(57)【要約】  Ａｐｏ−２Ｌレセプター分子に結合するペプチドを提供する。これらペプチドは、例えば、Ａｐｏ−２Ｌ及び／又はＤＲ５等のＡｐｏ−２Ｌレセプター分子の生物学的活性の調節が望まれる方法に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１４ないし配列番号：１０４（表８）からなる群から選択したアミノ酸配列を含んでなる単離したＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が、大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は酵母菌細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞を調製して；（ｂ）培養培地を調製して；（ｃ）Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを発現するのに十分な条件下にて培養培地中で宿主細胞を培養して；（ｄ）宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを回収して；（ｅ）Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを精製する工程を含む、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの生成方法。
【請求項７】
ペプチドが、ヒトＤＲ４レセプターポリペプチドと図１のアミノ酸１１４から２８１を含んでなるＡｐｏ−２リガンドポリペプチドとの相互作用を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、ヒトＤＲ５レセプターポリペプチドと図１のアミノ酸１１４から２８１を含んでなるＡｐｏ−２リガンドポリペプチドとの相互作用を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドが、一以上の哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
ペプチドが、そのＮ末端から第１、２、３、４、５、６又は７位にシステイン残基を持つ、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
ペプチドはモチーフシステイン―Ｘ１―Ｘ２―Ｘ３―システインを含んでなるものであり、Ｘ１はメチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ２はスレオニン及びアラニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ３はセリン、メチオニン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
ＤＲ５レセプターに結合し、ＤＲ４レセプターには結合しない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
ＤＲ５レセプターに結合して、更にＤＲ４レセプター、ＤｃＲ１レセプター、及び／又はＤｃＲ２レセプターに結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが異種性ポリペプチド配列に連結する、請求項１又は７ないし１３の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
【請求項１５】
異種性ポリペプチド配列が、アミノ酸配列グリシン−グリシン−メチオニンを含んでなるロイシンジッパードメインである、請求項１又は７ないし１４の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
【請求項１６】
Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが一以上のポリオール基を抱合又は連結している、請求項１又は７ないし１５の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
【請求項１７】
請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のペプチドを担体に含んでなる組成物。
【請求項１８】
無菌である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ペプチドが、一以上の哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳動物細胞を有効量の請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドに曝すことを含む、哺乳動物細胞のアポトーシス誘導方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の癌の治療方法。
【請求項２３】
癌が、肺癌、乳癌、大腸癌又は結腸直腸癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
有効量の請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の免疫関連疾患の治療方法。
【請求項２５】
前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１又は７ないし１６の何れかに記載の少なくとも一ペプチドを包含する容器及びペプチドの利用を使用者に指示する指示書を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（出願について）
この出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、２００３年５月９日提出の米国特許仮出願番号第６０／４６９，４３６号の優先権を主張する本出願であり、ここに出典明記により組み込まれるものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ａｐｏ−２Ｌのレセプターに結合するペプチドに関する。そのようなペプチドは、例えばＡｐｏ−２Ｌ及び／又はＡｐｏ−２Ｌレセプターの生物学的活性の調節を目的とする方法で用いることができる。
【０００３】
（発明の背景）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ−２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Browningら, Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら, Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開のWO97/01633；1997年7月17日公開のWO97/25428；Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開のWO98/28426；1998年10月22日公開のWO98/46751；1998年5月7日公開のWO/98/18921；Mooreら, Science, 285:260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ−２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００４】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWileyら, Immunity, 3:673-682 (1995); Pittiら, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)］。完全長ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素による切断を通して、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Marianiら, J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitzら, Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitzら, Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、（ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の）３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitzら; Bodmerら, J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を含む免疫系の調節、及びＨＩＶの治療に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている［例えば、Thomasら, J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsenら, Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffithら, J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Songら, J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)；Jeremias ら., Eur. J. Immunol., 28:143-152 (1998)；Katsikis ら., J. Exp. Med., 186:1365-1372 (1997)；Miura ら., J. Exp. Med., 193:651-660 (2001)］。
【０００５】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型はまた大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含むインビトロの様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWileyら; 上掲のPittiら; Riegerら, FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczakら, Nature Med., 5:157-163 (1999); Keaneら, Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutaniら, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yuら, Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyanら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenaziら;上掲のWalzcakら;Gliniakら, Cancer Res., 59:6153-6158 (1999);上掲のChinnaiyanら; Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenaziら;上掲のWalzcakら］。ＪｏらはＡｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Joら, Nature Med., 6:564-567 (2000);またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、死亡対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
そのようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞応答の誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。既に、約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されている［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；１９９１年３月２０日に公開された欧州特許第４１７５６３号；Loetscherら, Cell, 61：351(1990)；Schallら, Cell, 61：361(1990)；Smithら, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。それらのＴＮＦＲが細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有している。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出されている［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)；Hale等［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００６】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２-末端から出発して、１から４と命名される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０アミノ酸長で、よく保存されている位置に４から６のシステイン残基を含んでいる［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲；Bannerら, Cell, 73:431-435 (1993)］。ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら, 上掲及びItohら, Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
【０００７】
リンホトキシン-βを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、一般的にＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプターは一般的にＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００８】
Panらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)；１９９８年７月３０日公開のＷＯ９８／３２８５６も参照］。ＤＲ４は細胞自殺機構に関与可能な細胞質デスドメインを含むと報告されている。Panらは、ＤＲ４がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridanら, Science, 277: 818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［１９９８年１１月１９日に公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９もまた参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている［Screatonら, Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387 (1997);Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997);１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９８年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１］）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitzら, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【０００９】
最近同定されたレセプターの更なるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達トランスデューサーというよりはむしろ阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Panら, Science, 276：111-113(1997)；Sheridanら, Science, 277：818-821 (1997)；McFarlaneら, J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapayaら, J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marstersら, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Panら, FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［上掲のSimonetら；下掲のEmeryら］及びＤＣＲ３［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合すると報告されている。
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬは細胞表面「デスレセプター」ＤＲ４及びＤＲ５を通して作用してカスパーゼ、又は細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている。リガンド結合の際、ＤＲ４とＤＲ５は、双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１［Kischkelら, Immunity, 12:611-620 (2000); Sprickら, Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmerら, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997); Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001)を参照。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、Ａｐｏ−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称する）に対するレセプターに結合するペプチドを提供する。場合によっては、ペプチドは、単量体、二量体、三量体、四量体、又はより高次のオリゴマー型である。場合によっては、ペプチドはオリゴマー複合体形成を容易にする異種性ペプチド配列（例えば、ロイシンジッパードメイン）に融合したＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを含んでなるキメラ分子である。一実施態様では、ペプチドは、その少なくとも一レセプター、例えばＤＲ５レセプターとＡｐｏ−２Ｌの相互作用を阻害する。場合によっては、化合物は、少なくとも一のＡｐｏ−２Ｌ関連生物学的活性、例えばＤＲ５レセプターを介したアポトーシスの誘導のアゴニストである。
ある実施態様では、ペプチドは、約１０ないし約２５アミノ酸残基を有するＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドであり、配列番号：１４ないし配列番号：１０４（表８）からなる群から選択したアミノ酸配列を含んでなるものである。本発明の関連の実施態様には、配列番号：１４ないし配列番号：１０４（表８）からなる群から選択したアミノ酸配列を含んでなるＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドをコードする核酸分子を含む。更に、本発明の実施態様には、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドをコードする核酸分子を含んでなるベクター、並びにこのベクターを含んでなる宿主細胞（例えば大腸菌）を含む。
【００１１】
本発明の付加的な実施態様には、配列番号：１４ないし配列番号：１０４（表８）からなる群から選択したアミノ酸配列を含んでなるＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドをコードする核酸分子を内含するベクターを有する宿主細胞を調製して；（ｂ）培養培地を調製して；（ｃ）Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを発現するのに十分な条件下にて培養培地中で宿主細胞を培養して；（ｄ）宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを回収して；（ｅ）Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを精製する工程を含む、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの生成方法を含む。
例として表８に示すように、本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは好ましくは特有の性質又は特徴がある。例えば、本発明のある実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、そのＮ末端から第１、２、３、４、５、６又は７位にシステイン残基を持つ。好ましい実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドには以下のモチーフが含まれる：システイン―Ｘ１―Ｘ２―Ｘ３―システインであり、Ｘ１はメチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ２はスレオニン及びアラニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ３はセリン、メチオニン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【００１２】
本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、当分野で公知の広義の様々な方法の一つを用いて修飾してもよい。本発明の好ましい実施態様では、本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは異種性分子又はポリペプチド配列に連結している。場合によっては、異種性ポリペプチド配列はロイシンジッパードメインである。場合によっては、異種性配列はアミノ酸配列グリシン−グリシン−メチオニンを含む。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが一以上のリンカー分子又はポリオール基を抱合ないし連結してよい。
本発明のある実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドはＡｐｏ−２ＬとＤＲ４との相互作用を阻害する。本発明のいくつかの実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドはＡｐｏ−２ＬとＤＲ５との相互作用を阻害する。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは一以上の哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導する。
また、少なくとも一の上記ペプチドを担体に含んでなる組成物もここに提供する。好ましくは、この組成物は殺菌されている。加えて、本発明は上記組成物の調整方法を提供する。特に望ましい実施態様では、結果として生じる組成物は薬学的に受容可能な製剤である。
また、上記ペプチドをコードする単離した核酸も提供し、例えばインビボまたはエクスビボの遺伝子治療に用いてよい。
【００１３】
更に他の実施態様では、ペプチドの用量を適切に調製するために、生体液中の特定のＡｐｏ−２Ｌレセプターに結合したペプチドの量を測定する方法を提供する。またここでは、リガンドに結合するポリペプチドと競合するペプチドのリガンド結合についての相対的親和性を予測する方法を提供し、該ペプチドはファージディスプレイライブラリ由来のものであり、該方法は、ペプチドに対応するファジミドクローンをリガンドと共にポリペプチドとインキュベートし、ファージを連続的に希釈し、ペプチドにより阻害されるファジミドクローンのリガンド結合の程度を測定することを含むものであり、この方法において、低濃度のファージでしか阻害されないファジミドクローンは、高濃度及び低濃度のファージの両方で阻害されるファジミドクローンよりリガンドへの親和性が高いものである。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物細胞のＡｐｏ−２Ｌ及び／又はＡｐｏ−２Ｌレセプターの生物学的活性の調節方法である。本発明の好ましい実施態様は、哺乳動物細胞を有効量のここに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドに曝すことを含む、哺乳動物細胞のアポトーシス誘導方法である。本発明のもう一つの実施態様は、哺乳動物細胞を有効量のここに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドに曝すことを含む、哺乳動物細胞のアポトーシス等のＡｐｏ−２Ｌ関連生物学的活性を阻害する方法である。哺乳動物細胞は例えば癌細胞でもよい。更なる態様では、本発明は、哺乳動物に有効量の本発明で提供するＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを場合によっては注射又は輸液によって投与することを含む、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患等の疾患の治療方法を提供する。場合によっては、疾患は癌、特に乳癌、肺癌又は大腸癌（又は直腸結腸癌）である。ここに記載のペプチドは単独又は他の薬剤と共に投与されうる。
付加的な実施態様では、本発明は、ここに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを包含する容器とＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの使用；例えば、効果があるペプチドの疾患治療への使用についての指示書を含んでなるキットを提供する。場合によっては、疾患は癌、特に、乳癌、肺癌又は大腸癌（又は結腸直腸癌）である。
本発明の更なる他の実施態様は、ここに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを内包する容器と、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの使用についての印刷された指示書を含んでなる製造品である。場合によっては、容器は、ボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である。場合によっては、製造品は、注射用水、生理食塩水、リンガー溶液又はブドウ糖溶液を内包する第２の容器を含む。
【００１４】
特に、請求項の形式で述べた以下の実施態様を提供する：
１．配列番号：１４ないし配列番号：１０４（表８）からなる群から選択したアミノ酸配列を含んでなる単離したＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
２．請求項１に記載のペプチドをコードする核酸分子。
３．請求項２に記載の核酸配列を含んでなるベクター。
４．請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
５．前記宿主細胞が、大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は酵母菌細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
６．請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞を調製して；（ｂ）培養培地を調製して；（ｃ）Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを発現するのに十分な条件下にて培養培地中で宿主細胞を培養して；（ｄ）宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを回収して；（ｅ）Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを精製する工程を含む、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの生成方法。
７．ペプチドが、ヒトＤＲ４レセプターポリペプチドと図１のアミノ酸１１４から２８１を含んでなるＡｐｏ−２リガンドポリペプチドとの相互作用を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
８．ペプチドが、ヒトＤＲ５レセプターポリペプチドと図１のアミノ酸１１４から２８１を含んでなるＡｐｏ−２リガンドポリペプチドとの相互作用を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
９．ペプチドが、一以上の哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１に記載のペプチド。
１０．ペプチドが、そのＮ末端から第１、２、３、４、５、６又は７位にシステイン残基を持つ、請求項１に記載のペプチド。
１１．ペプチドはモチーフシステイン―Ｘ１―Ｘ２―Ｘ３―システインを含んでなるものであり、Ｘ１はメチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ２はスレオニン及びアラニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ３はセリン、メチオニン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載のペプチド。
１２．ＤＲ５レセプターに結合し、ＤＲ４レセプターには結合しない、請求項１に記載のペプチド。
１３．ＤＲ５レセプターに結合して、更にＤＲ４レセプター、ＤｃＲ１レセプター、及び／又はＤｃＲ２レセプターに結合する、請求項１に記載のペプチド。
１４．Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが異種性ポリペプチド配列に連結する、請求項１又は７ないし１３の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
１５．異種性ポリペプチド配列が、アミノ酸配列グリシン−グリシン−メチオニンを含んでなるロイシンジッパードメインである、請求項１又は７ないし１４の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
１６．Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが一以上のポリオール基を抱合又は連結している、請求項１又は７ないし１５の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド。
１７．請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のペプチドを担体に含んでなる組成物。
１８．無菌である請求項１７に記載の組成物。
１９．ペプチドが、一以上の哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１７に記載の組成物。
２０．哺乳動物細胞を有効量の請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドに曝すことを含む、哺乳動物細胞のアポトーシス誘導方法。
２１．哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項２０に記載の方法。
２２．有効量の請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の癌の治療方法。
２３．癌が、肺癌、乳癌、大腸癌又は結腸直腸癌である、請求項２２に記載の方法。
２４．有効量の請求項１又は７ないし１６の何れかに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の免疫関連疾患の治療方法。
２５．前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項２４に記載の方法。
２６．請求項１又は７ないし１６の何れかに記載の少なくとも一ペプチドを包含する容器及びペプチドの利用を使用者に指示する指示書を含んでなるキット。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
Ａ．定義
「ＴＮＦファミリーメンバー」は広範囲の意味に使用され、構造又は機能に関し、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)にある程度の類似性を共有する種々のポリペプチドを称する。ＴＮＦファミリーのポリペプチドに関連したある種の構造的及び機能的特徴は、当該分野において公知であり、例えば、上述した本発明の背景に記載されている。限定されるものではないが、このようなポリペプチドには、当該分野でＴＮＦ-アルファ、ＴＮＦ-ベータ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(ＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(TWEAKとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(Ｂ１ｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)と称されるポリペプチドが含まれる［例えば、Gruss及びDower, Blood 1995, 85：3378-3404；Pittiら, J. Biol. Chem., 1996, 271：12687-12690；Wileyら, Immunity, 1995, 3：673-682；Browning等, Cell, 1993, 72:847-856 ；Armitage等, Nature 1992, 357:80-82 、国際公開第97/01633号；国際公開第97/25428号；Marstersら, Curr. Biol., 1998, 8：525-528；Chicheporticheら, Biol. Chem. 1997, 272：32401-32410；Hahneら, J. Exp. Med. 1998, 188：1185-1190；国際公開第98/28426号；国際公開第98/46751号；及び国際公開第98/18921号；Mooreら, Science 1999, 285：260-263；Shuら, J. Leukocyte Biol. 1999, 65：680；Schneiderら, J. Exp. Med.,  1999,189：1747-1756；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem. 1999, 274：15978-15981(1999)を参照のこと］。
【００１６】
「Ａｐｏ-２Ｌレセプター結合ペプチド」とは、広義で一以上のＡｐｏ-２Ｌレセプターに結合するペプチドを意味する。「Ａｐｏ-２Ｌレセプター結合ペプチド」はＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターに方向付けられた抗体を含む。好ましくは、ペプチドは約１０ないし約２５アミノ酸残基、又は約１０ないし約２０残基、及びより好ましくは約１２ないし約２０アミノ酸残基を有する。場合によっては、Ａｐｏ‐２Ｌレセプター結合ペプチドは２５以下のアミノ酸残基（例えば、２５又はより少ないアミノ酸残基）からなる。好ましくは、ペプチドは、そのＮ末端から第１、２、３、４、５、６又は７位にシステイン残基を有する。さらにより好ましくは、加えてペプチドは、Ｎ末端システイン残基にバリン、グルタミン酸又はグリシン残基Ｎ末端を有する。さらにより好ましくは、ペプチドは、Ｎ末端システイン残基への残基Ｎ末端がバリン残基である。さらにより好ましくは、ペプチドは以下を含むモチーフを有する：システイン−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−システイン。好ましくは、Ｘ１はメチオニン又はロイシンのいずれかの残基である。好ましくは、Ｘ２はスレオニン又はアラニン残基である。好ましくは、Ｘ３はセリン、メチオニン、ロイシン又はグルタミン酸残基である。さらにより好ましくは、当該ペプチドは、そのＣ末端から第２位にロイシン残基を有する。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは異種性の配列又は分子に融合又は連結している。好ましくは、異種性配列は、ペプチドが高次構造又はオリゴマー複合体を形成させる又は形成を補助する（例えば、ロイシンジッパードメイン）。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは一のＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えば、ＤＲ５）に結合し、他のＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えば、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２）には結合しない。あるいは、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは一のＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えば、ＤＲ５）に結合し、さらに一以上の他のＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えば、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２）に結合する。場合によっては、ペプチドは、Ａｐｏ−２ＬとＤＲ５との相互作用を阻害するアンタゴニストである。あるいは、ペプチドは、ＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。場合によっては、ペプチドは、Ａｐｏ−２ＬとＤＲ４との相互作用を阻害するアンタゴニストである。あるいは、ペプチドは、ＤＲ４シグナル伝達活性のアゴニストである。
場合によっては、本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、ペプチド結合アッセイで測定できるように（以下の実施例に開示するように）、約１ｎＭないし約１ｍＭ（及び場合によっては約１００ｎＭないし約１ｍＭ）の濃度範囲でＡｐｏ−２Ｌレセプターに結合する。場合によっては、本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、ペプチド結合アッセイで測定できるように（以下の実施例に開示するように）、ＩＣ５０値が約３ｎｍないし約１５０ｎｍ（及び好ましくは、約６ｎｍないし約５０ｎｍ）を示す。
【００１７】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、図１に示されたアミノ酸配列(配列番号：１)のアミノ酸残基１１４-２８１、９５-２８１、残基９２-２８１、残基９１-２８１、残基４１-２８１、残基１５-２８１、又は残基１-２８１、並びに上記配列の生物活性な断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチド配列を称するために、ここでは使用される。一実施態様において、ポリペプチド配列は、図１(配列番号：１)の残基１１４-２８１を含み、場合によっては図１(配列番号：１)の残基１１４-２８１からなる。場合によっては、ポリペプチド配列は、図１(配列番号：１)の残基９２-２８１又は残基９１-２８１を有する。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは、図１に示す天然のヌクレオチド配列(配列番号：２)によりコードされ得る。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９(図１；配列番号：２)をコードするコドンは、「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」であってよい。他の一実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、列挙されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列の何れかと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、図１にて提供されるコード化ポリヌクレオチド配列(配列番号：２)と、緊縮条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされる。本定義は、少なくとも一の天然アミノ酸がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの置換変異体を包含する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の置換変異体は、少なくとも一のアミノ酸がアラニン残基で置換されたものを包含する。これらの置換変異体には、例えば「Ｄ２０３Ａ」；「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されているものが含まれる。この命名は、（図１に示される(配列番号：１)の番号を用いて）位置２０３、２１８及び／又は２６９で、アスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を同定するのに使用される。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ変異体はＰＣＴ出願国際公開第０１／００８３２号に公開された表１に列挙されている、一又は複数のアラニン置換基を含有していてもよい。置換変異体には、２００１年１月４日に公開されている国際公開第０１／００８３２号の表１において同定されている、一又は複数の残基置換が含まれる。また本定義は、組換え又は合成法により調製されるか、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ供給源から単離された、天然配列Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬも包含する。本発明のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬには、ＰＣＴ出願国際公開第９７／２５４２８号及び国際公開第９７／０１６３３号に開示されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドも含まれる。「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」又は「Ａｐｏ２Ｌ」なる「用語は、一量体、二量体又は三量体形態のポリペプチドを含む、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ形態のものを一般的に称するために使用される。特に記載しない限りは、Ａｐｏ２Ｌに記載されているアミノ酸残基の全てのナンバリングが、図１(配列番号：１)のナンバリングに使用されている。例えば「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、図１に付与された配列(配列番号：１)の位置２０３にあるアスパラギン酸残基を意味する。
【００１８】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ ＥＣＤ」なる用語は、膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの形態を称する。通常、ＥＣＤはこのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。本発明のポリペプチドとして同定される任意の膜貫通ドメイン(類)は、疎水性ドメインのタイプのものを同定するのに、当該分野で常套的に使用されている基準に従い同定されると理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は多様であるが、多くの場合は、最初同定されたドメインのいずれかの末端において、約５アミノ酸を超えないと思われる。好ましい実施態様において、ＥＣＤは、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインのない(膜に結合していない)ポリペプチドの、可溶性の細胞外ドメイン配列からなる。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の細胞外ドメインは、ＰＣＴ出願国際公開第９７／０１６３３号及び国際公開第９７／２５４２８号に記載されている。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ単量体」なる用語は、Ａｐｏ２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有鎖を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ二量体」なる用語は、ジスルフィド結合を介して共有結合に連結した２つのＡｐｏ-２Ｌモノマーを称する。ここで使用される場合の用語には、独立したＡｐｏ２Ｌ二量体、及び三量体形態のＡｐｏ２Ｌが範囲に入る二量体(すなわち、互いに結合した、第２のＡｐｏ２Ｌ単量体)が含まれる。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ三量体」なる用語は、非共有結合している３つのＡｐｏ２Ｌ単量体を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ凝集体」なる用語は、自己結合した高級オリゴマー性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体、さらには六量体及びナノ量体(nanomeric)の形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを形成するものを称するために使用する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体、二量体又は三量体(又は他の凝集体)の存在性及び量の決定は、当該分野で公知の方法及びアッセイ(市販されている物質を使用)、例えば天然サイズ排除ＨＰＬＣ(「ＳＥＣ」)、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する変性サイズ排除(「ＳＤＳ-ＳＥＣ」)、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動によりなされ得る。
【００１９】
「Ａｐｏ−２リガンドレセプター」は、当分野では、図２及び３それぞれに示すポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を有する「ＤＲ４」及び「ＤＲ５」として称されるレセプターを含む。Panらにより、「ＤＲ４」と呼ばれるTNFレセプターファミリーのメンバーが開示されている（Pan等, Science, 276:111-113, 1997年; ならびに１９９８年７月３０日公開のＷＯ９８／３２８５６を参照）。このDR4レセプターは、細胞自殺機構に関与しうる細胞質のデスドメインを有することが報告されている。Panらにより、ＤＲ４は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  として知られるリガンドのレセプターと考えられることが開示されている。Sheridan等によるScience, 277:818-821（1997年）およびPan等によるScience, 277:815-818（1997年）には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターが開示されている（１９９８年１１月１９日公開のＷＯ９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開のＷＯ９８／４１６２９も参照）。このレセプターはＤＲ５と称される（あるいは、該レセプターはＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲとも称される；Screaton等, Curr. Biol., 7:693-696, 1997年; Walczak等, EMBO J., 16:5386-5387, 1997年; Wu等, Nature Genetics, 17:141-143, 1997年；１９９８年８月２０日公開のＷＯ９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開のＥＰ８７０，８２７；１９９８年１０月２２日公開のＷＯ９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開のＷＯ９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開のＷＯ９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開のＷＯ９９／１１７９１参照）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質のデスドメインを有し、アポトーシスの信号を出すことができると報告されている。上記のように、Ａｐｏ−２Ｌの他のレセプターはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧを含む（Sheridan等., 上掲；Marsters 等., 上掲；及びSimonet 等.,上掲）。ここで用いられるところの「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」という用語は、天然配列レセプターとレセプター変異体を包含する。これらの用語はヒトを含む様々な哺乳動物で発現されるＡｐｏ−２Ｌレセプターを包含する。Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、多くのヒト組織株で自然に起こるように内在的に発現されてもよいし、あるいは組換え又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」には、天然由来のＡｐｏ−２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。ゆえに、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、任意の動物由来の天然に生じるＡｐｏ−２Ｌレセプターのアミノ酸配列を持ちうる。そのような天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、天然から単離してもよいし、組み換え又は合成手法により生成することもできる。特に、「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」なる用語は、天然に生じる切断型又は分泌型のレセプター（例えば、可溶型を含む、さらには細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）、及び天然に生じる対立変異型を包含する。レセプター変異型は天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターの断片又は欠損変異型を含みうる。
【００２０】
「アンタゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和する任意の分子を含む。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５の生物学的活性の例には、ＤＲ４又はＤＲ５へのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合、アポトーシスの誘導並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アンタゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アンタゴニストは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＤＲ４ないしＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和するために機能するかもしれない。また、アンタゴニストは、例えば、他のエフェクター分子を遮断ないし阻害する結果としてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和するために間接的に機能するかもしれない。アンタゴニスト分子には、分子がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和することができる「二重」アンタゴニスト活性が含まれるかもしれない。
「アゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５の生物学的活性の例には、ＤＲ４又はＤＲ５へのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合、アポトーシス並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こすＤＲ４ないしＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでのＤＲ４ないしＤＲ５の一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために機能するかもしれない。また、アゴニストは、例えば、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてのＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために間接的に機能するかもしれない。アゴニストは、ＤＲ４ないしＤＲ５の活性化ないし活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のＡｐｏ−２Ｌの活性を亢進しうる。例えば、これはＤＲ４ないしＤＲ５をプレ複合体化することによって、ないし、ＤＲ４ないしＤＲ５レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる（Ａｐｏ−２ＬとＤＲ４ないしＤＲ５との天然複合体型を安定化するなど）。
【００２１】
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド、又は選択的にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はその一部を含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化（例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような）等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的にＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００２２】
「二価の金属イオン」なる用語は、２つの正電荷を有する金属イオンを称する。限定するものでないが、二価の金属イオンの例には、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム及びマンガンが含まれる。使用され得るこのような金属の特定の形態には塩の形態(例えば、製薬的に許容可能な塩の形態)、上述した二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩の形態のものが含まれる。場合によっては、本発明で使用される二価の金属イオンは亜鉛、好ましくは硫酸亜鉛又は塩化亜鉛等の塩の形態をしている。
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど、又は(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように充分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２３】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２４】
ハイブリッド形成反応の「ストリンジェント」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェントを低下させる。ハイブリッド形成反応のストリンジェントの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００２５】
ここで定義される「高度のストリンジェント条件」は、(１)洗浄のために低イオン強度及び高温度；５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリッド形成中に変性剤；４２℃において５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃における５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェント洗浄を用いるものによって同定され得る。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００２６】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２７】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、-ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１７等のインターロイキン（ＩＬ）；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００２８】
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素等の毒素又はその断片を含むことが意図されている。
【００２９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンフィーＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；ビスホスホナート類、例えばクロドロナート；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(アドリアマイシンＴＭ)(モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)(GemzarＴＭ)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)(NavelbineＴＭ)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；エダトレキサート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼイン��ビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸等のレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NolvadexＴＭを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FarestonＴＭ)を含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(SERMs)；副腎におけるエストロゲン生成を調節する、アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼインヒビター、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、酢酸メゲステロール(MegaceＴＭ)、エグゼメスタン(exemestane)、ホルメスタン(formestane)、ファドロゾール、ボロゾール(vorozole)(RivisorＴＭ)、レトロゾール(letrozole)(FemaraＴＭ)、及びアナストロゾール(anastrozole)(ArimidexＴＭ)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００３０】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」なる用語は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、ここで同定された任意の遺伝子が発現する細胞、特に癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。よって、成長阻害剤とは、Ｓ相において、このような細胞が発現する細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ相以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ相停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ相ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、TAXOL、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ相停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００３１】
ここでの目的における「生物学的に活性な」又は「生物学的活性」とは、（ａ）単一の薬剤として単独で、又は化学療法剤等の他の薬剤と組合せて、インビボ又はエキソビボで、少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞又はウイルス感染した細胞においてアポトーシスを誘発又は刺激又は阻害する能力を有する（ｂ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプター(例えば該レセプターには、ＤＲ４レセプター、ＤＲ５レセプター、ＯＰＧ、ＤｃＲ１レセプター、及びＤｃＲ２レセプターを含んでよい)に結合及び／又は刺激可能である；又は(ｃ)天然又は天然に生じるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの活性を保持していることを意味する。生物学的活性を測定するためのアッセイは、当該分野において公知の方法、例えばＤＮＡ断片化(例えば、Marsters等,Curr. Biology, 6：1669(1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、ＤＲ４結合、ＤＲ５結合(例えば、１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号を参照）、ＤｃＲ１結合（例えば、１９９８年１２月２３日公開の国際公開第９８／５８０６２号を参照）、ＤｃＲ２結合（例えば、１９９９年３月４日公開の国際公開第９９／１０４８４号）、並びにＰＣＴ出願国際公開第９７／０１６３３号、国際公開第９７／２５４２８号、国際公開第０１／００８３２号及び国際公開第０１／２２９８７号に記載されているアッセイを使用して実施することができる。
【００３２】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称する。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はＭＴＴアッセイ)、ＦＡＣＳ分析、カスパーゼ活性化、ＤＮＡ断片化(例えば、Nicolettiら, J. Immunol. Methods, 139：271-279(1991)を参照)、ポリ-ＡＤＰリボースポリメラーゼ、「ＰＡＲＰ」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
【００３３】
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、有効量のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドにより治療可能な任意の病気又は疾患を含む、ここに記載された組成物で治療することで恩恵を得るあらゆる症状を一般的に称する。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させる病理状態が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的例には、良性及び悪性の腫瘍；炎症、血管由来及び免疫学的疾患、自己免疫疾患、関節炎(関節リウマチを含む)、多発性硬化症、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳが含まれる。
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、消化管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽細胞種、膵臓癌、多形成膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、結腸癌、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００３４】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、AIDS（HIV感染）、A、B、C、D及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
【００３５】
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液又は細胞の免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
【００３６】
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ事実的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む、哺乳類に分類される任意の哺乳動物を称する。本発明の好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００３７】
Ｂ．本発明の例示的材料及び方法
ここに記載の本発明は、Ａｐｏ−２Ｌレセプターに結合するペプチドに関する。場合によっては、ペプチドはＡｐｏ−２ＬとＤＲ５との相互作用を阻害するアンタゴニストである。あるいは、ペプチド化合物はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。場合によっては、ペプチド化合物はＡｐｏ−２ＬとＤＲ４との相互作用を阻害するアンタゴニストである。あるいは、ペプチド化合物はＤＲ４シグナル伝達活性のアゴニストである。好ましくは、ペプチドは約１０ないし約２５アミノ酸残基、又は約１５ないし約２０残基、及びより好ましくは約１２ないし約２０アミノ酸残基を有する。より好ましくは、ペプチドは、そのＮ末端から第１、２、３、４、５、６又は７位にシステイン残基を有する。さらにより好ましくは、加えてペプチドは、Ｎ末端システイン残基にバリン、グルタミン酸又はグリシン残基Ｎ末端を有する。さらにより好ましくは、ペプチドは、Ｎ末端システイン残基への残基Ｎ末端がバリン残基である。さらにより好ましくは、ペプチドはシステイン−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−システインを含むモチーフを有する。好ましくは、Ｘ１はメチオニン又はロイシンのいずれかの残基である。好ましくは、Ｘ２はスレオニン又はアラニン残基である。好ましくは、Ｘ３はセリン、メチオニン、ロイシン又はグルタミン酸残基である。さらにより好ましくは、当該ペプチドは、そのＣ末端から第２位にロイシン残基を有する。
【００３８】
本発明のペプチドは、化学合成或いは組み替え技術を用いることによって作製することが可能である。これらの技術は、当該技術分野においては知られている技術である。化学合成、特に固相合成法は、短いペプチド（５０残基未満）又はＤ−チロシン、オルニチン、アミノアジピン酸、及びその類似物などの非天然或いは異常アミノ酸を含むペプチドの合成に好まれる。組み替え法は、長いペプチドに好まれる。組み替え法が選択された場合には、合成遺伝子がデノボ合成される、又は天然遺伝子が、例えばカセット式変異誘発法によって構築される。下記に示されるのは、模範的な一般的組み換え法である。
ＤＲ４又はＤＲ５レセプター及びそれらの各々のアミノ酸配列を用いて、例えば、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドアンタゴニスト又はアゴニストはここに記載の方法を用いて同定されうる。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、ペプチド合成法又は組み換えＤＮＡ技術等の当業者に公知の方法を用いて生成されうる。ＤＮＡ技術は、簡略化した形式で、天然か合成かの、ペプチドをコードする遺伝子を取り；好適なベクターに挿入し；好適な宿主細胞にベクターを挿入し；遺伝子を発現させるために宿主細胞を培養し；そして生成されたペプチドを回収又は単離することを考慮する。好ましくは、ついで回収したペプチドを好適な程度まで精製する。
【００３９】
若干より詳しくは、ペプチジルＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドをコードするＤＮＡは、適した宿主で発現するようにクローン化及び操作される。親ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムライブラリー、ペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は合成的に構築されたＤＮＡ配列によって得ることが可能である（Sambrook等., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2ded.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989）。
そして、親ＤＮＡは、宿主細胞の形質転換に使用される適切なプラスミド又はベクターへ挿入される。一般には、宿主との関連において、宿主と適合する種由来の複製及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが使用される。ベクターは、通常、形質転換細胞の形質選択を提供できるタンパク質又はペプチドをコードする配列と同様に、複製部位を持つ。
例えば、大腸菌は、大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用することによって形質転換される（Mandel等., J.Mol.Biol.53:154(1970)）。プラスミドは、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、それ故に選択が容易な方法を提供する。他のベクターは、発現にしばしば重要な異なったプロモーターのような、異なった特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ−ｌａｍｂｄａは、ｔａｃ、ｔｒｐ、又はＰＬプロモーターを持つ、程なく入手可能な発現ベクターである（Pharmacia biotechnology）。
他の好ましいベクターは、前記に示したベクターの適切な特徴を組み合わせることによる標準的技術を使用することで構築が可能である。適切な特徴とは、プロモーター、リボゾーム結合部位、decorsin又はornatin遺伝子、或いは遺伝子融合（プロテインＡのＺドメイン及びdecorsin又はornatinとそのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。
【００４０】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物でよい。原核生物は、親ＩＧＦ−Iポリペプチド、断片置換ペプチド、及びペプチド変異体を生産する為に、ＤＮＡ配列のクローニング及び発現の為に好まれる。例えば、大腸菌Ｋ−１２株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１４４６）は、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）、及び大腸菌ｃ６００及びｃ６００ｈｆｌ、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ、原栄養／ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５）、枯草菌のような桿菌、ネズミチフス菌又はセラチア・マルセッセンス菌のような腸内細菌，及び様々なシュードモナス属と同様に使用される。好ましい原核生物は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物において発現された場合、ペプチドはＮ末端メチオニン又はホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融合タンパク質の場合は、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンが融合タンパク質のアミノ末端に、又は融合タンパク質のシグナル配列が存在する。これらの例は、限定的というよりも実証となることを意図されている。
原核生物に加えて、酵母培養菌、又は多細胞生物由来の細胞のような真核生物が使用することができる。基本的には、そのような全ての細胞が機能する。しかし、関心は脊椎動物細胞についてがもっとも大きく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は再現性のある方法になっている（Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors(1973)）。このような有用な宿主株化細胞は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の株化細胞、Ｗ１３８，２９３，ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、及びＭＤＣＫ株化細胞である。
【００４１】
前記方法の変形は、所望するペプチドをコードする遺伝子が、ベクター中の他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子と関連している場合に、遺伝子融合を意図するものである。これは、所望するペプチドが他のタンパク質又はペプチドと融合し、宿主細胞によって生産される結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドとは、多くの場合、細胞から分泌が可能なタンパク質又はペプチドのことで、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製、そして所望するペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除くことを可能にする。もう一つの方法としては、融合タンパク質は細胞内に発現することが可能である。
好ましい実施態様では、ペプチドはＩｇＧ分子のＦｃ領域等のイムノグロブリン（免疫グロブリン）又はイムノグロブリンの特定の領域に融合しうる。そのような融合は、例えば望ましいペプチド組成物のインビボプラズマ半減期を延長させるために生成しうる。一般的な実施態様では、イムノグロブリン融合には、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域が含まれる。イムノグロブリン融合体の生成には、例として米国特許第５，４２８，１３０号を参照し、出典明記によりここに組み込まれる。
遺伝子融合は、必須ではないが、後のこれら遺伝子産物の精製のみならず大腸菌における異種ペプチドの発現を容易にする。Harris, Genetic Engineering, Willianson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljunguist等., Eur.J.Biochem., 186: 557-561(1989)及びLjungquist等., Eur.J.Biochem., 186: 563-569(1989)。プロテインＡ融合は、プロテインＡの結合、より詳しくはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の為の「親和性取っ手」を提供することから、頻繁に使用される。多くの異種タンパク質が大腸菌内で直接に発現されると分解されることが知られているが、融合タンパク質として発現された場合は安定である（Marston, Biochem J., 240: 1(1986)）。また、遺伝子融合を用いると、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド二量体、三量体及び四量体などのオリゴマー複合体の形成を容易にしうる。好ましくは、異種ペプチド配列は、以下の実施例３に記載のようにロイシンジッパードメインを含む。
【００４２】
融合タンパク質は、メチオニン又はヒドロキシアミンで切断する、アスパラギン及びグリシン残基間を切断する臭化シアンのような化学薬品を使用することによって切断が可能である。標準的な組み替えＤＮＡ技術を使用することによって、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望するペプチドをコードする遺伝子の５' 末端の即前に挿入することができる。
もう一つの方法としては、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能である（Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-Scale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series No.427,1990), Ch13, page 181-193）。
第Ｘａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、他の多数のプロテアーゼが、融合タンパク質の切断に首尾よく使用されている。典型的には、プロテアーゼによる切断を受けやすいペプチドリンカーは、「他の」のタンパク質（例えばプロテインＡのＺドメイン）と所望するペプチドとの間に挿入される。組み替えＤＮＡ技術を使用すると、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対は、他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入される。タンパク質分解による正確なリンカーを含む部分精製融合タンパク質の切断は、その結果、天然融合タンパク質、又は還元型或いは変性融合タンパク質について行うことができる。
【００４３】
ペプチドは、融合タンパク質として発現した場合は、適切に折り畳まれる或いは折り畳まれないことがある。さらに、切断部位を含有する特定のペプチドリンカーは、プロテアーゼへ接触可能又は接触不可能なことがある。これらの要因が、融合タンパク質は変性及び再折り畳みがなされるべきなのか、もしそうならば、これらの手段を切断の前又は後に用いられるべきなのかを確定する。
変性及び再折り畳みが必要な場合は、通常は、ペプチドは塩酸グアニジンのようなカオトロピック剤によって処理され、その後、例えばペプチドが天然構造へと再折り畳むような適切な割合、ｐＨ、及び温度において、還元及び酸化型ジチオスレイトール又はグルタチオンを含有する酸化還元緩衝液によって処理される。
【００４４】
ペプチドが組み替えＤＮＡ技術によって調製されない場合は、ペプチドは、一般的に、Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85: 2149(1963)に記載されているような固相合成法によって調製されるが、当該技術分野において周知である他の同等な化学合成法も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適合する樹脂と連結することによってＣ末端から開始する。そのような開始物質は、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をクロロメチル化された樹脂又はヒドロキシメチル化された樹脂にへエステル結合すること、又はＢＨＡ樹脂或いはＭＢＨＡ樹脂へアミド結合することによって調製が可能である。ヒドロキシメチル化樹脂の調製方法は、Bodansky等., Chem.Ind.(London), 38: 1597-1598(1966)に記載されている。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories, Richmond, CA 及び Lab. system, Inc.より入手可能である。そのような樹脂の調製方法は、Stwart等., "Sold Phase Peptide Synthesis"(Freeman & Co., San Francisco 1969), 第１章, pp.1-6 に記載されている。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂担体は、商業的に入手可能で、一般的には、合成された所望のポリペプチドが、Ｃ末端に置換されていないアミドを有している場合のみに使用される。アミノ酸は、ペプチド結合の形成に関する技術分野のにおいて周知の技術を使用することによりペプチド鎖と連結される。一つの方法は、カルボキシル基のペプチド断片の遊離Ｎ末端アミノ基との反応をさらに受けやすくする誘導体へとアミノ酸を変換することを含む。例えば、アミノ酸は、保護されたアミノ酸のクロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、ｓｅｃ−クロロギ酸ブチル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル、又は類似の酸塩化物との反応によって混合無水酸化物への変換が可能である。他の選択としては、アミノ酸は、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、又はエステル型の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性型エステルへ変換へ可能である。
その他のカップリング法は、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミドなどの適したカップリング剤を使用することを含む。他のカップリング剤で、当該技術に熟練している者に明らかなものは、E.Gross & J.Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.I: Major Method of Peptide Bond Formation(Academic Press, New York, 1979)に記載されている。
【００４５】
ペプチド合成に使用される各々のアミノ酸のα−アミノ酸基は、側鎖がそれらの活性α−アミノ機能に関与することを防ぐ為に、カップリング反応中は保護されるべきことが認識されなければならない。また、あるアミノ酸が反応性の側鎖機能基（例えば、メルカプト(スルフヒドリル）、アミノ、カルボキシ、及び水酸基（ヒドロキシ））を有し、そのような機能基は、初期とそれに続くカップリング段階において、適した保護基によって化学反応から同じく保護されなければならないことも認識されなければならない。当該技術分野で知られている適した保護基は、Gross & .Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.3:" Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis"(Academic Press, New York, 1981)に記載されている。
ペプチド合成に使用される特定の側鎖保護基の選択では、次の一般的規則が順守される。α−アミノ保護基は（ａ）カップリング反応が用いられている条件下においては、α−アミノ機能を不活性にする、（ｂ）側鎖保護基を除かない及びペプチド断片の構造を改変しない条件下においては、カップリング反応後は容易に除去可能でなけれならない、（ｃ）カップリング直前の活性化においては、ラセミ化の可能性を除去しなければならない。側鎖保護基は（ａ）カップリング反応が用いられている条件下においては、側鎖機能基を不活性にする、（ｂ）α−アミノ保護基を除去の際に用いられている条件下では、安定でなけれならない、（ｃ）ペプチド鎖の構造を改変しない条件下では、所望のアミノ酸ペプチドの完成時には容易に除去可能でなければならない。
【００４６】
ペプチド合成に有用な保護基が、それらの除去の為に使用される薬剤との反応性によって変わることは、当該技術分野に熟練した者には明らかなことである。例えば、トリフェニルメチル及び２−（ｐ−ビフェニニル）イソプロピキシルカルボニルのようなある保護基は、温和な酸性の条件においては、非常に弱くそして開裂する可能性がある。ｔ−ブチルロキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミロキシカルボニル、アダマンチル−オキシカルボニル、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルのような他の保護基は、不安定とは言えず、トリフロオロ酢酸塩、塩酸、又は酢酸中の三フッ化ホウ素などの中程度の強酸性をそれらの除去の為に必要とする。さらには、ベンゾイルオキシカルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、ハロベンゾイルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンゾイルオキシカルボニル  シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニルなどの他の保護基は、やはり不安定とは言えず、フッ化水素、臭化水素、又はトリフルオロ酢酸中のホウ化トリフルオロ酢酸などの強酸をそれらの除去の為に必要とする。
有用なアミノ酸保護基の種類は：
【００４７】
（１）α-アミノ酸基については、（ａ）芳香族ウレタン型保護基、例えばフルオレニルメチルカルボニル（ＦＭＯＣ）ＣＢＺ、及び置換されたＣＢＺ、例えばｐ-クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ-６-ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ-ブロモベンジルカルボニル及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル、２,４-ジクロロベンジルオキシカルボニル、２,６-ジクロロベンジルオキシカルボニルなど；（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基、例えばＢＯＣ、ｔ-アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２-(ｐ-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルなど；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロへキシルオキシカルボニル；及び（ｄ）アリールカルボニル。好ましいα-アミノ保護基はＢＯＣ及びＦＭＯＣである。
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基については、保護は、ＢＯＣ、ｐ-クロロベンジルオキシカルボニル等といった上記（１）に述べた任意の基によってなされる。
（３）Ａｒｇのグアニジド基については、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル又は２,３,６-トリメチル-４-メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯＣによってなされる。
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒのヒドロキシル基については、保護は、例えば、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、例えばｔ-ブチル；ベンジル（ＢＺＬ）；置換ＢＺＬ、例えばｐ-メトキシベンジル、ｐ-ニトロベンジル、ｐ-クロロベンジル、ｏ-クロロベンジル、及び２,６-ジクロロベンジル。
（５）Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基については、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ-ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなどの基を用いたエステル化によってなされる。
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素については、トシル部が好ましく使用される。
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基については、テトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４-ブロモベンジル、又は２,６-ジクロロベンジルなどの保護基が好ましく使用される。好ましい保護基は２,６-ジクロロベンジルである。
（８）Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が好ましく用いられる。
（９）Ｍｅｔについては、アミノ酸は好ましくは保護せずに残す。
（１０）Ｃｙｓのチオ基については、ｐ-メトキシベンジルが典型的に用いられる。
Ｃ-末端アミノ酸、例えばＬｙｓは、Ｎ-アミノ位置において適切に選択された保護基、Ｌｙｓの場合はＢＯＣによって保護される。ＢＯＣ-Ｌｙｓ-ＯＨは、最初にベンジルヒドリルアミン又はクロロメチル化樹脂に、Horiki等, Chemistry Letters, 165-168 (1978)に記載された方法に従って又はイソプロピルカルボジイミドを用いて約２５℃で２時間攪拌しながら結合させる。ＢＯＣ保護アミノ酸の樹脂支持体への結合に続いて、α-アミノ酸保護基を、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はＴＦＡ単品を用いるなどして除去する。脱保護は、約０℃から室温までの温度で実施する。他の標準的な開裂試薬、例えばジオキサン中のＨＣｌ、及び特定のα-アミノ保護基の除去条件は文献に記載されている。
【００４８】
α-アミノ保護基の除去の後、残ったα-アミノ及び側鎖保護アミノ酸を望まれる順序で段階的に結合させる。合成において各アミノ酸を別々に添加する代わりに、固相合成機に添加する前に互いに結合させてよいものもある。適当なカップリング試薬は当業者の技量の範囲内である。カップリング試薬として特に好ましいのは、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。
各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は固相反応器に過剰に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＣＨ２Ｃｌ２又はそれらの混合物の媒体中でカップリングを適切に実施させる。不完全なカップリングが生じた場合、次のアミノ酸のカップリングに先立つＮ-アミノ保護基を除去する前にカップリング方法を繰り返す。合成の各段階でのカップリング反応の成功を監視してもよい。合成を監視する好ましい方法は、Kaiser等, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)に記載されたニンヒドリン反応である。カップリング反応は、周知の方法、例えばBIOSEARCH 9500(商品名)ペプチド合成機を使用して自動的に実施できる。
【００４９】
所望のペプチド配列が完成したら、保護ペプチドを樹脂支持体から切断し、全ての保護基を除去しなければならない。切断反応及び保護基の除去は、同時に又は段階的に好ましく達成される。樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、ペプチドを樹脂に繋留している結合は、Ｃ末端残基の遊離カルボキシル基と樹脂マトリクス上に存在する多数のクロロメチル基の一つの間のエステル結合である。繋留結合は、エステル結合を切断でき樹脂マトリクスを透過できることが知られた試薬によって切断できる。
一つの特に便利な方法は、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬はペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての保護基を除去するであろう。従って、この試薬を使用することは、完全に保護されたペプチドを直接に生じる。クロロメチル化樹脂を使用した場合、フッ化水素処理は遊離のペプチド酸の形成をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用した場合、フッ化水素処理により直接に遊離のペプチドアミンとなる。アニソール及びジメチルスルホキシドの存在下での０℃で１時間のフッ化水素との反応は、同時に側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを解放する。
【００５０】
保護基を除去することなくペプチドを切断することが望まれる場合、保護ペプチド−樹脂にメタノール分解を施して、Ｃ-末端カルボキシル基がメチル化された保護ペプチドを生成させることができる。このメチルエステルは、次いで、温和なアルカリ条件下で遊離のＣ-末端カルボキシル基を与える。次いで、ペプチド鎖上の保護基を液体フッ化水素などの強酸で処理することにより除去する。メタノール分解についての特に有用な技術は、Moore等, Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman及びJ. Meinhofer, 編, (John Wiley, N.Y., 1977), p. 518-521のものであり、そこでは保護ペプチド−樹脂がクラウンエーテルの存在下でメタノール及びシアン化カリウムで処理される。
クロロメチル化樹脂を使用した場合に保護されたペプチドを樹脂から切断する他の方法は、加アンモニア分解又はヒドラジンでの処理である。必要ならば、得られるＣ-末端アミド又はヒドラジドは加水分解して遊離のＣ-末端カルボキシル部とでき、保護基は従来技術により除去できる。
また、Ｎ-末端α-アミノ基に存在する保護基も、保護ペプチドが支持体から切断される前又は後に優先的に除去してよいと認められる。
本発明のポリペプチドの精製は、典型的には従来の手法、例えば分離用ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）又は他の周知のクロマトグラフィ技術、例えばゲル浸透、イオン交換、分配クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（モノクローナル抗体カラムを含む）、又は向流分配によって達成される。
【００５１】
本発明のペプチドは、重合によって安定化させてもよい。これは、モノマー鎖を多官能性架橋試薬で直接的に、又は多官能性ポリマーを介して間接的に架橋させることにより達成される。通常は、２つの実質的に同一のポリペプチドが、二官能性架橋試薬を用いてそれらのＣ-又はＮ-末端において架橋する。試薬は、末端アミノ及び／又はカルボキシル基を架橋するために使用される。一般に、両末端カルボキシル基又は両末端アミノ基が互いに架橋するが、適切な架橋試薬を選択することにより、一方のポリペプチドのアルファアミノが他方のポリペプチドの末端カルボキシル基と架橋する。好ましくは、ポリペプチドはそれらのＣ-末端においてシステインで置換されている。この分野で良く知られた条件下で、末端システイン間でジスルフィド結合が形成され、それによりポリペプチド鎖が架橋される。例えば、ジスルフィド架橋は、遊離のシステインの金属触媒酸化により又は適切に修飾されたシステイン残基の求核置換によって便利に形成される。架橋試薬の選択は、ポリペプチドに存在するアミノ酸の反応性側鎖の個性に依存するであろう。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがポリペプチドのＣ-末端以外のさらなる部位に存在する場合には好ましくないであろう。また、この範囲には、メチレン架橋で架橋したペプチドも包含される。
【００５２】
Ｎ-末端アミノ及びＣー末端カルボキシル基以外の、ペプチド上の好適な架橋部位は、リジン残基上に見られるイプシロンアミノ基、並びにペプチドの内部残基又はフランキング配列に導入された残基の側鎖に位置するアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル及びヒドロキシル基を含む。外部から添加された架橋試薬を介する架橋は、例えば、当業者に馴染み深い多くの試薬を用いて、例えば、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して適当に達成される。好適な多官能性（通常は二官能性）架橋試薬の他の例は文献に見いだされる。
本発明のペプチドは、環化によって立体配置的に安定化させてもよい。ペプチドは通常、一のペプチドの−及びＣ-末端ドメインを本発明の他のペプチドの対応するドメインに共有結合させることにより環化され、２又はそれ以上の反復ペプチド配列を含み、各反復ペプチドが実質的に同じ配列を有するシクロ-オリゴマーを形成する。さらに、環化したペプチド（シクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーのいずれか）は、架橋して１−３の環状構造を形成し、その中には２から６のペプチドが含まれる。ペプチドは好ましくはα-アミノ及び主鎖カルボキシル基（頭部から尾部）を介して共有結合せず、−及びＣ-末端ドメインに位置する残基の側鎖を介して架橋する。よって結合部位は一般に残基の側鎖間になるであろう。
【００５３】
ここで考慮されるようなモノ-又はポリ環化ペプチドを調製するために、多くの好適な方法自体は知られている。Ｌｙｓ／Ａｓｐ環化は、Ｌｙｓ／ＡｓｐについてＦｍｏｃ／９-フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護を持つ固相支持体上でＮａ-Ｂｏｃ-アミノ酸を用いて達成され；この方法は、環化に続くピペリジン処理によって完了する。
Ｇｌｕ及びＬｙｓ側鎖も、環状又は二環状ペプチドの調製において架橋され；このペプチドはｐ-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学によって合成される。ペプチドは樹脂から切断されて脱保護される。環状ペプチドは、希釈メチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。これに代わる方法については、Schiller等, Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985)を参照のこと。米国特許第４，５４７，４８９号参照。
【００５４】
ジスルフィド架橋又は環化されたペプチドは従来の方法により生成される。Pelton等（J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)）の方法は、シクロ-モノマーの調製についてPelton等に記載された希釈反応混合物よりも濃厚な溶液中で反応を実施することにより多くの割合でシクロ-オリゴマーが生成されることを除いて好ましい。同じ化学は、ダイマー又はシクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーの合成に有用である。また有用なのはチオメチレン架橋である。Lebl及びHruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984)。また、Cody等, J. Med. Chem., 28: 583 (1985)参照。
望ましい環状又は重合性ポリペプチドは、ゲル濾過に次ぐ逆相高圧液体クロマトグラフィ又は他の従来の手法により精製される。ペプチドは滅菌濾過され、従来からの薬理学的に許容される媒体中に処方される。
【００５５】
ここに記載するプロセス必要とされる出発材料は文献で知られているか、又は周知の方法及び周知の出発材料から調製できる。
４つの異なる置換基に結合した炭素原子から生成されたペプチドが不斉の場合、ペプチドはジアステレオマー、エナンチオマー又はそれらの混合物として存在しうる。上記の合成は、出発材料又は中間体としてラセミ化合物、エナンチオマー又はジアステレオマーを用いてもよい。そのような合成から得られるジアステレオマー生成物は、クロマトグラフィ又は結晶化法によって分離しうる。同様に、エナンチオマー混合物は、同様の技術又はこの分野で知られた他の技術によって分離してよい。各不斉炭素原子は、存在する場合は、２つの立体配置（Ｒ又はＳ）の一方でよく、それらともに本発明の範囲内である。
【００５６】
本発明に記載のペプチド化合物は、遊離酸又は、様々な無機酸及び有機酸及び塩基類の塩基又は変換型塩類として単離してもよい。そのような塩類は本発明の範囲内である。そのような塩類の例には、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのような金属塩類；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなどのような有機塩基を有する塩類；そして、アルギニン又はリジンのようなアミノ酸を有する塩類が含まれる。無機酸及び有機酸を有する塩類は、例えば、塩酸、臭化水素、硫黄、リン、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸などを用いて同様に調整してもよい。単離及び精製の過程で他の望ましくない塩類を用いても、非毒性で生理的に互換性のある塩類は特に有効である。
上記の塩類の調整にいくつかの方法が有用であり、当業者に公知である。実施例には、ペプチドの遊離酸又は遊離塩型と、溶媒又は不溶性の塩を含む溶媒混合液；または、溶媒が蒸発、蒸留又は凍結乾燥によって除去された後の水のような溶媒中の一以上の望ましい酸又は塩のモル等価物との反応を含む。あるいは、生成物の遊離酸ないし塩型はイオン交換樹脂を通して望ましい塩を形成するか、生成物の一塩型を同じ一般的な工程を用いて他に変換してもよい。
ここでのペプチドの化学的合成に好適なある特定の案は、１９９６年５月２３日公開のＷＯ９６／１５１４８に示し、出典明記によりここにその内容が組み込まれる。
本発明のペプチドは、経口、非経口（例えば筋肉内、腹膜内、静脈内又は皮下的注入ないし輸液、又は移植）、鼻、肺、膣、直腸、舌下、又は局在的投与方法を含むいかなる適切な技術により哺乳動物に投与されてもよく、投与の各々のルートに適切な用量の形式で調製されうる。特定の投与方法は、例えば、患者の病歴、該化合物を使用したときの認識されている又は予測される副作用、投与されるペプチドのタイプ及び修正される特定の疾患によるであろう。場合によって、投与は、持続的点滴（例えば、緩効性の装置又は浸透圧ポンプ又は皮膚パッチ等のミニポンプを用いる）によって、または、注入（例えば、静脈内か皮下的手段を用いる）によって行う。
【００５７】
Ｃ．製剤の調製
ここでの一般的な製剤の調製において、使用される成分の推奨される質又は「等級」は、製剤の最終的な用途に依存する。治療用途において、成分(群)は製薬品への添加剤として許容可能な等級(例えば「ＧＲＡＳ」)のものであることが好ましい。
ある実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド、及びＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する、及び／又は賦形剤を含有する組成物が提供され、その組成物は６(又は約６)〜９(又は約９)のｐＨを有する。Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、例えば上述した方法のような、所望の純度のタンパク質を達成するのに適した任意の方法で調製され得る。ある実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、大腸菌宿主細胞において組換え的に発現されるか、化学的合成法により調製される。製剤中のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの濃度は、例えば製剤の意図される用途に応じて変わりうる。当業者であれば、過度の実験をすることなく、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの所望の濃度を決定することができる。
【００５８】
Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する製剤中の一又は複数の賦形剤は、場合によってはポリイオン性の有機又は無機酸、アスパラギン酸塩、硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、カプチソール(Captisol)ＴＭ、Ｔｒｉｓ、アルギニン塩、又は他のアミノ酸、糖、及びポリオール類、例えばトレハロース及びスクロースである。好ましくは、十分なイオン強度を付与する製剤中の一又は複数の賦形剤は塩である。使用され得る塩には、限定されるものではないが、ナトリウム塩及びアルギニン塩が含まれる。使用される塩の種類及び塩の濃度は、製剤においてＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが安定可能なように、製剤が比較的高いイオン強度を有するようになされることが好ましい。場合によっては、塩は約２０ｍＭ〜約０．５Ｍの濃度で製剤中に存在する。
組成物は、好ましくは６(又は約６)〜９(又は約９)、より好ましくは約６．５〜約８．５、さらに好ましくは約７〜約７．５のｐＨを有する。この実施態様の好ましい側面では、組成物は、組成物のｐＨを少なくとも約６〜約８に保持するためのバッファーをさらに含有する。使用され得るバッファーの例には、限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及びヒスチジンが含まれる。Ｔｒｉｓを使用する場合、ｐＨは、場合によっては約７〜約８．５に調節され得る。Ｈｅｐｅｓ又はヒスチジンを使用する場合は、ｐＨは、場合によっては約６．５〜７に調節され得る。場合によっては、バッファーは、製剤中で約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度、好ましくは約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で使用される。
【００５９】
特に液体製剤(又は再構成された凍結乾燥製剤)においては、組成物に一又は複数の界面活性剤を含有せしめることが望ましい場合がある。このような界面活性剤は、例えば非イオン性界面活性剤、中でもトゥイーン(TWEEN)ＴＭ又はプルロニクス(PLURONICS)ＴＭ(例えばポリソルベート又はポロキサマー)を含みうる。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０(「トゥイーン２０」)を含む。界面活性剤は、場合によっては約０．００５％〜約０．２％の濃度で使用される。
本発明の製剤は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドに加えて、上述した成分、さらには種々の例えばの賦形剤又は成分を含有していてもよい。場合によっては、製剤は、非経口投与のために、製薬的又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度及び用量で受容者に対して毒性がなく、製剤の他の成分と融和性のあるものを含有してよい。場合によっては、担体は非経口用担体、例えば受容者の血液と等張な溶液である。このような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、又は緩衝溶液、例えばリン酸緩衝液(ＰＢＳ)、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。種々の任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, Osol, A.編(1980)に、さらに記載されている。
【００６０】
ここで、製剤は一又は複数の保存料を含有してよい。具体例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンズアルコニウムクロリド(アルキル基が長鎖の化合物である、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物)、塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の保存料には、芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、及びｍ-クレゾールが含まれる。酸化防止剤には、アスコルビン酸及びメチオニン；保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；塩化ベンゼトニウム；ブチルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；又はポリエチレングリセロール(ＰＥＧ)が含まれる。
【００６１】
このような担体のさらなる例には、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、塩化ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質が含まれる。ゲルベースの形態をした担体には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールが含まれる。従来のデポー形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、及び除放性製剤が含まれる。
【００６２】
本発明の組成物は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドが結晶又は非晶質の沈殿物の形態をした、液体製剤(液状溶液又は液状懸濁液)、及び凍結乾燥製剤、並びに懸濁製剤でありうる。
最終製剤が液体である場合、好ましくは≦２０℃で凍らせて保存される。また、製剤は凍結乾燥することもでき、場合によっては２−３０℃で保存されうる注射用の水で再構成されるパウダーとして提供することができる。
治療投与に使用される製剤は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜(例えば０．２ミクロンの膜)を通した濾過により容易に達成される。治療用組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルを具備する容器に配されている。
【００６３】
組成物は通常、単位毎又は多数回用量容器、例えば封入されたアンプル又はバイアルに、水溶液、又は再構成用の凍結乾燥された製剤として貯蔵される。容器は、当該分野で任意の入手可能な容器で、常法を用いて充填されるものであってよい。場合によっては、製剤は、注射ペン装置(又は、ペン装置に嵌合するカートリッジ)、例えば製剤の治療的送達に適した、当該分野で入手可能なもの(例えば、米国特許第5370629号を参照)に収容されうる。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルに、滅菌濾過された２％(ｗ／ｖ)のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド水溶液５．５ｍＬを満たし、この得られた混合物を凍結乾燥させたものが挙げられる。注射用溶液は、例えば注射用の水を使用し、凍結乾燥されたＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド製剤を再構成することにより調製することができる。
【００６４】
Ｄ．使用方法と他の応用例
ここに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、様々な治療的及び非治療的手段で用いることができる。これらの手段の中には、癌、免疫関連症状又はウイルス症状などの疾患を治療する方法がある。そのような治療的及び非治療的手段は、例えばＷＯ９７／２５４２８、ＷＯ９７／０１６３３及びＷＯ０１／２２９８７に更に記載されている。
本発明は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドをコードする核酸を用いて、哺乳動物を治療することを目的とした遺伝子治療の使用を含む。Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドをコードする核酸をこの目的で用いることができる。アミノ酸配列が公知になると、遺伝子コードの縮重を用いて様々な核酸分子を精製し、遺伝子治療に使用できるものを選択することができる。
遺伝子治療を目的として患者の細胞内に核酸を（場合によってはベクターに内包して）入れる方法には主に二つある：インビボ及びエクスビボ。インビボ送達のために、核酸は、患者に、通常Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド化合物が必要とされる部位に直接注入する。エクスビボ送達のために、患者の細胞を取り出し、核酸をこの単離した細胞に導入し、修飾した細胞を直接的又は、例えば患者内に埋めこんだ小胞膜内にカプセル抱合するかのいずれかにて患者に投与する。例として、米国特許第４８９２５３８号及び同第５２８３１８７号を参照。
【００６５】
生細胞に核酸を導入するために有用な方法は多種ある。その技術は、核酸が意図する宿主のインビトロ又はインビボで培養細胞へ形質移入するかどうかによって異なる。インビトロの哺乳動物細胞内へ核酸を移入するのに好適な技術には、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを用いたものが含まれる。遺伝子のエクスビボ送達に共通して用いるベクターはレトロウイルスである。
近年の好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクターを用いた形質移入（例として、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質を元にしたシステム（例えば、遺伝子の脂質媒介性移入に有用な脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）が含まれる。ある場合には、核酸源に標的細胞を標的とした薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを供給することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシス関連の細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に対して親和性があるカプシドタンパク質又はその断片、循環時に内部移行されるタンパク質に対する抗体、及び細胞内の限局した部位を標的として細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティング及び／又は取り込みを促進するために用いてもよい。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例としてWu等., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)；及び Wagner等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。近年公知になった遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概観については、Anderson 等., Science, 256: 808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びここに挙げた文献も参照のこと。
【００６６】
疾患を治療する本発明の方法では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド製剤は、注入又は注射を含む、任意の適切な技術により、哺乳動物に直接投与することができる。特定の投与経路は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの使用による、知覚又は予想される任意の副作用を含む、患者の医薬履歴、及び是正する特定の疾患などに依存するであろう。非経口投与の例には、組成物の皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び腹膜内投与が含まれる。製剤は、好ましくは繰り返し静脈内(ｉ．ｖ．)、皮下(ｓ．ｃ．)、又は筋肉内(ｉ．ｍ．)注射又は注入、頭蓋内注入として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される(肺内送達については、例えば欧州特許第257956号を参照)。
注射の浸透圧は、皮下及び筋肉内注射において重要であり得る。注射用溶液が低張又は高張であると、注入時に、患者に痛みが生じるおそれがある。通常、ここで治療用の注射用製剤は、注射用溶液の相対浸透圧が約３００ｍｏｓｍ〜約６００ｍｏｓｍになるようにされることが好ましい。
【００６７】
また、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、経口又は徐放性製剤の形態で投与することもできる。徐放性製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロース)、非水性媒体にスクロース-アセタート-イソブチラート(ＳＡＢＥＲＴＭ)が入ったもの、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)(Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 1981, 15: 167-277 及びLanger, Chem. Tech., 1982, 12: 98-105又はポリ(ビニルアルコール) )、ポリラクチド(米国特許第3773919号、欧州特許第58481号)、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers,  1983, 22: 547-556 )、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer等, 上掲)、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(乳酸-グリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸(欧州特許第133988号)を含む。全身作用性の薬剤を送達せしめる任意の一方法は、連続注入(例えば、徐放性装置又はミニポンプ、例えば浸透圧ポンプ又は皮膚パッチ)、又は注射(例えば、単一ボーラス投与を含む、静脈内又は皮下手段を使用する)による投与に係る。
【００６８】
組成物は、個々の患者の臨床的状態、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び実務者に公知の他の要因を考慮に入れ、良好な医療行為に矛盾することのない様式で調製され、投薬されるであろう。ここでの目的において、各成分の「有効量」はこのような考察に決定され、哺乳動物に対するＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド又は他の薬剤の生物学的利用能に帰着する量である。
さらに付加的な治療が本方法において使用され得ることを考慮する。一又は複数の他の治療には、限定されるものではないが、放射線治療、サイトカイン(類)、成長阻害剤(類)、化学治療剤(類)、細胞障害剤(類)、チロシンキナーゼインヒビター、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、血管形成インヒビター、サイクリン依存性キナーゼインヒビターで、当該分野で公知であり、更に上のセクションＩに詳細に記載されており、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドと組み合わせて（例えば、同時に又は連続して）投与しうるものの投与が含まれる。さらに、治療は、ＣＤ２０抗体（RituxanＴＭを含む）又はＨｅｒレセプター抗体（HerceptinＴＭを含む）等の腫瘍又は他の細胞抗原を標的にする治療用抗体、並びに抗-血管形成抗体、例えば抗ＶＥＧＦ、又はＡｐｏ２Ｌレセプター、例えばＤＲ５又はＤＲ４を標的にする抗体をベースにしている。
【００６９】
化学治療剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定されて使用される。また、このような化学治療の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
また、他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーのメンバー(例えば、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、あるいは付加的に、ここに開示した同一の又は二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。
【００７０】
Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド製剤は、例えば上述の明細書の定義の項目に特に挙げた他の薬剤、サイトカイン、化学療法剤、抗体等と組み合わせて、例えば同時に又は連続して、本出願に記載の何れかの治療方法で投与されてもよい。例えば、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド製剤は前処理(このような任意の他の薬剤の投与前)として、例えば、さもなければ他の治療薬のアポトーシス効果に耐性のある癌細胞の前処理として投与されてもよい。
上記したように、本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは様々な有用性を有する。例えば、ＤＲ5作用性ペプチドは、哺乳動物の病的状態、例えば癌又は免疫関連疾患の治療方法に用いてもよい。その方法において、単独又は、さらに他の治療薬ないし技術と組み合わせて、ＤＲ5結合ペプチド、好ましくは作用性結合ペプチドを哺乳動物に投与する。
ここで記載されている様々な病的状態の哺乳動物の診断は、熟練した専門家によってなされることができる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断ないし検出をする分野において有用である。例えば、癌は、限定するものではないが、触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲなどを含む技術により同定してもよい。また、免疫関連疾患は直ちに同定されうる。全身エリテマトーデスにおいて、疾患の中心的媒体は、自己タンパク質／組織に対する自己応答性抗体の生成と続いて起こる免疫媒介性炎症である。腎臓、肺、筋骨格系、皮膚粘膜、目、中枢神経系、心血管系、消化管、骨髄及び血液を含む多数の器官および系が、臨床的に影響を受ける。
【００７１】
医師は、免疫及び／又は炎症性反応の介入が有益である多くの疾患に精通している。例えば、リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、二つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第二の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【００７２】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は三つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：Bechterew氏病(ankylosing sponylitis)、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応を誘発すると仮定されている。
【００７３】
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴う場合がある。この疾患は、双方とも小さいＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
【００７４】
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球（いくつかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞）表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【００７５】
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、いくつかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
【００７６】
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウィルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
【００７７】
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はＴリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患は、限定するものではないがウィルス感染（限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる）を含む感染疾患、ＭＬＲを刺激し、治療に利用し、遺伝性、獲得性、感染誘発性（例えばＨＩＶ感染）、又は医原性（即ち、化学療法からのもの）免疫不全の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることが可能な免疫欠損疾患（分子／誘導体／アゴニスト）、及び異常増殖である。
【００７８】
また、リガンドに結合するためにポリペプチドと競合するペプチドのリガンドへの相対的結合親和性を予測する方法が提供され、該ペプチドはファージディスプレイライブラリー由来であり、該方法はリガンド存在下にてポリペプチドを用いてペプチドに一致するファジミドクローンを培養し、連続的に希釈し、ペプチドによって阻害されるリガンドに対するファジミドクローンの結合の程度を測定し、低濃度のファージでしか阻害されないファジミドクローンが、高及び低濃度のファージの両方で阻害されるファジミドクローンよりもリガンドに対する親和性が高いことを示すものである。
またここで診断方法を提供する。例えば、Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、Ａｐｏ−２Ｌ、ＤＲ４又はＤＲ５関連の病理状態を有することがわかっている又は有すると思われる哺乳動物において、ＤＲ４又はＤＲ５レセプターそれぞれを検出するために用いてもよい。該結合ペプチドは、例えば試料中のＤＲ４又はＤＲ５を検出ないし定量するアッセイで用いてよい。哺乳動物から得た細胞などの試料を標識した結合ペプチド存在下でインキュベートし、試料中の結合した標識結合ペプチドを検出することができる。様々な臨床的アッセイ手段を含むこのようなアッセイは、例えばVoller等., Immunoassays, University Park, 1981に記載のように当分野に公知である。
【００７９】
また本発明は、ここで記載されたＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを収容するキットを提供する。典型的なキットは、上述した一又は複数の賦形剤にＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドのための容器、好ましくはバイアル；及び使用者にＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド製剤の使い方を指示する製品挿入物又はラベル等の使用説明書を具備する。これにより、好ましくは製薬用製剤が提供される。好ましくは、製薬用製剤は癌又は免疫に関連した病状を処置するためのものである。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は疾患の診断又は処置に有効なＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド製剤を収容しており、滅菌したアクセスポートを有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。容器上の又は容器に伴うラベルには、製剤が、選択された疾患の診断又は処置に使用されることが示されている。製造品は、注射用水、製薬的に許容可能な溶液、塩水、リンガー液、又はデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
全ての特許、特許出願、出版物、製品についての記載、及びプロトコルは、この出願を通して引用され、その開示は、それらの全てが参照としてここに取り込まれる。
【００８０】
(実施例)
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものでは決してない。実施例に示されている市販試薬は、特に記載しない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。以下の実施例及び明細書を通して、ＡＴＣＣ受託番号により特定されたそれらの細胞の供給源は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア州である。
【００８１】
実施例１：Ａｐｏ−２Ｌレセプターに結合するファージ由来ペプチド
次の一連の実施例において、中間体及び終末産物を指すときに、共通のα−アミノ酸は標準の１−又は３−文字アミノ酸コードによって記載されていてもよい。共通のα−アミノ酸によって、ｍＲＮＡによってタンパク質に組み込まれるアミノ酸を意味する。標準的な略語は、The Merck Index, 10th Edition, pp Misc-2 - Misc-3に挙げられている。示さない限り、共通のα−アミノ酸は天然又はα炭素原子で「Ｌ」−構成を有する。コードが「Ｄ」の後にある場合、共通のα−アミノ酸の逆の光学異性体を示す。ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びオルニチン（Ｏｒｎ）等の修飾型又は非一般的αアミノ酸は、U.S. Patent and Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, May 15, 1990に記載のように表示する。
タンパク質などの標的分子に対して測定可能な親和性を有し、特異的に結合するペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質融合を用いて結合選択することによって多くの結合及び非結合ペプチドの初期ライブラリから同定することができる。Smith, Science, 228: 1315 (1985)；Scott及びSmith, Science, 249: 386 (1990)；Cwirla等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 309 (1990)；Devlin等., Science, 249: 404 (1990)；Wells及びLowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 597 (1992)による概説；米国特許第5,223,409号。加えて、ファージ上に表出したタンパク質及びペプチドの両方は突然変異、選別及び蔓延の相互サイクルにより親和性を亢進することができる。
配列中の特定の残基位置で異なっているペプチドのライブラリーは、合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いて構築しうる。ペプチドはバクテリオファージ粒子上のファージコートタンパク質（例えばｇ３ｐ又はｇ８ｐ）を有する融合タンパク質として表出され、それぞれは特定のペプチド変異型をコードしている一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。親和性精製のサイクルの後、固定されたターゲット分子を用いて個々のバクテリオファージクローンを単離し、それらの表出したペプチドのアミノ酸配列はそれらのＤＮＡ配列から推論する。
Ｉ．ペプチド−ファージライブラリーの構築
Ａｐｏ−２Ｌレセプタ（例えばＤＲ４又はＤＲ５）に結合する能力を有するペプチド分子を同定するために、約１２から約２４の範囲のアミノ酸残基長ペプチドのいくつかの多様なファージライブラリーを構築した。溶液中で明確な構造を維持することができるペプチドの選別をある程度容易にする傾向があるため、この長さ又はサイズのペプチドを選んだ。このサイズの天然のアミノ酸ペプチドは、２０１８−２０２０（すなわち２．６×１０２３から１．０×１０２６）の変異体の潜在的な配列多様性を有する。各々のペプチド内でのジスルフィド結合又はβターン等のペプチド構造の安定成分を与える又は亢進することを期待して、残基は固定又は一定にした。
ライブラリ構築物の鋳型として、プラスミド、バクテリオファージＭ１３のｇ８ｐに融合した抗体認識可能な（ｇＤ−タグ）ペプチドを発現するｐｔ４．ｇ８を用いた。このプラスミドは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ複製起源を含む。ｐｈｏＡプロモータ及びＳＴＩＩ分泌シグナル配列は、ｇＤペプチドの上流で（以下の下線部分）、その後に「リンカー」ペプチド（以下の二重線部分（「GGGSGGG」））が続き、そして、バクテリオファージＭ１３のｇ８ｐが続く：
SGTAMADPNRFRGKDLAGSPGGGSGGGAEGDDPAKAAFNSLQASATEYIGYAWAMVVVIVGATIGIKLFKKFTSKAS（配列番号：７）
一本鎖鋳型特異的突然変異誘発法(Kunkel等., Methods. Enzymol., 204:125 (1991))を用いて様々なランダム配列ペプチドライブラリを構築した。これらライブラリを以下の表Ｉ及びＩＩに示す。
ここに示すＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは、以下のファジミド結合アッセイを用いて表Ｉ及びＩＩに示すバクテリオファージペプチドライブラリ構築物から同定した。
【００８２】
ファジミド結合アッセイ
１．８０μｌの１μｇ／ｍｌ  Ａｐｏ−２ＬレセプターＤＲ５ＥＣＤ（配列番号：１０５）（５０ｍＭ  炭酸ナトリウムｐＨ９．６中）を含むコートマイクロタイタープレートウェルを４℃で一晩置く。
２．２００μｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにてコートを除去しブロック（遮断）する。１時間室温にてインキュベート。
３．競合的レセプター溶液の調製（１００μｌ／試料)。
−５０μｌの結合用緩衝液を新規な非粘着性９６ウェルプレートのＢからＨ列までに分配する。
−７５μｌの競合用レセプター溶液をＡ列に分配する。
−Ｈ列を除きカラムを通した２５μｌ溶液を移すことによって３倍に連続的に希釈した（それぞれの一連の移動には新しいチップを用いる）。
４．適度に飽和したファージ希釈液を調製する（一連のファージ希釈液から予測する）。
−５０μｌのファージ希釈液を非粘着性のプレートの各マイクロタイターウェルに移す。Ｈ列から初め、そしてＧ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、Ａとそれぞれ行う。
−室温で２時間インキュベート。
５．ＤＲ５  ＥＣＤ（配列番号：１０５）でコートしたプレートの遮断物を取り除き、ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ２０にて１０回すすぐ。
６．８０μｌの競合用レセプターとファージの混合液を非粘着性のプレートからＤＲ５  ＥＣＤコートプレートに移し、室温にて２０分間インキュベートする。
７．ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３モノクローナルＡｂ(Amersham Pharmacia Biotech)を結合用緩衝液で１：５０００に希釈する。
−プレートをＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ２０にて１０回すすぐ（これによって膨大な量の非表出ファージを取り除く）。
−８０μｌのＡｂ希釈液をＨ列からＡ列まで加える。
−室温にて１時間インキュベートする。
８．ＴＭＢペルオキシダーゼ基質と等量のペルオキシダーゼ溶液Ｂを混合する。
−プレートをＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ２０にて１０回すすぐ。
−８０μｌの基質をＨ列からＡ列まで加える。
−生育に必要なだけインキュベートし、８０μｌの２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４にて反応を停止させる。
ついで、このアッセイを用いて同定したＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドは以下の手順により親和性分類を行った。
【００８３】
親和性分類−ペプチド法１：
分類１
１．Maxisorpイムノプレート２４ウェルに２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルのコート標的タンパク質（ヒトＤＲ５ＥＣＤ、配列番号：１０５）を入れ、４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートの遮断：２００μｌのカゼインを含むＰＢＳを加えて室温にて１時間置く。
３．ファージの遮断：遮断用緩衝液（カゼイン）をファージ溶液に１：１の割合で加え、室温にて１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＴ緩衝液にて５回すすぐ。
５．１００μｌのライブラリファージ溶液（ステップ４からのもの）をウェルに加え、室温にて２時間、ゆっくりと攪拌しながらインキュベートする。
６．プレートをＰＴ緩衝液にて１０回すすぐ。
７．第一の１２ウェルを５０μｌの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２にて３０分間溶出し、ついで、第二の１２ウェルに溶液を移して３０分間インキュベートする。１．０Ｍトリス塩基（約１／６量）にて溶出物を中和する。
８．１．５ｍｌのファージ溶出物を５ｍｌのＸｌ１−ブルー細胞（ＯＤ６００＝１．０）に感染させる。３７℃で２０分間生育する。ＬＢ／カーブプレート上で力価を測定し、５０ｍｌの２ＹＴ／カーブＶＣＳに培養物を移して３７℃で一晩生育させる。
９．細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去する。
【００８４】
分類２
１．標的タンパク質にて１２ウェルをコートする。
２．プレートの遮断：２００μｌのスーパーブロックを加え室温にて１時間。
３．ファージの遮断：スーパーブロック(superblock)(Pierce, CA)をファージ上清（分類１のステップ１２からのもの）に１：１の割合で加え、室温にて１時間インキュベートする。
４．０．３ｍｌのファージ溶出物を１ｍｌのＸｌ１−ブルー細胞（ＯＤ６００＝１．０）に感染させる。３７℃で２０分間生育する。ＬＢ／カーブプレート上で力価を測定し、２５ｍｌの２ＹＴ／カーブＶＣＳに培養物を移して３７℃で一晩生育させる。
５．細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去する。
【００８５】
分類３
１．標的タンパク質にて１２ウェルをコートする。
２．プレートの遮断：２００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡを加え室温にて１時間。
３．ファージの遮断：ＰＢＳ／ＰＢＳをファージ上清に１：１の割合で加え、室温にて１時間インキュベートする。
４−５．上記と同じ。
【００８６】
親和性分類−ペプチド法２
分類１
１．ビーズをブロックする。
４．ビーズを完全に混合して、６００μｌのビーズをエッペンドルフチューブに取り除く。
５．１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡにて３度洗浄する。
６．ＰＢＳ／ＢＳＡに洗浄したビーズを再懸濁する。
７．回転板上で室温にて１時間置く。
２．ファージの遮断：
ａ）ペプチドファージライブラリーに遮断用緩衝液（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を１：１の割合で加える。
ｂ）回転板上で室温にて１／２時間置く。
ｃ）５０ｎＭのＤｒ４  ＩｇＧ（配列番号：１０８）（Ｄｒ５特異的のために）又はＤｒ５  ＩｇＧ（配列番号：１０９）（Ｄｒ４特異的のために）を加える。
ｄ）回転板上で室温にて１時間置く。
３．抗原へのペプチドファージ結合：
ａ）１００ｎＭのビオチン標識標的タンパク質をファージ溶液に加える。
ｂ）室温にて１−２時間回転させる。
４．ファージ混合液（ステップ３からのもの）をブロックしたビーズ（ステップ１からのもの）に移し、回転板上に１５分間置く。
５．ビーズをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにて１０回洗浄する。
６．ファージを１００μｌの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２にて３０分間溶出し、ついで、１．０Ｍトリス塩基（約１／６量）にて溶出物を中和する。
７．０．５ｍｌのファージ溶出物を５ｍｌのＸｌ１−ブルー細胞（ＯＤ６００＝１．０）に感染させる。３７℃で２０分間生育する。ＬＢ／カーブプレート上で力価を測定し、２５ｍｌの２ＹＴ／カーブＶＣＳに培養物を移して３７℃で一晩生育させる。
８．細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去する。
【００８７】
分類２
分類１と同様、濃度：以下の表Ａを参照。カゼインを含むブロック溶液。
分類３
分類１と同様、濃度：以下の表Ａを参照。スーパーブロックを含むブロック溶液。
分類４
望ましくは、分類１と同様、濃度：以下の表Ａを参照。５％スキムミルクを含むブロック溶液。
【００８８】
表Ａ
2007530008.tif 000002
ここで開示されるペプチドを同定して、単離するためにいくつかのスクリーニングプロトコル方策を行った。第一のプロトコルは、クローンが２又は３の分類ステップの後でクローンを選別する早期で大量の（「Ｅ.Ｍ.」）スクリーニング方策からなる。このＥ.Ｍ.方策において、早期で大量の選別方法は、結合エピトープの相対的な多様性（例えば配列構造および結合親和性の多様性）を有するペプチド配列を同定するために行った。
ここに記載のペプチドを同定するために行う第二のプロトコールは、付加的な分類ステップ（例えば、４から６）の後にクローニングを選別する後期で限定的な（「Ｌ．Ｌ．」）スクリーニング方策からなる。Ｌ．Ｌ．スクリーニング方策は、より親和性の高いペプチド種を選別するために用いた。
【００８９】
このペプチドスクリーニングプロトコールで用いた材料と方法を以下に示す：
Ａ．材料：
１．固体支持体、ＮＵＮＣ３８４ウェルプレート（Ｃａｔ＃７８１０６１）。
２．コート用緩衝液（ＣＢ）、０．０５Ｍ  炭酸塩／重炭酸塩  ｐＨ９．６。
３．洗浄用緩衝液（ＷＢ）、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４。
４．ＥＬＩＳＡ希釈液ｗ／ｏチメロサール（ＡＢ）、ＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０。
５．基質（Ｓ）、ＴＭＢ。
６．停止用溶液（ＳＳ）、１Ｍ  リン酸（６７．５ｍＬ  Ｈ３ＰＯ４＋９３２．５ｍＬ  ｄＨ２Ｏ）。
７．コート標的、２μｇ／ｍｌ。
８．コート抗ｇＤ（５μｇ／ｍｌ）。
９．コンジュゲート、抗−Ｍ１３／ＨＲＰ  １：５０００希釈(Amersham Pharmacia biotech)。
【００９０】
Ｂ．手順：
１．ａ）０．４ｍｌの２ＹＴ／ｃａｂＶＣＳにて３７℃で一晩ファージを生育する。
ｂ）標的タンパク質（ＤＲ５  ＥＣＤ、配列番号：１０５）を２μｇ／ｍｌに希釈する。各ウェルに４０μｌを加える。２−８℃で一晩インキュベートする。
２．プレート洗浄機上でプレートを洗浄する（１００μｌで３回）。吸い取って乾燥させる。
３．各ウェルに１００μｌのＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液を加えてプレートをブロックする。室温にて１時間、ゆっくりと撹拌しながらインキュベートする。
４．プレート洗浄機上でプレートを洗浄する（１００μｌで３回）。吸い取って乾燥させる。
５．各ウェルに３０μｌの試料（ファージ希釈試料１／３）を加える。試料を９６ウェルプレートから３８４プレートに４つに分けて移す。室温にて５５分から１時間１５分の間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートする。
６．プレート洗浄機上でプレートを洗浄する（１００μｌで６回）。吸い取って乾燥させる。
７．アッセイ緩衝液で希釈した４０μｌの抗Ｍ１３／ＨＲＰ（１：５０Ｋ）を各ウェルに加える。室温にて５５分から１時間１５分の間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートする。
８．プレート洗浄機上でプレートを洗浄する（１００μｌで６回）。吸い取って乾燥させる。
９．等量の基質とペルオキシダーゼ溶液を混合する。４０μｌの溶液を各ウェルに加える。十分に色が発色するまでインキュベートする（〜１８ないし２３分）。
１０．各ウェルに４０μｌの停止用溶液を加える。
１１．参考までに４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を読む。
ここで開示したペプチドを同定するために用いたスクリーニング工程では、ＣＲＳロボットシステム（カーネル(Kernel)手順＝ファージ）により上記ステップ４−１１を行った。
【００９１】
ファージクローン精製
上記の方法を用いて目的のペプチドを発現するいくつかのバクテリオファージを生成し、ついで限定的希釈法を用いて精製した。更に目的の特定のクローンを特徴付けるために（例えば、Ｉｃ５０値を測定するため）、ファージクローンを成育して、Sidhu等., Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000)に記載のポリエチレングリコールベースの方法を用いて精製した。また、バクテリオファージの生成及び精製の変法も当分野で公知である。例としてCurrent Protocols In Molecular Biology, Volume 1, Units 1, 5及び6, Frederick M. Ausubel等. eds., 1995を参照。
上記方法を用いて同定したファージクローンを生育して、ついで以下のポリエチレングリコールベースの方法を用いて精製した。簡単に言うと、目的のファージクローンを感染させた細菌培養物をファージの成育に好適な条件下にて成育させ、ついで１６０００ｇ、２℃で１０分間遠心分離する。そして、上清を新しい遠心分離用チューブに移し、１／５量のＰＥＧ-ＮａＣｌ（ＰＥＧ８０００（２００ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１４６ｇ／Ｌ）、高圧滅菌)を加える。ついで、混合液を室温にて５分間インキュベートする。ついで、この混合液を上記のように遠心分離し、上清を移す。ついで、上清を短く再遠心し、残りの上清を取り除く。ついで、ファージペレットを１／２０量のＰＢＳ（又は他の類似緩衝液）に再懸濁する。そして、遠心分離により不溶性物質をペレット状にする。精製したファージを含む上清を取り出し、以下の実施例に記載のＩｃ５０及びＥｃ５０アッセイなどのアッセイ法に用いる。
本発明のペプチドとＩｃ５０値（例えば、ＤＲ５ＥＣＤ（配列番号：１０５）競合物質を用いたＥＬＩＳＡベースのアッセイでのＩｃ５０の決定）を以下の表ＩＩＩに示す。ここに示した表で、「Ｉｃ５０」は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター分子（例えば、ＤＲ４-ＩｇＧ（配列番号：１０８）又はＤＲ５ＥＣＤ（配列番号：１０５）など）へのＡｐｏ−２Ｌ（例えば、配列番号：１のアミノ酸１１４から２８１）の結合を５０％阻害するのに必要なペプチドの濃度の基準を意味する。ペプチドは、それぞれａ、ｂ、ｃ、及びｄで表すクラス１-クラス４に分類する。
以下の表ＩＶに選択したペプチドの特定の性質、例えば、ＤＲ４及びＤＲ５ポリペプチドとのＩｃ５０交差反応データを提供する。表ＶＩＩＩに、ここで開示する様々なペプチドについての配列同定番号（配列番号）を示す。
【００９２】
実施例２：Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを操作及び／又は修飾するために用いたプロトコール
この実施例で開示するように、上記の方法を用いて同定したペプチドをいくつかの分野に容認されたプロトコールに従って修飾した。
第一の工程では、特定のペプチドを更なる修飾について選別した。特定の濃度でＡｐｏ−２Ｌ．０（配列番号：１のアミノ酸１１４から２８１）とＤＲ５（配列番号：１０５及び１０９）との相互作用を阻害する能力及び／又は特異的な親和性を有するＤＲ５ポリペプチド（配列番号：１０５及び１０９）への結合能を含む基準に基づいて、修飾のためのペプチドを選択した。図４Ａに示すように、ペプチドＨｄ５−１０（配列番号：１４）、Ｈｄ５−１１（配列番号：１５）、Ｈｄ５−８（配列番号：９２）及びＨｄ５−９（配列番号：９９）を第一世代（Ｇ１）ペプチドリードとして同定した。
図４Ｂに示すように、Ｈｄ５−１１ペプチド内の元のアミノ酸残基をアミノ酸置換により修飾した。上記のように選択したペプチド内の同じ配列位置に高頻度に出現するものを修飾のための特定の残基を選択した。図４Ｂに示すように、Ｈｄ５−１１内のシステイン残基４、８及び１４をアラニン残基に置換した。ついで、図４Ｂのグラフに示すように、Ｃ→Ａの置換のペプチドＩｃ５０値への効果を測定した。この方法により生成された第二世代（Ｇ２）ペプチドを図４Ｂに示す。
出現の頻度に加えて、ジスルフィド結合の形成に関する残基（すなわち、システイン）の除去が望ましいこと、並びに続く操作が特に行いやすい残基（例えば、ポリオールへの結合を促進する残基）の付加を含む様々な付加的基準に基づいて、ペプチド内の特定の残基を選択することができる。
【００９３】
図４Ｃに示すように、図４Ｂで同定したＧ２ペプチドを、ペプチドの一以上の末端残基が欠損しているトランケーションスキャニングプロトコールを用いて修飾した（例としてBing Li等., Science 270, 1657 (1995)を参照）。図４Ｃのグラフに示すように、トランケーションのペプチドＩｃ５０値への効果を測定した。このペプチドの修飾を容易にしたライブラリーのデザインを図４Ｃに示す。この方法により生成した第３世代（Ｇ３）ペプチドを図４Ｃに示す。
図４Ｃに示すように、Ｇ３ペプチド内のアミノ酸残基をアラニンスキャニングプロトコールを用いて修飾した（例としてCunningham B.C.等. Science 244,1081 (1989)を参照）。このプロトコールでは、Ｇ３ペプチドの一以上の残基をアラニンに置換し、その様々な置換のペプチドＩｃ５０値への効果を測定した。図４Ｄに示すようにライブラリーデザインはこのペプチド修飾を容易にした。この方法により生成した第４世代（Ｇ４）ペプチドを図４Ｃに示す。
以下の実施例５に考察するように、ペプチド修飾の効果をＡｐｏ−２ＬとＡｐｏ−２Ｌレセプターとの相互作用を阻害するペプチドの能力を評価するアッセイで試験した。以下の実施例４で考察するように（及び図５Ｂに示す）、ペプチド修飾の効果をＳＫ−ＭＥＳ−１細胞のアポトーシスを誘導するロイシンジッパー配列に連結したＬＢ８８１Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド（配列番号：４５）の能力のアッセイでも試験した。
【００９４】
実施例３：ＤＲ５結合ペプチドオリゴマー化
表ＩＩＩに示すＬＢ８８１ペプチドの特徴付けられたオリゴマー（配列番号：４５）をＧＣＮ４コイルドコイルのアミノ末端に融合することによって操作した（例としてO'Shea 等., (1989) Science 243, 538-542を参照）。ＧＣＮ４二量体の三量体及び四量体変異体は、Harbury等. (例としてHarbury等., (1993) Science 262, 1401-1407を参照)によって報告された配列に基づくが、ＧＣＮ４配列の末端は異なる。３つのすべてのＧＣＮ４変異体はアミノ末端に２残基を付加しており（Ｌｙｓ及び好適な疎水性残基；以下の表Ｖを参照）、３つすべては配列「ＶＧＥＲ」で終わっている。ペプチドを異なる長さのリンカーを介してＧＣＮ４変異体に融合させた（以下の表ＶＩ参照）。
【００９５】
方法論：
ペプチド−ＧＣＮ４コイルド融合体の発現プラスミドは、標準的な分子クローニング技術を用いてＧＣＮ４−ｐＲのＮｄｅＩ部位にペプチドリンカーカセットを挿入することによって生成した（例としてCochran, A. G. & Kim, P. S. (1996) Science 271, 1113-1116を参照）（ＧＣＮ４二量体化ドメイン又は好適な変異体をコードする）。ついで、リンカー変異体は初めのコンストラクトにケンネル突然変異を誘発して生成した。融合ペプチドをコードするプラスミドは大腸菌株ＢＬ２１−ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ(Novagen)内に形質移入した。Ｌ培養液（ＬＢ）の培地に３７℃で一晩、振とうしながら単一コロニーをインキュベートした。ついで、発現培地（１ＬのＬＢ）を１０ｍｌの一晩培養した培養物と共に３７℃で振とうしながらインキュベートした。培養物の５５０ｎｍの吸光度が０．５に達したら、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（最終濃度０．４ｍＭ）でペプチド発現を誘発した。更に３時間生育した後、遠心分離により細胞を回収した。
−２０℃で細胞ペレットを凍結し、室温で解凍して氷酢酸（元の培養物１Ｌ当たり１０ｍｌ）に溶解した。遠心分離により沈殿物を取り除き、５ｃｍ×２５ｃｍの大きさの排斥カラム(Sephadex G75 fine; Pharmacia)に上清を流した。１分当たり３ｍｌの流速の５％（ｖ／ｖ）水性酢酸にて融合ペプチドを溶出した。融合ペプチドを含む分画を、Microsorb Ｃ１８カラム（部品番号R0089203C5, Varian Chromatography Systems）と水中のアセトニトリル勾配（０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）を用いて、液性クロマトグラフ質量分析（Shimadzu LC-10ADポンプを有するPE SCIEX API 150 EX質量分析機、Shimadzu ２波長UV検出器SPD-10AVP型、及びPerkin Elmer Series 200 autosampler）により同定した。融合ペプチド分画を混合して凍結乾燥した。
【００９６】
凍結乾燥した融合ペプチドを、水中のアセトニトリル勾配（０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）を用いて、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水に溶解し、更に逆相分離用ＨＰＬＣにより精製した。精製した融合ペプチドを含むＨＰＬＣ分画を混合して、イオジン飽和酢酸の付加によって酸化させた。酸化工程の間に起こりうる分子間交差を減らすために、凍結乾燥した製品の重さを量り、２ｍｇ／ｍｌの濃度で、６Ｍ  グアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ  トリス，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）の変性条件下に再懸濁した。変性ペプチドを水性フェリシアン化カリウムで酸化させた。Pharmacia HiPrep 26/60 Sephacryl S-100高分解能カラムのゲル濾過クロマトグラフィーにより、単量体ペプチドを交差凝集体から分離した。ランニング(running)緩衝液は緩衝液Ａとした。単量体ペプチドを含む分画を５０ｍＭトリス,ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡにて４℃で少なくとも３時間透析した。透析した分画をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により純度を分析した。純粋な分画を混合し、溜めた透析分画を２−１０ｍｇの最終回収率になるよう再度逆相ＨＰＬＣにて精製した。
凍結乾燥粉を１ｍＬ当たり２５ｍｇで水に溶解し、例えばGill, S. C. & von Hippel, P. H. (1989) Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182, 319-326に記載のように吸光度からペプチド濃度を測定した。貯蔵溶液は、ペプチドを２ｍＭまで希釈してｐＨの中和のためにＮａ２ＨＳＯ４を付加することによってアッセイ用に調製した。以下の表ＶＩＩにＧＣＮ４コイルドコイルのアミノ末端に融合したＬＢ８８１ペプチド（配列番号：４５）についてのデータを示す。
【００９７】
実施例４：Ａｐｏ−２レセプター結合ペプチドのアポトーシス作用的誘導能のアラマーブルーアッセイ
蛍光色素の代謝転換から細胞生存度を測定するバイオアッセイは、ＧＣＮ4コイルドコイル（配列番号：１１３）のアミノ末端に融和した表ＩＸに示されるＬＢ８８１  Ａｐｏ２Ｌレセプター結合ペプチドのアポトーシスの活性を決定するために用いられた。このバイオアッセイからのデータを図５Bに示す。
簡潔にいうと、Ａｐｏ−２Ｌ．０又はこのＡｐｏ２Ｌレセプター結合ペプチドの連続的２倍希釈液を、０．１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco）で作り、５０μＬの各希釈液を９６ウェルファルコン組織培養マイクロプレートの個々のウェルに移した。「Ａｐｏ−２Ｌ．０」および「Ａｐｏ２Ｌ．０」なる用語は、図１のアミノ酸１１４から２８１（配列番号：１のアミノ酸１１４から２８１）からなるＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの形態を意味し、いかなるエピトープタグ配列に連結又はコンジュゲートするものではない。Ａｐｏ−２Ｌ．０又はＡｐｏ２Ｌレセプター結合ペプチド希釈工程の後、５０μＬのＳＫ―ＭＥＳ―１ヒト肺上皮癌細胞(ATCC HTB58)（ＲＭＰＩ-１６４０、０．１％ＢＳＡ中）を、２×１０４細胞／ウェルの密度で加えた。これらの混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。２１時間目に、２５μＬのアラマーブルー(AccuMed, Inc., Westlake, Ohio)を加えた。５３０ｎｍでの刺激と５９０ｎｍの放出を有する９６-ウェル蛍光光度計を用いて蛍光を読み込んだ。結果は、相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）で表した。データ分析のために、４-パラメータ曲線適合プログラム（Kaleidagraph）を用いた。
これらのバイオアッセイ方法を用いて、Ａｐｏ−２ＬＬＢ８８１レセプター結合ペプチドのＥｃ５０値を求め、下記の表ＶＩＩに示す。「Ｅｃ５０」は、５０％の細胞集団のアポトーシス誘発が観察されるペプチドの半有効濃度を指す。
【００９８】
実施例５：Ａｐｏ−２ＬのＡｐｏ−２Ｌレセプターへの結合を阻害するＡｐｏ−２レセプター結合ペプチド能力についてのアッセイ
本発明の精製されたＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチド（上の実施例１にて説明したように）は、Ａｐｏ−２ＬレセプタコンストラクトヒトＤＲ５−ＥＣＤ（配列番号：１０５）へのＡｐｏ−２リガンド（配列番号：１のアミノ酸１１４〜２８１）の結合を阻害する活性について試験した。簡潔に言うと、ＥＬＩＳＡで、９６ウェルマイクロタイタプレート(Maxisorp; Nunc, Kamstrup, Denmark)を、各ウェルのコート用緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６）に１００μｌの５μｇ／ｍｌヒトＤＲ５−ＥＣＤ（配列番号：１０５）を加え、４℃で一晩インキュベートすることによってコートした。ついで、プレートを、洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）にて３回洗浄した。それから、ウェルを２００μｌの２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにてブロックし、室温で１時間インキュベートした。ついで、プレートを、洗浄緩衝液にて再度３回洗浄した。
洗浄工程手段後、アッセイ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中で、１００μｌの精製したＡｐｏ−２レセプター結合ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）の３倍連続希釈液を、指定したウェルに加えた。ついで、プレートをシェーカ装置上で室温にて１時間インキュベートし、洗浄緩衝液にて３回洗浄した。
【００９９】
次に、アッセイ緩衝液に１００μｌの１:１０００に希釈したビオチン付加Ａｐｏ-2Ｌ.0（配列番号：１のアミノ酸１１４から２８１）を各ウェルに加え、プレートをシェーカ上で室温にて１時間インキュベートした。ついで、プレートを洗浄緩衝液にて３回洗浄した後、アッセイ緩衝液に１:１０００に希釈した１００μｌのストレプトアビジン-ＨＲＰ (Zymed, South San Francisco CA)を付加し、シェーカ装置上で室温にて１時間インキュベートし、ついで洗浄緩衝液にて３回洗浄した。
ついで、各ウェルに５０μｌの基質(TMB Microwell peroxidase substrate, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を添加し、室温にて１０分間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ-１成分停止用溶液(Diethyl Glycol; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を反応を止めるため各ウェルに加え、４５０ｎｍの吸収度を自動化したマイクロタイタプレートリーダーで読んだ。
これらの方法を用いて、目的のペプチド配列を発現する様々なファージクローンのＩｃ５０値を求め、下記の表に示す。表において、「Ｉｃ５０」は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター分子（例えばＤＲ４−ＩｇＧ（配列番号：１０８）又はＤＲ５  ＥＣＤ（配列番号：１０５）など）へのＡｐｏ−２Ｌの結合を５０％阻害するために必要なペプチドの濃度の基準を表す。
この実施例ではＤＲ５−ＥＣＤコンストラクト（配列番号：１０５）を標的レセプター分子として用いるＥＬＩＳＡアッセイプロトコルを記載するが、他のＡｐｏ−２Ｌレセプター分子に結合するこれらＡｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドの能力はこのＥＬＩＳＡベースの方法を用いて調べることができる。
【０１００】
本発明はここに記載する特定の実施態様によって範囲を限定されるものではない。実際、ここに記載のものに加えて本発明への様々な修飾が、先の明細書及び添付の図から当分野の技術者に明らかであろう。このような修飾は、付記した請求の範囲内であることを意味する。
【０１０１】
表
表Ｉ−ＩＩ：Ｇ８ディスプレイのための天然ライブラリ
表Ｉ：Ｇ１−Ｇ２
2007530008.tif 000003
【０１０２】
表ＩＩ：Ｇ３−Ｇ５
2007530008.tif 000004
【０１０３】
表ＩＩＩ：ファージ競合Ｉｃ５ポジティブクローン（Ｃｏｍｐ／ＤＲ５ＥＣＤ）
2007530008.tif 000005
2007530008.tif 000006
2007530008.tif 000007
ＬＧ：ライブラリ世代
ＰＭ：点突然変異体
２Ｈｄ１３：点突然変異体のテンプレート
【０１０４】
表ＩＶ：選択したペプチドの特定の性質
交差反応(cross-reactivity)
2007530008.tif 000008
【０１０５】
表Ｖ．ＧＣＮ４コイルドコイル変異体
配列間で異なる部位を太字で示す。
2007530008.tif 000009
【０１０６】
表ＶＩ．リンカー変異体
2007530008.tif 000010
【０１０７】
表ＶＩＩ：ロイシンジッパードメインに融合した例示的ペプチドのＩＣ５０値
2007530008.tif 000011
【０１０８】
表ＶＩＩＩ：Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドに対して同定された配列の数
2007530008.tif 000012
2007530008.tif 000013
2007530008.tif 000014
【０１０９】
表ＩＸ：Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを特定するために用いた試薬のポリペプチド配列
2007530008.tif 000015
2007530008.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ヒトＡｐｏ−２リガンドｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列と、それより得られるアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド位置４４７（配列番号２中）の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であることを示すために使用されている。
【図２Ａ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）と、それより得られるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ヒトＤＲ４の対応するヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、Pan等, Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図２Ｂ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）と、それより得られるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ヒトＤＲ４の対応するヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、Pan等, Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図３Ａ】１９９８年１１月１９日公開のＷＯ９８／５１７９３に開示されているヒトＤＲ５の４１１アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図３Ｂ】ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異型は当分野で公知である。このＤＲ５スプライシング変異型は、１９９８年８月２０日公開のＷＯ９８／３５９８６に公開のように、図３Ｂ及び３ＣのヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列をコードする。
【図３Ｃ】ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異型は当分野で公知である。このＤＲ５スプライシング変異型は、１９９８年８月２０日公開のＷＯ９８／３５９８６に公開のように、図３Ｂ及び３ＣのヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列をコードする。
【図４Ａ】Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを修飾するために用いたプロトコールを図示する。
【図４Ｂ−１】Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを修飾するために用いたプロトコールを図示する。
【図４Ｂ−２】Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを修飾するために用いたプロトコールを図示する。
【図４Ｃ】Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを修飾するために用いたプロトコールを図示する。
【図４Ｄ】Ａｐｏ−２Ｌレセプター結合ペプチドを修飾するために用いたプロトコールを図示する。
【図５】Ａ：異種性のロイシンジッパーポリペプチドに連結しているＧ４（ＬＢ８８１）ペプチドの略図である。このポリペプチドの完全なアミノ酸配列は、GEVCLTSCSRLRGGSGGM KLKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLVGER (配列番号：113)である。Ｂ：オリゴマー化したＬＢ８８１  Ａｐｏ−２Ｌ結合ペプチド（配列番号：１１３）のアポトーシス誘導活性をグラフに示す。当該分子のアポトーシス誘導性活性は、ＳＫ−ＭＥＳ−１肺上皮癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した（以下の実施例４に記載）。
【図１】
2007530008.tif 000017
【図２Ａ】
2007530008.tif 000018
【図２Ｂ】
2007530008.tif 000019
【図３Ａ】
2007530008.tif 000020
【図３Ｂ】
2007530008.tif 000021
【図３Ｃ】
2007530008.tif 000022
【図４Ａ】
2007530008.tif 000023
【図４Ｂ−１】
2007530008.tif 000024
【図４Ｂ−２】
2007530008.tif 000025
【図４Ｃ】
2007530008.tif 000026
【図４Ｄ】
2007530008.tif 000027
【図５】
2007530008.tif 000028
【国際調査報告】
2007530008.tif 000029
2007530008.tif 000030
2007530008.tif 000031
2007530008.tif 000032