(57)【要約】  二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び該プローブを使用する方法が記載されている。記載されているプローブは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応に対して特に適しており、ミスマッチに対して高い許容性を有する。
2007512837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸を含む核酸プローブであって、
（ａ）前記第一のオリゴ核酸が、
（ｉ）対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び
（ｉｉ）フルオロフォアを含み、
（ｂ）前記第二のオリゴ核酸が消光基質を含み、
（ｃ）前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が互いに対して実質的に相補的であり、
（ｄ）前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されたときに、前記第一のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
（ｅ）前記核酸プローブが、
（ｉ）前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「ｎ」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的で「ｍ」個の核酸塩基を含み、「ｍ」及び「ｎ」が、独立に選択される整数であり、並びに
（ｉｉ）ｍが２５未満であるときには、ｎはｍ／２以下であり；ｍが２６ないし２９であるときには、ｎは８ないし１３であり；ｍが３０ないし３４であるときには、ｎは８ないし１５であり；ｍが３５ないし３９であるときには、ｎは８ないし２０であり；ｍが４０ないし４４であるときには、ｎは９ないし２５であり；ｍが４５ないし４９であるときには、ｎは１０ないし３０であり；ｍが５０ないし５４であるときには、ｎは１０ないし３５であり；ｍが５５ないし５９であるときには、ｎは１０ないし４０であり；ｍが６０ないし６４であるときには、ｎは１１ないし４５であり；ｍが６５ないし６９であるときには、ｎは１１ないし５０であり；ｍが７０ないし７５であるときには、ｎは１５ないし５５である、
ことを特徴とする、
前記核酸プローブ。
【請求項２】
第一及び第二のオリゴ核酸が、対象核酸及び第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的でないさらなる核酸塩基を、それぞれ５’及び３’末端にさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が１．１を超える、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が０．１を超え及び０．９未満である、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項５】
第一のオリゴ核酸が消光基質をさらに含む、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項６】
第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が０．１を超え及び０．９未満である、請求項５に記載の核酸プローブ。
【請求項７】
第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が１．１を超える、請求項５に記載の核酸プローブ。
【請求項８】
対象核酸に結合されたときに２個のフルオロフォアを含む第一のオリゴ核酸によって生成される蛍光が、ただ一つのフルオロフォアが存在する場合に生成される蛍光より実質的に大きくなるようにするために、前記第一のオリゴ核酸が少なくとも２個のフルオロフォアを含む、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項９】
第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸を含む核酸プローブであって、
（ａ）前記第一のオリゴ核酸が、
（ｉ）対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び
（ｉｉ）消光基質を含み、
（ｂ）前記第二のオリゴ核酸がフルオロフォアを含み、
（ｃ）前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が互いに対して実質的に相補的であり、
（ｄ）前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されるときに、前記第二のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
（ｅ）前記核酸プローブが、
（ｉ）前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「ｎ」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的な「ｍ」個の核酸塩基を含み、「ｍ」及び「ｎ」が独立に選択される整数であり、並びに
（ｉｉ）ｍが２５未満であるときには、ｎはｍ／２以下であり；ｍが２６ないし２９であるときには、ｎは８ないし１３であり；ｍが３０ないし３４であるときには、ｎは８ないし１５であり；ｍが３５ないし３９であるときには、ｎは８ないし２０であり；ｍが４０ないし４４であるときには、ｎは９ないし２５であり；ｍが４５ないし４９であるときには、ｎは１０ないし３０であり；ｍが５０ないし５４であるときには、ｎは１０ないし３５であり；ｍが５５ないし５９であるときには、ｎは１０ないし４０であり；ｍが６０ないし６４であるときには、ｎは１１ないし４５であり；ｍが６５ないし６９であるときには、ｎは１１ないし５０であり；ｍが７０ないし７５であるときには、ｎは１５ないし５５である、
ことを特徴とする、
前記核酸プローブ。
【請求項１０】
第一及び第二のオリゴヌクレオチドが、対象核酸及び第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的でないさらなる核酸塩基を、それぞれ５’及び３’末端にさらに含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
第二のオリゴ核酸に対する第一のオリゴ核酸の比が１．１を超える、請求項９に記載の核酸プローブ。
【請求項１２】
第二のオリゴ核酸に対する第一のオリゴ核酸の比が０．１を超え及び０．９未満である、請求項９に記載の核酸プローブ。
【請求項１３】
第二のオリゴ核酸が消光基質をさらに含む、請求項９に記載の核酸プローブ。
【請求項１４】
第二のオリゴヌクレオチドに対する第一のオリゴヌクレオチドの比が０．１を超え及び０．９未満である、請求項１３に記載の核酸プローブ。
【請求項１５】
第二のオリゴヌクレオチドに対する第一のオリゴヌクレオチドの比が１．１を超える、請求項１３に記載の核酸プローブ。
【請求項１６】
検査試料中の対象核酸を検出する方法であって、
ａ）検査試料を、必要に応じて逆転写試薬と、請求項１に記載の蛍光プローブを含むＤＮＡ増幅試薬と混合して反応容器中に混合物を生成させること、
（ｂ）必要に応じて適切な時間及び適切な逆転写条件下で、反応物をインキュベートしてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること、
（ｃ）適切な時間及び適切なＤＮＡ増幅条件下で、反応物をインキュベートして対象核酸の一部を増幅すること、並びに
（ｄ）前記検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、前記蛍光プローブからの蛍光を測定すること、を含み、
容器を閉鎖する前に、消光基質を含むオリゴ核酸の追加量を前記容器に添加して、１．１を超え及び２０未満である第二のオリゴヌクレオチド及び第一のオリゴヌクレオチド間のモル比を得る前記方法。
【請求項１７】
検査試料中の対象核酸を検出する方法であって、
ａ）検査試料を、必要に応じて逆転写試薬と、請求項９に記載の蛍光プローブを含むＤＮＡ増幅試薬と混合して、反応容器中に混合物を生成させること、
（ｂ）必要に応じて適切な時間及び適切な逆転写条件下で、反応物をインキュベートして、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること、
（ｃ）適切な時間及び適切なＤＮＡ増幅条件下で、反応物をインキュベートして、対象核酸の一部を増幅すること、
（ｄ）前記検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、前記蛍光プローブからの蛍光を測定すること、
容器を閉鎖する前に、消光基質を含む前記オリゴ核酸の追加量を前記容器に添加して１．１を超え及び２０未満である第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチド間のモル比を得る、前記方法。
【請求項１８】
検査試料中のＲＮＡを定量する方法であって、
（Ａ）検査試料を、増幅試薬、逆転写試薬及び第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸とを含む請求項１に記載の核酸プローブと混合して、反応容器中に混合物を生成すること、
（（ａ）前記第一のオリゴ核酸は、対象核酸に対して実質的に相補的であり、及びフルオロフォア含み、
（ｂ）前記第二のオリゴ核酸は、消光基質を含み、
（ｃ）前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸は互いに対して実質的に相補的であり、
（ｄ）前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されるときに、前記第一のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
（ｅ）前記核酸プローブは、
（ｉ）前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「ｎ」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的な「ｍ」個の核酸塩基を含み、「ｍ」及び「ｎ」が独立に選択される整数であり、並びに
（ｉｉ）ｍが２５未満であるときには、ｎはｍ／２以下であり；ｍが２６ないし２９であるときには、ｎは８ないし１３であり；ｍが３０ないし３４であるときには、ｎは８ないし１５であり；ｍが３５ないし３９であるときには、ｎは８ないし２０であり；ｍが４０ないし４４であるときには、ｎは９ないし２５であり；ｍが４５ないし４９であるときには、ｎは１０ないし３０であり；ｍが５０ないし５４であるときには、ｎは１０ないし３５であり；ｍが５５ないし５９であるときには、ｎは１０ないし４０であり；ｍが６０ないし６４であるときには、ｎは１１ないし４５であり；ｍが６５ないし６９であるときには、ｎは１１ないし５０であり；ｍが７０ないし７５であるときには、ｎは１５ないし５５である、
ことを特徴とする。）
（Ｂ）ｃＤＮＡが産生されるように、逆転写を許容することができ、必要に応じて増幅を許容することもできる条件下に検査試料を置くこと、
（Ｃ）ｃＤＮＡが増幅されるように、前記検査試料に熱サイクルを行うこと、
（Ｄ）前記検査試料中のＲＮＡの量の指標として、前記増幅反応の間に、前記検査混合物の蛍光を測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
検査試料中のＲＮＡを定量する方法であって、
（Ａ）検査試料を、増幅試薬、逆転写試薬及び第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸とを含む請求項９に記載の核酸プローブと混合して、反応容器中に混合物を生成すること、
（（ａ）前記第一のオリゴ核酸は、対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び消光基質を含み、
（ｂ）前記第二のオリゴ核酸がフルオロフォアを含み、
（ｃ）前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して、二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が互いに対して実質的に相補的であり、
（ｄ）前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されるときに、前記第二のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
（ｅ）前記核酸プローブは、
（ｉ）前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「ｎ」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的な「ｍ」個の核酸塩基を含み、「ｍ」及び「ｎ」が独立に選択される整数であり、並びに
（ｉｉ）ｍが２５未満であるときには、ｎはｍ／２以下であり；ｍが２６ないし２９であるときには、ｎは８ないし１３であり；ｍが３０ないし３４であるときには、ｎは８ないし１５であり；ｍが３５ないし３９であるときには、ｎは８ないし２０であり；ｍが４０ないし４４であるときには、ｎは９ないし２５であり；ｍが４５ないし４９であるときには、ｎは１０ないし３０であり；ｍが５０ないし５４であるときには、ｎは１０ないし３５であり；ｍが５５ないし５９であるときには、ｎは１０ないし４０であり；ｍが６０ないし６４であるときには、ｎは１１ないし４５であり；ｍが６５ないし６９であるときには、ｎは１１ないし５０であり；ｍが７０ないし７５であるときには、ｎは１５ないし５５である、
ことを特徴とする。）
（Ｂ）ｃＤＮＡが産生されるように、逆転写を許容することができ、必要に応じて増幅を許容することもできる条件下に検査試料を置くこと、
（Ｃ）ｃＤＮＡが増幅されるように、前記検査試料に熱サイクルを行うこと、
（Ｄ）前記検査試料中のＲＮＡの量の指標として、前記増幅反応の間に、前記検査混合物の蛍光を測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２０】
核酸プローブの、第一のオリゴ核酸および前記第二のオリゴ核酸が、逆転写温度において、一緒に結合しない、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
第一のオリゴ核酸も第二のオリゴ核酸も、逆転写温度において、対象ＲＮＡに実質的に結合しない、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
検査試料中の対象核酸を検出する方法であって、
（ｉ）検査試料をＤＮＡ増幅試薬と混合することと、
（ｉｉ）適切な時間及び適切なＤＮＡ増幅条件下で、反応物をインキュベートして、対象核酸の一部を増幅すること、
（ｉｉｉ）一本鎖であり、並びにフルオロフォア及び消光基質を含む第一のオリゴ核酸を添加すること、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の前、後又は同時に、消光基質を含む第二のオリゴ核酸を添加すること（溶液中で二本鎖を形成することができるように、第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸は相補的であり、前記検査試料中の前記第一のオリゴ核酸に対する前記第二のオリゴ核酸の比は０．１を超え及び０．９未満である。）、
（ｖ）前記検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、蛍光プローブからの蛍光を測定すること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、核酸の増幅及び検出の分野に関する。さらに、本発明は、単一の試薬混合物を用いてＰＣＲ及びプローブハイブリダイゼーションを実施するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡをベースとした分析は、臨床血液学、分子遺伝学、微生物学および免疫学を含む幅広い状況で日常的に使用されている。多くの現行技術は、いくつものタイプの増幅後検出技術と組み合わされた、対象ポリヌクレオチド（以後、「標的分子」という。）のＰＣＲ増幅に依存している。ＰＣＲをベースとしない他の増幅技術は、本分野において周知であり、オリゴライゲーション分析（ＯＬＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写により媒介される増幅（ＴＭＡ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれるが、これらには限定されない。さらに、これらの技術は、混合に適している。すなわち、一つの増幅反応の産物は別の増幅反応の標的として使用することができるので、感度を増加する傾向にある追加工程によって感度を増大することができる。
【０００３】
ある好ましい増幅フォーマットはリアルタイムホモジニアスアッセイとして知られている。リアルタイムアッセイとは、増幅過程の終わりではなく、増幅過程中に標的分子の存在または量を示すデータを生じるアッセイである。ホモジニアスアッセイとは、増幅および検出試薬が一緒に混合され、同時に、標的核酸分子を含有し得る試料と接触されるアッセイである。このため、増幅が進行するにつれて、リアル均質システムにおいてＤＮＡ標的を検出及び定量する能力は、標的分子の増幅及び検出に必要とされるプロセスが単一の「閉じたチューブ」の反応フォーマットで行われる単一チューブアッセイに集中化される。例えば、ＰＣＲ増幅を用い、これらの特長を有する現行技術は、リアルタイムＰＣＲ技術として一般に知られている。同様に、ＰＣＲをベースとしない技術も当業者の範疇に属し、均質な検出方法に適している。
【０００４】
多くの増幅及び検出技術において、増幅産物を検出するためにプローブが用いられる。本分野で公知の幾つかのプローブシステムは、フルオロフォアおよび消光基質を利用する。例えば、分子指標プローブは、通常、フルオロフォアおよび消光基質がオリゴヌクレオチドの反対末端に配置されたヘアピン構造を形成できる一本鎖オリゴ核酸プローブである。プローブのいずれかの末端において、短い相補的配列により分子内幹の形成が可能となり、この分子内幹によってフルオロフォアおよび消光基質が極めて近接した状態になる。分子指標のループ部分は、対象標的核酸に対して相補的である。その対象標的核酸への、このプローブの結合は、幹を分離させるハイブリッドを形成する。これにより、フルオロフォアおよび消光基質が互いに離れるように移動させる高次構造変化が引き起こされ、より強い蛍光信号をもたらす。しかしながら、分子指標プローブは、プローブ標的中のわずかな配列変動に対して非常に感度が高い（Ｔｙａｇｉ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ．Ｒ．，  Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１４，  ｐａｇｅｓ  ３０３−３０８（１９９６）；Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６，ｐａｇｅｓ  ４９−５３  （１９９８）；  Ｐｉａｔｅｋ  ｅｔａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １６，  ｐａｇｅｓ  ３５９−３６３  （１９９８）；  Ｍａｒｒａｓ  Ｓ．  ｅｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ：  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．  １４，  ｐａｇｅｓ  １５１−１５６  （１９９９）；  Ｔａｅｐｐ  ｅｔ  ａｌ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ  ２８  ７３２−７３８  （２０００））。
【０００５】
分子指標プローブとは異なり、オリゴヌクレオチドの反対末端に消光基質およびフルオロフォアも付着された一部の一本鎖直鎖プローブは、ヘアピン構造を形成しない。代わりに、溶液中でのこの種の直鎖オリゴヌクレオチドプローブは、ランダムコイルのように挙動し、その二つの末端は時々互いに近接し、エネルギー転移が測定可能に変化する。しかしながら、プローブがその標的に結合するときに、プローブ−標的ハイブリッドはそのプローブの二つの末端を引き離すので、二つの末端部分の間の相互作用を崩壊させ、このためフルオロフォアからの蛍光信号を回復させる。さらに、一本鎖の直鎖プローブは、ＰＣＲの間に標的ストランドへ結合する「ＴａｑＭａｎプローブ」として設計することが可能であり、このため、ＰＣＲサイクルのプライマー伸長相の間に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって酵素的に開裂することができ、生成された特異的生成物の量に比例して、各サイクルにおいて蛍光の増加がもたらされる。長い一本鎖直鎖プローブには、高い「背景」信号という欠点を伴うのに対して、より短い一本鎖直鎖プローブは、単一塩基のミスマッチの影響を受けやすいことが報告されている（Ｌｅｅ  Ｌ．  Ｇ．  ｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｖｏｌ．  ２１，  ｐａｇｅｓ  ３７６１−３７６６（１９９３）；Ｔａｅｐｐ  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．（上記）；米国特許第６，２５８，  ５６９号；米国特許第６，０３０，  ７８７号）。
【０００６】
二本鎖直鎖プローブも本分野において公知である。二本鎖直鎖プローブは二つの相補的オリゴヌクレオチドを有する。従来技術に記載されているプローブは等しい長さのプローブであり、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが一本鎖高次構造中の標的配列に対するプローブとして作用する。オリゴヌクレオチドの一つの５’端はフルオロフォアで標識され、他のオリゴヌクレオチドの３’端は消光基質、例えばアクセプターフルオロフォアで標識され、又はこの逆も可能である。これら２つのオリゴヌクレオチドが互いにアニールされると、２つの標識は互いに近接し、それにより蛍光を消光する。しかしながら、標的核酸はプローブへの結合に関して競合し、標的核酸の濃度が増加しても、プローブの蛍光は比例的に増加しない（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８３，ｐａｇｅｓ  ２３１−２４４（１９８９）；米国特許５，９２８，８６２号）。
【０００７】
部分的に二重鎖の直鎖プローブを作製するために、２つの相補的オリゴヌクレオチドの一つを数塩基短縮されることによって修飾された二本鎖の直鎖プローブも本分野において公知である。従来技術におけるこのような二本鎖の直鎖プローブでは、より長いオリゴヌクレオチドがフルオロフォアで末端を標識され、わずかに短いオリゴヌクレオチドが消光基質で末端を標識されている。二本鎖の形態では、フルオロフォアおよび消光基質が近接しているために、プローブの蛍光はより小さい。しかしながら、標的の存在下では、より短い消光基質オリゴヌクレオチドが標的によって置換される。その結果、（プローブ−標的ハイブリッドの形態の）より長い方のオリゴヌクレオチドが実質的により蛍光が強くなる。
【０００８】
長さが等しくないオリゴヌクレオチドを有する、従来技術において公知の二本鎖プローブは、完全に適合した標的と単一ヌクレオチドのミスマッチ標的を完全に識別する。また、これらのプローブは、特に少量の標的核酸が存在する場合には、最適な反応速度論を有しない（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．３０，  Ｎｏ．  ２，  ｅ５  （２００２））。
【０００９】
ウイルスＲＮＡの検出には、対象ＤＮＡの検出を望む場合には存在しない、幾つかの困難な課題がある。従来技術のプローブはウイルスＲＮＡの検出に適しているが、改善の余地があり得る。まず、ウイルスＲＮＡ標的の中には、それらの宿主の体内で迅速に突然変異する傾向が存在するものがある。突然変異されたウイルスＲＮＡ配列がいわゆる「野生型」配列にとともに検出できるようにするために、ウイルスＲＮＡを検出するために使用される核酸プローブはミスマッチを許容できるものであり、且つ非標的核酸との相互作用（すなわち、偽陽性結果）を避けるために十分特異的でなければならない。従来技術のプローブの多くは、一本鎖のヌクレオチド変化の影響を受けやすく、従って、ウイルス核酸の検出に最適ではない。
【００１０】
さらに、ウイルスＲＮＡは、しばしば、対象核酸配列の増幅前に、ＤＮＡへと逆転写されなければならない。不運なことに、いくつかの従来技術の核酸プローブは、逆転写（すなわち、ＲＮＡ配列のＤＮＡ配列への酵素的複製）を妨げうることが本発明者によって発見されている。
【００１１】
核酸プローブが対象核酸の少量および多量の両方を高感度で検出できることも望ましい。従来技術の核酸プローブには、少量の対象核酸を検出するにはあまり適していないものがある。従来技術の他の核酸プローブは多量の核酸の高感度検出にはあまり適していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記に照らして、ａ）配列が容易に操作できる、ｂ）オリゴヌクレオチドが、幹またはループを形成できるように簡単に設計される（これに限定されない。）、ｃ）ミスマッチに対して高い許容性性がある、及び／又はｄ）オリゴヌクレオチドがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応に適している、プローブに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、一般的には、二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び該プローブを使用する方法に関する。本願のプローブは、任意の適切な様式で使用することが可能であり、単一の反応容器及び単一の試薬混合物を用いたＰＣＲ増幅及びプローブハイブリダイゼーションに特に極めて適している。
【００１４】
本発明は、第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸とを含む核酸プローブを提供する。前記第一のオリゴ核酸はフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）によって標識されており、対象核酸が存在する場合に、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に結合できるように、前記第一のオリゴ核酸は対象核酸に対して実質的に相補的である。前記第二のオリゴ核酸は消光基質分子を有し、前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である。従って、前記第一及び第二のオリゴ核酸は一緒に結合して、二本鎖核酸を形成することができる。前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されると、前記第一のオリゴ核酸に付着されたフルオロフォアの蛍光放射は消光される（すなわち、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合されていないときに、同一のフルオロフォアの放射に比べて検出可能に少なくなる。）。前記対象核酸への前記第一のオリゴ核酸の結合は、従って、検査システム中の蛍光を増加させ、それにより、対象核酸が存在するかどうかを示す。前記第一のオリゴ核酸は、対象核酸に対して実質的に相補的な「ｍ」個の連続する核酸塩基を含み、前記第二のオリゴ核酸は、第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的な「ｎ」個の連続する核酸塩基を含み、「ｍ」及び「ｎ」は、独立に選択される整数であり、ｍが２５未満であるときには、ｎは最大ｍの半分であり；ｍが２６ないし２９であるときには、ｎは８ないし１３であり；ｍが３０ないし３４であるときには、ｎは８ないし１５であり；ｍが３５ないし３９であるときには、ｎは８ないし２０であり；ｍが４０ないし４４であるときには、ｎは９ないし２５であり；ｍが４５ないし４９であるときには、ｎは１０ないし３０であり；ｍが５０ないし５４であるときには、ｎは１０ないし３５であり；ｍが５５ないし５９であるときには、ｎは１０ないし４０であり；ｍが６０ないし６４であるときには、ｎは１１ないし４５であり；ｍが６５ないし６９であるときには、ｎは１１ないし５０であり；ｍが７０ないし７５であるときには、ｎは１５ないし５５である。
【００１５】
本発明は、前記第一の長い方のオリゴ核酸が、対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び消光基質を含む、核酸プローブも提供する。前記第二の短い方のオリゴ核酸がフルオロフォアを含む。前記第一のオリゴ核酸は前記第二のオリゴ核酸に対して実質的に相補的であり、これにより、第一のオリゴ核酸の第二のオリゴ核酸の同時ハイブリダイゼーション及び第二のオリゴ核酸の蛍光の消光が可能になる。前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に結合されると、前記第二のオリゴ核酸が置換され、フルオロフォアの蛍光放射は、それが第一のオリゴヌクレオチドにアニールされたときより検出可能に大きい。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載されている本発明の核酸プローブの任意の実施形態を使用して、検査試料中の対象核酸を検出又は定量する方法も提供する。例えば、本発明は、ｃＤＮＡが産生及び増幅されるように、逆転写が可能であり、及び後に／同時に核酸増幅が可能である条件下で、試料が核酸増幅試薬及び逆転写試薬と接触される、検査試料中のＲＮＡを定量する方法を提供する。この混合物は、本明細書に記載されている本発明の核酸プローブと順次又は同時に接触され、前記プローブの第一及び第二のオリゴ核酸は、逆転写工程の温度では、互いに及び／又は標的ＲＮＡに結合しない。
【００１７】
本発明は、対象核酸の一部を増幅するためのＤＮＡ増幅試薬と、並びにフルオロフォア及び消光基質を有し、増幅される核酸に対して特異的である第一のオリゴ核酸プローブと、検査試料が接触される、検査試料中の対象核酸を検出及び／又は定量する方法も提供する。混合物中の第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が１未満となり得、及び前記第一及び第二のオリゴ核酸が溶液中で二本鎖を形成するような比で、第一の一本鎖オリゴ核酸の添加前、添加中又は添加後に、消光基質を含む第二のオリゴ核酸が添加される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、対象核酸（一般的には、標的とも呼ばれる。）の存在を検出するのに有用な、以下に記載されている核酸プローブを提供する。もちろん、第一のオリゴ核酸は、対象核酸の増幅された部分にも結合することができる。記述および理解を簡単にするために、対象核酸又は「標的」という表記は、別段の記載がなければ、検査試料中に見出されるこれらの部分及びこれらの核酸の部分の増幅されたコピーの両方を表す。
【００１９】
本発明は、第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸とを含む核酸プローブを提供する。前記第一のオリゴ核酸はフルオロフォアによって標識されており、対象核酸が存在する場合に、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に結合できるように、前記第一のオリゴ核酸は対象核酸に対して実質的に相補的である。本発明において、「実質的に相補的な」という用語は、対応するヌクレオチドが互いにハイブリダイズできるようなアラインメントにおいて、プローブの一方の鎖上の８０％以上の核酸塩基が、プローブの他方の鎖上（又は対象核酸中）にそのワトソン・クリック結合対を見出すことを意味する。第一のオリゴ核酸が対象核酸に結合することにより、プローブの第一のオリゴ核酸への第二のオリゴ核酸の結合が妨げられる。第二のオリゴ核酸は消光基質分子を有し、前記第一のオリゴ核酸に対しても実質的に相補的である。従って、対象核酸が存在しない場合には、第一及び第二のオリゴ核酸は一緒に結合して、二本鎖核酸を形成することができる。第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸と結合すると、前記第一のオリゴ核酸に付着されたフルオロフォアの蛍光放射が消光される（すなわち、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合されていない場合に、同一の蛍光プローブの放射に比べて検出可能に変化する、好ましくは減少する。）。前記対象核酸への前記第一のオリゴ核酸の結合は、従って、検査システム中の蛍光を変化させ、好ましくは増加させ、それにより、対象核酸が存在するかどうかを示す。一実施形態において、前記第一のオリゴ核酸は、標的に実質的に相補的な１５ないし７５個の核酸塩基（「ｍ」）を含有し、前記第二のオリゴ核酸は、前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的な「ｎ」個（「ｎ」は、「ｍ」より有意に短い。）の核酸塩基を含有する。第二のオリゴ核酸は、対象核酸が存在しない場合に、検査試料中の対象核酸の有無を推定するためにプローブが使用される温度及び溶媒条件下で、第二のオリゴ核酸が第一のオリゴ核酸と結合しなければならないことを第一に考えながら、任意の適切な長さとすることができる。
【００２０】
表１は、本発明の本実施形態の二本鎖プローブ中に取り込まれた第一および第二のオリゴ核酸の好ましい長さ及びさらに好ましい長さを示している。
【００２１】
【表１】
2007512837.tif 000003
【００２２】
いかなる理論に拘泥することも望むものではないが、第一のオリゴ核酸の長い一本鎖部分は、対象標的核酸への第一のオリゴ核酸の結合を強く好み、それにより、プローブの感受性を増加させ、幾つかの条件下では、検出反応の速度を向上させると考えられている。さらに、第一のオリゴ核酸の長さが長いほど、ミスマッチハイブリダイゼーションを許容するハイブリダイゼーション条件の使用が可能となる。
【００２３】
オリゴ核酸は、天然に存在する核酸塩基又は修飾された核酸塩基のオリゴマーである。グアニン、アデニン、チミン、ウリジン、シトシン、並びに必要に応じてイノシン及び／又はインドールが、本発明のオリゴ核酸中に取り込まれる好ましい核酸塩基に属するが、任意の適切な核酸塩基が本発明のプローブ中に取り込まれ得る。オリゴ核酸は、必ずしも、酸又は酸の残基ではない。むしろ、本明細書において使用されるオリゴ核酸は、ワトソン−クリックタイプの塩基対などの、単量体と単量体の相互作用の規則的パターンを通じて、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる核酸塩基又は核酸塩基類縁体のポリマーである。最も一般的には、単量体は、ホスホジエステル結合によって連結されている。これより一般的ではないが、単量体は、（デオキシリボシル）ホスホニルポリマー又はホスホチオレートポリマーなど、ホスホジエステル結合の類縁体によって連結される。同じくこれに比べて一般的に使用されていないのは、アミド結合を規則的な間隔で含有するポリマーによって核酸塩基が配列中に連結されているペプチド核酸（本分野では一般的に、ＰＮＡと称される。）である（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ２５４：１４９７−１５００  （１９９１））。
【００２４】
本発明のプローブ中に取り込まれたオリゴ核酸を合成する方法は本分野において周知であり、本発明のオリゴ核酸を取得する任意の適切な方法を使用することができる。
【００２５】
フルオロフォア又は「蛍光標識」は、光を放射することができる任意の適切な部分であり得る。光は、励起性光子に反応して、化学的に、生物学的に生成されることができ、又は他の任意の適切な原因から生成されることができる。好ましくは、フルオロフォアは、連結部分を介して、プローブのオリゴ核酸に付着するために誘導化された蛍光有機色素である。核酸塩基を一緒に連結するためにリボシル又はデオキシリボシルポリマーが使用される場合には、前記色素は、ポリマーの末端３’炭素又は末端５’炭素に連結するように、有利に誘導化され得る。
【００２６】
本発明において適切なフルオロフォアには、スミレ色／青色の色素（Ｅｍｍａｘ  ３７５−４９１ｎｍ）  ７−メトキシクマリン−３−カルボキシ、ＡＭＣＡ−Ｘ（７−アミノクマリン−Ｘ）、６−ＭＩ又は６−ＭＡＰ（６−メチル−８−（２−デオイ（ｄｅｏｙ）−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリジン）；緑色／黄色の色素（Ｅｍｍａｘ  ４９２−５８５ｎｍ）ＤＴＡＦ（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン、６−ＦＡＭ（フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン）、ダンシル−Ｘ（６−（（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル）アミノ）ヘキサノエート、６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ（テトラメチルローダミン置換体）、ＰｙＭＰＯ（１−（３−カルボキシベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド）、ＴＡＭＲＡ−Ｘ（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）；オレンジ色の色素（Ｅｍｍａｘ  ５８６−６４７ｎｍ）ローダミン誘導体ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＲＯＸ（カルボキシローダミン）、ＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＮＥＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及び赤色の色素（Ｅｍｍａｘ  ６４７−７００ｎｍ）カルボキシナフトフルオレセインが含まれる（これらに限定されない。）。
【００２７】
本明細書において使用される消光基質とは、信号が測定される波長でフルオロフォアによって放射される光を減少させる部分であり、又は核酸プローブのフルオロフォアによって放射される光の波長をシフトさせる役割を果たす蛍光部分である。本発明において適切な消光基質には、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＱＳＹ−７−（９−［２−［［４−［［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］カルボニル］−１−ピペリジニル］スルホニル］フェニル］−３，６−ビス（メチルフェニルアミノ））、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  ２００３，  Ｃａｔ．  Ｎｏｓ．  ＢＧ５−５０４１Ｔ、ＢＧ５−５０４２Ｔ及びＢＧ５−５０４３Ｔ）及びＴＡＭＲＡ（（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）が含まれる（これらに限定されない。）。さらに、消光基質は、本発明の実施形態に応じて、蛍光性であってもよく、蛍光性でなくてもよい有機色素であり得る。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、前記第一及び第二のオリゴ核酸が、対象核酸又は前記第一の核酸に対して相補的でない追加の核酸塩基を、それぞれ５’及び３’末端に含むプローブを含む。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、フルオロフォアを含む前記第一のオリゴ核酸に対する、消光基質を含む前記第二のオリゴ核酸の比が１．１を超え得るプローブを含む。さらに、別の実施形態は、フルオロフォアを含む前記第一のオリゴ核酸に対する、消光基質を含む前記第二のオリゴ核酸の比が０．１超及び０．９未満プローブであり得るプローブを含む。
【００３０】
本発明のプローブの別の実施形態では、前記第一のオリゴ核酸は、２つの標識部分（１つはフルオロフォア及び１つの消光基質）を含む。第一のオリゴ核酸中に（フルオロフォアに加えて）消光基質を取り込むことによって、第一のオリゴ核酸が標的にも、消光基質を含む第二のオリゴ核酸にも結合しない場合に生じ得るバックグラウンド蛍光放射（又はバックグラウンド信号）が減少する。別の実施形態は、（１つのフルオロフォアと１つの消光基質を含む）前記第一のオリゴ核酸に対する前記第二のオリゴ核酸（消光基質を含む。）のモル比が、０．１超及び０．９未満であるプローブを含む。さらに、別の実施形態は、前記第一のオリゴ核酸（２つの標識部分を有する）に対する第二のオリゴ核酸のモル比が１．１超であるプローブを含む。
【００３１】
本発明の核酸プローブからの蛍光シグナルを向上させるために、標的に結合するオリゴ核酸に、２以上の蛍光プローブを連結させ得る。好ましくは、２以上の蛍光プローブを含む本発明のプローブは、単一の蛍光プローブのみを含む等価なプローブより実質的に多い蛍光シグナルを放射する。思いがけないことに、少なくとも３個の蛍光プローブを含有するプローブは、標的分子とのミスマッチ（すなわち、完全な相補的に満たない）を許容することが見出された。これは、ＨＩＶ−１及び他のレトロウイルスの部分の場合のように、標的核酸が高度に多型性であるときに特に有利であり得る。本発明のプローブのミスマッチ許容性は、プローブの第一のオリゴ核酸に付着されたフルオロフォアの数に依存せず、２以上のフルオロフォアを有するプローブは、２、３又は４個のミスマッチを有する標的に対して、蛍光色素をただ一つ有する類似の長さのプローブと同じ高い許容性を示すので、本発明のプローブは、ウイルス標的配列の検出及び定量に極めて適している。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の核酸プローブは３つのオリゴ核酸を含み、第一のオリゴ核酸はフルオロフォアを含み、第二のオリゴ核酸は消光基質を含む。第三のオリゴ核酸は、好ましくは、消光基質も含む。いかなる理論にも拘泥することを望むものではないが、第三のオリゴ核酸中にさらに消光基質を取り込むことにより、バックグラウンド蛍光放射（またはバックグラウンドシグナル）が減少すると思われる。一般的には、バックグラウンド信号は、対象標的核酸への、プローブの蛍光標識されたオリゴ核酸の結合によって引き起こされたものではない蛍光の放射である。
【００３３】
別の実施形態では、長い方のオリゴ核酸が消光基質を含み、短い方のオリゴ核酸がフルオロフォアを含む。さらに、本実施形態は、前記第一及び第二のオリゴヌクレオチドが、対象核酸及び前記第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的でないさらなる核酸塩基を、それぞれ５’及び３’末端にさらに含むプローブを含む。さらに、第一及び第二のオリゴ核酸は何れも、複数の標識部分を含むこともできる。例えば、第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸の両方が、フルオロフォアと消光基質を両方含むことができる。典型的には、非標識オリゴヌクレオチド配列（例えば、標識）に結合された場合に、フルオロフォアと消光基質が分離され、フルオロフォアが光を放射できるように、フルオロフォアと消光基質は、オリゴ核酸中に取り込まれる。しかしながら、プローブの第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合されると、第一のオリゴ核酸のフルオロフォアは、第二のオリゴ核酸の消光基質と近接し、逆も同様である（すなわち、第二のオリゴ核酸のフルオロフォアが、第一のオリゴ核酸の消光基質と近接する）。このように、第一及び第二のオリゴ核酸は何れも、標的の存在下で光を放射することができるが、標的の不存在下では相互に消光される。さらに、本実施形態の前記第一及び第二のオリゴ核酸は、対象核酸又は前記第一の核酸に対して相補的でない追加の核酸塩基を、それぞれ５’及び３’末端に含み得る。
【００３４】
さらに、本実施形態は、フルオロフォアを含む前記第二のオリゴ核酸に対する、消光基質を含む前記第一のオリゴ核酸の比が１．１を超える核酸プローブを含む。さらに別の実施形態では、前記第一のオリゴ核酸は追加の消光基質を含む。本実施形態は、第二のオリゴ核酸に対する第一のオリゴ核酸の比が０．１超及び０．９未満であるプローブを許容する。また、本実施形態は、第二のオリゴ核酸に対する第一のオリゴ核酸の比が１．１超であるプローブを許容する。
【００３５】
好ましい実施形態では、フルオロフォアと消光基質が近接している場合の二本鎖形態と、フルオロフォアが消光基質から離れているときに標的がハイブリダイズした状態との蛍光シグナルの差は、最大２０桁にも及び得る。この効果は、双方が近接している場合には、フルオロフォアの比較的効率的な消光が存在するのに対して、第一のオリゴ核酸が標的核酸にアニールした場合には、それは（消光基質を含む）第二のオリゴ核酸から離れ、フルオロフォアはもはや消光されなくなるという事実に起因する。本明細書において使用される「消光」という用語は、フルオロフォア分子と消光基質分子が近接した場合に蛍光の大幅な喪失が生じる任意のプロセスを指す。消光基質の群に含まれるのは、フルオロフォアから光エネルギーを受容することができる非蛍光分子及び蛍光分子である。
【００３６】
好ましい実施形態では、第一のオリゴ核酸の３’末端は、単独で又はプローブの第二のオリゴ核酸の３’末端と一緒になって、ＰＣＲ重合工程との妨害を抑制し、それにより、増幅の段階的な効率性の減少を抑制するために、核酸ポリメラーゼによる伸長を不可能とされる。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、二本鎖プローブの第一のオリゴ核酸又は第一及び第二のオリゴ核酸は、核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解の影響を受けないようにされる。好ましくは、オリゴ核酸の５’末端は、一以上の修飾されたヌクレオチド間結合をオリゴ核酸の５’末端中に含めることによって、消化に対して耐性を与えられる。最低限、５’末端のヌクレオチド間結合は修飾されなければならないが、オリゴヌクレオチド中の最大全てのヌクレオチド間結合を修飾することができる。このようなヌクレオチド間修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成において使用される種類の修飾された結合を含み得る。このようなヌクレアーゼ耐性結合の例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２５４，  ｐａｇｅｓ  １４９７−１５００（１９９１））、及び他の類似のエキソヌクレアーゼ耐性結合が含まれる。あるいは、対象核酸に対して相補的でない配列を添加することによって、又はオリゴ核酸の５’末端への誘導体部分の添加によって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解に対する耐性を５’末端に与えることができる。
【００３８】
有利なことに、上記プローブは何れも（各々が２個のオリゴ核酸を含む。）、標的核酸の存在又は量を決定する方法において使用することができる。以下の方法では、任意の適切な対象核酸が標的核酸であり得る。しかしながら、標的核酸は、好ましくは、ウイルスＲＮＡ又はｍＲＮＡなどのＲＮＡである。幾つかの実施形態では、好ましくは、標的ＲＮＡは増幅の前に逆転写され、この増幅も、好ましくは、逆転写工程と同じチューブ及び反応混合物中に実施される。
【００３９】
検査試料中の対象核酸を検出又は定量する本発明の方法は、対象核酸の一部を増幅するために、検査試料をＤＮＡ増幅試薬と混合することを含む。該試薬は、必要に応じて、逆転写試薬を含むことができる。増幅試薬と対象核酸の混合物は、次いで、標的ＲＮＡを標的相補的ＤＮＡへ適宜逆転写した後、標的ＤＮＡを増幅するために、適切な条件下でインキュベートされる。本方法は、フルオロフォアを有する第一のオリゴ核酸と上述されているような消光基質を有する第二のオリゴ核酸とを含む核酸蛍光プローブを添加することと、検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、蛍光プローブからの蛍光を測定することも含む。幾つかの実施形態において、前記プローブは、増幅試薬の前又は増幅試薬と実質的に同時に対象核酸に接触され、増幅試薬を対象核酸に接触させる前に、増幅試薬と必要に応じて混合される。他の実施形態において、前記プローブは、（対象核酸の一部を増幅するために）対象核酸及び増幅試薬を適切な増幅条件下でインキュベートした後に、対象核酸に接触させられる。
【００４０】
増幅試薬は、ＰＣＲプロセスを実行するために必要とされる、標的核酸配列とは異なる化学物質を指す。これらの化学物質は、以下の４つのクラスの成分に都合よく分類することができる。（ｉ）しばしば、マグネシウム塩（これに限定されない。）を含む水性緩衝液、（ｉｉ）重合を基礎とする増幅における４つのリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）若しくは好ましくは少なくとも４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）又は連結をベースとする増幅におけるＡＴＰなどの増幅基質、（ｉｉｉ）一以上のオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブ（通常、各標的配列（ＰＣＲが使用される場合に、二本鎖標的配列の２つの相補鎖の５’末端を画する配列）に対する２つのプライマー）、及び（ｉｖ）ポリヌクレオチドポリメラーゼ（例えば、ＰＣＲ用のＴａｑポリメラーゼ又はＴＭＡ用のＲＮＡポリメラーゼ）又はリガーゼなどの増幅酵素。当業者の裁量により、さらなる試薬又は添加剤を含ませることも可能であり、これらの試薬の選択は当業者の技術の範疇に属する。もちろん、増幅試薬が逆転写と増幅の双方を生じさせるために使用される場合には、逆転写試薬は増幅試薬中にも含まれる。使用される増幅反応の方法に従って、増幅試薬を選択することは、当業者の技術の範疇に属する。
【００４１】
「均質な」増幅及び検出工程を使用する実施形態では、すなわち、単一のチューブ中、単一の反応混合物中で、増幅及びプローブハイブリダイゼーション検出を一体として実施する場合には、（ｉ）プローブの２つのオリゴ核酸は何れも、好ましくは、ＰＣＲ若しくは他の増幅工程を遮断若しくはその他の方法で妨害せず、又はＰＣＲ若しくは他の増幅工程に関与せず；（ｉｉ）プローブのオリゴ核酸は何れも、酵素によって（例えば、ポリメラーゼ酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって）分解されず；並びに（ｉｉｉ）プローブのオリゴ核酸は、好ましくは、酵素、例えば、ポリメラーゼの５’→３’重合活性によって伸長又はその他の修飾を受けない。
【００４２】
本発明の方法の別の実施形態では、容器を閉鎖する前に、（消光基質を含む）第二のオリゴ核酸のさらなる量が容器に添加され、１を上回り、必要に応じて１．１以上又は１．２以上であり、且つ２０未満、好ましくは５以下、より好ましくは２．５以下、さらに好ましくは２以下であり、必要に応じて１．５以下である、フルオロフォアを含む第一のオリゴ核酸に対する消光基質を含む第二のオリゴ核酸のモル比を得るために、増幅条件下で反応混合物をインキュベートする。
【００４３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記プローブは、核酸重合を遮断することができる本分野で公知の有機又は無機部分を核酸の３’末端に連結することによって、ＰＣＲ重合工程を妨害し、又はＰＣＲ重合工程に関与できないようにされる。有利なことに、この重合遮断部分は、フルオロフォア又は消光基質分子とすることが可能であり、連結部分によって、又は３’末端のヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにすることによって、プローブのオリゴ核酸の一方又は両方に付着させることができる。同様に、プローブのオリゴ核酸は、プローブのオリゴ核酸が酵素を介した重合を開始することができないように、完全に又は部分的にＰＮＡとすることができる。あるいは、オリゴ核酸の３’末端は、ホスホノエート又はホスホチオレート結合などの（これらに限定されない。）一以上の修飾されたポリメラーゼ耐性ヌクレオチド間結合をオリゴヌクレオチドの３’末端中に含めることによって、ポリメラーゼの５’→３’伸長活性の影響を受けないようにされる。同様に、ミスマッチが酵素を介した重合を妨げ、又は抑制するように、プローブのオリゴ核酸の一方又は両方の３’末端に、対象核酸に対して非相補的な配列を付着させることができる。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、本発明のプローブのオリゴ核酸は、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性があり、又はエキソヌクレアーゼ消化の影響を受けないようにすることができる。エキソヌクレアーゼ消化を妨げ、又は抑制する適切な方法には、対象核酸に相補的でない５’伸長を導入すること、オリゴ核酸の２つのヌクレオチジル塩基の間に非ホスホジエステル結合を付加すること、及びオリゴ核酸の一方又は両方の５’末端に（それ自体）本分野で公知の有機又は無機の遮断部分を付加することが含まれる（これらに限定されない。）。
【００４５】
同様に、プローブのオリゴ核酸の酵素的分解は、このような活性を欠く増幅酵素を使用することによって、妨げ、又は抑制することができる。増幅をベースとする反応の場合には、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用することができる。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼは、本分野において公知であり、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片、及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たない他の同様のＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
ポリメラーゼは、必要に応じて、少なくともそのエキソヌクレアーゼ活性に関して、ハイブリダイゼーション工程の間、不活性とすることも可能である。このような不活化は、（ｉ）ハイブリダイゼーション温度で、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し得る温度感受性阻害剤（例えば、固体吸着剤、特異的な抗体分子又は他の同様の可逆的若しくは不可逆的ポリメラーゼ阻害剤）を反応中に導入すること；（ｉｉ）ハイブリダイゼーション温度で、その活性が大幅に減少されるポリメラーゼを使用すること；又は（ｉｉｉ）ポリメラーゼ酵素を不可逆的に非活性化する酵素非活性化工程をハイブリダイゼーション工程の前に導入すること（すなわち、高温での期間の延長）を含む数多くの方法で達成することができる。
【００４７】
ある実施形態において、逆転写の効率は、反応混合物が逆転写中にインキュベートされる温度より低い、第二のオリゴ核酸への第一のオリゴ核酸のＴｍ（融解温度）を有する、対象標的ＲＮＡに対して相補的であるオリゴ核酸を含むプローブを使用することによって増加される。いかなる理論にも拘泥することを望むものではないが、プローブのＴｍの各々を上回る温度で逆転写工程を実行することによって、プローブは、逆転写を媒介する酵素に拮抗的に結合することにより標的ＲＮＡと競合しない。
【００４８】
同様に、プローブの存在下で逆転写を使用する実施形態では、プローブのオリゴ核酸は何れも（又は全く）、逆転写が起こる温度で標的ＲＮＡに結合しない。
【００４９】
（実施例）
本発明は以下の実施例によってさらに明確になるが、実施例は本発明を説明することを意図するものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５０】
融解曲線アッセイによって評価されるミスマッチ許容性に及ぼす核酸プローブの二つのオリゴ核酸の間の長さの差の影響。
【００５１】
融解反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量ＰＣＲシステムにおいて、以下のサイクル条件で行った。すなわち、９５℃、３分間の変性を１サイクルと、１サイクルあたり１℃の低下させながら、８５℃から１０℃の範囲の温度での１分間の保持を７５サイクル。フルオレセイン（ＦＡＭ）蛍光測定結果は、７５サイクルの各１分間の保持の間に記録された。各操作の終わりに、データを分析し、融解曲線を作成した。
【００５２】
表２には、本実施例およびその後の実施例において用いられるＰＣＲプライマーおよび直鎖プローブの配列が記載されている。
【００５３】
【表２】
2007512837.tif 000004
【００５４】
各アッセイにおいて、１００μｌの反応液は１．２５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（６２．５ｍＭビシン、ｐＨ８．０５〜８．２５、１４３．７５ｍＭ  酢酸カリウム、１０％グリセロール、０．１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１２５ｍｇ／ｍｌ  アセチル化ウシ血清アルブミン（アセチル化ＢＳＡ）、０．０７８％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、および０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．２μＭのＦＡＭ標識されたオリゴ核酸（「オリゴ」）、０．２μＭのＤＡＢＣＹＬ標識された消光オリゴ、および４８ヌクレオチド長であり、０、１、２、３または４個のミスマッチを有するＦＡＭ標識されたオリゴを含む（オリゴはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓから入手した。）１μＭの一本鎖相補的標的オリゴを含んでおり、。ＦＡＭ標識されたオリゴの長さは２０ヌクレオチド長又は３１ヌクレオチド長のいずれかであるのに対して、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光オリゴは、長さ１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、または１６ヌクレオチドであった。図１Ａ〜Ｆは、０〜４の範囲の異なる数のミスマッチを有する標的オリゴの存在下又は不存在下で、一連の二本鎖直鎖プローブセットでの融解曲線を示す。ＦＡＭ蛍光強度は温度の関数として測定された。（Ａ）５２０−２０／ｑｕｅ−１６；（Ｂ）５２０−２０／ｑｕｅ−１４；（Ｃ）５２０−２０／ｑｕｅ−１２；（Ｄ）５２０−３１／ｑｕｅ−１４；（Ｅ）５２０−２０／ｑｕｅ−１２；（Ｆ）５２０−３１／ｑｕｅ−１４であった。（Ａ）〜（Ｃ）についてのミスマッチ（以後、「ｍｉｓ」）の位置は次のとおりである。１ｍｉｓは１２番目のヌクレオチドである；２ｍｉｓは１２番目および１８番目のヌクレオチドである。（Ｄ）についてのミスマッチの位置については、１ｍｉｓは１２番目のヌクレオチドである；３ｍｉｓは１２番目、１８番目、および２７番目のヌクレオチドである。（Ｅ）についてのミスマッチの位置については、１ｍｉｓは３番目、９番目、または１２番目であり；２ｍｉｓは９番目および１２番目のヌクレオチドである。（Ｆ）についてのミスマッチの位置は以下のとおりである。１ｍｉｓは１２番目である；２ｍｉｓは９番目および２７番目、２１番目および２７番目、２４番目および２７番目、３番目および２７番目、または９番目および１２番目のヌクレオチドである；３ｍｉｓは２４番目、２５番目、および２７番目、または１２番目、２１番目、２７番目のヌクレオチドである；４ｍｉｓは２１番目、２４番目、２５番目、２７番目のヌクレオチドである。ミスマッチとなったすべてのヌクレオチドの位置は各個々のＨＩＶ  ＦＡＭ直鎖プローブの５’末端から始まる。
【００５５】
高温で、各二本鎖直鎖プローブセットのＦＡＭ標識されたオリゴと、これより短いＤＡＢＣＹＬ標識された相補的消光オリゴは分離されるので、ＦＡＭ蛍光の回復がもたらされた。標的オリゴの不存在下では、これら二つのオリゴは、インキュベーション温度が低下するにつれ、互いに徐々にハイブリダイズする傾向があり、蛍光プローブＦＡＭおよび消光基質ＤＡＢＣＹＬが近接するために、非蛍光性二本鎖を形成した。消光オリゴのＴｍは非蛍光性二本鎖が形成し始めるインキュベーション温度を決定した。１６の相補的ヌクレオチドの長さを有する消光オリゴｑｕｅ−１６（表２）は約６０℃で非蛍光性二本鎖の形成を開始した（図１Ａ）のに対し、１４塩基（ｑｕｅ−１４；表２）および１２塩基（ｑｕｅ−１２；表２）の消光オリゴは、それぞれ約５５℃および５０℃付近で開始した（図１Ｂおよび図１Ｃ）。０ミスマッチの標的オリゴの存在下では、標的オリゴよりも短く、このためＴｍが低い消光オリゴは、ＦＡＭ標識されたオリゴに結合するための標的オリゴと競合できないため、蛍光放射するプローブ−標的ハイブリッドの形成を生じた（図１Ａ〜図１Ｆ）。ミスマッチを有する標的オリゴの存在下では、１２塩基の消光オリゴｑｕｅ−１２は、なお、２０塩基のＦＡＭ標識されたオリゴ５２０−２０に結合するための１個または２個のミスマッチを有する標的オリゴと競合できなかった（表２）（図１Ｃ）；これに対して、１４塩基の消光オリゴｑｕｅ−１４は、１個のミスマッチを有する標的オリゴとまだ競合できなかったが、２個のミスマッチを有する標的オリゴの存在下でＦＡＭオリゴ５２０−２０に何とか結合した（図１Ｂ）。対照的に、１６塩基の消光オリゴｑｕｅ−１６は１個のミスマッチの存在下で５２０−２０へ結合でき、２個のミスマッチの存在下では、さらに結合した（図１Ａ）。これらの結果は、消光オリゴの長さを伸長することが、そのＦＡＭ標識された相補的オリゴの、ミスマッチを有する標的オリゴへ結合する能力を低下させたことを示す。言い換えれば、ＦＡＭ標識されたオリゴとＤＡＢＣＹＬ標識されたその相補的消光オリゴ間の長さの差を増すことは、ミスマッチを有する標的オリゴに対するＦＡＭ標識されたオリゴの許容性のレベルを高める。同じ結論は、直鎖プローブセット５２０−２０／ｑｕｅ−１４の融解曲線（図１Ｂ）を５２０−３１／ｑｕｅ−１４の溶解曲線（図１Ｄ）と比較した場合にも導き出すことができる。プローブセット５２０−３１／ｑｕｅ−１４は幅広い範囲のハイブリダイゼーション温度にわたり、０個のミスマッチを有するものと同程度に効率的に、４個のミスマッチを備えた標的オリゴを拾い上げることさえ可能であった（図１Ｆ）。
【実施例２】
【００５６】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにより評価されるミスマッチの許容性に及ぼす核酸プローブの二つのオリゴ核酸の間の長さの差の影響。
【００５７】
この実施例は、３つの異なるプローブセット５２０−２０／ｑｕｅ−１６、５２０−２０／ｑｕｅ−１２、および５２０−３１／ｑｕｅ−１４に対して、それらのミスマッチ許容性についての評価を、定量性リアルタイムＲＴ（逆転写）−ＰＣＲアッセイによって示す。これらの３つのプローブセットを調べるために、異なる突然変異を有する５つの転写物を利用した。これらの非競合的定量アッセイにおいて、各１００μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応液は１．２５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（６２．５ｍＭビシン、ｐＨ８．０５〜８．２５、１４３．７５ｍＭ  酢酸カリウム、１０％グリセロール、０．１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１２５ｍｇ／ｍｌ  アセチルウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０７８％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、および０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．３７５ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１３．１３単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．６μＭ  ＨＩＶフォワードＰＣＲプライマーＦＰ−２９、１．６μＭ  ＨＩＶリバースＰＣＲプライマーＲＰ−２５（表２）、０．１μＭ内部対照（ＩＣ）フォワードプライマー−１９６、０．３μＭ  ＩＣリバースプライマー−３１０、ＨＩＶ  ＰＣＲ産物の検出用の０．２μＭ  ＦＡＭ標識されたオリゴプローブ、ＦＡＭプローブの蛍光シグナルを消光させるための０．２μＭ  ＤＡＢＣＹＬ標識された消光オリゴ、ＩＣ  ＰＣＲ産物を検出するための０．１μＭ  ＶＩＣ標識された指標プローブ（フルオロフォア標識されたオリゴ及び消光基質標識されたオリゴは全て、ＴｒｉＬｉｎｋから入手した。）、シグナル標準化のための基準色素としての１×ＦＲＥＴＲＯＸ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、５０００コピーのＩＣ転写物、および異なるレベルのＨＩＶ野生型転写標準物質（１回の反応あたり、０、４．１７×１０１、４．１７×１０２、４．１７×１０３、４．１７×１０４、または４．１７×１０５のコピー）を含んでいた。３つのプローブセットの各々によって５つの転写物を定量するため、１回の反応あたり１×１０４コピーでの各転写物が用いられ、野生型転写物標準物質と平行してアッセイを実行した。増幅反応は、以下のサイクル条件を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＰＣＲシステムにおいて実行され、すなわち、５９℃で３０分間の逆転写を１サイクル、９５℃で１分及び５４℃で１分の低ストリンエジェント増幅を２サイクル、９５℃で１５秒及び５９℃で１分の高ストリンエジェント増幅を１０サイクル、９５℃で１５秒及び４５℃で２分３０秒の４０回の増幅及び検出サイクル。蛍光測定結果は４０サイクルの各４５℃の段階の間に記録された。各リアルタイムＰＣＲ実行の終わりに、データをシステムにより自動的に分析し、増幅プロットを得た。５つの試料転写物の量を、それぞれの蛍光閾値サイクル（ＣＴ）に対するｌｏｇ１０ＨＩＶ標準コピー数をプロットすることから得られる較正曲線を用いて決定した。図２Ａ〜図２Ｃは、３つの二本鎖直鎖プローブセット５２０−２０／ｑｕｅ−１６、５２０−２０／ｑｕｅ−１２及び５２０−３１／ｑｕｅ−１４をそれぞれ用いることによる、５つの転写物の増幅プロットを示す。各転写物の１×１０４コピーを増幅し、各サイクルで発生されたＰＣＲ産物の量を３つの二本鎖直鎖プローブセット、すなわち（Ａ）５２０−２０／ｑｕｅ−１６、（Ｂ）５２０−２０／ｑｕｅ−１２、（Ｃ）５２０−３１／ｑｕｅ−１４のうちの１つによって検出した。５つの転写物に対し、ＦＡＭ標識されたオリゴ５２０−２０はそれらのうちの２つに対して０個のミスマッチに遭遇し、残りの３つに対し２つのミスマッチに遭遇した（表４）。ＤＡＢＣＹＬ標識された消光オリゴｑｕｅ−１６と対にされた場合、プローブ５２０−２０は、２つのミスマッチを有する３つの転写物をほとんど検出せず（図２Ａ）、したがってそれらの濃度を１  ｌｏｇ１０よりも大きく過小評価した（表３）。これに対して、４塩基短い消光オリゴｑｕｅ−１２と対にされた場合には、プローブ５２０−２０はより高い効率性で２個のミスマッチの転写物を３つ検出でき（図２Ｂ）、それらの量は０．５ｌｏｇ１０未満で過小評価されたに過ぎなかった（表４）。これらの結果は、二本鎖直鎖プローブの二成分オリゴ（ＦＡＭ標識されたオリゴおよびＤＡＢＣＹＬ標識するその相補的消光オリゴ）間の長さの差を大きくすることによって、ミスマッチを有する標的オリゴを拾い上げるＦＡＭ標識されたオリゴの効率性を高めるという実施例１で得られた結論を確認した。この結論は、二つの成分オリゴ間の長さの差が１７塩基に拡大することにより、プローブセット５２０−３１／ｑｕｅ−１４が、野生型の転写物とほぼ同じくらい効率的に、最大４つの突然変異を有する転写物を検出できることによってさらに立証された（図２Ｃ）。５２０−２０より１１塩基長く、同じセットの５つの転写物に対してより多くのミスマッチを同定しなければならないプローブ５２０−３１は、（表５）、５つの転写物がすべて１．３×１０４〜３．１×１０４であると定量した（表５）。これらの決定されたコピー数は、予測された１×１０４に非常に近かった。ｌｏｇ１０スケールにおいて、突然変異と野生型の間で決定されたコピー数の最大差は、許容可能な０．５ｌｏｇ１０内の０．４ｌｏｇ１０であった（表５）。結論として、部分的に二本鎖のプローブは、核酸試料を正確に定量するために利用でき、適切にデザインされると、それらのプローブは野生型と同じくらい正確に突然変異体を定量できる。
【００５８】
【表３】
2007512837.tif 000005
【００５９】
【表４】
2007512837.tif 000006
【００６０】
【表５】
2007512837.tif 000007
【実施例３】
【００６１】
ＲＴ温度よりも高いＴｍを有する消光オリゴヌクレオチドによるＲＴ−ＰＣＲの阻害。
【００６２】
ＲＴ反応のインキュベーション温度を上回るＴｍを有する消光基質プローブを利用する影響を検討するため、ｌｉｎ−４１およびｑｕｅ−２３のプローブ（表２）の組み合わせの性能を定量性リアルタイム逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲアッセイにおいて評価した。消光オリゴｑｕｅ−２３は、６０．２７のＴｍを有し、５９℃のＲＴインキュベーション温度を上回る。この競合性定量アッセイにおいて、各１００μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応が１×ＥＺ緩衝液（５０ｍＭビシン、ｐＨ８．２、１１５ｍＭ  酢酸カリウム、および８％グリセロール）、２．５ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）２、０．４ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、２０単位のＲＮａｓｅ阻害剤、１０単位のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２μＭのＨＩＶフォワードＰＣＲプライマーＦＰ−２９、１．０μＭのＨＩＶリバースＰＣＲプライマーＲＰ−２４、ＨＩＶ野生型ＰＣＲ産物の検出用の０．１μＭのＦＡＭ標識されたオリゴプローブｌｉｎ−４１、ＦＡＭプローブを消光する０．２μＭのＤＡＢＣＹＬ標識された消光オリゴｑｕｅ−２３、内部対照（ＩＣ）ＰＣＲ産物を検出するための０．１μＭのテキサスレッド標識指標プローブｂｐｉｃ−７、シグナル標準化のための基準色素としての０．０４μｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１００コピーの内部対照転写物、および異なるコピー数のＨＩＶ野生型転写物（０、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６コピー）の存在下で実行される。増幅反応はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量性ＰＣＲシステムにおいて、以下のサイクル条件で実行された。すなわち、９５℃で５秒及び５９℃で３０分の逆転写を１サイクル；９５℃で３０秒、５４℃で３０秒および７２℃で３０秒の低ストリンジェント増幅を２サイクル；９５℃で３０秒、５９℃で３０秒および７２℃で３０秒の高ストリンジェント増幅を１０サイクル；９５℃で３０秒、５０℃で１分及び７２℃で３０秒の３３サイクルの増幅および検出であった。蛍光測定結果は３３サイクルの各５０℃の段階の間に記録された。各リアルタイムＰＣＲ操作の終わりに、データをシステムにより自動的に分析し、増幅プロットを得た。野生型および内部対照転写物の増幅曲線は図３Ａおよび図３Ｂにそれぞれ示されている。異なる数のＨＩＶ野生型テンプレート転写物で各々開始された７つの反応液を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＭｘ４０００中で、同時にインキュベートした。増幅の各サイクルの後に存在するアンプリコンの濃度はアニーリング工程の最後の２１秒の間のプローブ−標的ハイブリッドから生じるＦＡＭ蛍光シグナルを測定することによって決定された。各反応におけるＦＡＭ蛍光強度はサイクルの関数として測定された。１０１〜１０６の範囲の野生型転写物入力レベルのうち、高いコピー数（すなわち１０４〜１０６）についてのみ有意な増幅が観察されたのに対し、０〜１０３の低コピー数について蛍光シグナルは記録されなかった。対照の転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅について、内部対照転写物１００コピーが用いられた。各サイクルで生じた内部対照ＰＣＲ産物の量はテキサス��ッドで標識された分子指標プローブｂｐｉｃ−７により検出された。各曲線の隣に示されている野生型転写物のコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲ反応において、１００コピーの内部対照転写物とともに増幅された。１００コピーの内部対照転写物について蛍光シグナルは観察されなかった。これらのデータは、Ｔｍが６０．２７であり５９℃のＲＴ温度よりも高いＤＡＢＣＹＬ標識消光オリゴｑｕｅ−２３がＦＡＭ標識された直鎖プローブｌｉｎ−４１にハイブリダイズし、ｌｉｎ−４１／ｑｕｅ−２３二本鎖が逆転写を阻害するという仮説と一致する。その阻害は、野生型転写物および内部対照転写物の両者の逆転写の効率性を有意に低下させた。基線を上回る蛍光シグナルは低コピー数（０〜１０３）では観察されなかったのに対し、高コピー数（１０４〜１０６）についての増幅曲線ではサイクル数が有意に遅延し、最大下レベルに達した。
【実施例４】
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＴ温度よりも低いＴｍを有する消光オリゴ核酸による阻害の除去。
【００６４】
消光オリゴのＴｍとＲＴ−ＰＣＲアッセイの性能との関係を評価するため、ＦＡＭ標識されたプローブであるｌｉｎ−４１を消光オリゴであるｑｕｅ−２２と組み合わせて用いた（表２）。オリゴｑｕｅ−２２は５５．８６℃のＴｍを有し、逆転写（ＲＴ）のインキュベーション温度である５９℃を下回る。定量性リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、消光オリゴｑｕｅ−２２がｑｕｅ−２３に置き換えられたことを除き、実施例３において記載されているように実行された。得られたデータは図４Ａおよび図４Ｂに表されている。実施例３において得られた結果とは対照的に、典型的な増幅曲線が野生型転写物と内部対照転写物の両者について、すべてのコピーレベルで見られた。１０４、１０５及び１０６のテンプレート濃度での野生型増幅曲線は約８サイクル早く現れ、１００００よりも高い最高レベルに達した。調査された最低のテンプレート入力レベルである１反応あたり１０コピーでさえ、有意な増幅が観察された（〜２０００単位）。観察された増幅は基線を有意に上回り、ｌｉｎ−４１／ｑｕｅ−２２のプローブの組み合わせは高い感度を提供することを示した。さらに、本アッセイは広い動的範囲で直線関係を示し、相関係数（ｒ２）は、標的濃度の６桁（１０〜１０６）にわたって０．９９８であった。１００コピーの内部対照転写物について、増幅曲線は、内部対照蛍光シグナルが野生型転写物コピー数の増加に応じて低下するという競合的ＰＣＲの典型的な特性を示した。これらのデータは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅及び定量のためのＲＴインキュベーション段階を下回る（ＦＡＭ標識された直鎖プローブについての）Ｔｍを有する消光プローブの実用性を示す。
【実施例５】
【００６５】
二つ以上の蛍光分子で標識された直鎖プローブを用いることによるシグナル増強。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて生じた蛍光シグナルが二つ以上の蛍光標識を有する直鎖プローブの使用により高まりうるかどうかを調べるために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを多重標識されたプローブを用いてセットアップした。３つのＦＡＭ標識された直鎖プローブであるｓｌｉｎ−４７、ｄｆａｍ−５０およびｆａｍ−６５０（表２）を、二つの消光オリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨおよびｂｈｑ−５０１５とともに用いた。両者の消光オリゴプローブは３つのＦＡＭ標識された直鎖プローブすべてに結合する。プローブｓｌｉｎ−４７は５’端に一つのＦＡＭ（１×ＦＡＭ）を、３’末端にＤＡＢＣＹＬを有するのに対し、プローブｄｆａｍ−５０は５’端と３’の両者に一つのＦＡＭを有し（２×ＦＡＭ）、プローブｆａｍ−６５０はその二つの末端のＦＡＭに加えて内部ＦＡＭを有する（３×ＦＡＭ）。この競合性定量アッセイにおけるＲＴ−ＰＣＲ反応は、実施例３において記載されているものと同様の条件下で実行された。各１００μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応液は１×ＥＺ緩衝液（５０ｍＭ  ビシン、ｐＨ８．２、１１５ｍＭ  酢酸カリウムおよび８％グリセロールを含む）、２．５ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）２、０．４ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、２０単位のＲＮａｓｅ阻害剤、１０単位のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ由来）、０．１μＭのＨＩＶフォワードＰＣＲプライマーＦＰ−２９、１．０μＭのＨＩＶリバースＰＣＲプライマーＲＰ−２４、ＨＩＶ野生型ＰＣＲ産物を検出するための０．２μＭのＦＡＭ標識されたオリゴプローブ（ｓｌｉｎ−４７、ｄｆａｍ−５０またはｆａｍ−６５０）、ＦＡＭプローブの５’端を消光するための０．２５μＭのＢＨＱ標識された消光オリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨ、ＦＡＭプローブの３’端を消光するための０．２５μＭのＢＨＱ標識された消光オリゴｂｈｑ−５０１５、内部対照（ＩＣ）ＰＣＲ産物を検出するための０．２μＭのテキサスレッド標識された指標プローブｂｐｉｃ−７ＢＨ、シグナル標準化のための基準色素としての０．０４μｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ、１００コピーの内部対照転写物、および異なるコピー数のＨＩＶ野生型転写物（０、１０、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６コピー）を含んでいた。増幅反応はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＭｘ４０００多重定量性ＰＣＲシステムにおいて実行され、以下のサイクル条件を用いた。すなわち、５９℃で６０分の逆転写を１サイクル；９５℃で１分及び５４℃で１分の低ストリンジェント増幅を２サイクル；９５℃で１５秒及び５９℃で１分の高ストリンジェント増幅を１０サイクル、９５℃で１５秒及び４０℃で２分３０秒の増幅及び検出を３３サイクルであった。蛍光測定結果は３３サイクルの約４０℃の各段階の間に記録された。各リアルタイムＰＣＲ操作の終わりに、データはシステムにより自動的に分析され、増幅プロットを得た。３つのＦＡＭ標識されたプローブすべてによって、野生型転写物のすべての入力レベルで、典型的な増幅特性が観察された。図５は１反応あたり１０コピー（Ａ）、１反応あたり１０３コピー（Ｂ）、１反応あたり１０５コピー（Ｃ）、および１反応あ��り１０６コピー（Ｄ）での野生型転写物についての増幅プロットを示す。検査される各コピー数で、３×ＦＡＭプローブは全体として、２×ＦＡＭプローブよりも大きな蛍光シグナルを生じ、２×ＦＡＭプローブは、次いで、１×ＦＡＭプローブよりも大きなシグナルを全体として生じた。蛍光シグナルレベルが全体的により高いことに加えて、アッセイ感度が上昇し、多重ＦＡＭ標識を有する直鎖プローブは、勾配がさらに急な増幅曲線を生じ、蛍光閾値サイクル（ＣＴ）の決定を容易にした。
【実施例６】
【００６７】
突然変異を伴うまたは伴わない転写物の定量。
【００６８】
ミスマッチを有するテンプレートを信頼可能に検出及び定量するための部分的に二本鎖のプローブの実用性を検討するため、プローブセットであるｆａｍ−６５０（３ＦＡＭ標識）／ｓｑｕｅ−１５ＢＨ＋ｂｈｑ−５０１５（表２）が用いられ、多重突然変異を有する転写物を定量した。０、２、３、４、または５個の突然変異を有する５つの転写物を各々、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて定量した。転写物のコピー数はＯＤ２６０測定により決定した。アッセイは異なるコピー数の野生型転写物を用いて標準化された。この競合的定量アッセイにおけるＲＴ−ＰＣＲ反応は、実施例５において述べられるのと同様の条件下で行われた。各１００μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応液は１×ＥＺ緩衝液（５０ｍＭビシン、ｐＨ８．２、１１５ｍＭ  酢酸カリウム、および８％グリセロールを含む）、２．５ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）２、０．４ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、２０単位のＲＮａｓｅ阻害剤、１０単位のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．１μＭのＨＩＶフォワードＰＣＲプライマーＦＰ−２９、１．０μＭのＨＩＶリバースＰＣＲプライマーＲＰ−２４、ＨＩＶ野生型ＰＣＲ産物の検出用の０．１５μＭのＦＡＭ標識されたオリゴプローブｆａｍ−６５０、ＦＡＭプローブの５’端を消光させるための０．２５μＭのＢＨＱ標識された消光オリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨ、ＦＡＭプローブの３’端を消光させるための０．２５μＭのＢＨＱ標識された消光オリゴｂｈｑ−５０１５、内部対照（ＩＣ）ＰＣＲ産物を検出するための０．１μＭのテキサスレッド標識された直鎖プローブｔｒｐ−３４、テキサス  レッドＩＣを消光させるための０．１μＭのＢＨＱ標識消光オリゴｃｔｒｐ−１５ｂｈｑ、シグナル標準化のための基準色素としての０．０４μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ、２００コピーの内部対照転写物および異なるコピー数のＨＩＶ野生型標準転写物（０、１０、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６コピー）を含んでいた。５つの転写物を定量するため、野生型標準物質の代わりに８×１０３コピーの各転写物を１つのＲＴ−ＰＣＲ反応物に加え、７つのＨＩＶ標準物質とともに増幅した。増幅反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＭｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステムにおいて実行され、以下のサイクル条件を伴った。すなわち、５９℃で６０分逆転写を１サイクル；９５℃で１分間および５４℃で１分間低ストリンジェント増幅を２サイクル；９５℃で１５秒および５９℃で１分で高ストリンジェント増幅を１０サイクル、９５℃で１５秒及び４０℃で２分３０秒の増幅および検出を３３サイクルであった。蛍光測定の結果は、３３サイクルの各４０℃工程中に記録した。各リアルタイムＰＣＲ実行の終わりに、データをシステムにより自動的に分析し、増幅プロットを得た。図６は５つの転写物の増幅プロットを示す。すべての５つの曲線は互いに群を成し、サイクル１５で出現する。本定量アッセイによって決定された５つの転写物のコピー数は、９．６×１０３（０個のミスマッチ）、１．１×１０４（２個のミスマッチ）、７．２×１０３（３個のミスマッチ）、５．６×１０３（４個のミスマッチ）、および６．３×１０３（５個のミスマッチ）で���ることが明らかとなり、これらのコピー数は予測された８×１０３に非常に近かった。ｌｏｇ１０尺度では、これら５つの決定されたコピー数のうち最高の差異は０．２９ｌｏｇ１０であった。したがって、部分的に二本鎖の直鎖プローブセットは野生型（０個のミスマッチ）と同じくらい正確に最大５つの突然変異を有する転写物を定量した。このことはミスマッチに対する部分的に二本鎖のプローブの許容性を実証するものであり、遺伝的多型性を含有する標的領域を定量するためのそれらの実用性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】図１Ａは、ミスマッチになった標的オリゴヌクレオチドなし又はありでの（各曲線の隣に示されている）、本発明の核酸プローブの融解曲線データをグラフで表している。（Ａ）５２０−２０／ｑｕｅ−１６。「ｍ」は、標的に対して実質的に相補的な、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸の連続する核酸塩基の長さを示すのに対し、「ｎ」は、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸に対して実質的に相補的な、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光しているオリゴ核酸の連続した核酸塩基の長さを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ミスマッチになった標的オリゴヌクレオチドなし又はありでの（各曲線の隣に示されている）、本発明の核酸プローブの融解曲線データをグラフで表している。（Ｂ）５２０−２０／ｑｕｅ−１４。「ｍ」は、標的に対して実質的に相補的な、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸の連続する核酸塩基の長さを示すのに対し、「ｎ」は、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸に対して実質的に相補的な、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光しているオリゴ核酸の連続した核酸塩基の長さを表す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ミスマッチになった標的オリゴヌクレオチドなし又はありでの（各曲線の隣に示されている）、本発明の核酸プローブの融解曲線データをグラフで表している。（Ｃ）５２０−２０／ｑｕｅ−１２。「ｍ」は、標的に対して実質的に相補的な、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸の連続する核酸塩基の長さを示すのに対し、「ｎ」は、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸に対して実質的に相補的な、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光しているオリゴ核酸の連続した核酸塩基の長さを表す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ミスマッチになった標的オリゴヌクレオチドなし又はありでの（各曲線の隣に示されている）、本発明の核酸プローブの融解曲線データをグラフで表している。（Ｄ）５２０−３１／ｑｕｅ−１４。「ｍ」は、標的に対して実質的に相補的な、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸の連続する核酸塩基の長さを示すのに対し、「ｎ」は、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸に対して実質的に相補的な、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光しているオリゴ核酸の連続した核酸塩基の長さを表す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ミスマッチになった標的オリゴヌクレオチドなし又はありでの（各曲線の隣に示されている）、本発明の核酸プローブの融解曲線データをグラフで表している。（Ｅ）５２０−２０／列−１２。「ｍ」は、標的に対して実質的に相補的な、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸の連続する核酸塩基の長さを示すのに対し、「ｎ」は、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸に対して実質的に相補的な、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光しているオリゴ核酸の連続した核酸塩基の長さを表す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ミスマッチになった標的オリゴヌクレオチドなし又はありでの（各曲線の隣に示されている）、本発明の核酸プローブの融解曲線データをグラフで表している。（Ｆ）５２０−３１／列−１４。「ｍ」は、標的に対して実質的に相補的な、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸の連続する核酸塩基の長さを示すのに対し、「ｎ」は、ＦＡＭ標識されたオリゴ核酸に対して実質的に相補的な、ＤＡＢＣＹＬ標識された消光しているオリゴ核酸の連続した核酸塩基の長さを表す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットと、（各曲線の隣に示されている）突然変異を受けた転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットとの比較を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットと、（各曲線の隣に示されている）突然変異を受けた転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットとの比較を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットと、（各曲線の隣に示されている）突然変異を受けた転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットとの比較を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、（Ａ）ＨＩＶ野生型テンプレート転写物を用いて、部分的に二本鎖の直鎖プローブセットｌｉｎ−４１／ｑｕｅ−２３を用いるＲＴ−ＰＣＲ時のアンプリコン合成のリアルタイムの測定をグラフで表している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｂ）反応混合物あたり１００コピーの内部対照転写物を用いて、部分的に二本鎖の直鎖プローブセットｌｉｎ−４１／ｑｕｅ−２３を用いるＲＴ−ＰＣＲ時のアンプリコン合成のリアルタイムの測定をグラフで表している。
【図４Ａ】図４Ａは、（Ａ）ＨＩＶ野生型テンプレート転写物とともに、プローブセットｌｉｎ−４１／ｑｕｅ−２２を用いるＲＴ−ＰＣＲ反応時のアンプリコン合成のリアルタイム測定結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、（Ｂ）反応混合物あたり１００コピーの内部対照転写物とともに、プローブセットｌｉｎ−４１／ｑｕｅ−２２を用いるＲＴ−ＰＣＲ反応時のアンプリコン合成のリアルタイム測定結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＣＲ反応あたり１０コピー（Ａ）の転写物コピー数で、（各曲線の隣に示されているように）１×ＦＡＭプローブ（ｓｌｉｎ−４７）、２×ＦＡＭプローブ（ｄｆａｍ−５０）または３×ＦＡＭプローブ（ｆａｍ−６５０）によって検出された野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットデータをグラフで表している。この３つのＦＡＭ標識された直鎖オリゴ核酸プローブの各々はオリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨおよびオリゴｂｈｑ−５０１５によって消光された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＣＲ反応あたり１０ｅ３コピー（Ｂ）の転写物コピー数で、（各曲線の隣に示されているように）１×ＦＡＭプローブ（ｓｌｉｎ−４７）、２×ＦＡＭプローブ（ｄｆａｍ−５０）または３×ＦＡＭプローブ（ｆａｍ−６５０）によって検出された野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットデータをグラフで表している。この３つのＦＡＭ標識された直鎖オリゴ核酸プローブの各々はオリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨおよびオリゴｂｈｑ−５０１５によって消光された。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＰＣＲ反応あたり１０ｅ５コピー（Ｃ）の転写物コピー数で、（各曲線の隣に示されているように）１×ＦＡＭプローブ（ｓｌｉｎ−４７）、２×ＦＡＭプローブ（ｄｆａｍ−５０）または３×ＦＡＭプローブ（ｆａｍ−６５０）によって検出された野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットデータをグラフで表している。この３つのＦＡＭ標識された直鎖オリゴ核酸プローブの各々はオリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨおよびオリゴｂｈｑ−５０１５によって消光された。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＰＣＲ反応あたり１０ｅ６コピー（Ｄ）の転写物コピー数で、（各曲線の隣に示されているように）１×ＦＡＭプローブ（ｓｌｉｎ−４７）、２×ＦＡＭプローブ（ｄｆａｍ−５０）または３×ＦＡＭプローブ（ｆａｍ−６５０）によって検出された野生型転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットデータをグラフで表している。この３つのＦＡＭ標識された直鎖オリゴ核酸プローブの各々はオリゴｓｑｕｅ−１５ＢＨおよびオリゴｂｈｑ−５０１５によって消光された。
【図６】図６は、（各曲線の隣に示されているように）０、２、３、４または５個の突然変異を伴う転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットデータをグラフで表している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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