(57)【要約】  本発明は、少なくとも1つの炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列と、グルコアミラーゼ活性を有する少なくとも触媒モジュールのアミノ酸配列とを含んでなるハイブリッド酵素に関する。本発明は、また、デンプン処理、特にエタノール製造におけるハイブリッド酵素の使用に関する。
2007509630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールのアミノ酸配列と、炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列とを含んでなるハイブリッド酵素。
【請求項２】
炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列が真菌由来、好ましくはアスペルギルス (Aspergillus) の種、アテリア (Athelia) の種またはタラロマイセス (Talaromyces) の種由来である、請求項1に記載のハイブリッド酵素。
【請求項３】
炭水化物結合性モジュールがアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) に由来し、例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するCBMであるか、あるいは炭水化物結合性モジュール (CBM) のアミノ酸配列がアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来し、好ましくは配列番号18に示すアミノ酸配列を有するCBMであるか、あるいは炭水化物結合性モジュール (CBM) のアミノ酸配列がアテリア (Athelia) の種、好ましくはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) に由来し、特に配列番号28に示すアミノ酸配列を有するCBMである、請求項2に記載のハイブリッド酵素。
【請求項４】
触媒モジュールが真菌由来であり、好ましくはアスペルギルス (Aspergillus) の株、好ましくはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) の株に由来し、特に配列番号24に示す配列であり、アテリア (Athelia) 、好ましくはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) に由来し、特に配列番号26に示す配列であり、タラロマイセス (Talaromyces) 、好ましくはタラロマイセス・エメルソニイ(Talaromyces emersonii) に由来し、特に配列番号25に示すアミノ酸配列である、請求項1〜3のいずれかに記載のハイブリッド酵素。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれかに記載のハイブリッド酵素をコードするDNA配列。
【請求項６】
請求項5に記載のDNA配列を含んでなるDNA構築物。
【請求項７】
請求項5に記載のDNA配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項８】
請求項5に記載のDNA配列を発現することができる請求項7に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
水性媒質中で請求項1〜4のいずれかに記載のハイブリッド酵素に粒状デンプンを暴露することを含んでなる、シロップを製造する方法。
【請求項１０】
粒状デンプンをα-アミラーゼにさらに暴露する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
α-アミラーゼが酸性α-アミラーゼであり、好ましくは真菌、好ましくは属アスペルギルス (Aspergillus)、特にアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) に由来する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
シロップがグルコースまたはマルトースである、請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
発酵生物の存在下に水性媒質中で請求項1〜4のいずれかに記載のハイブリッド酵素に粒状デンプンを暴露することを含んでなる、発酵生成物を製造する方法。
【請求項１４】
粒状デンプンをα-アミラーゼにさらに暴露する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
α-アミラーゼが酸性α-アミラーゼであり、好ましくは真菌、好ましくは属アスペルギルス (Aspergillus)、特にアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) に由来する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
発酵生物が酵母、好ましくはサッカロマイセス (Saccharomyces) 、特にサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) である、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
発酵生成物がエタノール、例えば、燃料または飲用エタノールである、請求項13〜16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
発酵生成物またはシロップを製造するための請求項1〜4のいずれかに記載のハイブリッド酵素の使用。
【請求項１９】
エタノールを製造するための請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
請求項9〜17のいずれかに記載の方法における請求項1〜4のいずれかに記載のハイブリッド酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リストに対する参照
この出願はコンピュータ読取り可能な形態の配列リストを含有する。コンピュータ読取り可能な形態は引用することによって本明細書の一部とされる。
発明の背景
発明の分野
本発明は、なかでも、グルコアミラーゼの少なくとも1つの炭水化物結合性モジュール (CBM) と少なくとも触媒モジュール (CM) との間のハイブリッドに関する。本発明は、また、粒状デンプンを発酵生成物、特にエタノールの製造における酵母の栄養素として使用できる糖、例えば、シロップに分解する、デンプン処理におけるハイブリッド酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関係する技術の説明
デンプンを、甘味料または他のサッカリドの前駆体、例えば、フルクトースに使用するためのデンプン加水分解物、例えば、マルトース、グルコース、特にシロップに転化する多数の方法が記載されてきている。
デンプンはグルコース単位の鎖から成る高分子量ポリマーである。通常、それは約80%のアミロペクチンおよび20%のアミロースから成る。アミロペクチンは、α-1,4 D-グルコース残基の直鎖がα-1,6 グリコシド結合で結合されている、分枝鎖状多糖である。
【０００３】
アミロースは、α-1,4 グリコシド結合で一緒に結合されたD-グルコピラノース単位から構築された、直鎖状多糖である。デンプンを可溶性デンプン加水分解物に転化する場合において、デンプンは解重合される。慣用の解重合プロセスは、糊化工程および2つの連続的プロセス工程、すなわち、液化プロセスおよびサッカリド化プロセスから成る。
【０００４】
粒状デンプンは、室温において水中に不溶性である微視的粒体から成る。水性デンプンスラリーを加熱するとき、粒体は膨潤し、究極的に破裂して、デンプン分子を溶液中に分散させる。この「糊化」プロセス間に、粘度が劇的に増加する。典型的な産業的プロセスにおいて、固形分レベルは30〜40%であるので、デンプンを希釈または「液化」して取扱い可能としなくてはならない。この粘度減少は今日主として酵素分解により実施される。液化工程間に、長鎖デンプンはα-アミラーゼにより小さい分枝鎖状単位および直鎖状単位 (マルトデキストリン) に分解される。典型的には、液化プロセスは約105〜110℃において約5〜10分間、次いで約95℃において約1〜2時間実施される。次いで温度を60℃に低下させて、グルコアミラーゼまたはβ-アミラーゼおよび必要に応じて脱分枝酵素、例えば、イソアミラーゼまたはプルラナーゼを添加し、そしてサッカリド化プロセスを約24〜72時間進行させる。
【０００５】
慣用のデンプン転化プロセスは、種々の工程間の温度に関する異なる必要条件のために、非常にエネルギーを消費する。こうして、デンプンを糊化しないで全体のプロセスを実施できるように、このプロセスにおいて使用する酵素を選択することが望ましい。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約
第1の面において、本発明は、グルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールのアミノ酸配列と、炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列とを含んでなるハイブリッド酵素を提供する。触媒モジュールは真菌、細菌または植物由来であることが好ましい。
【０００７】
それ以上の面において、本発明は、第1の面のハイブリッド酵素をコードする単離されたDNA配列、第1の面のハイブリッド酵素をコードするDNA配列を含んでなるDNA構築物、第1の面のハイブリッド酵素をコードする単離されたDNA配列を含んでなる発現ベクター、および第1の面のハイブリッド酵素をコードする単離されたDNA配列を発現することができる、ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０００８】
最後の面において、本発明は、生デンプンを水性媒質中でα-アミラーゼと、本発明のグルコアミラーゼ活性を有するハイブリッド酵素とに暴露することを含んでなる、シロップまたは発酵生成物を製造する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
用語「粒状デンプン」は、原料の生デンプン、すなわち、糊化されていないデンプンとして理解される。デンプンは水中に不溶性である小さい粒体として植物中で形成される。これらの粒体は初期糊化温度より低い温度においてデンプン中に保存される。冷水中に入れると、粒体は少量の液体を吸収する。50℃〜70℃まで、膨潤は可逆的であり、可逆性の程度は特定のデンプンに依存する。より高い温度において、糊化と呼ばれる不可逆的膨潤が開始する。
【００１０】
用語「初期糊化温度」は、デンプンの糊化が開始する最低温度として理解される。水中で加熱されたデンプンは50℃〜75℃において糊化し始める; 糊化の正確な温度は特定のデンプンに依存し、当業者はそれを容易に測定することができる。こうして、初期糊化温度は植物種、植物種の特定の変種、ならびに成長条件に従い変化することがある。本発明の関係において、所定のデンプンの初期糊化温度は、下記の文献に記載されている方法を使用してデンプン粒体の5%において複屈折が喪失する温度である: Gorinstein S. およびLii C. 、Starch/Sterke、Vol. 44 (12) pp. 461-466 (1992) 。
【００１１】
用語「可溶性デンプン加水分解物」は、本発明の方法の可溶性生成物として理解され、そして単糖、二糖、およびオリゴ糖、例えば、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、シクロデキストリンおよびこれらの任意の混合物を含んでなることができる。好ましくは、粒状デンプンの乾燥固形分の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも99%は可溶性デンプン加水分解物に転化される。
【００１２】
ポリペプチドの「相同性」(homology) は、第1配列が第2配列から偏っていることを示す、2配列間の同一性の程度として理解される。相同性はこの分野において知られているコンピュータプログラム、例えば、下記により適当に決定することができる: GCGプログラムパッケージで提供されるGAP (Program Manual for the Wisconsin Package、Version 8、1994年8月、Genetics Computer Group、575 Science Drive、米国 53711 ウィスコンシン州マディソン) (Needleman S. B. およびWunsch C. D. (1970) 、Journal of Molecular Biology 48、443-453。アミノ酸配列を比較するために下記の設定を使用する: 3.0のGAP生成ペナルティーおよび0.1のGAPエクステンションペナルティー。
【００１３】
ハイブリッド酵素
特許請求の範囲を含むこの明細書中で言及する酵素分類ナンバリング (ECナンバリング) は下記にに従う: Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology、Academic Press Inc. 1992。
【００１４】
本明細書において言及するハイブリッド酵素は、炭水化物結合性モジュール (CBM) を含んでなるアミノ酸配列に結合した (すなわち、共有結合した) グルコアミラーゼ (EC 3.2.1.3) のアミノ酸配列を含んでなる種を包含する。また、用語「炭水化物結合性モジュール (CBM) 」は、「炭水化物結合性ドメイン (CBD) 」として言及される。
【００１５】
CBMを含有するハイブリッド酵素、ならびにそれらの製造および精製はこの分野において知られている [例えば、下記の文献を参照のこと: WO 90/00609、WO 94/24158およびWO 95/16782、ならびにGreenwood 他、Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295-1305] 。それらは、例えば、次のようにして製造することができる: それ自身の自然の炭水化物結合性モジュールを含むか、あるいは含まない、問題のグルコアミラーゼをコードするDNA配列に、リンカーを使用するか、あるいは使用しないで、結合した炭水化物結合性モジュールをコードする少なくとも1つのDNAフラグメントを含んでなるDNA構築物を宿主細胞の中に形質転換し、そして形質転換された宿主細胞を増殖させて融合遺伝子を発現させる。生ずる組換え生成物 (ハイブリッド酵素) (しばしばこの分野において「融合タンパク質」と言及される) は、下記の一般式で記載することができる:
【００１６】
A-CBM-MR-X
後者の式において、A-CBMは少なくとも炭水化物結合性モジュール (CBM) それ自体を含んでなるアミノ酸配列のN-末端またはC-末端の領域である。MRは中央領域 (「リンカー」) であり、そしてXはCBMを結合すべき酵素 (または他のタンパク質) をコードするDNA配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸残基の配列である。
【００１７】
部分Aは非存在である (A-CBMがCBMそれ自体である、すなわち、CBMを構築するもの以外のアミノ酸残基を含まないように) か、あるいは1または2以上のアミノ酸残基の配列 (CBMそれ自体の末端エクステンションとして機能する) であることができる。リンカー (MR) は結合であるか、あるいは約2〜約100炭素原子、特に2〜40炭素原子を含んでなる短い結合基であることができる。しかしながら、MRは約2〜約100アミノ酸残基、特に2〜40アミノ酸残基、例えば、2〜15アミノ酸残基の配列であることが好ましい。
【００１８】
部分Xはハイブリッド酵素全体のN-末端またはC-末端の領域を構築することができる。
こうして、前述の説明から明らかなように、問題のタイプのハイブリッド酵素中のCBMはハイブリッド酵素中のN-末端、C-末端または内部に位置することができる。
CBMが内部にある態様において、このCBMは２個のリンカーを介して連結されても良い。
【００１９】
本発明のハイブリッド酵素は、１個より多くの、例えば２個又は３個のCBMを有することができることが理解される。１個より多くのCBMが加えられる態様、例えば２個又はそれより多くのC又はN末端によるタンデム構成、N-末端＋C-末端CBMを有する構成が含まれる。
また、本発明による考えられるハイブリッドの例は下記一般式のハイブリッドを包含する:
A-CBM1-MR1-X-MR2-CBM2-B
A-CBM1-MR1-B-CBM2-MR2-X
A-CBM1-MR1-CBM2-X-MR3-CBM3-C
【００２０】
CBM1およびCBM2は異なるか、あるいは同一であることができる。BおよびCは非存在である (例えば、B-CBN2それら自体である、すなわち、CBM2を構築するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を含まないように) か、あるいは (Aとして) 1または2以上のアミノ酸残基の配列 (CBM2それら自体の末端エクステンションとして機能する) であることがある。リンカーは存在または非存在であることができる。
【００２１】
リンカー配列
リンカー配列は任意の適当なリンカー配列であることができる。好ましい態様において、1または2以上のリンカー配列は、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼ、またはアスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) α-アミラーゼに由来する。このようなリンカー配列の特定の例は次の通りである: 
【００２２】
- アスペルギルス・ニガー (A. niger) AMGリンカー:
TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA (配列番号20)、
- アスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) α-アミラーゼリンカー:
TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS (配列番号21)、
- アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカー:
STGATSPGGSSGS (配列番号27)、
- PEPTリンカー:
PEPTPEPT (配列番号22)。
【００２３】
リンカーはまた上記リンカーのフラグメントであってもよい。
他の好ましい態様において、ハイブリッド酵素は、10以下の位置、9以下の位置、8以下の位置、7以下の位置、6以下の位置、5以下の位置、4以下の位置、3以下の位置、2以下の位置、または1以下の位置に配列番号20、配列番号21、配列番号27、または配列番号22に示すアミノ酸配列と異なるリンカー配列を有する。
【００２４】
炭水化物結合性モジュール (CBM) 
炭水化物結合性モジュール (CBM) は、多糖またはオリゴ糖 (炭水化物) に優先的に結合し、頻繁に、しかし必ずしも独占的にではなく、それらの水不溶性 (結晶質を包含する) 形態に結合するポリペプチドアミノ酸配列である。
【００２５】
デンプン分解酵素に由来するCBMは、デンプン結合性モジュールまたはSBM (ある種のデンプン加水分解酵素、例えば、ある種のグルコアミラーゼ、またはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのような酵素、またはα-アミラーゼ中に存在することがあるCBM) をしばしば意味する。同様に、CBMの他のサブクラスは、例えば、セルロース結合性モジュール (セルロース分解酵素からのCBM) 、キチン結合性モジュール (典型的にはキチナーゼ中に存在するCBM) 、キシラン結合性モジュール (典型的にはキシラナーゼ中に存在するCBM) 、マンナン結合性モジュール (典型的にはマンナナーゼ中に存在するCBM) を包含するであろう。SBMはしばしばSBD (デンプン結合性ドメイン) と呼ばれる。
【００２６】
CBMは、特に典型的には基質加水分解のための活性部位を含有する触媒モジュールと、問題の炭水化物基質に結合するための炭水化物結合性モジュール (CBM) とを含んでなる加水分解酵素 (ヒドロラーゼ) において、2またはそれ以上のポリペプチドアミノ酸配列領域から成る大きいポリペプチドまたはタンパク質の一体的部分として見出される。このような酵素は2以上の触媒モジュールと、1、2または3つのCBMとを含んでなることができ、必要に応じて1または2以上のCBMを1または2以上の触媒モジュールに結合させる1または2以上のポリペプチドアミノ酸配列をさらに含んでなり、後者のタイプの領域は通常「リンカー」と呼ばれる。CBMを含んでなる加水分解酵素の例 (それらのあるものは既に前述した) は、セルラーゼ、α-アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼおよびキチナーゼである。CBMは、また、藻類、例えば、赤色藻ポルフィラ・プルプレア (Porphyra purpurea) 中に非加水分解性多糖結合性タンパク質の形態で見出された。
【００２７】
CBMがその中に存在するタンパク質/ポリペプチド (例えば、酵素、典型的には加水分解酵素) において、CBMはN末端またはC末端にまたは内部に位置することができる。
CBMそれ自体を構成するポリペプチドまたはタンパク質 (例えば、加水分解酵素) の部分は、典型的には約30より多くかつ約250より少ないアミノ酸残基から成る。
【００２８】
「ファミリー20の炭水化物結合性モジュール」またはCBM-20モジュールは、本発明の関係において、下記の文献に開示されているポリペプチドの炭水化物結合性モジュール (CBM) に対して少なくとも45%の相同性を有するほぼ100アミノ酸の配列として定義される: 第1図、Joergensen 他 (1997) Biotechnol. Lett. 19: 1027-1031。CBMはポリペプチドの最後の102アミノ酸、すなわち、アミノ酸582〜アミノ酸683のサブ配列を含んでなる。
【００２９】
この開示において適用されるグリコシドヒドロラーゼファミリーのナンバリングは下記の概念に従う: Coutinho P. M. およびHenrissat B. (1999) CAZy-Carbohydrate-Active Enzymes server at URL: afmb.cnrs-mrs.fr/〜cazy/CAZY/index.htmlまたは選択的にCoutinho P. M. およびHenrissat B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach、”Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation”、 編者: K. Ohmiya、K. Hayashi、K. Sakka、Y. Kobayashi、C. Karitaおよび. Kimura、Uni Publishers Co.  東京、pp. 15-23、およびBourne Y. およびHenrissat B. 2001; Glycoside hydrolase and glycosyltransferases: families and functional modules、Current Opinion in Structural Biology 11: 593-600。
【００３０】
本発明の関係において使用するために適当なCBMを含んでなる酵素の例は、α-アミラーゼ、マルトジェニックα-アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼおよびキチナーゼである。本発明に関して問題のそれ以上のCBMは、グルコアミラーゼ (EC 3.2.1.3) またはCGTアーゼ (EC 2.4.1.19) に由来するCBMを包含する。
【００３１】
一般に、真菌、細菌または植物源に由来するCBMは、本発明の関係において使用するために適当である。アスペルギルス (Aspergillus) の種、アテリア (Athelia) の種、タラロマイセス (Talaromyces) の種、バシラス (Bacillus) の種、クレブシエラ (Klebsiella) の種、またはリゾプス (Rhizopus) の種からのCBMは好ましい。真菌由来のCBMは好ましい。この関係において、関係する遺伝子を単離する技術はこの分野においてよく知られている。
【００３２】
炭水化物結合性モジュールファミリー20のCBMは本発明のために好ましい。「ファミリー20の炭水化物結合性モジュール」またはCBM-20モジュールは、本発明の関係において、下記の文献に開示されているポリペプチドの炭水化物結合性モジュール (CBM) に対して少なくとも45%の相同性を有するほぼ100アミノ酸の配列として定義される: 第1図、Joergensen 他 (1997) Biotechnol. Lett. 19: 1027-1031。CBMはポリペプチドの最後の102アミノ酸、すなわち、アミノ酸582〜アミノ酸683のサブ配列を含んでなる。
【００３３】
この開示において適用されるグリコシドヒドロラーゼファミリーのナンバリングは、CoutinhoおよびHenrissat 1999の概念に従う (Coutinho P. M. およびHenrissat B. The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach、”Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation”、 編者: K. Ohmiya、K. Hayashi、K. Sakka、Y. Kobayashi、C. Karitaおよび. Kimura、Uni Publishers Co.  東京、pp. 15-23または選択的にCoutinho P. M. およびHenrissat B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server at URL: afmb.cnrs-mrs.fr/〜cazy/CAZY/index.htm。
【００３４】
本発明に適当な炭水化物結合性モジュールファミリー20のCBMは下記に由来することができる: アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) (SWISSPROT Q12537) 、アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) (SWISSPROT P23176) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) (SWISSPROT P04064) 、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) (SWISSPROT P36914) のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) (EMBL: #AB008370) 、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) (NCBI AAF17100.1) のα-アミラーゼ、バシラス・セレウス (Bacillus cereus) (SWISSPROT P36924) のβ‐アミラーゼ、またはバシラス・サーキュラン (Bacillus circulans) (SWISSPROT P43379)  のCGTアーゼ。
【００３５】
アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) (EMBL: #AB008370) のα-アミラーゼからのCBMならびにアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) (EMBL: #AB008370) のα-アミラーゼからのCBMに対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%またはさらに少なくとも99%の相同性を有するCBM、すなわち、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%またはさらに少なくとも99%の相同性を有するCBM、Mは好ましい。
【００３６】
また、配列番号3 (バシラス・フラボテルムス (Bacillus flavothermus CBM)、配列番号4 (バシラス (Bacillus) の種CBM)、および配列番号5 (好アルカリ性バシラス (Bacillus) CBM) に示すアミノ酸配列を有する炭水化物結合性モジュールファミリー20のCBMは本発明のために好ましい。
【００３７】
それ以上の好ましいCBMは下記に由来するグルコアミラーゼのCBMを包含する: ホルモコニス (Hormoconis) の種、例えば、ホルモコニス・レジネ (Hormoconis resinae) (Syn. Creosote真菌またはアモルホテカ・レジネ (Amorphotheca resinae)) 、例えば、SWISSPROT: Q03045 (配列番号6) のCBM、レンチヌラ (Lentinula) の種、例えば、レンチヌラ・エドデス (Lentinula edodes) (シイタケキノコ) 、例えば、SPTREMBL: Q9P4C5のCBM (配列番号7) 、ニューロスポラ (Neurospora) の種、例えば、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa)、例えば、SWISSPROT: P14804のCBM (配列番号8) 、タラロマイセス (Talaromyces) の種、例えば、タラロマイセス・ビッソクラミジオイデス (Talaromyces byssochlamydioides) 、例えば、NN005220のCBM (配列番号9) 、ゲオスミチア (Geosmithia) の種、例えば、ゲオスミチア・シリンドロスポラ (Geosmithia cylindrospora) 、例えば、NN48286のCBM (配列番号10) 、
【００３８】
スコリアス (Scorias) の種、例えば、スコリアス・スポンギオサ (Scorias spongiosa) 、例えば、NN007096のCBM (配列番号11) 、エウペニシリウム (Eupenicillium) の種、例えば、エウペニシリウム・ルドウィギイ (Eupenicillium ludwigii) 、例えば、NN005968のCBM (配列番号12) 、アスペルギルス (Aspergillus) の種、例えば、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus) 、例えば、NN001136 のCBM (配列番号13) 、ペニシリウム (Penicillium) の種、例えば、ペニシリウムcfミクジンスキイ (Penicillium cf miczynskii) 、例えば、NN48691のCBM (配列番号14) 、Mz1 ペニシリウム (Penicillium) の種、例えば、NN48690のCBM (配列番号15) 、チサノホラ (Thysanophora) 、例えば、NN48711のCBM (配列番号16) 、およびフミコラ (Humicola) の種、例えば、フミコラ・グリセア・ヴァル・テルモデア (Humicola grisea var. thermoidea) 、例えば、SPTREMBL: Q12623のCBM (配列番号17) 。
【００３９】
最も好ましいCBMは下記に由来するグルコアミラーゼのCBMを包含する: アスペルギルス (Aspergillus) の種、例えば、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、例えば、配列番号18、および アテリア (Athelia) の種、例えば、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、例えば、配列番号19。また、前述のCBMアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%またはさらに少なくとも99%の相同性を有するCBMは本発明において好ましい。
それ以上の適当な炭水化物結合性モジュールファミリー20は下記において見出される: Carbohydrate-Active Enzymes server at URL : afmb.cnrs-mrs.fr/〜cazy/CAZY/index.htm。
【００４０】
他のCBMは下記に由来するグルコアミラーゼ中に見出すことができる: ムコル・シルシネロイデス (Mucor circinelloides)、リゾプス・オリゼ (Rhizopus oryzae) およびアルクスラ・アデニニボランス (Arxula adeninivorans)。
【００４１】
いったん基質結合性 (炭水化物結合性) 領域をコードするヌクレオチド配列、例えば、cDNAまたは染色体DNAが同定されると、次いで種々の方法で操作して問題の酵素をコードするDNA配列にそれを融合させることができる。次いで、リンカーを使用するか、あるいは使用しないで、炭水化物結合性アミノ酸配列をコードするDNAフラグメント、および問題の酵素をコードするDNAを結合する。次いで、生ずる結合したDNAを種々の方法で操作して発現を達成する。
【００４２】
グルコアミラーゼ配列
本発明のCBM/グルコアミラーゼハイブリッドの基礎として適当なグルコアミラーゼは、例えば、真菌生物、細菌または植物に由来するグルコアミラーゼを包含する。好ましいグルコアミラーゼは下記から成る群から選択される真菌または細菌由来のグルコアミラーゼである: アスペルギルス (Aspergillus) グルコアミラーゼ、特に配列番号24に示すアスペルギルス・ニガー (A. niger) G1またはC2グルコアミラーゼ (Boel 他 (1984)、ENBO J. 3 (5)、pp. 1097-1102) またはそれらの変異型、例えば、WO 92/00381、WO 00/04136およびWO 01/04273 (Novozymes、デンマーク国) に開示されているグルコアミラーゼ; アスペルギルス・アワモリ (A. awamori) グルコアミラーゼ (WO 84/02921)、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) (Agric. Biol. Chem. (1991)、55 (4)、pp. 941-949)、またはそれらの変異型またはフラグメント。
【００４３】
他のグルコアミラーゼは下記を包含する: 配列番号26に示すアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼ (米国特許第4,727,046号)、タラロマイセス (Talaromyces) グルコアミラーゼ、特に配列番号25に示すタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) (WO 99/28448)、タラロマイセス・レイセタヌス (Talaromyces leycettanus) (米国特許再発行32,153)、タラロマイセス・ズポンチ (Talaromyces duponti)、タラロマイセス・サーモフィルス (Talaromyces thermophilus) (米国特許第4,587,215号) に由来するグルコアミラーゼ。
【００４４】
考えられる細菌のグルコアミラーゼは、属クロストリジウム(Clostridium)、特にクロストリジウム・テルモヒドロスルフリカム (C. thermohydrosulfuricum) (EP 135,138) およびクロストリジウム・テルモヒドロスルフリカム (C. thermohydrosulfuricum) (WO 86/01831) からのグルコアミラーゼを包含する。グルコアミラーゼは自然のCBMを含むか、あるいは含まないことがあるが、少なくとも触媒モジュール (CM) を含んでなる。
【００４５】
好ましいグルコアミラーゼは、配列番号24に開示されているアスペルギルス・ニガー (A. niger) グルコアミラーゼであるか、あるいは配列番号24に示すアミノ酸配列に対して50%より大きい、例えば、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99％の相同性を有するグルコアミラーゼである。
グルコアミラーゼ (触媒モジュール) は1つの態様においてグルコアミラーゼ活性を有する活性フラグメントであることができることを理解すべきである。
【００４６】
他の好ましいグルコアミラーゼは、配列番号26に示すアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼグルコアミラーゼであるか、あるいは配列番号26に示すアミノ酸配列に対して50%より大きい、例えば、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99％の相同性を有するグルコアミラーゼである。
他の好ましいグルコアミラーゼは、配列番号25に示すタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼグルコアミラーゼであるか、あるいは配列番号25に示すアミノ酸配列に対して50%より大きい、例えば、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99％の相同性を有するグルコアミラーゼである。
【００４７】
ハイブリッド
1つの面において、本発明は、グルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールのアミノ酸配列と、炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列とを含んでなるハイブリッド酵素に関する。他の好ましい態様において、触媒モジュールは真菌由来であり、より好ましい態様において、触媒モジュールはタラロマイセス (Talaromyces) の株、好ましくはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii)、アスペルギルス (Aspergillus) の株、好ましくはアスペルギルス・ニガー (A. niger) またはアテリア (Athelia) の株、好ましくはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) に由来する。
【００４８】
好ましい態様において、本発明のハイブリッド酵素は、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールと、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) からの炭水化物結合性モジュールとを含んでなる。1つの態様において、ハイブリッドはリンカー配列、好ましくはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii)、アスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) からのリンカー配列を触媒モジュールと炭水化物結合性モジュールとの間に含む。
【００４９】
好ましい態様において、本発明のハイブリッド酵素は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来するルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールと、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) からの炭水化物結合性モジュールとを含んでなる。1つの態様において、ハイブリッドはリンカー配列、好ましくはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii)、アスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) からのリンカー配列を触媒モジュールと炭水化物結合性モジュールとの間に含む。
【００５０】
他の好ましい態様において、本発明のハイブリッド酵素は、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) に由来するルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールと、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) からの炭水化物結合性モジュールとを含んでなる。1つの態様において、ハイブリッドはリンカー配列、好ましくはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii)、アスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) からのリンカー配列を触媒モジュールと炭水化物結合性モジュールとの間に含む。
【００５１】
好ましいアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アテリア (Athelia) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) は、それぞれ、配列番号24、配列番号25、および配列番号26に示すものである。
【００５２】
好ましくは、ハイブリッド酵素は、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、または配列番号19に示すアミノ酸配列に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%または99％の相同性を有するCBM配列を含んでなる。
【００５３】
なおいっそう好ましくは、ハイブリッド酵素は配列番号28に示すアミノ酸配列を有するCBM配列を含んでなる。なお他の好ましい態様において、CBM配列は、10アミノ酸以下の位置、9以下の位置、8以下の位置、7以下の位置、6以下の位置、5以下の位置、4以下の位置、3以下の位置、2以下の位置、または1以下の位置において、配列番号28に示すアミノ酸配列、または他のCBM配列のいずれか1つと異なる。最も好ましい態様において、ハイブリッド酵素は、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) からのグルコアミラーゼ、例えば、米国特許第4,727,026号に記載されているアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AHU 9627からのAMGまたはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) からのCBMに由来するCBM配列を含んでなる。
【００５４】
【表１】
2007509630.tif 000003
【００５５】
発現ベクター
本発明は、また、ハイブリッド酵素をコードするDNA配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写および翻訳停止シグナルを含んでなることができる組換え発現ベクターに関する。前述の種々のDNA配列および制御配列を一緒に結合して組換え発現ベクターを生成することができ、このような発現ベクターは、制限部位におけるポリペプチドエンコーディングDNA配列の挿入または置換を可能とする1または2以上の好都合な制限部位を含むことができる。選択的に、本発明のDNA配列は、DNA配列または前記配列を含んでなるDNA構築物を発現に適当なベクター中に挿入することによって発現させることができる。発現ベクターをつくるとき、コーディング配列が発現に、かつ可能ならば分泌に、適当な制御配列に作用可能に連鎖されるように、コーディング配列はベクター中に位置する。
【００５６】
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に好都合に付すことができ、かつDNA配列の発現を生ずることができる、任意のベクター (例えば、プラスミドまたはウイルス) であることができる。典型的には、ベクターの選択はベクターと導入すべき宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは線状または閉じた円のプラスミドであることができる。ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体に対して独立である、染色体外実在物として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、コスミドまたは人工的染色体であることができる。
【００５７】
ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含有することができる。選択的に、ベクターは、宿主細胞中に挿入したとき、ゲノム中に組込まれ、それが組込まれた1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。ベクター系は単一のベクターまたはプラスミドであるか、あるいは宿主細胞のゲノム中に導入すべき全DNAを一緒に含有する2またはそれ以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンであることができる。
【００５８】
マーカー
本発明のベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能とする、1または2以上の選択可能なマーカーを含有することが好ましい。選択可能なマーカーは、その生成物が殺生物剤またはウイルスの耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性株に対するプロトトロフィー、およびその他を提供する遺伝子である。
【００５９】
糸状真菌の宿主細胞において使用する選択可能なマーカーの例は、下記を包含する群から選択できるが、これらに限定されない: amdS (アセトアミダーゼ) 、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ) 、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ) 、hygB (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ) 、niaD (硝酸レダクターゼ) 、pyrG (オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ) 、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) 、trpC (アントラニレートシンターゼ) 、およびグルフォシネート耐性マーカー、ならびに他の種からの同等のマーカー。
【００６０】
アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) のamdSおよびpyrGマーカー、およびストレプトマイセス・ヒグロスコピカス (Streptomyces hygroscopicus) のbarマーカーは、アスペルギルス (Aspergillus) 細胞において使用するために好ましい。さらに、例えば、WO 91/17243に記載されているように、選択は共形質転換により達成することができ、ここで選択可能なマーカーは別のベクター上に存在する。
本発明のベクターは、宿主細胞ゲノムの中へのベクターの安定な組込みまたは細胞のゲノムに対して独立に細胞中でベクターの自律的複製を可能とする、1または2以上の因子を含有することが好ましい。
【００６１】
本発明のベクターは、宿主細胞の中に導入するとき、宿主細胞ゲノム中に組込むことができる。組込みのために、ベクターは問題のポリペプチドをコードするDNA配列に頼るか、あるいはまたは相同的組換えまたは非相同的組換えによりゲノム中にベクターを安定に組込む、ベクターの他の因子に頼ることができる。選択的に、ベクターは相同的組換えにより組込みを宿主細胞ゲノム中に向ける、追加のDNA配列を含有することができる。追加のDNA配列は、1または2以上の染色体中の1または2以上の精確な位置において宿主細胞ゲノム中にベクターを組込むことができる。精確な位置における組込みの確度を増加させるために、組込み因子は、相同的に組換えの確率を増大するために対応するターゲット配列と高度に相同性である、十分な数のDNA、例えば、100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、最も好ましくは800〜1,500塩基対を含有することが好ましいであろう。
【００６２】
組込み因子は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同性である任意の配列であることができる。さらに、組込み因子は非エンコーディングまたはコーディングDNA配列であることができる。他方において、ベクターは非相同的組換えにより宿主細胞ゲノム中に組込まれることができる。これらのDNA配列は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同性である任意の配列であり、さらに、非エンコーディングまたはコーディング配列であることができる。
【００６３】
自律的複製のために、ベクターは問題の宿主細胞中でベクターを複製させることができる複製起点をさらに含んでなることができる。WO 00/24883に開示されているAMA1プラスミドベクターを複製するエピソームを使用することができる。
【００６４】
問題のポリペプチドをコードするDNA配列の2以上のコピーを宿主細胞中に挿入して、DNA配列の発現を増強することができる。この分野においてよく知られている方法に従い、配列の少なくとも1つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組込み、形質転換体について選択することによって、DNA配列を安定に増幅することができる。
【００６５】
前述の因子を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築する手順はこの分野においてよく知られている (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー) 。
【００６６】
宿主細胞
宿主細胞は、真菌、例えば、糸状真菌または酵母由来であるか、あるいは細菌由来、例えば、バシラス (Bacillus) 由来であることができる。
【００６７】
DNA構築物を含んでなるか、あるいはハイブリッド酵素をコードするDNA配列を含んでなる、本発明の宿主細胞は、ハイブリッド酵素の組換え産生において宿主細胞として好都合に使用される。この細胞を発現ベクターで形質転換することができる。選択的に、宿主染色体中にDNA構築物 (1または2以上のコピー) を組込むことによって、ハイブリッド酵素をコードする本発明のDNA構築物で細胞を形質転換することができる。宿主染色体中へのDNA構築物の組込みは、慣用法、例えば、相同的または異種的組換えにより実施することができる。
【００６８】
好ましい態様において、宿主細胞は下記のグループにより代表される糸状真菌の細胞である: 子嚢菌門 (Ascomycota) 、例えば、アカバンカビ (Neurospora)、エウペニシリウム (Eupenicillium) (= ペニシリウム (Penicillium)) 、エメリセラ (Emericella) (= アスペルギルス (Aspergillus)) 、コウジカビ (Eurotium) (=アスペルギルス (Aspergillus)) 。
【００６９】
より好ましい態様において、糸状真菌は、亜門の真菌門 (Eumycota) および卵菌門 (Oomycota) の糸状形態を包含する (下記により規定された: Hawksworth 他、Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi、第8版、CAB International、University Press、英国ケンブリッジ) 。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成された栄養菌糸体により特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長により、そして炭素異化作用は無条件的に好気的である。
【００７０】
さらにより好ましい態様において、糸状真菌の宿主細胞は下記の種に属する株から成る群から選択される細胞であるが、これらに限定されない: アスペルギルス (Aspergillus) の種、好ましくはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) 、またはフザリウム (Fusarium) 株、例えば、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) 、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum) (完全な状態における名称Gibberella zeae、以前においてSphaeria zeae、同義Gibberella roseumおよびGibberella roseum f. sp. cerealis) 、またはフザリウム・スルフリウム (Fusarium sulphureum) (完全な状態における名称Gibberella puricaris、同義Fusarium trichothecioides、Fusarium bactridioides、Fusarium sambucium、Fusarium roseum、およびFusarium roseum var. graminearum) 、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis) (同義Fusarium crookwellense) 、またはフザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) の株。
【００７１】
最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞はアスペルギルス (Aspergillus) の種、好ましくはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 、またはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に属する株の細胞である。
【００７２】
宿主細胞は、野生型糸状真菌宿主細胞または変異型、突然変異体または遺伝的に修飾された糸状真菌宿主細胞であることができる。本発明の好ましい態様において、宿主細胞はプロテアーゼ欠乏またはプロテアーゼマイナス株である。また、特別に、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、α-1,6-トランスグルコシダーゼ、およびプロテアーゼ活性の発現を崩壊または減少させるように遺伝的に修飾されたアスペルギルス (Aspergillus) 株、例えば、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 株が考えられる。
【００７３】
他の好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」は、本明細書において使用するとき、子嚢胞子発生酵母 (エンドミケス目 (Endomycetales))、担子胞子発生酵母、および不完全菌類 (Fungi Imperfecti) (ブラストミセテス (Blastomycetes)) を包含する。酵母の分類は将来において変化することがあるので、本発明の目的に対して、酵母は下記の文献に記載されているように定義される: Biology and Activities of Yeast (Skinner F. A.、Passmore S. M. およびDavenport R. R. 編、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980)。
【００７４】
なおより好ましい態様において、酵母菌宿主細胞は、カンジダ (Candida)、ハンゼヌラ (Hansenula)、クライベロマイセス (Kluyveromyces)、ピキア (Pichia)、サッカロマイセス (Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) またはヤロウィア (Yarrowia) 細胞である。
【００７５】
最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞は、サッカロマイセス・カリスベルゲンシス (Saccharomyces carisbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ドウグラシイ (Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・クルイベリ (Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス (Saccharomyces norbensis) またはサッカロマイセス・オビフォルミス (Saccharomyces oviformis) 細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はクライベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis) 細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 細胞である。
【００７６】
糸状真菌宿主細胞の形質転換
糸状真菌宿主細胞は、この分野においてそれ自体知られている方法においてプロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生を包含するプロセスにより形質転換することができる。アスペルギルス (Aspergillus) 宿主細胞に適当な形質転換手順は下記の文献に開示されている: EP 238 023、およびYelton 他、1984、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474。フザリウム (Fusarium) の種に適当な形質転換法は下記の文献に開示されている: Malardier 他、1989、Gene 78: 147-156またはWO 96/00787。
【００７７】
酵母は下記の文献に記載されている手順ように形質転換ことができる: BeckerおよびGuarente著、Abelson J. N. およびSimon M. I. 編、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology Vol. 194、pp. 182-187、Academic Press, Inc.、New York; Ito. 他、1983、Journal of Bacteriology 153: 163; およびHinnen 他、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920。
【００７８】
DNA配列の単離およびクローニング
問題のポリペプチドをコードするDNA配列を単離またはクローニングするために使用する技術はこの分野において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、またはそれらの組合わせを包含する。このようなゲノムDNAからの本発明のDNA配列のクローニングは、例えば、広く知られているポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) または構造的特徴を共有するクローニングされたDNAフラグメントを検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することによって、実施することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Innis 他、PCR: A Guide to Methods and Application、Academic Press、New York。他のDNA増幅手法、例えば、リガーゼ連鎖反応 (LCR) 、結合活性化転写 (LAT) およびDNA配列配列決定に基づく増幅 (NASBA) を使用することができる。
【００７９】
単離されたDNA配列
本発明は、なかでも、グルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールのアミノ酸配列と、炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列とを含んでなるハイブリッド酵素をコードするDNA配列を含んでなる単離されたDNA配列に関し、ここで触媒モジュールは真菌由来である。
【００８０】
用語「単離されたDNA配列」は、本明細書において使用するとき、他のDNA配列を本質的に含まない、例えば、アガロース電気泳動により決定して、少なくとも約20%の純度、好ましくは少なくとも約40%の純度、より好ましくは少なくとも約60%の純度、なおより好ましくは少なくとも約80%の純度、最も好ましくは少なくとも約90%の純度のDNA配列を意味する。
【００８１】
例えば、単離されたDNA配列は、遺伝子操作において使用される標準的クローニング手法を使用して、DNA配列をその天然の位置からそれが複製される異なる部位に再配置することによって、得ることができる。クリーニング手法は、問題のポリペプチドをコードするDNA配列を含んでなる必要なDNAフラグメントの切除および単離、ベクター分子の中へのフラグメントの挿入、および宿主細胞の中への組換えベクターの組込みを包含し、宿主細胞においてDNA配列の複数のコピーまたはクローンが複製される。単離されたDNA配列を種々の方法で操作して、問題のポリペプチドを発現させることができる。ベクターの中への挿入前のDNA配列の操作は、発現ベクターに依存して望ましいか、あるいは必要であることがある。組換えDNA法を使用してDNA配列を修飾する技術は、この分野においてよく知られている。
【００８２】
DNA構築物
本発明は、なかでも、グルコアミラーゼ活性を有する触媒モジュールのアミノ酸配列と、炭水化物結合性モジュールのアミノ酸配列とを含んでなるハイブリッド酵素をコードするDNA配列を含んでなるDNA構築物に関する。ある態様において、触媒モジュールは真菌由来である。「DNA構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、あるいはそうでなければ天然に存在しないような方法で組合わせかつ並置された、DNAのセグメントを含有するように修飾された、一本鎖または二本鎖のDNA分子として定義される。用語「DNA構築物」は、DNA構築物が本発明のコーディング配列の発現に要求されるすべてのコントロール配列を含有するとき、用語「発現カセット」と同義である。
【００８３】
製造方法
本発明のハイブリッドは、任意の方法、例えば、(a) ハイブリッドの製造を促進する条件下に宿主細胞を培養し、そして (b) ハイブリッドを回収することを含んでなる方法により製造することができる。
【００８４】
本発明の製造方法において、この分野において知られている方法に従いハイブリッドの製造に適当な栄養培地中で細胞を培養する。例えば、震蘯フラスコ培養、小規模または大規模の発酵 (連続的、バッチ式、供給バッチ式、または固体状態の発酵を包含する) により、ハイブリッドの発現および/または単離を可能とする適当な培地中でかつ条件下に実施される実験室または工業的発酵槽において、細胞を培養することができる。炭素お源よび窒素源および無機塩を含んでなる適当な栄養培地中で、この分野において知られている手順を使用して、培養を実施する。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された組成に従い調製することができる (例えば、American Type Culture Collectionのカタログ) 。ハイブリッドが栄養培地中に分泌される場合、それを培地から直接回収することができる。ハイブリッドが分泌されない場合、それは細胞ライゼイトから回収することができる。
【００８５】
ハイブリッドに対して特異的である、この分野において知られている方法を使用して、ハイブリッドを検出することができる。これらの検出方法は特異的抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失を包含することができる。例えば、酵素アッセイを使用して、本明細書に記載するハイブリッドの活性を決定することができる。
生ずるハイブリッドはこの分野において知られている方法により回収することができる。例えば、ハイブリッドは下記を包含するが、これらに限定されない手順により回収することができる: 遠心、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿。
【００８６】
ハイブリッドはこの分野において知られている種々の手順により精製することができ、このような手順は下記を包含するが、これらに限定されない: クロマトグラフィー (例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除) 、電気泳動手順 (例えば、調製用等電点電気泳動) 、示差溶解度 (例えば、硫酸アンモニウム沈降法) 、SDS-PAGE、または抽出 (例えば、下記の文献を参照のこと: Protein Purification、J. -C. JansonおよびLars Ryden、編者、VCH Publishers、New York、1989) 。
【００８７】
デンプン処理
本発明の第1の面のハイブリッド酵素は、シロップまたは発酵生成物、例えば、特にエタノールを製造する方法において使用することができる。ここで、粒状デンプンを水性媒質中においてグルコアミラーゼ活性を有する本発明のハイブリッド酵素で処理する。グルコアミラーゼ活性を有するハイブリッド酵素は、ある態様において、0.02〜20 AGU/g DS、好ましくは01〜10 AGU/g DS、例えば、約0.1、0.3、0.5、1または2 AGU/g DS、例えば、0.1〜0.5 AGU/g DSの量で添加することができる。さらに、粒状デンプンをα-アミラーゼ、好ましくは後述するα-アミラーゼに暴露することができる。
【００８８】
α-アミラーゼ
本発明によれば、α-アミラーゼは任意の由来であることができる。真菌または細菌由来のα-アミラーゼは好ましい。α-アミラーゼは、バシラス (Bacillus) α-アミラーゼ、例えば、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) およびバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) の株に由来するα-アミラーゼであることができる。
【００８９】
他のα-アミラーゼは下記を包含する: バシラス (Bacillus) の種NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513またはDSM 9375からのα-アミラーゼ (それらのすべてはWO 95/26397に詳細に記載されている)、および下記の文献に記載されているα-アミラーゼ: Tsukamoto 他、Biochemical and Biophysical Research Communications 151 (1988)、pp. 25-31。他のα-アミラーゼの変異型およびハイブリッドは下記の文献に記載されている: WO 96/23874、WO 97/41213およびWO 99/19467。
【００９０】
他のα-アミラーゼは、アスペルギルス (Aspergillus) 株、例えば、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) のα-アミラーゼを包含する。好ましい態様において、α-アミラーゼは酸性α-アミラーゼである。より好ましい態様において、酸性α-アミラーゼは酸性真菌α-アミラーゼまたは酸性細菌α-アミラーゼである。より好ましくは、酸性α-アミラーゼは属アスペルギルス (Aspergillus) に由来する酸性真菌α-アミラーゼである。商業的に入手可能な酸性真菌アミラーゼはSP288 (Novozymes A/S、デンマーク国から入手可能である) である。好ましい態様において、α-アミラーゼは酸性α-アミラーゼである。
【００９１】
用語「α-アミラーゼ」は、有効量で添加したときpH 3.0〜7.0、好ましくはpH 3.5〜6.0、より好ましくはpH 4.0〜5.0において活性を有するα-アミラーゼ (EC 3.2.1.1) を意味する。好ましい酸性真菌α-アミラーゼはフンガミル様α-アミラーゼである。本発明の開示において、用語「フンガミル様α-アミラーゼ」は、WO 96/23874中の配列番号10に示すアミノ酸配列に対して高い相同性、すなわち、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはさらに100%の相同性 (同一性) を有するα-アミラーゼを示す。
【００９２】
好ましくは、α-アミラーゼは酸性α-アミラーゼ、好ましくは属アスペルギルス (Aspergillus)、好ましくは種アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) からの酸性α-アミラーゼである。好ましい態様において、酸性真菌α-アミラーゼは、Swiss-prot/TeEMBLデータベースに一次受け入れ番号P56271で「AMYA_ASPNG」として開示されているアスペルギルス・ニガー (A. niger) からのα-アミラーゼである。また、前記酸性真菌アミラーゼに対して少なくとも80%またはさらに少なくとも90%の同一性、例えば、少なくとも95%、96%、97%、98%または少なくとも99%の同一性を有する、前記酸性真菌アミラーゼの変異型が考えられる。
【００９３】
また、アミラーゼはマルトジェニックα-アミラーゼであることができる。「マルトジェニックα-アミラーゼ」(グルカン1,4-α-マルトヒドロラーゼ、EC 3.2.1.133) は、アミロースおよびアミロペクチンをα-立体配置のマルトースに加水分解することができる。バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 株NCIB 11837からのマルトジェニックα-アミラーゼは、Novozymes A/Sから商品名NOVAMYLTMで商業的に入手可能である。マルトジェニックα-アミラーゼは、米国特許第4,598,048号、米国特許第4,604,355号および米国特許第6,162,628号 (これらは引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている。好ましくは、マルトジェニックα-アミラーゼは、例えば、WO 95/10627 (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている、生デンプンの加水分解法において使用される。
【００９４】
α-アミラーゼを使用するとき、例えば、マルトース発生酵素として、真菌α-アミラーゼは0.001〜1.0 AGU/g DS、好ましくは0.002〜0.5 AGU/g DS、好ましくは0.02〜0.1 AGU/g DSの量で添加することができる。
α-アミラーゼを含んでなる好ましい商業的組成物は下記を包含する: MYCOLASE (DSM (Gist Brocades)から)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM XおよびSANTM SUPER、SANTM EXTRA L (Novozymes A/S) およびCLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYME FRED、SPEZYMETM AAおよびSPEZYMETM DELTA AA (Genencor Int.) および商品名SP288 (Novozymes A/S、デンマーク国から入手可能である) で販売されている酸性真菌α-アミラーゼ。
【００９５】
α-アミラーゼは、この分野においてよく知られている量で、添加することができる。AAU単位で測定したとき、酸性α-アミラーゼ活性は好ましくは5〜50,000 AAU/kg Dの量で、500〜50,000 AAU/kg DSの量で、より好ましくは100〜10,000 AAU/kg DSの量で、例えば、500〜1,000 AAU/kg DSの量で存在する。真菌酸性α-アミラーゼは好ましくは10〜10,000 AFAU/kg DSの量で、500〜2,500 AFAU/kg DSの量で、より好ましくは100〜1,000 AFAU/kg DSの量で、例えば、ほぼ500 AFAU/kg DSの量で添加される。
【００９６】
方法
1つの態様において、本発明の方法は、粒状デンプン基質のスラリーの加水分解を含み、特に前記粒状デンプンの初期糊化温度以下の温度において粒状デンプンを可溶性デンプンに加水分解することを含む。
本発明の方法に付すべき粒状デンプンスラリーは、20〜55%の乾燥固形分の粒状デンプン、好ましくは25〜40%の乾燥固形分の粒状デンプン、より好ましくは30〜35%の乾燥固形分の粒状デンプンを有することができる。
【００９７】
本発明の方法に付した後、粒状デンプンの乾燥固形分の少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%は可溶性デンプン加水分解物に転化される。
【００９８】
本発明によれば、この方法は初期糊化温度以下の温度において実施される。好ましくは、この方法を実施する温度は、30〜60℃、少なくとも30℃、少なくとも31℃、少なくとも32℃、少なくとも33℃、少なくとも34℃、少なくとも35℃、少なくとも36℃、少なくとも37℃、少なくとも38℃、少なくとも39℃、少なくとも40℃、少なくとも41℃、少なくとも42℃、少なくとも43℃、少なくとも44℃、少なくとも45℃、少なくとも46℃、少なくとも47℃、少なくとも48℃、少なくとも49℃、少なくとも50℃、少なくとも51℃、少なくとも52℃、少なくとも53℃、少なくとも54℃、少なくとも55℃、少なくとも56℃、少なくとも57℃、少なくとも58℃、少なくとも59℃、好ましくは少なくとも60℃である。
【００９９】
この方法を実施するpHは3.0〜7.0、好ましくは3.5〜6.0、より好ましくは4.0〜5.0の範囲である。
本発明の方法において処理すべき粒状デンプンは、特に塊茎、根、茎、莢、穀物または全穀粒から得ることができる。さらに詳しくは、粒状デンプンはトウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴ、カッサバ、タピオカ、モロコシ、イネ、エンドウ、ソラマメ・インゲン・ササゲの類、バナナまたはジャガイモから得ることができる。トウモロコシおよびオオムギの蝋質および非蝋質の両方のタイプが特別に考えられる。処理すべき粒状デンプンは、高度に精製されたデンプン品質、好ましくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%または少なくとも99.5%の純度であることができるか、あるいは非デンプン画分、例えば、胚芽残留物および繊維を含む微粉砕全穀粒を含んでなる材料を含有するいっそう粗製のデンプンであることができる。
【０１００】
原料、例えば、全穀粒を微粉砕して構造を開き、それ以上の処理を可能とする。2種類の微粉砕プロセスは本発明において好ましい: 乾式微粉砕および湿式微粉砕。乾式微粉砕において、全仁を微粉砕し、使用する。湿式微粉砕において、胚芽と粉末 (デンプン粒体およびタンパク質) は良好に分離され、デンプン加水分解物をシロップの製造に使用する位置に適用され、ここでわずかの例外が存在する。乾式微粉砕および湿式微粉砕の両方はデンプン処理の分野においてよく知られており、そして本発明の方法のために等しく考えられる。
【０１０１】
発酵生成物
最後の面において、本発明は、発酵生成物、特にエタノールを製造する方法におけるグルコアミラーゼ活性を有するハイブリッド酵素の使用に関する。この方法は、発酵生物の存在下に水性媒質中で本発明のハイブリッド酵素に粒状デンプンを暴露することを含む。α-アミラーゼは、任意のα-アミラーゼ、好ましくは前述のα-アミラーゼであることができる。酸性真菌α-アミラーゼ、特にアスペルギルス (Aspergillus) 由来のα-アミラーゼは好ましい。
【０１０２】
好ましい発酵生物は酵母である。好ましくは、この方法はα-アミラーゼおよび本発明のハイブリッド酵素を使用する粒状デンプンスラリーの加水分解と同時に酵母を使用する発酵を実施することを含む。発酵は30℃〜35℃、より好ましくは31℃〜34℃の温度において加水分解と同時に実施する。
【０１０３】
「発酵生物」は、所望の発酵プロセスにおいて使用するために適当な微生物を意味する。本発明による適当な発酵生物は、糖、例えば、グルコースおよび/またはマルトースを、直接的または間接的に、所望の発酵生成物に発酵、すなわち、転化することができる。発酵生物の例は、真菌生物、例えば、酵母を包含する。好ましい酵母は、サッカロマイセス (Saccharomyces) の種の株、特にサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) を包含する。商業的に入手可能な酵母は、例えば、下記を包含する: RED STAR (商標) /Lesaffre Ethanol Red (Red Star/Lesaffre、米国から入手可能である)、FALI (Pleischmann’s Yeast、a division of Burns Philp Food Inc. 米国から入手可能である)、SUPERSTART (Alltechから入手可能である)、GERT STRAND (Gert Strand AB、スウェーデン国から入手可能である) およびFERMIOL (DSM Specialtiesから入手可能である)。
【０１０４】
本発明のハイブリッドの使用
最後の面において、本発明は、発酵生成物、例えば、特にエタノール、またはシロップ、好ましくはグルコースまたはマルトースを製造するための本発明のハイブリッド酵素の使用に関する。
【０１０５】
本明細書に記載しかつ特許請求した本発明の範囲は、本明細書に開示する特定の態様に限定されるべきでない。なぜなら、これらの態様は本発明のいくつかの面の例示を意図しているからである。事実、本明細書に示しかつ記載したものに加えて、本発明の種々の変更は、以上の説明から、当業者にとって明らかとなるであろう。このような変更は添付された特許請求の範囲に入ることを意図する。矛盾する場合、定義を含む本発明の開示はコントロールするであろう。
種々の参考文献および配列リストは本明細書中に引用され、それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１０６】
材料および方法
酵母:
RED STAR (商標) /Lesaffre Ethanol Red (Red Star/Lesaffre、米国から入手可能である)。
【０１０７】
酸安定性α-アミラーゼ活性
本発明に従いを使用するとき、酸安定性α−アミラーゼの活性は、酵素標準に関して決定されるAFAU (酸性真菌α-アミラーゼ単位) で測定することができる。1 FAUは後述する標準条件下に1時間当たり5.260 mgのデンプン乾燥固体を分解する酵素の量として定義される。
【０１０８】
酸安定性α−アミラーゼ、エンド-α-アミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルカノ-ヒドロラーゼ、EC 3.2.1.1) は、デンプン分子の内側領域中のα-1,4 グリコシド結合を加水分解して、異なる鎖長をもつデキストリンおよびオリゴ糖を形成する。ヨウ素で生成される色強度はデンプン濃度に対して直接比例する。アミラーゼ活性は、特定した分析条件下におけるデンプン濃度の減少として、逆比色分析を使用して決定される。
【０１０９】
【化１】
2007509630.tif 000004
【０１１０】
【表２】
2007509630.tif 000005
【０１１１】
この分析法をいっそう詳しく記載するフォルダーEB-SM-0259.02/01は、ノボザイムA/S (デンマーク国) に対する要求に応じて入手可能であり、引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１１２】
グルコアミラーゼ活性
グルコアミラーゼ活性はアミログリコシダーゼ単位 (AGU) で測定することができる。AGUは標準条件: 37℃、pH 4.3、基質: マルトース 23.2 mM、緩衝剤: 酢酸塩 0.1 M、反応時間: 5分において、1分当たり1 μMのマルトースを加水分解する酵素の量として定義される。
【０１１３】
自動分析装置を使用することができる。存在するα-D-グルコースがβ-D-グルコースに転化されるように、ムタロターゼをグルコースデヒドロゲナーゼ試薬に添加する。グルコースデヒドロゲナーゼは前述の反応においてβ-D-グルコースと特異的に反応してNADHを生成し、これは340 nmにおいて測光計を使用してもとのグルコース濃度の測度として測定される。
【０１１４】
【表３】
2007509630.tif 000006
【０１１５】
この分析法をいっそう詳しく記載するフォルダー(EB-SM-0131.02/01) は、ノボザイムA/S (デンマーク国) に対する要求に応じて入手可能であり、引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１１６】
DNAの操作
特記しない限り、DNAの操作および形質転換は、下記の文献に記載されている分子生物学の標準的方法を使用して実施した: Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー; Ausubel F. M. 他 (編者) “Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley ＆ Sons、1995; Harwood C. R. およびCutting S. M. (編者) 。
【実施例】
【０１１７】
実施例１．グルコアミラーゼ触媒ドメイン-デンプン結合性ドメインのハイブリッドの構築および発現
18の異なるAMGハイブリッド (表4) を発現するプラスミドを、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) (AN)、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) (TE) およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) (AR) からのグルコアミラーゼの触媒ドメイン (CD) およびデンプン結合性ドメイン (SBD) の間で構築した。プラスミドを組換えタンパク質の発現のためにサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) の中に形質転換するか、あるいは構築されたグルコアミラーゼハイブリッドを引き続いてアスペルギルス・ニガー (A. niger) におけるハイブリッドタンパク質の発現のためにアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 発現ベクター中に再クローニングした。
【０１１８】
【表４】
2007509630.tif 000007
【０１１９】
実験手順
細菌および真菌の株およびプラスミド
大腸菌 (E. coli) DH10B (mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 deoR recA1endA1 araD139 (ara、leu) 7697 galU galK、rpsL nupG)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) INVSc1 (MATa、his3D1、leu2、trp1-289、ura3-52) および大腸菌 (E. coli) 酵母プラスミドのシャトルベクターpYES2をインビトロジェン・インコーポレーテッド (Invitrogen Inc. カリフォルニア州サンディエゴ) から購入した。
【０１２０】
DNA構築
DNA操作を本質的に下記の文献に記載されているようにして実施した: Sambrook 他、(1989) Maniatis T. 1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New YorkおよびDan Burke、Dean Dawson、Tim Stearns (2000) Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory。制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼをニュー・イングランド・バイオラブス (New England Biolabs) から購入した。Pwo DNAポリメラーゼ (Boehringer Mannheim) を本質的に供給会社が規定しているようにして使用した。
【０１２１】
SOE PCR反応のために、ほぼ100 ngの各必要なPCRフラグメントをゲル精製し、一緒に混合し、プライマーを添加しないでPCRの25サイクルに付した。反応物をアガロースゲル電気泳動により分離し、期待したサイズで移動するDNAバンドをゲルから切断し、スピンカラムで精製し、フランキングプライマーを使用する新しいPCR反応において鋳型として使用した。
【０１２２】
プラスミドpSteD226を2工程において構築した: まず、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼのコーディング配列 (配列番号80) をHindIII-XbaIフラグメントとしてpYES2中にクローニングしてpSteD212をつくった。その後、ガラクトース誘導可能なプロモーターを含有するpSteD212のAgeI-HindIIIフラグメントを構成的TPIプロモーターを含有するAgeI-HindIIIフラグメント (AlberおよびKawasaki (1982) Nucleotide sequence of the triose phosphate isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Appl. Gent. 1: 419-434) と置換してpSteD226をつくった。
【０１２３】
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼのG1形態のコーディング配列 (配列番号81) を酵母/大腸菌 (E. coli) シャトルベクターpMT742中にEcoRI-HindIIIフラグメントとしてクローニングすることによって、プラスミドpLac102を構築した。CDおよびSBDの増幅のために、下記のDNA鋳型を使用した: アスペルギルス・ニガー (A. niger) G1グルコアミラーゼのG1形態をコードするcDNAを担持するプラスミドpLAc102; タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼのG1形態をコードするcDNAを担持するプラスミドpSteD226; アテリア・ロルフシイ (A. rolfsii) グルコアミラーゼのG1形態を含有するアテリア・ロルフシイ (A. rolfsii) から合成したcDNA。
【０１２４】
CDおよびSBDのPCR生成物を増幅するために使用したオリゴを、それぞれ表2および表3に列挙する。SOE PCR生成物をゲル電気泳動およびクイアゲン (Qiagen) スピンカラムにより精製し、HindIII/XbaIで消化し、HindIII/XbaIで切断し、ゲル精製したpSteD226中に結合した。結合後、一夜の反応物をDH10B中にエレクトロポレートし、100 μg/mlのアンピシリン (Sigma) を補充したLB寒天平板上にプレートした。形質転換体をプレート精製し、配列決定のためにプラスミドを抽出した。全クローニングしたHindIII-XbaIフラグメントの完全性を制限分析およびDNA配列決定により確認した。次いで選択したプラスミドをコンピテント酵母InvScI中に形質転換し、選択培地上にプレートした。酵母の形質転換体を単一コロニーに精製し、アリコートを-80℃において15%のグリセロール中で貯蔵した。
【０１２５】
【表５】
2007509630.tif 000008
【０１２６】
【表６】
2007509630.tif 000009
【０１２７】
【表７】
2007509630.tif 000010
【０１２８】
SOE (オーバーラップエクステンションによるスプライシング) PCRによる触媒ドメインおよびデンプン結合性ドメインの融合
実験手順に記載されているようなSOE PCRを使用して、必要なCD-SBD融合物を発生させた。SOE反応において使用したPCR生成物の組合わせおよび生ずるSOEハイブリッドを表8に列挙する。
【０１２９】
【表８】
2007509630.tif 000011
【０１３０】
実施例２．「1工程」燃料エタノール発酵におけるグルコアミラーゼ-SBMハイブリッドの評価
最小規模発酵により、純粋なタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼに対するグルコアミラーゼ-SBMハイブリッド (TEAN-1、TEAN-3) の相対的性能を評価した。約380 gの粉砕トウモロコシ (1.65 mmの篩に通してパイロット規模のハンマーミル中で粉砕した) を約620 gの水道水に添加した。この混合物に3 mLの1 g/Lのペニシリンを補充した。このスラリーのpHを40% H2SO4で5.0に調節した。三重反復実験において、乾燥固形分 (DS) レベルは32%であると測定された。ほぼ5 gのこのスラリーを15 mLの管に添加した。この研究において使用した酵素を下に詳述する:
【０１３１】
【表９】
2007509630.tif 000012
【０１３２】
4投与量の投与量-応答実験を各酵素を使用して実施した。使用した投与量は0.1、0.3、0.6および1.0 AGU/g DSであった。6回の二重反復実験を実施した。
投与後、トウモロコシマッシュで22.5時間増殖させた酵母増殖物 (Red StarTM酵母) の0.04 mL/gのマッシュを管に接種した。小さい針で打抜きして気体の解放を可能としたキャップで管にふたをし、短時間攪拌した後、秤量し、32℃においてインキュベートした。経時的に管を秤量することによって、発酵の進行を追跡した。管を短時間攪拌した後、秤量した。発酵をほぼ200時間続けた。実験結果を図1に示す。
【０１３３】
図1から、2つのハイブリッドTEAN-1およびTEAN-3は、野生型タラロマイセス・エメルソニイ (T. emersonii) グルコアミラーゼよりも有意に高いエタノール収量/g DSを与えたことを理解することができる。
【０１３４】
実施例３．「1工程」燃料エタノール発酵におけるグルコアミラーゼ-SBMハイブリッドの評価
最小規模発酵により、純粋なタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼに対するグルコアミラーゼ-SBMハイブリッド (TEAR-1、TEAR-2) の相対的性能を評価した。約380 gの粉砕トウモロコシ (1.65 mmの篩に通してパイロット規模のハンマーミル中で粉砕した) を約620 gの水道水に添加した。この混合物に3 mLの1 g/Lのペニシリンを補充した。このスラリーのpHを40% H2SO4で5.0に調節した。三重反復実験において、乾燥固形分 (DS) レベルは32%であると測定された。ほぼ5 gのこのスラリーを15 mLの管に添加した。
【０１３５】
0.3  AGU/g DSの各酵素を使用して投与量-応答実験を実施した。投与後、トウモロコシマッシュで22.5時間増殖させた酵母増殖物 (Red STARTM酵母) の0.04 mL/gのマッシュを管に接種した。小さい針で打抜きして気体の解放を可能としたキャップで管にふたをし、短時間攪拌した後、秤量し、32℃においてインキュベートした。経時的に管を秤量することによって、発酵の進行を追跡した。管を短時間攪拌した後、秤量した。発酵をほぼ70時間続けた。実験結果を下記表10に示す:
【０１３６】
【表１０】
2007509630.tif 000013
【０１３７】
表10から、2つのハイブリッドTEAR-1およびTEAR-2は、野生型タラロマイセス・エメルソニイ (T. emersonii) グルコアミラーゼよりも有意に相対活性を有することを理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図1は、タラロマイセス・エメルソニイ (T. emersonii) 触媒ドメインおよびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) SBMを含んでなる2つのSBM (デンプン結合性モジュール) ハイブリッド (TEAN-1およびTEAN-3) の1 g DS当たりのエタノール収率を野生型タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼと比較して示す。
【図１】
2007509630.tif 000014
【配列表】
2007509630000001.app
【国際調査報告】
2007509630.tif 000015
2007509630.tif 000016