(57)【要約】  本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体を用いて、アグリカンまたは他のプロテオグリカン分子を切断する方法に関する。本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８のタンパク質分解活性を阻害または強化できるＡＤＡＭＴＳ−８調節因子を同定する方法にも関する。加えて、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体もしくは調節因子を含む医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、プロテオグリカンの切断または代謝の欠損または異常を特徴とする疾患を治療するのに使用することができる。
2007534675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンを切断する方法であって、該プロテオグリカンと、該プロテオグリカンを切断する単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質とを接触させることを含む、方法。
【請求項２】
プロテオグリカンがアグリカン分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質が成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３によってコードされているが、シグナルペプチドおよびプロドメインを欠失している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質が配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜８９０を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
プロテオグリカンを単離されたプロテアーゼと接触させて該プロテオグリカンを切断することを含むプロテオグリカンの切断方法であって、該プロテアーゼがＡＤＡＭＴＳ−８メタロプロテアーゼ触媒ドメインを含む、方法。
【請求項７】
プロテオグリカンがアグリカン分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ−８メタロプロテアーゼ触媒ドメインが配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜４３９からなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
プロテアーゼが配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜５８８を含む、請求項６、７、または８に記載の方法。
【請求項１０】
プロテアーゼを組換え発現ベクターから発現させることを含む、プロテオグリカンを切断する方法であって、該プロテアーゼがＡＤＡＭＴＳ−８メタロプロテアーゼ触媒ドメインを含み、該プロテアーゼが該プロテオグリカンを切断する、方法。
【請求項１１】
プロテオグリカンがアグリカン分子であり、該組換え発現ベクターが、該プロテアーゼを分泌する哺乳動物細胞内で発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組換え発現ベクターが、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜８９０をコードする配列を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
組換え発現ベクターが、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜５８８をコードする配列を含む、請求項１０、１１、または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のアグリカン切断活性の調節能を有する薬剤を同定する方法であって、
該薬剤の存在するまたは存在しない下で、該ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質をアグリカン分子と接触させ、
該薬剤の存在するまたは存在しない下で、該ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のアグリカン切断活性を測定することを含み、
該薬剤の存在しない下でのアグリカン切断活性と比較した場合に、該薬剤の存在する下でのアグリカン切断活性が変化することで、該薬剤が該アグリカン切断活性の調節能を有することが分かる、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法に従って同定された薬剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】
哺乳動物のアグリカン切断異常を治療する方法であって、請求項１４に記載の方法に従って同定された薬剤を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のアグリカン切断活性の調節能を有する薬剤を同定する方法であって、
該薬剤の存在するまたは存在しない下で、ＡＤＡＭＴＳ−８メタロプロテアーゼ触媒ドメインを含み、かつアグリカン切断活性を有するプロテアーゼを、アグリカン分子と接触させ、
該薬剤の存在するまたは存在しない下で、該プロテアーゼのアグリカン切断活性を測定することを含み、
該薬剤の存在しない下でのアグリカン切断活性と比較した場合に、該薬剤の存在する下でのアグリカン切断活性が変化することで、該薬剤が該アグリカン切断活性の調節能を有することが分かる、方法。
【請求項１８】
哺乳動物細胞の細胞外領域におけるアグリカン切断活性を調節する方法であって、該哺乳動物細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−８の発現を阻害することを含む、方法。
【請求項１９】
阻害が、ＡＤＡＭＴＳ−８  ＲＮＡｉ配列またはアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドまたはコードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物のアグリカン切断異常を治療する方法であって、該哺乳動物の選択された細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−８の発現を阻害することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年４月１６日出願の米国特許仮出願第６０／５６２６８７号に基づく権利を主張し、この開示を全体として出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質、ならびにそれらの誘導体および調節因子と、プロテオグリカンの切断または代謝の欠損または異常を特徴とする疾患をそれらの物質を用いて治療する方法と、に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーには、共通のドメイン構造に基づいて相互に関連した少なくとも１９のメンバーが含まれる。ＡＤＡＭファミリーのメンバーとは対照的に、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、膜貫通ドメインをもたず、少なくとも１つのトロンボスポンジン１様モチーフを含有している。典型的なＡＤＡＭＴＳタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、シグナル配列、プロドメイン、メタロプロテアーゼ触媒ドメイン、ジスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型リピート、システインリッチドメイン、およびスペーサードメインを含有している。Ｃａｌら、ＧＥＮＥ、２８３：４９−６２（２００２年）を参照。多くのＡＤＡＭＴＳタンパク質が、スペーサードメインの後に１つまたは複数のトロンボスポンジン１様リピートも含有している。ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、スペーサードメインおよびトロンボスポンジン１様リピート内での相互作用を介して、細胞外マトリックス成分と結合できる。ＫｕｎｏおよびＭａｔｓｕｓｈｉｍａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨＥＭ．、２７３：１３９１２−１３９１７（１９９８年）参照。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーの小さな部分集団の生理学的役割が解明されており、あるケースでは、その発現異常とヒト疾病との関連が示唆されている。ＡＤＡＭＴＳ−２、ＡＤＡＭＴＳ−３、およびＡＤＡＭＴＳ−１４は、プロコラゲナーゼとして機能すると報告されている。ＡＤＡＭＴＳ−２は、Ｉ型およびＩＩ型プロコラーゲンのプロセシングを行うプロコラーゲンＩ  Ｎ−プロテナーゼ（ｐＮＰＩ）として同定されている。Ｉ型コラーゲンプロセシングが行われないと、アミノ末端プロペプチドを保持しているコラーゲン原線維（ｐＮ−コラーゲンＩ）の蓄積がもたらされる。ｐＮ−コラーゲンＩから構築された原線維は、正常なレベルの張力を生み出さず、それによって、疾患に関連した結合組織欠損を引き起こす。Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群ＶＩＩＣ型は、Ｉ型プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングができず、その結果、関節の完全性欠損と皮膚の脆弱性とを引き起こす劣性のヒト遺伝病である。ウシ、ヒツジ、およびネコの一部の品種で見られる関連疾患はデルマトスパラキシス（「皮膚の裂傷」）と呼ばれている。これらの疾患は、両方ともＡＤＡＭＴＳ−２活性の減失と結びついている。ＡＤＡＭＴＳ−２活性の非存在下で１型コラーゲンのアミノ−プロペプチド切断が残留していることによって、ＡＤＡＭＴＳ−１４もｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩ型コラーゲンを切断できるという発見が導かれた。ＡＤＡＭＴＳ−３が主要なプロコラーゲンＩＩ  Ｎ−プロペプチダーゼであると提唱されている。ＡＤＡＭＴＳ−１３は、フォンウィルブラント因子（ｖＷＦ）における、Ａ２ドメイン内の特定のＴｙｒ−Ｍｅｔ結合を切断する血漿プロテアーゼとして同定されている。血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、微小血管血栓症、血小板数低下、および貧血を特徴とする症候群である。内皮細胞から放出された大型のｖＷＦ（ＵＬ−ｖＷＦ）多量体が適切に切断されないことによってＴＴＰがもたらされるのであろうと推測されている。４家族のＴＴＰ血統の遺伝子解析によって、ＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子の変異がこの障害の主要原因であることが実証された。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、およびＡＤＡＭＴＳ−９は、異なった程度の効率で細胞外マトリックスプロテオグリカンを切断できることが示されている。例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、およびＡＤＡＭＴＳ−５は、アグリカンの球間ドメイン（ＩＧＤ）におけるＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合を切断することができる。Ｃａｔｅｒｓｏｎら、ＭＡＴＲＩＸ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９：３３３−３４４（２０００年）参照。このタンパク質分解活性はアグレカナーゼ活性と呼ばれ、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合がアグレカナーゼ切断部位として知られている。アグレカナーゼ活性を有するタンパク質はアグレカナーゼと呼ばれる。Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合は、変形性関節炎などの退行性骨関節症の際にｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解される。軟骨分解中におけるＩＧＤの主要な切断はアグレカナーゼによるものであると示唆する証拠がある。上記のＣａｔｅｒｓｏｎらを参照のこと。ＡＤＡＭＴＳ４は、成人脳で豊富なプロテオグリカンであるブレビカンの切断で役割を果たしていることも見出されており、また、ＡＤＡＭＴＳ１と共にベーシカンを切断することも示されている。
【０００６】
ＡＤＡＭＴＳ−８は、Ｍｅｔｈ２としても知られており、血管新生との関連が示唆されている。組換え体ＡＤＡＭＴＳ−８が内皮細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害できること、そして、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで血管新生を阻害できることを示す研究がある。例えば、Ｖａｚｑｕｅｚら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．、２７４：２３３４９−２３３５７（１９９９年）を参照。ＡＤＡＭＴＳ−８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を阻害でき、その効率はトロンボスポンジン−１またはエンドスタチンよりも高いが、ＡＤＡＭＴＳ−１よりは低いようである。ＡＤＡＭＴＳ−８ではいかなるタンパク質分解活性も同定されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、プロテオグリカンを切断するための、単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の使用に関する。この目的に適した方法は、プロテオグリカン分子を切断する単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質と、プロテオグリカンを接触させる工程を含む。多くの実施形態で、切断されるプロテオグリカン分子がアグリカン分子であり、このアグリカン分子のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合を、単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質が切断する。本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、完全長の成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質でありうる。一例では、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜８９０を含むものまたはこれからなるものである。別の例では、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３によってコードされているが、シグナルペプチドおよびプロドメインを欠失している。
【０００８】
本発明は、プロテオグリカンを切断するための、単離されたＡＤＡＭＴＳ−８誘導体の使用にも関する。これらのＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、ＡＤＡＭＴＳ−８メタロプロテアーゼ触媒ドメインを含み、完全長の成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のプロテオグリカン切断活性（例えばアグレカナーゼ活性）を保持するものである。そのようなＡＤＡＭＴＳ−８誘導体をプロテオグリカン分子（例えばアグリカン分子）と接触させると、プロテオグリカン分子が切断される。一例では、本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８メタロプロテアーゼ触媒ドメインは、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜４３９を含むもの、またはこれからなるものである。ＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、ＡＤＡＭＴＳ−８ジスインテグリン様ドメインおよび／またはＡＤＡＭＴＳ−８中央トロンボスポンジンＩ型リピートをさらに含みうる。
【０００９】
本発明に適したＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、任意の従来の手段によって調製することができる。多くの場合、そのようなＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、シグナルペプチドもプロドメインも含んでいない。ＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、完全長ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質における選択されたアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換によって調製することができる。一実施形態では、本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜５８８を含むもの、またはこれからなるものである。これに相当するアミノ酸配列からなるＡＤＡＭＴＳ−７またはＡＤＡＭＴＳ−９誘導体は、元の完全長タンパク質のアグレカナーゼ活性を保持することが示されている。
【００１０】
別の態様では、本発明は、プロテオグリカンを切断するための、組換え産生されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体の使用に関する。この目的に適した方法は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体を組換え発現ベクターから発現する工程を含む。発現されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体は、プロテオグリカン分子（例えばアグリカン分子）と接触した際にそれを切断する。本明細書に記載のいかなるＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質も、または誘導体も組換え産生することができる。多くの実施形態で、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体をコードする組換え体ベクターが哺乳動物細胞で発現され、発現されたタンパク質または誘導体が、それらの細胞によって培地または細胞外マトリックス領域に分泌される。一例では、本発明で用いられる組換え発現ベクターは、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜８９０をコードする配列を含む。別の例では、本発明で用いられる組換え発現ベクターは、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜５８８をコードする配列を含む。さらに別の例では、本発明で用いられる組換え発現ベクターは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３のタンパク質コード配列を含む。
【００１１】
本発明に従って切断されるプロテオグリカンは、組織、組織培養、または細胞培養中に存在するものでありうる。単離または組換え産生されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体は、非経口、静脈内、局所的、皮内、経皮、または皮下投与によって、あるいはＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体をコードする発現ベクターをその組織部位にある選択された細胞の中に導入することによってなど、任意の従来の手段によって組織部位に送達することができる。
【００１２】
本発明は、さらに、ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子を同定する方法に関する。これらの方法は、
対象の薬剤の存在下または非存在下で、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体をプロテオグリカン分子（例えばアグリカン分子）と接触させる工程と、
上記薬剤の存在下または非存在下で、上記ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体のプロテオグリカン切断活性（例えばアグレカナーゼ活性）を測定する工程と
を含む。上記薬剤の存在下における、前記薬剤の非存在下と比較したプロテオグリカン切断活性（例えばアグレカナーゼ活性）の変化によって、上記薬剤が上記ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体のアグリカン切断活性を調節できることが示される。ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子を得るためのスクリーニングには、本明細書に記載のいずれのＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体も使用できる。本発明によって同定された調節因子は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のプロテオグリカン切断活性（例えばアグレカナーゼ活性）を阻害（例えば低下または除去）または強化することができる。
【００１３】
本発明は、プロテオグリカン切断（例えばアグリカン切断）の欠損または異常を特徴とする疾患を治療するための、ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子の使用にも関する。この目的に適した方法は、治療有効量のＡＤＡＭＴＳ−８調節因子を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む。ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子が望ましい組織部位に到達でき、その部位のプロテオグリカン切断活性を改変するのに効果的であるならば、いかなる投与経路を用いてもよい。本発明によって同定されたいかなるＡＤＡＭＴＳ−８調節因子も、プロテオグリカンの欠損または異常を治療するのに用いることができる。
【００１４】
組織部位のプロテオグリカン切断活性の調節は、単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体を導入することによって、あるいは、組換え体ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質または誘導体をその部位で発現することによって行うことができる。さらに、細胞外マトリックス領域の選択された細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−８の発現を阻害することによって、細胞外マトリックス領域のプロテオグリカン切断活性を調節することができる。この目的に適した方法には、ＡＤＡＭＴＳ−８  ＲＮＡｉ配列またはアンチセンス配列を、選択された細胞に導入または発現することが含まれるが、これらに限定されない。多くの場合、用いられるＲＮＡｉ配列またはアンチセンス配列は、ＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子に特異的であって、他のプロテアーゼ遺伝子の発現を阻害できないものである。
【００１５】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質、またはそれらの誘導体もしくは調節因子を含む医薬組成物にも関する。
【００１６】
本発明の他の特徴、対象、および利点は以下の詳細な説明で明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、限定ではなく、例示のみを目的として提示されていることを理解するべきである。当業者には、本発明の範囲内にある様々な変更および改変が詳細な説明から明らかになろう。
【００１７】
（図面の簡単な記載）
図面は、何ら限定するものではなく、例示のために提示するものである。
【００１８】
図１は、ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーの系統樹を図示する。複数のＡＤＡＭＴＳタンパク質のアミノ酸配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較し、ＴｒｅｅＶｉｅｗを用いて示した。この系統樹は、配列の関連性に基づいてタンパク質を分類している。
【００１９】
図２Ａは、ＣＨＯ培養上清から単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）精製（ＩＢＡ、独国）で得たタンパク質画分の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。このＳＤＳ−ＰＡＧＥはクーマシーブリリアントブルーで染色した。レーン：１、ＣＨＯ細胞培養上清；レーン２、限外濾過で得られたフロースルー画分（濾過液）；レーン３、濃縮限外濾過残留画分；レーン４、ストレプトアクチンカラムフロースルー画分；レーン５〜９、ストレプトアクチンカラム洗浄画分；レーン１０〜１５、ストレプトアクチンカラム溶出分画。
【００２０】
図２Ｂは、抗Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩポリクローナル抗血清（ＩＢＡ）を用いた、図２ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタンブロットである。
【００２１】
図３Ａは、ヒトＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子由来のｃＤＮＡ断片プローブでプロービングした、７６の異なった人体組織から調製されたｍＲＮＡ多組織発現アレイを示す。
【００２２】
図３Ｂは、図３Ａの多組織発現アレイで使用されたｍＲＮＡの取得源を示す。空白の欄は、それらの座標にｍＲＮＡがスポットされなかったことを示す。ＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡの相対量が多かった組織は、肺（Ａ８）、大動脈（Ｂ４）、および胎児心臓（Ｂ１１）であり、低レベルのＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡが検出可能であったのは、虫垂（Ｇ５）、脳の様々な領域（Ａ１〜Ｇ１、Ｃ３〜Ｈ３、およびＢ３）であった。
【００２３】
図４は、無疾患の軟骨および骨関節炎（ＯＡ）の軟骨のヒト臨床標本における、リアルタイムＰＣＲで測定されたＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡ発現レベルのヒストグラムを示す。試料Ｗ−０４からＷ−１３は、ＯＡを患っていない（「無疾患」）膝関節軟骨を表す。試料７７Ｍ〜９６Ｍは、視覚的に現れていない後期段階ＯＡ関節軟骨（「軽度ＯＡ」）の領域を表す。試料８８Ｓ〜９８Ｓは、重度に影響が現れている後期段階ＯＡ関節軟骨（「重度ＯＡ」）の領域を表す。各試料のＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡ存在量は、ＡＤＡＭＴＳ−８に関して測定された平均データを、ＧＡＰＤＨに関して同一試料で測定された平均データ割ることによって、正規化された値として示されている。
【００２４】
図５は、モノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を用いた競合阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。ストレプトアビジンコーティングされたマイクロタイタープレートを、ビオチン化されたａｇｇｃ１ペプチドでコーティングした。阻害アッセイは、以下の競合物質、すなわち、合成ペプチドＧＧＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ（配列番号２２、黒塗り四角）、ＧＧＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号２３、中空四角）、ＡＤＡＭＴＳ−４消化されたアグリカン（黒塗り円）、および「非消化」アグリカン（中空円）を用いて行った。
【００２５】
図６Ａは、モノクローナル抗体ＢＣ−３を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−４消化およびＡＤＡＭＴＳ−８消化されたウシアグリカンのウエスタンブロットである。ＡＤＡＭＴＳ−４またはＡＤＡＭＴＳ−８の存在下または非存在下でウシアグリカンを３７℃で１６時間インキュベートした。消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、モノクローナル抗体ＢＣ−３を用いたウエスタンイムノブロッティングによって可視化した。レーン１、酵素無添加；レーン２、ＡＤＡＭＴＳ−４消化されたアグリカン（酵素：基質モル比１：２０）；レーン３〜７、各レーン上に示された酵素：基質モル比でＡＤＡＭＴＳ−８消化されたアグリカン。球状タンパク質標準物質の移動位置をブロットの左側に示す。
【００２６】
図６Ｂは、モノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−８消化されたウシアグリカンのウエスタンブロットである。ウシアグリカンを、無酵素、または様々なモル比のＡＤＡＭＴＳ−８と共に３７℃で１６時間インキュベートした。消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、モノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を用いたウエスタンイムノブロッティングによって可視化した。各消化における酵素：基質相対モル比は示されている通りである。
【００２７】
図６Ｃは、モノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−４消化されたウシアグリカンのウエスタンブロットを示す。ウシアグリカン（１２．５ｐｍｏｌ）を無酵素、あるいは、それぞれ０．０５ｎｇ、０．１ｎｇ、０．２５ｎｇ、０．５ｎｇ、または１ｎｇのＡＤＡＭＴＳ−４と共に３７℃で１６時間インキュベートされた。消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＡＧＧ−Ｃ１を用いたウエスタンイムノブロッティングによって可視化した。各消化における酵素：基質相対モル比は示されている通りである。
【００２８】
図７は、アグレカナーゼ活性の競合阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。検量線は、様々な量の組換え体ＡＤＡＭＴＳ−４と共にウシアグリカンを３７℃で１６時間インキュベートし、それに続いて、各消化物にモノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を添加することによって作成した。競合阻害ＥＬＩＳＡで４５％の阻害をもたらす量のアグリカン切断産物を産生するのに約１ｎｇのＡＤＡＭＴＳ−４を必要とする。
【００２９】
（詳細な説明）
本発明は、プロテオグリカン分子を切断するための、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体の使用に関する。本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８のタンパク質分解活性を阻害または強化できるＡＤＡＭＴＳ−８調節因子を同定する方法にも関する。加えて、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質、またはそれらの誘導体もしくは調節因子を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、プロテオグリカンの切断または代謝の欠損または異常を特徴とする状態を治療するのに用いることができる。
【００３０】
本発明の様々な態様を以下のセクションに詳細に説明する。以下のセクションの使用は、本発明の限定を意図するものではない。各セクションは本発明のいかなる態様にも適用できる。この出願では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。
【００３１】
（Ｉ．ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質およびそれらの機能的誘導体）
本発明は、アグリカンまたは他のプロテオグリカン分子を切断するための、成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の使用に関する。成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、シグナルペプチドとプロドメインとを欠失している。適当な成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の例には、完全長の成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３によってコードされている、フューリンプロセシイングされたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質）、およびオルタナティブＲＮＡスプライシングまたは補助的ドメインのタンパク質分解性プロセシングによって生成された成熟ＡＤＡＭＴＳ−８アイソフォーム）が含まれるが、これらに限定されない。オルタナティブＲＮＡスプライシングは、１つまたは複数のＣ末端トロンボスポンジン１様リピートの欠失をもたらし、ＡＤＡＭＴＳファミリーの特定のメンバーで観察されている。成熟過程におけるＣ末端補助的ドメインのタンパク分解性の除去は、ＡＤＡＭＴＳファミリーの特定のメンバーで報告されている。
【００３２】
本発明は、アグリカンまたは他のプロテオグリカン分子を切断するための、プロセシングされていないＡＤＡＭＴＳタンパク質の使用も企図する。これらのプロセシングされていないタンパク質は、シグナルペプチドまたはプロドメインを含んでいる。多くの場合、プロセシングされていないＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、適当な宿主細胞の中で組換え発現され、培地または細胞外マトリックス領域に分泌される。これらの分泌タンパク質は、通常シグナル配列を欠失している。これらのタンパク質をさらに処理することによって、プロドメインを除去することができる。
【００３３】
本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３によってコードされているものなどの天然存在のタンパク質でも、天然に存在するそれらのタンパク質分解産物でもよい。一例では、本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質は、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜８９０を含むものである。
【００３４】
本発明は、アグリカンまたは他のプロテオグリカン分子を切断するための、天然に存在するＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の変種の使用にも関する。これらの変種は、元のタンパク質のプロテオグリカン切断活性（例えばアグレカナーゼ活性）を保持するものである。変種のアミノ酸配列は、元のタンパク質の配列に実質的に同一である。一例では、変種のアミノ酸配列は、元のタンパク質に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％以上の全域的配列同一性または類似性を有する。配列同一性または類似性は、当技術分野で知られている様々な方法を用いて決定することができる。例えば、配列の同一性または類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．、２１５、４０３−４１０（１９９０年）に記載のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．、４８：４４４−４５３（１９７０年）のアルゴリズム、Ｍｅｙｅｒｓら、ＣＯＭＰＵＴ．ＡＰＰＬ．ＢＩＯＳＣＩ．、４：１１−１７（１９８８年）のアルゴリズム、おとびドットマトリクス解析などの標準的アラインメントアルゴリズムを用いて決定することができる。この目的に適したソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ））提供のＢＬＡＳＴプログラムと、ＤＮＡＳＴＡＲ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）提供のＭｅｇＡｌｉｇｎが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、ＧＣＧ（ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）社のＧＡＰプログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム）を用いて、配列の同一性または類似性を決定する。プログラムによって指定されているデフォルト値を用いることができる（例えば、配列の一方におけるギャップ開始のペナルティが１１であり、ギャップ伸長のペナルティが８である）。類似したアミノ酸は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリクスを用いて定義することができる。
【００３５】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質変種は、対立遺伝子変異および多型など、天然に存在するものでも、人為的に構築されたものでもよい。多数の例で、タンパク質の構造または生物活性を有意に改変せずに、タンパク質配列に保存的アミノ酸置換を導入することができる。保存的アミノ酸置換は、残基の極性、電荷量、溶解性、疎水性、親水性、または両親媒性の類似性に基づいて導入することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）などの塩基性側鎖を有するアミノ酸相互；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）などの酸性側鎖を有するアミノ酸相互；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）などの無電荷極性側鎖を有するアミノ酸相互；ならびに、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ｐｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、およびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）などの非極性側鎖を有するアミノ酸相互で行うことができる。他の適当なアミノ酸置換を表１に例示する。
【表１】
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【００３６】
置換には、天然に存在しないアミノ酸残基も使用できる。これらのアミノ酸残基は、通常、生物システム中での合成ではなく、化学ペプチド合成によって組み込まれる。
【００３７】
加えて、ＡＤＡＭＴＳ−８変種は、分子の安定性を増強するアミノ酸置換を含むものでもよい。また、他の望ましいアミノ酸置換（保守的または非保存的）もＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質に導入することができる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性に重要なアミノ酸残基を同定することができ、タンパク質分解活性を増強または低減できる置換を選択することができる。
【００３８】
さらに、ＡＤＡＭＴＳ−８変種は、グリコシル化部位の改変を含むものでもよい。これらの改変は、Ｏ結合型またはＮ結合型のグリコシル化部位に関与するものでありうる。例えば、アスパラギン結合グリコシル化認識部位のアミノ酸残基を置換または除去することができ、その結果、グリコシル化の部分的または完全な廃止がもたらされる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、通常、適切な細胞性グリコシル化酵素によって認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、例えば、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンでよく、配列中、通常、Ｘは任意のアミノ酸である。グリコシル化認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方における様々なアミノ酸置換または欠失（あるいは２番目の位置のけるアミノ酸欠失）によって、改変されたトリペプチド配列の非グリコシル化をもたらすことができる。さらに、細菌内での発現は、グリコシル化部位が改変されていないままでも、非グリコシル化タンパク質の産生をもたらす。
【００３９】
他のタイプの改変も、ＡＤＡＭＴＳ−８変種に導入することができる。これらの改変は、翻訳後修飾などの天然存在の過程によって導入されたものでも、人為的過程または合成過程によって導入されたものでもよい。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ酸末端、およびカルボキシル末端を含めた、ポリペプチドのいかなる箇所でも起こりうる。同じタイプの修飾が、変種のいくつかの部位に、同程度または異なった程度で存在しうる。変種は、多数の異なったタイプの改変を含みうる。本発明に適した改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合化、ヘム部分の共有結合化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化反応、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化などの、タンパク質への転移ＲＮＡ媒介型のアミノ酸付加、ユビキチン結合、またはこれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド変種は、分岐したもの（例えばユビキチン結合の結果）でも、環状のものでもよく、環状のものは分岐を有するものでも、分枝をもたないものでもよい。
【００４０】
本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８変種は、１つまたは複数の領域で元のＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質に実質的に同一であるが、他の領域では異なるものでありうる。ＡＤＡＭＴＳ−８変種は、元のＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の全域的ドメイン構造を保持しているものでありうる。一実施形態では、天然存在のＡＤＡＭＴＳ−８配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸残基、またはさらに多くのアミノ酸残基を改変することによって変種を調製する。改変の例には、置換、欠失、および挿入が含まれるが、これらに限定されない。置換は、保守的置換でも、非保存的置換でも、あるいはこれら両方を含むものでもよい。これらの改変は、元のタンパク質のタンパク質分解活性（例えばアグレカナーゼ活性）に有意な影響を与えない。例えば、変種は、元のＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはこれより大きなタンパク質分解活性（例えばアグレカナーゼ活性）を保持するものでありうる。変種は、元のＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質と比較して、増強しているタンパク質分解活性（例えば増強したアグレカナーゼ活性）を有するものでもよい。
【００４１】
本発明はさらに、アグリカンまたはプロテオグリカン分子を切断するための、ＡＤＡＭＴＳ−８誘導体の使用にも関する。これらのＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失または改変を有する改変ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質である。一例では、ＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、完全長ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質における補助的ドメインのかなりの部分の欠失を含んでいる。別の例では、ＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、スペーサードメインおよびＣ末端トロンボスポンジン１様リピートの、完全長ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質からの欠失を含んでいる。スペーサードメインおよびＣ末端トロンボスポンジン１様リピートの後のいかなる領域も除去される可能性がある。
【００４２】
一実施形態では、本発明で用いられるＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、配列番号２８におけるＰｈｅ５８８以降にあるアミノ酸残基のかなりの部分の欠失を含むものである。これに相当する配列を欠失したＡＤＡＭＴＳ−７またはＡＤＡＭＴＳ−９末端欠失体は、元の完全長タンパク質のアグレカナーゼ活性を保持することが示されている。完全長ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質から除去されるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ５８８のＣ末端側にあるアミノ酸残基の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むものでありうるが、これらに限定されない。除去されるアミノ酸残基は、システインリッチドメイン、スペーサードメイン、Ｃ末端トロンボスポンジン１様リピート、または、それ以降もしくはそれらの間に位置する任意の領域から選択することができる。除去される残基は、隣接したものでも、隣接していないものでもよい。一例では、ＡＤＡＭＴＳ−８誘導体は、配列番号２８におけるアミノ酸２１４〜５８８を含むもの、またはこれらからなるものである。
【００４３】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のＮ末端領域にあるアミノ酸残基も改変できる。例えば、シグナル配列、プロドメイン、メタロプロテアーゼ触媒ドメイン、ジスインテグリン様ドメイン、または中央トロンボスポンジンＩ型リピート中の選択された特定の残基を、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性（例えばアグレカナーゼ活性）を有意に減少させないで、除去または別の方法で改変することができる。
【００４４】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはその機能的誘導体のＮ−末端またはＣ末端に追加のポリペプチドを融合させることもできる。これらのポリペプチドの非限定的な例には、ペプチドタグ、酵素、抗体、受容体、リガンド／受容体結合タンパク質、またはこれらの組合せが含まれる。この目的に適した抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え体抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、接木抗体、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体断片を用いることもできる。これらの抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、またはｄＡｂが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはその誘導体にペプチドタグを付加することもできる。適当なペプチドタグには、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）（ＩＢＡ）、ポリヒスチジンもしくはポリーヒスチジングリシンタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、ＫＴ３エピトープペプチド、インフルエンザＨＡタグポリペプチド、ｃ−ｍｙｃタグ、単純ヘルペス糖タンパク質Ｄ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ、チューブリンエピトープペプチド、Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。これらのペプチドタグに対する抗体は、様々な販売会社から容易に入手できる。代表的な抗体には、インフルエンザＨＡタグポリペプチドに対する抗体１２ＣＡ５と、ｃ−ｍｙｃタグに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体とが含まれる。ペプチドタグの利便性を強化するために、ペプチドタグと元のタンパク質との間にペプチドリンカーを付加することができる。
【００４６】
付加されるポリペプチドと元のタンパク質との間に、タンパク質分解によって切断可能な部位を導入することができる。これらの切断可能部位は、元のタンパク質の、付加されたポリペプチドからの分離を可能にする。この目的に適した酵素には、Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
添加されるポリペプチドは、タンパク質精製、検出、固定、折りたたみ、またはターゲッティングを促進するか、あるいは他の望ましい目的に役立つように用いることができる。これらのポリペプチドは、融合タンパク質の発現、溶解性、または安定性を増強するのに用いることもできる。多くの実施形態で、付加されるポリペプチドは、融合タンパク質のタンパク質分解活性（例えばアグレカナーゼ活性）に有意な影響を与えない。
【００４８】
（ＩＩ．ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド）
様々な方法を用いて、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡでも、ＲＮＡでも、発現可能な他の核酸分子でもよい。それらは、一本鎖でも、二本鎖でもよい。
【００４９】
一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体のコード配列を調製するのに、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３を用いる。標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３のタンパク質コード配列に欠失または他の改変を導入することができる。例示的なＤＮＡ欠失／改変技術には、ＰＣＲ媒介変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的「ループアウト」変異誘発、ＰＣＲオーバラップ伸長、時間制御されたエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化、メガプライマー法、逆ＰＣＲ、および自動ＤＮＡ合成が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
欠失ライブラリーを用いることもできる。これらの欠失ライブラリーは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、または内部欠失ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のコード配列を含有する。欠失ライブラリーを構築する例示的方法には、Ｐｕｅｓら、ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．、２５：１３０３−１３０５（１９９７年）に記載のものが含まれるが、これに限定されない。ＥＺ：：ＴＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＭａｃｈｉｎｅおよびｐＷＥＢ：：ＴＮＣ（商標）Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｃｏｓｍｉｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などの市販の欠失キットも、ＡＤＡＭＴＳ−８欠失ライブラリーを作製するのに用いることができる。元のＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性を保持する欠失体を選択することができる。
【００５１】
本発明で用いられるポリヌクレオチドは、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性が増大するように改変することができる。可能な改変には、５’末端または３’末端への隣接配列の付加；バックボーンのホスホジエステラーゼ結合の代わりにホスホロチオエート結合または２−ｏ−メチル結合を使用すること；ならびに、イノシン、ケオシン、およびワイブトシンなどの非伝統的な塩基や、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル修飾、メチル修飾、チオ修飾、または他の修飾型の包含が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードする発現ベクターにも関する。これらの発現ベクターは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードするタンパク質コード配列に作用可能に連結した５’または３’非翻訳調節配列を含む。発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択および望ましい発現レベルなどの因子に応じて異なる。適切な表現ベクターの非限定的な例には、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫細胞発現ベクター、および哺乳動物発現ベクターが含まれる。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、またはトガウイルスベクターなどのウイルスベクターも使用できる。本発明によって用いられる発現ベクターは、構成的プロモーターによって制御されるものでも、誘導性プロモーターによって制御されるものでもよい。
【００５３】
本発明は、組織特異的プロモーターまたは発生調節プロモーターの使用も企図する。適切な組織特異的プロモーターの例には、軟骨特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、大動脈特異的プロモーター、虫垂特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、リンパ球特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、乳腺特異的プロモーター、軟骨細胞特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、グリア細胞特異的プロモーターおよびＴ細胞特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。発生調節プロモーターの例には、α胎児性タンパク質プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターまたは発生調節プロモーターの使用は、所定の組織または特定の発生段階における、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体の選択的発現を可能にする。
【００５４】
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体の発現には、調節可能な発現システムを用いることもできる。この目的に適したシステムには、Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆシステム、エクジソンシステム、プロゲステロンシステム、およびラパミシンシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
（ＩＩＩ．ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体の発現および精製）
ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードする発現ベクターは、発現用の宿主細胞に安定的または一時的に導入することができる。発現されたタンパク質は、従来の手段を用いて宿主細胞から単離することができる。この目的に適した宿主細胞には、真核細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母）および原核細胞（例えば細菌）が含まれるが、これらに限定されない。適当な真核細胞宿主細胞の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＣＶ１細胞が含まれる。真核細胞宿主細胞は、通常、グリコシル化などの望ましい翻訳後修飾を、発現されるタンパク質に施す。適当な原核細胞の宿主細胞の非限定的な例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１Ｏ６１）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびシュードモナスが含まれる。本発明で用いられる宿主細胞は、細胞系でも、初代細胞培養でも、組織培養でもよい。それらの細胞は、トランスジェニック動物またはキメラ動物体内の細胞でもよい。適当な宿主細胞、ならびに培養形質移入／形質転換、増幅、スクリーニング、産物産生、および精製方法の選択は、当技術分野における一般的な技術レベルの範囲内にある日常的実験計画の問題である。
【００５６】
一実施形態では、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌する哺乳動物宿主細胞で、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体を発現させる。アフィニティークロマトグラフィー（免疫アフィニティークロマトグラフィーを含める）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿（免疫沈降反応を含める）、差次的可溶化、電気泳働、遠心法、結晶化、またはこれらの任意の組合せなどの標準的な単離／精製技法を用いて、分泌産物を単離または精製することができる。発現されたタンパク質の単離を容易にするためストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、またはグルタチオンＳ−転移酵素などの精製タグを用いることができる。精製タグは、精製後に発現されたタンパク質から切断できる。精製タグは、分泌されなかったＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質を細胞溶解液から単離または精製するのにも用いることができる。
【００５７】
別の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの機能的誘導体が原核細胞の宿主細胞内で発現され、これらの細胞のインクルージョンボディーに濃縮される。濃縮されたタンパク質は、インクルージョンボディーから可溶化し、リフォールディングさせ、その後、上述の方法を用いて単離することができる。
【００５８】
単離されたＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはその誘導体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはイムノブロットなどの標準的な技法を用いて分析または確認できる。単離されたタンパク質は、タンパク質シーケンシングまたは質量分析によって分析することもできる。一例では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の対象タンパク質バンドをゲルから手操作で切り取り、その後、還元およびアルキル化し、トリプシンまたはエンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で消化する。この消化は、自動インゲル消化ロボットを用いてｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。消化の後、ペプチド抽出物を濃縮し、マイクロエレクトロスプレイ逆相ＨＰＬＣによって分離する。ペプチド分析はＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行うことができる。ＭＳ／ＭＳデータの自動分析は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓデータ解析パッケージ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に組み込まれているＳＥＱＵＥＳＴコンピュータアルゴリズムを用いて行うことができる。
【００５９】
本発明は、無細胞の転写および翻訳系による、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはそれらの誘導体の発現にも関する。適当な無細胞発現系には、麦芽抽出物、網赤血球溶解物、およびＨｅＬａ核抽出物が含まれるが、これらに限定されない。発現されたタンパク質は、上述の方法を用いて、単離または精製することができる。
【００６０】
（ＩＶ．タンパク質分解活性の検出）
アグレカナーゼ活性は、蛍光ペプチドアッセイ、ネオエピトープウエスタンブロット、アグリカンＥＬＩＳＡ、または活性アッセイを用いて評価できる。これらのうち最初の２つのアッセイは、アグリカンのＩＧＤにおけるＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合の切断能力を検出するのに適している。
【００６１】
蛍光ペプチドアッセイでは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはそれらの誘導体）を、アグレカナーゼ切断部位のアミノ酸配列を含有する合成ペプチドと共にインキュベートする。合成ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかを蛍光色素で標識し、もう一方の末端はクエンチャーを含有する。ペプチドの切断によって蛍光色素とクエンチャーとが分離し、それによって蛍光が誘発される。タンパク質の相対アグレカナーゼ活性を、相対蛍光を用いて決定することができる。
【００６２】
ネオエピトープウエスタンブロットでは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはそれらの誘導体）を、完全なアグリカンと共にインキュベートする。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離する前に、切断産物にいくつかの生化学的処理を施す。この生化学処理には、例えば、透析、コンドロイチナーゼ処理、凍結乾燥、および再構成が含まれる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質試料を膜（ニトロセルロース紙など）に移し、ネオエピトープ特異的抗体で染色する。ネオエピトープ抗体は、アグリカンのタンパク質分解性切断によって曝露された新規のＮ末端またはＣ末端アミノ酸配列を特異的に認識する。この抗体は、元の分子すなわち切断されていない分子上のエピトープには結合しない。適当なネオエピトープ抗体には、ＭＡｂ  ＢＣ−１３、ＭＡｂ  ＢＣ−３、およびＩ１９Ｃ抗体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、上記のＣａｔｅｒｓｏｎら；および、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ、４９４：１９２−１９５（２００１年）を参照のこと。一例では、切断されたアグリカン断片を、アルカリ性ホスファターゼ結合二次抗体、ニトロブルーテトラゾリウム色素原、およびブロモクロロインドリルリン酸基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて可視化する。バンドの相対密度が相対アグレカナーゼ活性を示す。
【００６３】
アグリカン分子中のいかなる切断を検出するのにもアグリカンＥＬＩＳＡを用いることができる。このアッセイでは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）を、予めプラスチックウェルに固定された完全なアグリカンと共にインキュベートする。ウェルを洗浄し、その後、アグリカンを検出する抗体と共にインキュベートする。ウェルを二次抗体で発色させる。元の量のアグリカンがウェル中に残っている場合には、濃い抗体染色が得られるであろう。ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）によってアグリカンが消化された場合には、付着していたアグリカン分子がウェルから離れ、それによって、後の抗体染色が減弱される。このアッセイは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）がアグリカンを切断できるかどうか検出することができる。このアッセイを用いて、相対切断活性は測定することもできる。
【００６４】
活性分析では、最初にマイクロタイタープレートをヒアルロン酸（ＩＣＮ）でコーティングし、それに続いて、コンドロイチナーゼ処理されたウシアグリカンでコーティングする。コンドロイチナーゼは、例えばＳｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手できる。このアグリカンコーティングされたプレートに、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）を含有する培養培地を添加する。ＩＧＤ中のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４で切断されたアグリカンを洗い流す。残っている切断されていないアグリカンを３Ｂ３抗体（ＩＣＮ）と、それに続く抗ＩｇＭ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）とによって検出することができる。最後の発色は、例えば、３，３”，５，５”テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて行うことができる。
【００６５】
ブレビカン、ベーシカン、ニューロカン、または他のプロテオグリカンもしくは細胞外マトリックスタンパク質に対するタンパク質分解活性も、従来の手段を用いて評価することができる。例えば、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．、２７８：９５０３−９５１３（２００３年）（ベーシカナーゼ活性のアッセイについて記載する）を参照。これらの方法は、通常、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）をプロテオグリカン分子と接触させ、それに続いて、プロテオグリカン分子のいかなる切断も検出するものである。
【００６６】
（Ｖ．ＡＤＡＭＴＳ−８の阻害物質、アンチセンスポリヌクレオチド、およびＲＮＡｉ配列の開発）
本発明はＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質の同定に関する。この目的に適したスクリーニングアッセイは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）を、対象化合物の存在下または非存在下でプロテオグリカン基質と接触させる工程を含む。ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質（またはその誘導体）のタンパク質分解活性を、この化合物の存在下または非存在下で評価することによって、この化合物がタンパク質分解活性に何らかの阻害作用を有するかどうか判定する。例えば、上記のＨａｓｈｉｍｏｔｏらを参照。ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質の同定を容易にするために、ハイスループットスクリーニングアッセイまたは化合物ライブラリーを用いることができる。ＡＤＡＭＴＳ−８の賦活物質も同様に同定することができる。
【００６７】
三次元構造分析またはコンピュータ援用薬品設計を用いて、ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質を同定することもできる。後者の方法は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質およびそれらのプロテオグリカン基質（例えばアグリカン）の三次元構造に基づいて、阻害物質への結合部位の決定を行うものである。ＡＤＡＭＴＳ−８上の結合部位またはその基質に対して反応する分子を選択する。その後、候補分子に何らかの阻害作用があるかどうか判定するために、それらをアッセイする。プロテアーゼ阻害物質の開発に適した他の方法も、ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質の同定に用いることができる。
【００６８】
ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質は、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、化学化合物、または小分子でありうる。一実施形態では、本発明によって同定されるＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性（例えばアグレカナーゼ活性）を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上阻害できるものである。別の実施形態では、本発明によって同定されるＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性を特異的に阻害でき、ＭＭＰなど、他の非ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼを阻害しないものである。さらに別の実施形態では、本発明によって同定されるＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性を特異的に阻害でき、他のＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーを阻害しないものである。「特異的に阻害する」によって、ある阻害物質が標的タンパク質の活性を低減または消失させることができるが、他のタンパク質の活性には有意な影響を与えないことを意味する。一部の例では、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質に特異的な阻害物質が、他のプロテアーゼの活性を１０％、５％、または１％未満阻害するものである。多の一部の例では、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質に特異的な阻害物質が、他のプロテアーゼに対して検出可能な影響をもたないものである。
【００６９】
本発明のＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質は、試料中のＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の存在または不在を判定するか、あるいはそれを定量化するのに用いることができる。ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の存在または発現レベルを疾患と相関させることによって、当業者は、疾患またはその重度を判定するための診断用生物学的マーカーとして、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質を用いることができる。
【００７０】
ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質の、診断目的での使用を意図している場合、例えば、リガンドグループ（例えば、ビオチン、または特異的な結合パートナーを有する他の分子）または検出可能なマーカーグループ（例えば、蛍光色素、発色団、放射性原子、高電子密度試薬、または酵素）で阻害物質を修飾するのが望ましい場合がある。特異的な結合パートナーを有する分子には、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、ならびに、当技術分野で知られている多数の受容体−リガンド対が含まれるが、これらに限定されない。ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質に結合した酵素マーカーは、それらの酵素活性によって検出することができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量化可能な青色色素に変換する能力によって検出することができる。
【００７１】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８配列に対してアンチセンスであるポリヌクレオチドにも関する。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質をコードするセンスポリヌクレオチドと水素結合を形成することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＡＤＡＭＴＳ−８配列のコード領域または非コード領域に相補的なものでありうる。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＡＤＡＭＴＳ−８転写産物の鎖全体に相補的なものでも、その一部分のみに相補的なものでもよい。アンチセンスポリヌクレオチドは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド残基またはそれより多くのヌクレオチド残基を含むものでありうる。
【００７２】
アンチセンスポリヌクレオチドを調製するのに、当技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。一実施形態では、天然存在のヌクレオチドを用いてアンチセンスポリヌクレオチドを化学的に合成する。別の実施形態では、分子の生物学的安定性、またはアンチセンスとセンスポリヌクレオチドとの間で形成される二本鎖分子の物理的安定性を増大させるために、修飾ヌクレオチドを用いてアンチセンスポリヌクレオチドを合成する。修飾ヌクレオチドの例には、ホスホロチオエート誘導体、アクリジン置換ヌクレオチド、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデン４エキシン（isopentenyladen4exine）、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。アンチセンスポリヌクレオチドは、天然存在のヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの両方を用いて調製することもできる。
【００７３】
さらに別の実施形態では、発現ベクターを用いて生物学的にアンチセンスポリヌクレオチドを産生する。これらの発現ベクターは、そこから転写されたＲＮＡが標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンス方向のものとなるような方向にポリヌクレオチドをコードする。
【００７４】
別の実施形態では、アンチセンス分子がα−アノマーポリヌクレオチド分子である。α−アノマーポリヌクレオチド分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリットを形成することができ、その中では、通常のβ−ユニットとは逆に、鎖が相互に対して平行に走行している。さらに別の実施形態では、アンチセンス分子が２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を含んでいる。
【００７５】
さらに別の実施形態では、アンチセンス分子がリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的な領域を有する一本鎖ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を切断できる触媒ＲＮＡ分子である。当技術分野で知られている様々な方法を用いて、ＡＤＡＭＴＳ−８  ＲＮＡに特異的なリボザイムを設計または選択することができる。
【００７６】
さらに別の実施形態では、アンチセンス分子は、ＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子の調節領域と三重らせん構造を形成することができ、それによって、ＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子の転写が阻止される。
【００７７】
アンチセンスポリヌクレオチドは、通常、医薬組成物中で、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕで発現ベクターから産生されて対象に投与される。一例では、アンチセンスポリヌクレオチドを組織部位（例えば関節軟骨）に直接注射する。別の例では、アンチセンスポリヌクレオチドを全身投与する。全身投与用には、最初に、それらが選択された細胞の表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合できるように、アンチセンス分子を修飾することができる。アンチセンス分子をコードする発現ベクターは、任意の従来の手段で組織部位に投与することができる。アンチセンス分子の細胞内濃度が十分なものにするため、発現ベクターでは、ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターなどの強力なプロモーターを用いることができる。直接投与またはベクター産生されたアンチセンス分子は、細胞のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリッド形成または結合でき、それによって、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の翻訳または転写を阻害する。
【００７８】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の発現を阻害するための、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）の使用をさらに企図する。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子サイレンシング機構を提供する。本発明のＲＮＡｉ配列は、いかなる望ましい長さを有するものでもよい。多くの場合、このＲＮＡｉ配列は、連続した少なくとも１０、１５、２０、２５ヌクレオチド、またはそれより多くのヌクレオチドを有する。標的ｍＲＮＡ転写産物を分解する機能的なサイレンシング複合体を形成できるならば、ＲＮＡｉ配列は、ｄｓＲＮＡでも、他のタイプのポリヌクレオチドでもよい。
【００７９】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ配列は、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を含むか、あるいはこれからなる。多くの適用で、ｓｉＲＮＡは約１９〜２５ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩに関連した核酸分解酵素であるＤｉｃｅｒによって、より長いｄｓＲＮＡ分子が分解されることによって内因的に産生されることがある。ｓｉＲＮＡは、細胞内に外因的に導入することも、発現ベクターから転写させることもできる。ｓｉＲＮＡが産生されたならば、それはタンパク質成分と集合して、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られている、エンドリボヌクレアーゼを含有する複合体を形成する。活性のＲＩＳＣは、相補的なｍＲＮＡ転写物を切断し、破壊する。この配列特異的ｍＲＮＡ分解の結果として、遺伝子サイレンシングがもたらされる。
【００８０】
ｓｉＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングを実現するために、少なくとも２通りの方法を用いることができる。第１の方法では、ｓｉＲＮＡｓをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成し、その後、それを細胞内に導入して遺伝子発現を一時的に阻害する。合成ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを実現する簡単かつ効率的な方法を提供する。多くの実施形態で、ｓｉＲＮＡは、左右対称のジヌクレオチド３’オーバーハング（例えば、ＵＵまたはｄＴｄＴ  ３’オーバーハング）を有する約１９〜２３ヌクレオチドを含有する混合短鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖分子である。これらのｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化させずに、哺乳動物細胞で標的の遺伝子翻訳を特異的に阻害することができる。ＰＫＲの活性化は、多数のタンパク質の翻訳の非特異的な阻害を引き起こすことが報告されている。
【００８１】
第２の方法では、ｓｉＲＮＡをベクターから発現させる。このアプローチは、トランスジェニック動物または細胞で、ｓｉＲＮＡを安定的または一時的に発現させるのに用いることができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ転写がポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）転写ユニットから起こるようにｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築する。多くの場合、Ｐｏｌ  ＩＩＩ転写ユニットは、２ｂｐオーバーハング（例えばＵＵ）の、ヘアピンｓｉＲＮＡへの付加−ｓｉＲＮＡ機能に有用な性質−を導く、短いＡＴリッチな転写終結部位を用いる。Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡｓを発現するトランスジェニック動物の作製にも使用できる。加えて、選択された細胞または組織でｓｉＲＮＡを発現するのに組織特異的プロモーターを用いることもできる。組織特異的なノックアウト動物を作製するのにも、同様なアプローチを用いることができる。別の実施形態では、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を最初にベクターから発現させる。長いｄｓＲＮＡは、その後、ＤｉｃｅｒによってｓｉＲＮＡにプロセシングされて、遺伝子特異的なサイレンシングを生み出す。
【００８２】
ｓｉＲＮＡ設計には、多数の３’ジヌクレオチドオーバーハング（例えばＵＵ）が使用可能である。一部の場合では、一本鎖のＧ残基でｓｉＲＮＡがＲＮアーゼによって切断される危険を低下させるために、オーバーハング中でのＧ残基の使用を回避する。
【００８３】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡのＧＣ含量が約３０〜５０％である。別の実施形態では、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから発現されるｓｉＲＮＡを設計する際に、標的配列中でＴまたはＡが４塩基を超えて連続して伸長するのを避ける。さらに別の実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列が強度に構造化されたり、調節タンパク質が結合したりしないようにｓｉＲＮＡを選択する。さらに別の実施形態では、仮想的標的部位を適切なゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して、連続した１６〜１７塩基対を超える相同性を有する標的配列を考慮から外すことができる。
【００８４】
さらに別の実施形態では、短いスペーサー配列によって分離された２つの逆向き反復配列を有するように、そして、転写終結部位として働くひと続きのＴが終端となるようにｓｉＲＮＡを設計する。この設計では、短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡに折りたたまれることが予測されるＲＮＡ転写物が産生される。望ましい結果を実現するために、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択、推定上のヘアピンのステムをコードする逆向き反復配列の長さ、逆向き反復配列の順序、ヘアピンのループをコードするスペーサー配列の長さおよび組成、ならびに５’オーバーハングの有無を変化させることができる。
【００８５】
別の実施形態では、標的センス鎖と、それに続く、短いスペーサー、標的アンチセンス鎖、および転写ターミネーターとして働く５〜６塩基のＴとを含有するように、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現カセットを構築する。ｓｉＲＮＡ発現コンストラクト中のセンス鎖およびアンチセンス鎖の順序は、ヘアピンｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に影響を与えずに変えることができる。しかし、場合によっては、順序を逆転させることによって、遺伝子サイレンシング活性の部分的低下が起こることがある。
【００８６】
さらに別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ発現カセットのステムとして使用されるヌクレオチド配列の長さが約１９〜２９の範囲にある。ループのサイズは、３〜２３ヌクレオチドの範囲でありうる。他のステム長またはループサイズも使用できる。
【００８７】
ｓｉＲＮＡ標的の選択には、様々な方法が利用可能である。一例では、ＡＡジヌクレオチドを求めてｍＲＮＡ配列をスキャンし、ＡＡのすぐ下流にある１９ヌクレオチドを記録することによって、ｓｉＲＮＡ標的を選択する。別の例では、標的配列はＧＧで始まり、ＢＬＡＳＴ検索によって分析した際に他の遺伝子と有意の配列相同性を共有しないという条件の下に、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択を純粋に経験的に決定する。さらに別の例では、内因性ｍＲＮＡ中のアクセス可能な部位が、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド／ＲＮアーゼＨ法による分解の標的となりうるという観察に基づいて、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択を行う（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：５００−５０５（２００２年））。
【００８８】
一実施形態では、ＲＮＡｉの標的配列は、ＡＤＡＭＴＳ−８コード配列に基づいて選択された２１量体配列断片である。各標的配列の５’末端は、ジヌクレオチド「ＮＡ」を含み、配列中「Ｎ」は任意の塩基でよく、「Ａ」はアデニンを表す。残りの１９量体配列は、３５％から５５％の間のＧＣ含量を有する。加えて、残りの１９量体配列は、４塩基連続したＡまたはＴ（すなわち、ＡＡＡＡまたはＴＴＴＴ）、３塩基連続したＧまたはＣ（すなわち、ＧＧＧまたはＣＣＣ）または７つ一列の「ＧＣ」を含有しない。
【００８９】
ＲＮＡｉ標的配列設計には、追加の規準も含めることができる。例えば、残りの１９量体配列のＧＣ含量を４５％から５５％までの間に限定することができる。さらに、３塩基連続した同一の塩基（すなわち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、またはＡＡＡ）、または５塩基以上のパリンドローム配列を有するいかなる１９量体配列も除外することができる。さらに、残りの１９量体配列は、他の遺伝子に対して低い配列相同性を有するように選択することができる。一例では、仮想的標的配列を、ＢＬＡＳＴＮによって、ＮＣＢＩのヒトＵｎｉＧｅｎｅクラスター配列データベースに対して検索する。ヒトＵｎｉＧｅｎｅデータベースは、遺伝子指向クラスターの重複のないセットを含有している。各ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは特有の遺伝子を表す配列を含んでいる。ＢＬＡＳＴＮ検索によって他のヒト遺伝子にヒットしない１９量体配列を選択することができる。検索中には、ｅ値を最も厳密な値（「１」など）に設定することができる。
【００９０】
多数の方法を用いて、本発明のｓｉＲＮＡ配列の有効性を評価することができる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ−８を発現する細胞に、本発明のｓｉＲＮＡ配列を導入することができる。細胞内のＡＤＡＭＴＳ−８ポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルを検出することができる。ｓｉＲＮＡ配列を導入した後に、ＡＤＡＭＴＳ−８の発現レベルが低下すれば、それは、導入されたｓｉＲＮＡ配列が、ＲＮＡ干渉を誘導するのに効果的であることを示す。
【００９１】
他の遺伝子の発現レベルも、ｓｉＲＮＡ配列を導入した前後にモニターすることができる。ＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子の発現に対して阻害作用を有するが、他の遺伝子にはもたないｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。加えて、ＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子を阻害するために、様々なｓｉＲＮＡ配列を同一の細胞に導入することができる。
【００９２】
（ＶＩ．疾患治療）
本発明は、プロテアーゼ関連の疾患を処理するための、ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子の使用に関する。ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子には、ＡＤＡＭＴＳ−８抗体、ＡＤＡＭＴＳ−８阻害物質、ＡＤＡＭＴＳ−８アンチセンスまたはＲＮＡｉ配列、およびＡＤＡＭＴＳ−８アンチセンスまたはＲＮＡｉ配列をコードまたは含有するベクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明で治療可能なプロテアーゼ関連の疾患には、癌、炎症性関節病、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、敗血症性関節炎、歯周疾患、角膜潰瘍形成、蛋白尿、アテローム硬化斑裂創に由来する冠動脈血栓、動脈瘤性大動脈疾患、炎症性腸疾患、クローン病、肺気腫、成人型呼吸窮促迫症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、脳および造血器悪性腫瘍、骨粗鬆症、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、ハンチントン病、多発性硬化症、眼血管新生、黄斑変性症、大動脈瘤性心筋梗塞、自己免疫異常、外傷性関節損傷に続く変形性軟骨減失、頭部外傷、ジストロフィー型表皮水疱症、脊髄損傷、急性および慢性神経変性疾患、骨減少症、顎関節病、神経の脱髄性疾患、臓器移植の毒性および拒絶反応、悪液質、過敏症、組織潰瘍形成、再狭窄、ならびに、細胞外マトリックスタンパク質またはプロテオグリカン分子の異常な分解を特徴とする他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
治療には、治療上の処置、および予防または防止上の処置の両方が含まれうる。治療を必要とするものには、特定の医学的障害を既に有する個体、および最終的に障害を得る可能性のある個体が含まれる。多くの例で、望ましい治療は、疾患の臨床的症状を予防するため、あるいは寛解させるために、ＡＤＡＭＴＳ−８のタンパク質分解活性または遺伝子発現を調節するものである。ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ−８とそのプロテオグリカン基質との相互作用を阻止すること、ＡＤＡＭＴＳ−８の触活性を低減または消失させること、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子の転写または翻訳を低減または消失させることによって機能しうる。
【００９４】
一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子（例えば、抗体か阻害剤類）を医薬組成物中に入れてヒトまたは動物に投与する。医薬組成物は、通常、薬学的に許容される担体と、治療有効量のＡＤＡＭＴＳ−８調節因子とを含む。薬学的に許容される担体の例には、薬事規制に適合した溶媒、溶解補助剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、塩基、緩衝剤、潤滑剤、徐放性媒体、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、分散媒、剤皮、抗菌薬または抗真菌薬、等張剤、吸収遅延剤および同様のものが含まれる。薬学的作用物質用の担体および薬剤の使用は当技術分野で周知のものである。補助薬も組成物中に組み入れることができる。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、意図されている投与経路に適合するように処方することができる。投与経路の例には、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、直腸、経粘膜、局所、および全身投与が含まれる。一例では、インプラントを用いることによって投与を行う。
【００９６】
一実施形態では、非経口、皮内、または、皮下適用に使用される溶液または懸濁液が、以下の成分、すなわち、水、塩性水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラオキシ安息香酸エステルなどの抗菌薬；アスコルビン酸または硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤；および、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの張度調節剤を含有する。医薬組成物のｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。一例では、非経口製剤を、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多用量バイアルに封入する。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、その中に含まれるＡＤＡＭＴＳ−８調節因子が、標的ＡＤＡＭＴＳ−８活性または発現を低減または消失させるのに十分な量となるようにして、患者または動物に投与することができる。ＡＤＡＭＴＳ−８抗体または阻害物質の適切な治療用量は、５ｍｇから１００ｍｇまで、１５ｍｇから８５ｍｇまで、３０ｍｇから７０ｍｇまで、または４０ｍｇから６０ｍｇまでの範囲でありうるが、これらに限定されない。５ｍｇ未満または１００ｍｇ超の用量も使用できる。ＡＤＡＭＴＳ−８抗体または阻害物質の投与は、単回投与で行うことも、複数回投与で行うこともできる。投与は、１日１回、毎週１回、毎月１回の間隔で行うことができるが、これらに限定されない。ＡＤＡＭＴＳ−８抗体または阻害物質を投与する投与計画は、例えば、標的に対する抗体／阻害物質の親和性、抗体／阻害物質の半減期、および患者の状態の重篤度に基づいて調整することができる。一実施形態では、抗体または阻害物質の循環レベルを最大にするために、大量瞬時投与で投与する。別の実施形態では、大量瞬時投与の後に、持続注入を用いる。
【００９８】
細胞培養または実験動物モデルにおける標準的な薬学的手順によって、ＡＤＡＭＴＳ−８調節因子の毒性および治療効率を測定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療上有効である用量）を測定することができる。毒性効果をもつ用量と、治療効果をもつ用量との比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比率として計算できる。一例では、大きな治療係数を示す調節因子を選択する。
【００９９】
細胞培養アッセイまたは動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための用量の範囲を処方するのに使用できる。多くの場合、そのような化合物または調節因子の用量は、毒性をまったく伴わないか、あるいはほとんど伴わず、その循環濃度がＥＤ５０を示す範囲内にある。用量は、使用する剤形および投与経路によって、この範囲内で変化してもよい。本発明に従って使用されるいかなる調節因子の治療有効量も、最初に、細胞培養アッセイまたは動物モデルから推算することができる。一実施形態では、動物モデルにおいて、細胞培養アッセイで決定されたＩＣ５０（すなわち、症候の阻害が最大限度の半分に達する試験阻害物質の濃度）を示す血漿中循環濃度の範囲になるように、用量を処方することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。いかなる特定の用量の影響も、適当なバイオアッセイによってモニターすることができる。バイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＧＤＦタンパク質／受容体結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づいたアッセイ、脂肪細胞のグルコース摂取に基づいたアッセイ、および免疫学的アッセイが含まれる。
【０１００】
症状の部位、疾患の重度、患者の年齢、性別、および食餌、任意の炎症の重度、投与時間、ならびに他の臨床因子などの様々な因子に基づいて、主治医が、本発明の医薬組成物を投与する投与計画を決定することができる。特定の実施形態では、全身投与または注射投与を、最小限度に効果的な用量で開始し、予め選択されたタイムコースで、明白な効果が観測されるまで、用量を増大させるであろう。次に、生じうるいかなる有害事象にも配慮しながら、用量を徐々に増大させるであろう。これによって、対応する効果の増大を生み出すレベルに限定する。最終組成物への、他の既知因子の添加も、用量に影響を与えうる。
【０１０１】
本発明は、アグリカンまたは他のプロテオグリカンの異常蓄積によって引き起こされるか、あるいはそれらに関連した疾患の治療も企図する。一実施形態では、この治療は、そのような疾患を患うヒトまたは動物に、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはその機能的誘導体を含む医薬組成物を投与することを含む。別の実施形態では、プロテオグリカンの異常蓄積を修正するのに、ベクターベースの治療を用いる。これらの治療は、通常、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質またはその機能的誘導体をコードする発現ベクターまたは遺伝子デリバリーベクターを、それらを必要とするヒトまたは動物に導入することを含む。
【０１０２】
上述の実施形態および下記の実施例は、限定ではなく、例示を目的としていることを理解するべきである。本明細書の説明から、本発明の範囲内にある様々な変更および改変が当業者には明らかであろう。
（実施例１）
【０１０３】
（系統樹の作成）
系統樹を作成するために、以下のヒトＡＤＡＭＴＳファミリーメンバータンパク質を収集した。すなわち、ＡＤＡＭＴＳ−１／ＡＢ０３７７６７、ＡＤＡＭＴＳ−２／ＡＪ００３１２５（系統樹に使用した配列と比較して、公表されている配列は以下の変化を有していた：Ｗ６４３Ｃ、Ｐ１００１Ｌ、およびＳ１０８９Ｃ）、ＡＤＡＭＴＳ−３／ＡＦ２４７６６８、ＡＤＡＭＴＳ−４／ＡＦ１４８２１３、ＡＤＡＭＴＳ−５／ＡＦ１４２０９９、ＡＤＡＭＴＳ−６／米国特許出願公開第２００２０１２０１１３号の「配列番号２」、ＡＤＡＭＴＳ−７／ＡＦ１４０６７５、ＡＤＡＭＴＳ−８／ＡＦ０６０１５３（系統樹に使用した配列と比較して、公表されている配列は以下の変化を有していた：Ｌ１１Ｐ、Ｆ１３Ｌ、Ｌ２１Ｐ、Ｐ２３Δ、Ｌ２４Δ、およびＬ１２９Ｑ、ここで、Δは欠失を意味する）、ＡＤＡＭＴＳ−９／ＡＦ２６１９１８（系統樹に使用した配列と比較して、公表されている配列は以下の変化を有していた：Ｇ４６ＳおよびＳ９６Ｔ）、ＡＤＡＭＴＳ−１０／国際公開第ＷＯ０２／６０９４２号の「配列番号９」（系統樹に使用した配列と比較して、公表されている配列は以下の変化を有していた：Ｖ２６７Ｉ）、ＡＤＡＭＴＳ−１２／ＡＪ２５０７２５、ＡＤＡＭＴＳ−１３／ＡＪ３０５３１４、ＡＤＡＭＴＳ−１４／ＡＦ３５８６６６（系統樹に使用した配列と比較して、公表されている配列は以下の変化を有していた：Ｌ９３７Ｍ）、ＡＤＡＭＴＳ−１５／ＡＪ３１５７３３、ＡＤＡＭＴＳ−１６／国際公開第ＷＯ０２／３１１６３号の「配列番号４」、ＡＤＡＭＴＳ−１７／ＡＪ３１５７３５（系統樹に使用した配列と比較して、公表されている配列は以下の変化を有していた：アミノ酸配列７１３ＡＬＫＤ７１６がアミノ酸配列７１３ＧＹＩＥＡＡＶＩＰＡＧＡＲＲＩＲＶＶＥＤＫＰＡＨＳＦＬＡＬＫＤ７４３（配列番号１）で置換されていた）、ＡＤＡＭＴＳ−１８／ＡＪ３１１９０３、ＡＤＡＭＴＳ−１９／ＡＪ３１１９０４、およびＡＤＡＭＴＳ−２０／国際公開第ＷＯ０１／８３７８２号の「配列番号５７」である。１９のタンパク質配列ファイルを単一の多配列ＦＡＳＴＡファイルにつなぎ合わせ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ１．８１（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのウェブサイトを参照）の入力として使用し、ＩＲＩＸ６４上で動作させた。ＣＬＵＳＴＡＬＷはデフォルト設定で動作させた。この結果得られた．ｄｎｄツリーファイルをＴＲＥＥＶＩＥＷ１．６．６（Ｐａｇｅ、ＣＯＭＰＵＴ．ＡＰＰＬ．ＢＩＯＳＣＩ．、１２：３５７−３５８（１９９６年）；および、ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ／ｒｏｄ／ｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌのウェブサイト）の入力として使用して、系統樹を生成した。
【０１０４】
ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーの系統樹を図１に示す。この系統樹は、配列の関連性に基づいてタンパク質を分類している。プログラムによって一緒に分類されたＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーを、特徴付けされているＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーの既知な機能情報と比較した。例えば、ＡＤＡＭＴＳ−２、３、および１４は、プロコラーゲンプロセシング酵素であると予測される。これらのファミリーメンバーは、相互の配列相同性が最も類似しており、系統樹上で独特のクラスターを形成する。別の事例では、ＡＤＡＭＴＳ−１３における変異が、ｖＷＦプロセシングの欠損を引き起こし、その結果、血栓性血小板減少性紫斑症となることが示された。このファミリーメンバーは、系統樹上でそれ自体のみからなるノードを形成する。加えて、ＡＤＡＭＴＳ−１、４、５および９は、アグリカンを異なった効率で切断することが示された。配列相同性の分析によって、これらのアグリカン分解性ＡＤＡＭＴＳすべてと、ＡＤＡＭＴＳ−８、１５、および２０を含有するクラスターの存在が実証された。これは、ＡＤＡＭＴＳ−８もアグリカン切断活性を有する可能性があることを示唆する。次に、ＡＤＡＭＴＳ−８がアグリカンを切断する能力を有するかどうか決定するために、ＡＤＡＭＴＳ−８をクローニングし、発現させ、精製した。
【０１０５】
これまで、少なくとも１９のＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーが同定されている。これらのＡＤＡＭＴＳタンパク質のうち、機能が特定されているのは半分未満であり、少なくとも１０メンバーが、機能が未知のまま残っている。ファミリーメンバー相互の配列類似性に基づいた系統樹（図１）の構築によって、類似の機能を有する（例えば、実証済みのアグリカン分解活性またはプロコラーゲンプロセシング活性）ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーが一緒に分類されたことが観察された。これは、系統樹における推定上の「アグリカン分解性」ノードの他のメンバーが有意なアグレカナーゼ活性を有するかもしれないこと、そして、ＡＤＡＭＴＳ−４またはＡＤＡＭＴＳ−５よりも大きな、変形性関節炎との疾患関連性を示しうることを示唆した。以下の実施例で実証されるように、「アグリカン分解性」ノードの別のメンバーであるＡＤＡＭＴＳ−８は、変形性関節炎に関連したＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合で、アグリカンを切断することができ、したがって、このタンパク質では、配列相同性によって予測された構造／機能関連性が妥当している。
（実施例２）
【０１０６】
（ＡＤＡＭＴＳ−８発現ベクターの構築）
ＡＤＡＭＴＳ−８のＤＮＡ配列は、上記のＶａｚｑｕｅｚらによってＧｅｎＢａｎｋに寄託されている（受託番号ＡＦ０６０１５３）。遺伝子を単離するため、ＡＤＡＭＴＳ−８のオープンリーディングフレームにまたがる４セットのオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。
【０１０７】
第１のプライマー対には、ＡＴＧＴＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＧＴＧ（配列番号２）、およびＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣＴ（配列番号３）が含まれる。第２のプライマー対には、ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＧＧＣ（配列番号４）、およびＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＡＴＡＣＡＴＧＧＣＧＣＴ（配列番号５）が含まれる。第３のプライマー対には、ＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡ（配列番号６）、およびＡＣＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＣＴＣ（配列番号７）が含まれる。第４のプライマー対には、ＣＡＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＡＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＧ（配列番号８）、およびＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣ（配列番号９）が含まれる。
【０１０８】
製造会社の指示に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ社販売のＧＣキットを使用し、成体肺ｃＤＮＡライブラリー上でＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物の増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００で行った。５０μｌのＰＣＲ反応液を、１分間のプレインキュベーション工程で９５℃まで加熱し、その直後に、９５℃でのインキュベーション１５秒と、それに続く６８℃でのインキュベーション２分間からなるサイクルを２５サイクル行った。この結果得られたＰＣＲ産物を精製し、適当な制限酵素（それぞれＥｃｏＲ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ／Ａｆｌ  ＩＩＩ、Ａｆｌ  ＩＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉ）で消化し、ＣＨＯ発現ベクターｐＨＴｏｐ（ｐＥＤの誘導体）中に併せて連結した。ＰＣＲインサートは、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。
【０１０９】
ＡＤＡＭＴＳ−８発現コンストラクトを、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）配列（ＩＢＡ社）の付加によって修飾した。このタグは、５アミノ酸のリンカー（ＧＳＧＳＡ（配列番号１０））をコードする３’伸長と、それに続く、８アミノ酸のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１１））をコードする追加配列とを有するＰＣＲプライマーを用いて付加した。これらの１３アミノ酸を、ＡＤＡＭＴＳ−８オープンリーディングフレームの最終アミノ酸へのＣ末端翻訳融合物として付加した。このＰＣＲプライマー対は、順方向プライマーであるＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＡＣＧＧＡＧＡＣ（配列番号１２）、および逆方向プライマーであるＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＡ（配列番号１３）からなっていた。ＰＣＲ産物の増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００で行った。ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用し、反応条件は製造会社の指示に従った。最初に、ＰＣＲ反応物を９４℃まで２分間加熱し、それに続いて、９４℃で１５秒／７０℃で２分間のサイクルを２５サイクル行った。最終サイクルの後に、ＰＣＲ反応物を７２℃に５分間維持した。ＰＣＲ産物を精製し、適当な制限酵素（Ｂｇｌ  ＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉ）で消化し、適切なＡＤＡＭＴＳ−８断片を共にｐＨＴｏｐ発現ベクター中に連結させた。
【０１１０】
ＡＦ０６０１５３をクローニングされた配列と比較した際に、数アミノ酸の変異が同定された。観察された変化は、シグナルペプチドとプロドメインとに限定されていた。ＡＤＡＭＴＳ−８単離体のシグナル配列における変異のうち２つは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列登録（受託番号ＡＡＢ７４９４６）にも見出された。ＡＤＡＭＴＳ−８単離体で観察された、対立遺伝子変異によるものと特定できなかった変化（例えば、Ｆ１３およびＦ１４の欠失、ならびにＬ１２９Ｑ）によって、２５アミノ酸のシグナルペプチドと、プロドメイン中の単一アミノ酸変化とが生じた。これらの変化は、それらの位置のおかげで、成熟タンパク質の発現にも、活性にも影響を与えなかった。それらは、発現コンストラクト中にそのまま変えずに残した。このタンパク質の成熟部分の予測タンパク質配列は、ＡＦ０６０１５３と同一であった。
（実施例３）
【０１１１】
（ＡＤＡＭＴＳ−８発現用のＣＨＯ細胞系の確立）
ＡＤＡＭＴＳ−８を発現する安定細胞系を確立するのに、ＣＨＯ／Ａ２細胞を用いた。ＣＨＯ／Ａ２細胞系は、ＴｅｔレプレッサーとヘルペスウイルスのＶＰ１６転写ドメインとからなる融合タンパク質である転写活性化因子ｔＴＡの安定した組み込みによって、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ  Ｂ１１から得た。ＡＤＡＭＴＳ−８／ｐＨＴｏｐ発現ベクターは、ＡＤＡＭＴＳ−８配列の上流に６つのｔｅｔオペレーターリピートを含有している。ｐＨＴｏｐ中のＴｅｔオペレータにｔＴＡが結合することによって、下流遺伝子の転写が活性化される。ジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする遺伝子も、ｐＨＴｏｐ発現ベクター中に含有されており、それによって、メトトレキセート耐性による安定形質変換体の選択が可能となっている。製造会社が推奨するリポフェクション（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製のリポフェクチン）用プロトコールを用いて、ｐＨＴｏｐ／ＡＤＡＭＴＳ−８  ＤＮＡでＣＨＯ／Ａ２細胞に形質移入することによって、細胞外ＡＤＡＭＴＳ−８を発現するＣＨＯ細胞系を確立した。クローンは０．０２μＭメトトレキサート中で選択した。ＣＨＯ培養上清中のＡＤＡＭＴＳ−８抗原をモニターすることによって、ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質を最も高いレベルで発現している細胞系を選択した。ＡＤＡＭＴＳ−８抗原のモニターは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に結合した抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ抗体を用いたウエスタンブロットと、それに続く、ＥＣＬ化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびオートラジオグラフィーとによって行った。
（実施例４）
【０１１２】
（ＡＤＡＭＴＳ−８の精製）
ＡＤＡＭＴＳ−８を発現する安定ＣＨＯ細胞系の培養上清（３００ｍｌ）を収集し、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）フィルターを装着したｓｔｉｒ  ｃｅｌｌ（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いた限外濾過によって、３倍に（１０ｍｌ）濃縮した。いかなる混入ビオチンも除去するために、Ｓｉｇｍａ社のビーズ状架橋６％アガロース（１ｍｌ）に固定されたアビジンを、濃縮された培養上清と４℃で１時間混合した。これに続く遠心分離によって上清を回収し、１ｍｌのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ社）中に添加した。１ｍｌアリコートの緩衝液Ｗ（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）でカラムを５回洗浄し、２．５ｍＭデスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ社）を含有する緩衝剤Ｗで、結合していたタンパク質を、ラムから溶出させた。濃縮培養上清、カラムフロースルー、洗浄液、および溶出分画のアリコートを、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（図２Ａ）と、それに続く、抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩポリクローナル抗血清（ＩＢＡ社）およびオートラジオグラフィーによるＥＣＬ検出を用いたウエスタン分析（図２Ｂ）とによって分析した。
【０１１３】
図２Ａは、ＣＨＯ培養上清から得たＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ精製によって得られたタンパク質画分の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを図示する。このＳＤＳ−ＰＡＧＥはクーマシーブリリアントブルーで染色した。レーン１はＣＨＯ細胞培養上清を示す。レーン２は、限外濾過で得られたフロースルー画分（濾過液）を示す。レーン３は、濃縮された限外濾過残留画分である。レーン４は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラムのフロースルー画分を表す。レーン５〜９は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラムの洗浄画分である。レーン１０〜１５は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラムの溶出画分を示す。
【０１１４】
図２Ｂは、図２ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの対応するウエスタンブロットを示す。このウエスタン分析では、抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩポリクローナル抗血清（ＩＢＡ社）を用いた。
【０１１５】
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含有する、プロセシングされていないＡＤＡＭＴＳ−８およびフューリンでプロセシングされたＡＤＡＭＴＳ−８の予測分子量は、グリコシル化による移動度の変化を考慮しない場合、それぞれ９５ｋＤａおよび７５ｋＤａである。精製の主要産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、見かけの分子量１１０ｋＤａおよび９５ｋＤａで移動し（図２Ａ、レーン１２）、ウエスタンブロット上でＳｔｒｅｐ−ｔａｇ抗体に結合した（図２Ｂ、レーン１２）２本のバンドであった。ＣＨＯ／Ａ２細胞で、可溶性のＰＡＣＥ（フューリンすなわち対塩基性アミノ酸切断酵素（ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ））をＡＤＡＭＴＳ−８発現コンストラクトと同時発現させたところ、１１０ｋＤａのプロＡＤＡＭＴＳ−８バンドが消失し、それに伴って、９５ｋＤａバンドの量が増大した。これは、１１０ｋＤａバンドが分泌されたプロＡＤＡＭＴＳ−８を表すものであったことを示唆する。成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質には、５箇所の推定Ｎ−結合型グリコシル化部位があり、これらは、成熟ＡＤＡＭＴＳ−８の見かけの分子量が、予測されている７５ｋＤａから、観測された９５ｋＤａに増加していることを説明するものである。精製タンパク質画分のウエスタン分析は、完全長タンパク質の優勢を示し、分子量の低下した免疫反応性バンドは小さな部分でしかなかった（図２Ｂのレーン１２）。これらの少量産物は、成熟ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の分解または自己触媒の結果でありうる。プロＡＤＡＭＴＳ−８およびプロセシングされた成熟ＡＤＡＭＴＳ−８を両方とも含有する溶出画分を、これに続く活性分析に用いた。
【０１１６】
この例では、完全長ＡＤＡＭＴＳ−８ｃＤＮＡにカルボキシ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇをコードする配列を追加して、ＣＨＯ細胞で発現させた。タンパク質は効率的に発現され、培養上清中に分泌された。完全長タンパク質は、培養上清中に蓄積され、さらに小さい産物にはタンパク分解されなかった。この観察は、カルボキシ末端タグが保持されていることによって支持された。カルボキシ末端タグの保持は、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ抗体を用いたウエスタンブロットによって判定されそれらに、これらのタンパク質の大部分がＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂に結合できることによって確認された。対照的に、比較に用いられた組換え体ＡＤＡＭＴＳ−４は、Ｃ末端側ドメイン内の部位で自発的にタンパク分解され、それによって、スペーサードメインをもたない末端切除分子を産生した。Ｅ３６２Ｑ活性部位変異によって触媒活性が破壊されている改変型ＡＤＡＭＴＳ４は、この自発的のＣ末端切除を示さなかった（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、Ｊ．ＢＩＯ．ＣＨＥＭ．、２７７：４２７７５−４２７８０（２００２年））ので、ＡＤＡＭＴＳ−４の末端切除は、自己タンパク質分解イベントのようである。加えて、組換え体ＡＤＡＭＴＳ−５（アグレカナーゼ−２）は、そのＣ末端を自己切断することができる。組換え体ＡＤＡＭＴＳ−１２も、特徴的な２次Ｃ末端タンパク質分解を示す（Ｃａｌら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．、２７６：１７９３２−１７９４０（２００１年））。但し、出版された報告からは、これが自己タンパク質分解イベントであるのか、あるいは他のプロテアーゼによって媒介されたものであるのか明らかでない。さらに、報告によれば、２９３Ｔ細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−１の発現によって、このタンパク質の３つの型、すなわち、プロＡＤＡＭＴＳ−１を表すｐ１１０型、完全長成熟ＡＤＡＭＴＳ−１と推定されているｐ８７型、および、スペーサードメイン内でＣ末端切除された成熟ＡＤＡＭＴＳ−１を構成するｐ６５型が生じる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ−Ｍａｎｚａｎｅｑｕｅら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．、２７５：３３４７１−３３４７９（２０００年））。ＡＤＡＭＴＳ−４での観察と一致して、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性部位突然変異体はＣ末端切除を行わなかった。これは、自己タンパク質分解機構がＣ末端ドメイン除去の原因であることを示唆する。
【０１１７】
これらのデータに基づくと、この例で単離された組換え体ＡＤＡＭＴＳ−８のほとんどがＣ末端ドメインを保持し、自己タンパク質分解も、別のプロテアーゼによる切断もされていないようであったことは、驚くべきことであった。この組換え体ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質のタンパク質分解活性は、α−２マクログロブリン結合アッセイを用いて確認した。したがって、ＡＤＡＭＴＳ−８のカルボキシ末端トロンボスポンジンドメインおよびスペーサードメインは、それ自身の触媒活性または他のプロセシング酵素による２次プロセシングに対して類になく強い抵抗性を有し、それ故に、安定した完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質の触媒効率を評価する独特の機会を提供する。
（実施例５）
【０１１８】
（関節軟骨からのＲＮＡの分離）
非骨関節炎のヒト関節軟骨は、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ社（Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）から入手し、骨関節炎のヒト関節軟骨は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂａｐｔｉｓｔ病院（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。試料は、収集時に液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。ＲＮＡの単離には、液体窒素下、１５ＨｚのＳｐｅｘ  Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ冷凍製粉機（６７５０型）で、１グラムの冷凍関節軟骨を細かく２回粉砕した（各１分間、それぞれの粉砕の間に２分間の冷却工程を置いた）。その後、ＭｃＫｅｎｎａら、ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２８６：８０−８５（２０００年）の方法に従い、以下の改変を用いて、ＲＮＡを単離した。粉砕された軟骨を、２．５μｌの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含有する４Ｍ氷冷グアニジウムイソチオシアン酸塩（ＧＩＴＣ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）４ｍＬに懸濁した。直ちに、最高速度のＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ社）を用いて、氷上で、１分間、懸濁液をホモジナイズした。ホモジナイズされた軟骨溶解物を１５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を保存し、この結果得られたペレットは、もう一度再び、前と同様に４ｍｌのＧＩＴＣ／２−ＭＥ中で均質化ホモジナイズし、再度、１５００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。各ホモジネートから得られた上清画分を併せ、プールした上清画分に２５％トリトンＸ１００（Ｓｉｇｍａ社販売の１００％原液を無ＲＮアーゼｄＨ２０で２５％に希釈した）０．６５ｍｌを添加した。氷上で１５分間インキュベートした後、無ＲＮアーゼの３Ｍ  ＮａＯＡｃ緩衝液ｐＨ５．５（Ａｍｂｉｏｎ社）８ｍｌを添加し、この溶液を氷上でさらに１５分間インキュベートした。その後、酸性フェノール：クロロホルム５：１、ｐＨ４．５（Ａｍｂｉｏｎ）１５ｍｌを用い、激しく１分間混合し、氷上で１５分間インキュベートし、１５０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、ホモジネートの抽出を行った。その後、水相を回収し、上述の同じ手順を用いて、酸性フェノール：クロロホルムで再抽出した。２回目の酸性フェノール：クロロホルム抽出で得られた水相に、フェノール：クロロホルム：ＩＡＡ２５：２４：１、ｐＨ６．７／８．０（Ａｍｂｉｏｎ社）１５ｍｌで３回目の抽出を行った。すなわち、激しく１分間混合し、氷上で１５分間インキュベートし、１５０００×ｇ、４℃で、２０分間遠心した。水相を回収し、１００％  ２−プロパノール０．８容量を添加した。溶液を混合し、氷上で５分間インキュベートし、１５０００×ｇ、４℃で、３０分間遠心した。この結果得られた上清をデカンテーションによって慎重に除去し、緩衝液ＲＬＴ＋２−ＭＥ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＲＮｅａｓｙキット）０．９ｍｌにペレットを再懸濁した。その後、この工程以降、完了まで、上記のＭｃＫｅｎｎａらによって記載されたプロトコールに従った。
（実施例６）
【０１１９】
（ＡＤＡＭＴＳ−８の生体内分布）
ヒト多組織発現アレイ（ＭＴＥ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）ｍＲＮＡドットブロットを３９３ｂｐのＡＤＡＭＴＳ−８断片でプロービングした。このＡＤＡＭＴＳ−８断片は、ＡＤＡＭＴＳ−８配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０１５３）の塩基対２４６３から塩基対２０７０までに相当するＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片であった。この断片は、ジスインテグリンドメインの一部と、中央ＴＳＰ１型モチーフの一部を含有している。この断片の配列をクエリーとして用いて、ＮＣＢＩの基礎的局所アラインメント検索ツール、バージョン２（ＮＣＢＩ−ＢｌａｓｔＮ）を用いたＧｅｎＢａｎｋの検索を行った。ＢｌａｓｔＮ検索は、データベースの他のヒト転写産物と、ＡＤＡＭＴＳ−８プローブ配列との間にいかなる有意の相同性も見出さなかった。これは、このプローブ断片が、ＭＴＥハイブリダイゼーション条件下で、他のヒト転写産物と交差反応しないであろうことを示唆する。
【０１２０】
ＡＤＡＭＴＳ−８プローブ断片を精製し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（−ｄＣＴＰ）を製造業者の指示に従って使用して放射性標識した。Ｎｉｃｋカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を製造業者の指示に従って使用して、プライマーおよび取りこまれなかった放射性ヌクレオチドから、放射性標識された断片を精製し、その後、ＭＴＥのプロービングに用いた。ＭＴＥのハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄の条件は、放射性標識されたｃＤＮＡプローブ用に、製造会社が提唱する条件に従った（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＭＴＥ  Ａｒｒａｙ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ）。
【０１２１】
図３Ａは、７６の様々なヒト組織からのｍＲＮＡを用いたＭＴＥハイブリダイゼーション分析の結果を示す。様々な組織からのｍＲＮＡの配置を示す符号を図３Ｂに示す。空白の欄は、それらの座標にｍＲＮＡがスポットされなかったことを示す。ＭＴＥハイブリダイゼーション分析は、ＡＤＡＭＴＳ−８の生体内分布が、アグリカン分解性のＡＤＡＭＴＳ−１およびＡＤＡＭＴＳ−４転写産物よりも狭く、総合的な転写産物存在量が少ないことを示す。ＡＤＡＭＴＳ−１およびＡＤＡＭＴＳ−４転写産物は、広い生体内分布を有する。最も高いレベルのＡＤＡＭＴＳ−８発現を示した組織の１つは、成体肺（図３、Ａ行８列）であり、それより低レベルの発現が胎児肺（図３、Ｇ行１１列）で見出された。成体心臓（図３、列４）での発現は検出可能であったが、高い発現レベルを示した大動脈（図３、Ｂ行４列）を除けば低レベルであった。胎性心臓（図３、Ｂ行１１列）は、中程度の転写産物存在量を示した。また、脳、虫垂、および膀胱の様々な小区分で、中程度から低レベルの発現が見られた（例えば、Ｇ５、Ａ１〜Ｇ１、Ｃ３〜Ｈ３、およびＢ３）。様々な癌細胞系（図３、１０列）が、低レベルまたは検出不能なレベルの発現を示した。
（実施例７）
【０１２２】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲを行うことによって、ヒト関節軟骨における組織発現を明らかにした。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムを用いて、以下のＡＤＡＭＴＳ−８プライマーおよびプローブ、すなわち、５ＰプライマーＧＧＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴ（配列番号１４）、３ＰプライマーＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴ（配列番号１５）、およびプローブＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡ（配列番号１６）を設計した。ＡＤＡＭＴＳ−８用のプローブは、エキソン／イントロン境界とオーバーラップしており、ゲノムＤＮＡにはハイブリッド形成できないようにした。ＧＡＰＤＨへのプライマーおよびプローブを設計した。それらは以下の通り、すなわち、５ＰプライマーＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ（配列番号１７）、３ＰプライマーＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡ（配列番号１８）、およびプローブＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ（配列番号１９）であった。ＴａｑＭａｎプローブ（Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｒｏｕｐ社よって合成された）は、５Ｐ−レポーター色素６−ＦＡＭおよび３Ｐ−クエンチャーＴＡＭＲＡを含有していた。
【０１２３】
変形性関節炎を患っていない患者（無疾患）の膝関節、ならびに、変形性関節炎を患っている患者の膝関節における、中程度の病変領域、および重度の病変領域から関節軟骨ＲＮＡは単離した。精製された関節軟骨ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、その後、以下のプロトコールに従ってリアルタイムＰＣＲを行い、ｍＲＮＡを逆転写した後に、無疾患の第１ｃＤＮＡ鎖、および骨関節炎の関節軟骨の第１ｃＤＮＡ鎖のＴａｑＭａｎ分析を行った。ファージＴ７プロモーター部位と２４塩基のポリＴテール（ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２０））とを含有するプライマー２００ｐｍｏｌと共に全ＲＮＡ（５μｇ）を７０℃で１０分間インキュベートした。その後、１０単位／μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、２０μｌの反応混合物中、５０℃で１時間、ＲＮＡの逆転写を行った。反応混合物は、０．２５μｇ／μｌの全ＲＮＡ、１０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｔ７Ｔ２４プライマー、１×１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１単位／μｌ  ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ社）を含有していた。第１鎖の合成に続いて、第２鎖の合成を行った。反応混合物の最終容量を１５０μｌにした。この反応物は、第１鎖混合物と、以下の試薬（最終濃度）−すなわち、１×２ｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、０．０６７単位／μｌ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、０．２７単位／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および０．０１３単位／μｌ  ＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを含有していた。第２鎖合成反応物を１６℃で２時間インキュベートした。インキュベーションにおける最後の５分間に、最終濃度０．０６７単位／μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した。インキュベーションの後、反応物のＥＤＴＡ濃度を１６．６７ｍＭにし、結果として得られたｃＤＮＡを、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＢｉｏＭａｇ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄビーズを用いて精製した。第２鎖反応混合物を、１０％ＰＥＧ−８０００／１．２５Ｍ  ＮａＣｌにし、これをＢｉｏＭａｇビーズ（予め０．５Ｍ  ＥＤＴＡで洗浄しておく）１０μｌに添加した。ｃＤＮＡと、洗浄済みのＢｉｏＭａｇビーズを混合し、室温で１０分間インキュベートした。ＧｉｂｃｏＢＲＬ社のＭａｇｎａ−Ｓｅｐ磁石の補助を用い、３００μｌの７０％エタノールで２回このビーズを洗浄した。最後の洗浄の後、ビーズを室温で２分間空気乾燥させた。１０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．８）を用いて、精製されたｃＤＮＡをビーズから溶出させた。溶出液を希釈したアリコートの２８０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて測定することによって、溶出されたｃＤＮＡを定量化した。１００ｎｇの関節軟骨ｃＤＮＡを使用し、デュプリケートで、ＡＤＡＭＴＳ−８プローブ／プライマーセットの各ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応を行った。ＧＡＰＤＨプローブ／プライマーセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、組織間の発現レベルを正規化した。反応成分は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘから、製造会社の指示に従って調製され、プライマーの最終濃度は９００ｎｍｏｌ／μｌ、プローブの最終濃度は２５０ｎｍｏｌ／μｌであった。反応物を５０℃で２分間、その後、９５℃で１０分間インキュベートし、その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクルを４０サイクル行った。最終サイクルの後に、反応物を２５℃で２分間維持した。
【０１２４】
図４は、無疾患の軟骨および骨関節炎（ＯＡ）の軟骨のヒト臨床標本における、リアルタイムＰＣＲで測定されたＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡ発現レベルのヒストグラムを示す。試料Ｗ−０４からＷ−１３は、ＯＡを患っていない（「無疾患」）膝関節軟骨を表す。試料７７Ｍ〜９６Ｍは、視覚的に現れていない後期段階ＯＡ関節軟骨（「軽度ＯＡ」）の領域を表す。試料８８Ｓ〜９８Ｓは、重度に影響が現れている後期段階ＯＡ関節軟骨（「重度ＯＡ」）の領域を表す。各試料のＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡ存在量は、ＡＤＡＭＴＳ−８に関して測定された平均データを、ＧＡＰＤＨに関して同一試料で測定された平均データ割ることによって、正規化された値として示されている。ＴａｑＭａｎ分析の結果は、少なくともこの研究で用いられた後期のＯＡ軟骨では、骨関節炎の軟骨と比較して、無疾患の軟骨の平均転写産物レベルに有意差がなかったことを示した。しかし、ＯＡ軟骨試料９６Ｍでは、ＡＤＡＭＴＳ−８の発現レベルが有意に高かった。この観測は、軟骨組織におけるＡＤＡＭＴＳ−８発現が高くなっている選択された患者を治療する、個人化されたアプローチを支持するものである。
（実施例８）
【０１２５】
（モノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１（ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１）の産生）
合成ペプチドＣＧＧＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ（ペプチドａｇｇｃ１、配列番号２１）を担体タンパク質であるＫＬＨに結合させ、この結合体を、標準的なハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体産生用の免疫原として用いた。簡潔には、完全フロイントアジュバント中の免疫原２０μｇをＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射して免疫処置を行った。不完全フロインドアジュバント中のペプチドを用いて、注射を（隔週で）２回反復した。免疫処置されたマウスで、試験採血し、免疫処置に用いたペプチドと、ＡＤＡＭＴＳ−４消化されたウシ関節軟骨アグリカンとの両方に対する血清の反応性をＥＬＩＳＡによって評価した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、同上）。ハイブリドーマ融合の３日前に、最も高い抗体価を示すマウスに、アジュバントを用いない最終免疫処置を施した。このマウスの脾細胞を単離して、ＦＯ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に融合させ、ＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で培養した。ハイブリドーマ培養上清を、ＥＬＩＳＡによってＫＬＨ−ＣＧＧＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ抗原に対して、そして、ウエスタンブロットによってＡＤＡＭＴＳ−４消化されたアグリカンに対してスクリーニングした。限界希釈によって、陽性ハイブリドーマクローンをサブクローニング用に選択した。ＡＧＧ−Ｃ１と命名された単一ハイブリドーマ細胞系を培養で増殖させた。Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（Ｒｏｃｈｅ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて、抗体アイソタイプがＩｇＧ１（κ軽鎖）であると決定し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、１リットルの培地からＩｇＧを精製した。
（実施例９）
【０１２６】
（競合阻害ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１が適切なアグリカンネオエピトープを特異的に認識したことを実証するために競合阻害ＥＬＩＳＡ実験を行った。ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ社Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、Ｎ末端でビオチン化されたペプチドａｇｇｃ１（ｂ−ａｇｇｃ１）を用い、各ウェルをｂ−ａｇｇｃ１（１００ｎｇ／ｍｌ）１００μｌと共に室温で１時間インキュベートすることによってコーティングした。０．０１％トゥイーン−２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−トゥイーン）で４回洗浄した後、ウェルのブロッキングを、室温で１時間、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−トゥイーン１００μｌで行い、それに続いて、４回洗浄した。
【０１２７】
ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１のネオエピトープ特性を評価するため、ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１（０．０４μｇ／ｍｌ）、ならびに、合成ペプチドであるＧＧＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ（配列番号２２）１．０〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌＧＧＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号２３）、および消化されていないアグリカンまたはＡＤＡＭＴＳ−４消化されたアグリカンからなる競合混合物（１００μｌ）を室温で１時間プレインキュベートした。その後、混合物をｂ−ａｇｇｃ１コーティングされたウェルに移した。室温でさらに１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−トゥイーンでプレートを４回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス２次ＩｇＧ（１：１００００）１００μｌと共に室温で１時間インキュベートした。最後にＰＢＳ−トゥイーンで４回洗浄した後、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質のＴＭＢ１成分（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）と共に、ウェルをインキュベートした。０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって発色を終止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を分光光度計でモニターした。
【０１２８】
検量線を作成するために、ＡＤＡＭＴＳ−４（０．００１ｎｇ〜５ｎｇ）を用いて、ウシアグリカン（５０μｌ中に２５μｇ）を３７℃で１６時間消化させた。その後、各消化物にＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１（最終抗体濃度０．０４μｇ／ｍｌ）を添加し、これらの混合物を、室温で１時間プレインキュベートし、その後、これをｂ−ａｇｇｃ１でコーティングされたプレートに移し、ＥＬＩＳＡを完了させた。
【０１２９】
図５は、ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１を用いた競合阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。用量依存的な競合が、合成ペプチドＧＧＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ（配列番号２２、このペプチドのＣ末端はアグリカンコアタンパク質のＥ３７３に対応する）、およびＡＤＡＭＴＳ４消化されたアグリカンで観測された（それぞれ黒塗りの四角および黒塗りの円）。合成ペプチドＧＧＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫ（配列番号２３）および消化されていないアグリカンは、このアッセイで競合しなかった（それぞれ、中空の四角および中空の円）。
【０１３０】
図７は、アグレカナーゼ活性の別の競合阻害ＥＬＩＳＡを示す。検量線は、様々な量の組換え体ＡＤＡＭＴＳ−４と共にウシアグリカンを３７℃で１６時間インキュベートし、それに続いて、各消化物にモノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を添加することによって作成した。類似のアッセイが、ＡＤＡＭＴＳ−８の相対アグレカナーゼ活性を見積もるために行われた。ＡＤＡＭＴＳ−４の０．０１３５ｐＭが拮抗阻害ＥＬＩＳＡにおける４５％の阻害を生成しなければならなかったところでは、ＡＤＡＭＴＳ−８の４６．６±４．８ｐＭは類似の活動水準に達しなければならなかった。
（実施例１０）
【０１３１】
（ＡＤＡＭＴＳ−８消化およびＡＤＡＭＴＳ−４消化されたアグリカンのウエスタンブロッティング）
変形性関節炎に関連したアグレカナーゼ活性を定義する、アグレカナーゼ切断部位（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）でアグリカンを切断するＡＤＡＭＴＳ−８の能力を、２つの異なったモノクローナル抗体、すなわち、ＭＡｂ  ＢＣ−３およびＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１を用いて実証した。ＭＡｂ  ＢＣ−３は、ネオエピトープＮ末端配列３７４ＡＲＧＸＸ．．．（配列番号２４）を特異的に検出する。ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１は、ネオエピトープＣ末端配列．．．ＮＩＴＥＧＥ３７３（配列番号２５）を特異的に検出する。両方のネオエピトープとも、アグリカンの球間ドメイン内におけるＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４ペプチド結合のアグレカナーゼ切断によって生成される。
【０１３２】
図６Ａ〜６Ｃは、ＭＡｂ  ＢＣ−３およびＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−４消化およびＡＤＡＭＴＳ−８消化されたアグリカンのウエスタンブロット分析の結果を示す。図６Ａは、ＭＡｂ  ＢＣ−３を用いたウエスタンブロットを示す。レーン１では、酵素が添加されていない。レーン２は、酵素：基質モル比１：２０でＡＤＡＭＴＳ−４消化されたアグリカンを示す。レーン３〜７は、それぞれ、酵素：基質モル比１：２、１：０．５、１：０．２、１：０．１、および１：０．０７でＡＤＡＭＴＳ−８消化されたアグリカンを示す。ＭＡｂ  ＢＣ−３免疫反応性のバンドの強度は、アグリカン基質に対するＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質の量が増加するのに伴って増大した（図６Ａ、レーン３〜７）。これは、アグリカン切断がＯＡに関連した位置で起きたことを示す。しかし、基質に相対して必要な酵素の量は、ＡＤＡＭＴＳ４を用いた場合よりも多かった（図６Ａのレーン３〜７をレーン２と比較する）。
【０１３３】
図６Ｂは、ＡＧＧ−Ｃ１を用いたウエスタンブロットである。各消化における酵素：基質相対モル比は示されている通りである。１：１から１：０．３までの範囲の酵素：基質比を用いたＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１免疫反応性のバンドを図６Ｂに示した。同じアッセイで、ＡＤＡＭＴＳ４も、ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１免疫反応性のバンドを産生するが、それはずっと低い酵素：基質比のものであった（図６Ｃ、レーン２〜６）。球状タンパク質標準物質の移動位置を各ブロットの左側に示す。
【０１３４】
陰性対照として、最大２．５μｇまでのｒｈＭＭＰ−１３で消化されたアグリカン（２５μｇ）のウエスタンブロットを行ったところ、免疫反応性ペプチドが産生されなかった。これは、アグリカンのＭＭＰ切断で生成されるネオエピトープ配列．．．ＤＩＰＥＮ３４１（配列番号２６）をＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１が認識しないことを実証するものである。さらに、ＡＤＡＭＴＳ−８で用いたのと同程度の酵素：基質比でＭＭＰ−１３消化されたアグリカンは、ＭＡｂ−ＢＣ１４とは免疫反応性であったが、ＭＡｂ  ＢＣ−３によっては認識されなかった。ＭＡｂ−ＢＣ１４は、ＭＭＰによって産生されるネオエピトープ配列３４２ＦＦＧ．．．（配列番号２７）を認識し、ＭＡｂ  ＢＣ−３は、アグレカナーゼによって産生されるネオエピトープ配列３７３ＡＲＧＸＸ．．．（配列番号２４）を認識する。
【０１３５】
ウエスタンブロット分析の詳細な手順を以下に示す。１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有している５０ｍＭトリス、ｐＨ７．３中で、精製されたＡＤＡＭＴＳ−８またはＡＤＡＭＴＳ−４と共に、ウシ関節性軟骨アグリカンを３７℃で１６時間インキュベートした。コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ社、Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ；１ｍＵ／μｇアグリカン）ケラタナーゼ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社；１ｍＵ／μｇアグリカン）およびケラタナーゼＩＩ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社；０．０２ｍＵ／μｇアグリカン）の存在下、３７℃で２時間インキュベートすることによって、消化産物を脱グリコシル化した。消化産物を４〜１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で分離し、その後、電気泳動によってニトロセルロースに移した。ＭＡｂ  ＡＧＧ−Ｃ１（０．０４μｇ／ｍｌ）またはＭＡｂ  ＢＣ−３（Ｃａｔｅｒｓｏｎら、同上）ウエスタンブロット法によって免疫反応性の産物を検出した。続いて、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス２次ＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、１：７５００）を膜と共にインキュベートし、免疫反応性のバンドをＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて可視化した。すべての抗体インキュベーションを、室温で１時間行った。イムノブロットは、最適な発色を実現するために、基質と共に室温で５〜１５分インキュベートした。
【０１３６】
報告によれば、ＡＤＡＭＴＳ４（アグレカナーゼ１）およびＡＤＡＭＴＳ５（アグレカナーゼ２）の他に、他の２つのＡＤＡＭＴＳファミリーメンバー（ＡＤＡＭＴＳ１およびＡＤＡＭＴＳ９）も軟骨アグリカンを、このタンパク質内のどこかで切断することができる。そして、これらは両方とも系統樹上で、アグレカナーゼ１、アグレカナーゼ２、およびＡＤＡＭＴＳ−８と同じノードに分類されている。図６Ａ〜６Ｃは、アグレカナーゼとしてのＡＤＡＭＴＳ−８の活性の効率が、これらの他のＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーのものに匹敵していることを示す。加えて、組換え体ヒトＡＤＡＭＴＳ−８で消化されたアグリカンのＢＣ−３ウエスタンブロット（Ｃ末端アグリカン切断断片の産生をモニターする）およびＡＧＧ−Ｃ１ウエスタンブロット（Ｎ末端切断断片の産生をモニターする）は、ＡＤＡＭＴＳ−８処理によって適切なネオエピトープが産生されることを示し、産生された両方のアグリカン断片は元の状態のままで、さらに分解されていないようであり、アグリカンにおけるＧ１−Ｇ２球間ドメイン内での特異的切断を示しているので、ＡＤＡＭＴＳ−８アグレカナーゼ活性は、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位に特異的なようである。
【０１３７】
図６Ａ〜６Ｃは、ＡＤＡＭＴＳ−８によるウシ関節性の軟骨アグリカンの切断が酵素：基質比１：０．５で起こることも、ＢＣ−３ネオエピトープＭＡｂを用いて実証している。そして、おそらくは、さらに低い比率でも、ＡＧＧ−Ｃ１ネオエピトープＭＡｂを用いて容易に検出される可能性がある。アグリカンのＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４ペプチド結合を切断するこの効率は、ＡＤＡＭＴＳ−１およびＡＤＡＭＴＳ−９で報告されているアグレカナーゼ活性に勝るとも劣らないものである。
【０１３８】
同じウエスタンブロット上で、アグリカンのＡＤＡＭＴＳ−８切断をＡＤＡＭＴＳ−４と比較することによって、試験条件下では、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４ペプチド結合で軟骨アグリカンを切断するＡＤＡＭＴＳ−８の効率が、ＡＤＡＭＴＳ４より低いようであると判明した。ＡＤＡＭＴＳ４のカルボキシ末端タンパク質分解性プロセシングは、触媒ドメインから推定上のＣ末端ＥＣＭ結合ドメインを除去し、細胞外マトリックス中に存在するＧＡＧに対する親和性を低下させることによって、そのタンパク質分解活性を活性化し、また、酵素を可動化する役割を果たしているかもしれないと示唆されている。したがって、Ｃ末端側ドメインの永続的な存在によってＡＤＡＭＴＳ−８酵素活性が阻害されており、Ｃ末端切除されたＡＤＡＭＴＳ−８が高いアグレカナーゼ活性を示す可能性も存在している。この問題に取り組むため、Ｃ末端トロンボスポンジンドメインおよびスペーサードメインのコード配列が欠失している改変されたＡＤＡＭＴＳ−８  ｃＤＮＡを構築し、発現させた。このＣ末端切除された組換え体ＡＤＡＭＴＳ−８は、効率的に発現され、分泌された。そして、精製されたタンパク質は、α２−マクログロブリンアッセイによって、活性であると判定されたが、アグリカン基質では、完全長の組換え体ＡＤＡＭＴＳ−８ほど活性でないようであると、ＡＧＧ−Ｃ１ウエスタンブロット法によって判定された。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨アグリカンを切断するには、Ｃ末端のＧＡＧ結合ドメインをＡＤＡＭＴＳ−８が保持する能力は、軟骨マトリックスへの酵素の局在を維持し、それによって酵素の実効濃度を増大させることによって、ＡＤＡＭＴＳ−８をより効率的にしているようである。ＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡが正常なヒト関節軟骨および骨関節炎のヒト関節軟骨の両方で存在する（図４）ことは、ＡＤＡＭＴＳ−８がｉｎ  ｖｉｖｏでアグレカナーゼとして機能している可能性をさらに支持するものである。
【０１３９】
ニューロカン、ブレビカン、またはベーシカンなどの他の関連したヒアルロナン結合プロテオグリカンがＡＤＡＭＴＳ−８によって、より効率的に切断される可能性もある。ＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡは、脳の様々な小区分で容易に検出可能である。これは、ニューロカンおよびブレビカンの発現パターンと一致している。マウスＡＤＡＭＴＳ−８は、最初、血管新生アッセイで阻害性であることを示した２つのＡＤＡＭＴＳファミリーメンバー（もう一方はＡＤＡＭＴＳ−１であった）の１つであるＭｅｔｈ２として記載された（Ｖａｚｑｕｅｚら、同上）。ＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡが発現されている数少ない部位であり、かつ最も豊富な部位の１つが大動脈であり、これはベーシカンが豊富な組織である。ベーシカンは、細胞接着、増殖、および移動で様々な役割を果たしている重要な血管細胞外マトリックスタンパク質である。したがって、ＡＤＡＭＴＳ−８がベーシカナーゼ（ｖｅｒｓｉｃａｎａｓｅ）として内皮で機能し、もしかしたら、ベーシカンをＧ１ドメインの後で切断し、それをマトリックスから放出するのかもしれないという推測は魅力的なものである。増殖中の内皮細胞からの、そのようなＡＤＡＭＴＳ８媒介性の、ベーシカンの減失は、観測されたＡＤＡＭＴＳ−８の抗血管新生活性を説明するものでありうる。この可能性は、Ｇｌｕ４４１−Ａｌａ４４２結合で切断された大動脈ベーシカン断片がｉｎ  ｖｉｖｏで見出されるという観察によって支持されている。これは、発明者らが本研究で示すＡＤＡＭＴＳ−８の切断特異性と対応するものである。ベーシカナーゼ活性は、ＡＤＡＭＴＳ−１およびＡＤＡＭＴＳ−４で既に示されており、それによって、ＡＤＡＭＴＳ−８が何らかのレベルの効率および特異性でベーシカンを切断できるかもしれないという可能性がさらに大きくなっている。
（実施例１１）
【０１４０】
（発現ベクター）
本発明で哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２  ＣＸＭを用いることができる。ｐＭＴ２  ＣＸＭベクターは、ｐ９１０２３（ｂ）の誘導体であるが、前者は、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を含有し、さらに、ｃＤＮＡクローンを挿入するためのＸｈｏ  Ｉ部位を含有しているという点で、ｐＭＴ２  ＣＸＭベクターはｐ９１０２３（ｂ）と異なっている。ｐＭＴ２  ＣＸＭの機能エレメントには、アデノウイルスＶＡ遺伝子、ＳＶ４０の複製起点（７２ｂｐのエンハンサーを含む）、アデノウイルス主要後期プロモーター（アデノウイルスの後期ｍＲＮＡに存在する５’スプライス部位およびアデノウイルストリパータイトリーダー配列の大部分を含む）、３’スプライシング受容部位、ＤＨＦＲ挿入配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、および大腸菌中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列が含まれている。
【０１４１】
プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭは、ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲ  Ｉ消化によって得た。ｐＭＴ２−ＶＷＦは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ（米国））に、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２として寄託されている。ＥｃｏＲ  Ｉ消化によって、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入配列が切除され、直鎖型のｐＭＴ２が生成する。これを連結して、大腸菌ＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換するのに用いることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、従来の方法で調製することができる。次に、ループアウト／イン変異誘発を用いて、ｐＭＴ２  ＣＸＭを構築する。これは、ＳＶ４０の複製起点およびｐＭＴ２のエンハンサー配列近傍のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位との比較における塩基１０７５から１１４５までを除去する。加えて、これによって、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ  Ｉの認識部位を含有する配列が挿入される。ｐＭＴ２３と名付けられたｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、およびＸｈｏ  Ｉの認識部位を含有している。プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡは、従来の方法によって調製できる。
【０１４２】
ｐＭＴ２１に由来するｐＥＭＣ２β１も、本発明の実施に適したものでありうる。ｐＭＴ２１はｐＭＴ２に由来し、ｐＭＴ２はｐＭＴ２−ＶＷＦに由来する。上述の通り、ＥｃｏＲ  Ｉ消化によって、ｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入配列が切除され、直鎖型のｐＭＴ２が生成する。これを連結して、大腸菌ＨＲ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換するのに用いることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、従来の方法で調製することができる。
【０１４３】
ｐＭＴ２１は、以下の２つの改変を通してｐＭＴ２から得られた。第１に、ｃＤＮＡクローンのＧ／Ｃテーリングからの１９残基のＧストレッチを含む、ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの７６ｂｐの５’非翻訳領域が除去されている。この過程で、ＤＨＦＲのすぐ上流に、Ｐｓｔ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、およびＸｈｏ  Ｉ部位が挿入される。
【０１４４】
第２に、ＥｃｏＲ  ＶおよびＸｂａ  Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、Ｃｌａ  Ｉリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）に連結することによって、ユニークなＣｌａ  Ｉ部位を導入する。これによって、アデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から、２５０ｂｐのセグメントが除去されるが、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の発現も、機能も妨げられない。ｐＭＴ２１は、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化されて、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を派生させるのに使用される。
【０１４５】
ＥｃｏＲ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉで消化し、２７５２ｂｐの断片を得ることによって、ｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１からＥＭＣＶリーダー配列の一部を得る。この断片をＴａｑ  Ｉで消化すると、５０８ｂｐのＥｃｏＲ  Ｉ−Ｔａｑ  Ｉ断片が生成する。これを、低融点アガロースゲル上の電気泳働によって精製する。５’のＴａｑ  Ｉ突出末端と、３’のＸｈｏ  Ｉ突出末端とを有する、６８ｂｐのアダプターとその相補鎖とを合成する。
【０１４６】
このアダプター配列は、ヌクレオチド７６３から８２７までのＥＭＣウイルスリーダー配列と一致する。これは、ＥＭＣウイルスリーダー配列中の位置１０にあったＡＴＧをＡＴＴに変え、その後にはＸｈｏ  Ｉ部位が位置する。ｐＭＴ２１  ＥｃｏＲ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ断片と、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲ  Ｉ−Ｔａｑ  Ｉ断片と、６８ｂｐオリゴヌクレオチドアダプターであるＴａｑ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉアダプターとの３者間連結によって、ベクターｐＥＭＣ２β１が得られる。
【０１４７】
このベクターは、ＳＶ４０の複製開始点およびエンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、アデノウイルストリパータイトリーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を、哺乳動物細胞で所望のｃＤＮＡの高レベル発現を導くのに適した相関関係で含有する。
【０１４８】
ベクターの構築で、アグレカナーゼ関連ＤＮＡ配列の改変を行うこともある。例えば、コード領域の５’末端側および３’末端側に非コードヌクレオチドを除去することによって、アグレカナーゼをコードするｃＤＮＡを改変することができる。除去された非コードヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、また、置換しなくてもよい。これらのベクターは、本発明のアグレカナーゼを発現させるために、適切な宿主細胞の中に導入する。
【０１４９】
一例では、アグレカナーゼのコード配列に隣接する哺乳動物調節配列を除去するか、細菌配列で置換して、アグレカナーゼ分子の細胞内発現または細胞外発現に用いる細菌ベクターを作製する。コード配列をさらに操作することもできる（例えば、他の既知なリンカーに連結するか、非コード配列をそれから除去することによって改変するか、他の既知な技法によってその中のヌクレオチドを改変する）。その後、当業者によって理解されている手順を用いて、アグレカナーゼをコードする配列を、既知な細菌ベクター中に挿入することができる。この細菌ベクターを、本発明のアグレカナーゼを発現させるための細菌宿主細胞の中に導入することができる。細菌細胞で、アグレカナーゼタンパク質の細胞外の発現を生み出す戦略については、例えば、欧州特許出願第１７７３４３号を参照のこと。
【０１５０】
昆虫細胞での発現に用いる昆虫ベクターを構築するために、同様な操作を行うことができる（例えば、欧州特許出願公開第１５５４７６号に記載の手順を参照）。酵母細胞における、本発明のタンパク質の細胞内発現または細胞外発現用の酵母調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる（例えば、国際公開第ＷＯ８６／００６３９号、および欧州特許出願第１２３２８９号に記載の手順を参照）。
【０１５１】
哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫宿主細胞系で高レベルのアグレカナーゼタンパク質を産生する方法では、多コピーの異種アグレカナーゼ遺伝子を含有する細胞の構築を行うこともある。異種遺伝子は、増幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結することができる。増大したコピー数のＤＨＦＲ遺伝子を含有している細胞は、メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を増大させて細胞を増殖させることによって選択することができる。このアプローチは、多数の異なった細胞型で利用することができる。
【０１５２】
例えば、その発現を可能にする他のプラスミド配列と適切に作用する関係にあるアグレカナーゼのＤＮＡ配列を含有するプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミド（ｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３など）とを、カルシウムリン酸媒介形質移入、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合法を含めた様々な方法によって、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−ＢＩＩ）に同時導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地中で選択し、それに続いて、上昇中のＭＴＸ濃度（例えば、０．０２、０．２、１．０、および５μＭ  ＭＴＸの逐次工程）で成長させることによって増幅されるものを選択する。形質転換体をクローン化し、上述したアッセイの少なくとも１つによって、生物学的に活性なアグレカナーゼの発現をモニターする。ＭＴＸ耐性のレベルが増大するのに従って、アグレカナーゼタンパク質の発現レベルも増大するはずである。３５Ｓメチオニンまたはシステインを用いたパルス標識およびポリアクリルアミドゲル電気泳動など、当技術分野で知られている標準的な技法を用いて、アグレカナーゼポリペプチドの特徴付けを行う。同様な手順に従って、他のアグレカナーゼを産生することもできる。
（実施例１２）
【０１５３】
（発現ベクターによる形質移入）
一例として、本発明のアグレカナーゼヌクレオチド配列を、発現ベクターｐＥＤ６にクローニングする。アグレカナーゼ配列を用い、リポフェクション（ＬＦ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってＣＯＳ細胞およびＣＨＯ  ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞に一時的に形質移入する（＋／−別々のＰＥＤ６プラスミド中にあるＰＡＣＥで同時形質移入）。対象の分子それぞれについて、デュプリケートで形質移入を行う。（ａ）一方の形質移入セットは、活性アッセイ用の培養上清を採取するためのものであり、（ｂ）もう一方の形質移入セットは、３５−Ｓ−メチオニン／システイン代謝標識を行うためのものである。
【０１５４】
１日目に、セット（ａ）のウェルの培地を、ＤＭＥ培地（ＣＯＳ）またはアルファ培地（ＣＨＯ）プラス１％熱不活性化ウシ胎児血清＋／−１００μｇ／ｍｌヘパリンに変える。これらの培地は、活性アッセイ用に採取される。４８時間後に、活性アッセイ用の培養上清を採取する。
【０１５５】
３日目に、セット（ｂ）のデュプリケートウェルを、ＭＥＭ（無メチオニン／無システイン）培地プラス１％熱不活性化ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌヘパリン、および１００μＣｉ／ｍｌ  ３５Ｓメチオニン／システイン（Ｒｅｄｉｖｕｅ  Ｐｒｏ混合物、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に変える。３７℃で６時間インキュベートした後、培養上清を採取し、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離する。タンパク質はオートラジオグラフィーによって可視化できる。
【０１５６】
以上の本発明の説明は、例示および説明を提供するが、網羅的であることが意図されたものでも、本発明を、厳密に開示したものに限定するものでもない。上記教示と一致した修正および変形が可能であり、あるいは、本発明の実施からそれらが得られることもある。したがって、本発明の範囲は特許請求の範囲およびその均等物によって定義されることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーの系統樹を示す図である。
【図２】ＡＤＡＭＴＳ−８タンパク質精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す図である。
【図３】ヒトＡＤＡＭＴＳ−８遺伝子プローブでプロービングした、ｍＲＮＡ多組織発現アレイを示す図である。
【図４】無疾患の軟骨および骨関節炎（ＯＡ）の軟骨のヒト臨床標本における、リアルタイムＰＣＲで測定されたＡＤＡＭＴＳ−８ｍＲＮＡ発現レベルのヒストグラムである。
【図５】モノクローナル抗体ＡＧＧ−Ｃ１を用いた競合阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図６】モノクローナル抗体ＢＣ−３およびＡＧＧ−Ｃ１を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−４消化およびＡＤＡＭＴＳ−８消化されたウシアグリカンのウエスタンブロットを示す図である。
【図７】アグレカナーゼ活性の競合阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月15日(2006.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007534675.tif 000012
2007534675.tif 000013
2007534675.tif 000014