における１つ又は複数遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、遺伝子の１つもしくは複数のＲＮＡ又はこれらの一部に対して相補的な配列を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）組織又は器官における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を組織又は器官に導入すること。もう一つの態様において、組織は、眼組織であり、器官は眼である。もう一つの態様において、組織は、肝細胞及び／又は肝臓組織を含み、器官は、肝臓である。
【０１１０】
一つの態様において、本発明は、以下を含む組織又は器官における遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第一の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、遺伝子のＲＮＡの第二の部分又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）組織又は器官における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を組織又は器官に導入すること。ＲＮＡの第１及び第２の部分は、たとえば、遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。もう一つの態様において、組織は、眼組織であり、器官は、眼である。もう一つの態様において、組織は、肝細胞及び／又は肝臓組織を含み、器官は、肝臓である。
【０１１１】
一つの態様において、本発明は、以下を含む組織又は器官における複数の遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の鎖と第二の鎖とを含み、かつ第一の鎖は、第一の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含み、かつ第二の鎖は、第二の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して配列相補性を有する領域を含む多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、及び（ｂ）組織又は器官における遺伝子の発現を調節するために適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を組織又は器官に導入すること。第１及び第２の遺伝子のＲＮＡは、独立して遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列を含むことができる。一つの態様において、第一の遺伝子は、１つ又は複数のサイトカインをコードし、及び第二の遺伝子は、サイトカインの１つ又は複数の受容体をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、同じウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、異なるウイルスの一つ又は株をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、ウイルスの１つ又は複数の株をコードし、及び第二の遺伝子は、ウイルスの感染又は複製に関与する１つ又は複数の細胞因子をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、共通の生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。一つの態様において、第一の遺伝子は、第一のタンパク質をコードし、及び第二の遺伝子は、多岐にわたる生物学的経路に関与する第二のタンパク質をコードする。もう一つの態様において、組織は、眼組織であり、器官は、眼である。もう一つの態様において、組織は、肝細胞及び／又は肝臓組織を含み、器官は、肝臓である。
【０１１２】
本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、種々の核酸分子（たとえば、ＲＮＡ）のターゲティングによって、生物系における標的遺伝子発現をダウンレギュレートし、又は阻害するようにデザインすることができる。１つの実施形態においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とするよう用いられる。そのようなＲＮＡの非限定的な例には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、標的遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシング変種、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のプレ−ｍＲＮＡ、及び／又はＲＮＡテンプレートが含まれる。選択的スプライシングにより、適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合には、本発明は、適当なエクソンにより遺伝子発現を阻害して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するか又はその間を区別するために用いることができる。例えば、選択的スプライシングされた貫膜ドメインを含むタンパク質を、膜結合型及び分泌型の両方の形で発現させることができる。本発明を用いて貫膜ドメインを含むエクソンを標的とすることにより、分泌型のタンパク質に対して、膜結合型の薬理学的ターゲティングの機能的重要性を判定することができる。これらのＲＮＡ分子を標的とすることに関連する本発明の用途の非限定的な例には、治療的医薬用途、医薬の発見用途、分子診断及び遺伝子機能用途、及び遺伝子マッピング、例えば本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を用いる単一ヌクレオチド多型のマッピングが含まれる。そのような用途は、既知の遺伝子配列を用いて、又は発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列から実行することができる。
【０１１３】
もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、遺伝子ファミリーに対応する保存された配列（たとえば、インターロイキン・スーパーファミリー遺伝子、腫瘍壊死ファミリー・スーパーファミリー遺伝子、ウイルス株その他などの遺伝子のスーパーファミリーの異なるアイソフォーム又は異なるメンバー（たとえば、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開公報第０３／７４６５４号を参照されたい））を標的とするために使用される。そのように、多くの遺伝子を標的とする多機能ｓｉＮＡ分子は、増加した治療効果を提供することができる。さらに、多機能ｓｉＮＡは、種々の応用法において遺伝子機能の経路を特性決定するために用いることができる。例えば、本発明を用いて、経路における標的遺伝子の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、又は翻訳分析において、特性決定されていない遺伝子の機能を決定することができる。本発明は、医薬開発に向けて、種々の疾患及び健康状態に関与する可能性のある標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。本発明は、たとえば、生前発育及び生後発育などの発育に、及び／又は癌、感染症、自己免疫、炎症、内分泌障害、腎疾患、眼の疾患、肺疾患、神経疾患、心臓血管疾患、先天性異常、老化、遺伝子発現に関連した他の任意の疾患もしくは状態の進行及び／又は維持に関与する遺伝子発現の経路を理解するために使用することができる。
【０１１４】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子及び／又は方法は、Ｇｅｎｂａｎｋ目録によって参照されるＲＮＡをコードする遺伝子、たとえば、本明細書においてＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって参照されるＲＮＡ配列をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートし、又は阻害するために使用される。たとえば、哺乳類及びウイルスの標的の一覧については、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開公報第０３／７４６５４号を参照されたい（その全体が本明細書に参照により援用される）。
【０１１５】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）予め決定された複雑性を有する多機能ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリーを生成し、そして（ｂ）標的ＲＮＡ配列中の近接可能標的部位を決定するのに適した条件下で、上述の（ａ）の多機能ｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする、ことを含む方法を特徴とする。他の実施形態においては、（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子は、固定された長さ、例えば、約２８ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに他の実施形態においては、（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子は、異なる長さのものであり、例えば、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。他の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。他の実施形態においては、標的ＲＮＡのフラグメントを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析、又はＲＮＡｓｅ保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して、標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られるように、例えば、クローニング及び／又はインビトロ系については転写、インビボ系においては細胞発現により、得ることができる。
【０１１６】
「検出可能なレベルの切断」とは、標的ＲＮＡのランダム分解から生成するＲＮＡのバックグラウンドから切断産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（及び切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。ほとんどの検出方法について、標的ＲＮＡの１〜５％から切断産物が生成すれば、バックグラウンドから検出するのに充分である。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を薬理学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む組成物を特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、１又は複数の遺伝子を標的とし、化学的に修飾されていてもよい本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を薬理学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む医薬組成物を特徴とする。他の実施形態において、本発明は、被験者において疾患又は健康状態を診断する方法を特徴とし、該方法は、被験者に本発明の組成物を、被験者における疾病又は健康状態の診断に適した条件下で投与することを含む。他の実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の組成物を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。さらにもう一つの態様において、本発明は、被検者における組織拒絶反応を減少し、又は防止するための方法であって、被検者における組織拒絶反応の減少又は予防のために適した条件下で、被検者に対して本発明の組成物を投与することを含む方法を特徴とする。
【０１１８】
もう一つの態様において、本発明は、以下を含む生物系における遺伝子標的を確証するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の配列と第二の配列とを含み、かつ第一の配列は、遺伝子のＲＮＡの第一の部分又はこれらの一部に対して相補的であり、かつ第二の配列は、遺伝子のＲＮＡの第二の部分又はこれらの一部に対して相補的である多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、（ｂ）細胞、組織又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を細胞、組織又は生物体に導入すること、及び（ｃ）細胞、組織又は生物体における任意の表現型の変化についてアッセイすることによって遺伝子の機能を決定すること。
【０１１９】
もう一つの態様において、本発明は、以下を含む生物系における２つの遺伝子標的を含む生物学的経路を確証するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の配列と第二の配列とを含み、かつ第一の配列は、第一の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して相補的であり、かつ第二の配列は、第二の遺伝子のＲＮＡ又はこれらの一部に対して相補的である多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、（ｂ）細胞、組織又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を細胞、組織又は生物体に導入することと、及び（ｃ）細胞、組織又は生物体における任意の表現型の変化についてアッセイすることによって生物学的な経路の機能を決定すること。
【０１２０】
もう一つの態様において、本発明は、以下を含む生物系における２つ以上の遺伝子標的を含む生物学的経路を確証するための方法を特徴とする：（ａ）本発明の多機能ｓｉＮＡ分子であって、互いに相補的である第一の配列と第二の配列とを含み、かつ第一の配列は、１つ又は複数の第一の遺伝子標的のＲＮＡ又はこれらの一部に対して相補的であり、かつ第二の配列は、１つ又は複数の第二の遺伝子標的のＲＮＡ又はこれらの一部に対して相補的である多機能ｓｉＮＡ（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）を合成することと、（ｂ）細胞、組織又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を細胞、組織又は生物体に導入することと、及び（ｃ）細胞、組織又は生物体における任意の表現型の変化についてアッセイすることによって生物学的な経路の機能を決定すること。
【０１２１】
「生物学的システム」は、例えば、精製され又は精製されていない形態で、特に限定されないが、ヒト、動物、植物、昆虫、細菌、ウイルスその他の出所等を含む生物学的出所に由来する物質を意味する、「生物学的システム」との用語には、例えば、細胞、組織、又は生物、又はそれらの抽出物が含まれる。
【０１２２】
「表現型変化」とは、本発明の核酸分子（例えば多機能ｓｉＮＡ）との接触又は処理に応答して生ずる任意の検出可能な細胞の変化を意味する。そのような検出可能な変化には、限定されないが、形状、サイズ、増殖、運動性、タンパク質発現又はＲＮＡ発現、又は当該技術分野において知られる方法によりアッセイすることができる他の物理学的又は化学的変化が含まれる。検出可能な変化にはまた、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子／分子、又は発現されたタンパク質を同定するために用いられる種々のタグ、又はアッセイすることができる任意の他の細胞成分の発現が含まれる。
【０１２３】
１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし、これは細胞、組織、又は生物における標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし、これは細胞、組織、又は生物における標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。他の実施形態においては、本発明は、化学的に修飾されていてもよい２以上の本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし、これは細胞、組織、被験者、又は生物において２以上の標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明の１又は複数の多機能ｓｉＮＡ分子を含有する細胞を特徴とする。他の実施形態においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含有する細胞は哺乳動物細胞である。さらに他の実施形態においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を含有する細胞はヒト細胞である。
【０１２５】
一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ二重鎖分子（これは、化学修飾すること、又は修飾しないことができる）の合成は、以下を含む：（ａ）多機能ｓｉＮＡ分子として本明細書に定義された核酸分子を含む自己相補核酸配列を合成することと、（ｂ）多機能ｓｉＮＡ分子のために適した条件下で（ａ）の核酸分子をインキュベートして、二本鎖多機能ｓｉＮＡ分子を形成すること。一つの態様において、オリゴヌクレオチド又は多機能ｓｉＮＡを含む自己相補核酸配列の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡ分子は、発現ベクターから発現されるか、又は酵素的に合成される。
【０１２６】
他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の合成の方法は、Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第５，８８９，１３６号、第６，００８，４００号、及び第６，１１１，０８６号（その全体を参照として本明細書に組み込まれる）の教示を含む。
【０１２７】
一つの態様において、本発明は、細胞又は再構成された系における遺伝子発現の調節又は阻害を媒介する多機能ｓｉＮＡコンストラクトであって、１つ又は複数の化学修飾、たとえば多機能ｓｉＮＡコンストラクトのヌクレアーゼ耐性及び／又は全体の有効性もしくは能力を増大する式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有する１つ又は複数の化学修飾を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。
【０１２８】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドを多機能ｓｉＮＡ分子中に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子を、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大した多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でアッセイすることを含む、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大した多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１２９】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドを多機能ｓｉＮＡ分子中に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子を、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大した多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でアッセイすることを含む、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大した多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１３０】
もう一つの態様において、本発明は、以下を含む肝細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、初代細胞及びニューロン細胞などの標的細胞又は組織への送達が増大された多機能ｓｉＮＡ分子を作製するための方法を特徴とする。（ａ）多機能ｓｉＮＡ分子内に、式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有する化学修飾、抱合体又はヌクレオチドを導入することと、及び（ｂ）標的細胞又は組織への送達が増大された多機能ｓｉＮＡ分子を単離するために適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイすること。一つの態様において、本発明は、標的遺伝子に対して遺伝子発現の調節又は阻害を媒介する多機能ｓｉＮＡ二重鎖は構築であって、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの２つの鎖の間の結合親和性を調節する、本明細書に記述した１つ又は複数の化学修飾を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。
【０１３１】
一つの態様において、多機能ｓｉＮＡが遺伝子発現を調節する能力に関して、多機能ｓｉＮＡ分子の活性を増大するためには、本発明の多機能ｓｉＮＡによって形成される二重鎖の鎖間の結合親和性が調節される。もう一つの態様において、多機能ｓｉＮＡ二重鎖の２つの鎖間の結合親和性が減少される。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの鎖間の結合親和性は、多機能ｓｉＮＡ配列に、多機能ｓｉＮＡの二重鎖安定性を崩壊させる（たとえば、二重鎖のＴｍを低下させる）１つ又は複数の化学的に修飾されたヌクレオチドを導入することによって減少することができる。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの鎖間の結合親和性は、多機能ｓｉＮＡ配列に、ワトソン−クリック塩基対を形成しない１つ又は複数のヌクレオチドを導入することによって減少させることができる。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの鎖間の結合親和性は、多機能ｓｉＮＡ配列に、１つ又は複数のゆらぎ塩基対を導入することによって減少させることができる。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの鎖間の結合親和性は、多機能ｓｉＮＡ配列のＧＣ含量を変更すること（たとえば、多機能ｓｉＮＡ配列におけるＧＣ塩基対の数を減少させる）などにより、多機能ｓｉＮＡの核酸塩基組成物を修飾することによって減少させることができる。これらの修飾及び配列の変更を、多機能ｓｉＮＡ配列の予め決定された位置に選択的に導入して、多機能ｓｉＮＡを媒介した遺伝子発現の調節を増大させることができる。たとえば、このような修飾及び配列変更を導入して、一方の鎖の５’末端と他方の鎖の３’末端もしくは一方の鎖３’末端と他方の鎖の５’末端との間、又は多機能ｓｉＮＡ二重鎖の中央の多機能ｓｉＮＡ二重鎖安定性を崩壊させることができる。もう一つの態様において多機能ｓｉＮＡ活性を増大する際に観察される規則又は傾向に基づいて合理的にデザインするか、又は多機能ｓｉＮＡコンストラクトの部分的又は完全ないずれかの配列間隔をカバーする組み合わせ選択法を経てランダムに、いずれかによってこのような修飾及び配列変化を導入することにより、多機能ｓｉＮＡ分子を最適化された活性についてスクリーニングする。
【０１３２】
もう一つの態様において、本発明は、以下を含む多機能ｓｉＮＡ分子の鎖間の結合親和性を増大された多機能ｓｉＮＡ二重鎖分子を作製するための方法を特徴とする。（ａ）式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれかを有するヌクレオチド又はこれらの任意の組み合わせを、多機能ｓｉＮＡ分子に導入することと、及び（ｂ）多機能ｓｉＮＡ分子の鎖間の結合親和性が増大された多機能ｓｉＮＡ分子を単離するために適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイすること。
【０１３３】
一つの態様において、本発明は、標的ＲＮＡの発現を調節する多機能ｓｉＮＡコンストラクトであって、多機能ｓｉＮＡコンストラクトと細胞内の相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性を調節する、本明細書に記述された１つ又は複数の化学修飾を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。
【０１３４】
一つの態様において、本発明は、標的ＤＮＡの発現を調節する多機能ｓｉＮＡコンストラクトであって、多機能ｓｉＮＡコンストラクトと細胞内の相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性を調節する、本明細書に記述された１つ又は複数の化学修飾を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。
【０１３５】
他の実施形態において、本発明は、多機能ｓｉＮＡ分子と相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性が増加している多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式ＩＩＩ〜ＸＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドを多機能ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）多機能ｓｉＮＡ分子と相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性が増加している多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１３６】
他の実施形態において、本発明は、多機能ｓｉＮＡ分子と相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性が増加している多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドを多機能ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）多機能ｓｉＮＡ分子と相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性が増加している多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１３７】
一つの態様において、本発明は、細胞又は再構成された系における標的遺伝子の発現を調節する多機能ｓｉＮＡコンストラクトであって、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの細胞の取り込みを調節する、本明細書に記述された１つ又は複数の化学修飾を含む多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明は、改良された細胞取り込みを有する、標的遺伝子に対する多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は（ａ）式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドを多機能ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された細胞取り込みを有する多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する多機能ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここで、多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、例えば、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの薬物動態学を改良するポリエチレングリコール又は同等のコンジュゲート等のポリマー性コンジュゲートを結合させることにより、又はインビボで特定の組織のタイプ又は細胞のタイプにターゲティングするコンジュゲートを結合させることにより、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの生物利用性を増加させる、本明細書に記載される１又は複数の化学的修飾を含む。そのようなコンジュゲートの非限定的な例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他，米国特許出願１０／２０１，３９４号に記載され、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
１つの実施形態において、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）コンジュゲートを多機能ｓｉＮＡ分子の構造中に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有する多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。そのようなコンジュゲートには、細胞受容体のリガンド、例えば、天然に生ずるタンパク質リガンドに由来するペプチド、タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー、ビタミン及び他の補因子、例えば葉酸及びＮ−アセチルガラクトースアミン；ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン脂質、ポリアミン、例えばスペルミン又はスペルミジン、及び他のものが含まれる。
【０１４１】
一つの態様において、本発明は、以下を含む多機能ｓｉＮＡ分子を標的核酸配列に対してスクリーニングするための方法を特徴とする。（ａ）複数の無修飾多機能ｓｉＮＡ分子を作製することと、（ｂ）標的核酸配列の発現を調節する際に活性である多機能ｓｉＮＡ分子を単離するために適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイすることと、（ｃ）任意に、化学修飾（たとえば、本明細書に記述されたか、又はさもなければ当技術分野において公知の化学修飾）を（ｂ）の活性な多機能ｓｉＮＡ分子に導入することと、及び（ｄ）任意に、標的核酸配列の発現を調節する際に活性である化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子を単離するために適した条件下で、たとえば生物系において、（ｃ）の化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子再びスクリーニングすること。
【０１４２】
一つの態様において、本発明は、以下を含む多機能ｓｉＮＡ分子を１つ以上の標的核酸配列に対してスクリーニングするための方法を特徴とする。（ａ）複数の無修飾多機能ｓｉＮＡ分子を作製することと、（ｂ）標的核酸配列の発現を調節する際に活性である多機能ｓｉＮＡ分子を単離するために適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイすることと、（ｃ）任意に、化学修飾（たとえば、本明細書に記述されたか、又はさもなければ当技術分野において公知の化学修飾）を（ｂ）の活性な多機能ｓｉＮＡ分子に導入することと、及び（ｄ）任意に、標的核酸配列の発現を調節する際に活性である化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子を単離するために適した条件下で、たとえば生物系において、（ｃ）の化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子を再びスクリーニングすること。
【０１４３】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）複数の化学修飾された多機能ｓｉＮＡ分子（例えば、本明細書に記載の、又は他の公知の多機能ｓｉＮＡ分子）を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子を、標的核酸配列の発現を調節する活性を有する化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でスクリーニングすることを含む、標的核酸配列に対する多機能ｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）複数の化学修飾された多機能ｓｉＮＡ分子（例えば、本明細書に記載の、又は他の公知の多機能ｓｉＮＡ分子）を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子を、標的核酸配列の発現を調節する活性を有する化学的に修飾された多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でスクリーニングすることを含む、１つ以上の標的核酸配列に対する多機能ｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。
【０１４５】
他の実施形態においては、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）賦形剤処方を多機能ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有する多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。そのような賦形剤には、ポリマー、例えばシクロデキストリン、脂質、カチオン性脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンド、及びその他のものが含まれる。
【０１４６】
他の実施形態においては、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）賦形剤処方を多機能ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有する多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。そのような賦形剤には、ポリマー、例えばシクロデキストリン、脂質、カチオン性脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンド、及びその他のものが含まれる。
【０１４７】
他の実施形態においては、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式ＩＩＩ〜ＩＸのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドを多機能ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有する多機能ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）の多機能ｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１４８】
他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ化合物にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合的に結合させることができる。結合したＰＥＧは、任意の分子量のものであってよく、好ましくは約２、０００〜約５０、０００ダルトン（Ｄａ）である。
【０１４９】
本発明は、単独で、又はインビトロ又はインビボでＲＮＡを試験サンプル及び／又は被験者に導入するのに必要な試薬の少なくとも１つを有するキットの成分として、用いることができる。例えば、キットの好ましい成分には、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子及び多機能ｓｉＮＡｉＮＡを目的とする細胞内に導入することを促進する本明細書に記載されるビヒクルが含まれる（例えば、脂質及び当該技術分野において知られるトランスフェクションの他の方法、例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他，米国特許第６，３９５，７１３号明細書を参照）。キットは、標的評価、例えば、遺伝子機能及び／又は活性の判定において、又は薬剤最適化において、及び薬剤の発見において用いることができる（例えば、Ｕｓｍａｎ他，米国特許出願６０／４０２，９９６号を参照）。そのようなキットはまた、キットのユーザが本発明を実施できるようにするための指針を含むことができる。
【０１５０】
本明細書に使用される「多機能短鎖干渉核酸」、又は「多機能ｓｉＮＡ」という用語は、第一の標的核酸配列に対して相補的な核酸配列を有する１つの鎖の第一の領域と、第二の標的核酸配列に対して相補的な核酸配列を有する第二の鎖の第一の領域とを含む任意の短鎖干渉核酸分子であって、それぞれの鎖の第一の領域は、互いに相補的ではないか、又は相補性であるならば、７５％以上の相補性を共有しない短鎖干渉核酸分子をいう。
【０１５１】
本明細書において用いる場合、「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、又は「化学的に修飾された短鎖干渉核酸分子」という用語は、例えば、配列特異的様式でＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを媒介することにより遺伝子発現を阻害又はダウンレギュレートしうる任意の核酸分子を表す（例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒ他，ＷＯ００／４４８９５号国際公開公報；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他，ＷＯ０１／３６６４６号国際公開公報；Ｆｉｒｅ，ＷＯ９９／３２６１９号国際公開公報；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他，ＷＯ００／０１８４６号国際公開公報；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ，ＷＯ０１／２９０５８号国際公開公報；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，ＷＯ９９／０７４０９号国際公開公報；及びＬｉ他，ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ他，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ他，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ他，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ他，２００２，Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；及びＲｅｉｎｈａｒｔ及びＢａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例は、ベイグルマンその他のＷＯ  ０３／０７０９１８に示される。例えば、ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく、ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドであって、一方の鎖はセンス鎖であり、かつ他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス及びセンス鎖は、自己相補的であり（すなわち、それぞれの鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、その結果、アンチセンス鎖とセンス鎖とが、二重鎖又は二本鎖構造を形成し、たとえば、二本鎖領域は、約１９塩基対である）、アンチセンス鎖は、標的核酸分子のヌクレオチド配列又はこれらの一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつセンス鎖は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はこれらの一部を含むオリゴヌクレオチドから構築することができる。あるいは、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく、ここで、ｓｉＮＡの自己相補的センス領域及びアンチセンス領域は、核酸系又は非核酸系のリンカーにより連結されている。ｓｉＮＡは、自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は別の標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２又はそれ以上のループ構造及び自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、インビボ又はインビトロでプロセシングされて、ＲＮＡｉを媒介しうる活性なｓｉＮＡ分子を生ずることができる。ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば、そのようなｓｉＮＡ分子がｓｉＮＡ分子中に標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合）、ここで、一本鎖ポリヌクレオチドはさらに末端リン酸基、例えば５’−リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ他，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚ他，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．，１０，５３７−５６８を参照）、又は５’、３’−二リン酸を含んでいてもよい。ある実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含んでいてもよく、センス及びアンチセンス領域は、当該技術分野において知られるヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合により結合しているか、あるいは、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、及び／又はスタッキング相互作用により非共有結合的に結合している。ある態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の阻害が引き起こされるように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合、ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。ある態様においては、本発明の短鎖干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠失している。本出願人は、ある態様において、ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短鎖干渉核酸について記述している。しかし、ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１又は複数のヌクレオチドを含む、結合したリンカー又は他の結合又は会合している基、成分、又は分子鎖を有することができる。必要に応じて、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書において用いる場合、ｓｉＮＡとの用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介しうる核酸分子を記述するために���いられる他の用語、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、及び他のものと同等であることを意味する。さらに、本明細書において用いる場合、ＲＮＡｉとの用語は、配列特異的ＲＮＡ干渉を記述する他の用語、例えば転写後遺伝子サイレンシング、又は後成遺伝学（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）と同等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、転写後レベル又は転写前レベルの両方で後成的に遺伝子をサイレンシングさせることができる。非限定の例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的制御は、遺伝子発現を変更するためのｓｉＮＡを媒介したクロマチン構造の修飾によって生じさせることができる（たとえが、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，  ２００２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７，  １８１８−１８１９；  Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７，  １８３３−１８３７；  Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，  ２００２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７，  ２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７，  ２２３２−２２３７を参照されたい）。
【０１５２】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、遺伝子の発現又はＲＮＡ分子のレベル又は１又は複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子、又は１又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、モジュレーターが存在しない場合に観測される発現量、レベル、又は活性よりも大きく又は小さくなるように、上方制御又は下方制御されることを意味し、例えば、「調節する」という用語は「阻害する」ことを意味してもよいが、「調節する」という用語の用法は、本定義によって制限されるものではない。
【０１５３】
「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「下方制御する（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）」、又は「減少させる（ｒｅｄｕｃｅ）」という用語は、遺伝子の発現又はＲＮＡ分子のレベル又は１又は複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子、又は１又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が存在しない場合の観測値よりも低下することを意味する。１つの実施形態において、多機能ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は、不活性な又は活性の弱められた分子の存在下で観測されるレベルを下回る。他の実施形態において、多機能ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は例えば、スクランブル配列又はミスマッチを有する多機能ｓｉＮＡ分子の存在下で観測されるレベルを下回る。他の実施形態において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、核酸分子の存在する場合の方が存在しない場合よりも大きい。
【０１５４】
「回文構造」又は「反復」核酸配列とは、二重鎖に存在するときに、５’−〜−３’配列が同一である核酸配列を意味する。たとえば、二重鎖における本発明の回文構造配列は、二重鎖の一方鎖が５’−〜−３’方向（左から右に）に読み込まれ、他方の鎖が３’−〜−５’方向（右から左に）読み込まれる、同じ配列を有する配列を含むことができる。もう１つの例において、本発明の反復配列は、自己相補性を提供する程度に配置された繰り返しヌクレオチドを有する配列（たとえば５’−ＡＵＡＵ．．．−３’；５’−ＡＡＵＵ．．．−３’；５’−ＵＡＵＡ．．．−３’；５’−ＵＵＡＡ．．．−３’；５’−ＣＧＣＧ．．．−３’；５’−ＣＣＧＧ．．．−３’５’−ＧＧＣＣ．．．−３’；５’−ＣＣＧＧ．．．−３’；又はこれらの任意の拡張された反復その他）を含むことができる。回文構造又は反復配列は、偶数の約２〜約２４ヌクレオチド（たとえば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）を含むことができる。回文構造又は反復配列には、単独で、又はより長い核酸配列の一部として、いずれかで二重鎖に存在するときに、５’−〜−３’配列が同一である核酸配列を含むこと以外は、必要とされない。本発明の回文構造又は反復配列は、本明細書に記述したように、たとえばワトソン・クリック又は非ワトソン・クリック塩基対を形成することができる、化学修飾を含むことができる。
【０１５５】
「遺伝子」、又は「標的遺伝子」という用語は、例えば、ＲＮＡをコードする核酸を意味し、核酸配列は、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むがこれに限定されない。遺伝子又は標的遺伝子は、低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びそれらの前駆体ＲＮＡ等の、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）又は非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をコードしていてもよい。そのような非コーディングＲＮＡは、ｆＲＮＡ又は細胞過程の機能又は制御に関与するｎｃＲＮＡの活性を調節する場合における、多機能ｓｉＮＡ分子に媒介されたＲＮＡ干渉に対する標的核酸分子として作用することができる。したがって、疾患を招く異常なｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの活性を、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子により調節することができる。ｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡ分子は、被験者、生物、又は細胞の遺伝子型又は表現型を、遺伝子のインプリンティング、転写、翻訳、又は核酸のプロセシング（例えば、トランスアミノ化、メチル化等）等の細胞過程に介入することにより操作又は改変するために用いることができる。標的遺伝子は、細胞から誘導された遺伝子、内因性遺伝子、トランス遺伝子、又は、感染後に細胞内に存在するウイルス等の病原体の遺伝子等の外因性遺伝子であってもよい。標的遺伝子を含む細胞は、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア、又は真菌類等の任意の生物から誘導したものであっても含まれるものであってもよい。植物の非限定的な例としては、単子葉植物、双子葉植物、又は裸子植物が挙げられる。動物の非限定の例は、脊椎動物又は無脊椎動物を含む（たとえばＺｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国６，３５０，９３４号を参照されたい（本明細書に参照により援用される））。真菌の非限定の例は、糸状菌又は酵母を含む。遺標的伝子例は、当技術分野において一般に見いだすことができ、たとえば、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際公開公報第０３／７４６５４号及びＺｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，３５０，９３４号（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１５６】
「高度に保存された配列領域」とは、標的遺伝子の１つ又は複数の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、又は生物系間で有意に変化しないことを意味する。
【０１５７】
「癌」とは、増殖が抑制されないこと及び／又は異常な細胞の蔓延によって特徴づけられる疾患群を意味する。
【０１５８】
「標的核酸」とは、発現又は活性を調節する任意の核酸配列を意味する。標的核酸は、内在性ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡ又は遺伝子、ウイルス、細菌、真菌、哺乳類もしくは植物によってコードされるその他のＲＮＡなどのＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。
【０１５９】
「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン−クリック又は他の非伝統的なタイプのいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成しうることを意味する。本発明の核酸分子に関して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の適切な機能、例えば、多機能ｓｉＮＡによるＲＮＡｉ活性、遺伝子発現の阻害、又は二本鎖オリゴヌクレオチドの形成を促進するに十分なものである。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ他，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ他，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ他，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９，３７８３−３７８５を参照）。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（たとえば、ワトソン−クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子内の隣接する残基の割合を示す（たとえば、１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列に対して対形成した第一のオリゴヌクレオチド内の合計１０ヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％の相補性を示す）。「完全な相補性」とは、核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
【０１６０】
本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、癌もしくは癌性疾患、感染症、眼疾患、心臓血管疾患、神経系疾患、プリオン疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、ミトコンドリア疾患、内分泌性疾患、生殖関連疾患及び状態、並びに細胞又は生物に発現された遺伝子産物もしくはウイルス、真菌もしくは細菌ゲノムなどの外来核酸のレベルに反応することができる任意のその他の徴候を含む、広範囲の疾患及び状態に対する新規治療手段になる。
【０１６１】
本発明の一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖は、独立して、約２１〜約４４ヌクレオチドの長さ、特定の態様において約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、又は４４ヌクレオチドの長さである。もう一つの態様において、本発明の多機能ｓｉＮＡ二重鎖は、独立して、約１７〜約４４塩基対（たとえば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４塩基対）を含む。本発明の例示的な多機能ｓｉＮＡ分子を図１〜４に示す。
【０１６２】
本明細書において用いる場合、「細胞」は、その通常の生物学的意味で用いられ、多細胞生物全体を指さず、特にヒトを指さない。細胞は生物中で、例えば、鳥類、植物及び哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヤギ、無尾サル、有尾サル、ブタ、イヌ及びネコ中で存在することができる。細胞は、原核生物（例えば細菌細胞）又は真核生物（例えば哺乳動物又は植物細胞）であってもよい。細胞は体細胞起源でも生殖細胞系起源でもよく、全能細胞でも多能性細胞でもよく、分裂していても分裂していなくてもよい。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来するか、又はこれらを含むものであってもよい。
【０１６３】
本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、直接加えてもよく、又はカチオン性脂質と複合体化して、リポソーム中に封入して、又は他の方法により、標的細胞又は組織にデリバリーすることができる。核酸又は核酸複合体は、関連する組織にｅｘ  ｖｉｖｏで、又は注射、注入ポンプ又はステントを用いてインビボで、バイオポリマー中に取り込ませて又は取り込ませずに、局所的に投与することができる。
【０１６４】
他の態様において、本発明は、本発明の１又は複数の多機能ｓｉＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。１又は複数の多機能ｓｉＮＡ分子は、独立して、同じ又は異なる部位を標的とすることができる。
【０１６５】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に生成されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に製造されたＲＮＡ、並びに１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更により天然に生ずるＲＮＡと異なるように変更されたＲＮＡを含む。そのような変更は、非ヌクレオチド物質の付加、例えば、多機能ｓｉＮＡの末端又は内部（例えばＲＮＡの少なくとも１又は複数のヌクレオチド）への付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、標準的ではないヌクレオチド、例えば、天然に生じないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの変更されたＲＮＡは、類似体又は天然に生ずるＲＮＡの類似体と称することができる。
【０１６６】
「被験者」とは、外植された細胞のドナー又はレシピエントである生物又は細胞それ自体を意味する。「被験者」とはまた、本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。一般的に被験者とは哺乳動物又は哺乳動物細胞であり、ヒト又はヒト細胞を含む。
【０１６７】
「リガンド」という用語は、受容体等の他の化合物と直接的、又は間接的に相互作用することができる、薬剤、ペプチド、ホルモン、又は神経伝達物質等の任意の化合物を意味する。リガンドと相互作用する受容体は、細胞表面に存在していてもよく、あるいは、細胞間受容体であってもよい。リガンドと受容体との相互作用は、生化学反応を引き起こすものであってもよく、単純に物理的相互作用又は会合を引き起こすものであってもよい。
【０１６８】
本明細書において用いられる場合、「ホスホロチオアート」という用語は、式Ｉ（式中、Ｚ及び／又はＷは硫黄原子を含む）を有するヌクレオチド間結合を表す。したがって、ホスホロチオアートとの用語は、ホスホロチオアート及びホスホロジチオアートヌクレオチド間結合の両方を表す。
【０１６９】
本明細書において用いられる場合、「ホスホノ酢酸」という用語は、Ｚ及び／又はＷはアセチル又は保護されたアセチル基を有する、式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を意味する。
【０１７０】
本明細書において用いられる場合、「チオホスホノ酢酸」という用語は、Ｚはアセチル又は保護されたアセチル基を有し、Ｗは硫黄原子を有する、あるいは、Ｗはアセチル又は保護されたアセチル基を有し、Ｚは硫黄原子を有する、式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を意味する。
【０１７１】
本明細書において用いる場合、「万能塩基」という用語は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと、これらをほとんど区別せずに塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を表す。万能塩基の非限定的な例としては、当該技術分野において知られるように（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、及びニトロアゾール誘導体、例えば、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールが挙げられる。
【０１７２】
本明細書において用いる場合、「非環状ヌクレオチド」という用語は、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチド、例えば、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５）のいずれかが、独立して又は組み合わせてヌクレオチド中に存在しないヌクレオチドを表す。
【０１７３】
本発明の核酸分子は、個々に、又は併用して、又は他剤と組み合わせて、本明細書において論議した疾患又は状態（たとえば、癌及びその他の増殖状態、ウイルス感染、炎症性疾患、自己免疫、肺疾患、腎疾患、眼疾患、その他）を治療するために使用することができる。例えば、特定の疾患又は健康状態を治療するために、治療に適した条件下で、多機能ｓｉＮＡ分子を個別に又は１又は複数の薬剤と組み合わせて被験者に投与することができ、又は当業者には明らかな他の適当な細胞に投与することができる。
【０１７４】
１つの実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。別の態様において、血管新生、例えば、特に限定されないが、胸癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、前立腺癌、結直腸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭頚部癌、皮膚癌、上咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢アデノ癌腫、耳下腺の腺癌から生じている他の実施形態、疾患又は症状中の、卵嚢癌、黒色腫、リンパ腫、膠腫、間質性肉腫、そして、多種薬剤抵抗する癌等の癌につながる癌新生等の血管新生に由来する病気又は症状、糖尿病性網膜症、黄斑部変性、年齢関連がある黄斑部変性、黄斑浮腫、血管新生緑内障、近視性変性、関節炎、乾癬、子宮内膜症、女性の再生、尋常性疣贅、結節硬化症の血管線維腫、ポット−ワイン染色、ストウジ・ウェーバー症候群、Ｋｉｐｐｅｌ−Ｔｒｅｎａｕｎａｙ−ウェーバー症候群、オスラー−ウェーバー−ランデュ症候群、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）等の腎臓病、再狭窄、動脈硬化症、その他、細胞又は組織内においてＲＮＡ干渉単独で又は他の治療方法と組み合わせて、応答する病気又は症状である。
【０１７５】
一つの態様において、本発明は、被検者における眼疾患又は状態を治療し、又は予防するための方法であって、眼疾患又は状態は、血管形成又は新血管新生（血管内皮の成長因子、ＶＥＧＦ経路又はＴＧＦ−β経路の遺伝子を含むものなど）に関連しており、被検者における疾患又は状態の治療又は予防のために適した条件下で、被検者に本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を単独で、又は１つもしくは複数のその他の治療的化合物と組み合わせて投与することを含む方法を特徴とする。もう一つの態様において、眼疾患又は状態は、黄斑変性症、年齢関連黄斑変性症、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、血管新生緑内障、近視性変性症、トラコーマ、眼瘢痕化、白内障、眼炎症及び／又は眼感染症を含む。
【０１７６】
一つの態様において、本発明は、組織又は細胞（たとえば、眼又はレチナール、脳、ＣＮＳ）に対して、標的ＲＮＡ又はこれらの一部のヌクレオチド配列（たとえば、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体をコードする標的ＲＮＡ）に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む多機能ｓｉＮＡ分子又は多機能ｓｉＮＡ分子を発現するベクターによって形成される二重鎖ＲＮＡを局所的に投与する（たとえば、眼内、腫瘍内、核周囲、頭蓋内その他などの注射、局所的投与、カテーテル等による）方法であって、該局所投与のために適した条件下で該二重鎖ＲＮＡと該組織の細胞を接触させることを含む方法を特徴とする。
【０１７７】
一つの態様において、本発明は、被検者の組織又は細胞に対して全身投与（例えば、皮下、静脈内、局所的のような注射）し、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部である多機能ｓｉＮＡ分子で形成された二本鎖ＲＮＡ、又は、多機能ｓｉＮＡ分子を発現するベクターである方法であって、上記被験者を上記二本鎖ＲＮＡに、上記全身投与に適した条件下で接触させることを含む方法（例えば、標的ＲＮＡは、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体をコードする）を特徴とする。
【０１７８】
他の実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。
【０１７９】
他の実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。
【０１８０】
他の実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。
【０１８１】
一つの態様において、本発明は、被検者における神経疾患（たとえば、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、癲癇、その他）を治療し、又は予防するための方法であって、被検者における神経疾患の治療又は予防のために適した条件下で、被検者に対して本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を、単独で、又は１つ又は複数のその他の治療的化合物と組み合わせて投与することを含む方法を特徴とする。
【０１８２】
他の実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の多機能ｓｉＮＡ分子を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。
【０１８３】
さらなる態様において、多機能ｓｉＮＡ分子は、上で論議した状態又は疾患を治療するためのその他の公知の治療と組み合わせて使用することができる。たとえば、記述された分子を、疾患又は状態を治療するために、１つ又は複数の公知の治療薬と組み合わせて使用することができる。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子と容易に組み合わせることができるその他の治療薬の非限定の例は、酵素的核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ又はアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体などの抗体、小分子、並びに金属、塩及びイオンを含むその他の有機及び／又は無機化合物である。
【０１８４】
本発明の別の態様においては、標的ＲＮＡ分子と相互作用して、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書においてＧｅｎｂａｎｋアクセス番号で表される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子をダウンレギュレートする多機能ｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。多機能ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。多機能ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターを本明細書に記載されるようにデリバリーし、標的細胞中に残留させることができる。あるいは、多機能ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いてもよい。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。一旦発現されれば、多機能ｓｉＮＡ分子は、標的核酸と相互作用して、遺伝子機能又は発現をダウンレギュレートする。多機能ｓｉＮＡを発現するベクターのデリバリーは、全身的（例えば、静脈内又は筋肉内投与により）、被験者から外植された標的細胞に投与した後、被験者に再導入することにより、又は所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。
【０１８５】
一つの態様において、転写開始領域、転写終止部位及び発現ベクターは、少なくとも１つの多機能ｓｉＮＡをコードする遺伝子を含む。遺伝子は、多機能ｓｉＮＡの発現及び／又は送達をできる様式で、開始領域及び終結領域に対して作動可能に連結することができる。もう一つの態様において、発現ベクターは、転写開始領域、転写終止部位、オープンリーディングフレーム及び少なくとも１つの多機能ｓｉＮＡをコードする遺伝子を含み、遺伝子は、オープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に連結されている。遺伝子は、多機能ｓｉＮＡの発現及び／又は送達ができる様式で、開始領域、オープンリーディングフレーム及び終結領域に対して作動可能に連結することができる。もう一つの態様において、発現ベクターは、転写開始領域、転写終止部位、イントロン、及び少なくとも１つの多機能ｓｉＮＡをコードする遺伝子を含む。遺伝子は、多機能ｓｉＮＡ．の発現及び／又は送達ができる様式で、開始領域、イントロン及び終結領域に対して、作動可能に連結することができる。さらにもう一つの態様において、発現ベクターは、転写開始領域、転写終止部位、イントロン、オープンリーディングフレーム及び少なくとも１つの多機能ｓｉＮＡをコードする遺伝子を含み、遺伝子は、オープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に連結されている。遺伝子は、多機能ｓｉＮＡ．の発現及び／又は送達ができる様式で、開始領域、イントロン、オープンリーディングフレーム及び終結領域に対して作動可能に連結することができる。
【０１８６】
発現ベクターは、たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス又は細菌プラスミド、並びにその他の公知のベクターに由来することができる。発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターエレメント又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターエレメントに作動可能に連結することができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、たとえば、転移ＲＮＡ遺伝子、Ｕ６核内低分子ＲＮＡ遺伝子又はＴＲＺ  ＲＮＡ遺伝子に由来することができる。多機能ｓｉＮＡ転写物は、その５’末端にて、Ｕ６核内低分子ＲＮＡ遺伝子によってコードされる末端２７ヌクレオチドに対して相同的な配列を含むことができる。多機能ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリーは、多量体ランダムライブラリーであることができる。多量体ランダムライブラリーは、少なくとも１つの多機能ｓｉＮＡを含むことができる。
【０１８７】
本発明の多機能ｓｉＮＡは、化学的に合成すること、ベクターから発現させること、又は酵素的に合成することができる。
【０１８８】
「ベクター」とは、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子などの所望の核酸を産生し、発現し、及び／又は送達するために使用される核酸及び／又はウイルスに基づいた任意の技術を意味する。
【０１８９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の本発明の好ましい態様の説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９０】
図１は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有する、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。
【０１９１】
図２は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有する、単一のポリヌクレオチド配列を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図２Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図２Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。１つの実施形態において、これらの多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロにおいてプロセスされ、図１に示したような多機能ｓｉＮＡコンストラクトを生成する。
【０１９２】
図３は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有し、多機能ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、多機能の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図３Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図３Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。
【０１９３】
図４は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有し、多機能ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、単一のポリヌクレオチド配列を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図４Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図４Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。１つの実施形態において、これらの多機能ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロにおいてプロセスされ、図３に示したような多機能ｓｉＮＡコンストラクトを生成する。
【０１９４】
図５は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が、どのようにして、異なるタンパク質、例えばサイトカイン及び対応する受容体、異なるウイルス菌株、ウイルス及びウイルスの感染又は複製に関与する細胞タンパク質、又は疾患の維持又は進行に関与する共通の又は多様な生物学的経路に関与する異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の２つの個別の標的核酸分子を標的にするかの非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々の分子鎖は、個別の標的核酸分子に対して相補性を有する領域を有する。多機能ｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡの個々の分子鎖がＲＩＳＣ複合体に利用され、対応する標的のＲＮＡ干渉に媒介される分解を開始することができるようにデザインされる。これらのデザイン要素には、ｓｉＮＡコンストラクトのそれぞれの末端の安定化（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ他，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照）が含まれていてもよい。このような安定化は、例えば、グアノシン−シチジン塩基対、代わりの塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対）、又は末端ヌクレオチドの位置における不安定化されるような公知の化学修飾を受けたヌクレオチド等によって達成されてもよい。
【０１９５】
図６は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が、どのようにして、ＲＮＡの交互コード領域、ＲＮＡのコーディング及び非コーディング領域、又はＲＮＡの交互スプライス変異領域等の、同一標的核酸分子内の２つの個別の標的核酸配列を標的にするかの非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡコンストラクトの個々の分子鎖は、標的核酸分子の個別の領域に対して相補性を有する領域を有する。多機能ｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡの個々の分子鎖がＲＩＳＣ複合体に利用され、対応する標的領域のＲＮＡ干渉に媒介される分解を開始することができるようにデザインされる。これらのデザイン要素には、ｓｉＮＡコンストラクトのそれぞれの末端の安定化（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ他，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照）が含まれていてもよい。このような安定化は、例えば、グアノシン−シチジン塩基対、代わりの塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対）、又は末端ヌクレオチドの位置における不安定化されるような公知の化学修飾を受けたヌクレオチド等によって達成されてもよい。
【０１９６】
図７は、本発明のｓｉＮＡ分子をデザインするための、人工自己相補的な、回文構造又は反復配列を作製するために利用することができる非ワトソン・クリック塩基対の非限定の例を示す。
【０１９７】
図８は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提唱されるメカニズムの非限定的な例を示す図である。外来一本鎖ＲＮＡ、例えばウイルス、トランスポゾン、又は他の外因性ＲＮＡからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、ダイサー（ＤＩＣＥＲ）酵素を活性化し、次にこれはｓｉＮＡ二本鎖を生成する。あるいは、合成された又は発現されたｓｉＮＡを適当な手段により細胞内に直接導入することができる。活性なｓｉＮＡ複合体が形成され、これは標的ＲＮＡを認識し、その結果、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体により標的ＲＮＡが分解されるか、又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により追加のＲＮＡが合成され、これはダイサーを活性化して追加のｓｉＮＡ分子が生じ、このことによりＲＮＡｉ応答が増幅される。
【０１９８】
図９は、例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる、種々の安定化化学（１−１０）の非限定的な例を示す：（１）［３−３’］−反転デオキシリボ−ス；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；及び（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチド。図面に示されている修飾及び非修飾の骨格化学に加えて、これらの化学を本明細書に記載されるような別の骨格修飾、例えば、式ＩＩＩを有する骨格修飾と組み合わせることができる。さらに、示される末端修飾の５’側に示される２’−デオキシヌクレオチドは、本明細書に記載される別の修飾又は非修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド、例えば、式ＩＩＩ〜ＩＸ又はそれらの任意の組み合わせを有する修飾であってもよい。
【０１９９】
図１０は、本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す。
【０２００】
図１１Ａ−Ｃは、ｓｉＮＡヘアピンコンストラクトを生成するための発現カセットを作製するために用いられるスキームの概略図である。図１１Ａ：ＤＮＡオリゴマーは、５’−制限（Ｒ１）部位配列、続いて予め定められた標的配列と同一の領域を有する配列であって、センス領域は、たとえば、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド（Ｎ）の長さ、及び続いて、定義された配列（Ｘ）のループ配列と隣接して３’−制限部位（Ｒ２）を含む配列で合成する。図１１Ｂ：次に、合成コンストラクトをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて、自己相補的配列を有するヘアピン構造を生成する。図１１Ｃ：コンストラクトをＲ１及びＲ２に特異的な制限酵素で処理して二本鎖ＤＮＡを生成し、次にこれを細胞における発現用の適当なベクター中に挿入する。Ｕ６プロモーター領域がｄｓＤＮＡの両側を挟むように転写カセットを設計し、このことによりｓｉＮＡの別々のセンス鎖及びアンチセンス鎖が生ずる。ポリＴ末端配列をコンストラクトに付加して、得られる転写産物中にＵ突出を生成することができる。
【０２０１】
核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は、自動化方法を用いては困難であり、そのような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明においては、好ましくは、小さい核酸モチーフ（「小さい」とは、１００ヌクレオチド以下の長さ、好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ、最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ、例えば、別々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列又はタンデムで合成されたｓｉＮＡ配列を表す）が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため、核酸がタンパク質及び／又はＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが、他の分子も同様に合成することができる。
【０２０２】
オリゴヌクレオチド（例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド又はリボヌクレオチドを欠失しているオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，ＷＯ９９／５４４５９号国際公開公報，Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ他，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号明細書に記載されるような、当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する。これらの文献はすべて参照として本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの合成は、一般の核酸保護基及びカップリング基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、及び３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的な例においては、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程、及び２’−デオキシヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で、小スケールの合成を行う。表３は、合成サイクルにおいて用いる試薬の量及び接触時間の概要を示す。あるいは、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、９６ウエルプレート合成機、例えば、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）により製造される装置で、サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイト及び７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量により決定して、典型的には９７．５〜９９％である。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は、ＴＨＦ中１６．９ｍＭＩ２、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。あるいは、ホスホロチオアート結合の導入のためには、ボーケージ試薬（３Ｈ−１、２−ベン��ジチオール−３−オン−１、１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は、ＴＨＦ中１６．９ｍＭＩ２、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。あるいは、ホスホロチオアート結合の導入のためには、ボーケージ試薬（３Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１、１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０２０３】
ＤＮＡ系オリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中、６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して、白色粉末を得る。
【０２０４】
本発明のある種のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡについて用いられる合成方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５）、Ｓｃａｒｉｎｇｅら（１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３）及びＷｉｎｃｏｔｔら（１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）、Ｗｉｎｃｏｔｔら（１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９）に記載の方法にしたがい、慣用の核酸保護基及びカップリング基、例えば、５’末端にジメトキシトリチル、及び３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的な例においては、小スケールの合成は、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で、改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて、アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行う。表ＶＩＩは、合成サイクルにおいて用いる試薬の量及び接触時間の概要を示す。あるいは、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、９６ウエルプレート合成機、例えば、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で、サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイト及び１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量により決定して、典型的には９７．５〜９９％である。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９４型ＤＮＡシンセサイザーで用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は、ＴＨＦ中１６．９ｍＭヨウ素、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは、ホスホロチオアート結合の導入のためには、ボーケージ試薬（３Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１、１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０２０５】
ＲＮＡの脱保護は、２ポットプロトコル又は１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプロトコルについては、ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して、白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬＮ−メチルピロリジノン、７５０μＬＴＥＡ及び１．０ｍＬＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ、ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し、６５℃に加熱する。１．５時間後、オリゴマーを１．５Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3で反応を停止させる。
【０２０６】
あるいは、１ポットプロトコルのためには、ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で、６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温へ移動し、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え、バイアルを６５℃で１５分間熱する。試料を−２０℃に冷却し、次に１．５Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3で反応を停止させる。
【０２０７】
トリチルオンオリゴマーの精製のためには、停止したＮＨ4ＨＣＯ3溶液を、アセトニトリル、続いて５０ｍＭＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後、ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し、１ＭＮａＣｌで塩交換し、再び水で洗浄する。次に、３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
【０２０８】
平均段階カップリング収率は、典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は、合成のスケールは、上述の例より大きく又は小さく、例えば、限定されないが、９６ウェルのフォーマットに適合させることができることを認識するであろう。
【０２０９】
あるいは、本発明の核酸分子は、別々に合成して、合成後に例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ他，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ他，ＷＯ９３／２３５６９号国際公開公報；Ｓｈａｂａｒｏｖａ他，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ他，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ他，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ他，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、又は合成及び／又は脱保護の後にハイブリダイゼーションにより、一緒につなげてもよい。
【０２１０】
発現ベクターは、ベクターから発現することにより、二重鎖オリゴヌクレオチドに自己構築することができる自己相補的ｓｉＮＡ配列をコードすることができる。
【０２１１】
ｓｉＮＡコンストラクトは、一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ他，（上掲）を参照、その全体を参照として本明細書に組み込まれる）により精製し、水に再懸濁する。
【０２１２】
本発明の別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドであってもウイルスベクターであってもよい。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターを本明細書に記載されるようにデリバリーし、標的細胞中に残留させることができる。あるいは、ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いてもよい。
【０２１３】
あるいは、本発明の一定のｓｉＮＡ分子は、細胞内で、真核生物のプロモーターから発現することができる（たとえば、Ｉｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９，  ３４５；  ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  １９８６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８３，  ３９９；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２３，  ２２５９；  Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ４，  ４５）。当業者は、真核生物細胞中で任意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識するであろう。そのような核酸の活性は、酵素的核酸によりそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ他，ＷＯ９３／２３５６９号国際公開公報、Ｓｕｌｌｉｖａｎ他，ＷＯ９４／０２５９５号国際公開公報；Ｏｈｋａｗａ他，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ他，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ他，１９９３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ他，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６）。
【０２１４】
本発明の別の態様においては、本発明のＲＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えばＣｏｕｔｕｒｅ他，１９９６、ＴＩＧ．、１２、５１０を参照）。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。他の実施形態においては、ｐｏｌＩＩＩに基づくコンストラクトを用いて、本発明の核酸分子を発現させる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、米国特許５、９０２、８８０及び６、１４６、８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは、上述のようにデリバリーされ、標的細胞中に残留することができる。あるいは、核酸分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば、ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用して、ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの輸送は、全身的（例えば、静脈内又は筋肉内投与により）、患者から外植された標的細胞に投与した後、被験者に再導入することにより、又は所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により、行うことができる（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ他，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【０２１５】
１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、ベクターから発現することにより、二重鎖オリゴヌクレオチドに自己構築することができる自己相補的ｓｉＮＡ配列をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は、そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結することができる（例えば，Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ５，６２４，８０３；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ＵＳ  ５，９０２，８８０  ａｎｄ  ６，１４６，８８６；  Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ５０５；  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ４９７；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ５００；  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ８，  ６８１−６８６）。
【０２１６】
別の態様においては、本発明は、以下を含む発現ベクターを特徴とする：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩの終止領域）；及びｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含み、前記配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、前記開始領域及び前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは、必要に応じて、本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５’側又は３’側に動作可能なように連結されたタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；及び／又はイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。
【０２１７】
ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターにより推進させることができる。ｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写産物は、全ての細胞において高いレベルで発現される；あるタイプの細胞におけるあるｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサー等）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ他，１９９０Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が、そのようなプロモーターから発現した核酸分子が哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ他，１９９２  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ他，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ他，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ他，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ他，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ他，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には、転写ユニット、例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは、細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばｓｉＮＡ）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ他，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ他，米国特許第５，１６２４，８０３号明細書；Ｇｏｏｄ他，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ他，ＷＯ９６／１８７３６号国際公開公報）。限定されないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）、又はウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルス又はアルファウイルスベクター）など（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）を含む種々の哺乳類細胞導入用ベクターに、上述したｓｉＮＡ転写ユニットを組み込むことができる。
【０２１８】
別の観点においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を、そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴とする。１つの実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；及びｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み；この配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域及び終止領域に動作可能なように連結されている。
【０２１９】
他の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；及びｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み、この配列は、オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可能なように連結されており、配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域、オープンリーディングフレーム及び終止領域に動作可能なように連結されている。さらに他の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；及びｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み；この配列は、核酸分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域、イントロン及び終止領域に動作可能なように連結されている。
【０２２０】
他の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；及びｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み、この配列は、オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可能なように連結されており、配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域、イントロン、オープンリーディングフレーム及び終止領域に動作可能なように連結されている。
【０２２１】
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基、糖及び／又はリン酸）を有する化学的に合成した核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、このことによりその抗力を高めることができる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他，ＷＯ９２／０７０６５号国際公開公報；Ｐｅｒｒａｕｌｔ他，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ他，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ他，ＷＯ９３／１５１８７号国際公開公報；Ｒｏｓｓｉ他，ＷＯ９１／０３１６２号国際公開公報；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号明細書；Ｇｏｌｄ他，米国特許第６，３００，０７４号明細書及びＢｕｒｇｉｎ他，（上掲）を参照（これらはすべて参照として本明細書に組み込まれる）。上述の参考文献はすべて、本明細書に記載される核酸分子の塩基、リン酸及び／又は糖部分になしうる種々の化学修飾について記述している。細胞中におけるその抗力を増強するよう修飾し、及びオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
【０２２２】
当該技術分野には、そのヌクレアーゼ安定性及び効力を有意に増強することができる、核酸分子中に導入することができる糖、塩基及びリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリール、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリール、２’−Ｈ等のヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより、安定性を高め、及び／又は生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  ＴＩＴＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ他，１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ他，１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は、当技術分野において広範に記述されてきた（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＰＣＴ番号国際公開公報第９２／０７０６５号；  Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ，  １９９２，  １７，  ３３４−３３９；  Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  国際公開ＰＣＴ番号国際公開公報第９３／１５１８７号；  Ｓｐｒｏａｔ，  米国特許第５，３３４，７１１号及び  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ２５７０２；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ刊行物番号国際公開公報第９７／２６２７０号；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７１６，８２４号；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際公開公報第  ０３／７０９１８号；  Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２７，０５３号；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８年４月２０日に出願された米国特許出願第６０／０８２，４０４号；  Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３９，  １１３１；  Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，  １９９８，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），  ４８，  ３９−５５；  Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  １９９８，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６７，  ９９−１３４；及びＢｕｒｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ５，  １９９９−２０１０を９２／０７０６５参照されたい。参照文献の全ては、本明細書において参照することにより、これらの全体が本明細書に援用される）。これらの刊行物は、触媒活性を変更することなく、糖、塩基及び／又はリン酸修飾等を核酸分子中に組み込む位置を決定する一般的方法及び戦略を記載しており、参照として本明細書に組み込まれる。このような教示の態様から、ｓｉＮＡが細胞においてＲＮＡｉを促進する能力が有意に阻害されない限り、本明細書に記載されるように、同様の修飾を用いて本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
【０２２３】
ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、及び／又は５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改良するが、過剰な修飾はある種の毒性又は活性の低下を引き起こしうる。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。これらの結合の濃度を減少させると、毒性が低下し、これらの分子の効力が増加し特異性が高くなるはずである。
【０２２４】
活性を維持又は増強する化学的修飾を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子が提供される。そのような核酸はまた、一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対する耐性が高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボで活性は顕著に低下しないはずである。調節が目的である場合には、外的にデリバリーされる治療用核酸分子は、最適には、望ましくないタンパク質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は、疾患の状態により数時間から数日まで様々である。ＲＮＡ及びＤＮＡの化学合成における進歩（Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９（参照として本明細書に組み込まれる））により、上述のようにヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることにより、核酸分子を改変する可能性が拡大した。
【０２２５】
１つの実施形態においては、本発明の核酸分子は、１又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）のＧクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体であり、ここで、修飾は、二本鎖中の相補的グアニンのワトソン・クリック及びフーグスティーン面の両方の水素結合の能力を与える。オリゴヌクレオチド中の単一のＧクランプ類似体置換により、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときのらせん熱安定性及びミスマッチ識別性を実質的に増強することができる。そのようなヌクレオチドを本発明の核酸分子中に取り込ませることにより、核酸標的の相補的配列又はテンプレート鎖に対する親和性及び特異性の両方が増強される。他の実施形態においては、本発明の核酸分子は１又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）のＬＮＡ「ロック核酸」ヌクレオチド、例えば、２’、４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ他，ＷＯ００／６６６０４号国際公開公報及びＷＯ９９／１４２２６号国際公開公報を参照）。
【０２２６】
他の実施形態においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲート及び／又は複合体を特徴とする。そのようなコンジュゲート及び／又は複合体は、生物学的システム、例えば細胞へのｓｉＮＡ分子のデリバリーを容易にするために用いることができる。本発明によって提供される抱合体及び複合体は、細胞膜を横切って治療的化合物を移行させて、薬物動態を変更し、及び／又は本発明の核酸分子の局在化を調節することによって、治療的活性を与えることができる（たとえば国際公開公報第０２／０９４１８５号及び米国特許出願第１０／４２７，１６０号を  参照されたい。両方とも、本明細書において参照することにより、図面を含むこれらの全体が援用される）。本発明は、分子、例えば、限定されないが、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、トキシン、負に荷電したポリマー及び他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、又はポリアミンを、細胞膜を横切ってデリバリーするための、新規コンジュゲート及び複合体の設計及び合成を包含する。一般に、記載されるトランスポーターは、個々に又は多成分系の一部として、分解性リンカー付きで又はなしで用いるよう設計される。これらの化合物は、血清の存在下又は非存在下で、本発明の核酸分子を異なる組織に由来する多数の細胞タイプにデリバリー及び／又は局在化することを改良すると予測される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ，米国特許第５，８５４，０３８号明細書を参照）。本明細書に記載される分子のコンジュゲートは、生物分解性のリンカー、例えば生物分解性核酸リンカー分子を介して、生物学的に活性な分子に結合させることができる。
【０２２７】
本発明は、細胞などの生物系への分子の送達を容易にするための組成物及び抱合体を特徴とする。本発明によって提供される抱合体は、細胞の膜を横切って治療的化合物を移行させることによって、治療的活性を与えることができる。本発明は、ｓｉＮＡ分子を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）分子の送達のための新規薬剤の設計及び合成を包含する。記述した輸送体は、一般に、個々に、又は多成分系の一部として使用されるように設計されている。本明細書の式に一般に示した本発明の化合物は、血清の存在下又は非存在下において、種々の組織から生じる多数の細胞型への分子の送達を改善することが予想される。
【０２２８】
もう一つの態様において、本発明の化合物は、送達される予め定められた分子でカプセル化されたリポソームなどの脂質凝集体の表面成分として提供される。リポソーム（これは、単層又は多重層であることができる）は、種々のメカニズムによってカプセル化された材料を細胞に導入することができる。たとえば、リポソームは、細胞膜と融合することによって、そのカプセル化された材料を細胞の細胞質に直接導入することができる。あるいは、リポソームは、酸性空胞（すなわちエンドソーム）と、リポソームから及び酸性空胞から細胞の細胞質内に放出されるその内容物とに区分することができる。
【０２２９】
一つの態様において、本発明は、ホスファチジルコリン（多様な鎖長のもの；たとえば、卵黄ホスファチジルコリン）、コレステロール、カチオン脂質及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を含む本明細書に記述した化合物の脂質凝集体製剤を特徴とする。この脂質凝集体のカチオン脂質成分は、ジオレイル１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）などの当技術分野において公知の任意のカチオン脂質であることができる。もう一つの態様において、このカチオン脂質凝集体は、本明細書における式のいずれかに記述した、共有結合性に結合した化合物を含む。
【０２３０】
もう一つの態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明の化合物に共有結合で付着されている。付着されたＰＥＧは、任意の分子量であることができるが、好ましくは２０００〜５０，０００ダルトンの間である。
【０２３１】
本発明の化合物及び方法は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸分子、脂質、ペプチド、タンパク質及び／又は非ヌクレオシド小分子を細胞に導入する際に有用である。たとえば、本発明は、対応する標的作用部位が細胞内に存在する場合に、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、脂質、ペプチド、タンパク質及び／又は非ヌクレオシド小分子の送達のために使用することができる。
【０２３２】
一つの態様において、本発明の化合物は、高親和性葉酸受容体及びＡＳＧＰｒ受容体などの細胞受容体と相互作用することができる分子の抱合体を提供し、生体膜を横切った抱合化合物の効率的デリバリー及びその後の放出を可能にする多数の特徴を提供する。化合物は、細胞受容体と優先して相互作用することができる長さで送達されるように、受容体リガンドと化合物との間に化学結合を利用する。さらに、送達されるリガンドと化合物との間の化学結合は、たとえば、ヒドロキシル基などの求核試薬の近位にあるリン酸塩結合を利用することによって、分解可能な結合としてデザインすることができる。ｐＨ又はヌクレアーゼとの相互作用の結果として、ヒドロキシル基又は同等の基の脱プロトン化により、リン酸の求核攻撃を生じさせて、加水分解することができる環状リン酸中間体を生じさせることができる。この切断メカニズムは、塩基又はＲＮＡヌクレアーゼの存在下におけるＲＮＡ切断と類似する。あるいは、ＵＶ照射、細胞ヌクレアーゼ、ｐＨ、温度その他などの種々の因子に反応するその他の分解可能結合を選択することができる。分解可能な結合の使用により、送達された化合物を予め定められた系において、たとえば細胞の細胞質において、又は特定の細胞の細胞小器官において放出させることができる。
【０２３３】
また、本発明は、関心対象の化合物及び分子に容易に抱合されるリガンド由来ホスホラミダイトを提供する。本発明のホスホラミダイト化合物により、足場として核酸ホスホラミダイト種を使用することを必要とすることなく、関心対象の分子に抱合体の直接付着が可能になる。従って、ホスホロアミダイト化学を使用したものは、核酸のアミノ基、たとえばアデノシンのＮ６位置又は２’−デオキシ−２’−アミノ官能基に対するリガンドの縮合などのその他の縮合反応を必要とすることなく、関心対象の化合物に対する本発明の化合物の結合の際に直接使用することができる。加えて、本発明の化合物は、核酸に基づかずに抱合された結合をオリゴヌクレオチドに導入するために使用することができ、これにより、オリゴヌクレオチド合成の間に、核酸に基づいたホスホラミダイトの使用よりも効率的なカップリングを提供することができる。このカップリングが改善されたことにより、ペンダントアルキル結合を有する無塩基又は非ヌクレオシド足場の立体問題の改善を考慮することができる。
【０２３４】
三リン酸基を利用する本発明の化合物は、抱合分子のオリゴヌクレオチドへの酵素的組み込みの際に利用することができる。このような酵素的組み込みは、抱合体が、合成後の酵素的抱合又は選択反応に使用されるときに有用である（たとえば、  Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １０，  １２９９−１３０２；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＮＡＲ．，  ２９，  １５６５−１５７３；  Ｊｏｙｃｅ，  １９８９，  Ｇｅｎｅ，  ８２，  ８３−８７；  Ｂｅａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，  ６３５−６４１；  Ｊｏｙｃｅ，  １９９２，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６７，  ９０−９７；  Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，  ２６８；  Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８；  Ｓｚｏｓｔａｋ，  １９９３，  ＴＩＢＳ  １７，  ８９−９３；  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ９，  １１８３；  Ｂｒｅａｋｅｒ，  １９９６，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７，  ４４２；  Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９４，  ４２６２；  Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＲＮＡ  ３，  ９１４；  Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  １９９４，  前記；  Ｌｏｎｇ  ＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  １９９４，  前記；  Ｉｓｈｉｚａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，前記；  Ｖａｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，  ６４９５；  Ｋｕｗａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４，  ６６９を参照されたい）。
【０２３５】
本明細書において用いる場合、「生物分解性リンカー」という用語は、１つの分子を別の分子に、例えば、生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子又は本発明のｓｉＮＡ分子の鎖に接続するための生物分解性リンカーとして設計される核酸又は非核酸リンカー分子を表す。生物分解性リンカーは、特定の目的、例えば特定の組織又は細胞タイプへのデリバリーのためにその安定性を調節することができるように設計する。核酸に基づく生物分解性リンカー分子の安定性は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリール、２’−Ｏ−アリール、及び他の２’−修飾又は塩基修飾ヌクレオチドの種々の組み合わせを用いることにより調節することができる。生物分解性核酸リンカー分子は、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はより長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであることができ、又はリン酸に基づく結合、例えば、ホスホルアミデート又はホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。また、生体分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖又は核酸塩基修飾を含むことができる（たとえば、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際公開公報第０３／７０９１８号及びＶａｒｇｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第１０／２０１，３９４号及び第１０／４２７，１６０号を参照されたい）。
【０２３６】
本明細書において用いる場合、「生物分解性」との用語は、生物学的システムにおける分解、例えば酵素的分解又は化学的分解を表す。
【０２３７】
本明細書において用いる場合、「生物学的に活性な分子」という用語は、システムにおいて生物学的応答を導き出すか又は調節することができる化合物又は分子を表す。本発明により単独又は他の分子との組み合わせで企図される生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の非限定的な例としては、治療上活性な分子、例えば、抗体、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、２、５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ及びこれらの類似体が含まれる。本発明の生物学的に活性な分子には、他の生物学的に活性な分子の薬物動態学及び／又は薬力学を調節することができる分子、例えば、脂質及びポリマー、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテルも含まれる。
【０２３８】
本明細書において用いる場合、「リン脂質」との用語は、少なくとも１つのリン酸基を含む疎水性分子を表す。例えば、リン脂質は、リン酸含有基及び飽和又は不飽和アルキル基を含むことができ、これは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、又は置換若しくは未置換アリール基で必要に応じて置換されていてもよい。
【０２３９】
「アルキル」は、飽和脂肪族炭化水素を表し、直鎖、分枝鎖「イソアルキル」、及び環状アルキル基が含まれる。用語「アルキル」も、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、アリール又は置換アリール基を含む。好ましくは、アルキル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは、これは約１〜７個の炭素、より好ましくは約１〜４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換される場合、置換基は好ましくはヒドロキシ、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、シリル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、アリール又は置換アリール基を含む。用語「アルキル」は、また、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み、直鎖、分枝鎖、及び環状基を含む。好ましくは、アルケニル基は約２〜１２個の炭素を有する。より好ましくは、これは約２〜７個の炭素原子、より好ましくは約２〜４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されるとき、置換基は、好ましくはヒドロキシ、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、シリル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、アリール又は置換アリール基を含む。用語「アルキル」はまた、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み、直鎖、分枝鎖、及び環状基を含む。望ましくは、アルキニル基は、約２〜約１２の炭素を有する。より好ましくは、これは約２〜７個の炭素、より好ましくは約２〜４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は、置換されていてもされていなくてもよい。置換されるとき、置換基は、好ましくはヒドロキシ、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、シリル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、アリール又は置換アリール基を含む。そのようなアルキル基はまた、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環アリール、アミド及びエステル基を含むことができる。アリール基の好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアミノ基である。「アルキルアリール」基は、アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリール基は、芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は必要に応じて置換されていてもよい。複素環アリール基は、芳香族環中の環原子として１−３個の複素原子を有し、環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原子には、酸素、硫黄、及び窒素が含まれ、例えば、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル等が挙げられる。「アミド」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素のいずれかである）を表す。「エステル」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素のいずれかである）を表す。
【０２４０】
用語「アルコキシアルキル」は、本明細書で使用されるように、アルキル−Ｏ−アルキルエーテル、例えば、メトキシエチル又はエトキシメチルである。
【０２４１】
本明細書に使用される「アルキル−チオ−アルキル」という用語は、メチルチオメチル又はメチルチオエチルなどのアルキル−Ｓ−アルキルチオエーテルをいう。
【０２４２】
本明細書に使用される「アミノ」という用語は、当技術分野において公知のとおり、有機ラジカルによる１つ又は複数の水素ラジカルの置換によってアンモニアに由来する窒素含有基をいう。たとえば、「アミノアシル」及び「アミノアルキル」という用語は、それぞれアシル及びアルキル置換基で特異的にＮ−置換された有機ラジカルをいう。
【０２４３】
本明細書に使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、炭素原子数がデザインされた直鎖状又は分枝の炭化水素をいう。「アルケニル」の例は、ビニル、アリール及び２−メチル−３−ヘプテンを含む。
【０２４４】
本明細書に使用される「アルコキシ」という用語は、酸素橋を介して親分子部分に付着された、示された炭素原子数のアルキル基をいう。アルコキシ基の例は、たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びイソプロポキシを含む。
【０２４５】
本明細書に使用される「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、デザインされた炭素原子数の直鎖状又は分枝の炭化水素をいう。「アルキニル」の例は、プロパルギル、プロピン及び３−ヘキセンを含む。
【０２４６】
本明細書に使用される「アリール」という用語は、少なくとも１つの芳香環を含む芳香族炭化水素環系をいう。芳香環は、任意にその他の芳香族炭化水素環又は非芳香族炭化水素環に融合することができ、又はさもなければ付着することができる。アリール基の例は、たとえば、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン及びビフェニルを含む。アリール基の好ましい例は、フェニル及びナフチルを含む。
【０２４７】
本明細書に使用される「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、Ｃ３−Ｃ８環状炭化水素をいう。シクロアルケニルの例は、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエン、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエン、シクロ・ヘプテニル、シクロヘプタトリエニル及びシクロオクテニルを含む。
【０２４８】
本明細書に使用される「シクロアルキル」という用語は、Ｃ３−Ｃ８環状炭化水素をいう。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルを含む。
【０２４９】
本明細書に使用される「シクロアルキルアルキル」という用語は、上記記載のとおり、アルキル基を介して親分子部分に付着されたＣ３−Ｃ７シクロアルキル基をいう。シクロアルキルアルキル基の例は、シクロプロピルメチル及びシクロペンチルエチルを含む。
【０２５０】
本明細書に使用される「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を示すことをいう。
【０２５１】
本明細書に使用される「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む非芳香環系をいう。ヘテロシクロアルキル環は、任意にその他のヘテロシクロアルキル環及び／又は非芳香族炭化水素環に融合することができ、又はさもなければ付着することができる。好ましいヘテロシクロアルキル基は、３〜７員を有する。ヘテロシクロアルキル基の例は、たとえば、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン及びピラゾールを含む。好ましいヘテロシクロアルキル基は、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル及びピロリジニルを含む。
【０２５２】
本明細書に使用される「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香環系をいう。ヘテロアリール環は、１つ又は複数のヘテロアリール環、芳香族もしくは非芳香族炭化水素環又はヘテロシクロアルキル環に融合することができ、又はさもなければ付着することができる。ヘテロアリール基の例は、たとえば、ピリジン、フラン、チオフェン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン及びピリミジンを含む。ヘテロアリール基の好ましい例は、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾイル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル及びベンゾピラゾリルを含む。
【０２５３】
本明細書に使用される「Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル」という用語は、１〜６炭素原子を有する、任意に１つ又は複数の炭素−炭素二重又は三重結合を含む直鎖状、分枝又は環状のアルキル基をいう。ヒドロカルビル基の例は、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、イソペンチルである、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、３−メチルペンチル、ビニル、２−ペンテン、シクロプロピルメチル、シクロプロピル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシル及びプロパルギルを含む。本明細書において１つ又は２つの二重又は三重結合を含むＣ１−Ｃ６ヒドロカルビルについての言及がなされる場合、１つの二重又は三重結合のために、少なくとも２つの炭素がアルキルに存在し、２つの二重又は三重結合のために、少なくとも４つの炭素が存在することが理解される。
【０２５４】
本明細書に使用される「リン含有基」という用語は、リン原子を含む化学基をいう。リン原子は、三価であることができ、又は五価であることができ、Ｏ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｃ又はハロゲン原子で置換することができる。本発明のリン含有基の例は、ホスホナート、アルキルホスホナート、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ピロホスフェ−ト、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミダート、ホスホラミダイト基、ヌクレオチド及び核酸分子を含む、Ｏ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｃ又はハロゲン原子で置換されたリン原子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２５５】
本明細書に使用される「分解可能なリンカー」という用語は、種々の条件下で切断できるリンカー部分をいう。切断のために適した条件は、ｐＨ、ＵＶ照射、酵素活性、温度、加水分解、除去及び置換反応、並びに結合の熱力学的性質を含むが、これに限定されるわけではない。
【０２５６】
本明細書に使用される「感光性リンカー」という用語は、当技術分野において公知であるとおり、特定のＵＶ波長下で選択的に切断されるリンカー部分をいう。感光性リンカーを含む本発明の化合物は、関心対象の標的細胞又は組織に化合物を送達するために使用することができ、その後にＵＶ供与源の存在下において放出することができる。
【０２５７】
本明細書に使用される「核酸抱合体」という用語は、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド抱合体をいう。
【０２５８】
本明細書に使用される「脂質」という用語は、任意の親油性化合物をいう。脂質化合物の非限定の例は、直鎖、分枝鎖、飽和及び不飽和脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、並びにコレステロール及びこれらの誘導体又は類似体を含むステロイドを含む、脂肪酸及びこれらの誘導体を含む。
【０２５９】
本明細書に使用される「葉酸」という用語は、葉酸の類似体及び誘導体、たとえば葉酸代謝拮抗薬、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、テトラヒドロプテリン、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、１−デアザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザ、１０−デアザ、１，５−デアザ、５，１０ジデアザ、８，１０−ジデアザ及び５，８−ジデアザ葉酸、葉酸代謝拮抗薬及びプテロイン酸誘導体をいう。
【０２６０】
本明細書に使用される「中性電荷をもつ化合物」という用語は、中性もしくは生理学的なｐＨにて中性又は無電荷である組成物をいう。このような化合物の例は、コレステロール及びその他のステロイド、コレステリルヘミスクシナート（ＣＨＥＭＳ）、ジオレイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、脂肪酸（オレイン酸、ホスファチジン酸及びその誘導体など）、ホスファチジルセリン、ポリエチレングリコール抱合ホスファチジルアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及び関連した変異体、プレニル化化合物（ファルネソール、ポリプレノール、トコフェロール及びこれらの修飾形態を含む）、ジアシルスクシニルグリセロール、膜融合又は孔形成ペプチド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、セラミドなどである。
【０２６１】
本明細書に使用される「脂質凝集体」という用語は、脂質がリポソーム、ミセル（非層状相）又はその他の１つ又は複数の脂質との凝集体の形態である脂質含有組成物をいう。
【０２６２】
本明細書に使用される「窒素含有基」という用語は、窒素又は置換された窒素を含む任意の化学基又は部分をいう。窒素含有基の非限定の例は、アミン、置換アミン、アミド、アルキルアミン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸、スペルミン又はスペルミジなどのポリアミンン、ピリジンなどの環状アミン、ウラシル、チミン及びシトシンを含むピリミジン、モルホリン、フタルイミド、並びにグアニン及びアデニンを含むプリンなどの複素環式アミンを含む。
【０２６３】
外的にデリバリーされた治療用核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、最適には、ＲＮＡ転写産物のレベルが低下するのに充分長い時間ＲＮＡの逆転写が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。核酸分子は、有効な細胞内治療用薬剤として機能するためには、ヌクレアーゼに耐性である。本明細書に及び当該技術分野において記載される核酸分子の化学合成の改良により、上述したように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより、核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
【０２６４】
核酸に基づいた本発明の分子の使用により、併用療法の可能性がもたらされることによって、より優れた疾患進行の治療（たとえば、異なる遺伝子にターゲットされる複数のｓｉＮＡ分子；公知の小分子モジュレーターと結合した核酸分子；又は分子の併用（異なるモチーフ及び／又はその他の化学的もしくは生物学的分子を含む）による間欠性治療）につながるであろう。ｓｉＮＡ分子を用いる被験者の治療にはまた、異なる種類の核酸分子、例えば、酵素的核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２、５−Ａオリゴアデニレート、デコイ、及びアプタマーの組み合わせが含まれる。
【０２６５】
もう一つの局面において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ又は複数の３’−キャップ構造を含む。
【０２６６】
「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃ他，米国特許第５、９９８、２０３号明細書、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ０３／７０９１８（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、デリバリー及び／又は細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは、多機能ｓｉＮＡ（３’−キャップ）の一方又は両方の鎖の３’末端に存在することができる。非限定的な例においては、３’−キャップは、例えば、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１、３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１、２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１、５−アンヒドロヘキシト−ルヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’、４’セコヌクレオチド；３、４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３、５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転脱塩基部分；５’−ホスホルアミデ−ト；５’−ホスホロチオアート；１、４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋及び／又は非架橋５’−ホスホルアミデ−ト、ホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び５’−メルカプト部分からなる群より選択される（より詳細には、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ、１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。
【０２６７】
「非ヌクレオチド」との用語は、１又は複数のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ、糖及び／又はリン酸置換のいずれかを含み、残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基又は化合物を意味する。基又は化合物は、一般に認識されているヌクレオチド塩基、例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンを含まず、したがって１’位に塩基を欠失している場合、脱塩基である。
【０２６８】
本明細書において用いる場合、「ヌクレオチド」は、当該技術分野においては、天然塩基（標準的）、及び当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むと認識されている。そのような塩基は、一般にヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基部分において修飾されていても修飾されていなくてもよい（ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド等のように交換可能であるものも指す；例えば、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，前掲；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，前掲、すべての文献は、参照して本願明細書に取り込まれる。）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり、Ｌｉｍｂａｃｈ他，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入することができる塩基修飾のいくつかの非限定的な例としては、例えば、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２、４、６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピン及びその他のものが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ他，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、上掲）。この態様において、「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらの同等物を意味する。
【０２６９】
１つの実施形態においては、本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾されたｓｉＮＡ分子を特徴とし、これは１又は複数のホスホロチオアート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデ−ト、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び／又はアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＬｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ他，１９９４，Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照されたい。
【０２７０】
「脱塩基」とは、１’位において塩基を欠失しているか、又は塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃ他，米国特許第５、９９８、１０３号明細書を参照）。
【０２７１】
「非修飾ヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルのいずれかの塩基を意味する。
【０２７２】
「修飾ヌクレオシド」とは、非修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は式Ｉ〜ＶＩＩに示されるか、及び／又は本明細書に記載される他の修飾である。
【０２７３】
本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して、”アミノ”とは、２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他，米国特許第５、６７２、６９５号明細書及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ他，米国特許第６、２４８、８７８号明細書（いずれもその全体を参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２７４】
核酸ｓｉＮＡ構造に対する種々の修飾を作成して、これらの分子の有用性を高めることができる。例えば、このような修飾は、製品寿命、インビトロの半減期、安定性、及びそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め、例えば、細胞膜の透過性を高め、標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
【０２７５】
核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は、遺伝子発現に関連した任意の疾患、感染又は状態、並びに細胞又は組織における遺伝子産物のレベルに応答するその他の指標を、単独で、又はその他の療法と併せて治療するための使用に適応させることができる。例えば、ｓｉＮＡ分子は、被験者に投与するためのリポソーム等のデリバリービヒクル、担体及び希釈剤、及びそれらの塩を含むことができ、及び／又は薬理学的に許容できる処方中に存在することができる。核酸分子のデリバリーの方法は、Ａｋｈｔａｒ他．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；Ｍａｕｒｅｒ他．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；及びＬｅｅ他．．２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２（いずれも参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他．，米国特許第６，３９５，７１３号明細書及びＳｕｌｌｉｖａｎ他．，ＷＯ９４／０２５９５号国際公開公報は、さらに、核酸分子をデリバリーするための一般的な方法について記述している。これらのプロトコルを用いて、事実上いかなる核酸分子もデリバリーすることができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができ、これには、限定されないが、リポソームへの封入、イオントホレシス、又は他のビヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ他，１９９９、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４を参照、Ｗａｎｇ他，ＷＯ０３／４７５１８号及びＷＯ０３／４６１８５号国際公開公報）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡミクロスフェア（例えば米国特許第６，４４７，７９６号明細書及び米国特許出願公開公報第２００２１３０４３０号を参照）、生分解性ナノカプセル、及び生体接着性小球体への組み込み、又はタンパク質性ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開ＷＯ００／５３７２２）によるものが含まれる。一つの態様において、核酸分子又は本発明は、弾性形状記憶重合体などの生体分解性インプラント材を経て投与される（たとえばＬｅｎｄｅｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，  ２００２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６，  １６７３を参照されたい）。あるいは、核酸／媒体の組み合わせを直接注射によって、又はインフュージョンポンプを使用することによって局所的に送達される。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、又は皮内であるにかかわらず、標準的な針及び注射器法を使用して、又はＣｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５，  ２３３０−２３３７及びＢａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号国際公開公報第９９／３１２６２号に記述したものなどの無針技術によって行うことができる。当技術分野の多くの例では、浸透ポンプによるオリゴヌクレオチドのＣＮＳ送達法（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２５７，  １３５−１３８，  Ｄ’Ａｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５５，  １５１−１６４，  Ｄｒｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  １５７，  １６９−１７５，  Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２４７，  ２１−２４）を参照されたい）又は直接注射（Ｂｒｏａｄｄｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｆｏｃｕｓ，  ３，  ａｒｔｉｃｌｅ  ４）を記述する。その他の送達経路は、経口（錠剤又は丸剤形態）及び／又は髄腔内送達（Ｇｏｌｄ，  １９９７，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ７６，  １１５３−１１５８）を含むが、これらに限定されるわけではない。核酸送達及び投与のより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  前記、Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ  国際公開公報第９３／２３５６９号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ  国際公開公報第９９／０５０９４号及びＫｌｉｍｕｋ  ｅｔ  ａｌ．及びＰＣＴ国際公開公報第９９／０４８１９号に提供されており、これらの全てが、参照により本明細書に援用される。本発明の分子は、医薬品として使用することができる。医薬品は、被検者における疾患状態の発生を予防し、調節し、又は治療する（症候のある程度、好ましくは症候の全てを軽減する）。
【０２７６】
加えて、本発明は、本発明の核酸分子を、単球及びリンパ球を含む造血細胞に送達するための方法の使用を特徴とする。これらの方法は、Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ．  Ｐｈａｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２８５（２），  ９２０−９２８；  Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｌｏｏｄ，  ９１（３），  ８５２−８６２；  Ｆｉｌｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １３２９（２），  ３４５−３５６；  Ｍａ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，  １９９６，  Ｌｅｕｋ．  Ｒｅｓ．，  ２０（１１／１２），  ９２５−９３０；及びＢｏｎｇａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２（２２），  ４６８１−８によって詳述されている。上記したような方法は、オリゴヌクレオチドでの造血細胞のトランスフェクションのための、遊離のオリゴヌクレオチド、カチオン脂質製剤、ｐＨ感受性リポソーム及び免疫リポソームを含むリポソーム製剤、並びに膜融合ペプチドに抱合された生体抱合体を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【０２７７】
一つの態様において、眼の状態（たとえば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症その他）の治療のための化合物、分子又は組成物は、眼球内に、又は眼内手段によって被検者に投与される。もう一つの態様において、眼の状態（たとえば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症その他）の治療のための化合物、分子又は組成物は、眼周囲に、又は眼周囲手段によって被検者に投与される（たとえば、Ａｈｌｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ刊行物番号国際公開公報第０３／２４４２０号を参照されたい）。一つの態様において、ｓｉＮＡ分子及び／もしくは製剤又はこれらの組成物は、眼球内に、又は眼内手段によって被検者に投与される。もう一つの態様において、ｓｉＮＡ分子及び／もしくは製剤又はこれらの組成物は、眼周囲に、又は眼周囲手段によって被検者に投与される。眼周囲投与は、一般に、ｓｉＮＡ分子及び製剤又はこれらの組成物を被検者に投与するための、より浸潤性ではないアプローチを提供する（たとえば、Ａｈｌｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ刊行物番号国際公開公報第０３／２４４２０号を参照されたい）。また、眼周囲投与の使用により、網膜剥離のリスクが最小限になって、より多くの回数の投薬又は投与が可能となり、黄斑変性症及びその他の眼の状態のための臨床的に適した投与経路を提供し、さらに薬物送達のための貯蔵所（たとえば、インプラント、ポンプ又はその他の装置）を使用する可能性を提供する。
【０２７８】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、膜破壊剤、例えば米国特許出願公報第２００１０００７６６６号（図面を含む全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載のもの等と組み合わされる。他の実施形態において、膜破壊剤（１又は複数）及びｓｉＮＡは、カチオン性脂質又はヘルパー脂質分子、例えば米国特許第６，２３５，３１０号明細書（図面を含む全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載のもの等と組み合わされる。
【０２７９】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体により誘導体化したＰＥＩ、及びそれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体（例えば、Ｏｇｒｉｓ他，２００１，ＡＡＰＡ  ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１；Ｆｕｒｇｅｓｏｎ他，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１４，８４０−８４７；Ｋｕｎａｔｈ他，２００２，Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０−８１７；Ｃｈｏｉ他，２００１，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２，４６−５２；Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ他，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，５５８−５６１；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３，８４５−８５４；Ｅｒｂａｃｈｅｒ他，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８；Ｇｏｄｂｅｙ他，１９９９．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１；Ｇｏｄｂｅｙ他，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０；Ｄｉｅｂｏｌｄ他，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４；Ｔｈｏｍａｓ  及び  Ｋｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５；及びＳａｇａｒａ，米国特許第６，５８６，５２４号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）等を含む、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖状又は分岐を有するＰＥＩ）及び／又はポリエチレンイミン誘導体と共に製剤され又は複合体を形成している。
【０２８０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他，米国特許第１０／４２７，１６０号（２００３年４月３０日出願）、米国特許第６，５２８，６３１号、第６，３３５，４３４号、第６，２３５，８８６号、第６，１５３，７３７、第５，２１４，１３６号、第５，１３８，０４５号明細書（全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載の核酸コンジュゲート等のバイオコンジュゲートを含んでいる。
【０２８１】
すなわち、本発明は、本発明の１又は複数の核酸を、許容しうる担体、例えば安定剤、緩衝液等に含む医薬組成物を特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、安定剤、緩衝液等を用いて又は用いずに医薬組成物を形成することにより、任意の標準的な手段により、投与（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質）し、被験者に導入することができる。リポソームデリバリーメカニズムを利用することが望ましい場合には、リポソームを形成する標準的なプロトコルにしたがうことができる。また、本発明の組成物は、処方することができる、経口投与のための錠剤、カプセル又はエリキシル、直腸投与のための坐薬、注射剤投与のための無菌液、懸濁液、及び当技術分野において公知のその他の組成物として使用する。
【０２８２】
本発明はまた、記載される化合物の薬理学的に許容できる処方を含む。これらの処方には、上述の化合物の塩、例えば、酸付加塩（例えば、塩酸、シュウ酸、酢酸及びベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【０２８３】
医薬組成物又は処方は、細胞又は被験者（例えばヒト）への投与（例えば全身投与）に適当な形態の組成物又は処方を表す。適当な形態は、部分的には、使用する投与経路（例えば経口、経皮、又は注射）に依存する。そのような形態は、組成物又は処方が標的細胞（すなわち、負に荷電した核酸がデリバリーされることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例えば、血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており、例えば、毒性、及び組成物又は処方がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【０２８４】
「全身投与」とは、インビボでの全身吸収、又は血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には、限定されないが、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が含まれる。これらの投与経路のそれぞれは、本発明のｓｉＮＡ分子をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は、分子量又はサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬剤担体を使用することにより、薬剤を、例えば、あるタイプの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能である。薬剤と細胞（例えば白血球及びマクロファージ）の表面との会合を容易にすることができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は、マクロファージ及び白血球による異常な細胞の免疫認識の特異性を利用することにより、薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【０２８５】
「薬理学的に許容できる処方」又は「薬理学的に許容できる組成物」とは、本発明の核酸分子をその所望の活性に最も適した物理学的位置に有効に分布させることができる組成物又は処方を意味する。本発明の核酸分子とともに処方するのに適した薬剤の非限定的な例には以下のものが含まれる：ＣＮＳ中への薬剤の侵入を促進することができるＰ−糖タンパク質阻害剤（ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ及びＴｉｌｌｅｍｅｎｔ，１９９９，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３，１６−２６）；大脳内移植後の徐放輸送用の生分解性ポリマー、例えばポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ他，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、及び薬剤を脳血管関門を越えて輸送することができ、神経の取り込みメカニズムを変更しうる、例えばポリブチルシアノアクリレート製の充填されたナノ粒子（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）。本発明の核酸分子のデリバリー戦略の他の非限定的な例には、Ｂｏａｄｏ他，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５、Ｔｙｌｅｒ他，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ他，１９９５，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７、Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ他，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；及びＴｙｌｅｒ他，１９９９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載される物質が含まれる。
【０２８６】
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾、又は長期間循環リポソーム又はステルスリポソーム）を含む表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は、標的組織における薬剤の蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は、単核食細胞システム（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン作用及び排除に抵抗性であり、したがって、封入された薬剤の血流循環時間を長くし、組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉｃ他，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ他，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。このようなリポソームは、おそらく新生血管化した標的組織における血管外遊走及び捕獲によって、腫瘍に選択的に蓄積することが示された（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６７，  １２７５−１２７６；  Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２３８，  ８６−９０）。長期循環リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが公知である従来の陽イオン性リポソームと比較して、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬動力学を増強する、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９５，  ４２，  ２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ公開番号国際公開公報第９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  国際  ＰＣＴ公開番号国際公開公報第９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  国際  ＰＣＴ公開番号国際公開公報第９６／１０３９２号）。長期間循環リポソームはまた、代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織、例えば肝臓及び脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
【０２８７】
本発明はまた、薬理学的に有効量の所望の化合物を薬理学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む、保存又は投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体又は希釈剤は、医薬の技術分野においてよく知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編．１９８５）（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、染料、及び風味剤を用いることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いてもよい。
【０２８８】
薬理学的に有効な用量とは、疾患状態の予防、発症の阻害、又は治療（症状をある程度緩和し、好ましくは全ての症状を緩和する）に必要な用量である。薬理学的に有効な用量は、疾患の種類、用いる組成物、投与の経路、治療する哺乳動物の種類、考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性、同時に投与される薬剤、及び医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に、負に荷電したポリマーの効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
【０２８９】
本発明の核酸分子及びその処方は、慣用的な無毒性の薬理学的に許容できる担体、アジュバント及びビヒクルを含む用量単位処方中で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入又はスプレーにより、又は直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合、非経口的との用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、又は髄腔内注射又は注入の手法等が含まれる。さらに、本発明の核酸分子及び薬理学的に許容できる担体を含む医薬処方が提供される。１又は複数の本発明の核酸分子は、１又は複数の無毒性の薬理学的に許容できる担体及び／又は希釈剤、及び／又はアジュバント、及び所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形、例えば、錠剤、トローチ剤、菱形剤、水性又は油性懸濁液、分散可能な粉体又は顆粒、乳剤、硬カプセル又は軟カプセル、又はシロップ又はエリキシル剤の形であることができる。
【０２９０】
経口で使用することが意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ、そのような組成物は、薬理学的に洗練された口に合う製品を提供するために、１又は複数のそのような甘味剤、芳香剤、着色剤又は保存剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬理学的に許容できる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアラビアゴム、及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、既知の手法により被覆してもよい。場合によっては、既知の手法によりそのような被覆を調製して、胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させ、このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば、遅延用材料、例えばグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートを用いることができる。
【０２９１】
経口使用のための処方は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル、又は活性成分が水又は油状媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン又はオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってもよい。
【０２９２】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トララガントガム及びアラビアゴムである。分散剤又は湿潤剤は、天然に生ずるホフファチド、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁液はまた、１又は複数の保存剤、例えば、エチル−、又はｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１又は複数の着色剤、１又は複数の芳香剤、及び１又は複数の甘味剤、例えばショ糖又はサッカリンを含んでいてもよい。  
【０２９３】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、アラキス油、オリーブ油、ゴマ油又はココナッツ油、又は無機油、例えば液体パラフィン中に懸濁させることにより処方することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、密ロウ、硬パラフィン又はセチルアルコールを含むことができる。甘味剤及び芳香剤を加えて、口に合う経口製品を得ることができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸を加えることにより保存することができる。
【０２９４】
水を加えることにより水性懸濁液を製造するのに適した分散可能な粉体及び顆粒は、活性成分を、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１又は複数の保存剤との混合物中で与える。適当な分散剤又は湿潤剤又は懸濁剤は、上で例示したとおりである。さらに別の賦形剤、例えば、甘味剤、芳香剤及び着色剤が存在していてもよい。
【０２９５】
本発明の医薬組成物はまた、水中油エマルジョンの形であってもよい。油相は、植物油又はミネラルオイル又はこれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤としては、天然に生ずるガム、例えば、アラビアゴム又はトラガガントゴム、天然に生ずるホスファチド類、例えば、大豆、レクチン、及び脂肪酸とヘキシトールから誘導されるエステル又は部分エステル、無水物、例えば、ソルビタンモノオレエート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョンは、甘味料及び芳香剤を含んでいてもよい。
【０２９６】
シロップ及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はショ糖を用いて処方することができる。このような処方はまた、粘滑剤、保存剤及び甘味料及び着色料を含んでいてもよい。医薬組成物は、滅菌した注射可能な水性又は油性の懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は、上述した適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術分野において知られるように処方することができる。滅菌した注射可能な製品はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌した注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、１、３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることのできる許容可能なビヒクル及び溶媒の例は、水、リンゲル溶液及び等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌し固定した油を溶媒又は懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のためには、任意の非刺激性の固定した油、例えば、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを用いることができる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸を注射可能な薬剤の製造において用いることができる。
【０２９７】
本発明の核酸分子はまた、例えば、薬剤の直腸投与用に、座剤の形で投与することができる。これらの組成物は、薬剤を、通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸中で溶融して薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することにより製造することができる。そのような材料としては、カカオバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２９８】
本発明の核酸分子は、滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬剤は、使用するビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁されていてもよく、溶解されていてもよい。アジュバント、例えば局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤をビヒクル中に溶解することも有利である。
【０２９９】
上述した症状の治療には、体重１キログラムあたり１日あたり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが有用である（被験者あたり１日あたり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。担体物質と組み合わせて１回投与量形を生成することができる活性成分の量は、治療される宿主及び投与の特定のモードに依存して様々である。投与量単位形は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。
【０３００】
特定の被験者についての特定の投与量レベルは、種々の因子、例えば、用いる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、及び排出速度、薬剤の組み合わせ、及び治療をしている特定の疾患の重篤性に依存することが理解されるであろう。
【０３０１】
ヒト以外の動物に投与するためには、組成物を動物飼料又は飲料水に加えてもよい。動物が治療上適当な量の組成物を飼料とともに接種できるよう、動物飼料及び飲用水組成物を処方することが便利であろう。飼料又は飲料水に加えるように組成物をプレミックスとして製造することも便利であろう。
【０３０２】
本発明の核酸分子はまた、他の治療用化合物と組み合わせて被験者に投与して、全体的治療効果を高めることができる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いることにより、副作用の存在を低下させながら有益な効果を高めることができる。
【０３０３】
１つの実施形態においては、本発明は、特定の細胞タイプに本発明の核酸分子を投与するのに適した組成物を含む。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ及びＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２）は、肝細胞に独特であり、分枝鎖ガラクトース末端糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）に結合する。別の例においては、多くのガン細胞中で葉酸受容体が過剰発現されている。そのような糖タンパク質、合成グリココンジュゲート、又は葉酸の受容体への結合は、オリゴサッカライド鎖の分枝の程度に強く依存する親和性で生じ、例えば、三分枝構造は一分枝又は二分枝鎖よりも大きい親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，４，３１７−３２８により、炭水化物部分として、ガラクトースに比べて高い受容体への親和性を有しＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンを使用することで、高い特異性が得られた。この「クラスタリング効果」はまた、マンノシル末端糖タンパク質又はグリココンジュゲートの結合及び取込についても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ他，１９８１、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｅｎｔ．、２４、１３８８−１３９５）。ガラクトース、ガラクトサミン又は葉酸に基づくコンジュゲートを使用して外来性化合物を細胞膜を超えて輸送することにより、例えば、肝疾患、肝臓のガン、又は他のガンの治療に標的化デリバリー法を提供することができる。また、バイオコンジュゲートの使用により、治療に必要な治療用化合物の必要用量を低下させることができる。さらに、本発明の核酸コンジュゲートを使用することにより、治療薬の生物利用性、薬力学、及び薬物動態学的パラメータを調節することができる。このようなコンジュゲートの非限定例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳＳＮ  １０／２０１，３９４，２００１年８月１３日に出願、及び、Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳＳＮ  １０／１５１，１１６，２００２年５月１７日に出願に記述されている。一つの態様において、本発明の核酸分子は、Ｂ型肝炎ウイルスＳ、Ｍ又はＬ  エンベロープタンパク質などのナノ粒子と複合体を形成しているか、又は共有結合で付着されている（たとえばＹａｍａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２１，  ８８５を参照されたい）。一つの態様において、本発明の核酸分子は、ヒト腫瘍細胞、具体的には、たとえばＴ細胞、肝細胞、乳癌細胞、卵巣悪性腫瘍細胞、黒色腫細胞、腸管上皮細胞、前立腺細胞、精巣細胞、肺非小細胞癌、小細胞肺癌、その他を含む非アポトーシス性ヒト腫瘍細胞に対して特異的に送達される。
【０３０４】
あるいは、本発明の一定のｓｉＮＡ分子は、細胞内で、真核生物のプロモーターから発現することができる（たとえば、Ｉｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９，  ３４５；  ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  １９８６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８３，  ３９９；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２３，  ２２５９；  Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ４，  ４５；  Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ５，６２４，８０３；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  米国特許第５，９０２，８８０号及び第６，１４６，８８６号；  Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ５０５；  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ４９７；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ５００；  総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  ＴＩＧ．，  １２，  ５１０を参照されたい）。当業者は、真核生物細胞中で任意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識するであろう。そのような核酸の活性は、酵素的核酸によりそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ他，ＷＯ９３／２３５６９号国際公開公報、Ｓｕｌｌｉｖａｎ他，ＷＯ９４／０２５９５号国際公開公報；Ｏｈｋａｗａ他，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ他，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ他，１９９３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ他，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６）。
【０３０５】
本発明の別の態様においては、本発明のＲＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えばＣｏｕｔｕｒｅ他，１９９６、ＴＩＧ．、１２、５１０を参照）。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。他の実施形態においては、ｐｏｌＩＩＩに基づくコンストラクトを用いて、本発明の核酸分子を発現させる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、米国特許５、９０２、８８０及び６、１４６、８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは、上述のようにデリバリーされ、標的細胞中に残留することができる。あるいは、核酸分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば、ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用して、ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの輸送は、全身的（例えば、静脈内又は筋肉内投与により）、患者から外植された標的細胞に投与した後、被験者に再導入することにより、又は所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により、行うことができる（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ他，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【０３０６】
以下は本発明の核酸の選択、単離、合成及び活性を示す非限定的な例である。
【実施例１】
【０３０７】
化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの安定性
ヒト血清における天然のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド（又は、たとえば２つのチミジンヌクレオチド突出を含むもの）と比較して、これらのコンストラクトの安定性を決定するために、化学修飾をｓｉＮＡコンストラクトに導入する。ＲＮＡｉ安定性試験は、ｓｉＮＡによる二重鎖の形成を容易にするために適した緩衝液中でインキュベートすることによって、ｓｉＮＡを内部標識化し、二重鎖形成させることによって行う。次いで、二重鎖形成されたｓｉＮＡコンストラクトを、２μＭ  ｓｉＮＡ（鎖２濃度）の終濃度にて、９０％のマウス又はヒト血清中で３０秒、１分、５分、３０分、９０分、４時間１０分、１６時間２４分及び４９時間インキュベートすることによって安定性について試験する。各時点を１５％の変性ポリアクリルアミドゲルで行い、ホスホイメージャーで解析する。
【０３０８】
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）及び鎖２のヌクレオチド位置（たとえば、ヌクレオチド１３）に放射標識されたリン酸の付加をもつ32Ｐ−γ−ＡＴＰとキナーゼの反応を経て、内部標識化を行い、３’側から計数する。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼと残りの断片のライゲーションにより、全長鎖２を生じる。ｓｉＮＡの二重鎖形成は、たとえば適切な濃度のｓｉＮＡオリゴヌクレオチドを添加すること、及び９５℃に５分間加熱し、続いて室温に徐冷することによって達成される。反応は、ｓｉＮＡ二重鎖に１００％の血清を添加すること、及び３７℃にてインキュベートすること、次いで、所望の時間−位置にてアリクォートを除去することによって行う。
【実施例２】
【０３０９】
任意のＲＮＡ配列における潜在的ｓｉＮＡ標的部位の同定
ウイルス又はヒトｍＲＮＡ転写物などの、関心対象のＲＮＡ標的の配列を、たとえばコンピュータ・フォールディング・アルゴリズムを使用することにより、標的部位についてスクリーニングする。このような標的部位は、複数の標的核酸配列によって共有される相補的な、回文構造配列又は反復配列を含み得るため、その結果共通の回文構造又は反復配列を共有するか、又はある程度の自己相補性を有する異なる核酸配列を標的とするための多機能ｓｉＮＡ分子をデザインすることができる。加えて、天然に存在しないヌクレオチド又は非ヌクレオチドの使用により、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子内に人工の相補的領域、回文構造領域又は反復領域を作製するために利用することができる（たとえば、図７を参照されたい）。非限定的な例においては、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースから得られる遺伝子又はＲＮＡ遺伝子転写産物の配列を用いて、標的に対して相補性を有するｓｉＮＡ配列を生成する。そのような配列は、データベースから得ることができるか、又は当該技術分野において知られるように実験的に決定することができる。既知の標的部位、例えば、リボザイム又はアンチセンス等の他の核酸分子を用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定されている標的部位、又は疾患又は健康状態と関連していることが知られている標的、例えば変異又は欠失を含む部位を用いて、これらの部位を標的とするｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて、標的ＲＮＡ配列中でいずれの部位が最も適当な標的部位であるかを判定することができる。これらのパラメータには、限定されないが、二次又は三次ＲＮＡ構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の種々の領域間のホモロジーの程度、又はＲＮＡ転写産物中の標的配列の相対的位置が含まれる。これらの判定に基づいて、ＲＮＡ転写産物中の任意の数の標的部位を選択して、例えば、インビトロＲＮＡ切断アッセイ、培養細胞、又は動物モデルを用いることにより、効力についてｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることができる。非限定的な例においては、用いるべきｓｉＮＡコンストラクトのサイズに基づいて、転写産物中のいずれかの位置の１〜１０００個の標的部位を選択する。当該技術分野において知られる方法、例えば標的遺伝子発現の有効な減少を判定するマルチウエル又はマルチプレートアッセイ又はコンビナトリアル／ｓｉＮＡライブラリースクリーニングアッセイを用いて、ｓｉＮＡ分子をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。
【０３１０】
非限定の例において、多機能ｓｉＮＡは、２つの別々の核酸配列を標的とするように設計されている。２つの異なる標的に対して活性である２つの異なるｓｉＮＡを１つのｓｉＮＡ内に共に組み合わせることが目標である。ｓｉＮＡは、それぞれの鎖の５‘が、下記のイタリックに示すように、２つのｓｉＲＮＡのうちの１つの「アンチセンス」配列で開始する方向に連結される。
【化１２】
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【０３１１】
ＲＩＳＣは、５’末端から２つの鎖のいずれも取り込むことが予想される。これにより、いずれの鎖にも２つの型の活性ＲＩＳＣ集団を有することとなる。それぞれの鎖の５’の１９ｎｔは、分離された標的配列の分解のためのガイド配列として作用する。
【０３１２】
もう１つの例において、多機能ｓｉＮＡ分子のサイズは、重複を見いだすか、又は個々のｓｉＮＡ長を切断することによって減少される。後述する例示的な実行では、いずれの所与の第一の標的配列についても、第二の標的配列内に共有される相補配列が見いだされる可能性があることを示す。
【０３１３】
互いに独立して産生された２つのより長い配列間で生じることが予想される短いポリヌクレオチド配列（たとえば、１４ヌクレオチドよりも少ない）の自発的マッチの数を調査した。均一性ランダムジェネレーターＳＡＳ  Ｖ８．１を使用するシミュレーションでは、文字｛ＡＣＧＵ｝をランダムに反復回生成した４，０００個の文字列を利用した。次いで、この配列を位置（１、２．．．．ｎ）由来の記号としてＳ１、位置（２、３．．．ｎ＋１）由来のＳ２から、完全に最後のセット位置（４０００−ｎ＋１．．．、４０００）からのＳ  ４０００−ｎ＋１までを利用することによって形成されるほぼ４０００個の重複するセットに分割した。次いで、この過程を第二の４０００個の文字列について繰り返した。次いで、２つの文字列間の配列同一性について、同一セットの（サイズｎの）出現をソーティング及びマッチ−組み合わせルーチンによって調べた。この手順を９〜１１文字のセットについて繰り返した。結果は、長さｎ＝９文字（範囲３９〜７２）において平均５５マッチ配列であり；サイズｎ＝１０について１３個の共通セット（範囲６〜１８）であり、１１文字のセットについて平均４マッチ（範囲０〜６）であった。元の文字列長に対して４０００個を選択すると、ほぼＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のコード領域の長さである。この簡単なシミュレーションは、互いに独立して形成された任意の２つの長いコード領域が、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの長さを短くするために使用することができる共通の短配列を共有することを示唆する。この例では、サイズ９の共通配列は、単独で偶然に＞１％の頻度で生じた。
【０３１４】
以下は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を標的とする多機能ｓｉＮＡコンストラクトであり、そのそれぞれの鎖は、１４ｎｔの自己相補的領域（下線）と共に２４ｎｔの全長を有する。ＶＥＧＦＲ１を標的とするｓｉＮＡ「１」及びＶＥＧＦＲ２を標的とするｓｉＮＡ「２」のそれぞれのアンチセンス領域を（相補的領域は、イタリックで示す）を使用する。
【化１３】
2007523649.tif 000012
【０３１５】
もう１つの例において、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの長さは、それぞれの標的配列に対する塩基対の配列相同性がより少ないと、有効なＲＮＡｉ活性に対して許容的であり得るかどうかを決定することによって減少される。その場合は、多機能ｓｉＮＡの全長は、以下に示すように減少させることができる。以下の仮定的例において、４つのヌクレオチド（太字）をそれぞれ１９ヌクレオチドｓｉＮＡ「１」及びｓｉＮＡ「２」コンストラクトから減少させる。生じる多機能ｓｉＮＡは、３０塩基対の長さである。
【化１４】
2007523649.tif 000013
【実施例３】
【０３１６】
ＲＮＡにおけるｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の非限定的工程を用いて、所定の遺伝子配列又は転写産物を標的とするｓｉＮＡの選択を行うことができる。
【０３１７】
標的配列をインシリコで解析して、標的配列中に含まれる特定の長さの全てのフラグメント又はサブ配列、例えば２３ヌクレオチドフラグメントのリストを作成する。この工程は、典型的にはあつらえのＰｅｒｌスクリプトを用いて行うが、市販の配列分析プログラム、例えば、Ｏｌｉｇｏ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、又はｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅも同様に用いることができる。
【０３１８】
場合によっては、ｓｉＮＡは２以上の標的配列に対応する。これは、例えば、同じ遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合、１つ以上の遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合、又はヒト遺伝子と動物ホモログとの両方を標的とする場合に生じうる。この場合には、それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し、次にリストを比較して、各リスト中でマッチング配列を見いだす。次に、サブ配列を、所定のサブ配列を含む標的配列の数にしたがってランク付けする。この目的は、標的配列のほとんど又はすべてに存在するサブ配列を見いだすことである。あるいは、ランク付けにより、標的配列にユニークなサブ配列、例えば変異体標的配列を同定することができる。このような方法により、変異体配列を特異的に標的とし、正常な配列の発現に影響を及ぼさないｓｉＮＡの使用が可能となるであろう。
【０３１９】
場合によっては、ｓｉＮＡのサブ配列は、１又は複数の配列中には存在しないが、所望の標的配列中に存在する。これは、ｓｉＮＡが標的とされないままでいるべきパラロガスファミリーのメンバーを有する遺伝子を標的とする場合に生じうる。上述のケース２におけるように、それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し、次にリストを比較して、標的遺伝子中に存在するが標的ではないパラログ中には存在しない配列を見いだす。
【０３２０】
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、ＧＣ含量にしたがってランク付けすることができる。３０〜７０％のＧＣを含有する部位が好ましく、４０−６０％のＧＣを含有する部位がさらに好ましい。
【０３２１】
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、配列中にＧＧＧ又はＣＣＣの連続を有するか否かにしたがってランク付けすることができる。いずれかの鎖にＧＧＧ（又はさらに多いＧ）が存在すると、オリゴヌクレオチド合成に問題が生じることがあり、ＲＮＡｉ活性を妨害する可能性があり、これは他の適切な配列が利用できれば回避される。ＣＣＣはｓｉＮＡ鎖にＧＧＧを配置するため、標的鎖中で検索される。
【０３２２】
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、配列の３’末端にジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を、及び／又は配列の５’末端にＡＡ（ｓｉＮＡ配列に３’ＵＵを生ずる）を有するか否かにしたがってランク付けする。これらの配列により、末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子を設計することが可能となる。
【０３２３】
標的核酸配列を選択するときに、その他の設計事項を使用することができ、たとえばＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  １  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６を参照されたい。
【０３２４】
最も活性なｓｉＮＡ分子又は標的ＲＮＡ配列内の最も好ましい標的部位を同定するために、本明細書に記述した系又は当技術分野において公知の別のものなどの、適切なインビトロ系、細胞培養系又は動物モデル系でｓｉＮＡ分子をスクリーニングする。
【実施例４】
【０３２５】
ｓｉＮＡデザイン
ｓｉＮＡ標的部位は、標的ＲＮＡの配列を解析し、任意に、予測される二重鎖安定性、ＧＣ含量、折りたたみ（標的に対するｓｉＮＡのアクセスしやすさを決定するために解析される任意の所与の配列の構造）、当技術分野において公知のその他のパラメータなどの好ましい配列モチーフ（たとえば、（たとえば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  １  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６を参照されたい）に基づいて標的部位を優先させることによって、又はｓｉＮＡ分子のライブラリーを使用することによって選択した。
【０３２６】
一旦、多機能ｓｉＮＡコンストラクトに関して標的部位が同定されれば、ｓｉＮＡのそれぞれの鎖を、異なる標的核酸配列に対して相補的な、約１８〜約２８ヌクレオチドの間の長さの相補的領域にデザインする。それぞれの相補的領域は、標的配列に対して相補的ではないが、他方の配列の相補的領域に対して相補性を含む、約４〜約２２ヌクレオチドの隣接したフランキング領域にデザインした（たとえば、図１を参照されたい）。ヘアピンコンストラクトも同様にデザインすることができる（たとえば、図２を参照されたい）。異なる標的核酸配列で共有される相補的、回文構造配列又は反復配列の同定を使用して、多機能ｓｉＮＡコンストラクトの全長を短くすることができる（たとえば、図３及び４を参照されたい）。
【０３２７】
ｓｉＮＡ分子は、それぞれの標的に結合することができるように設計し、必要に応じて個々にコンピュータフォールディングにより分析して、ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用しうるか否かを評価した。種々の長さのｓｉＮＡ分子を選択して、活性を最適化することができる。一般に、標的ＲＮＡと結合するか、さもなくばこれと相互作用する十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが、種々の長さ又は塩基組成のｓｉＮＡ二本鎖に適応させるように、相補性の程度を調節することができる。そのような方法論を用いることにより、ｓｉＮＡ分子は、任意の既知のＲＮＡ配列、例えば、任意の遺伝子転写産物に対応するＲＮＡ配列中の部位を標的とするよう設計することができる。
【０３２８】
化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを設計して、遺伝子阻害活性を媒介する能力を保存しながら、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性及び／又は改良された薬物動態学、局在化、及びデリバリー特性を提供することができる。本明細書に記載される合成方法及び一般に当該技術分野において知られる合成方法を用いて、本明細書に記載される化学修飾を合成的に導入する。次に、血清及び／又は細胞／組織抽出物（例えば肝臓抽出物）中で、合成ｓｉＮＡコンストラクトをヌクレアーゼ安定性についてアッセイする。合成ｓｉＮＡコンストラクトはまた、適当なアッセイ、例えば本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーターッセイ又は阻害活性を定量しうる他の適当なアッセイを用いて、活性についても平行して試験する。ヌクレアーゼ安定性及びＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡコンストラクトは、さらに改変して、安定性及び活性のアッセイにおいて再評価することができる。次に、任意の選択されたＲＮＡを標的とするいずれかのｓｉＮＡ配列に安定化活性ｓｉＮＡコンストラクトの化学的修飾を適用して、例えば、標的スクリーニングアッセイにおいて用いて、治療薬を開発するためのｓｉＮＡ化合物のリードを拾い上げることができる。あるいは、化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを、適切なアッセイ法系（たとえば、細胞培養、動物モデルその他）における活性について直接スクリーニングすることができる。
【実施例５】
【０３２９】
ｓｉＮＡの化学的合成及び精製
ｓｉＮＡ分子は、たとえば、ＲＮＡメッセージの種々の部位（たとえば、図６参照されたい）、たとえば本明細書に記述したＲＮＡ配列内の標的配列と、又は異なるＲＮＡ配列の種々の部位（たとえば、図５を参照されたい）と相互作用するようにデザインした。ｓｉＮＡ分子の配列は、上述した標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的ではないようにスクランブル化することにより、合成することができる。一般に、ｓｉＮＡコンストラクトは、本明細書に記載されるように、固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる（例えば、Ｕｓｍａｎ他．，米国特許第５，８０４，６８３号；第５，８３１，０７１号；第５，９９８，２０３号；第６，１１７，６５７号；第６，３５３，０９８号；第６，３６２，３２３号；第６，４３７，１１７号；第６，４６９，１５８号明細書；Ｓｃａｒｉｎｇｅ他．，米国特許第６，１１１，０８６号；第６，００８，４００号；第６，１１１，０８６号明細書を参照（いずれもその全体を参照として本明細書に組み込まれる））。
【０３３０】
非限定的な例においては、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られるように、ホスホルアミダイト化学を用いて段階的様式で合成する。標準的なホスホルアミダイト化学においては、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基、及び環外アミン保護基（例えば、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−アセチルシチジン、及びＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。あるいは、Ｓｃａｒｉｎｇｅ（上掲）により記載されるように、ＲＮＡの合成において２’−Ｏ−シリルエーテルを酸不安定性２’−Ｏ−オルトエステル保護基と組み合わせて用いてもよい。異なる２’化学は異なる保護基を必要とし、例えば、Ｕｓｍａｎ他，米国特許第５，６３１，３６０号明細書（その全体を参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるように、２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドにはＮ−フタロイル保護を用いることができる。
【０３３１】
固相合成の間に、各ヌクレオチドを順番に（３’−から５’−方向に）固体支持体結合オリゴヌクレオチドに付加する。鎖の３’末端の最初のヌクレオシドを種々のリンカーを用いて固体支持体（例えば、調整多孔ガラス又はポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイト、及び活性化剤を混合して、第１のヌクレオシドの５’末端上に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる。次に支持体を洗浄し、未反応５’−ヒドロキシル基を無水酢酸等のキャッピング試薬を用いてキャッピングして、不活性な５’−アセチル部分を得る。次に３価リン結合を酸化してより安定なリン酸結合とする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、適当な条件下で（例えば、トリチル系の基については酸性条件、シリル系の基についてはフッ化物を用いて）、５’−Ｏ−保護基を切断する。それぞれの次のヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。
【０３３２】
合成条件を改変して、例えば、合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度、異なる接触時間、異なる固体支持体及び固体支持体リンカー化学を用いることにより、カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護及び精製は、一般に記載されているようにして行うことができる（Ｕｓｍａｎ他．，米国特許第５，８３１，０７１号，米国特許第６，３５３，０９８，米国特許第６，４３７，１１７号明細書，及びＢｅｌｌｏｎ他，米国特許第６，０５４，５７６号，米国特許第６，１６２，９０９号，米国特許第６，３０３，７７３号明細書又はＳｃａｒｉｎｇｅ（上掲）（これらはすべてその全体を参照として本明細書に組み込まれる））。さらに、脱保護条件を改変して、可能な限り最高の収量及び純度のｓｉＮＡコンストラクトを得る。例えば、本出願人は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることを見いだした。そのようなオリゴヌクレオチドは、水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には、水性メチルアミンで約３５℃にて３０分間脱保護した後、ＴＥＡ−ＨＦを加え、反応液をさらに１５分間約６５℃に維持する。
【実施例６】
【０３３３】
インビボでの標的ＲＮＡの核酸阻害
標的ＲＮＡにターゲットされるｓｉＮＡ分子は、上記のとおりにデザインし、合成される。これらの核酸分子は、たとえば以下の手順を使用してインビボでの切断活性について試験することができる。
【０３３４】
２つの形式を使用して、特定の遺伝子転写物を標的とするｓｉＮＡの効力を試験する。最初に、試薬を標的発現細胞（たとえば、ＨｅＬａ）に対して試験して、ＲＮＡ及びタンパク質阻害の範囲を決定する。本明細書に記載されるように、ＲＮＡ標的に対するｓｉＮＡ試薬を選択する。これらの試薬を適当なトランスフェクション試薬により細胞にデリバリーした後、ＲＮＡ阻害を測定する。増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ７７００Ｔａｑｍａｎ（登録商標））を用いて、アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を測定する。無関係標的に対して、又は同じ全体の長さ及び化学を有するがそれぞれの位置でランダムに置換されているランダム化ｓｉＮＡ対照に対して作製したオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して、比較を行う。標的に対して一次及び二次のリード試薬を選択し、最適化を行う。最適なトランスフェクション試薬濃度を選択した後、リ−ドｓｉＮＡ分子を用いてＲＮＡの阻害の経時変化を測定する。さらに、細胞播種フォーマットを用いて、ＲＮＡ阻害を判定することができる。
【０３３５】
ｓｉＮＡの細胞へのデリバリー
細胞（たとえば、ＨｅＬａ）を、トランスフェクションの前日に、たとえば６ウェルディッシュのウェルあたり１×１０5細胞でＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）に播種する。ｓｉＮＡ（たとえば、終濃度２０ｎＭ）及びカチオン脂質（たとえば、終濃度２μｇ／ｍｌ）を、ポリスチレン・チューブ内で、ＥＧＭ基本培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に中で３７℃にて３０分間、複合体を形成させる。ボルテックスした後、複合体化したｓｉＮＡを各ウェルに加え、示される時間インキュベートする。最初の最適化実験のためには、細胞を例えば、１×１０3で９６ウエルプレートに播種し、記載されるようにしてｓｉＮＡ複合体を加える。ｓｉＮＡの細胞へのデリバリーの効率は、脂質と複合体化した蛍光ｓｉＮＡを用いて決定する。６ウェルディッシュ中の細胞をｓｉＮＡとともに２４時間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定する。ｓｉＮＡの取り込みは蛍光顕微鏡を用いて可視化する。
【０３３６】
Ｔａｑｍａｎ及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒによるｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡのデリバリーの後、例えば、６ウェル用にはＱｉａｇｅｎＲＮＡ精製キットを、又は９６ウエルアッセイ用にはＲｎｅａｓｙ抽出キットを用いて、細胞から総ＲＮＡを調製する。Ｔａｑｍａｎ分析のためには、５’末端に共有結合させたレポーター染料（ＦＡＭ又はＪＯＥ）及び３’末端にコンジュゲート化したクエンチャー染料ＴＡＭＲＡを有する二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列Ｄｅｔｅｃｔ又はで、１０μｌの総ＲＮＡ、１００ｎＭのフォワードプライマー、９００ｎＭのリバースプライマー、１００ｎＭのプローブ、１ＸＴａｑＭａｎＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭＭｇＣｌ２、３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１０ＵのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ＵのＭ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から構成される５０μｌの反応液を用いて行う。熱サイクリング条件は、４８℃にて３０分、９５℃にて１０分、続いて９５℃にて１５秒、及び６０℃にて１分の４０サイクルからなることができる。ｍＲＮＡレベルの定量化は、段階希釈した総細胞のＲＮＡ（３００、１００、３３、１１ｎｇ／ｒｘｎ）から作製し、かつＴａｑＭａｎ反応において平行してβアクチン又はＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対して規準化した標準と関連して決定する。目的とする各遺伝子について、上側プライマー及び下側プライマー、及び蛍光標識したプローブを設計する。特定のＰＣＲ産物中へのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料のリアルタイム取り込みは、ガラスキャピラリー管で光サイクラーを用いて測定することができる。対照ｃＲＮＡを用いて、各プライマー対について標準曲線を作成する。値は、各サンプルにおいてＧＡＰＤＨに対する相対的発現として表す。
【０３３７】
ウェスタンブロッティング
核抽出物は、標準的なマイクロ調製手法（例えば、及びｒｅｗｓ及びＦａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９を参照）を用いて調製することができる。例えばＴＣＡ沈殿を用いて、上清からのタンパク質抽出物を調製する。等量の１０％ＴＣＡを細胞上清に加え、氷上で１時間インキュベートし、５分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットをアセトンで洗浄後乾燥し、水に再懸濁する。細胞蛋白質抽出物を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）又は４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲルに流し、ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は、例えば、５％無脂乳とともに１時間インキュベートすることによりブロッキングすることができ、次に一次抗体を用いて４℃で１６時間反応させる。洗浄した後、二次抗体、例えば（１：１０、０００希釈）を室温で１時間適用し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でシグナルを検出する。
【実施例７】
【０３３８】
ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体を標的とする多機能ｓｉＮＡコンストラクト
本明細書に記述した方法を使用して、多機能ｓｉＮＡコンストラクトをＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ（たとえばＶＥＧＦＲ１及び／又はＶＥＧＦＲ２）標的ＲＮＡ配列に対してデザインする。これらのｓｉＮＡコンストラクトは、いかなる相補性も共有しない両標的の直列配列を利用することができる（たとえば、図１及び２を参照されたい）。あるいは、ｓｉＮＡコンストラクトには、関心対象の標的核酸配列（たとえば、図３及び４を参照されたい）における相補的な、回文構造配列又は反復配列（たとえば、本明細書において式ＩのＺ）の同定を利用することができる。一般に、これらの相補的な回文構造／反復配列は、約２〜約１２ヌクレオチドの長さを含むが、特定の多機能ｓｉＮＡコンストラクトに従って変更することができる。一つの例において、ＶＥＧＦ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の３’−末端に取り込まれ、かつＶＥＧＦＲ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の３’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ａ）。あるいは、ＶＥＧＦ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の５’−末端にて取り込まれ、ＶＥＧＦＲ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の５’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ｂ）。自己相補的な、回文構造又は反復配列が使用される場合、一般に、標的核酸配列において同定される反復が長くなるほど、生じるｓｉＮＡ配列は、短くなる。たとえば、それぞれの標的配列が、２１ヌクレオチドの長さであり、かつ配列中に反復が見いだされない場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば２１＋０＋２１＝４２ヌクレオチドの長さである。最初の２１ヌクレオチドは、第一の標的核酸配列に対して相補的な配列を表し、０は、自己相補的、回文構造又は反復配列の欠如を表し、及び第二の２１ヌクレオチドは、第二の標的核酸配列に対して相補的な配列を表す。２つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１９＋２＋１９＝４０ヌクレオチドの長さである。４つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１７＋４＋１７＝３８ヌクレオチドの長さである。６つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば１５＋６＋１５＝３６ヌクレオチドの長さである。８つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１３＋８＋１３＝３４ヌクレオチドの長さである。１０個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１１＋１０＋１１＝３２ヌクレオチドの長さである。１２個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば９＋１２＋９＝３０ヌクレオチドの長さであり、等々。従って、標的部位におけるそれぞれヌクレオチド減少に関しては、ｓｉＮＡ長は、２ヌクレオチドまで短くすることができる。これらと同じ原理は、１４〜２８ヌクレオチドを含む標的部位などの、異なる長さヌクレオチド配列を有する標的部位についても利用することができる。加えて、５’及び３’突出配列の種々の組み合わせ（たとえば、ＴＴ）をｓｉＮＡコンストラクトに導入して、自己相補な、回文構造又は反復配列をデザインすることができる。
【０３３９】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡをＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２  ＲＮＡ標的に対してデザインし、対応する化学逆位対照、及びトランスフェクション対照（ＬＦ２Ｋ）と一緒に未処置の細胞を使用して、活性が公知の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトと一緒に細胞培養実験においてスクリーニングする。非限定の例において、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を標的とする多機能ｓｉＮＡ配列には、表Ｉに示した配列を含む。ＨＡＥＣ細胞には、たとえばＶＥＧＦＲ１部位１５０１及びＶＥＧＦＲ２部位５７６０を標的とする２５ｎＭ多機能ｓｉＮＡと複合を形成した０．２５μｇ／ウェルの脂質をトランスフェクトする。引き続きｓｉＮＡトランスフェクション混合物の存在下で細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間経過時に、処理した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製する。トランスフェクション混合物の上澄み液をまず取り除き、廃棄後、細胞を溶解し、それぞれのウェルからＲＮＡを調製する。処理後のＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現を、規格化のためのコントロール遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット）に対するＲＴ−ＰＣＲにより評価する。
【０３４０】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡをＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１  ＲＮＡ標的に対してデザインし、対応する化学逆位対照、及びトランスフェクション対照（ＬＦ２Ｋ）と一緒に未処置の細胞を使用して、活性が公知の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトと一緒に細胞培養実験においてスクリーニングする。非限定の例において、ＶＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ１を標的とする多機能ｓｉＮＡ配列には、表ＩＩに示した配列を含む。ＨＡＥＣ細胞には、たとえばＶＥＧＦＲ１部位５３５３及びＶＥＧＦ部位３６０を標的とする２５ｎＭ多機能ｓｉＮＡと複合を形成した０．２５μｇ／ウェルの脂質をトランスフェクトする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物の継続的存在において、細胞を２４時間３７度にてインキュベートする。引き続きｓｉＮＡトランスフェクション混合物の存在下で細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間経過時に、処理した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製する。トランスフェクション混合物の上澄み液をまず取り除き、廃棄後、細胞を溶解し、それぞれのウェルからＲＮＡを調製する。処理後のＶＲＧＦＲ１及びＶＥＧＦｍＲＮＡの発現を、規格化のためのコントロール遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット）に対するＲＴ−ＰＣＲにより評価する。
【０３４１】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡをＶＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ２  ＲＮＡ標的に対してデザインし、対応する化学逆位対照、及びトランスフェクション対照（ＬＦ２Ｋ）と一緒に未処置の細胞を使用して、活性が公知の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトと一緒に細胞培養実験においてスクリーニングする。非限定の例において、ＶＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ２を標的とする多機能ｓｉＮＡ配列には、表ＩＩＩに示した配列を含む。ＨＡＥＣ細胞には、たとえばＶＥＧＦＲ２部位９０５及びＶＥＧＦ部位２２０を標的とする２５ｎＭ多機能ｓｉＮＡと複合を形成した０．２５μｇ／ウェルの脂質をトランスフェクトする。引き続きｓｉＮＡトランスフェクション混合物の存在下で細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間経過時に、処理した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製する。トランスフェクション混合物の上澄み液をまず取り除き、廃棄後、細胞を溶解し、それぞれのウェルからＲＮＡを調製する。処理後のＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦｍＲＮＡの発現を、規格化のためのコントロール遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット）に対するＲＴ−ＰＣＲにより評価する。
【０３４２】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡをＶＥＧＦＲ  ＲＮＡ標的及びＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２  ＲＮＡ標的に対してデザインし、対応する化学逆位対照、及びトランスフェクション対照（ＬＦ２Ｋ）と一緒に未処置の細胞を使用して、活性が公知の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトと一緒に細胞培養実験においてスクリーニングする。非限定の例において、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を標的とする多機能ｓｉＮＡ配列には、表ＩＶに示した配列を含む。ＨＡＥＣ細胞には、たとえばＶＥＧＦＲ１／Ｒ２ハイブリッド部位３６４６及びＶＥＧＦ部位３４９を標的とする２５ｎＭ多機能ｓｉＮＡと複合を形成した０．２５μｇ／ウェルの脂質をトランスフェクトする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物の継続的存在において、細胞を２４時間３７°にてインキュベートする。引き続きｓｉＮＡトランスフェクション混合物の存在下で細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間経過時に、処理した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製する。トランスフェクション混合物の上澄み液をまず取り除き、廃棄後、細胞を溶解し、それぞれのウェルからＲＮＡを調製する。処理後のＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦｍＲＮＡの発現を、規格化のためのコントロール遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット）に対するＲＴ−ＰＣＲにより評価する。
【実施例８】
【０３４３】
ＨＢＶ及びＦＡＳＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡコンストラクト
本明細書に記述した方法を使用して、多機能ｓｉＮＡコンストラクトをＨＢＶ及びＦＡＳ標的ＲＮＡ配列に対してデザインする。これらのｓｉＮＡコンストラクトは、いかなる相補性も共有しない両標的の直列配列を利用することができる（たとえば、図１及び２を参照されたい）。あるいは、ｓｉＮＡコンストラクトには、関心対象の標的核酸配列（たとえば、図３及び４を参照されたい）における相補的、回文構造配列又は反復配列（たとえば、本明細書において式ＩのＺ）の同定を利用することができる。一般に、これらの相補的な回文構造／反復配列は、約２〜約１２ヌクレオチドの長さを含むが、特定の多機能ｓｉＮＡコンストラクトに従って変更することができる。一つの例において、ＨＢＶ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の３’−末端に取り込まれ、かつＦＡＳ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の３’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ａ）。あるいは、ＨＢＶ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の５’−末端にて取り込まれ、ＦＡＳ受容体標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の５’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ｂ）。自己相補的な、回文構造又は反復配列が使用される場合、一般に、標的核酸配列において同定される反復が長くなるほど、生じるｓｉＮＡ配列は、短くなる。たとえば、それぞれの標的配列が、２１ヌクレオチドの長さであり、かつ配列中に反復が見いだされない場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば２１＋０＋２１＝４２ヌクレオチドの長さである。最初の２１ヌクレオチドは、第一の標的核酸配列に対して相補的な配列を表し、０は、自己相補的、回文構造又は反復配列の欠如を表し、及び第二の２１ヌクレオチドは、第二の標的核酸配列に対して相補的な配列を表す。２つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１９＋２＋１９＝４０ヌクレオチドの長さである。４つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１７＋４＋１７＝３８ヌクレオチドの長さである。６つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば１５＋６＋１５＝３６ヌクレオチドの長さである。８つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１３＋８＋１３＝３４ヌクレオチドの長さである。１０個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１１＋１０＋１１＝３２ヌクレオチドの長さである。１２個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば９＋１２＋９＝３０ヌクレオチドの長さであり、等々。従って、標的部位におけるそれぞれヌクレオチド減少に関しては、ｓｉＮＡ長は、２ヌクレオチドまで短くすることができる。これらと同じ原理は、１４〜２８ヌクレオチドを含む標的部位などの、異なる長さヌクレオチド配列を有する標的部位についても利用することができる。加えて、５’及び３’突出配列の種々の組み合わせ（たとえば、ＴＴ）をｓｉＮＡコンストラクトに導入して、自己相補な、回文構造又は反復配列をデザインすることができる。
【０３４４】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡを本明細書に記述したＨＢＶ及びＦＡＳ  ＲＮＡ標的に対してデザインし、ＨｅｐＧ２細胞においてスクリーニングされる。複製能を有するＨＢＶ  ＤＮＡでのヒト肝臓癌株化細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）のトランスフェクションにより、ＨＢＶタンパク質の発現及びビリオンの産生を生じる。ヒト肝臓癌株化細胞Ｈｅｐ  Ｇ２は、１０％  ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ  必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ユニット  ペニシリン及び１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったダルベッコ修飾イーグル培地中で培養する。複製応答能のあるｃＤＮＡを作製するために、トランスフェクションの前に、ＨＢＶゲノム配列をｐｓＨＢＶ−１ベクターに含まれる細菌プラスミド配列から切除する。複製応答能のあるｃＤＮＡを作製するために、当技術分野において公知のその他の方法を使用することもできる。これを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限消化することができる。消化完了後、希釈条件（２０ｇ／ｍｌ）下でライゲーションを行って分子間ライゲーションのほうを選択させる。次いで、総ライゲーション混合物を、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムを使用して濃縮する。ＨＢＶ及びＦＡＳ  ＲＮＡの両方に対してターゲットされるｓｉＮＡの有効性を試験するために、ＨＢＶプレ・ゲノムＲＮＡ及びＦＡＳ  ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡ二重鎖を、１２．５μｇ／ｍｌの脂質と共に２５ｎＭのＨＢＶゲノムＤＮＡを一度にＨｅｐ  Ｇ２細胞へ同時トランスフェクトし、その後の分泌されたＨＢＶ表面抗原のレベル（ＨＢｓＡｇ）をＥＬＩＳＡによって解析し、ＦＡＳ  ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって定量化する。
【実施例９】
【０３４５】
ＨＣＶ及びＦＡＳ  ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡコンストラクト
本明細書に記述した方法を使用して、多機能ｓｉＮＡコンストラクトをＨＣＶ及びＦＡＳ標的ＲＮＡ配列に対してデザインする。これらのｓｉＮＡコンストラクトは、いかなる相補性も共有しない両標的の直列配列を利用することができる（たとえば、図１及び２を参照されたい）。あるいは、ｓｉＮＡコンストラクトには、関心対象の標的核酸配列（たとえば、図３及び４を参照されたい）における相補的、回文構造配列又は反復配列（たとえば、本明細書において式ＩのＺ）の同定を利用することができる。一般に、これらの相補的な回文構造／反復配列は、約２〜約１２ヌクレオチドの長さを含むが、特定の多機能ｓｉＮＡコンストラクトに従って変更することができる。一つの例において、ＨＣＶ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の３’−末端に取り込まれ、かつＦＡＳ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の３’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ａ）。あるいは、ＨＣＶ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の５’−末端にて取り込まれ、ＦＡＳ受容体標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の５’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ｂ）。自己相補的な、回文構造又は反復配列が使用される場合、一般に、標的核酸配列において同定される反復が長くなるほど、生じるｓｉＮＡ配列は、短くなる。たとえば、それぞれの標的配列が、２１ヌクレオチドの長さであり、かつ配列中に反復が見いだされない場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば２１＋０＋２１＝４２ヌクレオチドの長さである。最初の２１ヌクレオチドは、第一の標的核酸配列に対して相補的な配列を表し、０は、自己相補的、回文構造又は反復配列の欠如を表し、及び第二の２１ヌクレオチドは、第二の標的核酸配列に対して相補的な配列を表す。２つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１９＋２＋１９＝４０ヌクレオチドの長さである。４つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１７＋４＋１７＝３８ヌクレオチドの長さである。６つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば１５＋６＋１５＝３６ヌクレオチドの長さである。８つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１３＋８＋１３＝３４ヌクレオチドの長さである。１０個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１１＋１０＋１１＝３２ヌクレオチドの長さである。１２個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば９＋１２＋９＝３０ヌクレオチドの長さであり、等々。従って、標的部位におけるそれぞれヌクレオチド減少に関しては、ｓｉＮＡ長は、２ヌクレオチドまで短くすることができる。これらと同じ原理は、１４〜２８ヌクレオチドを含む標的部位などの、異なる長さヌクレオチド配列を有する標的部位についても利用することができる。加えて、５’及び３’突出配列の種々の組み合わせ（たとえば、ＴＴ）をｓｉＮＡコンストラクトに導入して、自己相補な、回文構造又は反復配列をデザインすることができる。
【０３４６】
一つの例において、ＨＣＶ標的ＲＮＡ及びＦＡＳ標的ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡの有効性を試験するために、ＨＣＶレプリコン系を使用する。ＨＣＶ及びＦＡＳ  ＲＮＡの範囲及び／又はタンパク質阻害を決定するために、Ｈｕｈ７細胞（たとえば、Ｒａｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  １００，  ２３５−２４０を参照されたい）を使用する細胞培養において試薬を試験する。本明細書に記述したように、多機能ｓｉＮＡをＨＣＶ及びＦＡＳ核酸標的に対して選択する。非限定の例において、ＨＣＶ  ＲＮＡ及びＦＡＳ  ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡ配列は、表Ｖに示した配列を含む。ＲＮＡ阻害を、適切なトランスフェクション薬剤によってＨｕｈ７細胞にこれらの試薬を送達後に測定する。増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ７７００Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング））を用いて、アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を測定する。無関係標的に対して、又は同じ全体の長さ及び化学を有するがそれぞれの位置でランダムに置換されているランダム化ｓｉＮＡ対照に対して作製したオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して、比較を行う。標的に対して一次及び二次のリード試薬を選択し、最適化を行う。最適なトランスフェクション試薬濃度を選択した後、リード多機能ｓｉＮＡ分子を用いてＲＮＡの阻害の経時変化を測定する。さらに、細胞播種フォーマットを用いて、ＲＮＡ阻害を判定することができる。一般に、ｓｉＮＡ試薬は、Ｈｕｈ７細胞に２５ｎＭにてトランスフェクトし、ＨＣＶ  ＲＮＡ及びＦＡ  ＲＮＡは、未処置の細胞とトランスフェクション対照としてリポフェクトアミンをトランスフェクトした細胞（「ＬＦＡ２Ｋ）とを比較して定量化する。
【実施例１０】
【０３４７】
ＴＧＦ−ベータ及びＴＧＦ−ベータ受容体ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡコンストラクト
本明細書に記述した方法を使用して、多機能ｓｉＮＡコンストラクトをＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β受容体標的ＲＮＡ配列に対してデザインする。これらのｓｉＮＡコンストラクトは、いかなる相補性も共有しない両標的の直列配列を利用することができる（たとえば、図１及び２を参照されたい）。あるいは、ｓｉＮＡコンストラクトには、関心対象の標的核酸配列（たとえば、図３及び４を参照されたい）における相補的、回文構造配列又は反復配列（たとえば、本明細書において式ＩのＺ）の同定を利用することができる。一般に、これらの相補的な回文構造／反復配列は、約２〜約１２ヌクレオチドの長さを含むが、特定の多機能ｓｉＮＡコンストラクトに従って変更することができる。一つの例において、ＴＧＦ−β標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の３’−末端に取り込まれ、かつＴＧＦ−β受容体標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の３’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ａ）。あるいは、ＴＧＦ−β標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の５’−末端にて取り込まれ、ＴＧＦ−β受容体標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の５’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ｂ）。自己相補的な、回文構造又は反復配列が使用される場合、一般に、標的核酸配列において同定される反復が長くなるほど、生じるｓｉＮＡ配列は、短くなる。たとえば、それぞれの標的配列が、２１ヌクレオチドの長さであり、かつ配列中に反復が見いだされない場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば２１＋０＋２１＝４２ヌクレオチドの長さである。最初の２１ヌクレオチドは、第一の標的核酸配列に対して相補的な配列を表し、０は、自己相補的、回文構造又は反復配列の欠如を表し、及び第二の２１ヌクレオチドは、第二の標的核酸配列に対して相補的な配列を表す。２つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１９＋２＋１９＝４０ヌクレオチドの長さである。４つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１７＋４＋１７＝３８ヌクレオチドの長さである。６つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば１５＋６＋１５＝３６ヌクレオチドの長さである。８つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１３＋８＋１３＝３４ヌクレオチドの長さである。１０個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１１＋１０＋１１＝３２ヌクレオチドの長さである。１２個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば９＋１２＋９＝３０ヌクレオチドの長さであり、等々。従って、標的部位におけるそれぞれヌクレオチド減少に関しては、ｓｉＮＡ長は、２ヌクレオチドまで短くすることができる。これらと同じ原理は、１４〜２８ヌクレオチドを含む標的部位などの、異なる長さヌクレオチド配列を有する標的部位についても利用することができる。加えて、５’及び３’突出配列の種々の組み合わせ（たとえば、ＴＴ）をｓｉＮＡコンストラクトに導入して、自己相補な、回文構造又は反復配列をデザインすることができる。
【０３４８】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡをＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β受容体標的に対してデザインし、対応する化学逆位対照、及びトランスフェクション対照（ＬＦ２Ｋ）と一緒に未処置の細胞を使用して、活性が公知の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトと一緒に細胞培養実験においてスクリーニングする。非限定の例において、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β受容体を標的とする多機能ｓｉＮＡ配列には、表ＶＩに示した配列を含む。Ａ５４９細胞には、たとえばＴＧＦ−β部位１６９及びＴＧＦ−β受容体部位１２７を標的とする２５ｎＭ多機能ｓｉＮＡと複合を形成した０．２５μｇ／ウェルの脂質をトランスフェクトする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物の継続的存在において、細胞を２４時間３７°にてインキュベートする。２４時間にて、処置した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製する。最初に、トランスフェクション混合物と共に上清を除去して、放棄し、細胞を溶解して、それぞれのウェルからＲＮＡを調製する。ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β受容体ｍＲＮＡについて、及び規準化のための対照遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼ・サブユニット）について、処置後の標的遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価する。
【実施例１１】
【０３４９】
ＨＩＶ及び細胞ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡコンストラクト
本明細書に記述される方法を使用して、多機能ｓｉＮＡコンストラクトをＨＩＶ及び細胞標的ＲＮＡ配列に対してデザインする。ＨＩＶ標的の非限定の例は、ＨＩＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＨＩＶ−ＲＥＶ、ＨＩＶ−ＮＥＦ、ＨＩＶ−ＲＲＥ、ＨＩＶ−ＴＡＲ、ＨＩＶ−ＶＩＦ及びＨＩＶ−ＥＮＦを含む。細胞標的の非限定の例は、本明細書に記述したＣＤ４受容体、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３及びその他を含む。これらのｓｉＮＡコンストラクトは、いかなる相補性も共有しない両標的の直列配列を利用することができる（たとえば、図１及び２を参照されたい）。あるいは、ｓｉＮＡコンストラクトには、関心対象の標的核酸配列（たとえば、図３及び４を参照されたい）における相補的、回文構造配列又は反復配列（たとえば、本明細書において式ＩのＺ）の同定を利用することができる。一般に、これらの相補的な回文構造／反復配列は、約２〜約１２ヌクレオチドの長さを含むが、特定の多機能ｓｉＮＡコンストラクトに従って変更することができる。一つの例において、ＨＩＶ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の３’−末端に取り込まれ、かつ細胞標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の３’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ａ）。あるいは、ＨＩＶ標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第一の鎖の５’−末端にて取り込まれ、細胞標的核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、ｓｉＮＡ分子の第二の鎖の５’−末端に取り込まれる（たとえば、図１Ｂ）。自己相補的な、回文構造又は反復配列が使用される場合、一般に、標的核酸配列において同定される反復が長くなるほど、生じるｓｉＮＡ配列は、短くなる。たとえば、それぞれの標的配列が、２１ヌクレオチドの長さであり、かつ配列中に反復が見いだされない場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば２１＋０＋２１＝４２ヌクレオチドの長さである。最初の２１ヌクレオチドは、第一の標的核酸配列に対して相補的な配列を表し、０は、自己相補的、回文構造又は反復配列の欠如を表し、及び第二の２１ヌクレオチドは、第二の標的核酸配列に対して相補的な配列を表す。２つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１９＋２＋１９＝４０ヌクレオチドの長さである。４つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１７＋４＋１７＝３８ヌクレオチドの長さである。６つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば１５＋６＋１５＝３６ヌクレオチドの長さである。８つのヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１３＋８＋１３＝３４ヌクレオチドの長さである。１０個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば、１１＋１０＋１１＝３２ヌクレオチドの長さである。１２個のヌクレオチド反復が利用される場合、生じるｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば９＋１２＋９＝３０ヌクレオチ���の長さであり、等々。従って、標的部位におけるそれぞれヌクレオチド減少に関しては、ｓｉＮＡ長は、２ヌクレオチドまで短くすることができる。これらと同じ原理は、１４〜２８ヌクレオチドを含む標的部位などの、異なる長さヌクレオチド配列を有する標的部位についても利用することができる。加えて、５’及び３’突出配列の種々の組み合わせ（たとえば、ＴＴ）をｓｉＮＡコンストラクトに導入して、自己相補な、回文構造又は反復配列をデザインすることができる。
【０３５０】
一つの例において、多機能ｓｉＮＡをＨＩＶ及び細胞標的に対してデザインし、対応する化学逆位対照、及びトランスフェクション対照（ＬＦ２Ｋ）と一緒に未処置の細胞を使用して、活性が公知の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトと一緒に細胞培養実験においてスクリーニングする。抗ＨＩＶ活性を有する化合物をスクリーニングするために一般に当技術分野において公知であるとおり、本発明のｓｉＮＡコンストラクトは、種々の細胞培養系に使用することができる。Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ及び内皮細胞培養系は、本発明のｓｉＮＡ分子をスクリーニングする際に容易に適応することができる細胞培養系の非限定の例である。非限定の例において、本発明のｓｉＮＡ分子を、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９，  ５００−５０５によって記述されているように、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターで駆動される発現系を使用して、２９３／ＥｃＲ細胞にＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３プロウィルスＤＮＡを同時トランスフェクトする。
【０３５１】
非限定の例において、ｓｉＮＡ発現ベクターは、以下のとおりに、前記Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．に記述されたｐＴＺ  Ｕ６＋１ベクターを使用して調製する。一方のカセットは、第一のｓｉＮＡ鎖を収容し、他方のものは、第二のｓｉＮＡ鎖を収容する。これらの配列は、本明細書に記述した標的ＨＩＶ及び細胞ＲＮＡを標的とするようにデザインする。ｓｉＮＡメカニズムを検証するための対照として、ＨＩＶ及び細胞標的に対する相補性を欠いた無関係な配列をｐＴＺ  Ｕ６＋１にサブクローニングする。ＲＮＡ試料は、ｓｉＮＡ又は対照コンストラクトを一過性に同時トランスフェクトし、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ誘導に供した２９３／ＥｃＲ細胞から調製する。また、ＲＮＡは、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３プロウィルスＤＮＡ及びｓｉＮＡ又は対照コンストラクトを同時トランスフェクトした２９３細胞から調製する。ｓｉＮＡの抗ＨＩＶ活性の決定のために、上記のとおりにｓｉＮＡコンストラクト及び感染性ＨＩＶプロウィルスＤＮＡ、ｐＮＬ４−３を２９３細胞に同時トランスフェクションし、続いて当技術分野において公知のとおりにノーザン分析を行うことによって、一過性アッセイ法を行う。たとえば、ｐ２４値は、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５０００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を用いて算出される。また、細胞生存度は、トランスフェクションの４日後にトリパンブルー色素排除カウントを使用して評価することができる。
【０３５２】
抗ＨＩＶ活性を有する化合物をスクリーニングするためのその他の細胞培養モデル系は、一般に当技術分野において公知である。たとえば、Ｄｕｚｇｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２０（４−７），  ５１５−５２３；  Ｃａｇｎｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，  １０，  ２５１；  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  １３  ｓｕｐｐ  ３，  １００；及びＢａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｌｏｏｄ，  ８９，  ２２５９は、合成の及びベクター発現された本発明の多機能ｓｉＮＡ組成物、並びに本明細書に記述したアッセイ法の両方の用途に容易に適応することができる細胞培養系を記述する。
【実施例１２】
【０３５３】
動物モデル
当技術分野において公知であるように、インビボに多機能ｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングするために、種々の動物モデル、たとえば、酵素核酸分子（リボザイム）及び／又はアンチセンスなどのその他の核酸技術を評価するために使用される動物モデルを使用することができる。このような動物モデルは、本明細書に記述したｓｉＮＡ分子の有効性を試験するために使用される。非限定の例において、動物モデルを使用して、抗血管形成薬としてデザインされたｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることができる。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ（たとえば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３）又はＶＥＧＦＲ（たとえば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３）遺伝子の種々の組み合わせなどの血管形成及び／又は転移と関連する遺伝子に対して向けられた、ｓｉＮＡなどの本発明の核酸の抗血管形成効果を試験にするために利用できる利用できるいくつかの動物モデルがある。
【０３５４】
抗血管形成の薬剤のスクリーニングのために、いくつかの動物モデルが存在する。これらは、角膜傷害に続く角膜血管形成を含む（Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５  Ｃｏｒｎｅａ  ４：  ３５−４１；  Ｌｅｐｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｊ．  Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １０：  ２７３−２８０；  Ｏｒｍｅｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １３７：  １２４３−１２５２）、又は内角膜成長因子インプラント（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３６：  ２８２−２９１；  Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５前記；  Ｚｉｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６７：  ７１１−７１５）、成長因子を含むマトリゲルマトリックス内での血管増殖（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２前記）、ホルモン操作に続く雌性生殖器新血管新生（Ｓｈｗｅｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１：  ２２３５−２２４３）、高度に血管新生化された固形腫瘍における腫瘍成長の阻害を含むいくつかのモデル（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｃｅｌｌ  ７９：  ３１５−３２８；  Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓ．  Ｒｅｖ．  １２：  ３０３−３２４；  Ｔａｋａｈａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：  ４２３３−４２３７；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  、前記）及びマウス網膜における一過性低酸素で誘導される新血管新生（Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９２：  ９０５−９０９）を含む。
【０３５５】
眼の血管形成のモデル
Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．前記に記述された角膜モデルは、最も共通かつ十分に特徴づけられた、抗血管形成の薬剤有効性をスクリーニングするためのモデルである。このモデルには、血管が刺激薬（成長因子、熱又はアルカリやけど、内毒素）によって漸加される無血管組織を含む。角膜モデルは、ペレットのほうへ血管を漸加するためにＶＥＧＦ−Ｈｙｄｒｏｎ溶液に浸漬したテフロン・ペレットの基質内角膜移植を利用し、これを標準的な顕微鏡学的技術及び画像分析技術を使用して定量化することができる。これらの抗血管形成の有効性を評価するためには、核酸を局所的に眼に適用するか、又はＨｙｄｒｏｎ内でテフロン・ペレット自体に対して結合させる。この無血管角膜、並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（下記を参照されたい）は、低バックグラウンドアッセイを提供する。角膜モデルは、ウサギにおいて広範囲に行われてきたが、ラットにおける研究も行われてきた。
【０３５６】
マウス・モデル（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，前記）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、基底膜（Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）の抽出物又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスクを利用する非組織モデルであり、これらは注射の前に液体状態のる成長因子及び抗血管形成薬を含浸させることができる。体温における皮下投与により、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスクは、固体インプラントを形成する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスクに包埋されたＶＥＧＦを使用して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスクのマトリックス内で血管を漸加させ、これを内皮細胞特異的ｖＷＦ（第ＶＩＩＩ因子抗原）免疫組織化学、３色−マソン染色又はヘモグロビン含量のために、組織学的に加工する。角膜の様に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスクは、無血管であるが、これは、組織ではない。Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスク・モデルでは、核酸をＭａｔｒｉｇｅｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）フィルターディスクのマトリックス内で投与して、これらの抗血管形成の有効性を試験する。従って、このモデルでのる送達問題は、ラット角膜モデルでのペレットにするＨｙｄｒｏｎ−コーティングされたテフロンによる核酸の送達と同様に、それぞれのマトリックス内に核酸が均一に存在することにより、あまり問題を含まないであろう。
【０３５７】
加えて、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲ（たとえばＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３）を標的とする本発明のｓｉＮＡ分子により、の活性トランスジェニック・マウスを評価して、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲの調節が眼の新血管新生を阻害することができるかどうかを決定することができる。脈絡叢新血管新生の動物モデルは、たとえばＭｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １８８，  ２５３；  Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １５９，  ３１３；  Ｏｈｎｏ−Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １６０，  ７１１；及びＫｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ４１，  ３１５８に記載されている。ＶＥＧＦは、網膜新血管新生を生じさせる際に中心的役割を果たす。トランスジェニック・マウスの網膜光受容体におけるＶＥＧＦＲ２の発現増加は、網膜内における新血管新生を刺激し、ＶＥＧＦＲ２シグナリングの遮断は、網膜脈絡叢の新血管新生（ＣＮＶ）を阻害することが示された（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １８８，  ２５３）。
【０３５８】
ＣＮＶは、たとえば、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてレーザーで誘導される。また、マウスには、それぞれの眼に、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦｒ（たとえば、ＶＥＧＦＲ２）ｓｉＮＡの硝子体内、眼周囲、又は網膜下注射が投与される。硝子体内注射は、ハーヴァード・ポンプ微量注入装置及び引いたガラス・マイクロピペットを使用して行われる。次いで、マイクロピペットを硝子体腔に縁郭の直後の強膜を介して通す。網膜下注射は、解剖顕微鏡での集光レンズシステムを使用して行われる。次いで、ピペット先端を縁郭の後方、及び網膜より上に位置する強膜を介して通す。ベクター注射の５日後に、マウスを塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔して、また１％のトロピカミドを使用して瞳孔を拡大させて、ダイオードレーザー光凝固を使用してそれぞれの眼の３箇所にブルック膜を破裂させる。細隙灯送達系及び手持ち式カバー・スライドをレーザー光凝固術のために使用する。やけどは、９、１２、及び３時に、視覚神経から２〜３ディスク直径の位置に作製する（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，前記）。
【０３５９】
マウスは、典型的には、出生７日前に光受容体にＶＥＧＦの発現を開始することにより、網膜下の新血管新生を発生する。出生２１日前に、マウスを麻酔して、５０ｍｇ／ｍｌのフルオレッセイン標識したデキストランを含む１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水で灌流する。次いで、眼を取り除き、１０％のリン酸緩衝ホルマリン中に１時間置く。網膜を取り出して、蛍光顕微鏡によって調べる（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，前記）。
【０３６０】
レーザーで誘導したブルック膜の破裂の１４日後に、より小さなＣＮＶが出現する領域について、ｓｉＮＡの硝子体内及び網膜下注射を受けた眼を評価し、その一方で、大きなＣＮＶ領域について、対照眼を評価する。また、ｓｉＮＡの硝子体内注射又は網膜下注射を受けた眼では、ｓｉＮＡの注射を受けなかった眼と比較して、網膜外面の新血管新生及び網膜表面に到達しない深い網膜毛細血管からの潜在的発育不全発芽について、より狭い領域を評価する。
【０３６１】
血管形成の腫瘍モデル
マウス・モデルの使用
投与群１０あたり匹のマウス（それぞれ２０ｇ）を含む典型的な全身研究のためには、５用量（１４日の連続投与にわたって毎日１、３、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）を塩類溶液中に処方した約４００ｍｇのｓｉＲＮＡを使用する。若年成体ラット（２００ｇ）における同様の研究では、４ｇ以上必要である。平行した薬物動態学的研究では、同量のｓｉＲＮＡの使用を含み、さらにマウス・モデルの使用を正当化する。
【０３６２】
ルイス肺癌腫及びＢ−１６黒色腫マウス・モデル
核酸の全身有効性試験のための共通の動物モデルを同定することは、全身有効性についての有効なｓｉＮＡのスクリーニング方法である。
【０３６３】
ルイス肺癌腫及びＢ−１６マウス黒色腫モデルは、十分に認められた原発性及び転移性癌のモデルであり、抗癌剤の初期のスクリーニングのために使用されている。これらのマウス・モデルは、免疫不全マウスの使用に依存せず、比較的廉価であり、収納容器の問題が最小限になる。ルイス肺及びＢ−１６黒色腫モデルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、転移性の活動的腫瘍株からの約１０6腫瘍細胞の皮下移植を含む（ルイス肺行３ＬＬ又はＤ１２２（ＬＬｃ−ＬＮ７）；Ｂ−１６−ＢＬ６黒色腫）。あるいは、ルイス肺モデルは、腫瘍球（直径約０．８ｍｍ）の外科的移植によって作製することができる。また、転移は、静脈内に直接腫瘍細胞を注射することによってモデル化することができる。ルイス肺モデルでは、顕微鏡学的転移を移植後、約１４日に観察することができ、定量化可能な巨視的転移性腫瘍が２１〜２５日以内に発生する。Ｂ−１６黒色腫は、同様の時間経過を示し、腫瘍新血管新生が移植後、４日に開始する。原これらのモデルでは、発性及び転移性腫瘍が両方とも２１〜２５日後の同じ動物に存在するので、有効性の指標として複数の測定をとることができる。原発腫瘍体積及び増殖潜伏性、並びに微小もしくは巨視的転移性肺病巣の数又は転移を示す動物の数を定量化することができる。また、寿命のパーセント増加を測定することもできる。従って、これらのモデルは、全身投与されたｓｉＲＮＡ核酸及びｓｉＲＮＡ核酸製剤をスクリーニングするための適切な主要な有効性アッセイ法を提供する。
【０３６４】
ルイス肺及びＢ−１６黒色腫モデルでは、通常、腫瘍移植／接種の１〜７日後に、多種多様な薬剤での全身薬物療法を連続的又は複数投与処方計画で開始する。予想される薬力学的効果について、ｓｉＲＮＡの十分な組織レベルを達成することができるかどうか決定するために、同時に薬物動態学的研究を行うことができる。さらにまた、原発性腫瘍及び二次肺転位を除くことができ、種々のインビトロ研究（すなわち、標的ＲＮＡ減少）に供することができる。
【０３６５】
血管形成に関連した腎臓病のモデル
加えて、動物モデルは、常染色体優性の多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）の結果などの腎不全を治療する際の有効性について、化合物、たとえばｓｉＮＡ分子をスクリーニングする際にも有用である。Ｈａｎ：ＳＰＲＤラット・モデル、Ｐｋｄ２遺伝子にターゲットされた突然変異をもつマウス及び先天性多発性嚢胞腎（ｃｐｋ）マウスは、ヒトＡＤＰＫＤに密接に似通っており、血管形成などのＡＤＰＫＤを媒介した腎不全の病原性因子の１つ又は複数を妨害する可能性を有するｓｉＮＡコンストラクトの治療効果を評価するための動物モデルを提供する。血管形成は、嚢胞細胞の増殖のためのＡＤＰＫＤの進行に、並びに嚢胞への液分泌促進する血管透過性の増大に必要であろう。嚢胞細胞は、培養において可溶性血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を産生するので、嚢胞上皮増殖は、ＡＤＰＫＤの特色でもある。また、ＶＥＧＦｒ１は、嚢胞尿細管上皮細胞においても検出されたが、嚢胞腎又は正常腎臓の脈管構造の内皮細胞では、検出されなかった。ＶＥＧＦｒ２発現は、嚢胞血管内皮細胞において、及び腎虚血−再灌流の間に内皮細胞において増大される。抗ＶＥＧＦｒ１及び抗ＶＥＧＦｒ２  ｓｉＮＡ分子でのＶＥＧＦ受容体の阻害により、ＡＤＰＫＤにおけるシスト形成、腎不全及び死亡率を減少させることが提唱されている。従って、シスト形成に関与する血管形成を阻害するために、抗ＶＥＧＦｒ２  ｓｉＮＡ分子をデザインすることが考えられる。ＶＥＧＦｒ１が嚢胞上皮に存在し、嚢胞血管内皮に存在しないので、抗ＶＥＧＦｒ１  ｓｉＮＡ分子は、嚢胞上皮細胞増殖及びアポトーシスを減らして、次にシスト形成をより少なくすことが提唱される。さらに、嚢胞上皮細胞によって産生されるＶＥＧＦは、血管形成並びに上皮細胞増殖及びアポトーシスのための刺激のうちの１つであることが提唱される。Ｈａｎ：ＳＰＲＤラット（たとえば、Ｋａｓｐａｒｅｉｔ−Ｒｉｔｔｉｎｇｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １３９，  ６９３−６９６を参照されたい）、Ｐｋｄ２遺伝子にターゲットされた突然変異をもつマウス（Ｐｋｄ２−／−マウス、たとえばＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ２４，  ７５−７８を参照されたい）及びｃｐｋマウス（たとえば、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８，  ７５０−７５３を参照されたい）は、全てＶＥＧＦｒ１及びＶＥＧＦを媒介した腎不全に対する本発明のｓｉＮＡ  分子の有効性を研究するための動物モデルを提供する。
【０３６６】
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦｒ１、ＶＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦｒ３タンパク質レベルは、ＦＡＣＳ解析によって臨床的に、又は実験的に測定することができる。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦｒ１、ＶＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦｒ３をコードするｍＲＮＡレベルは、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ−保護、プライマー伸長解析及び／又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価される。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦｒ１、ＶＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦｒ３タンパク質をコードするｍＲＮＡをブロックし、従って、インビトロで２０％以上減少したレベルのＶＥＧＦ、ＶＥＧＦｒ１、ＶＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦｒ３活性を生じるｓｉＮＡ核酸を同定することができる。
【０３６７】
ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β受容体動物モデル
動物モデルにおいて抗ＴＧＦ−β及び／又はＴＧＦ−βＲ剤の有効性を評価することは、ヒト臨床試験に重要な必要条件である。以下の記述は、本発明によって想定される疾患及び状態の非限定の例のための動物モデルを提供する。
【０３６８】
糖尿病性腎障害
視床下部に全長レプチン受容体の変異型を発現するｄＢ／ｄＢマウスは、第２月齢において高血糖症を、４月齢まで顕性腎症を発症する２型糖尿病の遺伝的モデルである。さらなる動物モデルは、ストレプトゾトシン糖尿病患者ラット又はマウス、自発的糖尿病性ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇラット及び非肥満性糖尿病性マウスを含む。これらのモデルは、糖尿病性腎障害を治療する際の有効性について、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βＲを標的とする本発明の核酸分子を評価する際に有用である。
【０３６９】
慢性肝疾患
マウス又はラットにおける四塩化炭素で誘導される肝硬変モデルは、慢性肝疾患を研究する際の有用なモデルである。マウス・モデルでは、標準的な食餌療法を１２週にて開始し、少なくとも１０週間続ける。指標には、血清化学（肝酵素、直接型ビリルビン）、コラーゲン含量の形態解析を伴う組織病理評価及び肝臓ヒドロキシプロリン含量を含む。ラット・モデルにおいて、食餌療法は、６週にて開始して、１６週間まで続ける。主要な指標は、高い肝酵素プロフィール及び進行性線維症又は明らかな肝硬変の組織病理学的証拠である。フェノバルビタールは、誘導療法に添加することができ、肝酵素をアップレギュレートして、疾患状態のより迅速に誘導させる。疾患プロセスの進行をモニターするために、肝臓パネルを毎週行う。これらのモデルは、慢性肝疾患を治療する際の有効性について、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βＲを標的とする本発明の核酸分子を評価する際に有用である。
【０３７０】
肺線維症：
急性（１４日）ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）で誘導される肺傷害モデルは、マウスにおいて、及びラットにおいて利用できる。このモデルは、胚線維症を治療する際の有効性について、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βＲを標的とする本発明の核酸分子を評価する際に有用である。
【０３７１】
ＨＣＶ動物モデル
動物モデルにおける抗ＨＣＶ薬剤の有効性を評価することは、ヒト臨床試験に重要な必要条件である。ＨＣＶ感染について最も特徴づけられた動物系は、チンパンジーである。さらに、チンパンジー及びヒトにおいてＨＣＶ感染によって生じる慢性肝炎は、非常に似ている。臨床的に関連にもかかわらず、チンパンジーモデルでは、いくつかの実用的障害を受けて、このモデルを利用するのを困難にしている。これらには、高コスト、長いインキュベーション要求及び十分な量の動物の不足を含む。これらの要因のため、多くのグループが、Ｃ型慢性肝炎感染の齧歯類モデルを開発することを試みてきた。直接感染は可能性ではなかったが、いくつかのグループは、齧歯類への部分又は完全ＨＣＶゲノムの安定なトランスフェクションを報告した（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９５  ２２（３）：  ８４７−８５５；  Ｇａｌｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １９９５  １７２（１）：２５−３０；  Ｋｏｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９５  ７６（１２）３０３１−３０３８；  Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９７  ２５（３）：  ７１９−７２７；  Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｓｙｍｐ  １９９５  ２５：１４３０１４９；  Ｍａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９７  ７８（７）  １５２７−１５３１；  Ｔａｋｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９５  ２１（３）：７４６−７５１；  Ｋａｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９７  ２５（４）：  １０１４−１０２１）。加えて、免疫無防備状態のマウスへのＨＣＶ感染したヒト肝臓の移植術により、動物血液中でのＨＣＶ  ＲＮＡの検出を延長させた。
【０３７２】
インビボの動物モデルにおいてＣ型肝炎ウイルスを発現するための方法が開発されている（Ｖｉｅｒｌｉｎｇ、国際ＰＣＴ公開番号国際公開公報第９９／１６３０７号）。生存可能な、ＨＣＶ感染したヒト肝細胞をｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス宿主の肝実質に移植する。次いで、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス宿主を生存可能な状態で維持し、それによって生存可能な、形態学的に無処置のヒト肝細胞をドナー組織に持続し、Ｃ型肝炎ウイルスが持続しているヒト肝細胞において複製される。このモデルは、インビボにおける酵素核酸によるＨＣＶ阻害の研究のための有効な手段を提供する。
【０３７３】
ＨＩＶ動物モデル
動物モデルにおいて抗ＨＩＶ薬剤の有効性を評価することは、ヒト臨床試験に重要な必要条件である。本発明のｓｉＮＡコンストラクトは、たとえば中空繊維ＨＩＶモデル（たとえば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ、米国特許第５，６２７，０７０号を参照されたい）、ＣＤ４プロモーター及びエンハンサーからＨＩＶ−１遺伝子を発現するトランスジェニック・マウスを使用するＡＩＤＳのためのマウス・モデル（Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ、たとえば国際ＰＣＴ公開番号国際公開公報第９８／５０５３５号を参照されたい）及び／又はＨＩＶ／ＳＩＶ／ＳＨＩＶ非ヒト霊長動物モデル（たとえば、Ｎａｒａｙａｎ、米国特許第５，８４９，９９４号を参照されたい）を含む種々の動物モデルにおいて評価することができる。ｓｉＮＡ化合物及びウイルスは、本明細書に記述したとおり、及び当技術分野において公知のとおりに、種々の方法及び経路によって投与することができる。これらのモデルにおける結果の定量化は、定量的ＰＣＲ、定量的及び容積共培養アッセイ法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｂｕｌｋ  ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）、血漿共培養アッセイ法、抗原及び抗体検出アッセイ法、リンパ球増殖、細胞内サイトカイン、フローサイトメトリー、並びに血液学的及びＣＢＣ評価を含む、種々の方法によって行うことができる。さらなる動物モデルが、一般に当技術分野において公知であり、たとえばＢａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １，  ２４４を参照されたい。
【０３７４】
ＨＢＶ動物モデル
本発明のｓｉＮＡ分子を評価する際に有用なＨＢＶ動物モデルの非限定の例は、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第１０／７５７，８０３号及び米国特許出願第１０／６６９，８４１号に記述されており、参照により本明細書に援用される。
【実施例１３】
【０３７５】
指標
本発明のｓｉＮＡ分子は、遺伝子発現の調節を介して種々の疾患及び状態を治療するために使用することができる。本明細書に記述した方法を使用して、癌関連遺伝子、代謝病、ウイルス、細菌又は真菌の感染症などの感染症、神経疾患、筋骨格疾患、免疫系疾患、シグナリング経路及び細胞メッセンジャー関連疾患、並びに分子ポンプ及びチャンネルを含む輸送系関連疾患を含むが、これらに限定されるわけではない多くの標的遺伝子の発現を調節するために、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子をデザインすることができる。
【０３７６】
本発明のｓｉＮＡ分子を使用して標的とすることができる種々のウイルス遺伝子の非限定の例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、たとえばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｄ１１１６８、Ｄ５０４８３．１、Ｌ３８３１８及びＳ８２２２７）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１００３０８．１）、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５１１８８）、ヒト免疫不全症ウイルス２型（ＨＩＶ−２、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６０６６７）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１５６３）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１３４７）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１７８１）、インフルエンザウィルス（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３７４１２）、ライノウイルス（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ００２３９、Ｘ０２３１６、Ｘ０１０８７、Ｌ２４９１７、Ｍ１６２４８、Ｋ０２１２１、Ｘ０１０８７）、乳頭腫ウイルス（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１３５３）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１３４５）並びにＨＴＬＶ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ４３０４５８）及びＳＡＲＳ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４７１８）などのその他のウイルスを含む。多くのウイルスゲノムにおける高いシーケンス可変性のため、幅広い医療に適用するためには、ｓｉＮＡ分子の選択はウイルスゲノムの保存領域を含む可能性が大きい。ウイルスゲノムの保存領域の非限定例には、５’−非コード領域（ＮＣＲ）、３’−非コード領域（ＮＣＲ）及び／又は内部リボソ−ム導入部位（ＩＲＥＳ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。種々のウイルスゲノムの保存領域に対して設計されるｓｉＮＡ分子は、多様な患者集団のウイルス複製を効果的に抑制でき、ｓｉＮＡ分子の効果をウイルスゲノムの非保存領域内の突然変異のために進化するウイルス擬似種から守ることができる。
【０３７７】
本明細書に記述した方法を使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して標的とすることができるヒト遺伝子の非限定の例は、任意のヒトＲＮＡ配列、たとえばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって一般に参照されるものを含む。これらのＲＮＡ配列は、遺伝子発現を阻害し、従って、これらの遺伝子の発現と関連する疾患、状態又は感染を消失させるｓｉＮＡ分子をデザインするために使用することができる。本発明のｓｉＮＡ分子を使用して標的とすることができるヒト遺伝子のこのような非限定の例は、ＶＥＧＦ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６．３）、ＶＥＧＦｒ（ＶＥＧＦＲ１、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０６７７２３、ＶＥＧＦＲ２、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６３６５８）、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４（たとえば、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５２２８、ＮＭ＿００４４４８、ＮＭ＿００１９８２、及びＮＭ＿００５２３５）、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００３２１９）、テロメラーゼＲＮＡ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８６０４６）、ＮＦκＢ、Ｒｅｌ−Ａ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２２８）、ＮＯＧＯ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２０６９３）、ＮＯＧＯｒ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０１５６２０）、ＲＡＳ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４２８３）、ＲＡＦ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３３８８４）、ＣＤ２０（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０７２０３）、ＭＥＴＡＰ２（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３２１９）、ＣＬＣＡ１（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２８５）、ホスホランバン（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６６７）、ＰＴＰ１Ｂ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３１７２４）、ＰＣＮＡ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５９２．１）、ＰＫＣ−α（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２７３７）、及びその他を含む。本明細書に記述した遺伝子は、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して標的とすることができる遺伝子の非限定の例として提供される。このような遺伝子のさらなる例は、２００２年３月１１日に出願のＢｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第６０／３６３，１２４号にアクセッション番号によって記述されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０３７８】
また、本発明のｓｉＮＡ分子は、殺虫薬、抗ウイルス薬、及び抗真菌薬としての使用、又は油及びデンプン・プロフィール及びストレス耐性などの植物形質の調節を含む、ｓｉＮＡを使用して植物における内因性又は外来性の遺伝子発現を調節することを含む種々の農業適用に使用することができる。
【実施例１４】
【０３７９】
診断への使用
本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の応用において、例えば、臨床、工業、環境、農業及び／又は研究の設定において、種々の診断用途、例えば分子標的（例えばＲＮＡ）の同定に用いることができる。そのようなｓｉＮＡ分子の診断における使用は、再構成されたＲＮＡｉ系、例えば、細胞溶解物又は部分的に精製された細胞溶解物を利用することを含む。本発明のｓｉＮＡ分子を診断手段として使用し、疾患に罹患した細胞内の遺伝的浮動及び変異を検査するか、又は細胞において内因性の又は外来の（例えばウイルス）ＲＮＡの存在を検出することができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により、分子のいずれの領域においても、標的ＲＮＡの塩基対形成及び３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載される多機能ｓｉＮＡ分子を複数使用することにより、インビトロ並びに細胞及び組織におけるＲＮＡの構造及び機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ｓｉＮＡ分子による標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子の発現を阻害し、疾患又は感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を明らかにすることができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は、組み合わせ療法の可能性を提供することにより、疾患進行のよりよい治療につながるであろう（例えば、異なる遺伝子を標的とする多数の多機能ｓｉＮＡ分子、既知の小分子阻害剤と組み合わせたｓｉＮＡ分子、ｓｉＮＡ分子及び／又は他の化学的又は生物学的分子と組み合わせた間欠的治療）。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており、これには、疾患、感染又は関連する健康状態に伴うｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは、ｓｉＮＡ分子で処理した後、標準的な方法論、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して切断産物の存在を判定することにより検出する。
【０３８０】
特定の例においては、標的ＲＮＡの野生型又は変異型のみしか切断できないｓｉＮＡ分子をアッセイに使用する。第１のｓｉＮＡ分子（すなわち、野生型の標的ＲＮＡのみを切断するもの）を用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し、第２のｓｉＮＡ分子（すなわち、変異型の標的ＲＮＡのみを切断するもの）を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型及び変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のｓｉＮＡ分子で切断し、反応におけるｓｉＮＡ分子の相対効率及び”非標的”ＲＮＡ種を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は、試料集団中の野生型及び変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。したがって、それぞれの分析は２つのｓｉＮＡ分子、２つの基質、及び１つの未知の試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在を、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて確認し、各ＲＮＡの完全長及び切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現及び所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために、必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型（すなわち、疾患に関連するか又は感染に関連する）の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば、ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり、初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても、より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
【０３８１】
本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用される全ての参考文献は、それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に、本明細書の一部として引用される。
【０３８２】
当業者は、本発明が、その目的を実施し、記載される結果及び利点、並びに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法及び組成物は、現在のところ好ましい態様の代表的なものであり、例示的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更及び他の用途をなすであろう。
【０３８３】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に対して種々の置換及び改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち、そのような追加の態様は、本発明及び特許請求の範囲の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介する改良された活性を有する核酸コンストラクトを得るために本明細書に記載される化学的修飾の種々の組み合わせ及び／又は置換を試験することを当業者に教示する。そのような改良された活性は、改良された安定性、改良された生物利用性、及び／又はＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改良された活性化を含むことができる。したがって、本明細書に記載される特定の態様は限定ではなく、当業者は、改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を同定するために、過度の実験なしに本明細書に記載される修飾の特定の組み合わせを試験しうることを容易に理解することができる。
【０３８４】
本明細書に例示的に記載されている発明は、本明細書に特定的に開示されていない任意の要素又は限定なしでも適切に実施することができる。すなわち、例えば、本明細書における各例において「・・・を含む」、「・・・から本質的になる」及び「・・・からなる」という用語は、他の２つのいずれかと置き換えることができる。そのような用語及び表現の使用においては、示されかつ記載されている特徴又はその一部の均等物を排除することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち、好ましい実施形態及び任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが、当業者には本明細書に記載される概念の変更及び変種が可能であり、そのような変更及び変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０３８５】
さらに、発明の特徴及び態様がマーカッシュ群又は他の代替群の用語で記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群又は他の群の個々のメンバー又はサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【０３８６】
【表１】
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【０３８７】
【表２】
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【０３８８】
【表３】
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【０３８９】
【表４】
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【０３９０】
【表５】
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【０３９１】
【表６】
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【０３９２】
【表７】
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【０３９３】
【表８】
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【０３９４】
【表９】
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【０３９５】
【表１０】
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【０３９６】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０３９７】
【図１】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有する、多機能の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図２】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有する、単一のポリヌクレオチド配列を有する多機能の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図３】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有し、多機能ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、多機能の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図４】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有し、多機能ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、単一のポリヌクレオチド配列を有する多機能の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図５】多機能の本発明のｓｉＮＡ分子が、どのようにして、異なるタンパク質、例えばサイトカイン及び対応する受容体、異なるウイルス菌株、ウイルス及びウイルスの感染又は複製に関与する細胞タンパク質、又は疾患の維持又は進行に関与する共通の又は多様な生物学的経路に関与する異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の２つの個別の標的核酸分子を標的にするかの非限定的な例を示す図である。
【図６】多機能の本発明のｓｉＮＡ分子が、どのようにして、ＲＮＡの交互コード領域、ＲＮＡのコーディング及び非コーディング領域、又はＲＮＡの交互スプライス変異領域等の、同一標的核酸分子内の２つの個別の標的核酸配列を標的にするかの非限定的な例を示す図である。
【図７】本発明のｓｉＮＡ分子をデザインするための、人工自己相補的な、回文構造又は反復配列を作製するために利用することができる非ワトソン・クリック塩基対の非限定の例を示す。
【図８】ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提唱されるメカニズムの非限定的な例を示す図である。
【図９】例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる、種々の安定化化学（１−１０）の非限定的な例を示す図である。
【図１０】本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す図である。
【図１１】発現カセットを作製して二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトを生成するために用いられるスキームの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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