(57)【要約】  本発明は、液体中の種と固体支持体上の種との間の相互作用を検出するための装置に関する。本装置は、固体支持体（１１）、それに前記支持体が曝露させられる液体量を一時的に減少させるための機構（１６）、前記固体支持体へ付着させられた種と前記液体中に含有された種との間の相互作用を検出することのできる検出器（１２）を含む。本発明は、前記第１の種を体支持体上へ付着させることと、第２の種を含有する液体へ前記第１の種を曝露させることと、前記第１の種と前記第２の種との間の相互作用を検出できる測定および参照測定を実施することと、を含む方法にさらに関する。前記液体は、測定中には一時的に減少させられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体へ付着させられた種と液体中の種との間の相互作用を、前記支持体および前記液体を接触させた場合に検出するための装置であって、
第１の種をその上の１つまたは複数の重複していない規定領域内に付着させることのできる固体支持体（１１）と、
前記固体支持体へ付着させられた前記種と前記液体中に含有される前記種との間の相互作用を検出できる検出器（１２）とを含み、
前記支持体の規定領域内で、検出中に前記支持体が接触する液体量を一時的に減少させるために適合する機構（１６）と、
少なくとも１つの規定領域が、検出のための参照領域を形成できるように、付着させられた関心対象の種を有していないこと、を特徴とする装置。
【請求項２】
前記固体支持体がその境界内に封入された液体を保持できる本質的に平らな培養皿である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記支持体の前記規定領域内における液体量の一時的減少を提供できるように、水平から傾斜した角度での培養皿の回転を可能にするためのモーターが提供される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
測定前に前記支持体から液体を吸引するため、および測定後に前記支持体へ液体を戻すための吸引装置が提供される、請求項１、２、または３に記載の装置。
【請求項５】
検出器（１２）がシンチレーション検出器であり、前記検出器（１２）からのインパルスを計数するための電子計数器（１３）、前記支持体（１１）の角度位置を調整かつ報告するための制御装置、および前記計数器（１３）からのシンチレーションカウンター出力と前記制御装置（１４）からの細胞培養皿支持体の角度位置とを同期化するためのコンピューター（１５）がさらに提供される、請求項１乃至４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
液体中の種と固体支持体上の種との間の相互作用を検出する方法であって、
第１の種を固体支持体の規定部分上に付着させることと、
前記固体支持体の規定部分を被覆できるように、第２の種を含有する液体へ前記第１の種を曝露させることと、
前記第１の種と前記第２の種との間の相互作用を検出できる測定を実施することとを含み、
前記支持体の規定部分を被覆する液体量が前記測定を実施する前に一時的に減少させられることと、
参照測定は固体支持体の相互作用が発生しない相違する部分上で実施され、前記部分が参照領域を規定すること、を特徴とする方法。
【請求項７】
全規定領域上での相互作用が１分間以内に検出され、および全相互作用の検出が相互作用の進行を経時的に決定するために少なくとも１５分間にわたり中断せずに繰り返される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記液体の一時的減少が、前記固体支持体と接触している液体の総量を変化させずに少なくとも１つの前記規定領域の近くの液体量の減少を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
標的測定値および参照測定値間の差が計算される、請求項６乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
曝露する工程、液体量を減少させる工程、および測定する工程の手順が繰り返され、ならびに前記工程手順が繰り返される前に前記第２の種の濃度が限定量ずつ増加させられる、請求項６乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体がその境界内に封入された液体を保持できる本質的に平らな培養皿である、請求項６乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
液体量の減少が、前記支持体の上方部分および下方部分を提供するために水平から傾斜した角度で前記支持体を方向付けることにより達成され、その結果として前記上方部分が前記下方部分より少量の液体によって被覆され、このとき前記支持体が所定の回転速度で回転させられる、請求項６乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の種が、組織、細胞、細菌、ウイルス粒子から選択される、請求項６乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
液体中に存在する第２の種が、１，０００，０００ｇ／モル未満の総分子量を有する溶解分子または溶解分子の複合体である、請求項６乃至１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相違する種が相互作用する方法についての特性解析の分野に関する。より詳細には、本発明は、１つまたは複数の種が固体支持体へ付着させられ、他の種が該固体支持体と接触している液体中へ入れられる方法に関する。よりいっそう詳細には、本発明は、生物学的または化学的起源の種、例えば細胞、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組織、合成化合物などの相互作用に関する。
【背景技術】
【０００２】
相違する種間の相互作用は、生体中および産業システムにおいて重要である。免疫系は、血流中の抗体が病原体と相互作用し、それにより該病原体へナチュラルキラー細胞を誘導する第１の例である。治療薬は、薬剤が酵素活性を阻害する方法で酵素と相互作用できる第２の例である。第３の例は、ヒトまたは動物由来のサンプルを、疾患を誘発する病原体と特異的に相互作用する種を含有する液体と接触させることによる、ヒトまたは動物における疾患の検出である。種が洗浄工程後に該サンプル上に残留した場合は、該サンプルは疾患を誘発する病原体を有している。まさに同一方法を、食品における汚染を検出するために使用できる。これは、種間の相互作用を特性解析するための方法および装置が、生物学および医学における研究や診断学のためだけではなく、様々な分野における品質管理および特性解析のためにも重要であることを意味している。
【０００３】
２つ以上の種間の相互作用を特性解析するためには多数の方法が知られている。１つの一般的方法は、１つの種を固体支持体へ付着させ、液体中に溶解させた第２の二官能種を添加する方法である。二官能種は、（ａ）容易に検出可能な特性（例、放射性である、またはそれに付着させられた蛍光成分を有する）を有し、そして（ｂ）固体支持体へ付着させられた種と相互作用するはずである。液体が、固体支持体と接触させられ、ときどきはその後に二官能種を含まない液体で固体支持体が洗浄される。二官能種が固体支持体上の種と安定して相互作用する場合は、二官能種は固体支持体上に堆積して洗浄後にもそこへ残留するであろう。そこで二官能種の存在を検出できる。また別の、相互作用を特性解析するために広範囲に使用されているより複雑な方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【０００４】
本発明は、複数の種が相互作用する方法についての特性解析を容易にすることを目的としている。本方法は、種の１つが大きい（分子の状況において）場合、例えば種の１つが細胞または細菌である場合に特に適合する。
【０００５】
最近の先行技術
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（米国、イリノイ州、ロックフォード）は、各ウェルの底部が、特異的タンパク質を認識する抗体が付着させられている１６までの規定領域を有するマイクロプレート（Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ（商標））を製造販売している。液体サンプルがウェル内へ注入されると、特異的タンパク質はウェルの底部上の様々な領域へ結合する。様々なタンパク質の検出は、各特異的タンパク質に付き１つの、発光成分で標識された二次抗体によって媒介される。次にカメラを使用して、各規定領域上の特異的タンパク質の濃度に関連する光強度が定量される。この方法は、現時点ではタンパク質に限定されており、参照目的で１つの規定領域を明示的には使用しない。Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ（商標）法についての詳細な説明は、参照して本明細書に組み込まれるＭＤ  Ｍｏｏｄｙ、ＳＷ  Ｖａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌ、ＫＰ  Ｍｕｒｐｈｙ、ＳＦ  ＯｒｅｎｃｏｌｅおよびＣ  Ｂｕｒｎｓによる論文（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（３１（１）：１８６−９０，１９２−４，Ｊｕｌ  ２００１）の中に見いだすことができる。
【０００６】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン国ウプサラ）は、相違する種を付着させることができる４つの規定領域を備える固体支持体を有する光学バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００）を製造している。液体サンプルは、固体支持体上へ注入される。液体中に存在する種が固体支持体へ付着させられた種へ結合すると、固体支持体の近くの屈折率が変化する。光学検出システムが、固体支持体の近くの屈折指数をリアルタイムで監視する。この機器を作動させる場合は、規定領域の１つを参照目的に使用することが推奨されている。しかし固体支持体と接触している液体は攪拌されず、その代わりに固体支持体の上方で連続液体流が発生する。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００は主としてタンパク質間の相互作用を監視するために設計されたが、細胞とタンパク質との間の相互作用が監視されている。ＢＩＡＣＯＲＥ機器の技術的側面についての詳細な考察は、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第５，３１３，２６４号の中に見いだすことができる。
【０００７】
光バイオディスクおよび付属するディスク読み取り装置は、参照して本明細書に組み込まれるＳＮ  Ｈｕｒｔ、ＪＦ  ＧｏｒｄｏｎおよびＫＲ  ＭｃＩｎｔｙｒｅ（米国特許出願公開公報第２００３／０２２４４５７号）によって記載されている。このバイオディスクは、入口および出口ポートを備える半径方向チャネルを含む本質的に平らなプラスチック製ディスクである。各チャネル内には、その上に様々な抗体が固定化される複数の標的ゾーンがある。一部の標的ゾーンは、固有の血液タイプに対して特異的である細胞上の抗原を認識する抗体を有する。他の標的ゾーンは、陰性または陽性対照として機能する。細胞懸濁液、例えば血液サンプルはチャネル内へ注入される。すると懸濁液中のいくらかの細胞は、患者の血液型に対して特異的な抗体を有する標的ゾーンへ結合することができる。次に、ディスクは、標的ゾーンからすべての未結合細胞が離れるように回転させられる。最終工程では、細胞が結合している標的ゾーンを光学的に検出することによって患者の血液型を決定できる。これは、バイオディスク測定が必ずしも洗浄工程を含んでおらず、その代わりに高速でディスクを回転させることによって惹起される沈降の加速によって未結合細胞が検出領域から完全に取り除かれることを意味する。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、相違する種が相互作用する方法についての特性解析を容易にすることである。第１態様では、本発明は、種間の相互作用を特性解析するための装置を提供する。本装置は請求項１に規定した。
【０００９】
また別の態様では、本発明は、相違する種が相互作用する方法を特性解析するための方法を提供する。本発明による方法は、請求項６に規定した。
【００１０】
好ましい実施形態における本発明は、４つの独特の特徴を有する。
【００１１】
・  少なくとも２つの、つまり１つは標的のためおよび少なくとも１つは参照目的のための規定領域を備える固体支持体である。しかし、いくつかの相違する標的を別個の規定領域内に提供することができる。溶解したリガンドを含有する液体は、標的とリガンドとの間の相互作用を可能にするために固体支持体と接触させる。
【００１２】
・  検出器は、規定領域の近くのリガンドの存在を検出および定量することができるように配列されている。
【００１３】
・  好ましくは、固体支持体と接触している液体の攪拌が提供される。
【００１４】
・  本質的な特徴は、検出中の規定領域での液体量を少なくとも一時的に減少させるための手段の用意である。
【００１５】
参照領域の近くでリガンドの量を定量する場合は、規定領域の近くに残留している液体中に存在する未結合リガンド、参照領域に非特異的に結合したリガンド、およびリガンドに関連していないバックグラウンドシグナルがシグナルに寄与するであろう。標的領域の近くのリガンドの量を定量する場合には、固体支持体へ付着させられた種へ結合したリガンドが追加のシグナル源となるであろう。そこで、標的へ結合したリガンドの検出量は、参照領域からのシグナルを減算することによってバックグラウンドシグナルについて補正できる。
【００１６】
液体中の未結合リガンドに関連するシグナルは固体支持体へ結合したリガンドからのシグナルよりはるかに大きい可能性があるので、規定領域の近くのリガンドの測定中には液体量を減少させることが有益である。しかし、液体を完全に除去する必要はない。液体の攪拌については２つの理由がある。第１に液体が容器内で均質になるであろう。そして第２に、平衡に達するために必要な時間は液体中でのリガンドの緩徐な拡散に起因して増加しないであろう。
【００１７】
以下では、添付の図面を参照しながら、本発明を本発明の明細書および下記の実施例においてより詳細に説明する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本出願のために、そして明確にするために、固体支持体へ付着させられる種を「標的」、そして液体中に存在する種を「リガンド」と表示する。考えられる種（すなわち、標的およびリガンド）には、組織サンプル、細胞、細菌、ウイルス、固体粒子、高分子（例、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびその他の化合物が含まれるが、それらに限定されない。好ましいリガンドには、高分子（例、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、他の化合物および液体中に溶解させることのできる任意の種が含まれる。
【００１９】
本発明は、相違する種間の相互作用についての特性解析の正確度および精度を向上させることを目的としている。また別の目的は、特性解析を実施するために必要な作業時間を減少させることである。
【００２０】
一般に、支持体へ付着させられた種（標的）と液体中の種（リガンド）との間の相互作用を、前記支持体および前記液体を接触させた場合に検出するための本発明による装置は、第１の種をその上の１つまたは複数の重複していない規定領域内に付着させることのできる固体支持体（１１）と、前記固体支持体へ付着させられた前記種と前記液体中に含有される前記種との間の相互作用を検出できる検出器（１２）と、を含む。本装置は、前記支持体の規定領域内で、検出中に前記支持体が接触する液体量を一時的に減少させるために適合する機構（１６）と、少なくとも１つの規定領域が、検出のための参照領域を形成できるように、付着させられた関心対象の種を有していないこと、を特徴とする。
【００２１】
第２の種は、好ましくは１，０００，０００ｇ／モル未満の総分子量を備える溶解分子または溶解分子の複合体として液体中に存在することができる。
【００２２】
好ましくは、固体支持体はペトリ皿などのその境界内に封入された液体を保持できる本質的に平らな培養皿であるが、液体を封入できる他の任意の種類のレセプタクルまたは容器が可能である。
【００２３】
液体を除去するために、本発明は、１つの実施形態では測定前に前記支持体から液体を吸引するため、および測定後に前記支持体へ液体を戻すための吸引装置を提供する。
【００２４】
好ましくは、検出器１２はシンチレーション検出器であるが、多数の他のタイプの検出器も可能であり、以下を参照されたい。検出器１２からのインパルスを計数するための電子計数器１３、支持体１１の角度位置を調整かつ報告するための制御装置、および計数器１３からのシンチレーションカウンター出力と制御装置１４からの細胞培養皿支持体の角度位置とを同期化するためのコンピューター１５がさらに提供される。
【００２５】
記載したような装置を用いて適切に実施される本発明による方法は、固体支持体の規定部分上に第１の種を付着させることを含む。次に前記第１の種（標的）は、固体支持体の規定部分を被覆できるように、第２の種（リガンド）を含有する液体へ曝露させられる。前記第１の種と前記第２の種との間の相互作用を検出できる測定が実施される。本発明によると、支持体の規定部分を被覆する液体量は前記測定を実施する前に一時的に減少させられる。参照測定は、固体支持体の相互作用が発生しない相違する部分上で実施され、前記部分が参照領域を規定する。
【００２６】
液体の一時的減少は、前記固体支持体と接触している液体の総量を変化させずに少なくとも１つの前記規定領域の近くの液体量の減少を含む。
【００２７】
適切には、標的測定値および参照測定値間の差が計算される。
【００２８】
曝露する工程、液体量を測定および減少させる工程の手順が、好ましくは繰り返され、そして前記工程手順が繰り返される前に前記リガンドの濃度が限定量ずつ増加させられる。
【００２９】
好ましい実施形態では、全規定領域上の相互作用が１分間以内に検出され、そして全相互作用の検出は、好ましくは相互作用の進行を経時的に決定するために少なくとも１５分間にわたり中断せずに繰り返される。
【００３０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、液体量の減少は、支持体を前記支持体の上方部分および下方部分を提供するための水平から傾斜した角度で前記支持体を方向付けることにより達成され、その結果として前記上方部分が下方部分より少量の液体によって被覆され、このとき前記支持体は所定の回転速度で回転させられる。
【００３１】
好ましくは、第１の種は、組織、細胞、細菌、ウイルス粒子から選択され、そして液体中に存在する第２の種は１，０００，０００ｇ／モル未満の総分子量を備える溶解分子または溶解分子の複合体である。
【００３２】
本発明による１つの実施形態によると、４つの主要な特徴を含む装置は、リガンドと標的との間の相互作用についての特性解析のために使用される。すなわち、１つの単一固体支持体上で２つ以上の領域が規定されるが、このとき少なくとも１つの領域は標的を付着させるために用意されており（活性領域とも呼ぶ）、そして少なくとも１つの領域は参照目的のために用意されている。参照領域は、それに付着しているものがない、またはそれに無関係の標的が付着しているのどちらかである。さらに、リガンドを含有する液体が固体支持体と接触させる。各領域上のリガンドの存在および量を検出できる検出システムもまた存在する。固体支持体上に存在する液体を攪拌するための機構が存在する。最後に、規定領域の近くに存在する液体量が検出中に一時的に減少させられることを保証する機構が存在する。
【００３３】
同一液体を活性領域（標的）および参照領域に接触させて活性および参照領域上のリガンドの存在を個別に検出することが可能であるので、活性領域についての検出器出力から参照領域についての検出器出力を減算することによってバックグラウンド補正が得られる。同様に、液体が攪拌されるので、平衡に達するために必要な時間は、固体支持体および液体が静止状態に置かれた場合に比較して短縮されるであろう。
【００３４】
標的とリガンドとの間の相互作用を特性解析するために一般に使用される方法は、洗浄工程を含むことが多い。その目的は、未結合リガンドの存在が検出されることがあるので、標的へ結合していないすべてのリガンドを除去することにある。有益にも、本発明では、参照領域の使用および検出中の液体の一時的減少のために洗浄工程は必要とされない。リガンドの存在は全領域で短時間で定量され、リガンドを含有する液体が一時的に減少させられるので、参照領域はその領域の近くに残留している液体中の未結合リガンドに関連する放射線およびバックグラウンド放射線によって活性領域を模倣するであろう。しかし洗浄工程は、液体中に極めて高濃度のリガンドが存在する場合には感受性を増加させることができる。
【００３５】
洗浄工程が必要とされないので、リガンドを含有する液体は特性解析を通して再使用できる。リガンドが高価である場合は、これは特に重要である。この場合は、低濃度のリガンドを備える液体が固体支持体と接触させる。この第１濃度の特性解析後に、高濃度のリガンドの少量のアリコートが添加される。するとリガンドの全濃度が第２レベルへ増加するので、結合が特性解析される。このプロセスは、所望の濃度が特性解析されるまで繰り返される。
【００３６】
固体支持体は、典型的には容器である。この容器内には、２つ以上の規定領域が存在する。容器内に注入された液体は全規定領域に接触する。少なくとも１つの規定領域は、参照目的で常に用意される。これは、１つのリガンドと数個の標的との間の相互作用を同時に特性解析することを可能にする。また別の可能性は、例えば相違する蛍光色素を相違するリガンド上に付着させ、規定色素に対応する相違する特徴的な発光波長で光強度を検出することによって、相違するリガンドを識別できる検出システムを使用することである。この構成を用いると、数種のリガンドを１つの液体中へ注入することができ、そして１つまたは複数の標的への全リガンドの結合を同時に特性解析することができる。
【００３７】
規定領域上への標的の付着は、様々な方法で実施することができる。細胞は、規定領域上で直接的に増殖させることができよう。規定領域は、細胞の付着を強化することが知られているタンパク質で被覆することができよう。規定領域は、標的を付着させるために使用する特異的分子へ結合することが知られているタンパク質で被覆することができよう。そのようなタンパク質の１つは、ビオチンへ強力に結合するストレプトアビジンである。ビオチン化標的（例、ビオチン化ＤＮＡ）は、次に規定領域への標的として便宜的に付着させることができよう。規定領域の表面は、標的の共有結合を可能にするために化学修飾することができよう。規定領域上への標的の受動的吸着もまた可能である。規定領域の表面は、必ずしも固体および平面ではない。多孔性表面またはバイオポリマー（例、ポリエチレングリコールまたはデキストラン）が付着した表面は、より高度のシグナルを可能にする標的密度上昇のために有益であろう。
【００３８】
固体支持体上の規定領域は、明示的にマーキングする必要はない。増殖中の細胞を標的として使用する場合は、１滴の細胞を固体支持体上に落とし、固体支持体の大半は参照目的で何もない状態で残すことができる。細胞が沈降して固体支持体へ付着し始めた時点に、細胞が乾燥するのを防止するためにより多くの液体（細胞を含まない）を固体支持体へ注意深く添加することができる。低い隆線などの使用によって、固体支持体を規定領域へ物理的に分割することもまた可能である。隆線は、標的の付着中に規定領域以外へ液体が到達することを防止できる程度に高く、しかし測定中に液体を全規定領域へ同時に接触させることができる程度に低くなければならない。
【００３９】
本方法では、数種の相違する検出原理を使用できる。２つの相違するタイプの検出器構成が可能である。つまり固体支持体と物理的に接触している検出器および固体支持体と物理的に接触していない検出器。固体支持体との物理的接触を必要とする検出器原理には、リガンドの電気化学的検出、屈折率測定法によるリガンドの検出が含まれる（が、それらに限定されない）。固体支持体との物理的接触を必要としない検出器原理には、２、３の例を挙げると、放射能の検出、放射光線の検出（例えば、蛍光または化学発光を用いる）、分光光度計による検出が含まれる（が、それらに限定されない）。本方法で使用する検出システムは、時間分解型である。これは、規定領域の検出が少なくとも１０分間毎、好ましくは２０〜６０秒間毎、よりいっそう好ましくは０．１〜２０秒間毎に繰り返されることを意味する。時間分解型測定は、相互作用の動態としても知られる標的へのリガンドの結合速度を監視することを可能にする。
【００４０】
検出中の規定領域の近くにある液体量を一時的に減少させる機構は有益ではあるが必須ではない。本方法は示差的測定（すなわち、活性領域からのシグナル−参照領域からのシグナル）に依拠しており、それ自体は、理論上は、検出中に規定領域の近くに存在する過剰な液体によって影響を受けるはずはない。だが実際には、そのような過剰な液体が一時的に除去されると性能が上昇することがある。問題は、例えば放射能の検出のような一部の検出原理については、検出器の近くにある容量中に存在するリガンドの量が検出されることにある。この容量は、規定領域および規定領域の近くに存在する液体を含む。液体中に存在する未結合リガンドの量は、しばしば標的へ結合したリガンドの量よりはるかに多くなるであろうが、これは検出器が活性領域および参照領域の検出中にほぼ同一の放射能の量を記録するであろうことを意味する。そのような示差的測定についての分解能はときどき低いことがある。この問題は、検出中に固体支持体を被覆する液体量を一時的に減少させることによって克服できる。規定領域上に残留している液体は、次に検出するために十分なリガンドを含有しているであろうが、しかし液体に関連するシグナルの大きさは規定領域と関連するシグナルの大きさに匹敵するであろう。液体中に存在する未結合リガンドからシグナルの有害な影響を回避する現在好ましい方法は、液体を完全に除去することである。リガンドを含有する液体を除去するために使用される最も一般的な方法は、リガンドを含んでいない適切な液体で固体支持体を洗浄する工程である。リガンドが粒子または細胞である場合に適用できるまた別の一般的ではないが可能性のある方法は、固体支持体を遠心分離し、それによって固体支持体の半径方向の最も離れた部分へ未結合リガンドを移動させることである（参照して本明細書に組み込まれる米国特許出願公開公報第２００３／０２２４４５７号に記載されている）。しかし、すべての未結合リガンドを除去することについては短所がある。リガンドと標的との間の相互作用は、典型的には可逆性プロセスである。生体分子相互作用についての単純かつ一般的モデルは、以下の方程式：
【数１】
2007523344.tif 000003
【００４１】
（式中、ＫＤは標的−リガンド相互作用についての平衡解離定数、［Ｔ］は未結合標的の濃度、［Ｌ］は未結合リガンドの濃度、および［ＴＬ］は標的−リガンド複合体の濃度である）によって記載される。固体支持体がリガンドを含有する液体と接触させると、［Ｔ］、［Ｌ］、および［ＴＬ］が方程式１を満たすまで標的−リガンド複合体が形成されるであろう。平衡に達するために必要な時間は、数秒間から数時間まで変動する。逆プロセスは、全未結合リガンドが除去されると、すなわち［Ｌ］が突然にゼロへ設定されると開始するであろう。平衡を再確立するために、標的−リガンド複合体は自然に崩壊するであろう。そこで、測定前に未結合リガンドを除去すると、標的−リガンド複合体の数が測定中に減少して測定に有害な影響を及ぼすであろう。この問題は、文献において、例えば参照して本明細書に組み込まれるＭ  Ｗａｄｈｗａらによる論文の中で考察されている（例えば“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ”，  Ｍ  Ｗａｄｈｗａ，Ｃ  Ｂｉｒｄ，Ｐ  Ｄｉｌｇｅｒ，Ｒ  Ｇａｉｎｅｓ−Ｄａｓ，ａｎｄ  Ｒ  Ｔｈｏｒｐｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７８：１−１７，２００３のセクション２．１．１を参照されたい）。
【００４２】
その代わりに測定中に固体支持体上の規定領域の近くでリガンドを含有する液体量を一時的に減少させることによって、せいぜい［Ｔ］、［Ｌ］、および［ＴＬ］のわずかな調整を導く未結合リガンド濃度におけるせいぜい小さな変化しか生じないであろう。そこで、特に数秒間以内に平衡へ調整する相互作用について、標的−リガンド複合体数がより正確に測定されると予測される。他方、測定が実施される規定領域の近くに残留している液体は、全シグナルに寄与する未結合リガンドを含有するであろう。要約すると、先行技術の方法は未結合リガンドを除去し、標的−リガンド複合体の連続的破壊を容認していた。本発明の方法は、標的−リガンド複合体の破壊が発生するのを防止するが、測定中の規定領域の近くのリガンドを含有する液体の存在を対処しなければならない。
【００４３】
固体支持体上の規定領域の近くの液体量を減少させるための１つの可能性のある方法は、円形固体支持体（例、細胞培養皿）を使用し、固体支持体の周辺に沿って規定領域を配置することである。そのような固体支持体がわずかな傾斜を有して取り付けられた回転ディスク上に置かれると、検出中に最高位置へ規定領域を配置することが可能になる。固体支持体上に存在する液体は、固体支持体の下端に蓄積し、規定領域上のリガンドの定量に重度の影響を及ぼさないであろう。固体支持体上の液体を一時的に移動させるためのまた別の可能性のある方法は、検出中に固体支持体を傾斜させることである。規定領域が固体支持体の一端に置かれてこの端部が検出中に上昇させられると、固体支持体上に存在する液体は他方の端部に蓄積してより確実な検出が可能になるであろう。第３の可能性のある方法は、検出中に固体支持体上の液体を吸引し、後になって固体支持体へ液体を分注し戻すポンプを使用することである。これらの方法全部がさらに固体支持体上に存在する液体の攪拌も提供することは注目に値する。検出中に規定領域上に残留する液体量は、固体支持体が静止状態で水平に配置された場合に規定領域の近くに存在する液体量の１０％未満、好ましくは５％未満、およびいっそうより好ましくは１％未満でなければならない。これは、規定領域に付着させられた標的を含んでいない固体支持体を用いて測定することができ、水平位置にある規定領域からのシグナルを、一時的に除去された液体を用いた検出のための正位置にある同一規定領域からのシグナルと比較できよう。規定領域上のリガンドを備える液体の十分な減少は、バックグラウンドシグナルの寄与に関して規定することができる。検出中の規定領域上にまだ存在する液体は、標的に結合したリガンドから発生する予想されたシグナルのせいぜい１０倍、および好ましくはせいぜい２倍であるバックグラウンドシグナルを生じさせることは容認できる。残留している液体の容認できる量は、除去率に関して容易に表示することはできないが、それは数値が多数のパラメータ（例、リガンドの濃度、相互作用の親和性および固体支持体中の液体の初期量）に依存するからである。典型的な数値として、親和性が約１×１０−８Ｍ、リガンド濃度が１×１０−９Ｍから５×１０−９Ｍの範囲内、固体支持体が直径およそ１０ｃｍのペトリ皿であり、液体量がおよそ２ｍＬである場合は、検出中に０．１〜１％の液体が規定領域上にまだ存在していても相互作用は測定可能であろう。
【００４４】
固体支持体から液体を一時的に除去する方法から攪拌を得られない場合は、攪拌装置が必要になる。この装置は、液体中へ入れられる振動ロッドまたは回転プロペラであってよい。または、液体中の移動を誘導するために固体支持体を繰り返して移動させることもできよう。可能性のある運動には、静かな振動および偏心性回転が含まれる。
【００４５】
本発明による装置の１つの実施形態の物理的構造を図１に例示した。この実施形態のためには、放射標識リガンドが使用されており、これにより標的はリガンドがそれに結合すると放射性になるであろう。本装置は、２つの重要な構成要素を含む。
【００４６】
（ｉ）緩徐に回転できる細胞培養皿支持体１１。
【００４７】
（ｉｉ）細胞培養皿の周辺部分上にのみ存在する相互作用を検出するように取り付けられた時間分解型シンチレーションカウンター１２。
【００４８】
ステッパーモーター１６は細胞培養皿支持体１１へ接続されている。モーターは、細胞培養皿支持体の角度位置を調整かつ報告できる電子装置１４によって制御される。シンチレーション検出器１２は、検出器１２からのインパルス数を計数する電子装置１３へ接続される。細胞培養皿支持体は傾斜しており、シンチレーションカウンターは細胞培養皿支持体の最高点に位置する。シンチレーションカウンターは、１ラウンド中に複数回の活性測定を許容するために高頻度で読み取られる。コンピューター１５は、１３からのシンチレーションカウンター出力と１４からの細胞培養皿支持体の角度位置とを同期化し、活性対角度位置曲線を生成する。
【００４９】
標的、本明細書ではヒト癌細胞は、図１に白色で示されたように、細胞培養皿の限定された区画上でのみ増殖させられる。リガンドを含有する液体、この場合には放射標識されたタンパク質が細胞培養皿へ添加される。リガンドが標的細胞表面上に存在する受容体へ結合することは既知である。培養皿が回転するにつれて、培養皿底部の活性は、あるときは標的細胞を備える領域、あるときは標的細胞を含んでいない領域が持続的に監視される。リガンドが標的細胞に結合すると、放射能の増加は、細胞培養皿の標的細胞領域が検出器を通過した時点にシンチレーションカウンターによって記録されるであろう。
【００５０】
上記で言及した本発明の４つの（主要な）特徴は、以下で説明するように具体化できる。
【００５１】
固体支持体、すなわち細胞培養皿は、その上に標的細胞を備える限定された領域を有する。細胞培養皿の残りの領域は、参照目的に使用される。検出器は、細胞培養皿の周辺部分に取り付けられている。細胞培養皿が回転すると、放射能が頻回に記録される。これは、細胞培養皿周辺上の位置に対する放射能度（すなわち、リガンドの量）をプロットすることを可能にする。攪拌は、細胞培養皿を非水平に取り付けることによって得られる。細胞培養皿が回転すると、液体は細胞培養皿とは相違する速度で回転し始めるであろう。液体の一時的な除去は、細胞培養皿を非水平に取り付けることによっても得られる。検出器は、最小量の液体が存在する地点である細胞培養皿の最高地点の近くへ取り付けられる。
【００５２】
以下では、本発明の非限定的実施例により本発明の背後にある原理を具体的に説明する。
【００５３】
実施例１
直径１０ｃｍの円形細胞培養皿の４分の１の上で増殖させたＵ３４３細胞を用いて上述した機器を試験した。培養皿は、分当たり約６回の速度で回転させた。細胞皿にとって適正な回転速度を選択することが重要である。培養皿の回転が速すぎると、培養皿中に存在する液体が培養皿の下端に蓄積する時間がなくなるので、検出器の近くの液体の一時的除去は不良になるであろう。回転が遅すぎると、活性領域および参照の測定値は、示差的測定を正当化するには測定間隔が開きすぎる。本実施例における機器にとって適正な回転速度は、分当たり約１回から秒当たり約１回の範囲に及ぶ。１２５Ｉを用いて標識した、ＥＧＦ（上皮成長因子）を含有する２ｍＬの液体は、濃度を上昇させながら細胞培養皿へ添加した。ＥＧＦはＥＧＦ受容体へ結合することが知られており、そしてＵ３４３細胞はそれらの表面上に高レベルのＥＧＦ受容体を有することが知られている。放射能は、１回転に付き約２０回の測定を行えるように秒当たり少なくとも２回測定した。ＥＧＦは細胞へ結合することが知られているので、測定された放射能は、標的細胞を保持する細胞培養皿の領域を検出器が通過する時点には他の時点に比較して高くなるであろう。これは、培養皿の角速度および細胞へ結合するＥＧＦの量による振幅によって期間が決定される連続波様時系列を生じさせる。
【００５４】
図２では、１つは低濃度のＥＧＦおよび１つは高濃度のＥＧＦの２つの時系列がプロットされている。図２のｙ軸は、秒当たり単位カウント（ｃｐｓ）、すなわち秒当たり１２５Ｉ崩壊数を示している。低濃度では、時系列において明白なパターンは存在しない。これは、標的細胞へ結合したＥＧＦの量が極めて少ないことを意味している。高濃度では、きれいな波様パターンが出現し、実際的に細胞が存在する細胞培養皿の部分へＥＧＦが特異的に結合することを証明している。精度を上昇させるために、各濃度のＥＧＦについて３〜６分間の時系列を得た。次に時系列中の全ピークを同定し、頂点間フラグメントを切り取り、オーバーレイし、図３に略述したように平均化した。矢印で示したように、太い平均線の振幅を測定値についてのシグナルとして使用した。
【００５５】
Ｕ３４３細胞へ結合する放射標識ＥＧＦについての結合曲線を収集するために、放射標識ＥＧＦの８種の濃度を機器中に挿入された１つの細胞培養皿へ添加した。操作順序は以下のとおりであった：
１．４ｍＬの培地＋放射標識ＥＧＦを添加する。培養皿を５００秒間回転させる。
【００５６】
２．濃度決定を可能にするために、培地＋放射標識ＥＧＦ液の２００μＬのアリコートを取り出す。
【００５７】
３．４〜８ｍＬの培地で細胞培養皿を洗浄する（この工程は低い方の３種の濃度については省略した）。
【００５８】
４．４ｍＬの培地を添加する。５００秒間中の放射能（時間分解）を記録する。
【００５９】
５．放射標識ＥＧＦを濃度を上昇させながら用いて工程１〜４を繰り返す。
【００６０】
各サンプルについてのシグナルは、上述したように頂点間フラグメントをオーバーレイし、平均化し、波振幅を抜き出す工程によって決定した。シグナル対濃度のプロット図は図４に見いだされる。これは、明らかに結合実験から予測されたＳ字状曲線に似ている。最初の３つのサンプルは洗浄工程（上記の操作順序における３）を含めずに直接的に測定したので、これはサンプル３とサンプル４との間の不連続性の理由である。
【００６１】
実施例２
類似の実験において、Ａ４３１細胞を８ｃｍ細胞培養皿上の限定された領域で増殖させた。Ａ４３１細胞は、表面上で高レベルのＥＧＦ受容体も有する。この実験における操作順序は以下のとおりであった：
１．２ｍＬの細胞培養培地＋放射標識ＥＧＦを添加する。培養皿を７００秒間回転させる。
【００６２】
２．さらに２００秒間にわたり細胞培養皿の回転を継続するが、同様に放射能（時間分解）を記録する。
【００６３】
３．濃度決定を可能にするために、培地＋放射標識ＥＧＦ液の２００μＬのアリコートを取り出す。
【００６４】
４．約４ｍＬの培地で細胞培養皿を洗浄する。
【００６５】
５．２ｍＬの培地を添加する。２００秒間中の放射能（時間分解）を記録する。
【００６６】
６．放射標識ＥＧＦを濃度を上昇させながら用いて工程１〜５を繰り返す。
【００６７】
洗浄前後の各濃度についてのシグナルを上述したように引き出し、図５にプロットした。このとき、ひし形は洗浄前の測定（工程２）に対応し、丸は洗浄後の測定（工程５）に対応する。洗浄の前後に測定された数値は概ね一致するので、妥当な測定値を得るための洗浄は必要としなかった。相互作用の親和性は、方程式
【数２】
2007523344.tif 000004
【００６８】
の式中のＳｍａｘおよびＫＤを測定されたデータへあてはめることによって決定できよう。方程式２では、Ｓはリガンド濃度ｃｏｎｃについて測定されたシグナルであり、Ｓｍａｘは規定領域内の標的の結合能力であり、そしてＫＤは相互作用の親和性である。この方法は、参照して本明細書に組み込まれる、以前にＫａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ．、Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、Ｒ．１９９５、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｓｐｏｔ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｌｏｗ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：２７４−２８０によって記載されている。計算された親和性値はＫＤ＝３．７ｎＭであり、計算された結合能力は５５ＣＰＳであった。計算された親和性値は文献に記載された数値と相当に一致している：０．３ｎＭ〜７ｎＭの範囲に及ぶＥＧＦ−ＥＧＦ受容体相互作用についての親和性は、参照して本明細書に組み込まれるＳｕｎｄｂｅｒｇ  Ａ．Ｌ．、Ａ．Ｏｒｌｏｖａ、Ａ．Ｂｒｕｓｋｉｎ、Ｌ．Ｇｅｄｄａ、Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｅ．Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ、Ｈ．Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ、Ｖ．Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ．、２００３年、［（１１１）Ｉｎ］  Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｈＥＧＦ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１８（４）：６４３−５４の中の表１に要約されているように報告されている。
【００６９】
本発明を、本発明者が現在知っている最良の態様を構成するその好ましい実施形態に関して説明してきたが、当業者には明白であるように、添付の特許請求の範囲で記載した本発明の範囲から逸脱せずに様々な変更および修飾を加えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】１つの考えられる機器設計の略図である。
【図２ａ】極めて低濃度のリガンドを用いて獲得したデータを示している。
【図２ｂ】高濃度のリガンドを用いて獲得したデータを示している。
【図３ａ】獲得したデータを評価する前の処理方法を示している。
【図３ｂ】獲得したデータを評価する前の処理方法を示している。
【図４】相違する濃度のリガンドが相違するシグナルを発生する方法を示している。
【図５】相違する濃度のリガンドが、洗浄工程を用いて、および用いずに各々得られる相違するシグナルを発生する方法を示している。
【図１】
2007523344.tif 000005
【図２ａ】
2007523344.tif 000006
【図２ｂ】
2007523344.tif 000007
【図３ａ】
2007523344.tif 000008
【図３ｂ】
2007523344.tif 000009
【図４】
2007523344.tif 000010
【図５】
2007523344.tif 000011
【国際調査報告】
2007523344.tif 000012
2007523344.tif 000013
2007523344.tif 000014