(57)【要約】  ジカルボン酸との位置特異的ラパマイシン４２−ヘミエステルおよびジカルボン酸との位置特異的ＦＫ５０６  ３２−エステルの合成方法を記載する。本方法は、ラパマイシンまたはＦＫ−５０６と無水ジカルボン酸またはジカルボン酸の二官能性活性化エステルとの反応をリパーゼで触媒することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラパマイシンまたはＦＫ−５０６と無水ジカルボン酸をリパーゼの存在下で反応させる段階を含む、ジカルボン酸とのラパマイシン４２−ヘミエステルまたはジカルボン酸とのＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルの位置特異的合成方法。
【請求項２】
ラパマイシンと無水ジカルボン酸をリパーゼの存在下で反応させる段階を含む、ジカルボン酸とのラパマイシン４２−ヘミエステルの位置特異的合成のための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＫ−５０６と無水ジカルボン酸をリパーゼの存在下で反応させる段階を含む、ジカルボン酸とのＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルの位置特異的合成のための、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記無水ジカルボン酸が、構造：
【化１】
2007532655.tif 000017
（式中、Ｌは、１から６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖を伴う連結基である）
を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記無水ジカルボン酸が、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水３−メチルグルタル酸およびこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リパーゼが、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehei）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、リゾープス・デレマ（Rhizopus delemar）およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）から成る群より選択される微生物からのリパーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
使用されるリパーゼが、カンジダ・アンタルクチカからの固定化リパーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応が、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、１，４−ジオキサン、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3、エチルエーテル、ヘキサンおよびこれらの混合物から成る群より選択される溶媒中で行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記反応が、２０℃から７５℃の範囲内で行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応が、３５℃から６０℃の範囲内で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リパーゼが、ＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５リパーゼであり、前記溶媒が、トルエン−アセトニトリルの５：１  ｖ／ｖの比率での混合物であり、および前記反応が、約４５℃の温度で行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）ラパマイシンまたはＦＫ−５０６とジカルボン酸の二官能性活性化エステルとをリパーゼの存在下で反応させて、エステル中間体を形成する段階、および
（ｂ）そのエステル中間体をリパーゼで加水分解する段階
を含む、ジカルボン酸とのラパマイシン４２−ヘミエステルまたはジカルボン酸とのＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルの位置特異的合成方法。
【請求項１３】
（ａ）ラパマイシンとジカルボン酸の二官能性活性化エステルとをリパーゼの存在下で反応させて、エステル中間体を形成する段階、および
（ｂ）そのエステル中間体をリパーゼで加水分解する段階
を含む、ジカルボン酸とのラパマイシン４２−ヘミエステルの位置特異的合成方法。
【請求項１４】
（ａ）ＦＫ−５０６とジカルボン酸の二官能性活性化エステルとをリパーゼの存在下で反応させて、エステル中間体を形成する段階、および
（ｂ）そのエステル中間体をリパーゼで加水分解する段階
を含む、ジカルボン酸とのＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルの位置特異的合成方法。
【請求項１５】
前記ジカルボン酸の二官能性エステルが、構造：
【化２】
2007532655.tif 000018
（式中、Ｒは、ビニル、イソプロペニル、またはＮ−スクシンイミジルであり、ならびにＬは、１から６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖を伴う連結基である）
を有する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｌが、１個またはそれ以上の酸素原子をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ａ）において使用されるリパーゼが、カンジダ・アンタルクチカ、カンジダ・ルゴサ、ムコール・ミーヘイ、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・フルオレッセンス、リゾープス・デレマおよびアスペルギルス・ニガーから成る群より選択される微生物からのリパーゼである、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ａ）において使用されるリパーゼが、カンジダ・アンタルクチカからのＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５、またはシュードモナス・セパシアからのリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ａ）における反応が、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＭｅＣＮ、１，４−ジオキサン、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3、エチルエーテル、ヘキサンおよびこれらの混合物から成る群より選択される溶媒中で行われる、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
モレキュラーシーブを反応に加えることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ａ）の反応が、２０℃から７５℃の範囲内で行われる、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）において使用されるリパーゼが、ＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５またはリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩであり、溶媒が、ＴＢMＥであり、および反応が、約４５℃の温度で行われる、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
段階（ｂ）において使用されるリパーゼが、カンジダ・アンタルクチカ、カンジダ・ルゴサ、ムコール・ミーヘイ、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・フルオレッセンス、リゾープス・デレマおよびアスペルギルス・ニガーから成る群より選択される微生物からのリパーゼである、請求項１２から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
段階（ｂ）において使用されるリパーゼが、カンジダ・アンタルクチカからのまたはシュードモナス・セパシアからのものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｂ）の加水分解が、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＭｅＣＮ、１，４−ジオキサン、ｔ−アミルアルコール、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3、エチルエーテル、ヘキサンおよびこれらの混合物から成る群より選択される溶媒中で行われ、前記溶媒または溶媒混合物が、約０．５から１０％ 水を含有する、請求項１２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
段階（ｂ）の加水分解が、室温から５０℃の範囲内で行われる、請求項１２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
段階（ｂ）において使用されるリパーゼが、ＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５またはリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩであり、溶媒が、２％ 水を含有するアセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり、および反応が、室温で行われる、請求項１２から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、２、４から１３および１５から２７のいずれか一項に記載の方法に従って製造された位置特異的ラパマイシン４２−ヘミエステル。
【請求項２９】
請求項２８に記載の位置特異的ラパマイシン４２−ヘミエステルを使用して製造されたラパマイシン抗体。
【請求項３０】
請求項２８に記載の位置特異的ラパマイシン４２−ヘミエステルを使用して製造されたラパマイシンコンジュゲート。
【請求項３１】
請求項２９に記載のラパマイシン抗体または請求項３０に記載のラパマイシンコンジュゲートを含む製品。
【請求項３２】
請求項３から１２および１４から２７のいずれか一項に記載の方法に従って製造された位置特異的ＦＫ５０６  ３２−ヘミエステル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）によって生産される大環状トリエン抗生物質であり、インビトロでも、インビボでも、抗真菌活性、特にカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する抗真菌活性を有することが判明した。ラパマイシンは、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ）として市販されている。ラパマイシンは、抗腫瘍組成物において免疫抑制剤として有用であり、関節リウマチの治療に有用であり、全身性エリテマトーデス［米国特許第５，０７８，９９９号］、肺の炎症［米国特許第５，０８０，８９９号］、インスリン依存性糖尿病［Fifth Int. Conf. Inflamm. Res. Assoc. 121 (Abstract), (1990)］、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫［欧州特許出願第５２５，９６０号Ａ１］ならびに血管損傷後の平滑筋細胞の増殖および内膜肥厚［R. Morris, J. Heart Lung Transplant 11 (pt. 2) : 197 (1992)］の予防または治療に有用であることも証明されている。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシンおよびその調製は、１９７５年１２月３０日発行の米国特許第３，９２９，９９２号に記載されている。３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９）は、インビトロ法においても、インビボ法においても、腫瘍成長に対して有意な阻害効果を実証したラパマイシンのエステルである。ＣＣＩ−７７９をはじめとするラパマイシンのヒドロキシエステルの調製および使用は、米国特許第５，３６２，７１８号および同第６，２７７，９８３号、ならびに米国特許公開第２００５−００３３０４６号Ａ１（米国特許出願番号１０／９０３，０６２）に開示されている。
【０００３】
４２−ＯＨ位置でのラパマイシンの誘導体は合成されており、数ある中でも移植拒絶反応、自己免疫疾患、固形腫瘍、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、高増殖性血管疾患の治療において、免疫抑制の誘導に有用であることが判明した。幾つかの誘導体は、以下の一般式（Ｉ）のラパマイシンコンジュゲートを合成するための前駆体として役立ち、それらのコンジュゲートは、ラパマイシンに特異的な抗体を作製するための免疫原性分子として有用であり、ならびにイムノアッセイのためのラパマイシン結合タンパク質の単離に、およびラパマイシンまたはその誘導体に特異的な抗体の検出に有用である。
【化３】
2007532655.tif 000002
【０００４】
式Ｉ中の担体は、免疫原性担体材料またはデテクター担体材料、例えばタンパク質またはポリペプチドであり、Ｌは、ラパマイシンを担体に取り付けることができるリンカーである。［米国特許公開第２００４−００１０９２０号］。
【０００５】
コンジュゲートの調製のために連結基として使用することができる、多数のラパマイシンの４２−誘導体が記載されている。例えば、ラパマイシンのフッ素化エステルの調製は、米国特許第５，１００，８８３号に記載されており、アミドエステルの調製は、米国特許第５，１１８，６６７号に記載されており、アミノエステルの調製は、米国特許第５，１３０，３０７号に記載されており、ラパマイシンのカルバメートの調製は、米国特許第５，１１８，６７８号に記載されており、スルホネートおよびスルファメートの調製は、米国特許第５，１７７，２０３号に記載されており、ラパマイシンの４２位でのコハク酸および他のジカルボン酸（アジピン酸、グルタル酸、ジグリコール酸など）とのエステルの調製は、米国特許公開第２００１−００１０９２０号Ａ１、米国特許第５，３７８，６９６号、ならびに国際特許公開パンフレット第９８／４５３３３号、同第９４／２５０７２号、同第９４／２５０２２号および同第９２／０５１７９号に記載されている。１つの実施形態において、４２位でのジカルボン酸とのエステル、例えば４２−ヘミスクシネート、４２−ヘミグルタレートおよび４２−ヘミアジペート（式ＩＩ）が、式Ｉのラパマイシンコンジュゲートの合成に使用される。
【化４】
2007532655.tif 000003
【０００６】
弱塩基の存在下、対応する無水物での４２−ＯＨの直接エステル化によって行われるような式（ＩＩ）の化合物の合成が記載されている。塩基条件に対するラパマイシンの感度に加えてその低い位置選択性により、所望の４２−ヘミエステルは、ＨＰＬＣ精製後、低い収率（典型的には２０％未満）で生成され、この粗生成物は、３１，４２−ジエステル、３１−エステルおよび他の副生成物が混入している。
【化５】
2007532655.tif 000004
【０００７】
このプロセスの収率を改善するための取り組みにおいて、ラパマイシンの４２−ヘミスクシネートの対応するベンジルおよびメチルエステルが、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）からのリパーゼを使用して加水分解される、二段階リパーゼ触媒加水分解法が用いられた［M. Adamczykら, Tetrahedron Letters, 35(7) : 1019 - 1022 (1994)］。僅かに改善された収率が得られた（ベンジルエステルから２９％およびメチルエステルから５０％）。しかし、従来どおりの化学によるラパマイシン４２−ヘミコハク酸ベンジルおよびメチルエステルの合成は、低い位置選択性、低い収率および時間のかかる精製段階という欠点を有する。
【化６】
2007532655.tif 000005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、改善された収率でのヘミエステルの効率的合成が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、加水分解酵素であるリパーゼの存在下でラパマイシンから式（ＩＩ）のラパマイシン４２−ヘミエステルを合成するためのプロセスを記載する。もう１つの態様において、本発明のプロセスは、リパーゼの存在下でのＦＫ−５０６からのＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルの位置特異的製造を提供する。本発明の方法は、優れた収率でこれらの化合物を合成するための位置選択的方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、本発明に従って製造された中間化合物を抗体およびコンジュゲートの作製に使用する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法により、ラパマイシンコンジュゲートを調製するための前駆体である、ラパマイシン４２−ヘミエステル（ＩＩ）またはＦＫ−５０６ヘミエステルが製造される。
【００１２】
本明細書で用いる場合、「ラパマイシン」は、基本ラパマイシン核（以下に示す）を含有する免疫抑制化合物の一類と定義する。
【化７】
2007532655.tif 000006
本発明に記載のラパマイシンは、ラパマイシン核の誘導体として化学的または生物学的に変性されていることもあるが、免疫抑制特性を未だ保持している化合物を包含する。従って、用語「ラパマイシン」は、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミン、ならびに核上の官能基が、例えば還元もしくは酸化によって変性されているラパマイシン、ラパマイシンの代謝産物、または開環型ラパマイシン（米国特許第５，２５２，５７９号に記載されているｓｅｃｏ−ラパマイシンなど）を包含する。用語「ラパマイシン」は、ラパマイシンの薬学的に許容される塩も包含し、酸性部分または塩基性部分のいずれかを含有することにより、そうした塩を形成することができる。
【００１３】
しかし、こうした化合物は、本発明の位置特異的４２−ヘミエステルの製造を可能ならしめるために、４２位にヒドロキシル基を保持する。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明において有用なラパマイシンのエステルおよびエーテルは、ラパマイシン核の３１位におけるヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、（２７−ケトンの化学的還元後の）２７位におけるヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、ならびにオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンがラパマイシン核のケトンのものであるエステルおよびエーテルである。
【００１５】
他の実施形態において、本発明において有用なラパマイシンの３１−エステルおよびエーテルは、以下の特許に記載されている：アルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号）；アミノアルキルエステル（米国特許第４，６５０，８０３号）；フッ素化エステル（米国特許第５，１００，８８３号）；アミドエステル（米国特許第５，１１８，６６７号）；カルバミン酸エステル（米国特許第５，１１８，６７８号）；シリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号）；アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号）；アセタール（米国特許第５，５１，４１３号）；アミノジエステル（米国特許第５，１６２，３３３号）；スルホネートおよびスルフェートエステル（米国特許第５，１７７，２０３号）；エステル（米国特許第５，２２１，６７０号）；アルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号）；Ｏ−アリール、−アルキル、−アルケニルおよび−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号）；炭酸エステル（米国特許第５，２６０，３００号）；アリールカルボニルおよびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号）；カルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号）；ヒドロキシエステル（米国特許第５，３６２，７１８号）；ヒンダードエステル（米国特許第５，３８５，９０８号）；複素環式エステル（米国特許第５，３８５，９０９号）；ｇｅｍ−二置換エステル（米国特許第５，３８５，９１０号）；アミノアルカン酸エステル（米国特許第５，３８９，６３９号）；ホスホリルカルバミン酸エステル（米国特許第５，３９１，７３０号）；カルバミン酸エステル（米国特許第５，４１１，９６７号）；カルバミン酸エステル（米国特許第５，４３４，２６０号）；アミジノカルバミン酸エステル（米国特許第５，４６３，０４８号）；カルバミン酸エステル（米国特許第５，４８０，９９８号）；カルバミン酸エステル（米国特許第５，４８０，９８９号）；カルバミン酸エステル（米国特許第５，４８９，６８０号）；ヒンダードＮ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号）；ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号）；Ｏ−アルキルエーテル（米国特許第５，６６５，７７２号）；およびラパマイシンのＰＥＧエステル（米国特許第５，７８０，４６２号）。これらのエステルおよびエーテルの調製は、上に挙げた特許に記載されている。
【００１６】
さらに他の実施形態において、本発明において有用なラパマイシンの２７−エステルおよびエーテルは、米国特許第５，２５６，７９０号に開示されている。これらのエステルおよびエーテルの調製は、上に挙げた特許に記載されている。
【００１７】
他の実施形態において、本発明において有用なラパマイシンのオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンは、米国特許第５，３７３，０１４号、同第５，３７８，８３６号、同第５，０２３，２６４号および同第５，５６３，１４５号に開示されている。これらのオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンの調製は、上に挙げた特許に開示されている。
【００１８】
追加の実施形態において、本発明において有用なラパマイシンとしては、ラパマイシン［米国特許第３，９２９，９９２号］、プロリン−ラパマイシン、７−デスメチルラパマイシン、３２−デスメチルラパマイシン、３２−デスメトキシラパマイシンおよび上に記載したようなそれらの誘導体が挙げられる。
【００１９】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、以下に図示する構造を有するＦＫ−５０６化合物からのＦＫ−５０６の３２−エステル（式ＩＩＩ）を調製するために使用することができる。
【化８】
2007532655.tif 000007
【００２０】
１つの実施形態において、リパーゼ触媒エステル化による式（ＩＩ）またはＦＫ−５０６  ３２−エステル（式ＩＩＩ）の調製は、対応する無水カルボン酸をアシル化剤として使用することにより行われる。この一段階法は、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）のための確固たるプロセスをもたらす。もう１つの態様において、本発明のヘミエステルの調製は、リパーゼの存在下、ジカルボン酸のジ（ビニル）、ジ（イソプロペニル）、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）エステルをはじめとする対応するジカルボン酸の二官能性活性化エステルをアシル化供与体として使用して行われる。得られたエステル中間体を、その後、他のリパーゼにより触媒される水での加水分解に付して、ヘミエステルを生じさせる。
【００２１】
Ｉ．アシル化剤としての無水ジカルボン酸の使用
以下の図式は、適する溶媒中、リパーゼの存在下でのラパマイシンおよび無水ジカルボン酸からのラパマイシン４２−ヘミエステル（II）の調製を図示するものである。
【化９】
2007532655.tif 000008
同様に、ＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルは、ＦＫ−５０６を出発原料として使用して、ＦＫ−５０６および無水ジカルボン酸から調製することができる。
【化１０】
2007532655.tif 000009
【００２２】
便宜上、以下の論考は、ラパマイシンおよびラパマイシン４２−エステルに言及することにする。しかし、明細書を通して、ラパマイシンおよびラパマイシン４２−ヘミエステルの代わりにＦＫ−５０６およびＦＫ−５０６  ３２−エステルを容易に用いることができることは理解されるはずである。
【００２３】
上の図式に関して、Ｌは連結基である。この実施形態において、適する連結基は、１から６個の炭素原子または２から４個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖から容易に選択される。適する連結基であるＬの例としては、直鎖または分枝鎖アルキレン、例えばジメチレン、トリメチレン、テトラメチレンおよび２−メチル−トリメチレンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の適する連結基は、当業者には容易に明らかとなることだろう。
【００２４】
上の図式における無水ジカルボン酸は、次の構造：
【化１１】
2007532655.tif 000010
によって図示される。当業者は、適切な無水ジカルボン酸（連結基の定義は上で示した）を容易に選択することができる。適する無水ジカルボン酸の例としては、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水３−メチルグルタル酸およびこれらの混合物が挙げられる。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明において有用なリパーゼは、「細菌リパーゼ」と呼ばれる細菌起源のリパーゼから選択される。細菌リパーゼとしては、例えば、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehei）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、リゾープス・デレマ（Rhizopus delemar）およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が挙げられる。もう１つの実施形態において、Ｂ型カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica, type B）からのリパーゼが、本発明の実施において使用される。Ｃ．アンタルクチカリパーゼは、例えば、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋから製品名 ＮＯＶＯ  ＳＰ４３５もしくはＮＯＶＯＺＹＭ  ４３５で、またはＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓから製品名ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−２で市販されている。さらにもう１つの実施形態において、リパーゼは、本明細書に記載の、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ（天野エンザイム株式会社）からのリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩである。本発明において有用なリパーゼは、異なる細菌起源からの、および様々な供給業者による異なる商品名での、粗製、不完全精製、精製または固定化形態で、使用することができる。
【００２６】
リパーゼは、有効な触媒量、すなわち、アシル化反応を妥当な反応速度で有効に触媒する量で使用される。この酵素を（ラパマイシンの量を基準にして）約１００から約８００重量％の量で使用できることは、当業者には理解されるであろう。１つの実施形態において、この酵素は、約２００から約７００重量％、約２５０から約６００重量％、または約３００から約５００重量％の量で使用される。
【００２７】
本発明の反応は、典型的には適する溶媒中で行われる。溶媒は、開始時に出発ラパマイシン［またはＦＫ−５０６］のすべてまたは一部を有効に溶解することができならびに妥当な速度で反応を進行させることができる量で、使用される。本発明において有用な溶媒の代表例としては、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、１，４−ジオキサン、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3、エチルエーテル、ヘキサン、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ）およびこれらの混合物が挙げられる。１つの実施形態において、トルエン−ＣＨ3ＣＮの混合物が使用される。さらなる実施形態において、トルエン−ＣＨ3ＣＮは、約１：１から約１０：１（ｖ／ｖ）、または約３：１から７：１（ｖ／ｖ）の比率で存在する。さらにもう１つの実施形態では、トルエンが溶媒として使用される。さらにもう１つの実施形態では、トルエン−ＣＨ3ＣＮ（５：１ｖ／ｖ）が使用される。
【００２８】
本発明の反応は、望ましくない副生成物の形成を低減するために十分低いが、過度に長い反応時間を必要とするほど低くはない温度で行われる。この酵素的プロセスに適する温度は、約２０℃から約７５℃、約２５から２７℃から７５℃、約３０℃から４０℃から約７０℃、約３２℃から３７℃から約６５℃の範囲内であり得る。１つの実施形態において、温度は、約３０℃から約６５℃、または約４０℃から５５℃である。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の方法は、次の手順に従って行われる。ラパマイシン［またはＦＫ−５０６］、無水物およびリパーゼを溶媒中で混合する。その後、その混合物をアルゴン（Ａｒ2）または窒素（Ｎ2）雰囲気下、４０℃から６０℃で１から７日間加熱する。その後、酵素を濾過により反応混合物から分離する。その後、その生成物を再結晶またはシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製する。
【００３０】
この反応は、様々な技法、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってモニターすることができる。あるいは、当業者は、他のモニター法を用いることができる。反応が完了したら、酵素（リパーゼ）を濾過して除去し、適する溶媒で洗浄する。この溶媒は、反応での使用に選択したものと同じであってもよいし、または反応における溶媒と異なっていてもよい。溶媒が異なる場合、それは、上で定義した溶媒、または他の一般に使用されている溶媒、例えば数ある中でもアセトン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、の中から選択することができる。その後、溶媒は、適する条件下、例えば減圧下で蒸発除去することができる。
【００３１】
１つの実施形態において、溶媒は、反応における含水率を最小にするように選択される。加えて、または代替として、モレキュラーシーブをその反応に適用することができ、および／または乾燥剤を反応に加えることができる。しかし、反応の含水率の制限は、本発明のこの態様には重要ではない。
【００３２】
その後、残留物を、適する手段によって、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、適する溶媒での溶離、または適する溶媒（例えば、数ある中でもヘキサン−アセトン、ヘキサン−酢酸エチル、エチルエーテル）での再結晶によって、精製する。他の精製手段は、当業者には公知であり、また、本発明により考えられる。
【００３３】
１つの実施形態において、反応が、上で述べたのように一定時間たっても完了しない場合、追加の酵素を添加してもよいし、ＴＬＣまたはＨＰＬＣによって判定して反応が完了するまで、さらなる時間にわたってその混合物を攪拌してもよい。
【００３４】
以下の実施例１は、ラパマイシン４２−ヘミスクシネートの合成を通して、この１段階の、位置選択性の高いプロセスを説明するものである。
【００３５】
ＩＩ．アシル化剤としての二官能性活性化ジカルボン酸エステルの使用
以下の図式は、ラパマイシンおよび二官能性ジカルボン酸エステルからのラパマイシン４２−ヘミエステル（ＩＩ）の調製を図示するものである。また、この方法を用いて、ＦＫ−５０６および二官能性カルボン酸エステルからＦＫ−５０６ヘミエステルを調製することができる。以下の明細書がラパマイシンを指す場合、ＦＫ−５０６  ３２−エステルを製造するために、ＦＫ−５０６を代用できることは、容易に理解されるであろう。
【００３６】
本発明の方法は、２つの段階を含む。第一の段階は、ラパマイシン（またはＦＫ−５０６）および二官能性ジカルボン酸を、上で定義したような細菌起源のリパーゼと共に、上で定義したような適する溶媒中で混合することによって行われる。第二の段階は、式（ＩＩ）の所望の化合物（またはＦＫ−５０６  ３２−エステル）を生じさせるための、リパーゼを使用する、得られたエステル中間体の加水分解である。
【化１２】
2007532655.tif 000011
【００３７】
二官能性ジカルボン酸エステル、
【化１３】
2007532655.tif 000012
に関して、Ｒは、アシル基を活性化するであろう任意の適する基である。例えば、数ある中でもビニル、イソプロペニル、Ｎ−スクシンイミジル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチルおよびオキシムエステルをはじめとする、広範なＲ基を利用できることは、当業者には容易に理解されることであろう。活性化基の選択は、本発明での制限事項ではない。Ｌは、上で定義したように連結基である。適するＬ基の例としては、上で特定したもの、ならびに１個もしくはそれ以上の酸素原子を含む鎖、またはアルキレン、例えばジメチレン（ＣＨ2ＣＨ2）、トリメチレン（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）、ＣＨ2ＯＣＨ2、テトラメチレン（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）、２−メチル−トリメチレン［ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2］、ペンタメチレン（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）、ヘキサメチレン（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）が挙げられる。これらの試薬は、市販されており、または文献に記載されている方法によって調製することができる。
【００３８】
同様に、ＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルは、ＦＫ−５０６および二官能性ジカルボン酸エステルから同じ方法を用いて調製することができる。以下の明細書がラパマイシンを指す場合、ＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルを製造するために、ＦＫ−５０６を代用できることは、容易に理解されるであろう。
【００３９】
第一段階での反応は、二官能性ジカルボン酸エステルを無水カルボン酸の代わりに利用すること以外はパートＩに記載したとおり行う。これら以外は、リパーゼおよび反応条件は、上のパートＩに記載したとおりである。
【００４０】
上のパートＩにおいて特定したものの中から溶媒を選択することができる。１つの実施形態において、溶媒は、上で定義したものの中から、またはトルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ヘキサンまたはそれらの混合物から選択することができる。もう１つの実施形態では、ＴＢＭＥが使用される。１つの実施形態では、ＴＢＭＥは、少なくとも４重量容量（wt volume）（すなわち、ラパマイシンの量の４倍（４Ｘ）より過剰である容量）から約１５ｗｔ容量、または約５から１０重量容量の量で使用することができる。
【００４１】
残留水は、ラパマイシンをいわゆるｓｅｃｏ−ラパマイシン誘導体に分解して、マクロラクトン環開環産物を形成させ得る。この副反応を最小限にするために、反応系において低水分量を維持する。１つの実施形態では、無水溶媒がリパーゼ触媒の標準的な市販製剤と共に使用される。もう１つの実施形態では、リパーゼ溶液中に存在する水の量を、乾燥剤、例えば数ある中でもＭｇＳＯ4、Ｎａ2ＳＯ4、の添加によって調整することにより、水分量を制御することができる。さらにもう１つの実施形態では、モレキュラーシーブを使用して、水分を制御することができる。数ある中でも５Å、４Åおよび３Åをはじめとする種々の大きさの細孔を有する多種類のシーブを容易に利用することができる。適するモレキュラーシーブは、様々な商業的供給源から入手することができる。
【００４２】
本発明の酵素的プロセスは、約２０℃から約５０℃、または約２５℃から約４５℃の範囲内の温度で行うことができる。１つの実施形態において、反応は、１２時間から４８時間、ラパマイシンの分解を最小限にするために、Ｎ2下で行われる。この反応は、様々な技法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってモニターすることができる。反応完了後、酵素（リパーゼ）を濾過して除去し、ヘキサンまたはヘプタンの添加によって、その粗製エステル生成物をその濾液に沈殿させる。
【００４３】
得られたエステル中間体を、その後、リパーゼ触媒加水分解に付して、所望のラパマイシン４２−ヘミアジペートを回収する。
【００４４】
第二段階は、湿式溶媒中、リパーゼの存在下での、第一段階からの粗製エステル中間体の加水分解を含む。このリパーゼは、第一段階において使用したものと同じであってもよいし、または本明細書において特定している適するリパーゼの中から独自に選択してもよい。１つの実施形態において、このリパーゼは、Amano EnzymeからのリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩであり、これは、メチルアクリル基で化学変性されたセラミック粒子上に固定化されている。
【００４５】
この加水分解段階に使用される媒体は、上で定義した溶媒の中から、または水混和性溶媒から選択することができる。水混和性溶媒の場合、その溶媒は、水で飽和されている。さらに好ましくは、例えば、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、ジオキサン、ｔ−アミルアルコール、アセトンまたはこれらの混合物および適量の水、例えば０．５％ｖ／ｖから１０％ｖ／ｖ、または１％ｖ／ｖから５％ｖ／ｖの水を含む水混和性溶媒が、選択される。
【００４６】
１つの実施形態において、この反応の温度は、約２０℃から約５０℃、またはほぼ室温（例えば約２５℃）から３５℃の範囲内である。もう１つの実施形態において、約２％ 水を含有するＭｅＣＮが反応媒体として、約２０重量％ ＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ  ４３５リパーゼと共に、室温で使用され；その反応は、数時間で完了する。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明のこの方法の加水分解段階は、次の手順に従って行われる。第一段階からの粗生成物を湿式溶媒に溶解する。十分な量のリパーゼを添加し、その後、その混合物を室温から４０℃、アルゴン（Ａｒ2）または窒素（Ｎ2）雰囲気下で、１から２４時間、またはすべての出発原料が式（ＩＩ）のヘミエステル生成物に転化されるまで攪拌する。これは、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をはじめとする、従来どおりの方法によってチェックすることができる。酵素を反応混合物から、例えば濾過によって分離する。その後、従来どおりの方法、例えばシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶を用いて、その粗生成物を優れた収率で精製する。
【００４８】
もう１つの実施形態において、この二段階プロセスは、ワンポット式で行うことができる。すなわち、第一段階からの中間体を単離せずに第二加水分解段階を行う。このワンポットプロセスにおいて、第一酵素的段階は上に記載したとおりに行う。反応完了後、溶媒および水を添加する。１つの実施形態において、溶媒は、水混和性溶媒、例えばＭｅＣＮ、ＴＨＦ、ジオキサン、ｔ−アミルアルコール、アセトンまたはこれらの混合物である。さらにもう１つの実施形態において、水の量は、０．５％ｖ／ｖから１０％ｖ／ｖ、または１％ｖ／ｖから５％ｖ／ｖである。その後、その混合物を一定の時間にわたって攪拌し、酵素を濾過して除去し、その後、シリカゲルクロマトグラフィーによってその粗生成物を精製する。１つの実施形態では、５％ 水を含有するＭｅＣＮがその反応混合物に添加され、反応は１時間以内に完了する。
【００４９】
式（ＩＩ）のラパマイシン４２−ヘミエステルのこの二段階酵素的プロセスは、実施例２に示すような二段階手順（方法１）またはワンポット手順（方法２）によるラパマイシン４２−ヘミアジペートの合成によって、さらに例証される。４２−ヘミスベレートの合成は、実施例３に示す。
【００５０】
ＩＩＩ．組成物および使用
本発明に従って製造されるジカルボン酸とのラパマイシン４２−ヘミエステルおよびジカルボン酸とのＦＫ−５０６  ３２−エステルは、免疫原、デテクター、および／またはマトリックス結合コンジュゲートを調製する際に有用な前駆体である。これらの免疫原、デテクターおよびコンジュゲートは、出発原料（例えば、ラパマイシンもしくはＦＫ−５０６）またはそれらの誘導体に特異的な抗体の作製および検出に、生体液または検査液中の出発原料またはその誘導体のレベルの測定に、ならびに出発原料またはその誘導体に結合しているタンパク質の単離に、有用である。
【００５１】
ラパマイシンコンジュゲートを調製するための前駆体として、本発明に従って調製した式（ＩＩ）の化合物中のカルボン酸は、ペプチドに関する文献に記載されている標準的な方法論を用いて活性化する。典型的に、これは、本発明の化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させて、活性化Ｎ−スクシンイミジルエステルを形成することを含む。この活性化エステルを、その後、免疫原性担体分子の求核末端と反応させて、ラパマイシンコンジュゲートを形成することができる。次の図式は、この技法を例示するものである。
【化１４】
2007532655.tif 000013
しかし、本発明は、そのように限定されない。本発明の化合物を使用して製造されるこれらおよび他のラパマイシン誘導体の使用が考えられる。
【００５２】
本発明のラパマイシン免疫原性コンジュゲートを使用して、当該技術分野において公知である標準的な技法により、ラパマイシンまたはその誘導体に特異的な抗体を作製することができる。１つの実施形態では、本発明の精製された位置特異的ラパマイシン４２−エステルが単独で、またはアジュバントと併用で、宿主動物の１箇所またはそれ以上の部位に接種される。本発明のラパマイシン免疫原性コンジュゲートから作製された抗体は、ラパマイシンレベルの判定のために、非常に多数のイムノアッセイにおいて使用することができ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイおよび蛍光イムノアッセイにおいて使用することができる。
【００５３】
もう１つの実施形態において、本発明のラパマイシン４２−誘導体またはそれらの使用により作製されたコンジュゲートもしくは抗体は、当該技術分野において説明されている任意の適する方法によって配合することができる。
【００５４】
同様に、本発明のＦＫ−５０６ヘミエステルからのＦＫ−５０６免疫原、抗体およびコンジュゲートの作製方法は、当業者には容易に明らかとなるだろう。
【００５５】
さらに、本発明は、本発明に従って製造され、その所望の使用、例えば抗体産生のために配合された、位置特異的ラパマイシン４２−ヘミエステルおよび／またはＦＫ−５０６  ３２−ヘミエステルを収容しているパッケージングおよびキットを提供する。もう１つの実施形態において、本発明の組成物を使用して作製された抗体またはラパマイシンコンジュゲートは、様々な適する担体、保存薬などを使用して配合することができる。ビン、バイアル、ブリスターパックなどをはじめとする適する容器は、当業者には公知である。こうしたパッケージングおよびキットは、例えば使用説明書、注射器、アプリケータ、標準的な濃度のラパマイシン（標準曲線を作成するためのもの）、容器、マイクロタイタープレート、固体支持体、試験管、トレーなどをはじめとする他の構成要素をさらに収容し得る。用いられるアッセイのタイプに依存して、多くの種類の試薬をキットに含めることができる。
【００５６】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、特許請求の範囲に記載する本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００５７】
ラパマイシン４２−ヘミスクシネートの合成
【化１５】
2007532655.tif 000014
リパーゼを含む溶媒中でラパマイシンと無水コハク酸を混合することにより、リパーゼ触媒アシル化を容易に行う。
【００５８】
方法１：
トルエン（２０ｍＬ）中のラパマイシン（２．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５（４．５ｇ）の混合物を４５℃、Ｎ2雰囲気下で４０時間（４０ｈ）攪拌した。酵素を濾過して除去し、トルエンで洗浄し、併せた有機溶媒を減圧下で濃縮した。残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ（１２：１）で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として生じさせた（２．０２ｇ、収率９１％）。
【００５９】
方法２：
トルエン−ＣＨ3ＣＮ（３ｍＬ、５：１ｖ／ｖ）中のラパマイシン（９１．４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１２０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５（４００ｍｇ）の混合物を４５℃、Ｎ2雰囲気下で１４４時間攪拌した。酵素を濾過して除去し、トルエンで洗浄し、併せた有機溶媒を減圧下で濃縮した。残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ（１２：１）で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体（８７ｍｇ）として生じさせ、同時にラパマイシン（１０ｍｇ）を回収した。４２−ヘミスクシネートの収率は、回収したラパマイシンに基づき９６％である（ラパマイシンの出発原料に基づき８６％）。ＭＳ：１０１３（Ｍ-）。
【実施例２】
【００６０】
ラパマイシン４２−ヘミアジペートの合成
【化１６】
2007532655.tif 000015
方法１：
ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（４ｍＬ）中のラパマイシン（４５７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ジビニルアジペート（２５０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、４Åモレキュラーシーブ（８０ｍｇ）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５（３００ｍｇ）の混合物を４５℃で１６時間攪拌した。酵素を濾過によって除去し、２ｘ１ｍＬ ＴＢＭＥで洗浄する。その後、濾液を氷冷ヘプタン（３０ｍＬ）に添加する。ブーフナー漏斗により固体を回収し、その白色の粉末を真空下で２時間乾燥させる。
【００６１】
その白色の粉末を４ｍＬ ＣＨ3ＣＮ［２％（ｖ／ｖ）水を含有する］に溶解する。ＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５（８０ｍｇ）を添加し、その混合物を室温で１〜２時間攪拌する。酵素を濾過によって除去し、２ｘ１ｍＬ ＭｅＣＮで洗浄する。濾液を濃縮し、残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（１５：１）で溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として生じさせる（４７０ｍｇ、二段階終了して収率９０％）。ＭＳ：１０４１（Ｍ-）。
【００６２】
方法２：
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（１８ｍＬ）中のラパマイシン（３．０ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、ジビニルアジペート（２．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５（３．０ｇ）の混合物を４０℃で３６時間攪拌した。ＭｅＣＮ（１０ｍＬ、５％ Ｈ2Ｏを含有するもの）を添加した。１５分（１５ｍｉｎ．）後、酵素を濾過によって除去し、ＴＢＭＥ／ＭｅＣＮ（２：１）で洗浄する。濃縮、およびヘキサン−アセトン（５：４）で溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって、表題化合物を白色の固体として生じさせる（３．０５ｇ、収率８９％）。
【実施例３】
【００６３】
ラパマイシン４２−スベレートの合成
【化１７】
2007532655.tif 000016
【００６４】
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（１８ｍＬ）中のラパマイシン（３．０ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、ジビニルスベレート（２．２６ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ＳＰ４３５（３．０ｇ）の混合物を４０℃で４８時間攪拌した。ＭｅＣＮ（１０ｍＬ、５％ Ｈ2Ｏを含有するもの）を添加した。１５分後、酵素を濾過によって除去し、ＴＢＭＥ／ＭｅＣＮ（２：１）で洗浄する。濃縮、およびヘキサン−アセトン（５：４）で溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって、表題化合物を白色のフォームとして生じさせる（２．８８ｇ、収率８２％）。
【００６５】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。実際、上述の説明および付随する図から、当業者には、本明細書に記載のものに加えて本発明の様々な変形が明らかとなろう。そうした変形は、添付の特許請求の範囲の中に入ると解釈される。
【００６６】
さらに、値は近似値であり、説明のために提供していることは、理解されるはずである。
【００６７】
特許、特許出願、出版物、手順などがこの出願のいたるところで引用されているが、これらの開示は、それら全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と参考文献の間に矛盾が存在し得る程に、本明細書においてその開示の言語は管理されている。
【国際調査報告】
2007532655.tif 000019
2007532655.tif 000020
2007532655.tif 000021
2007532655.tif 000022