(57)【要約】  本発明は、インビトロでの臓器機能の信頼できるモデリングのための方法およびデバイスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つもしくはそれ以上の培養スペースに固定化した細胞を培養するステップを含んで成る細胞および／または組織を培養するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの無細胞供給液体または規定された気体混合物、および
（ｂ）前記固定化した細胞のものとは異なる細胞型の細胞を含有する少なくとも１つの移動相、
を接触させる、方法。
【請求項２】
（ｉ）前記培養スペースが、好ましくは、ゲル、オープンポア発泡体類等などの多孔質材、織布もしくは不織布等から選択されるマトリクスを含んで成り、および／または
（ｉｉ）前記固定化細胞が哺乳動物細胞、特にヒト細胞であり、中でも造血幹細胞、樹状細胞、単球、マクロファージもしくは他の一次または形質転換細胞が特に好ましく、および／または
（ｉｉｉ）前記無細胞供給液体が、細胞および／または組織に適合した栄養溶液であり、および／または
（ｉｖ）前記規定された気体混合物が、標準の空気飽和と比べて３７℃で８０−１００％の培養液量の酸化を確実にするように適合されており、好ましくは、前記規定された気体混合物が２０−９５％Ｏ2（ｖ／ｖ）を含有し、
（ｖ）移動相の細胞が、調節特性または後に抗体を形成する特性を有する細胞、特にＴおよびＢリンパ球等などの単核細胞であり、および／または
（ｖｉ）前記無細胞供給液体および前記移動相が連続的に変更しており、および／または
（ｖｉｉ）前記無細胞供給液体がさらに前記組織および／または細胞によって形成される代謝産物／細胞産物を除去するために役立ち、および／または
（ｖｉｉｉ）前記無細胞供給液体および前記移動相が異なる流量を有する
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養スペースのマトリクスが、前記移動相、前記マトリクス内の細胞の移動、および局所流勾配（微環境）の形成によって十分な流入を可能にする多孔性を有し、好ましくは、３０μｍより大きい多孔性を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養スペースにおいて培養された細胞が、自己組織化および濃度勾配の形成が可能である１つもしくはそれ以上の細胞集団から成る、請求項１〜３のいずれか一項以上に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）前記移動相が、培養系における全細胞と組織集団との間の臓器典型的相互作用が確保され（Ｔリンパ球およびＤＣとともにＢリンパ球）、および／または前記移動相の亜集団、好ましくは、抗原特異的リンパ球が、好ましくは、抗原誘発胚中心の形成との、相互作用のために一時的に固定化されるようなやり方で前記培養スペースを流れ、および／または
（ｉｉ）流れの方向に対し横断する、または反対方向の細胞の移動が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
選択抗原（標的抗原）に対するヒト抗体およびヒト免疫担当細胞の選択的回収に適切である、請求項１〜５のいずれか一項以上に記載の方法。
【請求項７】
細胞および／または組織を安定させるために適切な少なくとも１つの培養スペース（２）またはマトリクス（８）、および異なる流体を前記スペース（２）またはマトリクス（８）に送達する少なくとも２つの流体送達手段（１４、１６；２７、３８）を含んで成り、それによって少なくとも１つの無細胞供給流体または供給気体（４）、および少なくとも１つの移動細胞相（６）が供給される、細胞および／または組織を培養するためのデバイス。
【請求項８】
（ｉ）前記培養スペース（２）がマトリクス（８）を含有し、および／または
（ｉｉ）液体流（４、６）が、前記培養スペース（２）または前記マトリクス（８
）の周表面に沿った、前記培養スペース（２）または前記マトリクス（８）に接する細胞浸透表面（１０、１２）に沿って流れ、または前記マトリクス（８）を拡散もしくは流れ、および／または
（ｉｉｉ）前記液体流（４、６）を浸透ライン（１４、１６）を通じて前記培養ス
ペース（２）または前記マトリクス（８）に供給することができ、前記浸透ラインの少なくとも１つが前記移動相に浸透性であり、および／または
（ｉｖ）前記少なくとも１つの供給液体（４）が、前記培養スペース（２）、また
は前記マトリクス（８）を通じて、またはこれに沿って、浸透ライン（１４、１６）、特に毛細管等を通じて、供給されうる
ことを特徴とする請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記マトリクス（８）のホロースペースが、前記移動相の細胞の細胞径の少なくとも２倍の直径を有することを特徴とする請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記マトリクス（８）が、好ましくは、約１〜１５ｍｍ、より好ましくは、約２〜１０ｍｍの厚さを有するシートであることを特徴とする請求項８または９に記載のデバイス。
【請求項１１】
（ｉ）前記少なくとも１つの移動細胞相（６）が横断流でマトリクス（８）を流れ
、および／または
（ｉｉ）好ましくは水平であるマトリクス（８）が、それを通じて前記少なくとも
１つの移動細胞相（６）が横断流で流れるホローチャンバー（２０ａ、２０ｂ）に維持されており、および／または
（ｉｉｉ）前記マトリクス（８）が、細胞浸透性の支持手段（１８ａ、１８ｂ）、
特に、スクリーンによってその１つもしくは２つの側面上で支持されており、前記支持手段（１８ａ、１８ｂ）の孔サイズが、好ましくは、約３０〜１００μｍであり、および／または
（ｉｖ）前記移動相の流れが、外部灌流型流体工学（ポンピング）または重力流動
（周期的回転）によって確立される
ことを特徴とする請求項８〜１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの供給液体（４）が、いくつかの多孔質ライン（１４）、特に、好ましくは、前記マトリクス（８）の内部で平行に走っている毛細管を通じて前記マトリクス（８）に供給されうるが、前記ライン（毛細管）の直径は、好ましくは、５０〜１５０μｍ、より好ましくは、約８０〜１２０μｍであり、前記ライン（１４）（毛細管）の多孔性が約３０〜５００ｋＤａであり、および／または、好ましくは、平行に走っている前記ライン（１４）（毛細管）の相互距離が、毛細管径の２〜１０倍、好ましくは、３〜５倍であることを特徴とする請求項８〜１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの供給液体（４）の前記ライン（１４、１６）および前記移動細胞相のラインが前記培養スペース（２）またはマトリクス（８）の外側面に沿って提供されることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
（ｉ）組織状培養に適切な微環境が、濃度勾配の形成およびこの相の最適な供給を
、すなわち、前記マトリクス（８）に存在する固定細胞相を通じて少なくとも１つの細胞および組織集団の連続的または非連続的に方向づけられた制御可能な流れによって確保する前記マトリクス（８）内で形成されており、および／または
（ｉｉ）前記移動細胞相を再循環し、または残りの回路中で沈降なしに直接通過さ
せることができ、および／または
（ｉｉｉ）抗原を必要に応じで前記培養スペース（２）に適用することができ、お
よび／または
（ｉｖ）それによって細胞または産物の収穫が、好ましくは、機械的、動的、およ
び／または酵素的機序によって実行されうる手段が提供される
ことを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項以上に記載のデバイス。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞または組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロでの臓器機能の信頼できるモデリングのための方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
一次哺乳動物細胞の培養は、その高い感受性、比較的遅い増殖、複雑な分化過程、および基本条件としての絶対滅菌により本質的に複雑である。
【０００３】
最近数十年間に、エクスビボ組織培養が広範囲に記載されている（フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）。高い細胞密度を有する、または組織状構造物としての培養には、例えば、半透膜による供給量(supply volume)および培養スペースの分離を必要とする。また、この供給原理は、酸素供給および他の必須栄養のための有効な溶液を実現する必要がある。これは、特殊な膜、溶液中の酸素トランスポーター等によって確保されている。また、特異的な生理的機能および構造（例えば、機能的軟骨形成）を導入しうるために培養物を機械的ストレスにかけることが可能である。
【０００４】
大部分の有効なバイオリアクターシステムにおいて、学術文献ではデノボ自己組織化の誘導がインビトロで示されうる（肝、軟骨、骨、皮膚等）。
【０００５】
記載されたシステムにおいて、細胞は通常、確実に供給された細胞培養スペースにおいて固定され、それから治療用途のために全体として（例えば、カプセル化膵島細胞）除去または移植されうる。肝置換システムなどのより複雑なシステムにおいては、異なる細胞型および組織型の共培養も実現されうる。しかし、記載された培養系のそれぞれの用途によれば、そのいずれからも、静的（非移動）固定化状態における一次細胞および組織構造物のデノボ組織化に加えて、少なくとも１つの移動組織型／細胞集団によって同時に固定化組織の継続的な調整可能／ディメンショナブル(dimensionable)な灌流を確保する可能性は得られない。
【０００６】
特に、組織状構造物の自己組織化の過程は、局所微環境のために、細胞移動、細胞−細胞相互作用、活性化、および分化によって誘導される。長期培養（例えば、数週間）における多細胞相互作用の形成のために、最小限であるが十分な栄養の供給、阻害代謝産物の除去、および内因性の局所微勾配の最大限のサポートとの間の明確なバランスが実現されなければならない。固定細胞相によって分泌されるサイトカインおよび成長因子は、移動相の懸濁または移動細胞に対して誘引性である部位に維持されなければならない。
【０００７】
ヒト免疫担当細胞のインビトロ免疫付与は、最終的にエクスビボでの臓器機能の刺激を意味し、したがって細胞培養に対する要求をさらに高いレベルへ増大させる。種々の細胞培養系が利用可能である。細胞が平面上、主に培養容器の底で成長する従来の二次元システムに加えて、細胞培養のための三次元システムがある。第三次元にも細胞成長する可能性により、後者は組織状の細胞培養を提供し、これはしたがって天然条件により近い。
【０００８】
適切な細胞および組織培養系は以下に記載されている。
【０００９】
国際公開第９９／４３７８８号パンフレットは、柔軟性かつ多孔質のマトリクス上に支持された扁桃腺またはリンパ節からの組織ブロックから成るウイルス感染および免疫応答のためのインビトロモデル系を記載しており、ここで組織ブロックは、その表面が組織ブロック／マトリクス界面と適合する培地で培養されている。この培養系を用いて抗ウイルス薬を選別し、ウイルス疾患の経過をモニタリングし、かつ抗原刺激に対する免疫応答をモニタリングすることができる。
【００１０】
国際公開第８９／１１５２９号パンフレットは、供給チャンバーおよび放出チャンバーの２つのチャンバー、および選択的に浸透性の限外ろ過膜によって分離される細胞チャンバーから成るバイオリアクターを記載している。この細胞チャンバー内では、生体適合性の三次元マトリクスが動物細胞を取込む。この生体適合性マトリクスの存在により、細胞チャンバーはゲル相を有し、すなわち、生体適合性マトリクスと細胞および液体相は、単離されうる細胞産物の濃縮溶液を含有する。
【００１１】
米国特許第５，４１６，０２２号明細書は、その内部が細胞培養スペースに相当する少なくとも１つの細胞培養コンパートメントを有する小型かつ容易に組立てられる細胞培養デバイスを記載している。
【００１２】
国際公開第０１／０４２６２号パンフレットは、栄養培地を使用する有機材料、特に細胞、を培養するためのバイオリアクターおよび方法に関する。有機材料の培養は、栄養の一定流量下に達成される。
【００１３】
ＤＥ−Ｃ−４２３０１９４号明細書およびＥＰ−Ａ−０５９０３４１号明細書は、２つの個別のホローファイバー膜システムによって横断され、細胞の培養がホローファイバーによって形成されたネットワーク上で達成される細胞培養のためのリアクターを記載している。このリアクターは、「テクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）」の名称で販売されている。テクノマウス（登録商標）バイオリアクターは、培地およびＯ2供給の連続的循環による三次元の細胞培養を可能にする小型灌流バイオリアクターである。お互いの上部に配置された５つの異なるホローファイバーモジュールがその中で同時に稼動されうる。個々のモジュールには栄養培地および空気／ＣＯ2混合物がそれぞれ基本デバイスによって供給される。栄養培地の供給は、５つの区分による１５〜１５０ｍｌ／時の培地の可変の供給を可能にするポンプヘッドによって実現される。気体供給のために、膜ポンプによって、周囲空気が、インキュベーターからガス塔を経てそれぞれのホローファイバーモジュールへ通過する。その上部および下部の対応するホローファイバーモジュールを制限するシリコーン膜を通じて、気体混合物は直接細胞培養スペースに達する。ナローメッシュで平行に配置されたホローファイバーは毛細管間スペースを形成し、栄養の供給および代謝の最終産物の除去を確保する。使用されるキュプロファン（Ｃｕｐｒｏｐｈａｎｅ）ホローファイバー膜は、１０ｋＤａのサイズまでの分子の通過を可能にする。ホローファイバーを取囲む毛細管外スペースにおいて、細胞は培養される。２つのポートが細胞収穫のみならず細胞および培地による接種を可能にする。ホローファイバーモジュールの毛細管外スペースの容積は約４．３ｍｌである。テクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓ）（登録商標）リアクターは、最初に動物試験の代替方法としてのモノクローナル抗体の調製ために確立された。培養技術および容積とサイズの比率の計算においてクリーンシステム操作の開発は、酸素取込みの特徴づけの試験に加えて、並行試験の対象であった（マイアー（Ｍａｉｅｒ）とナーゲル（Ｎａｇｅｌ）、ｄｉｐｌｏｍａ  ｔｈｅｓｅｓ  ＴＵ  Ｂｅｒｌｉｎ、１９９３年、ウィースマン（Ｗｉｅｓｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４１、ｐ．５３１−５３６（１９９４年））。
【００１４】
最後に、ＥＰ−Ｂ−０５８４１７０号明細書は、哺乳動物細胞が共通の供給回路におけるいくつかの個別培養容器で同時に培養される培養方法および対応するデバイスを記載しており、供給回路は細胞保持膜によって培養容器から分離されている。
【００１５】
米国特許第５，２９０，７００号明細書も少なくとも２つの異なる供給回路が存在するリアクターを開示している。
【００１６】
ＤＥ３４０９５０１号明細書およびＤＥ４２０９５０１明細書によるリアクターは、膜によって分離される２つのチャンバー、細胞培養チャンバーと供給チャンバーを有する。ＤＥ−Ａ−４２２９３３４号明細書は、２つのチャンバーを有する対応するジャー状の培養容器を記載している。
【００１７】
米国特許第４，２４２，４６０号明細書は、供給回路が半透膜スプールとしてのリアクタースプールの周りに巻きつけられたコイル状の細胞培養デバイスを開示している。ＥＰ−Ａ−０３６５３１３号明細書は、供給がいくつかのパイプシステムによって確保される円筒形のバイオリアクターを記載している。
【００１８】
米国特許第４，２２０，７２５号明細書および同第４，６４７，５３９号明細書およびＤＥ３８０５４１４号明細書は、半透膜毛細管の束によって横断されるリアクターを記載している。
【００１９】
国際公開第９３／１８１３３号パンフレットは、その上にコラーゲンのコーティングが培養される細胞培養と共に塗布されている、少なくとも部分的に気体浸透性であるプレート状の抗原細胞培養支持体上で細胞培養を処理するためのデバイスを記載している。ＤＥ−Ａ−４，３２２，７４６号明細書は、対応する細胞培養支持体としてホローファイバーを提案している。
【００２０】
ＥＰ０６９０１２５号明細書は、腫瘍細胞に対する殺傷活性を有する細胞毒性Ｔリンパ球の誘導培養のための方法に関し、これは前記腫瘍細胞および特異的リンパ球を含有する腫瘍組織を共培養するステップを含んで成る。この腫瘍組織は固定化されうる。
【００２１】
米国特許第５，６７７，１３９号明細書は、造血Ｔ細胞の増殖を開示している。発現は、単層として存在しうる間質細胞と、培養において同時に発生する。
【００２２】
米国特許第６，４７９，０６４号明細書は、内皮組織層の層によって覆われており、第２の培養細胞集団と接触する三次元骨格を利用する人工的臓器を確立するための方法に関する。
【００２３】
米国特許第６，２５１，６７２号明細書は、第１の哺乳動物細胞が固体支持体上に固定された第２の哺乳動物細胞と接触する哺乳動物細胞を培養するための方法に関する。
【００２４】
上記の三次元培養方法およびデバイスのすべては、効率性の点で天然系に未だ接近していない。特に、細胞の制御された成長、および調節因子／作用物、特に他の細胞型（栄養の連続的供給に加えて）を含んだ培養される細胞材料の制御された供給が確保されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
意外にも、現在、異なる細胞型の細胞を含有する移動相との接触による静的相での細胞／組織の培養は、機能的組織の形成に必須であり、かつ特定の組織型に決定的に重要であることがわかっている。したがって、本発明は、
（１）１つもしくはそれ以上の培養スペースに固定化した細胞を培養するステップを含んで成る細胞および／または組織を培養するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの無細胞供給液体または規定された気体混合物、および
（ｂ）前記固定化した細胞のものとは異なる細胞型の細胞を含有する少なくとも１つの移動相、を接触させる、方法と、
（２）異なる液体および／または流体流、すなわち少なくとも１つの無細胞供給液体およびまたは供給気体、および少なくとも１つの移動細胞相が連続的に供給されうる細胞および／または組織を安定させるための少なくとも１つの培養スペースまたはマトリクスを含んで成る細胞および／または組織を培養するためのデバイスと、
（３）上記（１）の方法によって得られる細胞および組織に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明による方法（および本発明によるデバイスも）は、とりわけ、選択抗原（標的抗原）に対するヒト抗体およびヒト免疫担当細胞の十分に狙い定めた獲得に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明によれば、「固定化細胞および組織培養」は、細胞が表面への付着によって、もしくは他の機械的または生理的機序によってデバイスのコンパートメント（培養スペース）内に保持されているデバイス内での培養を意味する。
【００２８】
「移動細胞相」または「細胞を含有する移動相」は、指向性の物理学的、生物物理学的、または生化学的方法、例えば、液体流、電磁場、指向性圧力、誘引勾配等によって一定時間にデバイスを通じて移動されるデバイス内のすべての細胞を意味する。
【００２９】
「無細胞供給液体」は、哺乳動物の培養に適した培養培地の任意の型に関する。適切な培養培地は当業者の範囲内にある。本発明による「規定された気体混合物」は、気体混合物標準の空気飽和と比べ３７℃で８０−１００％の培養液量の酸素飽和を確実にするように適合されおり、気体混合物は２０−９５％Ｏ2（ｖ／ｖ）を含有して供給される。炭酸緩衝化培養培地においては、培養液量における安定したｐＨ７．４を確保するために、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素濃度が提供される必要がある。窒素は７５％（ｖ／ｖ）まで補充される。
【００３０】
本発明による方法においては、適切な細胞、例えば、一次ヒト免疫担当細胞の共培養が、数か月にわたって確保される。共培養内の機能性は、支持マトリクスを使用する適切な培養スペースへ導入される適切な細胞集団（細胞成分、細胞系）によって確保される。連続的な供給システム（本発明の実施形態（２）によるデバイスのものなど）が、全培養期間にわたって一定の培養条件を確保するように考えられる。使用される細胞集団は、支持マトリクス内の自己組織化によって機能単位を形成する。
【００３１】
培養細胞および／または組織（以下では簡潔に「細胞系」とも呼ぶ）は、細胞組織および免疫学的機能がその中で模倣されることを特徴とし、これはヒトリンパ節またはヒト脾臓の胚中心の形の免疫学的に活性の組織のものに対応する。
【００３２】
胚中心の細胞組織化および微構造の形成は、異なる細胞型の指向性の一致によって確保される。インビトロで模倣される機能としては、指向性の抗原誘発細胞増殖と抗体発現および持続可能な免疫学的記憶の形成が挙げられる。
【００３３】
抗原提示、調節、および最後に抗体発現細胞の的確な一致は、免疫応答の選択的生成に必要である。本発明の方法（１）による固定化細胞の理想的な空間的分布および移動細胞（例えば、ＤＣ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等）の最適な混合比は、最適な細胞−細胞相互作用を確保する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態においては、標的抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ、ＡＰＣ）が、培養のために調製され、平衡化されているマトリクスへ最初に導入され、培養が開始される。マトリクスとともに、付着ＤＣは培養系におけるいわゆる「静的」相を表す。この静的相には、Ｔリンパ球が適切に添加され、これらはマトリクスへ注入され、その中に指向的に移動し、抗原特異的にＤＣと結合し、それによって活性化（抗原刺激）される。その後のステップにおいて、または同時に、Ｂリンパ球が注入され、これらは次に抗原提示ＤＣおよび相応して活性化したＴ細胞の複合体と結合し、かつ抗原特異的に活性化もされる。
【００３５】
ＡＰＣと活性化ＴおよびＢリンパ球のこれら複合体を発端として、胚中心（ＧＣ）または濾胞外胚中心（ｅｆＧＣ）のインビボ形成に対応する細胞組織が形成される。
【００３６】
インビトロｅｆＧＣおよびＤＣは、大規模な細胞増殖によって、ならびに最終的に抗体発現によって特徴づけられる。したがって、それらは細胞の集団およびサイズが増大する。ＡＰＣと移動性の移動リンパ球との初期相互作用のために、使用されるマトリクスは重要な役割を果たし、一方では、これはリンパ球に対するＤＣの近接性を確保し、他方では、細胞−細胞相互作用に決定的に重要である細胞のすぐ近くの分泌メッセンジャー（サイトカイン）の微勾配のシステムを安定化させる。また、周囲のマトリクスは、胚中心の拡張に従って次第に移動される。最初は、ＩｇＭ抗体が胚中心内の活性化Ｂリンパ球によって発現され、細胞表面上に提示される。数日間にわたって、最終的に発現され、形質細胞の細胞表面上に提示されるＩｇＧサブクラスの抗体への変更が生じる。サブクラスの変更と平行して、標的抗原に関する抗体の親和性成熟が、体細胞置換によってインビトロで胚中心において生じる。これは、その抗体が抗原に対して高い親和性を有し、したがって他の競合Ｂリンパ球（Ｔリンパ球の中でも）と比べＡＰＣとの延長した細胞−細胞接触を有する抗原特異的Ｂリンパ球の優先的増殖により生じる。したがって、抗原特異的抗体の全発現におけるその割合は増大し（クローン性増殖）、最後に培養において優位に立つ。
【００３７】
特異的ＢおよびＴメモリー細胞（二次免疫応答の誘導用）またはナイーブＢおよびＴリンパ球（一次免疫応答の誘導用）の数は、共培養において利用可能なＡＰＣに適合される。互いに対する、およびＡＰＣに対するＢリンパ球とＴリンパ球の適切な比によって、相互作用細胞（有効な移動および結合用）の適切な近接および共培養の理想的な全細胞集団の組合せ、誘発抗体産生および細胞増殖の形で胚中心の指向性形成および機能性が確保される。
【００３８】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、樹状細胞はその細胞表面上に処理抗原を有し、すぐ近くにある抗原特異的Ｔ４ヘルパー細胞（ナイーブまたはＴメモリー）を活性化することができる。活性化はサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ）の分泌およびクローン性増殖を誘発する。抗原の提示は、ＤＣの膜結合ＭＨＣクラス２受容体を通じて達成される。適切な提示のために、抗原はあらかじめ微粒子に結合され、ファゴサイトーシスおよび抗原処理のためにＡＰＣに与えられる。抗原の添加は、共培養の前後のいずれかに達成される。
【００３９】
機能的樹状細胞は、血液調製物から得られ、インビトロで分化される。リンパ球は同じまたは異なるドナーから調製される。それらは同時に調製され、ＤＣの分化期間中凍結保存され、または後日に調製されうる。関係細胞集団間の免疫原性効果を回避するには自己由来のコンセプトが好ましい。共培養のためには、同種異系または自己由来Ｔリンパ球が十分な量で、かつＤＣの分化および抗原提示が終了次第、提供される。細胞−細胞相互作用の範囲内で、Ｔリンパ球の調節効果が利用される。既存の免疫応答の誘導のために、これらはＴメモリー細胞（二次免疫応答）であるが、免疫応答の選択的デノボ生成のためには、ナイーブＴリンパ球が使用される（一次免疫応答）。高い細胞生存を有する十分な細胞集団の準備および調製細胞集団の寿命の拡大は、選択的Ｔ細胞増殖によって達成される。
【００４０】
また、自己由来Ｂリンパ球が十分な量で、かつ共培養に適切な時期に提供される。この場合も、二次または一次免疫応答を誘発するかどうかによって、メモリー細胞またはナイーブＢ細胞が使用されうる。高い細胞生存を有する細胞集団は、指定時間で凍結保存試料の再活性化によって獲得されうる。
【００４１】
主に調節目的で使用されるＴ細胞は、細胞−細胞接触およびサイトカイン分泌により適切な特異的Ｂ細胞（ナイーブまたはＢメモリー）を活性化し、サイトカイン分泌およびクローン性増殖を誘発しうる。また、細胞特異的免疫グロブリンの発現は、最初に、ＩｇＭ（ナイーブ、一次免疫応答）の形またはＩｇＧ（Ｂメモリー細胞、二次免疫応答、バイスタンダー反応）の形のいずれかであり、これらは移動性であり、ＡＰＣによって誘引される走化性によって移動する。細胞相互作用は指向性細胞移動、細胞−細胞接触の形成、オートクリンおよびパラクリン効果によるサイトカインの選択的相互刺激分泌、指向性細胞増殖、および形成された抗体の抗原駆動親和性成熟（抗体武装）の形で明示される。
【００４２】
したがって、インビトロで形成される胚中心の重要な機能は、抗原特異的Ｂ細胞の包括的指向性の形成、種々のサブクラスの抗原特異的抗体の発現、サブクラスの指向性変更、および標的抗原に特異的な抗体の親和性成熟にある。
【００４３】
支持細胞外マトリクスおよび培養管理はさらに、決定的に必要な共培養内の細胞組織状自己組織化および自己調節を確保する。これは細胞の移動性のほか、付着、移動、結合、および増殖を可能にしなければならない。また、マトリクスは数か月の培養期間にわたって胚中心の成長を支持する。このために、細胞代謝の基質および廃棄物の最適な拡散特性は、サイトカイン勾配の局所微環境を阻害することなく確保される。また、胚中心を形成する拡張によるマトリクスの制御された分解または移動が確保される。
【００４４】
形成される胚中心の長期培養は培養スペースを（例えば、無細胞供給液体（類）により）連続的に供給することによって確保される。供給システム、培養スペース、およびマトリクスは滅菌されうるとともに、長期の培養に対して数か月にわたって十分なプロセス安定性を示す。
【００４５】
連続的供給は、基質の十分かつ一定の供給、および代謝の限定最終産物の除去を確保する。培地量は培養系を通じて循環し、その後に培地の酸素濃度およびｐＨ値に関して理想的な培養条件に再生（平衡化）される。また、循環培養培地の一部は、選択的に調節可能な希釈レートで継続的に変更される。これは長期の培養期間にわたっても代謝関連基質と共に培養細胞の一定の供給および成長限定代謝物の除去を確保する。
【００４６】
また、培養の生理的状態（基質消費、サイトカイン回帰、抗体生成等）は、循環培養培地を定期的に試料採取することによってモニタリングされうる。
【００４７】
培養スペースは、十分な量の細胞が相互作用しうるとともに、それによって所望の抗原に対する免疫応答が自己由来共培養の範囲内で誘発されうることを確保するために、所定の寸法にされる。
【００４８】
培養スペースそのものは成長支持マトリクスで充填され、微多孔質膜表面によって横断され、これは重要な基質と共に細胞の供給および細胞によって形成される微環境（オートクリンおよびパラクリン効果を有する因子の勾配）を阻害することなく十分な範囲で重要かつ所望の最終産物の除去を確保する。
【００４９】
消化器系からの物質の膜表面からマトリクスへ、最後に代謝活性細胞への十分な輸送は、
１．膜表面の材料および微構造的外観、
２．膜表面の相互幾何学的配置、
３．培養スペース内の限定拡散長さ、および
４．優れた水力学性および拡散の形でのマトリクスの十分な輸送特性。
５．マトリクス充填量内での溶解物質の十分なバイオアベイラビリティ
によって制御される。
【００５０】
特に、無細胞供給液体または気体による酸素および／または二酸化炭素および／または基質の投与および／または除去は、異なる孔サイズの微多孔質膜によって提供される。すなわち、１００〜６００μｍの内径（ＩＤ）、２００〜１０００μｍの外径（ＯＤ）、２５〜２００μｍの壁厚（ＷＴ）、および０．０５〜０．２の孔サイズを有するホローファイバー。気体を用いる場合の拡散膜として適切なホローファイバーは、例えば、ＩＤ＝２００μｍ、ＯＤ＝３００μｍ、ポリプロピレン（ＰＰ）および０．２ｍｍの孔サイズ（アクレル（Ａｃｃｕｒｅｌ）、メンブラーナ（Ｍｅｍｂｒａｎａ）有限会社（ＧｍｂＨ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））であり、液体培地（基質および代謝産物、例えば、グルコース、乳酸に浸透性）を用いる場合のろ過膜として適切なホローファイバーは、例えば、ＩＤ＝５００μｍ、ＯＤ＝７００μｍ、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳＦ）孔サイズ０．２−５μｍ（ＧＫＳＳ、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））である。
【００５１】
他方、液体無細胞培養培地および／または酸素および／または二酸化炭素の供給用に基質の供給および／または代謝産物の除去のためにマトリクス補助培養スペースに固定された静的細胞相との相互作用のための懸濁細胞（移動細胞相）の灌流のための異なるサイズの微多孔質膜による細胞懸濁液、および無細胞供給液体または気体による培養液量の一定または周期的灌流は、１０〜１５０μｍの孔サイズおよび０．１〜２ｍｍの厚さを有する平面膜である。適切な膜は、厚さ１ｍｍの８０μｍ孔サイズ（規定された同多孔質孔）の細胞浸透性平面テフロン（登録商標）膜、および８０μｍメッシュサイズの細胞浸透性の機械的安定化テフロン（登録商標）グリッド（ボーレンダー（Ｂｏｈｌｅｎｄｅｒ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））である。この供給システムおよび培養スペースは、培養培地の連続的または周期的試料採取のほか、細胞および分泌型抗体など細胞産物の収穫を可能にする。
【００５２】
同じ細胞濃度では、開始集団におけるリンパ球含有率は増大するであろう。これはヒト血液における状況（Ｍ．クラッセン（Ｃｌａｓｓｅｎ）ら、アーバン  アンド  シュバルツェンベルク（Ｕｒｂａｎ  ＆  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ）、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、ボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９９１年））およびそれによれば２：１：０．２５のＴ細胞とＢ細胞とアクセサリー細胞の比が最適な比として推定されているボレバエック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）とダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ）によって提案された式（Ｃ．Ａ．Ｋ．ボレバエック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）、１９８９年、Ｌ．ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６１（１９８７年）、ｐ．５１−５５）への接近を意味する。比較のために、ＭＮＣ開始集団における言及された細胞の比は、２．７：１：１または０．８：０．２５：０．２５であり、３４日目には７：１：４１または０．０４：０．００６：０．２５であった。細胞の分離、特に単球集団の枯渇は、培養の経過に対する好ましくない効果を有する。
【００５３】
培養培地（および供給液体）の組成に関しては、より高いヒト血清の添加が培地補充に関して好ましいことがわかった。二次元培養の記載された検査の結果の類推によっても、ヒト血清の添加は約１０−１２％とすべきである。ボレバエック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）とダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ）は、１０％ヒト血清の添加を支持している（Ｃ．Ａ．Ｋ．ボレバエック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）、１９８９年、Ｌ．ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６１（１９８７年）、ｐ．５１−５５）。テクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）バイオリアクターにおいては、４％ＨＳＡが培養培地に添加された。培地添加物としてのＦＣＳの放棄は可能であるとみられる。血清不活性化は一般に厳格に観察されなければならない。バイオリアクターにおける有利な三次元培養にもかかわらず、有効なインビトロでの免疫付与は、ＴまたはＢ細胞の刺激なしに開発の現段階では検出されえなかった。経過において過度に高かったリンパ球減少に照らして、例えば、５０Ｕ／ｍｌの濃度でのＩＬ−２の使用、および追加的にＴ細胞調整培地の選択的添加は有利となる。ｍｌ当り０．３８μｇのＨＢｓＡｇの使用最終濃度は、ボレバエック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）とダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ）によっても好ましいと推定された濃度範囲内であった。細胞は臓器断片中で培地によって洗浄されなかったが、三次元スペースでナローメッシュ培地を有するホローファイバーによって供給されるため、フェロー（Ｆｅｒｒｏ）とホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）によって記載されているように、リンパ球活性化の刺激要求の増大によって示される上記のＩＬ−２またはＡｇ濃度の増大の理由はない（フェロー（Ｆｅｒｒｏ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８８（１９９３年）、ｐ．５１−６１、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７９（１９９５年）、ｐ．３７−４９）。
【００５４】
本発明による方法は、以下の特殊な実施形態を可能にする。すなわち、
−バイオマス用の多重免疫付与、並行配置、および大きさの長期の操作、
−例えば、形成された特異的抗体、またはサイトカイン混合物を回収することによるプロセスのモニタリング、
−ヒト型の特異的に再配置され、過剰変異されたＢリンパ球／形質細胞の回収および個別細胞ＲＮＡ／ＤＮＡの回収、
−モノクローナル抗体を生成する抗体遺伝子による細胞系のトランスフェクション、および／または
−細胞置換自家療法用の抗原特異的Ｔサプレッサー／キラー細胞の回収。
【００５５】
本発明によるデバイス（２）は、特に、方法（１）を実行するために適切である。特定の実施形態が図１〜４、および図８〜１０に示されている。
【００５６】
本発明はさらに、以下の図面および実施例によって示されているが、しかし、これらは本発明の保護の範囲を制限することはない。
【００５７】
図面の詳細な説明
図１および２は、異なる液体流４、６が、好ましくは連続的に、すなわち、少なくとも１つの無細胞供給液体４および少なくとも１つの移動細胞相６が供給される細胞および／または組織を安定化するための培養スペース２を有する細胞および／または組織を培養するためのデバイスの別の実施形態を示している。
【００５８】
図１においては、液体流４、６が、周表面と平行して、かつ培養スペース２のこの周表面に沿って浸透ライン１４、１６に誘導される。
【００５９】
ライン１４、１６の浸透性により、無細胞供給液体４および少なくとも１つの移動細胞相６は培養スペース２に含まれたマトリクス８へ拡散しうる。
【００６０】
図１においては、材料交換は、ライン１４、１６の輪郭が示された孔２５を指す矢印によって示されている。このラインは、好ましくは、毛細管、すなわち、約５０〜１５０μｍ、好ましくは、約８０〜１２０μｍの直径を有し、その多孔性が約３０〜５００ｋＤａであるホローファイバーから成る。孔２５は図３および４から最も良く確認されうる。
【００６１】
ライン１４、１６は、培養スペース２またはマトリクス８の接触面１０、１２に沿って提供されており、図１は、マトリクスの多孔性を表す培養スペース２の接触面を通じる経路も示す。
【００６２】
供給液体４のためのいくつかのライン１４が並んで、好ましくは、平行に走る場合は、その相互距離は毛細管径の２〜１０倍、好ましくは、３〜５倍である。
【００６３】
少なくとも１つの供給液体４および移動細胞相６のためにライン１４、１６が図１の実施例における培養スペース２またはマトリクス８の外側面に沿って提供されているが、図２の実施例は、マトリクス８がホローチャンバー２０ａ、２０ｂ内で、好ましくは、水平に保持されていることを示し、マトリクス８は横断流で少なくとも１つの移動細胞相６によって通過されると同時に、少なくとも１つの供給液体４はいくつかの多孔質ライン１４、特に、マトリクス８の内部を、好ましくは、平行に通過する毛細管により供給されうる。
【００６４】
マトリクス８は、下部側または両側のスクリーン１８ａ、１８ｂによって支持されうる。スクリーン１８ａ、１８ｂの孔サイズは、好ましくは、約３０〜１００μｍである。
【００６５】
図２の実施例においては、マトリクス８は、約１〜約１５ｍｍ、好ましくは、約２〜１０ｍｍの厚さを有するシートである。マトリクス８は、それらの間でマトリクス８を、支持デバイス１８ａ、１８ｂを含んで、または含まずに、受入れる２つのハウジングの各半分２０ａ、２０ｂによって形成されたホローチャンバー内に保持されている。ハウジングの各半分は、その片側で供給される供給液体４のためのポート３０、および他方の側では、場合により再循環されうる供給液体４を排出するためのポート３２を有するフランジ部２２ａおよび２２ｂを有する。ポート部３０からは、供給液体４は、好ましくは、マトリクス８の中間を走り、平行に配置されているいくつかのライン１４に分布されており、これは図４から最も良く確認されうる。
【００６６】
図２においては、移動細胞相６が、培養スペース２またはマトリクス８に対して横断方向に、上部から下部まで、すなわち、ポート３４を通じて入口側で供給されている。マトリクス８の下方では、移動細胞相が再びポート３６を通じて排出され、再循環されうる。フランジ部２２ａ、２２ｂは、シール２４、２６、２８によってホローチャンバーのハウジングの各半分２０ａ、２０ｂに対して密閉される。
【００６７】
図８は、サポートライン、制御、およびモニタリングを含む本発明のデバイス用の概略の構成を示す。規定された調製された気体混合物（例えば、Ｎ2７５％、Ｏ2２０％、ＣＯ2５％、リンデ（Ｌｉｎｄｅ）株式会社（ＡＧ））が規定された流れ（例えば、１０−１００ｃｍ2／分）で使用され、好ましくは９０％（相対空気飽和と比べ）の培養スペース中の溶解酸素（ｐＯ2）の濃度を平衡化する。気体は、フィルタ１０２によって滅菌ろ過された圧縮気体シリンダ１０１から取られ、フリット洗浄ボトル１０３で湿潤化される。気体は側方ポート１０４によって供給され、反対側のポート１０５で排出され、滅菌トラップ（第２のフリット洗浄ビン、１０６）へ方向づけられ、細菌の逆行した汚染を回避する。
【００６８】
培養モジュールの灌流のための細胞懸濁液および／または細胞培養培地の循環は、約１２ｍｌの閉鎖ループ流体系中の１００μｌ／分の一定流で蠕動ポンプデバイス（１０７）によって駆動される。注入または細胞懸濁液および／または培地をプロービング(probing)するためのポートが循環ループ（１０８）に統合されている。
【００６９】
ｐＯ2用のアナライザ１０９およびｐＨ用のアナライザ１１０は、酸素供給および安定したｐＨ値をモニタリングするために使用される（フィボックス（Ｆｉｂｏｘ）３、ｐＨ−１ミニ、プレセンス（ＰｒｅＳｅｎｓ）有限会社（ＧｍｂＨ））。滅菌センサースポット（１１１、１１２）が培養モジュール内部に固定されており、培養モジュールハウジングに取付けられた光ファイバーによって読取られる。培養モジュールハウジング（プロービングポートでの厚さ（ｄ＝１ｍｍ））に使用されるポリスルホンの透明性は、蛍光の光学読取りを可能にする（蛍光寿命）。
【００７０】
図９は、培養細胞および／または組織のためのデバイスの別の実施形態を示す断面図である。このデバイスは図２に示されているものと類似している。したがって、同一または類似の部分は同じ参照符号で指定されている。
【００７１】
主な違いは、ハウジングの各半分２０ａおよび２０ｂが、フランジ部２２ａにネジ込まれうるように円筒形である点である。ハウジングの各半分２０ａおよび２０ｂはそれぞれ、管２７ａ、２７ｂを受入れるスレット(threat)を有する円筒形の開口部２１ａ、２１ｂを有する。ハウジングの各半分２０ａ、２０ｂをフランジ部２２ａに接続することによって、シール２４、２６、２８を使用して十分なシーリング(ceiling)が得られうる。シールの反対側では、支持デバイス１８ａ、１８ｂは肩状部３６に押付けられる。２つの支持デバイス１８ａ、１８ｂ間には培養スペース２またはマトリクス８が配置されている。
【００７２】
無細胞供給液体４用の管３８は、開口部４０によって開口部４０内のフランジ部２２ｃに保持されており、管３８は対応するスレットを有する。フランジ部２２ａと２２ａとの間には第３のフランジ部２２ｂが提供されており、２つのフランジ部２２ａおよび２２ｃの接続を密閉する。
【００７３】
図１０は、図９と類似するデバイスの図９の線Ｉ−Ｉに沿った断面図を示し、それによってハウジングの半分２０ａは追加の手段を有する。マトリクス８内の細胞および培地をモニタリングするために、２つのポート４０および４２または光ファイバーがハウジングの半分２０ａ内に提供されている。光ファイバーは、ｐＨ用にセンサースポット４６、またはｐＯ2用にセンサースポット４４に接続されうる。
【００７４】
図１０に示されているデバイスの他の部分は、図９のものと同一である。
【００７５】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは本発明を制限するように解釈してはならない。
【実施例】
【００７６】
材料と方法
化学薬品、消耗品、および実験室装置：
一次細胞の調製用の血液サンプル（実施例１、２）（ヘマホールディング（Ｈａｅｍａ  Ｈｏｌｄｉｎｇ）株式会社（ＡＧ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
ＭＮＣの調製用の血液サンプル（実施例３、４）（ＩＫＩＴ、ライプチヒ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｉｐｚｉｇ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
骨髄サンプル（実施例４）（ライプチヒ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｉｐｚｉｇ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
Ｔ−フラスコ７５ｃｍ2（ヌンクロン  イージーフラスコ（Ｎｕｎｃｌｏｎ  ＥａｓｙＦｌａｓｋ）、ヌンク（Ｎｕｎｃ））、
Ｔ−フラスコ２５ｃｍ2（ヌンクロン  イージーフラスコ（Ｎｕｎｃｌｏｎ  ＥａｓｙＦｌａｓｋ）、ヌンク（Ｎｕｎｃ））、
２４ウェル、多ウェルプレート（ヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）、ヌンク（Ｎｕｎｃ））、
テクノマウス（Ｔｅｃｈｎｏ  Ｍｏｕｓｅ）（インテグラ  バイオサイエンシス（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
細胞インキュベーター（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）（セルセーフ（ＣｅｌｌＳａｆｅ）、ヘレウス（Ｈｅｒａｅｕｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））
５％二酸化炭素を補充した空気、温度３７℃、相体湿度９０％、
フローサイトメーター（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンシス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
ＥＬＩＳＡ用のサイトカイン検出（クアンチカイン−イムノアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、アールアンドディ（Ｒ＆Ｄ）−システムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）ビアマン（Ｂｉｅｒｍａｎ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
フローサイトメトリービーズアッセイ用のサイトカイン検出（ＣＢＡ、ＢＤバイオサイエンシス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））
倒立顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＩＸ−５０、オリンパスドイチュラント（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
デジタルカラーＣＣＤ−カメラ（ＤＰ−５０、オリンパスドイチュラント（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、
オートクレーブ（テクノクラフ（Ｔｅｃｎｏｃｌａｖ）１２０、フェデガリ（Ｆｅｄｅｇａｒｉ）、インテグラ  バイオサイエンシス（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【００７７】
滅菌：
温度１２１℃の水蒸気飽和雰囲気、および大気（圧）を１００ｋＰａ超える圧力で２０分間の品目のインキュベーション。
【００７８】
灌流バイオリアクターの全要素を層流デバイス下に滅菌アセンブリされたガンマ線照射（１７ｋＧｙ）で滅菌した。懸濁細胞（約１×１０6／モジュール）の接種も滅菌条件下で行った。培養モジュールおよび支持流体を含むバイオリアクター設定は温度制御インキュベーター（３７℃）に移行される。
【００７９】
培養培地：
培養培地ＲＰＭＩ  １６４０（ギブコ  インビトロジェン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、米国（ＵＳＡ））、
サイトカイン（ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α）（ＡＬ−イムノツールズ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【００８０】
抗体：
フローサイトメトリー用抗体（ＢＤバイオサイエンシス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【００８１】
試薬／略語：
ＣＤ１ａ−ＣＤ８６
臨床診断において証明された細胞表面上の分化規定マーカー群
ＦＩＴＣ
イソチオシアン酸フルオレセイン、結合タンパク質、例えば、抗体の標識用蛍光色素
ＰｅｒＣＰ
結合タンパク質、例えば、抗体の標識用蛍光色素（蛍光の励起／発光波長がＦＩＴＣとは異なる）
ＰＥ
フィコエチリン、結合タンパク質、例えば抗体の標識用蛍光色素（蛍光の励起／発光波長がＦＩＴＣまたはＰｅｒＣＰと異なる）
Ｔ細胞
末梢血調製物のヒトＴ−リンパ球
Ｂ細胞
末梢血調製物のヒトＢリンパ球
ＡＰＣ
抗原提示細胞は、その細胞表面、例えば、樹状細胞（ＤＣ）上に主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ  ＩＩ）を用いて抗原分子の一部を曝露している
ＤＣ
樹状細胞
ＧＣ
胚中心はリンパ節および脾臓における組織学的構造であり、ヒトにおける体液性免疫応答において重要な役割を果たす
ｅｆＧＣ
濾胞外胚中心は、リンパ節および脾臓における縮小された組織学的構造を有する胚中心の特殊な形態であり、非リンパ器官、例えば、四肢の滑膜継ぎ目でも確認されうる
ＩＬ−２〜ＩＬ−１２
インターロイキン、細胞走化性および細胞活性化に関与する白血球間の連絡のための高特異的メッセンジャー物質
ＩＦＮ−α、β、χ
インターフェロン、細胞走化性および細胞活性化に関与する白血球間の連絡のための高特異的メッセンジャー物質
ＧＭ−ＣＳＦ
顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子、細胞活性化および分化の高特異的メッセンジャー物質
ＦＣＳ
ウシ胎仔血清、胎仔のウシの血液からの生物学的調製品
ＤＮＡ／ＲＮＡ
核酸（デオキシリボ核酸、リボ核酸）細胞におけるゲノムおよびトランスクリプトームの特異的コード化情報分子
ＳＦＭ／ＳＦＭ２
無血清用途の細胞培養培地（ギブコ  インビトロジェン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））
ＥＬＩＳＡ
酵素結合イムノソルベントアッセイ、ペプチドおよびタンパク質の特異的検出および定量化のための分析方法
ＭＮＣ
単核細胞（末梢血液調製品からの白血球）
ＨｂｓＡＧ
共通Ｂ型肝炎ウイルス抗原
ＨＬＡ−ＤＲ
ヒト白血球抗原、免疫系の自己および非自己の認識用のＤＲ型細胞および組織抗原因子
ＩｇＭ／ＩｇＧ
免疫グロブリン、ＭまたはＧ型の抗体分子
ＰＷＭ
ヤマゴボウマイトジェン、高免疫原性およびマイトジェン潜在能力を有するヤマゴボウからの植物性レクチン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））
ＬＰＳ
リポ多糖、高免疫原性およびマイトジェン潜在能力を有する細菌細胞壁（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））の部分（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））
ＣＭＶ
サイトメガロウイルス、潜在的なヒト病原性ウイルス
【００８２】
実施例１：免疫担当細胞の生成および継代培養
インビトロで細胞免疫機能を調査するために、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、および樹状細胞を１人の患者のヒト血液サンプルから継代培養し、または生成し、異なる細胞集団から成るさらなる共培養の自己由来コンセプトを確実にした。
【００８３】
単核細胞（ＭＮＣ）を密度勾配遠心分離によって全血または白血球分離調製物から分離した。ヒト免疫担当細胞をＣＤ１４に対する第１のステップ、ＣＤ４またはＣＤ１９に対する第２のステップにおける表面マーカーによる免疫磁気分離法によって単離した。さらに、ＣＤ２５の枯渇を適用し、阻害ポテンシャルを有する調節細胞を除去した。
【００８４】
単離亜集団を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）培養で補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。
【００８５】
ＣＤ１４分離によって得られた単球を使用し、サイトカイン刺激によってヒト樹状細胞（ＤＣ）を分化した。したがって、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを培養日の調製後２４時間および４８時間に補充した（２×１０6細胞／ｍｌに対して各８００ＩＵ／ｍｌ）。さらにＴＮＦ−αを８日目に添加した。表面マーカーおよびファゴサイトーシスの活性についてフローサイトメトリーによってＤＣを特徴づけた。
【００８６】
ＣＤ１４陰性プールを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養し、３か月間、−８０℃で凍結保存しえた。凍結保存培地は、ＲＰＭＩ  １６４０培地、２５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、および１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で構成された。
【００８７】
ＣＤ１４陰性プールを用いて、分離されたＣＤ１４−（＋）分離から、またはそれぞれＣＤ１９またはＣＤ４についての分離による凍結保存試料の再活性後にＢ細胞およびＴ細胞を得た。
【００８８】
生成されたＤＣを表面マーカー（ＣＤマーカー）のパネルに対するフローサイトメトリーおよびファゴサイトーシス能力によって特徴づけた（ファゴテスト（Ｐｈａｇｏｔｅｓｔ）、ＢＤバイオサイエンシス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。分化の１２日後、生成されたＤＣは文献に記載されているように表面マーカーの発現への典型的な変化を示した。すなわち、単球マーカーＣＤ１４は、サイトカイン補充（ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ）の第１日目に消滅した。
【００８９】
対照的に、マーカーＣＤ１ａは段階的に増大した。分化の過程中、ＣＤ４０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６は顕著に増大した。抗原提示に重要であるＭＨＣ−ＩＩ複合体の主要部分であるマーカーＨＬＡ−ＤＲは一貫して発現された（図５）。
【００９０】
生成されたＤＣは、新しく単離されたＣＤ１４陽性細胞（単球／マクロファージ）と比べファゴサイトーシス活性の増強を示す。ファゴサイトーシス活性は、６．３３から１６．１５％へ増大した。したがって、ＤＣを蛍光標識細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートし、蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。摂取した細菌を有する細胞は、追加のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって無細菌と区別され、氷上（０℃）での制御インキュベーションによって吸着細菌と区別されえた（図６）。
【００９１】
実施例２：
ＤＣおよびＴ細胞の共培養による複合体細胞ネットワークの自発的形成
ＤＣおよびＴ細胞の規定された共培養が確立できた。ＤＣを特定の抗原（ＣＭＶラテックスビーズ、ＣＭＶ診断キット、アボット  ダイアグノスティックス（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む懸濁培養液で４時間、予備インキュベートした。次いで、１０5ＤＣ／ｍｌを多ウェルプレート（２４ウェル）上に播種し、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ）によってバイスタンダーを刺激した。培養の２４時間後、ＤＣは培養皿の表面上に展開し、１０5Ｔ細胞を添加した（急性または不顕性ＣＭＶ感染を有さない血液ドナーの選択によってＣＭＶ抗原に対して非誘導）。共培養を約１４日間モニタリングした。６−１０日後、ＤＣは自己組織化の方法によって樹状突起の複合体ネットワークを形成した（図７）。以前に懸濁したＴ細胞は粘着性に変化し、樹状ネットワークに移動し、樹状突起と密接に接触するようになった。Ｔ細胞の増殖が開始し、培養物表面と緩く接触した浮遊増殖群が確認できた（図７）。
【００９２】
さらに、共培養ＤＣおよびＴ細胞におけるネットワークの形成が三次元培養でも示されえた。フィブリノゲンヒト血液凝固系由来のヒドロゲルをマニュアル（ティシュコル  イムノ  キット（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｋｉｔ）、バクスター  バイオサイエンス（Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））に記載されているように、ただし１０倍希釈を用いて調製した。
【００９３】
ＤＣおよびＴ細胞をフィブリノゲン溶液中に懸濁し、凝固の誘発後、ゲル化マトリクスに均質に組込み、最終濃度をそれぞれ０．８×１０6、４．９×１０6細胞／ｍｌとした。マトリクスを高さ約１ｍｍの円板状の層で調製した。凝固前にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）によって希釈された１：１０〜１：５の濃度によって、それらは中等度の透明性〜混濁を有した。
【００９４】
組込まれた細胞を細菌のリポ多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＬＰＳ）１μｇ／ｍｌのマイトジェン補充によって刺激した。顕微鏡制御下に組込まれた細胞を約１０日間、培養した。
【００９５】
４〜６日の培養期間に、ＤＣは自己組織化方法による二次元培養で確認されるように樹状ネットワークを形成する。４〜６日に、以前に均質に分布したＴ細胞は、移動によってＤＣの周りに集まり、培養の最後まで増殖群を形成した。
【００９６】
実施例３：テクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）バイオリアクターにおけるヒトＭＮＣの三次元長期培養の試験（基準実施例）
健康なヒトドナーからのＭＮＣの同一調製物からの２つの異なる集団をテクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）バイオリアクターで５６日および３４日間培養した（上記の説明参照）。約４．３ｍｌの培養スペースを開始細胞数２．４×１０8（５５．８×１０6細胞／ｍｌ）および１．５４×１０8（３５．８×１０6細胞／ｍｌ）接種した。バイオリアクターの灌流系（毛細管内スペース）を７５ｍｌ／時の灌流速度で３０分間、５ｌ再循環ジャーからの培養培地ＩＦＭによる連続灌流によって予備インキュベートした。培養スペース（毛細管外スペース）を培養培地ＳＦＭ１で３０分間、予備インキュベートした。細胞をＳＦＭ２  ６ｍｌおよびＨＥＶＡＣ  ０．５ｍｌ中に懸濁し、培養スペースに移した。培地ジャーを１４日間隔で変更した。ＩＦＭの基準濃度に従い７日間隔でグルタミンを毛細管内スペースに添加した。ＳＦＭ２  ２ｍｌおよびＨＥＶＡＣ  ０．５ｍｌを３４日目に１回限り毛細管内スペースに添加した。バイオリアクターの供給のために、細胞培養インキュべーターからの気体混合物を使用した（空気／ＣＯ2混合物、５％ＣＯ2）。気体は１．８ｌ／分で循環した。代謝状態、栄養供給、および感染の早期認識をモニタリングするために、ＭＮＣ集団の細胞培養上清におけるグルコースおよび乳酸の濃度を毎日測定した。細胞計数を臭化エチジウム／アクリジンオレンジ法で行った。培養上清をＥＬＩＳＡによってＩｇＭ、ＩｇＧ、抗脂質Ａ、抗ＬＰＳＪ５、および抗ＨＢｓＡｇ抗体について分析した。サイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αをさらに分析した。培養の１日目および３４日目の両方の集団の比較ＦＡＣＳ分析により、培養中に発生する分化および増殖過程が見出されるはずであった。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＢＭＡ０３１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２５−Ｆ、ＣＤ４５を検査し、ＭＮＣ培養における３４日の培養期間中の分化および増殖マーカーのパターンの変化を確認した。
【００９７】
ＭＮＣおよびリンパ球集団を用いて、約９０％の生存が培養の５週間後に検出できた。免疫担当亜集団の分布率に関しては、ＭＮＣ開始集団の組成が、クラッセン（Ｃｌａｓｓｅｎ）（Ｍ．クラッセン（Ｃｌａｓｓｅｎ）ら、アーバン  アンド  シュバルツェンベルク（Ｕｒｂａｎ  ＆  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ）、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、ボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９９１年））によって記載された末梢ヒト血液における通常の分布にほぼ対応する。培養の最初の５週間において、細胞分布は明らかにマクロファージおよび樹状細胞に有利に変化した。ＦＡＣＳ分析の詳細な評価は、増殖および活性化の過程が両方の培養変形において起こったことを示す。増殖マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７１、およびＣＤ２５は、最初の５週間にわたってすべての亜集団で増大した。唯一の例外はＴサプレッサー細胞であり、ＨＬＡ−ＤＲの増大のみが確認しえた。
【００９８】
リンパ球数の明らかな減少にもかかわらず、増殖または活性化はリンパ球集団内で確認可能となる。両方の培養変形において、Ｔ細胞マーカーＣＤ２、ＣＤ４、およびＴＣＲαβの増大が検出できた。ＣＤ８の増大は、中央値を考慮した場合のみ、確認可能となり、結論として、すべてのＴ細胞亜集団の発育の前進が誘導されうる。この誘導は、Ｔメモリー細胞または活性化Ｔ細胞（ＣＤ４５Ｒ０）の同時の増大とともにナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ）の削減によって裏づけられる。ＣＤ１１ａおよびＬｅｃａｍ１の連続的な検出は、付着分子の機能的発現に有利であることを示す。ＥＬＩＳＡによって経過中に検査された抗体濃度は、高濃度の抗体が培養の８週に至るまでも検出されうることを示した（表７を参照）。
【００９９】
サイトカインＩＬ−８およびＩＬ−１ｒａは培養期間の全体を通じて検出できた。再循環培地（毛細管内スペース）におけるグルコースおよび乳酸の毎日の測定の評価により、培養経過の全体を通じて安定した上記濃度でのグルコースおよび乳酸のレベルが得られたため、代謝最終産物の重要な蓄積なしに安定した栄養の供給を可能にすると結論される。
【０１００】
経時的なＣＤ４５  ＲＡ／Ｒ０比の減少およびＩｇＭ／ＩｇＧ比の低下は、一次および二次免疫付与がすでにきわめて単純な試験方法において可能であるようにみられることを示す。
【０１０１】
培養経過の全期間にわたってのグルコースおよび乳酸濃度の毎日の測定において、グルコース含量は少なくとも１２．３ｍｍｏｌ／ｌであった。最大乳酸濃度は、１．９ｍｍｏｌ／ｌであった。
【０１０２】
表１：テクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）バイオリアクターにおけるヒトＭＮＣの三次元長期培養の経過における細胞計数の結果
【表１】
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【０１０３】
表２：ＦＡＣＳ分析によって測定されたそれぞれの総集団におけるリンパ球およびマクロファージ／樹状細胞の割合
【表２】
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注：ここで言及された亜集団への分類は、異なる物理的細胞特性によるＦＡＣＳデバイスの前方および側方散乱における細胞偏向の差、および抗体混合物ＣＤ４５−Ｆ／ＣＤ１４−ＰＥによる標識後の細胞の異なる蛍光により達成された。
【０１０４】
表３：それぞれの総集団における生体マクロファージ／樹状細胞での異なる分化および増殖マーカーの分布パターン
【表３】
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【０１０５】
表４： それぞれの総集団におけるリンパ球での異なる分化および増殖マーカーの分布パターン
【表４】
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【０１０６】
表５： それぞれの総集団におけるＴヘルパー細胞／炎症性Ｔ細胞での異なる分化および増殖マーカーの分布パターン
【表５】
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【０１０７】
表６： それぞれの総集団におけるＴサプレッサー細胞での異なる分化および増殖マーカーの分布パターン
【表６】
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【０１０８】
表７： 記載集団の細胞培養上清およびＥＬＩＳＡによるＭＮＣドナーの血清における異なる抗体の検出：
【表７】
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【０１０９】
表８： 記載集団の細胞培養上清における異なるサイトカインの検出
【表８】
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【０１１０】
実施例４：三次元組織培養を使用する白血病性Ｂリンパ球の形質細胞への分化
Ｂ慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）患者からの骨髄組織１０ｍｌを生検によって得た。有核骨髄細胞の９１％超は、ＣＤ１９／２０陽性白血病性Ｂリンパ球であり、細胞表面上にその抗体を有していた。生検後の赤血球および残りとともに１００％の生存率を示す合計２．５７Ｅ９  ＢＭ細胞を８ｍｌ  ＩＦＭ培地に懸濁した。細胞をテクノマウス（Ｔｅｃｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）培養カセットの培養スペースへ充填した。組織再組織化は、２つの薄いシリコーン膜による有効な酸素供給およびホローファイバーを経た基礎培地灌流により培養室で生じさせた。バイオリアクターは、５０ｍｌ／時の灌流速度で１４５日にわたって操作された。収穫は２週間ごとに行った。毛細管外スペースの接種および収穫細胞および培養培地上清のアリコートを分析した。懸濁細胞をＤＣ毛細管スペースについて特徴づけたものを分析した。懸濁細胞をフローサイトメトリーによってＣＤマーカーについて特徴づけた。上清を分泌免疫グロブリンについてクアンチカイン−イムノアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、アールアンドディ（Ｒ＆Ｄ）システムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビアマン（Ｂｉｅｒｍａｎ）を用いるＥＬＩＳＡおよびサイトカインによって分析した。
【０１１１】
文献に記載されているインビトロでのＢ−ＣＬＬ細胞の急速なアポトーシスとは対照的に、バイオリアクターにおける骨髄組織の自己組織化は、少なくとも１４日にわたってインビボと同様の挙動をもたらした。Ｂ細胞マーカーＣＤ１９／２０は、細胞の９０％超で残存した。同期間後、ＣＤ１９／２０の発現は急速に減少し、最終的に１４５日目で１０％になった。１４日目以降、６００ｐｇ／ｍｌという相当量のＩＬ−６が三次元細胞培養スペースに蓄積した。インターロイキン６は、以下の表に示されているように全培養期間にわたってきわめて高いままである。
【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
培養の時間経過とともに分泌した免疫グロブリンはきわめて高い力価に蓄積した。１４５日目には、１．５ｇ／ｌのＩｇＭおよび３．０ｇ／ｌのＩｇＧが収穫上清において確認できた。
【０１１４】
培養の最終段階でのリンパ球上のＣＤマーカーの欠如、および大量の蓄積されたＩｇＭとＩｇＧは、いずれもＢ−ＣＬＬ腫瘍細胞の非分裂抗体分泌形質細胞への分化に対応する。ＩＬ６などのサイトカインによって駆動され、１４日目以降の患者のインビトロ骨髄培養の微環境はその後に新しい形質細胞誘発表現型に変化した。したがって、機能的三次元ヒトリンパ組織の自己組織化および自己再組織化は、適切なバイオリアクターおよび方法設計を提供することによって誘発されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】本発明によるデバイスの第１の実施形態を示す図である。
【図２】本発明によるデバイスの第２の実施形態を示す図である。
【図３】図２に示されているデバイスを示す詳細図である。
【図４】図２に示されているデバイスを示す横断面図である。
【図５】ＤＣの特徴づけに一般的に使用される表面マーカーのパネルである。それぞれの棒は、分化方法の前（■）および後（１２時間、□）の汎白血球のＣＤ４５に対して陽性に選別された全細胞と比べ各マーカーを発現する細胞の部分を示す。
【図６】フローサイトメトリーによるファゴサイトーシス（phacocytosis）の定量化。白血球、例えば、ＤＣは核染色によって細菌から区別され（ＦＬ−２上のＰＩ、Ａ）、ＦＩＴＣ標識細菌を含有する細胞は象限統計を用いて定量化され（ＦＬ−１、Ｂ−Ｄ）、ファゴサイトーシスは氷上でのインキュベーションによって吸着から区別されうる（ＣおよびＤ）。
【図７】樹状ネットワークを形成するＤＣ。Ｔ細胞は樹状突起と密接し、増殖に対して活性化されており、Ｔ細胞はＤＣ樹状突起に移動し（Ａ）、Ｔ細胞はＤＣに密接し（Ｂの矢印）、Ｔ細胞が増殖を開始してＤＣと接触し（Ｃの矢印）、Ｔ細胞は浮遊増殖群を形成する（Ｄの矢印）。
【図８】本発明のデバイスのサポートラインを示すスキームである。
【図９】本発明によるデバイスの第３の実施形態を示す図である。
【図１０】本発明によるデバイスの第４の実施形態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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