(57)【要約】【課題】  新規バイオマーカーの発見およびこれらの通常的な臨床使用へ転換【解決手段】  生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の検出のための組成物および方法、ならびにヒトおよび非ヒト哺乳動物における癌の診断におけるこのような組成物および方法の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の生体サンプルにおいて抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するイムノアッセイであって、ステップ：
（ａ）生体サンプルを抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原と接触させるステップ、接触はサンプル中に存在するならば抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が抗原と結合し、抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体を形成するのに十分な条件下でなされる；
（ｂ）形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体を抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子と接触させるステップ、接触は抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体の抗ＥＣＰＫＡ自己抗体と結合し、拡大した複合体を形成するのに十分な条件下でなされる；および
（ｃ）形成した拡大した複合体の存在または濃度を測定することにより生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するステップ
を含むイムノアッセイ。
【請求項２】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が細胞外ＰＫＡタンパク質である、請求項１のイムノアッセイ。
【請求項３】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が該哺乳動物のとは異なる哺乳動物の種の抗体であり、該哺乳動物により産生された抗体に特異的である、請求項１のイムノアッセイ。
【請求項４】
哺乳動物がヒトであり、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がヒトＩｇＧ抗体である、請求項３のイムノアッセイ。
【請求項５】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている、請求項１のイムノアッセイ。
【請求項６】
検出可能な標識が化学標識である、請求項５のイムノアッセイ。
【請求項７】
ステップ（ａ）において、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の前に固体支持体に固定化される、請求項１のイムノアッセイ。
【請求項８】
ステップ（ａ）において、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の後に固体支持体に固定化される、請求項１のイムノアッセイ。
【請求項９】
イムノアッセイが免疫クロマトグラフィーイムノアッセイであり、ここで：
ステップ（ａ）において、生体サンプルは第１の多孔質担体との接触下におかれ、第１の多孔質担体は抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な非固定化、標識抗原を含む；
ステップ（ｂ）において、形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体は第２の多孔質担体との接触下におかれ、第２の多孔質担体は第１の多孔質担体と連通しており、固定化抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子を含む；および 
ステップ（ｃ）において、生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度が、第２の多孔質担体における抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な標識抗原の存在を検出することにより測定される、
請求項１のイムノアッセイ。
【請求項１０】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に結合する抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原を含む免疫複合体であって、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がさらに抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子に結合する免疫複合体。
【請求項１１】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が細胞外ＰＫＡタンパク質である、請求項１０の免疫複合体。
【請求項１２】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている、請求項１０の免疫複合体。
【請求項１３】
検出可能な標識が化学標識である、請求項１２の免疫複合体。
【請求項１４】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が免疫分子である、請求項１０の免疫複合体。
【請求項１５】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がヒト自己抗体であり、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求項１４の免疫複合体。
【請求項１６】
哺乳動物の生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するためのキットであって、キットは多層フィルターシステム、ならびに第１および第２の多孔質担体を含む中空のケースを含み、そこで第２の多孔質担体は第１の多孔質担体と連通しており、第１の多孔質担体は多層フィルターシステムと連通しており、その一部は該ケースから到達可能である；ここで： 
第１の多孔質担体は非固定化、標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントを含み；および
第２の多孔質担体はヒトＩｇＧに結合する固定化、非標識抗体を含む。
【請求項１７】
標識ＰＫＡ ＣαがＥＣＰＫＡである、請求項１６のキット。
【請求項１８】
標識ＰＫＡ Ｃαの標識が化学標識である、請求項１６のキット。
【請求項１９】
キットがヒト抗ＥＣＰＫＡ自己抗体を検出し、ヒトＩｇＧに結合する抗体が非ヒト哺乳動物の抗体である、請求項１６のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の検出のための組成物および方法、ならびにヒトおよび非ヒト哺乳動物における癌の診断におけるこのような組成物および方法の使用に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許出願番号６０／５５０，３４８（２００４年３月８日出願）、および６０／５５１，７７６（２００４年３月１１日出願）に対して優先権を主張するものであり、これらの出願は参照することによりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（政府利益の記載）
本発明は、国立衛生研究所のＮＣＩ内部研究プログラムＣＣＲから資金援助を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
腫瘍マーカーは、悪性細胞により合成され、血流中に放出される。このようなマーカーはまた、浸潤に応答してまたは腫瘍誘導代謝性変化の結果として、宿主組織により産生され得る。血液または組織液中の腫瘍マーカーのレベルは、腫瘍の進行または退縮の診断、スクリーニング、および監視に役立つ。理想的な腫瘍マーカーは、簡単な血液検査で癌を検出することができ、そのレベルは腫瘍進行の段階と相関するであろう。しかしながら、感度および特異性の欠如により、一般の健康集団または最も危険度の高い集団における単独マーカーはこれまでに確立されていない。癌診断における腫瘍マーカーの使用については、（Sluss, P. M. et al. [2004]" ESTABLISHMENT OF A CENTRAL LABORATORY SERUM TUMOR MARKER SERVICE ON A CONSOLIDATED IMMUNODIAGNOSTIC PLATFORM: DEVELOPMENT OF PRACTICE STANDARDS, SERVICE IMPROVEMENTS, AND OPERATIONAL EFFICIENCY, " Clin Leadersh Manag Rev. 18[1]:25-31; Gion, M. [2000]"SERUM TUMOUR MARKERS: FROM QUALITY CONTROL TO TOTAL QUALITY MANAGEMENT," Breast 9 [6]:306-11;. Wiesner,A. [2004] "DETECTION OF TUMOR MARKERS WITH PROTEINCHIP（登録商標） TECHNOLOGY," Curr Pharm Biotechnol. Feb;5[l]: 45-67; Crawford, N.P. et al.[2003] "TUMOR MARKERS AND COLORECTAL CANCER: UTILITY IN MANAGEMENT," J Surg Oncol.84 [4]: 239-48; Agnantis, N.J. et al.[2003] "TUMOR MARKERS. AN UPDATE APPROACH FOR THEIR PROGNOSTIC SIGNIFICANCE. PART I. IN VIVO," 17 [6]: 609-18; Riley, R. D. et al. [2004] "A SYSTEMATIC REVIEW OF MOLECULAR AND BIOLOGICAL TUMOR MARKERS IN NEUROBLASTOMA," Clin Cancer Res. 10 [1 Pt 1]: 4-12; Given, M. et al. [2000] "THE PREDICTIVE OF TUMOUR MARKERS CA 15-3, TPS AND CEA IN BREAST CANCER RECURRENCE,"Breast. 9 [5]: 277-80）に詳述されている。
【０００５】
現在利用可能な癌マーカーは、癌抗原を測定する。例えば、前立腺癌は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）癌マーカーを測定することにより診断することができる（Gretzer, M.B. et al. [2003] "PSA MARKERS IN PROSTATE CANCER DETECTION," Urol Clin North Am. 30 [4]: 677-86）。癌胎児抗原（ＣＥＡ）マーカーは、結腸直腸癌の評価において診断有用性を持つことが明らかにされている（Crawford, N. P. et al. [2003] "TUMOR MARKERS AND COLORECTAL CANCER: UTILITY IN MANAGEMENT," J Surg Oncol. 84 [4]: 239-48）。癌抗原、ＣＡ１５−３は、乳癌と関連付けられている（Cheung, K. L. et al.[2003] "OBJECTIVE MEASUREMENT OF REMISSION AND PROGRESSION IN METASTATIC BREAST CANCER BY THE USE OF SERUM TUMOUR MARKERS," Minerva Chir. Jun;58[3]:297-303）。癌抗原、ＣＡ１９−９は、消化管癌を診断するのに使用されている（Grotowski, M. [2002] "ANTIGENS [CEA AND CA 19-9] IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS COLORECTAL CANCER," Pol Merkuriusz Lek. 12[67]:77-80;Trompetas, V. et al. [2002] "GIANT BENIGN TRUE CYST OF THE SPLEEN WITH HIGH SERUM LEVEL OF CA19-9," Eur J Gastroenterol Hepatol. 14[1]: 85-8）。癌抗原、ＣＡ１２５は、卵巣癌を診断するのに用いられている（Anderiesz, C. et al.[2003]"SCREENING FOR OVARIAN CANCER," Med J Aust. 178 [12]:655-6）。
【０００６】
固形腫瘍の大部分は、細胞分裂の間に染色体分離の異常により生じる染色体不安定性を示す。いくつかの酵素的キナーゼが、適切な染色体分離の維持および細胞周期進行の調節に関与している。このようなキナーゼの１つである、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）は、細胞シグナリング、代謝、および増殖の多方面において機能的役割を有するようである（Matyakhina, L. et al.[2002] "PROTEIN KINASE A AND CHROMOSOMAL STABILITY," Ann NY Acad Sci. 968: 148-57; Tortora, G. et al. [2002] "PROTEIN KINASE A AS TARGET FOR NOVEL INTEGRATED STRATEGIES OF CANCER THERAPY," Ann NY Acad Sci. 968: 139-47）。
【０００７】
哺乳動物の細胞は、２種類のｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）種を保有している（Krebs, E.G. et al. [1979] "PHOSPHORYLATION-DEPHOSPHORYLATION OF ENZYMES," Annu Rev Biochem. 48:923-39）。これらのプロテインキナーゼは、Ｉ型（ＰＫＡ−Ｉ）およびＩＩ型（ＰＫＡ−ＩＩ）と表わされており；それらは異なる調節サブユニット（Ｒサブユニット）ＲＩおよびＲＩＩにより区別されており、共通の触媒サブユニット（Ｃサブユニット）を共有している（Beebe, S.J. et al.[1986] "CYCLIC NUCLEOTIDE-DEPENDENT PROTEIN KINASES," In: The Enzymes: Control by Phosphorylation, E.G. Krebs et al. [Eds] Academic Press: Orlando and London. pp.43-111）。
【０００８】
従来、プロテインキナーゼの酵素活性は、(γ−３２Ｐ) ＡＴＰから適切なタンパク質またはペプチド基質の残基への放射性リン酸基の移行により測定されている（例えば、Witt, J. J. et al. [1975] Anal Biochem. 66: 253-8; Casnellie, J. E. [1991] Methods Enzymol. 200: 115-20;米国特許6,498,005号参照）。ＰＫＡ酵素アッセイは、（Cohen, C.B. et al.[1999] "A MICROCHIP-BASED ENZYME ASSAY FOR PROTEIN KINASE A," Anal Chem. [1999] 273: 89-97; Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RIIBETASUBUNIT OVEREXPRESSION,” Proc Natl Acad Sci USA. 97[2]:835-40）に記載されている。
【０００９】
生化学研究および遺伝子クローニングを通じて、Ｒサブユニットの４つのアイソフォーム、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、およびＲＩＩβが同定されている（Amieux, P.S. et al. [2002] "THE ESSENTIAL ROLE OF RI ALPHA IN THE MAINTENANCE OF REGULATED PKA ACTIVITY," Ann NY Acad Sci. 968: 75-95; McKnight, G.S. et al. [1988] "ANALYSIS OF cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE SYSTEM USING MOLECULAR GENETIC APPROACHES," Recent Prog Honn Res. 44: 307-35; Levy, F.O. et al. [1988] "MOLECULAR CLONING, COMPLEMENTARY DEOXYRIBONUCLEIC ACID STRUCTURE AND PREDICTED FULL-LENGTH AMINO ACID SEQUENCE OF THE HORMONE-INDUCIBLE REGULATORY SUBUNIT OF 3',5'-CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE-DEPENDENT PROTEIN KINASE FROM HUMAN TESTIS," Mol Endocrinol. 2: 1364-73）。
【００１０】
重要なことに、ＰＫＡ−ＩのＰＫＡ−ＩＩに対する比は、細胞発生、分化、および形質転換の間に劇的に変化し得る（Lohmann, S. M. et al.[1984] "REGULATION OF THE CELLULAR AND SUBCELLULAR CONCENTRATIONS AND DISTRIBUTION OF CYCLIC NUCLEOTIDE-DEPENDENT PROTEIN KINASES, "In: Advances in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research, P. Greengard et al. [Eds] Raven Press: New York. pp.63-117; Cho-Chung, Y. S. [1990] "ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEINS IN GROWTH, DIFFERENTIATION, AND SUPPRESSION OF MALIGNANCY: NEW APPROACHES TO THERAPY, "Cancer Res. 50: 7093-100; Cho-Chung, Y.S. [2003] "cAMP SIGNALING IN CANCER GENESIS AND TREATMENT," Cancer Treat Res. 115: 123-43）。
【００１１】
ｃＡＭＰシグナリング経路は、リンパ性悪性腫瘍における治療標的として提唱されている（Lerner, A. et al. [2000] "THE cAMP SIGNALING PATHWAY AS A THERAPEUTIC TARGET IN LYMPHOID MALIGNANCIES," Leuk Lymphoma. 37 [1-2]: 39-51; Cho-Chung, Y.S. et al. [1995] "cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE: ROLE IN NORMAL AND MALIGNANT GROWTH," Crit Rev Oncol Hematol. 21 [1-3]: 33-61; Cho-Chung, Y.S. et al. [1993] "THE REGULATORY SUBUNIT OF cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE AS A TARGET FOR CHEMOTHERAPY OF CANCER AND OTHER CELLULAR DYSFUNCTIONAL-RELATED DISEASES," Pharmacol Ther. 60[2]: 265-88）。正常対応物と比べて、ＲＩα／ＰＫＡ−Ｉの発現上昇がヒト癌細胞株および原発腫瘍において確認されており（Cho-Chung, Y.S. [1990] "ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEINS IN GROWTH, DIFFERENTIATION, AND SUPPRESSION OF MALIGNANCY: NEW APPROACHES TO THERAPY," Cancer Res. 50: 7093-100; Miller, W. R. et al. [1993] "TYPES OF CYCLIC AMP BINDING PROTEINS IN HUMAN BREAST CANCERS," Eur J Cancer. 29A: 989-91）、それは化学またはウイルス発癌物質およびＫｉ−ｒａｓ癌遺伝子または形質転換増殖因子−αでの形質転換後、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子またはホルボールエステルでの細胞増殖の刺激時の細胞においてである（Cho-Chung, Y. S. [1990] "ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEINS IN GROWTH, DIFFERENTIATION, AND SUPPRESSION OF MALIGNANCY: NEW APPROACHES TO THERAPY," Cancer Res. 50: 7093-100; Cho-Chung, Y.S. et al. [2002] "DISSECTING THE CIRCUITRY OF PROTEIN KINASE A AND cAMP SIGNALING IN CANCER GENESIS: ANTISENSE, MICROARRAY, GENE OVEREXPRESSION, AND TRANSCRIPTION FACTOR DECOY," Ann NY Acad Sci. 968: 22-36）。逆に、ＲＩα／ＰＫＡ−Ｉの発現の低下は、広範囲のヒト癌細胞株およびヌードマウスで増殖したヒト腫瘍において、部位選択的なｃＡＭＰアナログおよびＰＫＡのＲＩαサブユニットを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより誘導される増殖阻害と相関する（Cho-Chung, Y.S. et al.[1989] "SITE-SELECTIVE CYCLIC AMP ANALOGS AS NEW BIOLOGICAL TOOLS IN GROWTH CONTROL, DIFFERENTIATION AND PROTO-ONCOGENE REGULATION," Cancer Inv. 7: 161-77; Cho-Chung, Y. S. et al.[1999] "ANTISENSE DNA-TARGETING PROTEIN KINASE A-RIα SUBUNIT: A NOVEL APPROACH TO CANCER TREATMENT," Front Biosci. 4: D898-D907）。
【００１２】
様々な癌細胞タイプがＰＫＡを馴化培地中に分泌することが、これまでに立証されている（Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHAAND RIIBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc Natl Acad Sci USA. 97[2]: 835-40）。この細胞外プロテインキナーゼＡ（ＥＣＰＫＡ）は、活性、遊離触媒サブユニット（Ｃサブユニット）型（「ＰＫＡ Ｃα」）で存在し、その活性は、ＰＫＡ阻害タンパク質ＰＫＩにより特異的に阻害される。発現ベクター中のＰＫＡのＣαまたはＲＩαサブユニット遺伝子の過剰発現は、細胞内ＰＫＡ−Ｉをアップレギュレートし、ＥＣＰＫＡ発現を顕著にアップレギュレートする。対照的に、ＰＫＡ−Ｉを除去し、ＰＫＡ−ＩＩをアップレギュレートし、形質転換した表現型を復帰させるＲＩＩβサブユニットの過剰発現は、ＥＣＰＫＡをダウンレギュレートする。ミリスチル化を妨げるＣα遺伝子の変異は、細胞内ＰＫＡアップレギュレーションをもたらすが、ＥＣＰＫＡ上昇を阻止し、ＣαのＮＨ２末端ミリスチル基がＥＣＰＫＡ発現に必要であるということを示唆している。癌患者の血清において、ＥＣＰＫＡ発現は、正常血清とは対照的に、顕著にアップレギュレートされている（Cho, Y. S. et al.[2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHAAND RIIBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc Natl Acad Sci USA. 97[2]: 835-40）。
【００１３】
モノクローナル抗体の開発は、悪性腫瘍の患者の血清および組織における多数の腫瘍関連抗原の同定をもたらしてきた。癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子のタンパク質生成物は、細胞外液中で検出され得、インビボで発癌の潜在的なマーカーとして働く。これらの増殖因子の中には、癌遺伝子によりコード化されているものもある。例えば、高レベルのｐ２ｌ−ｒａｓタンパク質は、患者の血液中に見られるｒａｓ癌遺伝子によりコード化されている。ｐ５３腫瘍抑制タンパク質に対する循環抗体は、乳および肺癌の患者の血清ならびにＢ細胞リンパ腫の子供において見出されている（Winter, S.F. et al. [1992] "DEVELOPMENT OF ANTIBODIES AGAINST p53 IN LUNG CANCER PATIENTS APPEARS TO BE DEPENDENT ON THE TYPE OF p53 MUTATION. "Cancer Res. 52: 4168-74; Lubin, R., et al. [1993] "ANALYSIS OF P53 ANTIBODIES IN PATIENTS WITH VARIOUS CANCERS DEFINE B-CELL EPITOPES OF HUMAN p53: DISTRIBUTION ON PRIMARY STRUCTURE AND EXPOSURE ON PROTEIN SURFACE." Cancer Res. 53: 5872-6; Crawford, L.V., et al. [1982] "DETECTION OF ANTIBODIES AGAINST THE CELLULAR PROTEIN p53 IN SERA FROM PATIENTS WITH BREAST CANCER." Int. J. Cancer. 30: 403-8）。ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂなどの癌遺伝子に対する抗体も、結腸直腸および乳房腫瘍の患者の血清において見出されている（Sorokine, I., K. et al. [1991] "PRESENCE OF CIRCULATING ANTI-C-MYB ONCOGENE PRODUCT ANTIBODIES IN HUMAN SERA." Int. J. Cancer. 47: 665-9; Ben-Mahrez, K., et al. [1988] "DETECTION OF CIRCULATING ANTIBODIES AGAINST C-MYC PROTEIN IN CANCER PATIENT SERA." Br J Cancer. 57: 529-34; Ben-Mahrez, K., et al. [1990] "CIRCULATING ANTIBODIES AGAINST C-MYC ONCOGENE PRODUCT IN SERA OF COLORECTAL CANCER PATIENTS." Int J Cancer. 46: 35-8）。
【００１４】
上述の新規マーカーに加えて、他のいくつかのタンパク質、ホルモン、および酵素が、過去３０年間マーカーとして用いられてきた。これらの中で注目すべきは、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、および前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）である。しかしながら、これらのマーカーの多くは、特異性を欠いている。これらのレベルは、良性症状下および妊娠の間にも上昇する。これらのマーカーの全ては、抗原定量法に基づいている；マーカーは特異性および感度を欠いている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
新規バイオマーカーの発見およびこれらを通常的な臨床使用へ転換することが大いに必要とされている。本発明は、このような必要性に向けられている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、細胞外プロテインキナーゼＡ（ＥＣＰＫＡ）に対するＩｇＧ抗体を測定するための高感度酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に関する。様々なタイプの癌の２９５患者および癌でない１００個人由来の血清を検査した。抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体の度数は、癌ではないもの（１４％）に比し癌患者（９２％）において有意に高いということを見出した。ＥＩＡにより測定された抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体とＰＫＡ酵素的アッセイにより測定されたＥＣＰＫＡ抗原との間には有意な相関関係はなく、抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体−ＥＩＡ法は、ＥＣＰＫＡ酵素的アッセイよりもより優れた感度および特異性をもたらした。これらの結果は、従来の抗原解析よりもむしろ自己抗体解析のアプローチが、癌診断に対する有用なアプローチを提供するということを立証している。
【００１７】
詳細には、本発明は、哺乳動物の生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するイムノアッセイを提供し、ここで該イムノアッセイはステップ：
（ａ）生体サンプルを抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原と接触させるステップ、該接触はサンプル中に存在するならば抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が抗原と結合し、抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体を形成するのに十分な条件下でなされる；
（ｂ）形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体を抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子と接触させるステップ、該接触は抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体の抗ＥＣＰＫＡ自己抗体と結合し、拡大した複合体を形成するのに十分な条件下でなされる；および
（ｃ）形成した拡大した複合体の存在または濃度を測定することにより、生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するステップ
を含む。
【００１８】
本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が細胞外ＰＫＡタンパク質である、上述のイムノアッセイの実施態様に関する。
【００１９】
本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が、該哺乳動物のとは異なる哺乳動物の種の抗体であり、該哺乳動物により産生された抗体に特異的である、上述のイムノアッセイの実施態様に関する。
【００２０】
本発明はさらに、哺乳動物がヒトであり、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がヒトＩｇＧ抗体である、上述のイムノアッセイの実施態様に関する。本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている（特に、化学または酵素標識で）、上述のイムノアッセイの実施態様に関する。
【００２１】
本発明はさらに、ステップ（ａ）において、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の前に固体担体に固定化される、上述のイムノアッセイの実施態様に関する。
【００２２】
本発明はさらに、ステップ（ａ）において、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の後に固体担体に固定化される、上述のイムノアッセイの実施態様に関する。
【００２３】
本発明はさらに、イムノアッセイが免疫クロマトグラフィーイムノアッセイである、上述のイムノアッセイの実施態様に関し、ここで：
ステップ（ａ）において、生体サンプルは第１の多孔質担体との接触下におかれ、該第１の多孔質担体は抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な非固定化、標識抗原を含む；
ステップ（ｂ）において、形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体は第２の多孔質担体との接触下におかれ、該第２の多孔質担体は該第１の多孔質担体と連通しており、固定化抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子を含む；および
ステップ（ｃ）において、生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度が、該第２の多孔質担体において抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な標識抗原の存在を検出することにより測定される。
【００２４】
本発明の抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に結合する抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原を含む免疫複合体、ここで抗ＥＣＰＫＡ自己抗体はさらに抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子に結合する。
【００２５】
本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が細胞外ＰＫＡタンパク質である、上述の免疫複合体の実施態様に関する。
【００２６】
本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている（特に、化学または酵素標識で）、上述の免疫複合体の実施態様に関する。
【００２７】
本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が免疫分子である、上述の免疫複合体の実施態様に関する。本発明はさらに、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がヒト自己抗体であり、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が抗ヒトＩｇＧ抗体である、上述の免疫複合体の実施態様に関する。
【００２８】
本発明はさらに、哺乳動物の生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するキットに関し、ここで該キットは多層フィルターシステム、ならびに第１および第２の多孔質担体を含む中空のケースを含み、そこで第２の多孔質担体は該第１の多孔質担体と連通しており、第１の多孔質担体は該多層フィルターシステムと連通しており、その一部は該ケースから到達可能である；ここで：
第１の多孔質担体は非固定化、標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントを含み；および
第２の多孔質担体はヒトＩｇＧに結合する固定化、非標識抗体を含む。
【００２９】
本発明はさらに、標識ＰＫＡ ＣαがＥＣＰＫＡである（特に、化学または酵素標識）、上述のキットの実施態様に関する。
【００３０】
本発明はさらに、キットがヒト抗ＥＣＰＫＡ自己抗体を検出し、ヒトＩｇＧに結合する抗体が非ヒト哺乳動物の抗体である、上述のキットの実施態様に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の検出のための組成物および方法、ならびにヒトおよび非ヒト哺乳動物（特にイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびウマの哺乳動物)における癌の診断におけるこのような組成物および方法の使用に関する。
【００３２】
ＰＫＡの細胞外型（ＥＣＰＫＡ）は、癌細胞から分泌される (Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RIIBETASUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc Natl Acad Sci USA. 97[2]: 835-40)。本発明は、一部においては、ＥＣＰＫＡ分泌が血清自己抗体の形成を誘発し、このような自己抗体の存在および／または濃度が癌診断および予後徴候マーカーとして働き得るという認識に由来する。ここで述べるように、本発明は、癌の疑いがあるおよび確定された患者の生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体（特に、抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体）の濃度および／または存在を測定する高感度のイムノアッセイを提供する。この自己抗体に基づくイムノアッセイ方法は、様々な癌細胞タイプを検出するための通常的な診断方法を提供する。
【００３３】
本発明は、抗原と抗体の結合に関する。ここで、「エピトープ」とは、抗体により認識され特異的に抗体結合する抗原の２または３次元領域である。ここで、抗原および抗体は互いに免疫特異的に結合できるのであれば、互いに「特異的」で、または互いに「認識」し、または互いに「結合」するといえる。
【００３４】
さまざまなアッセイ形式が、本発明の方法に従って用いられ得る。このような形式は、不均一系または均一系、連続的または同時的、競合的または非競合的であり得る。米国特許5,563,036号；5,627,080号；5,633,141号；5,679,525号；5,691,147号；5,698,411号；5,747,352号；5,811,526号；5,851,778号；および5,976,822号は、いくつかの異なるアッセイ形式および用途を例証している。このようなアッセイは、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の濃度または量を測定するために、定量的となるようにフォーマットでき、または抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または非存在を測定するために、定量的となるようにフォーマットされ得る。
【００３５】
不均一系イムノアッセイ法は、典型的には反応生成物が結合する固相材料の使用を含むが、非固定化抗原と抗体の結合（すなわち、溶液相イムノアッセイ）を含むように適合させることもできる。反応生成物は、固相を反応混合物から除去することにより（例えば、洗浄による）、過剰のサンプル、アッセイ試薬、および他の物質から分離される。本発明に従って用いられ得る固相イムノアッセイの１種は、サンドイッチイムノアッセイである。サンドイッチアッセイにおいて、より多くの分析物がサンプル中に存在すれば、より大きな量の標識が固相上に現れる。このタイプのアッセイ形式が、特に低い分析物濃度の視覚化のために、一般的に好ましく、それは固相上の標識の出現がより容易に検出されるからである。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体と特異的に反応する抗原を、固体支持体に結合させ（すなわち、固定化）、抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体の存在が検査される生体サンプルとの接触下でインキュベートする。分かるように、抗原は、非結合状態で生体サンプルとのインキュベート後、続いて固体支持体に結合し得る（すなわち、固定可能に（immobilizable））。支持体は次いで、存在するが結合抗原に結合し損ねたであろう非ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体を実質的に除去するために、好ましくは徹底的に処理される（例えば、洗浄により、など）。このような処理の結果、抗原と抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体との間で免疫複合体が形成する。
【００３７】
次に検出可能な程度に標識された２次抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体）を好ましくは添加し、支持体は、２次抗体が存在し得るいかなる抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体とも結合するのに十分な条件下でインキュベートされる。支持体は次いで、いかなる非結合２次抗体をも実質的に除去するために、好ましくは徹底的に処理される（例えば、洗浄による、など）。抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体が検査サンプル中に存在するのであれば、次いで２つの抗体は分析物と免疫複合体（すなわち、２次抗体／抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体／抗原サンドイッチ）を形成するであろう。このようなアッセイにおいて、支持体に結合した２次抗体の検出は、検査されている液体における抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体の指標となる。サンドイッチアッセイ形式は、Schuurs et al.米国特許3,791,932号および4,016,043号、ならびにPankratz, et al., 米国特許5,876,935号に記載されている。２次抗体は、非ヒト霊長類から単離された天然免疫グロブリン（例えば、抗ヒトＩｇＧマウス抗体、抗ヒトＩｇＧヤギ抗体、など）であり得、または組換えでまたは合成的に作製できる。それは完全免疫グロブリン、または免疫グロブリンフラグメント（例えば、ＦＡｂ、Ｆ[Ａｂ]２、など）であり得る。所望により、他の結合分子（抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に結合することができる)を、このような２次抗体と合わせてまたは代わりに用いることができる。例えば、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体はビオチン化することができ、また２次抗体は標識アビジンまたはストレプトアビジンと置き換えることもできる。
【００３８】
バウンド・フリー（bound-free）分離ステップを削除し、化学的結合アッセイに必要な時間および道具を減らすために、均一系アッセイ形式が代わりに用いられ得る。このようなアッセイにおいて、結合ペアの１つの成分は、固定化されたままであり得る；しかしながら、結合ペアの第２の成分の存在は、バウンド・フリー分離なしで検出される。均一系光学的方法の例は、蛍光消光の検出を通じて機能するSyva, Inc.（Sunnyvale, CA）のＥＭＩＴ法；光散乱における変化を検出することにより機能するBehringwerke社（Marburg, Germany）のレーザーネフロメトリーラテックス粒子凝集法；三菱化成工業株式会社（Mitsubishi Chemical Industries）(Tokyo, Japan)のＬＰＩＡラテックス粒子凝集法；アボット・ラボラトリーズ（Abbott Park, IL）のＴＤＸ蛍光偏光解消法；およびCis Bio International社（Paris, France）の蛍光エネルギー移行法である。このようなアッセイのいずれも、本発明の目的に従って用いるのに適合させられ得る。
【００３９】
本発明の結合アッセイは、競合的アッセイとして設定され得る。競合的アッセイにおいて、より多くの抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体が検査サンプルに存在すれば、より少ない量の標識が固相上に現れる。
【００４０】
サンドイッチアッセイと同様の方法において、競合的アッセイは、規定の量の標識抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体を提供し、検査されている液体が、支持体への結合に対して標識抗体と競合するであろう抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体を含んでいるかどうかを測定することにより実施することができる。このような競合的アッセイにおいて、捕捉された標識抗体の量は、検査サンプル中に存在する分析物の量に反比例している。Smith（米国特許4,401,764号）は、分析物または標識分析物を結合することができるが、そこで分析物および標識分析物は同時に複合体に結合することができない混合結合複合体を用いる、別の競合的アッセイ形式を記載している。Clagett（米国特許4,746,631号）は、そこで分析物／リガンド／マーカーコンジュゲートが検査サンプル分析物の存在下で反応表面から移動させられ、そしてそこで移動した分析物／リガンド／マーカーコンジュゲートが、第２の反応部位で固定化される反応チャンバーを用いるイムノアッセイ法を記載している。コンジュゲートには、ビオチン、ウシ血清アルブミン、およびコンジュゲートのリガンド成分としての合成ペプチド、および酵素、化学発光法材料、酵素阻害剤、およびコンジュゲートのマーカー成分としての放射性ヌクレオチドが挙げられる。Li（米国特許4,661,444号）は、検出可能な標識に特異的である、抗イディオタイプ抗体と２次抗体のコンジュゲートを用いる競合的イムノアッセイを記載しており、そこで検出可能な応答はサンプル中の分析物の存在に反比例している。Allen（欧州特許出願177,191号）は、リガンドアナログとフルオレセインなどの２次試薬のコンジュゲートを伴う結合アッセイを記載しており、そこでコンジュゲートは、リガンドに特異的な標識結合パートナーとの結合において分析物（リガンド）と競合しており、そこで結果として生じた標識コンジュゲートが次いで２次試薬に対する結合パートナーを保有する固相を用いて反応混合物から分離される。この結合アッセイ形式は、競合的結合技術と逆サンドイッチアッセイ配置の使用を組み合わせる；すなわち、固相へのコンジュゲートの結合による混合物からのコンジュゲートの分離より前の、標識結合メンバーへのコンジュゲートの結合。しかしながら、アッセイの結果は、そこで固相に結合した標識の量が検査サンプル中の分析物の量と反比例している、従来の競合的アッセイとして定められる。Chieregatt et al.（英国特許2,084,317号）は、分析物に特異的な標識結合パートナーを間接的に用いる同様のアッセイ形式を記載している。Mochida et al.（米国特許4,185,084号）はまた、固定化抗体への結合に対し抗原分析物と競合し、次いで標識化される二重−抗原コンジュゲートの使用を記載している。この方法はまた、そこで標識の量が検査サンプル中の分析物の量と反比例している固相上の標識の検出をもたらす。Sadeh et al.（米国特許4,243,749号）は、そこでハプテンコンジュゲートが固相上に固定化された抗体との結合に対し分析物と競合する、同様の酵素イムノアッセイを記載している。これらの様々なアッセイのいずれも、本発明に従って用いられ得る。
【００４１】
このようなアッセイ形式の全てにおいて、アッセイ試薬の少なくとも１つの成分は、好ましくは標識されておりまたはそうでなければ光の発生または消光により検出可能である。このような成分は、用いるイムノアッセイ形式に応じて、２次抗体、抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体、または抗ＥＣＰＫＡ ＩｇＧ抗体に結合する抗原であり得る。ラジオアイソトープ−結合アッセイ形式（例えば、ラジオイムノアッセイ、など）は、このような標識としてラジオアイソトープを用いる；シグナルは、蛍光または蛍光発生的成分の存在下で光の発生により検出可能である（Lucas et al.［米国特許5,698,411号］およびLandrum et al.［米国特許5,976,822号］参照）。酵素−結合アッセイ形式（例えば、ＥＬＩＳＡ、など）は、標識として酵素を用いる；シグナルは、色素生産性または蛍光発生的成分の存在下で色または光の発生により検出可能である。常磁性ラベル、カラー粒子などとして用いられる材料、ラテックス粒子、セレンおよび金などのコロイド金属、ならびに色素粒子などの他の標識（米国特許4,313,734号；4,373,932号、および5,501,985号参照）もまた、用い得る。検出可能な標識としての酵素（特に、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、またはウレアーゼ）の使用（すなわち、酵素イムノアッセイまたはＥＩＡ）が好ましい。
【００４２】
酵素標識の存在は、色素生産性基質（蛍光、ＵＶ、可視光、などを発生または吸着するものを含む）の使用を通じ、酵素標識による触媒作用に応えて検出され得る。より好ましくは、化学的標識が用いられ得る（例えば、コロイド金、ラテックスビーズ標識、など）。標識の検出は、マルチ検出器、マルチパスフィルター、格子、またはスペクトル的に異なる蛍光（例えば、米国特許5,759,781号参照）、などを用いて達成することができる。酵素標識としてペルオキシダーゼを、特に、色素生産性基質３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と合わせて用いることが、特に好ましい。酵素としてペルオキシダーゼで抗体を標識化する場合、過ヨウ素酸塩法（Nakane, P.K. et al. [1974] “PEROXIDASE-LABELED ANTIBODY. A NEW METHOD OF CONJUGATION,” J Histochem Cytochem. 22:1084-90）、またはそこでパートナーがヘテロ二官能性試薬と結びついていると報告されている方法（Ishikawa, E. et al. [1983] “ENZYME-LABELING OF ANTIBODIES AND THEIR FRAGMENTS FOR ENZYME IMMUNOASSAY AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING,” J Immunoassay. 4[3]:209-327）を用いることが可能である。
【００４３】
いかなる多種多様な固体支持体も本発明のイムノアッセイにおいて用いられ得る。固体支持体に適切な材料は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、または他の合成高分子のような合成品、セルロースのような天然高分子、酢酸セルロースまたはニトロセルロースのような誘導体化した天然高分子、およびガラス、特にグラスファイバーである。支持体は、球、棒、チューブ、およびマイクロアッセイまたはマイクロタイタープレートの形態をとることができる。紙片、小板、および膜のようなシート状の構造も、同様に適切である。担体の表面は、水溶液に対して透過性および不透過性であり得る。
【００４４】
前述の記載は、液体（例えば、血清、血液、尿、唾液、膵液、脳脊髄液、精液、など）である生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在を測定することに関するが、いかなる液体生体サンプル（例えば、組織またはバイオプシー抽出物、便抽出物、痰、など）も同様に本発明のアッセイに用いられ得るということが十分理解されるであろう。最も好ましくは、測定される生体サンプルは血清である。
【００４５】
本発明のアッセイにおいて用いられる材料は、理想的にはキットの調製にふさわしい。このようなキットは、厳重な管理を受けられるように区分化された担体を含み得る；１以上の容器は、バイアル、チューブなどで；各容器は、該方法において用いられる個別の成分の１つを含む。例えば、容器の１つは、固体支持体に結合した適切な抗原（ＥＣＰＫＡ（ＰＫＡ Ｃα、またはＣαフラグメント）または１以上の異なるタイプの癌細胞および腫瘍の抽出物など）を含み得る。第２の容器は、可溶性の、検出可能な程度に標識した２次抗体を、好ましくは凍結乾燥した形態、または溶液で含み得る。さらに、キットはまた、１以上の容器を含み得、その各々は（異なる）所定の量のＥＣＰＫＡ（ＰＫＡ Ｃα、またはＣαフラグメント）または抗ＥＣＰＫＡ（ＰＫＡ Ｃα）自己抗体を含む。これらの後者の容器は、未知量のＥＣＰＫＡに対する自己抗体を含むサンプルから得られた結果を内挿することができる標準曲線を作成するのに用いることができる。
【００４６】
キットの使用において、全使用者がしなくてはならないのは、測定可能であるが未知量のＥＣＰＫＡに対する自己抗体を含んでいることが疑われる前測定した量のサンプルを、第１の容器に存在している前測定した量の支持体−結合抗原を、および第２の容器に存在している前測定した量の検出可能な程度に標識した２次抗体を容器に添加することである。適当な時間のインキュベーションの後、免疫複合体が形成され、上澄み液から分離され、そして、放射能計測、酵素基質の添加、および着色により、または化学的標識（例えば、コロイド金、ラテックスビーズ、など）の封入により免疫複合体または上澄み液が検出される。
【００４７】
本発明は特に、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体を検出するための免疫クロマトグラフィーアッセイ形式の使用に関する。好ましい免疫クロマトグラフィーアッセイ形式において、２つの接触しているが、空間的には別個の、多孔質担体が用いられる。最初に、このような担体は非固定化、標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメント (例えば、ＥＣＰＫＡ [Ｃα] またはプロテアーゼ消化物またはＣα) を含み、次に、このような担体はＩｇＧに結合する固定化されているが、非標識の抗体 (例えば、ヒト抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が測定される場合、非標識抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体であり得る)を含むであろう。
【００４８】
好ましくは、デバイスは、例えば、プラスチック材料、などから構築された中空ケースを含み、そこで第１の担体は、デバイスから到達可能である多層フィルターシステムを介して間接的にケースの内部と連通し（例えば、それから突出することによりまたはデバイスにより不完全に覆われることにより）、こうして、血清、血漿、または全血液検査サンプルを直接フィルターシステムに注入することができ、それから第１の多孔質担体へと浸透するであろう。このようなデバイスにおいて、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体を含む液体の浸透は、第１の担体の非固定化標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントを移動性の抗体と結合するようにし、そして次いで第２の担体へと浸透するであろう。第２の担体はヒトＩｇＧに結合する固定化抗体を含むので、第２の担体に流れ込むいかなる標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントも、その中で捕捉されるであろう。
【００４９】
このように、固定化非標識抗体を含む担体における標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントの検出は、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が、評価されるサンプルに存在することを示している。アッセイは、第２の多孔質担体の中で結合する標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントの量を測定することにより、定量的に行うことができる。
【００５０】
ここで本発明の概要を記載したので、本発明は、以下の実施例を参考にすることにより容易に理解されるであろう。実施例は例証を提供するものであり、特に示さない限り、本発明の制限を意味するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１
ヒトの癌診断における抗ECPKA自己抗体イムノアッセイとPKA酵素的アッセイの比較評価 
【００５２】
材料および方法 
対象：血清サンプルを、様々な癌細胞タイプの295ヒト患者および癌でない100個人から採取した。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）：癌患者および健常人の血清における抗ECPKA IgG自己抗体を、固相ELISAアッセイにより測定した。このようなアッセイのために、丸底塩化ビニルマイクロタイタープレート（round-bottom polyvinyl chloride microtiter plates）（Thermolab System, Helsinki, Finland）を、100μlの希釈（PBSで50μg/mlの濃度）精製した組換えヒトPKA Cα抗原（材料および方法、PKA Cαの精製を参照）でコートした。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液（20 mM Hepes, 0.9％NaCl, 30 mM スクロース−0.1 % ウシ血清アルブミン [BSA], pH 7.0）で１回洗浄し、各ウェルを水に溶解した（4 g/400 ml）100μlのBlockace（Serotec, http://www.serotec.com）で室温で２時間ブロックし、次いでプレートをクエン酸ナトリウム洗浄液（50 mM Na citrate, 0.15 M NaCl, 0.1 ％ モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン Tween（登録商標）20, pH 5.0-5.2）で２回洗浄した。血清サンプルをサンプル希釈緩衝液（PBS pH 7.4, 0.25％ BSA [fatty acid free fraction V], 0.05％ Tween 20）で25,000倍に希釈し、100μlの希釈したサンプルを各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間インキュベートした。クエン酸ナトリウム洗浄液で３回洗浄した後、100μlのPBS中の20,000倍希釈した抗ヒトIgG−HRP抗体−酵素コンジュゲート（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）、1％ BSAをウェルに添加し、その後プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをクエン酸ナトリウム洗浄液で５回洗浄した後、100μ1のTMB基質を添加した。反応を100μlの0.45 M H2S04試薬で停止し、その後450 nmでの吸光度をELISAリーダー (BioRad [Hercules, CA] microplate reader benchmark)に記録した。ELISA特異度は、1 mg/mLの最終濃度の上述の抗原と室温で１時間インキュベートした血清サンプルで、阻害検査を同時に行うことにより確定した。
PKA Cαの精製：OT1529-Cαプラスミド由来の組換えヒトPKA Cα (1.1 kb)（Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RIIBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc Natl Acad Sci USA. 97[2]: 835-40）をpQE31 DNAに注入し、pQE-Cαを産生した（Hong,S.H. Seoul National University, Seoul, Korea, unpublished）。pQE-Cαプラスミドを大腸菌で発現させ、天然PKA Cαタンパク質の精製を行った（Paragon, Baltimore MD）。
PKAアッセイ：PKAの酵素活性を、Rohlff, C. et al. (1993)の方法("8-Cl-cAMP INDUCES TRUNCATION AND DOWN-REGULATION OF THE RI ALPHA SUBUNIT AND UP-REGULATION OF THE RII BETA SUBUNIT OF CAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE LEADING TO TYPE II HOLOENZYME-DEPENDENT GROWTH INHIBITION AND DIFFERENTIATION OF HL-60 LEUKEMIA CELLS, "J Biol Chem. 268: 5774-82)により測定した。血清ECPKA活性の測定のために、アッセイ（全量、50μ1）を、反応混合物中（50mM Tris HCl [pH 7.5], 1mM DTT, 10mM MgCl2, 5μM Kemptide [PKAに対する合成基質；GIBCO/BRL], 1.2μM [γ-32P]ATP [25 Ci/mmol; ICN] 5μM cAMPおよび5μM PKI 有りまたは無し、を含有）および10μ1の血清中で３７℃で２０分実行した。インキュベーションの後、反応混合物をホスホセルロースディスク (GIBCO/BRL)上にスポットし、0.5％ リン酸中で３回洗浄した。フィルターを風乾し、液体シンチレーションカウンターによりカウントした。PKA活性の１ユニットは、標準アッセイ系において３７℃で１分間に1 pmolの32Pを（γ-32P）ATPから回収タンパク質に移行した酵素の量と定義した。LDH活性を、市販のキット（Sigma）を用いることにより測定した。
【００５３】
結果
ヒト患者および正常対照個人の血清を、上述のELISAを用いて検査し、正常対照血清の平均吸光度との比として抗ECPKA自己抗体力価を適宜表した。正常対照の抗ECPKA自己抗体力価より、1.0より大きい比をポジティブと見なした。
【００５４】
アッセイは、再現性があることが分かり、測定内および測定間CVsはそれぞれ＜8.8％および＜9.0％である。癌患者由来の血清における抗ECPKA自己抗体の値を図１に示す。患者の度数および平均力価の両方は、正常対照（度数=14％、平均力価0.60）のものより有意に高い（度数=92％、平均力価2.2）。
【００５５】
異なるカットオフ値で計算されたELISAアッセイの感度および特異度を、受信者動作特性（ROC）曲線で図示する（図２）。相互作用点で、抗ECPKA自己抗体力価に対するカットオフ値は1.0であり（図１）、ELISA検査に対する感度および特異度は、それぞれ、90％および89％である。
【００５６】
イムノブロッティングは、癌患者の血清における抗ECPKA自己抗体を同定した（図３）。ランダムに選択された患者血清は、精製したPKA Cαタンパク質（40 kDa）に向けて免疫交差反応性を示し（図３、帯2-7）、一方、Cαタンパク質に対するこのような免疫交差反応性は、正常血清では観察されなかった（図３、帯8-12）。
【００５７】
ECPKA酵素的アッセイ（抗原濃度を測定する）は、度数および平均値（患者、度数=83％、平均値=130 mU/ml；正常対照、度数=21％、平均値=60 mU/ml）において、癌患者（n=66）と正常対照（n=66）との間の著しい重複をもたらし、それは感度および特異度の欠如を示している(図４)。
【００５８】
個々のELISAにより得られた抗ECPKA自己抗体力価とPKA酵素的アッセイにより測定されたECPKAの比較を図５に示す。ELISAにより得られた抗ECPKA IgG抗体の力価と酵素的アッセイ（ECPKA抗原測定）により測定されたECPKAの間には何の相関関係もなかった。
【００５９】
実施例２
ヒトの癌における抗ECPKA自己抗体イムノアッセイおよびその使用に関する結論
【００６０】
本発明は、ECPKAに対する自己抗体の血清中の存在は、癌と高度に相関するということを立証する。抗ECPKA自己抗体用に開発されたELISAは、高感度かつ特異的であり、癌患者において顕著に高い抗ECPKA自己抗体力価（平均力価2.2、度数92％）を示すが、正常人対照においては低いまたはネガティブな力価および度数（14％）を示す。ELISAにより検出された度数と酵素的アッセイにより検出されたものとの比較は、ECPKAに対する自己抗体を検出するELISAが、抗原活性を測定する酵素的アッセイと比較して高感度かつ特異的であるということを示している。
【００６１】
本発明の自己抗体検出法が他の癌抗原（細胞外に分泌された）にまで拡大しうるかどうかを検討するために、以下の実験を行った：HCT-15腫瘍（ヌードマウスで増殖した多剤耐性ヒト大腸癌）を癌抗原源として用いた。腫瘍を、緩衝液＃10（20 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.5%デオキシコール酸ナトリウム, 5 mM MgCl2, プロテアーゼ阻害剤カクテルセット１ [Calbiochem] ）（1:3）、腫瘍１部（重量）、緩衝液３部（体積）、中でホモジナイズした。ホモジネートを10,000 rpmで１０分間遠心分離し、上清を回収した（抽出液）。抽出液を、４℃で１時間回転させながらプロテインＡセファロース（3:1）とインキュベートし、調合液を6,000 rpmで２分間遠心分離した。上清を回収し、PBSに対して４℃で１晩透析した。このような透析の後、抽出液は、ELISAにおいてマイクロタイタープレートをコーティングするのにすぐに使える。図６は、癌患者（n=36）および健康人（n=25）由来の血清中の抗癌抗原抗体の力価を示す。＞1.5（破線）の値がポジティブである。図７は、異なるタイプの癌 (肺、腎臓、メラノーマ、膵臓、卵巣、大腸、肝臓、胃、膀胱、および子宮頸癌、ならびに肉腫および平滑筋腫の癌患者由来の血清における抗原抗体の観察された力価を示す。患者の血清（n=36）および正常血清（n=25）は、図６のものと同じである。
【００６２】
結果は、本発明の自己抗体検出方法がヒトおよび動物における癌抗原の検出に用いることができるということを立証する。結果は、ECPKAに対する抗原および他の癌抗原よりも自己抗体を検出するためのELISAが、ヒトおよび動物における癌の診断に対する新しいアプローチを提供することを示している。
【００６３】
本明細書において言及した全ての出版物および特許は、各出版物または特許出願が参考として組み込まれることが具体的および個別に示されるのと同程度に、本明細書中で参考として組み込まれる。
【００６４】
本発明はその具体的な実施態様に関して記載しているが、さらなる改変が可能であること、および本願は本発明のいかなるバリエーション、使用、または適用をも網羅することを目的とすることが理解されるであろう。それは、一般的に、本発明の原理に従い、本発明が関する分野内で周知または慣行となるようなおよび上文に説明した本質的特徴に適用し得るような現在の開示からの逸脱を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明の好ましいイムノアッセイ形式を用いて正常人および癌患者で得られた値を示す。患者の度数および平均力価の両方は、正常対照（度数１４％、平均力価０．６）より有意に高い（度数＝９２％、平均力価２．２）。１．０より大きい値（点線の上）がポジティブである。
【図２】図２は、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体ＥＬＩＳＡ (図１)の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。交差点で、ＥＬＩＳＡアッセイに対するカットオフ値は１．０力価であり、感度および特異度は、それぞれ９０％および８９％である。
【図３】図３は、癌患者の血清における抗ＥＣＰＫＡ自己抗体のウエスタンブロッティング解析の結果を示す。Ｍ（ｍｗマーカー）およびＣα（１μｇ）を含むレーンはクーマシーブルー（Coomassie Blue）で染色；帯１はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａｂ抗Ｃα抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）でブロット；帯２−７は癌患者の血清（１０，０００倍希釈）でブロット；帯８−１２は正常ヒト血清（１０，０００倍希釈）でブロット；帯１−１２は精製ＰＫＡ Ｃα（各１μｇ）を含む。
【図４】図４は、本発明のイムノアッセイ形式の感度および特徴的な性能の対照としてＥＣＰＫＡ酵素的アッセイを用いて得られた値を示す。正常人および癌患者より得られた値を示し（癌患者、度数＝８３％、平均値＝１３０ ｍＵ／ｍｌ；正常人対照、度数＝２１％、平均値＝６０ ｍＵ／ｍｌ）、これは感度および特異度の欠如を示している。７５ ｍＵ／ｍｌより大きい値（点線の上）がポジティブである。
【図５】図５は、癌患者および健康人由来の血清における抗ＥＣＰＫＡ抗体力価とＥＣＰＫＡ酵素活性の間の相関関係研究の結果を示す。癌患者に対する係数０．００３および健康人に対する係数０．００１は、統計学的に有意ではない。
【図６】図６は、癌抗原の源としてＨＣＴ−１５腫瘍抽出物を用いた癌患者および健康人由来の血清における抗癌抗原抗体の力価を示す。＞１.５（破線）の値がポジティブである。
【図７】図７は、異なるタイプの癌（肺、腎臓、膵臓、卵巣、大腸、肝臓、胃、膀胱、および子宮頸癌、メラノーマ、肉腫、および平滑筋腫）の患者由来の血清における抗原抗体の観測力価を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月7日(2006.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の生体サンプルにおいて抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するイムノアッセイであって、ステップ：
（ａ）生体サンプルを抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原と接触させるステップ、接触はサンプル中に存在するならば抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が抗原と結合し、抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体を形成するのに十分な条件下でなされる；
（ｂ）形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体を抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子と接触させるステップ、接触は抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体の抗ＥＣＰＫＡ自己抗体と結合し、拡大した複合体を形成するのに十分な条件下でなされる；および
（ｃ）形成した拡大した複合体の存在または濃度を測定することにより生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するステップ
を含むイムノアッセイ。
【請求項２】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が細胞外ＰＫＡタンパク質である、請求項１のイムノアッセイ。
【請求項３】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体が該哺乳動物のとは異なる哺乳動物の種の抗体であり、該哺乳動物により産生された抗体に特異的である、請求項１または２のイムノアッセイ。
【請求項４】
哺乳動物がヒトであり、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がヒトＩｇＧ抗体である、請求項３のイムノアッセイ。
【請求項５】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている、請求項１〜４のいずれかのイムノアッセイ。
【請求項６】
検出可能な標識が化学標識である、請求項５のイムノアッセイ。
【請求項７】
ステップ（ａ）において、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の前に固体支持体に固定化される、請求項１〜６のいずれかのイムノアッセイ。
【請求項８】
ステップ（ａ）において、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の後に固体支持体に固定化される、請求項１〜６のいずれかのイムノアッセイ。
【請求項９】
イムノアッセイが免疫クロマトグラフィーイムノアッセイであり、ここで：
ステップ（ａ）において、生体サンプルは第１の多孔質担体との接触下におかれ、第１の多孔質担体は抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な非固定化、標識抗原を含む；
ステップ（ｂ）において、形成した抗原−抗ＥＣＰＫＡ自己抗体複合体は第２の多孔質担体との接触下におかれ、第２の多孔質担体は第１の多孔質担体と連通しており、固定化抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子を含む；および 
ステップ（ｃ）において、生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度が、第２の多孔質担体における抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な標識抗原の存在を検出することにより測定される、
請求項１〜６のいずれかのイムノアッセイ。
【請求項１０】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に結合する抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原を含む免疫複合体であって、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がさらに抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子に結合する免疫複合体。
【請求項１１】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体に特異的な抗原が細胞外ＰＫＡタンパク質である、請求項１０の免疫複合体。
【請求項１２】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている、請求項１０または１１の免疫複合体。
【請求項１３】
検出可能な標識が化学標識である、請求項１２の免疫複合体。
【請求項１４】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が免疫分子である、請求項１０〜１３のいずれかの免疫複合体。
【請求項１５】
抗ＥＣＰＫＡ自己抗体がヒト自己抗体であり、抗ＥＣＰＫＡ自己抗体結合分子が抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求項１０〜１４のいずれかの免疫複合体。
【請求項１６】
哺乳動物の生体サンプルにおける抗ＥＣＰＫＡ自己抗体の存在または濃度を測定するためのキットであって、キットは多層フィルターシステム、ならびに第１および第２の多孔質担体を含む中空のケースを含み、そこで第２の多孔質担体は第１の多孔質担体と連通しており、第１の多孔質担体は多層フィルターシステムと連通しており、その一部は該ケースから到達可能である；ここで： 
第１の多孔質担体は非固定化、標識ＰＫＡ ＣαまたはＣαフラグメントを含み；および
第２の多孔質担体はヒトＩｇＧに結合する固定化、非標識抗体を含む。
【請求項１７】
標識ＰＫＡ ＣαがＥＣＰＫＡである、請求項１６のキット。
【請求項１８】
標識ＰＫＡ Ｃαの標識が化学標識である、請求項１６または１７のキット。
【請求項１９】
キットがヒト抗ＥＣＰＫＡ自己抗体を検出し、ヒトＩｇＧに結合する抗体が非ヒト哺乳動物の抗体である、請求項１６〜１８のいずれかのキット。
【国際調査報告】
2007528004.tif 000009
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2007528004.tif 000011