(57)【要約】  本発明は、照明ビーム路を画定する光源と、検出ビーム路を画定し、試料からの検出光を検出するスペクトル検出器とを有し、スペクトル分割部材を含む走査型顕微鏡に関する。この走査型顕微鏡は、スペクトル分割部材が照明ビーム路および検出ビーム路を分離することを特徴とする。
2007500368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明ビーム路を画定する少なくとも１つの光源と、検出ビーム路を画定し、試料からの検出光を検出するスペクトル検出器とを有し、スペクトル検出器がスペクトル分割部材を含む、走査型顕微鏡であって、
前記スペクトル分割部材が前記照明ビーム路および前記検出ビーム路を分離することを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記スペクトル分割部材が回折格子を含むことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記スペクトル分割部材がプリズムを含むことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記プリズムの一境界面が少なくとも部分的に反射コーティングされていることを特徴とする請求項３に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記境界面が検出光または照明光を内面反射することを特徴とする請求項３または４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記境界面が前記照明光または前記検出光を通すことを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記検出光が前記境界面の反射コーティングされた部分に当たり、前記照明光が前記境界面の反射コーティングされていない部分に当たることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記照明光が前記境界面の反射コーティングされた部分に当たり、前記検出光が前記境界面の反射コーティングされていない部分に当たることを特徴とする請求項４〜７のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記境界面の反射コーティングされていない部分に反射防止コーティングが設けられることを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記境界面の反射コーティングされた部分と前記境界面の反射コーティングされていない部分が交互に隣り合って配置されることを特徴とする請求項４〜９のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記境界面が二色性コーティングで被覆されることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記プリズムの一境界面が階段状またはのこぎり歯状の構造をなすことを特徴とする請求項３に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記境界面が前記検出光または前記照明光を内面全反射することを特徴とする請求項３〜１２のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記境界面の内面全反射部および前記境界面の非内面全反射部が交互に隣り合って配置されることを特徴とする請求項１２または１３に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記プリズムの屈折率とは異なる屈折率を有する材料からなるセグメントを一境界面に備えることを特徴とする請求項１３または１４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記走査型顕微鏡が共焦点走査型顕微鏡であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、照明ビーム路を画定する少なくとも１つの光源と、検出ビーム路を画定し、試料からの検出光を検出するスペクトル検出器とを有し、スペクトル検出器がスペクトル分割部材を含む、走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査式顕微鏡法では、試料を光線で照射し、この試料から出射される反射光または蛍光を観察できるようにする。照明光線の焦点は、制御可能な光偏向器によって、対象面内を移動する。この移動は、一般に２つのミラーを傾動させることにより行われるが、多くの場合、その偏向軸は互いに垂直となるように配置され、一方のミラーが光をＸ方向に、他方のミラーが光をＹ方向に偏向させる。例えばガルバノメータ位置調整素子を用いて、ミラーの傾動を行う。走査ビームの位置に応じて、対象物からの光のパワーが測定される。この位置調整素子は、通常、ミラーの現在位置を判定する複数のセンサを備える。
【０００３】
特に、共焦点走査式顕微鏡法では、対象物は光線の焦点を用いて三次元に走査される。
【０００４】
共焦点走査型顕微鏡は、一般に、光源と、光源からの光が励起ピンホールとして知られるピンホール上に合焦される合焦光学系と、ビームスプリッタと、光線を制御する光偏向器と、顕微鏡光学系と、検出用絞りと、検出光および蛍光を検出する複数の検出器を有する。照明光は、例えば、ニュートラルビームスプリッタまたはダイクロイック（二色性）ビームスプリッタとして構成されるビームスプリッタを介して結合されることが多い。ニュートラルビームスプリッタには、その分割比に応じて、多くの励起光または多くの検出光を損失するという欠点がある。
【０００５】
対象物からの蛍光または反射光は、光偏向器を介してビームスプリッタに返され、前記ビームスプリッタを通過した後、複数の検出器が後置される検出用絞りに合焦する。焦点領域に直接由来しない検出光は、これとは別の経路をとって検出用絞りを通過しないため、対象物を順次走査することにより三次元画像を生成するための点情報が取得される。大抵の場合、層状の画像データを撮像することにより三次元画像を取得するが、その際、走査光線の軌道は対象物上または対象物内部を理想的にはジグザグを描くように動く（Ｙ位置一定の下でＸ方向に１つのラインを走査し、さらにＸ方向の走査を維持／停止する。そしてＹ位置を変更して次に走査するラインへと移行し、次にＹ位置一定の下でこのラインをＸ方向に沿って逆向きに走査するなど）。層状の画像データを撮像するためには、１つの層を走査後、試料台または対物レンズが移動し、次に走査される層が対物レンズの合焦面となる。
【０００６】
多くの応用例において、試料は、数個のマーカ、例えば数種類の蛍光色素を用いて作成する。これらの色素は、例えば励起波長の異なる照明光線を複数用いて順次励起させることもできるが、様々な励起波長の光を含む１本の照明光線を用いた同時励起が一般的である。例えば、特許文献１の「多色蛍光用共焦点顕微鏡システム（Confocal Microscope System for Multicolor Fluorescence）」は、いくつかのレーザー線を出射する１つのレーザーを有する装置について開示している。現状では、前述のレーザーのほとんどが混合ガスレーザー、特にＡｒ−Ｋｒレーザーである。
【０００７】
試料から発せられる検出光の同時検出には、マルチバンド検出器を用いることが多い。特許文献２より、選択装置および検出装置を用いて光線の少なくとも２つのスペクトル域を選択および検出するシステムが知られている。高い歩留まりで、異なるスペクトル域を同時に選択および検出することを確実に行い、非常に簡易な構造とするために、このシステムは、選択装置が例えばプリズムまたは回折格子などの光線をスペクトル分割する構成要素と、一方で第１のスペクトル域を遮断し、他方で非遮断スペクトル域の少なくとも一部を反射する手段とを備え、検出装置が遮断された第１のスペクトル域の光路内に配置される第１の検出器と反射されたスペクトル域の光路内に配置される第２の検出器とを備えるように構成されている。第１のスペクトル域を遮断し、他方で非遮断スペクトル域の少なくとも一部を反射する手段は、複数の鏡映絞り側（mirrored aperture sides）を有するスリット絞り装置であることが好ましい。このシステムは特に、走査型顕微鏡内のマルチバンド検出器として使用することができる。
【０００８】
特許文献３より、顕微鏡内において１つ以上の波長を調整可能に結合および／または検出するシステムが知られている。このシステムは、照明光の波長を分離する少なくとも１つの分散素子と、少なくとも１つの波長域を顕微鏡照射方向へ再反射する少なくとも１つの部分的反射素子とからなる。前記反射素子は、照明光の分離された波長部分に配置されている。また、対象物の光の波長分離部分を調整可能に検出するために、少なくとの１つの波長域を調整可能に遮断する手段と、遮断された波長域を検出器の方向に偏向する手段とが設けられる。最後に、遮断される波長域は変化するため、このシステムは高価かつ複雑な構造になることを付言する。
【０００９】
特許文献４より、光源からの照明光が分光計システムによりスペクトル分割され、この分割照明光が波長選択絞りおよび線形照明用の他の分光計システムを介して試料に導かれる半共焦点蛍光顕微鏡が知られている。試料からの検出光は前述の他の分光計システムによってスペクトル分割され、スリット絞りを通過後、波長選択絞りと第３の分光計システムを介して検出システムに導かれる。波長選択絞りは、該当する波長域を設定するために、摺動可能に配置されている。この装置には少なくとも３つの分光計システムが必要であるため、特に製造に費用がかかり、調整が困難である。
【００１０】
【特許文献１】ＥＰ０  ４９５  ９３０号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第４３３０３４７  Ａ１号明細書
【特許文献３】独国特許出願公開第１９３  ４２  ２８８  Ａ１号明細書
【特許文献４】独国特許発明第１９５  １０  １０２  Ｃ１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、製作が簡易でありながら、好ましくは複数の波長を有する照明光を結合し、複数の波長域の検出光を検出することを可能にする走査型顕微鏡を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、スペクトル分割部材が照明ビーム路と検出ビーム路を分離することを特徴とする走査型顕微鏡によって達成される。
【００１３】
本発明は、多種多様な装置に存在する部材、すなわち検出光をスペクトル分割する部材を同時に照明光の結合の際に使用し、結果として、光路を複雑にする他の高額な部材を使用する必要が大幅に減るという利点がある。本発明の走査型顕微鏡において、スペクトル分割部材が主ビーム分離器として機能、つまり照明ビーム路と検出ビーム路とを分離する機能を果たすことが有利であり、これによりニュートラルビーム分離器に基づく主ビーム分離器に生じる問題点、つまり光パワーの大きな損失を避けることができる。
【００１４】
特定の実施形態において、スペクトル分割部材は回折格子として構成されており、この回折格子は、一方で照明光を受光し、その照明光をさらに試料へと導き、他方で試料からの光を回折させることによりスペクトル分割し、検出器へと導く。
【００１５】
走査型顕微鏡の好ましい一実施形態において、スペクトル分割部材はプリズムとして構成されている。
【００１６】
プリズムの一境界面は、少なくとも部分的に反射コーティングされていることが好ましい。特定の実施形態において、スペクトル分割される検出光がプリズムを透過し、その際この境界面の反射コーティングされた部分で反射される。境界面の反射コーティングされた部分の隣またはそれらの間には、反射防止コーティングしなくともよいが、好ましくは、照明光が結合される一つの反射防止コーティングが設けられる。
【００１７】
別の変形形態において、照明光は境界面の反射コーティングされた部分に当たり、検出光は境界面のコーティングされていない部分、または反射防止コーティングされた部分に当たる。
【００１８】
好ましい一実施形態において、境界面の反射コーティングされた部分と境界面の反射コーティングされていない部分は、交互に隣り合って配置される。本発明によると、ストークスシフトの法則により、蛍光を発する試料の場合、たとえばプリズムを境界面に沿って検出光の分割方向と垂直に移動させることにより、照明光の波長がスペクトル的に検出光の波長に向かってずれるという事実を利用して、照明／検出波長域を設定することができる。
【００１９】
特に好ましい実施形態において、特に安定性があり小型かつ簡易設計を実現するために、スペクトル分割部材は固定して配置されている。そのため、使用する照明線の数および波長を変更することはできないが、大抵の顕微鏡使用には十分である。
【００２０】
かかる１つまたは複数の照明光線を境界面のコーティングされた部分またはコーティングされていない部分を基準にずらすことにより、光のパワーを容易に制御することができる。このため、１つまたは複数の照明光線は横方向にカットされる。
【００２１】
照明光が結合する境界面部分は、その幅が約１００μｍであることが好ましい。照明光が結合する境界面部分の幅に対する検出光が検出器に到達する際に通過する境界面部分の幅の割合は、検出スペクトルの小さなギャップをなくすために、できるだけ大きい方が好ましい。
【００２２】
他の特に好ましい変形形態において、検出光または照明光のどちらかが内面全反射される。この変形には、反射コーティングは必要ない。これを実行するには、プリズムの境界面は、例えば、検出光が内面全反射される角度で境界面に当たり、照明光が透過する角度で境界面に当たるような階段状またはのこぎり歯状の構造をしていることが好ましい。もちろん、その反対も可能である。つまり、照明光が内面全反射され、検出光が透過するようにしてもよい。
【００２３】
別の変形において、境界面は、プリズムの屈折率と異なる屈折率を有する材料からなるセグメントを備える。そのため、境界面の内面全反射する領域と内面全反射を示さない領域を並んで配置するという簡潔な方法で構成される。
【００２４】
好ましい実施形態において、照明光は、例えば３つの選択されたレーザー線（例えば、４８８ｎｍ、５６０ｎｍ、６３３ｎｍ、また、好ましくは限定的に予め決定する任意の他の組み合わせ）を含む。これらのレーザー線は、検出光線と同一線上になるように、コーティングされた境界面を適切な角度で透過し、プリズム内で結合する。次に、照明ビーム路は逆側へと進み、照明および検出ピンホール（この変形において、照明ピンホールと検出ピンホールは同一である）を通り、ビーム偏向ユニットに到達し、チューブレンズと走査レンズを介し、対物レンズを通って試料へと導かれる。
【００２５】
また、４本以上のレーザー線を有する照明光を使用することもできるが、例えばビームスプリッタを基本とする走査型顕微鏡では使用することができない。その理由は、現在のところマルチクロイック（多色性）ビームスプリッタは存在せず、４本以上のレーザー線を有する照明光は、顕微鏡内で同時に結合する可能性がある。
【００２６】
本発明によると、波長が５３２ｎｍの照明光の結合も有利に行うことができるが、５３２ｎｍレーザー線はＡｒレーザー線の波長に非常に近いため、現行のビームスプリッタでは結合させることはできない。
【００２７】
好ましくは、境界面で分割された検出光の空間的な幅は約１ｃｍであり、これは約４００ｎｍのスペクトル幅に相当する。したがって、１００μｍ幅のコーティングされていないか反射防止コーティングされている結合スリットによって、それぞれたった４ｎｍのスリットが検出スペクトルから切り取られることになり、これはほとんどの用途で許容される。さらに、反射された照明光は同じ境界面を通ってレーザーに戻り、有利には検出ビーム路から放される。
【００２８】
また、照明光を境界面の無反射部分、つまり結合スリット上でそれほど強く合焦させる必要がないように、境界面で分割する空間スペクトルが大きくなる他のプリズムまたは他の種類のプリズムを使用することも考えられる。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、走査型顕微鏡は、共焦点走査型顕微鏡として構成される。
【００３０】
図面には、本発明の目的が概略的に示されており、その図面を参照しながら以下に説明する。同じ動作を行う構成要素には、同じ参照番号を付す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図１は、波長が４８８ｎｍの第１の照明光線３を出射する第１の光源１と、波長が５６０ｎｍの第２の照明光線７を出射する第２の光源５と、波長が６３３ｎｍの第３の照明光線１１を出射する第３の光源９とを有する走査型顕微鏡である。照明光線３、７、１１（破線で示す）は、プリズム１７として構成されるスペクトル分割部材１５の部分的にコーティングされている境界面１３に当たる。プリズム１７の境界面１３は、反射領域と無反射領域を有する。照明光線３、７、１１は、反射領域の間にある無反射領域に当たり、照明光線３、７、１１はプリズムを透過し、プリズムの別の境界面から出た後、ピンホール２１と同一線上に組み合わされた視野レンズ１９を透過して、カルダン方式で吊り下げられた走査ミラー２５を含むビーム偏向ユニット２３に到達する。ビーム偏向ユニット２３は、同一線上に集束された照明光線３、７、１１を走査レンズ２７、チューブレンズ２９、対物レンズ３１を通って、試料３３の内部または上部に導く。試料からの検出光３５は、同じ光路、つまり対物レンズ３１、チューブレンズ２９、走査レンズ２７を進み、ビーム偏向ユニット２３を介し、ピンホール２１に戻ってピンホールを通過し、視野レンズ１９を透過後、プリズム１７によって空間スペクトル分割される。プリズム１７を透過する際、検出光は境界面１３の反射コーティングされた部分によって内面反射され、空間スペクトル分割されたビームはプリズム１７の第３の境界面から出て、図示しない検出器に到達する。
【００３２】
図２は、図１で示した本発明の走査型顕微鏡の詳細図である。プリズムの境界面１３は、検出光を内面反射する反射領域３７と、照明光線３、７、１１が結合する反射防止コーティング領域３９とを有する。本構成において、ピンホール２１は、照明ピンホールおよび検出ピンホールとしての役割を果たす。
【００３３】
図３は、スペクトル分割部材１５とコーティングされた境界面１３の詳しい側面図である。境界面１３上に交互に配置されているのは、反射領域３７と反射防止コーティングされた無反射領域３９である。無反射領域３９の幅は、反射領域の幅と比べて誇張して描かれている。検出スペクトルのギャップを大きくしないように、無反射領域の幅はたった数分の１ミリメートルであり、反射領域の幅は数分の１センチメートルの範囲内である。
【００３４】
図４は、他のスペクトル分割部材の詳細図であり、これもまたプリズムの形態をとる。境界面１３は、のこぎり歯状構造４１を有する。この変形において、検出光は内面全反射するが、のこぎり歯構造のため、照明光は全反射の角度に制限がない箇所で境界面１３を透過する。
【００３５】
本発明について、特定の例示的実施形態を参照して説明したが、請求項の権利保護範囲を逸脱することがなく、変形および変更を行い得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の走査型顕微鏡を示す。
【図２】本発明の走査型顕微鏡の詳細図である。
【図３】スペクトル分割部材の詳細図である。
【図４】別のスペクトル分割部材の詳細図である。
【符号の説明】
【００３７】
１  第１の光源
３  第１の照明光線
５  第２の光源
７  第２の照明光線
９  第３の光源
１１  第３の照明光線
１３  境界面
１５  スペクトル分割部材
１７  プリズム
１９  視野レンズ
２１  ピンホール
２３  ビーム偏向ユニット
２５  走査ミラー
２７  走査レンズ
２９  チューブレンズ
３１  対物レンズ
３３  試料
３５  検出光
３７  反射領域
３９  反射防止コーティング領域
４１  のこぎり歯状構造
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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