(57)【要約】  本発明は、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患の原因となる、１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡによって同定された新規の細菌分離株、および、このような細菌を含むワクチンに関する。また、歯周疾患の治療および予防方法、ならびに、歯周疾患を検出し治療するためのキット、歯周疾患を検出し予防するためのキットも提供される。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも９５％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含み、直接的に、または、その他の病原性物質と組み合わされてコンパニオンアニマルにおける歯周疾患を引き起こす、少なくとも１種の単離された色素生産性嫌気性細菌。
【請求項２】
配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも９９％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも９９.５％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
バクテロイデス・デンティカノリスである、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１の同定された特徴の全てを有する細菌である、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
ポルフィロモナス・レビである、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８２、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８２の同定された特徴の全てを有する細菌である、請求項７に記載の細菌。
【請求項９】
タンネレラ・フォーサイセンシスである、請求項１に記載の細菌。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６０６３、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６０６３の同定された特徴の全てを有する細菌である、請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】
コンパニオンアニマルは、ネコまたはイヌである、請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の色素生産性嫌気性細菌を含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
色素生産性嫌気性細菌は、不活性化されている、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
製薬上許容できる担体をさらに含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
免疫学的に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細菌、および、製薬上許容できる担体を含む、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を治療または予防するためのワクチン。
【請求項１６】
細菌は、不活性化されている、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載のワクチン組成物を、歯周疾患の治療または予防が必要なコンパニオンアニマルに投与することを含む、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患の治療または予防方法。
【請求項１９】
サンプルにおける、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の１種またはそれ以上の色素生産性嫌気性細菌の存在が、病気の指標である、コンパニオンアニマルの口腔からのサンプルを解析することによるコンパニオンアニマルにおける歯周疾患の診断方法。
【請求項２０】
サンプルにおける、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも約９５％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドの存在が、病気の指標である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルにおける、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも約９９％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドの存在が、病気の指標である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サンプルにおける、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも約９９.５％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドの存在が、病気の指標である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
サンプルにおける、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３からなる群より選択される１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドの存在が、病気の指標である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
解析工程は、サンプルを、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、および、抗体検出からなる群より選択される方法を用いて解析することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのコンテナーに、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の、生きた、または不活性化された、単離された色素生産性嫌気性細菌の少なくとも１種の有効量、および、製薬上許容できる担体を含むコンパニオンアニマルにおける歯周疾患を治療および予防するための組成物を含み、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患の治療または予防に有用なキットであることを示す説明書一式をさらに含む、キット。
【請求項２６】
組成物を分注するための手段をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
少なくとも１つのコンテナーに、高度にストリンジェントな条件下で配列番号３、４、５、６、９、１０および１３に記載のヌクレオチド配列のいずれかの相補物にハイブリダイズする、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３のいずれかから選択される少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子を含み、第二のコンテナーに、高度にストリンジェントな条件下で配列番号３、４、５、６、９、１０および１３に記載のヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズする、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３に記載のヌクレオチド配列のいずれかの相補物から選択される少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第二の単離されたＤＮＡ分子を含み、さらに、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、または、タンネレラ属の検出に有用なキットであることを示す説明書一式を含むキット。
【請求項２８】
少なくとも１つのコンテナーに、配列番号３、４、５、６、９、１０および１３のいずれかから選択される少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子、またはその相補物を含み、該ハイブリダイゼーションは、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、または、タンネレラ属に特異的であり、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、または、タンネレラ属の検出に有用なキットであることを示す説明書一式をさらに含む、ハイブリダイゼーションキット。
【請求項２９】
ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件下で行われる、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
細菌は、配列番号３、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも約９９％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含む、生物学的に純粋な細菌培養物。
【請求項３１】
１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列は、配列番号３、６、９、１０および１３からなる群より選択される配列に少なくとも約９９.５％相同である、請求項３０に記載の生物学的に純粋な細菌培養物。
【請求項３２】
１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列は、配列番号３、６、９、１０および１３からなる群より選択される、請求項３０に記載の生物学的に純粋な細菌培養物。
【請求項３３】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１の同定された特徴の全てを有する培養物である、生物学的に純粋な細菌培養物。
【請求項３４】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８２、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８２の同定された特徴の全てを有する培養物である、生物学的に純粋な細菌培養物。
【請求項３５】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６０６３、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６０６３の同定された特徴の全てを有する培養物である、生物学的に純粋な細菌培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患の原因となる１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡによって同定された新規の細菌分離株、それらに含まれるポリヌクレオチド配列、このようなポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド、および、不活性化または弱毒化された上記細菌分離株、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むワクチンに関する。また、歯周疾患の治療および予防方法、ならびに、歯周疾患を検出し、治療し、予防するためのキットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
歯周疾患は、歯の支持組織に関する一連の感染で構成される。その重症度のレベルは、歯肉（歯茎）の軽度の可逆性炎症から、歯周組織（歯肉、歯根膜および歯槽骨）の慢性的な破壊（結果的に歯の脱落を伴う）に至る。歯周疾患に関する実験データの大半は、ヒト、または、ヒトから単離された細菌の研究に基づいている。それに対して、ヒト以外の動物、例えばコンパニオンアニマル、特にイヌおよびネコにおける歯周疾患に関してわかっていることはほとんどない。
【０００３】
微生物学的な観点からみれば、この病気の数々の特徴は興味深いものである。細菌的な原因論は、ヒトにおける病気発症と進行に関与する多種多様な生物と複雑に関連している。全てとは言えないがこれらの生物の多くは、歯周に関して健康な個体にも存在し得るもので、片利共生的に宿主と調和して存在する可能性がある。ヒトにおいて、歯および歯肉縁下の領域にうまく定住した生物は、これらの領域に生息する多くの（６００種を超える）その他の細菌種と共存していなければならないことがわかっている。
【０００４】
歯と歯肉の上皮細胞の石灰化した硬組織はいずれも、定着に利用可能である。これらの組織は、宿主の唾液分泌物や歯肉の歯肉溝滲出液（血清滲出液）に晒され、これらはいずれも細菌と直接相互作用し、優勢な環境条件を改変する分子を含む。局所的な環境は、歯肉縁上の歯表面と歯肉縁下の隙間（これは、歯根と歯肉との間のチャンネルであり、病気が進行するにつれて深くなり歯周ポケットになる）にある構成している微生物叢に様々な特有の制約を課する。ヒトにおける歯周疾患の病因の研究は、微環境の生態学的な複雑のために複雑化している。しかしながら、病気の発症は、例えば所定の生物の絶対数または相対数における変化、発病させる可能性の変化、または、特定の宿主の因子の変調の結果として、細菌と宿主の因子との生態学的均衡がシフトした結果として起こる可能性があると考えられる。
【０００５】
ヒトにおける歯周疾患の様々な兆候の分類は頻繁に変化しており、さらに、病気は、重症度、進行速度、および、影響を受けた歯の数に応じて変動し、乳歯の萌出の後に様々な年齢群において感染しやすくなることがいえる。病原性物質の性質は、これら病気そのものの間で、同様にヒト患者の間で変化し、さらに患者における異なる罹患部位の間でさえも変化する。しかしながら、一般的に、この病気の重度の形態は、多数のグラム陰性の嫌気性細菌に関連する。この群のなかでも、ヒトにおいて、ほとんどの証拠は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，以前はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に関する病因となる役割を指摘している。この生物は、単独で作用するか、または、その他の細菌との混合感染として作用するかのいずれかであり、場合によっては、宿主における有益種の非存在および所定の免疫応答と協調するが、この生物が存在することが病気の活性に必須のようである。
【０００６】
Ｐ．ジンジバリスのヒト口腔への最初の侵入は、感染した個体からの伝染によって起こると考えられる。従って、その他の媒介体もまた、作動する可能性があるようである。これらの研究によれば、定着部位または臨床状態に関係なく、個体は、単一の（または、少なくとも優勢の）遺伝子型でコロニー形成されることが示されている。それに対して、異なる個体に、多くの様々なクローン起源の株が存在する。これは、Ｐ．ジンジバリスは、実質的に、特定のクローンタイプに限定されない、毒性を有する日和見病原体であるという概念を裏付けるものである。
【０００７】
Ｐ．ジンジバリスに加えて、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）もまた、ヒトにおいて歯周炎に関連している。新規のバクテロイデス属、バクテロイデス・フォルシサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）が、嫌気的な歯周ポケットから最初に単離された（Ｔａｎｎｅｒ等，“Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍａｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ（１９７９年），６，２７８〜３０７）。近年、これは、様々な生化学的な基準に基づき、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ）と再分類された（Ｓａｋａｍｏｔｏ等，“Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ（Ｔａｎｎｅｒ等，１９８６年）  ａｓ  Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ  ｃｏｒｒｉｇ．，ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｃｏｍｂ．ｎｏｖ．”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２年），５２，８４１〜８４９）。
【０００８】
歯周疾患について、ヒトではかなりわかっているが、同じ病気でコンパニオンアニマルにおいてわかっていることは極めてわずかである。また、動物においてポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）も病気に関与するが、これらの分離株は、それらとヒトにおいてそれらに対応するものとを区別する特徴を有する（総論として、Ｈａｒｖｅｙ  ｉｎ  “Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．Ｅｔｉｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ”，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ−Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９９８年），２８，１１１１〜１１２８を参照）。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｄ．等は、動物におけるＰ．ジンジバリスのバイオタイプの、様々な動物宿主からの単離を説明している（“Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓ  ｇｕｌａｅ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ，Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ，Ｃｏｃｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｇｉｎｇｉｖａｌ  Ｓｕｌｃｕｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｓｔｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年），５１，１１７９〜１１８９）。この著者によれば、この生物（Ｐ．ｇｕｌａｅ）は、Ｐ．ジンジバリスとは別個のポルフィロモナス属の特徴を示すと仮定している。ＷＯ０３／０５４７５５では、イヌおよびネコ由来の新規のポルフィロモナス分離株、同様に、歯周疾患を治療および予防するための方法およびキットを説明している。
【０００９】
また、バクテロイデス種は、歯周疾患を有すると診断されたイヌにおいて歯肉縁下部位からも単離されている（Ｆｏｒｓｂｌｏｍ等，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ，Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ，Ｎｏｎｐｉｇｍｅｎｔｅｄ，Ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃ  Ｒｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｕｂｇｉｎｇｉｖａｌ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９７年），２５，Ｓ１００〜１０６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を治療および予防するための安全で有効なワクチンに関する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、直接的に、または、その他の病原性物質と組み合わされることのいずれかによって、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を引き起こす単離された色素生産性嫌気性細菌を提供する。
【００１２】
その他の実施形態において、本発明は、直接的に、または、その他の病原性物質と組み合わされることのいずれかによって、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を引き起こす単離された色素生産性嫌気性細菌を提供するものであって、ここにおいて、前記細菌は、コンパニオンアニマルなどの哺乳動物において歯周疾患を治療または予防するためのワクチンを製造するのに用いることができ、ここにおいて、前記ワクチンは、不活性化または弱毒化された少なくとも１種の細菌の免疫学的に有効な量を含む。
【００１３】
一実施形態において、本細菌はさらに、バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｅｎｔｉｃａｎｏｒｉｓ）、ポルフィロモナス・レビ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｌｅｖｉｉ）、および、タンネレラ・フォーサイセンシスからなる群より選択される。
【００１４】
好ましくは、本細菌は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群より選択される配列に少なくとも約９５％、９５.５％、９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％、９９.５％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群より選択されるヌクレオチド配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチド分子、および、それらに少なくとも約９５％、９５.５％、９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％、９９.５％の相同性を有する相同体を提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、以下で定義されるようなフラグメントおよび変異体を含む。
【００１６】
その他の形態において、本発明は、本発明に係る少なくとも１つの色素生産性嫌気性細菌、および、製薬上許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供する。本免疫原性組成物の細菌は、生きていてもよいし、または不活性化されていてもよい。場合により、本免疫原性組成物は、アジュバントを含んでいてもよい。
【００１７】
さらなる形態において、本発明は、コンパニオンアニマルなどの哺乳動物において歯周疾患を治療または予防するためのワクチンを提供するものであり、本ワクチンは、免疫学的に有効な量の本発明に係る少なくとも１つの色素生産性嫌気性細菌、および、製薬上許容できる担体を含む。本ワクチンの細菌は、生きていてもよいし、または不活性化されていてもよい。場合により、本ワクチンは、アジュバントを含んでいてもよい。
【００１８】
その他の形態において、本発明は、コンパニオンアニマルなどの哺乳動物において歯周疾患を治療または予防する方法を提供するものであり、本方法は、本発明に係るワクチン組成物を、それらが必要な哺乳動物に投与することを含む。
【００１９】
その他の形態において、本発明は、コンパニオンアニマルなどの哺乳動物において、本発明の細菌、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関してサンプルを解析することによって歯周疾患を診断するための方法を提供するものであり、ここにおいて、上記細菌、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの存在が、病気の指標である。好ましくは、この解析工程は、サンプルを、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、および、抗体検出からなる群より選択される方法を用いて解析することを含む。
【００２０】
さらにその他の形態において、本発明は、少なくとも１つのコンテナーに、コンパニオンアニマルなどの哺乳動物における歯周疾患を治療および予防するための組成物を含むキットを提供するものであり、ここにおいて、前記組成物は、少なくとも１つの不活性化または弱毒化された単離された色素生産性嫌気性細菌の有効量、または、前記色素生産性嫌気性細菌から誘導されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、および、製薬上許容できる担体を含む；本キットはさらに、哺乳動物において歯周疾患を治療または予防するのに有用なキットであることを示す説明書一式を含む。本キットは、前記組成物を分注するための手段をさらに含んでいてもよい。
【００２１】
さらにその他の形態において、本発明は、少なくとも１つのコンテナーに、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に記載のヌクレオチド配列のいずれかの相補物に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のいずれか一つから選択される少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子を含み、第二のコンテナーに、高度にストリンジェントな条件下で配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に記載のヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズする配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に記載のヌクレオチド配列のいずれかの相補物から選択される少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第二の単離されたＤＮＡ分子を含むキットを提供するものであり、本キットはさらに、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属およびタンネレラ属（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ）の検出に有用なキットであることを示す説明書一式を含む。このような方法は、一般的に、コンパニオンアニマルなどの全ての哺乳動物に用いることができる。
【００２２】
さらなる形態において、本発明は、少なくとも１つのコンテナーに、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のいずれか一つから選択される少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子、またはその相補物を含むハイブリダイゼーションキットを提供するものであり、ここにおいて、上記ハイブリダイゼーションは、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属に特異的であり、本キットはさらに、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属の検出に有用なキットであることを示す説明書一式を含む。好ましくは、上記ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件下で行われる。
【００２３】
本発明はさらに、生物学的に純粋な細菌培養物を提供するものであり、ここにおいて、前記細菌は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群より選択される配列に少なくとも約９５％、９５.５％、９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％、９９.５％相同な１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列を含む。
【００２４】
本発明はまた、生物学的に純粋な細菌培養物を提供するものであり、ここにおいて、前記培養物は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１の同定された特徴の全てを有する培養物である。本発明はまた、生物学的に純粋な細菌培養物を提供するものであり、ここにおいて、前記培養物は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８２、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８２の同定された特徴の全てを有する培養物である。本発明は、生物学的に純粋な細菌培養物を提供するものであり、ここにおいて、前記培養物は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６０６３、または、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６０６３の同定された特徴の全てを有する培養物である。
【００２５】
本発明はまた、コンパニオンアニマルなどの哺乳動物において歯周疾患を治療または予防するためのワクチンとしての有用性を有する本発明の細菌から誘導された、単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドも含む。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１．イヌおよびネコのＢＰＡＢ分離株の特徴付け、
図２．Ｂ．デンティカノリスＢ７８T、同様に、６種のコントロール細菌に関するＲａｐＩＤ  ＡＮＡ  ＩＩ試験の結果である。
図３．バクテロイデス網からの代表種に関する、近隣結合法による系統樹である。この系統樹は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘバージョン１．８１と、ＮＪプロットソフトウェアプログラム（いずれも、ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/より入手可能）を用いて作製された。この系統樹は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（登録番号Ｊ０１６９５）（データ示さず）を起源とした。ブートストラップ解析を１０００の複製を用いて行った。ブートストラップ値は、記号によって示される（●、＞９５０；■、＞８５０；○、＞７００；□、＞５００；記号なし、＜５００）。目盛りのバーは、ヌクレオチド位置あたり０.０１の置換を示す。矢印は、Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tの位置を示す。登録番号：Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７、Ｊ０１６９５；Ｐ．ｇｕｌａｅ  Ｂ２４３，ＡＦ２８５８７４；Ｐ．ｃａｎｓｕｌｃｉ  ＶＰＢ４８７５，Ｘ７６２６０；Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ  ＮＣＴＣ１１６３２，Ｌ２６１０３；Ｐ．ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３５４０６，ＡＹ２５３７２８；Ｔ．フォーサイセンシスＡＴＣＣ４３０３７，ＡＢ０３５４６０；バクテロイデスｃｆ．フォルシサスの口腔のクローンＢＵ４５，ＡＦ３８５５６５；Ｂ．ｍｅｒｄａｅ  ＡＴＣＣ４３１８４Ｔ，Ｘ８３９５４；Ｂ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＡＴＣＣ８５０３，Ｍ８６６９５；ウマの糞の細菌（Ｅｑｕｉｎｅ  ｆｅｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１１８ｄｓ１０，ＡＹ２１２５６９；Ｄ．ｓｈａｈｉｉ  ＣＣＵＧ  ４３４５７株，ＡＪ３１９８６７；Ａ．ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ２９８００，Ｌ１６４９７；Ｒ．ｍｉｃｒｏｆｕｓｕｓ  ＡＴＣＣ２９７２８，Ｌ１６４９８；ブタの糞の細菌（Ｓｗｉｎｅ  ｆｅｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＦＰＣ１１１，ＡＦ４４５２０５；バクテロイデス属１３９，ＡＦ３１９７７８；Ｂ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２５２８５Ｔ，Ｘ８３９３５；Ｂ．テタイオタオミクロン１７．４，ＡＹ３１９３９２株；Ｂ．ａｃｉｄｏｆａｃｉｅｎｓ  Ａ３７，ＡＢ０２１１６３株；Ｂ．デンティカノリスＢ７８T，ＡＹ５４９４３１；バクテロイデス属０１０３−８００，ＡＪ４１６９０６；培養されていないＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  Ｂｉｓｉｉ  ２７，ＵＢＡ３１８１７９；Ｐ．ｂｉｖｉａ  ＡＴＣＣ２９３０３．Ｌ１６４７５；Ｐ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ２５２６１，Ｌ１６４７９；Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ２５６１１，Ｌ１６４６８；Ｐ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ３５３０８，Ｌ１６４６７；および、Ｐ．ｂｕｃｃａｅ  ＡＴＣＣ３３６９０，Ｌ１６４７８。
【００２７】
図４．Ｂ．デンティカノリスの臨床分離株に関する近隣結合法による系統樹である。この系統樹は、図１と同様にして作成された。この系統樹は、バクテロイデス属０１０３−８００の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（登録番号ＡＪ４１６９０６）を起源とした。目盛りのバーは、ヌクレオチド位置あたり０.００１の置換を示す。それぞれの１６ＳｒＲＮＡ配列クラスターから、構成要素を１つだけ示す。登録番号：Ｂ．デンティカノリスＢ７８T、ＡＹ５４９４３１；Ｂ．デンティカノリスＢ８０、ＡＹ５４９４３２；Ｂ．デンティカノリスＢ８３、ＡＹ５４９４３３；Ｂ．デンティカノリスＢ２４１、ＡＹ５４９４３４；Ｂ．デンティカノリスＢ２４２、ＡＹ５４９４３５；Ｂ．デンティカノリスＢ３４２、ＡＹ５４９４３６；Ｂ．デンティカノリスＢ４５８、ＡＹ５４９４３７；Ｂ．デンティカノリスＢ４７３、ＡＹ５４９４３８；Ｂ．デンティカノリスＢ４７４、ＡＹ５４９４３９；および、Ｂ．デンティカノリスＢ４７６、ＡＹ５４９４４０。
図５．歯周疾患の口腔のマウスモデルにおける、Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tの病原性試験である。それぞれの試験群に１６匹のマウスを用いた。マウスを説明通りに処理した。開始後４２日にマウスを殺し、顎の肉を取り、染色した。それぞれの顎に対して、１４回の独立したＣＥＪ−ＡＢＣ距離の測定を行った。それぞれの群の平均ＣＥＪ−ＡＢＣ測定値を示す。それぞれの群の標準誤差を示す。２つの群の間の統計学的な有意性を示す。
【００２８】
配列表の簡単な説明
配列番号１  配列解析用プライマー、
配列番号２  配列解析用プライマー、
配列番号３  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ７８）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号４  ポルフィロモナス・レビ（Ｂ２２２）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号５  タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｂ３４３−２４）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号６  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ７８）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ（全長）、
配列番号７  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ８０）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号８  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ８３）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号９  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ２４１）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１０  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ２４２）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１１  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ３４２）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１２  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ４５８）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１３  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ４７３）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１４  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ４７４）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１５  バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ４７６）由来の１６ＳｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ、
配列番号１６  配列解析用プライマー、
配列番号１７  配列解析用プライマー。
【００２９】
発明の詳細な説明
細菌の分離株
本発明は、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患および様々なその他の病気、ならびに臨床的な兆候の原因となり得る、１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列によって同定された単離された嫌気性細菌を提供する。より具体的には、本細菌は、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属から選択される。
【００３０】
さらに本発明は、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を引き起こす新規の嫌気性細菌を提供する。この新規の分離株は、実験用の歯周疾患のマウスモデルにおいて、歯槽骨の減少を誘導する。この細菌の分離株の細胞形態学的および生化学的な特性によれば、これはバクテロイデス属の一員であることが示される。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の比較によれば、本細菌は、生化学、分子レベルの系統発生学、および、病原性の証拠に基づき、バクテロイデス属のなかでこれまで定義されていない種であることを示すことが示唆されており、我々はこれを、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｅｎｔｉｃａｎｏｒｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖと命名した。バクテロイデス・デンティカノリスの標準株は、Ｂ７８T株（＝ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１）である。従って、好ましくは、本発明の単離された細菌としては、バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ７８）、ポルフィロモナス・レビ（Ｂ２２２）、および、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｂ３４３−２４）が挙げられるが、その他の種または株も本発明に包含される。好ましい実施形態において、本発明の単離された細菌は、それらの１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列（配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示される）によって同定することができる。
【００３１】
本発明の細菌で感染させることによって引き起こされる病気としては、これらに限定されないが、コンパニオンアニマルの歯周疾患、コンパニオンアニマル  口の悪臭（口臭）、ウシの足腐敗症、イヌの冠動脈心疾患、および、イヌの全身感染が挙げられる。また、これらの属に含まれる細菌は、冠動脈心疾患、耳下腺炎、口の悪臭、歯肉炎、歯周炎、卒中、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、細菌性膣炎、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、および、低い出生時体重の乳児の早期産発生率の上昇などの様々なヒトの病気にも関連している。
【００３２】
本発明は、細菌種の単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はまた、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のいずれかに、少なくとも約９０％の相同性、好ましくは少なくとも約９５％、９５.５％、９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を提供する。
【００３３】
加えて、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示されるポリヌクレオチド配列のいずれかの相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００３４】
その他の具体的な実施形態において、高いストリンジェンシー条件化で、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示されたポリヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの相補物にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。一例として、ただしこれらに限定されないが、このような、９０個を超えるヌクレオチドからなるハイブリダイゼーション領域のための高いストリンジェンシー条件を用いる手法は以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、８時間〜一晩、６５℃で、６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％フィコール、０.０２％ＢＳＡ、および、５００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で行う。フィルターを、４８時間、６５℃で、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、および、５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐで標識したプローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で、ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、３７℃で１時間、２×ＳＳＣ、０.０１％ＰＶＰ、０.０１％フィコール、および、０.０１％ＢＳＡを含む溶液中で行う。それに続き、オートラジオグラフィの前に、０.１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄を行う。
【００３５】
使用可能なその他の高いストリンジェンシー条件は、核酸の性質（例えば長さ、ＧＣ含量など）や、ハイブリダイゼーションの目的（検出、増幅など）に応じて決まり、当業界周知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、約１５〜４０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補配列へのストリンジェントなハイブリダイゼーションは、以下の条件下、すなわち塩濃度は５０ｍＭのＫＣｌ、緩衝液濃度は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、Ｍｇ2+濃度は１.５ｍＭ、ｐＨ７〜７.５、および、アニーリング温度は５５〜６０℃で行われる。
【００３６】
好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は以下の通りである。それぞれのメンブレンを、２回洗浄し（それぞれ３０分間、それぞれ４５℃で、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.２、５％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.５％ウシ血清アルブミン中で）、続いて、４回洗浄する（それぞれ３０分間、リン酸ナトリウム、ｐＨ７.２、１％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で）。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションのためには、メンブレンをさらに、４回の洗浄（それぞれ３０分間、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.２、１％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、５５℃で）、続いて４回の洗浄（それぞれ３０分間、リン酸ナトリウム、ｐＨ７.２、１％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、６５℃）で処理する。
【００３７】
本発明はさらに、コンパニオンアニマルに治療有効量で投与すると、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患の治療または予防（すなわち、それに対して耐性を付与すること）に有用なワクチンおよびワクチン製剤を提供する。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１種の弱毒化した（弱毒化された生の）、または、不活性化された細胞全体の調製物（バクテリン）を含むワクチンを提供する。その他の実施形態において、本ワクチンは、免疫反応を誘発させることができる１種またはそれ以上の細菌種由来のサブユニット分画を含む。
【００３９】
弱毒化した（弱毒化された生の）、または、不活性化されたワクチン（バクテリン）は、その他の既知のワクチン製剤の成分（例えば適合するアジュバント、 希釈剤、または担体）と組み合わせて存在していてもよい。
【００４０】
定義および略語
ヌクレオチド配列に関する用語「同一性」または「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上で２つの最適に並べられた配列を比較することによって決定されるが、ここで、最適なアライメントによって最も高い並びの適合が得られ、さらに、試験配列または参照配列へヌクレオチド付加が導入されていてもよい。同一性のパーセンテージは、全配列にわたり、各位置での試験配列と参照配列との間で同一なヌクレオチドのパーセンテージを計算することによって決定される。最適な配列アライメントと同一性のパーセンテージは、手動で決定してもよいし、または、より好ましくは、コンピューターアルゴリズム（例えば、ただしこれらに限定されないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、および、ＣＬＵＳＴＡＬＷなど）によって決定してもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３〜１０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４〜８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９９４年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２２）：４６７３〜８０；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等，１９８４年，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５；Ｈｉｇｇｉｎｓ等，１９９６年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３〜４０２）。好ましくは、一連のＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）をデフォルトパラメーターで用いて、相同配列に関する複数のデータベースを検索することである。
【００４１】
用語「異種」は、本明細書で用いられる場合、異なる細菌種または株から誘導されていることを意味する。
用語「相同性」、「相同な」等は、本明細書で用いられる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性の程度を意味する。
用語「相同な」は、細菌種に関して用いられる場合、同じ細菌種または株を意味する。
用語「単離された」は、本明細書で用いられる場合、天然に存在する環境から分離されて、単独であるか、または、異種宿主細胞、または染色体もしくはベクター（例えばプラスミド、ファージなど）中に存在するかのいずれかを意味する。
【００４２】
用語「単離された嫌気性細菌」、「単離された細菌」、「単離された菌株」等は、例えば天然に存在する環境から本細菌を分離した場合に、培養物中において、本細菌にその他の微生物が実質的に含まれていない組成物を意味する。用語「生物学的に純粋な培養物」は、本発明の細菌に適用される場合、その他の微生物を実質的に含まない細菌培養物を意味する。
用語「単離されたポリヌクレオチド」は、単離されたヌクレオチドが、組成物の質量の少なくとも５０％含まれる組成物を示す。より好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、組成物の質量の約９５％、最も好ましくは９９％含まれる。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「機能的に同等な」は、内因性細菌由来の天然型のタンパク質の免疫応答と実質的に類似した免疫応答を惹起することが可能な、またはそれらを引き起こすことが可能な、コンパニオンアニマルにおいて歯周疾患を引き起こす細菌によって生産された天然型ポリペプチドまたは組換えポリペプチドに特異的な抗体によって認識することができる組換えポリペプチドを意味する。従って、機能的に同等なポリペプチドに対して生じる抗体もまた、コンパニオンアニマルにおいて歯周疾患を引き起こす細菌によって生産された天然型のポリペプチドを認識する。
【００４４】
用語「免疫原性」は、タンパク質またはポリペプチドが、コンパニオンアニマルにおいて歯周疾患を引き起こす細菌に対して特異的に向けられた免疫反応を惹起する能力を意味する。
用語「抗原性」は、タンパク質またはポリペプチドが、そのタンパク質またはポリペプチドに対して生じた抗体と免疫特異的に結合する能力を意味する。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原に結合することができる免疫グロブリン分子を意味する。抗体は、ポリクローナル混合物でもよいし、またはモノクローナルでもよい。抗体は、天然源または組換え源から誘導された完全な免疫グロブリンでもよいし、または、完全な免疫グロブリンの免疫活性部分でもよい。抗体は、例えばＦｖ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2などの多種多様な形態で存在していてもよいし、同様に一本鎖で存在していてもよい。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「コンパニオンアニマル」は、ヒト以外の、ペットとみなされる飼育されるあらゆる動物を意味する。このような動物としては、ただしこれらに限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、サル、および、齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、および、フェレットが挙げられる。
【００４７】
本明細書でワクチンに関して用いられる用語「保護」、「〜を保護すること」等は、ワクチンが、そのワクチンで用いられる抗原が得られる生物によって引き起こされる病気の症状を予防する、または、減少させることを意味する。また、用語「保護」および「〜を保護すること」等は、本ワクチンは、被検体がすでに持っている病気、または、それらの病気の複数の症状のうちいずれかを「治療する」のに用いることができることも意味する。
【００４８】
用語「治療有効量」は、細菌またはサブユニット（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド配列）、および、それらの組み合わせの、それらが投与される被検体において免疫反応を惹起するのに十分な量を意味する。この免疫反応には、これらに限定されないが、細胞性および／または体液性免疫の誘導が含まれる。
【００４９】
用語「感染を予防すること」は、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患の原因となる細菌の複製を予防または阻害すること、本細菌の感染を阻害すること、または、本細菌がその宿主に定着することを予防すること、または、感染によって引き起こされる病気の症状を緩和することを意味する。このような処理は、細菌の蓄積に減少がみられる場合、治療的なものとみなされる。
【００５０】
用語「製薬上許容できる担体」は、活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、それらが投与される被検体にとって非毒性である担体媒体を意味する。
【００５１】
用語「治療剤」は、それによって引き起こされる細菌感染または病気または状態の治療を支援するあらゆる分子、化合物または治療剤を意味し、好ましくは抗菌剤である。
【００５２】
用語「それらのフラグメントまたは変異体」は、本発明に係る部分的なヌクレオチド配列を意味する。類似体は、用語「それらのフラグメントまたは変異体」に包含される。１またはそれ以上の突然変異（ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換）を有する可能性がある突然変異ポリヌクレオチドは、用語「それらのフラグメントまたは変異体」に包含される。対立遺伝子変異体は、用語「それらのフラグメントまたは変異体」に包含される。
【００５３】
細菌種の単離および特徴付け
本発明によって提供される細菌は、既知のサンプリング、培養および単離技術を用いて得ることができる。例えば、微生物のサンプルは、歯周疾患を示すイヌおよびネコのようなコンパニオンアニマルの個体群から得ることができる。歯周疾患の証拠は、既知の基準（例えば、歯周ポケットが＞３ｍｍのイヌ、および、歯周ポケットが＞２ｍｍのネコ）を用いて観察することができる。歯周疾患を特徴付けるための既知のパラメーター、例えば歯科的な指数（歯肉炎指数、および、歯周疾患指数）、および、歯周ポケットの深さは、コンパニオンアニマルのサンプル群に関して決定することができる。個々のサンプルは、嫌気性条件下で維持され、様々な既知の培地を用いて培養された特定の動物の歯周ポケットから得ることができる。
【００５４】
臨床分離株は、多数の生化学的試験、および、１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列解析のような既知の技術を用いて特徴付けされ、それらの属および種を決定することができる。個々の分離株をプレートに移し、抗生物質ディスク（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を寒天表面に置き、それぞれの分離株の抗生物質耐性パターンを決定することができる。また、精製したコロニーは、既知のインドールおよびカタラーゼ試験（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理することもできる。リパーゼおよびレシチナーゼ生産パターンは、個々の分離株に関して決定することができる。
【００５５】
上記分離株は、それらの１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列に基づきタイプ分けすることができる。うまく単離された個々のコロニーを、例えばプライマー  Ｄ００５６およびＤ００５７（配列番号１および配列番号２；表１）を用いた、１６ＳｒＲＮＡ領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のためのテンプレートとして利用することができる。場合により、全長１６ＳＲＮＡは、例えば、配列番号１６および１７として開示されたプライマーを用いて増幅することができる。
【００５６】
得られたＰＣＲ産物は、市販のＰＣＲ調整キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）；マディソン，ウィスコンシン州）を用いて精製し、単離することによってプールすることができる。次に、精製したＰＣＲ産物を脱塩し、ＤＮＡ配列解析で処理することができる。得られたＤＮＡ配列を用いて、利用可能なＤＮＡデータベースを検索することができる。次に、この細菌分離株は、データベース検索によって同定された最も近いマッチングに基づきタイプ分けすることができる。
【００５７】
【表１】
2007508837.tif 000003
【００５８】
以下のコンパニオンアニマルの歯根膜の分離株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，マナサス，バージニア州，２０１１０，米国に寄託した：バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ７８；（ＰＴＡ−５８８１））、ポルフィロモナス・レビ（Ｂ２２２；（ＰＴＡ−５８８２））、および、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｂ３４３−２４；（ＰＴＡ−６０６３））。
【００５９】
細菌のヌクレオチド配列のクローニング
本発明のヌクレオチド配列をクローニングするのに用いることができる数種の既知の方法または技術がある。例えば、この配列は、制限フラグメントとして単離し、クローニングおよび／または発現ベクターにクローニングすることができ、その配列をＰＣＲで増幅し、クローニングおよび／または発現ベクターにクローニングしてもよいし、または、その配列をこれらの２つの方法を併用してクローニングしてもよい。
【００６０】
当業界既知であり、非特異的に説明されている標準的な分子生物学的な技術は、一般的に、以下で説明されているようなものに従ってもよい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ），ボルチモア，メリーランド州（１９８９年）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８８年）；Ｗａｔｓｏｎ等，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ等（編）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，第１〜４号  コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，ニューヨーク（１９９８年）；および、米国特許第４,６６６,８２８号；４,６８３,２０２号；４,８０１,５３１号；５,１９２,６５９号、および、５,２７２,０５７号に記載の方法論。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一般的に、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）で説明されているようにして行われる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび配列解析するのに有用な方法の例は、実施例に示す。
【００６２】
抗体産生
抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、または組換えのいずれかが可能である。抗体は、免疫原またはそれらの部分に対してうまく製造することができ、または、クローニング技術を用いて組換えによって製造することもでき、または、天然の遺伝子産物および／またはそれらの部分は、単離されて、免疫原として用いることができる。免疫原を用いて、当業者周知の標準的な抗体産生技術によって、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州，１９８８年、および、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．），１９９２年で一般的に説明されているようにして、抗体を生産することができる。また、当業者既知の方法によって、抗体から、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ' ）2、および、Ｆｖなどの抗体フラグメントを製造することもできる。
【００６３】
抗体生産において、望ましい抗体のスクリーニングは、当業界既知の免疫学において標準的な方法で達成することができる。非特異的に説明されている技術は、一般的に、Ｓｔｉｔｅｓ等（編），Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第八版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４年）およびＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー，ニューヨーク（１９８０年）に記載されているように行われる。一般的に、イムノアッセイの好ましいタイプは、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングである。これらの分析はいずれも当業者周知である。これらの分析に、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方が用いることができる。抗体は、固体支持体の基質に結合させてもよいし、または、検出可能な部分に接合させてもよいし、または、当業界周知の通りに、結合させ、かつ接合させてもよい（蛍光性の部分または酵素学的な部分の接合の総括的な考察については、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ＆Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８２年を参照）。また、固体支持体の基質への抗体の結合も当業界周知である（総括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリー・パブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），ニューヨーク，１９８８年、および、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー，１９９２年を参照）。本発明に使用するために考慮された検出可能な部分としては、これらに限定されないが、蛍光性、金属製、酵素学的、および、放射性マーカーが挙げられ、例えばビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、14Ｃおよびヨウ素化である。
【００６４】
必要に応じて、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなその他のイムノアッセイも、当業界既知の通りに用いることができる。利用可能なイムノアッセイは、特許や科学文献で広範囲にわたり説明されている。例えば、米国特許第３,７９１,９３２号；３,８３９,１５３号；３,８５０,７５２号；３,８５０,５７８号；３,８５３,９８７号；３,８６７,５１７号；３,８７９,２６２号；３,９０１,６５４号；３,９３５,０７４号；３,９８４,５３３号；３,９９６,３４５号；４,０３４,０７４号；４,０９８,８７６号；４,８７９,２１９号；５,０１１,７７１号；および、５,２８１,５２１、同様に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，１９８９年を参照。
【００６５】
検出、診断および予防キット
本発明はさらに、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、および、タンネレラ属を検出するためのキットを提供する。本キットは、本発明の前記生物、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の存在に関してサンプルを解析するための試薬を含み、ここにおいて、前記ヌクレオチド配列の存在は、前記生物の存在の指標である。この方法によれば、症状の発現の前に病気を診断することができ、患者へのダメージが生じる前に病気の発症を予防することができるので、有用である。細菌、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の存在は、抗体、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、およびその他の当業者既知の検出方法を用いて決定することができる。
【００６６】
一実施形態において、本キットは、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属に対する抗体を検出するための試薬を提供する。特定の実施形態において、本キットは、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属の検出に有用なキットであることを示す説明書一式またはラベルを含んでいてもよい。その他の実施形態において、本キットは、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属の核酸を検出するための試薬を提供する。一実施形態において、本キットは、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属の核酸のＰＣＲ検出のための試薬を提供し、本キットは、少なくとも１つのコンテナーに、少なくとも約１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドからなるフラグメント（このフラグメントは、ストリンジェントな条件下で、配列番号３〜５のポリヌクレオチドのいずれかに記載の少なくとも１５、３０、４５、６０、７５または９０個の連続したヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子にハイブリダイズする）を含む、第一の単離されたＤＮＡ分子、および、少なくとも１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドからなるフラグメント（このフラグメントは、ストリンジェントな条件下で、配列番号３〜５のポリヌクレオチドのいずれかに記載の少なくとも１５、３０、４５、６０、７５または９０個の連続したヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子にハイブリダイズする）を含む、第二の単離されたＤＮＡ分子を含み、これら第一および第二のＤＮＡ分子は、１６ＳｒＲＮＡ（この１６ＳｒＲＮＡは、配列番号３〜５からなる群より選択されるＤＮＡ分子によってコードされている）をコードするバクテロイデス属、ポルフィロモナス属またはタンネレラ属の核酸を特異的に増幅するのに用いることができる。
【００６７】
ワクチン製剤および投与方法
本発明のワクチンのコンパニオンアニマルへの投与は、本発明のワクチンが、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を治療的に処理するか、または、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患に対する耐性を付与するか、または、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を予防するような有効量で行うことができる。本発明のワクチンは、歯周疾患の原因となる細菌のコントロールにおいて有用である。本発明のワクチンは特に、獣医学の分野でコンパニオンアニマルを治療するために、および、本明細書で説明されているような歯周疾患の原因となることがわかっている細菌に対して、公衆衛生を維持するために用いることができる。
【００６８】
本発明のワクチンは、ヒトおよびコンパニオンアニマルにとって有害な細菌、または、病気の保菌生物として蔓延または作用する細菌（例えば本明細書で説明されている細菌）のコントロールにおいて有用である。本発明のワクチンは特に、コンパニオンアニマルに存在する細菌のコントロールに有用であり、その目的のために、本ワクチンは、あらゆる既知の投与方法（これらに限定されないが、経口、非経口、鼻腔内、皮下、または局所的など）を用いて投与することができる。
【００６９】
本発明のさらなる形態によれば、本発明のワクチンを、適合するアジュバント、希釈剤または担体と混合されて含む組成物が提供される。好ましい実施形態において、本発明のワクチン製剤は、少なくとも１種の本発明の細菌、および／または、少なくとも１つのサブユニットタンパク質を含む水性懸濁液または溶液で構成され、好ましくは生理学的なｐＨに緩衝化されており、すぐに注射できる形態である。
【００７０】
本発明はさらに、細菌感染を治療または予防する方法を提供するものであって、本方法は、本発明のワクチンまたはワクチン製剤の有効量を用いた治療を含む。当然ながら、処理といえば、細菌感染の確立された症状の予防、同様に、緩和も含む。
【００７１】
本発明のワクチンおよびワクチン製剤を用いて、歯周疾患を引き起こす細菌によって引き起こされた歯周疾患に特徴的な病理学的変化を予防する応答を誘導することができる。望ましくは、ワクチン製剤には、本細菌、精製したタンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせの免疫原性を示す量が、哺乳動物での使用に適した従来のワクチンアジュバントおよび生理学的なビヒクルと共に混合されている。
【００７２】
コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を予防するためのワクチン製剤は、少なくとも１種の単離、精製した不活性化または弱毒化された細菌、精製したポリペプチド（例えば天然型タンパク質、サブユニットタンパク質、またはポリペプチド）を用いて、これらの１またはそれ以上を適合するアジュバント、希釈剤、または担体と混合することによって生産することができる。
【００７３】
本発明はさらに、少なくとも１種の不活性化または弱毒化された細菌を、１またはそれ以上の追加の免疫原性成分と組み合わせて含む混合ワクチンを提供する。このような混合ワクチンは、驚くべきことに、ワクチン接種した動物において、別々に投与されたそれぞれの成分の作用を単に足したものから予想される作用より大きい作用を生じる。従って、混合ワクチンは、動物において相乗的な抗体生産を刺激する可能性がある。
【００７４】
本発明において考慮される混合ワクチンにおいて有用なその他の免疫原性成分としては、これらに限定されないが、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、および、狂犬病ウイルスが挙げられる。本発明のワクチン組成物に使用するための、これらの免疫原由来の抗原は、弱毒化された生のウイルス製剤、または、不活性化されたウイルス製剤の形態が可能である。これらのウイルスの毒性の株を弱毒化させる方法、および、不活性化されたウイルス製剤の製造方法は、当業界既知であり、例えば、米国特許第４,５６７,０４２号、および、４,５６７,０４３号で説明されている。
【００７５】
本発明によれば、本混合ワクチンは一般的に、獣医学的に許容できる担体を含む。獣医学的に許容できる担体としては、あらゆる、および、全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが挙げられる。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが挙げられる。等張剤としては、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、および、ラクトースが挙げられる。安定剤としては、特に、アルブミンが挙げられる。
【００７６】
その他の病原体由来の１種またはそれ以上の抗原と、獣医学的に許容できる担体は、混合ワクチン組成物を形成するのに都合がよく実用的なあらゆる手法（例えば混合、溶液、懸濁液、乳化、カプセル化、吸収など）で結合させることができ、注射、埋め込み、吸入法、摂取などに適した懸濁液、錠剤、カプセル、粉末、シロップのような製剤に製造することができる。
【００７７】
本発明のワクチンは、少なくとも１種の不活性化または弱毒化された細菌と、製薬上許容できる担体、好ましくはアジュバントとを組合せることによって製造することができる。
【００７８】
本発明のワクチンの適切な製剤としては、液状の溶液または懸濁液のいずれかの注射物質が挙げられる。また、注射の前に液状の製薬上許容できる担体への溶解または懸濁に適した固体を製造することもができる。本ワクチン製剤は、乳化させてもよい。活性な免疫原性成分は、好ましくは、製薬上許容でき、かつ活性な免疫原性成分に適合するアジュバントと混合される。適切なアジュバントとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム；界面活性物質、例えばリゾレシチン；配糖体、例えば、サポニン誘導体、例えばＱｕｉｌ  ＡまたはＧＰＩ−０１００（米国特許第５,９７７,０８１号）；カチオン性界面活性剤、例えばＤＤＡ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール；ポリアニオン；非イオン性ブロックポリマー、例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．，米国）；ペプチド；ミネラルオイル、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ，パリ，フランス）、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，オマハ、ネブラスカ州，米国）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，フレデリクスン，デンマーク）オイルエマルジョン、例えば、ミネラルオイル、例えばＢａｙｏｌＦ／Ａｒｌａｃｅｌ  Ａおよび水のエマルジョン、または、植物油、水および乳化剤、例えばレシチンのエマルジョン；アラム、コレステロール、ｒｍＬＴ、サイトカイン、および、それらの組み合わせ。また、免疫原性成分は、リポソームに包含されていてもよいし、または、ワクチン製剤に使用するための多糖類および／またはその他のポリマーに接合させてもよい。本発明の方法に使用するための生成物に含ませることができる追加の物質としては、これらに限定されないが、１またはそれ以上の保存剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の二ナトリウムまたは四ナトリウム塩、マーサイアレイトなどが挙げられる。
【００７９】
本ワクチンが投与される被検体は、好ましくはコンパニオンアニマルであり、最も好ましくはイヌまたはネコである。
【００８０】
本発明のワクチンは、ワクチン製剤の場合、単位剤形で存在することが好ましい。本発明の目的において、投与されると免疫原性を示す量は、約１×１０4〜約１×１０13個の不活性化された細菌細胞を含む。複数の成分を含むワクチン製剤では、上記免疫原性を示す量と同量か、またはそれより少ない量を有効に用いることができる。
【００８１】
適切な治療上有効な用量は、当業者によって、上記の免疫原性を示す量、治療される状態、および、動物の生理学的な特徴に基づき容易に決定することができる。従って、ワクチン製剤は、免疫原性を示す量の活性成分（ここにおいて、活性成分は、少なくとも１種の細菌である）の滅菌製剤の用量を提供する。追加の活性物質が存在する場合、これらの単位投与量は、当業者によって簡単に調節することができる。
【００８２】
望ましい用量の処方計画には、望ましいワクチン組成物の少なくとも１回の用量の投与が含まれ、ここにおいて、各単位中の抗原性の含量は上述した通りである。また、本発明のワクチンの有効量（免疫化する量）は、モデル試験系から得られた用量応答曲線から推定してもよい。本発明のワクチンの投与様式は、本ワクチンを宿主に運搬するあらゆる適切な経路が可能である。このような経路としては、これらに限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹膜内、皮下、鼻腔内経路、および、乱切法（例えば二又の注射針を用いて、皮膚の最上層に小さく浅い切開を行うこと）が挙げられる。しかしながら、本ワクチンは、好ましくは、皮下に、または、筋肉注射によって投与される。また、その他の投与様式も、要望に応じて用いることができ、例えば皮内、静脈内、鼻腔内、または扁桃内である。
【００８３】
研究によれば、上記で説明されたワクチン組成物それぞれにとって、望ましくは、幼動物の一次免疫化を開始し（８週齢になった後）、１２週および１６週齢にブースター用量を投与することが示されている。年１回の再ワクチン接種が推奨される。
【００８４】
本発明のワクチンは、それぞれの被検体の臨床的な状態、投与部位および方法、投与のスケジュール、被検体の年齢、性別、体重、および、医師には既知のその他の要素を考慮した優れた医療に従って、投与、服用される。
【００８５】
本発明はさらに、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を予防するためのキットを提供する。一実施形態において、本キットは、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を予防する治療有効量の組成物を含むコンテナーを提供する。また、同一または異なるコンテナーに、本組成物で使用可能な製薬上許容できる担体も提供される。本キットはさらに、本発明の組成物への応答の発生を支援するのに用いることができるアジュバントを含んでいてもよい。また、本キットは、本組成物を、好ましくは単位剤刑に分注するためのディスペンサーを含む。ディスペンサーは、例えば、金属またはプラスチック箔で構成されてもよく、例えばブリスターパックである。本キットに、コンパニオンアニマルにおける歯周疾患を予防するための本組成物の投与を説明したラベルまたは説明書が一緒に入っていてもよい。また、製薬上許容できる担体中に製剤化された本発明のワクチン組成物を含む組成物を製造し、適切なコンテナーに入れ、表示された歯根膜の状態の治療に関してラベルを付することもできる。
【００８６】
ワクチンの有効性の決定
本発明のワクチンおよびワクチン組成物により誘導された具体的な保護メカニズムは、以下で説明するインビボでの動物試験によって示されたように、ワクチン接種した動物における抗体の誘導および／または細胞免疫反応である。
本発明の細菌、ワクチンおよびワクチン組成物は、コンパニオンアニマルの歯周疾患、ウシの足腐敗症、冠動脈心疾患（イヌ）、または全身感染（イヌ）を治療または予防するのに有用である。本発明をさらに、以下の限定されない実施例および添付の表によって説明する。
【実施例】
【００８７】
実施例１
コンパニオンアニマルの歯肉溝滲出液サンプル
微生物のサンプルを、獣医診療所で歯根膜の治療に関して試験されたイヌおよびネコ、または、通常の検査に関して認定された所定の施設で試験されたイヌから採取した。この研究に、歯周ポケットが＞３ｍｍのイヌと、歯周ポケットが＞２ｍｍのネコを用いた。歯科的な指数（歯肉炎指数、および、歯周疾患指数）、および、歯周ポケットの深さを記録した。個々の目の粗い吸収紙の先端（ヘンリー・シャイン（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ）；メルビル，ニューヨーク州）を、無菌的に歯周ポケットに挿入した。除去する際に、その紙の先端を即座に、予め還元された、嫌気的に滅菌された（Ｐｒｅ−Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ  Ｓｔｅｒｉｌｅ；ＰＲＡＳ）嫌気性歯科用輸送用（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ；ＡＤＴ）培地（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；モーガンヒルズ，カリフォルニア州）を含むバイアルに挿入した。
【００８８】
バイアルを、ベクトロンＩＶ（Ｂａｃｔｒｏｎ  ＩＶ）嫌気性チャンバー（シェルドン・マニュファクチュアリング（Ｓｈｅｌｄｏｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ），コーネリアス，オレゴン州）に移し、９０％Ｎ2、５％Ｈ2、５％ＣＯ2下で処理した。紙の先端を無菌的に、ＰＲＡＳ脳心臓浸出液（ＢＨＩ）、ＰＹＧまたはＳＳＹＧ培地（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０μｌ中に置き、ボルテックスで３０秒混合した。ＢＨＩ、ＰＹＧまたはＳＳＹＧ培地で１：１００および１：１０００の希釈液を製造した。１：１００および１：１０００希釈液の１００μｌのアリコートを、ＰＲＡＳブルセラ血液寒天（ＢＲＵ）プレート（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に塗り広げた。このプレートを、嫌気性チャンバー中で、３７℃で５〜７日間インキュベートした。細菌のコロニーの総数、および、黒色色素生産性嫌気性細菌（ＢＰＡＢ）コロニーの数をカウントした。個々の  ＢＰＡＰコロニーを新しいＢＲＵプレートに移し、上述のように再びインキュベートした。
【００８９】
臨床分離株の特徴付け
それぞれの臨床分離株を、多数の生化学解析と、プライマーＤ００５６およびＤ００５７（配列番号１および配列番号２；表１）を用いた１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列解析で処理し、属と種を決定した。個々の分離株は、ＢＲＵプレート上で筋状にした。カナマイシン、バンコマイシンおよびコリスチンディスク（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を寒天表面に置き、それぞれの分離株のＫＶＣ耐性パターンを決定した。精製したコロニーもインドールおよびカタラーゼ試験（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。リパーゼおよびレシチナーゼ生産パターンを決定するために、個々の分離株を卵黄寒天（ＥＹＡ）プレート（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。このデータは、下記の図１に示す。
【００９０】
歯周疾患指数は、この多面的な病気の複数の特徴を考慮した歯周疾患の重症度の体系分類を意味する。このような指標としては、これらに限定されないが、ポケットの深さ、接着の喪失、プロービングにおける出血、歯の可動性、および、歯肉炎が挙げられる。歯肉炎指数は、歯肉の炎症の重症度の系統的な分類を意味する。観察されたこの分類に影響を与える前兆としては、これらに限定されないが、ある程度の浮腫、色、自発的な出血、歯肉後退、および、過形成が挙げられる。
【００９１】
特徴付けられた５種のタンネレラ・フォーサイセンシス分離株由来の部分的な１６ＳｒＲＮＡ配列から、約５２０ｂｐ領域で１００％同一であることが明らかになった。３種のポルフィロモナス・レビ分離株は、解析された部分的な１６ＳｒＲＮＡ配列の範囲内での同一性は９９％より大きく、１個のヌクレオチドしか異なっていなかった（配列番号４の１３位）。
【００９２】
バクテロイデス属の新規の種（バクテロイデス・デンティカノリス）の同定
この研究の経過中に、我々は、１６ＳｒＲＮＡ配列が利用可能なデータベースで高い類似性のマッチングを有さない多数の臨床分離株を同定したが、これは、これら細菌が、新規の分離株である可能性を示す。これらのうち一つの分離株群（以下の表２）は、新規の種であることを示しているようであった。ここに添付されたデータに基づき、我々は、この細菌分離株群を、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｅｎｔｉｃａｎｏｒｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．と称することを提唱する。Ｂ．デンティカノリスの標準株は、Ｂ７８T株（＝ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８８１）である。
【００９３】
【表２】
2007508837.tif 000004
【００９４】
バクテロイデス・デンティカノリスＢ７８Tの表現型の特徴付け
Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tを、歯周疾患に罹った５歳のメスの雑種犬から単離した。臨床的に、このイヌの歯周疾患指数スコアは３であり、歯肉炎指数スコアは２であった（Ｈａｒｖｅｙ，１９９８年）。紙の先端のサンプルを、歯周ポケットの深さが５ｍｍの左上の第四小臼歯から得た。このサンプルを上述のようにして処理した。精製した細胞は、グラム陰性であり、非胞子形成であり、非運動性であり、桿菌様であり、および、カタラーゼ陰性であった。ブルセラ血液寒天上で、３７℃で嫌気性インキュベートしてから約５日後に、コロニーが形成された。Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tのコロニーは、インキュベート５〜７日後に着色し始めた（黄褐色〜黒色）。この分離株は、ブルセラ血液寒天上で溶血性で、カナマイシン感受性であり、バンコマイシンとコリスチン（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製の抗生物質ディスク）の両方に耐性のようであった。卵黄寒天（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）上のコロニーは、レシチナーゼ活性があることを実証したが、リパーゼ活性は示さなかった。多数の培地タイプで別個のコロニーが出現したため、細菌の遊走は認められなかった（データ示さず）。
【００９５】
生化学解析
Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tを、ＲａｐＩＤ  ＡＮＡ  ＩＩ臨床試験キット（Ｒｅｍｅｌ；レネクサ，カンザス州）を用いた生化学解析で処理した。簡単に言えば、ブルセラ血液寒天上の３種のＢ．デンティカノリスＢ７８T培養物を、等量のＭｃＦａｒｌａｎｄ＃３に再懸濁した。この懸濁液を試験ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、１８種の別個の生化学的試験に関する結果を記録した。
図２に、Ｂ．デンティカノリスＢ７８T、同様に、６種のコントロール細菌に関するＲａｐＩＤ  ＡＮＡ  ＩＩ試験の結果を示す。ＲａｐＩＤ  ＡＮＡ  ＩＩキットによって行われた１８種の試験のうち、６種（ＯＮＰＧ、βＧＬＵ、αＦＵＣ、ＮＡＧ、ＰＯ4、および、ＬＧＹ）が、Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tに関して陽性であった。比較すると、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＡＴＣＣ２５６１１、タンネレラ・フォーサイセンシスＡＴＣＣ４３０３７、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＡＴＣＣ２９１４８、バクテロイデス・フラジリスＡＴＣＣ２５２８５、および、バクテロイデス・スプランキニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）  ＡＴＣＣ２９５７２はそれぞれ、５、４、１０、１２、９および８種の陽性試験結果を示した。
【００９６】
系統発生解析
Ｂ．デンティカノリスＢ７８T由来の全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、プライマーＤ１３４（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧ−３’  配列番号１６）、および、Ｄ５７（５’−ＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧ−３’  配列番号１７）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．））を用いて、三連でＰＣＲで増幅した。Ｓｌｏｔｓ，Ｊ．等．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ３０４〜Ｓ３０７（１９９５年）。
【００９７】
そのＰＣＲ産物をプールし、精製し、脱塩し、直接ＤＮＡ配列解析で処理した。Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を用いた国立バイオテクノロジー情報センターでの重複のないヌクレオチドデータベースのＢＬＡＳＴ−Ｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．等．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５，４０３〜４１０）（１９９０年）検索によれば、Ｂ．デンティカノリスＢ７８T分離株は、バクテロイデス属の種類に関連することが示された。このデータベース内で最も近い関連配列は、バクテロイデス属０１０３  ８００（登録番号ＡＪ４１６９０６）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列であり、１,４６３ｂｐにわたり９７％の同一性を示した。バクテロイデス属０１０３−８００を、嫌気性の脳膿瘍から単離した。
【００９８】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統発生解析をＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘバージョン１．８１ソフトウェアを用いて行った。近隣結合法を用いて系統樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．＆Ｎｅｉ，Ｍ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４，４０６〜４２５）（１９８７年）。
【００９９】
１０００個の複製を用いてブートストラップ値を得た。図３に、Ｂ．デンティカノリスＢ７８T単離株に関する系統発生解析の結果を示す。主要な属（ポルフィロモナス、バクテロイデス、プレボテラ、タンネレラなど）の配置は、サイトファーガ・フラボバクター・バクテロイデス（ｃｙｔｏｐｈａｇａ−ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ−ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ；ＣＦＢ）群に関して以前に公開された系統樹に一致する（Ｐａｓｔｅｒ等（１９９４年）．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６，７２５〜７３２．，Ｓｈａｈ，Ｈ．Ｎ．等．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，ａｎｄ  Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１３０５〜１３３０．Ａ．ＢａｌｏｗｓおよびＢ．Ｉ．Ｄｕｅｒｄｅｎ編．ロンドン：オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９８年））。
【０１００】
Ｂ．デンティカノリスＢ７８T、バクテロイデス属０１０３−８００、および、培養されていないＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  Ｂｉｓｉｉ２７分離株は、Ｂ．フラジリス群の枝分かれに分類され、Ｂ．フラジリス群はまた、Ｂ．Ａｃｉｄｏｆａｃｉｅｎｓ、および、Ｂ．テタイオタオミクロンも含む（図１）。Ｂ．フラジリス部分集団から、Ｂ．デンティカノリスＢ７８T部分集団の枝先端におけるブートストラップの信頼値が９９．９％であったことにより、この新たに同定された生物の系統発生学的な配置に対する信頼が高められた。
【０１０１】
９種の別のイヌのＢ．デンティカノリス臨床分離株由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の約５６０ｂｐの領域（表１）を、上述で説明したように、Ｄ５６およびＤ５７プライマーを用いてＰＣＲで増幅した（三連で）。ＰＣＲ産物を精製し、脱塩し、プールした。次にＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。その結果は、表３で詳述する。上記分離株をそれらの１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配列に基づきタイプ分けした。別々のよく単離されたコロニーを、プライマーＤ００５６およびＤ００５７（配列番号１および配列番号２；表１）を用いた１６ＳｒＲＮＡ領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（三連で）のためのテンプレートとして用いた。ＰＣＲは、１×ＰＣＲ緩衝液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ロックビル，メリーランド州）、１.０ｍＭのＭｇＣｌ2、１.２５μＭの各プライマー、３００μＭの各デオキシ−ＮＴＰ、および、２.５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）を含む反応液（５０μｌ）中で行った。以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：変性工程を９４℃で２分間；９４℃で４０秒変性、６０℃で４０秒アニーリング、および、７２℃で１分間伸長を３０サイクル；最終伸長工程を、７２℃で２分間；および、最終冷却工程を、〜４℃。全てのＰＣＲ増幅に、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００  サーモサイクラー（パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；フォスターシティ，カリフォルニア州）を用いた。
【０１０２】
得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ調整キット（プロメガ社；マディソン，ウィスコンシン州）を用いて精製し、単離することによってプールした。次に、精製したＰＣＲ産物を、点滴分析によって、滅菌水２５ｍＬに対して、０.０２５μｍのニトロセルロースフィルター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）；ベッドフォード，マサチューセッツ州）を用いて脱塩した。精製、脱塩されたＰＣＲ産物を、ＡＢＩ自動ＤＮＡシーケンサーでＤｙｅＤｅｏｘｙ停止反応を用いて、ＤＮＡ配列解析した。合成オリゴヌクレオチドプライマーＤ００５６およびＤ００５７（それぞれ配列番号１〜２；１）を用いて、二本鎖ＤＮＡ配列を得た。得られたＤＮＡ配列を用いて、公共的に利用可能であるＤＮＡデータベースを、国立バイオテクノロジー情報センター（米国）より公共的に利用可能であるＢＬＡＳＴ−Ｎプログラムを用いて検索した。
【０１０３】
【表３】
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【表４】
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【０１０４】
１０種のＢ．デンティカノリス分離株由来の部分的な１６ＳｒＲＮＡ配列は、４つの配列群（Ｂ７８T、Ｂ８０、Ｂ８３、Ｂ３４２、および、Ｂ４５８；Ｂ２４１；Ｂ２４２；
および、Ｂ４７３、Ｂ４７４、および、Ｂ４７６）に集団化できることがわかった。群内の全ての分離株は、この約５６０ｂｐ領域において同一な１６ＳｒＲＮＡ配列を有する。図４に、Ｂ．デンティカノリス分離株の部分的な１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の系統発生解析の結果を示す。全てのＢ．デンティカノリス分離株の間で、５６０ｂｐ領域の範囲において９９.５％ＤＮＡ配列同一性がある。この観察に基づき、我々は、これらの分離株は全て、同じ種の変異株であると結論付ける。加えて、この種の株は、地理的に離れた地域（ペンシルベニア州およびカリフォルニア州）で発見された。
【０１０５】
図１に、上記分離株全ての全リストと、それらのそれぞれの特徴を記載する。
【０１０６】
表４に、分離株の分布を示す。
【表５】
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上記の表は、分離株の数、同様に、示された細菌種が単離されたイヌの数とパーセンテージを示す。
【０１０７】
以下のコンパニオンアニマルの歯根膜の分離株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，マナサス，バージニア州，２０１１０，米国）に寄託した；バクテロイデス・デンティカノリス（Ｂ７８；（ＰＴＡ−５８８１）、ポルフィロモナス・レビ（Ｂ２２２；（ＰＴＡ−５８８２）、および、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｂ３４３−２４；（ＰＴＡ−６０６３）。
【０１０８】
細菌種に応じた培養条件
多くの嫌気性細菌のための標準的な増殖培地（脳心臓浸出液［ＢＨＩ］および細切れ肉の炭水化物［ＣＭＣ］培地）は、動物性の産物を含み、これらはワクチン生産には適さないので、これらの成分を含まない増殖培地を模索した。様々な培地組成（ヘミンおよびビタミンＫ含有／非含有）を、ＢＨＩまたはＣＭＣでの成長に匹敵する成長を維持する能力に関して試験した。ＰＹＧ完全およびＳＳＹＧ培地の両方が、バクテロイデス・デンティカニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ）、Ｐ．レビ、および、Ｔ．フォーサイセンシスの成長を維持した。増殖培地として、培養中に高密度培養物が得られる能力のためにＰＹＧ完全またはＳＳＹＧ−完全培地を選択した。ＰＹＧ培地は、以下の成分を含む：３％ファイトン（ｐｈｙｔｏｎｅ）（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；クッキーズビル，メリーランド州）、０.３％酵母抽出物（ベクトン・ディッキンソン）、０.３％グルコース（シグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ．）；セントルイス、ミズーリ州）、０.０５％チオグリコール酸ナトリウム（ベクトン・ディッキンソン）、０.５％塩化ナトリウム（シグマ社）、５μｇ／ｍｌヘミン（シグマ社）（オートクレーブ処理後に添加）、０.５μｇ／ｍｌメナジオン（シグマ社）（オートクレーブ処理後に添加）、および、０.２％重炭酸ナトリウム（シグマ社）、ｐＨ７.０。バクテロイデス・デンティカニス、Ｐ．レビ、および、Ｔ．フォーサイセンシスを、ブルセラ血液寒天プレート（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で、または、完全ＰＹＧ培地またはＢＨＩ中で、３７℃で、ベクトロンＩＶ嫌気性チャンバー（シェル・ラボス（Ｓｈｅｌ  Ｌａｂｓ）；コーネリアス，オレゴン州）中、９０％Ｎ2、５％ＣＯ2下で、３〜５日間（プレート）または２４〜４８時間（液体培養）、規定通りに培養した。ＳＳＹＧ培地は、以下の成分を含む：５％ソイトン（ベクトン・ディッキンソン）、０.３％酵母抽出物（ベクトン・ディッキンソン）、０.３％グルコース（ＥＭインダストリーズ（ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））、０.０５％チオグリコール酸ナトリウム（ベクトン・ディッキンソン）、０.５％塩化ナトリウム（シグマ社）、０.２％重炭酸ナトリウム（フィッシャー）、ｄＨ2Ｏ、ｐＨ７.０、ならびに、５μｇ／ｍｌヘミンのヘミン溶液、１Ｎ水酸化ナトリウム（ｄＨ2Ｏ中）および９５％エタノール中０.５μｇ／ｍｌのメナジオン溶液を含むヘミン−メナジオン溶液。
【０１０９】
臨床分離株の病原性試験
マウス歯根膜の骨量減少モデルで、バクテロイデス・デンティカノリス、および、Ｐ．レビを、それらの病原性に関して試験した。この研究に、推定体重１４〜１５グラム、３週齢の、年齢を適合させた雄Ｂａｌｂ／ｃ  ＣｙＪマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；バーハーバー，メイン州）を用いた。これらの動物を、正圧のバリアケージユニットで飼育した。実験の間中、その種に標準的なエサのペレットと水を適宜供給した。用いられた寝床は、歯肉組織での埋状を最小化するために、顆粒状のトウモロコシの穂軸の寝床（Ｂｅｄ  Ｏ’Ｃｏｂｂｓ）とした。全ての動物は、受け取った後、５〜７日順応させた。口腔フローラとの競合を減らすために、動物をスルファメトキサゾールおよびリメトプリム（飲用水１０ｍＬ；それぞれ約２ｍｇおよび０.４ｍｇ／ｍｌ）の混合液で１０日飼育し、それに続いて５日間の洗い流しを行った。それぞれのマウスの尾の静脈を出血させて血清サンプルを採取した。これらの動物を、約１×１０10ｃｆｕ／ｍｌの適切な菌株の１％カルボキシメチルセルロースの懸濁液０.５ｍＬで、胃管栄養によって感染させた。追加の液滴は、口腔内に入れた。この感染を、２回以上、総計３回（月曜日、水曜日、および、金曜日）繰り返した。
【０１１０】
実験１日目は、第一回目の感染の後の火曜日と定義した。２日目に全ての動物を殺した。感染後の血清を回収し、微生物サンプルも同様に回収した。それぞれのマウスの顎の肉を取り、染色し、顕微鏡を用いて水平骨欠損に関してスコア付けした。このスコア付けを操作員のエラーを少なくするために３回繰り返した。平均骨量減少は、平均骨量減少／部位／顎（ｍｍ）として示す。得られたデータの統計的分析を、Ｓｙｓｔａｔ（バージョン９）、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（バージョン２）、および、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン２０００）（ＳＰＳＳサイエンス社（ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ，シカゴ，イリノイ州）より入手可能）を用いて行った。表５に、これらの分離株に関する計算結果を示す。
【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
これらのデータによれば、バクテロイデス・デンティカノリス分離株は、歯周疾患のマウスモデルにおいて骨量減少を引き起こすことができることが示される。ポルフィロモナス・レビ分離株は、最小限であったが、マウスの歯根膜モデルにおいて骨量減少を引き起こした。図５に、バクテロイデス・デンティカノリスに関する結果を図を用いて示す。
【０１１３】
本願を通して、米国特許などの様々な特許および科学文献は、著者と年で引用され、特許は番号で引用される。これらの出版物および特許の開示は、本発明が属する分野の状況をよりよく説明するために、参照によりそれら全体を本願に加入させる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】イヌおよびネコのＢＰＡＢ分離株の特徴付けである。
【図２】Ｂ．デンティカノリスＢ７８T、同様に、６種のコントロール細菌に関するＲａｐＩＤ  ＡＮＡ  ＩＩ試験の結果である。
【図３】バクテロイデス網からの代表種に関する、近隣結合法による系統樹である。
【図４】Ｂ．デンティカノリスの臨床分離株に関する近隣結合法による系統樹である。
【図５】歯周疾患の口腔のマウスモデルにおける、Ｂ．デンティカノリスＢ７８Tの病原性試験である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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