(57)【要約】【課題】融合タンパク質及び該タンパク質の切断方法【解決手段】本発明は、アスパラギン酸特異的プロテアーゼを用いた組換えタンパク質の処理方法を提供する。【選択図】      なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの組換え生成方法であって、アスパラギン酸特異的プロテアーゼに特異的な配列を含む融合タンパク質としてペプチドを発現する工程と、該融合タンパク質の切断に前記プロテアーゼを適用する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記アスパラギン酸特異的プロテアーゼが、カスパーゼ1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 又は10或いはグランザイム B又はCED-3から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼがカスパーゼ３である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、アプロチニン、組織因子経路阻害剤又は他のプロテアーゼ阻害剤、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、グルカゴン1-37 （オキシントモデュリン(oxyntomodulin)）、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織プラスミノーゲン活性化因子、トランスフォーミング成長因子α又はβ、血小板由来成長因子、GRF (成長ホルモン放出因子)、免疫グロブリン、EPO、TPA、タンパク質C、FVII、FVIII、FV、FX、FIX又はFXIIIのような血液凝固因子、エクセンディン（exendin）-3又はエクセンチジン（exentidin）-4から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記インターロイキンが、IL-20, IL-21, IL-28, IL-29又はIL-31及び対応する受容体分子及び溶解性受容体分子から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、IL-21である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のペプチドを含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質に含まれる前記配列が、アスパラギン酸特異的プロテアーゼによって認識され得るものである融合タンパク質。
【請求項８】
前記ペプチドが、IL-21である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、配列DEXaaD、又は(Y/F/W)VXaaD、又は(I/L/V)EXaaDを含み、ここでXaaが任意のアミノ酸である、請求項７〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質に含まれる前記配列が、配列DEXaaDであり、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、前記プロテアーゼがカスパーゼ 2, 3, 7又はCED-3である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合タンパク質に含まれる前記配列が、配列(Y/F/W)VXaaDであり、ここでXaaは任意のアミノ酸であり、前記プロテアーゼはカスパーゼ 1, 4 又は5である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質に含まれる前記配列が、配列 (I/L/V)EXaaDであり、ここで、Xaaは、任意のアミノ酸であり、前記プロテアーゼはカスパーゼ 6, 8, 9, 10又はグランザイム Bである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記付加される配列は、DETD, DEVD, DMQD, DEVD又はDGPDであり、前記プロテアーゼはカスパーゼ 3又は7である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかのタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１３の何れかのタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを含有する、単細胞宿主生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質の合成及びカスパーゼを用いる特異的な方法におけるそのような融合タンパク質の切断を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド及びタンパク質の組換え生成は、所望のタンパク質のある性質を達成するために、しばしばペプチド又はタンパク質の融合を必要とする。本発明は、そのような融合タンパク質を切断する方法及び適切な切断サイトを提供する。
【０００３】
アスパラギン特異的プロテアーゼは、当該分野で周知である。それらの中で、カスパーゼ及びカスパーゼ活性化剤グランザイム Bは、最も良く記載されているものに含まれる。それらの酵素はすべて、それらの伸長された基質認識サイトのために、現在まで知られている最も特異的なタンパク分解酵素の中に含まれる。カスパーゼは、システイン依存性アスパラギン特異的プロテアーゼであり、プログラムされた細胞死又はアポトーシスを起こす細胞の形態学的特徴の発展を促進するための、インビボでタンパク質のスモールサブセットを切断する、高い特異性の制限プロテアーゼとして作用する能力がよく知られている。異なるAsp特異的プロテアーゼが当該分野で知られており、「Thornberry Chem Biol. 1998; 5:R97-103.; Stennicke ＆ Salvesen Biochim. Biophys. Acta 1998;1387:17-31」に開示されている。異なるプロテアーゼは、同じ主要な特異性を有するが、しかし、極めて異なる二次的な選択を有し、このため、特異的酵素の選択を可能にし、所望のサイトでの切断を保証する切断サイトモチーフのマッチングを可能にし、一方で、インビボ形態での活性の生成を保証すると同時に所望のタンパク質内の二次的サイトでの切断を最小にする。
【０００４】
今日、多くの他の融合タンパク質／処理システムが入手可能であるが、しかし、それらのほとんどは、還元条件に高い感受性を有する。一方でカスパーゼは、チオールプロテアーゼであり、還元条件下で十分に活性であり、時には、展開されたタンパク質中のタグ又は融合パートナーの除去に理想的に適するようにさせる、4Ｍまでの尿素中で活性を保持する。
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ペプチドのアミノ末端に、融合タンパク質の切断のためのアスパラギン酸特異的プロテアーゼに特異的な配列を有するペプチド（例えば融合タンパク質として）を発現させる工程と、該ペプチドを少なくとも一つのアスパラギン酸特異的プロテアーゼに接触させて開始ペプチド（例えば、融合ペプチド）からペプチドを遊離させる工程とを含む。
【０００６】
本発明の一つの態様において、前記アスパラギン酸特異的プロテアーゼは、カスパーゼ1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10、グランザイムB又はCED-3から選択される。
【０００７】
本発明は、上記されたような方法を提供し、ここで、前記融合タンパク質は宿主細胞で発現される。
【０００８】
本発明は、IL-21とアスパラギン酸特異的プロテアーゼに特異的な配列との間の融合タンパク質を提供する。  
本発明は、記載された何れかの融合タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【０００９】
本発明は、記載された何れかのタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
【００１０】
また本発明は、上記の何れかのタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを含有する単細胞宿主生物を提供する。
【定義】
【００１１】
本発明の内容において、IL-21は、配列番号２としてWO 00/53761に開示された配列として定義される。また、本発明は、その機能的誘導体及び断片をも包含する。  
本発明の内容において、「カスパーゼ」とは、起源または特異性に関わらずいずれのカスパーゼをも指し、また、グランザイムＢのような、カスパーゼ様基質特異性を有するプロテアーゼをも含む。  
位置Px 及び P’x の言及は、切断サイトに関してＮ-末端及びＣ-末端のそれぞれに対する位置x のアミノ酸を指す(Schechter & Berger (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157)。  
以下ではアミノ酸残基の一文字の略字を用いる。  
ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の用語は、本明細書では交換可能に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
本発明のタンパク質ポリペプチドは、全長タンパク質、タンパク質断片（例えば、リガンド結合断片）、及び融合ポリペプチドを含むが、従来技術に従って、遺伝子改変の宿主細胞中で生成されることができる。適切な宿主細胞は、外来性ＤＮＡで形質転換又は形質移入されることができ、培養液中で増殖可能なタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞、及び培養された高等真核生物細胞を含む。真核生物細胞、特に、多細胞性生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子の操作及び外来性ＤＮＡを種々の宿主細胞中へ導入する技術は、「Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)」及び「Ausubel et al., 同書」に開示されている。
【００１３】
本発明に従って、ｃＤＮＡが上記に記載されたように請求される場合、請求されたものはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方であり、それらのそれぞれの水素結合によって互いにアニールしたセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を有する二重鎖としてのＤＮＡであるということが理解されることが認められるであろう。また、本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）も請求され、このｍＲＮＡは上記のｃＤＮＡによってコードされるものである。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、各チミンヌクレオチド（Ｔ）がウラシルヌクレオチド（Ｕ）で置換される外は、上記で定義されたものと同じコドンを用いてポリペプチドをコードする。
【００１４】
上記したように、異なるAsp特異的プロテアーゼが当該分野で周知であり開示されている。一般的な規定として、カスパーゼ／グランザイムＢは下記のモチーフが選ばれる。
【表Ａ】
2007512008.tif 000002
ここで、Xaa及びZaaは、任意のアミノ酸残基であってよく、H、T及びVのようなアミノ酸はXaaのための好ましい置換基であり、S、T、G又はAは、Zaaとして好ましく、しかし、巨大な芳香族基も十分に許容される(Stennicke et al. Biochem. J. (2000) 350, 563-568)。
【００１５】
特に、カスパーゼ Iのために最も好ましいP4はY又はFである。  
カスパーゼ 6のために最も好ましいP4はThr又はValである;  
カスパーゼ 8のために好ましいP4はLeuである:  
位置P1の全てのカスパーゼのためにはAspが好ましい。  
カスパーゼにおける位置P’1は、好ましくはGly、Ser、Ala、Phe又はTyrである。最も好ましくは、Gly、Ser又はAlaである。
【００１６】
好ましいリンカーは、これらに限定されないが：
カスパーゼ 1には: YVHD-A、LESD-N、WEHD-A
カスパーゼ 3及び7には: DETD-S、DEVD-G、DMQD-N、DEVD-G及びDGPD-G
カスパーゼ 6には: VEID-N、VEVD-A を含む。
【００１７】
上記のリンカーは、カスパーゼによる切断のための連結部分における選択性を示す。
【００１８】
本発明の一つの態様において、プロテアーゼはカスパーゼ 3である。
【００１９】
本発明の一つの態様において、ペプチドは、アプロチニン、組織因子経路阻害剤又は他のプロテアーゼ阻害剤、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、グルカゴン1-37 （オキシントモデュリン(oxyntomodulin)）、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織プラスミノーゲン活性化因子、トランスフォーミング成長因子α又はβ、血小板由来成長因子、GRF (成長ホルモン放出因子)、免疫グロブリン、EPO、TPA、タンパク質C、FVII、FVIII、FV、FX、FIX又はFXIIIのような血液凝固因子、エクセンディン（exendin）-3又はエクセンチジン（exentidin）-4又は上記の何れかの機能的類縁体から成る群から選択される。
【００２０】
本発明の他の態様において、ペプチドは、IL-20、IL-21、IL-28、IL-29又はIL-31のようなインターロイキン、及び、対応する受容体分子及び溶解性受容体分子である。本発明の特定の態様において、ペプチドはIL-21である。
【００２１】
特定の態様は、上記の融合タンパク質であり、ここで、前記構築物は、リンカー配列DEXaaD、又は(Y/F/W)VXaaD、又は(I/L/V)EXaaDを含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。他の特定の態様は、上記のいずれかとしての融合タンパク質であり、ペプチドに付加される配列は、配列DEXaaDであり、ここでXaaは任意のアミノ酸であり、プロテアーゼはカスパーゼ 2,3, 7又はCED-3である。  
他の特定の態様は、上記のいずれかとしての融合タンパク質であり、ペプチドに付加される配列は、配列(Y/F/W)VXaaDであり、ここでXaaは任意のアミノ酸であり、プロテアーゼは、カスパーゼ 1, 4又は5である。  
他の特定の態様は、上記のいずれかとしての融合タンパク質であり、ペプチドに付加される配列は、配列(I/L/V)EXaaDであり、ここでXaaは任意のアミノ酸であり、プロテアーゼはカスパーゼ 6, 8, 9, 10又はグランザイム Bである。  
他の特定の態様は、上記のいずれかとしての融合タンパク質であり、付加される配列は、DETD、DEVD、DMQD、DEVD又はDGPDであり、プロテアーゼはカスパーゼ 3又は7である:
本発明の特定の態様は、Ｃ-末端配列中の組換えIL-21配列、及び、上記のいずれかとしてのアスパラギン酸特異的プロテアーゼによって認識可能な構築物である。
【００２２】
上記の好ましい態様は、本発明を限定すると解釈されるべきではない。結合部分の選択は、特異性及び動態学的な検討の選択である。カスパーゼは、他のモチーフに対しても活性を有するが、選択性は低く、特異的活性がより低いものもある。
【００２３】
このように、この形式のリンカーを用いると、任意のタンパク質を他のタンパク質の末端に結合させて融合タンパク質を形成することができる。好ましい態様においてこのタンパク質はIL-21である。
【００２４】
所望のタンパク質又はペプチドに先行する配列は、タンパク質の折りたたみ及び/又は精製を促進するのに適した任意の配列であってよい。それらの配列は、これらに限定されないが、myc-、T7-、HSV- 、V5-、HA-、FLAG-、ストレップタグ（strep-tags）、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、チオレドキシン(例えば、E.Coli TrxA)、His6 (-HHHHHH-)及びそれらの変異体、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質を含む。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、カスパーゼ3は、そのまれな認識サイトのために用いられるが、しかし、他の酵素も、所望のタンパク質の主要な配列に依存して用いられ得る。この特定の酵素は、P1及びP4におけるAsp並びにP3におけるGluの厳密な優先度によって特徴づけられる(previously described in Thornberry et al. J Biol Chem. 1997 Jul 18; 272(29):17907-11.)。
【００２６】
本発明に従って、当該分野の技術範囲における従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が用いられる。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、「Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning」:「A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein “Sambrook et al., 1989”) DNA Cloning」:「A Practical Approach, Volumes I and II /D.N. Glover ed. 1985)」;「Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)」;「Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds (1985))」;「Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984))」;「Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))」;「Immobilized Cells And Enzymes  (IRL Press, (1986))」;「B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)」を参照されたい。
【００２７】
本発明の一つの態様において、ペプチドは、アプロチニン、組織因子経路阻害剤又は他のプロテアーゼ阻害剤、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、グルカゴン1-37 （オキシントモデュリン(oxyntomodulin)）、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織プラスミノーゲン活性化因子、トランスフォーミング成長因子α又はβ、血小板由来成長因子、GRF (成長ホルモン放出因子)、免疫グロブリン、EPO、TPA、タンパク質C、FVII、FVIII、FV、FX、FIX又はFXIIIのような血液凝固因子、並びに、エクセンディン（exendin）-3又はエクセンチジン（exentidin）-4、及び上記の何れかの機能的類縁体である。本発明の一つの態様において、ペプチドは、IL-20、IL-21、IL-28、IL-29又はIL-31のようなインターロイキン及び対応する受容体分子及び溶解性受容体分子である。本発明の特定の態様において、ペプチドはIL-21である。
【００２８】
本発明の状況において、「機能的類縁体」という用語は、天然のタンパク質と同様の機能を有するタンパク質を示すことを意味する。該タンパク質は、天然のタンパク質と構造的に類似しており、天然のタンパク質のＣ-末端及びＮ-末端のいずれか又は両方に一以上のアミノ酸を付加することによって、天然のアミノ酸配列における一ヶ所又は多数の異なるサイトでの一以上のアミノ酸の置換によって、天然のタンパク質のいずれか又は両方の末端で又はアミノ酸配列中の一ヶ所又は幾つかのサイトで、一以上のアミノ酸を欠失することによって、或いは、天然のアミノ酸配列における一以上のサイトでの一以上のアミノ酸の挿入によって、天然のタンパク質から派生され得る。さらに該タンパク質は、一以上の位置においてアシル化されてもよい。GLP-1及びその類縁体のアシル化を開示しているWO 98/08871、及び、GLP-2及びその類縁体のアシル化を開示しているWO 98/08872を参照されたい。アシル化されたGLP-1誘導体の例は、Lys26(Nε-テトラデカノイル)-GLP-1(7-37)であり、これは位置26のLys残基のε-アミノ基がテトラデカノイル化されたGLP-1(7-37)である。
【００２９】
インスリン類縁体は、ヒトインスリン分子と比較して、A及び/又はBアミノ鎖の一以上の変異、置換、欠失及び/又は付加を有するインスリン分子である。このインスリン類縁体は、好ましくは、一以上の天然のアミノ酸残基、好ましくは一つ、二つ、又は三つのアミノ酸残基が、他のコード可能なアミノ酸残基で置換されているようなものである。例えばB鎖の位置28が、天然のPro残基からAsp、Lys、又はIleの一つに改変され得る。他の態様において、位置B29でのLysはProに改変され;また、位置A21のAsnはAla、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr又はValに改変されてよく、特にGly、Ala、Ser、又はThrに、好ましくはGlyに改変されてよい。さらに、位置B3のAsnは、Lysに改変されてよい。インスリン類縁体のさらなる例は、des(B30)ヒトインスリンであり、PheB1が欠失したインスリン類縁体; A-鎖及び/又はB-鎖がN-末端伸長を有するインスリン類縁体及びA-鎖及び/又はB-鎖がC-末端伸長を有するインスリン類縁体である。このように、一つ又は二つのArgが位置B1に付加されてもよく、又は一つのArgが位置B30に付加されてもよく、及び一つのArgが位置B31に付加されても良い。また、他のタンパク質の前駆体又は中間体が本発明の方法によって処理されることができる。そのような前駆体の例は、アミノ酸配列B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21)（ここで、A(1-21) はヒトインスリンのA鎖であり、B(1-29)はそのThr(B30)が欠失したヒトインスリンのB鎖である）を含むインスリン前駆体である。上記類縁体の組合せも含まれる。このように、インスリン類縁体A21Gly-B30Arg-B31Argは、本発明のインスリン類縁体の範囲内である。最後に、インスリン分子は、一以上の位置でアシル化されてよく、例えばヒトインスリン又はdesB30ヒトインスリンのB29位置でアシル化されてよい。アシル化されたインスリンの例は、NεB29-テトラデカノイルGlnB3des(B30)ヒトインスリン、NεB29-トリデカノイルヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン、NεB29-デカノイルヒトインスリン、及びNεB29-ドデカノイルヒトインスリンである。
【００３０】
「IL-21」は、国際特許出願公報WO 00/53761（2000年9月14日公開、その全てが本明細書に援用される）において開示されており、これはIL-21（「Zalpha11 ligand」として）を配列番号２として開示しており、その全てが本明細書中に援用され、それを製造する方法及びそれらに対する抗体及び蒸気出願の配列番号１としてのIL-21をコードするポリヌクレオチド配列も同様である。本発明は、少なくとも70%で、少なくとも80%で、少なくとも90%で、少なくとも95%で、又は95%より多く含むそれらの相同分子種を含む。また、本発明は、アミノ酸残基の配列に、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は95%より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの使用を含む。相同性割合の決定方法は下記に記載する。本発明のポリペプチドは、天然の対応物の生物活性の全て又はいくらかを保持している。ポリペプチドの中には、天然のタンパク質の生物活性よりも高い生物活性を有するものもある。
【００３１】
本発明は、他の種（「相同分子種」）からの相対タンパク質及びポリヌクレオチドを包含する。特に興味深くは、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、及び他の霊長類を含む、他の哺乳類種からのポリペプチドである。ヒトタンパク質の相同分子種は、本発明により提供される情報及び組成物を従来のクローニング技術と組み合わせて用いてクローン化されることができる。用いられるように、また請求項に記載したように、「ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドのすべての対立遺伝子変異体及び相同分子種を含む配列によって定義される前記ポリヌクレオチドである。
【００３２】
また、本発明は、前記タンパク質ポリペプチドと実質的に同一の単離されたタンパク質ポリペプチド及びその相同分子種を提供する。「単離された」という語は、その自然な環境以外の条件で見られるタンパク質又はポリペプチドを意味し、例えば、血液及び動物組織から分離したタンパク質又はポリペプチドを意味する。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは、実質的に他のポリペプチドを含まず、特に動物由来の他のポリペプチドを含まない。ポリペプチドは、高純度で、即ち、95%を超える純度、より好ましくは99%を超える純度の形態で提供されることが好ましい。「実質的に同一」という語は、天然のタンパク質又は相同分子種の配列と、50%、好ましくは60%、より好ましくは少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドを意味するように本明細書で用いられる。そのようなポリペプチドは、天然のタンパク質又はその相同分子種に対して、より好ましくは、少なくとも90%の同一性であり、最も好ましくは95%以上の同一性である。配列同一性のパーセントは、従来方法によって測定される。例えば、「Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986)」及び「Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992)」を参照されたい。ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記の割合を用いた同様の方法によって測定される。
【００３３】
変異体ポリペプチド又は実質的に同一なタンパク質及びポリペプチドは、一以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するとして特徴づけられる。これらの変化は、好ましくはマイナーな性質のものであり、これは保存的なアミノ酸置換(表１を参照) 及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に著しく影響しない他の置換である；わずかな欠失、典型的には１から約30アミノ酸；及びわずかなアミノ末端又はカルボキシ末端の伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約20-25残基までのわずかなリンカーペプチド、又は、精製を促進するわずかな伸長(親和性タグ)、例えば、ポリ-ヒスチジントラクト（tract）、タンパク質A、 Nilsson et al., EMBO J. 4：1075 (1985)； Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ、Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメイン。一般には、「Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991)」を参照されたい。親和性タグをコードするDNAは、商業的な供給者（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手可能である。
【表１】
2007512008.tif 000003
【００３４】
本発明のタンパク質は、非天然のアミノ酸残基をも含むことができる。非天然アミノ酸は、これらに限定されないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、cis-4-ヒドロキシプロリン、trans-4-ヒドロキシプロリン、Nメチルグリシン、addo-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、及び4-フルオロフェニルアラニンを含む。非天然のアミノ酸残基をタンパク質中に組み入れるための方法は、当該分野で幾つか知られている。例えば、インビトロ系を用いることができ、ここでナンセンス突然変異は、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制される。他の方法は、「Schultz et al. J. Org. Chem., 2003, 68, 174-176 or Science 2003, vol 299, 640」に開示されている。アミノ酸の合成方法及びtRNAのアミノアシル化方法は、当該分野で既知である。本発明のポリペプチドにおいて必須のアミノ酸は、当該分野で知られた手順、例えば、サイト直接的突然変異（site-directed mutagenesis）又はアラニンスキャニング突然変異（alanine scanning mutagenesis）「Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)」;「Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502 (1991)」のような手順に従って同定される。後者の技術において、シングルアラニン突然変異は、分子中の全ての残基で導入され、結果として生じる突然変異分子は、該分子の活性に決定的であるアミノ酸残基を同定するために生物活性（例えば、リガンド結合及びシグナル伝達）を試験される。リガンド-タンパク質相互作用のサイトは、核磁気共鳴、結晶学又は光親和性ラベリングのような技術によって決定されるような結晶構造の分析によっ
て決定されることもできる。例えば、「de Vos et al., Science 255:306-312 (1992)」；「Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)」；「Wlodaver et al., FEES Lett. 309:59-64 (1992)」を参照されたい。必須のアミノ酸の同定は、関連するタンパク質との相同性の分析からも推測されることができる。
【００３５】
複数のアミノ酸置換は、「Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-57 (1988)」又は「Bowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 (1989)」に開示されているような、突然変異及びスクリーニングの既知の方法を用いて作製されて試験されることができる。簡単に言えば、それらの著者は、ポリペプチドの二以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、各位置で許容できる置換のスペクトルを決定するために突然変異したポリペプチドを配列決定するための方法を開示している。用いられ得る他の方法には、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., Biochem.30:10832-10837 (1991)； Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204）及び領域直接的突然変異（region-directed mutagenesis）（Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986); Ner et al., DNA 7:127 (1988)）が含まれる。
【００３６】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合及び一以上のポリペプチド融合を含む関連する多量体のタンパク質を提供する。ポリペプチド融合は、遺伝子改変細胞において発現されうる。補助的なドメインは、それらを特定の細胞、組織、又は高分子（例えばコラーゲン）に向けるために、ポリペプチドに融合され得る。例えば、IL-21ポリペプチド又はタンパク質は、ポリペプチドを、標的細胞の表面の受容体に特異的に結合するリガンドに融合させることによって、所望の細胞タイプに向けられることができる。このように、ポリペプチド及びタンパク質は、治療目的又は診断目的のために標的にされ得る。IL-21ポリペプチドは、精製のための親和性タグ及び標的ドメインのような、二以上の部分に融合され得る。ポリペプチド融合は、一以上の切断サイトを特にドメインの間に含むこともできる。「Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9 (1996)」を参照されたい。
【００３７】
上記の方法を用いて、当該分野の通常の技術者は、種々のポリペプチド又はその対立遺伝子変異体を調製することができ、また野生型タンパク質の性質を保持することができる。本明細書で表し請求項に記載されたように、「ポリペプチド」という用語は、該ポリペプチドの全ての対立遺伝子変異体及び相同分子種を含む。
【００３８】
本発明のタンパク質ポリペプチドは、全長タンパク質、タンパク質断片（例えば、リガンド-結合断片）、及び融合ポリペプチドを含むが、従来技術に従って遺伝子改変宿主細胞において生成されることができる。適切な宿主細胞は、外来性ＤＮＡで形質転換又は形質移入されることができ、培養中で増殖できる細胞タイプであり、細菌、真菌細胞、及び培養高等真核生物細胞を含む。真核細胞は、多細胞生物の培養された細胞が特に好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子の操作のための技術及び外来性ＤＮＡを種々の宿主細胞中に導入する技術は、「Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)」及び「Ausubel et al., 同書」によって開示されている。
【実施例】
【００３９】
概括的方法：
工程Ａ：
１．第２の切断サイトの存在を決定することによる適切なカスパーゼの選択。この手順は、簡単な配列分析が幾つかの候補酵素を排除し得るために、大部分はコンピュータで行われ得る。しかしながら、ほとんどの場合、サイトの欠如のみが特定の酵素上での決定に用いられ得る一方、サイトの存在は、配列が三次元構造において近づけないために、排除されることを必ずしも保証するものではない。潜在的な切断サイトが構造中に存在する場合、到達性は、異常な切断のレベルを証明するために、上昇させた酵素濃度、即ち、最適なカスパーゼ活性のために提供された条件下での生成物に対するカスパーゼの割合1:20又は1:50を用いるカスパーゼ処理によってプローブされ得る（Stennicke & Salvesen. J.Biol.Chem. (1997) 272: 25719-25723）。
【００４０】
２．最適なリンカー及び融合パートナー／タグの組合せによる、適切な融合タンパク質の生成。TAG-カスパーゼサイト-IL21。一旦、特定の酵素上で決定されたら、IL21融合タンパク質は遺伝子工学によって生成され得る。そのような融合タンパク質の極めて簡単な例は、MHHHHHH-DEVD-IL21であり、これは、金属キレーティングクロマトグラフィーによる生成物の精製及び上述のカスパーゼ特異性に従ったカスパーゼ３又は７による処理を可能にする。
【００４１】
３．適切な発現宿主系におけるタンパク質の発現。E.coli中の封入体（IBs）中へのMet-IL21の発現のプロトコールは、既に開示されており（WO 00/53761又はWO 04055168）、このプロトコールは、融合タンパク質のためにも同様に利用できる。発現に続いて、細胞は遠心分離によって収集され、適切な物理的又は化学的技術、例えばソノケーション又はフレンチプレスによって破砕開口（broken open）される。IBs及び細胞断片は遠心分離で集められ、ペレットは、細胞断片の可溶化のための界面活性剤を含む適切なバッファーで繰り返し洗浄される。準精製IBsは、次いで、水で洗浄されて、適切な変性剤、典型的には尿素またはグアニジンに溶解される前に、界面活性剤の残渣を除去される。この時点で、タンパク質は、従来の方法に従って、親和性タグを用いてさらに精製され得る。
【００４２】
４．還元的当量の添加による所望のカスパーゼの活性化。カスパーゼのようなチオールプロテアーゼの使用において重要な工程は、還元による酵素の前活性化である。これは、ＤＴＴを、酵素ストック溶液に最終濃度10 mMで添加することによって最も容易に行われ、これは、３７℃で酵素の急速な活性化をもたらす。
【００４３】
５．折りたたみ又は展開の切断。一旦、融合タンパク質が単離されれば、3-4 Mの尿素及びEDTA又は還元当量を含むバッファー中でカスパーゼによって直接切断され得る。或いは、確立された手法（参考文献）を用いて再び折りたたまれ、次いで、純粋な再折りたたみ物質が適切なバッファー中で処理され得る。処理の完了に必要な時間は、カスパーゼ濃度、バッファー組成及び所望のIL-21タンパク質のＮ-末端配列に依存する。
【００４４】
６．生成物からのTAG及び未処理物質の分離。放出されたタグ及び未処理物質を除去するため、物質を簡単に、親和性マトリックスを通過させ、放出されたIL-21を含む通過液（flow-trough）を集める。カスパーゼを簡単に除去するために、幾つかのオプションがある：a) 未処理の物質と同時の除去を可能にするIL21と同じタグで生成され得る、b) ビーズ上で共有結合的に固定化され得る、又はc) 異なるタグが用いられる場合、幾つかの親和性マトリックスを含有する混合性ベッドカラムが、一つの工程で未処理物質、タグ及び酵素を除去するために用いられ得る。
【００４５】
[薬理学的方法]
CISNN116 (NT1-C3-hIL21)を発現するE.Coliの発酵からの細胞ペレットを、2 タブレット/L CompleteTM, 200 mg/L DNAse 及び20 mg/L MgCl2を含む溶解バッファーに再懸濁した。引き続いて細胞を、2000 Barで運転する細胞ディスプルーター（dispruter）を用いて開口（opened）した。
【００４６】
封入体(10 g)を、100 mlの6 M グアニジニウム（Guanidinium） HCl、100 mM Tris、40 mM ジチオスレイトール(DTT)、pH 8.0 に再懸濁した。再懸濁され還元された封入体を、2 Lの 0.9 M アルギニン、10 mM NaCl、2 mM MgCl2、0.5 mM KCl、2 mM CaCl2、1.5 mM DTT、4 mM L-システイン、50 mM Tris、pH 7.5、15 ℃にゆっくり添加することによる容積法を用いて、タンパク質を再び折りたたんだ。
【００４７】
一晩の再折りたたみ後、タンパク質を、25 mM Tris pH 7.5中に４倍に希釈し、TosoHaas sp 550cカラム上で、NaCl勾配を用いて溶出を行った。タンパク質を含む画分はプールし、親和性カラムで行った。
【００４８】
IL21融合タンパク質のカスパーゼ３タンパク分解のために用いたバッファーは；20 mM Tris、0.3 M NaCl、25 mM L-ヒスチジン、10 mM EDTA-Na2+、1 mM GSH、pH 7.0であった。プールされた画分は、カスパーゼ３を添加する前に37℃で予熱した。タンパク分解は、３７℃で１時間行った。タグ-DEVD-hIL21及びカスパーゼ 3の最終濃度は、それぞれ77 μM 及び 90 nMであった。
【００４９】
Maldi分析は、87 %の反応の完了を示した。天然のhIL-21は、Mono Sカラムを用いて、25 mMのTrisバッファー、pH 7.5中で、NaCl勾配により溶出し、タグ-DEVD-hIL-21 融合タンパク質及び他の不純物から分離した。
【００５０】
4 w/v % のマンニトールを、タンパク質の安定化のために、hIL-21を含む最終画分に加えた。続いて受容体アッセイ（BaFアッセイ）及びDSC（示差走査熱分析）分析は、CISNN116から生成したhIL-21が、先に精製されたバッチのMet-hIL-21と等効力であることを示し、また、先に精製されたバッチのMet-hIL-21と同じ融解温度 57 ℃を示した。
【国際調査報告】
2007512008.tif 000004
2007512008.tif 000005
2007512008.tif 000006
2007512008.tif 000007