(57)【要約】  本発明は、まず求核性アミンの塩を水に溶解して水溶液を形成し、この水溶液を塩基で脱塩する、アクリルアミド誘導体の合成方法に関し、本方法は下記の工程：（ａ）前記水溶液への活性化アクリル酸誘導体溶液の添加、（ｂ）水性相の酸性化、及び（ｃ）前記水性相の抽出を含む。  好適な実施態様では、アクリルアミド誘導体がイモビリン、特にアクリルアミドアグマチンである。イモビリンの好適な用途は２Ｄゲルの製造用である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
まず求核性アミンの塩を水に溶解して水溶液を形成し、この水溶液を塩基で脱塩するアクリルアミド誘導体の合成方法において、
（ａ）前記水溶液への活性化アクリル酸誘導体溶液の添加、
（ｂ）水性相の酸性化、及び
（ｃ）前記水性相の抽出
工程を含む、アクリルアミド誘導体の合成方法。
【請求項２】
前記アクリルアミド誘導体がイモビリンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アクリルアミド誘導体がアクリルアミドアグマチンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記塩がアグマチン塩である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の抽出を有機溶剤で行う、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
有機溶剤がＭＩＢＫ（メチルイソブチルケトン）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記アクリル酸誘導体がアクリロイルクロリド、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、４−ニトロフェニルアクリレートよりなる群から選ばれる活性化アクリル酸誘導体である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
脱塩をＮａＯＨ、ＴＥＡ（トリエチルアミン）、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）又はＫ２ＣＯ３で行う、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
さらにｐＨを７に固定する工程を含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）より前に、
（ｉ）水性相を有機塩基のｐＫａより高いｐＨに塩基化する工程、及び
（ｉｉ）水性相を有機溶剤で抽出して有機塩基を除去する工程
を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アグマチン硫酸塩を溶解し、Ｋ２ＣＯ３で脱塩する方法であり、
下記の工程：
（ａ）アクリロイルクロリドの添加、
（ｂ）ｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ２．３への酸性化、
（ｃ）濾過、
（ｄ）ＭＩＢＫでの抽出及び
（ｅ）ｐＨ７へのｐＨ調節
を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アクリルアミド誘導体、好ましくはイモビリンの合成方法に関する。本発明の方法は、イモビリン（アクリルアミドアグマチン）の合成に特に適当であるが、あらゆるアクリルアミド誘導体の合成に使用できる。本方法により合成した化合物は分離材料の製造に使用できる。好適な例は、等電点（ｐＩ）の差に基づいて、特に電気泳動（等電点電気泳動ＩＥＦ）によって両性化合物を分離するための分離材料である。もう一つの好適な例は二次元電気泳動用の分離材料である。
【背景技術】
【０００２】
二次元（２Ｄ）電気泳動では、複数の物質を二次元で分離する。一次元目では、等電点電気泳動により物質を分離する。等電点電気泳動の後、しばしば二次元目のゲル電気泳動を行い、分離された物質それぞれを分子量及び／又は分子サイズに従ってさらに分離する。等電点電気泳動及びゲル電気泳動を代表的には互いに直交する二次元で行う。２Ｄ電気泳動は、分析量の物質の分離及び調製量の物質の分離両方で行うことができる。
【０００３】
分離すべき物質は代表的にはバイオ有機物で、主としてポリペプチド構造及び／又は炭水化物構造を有する化合物を包含する。タンパク質はとくに重要である。
【０００４】
ある種の電気泳動では、担体材料を、目的の分離に有利な条件を与える基で官能化しておく。重要な種類の基はｐＨ緩衝基である。電気泳動ゲルのアノード端とカソード端との間でｐＫａの異なるｐＨ緩衝基を不動化（固定）することにより、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）を設定し、これを等電点電気泳動に用いることが１９７０年代に可能になった（Ａｍｉｎｋｅｍｉ米国特許第４１３０４７０号）。良好なｐＨ勾配を得るために、ある範囲の（所望のｐＨ間隔以内で離された増加／減少するｐＫａ値を有する）異なるｐＨ緩衝基を用意することが重要であった。２つの隣り合う緩衝基のｐＫａの差は代表的には１〜２ｐＨ単位であった。ｐＨ１０を超えるｐＨ間隔について、国際公開第０２／２５２６４号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、分離材料の製造用のｐＨ＞１０で加水分解に対して良好な安定性を有する帯電担体材料が記載されている。この特許文献には、
（１）（ａ）ｓｐ２混成炭素原子に結合する窒素原子上のｐＨ依存電荷及び（ｂ）ｐＫａ≧９．５、たとえば≧１０．０又は≧１０．５又は≧１１．０を有する基の中から固定ｐＨ緩衝基を適切に選択すること、及び／又は
（２）特定のアクリル単量体に基づく担体材料を使用すること
が記載されている。
【０００５】
イモビリン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）は緩衝基を有するアクリルアミド誘導体である。イモビリンは、ｐＫ値で決められる弱酸又は弱塩基である。イモビリンの好ましい用途は２Ｄ電気泳動用である。もっとも有益なイモビリンの一つはアクリルアミドアグマチンである。アクリルアミドアグマチンの合成では、国際公開第０２／２５３６４号に記載されているように、まずアグマチン硫酸塩と水酸化バリウムとを水中で反応させる。その後、形成された硫酸バリウムの沈殿を濾過により除去する必要があり、水性相のフリーズドライにより脱塩アグマチンを得る。硫酸バリウムの大部分を除去するために、沈殿を少なくとも１回繰り返す必要がある。つぎの工程で、脱塩アグマチンを有機溶剤に再溶解し、アクリロイルクロリド及び塩基を添加する。反応は時間がかかり、多くの場合、収率も純度も低い。さらに、反応混合物の後処理では、塩基及び過剰の未反応アクリロイルクロリド（しばしば、反応の途中でアクリル酸に加水分解されている）を除去する困難に直面する。
【０００６】
アクリルアミドアグマチンは理論ｐＫａ値１３．５２であり、１０に及ぶｐＨ間隔での分離用の分離材料の製造に適当である。
【特許文献１】米国特許第４１３０４７０号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／２５２６４号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上述した欠点を回避できる、アクリルアミド誘導体、好ましくはイモビリン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）を簡単に合成する方法に関する。
【０００８】
さらに本発明は、これまで知られているイモビリン群の隙間を埋める新規なアクリルアミド誘導体（イモビリン）を製造する方法に関する。
【０００９】
本発明の方法により製造されるイモビリンとしては、アクリルアミドアグマチンが好ましい。しかし、本発明の方法はあらゆるアクリルアミド誘導体に適用でき、特にｐＫａの高い、たとえばｐＫａ＞１０の親水性イモビリンの製造に適当である。
【００１０】
イモビリンは、固定化ｐＨ勾配を有する等電点電気泳動分離材料に用いるのが好ましい。分離材料は、本発明の方法により製造された、勾配のｐＨ間隔の少なくとも一部分を確定するイモビリンを含有する。好ましくは、勾配／間隔がｐＨ＞１０に及び、ｐＫａ≧９．５、たとえば≧１０．０又は≧１０．５又は≧１１．０を有するイモビリンが含まれる。
【００１１】
電気泳動分離法は２Ｄ電気泳動であるのが好ましい。
【００１２】
本発明は、まず求核性アミンの塩を水に溶解して水溶液を形成し、この水溶液を塩基で脱塩する、アクリルアミド誘導体の一般的な合成方法を提供し、本方法は下記の工程：
（ａ）前記水溶液への活性化アクリル酸誘導体溶液の添加、
（ｂ）水性相の酸性化、及び
（ｃ）前記水性相の抽出
を備える。
【００１３】
前記アクリルアミド誘導体がイモビリンであるのが好ましい。イモビリンがアクリルアミドアグマチンであるのが好ましい。
【００１４】
アクリルアミドアグマチンの製造には、アグマチン塩、特にアグマチン硫酸塩から出発するのが好ましい。
【００１５】
好適な実施態様では、工程（ｃ）の抽出を有機溶剤、好ましくはメチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）で行う。
【００１６】
前記アクリル酸誘導体は、アクリロイルクロリド、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、４−ニトロフェニルアクリレートなどよりなる群から選ばれる活性化アクリル酸誘導体である。
【００１７】
本発明によれば、アグマチン硫酸塩又は任意の他の求核性アミン塩の脱塩を、任意の有機塩基、好ましくはトリエチルアミン（ＴＥＡ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）又は任意の無機塩基、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）で行う。
【００１８】
好適な実施態様では、本方法はさらにｐＨを７に固定する工程を含む。
【００１９】
別の好適な実施態様では、本方法は、工程（ｂ）より前に、
（ｉ）水性相を有機塩基のｐＫａより高いｐＨに塩基化する工程、及び
（ｉｉ）水性相を有機溶剤で抽出して有機塩基を除去する工程
を含む。
【００２０】
アグマチン硫酸塩を溶解し、Ｋ２ＣＯ３で脱塩する本発明の方法の好適な実施態様では、本方法は下記の工程：
（ａ）アクリロイルクロリドの添加、
（ｂ）ｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ２．３への酸性化、
（ｃ）濾過、
（ｄ）ＭＩＢＫでの抽出及び
（ｅ）ｐＨ７へのｐＨ調節
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明によるアクリルアミド誘導体の新規な合成方法は、再現性の問題や健康面に関する問題など従来技術の問題すべてを解決する。本発明によれば、ＮａＯＨ、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ又はＫ２ＣＯ３を塩基として用いて出発材料を脱塩するとともに、アクリロイルクロリドと脱塩された出発材料との反応中に遊離されるプロトンを捕捉する。反応生成物の後処理を改良して、高純度、高収率を達成し、簡単なスケールアップを可能にする。過剰量のアクリロイルクロリドは、反応が好収率まで進行するのに必要であり、また反応の途中で加水分解してアクリル酸になるが、水性相の酸性化後にＭＩＢＫを用いて抽出することによりこの過剰量のアクリロイルクロリドを水性相から除去する。この合成アプローチは、２Ｄ電気泳動ゲルの製造に当該材料を用いる場合に汚染性アクリル酸が臨界的パラメータとなるような、他のイモビリンの調製にも簡単に適用できる。
【００２２】
本発明の方法は、種々の成分の選択時に多数の変数を提供し、アクリロイルクロリド又は任意の活性化アクリル酸誘導体（アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、４−ニトロフェニルアクリレートなど）にカップリングしなければならない遊離アミンのタイプにより規定される。
【００２３】
本発明の方法は、アクリルアミド誘導体の製造に新規な機会を提供する。特定の用途は、２Ｄ電気泳動用のイモビリンの調製であり、これについては下記の実験部分に示す。高ｐＫａ値のイモビリンは特に有用である。
【００２４】
しかし、本発明の方法は、イモビリンの製造に限定されず、アクリルアミド誘導体の製造を含む他の目的にも使用できる。アクリルアミドの例には、非置換及び／又はＮ−アルキル置換アクリルアミド又はメタクリルアミドに基づくものがある。
【００２５】
本発明を以下に多数の実施例で具体的に説明するが、実施例は限定的なものではない。本発明は特許請求の範囲に詳細に規定する。
【実施例】
【００２６】
Ｉ．アクリルアミドアグマチンの合成
アクリルアミドアグマチンの化学構造を下記に示す。
【００２７】
【化１】
2007509139.tif 000002
Ａ）ＮａＯＨを塩基として使用
磁気スターラ及びｐＨメータを取り付けた三口丸底フラスコ（５０ｍｌ）にて、硫酸アグマチン（２．２８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を蒸留水（２０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を氷浴で冷却した。
【００２８】
脱塩のために、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１Ｍ）を丸底フラスコにｐＨ１２となるまで添加した。アセトン（５ｍｌ）に溶解したアクリロイルクロリド（１．３６ｇ、１．２２ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）をフラスコに滴下した。アクリロイルクロリド溶液の添加中、ＮａＯＨ（１Ｍ）を用いて、反応混合物のｐＨを１１．８に維持した。反応を室温で２時間進行させた。その後撹拌を停止した。つぎに、濃硫酸を添加して、水性相のｐＨをｐＨ２．５に固定した。つぎに水性相（約４０ｍｌ）をＭＩＢＫ（メチルイソブチルケトン）（８０ｍｌ、３回）で抽出して、反応中に形成された過剰のアクリル酸を除去した。痕跡量のＭＩＢＫを回転エバポレータで蒸発させ、水中の生成物を得た。収率は５０％以上であった。
【００２９】
Ｂ）ＴＥＡを塩基として使用
磁気スターラを取り付けた丸底フラスコ（５０ｍｌ）にて、硫酸アグマチン（２．２８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を蒸留水（１５ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（３．５２ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに添加した。反応混合物を氷浴で冷却し、５℃で１０分間撹拌した。アセトン（５ｍｌ）に溶解したアクリロイルクロリド（１．３６ｇ、１．２９ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を、パスツールピペットを用いて、フラスコに滴下した。反応を５℃で１時間進行させた。その後撹拌を停止した。ｐＨが１１に落ち着くまで、Ｋ２ＣＯ３を丸底フラスコに添加した。このとき水性相の容量は７５ｍｌであった。つぎに水性相をＭＩＢＫ（１５０ｍｌ、２回）で抽出して、ＴＥＡを除去した。つぎに、濃硫酸を添加して、水性相のｐＨをｐＨ２．３に固定した。つぎに水性相をＭＩＢＫ（１５０ｍｌ、３回）で抽出して、反応中に形成された過剰のアクリル酸を除去した。つぎにＫ２ＣＯ３を添加して、水性相のｐＨをｐＨ７に固定した。収率は９５％以上であった。
【００３０】
所望に応じて、フリーズドライ法により水を除去することができたが、これによりアクリルアミドアグマチンが単独重合する恐れが増加した。しかし、この工程を実施した場合には、最終的な白色粉末をイソプロパノールに溶解し、濾過して、そのように形成されたポリマー及び水性相にまだ残っている塩を除去することができる。
【００３１】
Ｃ）ＤＩＰＥＡを塩基として使用
磁気スターラを取り付けた丸底フラスコ（５０ｍｌ）にて、硫酸アグマチン（２．２８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を蒸留水（１０ｍｌ）に溶解した。ジイソプロピルエチルジアミン（ＤＩＰＥＡ）（３．８８ｇ、５．２３ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）をアセトン（１０ｍｌ）とともに丸底フラスコに添加した。反応混合物を氷浴で冷却し、５℃で１０分間撹拌した。アセトン（５ｍｌ）に溶解したアクリロイルクロリド（１．８１ｇ、１．６２５ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を、パスツールピペットを用いて、フラスコに滴下した。反応を５℃で１時間進行させた。その後撹拌を停止した。ｐＨが１２に落ち着くまで、Ｋ２ＣＯ３を丸底フラスコに添加した。このとき水性相の容量は７５ｍｌであった。つぎに水性相をＭＩＢＫ（１５０ｍｌ、２回）で抽出して、ＤＩＰＥＡを除去した。つぎに、濃硫酸を添加して、水性相のｐＨをｐＨ２．３に固定した。つぎに水性相をＭＩＢＫ（１５０ｍｌ、３回）で抽出して、反応中に形成された過剰のアクリル酸を除去した。つぎにＫ２ＣＯ３を添加して、水性相のｐＨをｐＨ７に固定した。収率は９５％以上であった。
【００３２】
所望に応じて、フリーズドライ法により水を除去することができたが、これによりアクリルアミドアグマチンが単独重合する恐れが増加した。しかし、この工程を実施した場合には、最終的な白色粉末をイソプロパノールに溶解し、濾過して、そのように形成されたポリマー及び水性相にまだ残っている塩を除去することができる。
【００３３】
Ｄ）Ｋ２ＣＯ３を塩基として使用
Ｋ２ＣＯ３を塩基として使用するのは本発明を実施する最良の形態である。磁気スターラを取り付けた丸底フラスコ（５０ｍｌ）にて、硫酸アグマチン（２．２８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を蒸留水（１０ｍｌ）に溶解した。蒸留水（５ｍｌ）に溶解したＫ２ＣＯ３（４．１４ｇ、３０ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに添加した。反応混合物を氷浴で冷却し、５℃で１０分間撹拌した。アセトン（５ｍｌ）に溶解したアクリロイルクロリド（１．８１ｇ、１．６２５ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を、パスツールピペットを用いて、フラスコに滴下した。反応を５℃で１時間進行させた。その後撹拌を停止した。つぎに、水性相を濃硫酸でｐＨ２．３に固定し、ガラスフィルターで濾過した。つぎに水性相をＭＩＢＫ（１００ｍｌ、２回）で抽出して、反応中に形成された過剰のアクリル酸を除去した。つぎにＫ２ＣＯ３を添加して、水性相のｐＨをｐＨ７に固定した。収率は９５％以上であった。
【００３４】
所望に応じて、フリーズドライ法により水を除去することができたが、これによりアクリルアミドアグマチンが単独重合する恐れが増加した。しかし、この工程を実施した場合には、最終的な白色粉末をイソプロパノールに溶解し、濾過して、そのように形成されたポリマー及び水性相にまだ残っている塩を除去することができる。
【００３５】
ＩＩ．本発明で製造したアクリルアミド誘導体の使用
好適な使用例は、前述したように、イモビリン、特にアクリルアミドアグマチンの製造用である。イモビリンは、たとえば２Ｄゲルの製造に使用される。
【００３６】
本発明はまた、アクリルアミド誘導体を、他の電気泳動用途で担体として使用することに関する。
【００３７】
さらに、アクリルアミド誘導体は、クロマトグラフィ用ビーズや他のクロマトグラフィ用支持体の製造に使用できる。
【００３８】
さらに、アクリルアミド誘導体を凝集剤としてできる。
【国際調査報告】
2007509139.tif 000003
2007509139.tif 000004