(57)【要約】  ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子が提供される。具体的には、本発明はＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは酵母細胞内において高レベル発現をするようコドン最適化されている。本発明のもう１つの実施形態では、合成分子のヌクレオチド配列は酵母によって認識される転写終結シグナルを除去するよう改変されている。合成分子はＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を産生するため、およびＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを含むワクチンおよび医薬組成物を生産するために使用され得る。本発明のワクチンは、中和抗体および細胞媒介性免疫反応を通してパピローマウイルス感染に対する有効な免疫学的予防を提供し、また既存のＨＰＶ感染の治療にも有効であり得る。
2007530040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に規定される、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、その核酸配列が酵母細胞内での高レベル発現のためにコドン最適化されている核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ，およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅからなる群から選択される、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
組み換えＬ１タンパク質または組み換えＬ１＋Ｌ２タンパク質が酵母内で産生されるものである、ＨＰＶ５２の組み換えＬ１タンパク質または組み換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）。
【請求項９】
組み換えＬ１タンパク質または組み換えＬ１＋Ｌ２タンパク質がコドン最適化されたＨＰＶ５２  Ｌ１核酸分子にコードされている、請求項８に記載のＶＬＰｓ。
【請求項１０】
コドン最適化された核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のＶＬＰｓ。
【請求項１１】
（ａ）ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５２  Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードするコドン最適化されたＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること；
（ｂ）組み換えパピローマウイルスタンパク質を産生するために、コドン最適化されたＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下で、形質転換された酵母を培養すること；および
（ｃ）請求項９に記載のＶＬＰｓを産生するために、組み換えパピローマウイルスタンパク質を単離すること
を含む、請求項９に記載のＶＬＰｓを産生する方法。
【請求項１２】
請求項９に記載のＶＬＰｓを含むワクチン。
【請求項１３】
請求項９に記載のＶＬＰｓを含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ感染の予防方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のＶＬＰｓを動物に投与することを含む、動物における免疫応答の誘起方法。
【請求項１６】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ，およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅからなる群から選択される、請求項９に記載のウイルス様粒子。
【請求項１７】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１８】
さらに少なくとも１つの追加のＨＰＶ型のＶＬＰｓを含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１９】
少なくとも１つの追加のＨＰＶ型がＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、およびＨＰＶ６８からなる群から選択される、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
少なくとも１つのＨＰＶ型がＨＰＶ１６を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
さらにＨＰＶ１８  ＶＬＰｓを含む、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
さらにＨＰＶ６  ＶＬＰｓおよびＨＰＶ１１  ＶＬＰｓを含む、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
さらにＨＰＶ３１  ＶＬＰｓを含む、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
さらにＨＰＶ３１  ＶＬＰｓを含む、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２５】
さらにＨＰＶ４５  ＶＬＰｓを含む、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２６】
さらにＨＰＶ４５  ＶＬＰｓを含む、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２７】
さらにＨＰＶ５８  ＶＬＰｓを含む、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】
さらにＨＰＶ５８  ＶＬＰｓを含む、請求項２５に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の予防および／または治療に関する。より具体的には、本発明は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターおよび宿主に関する。本発明は、酵母細胞において組み換えＨＰＶ  ５２  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２の発現により産生されるＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）、およびＨＰＶ感染の予防および治療用のワクチン、並びに医薬組成物におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は８０タイプ以上存在するが、その多くは、良性の増殖性のいぼから悪性の癌まで、多様な生物学的表現型に関連している（ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５‐３３（２００１）参照）。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は最も一般的に良性のいぼ、非悪性の尖圭コンジローマ、および／または生殖器または呼吸器粘膜の軽度の異形成に関連する。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は最も頻繁に子宮頚部、腟、外陰部、および肛門管の上皮内癌および浸潤癌に関連する、リスクの高いタイプである。子宮頚癌の９０％以上はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８または罹患の少ない腫瘍形成型のＨＰＶ３１、‐３３、‐４５、‐５２および‐５８の感染と関連している（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８‐６４（１９９３））。ＨＰＶ  ＤＮＡが子宮頚癌の９０‐１００％において検出されるという観察は、ＨＰＶが子宮頚癌を引き起こすという強い疫学的証拠を与える（Ｂｏｓｃｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５５：２４４‐２６５（２００２）参照）。
【０００３】
パピローマウイルスは最大８個の初期および２個の後期遺伝子をコードする、小さく（５０‐６０ｎｍ）、エンベロープを持たない、二十面体のＤＮＡウイルスである。ウイルスのゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）はＥ１〜Ｅ７、およびＬ１、Ｌ２と命名されており、「Ｅ」は初期、「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１とＬ２はウイルスカプシドタンパク質をコードし、一方Ｅ遺伝子はウイルスの複製および細胞の形質転換のような機能に関連している。
【０００４】
Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、分子量５５‐６０ｋＤａを有する。Ｌ２タンパク質はマイナーなカプシドタンパク質である。免疫学的データにより、ウイルスのカプシドにおいてＬ２タンパク質の大部分はＬ１タンパク質より内側にあることが示唆されている。Ｌ１およびＬ２タンパク質は両方とも、異なるパピローマウイルスの間で高度に保存されている。
【０００５】
酵母、昆虫細胞、哺乳類の細胞または細菌における、Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せの発現は、ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の自己アセンブリをもたらす（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｎ，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ内：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ  １０１‐１２（１９９６）参照）。ＶＬＰｓは形態学的に本物のビリオンに類似しており、動物またはヒトに投与すると高い力価の中和抗体を誘導する能力がある。ＶＬＰｓは潜在的に腫瘍形成性のウイルスゲノムを含んでいないため、それらはＨＰＶワクチンの開発における生きたウイルスの使用に対する安全な選択肢を示している（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７‐７４（２０００）参照）。この理由から、Ｌ１およびＬ２遺伝子はＨＰＶ感染および疾患の予防および治療用ワクチンを開発するための免疫学的な標的として同定された。
【０００６】
ＨＰＶワクチンの開発および商品化は、形質転換が成功した宿主生物においてカプシドタンパク質の高い発現レベルを得ることと関連する障害によって妨げられており、これが精製タンパク質の産生を制限している。それゆえ、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質のようなＨＰＶ  Ｌ１タンパク質をコードする野生型のヌクレオチド配列が同定されているにもかかわらず、意図した宿主細胞内での発現を最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を利用する、粗ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の容易に再生可能な源を開発することが非常に期待されるであろう。加えて、ワクチン開発における使用のために天然タンパク質の免疫付与特性を有するＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ＶＬＰｓの大量生産は有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を誘起または増強する組成物および方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特に、本発明はＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供するものであり、このポリヌクレオチドは酵母細胞内で高レベル発現をするようコドン最適化されたものである。本発明のもう１つの実施形態においては、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は酵母によって認識される転写終結シグナルを除去するように改変されている。本発明はさらに酵母細胞における組み換えＨＰＶ  ５２  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２の発現により産生されるＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を提供し、またＨＰＶ疾患およびＨＰＶと関連のある癌の予防および／または治療のための免疫原性の組成物およびワクチンにおけるＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓの使用を開示している。
【０００９】
本発明は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。合成分子のコドンは酵母細胞によって優先されるコドンを使用するように設計されている。本発明のもう１つの実施形態では、合成分子のヌクレオチド配列は酵母によって認識される転写終結シグナルを除去するよう改変されている。合成分子はＶＬＰｓに自己アセンブリしうるＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の源として使用されうる。前記ＶＬＰｓは、ＶＬＰを主成分とするワクチンにおいて使用されうる。
【００１０】
本発明の典型的な実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に規定されるＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする合成核酸分子を含み、前記核酸分子は酵母細胞内での高レベル発現のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組み換えベクターおよび原核と真核の両方の組み換え宿主細胞を提供する。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞は酵母細胞である。
【００１２】
本発明は、（ａ）ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること；および（ｂ）酵母宿主細胞を前記ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で培養すること：を含む、組み換え宿主細胞でのＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現方法にも関する。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること（ここで、その核酸分子は酵母宿主細胞内で最適な発現をするようコドン最適化されている）；および（ｂ）酵母宿主細胞を前記ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で培養すること：を含む、組み換え宿主細胞でのＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現方法に関する。
【００１４】
好ましい実施形態においては、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む（本明細書中で「５２  Ｌ１  Ｒ配列」と呼ぶ）。
【００１５】
本発明は、酵母細胞内で産生されるＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓの産生方法、およびＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓの使用方法にも関する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態においては、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ，およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ：からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰであり、ＶＬＰは酵母細胞内でのＨＰＶ  ５２  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２の組み換え発現により産生される。
【００１８】
さらに、本発明のもう１つの態様は、コドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子により産生されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ  ５２  ＶＬＰである。本発明のこの態様の典型的な実施形態においては、コドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
本発明は、動物にＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子を投与することを含む、動物における免疫応答を誘起する方法も提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓはコドン最適化された遺伝子によって産生される。
【００２０】
さらに、本発明のもう１つの態様は、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶの関連する子宮頚癌の予防または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓは酵母内で産生される。
【００２１】
本発明は、ＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を含むワクチンにも関し、ここでＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓは酵母内で産生される。
【００２２】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、ワクチンはさらに少なくとも１つの追加のＨＰＶ型のＶＬＰｓを含む。少なくとも１つの追加のＨＰＶ型は関係のあるどんなＨＰＶ型でもよく、当分野で記載された全てのＨＰＶ型、またはその後に同定されたものも含む。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ型はいぼや子宮頚癌のような臨床的な表現型と関連する型である。さらに好ましい実施形態においては、少なくとも１つの追加のＨＰＶ型はＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、およびＨＰＶ６８：からなる群から選択される。
【００２３】
本発明は、ＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子を含む医薬組成物にも関し、ここでＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓは酵母内で産生される。さらに、本発明はＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓおよび少なくとも１つの追加のＨＰＶ型のＶＬＰｓを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、少なくとも１つの追加のＨＰＶ型はＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、およびＨＰＶ６８：からなる群から選択される。
【００２４】
本明細書を通しておよび添付の請求項において使用されているように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」はもし文脈が明らかに別のものを規定していなければ、複数の例を含んでいる。
【００２５】
本明細書および添付の請求項を通して使用されているように、以下の定義および略語が適用される：
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、転写活性を開始および作動するために、ＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成する。複合体は、「エンハンサー」または「上流活性化配列」と呼ばれる配列を活性化すること、または「サイレンサー」と呼ばれる配列を阻害することにより、修飾されうる。
【００２６】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片が宿主生物または宿主組織へと導入されうる、幾つかの手段を指す。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージおよびコスミドを含む様々な型のベクターが存在する。
【００２７】
「カセット」という用語は、ベクターから発現されるべきヌクレオチドまたは遺伝子配列を意味し、例えば、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチドまたは遺伝子配列である。概して、カセットはベクターに挿入される遺伝子配列を含み、ベクターは、ある実施形態においては、ヌクレオチドまたは遺伝子配列を発現するために制御配列を備えている。他の実施形態においては、ヌクレオチドまたは遺伝子配列はその発現のために制御配列を備えている。さらなる実施形態においては、ベクターは幾つかの制御配列を備えており、ヌクレオチドまたは遺伝子配列は他の制御配列を備えている。例えば、ベクターはヌクレオチドまたは遺伝子配列を転写するためのプロモーターを備えることができ、当該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は転写終結配列を備える。ベクターにより備えられうる制御配列は、エンハンサー、転写終結配列、スプライスアクセプターおよびドナー配列、イントロン、リボソーム結合配列、およびポリ（Ａ）付加配列を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
「５２  Ｌ１野生型配列」および「５２  Ｌ１  ｗｔ配列」という呼称は、本明細書にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として開示されるＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列を指す。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１野生型配列は以前に記述されているが、臨床的分離物から得られたＤＮＡ間での小さな配列の変化をみつけることは稀ではない。それゆえ、代表的なＨＰＶ  ５２  Ｌ１野生型配列を、以前にＨＰＶ  ５２  ＤＮＡを含むことが示されている臨床サンプルから分離した（実施例１参照）。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１野生型配列を、本明細書に開示されたコドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列と比較するために、参照配列として使用した（図１参照）。
【００２９】
「ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒ」および「５２  Ｌ１  Ｒ」という呼称は、代表的な合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を意味し、本明細書に開示されるように、当該配列は酵母細胞において高レベル発現をするように優先されるコドンを含むように、再構築されたものである。
【００３０】
「有効量」という用語は免疫応答が起こるよう、好適な濃度のポリペプチドを産生するのに十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。当業者はこの濃度が変動しうることを認識する。
【００３１】
「保存されたアミノ酸置換」はあるアミノ酸残基を別の、化学的に類似したアミノ酸残基により置き換えることを指す。そのような保存された置換の例は：一つの疎水性の残基（イソロイシン、ロイシン、バリン、またはメチオニン）を別のものの代わりに用いること；一つの極性残基を同じ電荷の別の極性残基の代わりに用いること（例えば、リジンの代わりにアルギニン；アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸）である。
【００３２】
「哺乳類」という用語は、ヒトを含む、あらゆる哺乳動物を指す。
【００３３】
「ＶＬＰ」または「ＶＬＰｓ」は、ウイルス様粒子または複数のウイルス様粒子を意味する。
【００３４】
「合成の」は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子が天然に生じることが設計された野生型ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子（５２  Ｌ１  ｗｔ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）中に存在するヌクレオチド配列と同じでないヌクレオチド配列を含むように作り出されたことを意味する。先に述べたように、合成分子は本明細書では酵母細胞による発現に好ましいコドンを含むヌクレオチド配列を含むものが提供されている。本明細書で提供される合成分子は、野生型ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と同じアミノ酸配列をコードしている。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
子宮頚癌のほとんどはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特定の腫瘍形成型の感染と関連がある。本発明は、腫瘍形成性のＨＰＶ型の遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を誘起または増強する組成物および方法に関する。具体的には、本発明はＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供するものであるが、このポリヌクレオチドは酵母細胞内において高レベル発現をするようにコドン最適化されたものである。本発明はまた酵母内で産生されるＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を提供し、ＨＰＶと関連性の癌の予防および／または治療のための免疫原性の組成物およびワクチンにおける前記ポリヌクレオチドおよびＶＬＰｓの使用を開示する。
【００３６】
野生型のＨＰＶ  ５２  Ｌ１ヌクレオチド配列は報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＮＣ  ００１５９２）。本発明は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の一つの態様においては、合成分子はコドン配列を含み、ここで少なくとも幾つかのコドンは高レベル発現をするよう酵母細胞に好まれるコドンを使用するよう改変されている。本発明のもう１つの態様においては、合成分子のヌクレオチド配列は酵母によって認識される転写終結シグナルを除去するように改変されている。合成分子はＶＬＰｓに自己アセンブリしうるＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質発現のためのコード配列として使用されうる。前記ＶＬＰｓはＶＬＰを主成分とするワクチンにおいて、中和抗体や細胞媒介性免疫反応を通してパピローマウイルス感染に対する効果的な免疫学的予防を提供するために使用されうる。そのようなＶＬＰを主成分とするワクチンは既に確立されているＨＰＶ感染の治療にも有効である可能性がある。
【００３７】
酵母細胞内でのＨＰＶ  ＶＬＰｓの発現は費用効率が高く、発酵槽での大規模生産に容易に適応するというメリットを提供する。加えて、酵母ゲノムは生育および発現の可能性が増加した組み換えおよび形質転換された酵母の選択を確実にするために、容易に改変が可能である。しかしながら、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１を含む多くのＨＰＶ  Ｌ１タンパク質は酵母細胞内での商用的スケールアップに望まれるよりも低レベルで発現される（実施例２参照）。
【００３８】
従って、本発明は、酵母細胞の環境内での高レベル発現のために「最適化」されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子配列に関する。
【００３９】
４つの可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６０以上の異なる形態で存在しうる。これらのコドンはわずか２０種の異なるアミノ酸へのメッセージを提供するので（転写の開始および終結と同様）、幾つかのアミノ酸は１つ以上のコドンによってコードされることができ、これはコドンの縮重性として知られる現象である。完全には理解されていない理由により、代替コドンは異なる型の細胞の内因性ＤＮＡ内に均一には現れない。実際、ある型の細胞においては一定のコドンに対する変わりやすい自然の序列または「優先性」が存在するようである。一例として、アミノ酸のロイシンはＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、およびＴＴＧを含む６つのＤＮＡコドンのいずれによっても指定される。微生物に対するゲノムコドンの使用頻度の徹底的な解析によって、酵母および粘菌類のＤＮＡが最も共通してＴＴＡというロイシンを指定するコドンを含むのに対して、大腸菌の内因性ＤＮＡは最も共通してＣＴＧというロイシンを指定するコドンを含むことが明らかにされている。この序列を考慮して、大腸菌の宿主によるロイシンの多いポリペプチドの高レベル発現を得る見込みは、ある程度はコドンの使用頻度に依存すると一般に考えられている。例えば、ＴＴＡコドンに富んだ遺伝子は大腸菌では発現が乏しく、これに対してＣＴＧに富んだ遺伝子は恐らくこの宿主で高度に発現されるようである。同様に、酵母宿主細胞内でのロイシンの多いポリペプチドの発現に対する優先コドンはＴＴＡであろう。
【００４０】
組み換えＤＮＡ技術におけるコドンの優先現象の意味合いは明白であり、この現象は形質転換が成功した宿主生物における外因性遺伝子の高発現レベルを得ることに対する、多くのこれまでの失敗を説明するのに役立つ可能性がある（挿入遺伝子中に優先度の低いコドンが繰り返し存在しているかも知れないし、発現のための宿主細胞の機構が同様に効率的に作動していないかも知れない）。この現象は計画された宿主細胞の優先コドンを含むように設計された合成遺伝子が、組み換えタンパク質発現の実施のために外来遺伝物質の最適な形態を与えることを示唆している。従って、本発明の一つの態様は、酵母細胞内において高レベル発現をするようコドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子である。本発明の好ましい実施形態においては、同じタンパク質配列をコードする代替コドンの使用は、酵母細胞によるＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質発現における制約を取り除く可能性があることが明らかになった。
【００４１】
本発明に従うと、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子セグメントは同一の翻訳配列を有するがＳｈａｒｐおよびＣｏｗｅにより記述されているように（本明細書に参考として援用するＳｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｙｅａｓｔ  ７：６５７‐６７８（１９９１））、代替コドンを使用した配列に改変された。この方法論は、一般に高度に発現される酵母遺伝子と一般に関連性のない野生型の配列内のコドンを同定すること、および酵母細胞内で高度に発現するために最適なコドンでそれらを置換することからなる。ついで、新しい遺伝子配列はこれらのコドンの置換によって発生した、望ましくない配列について点検される（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンのスプライス認識部位の不注意な創設、不要な制限酵素部位、高ＧＣ含量、酵母によって認識される転写終結シグナルなど）。望ましくない配列は、既存のコドンを同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換することによって除去される。ついで、合成遺伝子セグメントは改善された発現について試験される。
【００４２】
上記の方法をＨＰＶ  ５２  Ｌ１の合成遺伝子セグメントを創造するために使用して、遺伝子が高レベル発現をするよう最適化されたコドンを含む結果となった。上記手順がＨＰＶワクチンでの使用のためにコドン最適化された遺伝子を設計するための我々の方法論の概略を提供する一方、類似ワクチンの効力または増加した遺伝子発現は、手順における小さな変化または配列中の小さな変化によって得られた可能性があることが、当業者に理解されている。
【００４３】
従って、本発明は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチド、またはＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは突然変異体に関し、そのポリヌクレオチド配列は酵母細胞内での発現のために最適化されたコドンを含んでいる。前記のＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の突然変異体は：保存されたアミノ酸置換、アミノ末端のトランケーション、カルボキシ末端のトランケーション、欠失、または付加を含むが、これらに限定されるものではない。任意のそのような生物学的に活性なフラグメントおよび／または突然変異体も、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に規定されるＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を免疫学的特性に少なくとも実質的に模倣するタンパク質またはタンパク質フラグメントのいずれかをコードするであろう。本発明の合成ポリヌクレオチドは治療用または予防用のＨＰＶワクチンの開発に有用であるように、機能性ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードしている。
【００４４】
本発明の一つの態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に規定されるＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードするコドン最適化された核酸分子であり、前記核酸分子は酵母細胞内で高レベル発現をするようコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
本発明は、本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組み換えベクターおよび原核と真核の両方の組み換え宿主細胞にも関する。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞である。
【００４６】
本明細書に述べられる方法を通して構築される合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ＤＮＡ、それらの機能的等価物、およびそれらのフラグメントは、好適なプロモーターおよび他の適切な転写制御要素を含む発現ベクターへの分子クローニングにより組み換え発現されるであろう。前記発現ベクターは、組み換えＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を産生するために原核または真核の宿主細胞に形質転換されるであろう。そのような操作のための手法は、当分野で十分に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｏｓｅら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０），これらは本明細書に全て参考として援用されている）。
従って、本発明は、（ａ）ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること；および（ｂ）酵母宿主細胞を前記ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で培養すること：を含む、組み換え宿主細胞でのＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現方法に関する。
【００４７】
本発明はさらに、（ａ）ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること（ここで、その核酸分子は酵母宿主細胞内で最適な発現をするようコドン最適化されている。）；および（ｂ）酵母宿主細胞を前記ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で培養すること：を含む、組み換え宿主細胞でのＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現方法に関する。
【００４８】
本発明はさらに、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定される核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること；および（ｂ）酵母宿主細胞を前記ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で培養すること：を含む、組み換え宿主細胞でのＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現方法に関する。
【００４９】
本発明の合成遺伝子は、宿主細胞内でＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の効率的な発現を提供するよう設計された配列を含む発現カセット中にアセンブリされることが可能である。カセットは、望ましくは合成遺伝子を、作動可能なようにそれと連結された、関連する転写および翻訳制御配列、例えばプロモーター、および終結配列とともに含む。当業者はＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３またはＰＧＫプロモーター、または他の真核性の遺伝子プロモーターのような多数の他の周知の任意の酵母のプロモーターが使用されうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態においては、プロモーターはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１プロモーターである。他の周知の転写ターミネーターも使用されうるが、好ましい転写ターミネーターはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１ターミネーターである。ＧＡＬ１プロモーター‐ＡＤＨ１ターミネーターの組み合わせが特に好ましい。
【００５０】
本発明のもう１つの態様は、酵母細胞内でＨＰＶ  ５２  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２遺伝子を組み換え発現することによって産生されるＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを産生する方法、およびＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを使用する方法である。ＶＬＰｓは、ヒトおよび動物パピローマウイルスの主要なカプシドタンパク質であるＬ１が酵母、昆虫細胞、哺乳類の細胞または細菌内で発現された場合、自己アセンブリしうる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｎ，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ内：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ  １０１‐１２（１９９６）参照）。Ｌ１とＬ２カプシドタンパク質の組み合わせを発現することによって形態学的に不明瞭なＨＰＶ  ＶＬＰｓも産生される可能性がある。ＶＬＰｓはＴ＝７の二十面体構造であるＬ１の７２の五量体から構成される（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（６）：１４４５‐５６（１９９１））。
【００５１】
ＶＬＰｓは形態学的に真正なビリオンに似ており、動物に投与すると高力価の中和抗体を誘導する能力がある。ＶＬＰｓでのウサギの免疫化（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３９５９‐６３（１９９５））およびイヌの免疫化（Ｓｕｚｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（２５）：１１５５３‐５７（１９９５））は中和抗体を誘導し、且つ実験的なパピローマウイルス感染から守ることを示した。加えて、成人女性のＨＰＶ  １６  ＶＬＰｓによる免疫化は、ＨＰＶ  １６感染およびＨＰＶ  １６子宮頚管上皮内腫瘍から守ることを示した（Ｋｏｕｔｓｋｙら  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．  Ｍｅｄ．３４７：１６４５‐５１（２００２））。ＶＬＰｓは潜在的に腫瘍形成性のウイルスゲノムを含んでおらず、単一の遺伝子から発現された時、自己アセンブリしうるため、それらはＨＰＶワクチン開発における生きたウイルス使用に対する安全な選択肢を示している（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７‐７４（２０００）参照）。
【００５２】
従って、本発明はＨＰＶ  ５２の組み換えＬ１タンパク質または組み換えＬ１＋Ｌ２タンパク質からなるウイルス様粒子に関し、ここで組み換えタンパク質は酵母細胞内で発現される。
【００５３】
上に述べたように、本発明の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓは酵母内で産生される。さらに好ましい実施形態においては、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ，およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ：からなる群から選択される。
【００５４】
本発明のもう１つの態様は、コドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子により産生されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ  ５２  ＶＬＰである。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、コドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
さらに本発明のもう１つの態様は、（ａ）ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ  ５２  Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること；（ｂ）組み換えＨＰＶ  ５２タンパク質を産生するために、組み換えＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下で、形質転換された酵母を培養すること；および（ｃ）ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを産生するために、組み換えＨＰＶ  ５２タンパク質を単離すること：を含む、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓの産生方法である。
【００５６】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、酵母は、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを産生するようにコドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子で形質転換される。特に好ましい実施形態においては、コドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
本発明は、動物にＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子を投与することを含む、動物における免疫応答を誘起する方法も提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓはＨＰＶ  ５２  Ｌ１またはＨＰＶ  ５２  Ｌ１＋Ｌ２をコードするコドン最適化された遺伝子を組み換え発現することによって産生される。
【００５８】
さらに、本発明のもう１つの態様は、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ関連性の子宮頚癌の予防および／または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓは酵母内で産生される。
【００５９】
本発明は、ＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を含むワクチンにも関する。
【００６０】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、ワクチンはさらに少なくとも１つの追加のＨＰＶ型のＶＬＰｓを含む。好ましい実施形態においては、少なくとも１つの追加のＨＰＶ型はＨＰＶ  ６、ＨＰＶ  １１、ＨＰＶ  １６、ＨＰＶ  １８、ＨＰＶ  ３１、ＨＰＶ  ３３、ＨＰＶ  ３５、ＨＰＶ  ３９、ＨＰＶ  ４５、ＨＰＶ  ５１、ＨＰＶ  ５５、ＨＰＶ  ５６、ＨＰＶ  ５８、ＨＰＶ  ５９、およびＨＰＶ  ６８：からなる群から選択される。
【００６１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ワクチンはさらにＨＰＶ  １６  ＶＬＰｓを含む。
【００６２】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ワクチンはさらにＨＰＶ  １６  ＶＬＰｓおよびＨＰＶ  １８  ＶＬＰｓを含む。
【００６３】
本発明のさらにもう１つの好ましい実施形態においては、ワクチンはさらにＨＰＶ  ６  ＶＬＰｓ、ＨＰＶ  １１  ＶＬＰｓ、ＨＰＶ  １６  ＶＬＰｓおよびＨＰＶ  １８  ＶＬＰｓを含む。
【００６４】
本発明は、ＨＰＶ  ５２ウイルス様粒子を含む医薬組成物にも関する。さらに、本発明はＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓおよび少なくとも１つの追加のＨＰＶ型のＶＬＰｓを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、少なくとも１つの追加のＨＰＶ型はＨＰＶ  ６、ＨＰＶ  １１、ＨＰＶ  １６、ＨＰＶ  １８、ＨＰＶ  ３１、ＨＰＶ  ３３、ＨＰＶ  ３５、ＨＰＶ  ３９、ＨＰＶ  ４５、ＨＰＶ  ５１、ＨＰＶ  ５５、ＨＰＶ  ５６、ＨＰＶ  ５８、ＨＰＶ  ５９、およびＨＰＶ  ６８：からなる群から選択される。
【００６５】
本発明のワクチン組成物は、起こりうる毒性を最小限にしてＨＰＶ  ５２感染を最適に妨げるよう適切な用量で単独で使用されうる。加えて、他の薬剤を併用投与または連続投与することが望ましい可能性がある。
【００６６】
ワクチンレシピエントへ導入されるウイルス様粒子の量は、発現された遺伝子産物の免疫原性に依存するであろう。一般に、免疫学的または予防的に効果的な用量である約１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは約２０〜６０μｇのＶＬＰｓが筋肉組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を通しての圧入、および腹腔内、静脈内、または吸入送達のような他の投与方法も検討される。追加免疫ワクチン接種が供給されることも検討される。ミョウバンやメルク社のミョウバンアジュバントのようなアジュバントを、本発明ワクチンの非経口的な導入と同時にまたは続けて、静脈内、筋肉内、皮下または他の投与方法のような非経口投与することも有利である。
【００６７】
本明細書で挙げられた全ての公開文献は、本発明と関連して使用されるかも知れない方法論および原料を記述および開示する目的で本明細書に参考として援用されている。本明細書において、本発明が先の発明によってそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきものは何もない。
【００６８】
添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を記述したが、本発明がそれらの正確な実施形態に制限されず、様々な変化と改変は添付の請求項で定義される本発明の範囲または精神から逸脱することなしに当業者により実施され得ることを理解すべきである。
【００６９】
（実施例）
以下の実施例は、例示としての説明であるが、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００７０】
代表的ＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列の決定
ＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列は既に記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＮＣ  ００１５９２）。しかしながら、臨床的分離物から得られたＤＮＡ間で僅かな配列の変化を見つけることは珍しいことではない。代表的なＨＰＶ  ５２  Ｌ１野生型配列を決定するため、あらかじめＨＰＶ  ５２  ＤＮＡを含むことが示されている３つの臨床的サンプルからＤＮＡを単離した。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび以下のプライマー：５’Ｌ１  ５’  ‐  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ｃ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｇ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｃ  Ｃ  Ｔ  Ａ  Ｇ  Ｔ  ‐  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および３’５２  Ｂｇｌ  ＩＩ  ５’  ‐  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ａ  Ｔ  Ｃ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｔ  Ｔ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  ‐  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。増幅産物はアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。〜１５００  ｂｐのＬ１バンドを切り出し、ＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑ‐Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して精製した。ＤＮＡを、ついでＴＡクローニングベクターであるｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ＴＯＰ１０Ｆ’という大腸菌細胞をライゲーションミクスチャーを用いて形質転換し、青／白コロニー選択用のカナマイシン＋ＩＰＴＧおよびＸ‐ｇａｌ入りのＬＢ寒天でプレート培養した。プレートを反転し、１６時間３７℃でインキュベートした。
【００７１】
増幅した３つの臨床的分離物それぞれに由来する５つの白コロニーについてコロニーＰＣＲを行った。１段階目が９６℃、１５秒（変性）、５５℃、３０秒（アニーリング）および６８℃、２分（伸長）の１０サイクルを含み、二段階目がアニーリング段階が５０℃で３０秒行われることを除いては本質的に類似したプログラムの３５サイクルを含む、２ステップＰＣＲで５’Ｌ１および３’５２  Ｂｇｌ  ＩＩプライマーを使用した。ＰＣＲ産物はアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。各臨床分離物からの幾つかのコロニーは〜１５００  ｂｐのバンドの増幅産物を含んでいた。コロニーは３７℃で１６時間振とうしながら、カナマイシン入りのＬＢ培地で培養した。プラスミドＤＮＡを抽出するためにミニプレップを行い、プラスミド中のＬ１遺伝子の存在を証明するためそれらを制限酵素で消化した。生じた制限フラグメントはアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色で視覚化した。
【００７２】
３つの臨床分離物それぞれからのクローンのＬ１挿入物を含むプラスミドについてＤＮＡ配列決定を行った。ＤＮＡおよび翻訳されたアミノ酸配列を、互いにおよび既に公表されているＧｅｎｂａｎｋのＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列と比較した。３つの臨床分離物の配列解析で、Ｇｅｎｂａｎｋの配列と同一の配列はないことが明らかになった（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ  ００１５９２）。ｐＣＲ２．１  ＨＰＶ  ５２Ｌ１  ｃｌｏｎｅ  ＃２Ｃを代表的なＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列として選択し、それを本明細書では「５２  Ｌ１  野生型配列」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、図１参照）と呼ぶ。５２  Ｌ１  野生型（ｗｔ）として選択した配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列と比較すると１点の変異を含んでおり、これは１３０８番目のヌクレオチドのサイレント変異からなっていた（アデニン→グアニン）。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔ配列のアミノ酸配列は５２  Ｌ１のＧｅｎｂａｎｋの配列と同一であった。
【００７３】
ＨＰＶ  ５２  Ｌ１野生型配列は、Ｂｇｌ  ＩＩの伸長を加えるため前記５’Ｌ１  Ｂｇｌ  ＩＩプライマー（５’  ‐  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ａ  Ｔ  Ｃ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ｃ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｇ  Ｃ  ‐  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））および前記の３’５２  Ｂｇｌ  ＩＩプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼを使用して行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。〜１５００  ｂｐのバンドを切り出し、ＤＮＡはＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑ‐Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して精製した。ＰＣＲ産物を、ついでｐＣＲ２．１ベクターに連結し、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞をライゲーションミクスチャーを用いて形質転換した。白コロニーを３７℃で１６時間振とうしながら、カナマイシン入りのＬＢ培地で培養した。プラスミドＤＮＡを抽出するためにミニプレップを行った。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子をＢｇｌ  ＩＩという制限酵素による消化でベクター配列から解放した。消化されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。Ｌ１バンドはＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを使用して精製し、脱リン酸化されＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１１０ベクターに連結した。ＴＯＰ１０Ｆ’という大腸菌細胞をライゲーションミクスチャーを用いて形質転換した。正しい配向のＨＰＶ  ５２  Ｌ１挿入物を選別するため、コロニーからのプラスミドＤＮＡをＰＣＲで増幅した。挿入物の配列と配向を確認するためにＤＮＡ配列決定を行った。選択したクローンをｐＧＡＬ１１０‐ＨＰＶ  ５２Ｌ１  ＃５と名付けた。選択したクローンからのマキシプレップＤＮＡを調製した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はグルスラーゼでスフェロプラストにすることによってコンピテントな状態にし、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ  ５２Ｌ１  ＃５を用いて形質転換した。酵母の形質転換体ミクスチャーをＬｅｕ−のソルビトールプレート上のＬｅｕ−のソルビトールトップアガーでプレート培養し、反転して３０℃で３〜５日間インキュベートした。コロニーを突付き、単離のためＬｅｕ−のソルビトールプレート上で筋をつけた。単離したコロニーはその後ＨＰＶ  ５２  Ｌ１転写とタンパク質発現を誘導するために回転チューブ培養で、１．６％グルコースおよび４％ガラクトース入りの５ｍｌの５×Ｌｅｕ−Ａｄｅ−のソルビトール中で３０℃で増殖させた。
【実施例２】
【００７４】
酵母のコドン最適化
酵母で優先されるコドンは記述されている（Ｓｈａｒｐ，Ｐａｕｌ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｏｗｅ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ．  Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＥＡＳＴ  ７：６５７‐６７８（１９９１））。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔタンパク質の発現は検出可能であった；しかし転写レベルは非常に低く、ノーザンブロットでは検出できなかった。未成熟な転写終結がＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子の低発現レベルの原因である可能性があると仮定された。この遺伝子の転写を増加し完全長の転写産物が産生されることを確実にするために、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子を酵母で優先されるコドンを利用して再構築した。酵母に認識される酵母の転写終結シグナルの存在について配列を調べ、これらの配列を代替コドンで置換することによって除去し、一方で同じアミノ酸配列を保存した。再構築したＨＰＶ  ５２  Ｌ１配列（これは酵母のコドン最適化された配列を含む）は、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔ配列と比較して３７９のヌクレオチド改変を含んだ。生じた配列を本明細書では「５２  Ｌ１  Ｒ」（Ｒ＝再構築、図１参照）と呼ぶ。５２  Ｌ１  ｗｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と５２  Ｌ１  Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）との配列間のヌクレオチド改変を図１に示す。５８  Ｌ１  Ｒの翻訳されたアミノ酸配列は改変されなかった（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、図２参照）。再構築された配列は、増加したＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現をもたらし、これはワクチン開発における使用のための野生型にまさる重要な前進である。
【００７５】
最適化された遺伝子を生産するために用いられたストラテジーは、アミノ酸配列を維持しながらヌクレオチドを酵母で優先されるコドン配列で置換することによる、遺伝子をスパンする長いオーバーラップするセンスおよびアンチセンスのオリゴマーを設計することであった。これらのオリゴマーを、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ反応において鋳型のＤＮＡの代わりに使用した。追加の増幅プライマーを、鋳型のオリゴマーから再構築された配列を増幅するために設計し使用した。
【００７６】
増幅に最適な条件はセクション特異的であった；しかし、大部分の反応は９４℃、５分（変性）、ついで９５℃、３０秒を２５サイクル（変性）、５０〜５５℃、３０秒（アニーリング）、７２℃、１．５分（伸長）、ついで７２℃、７分の最終の伸長および４℃でホールドに類似するプログラムを使用した。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により調べた。適切なサイズのバンドを切り出し、ＤＮＡをゲルのスライスから精製した。次に、増幅フラグメントを１５１２  ｎｔの再構築されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子をアセンブリするための鋳型として使用した。
【００７７】
再構築に続いて、１５１２  ｎｔのバンドをゲル精製し、ｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。ライゲーションに続いて、コンピテントな大腸菌ＴＯＰ１０細胞をライゲーションミクスチャーを用いて形質転換した。コロニーをアンピシリン入りの４ｍｌのＬＢ培地で培養し、ミニプレップ技術によってコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡを望まれるＨＰＶ  ５２  Ｌ１の再構築の変化の存在を確認するために配列決定した。両端にＢａｍＨＩの伸長を加えるため、５２  Ｌ１  Ｒ（再構築）をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ‐５２  Ｌ１  Ｒから再度増幅した。増幅フラグメントを前記のようにクローニングし、生じたプラスミドＤＮＡを配列決定した。そのプラスミドｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ‐５２  Ｌ１  Ｒ（Ｂａｍ）をＢａｍＨＩで消化し、生じたＤＮＡフラグメント挿入物をアガロースゲルで電気泳動した。〜１５３０  ｂｐのＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒ（Ｂａｍ）フラグメントをゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１１０に連結した。ＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーションミクスチャーを用いて形質転換した。
【００７８】
生じたコロニーを正しい配向のＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒ挿入物についてＰＣＲでスクリーニングした。配列と配向をＤＮＡ配列決定によって確認した。マキシプレップでプラスミドＤＮＡを調製した。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞をスフェロプラストにすることによってコンピテント状態にし、形質転換した。酵母の形質転換物をＬｅｕ−のソルビトールアガープレート上のＬｅｕ−のソルビトールトップアガーでプレート培養し、反転して７日間培養した。コロニーを突付き、クローン単離のためＬｅｕ−のソルビトールアガープレート上で筋をつけた。単離したコロニーはついでＬ１の転写とタンパク質発現を誘導するために回転チューブ培養で１．６％グルコースおよび４％ガラクトース入りの５ｍｌの５×Ｌｅｕ−Ａｄｅ−のソルビトール中で３０℃で増殖させた。４８および／または７２時間後、ＯＤ６００＝１０に等価な培養量をペレット化し、上清を除去し、ペレットを凍結し−７０℃で保存した。
【実施例３】
【００７９】
ＲＮＡ調製 
ガラクトース誘導によりＨＰＶ  ５２  Ｌ１を発現するよう誘導した形質転換した酵母の細胞ペレットを氷上で解凍し、０．８  ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中に懸濁し、室温で５分間インキュベートした。５分の１量のクロロホルムをバイアルに添加した。ついでそれを撹拌するため１５秒間勢いよく振とうし、室温で３分間インキュベートした。１３  ｋ  ｒｐｍｓで５分間遠心分離した後、上層を回収し、新しいバイアルに移した。０．４  ｍｌのイソプロパノールをバイアルに添加した。混合物を室温で１０分間インキュベートした。ＲＮＡをペレット化するため、１３  ｋ  ｒｐｍｓで１０分間遠心分離を行った。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを７５％  ＥｔＯＨで洗浄し、遠心分離の工程を繰り返した。上清を静かに移し、ＲＮＡのペレットを１５分間空気乾燥し、ついでＲＮａｓｅを含まない水に懸濁した。Ａ２６０／２８０が１．７‐２．０の時、Ａ２６０が１＝４０μｇ／ｍｌのＲＮＡという仮定を使用して、サンプル中のＲＮＡ濃度を測定するために分光測光法を行った。
【実施例４】
【００８０】
ノーザンブロット解析
１．１  ％アガロースホルムアルデヒドゲルをキャストした。５および１０マイクログラムのＲＮＡを変性バッファーと混合し（最終濃度：６％  ホルムアルデヒド、５０％ホルムアミド、０．１×ＭＯＰＳ）、６５℃まで１０分間熱した。１０分の１量のゲルローディングバッファーを添加し、サンプルをゲルにロードした。電気泳動は７５ボルトで１×ＭＯＰＳバッファー中で〜３時間行った。ゲルを１０×ＳＳＣ中で６０分間洗浄した。
【００８１】
ＲＮＡを１０×ＳＳＣ中で１６時間にわたって毛管現象によりＨｙｂｏｎｄ‐Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移した。ついでＲＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒの自動架橋機能（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した架橋によってナイロンメンブレンに固定した。固定後、ナイロンメンブレンを空気乾燥した。
【００８２】
Ｒｏｃｈｅ  ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ‐Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．，  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をノーザンブロット上の５２  Ｌ１  ｗｔおよび５２  Ｌ１  Ｒ  ＲＮＡを検出するためのプローブとして使用すべく、５２  Ｌ１  ｗｔおよび５２  Ｌ１  Ｒ  ＤＮＡ配列をＤＩＧで標識するために使用した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびアルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を使用した免疫学的現像をメーカーの推奨に従って行った。要約すると、ブロットを３７℃で３０分間緩やかに振とうしてプレハイブリダイゼーションした。プローブは９５℃まで５分間熱し、ついで氷上で急冷することにより変性させた。プローブをハイブリダイゼーション溶液に添加し、４時間４４．６℃で緩やかに振とうしてメンブレンに作用させた。ついでハイブリダイゼーション溶液を除去し、ブロットを室温で０．１％ＳＤＳの２×ＳＳＣで５分間２回洗浄し、ついで６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで追加洗浄した。ついでブロットを３０分間ブロッキングし、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ結合抗体を１：５０００の希釈率で３０分間作用させた。ブロットを洗浄し、プローブが結合したＲＮＡの存在をアルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ結合抗体のＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質検出によって測定した。
【００８３】
ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔを発現している酵母の最初の解析によって、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質が発現されることが示唆された；しかし、レベルは低かった。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔを発現するよう誘導された培養液の酵母抽出物からのＲＮＡのノーザンブロット解析は、検出可能なＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ＲＮＡを全く示さなかった。適切なサイズの幾らかのタンパク質が検出されたので、幾つかの完全長のＲＮＡ転写産物が作られることは明らかであった。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子を酵母で優先されるコドン配列で再構築し、安定した転写を確実にするため、全ての可能性のある未成熟な転写終結部位を除外するよう設計した。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒの転写産物のノーザンブロット解析によって、完全長の転写産物が生成され、ノーザンブロット解析によって検出可能であることが明らかにされた（図３）。
【実施例５】
【００８４】
ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現
ガラクトースで誘導したＯＤ６００＝１０と等価の培養液の凍結された酵母細胞ペレットを氷上で解凍し、２ｍＭのＰＭＳＦ入り３００μｌのＰＣバッファー（１００  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４および０．５  Ｍ  ＮａＣＩ，ｐＨ  ７．０）中に懸濁させた。酸で洗浄した０．５ｍｍのガラスビーズを〜０．５ｇ／チューブ濃度で添加した。チューブを１分間の中断を入れて４℃で５分の３サイクルでボルテックスした。７．５μｌの２０％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加し、ボルテックス工程を４℃で５分繰り返した。チューブを１５分間氷上に置き、ついで４℃で１０分間遠心分離した。上清を滅菌されたマイクロ遠心管に移し、全酵母タンパク質抽出物のラベルと日付を付け、−７０℃で保存した。
【実施例６】
【００８５】
ウエスタンブロット解析
各ＨＰＶ  ５２  Ｌ１構築物に関する２０の単離された酵母コロニーからの全酵母タンパク質抽出物をガラクトース誘導後のＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質発現を確認するためにウェスタンブロットで解析した。
【００８６】
１０、５、および２．５マイクログラムの全酵母タンパク抽出物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥローディングバッファーと混合し、９５℃まで１０分間熱した。およそ５５  ｋＤａのＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質をポジティブコントロールとし、ＨＰＶ  Ｌ１を含まない全酵母タンパク質抽出物をネガティブコントロール（データは示されていない）として含めた。タンパク質を１０％  ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに供し、トリス‐グリシンバッファー中で電気泳動した。タンパク質分離後、タンパク質をゲルからニトロセルロースにウエスタン移動し、生じたブロットは１×希釈バッファー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で１時間室温で振とうしながらブロックした。ブロットを３回洗浄し、ＨＰＶ  １６およびＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質と交差反応する酵母吸収処理ヤギ抗‐ｔｒｐＥ‐ＨＰＶ  ３１  Ｌ１抗血清を室温で１６時間適用した。ついでブロットを３回洗浄し、１：２５００の希釈率の抗‐ヤギ‐ＨＲＰ結合抗体で１時間インキュベートした。ついでブロットを再度３回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出基質を適用した（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。免疫反応性のタンパク質をブロット上で紫色バンドとして検出した。
【００８７】
全ての事例において、ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質はおよそ５５  ｋＤａに対応してニトロセルロース上に明瞭な免疫反応性バンドとして検出された（図４）。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒバンド（２．５  μｇのレーン）の強度はＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔバンド（１０  μｇ）よりも有意に強く見えた。ウエスタンブロット上の直接的な比較の限界ではあるが、再構築によって、コドン最適化されたＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒの発現レベルが４倍以上増加したことは明らかであり、これはウエスタンブロット上の直接的比較の限界である。
【実施例７】
【００８８】
透過型電子顕微鏡研究
５２  Ｌ１タンパク質が、実際に５量体性Ｌ１カプソメア（これは順次ウイルス様粒子に自己アセンブリする）を形成するために自己アセンブリしていることを証明するために、部分的に精製したＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒタンパク質の抽出物を透過型電子顕微鏡研究（ＴＥＭ）に供した。
【００８９】
酵母を小スケール発酵で増殖させ、ペレット化した。生じたペレットを精製処理にかけた。ペレット化および浄化した酵母抽出物をＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の発現および精製手順を通しての保持を実証するために免疫ブロット法により解析した。ついで浄化した酵母の抽出物を４５％‐スクロース緩衝剤の上で遠心分離にかけ、生じたペレットをＴＥＭによるＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ＶＬＰｓ解析ためのバッファー中に懸濁させた。
【００９０】
産生したＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒ  ＶＬＰｓの代表的なサンプルを図５に示す。この粗標本中の球形粒子の直径は、幾つかの粒子がカプソメアの規則的アレイを示している状態で、４０〜７０ｎｍの範囲であった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ−１】本発明の合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子中で改変されたヌクレオチドを比較する配列アラインメントを示す図である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、「５２  Ｌ１  Ｒ」と示される）（実施例２参照）。参照配列は５２  Ｌ１野生型配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、「５２  Ｌ１  ｗｔ」と示される；実施例１を参照）である。改変されたヌクレオチドはその対応する位置で示される。ヌクレオチド番号はカッコ内に入っている。５２  Ｌ１再構築配列内の同一のヌクレオチドは点で示されている。
【図１Ａ−２】本発明の合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子中で改変されたヌクレオチドを比較する配列アラインメントを示す図である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、「５２  Ｌ１  Ｒ」と示される）（実施例２参照）。参照配列は５２  Ｌ１野生型配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、「５２  Ｌ１  ｗｔ」と示される；実施例１を参照）である。改変されたヌクレオチドはその対応する位置で示される。ヌクレオチド番号はカッコ内に入っている。５２  Ｌ１再構築配列内の同一のヌクレオチドは点で示されている。
【図１Ｃ】本発明の合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１遺伝子中で改変されたヌクレオチドを比較する配列アラインメントを示す図である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、「５２  Ｌ１  Ｒ」と示される）（実施例２参照）。参照配列は５２  Ｌ１野生型配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、「５２  Ｌ１  ｗｔ」と示される；実施例１を参照）である。改変されたヌクレオチドはその対応する位置で示される。ヌクレオチド番号はカッコ内に入っている。５２  Ｌ１再構築配列内の同一のヌクレオチドは点で示されている。
【図２Ａ】再構築した合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１二本鎖核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および７）および個々にコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す図である。ヌクレオチド番号は左に示される。
【図２Ｂ】再構築した合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１二本鎖核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および７）および個々にコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す図である。ヌクレオチド番号は左に示される。
【図２Ｃ】再構築した合成ＨＰＶ  ５２  Ｌ１二本鎖核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および７）および個々にコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す図である。ヌクレオチド番号は左に示される。
【図３】ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔおよびＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒの転写産物のノーザンブロットを示す図である（実施例４参照）。ブロットは５２  Ｌ１  ｗｔおよび５２  Ｌ１  Ｒ配列の両方に対して生成されたＤＮＡプローブの混合物でプローブされた。右の矢印は完全長の５２  Ｌ１転写産物の予測位置を示している。５２  Ｌ１  ｗｔ  ＲＮＡの５および１０μｇのレーンでは、どの長さの転写産物も検出されなかった。完全長の転写産物は５２  Ｌ１  Ｒの、５および１０μｇのレーン両方で見られた。
【図４】ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  ｗｔ（５２  ｗｔ）および５２  Ｌ１  Ｒ（５２Ｒ）タンパク質のウエスタンブロットを示す図である。ＨＰＶ  １６  Ｌ１は参考として含めた（１６）。１０、５および２．５マイクログラムの全酵母タンパク質抽出物を変性し、１０％  ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに適用した。タンパク質はウエスタンで移動させた。ＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質はＨＰＶ  ５２  Ｌ１およびＨＰＶ  １６  Ｌ１と交差反応する酵母吸収処理抗‐ｔｒｐＥ‐ＨＰＶ  ３１  Ｌ１ヤギポリクローナル抗血清を使用して結果のブロット上で検出した。分子量マーカーは左にｋＤａで指示されている。矢印はＨＰＶ  ５２  Ｌ１タンパク質の〜５５  ｋＤａの位置を示す。
【図５】ＨＰＶ  ５２  Ｌ１  Ｒタンパク質分子からなるＨＰＶ  ５２  ＶＬＰｓの代表的な実例を示す図であり、本明細書では透過型電子顕微鏡研究で視覚化されたものとして記載されている（実施例７を参照）。この粗標本内の球形粒子の直径は、幾つかの粒子がカプソメアの規則的な配列を示している状態で、４０〜７０ｎｍの範囲であった。横棒はおよそ０．１μｍを表す。
【図１Ａ−１】
2007530040.tif 000003
【図１Ａ−２】
2007530040.tif 000004
【図１Ｃ】
2007530040.tif 000005
【図２Ａ】
2007530040.tif 000006
【図２Ｂ】
2007530040.tif 000007
【図２Ｃ】
2007530040.tif 000008
【図３】
2007530040.tif 000009
【図４】
2007530040.tif 000010
【図５】
2007530040.tif 000011
【配列表】
2007530040000001.xml
【国際調査報告】
2007530040.tif 000017
2007530040.tif 000018
2007530040.tif 000019
2007530040.tif 000020