(57)【要約】  血液供給を生じる新しい組織の能力を特異的に防止するかもしくは抑制することにより、癌のような増殖性疾患と関連する病的プロセスを処置するためにＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストを使用する方法。本発明はさらに特に、血管新生を抑制するために有効な量の、少なくとも１つのＥＭＭＰＲＩＮタンパク質もしくはそのフラグメントに特異的な、特定の部分もしくはバリアントを包含する、ＥＭＭＰＲＩＮに対する抗体のようなＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストの使用によりそのような疾患を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における血管新生を抑制するのに有効な量のＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストを哺乳類に投与することを含んでなる処置を必要とする哺乳類における血管新生依存性疾患の処置方法。
【請求項２】
ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストがＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントである請求項１の方法。
【請求項３】
抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはその誘導体である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
モノクローナル抗体を静脈内に投与する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体を０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１２．０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与する請求項２に記載の方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体をボーラス用量で投与し、その後に該抗体を注入する請求項２に記載の方法。
【請求項７】
哺乳類がヒト患者である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血管新生依存性疾患が癌である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
血管新生依存性疾患が血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症、早産児網膜症、血管新生緑内障、血管新生により誘発される角膜疾患、初老期黄斑（ｉｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｕｌａ）、黄斑変性、翼状片、網膜変性、水晶体後線維増殖症、顆粒性結膜炎、乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、ざ瘡および関節炎よりなる群から選択される疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該血管新生依存性疾患が関節リウマチ、黄斑変性、乾癬、糖尿病性網膜症よりなる群から選択される炎症性疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該血管新生依存性疾患が乾癬、静脈性潰瘍、ざ瘡、酒さ、いぼ、湿疹、血管腫およびリンパ管形成よりなる群から選択される血管新生皮膚疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該血管新生依存性疾患が角膜もしくは網膜新血管形成に関する疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍の増殖を支える血管系の血管新生を抑制するのに有効な量のＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストを哺乳類に投与することを含んでなる抑制を必要とする哺乳類における腫瘍増殖の抑制方法。
【請求項１４】
腫瘍の増殖を支える血管系の血管新生を抑制するのに有効な量のＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを哺乳類に投与することを含んでなる防止を必要とする哺乳類における腫瘍増殖の防止方法。
【請求項１５】
哺乳類における転移を防止するのに有効な量のＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストを哺乳類に投与することを含んでなる防止を必要とする哺乳類における転移の防止方法。
【請求項１６】
ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストを第二の抗血管新生剤と組み合わせて投与する請求項１、２、１３、１４もしくは１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
第二の抗血管新生剤がアルファＶを含有する接着分子に特異的に結合することができるＭａｂである請求項１６の方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体が、ヒトＥＭＭＰＲＩＮへの結合に関してモノクローナル抗体ＣＤ１４７−ＲＤＩ／クローンＵＭ−８Ｄ６と競合する請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液供給を生じる増殖組織の能力を特異的に防止するかもしくは抑制することにより、癌のような増殖性疾患と関連する病的プロセスを処置するためにＥＭＭＰＲＩＮ（細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｒ））のアンタゴニストを使用する方法に関する。本発明は、さらに特に、血管新生を抑制するのに有効な量の、少なくとも１つのタンパク質もしくはそのフラグメントに特異的な、特定の部分もしくはバリアントを包含する、ＥＭＭＰＲＩＮに対する抗体のようなＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストの使用によりそのような疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＭＭＰＲＩＮ
血管新生は、新しい血管形成のプロセスである。成人において、血管新生は創傷治癒、月経および妊娠のような生理的条件下で局所的にそして一時的にのみ起こる。対照的に、過剰な血管新生は癌、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性失明、加齢性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬のような７０より多くの疾患症状において起こる。一方、不十分な血管新生は冠動脈疾患、卒中および遅延創傷治癒のような疾患の根底にある。
【０００３】
細胞外マトリックス成分の全てを切断することができる２０より多くのエンドペプチダーゼのファミリー、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、血管新生において重要な役割を果たす［非特許文献１］。血管新生は、腫瘍、炎症部位、もしくは他の病的症状を被る組織由来の血管新生刺激因子により活性化される毛細血管内皮細胞による血管基底膜の分解として始まる。活性化された内皮細胞は増加したＭＭＰを発現し、それらは次に、散在する内皮細胞がそれらの親血管から離れて遊走できるようにする。細胞が漏出した後にのみ、それらは様々な増殖因子に応答して増殖し、そして最終的に複雑な分化プロセスを経て新しい血管を形成する。ＭＭＰ−２もしくはＭＭＰ−９のようなＭＭＰの枯渇は、腫瘍血管新生の有意な抑制をもたらし、このプロセスにおけるＭＭＰの重要な役割を裏付ける［非特許文献２；非特許文献３］。
【０００４】
細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子（ＥＭＭＰＲＩＮ）（ＣＤ１４７としても知られている）は、元々は癌細胞の原形質膜から精製された５８ｋＤａの糖タンパク質であり、そして腫瘍間質線維芽細胞によるコラゲナーゼ−１（ＭＭＰ−１）合成を刺激するその能力のために腫瘍コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）と呼ばれた［非特許文献４；非特許文献５］。それはＭ６抗原およびヒトＢａｓｉｇｅｎと同一であることが示された（非特許文献６）。その後の研究により、ＥＭＭＰＲＩＮはまた、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ならびにＭＭＰ−２の内因性活性化因子として作用する膜１型ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ）およびＭＴ２−ＭＭＰの線維芽細胞合成も誘導することがさらに示された［非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９］。いくつかの臨床研究により、腫瘍組織におけるＥＭＭＰＲＩＮの発現レベルは腫瘍周辺間質組織におけるものより有意に高いことが示されている。これらの腫瘍には、肺［非特許文献１０］、乳房［非特許文献１０］、膀胱［非特許文献１１；非特許文献１２］および神経膠腫［非特許文献１３］が包含される。ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫染色を包含する様々な手段によるこれらの臨床サンプルにおけるＥＭＭＰＲＩＮ発現の検査により、ＥＭＭＰＲＩＮは腫瘍細胞により発現されるが、周辺の間質細胞により発現されないことが明らかになった。一方、ＭＭＰは腫瘍周辺間質細胞により発現される。腫瘍増殖および転移におけるＥＭＭＰＲＩＮの役割は、ＥＭＭＰＲＩＮを過剰発現するヒト乳癌細胞を用いて直接例証された。ＭＤＡ  ＭＢ  ４３６細胞は、それらをヌードマウスに移植した場合に通常はゆっくり増殖する細胞である。しかしながら、これらの細胞にＥＭＭＰＲＩＮをトランスフェクションすると、それらは加速された増殖速度および転移性表現型の両方を有して、より侵襲性の増殖パターンを取った［非特許文献１４］。
【０００５】
不適切な血管新生と関連する疾患
血管新生は新しい毛細血管を生成するプロセスであり、そしてそれは内皮細胞の活性化された増殖に起因する。新血管形成は厳重に調節され、そして胚発生、組織リモデリング、創傷治癒および黄体発生の定期的周期の間にのみ起こる（非特許文献１５）。
【０００６】
内皮細胞は、通常は体内の細胞の他のタイプよりはるかにゆっくりと増殖する。しかしながら、これらの細胞の増殖速度が調節されなくなる場合、病的血管新生が起こる可能性がある。病的血管新生は、多数の疾患に関与している。例えば、血管種、血管線維腫、血管変形、アテローム性動脈硬化症、癒着およびうっ血性硬化症のような心臓血管疾患；ならびに角膜移植後の新血管形成、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、血管新生角膜疾患、黄斑変性、翼状片、網膜変性、水晶体後線維増殖症および顆粒性結膜炎のような眼科疾患は、血管新生に関係する。関節炎のような慢性炎症性疾患；乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、静脈性潰瘍、ざ瘡、酒さ（酒さ性ざ瘡もしくは紅斑性）、いぼ（ゆうぜい）、湿疹、血管腫、リンパ管形成のような皮膚疾患もまた血管新生依存性である。
【０００７】
視力は、硝子体液に毛細管血液が浸潤する様々な眼疾患のために損なわれるかもしくは失われる可能性がある。糖尿病性網膜症は、非増殖性もしくは増殖性の２つの型のいずれかをとることができる。増殖性網膜症は、硝子体表面上で増殖するかもしくは硝子体腔中に広がる異常な新しい血管形成（新血管形成）を特徴とする。進行した疾患では、新生血管膜が生じ、けん引性網膜剥離をもたらす可能性がある。硝子体出血は、新血管形成に起因し得る。視覚症状は、様々である。硝子体内出血がある場合には突然の重度の視力喪失が起こる可能性がある。増殖性網膜症での視力の予後は、重度の網膜虚血、広範囲にわたる新血管形成もしくは広範囲にわたる線維組織形成と関連する場合にはより注意される。黄斑変性は、同様にドライおよびウェットの２つの型をとる。それほど一般的ではない滲出性黄斑変性（ウェット型）では、網膜内出血、網膜下液、色素上皮剥離および色素過剰と関連することが多い脈絡膜新血管形成の網膜下ネットワークの形成がある。最終的に、この複合体は収縮し、そして後極で目立つ隆起性瘢痕を残す。加齢性黄斑変性の両方の型は両側性であることが多く、そして黄斑領域におけるドルーゼが先行する。血管新生病因に関連する視力喪失の別の原因は、虹彩への損傷である。隅角（ａｎｇｌｅ）中に引き上げられている虹彩をもたらす２つの最も一般的な状況は、糖尿病もしくは網膜中心静脈閉塞症にかかっている患者での血管新生緑内障におけるような膜の収縮または虹彩を隅角中に引き上げるブトウ膜炎と関連する炎症性沈着物である（非特許文献１６）。
【０００８】
炎症性疾患の関節リウマチもまた、不適切な血管新生をもたらす。滑液腔における血管内皮細胞の増殖は、炎症性サイトカインにより活性化され、そして関節における軟骨破壊およびパンヌスでの置換をもたらす（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。
【０００９】
乾癬は、皮膚細胞の無制御増殖により引き起こされる。急速に増殖する細胞は十分な血管供給を必要とし、そして異常な血管新生が乾癬において誘導される（非特許文献２０）。
【００１０】
現在、腫瘍増殖および癌の進行は、腫瘍組織に栄養および酸素を提供するために、老廃物を運び去るために、そして遠隔部位への腫瘍細胞の転移のための導管の役割を果たすた
めに新しい血管の形成、血管新生を必要とするというかなりの証拠がある（非特許文献２１および非特許文献２２）。
【００１１】
多数の因子が、血管新生をもたらすプロセスおよび事象に関与している：細胞接着分子、インテグリン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＮＦアルファ、ｂＦＧＦ、ならびにＩＬ−６およびＩＬ−１２を包含するサイトカイン。例えば、近縁関係にあるが異なるインテグリンαＶβ３およびαＶβ５は、血管新生プロセスにおける独立した経路を媒介することが示されている。αＶβ３に対して作製された抗体は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）誘発性血管新生を阻止し、一方、αＶβ５に特異的な抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘発性血管新生を抑制した（非特許文献２３；非特許文献２４）。ＩＬ−６は血管新生を行っている組織において高められ、そしてヒト類表皮癌細胞系、Ａ４３１細胞においてＶＥＧＦを誘導することができる（非特許文献２５）。
【００１２】
従って、血管新生は、増殖しそして転移する腫瘍の能力、網膜症を包含する眼の疾患およびカポジ肉腫を包含する皮膚の疾患を包含する多数の病的症状における要因であることが既知である。多数の因子がこれらのプロセスと関連することが示されているが、ＥＭＭＰＲＩＮがＶＥＧＦ生産を直接刺激し、局所線維芽細胞に加えて、内皮細胞を刺激して、ＭＭＰを発現し、そしてその結果、腫瘍血管新生、増殖、浸潤および転移を促進することはこれまで示されていない。
【非特許文献１】Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅｓ  １９９９
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献３】Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献４】Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５
【非特許文献５】Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９
【非特許文献６】Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４３４，１９９５
【非特許文献７】Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献８】Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３
【非特許文献９】Ｓａｍｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００ｂ
【非特許文献１０】Ｐｏｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献１１】Ｊａｖａｄｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ｇｕｉｒｇｕｉｓ  １９９２
【非特許文献１２】Ｍｕｒａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３
【非特許文献１３】Ｓａｍｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００ａ
【非特許文献１４】Ｚｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１
【非特許文献１５】Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｔｒａｎ，Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１６，２０７−２４８（１９７６）
【非特許文献１６】Ｃｈ．９９．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  １７ｔｈ  Ｅｄ．１９９９
【非特許文献１７】Ｋｏｃｈ  ＡＫ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ  ＳＪ，Ａｒｔｈ；１５  Ｒｈｅｎｉｕｍ，２９，４７１−４７９（１９８６）
【非特許文献１８】Ｓｔｕｐａｃｋ  ＤＧ，Ｓｔｏｒｇａｒｄ  ＣＭ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  ＤＡ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３２，５７８−５８１（１９９９）
【非特許文献１９】Ｋｏｃｈ  ＡＫ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，４１，９５１  ９６２（１９９８）
【非特許文献２０】Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，５９，４０−４８（１９７２）
【非特許文献２１】Ｆｏｌｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２８５：１１８１−１１８６，１９７１
【非特許文献２２】Ｆｏｌｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３３３：１７５７−１７６３，１９９５
【非特許文献２３】Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２２７−１２３０（１９９９）
【非特許文献２４】Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１５００−１５０２（１９９５）
【非特許文献２５】Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７３６−７４１，１９９６
【発明の開示】
【００１３】
［発明の要約］
本発明は、異常な血管新生と関連する疾患症状における血管新生を抑制するために、少なくとも１つのＥＭＭＰＲＩＮタンパク質もしくはそのフラグメントに特異的な、ＥＭＭＰＲＩＮに対する抗体およびその特定の部分もしくはバリアントを包含する、ＥＭＭＰＲＩＮのアンタゴニストを使用する方法に関する。抗体のようなそのようなＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、用量に依存して、血管新生に関与する細胞である微小血管内皮細胞によるＭＭＰ発現をＥＭＭＰＲＩＮが刺激する能力を防止するそれらの能力によって作用することができる。第二に、そのようなアンタゴニストもしくは抗体は、局所環境におけるＶＥＧＦのＥＭＭＰＲＩＮ誘導を限定し、それにより組織の血管新生能力を下げることにより作用することができる。血管新生を妨げることにより、そのようなアンタゴニストは、血管新生と関連する事象を包含する癌組織の発生もしくは進行および癌の転移拡散と関連する事象を防止することができる。本発明のＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストの上記の作用に基づき、これらのアンタゴニストを抗血管新生ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストと最もうまく記述することができる。
【００１４】
従って、本発明によれば、我々は、ＥＭＭＰＲＩＮが用量に依存して、血管新生に関与する細胞である微小血管内皮細胞によるＭＭＰ−１発現を直接刺激できることを初めて示した。この刺激は、機能阻害抗ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体により特異的に抑制される。ＭＭＰは血管新生に必須であるので、そのようなＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、癌、糖尿病性失明、加齢性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬のような疾患の治療法として有用であることができる。
【００１５】
１つの態様として、ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、細胞によるＥＭＭＰＲＩＮの生産を防止することができる、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ分子。
【００１６】
特定の態様として、ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、ＥＭＭＰＲＩＮに特異的に結合する抗体である。そのような抗体の特別な利点は、それらがＥＭＭＰＲＩＮにその作用を全身的に防止するように結合できることである。従って、本発明の方法は、それらをヒトもしくは非ヒト患者における様々な形態の癌と関連する転移性病状の治療および予防処置に理想的に適しているようにする望ましい中和特性を有する抗体を用いる。従って、本発明は、血管新生を抑制するための中和ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の量を患者に投与することを含んでなるそのような処置を必要とする患者における血管新生に依存する疾患もしくは症状を処置する方法に関する。
【００１７】
本発明のＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニスト抗体の特に好ましい態様として、抗体はＣＮＴＯ１４６として知られており、そして組み換えＥＭＭＰＲＩＮで刺激された線維芽細胞におけるＭＭＰ−１生産を抑制すること、ならびに腫瘍細胞および線維芽細胞の共培養におけるＭＭＰ生産を抑制することを包含する、ＥＭＭＰＲＩＮに誘導されるＭＭＰ生産を抑制する際立った能力を有するＩｇＧ１ｋクラスのマウス抗ヒトＥＭＭＰＲＩＮである。
【００１８】
［発明の詳細な記述］
罹患組織における細胞により発現されるＥＭＭＰＲＩＮは、周辺内皮細胞を直接刺激し、それはＭＭＰ発現、すなわちＭＭＰ−１の増加をもたらす（図１を参照）。これらのＭＭＰは、次に、既存の血管の基底膜の分解を媒介し；内皮細胞を親血管から離れて遊走するように促進し；血管新生増殖因子の発現および放出を刺激し；内皮細胞が血管新生刺激因子に応答できるようにして細胞増殖をもたらし；そして内皮細胞分化および新しい血管の集合のための細胞外マトリックスのリモデリングを促進する。全てのこれらの変化は血管新生の増加をもたらし、そしてさらに全体的な疾患の進行の一因となる。
【００１９】
本発明の抗血管新生ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、それらが内皮細胞へのＥＭＭＰＲＩＮの刺激効果を阻止し、内皮細胞によるＶＥＧＦ生産を減らし、内皮細胞分裂を減らし、内皮細胞遊走を減らし、そして内皮細胞により分泌されるタンパク質分解酵素の活性を低下させる限りにおいて血管新生を抑制することおよび防止することにおいて有用である。様々な形態の充実性原発腫瘍および転移、眼の損傷ならびに皮膚の疾患を包含する多数の病変は、本発明の方法におけるＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストでの処置により改善される。
【００２０】
癌
とりわけ、頸癌、肛門癌および口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳／中枢神経系癌（例えば神経膠腫）、頭頸部癌、眼癌（ｅｙｅ）もしくは眼癌（ｏｃｕｌａｒ）、咽喉癌、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口腔／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、腎臓癌ならびにリンパ腫のような様々な癌を包含する、良性および悪性腫瘍の両方は、本発明の抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体を用いて処置することができる。さらに、とりわけ、神経線維腫症、結節硬化症（これらの症状の各々は、皮膚の良性腫瘍を生成する）、血管腫およびリンパ管形成のような症状は、本発明のＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストで効果的に処置することができる。
【００２１】
二次性腫瘍、転移は、体内のほかのどこかの原発部位に由来するが今や遠隔臓器に拡散している腫瘍である。転移の共通経路は、隣接構造への直接増殖、血管系もしくはリンパ系を通した拡散、ならびに例えば腹水もしくは脳脊髄液での組織平面および体腔に沿ったトラッキング（ｔｒａｃｋｉｎｇ）である。二次性肝臓腫瘍は、癌患者における最も一般的な死亡原因の１つであり、そして肝臓腫瘍の飛び抜けて最も一般的な形態である。事実上あらゆる悪性腫瘍は肝臓に転移することができるが、肝臓に転移する可能性が最も高い腫瘍には：胃、結腸および膵臓の癌；黒色腫；肺、中咽頭および膀胱の腫瘍；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫；乳房、卵巣および前立腺の腫瘍が包含される。二次性肺、脳および骨腫瘍は、進行期乳癌、前立腺癌および肺癌に共通している。あらゆる癌は骨に転移し得るが、癌腫からの転移が最も一般的である、特に乳房、肺、前立腺、腎臓および甲状腺において生じるもの。肺の癌腫は、肝臓、脳、副腎および骨への血行性転移拡散を非常に一般的に伴い、そして初期に起こり、明らかな肺の症状の前にそれらの部位で症状をもたらし得る。肺への転移は、乳房、結腸、前立腺、腎臓、甲状腺、胃、頸部、直腸、精巣および骨の原発癌からそして黒色腫から一般的である。上記に挙げた二次性腫瘍のそれぞれは、本発明の抗体により処置することができる。
【００２２】
腫瘍に加えて、血管の異常増殖を特徴とする多数の他の非腫瘍形成性血管新生依存性疾患もまた、本発明の抗血管新生ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストで処置することができる。
【００２３】
そのような非腫瘍形成性血管新生依存性疾患の代表例には、角膜新血管形成、肥厚性瘢
痕およびケロイド、増殖性糖尿病性網膜症、関節リウマチ、動静脈奇形（上記に説明する）、アテローム硬化性プラーク、遅延創傷治癒、血友病関節、癒着不能骨折、オスラー・ウェーバー症候群、乾癬、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、月経過多（上記に説明する）ならびに血管接着が包含される。
【００２４】
眼の血管新生症状
角膜は、血管を通常は欠く組織である。しかしながら、ある種の病的症状において、毛細血管は縁の角膜周囲血管叢から角膜に侵入し得る。角膜が血管化されると、それはまた白濁もし、患者の視力の低下をもたらす。角膜が完全に混濁する場合に視力喪失は完全になり得る。
【００２５】
血管は、新血管形成を誘導するプロセスにより、様々なパターンおよび深さで角膜に侵入することができる。これらのパターンは、以下のタイプ：トラコーマ性パンヌス、らい性パンヌス（ｐａｎｎｕｓ  ｌｅｐｒｏｓｕｓ）、フリクテン性パンヌス、変性性パンヌス（ｐａｎｎｕｓ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｕｓ）および緑内障性パンヌス（ｇｌｕｃｏｍａｔｏｕｓ  ｐａｎｎｕｓ）において眼科医により伝統的に定義されている。角膜実質はまた、前毛様体動脈の枝が侵入する可能性もあり（間質新血管形成と呼ばれる）、それはいくつかの異なった臨床病変：末端ループ、「ブラシ様」パターン、繖形形態（ｕｍｂｅｌ  ｆｏｒｍ）、格子形態、間質アーケード（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ａｒｃａｄｅｓ）（上強膜血管から）、および異常な不規則な血管を引き起こす。
【００２６】
角膜新血管形成は、角膜潰瘍に起因し得る。例えば角膜感染（トラコーマ、単純ヘルペス性角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（移植片拒絶およびスティーブンス・ジョンソン症候群）、アルカリによるやけど、外傷、炎症（任意の原因の）、中毒およびビタミンＡもしくはタンパク質欠乏症状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症としてを包含する多種多様な病因が、角膜潰瘍を引き起こす可能性がある。
【００２７】
角膜新血管形成の原因は異なり得るが、損傷への角膜の応答およびその後の血管内部成長は、原因にかかわらず同様である。いくつかの血管新生因子がこのプロセスに関与していると思われ、それらの多くは炎症応答の産物である。実際に角膜の新血管形成は、炎症細胞浸潤物と関連してのみ起こるようであり、そして血管新生の程度は炎症反応の程度に比例する。角膜浮腫は、それを通して毛細血管が成長する角膜実質フレームワークを緩めることにより血管内部成長をさらに促進する。
【００２８】
ＥＭＭＰＲＩＮ抗体での局所治療はまた、血管新生応答を誘導する高い可能性を有することが知られている角膜損傷（化学的熱傷のような）において予防的に有用であることもできる。これらの場合、処置は、おそらくステロイドと組み合わせて、その後の合併症を防ぐのに役立つように即座に行われることができる。
【００２９】
そのような方法はまた、移植された角膜の毛細血管侵入を防ぐために同様に利用することもできる。ステロイドと組み合わせた使用もまた意図される。
【００３０】
血管新生緑内障は、新しい毛細血管が眼の虹彩に発生する病的症状である。血管新生は、瞳孔辺縁に位置する血管に通常は由来し、そして虹彩の基部を越えて小柱網に進む。線維芽細胞および他の結合組織要素は毛細血管成長と関連し、そして線維性血管膜が生じ、それは虹彩の前面を越えて広がり、最終的に瘢痕を形成する。瘢痕形成は房水の適切な排水を妨げ、眼圧の増加をもたらし、それは失明をもたらす可能性がある。
【００３１】
血管新生緑内障は、網膜虚血が顕著である疾患の合併症として一般に起こる。特に、こ
の疾患にかかっている患者の約１／３は糖尿病性網膜症にかかっている。他の原因には、慢性網膜剥離、末期の緑内障、頸動脈閉塞性疾患、水晶体後線維増殖症、鎌状赤血球貧血、眼内腫瘍および頸動脈海綿静脈洞瘻が包含される。
【００３２】
皮膚の血管新生症状
本発明の別の態様内で、肥厚性瘢痕もしくはケロイドに上記の抗血管新生組成物の１つを投与する段階を含んでなる、肥厚性瘢痕およびケロイドを処置する方法が提供される。
【００３３】
創傷の治癒および瘢痕形成は、３段階：炎症、増殖および成熟で起こる。第一段階の炎症は、組織損傷および血管漏出を引き起こすほど重度である損傷に応答して起こる。３〜４日続くこの段階の間に、血液および組織液は接着性凝塊およびフィブリン網を形成し、それは一緒に創傷表面に結合する働きをする。次に、この後に増殖段階が続き、ここで、創傷端からの毛細血管および結合組織の内部成長、ならびに皮膚欠損の閉鎖がある。最後に、いったん毛細血管および線維芽細胞の増殖が止まると、成熟プロセスが始まり、ここで、瘢痕は収縮し、そして細胞がより少なくなり（ｌｅｓｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ）、血管がより少なくなり（ｌｅｓｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ）、そして平らで白色に見える。この最終段階は、６〜１２ヶ月の間かかる可能性がある。
【００３４】
創傷部位での結合組織の過剰生産は、引き続き細胞性のそしておそらく赤色で隆起した瘢痕が形成されるようにする。瘢痕が元の創傷の境界内にとどまる場合、それは肥厚性瘢痕と呼ばれるが、それが元の瘢痕を越えて周辺組織に広がる場合、該損傷はケロイドと呼ばれる。肥厚性瘢痕およびケロイドは、瘢痕形成の第二および第三段階の間に生成される。熱傷、開放創および感染創を包含するいくつかの創傷は、過剰な内皮および線維芽細胞増殖を特に起こしやすい。肥厚性瘢痕では、ある程度の成熟が起こり、そして穏やかな改善が起こる。しかしながら、ケロイドの場合には、実際の腫瘍が生成され、それはかなり大きくなり得る。そのような場合における自然な改善はまれにしか起こらない。従って、そのような症状における血管新生を抑制するための本発明の方法における抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の投与は、そのようなケロイド瘢痕の形成を抑制することができる。
【００３５】
ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストとの抗血管新生組み合わせ
血管新生は、平滑筋および内皮細胞の浸潤、遊走および増殖を特徴とする。αｖβ３インテグリン（ビトロネクチン受容体としても知られている）は、腫瘍転移、充実性腫瘍増殖（新形成）、骨粗鬆症、パジェット病、悪性の体液性高カルシウム血症、腫瘍血管新生を包含する血管新生、黄斑変性を包含する網膜症、関節リウマチを包含する関節炎、歯周病、乾癬および平滑筋細胞遊走（例えば再狭窄）を包含する様々な症状もしくは病状において役割を果たすことが知られている。
【００３６】
接着受容体インテグリンαｖβ３は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンビルブラント因子、ラミニン、トロンボスポンジンおよび他の同様のリガンドに結合する。それは、ニワトリおよびヒトにおける血管新生血管のマーカーとして同定され、そして血管新生もしくは新血管形成において重要な役割を果たす。αｖβ３のアンタゴニストは、新生血管系における細胞のアポトーシスを選択的に促進することによりこのプロセスを抑制する。従って、αｖβ３アンタゴニストは、新血管形成と関連するそのような症状を処置するための有用な治療標的である（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６４，（１９９４），５６９−５７１）。さらに、腫瘍細胞浸潤は、３段階プロセス：１）細胞外マトリックスへの腫瘍細胞接着；２）マトリックスのタンパク質分解溶解；および３）溶解したバリアを通した細胞の移動により起こる。このプロセスは繰り返し起こることができ、そして元の腫瘍からの遠隔部位での転移をもたらすことができる。αｖβ３インテグリンは、腫瘍細胞浸潤ならびに血管新生において役割を果たすことが示されている。
【００３７】
αｖβ３のアンタゴニストおよび中和抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は両方とも新生血管系を標的とするが、異なる機序によって作用するので、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体と抗インテグリン抗体との組み合わせは、正常組織毒性をほとんど有さずに特に強力でかつ有効な組み合わせ治療をもたらすはずである。従って、本発明の１つの態様として、そのような処置を必要とする患者における血管新生を抑制するためにインテグリンアンタゴニストおよび抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の組み合わせを投与することを含んでなる血管新生と関連する疾患もしくは症状を処置する方法が提供される。インテグリンもしくはインテグリンサブユニットに選択的に結合する他の抗体、特にアルファＶサブユニットに結合するものは、米国特許５，９８５，２７８および６，１６０，０９９に開示される。トリペプチドアルギニニル−グリシル−アスパルテート（ＲＧＤ）を含有するその天然リガンドへのアルファＶベータ３の結合を阻害するＭａｂは、ＵＳ５，７６６，５９１およびＷＯ００７８８１５に開示される。
【００３８】
抗体の好ましい組み合わせは、出願者の同時係属出願ＵＳ第０９／０９２，０２６号に記述されている抗アルファＶベータ３および抗アルファＶベータ５  Ｍａｂと本明細書に開示されるような抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である。先行出願の両方とも本願に引用することにより組み込まれ、そしてその開示の一部をなす。本発明によれば、サリドマイドのような他の既知の抗血管新生剤もまた、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体と組み合わせて用いることができる。
【００３９】
抗血管新生活性を評価する方法
血管新生、従って抗血管新生剤の広く受け入れられている機能アッセイは、ニワトリ絨毛尿膜アッセイ（ＣＡＭ）アッセイおよび新血管形成の角膜ミクロポケットアッセイである。
【００４０】
ＣＡＭアッセイでは、受精したニワトリ胚を３（もしくは４）日目にそれらの殻から取り除き、そして高湿度および５％ＣＯ２中でペトリ皿においてインキュベーションする。６日目に、試験物質を含有するメチルセルロースディスク（１０ｍｉｃｒｏＬ）を絨毛尿膜上に移植する。胚を４８時間後に調べ、そして透明な無血管帯がメチルセルロースディスクの周りに現れる場合、その帯の直径を測定する。帯が大きくなるほど、抗体はより効果的である。血管が組織切片における無血管帯の端近くで目に見えるようにホルマリン固定の直前にいくつかの胚の心臓に墨汁を注入することができる。絨毛尿膜の組織横断面を調べて試験物質が毛細血管の正常な発生を妨げるかどうかを決定する。引用することにより本明細書に同様に特に組み込まれる米国特許第５，００１，１１６号に記述されるこの方法は、抗血管新生化合物もしくは化合物の組み合わせの選択において該試験が有用であることを示した。
【００４１】
新血管形成の角膜ミクロポケットアッセイは、ラットもしくはウサギ角膜を用いて実施することができる。このインビボモデルは、多数の総説およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−３２８のような文献に記述されているように、臨床効果を一般に予測するとして広く受け入れられている。
【００４２】
簡潔に言えば、組み換えｂＦＧＦ（Ｔａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ−Ｊａｐａｎ）を含有するプラグもしくはペレットを麻酔したメスのニュージーランド白ウサギの各眼の角膜ミクロポケットに移植し（縁から２ｍｍ）、続いて角膜の表面上にエリスロマイシン軟膏を局所使用する。動物に試験化合物を投与し、そして角膜専門家が１日おきに細隙灯で調べる。様々な数学モデルを利用して血管形成角膜の量を決定し、そしてこの式は、ペレットに向かって成長する新血管形成の一群の領域の最も正確な概算を与えることが見出された。
【００４３】
該方法はまた、ラットを用いて実施することもできる。
【００４４】
本発明において、角膜ミクロポケットアッセイは、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の抗血管新生効果を示すために用いることができる。これは、角膜内の血管の数の一貫して認められそして好ましくは顕著な減少により示されるような、血管新生の有意な減少により明らかである。
【００４５】
内皮および非内皮細胞増殖
どの細胞タイプが腫瘍新血管形成に特異的な血管新生プロセスに関与しているかを立証することは重要である。腫瘍血管は一般に原始的であり、すなわち、内皮細胞のみを含有する。より成熟した血管に存在する他の細胞タイプには：平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞、線維芽細胞および上皮細胞、ならびに血管内皮腫細胞もしくは癌細胞のような腫瘍細胞が包含される。内皮細胞増殖を特異的に抑制する血管新生インヒビターの一例は、ＡＮＧＩＯＳＴＡＴＩＮＲタンパク質（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  上記）である。
【００４６】
様々な代表的な細胞系が試験に利用可能である。ウシ大動脈平滑筋（ＳＭＣ）、ウシ網膜色素上皮（ＲＰＥ）、ミンク肺上皮（ＭＬＥ）、ルイス肺癌（ＬＬＣ）およびＥＯＭＡ血管内皮腫細胞ならびに３Ｔ３線維芽細胞。増殖アッセイでは、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシンの０．０５％溶液に分散させる。細胞増殖アッセイの最適条件は、各々の異なる細胞タイプについて設定されている。一般に、細胞をトリプシン処理し、そしてＥＭＭＰＲＩＮおよび抗ＥＭＭＰＲＩＮ中和Ｍａｂの存在下および不在下で増殖培地に再接種する。約７２時間後に、テトラゾリウム色素のような生体染色を用いることによりもしくはＬＤＨ放出（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によりもしくは個々の細胞計数により細胞数の変化を評価する。
【００４７】
ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニスト
本明細書において用いる場合、「ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニスト」という用語は、ＥＭＭＰＲＩＮの血管新生活性を抑制するかもしくは中和する物質をさす。そのようなアンタゴニストは、様々な方法でこの効果を成し遂げる。ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストの１つのクラスは、ＥＭＭＰＲＩＮの血管新生作用を中和するために十分な親和性および特異性を有してＥＭＭＰＲＩＮタンパク質に結合する。このクラスの分子に含まれるのは、抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）もしくはＦ（ａｂ’）２分子のような）である。別のクラスのＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、ＥＭＭＰＲＩＮもしくはＥＭＭＰＲＩＮ結合相手に結合しそれによりＥＭＭＰＲＩＮの血管新生活性を抑制する、ＥＭＭＰＲＩＮタンパク質のフラグメント、突然変異タンパク質もしくは小有機分子、すなわち、ペプチド模倣物である。ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストは、それがＥＭＭＰＲＩＮ血管新生活性を抑制する物質である限りこれらのクラスの任意のものであることができる。ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストには、ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、ＥＭＭＰＲＩＮ受容体抗体、改変されたＥＭＭＰＲＩＮ、アンチセンスＥＭＰＲＩＮおよびＥＭＭＰＲＩＮもしくはＥＭＭＰＲＩＮＲの部分ペプチドが包含される。
【００４８】
抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体
ＴＮＦアルファのような、炎症および腫瘍増殖を媒介する可溶性因子に対する中和抗体は、非常に有効な治療法であると判明している。Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡにより販売される抗ＴＮＦアルファＭａｂ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（インフリキシマブ）はＲＡおよびクローン病に処方され、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，ＣＡにより販売される抗ＣＤ２０  Ｍａｂ、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）はＢ細胞リンパ腫を処置するために使用される。「中和」Ｍａｂはそれらの標的に結合するだけでなく、通常はそのコグネイト細胞表面受容体とのその相互作用を妨げることにより、その生物活性も抑制する。ある場合には、標的タンパク質は１つより多くの活性ドメインを含んでなり、そして１つより多くのリガンドもしくは受容体への結合のために多数の作用を示す。ＥＭＭＰＲＩＮはそのような分子であり、そして分子の細胞外部分に２つの免疫グロブリン様ドメイン、ベイシジンアイソフォーム２（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９４０９９１）ドメインのａａ２２〜１０３からのＩｇ様Ｃ２タイプドメインおよび同じアイソフォームの１０５〜１９９でＩｇ様Ｖタイプドメインを示す（Ｂｉｓｗａｓ，Ｚｈａｎｇ，ＤｅＣａｓｔｒｏ，Ｇｕｏ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｎａｂｅｓｈｉｍａ，（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：４３４−９）。癌細胞からのＥＭＭＰＲＩＮに対して作製されたモノクローナル抗体は、線維芽細胞におけるＥＭＭＰＲＩＮに誘導されるＭＭＰ生産を抑制することができ、中和活性を示す（Ｅｌｌｉｓ，Ｎａｂｅｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｂｉｓｗａｓ，（１９８９），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：３３８５−９１）。これらの抗体は、Ｃ２タイプドメイン内に位置する領域３４〜９９においてＥＭＭＰＲＩＮに結合することがその後に示された。対照的に、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞系（Ｔ−ＡＬＬ）ＣＥＭで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて作製されたＣＢＬ１、マウスＩｇＭ、抗ヒトリンパ芽球モノクローナル抗体。後者のＭａｂは、移植片対宿主病にかかっている患者において臨床的に試験されている（Ｈｅｓｌｏｐ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｌａｎｃｅｔ  ３４６：８０５−８０６）。ＷＯ９９４５０３１は、ＣＢＬ１と同様の活性を有する抗体が、ＲＶＳＲ（ＮＰ＿９４０９９１の残基２０１〜２０４）である、ＶタイプドメインよりＣ末端の領域に位置する共通結合配列を共有し、そしてＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインに対して作製された一団のＭＡｂのうちＭ−６／６と呼ばれるもののみがＯＫＴ３に誘導されるＴ細胞活性化を抑制することができ、そしてＣ２タイプドメインにおける領域に結合することを教示する（Ｋｏｃｈ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７７７−７８６；Ｓｔａｆｆｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１７０７−１７１４）。従って、スクリーニング手段としてインビトロアッセイの特定のセットを用いることにより独自に抗血管新生の抗ＥＭＭＰＲＩＮ  Ｍａｂの選択を成し遂げることができる。
【００４９】
抗血管新生ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストである当該技術分野において既知である抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体のいずれも、本発明の方法において用いることができる。ＥＭＭＰＲＩＮに対するマウスモノクローナル抗体は、例えば、Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８９  上記およびＫｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：７７７−７８６におけるように既知である。
【００５０】
従って、本明細書において用いる場合、「ＥＭＭＰＲＩＮ抗体」、「抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体」、「抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体部分」もしくは「抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体フラグメント」および／または「抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体バリアント」などには、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはその任意の部分のようなしかしこれらに限定されるものではない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、あるいは本発明において使用する抗体に導入することができる、ＥＭＭＰＲＩＮタンパク質もしくはペプチド由来のＥＭＭＰＲＩＮ結合タンパク質の少なくとも一部を含んでなる分子を含有する任意のタンパク質もしくはポリペプチドが包含される。そのような抗体は場合によりさらに、インビトロ、ｉｎ  ｓｉｔｕそして／もしくはインビボで、そのような抗体がＥＭＭＰＲＩＮ血管新生活性を調節し、減少し、増加し、中和し、作用し、軽減し、緩和し、阻止し、抑制し、取り消し、そして／もしくは妨げるようなしかしこれらに限定されるものではない、特定のリガンドに影響を及ぼしてもよい。限定されない例として、本発明の適当な抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、特定の部分もしくはバリアントは、少なくとも１つのＥＭＭＰＲＩＮタンパク質もしくはペプチド、またはその特定の部分、バリアントもしくはドメインに結合することができる。適当な抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、特定の部分
もしくはバリアントは、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質合成、ＥＭＭＰＲＩＮ放出、ＥＭＭＰＲＩＮ受容体シグナル伝達、ＥＭＭＰＲＩＮ受容体結合、ＥＭＭＰＲＩＮ生産および／もしくは合成のようなしかしこれらに限定されるものではない、様々な方法でＥＭＭＰＲＩＮ血管新生機能に影響を与える。「抗体」という用語にはさらに、一本鎖抗体およびそのフラグメントを包含する、抗体模倣物を包含するあるいは抗体またはその特定のフラグメントもしくは部分の構造および／もしくは機能を模倣する抗体の部分を含んでなる、抗体、その消化フラグメント、特定の部分およびバリアントが包含されるものとする。機能性フラグメントには、哺乳類ＥＭＭＰＲＩＮに結合する抗原結合フラグメントが包含される。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化および部分還元による）およびＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシンもしくはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分還元および再集合による）、ＦｖもしくはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学技術による）フラグメントが包含されるがこれらに限定されるものではない、ＥＭＭＰＲＩＮもしくはその一部に結合することができる抗体フラグメントは、本発明により包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記を参照）。
【００５１】
そのようなフラグメントは、当該技術分野において既知であるようにそして／もしくは本明細書に記述されているように、酵素切断、合成もしくは組み換え技術により製造することができる。抗体はまた、１つもしくはそれ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて様々な切断形態で製造することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／もしくはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の様々な部分は、通常の技術により化学的に一緒に連結することができ、もしくは遺伝子工学技術を用いて連続したタンパク質として製造することができる。
【００５２】
抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、霊長類、げっ歯類もしくはヒト抗体またはキメラもしくはヒト化抗体であることができる。本明細書において用いる場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的にあらゆる部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、わずかな配列変化もしくはバリエーションのみを有して、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体をさす。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど）および他の哺乳類と指定される抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科特異的抗体を示す。さらに、本発明のキメラ抗体は、上記の任意の組み合わせを含むことができる。そのような変化もしくはバリエーションは、場合によりそして好ましくは、非改変抗体に対してヒトもしくは他の種における免疫原性を保持するかもしくは減少する。従って、ヒト抗体は、キメラもしくはヒト化抗体と異なる。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／もしくは軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核もしくは真核細胞により製造できることが指摘される。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、それは天然のヒト抗体に存在しないリンカーペプチドを含んでなることができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域を連結する、２〜約８個のグリシンもしくは他のアミノ酸残基のような、リンカーペプチドを含んでなることができる。そのようなリンカーペプチドは、ヒト由来のものであると考えられる。
【００５３】
少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルの、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である二重特異性、異種特異性、ヘテロコンジュゲートもしくは同様の抗体もまた用いることができる。本発明の場合、結合特異性の一方は少なくとも１つのＥＭＭＰＲＩＮタンパク質に対してであり、もう一方は任意の他の抗原に対してである。二重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野において既知である。伝統的に、
二重特異性抗体の組み換え製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、ここで、２本の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、これらのうち１種のみが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われる、正しい分子の精製はかなり面倒であり、そして生成物収率は低い。同様の方法は、例えば、各々引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、ＷＯ９３／０８８２９、米国特許第６２１０６６８号、第６１９３９６７号、第６１３２９９２号、第６１０６８３３号、第６０６０２８５号、第６０３７４５３号、第６０１０９０２号、第５９８９５３０号、第５９５９０８４号、第５９５９０８３号、第５９３２４４８号、第５８３３９８５号、第５８２１３３３号、第５８０７７０６号、第５６４３７５９号、第５６０１８１９号、第５５８２９９６号、第５４９６５４９号、第４６７６９８０号、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、ＥＰ０３０８９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）に開示される。
【００５４】
本発明の方法および組成物において有用な抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、場合により、ＥＭＭＰＲＩＮへの高親和性結合および場合によりそして好ましくは低い毒性を有することを特徴とすることができる。特に、可変領域、定常領域およびフレームワークのような個々の成分が個々にそして／もしくは集合的に、場合によりそして好ましくは低い免疫原性を有する、本発明の抗体、特定のフラグメントもしくはバリアントは、本発明において有用である。本発明において用いることができる抗体は、場合により、症状の測定可能な緩和および低いそして／もしくは許容しうる毒性を有して長期間にわたって患者を処置するそれらの能力を特徴とする。低いもしくは許容しうる免疫原性および／もしくは高親和性、ならびに他の適当な特性は、得られる治療効果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、有意なＨＡＨＡ、ＨＡＣＡもしくはＨＡＭＡ応答を処置した患者の約７５％未満、もしくは好ましくは約５０％未満において引き起こし、そして／または処置した患者において低い力価をもたらす（二重抗原酵素免疫アッセイで測定される約３００未満、好ましくは約１００未満）と本明細書において定義される（引用することにより本明細書に全部が組み込まれる、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１２５−１１２７（１９９４））。
【００５５】
適当な抗体には、ヒトＥＭＭＰＲＩＮへの結合に関して市販されているモノクローナル抗体ＣＤ１４７−ＲＤＩ／クローンＵＭ−８Ｄ６（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）と競合するものが包含される。
【００５６】
組成物およびそれらの使用
本発明によれば、本明細書に記述される中和抗ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体は、血管新生を抑制し、従って腫瘍増殖を防止するかもしくは妨げ、そして転移を防止するかもしくは抑制するために用いることができる。従って、そのようなモノクローナル抗体は、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬および黄斑変性を包含することができるがこれらに限定されるものではない、そのような処置に適している血管新生炎症性疾患を抑制するために用いることができる。処置する個体は任意の哺乳類であることができ、そして好ましくは霊長類、哺乳類であるコンパニオンアニマルおよび最も好ましくはヒト患者である。投与するモノクローナル抗体の量は、それが使用されている目的および投与の方法に従って異なる。
【００５７】
抗血管新生抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、血管新生が防止されるかもしくは停止されることが所望される組織において効果をもたらすいくつでもの方法により投与することができる
。さらに、抗血管新生抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、抗血管新生効果を与えるために局所的に存在する必要はなく、従って、ＥＭＭＰＲＩＮを含有する体のコンパートメントもしくは体液へのアクセスが得られるところであればそれらを投与することができる。炎症を起こすか、悪性の、もしくはそうでなければ障害が起きた組織の場合、これらの方法には、抗体を含有する製剤の直接使用を包含することができる。そのような方法には、液状組成物の静脈内投与、液状もしくは固形製剤の経皮投与、経口、局所投与、または間質もしくは手術間（ｉｎｔｅｒ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）投与が包含される。投与は、例えば血管ステントのようなその主要機能が薬剤送達媒体としてではない可能性がある装置の埋め込みによりもたらすことができる。
【００５８】
特に、本発明の方法の１つの態様内で、血管の形成が抑制されるように、角膜に直接もしくは患者に全身的に本発明の抗血管新生ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の治療的に有効な量を投与する段階を含んでなる、角膜新血管形成（角膜移植片新血管形成を包含する）を処置する方法が提供される。
【００５９】
本発明の方法の別の態様内で、血管の形成が抑制されるように、眼に直接もしくは患者に全身的に抗血管新生中和抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の治療的に有効な量を投与する段階を含んでなる、血管新生緑内障を処置する方法が提供される。
【００６０】
本発明の別の態様として、本発明の抗血管新生ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は単独でもしくは別の抗血管新生剤と組み合わせて、肥厚性瘢痕もしくはケロイドにこれらの損傷の進行を防ぐために直接注入される。この治療は、熱傷のような肥厚性瘢痕およびケロイドの発生をもたらすことが既知である症状の予防処置において特に有益である。治療は、増殖段階が進む時間があった後に（最初の損傷後約１４日）、しかし肥厚性瘢痕もしくはケロイド発生の前に開始した場合に有効であり得る。
【００６１】
投与はまた、経口または腫瘍もしくは組織への局所注入によることもできるが、一般に、モノクローナル抗体は静脈内に投与される。一般に、投薬量範囲は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１２．０ｍｇ／ｋｇである。これは、ボーラスとしてまたは制御されたマイクロプロセッサーおよびプログラム可能なポンプ装置により制御されることができる遅いもしくは持続注入としてであることができる。
【００６２】
あるいはまた、好ましくは該モノクローナル抗体のフラグメントをコードするＤＮＡをハイブリドーマ細胞から単離し、そして哺乳類に投与することができる。ＤＮＡは、患者の細胞におけるＤＮＡの発現および抗体の送達をもたらすようにむき出しの形態でもしくは組み換えベクター、例えばワクシニアウイルスに挿入して投与することができる。
【００６３】
本発明の方法において使用するモノクローナル抗体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５に記述されているように、製薬学的組成物を調合する確立した方法のいずれかにより調合することができる。投与の容易さのために、モノクローナル抗体は、典型的に、製薬学的に許容しうる担体と組み合わされる。そのような担体には、水、生理食塩水もしくは油が包含される。
【００６４】
非経口投与に適当な製剤には、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有することができる水性および非水性の滅菌注射溶液；ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁剤が包含される。任意の通常の媒質が有効成分およびその意図する用途と不適合である場合を除いて、任意の組成物におけるその使用が意図される。
【００６５】
製剤は、単位用量もしくは複数用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルにおい
て与えることができ、そして使用直前に、滅菌液状担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態において保存することができる。
【００６６】
略語
Ａｂｓ              抗体、ポリクローナルもしくはモノクローナル
ａＶ                インテグリンサブユニットアルファＶ
ｂ３                インテグリンサブユニットベータ３
ｂＦＧＦ            塩基性線維芽細胞増殖因子
ＩＦＮ              インターフェロン
Ｉｇ                免疫グロブリン
ＩｇＧ              免疫グロブリンＧ
ＩＬ                インターロイキン
ＭＭＰ−１
ＥＭＭＰＲＩＮ      細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子
ＥＭＭＰＲＩＮＲ    受容体
ｓＥＭＭＰＲＩＮＲ  可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ受容体
Ｍａｂ              モノクローナル抗体
ＶＥＧＦ            血管内皮増殖因子
ＭＭＰ              マトリックスメタロプロテイナーゼ
【００６７】
本発明を一般論として記述しているが、本発明の態様は以下の実施例においてさらに開示される。
【００６８】
実施例
【実施例１】
【００６９】
組み換えＥＭＭＰＲＩＮは、肺からのヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）によるＭＭＰ−１生産を刺激する
内皮細胞へのＥＭＭＰＲＩＮの効果をインビボで血管新生プロセスに直接関与する細胞である微小血管内皮細胞を用いて調べた。
【００７０】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（カタログ番号ＣＣ−２５２７、ロット番号８Ｆ１５２８）から入手した。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞は、供給業者により推奨される条件下で培養した。簡潔に言えば、細胞をヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ−Ｂ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒトインシュリン様増殖因子−１（ｈＩＧＦ−１）、アスコルビン酸、ゲンタマイシン、５％ＦＢＳを含有する内皮細胞増殖培地ＭＶ（ＥＧＭ−２  ＭＶ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，カタログ番号ＣＣ−３２０２）において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００７１】
初期継代細胞（継代３回未満）をトリプシン処理し、そしてＲＰＭＩ−１６４０で１回洗浄した。細胞を希釈培地（ＤＭ−線維芽細胞基本培地＋２％  ＦＢＳ）に５ｘ１００，０００細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５０，０００個の細胞を含有する１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートにおける各ウェルに加えた。これらのウェルに可溶性組み換えヒトＥＭＭＰＲＩＮを２０μｇ／ｍｌ、６．６７μｇ／ｍｌ、２．２２μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌおよび０μｇ／ｍｌの最終濃度で前負荷した。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で１日および３日間インキュベーションした。ならし培地を各ウェルから集め、そしてＭＭＰ−１活性アッセイに供した。
【００７２】
ならし培地におけるＭＭＰ−１活性の定量的検出は、ヒトＭＭＰ−１活性キット（Ｒ＆
Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）（カタログ番号Ｆ１Ｍ００）を用いて実施した。簡潔に言えば、１５０μｌの基準もしくはサンプルにおけるＭＭＰ−１を各ウェルの底に固定化した抗ＭＭＰ−１抗体により捕獲した。次に、捕獲されたＭＭＰ−１を酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）により活性化した。各ウェルに加えたＭＭＰ基質は活性ＭＭＰ−１により切断され、そして得られる蛍光を以下のパラメーター：３２０ｎｍでの励起波長および４０５ｎｍでの発光波長でＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ、Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（カタログ番号Ｆ１２９００５、シリアルナンバー９４７４７）を用いて決定した。
【００７３】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を異なる濃度の組み換えＥＭＭＰＲＩＮでチャレンジして（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）ＭＭＰ−１生産を刺激した。図２に示されるように、ＥＭＭＰＲＩＮは、内皮細胞におけるＭＭＰ−１生産を用量依存的に刺激した。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞は、２０μｇ／ｍｌのＥＭＭＰＲＩＮで処理した場合に約４０ｎｇ／ｍｌのＭＭＰ−１を生産した。ＥＭＭＰＲＩＮ刺激に対するＨＭＶＥＣ−Ｌのこの応答は、ＮＨＬＦ細胞（これらは同じ処理に応答してその量の半分のＭＭＰ−１しか生産しなかった）によるものより一層強かった。ＭＭＰ−１生産の刺激は、１日のチャレンジ後に最初に認められ、そして少なくとも３日間持続した。
【００７４】
図２に示される結果は、ＥＭＭＰＲＩＮが、用量依存的に、血管新生に直接関与する細胞である微小血管内皮細胞によるＭＭＰ−１発現を直接刺激できることを初めて示した。
【実施例２】
【００７５】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞における抗ＥＭＭＰＲＩＮ  ｍＡｂによるＥＭＭＰＲＩＮに誘導されるＭＭＰ−１生産の抑制
ＥＭＭＰＲＩＮに誘導されるＭＭＰ−１生産の特異性をさらに確かめるために、細胞をＥＭＭＰＲＩＮで刺激した１５分後にヒトＥＭＭＰＲＩＮに対するモノクローナル抗体をアッセイに含んだ。１０μｇ／ｍｌで、ＣＤ１４７−ＲＤＩ／クローンＵＭ−８Ｄ６（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）は、ＥＭＭＰＬＩＮ（５μｇ／ｍｌ）によって誘導される線維芽細胞によるＭＭＰ−１生産を有意に抑制した（図３）。しかしながら、他の抗ＥＭＭＰＲＩＮ  ｍＡｂ（マウス抗ヒトＣＤ１４７／ＥＭＭＰＲＩＮ，クローンＨＩＭ６，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、ＥＭＭＰＲＩＮによって誘導されるＭＭＰ−１生産を抑制することができなかった。
【００７６】
我々の結果は、ＥＭＭＰＲＩＮによるＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるＭＭＰ−１生産の刺激が、ＵＭ−８Ｄ６によって認識されるがＨＩＭ６ではそうでないＥＭＭＰＲＩＮ上のユニークなエピトープにより特異的に媒介されることを示した。
【実施例３】
【００７７】
ヒト内皮細胞遊走へのＥＭＭＰＲＩＮの効果
血管新生におけるＥＭＭＰＲＩＮの役割はまた、インビトロ細胞遊走および浸潤アッセイを用いて直接調べることもできる。一次組織（臍帯）ＨＵＶＥＣ細胞由来のヒト内皮細胞をインビトロシステムにおいて使用し、ここで、内皮細胞は、１％のＦＢＳを含有する細胞培地においてトランスウェルシステムのトップウェルに接種される。ボトムウェルにおいて、１０％のＦＢＳを有する培養培地は細胞遊走もしくは浸潤を誘導するために走化性源として働く。トップおよびボトムウェルは、直径８μｍの細孔を有する膜で隔てられる。膜は、それぞれ、細胞遊走もしくは浸潤を測定するために、コーティングされないかまたは様々な細胞外マトリックスタンパク質、すなわち、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンもしくはマトリゲルでコーティングされる。
【００７８】
材料および方法  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。異なるレベルのＥＭＭＰＲＩＮを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトランスフェクションおよび樹立の方法は、以前に記述されている（Ｔａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：７３−８０）。細胞をｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）におけるヒトＥＭＭＰＲＩＮオープンリーディングフレームセンス（ＭＤＡ  ＭＢ２３１  Ｓ１−３）もしくは同じＯＲＦのアンチセンス鎖（ＭＤＡ  ＭＢ２３１  ＡＳ１−５およびＭＤＡ  ＭＢ２３１  ＡＳ２−５）に対応するｃＤＮＡでトランスフェクションした。空のベクターでトランスフェクションした細胞を第二のコントロール（Ｖｅｃｔｏｒ）として用いた。
【００７９】
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）遊走は、ＱＣＭＴＭ−コラーゲンＩ定量的細胞遊走アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を用いて評価した。ＨＵＶＥＣ細胞（１００μｌの無血清培地中１００，０００個）をトップコンパートメントに加えた。ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞：ＷＴ、Ｖｅｃｔｏｒ、Ｓ１−３、ＡＳ１−５もしくはＡＳ２−５により調節された無血清培地をチャンバーのボトムコンパートメントにおける化学誘引物質源として使用した。第二の実験において、ＶＥＧＦ生物活性を中和するために抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を様々な濃度でボトムコンパートメントに加えた。細胞遊走アッセイは、３７℃で６時間実施した。挿入フィルターを固定し、そしてトップコンパートメントに留まる細胞を除いた。フィルターをゲンチアン（Ｇｅｎｔｓｉａｎ）バイオレットで染色し、そして顕微鏡イメージングシステム（Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ  ３Ｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて遊走した細胞の数を決定した。
【００８０】
図４Ａは、様々なＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞構築物に由来するならし培地により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞遊走の相対レベルを示す。ＷＴ細胞に誘導される遊走を１００％に定めた。エラーバーは、三重反復データ点の標準偏差を表す。スチューデントＴ検定による有意差（＊）は、ＷＴ細胞により誘導される内皮細胞遊走と比較してｐ＜０．０１値であった。図４Ｂは、ＶＥＧＦに対する中和抗体が、用量依存的に、１００％として定められた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＭＭＰＲＩＮ  Ｓ１−３腫瘍細胞により調節された無血清培地により刺激される内皮細胞遊走を抑制したことを示す。エラーバーは、三重反復データ点の標準偏差を表す；＊抗−ＶＥＧＦ  ｍＡｂの不在下での内皮細胞遊走と比較してｐ＜０．０１。
【００８１】
これらのデータは、ＥＭＭＰＲＩＮに誘導される内皮細胞遊走におけるＶＥＧＦの関与を示す。
【実施例４】
【００８２】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞管形成へのＥＭＭＰＲＩＮの効果
血管新生におけるＥＭＭＰＲＩＮの役割は、インビトロ管形成アッセイを用いて示すことができる。マトリゲル上に接種すると、ＨＭＶＥＣ細胞は自然分化プロセスを開始して毛細血管様管構造を形成する。このインビトロ分化はインビボ血管新生プロセスによく似ており、そして血管新生研究においてしばしば用いられる。
【００８３】
我々は、ＥＭＭＰＲＩＮがＭＭＰ発現を刺激することにより内皮細胞の特性を変え、そしてそれ故に細胞遊走および浸潤を刺激すると予測する。これらの細胞をＥＭＭＰＲＩＮで刺激すると増大した管形成が起こる。
【００８４】
管形成におけるＥＭＭＰＲＩＮの特異性は、ヒトＥＭＭＰＲＩＮに対するモノクローナ
ル抗体を用いて調べられる。
【実施例５】
【００８５】
インビボでの血管新生へのＥＭＭＰＲＩＮの効果−マトリゲルプラグアッセイ
血管新生におけるＥＭＭＰＲＩＮの役割は、マトリゲルプラグアッセイを用いてインビボで直接調べられる。マトリゲルは、細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍、Ｅｎｇｅｌ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物である。主要成分はラミニンであるが、マトリゲルはまた微量の線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ−ベータ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびＥＨＳ腫瘍において天然に存在する他の増殖因子も含有する。マトリゲルは、いくつかのタイプの腫瘍細胞浸潤アッセイの基礎であり、そして血管新生の研究のための必要な物質を提供する。マトリゲルは、マウスもしくはラットに皮下注射した場合にソフトゲルプラグを形成し、そして血管新生因子を補足した場合に強い血管応答をサポートする。
【００８６】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）もしくは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生増殖因子の次善用量を含有するマトリゲルプラグは、インビボで血管新生を誘導するためにマウスに移植することができる。これらのプラグのいくつかに様々な用量の組み換えＥＭＭＰＲＩＮを補足する。ＥＭＭＰＲＩＮは内皮細胞遊走および内皮細胞によるＭＭＰ生産を誘導するので、増大した細胞遊走およびマトリゲルを通した浸潤に起因する血管新生の増加を認めることを予想する。
【００８７】
マトリゲルプラグ血管新生アッセイにおいて試験されるようなＥＭＭＰＲＩＮのこれらの効果は、血管新生を防ぐことにおけるｓｉＲＮＡもしくは抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体のようなＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストの活性を示すために用いることができる。
【実施例６】
【００８８】
インビボでの血管新生へのＥＭＭＰＲＩＮの効果−角膜ポケットアッセイ
同様に、血管新生におけるＥＭＭＰＲＩＮの役割は、角膜ポケットアッセイを用いてインビボで直接調べられる。
【００８９】
末梢に位置する辺縁血管系からの血管成長を引き起こすために塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）もしくは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生増殖因子を含有するポリマーディスクを角膜ポケットに移植する。我々は、様々な用量の組み換えＥＭＭＰＲＩＮを補足した血管新生増殖因子の次善用量の組み合わせを使用する。ＥＭＭＰＲＩＮは内皮細胞によるＭＭＰ生産を誘導するので、増大した内皮細胞遊走および浸潤に起因する血管新生の増加を認めることを予想する。
【００９０】
角膜ポケット血管新生アッセイにおけるＥＭＭＰＲＩＮの特異性は、ｓｉＲＮＡもしくは抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体のようなＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストを用いて調べられる。
【実施例７】
【００９１】
血管新生へのＥＭＭＰＲＩＮの効果−ＭＭＰにより媒介されるＶＥＧＦ生産および放出の刺激
ＥＭＭＰＲＩＮはまた、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）の発現も刺激することが報告されている［Ｓａｍｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００ｂ］。ＭＴ１−ＭＭＰは次に、最も強力な血管新生増殖因子の１つであるＶＥＧＦの発現を刺激し、増大した血管新生をもたらす［Ｄｅｒｙｕｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｓｏｕｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２］。しかしながら、ＥＭＭＰＲＩＮおよびＶＥＧＦ発現と血管新生との間の直接的関連は、まだ立証されていない。
【００９２】
組み換えＥＭＭＰＲＩＮもしくは改変されたレベルのＥＭＭＰＬＩＮを発現する腫瘍細胞のいずれかを用いて、インビトロおよびインビボ設定の両方において、ＥＭＭＰＲＩＮとＶＥＧＦとの間の関連を示すことができる。ＥＭＭＰＬＩＮに誘導される内皮細胞遊走および浸潤に加えて、ＶＥＧＦレベルの増加は血管新生を促進するので、腫瘍浸襲性および増殖速度への得られる効果は明らかにされる。
【００９３】
材料および方法  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。異なるレベルのＥＭＭＰＲＩＮを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトランスフェクションおよび樹立の方法は、以前に記述されている（Ｔａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：７３−８０）。細胞をｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）におけるヒトＥＭＭＰＲＩＮオープンリーディングフレームセンス（ＭＤＡ  ＭＢ２３１  Ｓ１−３）もしくは同じＯＲＦのアンチセンス鎖（ＭＤＡ  ＭＢ２３１  ＡＳ１−５およびＭＤＡ  ＭＢ２３１  ＡＳ２−５）に対応するｃＤＮＡでトランスフェクションした。
【００９４】
正常なヒト肺もしくは皮膚線維芽細胞（ＮＨＬＦもしくはＮＨＤＦ）、および肺からのヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）もしくはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手し、そしてそれぞれ線維芽細胞増殖培地もしくは内皮増殖培地−２（ＥＧＭ−２）において培養した。
【００９５】
癌および線維芽細胞の共培養研究では、１００，０００個の癌細胞（ＭＤＩ  ＭＢ２３１  ＷＴ、Ｓ１−３、ＡＳ１−５もしくはＡＳ２−５）を完全ＤＭＥＭ中で６ウェル培養プレートにおいて２００，０００個のＮＨＤＦ細胞と一緒に培養した。２４ｈ後に、培地を無血清ＤＥＭＥで置換し、そして培養を２日間続けた。培地を新しい無血清ＤＭＥＭで置換し、そして培養をさらに３日間持続し、その時点で培地を集め、分析した。細胞をＴｒｉｓ緩衝食塩水に加えて１％ＮＰ４０で溶解して細胞に関連するＥＭＭＰＲＩＮを測定した。
【００９６】
１０μｇの総細胞タンパク質において発現されるＥＭＭＰＲＩＮの相対量は、走査デンシトメトリーを用いるウェスタンブロット分析により、記述されているような（Ｔａｎｇ
ｅｔ  ａｌ．２００４）抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体（ＲＤＩ−１４７，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いる定量的ＥＬＩＳＡにより、そして細胞表面上で蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣ分析）により決定した。ＦＡＣ分析により、細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、アンチセンス構築物でトランスフェクションした細胞上に存在しないことが裏付けられた（データは示さない）。無血清培地もしくは腫瘍抽出物におけるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の存在は、１０μｇの総タンパク質を用いて基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィーにより決定した。ゲル上のタンパク質分解活性は、未消化のそして染色されたゼラチンの青色バックグラウンド上の透明なバンドとして検出された。ヒトもしくはマウスＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＶＥＧＦ濃度のＥＬＩＳＡ測定は、製造業者の説明書に従って、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。各サンプルを三重反復で分析した。簡潔に言えば、１００μｌの基準もしくはサンプル（５０μｇの総タンパク質に相当する）に含有されるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９もしくはＶＥＧＦをアッセイウェルの底に固定化した抗ＭＭＰ−２、抗ＭＭＰ−９もしくは抗ＶＥＧＦ抗体により捕獲した。洗浄した後に、ＭＭＰもしくはＶＥＧＦ特異的抗体を用いて存在する量を定量した。
【００９７】
結果  トランスフェクションした細胞は、細胞培養条件において培養した場合に改変されたレベルの総ＥＭＭＰＲＩＮを有した（表１）。Ｓ１−３細胞は、ＷＴ細胞のほぼ２倍のレベル、そしてＡＳ細胞のものの４倍のレベルを有した。
【００９８】
【表１】
2007530538.tif 000002
【００９９】
【表２】
2007530538.tif 000003
【０１００】
これらのデータは、設計した腫瘍細胞単独におけるＥＭＭＰＲＩＮの腫瘍細胞発現、ＭＭＰ発現およびＶＥＧＦレベル間の関係を示す。共培養データ（表２）は、ＮＨＤＦがＷＴヒト乳房腫瘍細胞もしくはＥＭＭＰＲＩＮを過剰発現するもの（Ｓ１−３）のいずれかと存在する場合に超相加的量のＶＥＧＦが生産されることを示す。
【実施例８】
【０１０１】
ＥＭＭＰＲＩＮによるインビボ腫瘍血管新生の刺激
新しい血管の形成である血管新生への腫瘍細胞由来のＥＭＭＰＲＩＮの刺激効果をインビボで直接評価した。ヒト乳癌細胞、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１を組み換えＤＮＡ技術を用いて異なるレベルのＥＭＭＰＲＩＮタンパク質を発現するように設計した。全長ヒトＥＭＭＰＲＩＮをコードする哺乳類発現ベクターで安定にトランスフェクションした単一細胞クローン由来の細胞集団に相当するセンスＥＭＭＰＲＩＮ細胞を作製した。アンチセンス細胞は、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１細胞をアンチセンスの向きの全長ヒトＥＭＭＰＲＩＮをコードする哺乳類発現ベクターでトランスフェクションすることにより作製した。センス細胞は増加したレベルのＥＭＭＰＬＩＮを構成的に発現し、そしてアンチセンス細胞は、アンチセンスＲＮＡによるタンパク質翻訳の抑制のために減少したレベルのＥＭＭＰＲＩＮを発現する（実施例７を参照）。これらの細胞を野生型細胞と一緒にヌードマウスに皮下移植した。腫瘍血管新生をこれらの細胞由来の腫瘍において評価した。
【０１０２】
動物およびそれらの世話に関する全ての方法は、ＮＩＨ基準に従う企業ＩＣＡＵＣ指針どおりに行った。４週齢のメスＣＤ１  Ｎｕ／Ｎｕマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、そして実験の前に１０〜１４日間順応させた。
【０１０３】
野生型由来の腫瘍もしくはベクターコントロール腫瘍細胞と比較して、最終腫瘍重量の５倍の増加がＥＭＭＰＲＩＮを過剰発現する細胞により生成されるＳ１−３腫瘍において見られた（図５Ａ）。ＡＳ１−５およびＡＳ２−５細胞は、同じ期間の間に、未改変のコントロール細胞、ＷＴ、もしくは空のベクターでトランスフェクションしたもの、Ｖｅｃｔｏｒと比較して有意に小さいサイズ（それぞれ、ｐ＝０．０２４２および０．０４３９）をもたらした（図５Ａ）。
【０１０４】
図５Ｂに示されるように、増加した血管新生は、センス細胞由来の腫瘍において多数の新しい毛細血管により明らかであるが、野生型およびアンチセンス細胞由来の腫瘍ではそうでなかった。
【０１０５】
ヒトＶＥＧＦレベルは、ＷＴ（９２．４）およびＶｅｃｔｏｒコントロール細胞（８６．０ｐｇ／μｇ総タンパク質）と比較した場合にＳ１−３細胞（２３５．３ｐｇ／μｇ総タンパク質）により生成される異種移植片組織において２．６倍高かった（ｐ＝０．００４３センス対野性型）（図５Ｃ）。抑制されたＥＭＭＰＲＩＮレベルを有する、ＡＳ細胞からの腫瘍組織は、４０．４％少ないヒトＶＥＧＦ、すなわち５５ｐｇ／ｍｇ総タンパク質を有した（ＷＴと比較してｐ＝０．０１７７）。
【０１０６】
より重要なことには、腫瘍組織におけるＶＥＧＦ発現への腫瘍細胞表面上の増加したＥＭＭＰＲＩＮレベルの影響は、腫瘍細胞を超えて広がった。腫瘍ＶＥＧＦ生産の刺激と付随して、マウス間質ＶＥＧＦ生産もまたＳ１−３腫瘍を有するマウスにおいて増加した。宿主由来のＶＥＧＦのレベルは、野生型およびベクターコントロール腫瘍における２３および２４ｐｇ／ｍｇ総タンパク質からセンス腫瘍における４８ｐｇ／μｇ総タンパク質まで２．１倍増大した（ｐ＝０．００００９センス対ＷＴ）（図５Ｃ）。ＡＳ細胞を与えたマウスからのマウス組織ＶＥＧＦは、−５６．５％少ないＶＥＧＦ、すなわち１０ｐｇ／ｍｇ総タンパク質を有した（ＷＴと比較してｐ＝０．０００１３）。
【０１０７】
従って、腫瘍および宿主細胞由来のＶＥＧＦレベルは両方とも、ＥＭＭＰＲＩＮ改変細胞由来の腫瘍におけるＥＭＭＰＲＩＮレベルおよびこれらの傾向に従った。これらの結果は、腫瘍ＥＭＭＰＲＩＮが、インビボでＶＥＧＦ生産ならびにその後の腫瘍血管新生および増殖を刺激するために腫瘍と間質コンパートメント間の活発な相互作用を媒介する新しいパラダイムを裏付ける。
【実施例９】
【０１０８】
ＭＭＰおよびＶＥＧＦに関する腫瘍組織環境への腫瘍ＥＭＭＰＲＩＮの効果
実施例３に記述されるヒト乳房腫瘍細胞を用いてインビボで腫瘍組織および腫瘍間質（線維芽細胞、内皮細胞および他の補助細胞）への増加したもしくは減少したＥＭＭＰＲＩＮの効果を評価した。
【０１０９】
０日目に、約６週齢で、マウスをグループ当たり８匹のマウスからなる５グループの各々に割り当てた。動物に０．１ｍＬの細胞懸濁液における１０７個の細胞を右横腹領域において皮下に接種した。腫瘍増殖をカリパス測定により毎週モニターし、そして腫瘍容積（ｍｍ３）を式［長さｘ幅ｘ幅］／２に基づいて計算した。実験の終了時に、全ての動物をＣＯ２窒息によって安楽死させた。原発腫瘍を切り出し、秤量し、よく冷えたＰＢＳにおいてすすぎ、そして組織学的／顕微鏡検査用に処理した。組織標本および切片はまた、タンパク質抽出および生化学分析用に液体窒素においてスナップ凍結もした。
【０１１０】
ヒトＥＭＭＰＲＩＮレベルはＥＬＩＳＡ分析で定量的に評価され、それは、野生型腫瘍における５９．０ｐｇ／μｇ総タンパク質と比較して、センス腫瘍においてＥＭＭＰＲＩＮレベルのかなりの増加（１０９．８ｐｇ／μｇ総タンパク質）そして逆にアンチセンス腫瘍において非常に抑制されたレベル（２６．０ｐｇ／μｇ総タンパク質）を示した（それぞれ野生型に対してセンスおよびアンチセンス腫瘍についてｐ＝０．００００４８および０．００００７７）（図６Ａ）。トランスフェクションした腫瘍細胞へのＥＭＭＰＲＩＮ発現のこの安定した効果は、続いて、インビボでＭＭＰ発現への影響に転換された。予想されるように、腫瘍組織抽出物の基質ザイモグラフィー分析は、ＥＭＭＰＲＩＮセンス腫瘍におけるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性の増加したレベル、そしてＥＭＭＰＲＩＮ発現が抑制される場合に低下したレベルを示した（図６Ｂ）。次に、腫瘍および宿主コンパートメントの両方におけるＭＭＰレベルを生化学分析により定量的に決定した。ＥＭＭＰＲＩＮが腫瘍細胞において過剰発現された場合、得られる異種移植片腫瘍におけるヒトＭＭＰ−２およびヒトＭＭＰ−９発現レベルは両方とも約２．５倍高められた（それぞれ野生型腫瘍と比較してｐ＝０．００６８および０．００５６）（図６Ｃ）。逆に、これら２つのＭＭＰの発現の２倍の減少が、アンチセンス腫瘍においてＥＭＭＰＲＩＮを抑制した場合に認められた（それぞれ野生型腫瘍と比較してｐ＝０．００２６および０．００３５）（図６Ｃ）。間質細胞と関連する宿主ＭＭＰ−９活性への腫瘍ＥＭＭＰＲＩＮ発現の効果は、腫瘍ＭＭＰへのものよりさらに大きかった。
【０１１１】
従って、腫瘍細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮの変化は、それぞれ、センスもしくはアンチセンス腫瘍小結節におけるマウスＭＭＰ−９発現の３．３倍の増加もしくは５９．３％の減少を誘導することができた（野生型腫瘍と比較してｐ＝０．０００１３および０．００４７）（図６Ｄ）。
【０１１２】
インビボでの腫瘍ＥＭＭＰＲＩＮ−ＭＭＰシステムの視覚化
腫瘍
ＥＭＭＰＲＩＮを過剰発現する細胞およびＷＴもしくは過少発現する細胞、ＡＳにより生成される腫瘍間の血管新生活性の違いは、明確に視認できる（図７）。
【０１１３】
宿主ＥＭＭＰＲＩＮ−ＭＭＰシステムへの腫瘍ＥＭＭＰＲＩＮ発現の効果を異種移植片腫瘍の免疫組織化学分析においてさらに調べた。ＥＭＭＰＲＩＮを過剰発現する腫瘍細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１  Ｓ１−３）により生成される腫瘍において、マウスＭＭＰ−９およびＥＭＭＰＲＩＮの両方のアップレギュレーションが間質細胞において検出された。これら２つのタンパク質の発現はマウス細胞に限定され、そして異種移植片ヒト腫瘍細胞において検出されなかった（図８）。興味深いことに、腫瘍の周りの被膜にもしくは腫瘍組織に浸潤した間質コンパートメントにおける線維芽細胞に存在する染色に加えて、マウスＥＭＭＰＲＩＮおよびＭＭＰ−９は両方とも血管様構造の周りで非常にアップレギュレーションされた（図８）。血管新生血管の周りのＭＭＰ−９およびＥＭＭＰＲＩＮの共局在性は、マウスＭＭＰ−９、ＥＭＭＰＲＩＮおよび血管マーカーであるＣＤ３１のものの重複する分布によりさらに裏付けられた（図８）。対照的に、Ｖｅｃｔｏｒコントロール腫瘍細胞により生成される腫瘍ではわずかなレベルのＭＭＰ−９およびＥＭＭＰＲＩＮ発現しかなかった。これらの腫瘍において、ＭＭＰ−９はマクロファージ様細胞において主に検出され、そしてＥＭＭＰＲＩＮはいくつかの線維芽細胞において非常に低いレベルで検出された（図８）。
【実施例１０】
【０１１４】
抗血管新生抗ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体の製造および特性化
抗血管新生抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、標準的な方法を用いて製造しそして抗血管新生抗ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストについて本明細書に記述される特性を用いてスクリーニングすることができる。
【０１１５】
材料および方法  ３匹の１２〜１４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。２匹のマウスに各々、０日目に等量のフロインド完全アジュバントに乳化した７５μＬのＰＢＳ中２５μｇのｒＨｕＥＭＭＰＲＩＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１２．５μｇ／部位）、そして１４、２８および５１日目に等量のフロインド不完全アジュバントに乳化した７５μＬのＰＢＳ中２５μｇのｒＨｕＥＭＭＰＲＩＮの皮内および腹腔内注射の組み合わせを与えた。第三のマウスには、尾の付け根でＳ．Ｑ．投与する１００μｌのＰＢＳ中２５μｇのｒＨｕＥＭＭＰＲＩＮ＋０．３３ｘ１０５ＵのマウスＩＦＮα＋０．３３ｘ１０５ＵのマウスＩＦＮβ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）の最初の注射を与えた。２および３日目に、マウスに尾の付け根でＳ．Ｑ．投与する１００μｌのＰＢＳ中０．３３ｘ１０５ＵのＩＦＮα＋０．３３ｘ１０５ＵのＩＦＮβの追加の注射を与えた。数週後に、マウスを尾の付け根でＳ．Ｑ．投与する２５μｇのＥＭＭＰＲＩＮ＋１００μｇの抗マウスＣＤ４０アゴニストＭａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で追加抗原刺激した（ｂｏｏｓｔｅｄ）。
【０１１６】
免疫スケジュールを通して様々な時間点でマウスから採血した。血液収集は後眼窩穿刺により行い、そして血清を固相ＥＩＡによる力価測定用に集めた。いったん力価プラトーが得られると、マウスに静脈内（ＩＶ）に与えるＰＢＳ中２５μｇのＥＭＭＰＲＩＮのそれらの最終ブースターを与えた。３日後にマウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、そして脾臓を無菌的に取り除き、そして１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢを含有する１０ｍＬの冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＰＳＡ）に浸した。冷ＰＢＳ／ＰＳＡに浸した金網スクリーンに細胞を無菌的に通すことによりリンパ球を採取した。細胞を冷ＰＳＡ／ＰＢＳにおいて１回洗浄し、トリパンブルー色素排除を用いて計数し、そして１０ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
【０１１７】
抗ヒトＥＭＭＰＲＩＮ抗体の特性化
酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を用いてハイブリドーマ細胞上清をヒト抗ＥＭＭＰＲＩＮ
Ｍａｂの存在について試験した。簡潔に言えば、プレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのヒトＥＭＭＰＲＩＮで一晩被覆した。０．０２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０を含有する０．１５Ｍの食塩水において洗浄した後に、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃で１ｈブロックした。希釈していないハイブリドーマ上清を被覆プレート上で３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして次に１％ＢＳＡ／ＰＢＳに１：１０，０００希釈したＨＲＰで標識したヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを再び洗浄し、次に１００μＬ／ウェルのクエン酸−リン酸基質溶液（０．１Ｍのクエン酸および０．２Ｍのリン酸ナトリウム、０．０１％のＨ２Ｏ２および１ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩）とＲＴで１５分間インキュベーションした。２５μＬ／ウェルで４Ｎ硫酸の添加により基質発色を止め、そして吸光度を自動プレート分光光度計によって４９０ｎｍで測定した。全ての反応性ハイブリッド細胞系をクローニングプレートにおいて１細胞／ウェルで限界希釈により２回サブクローン化した。均質な細胞系を凍結培地（９０％のＦＢＳ、１０％のＤＭＳＯ）において凍結保存し、そして液体窒素において保存した。
【０１１８】
マウス抗ヒトＥＭＭＰＲＩＮ抗体のアイソタイプを同定するために、モノクローナル抗体アイソタイピングキット−ＩｓｏＳｔｒｉｐ，ディップスティック形態（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に言えば、培養上清をＰＢＳにおいて１：１０希釈し、そして発色チューブに加えた。ディップスティックを発色チューブに加え、そしてＲＴで約１０分間インキュベーションした。アイソタイプは、インキュベーション後に視覚的評価により決定した。ヒトＥＭＭＰＲＩＮに特異的に結合するマウスＩｇＧ  Ｍａｂを分泌する１８個の異なるハイブリドーマクローンの一覧表を表３に示す。
【０１１９】
抗原タンパク質として使用した組み換えＥＭＭＰＲＩＮの生物活性は、ＥＭ線維芽細胞における刺激されたＭＰＲＩＮからのＭＭＰ−１の生産を刺激するその能力により評価し、３継代未満の非常に均質な初代ヒト線維芽細胞および改変された刺激条件を用いることにより改変して、記載のとおり行った（Ｇｕｏ，Ｚｕｃｋｅｒ，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｂｉｓｗａｓ，（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２４−７（２４））。サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、第ＶＩＩ因子関連抗原およびアルファアクチンについて陰性であると確かめられた非常に純粋な線維芽細胞のみをアッセイにおいて使用した。ＥＭＭＰＲＩＮ刺激への応答の大きさは、線維芽細胞の継代に依存した。初期の継代の細胞は、３回より多い継代にわたって培養されている細胞と比較して、増加した量のＭＭＰを生産することにおいてより強く応答した。さらに、新しい細胞チャレンジ方法を用いた。接着細胞に組み換えＥＭＭＰＲＩＮを加える代わりに、試験ウェルに組み換えＥＭＭＰＲＩＮを前負荷した。次に、懸濁した細胞をこれらのウェルに加え、そして組み換えＥＭＭＰＲＩＮに直接さらした。この新しいチャレンジ方法は、最適なアッセイ感度のためにＥＭＭＰＲＩＮへの、側底面上に発現されると思われそして接着細胞ではアクセスできない可能性がある細胞表面受容体の最大露出を保証する。
【０１２０】
ヒトＥＭＭＰＲＩＮタンパク質の細胞外ドメインに対応する組み換えＥＭＭＰＲＩＮをＮＳＯ細胞（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）において製造した。異なる量の組み換えＥＭＭＰＲＩＮタンパク質で処理した線維芽細胞により調節された無血清培地におけるＭＭＰ−１活性は、製品マニュアル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に従ってＭＭＰ−１活性アッセイキットを用いて定量的に決定した。簡潔に言えば、１５０μｌの基準もしくはサンプルに含まれるＭＭＰ−１をアッセイウェルの底に固定化した抗ＭＭＰ−１抗体により捕獲した。次に、捕獲されたＭＭＰ−１を酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）により活性化した。各ウェルに加えたＭＭＰ基質は活性化ＭＭＰ−１により切断され、そして得られる蛍光を以下のパラメーター：３２０ｎｍでの励起波長および４０５ｎｍでの発光波長を用いてＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）を用いて決定した。抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の抑制活性を決定するために、細胞を組み換えＥＭＭＰＲＩＮで１５分間刺激した後に抗体を細胞培養に加えた。
【０１２１】
１団のモノクローナル抗体をアイソタイピングに加えてこれらの２つの活性について全てスクリーニングした（表３）。
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
ＣＮＴＯ１４６と称する抗体は、抗血管新生抗ＥＭＭＰＲＩＮ  Ｍａｂの最初の選択基準を満たした。
【０１２４】
腫瘍細胞および線維芽細胞の共培養におけるＭＭＰ−２生産の抑制
共培養アッセイは正常なヒト皮膚線維芽細胞を用いて上記のように行い、そしてヒト黒色腫腫瘍細胞（Ｇ３６１）を使用し、そして市販の抗体ＲＤＩ  ＣＤ１４７もしくはＣＮＴＯ１４６のいずれかを培養物に加えた。無血清培地の最後の交換後３日で、ＭＭＰ−２の量を定量した。データは、ＣＮＴＯ１４６が市販の抗体のようにこれらの共培養物においてＭＭＰ−２生産を抑制できることを示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】異常な血管新生を伴う疾患におけるＥＭＭＰＲＩＮの中心的役割の略図。
【図２】組み換えＥＭＭＰＲＩＮは、ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞によるＭＭＰ−１生産を用量依存的に刺激した。
【図３】中和抗ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体によるＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるＥＭＭＰＲＩＮに誘導されるＭＭＰ−１生産の抑制。
【図４】（Ａ）通常（ＷＴ）より多いもしくは少ない量のＥＭＭＰＲＩＮを発現するように操作されたＭＤＡ  ＭＢ２３１ヒト乳房腫瘍細胞により誘導される相対的内皮細胞遊走、および（Ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体の増加する濃度の存在下でＷＴ細胞により誘導される内皮細胞の遊走の相対的減少を示す１組の棒グラフである。
【図５Ａ】通常（ＷＴ）もしくはＶｅｃｔｏｒコントロール細胞より多い（Ｓ１−３）もしくは少ない（ＡＳ１−５およびＡＳ２−５）量のＥＭＭＰＲＩＮを発現するように操作されたＭＤＡ  ＭＢ２３１ヒト乳房腫瘍細胞により生成される腫瘍の平均最終腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】ＷＴ対Ｓ１−３細胞でのマウスの移植により生成される腫瘍間の血管新生構造の違いを示す顕微鏡写真である。
【図５Ｃ】ＭＤＡ  ＭＢ２３１ヒト乳房腫瘍細胞タイプにより生成される腫瘍におけるヒトＶＥＧＦ（左側のパネル）およびマウスＶＥＧＦ（右側のパネル）の量を示す１組の棒グラフである。
【図６Ａ】ＷＴ、Ｖｅｃｔｏｒコントロール、Ｓ１−３もしくはＡＳ  ＥＭＭＰＲＩＮ改変ヒト腫瘍細胞由来の異種移植片腫瘍からの組織抽出物におけるヒトＥＭＭＰＲＩＮの量を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】１０μｇの総タンパク質を各レーンに加えた場合を含む同じ腫瘍からの組織抽出物におけるＭＭＰ発現プロフィールを示すザイモグラフィーゲルの写真である。
【図６Ｃ】異種移植片腫瘍におけるヒトおよびマウスＭＭＰ−２レベルの定量的測定を示す棒グラフである。
【図６Ｄ】異種移植片腫瘍におけるヒト（左側のパネル）およびマウス（右側のパネル）ＭＭＰ−９レベルの定量的測定を示す１対の棒グラフである。
【図７】ＥＭＭＰＲＩＮを発現するセンス細胞由来の腫瘍における、しかしＷＴもしくはＡＳ細胞由来の腫瘍ではそうでない、多数の新しい毛細血管により明らかな増加した血管新生を示す写真。
【図８】ＭＭＰ、ＶＥＧＦ、ＥＭＭＰＲＩＮの免疫組織化学分析後の腫瘍の写真を示す：Ａ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍のＨ＆Ｅ染色；Ｂ．マウスＭＭＰ−９染色；Ｃ．マウスＥＭＭＰＲＩＮ染色；Ｄ．抗ＣＤ３１抗体での血管染色。左側のパネル−Ｖｅｃｔｏｒコントロール腫瘍；右側のパネル−Ｓ１−３腫瘍。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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