(57)【要約】本発明は、部分Aおよび部分A'がラフト親和性部分であり、部分Bおよび部分B'がリンカーであり、部分Cおよび部分C'がファーマコフォアであって、部分Bおよび部分B'が少なくとも8個の炭素原子の骨格を有するリンカーであり、該炭素原子の1つ以上が窒素、酸素または硫黄と置換されてもよい、C−B−AまたはC'−B'−A'型の三者構造を含む化合物に関する。さらに、本発明化合物の特定の医薬的使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
三者構造：C−B−AまたはC'−B'−A'
［ここで、部分Aおよび部分A'は、ラフト親和性部分である；
ここで、部分BおよびB'は、リンカーである；
ここで、部分CおよびC'は、ファーマコフォアである；
ここで、部分Aおよび部分A'のラフト親和性は、4℃における非イオン性界面活性剤への不溶性を特徴とする脂質膜への分配を包含する；および
ここで、部分BおよびB'は、少なくとも8個の炭素原子の骨格を有するリンカーであり、1つまたはそれ以上の該炭素原子は、窒素、酸素または硫黄と置換されてもよい］
を含む化合物。
【請求項２】
部分Aおよび部分A'のラフト親和性が、コレステロールおよび／またはコレステロールの機能的類縁体、スフィンゴ脂質および／または機スフィンゴ脂質の能的類縁体、糖脂質およびグリセロリン脂質を含む脂質組成物を含む脂質膜への分配を包含する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該脂質組成物が、ガングリオシド、セレブロシド、グロボシドおよびスルファチドから選ばれる糖脂質を含む請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ガングリオシドが、GM1、GD1a、GD1b、GD3、GM2、GM3、GQ1aまたはGQ1bである請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
該スフィンゴ脂質および／またはスフィンゴ脂質の機能的類縁体が、スフィンゴミエリンまたはセラミドである請求項２〜４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項６】
該グリセロリン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンから選ばれる請求項２〜４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項７】
該脂質組成物が、5〜60%のコレステロールおよび／またはコレステロールの機能的類縁体、5〜40%のスフィンゴ脂質および／またはスフィンゴ脂質の機能的類縁体および20〜80 %のリン脂質を含む請求項２〜６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項８】
脂質膜が、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびガングリオシドを含む請求項２〜７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項９】
脂質膜が、40〜60%のコレステロール、0〜20%のスフィンゴミエリン、10〜20%のホスファチジルコリン、10〜20%のホスファチジルエタノールアミンおよび1〜10%のガングリオシドを含む請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
脂質膜が、50%のコレステロール、15%のスフィンゴミエリン、15%のホスファチジルコリン、15%のホスファチジルエタノールアミンおよび5%のガングリオシドからなる請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
該脂質膜が、該コレステロールおよび／またはその機能的類縁体、該スフィンゴ脂質および／またはその機能的類縁体および該リン脂質および／またはその機能的類縁体を等量で含む請求項２、６または７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１２】
脂質膜が、33%コレステロール、33%スフィンゴミエリン/セラミドおよび33%ホスファチジルコリンを含む請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
該部分Bおよび該部分B'が、全長1 nm〜50 nmである請求項１〜１２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１４】
ラフト親和性部分AまたはA'が、下記式2および3：
2007532512.tif 000096
［ここで、
2007532512.tif 000097
は、単結合または二重結合である；
三者構造がC−B−Aである場合、X21およびX31は、NH、O、S、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2CF2、NH(CH2)cSO2NH、NHCONH、NHCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCOO、NHCH(COOH)(CH2)dCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCONH、NHCH(COOH)(CH2)dCONH、NHCH(CONH2)(CH2)4NH((CO)CH2O)fおよびNHCH(COOH)(CH2)4NH((CO)CH2O)fから指向的に選ばれる、ここで、cは2〜3の整数であり、dは1〜2の整数であり、fは0〜1の整数であり、ここで、リンカーは、X21またはX31に結合する；
三者構造がC'−B'−A'である場合、X21およびX31は、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2CF2、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)eCH(CONH2)NHCO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)eCH(COOH)NHCO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)eCH(CONH2)NHCO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)eCH(COOH)NHCO(CH2)b(CO)aO、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOOである、ここで、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、eは1〜2の整数であり、ここで、リンカーは、X21またはX31の末端カルボニル基に結合する；および
R21およびR31は、C4−20炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］
の１つで表される請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
ラフト親和性部分AまたはA'が、以下の式4aおよび5a：
2007532512.tif 000098
［ここで、
2007532512.tif 000099
は、単結合、二重結合または三重結合であるが、ただし、
2007532512.tif 000100
が三重結合である場合、各Y42aは存在しない；
三者構造がC−B−Aである場合、X41aおよびX51aは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONH、NHCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCOO、NHCH(COOH)(CH2)dCOO、NH(CH2)4CH(CONH2)NH、NH(CH2)4CH(COOH)NH、NHCH(CONH2)(CH2)4NHおよびNHCH(COOH)(CH2)4NHから指向的に選ばれる、ここで、cは2〜3の整数であり、dは1〜2の整数であり、ここで、リンカーは、X41aまたはX51aに結合する；
三者構造がC'−B'−A'である場合、X41aおよびX51aは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3、CO(CH2)bNHCO2、CO(CH2)eCH(CONH2)NH、CO(CH2)eCH(COOH)NH、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOOである、ここで、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、eは1〜2の整数であり、ここで、リンカーは、X41aまたはX51aの末端カルボニル基に結合する；
X42aおよび各X52aは独立して、NH、O、S、OCO、NHCO、NHCONH、NHCO2またはNHSO2である；
Y41aは、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲンまたはOであるが、ただし、Y41aがNH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲンである場合、
2007532512.tif 000101
は、単結合であり、Y41aがOである場合、
2007532512.tif 000102
は、二重結合である；
各Y42aは独立して、HまたはOHである、ただし、Y42aがOHである場合、
2007532512.tif 000103
は、単結合である；
R41aは、C10−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される；および
R42aおよび各R52aは独立して、C14−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］
の１つで表される請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
ラフト親和性部分AまたはA'が、以下の式6および7：
2007532512.tif 000104
［ここで、
2007532512.tif 000105
は、単結合、二重結合または三重結合である；
三者構造がC−B−Aである場合、X61およびX71はOである、ここで、リンカーは、X61またはX71に結合する；
三者構造がC'−B'−A'である場合、X61およびX71は、CO(CH2)b(CO)aOである、ここで、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、ここで、リンカーは、X61またはX71の末端カルボニル基に結合する；
各X75は独立して、CO−C13−25炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素、以下の式：
2007532512.tif 000106
または以下の式：
2007532512.tif 000107
で示される基で置換される；
X62および各X72は独立して、OまたはOCOである；
X63およびX73は、PO3−CH2、SO3CH2、CH2、CO2CH2および直接結合から指向的に選ばれる；
X64およびX74は、NH、O、S、OCO、NHCO、NHCONH、NHCO2またはNHSO2である；
X76は、CO(CH2)b(CO)aOおよびCO(CH2)b(CO)aNHから指向的に選ばれる、ここで、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数である；
Y61は、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲンまたはOであるが、ただし、Y61がNH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲンである場合、
2007532512.tif 000108
は、単結合であり、Y61がOである場合、
2007532512.tif 000109
は、二重結合である；
各R61および各R71は独立して、C16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される；
R62は、C13−25炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される；および
R72は、C4−20炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］
の１つで表される請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
ラフト親和性部分AまたはA'が、以下の式18aおよび18b：
2007532512.tif 000110
［ここで、
三者構造がC−B−Aである場合、X181aおよびX181bは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONHおよびNHCOOから指向的に選ばれる、ここで、cは2〜3の整数であり、ここで、リンカーは、X181aまたはX181bに結合する；
三者構造がC'−B'−A'である場合、X181aおよびX181bは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3またはCO(CH2)bNHCO2である、ここで、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、ここで、リンカーは、X181aまたはX181bの末端カルボニル基に結合する；
各Y181aおよび各Y181bは独立して、NH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲンである；
各X182aおよび各X182bは独立して、O、NH、OCOまたはNHCOである；および
各R181aおよび各R181bは独立して、C15−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］
で表される請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
ラフト親和性部分AまたはA'が、以下の式19aおよび19b：
2007532512.tif 000111
［ここで、
2007532512.tif 000112
は、単結合または二重結合である；
三者構造がC−B−Aである場合、X191aは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONH、NHCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCOO、NHCH(COOH)(CH2)dCOO、NH(CH2)4CH(CONH2)NH、NH(CH2)4CH(COOH)NH、NHCH(CONH2)(CH2)4NHおよびNHCH(COOH)(CH2)4NHから指向的に選ばれる、ここで、cは2〜3の整数であり、dは1〜2の整数であり、ここで、リンカーは、X191aに結合する；
三者構造がC'−B'−A'である場合、X191aは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3、CO(CH2)bNHCO2、CO(CH2)eCH(CONH2)NH、CO(CH2)eCH(COOH)NH、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOOである、ここで、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、eは1〜2の整数であり、ここで、リンカーは、X191aの末端カルボニル基に結合する；
三者構造がC−B−Aである場合、X191bは、NH(CH2)cNHCOである、ここで、cは2〜3の整数であり、ここで、リンカーは、X191bの末端アミノ基に結合する；
三者構造がC'−B'−A'である場合、X191bは、COである、ここで、リンカーは、X191bに結合する；
X192aは、NHCOCH2NHまたはNHCOCH2OCH2CH2OCH2CH2NHから指向的に選ばれる；
X192bは、COCH2CH2NHCOCH2またはCOCH2から指向的に選ばれる；
X193aおよび各X193bは独立して、O、NH、C1−8 アルキレン−OおよびC1−8 アルキレン−NHから指向的に選ばれる；
Y191aは、NH2、OHまたはHである；
R191aおよび各R191bは独立して、C4−18炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される；および
R192aは、C13−25炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］
で表される請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
リンカーBまたはB'が、以下の式20：
2007532512.tif 000113
［ここで、
m20は3〜80の整数である；
各n20は独立して、0〜1の整数である；
各Raaは独立して、天然のアミノ酸の側鎖のいずれかであり、必要に応じて色素標識で置換される；
ここで、三者構造C−B−Aにおいて、C末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、N末端は、ファーマコフォアCに結合する；および 
ここで、三者構造C'−B'−A'において、N末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、C末端は、ファーマコフォアC'に結合する］
で表される請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
リンカーBまたはB'が、以下の式21：
2007532512.tif 000114
［ここで、
各n21は独立して、1〜2の整数である；
各o21は独立して、1〜3の整数である；
各p21は独立して、0〜1の整数である；
k21および各m21は独立して、0〜5の整数である；
l21は0〜10の整数である、ただし、k21およびl21の合計は少なくとも1である；および
Raaは、請求項１９と同意義である；
ここで、三者構造C−B−Aにおいて、C末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、N末端は、ファーマコフォアCに結合する；および 
ここで、三者構造C'−B'−A'において、N末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、C末端は、ファーマコフォアC'に結合する］
で表される請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
リンカーBまたはB'が、以下の式22：
2007532512.tif 000115
［ここで、
m22は0〜40の整数である；
n22は0〜1の整数である；
各o22は独立して、1〜5の整数である；
各X221は独立して、NHまたはOである；および
Raaは、請求項１９と同意義である；
ここで、三者構造C−B−Aにおいて、C末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、X221末端は、ファーマコフォアCに結合する；および
ここで、三者構造C'−B'−A'において、X221末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、C末端は、ファーマコフォアC'に結合する］
で表される請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
リンカーBまたはB'が、以下の式23：
2007532512.tif 000116
［ここで、
m23は0〜40の整数である；
n23は0〜1の整数である；
各o23は独立して、1〜5の整数である；および
Raaは、請求項１９と同意義である；
ここで、三者構造C−B−Aにおいて、SO2末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、N末端は、ファーマコフォアCに結合する；および 
ここで、三者構造C'−B'−A'において、N末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、SO2末端は、ファーマコフォアC'に結合する］
で表される請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
ファーマコフォアCまたはC'が、酵素、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体、アプタマー、ペプチド、融合タンパク質、小分子インヒビター、炭素環式化合物、複素環式化合物、ヌクレオシド誘導体およびアニリノナフタレン化合物から選ばれる請求項１〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
ファーマコフォアCまたはCが、酵素インヒビターである請求項１〜２２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２５】
酵素インヒビターが、ベータセクレターゼインヒビターIIIである請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
ファーマコフォアCまたはC'が、受容体インヒビターである請求項１〜２２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２７】
受容体インヒビターが、EGF受容体インヒビターである請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
該EGF受容体インヒビターが、アプタマー A30、抗体IMC−C225またはその機能的フラグメント、抗体ABX−EGFまたはその機能的フラグメント、抗体EMD7200またはその機能的フラグメント、抗体hR3またはその機能的フラグメントまたは抗体トラスツズマブまたはその機能的フラグメントから選ばれる請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
ファーマコフォアCまたはC'が、ETBRアンタゴニストである請求項１〜２２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項３０】
該ETBRアンタゴニストが、A−192621である請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
ファーマコフォアCまたはC'が、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン・シレキセチル(TCV−116)またはイルベサルタンである請求項１〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項３２】
該アニリノナフタレン化合物が、ビス−ANS(ビス8−アニリノナフタレンスルホネート)、ANS(8−アニリノナフタレンスルホネート)およびAmNS(1−アミノ−5−ナフタレンスルホネート)から選ばれる請求項２３に記載の化合物。
【請求項３３】
ファーマコフォアCまたはC'が、抗ウイルス薬である請求項１〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項３４】
抗ウイルス薬が、ザナミビル(2,4−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロ−4−グアニジノシアル酸)、オセルタミビル(エチル(3R,4R,5S)−4−アセトアミド−5−アミノ−3−(1−チルプロポキシ)−1−シクロヘキセン−1−カルボキシレート)、RWJ−270201(ペラミビル)、BCX−1812、BCX−1827、BCX−1898、BCX−1923、ノラキン(1−トリシクロ−(2,2,1,0)−ヘプチル−(2)−1−フェニル−3−ピペリジン−プロパノール；トリペリデン)、アキネトン(α−5−ノルボルネン−2−イル−α−フェニル−1−ピペリジンプロパノール；ビペリデン)、アンチパルキン(エチルベンズヒドラミン)およびパルコパン(トリヘキシフェニジル)から選ばれる請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
抗ウイルス薬が、フゼオン、T20、T1249、コセラン、AMD3100、AMD070、SCH351125およびAD101から選ばれる請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
以下の式24b：
2007532512.tif 000117
で表される請求項２５に記載の化合物およびその医薬的に許容しうる塩。
【請求項３７】
以下の式25b：
2007532512.tif 000118
で表される請求項２５に記載の化合物およびその医薬的に許容しうる塩。
【請求項３８】
請求項１４〜１８のいずれかに記載のラフト親和性部分A'および式28：
2007532512.tif 000119
［ここで、
R28aaは、色素標識で置換された天然のアミノ酸の側鎖である；
R28bbは、HまたはCH2CONH2である；および
m28およびn28は独立して、1〜3の整数である；
ここで、リンカーのN末端は、ラフト親和性部分A'に結合する］
で表されるリンカーを含む化合物。
【請求項３９】
リンカーが、式28a：
2007532512.tif 000120
で表される請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか１つに記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４１】
神経障害の治療、予防および／または改善用医薬組成物の製造のための請求項１〜２５、３７および３８のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項４２】
該神経障害が、アルツハイマー病またはダウン症候群である請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
増殖性障害またはガンの治療、予防および／または改善用医薬組成物の製造のための請求項１〜２３、２７および２８のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４４】
該ガンが、乳ガン、結腸ガン、胃ガン、泌尿生殖器ガン、肝臓ガン、頭頸部ガン、肺ガンまたは皮膚ガン(黒色種)から選ばれる請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
乳ガンの治療、予防および／または改善用医薬組成物の製造のための請求項２７および２８のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４６】
高血圧および／または鬱血性心不全の治療、予防および／または改善用医薬組成物の製造のための請求項２９〜３１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４７】
プリオン(PrP)関連疾患の治療、予防および／または改善用医薬組成物の製造のための請求項４３に記載の化合物の使用。
【請求項４８】
感染性疾患の治療、予防および／または改善用医薬組成物の製造のための請求項１〜２３および３３〜３５に記載の化合物の使用。
【請求項４９】
感染性疾患が、ウイルス感染である請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
ウイルス感染が、HIV感染である請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
ウイルス感染が、インフルエンザ感染である請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
感染性疾患が、細菌感染である請求項４８に記載の使用。
【請求項５３】
細菌感染が、マイコバクテリア感染または大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、コレラ菌、クロストリジウム・ディフィシル、破傷風菌、サルモネラ菌または赤痢菌の感染である請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
マイコバクテリア感染が、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの感染またはマイコバクテリウム・カンサシイもしくはマイコバクテリウム・ボビスの感染である請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
寄生虫感染の治療用医薬組成物の製造のための請求項１〜２３のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項５６】
寄生虫感染が、熱帯熱マラリア原虫感染またはトリパノソーマ、リーシュマニアまたはトキソプラズマ原虫による感染である請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
a)ラフト脂質のホスホリル頭部基または同等の頭部基と、ラフト会合型標的分子上ファーマコフォアC/C'の結合および／または相互作用部位との間の距離を決定し；
b)a)において決定した距離を橋渡しする能力があるリンカーB/B'を選択し；次いで、
c)b)において選択したリンカーによってラフト親和性部分A/A'およびファーマコフォアC/C'を結合する；
ステップを含む請求項１〜３５のいずれか１つに記載の化合物の製造方法。
【請求項５８】
請求項１〜３５のいずれか１つに記載の化合物および1つまたはそれ以上の医薬的に許容しうる賦形剤を混合することを含む医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部分Aおよび部分A'がラフト親和性部分であり、部分Bおよび部分B'がリンカーであり、部分Cおよび部分C'がファーマコフォアであって、部分Bおよび部分B'が少なくとも8個の炭素原子の骨格を有するリンカーであり、該炭素原子の1つ以上が窒素、酸素または硫黄と置換されてもよい、C−B−AまたはC'−B'−A'型の三者構造を含む化合物に関する。さらに、本発明化合物の特定の医薬的使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を形成する脂質二重層は、数十年間、生化学者および生物物理学者により、その組織化が徹底的な調査の目的となっている二次元の液体である。二重層のバルクは、均質な流体であるとみなされているが、我々の二重層液体の構造および動力学のモデルに、側方不均質性、脂質微小ドメインを導入しようとする試みが繰り返し行われている(Glaser、Curr. Opin. Struct. Biol. 3(1993)、475−481；Jacobson、Comments Mol. Cell Biophys. 8(1992)、1−144；Jain、Adv. Lipid Res. 15(1977)、1−60；Vaz、Curr. Opin. Struct. Biol. 3(1993))。上皮細胞が、その細胞表面をそれぞれの部分において異なるタンパク質および脂質組成をもつ頂端部および側底部へと二極化させるという理解が、「脂質ラフト」という概念をもたらす新たな進展を引き起こした(Simons、Biochemistry 27(1988)、6197−6202；Simons、Nature 387(1997)、569−572)。膜タンパク質のプラットホームとして機能するスフィンゴ脂質およびコレステロールの集合という概念は、これらの集合が界面活性剤抽出を切り抜けるという観察によって促進され、界面活性剤耐性膜DRM(Brown、Cell 68(1992)、533−544)と呼ばれている。これは、ラフト会合が4℃におけるTriton−X100抽出に対する耐性と同等にみなされる作戦上の飛躍的躍進であった。界面活性剤耐性の喪失をもたらす、メチル−β−シクロデキストリンを用いるコレステロールの枯渇(Ilangumaran、Biochem. J. 335(1998)、433−440；Scheiffele、Embo J. 16(1997)、5501−5508)という第2の判断基準の追加により、当分野における幾つかのグループが、広範な生体反応における脂質微小ドメインの役割を探求することに眼を向けることになった。今や、細胞極性、タンパク質輸送およびシグナルトランスダクションなどの多くの細胞過程を調節することにおける脂質集合体の役割に対するサポートが数多く存在する。細胞膜は二次元の液体である。したがって、側方不均質性は、膜平面における液−液非混和性を意味する。水和脂質二重層が、温度の関数として相転移をうけることはよく知られている。それぞれの脂質の種類に対して決まった温度で起こるこれらの転移は、系の順序において常に幾つかの変化を含む。これらの転移の最も重要なものは、二重層が、高秩序の疑似二次元結晶個体から疑似二次元液体に変換される、いわゆる「主」または「鎖融解」転移である。それは、系の順序、特に、二重層平面における翻訳（位置）順序およびこの平面に対して垂直方向での脂質鎖のコンホメーション順序における劇的な変化を含む。翻訳順序は、膜の平面における側方拡散係数に関連し、コンホメーション順序は、アシル鎖におけるトランス／ゴーシュ比に関連する。主転移は、2つの相が、転移温度より下の秩序固体(so)および転移温度より上の無秩序液体(ld)としてラベリングされうるような、秩序−無秩序相転移として述べられている。コレステロールおよびリン脂質は、コレステロールに乏しい無秩序液体(ld)相と共存することによって完全液体相膜において相共存を許容することができる秩序液体相(lo))を形成する能力がある(Ipsen、Biochem. Biophys．Acta 905(1987) 162−172；Ipsen、Biophys. J. 56(1989)、661−667)。ステロールは、隣接する脂肪族鎖にコンホメーション順序を強いることができるその平坦で厳密な分子構造の結果として、ステロールが鎖の最も近い隣である場合、対応する脂質の翻訳可動性の劇的な��下を強いることなく(Nielsen、Phys. Rev. E. Stat. Phys. Plasmas Fluids Relat．Interdiscip。Topics 59(1999)、5790−5803)、そのようになる(Sankaram、Biochemistry 29(1990)、10676−10684)。ステロールがso(ゲル)脂質二重層の結晶格子に正確にフィットしないという事実により、もしそれがこの相に溶解するならば、それは、コンホメーション順序を有意に攪乱させることなく、結晶翻訳順序を混乱させるであろう。したがって、適切なモル分率におけるコレステロールは、ldまたはso脂質二重層相を秩序液体(lo)相に変換することができる。
【０００３】
ラフトは、膜成分を細胞膜内に隔離するように機能する特定の化学成分（細胞膜の外葉におけるスフィンゴミエリンおよびコレステロールに富む）の脂質プラットホームである。ラフトは、相対的に小さい（直径30−50 nm、使用したプローブおよび検定した細胞型に応じて、大きさの推定は著しく変化する）と理解される。脂質組成に関する選択性は、不均質モデル膜系における相分離挙動を暗示する。事実、化学組成および界面活性剤溶解度における多くの特性は、不飽和ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン（または長鎖飽和ホスファチジルコリン）およびコレステロール三成分混合物からなるモデル系において観察されるものと同一である(de Almeida、Biophys. J. 85(2003)、2406−2416)。ラフトは、形質膜を構成する不均質l相脂質二重層におけるlo相のドメインであるとみなされることができた。他の共存相（1つまたは複数）は、現在明らかではない。生体膜は液体であるというコンセンサスがあり、したがって、so相共存は、ほとんどの場合無視されてよい。他の相（1つまたは複数）が、ldまたはlo相であるかどうかは、この相（1つまたは複数）を構成するリン脂質の化学的同一性およびその中のコレステロールのモル分率に応じて変わる。ラフトは、秩序液相と同等であるとみなされることができ、膜の残りを非ラフト液相と呼ぶ。熱力学の観点から、相は常に、多数の分子からなる巨視的系である。しかし、脂質二重層において、相はしばしば小さいドメイン（ほんの2,3千個の分子であることが多い）に細分化される傾向があり、そのそれぞれは、それ自体に相の熱力学的決定を厳密に満足するのに十分な数の分子をもたない。この種のメゾスコピック状態に対する、より良い表現および特定の系において多数のドメインがあるという仮定が無い場合は、同じ特性が、相を表すドメインに起因するように、あたかもドメインが巨視的相の一部であるかのようにそのドメインを処理することができる。この定義は、ドメインが小さくなりすぎないので、おそらく適切である。したがって、秩序液体ラフト相は、膜におけるラフト相のすべてのドメイン（小さいものまたはクラスター状のもの）を含む。ラフトを取り囲む膜の残りである液相は、均質な浸透液体相であってもよく、あるいは、まだ特徴決定されていない液体ドメインにさらに細分化されてもよい。
【０００４】
従来技術は、幾つかの医薬品が、細胞膜またはウイルスエンペロープなどの生体膜において活性があるという仮説を立てている。たとえば、抗HIV剤であるコサラン（cosalane）が、gp120がCD4に結合するのを阻害すること、ならびに逆転写前に結合後イベントを阻害することによって作用することが自明のこととして仮定された；Cushman、J. Chem. 37(1994)、3040。コサランのコレスタン部分は、脂質二重層に埋め込まれていることが推測され、「Golebiewski、Bioorg. & Med. Chemistry 4(1996)、1637」は、コサランのリンカーへのリン酸基の組み込みが、得られるホスホジエステルをポリ脂質の構造に似たものにすると推測している。
【０００５】
「Ruell、J. Org. Chem. 64(1999)、5858」において、コサラン化合物に対する研究が拡張された。特に、コサランファーマコフォア類縁体が、本来提案されるベンジルエーテル連鎖の代わりに、その末端置換安息香酸環に結合した短いアミドおよびメチレンリンカーを有することが提示される。この研究は、提案されたコサラン型化合物が、中間体または出発物質としてコサラン自身を利用しない経路によって接近可能であることを実証し、HIV−Iの細胞変性作用の阻害におけるインビトロ効果が示された。「Casimiro−Garcia、J. Bioorg. Med. Biochem. 8(2000)、191」において、コサランのアルケニル−リンカー鎖にアミド基またはアミノ部分が導入されたコサラン類縁体が提案される。この場合も、コサラン類縁体は、HIV−1およびHIV−2の細胞変性作用をインビトロで阻害した。さらに、コサラン類縁体は、US 5,439,899、US 6,562,805およびUS 2003/0212045から知られている。すべてのこれらのコサラン化合物／類縁体は、そのリンカー構造に修飾を含む。さらに、特にコサランの薬理学的部分が、この研究において修飾された。これらの修飾は、膜組み込みの有効性を増強しようとして行われたが、すべてのケースにおいて強度が減少した。この場合も、すべての公知のコサランおよびコサラン類縁体は、異なる生体膜を識別する能力、および／または異なる膜を分配する能力がない構造を含む。「2001、Hussey Organic Letters 4、415−418」に、内部移行による細胞へのエストラジオールのデリバリーのために設計された、コレステロールおよびコレスチラミンに結合したキメラエストラジオール誘導体の合成が記載された。同様に、「Hussey、J．Am. Chem. Soc. 123(2001)、1271−1273」には、哺乳動物細胞へのマクロ分子の細胞内デリバリーのための合成ストレプトアビジンタンパク質複合体が提案されている。「Hussey、J．Am. Chem. Soc. 124(2002)、6265−6273」には、コレステロールおよびスフィンゴ脂質との非共有結合性相互作用によるストレプトアビジンの細胞取り込みを可能にする、さらなる合成分子が記載され、脂質ラフトが議論されている。対応する化合物は、11原子のテザーを介してD−ビオチンに結合したコレステリルアミンの誘導体を含む。「Martin、Bioconjugate Chem. 14(2003)、67−74」には、コレステリルアミンでキャップされたペプチドを含む非天然細胞表面受容体が提案されている。これらの「非天然受容体」のためのリガンドは、ペプチド部分に非共有結合的に結合することが推定され、提案されたリガンドは、抗−HA、抗−Flagまたはストレプトアビジンを含む。この場合も、細胞へのマクロ分子取り込みのためのデリバリー戦略として非天然細胞膜受容体が提案されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の根本をなす問題は、哺乳動物細胞のスフィンゴ脂質／コレステロール微小ドメインにおいて起こる生化学的相互作用または過程に起因するか、またはそれに結びついた障害における医学的／薬学的介入のための化合物および方法の提供であった。
この技術的問題の解決は、請求の範囲に記載の具体例を提供することによって達成される。
したがって、本発明は、部分Aおよび部分A'がラフト親和性部分であり、部分Bおよび部分B'がリンカーであり、部分Cおよび部分C'がファーマコフォアであって、部分Aおよび部分A'のラフト親和性が、4℃における非イオン性界面活性剤への不溶性を特徴とする脂質膜への分配を包含し、部分Bおよび部分B'が少なくとも8個の炭素原子の骨格を有するリンカーであり、該炭素原子の1つ以上が窒素、酸素または硫黄と置換されてもよい、三者構造：C−B−AまたはC'−B'−A'を含む化合物を提供する。
【０００７】
用語「三者構造」は、共有結合的に結合したラフト親和性部分、リンカーおよびファーマコフォアを含む化合物に関し、したがって、該三者構造の個々の部分は、本明細書において、ラフト親和性部分について「部分Aおよび部分A'」、リンカーについて「部分Bおよび部分B'」および特定のファーマコフォアについて「部分Cおよび部分C'」と表示する。さらに、本発明化合物の「三者構造」が、さらなる構造的または機能的部分も含んでもよいことに注目すべきである。これらは、本発明構築物のN−またはC末端に結合するか、または、たとえば側鎖を介して、リンカー「C」および「C'」に結合することができる標識（たとえば、放射性標識、蛍光標識、精製タグなど）を含むが、それらに限定されるものではない。本発明構築物のさらなる機能的または構造的ドメインは、脂質ラフトにおける本発明構築物の集積を熱力学的にサポートするために、荷電基、水素結合を受容または供与することができる極性基、親油性または親水性コンパートメント間を媒介する両親媒性基、互いに相互作用しうる基などの非共有結合的に架橋する官能基を含む。さらなる機能的または構造的ドメインは、ファーマコフォア部分に直接結合しないのが好ましい。追加ドメインまたは部分が、直接的または間接的のいずれかでリンカーB/B'と接触するのが最も好ましい。
【０００８】
用語「ラフト親和性部分」は、膜ラフトと相互作用する能力がある化合物に関する。ラフトは、当業界で公知であり、特に、Simons、(1988)（前出）、またはDanielson、Biochem. Biophys. 1617(2003)、1−9を参照されたい。「ラフト親和性部分」は、天然の化合物のみならず、以下に詳述する合成化合物も含む。本発明の三者構造に含まれる「ラフト親和性部分」は、膜二重層の秩序液体(lo)相（本明細書においてラフトを意味する）に高親和性をもち、無秩序液体(ld)相（本明細書において非ラフトを意味する）と比べて、この相においてより多くの時間を費やす。ラフトへの分配は、細胞外もしくは小胞内腔空間から直接的に、または二重層から側方的に起こる。したがって、本発明構築物の「部分Aおよび部分A'」の特徴の1つは、脂質膜、好ましくは、細胞脂質膜へ分配するその能力に関し、それによって、該脂質膜は、4℃での非イオン性界面活性剤(たとえば、1.0%トリトンX−100、0.5%Lubrol WXまたは0.5%Brij 96など)への不溶性により特徴付けられる。「部分Aおよび部分A'」の特徴は、「ラフト親和性部分」が、スフィンゴ脂質およびコレステロールに富んだ微小ドメインへ挿入する、または該ドメインと相互作用する能力をもつという事実に対応する。したがって、先に定義したように、およびSimons(1988、1997)、（前出） and Brown(1992)、（前出）に教示されるように、ラフトは、（非イオン性）界面活性剤耐性膜(DRM)構造として定義することができる。したがって、特定の化合物（本明細書に定義する三者構造を有する）が、本明細書に定義する「部分A」または「部分A'」を含むかどうか、または特定の分子が本明細書に定義する「部分A/部分A'」として機能しうるかどうかを実証するための1つの可能性は、従来技術に開示されており、本明細書の実験パートに詳述したような界面活性剤耐性膜(DRM)試験である。要約すれば、非ラフトおよびラフト膜に由来する細胞膜フラクションにおける被検化合物の蓄積をDRMアッセイにおいて決定する。試験システムは、試験化合物で培養細胞を処理することを含む。インキュベーションに続いて、細胞を界面活性剤溶液に溶解し、スクロース勾配においてDRMフラクション（ラフト）を単離する。DRMフラクションを回収し、蛍光分析または定量的質量分析によって試験化合物を測定する。全膜の量と比較した場合のDRMフラクションにおいて回収された試験化合物の比率としてラフト親和性を決定する。異なる実験の結果のさらによい比較は、試験化合物のラフト親和性と公知のラフト親和性標準物質のラフト親和性とを比較することによって達成される。対応する例は、コレステリル4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノエート(コレステリルBODIPY(登録商標) FL C12、Molecular Probes（Eugene、US）製)または[3H]コレステロールである。さらに詳しくは、以下のようにDRM試験を行う。培養細胞を試験化合物とともにたとえば37℃にて1時間インキュベートし、次いで、細胞を洗浄し、冷界面活性剤、通常、冷(4℃)1%トリトンX−100で抽出する。スクロース密度勾配を通して細胞溶解液を遠心分離して、界面活性剤耐性膜を含む浮動層を作成する。ラフト親和性決定という目的のために、これらをラフトと同一であるとすることができる。ラフトおよび他の物質を集め、たとえば、質量分析または蛍光分析（試験化合物が蛍光性である場合）によって分析して、各ラフトにおける試験化合物の量を測定する。次いで、ラフトにおける相対的豊富さ（ラフト親和性）を計算する。対応する例は、実験パートにおいて提供する。
【０００９】
たとえば、コレステロール（ステロール）、スフィンゴ脂質（セラミド）、GPIアンカーまたは飽和脂肪酸などのラフト置換基脂質が、天然のラフト親和性部分であるとみなすことができる。ラフトアッセイによって決定されるように、特に、本明細書において提供されるように、これらの種類の化合物の誘導体化は、それらのラフトとの会合を妨害するとは推定されず、少なくとも親化合物と同程度に強い。
先に論じたように、このような天然のラフト親和性部分の例は、ヒドロキシル基、ステロール環または側鎖に結合した官能基を有するコレステロールの誘導体である。さらに、対応する例は、後述するとおりである。
【００１０】
リンカー(B/B')は、ラフト親和性部分(A/A')とファーマコフォア(C/C')を連結する。ラフト親和性部分およびリンカーの前駆体は、これらの間に共有結合を可能にする官能基を含む。官能基の性質は、特に限定されず、対応する例は、本明細書において後述するとおりである。ラフト親和性部分(A/A')をリンカー(B/B')に共有結合的に結合させるのに用いられるラフト親和性部分(A/A')の官能基は、本明細書において「フック」ともいう。これらのフックの化学構造は、特に限定されず、唯一の必要条件は、フックがラフトへの三者構造の解剖を妨害しないことである。好ましい具体例において、ラフト親和性部分(A/A')ラフト親和性および本発明三者構造のラフト親和性は、フックの適当な選択によって増強される。ラフト親和性部分(A/A')のラフト親和性におけるフックの影響は、後記実施例セクションにおいて実証される。
【００１１】
三者構造C'−B'−A'の場合、ラフト親和性部分A'は、リンカーB'上の求核基、すなわち、そのN末端に結合する。後記の特定の構造から明らかに分かるように、リンカーのN末端は、必ずしも窒素原子を含まなくてもよく、たとえば、X221が酸素であるリンカー22などとして酸素原子を含んでもよい。ラフト親和性部分A'をリンカーB'のN末端に結合するのに用いることができるフックの例は、スクシニルおよびアセチル基であり、ここで、リンカーB'のN末端は、スクシニルまたはアセチル基のカルボニル基に結合する。アセチル基のα炭素原子を介してラフト親和性部分A'の酸素原子に結合するアセチル基などのエーテル結合を含むフックが特に好ましい。ラフト親和性部分A'における適当なアミノ酸フックは、アスパラギン酸およびグルタミン酸であり、ここで、アミノ酸残基は、アミノ酸残基の側鎖カルボン酸基を介してラフト親和性部分に結合し、リンカーは、同じアミノ酸残基のαカルボン酸基に結合する。アミノ酸残基のαアミノ基は、たとえば、その酢酸塩として保護することができる。
【００１２】
三者構造C−B−Aの場合、ラフト親和性部分Aは、リンカーB上の求電子基、すなわちそのC末端に結合する。後記の特定の構造から明らかに分かるように、リンカーの C末端は、必ずしもC=O基でなくてもよく（たとえば、リンカー20、21および22のように）、たとえば、スルホニル(SO2)基であってもよい（たとえば、リンカー24）。ラフト親和性部分Aは、ラフト親和性部分Aの末端ヘテロ原子の使用によってリンカーBのC末端に直接カップリングすることができる。別法として、もし、直接カップリングが適当でないか、あるいは実行可能でないならば、たとえば、ラフト親和性部分AをリンカーBに結合するためのフックとしてアミノ酸を用いることができる：たとえば、ラフト親和性部分Aをリシン残基のεアミノ酸にカップリングさせることができ、リンカーBのC末端を同じリシン残基のαアミノ基にカップリングさせることができる。ラフト親和性部分A上の他の適当なアミノ酸フックは、アスパラギン酸およびグルタミン酸であり、ここで、アミノ酸残基は、アミノ酸残基の側鎖カルボン酸基を介してラフト親和性部分に結合し、リンカーは、同じアミノ酸残基のαアミノ基に結合する。アミノ酸フックにおいて、αカルボン酸基は、たとえば、第一級アミドとして保護することができる。
【００１３】
合成ラフト親和性部分は、ラフトに高親和性を有するが、天然のラフト脂質置換基の類縁体または誘導体でない部分またはその前駆体である。この場合も、このような合成ラフト親和性部分の例を本明細書において提供する。
上に指摘するように、水相からラフトドメインに分配するか、または周囲の非ラフトバルク脂質からラフトドメインに側方分離する化合物の傾向は、効率的な集積またはラフト脂質による化合物のパッキングを可能にするその構造の特定の性質にある。特に、ラフト親和性は、ラフトの脂質成分またはラフト会合型膜タンパク質の膜貫通部分との化合物の相互作用によって決定され、特に、先に概要を述べたDRMアッセイまたは後述および実施例に記載するLRAなどの本明細書で提供するアッセイによって決定される。
【００１４】
ラフト親和性に関連する特徴は、単独または組み合わせにおいて、炭化水素鎖またはトランス不飽和を含む鎖の疎水性および分枝度、スフィンゴ脂質およびコレステロールによって実証されるようラフトの上部での水素結合能力、ほとんど平坦な炭素環構造、マルチ炭化水素鎖、スフィンゴ脂質とコレステロールで効率的にパックする構造および集積が熱力学的に有利である構造である。
【００１５】
好ましいラフト親和性部分「A/A'」において、炭化水素鎖は、スフィンゴ脂質およびコレステロールなどのラフトの天然の構成要素に見出される炭化水素鎖に対応する全長を用いる。たとえば、後記の式2および3によって表される部分において、約8〜12個の炭素原子の長さを有する炭化水素鎖が好ましい。後記の式4aおよび5aによって表される部分において、約18〜２４個の炭素原子の長さを有する炭化水素鎖が好ましい。さらにラフトにおけるスフィンゴ脂質およびコレステロールによる効率的なパッキングは、飽和直鎖炭化水素鎖を選択することによって促進される。1つ以上の長鎖置換基を有するラフト親和性部分「A/A'」において、長鎖置換基間の炭素原子の数の相異が、4以下であるのが好ましく、2以下がより好ましい。たとえば、もしラフト親和性部分「A/A'」が、直鎖C18アルキル基である第1長鎖置換基を有するならば、第2長鎖置換基は直鎖C14−22アルキル基であるのが好ましく、直鎖C16−20アルキル基であるのがより好ましい。ラフト親和性部分「A/A'」上の2つ以上の長鎖置換基の間の炭素原子の数の差異を最小化することによって、この部分の全体的円錐形を回避することができ、ラフトに組み込まれたラフト親和性部分上の「A/A'」のディスラフト効果を最小化することができる。
特定の構造的特徴は、ラフトから排除され、したがって、ラフト親和性部分に含まれることができない。このような特徴は、cis−不飽和（たとえば、ジオレイルホスファチジルコリン）、直交複素環構造およびヌクレオシドをもつ炭化水素鎖を含む。
【００１６】
ラフトドメインへの分配に対する化合物の傾向は、検討中の脂質膜系との一定のインキュベーション時間後のラフトドメインおよび非ラフトドメインにおける化合物の濃度を測定するアッセイにおいて決定される。先に論じたDRM試験以外には、リポソームラフト親和性アッセイ(LRA)を用いることができる。簡単に述べると、非ラフト脂質（たとえば、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど）からなる単層リポソームまたはラフト脂質（たとえば、スフィンゴ脂質、ホスファチジルコリンおよびコレステロールなど）からなるリポソームを、本発明三者構造化合物または本発明の三者構造化合物の「部分A/A'」として機能することができると予測される部分の前駆体などの試験化合物とともに水性懸濁液中で、たとえば、37℃にて1時間インキュベートする。フラクションを分離し、各試験化合物の量を測定する。各リポソーム型について、リポソームに取り込まれた試験化合物の量から親油性値を決定する。ラフト親和性は、特定の化合物におけるラフト対非ラフトリポソームについての親油性の比として定義される。この場合も、対応する例を実験パートにおいて示す。さらに、当業者であれば、以下に要約するプロトコルを行うことによってLRAを容易に行うことができる。化合物の親油性を、特に、該LRAによって測定する。各リポソームの型（ラフトまたは非ラフト）について、親油性は、水相（すなわち、上清中の濃度）対脂質層（ラフトまたは非ラフト）（すなわち、リポソームを構成する脂質中の濃度）間の分配として定義される。
【００１７】
試験システムは、試験化合物が見出される3つの成分である脂質膜、水性上清および試験管壁を含む。インキュベーションに続いて、システムからリポソームを除去し、蛍光光度法または定量的質量分析によって水性および試験管壁フラクション中の試験化合物を測定する。データをコンピューター処理して、分配係数およびラフト親和性を得る。
したがって、本明細書に記載され、当業界で公知でもあるLRAは、本明細書に記載する三者構造を含む化合物のラフト親和性または本明細書に定義され、本発明化合物において利用される「部分A」ならびに「部分A'」の前駆体のラフト親和性を解明するためのさらなる試験システムを提供する。
【００１８】
本発明において、当業者が容易にリポソームを作成することができるということに留意すべきである。これらのリポソームは、前述の「ラフト」リポソームならびに「混合」リポソームおよび「非ラフト」リポソームを含む。対応する脂質は、当業界で公知である。「リポソーム形成脂質」は、疎水性および極性頭部基部分を有し、(a)リン脂質などの水中に自発的に二重層小胞を形成することができるか、または(b)二重層膜の内部疎水領域と接触する疎水性部分および膜の外部極性表面に向かう方向の極性頭部基部分をもつ脂質二重層に安定に組み込まれる両親媒性脂質を意味する。この型のリポソーム形成脂質は、典型的に、1つまたは2つの疎水性アシル炭化水素鎖またはステロイド基を含み、極性頭部基にアミン、酸、エステル、アルデヒドまたはアルコールなどの化学的反応性基を含むことができる。この種類の脂質として、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルイノシトール(PI)およびスフィンゴミエリン(SM)などのリン脂質が挙げられ、ここで、2つの炭化水素鎖は、典型的に、約14〜22個の炭素原子の長さであり、種々の不飽和度を有する。ラフト脂質は本明細書に定義される。
【００１９】
本発明の三者構造において用いる用語「リンカー(リンカー構造)」は、ラフト親和性部分AまたはA'とファーマコフォアCまたはC'を連結するために用いられる。これらのサブユニットは、ラフト親和性部分AまたはA'によるラフト親和性という観点においても、ファーマコフォアCまたはC'による薬剤活性という観点においても競争すべきではない。本発明にしたがって、リンカーはむしろ、ファーマコフォアに対するラフト親和性部分の共有結合を提供し、ラフト親和性部分が、たとえば、脂質ラフトにおける富化およびアンカリングなどのその機能を遂行するのを可能にするため、ならびにファーマコフォアが、酵素の阻害などのその機能を遂行するのを可能にするためのラフト親和性部分およびファーマコフォアの間の理想的な距離を提供する。この目的のために、リンカーの長さは、モジュール式組み立てによってケース毎に状況に適合される。
【００２０】
該リンカー(部分Bおよび部分B')のサブユニットは、アミノ酸、誘導体化もしくは官能性化アミノ酸、ポリエーテル、ウレア、カルバメート、スルホネートまたは上述の必要条件を満たす、すなわち、ラフト親和性部分(「部分Aおよび部分A'」)とファーマコフォア(「部分Cおよび部分C'」)の間の距離を提供するその他のサブユニットであってよい。
上述したように、部分Bおよび部分B'は、少なくとも8個の炭素原子(C)骨格を有するリンカーであり、ここで、1つまたはそれ以上の該炭素原子は、窒素(N)、酸素(O)またはイオウ(S)で置換されてもよい。該骨格が、少なくとも8個、最大で390個の原子を有するのが好ましく、該骨格が、少なくとも9個、最大で385個の原子を有するのがより好ましく、該骨格が、少なくとも10個、最大で320個の原子を有するのがさらにより好ましい。
【００２１】
リンカーBまたはB'が、共有結合で結合したαまたはβアミノ酸の配列を含むならば、骨格において上述した原子が、少なくとも9個および最大で320個であるのが好ましく、10〜80個、より好ましくは20〜70個、さらに好ましくは30〜65個、最も好ましくは34〜60個の炭素原子の骨格を有するアミノ酸からなるリンカーがより好ましい。該リンカーBまたはB'がポリエーテル（ポリエーテル骨格をもつアミノ酸）の配列を含む場合、該リンカーが、骨格中に9〜285個の原子を有するのが好ましい。リンカーBまたはB'がウレアを含む場合、骨格における好ましい原子数は、10〜381個である。カルバメートでできた骨格構造は、部分Bまたは部分B'に10〜381個の原子を有し、スルホンアミドからなるリンカー部分Bまたは部分B'が、少なくとも8個および最大で339個の原子を有するのが好ましい。
したがって、部分Bまたは部分B'の全長は、1 nm〜50 nm、より好ましくは5〜40 nm、より好ましくは8 nm〜30 nmおよび最も好ましくは10 nm〜25 nmである。
【００２２】
本明細書に定義する構造/部分、特にリンカーの長さは、分子モデリング（Hyperchem(登録商標)などの標準的ソフトウェアを用いるのが好ましい）など（これらに限定されるものではない）の当業界で公知の方法によって決定することができる。さらに、対応する長さ（または部分A/A'と部分C/C'の間の距離）は、結晶解析法、特にX線結晶解析によって推定することもできる。このようなX線結晶解析法は、当業界で公知であり［特に、McRee(1999)、Practical Protein Crystallography、2nd edition、Academic Pressにおける「X−ray chrystallography methods and interpretation」を参照のこと］、対応する情報も、インターネットから入手可能である［特に、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiにおいて、the National Center for Biotechnology Information、U.S. National Library of Medicineから入手可能なX線結晶解析構造およびタンパク質配列/ペプチド配列情報を参照のこと］。
【００２３】
リンカーの1つの機能は、二重層の脂質ラフトサブコンパートメント（ラフト）にラフト親和性部分が集積しうる方法でラフト親和性部分をファーマコフォア（インヒビターなど）に連結することであり、ファーマコフォアは、標的分子における作用の特定の部位（たとえば、インヒビター結合部位および／または相互作用部位など）と結合および／または相互作用することができる。
リンカーは、少なくとも8個の炭素原子を有する骨格構造の長さに少なくとも対応し、ラフト脂質のホスホリル頭部基または他の等価の頭部基と標的分子におけるファーマコフォア（インヒビターが好ましい）結合および／または相互作用部位との間の距離に対応する長さを有するように選択する。該結合および／または開始部位は、酵素の活性部位、タンパク質−タンパク質ドッキング部位、リガンド受容体結合部位などの天然リガンド結合部位または細胞膜タンパク質に結合するようにウイルスによって標的化される部位である。さらに、本発明は、上述した標的分子／部位に限定されない。リンカーの長さは、X線結晶解析、分子モデリングまたは異なるリンカー長さとのスクリーニングなどの当業界で公知の情報および方法によって決定することができる。
【００２４】
リンカーの長さを決定する方法の一例は、BACE−1 βセクレターゼタンパク質を考慮することによって得られる。例は、実験パートにおいても提供される。膜貫通配列とBACE−1基質アミロイド−前駆体タンパク質(APP)の切断部位との間の距離が、29アミノ酸であることが知られている(De Strooper、B.、Annaert、W.(2000)、Proteolytic processing and cell biological functions of the amyloid precursor protein、J. Cell Sci. 113、1857−70)。単純なαへリックスコンホメーションを仮定すれば、これは、この特定の例において、ラフト親和性部分とインヒビター結合部位との間の距離を橋渡しするためには、長さ29アミノ酸または10 nmのリンカーが、必要であることを意味する。
インヒビターIIIは、BACE−1 βセクレターゼタンパク質の公知のインヒビターである。インヒビターIII配列(Capell、J. Biol. Chem. 277(2002)、5637；Tung、J. Med. Chem. 45(2002)、259)は、第1のβ切断結合を非加水分解性スタチンで置き換え、C末端に4つ以上の残基を含む。インヒビターIIIから膜への24個のさらなるアミノ酸が必要である。これらのアミノ酸は、本明細書の三者化合物のために本明細書に記載した例におけるラフトへのインヒビターIIIのデリバリーのために定義されたリンカーに対応する。
【００２５】
したがって、本発明の適当な三者構造は、ファーマコフォア−Arg−His−Asp−Ser−Gly−Tyr−Glu−Val−His−His−Gln−Lys−Leu−Val−Phe−Phe−Ala−Glu−Asp−Val−Gly−Ser−Asn−Lys−ラフト親和性部分であり、ここで、ファーマコフォアは、たとえば、Glu−Val−Asn−Sta−Val−Ala−Glu−Phe(Staはスタチンである)である。たとえば、コレステリルグリコール酸は、ラフト親和性部分として用いることができる。後記式24で示される化合物も参照のこと。
別法として、上記例において10 nmの距離は、適当な数のポリエチレングリコールユニットを含むリンカーによって橋渡しされることもできる。後記の式25および25b、特に25bで示される化合物も参照のこと。この型のリンカーは水性媒体における三者構造の溶解度を増加させるので特に好ましい。
【００２６】
ラフト親和性部分−連結インヒビターの標的が、膜近位インヒビター−結合部位をもつ酵素または受容体である可能性が高いので、リンカーによって橋渡しされることが予測される長さの範囲は、上記のように、1 nm〜50 nm、好ましくは8〜30 nmである。1 nm〜50 nmは、骨格中の約8〜390個の炭素原子に対応する。当業者であれば、本明細書で定義されたリンカーの長さが、その一次構造のみならず、その二次構造（たとえば、ペプチドリンカーαへリックスおよび／またはβシート）によっても決定されるということを考慮に入れる。さらに、たとえば、Pro、Met、Cysなどのいくつかの天然アミノ酸を該リンカー内に含めてもよいが、これらは、リンカー構築物の形状に方向転換を誘発しうるので、本発明リンカーのためのビルディングブロックとして適当さが低いとみなされる。これは、インビトロ合成中の酸化に対する柔軟性または感受性の低下をもたらしうる。したがって、上記のことを考慮すると、長さ50 nmの（ペプチド）リンカーは、約80個のアミノ酸のみを必ずしも含むものではなく、より多くのアミノ酸を含んでもよい。
【００２７】
本発明の実施例および好ましい態様として、橋渡しされる範囲は、9〜240個の炭素原子に相当する、3〜80個のアミノ酸からなるポリペプチド長または3〜95個の(エチレン)グリコールユニットのポリグリコール長に相当する。しかし、リンカーが、少なくとも3個、より好ましくは少なくとも10個、さらに好ましくは少なくとも15個のアミノ酸または(エチレン)グリコールユニットを含むのが好ましい。15〜30個のアミノ酸または(エチレン)グリコールユニットからなるリンカーが最も好ましい。しかし、本発明は、アミノ酸または(エチレン)グリコールユニットからなるリンカーに限定されるものではない。上述した80ユニットという上限が、本発明構築物を制限するものではないということに留意すべきである。80ユニット以上を含むより長いリンカーが予測される。上に指摘したように、対応する距離は、前述および後述するラフト脂質内に含まれるホスホリル頭部基または対応する頭部基とファーマコフォア（阻害分子が好ましい）結合および／または相互作用部位との間の距離／長さによって定義されるべきである。
【００２８】
したがって、本発明のリンカーは、3〜80個またはそれ以上のアミノ酸を含むのが好ましく、ここで、アミノ酸は、αおよびβアミノ酸（たとえば、His、Arg、Lys、Phe、Leu、Ala、Asn、Val、Gly、Ser、Gln、Tyr、Asp、Glu、Thrおよびβ−Alaといったような天然アミノ酸など）に特定されてもよく、1つのアミノ酸側鎖（たとえば、GluまたはLysなどの）は、アッセイにおける検出のための(色素)標識（たとえば、ローダミンまたは合成によって修飾されたその誘導体など）または当業界で公知の他の標識を含んでもよい。本発明の可能な化合物は、たとえば、その三者構造を含むが、さらなる官能基、すなわち付加的標識も含む。
【００２９】
リンカーの他の機能は、インヒビターなどのファーマコフォアを疎水性脂質二重層から遠ざけること、および水性媒体における全体の化合物の溶解度を改良することである。したがって、リンカーは、極性であるのが最も好ましい。これは、両親媒性サブユニットの使用またはリンカーへの極性官能基の導入によって達成される。1つの例として、ポリペプチドリンカーへの1つまたはそれ以上のアルギニン残基の導入により、極性および溶解度が増加する。1つの好ましい実施態様において、リンカーは、水性媒体において溶解度を増加することが知られているポリエチレングリコールユニットを含む。
【００３０】
予測されるもう1つのリンカー機能は、ラフト親和性部分が、ラフトへの集積のためにそれ自身最適に位置することができるように、およびファーマコフォアがインヒビター結合部位との相互作用のためにそれ自体最適に位置することができるように、脂質二重層におけるラフト親和性部分の側方移動およびラフト親和性部分およびファーマコフォアの回転移動をも可能にすることである。
【００３１】
本明細書において提供するDRMおよびLRAなどの前述の生物学的アッセイは、本発明化合物への蛍光、放射または色素標識（たとえば、フルオレセイン、Mca、ローダミンBまたは合成によって修飾されたその誘導体）の結合によって有利になる。標識がリンカー構造に結合するのが好ましい。ラフト親和性部分およびファーマコフォアとその周囲とのそれぞれの相互作用を妨害されないように維持するために、標識をリンカーに共有結合的に結合させる（たとえば、グルタミン酸またはリシンなどのアミノ酸の側鎖に）。したがって、必要ならば、検出のための標識を行うことが、もう1つのリンカーの機能でありうる。しかし、該（検出可能な）標識は、本発明の三者構造化合物の「部分A/A'」または「部分C/C'」の一部であってもよい。
【００３２】
リンカーは、リンカーのリンカービルディングブロック（またはユニット）と呼ぶことができるサブユニットを含んでもよい。それらは特に以下に記載され、一方の端にカルボン酸またはスルホン酸官能基（「アクセプター末端」と称する）を含むことができ、他方の端にアミノまたはヒドロキシ官能基（「ドナー末端」）を含むことができる。合成経路の選択および使用したファーマコフォアのタイプに応じて、ファーマコフォアは、カルボキシル基（たとえば、インヒビターペプチドのC末端など）を介してリンカーのドナー末端に結合することができ、ラフト親和性部分は、ヘテロ原子またはラフト親和性部分のカルボキシ末端へそのεアミノ基によって、およびリンカービルディングブロックのアクセプター末端へそのαアミノ官能基によって、カップリングするリシンユニットのいずれかを介して、たとえば、リンカーのアクセプター末端に結合することができる。
【００３３】
本発明の
本発明において、用語「ファーマコフォア」は、本発明の三者化合物に含まれる共有結合している活性部位に関し、それによって、ファーマコフォアが、ラフトで起こる分子的および／または生化学的過程を妨害する能力がある阻害ユニットであるのが好ましい。
活性部分は別として、ファーマコフォアは、リンカーに結合するフック部分（たとえば、スクシニル、アセチル）も含む。さらに、色素標識、好ましくはローダミン、Mca、フルオレセインまたは合成によって修飾されたその誘導体などの蛍光色素標識が、ファーマコフォアに結合してもよい。
【００３４】
ファーマコフォアは、とりわけ、結合部位（たとえば、酵素活性部位、タンパク質−タンパク質ドッキング部位、リガンド−受容体結合部位またはウイルスタンパク質付着部位など）に対する特異性を有する小分子薬剤であってもよい。さらに、また、ファーマコフォアは、ペプチド模倣物質またはペプチド遷移状態インヒビターまたはポリペプチドもしくは(核酸)アプタマーであってもよい。下記に詳述するように、ペプチド遷移状態インヒビターの1つの例は、β切断部位におけるAPPのBACE−1切断を阻害する市販のβセクレターゼインヒビターIII(Glu−Val−Asn−Sta−Val−Ala−Glu−Phe−CONH2、ここで、Staはスタチンである)(Calbiochem)である。他の例は、 EGF受容体(ヘレグリン)インヒビターA30、核酸(RNA)アプタマー(Chen、Proc. Natl．Acad. Sci.(USA) 100(2003)、9226−31)または抗EGF受容体ブロッキング(モノクローナル)抗体（たとえば、トラスツズマブ(ヘルセプチン)など）である。小分子EGF受容体アンタゴニストとしてリファミシンの類縁体（US 6,143,740を参照）を本発明に用いることも想定される。さらに、抗HER2/新規ペプチド模倣物質(AHNP)小分子インヒビター、(Park、Nat. Biotech. 18(2000)、1948)が、本発明化合物に用いるファーマコフォアであってもよい。さらに、ノイラミニダーゼの活性部位に結合するザナミビル（リレンザ）およびオセルタミビル（タミフル）などのインフルエンザウイルスノイラミニダーゼインヒビターを用いることが想定される。
【００３５】
ファーマコフォア、好ましくはインヒビターのための主要標的は、その(インヒビター)結合部位が本発明のラフト親和性部分−リンカー−ファーマコフォア化合物に接近できるタンパク質である。したがって、これらは、たとえば、ラフトに位置するか、または機能を遂行するためにラフトに移動するタンパク質などである。
このような標的タンパク質上のファーマコフォア相互作用部位は通常、ホスホリル頭部基または原形質膜の場合は細胞外空間における、または小胞膜の場合は内腔空間におけるラフト脂質の他の等価の頭部基から1 nm〜50 nmである。
【００３６】
本発明にしたがって、驚いたことに、本明細書に記載され、上記の三者構造を有する新規化合物が、特定のファーマコフォア(特に、原形質膜および／または小胞ラフト内／上で起こる生物学的／生化学的過程のインヒビター)を、対応する標的に連結する能力があることが見出された。本発明にとって特に重要なことは、ラフト脂質の頭部基と本明細書に定義するファーマコフォアおよびその対応する標的分子の結合および／または相互作用部位との間の正確な距離を提供するのみならず、ラフト親和性部分「部分A/A'」と一緒にラフトにおけるファーマコフォアの明確な富化をも提供するリンカー構造である。この状況において、本明細書で用いる用語「ラフト」が、細胞の原形質膜上のラフトに限定されないばかりでなく、内部膜および小胞ラフトにも関連することが重要である。ラフトにおけるファーマコフォアの富化は、その濃度に基づく倍数富化を越えて効力における予期せぬ増加をもたらす。したがって、三者構造化合物のラフト親和性が、たとえば10である場合、効力における増加は、100の位である。これは、標的の近傍におけるファーマコフォアの滞留時間がより長いことによる、ファーマコフォアと標的の活性部位との間の生産的相互作用の数の増加の結果である。
【００３７】
本発明のより好ましい実施態様において、三者構造化合物は、コレステロールおよび／またはコレステロールの機能的類縁体、スフィンゴ脂質および／またはスフィンゴ脂質の機能的類縁体、糖脂質およびグリセロリン脂質などの脂質成分を含む脂質膜内に分配する能力がある「部分A/A'」を含む。
本発明において、コレステロール類縁体は、エルゴステロール、7−ジヒドロコレステロールまたはスチグマステロールである。本発明の化合物を試験するために、コレステロール類縁体を「ラフト」において用いてもよい。好ましいスフィンゴ脂質はスフィンゴミエリン、好ましいスフィンゴ脂質類縁体はセラミド、好ましい糖脂質はガングリオシドまたはセレブロシドまたはグロボシドまたはスルファチド、好ましいグリセロリン脂質は好ましくは飽和または一不飽和（脂肪酸アシル化）ホスファチジルコリンならびにホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンである。
コレステロールまたはスフィンゴ脂質の「機能的類縁体」は、とりわけ、対応するステロイドまたはラフト形成を可能にする構造的特徴を含む脂質構造を意味する(Xu、J. Biol. Chem. 276、(2001) 33540−33546、Wang、Biochemistry 43、(2004)1010−8)。
【００３８】
本発明の三者構造化合物のより好ましい実施態様において、脂質成分（部分A/A'が分配される）は、ガングリオシドまたはセレブロシドである糖脂質を含む。グロボシドが該脂質成分に含まれることも想定される。該脂質成分は、「非ラフト」脂質成分に対比して「ラフト」脂質成分であると考えられる。したがって、該脂質成分が、コレステロールおよびスフィンゴ脂質に富むのが最も好ましい。さらに、前述のように、ガングリオシドもまた含まれてもよい。これらのガングリオシドは、とりわけ、GM1、GD1a、GD1b、GD3、GM2、GM3、GQ1aまたはGQ1bであってもよい。これらのガングリオシドは、当業界で公知であり、特に、Svennerholm、Asbury、Reisfeld、「Biological Function of Gangliosides」、Elsevier Science Ltd、1994を参照のこと。
【００３９】
上記の本発明化合物のラフト親和性ならびに生物学的、生物薬剤学的および／または医薬的特性をインビトロで試験してもよい。添付の実施例は、そのためのさらなる指標を提供する。さらに、5〜60%の範囲のコレステロールおよび／またはコレステロールの機能的類縁体、5〜40%の範囲のスフィンゴ脂質および／またはスフィンゴ脂質の機能的類縁体および20〜80 %の範囲のグリセロリン脂質などの脂質成分を含む「ラフト」で対応する試験を行うのが好ましい。ラフトの脂質膜が、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびガングリオシド(ウシ脳、III型、Sigma−Aldrich Co.)を含むのが最も好ましい。ラフトの脂質膜が、40〜60%の範囲のコレステロール、10〜20%の範囲のスフィンゴミエリン、10〜20%の範囲のホスファチジルコリン、10〜20%の範囲のホスファチジルエタノールアミンおよび1〜10%の範囲のガングリオシドを含むのがより好ましい。よい例および最も好ましい「人工」ラフトは、50%のコレステロール、15%のスフィンゴミエリン、15%のホスファチジルコリン、15%のホスファチジルエタノールアミンおよび5%のガングリオシドからなる脂質膜を含む。
【００４０】
さらに、本発明化合物および特に三者構造化合物の「部分A」の前駆体を試験するために用いる脂質膜が、コレステロール、スフィンゴ脂質および／またはその機能的類縁体およびリン脂質を等量部で含むことも想定される。たとえば、「人工」ラフトは、33%コレステロール、33%スフィンゴミエリン／セラミドおよび33%ホスファチジルコリンを含む脂質膜からなることもできる。「非ラフト」脂質構造およびリポソームの例を、本明細書および添付の実施例にも挙げる。
以下に、本発明の三者構造化合物の例を挙げる。本発明化合物の特定の例を添付の請求の範囲にも挙げる。
【００４１】
以下の式において、
2007532512.tif 000002
は、単結合または二重結合を表すために用い、
2007532512.tif 000003
は、単結合、二重結合または三重結合を表すために用いる。
【００４２】
「炭化水素」は、炭素および水素原子に基づいた直鎖または分枝、飽和または不飽和、非環式または環式であるが、非芳香族の基を表すために用いる。炭化水素基は、これらの基の組み合わせを含むこともできる。必要に応じて、水素原子の一部をフッ素原子で置換することができる。たとえば、炭化水素基として、特に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルキレン−シクロアルキル基、シクロアルキレン−アルキル基、アルキレン−シクロアルケニル基およびシクロアルケニレン−アルキル基が挙げられる。シクロアルキルおよびシクロアルケニレン基が、その環に3〜8個の炭素原子を有するのが好ましい。シクロアルケニルおよびシクロアルケニレン基が、その環に5〜8個の炭素原子を有するのが好ましい。
【００４３】
本発明は、本発明化合物の医薬的に許容しうる塩を含むことを意図する。本発明化合物の医薬的に許容しうる塩は、種々の有機および無機酸ならびに塩基で形成することができる。酸付加塩の例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンホレート、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルホン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルスルホン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレートなどのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩の例として、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウムおよびカリウムなどのアルカリ金属塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩；ベンズアゼチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラビン、N−メチル−D−グルカミン、N−メチル−D−グルカミド、t−ブチルアミンなどの有機塩基（有機アミンなど）との塩、アルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩が挙げられる。
さらに、本発明における一般式は、それが示す化合物のすべての可能な立体異性体およびジアステレオマーを包含することを意図する。
【００４４】
以下の式2および3で表される部分は、本発明におけるラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000004
三者構造がC−B−Aである場合、X21およびX31は、NH、O、S、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2CF2、NH(CH2)cSO2NH、NHCONH、NHCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCOO、NHCH(COOH)(CH2)dCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCONH、NHCH(COOH)(CH2)dCONH、NHCH(CONH2)(CH2)4NH((CO)CH2O)fおよびNHCH(COOH)(CH2)4NH((CO)CH2O)f、好ましくは、NH、NH(CH2)cOPO3−およびNHCONHから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X21またはX31に結合する］。もう1つの好ましい実施態様において、X21およびX31は、NHCH(CONH2)(CH2)dCOOである。本発明において、「指向的に」は、X21およびX31で示される部分が、指示された方向においてリンカーおよび隣接構造に結合することを意味する。たとえば、NH(CH2)cOPO3−の場合、NHはリンカーに結合し、OPO3−はステロイド構造に結合する。cは2〜3の整数であり、2が好ましい。dは1〜2の整数であり、1が好ましい。fは0〜1の整数であり、0が好ましい。三者構造がC'−B'−A'である場合、X21およびX31は、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2CF2、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)eCH(CONH2)NHCO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)eCH(COOH)NHCO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)eCH(CONH2)NHCO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)eCH(COOH)NHCO(CH2)b(CO)aO、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOOであり、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONHまたはCO(CH2)bOCONH、より好ましくは、CO(CH2)b(CO)aNHまたはCO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X21またはX31の末端カルボニル基に結合する］。もう1つの好ましい実施態様において、X21およびX31は、CO(CH2)eCH(CONH2)NHCO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)eCH(COOH)NHCO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)eCH(CONH2)NHCO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)eCH(COOH)NHCO(CH2)b(CO)aO、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOOである。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。eは1〜2の整数であり、1が好ましい。
【００４５】
R21およびR31は、C4−20炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。R21およびR31が、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含むC4−20炭化水素基であるのが好ましく、C4−20アルキル基であるのがより好ましい。さらにより好ましくは、R21およびR31はC8−12アルキル基である。最も好ましくは、R21およびR31は天然コレステロールにおいて存在する分枝C8H17アルキル基である。
部分2のC3における立体中心が、天然コレステロールに見られるようであるのが好ましい。
好ましい実施態様において、
2007532512.tif 000005
は、単結合である。ステロイド骨格の炭素5および6の間の単結合の組み込みはより容易な合成を可能にする。さらに、ステロイド骨格の炭素5および6の間の単結合を有する誘導体はしばしば、対応する不飽和誘導体よりも、より高いラフト親和性を示す。
【００４６】
以下の部分200a〜200mおよび300a〜300gは、ラフト親和性部分A'のための部分2および3の好ましい例である：
2007532512.tif 000006
2007532512.tif 000007
部分200a、200b、200c、200e、200f、200j、200kおよび200lは、ラフト親和性部分A'の好ましい例である。部分200bおよび200fは、ラフト親和性部分A'のより好ましい例である。部分300aも、ラフト親和性部分A'の好ましい例である。部分200mは、ラフト親和性部分Aの特に好ましい例である。
【００４７】
以下の式4a、4b、5aおよび5bで表される部分は、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000008
三者構造がC−B−Aである場合、X41a、X41b、X51aおよびX51bは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONH、NHCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCOO、NHCH(COOH)(CH2)dCOO、NH(CH2)4CH(CONH2)NH、NH(CH2)4CH(COOH)NH、NHCH(CONH2)(CH2)4NHおよびNHCH(COOH)(CH2)4NH、好ましくは、O、NH(CH2)cOPO3−およびNHCOOから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X41a、X41b、X51aまたはX51bに結合する］。もう1つの好ましい実施態様において、X41a、X41b、X51aおよびX51bは、NHCH(CONH2)(CH2)dCOOである。cは2〜3の整数であり、2が好ましい。dは1〜2の整数であり、1が好ましい。三者構造がC'−B'−A'である場合、X41a、X41b、X51aおよびX51bは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3、CO(CH2)bNHCO2、CO(CH2)eCH(CONH2)NH、CO(CH2)eCH(COOH)NH、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOO、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aNHまたはCO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X41a、X41b、X51aまたはX51bの末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。eは1〜2の整数であり、1が好ましい。
【００４８】
X42a、X42b、各X52aおよび各X52bは独立して、NH、O、S、OCO、NHCO、NHCONH、NHCO2またはNHSO2、好ましくは、NH、O、NHCO、NHCONH、NHSO2またはOCO、より好ましくは、NHCOまたはNHSO2、さらにより好ましくは、NHCOである。
【００４９】
Y41aおよびY41bは、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲンまたはOであるが、ただし、Y41aまたはY41bが、NH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲンである場合、
2007532512.tif 000009
は単結合であり、Y41aまたはY41bがOである場合、
2007532512.tif 000010
は二重結合である。Y41aおよびY41bは好ましくは、OHまたはO、さらにより好ましくは、OHである。
【００５０】
各Y42aは独立して、HまたはOHであるが、ただし、
2007532512.tif 000011
が三重結合である場合、各Y42aは存在しない。各Y42aは好ましくはHである。
【００５１】
R41aは、C10−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R41aは、C10−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、R41aは、C13−19アルキル基である。
【００５２】
R42aおよび各R52aは独立して、C14−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R42aおよび各R52aは独立して、C14−30アルキル基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、R42aおよび各R52aは独立して、C14−30アルキル基である。R42aおよび各R52aのためのより好ましい基は、C16−26アルキル基、C18−24アルキル基およびC18−20アルキル基である。
L41bおよびL51bは、C24−40アルキレン基、C24−40アルケニレン基またはC24−40アルキニレン基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。
【００５３】
部分4aおよび5aの側鎖、すなわち、R41a、R42aおよび各R52aに関して、これらの基が二重または三重結合を含まないのが好ましい。さらに、これらの基が直鎖である、すなわち、分枝を含まないのが好ましい。特に好ましい実施態様において、R41aおよびR42a基の間の炭素原子の数における差異は、2またはそれ以下、より好ましくは、1またはそれ以下であり、2つのaR52a基の間の炭素原子の数における差異は、4またはそれ以下、より好ましくは、2またはそれ以下である。これらの好ましい基は、ラフト親和性部分の全体構造に適合するようにラフト親和性部分の幾何学的コンホメーションを最適化するという観点から選ばれる。飽和直線側鎖は、側鎖に最高度のコンホメーション屈曲性を提供して、ラフトへの組み込みを促進すると考えられる。1つのラフト親和性部分の2つの側鎖の炭素原子数の差異をできるだけ小さく選ぶことによって、すなわち、ラフト親和性部分の全体が円錐形になるのを回避することによって、ラフト組み立てにおいて組み込まれる際のラフト親和性部分の潜在的不安定化効果が最小になると考えられる。
【００５４】
部分4a、4b、5aおよび5bにおける立体中心は、天然スフィンゴシンと同様であるのが好ましい。
部分4aおよび4bにおいて、
2007532512.tif 000012
が二重結合である場合、それはシス立体配置またはトランス立体配置のいずれかである。部分4aおよび4bにおいて、
2007532512.tif 000013
が二重結合である場合、それはトランス立体配置であるのが好ましい。
【００５５】
以下の部分400aa〜400ap、400ba、500aa〜500aeおよび500baは、ラフト親和性部分A'のための部分4a、4b、5aおよび5bの例である：
2007532512.tif 000014
2007532512.tif 000015
部分400aa、400ab、and 400ad〜400apにおいて、Y41aは、単結合を介して炭素骨格に結合する。部分400acにおいて、Y41aは、二重結合を介して炭素骨格に結合する。
部分400aa、400ad、400af、400aj、400ak、400alおよび400apは、ラフト親和性部分A'の好ましい例である。
【００５６】
2007532512.tif 000016
2007532512.tif 000017
2007532512.tif 000018
部分500aaおよび500aeは、ラフト親和性部分A'の好ましい例である。部分500aeが特に好ましい。
【００５７】
2007532512.tif 000019
以下の式6および7で表される部分は、本発明におけるラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000020
三者構造がC−B−Aである場合、X61およびX71は、Oである［ここで、リンカーは、X61またはX71に結合する］。三者構造がC'−B'−A'である場合、X61およびX71は、CO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X61またはX71の末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。
【００５８】
各X75は独立して、CO−C13−25炭化水素基であり［ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］、以下の式の基：
2007532512.tif 000021
または以下の式の基：
2007532512.tif 000022
である。
【００５９】
好ましくは、X75は、CO−C13−25炭化水素基であり［ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される］、さらにより好ましくは、CO−C18−20アルキル基である。さらにより好ましい実施態様において、X75は、以下の式で示される基である：
2007532512.tif 000023
ここで、
2007532512.tif 000024
は単結合であるのが好ましい。
X62および各X72は独立して、OまたはOCO、好ましくは、OCOである。
X63およびX73は、PO3−CH2、SO3CH2、CH2、CO2CH2および直接結合、好ましくは、PO3−CH2から指向的に選ばれる。
X64およびX74は、NH、O、S、OCO、NHCO、NHCONH、NHCO2またはNHSO2である。
X76は、CO(CH2)b(CO)aOおよびCO(CH2)b(CO)aNH、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aOから指向的に選ばれる。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。最も好ましくは、X76は、COCH2Oである。
Y61は、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲンまたはOであるが、ただし、Y61が、NH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲンである場合、
2007532512.tif 000025
は、単結合であり、Y61がOである場合、
2007532512.tif 000026
は二重結合である。Y61がOHであるのが好ましい。
各R61および各R71は独立して、C16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、各R61および各R71は独立して、C16−24炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、各R61および各R71は独立して、C16−20アルキル基である。
【００６０】
R62は、C13−25炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R62は、C13−25炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、R62は、C13−19アルキル基である。
R72は、C4−20炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R72は、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含むC4−20炭化水素基であり、より好ましくは、C4−20アルキル基である。さらにより好ましくは、R72は、C8−12アルキル基である。最も好ましくは、R72は、天然コレステロールに存在する分枝C8H17アルキル基である。
部分6において、
2007532512.tif 000027
が二重結合である場合、それはシス立体配置またはトランス立体配置のいずれかである。部分6において、
2007532512.tif 000028
が二重結合である場合、それはトランス立体配置であるのが好ましい。
【００６１】
部分6および7の側鎖、すなわち、R61、R62およびR71に関し、これらの基が二重または三重結合のいずれも含まないのが好ましい。さらに、これらの基が直鎖、すなわち、いずれの分枝も含まないのが好ましい。特に好ましい実施態様において、R61およびR62基または3つのR71基の間の炭素原子の数の差異は、4またはそれ以下、より好ましくは2またはそれ以下である。X75がCO−C13−25炭化水素基である場合、R71およびX75基の間の炭素原子の数の差異は、4またはそれ以下、より好ましくは2またはそれ以下である。これらの好ましい基は、ラフト親和性部分の全体構造に適合するようにラフト親和性部分の幾何学的コンホメーションを最適化するという観点から選ばれる。飽和直線側鎖は、側鎖に最高度のコンホメーション屈曲性を提供して、ラフトへの組み込みを促進すると考えられる。1つのラフト親和性部分の2つの側鎖の炭素原子数の差異をできるだけ小さく選ぶことによって、すなわち、ラフト親和性部分の全体が円錐形になるのを回避することによって、ラフト組み立てにおいて組み込まれる際のラフト親和性部分の潜在的不安定化効果が最小になると考えられる。
【００６２】
以下の部分600および700は、ラフト親和性部分A'のための部分6および7の好ましい例である：
2007532512.tif 000029
【００６３】
以下の部分700a、700bおよび700cは、ラフト親和性部分A'のための部分7の特に好ましい例である：
2007532512.tif 000030
【００６４】
以下の式8a、8b、9および10によって表されるは、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000031
三者構造がC−B−Aである場合、X81a、X81b、X91およびX101は、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONHおよびNHCOO、好ましくは、NHおよびNHCONHから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X81a、X81b、X91またはX101に結合する］。cは2〜3の整数、好ましくは、2である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X81a、X81b、X91およびX101は、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3またはCO(CH2)bNHCO2、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aNHまたはCO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X81a、X81b、X91またはX101の末端カルボニル基に結合する。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。
【００６５】
各X82a、各X82b、各X92およびX102は独立して、CH2またはO、好ましくは、CH2である。
n9は1〜2の整数である。
各R81a、各R81bおよび各R91は独立して、HまたはC16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される、ただし、少なくとも1つのR81a、少なくとも1つのR81bおよび少なくとも1つのR91は、C16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、各R81a、各R81bおよび各R91は独立して、HまたはC16−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合または1つまたはそれ以上の三重結合を含み、ただし、少なくとも1つのR81a、少なくとも1つのR81bおよび少なくとも1つのR91は、C16−30炭化水素基である。より好ましくは、各R81a、各R81bおよび各R91は独立して、HまたはC16−30アルキル基であり、ただし、少なくとも1つのR81a、少なくとも1つのR81bおよび少なくとも1つのR91は、C16−30アルキル基である。
【００６６】
R101は、C16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R101は、C16−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合または1つまたはそれ以上の三重結合を含む。より好ましくは、R101は、C16−30アルキル基である。
【００６７】
R82a、R82bおよびR102は、C1−15炭化水素基（ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される）またはC1−15炭化水素基（ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される）である。好ましくは、R82a、R82bおよびR102は、C1−15アルキル基またはC1−15アルコキシ基である。
好ましくは、X81aは、6位においてベンゾ環に結合する。好ましくは、X81bは、7位においてベンゾ環に結合する。好ましくは、X91−(CH2)n9−は、3位においてピロール環に結合する。好ましくは、X101は、3位においてベンゾ環に結合する。
【００６８】
以下の部分800a、900および1000は、ラフト親和性部分A'のための部分8a、9および10の好ましい例である：
2007532512.tif 000032
【００６９】
以下の式11および12によって表される部分は、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000033
三者構造がC−B−Aである場合、X111は、O、NH、O(CH2)cOおよびNH(CH2)cSO2NHから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X111に結合する］。cは2〜3の整数である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X111は、CO(CH2)b(CO)aOまたはCO(CH2)b(CO)aNHである［ここで、リンカーは、X111の末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。
三者構造がC−B−Aである場合、X112は、(CH2)cNHまたは直接結合から指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X112に結合する］。cは2〜3の整数、好ましくは、2である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X112は、CO(CH2)bO(CO)またはCO(CH2)bである［ここで、リンカーは、X112のCO(CH2)b部分のカルボニル基に結合する］。bは1〜3の整数、好ましくは、2である。
各R111および各R121は独立して、C16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、各R111および各R121は独立して、C16−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合または1つまたはそれ以上の三重結合を含む。より好ましくは、各R111および各R121は独立して、C16−30アルキル基である。
【００７０】
以下の部分1100a、1100b、1200aおよび1200bは、ラフト親和性部分A'のための部分11および12の好ましい例である：
2007532512.tif 000034
2007532512.tif 000035
【００７１】
以下の式13によって表される部分は、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000036
三者構造がC−B−Aである場合、X131aおよびX131bは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONHおよびNHCOOから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X131aまたはX131bに結合する］。cは2〜3の整数、好ましくは、2である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X131aおよびX131bは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3またはCO(CH2)bNHCO2、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X131aまたはX131bの末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。X132aは、NH、OまたはSO2、好ましくは、NHまたはO、より好ましくは、Oである。
【００７２】
各X133aおよび各X133bは独立して、O、NH、CH2、OCOまたはNHCO、好ましくは、OCOまたはNHCOである。
Y131aは、NH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲン、好ましくは、HまたはOHである。
各R131aおよび各R131bは独立して、C16−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、各R131aおよび各R131bは独立して、C16−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合または1つまたはそれ以上の三重結合を含む。より好ましくは、各R131aおよび各R131bは独立して、C16−30アルキル基である。
【００７３】
以下の部分1300aa〜1300acは、ラフト親和性部分A'のための部分13aの好ましい例である：
2007532512.tif 000037
2007532512.tif 000038
以下の部分1300bは、ラフト親和性部分A'のための部分13bの好ましい例である：
2007532512.tif 000039
【００７４】
いずれかの利用可能な位置で、それぞれ1つの
2007532512.tif 000040
および1つの−X142−R141によって置換された（ただし、
2007532512.tif 000041
および−X142−R141が結合する炭素原子は、少なくとも2つの炭素原子によって分離される）ナフタレン部分14a、フェナントレン部分14bおよびクリセン部分14cは、本発明におけるラフト親和性部分AまたはA'として有用である。
ここで、非置換ナフタレン、非置換フェナントレンおよび非置換クリセンは、それぞれ以下の式14a−1、14b−1および14c−1によって表される：
2007532512.tif 000042
用語「少なくとも2つの炭素原子によって分離される」は、
2007532512.tif 000043
および−X142−R141が結合する炭素原子間の最短経路が、
2007532512.tif 000044
および−X142−R141が結合する炭素原子を数えずに、少なくとも2つの炭素原子を含むことを意味する。
【００７５】
三者構造がC−B−Aである場合、X141は、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONHおよびNHCOO、好ましくは、NHおよびNHCONHから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X141に結合する］。cは2〜3の整数である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X141は、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3またはCO(CH2)bNHCO2、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aOまたはCO(CH2)bSO2NHである［ここで、リンカーは、X141の末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。
X142は、OまたはCH2である。
R141は、C12−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R141は、C12−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合または1つまたはそれ以上の三重結合を含む。より好ましくは、R141は、C12−30アルキル基である。
【００７６】
以下の部分1400aa〜1400aeは、ラフト親和性部分A'のためのナフタレン部分の好ましい例である：
2007532512.tif 000045
2007532512.tif 000046
【００７７】
以下の化合物1400bは、ラフト親和性部分A'のためのフェナントレン部分の好ましい例である：
2007532512.tif 000047
【００７８】
以下の式15および16によって表される部分は、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000048
三者構造がC−B−Aである場合、X151およびX161は、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONHおよびNHCOO、好ましくは、NHおよびNHCONHから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X151またはX161に結合する］。cは2〜3の整数、好ましくは、2である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X151およびX161は、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3またはCO(CH2)bNHCO2、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aNHまたはCO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X151またはX161の末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。
X152およびX162は、CH2またはOである。
R151およびR161は、C14−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R151およびR161は、C14−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合または1つまたはそれ以上の三重結合を含む。より好ましくは、R151およびR161は、C14−30アルキル基である。
各R152および各R162は独立して、水素、CH3またはCH2CH3、好ましくは、水素である。
【００７９】
以下の部分1500aおよび1600aは、ラフト親和性部分A'のための部分15および16の好ましい例である：
2007532512.tif 000049
【００８０】
以下の式18aおよび18bによって表される部分は、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000050
三者構造がC−B−Aである場合、X181aおよびX181bは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONHおよびNHCOO、好ましくは、OおよびNH(CH2)cOPO3−から指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X181aまたはX181bに結合する］。cは2〜3の整数、好ましくは、2である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X181aおよびX181bは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3またはCO(CH2)bNHCO2、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X181aまたはX181bの末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。
各Y181aおよび各Y181bは独立して、NH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲン、好ましくは、OHである。
各X182aおよび各X182bは独立して、O、NH、OCOまたはNHCO、好ましくは、OCOである。
各R181aおよび各R181bは独立して、C15−30炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、各R181aおよび各R181bは独立して、C15−30炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、各R181aおよび各R181bは独立して、C15−24アルキル基である。
【００８１】
部分18aおよび18bの側鎖、すなわち、R181aおよびR181bに関して、これらの基が二重または三重結合を含まないのが好ましい。さらに、これらの基が直鎖である、すなわち、分枝を含まないのが好ましい。特に好ましい実施態様において、各R181a基間または各R181b基間の炭素原子の数における差異は、4またはそれ以下、より好ましくは、2またはそれ以下である。これらの好ましい基は、ラフト親和性部分の全体構造に適合するようにラフト親和性部分の幾何学的コンホメーションを最適化するという観点から選ばれる。飽和直線側鎖は、側鎖に最高度のコンホメーション屈曲性を提供して、ラフトへの組み込みを促進すると考えられる。1つのラフト親和性部分の2つの側鎖の炭素原子数の差異をできるだけ小さく選ぶことによって、すなわち、ラフト親和性部分の全体が円錐形になるのを回避することによって、ラフト組み立てにおいて組み込まれる際のラフト親和性部分の潜在的不安定化効果が最小になると考えられる。
【００８２】
以下の部分1800a〜1800cは、ラフト親和性部分A'のための部分18aの好ましい例である：
2007532512.tif 000051
2007532512.tif 000052
【００８３】
以下の部分1800dは、ラフト親和性部分A'のための部分18dの好ましい例である：
2007532512.tif 000053
【００８４】
以下の式19aおよび19bによって表される部分は、本発明のラフト親和性部分AまたはA'として有用である：
2007532512.tif 000054
三者構造がC−B−Aである場合、X191aは、NH、O、NH(CH2)cOPO3−、NH(CH2)cSO2NH、NHCONH、NHCOO、NHCH(CONH2)(CH2)dCOO、NHCH(COOH)(CH2)dCOO、NH(CH2)4CH(CONH2)NH、NH(CH2)4CH(COOH)NH、NHCH(CONH2)(CH2)4NHおよびNHCH(COOH)(CH2)4NH、好ましくは、OおよびNHCOOから指向的に選ばれる［ここで、リンカーは、X191aに結合する］。もう1つの好ましい実施態様において、X191aは、NHCH(CONH2)(CH2)dCOOである。cは2〜3の整数であり、2が好ましい。dは1〜2の整数であり、1が好ましい。三者構造がC'−B'−A'である場合、X191aは、CO(CH2)b(CO)aNH、CO(CH2)b(CO)aO、CO(CH2)bS、CO(CH2)bOPO3−、CO(CH2)bSO2NH、CO(CH2)bNHCONH、CO(CH2)bOCONH、CO(CH2)bOSO3、CO(CH2)bNHCO2、CO(CH2)eCH(CONH2)NH、CO(CH2)eCH(COOH)NH、COCH(NH2)(CH2)eCOOまたはCOCH(NHCOCH3)(CH2)eCOO、好ましくは、CO(CH2)b(CO)aOである［ここで、リンカーは、X191aの末端カルボニル基に結合する］。aは0〜1の整数である。bは1〜3の整数である。aが0ならば、bは1であるのが好ましい。aが1ならば、bは2であるのが好ましい。eは1〜2の整数であり、1が好ましい。
【００８５】
三者構造がC−B−Aである場合、X191bは、NH(CH2)cNHCOである［ここで、リンカーは、X191bの末端アミノ基に結合する］。cは2〜3の整数、好ましくは、2である。三者構造がC'−B'−A'である場合、X191bは、COである［ここで、リンカーは、X191bに結合する］。
X192aは、NHCOCH2NHまたはNHCOCH2OCH2CH2OCH2CH2NHから指向的に選ばれる。
X192bは、COCH2CH2NHCOCH2またはCOCH2から指向的に選ばれる。
X193aおよび各X193bは独立して、O、NH、C1−8アルキレン−OおよびC1−8アルキレン−NHから指向的に選ばれる。
Y191aは、NH2、OHまたはH、好ましくは、OHである。
R191aおよび各R191bは独立して、C4−18炭化水素基である。好ましくは、R191aおよび各R191bは独立して、C4−18炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、R191aおよび各R191bは独立して、C4−18アルキル基である。最も好ましくは、R191aおよび各R191bは、天然コレステロールに存在する分枝C8H17アルキル基。
R192aは、C13−25炭化水素基であり、ここで、1つまたはそれ以上の水素は必要に応じてフッ素で置換される。好ましくは、R192aは、C13−25炭化水素基であり、必要に応じて1つまたはそれ以上のトランス二重結合を含む。より好ましくは、R192aは、C13−19アルキル基である。
【００８６】
部分19aにおいて、環系の一部ではない
2007532512.tif 000055
が二重結合である場合、それはシス立体配置またはトランス立体配置のいずれかである。部分19aにおいて、環系の一部ではない
2007532512.tif 000056
が二重結合である場合、それはトランス立体配置であるのが好ましい。
部分19aおよび19bにおいて、環系の一部ではない
2007532512.tif 000057
が単結合であるのが好ましい。この状況において、部分2について上述した同じ注意が適用される。
【００８７】
以下の部分1900aおよび1900bは、ラフト親和性部分A'のための部分19aおよび19bの好ましい例である。
2007532512.tif 000058
【００８８】
以下に、リンカーにカップリングさせると本発明化合物においてラフト親和性部分AまたはA'として有用であることを上述した部分をもたらす前駆体の合成を記載する。
コレステリルグリコール酸、3−コレステリルアミンおよびコレステリルグリセリンの合成は、文献に記載されている(S. L. Hussey、E. He、B. R. Peterson、J．Am. Chem. Soc. 2001、123、12712−12713；S. L. Hussey、E. He、B. R. Peterson、Org. Lett. 2002、4、415−418；S. E. Martin、B. R. Peterson、Bioconjugate Chem. 2003、14、67−74)。ステロイド構想の3位にアミド、スルホンアミド、ウレアまたはカルバメート官能基を有する部分2の前駆体を3−コレステリルアミンから製造することができる。たとえば、DMAPの存在下で3−コレステリルアミンを無水コハク酸と反応させて、対応するスクシニル置換化合物を得ることができる。3−コレステリルアミンとクロロスルホニル酢酸との反応によって、対応するスルホンアミドを得ることができ、文献に記載のとおり製造することができる(R. L. Hinman、L. Locatell、J．Am. Chem. Soc. 1959、81、5655−5658)。対応するイソシアネートを介して、文献の手順にしたがって、対応するウレアまたはカルバメートを製造することができる(H.−J. Knolker、T. Braxmeier、G. Schlechtingen、Angew. Chem．Int. Ed. 1995、34、2497；H.−J. Knolker、T. Braxmeier、G. Schlechtingen、Synlett 1996、502；H.−J. Knolker、T. Braxmeier、Tetrahedron Lett. 1996、37、5861)。ステロイド構造の3位にホスフェートまたはカルボキシメチル化ホスフェートを有する部分2の前駆体は、文献に記載の通り製造することができる(Golebriewski、Keyes、Cushman、Bioorg. Med. Chem. 1996、4、1637−1648；Cusinato、Habelerら、J. Lipid Res. 1998、39、1844−1851；Himber、Missanoら、J. Lipid Res. 1995、36、1567−1585)。ステロイド構造の3位にチオールを有する部分2の前駆体は、文献に記載の通り製造することができ(J. G. Parkes、H. R．Watson、A. Joyce、R. Phadke、I.C. P. Smith、Biochim. Biophys．Acta 1982、691、24−29)、対応するアミンおよびアルコールについて記載されている単純なアルキル化によって、対応するカルボキシメチルチオールが得られる。ステロイド構造の3位にジフルオロメチレンスルホン誘導体を有する部分2の前駆体は、文献に記載の通り製造することができる(J. Lapierre、V．Ahmed、M.−J. Chen、M．Ispahany、J. G. Guillemette、S. D．Taylor、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004、14、151−155)。部分2の前駆体の17位における種々の側鎖の導入は、デヒドロイソアンドロステロンまたはプレグネノロンから出発する文献に記載の手順の使用によって達成することができる(E. D. Bergmann、M. Rabinovitz、Z.H. Levinson、J．Am. Chem. Soc. 1959、81、1239−1243およびその引用文献)。コレスタンから誘導される部分2の前駆体は、たとえば、種々の遷移金属触媒の存在下における水素添加などの文献に記載の手順を用いる5,6−二重結合の還元によってコレステロールから誘導される対応する部分2の前駆体から得ることができる。
【００８９】
エストロンから出発する部分2の前駆体について記載された方法と同様にして、3位に酸素誘導置換基を有する部分3の前駆体を製造する。3−アミノエストロンから出発する部分2の前駆体について記載された方法と同様にして、3位に窒素誘導置換を有する部分3の前駆体を、文献の記載にしたがって製造することができる(X. Zhang、Z. Sui、Tetrahedron Lett. 2003、44、3071−3073；L．W. L．Woo、M. Lightowler、A. Purohit、M. J. Reed、B. V. L. Potter、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996、57、79−88)。3−チオエストロンから出発する部分2の前駆体について記載された方法と同様にして、3位にイオウ誘導置換基を有する部分3の前駆体は、文献の記載にしたがって製造することができる(L．W. L．Woo、M. Lightowler、A. Purohit、M. J. Reed、B. V. L. Potter、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996、57、79−88)。エストロン構造の17位における種々の側鎖の導入は、文献の記載にしたがって、ウィッティッヒ法、次いで、得られる二重結合の水素添加によって達成することができる(R.H. Peters、D．F. Crowe、M．A．Avery、W. K. M. Chong、M．Tanabe、J. Med. Chem. 1989、32、1642−1652；A. M. Krubiner、E. P. Oliveto、J. Org. Chem. 1966、31、24−26)。側鎖内でのさらなる操作（たとえば、二重結合の構築、シクロアルキル修飾など）は、標準的手順によって達成することができる（スズキカップリングなど）。
【００９０】
異なる炭化水素基を有するセラミド、デヒドロセラミドおよびジヒドロセラミドのクラスに属する部分4aの前駆体は、文献に概略されるように得られる(A.H. Merrill、Jr.、Y．A. Hannun(Eds.)、Methods in Enzymology、Vol. 311、Academic Press、1999；P. M. Koskinen、A. M. P. Koskinen、Synthesis 1998、1075)。特に、スフィンゴシン塩基は、スフィンゴシン骨格の1位に酸素誘導置換を有する部分4aのすべての前駆体のための重要な中間体として用いることができる。対応するアミノ誘導体は、スルホネートの置換によって得ることができ、公知の手順にしたがってアルコールから製造することができる。1−アミノまたは1−ヒドロキシ誘導体のアルキル化およびアシル化は、それぞれブロモ酢酸および無水コハク酸との反応によって達成することができる。チオアセチル化誘導体は、スルホネートとメルカプト酢酸の置換によって製造することができる。ホスフェートおよびスルフェート誘導体は、文献に記載のように得られる(A.H. Merrill、Jr.、Y．A. Hannun(Eds.)、Methods in Enzymology、Vol. 311、Academic Press、1999；P. M. Koskinen、A. M. P. Koskinen、Synthesis 1998、1075)。アシル化、スルホニル化、ウレアおよびカルバメート形成は、標準的手順によって達成することができる。X42aがアミノまたはアミノ誘導官能基である部分4aの前駆体は、標準的手順を用い、Koskinenによる発表(P. M. Koskinen、A. M. P. Koskinen、Synthesis 1998、1075)により利用可能なスフィンゴシン塩基から出発して製造することができる。対応する2−酸素置換スフィンゴ脂質は、Yamanoi(T. Yamanoiら、Chem. Lett. 1989、335)によって発表された戦略によって得ることができる。両方のY42aが水酸基を表す部分4aの前駆体は、公知の手順を用いる対応するアルケンのビスヒドロキシル化によって得ることができる。対応するモノヒドロキシ誘導体は、文献に記載のとおり製造することができる(A. R. Howell、A. J. Ndakala、Curr. Org. Chem. 2002、6、365−391)。スフィンゴシン骨格の4位に組み込まれた三重結合を有する部分4aの前駆体は、文献に記載のとおり得ることができる(P. Garnerら、J. Org. Chem. 1988、53、4395；P. Herold、Helv. Chim．Acta 1988、74、354；H.−E. Radunzら、Liebigs Ann. Chem. 1988、1103)。部分4aの前駆体中の置換基R41aおよびR42aの修飾は、種々の総論に概略された手順および戦略によって達成することができる(H. J. Harwood、Chem. Rev. 1962、62、99−154；W. J. Gensler、Chem. Rev. 1957、57、191−280)。
部分4bの前駆体は、文献に記載の手順(S. Mullerら、J. Prakt. Chem. 2000、342、779)ならびに該手順と部分4aの前駆体の製造のために記載された手順との組み合わせによって得ることができる。
【００９１】
X51aおよびX52aが酸素誘導置換基である部分5aの前駆体は、Fraser−Reid(U. Schlueter、J. Lu、B．Fraser−Reid、Org. Lett. 2003、5、255−257)に概略されるとおり、市販の(R)−(−)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−メタノールから出発して製造することができる。化合物5aにおける置換基R52aのバリエーションは、種々の総論に概略された手順および戦略によって達成することができる(H. J. Harwood、Chem. Rev. 1962、62、99−154；W. J. Gensler、Chem. Rev. 1957、57、191−280)。X51aおよびX52aが窒素誘導置換基である部分5aの前駆体は、上記概略した対応するスルホネートの求核置換およびさらなる修飾によって対応する酸素置換系から出発するか、または文献に記載のとおり得られる1,2,3−トリアミノプロパンから出発して得ることができる(K. Henrick、M. McPartlin、S. Munjoma、P. G. Owston、R. Peters、S．A. Sangokoya、P．A．Tasker、J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1982、225−227)。
部分5bの前駆体は、部分4bの前駆体と同様な様式で、または別法として部分5aのω−エテニル化前駆体の閉環メタセシスによって得られる。
【００９２】
部分6および7の前駆体は、文献に記載の合成戦略(J. Xue、Z. Guo、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002、12、2015−2018；J. Xue、Z. Guo、J．Am. Chem. Soc. 2003、16334−16339；J. Xue、N. Shao、Z. Guo、J. Org. Chem. 2003、68、4020−4029；N. Shao、J. Xue、Z. Guo、Angew. Chem．Int. Ed. 2004、43、1569−1573)および該戦略と部分4aおよび5aの前駆体の製造のための上述の方法との組み合わせによって得られる。
部分8a、8bおよび10の前駆体は、文献に記載の合成戦略に従う全合成によって得られる(H.−J. Knolker、Chem. Soc. Rev. 1999、28、151−157；H.−J. Knolker、K. R. Reddy、Chem. Rev. 2002、102、4303−4427；H.−J. Knolker、J. Knoll、Chem. Commun. 2003、1170−1171；H.−J. Knolker、Curr. Org. Synthesis 2004、1、in preparation)。
【００９３】
部分9の前駆体は、4−メトキシ−3−メチルベンズアルデヒドから出発するNenitzescu型インドール合成によって製造して、6−メトキシ−5−メチルインドールを得ることができる。エーテル切断、トリフレート形成およびソノガシラカップリングにより、対応する6−アルキニル置換5−メチルインドールが得られる。ビルスマイヤーホルミル化、続いてニトロメタン付加を行い、3−ニトロビニル置換インドール誘導体を得、これを全体的水素添加に付して、6−アルキル置換5−メチルトリプタミンが形成される。無水コハク酸を用いるアミノ基のアシル化により製造が完了する。
【００９４】
部分11の前駆体は、文献に報告された構造と同様にして製造することができる(N. K. Djedovic、R．Ferdani、P.H. Schlesinger、G．W. Gokel、Tetrahedron 2002、58、10263−10268)。
部分12の前駆体は、対応するチオウレアを介した公知のグアニジン形成に続いて単純なアルキル化またはアシル化を行うことによって製造することができる。
部分13aの前駆体は、それぞれリボースまたはアザリボース誘導体から出発するGrinstaff(G. S. Hird、T. J. McIntosh、M．W. Grinstaff、J．Am. Chem. Soc. 2000、122、8097−8098)に発表された方法と同様にして製造することができる。
部分13bの前駆体は、シクロペンタジエンから出発して製造することができる。モノエポキシド化に続いて水素化リチウムアルミニウムで処理して、3−シクロペンテン−1を得、シリル保護する。ビスヒドロキシル化により、対応するジオールを得、次いで、脂肪酸を用いてアシル化する。脱シリルした後、ヒドロキシ官能基をアルキル化またはアシル化する。
【００９５】
部分14aの前駆体は、アルキル置換アルキンを導入するためのパラジウム媒介カップリングによって、対応する市販のブロモおよびニトロ置換ナフタレンから製造することができる。続いて、ニトロをアミノ官能基へ、およびアルキンをアルキル基へ還元し、続いて、アミノ基の無水コハク酸によるアシル化またはブロモ酢酸によるアルキル化のいずれかを行い、所望化合物を得る。
部分15の前駆体は、文献に記載の方法と同様にして製造することができる(J. G。Witteveen、A. J．A. Van der Weerdt、Rec．Trav. Chim. Pays−Bas 1987、106、29−34)。
部分14bの前駆体は、2,7−フェナントレンジオールから出発して製造することができ、モノ保護およびそれに続くトリフレート形成、次いでソノガシラカップリング、アルキンからアルキルへの還元、脱保護およびそれぞれアシル化またはアルキル化を行うことにより、文献に記載のとおり合成される(M. S. Newman、R. L. Childers、J. Org. Chem 1967、32、62−66)。
部分16の前駆体は、文献に記載の方法と同様にして製造することができる(W. Sucrow、H. Minas、H. Stegemeyer、P. Geschwinder、H. R. Murawski、C. Krueger、Chem. Ber. 1985、118、3332−3349；H. Minas、H. R. Murawski、H. Stegemeyer、W. Sucrow、J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1982、308−309)。
【００９６】
部分18の前駆体は、文献に概略された手順を組み合わせることにより、myo−またはscyllo−イノシトールから出発して製造することができる(N. Shao、J. Xue、Z. Guo、Angew. Chem．Int. Ed. 2004、43、1569−1573、およびその引用文献；D.−S．Wang、C.−S. Chen、J. Org. Chem. 1996、61、5905−5910、およびその引用文献)。
部分19aの前駆体は、部分4aの前駆体のために記載された方法と同様にして、スフィンゴシン塩基の遊離アミノ官能基をグリシンまたは2−(2−アミノエトキシ)エトキシ酢酸のいずれかでアシル化し、次いで、上述のとおり製造することができる対応するコレステリルまたはコレスタニル誘導体で遊離N末端をアシル化して、製造することができる。
部分19bの前駆体は、上述のとおり製造されるコレステリルまたはコレスタニル誘導体によるε−アミノ官能基のアシル化、およびコレステリルもしくはコレスタニル誘導体のいずれか、またはβ−アラニンによるα−アミノ官能基のアシル化、次いで、コレステリルまたはコレスタニル誘導体によるN末端のアシル化を行うことによって製造することができる。
【００９７】
以下の式20によって表される部分は、本発明のリンカーBまたはB'として有用である：
2007532512.tif 000059
m20は3〜80の整数であり、好ましくは、5〜80、より好ましくは、5〜40、最も好ましくは、5〜20である。各n20は独立して、0〜1の整数であり、より好ましくは、0である。各Raaは独立して、天然アミノ酸の側鎖のいずれかであり、必要に応じて、色素標識で置換され、蛍光色素標識が好ましい。色素標識は、ローダミン、Mca、フルオレセインまたはその合成的に修飾された誘導体である。三者構造C−B−Aにおいて、C末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、N末端は、ファーマコフォアCに結合する。三者構造C'−B'−A'において、N末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、C末端は、ファーマコフォアC'に結合する。
【００９８】
以下の部分2000は、リンカーBおよびB'のための部分20の例である：
2007532512.tif 000060
以下の部分2001は、リンカーBおよびB'のための部分20の好ましい例である。リンカー2001は、BACE−1 βセクレターゼタンパク質の阻害のための三者構造を含む化合物にとって特に適当である。
2007532512.tif 000061
【００９９】
以下の式21によって表される部分は、本発明のリンカーBまたはB'として有用である：
2007532512.tif 000062
各n21は独立して、1〜2の整数であり、好ましくは、1である。各o21は独立して、1〜3の整数であり、好ましくは、1〜2、より好ましくは、1である。各p21は独立して、0〜1の整数である。k21および各m21は独立して、0〜5の整数であり、好ましくは、1〜4、より好ましくは、1〜3である。l21は0〜10の整数であり、好ましくは、1〜5、より好ましくは、2〜3であり、ただし、k21およびl21の合計は、少なくとも1である。各Raaは独立して、天然アミノ酸の側鎖のいずれかであり、必要に応じて、色素標識で置換され、蛍光色素標識が好ましい。色素標識は、ローダミン、Mca、フルオレセインまたはその合成的に修飾された誘導体である。三者構造C−B−Aにおいて、C末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、N末端は、ファーマコフォアCに結合する。三者構造C'−B'−A'において、N末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、C末端は、ファーマコフォアC'に結合する。リンカーBおよびB'のための部分21の好ましい例は、ポリグリコールユニット、すなわち、各n21が1であることを含む。
【０１００】
以下の部分2100は、リンカーBおよびB'のための部分21の好ましい例である：
2007532512.tif 000063
特に、リンカーBおよびB'のそれぞれまたはどれかのための部分21の好ましい例において、好ましくはそれぞれのn21は1、それぞれまたはどれか、好ましくはそれぞれのo21は2およびそれぞれまたはどれか、好ましくは、それぞれのp21は0である。このタイプの部分の1つの例は、以下の部分2001である：
2007532512.tif 000064
リンカーBとして式2101を有する部分の有用性は、添付の実施例において実証される。
【０１０１】
以下の式22によって表される部分は、本発明のリンカーBまたはB'として有用である：
2007532512.tif 000065
m22は0〜40の整数、好ましくは、2〜30、より好ましくは、4〜20である。n22は0〜1の整数である。各o22は独立して、1〜5の整数、好ましくは、1〜3である。各X221は独立して、NHまたはOである。各Raaは独立して、必要に応じて好ましくは蛍光色素標識である色素標識で置換された天然アミノ酸の側鎖のいずれかである。色素標識は、ローダミン、Mca、フルオレセインまたは合成によって修飾されたその誘導体であってよい。三者構造C−B−Aにおいて、C末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、X221末端は、ファーマコフォアCに結合する。三者構造C'−B'−A'において、X221末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、C末端は、ファーマコフォアC'に結合する。
【０１０２】
以下の式23によって表される部分は、本発明のリンカーBまたはB'として有用である：
2007532512.tif 000066
m23は0〜40の整数、好ましくは、2〜30、より好ましくは、4〜20である。n23は0〜1の整数である。各o23は独立して、1〜5の整数、好ましくは、1〜3である。各Raaは独立して、必要に応じて好ましくは蛍光色素標識である色素標識で置換された天然アミノ酸の側鎖のいずれかである。色素標識は、ローダミン、Mca、フルオレセインまたは合成によって修飾されたその誘導体であってよい。三者構造C−B−Aにおいて、SO2末端は、ラフト親和性部分Aに結合し、N末端は、ファーマコフォアCに結合する。三者構造C'−B'−A'において、N末端は、ラフト親和性部分A'に結合し、SO2末端は、ファーマコフォアC'に結合する。
リンカーBおよびB'として用いることができる種々の部分のうち、一般式21によって表される部分が好ましい。たとえば、各n21が1、各o21が2および各p21が0である一般式21によって表される部分などのポリグリコールユニットを含む部分が特に好ましい。
【０１０３】
先に指摘したように、本発明の三者構造化合物に含まれるファーマコフォアは、結合または相互作用部位（酵素活性部位、タンパク質−タンパク質相互作用部位、受容体−リガンド朸作用部位または、とりわけ、ウイルス、細菌または寄生虫付着部位）に対する特異性を含む分子、好ましくは小分子である。したがって、該ファーマコフォアが、前述の生物系と相互作用する能力がある分子であり、たとえば、シグナル伝達分子の相互作用または受容体−リガンド−相互作用（たとえば、EGF−受容体およびその対応するリガンドなど）などの該系を妨げる能力があるのが最も好ましい。
したがって、本発明の三者構造化合物に含まれるファーマコフォア「C」または「C'」は、酵素、酵素インヒビター、受容体インヒビター、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体、アプタマー、ペプチド、融合タンパク質、小分子インヒビター、複素環式または炭素環式化合物およびヌクレオシド誘導体から選ばれる。
【０１０４】
上述したように、本発明の三者構造化合物の「部分C」および「部分C'」は、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体であってもよい。たとえば、乳ガンの管理に用いられる公知の抗HER2(ヘルセプチン)(またはその機能的フラグメントまたは誘導体)抗体を用いることができる。用語「抗体」は、まだ結合特異性を保持しているその誘導体またはフラグメントも含む。これらは、「機能的フラグメントまたは誘導体」であると考えられる。抗体の製造のための技術は、当業界で公知であり、たとえば、HarlowおよびLane 「Antibodies、A Laboratory Manual」、CSH Press、Cold Spring Harbor、1988に記載されている。
【０１０５】
したがって、本発明は、「部分C/部分C'」として、キメラ単鎖およびヒト化抗体ならびに、とりわけ、Fabフラグメントなどの抗体フラグメントを含む化合物を包含する。抗体フラグメントまたは誘導体としてさらに、F(ab')2、FvまたはscFvフラグメントが含まれる；たとえば、HarlowおよびLane、（前出）を参照のこと。種々の手順が当業界で公知であり、抗体および／またはフラグメントなどの製造に用いることができる。したがって、(抗体)誘導体は、ペプチド模倣分子によって製造することができる。さらに、単鎖抗体の製造のために記載された技術（特に、米国特許4,946,778を参照のこと）を適合させて、本発明のポリペプチドのための単鎖抗体を製造することができる。また、トランスジェニック動物を用いて、本発明ポリペプチドのためのヒト化抗体を発現させることができる。本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の製造のために、連続継代細胞系培養によって製造される抗体を提供する技術ののどれでも用いることができる。このような技術の例として、ヒトモノクローナル抗体を製造するためのトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびEBVハイブリドーマ技術が挙げられる。単鎖抗体の製造を記載する技術(たとえば、米国特許4,946,778)を上述の免疫原性ポリペプチドのための単鎖抗体の製造に適合させることができる。本発明に用いる抗体／抗体構築物ならびに抗体フラグメントまたは誘導体が、細胞内で発現する能力があるのが特に好ましい。このことは、対応するタンパク質性分子の直接注入によるか、またはをれをコードする核酸分子の注入によって特に達成される。本発明において、三者構築物に「部分C/部分C'」として含まれる用語「抗体分子」はまた、全免疫グロブリン分子ならびにこのような免疫グロブリン分子の部分に関する。さらに、この用語は、前述のとおり、キメラおよびヒト化抗体などの修飾および／または改変抗体分子に関する。用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体ならびに組換えまたは合成的に製造された／合成された抗体にも関する。用語は、インタクト抗体ならびに分離軽および重鎖、Fab、Fab/c、Fv、Fab'、F(ab')2などのその抗体フラグメントにも関する。用語「抗体分子」は、二官能性抗体および単鎖Fvs(scFv)または抗体−融合タンパク質などの抗体構築物も含む。
【０１０６】
アプタマーまたはアプタマー部分もまた、本発明化合物に含まれるファーマコフォアとみなされる。本発明にしたがって、用語「アプタマー」は、標的分子に結合することができる核酸分子を意味する。アプタマーは通例、RNA、一本鎖DNA、修飾RNAまたは修飾DNA分子を含む。アプタマーの製造は当業界で公知であり、とりわけ、結合サイドを同定するためのコンビナトリアルRNAライブラリーの使用が含まれる(Gold、Ann. Rev. Biochem. 64(1995)、763−797)。本発明の三者構造化合物に使用されるアプタマーの例には、ここに記載するものおよび下記のが含まれる。
【０１０７】
該ファーマコフォア「C」および「C'」は、酵素インヒビターであってもよい。ここに記載するとおり、該酵素インヒビターがβセクレターゼインヒビターIIIであるのが最も好ましい。
上記のとおり、ファーマコフォアC/C'は、たとえば、受容体とその対応するリガンドとの相互作用を妨害する受容体インヒビターなどの受容体インヒビターであってもよい。このような受容体インヒビターは、EGF受容体インヒビターヘルスタチン(Azios、Oncogene、 20、(2001) 5199−5209)またはアプタマーA30(Chen、Proc. Natl．Acad. Sci. USA、100(2003) 9226−9231)であってもよい。
【０１０８】
好ましい実施態様において、本発明に含まれるファーマコフォアC/C'は、抗ウイルス薬である。抗ウイルス薬は、当業界で公知であり、ザナミビル(2,4−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロ−4−グアニジノシアル酸)；von Itzstein M. Nature.(1993) 363、418−23；Woods JM．Antimicrob Agents Chemother.(1993) 37、1473−9.)またはオセルタミビル(エチル(3R,4R,5S)−4−アセトアミド−5−アミノ−3−(1−チルプロポキシ)−1−シクロヘキセン−1−カルボキシレート)；Eisenberg EJ．Antimicrob Agents Chemother.(1997) 41、1949−52；Kati WM. Biochem Biophys Res Commun.(1998) 244、408−13.)が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物は、インフルエンザ感染の治療または改善において特に有用である。インフルエンザウイルス結合薬、RWJ−270201(ペラミビル)、BCX−1812、BCX−1827、BCX−1898およびBCX−1923(Babu YS、J Med Chem.(2000) 43、3482−6；Smee DF．Antimicrob Agents Chemother.(2001) 45、743−8.)、ノラキン(1−トリシクロ−(2,2,1,0)−ヘプチル−(2)−1−フェニル−3−ピペリジン−プロパノール；トリペリデン)、アキネトン(α−5−ノルボルネン−2−イル−α−フェニル−1−ピペリジンプロパノール；ビペリデン)、アンチパルキン(エチルベンズヒドラミン)またはパルコパン(トリヘキシフェニジル)もまた好ましい。抗ウイルス薬を、フゼオン(Hartt JK. Biochem Biophys Res Commun.(2000) 272、699−704；Tremblay CL. J Acquir Immune Defic Syndr.(2000) 25、99−102.)、T1249(39量体；Trimeris Inc.)、コセラン、AMD3100、AMD070、SCH351125、AD101(すべてバイサイクラム；De Clercq. E Antimicrob Agents Chemother.(1994) 38、668−74 ；Palani A. J Med Chem.(2001) 44、3339−42.)から選択することもできる。この状況において、ファーマコフォアとしてシクロペンタンノイラミニダーゼインヒビターも想定される；とりわけ、Smee、Antimicrob．Agents Chemother. 45(2001)、743−748を参照のこと。これらの対応する三者化合物は、HIV感染およびAIDSの管理において用いてもよい。ANS、AmNSまたはビス−ANSなどのアニリノ−ナフタレン化合物もまた、ファーマコフォアC/C'として用いられる。対応する本発明の三者化合物は、感染性海綿状脳症などのPvP−関連疾患の治療または予防において特に有用である。ANS、AmNSおよびビス−ANSは、プリオン関連疾患におけるその医薬用途において以下のように定義される。
【０１０９】
したがって、本発明化合物、すなわち本明細書に記載の三者構造化合物は、医薬としての使用のみならず比較試験物質としての使用を含む医療設定において特に有用である。たとえば、本明細書に記載するように、式24で示される化合物などの三者構造化合物は、標識された構造などのさらなる機能的部分または構造含むことができる。本明細書に記載のラフト親和性アッセイにおいて、対応する化合物を用いることもでき、比較ならびに非比較試験設定において用いることもできる。しかし、本発明において提供される本発明化合物の最も重要な使用は、その医薬としての使用である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の三者構造化合物のいずれかを含む医薬組成物に関する。
【０１１０】
本発明の化合物は、それ自体で化合物として投与してもよく、または必要に応じて、担体、希釈剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、色素、安定剤、保存剤または抗酸化剤などの医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物として製剤してもよい。
医薬組成物は、Remington's Pharmaceutical Sciences、20版に記載された技術などの当業者に公知の技術によって製剤することができる。医薬組成物は、経口、筋肉内、静脈内、皮下、動脈内、直腸、経鼻、局所または膣内投与などの非経口用の投与剤形で製剤することができる。経口投与用剤形として、コーティングおよび非コーティング錠、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、ロゼンジ、トローチ、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、再構成用散剤および顆粒剤、分散性散剤および顆粒剤、薬用ガム、咀嚼錠ならびに発砲錠が挙げられる。非経口投与用剤形として、液剤、乳剤、懸濁剤、再構成用分散剤および散剤および顆粒剤が挙げられる。乳剤は、非経口投与のための好ましい投与剤形である。直腸および膣内投与のための投与剤形として、座薬およびオブラ(ovula)が挙げられる。経鼻投与のための投与剤形は、たとえば、吸入器法などによって、吸入または吹送を介して投与することができる。局所投与のための投与剤形として、クリーム剤、ゲル剤、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、パッチ剤および経皮デリバリシステムが挙げられる。
【０１１１】
本発明はまた、哺乳動物細胞のラフト構造上または内で起こる生化学的および／またはバイオ生理学的過程による（または関連する）障害または疾患の治療、改善または予防方法を提供する。最も好ましい設定において、本発明化合物は、治療を必要とする患者、特にヒト患者への該化合物の投与によるこれらの治療方法において用いられる。
液体クラスター形成以外に、数種の特定の細胞タンパク質が液体−秩序ラフト相へ分配するので、本発明の三者構造化合物は、医療設定において特に有用である(Simons、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33(2004)、269−295)。たとえば、トランスフェリン受容体がラフトから典型的に排除され、液体無秩序相をマークするのに対して、GPIアンカー型タンパク質が通例、脂質ラフトのマーカーとして用いられる(Harder、J. Cell Biol. 141(1998)、929−942)。このような分配を、調節することもでき、それによって活性およびラフトタンパク質の複合体形成が調節される(Harder、Curr. Opin. Cell Biol. 9(1997)、534−542)。たとえば、H−Rasは、これらの微小ドメインからの出口でのシグナル伝達における機能およびラフトにおける不活性状態に帰する。それに反して、βセクレターゼによるAPPプロセシングは、ラフトへの分配を必要とする（後記参照）。膜コンパートメント化および細胞生理機能における脂質ラフトの重要性は、病理過程へのその関与によって理解される。重要なヒト疾患における脂質ラフトの役割およびその調節の数例を以下に記する。
【０１１２】
アルツハイマー病(AD)は、大きな１型膜貫通タンパク質APP（アミロイド前駆体タンパク質）由来のフラグメントであるアミロイド−β−ペプチド(Aβ)を含む老人斑の形成に従属する(London、Curr. Opin. Struct. Biol. 12(2002)、480−486)。Aβフラグメントは、βセクレターゼ(BACE)およびベータセクレターゼと呼ばれる酵素によって順次切断される。BACEは、その内腔ドメインにおいてAPPを切断して分泌された細胞外ドメインを産生するアスパルチルプロテアーゼである。得られる10−kDaのC末端フラグメントは、APPの膜貫通ドメインにおいて働くベータセクレターゼによって順次切断され、Aβが放出される。第3の酵素活性であるベータセクレターゼは、Aβ領域の中央部においてAPPを切断して非アミロイド原性である生成物（該ベータフラグメント（分泌された細胞外ドメイン）およびベータセクレターゼによって切断もされる短いC末端切れ残り（stub））を得ることによってBACEの活性を相殺する。したがって、ベータ切断は、ベータ切断とそれらの通例の基質APPに対して直接競合する。
【０１１３】
脂質ラフトは、基質APPへのベータおよびベータセクレターゼの接近を調節することにおいて役割を演じる。コレステロール枯渇は、神経および他の細胞におけるベータ切断およびAβ形成を阻害して、ベータ切断のより高い比率をもたらす(London、Biochim. Biophys．Acta 1508(2000)、182−195)。APPおよびBACEは、脂質ラフト内で架橋するもう1つの抗体とコパッチ（co−patch）する(Ehehalt、J. Cell Biol. 160(2003)、113−123)。APPおよびBACEのフラクションは、脂質ラフトへの局在化の生化学的特徴であるDRM中に見出される(Simons、Proc. Natl．Acad. Sci. USA 95(1998)、6460−6464；Riddell、Curr. Biol. 11(2001) 1288−1293)。Aβ生成は、APPおよびBACEを含む表面ラフトを一緒にするラフトクラスター形成において強く刺激される(Ehehalt、(2003)、（前出）)。ラフト分配とAβ生成の間の因果関係の実証において、これらのデータは、Aβフラグメント生成およびアルツハイマー病の発生を阻害するための、1)ラフトにおけるAPPおよびBACEの分配の妨害；2)同じラフト内に集まるための細胞内輸送；および3)ラフト内におけるBACEの活性という手段を提供する。アルツハイマー病への介入のための対応する好ましい構築物が、本明細書において提供される；たとえば、本発明の特に好ましい実施態様である式 24および25ならびに式25bを参照のこと。対応する化合物をダウン症候群の治療に使用することも想定される。
【０１１４】
また、本明細書に記載する三者構造化合物の使用によって、感染性疾患を治療することまたは予防することさえできる。これらは、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体細胞ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エプスタイン−バーウイルス、エコーウイルス１、パピローマウイルス（たとえば、サルウイルス４０など）、ポリオーマウイルスまたはマイコバクテリア感染、とりわけ、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・カンサシイまたはマイコバクテリウム・ボビス感染などの細菌感染による感染を含むが、これらに限定されるものではない。大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、コレラ菌、クロストリジウム・ディフィシル、破傷風菌、サルモネラ菌または赤痢菌による感染もまた、本明細書において提供する化合物によって治療または予防されることが想定される。数個のウイルスおよび細菌は、宿主への感染のために脂質ラフトを使用する。前述の病原体および後述の具体例は、感染サイクル中のそのラフトの要件によって関連付けられる。
【０１１５】
ラフト要件に関して特徴付けられるウイルスの最初の例は、インフルエンザウイルスであった(Ipsen、(1987)、（前出）)。ラフトは、ウイルス集合過程において役割を演じる。ウイルスは、2つの内在性糖タンパク質、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含む。両方の糖タンパク質は、コレステロール依存性界面活性剤耐性によって判断されるようにラフト関連性である(Ipsen、(1987)、（前出）)。インフルエンザウイルスは、上皮細胞の頂端部膜から出芽し、ラフト脂質内において豊富である。インフルエンザウイルスは、ラフトクラスター形成を推進するMタンパク質の重合を介して、出芽中、そのエンベロープ内にラフト脂質を優先的に含む(Ipsen、(1987)、（前出）)。
本明細書に記載の三者化合物は、インフルエンザ感染における処置のための医療ツールを提供する。特異的対応ファーマコフォアは、前述したものである。
【０１１６】
ラフトはまた、HIVの感染サイクルの4つの重要なイベントに結びつけられる。1)宿主の粘膜を横切る通過。HIVは、粘膜上皮細胞の頂端部表面において糖スフィンゴ脂質ガラクトシルセラミドに結合し、次いで、上皮を横切って経細胞輸送されて側底側に放出される。ラフト会合を崩壊させることが、ウイルス経細胞輸送を遮断する(Israelachvili、Biochim. Biophys．Acta 469(1977)、221−225)。2)免疫細胞へのウイルスの侵入。DRMへの分配によって実証されるように、標的細胞の感染中、ウイルスエンベロープ成分ならびに内部Gagタンパク質（ウイルスエンベロープの集合に必須である）(Jacobson(1992)、（前出）)は、すべて最初にラフトに関連がある。事実、ウイルス糖タンパク質は、特異的抗体と架橋した後に、生細胞の表面上の公知のラフト関連タンパク質とコパッチすることができる(Jain(1977)、（前出）)。興味深いことに、宿主細胞表面上のウイルス受容体も、ラフト関連性がある。HIV糖タンパク質gp120は、細胞表面受容体CD40および共同受容体であるケモカイン受容体CCR5およびCXLR4とコパッチする。CD4、CCR5およびCXLR4は、DRM中に見出される。最初にCD4に、次いでケモカイン受容体に結合するウイルスのその表面受容体への結合は、ウイルスエンベロープと細胞膜の融合を開始するための膜におけるラフトクラスター形成およびタンパク質複合体の側方集合をもたらすように思われる。コレステロールおよび特異的糖スフィンゴ脂質化学種の両方が、融合複合体の構築における決定的な要素としての機能を果たす(Jorgensen、J. Phys. Chem. 104(2000)、11763−11773；Keller、Phys. Rev. Lett. 81(1998)、5019−5022)。3)宿主細胞におけるシグナル伝達の変更。HIVは、シグナル伝達の細胞内状態を変化させることによって宿主細胞を製造する。早期HIV遺伝子産物であるNefは、脂質ラフトを介するウイルス感染性を促進する(Kenworthy、Mol. Biol. Cell 11(2000)、1645−1644)；Nef欠損HIV−1ビリオンの感染は、AIDSにまで進行しない(Kholodenko、Trends Cell Biol. 10(2000)、173−178)。Nefタンパク質は、Srcファミリーのラフト関連非受容体チロシンキナーゼに結合することができるプロリンに富む反復配列をもつ末梢ミリストイル化膜タンパク質である。それは、DRMに関連し、T細胞活性化に必要な閾値を低下させることによってHIV感染に対して宿主細胞を刺激するように思われる(Kenworthy(2000)、（前出）)。休止T細胞は、生産的HIV感染を援助しないが、Nefは、IL−2分泌によってT細胞を活性化させ、共刺激シグナルの必要性を除去する。関連する宿主表面タンパク質を有する脂質ラフトをクラスター形成することによって、Nefオリゴマー形成は、T細胞シグナル伝達複合体およびHIV出芽サイトの構築を援助することができる(Kenworthy(2000)、（前出）；Kurzchalia、Curr. Opin. Cell Biol. 11(1999)、424−431)。4)細胞からのウイルスの脱出および宿主の脈管系を通る分散。別のラフト依存性ステップであるHIVの細胞からの脱出は、ウイルスGagタンパク質に決定的に依存する(Jorgensen(2000)、（前出）；Lipowsky、J. Biol. Phys. 28(2002)、195−210)。ウイルスは、膜の細胞質ゾルリーフレット上で、ウイルス集合および出芽を推進する多量体を形成する1,200−1,500個のGag分子を含む。この過程において、Gag−Gag相互作用は、出芽サイトにウイルススパイクタンパク質を集める。この過程は、gp120のパルミトイル化およびGagのミリストイル化を必要��し、コレステロール枯渇によって遮断することができる(Jorgensen(2000)、（前出）)。したがって、Gagタンパク質が、HIVスパイクタンパク質を含むラフトに特異的に結合し、ラフトを一緒にクラスター化して、ウイルス集合を促進することを想定することができる。HIV−1タンパク質と脂質ラフトの相互作用は、エンベロープ集合に要求されるGagにおけるコンホメーションの変更を引き起こすことができる。
【０１１７】
最近の研究により、HIVビリオンの出芽ならびに標的細胞との融合が、脂質ラフトを通して起こることが実証されている。出芽は、おそらく、HIVのGagの脂質ラフトへの優先的な選別を通して起こる(Nguyen、J. Virol. 74(2000) 3264−72)。感染されたT細胞系によって生成されたHIV−1粒子は、GPI−結合タンパク質Thy−1およびCD59ならびに脂質ラフト内に優先的に分配されることがわかっているガングリオシドGM1などのラフト成分を獲得する。感染性1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)ビリオンは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質gp41およびgp120の組み込みを必要とする。HIVエンベロープ糖タンパク質gp41は、ウイルスと標的細胞膜との融合においても重要な役割を果たす。gp41の細胞外ドメインは、3つの重要な機能的領域、すなわち、融合ペプチド(FP)、N−末端アミノ酸反復配列(NHR)およびC末端アミノ酸反復配列(CHR)を含む。HIVと標的細胞の膜との融合の過程中、FPが標的に挿入し、次いで、NHRおよびCHR領域がコンホメーションを変更し、互いに会合して融合活性gp41コアを形成する。それぞれNおよびCペプチドと称される、NHRおよびCHR領域から誘導されたペプチドは、それぞれCHRおよびNHR領域に結合して融合活性gp41コアの形成を妨げることによるHIV融合に対する強力な阻害活性を有する。Cペプチドに類似した作用のメカニズムを有する小分子非ペプチドHIV融合インヒビターが、最近明らかにされている(Jiang、Curr. Pharm. Des. 8(2002) 563−80。Wadia、Nat、Med. 10(2004) 310−315)。したがって、これらのペプチドおよび非ペプチドインヒビターは、本発明化合物のファーマコフォアC/C'として用いることができる。
【０１１８】
したがって、本発明はまた、ファーマコフォア「C/C'」としてHIVのライフサイクルを阻害する特異的化合物を含む前述の三者構造化合物を提供する。このようなファーマコフォアの例として、コサラン、AMD3100、AMD070、Fuzeon(登録商標)、T20、T1249、DP178などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載するように、本発明において特に好ましいファーマコフォアC/C'は、ペプチド類縁体T20/T1249/フゼオン(登録商標)またはエンフビルチドである。
【０１１９】
前述および後述するように、ファーマコフォアC/C'には、ペプチドまたはペプチド誘導体も含まれてよい。対応する非制限的例は、当業界で「T20」として知られる阻害性「HR2ペプチド」である。該ペプチドは、HIV/AIDSの医療的管理において有効であることが明らかにされている。「T20」は、「DP178」としても知られており、その関連ペプチドおよび／または誘導体は、当業界で周知であり、その抗レトロウイルス活性について記載されている；とりわけ、Wild(1992) PNAS 91、9770；WO 94/282920、US 5,464,933を参照のこと。ペプチド「T1249」もまた、当業界で公知であり、医療的介入に用いることができる。T1249は、本発明の三者構造にファーマコフォアC/C'として含めることができる。この場合も、このような本発明の三者ラフト親和性部分は、レトロウイルス感染の治療および／または医療的介入において特に有用であり、特にAIDSの管理および／またはHIV感染において有用である。T20およびT1249もまた、公知であり、特にWO2004013165に記載されているペグ化体の形態で本発明構築物に含まれてよい。T1249の製造は、とりわけ、US 5,955,422またはUS 6,348,568に記載されている。対応する本発明の三者構築物のさらなる詳細は、後述する実施例および図３に開示される。対応する本発明構築物は、特に式25cとして記載される。
【０１２０】
結核は、ラフトが関与する細菌が原因の感染性疾患のさらなる例である。まず、3型補体受容体(CR3)は、ザイモサンおよびC3bi被覆粒子を内部移行することができる受容体であり、ヒト好中球におけるMycobacterium カンサシイの非オプソニン食作用の原因である。これらの細胞において、CR3は、原形質膜の脂質ラフトに局在する数個のGPIアンカー型タンパク質と会合することが見出されている。コレステロール枯渇は、ザイモサンまたは血清オプソニン化マイコバクテリウム・カンサシイの食作用に影響を及ぼすことなくマイコバクテリウム・カンサシイの食作用を著しく阻害する。CR3は、GPIタンパク質と会合すると、マイコバクテリウム・カンサシイが内部以降されるコレステロールに富んだドメインに再配置される。CR3がGPIタンパク質と会合しない場合、それは、これらのドメインの外側に残り、ザイモサンおよびオプソニン化粒子の食作用を媒介するが、Vガンマ9Vデルタ2 T細胞を特異的に刺激するマイコバクテリア抗原であるマイコバクテリウム・カンサシイ・イソペンテニルピロホスフェート(IPP)の食作用を媒介しない。TNF−α生成において観察される遅延の原因であると思われるこの遅延は、抗原の架橋する能力および脂質ラフトへ大部分アンカーされた伝達分子を補充する能力の点で議論される(Peyron、J．Immunol. 165(2000)、5186−5191)。したがって、本発明の三者構造化合物は、結核および／またはマイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・ボビスなどのマイコバクテリアによって引き起こされるその他の疾患の予防、改善および／または治療においても有用である。
【０１２１】
さらに、マラリア原虫によるヒト赤血球のマラリア感染は、ラフト−コレステロール枯渇によって遮断することができる。赤血球ラフトは、原虫への侵入経路として働く(Samuel、J. Biol. Chem. 276(2001)、29319−29329)。したがって、本発明化合物は、熱帯熱マラリア原虫の感染経路の阻害において有用である。たとえば、抗CD36抗体またはその機能性フラグメントを本発明化合物におけるファーマコフォアとして用いることができることが想定される。このような抗体は、当業界で公知であり、たとえば、Alessio、Blood 82(1993)、3637−3647を参照のこと。
【０１２２】
さらに、本発明のさらなる実施態様において、本発明の三者構造化合物は、プリオン病の管理における医薬として使用することができる。アミロイド形成をもたらすコンホメーションの変更は、プリオン病の病因にも関与する。プリオン病は、宿主コード化されたタンパク質(PrPc)の異常型(PrPsc)によって促進されると考えられる。PrPscは、その正常体PrPcと相互作用し、それがPrPscに変わるようにPrPcのコンホメーションを変更することができる。次いで、PrPscは、脳内において自己会合し、これらの会合体は、クロイツフェルトヤコブ病、クルまたはゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群としてヒトに現れる障害を引き起こすと考えられている(McConnell、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32(2003)、469−492)。PrPcがPrPscに変換されるメカニズムは知られていないが、数系列の証拠から、脂質ラフトが関与することが示唆される(McLaughlin、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31(2002)、151−175；Milhiet、Single Mol. 2(2001)、119−121)。
【０１２３】
PrPは、GPIアンカー型タンパク質である。PrPcおよびPrPscは共に、コレステロール依存性様式でDRMと会合する。細胞のコレステロール枯渇は、PrPcからのPrPscの形成の減少をもたらす。GPIアンカーは、変換を必要とする。GPIアンカーが膜貫通ドメインと交換される場合、異常型タンパク質への変換は遮断される。インビトロにおいて、PrPプロテアーゼ耐性によってモニターされるように、PrPcからPrPscへの変換は、PrPscを含むミクロソームがPrPを含むDRMと融合する場合に起こる(McLaughlin(2002)、（前出）)。界面活性剤による抽出は、DRMにおけるラフトクラスター形成をもたらす。単純に膜を混合しても新たなPrPscの測定可能な生成がもたらされなかったので、ミクロソームとDRMとの融合は、この実験において必要であった。一方、ホスホリパーゼC処理によるPrPscからのPrP細胞外ドメインの放出もまた、この系におけるPrPからPrPscへの変換を刺激した。Baronら(McLaughlin(2002)、（前出）)は、膜成分が並置された細胞間を交換することを仮定する；このような交換のための可能なメカニズムは、細胞が隣接細胞と融合するPrPscを含む膜小胞を放出することである。実際に、同様の過程がラフト会合型ケモカイン受容体CCR5の移動を媒介することが見出されている(Murata、Proc. Nat．Acad. Sci. USA 92(1995)、10339−10343)。あるいは、GPIアンカー型PrPscは、それ自体は1つの細胞から放出されることができ、もう1つの細胞へ挿入されるように細胞外水相を横切って移動することができた。近年、細胞培養中のPrPsc感染性の伝達には、直接の細胞−細胞接触が必要であることが見出された(Nielsen(1999)、（前出）)。したがって、本発明構築物は、PrPsc感染の管理に有用である。
【０１２４】
プリオンタンパク質(PrP)は、感染性海綿状脳症の根底にある病原性メカニズムに関与しているとみなされるタンパク質である。PrP(C)から病原性PrP(Sc)へのコンホメーションの変化は、αヘリックス構造からβシートに富んだ構造への変換を含む。ビス−ANS(4,4'−ジアニリノ−1,1'−ビナフチル−5,5'−スルホネート)、ANS(1−アニリノナフタレン−8−スルホネート)およびAmNS(1−アミノ−5−ナフタレンスルホネート)などのアニリノ−ナフタレン化合物は、PrPと直接相互作用することによってプリオンペプチド凝集を阻害する(Cordeiro、J. Biol. Chem. 279(7)(2004)、5346−5352)。PrPはGPIアンカー型タンパク質であり、PrPcおよびPrPscは両方が脂質ラフトと会合するので、アニリノ−ナフタレン化合物の活性は、このようなファーマコフォアからラフトへの優先的標的化を通して増強される。
【０１２５】
喘息もまた、本発明の三者構造化合物の使用のための標的疾患である。FcεRI媒介型シグナル伝達における脂質ラフトの役割を研究するために最も集中的に用いられる細胞は、ラット好塩基球性白血病細胞(RBL)である。主としてシグナル伝達複合体における、FcεRI凝集に続く相互作用におけるラフトの役割は、T細胞の活性化のためのリンカー(LAT)の回りに集合した。抗原媒介型FcεRIクラスター形成に続く即時イベントにおけるラフトの関与が記載されている。ラフトは、マスト細胞系におけるFcεRI活性化に続くシグナル進行の制御および統合において重要である。したがって、本発明の三者構造化合物は、このシグナル進行を妨げる。
【０１２６】
さらに、数多くのシグナル伝達成分がラフトへの分配を通して調節されるので、本発明化合物は増殖性障害の管理に有用である。たとえば、EGF受容体のチロシンキナーゼ活性がラフトにおいて抑制され、コレステロールはこの過程において調節的役割を演じる(Ringerike、J. Cell Sci. 115(2002)、1331−1340)。同様に、H−Rasは、ラフトにおいて不活性であり、そのシグナル伝達活性は、ラフトからの脱出において起こる(Parton、Trends Cell Biol. 14(2004)、141−147)。その活性がラフトに依存するシグナル伝達因子のリストは、種々のタイプのリガンド−受容体複合体および下流シグナル伝達成分に拡張される(Simons(2004)、（前出）；Miaczynska、Curr. Opin. Cell Biol. 16(2004)、進行中)。したがって、前述のとおり、これらのシグナル伝達特性を妨害する能力がある特異的ファーマコフォアを本発明の三者構造化合物に導入してもよい。乳ガン、結腸ガン、胃ガン、泌尿生殖器ガン、肺ガンまたは黒色種などの皮膚ガンの治療において本発明化合物を用いるのが好ましい。乳ガンの治療／予防のために、タモキシフェン、フルベストラントまたはアナストロールなどの抗エストロゲンを本発明化合物のファーマコフォアC/C'として用いることも想定される。
【０１２７】
たとえば、ペプチドホルモンエンドセリンは、Gタンパク質共役受容体、エンドセリンA型(ETAR)およびB型(ETBR)受容体を介する増殖シグナルを伝達する。したがって、これらの分子は、抗腫瘍療法の発展における重要な治療標的である。ETARおよびETBRは、黒色腫の発生において重要である。ETBRは、カベオリン−1と複合体を形成し、したがって、カベオラと呼ばれる脂質ラフトの特殊な形に局在する(Yamaguchi、Eur. J. Biochem. 270(2003) 1816−1827)。小分子A−192621は、宿主−腫瘍相互作用およびガンの進行において重要である下流ETBRシグナル伝達経路を遮断することによってヌードマウスにおける黒色腫の成長を有意に阻害する非ペプチドETBRアンタゴニストである(Bagnato、Cancer Res. 64、(2004) 1436−1443)。したがって、A−192621および同様の誘導体は、本発明化合物におけるファーマコフォアとして用いることができる。
【０１２８】
近年の研究は、GLUT−4転位をもたらすインスリンシグナル伝達が、原形質膜におけるカベオラまたは脂質ラフトから発するインスリン受容体シグナル伝達に依存することを明らかにしている(Khan、Diabetologia 45(2002)、1475−1483)。したがって、記載された三者構造化合物は、糖尿病の医療管理にも有用である。
さらなる実施態様において、三者構造化合物は、マラリアについて前述したように、寄生虫感染の医療／薬剤介入において用いることができる。さらに、トリパノソーマ、リーシュマニアまたはトキソプラズマ原虫感染などの他の寄生虫感染が、本発明三者化合物の投与によって治療されることが想定される。
【０１２９】
本発明化合物が、高血圧および／または鬱血性心不全の医療管理に使用されることもまた想定される。対応するファーマコフォアC/C'は、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン・シレキセチルまたはイルベサルタンまたはTCV−116(2−エトキシ−1−[2'−(1H−テトラゾール−5−イル)ビフェニル−4−イル]−1−ベンズイミダゾール−7−カルボキシレート）などの受容体インヒビターである。本発明の教示にしたがって、本明細書に開示する化合物は、高アレルギー応答および喘息、T細胞およびB細胞応答、自己免疫疾患、慢性炎症、アテローム性動脈硬化、リソソーム蓄積症、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病、ファブリー病、異染性白質ジストロフィー、高血圧、パーキンソン病、多発ニューロパチー、脱髄性疾患ならびにキンジストロフィーなどの障害および疾患の治療、改善および／または予防にも有用である。
【０１３０】
前述のとおり、本発明はまた、好ましくは、a)ラフト脂質のホスホリル頭部基または同等の頭部基と、ラフト会合型標的分子上ファーマコフォアC/C'の結合および／または相互作用部位との間の距離を決定し；b)a)において決定した距離を橋渡しする能力があるリンカーB/B'を選択し；次いで、c)b)において選択したリンカーによってラフト親和性部分A/A'およびファーマコフォアC/C'を結合するステップを含む、本明細書に記載した化合物の製造方法を提供する。
【０１３１】
このような方法についての対応する実施例は、本明細書に記載されており、付随する実施例においても説明される。当業者は、既知あるいは可能性のあるファーマコフォアの関連性のある結合部位または相互作用部位を推定することができ、したがって、ラフト脂質のホスホリル頭部基または同等の頭部基と、ラフト会合型標的分子上ファーマコフォアC/C'の結合および／または相互作用部位との間の距離を決定するこができる。このような方法は、分子モデリング、インビトロおよび／または分子−相互作用または結合アッセイ(たとえば、酵母ツーまたはスリーハイブリッドシステム、ペプチドスポッティング、オーバーレイアッセイ、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、リボソームディスプレイなど)、原子間力顕微鏡ならびに分光法およびＸ線結晶解析を含むが、これらに限定されるものではない。さらに、既知のファーマコフォアまたは候補ファーマコフォアの推定相互作用部位およびその対応標的を確認するために、部位特異的突然変異誘発などの方法を用いることができる。
【０１３２】
前述したとおり、標的分子は、脂質ラフト(すなわち、コレステロール−スフィンゴ脂質微小ドメイン)で行われる生物過程に関与する分子であるのが最も好ましい。標的分子の非制限的例として、ベータセクレターゼ(BACE−1)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)、ラフト会合型ウイルス受容体または細菌受容体(前述)、Prp/PrP(SC)、ホルモン受容体(たとえば、インスリン受容体、エンドセリン受容体またはアンギオテンシンII受容体など)、成長因子受容体(たとえば、EGF受容体など)、Ig受容体(たとえば、IgE受容体FcεRIなど)、細胞表面タンパク質(たとえば、表面糖タンパク質CD36(GPIV)など)が挙げられる。該標的分子が、酵素、受容体分子および／またはシグナル伝達分子であるのが好ましい。標的分子のさらなる例は、前述のとおりである。本発明において、用語「ラフト会合型標的分子」は、分子が、対応する刺激および／または修飾（たとえば、リン酸化による二次修飾など）に際して、ラフトに含まれるかまたはラフトに転位されるかのいずれかであってよいことを意味する。
【０１３３】
リンカーの選択は、前述のとおりであり、実験部分にも示している。このような選択は、当業界で公知のリンカーの選択ならびにたとえば、分子モデリングおよび対応する合成、またはさらなる本明細書において提供する方法および当業界で公知の方法による新規リンカーの製造および使用を含む。
前記のステップb)で用いた用語「橋渡しする」は、たとえば酵素、シグナル伝達分子または受容体などの標的分子上の正確な位置に、特定のファーマコフォア(好ましくはインヒビター)を配置するように、およびラフト親和性部分A/A'がラフトの脂質層の部分にあるように、リンカーB/B'の長さを選ぶことを意味する。
【０１３４】
本発明の三者構造化合物の医療的重要性ゆえに、本発明はまた、本明細書に定義した化合物および1つまたはそれ以上の医薬的に許容しうる賦形剤の混合物を含む医薬組成物の製造方法を提供する。対応する賦形剤は、前述のとおりであり、シクロデキストリンが含まれるが、これに限定されるものではない。前述のとおり、本発明の医薬組成物は、注射または注入によって投与されるべきであり、医薬組成物が乳液であるのが好ましい。
当業者が、既知の三者構造ならびに個別の部分A/A'のラフト親和性を容易に推定、確認および／または評価することができることが強く主張されるべきである。対応する試験アッセイを本明細書にて提供し、付随の実施例においても説明する。
【０１３５】
たとえば、本明細書に記載の種々のラフト親和性部分の評価のために、評価されるラフト親和性部分を含むローダミン標識複合体および実施例３２に記載する文献に公知の修飾ローダミン色素を製造した。製造およびモジュール性を簡単にするために、修飾ローダミン色素をグルタミン酸の側鎖に結合させ、得られる標識アミノ酸を色素マーカーとして用いた。ラフト親和性部分およびローダミン標識グルタミン酸を、Arg−Arg−βAlaまたは3GI(12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸)などのリンカービルディングブロックを介して結合させた。
【０１３６】
ステロイド誘導型ラフト親和性部分の場合、ステロイド誘導型骨格の5および6位の間の単結合を含む化合物が、この位置に二重結合を有する化合物よりも好ましい。たとえば、LRAアッセイにおけるラフト親和性部分200aの評価では、ラフト親和性はRf16.5であったが(およびDRMアッセイにおいて相対的ラフト親和性rrel0.493)、一方、同一のリンカーおよび色素標識サブ構造を含むラフト親和性部分200bでは、LRAアッセイにおけるラフト親和性はRf42.7であった(およびDRMアッセイにおいて相対的ラフト親和性rrel0.536)。
同一のリンカーおよび色素標識サブ構造に結合した部分19bおよび部分200bの比較によって実証されるように、構造19bを含むラフト親和性部分が好ましい。LRAアッセイにおいて、部分19bのラフト親和性Rfは76.3であると計算され、一方、部分200bのRf値は、58.6であった。DRMアッセイにおける同じ構造の評価は、部分19bについて相対的ラフト親和性rrel0.503を、部分200bについて相対的ラフト親和性rrel0.336をもたらした。
【０１３７】
一般構造400aのセラミド誘導型ラフト親和性部分の場合、置換基R41aおよびR42aの鎖の長さを考慮すると、高いラフト親和性値を得るには、全体的に対称的な形が好ましい。たとえば、同一のリンカーおよび色素標識サブ構造を含むラフト親和性部分400aaおよび400afを比較する場合、DRMアッセイにおいて、部分400afの相対的ラフト親和性rrel0.560と比べて、より対称的な部分400aaについて、より高い相対的ラフト親和性rrel0.772が得られた。部分400afのエイコサノイル(C20)側鎖と比べて、より高い対称性が、部分400aaにおけるパルミチル(C16)側鎖から得られる。
【０１３８】
ラフト親和性部分7の場合、側鎖としてステロイド誘導型サブ構造を含む化合物が、単純なアシル側鎖を有する化合物よりも好ましい。たとえば、LRAおよびDRM評価の両方において実証されるように、それ自体ラフト親和性部分700aよりも好ましいラフト親和性部分700bよりも、ラフト親和性部分700cが好ましい。700cのラフト親和性は、LRAアッセイにおいて、Rf37.3およびDRMアッセイにおいて、相対的ラフト親和性rrel0.414と計算されたが、700bの測定結果は、LRAにおいて、Rf28.8およびDRMアッセイにおいて、相対的rrel0.403であった。単純な脂肪酸で修飾された部分700aの評価は、LRAにおいて、Rf18.6およびDRMアッセイにおいて、相対的ラフト親和性rrel 0.266をもたらした。
【０１３９】
一般に、本発明に記載するすべてのラフト親和性部分A/A'について、酢酸フックがコハク酸フックよりも好ましい。同一のリンカーおよび色素標識サブ構造を含む化合物を比較する場合、たとえば、ラフト親和性部分200eのラフト親和性は、LRAアッセイにおいて、Rf8.1であると測定されたが、ラフト親和性部分200bでは、LRAアッセイにおいて、Rf42.7であった。DRMアッセイを用いる同様の比較において、相対的ラフト親和性(rrel)0.468および0.536がそれぞれ得られた。したがって、特に、ステロイド誘導型骨格の3位またはスフィンゴシン誘導型構造の1位にエーテルまたはアミン官能基を含むラフト親和性部分が、これらの位置にアミドまたはエステル官能基を有する同様の部分よりも好ましい。エーテルおよびアミン官能基は加溶媒分解および酵素媒介性切断に対してアミドおよびエステル官能基よりも安定性が大きいので、このことは化学的安定性という観点からもあてはまり、それぞれに対して、アミド官能基はエステル官能基よりも安定性が大きい。
【０１４０】
既知のラフト親和性部分のラフト親和性におけるリンカー部分の影響を評価するために、12−アミノ官能基に200bを結合する様式で、12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸リンカーを介して修飾ローダミン色素にラフト親和性部分200bを結合し、修飾色素ビルディングブロックのN末端をC末端に結合した。LRAアッセイを用いて、ラフト親和性(Rf)58.6を算出した。Arg−Arg−βAlaという配列のペプチドリンカーを用いて製造した類似の複合体を試験した場合、Rf42.6が得られ、という配列のペプチドリンカーを用いて製造した類似の複合体を試験した場合、Rf24.1が得られた。したがって、高いラフト親和性を得るためには、ポリエーテルから作成されたリンカーが、ペプチドから作成されたリンカーよりも好ましく、ラフト親和性部分に近接してアルギン酸ユニットを含むリンカーが、その位置にリシンを有するリンカーよりも好ましい。さらに、化合物24bおよび25bの定性溶解度評価から、水性媒体中でポリエーテルリンカーを含む化合物24bの溶解度がより高いことが明白に実証された。
【０１４１】
本発明はまた、以下の化学的、生物学的および生化学的実施例を参照することにより説明されるが、これらの例は説明のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
また。後記図面においても本発明を説明する。添付図面は後記に示すとおりである。
【実施例】
【０１４２】
略語
DCC：N,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Dde：1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIPEA：ジイソプロピルエチルアミン
DMAP：ジメチルアミノピリジン
DMF：ジメチルホルムアミド
Fmoc：N−α−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)
HATU：2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HBTU：2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
NMO：N−メチルモルホリン N−オキシド
Pbf：2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5イルスルホニル
PE：石油エーテル
RT：保持時間
TBDMS：tert−ブチルジメチルシリル
TBDPS：tert−ブチルジフェニルシリル
THF：テトラヒドロフラン
Trt：トリチル
βAla：β−アラニン
Sta：スタチン
Chol：コレステリル
Dhc：ジヒドロコレステリル
Glc：−O−CH2−CO−
Succ：−CO−CH2−CH2−CO−
4GI：
2007532512.tif 000067
3GI：
2007532512.tif 000068
Glu(Rho)：
2007532512.tif 000069
【０１４３】
一般手順
側鎖を導入するためのアシル化（セラミド）
DMF/CH2Cl2(1：1)中の対応する酸(1.2当量)およびHATU(1.2当量)の溶液に、室温にて5分間撹拌しながらDIPEA(2.55当量)を加える。次いで、溶液をdCH2Cl2中の3(1.0当量)の溶液に加え、室温にて2時間撹拌する。反応混合物をCH2Cl2(100 mL)で希釈し、1 N HCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc)により精製して、生成物を得る。
【０１４４】
エステル化（イノシトールおよびグリセロール）
CH2Cl2(5 mL)中のアルコール(1.0当量)の溶液に、DCC(1.4当量)、DMAP(0.66当量)および対応する酸(1.4当量)を加え、アルゴン雰囲気下で室温にて24時間撹拌する。溶媒を減圧除去し、および残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、石油エーテル/EtOAc)に付して、生成物を得る。
【０１４５】
セラミドへのコハク酸頭部基の結合
無水コハク酸(1.1当量)をCH2Cl2(10 mL)中のセラミド(1.0当量)の撹拌溶液に加える。DMAP(1.2当量)を加えた後、反応混合物を室温にて16時間撹拌する。混合物を50 mL CH2Cl2で希釈し、1 N HCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、ヘキサン/EtOAc)により精製して、生成物を得る。
【０１４６】
グリセロールへのコハク酸頭部基の結合
無水コハク酸(2.0当量)をCH2Cl2(10 mL)中のアルコール(1.0当量)の撹拌溶液に加える。DMAP(2.0当量)を加えた後、反応混合物を室温にて48時間撹拌する。混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaCl溶液で洗浄し、CH2Cl2で抽出する。
有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc)により精製して、生成物を得る。
【０１４７】
TBDPS基の除去
フッ化テトラブチルアンモニウム(1 M THF溶液)(4.25当量)の溶液をTHF(15 mL)中のTBDPS保護セラミド(1.0当量)の溶液に加え、60℃にて3時間加熱する。反応混合物を冷却し、CH2Cl2(100 mL)で希釈し、1 N HCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、ヘキサン/EtOAc/MeOH)により精製して、生成物を得る。
【０１４８】
ベンジル基の除去
10%パラジウム／炭素をメタノール(5 mL)およびCH2Cl2(5 mL)の混合物中のベンジル保護イノシトール(1.0当量)の溶液に加え、H2雰囲気(800−900 torr)下で24時間激しく撹拌する。反応混合物をセライトのショートパスで濾過し(続いて、メタノール/CH2Cl2で洗浄する)、溶媒を蒸発させる。残渣をシリカゲルカラムでフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、メタノール/CH2Cl2)に付して、生成物を得る。
【０１４９】
脱アリル化
CH2Cl2(10 mL)、酢酸(19 mL)およびH2O(1 mL)の混合物中のO−アリル−イノシトール(1.0当量)の溶液に、塩化パラジウム(II)(1.6当量)、酢酸ナトリウム(4.0当量)を加え、室温にて24時間撹拌する。溶媒を減圧除去し、残渣をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3で洗浄する。有機層を合わせ、食塩水で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、石油エーテル/EtOAc)により精製して、生成物を得る。
【０１５０】
実施例1：コハク酸モノ(D−エリスロ−C16−セラミジル)エステル、部分400aaの前駆体の製造
2007532512.tif 000070
ジクロロメタン(5ml)中の3−O−tブチルジフェニルシリル−D−エリスロ−C16−セラミド(0.85g、1.09mmol)の溶液に、ジメチルアミノピリジン(0.25g、2.1mmol)および無水コハク酸(0.21g、2.1mmol)を加える。得られるスラリーを室温にて2日間撹拌して、明黄色溶液を得る。ジクロロメタン(50ml)で希釈した後、反応混合物を1M HClおよびH2Oで洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)する。粗収量：0.86g 無色油状物。
テトラヒドロフラン(4ml)中の上述の粗物質(0.82g、0.94mmol)およびフッ化テトラブチルアンモニウム(75%in H2O、1.05g、3mmol)の明黄色溶液を60℃にて3時間撹拌する。室温に冷却した後、反応混合物に1M HCl(50ml)を加えて反応を停止し、酢酸エチル(50ml)で抽出する。有機相を分離し、1M HClおよびH2Oで洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)する。粗物質(0.69g、白色個体)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル/メタノール 10：10：1)により精製して、0.3gのコハク酸モノ(D−エリスロ−C16−セラミジル)エステルを白色個体で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：d＝0.88(t、6H)、1.26(s、46H)、1.60(m、2H)、2.03(q、2H)、2.20(dt、2H)、2.64(m、4H)、4.19(m、3H)、4.33(m、1H)、5.46(dd、1H)、5.75(dt、1H)、6.10(d、1H). MS(ESI)：m/z＝660(M+Na)。
【０１５１】
実施例2：コハク酸モノ(D−エリスロ−C20−セラミジル)エステル、部分400afの前駆体の製造
2007532512.tif 000071
ジクロロメタン(5ml)中の3−O−tブチルジフェニルシリル−D−エリスロ−C20−セラミド(1g、1.2mmol)の溶液に、ジメチルアミノピリジン(0.32g、2.6mmol)および無水コハク酸(0.22g、2.2mmol)を加える。得られるスラリーを室温にて3時間撹拌する。ジクロロメタン(50ml)で希釈した後、反応混合物を1M HClおよびH2Oで洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)する。粗収量：1.02g 無色油状物。
粗物質(1.02g、1.09mmol)およびTBAF(75%水溶液、1.05g、3mmol)をTHF(3ml)に溶解して、明黄色溶液を得、50℃にて3時間撹拌する。室温に冷却した後、反応混合物に1M HCl(50ml)を加えて反応を停止し、酢酸エチル(50ml)で抽出する。有機相を分離し、水性飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)する。粗物質(0.89g 白色個体)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル/メタノール 10：10：1)により精製して、0.14gのコハク酸モノ(D−エリスロ−C20−セラミジル)エステルを白色個体で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：d＝0.88(t、6H)、1.25(s、54H)、1.60(m、2H)、2.03(q、2H)、2.20(dt、2H)、2.64(m、4H)、4.18−4.33(m、4H)、5.46(dd,1H)、5.75(dt、1H)、6.05(d、1H)。
MS(ESI)：m/z＝716(M+Na)。
【０１５２】
実施例3：コハク酸モノ(D−エリスロ−C16−セラミジル)エステル、部分400adの前駆体の製造
2007532512.tif 000072
ジクロロメタン(5ml)中の3−O−tブチルジフェニルシリル−4,5−デヒドロ−D−エリスロ−C16−セラミド(0.84g、1.08 mmol)の溶液に、ジメチルアミノピリジン(0.33g、2.7mmol)および無水コハク酸(0.2g、2mmol)を加える。得られるスラリーを室温にて2時間撹拌する。ジクロロメタン(50ml)で希釈した後、反応混合物を1M HClおよびH2Oで洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)する。粗収量：0.83g 無色油状物。
粗物質およびフッ化テトラブチルアンモニウム(75%水溶液、1.1g、3.2mmol)をテトラヒドロフラン(4ml)に溶解して、明黄色溶液を得、60℃にて3.5時間撹拌する。室温に冷却した後、反応混合物にH2O(50ml)を加えて反応を停止し、酢酸エチル(50ml)で抽出する。有機相を分離し、水性飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)する。ロウ状の明黄色固体である粗物質(0.82g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル/メタノール 10：10：1)により精製して、0.28gのコハク酸モノ(D−エリスロ−C16−セラミジル)エステルを白色個体で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：d＝0.88(t、6H)、1.26(s、44H)、1.49(q、2H)、1.62(m、2H)、2.22(q、4H)、2.65(br s、4H)、4.27(t、1H)、4.36(m、2H)、4.53(br s、1H)、6.13(d、1H)。
MS(ESI)：m/z＝658(M+Na)。
【０１５３】
実施例4：部分400alの前駆体の製造
以下の反応順序によって、化合物400alの前駆体を得る：
2007532512.tif 000073
文献の手順にしたがって、化合物1を得る。
DMF(25 mL)中の1(10.9 g、24.8 mmol)、イミダゾール(3.4 g、50 mmol)およびTBDPSCl(10.4 mL、40 mmol)の溶液を80℃にて3時間およびさらに100℃にて2時間撹拌する。反応混合物を室温に冷却し、H2O(300 mL)を加えて反応を停止し、Et2O(2x150 mL)で抽出する。有機層を合わせ、1 N HCl(100 mL)溶液、飽和NaHCO3溶液(100 mL)およびH2O(200 mL)で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc 30：1)により精製して、化合物2を無色油状物で得る(13.7 g、81%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.86(m、3H)、1.03(s、12H)、1.16(m、18H)、1.39(m、15H)、1.63(br s、2H)、3.85(m、2H)、4.12(m、2H)、4.90(m、1H)、5.18(m、1H)、7.34(m、6H)、7.61(m、4H)。
【０１５４】
1M HCl(25 mL)を1,4−ジオキサン(150 mL)中の2(13.7 g、20.2 mmol)の溶液に加え、100℃にて1時間加熱する。反応物を室温に冷却し、飽和NaHCO3(100 mL)溶液を加えて反応を停止し、Et2O(2x150 mL)で抽出する。有機層を合わせ、食塩水(100 mL)で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィ(シリカ、CH2Cl2/MeOH 20：1)ーにより精製して、3を明黄色油状物で得る(7.97 g、73%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.81(m、3H)、1.05(s、9H)、1.14(m、22H)、1.81(m、2H)、2.02(br s、3H)、2.80(m、1H)、3.42(m、1H)、3.59(m、1H)、4.01(m、1H)、5.21(m、2H)、7.31(m、6H)、7.62(m、4H)。
【０１５５】
CH2Cl2(20 mL)中の3(1.076 g、2.0 mmol)の溶液に、DMAP(488.7 mg、4.0 mmol)およびTBDMSCl(0.603 g、4.0 mmol)を加える。混合物を室温にて16時間撹拌する。反応混合物をCH2Cl2(100 mL)で希釈し、1 N HCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、CH2Cl2/MeOH 20：1)により精製して、4を明黄色油状物で得る(1.31 g、100%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝−0.10(m、6H)、0.72−0.82(m、21H)、0.92−1.16(s、22H)、1.73(m、2H)、3.08(m、1H)、3.67(d、J＝5.6 Hz、2H)、4.23(m、1H)、5.16(m、2H)、7.22(m、6H)、7.51(m、4H)。
【０１５６】
CH2Cl2(20 mL)中の4(1.311 g、2.01 mmol)の溶液に、DMAP(492 mg、4.03 mmol)および1−塩化ヘキサデカンスルホニル(1.334 g、4.10 mmol)を加える。混合物を20時間加熱還流する。反応混合物をCH2Cl2(100 mL)で希釈し、H2O(1000 mL)を加えて反応を停止し、NaCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、CH2Cl2/MeOH 20：1)により精製して、5を明黄色油状物で得る(1.486 g、79%)。粗生成物を次工程に付す。粗生成物を次工程に付す。
【０１５７】
1M HCl(10 mL)をジオキサン(10 mL)中の5(1.486 g、1.58 mmol)の溶液に加え、80℃にて2時間、さらに100℃にて2時間加熱する。反応物に飽和NaHCO3(50 mL)溶液を加えて反応を停止し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、ヘキサン/EtOAc 4：1)により精製して、6をロウ状固体で得る(642 mg、49%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.86(m、6H)、1.07(s、9H)、1.26(m、46H)、1.73(m、5H)、2.22(m、1H)、2.90(m、1H)、3.34(m、1H)、3.62(m、1H)、3.70(s、2H)、3.83(m、1H)、4.32(m、1H)、4.59(d、J＝8.06 Hz、1H)、5.32(m、2H)、7.33(m、6H)、7.60(m、4H)。
MS(ESI)：m/z＝843.6(M+NH4)
【０１５８】
一般手順に記載のとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物7(598 mg；89%)を得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.86(m、6H)、1.05(s、9H)、1.26(m、46H)、1.70(m、5H)、2.09(m、1H)、2.22(m、1H)、2.58(m、5H)、2.89(m、2H)、3.65(m、1H)、4.22(m、2H)、4.41(d、J＝8.7 Hz、1H)、5.30(m、2H)、7.33(m、6H)、7.60(m、4H)。
MS(ESI)：m/z＝943.6(M+NH4)
【０１５９】
一般手順にしたがって、保護基を除去して、化合物400al(300 mg；72%)を得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.86(m、6H)、1.26(s、46H)、1.52(m、1H)、1.70(m、7H)、2.09(m、1H)、2.24(m、2H)、2.47(m、2H)、2.52(br s、2H)、3.03(m、1H)、3.39(m、4H)、4.21(m、2H)、4.85(d、J＝8.7 Hz、1H)、5.30(m、1H)、5.78(m、1H)。
MS(ESI)：m/z＝705.5(M+NH4)
【０１６０】
実施例5：部分400akの前駆体の製造
2007532512.tif 000074
CH2Cl2(10 mL)中の実施例1で得た化合物(98 mg、0.154 mmol)の溶液に、NMO(19 mg、0.162 mmol)およびOsO4(39 mg、0.154 mmol)を加える。混合物を室温にて3時間撹拌し、次いで、50 mL CH2Cl2で希釈し、H2O(250 mL)、次いで、1N HClで洗浄し、CH2Cl2で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィ(シリカ、CH2Cl2/MeOH 1：1)ーにより精製して、部分400akの前駆体をロウ状固体で得る(106 mg、100%)。
MS(ESI)：m/z＝672.5(M+1)
【０１６１】
実施例6：部分400apの前駆体の製造
反応順序にしたがって、部分400apの前駆体を得る。
2007532512.tif 000075
前記実施例4に記載のとおり、化合物3を製造する。
ヘキサデシルイソシアネート(0.81 mL、2.6 mmol)をCH2Cl2(5 mL)中の3の溶液に加え、室温にて2時間撹拌する。反応混合物をCH2Cl2(100 mL)で希釈し、1 N HCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc 3：1)により精製して、生成物13を無色油状物で得る(0.72 g、35%)。
一般手順に記載のとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物14を得る(780 mg；97%)。粗生成物を次工程に付す。
一般手順にしたがって、保護基を除去して、部分400apの前駆体(440 mg；76%)を得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.76(m、6H)、1.14(s、49H)、1.35(m、1H)、1.90(m、2H)、2.50(m、4H)、2.96(m、2H)、3.81(m、1H)、3.97(m、1H)、4.04(m、1H)、4.11(m、1H)、5.33(m、1H)、5.58(m、1H)。
MS(ESI)：m/z＝667.5(M+1)
【０１６２】
実施例7：部分400ajの前駆体の製造
2007532512.tif 000076
前記実施例4に記載のとおり、化合物3を製造する。
DMF/CH2Cl2(1：1)(10 mL)の混合物中のパルミチン酸(0.77 g、3.0 mmol)およびHATU(1.142 g、3.0 mmol)の溶液5分間を撹拌する。CH2Cl2(10 mL)中のDIPEA(0.825 g、6.38 mmol)および3(1.345 g、2.5 mmol)の溶液を反応混合物に加え、室温にて2時間撹拌し、次いで、100 mL CH2Cl2で希釈し、1 N HCl溶液で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、ヘキサン/EtOAc 4：1)により精製して、16をロウ状固体で得る(1.685 g、87%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.84(m、6H)、1.04(s、6H)、1.24(m、44H)、1.49(m、4H)、1.86−2.33(m、6H)、2.79−2.95(m、2H)、3.58(m、1H)、3.85(m、2H)、4.32(m、1H)、5.38(m、2H)、5.92(m、1H)、7.35(m、6H)、7.59(m、4H)。
MS(ESI)：m/z＝776(M+1)
無水THF(15 mL)中の13(217 mg、0.28 mmol)の溶液を0℃に冷却し、LiAlH4(1M THF溶液)(0.842 mL、0.84 mmol)の溶液を滴下する。混合物を0℃にて2時間、室温にて16時間撹拌する。反応物に水(100 mL)を加えて反応を停止し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィ(シリカ、EtOAc)ーにより精製して、17を白色個体で得る(83 mg、57%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.86(m、6H)、1.26(s、46H)、1.52(m、5H)、2.05(m、2H)、2.43(m、2H)、2.70(m、2H)、3.42(m、1H)、3.73(br s、2H)、4.21(m、1H)、5.42(m、1H)、5.75(m、1H)。
MS(ESI)：m/z＝524.6(M+1)
一般手順に記載のとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物18を得る(98 mg；41%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.86(m、6H)、1.26(s、46H)、1.52(m、5H)、2.05(m、2H)、2.54(m、6H)、2.95(m、2H)、3.25(m、1H)、3.97(m、2H)、4.72(m、1H)、5.42(m、1H)、5.75(m、1H)。
MS(ESI)：m/z＝624.5(M+1)
【０１６３】
実施例8：コハク酸モノ(2,3−ジ−エイコシルオキシカルボニル−プロピル)エステル、部分500aaの前駆体の製造
2007532512.tif 000077
3−O−p−メトキシベンジル−sn−グリセロール
無水ジメチルホルムアミド(60 ml)中の3.0 g(22.70 mmol)(R)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサラン−4−メタノールの溶液をアルゴン雰囲気下で0℃に冷却し、塩化p−メトキシベンジル(3.70 ml、4.27 g、27.24 mmol)を加える。15分後、NaH(0.625 g、26.05 mmol)をゆっくりと加える。反応混合物を室温まで温め、20時間撹拌する。
反応物に5 ml エタノールを加えて反応を停止する。混合物に水性飽和塩化ナトリウム溶液を注ぎ入れ、水性層を酢酸エチルで2回抽出する。合わせた有機層を水で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、蒸発して、p−メトキシベンジル誘導体を得、さらに精製することなく次工程に用いる。
物質をメタノール(60 ml)および酢酸(50 ml)の混合物に溶解し、室温にて4日間撹拌する。ジオキサンとの連続的共蒸発により溶媒を除去する。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)により精製して、3−O−p−メトキシベンジル−sn−グリセロール(2.57 g、12.10 mmol)を無色油状物で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.24(d、J＝8.6 Hz、2 H)、6.88(d、J＝8.6 Hz、2 H)、4.42(s、3 H)、3.85−3.94(m、1 H)、3.81(s、3 H)、3.64−3.70(m、2 H)、3.52−3.56(m、2 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝159.40(C)、129.72(C)、129.45(CH)、113.90(CH)、73.27(CH2)、71.53(CH2)、70.53(CH)、64.12(CH2)、55.30(CH3)。
【０１６４】
(R)−1,2−ジ−エイコシルオキシカルボニル−3−(p−メトキシベンジル)−sn−グリセロール
p−メトキシベンジルグリセロール(212 mg、1 mmol)、エイコサン酸(781 mg、2.5 mmol)およびジメチルアミノピリジン(24 mg、0.2 mmol)を無水ジクロロメタン(50 ml)に溶解し、0℃に冷却する。ジシクロヘキシルカルボジイミド(516 mg、2.5 mmol)を10 ml 無水ジクロロメタンに溶解し、ゆっくりと撹拌反応物に加える。反応混合物を室温まで温め、22時間撹拌する。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル：6：1)により精製して、(R)−1,2−ジ−エイコシルオキシカルボニル−3−(p−メトキシベンジル)−sn−グリセロール(724 mg、90%)を得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.22(d、J＝8.6 Hz、2 H)、6.86(d、J＝8.6 Hz、2 H)、5.21(m、1 H)、4.45(m、2 H)、4.14−4.33(m、2 H)、3.79(s、3 H)、3.53−3.56(m、2 H)、2.30(t、J＝7.5 Hz、2 H)、2.28(t、J＝7.5 Hz、2 H)、1.54−1.62(m、4 H)、1.24(s、br、64 H)、0.87(t、J＝6.8 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝173.42(C=O)、173.12(C=O)、159.30(C)、129.76(C)、129.29(2 'CH)、113.80(2 'CH)、72.95(CH2)、70.00(CH)、67.89(CH2)、62.69(CH2)、55.25(CH3)、34.33(CH2)、34.12(CH2)、31.92(CH2)、29.70(CH2)、29.66(CH2)、29.50(CH2)、29.36(CH2)、29.30(CH2)、29.13(CH2)、29.09(CH2)、24.96(CH2)、24.88(CH2)、22.69(CH2)、14.12(2xCH3)。
MS(ESI)：823.9(M＋Na+)。
【０１６５】
(R)−1,2−ジ−エイコシルオキシカルボニル−sn−グリセロール
(R)−1,2−ジ−エイコシルオキシカルボニル−3−(p−メトキシベンジル)−sn−グリセロール(434 mg、0.55 mmol)およびDDQ 2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノ−1,4−ベンゾキノン(160 mg、0.70 mmol)を25 ml ジクロロメタンに溶解する。水(1.5 ml)を加え、混合物を空気下で24時間撹拌する。
溶液を濾過し、水性飽和重炭酸ナトリウム溶液を加える。水性層をジクロロメタン(2x50 ml)で2回抽出し、合わせた有機層を水性飽和重炭酸ナトリウム溶液および水性飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、溶媒を減圧除去する。残渣をさらに精製することなく用いることができる。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝5.07(m、1 H)、4.21−4.33(m、2 H)、3.72(d、J＝4.4 Hz、2 H)、2.33(t、J＝7.5 Hz、2 H)、2.31(t、J＝7.5 Hz、2 H)、1.57−1.65(m、4 H)、1.26(s、br、64 H)、0.87(t、J＝6.8 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝173.80(C=O)、173.43(C=O)、72.09(CH)、61.96(CH2)、61.57(CH2)、34.29(CH2)、34.10(CH2)、31.92(CH2)、29.70(CH2)、29.66(CH2)、29.62(CH2)、29.48(CH2)、29.36(CH2)、29.27(CH2)、29.12(CH2)、29.09(CH2)、24.94(CH2)、24.89(CH2)、22.69(CH2)、14.12(2xCH3)。
MS(ESI)：703.6(M＋Na+)。
【０１６６】
コハク酸モノ(2,3−ジ−エイコシルオキシカルボニル−プロピル)エステル
(R)−1,2−ジ−エイコシルオキシカルボニル−sn−グリセロール(272 mg、0.4 mmol)、無水コハク酸(50 mg、0.5 mmol)およびジメチルアミノピリジン(61 mg、0.5 mmol)を無水ジクロロメタン(25 ml)に溶解する。反応混合物を20時間撹拌する。
水性飽和塩化ナトリウム溶液(5 ml)を加え、混合物を5分間撹拌する。混合物をジクロロメタン(50 ml)および水(20 ml)で希釈する。水性層をジクロロメタン(25 ml)で2回抽出する。合わせた有機層を乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、溶媒を除去する。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル：1：1)により精製して、コハク酸モノ(2,3−ジ−エイコシルオキシカルボニル−プロピル)エステル(204 mg、0.26 mmol)を無色粉末で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝5.26(m、1 H)、4.26−4.33(m、2 H)、4.11−4.19(m、2 H)、2.62−2.69(m、4 H)、2.31(t、J＝7.5 Hz、2 H)、2.30(t、J＝7.5 Hz、2 H)、1.56−1.63(m、4 H)、1.24(s、br、64 H)、0.87(t、J＝6.8 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝175.68(C=O)、173.37(C=O)、172.95(C=O)、171.58(C=O)、68.71(CH)、62.63(CH2)、62.01(CH2)、34.17(CH2)、34.04(CH2)、31.92(CH2)、29.70(CH2)、29.66(CH2)、29.49(CH2)、29.36(CH2)、29.28(CH2)、29.12(CH2)、29.07(CH2)、28.71(CH2)、28.46(CH2)、24.89(CH2)、24.88(CH2)、22.69(CH2)、14.12(2xCH3)。
MS(ESI)：803.9(M＋Na+)。
【０１６７】
実施例9：部分500aeの前駆体の製造
以下の反応順序によって、化合物500aeの前駆体を得る。
2007532512.tif 000078
(R)−1,2−O−ジ−エイコシル−3−O−ベンジル−sn−グリセロール(5)
無水DMF(20 mL)中の3−O−ベンジル−sn−グリセロール4(182 mg、1 mmol)の溶液に、エイコシルブロミド(904 mg、2.5 mmol)およびNaH(60%、100 mg、2.5 mmol)をアルゴン雰囲気下で加え、100℃にて22時間、さらに130℃にて24時間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、CH2Cl2(50 mL)で希釈し、H2Oで洗浄する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc 20：1)により精製して、化合物5を無色ロウ状固体で得る(493 mg、66 %)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.28−7.34(m、5 H)、4.55(s、2 H)、3.48−3.59(m、5 H)、3.42(t、J＝6.6 Hz、2 H)、1.52−1.57(m、4 H)、1.20−1.35(m、68 H)、0.88(t、J＝6.7 Hz、6 H)。
MS(ESI)：743.7(M＋H+)、760.7(M＋NH4+)
【０１６８】
(R)−1,2−O−ジ−エイコシル−3−O−ベンジル−sn−グリセロール(6)
一般手順に記載したとおり、ベンジル基を除去して、化合物6を無色ロウ状固体で得る(349 mg、81 %))。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝3.41−3.71(m、9 H)、1.52−1.57(m、4 H)、1.20−1.39(m、68 H)、0.88(t、J＝6.7 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝78.24(CH)、71.86(CH2)、70.93(CH2)、70.39(CH2)、63.13(CH2)、31.92(CH2)、30.08(CH2)、29.70(CH2)、29.62(CH2)、29.47(CH2)、29.36(CH2)、26.10(CH2)、22.68(CH2)、14.10(2xCH3)。
MS(ESI)：670.7(M＋NH4+)、675.7(M＋Na+)
【０１６９】
(R)−1,2−O−ジ−エイコシル−sn−グリセロール−3−コハク酸塩(7)
一般手順に記載したとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物7を無色ロウ状固体で得る(345.7 mg、90%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝4.25(dd、J＝11.5、4.3 Hz、2 H)、3.60−3.63(m、1 H)、3.54(t、J＝6.7 Hz、2 H)、3.39−3.47(m、4 H)、2.66(t、J＝3.2 Hz、4 H) 1.47−1.55(m、4 H)、1.20−1.39(m、68 H)、0.87(t、J＝6.7 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝171.99(C=O)、171.16(C=O)、77.43(CH)、71.80(CH2)、70.68(CH2)、70.23(CH2)、64.41(CH2)、60.39(2xCH2)、31.92(CH2)、29.99(CH2)、29.70(CH2)、29.64(CH2)、29.48(CH2)、29.35(CH2)、28.87(CH2)、26.08(CH2)、 26.04(CH2)、22.68(CH2)、14.18(CH3)、14.10(CH3)。
MS(ESI)：770.8(M＋NH4+)、775.7(M＋Na+)
【０１７０】
実施例10：部分700aの前駆体の製造
以下の反応順序によって、化合物700aの前駆体を得る。
2007532512.tif 000079
文献に記載のとおり、化合物9を得る(J. Org. Chem. 2003、68、4020)。
一般手順に記載したとおり、エステル化を行って、化合物10をロウ状固体で得る(583 mg、98 %)。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.25−7.34(m、17 H)、6.85(d、J＝8.6 Hz、2 H)、5.94−6.00(m、1 H)、5.82(t、J＝2.7 Hz、1 H)、5.26(dd、J＝17.2、1.6 Hz、1 H)、5.15(dd、J＝10.4、1.3 Hz、1 H)、4.80−4.87(m、3 H)、4.76(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.71(d、J＝11.2 Hz、1 H)、4.63(d、J＝10.8 Hz、1 H)、4.50(d、J＝11.2 Hz、1 H)、4.44(d、J＝10.8 Hz、1 H)、4.36(dd、J＝12.1、5.7 Hz、1 H)、4.25(dd、J＝12.1、5.7 Hz、1H)、3.81(t、J＝9.6 Hz、1 H)、3.80(s、3 H)、3.69(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.36−3.45(m、3 H)、2.36(t、J＝7.3 Hz、2 H)、1.58−1.63(m、2 H)、1.16−1.29(m、32 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、3 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝173.28(C=O)、159.24(CH)、138.71(C)、138.52(C)、137.72(C)、135.30(CH)、129.93(C)、129.62(CH)、128.41(CH)、128.32(CH)、128.21(CH)、128.11(CH)、127.98(CH)、127.72(CH)、127.57(CH)、116.63(CH2)、113.71(CH)、82.91(CH)、81.36(CH)、81.12(CH)、78.34(CH)、77.90(CH)、76.29(CH2)、75.91(CH2)、74.61(CH2)、72.11(CH2)、66.37(CH)、55.23(CH3)、34.51(CH2)、32.79(CH2)、31.91(CH2)、30.90(CH2)、29.70(CH2)、29.65(CH2)、29.61(CH2)、 29.50(CH2)、29.47(CH2)、29.40(CH2)、29.35(CH2)、29.27(CH2)、28.97(CH2)、26.41(CH2)、25.51(CH2)、25.45(CH2)、25.32(CH2)、24.70(CH2)、22.68(CH2)、14.12(CH3)。
【０１７１】
アセトニトリル(23 mL)、トルエン(2 mL)および水(1 mL)の混合物中の10(213 mg、0.24 mmol)の溶液に、硝酸セリウムアンモニウム(645 mg、1.18 mmol)を0℃にて加え、0℃にて30分間、および室温に温めて2時間撹拌する。反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3溶液で洗浄する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc 5：1)により精製して、化合物11(162 mg、88 %)を無色油状物で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.25−7.34(m、15 H)、5.90−5.98(m、1 H)、5.74(t、J＝2.6 Hz、1 H)、5.27(dd、J＝17.2、1.5 Hz、1 H)、5.18(dd、J＝10.4、1.3 Hz、1 H)、4.89(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.88(d、J＝10.5 Hz、1 H)、4.72−4.79(m、3 H)、4.49(d、J＝11.2 Hz、1 H)、4.42(dd、J＝12.5、5.5 Hz、1 H)、4.23(dd、J＝12.5、6.0 Hz、1H)、3.82(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.58−3.64(m、2 H)、3.51(dd、J＝9.6、2.8 Hz、1H)、3.46(t、J＝9.2 Hz、1 H)、2.39(t、J＝7.4 Hz、2 H)、2.29(s、br 1 H) 1.60−1.67(m、2 H)、1.16−1.29(m、32 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、3 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝173.28(C=O)、138.57(C)、138.28(C)、137.61(C)、134.78(CH)、129.45(CH)、128.34(CH)、128.21(CH)、128.08(CH)、127.93(CH)、127.79(CH)、127.76(CH)、127.61(CH)、117.39(CH2)、83.12(CH)、81.89(CH)、81.17(CH)、78.50(CH)、75.96(CH2)、75.93(CH2)、74.34(CH2)、72.08(CH2)、70.17(CH)、68.85(CH)、34.50(CH2)、29.69(CH2)、29.66(CH2)、29.52(CH2)、29.37(CH2)、29.35(CH2)、29.02(CH2)、25.24(CH2)、22.68(CH2)、14.12(CH3)。
【０１７２】
一般手順に記載したとおり、エステル化を行って、化合物12(271 mg、91 %)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.26−7.32(m、15 H)、5.84−5.90(m、1 H)、5.73(t、J＝2.7 Hz、1 H)、5.22(dd、J＝17.2、1.5 Hz、1 H)、5.12(dd、J＝10.5、1.3 Hz、1 H)、 4.80−4.88(m、4 H)、4.76(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.67(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.46(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.27(dd、J＝12.5、5.5 Hz、1 H)、4.17(dd、J＝12.5、6.0 Hz、1H)、3.81(t、J＝9.6 Hz、1 H)、3.77(t、J＝9.8 Hz、1 H)、3.58(dd、J＝9.7、2.7 Hz、1 H)、3.49(t、J＝9.4 Hz、1 H) 2.35(t、J＝7.3 Hz、2 H)、2.27(t、J＝7.4 Hz、2 H) 1.60−1.67(m、4 H)、1.16−1.29(m、64 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝172.85(C=O)、172.82(C=O)、 138.55(C)、138.29(C)、137.50(C)、134.82(CH)、128.44(CH)、128.33(CH)、128.19(CH)、128.11(CH)、127.93(CH)、127.80(CH)、127.76(CH)、127.61(CH)、116.68(CH2)、82.84(CH)、81.30(CH)、79.07(CH)、78.10(CH)、76.31(CH2)、75.95(CH2)、74.38(CH2)、72.14(CH2)、71.30(CH)、67.37(CH)、34.40(CH2)、34.26(CH2)、31.91(CH2)、29.71(CH2)、29.66(CH2)、29.58(CH2)、29.48(CH2)、29.41(CH2)、29.36(CH2)、29.32(CH2)、29.13(CH2)、29.04(CH2)、25.34(CH2)、24.77(CH2)、14.12(2 x CH3)。
【０１７３】
一般手順に記載したとおり、アリル基を除去して、化合物13(199 mg、79 %)を無色油状物で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.26−7.35(m、15 H)、5.75(t、J＝2.7 Hz、1 H)、4.95(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.91(d、J＝10.7 Hz、1 H)、4.73−4.79(m、4 H)、 4.68(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.47(d、J＝11.1 Hz、1 H)、3.98(t、J＝10.0 Hz、1 H)、3.84(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.60(dd、J＝9.7、2.8 Hz、1 H)、3.40(t、J＝9.3 Hz、1 H) 2.35(t、J＝7.3 Hz、2 H)、2.28(t、J＝7.4 Hz、2 H) 1.55−1.64(m、4 H)、1.16−1.31(m、64 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝173.18(C=O)、172.83(C=O)、 138.42(C)、138.23(C)、137.42(C)、128.64(CH)、128.38(CH)、128.36(CH)、128.14(CH)、128.06(CH)、128.02(CH)、127.98(CH)、127.94(CH)、127.81(CH)、127.69(CH)、82.72(CH)、81.08(CH)、78.71(CH)、75.90(CH2)、75.80(CH2)、72.12(CH2)、71.05(CH)、70.95(CH)、67.18(CH)、34.34(CH2)、34.13(CH2)、31.91(CH2)、29.71(CH2)、29.65(CH2)、29.55(CH2)、29.46(CH2)、29.36(CH2)、29.29(CH2)、29.06(CH2)、29.05(CH2)、25.26(CH2)、24.75(CH2)、22.68(CH2)、14.12(2 x CH3)。
【０１７４】
一般手順に記載したとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物14(126 mg、62 %)を無色油状物で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.22−7.32(m、15 H)、5.73(t、J＝2.7 Hz、1 H)、5.48(t、J＝10.2 Hz)、4.83−4.89(m、3 H)、4.73(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.69(d、J＝11.1 Hz、1 H)、 4.62(d、J＝11.3 Hz、1 H)、4.47(d、J＝10.1 Hz、1 H)、3.91(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.60(dd、J＝9.7、2.8 Hz、1 H)、3.53(t、J＝9.5 Hz、1 H) 2.32−2.53(m、6 H)、2.21(t、J＝7.4 Hz、2 H) 1.50−1.70(m、4 H)、1.16−1.31(m、64 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、6 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝ 172.81(C=O)、173.06(C=O)、172.91(C=O)、170.86(C=O)、138.32(C)、138.13(C)、137.36(C)、128.42(CH)、128.36(CH)、128.11(CH)、128.03(CH)、127.91(CH)、127.85(CH)、127.78(CH)、127.71(CH)、81.30(CH)、80.56(CH)、77.91(CH)、76.00(CH2)、75.74(CH2)、72.19(CH2)、71.63(CH)、69.20(CH)、66.96(CH)、34.27(CH2)、33.98(CH2)、31.93(CH2)、29.72(CH2)、29.66(CH2)、29.55(CH2)、29.49(CH2)、29.36(CH2)、29.30(CH2)、29.07(CH2)、29.05(CH2)、28.75(CH2)、28.21(CH2)、25.20(CH2)、24.70(CH2)、22.67(CH2)、14.11(2 x CH3)。
【０１７５】
一般手順に記載したとおり、ベンジル基を除去して、化合物15を得る。
MS(ESI)：886.7(M＋NH4+)、867.4(M−H+)
【０１７６】
実施例11：部分700bの前駆体の製造
以下の反応順序によって、化合物700bの前駆体を得る。
2007532512.tif 000080
一般手順に記載したとおり、エステル化を行って、化合物11から化合物18(250 mg、99 %)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.26−7.32(m、15 H)、5.83−5.89(m、1 H)、5.72(t、J＝2.7 Hz、1 H)、5.21(dd、J＝17.2、1.6 Hz、1 H)、5.18(dd、J＝10.4、1.3 Hz、1 H)、4.90(dd、J＝10.3、2.8 Hz、1 H)、4.87(d、J＝10.7 Hz、1 H)、4.85(d、J＝10.5 Hz、1 H)、4.81(d、J＝10.4 Hz、1 H)、4.77(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.67(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.47(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.27(dd、J＝12.5、5.6 Hz、1 H)、4.15(dd、J＝12.3、5.3 Hz、1H)、4.07(d、J＝2.1 Hz、2 H)、3.82(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.77(t、J＝9.8 Hz、1 H)、3.58(dd、J＝9.7、2.7 Hz、1H)、3.50(t、J＝9.4 Hz、1 H)、3.30−3.40(m、1 H)、2.35(dt、J＝7.4、2.1 Hz、2 H)、2.30(m、1 H)、1.93−1.97(m、1 H)、1.78−1.86(m、2 H)、1.71(dt、J＝6.8、3.5 Hz、1 H)、1.58−1.66(m、4 H)、1.56(s、3 H)、1.45−1.54(m、4 H)、1.35−1.41(m、1 H)、1.19−1.33(m、32 H)、1.16(s、1 H)、0.93−1.15(m、11 H)、0.84−0.92(m、15 H)、0.79(s、3 H)、0.64(s、3 H)、0.60−0.62(m、1 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝172.85(C=O)、170.32(C=O)、138.52(C)、138.24(C)、137.44(C)、134.81(CH)、128.44(CH)、128.35(CH)、128.19(CH)、128.09(CH)、127.92(CH)、127.82(CH)、127.80(CH)、127.63(CH)、116.66(CH2)、82.74(CH)、81.97(CH)、79.40(CH)、78.97(CH)、76.30(CH2)、75.95(CH2)、74.34(CH2)、72.19(CH2)、71.83(CH)、67.34(CH)、65.19(CH2)、60.39(CH2)、56.46(CH)、56.27(CH)、54.33(CH)、44.75(CH)、42.57(C)、40.01(CH2)、39.49(CH2)、36.85(CH2)、36.15(CH2)、35.78(CH)、35.69(C)、35.46(CH)、34.41(CH2)、34.35(CH2)、32.07(CH2)、31.92(CH2)、29.75(CH2)、29.72(CH2)、29.66(CH2)、29.62(CH2)、29.45(CH2)、29.36(CH2)、29.08(CH2)、28.77(CH2)、28.00(CH3)、27.78(CH2)、25.29(CH2)、24.20(CH2)、23.82(CH2)、22.81(CH3)、22.69(CH2)、22.55(CH3)、21.23(CH2)、21.05(CH)、18.65(CH3)、14.13(CH3)、12.26(CH3)、12.05(CH3)。
MS(ESI)：1230.9(M＋NH4+)、1235.9(M＋Na+)。
【０１７７】
一般手順に記載したとおり、アリル基を除去して、化合物19(190 mg、86%)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.26−7.35(m、15 H)、5.74(t、J＝2.7 Hz、1 H)、4.95(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.91(d、J＝10.7 Hz、1 H)、4.84(dd、J＝10.4、2.8 Hz、1 H)、4.76(d、J＝10.7 Hz、1 H)、4.73(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.68(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.48(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.03−4.14(m、2 H)、3.98(t、J＝9.8 Hz、1 H)、3.84(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.61(dd、J＝9.7、2.8 Hz、1H)、3.40(t、J＝9.3 Hz、1 H)、3.28−3.37(m、1 H)、2.35(dt、J＝7.5、3.6 Hz、2 H)、2.25(br、1 H)、1.93−1.97(m、1 H)、1.74−1.86(m、2 H)、1.71(m、1 H)、1.43−1.68(m、11 H)、1.35−1.41(m、1 H)、1.19−1.33(m、34 H)、0.93−1.17(m、11 H)、0.84−0.92(m、15 H)、0.78(s、3 H)、0.63(s、3 H)、0.60−0.62(m、1 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝172.82(C=O)、170.62(C=O)、138.39(C)、138.19(C)、137.36(C)、128.66(CH)、128.39(CH)、128.12(CH)、128.08(CH)、127.98(CH)、127.85(CH)、127.71(CH)、82.60(CH)、81.05(CH)、79.48(CH)、79.18(CH)、75.93(CH2)、75.82(CH2)、72.17(CH2)、71.60(CH)、70.84(CH)、67.15(CH)、65.16(CH2)、 60.40(C)、56.48(CH)、56.28(CH)、54.31(CH)、44.75(CH)、42.58(C)、40.02(CH2)、39.50(CH2)、36.85(CH2)、36.16(CH2)、35.79(CH)、35.69(C)、35.46(CH)、34.43(CH2)、34.30(CH2)、32.07(CH2)、31.93(CH2)、29.75(CH2)、29.67(CH2)、29.60(CH2)、29.42(CH2)、29.37(CH2)、29.09(CH2)、28.77(CH2)、28.25(CH)、28.00(CH2)、 27.76(CH2)、25.22(CH2)、24.21(CH2)、22.81(CH3)、22.70(CH2)、22.55(CH)、21.23(CH2)、18.65(CH3)、14.13(CH3)、12.26(CH3)、12.06(CH3)。
MS(ESI)：1190.9(M＋NH4+)、1195.9(M＋Na+)。
【０１７８】
一般手順に記載したとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物20(150 mg、90%)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.20−7.32(m、15 H)、5.70(t、J＝2.7 Hz、1 H)、5.48(t、J＝10.1 Hz、1 H)、4.97(dd、J＝10.6、2.8 Hz、1 H)、 4.87(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.83(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.74(d、J＝10.6 Hz、1 H)、4.67(d、J＝11.2 Hz、1 H)、4.60(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.49(d、J＝11.2 Hz、1 H)、4.00−4.14(m、2 H)、3.93(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.60(dd、J＝9.5、2.8 Hz、1H)、3.52(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.33−3.38(m、1 H)、2.29−2.54(m、6 H)、2.25(br、1 H)、1.93−1.97(m、1 H)、1.75−1.84(m、2 H)、1.69−1.73(m、1 H)、1.58−1.65(m、5 H)、1.42−1.57(m、5 H)、1.19−1.40(m、35 H)、0.93−1.17(m、11 H)、0.84−0.92(m、15 H)、0.77(s、3 H)、0.63(s、3 H)、0.56−0.61(m、1 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝173.28(C=O)、173.03(C=O)、170.75(C=O)、170.11(C=O)、138.24(C)、138.02(C)、137.24(C)、128.45(CH)、128.40(CH)、128.37(CH)、128.08(CH)、128.03(CH)、127.98(CH)、127.90(CH)、127.81(CH)、127.74(CH)、81.25(CH)、80.47(CH)、80.14(CH)、77.69(CH)、76.02(CH2)、75.78(CH2)、72.24(CH2)、71.09(CH)、69.60(CH)、67.02(CH)、65.02(CH2)、 60.40(C)、56.44(CH)、56.28(CH)、54.29(CH)、44.76(CH)、42.56(C)、39.99(CH2)、39.49(CH2)、36.79(CH2)、36.15(CH2)、35.78(CH)、35.64(C)、35.44(CH)、34.34(CH2)、34.25(CH2)、32.04(CH2)、31.92(CH2)、29.74(CH2)、29.72(CH2)、29.66(CH2)、29.61(CH2)、29.42(CH2)、29.36(CH2)、29.08(CH2)、28.70(CH2)、28.23(CH)、28.00(CH2)、 27.49(CH2)、25.16(CH2)、24.19(CH2)、 23.83(CH2)、22.81(CH3)、22.69(CH2)、22.55(CH)、21.22(CH2)、18.64(CH3)、14.12(CH3)、12.23(CH3)、12.05(CH3)。
MS(ESI)：1290.8(M＋NH4+)、1295.9(M＋Na+)、1271.7(M−H+)。
【０１７９】
一般手順に記載したとおり、ベンジル基を除去して、化合物21(81.9 mg、80%)を無色固体で得る。
MS(ESI)：1020.8(M＋NH4+)、1025.8(M＋Na+)、1001.5(M−H+)。
【０１８０】
実施例12：部分700cの前駆体の製造
以下の反応順序によって、化合物700cの前駆体を得る。
2007532512.tif 000081
一般手順に記載したとおり、エステル化を行って、化合物23から化合物24(171.5 mg、80%)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.25−7.32(m、15 H)、5.79−5.92(m、1 H)、5.77(t、J＝2.6 Hz、1 H)、5.21(dd、J＝17.2、1.7 Hz、1 H)、5.12(d、J＝11.7 Hz、1 H)、4.93(dd、J＝9.9、2.6 Hz、1 H)、4.83−4.89(m、3 H)、4.78(d、J＝10.8 Hz、1 H)、4.67(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.50(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.24− 4.34(m、2 H)、4.08−4.17(m、4 H)、3.79−3.86(m、2 H)、3.60(dd、J＝10.1、3.0 Hz、1H)、3.52(t、J＝9.3 Hz、1 H)、3.28−3.37(m、2 H)、1.92−1.98(m、2 H)、1.76−1.85(m、4 H)、1.62−1.72(m、8 H)、1.36−1.56(m、10 H) 1.20−1.31(m、18 H)、1.00−1.15(m、16 H)、0.87−0.97(m、20 H)、0.78(d、J＝5.7 Hz、6 H)、0.63(s、6 H)、0.54−0.61(m、2 H)。
MS(ESI)：1365.0(M＋NH4+)、1370.0(M＋Na+)。
【０１８１】
一般手順に記載したとおり、アリル基を除去して、化合物25(123.0 mg、74%)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.26−7.34(m、15 H)、5.78(t、J＝2.5 Hz、1 H)、4.94(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.90(d、J＝10.7 Hz、1 H)、4.86(dd、J＝10.4、2.6 Hz、1 H)、4.77(d、J＝10.9 Hz、1 H)、4.74(d、J＝11.2 Hz、1 H)、4.67(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.50(d、J＝11.1 Hz、1 H)、4.04−4.21(m、4 H)、3.96(t、J＝9.8 Hz、1 H)、3.83(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.63(dd、J＝9.7、2.6 Hz、1H)、3.40(t、J＝9.6 Hz、1 H)、3.27−3.33(m、2 H)、1.92−1.98(m、2 H)、1.76−1.85(m、4 H)、1.62−1.72(m、8 H)、1.36−1.56(m、10 H) 1.20−1.31(m、18 H)、1.00−1.15(m、16 H)、0.87−0.97(m、20 H)、0.78(d、J＝5.7 Hz、6 H)、0.63(s、6 H)、0.54−0.61(m、2 H)。
MS(ESI)：1365.0(M＋NH4+)、1370.0(M＋Na+)。
【０１８２】
一般手順に記載したとおり、コハク酸頭部基の結合に続いてベンジル基の除去を行い、化合物26(80 mg、93%：二段階で)をロウ状固体で得る。
MS(ESI)：1154.6(M＋NH4+)、1159.7(M＋Na+)、1135.6(M−H+)
【０１８３】
実施例13：部分1800dの前駆体の製造
以下の反応順序によって、化合物1800dの前駆体を得る。
2007532512.tif 000082
文献に記載のとおり、化合物28を得る(Biochemistry、1994、33、11586)。
【０１８４】
CH2Cl2(20 mL)中の28(889.4 mg、1.85 mmol)の溶液に、4−メトキシベンジルクロリド(434.7 mg、2.78 mmol)および水素化ナトリウム(60%、111 mg、2.78 mmol)を加え、−15℃にて1時間、室温にて18時間撹拌する。反応混合物をEtOAc(50 mL)で希釈し、飽和NaCl溶液および水で洗浄し、EtOAcで抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc 6：1)により精製して、化合物29(1.023 g、92%)を無色油状物で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.28−7.36(m、12 H)、6.84(d、J＝8.7 Hz、2 H)、5.87−6.03(m、3 H)、5.27−5.33(m、3 H)、5.14−5.18(m、3 H)、4.87(d、J＝10.5 Hz、1 H)、4.80−4.83(m、3 H)、4.65(d、J＝11.8 Hz、1 H)、4.58(d、J＝11.7 Hz、1 H)、4.27−4.37(m、4 H)、4.06−4.12(m、2 H)、3.95−4.05(m、2 H)、3.81−3.84(m、1 H)、3.80(s、3 H)、3.30(dd、J＝9.9、2.3 Hz、1 H)、3.26(t、J＝9.3 Hz、1 H)、3.14(dd、J＝9.9、2.3 Hz、1 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝158.91(C)、138.86(C)、138.48(C)、135.51(CH)、135.40(CH)、134.98(CH)、131.03(C) 129.38(CH)、128.28(CH)、128.25(CH)、128.13(CH)、127.47(CH)、127.44(CH)、116.46(CH2)、116.40(CH2)、116.34(CH2)、113.43(CH)、83.28(CH)、81.52(CH)、81.33(CH)、80.69(CH)、80.44(CH)、75.83(CH2)、74.55(CH2)、74.48(CH2)、73.79(CH)、73.52(CH2)、72.65(CH2)、71.61(CH2)、55.21(CH3)。
MS(ESI)：618.2(M＋NH4+)、623.2(M＋Na+)
【０１８５】
エタノール(20 mL)中の29(216.5 mg、0.36 mmol)の溶液に、10%Pd/C(100 mg)およびp−トルエンスルホン酸(180 mg、0.95 mmol)を加え、2時間加熱還流する。溶媒を減圧除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、EtOAc)に付して、生成物(97 mg、56%)を無色油状物で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.25−7.34(m、12 H)、6.86(d、J＝8.6 Hz、2 H)、4.97(m、2 H)、4.75(d、J＝10.1 Hz、1 H)、4.68(s、2 H)、4.60(d、J＝10.2 Hz、1 H)、3.99−4.01(m、1 H)、3.83(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.79(s、3 H)、3.70(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.43−3.45(m、1 H)、3.32−3.38(m、2 H)、3.03(s、br、1 H) 、2.77(s、br、1 H) 、2.45(s、br、1 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝159.26(C)、138.57(C)、138.00(C)、130.60(C) 129.48(CH)、128.48(CH)、128.47(CH)、128.39(CH)、128.00(CH)、127.78(CH)、127.70(CH)、127.61(CH)、113.62(CH)、81.13(CH)、80.80(CH)、76.83(CH)、75.43(CH2)、74.53(CH2)、74.38(CH)、73.59(CH)、72.85(CH2)、72.06(CH)、55.25(CH3)。
【０１８６】
一般手順に記載したとおり、エステル化を行って、化合物30から化合物31(97 mg、56%)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.20−7.33(m、12 H)、6.83(d、J＝8.7 Hz、2 H)、5.56(t、J＝10.1 Hz、1 H)、5.10(t、J＝9.6 Hz、1 H)、4.84(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.78(dd、J＝10.5、2.4 Hz、1 H)、4.73(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.59−4.64(m、4 H)、4.10(t、J＝2.2 Hz、1 H)、4.06(t、J＝9.7 Hz、1 H)、3.79(s、3 H)、3.57(dd、J＝9.7、2.1 Hz、1 H)、2.10−2.30(m、6 H)、1.40−1.52(m、6 H)、1.15−1.30(m、96 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、9 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝172.95(C=O)、172.68(C=O)、172.63(C=O)、159.20(C)、138.37(C)、137.89(C)、130.24(C) 129.51(CH)、128.42(CH)、128.26(CH)、127.74(CH)、127.60(CH)、127.53(CH)、127.50(CH)、113.64(CH)、80.46(CH)、78.96(CH)、75.45(CH2)、74.37(CH2)、74.09(CH)、72.94(CH2)、72.47(CH)、71.52(CH)、69.96(CH)、55.23(CH3)、34.19(CH2)、34.17(CH2)、31.92(CH2)、29.71(CH2)、29.66(CH2)、29.52(CH2)、29.46(CH2)、29.36(CH2)、29.34(CH2)、29.21(CH2)、29.19(CH2)、24.93(CH2)、24.84 (CH2)、24.80(CH2)、22.69(CH2)、14.12(CH3)。
【０１８７】
CH2Cl2(10 mL)および水(0.2 mL)の混合物中の31(100 mg、0.073 mmol)の溶液に、ジクロロジシアノベンゾキノン (25 mg、0.101 mmol)を加え、室温にて5時間撹拌する。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3溶液で洗浄し、CH2Cl2で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濃縮する。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、PE/EtOAc 8：1)により精製して、生成物32(88.6 mg、97%)をロウ状固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝7.22−7.32(m、10 H)、5.55(t、J＝10.2 Hz、1 H)、5.12(t、J＝9.9 Hz、1 H)、4.88(dd、J＝10.3、2.8 Hz、1 H)、4.83(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.67(s、2 H)、4.62(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.28(t、J＝2.5 Hz、1 H)、3.98(t、J＝9.7 Hz、1 H)、3.61(dd、J＝9.5、2.5 Hz、1 H)、2.25−2.35(m、2 H)、2.09−2.23(m、4 H)、1.45−1.58(m、6 H)、1.09−1.39(m、96 H)、0.87(t、J＝6.9 Hz、9 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：δ＝172.92(C=O)、172.63(C=O)、172.53(C=O)、138.17(C)、137.23(C)、128.58(CH)、128.34(CH)、128.14(CH)、127.94(CH)、127.63(CH)、127.58(CH)、79.54(CH)、78.64(CH)、75.59(CH2)、73.02(CH2)、72.06(CH)、70.84(CH)、69.21(CH)、67.83(CH)、34.17(CH2)、33.79(CH2)、31.92(CH2)、29.72(CH2)、29.52(CH2)、29.49(CH2)、29.38(CH2)、29.33(CH2)、29.28(CH2)、29.21(CH2)、29.19(CH2)、29.12(CH2)、28.40(CH2)、24.94(CH2)、24.92 (CH2)、24.79(CH2)、22.69(CH2)、14.12(CH3)。
【０１８８】
一般手順に記載のとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物33(213 mg、78%)を無色固体で得る。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.19−7.32(m、10 H)、5.77(t、J＝2.6 Hz、1 H)、5.41(t、J＝10.3 Hz、1 H)、5.14(t、J＝9.9 Hz、1 H)、4.91(dd、J＝10.4、2.7 Hz、1 H)、4.84(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.66(d、J＝11.0 Hz、1 H)、4.59(d、J＝11.4 Hz、1 H)、4.49(d、J＝11.4 Hz、1 H)、3.87(t、J＝9.5 Hz、1 H)、3.67(dd、J＝10.1、3.1 Hz、1 H)、2.77−2.81(m、2 H)、2.65−2.70(m、2 H)、2.12−2.28(m、6 H)、1.41−1.59(m、6 H)、1.16−1.38(m、96 H)、0.87(t、J＝6.8 Hz、9 H)。
MS(ESI)：1361.1(M＋NH4+)、1341.9(M−H+)
【０１８９】
一般手順に記載したとおり、ベンジル基を除去して、化合物34(160 mg、97%)を無色固体で得る。
1H−NMR(500 MHz、CDCl3)：δ＝5.45(t、J＝2.7 Hz、1 H)、5.26(t、J＝10.2 Hz、1 H)、4.85−4.94(m、2 H)、3.69(t、J＝9.8 Hz、1 H)、3.56(dd、J＝9.9、2.8 Hz、1 H)、2.59−2.62(m、2 H)、2.53−2.56(m、2 H)、2.16−2.25(m、2 H)、2.06−2.12(m、4 H)、1.41−1.59(m、6 H)、1.16−1.38(m、96 H)、0.75(t、J＝6.7 Hz、9 H)。
13C−NMR(125 MHz、CDCl3)：174.45(C=O)、173.27(C=O)、172.77(C=O)、172.50(C=O)、171.71(C=O)、72.55(CH)、70.94(CH)、70.81(CH)、69.64(CH)、69.41(CH)、69.26(CH)、44.34(CH2)、33.95(CH2)、33.91(CH2)、33.66(CH2)、31.69(CH2)、29.47(CH2)、29.12(CH2)、28.95(CH2)、28.82(CH2)、24.69(CH2)、24.40(CH2)、22.44(CH2)、22.23(CH2)、21.89(CH2)、13.78(CH3)。
MS(ESI)：1186.0(M＋Na+)、1161.7(M−H+)
【０１９０】
実施例14：部分200aの前駆体の製造
以下のとおり、部分200aの遊離酸誘導体を製造する。
ジアゾ酢酸エチル(1.93 g、16.8 mmol)および触媒量の三フッ化ホウ素エーテル複合体(670 μリットル)をジクロロメタン(100 mL)中の市販のコレステロール(5 g、12.9 mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で連続的に加える。得られる反応混合物を室温にて約3時間撹拌する。飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液(60 mL)をゆっくりと添加した後、有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で再度洗浄する。溶媒を減圧除去し、粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/ジエチルエーテル 5：1)により精製する。対応するアルキル化コレステリル誘導体を無色固体で得る(3.67 g、60%収率)。
このようにして得た物質をエタノール(200 mL)に溶解し、溶液を50℃に加熱する。水酸化カリウム固体(1.2 g、22.3 mmol)を添加した後、得られる反応混合物を50℃にて約1時間撹拌する。塩酸を加えて混合物を酸性化し、ジクロロメタン(800 mL)および水(800 mL)に分配する。有機層を分離し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、溶媒を減圧除去する。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール 95：5)により精製する。部分200aの遊離酸誘導体を無色固体で得る(3.04 g、92%収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝5.36(d、J＝5.1 Hz、1 H)、4.14(s、2 H)、3.29(m、1 H)、2.22−2.38(m、3 H)、1.76−2.1(m、6 H)、0.84−1.67(m、28 H)、1.0(s、3 H)、0.67(s、3 H)。
MS(ESI)：m/z＝443.3(M−H)−
【０１９１】
実施例15：部分200bの前駆体の製造
以下のとおり、部分200bの遊離酸誘導体を製造する。
ジアゾ酢酸エチル(3.73 g、32.8 mmol)を無水ジクロロメタン(50 mL)中の市販のジヒドロコレステロール(9.8 g、25.2 mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で加える。触媒量の三フッ化ホウ素エーテル(1 mL、1M ジエチルエーテル溶液)を少しずつ加えた後、得られる反応混合物を室温にて36時間撹拌する。反応混合物に炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(1 L)を注ぎ入れ、酢酸エチル(1 L)で抽出する。水(1 L)で洗浄した後、有機層を乾燥(硫酸マグネシウム)し、溶媒を減圧除去する。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液として純ジクロロメタン)により精製する。
得られる生成物をジクロロメタン(15 mL)に溶解し、水酸化カリウムの1M水溶液(20 mL)を加える。得られる反応混合物を室温にて約48時間激しく撹拌する。水性層のpHが約pH 1−2になるまで1 M 塩酸水溶液を加える。混合物を水(1 L)および酢酸エチル(900 mL)に分配する。分離した後、有機層を水(1 L)で洗浄し、乾燥(硫酸マグネシウム)し、溶媒を減圧除去して、分析的に純粋な生成物を無色固体で得る(5.39 g、48%全収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝3.75(s、2 H)、3.32(m、1 H)、0.85−2.1(m、40 H)、0.80(s、3 H)、0.64(s、3 H)。
MS(ESI)：m/z＝445.2(M−H)−
【０１９２】
実施例16：部分200cの前駆体の製造
以下のとおり、部分200cの遊離酸誘導体を製造する。B. R. Petersonらの文献(S. L. Hussey、E. He、B. R. Peterson、J．Am. Chem. Soc. 2001、123、12712−12713；S. E. Martin、B. R. Peterson、Bioconjugate Chem. 2003、14、67−74)に詳細に記載されている合成方法にしたがって、部分200cの遊離酸誘導体を製造する。実際に、部分200cの遊離酸誘導体の代わりに、対応するN−ノシル保護誘導体を固相合成によって組み込み、上記のB. R. Petersonの文献に記載の実験プロトコルによる複合体構築の後、ノシル保護基を除去する。しかし、最終ラフト親和性部分ビルディングブロックは、部分200cの遊離酸誘導体によって表される。
【０１９３】
実施例17：部分200eの前駆体の製造
以下のとおり、部分200eの遊離酸誘導体を製造する。
トリエチルアミン(284 mg、2.81 mmol)をジクロロメタン(10 mL)中の市販のジヒドロコレステロール(840 mg、2.16 mmol)、無水コハク酸(281 mg、2.81 mmol)およびDMAP(342 mg、2.81 mmol)の溶液に加え、得られる反応混合物を室温にて一夜撹拌する。酢酸エチル(900 mL)で希釈した後、反応混合物を0.1M 水性塩酸(1 L)および水(2 x 1 L)で連続的に洗浄する。有機層を乾燥(硫酸ナトリウム)し、溶媒を減圧除去して、分析的に純粋な生成物を無色固体で得る(926 mg、87%収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝4.71(m、1 H)、2.67(m、2 H)、2.59(m、2 H)、1.96(m、1 H)、0.85−1.81(m、39 H)、0.81(s、3 H)、0.64(s、3 H)。
【０１９４】
実施例18：部分200fの前駆体の製造
以下のとおり、部分200fの遊離酸誘導体を製造する。
無水THF(250 mL)中の市販のジヒドロコレステロール(10 g、25.7 mmol)、トリフェニルホスフィン(20.3 g、77.2 mmol)およびメタンスルホン酸(5.2 g、53.9 mmol)の溶液をアルゴン雰囲気下で42℃に加熱する。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(15.6 g、77.2 mmol)を加えた後、得られる反応混合物を40℃にて約18時間撹拌する。水(20 mL)を加え、反応混合物を室温にて10分間撹拌する。さらに水(400 mL)およびジクロロメタン(200 mL)を加えた後、有機層を分離する。水層を ジクロロメタン(200 mL)で再度抽出し、有機層を合わせ、食塩水(800 mL)で洗浄する。有機層を乾燥(硫酸ナトリウム)した後、溶媒を減圧除去し、粗物質を勾配溶離(石油エーテル/酢酸エチル 10：1〜6：1)を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付す。予期されたメシレートを白色個体で得る(4.1 g、34%収率)。
このように得られた物質(4.1 g、8.8 mmol)をDMSO(80 mL)に溶解し、ナトリウムアジド(5.7 g、88 mmol)を加える。得られる反応混合物を90℃にて約18時間撹拌する。水(500 mL)を添加した後、混合物をジクロロメタン(400 mL)で抽出する。有機層を分離し、水(4 x 700 mL)で完全に洗浄する。乾燥(硫酸ナトリウム)した後、溶媒を減圧除去し、得られる分析的に純粋なアジドを真空乾燥する(2.7 g、75%収率)。
そのようにして得たアジド(2.5 g、6 mmol)を無水ジエチルエーテル(25 mL)に溶解し、得られる溶液を無水ジエチルエーテル(50 mL)中の水素化リチウムアルミニウム(690 mg、18.3 mmol)の懸濁液にアルゴン雰囲気下で36℃にて滴下する。得られる反応混合物を還流温度にて約18時間撹拌し、次いで、氷−水浴中で冷却し、ガスの放出が終わるまで水を滴下する。2M水酸化ナトリウムの水溶液(1 L)を加え、混合物をジエチルエーテル(500 mL)で抽出する。水層をジクロロメタン(2 x 500 mL)で再度抽出し、有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)する。溶媒を減圧除去し、高真空乾燥した後、分析的に純粋な予期されたアミンを得る(1.3 g、55%収率)。
ジクロロメタン(10 mL)中の上記アミン(160 mg、0.41 mmol)、DMAP(125 mg、1 mmol)および無水コハク酸(103 mg、1 mmol)の溶液を室温にて約48時間撹拌する。溶媒を減圧除去し、得られる固体残渣を酢酸エチル(20 mL)に溶解する。飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液(20 mL)および触媒量のDMAPを連続的に加えた後、得られる混合物を室温にて1時間撹拌する。0.1M 塩酸(500 mL)水溶液を加え、水層を酢酸エチル(2 x 400 mL)で抽出する。有機層を乾燥(硫酸ナトリウム)した後、溶媒を減圧除去し、分析的に純粋な部分200fの遊離酸誘導体を得る(78 mg、40%収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝3.78(m、1 H)、2.66(m、4 H)、1.97(m、1 H)、0.85−1.81(m、40 H)、0.78(s、3 H)、0.64(s、3 H)。
MS(ESI)：m/z＝488.4(M+H)+
【０１９５】
実施例19：部分200jの前駆体の製造
上記の部分200eの遊離酸誘導体のための記載と同じプロトコルを用いて、市販のコレステロールから部分200jの遊離酸誘導体を製造する。
部分200jの遊離酸誘導体を無色固体で得る(1.2 g、95%収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝5.37(d、J＝4.1 Hz、1 H)、4.63(m、1 H)、2.66−2.70(m、2 H)、2.58−2.62(m、2 H)、2.32(d、J＝7.8 Hz、2 H)、1.77−2.05(m、5 H)、0.85−1.65(m、30 H)、1.02(s、3 H)、0.68(s、3 H)。
MS(ESI)：m/z＝485.1(M−H)−
【０１９６】
実施例20：部分200kを含む化合物の製造
当業者に公知の標準的エステル化プロトコルを用いて、市販のFmoc−Asp−OtBuの側鎖の遊離カルボン酸官能基をジヒドロコレステロールとカップリングさせる。次いで、得られるFmoc−Asp−OtBuのジヒドロコレステリルエステルを、標準的トリフルオロ酢酸プロトコルを用いるOtBuエステルの切断に付して、対応するFmoc−Aspのジヒドロコレステリルエステルを得る。
次いで、このビルディングブロックをローダミン標識リンカー下部構造のN末端に連結し、次いで、標準的Fmoc脱保護を行い、部分200kを含む化合物を得る。
【０１９７】
実施例21：部分200lを含む化合物の製造
文献で既知の標準的プロトコルを用いる単純なアセチルキャッピングによって、実施例20で得た部分200kを含む化合物から、部分200lを含む化合物を得る。
【０１９８】
実施例22：部分200mの前駆体の製造
化合物25bの製造において記載したとおり、固相支持体への実施例20で得たFmoc−Aspのジヒドロコレステリルエステルの結合、次いで、N末端のFmoc脱保護ならびに遊離N末端の上にリンカーおよびファーマコフォア下部構造を組み立てるための固相ペプチド化学によって、部分200mを含む化合物を製造する。
【０１９９】
実施例23：部分300aの前駆体の製造
以下のとおり、部分300aの遊離酸誘導体を製造する。
無水DMSO(15 mL)中の水素化ナトリウム(500 mg 鉱物油懸濁液、12.25 mmol水素化ナトリウム)の懸濁液をアルゴン雰囲気下で70℃にて約45分間加熱する。無水DMSO(20 mL)中の市販のドデシルホスホニウムブロミドの溶液を添加した後、得られる赤色溶液を約60−65℃にて約10分間保持する。次いで、無水DMSO(20 mL)中の市販のエストロン(668 mg、2.47 mmol)の溶液をこの熱い溶液に加え、反応混合物を60℃にて18時間撹拌する。混合物に水(1 L)を注ぎ入れ、ジエチルエーテル(2 x 500 mL)で抽出する。有機層を合わせ、水(4 x 1 L)で繰り返し洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、。溶媒を減圧除去した後、粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル 4：1)により精製する。予期された17−ドデシリデニル化エストロンを白色個体で得る(531 mg、51%収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.08(d、J＝8.5 Hz、1 H)、6.56(dd、J＝2.7、8.5 Hz、1 H)、6.49(d、J＝2.7 Hz、1 H)、4.98(t、J＝7.4 Hz、1 H)、4.58(s、1 H)、2.75(m、2 H)、2.04−2.41(m、9 H)、1.15−1.87(m、24 H)、0.84(s、3 H)、0.82(t、J＝6.9 Hz、3 H)。
MS(ESI)：m/z＝422.6(M+)
【０２００】
上述の物質における17,20二重結合の水素添加は、ジクロロメタン(10 mL)中の17−ドデシリデニル化エストロン(475 mg、1.12 mmol)の溶液およびパラジウム(120 mg 10%／炭素、0.11 mmol)を水素雰囲気下で室温にて36時間処理することによって達成される。反応混合物をセライトパッドで濾過し、溶媒を減圧除去して、分析的に純粋な17β−ドデシル置換エストロンを無色固体で得る(452 mg、95%収率)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝7.09(d、J＝8.4 Hz、1 H)、6.55(dd、J＝2.6、8.4 Hz、1 H)、6.49(d、J＝2.6 Hz、1 H)、4.51(s、1 H)、2.73−2.77(m、2 H)、2.15−2.19(m、2 H)、1.77−1.82(m、2 H)、1.03−1.65(m、16 H)、0.81(t、J＝6.9 Hz、3 H)、0.53(s、3 H)。
MS(ESI)：m/z＝424.7(M+)
【０２０１】
DMF(6 mL)およびジクロロメタン(6 mL)中の上述の17β−ドデシル置換エストロン(440 mg、1.04 mmol)の溶液を、水素化ナトリウム(50 mg 鉱物油懸濁液、1.14 mmol 水素化ナトリウム)に加え、得られる懸濁液を約20分間加熱還流する。ブロモ酢酸tert−ブチル(242 mg、1.24 mmol)を加え、反応混合物を撹拌する約28時間加熱還流する。水(1 L)に注ぎ入れ、ジクロロメタン(600 mL)で抽出した後、有機層を水(3 x 800 mL)で洗浄し、乾燥(硫酸マグネシウム)する。溶媒を減圧除去し、分析的に純粋な生成物を無色固体で得る。
得られた物質をジクロロメタン(10 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(2.5 mL)を添加した後、得られる反応混合物を室温にて3時間撹拌する。溶媒を減圧除去し、得られる物質を18時間高真空乾燥する。部分300aの遊離酸誘導体を淡黄色固体で得る(394 mg、79%全収率)。
MS(ESI)：m/z＝481.3(M−H)−
【０２０２】
実施例24：部分1900aの前駆体の製造
以下のとおり、部分1900aの遊離酸誘導体を製造する。
2007532512.tif 000083
N−メチル−2−ピロリドン(4 mL)中の1(447 mg、1 mmol)、HATU(380 mg、1 mmol)、H−Gly−2Cl−Trt樹脂(0.54 mmol)(Novabiochemから市販されている、カタログ番号04−12−2800)およびDIPEA(259 mg、2 mmol)の溶液をペプチド合成機で1時間振とうする。N−メチル−2−ピロリドン洗浄、次いで、CH2Cl2洗浄を行う。このようにして得られる樹脂をCH2Cl2中の1%トリフルオロ酢酸溶液で処理することにより切断する。生成物を水(100 mL)で洗浄し、CH2Cl2(3x100 mL)で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸ナトリウム)し、減圧濃縮して、2を白色個体で得る(250 mg、100%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.58(s、6H)、0.70−1.77(series of m、36H)、1.87(d、J＝12.3 Hz、2H)、3.09(m、2H)、3.26(m、1H)、3.98(m、2H)、4.04(m、2H)、7.23(m、1H)、9.7(br s、1H)。
MS(ESI)：m/z＝502(M−1)
一般手順に記載したとおり、ステロイド含有側鎖を導入して、化合物4を白色個体で得る(281 mg、62%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.65(s、3H)、0.79(s、3H)、0.85−0.91(m、18H)、1.06−1.45(m、50H)、1.46−2.17(m、9H)、3.27(m、1H)、3.56−4.13(m、8H)、4.35(m、1H)、5.41(m、2H)、6.12(m、1H)、7.36(m、6H)、7.59(m、4H)。
MS(ESI)：m/z＝1023(M+1)
一般手順に記載したとおり、コハク酸頭部基を結合して、化合物5を得る(224 mg、73%)。
1H−NMR(300 MHz、CDCl3)：δ＝0.63(s、3H)、0.78(s、3H)、0.84−0.95(m、18H)、0.98−1.31(m、50H)、1.41−1.82(m、10H)、1.94(br d、J＝12.13 Hz、2H)、2.47(m、4H)、3.27(m、1H)、3.48(m、1H)、3.95(br s、2H)、4.19(m、4H)、5.28(m、2H)、7.29(m、6H)、7.59(m、4H)。
MS(ESI)：m/z＝1123.7(M+1)
一般手順に記載したとおり、保護基を除去して、化合物6を得る。
MS(ESI)：m/z＝885.6(M+1)
【０２０３】
実施例25：部分1900bの前駆体の製造
当業者に公知の固相ペプチド化学を用い、市販のFmoc−Lys(Dde)から出発して、部分1900bの遊離酸誘導体を製造する。固相支持体に、直角に保護された実施例24に記載のアミノ酸を最初に結合した後、文献に公知のプロトコルによってDde保護基を除去し、次いで、標準的ペプチドカップリングを用いて部分200bの遊離酸をキャッピングする。部分200bの遊離酸の製造は、前述のとおりである。次いで、Fmoc保護基を除去し、次いで、 市販のFmoc−β−Alaおよびラフト親和性部分200bの遊離酸を連続的にカップリングさせる。標準的条件下での固相支持体からの最終的切断により、部分1900bの遊離酸を得る。
【０２０４】
本発明化合物の合成のための一般的手順
本明細書に記載の三者化合物は、シリーズ200 UV/VIS検出器を備えたApplied Biosystems 433Aペプチド合成機（以降、ABI 433AおよびABI 433とも称する）を用いて固相支持体上に合成することができる。すべてのペプチド合成は、たとえば、脱保護試薬としてピペリジンおよびカップリング試薬として2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)またはO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラ−メチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)を用いるFmoc法を用いて行われる。合成法の原理は、一般的テキスト(たとえば、G．A. Grant編、「Synthetic Peptides：A User's Guide」、W.H. Freeman & Co.、New York 1992)に記載されている。ABI 433Aによって用いられる合成手順の詳細な記載は、ABI 433A取り扱い説明書中、部品番号904855 Rev. Cおよび904856C(著作権2001、Applied Biosystems)および説明書中、「Running the 433A with the Series 200 UV Detector」(著作権2002、Applied Biosystems)に記載されている。アミド樹脂Fmoc−PAL−PEG−PS(Applied Biosystems、部品番号 GEN913398)を固相支持体として用いることができる。アミノ酸ビルディングブロック、カップリング試薬および溶媒は、Applied BiosystemsまたはNovabiochemのいずれかから使える状態で購する。ポリグリコール骨格を有するアミノ酸は、文献(D. Boumrah、M. M. Campbell、S．Fenner、R. G. Kinsman、テトラhedron 1997、53、6977−6992)に記載のプロトコルにしたがって製造するか、またはNovabiochemから購入する。ABI 433Aによって処理することができない（たとえば、溶解度が低いことによる）液体ビルディングブロックは、上述のとおり生成された固相支持体上のペプチドのN末端にたとえば、手動でカップリングさせる。合成完了後、最終生成物を固相支持体から切断する。典型的な手順は以下のとおりである：トリフルオロ酢酸(87%)、水(4%)、アニソール(3%)、チオアニソール(3%)およびトリイソプロピルシラン(3%)を含む切断用反応混液を新たに製造する。この混合物4 mlを氷浴で冷却し、70 mgの樹脂結合ペプチドまたはリポペプチドを加える。混合物を5±2℃にて90〜120分間撹拌する。混合物を100 mlのジエチルエーテルおよびヘキサン(2：1)氷冷混合物中に濾過し、樹脂を切断用反応混液で数回洗浄し、同じ方法で濾過する。合わせた濾液を含むジエチルエーテル/ヘキサン混合物を冷凍庫(−18℃)で冷却し、粗ペプチドまたはリポペプチドを膜濾過によって単離する。粗生成物をジエチルエーテル/ヘキサン(2：1)で洗浄し、高真空乾燥し、プレパラティブ逆相HPLCによって精製する。
【０２０５】
実施例26
2007532512.tif 000084
自動ペプチド合成機を用いて、Fmoc−PAL−PEG−PS樹脂(610 mg、0.25 mmol、ローディング：0.41 mmol/g)を反応器内で以下の操作に付す：ジクロロメタンで洗浄、N−メチル−2−ピロリドンで洗浄、N−メチル−2−ピロリドン中の20%ピペリジンを用いる末端Fmoc基の切断(controlled by UVモニターにより制御)、N−メチル−2−ピロリドンで洗浄。
【０２０６】
以下のとおり、アミノ酸の活性化およびカップリングを達成する：Fmoc−Phe(1 mmol)を、気密cartush中、HBTU(1 mmol、2.2 mLの0.45 M N−メチル−2−ピロリドン溶液)およびジイソプロピルエチルアミン(2 mmol、0.5 mLの2 M N−メチル−2−ピロリドン溶液)を添加し、次いで、透明溶液が得られるまで反応混合物に窒素ガスを通すことによって、対応するN−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾールエステル(活性化)に変換する。混合物を反応器に移し、樹脂とともに30分間振とうする（カップリング）。樹脂を排液し、N−メチル−2−ピロリドンで洗浄する。上記の操作順序を、次のアミノ酸、すなわち、Fmoc−Glu(tBu)、Fmoc−Ala、Fmoc−Val、Fmoc−Sta、Fmoc−Asn(Trt)、Fmoc−Val、Fmoc−Glu(tBu)、Fmoc−Gly、Fmoc−βAlaについて繰り返して、Calbiochem、カタログ番号565780から入手可能なインヒビターIIIの保護誘導体を得る。
ジクロロメタンで最終洗浄を行った後、樹脂を高真空乾燥し、−18℃にて保管する。樹脂の一部を用いて26の製造を継続する。
【０２０７】
ローダミン標識グルタミン酸のカップリングを丸底フラスコにおいて手動で行う。そのままのジイソプロピルエチルアミン(78 mg、0.6 mmol)を、N−メチル−2−ピロリドン(6 mL)中のFmoc−Glu(Rho)(295 mg、0.3 mmol)およびHATU(115 mg、0.3 mmol)の溶液に加え、得られる反応混合物を室温にて10分間撹拌する（活性化）。この混合物を前述の樹脂(341 mg、0.1 mmol)に添加した後、得られる不均質な反応混合物を室温にて1時間注意深く撹拌する。樹脂を排液し、反応器に移し、自動ペプチド合成機を用いて、N−メチル−2−ピロリドンおよびジクロロメタンで連続的に洗浄する。
自動ペプチド合成機を用いる前述と同じ方法でFmoc−βAla、Fmoc−Arg(Pbf)およびFmoc−Arg(Pbf)の連続的活性化およびカップリングを行うことによって、ペプチド鎖の完成を達成する。
【０２０８】
コレステリルグリコール酸(すなわち、部分200aの前駆体)のカップリングを丸底フラスコにおいて再度手動で行う。そのままのジイソプロピルエチルアミン(42 mg、0.16 mmol)を、ジメチルホルムアミド(2 mL)中のコレステリルグリコール酸(73 mg、0.16 mmol)、HBTU(62 mg、0.16 mmol)およびN−ヒドロキシベンゾトリアゾール(25 mg、0.16 mmol)の溶液に加え、得られる反応混合物を室温にて10分間撹拌する(活性化)。この混合物を前述の樹脂(186 mg、0.054 mmol)に添加した後、得られる不均質な反応混合物を室温にて2時間注意深く撹拌する。樹脂を排液し、反応器に移し、自動ペプチド合成機を用いて、N−メチル−2−ピロリドンおよびジクロロメタンで連続的に洗浄する。
【０２０９】
一般的部分で記載したとおり、樹脂からの切断を行う：樹脂(134 mg)をトリフルオロ酢酸(87%)、水(4%)、トリイソプロピルシラン(3%)、チオアニソール(3%)およびアニソール(3%)の混合物に懸濁し、5℃(±2℃)にて90分間撹拌する。樹脂を排液し、前述の切断用反応混液(4x1 mL)で繰り返し洗浄する。濾液を氷冷ジエチルエーテル(40 mL)に注ぎ入れ、ヘキサン/ジエチルエーテル(1：2)で100 mLに希釈すると沈澱が完了する。生成物を膜濾過(PP膜、0.45 μm)により分離し、ヘキサン/ジエチルエーテル(1：2)で洗浄し、高真空乾燥する(粗収量：41 mg)。
粗生成物のプレパラティブHPLC精製(Vydac−C8−カラム、40 mL/分、A：水＋0.1%トリフルオロ酢酸、B：アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、51%〜63%Bの15分間にわたる勾配溶離、観測された保持時間：9.8分)を行い、溶媒を高真空除去し、酢酸から凍結乾燥した後、26を赤みがかったピンク色の泡状物で得る。
HPLC分析：Agilent Zorbax−C8カラム4.6x125 mm、流速1 mL/分、A：水＋0.1%トリフルオロ酢酸、B：アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、10%〜100%Bの45分間にわたる勾配溶離、保持時間：30.8分、215 nmで検出、91%純度。
ESI−MS：1262.4 [M+H]2+、842.3 [M+2H]3+。
【０２１０】
実施例27
2007532512.tif 000085
コレステリルグリコール酸(の前駆体部分200a)の代わりに、コハク酸モノ(D−エリスロ−C16−セラミジル)エステル(すなわち、部分400aaの前駆体)をN末端アルギニンへカップリングすることによって、化合物26の製造の記載と同様にして、化合物27の製造を達成する。化合物26の記載と同様にして、切断および精製を行う。化合物27を赤色粉末で得る(4.1 mg)。
HPLC分析：化合物26の記載と同様のプロトコルであるが、ただし、66%アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸で45分間の定組成溶離を用いる；保持時間：13.5分；215 nmにて検出；90%純度。
ESI−MS：1358 [M+2H]2+、906 [M+2H]3+。
【０２１１】
実施例28：式24の本発明化合物の製造
2007532512.tif 000086
一般的記載において前述したとおり、24の製造を達成する。Fmoc−PAL−PEG−PSアミド樹脂および自動固相ペプチド合成プロトコルを用い、Fmoc−Lys(CholGlc)、Fmoc−Asn、Fmoc−Ser(tBu)、Fmoc−Gly、Fmoc−Val、Fmoc−Asp(OtBu)、Fmoc−Glu(Rho)、Fmoc−Ala、Fmoc−Phe、Fmoc−Phe、Fmoc−Val、Fmoc−Leu、Fmoc−Lys(Trt)、Fmoc−Gln、Fmoc−His、Fmoc−His、Fmoc−Val、Fmoc−Glu(OtBu)、Fmoc−Tyr、Fmoc−Gly、Fmoc−Ser、Fmoc−Asp(OtBu)、Fmoc−His、Fmoc−Arg(Pbf)、Fmoc−Phe、Fmoc−Glu(OtBu)、Fmoc−Ala、Fmoc−Val、Fmoc−Sta、Fmoc−Asn、Fmoc−Val、Fmoc−Glu(OtBu)の連続的カップリングを行い、固相上にファーマコフォア−ペプチドリンカー配列を得る。標準的ペプチドカップリング技術を用いるコレステリルグリコール酸(部分200aの前駆体)の連続的手動カップリングにより、C末端を介して固相支持体に固定された24を得る。
最終的に、前述の一般的切断手順にしたがって樹脂から切断し、プレパラティブHPLCにより精製した後、アミド24を得る。
リンカー長は、Hyperchem(登録商標)ソフトウェアを用いるMM＋力場最適化によって8.87 nmであると計算された。
【０２１２】
実施例29：式24bの本発明化合物の製造
2007532512.tif 000087
Glu(Rho)−βAla−Gly−Glu−Val−Asn−Sta−Val−Ala−Glu−Phe−Arg−His−Asp−Ser−Gly−Tyr−Glu−Val−His−His−Gln−Lys−Leu−Val−Phe−Phe−Ala−Glu−Asp−Val−Gly−Ser−Asn−Lys−Asp(ジヒドロコレステリル)−NH2
化合物25bの記載にしたがって、Fmoc−Asp(ジヒドロコレステリル)(前記の部分200kの記載にしたがって製造)を0.1 mmolのPAL−PEG−PS樹脂にロードする。自動洗浄、キャッピングおよび脱保護の後、234 mg(0.5 mmol)のFmoc−Lys、190 mg(0.5 mmol)のHATU、190 μl(1.0 mmol)のDIPEA、前述の手順を用いて、次のアミノ酸、Fmoc−Lys(Boc)を手動でロードする。化合物25bの記載にしたがって、以下のとおり、ABI 433ペプチド合成機を用いて、βAlaまでの残りの配列を構築する。化合物25bと同様にして、244 mg(0.25 mmol)のFmoc−Glu(Rho)、95 mg(0.25 mmol)のHATU、84 μlのDIPEAおよび3 ml DMFを用いて、Glu(Rho)を手動で結合する。ABI 433を用いて樹脂を脱保護および洗浄し、減圧乾燥する。化合物25bの記載にしたがって、トリフルオロ酢酸/H2O/トリイソプロピルシラン/アニソール/チオアニソール(87：4：3：3：3)を用いて切断を行う。他の条件は、化合物25bの記載と同様にして、30分間にわたる42〜46%Bの勾配を用いて、HPLC精製を行う(RT 約24分)。乾燥(硫酸マグネシウム)して、12.7 mgの赤色個体を得る。
C8カラム型Vydac 208TP104、プレパラティブ分離と同じ溶離液、1 ml/分の流速および35分間にわたる42〜56%Bの勾配を用い、分析的HPLC−MSを行う。合計純度は、MSトレースにより80.9%であることがわかる。生成物ピークの内部で共溶離する2つの不純物の量は12.3%である。ESI−MS：1246.1 [M]4+. MALDI：4977.7 [M]+。
【０２１３】
実施例30：式25の本発明化合物の製造
2007532512.tif 000088
一般的記載において前述したとおり、25の製造を達成する。リシンのε−アミノ基にコレステリルグリコール酸(部分200aの前駆体)を手動カップリングした後、得られるリシン誘導体をそのC末端を介してFmoc−PAL−PEG−PSアミド樹脂にカップリングし、次いで、2−[2−(2−アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ酢酸2回、ローダミン標識グルタミン酸、2−[2−(2−アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ酢酸2回、フェニルアラニン、グルタミン酸、アラニン、バリン、スタチン、アスパラギン、バリンおよびグルタミン酸の自動固相ペプチド合成カップリングを連続的に行って、固相支持体上にファーマコフォア−ポリグリコールリンカー−ラフト親和性部分複合体を得る。次いで、前述の一般的切断手順にしたがって樹脂から切断し、プレパラティブHPLCにより精製した後、25を得る。
【０２１４】
実施例31：式25bの本発明化合物の製造
2007532512.tif 000089
Glu(Rho)−βAla−Gly−Glu−Val−Asn−Sta−Val−Ala−Glu−Phe−4Gl−3Gl−4Gl−3Gl−4Gl−Asp(ジヒドロコレステリル)−NH2
363 mg(0.5 mmol)のFmoc−Asp(ジヒドロコレステリル)(部分200kのために前述したとおり製造)、190 mg(0.5 mmol)のHATU、190 μl(1.0 mmol)のDIPEA、2 mlのCH2Cl2および1 mlのDMFから活性エステル溶液を製造する。この溶液を100 μmolの脱保護CH2Cl2−湿潤PAL−PEG−PS−樹脂(ローディング：0.21 mmol/g)に加える。アミノ酸を1時間カップリングに付し、その間に沈澱を除去するために1 mlのDMFを加える。ABI−433合成機を用いて洗浄および脱保護を行う。Glu(Rho)を除いて、残りの配列をABI−433で構築する。樹脂ロードが少なく、処理する配列が長いので、より大きい反応量を可能にし、より多い洗浄溶媒を使用する0.25 mmolで行う化学反応プログラムを使用する。さらに、カップリング時間を50分間に延長し、第2の「残基」(4Gl)を、二重カップリングを介して結合する。最終的脱保護および洗浄の後、Fmoc−Asp(DHC)のカップリングのために前述した方法と同様にして、293 mg(0.3 mmol)のGlu(Rho)、114 mg(0.3 mmol)のHATU、102 μl(0.6 mmol)のDIPEA、2 mlのDMFおよび2 mlのCH2Cl2およびカップリング時間1.5時間を用いて、N末端Glu(Rho)を結合するABI−433を用いて。最終的脱保護および洗浄を行う。トリフルオロ酢酸/H2O/anisol/トリイソプロピルシラン(90：4：3：3)および90 分間の反応時間を用いて、切断および脱保護を行う。エーテル/石油エーテル(30：70)で生成物を沈澱させ、MeCN/MeOH(1：1)を加え、回転蒸発乾固し、高真空乾燥する。25分間にわたる40〜57%B勾配を用いて、プレパラティブHPLC精製を行う(RT＝24.06分)。乾燥した後、34.1 mgの赤色固体を得る。分析的HPLCにより、保持時間(RT)32.1分および純度93%(215 nm)を得る。MALDI：3346.9 [M]+。
【０２１５】
実施例32：LRAおよびDRMアッセイにおけるラフト親和性の評価のためのローダミン標識ラフト親和性部分の製造
概論
Fmocプロトコルおよびカップリング試薬としてHBTUを用いて、ABI−433合成機にてペプチドカップリングを行う。典型的には、樹脂に対して4当量の活性エステルおよびカップリング時間1時間を用いる。化合物使用量を最大にするために、HBTUの代わりにHATUを用い、より長いカップリング時間を用いて、場合によって量を少なくして（活性エステル2当量以下）、高価なアミノ酸または困難なカップリングを行なう。
たとえば、固相支持体からの切断中のセラミドの副反応／分解を回避するために、非常に酸不安定なシーバー（Sieber）樹脂の使用が好ましい。Arg(Pbf)などのアミノ酸は、脱保護のために、85%以上のトリフルオロ酢酸および1時間以上の反応時間を必要とする。シーバーリンカーは濃トリフルオロ酢酸中で副反応を引き起こすので、これらの場合リンカーはPAL−PEG−PS−樹脂が好ましい。
【０２１６】
典型的手順
濃トリフルオロ酢酸を使用する切断プロトコルを用いる、ラフト親和性部分と色素標識との間に短いペプチドリンカーを有するローダミン標識ラフト親和性部分200bの製造
2007532512.tif 000090
DHC−Glc−Arg−Arg−βAla−Glu(Rho)−Gly−NH2
前述したとおり、0.25 mmolのシーバーアミド樹脂をFmoc−Glyでロードし、ピペリジンで脱保護する。樹脂をN−メチル−2−ピロリドンおよびCH2Cl2で洗浄し、アルゴン入り口、隔壁および撹拌棒を備えたフラスコに移す。フラスコをすばやく脱気し、アルゴンを2回補充する。別のフラスコにて、590 mg(0.6 mmol)のFmoc−Glu(Rho)および229 mg(0.6 mmol)のHATUを、アルゴン下で撹拌しながら3 mlのDMFに懸濁する。208 μL(1.2 mmol)のDIPEAを加え、固体を撹拌および5−10分間の超音波処理により溶解する。得られる深赤色溶液を、シリンジを介して樹脂に加える。この溶液中で樹脂を緩やかに1時間撹拌する。液体を濾去し、樹脂をN−メチル−2−ピロリドンおよびCH2Cl2で簡単に洗浄し、合成機に戻し、洗液が無色になるまでN−メチル−2−ピロリドンで洗浄する。Fmoc−βAlaおよび2xFmoc−Argのカップリングによって自動合成を続ける。UVモニタリングを用いて、カップリングステップの完了を確認する。最終的脱保護の後、樹脂をN−メチル−2−ピロリドン およびCH2Cl2で洗浄し、約50 μmolずつに分割し、減圧乾燥する。ジヒドロコレステリルグリコール酸(142 mg、318 μmol)およびHATU(121 mg、318 μmol)をアルゴン下で加える。DMF(3 ml)、CH2Cl2(2 mL)およびDIPEA(104 μL、636 μmol)を加え、混合物を撹拌し、透明な溶液が得られるまで超音波処理する（約5分間)。この溶液を50 μMol部の前述の樹脂に移し、得られる懸濁液をアルゴン下で1時間緩やかに撹拌する。樹脂をDMFおよびCH2Cl2で簡単に手動洗浄し、ABI合成機に移し、N−メチル−2−ピロリドンおよびCH2Cl2で洗浄し、減圧乾燥する。乾燥した樹脂に、3−4 mlのトリフルオロ酢酸/H2O/アニソール/チオアニソール/トリイソプロピルシラン(87：4：3：3：3)の混合物を加え、得られる懸濁液をアルゴン下で2時間緩やかに撹拌する。樹脂を濾去し、約2 mlの切断用反応混液で洗浄する。冷エーテル/石油エーテル(1：2、約100 mL)を加えることによって生成物を濾液から沈澱させ、遠心分離によって分離する。上清を捨て、油状赤色沈澱にMeCN/MeOH(2：1)を加え、回転蒸発乾固し、減圧乾燥する。
Vydac C8カラム(30x250 mm)タイプ208TP1030、溶離液AとしてH2O/MeCN/MeOH(90：5：5)＋0.1%トリフルオロ酢酸、溶離液BとしてMeCN＋0.1%トリフルオロ酢酸、流速40 mL/分および30分間にわたる50〜65%Bの勾配を用いて、プレパラティブRP−HPLC精製を行う(RT＝14分、215 nmにおけるUV検出)。生成物画分を合わせ、回転蒸発乾固し、HV中で乾燥して、24.4 mgの暗紫色固体を得る。
上述と同じ溶離剤、Vydac 208TP104カラム(4.6x250 mm)および1 ml/分の流速での25分間にわたる45〜70%Bの勾配を用いて分析的HPLCを行う。RT＝18.3分、純度：99%(215 nm)。ESI−MS：754.5 [M+H]2+。
【０２１７】
1%トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンを使用する穏やかな切断プロトコルを用いる、ラフト親和性部分と色素標識との間に短いグリコールリンカーをを有するローダミン標識ラフト親和性部分200jの製造
2007532512.tif 000091
Chol−Suc−3Gl−Glu(Rho)−NH2
リンカービルディングブロックとして市販のFmoc−12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸を用い、前述の方法と同様にして、250 μmolの3Gl−Glu(Rho)−NH−[シーバー樹脂]を製造する。50 μmol部のこの樹脂に、前述のとおり、コレステリルヘミコハク酸塩(97.4 mg、200 mmol)、HATU(76 mg、200 μmol)、CH2Cl2(1.5 mL)、DMF(0.5 mL)およびDIPEA(68 μL、400 μmol)から製造した活性エステル溶液を加える。2.5時間反応させた後、樹脂を前述のとおり洗浄する。酸溶液が無色になるまで、2−4 ml部の1%トリフルオロ酢酸／CH2Cl2とともにCH2Cl2−湿潤樹脂を2−3分間繰り返し振とうし、濾過する（約8−10回）。合わせた濾液を回転蒸発乾固し、28℃浴温にて減圧乾燥する。残渣にアセトニトリルを加え、より小さいフラスコに移し、再度回転蒸発し、減圧乾燥する。
上述のとおり、HPLC精製を行が、ただし、溶離液AとしてH2O/MeCN/MeOH(85：10：5)＋0.1%トリフルオロ酢酸および20分間にわたる64〜74%Bの勾配を用いる(RT：14.5分)。同じ溶離液および45分間にわたる10〜100%Bの勾配を用いて、分析的HPLCを行う（他の条件は、先の実施例と同じ）。RT：38.4分、純度：96%(215 nm)。ESI−MS：1310.8 [M]+。
【０２１８】
実施例33：リポソームラフト親和性アッセイ(LRA)および界面活性剤耐性膜アッセイ(DRM)
本発明にしたがって、合成した化合物のインビトロ試験によって本発明化合物のラフト親和性を定量することができる。このようなインビトロ試験は、本明細書において提供される試験を含む。本明細書に提供され、以下に詳細に記載されるアッセイを単一のアッセイまたは組み合わせアッセイとして用いることができる。
【０２１９】
A．LRAの原理
非ラフトまたはラフト膜のいずれかを提示しているリポソームへの試験化合物の分配を定量する。試験系は、試験化合物を見出すことができる3つの構成要素、脂質膜(非ラフトまたはラフト)、水性上清および試験管壁を含む。インキュベーションに続いて、リポソームを系から除去し、Tecan Safire多機能ダブルモノクロメーター蛍光強度リーダーを用いる蛍光定量法または定量的質量分析によって、水性および試験管壁画分において試験化合物を測定する。ヒューレット−パッカード1100(HPLC)およびエスカイヤLC(質量分析)を用いるHPLCおよび質量分析の組み合わせ(HPLC−MS)によって、質量分析を行う；質量分析のために用いた方法は化学反応にも用いられる電子スプレーイオン化(ESI)である。データを計算して、分配係数およびラフト親和性を得る。
【０２２０】
実験プロトコル
1．ラフト(R)または非ラフト(N)リポソーム(リポソーム製造を参照；以下を参照)をレプリカ管に加え、プレインキュベートする。
2．試験化合物(通常、ジメチルスルホキシド(DMSO)中)を加え、1時間インキュベートする。管の1つのセットからリポソームを除去し、100 μlの40 mM オクチル−β−D−グルコピラノシド(OG)／ホスフェート緩衝液(PBS)(A)で管壁から付着化合物を溶離する。反応工程式1にしたがって、管の第2のセットを400,000xgにて遠心分離して、上清(S)を集める。
【０２２１】
反応工程式1
2007532512.tif 000092
蛍光定量法または定量的質量分析によって、水性上清および付着画分を検出する。
【０２２２】
分配係数およびラフト親和性の計算
画分
L：リポソーム(遠心分離前)
A：管付着物
S：上清、遊離化合物濃度
I：投入濃度＝L＋A
膜画分中の濃度(M)
M＝L−S      (1)
[M]＝M＊f(体積比ファクター)      (2)
f＝1 mg脂質/mlにおける水性：膜の体積比＝878.65
分配係数およびラフト親和性
分配係数Cpは、膜および水性相中の化合物濃度の比である。
Cp＝[M]／S      (3)
ラフト親和性(Rf)
Rf＝Cp(R)／Cp(N)      (4)
【０２２３】
リポソーム製造
脂質混合物の製造および貯蔵
脂質溶液および混合物は通常、10 mg/mlにする。
リポソーム混合物の組成例。
2007532512.tif 000093
【０２２４】
透析によるリポソームの形成
1．脂質をPBSまたは他の緩衝液中の400 mM 1−オクチル−β−D−グルコシド(OG)600μl中に、室温加え、37℃(非ラフト脂質)または50℃(ラフト脂質)にて回転蒸発する。溶解時、10秒間ボルテックスする。脂質濃度に比例して界面活性剤濃度を変化させる。
2．脂質を1 mg/mlに稀釈する。5.4 mlの緩衝液(細胞培養品質)を室温にて加え、10秒間ボルテックスする。脂質残渣が残るならば、37℃または50℃にてさらに5−10分間回転を続ける。透析の開始時、ラフト脂質：界面活性剤比は0.04であるべきである。
3．22℃の室内で、5リットルのPBSおよび20 gの予備処理アンバーライトXAD−2ビーズを入れた5リットルのガラスビーカーを準備する。200−250rpmで撹拌する。
4．脂質を10−20 mlのシリンジに吸い取り、スライド−A−ライザーカセットの窓に注入する。カセットから注意深くすべての空気を抜く。8時間透析し、交換し、一夜透析する。
5．リポソームの回収：緩衝液で濯ぐことによってカセットの外側に付着しているアンバーライトビーズを除去する。10−20 mlシリンジで未使用の窓からカセットに十分な空気を満たし、カセットを傾け、リポソームを回収する。
6．ガラス管に移し、暗室で氷中に保管する。使用するまで冷たい場所に保持し、翌3日以内に使用する。
【０２２５】
本発明によれば、本発明化合物、特に三者化合物は、先に定義した平衡定数の比が8より大きい、より好ましくは9より大きい、なお好ましくは10より大きい、さらにより好ましくは11より大きい場合に「ラフト親和性」であるとみなされる。本明細書に記載したとおり、より好ましい化合物（本発明の三者化合物の部分Aおよび部分A'の前駆体または完全な三者化合物のいずれか）は、平衡定数の比が20より大きい、より好ましくは30より大きい、最も好ましくは40より大きい化合物である。
この試験／アッセイならびに次のDRMアッセイは、ある構築物、たとえば、本発明三者構築物のラフト親和性ならびに本発明化合物の 部分A/A'のラフト親和性を推定、確認および／または決定するのに有用である。
【０２２６】
B．界面活性剤耐性膜アッセイ(DRM)の原理
非ラフトおよびラフト膜由来の細胞膜画分中の試験化合物の蓄積を決定する。試験システムは、培養細胞を試験化合物で処理することを含む。インキュベーションに続いて、細胞を界面活性剤溶液に溶解し、DRM画分(ラフト)をスクロース勾配上に単離する。DRM画分を回収し、蛍光定量法または定量的質量分析によって試験化合物を測定する。全膜に含まれる試験化合物に対するDRM画分に回収された試験化合物の比としてラフト親和性を決定する。
異なる実験の結果のよりよい比較は、試験化合物のラフト親和性をと既知のラフト親和性標準と比較することによって達成される。
【０２２７】
実験プロトコル
1．培養した哺乳動物細胞（たとえば、MDCK、NIH3T3、E6.1ジャーカットT、RBL−2H3、NK3.3、Ramos、Caco−2、BHKなど）をサブ集密に成長させる。
2．細胞を試験化合物(通常、エタノールまたはDMSO中1−10 μM)とともに37℃にて1時間インキュベートする；2 ml氷冷TNE緩衝液(100 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaClおよび0.2 mM EGTA(エチレングリコール−ビス−(ベータ−アミノ−エチルエーテル)N,N,N',N'−テトラ−酢酸))で皿を2回洗浄し、5分間冷やす。細胞を1%(w/v) トリトンX−100を含むTNE緩衝液0.5 mlで4℃にて30分間抽出する。
3．細胞をセルリフターで掻き取り、1 mlのピペットチップを10回通して均質化する。溶解液をエッペンドルフ管に移し、氷水浴で超音波処理し、次いで、4℃にて5分間3,000 rpmで遠心分離する。
4．0.3 mlの溶解液を、0.6 ml 65%(w/w)スクロース/TNEを含むエッペンドルフ管に移し、激しくボルテックスすることによって溶解液に約47%スクロースを加える。この溶解液／スクロースサンプル0.7 mlをSW−60管の底に置き、その上に2.7 mlの35%(w/w)スクロース/TNE、次いで、0.8 mlのTNEを加える。勾配をSW−60ローターで335,000xgで4℃にて16時間遠心分離する。
5．DRMおよび非DRM画分1040 μlを勾配の頂部から出発して集める。DRM画分は、画分2および3であり、非DRM画分は、画分6、7および8である。蛍光定量法または定量的質量分析によって画分中の化合物を検出する。
【０２２８】
DRMに基づくラフト親和性の計算
無次元のラフト親和性の商rqは、以下の式から得られる：
rq＝%DRM／%非DRM
標準に対する未知化合物の相対的ラフト親和性(rrel)は、以下の式で計算される：
rrel＝rq(試験化合物)／rq(標準)
正の値は、試験化合物が標準よりも高いラフト親和性を有することを示す。標準として、コレステリル 4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノエート(コレステリルBODIPY(登録商標) FL C12；Molecular Probes、Eugene、USA)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書および本発明において提供されるアッセイによれば、化合物、特に本発明化合物は、対応する相対値（標準と比較した）が0.1より大きい場合に「ラフト親和性」であると判断される。
【０２２９】
実施例34：例示のLRA試験
このアッセイは、リポソームとのインキュベーション後に測定可能な水中濃度を得るために十分な水溶性があるすべての試験化合物に対して用いられる。他の親油性試験化合物(たとえば、化合物27など)は、DRMアッセイにおいて測定される(実施例33を参照)。
三者化合物およびコレステリルグリコール酸を、非ラフト(ホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミン(50：50))を表す脂質混合物と比較した場合のラフト(コレステロール：スフィンゴミエリン：ホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミン：ガングリオシド(ウシ脳、III型、Sigma−Aldrich Co.)(50：15：15：15：5))を表す脂質混合物からなるリポソームに37℃にて分配する能力について、評価する。前述の相対的分配をLRAアッセイにおけるラフト親和性と定義する。上述の組成物を用いるリポソームの二重のセットに、DMSOまたはエタノール貯蔵溶液から最終濃度0.2−2.0 μMで化合物を加える。最大化合物濃度は、脂質濃度に関して2 mol%である。リポソームをサーモミキサーにてPBS中30分間プレインキュベートした後、化合物を加え、さらに37℃にて1時間インキュベートする。1つのセットの管からリポソームを定量的に移し、残りの化合物を管壁から PBS中の40 mM オクチル−β−D−グルコピラノシド100 μlで溶離する。第2のセットの管を400,000xgで遠心分離し、上清を集める。蛍光定量法または定量的質量分析によって、全リポソーム溶液、付着画分および水性上清中の化合物濃度を決定する。
【０２３０】
各リポソーム型中の化合物の分配係数を、リポソーム膜中の化合物の濃度対水性上清中の濃度の比として決定する。878.65という1 mg脂質/mlにおける水性：膜の体積比を用いて、リポソーム膜の体積を計算する。ラフトおよび非ラフトリポソームについての分配係数の比としてラフトアフィニティー(ラフト親和性)を計算する。コレステロールベースラフトアンカー単独のLRAラフト親和性は、約50であり（すなわち、ラフトリポソームに対する親和性が50倍大きい）、三者化合物のその親和性は50以上である。
前述したとおり、本発明によれば、8以上、好ましくは9以上の値が、LRAにおけるラフト親和性の指標であると判断される。対応するLRA値が10以上である場合、好ましいラフト親和性化合物は、著しくラフト親和性である。したがって、上記試験した三者化合物は、ラフト親和性が高い化合物であると判断される。
【０２３１】
実施例35：例示のDRMアッセイ/DRM試験
アール塩を含む最小必須培地(MEM−E)、1x GlutaMax I(Invitrogen)、5%FCS、250 μg/ml G418中で成長させたサブ集密なMCDK(イヌ腎臓上皮)またはRBL−2H3(ラットB細胞リンパ球)細胞をMEM−E、1x GlutaMax I、10 mM HEPES、pH 7.3で洗浄し、同じであるが化合物27を含む培地中、DMSOまたはエタノール貯蔵溶液の両方からのたとえば、1.0 μMのコレステリル BODIPY−FL C12(Molecular Probes、Inc)などのラフトマーカー物質とともに最終濃度1.0−10 μMで37℃にて1時間インキュベートする。細胞を2 mlのCa2+、Mg2+含有氷冷ダルベッコPBSで2回洗浄し、4℃にて5分間冷やし、次いで、0.5 mlの25 mM Tris−HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)、1%(w/v) トリトンX−100(TN−T)で4℃にて30分間抽出する。細胞をプレートから掻き取り、25Gシリンジ針を10回通して均質化する。溶解液を氷水浴中でBandelin Sonoplus HD200 sonifier(MS73チップ、パワー設定MS72/D、60秒、10%サイクル)で超音波処理し、続いて、4℃にて5分間3000xgで遠心分離する。0.3 mlの溶解液を、0.6 ml 65%(w/w)スクロース/25 mM Tris−HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA(TNE)を含むエッペンドルフ管に移すことによって、溶解液に47%スクロースを加え、激しくボルテックスする。溶解液／スクロースサンプル0.7 mlをSW−60管の底に置き、その上に2.7 mlの35%(w/w)スクロース/TNE、次いで、0.8 mlのTNEを加える。勾配をBeckman LE 80K遠心分離機にて、SW−60ローターで335,000xgで4℃にて16時間遠心分離する。各520 μlの画分を勾配の頂部から底部まで集める。プールした画分2および3を集める。これは、DRM画分を表す。プールした画分6、7および8は、非DRM画分を表す。定量的蛍光定量法または質量分析によって、DRMおよび非DRM画分中の化合物濃度を決定する。無次元のラフト親和性の商rqは、式：rq＝%DRM／%非DRMから得られ、ここで、DRM%および非DRM%は、それぞれの画分における化合物の全蛍光または質量である。DRMアッセイにおける試験化合物のラフト親和性rqを、たとえば、 Molecular Probesから入手可能なコレステロール BODIPY−FL C12などの標準のラフト親和性に対して標準化する、rrel＝rq(試験化合物)／rq(標準)。
このアッセイにおいて、ラフト親和性部分としてセラミドを含む三者化合物27のrrelは0.48である。
したがって、rrel(このアッセイシステムにおいて)が0.2以上、より好ましくは0.3以上、さらにより好ましくは0.4以上である場合、本明細書に定義する化合物、特に、三者構築物/化合物ならびに個々の部分Aおよび部分A'は、「ラフト親和性」であると判断することができる。
【０２３２】
実施例36：本発明の三者化合物によるBACE−1の阻害
全細胞アッセイにおいて、ベータセクレターゼ(BACE−1)を阻害する能力および遊離インヒビターIIIの力価と比較した場合のそれらの力価について、式24、24b、25および25bの三者化合物を試験した。DMEM(ダルベッコ変更イーグル培地)、1x グルタミン、10%FCS(fetal calf serum)中で成長させたマウス神経芽腫細胞(N2a)を、アミロイド前駆体タンパク質(APP)遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させる。感染から75分後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、継代培養する。約20時間後(50%集密)、培地を吸引し、DMSOまたはメタノール中の10 nM〜10 μMの試験化合物を含む新鮮な培地と交換し、5%CO2中、細胞を37℃にて3−4時間インキュベートする。インキュベーション後、上清サンプルを集め、βAPPsに対する特異的モノクローナル抗体およびβAPPsのN末端に対する第2抗体によるELISAアッセイを用いて、APPのβ切断細胞外ドメイン(βAPPs)の生成を測定する。添付の図面においても実証されるように、このシステムにおいて、インヒビターIII単独では、阻害性ではないが、三者化合物25、特に25bは、βAPPsの強力なインヒビターであり、したがって、ベータセクレターゼ活性の強力なインヒビターである。さらに、より短いリンカーを含む三者化合物[化合物26および27を参照]は、この特異的アッセイにおいて、有効性が低く、インヒビターIIIによるベータセクレターゼの阻害にとってリンカー長が重大であることが実証される。したがって、化合物26および27は、おそらく、BACE−1酵素上の正確な遺伝子座に特異的ファーマコフォアインヒビターIIIを置かない。さらに、化合物26および27において定義されるリンカーは、対応する結合／相互作用部位がラフトのリン脂質の頭部のより近くに位置する生体分子の阻害についての他の試験システムにおいて有用である。
【０２３３】
実施例37：プロテオリポソームアッセイにおける本発明の三者化合物
以下において、モデルとして本明細書に開示の三者構造を用いて、確認および／または特徴決定のための以下のさらなる非制限的アッセイを記載する。このアッセイは、プロテオリポソームアッセイである。
BACEプロテオリポソームアッセイの原理
三者ラフト親和性試験化合物を、ラフト膜を表しているリポソームに組み入れ、次いで、Aで述べたように組換えBACEと再構築する(BACEプロテオリポソーム)。BACEは、膜貫通ドメインによる膜アンカー型である。試験化合物の脂質部分を膜にアンカーすると同時に、スペーサーおよびファーマコフォアを水相に投入する。最適トポロジーにおいて、ファーマコフォアは、BACE活性部位をブロックすることができる(図１：上部)。活性および阻害アッセイのために、BACEプロテオリポソームをアッセイ緩衝液に懸濁し、室温にて10分間プレインキュベートする。温度をに 37℃し、内部消光蛍光基質類縁体FS−1(Dabcyl−[Asn670,Leu671]−アミロイドβ/A4 タンパク質前駆体770フラグメント(661−675)−Edans；Sigma A 4972)を加え、その切断が蛍光シグナルを顕在化させる。このシグナルをThermoscan Ascent fluorimeterで規定の間隔で記録する(図１：下部参照)。
【０２３４】
実験的プロトコル
プロテオリポソームを二段階で製造する：
1．連続透析によるリポソーム形成および試験化合物組み込み；次いで、
2．BACEの界面活性剤促進性膜再構築およびゲル濾過による精製および密度勾配遠心分離。
Ad 1．透析による試験化合物組み込みリポソームの形成
1.1．クロロホルム溶液中のブタ脳脂質(Avanti 131101)5 mgを回転蒸発機中の丸底フラスコに塗布し、デシケーター中で一夜蒸発する。脂質に、水中の400 mM 1−オクチル−β−D−グルコシド(OG)0.5 mlを加え、50℃にて回転し、次いで、1.166 mlリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.02 %ナトリウムアジド(NaN3)を加えて最終OG濃度120 mMおよび脂質濃度3 mg/mlまたは4.8 mMにする。均質になるまで懸濁液を50℃にて約5分間再度回転する。
1.1.a  ブタ脳脂質リポソームのラフト特性の証明。ブタ脳脂質は、LRAで用いたラフト脂質混合物と比べて、質的および量的に類似しているが、より複雑な組成物である。実施例33、A．LRAの原理、リポソーム製造に記載にしたがって製造したラフト(R)リポソームおよび非ラフト(N)リポソームおよびブタ脳脂質リポソーム(P)を、標準的ラフト親和性トレーサーで試験する。Pリポソームへの分配は、Rリポソームへの分配と同一であるかまたはいくらか大きいことが示される；ラフト親和性(Rf)≧40。
【０２３５】
1.2．脂質懸濁液をガラス管中のアリコートにする(コントロール用0.35 mlおよび 試験化合物の組み込み用0.26 ml)。いくつかのアリコートに、DMSO中の100x貯蔵溶液からの試験化合物を加え、10秒間ボルテックスする。透析開始において、全脂質：界面活性剤比が0.04および1 %DMSOである必要がある。試験化合物出発濃度は、0.0005〜0.05 mol %の間である。
1.3．1 mlシリンジで0.25 ml(initial volume、vi)脂質混合物を吸い取り、10 kD排除で一夜予備透析した0.5 mlのスライド−A−ライザーカセット(Pierce)の窓に注入する。カセットから注意深く空気を抜く。各カセットを、カセットの直下に置いた375 μlのPBS/0.02 %NaN3およびカセットの頂部に置いた375 μl PBSを含むペトリ皿に移す。3時間透析し、各交換に新しいペトリ皿を用いる2回交換。3回目の透析は、一夜行う。2x2.5 ml PBSを3回交換して第2日も継続する。
【０２３６】
1.4．22℃のインキュベーター中に、5 L PBSおよび100 mlの20%予備処理アンバーライトXAD−2ビーズ(Supelco 20275)を入れた5 Lガラスビーカーを準備する。カセットをビーカーに移し、16時間透析する。200−250 rpmにて撹拌する。
1.5．緩衝液で濯ぐことによってカセットの外側に付着しているアンバーライトビーズを除去する。1 mlシリンジで未使用の窓からカセットに十分な空気を満たし、カセットを傾け、リポソームを回収する。
1.6．透析後の体積(vp)をシリンジで測定し、茶色ガラス管に移す。各サンプルを初期体積の3倍に希釈する。蛍光定量法、質量分析または他の適当な方法によって、透析後の試験化合物濃度を決定する。以内に使用するまで、暗所にて氷上に保管する。
【０２３７】
Ad 2.プロテオリポソーム製造
2.1．リポソームをペレットにし、70 μl 10 mM Hepes/150 mM NaCl pH 7.3(緩衝液)に加える。8 μl 10 %デカノイルl−N−ヒドロキシエチルグルカミド(HEGA 10)を加える。次いで、2 μg/8 μl組換えBACE(in 0.4 %トリトンX−100)を加える。
2.2．Sephadex G−50 in 10 mM Hepes/150 mM NaCl pH 7.3でゲル濾過する。
2.3．5 %Optiprep勾配に浮かせて、空のリポソームからプロテオリポソームを分離する。
2.4．ロテオリポソームバンドを採集し、希釈し、ペレットにする。ペレットを50−100 μl緩衝液に再懸濁し、タンパク質を定量する。
【０２３８】
プロテオリポソームアッセイの例示：
1．透析によるリポソーム組み込み試験化合物の形成
1.1．脂質の塗布および均質化
クロロホルム中の4 mgのブタ脳脂質(Avanti 131101)を回転蒸発機中の丸底フラスコにおいて50℃にて乾燥する。1.5 mlのtert−ブタノールを加えて、脂質を再溶解する。脂質が均質なフィルムを形成するまでフラスコを50℃にて回転する。デシケーター中でフラスコを一夜乾燥することによって、痕跡量の溶媒を除去する。脂質に水中の400 mM 1−オクチル−β−D−グルコシド(OG)0.5 mlを加え、次いで、50℃にて回転し、次いで、1.166 mlリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.02 %ナトリウムアジド(NaN3)を加えて最終OG濃度120 mMおよび脂質濃度3 mg/mlまたは4.8 mMにする。均質になるまで懸濁液を50℃にて約5分間再度回転する。
1.2．試験化合物の添加
脂質懸濁液をガラス管中のアリコートにする(コントロール用0.35 mlおよび 試験化合物の組み込み用0.26 ml)。アリコートに、DMSO中の100x貯蔵溶液からの試験化合物25bを加えて1：100に稀釈する（表１を比較）：
0.05 mol %       2.4 μM  2.4 μl (250 μM貯蔵液)
0.005 mol %     0.24 μM  2.4 μl (25 μM貯蔵液)
0.0005 mol %   0.024 μM  2.4 μl (2.5 μM貯蔵液)
次いで、管を10秒間ボルテックスする。
【０２３９】
1.3．連続透析
0.25 ml(初期値、vi、表1)の脂質混合物を、1 mlシリンジに移し、10 kD排除で一夜予備透析した0.5 mlのスライド−A−ライザーカセット(Pierce)の窓に注入する。次いで、カセットからすべての空気を抜く。各カセットを、カセットの直下にピペットで移した375 μlのPBS/0.02 %NaN3およびカセットの頂部に移した375 μl PBSを含む別のペトリ皿に置く。3時間透析した後、カセットを新しいペトリ皿に移し、手順を繰り返す。3回目の透析は、一夜行う。第2日に、2x2.5 ml PBS(カセットの下に2.5 ml PBSおよび頂部に2.5 ml PBS )を3回取り替えて手順を繰り返す。退色を避けるために、全手順を通して、ペトリ皿をアルミホイルで包む。
1.4．バルク透析
5 L PBSおよび100 mlの20%予備処理アンバーライトXAD−2ビーズ(Supelco 20275)および磁気撹拌棒を入れた5 Lガラスビーカーを22℃のインキュベーター中に置く。すべてのカセットをフロート(Pierce)に挿入し、ビーカーに置き、200−250 rpmにて16時間透析する。ビーカーをアルミホイルで包む。
1.5．リポソームの回収 
カセットの外側に付着しているアンバーライトビーズを濯ぎ落とす。
1 mlシリンジを用いて、未使用の窓からカセットに空気を満たし、カセットを傾け、シリンジでリポソームを回収する。透析後の体積(vp)を、シリンジを用いて測定し、リポソームをねじぶた付き茶色ガラス管に移す。各サンプルをPBSで初期体積viの3倍に希釈する（表１参照）。
1.6．最終25b濃度の決定
25bの濃度基準25、250および2500 nMをPBS/40 mM OG中で調製し、各基準の4個のサンプル100 μlを96ウエルプレート（Nunc Maxisorb）のウエルに満たす。50 μlの各リポソーム調製物を96ウエルプレートにおいて50 μlの80 mM OG/PBSに希釈する。PBSおよびOGコントロールを添加し、短時間振とうした後、Tecan Safire蛍光光度計プレートにおいて553/592 nm（励起／発光波長）で蛍光を記録する。基準の蛍光読み取りをプロットし、回帰直線を計算し(Excel)、それからリポソーム調製物中の最終25b濃度を計算する（表１参照）。
【０２４０】
2.プロテオリポソーム調製
2.1．TLA−100ローターにおいて48,000 rpmで20分間処理してリポソームをペレットにし、70 μlの10 mM Hepes/150 mM NaCl pH 7.3(緩衝液)を加える。8 μlの10 %デカノイル−N−ヒドロキシエチルグルカミド(HEGA 10)を加える。最後に、2 μg/8 μlの組換えBACE(0.4 %トリトンX−100中)を加え、ピペットで吸引および排出することによって混合する。
2.2．10 mM Hepes/150 mM NaCl pH 7.3中のSephadex G−50におけるゲル濾過。サンプルをピペットでゲル濾過カラムに入れる。プロテオリポソームを含むフロースルーを集める。
2.3．この物質をピペットで5 %Optiprep勾配に置き、遠心分離する。プロテオリポソームバンドを採集し、希釈し、ペレットにする。ペレットを50−100 μlの緩衝液に再懸濁する。タンパク質を定量する。
2.4．BACEアッセイ
96ウエルプレートのウエルごとに、10 μlのプロテオリポソーム(60 ng BACE、4.5 μg脂質)、70 μlの80 mM NaOAc pH 5.1および20 μlの10 mM Hepes/150 mM NaCl pH 7.3を加える。混合物を37℃にて30分間プレインキュベートする。最後に、1.5 M HAc(5 μM 最終濃度)中の2 μlの基質FS−1を加える。各測定前に8秒間振とうし、40秒ごとに485 nm(励起340 nm)にて蛍光を記録する。
【０２４１】
表1．プロテオリポソーム調製中の脂質および試験化合物濃度の概観
2007532512.tif 000094
1 mol %は、脂質濃度に関して付与される。
【０２４２】
ラフト親和性部分へのカップリングによるラフトサブコンパートメント内のインヒビターの富化は、インヒビター濃度に比例した強度の増加をもたらすだけでなく、インヒビターの作用部位から拡散する能力の低下による不均衡な増加ももたらす。この「ロックイン」効果は、細胞によって用いられる同じ現象を活用して、タンパク質−タンパク質相互作用を増加する。図１に示される結果は、25bがインヒビターIIIよりもさらに強力であることを明らかにする。グラフから得られる測定値は、インヒビターIIIのED50が500−1000 nMであるのに比較して、25bのED50(BACE活性が50%に低下する濃度)が約1 nMであることを示す。このように、インヒビターの強度は、25bによって例示される型の三者構造に組み込むことによって 500−1000倍に増加する。
【０２４３】
実施例36に記載するとおり、外因性swAPP（APPからの切断可能性が高い）を発現している神経細胞を組み込む機能的アッセイにおいてもインヒビターを試験した（図２：上部参照）。25bまたはインヒビター IIIで細胞を処理し、細胞培養上清中のベータ切断産物の放出を測定する。
【０２４４】
図２に示す結果から、25bは全細胞アッセイにおいて阻害性があるが、市販のインヒビターIIIは、完全に不活性であることが明らかである。25bは、1 μMにおいて65%まで活性を低下させることができる。BACE−1は、酸性エンドソームにおいて活性であり、したがって、遊離インヒビターIIIは、標的に到達するには細胞およびエンドソーム膜の両方を通過することが必要である。理論によって縛られることなく、25bは、BACE−1が特定の場所に置かれるラフト膜に挿入され、タンパク質とともに取り込まれると思われる。ゆえに、標的化および効力は、三者構築物の存在によって確実になる（図２：上部）。したがって、インヒビターIIIは、細胞膜を横切らず、ラフト親和性部分結合インヒビター25bは、細胞内部への進入を獲得し、効率よくベータセクレターゼ活性を阻害する。
【０２４５】
実施例38：三者ラフト親和性構造によるHIV感染の具体的阻害
HIV感染の早期段階−吸収から宿主細胞への進入まで−は、以下の連続的段階を含む(Olson(2003) Infect．Disorders 3、255に概説される)：そのスパイクタンパク質gp120を介して、HIVは最初の受容体CD4ラフトタンパク質に結合する。結合により、gp120のコンホメーション変化が誘発され、数個のケモカイン受容体の1つである共受容体に結合してラフトに補充されるのが可能になる(Fantini(2001) Glycoconj．J．17、199−204)。これは、順に、gp120に密接に結びついているウイルス融合タンパク質であるgp41のコンホメーション変化の引き金をひく。gp41は、N末端融合ペプチドが原形質膜に突き出し、7回反復領域HR1およびHR2が露出される2つの伸長されたプレヘアピンコンホメーションをとる。3コピーのHR2がヘアピンを形成するHR1三量体へ折り返すとき、ウイルスおよび原形質膜−2つの並置されたラフトドメイン−は、一緒に形作られ、融合する(Weissenhorn et(1997) Nature 387、426−430)。HR1およびHR2の間の強い相互作用は、可溶性HR2ペプチド類縁体（エンフビルチド(T20；DP178)はその1つである）によって遮断される(Wild (1992) Proc Natl Acad Sci USA 91、9770−9774)。また、とりわけ、T1249およびこれらのペプチドインヒビターのペグ化体が公知である。
【０２４６】
ヘアピンは形成されず、ウイルスと宿主膜との融合が妨げられる。可溶性インヒビターは、その2つの受容体と結合した後にのみ、ウイルスに結合することができること、すなわち、膜近位で作用することがが明らかである。事実、T20もまた、適当な構築物から細胞膜に発現した場合に阻害性である(Hildinger(2001) J．Virol．75、3038−3042)。本発明の三者構造におけるファーマコフォア(エンフビルチド)は、インヒビターが感染するビリオンに向かって標的膜ラフトから付き出すように、スペーサーエレメント（ヒンジおよびリンカー）を介してラフトアンカー(ラフト親和性部分)に連結される（図３参照）。三者薬物のファーマコフォア(HR2類縁体)は、gp41のコンホメーション変化中に露出されたHR1エレメントに結合し、効率よくタンパク質をそのコンホメーション遷移状態内にロックすること、ならびに原形質膜に物理的に固定することができる。(1)三者薬物は、媒体に関して約10,000倍およびラフト膜に関して約50倍ラフトドメインにおいて富んでおり、(2)不可逆的に感染を遮断し、破壊のためにビリオンにねらいをつけるのに必要なビリオンあたりの三者薬物分子の数がより少ないので、これを達成するための薬物濃度は、エンフビルチドのような可溶性インヒビターのものより低い規模のオーダーであることが予測される。遊離ウイルスの侵入の阻害に加えて、同じ阻害性メカニズムが、同じイベントに従属する感染細胞と非感染細胞の融合を遮断する。
【０２４７】
HIV侵入アッセイ(Salzwedelら、1999の後)。
ヒト胎児腎臓293T細胞に対象のHIV菌株のプロウイルスクローンをトランスフェクトする。60−72時間後、ウイルス含有細胞培養上清を集め、0.45 μm孔径フィルターで濾過する。次いで、ウイルスを用いてHeLa−CD4/LTR−β−gal細胞を感染させる。細胞をX−galで生体内原位置染色し、単層をCCDカメラ(Fuji LAS)で撮像し、青い病巣を数える。別の読み取り情報として、ELISAによってHIVgp24の発現をモニターすることができる(たとえば、Hildinger(2001)を参照、前出)。同様に、細胞−細胞融合を測定するために、感染293T細胞を非感染HeLa−CD4/LTR−β−gal細胞と混合し、同様の方法で評価する；たとえば、Salzwedel(1999) J．Virol．73、2469−2480を参照。
【０２４８】
ファーマコフォアCとしてT20を含む本発明化合物25cの合成
2007532512.tif 000095
Ac−Tyr−Thr−Ser−Leu−Ile−His−Ser−Leu−Ile−Glu−Glu−Ser−Gln−Asn−Gln−Gln−Glu−Lys−Asn−Glu−Gln−Glu−Leu−Leu−Glu−Leu−Asp−Lys−Trp−Ala−Ser−Leu−Trp−Asn−Trp−Phe−4Gl−Glu(Rho)−4Gl−Lys(CO−CH2−ジヒドロコレステリル)−NH2
HBTUのABI−433の貯蔵溶液をと置き換えるか、または固体HATUおよびFmoc−アミノ酸(1 mmol each)の混合物を合成機のアミノ酸カートリッジに置き、それに合うように合成機のソフトウェアを変更するかのいずれかによって、HATUを用いるカップリングを行う。固相支持体としてPAL−PEG−PS樹脂(ローディング：0.21 mmol/g)を用いる。0.25 mmolで行う化学反応プログラムおよび0.25 mmolの反応器を用いて0.1 mmolの樹脂を処理して、合成中に相当な量の獲得を可能にする。Dde−Lys(Fmoc)を用いてラフト親和性部分をリシンの側鎖に結合する。[Novabiochemカタログ2004/5、p48；p4−12]。Ac2Oによるキャッピングに続いて各カップリングを行う。
【０２４９】
Dde−Lys(Fmoc)を樹脂に結合し、脱保護し、自動合成機により洗浄する。ジヒドロコレステリル−CH2−COOHを側鎖にカップリングし、DMF中の2%ヒドラジン水和物(4x12 ml；各5分間)処理によってDde基を除去する。前述のとおり、残りの配列をカップリングする。わずか0.5 mmol(5当量）のGlu(Rho)を用いる。UVモニタリングにより、配列の終わりに向かってカップリング収率が減少することが示される。
【０２５０】
樹脂から切断する前に、CH2Cl2/トリイソプロピルシラン/トリフルオロ酢酸(94：5：1)で5回洗浄することによってトリチル基を除去する。樹脂をCH2Cl2(4x)で洗浄し、減圧乾燥する。トリフルオロ酢酸/H2O/ジチオスレイトール/トリイソプロピルシラン(87：5：5：3)および反応時間2時間を用いて切断および脱保護を行う。溶液を濾過し、回転蒸発機(浴温28℃)にて＜50%に濃縮し、石油エーテル／メチルtert−ブチルエーテル(3：1)でトリチュレートする。遠心分離によって油性粗生成物を分離し、4部の石油エーテル／メチルtert−ブチルエーテル(4：1)でトリチュレートすると、赤色の半固体が形成される。これをアセトニトリル(3.5 ml)、H2O(2.5 ml)および酢酸(65 μl)の混合物に溶解し、アルゴン気流によって脱ガスし、室温にて一夜放置する。
【０２５１】
A：H2O/MeCN(85：15)＋0.1%トリフルオロ酢酸、B：MeCN＋0.1%トリフルオロ酢酸、Vydac−C8 カラム型208TP104および流速1 ml/分での45分間にわたる10%〜100%Bの勾配を用いて、粗混合物の分析的HPLCを行う。ESI−MSは、生成物のRT＝32.2分tを示す。
【０２５２】
二段階でプレパラティブ精製を行う。最初に、前記と同じ溶離液および流速20 ml/での53%〜64%Bの勾配を用いるVydacカラム型208TP1030にて物質をクロマトグラフィーに付す。RT＝18.1−23.1分で溶出する画分を集める。流速40 ml/分および5分間にわたる30%〜40%Bの勾配、次いで、100分間にわたる40%〜50%Bの勾配（溶離液は前記と同様）。生成物(RT＝81.3分)を分離し、回転蒸発機で濃縮し、減圧乾燥する。収量：4.5 mgの赤色固体。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】上部、三者構造25bおよびBACEインヒビターIIIの提案メカニズム；下部、化合物25bおよびBACEインヒビターIIIによるBACE活性の阻害。コントロール(インヒビターなし)活性は、100%に設定した。
【図２】上部、化合物25bおよびBACEインヒビターIIIを用いる全神経細胞におけるベータセクレターゼ(BACE)活性の阻害作用の提案メカニズム；下部、化合物25bおよびBACEインヒビターIIIによるベータセクレターゼ(BACE)活性の阻害(実施例36も参照のこと)。
【図３】上部、HIV膜融合インヒビターエンフビルチドを組み込んでいる三者構造の活性の提案メカニズム。HIVスパイクタンパク質は、ラフトにおいて細胞膜受容体に結合し、膜融合を促進する。エンフビルチドは、結合したスパイクタンパク質のコンホメーションの変更を妨げて、膜融合を防止する。三者インヒビターの効力は、ラフトにおいて富んでいることにより、100−1000倍高いことが提案される。
【図１】
2007532512.tif 000121
【図２】
2007532512.tif 000122
【図３】
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【配列表】
2007532512000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月6日(2006.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007532512000001.app
【国際調査報告】
2007532512.tif 000128
2007532512.tif 000129
2007532512.tif 000130
2007532512.tif 000131
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