(57)【要約】  本発明は、インビボイメージングのための診断造影剤に関する。その造影剤は、インビボ診断イメージングに適する造影性基で標識した合成カスパーゼ−３阻害剤を含む。本発明は、又、キット造影剤を含む医薬及び放射性医薬組成物と共に放射性医薬品の調製のためのキットを提供する。放射性又は常磁性金属イオンを含む造影剤の調製に適したカスパーゼ−３阻害剤のキレーターコンジュゲートも記載されている。該造影剤は、カスパーゼ−３が関与するさまざまな疾患状態のインビボ診断イメージング及び又は治療モニタリングのために有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造影性基で標識した合成カスパーゼ−３阻害剤を含む造影剤であって、カスパーゼ−３阻害剤が、カスパーゼ−３に対して２０００ｎＭ未満のＫｉを有しており、哺乳類生体内への標識カスパーゼ−３投与後に外部から非侵襲的に又はインビボ用に設計された検出器の使用によって造影性基を検出することができる造影剤。
【請求項２】
合成カスパーゼ−３阻害剤がカスパーゼ−３に対して５００ｎＭ未満のＫｉを有する、請求項１記載の造影剤。
【請求項３】
合成カスパーゼ−３阻害剤が１５０〜３０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は請求項２記載の造影剤。
【請求項４】
造影性基が以下の（ｉ）〜（ｖｉ）を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の造影剤。
（ｉ）放射性金属イオン、
（ｉｉ）常磁性金属イオン、
（ｉｉｉ）γ線放出型放射性ハロゲン、
（ｉｖ）陽電子放出型放射性非金属、
（ｖ）過分極ＮＭＲ活性核種、
（ｖｉ）インビボイメージングに適した光学色素。
【請求項５】
４〜２０量体のリーダーペプチド配列をさらに含み、該リーダーペプチドが、インビボでの細胞膜の哺乳類細胞の外側から内側への輸送を促進する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項６】
合成カスパーゼ−３阻害剤コンジュゲートが次の式Ｉで表される、請求項５記載の造影剤。
【化１】
2007512302.tif 000038
式中、
｛阻害剤｝は、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のカスパーゼ−３阻害剤であり、
［リーダーペプチド］は請求項４記載の通りであって、そのアミン末端又はカルボキシル末端のいずれかで結合しており、
−（Ａ）ｎ−は、各Ａが独立に、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４〜８シクロへテロアルキレン基、Ｃ４〜８シクロアルキレン基、Ｃ５〜１２アリーレン基、若しくはＣ３〜１２へテロアリーレン基、アミノ酸、又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成要素であるリンカー基であり、
Ｒは独立に、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、Ｃ１〜４アルコキシアルキル、又はＣ１〜４ヒドロキシアルキルから選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｍは、０又は１であり、
Ｘａは、Ｈ、ＯＨ、Ｈａｌ、ＮＨ２、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４アルコキシアルキル、Ｃ１〜４ヒドロキシアルキルであるか、或いはＸａは、造影性基である。
【請求項７】
放射性金属イオンがγ線放射体又は陽電子放射体である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項８】
放射性金属イオンが９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ又は６８Ｇａである、請求項７記載の造影剤。
【請求項９】
常磁性金属イオンがＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）又はＦｅ（ＩＩＩ）である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項１０】
γ線放出型放射性ハロゲンが１２３Ｉである、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項１１】
陽電子放出型放射性非金属が１８Ｆ、１１Ｃ、１２４Ｉ又は１３Ｎから選択される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項１２】
合成カスパーゼ−３阻害剤が以下の（ｉ）〜（ｉｘ）で定義される１種又は複数のカスパーゼ−３阻害剤を含む請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の造影剤。
（ｉ）式ＩＩＩのテトラペプチド誘導体
Ｚ１−Ａｓｐ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ａｓｐ−Ｘ１  （ＩＩＩ）
（式中、Ｚ１は、テトラペプチドのＮ末端に結合した代謝阻害基であり、
Ｘａａ１及びＸａａ２は独立に、任意のアミノ酸であり、
Ｘ１は、テトラペプチドのカルボキシ末端に結合した−Ｒ１又は−ＣＨ２ＯＲ２基であり、
Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜５アルコキシ又は−（ＣＨ２）ｑＡｒ１であり、
ｑは、１〜６の整数であり、Ａｒ１は、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ５〜１２アルキル−アリール、Ｃ５〜１２フルオロ置換アリール又はＣ３〜１２ヘテロアリールであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜１０アシル又はＡｒ１である）、
（ｉｉ）キナゾリン又はアニリノキナゾリン、
（ｉｉｉ）２−オキシインドールスルホンアミド、
（ｉｖ）オキソアゼピノインドリン、
（ｖ）式ＩＶの化合物
【化２】
2007512302.tif 000039
（式中、Ｘ２は、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル又は−（ＣＨ２）ｒ−（Ｓ）ｓ−（ＣＨ２）ｔＡｒ３であり、ｒ及びｔは、０〜６の整数であり、ｓは、０又は１であり、Ａｒ３は、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ５〜１２アルキル置換アリール、Ｃ５〜１２ハロ置換アリール又はＣ３〜１２ヘテロアリールであり、
Ａｒ２は、Ｃ６〜１２アリール又はＣ３〜１２ヘテロアリールであり、
Ｘ３は、Ｒｂ基であり、
Ｘ４は、−ＳＯ２−又は−ＣＲ２−であり、
Ｒａは、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル又はＰＧＰであり、ＰＧＰは保護基であり、
Ｒｂは、Ｒａ基又はＣ１〜５アシルであり、
各Ｒｃは独立に、Ｈ又はＣ１〜５アルキルである）、
（ｖｉ）式Ｖの化合物
【化３】
2007512302.tif 000040
（ｖｉｉ）ピラジノン、
（ｖｉｉｉ）式ＶＩのジペプチド
Ｚ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ１  （ＶＩ）
（式中、−ＣＨ２ＳＲ１基は、ジペプチドのカルボキシ末端に結合しており、Ｚ１及びＲ１は、式（ＩＩＩ）について定義の通りである）、
（ｉｘ）式ＸＩのサリチル酸スルホンアミド
【化４】
2007512302.tif 000041
（式中、Ａｒ６は、５又は６員のＣ４〜６アリール又はヘテロアリール環であり、Ｘ６は、Ｈ又は−ＣＨ２ＳＲ２であり、Ｒ２は上記で定義した通りである）。
【請求項１３】
合成カスパーゼ−３阻害剤が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかを含む請求項１２記載の造影剤。
（ｉ）式ＩＩＩのテトラペプチド、
（ｉｉ）２−オキシインドールスルホンアミド、
（ｉｉｉ）式ＶＩのジペプチド。
【請求項１４】
合成カスパーゼ−３阻害剤がカスパーゼ−３に対してカスパーゼ−１より少なくとも５０倍選択的である、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項１５】
合成カスパーゼ−３阻害剤が式ＩＩＩのテトラペプチド又は式ＶＩのジペプチドを含む、請求項１３又は請求項１４記載の造影剤。
【請求項１６】
請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の造影剤を、生体適合性担体と共に哺乳類投与に適した形態で含む医薬組成物。
【請求項１７】
造影性基が放射性である請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の造影剤を、生体適合性担体と共に哺乳類投与に適した形態で含む放射性医薬組成物。
【請求項１８】
造影性基が陽電子放出型放射性非金属又はγ線放出型放射性ハロゲンを含む、請求項１７記載の放射性医薬組成物。
【請求項１９】
造影性基が放射性金属イオンを含む、請求項１７記載の放射性医薬組成物。
【請求項２０】
合成カスパーゼ−３阻害剤のリガンドとのコンジュゲートであって、カスパーゼ−３阻害剤が、カスパーゼ−３に対して２０００ｎＭ未満のＫｉを有しており、リガンドが、放射性又は常磁性金属イオンと金属錯体を形成することができるコンジュゲート。
【請求項２１】
以下の式Ｉｂで表される、請求項２０記載のコンジュゲート。
【化５】
2007512302.tif 000042
式中、Ａ、ｎ、ｍ、及びＸａは、請求項６記載の通りである。
【請求項２２】
リガンドがキレート剤である、請求項２０又は請求項２１記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
キレート剤がジアミンジオキシム、Ｎ２Ｓ２又はＮ３Ｓドナーセットを有する、請求項２２記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
請求項１９記載の放射性医薬組成物を調製するためのキットであって、請求項２０乃至請求項２３のいずれか１項記載のコンジュゲートを含むキット。
【請求項２５】
放射性金属イオンが９９ｍＴｃであり、キットが生体適合性の還元剤をさらに含む、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のカスパーゼ−３阻害剤の非放射性誘導体である前駆体を含む、請求項１８記載の放射性医薬組成物を調製するためのキットであって、非放射性誘導体が、陽電子放出型放射性非金属又はγ線放出型放射性ハロゲン源と反応して所望の放射性医薬品を生じることができるキット。
【請求項２７】
前駆体が無菌で非発熱性の形態をしている、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
陽電子放出型放射性非金属又はγ線放出型放射性ハロゲン源が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）から選択される、請求項２６又は請求項２７記載のキット。
（ｉ）ハロゲン化物イオン又はＦ＋若しくはＩ＋、
（ｉｉ）ハロゲン化アルキル、ハロゲン化フルオロアルキル、トシレート、トリフレート又はメシレートから選択されるアルキル化剤。
【請求項２９】
非放射性誘導体が以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される、請求項２４乃至請求項２８のいずれか１項記載のキット。
（ｉ）トリアルキルスタンナン又はトリアルキルシラン等の有機金属誘導体、
（ｉｉ）求核置換のためのハロゲン化アルキル、アルキルトシレート又はアルキルメシレートを含む誘導体、
（ｉｉｉ）求核又は求電子置換のために活性化された芳香族環を含む誘導体、
（ｉｖ）容易にアルキル化を起こす官能基を含む誘導体、
（ｖ）チオール含有化合物をアルキル化してチオエーテル含有生成物を生じさせる誘導体。
【請求項３０】
前駆体が固相に結合している請求項２６乃至請求項２９のいずれか１項記載のキット。
【請求項３１】
哺乳類の身体のカスパーゼ−３が関係する疾患状態の診断法における請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の造影剤の使用であって、請求項１６記載の医薬組成物又は請求項１７乃至請求項１９のいずれか１項記載の放射性医薬組成物が、哺乳類に予め投与される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボイメージングのための診断造影剤に関する。該造影剤は、生体内での診断イメージングに適した造影性基で標識した合成カスパーゼ−３−阻害剤を含む。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスによるプログラム細胞死は、複雑なプロセスであり、調節の水準が多数ある数々の細胞プロセスを伴う。それは２つの経路の１つによって開始される。１番目は、細胞表面の細胞死受容体で開始される外因性の経路を経由し、２番目は、ＵＶ照射によるＤＮＡの損傷等の内因性イニシエータを介する。これらの経路は両方とも、エネルギーを必要とし、壊死による細胞死とは異なり炎症反応を伴わない細胞の組織的な死に達する。アポトーシスに関係する細胞は、それらの細胞表面に「イートミー」シグナルを出して、他の細胞を招き、ファゴサイトーシス（貪食作用）によってそれらを消費させる。
【０００３】
アポトーシスは、体内の多数のプロセスにおける重要な事象である。例えば、胚発生は、アポトーシスに完全に依存しており、急速に代謝回転する組織は、深刻な病理学的影響を避けるための厳密な制御が必要である。アポトーシス制御の失敗は、癌（不十分な細胞死）及びアルツハイマー病（過多な細胞死）のような神経症状を起こし得る。さらにアポトーシスは、また、虚血／再灌流傷害の後の心臓内の部位などの組織の損傷につながり得る。
【０００４】
アネキシン−５は、アポトーシス細胞の外側膜でホスファチジルセリン（ＰＳ）に約１０−９Ｍの親和力で結合する内在性のヒトタンパク質（ＲＭＭ３６ｋＤａ）である。９９ｍＴｃ標識アネキシン−５が、生体内でアポトーシスをイメージ化するために使用されている［Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，  ４０，  １８４−１９１  （１９９９）］。しかしながら、この取り組みにはいくつかの問題がある。第１に、アネキシン−５は、壊死細胞にも入って細胞膜の内部小葉に露出したＰＳに結合することができ、それによって誤った陽性の結果をもたらし得る。第２は、標識アネキシン−５を注射した後少なくとも２時間にわたって維持される高い血液プール活性である。このことは、イメージングの最適の時機選びが注射後１０時間と１５時間の間であることを意味し［Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，  ２６５  （１−２），  １２３−３２  （２００２）］、急性冠不全症候群の患者の医療判断をするためには不適切である。さらに、アネキシン−５の排除は、腹部における非常に強いバックグラウンド信号を伴って腎臓及び肝臓を経由して起こる。これは、腹部の細胞死のイメージング（例えば生体腎臓の移植及び腫瘍のモニタリングにおける）を不可能にする。
【０００５】
国際公開第０１／８９５８４号は、実施例１６から１８及び２１においてカスパーゼ−３基質テトラペプチドＤＥＶＤのキレーターコンジュゲート（即ち、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ）が、ＭＲＩ又はシンチグラフィーを用いるアポトーシス組織のインビボイメージングに有用であることを開示している。
【０００６】
Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ，  ［Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，  ２８，  ７９３−７９８  （２００１）］は、可能性のあるアポトーシス造影剤として、放射性同位元素の１３１Ｉで標識したパン−カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、即ち、ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＤＬ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）−フルオロメチルケトンについて研究した。彼らは、その薬剤の細胞への取り込みの絶対量が低いことを見出し、これを活性化型カスパーゼ１個当たり１個のみの阻害剤分子を捕捉することに帰した。彼らは、標識カスパーゼ基質は、この問題を被るはずがなく、造影剤へのより優れたアプローチであると結論付けた。
【０００７】
アポトーシスイメージングに対する放射性医薬品は、  Ｌａｈｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，  ３１，  ８８７−９１９  （２００４）］に概説されている。
【０００８】
それ故、迅速（例えば注射後１時間以内）で、且つ血液及びバックグラウンド臓器からの優れたクリアランスを有するイメージングを可能にするアポトーシス造影剤に対する必要性が依然として存在する。
【特許文献１】国際公開第０１／８９５８４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／０７７２８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第００／３２２３６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９１／０１１４４号パンフレット
【特許文献５】米国特許第４８８５３６３号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／１１１０９号パンフレット
【特許文献７】米国特許第６４４４８１１号明細書
【特許文献８】国際公開第０３／０２４９５５号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０３／００２４８９号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０３／００２１５７号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．  ４０，  １８４−１９１  （１９９９）
【非特許文献２】Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，  ２６５  （１−２），  １２３−３２  （２００２）
【非特許文献３】Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．  ２８，  ７９３−７９８  （２００１）
【非特許文献４】Ｌａｈｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，  ３１，  ８８７−９１９  （２００４）
【非特許文献５】Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．  Ｌ．，  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｏｘ，  Ｍ．  Ｍ．  （１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２ｎｄ  ｅｄｎ．）  Ｗｏｒｔｈ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献６】Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （４ｔｈ  ｅｄｎ．）  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献７】Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ  Ｑ  Ｊ．Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，  ４３（２）：１５９−６２  （１９９９）
【非特許文献８】Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １５；  ２６３（３２）：１６７０９−１３  （１９８８）
【非特許文献９】Ｔａｍｕｒａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  Ｔｏｋｙｏ  ４１，  ９７８−９８０  （１９９３）
【非特許文献１０】Ｍｉｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２４；  ３１０（３）：７３０−４  （２００３）
【非特許文献１１】Ｐｏｔｏｃｋｙ  ＴＢ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ｓｅｐ  ２９  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
【非特許文献１２】Ｋｏｋｒｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．；  ３２７（２）：２３１−６  （１９９３）
【非特許文献１３】Ｊｕｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，  ９９，  ２２０５−２２１８  （１９９９）
【非特許文献１４】Ｂｏｌｔｏｎ，  Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）
【非特許文献１５】Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｏｍｐ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．  ４５，  １０４５−１０５３  （２００２）
【非特許文献１６】Ｂｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９３，  ２８９７  （１９７１）
【非特許文献１７】Ｐｏｅｔｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ  ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．，  ４５，  ８９２−９０２  （２００４）
【非特許文献１８】Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  １９（３），  ２７５−２８１  （１９９２）
【非特許文献１９】Ｊｏｈｎｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．，  １０３  （Ｓｕｐｐｌ．  ４８），  ４５−８５  （２００２）
【非特許文献２０】’Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，  Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  （Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９）
【非特許文献２１】Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２  （２９），  １７９０７−１７９１１  （１９９７）
【非特許文献２２】Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７３  （４９），  ３２６０８−３２６１３  （１９９８）
【非特許文献２３】Ｐ．  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｆ．  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｇｉｒａｌｄ；  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７
【非特許文献２４】Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｔｈｅｒ．，  ３０４（１），  ４３３−４４０  （２００３）
【非特許文献２５】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  １６００７−１６０１４  （２０００）
【非特許文献２６】Ｄｅｃｋｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．  Ｒｅｓ．，  ５２，  ５７９−５８６  （２００１）
【非特許文献２７】Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １（６），  ４９６−５０１  （２０００）
【非特許文献２８】Ｃｈｅｍ．  Ｈｅｔｅｒ．  Ｃｏｍｐ．  ２００２，  ３６（９），  １０９１−６
【非特許文献２９】Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９９８，  ４１（２３），  ４４６６−７４
【非特許文献３０】Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ２００４，  １４，  ８０５−８０８）
【非特許文献３１】Ｃｈｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４５，  ５００５−５０２２  （２００２）
【非特許文献３２】Ｅｒｌａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２１，  ３０８−３１４  （２００３）
【非特許文献３３】Ｂｏｌｔｏｎ，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｏｍｐ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，  ４５，  ４８５−５２８  （２００２）
【非特許文献３４】Ｂａｒａｎｙ，  Ｇ；  Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｍｕｌｌｅｎ，  Ｄ．Ｇ．  （１９８７）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，  ７０５−７３９
【非特許文献３５】Ｗｅｌｌｉｎｇｓ，  Ｄ．Ａ．，  Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｅ．  （１９９７）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｇ．  ｅｄ），  ２８９，  ｐ．  ５３−５４，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３６】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ：  ”Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｂａｋ  ｉｎ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ａｕｇ  ２００１；  ２７６：  ３４３０７−３４３１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
今回、造影性基で標識した合成カスパーゼ−３阻害剤が、異常なアポトーシス特に過剰なアポトーシスが関与する哺乳類の身体の疾患のインビボイメージングのための有用な診断造影剤であることが見出された。
【００１０】
その造影性基は、放射性（例えば、放射性金属イオン、γ線放出型放射性ハロゲン又は陽電子放出型放射性非金属）であるか又は非放射性（例えば、常磁性金属イオン、過分極ＮＭＲ活性核種又はインビボイメージングに適した光学色素）であり得る。
【００１１】
過剰のアポトーシスは、広範なヒトの疾患と関係しており、これらの傷害の多くの進行におけるカスパーゼの重要性が証明されている。従って、本発明の造影剤は、
（ａ）心臓及び脳の虚血性／再灌流障害（例えば、それぞれ心筋梗塞又は脳梗塞）、脊髄損傷、外傷性脳損傷、移植手術中の臓器拒絶反応、肝臓変性症（例えば、肝炎）、敗血症及び細菌性髄膜炎等の急性の傷害；
（ｂ）神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、ダウン症候群、脊髄性筋萎縮症、多発性硬化症、パーキンソン病）、免疫不全症（例えばＨＩＶ）、関節炎、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病等の慢性の傷害；
（ｃ）膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌等の癌においてアポトーシスを誘発するために使用される薬剤についての効果をモニタリングすること
を含む一連の疾患状態における生体内画像診断及び又は治療モニタリングのために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
第１の態様において、本発明は、造影性基で標識した合成カスパーゼ−３阻害剤を含む造影剤であって、カスパーゼ−３阻害剤が、カスパーゼ−３に対して２０００ｎＭ未満のＫｉを有しており、前記哺乳類生体内への標識カスパーゼ−３投与後に造影性基を、血管内放射線検出器又は光学検出器（例えば内視鏡）或いは手術中の使用のために設計された放射線検出器等、外部から非侵襲的に、又はインビボで使用されるように設計された検出器の使用によって検出することができる造影剤を提供する。
【００１３】
今までに少なくとも１４個の異なるカスパーゼの存在がヒトにおいて確認されており、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２などと呼ばれている。カスパーゼ類は、次の３つの主要な機能別カテゴリーに分類されており、
グループＩカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−１、−４、−５及び−１３）は、主として炎症反応経路と関係し、
グループＩＩカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３、−６及び−７）は、エフェクター又は「殺し屋」カスパーゼであり、
グループＩＩＩカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−８、−９及び−２）は、イニシエータカスパーゼである。
【００１４】
本発明は、ＣＰＰ３２としても知られており、２９ｋＤａシステインプロテアーゼであるカスパーゼ−３の阻害剤に関する。
【００１５】
本発明の好適な造影剤は、良好な細胞膜透過性を示し、それ故、細胞内酵素であるカスパーゼ−３を標的にすることができる。細胞膜輸送を容易にするために、本発明の造影剤は、適宜下で定義する「リーダーペプチド」を含むことができる。好ましい造影剤は、生体内で容易に代謝されることはなく、そのため、ヒトで６０〜２４０分のインビボ半減期を有するのが最も好ましい。造影剤は、腎臓で排出される（即ち、尿中排泄を示す）のが好ましい。造影剤は、アポトーシスの焦点において示すシグナル対バックグラウンド比が、好ましくは少なくとも１．５、最も好ましくは少なくとも５であり、少なくとも１０が特に好ましい。造影性基が、放射性である場合、生体内で非特異的に結合しているか遊離しているかのいずれかである造影剤のピーク水準の２分の１のクリアランスは、放射性同位体の放射性崩壊の半減期以下の期間で現れるのが好ましい。
【００１６】
造影剤の分子量は、適切には５０００ダルトンまでである。好ましくは、分子量は１５０〜３０００ダルトンの範囲、最も好ましくは２００〜１５００ダルトンの範囲であり、３００〜８００ダルトンが特に好ましい。
【００１７】
本発明の適切な合成カスパーゼ−３阻害剤は、カスパーゼ−３に対して２０００ｎＭ未満のＫｉを示す。カスパーゼ−３は、殆どすべての組織内で他のカスパーゼと対比して高濃度で発現させることができ、他のグループＩＩのカスパーゼと比較して高い触媒活性を示す。カスパーゼ−３は、しかしながら、アポトーシスの間の活性な形態でのみ発現する。このことが、本発明の標識阻害剤が良好なシグナル対ノイズを備えた実現性のある造影剤であるための基礎を形成している。阻害定数Ｋｉは、酵素−阻害剤結合に対する解離定数である［Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．  Ｌ．，  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｏｘ，  Ｍ．  Ｍ．  （１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２ｎｄ  ｅｄｎ．）  Ｗｏｒｔｈ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （４ｔｈ  ｅｄｎ．）  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］。好ましくは、阻害剤は、カスパーゼ−３に対して５００ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満のＫｉを有する。本発明の合成カスパーゼ−３阻害剤は、又、カスパーゼ−３に対して他のカスパーゼよりも好ましくは選択的である。上記選択的阻害剤は、Ｋｉで規定して、カスパーゼ−３に対して、カスパーゼ−１より少なくとも５０倍、好ましくは少なくとも１００倍、最も好ましくは少なくとも５００倍大きい効能を適切には示す。
【００１８】
本発明の好ましい合成カスパーゼ−３阻害剤は、不可逆性、即ち、酵素に共有結合で結合する。カスパーゼ−３は、細胞内酵素であるため、好ましいカスパーゼ−３阻害剤は、良好な細胞膜透過性を示す（即ち、生体内で哺乳類細胞膜を超えて効率よく輸送される）。この点おいては、非ペプチド阻害剤が好ましい。
【００１９】
用語「標識」とは、カスパーゼ−３阻害剤それ自体が、造影性基を含むか、又はその造影性基が、式Ｉについて下に示すように、さらなる核種として、適宜リンカー基を介して結合しているかのいずれかを意味する。カスパーゼ−３阻害剤それ自体が造影性基を含むとき、それは、「造影性基」がその阻害剤の化学構造の一部を形成しており、放射性又は非放射性同位体が天然に存在する量のレベルより著しく高いレベルで存在する前記同位体であることを意味する。上記の同位体の高められたレベル又は濃縮されたレベルとは、問題にしている同位体の天然に存在する量のレベルの、適切には５倍、好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍、理想的には少なくとも５０倍であるか、さもなくば、問題にしている同位体の濃縮度のレベルが９０％から１００％であるレベルで存在する。「造影性基」を含むカスパーゼ−３阻害剤の例を以下に記載するが、造影性基が、カスパーゼ−３阻害剤の化学構造中の同位体標識をした１３Ｃ、１１Ｃ又は１８Ｆであるように、１３Ｃ又は１１Ｃのレベルを高めたＣＨ３基及び１８Ｆのレベルを高めたフルオロアルキル基を含む。放射性同位元素３Ｈ及び１４Ｃは、適切な造影性基ではない。
【００２０】
「造影性基」は、哺乳類の体外から検出できるものか又はインビボで使用されるように設計された検出器の使用を介して検出され、例えば血管内照射又は光学的検出器、例えば内視鏡又は施術内使用のために設計された放射能検出器で検出し得る。好ましい造影性基は生体内投与後に非侵襲的な方法で外部から検出できるものである。その「造影性基」は、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）から好ましくは選択される。
（ｉ）放射性金属イオン、
（ｉｉ）常磁性金属イオン、
（ｉｉｉ）γ線放出型放射性ハロゲン、
（ｉｖ）陽電子放出型放射性非金属、
（ｖ）過分極ＮＭＲ活性核種、
（ｖｉ）インビボイメージングに適した光学色素。
最も好ましい造影性基は、放射性、特に放射性金属イオン、γ線放出型放射性ハロゲン及び陽電子放出型放射性非金属、特にＳＰＥＣＴ又はＰＥＴを用いたイメージングに適したものである。
【００２１】
造影性基が放射性金属イオン、即ち放射性金属である場合は、用語「放射性金属」は、放射能を持った遷移元素に加えてランタニド及びアクチニド、並びに金属主族元素を含む。半金属のヒ素、セレン及びテルルはその範囲から除かれる。適切な放射性金属は、陽電子放出体、例えば６４Ｃｕ、４８Ｖ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、９４ｍＴｃ又は６８Ｇａ、γ放射体、例えば９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、６７Ｃｕ又は６７Ｇａであり得る。好ましい放射性金属は９９ｍＴｃ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ及び１１１Ｉｎである。最も好ましい放射性金属はγ放射体、特に９９ｍＴｃである。
【００２２】
造影性基が常磁性金属イオンである場合は、適切なかかる金属イオンとしては、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）又はＤｙ（ＩＩＩ）が挙げられる。好ましい常磁性金属イオンはＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）であり、Ｇｄ（ＩＩＩ）が特に好ましい。
【００２３】
造影性基がγ線放出型放射性ハロゲンである場合は、放射性ハロゲンは、１２３Ｉ、１３１Ｉ又は７７Ｂｒから適宜選択される。好ましいγ線放出型放射性ハロゲンは、１２３Ｉである。
【００２４】
造影性基が陽電子放出型放射性非金属である場合は、かかる陽電子放出体の適当なものとして、１１Ｃ、１３Ｎ、１７Ｆ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ又は１２４Ｉが挙げられる。好ましい陽電子放出型放射性非金属は１１Ｃ、１３Ｎ、１２４Ｉ及び１８Ｆであり、特に好ましくは１１Ｃ及び１８Ｆであり、最も好ましくは１８Ｆである。
【００２５】
造影性基が過分極ＮＭＲ活性核種である場合は、かかるＮＭＲ活性核種は非ゼロ核スピンを有し、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、２９Ｓｉ及び３１Ｐが挙げられる。これらのうち、１３Ｃが好ましい。「過分極」という用語は、ＮＭＲ活性核種の分極の程度がその平衡分極を超えていることを意味する。１３Ｃの天然の存在量（１２Ｃと比較して）は約１％であり、適当な１３Ｃ標識化合物は、過分極される前に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％の存在量となるように適宜濃縮される。本発明のカスパーゼ−３阻害剤の炭素含有置換基の少なくとも１つの炭素原子は、１３Ｃで適宜濃縮し、それをその後過分極させる。
【００２６】
造影性基が生体内光学イメージングに適したレポーターである場合は、そのレポーターは光学イメージング手順において直接又は間接的に検出できる何らかの部分である。そのレポーターは光散乱体（例えば着色又は未着色粒子）、光吸収体又は光放射体であり得る。さらに好ましくは、レポーターは発色団又は蛍光化合物のような染料である。染料は紫外乃至近赤外域の波長を有する電磁スペクトルの光と相互作用する任意の染料であり得る。最も好ましくは、レポーターは蛍光特性を有する。
【００２７】
好ましい有機発色団及び蛍光団レポーターとしては、広範囲に非局在化した電子系を有する基、シアニン、メロシアニン、インドシアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン、ポルフィリン、ピリリウム染料、チアピリリアプ染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、アズレニウム染料、インドアニリン、ベンゾフェノキサジニウム染料、ベンゾチアフェノチアジニウム染料、アントラキノン、ナフトキノン、インダスレン、フタロイルアクリドン、トリスフェノキノン、アゾ染料、分子内及び分子間電荷移動染料及び染料錯体、トロポン、テトラジン、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、ヨードアニリン染料、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体が挙げられる。蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び吸収／発光特性の異なるＧＦＰの修飾物も有用である。ある種の希土類金属（例えばユーロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体も、蛍光ナノ結晶（量子ドット）のような特定の状況で用いられる。
【００２８】
使用し得る発色団の具体例としては、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、マリーナブルー、パシフィックブルー、オレゴングリーン８８、オレゴングリーン５１４、テトラメチルローダミン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０が挙げられる。
【００２９】
特に好ましいのは、４００ｎｍと３μｍの間、特に６００ｎｍと１３００ｎｍの間の可視又は近赤外域に吸収極大を有する染料である。
【００３０】
光学イメージングモダリティ及び測定手法としては、これらに限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学的密着断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦イメージング、非線形顕微鏡分析、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、密着干渉計、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波長、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、及び光の散乱、吸収、分極、発光、蛍光寿命、量子収率及び消光の測定などが挙げられる。
【００３１】
本発明の造影剤は、好ましくは式Ｉで表される。
【００３２】
【化１】
2007512302.tif 000002
【００３３】
式中、
｛阻害剤｝は、本発明のカスパーゼ−３阻害剤であり、
［リーダーペプチド］は、４〜２０量体のペプチド細胞膜輸送体ペプチドであって、そのアミン末端又はカルボキシル末端のいずれかで結合しており、
−（Ａ）ｎ−は、各Ａが独立に、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４〜８シクロへテロアルキレン基、Ｃ４〜８シクロアルキレン基、Ｃ５〜１２アリーレン基、又はＣ３〜１２へテロアリーレン基、アミノ酸、糖、或いは単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成要素であるリンカー基であり、
Ｒは独立に、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、Ｃ１〜４アルコキシアルキル、又はＣ１〜４ヒドロキシアルキルから選択され、
ｎは、０から１０の整数であり、
ｍは、０又は１であり、
Ｘａは、Ｈ、ＯＨ、Ｈａｌ、ＮＨ２、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４アルコキシアルキル、Ｃ１〜４ヒドロキシアルキルであるか、或いはＸａは、造影性基である。
【００３４】
式Ｉに示すように、本発明の化合物は、造影性基「で標識」されている。上で定義したように、これは、｛阻害剤｝、リンカー基−（Ａ）ｎ又はリーダーペプチドの１個又は複数が、少なくとも１個の「造影性基」を含んでいるか又は結合しているかのいずれかであることを意味する。好ましくは、カスパーゼ−３阻害剤又はリンカー基は、造影性基に結合しているか又はそれを含んでいる。
【００３５】
本発明の「リーダーペプチド」は、細胞膜輸送を促進する４〜２０量体のペプチドである。カスパーゼ−３は、細胞内酵素であり、それ故造影剤は、細胞膜を超えることができなければならないのでこのことは重要である。「リーダーペプチド」は、しかしながら、生体内で生物学的ターゲティングを提供しない。適当なリーダーペプチドは、技術的に知られており、Ｔａｔペプチド、タキルプレシン誘導体及びプロテグリン誘導体が含まれる。特定の「リーダーペプチド」配列及びそれの参照を以下に示す。
【００３６】
【表１】
2007512302.tif 000003
【００３７】
好ましい「リーダーペプチド」は、Ｔａｔペプチド、タキルプレシン誘導体及びプロテグリン誘導体である。最も好ましいのは、タキルプレシン誘導体及びプロテグリン誘導体である。
【００３８】
「アミノ酸」という用語は、Ｌアミノ酸又はＤアミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）又はアミノ酸模倣体を意味し、それらは、天然素材又は純粋に合成由来のものであることができ、光学的に純粋、即ち、単一の光学異性体、従ってキラルであるか、光学異性体の混合物であり得る。好ましくは、本発明のアミノ酸は、光学的に純粋である。
【００３９】
「糖」という用語は、単糖類、二糖類又は三糖類を意味する。適当な糖としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースが挙げられる。適宜、その糖は、アミノ酸への容易な結合を可能にするように官能化することができる。従って、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸に結合させることができる。アスパラギンのグルコサミン誘導体（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社から市販されている）は、この１例である。
【００４０】
【化２】
2007512302.tif 000004
【００４１】
式Ｉにおいて、Ｘａは、好ましくは造影性基である。このことは、式Ｉのリンカー基−（Ａ）ｎ−が造影性基をメタロプロテイナーゼ阻害剤の活性部位から遠ざける利点を有する。これは、造影性基が比較的嵩高い（例えば金属錯体又は放射性ヨウ素原子）場合にカスパーゼ酵素への阻害剤の結合が損なわれないようにするために特に重要である。これは、嵩高い基が活性部位から遠ざかる自由度をもつようにするための柔軟性（例えば単純なアルキル鎖）及び／又は金属錯体を活性部位から遠ざけるシクロアルキル又はアリールのスペーサーのような剛直性の組合せによって達成することができる。
【００４２】
リンカー基の性状は造影剤の体内分布を変化させるためにも使用できる。例えば、リンカーにエーテル基を導入すると、血漿タンパク質の結合を最小限にすることが容易になる。−（Ａ）ｎ−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成要素又はアミノ酸残基１〜１０個のペプチド鎖を含むと、リンカー基はインビボでの造影剤の薬物動態及び血液クリアランス速度を変化させる機能をもつことができる。かかる「バイオモディファイアー」のリンカー基はバックグラウンド組織、例えば筋肉又は肝臓及び／又は血液からの造影剤のクリアランスを加速し、バックグラウンドの干渉の低減による良好な診断画像をもたらす。バイオモディファイアーリンカー基はまた肝臓を経る場合とは対照的な、例えば腎臓を経る排出の特定の経路を優先するために使用することもできる。
【００４３】
−（Ａ）ｎ−がアミノ酸残基１〜１０個のペプチド鎖を含む場合、そのアミノ酸残基は、好ましくは、グリシン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンから選択される。−（Ａ）ｎ−がＰＥＧ部分を含む場合、それは、式ＩＩＡ又は式ＩＩＢの単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で誘導される単位、即ち式ＩＩＡの１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸を好ましくは含む。
【００４４】
【化３】
2007512302.tif 000005
【００４５】
式中、ｐは１〜１０の整数であり、Ｃ末端単位（＊）は造影性基に連結している。別法では、式ＩＩＢのプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造を使用することができる。
【００４６】
【化４】
2007512302.tif 000006
【００４７】
式中、ｐは、式ＩＩＡについて定義の通りであり、ｑは、３から１５までの整数である。式ＩＩＢにおいて、ｐは、好ましくは１又は２であり、ｑは、好ましくは５〜１２である。
【００４８】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましい−（Ａ）ｎ−基は、２〜１０個の原子、最も好ましくは２〜５個の原子、特に２個又は３個の原子が好ましい−（Ａ）ｎ−部分をなす連結原子の骨格鎖を有する。２原子の最小のリンカー基骨格鎖は如何なる相互作用も最小限とするために造影性基がカスパーゼ−３阻害剤から十分隔離されているという利点を与える。
【００４９】
アルキレン基又はアリーレン基のような非ペプチドリンカー基は、それが結合したカスパーゼ−３阻害剤と顕著な水素結合相互作用をもたず、その阻害剤にリンカーが巻きつかないという利点を有する。好ましいアルキレンスペーサー基は−（ＣＨ２）ｑ−であり、ｑは２〜５である。好ましいアリーレンスペーサーは次式のものである。
【００５０】
【化５】
2007512302.tif 000007
【００５１】
式中、ａ及びｂは独立に０、１又は２である。
【００５２】
リンカー基−（Ａ）ｎ−は、好ましくは、ジグリコール酸部分、マレイミド部分、グルタル酸、コハク酸、ポリエチレングリコールに基づく単位又は式ＩＩＡのＰＥＧ様単位を含む。
【００５３】
造影性基が金属イオンを含む場合、その金属イオンは金属錯体として存在する。かかるカスパーゼ−３阻害剤の金属イオンとのコンジュゲートは、それ故、好適には式Ｉａのものである。
【００５４】
【化６】
2007512302.tif 000008
【００５５】
式中、Ａ、ｎ、ｍ及びＸａは、上記の式Ｉで定義の通りである。
【００５６】
「金属錯体」という用語は、金属イオンと１個又は複数のリガンドとの配位錯体を意味する。金属錯体は「トランスキレート化に対して耐性」、即ち、金属の配位部位に対する他の潜在的な競合リガンドとリガンド交換を容易に行わないことが極めて好ましい。潜在的な競合リガンドには、カスパーゼ−３阻害剤自体及びインビトロ製剤中の他の賦形剤（製剤に使用される例えば放射能保護物質又は抗微生物保存料）又は生体内内因性化合物（例えばグルタチオン、トランスフェリン又は血漿タンパク質）がある。金属錯体は、リンカー基−（Ａ）ｎ−又はリーダーペプチドのアミノ酸残基の１つに好ましくは結合している。金属錯体は、リーダーペプチドが、リンカー基の末端Ａ残基に結合するか、又は非末端のＡ残基から枝分れすることによるかのいずれかによって同様に存在することができるように、阻害剤から最も離れたＡ残基の１つに結合しているのが最も好ましい。
【００５７】
式Ｉａの金属錯体は次の式Ｉｂのリガンドのコンジュゲートから誘導される。
【００５８】
【化７】
2007512302.tif 000009
【００５９】
式中、Ａ、ｎ、ｍ及びＸａは、上記の式Ｉで定義の通りである。
【００６０】
トランスキレート化に耐性である金属錯体を形成する本発明の使用に適したリガンドとしては、（金属ドナー原子同士を連結している炭素原子又は非配位ヘテロ原子の非配位骨格を有することによって）５又は６員キレート環が形成されるように２〜６個、好ましくは２〜４個の金属ドナー原子が配列したキレート剤、又はイソニトリル、ホスフィン又はジアゼニドなどの金属イオンに強力に結合するドナー原子を含む単座リガンドが挙げられる。キレート剤の部分として金属に良好に結合するドナー原子の例は、アミン、チオール、アミド、オキシム及びホスフィンである。ホスフィン類は、強力な金属錯体を形成するために、単座又は２座のホスフィンであっても適当な金属錯体を形成する。イソニトリル及びジアゼニドの直線の幾何学的特徴は、それらがキレート剤に容易に取り込まれないようにするものであり、従って、一般的には単座リガンドとして使用される。適当なイソニトリルの例としては、ｔ−ブチルイソニトリルのような単純なアルキルイソニトリル及びｍｉｂｉ（即ち、１−イソシアノ−２−メトキシ−２−メチルプロパン）のようなエーテル置換イソニトリルが挙げられる。適当なホスフィンの例としては、テトロホスミン及び単座ホスフィン類、例えばトリス（３−メトキシプロピル）ホスフィンが挙げられる。適当なジアゼニドの例としては、リガンドのＨＹＮＩＣシリーズ、即ちヒドラジン置換ピリジン又はニコチンアミドが挙げられる。
【００６１】
トランスキレート化に耐性の金属錯体を形成するテクネチウムのための適当なキレート剤の例としては、これに限定はしないが、以下の（ｉ）〜（ｖ）が挙げられる。
（ｉ）次式のジアミンジオキシム：
【００６２】
【化８】
2007512302.tif 000010
【００６３】
式中、Ｅ１〜Ｅ６は各々独立にＲ’基であり、
各Ｒ’はＨ又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ３〜１０アルキルアリール、Ｃ２〜１０アルコキシアルキル、Ｃ１〜１０ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜１０フルオロアルキル、Ｃ２〜１０カルボキシアルキル又はＣ１〜１０アミノアルキルであるか、或いは２個以上のＲ’基がそれらと結合している原子と共に炭素環、複素環、飽和環又は不飽和環を形成するもので、Ｒ’基の１つ又は複数がカスパーゼ−３阻害剤に結合しており、
Ｑは式−（Ｊ）ｆ−の架橋基であり、
ｆは３、４又は５であり、各Ｊは独立に−Ｏ−、−ＮＲ’−又は−Ｃ（Ｒ’）２−であるが、ただし、−（Ｊ）ｆ−が、−Ｏ−又は−ＮＲ’−である最大で１個のＪ基を含むことを条件とする。
【００６４】
好ましいＱ基は以下のものである：
Ｑ＝−（ＣＨ２）（ＣＨＲ’）（ＣＨ２）−、即ちプロピレンアミンオキシムつまりＰｎＡＯ誘導体、
Ｑ＝−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ’）（ＣＨ２）２−、即ちペンチレンアミンオキシムつまりＰｅｎｔＡＯ誘導体、
Ｑ＝−（ＣＨ２）２ＮＲ’（ＣＨ２）２−。
【００６５】
Ｅ１〜Ｅ６は、好ましくはＣ１〜３アルキル、アルキルアリールアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキル、カルボキシアルキル又はアミノアルキルから選択される。最も好ましくは、各Ｅ１〜Ｅ６基はＣＨ３である。
【００６６】
カスパーゼ−３阻害剤は好ましくはＥ１又はＥ６のＲ’基、又はＱ部分のＲ’基のいずれかで結合する。最も好ましくは、カスパーゼ−３阻害剤はＱ部分のＲ’基に結合する。カスパーゼ−３阻害剤がＱ部分のＲ’基に結合する場合は、Ｒ’基は好ましくはブリッジヘッド位置にある。かかる場合、Ｑは好ましくは−（ＣＨ２）（ＣＨＲ’）（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ’）（ＣＨ２）２−又は−（ＣＨ２）２ＮＲ’（ＣＨ２）２−、最も好ましくは−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ’）（ＣＨ２）２−である。
【００６７】
特に好ましい二官能性ジアミンジオキシムキレーターは、キレーター１であり、
【００６８】
【化９】
2007512302.tif 000011
【００６９】
カスパーゼ−３阻害剤はブリッジヘッド−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基を介して結合している。
【００７０】
（ｉｉ）チオールトリアミドドナーセットを有するＮ３Ｓリガンド、例えばＭＡＧ３（メルカプトアセチルトリグリシン）及び関連のリガンド、又はジアミドピリジンチオールドナーセット、例えばＰｉｃａを有するもの、
（ｉｉｉ）ジアミンジチオールドナーセットを有するＮ２Ｓ２リガンド、例えばＢＡＴ又はＥＣＤ（即ちエチルシステイネート二量体）、又はアミドアミンジチオールドナーセットを有するもの、例えばＭＡＭＡなど、
（ｉｖ）テトラミン、アミドトリアミン又はジアミドジアミンドナーセットを有する開鎖又はマクロ環状リガンドであるＮ４リガンド、例えばサイクラム、モノオキソサイクラム又はジオキソサイクラム。
【００７１】
（ｖ）ジアミンジフェノールドナーセットを有するＮ２Ｏ２リガンド。
【００７２】
上記リガンドはテクネチウム、例えば９４ｍＴｃ又は９９ｍＴｃの錯化に特に適しており、Ｊｕｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、［Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，  ９９，  ２２０５−２２１８  （１９９９）］に更に詳細に説明されている。これらのリガンドは、他の金属、例えば銅（６４Ｃｕ又は６７Ｃｕ）、バナジウム（例えば４８Ｖ）、鉄（例えば５２Ｆｅ）又はコバルト（例えば５５Ｃｏ）にも有用である。他の適当なリガンドとしては、Ｓａｎｄｏｚの国際公開第９１／０１１４４号に記載されたものがあり、インジウム、イットリウム及びガドリニウムに特に適したリガンド、特にマクロ環アミノカルボキシレート及びアミノホスホン酸リガンドが挙げられる。ガドリニウムの非イオン系（即ち中性）の金属錯体を形成するリガンドは公知であり、米国特許第４８８５３６３号に記載されている。放射性金属イオンがテクネチウムである場合は、リガンドは好ましくは４座のキレート剤である。テクネチウムに対する好ましいキレート剤はジアミンジオキシム又は上記Ｎ２Ｓ２又はＮ３Ｓのドナーセットを有するものである。
【００７３】
造影性基が放射性ハロゲン、例えばヨウ素である場合は、カスパーゼ−３阻害剤は以下の要素、即ち：非放射性前駆体ハロゲン原子、例えばアリールのヨウ化物又は臭化物（放射性ヨウ素交換を可能とするため）、活性化前駆体アリール環（例えばフェノール基）、有機金属前駆体化合物（例えばトリアルキルスズ又はトリアルキルシリル）、有機前駆体、例えばトリアゼン又は求核置換反応のための良好な脱離基、例えばヨードニウム塩を含むように適宜選択される。放射性ハロゲン（例えば１２３Ｉ及び１８Ｆ）を導入する方法は、Ｂｏｌｔｏｎ、［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）］に記載されている。放射性ハロゲン、特にヨウ素が結合することができる適当な前駆体アリール基の例を以下に示す。
【００７４】
【化１０】
2007512302.tif 000012
【００７５】
両者共に芳香族環上への容易な放射性ヨウ素置換を可能とする置換基を含んでいる。放射性ヨウ素を含む別の置換基は、例えば以下に示すような放射性ハロゲン交換による直接ヨウ素化によって合成できる。
【００７６】
【化１１】
2007512302.tif 000013
【００７７】
造影性基がヨウ素の放射性同位体である場合は、放射性ヨウ素原子は好ましくは芳香族環、例えばベンゼン環又はビニル基に直接の共有結合で結合する。飽和脂肪族系に結合しているヨウ素原子は生体内代謝を受けやすく、放射性ヨウ素が消失しやすいことが知られているからである。
【００７８】
造影性基がフッ素の放射性同位体（例えば１８Ｆ）を含む場合は、その放射性ハロゲン化は、アルキルブロミド、アルキルメシレート又はアルキルトシレートのような良好な脱離基を有する適当な前駆体との１８Ｆ−フロリドの反応を用いた直接標識によって実施し得る。１８Ｆはまた、Ｎ−（ＣＨ２）３１８Ｆを得るための１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＭｓ（Ｍｓはメシレート）のようなアルキル化剤を用いたアミン前駆体のＮ−アルキル化によるか、又は、１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＭｓ又は１８Ｆ（ＣＨ２）３Ｂｒを用いたヒドロキシル基のＯ−アルキル化によって導入することもできる。１８Ｆはまた、１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＨ反応物を用いるＮ−ハロアセチル基のアルキル化で導入されて−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３１８Ｆ誘導体を生じさせることもできる。アリール系については、アリールジアゾニウム塩からの１８Ｆ−フロリド求核置換、アリールニトロ化合物又はアリール第四級アンモニウム塩がアリール−１８Ｆ誘導体への適切な経路である。
【００７９】
第一級アミン含有カスパーゼ−３阻害剤もまた、Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｏｍｐ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．  ４５，  １０４５−１０５３  （２００２）］及びＢｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．［Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９３，  ２８９７  （１９７１）］に教示されているように、１８Ｆ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯを用いる還元的アミノ化で１８Ｆで標識することができる。このやり方は、アリール第一級アミン例えばフェニル−ＮＨ２又はフェニル−ＣＨ２ＮＨ２基を含む化合物などにも有効に応用することができる。ハロアルキルケトン官能基を同様に含有していないペプチド系阻害剤については、このやり方は、Ｐｏｅｔｈｋｏら［Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．，  ４５，  ８９２−９０２  （２００４）］に教示されているように、ペプチドのアミノオキシ誘導体に応用することができる。
【００８０】
アミン含有カスパーゼ−３阻害剤は、また、１８Ｆ標識活性エステル例えば
【００８１】
【化１２】
2007512302.tif 000014
【００８２】
と反応させてアミド結合でつながった生成物を生じさせることによって１８Ｆで標識することもできる。前掲のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びそれのペプチド標識のための使用は、Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  １９（３），  ２７５−２８１  （１９９２）］及びＪｏｈｎｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．，  １０３  （Ｓｕｐｐｌ．  ４８），  ４５−８５  （２００２）］に教示されている。１８Ｆ標識誘導体への合成経路のさらなる詳細は、Ｂｏｌｔｏｎ、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｏｍｐ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，  ４５，  ４８５−５２８  （２００２）に記載されている。
【００８３】
インビボでの最大の感度のためには、造影性基が放射性元素を含むことが最も好ましい。造影性基は、陽電子放出型又はγ線放出型放射性同位元素を好ましくは含む。
【００８４】
本発明の合成カスパーゼ−３阻害剤は、以下の（ｉ）〜（ｉｘ）から好ましくは選択される。
（ｉ）式ＩＩＩのテトラペプチド誘導体
Ｚ１−Ａｓｐ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ａｓｐ−Ｘ１    （ＩＩＩ）
（式中、Ｚ１は、テトラペプチドのＮ末端に結合した代謝阻害基であり、
Ｘａａ１及びＸａａ２は、独立に任意のアミノ酸であり、
Ａｓｐは、アスパラギン酸に対する通常の３文字の略語であり、
Ｘ１は、テトラペプチドのカルボキシ末端に結合した−Ｒ１又は−ＣＨ２ＯＲ２基であり、
Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜５アルコキシ又は−（ＣＨ２）ｑＡｒ１であり、
ｑは、１〜６の整数であり、Ａｒ１は、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ５〜１２アルキル−アリール、Ｃ５〜１２フルオロ置換アリール又はＣ３〜１２ヘテロアリールであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜１０アシル又はＡｒ１である）、
（ｉｉ）キナゾリン又はアニリノキナゾリン、
（ｉｉｉ）２−オキシインドールスルホンアミド、
（ｉｖ）オキソアゼピノインドリン、
（ｖ）式ＩＶの化合物
【００８５】
【化１３】
2007512302.tif 000015
【００８６】
（式中、Ｘ２は、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル又は−（ＣＨ２）ｒ−（Ｓ）ｓ−（ＣＨ２）ｔＡｒ３であり、ｒ及びｔは、０〜６の整数であり、ｓは、０又は１であり、Ａｒ３は、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ５〜１２アルキル置換アリール、Ｃ５〜１２ハロ置換アリール又はＣ３〜１２ヘテロアリールであり、
Ａｒ２はＣ６〜１２アリール又はＣ３〜１２ヘテロアリールであり、
Ｘ３は、Ｒｂ基であり、
Ｘ４は、−ＳＯ２−又は−ＣＲ２−であり、
Ｒａは、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル又はＰＧＰであり、ＰＧＰは保護基であり、
Ｒｂは、Ｒａ基又はＣ１〜５アシルであり、
各Ｒｃは独立に、Ｈ又はＣ１〜５アルキルである）
（ｖｉ）式Ｖの化合物
【００８７】
【化１４】
2007512302.tif 000016
【００８８】
（ｖｉｉ）ピラジノン、
（ｖｉｉｉ）式ＶＩのジペプチド
Ｚ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ１    （ＶＩ）
（式中、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ１基は、ジペプチドのカルボキシ末端に結合しており、Ｚ１及びＲ１は、式（ＩＩＩ）に対して定義したものである）、
（ｉｘ）式ＸＩのサリチル酸スルホンアミド
【００８９】
【化１５】
2007512302.tif 000017
【００９０】
（式中、Ａｒ６は、５又は６員のＣ４〜６アリール又はヘテロアリール環であり、Ｘ６は、Ｈ又は−ＣＨ２ＳＲ２であり、Ｒ２は上記で定義した通りである）。
【００９１】
用語「アミノ酸」は、上記で定義した通りである。
【００９２】
式ＩＩＩのペプチドアルデヒド（Ｘ１＝Ｒ１＝Ｈ）、ケトン［Ｘ１＝Ｒ１＝Ｃ１〜５アルキル又は−（ＣＨ２）ｑＡｒ１］又はフェノキシメチルケトン（Ｘ１＝−ＣＨ２ＯＲ２及びＲ２＝Ａｒ１＝フェニル）の阻害剤は、可逆性のカスパーゼ阻害剤であり、一方クロロメチル及びフルオロメチル誘導体（Ｘ１＝Ｒ１＝−ＣＨ２Ｆ又は−ＣＨ２Ｃｌ）に加えてアシルオキシメチルケトン（Ｘ１＝−ＣＨ２ＯＲ２及びＲ２＝Ｃ１〜１０アシル）は、不可逆性の阻害剤である。ハロメチルケトンペプチドは、カスパーゼ−３のシステインチオールに結合してチオメチルケトンを形成し、かくして酵素を不可逆的に不活性にするものと考えられる。前述のとおりそのような不可逆性の阻害剤が好ましい。従って、式ＩＩＩのＸ１は、好ましくは、−ＣＨ２Ｆ又は−ＣＨ２ＯＲ２であり、Ｒ２＝Ｃ１〜１０アシルである。Ｒ２がＣ１〜１０アシルである場合、好ましい該アシル基は、（２，６−ジメチルフェニル）（Ｃ＝Ｏ）−又は［２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］（Ｃ＝Ｏ）等の２，６−二置換ベンゾイルである。
【００９３】
用語「代謝阻害基」（Ｚ１）とは、アミノ末端におけるペプチド又はアミノ酸の代謝を生体内で阻害又は抑圧する生体適合性の基を意味する。該基は、当業者にはよく知られており、ペプチドアミン末端に対して、アセチル、Ｂｏｃ（Ｂｏｃは、ｔ−ブチルオキシカルボニルである）、Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃは、フルオレニルメトキシカルボニルである）、ベンジルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から適切に選択される。ペプチドＮ末端に対する好ましい代謝阻害基は、アセチルである。
【００９４】
式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ１及びＸａａ２は、最も好ましくは任意のＬ−アミノ酸である。Ｘａａ１−Ｘａａ２は、式ＩＩＩの好ましい化合物が、Ｚ１−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｘ１又はＺ１−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｘ１（即ち、Ｚ１−ＤＥＶＤ−Ｘ１又はＺ１−ＤＱＭＤ−Ｘ１）であるように、好ましくはＧｌｕ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｍｅｔである。
【００９５】
式ＩＩＩにおいて、アスパルチル及びグルタミル側鎖のカルボキシ基は、カスパーゼ−３阻害剤が強力であるように遊離のカルボキシレートとして好ましくは存在する。しかしながら、そのカルボキシ基は、又、細胞透過性を改良するためにエステル、例えばメチルエステルとして存在することもできる。そのエステルは、後に、非壊死細胞中に存在するエステラーゼによって脱保護される。式ＩＩＩについて、造影性基は、Ｚ１又はＸ１の位置に好ましくは結合している。造影性基が金属を含む場合、式ＩＩＩのペプチドのペプチドアミン又はカルボキシル末端の代謝の阻害は、いずれか又は両方の末端のその金属の金属錯体への結合で好ましくは達成される。
【００９６】
用語「保護基」（ＰＧＰ）とは、望ましくない化学反応を阻害又は抑圧するが、十分に反応性であって、分子残部を修飾することのない十分に穏やかな条件下でそれが問題の官能基から切断することができるように設計されている基を意味する。脱保護の後、所望の生成物が得られる。保護基は、当業者にはよく知られており、アミン基に対しては、Ｂｏｃ（Ｂｏｃは、ｔ−ブチルオキシカルボニルである）、Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃは、フルオレニルメトキシカルボニルである）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から、カルボキシル基に対しては、メチルエステル、ｔ−ブチルエステル又はベンジルエステルから適切に選択される。ヒドロキシル基に対する適当な保護基は、ベンジル、アセチル、ベンゾイル、トリチル（Ｔｒｔ）又はテトラブチルジメチルシリル等のトリアルキルシリルである。チオール基に対して適当な保護基は、トリチル及び４−メトキシベンジルである。さらなる保護基の使用は、’Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’  Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ  （Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９）に記載されている。
【００９７】
式ＩＩＩのいくつかのカスパーゼ−３阻害剤は、市販されており、例えば、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫを、ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＴＤ．  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｇｎａ  Ｐａｒｋ，Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  ＬＥ１７  ４ＸＮ  ＵＮＩＴＥＤ  ＫＩＮＧＤＯＭ経由でＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入することができる。その他は、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２  （２９），  １７９０７−１７９１１  （１９９７）；  ｉｂｉｄ，  ２７３  （４９），  ３２６０８−３２６１３  （１９９８）］に記載されているようにして調製することができる。本発明のペプチド含有カスパーゼ−３阻害剤及びリーダーペプチドは、又、Ｐ．  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｆ．  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｇｉｒａｌｄ；  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７に記載されているように、通常の固相合成によっても得ることができる。
【００９８】
キナゾリン又はアニリノキナゾリンカスパーゼ−３阻害剤については、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｔｈｅｒ．，  ３０４（１），  ４３３−４４０  （２００３）］に記載されている。好ましい上記化合物は一般式ＶＩＩを有する。
【００９９】
【化１６】
2007512302.tif 000018
【０１００】
式中、Ｒ３は、Ｈ又はＣｌであり、
Ｒ４は、Ｃｌ又はＦであり、
Ｒ８は、−ＣＯＮＨ−Ｘ５又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ａｒ４であり、Ｘ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又は−（ＣＨ２）ｓＡｒ４であり、ｓは、０又は１であり、Ａｒ４は、−Ｃ６Ｈ５Ｘ６であり、Ｘ６は、Ｈａｌ、ＣＦ３又は−ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７である。
Ｒ６及びＲ７は、独立にＣ１〜３アルキルであるか、又は結合してＣ５〜７シクロアルキル環を形成していてもよい。
Ｒ８は、好ましくは、−ＣＯＮＨ−Ｘ５（Ｘ５は−（ＣＨ２）ｓＡｒ４である）であり、Ｘ６は、好ましくは、Ｆ、ＣＦ３又は−ＳＯ２ＮＣ６Ｈ１０である。
【０１０１】
本発明の好ましい２−オキシインドールスルホンアミド誘導体は、式ＶＩＩＩのものである。
【０１０２】
【化１７】
2007512302.tif 000019
【０１０３】
式中、Ｒ９は、Ｈ又はＣ１〜４アルキルであり、
Ｒ１０は、Ｃ１〜１０アルキル、アリールＣ１〜４アルキル、ヘテロアリールＣ１〜４アルキルＣ３〜７シクロアルキルであり、或いは、Ｒ９及びＲ１０は、それらが結合している窒素原子と共に、Ｏ、Ｎ又はＳから選択されるさらなるヘテロ原子を適宜含有する３〜１０員環を形成しており、
Ｒ１１及びＲ１２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＯ２又はＨａｌであり、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１２アリールアルキル又はＣ３〜１２ヘテロアリールアルキルであり、
Ｒ１４及びＲ１５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ＝Ｏカルボニル基を形成している。
【０１０４】
式ＶＩＩＩにおいて、Ｒ１４及びＲ１５は、好ましくは共にＣ＝Ｏに相当し、即ち、イサチン誘導体である。Ｒ１３は、好ましくは、Ｈ又はＣＨ３である。Ｒ９及びＲ１０は、好ましくは、Ｃ４〜６シクロアルキル、最も好ましくは、Ｃ５シクロアルキルである。Ｒ９及びＲ１０が、Ｃ４〜６シクロアルキルである場合、そのシクロアルキル環は、Ｘ７基で好ましくは置換されており、Ｘ７は、−ＣＨ２ＯＲ１６又は−ＣＨ２ＮＨＲ１６であり、Ｒ１６は、Ｃ１〜３アルキル又はＣ４〜７アリールである。式ＶＩＩＩの２−オキシインドール誘導体は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  １６００７−１６０１４  （２０００）］に記載されているようにして調製することができる。
【０１０５】
造影性基は、式ＶＩＩＩの阻害剤の好ましくはＲ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２又はＲ１３の置換基に、最も好ましくはＲ９、Ｒ１０又はＲ１３の置換基に結合している。１８Ｆ標識については、Ｒ１３は、４−１８Ｆ−ベンズアルデヒドイミンのルート（前述の）に対しては−ＣＨ２ＯＮＨ２であり、１８Ｆ−（ＣＨ２）３Ｂｒ又は１８Ｆ−（ＣＨ２）３ＯＴｓタイプのＯ−アルキル化剤による標識に対しては−ＣＨ２ＯＨであるようにいずれかを選択する。別法では、Ｒ１３は、直接のＮアルキル化が所望の１８Ｆ誘導体をもたらすようにＨであるように選択する。
【０１０６】
本発明の好ましいオキソアゼピノインドリンは、ＩＤＮ５３７０であり、式ＩＸで示される。
【０１０７】
【化１８】
2007512302.tif 000020
【０１０８】
最も好ましいオキソアゼピノインドリンは、インダンＡ（Ｉｎｄｕｎ  Ａ）である。
【０１０９】
【化１９】
2007512302.tif 000021
【０１１０】
本発明のオキソアゼピノインドリンは、Ｄｅｃｋｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．  Ｒｅｓ．，  ５２，  ５７９−５８６  （２００１）］及び国際公開第９８／１１１０９号に記載されている。
【０１１１】
本発明のピラジノンは、式Ｘのものが適当である。
【０１１２】
【化２０】
2007512302.tif 000022
【０１１３】
式中、
Ｒ１７は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲｉ、Ｎ（Ｒｉ）２、Ｒｉ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ａｒ５、Ｈｅｔ１、Ｘ８（ＣＯ）−、Ｘ８ＳＯ−又はＸ８ＳＯ２−であり、
各Ｒｉは独立に、ＯＨ、Ｈａｌ、ＣＯ２Ｈ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、Ａｒ５及びＣ１〜４アシルから選択される１〜３個の置換基で適宜置換されていてもよいＣ１〜６アルキルであり、
Ａｒ５は、１〜３個のＯＨ、Ｈａｌ、ＣＯ２Ｈ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｈｅｔ１又はＣ１〜４アシル置換基で適宜置換されていてもよいＣ６〜１４芳香族環であり、
Ｘ８は、Ｒｉ、Ａｒ５又はＨｅｔ１であり、
Ｈｅｔ１は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有し、１個又は２個のオキソ基、及びＣ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４アシル及びＣＦ３から選択される１〜３個の基で適宜置換されていてもよい５〜１５員のヘテロ環又はヘテロアリール環であり、
Ｒ１８は、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル、Ａｒ５又はＨｅｔ１であり、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｈａｌ又はＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２０は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ａｒ５、Ｈｅｔ１、−（ＣＨ２）ｚＳＲｉ、−（ＣＨ２）ｚＯＲｉ、−（ＣＨ２）ｚＯＣ（Ｏ）Ｒｊ又は−（ＣＨ２）ｚＮＲ２１Ｒ２２であり、ｚは、１、２又は３であり、
Ｒｊは、Ｃ１〜８アルキル、Ａｒ５又はＨｅｔ１であり、
Ｒ２１及びＲ２２は独立に、Ｈ、Ｒｉ、Ａｒ５又はＨｅｔ１であり、或いはＲ２１及びＲ２２は、それらが結合している窒素原子と共に、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有し、１個又は２個のオキソ基、及びＣ１〜４アルキル、Ｈｅｔ１、Ｃ１〜４カルボキシ、Ｃ１〜４アシル及びＣ１〜６カルボキシアミドから選択される１〜３個の基で適宜置換されていてもよい３〜１０員の環系を形成しており、
Ｒｄ及びＲｅは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル又はＡｒ５であるか、或いはそれらが結合している炭素原子と組み合わさって、Ｏ、Ｓ及びＮＲ２３（Ｒ２３は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル又はＣ１〜４アシルである）から選択される１個のヘテロ原子を適宜含有する３〜７員の非芳香族脂環式又はヘテロ環式の環を形成していてもよく、
Ｒｆ及びＲｇは独立に、Ｈ、Ａｒ５、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシアルキル、又はＣ５〜７シクロアルキルであり、
ｗは、０〜６の整数である。
【０１１４】
カスパーゼ−３に対して選択的である好ましいピラジノンは、Ｌ−８２６、７９１又はＭ−８２６である［Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １（６），  ４９６−５０１  （２０００）］。
【０１１５】
【化２１】
2007512302.tif 000023
【０１１６】
本発明のピラジノンカスパーゼ−３阻害剤の合成は、米国特許第６４４４８１１号に記載されており、スキーム１（次ページ）に示されている。出発材料は、市販されているジメチルグリオキシムである。
【０１１７】
【化２２】
2007512302.tif 000024
【０１１８】
式Ｖの化合物は、国際公開第０３／０２４９５５号に記載のようにして調製することができる。式ＶＩの化合物は、スキーム２に示すようにして調製することができる。
【０１１９】
【化２３】
2007512302.tif 000025
【０１２０】
式ＶＩのジペプチド阻害剤は、アスパルチルケトンであり、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ２００４，  １４，  ８０５−８０８）］に記載されている。強力で選択的なカスパーゼ−３阻害剤が存在する。式ＶＩに対して、造影性基は、Ｚ１又はＸ１の位置に付いているのが好ましい。式ＶＩの好ましいカスパーゼ−３阻害剤は、式ＶＩａのものである。
【０１２１】
【化２４】
2007512302.tif 000026
【０１２２】
式中、Ｒ２４は、Ｃ６〜１２アリール又はＣ６〜１２ヘテロアリールであり、
Ｒ２５は、Ｃ１〜４アルキル又はベンジルであり、そのベンジル基のフェニル環は、１個又は２個のハロゲン原子で適宜置換されており、
Ｒ２４は、好ましくはベンジル基であって、そのベンジル基のフェニル環は、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシ、Ｃ１〜３カルボキシル又はＣ２〜４カルボキシエステル基で置換されたＣ１〜３アルコキシ、Ｃ１〜３アシル、Ｃ２〜４アルケニル又はＣ１〜３アルキルスルホニルから選択された１個又は２個の基で適宜置換されている。
Ｒ２５は好ましくはベンジル基又は２−クロロ−５−フルオロ−ベンジル基である。
特に好ましい式ＶＩの阻害剤は、Ｒ１に置換された２−クロロ−６−フルオロベンジル基及びＺ１に２，５−二置換ベンジルカルボニルを含有する。これらは、式ＶＩｂのものである。
【０１２３】
【化２５】
2007512302.tif 000027
【０１２４】
阻害剤６Ａ、６Ａ’、６Ｂ及び６Ｃは、ナノモル範囲の低いところのカスパーゼ−３に対するＩＣ５０を示す［Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ２００４，  １４，  ８０５−８０８）］。エステル誘導体の６Ａ及び６Ｂは、細胞内で加水分解されてより強力な酸６Ａ’となる。
【０１２５】
式ＶＩの化合物及びそれに基づく最も好ましい強力なカスパーゼ−３阻害剤の合成については、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １４（３），  ８０５−８０８  （２００４）］に記載されている。造影性基は、好ましくは式ＶＩｂのフェニル環のいずれかに、最も好ましくはＺ２の位置に付着している。１８Ｆ標識は、スキーム３に示すようにして導入されるものと考えられる。
【０１２６】
【化２６】
2007512302.tif 000028
【０１２７】
式ＸＩの阻害剤は、Ｃｈｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４５，  ５００５−５０２２  （２００２）］、Ｅｒｌａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２１，  ３０８−３１４  （２００３）］又は国際公開第０３／０２４９５５号の方法で調製することができる。式ＸＩの好ましい阻害剤は、フェニル、チオフェン又はピリジンから選択されるＡｒ６、特にチオフェンを有する。式ＸＩにおいて、Ｘ６は、好ましくは−ＣＨ２ＳＡｒ７であり、Ａｒ７は、ハロゲンで置換されているフェニル環である。式ＸＩの好ましい阻害剤は、式ＸＩａのものである。
【０１２８】
【化２７】
2007512302.tif 000029
【０１２９】
本発明の好ましいカスパーゼ−３阻害剤は、式ＩＩＩのテトラペプチド、式ＶＩのジペプチド又は式ＶＩＩＩの２−オキシインドールスルホンアミドである。最も好ましい阻害剤は、式ＩＩＩのテトラペプチド及び式ＶＩのジペプチドである。
【０１３０】
本発明の造影剤が、放射性又は常磁性金属イオンを含む場合、その金属イオンは、適切には金属錯体として存在する。該金属錯体は、式Ｉａのコンジュゲートと適切な金属イオンとの反応によって適切に調製される。式Ｉａのカスパーゼ−３阻害剤のリガンドコンジュゲート又はキレーターコンジュゲートは、二官能キレートの手法で調製することができる。従って、官能基（それぞれ「二官能性リンカー」又は二官能性キレート」）をそこに結合させたリガンド又はキレート剤を調製することはよく知られている。結合されている官能基としては、アミン、チオシアネート、マレイミド及び活性エステル類例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールなどが挙げられる。本発明のキレーター１は、アミン官能化二官能性キレートの例である。上記二官能性キレートは、カスパーゼ−３阻害剤上の適当な官能基と反応して所望のコンジュゲートを形成することができる。カスパーゼ−３阻害剤上のかかる適当な官能基としては、カルボキシル（アミン官能化二官能性キレーターとのアミド結合形成用）、アミン（カルボキシル又は活性エステル官能化二官能性キレーターとのアミド結合形成用）、ハロゲン、メシレート及びトシレート（アミン官能化二官能性キレーターのＮ−アルキル化用）及びチオール（マレイミド官能化二官能性キレーターとの反応用）が挙げられる。
【０１３１】
本発明の放射性金属錯体は、適当なｐＨで式Ｉａのリガンドコンジュゲートに適当な酸化状態の放射性金属の溶液を反応させることによって調製することができる。溶液は好ましくは金属と弱く錯形成するリガンド（例えばグルコネート又はシトレート）を含み、即ち放射性金属錯体はリガンドの交換又はトランスキレート化で調製する。かかる条件は金属イオンの加水分解のような不都合な副反応を抑制するのに有用である。放射性金属イオンが９９ｍＴｃの場合は、通常の出発材料は９９Ｍｏ発生物質に由来のナトリウムペルテクネテートである。テクネチウムは比較的非反応性であるＴｃ（ＶＩＩ）酸化状態における９９ｍＴｃペルテクネテート中に存在する。酸化状態の低いＴｃ（Ｉ）〜Ｔｃ（Ｖ）のテクネチウム錯体の調製は、それ故通常は錯形成を促進するために、ナトリウムジチオナイト、ナトリウムビスルファイト、アスコルビン酸、ホルムアミジンスルフィン酸、スズイオン、Ｆｅ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）のような適当な薬学的に許容される還元剤の添加を必要とする。薬学的に許容される還元剤は好ましくはスズ塩、最も好ましくは塩化スズ、フッ化スズ又は酒石酸スズである。
【０１３２】
造影性基が過分極ＮＭＲ活性核種、例えば過分極１３Ｃ原子である場合、所望の過分極化合物は適当な１３Ｃ富化カスパーゼ−３阻害剤への過分極ガス（例えば１２９Ｘｅ又は３Ｈｅ）からの分極交換で調製することができる。
【０１３３】
第２の態様において、本発明は哺乳類への投与に適した形態の生体適合性キャリヤーと共に上記造影剤を含む医薬組成物を提供する。「生体適合性キャリヤー」とは流体、特に液体であり、組成物が生理学的耐容性をもち、即ち、毒性又は予定外の不快感を伴うことなく哺乳類の身体内に投与できるように造影剤を懸濁又は溶解できるものである。生体適合性キャリヤーは適宜、注射用キャリヤー液体、例えば滅菌された発熱物質非含有の注射用水、水溶液、例えば生理食塩水（注射用の最終生成物が等張性又は非低張性であるように好都合に平衡されていてよい）、浸透圧調節物質（例えば生体適合性対イオンを有する血漿中カチオンの塩）、糖類（例えばグルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えばソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えばグリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール等）の１種以上の水溶液である。
【０１３４】
第３の態様において、本発明は、哺乳類への投与に適した形態の生体適合性キャリヤー（上記の第２の態様において定義）と共に造影性基が放射性である上記造影剤を含む放射性医薬組成物を提供する。かかる放射性医薬品は無菌状態を維持しながら皮下注射用の針で単回又は複数回穿刺するのに適したシール（例えばクリンプドオンセプタムシール蓋）と共に提供される何れかの容器中において供給されるのが適している。かかる容器は単回又は多数回の患者用量を含有することができる。好ましい多用量の容器には、多数回の患者用量を含む単一の大型バイアル（例えば１０〜３０ｃｍ３容量）を含み、これによって単回分の患者用量を臨床用等級のシリンジ内に様々な時間間隔で臨床状況に適した製剤の有効期限内に取り出すことができる。充填済みシリンジはヒト用単回用量を含むように設計され、従って好ましくは使い捨て又は他の臨床用途に適したシリンジである。充填済みシリンジは適宜放射線量からオペレーターを保護するためにシリンジシールドと共に提供してよい。適当なかかる放射性医薬品用シリンジシールドは当該分野で知られており、好ましくは鉛又はタングステンを含む。
【０１３５】
造影性基が９９ｍＴｃを含む場合、診断イメージング放射性医薬品に適した放射線の含量は生体内でイメージングされる部位、取り込み及び標的のバックグラウンドに対する比に応じて、９９ｍＴｃの１８０〜１５００ＭＢｑの範囲である。
【０１３６】
本発明の放射性医薬品は、以下の第５及び第６の実施形態に記載されているキットで調製することができる。別法では、放射性医薬品は、所望の滅菌製品を生じさせるために無菌製造条件下で調製することができる。その放射性医薬品は、また、非無菌条件下で調製した後に、例えばγ線照射、高圧蒸気殺菌、乾式加熱又は化学的処理（例えばエチレンオキシドによる）を用いる最終的な殺菌を続けてもよい。好ましくは、本発明の放射性医薬品はキットから調製する。
【０１３７】
第４の態様において、本発明は本発明の合成カスパーゼ−３阻害剤のリガンドとのコンジュゲートを提供する。前記コンジュゲートは放射性金属イオン又は常磁性金属イオンのいずれかで標識した合成カスパーゼ−３阻害剤の製造に有用である。好ましくは、そのリガンドコンジュゲートは上で定義した式Ｉａのものである。本発明の第４の態様のコンジュゲートのリガンドは、好ましくはキレート剤である。好ましくは、そのキレート剤は、ジアミンジオキシム、Ｎ２Ｓ２ジアミンジチオール又はＮ３Ｓジアミンピリジンチオールドナーセットを有する。最も好ましくは、そのキレート剤は、ジアミンジオキシムである。
【０１３８】
第５の態様において、本発明は、造影性基が、放射性金属を含む上記の放射性医薬組成物を調製するための非放射性キットを提供する。そのキットは、リガンドの式（Ｉ）のカスパーゼ−３阻害剤とのコンジュゲートを含む。その放射性金属が９９ｍＴｃである場合は、そのキットは生体適合性の還元剤を適切にはさらに含む。リガンドコンジュゲート、及びその好ましい態様は、上の第４の態様に記載されている。
【０１３９】
かかるキットは例えば血流中への直接の注射によるヒトへの投与に適した滅菌された放射性医薬品を生じるように設計される。９９ｍＴｃについては、そのキットは、好ましくは凍結乾燥され、９９ｍＴｃ放射性同位体発生物質由来の無菌の９９ｍＴｃ−ペルテクネテート（ＴｃＯ４−）と共に希釈再調製することによってさらなる操作無しのヒトへの投与に適した溶液を与えるように設計されている。適当なキットは、ナトリウムジチオナイト、ナトリウムビスルファイト、アスコルビン酸、ホルムアミジンスルフィン酸、スズイオン、Ｆｅ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）のような「生体適合性の還元剤」と共に遊離の塩基塩又は酸塩のいずれかの形態のリガンド又はキレーターコンジュゲートを含有する容器を含む。その生体適合性還元剤は好ましくはスズ塩、例えば塩化スズ又は酒石酸スズなどである。別法では、そのキットは、放射性金属を添加すると金属交換反応（即ち、金属の転換）に会って所望の生成物を生じる金属錯体を適宜含有していてもよい。
【０１４０】
適当なキットは、無菌状態及び／又は放射能安全性と、その上場合によって不活性のヘッドスペースガス（例えば窒素又はアルゴン）を維持することを可能とし、一方シリンジによる溶液の追加及び引き出しを可能にする密封容器を含む。好ましいかかる容器は、気密クロージャがオーバーシール（一般的にはアルミニウム製）と共に圧着されているセプタム密封バイアルである。かかる容器は、そのクロージャが、必要に応じて、例えばヘッドスペースのガスを交換するか又は溶液からガスを抜くときに真空に耐えることができるというさらなる利点を有する。
【０１４１】
非放射性キットは適宜更にトランスキレート剤、放射能保護剤、抗微生物保存料、ｐＨ調節剤又は充填剤のような別の成分を含むことができる。「トランスキレート剤」とは急速に反応して放射性金属と弱い錯体を形成し、次いでリガンドで置き換えられる化合物である。テクネチウムについては、これによってテクネチウム錯体形成と競合するペルテクネテートの急速な還元による還元加水分解テクネチウム（ＲＨＴ）の形成の危険性が最小限となる。適当なかかるトランスキレート剤は、弱い有機酸、即ち３〜７のｐＫａを有する有機酸と、生体適合性のカチオンの塩である。適当な上記の弱い有機酸は、酢酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、安息香酸、フェノール又はホスホン酸である。従って適当な塩は、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、安息香酸塩、フェノレート又はホスホン酸塩である。好ましいかかる塩は酒石酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、安息香酸塩又はホスホン酸塩であり、最も好ましくはホスホン酸塩であり、特にジホスホン酸塩である。「生体適合性カチオン」という用語は、イオン化した負帯電基と塩を形成する正帯電した対イオンを意味し、前記正帯電した対イオンは、また、無毒性であり、従って哺乳類の身体、特に人体に投与するのに適している。適当な生体適合性カチオンの例としては、アルカリ金属のナトリウム又はカリウム、アルカリ土類金属のカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンが挙げられる。好ましい生体適合性カチオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。好ましいかかるトランスキレート剤はＭＤＰ、即ちメチレンジホスホン酸の生体適合性カチオンとの塩である。
【０１４２】
「放射能保護剤」という用語は水の放射線分解で生じる酸素含有フリーラジカルのような高度な反応性を有するフリーラジカルを捕獲することによって酸化還元過程のような分解反応を抑制する化合物を意味する。本発明の放射能保護剤はアスコルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸（即ち４−アミノ安息香酸）、ゲンチシン酸（即ち２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及び上記生体適合性カチオンとのこれらの塩から適宜選択される。
【０１４３】
「抗微生物保存料」という用語は、細菌、酵母又はカビのような潜在的に有害な微生物の生育を抑制する薬剤を意味する。抗微生物保存料はまた用量に応じてある程度の殺菌作用も有する。本発明の抗微生物保存料の主な役割は、希釈再調製後の放射性医薬組成物中、即ち放射性診断用品自体中の何れかのかかる微生物の生育を抑制することである。しかしながら抗微生物保存料は、また、適宜希釈再調製前の本発明の非放射性キットの成分１種以上中の潜在的に有害な微生物の生育を抑制するために使用し得る。適当な抗微生物保存料としては、パラベン類、即ちメチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン又はこれらの混合物、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールが挙げられる。好ましい抗微生物保存料はパラベン類である。
【０１４４】
「ｐＨ調節剤」という用語は、希釈再調製キットのｐＨがヒト又は哺乳類への投与のための許容限度（約ｐＨ４．０〜１０．５）内とするために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。かかるｐＨ調節剤として適当なものとしては、薬学的に許容される緩衝物質、例えばトリシン、ホスフェート又はＴＲＩＳ［即ちトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］及び薬学的に許容される塩基、例えば炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物が挙げられる。コンジュゲートが酸の塩の形態で用いられる場合は、ｐＨ調節剤は適宜、キットのユーザーが多段階手順の一部としてｐＨを調節できるように個別のバイアル又は容器内に入れて提供することができる。
【０１４５】
「充填剤」という用語は、製造及び凍結乾燥の間の材料の取り扱いを容易にする薬学的に許容される増量剤を意味する。適当な充填剤としては、塩化ナトリウムのような無機塩及び水溶性糖類又は糖アルコール、例えばスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースが挙げられる。
【０１４６】
第６の態様において、本発明は造影性基が非金属放射性同位体、即ちγ線放出型放射性ハロゲン又は陽電子放出型放射性非金属を含む放射性医薬製剤の製造用キットを提供する。かかるキットは、無菌の放射性同位体源との反応で最小数の操作で所望の放射性薬品が得られるように、好ましくは無菌非発熱物質の形態で、「前駆体」を含む。かかる考え方は、放射性同位体が比較的短い半減期を有する放射性医薬品に関して、取り扱いの容易さとこれによる放射線薬剤師に対する低減された放射線量の観点から、特に重要である。従って、かかるキットの希釈再調製のための反応媒体は好ましくは上で定義した「生体適合性キャリヤー」であり、最も好ましくは水性である。
【０１４７】
その「前駆体」は、所望の非金属放射性同位体の好都合な化学的形態をした化学反応が所望の放射能をもつ生成物を生じさせるために最少の段階数（理想的には単一の段階）と大した精製を必要としない（理想的にはさらなる精製はなし）で実施することができるように設計された無菌の非発熱性形態をしたカスパーゼ−３阻害剤物質の非放射性誘導体を適切には含む。かかる前駆体は、良好な化学的純度で都合よく得ることができる。その「前駆体」は、カスパーゼ−３阻害剤の特定の官能基のための上で定義した保護基（ＰＧＰ）を適宜含んでもよい。適当な前駆体は、ＢｏｌｔｏｎのＪ．  Ｌａｂ．  Ｃｏｍｐ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，  ４５，  ４８５−５２８  （２００２）に記載されている。
【０１４８】
この実施形態の好ましい前駆体は、求電子又は求核ハロゲン化のいずれかを受け、アルキル又はハロゲン化フルオロアルキル、トシレート、トリフレート（即ち、トリフルオロメタンスルホネート）若しくはメシレートから選択されるアルキル化剤で容易にアルキル化され、或いはチオール部分をアルキル化してチオエーテル連鎖を形成する誘導体を含む。第１のカテゴリーの例は、
（ａ）トリアルキルスタンナン（例えば、トリメチルスタンニル又はトリブチルスタンニル）又はトリアルキルシラン（トリメチルシリル）などの有機金属誘導体、
（ｂ）ハロゲン交換のための非放射性ヨウ化アルキル又は臭化アルキル及び求核ハロゲン化のためのアルキルトシレート、メシレート又はトリフレート、
（ｃ）求電子ハロゲン化に向けて活性化された芳香族環（例えばフェノール）及び求核ハロゲン化に向けて活性化された芳香族環（例えばアリールヨードニウム、アリールジアゾニウム、ニトロアリール）
である。
【０１４９】
容易にアルキル化を受ける好ましい誘導体は、アルコール、フェノール又はアミン基、特にフェノール類及び立体的に込み入っていない第一級又は第二級アミンである。
【０１５０】
チオール含有放射性同位体反応物をアルキル化する好ましい誘導体は、Ｎ−ハロアセチル基、特にＮ−クロロアセチル及びＮ−ブロモアセチル誘導体である。
【０１５１】
前駆体は、無菌の製造条件下で使用して所望の無菌の非発熱性物質を生じさせることができる。その前駆体は、また、非無菌条件下で使用した後に、例えばγ線照射、高圧蒸気殺菌、乾式加熱又は化学的処理（例えばエチレンオキシドによる）を用いる最終的な殺菌を続けてもよい。好ましくは、前駆体は、無菌の非発熱性の形態で使用する。最も好ましくは、無菌の非発熱性前駆体は、上記のように密封された容器内で使用される。
【０１５２】
キットの「前駆体」は、固体支持体マトリックスに共有結合した状態で好ましくは供給される。こうすることによって、所望の放射性医薬品が溶液中に形成され、一方、出発材料及び不純物は固相に結合したままとなる。１８Ｆ−フッ化物を用いた固相求電子フッ素化のための前駆体は、国際公開第０３／００２４８９号に記載されている。１８Ｆ−フッ化物による固相求核フッ素化のための前駆体は国際公開第０３／００２１５７号に記載されている。キットは、それ故、適切に適合された自動化合成装置に装填することができるカートリッジを含むことができる。そのカートリッジは、固体支持体結合前駆体とは別に、望ましくないフッ化物イオンを除去するためのカラム、及び、反応混合物を蒸発させ生成物が所望通りに製剤化されるようにするために連結された適当な容器を含むことができる。合成に必要な試薬及び溶媒及び他の消耗品もまた、放射性物質の濃度、容量、デリバリー時間等に関する顧客の要望に合致するような方法で合成装置が操作できるようにするソフトウエアの入ったコンパクトディスクと共に組み込むことができる。好適には、キットの全ての要素を使い捨てとすることによって、試験相互間の混入の可能性を最小限にし、無菌であり、品質保証される。
【０１５３】
第７の態様において、本発明は、カスパーゼ−３が関係すると見なされる哺乳類の身体の疾患状態のインビボイメージング診断に対する第１の実施形態の造影剤の使用を開示する。かかる非侵襲性イメージングは、異常なアポトーシスにおけるカスパーゼ−３にかかわり、多数の疾患における細胞死の監視に有用であろう。細胞増殖及びアポトーシスが盛んな病態、例えば心筋梗塞、高悪性度の腫瘍及び移植片拒絶反応において、アポトーシスのイメージングは非常に役に立つものと考えられる。かかるイメージングは、又、これらの状態の化学療法薬治療の監視においても有益であろう。
【０１５４】
アポトーシスが重要であると思われるが、アルツハイマー病のようなアポトーシス事象の数が比較的まれなその他の疾患においては、利用できる細胞プールが小さく、従って可視化するのがより一層困難である。それ故、本発明のアポトーシス造影剤は、アポトーシスが、心筋梗塞、高悪性度の腫瘍及び移植片拒絶反応において見られるように比較的急性である病態に適用するのが最善であるように考えられる。アポトーシスが、神経病又は悪性度の少ない腫瘍等のより慢性的である疾患については、アポトーシス細胞は、上のバックグラウンドに記録するには不十分であり得る。
【０１５５】
基本的に、放射線治療、化学療法又は免疫療法を含むすべての癌治療は、それらの腫瘍細胞標的におけるアポトーシスを誘発させようとするものである。アポトーシスのイメージングは、癌患者が扱われている方法を根本的に改めることができる腫瘍治療の効果の迅速で直接の評価又は監視を提供する可能性を有し得る。その人の腫瘍が治療に応答している患者は、腫瘍中の高められたアポトーシス反応で造影剤の著しく増加した取り込みを示すことが予想される。腫瘍がさらなる治療に応答しない患者は、彼らの腫瘍が治療後造影剤を取り込まないことによって確認することができる。
【０１５６】
測定可能な病気の癌患者における治療的介入の評価には、以下のいくつかの応用がある：
・新しい抗癌剤の抗新生物活性の評価、
・有効な治療措置を決定すること、
・新しい抗癌剤に対する最適用量及び服薬スケジュールの確認、
・既存抗癌剤及び複合薬に対する最適用量及び服薬スケジュールの確認、
・臨床試験における癌患者の、治療措置の応答者及び非応答者へのより効果的な層別化、
・個々の患者の設定された治療上の抗癌措置に対する応答の効果的で時機を得た評価。
【実施例】
【０１５７】
本発明を以下に詳述する非限定的な実施例で説明する。実施例１は化合物１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの合成について説明する。実施例２は潜在的に有害なアジド中間体の使用を回避する１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの別の合成法を提供する。実施例３はクロロニトロソアルカン前駆体の合成について説明する。実施例４は本発明の好ましいアミン置換二官能性ジアミンジオキシムの合成について説明する（キレーター１）。実施例５は、本発明のペプチド阻害剤の合成法を提供する。実施例６及び８は、本発明の２個の放射性ハロゲン化前駆体の合成法を提供する。実施例７は、本発明の非ペプチドカスパーゼ−３阻害剤の合成法を提供する。実施例９は、カスパーゼ−３阻害剤アッセイについて、実施例１０は、細胞に基づくカスパーゼ−３アッセイについて説明する。実施例１１及び１２は、カスパーゼ−３阻害剤の１８Ｆ放射能標識のための適当な１８Ｆ標識化合物の合成法を提供する。実施例１３は、本発明の阻害剤の放射性ヨウ素化について説明する。
【０１５８】
実施例１
１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの合成
（段階ａ）：３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル
トルエン（６００ｍｌ）中のカルボメトキシメチレントリフェニルホスホラン（１６７ｇ、０．５モル）をジメチル３−オキソグルタレート（８７ｇ、０．５モル）で処理し、反応混合物を３６時間窒素雰囲気下で１２０℃の油浴上で１００℃に加熱した。次に反応混合物を真空下で濃縮し、油状の残留物を４０／６０石油エーテル／ジエチルエーテル１：１、６００ｍｌで粉状にした。トリフェニルホスフィン酸化物を沈殿させ、上清をデカントし、濾去した。真空下で蒸発させた残留物を高真空Ｂｐｔ（０．２トルでオーブン温度１８０〜２００℃）下にクーゲルロール蒸留し、３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル（８９．０８ｇ、５３％）を得た。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２）、３．７（９Ｈ，ｓ，３×ＯＣＨ３）、３．８７（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２）、５．７９（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ，）ｐｐｍ。
ＮＭＲ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３）δ３６．５６、ＣＨ３、４８．７、２×ＣＨ３、５２．０９及び５２．５（２×ＣＨ２）；１２２．３及び１４６．１６  Ｃ＝ＣＨ；１６５．９、１７０．０及び１７０．５  ３×ＣＯＯ  ｐｐｍ。
【０１５９】
（段階ｂ）：３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステルの水素化
メタノール（２００ｍｌ）中の３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル（８９ｇ、２６７ｍｍｏｌ）を（３０時間）にわたって水素ガス（３．５バール）雰囲気下で（１０％Ｐｄ／Ｃ：５０％水）（９ｇ）とともに振盪した。溶液をケイソウ土を通して濾過し、真空下に濃縮して、油状物として３−（メトキシカルボニルメチル）グルタル酸ジメチルエステルを得た、収量（８４．９ｇ、９４％）。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ２．４８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，３×ＣＨ２）、２．７８（１Ｈ，六重線，Ｊ＝８Ｈｚ  ＣＨ，）３．７（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３）。
ＮＭＲ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３）δ２８．６、ＣＨ；３７．５０、３×ＣＨ３；５１．６、３×ＣＨ２；１７２．２８、３×ＣＯＯ。
【０１６０】
（段階ｃ）トリメチルエステルからトリアセテートへの還元及びエステル化
３つ口２Ｌ丸底フラスコ中に窒素雰囲気下で、テトラヒドロフラン（４００ｍｌ）中の水素化リチウムアルミニウム（２０ｇ、５８８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）中のトリス（メトキシカルボニルメチル）メタン（４０ｇ、２１２ｍｍｏｌ）で１時間慎重に処理した。激しい発熱反応が発生し、溶媒が激しく還流した。反応混合物を３日間還流下に９０℃の油浴上で加熱した。反応混合物を水素の放出が終了するまで酢酸（１００ｍｌ）を慎重に滴加して失活させた。攪拌した反応混合物を穏やかな還流が生じる程度の速度で、無水酢酸溶液（５００ｍｌ）で慎重に処理した。フラスコに蒸留装置を付け、撹拌し次に９０℃（油浴温度）で加熱し、テトラヒドロフランを留去した。無水酢酸（３００ｍｌ）をさらに添加し、反応混合物を還流配置に戻し、１４０℃の油浴中で５時間攪拌し、加熱した。反応混合物を放冷し、濾過した。酸化アルミニウム沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、合わせた濾液を真空（５ｍｍＨｇ）下に５０℃のウォーターバス温度でロータリーエバポレーター上で濃縮し、油状物を得た。油状物を酢酸エチル（５００ｍｌ）に溶解し、飽和炭酸カリウム溶液で洗浄した。酢酸エチル溶液を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮して油状物を得た。油状物を高真空下でクーゲルロール蒸留し、油状物としてトリス（２−アセトキシエチル）メタン（４５．３ｇ、９６％）を得た。沸点０．１ｍｍＨｇで２２０℃。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ１．６６（７Ｈ，ｍ，３×ＣＨ２，ＣＨ）、２．０８（１Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３）；４．１（６Ｈ，ｔ，３×ＣＨ２Ｏ）。
ＮＭＲ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３）、δ２０．９、ＣＨ３；２９．３４、ＣＨ；３２．１７、ＣＨ２；６２．１５、ＣＨ２Ｏ；１７１、ＣＯ。
【０１６１】
（段階ｄ）：トリアセテートからのアセテート基の除去
メタノール（２００ｍｌ）中のトリス（２−アセトキシエチル）メタン（４５．３ｇ、１６５ｍＭ）及び８８０アンモニア（１００ｍｌ）を２日間８０℃の油浴中で加熱した。反応混合物を８８０アンモニア（５０ｍｌ）でさらに処理し、２４時間油浴中８０℃で加熱した。８８０アンモニア（５０ｍｌ）をさらに添加し、反応混合物を２４時間８０℃で加熱した。次に反応混合物を真空下で濃縮し、全溶媒を除去し、油状物を得た。これを８８０アンモニア（１５０ｍｌ）に溶解し、２４時間８０℃で加熱した。次に反応混合物を真空下で濃縮し、全溶媒を除去し、油状物を得た。クーゲルロール蒸留してアセトアミド沸点１７０〜１８０  ０．２ｍｍを得た。アセトアミドを含有するバルブをきれいに洗浄し、蒸留を続行した。トリス（２−ヒドロキシエチル）メタン（２２．５３ｇ、９２％）を沸点２２０℃  ０．２ｍｍで蒸留した。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ１．４５（６Ｈ，ｑ，３×ＣＨ２）、２．２（１Ｈ，五重線，ＣＨ）；３．７（６Ｈ，ｔ，３×ＣＨ２ＯＨ）；５．５（３Ｈ，ｂｒｓ，３×ＯＨ）。
ＮＭＲ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３）、δ２２．１３、ＣＨ；３３．９５、３×ＣＨ２；５７．８、３×ＣＨ２ＯＨ。
【０１６２】
（段階ｅ）：トリオールのトリス（メタンスルホネート）への転化
ジクロロメタン（５０ｍｌ）中のトリス（２−ヒドロキシエチル）メタン（１０ｇ、０．０６７６モル）の攪拌氷冷溶液にジクロロメタン（５０ｍｌ）中の塩化メタンスルホニル（４０ｇ、０．３４９モル）の溶液を温度が１５℃を超えないような速度で窒素下でゆっくり滴下した。次にジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解したピリジン（２１．４ｇ、０．２７モル、４当量）を発熱反応で温度が１５℃を超えないような速度で滴下して加えた。反応混合物を２４時間室温で攪拌し続け、次に５Ｎ塩酸溶液（８０ｍｌ）で処理し、層分離した。水層をジクロロメタン（５０ｍｌ）でさらに抽出し有機抽出物を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して過剰の塩化メタンスルホニルを含有するトリス［２−（メチルスルホニルオキシ）エチル］メタンを得た。理論上の収量は２５．８ｇであった。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ４．３（６Ｈ，ｔ，２×ＣＨ２）、３．０（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３）、２（１Ｈ，六重線，ＣＨ）、１．８５（６Ｈ，ｑ，３×ＣＨ２）。
【０１６３】
（段階ｆ）：１，１，１−トリス（２−アジドエチル）メタンの調製
乾燥ＤＭＦ（２５０ｍｌ）中のトリス［２−（メチルスルホニルオキシ）エチル］メタン［段階１（ｅ）から、過剰の塩化メチルスルホニルに汚染されている］（２５．８ｇ、６７ｍｍｏｌ、理論上）の窒素下での攪拌溶液を、アジ化ナトリウム（３０．７ｇ、０．４７モル）で１５分かけて少しずつ処理した。発熱が観察され、反応混合物を氷浴上で冷却した。３０分後、反応混合物を２４時間５０℃の油浴上で加熱した。反応混合物は茶色になった。反応混合物を放冷し、希炭酸カリウム溶液（２００ｍｌ）で処理し、４０／６０石油エーテル／ジエチルエーテル１０：１（３×１５０ｍｌ）で３回抽出した。有機抽出物を水（２×１５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。石油／エーテル溶液にエタノール（２００ｍｌ）を添加してトリアゾールを溶液中に保持し、真空下で容量を、２００ｍｌを下回らないように減量した。エタノール（２００ｍｌ）を添加し、真空下に再濃縮し、エタノール溶液が２００ｍｌを下回らないように石油の痕跡を除去した。トリアゾールのエタノール溶液を段階１（ｇ）に直接使用した。
注意：アジドは潜在的に爆発性があるので、全溶媒を除去してはいけないし、常に希溶液を保持すべきである。
溶液０．２ｍｌ未満を真空下で蒸発させてエタノールを除去し、この少量の試料でＮＭＲを実施した。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ３．３５（６Ｈ，ｔ，３×ＣＨ２）、１．８（１Ｈ，七重線，ＣＨ，）、１．６（６Ｈ，ｑ，３×ＣＨ２）。
【０１６４】
（段階ｇ）：１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの調製
エタノール（２００ｍｌ）中のトリス（２−アジドエチル）メタン（１５．０６ｇ、０．０６７６モル）（前反応から１００％の収率と仮定）を１０％Ｐｄ／Ｃ（２ｇ、５０％水）で処理し、１２時間水素化した。反応容器を２時間ごとに排気し、反応混合物から出てくる窒素を除去し、水素で補充した。ＮＭＲ分析のために試料を取り、トリアジドのトリアミンへの完全な転化を確認した。
警告：還元しないアジドは蒸留で爆発することがある。反応混合物を、セライトパッドを通して濾過し、触媒を除去し、真空下で濃縮して油状物としてトリス（２−アミノエチル）メタンを得た。これを０．４ｍｍ／Ｈｇで沸点１８０〜２００℃のクーゲルロール蒸留でさらに精製し無色の油状物（８．１ｇ、トリオールからの全収率８２．７％）を得た。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ２．７２（６Ｈ，ｔ，３×ＣＨ２Ｎ）、１．４１（Ｈ，七重線，ＣＨ）、１．３９（６Ｈ，ｑ，３×ＣＨ２）。
ＮＭＲ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３）、δ３９．８（ＣＨ２ＮＨ２）、３８．２（ＣＨ２．）、３１．０（ＣＨ）。
【０１６５】
実施例２
１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの別の調製法
（段階ａ）：トリメチルエステルのｐ−メトキシ−ベンジルアミンによるアミド化
トリス（メチルオキシカルボニルメチル）メタン［２ｇ、８．４ｍｍｏｌ、上記段階１（ｂ）の通り調製］をｐ−メトキシ−ベンジルアミン（２５ｇ、１７８．６ｍｍｏｌ）に溶解した。蒸留のために装置を設置し、窒素気流下で、２４時間１２０℃まで加熱した。反応の進行を収集されるメタノールの量で監視した。反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチル３０ｍｌを添加し、次に沈殿したトリアミド生成物を３０分間攪拌した。トリアミドを濾過で単離し、フィルターケーキを十分な量の酢酸エチルで数回洗浄し、過剰のｐ−メトキシ−ベンジルアミンを除去した。乾燥後、白色粉末４．６ｇ、１００％を得た。高度に不溶性の生成物をさらに精製又は特性化することなく直接次の段階で使用した。
【０１６６】
（段階ｂ）：１，１，１−トリス［２−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）エチル］メタンの調製
氷水浴中で冷却した１０００ｍｌ３つ口丸底フラスコに、段階２（ａ）からのトリアミド（１０ｇ、１７．８９ｍｍｏｌ）を注意深く加え、２５０ｍｌの１Ｍボラン溶液、（３．５ｇ、２４４．３ｍｍｏｌ）とする。添加完了後、氷水浴を除去し、反応混合物をゆっくり６０℃に加熱する。反応混合物を２０時間６０℃で攪拌する。反応混合物の試料（１ｍｌ）を引き出し、０．５ｍｌの５ＮのＨＣｌと混合し、３０分間放置した。試料に０．５ｍｌの５０ＮａＯＨ、ついで水２ｍｌを加え、白色沈殿がすべて溶解するまで溶液を攪拌した。溶液をエーテル（５ｍｌ）で抽出し、蒸発させた。残留物を１ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリルに溶解し、ＭＳで分析した。ＭＳスペクトルでモノ−及びジアミド（Ｍ＋Ｈ／ｚ＝５２０及び５３４）が観察された場合は、反応は完了していない。反応を完結させるため、さらに１００ｍｌの１ＭボランＴＨＦ溶液を加え、反応混合物を６０℃でさらに６時間攪拌し、前の試料採取手順に従って新しい試料を引き出す。トリアミンへの完全な転化が完了するまで、必要に応じて１ＭのボランＴＨＦ溶液をさらに添加し続ける。
【０１６７】
反応混合物を室温まで冷却し、５ＮのＨＣｌをゆっくり添加する［注意：激しい泡沫形成が起こる！］。ガス放出が観察されなくなるまでＨＣｌを添加した。混合物を３０分間攪拌し、次に蒸発させた。ケーキをＮａＯＨ水溶液（２０〜４０％、１：２ｗ／ｖ）中に懸濁させ、３０分間攪拌した。次に混合物を水で（３倍に）希釈した。次に混合物をジエチルエーテル（２×１５０ｍｌ）で抽出した［注意：ハロゲン化溶媒を使用してはいけない］。合わせた有機相を次に水（１×２００ｍｌ）、塩水（１５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。蒸発後の収量：油状物として７．６ｇ、８４％。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ：１．４５、（６Ｈ，ｍ，３×ＣＨ２；１．５４、（１Ｈ，七重線，ＣＨ）；２．６０（６Ｈ，ｔ，３×ＣＨ２Ｎ）；３．６８（６Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ２）；３．７８（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３Ｏ）；６．９４（６Ｈ，ｄ，６×Ａｒ）。７．２０（６Ｈ，ｄ，６×Ａｒ）。
ＮＭＲ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３）、δ：３２．１７、ＣＨ；３４．４４、ＣＨ２；４７．００、ＣＨ２；５３．５６、ＡｒＣＨ２；５５．２５、ＣＨ３Ｏ；１１３．７８、Ａｒ；１２９．２９、Ａｒ；１３２．６１；Ａｒ；１５８．６０、Ａｒ；
（段階ｃ）：１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの調製
１，１，１−トリス［２−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）エチル］メタン（２０．０グラム、０．０３６モル）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解し、Ｐｄ（ＯＨ）２（５．０グラム）を添加した。その混合物を水素化し（３バール、１００℃、オートクレーブ中）、５時間攪拌した。Ｐｄ（ＯＨ）２をさらに２回に分けて（２×５グラム）それぞれ１０及び１５時間後に加えた。反応混合物を濾過し、濾液をメタノールで洗浄した。合わせた有機相を蒸発させ、残留物を真空（１×１０−２、１１０℃）下で蒸留し、前述の実施例１と同様に１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタン２．６０グラム（５０％）を得た。
【０１６８】
実施例３
３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンの調製
２−メチルブタ−２−エン（１４７ｍｌ、１．４モル）及び亜硝酸イソアミル（１５６ｍｌ、１．１６モル）の混合物を、ドライアイス及びメタノールのバス中で−３０℃に冷却し、オーバヘッドエア攪拌器で激しく攪拌し、温度を−２０℃より下に維持するような速度で、濃塩酸（１４０ｍｌ、１．６８モル）を滴下して処理した。かなりの発熱があり、過熱を防ぐために注意を払う必要があるのでこれに１時間を要する。エタノール（１００ｍｌ）を添加し、添加の終わりに形成されたスラリーの粘度を低下させ、反応混合物をさらに２時間−２０〜−１０℃で攪拌し、反応を完了させた。沈殿物を真空下で濾過して回収し、４×３０ｍｌの冷（−２０℃）エタノール及び１００ｍｌの氷冷水で洗浄し、真空乾燥し、白色固体としての３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンを得た。エタノール濾液及び洗浄液をあわせ、水（２００ｍｌ）で希釈し、冷却し、−１０℃で１時間放置したところ、３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンがさらに晶出した。沈殿物を濾過して回収し、少量の水で洗浄し、真空下で乾燥し、ＮＭＲによる純度＞９８％の３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンの総収量（１１５ｇ  ０．８５モル、７３％）を得た。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、異性体の混合物として（異性体１、９０％）１．５ｄ、（２Ｈ、ＣＨ３）、１．６５ｄ、（４Ｈ、２×ＣＨ３）、５．８５、ｑ、及び５．９５、ｑ、共に１Ｈ。（異性体２、１０％）、１．７６ｓ、（６Ｈ、２×ＣＨ３）、２．０７（３Ｈ、ＣＨ３）。
【０１６９】
実施例４
ビス［Ｎ−（１，１−ジメチル−２−Ｎ−ヒドロキシイミンプロピル）２−アミノエチル］−（２−アミノエチル）メタン（キレーター１）の合成
乾燥エタノール（３０ｍｌ）中のトリス（２−アミノエチル）メタン（４．０４７ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（７．７ｇ、５５．８ｍｍｏｌ、２当量）を窒素雰囲気下で激しく攪拌しながら室温で添加した。３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（７．５６ｇ、５５．８モル、２当量）の溶液を乾燥エタノール（１００ｍｌ）に溶解し、この溶液７５ｍｌを反応混合物にゆっくり滴下した。次いで反応混合物をシリカに基づくＴＬＣ［プレートをジクロロメタン、メタノール、濃（０．８８ｓｇ）アンモニア、１００／３０／５で処理し、ニンヒドリンを噴霧・加熱してＴＬＣプレートを展開］に付した。モノ−、ジ−及びトリ−アルキル化生成物がその順序でのＲＦの増加を伴って観察された。３％アンモニア水中の７．５〜７５％アセトニトリルグラジエントにおけるＲＰＲ逆相カラムを使用し分析ＨＰＬＣを実施した。反応混合物を真空下で濃縮し、エタノールを除去し、水（１１０ｍｌ）に再懸濁させた。水性スラリーをエーテル（１００ｍｌ）で抽出し、いくつかのトリアルキル化化合物及び親油性不純物を除去し、水層にモノ及び所望のジアルキル化生成物を残存させた。良好なクロマトグラフィーを確保するため水溶液を酢酸アンモニウム（２当量、４．３ｇ、５５．８ｍｍｏｌ）で緩衝した。水溶液を自動分離用ＨＰＬＣで精製する前に４℃で一晩保管した。
収量（２．２ｇ、６．４ｍｍｏｌ、２３％）。
マススペクトル；陽イオン１０Ｖｃｏｎｅ電圧。測定値：３４４；計算Ｍ＋Ｈ＝３４４。
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３）、δ１．２４（６Ｈ，ｓ，２×ＣＨ３）、１．３（６Ｈ，ｓ，２×ＣＨ３）、１．２５〜１．７５（７Ｈ，ｍ，３×ＣＨ２  ＣＨ）、（３Ｈ，ｓ，２×ＣＨ２）、２．５８（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｎ）、２．８８（２Ｈ，ｔ  ＣＨ２Ｎ２）、５．０（６Ｈ，ｓ，ＮＨ２，２×ＮＨ，２×ＯＨ）。
ＮＭＲ  １Ｈ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ１．１  ４×ＣＨ；１．２９、３×ＣＨ２；２．１（４Ｈ，ｔ，２×ＣＨ２）；
ＮＭＲ  １３Ｃ（（ＣＤ３）２ＳＯ）、δ９．０（４×ＣＨ３）、２５．８（２×ＣＨ３）、３１．０  ２×ＣＨ２、３４．６  ＣＨ２、５６．８  ２×ＣＨ２Ｎ；１６０．３、Ｃ＝Ｎ。
【０１７０】
ＨＰＬＣ条件：流速８ｍｌ／分２５ｍｍＰＲＰカラム使用
Ａ＝３％アンモニア溶液（比重＝０．８８）／水；Ｂ＝アセトニトリル
時間      ％Ｂ
０        ７．５
１５      ７５．０
２０      ７５．０
２２      ７．５
３０      ７．５
１回の運転当り水溶液３ｍｌをロードし、１２．５〜１３．５分の時間窓で収集する。
【０１７１】
実施例５
３−ヨード−ベンゾイル−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈ（化合物３）の合成
【０１７２】
【化２８】
2007512302.tif 000030
【０１７３】
上の配列に対応するペプチジル樹脂を、標準的な固相ペプチド化学（Ｂａｒａｎｙ，  Ｇ；  Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｍｕｌｌｅｎ，  Ｄ．Ｇ．  （１９８７）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，  ７０５−７３９）によってＨ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｈ  ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）上に組み立てた。手動の窒素バブラー装置を使用した（Ｗｅｌｌｉｎｇｓ，  Ｄ．Ａ．，  Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｅ．  （１９９７）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｇ．  ｅｄ），  ２８９，  ｐ．  ５３−５４，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。組み立てたペプチジル樹脂３−ヨード−ベンゾイル−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｈ  ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧ樹脂（化合物１）を、ｔ−ブチル保護基を除去するために２．５％の水を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した。アスパルチル及びグルタミル残基の側鎖は、メタノール中の塩化チオニル（２０当量）を用いてメチルエステルに変換し、ペプチド樹脂（化合物２）を生じさせた。そのペプチジル樹脂を０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する６０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液で４時間にわたって処理することによって樹脂からペプチド生成物（化合物３）を遊離させた。樹脂の残りを濾別し、その濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで粉末にし、生成物を遠心分離で単離した。その生成物は、０．１％ＴＦＡ水溶液中の０〜７０％ＡＣＮのグラジエントで０．３ｍｌ／分で１０分間溶出し、溶出液をλ＝２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収で検出する分析用ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）  ５０ｍｍ×２ｍｍ）の使用とエレクトロスプレー質量分析によるＬＣ−ＭＳで特性を明らかにした。ｔＲ＝８．２分において、７３３．５ｍ／ｚ（期待値：７３３．２ｍ／ｚ）の［Ｍ＋Ｈ］＋で所望の生成物を確認した。
【０１７４】
実施例６
放射性ハロゲン化のためのトリメチルスタンニル前駆体（化合物４）の合成
【０１７５】
【化２９】
2007512302.tif 000031
【０１７６】
上の実施例５からの３−ヨード−ベンゾイル−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈ  ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧ樹脂（化合物２）を、マイクロ波技術を用いてスタンニル化した。３−ヨード官能化樹脂（５０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を、アルゴン下の照射管に入れ、乾燥Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（７ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）及びヘキサメチルジスズ（７．８６ｍｇ、５μｌ、０．０２４ｍｍｏｌ）で処理した。その管を密封し、空所に置いて１００℃で５分間照射した。冷却後黒色になった混合物を洗浄し、スタンニル化したペプチド（化合物４）を樹脂から切断し、上の実施例５で記したように仕上げた。その生成物は、０．１％ＴＦＡ水溶液中の１０〜８０％ＡＣＮのグラジエントで０．３ｍｌ／分で１０分間溶出し、溶出液をλ＝２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収で検出する分析用ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）  ５０ｍｍ×２ｍｍ）の使用とエレクトロスプレー質量分析によるＬＣ−ＭＳで特性を明らかにした。ｔＲ＝８．３分において、７７１．１ｍ／ｚ（期待値：７７１．２ｍ／ｚ）の［Ｍ＋Ｈ］＋で所望の生成物を確認した。
【０１７７】
実施例７
１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−メトキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（化合物５）の合成
【０１７８】
【化３０】
2007512302.tif 000032
【０１７９】
アルゴン下及び室温において、６０％の水素化ナトリウムを、無水ＤＭＦ（５ｍｌ）中の５−（２−メトキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（イサチン誘導体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから市販、Ｃａｔ＃２１８８２６、５０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）の透明な黄色の溶液に加えた。その混合物は直ちに濃い紫色に変化した。１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（２００μｌ）中の４−ヨードベンジルブロミド（４６．５６ｍｇ）を加え、室温での攪拌を続けた。反応の進行と共に紫色が消え、２４時間後、ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール、８：２）のｒｆ  ｃａ２が反応の完結を示した。ＤＭＦを次に減圧下で蒸発させて除去し、残渣をクロロホルム：メタノール（８：２）を用いるフラッシュクロマトグラフにかけて６１ｍｇ（７３％）の黄色の半固体を生じさせた。その生成物を分離用ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製した。カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８  １０μ、２２×２５０ｍｍ）を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液中の３０〜８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）のグラジエントで１０ｍｌ／分で６０分間溶出した。所望のピーク分画をためて純粋な化合物５を産出した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析：ｔＲ＝５．３９分、（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）  ５０ｍｍ×２ｍｍ、０．１％ＴＦＡ水溶液中３０〜８０％ＡＣＮ、０．３ｍｌ／分で１０分間、λ＝２１４ｎｍ）。エレクトロスプレーＭＳ：５４１．０ｍ／ｚに期待された生成物の［Ｍ＋Ｈ］＋が５４０．９ｍ／ｚに認められた。
【０１８０】
実施例８
５−（２−メトキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）−１−（４トリメチルスタンニル−ベンジル）−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（化合物６）
【０１８１】
【化３１】
2007512302.tif 000033
【０１８２】
トルエン（８ｍｌ）中の化合物５（２７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、上の実施例７由来）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５．７８ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）及びヘキサメチルジスズ（２１μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）の透明な黄色の溶液を、マイクロ波照射のもとで１２０℃で５分間加熱した。得られた黒い混合物を濾過した。濾液を乾燥するまで蒸発させ、残渣を酢酸エチル：ヘキサン（１：１）を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製し、８３％の収率で黄色の油状物としての純粋な生成物を生じた。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析：ｔＲ＝７．９２分、（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）  ５０ｍｍ×２ｍｍ、０．１％ＴＦＡ水溶液中３０〜８０％ＡＣＮ、０．３ｍｌ／分で１０分間、λ＝２１４ｎｍ）。エレクトロスプレーＭＳ：５７８．９ｍ／ｚに期待された生成物の［Ｍ＋Ｈ］＋が５７８．９ｍ／ｚに認められた。
【０１８３】
実施例９
生体内カスパーゼ−３阻害剤アッセイ
カスパーゼ−３阻害剤の生体内効能を、市販のアッセイキット（例えば、Ｂｉｏｍｏｌ、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌ．Ｐ．５１２０  Ｂｕｔｌｅｒ  Ｐｉｋｅ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ  １９４６２−１２０２）を用いて評価した。要するに、カスパーゼ−３アッセイキットは、カスパーゼ−３のプロテアーゼ活性を測定するように設計された完璧なアッセイシステムである。それは、比色基質（ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）及び蛍光発生基質（ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）の両方を含んでいる。比色基質からのｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の切断は、４０５ｎｍにおける吸収を増大させる。蛍光アッセイは、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）染料のペプチド基質のＣ末端からの切断に基づく。その染料の基質からの切断は、４６０ｎｍにおけるその蛍光強度を増大する。それらのアッセイは、便利な９６ウェルマイクロプレートフォーマット中で実施される。そのキットは、カスパーゼ−３の阻害剤、有望な治療標的を選別するために有用である。阻害剤、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（アルデヒド）もまた、原型の対照阻害剤１として含まれる。ＤＥＶＤアミノ酸配列は、ＰＡＲＰ［ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ］におけるカスパーゼ−３切断部位に由来する。
【０１８４】
実施例１０
カスパーゼ−３細胞アッセイ
Ｗａｎｇらによる”Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｂａｋ  ｉｎ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ａｕｇ  ２００１；  ２７６：  ３４３０７−３４３１７に記載されているように、スタウロスポリンで誘発されたアポトーシスのある細胞をベースにしたモデルにおいて、ジャーカット及びＨＬ−６０細胞を使用した。
【０１８５】
カスパーゼ−３阻害剤について、それらが細胞に入り、その後カスパーゼ−３の標的と結合する能力を試験するためには二官能性細胞に基づくアッセイが必要である。そのアッセイは、カスパーゼのフルオロクロム阻害剤（ＦＬＩＣＡ）に基づく。その阻害剤は、細胞透過性であり、一旦細胞内に入るとそれらは活性なカスパーゼ−３と共有結合で結合し、ＦＬＩＣＡ蛍光を検出することができる。細胞の集団に加えられたとき、ＦＬＩＣＡプローブは、各細胞に入り、活性カスパーゼヘテロダイマーの大きなサブユニットにある活性なシステイン残基に共有結合し、それによってさらなる酵素活性を阻害する。結合した標識試薬は細胞内に保持され、一方、結合していない試薬は細胞外に拡散し流出する。緑色の蛍光シグナルは、試薬を加えた時の細胞集団中に存在する活性なカスパーゼ−３の量の直接の尺度である。結合した標識試薬を含有する細胞は、蛍光用の９６ウェルプレート中で分析することができる。
【０１８６】
アッセイ検証被検物質もまたカスパーゼ−３標的阻害剤であり、これらはＦＬＩＣＡ処理の前にアポトーシス細胞に加えられた。強力な試験化合物は、ＦＬＩＣＡの活性カスパーゼ−３への結合を妨害し、ＦＬＩＣＡに伴う蛍光の減少を追跡することによって、ある程度の効能の観察を可能にする。
【０１８７】
実施例１１
Ｎ−アルキル化のための１８Ｆ−標識誘導体の合成
３−［１８Ｆ］フルオロプロピルトシレートの合成
【０１８８】
【化３２】
2007512302.tif 000034
【０１８９】
２方向コックを通して、ガラスバイアルに用意したアセトニトリル（３００μｌ）中のＫｒｙｐｔｏｆｉｘ２２２（１０ｍｇ）及び水（３００μｌ）中の炭酸カリウム（４ｍｇ）を、プラスチックのシリンジ（１ｍｌ）を用いて真鍮製ヒーター内に設置した炭素ガラスの反応容器中に移した。ターゲット用水中（０．５〜２ｍｌ）の１８Ｆフッ化物（１８５〜３７０ＭＢｑ）を、次に２方向コックを通して加えた。ヒーターを１２５℃にセットし、タイマーを始動させた。１５分後、３個のアセトニトリルのアリコート（０．５ｍｌ）を１分間隔で加えた。その１８Ｆフッ化物を、最大で合計４０分まで枯渇させた。４０分後、ヒーターを圧搾空気で冷却し、ポットの蓋を取り除き、１，３−プロパンジオール−ジ−ｐ−トシレート（５〜１２ｍｇ）及びアセトニトリル（１ｍｌ）を加えた。ポットの蓋を元に戻し、ラインをストッパーで締めた。ヒーターを１００℃にセットし、１００℃／１０分で標識した。標識後、３−［１８Ｆ］フルオロプロピルトシレートを、Ｇｉｌｓｏｎ  ＲＰ  ＨＰＬＣで以下の条件を用いて単離した。
【０１９０】
カラム          ｕ−ｂｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８  ７．８×３００ｍｍ
溶出液          水（ポンプＡ）：アセトニトリル（ポンプＢ）
ループサイズ    １ｍｌ
ポンプ速度      ４ｍｌ／分
波長            ２５４ｎｍ
グラジエント    ２０分で５〜９０％の溶出液Ｂ
生成物Ｒｔ      １２分
一旦単離したら、カットサンプル（約１０ｍｌ）を水（１０ｍｌ）で希釈し、調整済みのＣ１８セップパック（ｓｅｐ  ｐａｋ）に装填した。そのセップパックを窒素で１５分間乾燥させ、有機溶媒、ピリジン（２ｍｌ）、アセトニトリル（２ｍｌ）又はＤＭＦ（２ｍｌ）を流して洗った。活性のほぼ９９％が洗い流された。
【０１９１】
３−［１８Ｆ］フルオロプロピルトシレートを、ピリジン中で還流させることによってアミンをＮ−アルキル化するために使用する。
【０１９２】
実施例１２
Ｓ−アルキル化のための［１８Ｆ］−チオール誘導体
段階（ａ）：３−［１８Ｆ］フルオロ−トリチルスルファニル−プロパンの調製
【０１９３】
【化３３】
2007512302.tif 000035
【０１９４】
２方向コックを通して、ガラスバイアルに用意したアセトニトリル（８００μｌ）中のＫｒｙｐｔｏｆｉｘ２２２（１０ｍｇ）及び水（５０μｌ）中の炭酸カリウム（１ｍｇ）を、プラスチックのシリンジ（１ｍｌ）を用いて真鍮製ヒーター内に設置した炭素ガラスの反応容器中に移した。ターゲット用水中（０．５〜２ｍｌ）の１８Ｆフッ化物（１８５〜３７０ＭＢｑ）を、次に２方向コックを通して加えた。ヒーターを１２５℃にセットし、タイマーを始動させた。１５分後３個のアセトニトリルのアリコート（０．５ｍｌ）を１分間隔で加えた。その１８Ｆ−フッ化物を、最大で合計４０分まで枯渇させた。４０分後、ヒーターを圧搾空気で冷却し、ポットの蓋を取り除き、トリメチル−（３−トリチルスルファニル−プロポキシ）シラン（１〜２ｍｇ）及びＤＭＳＯ（０．２ｍｌ）を加えた。ポットの蓋を元に戻し、ラインをストッパーで締めた。ヒーターを８０℃にセットし、８０℃／５分で標識した。標識後、反応混合物をＲＰ  ＨＰＬＣで以下のＨＰＬＣ条件を用いて単離した。
【０１９５】
カラム          ｕ−ｂｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８  ７．８×３００ｍｍ
溶出液          ０１．％ＴＦＡ／水（ポンプＡ）：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
（ポンプＢ）
ループサイズ    １００μｌ
ポンプ速度      ４ｍｌ／分
波長            ２５４ｎｍ
グラジエント    １分      ４０％Ｂ
１５分    ４０〜８０％Ｂ
５分      ８０％Ｂ
反応混合物をＤＭＳＯ／水（１：１ｖ／ｖ、０．１５ｍｌ）で希釈し、調整済みのｔ−Ｃ１８セップパックに装填した。そのセップパックを水（１０ｍｌ）で洗浄し、窒素で乾燥させ、３−［１８Ｆ］フルオロ−１−トリチルスルファニル−プロパンを、４個のアセトニトリルのアリコート（１アリコート当たり０．５ｍｌ）で溶出した。
【０１９６】
段階（ｂ）：３−［１８Ｆ］フルオロ−プロパン−１−チオールの調製
【０１９７】
【化３４】
2007512302.tif 000036
【０１９８】
３−［１８Ｆ］フルオロ−１−トリチルスルファニル−プロパンのアセトニトリル（１〜２ｍｌ）中の溶液を、１００℃／１０分の窒素気流を用いて乾燥するまで蒸発させた。ＴＦＡ（０．０５ｍｌ）、トリイソプロピルシラン（０．０１ｍｌ）及び水（０．０１ｍｌ）の混合物を加え、続いて８０℃／１０分加熱して３−［１８Ｆ］フルオロ−プロパン−１−チオールを生成させた。
【０１９９】
段階（ｃ）：−Ｎ（ＣＯ）ＣＨ２Ｃｌ前駆体との反応
クロロアセチル前駆体を標識する一般的方法は、段階（ｂ）からの３−［１８Ｆ］フルオロ−１−メルカプト−プロパンを含有する反応容器を圧搾空気で冷却し、次にアンモニア（２７％水溶液、０．１ｍｌ）及び前駆体（１ｍｇ）の（０．０５ｍｌ）水溶液を加え、その混合物を８０℃で１０分間加熱する。
【０２００】
実施例１３
カスパーゼ−３阻害剤の［１２３Ｉ］−放射標識
段階（ａ）：化合物５合成の別法
化合物５は、非放射性類似体、即ちヨウ素同位体が１２７Ｉであり、下のスキーム４に従って調製した。
【０２０１】
【化３５】
2007512302.tif 000037
【０２０２】
質量分光分析で化合物５であることを確認した。
【０２０３】
段階（ｂ）：化合物５Ａの合成
１２３Ｉ標識化合物５（化合物５Ａ）を調製するために段階（ａ）と類似の手順をたどった。キャリヤー無しの８〜３０μｌの［１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウムに、１００μｌのｐＨ４で０．２Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液、１０μｌの［１２７Ｉ］ヨウ化ナトリウム、１５ｍｇ／１００ｍｌ溶液の０．０１Ｍ水酸化ナトリウム中のヨウ化ナトリウム、（１×１０−８モル）及び５０μｌのアセトニトリルを加えた。試薬を混合し、シラン処理したＰ１５バイアルに移した。最後に１０μｌの０．００１Ｍ過酢酸溶液（１×１０−８モル）及び化合物６のアセトニトリル中の１ｍｇ／ｍｌ溶液の５８μｌ（１×１０−７モル）を加えた。［１２３Ｉ］−化合物５（化合物５Ａ）を、ＨＰＬＣ精製し、１０％のエタノールを含む（溶解性を助けるため）ｐＨ７．４、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中に希釈して、それぞれ１４ＭＢｑ／ｎｍｏｌ及び４１ＭＢｑ／ｎｍｏｌの代表的な比放射能を有する２０ＭＢｑ／ｍｌ又は１００ＭＢｑ／ｍｌとした。両製剤とも、ｐＨ７．５で安定（４時間を越えて＞９５％のＲＣＰ）であることがわかった。段階（ａ）からの１２７Ｉ標準を含む共溶出が観察され同一性を確認した。
【国際調査報告】
2007512302.tif 000043
2007512302.tif 000044
2007512302.tif 000045