(57)【要約】  本発明は、耐熱性特性を有する、好熱性微生物から新規に同定された加水分解酵素に関し、さらに具体的には、高温で高活性を示す新規の耐熱性加水分解酵素に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３および／または配列番号４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む耐熱性加水分解酵素。
【請求項２】
配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項３】
配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項４】
配列番号３と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項５】
配列番号４と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項６】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項７】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項８】
加水分解の比活性を少なくとも８０％維持している請求項１〜７のいずれか一項に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項９】
アミノ酸モチーフＥＡＥを含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項１０】
前記ＥＡＥモチーフのＮ末端および／またはＣ末端に直接隣接する前記アミノ酸が、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、およびＫからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項１１】
前記加水分解酵素が、組換えポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項１２】
前記加水分解酵素が、遊離もしくは固定化ポリペプチドであることを特徴とする請求項１１に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項１３】
前記加水分解酵素が、繰り返して使用される請求項１２に記載の固定化加水分解酵素。
【請求項１４】
前記加水分解酵素が、エステラーゼである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項１５】
前記加水分解酵素が、リパーゼ、カルボキシエステラーゼ、アミダーゼまたはトランスアミダーゼである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の耐熱性加水分解酵素。
【請求項１６】
請求項１〜１５にいずれか一項に記載の前記アミノ酸配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号１もしくは配列番号２で示されるヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの縮重配列のいずれかを有する請求項１６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
配列番号３もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする請求項１６もしくは１７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列のいずれかと相補的であるアンチセンスヌクレオチド配列。
【請求項２０】
パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物に由来する、請求項１〜１９における配列番号１〜配列番号４のいずれかに記載のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列。
【請求項２１】
請求項１６〜１８および２０に記載のヌクレオチド配列のいずれかを含むプラスミド。
【請求項２２】
請求項１６〜１８および２０に記載のヌクレオチド配列のいずれかを含むベクター。
【請求項２３】
請求項１６〜１８および２０に記載のヌクレオチド配列のいずれかを提供する細胞。
【請求項２４】
アシル化合物の生成のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の加水分解酵素の使用。
【請求項２５】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の前記ヌクレオチド配列のプローブとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、耐熱性特性を有する、好熱性微生物から新規に同定された加水分解酵素に関し、さらに具体的には、高温で高活性を示す新規の耐熱性加水分解酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
加水分解酵素は、生体触媒としてよく知られている。一般的に、加水分解酵素は、エステルもしくはアミドのようなアシル化合物の合成もしくは変換に使用されることが可能である。前記反応により得られる生成物は、広範囲の用途を見出す。加水分解酵素は、例えば、トリグリセリドの工業用加水分解もしくはエステル交換に使用されるものとしてよく知られている。他の例として、医薬品もしくは化粧品の成分の製造であり、該分野では、立体選択性もしくは優れた品質が特に関心の対象となる。酵素反応に関する生成条件は、通常、従来型の化学触媒の生成条件よりも穏やかで特定的である。従って、酵素反応は、圧倒的に強く注目を受け、該注目はさらに高まっている。
【０００３】
工業用に使用される加水分解酵素は、細菌、酵母菌、高等動物および植物を含む多様の生物から単離されてきた。しかしながら、大部分の加水分解酵素は、使用温度範囲が限られており、高温での使用に適していない。
【０００４】
約６０℃の温度（７０℃が絶対温度最大である）で非活性化することなく使用できる加水分解酵素、さらに具体的にはエステラーゼが、いくつか存在する。一例を挙げると、固定化状態で供給される、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）から単離したリパーゼである。上記酵素の絶対温度最大は、酵素の分解が耐え難いほど強くなる前の７０℃である。
【０００５】
しかしながら、油化学および界面活性剤化学の分野において、約６５℃でまたは６５℃をかなり超えると溶解する原料や製品が非常に多く存在する（例えば、ステアリン酸７１℃、ベヘン酸７９℃）。溶媒を使用しない酵素反応は、通常好ましくないことであり、生産コストをかなり増加させる可能性がある。上記の酵素反応を実行するためには、６０℃を超えてもかなり安定性のある酵素が必要となる。高温で酵素反応を実施する別の利点は、粘性低下効果である。オリゴマーもしくはポリマーが、酵素反応によって変換される場合、この効果は、特に有用である。上記の場合、耐熱性酵素は、上昇温度で反応を実施するために前提とされる条件である。表面活性化合物の合成に特に重要である耐熱性酵素の利点を強調する三番目の特徴は、互いに反応するには相溶化する必要がある、親水性化合物と親油性化合物との反応である。上記の目的上、容易で有効な手段は、温度を上げることであり、そのためには、適切な酵素が必要である。
【０００６】
工業用に有用な加水分解酵素、生体触媒にとって、優れた熱安定性には、種々の基質および溶媒に対する広範囲の基質特異性および耐性を伴うことが必要である。事実、用途が多い触媒は、融通性の要件を満たすことが必要とされ、該要件は、特殊化学薬品の製造に使用されることが多い、多用途の製造単位にとって不可欠なことである。
【０００７】
この２０年のうちに、例えば温泉もしくは深海の熱水噴出口から単離された真正細菌もしくは古細菌などの好熱性微生物の発見そして単離により、結果として６０℃を超える温度で作用する新規の加水分解酵素の同定がされるようになった。
【０００８】
加水分解酵素、特にエステラーゼは、様々な基質特異性、置換基または鎖長の選択によって、また独自な阻害物質によって、特徴付けられる（バーマン（Ｂａｒｍａｎ）Ｔ．Ｅ．、酵素ハンドブック（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）（ベルリン、ハイデルベルクのシュプリンガー社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ,Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、１９６９年；ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）Ｍらのエンザイム、アカデミックプレス、ニューヨーク（Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）１９７９年）。多種の加水分解酵素は、カルボン酸エステル加水分解酵素（例、カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ等）からペプチド加水分解酵素およびプロテアーゼまで多岐にわたっている。例えば、リパーゼは、長い炭素鎖の基質（脂肪および油脂、或いは一般的に言えば親油性基質）で特異的に作用するが、一方アシラーゼは、短鎖誘導体（例、Ｃ２−Ｃ６エステル等）に対して特異的である。その他の非常に特異的なエステラーゼは、コリンエステラーゼ、ステリルエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ１およびＡ２などである。多くの場合、上記の加水分解酵素は、タンパク質活性部位に本来備わっているキラル性から生じる立体および位置選択的な優位を示すと知られている。
【０００９】
加水分解酵素は、水溶液中でそれらの自然反応（例えば、エステル結合の加水分解）を実行する。水が十分でない条件下では、上記反応は、逆方向に進むこともあり、酸とアルコールからエステルが生成される。上記の酵素を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エステル含有の環状および非環式アルコール、モノ−およびジエステル、およびラクタムを含む種々様々な基質で反応を実行することが可能である（サンタニエッロ（Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ），Ｅ．ら、「鏡異性体の純粋なキラルのビルディングブロックの調製を導く生体触媒アプローチ（Ｔｈｅ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｃｈｉｒａｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）」（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９２：１０７１−１１４０，１９９２年））。水の存在なしで上記反応を実行することにより、加水分解酵素反応は、逆方向に進むこともある。上記酵素は、エステル化もしくはアシル化反応において触媒として働き、エステルもしくはアミド結合を形成することができる（サンタニエッロ（Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｅ．）ら、上記）。この方法も、エステルのエステル交換反応、および閉環もしくは開始反応にも用いることが可能である。
【００１０】
加水分解酵素は、脂肪の代謝における一群の鍵酵素であり、微生物から哺乳類にいたる全ての生物に見出せる。加水分解反応において、エステルもしくはアミド基は、有機酸とアルコールもしくはアミンに加水分解される。
【００１１】
加水分解酵素には工業用や科学的な多くの用途が存在する。加水分解酵素の多くの使用例のうちの一部の例を以下に記載する。
１）スイスタイプのチーズなどのチーズの熟成プライマー（ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ｓｔａｒｔｅｒ）としての乳製品業界における加水分解酵素
２）紙、パルプ業界における、セルロースパルプからリグニンを除去するための加水分解酵素、芳香族酸とリグニン間のエステル結合およびリグニンとヘミセルロース間のエステル結合を切断することによるリグニンの可溶化のための加水分解酵素、および生物パルプ化やパルプの生物漂白において、キシラナーゼや他のキシラン分解酵素と組み合わせで使用する場合の細胞壁構造を破砕するための加水分解酵素
３）炭水化物誘導体（例、糖誘導体）の合成における加水分解酵素
４）各種の化学薬品や燃料を製造するために、リグノセルロース廃棄物を発酵性糖に変換する際の、キシラナーゼとセルラーゼとの組み合わせにおける加水分解酵素
５）植物の細胞壁構造、具体的には、細胞壁マトリックスにおけるリグニンと炭水化物ポリマー間の共有結合の性質に関する研究における研究用試薬としての加水分解酵素
６）植物の耐病性に関連する機序および有機物分解のプロセスに関する研究用試薬としての加水分解酵素
７）非常に消化されやすい動物の餌、特に反芻動物の餌を製造するための植物育成の選択における加水分解酵素
８）脂肪と油脂を加水分解して脂肪酸を生成する際のリパーゼ
９）特殊脂肪を生成する、脂肪と油脂のエステル交換におけるリパーゼ。
【００１２】
本明細書で用いる用語「加水分解酵素」は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｖ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎａｙｍｅ／において判明される)によると、Ｅ．Ｃ．３群に属する酵素を意味する。
【００１３】
耐熱性リパーゼとして、或いは耐熱性加水分解酵素として使用される市販の公知の加水分解酵素の殆どは、熱に対する安定性において、適切でなく、高温、広範囲のｐＨ値での工業用用途に実用的でなく、長時間の反応にも適切でない。現在までに、１種類の加水分解酵素と数種類のリパーゼのみが、適度の耐熱性を有すると報告されている。
【００１４】
イケダ（Ｉｋｅｄａ，Ｍ.）とクラーク（Ｄ．Ｓ．Ｃｌａｒｋ）による（バイオテクノロジーおよびバイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、５７、６２４−９頁、１９９８年）は、大腸菌中の超好熱古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得た耐熱性加水分解酵素遺伝子の分子クローン化を記載する。しかしながら、前記文献は、上記の加水分解酵素の核酸配列もアミノ酸配列も開示してなく、上記水分解酵素は、ｐＨ値７．６あたりの狭い範囲においてのみ最適に機能し、至適温度１００℃で、狭い温度範囲においてのみ良好な活性を示す。温度安定性は、半減期に対して以下の結果を示されうる：１００℃で３４時間、１１０℃で６時間、１２０℃で２時間および１２６℃で５０分。上記酵素は、低いまたは適度にしかリパーゼ活性を有さず、短鎖の炭化水素の基質に、より活性を示す。加水分解酵素ＤＮＡ配列を含有するプラスミドの発現は、形質転換した大腸菌の液体培養でのプラスミドの安定性が低いために、非常に困難である。
【００１５】
チューリン（Ｔｕｌｉｎ）ら（Ｂｉｏｓｃｉ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７、８５６〜８５７頁、１９９３年）は、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）にクローンするバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の加水分解酵素について、報告した。しかしながら、上記加水分解酵素は、７０℃で１０分までしか安定していなかった。スギハラ（Ｓｕｇｉｈａｒａ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.１１２、５９８〜６０３頁、１９９２年）は、２種の微生物、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）土壌単離およびシュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）土壌単離から新規の耐熱性リパーゼを単離した。前者のリパーゼは、６５℃で３０分まで安定しているが、この温度を超えると、急激に不活性化される。シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼは、７５℃、ｐＨ６．５で３０分間加熱された場合、安定しているが、上記温度でアッセイされる場合、その活性の１０％だけを有した。
【００１６】
シグルギスラドッチル（Ｓｉｇｕｒｇｉｓｌａｄｏｔｔｉｒ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５、３６１〜３６６頁、１９９３年）は、８０℃までの温度でオリーブオイルに作用するリパーゼを含有する１種のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）菌と２種のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌の単離に関して報告したが、この研究に酵素安定性に関する論文は報告されていない。
【００１７】
ホッタ（Ｈｏｔｔａ）ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８、３９２５〜３９３１頁、２００２年）は、古細菌ピロバクラム・カリディフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）中に耐熱性加水分解酵素を発見し、特性を決定した。上記加水分解酵素は、１００℃で少なくとも２時間、耐熱性であり、１１０℃で５６分の半減期を有することを示した（双方とも水溶性媒体で測定した）。上記加水分解酵素は、さらに、水混和性有機溶媒の存在下でかなり安定している。その基質特異性は、短鎖の炭化水素の基質（Ｃ6鎖が最適である）に限定される。
【００１８】
特開昭６２-７９７８２号公報は、耐熱性リパーゼを提案した。しかしながら、酵素の至適温度は、６０℃〜７０℃の範囲であり、７０℃で１５分の処理後の残留活性は、１０％未満であるので、その熱安定性は、十分ではない。
【００１９】
欧州特許公報ＥＰ０１１７５５３号明細書は、リゾープス・キネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉ）由来の耐熱性リパーゼを開示するが、この酵素の至適温度は、６０℃でしかなく、高温での活性は、十分ではない。
【００２０】
さらに、７０℃の至適温度を有し、６０℃で１４時間の熱処理により不活性化されない、シュードモナス・メフィチカ・バラエティ・ポリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｐｈｉｔｉｃａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｐｏｌｙｔｉｃａ）により産生されるリパーゼ（特公昭５０−２５５５３号公報）と、７５℃〜８０℃の範囲で至適温度を有し、７０℃で２０分間の熱処理後、９５％の活性を維持する、シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｊｉ）により産生される２番目のリパーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４１，１３５３−１３５８、１９７７年）に関する論文がある。しかしながら、上記の酵素の温度安定性は、８０℃以下で１時間なので、それらは、熱安定性に関して十分に満足しない。
【００２１】
米国特許第５，７６６，９１２号明細書は、６０℃、ｐＨ約６〜約９で２時間後少なくとも９０％の、６０℃、ｐＨ約５．５〜約９．２で２時間後少なくとも８０％の残留活性を有する組換え型フミコラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．）リパーゼを記載し、請求する。上記リパーゼは、５５℃、ｐＨ約６〜約９．５で２時間後少なくとも９５％の残留活性を有する。
【００２２】
米国特許第５，１７３，４１７号明細書は、ｐＨ約４〜７の範囲を有する緩衝液中で、約６０℃で約１５分間処理した場合、加水分解活性の約１００％保持を示す、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から得る耐熱性リポタンパク質リパーゼと、少なくとも約１５％の活性率を形成する、活性／脂肪酸を生成するグリセロールを記載する。
【００２３】
米国特許第５，３０６，６３６号明細書は、ｐＨ７．０、温度６０℃で２４時間安定であり、基質としてのオリーブオイルと適応可能な作用温度の範囲が、至適ｐＨ５．５〜７．９で６０℃〜６５℃であるシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）ＫＷＩ−５６から得る耐熱性リパーゼを記載する。しかしながら、このリパーゼは、７０℃で２４時間の熱処理後、８２％程度まで不活性化される。
【００２４】
米国特許第５，８４６，８０１号明細書は、ｐＨ範囲約４〜１２、至適ｐＨ６．５〜９．５で、８０〜９０℃の至適温度（基質としてトリオレインエマルションを用いて測定した）を有するシュードモナス・ソラナシアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）から得る耐熱性リパーゼを記載するが、酵素の残留活性は、１時間以内でしか測定されていない。さらに、シュードモナス・ソラナシアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）は、病原性微生物である。
【００２５】
米国特許第５，４８０，７８７号明細書は、リパーゼ粉末を用いるエステル交換の方法を開示する。アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ）から得る市販のリパーゼを使用して、油脂、脂肪および樹脂をエステル交換するのは好ましいが、エステル化も加水分解反応どちらも開示されていない。さらに、前記酵素によるアミド生成に関する開示もされていない。さらに、固定化加水分解酵素の粒子直径は、酵素反応中、完全に制御される必要がある。そうしないと反応性が低下し、反応液からリパーゼ粒子の回収が困難になり、再利用が不可能となる。
【００２６】
ＥＰ０７０９４６５号明細書およびＥＰ０７１４９８４号明細書は、溶媒を使用しない水無添加の条件下で、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ）由来の耐熱性リパーゼによる光学活性アルコールの生成方法を記載する。しかしながら、前記公報は、加水分解もしくはエステル化反応での前記リパーゼの使用を開示していない。
【００２７】
米国特許第５，７１４，３７３号明細書は、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＶ４と、サーモコッカスによって産生される酵素とを開示する。前記公報は、耐熱性リパーゼの同定を開示し、前記リパーゼは、リパーゼ活性により検出される（例、トリグリセリドからジグリセリドと脂肪酸への加水分解、そしてモノグリセリドとグリセロールへの加水分解）。しかしながら、上記の反応例も熱安定性に関するデータも開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
先行技術の観点から、先行技術の酵素には見出せない有利な特質をいくつか組み合わせた加水分解酵素およびその加水分解酵素を産生する微生物を提供することが望ましい。従って、長時間の反応中に優れた熱安定性を有し、広いｐＨの範囲、各種の媒体において、優れた能力を有し、広範囲の基質に対して作用できる新規の加水分解酵素を提供することが必要とされていた。
【００２９】
定義
本明細書で用いる用語「耐熱性加水分解酵素」は、触媒加水分解、エステル化、エステル交換またはアミド生成反応において、４０℃〜１１０℃までの広い温度範囲にわたって活性を有する加水分解酵素を意味する。
【００３０】
本発明の加水分解酵素は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会に基づいて、Ｅ．Ｃ．３分類され、エステル結合、ペプチド結合および炭素−窒素結合に作用する酵素（例、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、およびアミダーゼ等）を包含する。
【００３１】
本発明の明細書で用いる「至適ｐＨ」は、酵素が最大活性の少なくとも９０％の活性を有するｐＨである。
【００３２】
本発明の明細書で用いる「至適温度」は、酵素が最大活性の少なくとも９０％の活性を有する温度（℃）である。
【００３３】
本明細書で用いる「加水分解酵素の活性」は、エステラーゼ単位（ＥＵ）で表される。１ＥＵは、１分当たりに１ミクロモルのエステルを加水分解する酵素の量である。単位ＥＵは、さらに一般的に、加水分解酵素が触媒として作用する全種類の反応（例えば、加水分解、エステル化、エステル交換、アミド化、アミド基転位等）に適用されることができる。ＥＵで表される加水分解酵素の活性は、各反応の種類で異なり、１分内に変換された分解物（ｅｄｕｃｔ）のミクロモルでの量に対応する。比活性は、例えばミリグラムで測定される重量当たりの生体触媒の量に相関する活性である。
【００３４】
本明細書で用いる用語「比活性」は、本発明の加水分解酵素の特徴付けにも使用される。上記の目的上、２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシブチルアルカネートの加水分解を適用する。特に、２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシブチルデカノエートの加水分解によるＥＵ／ｍｇにおける比活性の測定を、実施例１．１に記載するラガルデ（Ｌａｇａｒｄｅ，Ｄ.）らの方法（Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．６（２００２年）４４１）に従って、実行する。１００％の比活性は、本明細書の実施例６．２に記載される通り、２０ＥＵ／ｍｇと規定される。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明の詳細な説明
本発明は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）に基づいて、ＥＣ３酵素として分類される新規の耐熱性加水分解酵素に関し、前記加水分解酵素は、以前は未知であった核酸およびアミノ酸配列を有し、高温で、加水分解、エステル合成またはアミド合成のように、アシル残基に影響を与える反応に一般的に使用しうる、サーモコッカルス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目の古細菌から獲得できる優れた耐熱性特性を有する。従って、ＥＣ３．１、ＥＣ３．４およびＥＣ３．５としてＥＣ分類を有する加水分解酵素が好ましい（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ac．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３／参照）。
【００３６】
さらに具体的には、本発明は、配列番号３および／または配列番号４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む耐熱性加水分解酵素に関し、好ましくは配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む耐熱性加水分解酵素、または配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む耐熱性加水分解酵素に関する。
【００３７】
さらに好ましくは、本発明に係る耐熱性加水分解酵素は、配列番号３と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含み、または耐熱性加水分解酵素は、配列番号４と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３８】
さらになお好ましくは、本発明に係る耐熱性加水分解酵素は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、または耐熱性加水分解酵素は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
最も好ましくは、上記耐熱性加水分解酵素は、配列番号３で示されるアミノ酸配列、または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる。
【００４０】
本発明の加水分解酵素は、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属もしくはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の古細菌から獲得できることが好ましい。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、本発明に係る耐熱性加水分解酵素は、遺伝子組換えによって産生された加水分解酵素である。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明に係る耐熱性加水分解酵素は、繰り返して使用されうる。つまり、１回目の反応に使用した後、２回目もしくはさらなる回数、同じもしくは異なる反応に使用されうる。このような耐熱性加水分解酵素は、本発明に関連して、再使用性加水分解酵素（ｒｅｃｙｃｌｅｄ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）と称される。
【００４３】
本出願のさらなる実施形態において、本発明に係る加水分解酵素は、加水分解酵素が担体上もしくは担体内に固定化されていないことを意味する遊離の加水分解酵素として使用される。
【００４４】
さらに別の実施形態において、本出願の加水分解酵素は、固定化加水分解酵素として使用される。当業者には公知の方法によって、上記加水分解酵素を担体物質上もしくは担体物質内に固定化することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
温度、ｐＨおよび他の応力条件に関して、酵素の全体的な安定性を向上させるために、固定化は、通常有利である。固定化は、さらに、例えば濾過によって反応混合物からの酵素の除去を促進し、また固定化は、酵素の生産性を向上させる場合さえもある。
【００４６】
固定化に関する多くの公知の技法が存在する。通常、それらの技法には、吸着手段による、または共有結合による、固体支持体への酵素の結合が含まれる。遊離もしくは結晶形態の酵素の架橋を用いる他の技法も存在する。固体マトリックスもしくは制限された膜分画への閉じ込めのように、酵素を制限領域に閉じ込めることは、可能であり、使用されることが多い。固定化技法により、生体触媒の特性（例、安定性、選択性、基質への結合性、ｐＨおよび温度の特性）を変えることが可能である。
【００４７】
酵素の架橋とは、結果として不溶性高分子結合体となる、酵素分子と他の酵素分子の共有結合による結合を意味する（Ｓ．Ｓ．ウォン（Ｗｏｎｇ）、Ｌ−ＪＣ．ウォン（Ｗｏｎｇ）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９２年）８６６）。遊離酵素分子は、さらに、他の不活性「充填」タンパク質（例、アルブミン等）で架橋されることが可能である。架橋による固定化に最も一般的に使用される試薬は、α，ω−グルタルジアルデヒドであり（Ｓ．Ｓ．カーン（Ｋｈａｎ）Ａ．Ｍ．Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２７（１９８５年）４１５）、ポリアゼチジンのような他の架橋剤と組み合わせで使用されることもある。上記方法の利点は、その容易さである。
【００４８】
本発明は、さらに、触媒加水分解、エステル化、エステル交換またはアミド生成反応において、４０℃〜１１０℃までの広い温度範囲にわたって、好ましくは６０℃〜１０５℃の温度で、さらに好ましくは８０℃〜１０５℃の温度で、そして最も好ましくは９０℃〜１００℃の温度で、さらに最も好ましくは約９５℃〜１００℃の温度で、活性を有する耐熱性加水分解酵素に関する。
【００４９】
本発明に係る耐熱性加水分解酵素は、５０℃を超える、好ましくは６０℃〜１００℃の温度範囲に、さらに好ましくは８０℃〜１００℃の範囲に、なおさらに好ましくは９０℃〜１００℃の範囲に、至適温度範囲を有し、至適温度が９５℃（２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチルデカノエートの加水分解により測定）であるのが最も好ましい。
【００５０】
本明細書に使用される「温度安定性」とは、遊離酵素が、６０℃を超える温度、好ましくは７０℃〜１１５℃、さらに好ましくは８０℃〜１１０℃で、その加水分解酵素の活性の少なくとも１５％、好ましくは２５％、最も好ましくは３５％を維持することを意味し、最も好ましくは酵素が、８５℃〜１０５℃の温度で、少なくとも１６時間、好ましくは２４時間、最も好ましくは４０時間にわたって安定であることを意味する（２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチルデカノエートの加水分解により測定）。
【００５１】
またさらに、本発明に係る遊離の加水分解酵素は、広範囲のｐＨ値で、つまり、ｐＨ３〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ４〜８で、さらに好ましくはｐＨ４〜７で、最もさらに好ましくはｐＨ５〜７で、活性を示す（２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチルデカノエートの加水分解により測定）。本発明の加水分解酵素は、ｐＨ６の至適ｐＨを有するのが特に好適である。つまり、上記加水分解酵素は、ｐＨ６で、５０％〜１００％の加水分解酵素の相対活性、好ましくは７５％〜１００％の相対活性、最も好ましくは９０％〜１００％の相対活性を有する（２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチルデカノエートの加水分解により測定）。
【００５２】
さらに、本発明に係る遊離の加水分解酵素は、水溶性、極性および無極性媒体を含む溶媒条件の範囲において、活性を維持する。
【００５３】
好ましいことに、本発明に係る加水分解酵素は、９０℃で３０分間の熱処理後、水溶性または極性もしくは非極性有機媒体（例、アルコール、ケトン、エステル、カルボン酸、脂肪族および芳香族炭化水素またはそれらの混合物等）中で、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の残留活性を有する。上記の有機媒体の例として、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、エチレングリコール、アセトン、シクロヘキサン、エチルアセタート、エチレングリコールジヒドロキシステアラート、メチルシクロヘキサン、またはトルエンが挙げられる。
【００５４】
本発明の加水分解酵素は、エステル、アミドまたはその他のアシル化合物の合成において触媒として使用されるのに非常に適切であり、いくつかの例を挙げると、アルコールとカルボン酸、アルコールとエステル、カルボン酸とエステル、エステルとアルキルアミンからなる対応する反応媒体において、非常に良好な安定性を示す。
【００５５】
本発明の好適な一実施形態において、本発明の加水分解酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、カルボキシエステラーゼ、アミダーゼまたはトランスアミダーゼである。メディカルサーチエンジン（ｗｗｗ．ｂｏｏｋｓ．ｍｄ）により、加水分解酵素の上記の型に関して以下の定義が得られる。
−  エステラーゼは、有機エステルの加水分解を触媒して、アルコールもしくはチオールと酸を放つ。上記用語は、カルボン酸エステル、リン酸エステルおよび硫酸エステルを加水分解する酵素に適用されうるが、第一クラスの基質に限定されることがさらに多い。
−  リパーゼは、脂肪（モノ−、ジ−またはトリグリセリド）をグリセロールと脂肪酸に加水分解する。
−  カルボキシエステラーゼは、アルコールとカルボン酸アニオンを生じる、カルボン酸エステルの加水分解を触媒する。
−  アミダーゼは、遊離酸とＮＨ3を生じる、モノカルボン酸アミドの加水分解を触媒する。
−  トランスアミダーゼは、アミド基から別の分子へのＮＨ2の移動を触媒する。
【００５６】
さらに、本発明に係る加水分解酵素は、２〜５０、好ましくは２〜２４、さらに好ましくは３〜１８個の炭素原子の鎖長を有する広範囲の基質に対して活性を示す。
【００５７】
具体的には、本発明に係る加水分解酵素は、２０〜１００ＥＵ／ｍｇの加水分解活性を有する（ｐＨ５〜７および８０℃〜１００℃で、２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシブチルデカノエートの加水分解により測定）。
【００５８】
さらに、本発明に係る加水分解酵素は、オクタノールとラウリン酸からラウリン酸オクチルを生じる反応において、８０℃〜１００℃で、２０〜１００ＥＵ／ｍｇのエステル化活性を有する。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明の酵素をコード化する単離核酸分子を提供し、さらに類似の配列を提供する。
【００６０】
好適な一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは４に基づいたアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントのいずれかをコードしている。
【００６１】
別の好適な実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号２で示され、或いは、それらは、それらのいずれかの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）配列である。
【００６２】
本発明に関連して、用語「類似性」は、核酸に関する場合、関連した２本以上の別々の核酸の鎖が、互いに対してどのくらい類似しているかを定義するために用いられる。
【００６３】
本発明により包含される単離した核酸配列が、以下であるならば、類似性がある。
ａ）それらが、以下に記載の条件下で、配列番号３もしくは４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列番号１もしくは２に相補的であるポリヌクレオチドとハイブリッド形成でき、かつコードされたタンパク質が、その元来の比活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％を保持するならば、類似性がある。
ｂ）それらが、配列番号１もしくは２のポリヌクレオチドの縮重変異体であり、コード化タンパク質が、加水分解酵素のその元来の活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％を保持するならば、類似性がある。
【００６４】
配列番号１もしくは２のＤＮＡ配列は、各々配列番号３および４のアミノ酸配列をコード化するが、ヌクレオチドコード配列に変異を有する配列番号１および２の縮重ＤＮＡ配列も、それらが、配列番号３もしくは４に記載のアミノ酸をコード化するならば、本発明の範囲内である。さらに、類似性である配列も、本発明の範囲内に含まれる。これらの類似性の配列は、好ましくは下記のコード化アミノ酸モチーフ「ＥＡＥ」を変えないで、１〜３０のヌクレオチド交換、好ましくは１〜１０の交換を有する場合もあり、コード化タンパク質が、配列番号１もしくは２によりコード化されたタンパク質の元来の比活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％を保持するのが好ましい。類似性であるヌクレオチド配列は、ハイブリッド形成もしくは配列比較により同定されることが可能である。
【００６５】
本発明の酵素をコードする核酸分子を単離する手段としては、天然もしくは人工的に設計されたプローブを用い、技術的に妥当と認められた手順（例えば、分子生物学における最新のプロトコル（分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら、（ＥＤＳ）グリーンパブリッシング社（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ａｓｓｏｃ．）およびジョンワイリー・インターサイエンス（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク、１９８９年、１９９２年を参照））を用いて遺伝子ライブラリーを探索することが挙げられ、ここで、該プローブは、配列番号１もしくは２のどちらかに相補的であり、同定した核酸は、配列番号１もしくは２と少なくとも９０％、好ましくは９１％〜９７％の類似性を有するものとなる。アミノ酸モチーフ「ＥＡＥ」を包含し、コードされたタンパク質の元来の比活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％を維持するアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは配列番号２、またはそれらのフラグメントと相補的なポリヌクレオチドが特に有用なプローブであることは、当業者に認められている。
【００６６】
本明細書に開示した特異的な核酸配列とハイブリッド形成する核酸配列に関して、ハイブリッド形成は、緩和したストリンジェントな条件、中間のストリンジェントまたはストリンジェントな条件でさえ起こりうる。ストリンジェントなオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の例として、固定化した変性核酸を含有するポリマー膜は、０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ2Ｐ０4、ｐＨ７．０、５．０ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、１０×デンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、および０．５ｍｇ／ｍＬのポリリボアデニル酸からなる溶液中で、最初に４５℃で３０分間プレハイブリダイズされる。次に、およそ２×１０7ｃｐｍ（比活性４〜９×ｌ０8ｃｐｍ／μｇ）の32Ｐ末端ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを上記溶液に加える。１２〜１６時間のインキューベーション後、０．５％のＳＤＳを含有する１×ＳＴＥ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸塩、ｐＨ７．８、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ）中で、膜を室温で３０分間洗浄した後、新規の１×ＳＴＥ中においてＴｍ−１０Ｃで、オリゴヌクレオチドプローブのために、３０分間洗浄する。次に、ハイブリッド形成シグナルの検出のために、自動放射線用フィルムに膜を暴露する。
【００６７】
ストリンジェントな条件とは、配列番号１もしくは配列番号２の配列とハイブリッド形成により同定された配列とに少なくとも９０％の類似性、好ましくは少なくとも９５％の類似性、最も好ましくは少なくとも９７％の類似性が存在する場合に限り、ハイブリッド形成が、起こりうることを意味する（Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らのモレキュラー・クローニング実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年を参照）。
【００６８】
本明細書で用いるＤＮＡ（ＲＮＡ）配列は、互いに適切に整列している場合、一方の配列の塩基と他方の配列の塩基の間に前記類似性があるならば、別のＤＮＡ（ＲＮＡ）配列と、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、或いは少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、なおさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の類似性がある。この目的上、いかなる配列プログラムも使用可能である（例えば、ＢＬＡＳＴＮ（登録商標））。
【００６９】
本発明は、さらに、変異がサイレント変異である（例えば、変異が、ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列を変えない）ような、基準ポリヌクレオチドと異なる縮重ポリヌクレオチドにも関する。本発明は、さらに、基準ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド中に、アミノ酸の置換、付加、欠失、結合およびトランケーションを生じる結果となるヌクレオチド変化に関する。本発明の好適な一態様において、上記のポリペプチドは、基準ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドと同じ生物活性を保持するが、しかしながらそれらは、天然ポリペプチドの生物活性の少なくとも９０％を保持するのが望ましい。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡがｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＲＮＡもしくはＤＮＡの形態であってもよい。上記ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖であってもよく、一本鎖ならば、コーディング鎖でも非コード（アンチ−センス）鎖であってもよい。
【００７１】
上記酵素をコードするコーディング配列は、配列番号１および２で示されるコーディング配列と同一でもよく、異なるコーディング配列を有してもよい。しかしながら、上記コーディング配列は、遺伝子コードの重複もしくは縮重の結果として、配列番号１および２のＤＮＡと同じ酵素をコード化する。
【００７２】
配列番号１および２の酵素をコード化するポリヌクレオチド、およびそれらと類似の配列には、それに限定することなく、酵素のコード配列のみ；酵素のコード配列と付加的コード配列（例、リーダー配列もしくはプロタンパク質配列）；酵素のコード配列（および場合により、付加的コード配列）および非コード鎖配列（例、酵素のコード配列のイントロンもしくは非コード配列５’および／または３’）が含まれてもよい。
【００７３】
従って、用語「酵素（タンパク質）をコード化するポリヌクレオチド」は、酵素のコード配列のみを含むポリヌクレオチドだけでなく、付加的コードおよび／または非コード鎖配列を含むポリヌクレオチドも包含する。
【００７４】
本発明は、さらに、配列番号３および４およびその類似の推定アミノ酸配列を有する酵素のフラグメントおよび誘導体をコード化する上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。上記ポリヌクレオチドの変異体は、天然物由来のポリヌクレオチド対立遺伝子の変異体でも、非天然物由来のポリヌクレオチド変異体でもよい。
【００７５】
従って、本発明には、配列番号３および４に示されるのと同じ酵素をコード化するポリヌクレオチドだけでなく、変異体が酵素のフラグメント、誘導体または類似体に対してコード化する上記のポリヌクレオチドの変異体も含まれる。上記のヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体および付加もしくは挿入変異体が含まれる。
【００７６】
上記に示唆した通り、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１および２に示されるコード配列の天然物由来の対立遺伝子変異体であるコード配列を有してもよい。当技術分野では公知の如く、対立遺伝子変異体は、１種もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有しうるポリヌクレオチド配列の代替形式であり、それらは、コード化酵素の働きを殆ど変えない。つまり、少なくとも８０％、好ましくは９０％の天然酵素の活性が保持される。
【００７７】
完全長ＤＮＡを単離するために、および遺伝子もしくは類似の生物活性と高い配列類似性を有する他のＤＮＡを単離するために、本発明の完全長遺伝子のフラグメントを、ハイブリッド形成プローブとして、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーに用いてもよい。この型のプローブは、好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも１５、なおさらに好ましくは少なくとも３０種の塩基を有し、例えば、少なくとも５０種以上の塩基を含有しうる。プローブを使用して、調節およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全遺伝子を含有する完全長転写物および１種のゲノムクローンもしくは複数種のクローンに対応するＤＮＡクローンを同定してもよい。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために、公知のＤＮＡ配列を用いて、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、プローブがハイブリッド形成するライブラリーの構成要素を決めるためゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
【００７８】
上記のプローブが、プローブの同定を促進するように、分析検出試薬で標識されることが可能であり、そうされるのが好ましいとが認識されている。有用な試薬として、これに限定しないが、検出可能な生成物の生成に触媒作用を及ぼすことができる放射能、蛍光染料もしくは酵素が挙げられる。従って、上記プローブは、他の源から得たＤＮＡの相補的複写を単離するのに有用であり、或いは関連する配列の上記の源をスクリーニングするのに有用である。
【００７９】
本発明は、さらに、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、或いは少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、なおさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、配列間に類似性が存在するならば、上記の配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件で、上記のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。好適な一実施形態における上記のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、配列番号１および２のＤＮＡによりコード化される酵素とほぼ同じ生物機能か活性のどちらかを（つまり、天然の酵素の活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％）保持する酵素をコード化する。
【００８０】
別の方法として、本発明によって同様に包含されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのいずれかの部分とハイブリッド形成する少なくとも１５種の塩基、好ましくは少なくとも３０種の塩基、さらに好ましくは少なくとも５０種の塩基を有してもよい。例えば、上記のポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドを回収するために配列番号１および２のポリヌクレオチドのプローブとして、または診断プローブとして、或いはＰＣＲプライマーとして、使用されてもよい。
【００８１】
従って、本発明は、配列番号３および４の酵素だけでなく、該ポリヌクレオチドのフラグメントもコード化するポリヌクレオチドと少なくとも５０％、または少なくとも６０％、或いは少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、なおさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の類似性を有するポリヌクレオチドに関し、前記フラグメントは、少なくとも１５種の塩基、好ましくは少なくとも３０種の塩基、最も好ましくは少なくとも５０種の塩基を有し、フラグメントは、ストリンジェントな条件で、本発明のポリヌクレオチドのいずれかの部分と少なくとも９０％相補的、好ましくは少なくとも９５％相補的、最も好ましくは少なくとも９７％相補的である。
【００８２】
本発明の好適な一実施形態において、耐熱性加水分解酵素は、配列番号３かもしくは配列番号４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
本発明は、さらに、配列番号３もしくは４の推定アミノ酸配列を有する酵素に関し、代替実施形態において、上記酵素のフラグメント、類似体および誘導体に関する。
【００８４】
一代替実施形態において、用語「フラグメント」、「類似体」および「誘導体」は、配列番号３もしくは４の酵素に関する場合、酵素自体と本質的に同じ生物機能または少なくとも８０％、好ましくは９０％の活性を保持する酵素を意味する。従って、類似体には、活性酵素を産生するプロタンパク質部分の開裂によって、活性化されうるプロタンパク質が含まれる。
【００８５】
さらなる一代替実施形態において、本発明の酵素は、天然もしくは組換え型酵素でもよく、組換え型酵素が好ましい。
【００８６】
さらにさらなる一代替実施形態は、配列番号３もしくは４の酵素のフラグメント、誘導体または類似体を明示し、１種もしくはそれ以上の、例えば、1〜２０、好ましくは1〜１０種のアミノ酸残基が、保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換される。このような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコード化されている配列もしくはコード化されない配列、または１種もしくはそれ以上のアミノ酸残基が、１個の置換基を含んでいる配列もしくは含んでいない配列、或いは酵素が、酵素の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物と結合している配列もしくは結合していない配列、或いは追加のアミノ酸が、酵素に結合する配列ものもしくは結合しない配列（例、リーダーもしくは分泌配列、または酵素の精製のために採用される配列、或いはプロタンパク質配列など）でもよい。
【００８７】
本発明において、アミノ酸を標準の単一文字コードか、それらの三文字コードのどちらかで略語として表す。
【００８８】
【表１】
2007507211.tif 000002
【００８９】
本発明の酵素およびポリヌクレオチドは、単離された形態で提供されるのが好ましく、均一に精製されるのが好ましい。用語「単離される」は、物質がその元来の環境（例えば、天然物由来である自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然物由来のポリヌクレオチドもしくは酵素は、単離されないが、自然系に共存するある種のもしくは全ての物質から分離される同種のポリヌクレオチドもしくは酵素は、単離される。上記のポリヌクレオチドもしくは酵素は、このようなベクターもしくは組成物がその自然環境の一部ではない点で、組成物の一部であることもあり、また依然として単離されることもある。
【００９０】
文献において、用語「類似性」と「相同性」は、アミノ酸配列に関する場合、互いに交換して使用されることが多い。しかし、定義（ＩＵＢＭＢ／ＩＵＰＡＣ生化学命名委員会（ＩＵＢＭＢ−ＩＵＰＡＣ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（ＪＣＢＮ）および国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.１９８９年、１８３、１〜４頁に既に発表された公報１９８９年）によると、それらが、共通の進化の歴史を共有するならば、すなわち、両方の配列の祖先であった過去における祖先分子が存在するならば、２つの配列は、「相同」である。「類似性」は、同一アミノ酸または２つの配列間に類似性を有するアミノ酸の百分率を示す量である。２つの相同な配列は、それらの由来により類似であり、類似配列は、必ずしも相同ではない（Ｇｉｂａｓ  Ｃ，Ｊａｍｂｅｃｋ  Ｐ．Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  ｐｒａｋｔｉｓｃｈｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｋ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｋｏｅｌｎ，２００２年、第１版、１８５頁）
【００９１】
本明細書で使用される「保存的」もしくは「非保存的突然変異」は、１個のアミノ酸残基を、酵素機能を変えない別のアミノ酸残基で置換することを意味する。
【００９２】
本明細書で使用される用語「同一性」は、２つのアミノ酸配列もしくは核酸配列が、変化しない程度を意味する。言い換えれば、「同一性」は、２つの整列した配列の間に変化がないアミノ酸もしくはヌクレオチドの百分率である。
【００９３】
用語「整列」に基づいて、類似性の程度、および相同性の可能性を評価する目的上、最大レベルの同一性（アミノ酸配列の場合、保存）を達成するために２つ以上の配列を並べるプロセスが一般的に理解されている。
【００９４】
所謂、大域配列において、可能な限り多くの特質を有する全配列を整列させる試みがされた（つまり、ポリペプチドの単一アミノ酸残基、ポリヌクレオチドの単一ヌクレオチド）。局所配列において、対照的に、最も高い密度の一致を有する配列の伸張が、最も高い優先度を付与されるので、整列した配列において、１回もしくはそれ以上、一致した孤立部分（ｓｈｏｒｔ−ｉｓｌａｎｄ）を生じる。
【００９５】
配列が整列される場合、通例、対象の配列は、データベースにおける配列と比較される。対象の配列は、不完全な配列に整列されることもある。この場合、コンピュータープログラムは、アミノ酸を最も可能性のある方法で整列させる。
【００９６】
配列の整列および類似性の百分率の測定は、一群のアミノ酸配列データを配列エディターｓｅａＶｉｅｗにインポートすることにより、実現できる（Ｇａｌｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｇｏｕｙ，Ｍ．およびＧａｕｔｉｅｒ，Ｃ．；ＣＡＢＩＯＳ  １２、５４３〜５４８頁、１９９６年）。隙間の数を最小限に抑え、配列の様々な類似のドメインを明白に比較するために、全配列を手動で整列させる。異なる配列間の類似性の百分率の測定を可能にし、本出願において付与される類似性の程度を測定するために利用される系統発生的プログラム（ＰｈｙｌｏＷｉｎ）に、この最適化された配列をインポートすることが可能である。
【００９７】
タンパクの距離とＰＡＭ距離に基づく系統発生的プログラムを用いて、種々の配列間の系統発生的距離を算出する。２つの配列間の距離は、式（１−ｄ）・１００によって、類似性の百分率に変換されうる。本研究において、完全に整列した配列を用いて、分析をした。
【００９８】
本発明の酵素には、配列番号３および４の酵素だけでなく、配列番号３および／または４の酵素と少なくとも７０％、好ましくは７５％、さらに好ましくは８０％、なおさらに好ましくは８５％、それよりもさらに好ましくは９０％の類似性、それよりももっとさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の類似性を有する酵素も含まれ、さらに、通例少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０種のアミノ酸を、さらに好ましくは少なくとも５０、なおさらに好ましくは少なくとも１００種のアミノ酸を含有する酵素のこのような部分を有する上記酵素のフラグメントも含まれる。配列番号３もしくは４の酵素と７０％、好ましくは７５％、さらに好ましくは８０％、なおさらに好ましくは８５％、それよりもなおさらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列も、同様に好ましい。本発明において、ヌクレオチド配列（配列番号１および２）と示されるように整列されうるこれらの配列が、好適であり、上記で考察した数字においてヌクレオチド配列（配列番号１）により概略的に表されるヌクレオチド配列が、最も好適である。
【００９９】
変異体、つまり、「フラグメント」、もしくは「誘導体」ポリペプチド、および基準ポリペプチドは、最大１０％まで、好ましくは最大５％以下まで、置換、付加、欠失、結合およびトランケーションによってアミノ酸配列において異なり、上記の変性は、いずれかの組み合わせで存在することもある。
【０１００】
好適な変異体のうち、酵素機能を変えないいずれかのアミノ酸の置換により、基準と異なる変異体がある。これらの置換は、保存的でも非保存的でも可能である。保存的置換として一般的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの１対１の置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換である。
【０１０１】
基準ポリペプチドと同じ生物機能と、天然ポリペプチドの活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％の活性とを保持する変異体が、最もきわめて好適である。
【０１０２】
本発明の酵素のフラグメントもしくは一部が、ペプチド合成によって対応する完全長酵素を産生するために、利用されることもある。従って、上記フラグメントが、完全長酵素を産生するために、中間生成物として使用されることもある。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントもしくは部分を用いて、本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成してもよい。
【０１０３】
本発明に係る加水分解酵素が、配列番号３もしくは４に基づいたアミノ酸配列を有し、アミノ酸モチーフ「ＥＡＥ」を包含することは、非常に好ましい。これに関連して用語「アミノ酸モチーフ」は、他のどんなアミノ酸も介入しないアミノ酸の固定された配列を意味する。
【０１０４】
さらに、本発明の加水分解酵素が配列番号３もしくは４に基づいたアミノ酸配列を有し、該アミノ酸「ＥＡＥ」において、「ＥＡＥ−モチーフ」のＮ−末端および／またはＣ−末端に、国際命名法によって表された１群（つまりＥ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｋ）から選択されるアミノ酸のいずれかが直接隣接することが好適である。ここにおいて、用語「直接隣接する」は、上記のアミノ酸が、前記アミノ酸モチーフ（例えば、ＥＥＡＥもしくはＥＡＥＫなど）に直接先行するかまたは追随することを意味する。
【０１０５】
本発明の加水分解酵素が、配列番号３および４に基づいたアミノ酸配列を有し、アミノ酸モチーフＲＥＡＥＫＩＫＶＰ（配列番号５）もしくはＲＥＡＥＮＩＲＶＰ（配列番号６）を包含し、加水分解酵素活性を有することは、よりさらに好適である。
【０１０６】
本発明の加水分解酵素は、さらに、アミノ酸モチーフ「ＥＡＥ」が保持されるという条件で、配列番号３もしくは４と少なくとも８５％の類似性を有する加水分解酵素のアミノ酸配列に関する。
【０１０７】
本発明のアミノ酸配列は、微生物（例えば古細菌）由来であるのが好ましい。アミノ酸配列（配列番号３および４）だけでなく、本発明に係る加水分解酵素の配列番号１および２で示されるポリヌクレオチドも、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物由来であるのがよりさらに好適であり、アミノ酸配列（配列番号３）を含有する種由来であるのが、最も好適である。
【０１０８】
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子工学的に操作された宿主細胞、および遺伝子組換え法による本発明の酵素の産生に関する。
【０１０９】
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターもしくは発現ベクターでありうる本発明のベクターによって、遺伝子工学的に操作される（形質導入もしくは形質転換または形質移入される）。上記ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換株を選択し、または本発明の遺伝子を増幅するのに適切であるように修正された従来型の栄養培地中で培養されることが可能である。
【０１１０】
温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択される宿主細胞で既に用いられている条件であり、当業者には明らかであろう。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドを、組換え技法により酵素を産生するために用いてもよい。従って、例えば、上記ポリヌクレオチドは、酵素を発現するための種々の発現ベクターのいずれかひとつに含まれうる。上記のベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列が含まれ、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、相ＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母菌プラスミド、プラスミドと相ＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病等）が挙げられる。
【０１１２】
しかしながら、その他のベクターが宿主細胞中で複製可能であるならば、それを使用してもよい。
【０１１３】
適切なＤＮＡ配列は、様々な手順により、上記ベクターに挿入されうる。一般的に、ＤＮＡ配列は、当技術分野では公知の手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。上記手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１１４】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くように、適切な発現の対照配列（プロモーター）に機能的に作用するように結合される。上記プロモーターの典型な例として、以下を記載しうる：原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルス中のＬＴＲもしくはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃもしくはｔｒｐ、相ラムダＰＬプロモーターおよび遺伝子発現の調節に公知の他のプロモーター。発現ベクターは、さらに翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結部位を含有する。上記ベクターは、さらに、発現を増幅するのに適切な配列を含んでもよい。
【０１１５】
さらに、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のために表現型特性を提供する１種もしくはそれ以上の選択可能な標識遺伝子（例、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性、または大腸菌中のテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性等）を含有するのが好ましい。
【０１１６】
上記の適切なＤＮＡ配列だけでなく、適切なプロモーターもしくは対照配列も含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して、宿主のタンパク質発現を認めさせるために、使用されうる。
【０１１７】
適切な宿主の典型的な例として、以下を記載しうる：細菌細胞（例、大腸菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、真菌細胞（例、アスペルギルス・トリコデルマ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等）、酵母菌（例、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）等）、昆虫細胞（例、ショウジョウバエＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）等）、他の動物細胞（例、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズ・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）等）、アデノウイルス、植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１１８】
さらに具体的には、本発明は、さらに、１つもしくはそれ以上の上記に概して記載した配列を含む組み換え構成体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む。上記構成体は、本発明の配列が挿入されたベクター（例、プラスミドもしくはウイルスベクター等）を順方向もしくは逆方向に含む。本実施形態の好適な一態様において、上記構成体は、さらに、例えば、機能的に作用するように該配列に結合するプロモーターを含む調節配列を含む。多種の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者には公知であり、市販されている。しかしながら、宿主中で複製可能であるならば、プラスミドもしくはベクター以外も、使用されることもある。
【０１１９】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターもしくは選択可能なマーカを有する他のベクターを用いて、全ての所望の遺伝子から、選択されることが可能である。特に、細菌（ＬａｃＩ、ｔｒｐ、ａｒａ、ａｌｋ）、ファージック（ｐｈａｇｉｃ）（Ｔ３、Ｔ７、ＰＬ）またはハイブリッドプロモーター（Ｔｒｃ、Ｔａｃ）が、例として、挙げられる。真核性プロモーターとして、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲｓおよびマウスのメタロチオニン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、分野の通常の技術のレベル内で十分である。
【０１２０】
さらなる一実施形態において、本発明は、上記の構成体を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例、哺乳類細胞等）、または下等真核細胞（例、酵母菌細胞）であることが可能であり、或いは、宿主細胞は、原核生物細胞（例、細菌細胞等）であることが可能である。構成体の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）介在の形質移入、または電気穿孔法により、達成される（デービス（Ｄａｖｉｓ，  Ｌ．）、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．「分子生物学の基本方法（Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９８６年）。
【０１２１】
宿主細胞中の構成体を従来型方法で使用して、組換え配列でコード化された遺伝子生成物を生成することが可能である。代替的に、本発明の酵素は、従来型ペプチドシンセサイザーにより、合成されることが可能である。
【０１２２】
タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳類細胞、酵母菌、細菌、または他の細胞において発現されることが可能である。無細胞翻訳系を採用し、本発明のＤＮＡ構成体由来のＲＮＡを用いて上記のタンパク質を生成することができる。原核および真核宿主と一緒に使用するのに適切なクローン化および発現ベクターは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより記載されている（分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、ニューヨークのコールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｙ）、１９８９年）。
【０１２３】
高等真核生物によって本発明の酵素をコード化するＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を上記ベクターに挿入することによって、増大する。エンハンサーは、ＤＮＡのシス活性化因子であり、その転写を増大するためにプロモーターから離れた通常約１０〜３００種のヌクレオチドである。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点配列の後面のプロモーターエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１２４】
一般的に、組換え発現ベクターには、複製の起点および宿主細胞を形質転換させる選択可能なマーカ（例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰｌ遺伝子）、および下流配列の転写を導く高発現遺伝子由来のプロモーターが含まれうる。上記のプロモーターは、糖分解酵素（例、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質など）をコード化するオペロンから得ることが可能である。非相同配列は、翻訳開始および終止配列、好ましくは翻訳された酵素の分泌を導くことができるリーダー配列を有する適切な相に集められる。場合により、非相同配列は、所望の特性（例えば、発現した組換え製品の安定化処理もしくは簡略化精製）を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む結合酵素をコード化できる。
【０１２５】
適切な宿主菌株の形質転換、そして宿主菌株の適切な細胞密度への成長後、選択したプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトもしくは化学薬品の導入）によって、誘導され、細胞は、さらなる期間培養される。
【０１２６】
細胞は、通常、遠心分離により採取され、物理的もしくは化学的手段により、粉砕され、結果としての粗抽出物が、さらなる精製のために確保される。酵素が培地に分泌される場合、細胞は、通例遠心分離により、除去され、さらなる濃縮および精製工程のために、上澄み液を用いる。
【０１２７】
タンパク質の発現に採用した微生物細胞は、当業者には公知である凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む好都合な方法のいずれかにより、破砕されることが可能である。
【０１２８】
種々の哺乳類細胞の培養系を採用して、組換えタンパク質を発現することが可能である。哺乳類の発現系の例として、グルーズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）により（セル（Ｃｅｌｌ）、２３、１７５頁、1９８１年）に記載されているサル腎臓の繊維芽細胞のＣＯＳ−７ライン、および適合性ベクターを発現できる他の細胞系（例えば、Ｃ１２７、３１３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製の起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位、転写終止配列、および５'位の非転写配列を含むと想定される。ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて、必要とされる非転写遺伝子構成要素を提供してもよい。
【０１２９】
硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする方法により、組換え細胞の培養物から上記酵素を回収して、精製することができる。タンパク質の完全な配列に必要である、タンパク質のリフォールディング段階を用いることが可能である。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階に用いることが可能である。
【０１３０】
本発明の酵素は、天然で精製される製品でも、化学合成手順による製品でも、原核もしくは真核宿主（例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫および哺乳類の培養細胞）から、組換え技法により製造される製品でもよい。組換え製造手順に採用される宿主に応じて、本発明の酵素は、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。本発明の酵素は、元来のメチオニンアミノ酸残渣を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０１３１】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明されるだろう。しかしながら、本発明は、上記実施例を限定するものではないことを理解されたい。
【実施例】
【０１３２】
実施例１：エステラーゼ活性の測定のための一般的方法
１．１：加水分解活性
生体触媒のミリグラム当たりのエステラーゼ単位（ＥＵ）で、エステラーゼの比活性を表す。１ＥＵは、１分以内に加水分解もしくは生成されたμモルでのエステルの量である。
【数１】
2007507211.tif 000003
【０１３３】
既発表の方法（Ｄ．ラガルデ（Ｌａｇａｒｄｅ），Ｈ．Ｋ．グエン（Ｎｇｕｙｅｎ），Ｇ．Ｒａｖｏｔ，Ｄ．Ｗａｈｌｅｒ，Ｊ．−Ｌ．レーモン（Ｒｅｙｍｏｎｄ），Ｇ．ヒルズ（Ｈｉｌｌｓ），Ｔ．Ｖｅｉｔ，Ｆ．Ｌｅｆｅｖｒｅ、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ.６、４４１頁、２００２年）に従って、λ＝４１４ｎｍの波長で２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチルデカノエート（Ｃ１０−ＨｐＮＰＢ）から遊離したｐ−ニトロフェノールの濃度をモニターすることにより、加水分解におけるエステラーゼの比活性を測定した。その手順は、以下の通りである。全試薬および緩衝液を、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）脱イオン水中で調製した。アセトニトリル中にＣ１０−ＨｐＮＰＢを溶かした２０ｍＭの保存液を調製した。ＢＳＡ溶液を保存水溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）として調製した。ＮａＩＯ4溶液を１００ｍＭの保存水溶液として新規に調製した。８μＬのＣ１０−ＨｐＮＰＢ保存液を７４μＬのＰＩＰＥＳ緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた。１０μＬの酵素試料を加えて、反応を開始した。反応混合液を９０℃で４０分間インキューベーションした。試料を氷上で冷却させ、ＢＳＡ（２ｍＭ）、ＮａＩＯ4（２８ｍＭ）およびＮａ2Ｃ０3（４０ｍＭ）を混合液に加えた。２５℃で１０分間のインキューベーション後、試料を、６０００ｇで５分間、遠心分離機にかけ、マイクロプレートに移した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０マイクロプレート分光光度計（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社）を用いて、λ＝４１４ｎｍで、黄色のｐ−ニトロフェノールの光学密度を記録した。
【０１３４】
相対活性を測定するために、百分率で互いを相関して絶対活性を設定した。絶対活性を測定するための手順は、以下の通りである。
【０１３５】
公知のｐ−ニトロフェノールの吸光係数
【数２】
2007507211.tif 000004
を用いて、ｐ−ニトロフェノールの濃度変化ΔＣ遊離シタp-ニトロフェノールをランベルト・ベールの法則（ｌａｗ  ｏｆ  Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒ）で算出することができる。
【数３】
2007507211.tif 000005
式中、ｄは、層の厚さを表し、ΔＥは、吸光度の変化を示す。ｐ−ニトロフェノール濃度の時間依存変化により、体積活性（ｖｏｌ．活性）を得る。
【数４】
2007507211.tif 000006
式中、ｔmonは、モニターする時間を表し、ｆdは、酵素抽出物の希釈係数である。最後に、体積活性を酵素含有物質（例えば、未加工抽出物、固定化酵素、純粋酵素）の濃度Ｃ酵素で除して、比活性を算出しうる。
【数５】
2007507211.tif 000007
対応する蛍光のウンベリフェロン誘導体に関して記載した通り、２−ブロモ-ブテンからＣ１０−ＨｐＮＰＢを合成した（Ｆ．Ｂａｄａｌａｓｓｉ，Ｄ．Ｗａｈｌｅｒ，Ｇ．クラン（Ｋｌｅｉｎ），Ｐ．Ｃｒｏｔｔｉ，Ｊ．−Ｌ．レーモン（Ｒｅｙｍｏｎｄ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９、４０６７頁、２０００年；Ｄ．Ｗａｈｌｅｒ，Ｆ．Ｂａｄａｌａｓｓｉ，Ｐ．Ｃｒｏｔｔｉ，Ｊ．−Ｌ．レーモン（Ｒｅｙｍｏｎｄ），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４０、４４５７頁、２００１年）。
【０１３６】
１．２：エステル化活性
滴定により酸価を求め、変換率を測定し、エステル化における活性を測定した。所与の時点ｔでの変換率（ｔ）を以下のように算出した。
【数６】
2007507211.tif 000008
式中、酸の量（ｔ＝０）は、初期の酸の量であり、酸の量（ｔ）は、所与の時点ｔでの酸の量である。変換率（ｔ）を時間ｔに対して記入し、結果としてのデータポイントをプログラムＧｒａＦｉｔ（英国のエリタクス・ソフトウエアー社（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ２７４，Ｈｏｒｌｅｙ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＲＨ６  ９ＹＪ，ＵＫ）を用いて、適合したミハエリス−メンテンの式（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）に適合させた。
【数７】
2007507211.tif 000009
本式において、「変換率最大は、最大変換率を示し、「定数」は、曲線の屈曲を表す変量である。測定した曲線の初期の傾きを計算するためｔで微分すると、以下の式を得る。
【数８】
2007507211.tif 000010
初期の酵素の比活性ｋを以下のようにｔ＝１で計算した。
【数９】
2007507211.tif 000011
【０１３７】
１．３：エステル交換活性
実施例１．２に記載した数学的手段を用いて、ＧＣで変換率（ｔ）を測定して、エステル交換活性を算出した。Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロ−アセトアミド（ＭＳＴＦＡ）で、反応混合物を誘導化し、３０ｍ０．３２ｍｍの無極性キャピラリー（ｃａｐｉｌａｒ）ＧＣカラムを用いて、分割注入とＦＩＤ検出で試料の組成を測定した。所与の時点ｔでの変換率（ｔ）を以下のように算出した。
【数１０】
2007507211.tif 000012
本式において、Ａエステル（ｔ＝０）は、反応前の抽出エステルの初期のＧＣ面積を示し、Ａエステル（ｔ）は、所与の時点ｔでの抽出エステルのＧＣ面積を表す。
【０１３８】
実施例２：遊離のパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）エステラーゼ（配列番号３）の生成
以下において、上記のエステラーゼをＥｓｔ  Ｐ１０２１と称す。
【０１３９】
２．１：培地Ｍ２１およびパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌株Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の成長条件
（Ｌ−１）を含有する媒地Ｍ２１を以下のように調製した。
【０１４０】
【表２】
2007507211.tif 000013
【０１４１】
ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節し、培地を１００℃まで過熱し、冷却して、Ｎ2／ＣＯ2（８０／２０）下で分配した。使用の前に、１００ｍＬのＭ２１培地に対してＮａ2Ｓ・９Ｈ2０（２％Ｗ／ｖ）の無菌嫌気性溶液２ｍＬで、培地を還元した。
【０１４２】
２．２：天然の菌株を用いてＥｓｔ  Ｐ１０２１の生成
エステラーゼの生成に関して、培地Ｍ２１を３Ｌ含有する４個の嫌気フラスコ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｆｌａｓｋ）を調製した。各フラスコに、実施例２．１に記載の条件下で成長した１２０ｍＬの新規の一晩培養のパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｐ１０２１）を接種した。９５℃で１６時間のインキューベーションをした後、培養物を８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離機にかけた。上澄み液を廃棄して、細胞を２７ｍＬの新規のＭ２１培地中で再懸濁した。ホーンの先端での超音波振動の振幅１０を用いて、超音波処理によって細胞を溶解させた。１分停止で３０秒の１０サイクルを用いた（ソニケイター（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）超音波細胞破砕機ＸＬ、Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）。遠心分離により、細胞残渣を除去し、上澄み液からタンパク質を回収した。ウシ血清アルブミンを基準としたブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法に従って、タンパク質濃度を測定した（Ｍ．Ｍ．ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１９７６年）２４８）。実施例１．１に従って、比活性を測定し、以下のデータ、８．５〜１２ｍｇ／ｍＬの原液タンパク質濃度で５〜７ｍＥＵ／ｍｇであった。
【数１１】
2007507211.tif 000014
【０１４３】
実施例３：パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）エステラーゼ（Ｅｓｔ  Ｐ１０２１）のクローン化
菌株Ｐ  １０２１のゲノムライブラリー（７０００クローン）を構築し、既に報告したように、Ｃ１０−ＨｐＮＰＢ基質を用いて、９５℃でスクリーニングした（Ｄ．ラガルデ（Ｌａｇａｒｄｅ），Ｈ．Ｋ．グエン（Ｎｇｕｙｅｎ），Ｇ．Ｒａｖｏｔ，Ｄ．Ｗａｈｌｅｒ，Ｊ．−Ｌ．レーモン（Ｒｅｙｍｏｎｄ），Ｇ．ヒルズ（Ｈｉｌｌｓ），Ｔ．Ｖｅｉｔ，Ｆ．Ｌｅｆｅｖｒｅ、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，６（２００２年）４４１）。９５℃でエステラーゼ活性を示す３種の異なるクローンの配列を決定した。各クローンは、エステラーゼ活性に対してコード化する７７１ｂｐの共通の読み取り枠を示した。このゲノムフラグメントうちひとつを、形質転換ベクターを構築するために、直接使用した。
【０１４４】
実施例４：ベクターｐＡＲＡ  Ｐ１０２１の構築
エステラーゼ遺伝子Ｐ１０２１として同定された読み取り枠をｐＡＲＡ１４ベースのベクターにサブクローンした（Ｃ．Ｃａｇｎｏｎ，Ｖ．Ｖａｌｖｅｒｄｅ，Ｊ．Ｍ．Ｍａｓｓｏｎ：プロティンエンジンニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）４，８４３、１９９１年）（ＮｃｏＩクローニング部位は、ＮｄｅＩクローニング部位と置換されていた）。アラビノース誘発性プロモーターの制御下で、ｐＡＲＡベースのベクターにおけるエステラーゼ遺伝子のクローン化ために、５'位にＮｄｅＩ部位、３'位にＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する２プライマーを用いて、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌株Ｐ１０２１のゲノムＤＮＡから増幅された読み取り枠のポリメラーゼ鎖の反応生成物を得た。結果としてのベクターの地図を図１に示す。
【０１４５】
実施例５：ベクターｐＡＲＡ  Ｐ１０２１を用いる組換え型ＥＳＴ  Ｐ１０２1の生成
実施例４から得たｐＡＲＡ  Ｐ１０２１ベクターを用いて、大腸菌株ＭＣ  １０６１  ｐＲＩＬを形質転換した。４リットルの三角フラスコでの発酵を、１０ｇ／Ｌのバクトトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有する標準のルリアブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）培地で実施した。ＬＢ培地に１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを補った。培地に、３７℃、ｐＨ７．０で３％ｖ／ｖの前培養物を接種した。培養物を振り混ぜながら（２００ｒｐｍ）インキューベーションした。６００ｎｍで０．４の光学密度で０．０２％（ｖ／ｖ）のＬ−アラビノースを添加して、エステラーゼ遺伝子の発現を誘導した。導入後、６００ｎｍで１．９の最終光学密度まで、細胞を３時間遠心分離機にかけた。溶解させるため、細胞を０．２０Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中で再懸濁して、最終体積３０ｍＬを得た。次に、細胞懸濁液を、２キロバールで高圧ホモゲナイザーに１回通過させ、１３０００ｇで２０分間の遠心分離によって、残渣を除去した。保存タンパク質の濃度は、約２０〜３０ｍｇ／ｍＬであった。実施例１．１に従って、未精製の組換え型エステラーゼの比活性を測定して、以下のデータで、２〜３ｍＥＵ／ｍｇであった。
【数１２】
2007507211.tif 000015
【０１４６】
実施例６：遊離の精製したエステラーゼＥｓｔ  Ｐ１０２１の加水分解活性
６．１：エステラーゼＥｓｔ  Ｐ１０２１の精製
精製するために、実施例５から得た採取細胞を、ヘペス緩衝液（ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）（０．１ＭのＨＥＰＥＳ、０．５％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．０）中で、波長６００ｎｍでの光学密度が１２０まで、再懸濁した。超音波処理（ブランソン・ソニケイター（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）氷上１０レベルで４５０／２ｘ３０ｓ）により、細胞を溶解させ、１３０００ｇで２０分間の遠心分離により、可溶性タンパク質を不溶性部と細胞残渣とから分離した。上澄み液を８０℃で３０分間加熱した。１３０００ｇで２０分間２回目の遠心分離を行い、沈殿した大腸菌タンパク質を分離した。平衡状態にした陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ  ２０ＨＱ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、１．６ｍＬのゲル；５０ｍＭのＨＥＰＥＳと０．５％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳからなるヘペス緩衝液（ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．５）で平衡）に、透明な上澄み液を供給した。０〜１ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配により、５分以内に１０ｍＬ／分の流量で、タンパク質を溶出した。１ｍＬの留分を回収した。Ｃ１０−ＨｐＮＰＢで加水分解活性を示すこれらの留分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７、６８０頁、１９７０年）により、分析した。該留分を１５％の分離ゲルに塗り、該ゲルを、クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色液（０．２％のクーマシー、３０％のエタノール、１０％の酢酸）で汚染した。少なくとも９０％の均一性（０．７５〜０．８ＭのＮａＣｌ）を有する上記の留分を貯留した。精製したエステラーゼは、ウシ血清アルブミン（Ｍ．Ｍ．ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８頁、１９７６年）を基準としたブラッドフォード法により測定された通り、濃度０．２ｍｇ／ｍＬを有するＳＤＳ−ＰＡＧＥで、およそ２４ｋＤａの帯域を示した。
【０１４７】
６．２：ＥＳＴ  Ｐ  １０２１の加水分解活性の測定
精製したエステラーゼを用いて、その加水分解活性を測定した。Ｅｓｔ  Ｐ１０２１（実施例６．１から得た０．２ｍｇ／ｍＬ保存液）を、０．１Ｍのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）中で、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１．７ｍＭのＣ１０−ＨｐＮＰＢと混合した。混合液を９０℃で４０分間インキューベーションし、氷上に滴下して、反応を停止させた。実施例１．１に従って、加水分解の比活性を算出し、以下のデータで、２０ＥＵ／ｍｇのタンパク質であった。
ΔＥ＝０．４５４；ε＝１４２００Ｍ-1ｃｍ-1；ｄ＝０．２ｃｍ；ｔmon＝４０分；ｆd＝１０００
【０１４８】
実施例７：遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１活性への温度の影響
【０１４９】
【表３】
2007507211.tif 000016
【０１５０】
温度を変えたことを除いて、実施例１．１に記載した通り、加水分解活性でのアッセイにより、Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の活性を測定した。Ｅｓｔ  Ｐ１０２１のインキューベーションを、０．２Ｍのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。本発明のエステラーゼの１００℃での活性を１００％として、結果を上に（表１）に示す。
【０１５１】
実施例８：遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１活性へのｐＨの影響
ｐＨを変えたことを除いて、実施例１．１に記載した通り、各種の水溶性緩衝液を用いて、加水分解活性でのアッセイにより、Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の活性を測定した。ｐＨ６での活性を１００％として、結果を以下に示す。
【０１５２】
【表４】
2007507211.tif 000017
【０１５３】
実施例９：遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の熱安定性
実施例５と同じように調製した培養液の試料を、０．２Ｍのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液で調節した水溶液中で、インキューベーションの時間を変えて、１００℃で熱処理した。実施例１．１に記載した通り、加水分解活性アッセイを用いて、熱処理した試料のエステラーゼ活性を測定した。結果を、熱処理を行わなかった対照試料と比較して相対活性として表し、表３に示す。
【０１５４】
【表５】
2007507211.tif 000018
【０１５５】
実施例１０：遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の溶媒耐性
２ｍｇの遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１を、１００ｍＭ緩衝液で調節した２ｍＬの水溶液（ｐＨ７．０）中に溶解させた。イソプロパノールおよびエタノールと一緒に１Ｍの濃度で４０分間攪拌しながら酵素をインキューベーションした。次に、実施例１．１に記載した通り、酵素の加水分解活性を測定し、有機溶媒中でインキューベーションを行わなかった対照試料と比較して相対活性とした。結果を表４に示す。
【０１５６】
【表６】
2007507211.tif 000019
【０１５７】
実施例１１：遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の基質特異性
【０１５８】
【表７】
2007507211.tif 000020
【０１５９】
実施例１．１に記載した通り、加水分解活性アッセイにより、Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の活性を測定した。Ｃ１０−ＨｐＮＰＢだけの代わりに、以下の基質も０．２Ｍのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液で調節した水溶液中で処理した。
２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチル−アセタート（Ｃ２−ＨｐＮＰＢ）、
２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチル−プロピオン酸（Ｃ３−ＨｐＮＰＢ）、
２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチル−パルミタート（Ｃ１６−ＨｐＮＰＢ）、
２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチル−ステアレート（Ｃ１８−ＨｐＮＰＢ）、
２−ヒドロキシ−４−ｐ−ニトロフェノキシ−ブチル−オレエート（Ｃ１８’−ＨｐＮＰＢ）。
【０１６０】
Ｃ１０−ＨｐＮＰＢに対する活性を１００％として、結果を表５に示す。
【０１６１】
実施例１２：遊離Ｅｓｔ  Ｐ１０２１でのメチルラウレートとデカノールとのエステル交換反応
５３５ｍｇのメチルラウレートと３９５ｍｇのデカノールを９５℃まで加熱して、４０ｍｇの凍結乾燥した未精製のＥｓｔ  Ｐ１０２１を加えた。凍結乾燥は、凍結保護剤として、２％（ｖ／ｖ）のＰＥＧジメチルエーテルを加えることにより、達成される。メチルラウレートを基準とした反応変換率を、実施例１．３に記載した如く、ＧＣにより測定し、表６に示した。保持時間：３．５分（デカノール）；５．１分（メチルラウレート）；１２．７分（デシルラウレート）。
【０１６２】
【表８】
2007507211.tif 000021
【０１６３】
時間に対して変換率を記入し（図２）、データポイントを実施例１．３に従って、分析した。このエステル交換におけるＥｓｔ  Ｐ１０２１の初期活性ｋを算出した。
【数１３】
2007507211.tif 000022
【０１６４】
実施例１３：固定化組換え型Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の調製
実施例５に記載した通りに、組換え型大腸菌の培養物を得た。６０００ｇで１５分間の遠心分離によって、細胞を集めた。細胞を０．２５ＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．５）で再懸濁して、およそ３０〜４０ｇ／Ｌの乾燥した細胞に達した。その後、フレンチプレスで細胞を破砕した。遠心分離により、細胞残渣を除去し、上澄み液からタンパク質（濃度１５〜３０ｇ／Ｌ）を回収した。０．２５ＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．５）で、混合液のｐＨを８〜８．５に調節した。タンパク質の乾燥重量を基準として、２０％のマルチトール（ｗ／ｗ）と１０％のグルタルアルデヒド（ｗ／ｗ）を混合液に加えた。反応混合液を室温で３０分間攪拌して、タンパク質の乾燥重量を基準として、２０％のポリアゼチジン（ｗ／ｗ）を加えた。反応混合液を室温で１５分間攪拌した。得られたペーストを５０℃で一晩中乾燥させた。乾燥したペレットを粉砕して、微細な粉末を得た。
【０１６５】
実施例１４：固定化組換え型Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の活性の測定
【０１６６】
【表９】
2007507211.tif 000023
【０１６７】
Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の活性を評価するために、９．２５ｇのｎ−プロパノールと３０．８５ｇのラウリン酸を、溶媒を加えないで、６０℃まで加熱し、実施例１３に記載した通りに調製した２ｇの粉砕した固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１を加えた。エタノールに溶かした０．１ＮのＫＯＨで滴定して、酸価を測定し、反応の変換率を算出した。結果を表７および図３に示す。
【０１６８】
ｎ−プロピルラウレートの合成におけるエステラーゼの合成活性を実施例１．２と同様に算出して、適合したミハエリスーメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の式に対する以下のパラメータ：変換率最大＝０．２４；定数＝３０３分（ｔ＝１分に対して）と共に
【数１４】
2007507211.tif 000024
を得た。
【０１６９】
実施例１５：有機溶媒中での固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の活性への温度の影響
４ｇの粉砕した固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１を、６０ｍＬのメチルシクロヘキサン中で、９５℃で４５０分間にわたってインキューベーションし、本発明のエステラーゼの熱安定性を測定した。試料（１０ｍＬ）を１２３分、２４８分および４５０分後に回収した。溶媒を濾過して、残存する酵素を６０ｍバールの減圧でのデシケーター内で、室温で一晩中乾燥させた。ｎ−プロピルラウレート合成における実施例１４と同様に、残存する初期の酵素活性を測定し、表８に、未処理の酵素と比較した相対活性を示す。活性の損失は、４５０分間にわたって、観察されなかった。
【０１７０】
【表１０】
2007507211.tif 000025
【０１７１】
実施例１６：水中での固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１への活性の温度の影響
４ｇの粉砕した固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１を、６０ｍＬの水中で、９５℃で４８０分間にわたってインキューベーションし、本発明のエステラーゼの熱安定性を測定した。試料（１０ｍＬ）を１２０分、２４０分および４８０分後に回収した。水を濾過して、残存する酵素を６０ｍバールの減圧でのデシケーター内で、室温で一晩中乾燥させた。ｎ−プロピルラウレート合成における実施例１４と同様に、残存する元来の酵素活性を測定し、表９に、未処理の酵素と比較した相対活性を示す。活性の損失は、４８０分間にわたって、観察されなかった。
【０１７２】
【表１１】
2007507211.tif 000026
【０１７３】
実施例１７：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１へのｐＨの影響
固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の加水分解の比活性を、ｐＨを変えたことを除いて、実施例１．１に記載の通りに測定した。ｐＨ６での活性を１００％として、結果を相対活性として、下記の表１０に示す。
【０１７４】
【表１２】
2007507211.tif 000027
【０１７５】
実施例１８：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の熱安定性
実施例１３に記載の通りに調製したＥｓｔ  Ｐ１０２１粉末（２ｍｇ）を様々なインキューベーション時間に対して９０℃と１００℃に加熱した。次に、熱処理した試料および熱処理を実施しなかった対照試料の加水分解の比活性を実施例１．１に記載の通り測定した。未処理の試料の活性を１００％として、結果を相対活性として、下記の表１１に示す。
【０１７６】
【表１３】
2007507211.tif 000028
【０１７７】
実施例１９：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の溶媒耐性
【０１７８】
【表１４】
2007507211.tif 000029
【０１７９】
実施例１３に記載の通りに調製したＥｓｔ  Ｐ１０２１粉末（２ｍｇ）を各種溶媒の存在下で、様々な時間で、９０℃で熱処理した。次に、濾過により溶媒を除去し、エステラーゼ粉末を０．２Ｍのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７）で、３回洗浄した。処理した試料と対照試料のＥｓｔ  Ｐ１０２１の加水分解活性を実施例１．１に記載の通りに測定した。未処理の試料の活性を１００％として、結果を相対活性として、表１２に示す。
【０１８０】
実施例２０：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１でのミリスチルアルコールとミリスチン酸のエステル化
３４．３ｇのミリスチン酸と３２．２ｇのミリスチルアルコールを９５℃まで加熱し、本発明に係る粉砕したエステラーゼ（４ｇ）を加えた。１．９６日、３．９日、および７．７２日後、反応混合物の試料（１０ｇ）を取り出し、４０ｇの常温アセトンと混合し、濾過し、２０ｇの常温アセトンで２回再洗浄し、エステルを除去した。２０ｍバールの減圧、周囲温度で、デシケーター内で一晩中乾燥させた後、初期の活性を実施例１４と同様に測定し、未処理の酵素と比較して、相対活性として表した。活性の損失は、上記の７．７２日の期間にわたって認識されなかった（表１３）。
【０１８１】
【表１５】
2007507211.tif 000030
【０１８２】
実施例２１：ミリスチルミリステート合成における固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１の繰り返しの使用
３４．３ｇのミリスチン酸と３２．２ｇのミリスチルアルコールを９５℃まで加熱し、実施例１３で調製した粉砕した固定化エステラーゼ（４ｇ）を加えた。滴定により酸価を測定し変換率を測定するために、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間後、反応混合物の試料を取り出した。実施例１．２の数学的手段を使って、ミリスチルミリステート合成における初期の活性を測定した。２４時間後、反応を停止させて、エステルを２００ｇの常温アセトンと混合させて、酵素を回収し、濾過し、４０ｇの常温アセトンで２回、残留酵素を洗浄した。２０ｍバールの減圧、周囲温度で、デシケーター内で一晩中、酵素を乾燥させた後、上記と同じ方法でのミリスチルミリステート合成に、回収した酵素を再び使用した。回収した酵素は、上記の手順後に、その活性を維持していることを示した。該手順を１０回繰り返した。全試験中、上記酵素は安定していた。最終サイクルでの相対活性は、およそ９５％であることが判明し、それは、検出限界の範囲内である。結果を表１４に示す。
【０１８３】
【表１６】
2007507211.tif 000031
【０１８４】
実施例２２：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１でのメチルラウレートとデカノールのエステル交換
２３．７ｇのデカノールと３２．２ｇのメチルラウレートを９５℃まで加熱し、実施例１３から得た固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１（１．４ｇ）を加えた。生成したメタノールを３００ｍバールで除去した。４８時間後、反応を停止させ、濾過により、触媒を反応混合物から除去した。実施例１．３に従って、反応混合物の組成と変換率をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で測定した。保持時間：３．５分（デカノール）；５．１分（メチルラウレート）；１２．７分（デシルラウレート）。変換率は、９５％まで測定された。
【０１８５】
実施例２３：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１でのジグリセロールとカプリル酸とのエステル化
５０ｇのジグリセロールと４３．３ｇのカプリル酸を９５℃まで加熱し、実施例１３から得た固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１（３．７ｇ）を加えた。生成した水を５０ｍバールで除去した。４８時間後、反応を停止させ、濾過により、触媒を反応混合物から除去した。エタノールに溶かした０．１ＮのＫＯＨでの滴定により酸価を測定し、変換率を算出し、カプリル酸に対して８９％であった。
【０１８６】
実施例２４：メチルステアレートとステアリルアミンと固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１との反応によるＮ−ステアロイルステアリルアミドの合成
２４．３ｇのステアリルアミンと２６．９ｇのメチルステアレートを９５℃まで加熱し、実施例１３から得た固定化エステラーゼ（２ｇ）を加えた。４８時間後、５００ｍバールで反応を停止させ、濾過により、触媒を反応混合物から除去した。実施例１．３に従って、反応混合物の組成とメチルステアレートに対する変換率をＧＣにより、測定した。変換率は、９５％まで測定された。反応時間：８．６分（ステアリルアミン）；９．４分（メチルステアレート）；２１．１分（ステアロイルステアリル−アミド）。
【０１８７】
実施例２５：遊離のＥｓｔ  Ｐ１０２１、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来のリパーゼＰＬおよびＱＬ、およびカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢの比較例
遊離の酵素溶液（リパーゼＱＬおよびＰＬ  １ｍｇ／ｍＬ；リパーゼＢ（最先端技術）およびＥｓｔ  Ｐ１０２１（本発明）０．０１ｍｇ／ｍＬ）を、様々なインキューベーション時間で、０．２Ｍのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液で調節した水溶液中で、９０℃で熱処理した。リパーゼＱＬおよびＰＬのアッセイ温度を４０℃に、リパーゼＢのアッセイ温度を６０℃に設定したことを除いて、実施例１．１に記載した加水分解アッセイを用いて、熱処理した試料のエステラーゼの比活性を測定した。上記の温度では、熱処理を施さなかった酵素の最も高い活性は、見つけられなかった。結果を、熱処理を施さなかった酵素と比較して、相対活性として表し、表１５に示す。
【０１８８】
【表１７】
2007507211.tif 000032
【０１８９】
実施例２６：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１およびカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来の固定化リパーゼＢ（ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２）の比較例
【０１９０】
【表１８】
2007507211.tif 000033
【０１９１】
実施例１３に記載した通りに調製したエステラーゼ粉末（２ｍｇ）とＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２（２ｍｇ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社）を、メチルラウレートとデカノールが等モル比の存在下で、１週間継続的に攪拌しながら、９５℃で熱処理した。その後、生体触媒を回収し、メチルラウレートとデカノールのエステル交換における実施例１．３に従って、ＧＣにより、そのエステル交換反応率を測定した。ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２は、上記の条件下で、その全ての活性を失ったが、一方、固定化Ｅｓｔ  Ｐ１０２１は、その初期の活性の４０％のみを失っただけだった。結果を、熱処理を施さなかった生体触媒と比較して、相対活性として表し、表１６に示す。
【０１９２】
実施例２７：遊離のサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）エステラーゼ（配列番号４）の生成
以下、上記エステラーゼをＥｓｔ  Ｐ１５８と称す。
【０１９３】
２７．１：培地Ｍ２１およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）菌株Ｐ１５８の成長条件
（Ｌ−１）を含有する培地Ｍ２１を以下のように調製した。
【０１９４】
【表１９】
2007507211.tif 000034
【０１９５】
ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節し、培地を１００℃まで過熱して、冷却し、Ｎ2／ＣＯ2（８０／２０）下で分配した。使用の前に、１００ｍＬのＭ２１培地に対してＮａ2Ｓ・９Ｈ2０（２％Ｗ／ｖ）の無菌嫌気性溶液２ｍＬで、培地を還元した。
【０１９６】
２７．２：天然のサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）菌株でのＥｓｔ  Ｐ１５８の生成
Ｅｓｔ  Ｐ１５８の生成のために、２．５Ｌの培地Ｍ２１を含有する嫌気フラスコを調製した。フラスコに、実施例２７．１に記載の条件下で成長した１００ｍＬの新規の一晩培養したサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）菌株Ｐ１５８を接種した。８０℃で１６時間のインキューベーションをした後、培養物を８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離機にかけた。上澄み液を廃棄して、細胞を１２．５ｍＬの新規のＭ２１培地中で再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解させた。ホーンの先端での振幅６で１０サイクル、振幅７で１５サイクルおよび振幅９で３サイクルを利用した。各サイクルは、１分停止で３０秒であった（ソニケイター（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）超音波細胞破砕機ＸＬ、Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）。遠心分離により、細胞残渣を除去し、上澄み液からタンパク質を回収した。ウシ血清アルブミンを基準としたブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法に従って、タンパク質濃度を測定した（Ｍ．Ｍ．ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１９７６年）２４８）。実施例１．１に従って、比活性を測定し、以下のデータ、４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬの原液タンパク質濃度で８〜１０ｍＥＵ／ｍｇであった。
ΔＥ＝０．５１１；ε＝１４２００Ｍ-1ｃｍ-1；ｄ＝０．２ｃｍ；ｔmon＝４０分；ｆd＝１０
【０１９７】
実施例２８：遊離のＥｓｔ  Ｐ１５８への温度の影響
温度を変えたことを除いて、実施例１．１に記載した通り、加水分解活性のアッセイにより、Ｅｓｔ  Ｐ１５８の活性を測定した。結果を、本発明のエステラーゼの７０℃での活性を１００％として、相対活性として以下に示す（表１７）。
【０１９８】
【表２０】
2007507211.tif 000035
【０１９９】
実施例２９：遊離のＥｓｔ  Ｐ１５８の熱安定性
実施例２７．２の通りに調製した培養液試料を、７０℃で、緩衝液中で（２００ｍＭのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）、様々なインキューベーション時間で、熱処理した。実施例１．１に記載した通り、加水分解アッセイを用いて、熱処理した試料のＥｓｔ  Ｐ１５８活性を測定した。インキューベーションを施さなかったＥｓｔ  Ｐ１５８試料と比較して、相対活性として、結果を表し、表１８に示す。
【０２００】
【表２１】
2007507211.tif 000036
【０２０１】
実施例３０：遊離のＥｓｔ  Ｐ１５８の溶媒耐性
２ｍｇの遊離のＥｓｔ  Ｐ１５８を、１００ｍＭのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液で調節した水溶液（ｐＨ７．０）２ｍＬに溶かした。酵素を、７０℃でイソプロパノールおよびエタノールと１Ｍの濃度で４０分間攪拌しながら、インキューベーションした。次に、実施例１．１に従って、酵素の加水分解活性を測定し、有機溶媒中でインキューベーションを施さなかった対照試料と比較して、相対活性として示した。結果を表１９に示す。
【０２０２】
【表２２】
2007507211.tif 000037
【０２０３】
実施例３１：遊離のＥｓｔ  Ｐ１５８の基質特異性
温度が７０℃であったことと、Ｃ１０−ＨｐＮＰＢだけの代わりに、以下の基質：（Ｃ１６−ＨｐＮＰＢ）、（Ｃ１８−ＨｐＮＰＢ）；（Ｃ１８オレエート−ＨｐＮＰＢ）も処理したことを除いて、実施例１．１に記載した通り、加水分解活性アッセイにより、Ｅｓｔ  Ｐ１５８エステラーゼの活性を測定した。Ｃ１０の活性を１００％として結果を表し、表２０に示す。
【０２０４】
【表２３】
2007507211.tif 000038
【０２０５】
実施例３２：固定化した天然のＥｓｔ  Ｐ１５８の熱安定性
実施例１３のＥｓｔ  Ｐ１０２１に関して記載したように調製したエステラーゼ粉末（約２ｍｇ）を、７０℃で、緩衝液（２００ｍＭのピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）中で、様々なインキューベーション時間で、熱処理した。次に、実施例１．１に記載した通り、熱処理した試料の加水分解活性を測定した。インキューベーションを施さなかった固定化Ｅｓｔ  Ｐ１５８試料と比較して、相対活性として、結果を表し、表２１に示す。
【０２０６】
【表２４】
2007507211.tif 000039
【０２０７】
実施例３３：固定化Ｅｓｔ  Ｐ１５８の溶媒耐性
【０２０８】
【表２５】
2007507211.tif 000040
【０２０９】
実施例１３の如く調製したＥｓｔ  Ｐ１５８粉末（２ｍｇ）を、７０℃で、各種溶媒の存在下で、様々な時間で熱処理した。
【０２１０】
実施例３４：Ｅｓｔ  Ｐ１５８のクローン化
実施例３〜５においてＥｓｔ  Ｐ１０２１に関して記載した通りに、Ｅｓｔ  Ｐ１５８のクローン化を実施した。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】本発明の遺伝子を担持するベクターｐＡＲＡ１０２１の地図を示す。
【図２】遊離のＥｓｔＰ１０２１でのデカノールとメチルラウレートとのエステル交換のグラフを示す。
【図３】固定化組換え型ＥｓｔＰ１０２１の活性の測定を例証するグラフを示す。
【図１】
2007507211.tif 000041
【図２】
2007507211.tif 000042
【図３】
2007507211.tif 000043
【配列表】
2007507211000001.app
【国際調査報告】
2007507211.tif 000044
2007507211.tif 000045
2007507211.tif 000046
2007507211.tif 000047
2007507211.tif 000048