(57)【要約】ヒトサブグループＢアデノウイルスを使用して疾患を処置するための方法および組成物。上記のようなウイルス由来のベクターであって、１つ以上のサブグループＢアデノウイルス遺伝子が、外来遺伝子によって置換される発現ベクター系を含むベクター。本発明の特徴は、組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスの記載であり、この組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスは、機能的腫瘍サプレッサ遺伝子産物に結合し得る、発現されたウイルス腫瘍タンパク質を欠き、そして主にＣＡＲ依存性機構によって細胞に感染する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団における新形成細胞を除去するための方法であって、以下の工程：
感染条件の下で（１）機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、組換え複製欠損サブグループＢアデノウイルスと、（２）ウイルス性腫瘍タンパク質と結合複合体を形成する該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を含有する非新形成細胞、および該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を欠く新形成細胞を含む細胞集団とを接触させることによって、感染された細胞集団を生成させる工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記腫瘍抑制物質が、ｐ５３、またはｐＲｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス性腫瘍タンパク質が、アデノウイルスＥ１ｂポリペプチドまたはアデノウイルスＥ１Ａポリペプチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サブグループＢアデノウイルスが、３型または３４型からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
患者の癌を処置する方法であって、該患者に、機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたアデノウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、組換え複製欠損サブグループＢアデノウイルスを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６】
前記サブグループＢアデノウイルスが、３型または３４型からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アデノウイルス性腫瘍タンパク質が、Ｅ１ｂポリペプチドまたはＥ１Ａポリペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
図１に示されるヌクレオチド配列を含む、組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３型。
【請求項９】
ストリンジェント条件の下で図１に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列。
【請求項１０】
図２に示されるヌクレオチド配列を含む、組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３４型。
【請求項１１】
ストリンジェント条件の下で図２に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ｐＲｂまたはｐ５３にそれぞれ結合する腫瘍タンパク質をコードするＥ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域における変異を含み、該変異が、ｐＲｂまたはｐ５３のそれぞれに対する該腫瘍タンパク質の結合を減少または排除する変異である、請求項８に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３型。
【請求項１３】
前記変異が、欠失変異または点変異である、請求項１２に記載の組換えヒトアデノウイルス。
【請求項１４】
ｐＲｂまたはｐ５３にそれぞれ結合する腫瘍タンパク質をコードするＥ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域における変異を含み、該変異が、ｐＲｂまたはｐ５３のそれぞれに対する該腫瘍タンパク質の結合を、減少または排除する変異である、請求項１０に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３４型。
【請求項１５】
前記変異が、欠失変異または点変異である、請求項１４に記載の組換えヒトアデノウイルス。
【請求項１６】
Ｅ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする領域を含む、図１または図２に示されるヌクレオチド配列、またはストリンジェント条件下で該配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【請求項１７】
図１または図２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質、またはストリンジェント条件の下で該配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術）
本明細書中で記載される本発明は、ヒトサブグループＢアデノウイルスを使用して疾患を処置する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
条件により複製するウイルスは、抗癌剤の有望な新たなクラスを表す。癌細胞において選択的に複製して、そしてその癌細胞を殺傷する、ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）の誘導体が開発されている。このようなウイルスの基本型であるＯＮＹＸ−０１５（サブグループＣアデノウイルス）は、再発性の頭頚部癌を有する患者、ならびに肝転移性疾患を有する患者についての、いくつかの第Ｉ相臨床試験および第ＩＩ相臨床試験において有望な結果を示した。
【０００３】
アデノウイルスが細胞において効率的に複製するために、アデノウイルスＥ１ｂ遺伝子産物ｐ５５は、宿主細胞ｐ５３タンパク質と複合体を形成し、これによって、ｐ５３を隔絶および／または不活化し、そしてｐ５３機能を欠損している細胞を産生する。ｐ５３機能を欠損したこのような細胞は、アデノウイルスの複製を支持し得る。このように、野生型アデノウイルスは、ｐ５３を含有する細胞において複製し得る。なぜなら、アデノウイルスｐ５５タンパク質は、宿主細胞のｐ５３タンパク質を不活化および／または隔絶するからである。Ｏｎｙｘ−０１５は、変異ｐ５５タンパク質をコードするＥ１ｂ遺伝子座を含む組換えアデノウイルスであり、その変異ｐ５５タンパク質は、上記組換えアデノウイルスによって感染され得る新形成細胞を含む個体または細胞集団に投与される場合、感染細胞においてｐ５３タンパク質と機能的な複合体を実質的に形成し得ない。組換えアデノウイルスが、感染非新形成細胞においてｐ５３タンパク質を効率的に隔絶することに実質的に無能であることは、非新形成細胞において複製表現型を発現できない、導入された組換えアデノウイルスポリヌクレオチドを生じる。対照的に、機能的ｐ５３タンパク質を欠く新形成細胞は、導入された組換えアデノウイルスによる、複製表現型の発現を支持し、これは、アデノウイルス細胞変性効果による新形成細胞の難解および／または複製表現型に連結された陰性選択遺伝子の発現をもたらす。
【０００４】
Ｏｎｙｘ−０１５を用いる持続的な臨床試験から学んだ教訓は、毒性よりも効力がその治療上の利点を限定するらしいということである。現在までに、用量が限定する毒性は観察されていない。腫瘍溶解性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ウイルスの臨床的効力を高めるための１つの戦略は、それらを他の治療（例えば、標準的な化学療法）と組み合わせること、またはそれらに抗癌遺伝子（例えば、抗血管新形成因子、細胞傷害剤、酵素を変換するプロドラッグ、もしくはサイトカインなど）を加えることである。別のアプローチ（これは、化学療法および抗癌遺伝子と組み合わせられ得る）は、遺伝学的にウイルスを変換し、そのウイルスをより強力にすること（すなわち、より迅速に複製すること、より多くのウイルス子孫を産生すること、ならびに組織特異性および／または細胞型特異性を高めることなど）である。癌細胞をより迅速に、より選択的に殺傷し、そして最終的に癌を根絶する、治療用ウイルスを生じることが、ここでの目的である。
【０００５】
そのような治療的戦略の臨床的局面は、アデノウイルスが標的細胞に進入する能力に依存する。このプロセスは、多段階現象であり、この現象は、アデノウイルス線維ノブタンパク質がその細胞レセプターＣＡＲに結合することによる、細胞へのウイルスの結合によって開始されると考えられている（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１３２０−１３２３）。次いで、第２の段階において、ウイルスの内在化は、αｖβ３インテグリンおよびαｖβ５インテグリンによって、アデノウイルスペントンベースのＲＧＤドメインとの相互作用を介して、媒介される（Ｗｉｃｋｈａｍら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９；Ｍａｔｈｉａｓら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６８１１−６８１４）。内在化の後、ウイルス粒子は、核膜に移動する。このプロセスの間、キャプシドが取り除かれ、最後に、ウイルスＤＮＡが核に放出され、ここでウイルスＤＮＡの複製が開始される。細胞上のＣＡＲの存在は、アデノウイルス感染の効力について主要な決定因子であると考えられる。対照的に、二次アデノウイルスレセプター（αｖβ３インテグリンおよびαｖβ５インテグリンを含む）の発現とは関係がない（Ｈｅｍｍｉら（１９９８）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２３６３−２３７３）。
【０００６】
サブグループＣアデノウイルスを癌を処置するために使用することに対する潜在的な障害が、２つ存在する。１つは、最近の実験研究が、ＣＡＲ発現は、癌の特定形態に罹患する患者において、インビトロおよびインビボの両方で、正常細胞と比較して腫瘍細胞において減少されることを示したことである。ＣＡＲ発現レベルとトランスフェクション有効性アデノウイルスとの間に良好な相関が存在することが、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によって見出された（Ｊｅｅ  ＹＳ，Ｌｅｅ  ＳＧ，Ｌｅｅ  ＪＣ，Ｋｉｍ  ＭＪ，Ｌｅｅ  ＪＪ，Ｋｉｍ  ＤＹ，Ｐａｒｋ  ＳＷ，Ｓｕｎｇ  ＭＷ，Ｈｅｏ  ＤＳ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２２（５）：２６２９−３４）。また、内因性ＣＡＲ発現を示さないヒト膀胱癌細胞へのＣＡＲのトランスフェクションは、これらの細胞の感染能力（ｉｎｆｅｃｔｉｂｉｌｉｔｙ）を増大させた（Ｌｉら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３２５−３３０）。
【０００７】
癌治療のためにサブグループＣアデノウイルスを使用することに関する２つ目の障害は、肝臓においてウイルスの蓄積を促進するという所望しない副作用を有する、肝細胞（ｈｅｐｏｃｙｔｅ）中のＣＡＲの存在である。サブグループＢ系および最適タンデム線維系を実証するサブグループＢウイルスは、Ａｄ５線維ベクターと比較して、２ログをこえて肝臓の形質転換を減少した（Ｓｃｈｏｇｇｉｎｓ  ＪＷ，Ｇａｌｌ  ＪＧ，Ｆａｌｃｋ−ＰｅｄｅｒｓｅｎＥ．：Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００３  Ｊａｎ；７７（２）：１０３９−４８）。
【０００８】
上述のように、基本型腫瘍溶解性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ウイルスはＯｎｙｘ０１５であり、これはサブグループＣウイルスである。上で考察した理由のために、サブグループＣウイルスから構築されたアデノウイルスベクターは、それらの腫瘍溶解性の潜在性を制限するという、ある特性を有する。医者に別の腫瘍溶解性ウイルスを提供するために、Ｏｎｙｘ  ０１５の特性、およびサブグループＢアデノウイルスの特性を有するアデノウイルスを産生することが有用である。
【０００９】
科学文献および特許文献において、サブグループＢアデノウイルスの遺伝子の局面（これらのウイルスの特定領域のヌクレオチド配列を含む）を記載する報告が存在する。
【００１０】
ＷＯ０２４０６９３Ａ１は、アデノウイルスレプリコンが、Ａｄ５由来のＤＮＡとサブグループＢアデノウイルスＤＮＡとの間に融合を有する組換えアデノウイルスを含むことを示す。
【００１１】
ＷＯ０２４０６６５は、サブグループＢ（好ましくはアデノウイルス３５型）由来の血清型に基づく組換えアデノウイルスを補完し得るパッケージング細胞株を示す。
【００１２】
ＷＯ０２２７００６は、骨格筋細胞の形質転換のための手段および方法、上記細胞に対して親和性を有するアデノウイルスに由来する遺伝子送達ビヒクルの使用を示す。上記遺伝子送達ビヒクルは、サブグループＢのアデノウイルス線維タンパク質の少なくとも１つの親和性決定部分を含む。
【００１３】
ＷＯ００５２１８６は、線維芽細胞様細胞またはマクロファージ様細胞に対する組織親和性を有する、アデノウイルスサブグループＢ核酸送達ビヒクルを記載する。
【００１４】
ＷＯ００３１２８５は、平滑筋細胞および／または内皮細胞に対する組織親和性を有する核酸送達ビヒクルを提供する。１つの局面において、上記核酸送達ビヒクルは、サブグループＢアデノウイルスのウイルスキャプシドである。
【００１５】
ＷＯ８９０６２８２は、改変された自己抑圧機能ドメインを有するヒトアデノウイルスサブグループＢ：ｌの機能変異ＥｌＡ遺伝子を記載する。
【００１６】
米国特許第６，４９２，１６９号は、サブグループＢ（好ましくはアデノウイルス３５型）由来の血清型に基づく組換えアデノウイルスを補完するパッケージング細胞株を示す。
【００１７】
米国特許第５，７７０，４４２号は、サブグループＢアデノウイルスキメラ線維タンパク質を含む組換えアデノウイルスを示す。
【００１８】
米国特許第４，９２０，２１１号は、改変された自己抑圧機能ドメインを有するヒトアデノウイルスサブグループＢ：ｌの機能変異ＥｌＡ遺伝子を示し、このドメインは、ＥｌＡ変異遺伝子を制御するプロモーターの正味の抑圧なしに促進するＥ１Ａ産物を発現するのに効率的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明の特徴は、組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスの記載である。
【００２０】
本発明はまた、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型およびヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ゲノム配列を示す。
【００２１】
別の局面において、本発明は、異質ＤＮＡ配列の発現のための、組換えヒトサブグループＢアデノウイルス、および上記アデノウイルスに由来する組換えウイルスベクターの使用を包含する。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、サブグループＢ３型およびサブグループＢ３４型に基づくヒトアデノウイルス発現ベクター系（ここで、Ｅ１遺伝子領域およびＥ３遺伝子領域の１つもしくは両方の一部または全体が欠失される）に関する。
【００２３】
本発明の特徴は、組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスの記載であり、この組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスは、機能的腫瘍サプレッサ遺伝子産物に結合し得る、発現されたウイルス腫瘍タンパク質を欠き、そして主にＣＡＲ依存性機構によって細胞に感染する。
【００２４】
本発明の別の特徴は、機能的腫瘍サプレッサ遺伝子産物に結合し得る、発現されたウイルス腫瘍タンパク質を欠く、腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスの記載である。
【００２５】
本発明の別の局面は、機能的Ｅ１Ａウイルス腫瘍タンパク質または機能的Ｅ１Ｂ  ５５ｋウイルス腫瘍タンパク質をコードする能力を欠く、ヒトサブグループＢアデノウイルスに関する。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、組換えヒトサブグループＢアデノウイルスを使用して疾患を処置することの記載である。
【００２７】
本発明のこれらの局面および別の局面は、以下を完全に考慮する際、当業者に明らかとなる。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本特許の全体にわたって引用される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許／特許出願が具体的にかつ別々に、その全体が参照として援用されるように示される場合と同程度まで、参照として援用される。本発明の実施は、他で特に示されない限り、慣用的な微生物学、免疫学、ウイルス学、分子生物学、および当該分野の範囲内である組換えＤＮＡ技術を使用する。これらの技術は、文献に完全に説明される。例えば、以下を参照のこと：Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ（編））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ（編）（１９８４））；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（編）（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４），Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；第Ｉ巻，第ＩＩ巻および第ＩＩＩ巻（１９８９）。また、以下も参照のこと：  Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９。
【００２９】
（Ａ．定義）
他で特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語の全ては、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中で記載される方法および材料と類似または等価であるいずれの方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。
【００３０】
米国特許第５，６７７，１７８号および同第５，８０１，０２９号に示される定義は、本明細書において適用可能であり、そして以下の用語を包含する。
【００３１】
「複製欠損ウイルス」とは、所定の細胞集団（例えば、ｐ５３機能および／またはＲＢ機能を実質的に欠く細胞）における細胞増殖を優先的に阻害するウイルスをいい、これは、非複製の形質転換されていない細胞に特徴的な正常なｐ５３レベルまたはＲＢレベルを含む細胞において、ウイルス複製表現型の発現を支持し、そして実質的に、細胞増殖を阻害し得るか、アポトーシスを誘発し得るか、または複製表現型を発現し得る。代表的に、複製欠損ウイルスは、正常なｐ５３機能またはＲＢ機能を含む細胞に対するプラーク効率（ｐｌａｑｕｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の実質的な低下を示す。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ｐ５３機能」とは、ｐ５３遺伝子によってコードされるポリペプチドの本質的に正常なレベル（すなわち、同じ組織学型の非新形成細胞に対して）を有する特性をいい、ここで、ｐ５３ポリペプチドは、サブグループＣ野生型アデノウイルス３４のＥ１ｂ  ｐ５５タンパク質に結合し得る。例えば、ｐ５３機能は、ｐ５３の不活性（すなわち、変異体）形態の産生によって、またはｐ５３ポリペプチド発現の実質的な低下または全体的な損失によって、損失され得る。また、ｐ５３機能は、野生型ｐ５３タンパク質をコードするｐ５３対立遺伝子を含む新形成細胞において実質的に存在し得ない；例えば、ｐ５３遺伝子座以外での遺伝学的変化（例えば、異常な細胞下プロセシングまたはｐ５３の局在化をもたらす変異（例えば、核よりも細胞質において優位なｐ５３の局在化をもたらす変異）、またはｐ５３が作用することによる、分子の損失もしくは不活性化）は、ｐ５３機能の損失をもたらし得る。つまり、生化学的経路において、ｐ５３が作用することによる変化が存在し得、これは、ｐ５３機能の損失を引き起こす。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「複製表現型」とは、複製欠損アデノウイルスのようなウイルスに感染された細胞の以下の表現型特徴のうちの１つ以上をいう：（１）後期遺伝子産物（例えば、キャプシドタンパク質（例えば、アデノウイルスペントン塩基ポリペプチド）またはウイルス性後期遺伝子プロモーターから開始されるＲＮＡ転写物）の実質的な発現、（２）ウイルスゲノムの複製または複製中間体の形成、（３）ウイルスキャプシドまたはパッケージングされたビリオン粒子のアセンブリ、（４）感染細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現、（５）ウイルス溶解性サイクルの完了、および（６）他の表現型変化（これは、代表的に機能的腫瘍タンパク質をコードする野生型複製コンピテントＤＮＡウイルスに感染された非新形成細胞におけるｐ５３機能の抑止に付随する）。複製表現型は、列挙された表現型特徴のうちの少なくとも１つ、好ましくはその表現型特徴のうちの１つより多くを含む。
【００３４】
用語「抗腫瘍性複製欠損ウイルス」は、本明細書中で、同一の組織学的細胞型の感染性の非複製非新形成細胞に対して感染新形成細胞を優先的に細胞殺傷することによって、ヒトにおける新形成物の発生または発達を阻害する機能的特性を有する組換えウイルスをいうことに使用される。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「新形成（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）」、「新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」、「癌」または「腫瘍」とは、比較的に自発的増殖を示し、その結果、細胞増殖制御の有意な損失を特徴とする異常な増殖表現型を示す細胞をいう。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結されている」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれる場合、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写物に影響を与える場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されていることは、連結されているＤＮＡ配列が代表的には隣接し、２つのタンパク質コード領域に結合することが必要な場合、隣接してリーディングフレーム中に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは一般的に、プロモーターから数キロベース離された場合に機能し、そしてイントロン配列は可変性の長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結され得るが、隣接はしていない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「生理学的条件」とは、インタクトな哺乳動物細胞内あるいは生きている哺乳動物の組織空間または器官内の条件と実質的に類似したイオン強度、ｐＨ、および温度を有する水性環境をいう。代表的に、生理学的条件は、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（または必要に応じてＫＣｌ）、ｐＨ６．５〜８．１、および約２０℃〜４５℃の温度を有する水溶液を包含する。一般的に、生理学的条件は、生物学的高分子の分子間会合のために適切な結合条件である。例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３７℃での生理学的条件が、一般的に適切である。
【００３８】
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節塩基配列の制御の下に置かれる場合、インビボでポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、ウイルスＤＮＡ、およびさらに合成ＤＡＮ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’にある。
【００３９】
「転写プロモーター配列」とは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列は、コード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）によって３’末端で結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含むために、上流（５’方向）を伸長する。
【００４０】
ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモーター配列、リボソーム結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、エンハンサー、翻訳終結配列などを集合的にいい、それらは、宿主細胞中のコード配列の転写および翻訳を集合的に提供する。
【００４１】
コード配列またはコードする配列とは、ＲＮＡポリメーラーゼが、プロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、そのｍＲＮＡが、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される場合、細胞中の制御配列に「作用可能に連結される」か、または細胞中の制御配列「の制御の下」にある。
【００４２】
「宿主細胞」とは、外因性のＤＮＡ配列によって、形質転換されているか、または形質転換され得る細胞である。
【００４３】
２つのポリペプチド配列は、アミノ酸の少なくとも約８０％（好ましくは、少なくとも約９０％、および最も好ましくは、少なくとも約９５％）が、分子の定義された長さにわたって一致する場合、「実質的に相同性」である。
【００４４】
２つのＤＮＡ配列は、それらがヌクレオチドに対して同一であるか、またはヌクレオチドの４０％より多く、好ましくはヌクレオチドの約３０％より多く（すなわち、少なくとも約７０％の相同性）、より好ましくはヌクレオチドの約２０％より多く、および最も好ましくはヌクレオチドの約１０％より多くと相違しない場合、「実質的に相同性」である。
【００４５】
実質的に相同性であるＤＮＡ配列は、サザンハイブリダイゼーションの実験で、例えば、特定の系について定義されるような、ストリンジェントな条件下で同定され得る。高度にストリンジェントな条件としては、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中のフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の洗浄が挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋのｐ．２．１０．３）。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該分野の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００４６】
ＤＮＡコンストラクトの「異種」領域とは、天然の他の分子との会合において見い出されていない別のＤＮＡ分子内または別のＤＮＡ分子に付着されるＤＮＡの同定可能なセグメントである。
【００４７】
「融合タンパク質」は、通常、リーダー配列をコードするか、またはポリペプチドを安定化させる第１領域、および異種タンパク質をコードする第２領域を含む遺伝子の発現産物として定義される。それは、抗原タンパク質フラグメントまたは全長アデノウイルスタンパク質配列ならびに異種配列、代表的に、細胞内に発現したポリペプチドについての組み換え宿主における分泌のための機能的なリーダー配列、を含むポリペプチドに関与する。抗原タンパク質フラグメントは、通常、長さが約５〜７アミノ酸である。
【００４８】
「組み換え」ポリペプチドとは、組み換えＤＮＡ技術によって生成されるポリペプチドをいう。
【００４９】
「実質的に純粋な」タンパク質とは、他のタンパク質がなく、好ましくは、少なくとも１０％の相同性、より好ましくは６０％の相同性、および最も好ましくは９５％の相同性である。
【００５０】
「感染性」によって、アデノウイルスゲノムを細胞に送達するための能力を有することが意味される。
【００５１】
「ＣＡＲ」とは、宿主細胞に感染して侵入を増やす過程で、サブグループＣアデノウイルスが結合する細胞上のレセプターをいう。それは、Ｃｏｋｓａｋｉｅ  アデノウイルスレセプター（Ｃｏｋｓａｋｉｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の略語である。
【００５２】
「腫瘍溶解性」とは、正常細胞を実質的に選択して；すなわち、実質的に正常細胞に害を与えないで腫瘍性細胞を殺すための本発明のヒトサブグループＢアデノウイルスの能力をいう。
【００５３】
（Ｂ．一般的な方法）
アデノウイルスサブグループＢゲノム／コード領域：ヒトサブグループＢアデノウイルスゲノムは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手され得る。好ましくは、サブグループＢ３型および３４型由来のそのウイルスは、Ａ５４９細胞ならびに標準的な感染技術および増殖技術を含む、当該分野において周知の物質および方法を使用して、増殖され得る。Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ、編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９。ウイルスは、塩化セシウム勾配バンディング遠心分離を含むいくつかの技術によって精製され得る。例えば、米国特許第５，８３７，５２０号および米国特許第６，００８，０３６号を参照のこと。
【００５４】
ウイルスＤＮＡは、好ましくは：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６％  ＳＤＳおよび１ｍｌあたり１．５ｍｇのプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からなる溶解溶液中のウイルス粒子を溶解することによって配列決定のために調製される。その溶液は、好ましくは、３７℃である。溶解したウイルス粒子は、フェノール／クロロホルムで抽出され、ウイルスＤＮＡは、エタノールで沈殿される。精製したウイルスＤＮＡは、蒸留水に溶解されて、ＤＮＡ配列決定のために使用される。
【００５５】
次に、アデノウイルスサブグループＢ３型または３４型のいずれか由来のウイルスＤＮＡは、適切な制限酵素、好ましくはＳａｕ  ３ＡＩで制限消化され、続いて１％アガロースゲル中で消化したＤＮＡを分解する。サイズが０．８ｋｂと１．２ｋｂとの間のフラグメントは、商業的なＤＮＡゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して精製され、その後、適合した制限酵素で以前に消化した適切なベクターにクローン化される。実施例により詳細に記載されるように、Ｂａｍ  ＨＩは、ベクターであるｐＧｅｍ−７ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を消化するために使用され得る。
【００５６】
次に、数百の個々のクローンは、自動シークエンサー、ＣＥＱ２００００ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ならびに標準的なＴ７およびＳＰ６シークエンシングプライマーを使用して配列決定される。コンティグは、ＳｅｑＭａｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を使用して構築された。構築された配列に基づいて、オリゴヌクレオチドは合成され、プライマーウォーキングは、全てのコンティグが結合されるまで行われ得る。以下に記載したように、ほとんどの領域は、少なくとも２つの独立した配列決定によって対象とされた。
【００５７】
本発明は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型および３４型の完全なヌクレオチドゲノム配列を開示する。それぞれ、図１および図２を参照のこと。また示しているのは、これらのウイルスの特定の領域（Ｅ１Ａを含む）についてのヌクレオチド配列（３型および３４型について、それぞれ、図３および図５）、Ｅ１Ａ領域についてのアミノ酸配列（３型および３４型について、それぞれ、図４および図６）である。５５Ｋタンパク質、およびそれらのアミノ酸配列をコードするＥ１Ｂ領域をコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルス３型および３４型について、それぞれ、図１および図２に示されている。
【００５８】
ヒトサブグループＢアデノウイルス３型および３４型のゲノム配列に加えて、これらのウイルスの種々の領域は、配列決定されて、アミノ酸配列は決定されている（図３）。
組み換え体：１つの実施形態において、本発明は、Ｅ１領域、特にＥ１Ｂ領域、および／またはＥ３領域を含む、ヒトサブグループＢアデノウイルスのヌクレオチド配列の一部または全てを欠失させる方法を特定し、提供する。所望の場合、外来遺伝子またはそのフラグメントをコードする異種または相同性のヌクレオチド配列は、ヒトアデノウイルス組み換え体を生成するために、挿入され得る。「欠失部分の」ヌクレオチド配列によって、Ｅ１Ｂおよび／またはＥ３領域の一部のヌクレオチド配列を欠失させるための従来の遺伝子工学技術を使用することが意味される。
【００５９】
挿入は、制限消化、ヌクレアーゼ消化、ライゲーション、キナーゼおよびホスファターゼ処理、ＤＮＡポリメラーゼ処理、逆転写酵素処理、ならびに化学的なオリゴヌクレオチド合成に限定されないが、これらを含む、当該分野で理解されている技術によって作製される。目的の外来の核酸配列は、プラスミドベクター内にクローン化され、その結果、その外来の配列は、挿入が指向されるアデノウイルスゲノムの領域と実質的に相同性を有する配列に隣接する。次いで、これらの構築物は、所望のサブグループＢウイルスと同時感染される宿主細胞内に導入される。感染の間に、これらの構築物とアデノウイルスゲノムとの間の相同的な組み換えが生じ、組み換えアデノウイルスベクターを生成する。挿入が、アデノウイルスゲノムの本質的な領域において生じる場合、組み換えアデノウイルスベクターは、挿入によって失ったウイルス機能を供給するヘルパー細胞株中で増殖される。
【００６０】
好ましいアデノウイルスの欠失は、腫瘍性タンパク質である５５ＫをコードするＥ１Ｂ領域の全てまたは一部が除去されていることである。この欠失は、複製欠失サブグループＢアデノウイルスを生成する効果を有する。同様に、Ｅ１Ｂ領域において選択した変異を作製することによって、複製欠失であるサブグループＢアデノウイルスを生成することが可能である。米国特許第６，０８０，５７８号を参照のこと。そのような複製欠失サブグループＢアデノウイルスは、ｐ５３機能を欠き、ＣＡＲでない機構により主に腫瘍性細胞に感染する腫瘍細胞に対して腫瘍溶解性である。ＣＡＲは、肝細胞上に高レベルで存在し、しばしば腫瘍細胞上で減少するので、サブグループＢの複製の欠失したアデノウイルスは、例えば、サブグループＣアデノウイルスと比べて肝臓によって容易に取り込まれないという点で、全身の活性を高めている。従って、それはまた、サブグループＣアデノウイルスと比べた場合、高レベルの腫瘍溶解性の活性を示す。
【００６１】
本発明の代替の実施形態において、Ｅ１ａ腫瘍性タンパク質をコードするＥ１ａ遺伝子座における欠失または変異を含む組み換えサブグループＢアデノウイルスが構築され得、その欠失または変異は、Ｅ１ａタンパク質が、感染細胞中のＲＢタンパク質と複合体を実質的に形成し得なくさせる。例えば、米国特許第５，８０１，０２９号を参照のこと。このタイプの組み換えサブグループＢウイルスの利点は、感染した非腫瘍性細胞中のＲＢタンパク質を実質的に引き離すのが実質的に不能であることであり、これにより、非腫瘍性細胞中で複製表現型を発現できない導入した組み換えアデノウイルスを生じる。対照的に、機能的なＲＢタンパク質を欠く腫瘍性細胞は、アデノウイルスの細胞変性効果による腫瘍性細胞の除去をもたらす導入した組み換えアデノウイルスによる複製表現型の発現を支持する。
【００６２】
これらの実施形態の好ましい変化において、組み換えサブグループＢアデノウイルスは、ｐＲＢ（および／または３００ｋＤのポリペプチドおよび／または１０７ｋＤのポリペプチド）を結合し得るドメインを欠くが、アデノウイルス初期遺伝子をトランス活性化し得る機能的なＥ１ａドメインを含む、変異Ｅ１ａタンパク質をコードするＥ１ａ遺伝子座を含む。これらの実施形態のさらなる変化としては、組み換えアデノウイルスが、ｐＲＢに結合して不活性化するタンパク質を実質的に発現し得ない非機能的なＥ１ａ遺伝子座を含むことが挙げられる。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、高い効率で、Ｅ３を欠失させた組み換えアデノウイルスサブグループＢ（異種配列の挿入を有するか、または有さない）を構築、単離および増殖させるための組成物および方法を提供する。これらとしては、アデノウイルスＥ１の機能を発現する適切な細胞株または等価の細胞株における組み換えウイルスの単離、および方法が挙げられ、この方法において、組み換えゲノムは、適切な宿主細胞における相同的な組み換えによって構築され、それによって得られる組み換えゲノムは、適切な細胞株にトランスフェクトされ、組み換えウイルスは、トランスフェクトされた細胞から単離される。例えば、米国特許第６，４９２，１６９号を参照のこと。
【００６４】
本発明の１つの実施形態において、組み換えアデノウイルスサブグループＢ発現カセットは、１つ以上の適切な制限酵素で野生型のゲノムを開裂することによって得られ得、以下；例えば、Ｅ１、好ましくはｐＲＢを結合する腫瘍性タンパク質をコードするＥ１Ａ、またはｐ５３を結合する５５Ｋタンパク質をコードするＥ１Ｂ、あるいはＥ３領域の配列、をそれぞれ含むウイルス制限酵素フラグメントを生成する。ウイルス制限酵素フラグメントは、クローニングビヒクル（例えば、プラスミド）に挿入され得、その後、少なくとも１つの異種配列（異種タンパク質をコードし得るか、またはコードし得ない）は、作動可能に連結された真核生物の転写調節配列を有するかまたは有さない選択されたウイルス領域中に挿入され得る。その組み換え発現カセットは、アデノウイルスサブグループＢゲノムと接触され、適切な宿主細胞における相同的な組み換え、または他の従来の遺伝子工学方法によって、所望の組み換え体が得られる。
【００６５】
適切な宿主細胞としては、アデノウイルスサブグループＢゲノムとウイルス配列を含むプラスミドとの間、または各々がウイルス配列を含む２つ以上のプラスミドとの間の組み換えを支持する任意の細胞が挙げられる。ウイルス粒子を生成するために、ウイルスゲノムを含むプラスミドのトランスフェクションは、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは２９３細胞、およびそれらの等価物で行われるが、組み換えは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）で行われ得る。細菌細胞培養物の増殖、ならびに真核細胞および哺乳動物細胞株の培養および維持は、当業者に周知の方法である。
【００６６】
１つ以上の異種配列は、アデノウイルスサブグループＢゲノムの１つ以上の領域中に挿入されて組み換えウイルスベクターを生成し得、これは、ウイルスゲノムの挿入能力および挿入した異種配列を発現する組み換えウイルスベクターの能力によってのみ制限される。融合タンパク質は、この方法で生成され得る。一般に、アデノウイルスゲノムは、約５％のゲノムの長さの挿入を受け入れ得、ウイルス粒子中にパッケージされ得るままであり得る。挿入能力は、本質的でない領域の欠失および／または本質的な領域の欠失によって増加され得、その機能は、ヘルパー細胞株によって与えられる。
【００６７】
本発明の一つの実施形態において、挿入は、挿入が所望されるサブグループＢのアデノウイルスゲノムの領域を含むプラスミドを構築することによって達成され得る。次いで、このプラスミドは、このプラスミドのウイルス部分における認識配列を有する制限酵素で消化される。そして、異種配列が、制限消化の部位に挿入される。上記プラスミドは、挿入された異種配列を有するウイルスゲノムの一部分を含み、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に、アデノウイルスゲノムまたはアデノウイルスゲノムを含む直鎖状プラスミドと共に、共形質転換される。ここで、上記アデノウイルスゲノムは、全長ゲノムであり得るか、または１以上の欠失を含み得る。プラスミドの間の相同組換えは、挿入された異種配列を含む組換えアデノウイルスゲノムを生み出す。
【００６８】
異種配列を挿入するための部位を提供するためか、または異なる部位において挿入するためのさらなる能力を提供するために、アデノウイルスサブグループＢの配列の欠失は、当業者に周知の方法によって達成され得る。例えば、プラスミド中でクローニングされた配列について、１以上の制限酵素を用いた（ウイルス挿入物における少なくとも１つの認識配列を用いた）消化の後にライゲーションされ、いくつかの場合において、制限酵素認識部位の間の配列の欠失を生じる。あるいは、ウイルス挿入物内の一個の制限酵素認識部位における消化の後に、エキソヌクレアーゼ処理をされ、続いてライゲーションされる。これは、制限部位に隣接したウイルス配列の欠失を生じる。１以上の欠失を有するアデノウイルスゲノムの１以上の部分を含むプラスミドは、上に記載されるように構築され、細菌細胞中に、アデノウイルスサブグループＢゲノム（全長または欠失された）あるいは全長ウイルスゲノムまたは欠失したウイルスゲノムのどちらかを含むプラスミドとともに共形質転換され得、相同組換えによって１以上の特定の部位に欠失を有する、組換えウイルスゲノムを含むプラスミドを生み出す。次いで、欠失を含むサブグループＢウイルスは、組換えウイルスゲノムを含むプラスミドを用いた哺乳動物細胞のトランスフェクションによって得られ得る。
【００６９】
本発明の一実施形態において、挿入部位は、アデノウイルスプロモーターに隣接し得、そして（転写鎖において）下流に位置し得る。プロモーターの位置、および挿入部位として使用するための制限酵素認識配列は、本明細書中に提供されるサブグループＢアデノウイルスヌクレオチド配列から、当業者によって容易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術は、特定の部位における制限酵素認識配列の挿入のためか、または制限酵素認識配列を含まない部位における異種配列の挿入のために、使用され得る。このような方法としては、１以上の制限酵素認識配列の挿入のための、オリゴヌクレオチド媒介性ヘテロ二重鎖形成（例えば、Ｚｏｌｌｅｒら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９０）Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：８９−９６；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４：３６７−３８２を参照のこと）およびより長い配列を挿入するためのＰＣＲ媒介性方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｚｈｅｎｇら（１９９４）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：１６３−１８６を参照のこと。
【００７０】
上記異種配列が、真核細胞において活性である転写調節配列をさらに含む場合、アデノウイルスサブグループＢプロモーターから下流でない部位に挿入された異種配列の発現を得ることもまた、可能である。
【００７１】
本発明はまた、異種遺伝子の発現を調節するために使用され得るアデノウイルスサブグループＢ調節配列も提供する。調節配列は、例えば、転写調節配列、プロモーター、エンハンサー、上流調節ドメイン、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、翻訳調節配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列であり得る。
【００７２】
別の実施形態において、本発明は、外来遺伝子もしくはそれらのフラグメントをコードしてウイルス組換えを生み出す、異種のヌクレオチド配列または相同なヌクレオチド配列を挿入するために適切なサブグループＢアデノウイルスゲノム（およびそのフラグメント）のさらなる領域を同定し、提供する。別の実施形態において、クローンのサブグループＢアデノウイルスゲノムは、プラスミドとして増殖され得、そしてプラスミド含有細胞から、感染性ウイルスがレスキューされ得る。
【００７３】
アデノウイルス核酸の存在は、当業者に公知の技術（ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、および他の型の増幅反応が挙げられるが、これらに限定されない）によって検出され得る。同様に、タンパク質を検出するための方法は、当業者に周知であって、これらの方法としては、種々の型の免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、酵素アッセイ、免疫組織化学などが挙げられるが、これらに限定されない。種々の外来遺伝子またはヌクレオチド配列またはコード配列（原核細胞、および真核細胞）は、本発明に従って、アデノウイルスヌクレオチド配列中（例えば、ＤＮＡ）に挿入され得る。異種のヌクレオチド配列は、１以上の目的遺伝子、好ましくは治療目的遺伝子からなり得る。本発明の文脈において、目的の遺伝子は、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）；リンフォカイン；陰性選択剤（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）（例えば、チミジンキナーゼ）、膜レセプター（例えば、病原体（ウイルス、細菌または寄生物）によって、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）によって認識されるレセプター）；または増殖因子をコードする遺伝子のいずれかをコードし得る。この列挙は限定ではなく、目的の他の遺伝子が、本発明の文脈において使用され得る。
【００７４】
目的の遺伝子は、ゲノム型（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｙｐｅ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）型、または混合型（ミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）、少なくとも１つのイントロンが欠失している）であり得る。これは、成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体（特に、分泌され、そしてその結果、一個のペプチドを含むことが意図される前駆体）、多様な起源の配列の融合が起源であるキメラタンパク質、または改良もしくは改変された生物学的特性を示す天然タンパク質の変異体をコードし得る。このような変異体は、天然のタンパク質をコードする遺伝子の１以上のヌクレオチドの欠失、置換および／または付加、あるいは、天然のタンパク質をコードする配列中の任意の他の型の変化（例えば、転移または逆位）によって得られ得る。
【００７５】
目的の遺伝子は、宿主細胞において発現するために適切なエレメント（ＤＮＡ制御配列）の制御のもとに配置され得る。適切なＤＮＡ制御配列は、遺伝子のＲＮＡへの転写（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳に必要とされるエレメントのセットを意味することが、理解される。転写に必要とされるエレメントのうちで、プロモーターが特に重要であると考えられる。プロモーターは、定常的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターまたは調節可能な（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）プロモーターであり得、真核細胞起源、原核細胞起源、またはウイルス起源の任意の遺伝子、およびさらにアデノウイルス起源の任意の遺伝子から単離され得る。あるいは、プロモーターは、目的の遺伝子の天然のプロモーターであり得る。概して、本発明で使用されるプロモーターは、調節配列を含むように改変され得る。例えば、ＨＳＶ−１  ＴＫ（ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）（特に、ヒトアデノウイルス２型）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長末端反復）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）初期プロモーター、およびＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子プロモーターを含む、種々のプロモーターが使用され得、多くの細胞型における発現を可能にする。
【００７６】
サブグループＢアデノウイルス組換えの複製またはそこからの遺伝子の発現を調節するために、有利に（ａｄｖａｎｔａｇｏｕｓｌｙ）適用され得るプロモーターは、米国特許出願番号０９／７１４，４０９またはＥＰＡ  １２３０３７８に記載される、Ｅ２Ｆプロモーターである。
【００７７】
特定の細胞型に対する組換えサブグループＢアデノウイルスベクターの標的化は、組換えヘキソンおよび／またはファイバー（ｆｉｂｅｒ）遺伝子を構築することによって、達成され得る。これらの遺伝子のタンパク質産物は、宿主細胞の認識に関連する；従って、これらの遺伝子は、ウイルスが代替の宿主細胞を認識することを可能にするペプチド配列を含むように、改変され得る。
【００７８】
野生型の生物において見出される完全配列でなく、遺伝子のヌクレオチド配列のフラグメントのみが使用され得ること（ここで、これらは、防御性免疫応答または特定の生物学的効果を生み出すために十分である）もまた、可能である。入手可能な場合、合成遺伝子またはそのフラグメントもまた、使用され得る。しかし、本発明は、多種多様な遺伝子、フラグメントなどと共に使用され得、上に記載されたものに限定されない。
【００７９】
いくつかの場合において、特定の抗原に対する遺伝子は、多くのイントロンを含み得るか、またはＲＮＡウイルス由来であり得る。これらの場合において、相補的ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）が使用され得る。
【００８０】
遺伝子の発現が成功して起こるために、それは、エンハンサーエレメントおよびポリアデニル化配列を含む適切なプロモーターと一緒に、発現ベクター中に挿入され得る。哺乳細胞において、外来遺伝子の発現の成功を提供する、多くの真核細胞プロモーターおよびポリアデニル化配列、ならびに発現カセットを構築する方法は、当該分野（例えば、米国特許第５，１５１，２６７号、本明細書中に参考として援用される開示）で公知である。上記プロモーターが選択され、公知の判断基準に従う体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、および粘膜性免疫応答を順番に十分に生じる、免疫原性タンパク質の最適な発現を与える。
【００８１】
本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクルおよび／またはアジュバントと組み合わせた、治療有効量の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢウイルスまたは、本発明の方法に従って調製される、そこから由来するベクターを含む薬学的組成物も含む。このような薬学的組成物は、当該分野で周知である技術に従って調製され得、そして決定される投薬量であり得る。本発明の薬学的組成物は、任意の公知の投与経路によって投与され得る。これらの投与経路としては、全身性（例えば、静脈内、気管内、血管内、肺内、腹腔内、鼻内、非経口、経腸、筋肉内、皮下、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）または頭蓋内）投与またはエーロゾール投与もしくは肺内点滴注入による投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、単回用量または特定の時間間隔後の１回以上繰り返される投与で行われ得る。適切な投与経路および投薬量は、状況（例えば、処置される個体、処置される障害、または目的の遺伝子もしくはポリペプチド）に従って異なるが、当業者によって決定され得る。
【００８２】
本発明の別の実施形態において、Ｅ１機能（あるいは、任意の特定のウイルスベクターにおいて変異または欠失され得る、他のウイルス領域の機能）は、細胞を、上記ベクターが欠く機能を発現するウイルスに共感染させることによって（補完する細胞株（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を提供するために）、供給され得る。
【００８３】
本発明はまた、サブグループＢアデノウイルス発現ベクターを含む発現系も含む。この発現系において、異種ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）は、Ｅ３領域の一部または全て、Ｅ１領域もしくはＥ１Ｂ領域の一部または全て、Ｅ２領域の一部または全て、Ｅ４領域の一部または全て、Ｅ４とゲノムの右端との間の領域の一部または全て、後半（ｌａｔｅ）領域（Ｌ１−Ｌ７）の一部または全て、ならびに／あるいはペントン遺伝子によって占有される領域の一部または全てを置換する。上記発現系は、外来ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）が任意の他の異種プロモーターの制御ありか、または制御なしで、使用され得る。
【００８４】
ヒトにおける遺伝子治療に関して、本発明の実施は、疾患（癌、心臓血疾患などが挙げられるが、これらに限定されない）の予防または処置が意図される。癌の処置に対して適用される場合、上記アデノウイルスベクターは、化学療法と併用され得る。本発明の目的のために、本発明の方法によって調製されるベクター、細胞、およびウイルス粒子は、エキソビボ（すなわち、細胞または患者から除かれた細胞において）で被験体に導入され得るか、または処置される身体にインビボで直接的に導入され得るかのいずれかである。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞であり、そしてより好ましくは、肺細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、またはリンパ球性細胞もしくは造血性系統の細胞である。
【００８５】
本発明のアデノウイルスは、患者に対する治療投与および診断投与のために処方され得る。治療用途または予防用途のために、薬理学的有効投薬量のアデノウイルスを含む無菌の組成物が、例えば、新形成状態の処置のために、ヒト患者または獣医学的な非ヒト患者に対して投与される。一般的に、上記組成物は、水性懸濁液中に、約１０３〜１０５以上のアデノウイルス粒子を含む。薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤が、多くの場合、このような無菌組成物中に適用される。種々の水性溶液（例えば、水、緩衝化水、０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンなど）が、使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般的に所望のアデノウイルスベクター以外の粒子状物質を含まない。上記組成物は、生理学的状態に近いことが必要とされるので、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、毒性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。アデノウイルスによって細胞の感染を増強する賦形剤が、含まれ得る。
【００８６】
本発明のサブグループＢアデノウイルス、またはそこに含まれるＤＮＡは、リポソーム送達または免疫リポソーム送達によって新形成細胞にも送達され得；そのような送達は、新形成細胞集団上に存在する細胞表面の性質（例えば、免疫リポソーム中の免疫グロブリンに結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づき、選択的に新形成細胞を標的とすることができる。代表的には、ビリオンを含有する水性懸濁液をリポソームまたは免疫リポソーム中に被包する。例えば、アデノウイルスビリオンの懸濁液を、従来の方法によりミセルに被包し免疫リポソームを生成することができる（米国特許第５，０４３，１６４号、同第４，９５７，７３５号、同第４，９２５，６６１号；ＣｏｎｎｏｒおよびＨｕａｎｇ（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：５８２；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２７９；Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ＬＦおよびＮｉｍｍｏ  ＷＳ編；Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９８９）；Ｒｅｄｄｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５ページ）。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原（例えばＣＡＬＬＡ、ＣＥＡ）に特異的に結合する抗体を含む免疫リポソームは、ビリオンまたはビリオンＤＮＡをこれらの細胞に標的とするために使用され得る。
【００８７】
本発明のアデノウイルスまたはそのカクテルを含有する組成物は、新生物疾患の治療的処置のために投与され得る。治療的適用では、既に特定の新生物疾患に罹患している患者に、その状態および合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するに充分な量の組成物が投与される。これを達成するための十分な量を、「治療的有効用量」または「有効用量」と定義する。この用途のための有効な量は、状態の重篤度、患者の一般状態、および投与経路に依存する。
【００８８】
以下の記載は、本発明の実施例である。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供され、決して本発明の範囲を制限することは意図されない。本開示を考慮して、特許請求の範囲内の多くの実施形態は、当業者にとって明らかである。本明細書において引用された参考文献の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【００８９】
（実施例１：アデノウイルス３ゲノム配列およびアデノウイルス３４ゲノム配列）
ヒトサブグループＢアデノウイルス３型およびヒトサブグループＢアデノウイルス３４型（以下、それぞれ、Ａｄ３またはＡｄ  ３４としても言及される）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。上記ウイルスを、Ａ５４９細胞（これもまたＡＴＣＣから入手可能）において、標準的感染技術および標準的増殖技術を利用して増殖させた。両方のウイルスを、塩化セシウム勾配バンド形成遠心分離（ｃｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｂａｎｄｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって精製した。
【００９０】
ウイルスＤＮＡを、塩化セシウム勾配バンド化ウイルス粒子から、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６％  ＳＤＳおよび１ｍｌあたり１．５ｍｇのプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からなる溶液中で上記ウイルス粒子を溶解することによって得た。上記溶液は３７℃であった。溶解した粒子を、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、そしてウイルスＤＮＡを、エタノールで沈澱させた。精製されたウイルスＤＮＡを、蒸留水に溶解し、そしてＤＮＡ配列決定に使用した。
【００９１】
次に、ウイルスＤＮＡを、Ｓａｕ  ３ＡＩを用いた制限消化に供し、その後、１％アガロースゲル中で、消化されたＤＮＡを分離した。０．８ｋｂと１．２ｋｂとの間の大きさのフラグメントを、市販のＤＮＡゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して精製し、次いでＢａｍ  ＨＩで消化したベクターｐＧｅｍ−７ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ベクターにクローンした。
【００９２】
２００個の個別のクローンを、自動シークエンサー、ＣＥＱ２００００ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ）および、標準的なＴ７シークエンスプライマーおよびＳＰ６シークエンスプライマーを使用して配列決定した。コンフィグ（ｃｏｎｔｉｇ）は、ＳｅｑＭａｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を使用して構築した。上記構築された配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成し、そして全てのコンフィグが結びつくまでプライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）を行った。ほとんどの領域を、少なくとも２つの独立した配列決定によって補った。
【００９３】
（実施例２：Ａｄ３４基幹（ｂａｃｋｂｏｎｅ）におけるＥ１Ｂ  ５５Ｋ欠失ウイルスの構築）
（プラスミド構築）
ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に基づくベクターを、改変し、そして該当するヌクレオチド配列をクローニング、サブクローニングするために使用した。プラスミド構築は、固有のＮｈｅＩ制限酵素認識部位が、Ａｄ３４ゲノムの左端から６．５ＫＢにあるという事実に基づいた。プラスミド構築は、ＨｉｎｄＩＩＩを用いたＡｄ３４ゲノム（１５μｇ）の消化で開始した。２．２Ｋｂおよび３．４Ｋｂの大きさの、２つのフラグメントを、１％アガロースゲル上で単離し、Ｂｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを使用して精製した。上記２．２Ｋｂのフラグメントを、事前にＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したｐＧＥＭ−７Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした。上記構築物を、正しいフラグメントおよび正しい方向性のために、制限酵素マッピングによって評価した。この構築物を２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚと呼称した。次に、上記２．２／ｐＧＥＭ７Ｚ構築物における上記ＮｈｅＩ部位に近い上記ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＮｈｅＩおよびＣｌａＩを用いて消化し、その後、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め込み、そして再ライゲーションすることによって除去した。第１の上記Ａｄ３４ゲノムの１．４Ｋｂは、ＰＣＲプライマーＰ０４  Ｆｗｄ  （５’ＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡ−３’）およびＡｄ３４−１３７０Ｂ（５’ＧＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡ−３’）、１ｎｇのゲノムテンプレートＤＮＡおよびＰｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）によって生成した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、１％アガロースゲル上で単離し、そしてＢｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製された１．４Ｋｂのフラグメントを、１．４／２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚ構築物を作製するために、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚにライゲーションした。３．４Ｋｂのフラグメントを、事前にＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したｐＧＥＭ−９Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。上記構築物を、正しいフラグメントおよび正しい方向性について、制限酵素マッピングによって評価した。
【００９４】
Ｅ１Ｂ１９Ｋ遺伝子重複およびＥ１Ｂ５５Ｋ遺伝子重複として、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子の不活性化を、Ｅ１Ｂ５５Ｋの開始部位の下流に終止コドンを導入し、そしてＥ１Ｂ１９Ｋ末端の末端とＥ１Ｂ５５Ｋ遺伝子の残部との間の配列の削除によって達成した。上記削除領域を、ＰｍｅＩ部位で置換した。Ｅ１Ｂ５５Ｋの変異誘発を、３．４／ｐＧＥＭ９Ｚ構築物を用いた２工程ＰＣＲプロセスを使用して行った。ＰＣＲの第１工程に由来する産物を、ＰＣＲプライマーＰ０２  ｆｗｄ（５’−ＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＴ−３’）、Ｐ０３  Ｒｅｖ（５’−ＴＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）、１０ｎｇの３．４／ｐＧＥＭ−９ＺテンプレートＤＮＡおよびＦａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して生成した。第２のＰＣＲ工程産物を、ＰＣＲプライマーＰ０１  ｆｗｄ（５’−ＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＧ−３’）および第１のＰＣＲ反応由来の産物、１０ｎｇの３．４／ｐＧＥＭ９ＺテンプレートＤＮＡならびにＦａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して生成した。上記ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、ＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、２％アガロースゲル上で単離し、そしてＢｉｏ１０１  ＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いて精製した。上記精製されたＥ１Ｂ５５Ｋ欠失フラグメントを、３．４Δ５５Ｋ／ｐＧＥＭ−９Ｚを生成するために、事前にＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した３．４／ｐＧＥＭ９Ｚ中にライゲーションした。上記１．４Ｋｂのフラグメント、上記２．２ｋｂのフラグメントおよび上記３．４Δ５５Ｋフラグメントを構築するために、上記３．４Δ５５Ｋ／ｐＧＥＭ−９Ｚ構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、この３．４Δ５５Ｋフラグメントを、１％アガロースゲル上で単離し、Ｂｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製された３．４Δ５５Ｋフラグメントを、シャトルベクター（ＳＶ１３）を作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そしてＣＩＰによって処理した１．４／２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚ構築物中にライゲーションした。
【００９５】
上記シャトルベクター（ＳＶ１３）を配列決定した後、上記ＰＣＲにおける誤差によって引き起こされた、１．４ＫＢフラグメント中の単一の点変異があることを発見した。この誤差を修正するために、新しい１．４ＫＢ  ＰＣＲ産物を、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ由来のｐｆｕ）を使用したことを除いて、同じＰＣＲ条件を使用して生成した。精製された１．４Ｋｂフラグメントを、シャトルベクター、ＳＶ２−５を生成するために、ＮｏｔＩおよびＢｍｇＢＩを用いて消化したＳＶ１３シャトルベクターにライゲーションした。この構築物を、配列決定によって検証した。
【００９６】
（ウイルス構築およびウイルス単離）
サブグループＢアデノウイルス３４型（Ａｄ３４）（ＡＴＣＣ）ＴＰ  ＤＮＡを、Ｓ．Ｍｉｙａｋｅら、（ＰＮＡＳ  １９９６）に記載されるように作製した。Ａｄ３４ΔＥ１Ｂ５５Ｋウイルスを構築するために、上記ＳＶ２−５構築物を、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ（８．５μｇ）を用いて消化し、１％アガロースゲル上で単離し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。その後、このフラグメントの５μｇを、室温で一晩、ＮｈｅＩを用いて、３７℃で６時間消化した０．２５μｇのＡＤ３４−ＴＰ  ＤＮＡにライゲーションした。上記ライゲーション混合物を、６０ｍｍディッシュにおいて、２％  ＦＢＳ培地を補充したＤＭＥＭ中のＨＥＫ２９３細胞内に、製造業者のプロトコルに従って、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してトランスフェクトした。上記トランスフェクトを、３７℃／３％ＣＯ２で一晩、２４時間インキュベートした。トランスフェクトを、２４時間後に、上記培地を除去し、そしてその培地を２％  ＦＢＳ、２％  Ｌ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｅｉｎｅ）、１％  ＰＳを補充したＤＭＥＭで置換することによって停止し、その後、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。上記細胞を、２％  ＦＢＳ、２％  Ｌ−グルタミン、１％  ＮＥＡＡ、１％  ＰＳおよび１．５％  ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースを含むＤＭＥＭ感染培地でオーバーレイし（ｏｖｅｒｌａｙ）、そして新鮮なオーバーレイ培地を２〜３日ごとに供給した。プラークを単離し、ＨＥＫ２９３細胞上で増殖し、そしてウイルスＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。ウイルスを、Ｅ１Ｂ５５Ｋ欠失領域について、以下のプライマー：ＳＶｆｗｄ０５（５’−ＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＧＧＣ−３’）およびＰ０３Ｒｅｖ（５’−ＴＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）を使用して、ＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲを、Ｆａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、以下のサイクル条件：９４℃で５分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間〜９０秒間を２５〜３０サイクル、そして７２℃で７分間を１サイクル、そして最後に４℃で無期限の下で行った。陽性プラークを、２９３／Ｅ４細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）上で４ラウンド精製した。全てのウイルス単離物を、Ｅ１Ｂ５５Ｋ欠失配列およびＡｄ３４野生型Ｅ１Ｂ５５Ｋの内部配列について、以下のプライマー：３．４ｆｗｄ０３（５’−ＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＧＣ−３’）および３．４ｒｅｖ１２（５’−ＧＴＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲによってスクリーニングした。
【００９７】
Ａｄ３４ΔＥ１Ｂ５５Ｋウイルス、上記シャトルベクター（ＳＶ２−５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、それぞれ、受託番号＿および受託番号＿で寄託する。
【００９８】
本発明は、明確な理解を目的として、例示によってある程度詳細に記載されたが、特定の変更および改変が、特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−１】図１−１は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図１−２】図１−２は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図１−３】図１−３は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図１−４】図１−４は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図１−５】図１−５は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図１−６】図１−６は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図１−７】図１−７は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−８】図２−８は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−９】図２−９は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−１０】図２−１０は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−１１】図２−１１は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−１２】図２−１２は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−１３】図２−１３は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図２−１４】図２−１４は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域を示す。
【図３】図３は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型のＥ１Ａ領域のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型のｃＤＮＡによってコードされるＥ１Ａ領域のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型のＥ１Ａ領域のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型のｃＤＮＡによってコードされるＥ１Ａ領域のアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型のオープンリーディングフレーム６のＤＮＡ配列を示す。
【図１−１】
2007530004.tif 000002
【図１−２】
2007530004.tif 000003
【図１−３】
2007530004.tif 000004
【図１−４】
2007530004.tif 000005
【図１−５】
2007530004.tif 000006
【図１−６】
2007530004.tif 000007
【図１−７】
2007530004.tif 000008
【図２−８】
2007530004.tif 000009
【図２−９】
2007530004.tif 000010
【図２−１０】
2007530004.tif 000011
【図２−１１】
2007530004.tif 000012
【図２−１２】
2007530004.tif 000013
【図２−１３】
2007530004.tif 000014
【図２−１４】
2007530004.tif 000015
【図３】
2007530004.tif 000016
【図４】
2007530004.tif 000017
【図５】
2007530004.tif 000018
【図６】
2007530004.tif 000019
【図７】
2007530004.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月16日(2006.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３型。
【請求項２】
配列番号１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３型。
【請求項３】
配列番号１として提示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３型。
【請求項４】
配列番号３に対して少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３４型。
【請求項５】
配列番号３に対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３４型。
【請求項６】
配列番号３として提示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループＢ  ３４型。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えヒトアデノウイルスであって、ｐＲｂまたはｐ５３にそれぞれ結合する腫瘍タンパク質をコードするアデノウイルスのＥ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域における変異をさらに含み、該変異が、ｐＲｂまたはｐ５３のそれぞれに対する該腫瘍タンパク質の結合を減少または排除する変異である、組換えヒトアデノウイルス。
【請求項８】
前記変異が、欠失変異または点変異である、請求項７に記載の組換えヒトアデノウイルス。
【請求項９】
癌の処置に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えヒトアデノウイルスの薬学的組成物。
【請求項１０】
ストリンジェント条件の下で配列番号１として提示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１１】
配列番号１に対する少なくとも約８０％の同一性を含む、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号１に対する少なくとも約９０％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号１として提示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１４】
ストリンジェント条件の下で配列番号３として提示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１５】
配列番号３に対する少なくとも約８０％の同一性を含む、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１６】
配列番号３に対する少なくとも約９０％の同一性を含む、請求項１５に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号３として提示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１８】
癌を処置するための医薬を製造する際の、請求項１〜８に記載のいずれか１項に記載の組換えヒトアデノウイルス、または請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の単離された核酸配列の使用。
【請求項１９】
Ｅ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、配列番号１９または配列番号２０に対する少なくとも約９０％の同一性を含む、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９または配列番号２０である、請求項１９に記載のＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２１】
Ｅ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ストリジェント条件下で配列番号１９または配列番号２０にハイブリダイズする、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、実質的に純粋なＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質。
【請求項２３】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の実質的に純粋なＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質。
【請求項２４】
Ｅ１Ａタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、配列番号５または配列番号７に対する少なくとも約９０％の同一性を含む、Ｅ１Ａタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号５または配列番号７である、請求項２４に記載のＥ１Ａタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２６】
Ｅ１Ａタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ストリジェント条件下で配列番号５または配列番号７にハイブリダイズする、Ｅ１Ａタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる実質的に純粋なＥ１Ａタンパク質。
【請求項２８】
配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の実質的に純粋なＥ１Ａタンパク質。
【請求項２９】
細胞集団における新形成細胞を除去するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は：
機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、請求項７または８に記載の組換え複製欠損サブグループＢアデノウイルスを、（ｉ）ウイルス性腫瘍タンパク質と結合複合体を形成する該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を含有する非新形成細胞、および（ｉｉ）該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を欠く新形成細胞を含む細胞集団と共に含み、該薬学的組成物は、感染条件下で接触されるように処方され、接触させることによって、感染された細胞集団を生成させる、薬学的組成物。
【請求項３０】
患者の癌を処置するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたアデノウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、請求項７または８に記載の組換え複製欠損サブグループＢアデノウイルスを含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
細胞集団における新形成細胞を除去するためのエキソビボまたはインビトロの方法であって、以下の工程：
感染条件の下で（１）機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、請求項７または８に記載の組換え複製欠損サブグループＢアデノウイルスと、（２）（ｉ）ウイルス性腫瘍タンパク質と結合複合体を形成する該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を含有する非新形成細胞、および（ｉｉ）該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を欠く新形成細胞を含む細胞集団とを接触させることによって、エキソビボまたはインビトロで感染された細胞集団を生成させる工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
細胞集団において癌細胞を優先的に殺傷するエキソビボまたはインビトロの方法であって、該方法は、感染条件の下で、機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたアデノウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、請求項７または８に記載の組換え複製欠損サブグループＢアデノウイルスと、該細胞集団とを接触させて、感染された細胞集団を生成させる工程
を包含する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
癌治療のためにサブグループＣアデノウイルスを使用することに関する２つ目の障害は、肝臓においてウイルスの蓄積を促進するという所望しない副作用を有する、肝細胞中のＣＡＲの存在である。サブグループＢ系および最適タンデム線維系を実証するサブグループＢウイルスは、Ａｄ５線維ベクターと比較して、２ログをこえて肝臓の形質転換を減少した（Ｓｃｈｏｇｇｉｎｓ  ＪＷ，Ｇａｌｌ  ＪＧ，Ｆａｌｃｋ−ＰｅｄｅｒｓｅｎＥ．：Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００３  Ｊａｎ；７７（２）：１０３９−４８）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の特徴は、組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスの記載であり、この組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループＢアデノウイルスは、機能的腫瘍サプレッサ遺伝子産物に結合し得る、発現されたウイルス腫瘍タンパク質を欠き、そして主にＣＡＲ非依存性機構によって細胞に感染する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
「ＣＡＲ」とは、宿主細胞に感染して侵入を増やす過程で、サブグループＣアデノウイルスが結合する細胞上のレセプターをいう。それは、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  アデノウイルスレセプター（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の略語である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
サブグループＢアデノウイルス組換えの複製またはそこからの遺伝子の発現を調節するために、有利に適用され得るプロモーターは、米国特許出願番号０９／７１４，４０９またはＥＰＡ  １２３０３７８に記載される、Ｅ２Ｆプロモーターである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
２００個の個別のクローンを、自動シークエンサー、ＣＥＱ２００００ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ）および、標準的なＴ７シークエンスプライマーおよびＳＰ６シークエンスプライマーを使用して配列決定した。コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）は、ＳｅｑＭａｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を使用して構築した。上記構築された配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成し、そして全てのコンティグが結びつくまでプライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）を行った。ほとんどの領域を、少なくとも２つの独立した配列決定によって補った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
（実施例２：Ａｄ３４基幹（ｂａｃｋｂｏｎｅ）におけるＥ１Ｂ  ５５Ｋ欠失ウイルスの構築）
（プラスミド構築）
ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に基づくベクターを、改変し、そして該当するヌクレオチド配列をクローニング、サブクローニングするために使用した。プラスミド構築は、固有のＮｈｅＩ制限酵素認識部位が、Ａｄ３４ゲノムの左端から６．５ＫＢにあるという事実に基づいた。プラスミド構築は、ＨｉｎｄＩＩＩを用いたＡｄ３４ゲノム（１５μｇ）の消化で開始した。２．２Ｋｂおよび３．４Ｋｂの大きさの、２つのフラグメントを、１％アガロースゲル上で単離し、Ｂｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを使用して精製した。上記２．２Ｋｂのフラグメントを、事前にＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したｐＧＥＭ−７Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした。上記構築物を、正しいフラグメントおよび正しい方向性のために、制限酵素マッピングによって評価した。この構築物を２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚと呼称した。次に、上記２．２／ｐＧＥＭ７Ｚ構築物における上記ＮｈｅＩ部位に近い上記ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＮｈｅＩおよびＣｌａＩを用いて消化し、その後、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め込み、そして再ライゲーションすることによって除去した。第１の上記Ａｄ３４ゲノムの１．４Ｋｂは、ＰＣＲプライマーＰ０４  Ｆｗｄ（５’ＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡ−３’；配列番号１０）およびＡｄ３４−１３７０Ｂ（５’ＧＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡ−３’；配列番号１１）、１ｎｇのゲノムテンプレートＤＮＡおよびＰｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）によって生成した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、１％アガロースゲル上で単離し、そしてＢｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製された１．４Ｋｂのフラグメントを、１．４／２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚ構築物を作製するために、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚにライゲーションした。３．４Ｋｂのフラグメントを、事前にＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したｐＧＥＭ−９Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。上記構築物を、正しいフラグメントおよび正しい方向性について、制限酵素マッピングによって評価した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
Ｅ１Ｂ１９Ｋ遺伝子重複およびＥ１Ｂ５５Ｋ遺伝子重複として、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子の不活性化を、Ｅ１Ｂ５５Ｋの開始部位の下流に終止コドンを導入し、そしてＥ１Ｂ１９Ｋ末端の末端とＥ１Ｂ５５Ｋ遺伝子の残部との間の配列の削除によって達成した。上記削除領域を、ＰｍｅＩ部位で置換した。Ｅ１Ｂ５５Ｋの変異誘発を、３．４／ｐＧＥＭ９Ｚ構築物を用いた２工程ＰＣＲプロセスを使用して行った。ＰＣＲの第１工程に由来する産物を、ＰＣＲプライマーＰ０２  ｆｗｄ（５’−ＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＴ−３’；配列番号１２）、Ｐ０３  Ｒｅｖ（５’−ＴＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’；配列番号１３）、１０ｎｇの３．４／ｐＧＥＭ−９ＺテンプレートＤＮＡおよびＦａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して生成した。第２のＰＣＲ工程産物を、ＰＣＲプライマーＰ０１  ｆｗｄ（５’−ＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＧ−３’；配列番号１４）および第１のＰＣＲ反応由来の産物、１０ｎｇの３．４／ｐＧＥＭ９ＺテンプレートＤＮＡならびにＦａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して生成した。上記ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、ＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、２％アガロースゲル上で単離し、そしてＢｉｏ１０１  ＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いて精製した。上記精製されたＥ１Ｂ５５Ｋ欠失フラグメントを、３．４Δ５５Ｋ／ｐＧＥＭ−９Ｚを生成するために、事前にＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した３．４／ｐＧＥＭ９Ｚ中にライゲーションした。上記１．４Ｋｂのフラグメント、上記２．２ｋｂのフラグメントおよび上記３．４Δ５５Ｋフラグメントを構築するために、上記３．４Δ５５Ｋ／ｐＧＥＭ−９Ｚ構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、この３．４Δ５５Ｋフラグメントを、１％アガロースゲル上で単離し、Ｂｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製された３．４Δ５５Ｋフラグメントを、シャトルベクター（ＳＶ１３）を作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そしてＣＩＰによって処理した１．４／２．２／ｐＧＥＭ−７Ｚ構築物中にライゲーションした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
（ウイルス構築およびウイルス単離）
サブグループＢアデノウイルス３４型（Ａｄ３４）（ＡＴＣＣ）ＴＰ  ＤＮＡを、Ｓ．Ｍｉｙａｋｅら、（ＰＮＡＳ  １９９６）に記載されるように作製した。Ａｄ３４ΔＥ１Ｂ５５Ｋウイルスを構築するために、上記ＳＶ２−５構築物を、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ（８．５μｇ）を用いて消化し、１％アガロースゲル上で単離し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。その後、このフラグメントの５μｇを、室温で一晩、ＮｈｅＩを用いて、３７℃で６時間消化した０．２５μｇのＡＤ３４−ＴＰ  ＤＮＡにライゲーションした。上記ライゲーション混合物を、６０ｍｍディッシュにおいて、２％  ＦＢＳ培地を補充したＤＭＥＭ中のＨＥＫ２９３細胞内に、製造業者のプロトコルに従って、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してトランスフェクトした。上記トランスフェクトを、３７℃／３％ＣＯ２で一晩、２４時間インキュベートした。トランスフェクトを、２４時間後に、上記培地を除去し、そしてその培地を２％  ＦＢＳ、２％  Ｌ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｅｉｎｅ）、１％  ＰＳを補充したＤＭＥＭで置換することによって停止し、その後、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。上記細胞を、２％  ＦＢＳ、２％  Ｌ−グルタミン、１％  ＮＥＡＡ、１％  ＰＳおよび１．５％  ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースを含むＤＭＥＭ感染培地でオーバーレイし（ｏｖｅｒｌａｙ）、そして新鮮なオーバーレイ培地を２〜３日ごとに供給した。プラークを単離し、ＨＥＫ２９３細胞上で増殖し、そしてウイルスＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。ウイルスを、Ｅ１Ｂ５５Ｋ欠失領域について、以下のプライマー：ＳＶｆｗｄ０５（５’−ＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＧＧＣ−３’；配列番号１５）およびＰ０３Ｒｅｖ（５’−ＴＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’；配列番号１６）を使用して、ＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲを、Ｆａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、以下のサイクル条件：９４℃で５分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間〜９０秒間を２５〜３０サイクル、そして７２℃で７分間を１サイクル、そして最後に４℃で無期限の下で行った。陽性プラークを、２９３／Ｅ４細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）上で４ラウンド精製した。全てのウイルス単離物を、Ｅ１Ｂ５５Ｋ欠失配列およびＡｄ３４野生型Ｅ１Ｂ５５Ｋの内部配列について、以下のプライマー：３．４ｆｗｄ０３（５’−ＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＧＣ−３’；配列番号１７）および３．４ｒｅｖ１２（５’−ＧＴＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧ−３’；配列番号１８）を用いて、ＰＣＲによってスクリーニングした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【図１−１】図１−１は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図１−２】図１−２は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図１−３】図１−３は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図１−４】図１−４は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図１−５】図１−５は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図１−６】図１−６は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図１−７】図１−７は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号１９）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号２）を示す。
【図２−８】図２−８は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図２−９】図２−９は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図２−１０】図２−１０は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図２−１１】図２−１１は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図２−１２】図２−１２は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図２−１３】図２−１３は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図２−１４】図２−１４は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質をコードする領域（配列番号２０）、およびＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の配列（配列番号４）を示す。
【図３】図３は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型のＥ１Ａ領域のｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４】図４は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型のｃＤＮＡによってコードされるＥ１Ａ領域のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５】図５は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型のＥ１Ａ領域のｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図６】図６は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３４型のｃＤＮＡによってコードされるＥ１Ａ領域のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図７】図７は、ヒトサブグループＢアデノウイルス３型のオープンリーディングフレーム６のＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007530004000001.app
【国際調査報告】
2007530004.tif 000021
2007530004.tif 000022
2007530004.tif 000023
2007530004.tif 000024