(57)【要約】  本発明は、同一性、タンパク質及び／又はペプチドパターン、並びに、脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物、特に消化酵素、例えばパンクレアチンの混合物を含有する試料の安定性を、特に前記の酵素混合物、例えば沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアを含有する医薬製剤の製造において分析するための新規の方法に関する。
2007500343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の治療のための医薬製剤の製造において使用される脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の消化酵素混合物を含有するタンパク質試料を２次元ゲル電気泳動によって特性解析及び／又は特定するための分析法において、前記方法が、
（ａ）酵素混合物試料をゲル電気泳動のための溶剤組成物中に溶解させることによる試料調製、ここで、前記溶剤組成物はタンパク質材料を溶解させるのに適当な特定の溶剤、タンパク質の定量化のための内部標準及びプロテアーゼインヒビターを含有する、
（ｂ）ゲル電気泳動の一次元を定義し、かつタンパク質分画の分離のためにグラジエントを施与するための等電点電気泳動工程；
（ｃ）再緩衝を含む後続の予備処理工程；
（ｄ）二次元への移行及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離；
（ｅ）工程（ｄ）から得られるゲルの固定及び染色；及び
（ｆ）蛍光走査による比重評価
を含むことを特徴とする分析法。
【請求項２】
微生物合成リパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの混合物を酵素混合物として使用する、請求項１記載の分析法。
【請求項３】
パンクレアチン及び／又は消化酵素のパンクレアチン様混合物を酵素混合物として使用する、請求項１記載の分析法。
【請求項４】
方法を、沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアであるパンクレアチン試料に適用する、請求項３記載の分析法。
【請求項５】
工程（ａ）において試料を溶解させるために使用する溶剤が、ｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファである、請求項１記載の分析法。
【請求項６】
工程（ａ）において使用するタンパク質の定量化のための内部標準が、ホスホリラーゼＢ、有利にウサギホスホリラーゼＢ又は炭酸脱水酵素、有利にウシ炭酸脱水酵素である、請求項１記載の分析法。
【請求項７】
プロテアーゼインヒビターがミニコンプリート及び／又はペファブロックである、請求項１記載の分析法。
【請求項８】
工程（ａ）において試料を溶解させるために使用する溶剤が、１：１ｖ／ｖの比で、ｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたミニコンプリート１．５ｍｇと、リーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたペファブロック１ｍｇとから成るＬｐ３である、請求項７記載の分析法。
【請求項９】
約８ｋＤを上回る分子量を有するタンパク質及び／又はペプチド分画の特性解析及び定量化のために適用する、請求項１記載の分析法。
【請求項１０】
パンクレアチンの、有利に沈降パンクレアチン試料の、又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェア試料の同一性及び／又はタンパク質及び／又はペプチドパターンの決定を含む、請求項１記載の分析法。
【請求項１１】
更にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたタンパク質及び／又はペプチドスポットの同定を含む、請求項１０記載の分析法。
【請求項１２】
パンクレアチンの、有利に沈降パンクレアチン試料の、又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェア試料の同一性及び／又はタンパク質及び／又はペプチドパターン及び不純物及び／又は分解物を決定するためのストレス又は安定性試験として行い、かつ場合により前記のタンパク質、ペプチド、不純物及び／又は分解物の定量化をも含む、請求項１から１０までのいずれか１項記載の分析法。
【請求項１３】
更に、ＲＰ−ＨＰＬＣによる、低分子タンパク質及び約８ｋＤを下回る分子量を有するペプチド分画の特性解析及び定量化を含む、請求項９記載の分析法。
【請求項１４】
疾患の治療のための医薬製剤の製造において使用される脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物の試料を２次元ゲル電気泳動によって特性解析及び／又は特定するための適当な溶剤組成物において、前記溶剤組成物が、
（ａ）ゲル電気泳動及びタンパク質材料を溶解させるのに適当な溶剤、その際、前記溶剤はｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファである；
（ｂ）タンパク質の定量化のための内部標準；及び
（ｃ）プロテアーゼインヒビター
を含むことを特徴とする溶剤組成物。
【請求項１５】
試料を溶解させるための溶剤が、１：１ｖ／ｖの比で、ｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたミニコンプリート１．５ｍｇと、リーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたペファブロック１ｍｇとから成るＬｐ３である、請求項１４記載の溶剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一性、タンパク質及び／又はペプチドパターン、並びに、脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物、特に消化酵素、例えばパンクレアチンの混合物を含有する試料の安定性を、特に前記の酵素混合物、例えば沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアを含有する医薬品の製造において分析するための新規の方法に関する。
【０００２】
本発明の課題は、消化酵素、例えばパンクレアチンの混合物を含有する製薬的調剤のために、特に前記の酵素混合物、例えばパンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアを含有する医薬品の製造において適当な新規の分析法を提供することである。特に、同一性、タンパク質及び／又はペプチドパターン、並びに前記の消化酵素試料の安定性を分析及び決定するための、医薬製造のために適当でありかつ確認の信頼性のある分析法を提供することが課題である。更なる課題は、パンクレアチン、特に沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェア試料の分析のために最適化された条件で前記分析法を提供することである。
【０００３】
本発明によれば、脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物、例えば微生物由来の適当な酵素混合物及び／又は特に動物由来の消化酵素の混合物、例えば有利にパンクレアチン又は消化酵素のパンクレアチン様混合物が、本質的に本願明細書中に記載された分析法により分析される。
【０００４】
本発明のために、全ての動物又は微生物由来の脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物を分析することができる。本発明の方法により分析される脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する酵素混合物は、純粋に微生物由来、純粋に動物由来のものであってもよいし、動物及び微生物由来の酵素の混合物であってもよい。
【０００５】
従って本発明の１つの変形において、使用される酵素混合物は純粋に微生物由来ものである。特に、細菌により、即ちバチルス又はシュードモナス属菌株により、又は真菌培養組織、例えば糸状菌、例えばクモノスカビ属及びアスペルギルス属菌株により生成される酵素は、微生物酵素として特に適当である。そのような生理的に認容性の細菌及び／又は糸状菌類酵素の例は、例えばその合成及び消化不良の治療のための使用と関連して既に先行技術に記載されている。リパーゼは例えばバチルス又はシュードモナス属菌株から誘導されることができ、アミラーゼ及びリパーゼは糸状菌類、例えばクモノスカビ属菌株から誘導されることができ、プロテアーゼは例えばアスペルギルス属から誘導されることができる。
【０００６】
しかしながら本発明の有利な変形は、特性がパンクレアチンに極めて類似している脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する消化酵素の混合物の使用を含む。本発明のために、パンクレアチンを含有する消化酵素の混合物及び特にパンクレアチン自体が有利に使用され、かつリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの群の１種以上の微生物酵素、即ち微生物により合成される酵素を、所望であれば、パンクレアチン又はパンクレアチンを含有する消化酵素の混合物に添加することができる。更に有利に、本発明による方法は、沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェア試料の分析に適当である。
【０００７】
パンクレアチンは脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する公知の酵素混合物であり、例えば腸溶マイクロスフェアを含有する顆粒、ペレット又はカプセルの形のクレオン(Creon)（登録商標）の商品名で市販で入手可能であり、例えば膵機能不全、胃の手術後の消化機能不全、肝臓及び胆管疾患、嚢胞性繊維症.及び慢性膵炎における酵素代替物のために医学的に使用される。パンクレアチンは一般に、例えばドイツ国特許明細書ＤＥ２５１２７４６及びＤＥ４２０３３１５に記載された方法によってブタの膵臓から抽出することにより天然酵素の混合物として得られ、その後当業者に公知の方法で所望のガレヌス形に変換される。膵酵素は通常固体製剤の形で経口投与される。
【０００８】
本発明の１つの変形において、本発明により分析することができる医薬製剤は有利にパンクレアチン又はパンクレアチンを含有する消化酵素の混合物を含有する。この本発明により分析される医薬製剤は、パンクレアチン又はパンクレアチンを含有する消化酵素の混合物、及びパンクレアチンに加えて、リパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの群からの１種以上の生理的に認容性の、微生物から得ることができる種の酵素を含有してよい。このサプリメントにおいて使用される微生物酵素には特に既に上記されたバチルス又はシュードモナス属菌株による、又は真菌培養組織、例えば糸状菌、例えばクモノスカビ属又はアスペルギルス属菌株による細菌合成酵素が含まれる。パンクレアチン又はパンクレアチンを含有する酵素の混合物の他に含まれるリパーゼは、例えばバチルス又はシュードモナス属菌株に由来してよく、アミラーゼ及びリパーゼは糸状菌類、例えばクモノスカビ属菌株に由来してよく、プロテアーゼは例えばアスペルギルス属に由来してよい。
【０００９】
微生物及び／又は動物源から得ることができ、かつ本発明に関連して記載される、脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物、例えばパンクレアチン又は非動物由来の酵素混合物を、本発明の方法により極めて効率的に分析することができることが見い出された。本発明は、例えば同一性、タンパク質及び／又はペプチドパターン、並びに、前記消化酵素組成物又は脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物を含有する試料の安定性を分析及び決定するための強力でかつ信頼性のある（再現性のある）方法を提供する。与えられたパラメータを本発明による方法の全体的な機能を損なうことなくある程度変動させることができ；方法を実施するために以下の記載、実施例、表及び図に示されたパラメータの＋／−１０％、特に＋／−５％の調整を望むことができることは当業者に自明である。
【００１０】
従って、本発明は、疾患の治療のための医薬製剤の製造において使用される脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の消化酵素混合物を含有するタンパク質試料を２次元ゲル電気泳動（２Ｄ  ＧＥ）によって特性解析及び／又は特定するための分析法に関するものであり、前記方法は
（ａ）酵素混合物試料をゲル電気泳動のための溶剤組成物中に溶解させることによる試料調製、ここで、前記溶剤組成物はタンパク質材料を溶解させるのに適当な特定の溶剤、タンパク質の定量化のための内部標準及びプロテアーゼインヒビターを含有する、
（ｂ）ゲル電気泳動の一次元を定義し、かつタンパク質分画の分離のためにグラジエントを施与するための等電点電気泳動工程；
（ｃ）再緩衝を含む後続の予備処理工程；
（ｄ）二次元への移行及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離；
（ｅ）工程（ｄ）から得られるゲルの固定及び染色；及び
（ｆ）蛍光走査による比重評価
を含む。
【００１１】
２Ｄ  ＧＥ法は、同一性、タンパク質及び／又はペプチドパターン、並びに、約８ｋＤａ（キロダルトン）を上回るタンパク質又はペプチド分画の分子量を有する、前記消化酵素組成物又は脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物を含有する試料を分析及び決定するため特に適当である。本発明の変形において、同一性、タンパク質及び／又はペプチドパターン、並びに、パンクレアチン、特に沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアの安定性を分析及び決定するのに特に適当である。本発明の方法のバリエーションを実施する際に適用可能なパラメータを、本発明の文脈において、以下の「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたスポットの同定」「沈降パンクレアチンのストレス試験研究」「沈降パンクレアチン試料の同一性及びタンパク質パターンを２Ｄゲル電気泳動によって決定するための分析手法」に関する記載の段落及び関連する表に記載し、かつ与えられた図により更に説明する。
【００１２】
消化酵素試料、例えばパンクレアチン及び特に約８ｋＤ（キロダルトン）を下回るタンパク質又はペプチド分画の分子量を有する沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアのために、本発明の変形によれば、該方法に分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法の付加的な適用を追加することができる。
【００１３】
１つの態様において、本発明は上記で定義されたように、微生物合成リパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの酵素混合物の分析に関する。他の態様において、本発明は上記で定義されたように、消化酵素のパンクレアチン及び／又はパンクレアチン様混合物の分析に関する。更に他の態様において、本発明は上記で定義されたように、沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアであるパンクレアチン試料の分析に関する。
【００１４】
他の態様において、本発明は上記で定義されたように、工程（ａ）において試料を溶解させるために使用する溶剤が、ｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト(Pharmalyte)（登録商標）のリーシスバッファである分析法に関する。
【００１５】
更に他の態様において、本発明は上記で定義されたように、工程（ａ）において使用するタンパク質の定量化のための内部標準が、ホスホリラーゼＢ、有利にウサギホスホリラーゼＢ又は炭酸脱水酵素、有利にウシ炭酸脱水酵素である分析法に関する。
【００１６】
付加的な態様において、本発明は上記で定義されたように、プロテアーゼインヒビターがミニコンプリート(Mini Complete)及び／又はペファブロック(Pefabloc)である分析法に関する。
【００１７】
他の態様において、本発明は上記で定義されたように、工程（ａ）において試料を溶解させるために使用する溶剤が、１：１ｖ／ｖの比で、ｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたミニコンプリート１．５ｍｇと、リーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたペファブロック１ｍｇとから成るＬｐ３である分析法に関する。
【００１８】
本発明は上記で定義されたように、約８ｋＤを上回る分子量を有するタンパク質及び／又はペプチド分画の特性解析及び定量化のために適用する分析２Ｄ  ＧＥ法にも関する。
【００１９】
他の態様において、本発明は上記で定義されたように、パンクレアチンの、有利に沈降パンクレアチン試料の、又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェア試料の同一性及び／又はタンパク質及び／又はペプチドパターンの決定を含む分析法に関する。
【００２０】
他の態様において、本発明は上記で定義されたように、更にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたタンパク質及び／又はペプチドスポットの同定を含む分析法に関する。
【００２１】
１つの態様において、本発明は上記で定義されたように、パンクレアチンの、有利に沈降パンクレアチン試料の、又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェア試料の同一性及び／又はタンパク質及び／又はペプチドパターン及び不純物及び／又は分解物を決定するためのストレス又は安定性試験として行い、かつ場合により前記のタンパク質、ペプチド、不純物及び／又は分解物の定量化をも含む分析法に関する。
【００２２】
他の態様において、本発明は上記で定義されたように、更に、ＲＰ−ＨＰＬＣによる、低分子タンパク質及び約８ｋＤを下回る分子量を有するペプチド分画の特性解析及び定量化を含む分析法に関する。
【００２３】
更に他の態様において、本発明は上記で定義されたように、疾患の治療のための医薬製剤の製造において使用される脂質分解活性、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する生理的に認容性の酵素混合物の試料を２次元ゲル電気泳動によって特性解析及び／又は特定するための適当な溶剤組成物において、前記溶剤組成物が、
（ａ）ゲル電気泳動及びタンパク質材料を溶解させるのに適当な溶剤、その際、前記溶剤はｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファである；
（ｂ）タンパク質の定量化のための内部標準；及び
（ｃ）プロテアーゼインヒビター
を含むことを特徴とする溶剤組成物に関する。
【００２４】
この溶剤の変形において、試料を溶解させるための溶剤は、１：１ｖ／ｖの比で、ｐＨ３〜１０の、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び０．５％ファーマライト（登録商標）のリーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたミニコンプリート１．５ｍｇと、リーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたペファブロック１ｍｇとから成るＬｐ３である。
【００２５】
以下で使用される幾つかの略記及び／又は用語の列挙：
ｍｍｓ  ミニ−マイクロスフェア（mini-microspheres）（パンクレアチンミニ−マイクロスフェア）
ＨＣｌ  塩酸
ＡＰＩ  活性薬理成分（active pharmaceutical ingredient）
ＮＤＡ  新薬承認申請（New Drug Application）
ＦＤＡ  食品医薬品局（Food and Drug Administration）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（matrix assisted laser desorption and ionization mass spectroscopy）
ＵＴＬＩＥＦ  超薄層等電点電気泳動（ultrathin-layer isoelectric focusing）
ＭＳＩ−ＭＳ  エレクトロスプレーイオン化質量分析（electrospray ionization mass spectroscopy）
特に製薬及び調節の目的のための確認の後の本発明による分析法は、有利に沈降パンクレアチンの特性解析及び特定のために使用することが意図され、かつパンクレアチン腸溶マイクロスフェア（パンクレアチンミニ−マイクロスフェア）に適用することもできる。
【００２６】
例えば、活性成分である沈降パンクレアチン及び投与形であるパンクレアチン腸溶ｍｍｓに関してＮＤＡのために提出されるべき製品の規格は、同定、純度、アッセイ、胃酸耐性及び酵素の放出といった項目を網羅している。技術水準の同定は酵素アッセイに基づいており、これはＡＰＩと投与形の双方において酵素の活性を測定するために使用される。「純度」には残留溶剤（ＡＰＩ、ｍｍｓ）、脂肪分（ＡＰＩ）、水（ＡＰＩ、ｍｍｓ）及び微生物学的特性の測定も含まれる。Ｑ６Ｂガイドライン「生物工学／生物学的製品のための規格・試験方法と判定基準」に基づく現在のＦＤＡ要求及び期待を考慮するために、種々のクラスの酵素、不純物及び前記酵素からの分解物の同定及び定量化に特に注目した医薬物質及び投与形のために必要な更に詳細な特性解析が考慮される。特性解析からの結果及び方法は規格設定のために選択される。
【００２７】
従って、本発明は、特性解析及び規格設定のために２Ｄゲル電気泳動（２Ｄ  ＧＥ）の使用を提案する。なぜならば、沈降パンクレアチンは種々のクラスの成分の複合混合物であるため、２次元ゲル電気泳動はペプチド及びタンパク質、即ち種々のクラスの酵素、不純物及びタンパク質の分解物を分離するための極めて優れた選択性をもたらすことが期待されることが見い出されたためである。更に、染色ゲルの画像化により、成分の定量化及びパンクレアチン試料、沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアの試料におけるタンパク質及び／又はペプチドパターンの比較が可能となる。本発明は、最も顕著なスポットの同定を、トリプシン消化の後にスポットピッキング及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより行うことができることを示す。
【００２８】
一般に、本発明による２Ｄ  ＧＥ法による分離は一次元（工程（ｂ）等電点電気泳動）においてパンクレアチン試料又はｍｍｓ試料の緩衝水溶液から、試料の脱塩の後に、ゲル上で３〜１０のｐＨグラジエントで行われ、潜在的な成分又は化合物の広い範囲が網羅される。電気泳動はイモビリンドライストリップ（immobiline dry strip）上で実施される。開始するための例示的なグラジエントを以下に作表する：
【００２９】
【表１】
2007500343.tif 000003
【００３０】
一般に、本発明による２Ｄ  ＧＥ法の二次元での分離（工程（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、手製のゲル上で（例えば以下の条件下で：Ｔ＝１３％、Ｃ＝３％）、例えばＳＤＳ−ＧＬＹＣＩＮ−ＴＲＩＳバッファを用いて以下に作表した通りの例示的なグラジエントで実施される：
【００３１】
【表２】
2007500343.tif 000004
【００３２】
一般に、染色を例えばエタノール／酢酸混合物で固定した後に蛍光染料を用いて行い、引き続き例えばエタノール／酢酸中で脱色する。水で洗浄した後、比重走査を行う。その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる同定のために例えばコロイド状のクーマシーブルーでの染色を行う。この目的のために、スポットをゲルから選び取り、トリプシン消化物に施与する。ペプチドを例えばアセトニトリル／０．１％ＴＦＡを用いてゲルから抽出し、C18 ZipTipカラム上で精製する。２，５−ジヒドロキシ安息香酸を用いて共結晶化した後、抽出物をピペットで目的のプレート上に移す。
【００３３】
本発明の適用可能性及び有用性を説明するための例として、分析法において、パンクレアチンＳＰＬ８５を含む沈降パンクレアチン（種々の国及び種々の製造法からのもの）の３つの種の３つの各バッチを選択した。各バッチの１つの試料をゲルに施与し、各々の種の１つのバッチに関して、沈降工程、試料調製及び分離の再現性を確認するために分析を３回実施した。スポットを定量化し、特徴的なスポットの同定を実施した。
【００３４】
本発明の適用可能性及び有用性を説明するための例として、安定性試験において、適用可能性及び有用性を説明するために前に使用したのと同一のバッチをストレス条件（温度、湿度、光）下におき、活性の損失を測定し、その後、差異を分析又は検査し、適切であれば潜在的な分解物を同定する。
【００３５】
上記に示したように、消化酵素試料、例えばパンクレアチン及び特に約８ｋＤ（キロダルトン）を下回るタンパク質又はペプチド分画の分子量を有する沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアのために、本発明の変形によれば、該方法に分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法の付加的な適用を追加することができる。本発明のＲＰ−ＨＰＬＣ法の変形の実施において適用可能なパラメータを、以下で「パンクレアチンの分析のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたＲＰ−ＨＰＬＣの実現性」に関する記載の項で詳述する。
【００３６】
本発明の文脈において、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたスポットの同定」、「沈降パンクレアチンのためのストレス試験研究」、「沈降パンクレアチンのストレス試験研究」「沈降パンクレアチン試料の同一性及びタンパク質パターンを２Ｄゲル電気泳動によって決定するための分析手法」及び関連する表を、与えられた図により更に説明する。
【００３７】
ＨＰＬＣは、ルーチン分析のために、またタンパク質分析においても幅広く用いられている、広範囲に自動化され、十分に再現性を有する高度に選択的な方法である。化合物の定量化が容易であり、ピークの同定をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより行うことができる。低分子のペプチド及び他の低分子の化合物を検出及び同定することができ、該方法は例えば２Ｄ−ゲル電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して相補的である。従って、これを特に酵素クラス、不純物及び分解物のフィンガープリンティング、同定目的及び定量化のために使用することができる。
【００３８】
通常、ＨＰＬＣ法には例えば以下のものから構成されたagilent ＨＰＬＣ装置又は同等のシステムが含まれる：オートサンプラー G 1313A；Quat. pump G 1311A；ＵＶ検出器G 1314A；真空脱気装置G 1322A；HPカラムオーブンG1316A；1100 制御モジュール G 1323A；LANインターフェース35900E；及びChemServer。典型的なＨＰＬＣカラムは例としてＲＰ１８、５．０μｍの固定相を有するMODULO O-CART QS UPTISPHERE 5 WRP, Interchim(UP5WRP$15QS)、長さ１５０ｍｍ、内径３．０ｍｍのステンレス鋼の管材料；又は比較可能な同等のＨＰＬＣカラムであってよい。ＲＰ１８、５．０μｍの相は例えば水１００％で操作でき、かつタンパク質及びペプチドのために適当であるために有益である。適当なカラムの他の例は、例えばVarian B.V., Middelburg, The Netherlandsから入手可能なPolaris 5μｍ C18-A 150 x 4.6 mm（製品オーダー番号A2000150X046）；又は例えばMicroSolv Technology Corporation, Long Branch, NJ 07740, USAからのCogent Bidentate, C( (Octyl), 4μｍ, 300 A, 150 x 4.6 mmである。
【００３９】
ＨＰＬＣ法を以下の例示的な条件下で運転することができる：
操作モード            グラジエントＨＰＬＣ
移動相                移動相Ａ  水／ＴＦＡ０．０５％（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ  アセトニトリル／ＴＦＡ０．０５％（ｖ／ｖ）
グラジエント
【００４０】
【表３】
2007500343.tif 000005
【００４１】
流動速度              １．０ｍｌ／分
分析の期間            ７５分
温度                  ２０±５．０℃
注入体積              １０μｌ
検出のために例えばＵＶ検出器を波長２１４ｎｍで使用することができる。
【００４２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたスポットの同定
本発明の一つの態様によれば、分析法は、例えば沈降パンクレアチンの試料のための、２Ｄゲルからのタンパク質スポットの同定を含む。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたこのスポットの同定を、以下の項でより詳細に記載する。方法の手順を、２Ｄゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに関して更に以下により詳細に記載する。タンパク質特性解析を、２Ｄゲル法を行うことにより得られた湿潤ゲルからペプチドマスフィンガープリンティングを確立することにより、及び明確に同定されなかったスポットのために付加的にＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを適用することにより行う。
【００４３】
ペプチドマスフィンガープリンティング：
ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）のために、個々のスポットを、直径０．２ｃｍの操作されたピペットチップを用いて湿潤ゲルから手動で切り出す。その後、各スポットを単一の管に移す（０．５ｍｌ）。クーマシーブルーで染色したスポットを特別な洗浄手順で脱色する：１．  １０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１００μｌ、５分間振盪、２．  １０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５０％アセトニトリル、５分間振盪。この手順を少なくとも３回、又は全てのスポットが完全に無色になるまで繰り返さねばならない。最終の洗浄工程の後にアセトニトリル５μｌを各管に添加する。スポットが白色の場合、消化用バッファを管内のゲルの量に応じて２〜６μｌ添加することができる。消化用バッファは０．０１μｇ／μｌ変性ウシトリプシン（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を含有する１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムである。消化を３７℃で一晩実施する。
【００４４】
消化の後、上澄み液を除去するとゲルマトリックスが管内に残る。上澄み液が残存していない場合には抽出媒体（１％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル）５μｌを添加すべきである。超音波処理浴内で超音波処理を１０分間行った後、管をスピードバック(speedvac)に移し、アセトニトリルを除去する。その後、ペプチドを濃縮し、C18 ZipTip（Millipore, USA）を用いて製造者の指示に従って試料を脱塩する。抽出された混合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳターゲット（Applied Biosystems）の上に移すことができる。試料０．１μｌの量をＤＨＢＳマトリックス（２，５−ジヒドロキシ安息香酸：２ヒドロキシ−５メトキシ安息香酸  ９：１）０．１μｌと混合する。その後、ターゲットをＭＡＬＤＩ質量分析計により測定する（Voyager STR, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）。リフレクターモードでの質量範囲として６００〜４２００ダルトン（Ｄａ）を使用した。低分子量範囲（＜６００Ｄａ）はマトリックス効果のために検出が困難である。
【００４５】
ＰＭＦスペクトルを標識し、公知の自己トリプシン(autotryptic)ペプチドの２種の質量に対して内部キャリブレーションする（８０５．４２Ｄａ；２１６３．０５Ｄａ）。キャリブレーションしたスペクトルは通常５０ｐｐｍ未満の精度を有する。ＰＭＦのためのデータベース検索をソフトウェアProFound（Genomic Solutions, USA）を用いて行う。ヒット１とヒット２との間のギャップが少なくともｅ−０４であり、かつ最も強度の質量を説明することができるか又はシーケンスカバー率が比較的高い（＞３０％）場合、顕著なヒットに達する。
【００４６】
同定の結果を以下の表Ａに作表する。また、図１は沈降パンクレアチンからの同定スポットの標識により得られた２Ｄゲルを示す。
【００４７】
更に、図２は本発明による方法の高い再現性を示す。３種のゲルを別々の４日間で沈降パンクレアチンの単一試料から準備した。
【００４８】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ：
ＰＭＦにより明確に同定することができなかったタンパク質スポットを、プロテオミクス分析器4700 (Applied Biosystems, Framingham, CA, USA)を用いてＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳのために選択した。この目的のために、所定のピーク強度を有するペプチドを選択してかつ断片化し、シーケンス情報を得る。得られた断片スペクトルを使用し、マスコット（Mascot）ソフトウェア（Matrixscience, London, UK）を用いてＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nih.gov/）,National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine,Building 38A, Bethesda, MD 20894, USAを検索した。所定のマスコットスコアを超えるスペクトルが有意である。疑問の余地のある場合にはマニュアル制御を行う。
【００４９】
表ＡはＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより得られる結果を示す。
【００５０】
沈降パンクレアチンのストレス試験研究
本発明の他の態様によれば、２Ｄゲル電気泳動法を、沈降パンクレアチンの試料の分解プロセスのモニタリング及び／又は安定性のモニタリングのために使用する。この安定性試験を沈降パンクレアチンのためのストレス（安定性）試験に関する以下の試験報告においてより詳細に記載する。
【００５１】
本発明の他の態様によれば、ストレス試験において、２Ｄゲル電気泳動（２Ｄ  ＧＥ）法の適性を、（ａ）沈降パンクレアチンに適用した際の安定性試験に関して、（ｂ）ストレス試験の間に生じる潜在的な分解生成物の探索に関して、及び（ｃ）分解を示すスポットの同定に関して検査した。研究により、この研究において含まれる沈降パンクレアチンの双方の型に関して比較可能な、既に同定された幾つかのスポットの顕著な変化が明らかとなった。従って該方法は安定性を示すものと見なされる。
【００５２】
２Ｄ  ＧＥ法を、沈降パンクレアチンの特性解析のためのその適性について評価するために、沈降パンクレアチンの試料をストレス試験条件下で保管し、本発明の方法により検査した。前記試料のアリコートを２Ｄ  ＧＥによって試験し、ストレス試験を実施するために必要な持続時間を測定し、かつパンクレアチンの分解生成物に関連し得るスポットを探索した。
【００５３】
ストレス試験を以下の詳細に記載するように分析手法「２Ｄゲル電気泳動による同一性及びタンパク質パターン」により行った。
【００５４】
ストレス試験のために以下の試料を使用した：
【００５５】
【表４】
2007500343.tif 000006
【００５６】
沈降パンクレアチン２０ｇの量をペトリ皿に充填し、第二のペトリ皿でカバーした。試料を４０℃／７５％ｒ．ｈ．で保管した。試料１００ｍｇを最初及び１、２、４、８、１６及び３２日後に収穫した。０、１６及び３２日後に引き出した試料を２Ｄ  ＧＥにより試験した。全ての試料を、検査のために使用するまで、深冷凍結、即ち−１５℃未満で、光及び湿気から保護して保管した。
【００５７】
結果を表Ａ〜Ｉ及び図１〜７に示す。該図は沈降パンクレアチン試料のストレス安定性試験において得られた２Ｄゲルを示す。前記表及び図の内容を以下の通りにまとめる：
表Ａ〜Ｉの内容：
表Ａ  ２Ｄ−ＧＥからのスポット及びＮＣＢＩデータベースへのアクセッション番号（図１も参照のこと）
表Ｂ  パンクレアチンバッチ１（ｔ＝０及び１６日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｃ  パンクレアチンバッチ１（ｔ＝０及び１６日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｄ  パンクレアチンバッチ１（ｔ＝３２日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｅ  パンクレアチンバッチ１（ｔ＝３２日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｆ  パンクレアチンバッチ２（ｔ＝０及び１５日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｇ  パンクレアチンバッチ２（ｔ＝０及び１５日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｈ  パンクレアチンバッチ２（ｔ＝３２日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
表Ｉ  パンクレアチンバッチ２（ｔ＝３２日）に関するスポット強度及びスポットの平均及び標準偏差及びｔ０に対する調節
図１〜７の内容：
図１  標識された同定スポットを有する沈降パンクレアチンにより得られる２Ｄゲル（表Ｊ及びＫのデータも参照のこと）
図２  沈降パンクレアチンの単一試料を用いた２Ｄゲル法の再現性；別々の４日間で行われた３種のゲル（ＩＰＧ  ３−１０ＮＬ、蛍光染色；外部標準炭酸脱水酵素、３２０ｎｇの量で施与）
図３  ストレス試験後のパンクレアチンバッチ１に関して得られた２Ｄゲル（Sypro Ruby）
図４  ストレス試験後のパンクレアチンバッチ２に関して得られた２Ｄゲル（Sypro Ruby）
図５  パンクレアチンバッチ１に関して算出された平均化されたゲル（ｎ＝３）
図６  パンクレアチンバッチ２に関して算出された平均化されたゲル（ｎ＝３）
図７  分析手法「同一性及びタンパク質パターン」に関する記載の項に記載されている通りに得られた、２種の内部標識タンパク質ホスホリラーゼＢ及び炭酸脱水酵素を添加した、沈降パンクレアチンの２Ｄゲル
沈降パンクレアチン試料の同一性及びタンパク質パターンを２Ｄゲル電気泳動によって決定するための分析手法
本発明の１つの態様によれば、２Ｄゲル電気泳動法を、沈降パンクレアチン試料の同一性及びタンパク質パターンを２Ｄゲル電気泳動によって決定するための分析手法として用いる。ここでこの手法を以下の略記を用いてより詳細に記載する：
ＣＨＡＰＳ  ３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルホネート
ＤＴＴ        ジチオトレイトール
ＴＲＩＳ      トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン
ＡＰＳ        過硫酸アンモニウム
ＴＥＭＥＤ    Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
ＳＤＳ        ドデシル硫酸ナトリウム
適用された２Ｄ  ＧＥ法の記載：
２次元ゲル電気泳動（２Ｄ  ＧＥ）分離技術（O’Farrell PH, J. Biol. Chem. 250: 4007 − 4021 (1975)）は、タンパク質の複合混合物の個々の成分の電気泳動度を利用したものであり、一次元において等電点電気泳動（ＩＥＦ）により電荷（ｐＩ）に従って分画し、２次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ（Ｍｒ）に従って分画する。
【００５８】
一般に、電気泳動は欧州薬局方（Ph. Eur. 2.2.31）に準拠して行われ、かつこの文脈において限定のない「水」という用語は二回蒸留された水、又は脱イオン水又は同等の品質の水を意味する。
【００５９】
該方法において以下の材料及び試薬を適用する：
−アセトニトリル、例えばMerck, Art.No. 1033530220
−アクリルアミド溶液、例えばServa, Art.No. 10688.02
−アガロース、例えばVWR International, Art.No. 1.16802.0025
−過硫酸アンモニウム、例えばServa, Art.No. 13 375.01
−ブロムフェノールブルー、例えばVWR International, Art.No. 1.08122.0005
−２−ブタノール、例えばVWR International, Art.No. 8.22263.1000
−ＣＨＡＰＳ、例えばRoth, Art.No. 1479.2
−ＤＴＴ、１，４−ジチオスレイトール、例えばRoth, Art.No. 6908.2
−電極紙、例えばAmersham Biosciences, Art.No. 80-1106-19
−電極紙ストリップ、例えばAmersham Biosciences, Art.No. 18-1004-40
−エタノール、例えばVWR International, Art.No. TC212-9025
−酢酸、例えばRoth, Art.No. 3738.2
−Immobiline Dry Strips, pH3-10NL、例えばAmersham Biosciences, Art.No.17-1235-01
−グリセリン、例えばServa, Art.No. 23176
−グリシン、例えばRoth, Art.No. 3908.3
−尿素、例えばRoche Diagnostics, Art.No. 1 685 902
−ヨードアセトアミド、例えばSigma, Art.No. I-6125
−PharmalyteTM 3-10, Amersham Biosciences, Art.No. 17-0456-01
−Protein Test Mixture 4, Serva, Art.No. 39208.01
−Protein Test Mixture 5, Serva, Art.No. 39209.01
−Roti-Blue（登録商標）-Concentrate, Art.No., A152.1
−試料カップ、例えばAmersham Biosciences, Art.No. 18-1004-35
−ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム、例えばServa, Art.No. 20 763.02
−シリコーン油、例えばServa, Art.No. 35132
−ＴＥＭＥＤ、例えばBio-Rad, Art.No. 161-0800
−チオ尿素、例えばFluka, Art.No. 88810
−電極バッファ用ＴＲＩＳ、例えばRoth, Art.No. 4855.2
−全ての他の溶液用のＴＲＩＳ、例えばBio-Rad, Art.No. 161-0719。
【００６０】
該方法において、以下の溶液を適用する：
（１）リーシスバッファ：
７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ、０．５％PharmalyteTM pH 3-10
（２）試料Ｌｐ３のための溶剤：
リーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたミニコンプリート１．５ｍｇ：リーシスバッファ２ｍｌ中に溶解されたペファブロック１ｍｇ（１：１ｖ／ｖ）
（３）再水和溶液：
６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．２％ＤＴＴ、０．２％PharmalyteTM pH 3-10、若干のブロムフェノールブルー
（４）ゲル溶液（Ｔ＝１３％、Ｃ＝３％）：
グリセリン７５ｇ、水４２５ｍＬ、分離ゲルバッファ（５）３７５ｍＬ、アクリルアミド溶液６３０ｍＬ
（５）分離ゲルバッファ：
水９００ｍｌ中にＴＲＩＳ１８１．６６ｇ、ＳＤＳ４ｇを溶解し、塩酸ＲでｐＨを８．８に調節し、体積が１０００ｍｌとなるように水で調節したもの。
【００６１】
（６）ＡＰＳ−溶液：
水中の過硫酸アンモニウム１０％（ｗ／ｖ）
（７）グリセリン溶液：
水中のグリセリン５０％（ｖ／ｖ）、若干のブロムフェノールブルーを添加したもの。
【００６２】
（８）水で含浸されたブタノール：
水上で貯蔵された２−ブタノール
（９）電極バッファ：
ＳＤＳ１９．９ｇ、グリシン２９９．６ｇ、ＴＲＩＳ５８．０ｇを水２０ｌ中に溶解させたもの。
【００６３】
（１０）ＤＴＴ−溶液：
平衡バッファ中の１％ＤＴＴ
（１１）ヨードアセトアミド溶液：
平衡バッファ中の溶解された４％ヨードアセトアミド
（１２）平衡バッファ：
３０％グリセリン、６Ｍ尿素、４％ＳＤＳ及び分離ゲルバッファ（５）３３．４０ｍＬを水中に溶解させ、体積を１０００ｍｌに調節したもの。
【００６４】
（１３）アガロース溶液：
バッファ（９）６０ｍｌ中にアガロース３００ｍｇ及び若干のブロモフェノールブルーを溶解させ、溶液が澄明になるまで沸騰させたもの。
【００６５】
（１４）タンパク質標準溶液：
Protein Test Mixture４及び５各１０ｍｇをリーシスバッファ（１）１ｍＬ中に溶解させる。溶液を少量のブロモフェノールブルーを添加することにより着色する。タンパク質の分子量は６．５ｋＤａ、１２．５ｋＤａ、２１ｋＤａ、２９ｋＤａ、４５ｋＤａ、６７ｋＤａ、９７．４ｋＤａである。
【００６６】
（１５）エタノール／酢酸混合物：７％酢酸、１０％エタノール
（１６）Sypro Ruby溶液、Biorad：
（１７）クーマシー溶液：
撹拌しながら、水１８０ｍＬ及びメタノール６０ｍＬをRoti-Blue（登録商標）-Concentrate６０ｍＬに添加する。
【００６７】
ペファブロックＳＣの記載：
ＡＥＢＳＦフッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩；これは以下の特徴を有する：
ＴＬＣ中で均質；式：Ｃ８Ｈ１０ＮＯ２ＳＦ  ｘ  ＨＣｌ；分子量：Ｍｒ＝２３９．５；セリンプロテアーゼの特異的な、有効な、及び非可逆的なインヒビター。ペファブロックＳＣの阻害活性はＰＭＳＦ又はＤＦＰと比較可能であるが、しかしながらこれは非毒性である。提案される開始濃度は０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ（０．４〜４ｍＭ）である。
【００６８】
ミニコンプリートの記載：
コンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット；これは以下の製品プロフィールを有する；インヒビターの特異性；広い阻害特異性を有する数種のプロテアーゼインヒビターの混合物。セリン、システイン及びメタロプロテアーゼ並びにカルパインを阻害する。動物、植物、細菌、酵母及び真菌を含む組織又は細胞からの抽出物を使用する。可逆的及び非可逆的なプロテアーゼの双方を含有する。溶解性／安定性：水性バッファ中に可溶性であるか、又は抽出媒体に直接添加する。また、水１．５ｍｌ中の７ｘ原液又は１００ｍＭホスフェートバッファ、ｐＨ７．０を準備する。原液は４℃で１〜２週間、又は−２０℃で少なくとも１２週間安定である。コンプリート中の全てのインヒビターを透析により除去することができる。＞１０ｋＤａのカットオフの膜を使用することが推奨される。コンプリートを室温でチオール含有溶液中で使用することができる。提案される開始濃度：タブレット１つを水性バッファ又は水１０ｍｌ中に溶解させる。極めて高いタンパク質分解活性が存在する場合にはタブレット１つに対してバッファ７ｍｌを使用する。
【００６９】
該方法を以下の装置又は当業者に公知の適当な同等の装置を用いて行う：
−：超音波処理装置：Bandelin electronics, Sonoplus, HD 2070
−：再膨潤トレー：ＩＰＧストリップ７〜１８ｃｍのためのImmobiline DryStrip Reswelling Tray；Art.No. 80-6371-84, Amersham Biosciences
−：電気泳動装置：Multiphor II, Art.No. 18-1018-06, Immobiline Dry Strip Kit, Art.No. 18-1004-30, Amersham Biosciences
−：ゲルキャスター：DALT Multiple Gel Caster, Art.No. 80-6330-61, Amersham Biosciences
−：キャスティングカセット：Dalt Gel Cassette, Art.No. 80-6067-27, Amersham Biosciences
−：分離シート：Separator Sheets, Art.No. 80-6436-63, Amersham Biosciences
−：Hoefer Dalt分離チャンバ：IsoDalt Gel Electrophoresis System ID 440-230V; Art.No. 80-6068-98, Amersham Biosciences
−：サーモスタットユニット：MultiTemp III Thermostatic Circulator, Art.No. 18-1102-78, Amersham Biosciences
−：電気泳動電源：EPS 3501 XL Power Supply, Art.No. 18-1130-05, Amersham Biosciences
−：蛍光スキャナ：FLA3000 (Raytest)
−：ProteomWeaver 2.2 (Definiens AG, 80339 Muenchen, Germany)
（Ａ）試料調製
試験すべき沈降パンクレアチンの試料１０ｍｇをＬｐ３  ５００μｌ中に溶解させる。大気温度で５分間振盪した後、懸濁液を遠心分離する。澄明な上澄み液をタンパク質含分の測定のために使用する(Bradford)。２種の異なるタンパク質を内部標準、即ち（ウサギからの）ホスホリラーゼｂ及びウシ炭酸脱水酵素として使用する。前記の標準を、一次元での分離を行う前に使用溶液に添加する。澄明な上澄み液の量を変化させる（５〜１５μｌ）ために、内部標準溶液１  ２μｌ及び内部標準溶液２  ６．７μｌを添加する。
【００７０】
内部標準溶液１の調製（ホスホリラーゼｂ）：
ホスホリラーゼｂの溶液を調製する  −  ２０℃で３０分間振盪することにより１μｇ／μｌの濃度を有するリーシスバッファ３中で凍結乾燥させる(Sigma, Prod.No.: P-6635)。
【００７１】
内部標準溶液２の調製（炭酸脱水酵素）：
炭酸脱水酵素の溶液を調製する  −  ２０℃で３０分間振盪することにより０．０３μｇ／μｌの濃度を有するリーシスバッファ３中で凍結乾燥させる(Sigma, Prod.No.: P-6403)。
【００７２】
（Ｂ）Immobiline Dry Stripsの再水和
既にカットされているＩＰＧストリップ（Immmobiline Dry Strips (Ｔ＝４％、Ｃ＝２．７％、ｐＨ３−１０ＮＬ）を乾燥かつ凍結状態におく。使用前にストリップをReswelling Tray内で一晩再水和させる。１８ｃｍのストリップのために、再水和溶液（３）３５０μＬを使用する。
【００７３】
（Ｃ）等電点電気泳動（１次元）
（Ｃ．１）再水和されたImmobiline Dry Stripsの準備
等電点電気泳動チャンバの冷却ブロックをサーモスタットで調温し、２０℃にする。再水和したストリップを水に浸漬し、ゲルアップ（gel up）で水を含浸させた濾紙（電極紙）のシート上に配置する。濾紙の第二のシートを水で湿潤させ、これを吸取って過剰の水を除去し、ＩＰＧゲルストリップの表面上に置く。穏やかに数秒間吸取り、過剰の再水和溶液を除去する。
【００７４】
（Ｃ．２）該手法を以下の工程１〜１３に従って行う。
【００７５】
１．冷却プレートをMultiphor II 電気泳動ユニット内に配置する。シリコーン油５ｍｌをピペットで冷却プレート上に施与し、次いでImmobiline DryStrip trayを冷却プレート上に配置する。トレーと冷却プレートとの間の大きな気泡のトラッピングを避けるべきである。
【００７６】
２．トレー上の電極リードとMultiphor IIユニットとを接続する。
【００７７】
３．シリコーン油約５ｍｌをトレーに注ぐ
４．Immobiline stripアライナーを油の頂部でトレー内に配置する。
【００７８】
５．再水和されたＩＰＧゲルストリップ（ゲル面が上で酸末端がアノードに向いている）をトレー内のアライナーの隣接した溝内に移す。アノードゲル縁部が並ぶようにストリップを調整する。
【００７９】
６．  ２種のＩＥＦ電極ストリップ又は厚さ２ｍｍの濾紙から製造された紙ストリップ（例えばMN 440, Macherey & Nagel, Germany）をトレーに並んでいる全てのＩＰＧゲルストリップの幅と相応する長さにカットする。電極ストリップを水で浸漬させ、過剰の湿分を濾紙で吸取ることにより除去し、湿潤したＩＥＦ電極ストリップをカソード及びアノード近傍の調整されたストリップの頂部に配置する。
【００８０】
７．電極を配置し、これをＩＥＦ電極ストリップの頂部に静かに押し下げる。
【００８１】
８．試料カップを試料カップバー上に配置する。カップをバーがゲル表面に接触しないような十分な高さに配置する。試料カップバーを、試料カップとアノード（又は、カソード試料適用の場合にはカソード）との間に数ミリメートルの距離ができるような位置に配置する。
【００８２】
９．  各ＩＰＧゲルストリップの上に１つの試料カップがのるように試料カップを移動させ、最後に、各ストリップとの良好な接触を保証するために試料カップを押し下げる。
【００８３】
１０．  試料カップを正しく配置したらすぐに、シリコーン油約５０ｍｌをトレーに注ぎ、ＩＰＧゲルストリップを完全にカバーする。油が試料カップ内に漏れた場合、油を吸収し、試料カップを再度調節し、再度漏れを確認する。各試料カップを数滴のシリコーン油で充填する。
【００８４】
１１．  アンダーレイにより試料をカップ内にピペットで施与し、再度漏れを確認する。
【００８５】
１２．  Multiphor II 電気泳動チャンバの蓋を閉鎖し、以下の表に与えられたパラメータ（運転条件）により運転を開始させる。試料搬入を改善するために、最初の数時間は電圧を低い電圧（１５０〜３００Ｖ）に制限する。その後、定常状態を持続させる。
【００８６】
【表５】
2007500343.tif 000007
【００８７】
１３．  ＩＥＨ運転が完了したら、電極、試料カップバー及びＩＥＦ電極ストリップをトレーから取り除く。清浄なピンセットを使用し、ＩＰＧゲルストリップをトレーから取り除く。二次元の運転のためにすぐに使用されるわけではなく、かつ／又は他の参照のために保持されるＩＰＧゲルストリップを２枚のプラスチックフィルムのシートの間で−７８℃で数ヶ月放置する。
【００８８】
（Ｄ）二次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のためのゲルのキャスティング
ゲルのキャスティングの１日前に、ゲル溶液１．５Ｌを準備し、脱気及び濾過する。溶液をしっかりと閉鎖されたフラスコ内で４℃で一晩保管する。キャスティングチャンバの溜めを漏斗で閉鎖する。グリセリン溶液１２５ｍｌを充填する。キャスティングの直前にＴＥＭＥＤ７５μＬ及びＡＰＳ−溶液８ｍｌをゲル溶液に撹拌しながら添加し、溶液をキャスティングチャンバに充填する。ゲル溶液を完全に移動した後、漏斗を取り除き、溜めからのグリセリン溶液を添加する。ゲル溶液をキャスティングチャンバのキャスティングカセット内にのみ配置する。ゲルを即座にブタノールで覆い、水を含浸させ、ゲルを３時間重合させる。
【００８９】
（Ｅ）二次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を以下の工程１〜１１に従って実施する：
１．  電気泳動チャンバを電極バッファ（９）で充填し、冷却する（１３℃）。キャスティングチャンバ内のゲルを、使用するまで、若干の水で覆う。
【００９０】
２．  各ゲルに対して、濾紙の小ストリップをタンパク質標準溶液５μｌで浸漬する。
【００９１】
３．  ＳＤＳゲルを鉛直位置で支持し、一次元ＩＰＧストリップの適用を助長する。
【００９２】
４．  ＩＰＧゲルストリップを以下のように平衡化する：
集束させたＩＰＧゲルストリップを冷凍装置から取り出し、個々の試験管内に配置する。平衡バッファ１０ｍｌを添加する。試験管をパラフィルムでシールし、振盪器上で１０分間振盪させ、その後平衡バッファを流出させる。ヨードアセトアミド溶液１０ｍｌを上記のように試験管に添加し、振盪器上で更に１０分間平衡化させる。
【００９３】
５．  第二の平衡化の後に、ＩＰＧゲルストリップを電極バッファで数秒間リンスする。
【００９４】
６．  過剰の水をゲルから除去し、ＩＰＧゲルストリップ及び濾紙及びタンパク質標準溶液をＳＤＳゲルの頂部の近傍に配置し、高温のアガロース溶液（７５℃）で覆う。慎重にＩＰＧストリップをＳＤＳゲルの表面にスパチュラで押し当て、完全な接触を達成する。アガロースを少なくとも５分間凝固させる。この手法を残りのＩＰＧストリップに対して繰り返す。
【００９５】
７．  ゲルカセットを電気泳動装置内に挿入し、電気泳動を開始させる。
【００９６】
８．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを以下の表で説明する通りに一晩運転させる。工程１は５０Ｖｈ続く。
【００９７】
【表６】
2007500343.tif 000008
【００９８】
９．  ブロモフェノールブルートラッキング染料がゲルの低い端部に達したら運転を停止する。
【００９９】
１０．  カセットをスパチュラで慎重に開け、スパチュラをポリアクリルアミドゲルからアガロースオーバーレイを取り除くためにも使用する。
【０１００】
１１．  ゲルをカセットホルダーから取り除き、その後水に浸漬してガラスプレートからゲルを取り除く。その後、固定、タンパク質染色又はブロッティングを続ける。
【０１０１】
（Ｆ）ゲルの固定及び染色
各ゲルを個々に固定する。固定をエタノール／酢酸混合物３５０ｍＬで３０分間実施する。染色を、SyproRuby−溶液（３５０ｍｌ）を用いて光から保護して３時間実施する。バックグラウンドの脱色を、エタノール／酢酸混合物３５０ｍＬを用いて、光から保護して３０分間行う。走査前に、ゲルを水で２回洗浄する。必要であればゲルを走査後にコロイド状のクーマシー−溶液で一晩染色する。翌日、着色されたゲルを水中で振盪する。バックグラウンドがほぼ脱色されたら光学式スキャナを用いて走査を行うことができる。
【０１０２】
分析２Ｄゲル電気泳動法の評価
沈降パンクレアチンを用いて得られた典型的な２Ｄゲルを、標識された同定スポットと共に図１に示す。
【０１０３】
２Ｄゲルの評価のための全ての得られた像を、蛍光スキャナ：FLA3000 (Raytest)を用いて測定する。ゲルをピクセルサイズ１００μの１６ビットファイルとして走査する。励起波長は４７３ｎｍである。
【０１０４】
Tiffファイルの評価をProteomWeaver 2.2 (Definiens)を用いて行う。像を適切な群に分類することにより実験を行う。その後、ソフトウェアのアルゴリズムに従って全てのゲルにわたってスポット検出を実施する。検出のために使用する設定はデフォルト設定であり、ゲル内のほぼ全ての観察可能なスポットに対して十分である。スポット検出後、全ての個々のゲルを手動で再確認し、不正確な検出が最小限に抑えられていることを確認する。スポット検出を行うと同時に、スポットの自動定量化をソフトウェアにより行い、実験全体にわたって量を標準化し、ゲル内の種々のスポットのスポット同一性の比較を容易にする。この標準化プロセスは、実験におけるゲルの数とは無関係であり、異なる時点での実験に集約されるゲルに関して実施することもできる。その後、ゲル全体にわたって、同じスポット同一物を同一のスポットに割り当てるマッチングプロセスを開始する。
【０１０５】
更に、２種の内部標識タンパク質ホスホリラーゼＢ及び炭酸脱水酵素を添加して、沈降パンクレアチンを用いて得られた典型的な２Ｄゲルを図７に示す。標準化、定量化及び結果的なマッチングプロセスにより、２種の内部標識タンパク質の強度が参照された１つのスポットの強度と公知のタンパク質の量との比較が容易になる。本発明による実施例において、ホスホリラーゼＢ及び炭酸脱水酵素を、特徴的であるがしかしながら常に一定の量のタンパク質を有する全ての試料に対して添加する（それぞれ２μｇ及び０．２μｇ）。双方のタンパク質が２Ｄゲルにおいて一定のパターンを示し、かつパンクレアチン試料の存在するスポットと重ならないことが示された。炭酸脱水酵素のみが単一スポットを生じ、ホスホリラーゼＢは少なくとも５種のアイソホームで現れるが、双方のタンパク質に関してスポット検出及び従って定量化を極めて容易に行うことができる。注目するスポットの強度と２種の標識タンパク質の強度との直接比較によって、スポットの強度が標識タンパク質の強度の範囲内になるとすぐに絶対的定量化がもたらされる。統計的に有意な結果を達成するために、全てのゲルを反復して処理し、少なくとも３回処理し、ゲルの群を相互に比較する。スポットの得られた平均強度は相互間のスポットの比較のためのベースである。
【０１０６】
パンクレアチンの分析のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたＲＰ−ＨＰＬＣの実現性
実現性の研究の主題は、パンクレアチン、特に沈降パンクレアチン又はパンクレアチンミニ−マイクロスフェアの分析のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いたＲＰ−ＨＰＬＣの有用性を示すことである。以下の試験において、Peptidomics（登録商標）プラットフォーム(BioVisioN AG, Hannover)を、ＨＰＬＣ法の特異性に関する詳細な評価及び確認を含め、以下で詳細に説明する通りに、沈降パンクレアチンの特性解析のために適用した。
【０１０７】
試料として、パンクレアチンの２種のバッチ（バッチ１及びバッチ２）をＨＰＬＣ試験において使用した。試料は、特性解析のために使用されるまで、光及び湿気から保護されて、例えば密閉瓶中で５＋／−３℃で保管されねばならない。開ける前に、例えば平衡化が完了するまで瓶を周囲条件で貯蔵することにより瓶を周囲条件に調節すべきである。
【０１０８】
以下に概説するＨＰＬＣ法を使用し、試料を試験した。破砕によって分画にし、引き続き、当業者に公知の標準プロトコル、例えばPeptidomics（登録商標）プラットフォームによるプロトコルに従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより特性解析を行った。液体のクロマトグラフィーを欧州薬局方（Ph. Eur., 2.2.29）に従って実施する。
【０１０９】
沈降パンクレアチンの特定成分（化合物）のタンパク質及び／又はペプチドパターンを２１４ｎｍの検出波長でＲＰ−１８逆相カラム上でグラジエントＨＰＬＣにより行う。定量化を、面積％法に従って行う。一般に、Ph. Eur.試薬は文字Ｒにより示され；秤量又は測定された量はPh. Eur.において示される精度の程度に相応する（１．通則）。更に、限定のない「水」という用語は、比抵抗ＮＬＴ０．１８ＭΩｍ及びＴＯＣ  ＮＭＴ０．５ｍｇ／ｍｌの脱イオン水を意味する。
【０１１０】
以下の試薬をテスト実験において使用した：
−クロマトグラフィー用のアセトニトリルＲ、例えばBaker, no.: 9017
−トリフルオロ酢酸Ｒ
−塩化ナトリウムＲ
−溶剤：水１ｌ中に塩化ナトリウムＲ２０．００ｇを溶解したもの（２％  ＮａＣｌ溶液）
以下の装置又は同等のシステムをテスト試験において使用した：
以下のものから構成されたAgilent ＨＰＬＣ装置：
−オートサンプラー G 1313A
−ALSTherm G1330A
−Quat. pump G 1311A
−ＵＶ検出器G 1314A
−真空脱気装置G 1322A
−HPカラムオーブンG1316A
−1100 制御モジュール G 1323A
−LANインターフェース35900E
−ChemServer
Heraeus Biofuge 17RS又は同等のシステム。
【０１１１】
カラム：
−Type: MODULO O-CART QS UPTISPHERE 5 WRP, Interchim(UP5WRP$15QS)
−固定相：ＲＰ  −  １８、５．０μｍ
−管材料：ステンレス鋼
−長さ：１５０ｍｍ
−内径：３．０ｍｍ
ＨＰＬＣ試験を以下の条件下で実施する：
操作モード            グラジエントＨＰＬＣ
移動相                移動相Ａ  水／ＴＦＡ０．０５％（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ  アセトニトリル／ＴＦＡ０．０５％（ｖ／ｖ）
グラジエント
【０１１２】
【表７】
2007500343.tif 000009
【０１１３】
流動速度              １．０ｍｌ／分
分析の期間            ９５分
温度                  ２７±２．０℃
注入体積              １０μｌ
オートサンプラー温度  ４℃±１℃
２１４ｎｍの波長でのＵＶ検出器による検出
アッセイ準備：
試験すべき沈降パンクレアチン約８０．０ｍｇを３０ｍｌのビーカー中に秤り入れる。パンクレアチン腸溶ミニ−マイクロスフェアの試験のために、ミニ−マイクロスフェアを予め粉砕しなければならず、かつ粉末１４０ｍｇを秤り入れる。試料を＜４℃で１５分間撹拌しながら氷冷溶剤１０ｍｌ中に溶解させる。溶液を遠心分離する（約８ｍｌ；１０分；１５０００ｒ．ｐ．ｍ．；４℃；Heraeus Biofuge 17RS）。澄明な上澄み液を試料溶液として注入する。試料調製をシーケンスを開始する直前に新たに行わなければならない。
【０１１４】
パフォーマンス：
沈降パンクレアチンの異なるバッチ及びその調製物は、上記のＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いることによりすでに試験されている。選択性は適当な処理時間内にピークの最大数を得るために最適化される。パンクレアチンバッチ１により得られる典型的なクロマトグラムを図８〜１１及び表Ｊ及びＫに示す。
【０１１５】
表Ｊ及びＫの内容：
表Ｊ  パンクレアチンのスポット同定に関するデータ（図１１参照）：同定２０＋
表Ｋ  パンクレアチンのスポット同定に関するデータ（図１１参照）：同定２０＋Ｘ
図８〜１１の内容：
図８  沈降パンクレアチンの典型的なクロマトグラム、バッチ１
図９  沈降パンクレアチンの典型的なクロマトグラム（０〜１４分）、バッチ１
図１０  沈降パンクレアチンの典型的なクロマトグラム（６０〜９０分）、バッチ１
図１１  沈降パンクレアチンの注釈付きのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（３５分）、バッチ１
特異性の評価及びピークの同定に関して、ＥＳＩ−ＭＳへのＬＣの結合は既に試されていたが、シグナルは重なっていた。従って、Peptidomics（登録商標）技術を適用することにより、沈降パンクレアチンの試料を試験した。クロマトグラムは自動的に９６個の分画に分割され、その際、１つの分画は約５５．１秒の処理時間に相当する。その後、分画を自動的にシナピン酸のマトリックスと一緒にピペットでターゲットプレート上に移した。個々の単一スポットをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにかけ、自動的なポジショニングの後に多重脱離及びイオン化を伴う。
【０１１６】
考慮すべき興味深い質量範囲はｍ／ｚ１〜約６００００にわたる。この範囲を、シングルｍ／ｚシグナルの定量化を伴うPeptidomics（登録商標）技術のための標準プロトコルに従って視覚化した。見い出されたｍ／ｚを相応する分画及びもとのクロマトグラムに沿って示した。
【０１１７】
【表８】
2007500343.tif 000010
【０１１８】
【表９】
2007500343.tif 000011
【０１１９】
【表１０】
2007500343.tif 000012
【０１２０】
【表１１】
2007500343.tif 000013
【０１２１】
【表１２】
2007500343.tif 000014
【０１２２】
【表１３】
2007500343.tif 000015
【０１２３】
【表１４】
2007500343.tif 000016
【０１２４】
【表１５】
2007500343.tif 000017
【０１２５】
【表１６】
2007500343.tif 000018
【０１２６】
【表１７】
2007500343.tif 000019
【０１２７】
【表１８】
2007500343.tif 000020
【０１２８】
【表１９】
2007500343.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】標識された同定スポットを有する沈降パンクレアチンにより得られる２Ｄゲル（表Ｊ及びＫのデータも参照のこと）。
【図２】沈降パンクレアチンの単一試料を用いた２Ｄゲル法の再現性；別々の４日間で行われた３種のゲルを示す図（ＩＰＧ  ３−１０ＮＬ、蛍光染色；外部標準炭酸脱水酵素、３２０ｎｇの量で施与）。
【図３】ストレス試験後のパンクレアチンバッチ１に関して得られた２Ｄゲルを示す図（Sypro Ruby）。
【図４】ストレス試験後のパンクレアチンバッチ２に関して得られた２Ｄゲルを示す図（Sypro Ruby）。
【図５】パンクレアチンバッチ１に関して算出された平均化されたゲルを示す図（ｎ＝３）。
【図６】パンクレアチンバッチ２に関して算出された平均化されたゲルを示す図（ｎ＝３）。
【図７】分析手法「同一性及びタンパク質パターン」に関する記載の項に記載されている通りに得られた、２種の内部標識タンパク質ホスホリラーゼＢ及び炭酸脱水酵素を添加した、沈降パンクレアチンの２Ｄゲルを示す図。
【図８】沈降パンクレアチンの典型的なクロマトグラム、バッチ１を示す図。
【図９】沈降パンクレアチンの典型的なクロマトグラム（０〜１４分）、バッチ１を示す図。
【図１０】沈降パンクレアチンの典型的なクロマトグラム（６０〜９０分）、バッチ１を示す図。
【図１１】沈降パンクレアチンの注釈付きのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（３５分）、バッチ１を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007500343.tif 000029
【図９】
2007500343.tif 000030
【図１０】
2007500343.tif 000031
【図１１】
2007500343.tif 000032
【国際調査報告】
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