(57)【要約】  本発明は、増殖性疾患の治療のための、ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ−１またはＨＩＡＰ−２に対するアンチセンスオリゴマー、および化学療法剤、ならびにその組成物およびキットの使用を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患を有する患者を治療する方法であって、前記患者へ、
（ｉ）８〜３０核酸塩基長のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基のオリゴマー、および
（ｉｉ）化学療法薬
を前記患者を治療するために総合して十分な量で投与することを含む方法。
【請求項２】
前記アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび前記化学療法薬が互いに２８日以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび前記化学療法薬が互いに２４時間以内に投与される、請求項２に記載の方法
【請求項４】
前記アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび前記化学療法薬が互いに１時間以内に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび前記化学療法薬が同時に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号１〜９９、１４３、１４７、１５１、１６３〜２６０、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される、少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される、少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される配列から本質的に構成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される配列から構成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸塩基オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾された結合を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾された結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエートおよびホスホセレネート結合からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸塩基オリゴマーが少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾された糖部分が２’−Ｏ−メチル基または２’−Ｏ−メトキシエチル基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸塩基オリゴマーが少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記核酸塩基オリゴマーがキメラ核酸塩基オリゴマーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸塩基オリゴマーがホスホロチオエート結合により互いに連結されているＤＮＡ残基を含み、前記ＤＮＡ残基の両側が少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ残基の両側が少なくとも３個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ残基の両側が４個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡ残基がホスホロチオエート結合により互いに連結され、前記ＲＮＡ残基が前記ＤＮＡ残基とホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸塩基オリゴマーがホスホジエステル結合により互いに連結されたＤＮＡ残基を含み、前記ＤＮＡ残基の両側がホスホロチオエート結合により互いに連結された少なくとも２個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ残基の両側が少なくとも３個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸塩基オリゴマーが、４個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基を両側に隣接する１１個のＤＮＡ残基を含んでなり、前記核酸塩基オリゴマーが以下の配列：
５’−ＡＵＵＧＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＧＵＵＣＵ−３’（配列番号１５５）、
５’−ＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１６）、
５’−ＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＡＡ−３’（配列番号１５７）、
５’−ＵＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＣＵＧＡＡ−３’（配列番号２７）、
５’−ＧＣＵＧＡＧＴＣＴＣＣＡＴＡＴＵＧＣＣ−３’（配列番号１４１）、
５’−ＵＣＧＧＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＣＵＧＡ−３’（配列番号４１）、
５’−ＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＵＣＡＣ−３’（配列番号４７）、
５’−ＣＣＧＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５１）、
５’−ＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＴＴＵＡＧＣ−３’（配列番号６３）、
５’−ＵＧＵＣＡＧＴＡＣＡＴＧＴＴＧＧＣＵＣ−３’（配列番号１６１）、および
５’−ＵＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＵＵＵ−３’（配列番号１５１）の中の１つからなり、前記残基がホスホロチオエート結合により互いに連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学療法薬が微小管を崩壊する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法薬が微小管を安定させる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学療法薬がタキサンである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記タキサンがパクリタキセル、ドキセタキセル、ＲＰＲ  １０９８８１Ａ、ＳＢ−Ｔ−１２１３、ＳＢ−Ｔ−１２５０、ＳＢ−Ｔ−１０１１８７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＢＲＴ２１６、ＤＪ−９２７、ＭＡＣ−３２１、ＩＤＮ５１０９、またはＩＤＮ５３９０である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法薬がビンカアルカロイドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ビンカアルカロイドが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、またはヒドロビンブラスチンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学療法薬がドラスタチンである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ドラスタチンが、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、ＩＬＸ６５１、ＴＺＴ−１０２７、シンプロスタチン１、シンプロスタチン３、またはセマドチンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学療法薬がクリプトフィシンである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記クリプトフィシンがクリプトフィシン１またはクリプトフィシン５２である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化学療法薬がエポチロンである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記エポチロンがエポチロンＡ、エポチロンＢ、デオキシエポチロンＢまたはエポチロンＢラクタムである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記化学療法薬が、エレウテロビン、ディスコデルモリド、２−エピ−ディスコデルモリド、２−デス−メチルディスコデルモリド、５−ヒドロキシメチルディスコデルモリド、１９−デス−アミノカルボニルディスコデルモリド、９（１３）−シクロディスコデルモリド、またはラウリマリドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記化学療法薬が、表１に記載されるものから選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者へ化学的感作剤を投与することをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者へ生物学的応答修飾薬を投与することをさらに含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者へ第２の化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
増殖性疾患を有する患者を治療するために総合して十分な量の、
（ｉ）８〜３０核酸塩基長のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基のオリゴマー、および
（ｉｉ）化学療法薬
を含む組成物。
【請求項４５】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号１〜９９、１４３、１４７、１５１、１６３〜２６０、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される、少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される、少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される配列から本質的に構成される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記核酸塩基オリゴマーが、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９、および３００〜４６０からなる群から選択される配列から構成される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記核酸塩基オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾された結合を含む、請求項４９の組成物。
【請求項５１】
前記修飾された結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエートおよびホスホセレネート結合からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記核酸塩基オリゴマーが少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記修飾された糖部分が２’−Ｏ−メチル基または２’−Ｏ−メトキシエチル基である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記核酸塩基オリゴマーが少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項５４の組成物。
【請求項５６】
前記核酸塩基オリゴマーがキメラ核酸塩基オリゴマーである、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記核酸塩基オリゴマーがホスホロチオエート結合により互いに連結されているＤＮＡ残基を含み、前記ＤＮＡ残基の両側が少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ＤＮＡ残基の両側が少なくとも３個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ＤＮＡ残基の両側が４個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ＲＮＡ残基がホスホロチオエート結合により互いに連結され、前記ＲＮＡ残基が前記ＤＮＡ残基とホスホロチオエート結合により連結されている、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６１】
前記核酸塩基オリゴマーがホスホジエステル結合により互いに連結されたＤＮＡ残基を含み、前記ＤＮＡ残基の両側がホスホロチオエート結合により互いに連結された少なくとも２個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ＤＮＡ残基の両側が少なくとも３個の２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基に隣接している、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記核酸塩基オリゴマーが、４個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基を両側に隣接する１１個のＤＮＡ残基を含んでなり、前記核酸塩基オリゴマーが以下の配列：
５’−ＡＵＵＧＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＧＵＵＣＵ−３’（配列番号１５５）、
５’−ＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１６）、
５’−ＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＡＡ−３’（配列番号１５７）、
５’−ＵＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＣＵＧＡＡ−３’（配列番号２７）、
５’−ＧＣＵＧＡＧＴＣＴＣＣＡＴＡＴＵＧＣＣ−３’（配列番号１４１）、
５’−ＵＣＧＧＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＣＵＧＡ−３’（配列番号４１）、
５’−ＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＵＣＡＣ−３’（配列番号４７）、
５’−ＣＣＧＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５１）、
５’−ＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＴＴＵＡＧＣ−３’（配列番号６３）、
５’−ＵＧＵＣＡＧＴＡＣＡＴＧＴＴＧＧＣＵＣ−３’（配列番号１６１）、および
５’−ＵＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＵＵＵ−３’（配列番号１５１）の中の１つからなり、前記残基がホスホロチオエート結合により互いに連結されている、請求項４４に記載の組成物。
【請求項６４】
前記化学療法薬が微小管を崩壊する、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記化学療法薬が微小管を安定させる、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記化学療法薬がタキサンである、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記タキサンがパクリタキセル、ドキセタキセル、ＲＰＲ１０９８８１Ａ、ＳＢ−Ｔ−１２１３、ＳＢ−Ｔ−１２５０、ＳＢ−Ｔ−１０１１８７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＢＲＴ２１６、ＤＪ−９２７、ＭＡＣ−３２１、ＩＤＮ５１０９、またはＩＤＮ５３９０である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記化学療法薬がビンカアルカロイドである、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ビンカアルカロイドが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、またはヒドロビンブラスチンである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記化学療法薬がドラスタチンである、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ドラスタチンが、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、ＩＬＸ６５１、ＴＺＴ−１０２７、シンプロスタチン１、シンプロスタチン３、またはセマドチンである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記化学療法薬がクリプトフィシンである、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記クリプトフィシンがクリプトフィシン１またはクリプトフィシン５２である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記化学療法薬がエポチロンである、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記エポチロンがエポチロンＡ、エポチロンＢ、デオキシエポチロンＢまたはエポチロンＢラクタムである、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記化学療法薬が、エレウテロビン、ディスコデルモリド、２−エピ−ディスコデルモリド、２−デス−メチルディスコデルモリド、５−ヒドロキシメチルディスコデルモリド、１９−デス−アミノカルボニルディスコデルモリド、９（１３）−シクロディスコデルモリド、またはラウリマリドである、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記化学療法薬が、表１に記載されるものから選択される、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
細胞のアポトーシスを促進させる方法であって、前記細胞を請求項４４〜７７のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項７９】
前記細胞が生体内に存在する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が生体外に存在する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞が癌細胞である、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記癌細胞がヒト癌細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
（ｉ）８〜３０核酸塩基長のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基のオリゴマー、
（ｉｉ）化学療法薬、および
（ｉｉｉ）前記アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび前記化学療法薬を、増殖性疾患を有する患者へ前記増殖性疾患を治療するために十分な量で投与するための説明書、
を備えるキット。
【請求項８４】
（ｉ）８〜３０核酸塩基長のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基のオリゴマー、および
（ｉｉ）前記アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび化学療法薬を、増殖性疾患を有する患者へ前記増殖性疾患を治療するために十分な量で投与するための説明書、
を備えるキット。
【請求項８５】
（ｉ）請求項４４〜７７のいずれか一項に記載の組成物、および
（ｉｉ）前記組成物を、増殖性疾患を有する患者へ前記増殖性疾患を治療するために十分な量で投与するための説明書、
を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌およびその他の増殖性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が死滅する一つの方法を、アポトーシス、またはプログラム細胞死と呼ぶ。アポトーシスは、多くの場合健康な組織の発達および維持の正常な部分として生じる。このプロセスの発生は急速なため、検知するのが困難である。
【０００３】
アポトーシス経路は、胚の発生、ウイルス病原性、癌、自己免疫疾患、および神経変性疾患、ならびにその他の現象に決定的役割を果たすことが知られている。アポトーシス応答の不全は、癌、自己免疫疾患、例えばエリテマトーデスおよび多発性硬化症の発症に、ならびにヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルスに関連するものをはじめとするウイルス感染に関与している。
【０００４】
近年、癌におけるアポトーシスの重要性が明らかになってきた。１９７０年代後半に増殖を促進する癌遺伝子が同定されたことで、ほとんど全世界の注目が細胞増殖に集まり、細胞増殖は何年もの間癌生物学で優位を占める研究となっている。長年にわたる定説では、抗癌治療は「正常」細胞と比較して急速に分裂する癌細胞を選択的に標的とするとされていた。この解釈は、増殖の遅い腫瘍の中にも治療の容易なものがあり、急速に分裂する腫瘍種の多くは抗癌治療に対して極めて耐性が高いことから、完全に満足のいくものではなかった。癌分野における進歩により、現在、腫瘍形成をプログラム細胞死の正常経路が実施されなかったものとみなす癌生物学の新しいパラダイムが導かれている。正常細胞は、隣接細胞から種々の成長因子を介して連続的なフィードバックを受け、この状況から除かれた場合に「自殺」する。癌細胞はこれらの命令を何とかして回避し、不適当な増殖を続ける。放射線治療および多くの化学療法を含む癌治療の多くは、以前は細胞傷害を起こすことにより作用すると考えられていたが、現在では実際にはアポトーシスを誘導することにより働くと考えられている。
【０００５】
正常な細胞種と癌細胞種の両方がアポトーシス誘導に対して広範囲の感受性を示すが、この耐性の決定因子だけが今も調査中である。正常な細胞種の多くが致死量以下の放射線量または致死量以下の用量の細胞傷害性化学薬品に応答して一時的な増殖停止を起こすが、近傍の癌細胞はアポトーシスを起こす。この投与量による差次的効果が、抗癌治療の成功を可能にする重大な治療手段をもたらす。したがって、アポトーシスに対する腫瘍細胞の耐性が、癌治療失敗の主な理由として浮上してきても驚くにはあたらない。
【０００６】
アポトーシスを阻害する強力な内在タンパク質が、Ｂｃｌ−２および哺乳類におけるＩＡＰタンパク質ファミリーをはじめとして、いくつか同定されている。ＩＡＰファミリーの特定のメンバーは、末端エフェクターカスパーゼ、すなわち細胞死の実行に関与するｃａｓｐ−３およびｃａｓｐ−７、ならびに癌化学療法に誘発される細胞死の仲介に重要な、鍵となるミトコンドリアのイニシエーターカスパーゼ、ｃａｓｐ−９を直接阻害する。ＩＡＰは唯一既知の内生カスパーゼ阻害物質であり、従ってアポトーシスの調節に中心的役割を果たす。
【０００７】
ＩＡＰはいくつかの癌の進行に寄与すると想定されており、特定の１種類のＩＡＰ(ｃＩＡＰ２／ＨＩＡＰ１)に関して想定される偶然の染色体転座がモルトリンパ腫で確認されている。最近、ＸＩＡＰの上昇、予後の不良、および短い生存期間の間に相関関係のあることが、急性骨髄性白血病の患者において実証された。さらに、ＸＩＡＰは、ＮＣＩパネルの腫瘍細胞系統の多くで高度に過剰発現した。
【０００８】
改良された癌治療薬、および、特に癌細胞がアポトーシスを起こすよう誘導し、このような細胞にもたらされる抗アポトーシスシグナルを退けることのできる治療薬に対する必要性がある。
【非特許文献１】Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＲ．  （２０００）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ｉｓ  ｉｔ  ａｓ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ？  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ．  ６，  ７２−８１．
【非特許文献２】Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  Ｇ，  Ａｄｉｄａ  Ｃ，  Ｓｉｒｕｇｏ  Ｇ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （１９９８）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  １１１７７−１１１８２．
【非特許文献３】Ａｏｋｉ  Ｙ，  Ｃｉｏｃａ  ＤＰ，  Ｏｉｄａｉｒａ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｓａｗａ  Ｋ  （２００３）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｙ  ｂｅ  ｍｏｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｈａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０，  ９６−１０２．
【非特許文献４】Ａｓｓｅｌｉｎ  Ｅ，  Ｍｉｌｌｓ  ＧＢ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２００１ａ）  ＸＩＡＰ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ａｋｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  １８６２−１８６８．
【非特許文献５】Ａｓｓｅｌｉｎ  Ｅ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２００１ｂ）  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １４２，  ２４５１−２４５７．
【非特許文献６】Ｂａｒｔｏｎ  ＧＭ，  ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ  （２００２）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：  １４９４３−１４９４５．
【非特許文献７】Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａ  Ｌ，  Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ．  （２０００）  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，  ２８７−２９７．
【非特許文献８】Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ＪＲ，  Ｐｏｔｔｉｅｒ  Ｍ，  Ｖｅｋｒｉｓ  Ａ，  Ｏｐｏｌｏｎ  Ｐ，  Ｍａｋｓｉｍｅｎｋｏ  Ａ，  ａｎｄ  Ｍａｌｖｙ  Ｃ．  （２００２）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９６，  １０００−１００４．
【非特許文献９】Ｂｉｌｉｍ  Ｖ，  Ｋａｓａｈａｒａ  Ｔ，  Ｈａｒａ  Ｎ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ．  （２００３）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＸＩＡＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  （ＴＣＣ）  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＸＩＡＰ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＴＣＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １０３，  ２９−３７．
【非特許文献１０】Ｂｏｈｕｌａ  ＥＡ，  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＡＪ，  Ｓｏｈａｉｌ  Ｍ，  Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ＭＰ，  Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ  Ｊ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ，  ａｎｄ  Ｍａｃａｕｌａｙ  ＶＭ  （２００３）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  １  ＩＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＧＦ１Ｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （ｍｉｓｓｉｎｇ  ｖｏｌ  ａｎｄ  ｐａｇｅ  ｉｎｆｏ，  ｅｐｕｂ  ｏｎ  Ｆｅｂ  ２４）．
【非特許文献１１】Ｂｒａａｓｃｈ  ＤＡ，  Ｊｅｎｓｅｎ  Ｓ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｋａｕｒ  Ｋ，  Ａｒａｒ  Ｋ，  Ｗｈｉｔｅ  ＭＡ，  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ  ＤＲ．  （２００３）  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４２，  ７９６７−７９７５．
【非特許文献１２】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ，  Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ  Ｒ．  （２００２）  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９６，  ５５０−５５３．
【非特許文献１３】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ，  Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ  Ｒ．  （２００２）  Ｓｔａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２，  ２４３−２４７．
【非特許文献１４】Ｃａｒｍｅｌｌ  ＭＡ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＤＳ，  Ｈａｒｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ  ＴＡ．  （２００３）  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１０，  ９１−９２．
【非特許文献１５】Ｃａｒｖａｌｈｏ  Ａ，  Ｃａｒｍｅｎａ  Ｍ，  Ｓａｍｂａｄｅ  Ｃ，  Ｅａｒｎｓｈａｗ  ＷＣ，  ａｎｄ  Ｗｈｅａｔｌｅｙ  ＳＰ．  （２００３）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔａｘｏｌ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６，  ２９８７−２９９８．
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎ  Ｚ，  Ｎａｉｔｏ  Ｍ，  Ｈｏｒｉ  Ｓ，  Ｍａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｙａｍｏｒｉ  Ｔ，  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．  （１９９９）  Ａ  ｈｕｍａｎ  ＩＡＰ−ｆａｍｉｌｙ  ｇｅｎｅ，  ａｐｏｌｌｏｎ，  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６４，  ８４７−８５４．
【非特許文献１７】Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｗｕ  Ｗ，  Ｔａｈｉｒ  ＳＫ，  Ｋｒｏｅｇｅｒ  ＰＥ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＨ，  Ｃｏｗｓｅｒｔ  ＬＭ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｆ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ  Ｓ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋａ  Ｍ，  Ｗｅｌｓｈ  Ｋ，  Ｒｅｅｄ  ＪＣ，  ａｎｄ  Ｎｇ  ＳＣ．  （２０００）  Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．  ２，  ２３５−２４１．
【非特許文献１８】Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｊｉｎ  Ｓ，  Ｔａｈｉｒ  ＳＫ，  Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｓａｒｔｈｙ  ＡＶ，  ＭｃＧｏｎｉｇａｌ  ＴＰ，  Ｌｉｕ  Ｚ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＨ，  ａｎｄ  Ｎｇ  ＳＣ．  （２００３）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ｂ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  ４８６−４９０．
【非特許文献１９】Ｃｈｏｉ  ＫＳ，  Ｌｅｅ  ＴＨ，  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ  ＭＨ．  （２００３）  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０，  ８７−９５．
【非特許文献２０】Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  Ｆ，  Ｆｅｃｈｔｎｅｒ  Ｍ，  Ｄａｍｅｓ  Ｓ，  Ａｙｇｕｎ  Ｈ，  ＫｌｉｐｐｅＩＡＰｒｏｎｋ  ＧＪ，  Ｇｉｅｓｅ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｊ．  （２００３）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，  ２７０５−２７１６．  Ｄａｉ  Ｚ，  Ｚｈｕ  ＷＧ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＣＤ，  Ｂｒｅｎａ  ＲＭ，  Ｓｍｉｒａｇｌｉａ  ＤＪ，  Ｒａｖａｌ  Ａ，  Ｗｕ  ＹＺ，  Ｒｕｓｈ  ＬＪ，  Ｒｏｓｓ  Ｐ，  Ｍｏｌｉｎａ  ＪＲ，  Ｏｔｔｅｒｓｏｎ  ＧＡ，  ａｎｄ  Ｐｌａｓｓ  Ｃ．  （２００３）  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｃＩＡＰ  １  ａｎｄ  ｃＩＡＰ２  ａｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １２，  ７９１−８０１．
【非特許文献２１】Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ＱＬ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｒ，  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （１９９７）．  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ＩＡＰ  ｉｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８８，  ３００−３０４．
【非特許文献２２】Ｄｉｅｒｌａｍｍ  Ｊ，  Ｂａｅｎｓ  Ｍ，  Ｗｌｏｄａｒｓｋａ  Ｉ，  Ｓｔｅｆａｎｏｖａ−Ｏｕｚｏｕｎｏｖａ  Ｍ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＭ，  Ｈｏｓｓｆｅｌｄ  ＤＫ，  Ｄｅ  Ｗｏｌｆ−Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｃ，  Ｈａｇｅｍｅｉｊｅｒ  Ａ，  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｍａｒｙｎｅｎ  Ｐ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ＡＰＩ２  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  １８ｑ  ｇｅｎｅ，  ＭＬＴ，  ａｒｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔ（１  １、  １  ８）（ｑ２  １  、ｑ２１）  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  ９３，  ３６０１−３６０９．
【非特許文献２３】Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ＤＭ，  Ｎｏｖｉｎａ  ＣＤ，  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ  （２００３）  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ：  ｓｈｏｒｔ  ＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４，  ４５７−４６７．  Ｅａｒｎｓｈａｗ  ＷＣ，  Ｍａｒｔｉｎｓ  ＬＭ，  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．  （１９９９）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｓｐａｓｅｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６８，  ３８３−４２４．
【非特許文献２４】Ｅｒｌ  Ｗ，  Ｈａｎｓｓｏｎ  ＧＫ，  ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，  Ｄｒａｕｄｅ  Ｇ，  Ｗｅｂｅｒ  ＫＳ，  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  Ｃ．  （１９９９）  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ８４，  ６６８−６７７．
【非特許文献２５】Ｆｒａｓｅｒ  ＡＧ，  Ｊａｍｅｓ  Ｃ，  Ｅｖａｎ  ＧＩ，  ａｎｄ  Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ  ＭＯ．  （１９９９）  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ＢＩＲ−１  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ９，  ２９２−３０１．
【非特許文献２６】Ｇｏｒｄｏｎ  ＧＪ，  Ａｐｐａｓａｎｉ  Ｋ，  Ｐａｒｃｅｌｌｓ  ＪＰ，  Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ＮＫ，  Ｊａｋｌｉｔｓｃｈ  ＭＴ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＷＧ，  Ｓｕｇａｒｂａｋｅｒ  ＤＪ，  ａｎｄ  Ｂｕｅｎｏ  Ｒ．  （２００２）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ２３，  １０１７−１０２４．
【非特許文献２７】Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｄ，  ＭｃＮｉｆｆ  ＪＭ，  Ｌｉ  Ｆ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｓｕｒｖｉｖｉｎ，  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３，  １０７６−１０８１．
【非特許文献２８】Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｄ，  ＭｃＮｉｆ’ｆ  ＪＭ，  Ｌｉ  Ｆ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （１９９９）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｓｕｒｖｉｖｉｎ，  ｉｎ  ｎｏｎｍｅｌａｎｏｍａ  ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９，  １１２１−１１２６．
【非特許文献２９】Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  Ａ，  Ｗｙｓｚｋｏ  Ｅ，  Ｂｉｅｂｅｒ  Ｂ，  Ｊａｈｎｅｌ  Ｒ，  Ｅｒｄｍａｎｎ  ＶＡ，  ａｎｄ  Ｋｕｒｒｅｃｋ  Ｊ．  （２００３）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ＲＮＡ，  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ３１８５−３１９３．
【非特許文献３０】Ｈａｍａｄａ  Ｍ，  Ｏｈｔｓｕｋａ  Ｔ，  Ｋａｗａｉｄａ  Ｒ，  Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｍ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ｋ，  Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｈ，  Ｉｍａｎｉｓｈｉ  Ｔ，  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ  Ｋ．  （２００２）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （ＲＮＡｉ）  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ３´−ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  １２，  ３０１−３０９．
【非特許文献３１】Ｈｅｍａｎｎ  ＭＴ，  Ｆｒｉｄｍａｎ  ＪＳ，  Ｚｉｌｆｏｕ  ＪＴ，  Ｈｅｒｎａｎｄｏ  Ｅ，  Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｌｏｗｅ  ＳＷ．  （２００３）  Ａｎ  ｅｐｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐ５３  ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡｉ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３３，  ３９６−４００．
【非特許文献３２】Ｈｏｌｏｉｋ  Ｍ，  Ｙｅｈ  Ｃ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ  Ｔ．  （２０００）  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （ＸＩＡＰ）  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９，  ４１７４−４１７７．
【非特許文献３３】Ｈｏｌｃｉｋ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ．  （２００１）  ＸＩＡＰ，  ｔｈｅ  ｇｕａｒｄｉａｎ  ａｎｇｅｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  ５５０−５５６．
【非特許文献３４】Ｈｏｌｅｎ  Ｔ，  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  Ｍ，  Ｂａｂａｉｅ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｐｒｙｄｚ  Ｈ  （２００３）  Ｓｉｍｉｌａｒ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｂｄ  ｓｉ  ＲＮＡｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈｅｙ  ａｃｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ＲＮＡｉ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，  ２４０１−２４０７．
【非特許文献３５】Ｈｏｕｇｈ  ＳＲ，  Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｔ  ＫＡ，  Ｂｕｒｒｉｅｒ  ＡＣ，  Ｗｏｏｌｆ  ＴＭ，  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ  ＭＦ．  （２００３）  Ｗｈｙ  ＲＮＡｉ  ｍａｋｅｓ  ｓｅｎｓｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，  ７３１−７３２
【非特許文献３６】Ｈｕ  Ｙ，  Ｃｈｅｒｔｏｎ−Ｈｏｒｖａｔ  Ｇ，  Ｄｒａｇｏｗｓｋａ  Ｖ，  Ｂａｉｒｄ  Ｓ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  Ｄｕｒｋｉｎ  ＪＰ，  Ｍａｙｅｒ  ＬＤ，  ａｎｄ  ＬａＣａｓｓｅ  ＥＣ．  （２００３）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＸＩＡＰ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ２８２６−３６．
【非特許文献３７】Ｉｍｏｔｏ  Ｉ，  Ｙａｎｇ  ＺＱ，  Ｐｉｍｋｈａｏｋｈａｍ  Ａ，  Ｔｓｕｄａ  Ｈ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｙ，  Ｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｏｈｋｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．  （２００１）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＩＡＰ１  ａｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ａｔ  １１  ｑ２２  ｉｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ６６２９−６６３４．
【非特許文献３８】Ｉｍｏｔｏ  Ｉ，  Ｔｓｕｄａ  Ｈ，  Ｈｉｒａｓａｗａ  Ａ，  Ｍｉｕｒａ  Ｍ，  Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．  （２００２）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＩＡＰ１，  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  １１ｑ２２  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｔｏ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２，  ４８６０−４８６６．
【非特許文献３９】Ｊａｎｓｅｎ  Ｂ，  ａｎｄ  Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ  Ｕ．  （２００２）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ−−ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｔｒｕｔｈ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ３，  ６７２−６８３．
【非特許文献４０】Ｋａｌｌｉｏ  ＭＪ，  Ｎｉｅｍｉｎｅｎ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ＪＥ．  （２００１）  Ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｅｘｉｔ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １５，  ２７２１−２７２３．
【非特許文献４１】Ｋａｎｗａｒ  ＪＲ，  Ｓｈｅｎ  ＷＰ，  Ｋａｎｗａｒ  ＲＫ，  Ｂｅｒｇ  ＲＷ，  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｓａｎｓｅｎ  ＧＷ．  （２００１）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂ７−１  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９３，  １５４１−１５５２．
【非特許文献４２】Ｋａｓｏｆ  ＧＭ，  ａｎｄ  Ｇｏｍｅｓ  ＢＣ．  （２００１）  Ｌｉｖｉｎ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ３２３８−３２４６．
【非特許文献４３】Ｋｕｎａｔｈ  Ｔ，  Ｇｉｓｈ  Ｇ，  Ｌｉｃｋｅｒｔ  Ｈ，  Ｊｏｎｅｓ  Ｎ，  Ｐａｗｓｏｎ  Ｔ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ  Ｊ．  （２００３）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｕｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，  ５５９−５６１．
【非特許文献４４】ＬａＣａｓｓｅ  ＢＣ，  Ｂａｉｒｄ  Ｓ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ＡＥ．  （１９９８）  Ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （ＩＡＰｓ）  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １７，  ３２４７−３２５９．
【非特許文献４５】Ｌｅｎｓ  ＳＭ，  Ｗｏｌｔｈｕｉｓ  ＲＭ，  Ｋｌｏｍｐｍａｋｅｒ  Ｒ，  Ｋａｕｗ  Ｊ，  Ａｇａｍｉ  Ｒ，  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ，  Ｋｏｐｓ  Ｇ，  ａｎｄ  Ｍｅｄｅｍａ  ＲＨ．  （２００３）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｔｅｎｓｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２２，  ２９３４−２９４７．  Ｌｅｗｉｓ  ＤＬ，  Ｈａｇｓｔｒｏｍ  ＪＥ，  Ｌｏｏｍｉｓ  ＡＧ，  Ｗｏｌｆｆ  ＪＡ，  ａｎｄ  Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ  Ｈ．  （２００２）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３２，  １０７−１０８．
【非特許文献４６】Ｆ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  ＥＪ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＦ，  Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ  ＡＬ，  Ｐｌｅｓｃｉａ  Ｊ，  Ｔｏｇｎｉｎ  Ｓ，  Ｖｉｌｌａ  Ａ，  Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ  ＰＣ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （１９９９）  Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｃｅｌｌ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １，  ４６１−４６６．
【非特許文献４７】Ｌｉ  Ｊ，  Ｆｅｎｇ  Ｑ，  Ｋｉｍ  ＪＭ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ  Ｄ，  Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｌｉ  Ｍ，  Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ  Ｂ，  Ｆａｕｇｈｔ  Ｗ，  Ｆｕｎｇ  ＭＦ，  Ｓｅｎｔｅｒｍａｎ  Ｍ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２００１）  Ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １４２，  ３７０−３８０．
【非特許文献４８】Ｌｉｎ  Ｈ，  Ｃｈｅｎ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  ＢＤ．  （２００１）  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３５３，  ２９９−３０６．
【非特許文献４９】Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｔａｍａｉ  Ｋ，  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｃ，  Ｂａｉｒｄ  Ｓ，  Ｃｈｅｒｔｏｎ−Ｈｏｒｖａｔ  Ｇ，  Ｆａｒａｈａｎｉ  Ｒ，  ＭｃＬｅａｎ  Ｍ，  Ｉｋｅｄａ  ＪＥ，  ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  Ａ，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ．  （１９９６）  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＮＡＩＩＰ  ａｎｄ  ａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＩＡＰ  ｇｅｎｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７９，  ３４９−３５３．
【非特許文献５０】Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｆｏｎｇ  ＷＧ，  Ｋｅｌｌｙ  ＮＬ，  Ｔｏｊｉ  Ｓ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ，  Ｃｏｎｔｅ  Ｄ，  Ｔａｍａｉ  Ｋ，  Ｃｒａｉｇ  ＣＧ，  ＭｃＢｕｒｎｅｙ  ＭＷ，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ．  （２００１）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＸＡＦ１  ａｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＸＩＡＰ  ａｎｔｉ−Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３，  １２８−１３３．
【非特許文献５１】Ｌｉｕ  Ｈ，  Ｒｕｓｋｏｎ−Ｆｏｕｒｍｅｓｔｒａｕｘ  Ａ，  Ｌａｖｅｒｇｎｅ−Ｓｌｏｖｅ  Ａ，  Ｙｅ  Ｈ，  Ｍｏｌｉｎａ  Ｔ，  Ｂｏｕｈｎｉｋ  Ｙ，  Ｈａｍｏｕｄｉ  ＲＡ，  Ｄｉｓｓ  ＴＣ，  Ｄｏｇａｎ  Ａ，  Ｍｅｇｒａｕｄ  Ｆ，  Ｒａｍｂａｕｄ  ＪＣ，  Ｄｕ  ＭＱ，  ａｎｄ  Ｉｓａａｃｓｏｎ  ＰＧ．  （２００１）  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔ（１１、１８）  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｏ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｌａｎｃｅｔ．  ３５７，  ３９−４０．
【非特許文献５２】Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＬＡ，  Ｎａｇｕｉｂｎｅｖａ  Ｉ，  Ｌｅｈｒｍａｎｎ  Ｈ，  Ｖｅｒｖｉｓｃｈ  Ａ，  Ｔｃｈｅｎｉｏ  Ｔ，  Ｌｏｚａｎｏ  Ｇ，  ａｎｄ  Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ  Ａ  （２００２）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＲＮＡｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｐ５３  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：  １４８４９−１４８５４．
【非特許文献５３】ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ＡＰ，  Ｍｅｕｓｅ  Ｌ，  Ｐｈａｍ  ＴＴ，  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＤＳ，  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｋａｙ  ＭＡ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ３８−３９．
【非特許文献５４】ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ，  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ  （２００２）  Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３，  ７３７−７４７．
【非特許文献５５】Ｍｅｓｒｉ  Ｍ，  Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｒｕｉｚ  Ｍ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  ＥＪ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＦ，  Ｐｏｂｅｒ  ＪＳ，  Ｓｅｓｓａ  ＷＣ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （２００１）  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １５８，  １７５７−１７６５．
【非特許文献５６】Ｍｉｌｌｅｒ  ＶＭ，  Ｘｉａ  Ｈ，  Ｍａｒｒｓ  ＧＬ，  Ｇｏｕｖｉｏｎ  ＣＭ，  Ｌｅｅ  Ｇ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＢＬ，  ａｎｄ  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＨＬ．  （２００３）  Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １００，  ７１９５−７２００．
【非特許文献５７】Ｍｉｒａｎｄａ  ＭＢ，  Ｄｙｅｒ  ＫＦ，  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＪＲ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＥ．  （２００３）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｖｓ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：  ａ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）ａｎｄ  ＸＩＡＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  １７，  ３９０−４００．
【非特許文献５８】Ｈｙｂｒｉｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｇｅｒａ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇ．  （２００２）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２，４８３−４８４．
【非特許文献５９】Ｏｌｉｅ  ＲＡ，  Ｓｉｍｏｅｓ−Ｗｕｓｔ  ＡＰ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｂ，  Ｌｅｅｃｈ  ＳＨ，  Ｆａｂｂｒｏ  Ｄ，  Ｓｔａｈｅｌ  ＲＡ，  ａｎｄ  Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ  Ｕ．  （２０００）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０，  ２８０５−２８０９．
【非特許文献６０】Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  Ｃａｕｄｙ  ＡＡ，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ，  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＤＳ．  （２００２ａ）  Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  （ｓｈＲＮＡｓ）  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６，  ９４８−９５８．
【非特許文献６１】Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  Ｃａｎｄｙ  ＡＡ，  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ．  （２００２ｂ）  Ｓｔａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９９，  １４４３−１４４８．
【非特許文献６２】Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ？  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２，  １７−２３．  Ｐｅｎｎａｔｉ  Ｍ，  Ｃｏｌｅｌｌａ  Ｇ，  Ｆｏｌｉｎｉ  Ｍ，  Ｃｉｔｔｉ  Ｌ，  Ｄａｉｄｏｎｅ  ＭＧ，  ａｎｄ  Ｚａｆｆａｒｏｎｉ  Ｎ．  （２００２）  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９，  ２８５−２８６．
【非特許文献６３】Ｐｅｒｒｅｌｅｔ  Ｄ，  Ｆｅｒｒｉ  Ａ，  Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｍｕｚｚｉｎ  Ｐ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  Ｋａｔｏ  ＡＣ．  （２００２）  ＩＡＰｓ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＧＤＮＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４，  １７５−１７９．
【非特許文献６４】Ｐｉｒｏｌｌｏ  ＫＦ，  Ｒａｉｔ  Ａ，  Ｓｌｅｅｒ  ＬＳ，  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ  ＥＨ  （２００３）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ  ９９，  ５５−７７．
【非特許文献６５】Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｍａｈａｄｅｖａｎ  ＭＳ，  ＭｃＬｅａｎ  Ｍ，  Ｓｈｕｔｌｅｒ  Ｇ，  Ｙａｒａｇｈｉ  Ｚ，  Ｆａｒａｈａｎｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａＩＡＰｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．  Ｃｅｌｌ  ８０，  １６７−１７８．
【非特許文献６６】Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｍａｈａｄｅｖａｎ  ＭＳ，  ＭｃＬｅａｎ  Ｍ，  Ｓｈｕｔｌｅｒ  Ｇ，  Ｙａｒａｇｈｉ  Ｚ，  Ｆａｒａｈａｎｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａＩＡＰｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．  Ｃｅｌｌ  ８０，  １６７−１７８．
【非特許文献６７】Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ＱＬ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｒ，  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （１９９７）  Ｔｈｅ  ｃ−ＩＡＰ−１  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ−２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｓｐａｓｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６，  ６９１４−６９２５．
【非特許文献６８】Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ＤＡ，  Ｄｉｌｌｏｎ  ＣＰ，  Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ  ＡＶ，  Ｓｉｅｖｅｒｓ  Ｃ，  Ｙａｎｇ  Ｌ，  Ｋｏｐｉｎｊａ  Ｊ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＤＬ，  Ｉｈｒｉｇ  ＭＭ，  ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ，  Ｇｅｒｔｌｅｒ  ＦＢ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭＬ，  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｐａｒｉｊｓ  Ｌ．  （２００３）  Ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３３，  ４０１−４０６．
【非特許文献６９】Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｄｕｃｋｅｔｔ  ＣＳ．  （２００２）  ＩＡＰ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ’ｓ  ｄｏｏｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３，  ４０１−４１０．
【非特許文献７０】Ｓａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｓｈｅｎｇ  Ｙ，  Ｋｏｔｓｕｊｉ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２０００）  Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０，  ５６５９−５６６６．
【非特許文献７１】Ｓｈａｎｋａｒ  ＳＬ，  Ｍａｎｉ  Ｓ，  Ｏ’Ｇｕｉｎ  ＫＮ，  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＲ，  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｓｈａｆｉｔ−Ｚａｇａｒｄｏ  Ｂ．  （２００１）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７９，  ４２６−４３６．
【非特許文献７２】Ｓｈｅｎ  Ｃ，  Ｂｕｃｋ  Ａ，  Ｐｏｌａｔ  Ｂ，  Ｓｃｈｍｉｄ−Ｋｏｔｓａｓ  Ａ，  Ｍａｔｕｓｃｈｅｋ  Ｃ，  Ｇｒｏｓｓ  ＨＪ，  Ｂａｃｈｅｍ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｒｅｓｋｅ  ＳＮ．  （２００３）  Ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０，  ４０３−４１０．
【非特許文献７３】Ｓｈｕｅｙ  ＤＪ，  ＭｃＣａｌｌｕｓ  ＤＥ，  ａｎｄ  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｔ  （２００２）  ＲＮＡｉ：  ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ７，  １０４０−１０４６．
【非特許文献７４】Ｓｏｈａｉｌ  Ｍ，  Ｄｏｒａｎ  Ｇ，  Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ  Ｊ，  Ｍａｃａｕｌａｙ  Ｖ，  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ．  （２００３）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ｅ３８．
【非特許文献７５】Ｓｏｍｍｅｒ  ＫＷ，  Ｓｃｈａｍｂｅｒｇｅｒ  ＣＪ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＧＥ，  Ｓａｓｇａｒｙ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｃｅｒｎｉ  Ｃ．  （２００３）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｃ−Ｈ−Ｒａｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２２，  ４２６６−４２８０．
【非特許文献７６】Ｓｏｎｇ  Ｅ，  Ｌｅｅ  ＳＫ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｉｎｃｅ  Ｎ，  Ｏｕｙａｎｇ  Ｎ，  Ｍｉｎ  Ｊ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋａｒ  Ｐ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  Ｊ．  （２００３）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｆａｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ９，  ３４７−３５１．
【非特許文献７７】Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＤＲ，  Ｌｅｉｒｄａｌ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｓｉｏｕｄ  Ｍ．  （２００３）  Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３２７，  ７６１−７６６．
【非特許文献７８】Ｓｐａｌｄｉｎｇ  ＡＣ，  Ｊｏｔｔｅ  ＲＭ，  Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ  ＲＩ，  Ｇｅｒａｃｉ  ＭＷ，  Ｃｌａｒｋｅ  Ｐ，  Ｔｙｌｅｒ  ＫＬ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＧＬ．  （２００２）  ＴＲＡＩＬ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｒｅ  ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  ｇｅｎｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２１，  ２６０−２７１．
【非特許文献７９】Ｓｐｅｌｉｏｔｅｓ  ＥＫ，  Ｕｒｅｎ  Ａ，  Ｖａｕｘ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ  ＨＲ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＢＩＲ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＡＩＲ−２  ｔｏ  ａｆｆｅｃｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｍｉｄｚｏｎｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ６，２１１−２２３．
【非特許文献８０】Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ．  （２００１）  Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，  ６４１−６４４．
【非特許文献８１】Ｓｔｅｉｎ  Ｐ，  Ｓｖｏｂｏｄａ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＲＭ．  （２００３）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｏｏｃｙｔｅｓ：  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｆａｓｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２５６，  １８７−１９３．
【非特許文献８２】Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ＨＲ，  Ｒｙａｎ  ＣＡ，  ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ  （２００２）  Ｒｅｐｒｉｅｖａｌ  ｆｒｏｍ  ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２７，  ９４−１０１．
【非特許文献８３】Ｓｔｅｗａｒｔ  ＳＡ，  Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ＤＭ，  Ｐａｌｌｉｓｅｒ  Ｄ，  Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ，  Ｙｕ  ＥＹ，  Ａｎ  ＤＳ，  Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ，  Ｃｈｅｎ  ＩＳ，  Ｈａｈｎ  ＷＣ，  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ，  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ，  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｎａ  ＣＤ．  （２００３）  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  ＲＮＡ．  ９，  ４９３−５０１．
【非特許文献８４】Ｔａｍｍ  Ｉ，  Ｋｏｒｎｂｌａｕ  ＳＭ，  Ｓｅｇａｌｌ  Ｈ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ  Ｓ，  Ｗｅｌｓｈ  Ｋ，  Ｋｉｔａｄａ  Ｓ，  Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  ＤＡ，  Ｔｕｄｏｒ  Ｇ，  Ｑｕｉ  ＹＨ，  Ｍｏｎｋｓ  Ａ，  Ａｎｄｒｅｅｆｆ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （２０００）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＩＡＰ−ｆａｍｉｌｙ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６，  １７９６−１８０３．
【非特許文献８５】Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ＮＡ，  ａｎｄ  Ｌａｚｅｂｎｉｋ  Ｙ．  （１９９８）  Ｃａｓｐａｓｅｓ：  ｅｎｅｍｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２８１，  １３１２−１３１６．
【非特許文献８６】Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ  Ｇ，  Ｓｉｎｇｅｒ  Ｏ，  Ｉｋａｗａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ  ＩＭ．  （２００３）  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１００，  １８４４−１８４８．
【非特許文献８７】Ｔｒｏｙ  ＣＭ，  Ｒａｂａｃｃｈｉ  ＳＡ，  Ｈｏｈｌ  ＪＢ，  Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏ  ＪＭ，  Ｇｒｅｅｎｅ  ＬＡ，  ａｎｄ  Ｓｈｅｌａｎｓｋｉ  ＭＬ．  （２００１）  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ：  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｓｐａｓｅ−２  ａｎｄ  −９  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２１，  ５００７−５０１６．
【非特許文献８８】Ｕｒｅｎ  ＡＧ，  Ｗｏｎｇ  Ｌ，  Ｐａｋｕｓｃｈ  Ｍ，  Ｆｏｗｌｅｒ  ＫＪ，  Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＦＪ，  Ｖａｕｘ  ＤＬ，  ａｎｄ  Ｃｈｏｏ  ＫＨ．  （２０００）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＮＣＥＮＰ  ｓｈｏｗ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １０，  １３１９−１３２８．
【非特許文献８９】ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  Ｍ，  Ｏｖｉｎｇ  Ｉ，  Ｍｕｎｃａｎ  Ｖ，  Ｐｏｎ  Ｆｏｎｇ  ＭＴ，  Ｂｒａｎｔｊｅｓ  Ｈ，  ｖａｎ  Ｌｅｅｎｅｎ  Ｄ，  Ｈｏｌｓｔｅｇｅ  ＰＣ，  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ，  Ａｇａｍｉ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．  （２００３）  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔａｂｌｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ，  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｍａｌｌ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ−ＲＮＡ  ｖｅｃｔｏｒ．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ４，  ６０９−６１５．
【非特許文献９０】Ｖｉｃｋｅｒｓ  ＴＡ，  Ｋｏｏ  Ｓ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＦ，  Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ，  Ｄｅａｎ  ＮＭ，  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  ＢＦ．  （２００３）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｇｅｎｔｓ．  Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  ７１０８−７１１８．
【非特許文献９１】Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｔｅｋｌｅ  Ｅ，  Ｏｕｂｒａｈｉｍ  Ｈ，  Ｍｉｅｙａｌ  ＪＪ，  Ｓｔａｄｔｍａｎ  ＥＲ，  ａｎｄ  Ｃｈｏｃｋ  ＰＢ．  （２００３）  Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｅｄ  ａｃｔｉｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １００，  ５１０３−５１０６．
【非特許文献９２】Ｗｉｅｓｅ  Ｓ，  Ｄｉｇｂｙ  ＭＲ，  Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ＪＭ，  Ｇｏｔｚ  Ｒ，  Ｐｅｉ  Ｇ，  Ｈｏｌｔｍａｎｎ  Ｂ，  Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｅｎｄｔｎｅｒ  Ｍ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＴＡ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＮＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｈｉｃｋ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２，  ９７８−９８３．
【非特許文献９３】Ｗｉｌｄａ  Ｍ，  Ｆｕｃｈｓ  Ｕ，  Ｗｏｓｓｍａｎｎ  Ｗ，  ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ  Ａ  （２００２）  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＢＣＲ／ＡＢＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  （ＲＮＡｉ）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，  ５７１６−５７２４．
【非特許文献９４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＮＳ，  Ｇａｙｎｏｒ  ＲＢ，  Ｓｃｏｇｇｉｎ  Ｓ，  Ｖｅｒｍａ  Ｕ，  Ｇｏｋａｓｌａｎ  Ｔ，  Ｓｉｍｍａｎｇ  Ｃ，  Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｊ，  Ｔａｖａｎａ  Ｄ，  Ｆｒｅｎｋｅｌ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｂｅｃｅｒｒａ  Ｃ．  （２００３）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ９３１−９４６．
【非特許文献９５】Ｘｉａ  Ｃ，  Ｘｕ  Ｚ，  Ｙｕａｎ  Ｘ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｋ，  Ｙｏｕ  Ｌ，  Ｌｉ  Ｋ，  Ｌｉ  Ｌ，  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｊａｂｌｏｎｓ  ＤＭ．  （２００２）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １，  ６８７−６９４．
【非特許文献９６】Ｘｉａ  Ｈ，  Ｍａｏ  Ｑ，  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＨＬ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＢＬ．  （２００２）  ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０，  １００６−１０１０．
【非特許文献９７】Ｘｕ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  ＨＹ，  Ｔｈｏｒｍｅｙｅｒ  Ｄ，  Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｏ，  Ｄｕ  Ｑ，  Ｅｌｍｅｎ  Ｊ，  Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ  Ｚ．  （２００３）  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡｓ  ｈａｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０６，  ７１２−７１７．
【非特許文献９８】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｍａｎｏｍｅ  Ｙ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｎ．  （２００２）  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ３８，  ２３１６−２３２４．
【非特許文献９９】Ｙｕ  Ｄ，  Ｚｈｕ  Ｆ−Ｇ，  Ｂｈａｇａｔ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＫ，  Ｚｈａｎｇ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ  （２００２）  Ｐｏｔｅｎｔ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９７，  ８３−９０．
【非特許文献１００】Ｙｕ  Ｄ，  Ｚｈｕ  Ｆ−Ｇ，  Ｂｈａｇａｔ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＫ，  Ｚｈａｎｇ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ  （２００２）  Ｐｏｔｅｎｔ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９７，  ８３−９０．
【非特許文献１０１】Ｙｕ  ＪＹ，  ＤｅＲｕｉｔｅｒ  ＳＬ，  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ  ＤＬ  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９９，  ６０４７−６０５２．
【非特許文献１０２】Ｚｅｎｄｅｒ  Ｌ，  Ｈｕｔｋｅｒ  Ｓ，  Ｌｉｅｄｔｋｅ  Ｃ，  Ｔｉｌｌｍａｎｎ  ＨＬ，  Ｚｅｎｄｅｒ  Ｓ，  Ｍｕｎｄｔ  Ｂ，  Ｗａｌｔｅｍａｔｈｅ  Ｍ，  Ｇｏｓｌｉｎｇ  Ｔ，  Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  Ｐ，  Ｍａｌｅｋ  ＮＰ，  Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，  Ｍａｎｎｓ  ＭＰ，  Ｋｕｈｎｅｌ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｋｕｂｉｃｋａ  Ｓ．  （２００３）  Ｃａｓｐａｓｅ  ８  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １００，  ７７９７−７８０２．
【非特許文献１０３】Ｚｈａｎｇ  ＨＧ，  Ｈｕａｎｇ  Ｎ，  Ｌｉｕ  Ｄ，  Ｂｉｌｂａｏ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｙａｎｇ  Ｐ，  Ｚｈｏｕ  Ｔ，  Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ，  ａｎｄ  Ｍｏｕｎｔｚ  ＪＤ．  （２０００）  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４３，  １０９４−１１０５．
【非特許文献１０４】Ｚｈｏｕ  Ｗ，  ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ．  （１９９８）  Ｍｉｘｅｄ−ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉ  ｓｅｎｓｅａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ８，  ３２６９−３２７４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、一般に、細胞でアポトーシスを誘導するために有用な方法を特徴とする。本発明の方法は、癌および他の増殖性疾患の治療の際に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、増殖性疾患、例えば癌を有する患者をアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび化学療法薬を投与することにより治療する方法を特徴とする。化学療法薬およびアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーは同時に、または互いに２８日以内（例えば、２１日、１４日、７日、１日、または１時間以内）に、患者を治療するために総合して十分な量で投与する。アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーは、産生されるＩＡＰタンパク質の量を減少させ、正常にＩＡＰを発現する細胞にアポトーシスを起こさせる。これは、ＩＡＰをコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドで特異的にハイブリダイズする核酸塩基オリゴマーを施与することにより達成される。ＩＡＰポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を用いる核酸塩基オリゴマーの特異的ハイブリダイゼーションは、そのＩＡＰポリヌクレオチドの正常な機能を妨げ、産生されるＩＡＰタンパク質の量を低下させる。標的と特異的にハイブリダイズさせることで標的核酸の機能を調節する核酸分子を、一般に「アンチセンス治療薬」と呼ぶ。
【００１１】
ＩＡＰ発現レベルを低下させるのであればどのアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーを用いてもよいが、一態様では、核酸塩基オリゴマーは、８〜３０核酸塩基長で、配列番号１〜９９、１４３、１４７、１５１、１６３〜２６０、２８７、２８９、および３００〜４６０から選択される少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、核酸塩基オリゴマーは、配列番号１〜９９、１４３、１４７、１５１、１６３〜２６０、２８７、２８９、および３００〜４６０から選択される配列を含む。核酸塩基オリゴマーは、前記の配列番号のうちの１つまたはそれ以上から構成される（または本質的に構成される）のが望ましい。例えば、核酸塩基オリゴマーは、配列番号９７、９８、９９、１４３、１４７、１５１、２８７、２８９から、配列番号３００〜３８９から、または配列番号３９０〜４６０から選択される配列を含む。特に望ましい実施形態では、本発明は、両側が４個の２'−Ｏ−メチルＲＮＡ残基に隣接している１１個のＤＮＡ残基を有し、以下の配列：５'−ＡＵＵＧＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＧＵＵＣＵ−３'（配列番号１５５）、５'−ＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡ−３'（配列番号１６）、５'−ＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＡＡ−３'（配列番号１５７）、５'−ＵＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＣＵＧＡＡ−３'（配列番号２７）、５'−ＧＣＵＧＡＧＴＣＴＣＣＡＴＡＴＵＧＣＣ−３'（配列番号１４１）、５'−ＵＣＧＧＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＣＵＧＡ−３'（配列番号４１）、５'−ＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＵＣＡＣ−３'（配列番号４７）、５'−ＣＣＧＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧ−３'（配列番号５１）、５'−ＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＴＴＵＡＧＣ−３'（配列番号６３）、５'−ＵＧＵＣＡＧＴＡＣＡＴＧＴＴＧＧＣＵＣ−３'（配列番号１６１）、および５'−ＵＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＵＵＵ−３'（配列番号１５１）で構成される核酸塩基オリゴマーを特徴とする。
【００１３】
別の実施形態では、アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーは３０核酸塩基長以下で、配列番号４６１〜４９０から選択される少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む。
【００１４】
化学療法薬と併せて投与することのできる他のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーは、高いストリンジェンシーで、ＮＡＩＰ（Ｂｉｒｃｌ）、ＨＩＡＰ１（ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ２、ＭＩＨＣ、ｈＩＴＡ）、ＨＩＡＰ２（ｃｌＡＰＩ、ＭＩＨＢ）、ＸＩＡＰ（ｈＩＬＰ、ｈＩＬＰ１、ＭＩＨＡ、ＡＰＩ３）、サバイビン（ＴＩＡＰ、ＭＩＨＤ、ＡＰＩ４）、リビン（ＫＩＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ｃＩＡＰ３、ＨＩＡＰ３）、およびｈＩＬＰ２（Ｔｓ−ＩＡＰ、ＴＩＡＰ）から選択されるＩＡＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと混成するものである。
【００１５】
本発明の方法において用いられる核酸塩基オリゴマーは、少なくとも１つの修飾された結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエートまたはホスホセレネート結合）、修飾された核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン）、および／または修飾された糖部分（例えば、２'−Ｏ−メトキシエチル基または２'−Ｏ−メチル基）を含んでよい。一実施形態では、オリゴマーはキメラオリゴマー（例えば、両側がホスホロチオエート結合により互いに連結された少なくとも１個の、２個の、３個の、または４個の２'−Ｏ−メチルＲＮＡ残基に隣接している、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル結合により互いに連結されたＤＮＡ残基を含むオリゴヌクレオチド）である。
【００１６】
別の態様では、本発明は細胞でのアポトーシスを促進する方法を特徴とする。この方法は、細胞へアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび化学療法薬を同時にまたは互いに２８日以内に、アポトーシスを促進するために総合して十分な量で投与する段階を含む。細胞はｅｘ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもあり得る。一実施形態では、細胞は癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）またはリンパ系または骨髄系を起源とする細胞である。
【００１７】
癌は、例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫である。癌を治療する際、１種類またはそれ以上のさらなる化学療法薬、生物学的応答修飾薬、および／または化学的感作剤も投与するのが望ましい。１種類またはそれ以上のこれらの薬剤を投与するのは、核酸塩基オリゴマーの投与の２８日以内が望ましい。
【００１８】
化学療法薬および核酸塩基オリゴマーは、同じ経路でも異なる経路でも投与できる。所望の部位へ有効量をもたらすのであればどの投与経路を用いてもよいが、特に望ましい経路は静脈内および腫瘍内投与である。 
【００１９】
別の態様では、本発明は、化学療法薬およびアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーを含む医薬組成物を特徴とし、化学療法薬およびアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーは増殖性疾患を有する患者（例えば、癌）を治療するために総合して十分な量で投与される。必要に応じて、医薬組成物にさらなる成分（例えば、コロイド分散系）を追加してもよい。
【００２０】
また、本発明は、増殖性疾患、例えば、癌またはリンパ球増殖性疾患を有する患者を、化学療法薬および触媒機能を有するＲＮＡ分子、またはこのような触媒性ＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを投与することにより治療する方法を特徴とし、化学療法薬および触媒性ＲＮＡ分子は、同時にまたは互いに２８日以内に患者を治療するために総合して十分な量で投与される。望ましい実施形態では、触媒性ＲＮＡ分子は、その結合アーム中に、アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマー（例えば、表２、３、７、８、および９のうちのいずれか１つの核酸塩基配列）に対応する少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む。ＲＮＡ分子は、ハンマーヘッドモチーフ型であるのが望ましいが、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、グループ１イントロン、ＶＳ  ＲＮＡまたはリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡモチーフ型であってもよい。
【００２１】
また、本発明は、癌またはリンパ球増殖性疾患を有する患者を、化学療法薬および２１〜２９個の核酸塩基を有する二本鎖ＲＮＡ分子を投与することにより治療する方法を特徴とし、その中の少なくとも８個の連続した核酸塩基はアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマー（例えば、表２、３、７、８、および９のうちのいずれか１つの配列）に対応する。化学療法薬および二本鎖ＲＮＡ分子は、同時にまたは互いに２８日以内に、患者を治療するために総合して十分な量で投与される。
【００２２】
また、関連する態様では、本発明は、癌またはリンパ球増殖性疾患を有する患者を、化学療法薬および５０〜７０個の核酸塩基を有する二本鎖ＲＮＡ分子を投与することにより治療する方法を特徴とし、前記ＲＮＡ分子は、アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマー（例えば、表２、３、７、８、および９のうちのいずれか１つの配列）に対応する少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む２１〜２９核酸塩基の第一ドメイン、第一ドメインに相補的な第二ドメイン、および第一ドメインと第二ドメインが二本鎖化して二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができるように第一ドメインと第二ドメインの間に位置しているループドメインを有する。化学療法薬および二本鎖ＲＮＡ分子は、同時にまたは互いに２８日以内に患者を治療するために総合して十分な量で投与される。
【００２３】
また、本発明は、いくつかのキットを特徴とする。このようなキットの１つには、（ｉ）８〜３０核酸塩基長のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマー、（ｉｉ）化学療法薬、および（ｉｉｉ）アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび化学療法薬を、増殖性疾患を有する患者へ増殖性疾患を治療するために十分な量で投与するための説明書が含まれる。
【００２４】
別の本発明のキットには、（ｉ）８〜３０核酸塩基長のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基のオリゴマー、および（ｉｉ）アンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび化学療法薬を、増殖性疾患を有する患者へ増殖性疾患を治療するために十分な量で投与するための説明書が含まれる。
【００２５】
また別の本発明のキットには、（ｉ）本発明の組成物(前記の通り)、および
（ｉｉ）組成物を、増殖性疾患を有する患者へ増殖性疾患を治療するために十分な量で投与するための説明書が含まれる。
【００２６】
「核酸塩基オリゴマー」とは、連結基により互いに結合された少なくとも８個の核酸塩基の鎖を含む化合物を意味する。この定義には、修飾されているおよび修飾されていない双方の天然および非天然オリゴヌクレオチド、ならびに、オリゴヌクレオチド模倣体、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびアラビノ核酸（ＡＮＡ）も含まれる。本発明の核酸塩基オリゴマーには、後に本明細書中で「オリゴヌクレオチドおよび他の核酸塩基オリゴマー」との表題の部分で詳細に記載されるものをはじめ、多数の核酸塩基および連結基を用いてよい。
【００２７】
「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」とは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、天然に存在するポリペプチドまたはペプチドの全てまたは一部を構成する、あるいは非天然ポリペプチドまたはペプチドを構成する、２またはそれ以上のアミノ酸からなる鎖を意味する。
【００２８】
「アポトーシス」は、死んでいく細胞が、細胞膜ブレブ形成、細胞体収縮、クロマチン凝縮、およびＤＮＡラダー形成を含む、一連の明確な生化学的に顕著な特徴を示す細胞死の過程を意味する。
【００２９】
「ＩＡＰ遺伝子」とは、少なくとも１つのＢＩＲドメインを有するポリペプチドをコードし、かつ他の細胞内または細胞外送達法により施与される場合、細胞または組織においてアポトーシスを調節すること（阻害することまたは促進すること）のできる遺伝子を意味する（例えば、米国特許第５，９１９，９１２号参照）。好ましい実施形態では、ＩＡＰ遺伝子は、ヒトもしくはネズミＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ１、またはＨＩＡＰ２（その各々は米国特許第６，１５６，５３５号に記載されている）の少なくとも１つと５０％またはそれまたはそれ以上のヌクレオチド配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％）をもつ遺伝子である。同一性を測定する配列の領域は、少なくとも１つのＢＩＲドメインおよびＲＩＮＧジンクフィンガードメインをコードする領域であるのが好ましい。哺乳類のＩＡＰ遺伝子は、任意の哺乳類の供給源から単離されるヌクレオチド配列を含む。この哺乳類はヒトであるのが好ましい。
【００３０】
「ＩＡＰタンパク質」または「ＩＡＰポリペプチド」とは、ＩＡＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはその断片を意味する。ＩＡＰポリペプチドとしては、ＮＡＩＰ（Ｂｉｒｃｌ）、ＨＩＡＰ１（ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ２、ＭＩＨＣ、ｈＩＴＡ）、ＨＩＡＰ２（ｃＩＡＰ１、ＭＩＨＢ）、ＸＩＡＰ（ｈＩＬＰ、ｈＩＬＰｌ、ＭＩＨＡ、ＡＰＩ３）、サバイビン（ＴＩＡＰ、ＭＩＨＤ、ＡＰＩ４）、リビン（ＫＩＡＰ、ＭＬ-ＩＡＰ、ｃＩＡＰ３、ＨＩＡＰ３）、およびｈＩＬＰ２（Ｔｓ-ＩＡＰ、ＴＩＡＰ）が挙げられる。
【００３１】
「ＩＡＰ生物活性」とは、ＩＡＰポリペプチドによりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで引き起こされる活性を意味する。
【００３２】
「アポトーシスを促進すること」とは、任意の細胞集団（例えば、癌細胞、リンパ球、繊維芽細胞、またはその他の細胞）においてアポトーシスする細胞の数を増加させることを意味する。当然のことながら、任意のアッセイにおいてアポトーシス促進化合物によりもたらされるアポトーシス促進の程度は異なるが、当業者であれば、本来ならばＩＡＰにより制限されるアポトーシスを促進する核酸塩基オリゴマーを識別する統計上有意なアポトーシスレベルの変化を測定することができる。好ましくは、「アポトーシスを促進すること」とは、本発明の核酸塩基オリゴマーは投与しないがその他は実質的に同様に処理した細胞と比較して、アポトーシスを起こす細胞数の増加が少なくとも１０％、より好ましくは増加が２５％またはさらに５０％、また最も好ましくは、増加が少なくとも１倍である。モニターされるサンプルは、通常は不十分なアポトーシスを起こす細胞（すなわち、癌細胞）のサンプルであるのが好ましい。アポトーシスレベルの変化（すなわち、促進または低下）を検出するための方法は本明細書に記載されている。
【００３３】
標的遺伝子(例えば、ＩＡＰ)の「発現を阻害する」核酸塩基オリゴマーとは、標的ｍＲＮＡ、またはこのようなｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の量を、未処理の対照と比較して、少なくとも約５％、より望ましくは少なくとも約１０％、２５％、または５０％にまで低下させるものを意味する。ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの双方を測定するための方法は当技術分野で周知であり、方法の例は本明細書に記載されている。
【００３４】
「ハイブリダイゼーション」とは水素結合を意味し、相補的な核酸塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合でありうる。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対となる相補的な核酸塩基である。
【００３５】
「増殖性疾患」とは、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、もしくは双方により引き起こされる、またはそれらの結果として生じる疾患を意味する。例えば、癌は増殖性疾患の例である。癌の例としては、限定されるものではないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫(ホジキン病、非ホジキン病)、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫）が挙げられる。リンパ球増殖性疾患もまた増殖性疾患であるとみなされる。
【００３６】
本発明の方法において用いられる核酸塩基オリゴマーは、通常には十分なアポトーシスを起こさない細胞中に存在する場合、アポトーシスを促進することおよび／またはＩＡＰ  ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルを低下することができるのが好ましい。対照と比較して、増加は少なくとも１０％であるのが好ましく、２５％がより好ましく、また、１倍またはそれ以上であるのが最も好ましい。本発明の方法で用いられる核酸塩基オリゴマーは約８〜３０個の核酸塩基を含むのが望ましい。ある実施形態では、少なくとも８個の連続した核酸塩基は、配列番号１〜９９、１４３、１４７、１５１、１６３〜２６０、２８７、２８９、３００〜４９０からなるから選択される配列からなる。また、本発明の核酸塩基オリゴマーは、例えば、ＩＡＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的であるさらなる２０、４０、６０、８５、１２０個またはそれ以上の連続した核酸塩基を含み得る。核酸塩基オリゴマー（またはそのタンパク質）は修飾された骨格を含み得る。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよび他の修飾された骨格が当技術分野で公知である。また、核酸塩基オリゴマーは、１またはそれ以上の非天然結合を含み得る。
【００３７】
「患者」とは、任意の動物を意味する（例えば、ヒト）。本発明の方法、組成物、およびキットを用いて処置できる非ヒト患者としては、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、ウシ、魚および鳥類が挙げられる。
【００３８】
「化学療法薬」とは、癌細胞を死滅させるまたはそれらの増殖を遅らせるために用いる薬剤を意味する。したがって、細胞傷害性薬と細胞増殖抑制剤の双方が化学療法薬であるとみなされる。化学療法薬の例は、タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル、ＲＰＲ１０９８８１Ａ、ＳＢ−Ｔ−１２１３、ＳＢ−Ｔ−１２５０、ＳＢ−Ｔ−１０１１８７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＢＲＴ  ２１６、ＤＪ−９２７、ＭＡＣ−３２１、ＩＤＮ５１０９、およびＩＤＮ５３９０）、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、およびヒドロビンブラスチン）、ドラスタチン類（ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、ＩＬＸ６５１、ＴＺＴ−１０２７、シンプロスタチン１、シンプロスタチン３、およびＬＵ１０３７９３）、クリプトフィシン類（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン５２）、エポチロン類（例えば、エポチロンＡ、エポチロンＢ、デオキシエポチロンＢ、およびエポチロンＢラクタム）、エレウテロビン、ディスコデルモリド、２−エピ−ディスコデルモリド、２−デス−メチルディスコデルモリド、５−ヒドロキシメチルディスコデルモリド、１９−デス−アミノカルボニルディスコデルモリド、９（１３）−シクロディスコデルモリド、またはラウリマリドである。その他は下記表１に記載されている。
【００３９】
「生物学的応答修飾薬」とは、疾病と闘う免疫系の能力を刺激するまたは回復させる薬剤を意味する。すべてではないがいくつかの生物学的応答修飾薬は、癌細胞の増殖を遅らせることができ、したがって化学療法剤であるともみなされる。生物学的応答修飾薬の例は、インターフェロン(α、β、γ)、インターロイキン−２、リツキシマブ、およびトラスツズマブである。
【００４０】
「化学的感作剤」とは、腫瘍細胞の感受性を化学療法の効果に対してより高くさせる薬剤を意味する。
【００４１】
「リンパ球増殖性疾患」とは、リンパ系の細胞(例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞)の異常な増殖がある疾患を意味する。
【００４２】
「リボザイム」とは、標的ＲＮＡ分子に対して部位特異性および切断能力を有する、酵素活性をもつＲＮＡを意味する。リボザイムを用いて、ポリペプチドの発現を減少させることができる。リボザイムを用いてポリペプチド発現を減少させるための方法は、例えば、Ｔｕｒｎｅｒら（Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４６５：３０３−３１８，  ２０００）およびＮｏｒｒｉｓら（Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４６５：２９３−３０１，  ２０００）に記載されている。
【００４３】
「レポーター遺伝子」とは、発現がアッセイされうるポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。このようなポリペプチドとしては、限定されるものではないが、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）およびβガラクトシダーゼが挙げられる。
【００４４】
「プロモーター」とは、転写を指示するために十分なポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「作動可能なように連結された」とは、適切な分子(例えば、転写アクチベータータンパク質)が第二ポリヌクレオチドに結合している場合に、第一ポリヌクレオチドが、第一ポリヌクレオチドの転写を指示する第二ポリヌクレオチドに隣接して位置していることを意味する。
【００４６】
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の以下の説明および請求項から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、本発明の核酸塩基オリゴマーを化学療法薬、例えば細胞傷害性薬、細胞増殖抑制剤、または生物学的応答修飾薬と組み合わせて投与することによる、細胞においてアポトーシスを促進するための方法を特徴とする。この２つの薬剤は同時にまたは互いに２８日以内に投与するのが望ましい。特定の実施形態では、化学療法薬は、微小管を崩壊させるかまたは安定させるものである。化学療法薬は、例えば、タキサンまたはビンカアルカロイドであってよい。必要に応じて、化学的感作剤（すなわち、増殖性細胞の化学療法に対する感受性をより高くする薬剤）を投与してもよい。また、前記薬剤の任意の組合せを用いて医薬組成物を形成してもよい。これらの医薬組成物は、増殖性疾患、例えば癌またはリンパ球増殖性疾患、あるいは増殖性疾患の症状を治療するために用いてよい。また、本発明の核酸塩基オリゴマー／化学療法薬の組合せを、癌または他の増殖性疾患の治療のために放射線療法と組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
癌細胞におけるアポトーシスの活性化は、従来の化学療法または放射線療法に対する患者の応答を改善するための、新規であり、かつ有用である可能性の高いアプローチを提供する。ＸＩＡＰは、カスパーゼを直接阻害する能力およびアポトーシスを抑制する能力という点に関して、ＩＡＰ遺伝子ファミリーの中で最も強力なメンバーである。発明者らは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト非小細胞肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０）の増殖に対するＸＩＡＰダウンレギュレーションの効果を調べた。培養Ｈ４６０ヒト肺癌細胞において、オリゴヌクレオチドＧ４  ＡＳが、最も強力な化合物であると確認された。これは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット法によりそれぞれ測定すると、ＸＩＡＰ  ｍＲＮＡを５５％、タンパク質レベルを６０％まで効果的にダウンレギュレートし、濃度１．２μＭで６０％細胞死を誘導した。対照的に、スクランブル対照Ｇ４オリゴヌクレオチドは、僅かなＸＩＡＰ減少および１０％未満の細胞死をもたらした。Ｇ４  ＡＳでの処理は、プロ−カスパーゼ−３およびＰＡＲＰタンパク質の分解により明らかなように、濃度１．２μＭで有意な核ＤＮＡ凝縮および断片化を伴ってアポトーシスを誘導した。さらに、ＸＩＡＰ  ＡＳオリゴヌクレオチドはＨ４６０細胞をドキソルビシン、タキソール、ビノレルビン、およびエトポシドの細胞傷害効果に感作させた。動物モデルでは、発明者らはＧ４  ＡＳが１５ｍｇ／ｋｇで、全身への腹腔内投与によりＳＣＩＤ／ＲＡＧ２−免疫不全マウスの異種移植モデルにおけるヒトＨ４６０腫瘍に対し有意な配列特異的増殖阻害効果を生じたことを実証した。全身へのＡＳ  ＯＤＮの投与は、腫瘍異種移植片におけるＸＩＡＰタンパク質の８５％ダウンレギュレーションに関連した。１５ｍｇ／ｋｇ  Ｇ４  ＡＳと５ｍｇ／ｋｇビノレルビンとの組合せは、いずれかの薬剤単独よりも腫瘍増殖を有意に阻害した。これらの研究は、ＸＩＡＰのダウンレギュレーションが、肺癌細胞における有力な死のシグナルであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを誘導する、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害することができることを示している。これらの研究は、ＩＡＰがヒト非小細胞肺癌、ならびに他の固形腫瘍における癌治療に適した標的であるとの論点を裏付ける。
【００４９】
（治療）
治療は、癌治療が正常に行われる場所：自宅、医院、診療所、病院の外来患者部門、または病院であればどこでも提供できる。一般に、治療は、医師が治療の効果を綿密に観察し、必要な調整を行うことができるように病院で始まる。治療期間は、治療される癌の種類、患者の年齢および症状、患者の疾病のステージおよび種類、ならびに患者の身体が治療に対してどのように応答するかによって決まる。薬剤投与は、異なる間隔（例えば、毎日、週１回、または月１回）で実施されうる。治療は、患者の身体が健康な新しい細胞を構築し、かつ体力を回復する機会を持てるよう、休止期間を含む断続的な周期で与えてもよい。
【００５０】
治療は、癌の種類およびその進行のステージに応じて、癌の拡散を遅らせるため、癌の増殖を遅らせるため、最初の腫瘍から身体の他の部分へ広がる可能性のある癌細胞を死滅させるかまたは停止させるため、癌により引き起こされる症状を軽減するため、または最初から癌を予防するために用いることができる。
【００５１】
本明細書において、「癌」または「新生物」または「新生細胞」とは、異常な方法で増殖した細胞の集合を意味する。癌増殖は制御不能であり、かつ進行性であって、通常であれば誘発されないか、または正常細胞の増殖の休止が引き起こされる条件下で生じる。
【００５２】
従来の製薬手法を用いて、適した製剤または組成物を形成し、化合物を過剰な細胞増殖により引き起こされる疾病を患う患者へ投与できる。投与は患者が症状を示す前に始めてもよい。適切であればどの投与経路を用いてもよい。例えば、投与は非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、肝内、関節内、くも膜下腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアゾル、坐剤、または経口投与であってよい。例えば、治療用製剤は液体溶液または懸濁液の形であってよく、経口投与には製剤は錠剤またはカプセル剤の形であってよく、鼻腔内投与には製剤は粉剤、点鼻剤、またはエアロゾルの形であってよい。
【００５３】
当技術分野で周知の製剤を製造するための方法は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”Ｅｄ．  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｕｒｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ２０００に見出される。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含みうる。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いて、化合物の放出を制御してもよい。他の有用である可能性の高い、ＩＡＰ調節化合物の非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。吸入のための製剤には、賦形剤、例えばラクトースを含んでもよく、または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩、およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、または、点鼻薬の形態をとった、またはゲルとしての投与のための油性溶液であってよい。
【００５４】
製剤は、疾病または症状のための治療を提供するために治療上有効な量で（例えば、病状を予防する、取り除く、または減少させる量）ヒト患者へ投与することができる。本発明の核酸塩基オリゴマーの好ましい用量は、疾患の種類および程度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の製剤、およびその投与経路などの変数に依存する可能性がある。
【００５５】
前記のように、必要に応じて、本発明の核酸塩基オリゴマーでの治療は、増殖性疾患の治療のための治療法（例えば、放射線療法、外科手術、または化学療法）と組み合わせてもよい。
【００５６】
前記の適用方法のいずれについても、本発明の核酸塩基オリゴマーは、静脈内投与されるか、または必要とされるアポトーシス事象の部位へ(例えば、注射によって)適用されるのが望ましい。
【００５７】
（オリゴヌクレオチドおよび他の核酸塩基オリゴマー）
少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド：ホスホジエステル（ＰＯ）またはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有するポリデオキシヌクレオチドが、リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡの切断を誘導する。２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ配列はＲＮＡ標的に対して高親和性を示すが、これらの配列はリボヌクレアーゼＨの基質ではない。望ましいオリゴヌクレオチドは、いくつかまたは全てのヌクレオチド間結合がヌクレアーゼ耐性のためにホスホロチオエートへと修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドギャップを含む２’−修飾オリゴヌクレオチドに基づくものである。メチルホスホネート修飾の存在は、その標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドの親和性を高め、従ってＩＣ５０を低下させる。また、この修飾は修飾されたオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。当然のことながら、本発明の方法および試薬は、共有結合で閉じられた多重アンチセンス（ＣＭＡＳ）オリゴヌクレオチド（Ｍｏｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３４６：２９５−３０３，  ２０００、国際公開第００／６１５９５号)、リボン型アンチセンス（ＲｉＡＳ）オリゴヌクレオチド（Ｍｏｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：４６４７−４６５３，  ２０００、国際公開第００／６１５９５号)、および大環状アンチセンスオリゴヌクレオチド(米国特許出願公開第２００２／０１６８６３１号)をはじめとする、開発されうる任意の技術と共に使用できる。
【００５８】
当技術分野で公知の通り、ヌクレオシドは核酸塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。このような複素環塩基の最も一般的な２つの種類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドに対し、リン酸基は糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかと結合できる。オリゴヌクレオチド形成の際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して直鎖状高分子化合物を形成する。今度は、この直鎖状高分子構造の個々の末端をさらに結合して環状構造を形成することができる。一般に、開いた直鎖構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドの骨格を形成すると言われている。通常の結合またはＲＮＡおよびＤＮＡの骨格は、３’〜５’ホスホジエステル結合である。
【００５９】
本発明で有用な好ましい核酸塩基オリゴマーの特定の例としては、修飾された骨格または非天然インターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチである。本明細書中に定義されるように、修飾された骨格を有する核酸塩基オリゴマーとしては、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のためには、そのインターヌクレオシド骨格にリン原子をもたない修飾されたオリゴヌクレオチドも核酸塩基オリゴマーであるとみなされる。
【００６０】
修飾されたオリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合、これらの２’−５’結合類似体を有するボラノホスフェート、ならびにヌクレオシドユニットの隣接する対が３’−５’を５’−３’へ、または２’−５’を５’−２’へ連結されている、逆の極性を有するものが挙げられる。また、多様な塩、混合塩および遊離酸型も含まれる。前記リン含有結合の製造を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、同４，４６９，８６３号、同４，４７６，３０１号、同５，０２３，２４３号、同５，１７７，１９６号、同５，１８８，８９７号、同５，２６４，４２３号、同５，２７６，０１９号、同５，２７８，３０２号、同５，２８６，７１７号、同５，３２１，１３１号、同５，３９９，６７６号、同５，４０５，９３９号、同５，４５３，４９６号、同５，４５５，２３３号、同５，４６６，６７７号、同５，４７６，９２５号、同５，５１９，１２６号、同５，５３６，８２１号、同５，５４１，３０６号、同５，５５０，１１１号、同５，５６３，２５３号、同５，５７１，７９９号、同５，５８７，３６１号、および同５，６２５，０５０号が挙げられ、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
その中にリン原子を含まない、修飾されたオリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、混合へテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、あるいは１またはそれ以上の短鎖ヘテロ原子のまたは複素環のインターヌクレオシド結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、 スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格をもつもの、ならびに他の混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分をもつものが挙げられる。前記オリゴヌクレオチドの製造を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号、同５，１６６，３１５号、同５，１８５，４４４号、同５，２１４，１３４号、同５，２１６，１４１号、同５，２３５，０３３号、同５，２６４，５６２号、同５，２６４，５６４号、同５，４０５，９３８号、同５，４３４，２５７号、同５，４６６，６７７号、同５，４７０，９６７号、同５，４８９，６７７号、同５，５２１，０６３号、同５，５０６，３３７号、同５，５４１，３０７号、同５，５６１，２２５号、同５，５９６，０８６号、同５，６０２，２４０号、同５，６１０，２８９号、同５，６０２，２４０号、同５，６０８，０４６号、同５，６１０，２８９号、同５，６１８，７０４号、同５，６２３，０７０号、同５，６６３，３１２号、同５，６３３，３６０号、同５，６７７，４３７号、同５，６７７，４３９号、同５，６９８，６８５号、および同６，３６５，５７７号が挙げられ、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６２】
他の核酸塩基オリゴマーでは、糖とインターヌクレオシド結合の双方、すなわち骨格が新規な基と置き換えられる。核酸塩基ユニットは、ＩＡＰとのハイブリダイゼーションのために維持される。このような核酸塩基オリゴマーの一つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミドを含む骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は保持され、直接または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子と結合している。これらの核酸塩基オリゴマーを作成するため、および使用するための方法は、例えば、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”  Ｅｄ．  Ｐ．  Ｅ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｏｒｆｏｌｋ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，  １９９９中に記載されている。ＰＮＡの製造を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号、同５，７１４，３３１号、および同５，７１９，２６２号が挙げられ、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９１，２５４，  １４９７−１５００に見出すことができる。
【００６３】
本発明の特定の実施形態では、核酸塩基オリゴマーは、ホスホロチオエート骨格およびヘテロ原子骨格を有するヌクレオシド、ならびに特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されているモルホリノ骨格構造を有する。
【００６４】
また、核酸塩基オリゴマーは、１またはそれ以上の置換された糖部分を含みうる。核酸塩基オリゴマーは、２’位において以下のうちの一つを含む：ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−，またはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル、あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、上式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。特に好ましいものは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］］２であり、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましい核酸塩基オリゴマーとしては、２’位において以下のうちの一つを含むものが挙げられる：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル(alkaryl)、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断群、リポーター群、干渉物質、核酸塩基オリゴマーの薬物動態特性を改善するための群、または核酸塩基オリゴマーの薬力学的特性を改善するための群、および類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、２’−Ｏ−メチルおよび２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチルとしても公知）または２’−ＭＯＥ）である。別の望ましい修飾は、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２）である。他の修飾としては、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）である。また、類似の修飾が、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマーでの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上のまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位ならびに５’末端ヌクレオチドの５’位でなされうる。また、核酸塩基オリゴマーは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の製造を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号、同５，１１８，８００号、同５，３１９，０８０号、同５，３５９，０４４号、同５，３９３，８７８号、同５，４４６，１３７号、同５，４６６，７８６号、同５，５１４，７８５号、同５，５１９，１３４号、同５，５６７，８１１号、同５，５７６，４２７号、同５，５９１，７２２号、同５，５９７，９０９号、同５，６１０，３００号、同５，６２７，０５３号、同５，６３９，８７３号、同５，６４６，２６５号、同５，６５８，８７３号、同５，６７０，６３３号、および同５，７００，９２０号が挙げられ、その各々は参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【００６５】
また、核酸塩基オリゴマーは、核酸塩基の修飾または置換を含む。本明細書において、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン(５−ｍｅ−Ｃ)、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびに他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルならびに他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（例えば、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ｐｐ．  ８５８−８５９，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  １．，  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ２８９−３０２，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３に開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基の一部は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  ｅｄｓ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３，  ｐｐ．  ２７６−２７８）、塩基の置換に望ましく、特に、２'−Ｏ−メトキシエチルまたは２'−Ｏ−メチル等修飾と組み合わせた場合にさらに望ましい。前記の修飾された核酸塩基の一部ならびに他の修飾された核酸塩基の製造を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，８４５，２０５号、同５，１３０，３０２号、同５，１３４，０６６号、同５，１７５，２７３号、同５，３６７，０６６号、同５，４３２，２７２号、同５，４５７，１８７号、同５，４５９，２５５号、同５，４８４，９０８号、同５，５０２，１７７号、同５，５２５，７１１号、同５，５５２，５４０号、同５，５８７，４６９号、同５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号、同５，６１４，６１７号、同５，６８１，９４１号、および同５，７５０，６９２号が挙げられ、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６６】
本発明の核酸塩基オリゴマーの別の修飾は、核酸塩基オリゴマーと、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１またはそれ以上の部分または複合体との化学結合を含む。このような部分としては、限定されるものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：６５５３−６５５６，  １９８９）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ，  ４：１０５３−１０６０，  １９９４）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６６０：３０６−３０９，  １９９２、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  ３：  ２７６５−２７７０，  １９９３）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：５３３−５３８：  １９９２）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：１１１１−１１１８，  １９９１、Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２５９：３２７−３３０，  １９９０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ７５：４９−５４，  １９９３）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６：３６５１−３６５４，  １９９５、Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：３７７７−３７８３，  １９９０）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １４：９６９−９７３，  １９９５）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６：３６５１−３６５４，  １９９５）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２６４：２２９−２３７，  １９９５）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２７７：９２３−９３７，  １９９６）を含む。そのような核酸塩基オリゴマー複合体の製造を開示する代表的な米国特許は、米国特許第４，５８７，０４４号、同４，６０５，７３５号、同４，６６７，０２５号、同４，７６２，７７９号、同４，７８９，７３７号、同４，８２４，９４１号、同４，８２８，９７９号、同４，８３５，２６３号、同４，８７６，３３５号、同４，９０４，５８２号、同４，９４８，８８２号、同４，９５８，０１３号、同５，０８２，８３０号、同５，１０９，１２４号、同５，１１２，９６３号、同５，１１８，８０２号、同５，１３８，０４５号、同５，２１４，１３６号、同５，２１８，１０５号、同５，２４５，０２２号、同５，２５４，４６９号、同５，２５８，５０６号、同５，２６２，５３６号、同５，２��２，２５０号、同５，２９２，８７３号、同５，３１７，０９８号、同５，３７１，２４１号、同５，３９１，７２３号、同５，４１４，０７７号、同５，４１６，２０３号、同５，４５１，４６３号、同５，４８６，６０３号、同５，５１０，４７５号、同５，５１２，４３９号、同５，５１２，６６７号、同５，５１４，７８５号、同５，５２５，４６５号、同５，５４１，３１３号、同５，５４５，７３０号、同５，５５２，５３８号、同５，５６５，５５２号、同５，５６７，８１０号、同５，５７４，１４２号、同５，５７８，７１７号、同５，５７８，７１８号、同５，５８０，７３１号、同５，５８５，４８１号、同５，５８７，３７１号、同５，５９１，５８４号、同５，５９５，７２６号、同５，５９７，６９６号、同５，５９９，９２３号、同５，５９９，９２８号、同５，６０８，０４６号、および同５，６８８，９４１号であり、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
また、本発明は、キメラ化合物である核酸塩基オリゴマーを含む。「キメラの」核酸塩基オリゴマーは、核酸塩基オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドであり、各々が少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチドの場合にはヌクレオチドで構成されている２またはそれ以上の化学的に別個の領域を含む。これらの核酸塩基オリゴマーは、一般に、核酸塩基オリゴマーを修飾して、核酸塩基オリゴマーにヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の向上を付与した、少なくとも１つの領域を含む。核酸塩基オリゴマーのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することのできる酵素の基質としての役割を果たしうる。例として、リボヌクレアーゼＨは、細胞のエンドヌクレアーゼであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより核酸塩基オリゴマーの遺伝子発現阻害効率を大いに増強する。したがって、同じ標的領域へハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラ核酸塩基オリゴマーを用いる場合には、短い核酸塩基オリゴマーで匹敵する結果を得られることが多い。
【００６８】
本発明のキメラ核酸塩基オリゴマーは、前記のように、２またはそれ以上の核酸塩基オリゴマーからなる複合構造として形成され得る。このような核酸塩基オリゴマーは、オリゴヌクレオチドであれば、当技術分野でハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の製造を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０１３，８３０号、同５，１４９，７９７号、同５，２２０，００７号、同５，２５６，７７５号、同５，３６６，８７８号、同５，４０３，７１１号、同５，４９１，１３３号、同５，５６５，３５０号、同５，６２３，０６５号、同５，６５２，３５５号、同５，６５２，３５６号および同５，７００，９２２号であり、その各々は参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【００６９】
本発明に従って用いられる核酸塩基オリゴマーは、周知の固相合成技術によって便宜にかつ日常的に作出できる。このような合成のための装置は、例えば、アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティ、ＣＡ）をはじめとするいくつかの業者により販売されている。このような合成のための当技術分野で公知の他の手段を、付加的に、または代わりに用いてもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を製造するために類似の技術を用いることはよく知られている。
【００７０】
また、本発明の核酸塩基オリゴマーは、取り込み、分布および／または吸収を補助するために、他の分子、分子構造または化合物の混合物、例として、リポソーム、受容体標的化分子、経口製剤、直腸製剤、局所用製剤または他の製剤と混合しても、カプセル化しても、コンジュゲートしても、またあるいは会合してもよい。このような取り込み、分布および／または吸収を補助する製剤の製造を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，１０８，９２１号、同５，３５４，８４４号、同５，４１６，０１６号、同５，４５９，１２７号、同５，５２１，２９１号、同５，５４３，１５８号、同５，５４７，９３２号、同５，５８３，０２０号、同５，５９１，７２１号、同４，４２６，３３０号、同４，５３４，８９９号、同５，０１３，５５６号、同５，１０８，９２１号、同５，２１３，８０４号、同５，２２７，１７０号、同５，２６４，２２１号、同５，３５６，６３３号、同５，３９５，６１９号、同５，４１６，０１６号、同５，４１７，９７８号、同５，４６２，８５４号、同５，４６９，８５４号、同５，５１２，２９５号、同５，５２７，５２８号、同５，５３４，２５９号、同５，５４３，１５２号、同５，５５６，９４８号、同５，５８０，５７５号および同５，５９５，７５６号であり、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７１】
本発明の核酸塩基オリゴマーは、任意の製薬上許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、あるいは、患者への投与において、生物活性のある代謝物またはその残留物を（直接または間接的に）与えることのできる任意の他の化合物を抱合する。従って、例えば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび製薬上許容される塩、そのようなプロドラッグの製薬上許容される塩、ならびに他の生物学的同等物にも引用される。
【００７２】
「プロドラッグ」とは、内在酵素または他の化学物質および／または状態の作用により、身体またはその細胞内で活性型（すなわち、薬剤）へと変換される不活性型に調剤される治療薬を表す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、国際公開第９３／２４５１０号または第９４／２６７６４号に開示されている方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として製造できる。
【００７３】
「製薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、かつ望ましくない毒性作用をそれに与えない塩をいう。製薬上許容される塩基付加塩は、金属またはアミン、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，  ６６：１−１９，  １９７７参照）。酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方法で塩を生成するために遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させることにより製造される。遊離酸型は、従来の方法で塩型を酸と接触させ、遊離酸を単離することによりを再生成できる。遊離酸型は、ある種の物理的特性、例えば極性溶媒中の溶解度において、それらの個々の塩型とは若干異なるが、その他の点では塩は本発明の目的のためのそれらの個々の遊離酸と同等である。本明細書において、「製薬上の付加塩」とは、本発明の組成物の成分の中の１つの酸型の製薬上許容される塩を含む。これらには、アミンの有機または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適した製薬上許容される塩は、当業者に周知であり、種々の無機酸および有機酸の塩基性塩、例えば、無機酸については、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸、有機酸については、カルボン酸、スルホン酸、スルホもしくはホスホ酸またはＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸、ならびに、アミノ酸については、例えば天然においてタンパク質の合成に関与する２０個のαアミノ酸、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸、およびまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成と共に）、あるいは他の酸の有機化合物、例えばアスコルビン酸が挙げられる。また、化合物の製薬上許容される塩も製薬上許容される陽イオンを用いて製造することができる。適した製薬上許容される陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよび第四級アンモニウム陽イオンが挙げられる。炭酸塩または炭素水素塩も可能である。
【００７４】
オリゴヌクレオチドおよび他の核酸塩基オリゴマーに適した製薬上許容される塩としては、（ｉ）陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン類、例えばスペルミンおよびスペルミジン、その他で形成される塩、（ｉｉ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸その他で形成される酸付加塩、（ｉｉｉ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、その他で形成される塩、ならびに（ｉｖ）元素の陰イオン、例えば塩素、臭素、およびヨウ素から形成される塩が挙げられる。
【００７５】
また、本発明は、本発明の核酸塩基オリゴマーを含む医薬組成物および製剤を含む。本発明の医薬組成物は、局所的治療または全身的治療のどちらを望むかに応じて、また治療する部位に応じて多数の方法で投与されうる。投与は、局所（眼内ならびに、膣送達および直腸送達を含む粘膜を含む）肺、例えば、粉剤またはエアゾルの吸入または通気法（ネブライザーによる、気管内、鼻腔内、上皮および経皮的）、経口、もしくは非経口であってよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射もしくは注入、あるいは頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与が挙げられる。
【００７６】
（ロックド核酸）
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、本発明に用いることのできる核酸塩基オリゴマーである。ＬＮＡはヌクレオチド類似体のリボフラノース環の柔軟性を制限する２'−Ｏ，４'−Ｃメチレン架橋を含み、それを強固な二環式Ｎ型コンホメーションへと固定する。ＬＮＡは、特定のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼならびに活性化リボヌクレアーゼＨに対し改良された耐性を示し、ほとんどどのような核酸塩基オリゴマーにも組み入れることができる。さらに、ＬＮＡを含有する核酸塩基オリゴマーは、標準のホスホルアミダイト合成プロトコールを用いて製造できる。ＬＮＡに関するさらなる詳細は、国際公開第９９／１４２２６号および米国特許出願第２００２／００９４５５５号に見出すことができ、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７７】
（アラビノ核酸）
アラビノ核酸（ＡＮＡ）も本発明の方法および試薬に用いることができる。ＡＮＡは天然のＤ−２’−デオキシリボース糖の代わりにＤ−アラビノース糖を基にした核酸塩基オリゴマーである。誘導体化されないＡＮＡ類似体は、ＲＮＡに対しホスホロチオエートがもつものと類似の結合親和性を有する。アラビノース糖をフッ素（２’Ｆ−ＡＮＡ）で誘導体化すると、結果として結合親和性の増加がもたらされ、結合したＲＮＡの選択的加水分解が生じるＡＮＡ／ＲＮＡおよびＦ−ＡＮＡ／ＲＮＡ二重鎖において効率的に生じる。これらの類似体は、単純なＬ糖を用いるそれらの末端での誘導体化により細胞培地中で安定化させることができる。ＡＮＡの治療への使用は、例えば、Ｄａｍｈａら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０：４２９−４４０，２００１中に考察されている。
【００７８】
（核酸塩基オリゴマーの送達）
発明者らは、裸のオリゴヌクレオチドが腫瘍細胞に入り、ＩＡＰ発現を阻害することが可能であることを本明細書中で実証している。それでもなお、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマーの細胞への送達を助ける製剤を利用するのが望ましい（例えば、米国特許第５，６５６，６１１号、同５，７５３，６１３号、同５，７８５，９９２号、同６，１２０，７９８号、同６，２２１，９５９号、同６，３４６，６１３号および同６，３５３，０５５号参照、その各々は参照により本明細書に組み入れられる）。
【００７９】
（リボザイム）
本発明のアンチセンスＩＡＰ配列を含む触媒性ＲＮＡ分子またはリボザイムを用いてＩＡＰポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を阻害することができる。アンチセンスＲＮＡ内へのリボザイム配列の封入は、ＲＮＡ切断活性をそれらに与え、その結果構築物の活性を増加させる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１，  １９８８、および米国特許出願第２００３／０００３４６９号に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８０】
従って、本発明はまた、その結合アームに、表１、２、６、および７のうちのいずれか１つの配列に対応する８〜１９個の連続した核酸塩基を有するアンチセンスＲＮＡを含む触媒性ＲＮＡ分子も特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、触媒性核酸分子はハンマーヘッド型またはヘアピン型モチーフで形成されるが、δ型肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連）またはニューロスポラＶＳ  ＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッド型モチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，  ８：１８３，  １９９２に記載されている。ヘアピン型モチーフの例は、米国特許第５，５２７，８９５号、同５，８５６，１８８号、および同６，２２１，６６１号に、ならびにＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚによりＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２８：４９２９，  １９８９、およびＨａｍｐｅｌらにより、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １８：２９９，  １９９０に記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎによりＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３１：１６，  １９９２に記載されている。リボヌクレアーゼＰモチーフは、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−ＴａｋａｄａらによりＣｅｌｌ，  ３５：８４９，  １９８３に記載されている。ニューロスポラＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフはＣｏｌｌｉｎｓらにより記載されている（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，  Ｃｅｌｌ  ６１：６８５−６９６，  １９９０、ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８８２６−８８３０，１９９１  、ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：２７９５−２７９９，  １９９３）。これらの特定のモチーフは、本発明中で限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の酵素的核酸分子に重要なことは、１またはそれ以上の標的遺伝子のＲＮＡ領域と相補的な特定の基質結合部位を有すること、およびその基質結合部位内部または周囲に分子へＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することであると認識するであろう。
【００８１】
（ＲＮＡ干渉）
本発明の核酸塩基オリゴマーは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に媒介されるＩＡＰ発現のノックダウンのための二本鎖ＲＮＡに用いてよい。ＲＮＡｉとは、注目される特定のタンパク質の細胞発現を減少させるための方法である（Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２：２３９−２４５，  ２００１、Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．  １５：４８５−４９０，  ２０００、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖｅｌ．  １２：２２５−２３２，  ２００２およびＨａｎｎｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−２５１，  ２００２に総説）。ＲＮＡｉにおいて、遺伝子サイレンシングは、一般に転写後に細胞中の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ)の存在により誘発される。このｄｓＲＮＡは細胞内で低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短い断片へプロセシングされる。ｄｓＲＮＡのトランスフェクションによるかまたはプラスミドに基づく発現系を用いるｓｉＲＮＡの発現によるｓｉＲＮＡの細胞への導入は、哺乳類細胞において機能表現型の喪失を作り出すために次第に用いられるようになっている。
【００８２】
本発明の一実施形態では、本発明の核酸塩基オリゴマーの８〜１９個の連続した核酸塩基を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が作製される。ｄｓＲＮＡは、二本鎖化したＲＮＡの２つの別個の鎖か、または自己二本鎖化した単一のＲＮＡ鎖（低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ）であり得る。一般に、ｄｓＲＮＡは約２１〜２２塩基対であるが、必要に応じて短くても長くてもよい（約２９核酸塩基まで）。ｄｓＲＮＡは、標準技術（例えば、化学合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）を用いて作製できる。キットは、例えば、アンビオン（オースチン、ＴＸ）およびエピセンター（マディソン、ＷＩ）から市販されている。哺乳類細胞においてｄｓＲＮＡを発現する方法は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３，  ２００２、  Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．  １６：９４８−９５８，  ２００２、  Ｐａｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５０５−５０８，  ２００２、  Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：５５１５−５５２０，  ２００２、  Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，  ２００２、  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４９７−５００，  ２００２およびＬｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５００−５０５，  ２００２に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
低分子ヘアピン型ＲＮＡは、場合により３'突出を含むステムループ構造からなる。変形形態もあり得、ステムは２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）の範囲で、ループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）の範囲であり得る。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現には、ポリメラーゼＩＩＩＨ１-ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはＵ６プロモーターのいずれか、ステムループ化ＲＮＡ挿入のためのクローニング部位、および４−５−チミジン転写終結シグナルを含む、プラスミドベクターを用いることができる。一般に、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは明確な開始および停止部位を有し、それらの転写物はポリ（Ａ）テールを欠く。これらのプロモーターのための終結シグナルは、ポリチミジン域により定義され、転写物は一般に２番目のウリジンの後で切断される。この位置での切断により発現したｓｈＲＮＡに３'ＵＵ突出が生じ、これは合成ｓｉＲＮＡの３’突出に類似している。哺乳類細胞においてｓｈＲＮＡを発現するさらなる方法は、前記で引用した参照文献中に記載されている。
【００８４】
（化学療法薬）
核酸塩基オリゴマーを、微小管を崩壊または安定させる１またはそれ以上の化学療法薬と組み合わせて使用することは、癌および他の新生物の治療に特に有効である。微小管崩壊剤（例えば、ビンカアルカロイド類）および微小管分解防止剤（例えば、タキサン類）は、より詳細に下に記載されている。
【００８５】
（ビンカアルカロイド類および関連化合物）
癌および他の新生物を治療するために本発明の核酸塩基オリゴマーと併せて使用できるビンカアルカロイド類としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、およびヒドロビンブラスチンが挙げられる。
【００８６】
ドラスタチンは、ビンカアルカロイド結合ドメインで主にチュブリンを干渉するオリゴペプチドである。これらの化合物を癌および他の新生物を治療するために本発明の核酸塩基オリゴマーと併せて使用することもできる。ドラスタチンには、ドラスタチン−１０（ＮＣＳ  ３７６１２８）、ドラスタチン−１５、ＩＬＸ６５１、ＴＺＴ−１０２７、シンプロスタチン１、シンプロスタチン３、およびＬＵ１０３７９３（セマドチン）が挙げられる。
【００８７】
クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン５２（ＬＹ３５５７０３））は、ビンカアルカロイド結合ドメイン内でチュブリンと結合し、Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシスを誘導する。これらの化合物はいずれも、癌および他の新生物を治療するために本発明の核酸塩基オリゴマーと併せて使用できる。
【００８８】
癌および他の新生物を治療するために本発明の核酸塩基オリゴマーと併せて使用することのできる他の微小管崩壊化合物は、米国特許第６，４５８，７６５号、同６，４３３，１８７号、同６，３２３，３１５号、同６，２５８，８４１号、同６，１４３，７２１号、同６，１２７，３７７号、同６，１０３，６９８号、同６，０２３，６２６号、同５，９８５，８３７号、同５，９６５，５３７号、同５，９５５，４２３号、同５，９５２，２９８号、同５，９３９，５２７号、同５，８８６，０２５号、同５，８３１，００２号、同５，７４１，８９２号、同５，６６５，８６０号、同５，６５４，３９９号、同５，６３５，４８３号、同５，５９９，９０２号、同５，５３０，０９７号、同５，５２１，２８４号、同５，５０４，１９１号、同４，８７９，２７８号、および同４，８１６，４４４号、ならびに米国特許出願第２００３／０１５３５０５号、同２００３／００８３２６３号および同２００３／００５５００２号に記載され、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８９】
（タキサン類および他の微小管安定化化合物）
タキサン類、例えばパクリタキセル、ドキセタキセル、ＲＰＲ  １０９８８１Ａ、ＳＢ−Ｔ−１２１３、ＳＢ−Ｔ−１２５０、ＳＢ−Ｔ−１０１１８７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＢＲＴ２１６、ＤＪ−９２７、ＭＡＣ−３２１、ＩＤＮ５１０９、およびＩＤＮ５３９０は、癌および他の新生物を治療するために本発明の核酸塩基オリゴマーと併せて使用できる。タキサン類似体（例えば、ＢＭＳ−１８４４７６、ＢＭＳ−１８８７９７）および機能的に関連した非タキサン類（例えば、エポチロン類（例えば、エポチロンＡ、エポチロンＢ（ＥＰ０９０６）、デオキシエポチロンＢ、およびエポチロンＢラクタム（ＢＭＳ−２４７５５０））、エレウテロビン、ディスコデルモリド、２−エピ−ディスコデルモリド、２−デス−メチルディスコデルモリド、５−ヒドロキシメチルディスコデルモリド、１９−デス−アミノカルボニルディスコデルモリド、９（１３）−シクロディスコデルモリド、またはラウリマリド）も本発明の方法および組成物に用いることができる。
【００９０】
癌および他の新生物を治療するために本発明の核酸塩基オリゴマーと併せて使用できる他の微小管安定化化合物は、米国特許第６，６２４，３１７号、同６，６１０，７３６号、同６，６０５，５９９号、同６，５８９，９６８号、同６，５８３，２９０号、同６，５７６，６５８号、同６，５１５，０１７号、同６，５３１，４９７号、同６，５００，８５８号、同６，４９８，２５７号、同６，４９５，５９４号、同６，４８９，３１４号、同６，４５８，９７６号、同６，４４１，１８６号、同６，４４１，０２５号、同６，４１４，０１５号、同６，３８７，９２７号、同６，３８０，３９５号、同６，３８０，３９４号、同６，３６２，２１７号、同６，３５９，１４０号、同６，３０６，８９３号、同６，３０２，８３８号、同６，３００，３５５号、同６，２９１，６９０号、同６，２９１，６８４号、同６，２６８，３８１号、同６，２６２，１０７号、同６，２６２，０９４号、同６，１４７，２３４号、同６，１３６，８０８号、同６，１２７，４０６号、同６，１００，４１１号、同６，０９６，９０９号、同６，０２５，３８５号、同６，０１１，０５６号、同５，９６５，７１８号、同５，９５５，４８９号、同５，９１９，８１５号、同５，９１２，２６３号、同５，８４０，７５０号、同５，８２１，２６３号、同５，７６７，２９７号、同５，７２８，７２５号、同５，７２１，２６８号、同５，７１９，１７７号、同５，７１４，５１３号、同５，５８７，４８９号、同５，４７３，０５７号、同５，４０７，６７４号、同５，２５０，７２２号、同５，０１０，０９９号、および同４，９３９，１６８号、ならびに米国特許出願第２００３／０１８６９６５号、２００３／０１７６７１０号、２００３／０１７６４７３号、２００３／０１４４５２３号、２００３／０１３４８８３号、２００３／００８７８８８号、２００３／００６０６２３号、２００３／００４５７１１号、２００３／００２３０８２号、２００２／０１９８２５６号、２００２／０１９３３６１号、２００２／０１８８０１４号、２００２／０１６５２５７号、２００２／０１５６１１０号、２００２／０１２８４７１号、２００２／００４５６０９号、２００２／００２２６５１号、２００２／００１６３５６号、２００２／０００２２９２号に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
アンチセンスＩＡＰ核酸塩基化合物と共に投与してよい他の化学療法薬は表１に記載されている。
【００９２】
【表１ａ】
2007509861.tif 000002
【表１ｂ】
2007509861.tif 000003
【表１ｃ】
2007509861.tif 000004
【表１ｄ】
2007509861.tif 000005
【表１ｅ】
2007509861.tif 000006
【表１ｆ】
2007509861.tif 000007
【表１ｇ】
2007509861.tif 000008
【表１ｈ】
2007509861.tif 000009
【表１ｉ】
2007509861.tif 000010
【００９３】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。それらは、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９４】
（核酸塩基オリゴマーの選択）
発明者らは、下に記載した選択基準に基づいて、ヒトＸＩＡＰおよびＨＩＡＰ１に対してそれぞれ９６個および９８個の、大部分が重複していない、１９塩基長の核酸塩基配列を選択した。ＸＩＡＰの場合、ｃＤＮＡ配列の開始コドンの約１ｋｂ上流から停止コドンの約１ｋｂ下流までの領域の９６個の配列（各１９核酸塩基長）（配列番号１〜９６、表２）を選択した。これはコーディング領域、ならびに隣接する５'および３'ＵＴＲ配列の約５０%を網羅する（すなわち、９６個の１９塩基長が１．８ｋｂの配列にわたるのに対し、標的とされる領域の長さは、コーディング領域の１．５ｋｂに加えてＵＴＲ配列の両端の１ｋｂからなる約３．５ｋｂである）。
【００９５】
【表２ａ】
2007509861.tif 000011
【表２ｂ】
2007509861.tif 000012
【表２ｃ】
2007509861.tif 000013
【表２ｄ】
2007509861.tif 000014
【表２ｅ】
2007509861.tif 000015
【表２ｆ】
2007509861.tif 000016
【００９６】
前記核酸塩基オリゴマー、または本明細書に記載の他の核酸塩基オリゴマーのいずれにおいても、各々の核酸塩基は独立にＤＮＡ残基またはＲＮＡ残基、例えば２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ残基であり得ることを留意されたい。配列番号３の核酸塩基配列は、例えば、５’−ＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＣＴ−３’、５’−ＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＣＵ−３’、または５’−ｍＣｍＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡｍＣｍＵ−３’（配列中、ｍＸは２’−Ｏ−メチルＸ残基を表す）であり得る。さらなる修飾された核酸塩基は当技術分野で公知である。結合は、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、またはメチルホスホネート（ＭＰ）結合であってよく、あるいは、混合した骨格（ＭＢ）を有してもよい。骨格は、核酸塩基オリゴマーの標的ＩＡＰポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にする任意の適した骨格であり得る。骨格の例は本明細書に記載されている。他の実施形態では、核酸塩基オリゴマーは、アクリジン保護結合、コレステリルもしくはソラレン成分、Ｃ５−プロピニルピリミジン、またはＣ５−メチルピリミジンを含む。本発明の核酸塩基オリゴマーに適した修飾としては、上に記載のもの、ならびに米国特許出願第２００２／０１２８２１６号に記載のものが挙げられ、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
核酸塩基オリゴマーの例を下の表３に記載する（ｍＸは２’−Ｏ−メチルＸ残基を表す）。
【００９８】
【表３ａ】
2007509861.tif 000017
【表３ｂ】
2007509861.tif 000018
【表３ｃ】
2007509861.tif 000019
【００９９】
ＨＩＡＰ１に対する核酸塩基オリゴマーをデザインするために、類似の同定アプローチを用いた。最初に、９８個の１９塩基長核酸塩基オリゴマーを選択した（配列番号１６３〜２６０、表４）。ＨＩＡＰ１配列へ標的化したこれらの９８個の核酸塩基オリゴマーのうち１５個（配列番号１６３〜１７０、１７３、１７９、２０２、２２２、２２３、２４７、および２５９）をさらなる評価のために選択した。これらの１５個の候補核酸塩基オリゴマーには、コード領域を標的とする４個の核酸塩基オリゴマー（配列番号２０２、２２２、２２３、および２４７）、３’ＵＴＲを標的とする１個の核酸塩基オリゴマー（配列番号２５９）、５’ＵＴＲを標的とする７個の核酸塩基オリゴマー（配列番号１６６〜１７０、１７３、および１７９、７個の核酸塩基オリゴマーのうちの１個は開始コドンと重なっている）、ならびに５’ＵＴＲのイントロンのセグメントを標的とするようデザインされた他の３個のオリゴヌクレオチド（配列番号１６３〜１６５）が含まれる。
【０１００】
【表４ａ】
2007509861.tif 000020
【表４ｂ】
2007509861.tif 000021
【表４ｃ】
2007509861.tif 000022
【０１０１】
（核酸塩基オリゴマーの選択判定基準）
コンピュータプログラムＯＬＩＧＯ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社により既に流通済み）を用いて、以下の判定基準：
１）ＧＣ含量７５％以内、かつＡＴ含量７５％以内であること、
２）好ましくは、４またはそれ以上の連続したＧ残基を含む核酸塩基オリゴマーでないこと（既報告の毒性作用のためであるが、１個は毒性対照として選択）、
３）安定した二量体またはヘアピン型構造を形成する能力を有する核酸塩基オリゴマーでないこと、および
４）翻訳開始部位の周囲の配列が好ましい領域であること
に基づいて候補核酸塩基オリゴマーを選択した。
【０１０２】
さらに、ＲＮＡ二次構造フォールディングプログラムＭＦＯＬＤの助けを借りて標的ｍＲＮＡの利用可能領域を予測した（Ｍ．  Ｚｕｋｅｒ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｔｈｅｗｓ  ＆  Ｄ．  Ｈ．  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ．  Ｉｎ：  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ  ＆  Ｂ．  Ｆ．  Ｃ．  Ｃｌａｒｋ，  Ｅｄ．，  ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  （１９９９））。予測された最も安定したｍＲＮＡの折り畳みの５％以内の自由エネルギー値を有する準最適フォールドを、残基が塩基対結合を形成する相補的な塩基を見出すことのできる２００塩基のウィンドウを用いて予測した。塩基対を形成しなかったオープン領域を各準最適フォールドとともに合計し、一貫してオープンであると予測された領域を核酸塩基オリゴマーとの結合に利用しやすいと考えた。前記選択判定基準のうちのいくつかを部分的にしか満たしていない核酸塩基オリゴマーも、それらが標的ｍＲＮＡの予測オープン領域を認識するのであれば可能性のある候補として追加的に選択した。
【実施例２】
【０１０３】
（オリゴヌクレオチド合成）
核酸塩基オリゴマーのＩＡＰ発現を阻害する能力を、オリゴヌクレオチド、例えば核酸塩基オリゴマーを用いて試験した。オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を隣接するＲＮＡ残基間に有する２個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基に両側を隣接されているホスホジエステルＤＮＡ残基のコアからなる、キメラの、第二世代オリゴヌクレオチドとしてＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）により合成された。９６ウェルプレート、ならびに適合するチューブに最低限１２ＯＤの核酸塩基オリゴマーを含むオリゴヌクレオチドを準備した。この濃度は、検出方法が感度の高い方法、例えばＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲ、またはＥＬＩＳＡである場合にトランスフェクションのために十分な材料（９６ウェルのフォーマットで１００回を超えるアッセイ）を供給した。陽性のヒットが確認されると（下記参照）、２個に代えて３個の隣接ＲＮＡ残基でオリゴヌクレオチドを再合成して安定性／ヌクレアーゼ耐性をさらに増大させた。さらに、妥当性を確認するため、適当な対照（例えばスクランブル、４−塩基ミスマッチ、および逆極性オリゴヌクレオチド）を、最も高い活性を生じた標的のいくつかについて合成した。
【実施例３】
【０１０４】
（スクリーニングアッセイおよび核酸塩基オリゴマーの最適化）
ＩＡＰの発現を阻害することのできる核酸塩基オリゴマーを同定するための発明者らのアプローチは、上記のオリゴヌクレオチドライブラリーを、標的とされる特定のＩＡＰ遺伝子に対するＲＮＡおよび／またはタンパク質の特異的減少（ノックダウン）についてスクリーニングすることであった。細胞中のＲＮＡおよびタンパク質レベルを検出するために任意の数の標準アッセイを使用できる。例えば、ＲＮＡレベルは、標準的なノーザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて測定できる。タンパク質レベルは、例えば、標準的なウエスタンブロット解析または免疫沈降技術により測定できる。あるいは、アンチセンスＩＡＰ核酸を投与した細胞を、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９１９，９１２号、同６，１５６，５３５号、および同６，１３３，４３７号に記載されている方法に従って、細胞生存度について調べてもよい。
【０１０５】
発明者らは、ＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲ（下に記載）を用いてオリゴヌクレオチド処理後のｍＲＮＡレベルの変化についてアッセイした。ＸＩＡＰタンパク質レベルを測定するためにＥＬＩＳＡを用い、ＨＩＡＰ１タンパク質レベルを測定するためにウエスタンブロット法を使用した。トランスフェクション条件の最適化は、対照として開始コドンにかかるＸＩＡＰ由来のフルオレセイン標識センスオリゴヌクレオチド（５’−ｍＧｍＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＴＧＧＴＡＡｍＣｍＡ−３’、配列番号２６１）を用いて、リポフェクタミンに加えてまたはリポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジーズ，Ｃａｎａｄａ）でＴ２４膀胱癌細胞またはＨ４６０非小細胞肺癌細胞に対して行い、または、リポフェクチンでＳＦ−２９５神経膠芽腫細胞に対して行った。結果を視覚化し、落射蛍光顕微鏡で測定した。Ｔ２４細胞の場合、発表されたオリゴヌクレオチドのサバイビン発現をダウンレギュレートする能力に基づいてトランスフェクションをさらに最適化した（Ｌｉら、Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １：４６１−４６６，  １９９９）（５’−Ｕ／ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＵ／ＴＵ／Ｔ−３’配列番号２６２）。発明者らは、以下詳細に記載するＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブで検出されたサバイビンＲＮＡノックダウンのＴａｑＭａｎ結果に基づいてトランスフェクション条件を最適化した。細胞によるオリゴヌクレオチド取り込みのための最適条件を、９４０ｎＭオリゴヌクレオチド、ならびに総量７０μＬ中４μＬ  ＰＬＵＳ試薬および０．８μＬリポフェクタミンで３時間であると見出した。次に、これらの条件を、Ｔ２４細胞に対してオリゴライブラリーを用いるＸＩＡＰタンパク質ノックダウンについてのスクリーニングに適用した。
【０１０６】
ＨＩＡＰ１ノックダウンをＳＦ−２９５細胞において調べた。なぜならこれらの細胞は７０ｋＤａ  ＨＩＡＰ１タンパク質を容易に検出かつ識別可能であるからで、その一方で多くの細胞系統は高いレベルのタンパク質を発現しない、または大量の類似のサイズの６８ｋＤａ  ＨＩＡＰ２タンパク質と識別できないからである。
【０１０７】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＲＮＡを、ＲＬＴバッファー（キアゲン、バレンシア、ＣＡ)に溶解した細胞から抽出し、キアゲンＲＮｅａｓｙカラム／キットを用いて精製した。パーキンエルマーＡＢＩ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ  ＰＣＲ合成機を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを実施した。ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ１、サバイビン、またはＧＡＰＤＨを特異的に認識するようデザインされたプライマーおよびプローブを用いて、ＰＥバイオシステムズのＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスのプロトコールに従って、ＲＮＡを逆転写し、増幅した。ヒトサバイビンには、正方向プライマーは５’−ＴＣＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡ−３’（配列番号２６３）、逆方向プライマーは５’−ＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＧＣＡＡＣＣＧ−３’（配列番号２６４）、プローブは５’−（ＦＡＭ）ＡＧＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２６５）であった。ヒトＨＩＡＰ１には、正方向プライマーは５’−ＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号２６６）、逆方向プライマーは５’−ＧＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＧＴ−３’（配列番号２６７）、およびプローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＴＧ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２６８）であった。ヒトＸＩＡＰには、正方向プライマーは５’−ＧＧＴＧＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２６９）、逆方向プライマーは５’−ＴＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡ−３’（配列番号２７０）、およびプローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＡＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＡＡＴＡＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２７１）であった。ヒトＧＡＰＤＨには、正方向プライマーは５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号２７２）、逆方向プライマーは５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号２７３）、およびプローブは５’−（ＪＯＥ）ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２７４）であった。ＦＡＭは６−カルボキシフルオロセインであり、ＪＯＥは６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメトキシフルオロセインであり、ＴＡＭＲＡは６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミンである。ＦＡＭおよびＪＯＥは５’リポーター色素であるが、ＴＡＭＲＡは３’クエンチャー色素である。
【０１０８】
遺伝子発現の相対定量を、ＧＡＰＤＨを内部標準として用いて、ＰＥバイオシステムズのマニュアルに記載のとおり実施した。比較Ｃｔ（サイクル閾値）法を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルと比較したＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルの相対定量化に用いた。要するに、リアルタイム蛍光測定を各ＰＣＲサイクルで行い、蛍光値がベースライン標準偏差の３０倍という限界値を越えるポイントを測定することにより各サンプルの閾値サイクル（Ｃｔ）値を計出した。ベースライン平均値およびベースラインＳＤの計算は、３回目のサイクルのベースライン値から開始して、シグナルが指数関数的に上昇し始める３サイクル前のベースライン値で終了する。特定のＩＡＰのためのＰＣＲプライマーおよび／またはプローブは、ゲノムＤＮＡ混入を増幅することおよび検出することの可能性を減らすため、１ｋｂまたはそれ以上のゲノムＤＮＡにより分離される、少なくとも１つのエキソン−イントロン境界にかかるようデザインした。逆転写およびＰＣＲ反応段階を実施する前に、ＲＮＡサンプルをＤＮアーゼかまたはリボヌクレアーゼのいずれかで処理することにより、シグナルの特異性、および起こりうるＤＮＡからの混入を確認した。
【０１０９】
（ＸＩＡＰ  ＥＬＩＳＡおよびＨＩＡＰ１ウェスタンイムノブロット法）
標準的な比色ＸＩＡＰ  ＥＬＩＳＡアッセイを、捕獲抗体としてのＸＩＡＰに対するアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗体を用いて行い、ＸＩＡＰモノクローナル抗体（ＭＢＬ、日本）、ビオチン化抗マウスＩｇ抗体とセイヨウワサビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジンコンジュゲートおよびＴＭＢ基質で検出した。あるいは、ポリクローナルＸＩＡＰまたはＨＩＡＰ１抗体を用いて、ＸＩＡＰまたはＨＩＡＰ１のタンパク質レベルをそれぞれ測定してもよい。
ＨＩＡＰ１を、ウェスタンイムノブロット上でアフィニティ精製した抗ラットＨＩＡＰ１ウサギポリクローナル抗体を一次抗体として用いて検出し、Ｘ線フィルム上で二次セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇ抗体および化学発光基質を用いてＥＣＬ（アマシャム）により検出した。この抗ＨＩＡＰ１ポリクローナル抗体は、ラットＨＩＡＰ１のＧＳＴとの融合体に対して作製されている。この抗体は、ヒトおよびネズミ双方のＨＩＡＰ１およびＨＩＡＰ２と交差反応する。
【実施例４】
【０１１０】
（アンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドによるＸＩＡＰ  ＲＮＡおよびポリペプチド発現の低下）
９６個のアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるＸＩＡＰ合成ライブラリーを、最初にＸＩＡＰタンパク質レベルの減少についてスクリーニングした。具体的には、Ｔ２４細胞（１．５×１０４細胞／ウェル）を１日目に９６ウェルプレートのウェルに播種し、抗生物質フリーのマッコイ培地で２４時間培養した。２日目に、細胞を前記のようにＸＩＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした（オリゴヌクレオチドはそれらのプレーティングされた位置、すなわちＡ１〜Ｈ１２に従って標識され、２個の反復部分である、シーリングメンブレンに固着した凍結乾燥したＤＮＡペレットを含むＡ１３とＢ１３を含む）。要するに、核酸塩基オリゴマーを、１０μｌ／ウェルの血清フリー、抗生物質フリーのマッコイ培地に希釈し、次にＰＬＵＳ試薬を添加した。リポフェクタミンを１０μｌ／ウェルの血清フリー、抗生物質フリーのマッコイ培地に希釈し、双方の混合物を室温で１５分間インキュベートした。次に、混合物を合し、室温で１５分間インキュベートした。
【０１１１】
その一方で、完全培地を細胞から取り除き、５０μｌ／ウェルの血清フリー、抗生物質フリーの培地を細胞へ加えた。トランスフェクション混合物をウェルへ加え、細胞を３時間インキュベートした。次に、３０μｌ／ウェルの血清フリー、抗生物質フリーの培地および２０％ウシ胎児血清を含む１００μｌ／ウェルの抗生物質フリーの完全培地を各ウェルに加えた。
【０１１２】
３日目に、前記のようにリアルタイム定量ＰＣＲ技術を用いてＸＩＡＰ  ＲＮＡレベルを測定した。４日目に、ＸＩＡＰタンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより測定し（図１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｇ、１Ｉ、および１Ｋ）、細胞の総タンパク質量を生化学的に測定した（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ、１Ｈ、１Ｊ、および１Ｌ、ＸＩＡＰタンパク質レベルの標準化に用いた)。結果を偽トランスフェクションサンプル(トランスフェクション剤で処理したがオリゴヌクレオチドＤＮＡは添加せず、その後、他のサンプルのようにプロセシングされた)と比較した。経時変化実験により、タンパク質ノックダウンに最適な時間は約１２〜２４時間であると決定された。
【０１１３】
また、オリゴヌクレオチドライブラリーを、前記のプライマーおよびプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ特異的ＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブを適切な最適時間に用いるＲＮＡレベルの減少についてスクリーニングした。経時変化実験により、６〜９時間でｍＲＮＡが最大限減少すると測定された。これらの結果は、タンパク質の結果とよく一致する。
【０１１４】
最初のスクリーニング(ＸＩＡＰレベルが正常に戻る準最適時点でおこなったが、おそらく非トランスフェクト細胞の結果に起因する)は、試験した９６個の核酸塩基オリゴマーのうち偽（核酸塩基オリゴマーを含まない）トランスフェクションレベルと比較して総タンパク質に対してＸＩＡＰタンパク質レベルがいくらかの減少を示す（図１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｇ、１Ｉおよび１Ｋ）、１６個のアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定した（表１：Ｃ２、Ｅ２、Ｅ３、Ｆ３、Ｃ４、Ｄ４、Ｅ４、Ｆ４、Ｇ４、Ｃ５、Ｄ５、Ｂ６、Ｆ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ８）。総タンパク質量は、これらの１６の核酸塩基オリゴマーの各々に関して減少し、これらの核酸塩基オリゴマーの毒性作用または細胞分裂停止作用を示す（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ、１Ｈ、１Ｊ、１Ｌ）。核酸塩基オリゴマーＢ９およびＣ９は総タンパク質量において明らかな低下を示したが、ＸＩＡＰタンパク質レベルにおいては相対的な低下を示さなかった。
【０１１５】
偽のトランスフェクションと比較して相対ＸＩＡＰタンパク質レベルにいくらかの低下を示した１６個のアンチセンス核酸塩基オリゴマーを、単独または組み合わせて、１個の対照核酸塩基オリゴマー（Ｄ２）を含めて、前記の経時変化調査（図２Ｂ）に基づいて、より最適な時点（１２時間）でＸＩＡＰタンパク質をノックダウンするそれらの能力について再び試験した。また、これらの核酸塩基オリゴマーを、１２時間でＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルを低下させるそれらの能力について調べ、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化し、偽トランスフェクションと比較した。１２時間での総タンパク質濃度も測定した（図２Ｃ）。
【０１１６】
核酸塩基オリゴマーのＸＩＡＰタンパク質レベルを低下させる能力（図２Ｂ）とＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルを低下させる能力（図２Ａ）との間には、良い相関関係があった。さらに、この早い時点での総タンパク質量の大きな減少はなく、ＸＩＡＰ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の減少は、後の時点で見られる総タンパク質量の減少の前に起こる。ＸＩＡＰタンパク質またはｍＲＮＡレベルの５０％を超える減少を示す核酸塩基オリゴマーが、単独で、または１：１の比で加えられた２個の核酸塩基オリゴマーとの組合せで、最良の核酸塩基オリゴマーであると同定され、さらに確認された。用いるトランスフェクション条件によるが、これらの１６個のオリゴヌクレオチドのうち１０個（Ｅ２、Ｅ３、Ｆ３、Ｅ４、Ｆ４、Ｇ４、Ｃ５、Ｂ６、Ｄ７、Ｆ８）が、または組み合わせて用いる場合（Ｃ５とＧ４)に、ＸＩＡＰタンパク質またはＲＮＡレベルを５０％を超えて減少させる一貫した能力を示した。さらに、アンチセンス活性を実証したこれらの１６個のオリゴヌクレオチドは、ＸＩＡＰ  ｍＲＮＡの４つの異なる標的領域にクラスターを形成し、隣接する核酸塩基オリゴマーはいくらかのノックダウン活性を示した。これらの領域または感受性のアイランド間の配列を標的とする核酸塩基オリゴマーでは、アンチセンス活性はほとんどまたはまったく見出されなかった。おそらく、これらの領域は、核酸塩基オリゴマーにとって細胞の内部へ接近しやすいｍＲＮＡ上のオープン域を表す。２個の核酸塩基オリゴマー、Ｅ３およびＦ３は、ＩＲＥＳと翻訳開始部位との間の介在領域において開始コドンのすぐ上流のＸＩＡＰを標的とし、ＩＲＥＳエレメントの末端と部分的に重なり合う。Ｃ２、Ｄ２、およびＥ２は、最小ＩＲＥＳエレメントの上流ＸＩＡＰ領域を標的とし、最小ＩＲＥＳ領域が、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸塩基オリゴマーが容易に接近しにくい高次構造化されたＲＮＡの領域であるということをさらに証明している。他の核酸塩基オリゴマーは全てコーディング領域の一部分と相補的であり、例えば核酸塩基オリゴマーＣ５およびＤ５により実証されたように、ＸＩＡＰ配列（Ｅ４、Ｆ４、およびＧ４）の８５６〜９１６位の活性のクラスターならびに小さな個別の領域が挙げられる。
【０１１７】
表２に表した９６個の核酸塩基オリゴマーの一部を、トランスフェクション後９時間でＮＣＩ−Ｈ４６０細胞中においてＸＩＡＰ  ｍＲＮＡをノックダウンするそれらの能力について再スクリーニングした。データを下の表５にまとめる。
【０１１８】
【表５ａ】
2007509861.tif 000023
【表５ｂ】
2007509861.tif 000024
【０１１９】
また、発明者らは、４×４  ＭＢＯ（全てＰＳ、ＤＮＡ残基の両側に４個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基が隣接している）が、Ｈ４６０細胞においてＸＩＡＰタンパク質をノックダウンすることができるかどうか測定した。図３および４に示すように、Ｅ１２および別のオリゴヌクレオチド、ＦＧ８の４×４  ＭＢは、３１ｎＭほどの低い量で効果的であった。
【実施例５】
【０１２０】
（ＸＩＡＰアンチセンス核酸塩基オリゴマーによる細胞傷害性および化学的感作の増強）
発明者らは、ＸＩＡＰアンチセンス核酸塩基オリゴマーが、伝統的な化学療法薬、例えばアドリアマイシンまたはシスプラチンに対して薬剤耐性の高いＴ２４細胞を化学的に感作することができるかどうかを調査した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、異なるＸＩＡＰ標的領域のいくつかを代表するように選択し、単独でまたは他のオリゴヌクレオチドもしくは薬剤と組み合わせて、それらの細胞傷害性効果について試験した。５個のＸＩＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｔ２４膀胱癌細胞を死滅させるまたは化学的に感作するそれらの能力について試験し、３つの対応するスクランブル対照オリゴヌクレオチドの効果と比較した。
【０１２１】
Ｔ２４細胞を、ＸＩＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、スクランブルオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなし（偽トランスフェクション）でトランスフェクトし、または未処理のままとした。これらの細胞（未処理対照を除く）をトランスフェクション２０時間後の生存度について、ＷＳＴ−１テトラゾリウム色素が代謝的に活性な細胞においては着色したホルマザン生成物へと還元される、ＷＳＴ−１テトラゾリウム色素アッセイを用いて試験した（図５Ａ）。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドＥ４によって誘導された細胞傷害の発生を、未処理のままとしたＴ２４細胞、偽トランスフェクトＴ２４細胞、またはＥ４オリゴヌクレオチド、Ｅ４スクランブルオリゴヌクレオチド、Ｅ４逆極性オリゴヌクレオチドもしくはＥ４ミスマッチオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＴ２４細胞を目視検査することにより調べた。トランスフェクションの２０時間後、それらの細胞を形態について調べた（図５Ｄ）。アンチセンスＥ４オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞だけが毒性の徴候を示した。
【０１２３】
シスプラチンまたはアドリアマイシンに対するＴ２４細胞の化学的感作への核酸塩基オリゴマーの効果を調べるため、オリゴヌクレオチドを、一定用量のアドリアマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下でＴ２４細胞をさらに死滅させるそれらの能力について試験した。細胞をまず、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、次に、さらに２０時間アドリアマイシンを添加した。２０時間の薬物処理終了時にＷＳＴ−１により生存度を測定した（図５Ｂ）。結果を、核酸塩基オリゴマー処理単独と比較した生存度％として図５Ｃに示す。
【０１２４】
試験した５個の核酸塩基オリゴマー（Ｆ３、Ｅ４、Ｇ４、Ｃ５、Ｄ７）の全て、ならびにＥ４＋Ｃ５およびＧ４＋Ｃ５の組合せは、Ｔ２４細胞を死滅させ、２４時間後には、偽（オリゴヌクレオチドなし）トランスフェクト細胞またはＦ３（５’−ｍＣｍＡｍＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡｍＣｍＧｍＵ−３’、配列番号２７５）、Ｅ４（５’−ｍＣｍＵｍＡＣＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴｍＵｍＣｍＡ−３’、配列番号２７６）およびＣ５（５’−ｍＵｍＧｍＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＧｍＵｍＣｍＡ−３’、配列番号２７７）に対応する３つのスクランブル対照でトランスフェクトした細胞と比較して、わずか１０〜１５％の生存細胞を残した（図５Ａおよび５Ｃ）。したがって、毒性は、ＸＩＡＰレベルを低下させる核酸塩基オリゴマーに配列特異的であり、一般に、この化学は核酸塩基オリゴマーに起因する非配列特異的な毒性によるものではない。この細胞傷害性は、ＸＩＡＰタンパク質ノックダウン（およびＸＩＡＰによって生じる抗アポトーシス保護の予測損失）とトランスフェクション自体の細胞障害性との複合効果に起因しうる。
【０１２５】
３時間のトランスフェクション期間の終わりに一定用量のアドリアマイシンまたはシスプラチンを添加すると、結果として、試験したオリゴヌクレオチドの一部で生存がさらに減少し、核酸塩基オリゴマーＦ３、Ｄ７およびＧ４＋Ｃ５の組合せでは、対応するそれらのオリゴヌクレオチドで処理した値（図５Ｃ）と比較して２０時間後に生存はさらに４０％減少した（図５Ｂ）。図５Ｂでの値（オリゴヌクレオチドと薬剤）は、図５Ｃでのオリゴヌクレオチド単独の値（この値を各ＯＤＮに対して１００％とする）と比較される。アドリアマイシン化学的感作についての結果のみが示され、細胞をシスプラチンで化学的に感作した場合にも同様の結果が得られた。使用した一定用量で、偽トランスフェクションおよびスクランブル対照トランスフェクションは、アドリアマイシンで処理した場合、いずれにも生存喪失の増加を全く示さなかった（図５Ｂ）。化学的感作は、ＸＩＡＰレベルが特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって低下する場合にのみ見られる。
【実施例６】
【０１２６】
（Ｈ４６０細胞におけるＸＩＡＰ  ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのダウンレギュレーション効果）
リアルタイムＰＣＲを利用することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド（２×２  ＭＢＯ、両末端に、ホスホロチオエート結合をもつ２個の隣接する２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基、および１５個のホスホジエステルＤＮＡ残基からなる中心コアで構成される）を、Ｈ４６０細胞におけるＸＩＡＰ  ｍＲＮＡに対するそれらの効果について調べた。この構成において、核酸塩基オリゴマーＦ３、Ｇ４、Ｃ５、ＡＢ６およびＤＥ４は、未処理の対照と比較してｍＲＮＡレベルを５０〜７０％低下させ、一方、Ｄ７  ＡＳ核酸塩基オリゴマーはｍＲＮＡレベルを３０％低下させた（図６）。それに対して、対照核酸塩基オリゴマーおよびトランスフェクタント剤単独（ＬＦＡ）は、それぞれ、ｍＲＮＡレベルを未処理の対照の２０％未満まで低下させただけであった（図６）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる研究用に核酸塩基オリゴマーＦ３、Ｇ４およびＣ５を選択した。ＴａｑＭａｎ解析により観察されたＸＩＡＰ  ｍＲＮＡのさらなるノックダウンを図７および８に示す。
【実施例７】
【０１２７】
（ＸＩＡＰタンパク質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのダウンレギュレーション効果）
発明者らは、ウエスタンブロット解析により、オリゴヌクレオチド構成における核酸塩基オリゴマーＦ３、Ｇ４およびＣ５の、ＸＩＡＰタンパク質発現に対する効力を特徴付けた（図９、１０Ａおよび１０Ｂ）。Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドは、ＸＩＡＰタンパク質に対して最大のダウンレギュレーション効果を示し、１．２μＭの濃度でのトランスフェクション終了の２４時間後にＸＩＡＰタンパク質レベルを６２％低下させた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。Ｆ３  ＡＳオリゴヌクレオチドは、１．２μＭでＸＩＡＰタンパク質レベルを５０％低下させ、一方、Ｃ５  ＡＳオリゴヌクレオチドはその対照と比較して配列特異的な効果は示さなかった（図１０Ｂ）。さらなる研究では、Ｅ１２およびＦＧ８  ＡＳオリゴヌクレオチドがＸＩＡＰタンパク質レベルを著しく低下させた（図９）。
【実施例８】
【０１２８】
（ＸＩＡＰ  ＡＳオリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導）
ＸＩＡＰ  ＡＳ核酸塩基オリゴマーはＨ４６０細胞およびＴ２４膀胱癌細胞のその後の生存度を低下させることが可能であるということが実証されたため、発明者らは、観察された細胞死がアポトーシスの誘導に起因するのかどうかを判定した。図１１Ａに示すように、１．２μＭのＦ３またはＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処理したＨ４６０細胞はプロカスパーゼ−３タンパク質を活性化および分解し、それぞれ、未処理の対照細胞と比較してタンパク質レベルの４０％または６０％の低下を伴った。ＰＡＲＰもカスパーゼ−３によって生じるその予測断片であった（図１１Ａ）。それに対して、１．２μＭのＦ３およびＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチド対照はカスパーゼ−３またはＰＡＲＰタンパク質発現に対して全く効果がなかった（図１１Ａ）。Ｂｃｌ−２とＢａｘの比は、１．２μＭのＦ３およびＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドおよびそれら各々の対照で処理したＨ４６０細胞では変わらなかった。フローサイトメトリーを用いて、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処理し、ＰＩで染色したＨ４６０細胞における低二倍体ＤＮＡ量を検出した（図１２Ａ）。Ｈ４６０細胞を１．２μＭのＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドまたはスクランブル対照オリゴヌクレオチドで処理した場合、細胞の低二倍体ＤＮＡ量は、未処理の対照細胞の場合の１６．６％と比較して、それぞれ、４０．８および２２．１％であった。ＤＡＰＩ染色を用いて、１．２μＭのＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドまたはスクランブル対照オリゴヌクレオチドで処理したＨ４６０細胞の核の形態変化を検出した。図１２Ｂに示すように、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処理した細胞は、クロマチン凝縮および核ＤＮＡ断片化をはじめとするアポトーシスに特徴的な形態上の変化を受けた。Ｇ４  ＳＣで処理した対照細胞においては、ほとんどの細胞がこれらの形態上の変化を示さなかった。
【実施例９】
【０１２９】
（ＡＳオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害および抗癌剤に対するＨ４６０細胞の感作）
ＸＩＡＰ発現のダウンレギュレーションおよびアポトーシスに関連する核酸塩基オリゴマーの生物学的効果を分析するために、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処理したＨ４６０細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより調べた。トランスフェクションの４８時間後、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドはＨ４６０細胞増殖を用量依存的に低下させ、１．２μＭで未処理の対照のレベルに対して５５％の低下を示した（図１３Ａ）。それに対して、Ｇ４  ＳＣオリゴヌクレオチドまたはトランスフェクタント剤単独の増殖阻害効果は比較的低く、それらの未処理の対照の１０％未満にすぎなかった。
【０１３０】
ＸＩＡＰ発現のダウンレギュレーションがＨ４６０細胞を化学療法に対して感作させる可能性があるかどうかを調べるために、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドと以下の抗癌剤の１つを用いる組合せ処理を行った：ドキソルビシン（ＤＯＸ）、タキソール、ビノレルビン（ＶＮＢ）およびエトポシド（Ｅｔｏｐ）。図１３Ｂは、それらの各組合せによって、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドまたは抗癌剤のいずれかを単独で用いた処理と比較して、細胞死に対して少なくとも相加的な細胞傷害性効果がもたらされたことを示している。
【実施例１０】
【０１３１】
（Ｈ４６０およびＬＣＣ６腫瘍異種移植片に対するＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドの抗腫瘍効果）
発明者らは、まず、皮下にＨ４６０ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスへのＸＩＡＰアンチセンス２×２−ＭＢＯの腫瘍内注射が、腫瘍増殖量を減少させるかどうか測定した。処置は、腫瘍細胞接種（１０６細胞の肩皮下注射）の１４日後に、ＭＢＯ（腫瘍１ｇ当たり５０μｇの２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチド）を触知可能な腫瘤に週に３回２週間、注射することにより開始した。ビノレルビン（ＶＮＢ、別名ナベルビン（ＮＶＢ）（腹腔内、１５ｍｇ／ｋｇ）を１７日目および２４日目に注射した。腫瘍サイズをノギスで週に３回測定した。処置期間終了時（２４日目）に、Ｃ５＋Ｇ４  ＡＳ  ＭＢＯとＶＮＢの組合せで処置したマウスの平均相対腫瘍増殖は、スクランブル対照ＭＢＯとＶＮＢで処置したものと比較して〜７０％縮小していた。Ｃ５  ＡＳ  ＭＢＯおよびＶＮＢで処置した結果、スクランブル対照と比較して、腫瘍サイズの〜６０％が縮小した（図１４）。
【０１３２】
最初の全身性ＰＳ−オリゴヌクレオチド研究は、化学療法薬を一切用いずに設計された。ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスにＨ４６０ヒト肺癌細胞を接種（１０６細胞の肩皮下注射）し、腫瘍接種の３日後にＧ４およびＦ３  ＡＳ  ＰＳ−オリゴヌクレオチド、ならびにスクランブル対照での処置を開始した。核酸塩基オリゴマー注射を、週に３回３週間、１２．５ｍｇ／ｋｇにて腹腔内投与した。処理期間終了時に、Ｇ４またはＦ３  ＡＳオリゴヌクレオチドのいずれかで処置した群での平均腫瘍サイズは、スクランブル対照オリゴヌクレオチドで処置した群よりも〜５０％小さかった（図１５）。同じ処置プロトコールを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＬＣＣ６ヒト乳癌細胞を同所接種した雌ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスにおいて試験した。最終処置の２週間後（３５日目）、Ｆ３、Ｃ５またはＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処置したマウスの腫瘍容積は媒体対照よりもそれぞれ、７０％、６０％および４５％小さかった（図１６）。
【０１３３】
発明者らは、皮下移植したＨ４６０ヒト非小細胞肺腫瘍の異種移植片を有するＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスにおいてＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドの抗腫瘍効果についての追加試験を実施した。生理食塩水で処理した対照腫瘍は、約２４日以内に０．７５ｃｍ３のサイズまで再現性よく増殖した（図１７）。オリゴヌクレオチド処置は、腫瘍細胞接種の３日後に開始した。Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド（５〜１５ｍｇ／ｋｇ）は、３〜７日目、１０〜１４日目および１７〜２１日目に１日１回行う腹腔内注射の処置スケジュールを使用して投与した。５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドでの処置は腫瘍増殖を大いに遅らせ、２４日目に平均腫瘍サイズは、対照、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ処置群において、それぞれ、０．７５ｃｍ３、０．４５ｃｍ３および０．２９ｃｍ３であった（図１８Ａ）。腫瘍増殖の用量依存的阻害があった。１５ｍｇ／ｋｇのＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処置したマウスの腫瘍サイズは対照群よりもかなり小さく、対照の平均腫瘍サイズの３９％を示した。それに対して、１５ｍｇ／ｋｇのＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドの投与では治療的活性が得られなかった（図１７）。オリゴヌクレオチドで処理したマウスはいずれも毒性の徴候を全く示さず、オリゴヌクレオチドの用量は双方とも良好な耐容性を示した。今後の抗癌剤との併用処置投与計画には、１５ｍｇ／ｋｇの用量を選択した。
【実施例１１】
【０１３４】
（Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処理したＨ４６０腫瘍におけるＸＩＡＰ発現の低下）
Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドの腫瘍増殖阻害効果をＸＩＡＰタンパク質発現と相関させるために、発明者らは、１５ｍｇ／ｋｇのＧ４  ＡＳおよびＳＣオリゴヌクレオチドを用いるｉｎ  ｖｉｖｏ処置の終了時に、ＸＩＡＰ発現の変化を調べた。腫瘍が１ｃｍ３の大きさに達した腫瘍接種後２１日または２４日の時点で（図１７）、腫瘍を回収し、腫瘍ホモジネートからの溶解物をウエスタンブロット解析に用いた。ヒトタンパク質に対するＸＩＡＰおよびβ−アクチン抗体を用いることにより、腫瘍細胞検体からマウス細胞由来のＸＩＡＰの混入なく得られたヒトＸＩＡＰレベルの測定が可能となった。Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドで処理した腫瘍におけるＸＩＡＰタンパク質レベルは、対照腫瘍の約８５％まで有意に低下した（Ｐ＜０．００５）（図１８Ａおよび１８Ｂ）。Ｇ４  ＳＣオリゴヌクレオチドで処理した腫瘍は、サイズが対照腫瘍の２４％縮小した。これらの結果は、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドによるＨ４６０腫瘍増殖の阻害がＸＩＡＰタンパク質発現のダウンレギュレーションと相関していることを示した。
【実施例１２】
【０１３５】
（腫瘍検体の組織病理）
ＸＩＡＰ  ＡＳオリゴヌクレオチドの投与が直接的に腫瘍細胞の死滅をもたらすのかどうかを評価するため、発明者らは、処理後の腫瘍の組織像を形態とユビキチン免疫染色の双方について調べた（図１９Ａおよび１９Ｂ）。腫瘍接種後２１日または２４日の時点で、１５ｍｇ／ｋｇのＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチド、ＳＣオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水対照で処理した腫瘍を切除し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。その結果は、所定のＸＩＡＰ  ＡＳオリゴヌクレオチド処理を施した動物の腫瘍においては、その無定形な形および凝縮した核物質により形態学的に確認される死細胞の数が増加していることを実証する（図１９Ａ）。
【０１３６】
タンパク質の分解は、大部分がユビキチン−プロテアソーム依存性分解であり、アポトーシス中にユビキチン発現の増加が観察されている。従って、発明者らは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色に用いた腫瘍切片中のユビキチン発現を調べた。図１９Ｂに示すように、ＸＩＡＰ  ＡＳオリゴヌクレオチドを投与したマウスの腫瘍は、対照またはＳＣ  ＯＤＮ処理マウスの腫瘍と比較してより強い免疫組織化学的染色を示した。これらのデータは、ＸＩＡＰ  ＡＳ核酸塩基オリゴヌクレオチドで処理した腫瘍細胞には、対照腫瘍よりも遊離したユビキチンおよび／またはユビキチン化したタンパク質が多く存在していることを示す。
【実施例１３】
【０１３７】
（Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドとビノレルビンとの併用処理）
Ｇ４  ＡＳ核酸塩基オリゴマーと、肺癌治療に用いられる化学療法薬であるビノレルビン（ＶＮＢ）との併用処理が何らかの協同的効果をもたらすかどうかを評価するため、発明者らは、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドまたはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドの存在下および不在下でのＶＮＢの治療効力を比較した。処理計画は腫瘍接種の３日後に開始した。図２０Ａは、Ｈ４６０腫瘍を有するマウスに投与し、生理食塩水対照と比較した、ＶＮＢの５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性の結果を示している。２つの投与計画それぞれが、望ましくない有意な毒性の徴候（すなわち、体重減少）を示すことなく、用量依存的に有意な腫瘍増殖抑制を誘導した。Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド（１５ｍｇ／ｋｇ）の投与にＨ４６０腫瘍処理のためＶＮＢ（５ｍｇ／ｋｇ）を組み合わせた場合、いずれかを単独投与した処理と比較して、Ｈ４６０腫瘍増殖のより一層著しい遅延が観察された（図２０Ｂ）。この場合もやはり、マウスは有意な毒性の徴候（すなわち、体重減少）を全く示さなかった。Ｇ４  ＡＳもしくはＳＣオリゴヌクレオチドの存在下または不在下で５ｍｇ／ｋｇ  ＶＮＢで処理したマウスにおける平均腫瘍サイズを２９日目に比較した（図２０Ａおよび２０Ｂ）。ＶＮＢおよびＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドの群における平均腫瘍サイズは０．２２±０．０３ｃｍ３であり、これらの値は、５ｍｇ／ｋｇ  ＶＮＢ単独でまたはＶＮＢとＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドの組合せで処理した動物における平均腫瘍サイズ（それぞれ、０．５９±０．０４ｃｍ３および０．４８±０．０５ｃｍ３）よりも有意に小さかった。
【０１３８】
（方法）
実施例５〜１３において得られた結果は、以下の方法を用いて得た。
【０１３９】
（オリゴヌクレオチド合成）
９６個を超える重複していないキメラまたは混合骨格（ＭＢＯ）の１９塩基長アンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーを、両末端の、ホスホロチオエート結合をもつ２個の隣接する２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基と１５個のホスホジエステルＤＮＡ残基からなる中心コアで構成される２×２  ＭＢＯオリゴヌクレオチドとして合成した。各最終生成物を、セファデックスＧ−２５クロマトグラフィー（ＩＤＴ社、コーラルビル、ＩＡ）により脱塩した。このキメラのウィングマー配置および、ホスホロチオエートとホスホジエステル結合の混合体（２×２  ＰＳ／ＰＯと呼ばれる）が十分な安定性をもたらし、その一方で、ホスホロチオエート残基に関連する非特異的毒性も低減した。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究用に、十分にホスホロチオエート化された非キメラの（ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドをＴｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【０１４０】
（アンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング）
１〜１．２μＭオリゴヌクレオチド−リポフェクチン複合体で２４〜４８時間トランスフェクトしたＴ２４膀胱癌細胞を評価してＸＩＡＰタンパク質をノックダウンする各オリゴヌクレオチドの能力を測定した。陽性ヒット数によって、Ｔ２４膀胱癌細胞およびＨ４６０肺癌細胞における（ｉ）ウエスタン解析によるトランスフェクション後１２〜１８時間でのＸＩＡＰタンパク質レベルをノックダウンする能力、ならびに（ｉｉ）定量ＲＴ−ＰＣＲ（下記参照）によるトランスフェクション後６〜９時間でのＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルをノックダウンする能力を再確認した。候補オリゴヌクレオチドを同定し、さらに試験した。同定された２×２  ＰＳ／ＰＯキメラオリゴヌクレオチドは、４００〜１２００ｎＭの濃度範囲において、６〜９時間でＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルを減少させる用量依存的な能力を示した。オリゴヌクレオチドの例を表６に示す。
【０１４１】
【表６】
2007509861.tif 000025
【０１４２】
（腫瘍細胞系および動物異種移植片モデル）
ヒト非小細胞肺癌細胞系（大細胞型）ＮＣＩ−Ｈ４６０（Ｈ４６０）をＡＴＣＣより入手し、１０％ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ  １６４０中で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、３７℃で維持した。最大２５代のｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代までの対数増殖期の細胞を用いた。雄ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウス（７〜９週齢、２３〜２６ｇ）を、ブリティッシュコロンビア癌研究所付属動物実験施設の繁殖コロニーから入手し、無菌環境で維持した。ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の腫瘍モデルは、マウスの背に１×１０６個のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を皮下移植することにより確立した。
【０１４３】
（アンチセンス薬および抗癌剤による細胞の処理）
トランスフェクションの１日前に、Ｈ４６０細胞を６ウェルまたは９６ウェル組織培養プレートにプレーティングした。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを、リポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジーズ）とともに、リポソーム−オリゴヌクレオチド複合体として細胞に送達した。トランスフェクションの４．５時間または６時間後、トランスフェクション培地を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地と交換し、細胞をさらに２４時間または４８時間インキュベートした。
【０１４４】
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ）
リポソーム−オリゴヌクレオチド複合体で６時間処理したＨ４６０細胞由来の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムおよびデオキシリボヌクレアーゼ処理（キアゲン、バレンシア、ＣＡ）を用いて直ちに単離した。特定のＸＩＡＰ  ｍＲＮＡは、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した。ＸＩＡＰ正方向および逆方向プライマー（６００ｎＭ）ならびにプローブ（２００ｎＭ）（５’−ＧＧＴＧＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２９３）、６ＦＡＭ−ＣＡＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＡＡＴＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２９４）および５’−ＴＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡ−３’（配列番号２９５）は、エキソン３〜４および４〜５ジャンクションに及ぶように設定された。プライマーおよびプローブの１つは、イントロン−エキソン境界に重なるように設定して、いかなる起こりうるゲノムＤＮＡ混入の検出も阻止した。ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（ＰＥ／ＡＢＩ）においてＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＰＥ／ＡＢＩ、フォスターシティ、ＣＡ）を使用してＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲ増幅した。ＲＴ段階のための熱サイクリング条件は、５０℃で２分間、６０℃で３０分間、９５℃で５分間とし、続いてＰＣＲ（１サイクルにつき、９４℃で２０秒間、６０℃で１分間）を４５サイクル行った。各サンプルのＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルを、未処理の対照細胞と比較して算出した。ＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルは、ベースラインＳＤの３０倍の閾値を用いるサイクル閾値法（Ｃｔ）により測定し、ＸＩＡＰレベルは、ＰＥ／ＡＢＩ提供プライマーおよびプローブを用いてＧＡＰＤＨ含有量に対して標準化した。
【０１４５】
（ウエスタンブロット解析）
細胞または腫瘍組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤錠、ベーリンガー・マンハイムＧｍＢＨ、マンハイム、ドイツ）を含む氷冷溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．０２％アジ化ナトリウム）で溶解した。氷上で３０分間インキュベーションした後、サンプルを１０，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、−２０℃で保存した。溶解抽出物中のタンパク質含量を界面活性剤適合性バイオ−ラッドアッセイ（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、ＣＡ）を用いて測定した。等量のタンパク質（４０μｇ／レーン）を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルまたは４〜１５％勾配ＳＤＳポリアクリルアミド事前作製ゲル（バイオ−ラッド）で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２（ＤＡＫＯ、グルストラップ、デンマーク）、Ｂａｘ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）、β−アクチン（シグマ）、カスパーゼ−３（ＢＤファーミンジェン、サンディエゴ、ＣＡ）およびＰＡＲＰ（ＢＤファーミンジェン）に対する一次抗体を使用した。二次抗体は、適当なセイヨウワサビコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（プロメガ、マディソン、ＷＩ）であった。タンパク質を、高感度化学発光法（ＥＣＬ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク、バッキンガムシャー、イギリス）により検出し、コダック・オートラジオグラフィーフィルムへの露光後、可視化した。走査式濃度測定（モレキュラー・ダイナミクス、サニーベール、ＣＡ）を実施して、量／面積の積分によりバンド強度を定量した。細胞におけるＸＩＡＰ、カスパーゼ−３、Ｂｃｌ−２およびＢａｘの量は、剥離とリプロービングを行った後、それらのそれぞれのレーンのβアクチンレベルに対して標準化した。
【０１４６】
（細胞増殖および細胞生存度または細胞死の測定）
Ｈ４６０細胞の増殖阻害を比色定量ＭＴＴ細胞生存度／増殖アッセイ法により測定した。要するに、細胞をリポソーム−オリゴヌクレオチド複合体で４．５時間処理した後、抗癌剤の存在下または不在下でトランスフェクション試薬またはオリゴヌクレオチドを含まない培地中で３７℃でさらに４８時間インキュベートした。ＭＴＴ（２５μｇ／ウェル）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション段階の後、２００μｌ  ＤＭＳＯを添加して着色したホルマザン生成物を溶解した。マイクロタイタープレートリーダー（ダイネックス・テクノロジーズ社、チャンティリー、ＶＡ）を用いて波長５７０ｎｍでプレートを読み取った。オリゴヌクレオチドで処理したウェル中の生存細胞のパーセンテージを未処理の対照に対して標準化した。全てのアッセイを３回行った。
【０１４７】
（アポトーシスのフローサイトメトリーアッセイ）
細胞をリポソーム−オリゴヌクレオチド複合体で４．５時間処理し、トランスフェクション試薬を含まない培地中で３７℃でさらに４８時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を回収し、サンプルバッファー（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＰＢＳ中０．５％グルコース）で２回洗浄し、７０％冷エタノールで４℃で少なくとも１８時間固定した。サンプルを３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、次に、５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および４００Ｕ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを含有するサンプルバッファーに再懸濁した。サンプルを室温で３０分間、および氷上で３０分間インキュベートし、その後フローサイトメトリー解析を行った。ＥＸＰＯソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、サクラメント、ＣＡ）を使用してヒストグラムを作成し、破片除去後、このヒストグラムを用いて細胞周期位相分布を決定した。サブＧ１／Ｇ０細胞画分をアポトーシスを起こした細胞を代表するものとみなした。
【０１４８】
（核形態学）
細胞をリポソーム−オリゴヌクレオチド複合体で４．５時間処理し、トランスフェクション試薬またはオリゴヌクレオチドを含まない培地中で３７℃でさらに４８時間インキュベートした。細胞を回収し、０．１０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−２−フェニルインドール）を用いて室温にて３０分間染色した。細胞をスライドガラス上に置き、サイトスピンし、ＵＶ蛍光照明下でライカ顕微鏡および４０倍対物レンズを使用して観察した。デジタル画像は、イメージデータベースＶ．４．０１ソフトウェア（ライカ、ドイツ）を使用して取り込んだ。
【０１４９】
（Ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性）
有効性試験をＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍を有する雄ＲＡＧ２免疫不全マウスまたはＬＣＣ６腫瘍を有する雌ＲＡＧ２マウスにおいて実施した。処理は腫瘍接種の３日後に開始した。生理食塩水（対照）、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド（５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ）、Ｇ４  ＳＣオリゴヌクレオチド（５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ）を、３週間の投与計画を通じて週に５用量として毎日腹腔内に投与した。ビノレルビン（ＶＮＢ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を、腫瘍接種の３日後、７日後、１１日後および１７日後に単独またはオリゴヌクレオチドと組合せて尾静脈から静脈投与した。オリゴヌクレオチドをＶＮＢと組み合わせて投与する場合、薬物処理はＯＤＮ処理の４時間後に行った。
マウスは毎日観察した。体重測定およびストレスの徴候（例えば、無気力、毛の逆立ち、運動失調）を、可能性のある毒性の検出に用いた。潰瘍化した腫瘍または１ｃｍ３以上の腫瘍容積を有する動物を殺した。デジタルノギスによる腫瘍の測定値を、式：１／２［長さ（ｃｍ）］×［幅（ｃｍ）］２を用いて平均腫瘍サイズ（ｃｍ３）へ変換した。マウス１匹当たりの平均腫瘍サイズを用いて、１つの群につき少なくとも２つの独立した試験から群平均腫瘍サイズ±ＳＥ（ｎ＝マウス６匹）を算出した。
【０１５０】
（腫瘍および組織の処理）
マウス腫瘍は、腫瘍接種および処理の２１日後または２４日後に回収した。腫瘍組織の一部をホルマリンで固定した。パラフィン包埋組織を切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いる肉眼組織病理学ならびにユビキチン発現についての免疫組織化学に付した。腫瘍の他の部分は、ウエスタンブロット解析用に溶解バッファー中で均質化した（上記参照）。
【０１５１】
（統計的解析）
スチューデントのｔ検定により２つの処理群間の統計的有意性を判定した。多重比較は、一元ＡＮＯＶＡ、およびシェレ検定基準により異なる処理群を比較する事後検定により行った（スタティスティカ・リリース４．５、スタットソフト社、タルサ、ＯＫ）。データはＰ値＜０．０５で有意性を検討した。
【実施例１４】
【０１５２】
（アンチセンスＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドによる、ＨＩＡＰ１  ＲＮＡおよびポリペプチド発現の低下）
オリゴヌクレオチドとしての１５個のＨＩＡＰ１アンチセンス核酸塩基オリゴマーのライブラリーを、ウエスタンブロット解析によりタンパク質ノックダウンについて、ならびに２つの異なる条件下で上記実施例３に記載されているプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎによりＲＮＡノックダウンについてスクリーニングした。ＨＩＡＰ１  ＲＮＡレベルは、標準的なノーザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて検出できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、基本条件下またはシクロヘキシミド誘導条件下（毒性水準下の用量で２４時間処理）で細胞に投与した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ）は、処理した細胞系に応じて、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの１０倍〜２００倍の誘導を導くことができる。これは次にはウエスタンブロットで見られるような（７０ｋＤａバンド）ＨＩＡＰ１タンパク質の増加を導く。ＣＨＸのこの効果は２つの別個の作用機構による。第一に、ＣＨＸは、既知のＨＩＡＰ１転写誘導物質であるＮＦκＢを、ＮＦκＢの阻害剤である不安定なタンパク質ＩκＢのデノボ合成を遮断することにより活性化する。類似した効果は、別のタンパク質合成阻害剤であるピューロマイシンやＴＮＦ−αによってもみられ、ＴＮＦ−αはＩκＢのリン酸化、ユビキチン化および分解を導くシグナル伝達カスケードを誘導する。アクチノマイシンＤとピューロマイシンもしくはＴＮＦ−αとの組合せとは対照的に、デノボ転写を遮断するアクチノマイシンＤとＣＨＸとの存在下でＨＩＡＰ１メッセージの消失率が低下することから分かるように、ＣＨＸのみがＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡをさらに安定化させる。
【０１５３】
ＳＦ２９５神経膠芽腫細胞を、リポフェクチンおよびオリゴヌクレオチド（スクランブルされたサバイビン、オリゴヌクレオチドなし、アンチセンスＡＰＯ１〜ＡＰＯ１５）でトランスフェクトするか、または未処理のままとした。トランスフェクションの６時間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡのレベルを定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ解析）により測定し、スクランブルサバイビンオリゴヌクレオチドトランスフェクションの値を１．０と設定して、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対して標準化した。この試験の結果は、３つの独立した試験をまとめたものとして図２１に示す。スクランブルサバイビンオリゴヌクレオチド、偽トランスフェクションおよび未処理（未トランスフェクト）細胞は全て、類似したＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡレベルを示した。１５のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち７つ（ＡＰＯ１、２、７、８、９、１２、１５）が、偽トランスフェクションまたはサバイビンスクランブル対照オリゴヌクレオチドトランスフェクション（５’−ｍＵｍＡｍＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＴＧＴＧｍＵｍＵｍＣ−３’、配列番号２９６）と比較してほぼ５０％の減少を示した（図２１）。オリゴヌクレオチドの中には、毒性を有する非特異的オリゴヌクレオチドに対するストレス応答である可能性があるＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの誘導をもたらしたものがあった。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが翻訳プロセスに干渉可能な場合に、たとえそのメッセージが増加したとしても、ＨＩＡＰ１タンパク質レベルをノックダウンするのになお有効である可能性がある。
【０１５４】
また、ＨＩＡＰ１タンパク質およびｍＲＮＡ発現に対するＨＩＡＰ１アンチセンス核酸塩基オリゴマーの効果を、ＨＩＡＰ１を発現するように誘導された細胞において調べた。ＳＦ２９５細胞を、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトするか、または偽トランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで２４時間処理して、７０ｋＤａ  ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質を誘導した。抗ＨＩＡＰ１ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によりタンパク質レベルを測定し、そのブロットをリプロービングしてアクチンタンパク質に対して標準化した。ウエスタンブロットの走査結果を図２２Ａに示す。比重走査の結果を偽の結果（１００％に設定）に対してプロットした（図２２Ｂ）。最も効力のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドを容易に識別できるように、５０％で線を引いている。ウェスタンイムノブロットで示されるように、未処理のサンプルと比較して、トランスフェクションプロセス自体（例えば、偽またはスクランブルサバイビン）がＨＩＡＰ１タンパク質を誘導している。
【０１５５】
１５個の試験核酸塩基オリゴマーのうち、６つ（ＡＰＯ１、２、７、８、１２、および１５）は、タンパク質およびｍＲＮＡアッセイの双方において高い活性を示すか、または有意な活性を有しており、ＡＰＯ４、６、１１、１３、１４に関して見られるような（図２１）、およびＡＰＯ２に対する対照オリゴヌクレオチド（ミスマッチまたは逆極性、本文下記ならびに図２３および図２４を参照）により見られるようなＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡのストレス誘導性増加を引き起こさなかった。また、ＡＰＯ６は、タンパク質総量の全般的な減少により見られるように毒性の徴候も示したことに留意されたい（図２３）。
【０１５６】
シクロヘキシミド誘導条件下でのＨＩＡＰ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力をさらに調査するため、ＨＩＡＰ１のイントロン内のＡｌｕ繰り返し配列を標的とし、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質のＣＨＸ誘導アップレギュレーションの最大の遮断をもたらすＡＰＯ２を用いるトランスフェクションの６時間後に、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの変化をＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲにより測定した。この試験の対照は、ＡＰＯ２についての３個のオリゴヌクレオチド：１個のスクランブル配列（同一塩基組成であるが、順序がランダムなもの、５’−ＡＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＡＣ−３’、配列番号２９７）、１個の逆極性（同一塩基組成、同一配列順序であるが、逆方向のもの、５’−ＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣ−３’、配列番号２９８）および１個のミスマッチ配列（１９個の塩基のうち４個の塩基ミスマッチを含む、５’−ＣＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡ−３’、配列番号２９９）であった。
【０１５７】
ＡＰＯ２アンチセンスの細胞へのトランスフェクションの結果、スクランブルサバイビン対照と比較して、ｍＲＮＡの５０％減少をもたらし、タンパク質の結果と完全に一致していたが、ＡＰＯ２に対するスクランブル対照（図２４におけるＨ１  ｓｃ  ａｐｏ２）は、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡレベルを全く変化させなかった（ここでは、２つの異なる試験において２回繰り返した）。しかし、ミスマッチ対照ＯＤＮ（Ｈ１  ｍｍ  ａｐｏ２）および逆極性対照オリゴヌクレオチド（Ｈ１  ＲＶ  ａｐｏ２）は、６時間の時点においてＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの６〜７倍の誘導を示した。これらのオリゴヌクレオチドは、予想どおり、ＨＩＡＰ１をもはや標的とはしないが、それでもなお、これらの配列の縮重および反復性により、Ａｌｕ繰り返し配列を標的にしている可能性がある。したがって、これらの２つの対照が細胞に対して毒性であって、ＨＩＡＰ１の誘導へとつながるストレス応答を引き起こすという可能性がある。この効果はアンチセンスＡＰＯ２オリゴヌクレオチドでも起こり得るが、この場合、ＡＰＯ２は、スクランブルサバイビン対照と比較して、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの相対的な減少をもたらす誘導されたＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの分解も引き起こし、さらに、スクランブルサバイビン対照オリゴヌクレオチドと比較して、トランスフェクションおよびＣＨＸ処理後のＨＩＡＰ１タンパク質の相対的な折り畳み誘導を減少させる。
【０１５８】
６つのアンチセンスＨＩＡＰ１核酸塩基オリゴマーは、イントロン配列に対し非常に効力のある２個のオリゴヌクレオチドを含む（ＡＰＯ１およびＡＰＯ２、ＡＰＯ２がより優れた活性を示す）。これらのオリゴヌクレオチドは、癌または自己免疫疾患の治療のために用いることができる。イントロン配列に対してオリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡ（極めて短寿命の標的）だけを標的とし、プロセシングを受けた成熟型ＨＩＡＰ１を標的とはしない可能性が高い。一般に、イントロンは、イントロン−エキソン境界または分枝点を標的にすることによってスプライシングを変えたい場合を除き、アンチセンスの標的とはならない。これらは、通常、メッセージのリボヌクレアーゼによる分解よりむしろ、エキソンスキッピングをもたらす。スキッピングによって、ＨＩＡＰ１の最初の２つの重要なＢＩＲドメインをコードするエキソンの損失が生じるため、両機構ともにアポトーシスの促進には有利であろう。また、ＡＰＯ２アンチセンスＯＤＮは、１９個のうちの連続した１８個の塩基であるサバイビンのイントロンも標的とするが、発明者らは、サバイビンタンパク質のいかなる損失も見ることはなかった。ＨＩＡＰ１だけがオリゴ処理後に減少し、これによりＨＩＡＰ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性が実証された。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＩＡＰ１イントロンにおいて、また可能性のある多くの他の遺伝子においてＡｌｕ配列をヒットし、癌細胞が死滅するように誘導する（下記参照）が、これはＨＩＡＰ１およびいくつかの他の重要な遺伝子をダウンレギュレートすることの結果である可能性があり、従ってそれがもし正常細胞に対してあまり毒性がない場合には治療価値がある可能性がある。
【０１５９】
癌細胞は、報告によれば、より多くのＡｌｕ含有転写物を有しており、したがって、Ａｌｕを標的とする核酸塩基オリゴマーでのアポトーシス誘導に対して感受性がより高い可能性がある。さらに、核酸塩基オリゴマーＡＰＯ１およびＡＰＯ２のこの死滅効果は、Ａｌｕ配列とＨＩＡＰ１の双方を同時に標的とする複合効果による可能性がある。この二重効果は、細胞が特定の毒物に曝された場合に、ＨＩＡＰ１誘導の正常なストレス応答をＮＦκＢ経路を通じて阻止するための効果的な方法をもたらすものと思われる。このストレス応答は、癌細胞の抗アポトーシスプログラムの一部である可能性が高い。ＨＩＡＰ１発現を遮断することにより、発明者らはこの抗アポトーシス性ストレス応答を抑え、癌細胞の死滅を促進する。
【実施例１５】
【０１６０】
（ＨＩＡＰ１アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞傷害性および化学的感受性の増強）
ＨＩＡＰ１アンチセンス核酸塩基オリゴマーのＳＦ２９５細胞の化学的感作への効果も評価した。細胞を異なる３個のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＰＯ７、ＡＰＯ１５およびＳＣ  ＡＰＯ２（対照））の１個でトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの２４時間後、細胞をアドリアマイシンとともにさらに２４時間インキュベートし、その後、ＷＳＴ−１を測定することによって細胞生存について評価した。
【０１６１】
上記のＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした後、漸増濃度のアドリアマイシンで処理したＳＦ２９５細胞についてのＷＳＴ−１生存曲線を図２５に示す。ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡの減少をもたらした２個のオリゴヌクレオチドは、アドリアマイシンで処理した場合に、ＨＩＡＰ１  ｍＲＮＡレベルを低下させないオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較して、生存の減少も示した。従って、アンチセンスまたは他の手段によってＨＩＡＰ１レベルを低下させることにより、多くの化学療法薬の細胞傷害性作用に対して耐性の高い神経膠芽腫細胞系を化学的に感作することができる。
【０１６２】
本発明の方法に用いることのできるさらなる８９のＨＩＡＰ１アンチセンス配列を表７に示す。ヒトＨＩＡＰ１とヒトＨＩＡＰ２との間で１００％同一である配列または１つもしくは２つのミスマッチを有する配列を太字にしている。
【０１６３】
【表７ａ】
2007509861.tif 000026
【表７ｂ】
2007509861.tif 000027
【０１６４】
発明者らはまた、アンチセンス核酸塩基オリゴマーとしての使用に適した配列のためのヒトＨＩＡＰ２を解析した。同定された配列を表８に示す。
【０１６５】
【表８ａ】
2007509861.tif 000028
【表８ｂ】
2007509861.tif 000029
【０１６６】
他のアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマー（米国特許第６，０８７，１７３号の表２に記載されているものを含む）も以下の表９に示す。
【０１６７】
【表９】
2007509861.tif 000030
【０１６８】
本発明の方法において有用なアンチセンスＩＡＰ核酸塩基オリゴマーのためのその他の配列は、例えば、米国特許第６，３５５，１９４号、同６，１６５，７８８号、同６，０７７，７０９号、同５，９５８，７７２号、同５，９５８，７７１号、米国特許出願公開番号２００３／０１２５２８７  Ａ１および同２００２／０１３７７０８、Ｃａｒｔｅｒら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＸＩＡＰ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ”  （Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  １１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００３、  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓｊ．ｌｅｕ．２４０３１１３）、ならびにＢｉｌｉｍら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １０３：  ２９−３７  （２００３）に記載されている。
【０１６９】
（他の実施形態）
本明細書に記載されている全ての刊行物および特許出願は、各独立した刊行物または特許出願が引用により本明細書の一部とされることが具体的にかつ個別に示されるのと同一程度に、引用により本明細書の一部とされる。
本発明はその特定の実施形態に関して記載されているが、当然のことながら、本発明はさらなる改変が可能であって、本願は、概して本発明の原理に従い、かつ本発明の属する技術分野内の公知のまたは慣習的な実施内に入り、上に記載された本質的な特徴に適用され得る本開示からのかかる逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用または適応も網羅することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＸＩＡＰタンパク質発現に対するアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの効果を総タンパク質量に関して示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、上のＸＩＡＰタンパク質結果を標準化するために用いた偽のトランスフェクション結果と比較した、各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度の値である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＸＩＡＰタンパク質発現に対するアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの効果を総タンパク質量に関して示すグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、上のＸＩＡＰタンパク質結果を標準化するために用いた偽のトランスフェクション結果と比較した、各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度の値である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＸＩＡＰタンパク質発現に対するアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの効果を総タンパク質量に関して示すグラフである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、上のＸＩＡＰタンパク質結果を標準化するために用いた偽のトランスフェクション結果と比較した、各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度の値である。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＸＩＡＰタンパク質発現に対するアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの効果を総タンパク質量に関して示すグラフである。
【図１Ｈ】図１Ｈは、上のＸＩＡＰタンパク質結果を標準化するために用いた偽のトランスフェクション結果と比較した、各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度の値である。
【図１Ｉ】図１Ｉは、ＸＩＡＰタンパク質発現に対するアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの効果を総タンパク質量に関して示すグラフである。
【図１Ｊ】図１Ｊは、上のＸＩＡＰタンパク質結果を標準化するために用いた偽のトランスフェクション結果と比較した、各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度の値である。
【図１Ｋ】図１Ｋは、ＸＩＡＰタンパク質発現に対するアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの効果を総タンパク質量に関して示すグラフである。
【図１Ｌ】図１Ｌは、上のＸＩＡＰタンパク質結果を標準化するために用いた偽のトランスフェクション結果と比較した、各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度の値である。
【図２Ａ】図２Ａは、種々のアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの単独または組合せでの、ＸＩＡＰ  ＲＮＡに対する効果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々のアンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの単独または組合せでの、ＸＩＡＰ  タンパク質に対する効果を示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは偽のトランスフェクション結果と比較した各オリゴヌクレオチドトランスフェクションの総タンパク質濃度値を示すグラフであり、偽トランスフェクション結果を用いて図２Ｂに示したＸＩＡＰタンパク質の結果を標準化した。
【図３】３１ｎＭ量での、４×４混合骨格（ＭＢＯ）ＦＧ８またはＥ１２オリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。Ｈ４６０肺癌細胞を、１２５ｎＭ  ＭＢＯおよびリポフェクタミン２０００を用いて１、２、または３日の連続した日に１８時間トランスフェクトした。ウエスタン解析のためのサンプルを示された時間に回収した。走査による濃度測定を実施し、ＸＩＡＰタンパク質レベルをＧＡＰＤＨに対して標準化し、１００％に設定した偽対照と比較した。示したパーセンテージは、特定のスクランブル対照に対するＸＩＡＰタンパク質のノックダウン％を表す。
【図４】６３ｎＭ量での、４×４混合骨格（ＭＢＯ）ＦＧ８またはＥ１２オリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。Ｈ４６０肺癌細胞を、１２５ｎＭ  ＭＢＯおよびリポフェクタミン２０００を用いて１、２、または３日の連続した日に１８時間トランスフェクトした。ウエスタン解析のためのサンプルを示された時間に回収した。走査による濃度測定を実施し、ＸＩＡＰタンパク質レベルをＧＡＰＤＨに対して標準化し、１００％に設定した偽対照と比較した。示したパーセンテージは、特定のスクランブル対照に対するＸＩＡＰタンパク質のノックダウン％を表す。
【図５Ａ】図５Ａは、アンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの細胞生存度に対する効果を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、アドリアマイシンの存在下での化学的感作に対する効果を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、アンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの細胞生存度に対する効果を示すグラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、アンチセンスＸＩＡＰオリゴヌクレオチドの細胞生存度に対する効果を示すグラフである。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏＨ４６０細胞における、オリゴヌクレオチドによるＸＩＡＰ  ｍＲＮＡの特異的ダウンレギュレーションを示すグラフである。リポフェクタミン２０００単独で（ＬＦＡ）、あるいは１．２μＭのオリゴヌクレオチドＦ３、Ｇ４、Ｃ５、ＡＢ６、ＤＥ４もしくはＤ７、またはそれぞれの逆極性（ＲＰ）またはスクランブル（ＳＣ）オリゴヌクレオチド対照と共にリポフェクタミン２０００で処理したＨ４６０細胞におけるＸＩＡＰ  ｍＲＮＡレベルを示す。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＸＩＡＰ  ｍＲＮＡの相対量の定量化をトランスフェクション後６時間で実施した。データは全て代表的な実験を３回行った結果の平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。同一実験条件下で維持された未処理細胞（対照）中のＸＩＡＰ  ｍＲＮＡのレベルに１の値を割り当てた。
【図７】種々のＰＳ−ＸＩＡＰオリゴヌクレオチドでのトランスフェクション後のＨ４６０細胞におけるＸＩＡＰ  ＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｈ４６０ヒト肺癌細胞を、１μＭ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドおよびリポフェクタミン２０００を用いて６時間トランスフェクトした。その後、Ｔａｑｍａｎ解析用に細胞を回収した。
【図８】４×４  ＭＢＯでのトランスフェクション後９時間のＨ４６０細胞におけるＸＩＡＰ  ＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｈ４６０細胞を、６２．５ｎＭ〜１μＭの４×４  ＭＢＯおよびリポフェクタミン２０００を用いて９時間トランスフェクトした。その後、Ｔａｑｍａｎ解析用に細胞を回収した。
【図９】４×４  ＭＢＯでのトランスフェクション後２４時間のＨ４６０細胞におけるＸＩＡＰタンパク質ノックダウンを示すグラフである。Ｈ４６０細胞を、１μＭ  ４×４  ＭＢＯを１μＭでおよびリポフェクタミン２０００を用いて２４時間トランスフェクトした。その後、ウエスタンブロット解析用に細胞を回収した。走査による濃度測定を実施し、ＸＩＡＰタンパク質レベルをアクチンに対して標準化し、１００％に設定したそれらの特定のスクランブル（ｓｍ、ｒｍ）対照と比較した。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨ４６０細胞中におけるＸＩＡＰタンパク質のアンチセンスによる特異的ダウンレギュレーションを示す略図である。リポフェクタミン２０００単独で（ＬＦＡ）、あるいはＬＦＡに１．２μＭのＸＩＡＰオリゴヌクレオチドＦ３、Ｇ４、もしくはＣ５、またはそれらの個々のオリゴヌクレオチド対照（ＲＰ、ＳＣ）を加えて処理したＨ４６０細胞におけるＸＩＡＰタンパク質レベルを示す。ＸＩＡＰタンパク質レベルをウエスタンブロット法により解析し（図１０Ａ）、タンパク質の量を濃度測定により定量化した（図１０Ｂ）。ＸＩＡＰレベルを細胞のアクチンレベルに対して標準化し、未処理対照（ＣＮＴ）レベルと比較した。
【図１１】ＸＩＡＰオリゴヌクレオチドによるカスパーゼ活性化に対する効果を示す略図である。ＸＩＡＰ  オリゴヌクレオチドＦ３、Ｇ４、もしくはＣ５、またはそれらの個別のＲＰおよびＳＣ  ＯＤＮ対照１．２μＭでの、トランスフェクトされたＨ４６０細胞における、対照と比較した、プロカスパーゼ−３、ＰＡＲＰ（完全長（１１６ｋＤａ）とプロセシングされたもの（８５ｋＤａ）との双方）の発現（図１０Ａ）ならびにＢｃｌ−２およびＢａｘタンパク質レベル（図１０Ｂ）に対する効果を示す。タンパク質発現をウエスタンブロット法により解析した。Ｂｃｌ−２およびＢａｘタンパク質レベルは、細胞のアクチンレベルに対して標準化し、濃度測定により定量した。Ｂｃｌ−２／Ｂａｘの比を２つまたは３つの独立した実験の平均値として示し、対照（ＣＮＴ）細胞における比を１と設定する。
【図１２】アポトーシスのＸＩＡＰオリゴヌクレオチド特異的誘導を示す略図である。アポトーシスの誘導を、１．２μＭのＸＩＡＰ  Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド、Ｇ４  ＳＣオリゴヌクレオチドまたは未処理対照（ＣＮＴ）で処理したＨ４６０細胞において測定した。図１２Ａは、ヨード化プロビジウム（ＰＩ）染色およびフローサイトメトリーにより測定された、サブＧ０／Ｇ１（アポトーシス）ＤＮＡ含量を有する細胞のパーセンテージを示す。図１２Ｂは、ＤＡＰＩ染色したオリゴヌクレオチド処理Ｈ４６０細胞の核の形態を示す。矢印は、核ＤＮＡの凝縮または断片化というアポトーシスに特徴的な形態をもつ細胞を示す。
【図１３Ａ】ＸＩＡＰ  Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド処理のＨ４６０細胞の生存度に対する効果を示すグラフである。細胞を漸増濃度のＬＦＡ単独、またはＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドを含むＬＦＡ-オリゴヌクレオチド複合体で処理し、処理の２４時間後にＭＴＴアッセイにより細胞生存度を測定した。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。図１３Ｂは、ＭＴＴアッセイにより測定される、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、タキソール、ビノレルビン（ＶＮＢ）またはエトポシド（Ｅｔｏｐ）の存在下または不在下で、ＬＦＡ、およびＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドを含む複合体を用いて用量０．４μＭで処理した後のＨ４６０死細胞のパーセンテージを示すグラフである。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図１３Ｂ】ＸＩＡＰ  Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド処理のＨ４６０細胞の生存度に対する効果を示すグラフである。細胞を漸増濃度のＬＦＡ単独、またはＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドを含むＬＦＡ-オリゴヌクレオチド複合体で処理し、処理の２４時間後にＭＴＴアッセイにより細胞生存度を測定した。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。図１３Ｂは、ＭＴＴアッセイにより測定される、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、タキソール、ビノレルビン（ＶＮＢ）またはエトポシド（Ｅｔｏｐ）の存在下または不在下で、ＬＦＡ、およびＧ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドを含む複合体を用いて用量０．４μＭで処理した後のＨ４６０死細胞のパーセンテージを示すグラフである。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図１４】ＸＩＡＰ  ＡＳ  ２×２ＭＢＯおよびビノレルビンで処理したマウスにおける、相対Ｈ４６０腫瘍増殖を示すグラフである。オリゴヌクレオチドの腫瘍内注射を５０μｇ／腫瘍塊ｇで皮下Ｈ４６０細胞異種移植片を有するＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスに実施した。この処置はビノレルビンの投与と組み合わされた。
【図１５】ＸＩＡＰ  ＡＳ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドで全身に処理したマウスにおけるＨ４６０細胞の腫瘍サイズの平均を示すグラフである。皮下Ｈ４６０細胞異種移植片を移植したＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスへのＸＩＡＰ  ＡＳ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドの全身送達（腹腔内）は、対照と比較して腫瘍のサイズを縮小させた。
【図１６】ＸＩＡＰ  ＡＳ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドで全身に処置したマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＬＣＣ６ヒト乳癌細胞（ＬＣＣ細胞）の腫瘍サイズを示すグラフである。ＬＣＣ６細胞異種移植片を乳房脂肪パッドに移植した雌ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスに対するＸＩＡＰ  ＡＳ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドの全身送達（腹腔内）は、対照と比較して腫瘍のサイズを縮小させた。
【図１７】腫瘍増殖および腫瘍ＸＩＡＰタンパク質レベルに対するＧ４  オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を示す略図である。雄ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスにおける皮下Ｈ４６０細胞異種移植片の増殖に対する、全身に送達された裸のＸＩＡＰ  Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドの抗腫瘍効力。データは全て平均±ＳＥＭ（ｎ＝６マウス／群）として表されている。
【図１８】ウエスタンブロット法により解析し、濃度測定により定量した、Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチド、Ｇ４  ＳＣオリゴヌクレオチド、または媒体単独（対照）で２１日間処理した後の、ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスに移植したＨ４６０細胞異種移植片における、ＸＩＡＰタンパク質発現レベルを示す略図である。ＸＩＡＰレベルは、細胞のアクチンレベルに対して標準化した。データは全て平均ＳＤとして表されている（ｎ＝３）。
【図１９】２１日間にわたるＸＩＡＰ  Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドの１５ｍｇ／ｋｇの全身投与後の、ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスに移植されたＨ４６０腫瘍の組織病理に対するＧ４オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を示す顕微鏡写真である。図１９Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した腫瘍切片を示す。図１９Ｂは腫瘍切片におけるユビキチン発現の免疫組織化学を示す。代表的な腫瘍顕微鏡写真を示す。内部スケールマーカーは、１００μｍに等しい。
【図２０】ＸＩＡＰ  オリゴヌクレオチドと組み合わせたビノレルビン（ＶＮＢ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの効力の増加を示すグラフである。ＸＩＡＰ  Ｇ４  ＡＳオリゴヌクレオチドもしくはＧ４  ＳＣオリゴヌクレオチドを伴うまたは伴わないＶＮＢのＨ４６０腫瘍異種移植片に対する抗腫瘍効力を、ＳＣＩＤ−ＲＡＧ２マウスにおいて測定した。図２０Ａは、単一の薬剤による抗腫瘍活性を示し、一方、図２０Ｂは、ＶＮＢとＧ４オリゴヌクレオチドを組み合わせた抗腫瘍活性を示す。データは全て平均±ＳＥＭ（ｎ＝６マウス／群）として表されている。
【図２１】ＨＩＡＰ１  ＲＮＡレベルに対するＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。
【図２２】ＨＩＡＰ１タンパク質のシクロヘキシミド誘導性アップレギュレーションを遮断する細胞の能力に対する、ＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドの効果を示すウエスタンブロットの濃度測定走査を示す略図である。
【図２３】総タンパク質量により測定される、細胞傷害性に対するＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。
【図２４】ＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドＡＰＯ２に対する配列特異性の妥当性を示すグラフである。
【図２５】薬剤耐性のあるＳＦ２９５神経膠芽腫の化学的感作に対するＨＩＡＰ１オリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。
【図１Ａ】
2007509861.tif 000031
【図１Ｂ】
2007509861.tif 000032
【図１Ｃ】
2007509861.tif 000033
【図１Ｄ】
2007509861.tif 000034
【図１Ｅ】
2007509861.tif 000035
【図１Ｆ】
2007509861.tif 000036
【図１Ｇ】
2007509861.tif 000037
【図１Ｈ】
2007509861.tif 000038
【図１Ｉ】
2007509861.tif 000039
【図１Ｊ】
2007509861.tif 000040
【図１Ｋ】
2007509861.tif 000041
【図１Ｌ】
2007509861.tif 000042
【図２Ａ】
2007509861.tif 000043
【図２Ｂ】
2007509861.tif 000044
【図２Ｃ】
2007509861.tif 000045
【図３】
2007509861.tif 000046
【図４】
2007509861.tif 000047
【図５Ａ】
2007509861.tif 000048
【図５Ｂ】
2007509861.tif 000049
【図５Ｃ】
2007509861.tif 000050
【図５Ｄ】
2007509861.tif 000051
【図６】
2007509861.tif 000052
【図７】
2007509861.tif 000053
【図８】
2007509861.tif 000054
【図９】
2007509861.tif 000055
【図１０】
2007509861.tif 000056
【図１１】
2007509861.tif 000057
【図１２】
2007509861.tif 000058
【図１３Ａ】
2007509861.tif 000059
【図１３Ｂ】
2007509861.tif 000060
【図１４】
2007509861.tif 000061
【図１５】
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【図１６】
2007509861.tif 000063
【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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