(57)【要約】  ＰＰＡＲデルタアゴニストの有効量を用いた処置によって脱髄疾患の治療を必要とする患者の脱髄疾患を治療する方法が開示される。本方法で有効に治療される可能性のある脱髄疾患としては、これらに限定されないが、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、およびミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害（脊髄損傷、神経障害および神経損傷など）が挙げられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量のｈＰＰＡＲデルタアゴニストを投与することを含む、患者の脱髄疾患を治療するための方法。
【請求項２】
ｈＰＰＡＲデルタアゴニストは、選択的アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱髄疾患は、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脱髄疾患は、多発性硬化症である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アゴニストは、式（１）および式（２）：
【化１】
2007530703.tif 000009
で示される化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
式（１）および式（２）：
【化２】
2007530703.tif 000010
で示される化合物からなる群より選択される化合物を、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害を治療するのに有効な量で、少なくとも１種の製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項７】
多発性硬化症を治療するのに有効な量を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）およびその他の脱髄疾患を治療するためのＰＰＡＲデルタアゴニストの使用に関する。本発明はまた、ＭＳおよびその他の脱髄疾患を治療するための選択的なＰＰＡＲデルタアゴニストである、ある種の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、核内受容体スーパーファミリーのサブファミリーを構成する。３種の密接に関連したアイソフォームが同定され、クローニングされており、これらは一般的に、ＰＰＡＲアルファ、ＰＰＡＲガンマ、および、ＰＰＡＲデルタとして知られている。各受容体サブタイプは、特徴的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有し、これらはいずれもリガンドで活性化された遺伝子発現に必要である。ＰＰＡＲは、レチノイドＸ受容体とのヘテロ二量体として結合する。Ｊ．ＢｅｒｇｅｒおよびＤ.Ｅ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ.，２００２年，５３，４０９〜４３５を参照。
【０００３】
ＰＰＡＲデルタ（また、ＰＰＡＲベータとして知られている）は、広範囲の哺乳動物組織で発現されるが、この受容体によって調節されるそれらの生物学的機能または完全な遺伝子アレイに関する情報は、ほとんど明確になっていない。しかしながら、近年、アゴニストは、脂質代謝異常のような状態およびある種の皮膚科学的な状態を治療するのに有用であり得る一方で、アンタゴニストは、骨粗鬆症または結腸直腸癌を治療するのに有用であり得ることが見出された（Ｄ．Ｓｔｅｒｎｂａｃｈ，ｉｎ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３８巻，Ａ.Ｍ．Ｄｏｈｅｒｔｙ編，エルゼビア・アカデミックプレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），２００３年，７１〜８０頁）。
【０００４】
ＰＰＡＲデルタは、ＣＮＳで著しく発現されるようである；しかしながら、その機能の多くが、なおわからないままである。しかしながら、ＰＰＡＲデルタは、げっ歯類の乏突起膠細胞（ＣＮＳの主要な脂質生産細胞）で発現されたという発見は、極めて興味深い（Ｊ．Ｇｒａｎｎｅｍａｎ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ.，１９９８年，５１，５６３〜５７３）。その上、ＰＰＡＲデルタ選択的アゴニストが、マウス培養物において乏突起膠細胞のミエリン遺伝子発現とミエリン鞘の直径を著しく増加させることが見出されたこともわかっている（Ｉ．Ｓａｌｕｊａ等，Ｇｌｉａ，２００１年，３３，１９４〜２０４）。
【０００５】
脱髄状態は、ミエリン（多くの神経線維を覆う脂質とタンパク質からなる複数の密な層）の損失の兆候が見られる。これらの層は、中枢神経系（ＣＮＳ）では乏突起膠細胞、および末梢神経系（ＰＮＳ）ではシュヴァン細胞によって提供される。多発性硬化症（ＭＳ）において、乏突起膠細胞（ＣＮＳ中のミエリンを形成する細胞）は破壊され、軸索は損傷を受け、その結果、著しく損なわれたニューロンの活性や、麻痺などの機能障害が起こる。脱髄状態を有する患者において、髄鞘脱落は回復不能の場合が多い；これは通常、軸索の変性、そして、しばしば細胞変性を伴うか、または続発する。髄鞘脱落は、ニューロンの損傷またはミエリンそのものへの損傷（これらは、異常な免疫反応、局所損傷、虚血、代謝性疾患、毒物またはウイルス感染のいずれかによっても生じる）の結果として起こる可能性がある（ＰｒｉｎｅａｓおよびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎ  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ'ｓ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．（Ｅｄｗａｒｄ  Ａｒｎｏｌｄ：ニューヨーク，１９９７年）８１３
〜８１１、ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ編，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  ｅｄ．（ホワイトハウスステーション，ニュージャージー州：メルク・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），１９９９年）１２９９，１４３７，１４７３〜７６，１４８３）。しかしながら、髄鞘脱落の全領域に新たに形成された乏突起膠細胞の前駆細胞が存在することから、これらの前駆細胞を成熟した乏突起膠細胞へ分化するように誘導できるならば、自己修復の可能性が示唆される。
【０００６】
中枢の髄鞘脱落（ＣＮＳの髄鞘脱落）が数種の状態で起こるが、病因が不明であることが多く、これらは、原発性脱髄疾患として知られるようになった。これらの中でも、多発性硬化症が最も多発している。その他の原発性脱髄疾患としては、副腎白質ジストロトフィー（ＡＬＤ）、副腎脊髄神経障害、ＡＩＤＳ−空胞性脊髄症、ＨＴＬＶ関連脊髄症、レーバー遺伝性視神経萎縮、進行性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）、亜急性硬化性全脳炎、および熱帯性痙性不全対麻痺が挙げられる。加えて、髄鞘脱落がＣＮＳで起こる急性の症状があり、例えば急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）および急性ウイルス脳炎である。その上、急性横断性脊髄炎、原因不明の急性脊髄離断が１またはそれ以上の隣接する胸分節における灰白質と白質の両方に影響を与える症候群もまた、髄鞘脱落を起こす場合がある。
【０００７】
ＭＳは、ほとんどが若年成人に影響を与える慢性の破壊的な神経疾患である。ＭＳの病因は、ミエリンと乏突起膠細胞の破壊、ならびに脳および脊髄における軸索の損傷を引き起こす複合的なプロセスにある（ＰｒｉｎｅａｓおよびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎ  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ'ｓ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．（Ｅｄｗａｒｄ  Ａｒｎｏｌｄ：ニューヨーク，１９９７年）８１３〜８１１，Ｔｒａｐｐ等，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ.，３３８：２７８〜８５，１９９８年）。病理組織学的に、ＭＳは、炎症、ＣＮＳ組織における髄鞘脱落の浸潤細胞のプラーク、乏突起膠細胞の喪失、および病巣における軸索傷害によって特徴付けられる（ＰｒｉｎｅａｓおよびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎ  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ'ｓ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ.（Ｅｄｗａｒｄ  Ａｒｎｏｌｄ：ニューヨーク，１９９７年）８１３〜８１１）。この病気は、ミエリン（場合によってはミエリンではない自己抗原）に対する異常な免疫反応によって生じると考えられている（Ｂａｒ−Ｏｒ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１００：２５２〜５９，１９９９年，Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｈ.−Ｐ.，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８：１９１〜９９，１９９５年）。臨床的に、ＭＳは、再発寛解を繰り返し、または身体障害を強めながら慢性的な進行性の経過をたどる可能性がある（Ｇｏｌｄ等，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，６：８８〜９１，２０００年）。典型的には、ＭＳの症状としては、協調運動障害、感覚異常、言語および視覚障害ならびに衰弱が挙げられる。
【０００８】
現在の様々な脱髄状態の治療は、費用がかかり、対症的であり、ほんの部分的にしか有効ではない場合が多く、さらに望ましくない二次的な影響を引き起こす可能性がある。ＭＳの主要な治療法の代表は、コルチコステロイド（経口プレドニゾンを６０〜１００ｍｇ／日、２〜３週間かけて漸減、または静脈内メチルプレドニゾロンを５００〜１０００ｍｇ／日、３〜５日間）である。発病中の症状出現期を短くすることが可能だが、最終的な長期障害に影響を与えることができない。長期のコルチコステロイド治療は、正当とされることはあまりなく、骨粗鬆症、潰瘍および糖尿病などの多数の内科的な合併症を引き起こす可能性がある（ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ編，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  ｅｄ．（ホワイトハウスステーション，ニュージャージー州：メルク・リサーチ・ラボラトリーズ，１９９９年）１２９９，１４３７，１４７３〜７６，１４８３）。
【０００９】
組換えヒトインターフェロンベータ（ベータセロンおよびアボネックス）、およびコポリマー（コパクソン）を用いた免疫調節療法では、ＭＳの再発頻度をわずかに減少させ、その結果生じる能力障害の遅延を助長することができる（ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ編，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  ｅｄ.（ホワイトハウスステーション，ニュージャージー州：メルク・リサーチ・ラボラトリーズ，１９９９年）１２９９，１４３７，１４７３〜７６，１４８３）。現在のところ、ＭＳの治療様式としてインターフェロンベータとコポリマーの形態両方が用いられているが、いずれも費用がかかる。より重度の進行性の形態には、免疫抑制薬（アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、および、メトトレキサート）が用いられている。しかしながら、これらは必ずしも一様に有益ということはなく、顕著な毒性の副作用を有する。数種の薬物（例えば、バクロフェン、分割投与で３０〜６０ｍｇ／日）は、脊髄反射を阻害することにより痙縮を減少させることが可能である。だがＭＳ患者における痙縮の薬剤により誘発される減少は、衰弱を増悪させることが多く、それによりさらに患者を活動不能にするので、用心深く慎重な使用が必要である。
【００１０】
同様に、現在のＡＬＤ、その他の破壊的な脱髄疾患のための治療は、比較的効果がない。ＡＬＤの症状としては、皮質盲、皮質脊髄路の機能障害、精神衰退および痙縮を挙げることができる。ＡＬＤの経過を制御するための治療としては、骨髄移植、および、食事療法が挙げられるが（ＤｉＢｉａｓｅ等，Ａｎｎ．Ｉｓｔ．Ｓｕｐｅｒ  Ｓａｎｉｔａ，３５：１８５〜９２，１９９９年）、激しい神経機能の低下が常に発生し、最終的には死に至る［Ｋｒｉｖｉｔ等，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ.，６：３７７〜８２，１９９９年，（ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ編，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  ｅｄ．（ホワイトハウスステーション，ニュージャージー州：メルク・リサーチ・ラボラトリーズ，１９９９年）１２９９，１４３７，１４７３〜７６，１４８３）。ＥＡＥおよびＥＡＮを有する動物を、グリア細胞移植と成長因子を用い、さらに接着分子、自己抗体およびサイトカインを阻害することによって治療すると、多少の進歩が認められた（ＮｊｅｎｇａおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，９：１５９〜６４，１９９６年）。しかしながら、これらの治療は、ヒトにおいても有益であるとは示されておらず、場合によっては大規模な脳神経外科的な介入を必要とする。従って、前述のことから、望ましくない二次的な影響を起こすことなく多種多様な脱髄状態を治療するための、より有効で、且つより費用がかからず、より侵襲性が少ない方法の要求が存在することは明らかである。
【００１１】
本発明は、現在の脱髄障害を治療するための免疫調節療法を著しく改良するために、低分子物質で活性化された再生アプローチの使用を伴う。
【００１２】
選択的ＰＰＡＲデルタであることがわかっている化合物は当該技術分野で既知であり、具体的には、式（１）で示される化合物であり、これは、一般的には、ＷＯ０１／００６０３に記載のＧＷ５０１５１６として知られている。
【化１】
2007530703.tif 000003
【００１３】
式（２）で示される化合物もまた、Ｌ１６５,０４１として知られており、欧州特許出願第２８０６３号およびＷＯ９７／２８１４９で開示されており、そこでこれは、選択的ＰＰＡＲデルタアゴニストと同定されている。
【化２】
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ（ＰＰＡＲデルタ）アゴニストの、げっ歯類の大脳から急性摘出した乏突起膠細胞の前駆細胞の分化を促進し、ミエリン鞘の直径とミエリンの遺伝子発現の両方を著しく増加させる潜在的な能力により、ＰＰＡＲデルタアゴニストは、乏突起膠細胞の前駆細胞におけるＰＰＡＲデルタ経路を活性化し、さらに脱髄疾患（特にＭＳ）の脱髄した軸索にミエリン鞘を回復させることによってニューロン修復を強化する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明の実施形態によれば、多種多様な脱髄疾患状態（特に多発性硬化症）をＰＰＡＲデルタアゴニストで治療する方法が提供される。一般的に、本発明の実施形態に従って治療できる上記疾患状態としては、これらに限定されないが、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、およびミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害（脊髄損傷、神経障害および神経損傷など）が挙げられる。本明細書で開示された疾患は、このような治療が必要な患者に、治療上有効な量のＰＰＡＲデルタアゴニストを投与することによって治療することができる。
【００１６】
本発明はまた、脱髄疾患、特に多発性硬化症を治療するための、式（１）および式（２）で示される化合物の使用にも向けられる。
【化３】
2007530703.tif 000005
【００１７】
本発明はまた、式（１）または式（２）で示される化合物またはそれらの製薬上許容できる塩と、治療上有効な量で多発性硬化症を治療するのに有効であることがわかっているその他の化合物との組み合わせを投与することによって、患者における多発性硬化症を治療する方法も含む。上記疾患を治療するために現在用いられている化合物は、疾患修飾薬、例えばインターフェロン（インターフェロンベータ１−ａ、ベータ１−ｂ、および、アルファ２）、酢酸グラチラマー（Ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ）またはコルチコステロイド、例えばメチルプレドニゾロンおよびプレドニゾンである。さらに、化学療法剤、例えばメトトレキサート、アザチオプリン、クラドリビン  シクロホスファミドおよびシクロスポリンも挙げられる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書で用いられるように、表現「製薬上許容できるキャリアー」は、非毒性の溶媒、分散剤、賦形剤、アジュバント、またはその他の材料を意味し、これらは、医薬組成物、すなわち患者に投与できる投薬形態が形成できるようにするために本発明の化合物と混合される。このようなキャリアーの一例は、製薬上許容できるオイルであり、典型的には、非経口投与に用いられる。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「製薬上許容できる塩」は、本発明の化合物の塩が医薬製剤で用いることができることを意味する。しかしながら、その他の塩も、本発明に係る化合物またはそれらの製薬上許容できる塩の製造において有用な場合がある。本発明の化合物の適切な製薬上許容できる塩としては、酸付加塩が挙げられ、これは例えば、本発明に係る化合物の溶液と、製薬上許容できる酸の溶液とを混合することによって形成することができ、このような製薬上許容できる酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、グルタル酸、酢酸、サリチル酸、ケイ皮酸、２−フェノキシ安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、炭酸またはリン酸である。また、上記酸の金属塩（例えばオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウム）を形成してもよい。また、このようにして形成された塩は、一酸または二酸の塩のいずれかで存在する可能性があり、さらに水和物として存在してもよいし、または実質的に無水でもよい。その上、本発明の化合物に酸性部分が含まれる場合、適切なそれらの製薬上許容できる塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム塩；および適切な有機配位子で形成された塩（例えば第四アンモニウム塩）も挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、本化合物の、上記の障害または状態の治療に有効な量を意味する。
【００２１】
本明細書で用いられる表現「製薬上許容できるキャリアー」は、非毒性の溶媒、分散剤、賦形剤、アジュバント、またはその他の材料を意味し、これらは、医薬組成物、すなわち患者に投与できる投薬形態が形成できるようにするために本発明の化合物と混合される。このようなキャリアーの一例は、製薬上許容できるオイルであり、典型的には、非経口投与に用いられる。
【００２２】
本発明はまた、本発明に係る化合物の１種またはそれ以上を、製薬上許容できるキャリアーと共に含む医薬組成物を提供する。好ましくは、これらの組成物は、単位投与形態であり、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口液剤または懸濁剤、定量エアゾールまたは液体スプレー剤、滴剤、アンプル、自動注入装置または坐剤であり；これらは、経口、非経口、鼻腔内、舌下または直腸投与のため、または吸入法もしくは吹送法による投与のためのものである。あるいは、本組成物は、週１回または月１回の投与に適した形態で提供されてもよく；例えば、本活性化合物の不溶性塩（例えばデカン酸塩）を、筋肉内注射用のデポ製剤を提供するのに適合させてもよい。上記活性成分を含む浸食性のポリマーを考慮してもよい。錠剤のような固形組成物を製造するために、主要な活性成分を、製薬用キャリアー、例えば従来の錠剤化成分、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウムまたはガム類、およびその他の製薬用の希釈剤、例えば水と混合し、本発明の化合物またはそれらの製薬上許容できる塩の均一な混合物を含む固形の予備製剤組成物を形成することができる。これらの予備製剤組成物が均一であるという場合、上記活性成分が本組成物全体に一様に分散されており、従って本組成物を等しく有効な単位投薬形態（例えば錠剤、丸剤およびカプセル剤）中に容易に細分できることを意味する。次に、この固形の予備製剤組成物を、本発明活性成分の０.１〜約５００ｍｇを含む上述のタイプの単位投薬形態の中に細分する。矯味矯臭した単位投薬形態は、上記活性成分を１〜１００ｍｇ、例えば１、２、５、１０、２５、５０または１００ｍｇ含む。その新規組成物の錠剤または丸剤は、コーティングしてもよいし、または別の方法で、持続性の作用の利点を提供する投薬形態が提供されるように配合してもよい。例えば、錠剤または丸剤は、内部の投与成分と外部の投与成分とで構成されていてもよく、この場合、後者が、前者を覆う外被の形態である。２種の成分は、腸溶性の層で分離することができ、この層は、胃での崩壊に耐えるように作用し、内部の成分を十二指腸に無傷で通過させる、またはそれらの放出を遅らせることができる。このような腸溶性の層またはコーティングには、多種多様な材料を用いることができ、このような材料としては、多数のポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物が挙げられる。
【００２３】
経口投与のための、または注射による本発明の新規の組成物を包含することができる液体の形態としては、水性液剤、適切に矯味矯臭したシロップ剤、水性または油性懸濁剤、および可食油（例えば綿実油、ゴマ油、ヤシ油または落花生油）、ならびにエリキシルおよび類似の製薬ビヒクルを用いた矯味矯臭した乳剤が挙げられる。水性懸濁剤とするのに適した分散剤または懸濁化剤としては、合成ゴムおよび天然ゴム、例えばトラガカント、アラビアゴム、アルギネート、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンが挙げられる。
【００２４】
本明細書で説明されているような様々な病態の治療において、適切な用量のレベルは、１日あたり約０.０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、特に１日あたり約０.０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、特には１日あたり約０.０５〜２０ｍｇ／ｋｇである。本化合物は、１日あたり１〜４回の用法で投与してもよい。
【００２５】
本発明の一形態において、治療上有効な量のｈＰＰＡＲデルタアゴニストを投与することを含む、患者の脱髄疾患を治療する方法が開示される。
【００２６】
この実施態様のさらなる形態において、ｈＰＰＡＲデルタアゴニストは、選択的アゴニストである。
【００２７】
この実施態様のその他の形態において、上記脱髄疾患は、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害からなる群より選択される上記方法が開示される。
【００２８】
この実施態様のさらなる形態において、上記脱髄疾患は、多発性硬化症である上記方法が開示される。
【００２９】
この実施態様のさらにその他の形態において、上記アゴニストは、式（１）および式（２）で示される化合物からなる群より選択される上記方法が開示される。
【化４】
2007530703.tif 000006
【００３０】
本発明で開示されるその他の実施態様には、式（１）および式（２）で示される化合物からなる群より選択される化合物を、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、および、ミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害（脊髄損傷、神経障害および神経損傷など）を治療するのに有効な量で、少なくとも１種の製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含む医薬組成物がある。
【００３１】
【化５】
2007530703.tif 000007
【００３２】
この実施態様のさらなる形態において、多発性硬化症の治療に有効な量を含む医薬組成物が開示される。
【００３３】
図面の説明
図１：培養されたラットの乏突起膠細胞における、ＰＰＡＲデルタアゴニストによるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫反応性の強化を説明する。
図２：このグラフは、培養されたラットの乏突起膠細胞における化合物１によるＭＢＰのｍＲＮＡの強化を示す。
図３：このグラフは、培養されたラットの乏突起膠細胞における化合物２によるＭＢＰのｍＲＮＡの強化を示す。
図４Ａ：培養されたラットの乏突起膠細胞におけるＰＰＡＲデルタアゴニストの経路の活性化を確認する転写マーカーに対する化合物１の作用を説明する。
図４Ｂ：さらに、培養されたラットの乏突起膠細胞におけるＰＰＡＲデルタアゴニストの経路の活性化を確認する転写マーカーに対する化合物１の作用を説明しており、ＡＤＲＰのｍＲＮＡは、培養されたラットの乏突起膠細胞でアップレギュレートされることが示される。
図５：化合物１の作用を受けたヒト乏突起膠細胞の混合された培養物におけるＯ４免疫陽性細胞の数の増加を示す。
図６：化合物２の作用を受けたヒト乏突起膠細胞の混合された培養物におけるＯ４免疫陽性細胞の数の増加を示す。
【００３４】
化合物の実施例:
式（１）で示される化合物（ＧＷ５０１５１６）は、ＷＯ０１／００６０３で公開されたようにして製造することができる。式（２）で示される化合物（Ｌ１６５,０４１）は、ＷＯ９７／２８１４９で説明されているようにして製造することができる。
【００３５】
生物学的な実施例:
本発明の化合物の生物学的な特性を確認するために、以下の試験プロトコールを用いた。以下の実施例は、本発明をさらに説明するために示される。しかしながら、これらは、どのような形でも本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【００３６】
本発明のＰＰＡＲデルタアゴニストを、ミエリン発現を促進し、さらに再生プロセスを強化するそれらの能力に関して、インビトロおよびインビボのモデルで評価した。
【００３７】
最適な核内受容体の選択性のプロファイルは、ＧＡＬ４／ルシフェラーゼレポーター分析によって決定された。げっ歯類細胞の分析は、培養された乏突起膠細胞の前駆細胞の、成熟した乏突起膠細胞への分化を指示／促進する本化合物の能力を示す。
【００３８】
ＭＳの治療に関する有効性を示す具体的な生物学的分析は、齧歯類で行われるリゾレシチンで誘導された髄鞘脱落と、実験的アレルギー性脳脊髄炎である。
【００３９】
細胞のＰＰＡＲデルタ分析におけるＰＰＡＲアゴニストのＥＣ50値の決定
原理
アゴニストの様式でヒトＰＰＡＲデルタに結合し、それらを活性化する物質の効力は、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ細胞系（ＨＥＫ＝ヒト胎児腎臓）（本明細書においてＰＰＡＲデルタレポーター細胞系と称する）を用いて解析された。ＰＰＡＲデルタレポーター細胞系は、２つの遺伝学的要素、ルシフェラーゼレポーター要素（ｐｄｅｌｔａＭ−ＧＡＬ４−Ｌｕｃ−Ｚｅｏ）、およびＰＰＡＲデルタリガンドに依存してルシフェラーゼレポーター要素の発現を仲介するＰＰＡＲデルタ融合タンパク質（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲデルタ−ＬＢＤ）を含む。安定して、かつ構成的に発現された融合タンパク質ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲデルタ−ＬＢＤは、ＰＰＡＲデルタレポーター細胞系の細胞核中で、ＧＡＬ４タンパク質部分を介して、細胞系のゲノムに安定して統合されているルシフェラーゼレポーター要素のＧＡＬ４のＤＮＡ結合モチーフの５’上流に結合する。本分析で脂肪酸を枯渇させたウシ胎仔血清（ｃｓ−ＦＣＳ）が用いられた場合、ＰＰＡＲデルタリガンドの非存在下では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子はほんのわずかしか発現しない。ＰＰＡＲデルタリガンドは、ＰＰＡＲデルタ融合タンパク質に結合し、活性化し、およびそれによって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を刺激する。形成されるルシフェラーゼは、適切な基質を介した化学発光によって検出することができる。
【００４０】
ＰＰＡＲデルタレポーター細胞系の構築：
安定なＰＰＡＲデルタレポーター細胞系の生産は、ルシフェラーゼレポーター要素で安定してトランスフェクションされた安定なＨＥＫ−細胞クローンに基づく。この工程はすでに、「ＰＰＡＲアルファレポーター細胞系の構築」の章で述べられている。第二の工程において、ＰＰＡＲデルタ融合タンパク質（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲデルタ−ＬＢＤ）を、この細胞のクローンに安定して導入した。この目的のために、糖質コルチコイド受容体のＮ末端の７６個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ（登録番号Ｐ０４１５０）を、酵母転写因子ＧＡＬ４（登録番号Ｐ０４３８６）のアミノ酸１〜１４７をコードするｃＤＮＡ断片に連結させた。ヒトＰＰＡＲデルタ受容体（アミノ酸Ｓ１３９−Ｙ４４１；登録番号Ｌ０７５９２）のリガンド−結合ドメインのｃＤＮＡを、このＧＲ−ＧＡＬ４コンストラクトの３’末端でクローニングした。この方法で製造された融合コンストラクト（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲデルタ−ＬＢＤ）を、サイトメガロウイルスプロモーターにより構成的に発現させるために、プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に再度クローニングした。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼで直線状にし、およびルシフェラーゼレポーター要素を含む上述した細胞クローンに安定してトランスフェクションさせた。このようにして得られた、ルシフェラーゼレポーター要素を含み、ＰＰＡＲデルタ融合タンパク質（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲデルタ−ＬＢＤ）を構成的に発現するＰＰＡＲデルタレポーター細胞系を、ゼオシン（０.５ｍｇ／ｍｌ）とＧ４１８（０.５ｍｇ／ｍｌ）を用いた選択によって単離した。
【００４１】
分析法および評価：
ＰＰＡＲデルタアゴニストの活性は、以下で説明される３日間の分析で決定された：
１日目
ＰＰＡＲデルタレポーター細胞系を培養し、以下の添加物：１０％ｃｓ−ＦＣＳ（ウシ胎仔血清；＃ＳＨ−３００６８.０３，ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））、０.５ｍｇ／ｍｌゼオシン（＃Ｒ２５０−０１，インビトロジェン）、０.５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（＃１０１３１−０２７，インビトロジェン）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（＃１５１４０−１２２，インビトロジェン）および２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４，インビトロジェン）と混合したＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９，インビトロジェン）中８０％のコンフルエントにした。培養は、細胞培養インキュベーター中の標準的な細胞培養瓶（＃３５３１１２，ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で、３７℃で、５％ＣＯ2の存在下で行われた。８０％コンフルエントの細胞をＰＢＳ １５ｍｌ（＃１４１９０−０９４，インビトロジェン）で１回洗浄し、トリプシン溶液３ｍｌ（＃２５３００−０５４，インビトロジェン）で、３７℃で２分間処理し、上述のＤＭＥＭ ５ｍｌに溶解させ、細胞計数器で計数した。５００,０００細胞／ｍｌに希釈した後、３５,０００個の細胞を、透明プラスチックベースの９６ウェルのマイクロタイタープレート（＃３６１０，コーニング・コースター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ））の各ウェルにシーディングした。このプレートを、細胞培養インキュベーター中で、３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間インキュベートした。
【００４２】
２日目
試験しようとするＰＰＡＲデルタアゴニストを、濃度１０ｍＭのＤＭＳＯに溶解させた。このストック溶液を、５％ｃｓ−ＦＣＳ（＃ＳＨ−３００６８.０３，ハイクローン）、２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４，インビトロジェン）、および上述した抗生物質（ゼオシン、Ｇ４１８、ペニシリンおよびストレプトマイシン）と混合したＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９，インビトロジェン）に希釈した。
試験物質を、１０μＭ〜１００ｐＭの範囲の１１種の異なる濃度で試験した。より強力な化合物は、１μＭ〜１０ｐＭまたは１００ｎＭ〜１ｐＭの濃度範囲で試験した。
【００４３】
１日目にシーディングしたＰＰＡＲデルタレポーター細胞系の培地を吸引によって完全に除去し、培地で希釈した試験物質を、細胞に即座に添加した。物質の希釈および添加はロボット（ベックマンＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＦＸ））によって行われた。培地で希釈した試験物質の最終容量は、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェル１つあたり１００μｌとした。この分析におけるＤＭＳＯ濃度は、溶媒の細胞傷害作用を防ぐために０.１％ｖ／ｖ未満とした。
【００４４】
それぞれ個々のプレートにおいてこの分析が機能していることを実証するために、各プレートに、同様に１１種の異なる濃度に希釈された標準ＰＰＡＲデルタアゴニストを入れた。分析プレートを、インキュベーターで、３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間インキュベートした。
【００４５】
３日目
ＰＰＡＲデルタレポーター細胞を、インキュベーターから取り出された試験物質で処理し、培地を吸引して除いた。９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルにブライトグロ（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ）試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）５０μｌをピペッティングして細胞を溶解させた。室温で、暗所で１０分間インキュベートした後に、マイクロタイタープレートを、ルミノメーター（トリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ），ワラック（（Ｗａｌｌａｃ）製））で測定した。マイクロタイタープレートの各ウェルの測定時間は１秒とした。
【００４６】
評価：
ルミノメーターからの生データを、マイクロソフトエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）のファイルに移した。ＰＰＡＲアゴニストの用量−効果をプロットし、およびＥＣ50値をＸＬ．Ｆｉｔプログラムを製造元（ＩＤＢＳ）が説明している通りにして用いて計算した。
【００４７】
細胞のＰＰＡＲアルファ分析におけるＰＰＡＲアゴニストのＥＣ50値の決定：
原理
アゴニストの様式でヒトＰＰＡＲアルファに結合し、それらを活性化する物質の効力は、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ細胞系（ＨＥＫ＝ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｋｉｄｎｅｙ（ヒト胎児腎臓））（本明細書においてＰＰＡＲアルファレポーター細胞系と称する）を用いて解析された。これは、２つの遺伝学的要素、ルシフェラーゼレポーター要素（ｐｄｅｌｔａＭ−ＧＡＬ４−Ｌｕｃ−Ｚｅｏ）、およびＰＰＡＲアルファリガンドに依存してルシフェラーゼレポーター要素の発現を仲介するＰＰＡＲアルファ融合タンパク質（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲアルファ−ＬＢＤ）を含む。安定して、かつ構成的に発現された融合タンパク質ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲアルファ−ＬＢＤは、ＰＰＡＲアルファレポーター細胞系の細胞核中で、ＧＡＬ４タンパク質部分を介して、細胞系のゲノムに安定して統合されているルシフェラーゼレポーター要素のＧＡＬ４のＤＮＡ結合モチーフの５’上流に結合する。本分析で脂肪酸を枯渇させたウシ胎仔血清（ｃｓ−ＦＣＳ）が用いられた場合、ＰＰＡＲアルファリガンドの非存在下では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現はほんのわずかしか発現しない。ＰＰＡＲアルファリガンドは、ＰＰＡＲアルファ融合タンパク質に結合し、活性化し、それによって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を刺激する。形成されるルシフェラーゼは、適切な基質を介した化学発光によって検出することができる。
【００４８】
ＰＰＡＲアルファレポーター細胞系の構築：
ＰＰＡＲアルファレポーター細胞系を２段階で製造した。まず第一に、ルシフェラーゼレポーター要素を構築し、ＨＥＫ細胞に安定してトランスフェクションした。この目的のために、酵母転写因子ＧＡＬ４（登録番号ＡＦ２６４７２４）の５つの結合部位を、６８ｂｐ長の最小ＭＭＴＶプロモーター（登録番号Ｖ０１１７５）の５’上流にクローニングした。最小ＭＭＴＶプロモーターのセクションは、ＲＮＡポリメラーゼIIによる効率的な転写を可能にするために、ＣＣＡＡＴボックスとＴＡＴＡ要素を含む。ＧＡＬ４−ＭＭＴＶコンストラクトのクローニングおよび配列解析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９８９年）の説明と同様にして行なわれた。次に、完全なホタルの一種（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）の遺伝子（登録番号Ｍ１５０７７）を、ＧＡＬ４−ＭＭＴＶ要素の３’下流にクローニングした。配列解析した後、５つのＧＡＬ４結合部位、ＭＭＴＶプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子からなるルシフェラーゼレポーター要素を、プラスミドｐｄｅｌｔａＭ−ＧＡＬ４−Ｌｕｃ−Ｚｅｏを得るために、ゼオシン耐性を付与するプラスミドに再度クローニングした。このベクターを、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１〜３巻，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.），１９９５年）における記述に従って、ＨＥＫ細胞にトランスフェクションした。次に、ゼオシンを含む培地（０.５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子の極めて低い基底発現を示す適切な安定な細胞クローンを選択した。
【００４９】
第二の工程において、ＰＰＡＲアルファ融合タンパク質（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲアルファ−ＬＢＤ）を、上述した安定な細胞クローンに導入した。この目的のために、まず糖質コルチコイド受容体のＮ末端の７６個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ（登録番号Ｐ０４１５０）を、酵母転写因子ＧＡＬ４（登録番号Ｐ０４３８６）のアミノ酸１〜１４７をコードするｃＤＮＡ断片に連結させた。ヒトＰＰＡＲアルファ受容体のリガンド−結合ドメインのｃＤＮＡ（アミノ酸Ｓ１６７−Ｙ４６８；登録番号Ｓ７４３４９）を、このＧＲ−ＧＡＬ４コンストラクトの３’末端でクローニングした。この方法で製造された融合コンストラクト（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲアルファ−ＬＢＤ）を、サイトメガロウイルスプロモーターによってそこで構成的に発現されるように、プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）に再度クローニングした。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼで直線状にし、およびルシフェラーゼレポーター要素を含む上述した細胞クローンに安定してトランスフェクションさせた。このようにして完成した、ルシフェラーゼレポーター要素を含み、ＰＰＡＲアルファ融合タンパク質（ＧＲ−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲアルファ−ＬＢＤ）を構成的に発現するＰＰＡＲアルファレポーター細胞系を、ゼオシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いた選択によって単離した。
【００５０】
分析法：
ＰＰＡＲアルファアゴニストの活性は、以下で説明される３日間の分析で決定された：１日目
ＰＰＡＲアルファレポーター細胞系を培養し、以下の添加物：１０％ｃｓ−ＦＣＳ（ウシ胎仔血清；＃ＳＨ−３００６８．０３，ハイクローン）、０.５ｍｇ／ｍｌゼオシン（＃Ｒ２５０−０１，インビトロジェン）、０.５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（＃１０１３１−０２７，インビトロジェン）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（＃１５１４０−１２２，インビトロジェン）および２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４，インビトロジェン）と混合したＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９，インビトロジェン）中８０％のコンフルエントにした。培養は、細胞培養インキュベーター中の標準的な細胞培養瓶（＃３５３１１２，ベクトン・ディッキンソン）で、３７℃で、５％ＣＯ2の存在下で行われた。８０％コンフルエントの細胞をＰＢＳ（＃１４１９０−０９４，インビトロジェン）１５ｍｌで１回洗浄し、トリプシン溶液３ｍｌ（＃２５３００−０５４，インビトロジェン）で、３７℃で２分間処理し、上述のＤＭＥＭ ５ｍｌに溶解させ、細胞計数器で計数した。５００,０００細胞／ｍｌに希釈した後、３５,０００個の細胞を、透明プラスチックベースの９６ウェルのマイクロタイタープレート（＃３６１０，コーニング・コースター）の各ウェルにシーディングした。このプレートを、細胞培養インキュベーター中で、３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間インキュベートした。
【００５１】
２日目
試験されるＰＰＡＲアルファアゴニストを、濃度１０ｍＭのＤＭＳＯに溶解させた。このストック溶液を、５％ｃｓ−ＦＣＳ（＃ＳＨ−３００６８.０３，ハイクローン）、２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４，インビトロジェン）および上述した抗生物質（ゼオシン、Ｇ４１８、ペニシリンおよびストレプトマイシン）と混合したＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９，インビトロジェン）で希釈した。
試験物質を、１０μＭ〜１００ｐＭの範囲の１１種の異なる濃度で試験した。より強力な化合物は、１μＭ〜１０ｐＭまたは１００ｎＭ〜１ｐＭの濃度範囲で試験した。
【００５２】
１日目にシーディングしたＰＰＡＲアルファレポーター細胞系の培地を吸引によって完全に除去し、培地で希釈した試験物質を、細胞に即座に添加した。物質の希釈および添加はロボット（ベックマンＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＦＸ））によって行われた。培地で希釈した試験物質の最終容量は、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェル１つあたり１００μｌとした。この分析におけるＤＭＳＯ濃度は、溶媒の細胞傷害作用を防ぐために０.１％ｖ／ｖ未満とした。
【００５３】
それぞれ個々のプレートにおいてこの分析が機能していることを実証するために、各プレートに、同様に１１種の異なる濃度に希釈された標準ＰＰＡＲアルファアゴニストを入れた。分析プレートを、インキュベーターで、３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間インキュベートした。
【００５４】
３日目
ＰＰＡＲアルファレポーター細胞を、インキュベーターから取り出された試験物質で処理し、培地を吸引して除いた。９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルにブライトグロ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）５０μｌをピペッティングして細胞を溶解させた。室温で、暗所で１０分間インキュベートした後に、マイクロタイタープレートを、ルミノメーター（トリラックス，ワラック製）で測定した。マイクロタイタープレートの各ウェルの測定時間は１秒とした。
【００５５】
評価:
ルミノメーターからの生データを、マイクロソフトエクセルのファイルに移した。ＰＰＡＲアゴニストの用量−効果をプロットし、および、ＥＣ50値をＸＬ．Ｆｉｔプログラムを製造元（ＩＤＢＳ）が説明している通りにして用いて計算した。
【００５６】
細胞のＰＰＡＲガンマ分析におけるＰＰＡＲアゴニストのＥＣ50値の決定
細胞ベースのＰＰＡＲガンマ分析プロトコール
細胞ベースの分析を行うために、ルシフェラーゼ分析を９６ウェルプレートで以下のようにして行った：
１日目：細胞の平板培養：
・８０〜９０％コンフルエントに成長させた細胞をPBSで１回洗浄した；
・２分間トリプシン処理した；
・分析培地（ＤＭＥＭ，インビトロジェン，カタログ番号４１９６５−０３９；５％のチャコール／デキストラン処理したＦＢＳ，ハイクローン，カタログ番号ＳＨ３００６８；０.５ｍｇ／ｍｌゼオシン，インビトロジェン，カタログ番号４６−００７２；０.５ｍｇ／ｍｌゲネチシン，インビトロジェン，カタログ番号１０１３１−０２７；１％ペニシリン／ストレプトマイシン，インビトロジェン，カタログ番号１５１４０−１２２；２ｍＭのＬ−グルタミン，インビトロジェン，カタログ番号２５０３０−０２４；７.５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ・ＨＣｌ，インビトロジェン，カタログ番号Ｒ２１０−０１；１μｇ／ｍｌドキシサイクリン、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），カタログ番号８６３４−１）１５ｍｌを添加した；
・細胞を計数した；
・細胞を分析培地中で５００.０００細胞／ｍｌに希釈した；
・底が透明なコーニング製プレート中で、ウェルあたり細胞懸濁液１００μｌを分配した（５０.０００細胞／ウェルにする）；
・２４時間、３７℃で、５％ＣＯ2で、インキュベートした。
【００５７】
２日目：試験化合物の投与：
・試験化合物をＤＭＳＯに溶解させ、１０ｍＭストック溶液を作製した；
・化合物を、分析培地（ＤＭＥＭ，インビトロジェン，カタログ番号４１９６５−０３９；５％のチャコール／デキストラン処理したＦＢＳ，ハイクローン，カタログ番号ＳＨ３００６８；０.５ｍｇ／ｍｌゼオシン，インビトロジェン，カタログ番号４６−００７２；０.５ｍｇ／ｍｌゲネチシン，インビトロジェン，カタログ番号１０１３１−０２７；１％ペニシリン／ストレプトマイシン，インビトロジェン，カタログ番号１５１４０−１２２；２ｍＭのＬ−グルタミン，インビトロジェン，カタログ番号２５０３０−０２４；７.５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ・ＨＣｌ，インビトロジェン，カタログ番号Ｒ２１０−０１；１μｇ／ｍｌドキシサイクリン、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），カタログ番号８６３４−１）で適切な濃度に希釈した（標準のＦＣＳは、ＰＰＡＲリガンド結合ドメインに干渉する遊離の脂肪酸を含む）；
・培地を吸引した（細胞は、この工程で極めて敏感である細胞を１分間より長く培地で覆われない状態にしないことを確認する）；
・希釈した化合物を、９６ウェルに移した（化合物を含む培地１００μｌ）；
・標準化合物（例えば、ロシグリタゾン）でコントロールを作製し、同様に、ＤＭＳＯコントロール（０.１％ＤＭＳＯ）を作製した；
・２４時間、３７℃、５％ＣＯ2で細胞をインキュベートした。
【００５８】
希釈工程および希釈した化合物の添加は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）のバイオメック２０００（Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００）またはベックマンのＦＸロボットを用いてなされた。
【００５９】
３日目：細胞の溶解およびルシフェラーゼ活性の測定：
・細胞から培地を吸引した；
・プレートを−２０℃に凍結させた（任意）；
・プレートを３０分間融解させた（必要に応じて）；
・ブライト−グロ−ルシフェラーゼ分析試薬（プロメガ，カタログ番号Ｅ２６５０）５０μｌを添加した；
・暗所で１０分間インキュベートした；
・ウェルあたり２秒で発光を測定した（ワラックのマイクロベータ（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ））。
【００６０】
データ解析：
マイクロソフトエクセルとＸＬＦｉｔ（ＩＤＢＳにより開発された）とを併用して、ＥＣ50値を、フィッティングアルゴリズム＃２０５を用いて決定した。
【００６１】
細胞のヒトＲＸＲ受容体分析におけるＥＣ５０値の決定
細胞ベースのＲＸＲ分析プロトコール
細胞ベースの分析を行うために、ルシフェラーゼ分析を９６ウェルプレートで以下のようにして行った：
１日目：細胞の平板培養
・８０〜９０％コンフルエントに成長させた細胞をＰＢＳで１回洗浄した；
・２分間トリプシン処理した；
・培地（ＤＭＥＭ，インビトロジェン，カタログ番号４１９６５−０３９；１０％のチャコール／デキストラン処理したＦＢＳ，ハイクローン，カタログ番号ＳＨ３００６８；０.５ｍｇ／ｍｌゼオシン，インビトロジェン，カタログ番号４６−００７２；０.５ｍｇ／ｍｌゲネチシン，インビトロジェン，カタログ番号１０１３１−０２７；１％ペニシリン／ストレプトマイシン，インビトロジェン，カタログ番号１５１４０−１２２；２ｍＭのＬ−グルタミン，インビトロジェン，カタログ番号２５０３０−０２４）１５ｍｌを添加した；
・細胞を計数した；
・細胞を培地中で１７５,０００細胞／ｍｌに希釈した；
・底が透明なコーニング製プレート中で、ウェルあたり細胞懸濁液２００μｌを分配した（３５,０００細胞／ウェルにする）；
・２４時間、３７℃で、５％ＣＯ2で、インキュベートした。
【００６２】
２日目：試験化合物の投与
・試験化合物をＤＭＳＯに溶解させ、１０ｍＭストック溶液を作製した；
・化合物を、分析培地（ＤＭＥＭ  ｗ／ｏフェノールレッド，インビトロジェン，カタログ番号２１０６３−０２９；５％のチャコール／デキストラン処理したＦＢＳ，ハイクローン，カタログ番号ＳＨ３００６８；０.５ｍｇ／ｍｌゼオシン，インビトロジェン，カタログ番号４６−００７２；０.５ｍｇ／ｍｌゲネチシン，インビトロジェン，カタログ番号１０１３１−０２７；１％ペニシリン／ストレプトマイシン，インビトロジェン，カタログ番号１５１４０−１２２；２ｍＭのＬ−グルタミン，インビトロジェン，カタログ番号２５０３０−０２４）で適切な濃度に希釈した（標準のＦＣＳは、ＰＰＡＲリガンド結合ドメインに干渉する遊離の脂肪酸を含む）；
・培地を吸引した（細胞は、この工程で極めて敏感である細胞を１分間より長く培地で覆われない状態にしないことを確認する）；
・希釈した化合物を、９６ウェルに移した（化合物を含む培地１００μｌ）；
・標準化合物（例えば、ＲＰＲ２５８１３４）でコントロールを作製し、同様に、ＤＭＳＯコントロール（０.１％ＤＭＳＯ）を作製した；
・２４時間、３７℃、５％ＣＯ2で細胞をインキュベートした。
【００６３】
希釈工程および希釈した化合物の添加は、ベックマンのバイオメック２０００（Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００）またはベックマンのＦＸロボットを用いてなされた。
【００６４】
３日目：細胞の溶解およびルシフェラーゼ活性の測定
・細胞から培地を吸引した；
・プレートを−２０℃に凍結させた（任意）；
・プレートを３０分間融解させた（必要に応じて）；
・ブライト−グロ−ルシフェラーゼ分析試薬（プロメガ，カタログ番号Ｅ２６５０）５０μｌを添加した；
・暗所で１０分間インキュベートした；
・ウェルあたり２秒で発光を測定した（ワラックのマイクロベータ）。
【００６５】
データ解析：
マイクロソフトエクセルとＸＬＦｉｔ（ＩＤＢＳにより開発された）とを併用して、ＥＣ50値を、フィッティングアルゴリズム＃２０５を用いて決定した。
【００６６】
表１は、レポーター分析の場合の結果を示す。この結果によれば、化合物１および２が、ＰＰＡＲアルファ、ガンマおよびＲＸＲ活性が低い選択的ＰＰＡＲデルタ活性化因子であることが示される。
【表１】
2007530703.tif 000008
【００６７】
ラット／マウス乏突起膠細胞培養
細胞の調製：
１．一次ラット乏突起膠細胞の前駆細胞を、新生児（出生後２〜３日）ラットまたはマウスの新皮質から得て、さらに、小グリア細胞を除去した後に、元々ＭｃＣａｒｔｈｙおよびｄｅ  Ｖｅｌｌｉｓ（１９８０年）で説明されている技術の改変法を用いて、星状細胞の単層から機械的に分離することによって高濃度化した。
２．新生児のラットの脳から髄膜を除去し、組織を機械的に解離させた。細胞をＴ７５フラスコで平板培養し、細胞にＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳを与えた。
３．星状細胞が敷き詰められた層で成長した乏突起膠細胞を、最初の摘出日の１４日後に、シェイキング・オフ（ｓｈａｋｉｎｇ−ｏｆｆ）法で回収した。懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを、以下の成長因子：血小板由来成長因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ）および線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ）が追加された無血清培地（ＳＦＭ；以下を含むＤＭＥＭ：２５μｇ／ｍｌトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、３０ｎＭトリヨードチロニン、２０ｎＭヒドロコルチゾン、２０ｎＭプロゲステロン、１０ｎＭビオチン、１×微量元素、３０ｎＭセレン、１μｇ／ｍｌプトレシン、０.１％ＢＳＡ、５Ｕ／ｍｌペンストレップ（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）、１０μｇ／ｍｌインスリン）に再懸濁した。
４．細胞をＰＤＬでコーティングされた培養皿で平板培養し、３７℃で、６〜７％ＣＯ2で、インキュベートした。
５．培地成分を４８時間ごとに置き換え、細胞を始原状態に維持した。
【００６８】
スクリーニング分析のために細胞数を増加させるための前駆細胞の継代：
１．培養物が集密してきたら、培養物をＰＢＳでリンスし、トリプシンを添加し、３７℃で〜２〜３分間インキュベートした。
２．この細胞懸濁液を中和し、９００ｇで５分間遠心分離した。
３．細胞ペレットをＳＦＭ＋ＰＤＧＦ／ＦＧＦに再懸濁した。
４．細胞に新しい成長因子を４８時間ごとに与え、前駆細胞に迅速に分裂させるために高濃度を維持した。
５．実験分析の前に、細胞をわずか４〜５回しか継代させていない。
６．乏突起膠細胞の前駆細胞を必要とする実験は全て、これらの条件下で継続的に維持された細胞を用いて行われた。全ての細胞の９５％超が、Ａ２Ｂ５免疫陽性であり、さらに、２’３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼII  ｍＲＮＡを発現した。
７．成熟した乏突起膠細胞を発生させるために、平板培養してから２４時間後に、前駆細胞をＳＦＭ（ＩＧＦ−Ｉ含有または非含有）に切り替え、実験分析前７日間、これらの条件下で成長させた。
８．あるいは、高濃度化されたラットの中枢のグリア−４（Ｇｌｉａ−４，ＣＧ４）前駆細胞系を用いて、Ｂ−１０４神経芽細胞腫細胞系由来の３０％調整培地が追加された基礎培地（ＤＭＥＭ，以下を含む；２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ビオチン（４０ｎＭ）、インスリン（１μＭ）およびＮ１）中で維持してもよい。分化を誘導するために、ＣＧ４細胞の培地を、１％ウシ胎仔血清（２日後に除去した）およびインスリン（５００ｎＭ）を含む基礎培地に切り替えた。Ａ２Ｂ５、および、ＭＢＰ免疫反応性を用いて、未成熟の培養物および成熟した培養物それぞれにおいて、＞９５％を超えて高濃度化されたことを確認した。
【００６９】
ラット／マウス培養物の化合物での処理：
１．細胞を１０,０００〜１５,０００細胞／ウェルで２４ウェルのＰＤＬでコーティングされたプレートに置き、細胞をマイトジェン（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で一晩培養した。
２．マイトジェンの存在下で：
ａ．次の日、古い培地を除去し、新しい培地（マイトジェン含有）に化合物を添加した。
ｂ．化合物の用量反応の評価は、６種の異なる濃度（１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０.１ｎＭ）で行われた；
ｃ．各化合物濃度に対して３連のウェルで実験した。
３．マイトジェンの非存在下で：
ａ．次の日、古い培地を除去し、新しい培地（マイトジェン非含有）に化合物を添加した。
ｂ．化合物の用量反応の評価は、６種の異なる濃度（１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０.１ｎＭ）で行われた；
ｃ．各化合物濃度に対して３連のウェルで実験した。
４．実験分析で使用する前７日間、処理した細胞を培養した。
【００７０】
ヒト乏突起膠細胞培養
細胞の調製：
１．ヒトニューロスフェア（Ｅ１９．５−Ｅ２２ヒト胎児皮質から回収された）を、前駆培地：ＰＤＧＦ、および、ＦＧＦが追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、３０ｎＭトリヨードチロニン、２０ｎＭヒドロコルチゾン、２０ｎＭプロゲステロン、１０ｎＭビオチン、１×微量元素、３０ｎＭセレン、６０μＭプトレシン、０.１％ＢＳＡ、５Ｕ／ｍｌペンストレップ、２５μｇ／ｍｌインスリン）で２週間培養した。
２．２０Ｕ／ｍｌパパインを３７℃で３０〜５０分間用いてニューロスフェアを解離した。
３．細胞を、５０,０００〜１００,０００細胞／ウェルの密度で、ＰＤＬでコーティングされた培養皿で、ＰＤＧＦ／ＦＧＦを含む前駆培地中で平板培養し、３７℃、５〜６％ＣＯ2でインキュベートした。
４．４８時間ごとに培地と成長因子を補充した。
【００７１】
ヒト培養物の化合物での処理：
１．平板培養の２４〜４８時間後に、古い培地を除去し、新しい培地（マイトジェン含有）に化合物を添加した。
２．化合物の用量反応の評価は、３〜６種の異なる濃度（１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０.１ｎＭ）で行われた。
３．各化合物濃度に対して３連のウェルで実験した。
５．実験分析で使用する前７日間、処理した細胞を培養した。
【００７２】
ラット／マウス／ヒト乏突起膠細胞に特異的な免疫染色：
化合物と接触させた後、乏突起膠細胞に特異的な抗体を用いて、乏突起膠細胞の分化を加速／促進する化合物の能力を評価した（例えば、Ｏ４、Ｏ１またはミエリン塩基性タンパク質の免疫反応性は、化合物で処理した培養物と未処理の培養物の間では経時的であった）。
【００７３】
１．細胞を、ポリ−Ｄ−リシンで処理した４−ウェルのチャンバースライドで、５×１０3〜２０×１０3細胞／ウェルで平板培養し、上述のようにして成長させた。ＰＤＧＦおよびＦＧＦ非含有でインビトロで毎日測定して、細胞の分化の程度が高まる乏突起膠細胞集団に対して連続的に染色した。
２．３７℃で３０分間の生染色を用いて、乏突起膠細胞の段階に特異的な細胞表面マーカー（例えばＡ２Ｂ５、Ｏ４、および、Ｏ１など）の発現を検出した。
３．その後、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで、室温で１０分間で固定した。
４．固定染色手法を用いて、乏突起膠細胞の段階に特異的な細胞表面マーカー（例えばミエリン塩基性タンパク質、ＭＢＰなど）の発現を検出した。
５．ＰＢＳでリンスした。
６．１×ＰＢＳで希釈した０.１％トリトン／０.０１％ＮａＡｚを用いて室温で１０分間透過させた。
７．抗体希釈緩衝液（０.１％トリトン−Ｘ１００および１％ＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミン；抗体を希釈するのにも用いた）中の５〜１０％ヤギ血清で、室温で１５分間ブロックした。
８．抗体希釈緩衝液で希釈した一次抗体を添加した。
９．穏やかに揺らしながら、４℃で一晩インキュベートした。
10．次の日、ＰＢＳで１×５分間、続いて３×各１５分間室温でリンスした。
11．適切な二次抗体と共に、室温で４５分間インキュベートした。
12．細胞核を、４,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて、室温で１５分間染色した。
13．ＰＢＳで数回リンスし、蛍光顕微鏡を用いて評価した。
14．以下の条件を、経時的に、さらに異なる化合物用量で比較した：ＰＤＧＦ／ＦＧＦ単独、ＳＦＭ単独、ＳＦＭ−ＩＧＦ１単独、ＰＤＧＦ／ＦＧＦと化合物、ＳＦＭと化合物。
【００７４】
ラット／マウス／ヒトのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）免疫染色：
化合物が細胞増殖を促進しないことの確認
１．乏突起膠細胞の前駆細胞を１０μＭのＢｒｄＵで２０時間標識し、次に、７０％エタノール、または、４％パラホルムアルデヒドのいずれかで固定した。
２．ＰＢＳでの洗浄を３回はさんで、ビオチン化したマウス抗ＢｒｄＵおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼで連続的に細胞をインキュベートした。
３．ＤＡＢを用いてＢｒｄＵ免疫反応性の比色的な可視化を行ない、総細胞数をカウンターを用いて評価した（染色はヘマトキシリン）。
４．２回の独立した観察でＢｒｄＵ免疫陽性細胞を計数した。
【００７５】
ラット／マウス／ヒト培養物の画像解析：蛍光顕微鏡を用いて、化合物と接触させた後の乏突起膠細胞の分化の程度を定量した。この分析により、選択的アゴニストが、乏突起膠細胞の分化を加速／促進することが示された。
１．手動での細胞の計数：各実験条件あたり４ヶ所のフィールドをランダムに選択し、各フィールドで５００〜６００個の細胞を計数した。ＤＡＰＩ陽性細胞（総細胞数）細胞に対するＭＢＰ（またはＯ４）免疫陽性細胞（ミエリン鞘を有する、または有さない成熟したプロセスで生産された細胞）のパーセンテージを、コントロールと薬物で処理した群とで比較した。
２．自動の細胞の計数：蛍光顕微鏡を用いて、化合物と接触させた後の乏突起膠細胞の分化の程度を定量した。６ヶ所のフィールド／ウェルをランダムに選択して、総集団（約８〜１５×１０3細胞を計数した／ウェル）のうちの分化している乏突起膠細胞の数を評価した。免疫蛍光法の画像は、ツァイス・アキシオカムＨＲｃ（Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ）を備えたツァイス・アキソビジョン（Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ）デジタルイメージングシステムを用いて、上記顕微鏡に冷却したＣＣＤカメラを連結して得た。全ての顕微鏡のイメージングパラメーターは、細胞の免疫蛍光強度の解析のための画像が得られるように設定された。全ての細胞（ＤＡＰＩで核染色された）に対するＭＢＰ陽性（分化した）細胞のパーセンテージを、コントロールと薬物で処理した群とで比較した。このイメージング条件下では、細胞の自己蛍光は検出できなかった。
３．ヒト乏突起膠細胞の分化の分析：Ｏ４免疫陽性細胞／ウェルを手動で総数を求めた（二極および多極）。
【００７６】
図１に、ラット乏突起膠細胞培養を用いた結果を示し、図５および６に、ヒト乏突起膠細胞の混合された培養物を用いた結果を示す。その結果によれば、未処理コントロールと比較してミエリン塩基性タンパク質の発現の増加が測定されたことから、ＰＰＡＲデルタアゴニストは、ラットおよびヒト乏突起膠細胞の分化を強化または促進することが示された。この新規の発見は、ＭＳおよびその他の脱髄性の障害などの病気に罹った、または損傷したＣＮＳにおいて、化合物１および化合物２および選択的ＰＰＡＲデルタアゴニストは、一般的にインビボでの乏突起膠細胞の分化およびミエリン形成を強化、促進または刺激することを示唆するものと考えられる。
【００７７】
ラット／マウス／ヒトの定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：化合物で誘導されたＰＰＡＲデルタ経路の活性化および乏突起膠細胞の成熟の程度の評価（ｍＲＮＡレベルの変化）。
１．トリゾール（ＴｒｉＺｏｌ）試薬を用いて培養した乏突起膠細胞からトータルＲＮＡを抽出した。
２．その後、ｍＲＮＡをＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼで処理し、再度精製し、次に、ＲＴ反応（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰＣＲキットのためのアドバンテージＲＴ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ））を用いてｃＤＮＡテンプレートに変換した。
３．ＳｙｂｒグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）を用いてＰＰＡＲデルタ経路の構成要素の転写発現を定量した。
４．１８ＳリボソームＲＮＡプライマー／プローブミックス（１８６ｂｐの産物）をＴａｑｍａｎ２ＸＰＣＲマスターミックスに懸濁し、これをインターナルコントロールとして用いた。
５．定量ＰＣＲは、リアルタイムＴａｑｍａｎTM 技術（Ｇｉｂｓｏｎ等，１９９６年）を用いて、モデル７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，カリフォルニア州）を用いて行なった。
６．配列検出システムソフトウェア・バージョン１.９１を用いて結果を解析した。
【００７８】
図２、３、４Ａおよび４Ｂに、これらの分析の結果を示す。これらの結果から、ＰＰＡＲデルタ選択的アゴニストは、ＰＰＡＲデルタ受容体に結合し、乏突起膠細胞のＰＰＡＲデルタ経路を直接活性化することが示唆され、これは、インビボでも同様に作用すると予想される。
【００７９】
ラットＥＬＩＳＡ分析：化合物で誘導されたＰＰＡＲデルタ経路の活性化、および、乏突起膠細胞の成熟の程度の評価（タンパク質レベルの変化）。
１．プレートをＰＢＳで洗浄し、次に、氷上で維持した。氷冷した溶解緩衝液（トリス５０ｍＭ、ｐＨ７.４、ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、β−メルカプトエタノール５ｍＭ、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０  １％、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））：１錠／５０ｍｌ）２００μｌを各ウェルに添加した。
２．ピペットを上下させて用いることによって細胞を溶解させ、２０００ｒｐｍで、４℃で５分間プレートを回転させた。上清をすぐ使用できるようにした。
３．標準、コントロールおよびサンプル５０μｌをウェルにピペットで入れた。
４．ＭＢＰ分析緩衝液５０μｌを各ウェルに添加した。
５．回転式マイクロプレート振盪機で５００〜７００ｒｐｍで撹拌してウェルを室温で２時間インキュベートした。
６．ＭＢＰ抗体−ビオチン結合体１００μｌを各ウェルに添加した。
７．ウェルを、回転式マイクロプレート振盪機で５００〜７００ｒｐｍで撹拌して室温で１時間インキュベートした。
８．洗浄溶液（Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でウェルを５回洗浄した。吸収材上でプレートを反転させブロットを乾燥させた。
９．ストレプトアビジン−酵素結合体の濃縮物を、ＭＢＰ  ＥＬＩＳＡ分析緩衝液で１：５０に希釈した。（分析で使用する直前に希釈しなければならない）。
10．ストレプトアビジン−酵素結合体の溶液１００μｌを各ウェルに添加した。
11．回転式マイクロプレート振盪機で、５００〜７００ｒｐｍで撹拌してウェルを室温で３０分間インキュベートした。
12．洗浄溶液（Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でウェルを５回洗浄した。吸収材上でプレートを反転させブロットを乾燥させた。
13．ＴＭＢクロモゲン溶液（ＴＭＢ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを各ウェルに添加した。
14．回転式マイクロプレート振盪機で、５００〜７００ｒｐｍで撹拌してウェルを室温で１０〜２０分間インキュベートした。直射日光に曝さないようにした。
15．停止溶液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを各ウェルに添加した。
16．４５０ｎＭに設定されたマイクロプレートリーダーを用いて、３０分以内にウェル中の溶液の吸光度を読み取った。
【００８０】
通常得られた上記の結果（図１〜６に示される）によれば、ＰＰＡＲデルタアゴニストは、細胞を分裂が活性な状態に正常に維持し、細胞の分化を阻害するマイトジェンの存在下でも、乏突起膠細胞の分化を促進することが明らかである。従って、損傷を受けた、または病気に罹ったＣＮＳにおいて、選択的ＰＰＡＲデルタアゴニストは、乏突起膠細胞の前駆細胞の分裂を引き起こし、ミエリンタンパク質を発現させ、脱髄した、または髄鞘形成が減少した軸索を鞘で覆うことが可能であると予想される。
【００８１】
インビボでのコンセプトモデルの証明
巣状病変：（化合物がミエリンの無傷な状態を保護するかどうか、または、再ミエリン化の速度を促進／強化するかどうかを評価するために用いられた）
１．７週齢のラットに自由に餌と水を摂取させ、実験で使用する前に最低４日間順応させた。
２．外科手術の前に、各動物の重さを量った。次に、ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）とキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）とを１.８：１の比率で併用してラットを麻酔した。外科手術の前に、ラットの腹腔内に０.１５ｍｌ／１８０ｇ体重の麻酔剤の溶液を注射した。ＩＡＣＵＣガイドラインに従って、無菌条件を使用して動物を外科手術のために準備した。全ての外科機器をオートクレーブ処理した。毛を両耳の間で挟み、この領域をベタジンでこすり洗いし、滅菌生理食塩水で洗い、最後に予め包装された滅菌アルコール綿棒で拭いた。
３．外科手術のために、ラットを、頭部が安定して固定されるように設計された小動物用の定位機器に腹ばいに置いた。ＳＤラットの頭蓋の位置がフラットになるように示されているため、切歯棒は、常に−３.９ｍｍに設定された。
４．耳の間の頭蓋を覆う皮膚（予め毛を剃った）に切開術を施した。
５．骨の小さい領域（直径０.７５ｍｍ）に、以下の座標：ラムダからＡＰ−１.８、ＭＬ−３.１に穴を開けた。
６．骨を除去し、ラットの右の尾側の小脳脚、ＤＶ−７.１ｍｍに、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）μｌ注射器および注射針によって２μｌのエチジウムブロミド、リゾレシチンまたはＳＩＮ−１を２分かけて注射した。あるいは、脊髄、脳梁または皮質に注射した。
７．さらに２分間、注射針をそこに留置した。
８．注射針を引き抜いた後、切開部を縫合した。
９．各ラットの後肢に、ブプレノルフィン０.００３ｍｇを筋肉内注射した。
10．ラットを意識が回復するまで暖かい棚に置いた。意識が回復したら、それらを飼育ケージに戻した。ラットが互いの縫合糸を引っ張り合うと予想されるため、１ケージあたりのラット数は、２匹以下とした。
11．マウスを用いて、類似の手法も行なわれた。
【００８２】
ラットの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ラットＥＡＥ）病気モデル：
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、感染しやすい動物で、脊髄ホモジネート全体または成分（ミエリン塩基性タンパク質）のいずれかで感作させた後に発症する神経系のＴ細胞介在の自己免疫疾患である。ＥＡＥげっ歯類モデルは、ＭＳ患者で観察された脳および脊髄の炎症を研究するのに適したツールである。齧歯類において、脊髄全体または脊髄の成分（例えばミエリン塩基性タンパク質）を注射すると、Ｔリンパ球の活性化に基づく自己免疫反応が誘発される。典型的には、臨床疾患は、接種後の８〜１０日目ごろに発症するようになり、これは、軽度の歩行困難や尾の緊張減退から、完全麻痺や死に至る広範囲の行動異常として観察される。典型的には、体重減少が起こる。生き延びた動物において、自発的な回復が起こるが、多くの運動機能の回復のばらつきを伴う。種、アレルゲンおよび用いられる方法論に応じて、ＥＡＥモデルで試験される動物は、単回の（急性ＥＡＥ）または数回の（慢性の再発性ＥＡＥ）の病状発現の可能性がある。数種の治療パラダイムを用いてもよい：選択された薬物または治療の施与は、免疫化の前、無症候期間中または臨床疾患中のいずれでもよい。
【００８３】
動物：
雌ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラット、１６０〜２２０ｇ（チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ））。
【００８４】
抗原：
モルモット脊髄全体（ハーラン・バイオサイエンス（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、
完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ［１ｍｇ／ｍｌヒト結核菌ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium Tuberculosis）Ｈ３７Ｒａ］（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））。
【００８５】
追加抗原：
ヒト結核菌（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））、
百日咳菌ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）［加熱死菌］（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））。
【００８６】
抗原の製造：（動物約７２０匹用の）：
１．凍結させたモルモット脊髄を５グラム量った。
２．丸底の遠心管中で、脊髄５ｇを０.９％食塩水（１ｇ／ｍｌ）５ｍｌに添加した。
３．氷上で、ティッシュ−テック（Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｃｈ）を用いて、組織が完全に破壊されるまで（約５分間）ホモジナイズした。
４．ヒト結核菌（２０ｍｇ／ｍｌ完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ）２００ｍｇが追加された完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ（１０ｍｌ）を添加した。
５．１８ゲージのエマルジョンニードルを備えた１０ｍｌ注射器に吸引させることによって、遠心管からホモジネート／アジュバントを抽出した。
６．２つの３０ｍｌガラス製注射器の間で、材料が注射針を通過させることが継続しにくくなるまで乳化した（約５分間｛油相と水相間で分離しなくてもよい｝）。
７．即座に使用するか、または必要になるまで氷上で維持した（３０分間を超えない）（凍結させない）。
【００８７】
プロトコール
１．雌ルイスラット（チャールス・リバー）に自由に餌と水を摂取させ、実験で使用する前に最低３日間順応させた。
２．まず、体重１６０および２２０グラムのラットで、５％イソフルラン（エラン（Ａｅｒｒａｎｅ），フォートドッジ）、３０％Ｏ2、７０％Ｎ2Ｏで２〜５分間誘発した。
３．次に、ラットを、循環水加熱毛布（ゲイマー（Ｇａｙｍａｒ））上で（背面を上にして）、麻酔ガスの自発呼吸のためのノーズコーン中に置いた。イソフルランを２％に減
少させた。
４．抗原または生理食塩水のいずれかの２回の皮下注射（各０.１ｍｌ）を、後肢の腹側表面に与えた。
５．ノーズコーンから動物を離し、重さを量り、番号を付けた。
６．ラットを麻酔から覚醒させ、それぞれのケージに入れた。
７．動物を、ＥＡＥ誘発の兆候に関して毎日観察した（以下の基準を参照）。
【００８８】
ステージ：０  正常
ステージ：１  異常なゲートおよび尾の緊張減退
ステージ：２  後肢の片方または両方の軽度だが明確な衰弱
ステージ：３  後肢の片方または両方の重度の衰弱または軽度の運動失調
ステージ：４  重度の不全対麻痺および最小の後肢の動き
ステージ：５  後肢の動きなし、および対麻痺
ステージ：６  自発的な動きがない瀕死状態および呼吸機能の障害。前肢の関与の程度の増加、ならびに尿および便失禁が起こる場合もある。
ステージ：７  死亡。
【００８９】
免疫化の１０日後に治療を開始した。このモデルにおける疾患の症状は、典型的には、接種の１０〜１１日後に現れるため、このタイムポイントが、ＭＳの急性発症の初期のフェーズを示すと考えることができる。これは、このようにして治療開始を遅らせることで、従来用いられてきた接種時または接種の前に薬物が投与されるプロトコールよりも厳密に、臨床症状を模擬していると判断されている（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  Ｄ.等．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９年；９６：３８４２〜３８４７およびＢｒｏｄ  Ｓ.Ａ.等，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０００年；４７：１２７〜１３１）。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】培養されたラットの乏突起膠細胞における、ＰＰＡＲデルタアゴニストによるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫反応性の強化を説明する。
【図２】このグラフは、培養されたラットの乏突起膠細胞における化合物１によるＭＢＰのｍＲＮＡの強化を示す。
【図３】このグラフは、培養されたラットの乏突起膠細胞における化合物２によるＭＢＰのｍＲＮＡの強化を示す。
【図４Ａ】培養されたラットの乏突起膠細胞におけるＰＰＡＲデルタアゴニストの経路の活性化を確認する転写マーカーに対する化合物１の作用を説明する。
【図４Ｂ】さらに、培養されたラットの乏突起膠細胞におけるＰＰＡＲデルタアゴニストの経路の活性化を確認する転写マーカーに対する化合物１の作用を説明する。
【図５】化合物１の作用を受けたヒト乏突起膠細胞の混合された培養物におけるＯ４免疫陽性細胞の数の増加を示す。
【図６】化合物２の作用を受けたヒト乏突起膠細胞の混合された培養物におけるＯ４免疫陽性細胞の数の増加を示す。
【図１】
2007530703.tif 000011
【図２】
2007530703.tif 000012
【図３】
2007530703.tif 000013
【図４Ａ】
2007530703.tif 000014
【図４Ｂ】
2007530703.tif 000015
【図５】
2007530703.tif 000016
【図６】
2007530703.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月2日(2006.1.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の、式（１）および式（２）：
【化１】
2007530703.tif 000018
で示される化合物からなる群より選択される化合物を投与することを含む、患者の脱髄疾患を治療するための方法。
【請求項２】
脱髄疾患は、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱髄疾患は、多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式（１）および式（２）：
【化２】
2007530703.tif 000019
で示される化合物からなる群より選択される化合物を、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害を治療するのに有効な量で、少なくとも１種の製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項５】
多発性硬化症を治療するのに有効な量を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月8日(2006.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の、式（１）および式（２）：
【化１】
2007530703.tif 000020
で示される化合物からなる群より選択される化合物を投与することを含む、患者の脱髄疾患を治療するための方法。
【請求項２】
脱髄疾患は、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱髄疾患は、多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式（１）および式（２）：
【化２】
2007530703.tif 000021
で示される化合物からなる群より選択される化合物を、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害を治療するのに有効な量で、少なくとも１種の製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項５】
多発性硬化症を治療するのに有効な量を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
脱髄疾患を治療するための、式（１）および式（２）：
【化３】
2007530703.tif 000022
で示される化合物からなる群より選択される化合物の使用。
【請求項７】
脱髄疾患を治療するための医薬組成物を製造するための、式（１）および式（２）：
【化４】
2007530703.tif 000023
で示される化合物からなる群より選択される化合物の使用。
【請求項８】
脱髄疾患は、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロトフィー、ギラン・バレー症候群、ならびに脊髄損傷、神経障害および神経損傷を含むミエリンを形成するグリア細胞が損傷を受ける障害から選択される、請求項６または７に記載の使用。
【国際調査報告】
2007530703.tif 000024
2007530703.tif 000025
2007530703.tif 000026
2007530703.tif 000027