(57)【要約】  本発明は、動物におけるＩｇＡ関連障害に対する感受性を決定するための方法に関し、該方法は：ａ）動物由来のサンプルに存在するＩｇＡ対立遺伝子変異体または各ＩｇＡ対立遺伝子変異体を同定すること；およびｂ）それによって、動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定することを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物におけるＩｇＡ関連障害に対する感受性を決定するための方法であって：
ａ）動物由来のサンプルに存在するＩｇＡ対立遺伝子変異体または各ＩｇＡ対立遺伝子変異体を同定すること；および
ｂ）それによって、前記動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
動物がイヌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩｇＡ関連障害が胃腸疾患、皮膚病、呼吸器系疾患、リウマチ様疾患または歯周病である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
疾患が下痢、小腸細菌異常増殖、炎症性腸疾患、肛門周囲瘻、アトピー性皮膚炎、膿皮症、肛門フルンケル症、マラセチア感染症（malasessia infestans）または播種性アスペルギルス症である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対立遺伝子変異体の同定が、ＩｇＡ対立遺伝子変異体のヒンジ領域における１つもしくはそれ以上の多型、またはそのような多型を伴う連鎖不平衡において存在する多型を検出することを含んでなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多型が、配列番号１に対して以下の位置：
・１７９位［Ｃ／Ｔ］；
・３７０位［Ｔ／Ｃ］；
・３７１位［Ｔ／Ｃ］；
・３７２位［Ｃ／Ｇ］；
・３７５位［Ｇ／Ｔ］；
・５１４〜５４６位［ＣＴの反復数］；
・５４７位［Ｔ／Ａ］；
・５６３位［Ａ／Ｔ］；
・５６３〜５７１位［欠失］；
・５７６〜５７８位［付加］；
・５８２位［Ｃ／Ｔ］；
・５８３位［Ａ／Ｇ］；
・５８４位［Ｔ／Ａ］；
・５９２位［Ｇ／Ａ］；または
・６０６位［Ｇ／Ａ］；
のいずれか１つに存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの変異体Ｃ対立遺伝子の存在がＩｇＡ関連障害に対する感受性を示す、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）が、ＩｇＡ対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドと、対立遺伝子変異体に対する特異的結合因子とを接触させること、および前記因子が前記ポリヌクレオチドに結合するかどうかを決定することを含んでなり、ここで、前記因子の前記ポリヌクレオチドへの結合が対立遺伝子変異体の存在を示す、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
因子が、ＩｇＡ対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドに結合することが可能であるが、異なるＩｇＡ対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドには結合しないポリヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）が、ＩｇＡ対立遺伝子変異体ポリペプチドと、対立遺伝子変異体に対する特異的結合因子とを接触させること、および前記因子が前記ポリペプチドに結合するかどうかを決定することを含んでなり、ここで、前記因子の前記ポリペプチドへの結合が対立遺伝子変異体の存在を示す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
対立遺伝子変異体が、ゲル電気泳動中のＩｇＡ対立遺伝子変異体ポリペプチドまたはＩｇＡ対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドの移動度を測定することによって検出される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＩｇＡ対立遺伝子変異体を検出することが可能であるプローブ、プライマーまたは抗体。
【請求項１３】
ＩｇＡ対立遺伝子変異体を検出するための手段を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１４】
請求項１２に記載のプローブ、プライマーまたは抗体を含んでなる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のためにカスタマイズされた食物を調製するための方法であって：
（ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって、動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること；および
（ｂ）前記動物に適切な食物を調製すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
カスタマイズされた動物用食物が、ＩｇＡ関連障害を防止もしくは緩和する成分を含んでなり、および／またはＩｇＡ関連障害の一因となるかもしくは悪化する成分を含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
カスタマイズされた動物用食物が、β−グルカン、グルタミン、プロバイオティクス、オリゴ糖、外因性ＩｇＡ、低アレルギー性タンパク質、加水分解タンパク質、ビタミンＣ、タウリン、クルクミン、アロエベラ（aloe vera）、ルテイン、リコピン、β−カロテン、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
動物、動物の所有者または動物に給餌することを担う人に食物を提供することをさらに含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物に適した食物を、動物、動物の所有者または動物に給餌することを担う人に提供することを含んでなり、ここで、前記動物はＩｇＡ関連障害にかかり易いことが遺伝子的に決定されている、カスタマイズされた動物用食物を提供する方法。
【請求項２０】
ＩｇＡ関連障害の処置のための因子を同定するための方法であって：
（ａ）ＩｇＡ対立遺伝子変異体ポリペプチドまたはＩｇＡ対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドと、試験因子とを接触させること；および
（ｂ）前記因子が前記ポリペプチドに結合するか、あるいは前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性もしくは発現を調節することが可能であるかどうかを決定すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によってＩｇＡ関連障害にかかり易いことが同定されている動物のＩｇＡ関連障害の防止または処置のための薬剤の製造におけるＩｇＡ関連障害に対して治療上有効である化合物の使用。
【請求項２２】
ＩｇＡ関連障害について動物を処置する方法であって、障害を防止または処置する有効量の治療化合物を動物に投与することを含んでなり、ここで、前記動物は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって、ＩｇＡ関連障害にかかり易いことが同定されている、前記方法。
【請求項２３】
ＩｇＡ対立遺伝子変異体、および場合により、それらのＩｇＡ関連障害との関連に関する情報を含んでなる、データベース。
【請求項２４】
動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定するための方法であって：
（ａ）動物に存在する１つもしくはそれ以上のＩｇＡ対立遺伝子変異体のデータをコンピュータシステムに入力すること；
（ｂ）前記データをコンピュータデータベースと比較することであって、該データベースは、ＩｇＡ対立遺伝子変異体および変異体と関連するＩｇＡ関連障害感受性に関する情報を含んでなり；および
（ｃ）比較に基づいて、前記動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項２５】
ＩｇＡ対立遺伝子変異体が、請求項６または７において規定された通りである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プログラムをコンピュータ上で稼動させる場合に、請求項２４に記載のすべての工程を実施するためのプログラムコード手段を含んでなる、コンピュータプログラム。
【請求項２７】
プログラム製品をコンピュータ上で稼動させる場合に、請求項２４に記載の方法を実施するためのコンピュータ読み取り可能な媒体上に記憶されたプログラムコード手段を含んでなる、コンピュータプログラム製品。
【請求項２８】
搬送波上にプログラムコード手段を含んでなるコンピュータプログラム製品であって、該プログラムコード手段は、コンピュータシステム上で実行される場合、請求項２４に記載の方法を実施するようにコンピュータシステムを指示する、前記製品。
【請求項２９】
（ａ）動物に存在する１つもしくはそれ以上のＩｇＡ対立遺伝子変異体のデータを受け取るための手段；
（ｂ）前記データと、ＩｇＡ対立遺伝子変異体および変異体に関連するＩｇＡ関連障害感受性に関する情報を含んでなるデータベースとを比較するためのモジュール；および
（ｃ）前記比較に基づいて、前記動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定するための手段、
を含んでなる、請求項２４に記載の方法を実施するために配置されたコンピュータシステム。
【請求項３０】
ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のためにカスタマイズされた食物を調製するための方法であって：
（ａ）請求項２４に記載の方法によって、動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること；
（ｂ）前記動物に適したカスタマイズされた動物用食物の処方を電子的に作成すること；
（ｃ）カスタマイズされた動物用食物の処方に従って、食物製造装置の操作を制御するための電子製造指示書を作成すること；および
（ｄ）前記電子製造指示書に従って、カスタマイズされた動物用食物を製造すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項３１】
（ｄ）前記動物に適したカスタマイズされた動物用食物の処方を電子的に作成するための手段；
（ｅ）カスタマイズされた動物用食物の処方に従って、食物製造装置の操作を制御するための電子製造指示書を作成するための手段；および
（ｆ）食品製造装置
をさらに含んでなる、請求項２９に記載のコンピュータシステム。
【請求項３２】
カスタマイズされた動物用食品を作製するために請求項３１において規定されるコンピュータシステムの使用。
【請求項３３】
（ａ）請求項６において規定される１つもしくはそれ以上の多型位置で配列番号１と異なるＩｇＡ変異体配列；
（ｂ）配列番号３、５、７または９のいずれか１つ；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）において規定される配列に相補的であるかまたは遺伝子暗号の結果として縮重である配列；あるいは
（ｄ）請求項６において規定される１つもしくはそれ以上の多型位置で配列番号１と異なり、少なくとも１０ヌクレオチド長である（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のフラグメント；
を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３４】
（ａ）請求項３３に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
（ｂ）配列番号４、６、８または１０のいずれか１つ；あるいは
（ｃ）請求項６において規定される１つもしくはそれ以上の多型位置で配列番号２と異なり、少なくとも１０アミノ酸長である（ａ）または（ｂ）に記載のフラグメント；
を含んでなるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
対立遺伝子変異体
本発明は、動物におけるＩｇＡ関連障害、例えば、胃腸疾患、皮膚病および呼吸器系疾患の診断および処置、ならびに新規のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャーマン・シェパード品種のイヌは、小腸細菌異常増殖および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む多くの炎症性ならびに免疫介在性消化器系疾患に特にかかり易い。ジャーマン・シェパード・ドッグ（ＧＳＤ）はまた、コントロール集団と比較して減少した濃度の血清ＩｇＡに基づき、相対的ＩｇＡ欠損症（relative IgA deficiency）を有することも報告されている。ＩｇＡ濃度における同様の差異は、他の品種のイヌと比較した場合のこの品種の涙液、十二指腸液、十二指腸外植片培養培地および排泄物において報告されている。減少した濃度のＩｇＡは、正常なイヌと比較して、小腸細菌異常増殖を伴うＧＳＤ由来の十二指腸液において見出されており、慢性の下痢を伴うＧＳＤ由来の２４時間十二指腸外植片由来の組織培養上清は、罹患した他の品種のイヌ由来の外植片より少ないＩｇＡを産生する。しかし、同じ集団において、十二指腸粘膜固有層内のＩｇＡ+形質細胞またはＣＤ４+Ｔ細胞の数に差異は認められなかった。
【０００３】
ＩｇＡは、粘膜部位の免疫防御において重要な役割を果たし、他の免疫グロブリンのクラスよりはるかに過剰な濃度で分泌される。これに関して、ＩｇＡは、微生物によるコロニー化および侵入を防止し、細菌毒素を中和し、上皮下粘膜固有層由来の抗原の排除に関与する。胃腸管の免疫学的防御、および粘膜免疫の不全に特に関連するＩｇＡ分子は、ヒトおよび他の種において生じるある範囲の特発性炎症性腸疾患の一因となる。複数のＩｇＡサブクラスが、ヒト、霊長類およびウサギ目において同定されているが、マウス、ウシおよびイヌは単一のサブクラスしか有さない。２種のヒトサブクラス（ＩｇＡ1およびＩｇＡ2）は、ＣＨ1およびＣＨ2ドメイン間のヒンジ領域の長さの差異によって規定される。イヌにおいて同定される単一のＩｇＡサブクラスは、ヒトのＩｇＡ1サブクラスに類似の予想されたアミノ酸配列を伴うヒンジ領域を有する。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明者らは、イヌが複数のＩｇＡ対立遺伝子変異体を有することを示した。これらの変異体は、原則として、α重鎖遺伝子の第２のエキソンの５’末端部、分子のヒンジ領域に対応する領域内が異なる。ＩｇＡに延長したヒンジ領域が存在すると、プロテアーゼによる切断をより受け易くなる。従って、変異体間のヒンジの長さの差異および組成は、それらがコードするＩｇＡ分子の機能に重要な影響を及ぼす。これらの差異は、ヒンジ領域を切断することができるプロテアーゼを産生する病原体によって生じる疾患に対して増加した感受性を有する所定の遺伝子型を生じる。
【０００５】
従って、本発明は、動物におけるＩｇＡ関連障害に対する感受性を決定するための方法を提供し、該方法は
ａ）動物由来のサンプルに存在するＩｇＡ対立遺伝子変異体または各ＩｇＡ対立遺伝子変異体を同定すること；および
ｂ）それによって、前記動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること、を含んでなる。本発明は、さらに以下のものを提供する：
・ＩｇＡ対立遺伝子変異体を検出することが可能であるプローブ、プライマーまたは抗体；
・ＩｇＡ対立遺伝子変異体を検出するための手段を含んでなる本発明の方法を行うためのキット；
・ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のためにカスタマイズされた食物を調製するための方法であって、該方法は以下を含んでなる：
（ａ）本発明の方法によって、動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること；および
（ｂ）前記動物に適切な食物を調製すること；
・ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物に適した食物を、動物、動物の所有者または動物に給餌することを担う人に提供することを含んでなり、ここで、前記動物はＩｇＡ関連障害にかかり易いことが遺伝子的に決定されている、カスタマイズされた動物用食物を提供する方法；
・ＩｇＡ関連障害の処置のための因子を同定するための方法であって、該方法は以下を含んでなる：
（ａ）ＩｇＡ対立遺伝子変異体ポリペプチドまたはＩｇＡ対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドと、試験因子とを接触させること；および
（ｂ）前記因子が前記ポリペプチドに結合するか、あるいは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドの活性もしくは発現を調節することが可能であるかどうかを決定すること；
・本発明の方法によってＩｇＡ関連障害にかかり易いことが同定されている動物のＩｇＡ関連障害の防止または処置のための薬剤の製造におけるＩｇＡ関連障害に対して治療上有効である化合物の使用；
・ＩｇＡ関連障害について動物を処置する方法であって、該方法は、障害を防止または処置する有効量の治療化合物を動物に投与することを含んでなり、ここで、前記動物は、本発明の方法によって、ＩｇＡ関連障害にかかり易いことが同定されている；
・ＩｇＡ対立遺伝子変異体、および場合により、それらのＩｇＡ関連障害との関係に関する情報を含んでなる、データベース；
・動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定するための方法であって、該方法は以下を含んでなる：
（ａ）動物に存在する１つもしくはそれ以上のＩｇＡ対立遺伝子変異体のデータをコンピュータシステムに入力すること；
（ｂ）前記データをコンピュータデータベースと比較することであって、該データベースは、ＩｇＡ対立遺伝子変異体および変異体と関連するＩｇＡ関連障害感受性に関する情報を含んでなり；および
（ｃ）前記比較に基づいて、動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること；
・コンピュータシステム上で実行される場合、本発明に従う方法を実行するようにコンピュータシステムを指示するプログラムコード手段を含んでなるコンピュータプログラム；
・本発明に従うコンピュータプログラムを記録しているコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を含んでなるコンピュータプログラム製品；
・搬送波上にプログラムコード手段を含んでなるコンピュータプログラム製品であって、該プログラムコード手段は、コンピュータシステム上で実行される場合、本発明の方法を実施するようにコンピュータシステムを指示する前記製品；
・本発明の方法を実施するために配置されたコンピュータシステムであって、以下のものを含んでなる：
（ａ）動物に存在する１つもしくはそれ以上のＩｇＡ対立遺伝子変異体のデータを受け取るための手段；
（ｂ）前記データと、ＩｇＡ対立遺伝子変異体および変異体に関連するＩｇＡ関連障害感受性に関する情報を含んでなるデータベースとを比較するためのモジュール；および
（ｃ）前記比較に基づいて、前記動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定するための手段；
・ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のためにカスタマイズされた食物を調製するための方法であって、該方法は以下を含んでなる：
（ａ）請求項２３に記載の方法によって、動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること；
（ｂ）前記動物に適したカスタマイズされた動物用食物の処方を電子的に作成すること；
（ｃ）前記カスタマイズされた動物用食物の処方に従って、食物製造装置の操作を制御するための電子製造指示書を作成すること；および
（ｄ）前記電子製造指示書に従って、カスタマイズされた動物用食物を製造すること；
・カスタマイズされた動物食品を作製するための本発明のコンピュータシステムの使用。
・以下のものを含んでなる単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）本明細書において規定される１つもしくはそれ以上の多型位置で配列番号１と異なるＩｇＡ変異体配列；
（ｂ）配列番号３、５、７または９のいずれか１つ；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）において規定される配列に相補的であるかまたは遺伝子暗号の結果として縮重である配列；あるいは
（ｄ）請求項５において規定される１つもしくはそれ以上の多型位置で配列番号１と異なり、少なくとも１０ヌクレオチド長である（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のフラグメント；および
・以下のものを含んでなるポリペプチド：
（ａ）本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
（ｂ）配列番号４、６、８または１０のいずれか１つ；あるいは
（ｃ）請求項５において規定される１つもしくはそれ以上の多型位置で配列番号２と異なり、少なくとも１０アミノ酸長である（ａ）または（ｂ）に記載のフラグメント。
【０００６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、イヌＩｇＡα鎖のポリヌクレオチド配列を示し、エキソン１の発端部から開始する。配列番号２は対応するポリペプチド配列を示す。
【０００７】
配列番号３および４はイヌＩｇＡα鎖の変異体Ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を示す。
【０００８】
配列番号５および６はイヌＩｇＡα鎖の変異体Ｂのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を示す。
【０００９】
配列番号７および８はイヌＩｇＡα鎖の変異体Ｃのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を示す。
【００１０】
配列番号９および１０はイヌＩｇＡα鎖の変異体Ｄのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を示す。
【００１１】
配列番号１１〜１７はプライマーおよびプローブ配列を示す。
【００１２】
配列番号１８はジェンバンク（GenBank）配列Ｌ３６８７１（イヌＩｇＡα鎖ポリヌクレオチド配列）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ＩｇＡ抗体の主な機能的役割は、上皮表面を感染因子から保護することである。従って、ＩｇＡ合成および分泌の主要部位は消化管、呼吸上皮、授乳期乳房ならびに他の外分泌腺、例えば、唾液および涙腺である。ＩｇＡ抗体は、上皮を横切って消化管の管腔のような部位に選択的に輸送され、毒素およびウイルスを中和し、腸管上皮を横切る細菌の進入を遮断する。ＩｇＡ抗体はまた、母乳（初乳）においても分泌され、新生児の消化管に移され、疾患に対する保護を提供する。
【００１４】
ＩｇＡ分子は２本の軽鎖および２本の重（α）鎖よりなる。重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶH）および３つの定常ドメイン（ＣH１、ＣH２およびＣH３）に分けられる。重鎖はまた、ＣH１およびＣH２ドメイン間に局在するヒンジ領域として知られるポリペプチド鎖の可撓性ストレッチを含んでなる。ヒンジ領域の可撓性は、抗体分子の両腕を、異なる距離で離れている部位に結合させるのに必要であり、また、免疫エフェクター機構を仲介する抗体結合タンパク質との相互作用にも必要である。
【００１５】
本発明者らは、イヌＩｇＡの４種の新規の対立遺伝子変異体（アロタイプ）を同定した。これらの変異体は、α重鎖遺伝子、特に、ヒンジのコーディング領域の配列が異なる。これらの差異により、各対立遺伝子変異体間のヒンジの長さにばらつきが生じる。このばらつきは、一部に、配列番号１について５４７位の第２のエキソンに対するスプライスアクセプターにおける一塩基多型の存在による。５４７位のデオキシスレオニン（deoxythreonine）（Ｔ）の存在により、短いヒンジ変異体、例えば変異体ＡおよびＢが生じる。５４７位のデオキシアデノシン（Ａ）の存在により、スプライスアクセプター部位が廃止され、従って、長いヒンジ変異体、例えば、変異体ＣおよびＤが生じる。ヒンジの長さのばらつきはまた、本明細書において考察されるように、ヒンジのコーディング領域における他の配列の差異によっても生じる。
【００１６】
ＩｇＡに延長したヒンジ領域が存在すると、プロテアーゼによる切断をより受け易くなる。多様な病原体がＩｇ分子のヒンジ領域を切断することができるプロテアーゼを分泌する。従って、動物におけるＩｇＡの長いヒンジ変異体の存在は、そのような病原体によって生じる疾患、例えば、胃腸疾患、皮膚病および呼吸器系疾患に対する感受性を生じ得る。
【００１７】
従って、本発明は、動物におけるＩｇＡ関連障害に対する感受性を決定するための方法を提供し、該方法は：
ａ）動物由来のサンプルに存在するＩｇＡ対立遺伝子変異体または各ＩｇＡ対立遺伝子変異体を同定すること；および
ｂ）それによって、前記動物がＩｇＡ関連障害にかかり易いかどうかを決定すること、を含んでなる。
【００１８】
ＩｇＡ関連障害は、ＩｇＡ欠損症または不全症に関連する任意の疾患、状態または障害であり得る。そのような障害は、典型的に、免疫関連障害または任意の上皮における細菌異常増殖障害であり、ここで、ＩｇＡは、消化管、皮膚または呼吸上皮などにおいて分泌される。従って、ＩｇＡ関連障害は、典型的に、胃腸疾患、皮膚病、呼吸器系疾患、リウマチ様疾患または歯周病である。詳細には、疾患は、下痢、小腸細菌異常増殖、炎症性腸疾患、肛門周囲瘻、アトピー性皮膚炎、膿皮症、肛門フルンケル症、マラセチア感染症（malasessia infestans）または播種性アスペルギルス症であり得る。
【００１９】
試験される動物は、典型的に、哺乳動物、好ましくは、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシまたはヒツジである。動物はコンパニオンアニマルまたはペットであってもよい。好適な実施形態では、試験される動物はイヌである。試験されるイヌは、いずれの品種であってもよく、あるいはミックスもしくはクロスブレッド（crossbred）のイヌ、またはアウトブレッド（outbred）のイヌ（雑種）であってもよい。イヌは、ＩｇＡ欠損症の傾向がある品種、例えば、ジャーマン・シェパード・ドッグ、ビーグル、コッカー・スパニエル、アイリッシュ・ウルフハウンド、ロットワイラーまたはシャー・ペイであってもよい。あるいは、試験されるイヌは、特に皮膚病にかかり易い品種、例えば、シャー・ペイ、ウェスト・ハイランド・ホワイトテリア、ラブラドール・レトリバー、ジャーマン・シェパード・ドッグもしくはゴールデン・レトリバー、または歯周病にかかり易いことが公知である品種、例えば、マルチーズ・テリア、シー・ズー、ヨークシャー・テリア、プードルおよび他の小型の品種のイヌであってもよい。
【００２０】
１つの実施形態では、試験されるイヌは、胃腸疾患にかかり易い品種、例えば、ボクサー、スタンダードプードル、ラブラドール・レトリバー、ゴールデンレトリバーまたはアイリッシュ・ウルフハウンドである。ジャーマン・シェパード・ドッグ（アルザチアン（Alsatian）としても公知である）は、特に、多くの胃腸疾患にかかり易い。従って、好適な実施形態では、本発明の方法によって試験されるイヌはジャーマン・シェパード・ドッグ（ＧＳＤ）品種である。別の態様では、イヌは、ジャーマン・シェパード・ドッグ品種と１つもしくはそれ以上の他の品種との組み合わせの結果である、クロスブレッドまたはアウトブレッドのイヌであってもよい。
【００２１】
本発明の１つの実施形態では、ＩｇＡ対立遺伝子変異体の同定は、ＩｇＡ対立遺伝子変異体のヒンジ領域における１つもしくはそれ以上の多型、またはそのような多型を伴う連鎖不平衡にある多型を検出することを含んでなる。好ましくは、そのような多型は、配列番号１について以下の位置のいずれか１つにある：
・１７９位［Ｃ／Ｔ］；
・３７０位［Ｔ／Ｃ］；
・３７１位［Ｔ／Ｃ］；
・３７２位［Ｃ／Ｇ］；
・３７５位［Ｇ／Ｔ］；
・５１４〜５４６位［ＣＴの反復数］；
・５４７位［Ｔ／Ａ］；
・５６３位［Ａ／Ｔ］；
・５６３〜５７１位［欠失］；
・５７６〜５７８位［付加］；
・５８２位［Ｃ／Ｔ］；
・５８３位［Ａ／Ｇ］；
・５８４位［Ｔ／Ａ］；
・５９２位［Ｇ／Ａ］；または
・６０６位［Ｇ／Ａ］。
【００２２】
本発明者らは、非特異的食餌感受性と１つもしくはそれ以上の変異体Ｃ対立遺伝子の存在との間の関係を同定した。従って、好適な別の実施形態では、動物は、１つもしくはそれ以上のＣ変異体対立遺伝子の存在について試験され、ここでは、少なくとも１つの変異体Ｃ対立遺伝子の存在はＩｇＡ関連障害に対する感受性を示す。
【００２３】
動物は、好ましくは、ＩｇＡ関連障害の任意の症状が検出され得る前に、試験される。従って、ＩｇＡ関連障害の発達または発症を防止することを可能にするために、試験を使用して、動物における疾患に対する感受性を検出することができる。そのような防止作用は、医学的処置、食餌への介入または本明細書において考察されるようなＩｇＡ関連障害を防止もしくは処置する他の任意の手段に関係し得る。しかし、試験を使用して、動物におけるＩｇＡ関連障害の診断を援助または確認することができる。
【００２４】
対立遺伝子変異体の検出
本発明に従う対立遺伝子変異体の検出は、動物のＩｇＡポリヌクレオチドまたはタンパク質と、ＩｇＡ変異体に対する特異的結合因子とを接触させること、および前記因子がポリヌクレオチドまたはタンパク質に結合するかどうかを決定することを含んでなることができ、ここで、前記因子の結合はＩｇＡ変異体の存在を示し、因子の結合の欠如はＩｇＡ変異体の不在を示す。
【００２５】
当該方法は、一般に、動物由来のサンプルに対してインビトロで行われる。サンプルは、典型的に、個体の体液および／または細胞を含んでなり、例えば、綿棒、例えば、口腔用綿棒を使用して入手することができる。サンプルは、血液、尿、唾液、皮膚、頬細胞または毛根サンプルであってもよい。サンプルは、典型的に、該方法が行われる前に処理され、例えば、ＤＮＡ抽出を行うことができる。サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、物理的または化学的のいずれか、例えば、適切な酵素を使用して、切断することができる。１つの実施形態では、サンプル中のポリヌクレオチドの部分は、対立遺伝子変異体を検出する前に、例えば、クローニングによってか、もしくはＰＣＲに基づく方法を使用して、コピーまたは増幅される。
【００２６】
本発明では、１つもしくはそれ以上の任意の方法が動物における１つもしくはそれ以上のＩｇＡ変異体の有無を決定することを含んでなり得る。ＩｇＡ変異体は、動物のポリヌクレオチドまたはタンパク質における多型配列の存在を直接決定することによって、典型的に検出される。そのようなポリヌクレオチドは、典型的にゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。対立遺伝子変異体は、適切な任意の方法、例えば、以下に記述するような方法によって、検出することができる。
【００２７】
特異的結合因子は、対立遺伝子変異体を有するタンパク質またはポリペプチドには好適もしくは高い親和性で結合するが、他のポリペプチドまたはタンパク質には結合しないかもしくは低い親和性でしか結合しない因子である。特異的結合因子は、プローブであったもまたはプライマーであってもよい。プローブは、タンパク質（例えば、抗体）であってもまたはオリゴヌクレオチドであってもよい。プローブは、標識され得るか、または間接的に標識することが可能であり得る。プローブのポリヌクレオチドまたはタンパク質への結合を使用して、プローブあるいはポリヌクレオチドまたはタンパク質のいずれかを固定化することができる。
【００２８】
一般に、該方法では、ＩｇＡ変異体に対する因子の結合の決定は、動物のポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する因子の結合を決定することによって行うことができる。しかし、１つの実施形態では、因子はまた、例えば、対立遺伝子変異体位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結合することによって、対応する野生型配列に結合することが可能であるが、野生型配列に対する結合の様式は、対立遺伝子変異体を含有するポリヌクレオチドまたはタンパク質の結合とは検出可能な程度に異なる。
【００２９】
当該方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用するオリゴヌクレオチド連結アッセイに基づき得る。これらのプローブは、対立遺伝子変異体を含有するポリヌクレオチド上の隣接領域に結合し、結合後、適切なリガーゼ酵素によって２つのプローブを共に連結させることが可能である。しかし、プローブのうちの一方にただ１つのミスマッチが存在しても、結合および連結が破壊され得る。それ故、連結されたプローブは、対立遺伝子変異体を含有するポリヌクレオチドを伴う場合にのみ生じ、従って、連結された産物の検出を使用して、対立遺伝子変異体の存在を決定することができる。
【００３０】
１つの実施形態では、プローブは、ヘテロ二重鎖分析に基づくシステムにおいて使用される。そのようなシステムでは、プローブが対立遺伝子変異体を含有するポリヌクレオチド配列に結合する場合、プローブは、対立遺伝子変異体が発生し、従って、二本鎖構造を形成しない部位で、ヘテロ二重鎖を形成する。そのようなヘテロ二重鎖構造は、一本鎖または二本鎖特異的酵素の使用によって検出することができる。典型的に、プローブはＲＮＡプローブであり、ヘテロ二重鎖領域は、RNAaseHを使用して切断され、対立遺伝子変異体は、切断産物を検出することによって検出される。
【００３１】
当該方法は、例えば、PCR Methods and Applications3,268-71（1994年）およびProc.Natl.Acad.Sci.85,4397-4401（1998年）に記載されている蛍光化学的切断ミスマッチ分析に基づき得る。
【００３２】
１つの実施形態では、ＰＣＲプライマーが対立遺伝子変異体を含有するポリヌクレオチド、例えば、配列または対立遺伝子特異的ＰＣＲシステムに結合する場合にのみＰＣＲ反応をプライムするＰＣＲプライマーが使用され、対立遺伝子変異体の存在は、ＰＣＲ産物を検出することによって決定することができる。好ましくは、対立遺伝子変異体に相補的であるプライマーの領域は、プライマーの３’末端またはその付近にある。対立遺伝子変異体の存在は、蛍光染料を使用し、因子に基づくＰＣＲアッセイ、例えば、タックマン（Taqman）ＰＣＲ検出システムをクエンチングすることによって、決定することができる。好適な実施形態では、表４に示される１つもしくはそれ以上のプローブおよび／またはプライマー（例えば、表４におけるすべてのプローブおよびプライマー）が、対立遺伝子変異体を検出するためにタックマン（Taqman）アッセイにおいて使用される。
【００３３】
特異的結合因子は、変異体配列によってコードされるアミノ酸配列に特異的に結合することが可能であり得る。例えば、因子は、抗体であってもまたは抗体フラグメントであってもよい。検出方法は、ＥＬＩＳＡシステムに基づき得る。方法は、ＲＦＬＰに基づくシステムであってもよい。これは、ポリヌクレオチドにおける対立遺伝子変異体の存在によって、制限酵素によって認識される制限部位が作製または破壊される場合に、使用することができる。
【００３４】
対立遺伝子変異体の存在は、対立遺伝子変異体の存在によってゲル電気泳動中のポリヌクレオチドまたはタンパク質の移動度に生じる変化に基づいて、決定することができる。ポリヌクレオチドの場合、一本鎖高次構造対立遺伝子変異体（ＳＳＣＰ）または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＤＧＥ）分析を使用することができる。対立遺伝子変異体を検出する別の方法では、多型領域を含んでなるポリヌクレオチドが対立遺伝子変異体を含有する領域に沿って配列決定され、対立遺伝子変異体の存在が決定される。
【００３５】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、ＩｇＡ変異体配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。ＩｇＡ変異体配列は、典型的に、以下の多型位置の１つもしくはそれ以上で配列番号１（ジェンバンク（GenBank）配列Ｌ３６８７１）と異なる：
・１７９位［Ｃ／Ｔ］；
・３７０位［Ｔ／Ｃ］；
・３７１位［Ｔ／Ｃ］；
・３７２位［Ｃ／Ｇ］；
・３７５位［Ｇ／Ｔ］；
・５１４〜５４６位［ＣＴの反復数］；
・５４７位［Ｔ／Ａ］；
・５６３位［Ａ／Ｔ］；
・５６３〜５７１位［欠失］；
・５７６〜５７８位［付加］；
・５８２位［Ｃ／Ｔ］；
・５８３位［Ａ／Ｇ］；
・５８４位［Ｔ／Ａ］；
・５９２位［Ｇ／Ａ］；または
・６０６位［Ｇ／Ａ］。
【００３６】
好ましくは、対立遺伝子変異体配列は、本明細書において考察されるように、変異体Ａ、Ｂ、ＣまたはＤである。従って、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９またはそのフラグメントの配列を含んでなる。ポリヌクレオチドは、典型的に、少なくとも１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００または５００塩基長、例えば、最小または最大１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１０００ｋｂ長もしくはそれ以上である。ポリヌクレオチドは、典型的に、対立遺伝子変異体（に対し５’もしくは３’側）の片側または両側における隣接するヌクレオチド、例えば、全体または各側で、少なくとも２、５、１０、１５もしくはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含んでなる。典型的に、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７または９のポリヌクレオチド配列に対し、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９９％、さらにより好ましくは、少なくとも９９．９％同一である。置換および／または挿入および／または欠失のそのような数ならびに／あるいは同一性百分率は、ポリヌクレオチドの全体の長さあるいは全体または各側で、５０超、３０、１５、１０もしくはそれ以下の隣接するヌクレオチドについて、採用され得る。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもまたはＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、合成または修飾されたヌクレオチド、例えば、メチルホスホン酸およびホスホロチオエート骨格あるいは分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加を含んでなり得る。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲのためのプライマー、またはプローブとして使用することができる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、標示標識を担持し得る。適切な標識として、放射性同位元素、例えば、32Ｐまたは35Ｓ、蛍光標識、酵素標識または他のタンパク質標識、例えば、ビオチンが挙げられる。
【００３９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現することが可能である発現ベクターを提供する。そのようなベクターはまた、適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えば、ポリアデニル化シグナルを含んでなり、それらは必要であり得、タンパク質発現を可能にするために正確な配向で配置される。従って、ベクターにおけるコーディング配列は、（典型的に細胞において）コーディング配列の発現を提供するようなエレメントに操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は並置を指し、ここで、記載の構成要素は、それらが、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある。
【００４０】
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよい。典型的に、ベクターは複製開始点を有する。ベクターは、１つもしくはそれ以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または真菌ベクターでは耐性遺伝子を含んでなることができる。ベクターは、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡの産生についてインビトロで使用することができるか、または宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するために使用することができる。ベクターはまた、インビボ、例えば、遺伝子治療の方法において使用するために適応することができる。
【００４１】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞と両立し得るように選択することができる。例えば、酵母プロモーターとして、出芽酵母（S.cerevisiae）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、分裂酵母（S.pombe）ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターが挙げられる。哺乳動物のプロモーターとしては、重金属、例えば、カドミウムに応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターを使用してもよい。哺乳動物のプロモーター、例えば、βアクチンプロモーターを使用してもよい。組織特異的プロモーターは特に好適である。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（例えば、ＨＳＶ ＩＥプロモーター）、またはＨＰＶプロモーター、特に、ＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を使用することもできる。
【００４２】
ベクターは、真核生物のゲノム配列、好ましくは、哺乳動物のゲノム配列、またはウイルスゲノム配列に相同な配列を含むポリヌクレオチドを生じるポリヌクレオチドに隣接する配列をさらに含む。これは、相同組換えによる本発明のポリヌクレオチドの真核細胞またはウイルスのゲノムへの導入を可能にする。特に、ウイルス配列によって隣接される発現カセットを含んでなるプラスミドベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適切なウイルスベクターを調製することができる。適切なウイルスベクターの他の例として、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびＨＰＶウイルスを含む単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスが挙げられる。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は当業者に公知である。レトロウイルスベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを安定に組み入れて、宿主ゲノムにポリヌクレオチドを生じさせるために使用することができる。対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターはエピソームに留まり、従って、一過性発現を可能にする。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＩｇＡ変異体に選択的に結合することが可能であるプローブまたはプライマーとして使用することができる。好ましくは、プローブまたはプライマーは、配列番号３、５、７または９のポリヌクレオチド配列に選択的に結合することが可能である。従って、本発明は、本発明に従う方法における使用のためのプローブまたはプライマーを提供し、該プローブまたはプライマーは、ＩｇＡ変異体の存在を選択的に検出することが可能である。好ましくは、プローブは単離されたまたは組換え核酸である。それは、配列番号３、５、７もしくは９のポリヌクレオチド配列に対応するかまたは該配列のアンチセンスであり得る。プローブは、アレイ、例えば、ポリヌクレオチドアレイ上に固定化してもよい。
【００４４】
そのようなプライマーおよび他のフラグメントは、好ましくは、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５または少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチド長である。それらは、典型的に、４０、５０、６０、７０、１００または１５０ヌクレオチド長までである。プローブおよびフラグメントは、１５０ヌクレオチド長より長く、例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００ヌクレオチド長までであるか、またはさらに本発明の全長ポリヌクレオチド配列より数ヌクレオチドまで、例えば、５もしくは１０ヌクレオチド短くあり得る。
【００４５】
相同物（Homologues）
ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の相同物についても本明細書において言及する。そのような相同物は、典型的に、例えば、少なくとも１５、２０、３０、１００を超える連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に対し、少なくとも７０％相同性、好ましくは、少なくとも８０、９０％、９５％、９７％もしくは９９％相同性を有する。相同性は、ヌクレオチドまたはアミノ酸同一性に基づいて算出することができる（時々「ハードホモロジー（hard homology）」と称される）。
【００４６】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定値において使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（デヴェロー（Devereux）ら（1984年）Nucleic Acids Research12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を算出するかまたは配列を並列配置することができる（例えば、等価または対応する配列を（典型的に、デフォルト設定値において）同定する（例えば、アルトシュールＳ.Ｆ.（Altschul S.F.）（1993年）J Mol Evol36：290-300；アルトシュール，Ｓ.Ｆ.（Altschul,S,F）ら(1990年)J Mol Biol215:403-10に記載されている））。
【００４７】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードで整列する場合、いくつかのポジティブに評価された閾値スコアＴに一致するかまたは満足する問い合わせ配列において長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することに関与する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（アルトシュール（Altschul）ら、上掲）。これらの初期隣接ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアを増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向におけるワードのヒットの延長は、次の場合停止される：累積アラインメントスコアが、その最大限に達成された値から量Ｘだけ低下する場合；１つもしくはそれ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積のため累積スコアが０もしくはそれ未満になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Henikoff）およびヘニコフ（Henikoff）（1992年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919を参照のこと）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００４８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する；例えば、カーリン（Karlin）およびアルトシュール（Altschul）（1993年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の表示を提供する最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、配列は、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率（smallest sum probability）が約１未満、好ましくは、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満である場合に他の配列と類似していると考えられる。
【００４９】
相同配列は、典型的に、少なくとも１、２、５、１０、２０もしくはそれ上の変異で異なり、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換、欠失または置換であり得る。これらの変異は、相同性の算出に関連して上述した領域のいずれかに沿って測定することができる。タンパク質の場合、置換は、好ましくは、保存的置換である。これらは、以下の表に従って、規定される。第２のカラムの同じブロック、および好ましくは、第３のカラムの同じ行のアミノ酸は、相互に置換することができる。
【００５０】
【表１】
2007502106.tif 000002
【００５１】
より短いポリペプチド配列もまた、本発明の範囲内にある。例えば、本発明のポリペプチド配列のフラグメントは、典型的に、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０または２００アミノ酸長である。特に、本発明のこの態様は、ポリペプチドがアミノ酸配列において非変異体配列（即ち、配列番号１）の対応するフラグメントとは異なる変異体イヌＩｇＡ重α鎖のフラグメントである状況を包含する。変異体ＩｇＡのフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）またはＦ（ａｂ’）2フラグメントであってもよい。本発明の変異体ＩｇＡフラグメントは、典型的に、重鎖のヒンジ領域を含んでなる。
【００５２】
本発明のポリペプチドは、化学的に修飾されていてもよく、例えば、翻訳後修飾される。ポリペプチドは、グリコシル化され得るかまたは修飾されたアミノ酸残基を含んでなり得る。そのような修飾されたポリペプチドは、本発明の用語「ポリペプチド」の範囲内にある。
【００５３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または抗体は、単離されたもしくは実質的に精製された形態で存在し得る。それらは、それらの意図される用途を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合され得、なお実質的に単離されたとして認識される。それらはまた、実質的に精製された形態であってもよく、この場合、それらは一般に、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞または調製物の乾燥質量の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％もしくは９９％を含んでなる。
【００５４】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関連する上記の特徴のいずれもまた、本明細書に記載の他のポリペプチドならびにタンパク質、例えば、本発明のスクリーニングおよび治療的局面において使用されるポリペプチドおよびタンパク質の特徴であり得ることが理解される。特に、そのような特徴は、上記の長さ、修飾およびベクターの形態のいずれであってもよい。
【００５５】
検出抗体
本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的な検出抗体を提供する。検出抗体は、１つのＩｇＡ変異体、例えば、変異体Ａ、Ｂ、ＣまたはＤに特異的であるが、他の任意のＩｇＡ変異体には結合しない。本発明の検出抗体は、例えば、精製、単離、または免疫沈降技術に関与するスクリーニング方法に有用である。
【００５６】
抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対して惹起させることができる。抗体または他の化合物は、それが特異的であるタンパク質に好適または高い親和性で結合するが、他のポリペプチドには実質的に結合しないかまたは低い親和性でしか結合しない場合、ポリペプチドに「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能を決定するための競合的結合または免疫放射定量法の様々なプロトコルについては、当該分野において周知である（例えば、マダックス（Maddox）ら、J.Exp.Med.158,1211-1226,1993を参照のこと）。そのような免疫アッセイは、典型的に、特定のタンパク質とその抗体との間の複合体の形成および複合体形成の測定を含む。
【００５７】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、それと反対のことを指定しない限り、本発明のポリペプチドに結合するフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）2フラグメント、ならびに一本鎖抗体を含む。さらに、抗体およびそれらのフラグメントは、従って、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００５８】
抗体は、生物学的サンプル（例えば、本明細書において記載のような任意のサンプル）中の本発明のポリペプチドを検出するための方法において使用することができ、該方法は：
Ｉ  本発明の抗体を提供すること；
ＩＩ  抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、生物学的サンプルと共に前記抗体をインキュベートすること；および
ＩＩＩ  前記抗体を含んでなる抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを決定すること、を含んでなる。
【００５９】
本発明の抗体は、任意の適切な方法によって産生させることができる。抗体を調製し、特徴付けるための手段については当該分野において周知であり、例えば、ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）（1988年）「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州を参照のこと。例えば、抗体は、ポリペプチド全体またはそのフラグメント、例えば、その抗原エピトープ（本明細書において、以後「免疫原」）に対し、宿主動物において抗体を惹起することによって、産生させることができる。フラグメントは、本明細書に記載のフラグメント（典型的に、少なくとも１０または少なくとも１５アミノ酸長）のいずれであってもよい。
【００６０】
ポリクローナル抗体を産生させるための方法は、適切な宿主動物、例えば、実験動物を免疫原で免疫し、動物の血清から免疫グロブリンを単離することを含んでなる。従って、動物に免疫原を接種し、続いて、血液を動物から取り出し、ＩｇＧ画分を精製することができる。モノクローナル抗体を産生させるための方法は、所望される抗体を産生する細胞を不死化することを含んでなる。ハイブリドーマ細胞は、腫瘍細胞を接種した実験動物から脾臓細胞を融合することによって、産生させることができる（コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）（1975年）Nature256,495-497）。
【００６１】
所望される抗体を産生する不死化細胞は、従来の手順によって選択することができる。ハイブリドーマを、培養において増殖させるか、あるいは腹水の形成のために腹腔内または同種宿主もしくは免疫不全宿主の血流に注入することができる。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫化、続いて、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルスによるリンパ球の形質転換によって調製することができる。
【００６２】
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の産生について、実験動物は、適切には、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ヒツジまたはウマである。所望であれば、免疫原は、例えば、アミノ酸残基のうちの１つの側鎖を介して、免疫原が適切なキャリアに結合されるコンジュゲートとして投与され得る。キャリア分子は、典型的に生理学的に許容可能なキャリアである。得られる抗体は、単離することができ、所望であれば、精製することができる。
【００６３】
検出キット
本発明はまた、動物における１つもしくはそれ以上のＩｇＡ対立遺伝子変異体の有無を決定するための手段を含んでなるキットを提供する。特に、そのような手段は、本明細書において規定されるように、ＩｇＡ対立遺伝子変異体を検出するかもしくはその検出を援助することが可能である特異的結合因子、プローブ、プライマー、プライマーの対または組み合わせ、あるいは抗体フラグメントを含む抗体を含んでもよい。プライマーまたはプライマーの対もしくは組み合わせは、本明細書において考察されるように、検出しようとするＩｇＡ変異体含んでなるポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のみを生じる配列特異的プライマーであり得る。キットはまた、対立遺伝子変異体の非存在を検出することが可能である特異的結合因子、プローブ、プライマー、プライマーの対もしくは組み合わせ、または抗体を含んでなることができる。キットは、緩衝液または水溶液をさらに含んでもよい。
【００６４】
キットは、行おうとする上記の方法の実施形態のいずれかを可能にする１つもしくはそれ以上の他の試薬または取扱説明書をさらに含んでもよい。そのような試薬または取扱説明書は、１つもしくはそれ以上の次のもの：因子の対立遺伝子変異体への結合を検出するための手段、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、ポリヌクレオチドに対して作用可能な酵素、典型的に、ポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、RNAseHまたはポリヌクレオチドに標識を付着させることができる酵素、酵素試薬に適切な緩衝液または水溶液、本明細書において考察されるような対立遺伝子変異体に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、ポジティブおよび／またはネガティブコントロール、ゲル電気泳動装置、サンプルからＤＮＡを単離するための手段、個体からサンプルを入手するための手段、例えば、綿棒または針を含んでなる器具、あるいは検出反応を行うことができるウェルを含んでなる支持体を含んでもよい。キットは、アレイ、例えば、本発明の特異的結合因子、好ましくは、プローブを含んでなるポリヌクレオチドアレイであるか、または該アレイを含んでもよい。キットは、典型的に、キットを使用するための１組の取扱説明書を含む。
【００６５】
治療因子のスクリーニング
本発明はまた、ＩｇＡ関連障害の処置のための治療因子を同定するためのスクリーニング標的としての変異体ＩｇＡの使用に関する。１つの実施形態では、本発明は、ＩｇＡ関連障害の処置に有用な因子を同定するための方法を提供し、該方法は、変異体ＩｇＡポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験因子とを接触させること、および因子がポリペプチドに結合するかあるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性もしくは発現を調節することが可能であるかどうかを決定することを含んでなる。任意の適切な結合アッセイ形式を使用して、以下で考察する形式のように、ＩｇＡ変異体が試験因子に結合するかどうかを決定することができる。
【００６６】
当該方法は、インビトロ、細胞の内部もしくは外部で、またはインビボで行うことができる。１つの実施形態では、当該方法は、変異体ＩｇＡタンパク質もしくはポリヌクレオチドを含んでなる細胞、細胞培養物または細胞抽出物に対して行われる。細胞は任意の適切な細胞であってもよく、典型的には、産物が天然に発現される細胞である。例えば、細胞は、粘膜上皮細胞、例えば、十二指腸粘膜固有層由来のＩｇＡ+形質細胞であってもよい。当該方法はまた、ＩｇＡ変異体ポリヌクレオチドについてトランスジェニックである非ヒト動物においても、インビボで行うことができる。トランスジェニック非ヒト動物は、典型的に、バイオメディカル研究において一般に使用される種であり、好ましくは、研究株である。適切な動物としては、げっ歯類、特に、マウス、ラット、モルモット、フェレット、アレチネズミまたはハムスターが挙げられる。最も好ましくは、動物はマウスである。
【００６７】
用語「調節する」は、因子がＩｇＡ変異体ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節することが可能である本明細書に記載の方法のいずれをも含む。これは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を可能にする条件下で、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験因子とを接触させ、試験因子がポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節することが可能であるかどうかを決定することによって、決定することができる。
【００６８】
測定される活性は本明細書に記載のいずれの活性であってもよく、ＩｇＡ変異体ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの特性、または当該方法が行われる細胞構成要素、細胞もしくは動物に対する影響の測定であってもよい。効果は、ＩｇＡ関連障害に関連する効果であってもよく、ＩｇＡ関連障害の特徴または徴候、例えば、本明細書に記載の任意のそのような特徴もしくは徴候であってもよい。
【００６９】
１つの実施形態では、アッセイは、変異体ＩｇＡポリペプチドまたはポリヌクレオチドと別の因子、例えば、プロテアーゼとの間の結合に対する試験因子の効果を測定する。特に、アッセイは、イヌにおいてＩｇＡ関連障害を生じることが公知である病原体由来のプロテアーゼを含んでもよい。そのような相互作用における変化を測定するための適切なアッセイとして、蛍光イメージングプレートリーダーアッセイ、およびラジオリガンド結合アッセイが挙げられる。活性が遺伝子からの転写である場合、当該方法は、例えば、レポーター遺伝子アッセイにおいて、候補物質が転写を調節する能力を測定することを含んでなり得る。
【００７０】
上記のスクリーニング方法において試験することができる適切な候補因子として、抗体因子、例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体が挙げられる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、規定された化学的同一性、ペプチドおよびペプチド模擬物、オリゴヌクレオチドならびに天然因子ライブラリー、例えば、ディスプレイライブラリーも試験され得る。試験因子は化学的化合物であってもよく、典型的に、本明細書に記載の因子のいずれかの特性を有し得る小さな分子を中心とする合成から誘導される。候補因子のバッチを、例えば、１反応あたり１０種の物質の初期選別において使用することができ、該バッチのうち調節を示す物質が個々に試験される。用語「因子」は、単一の物質、２、３種もしくはそれ以上の物質の組み合わせを含むことが意図される。例えば、因子という用語は、単一のペプチド、２もしくはそれ以上のペプチドの混合物またはペプチドおよび規定された化学実体の混合物を指し得る。
【００７１】
本発明の１つの態様では、試験因子は食物成分である。従って、本発明は、食物成分をスクリーニングして、それらが罹患しやすい動物において胃腸疾患の一因になるかもしくは悪化させるかどうか、またはそれらが胃腸疾患を防止するかもしくは軽減するかどうかを決定する方法に関する。食物成分は、動物もしくはペットフードまたは他のタイプの食物において典型的に使用される成分であってもよく、または新規の食物成分であってもよい。
【００７２】
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって同定される因子を提供する。本発明のスクリーニング方法において同定される因子は、ＩｇＡ関連障害の治療的処置において使用することができる。そのような因子は、以下に考察される任意の手段または量において処方および投与することができる。
【００７３】
ＩｇＡ関連障害の処置
本発明は、ＩｇＡ関連障害について動物を処置する方法を提供し、該方法は、本発明の方法によってＩｇＡ関連障害にかかり易い動物を同定すること、およびＩｇＡ関連障害を処置する有効量の治療因子を当該動物に投与することを含んでなる。ＩｇＡ関連障害は、本明細書に記載の任意の疾患または障害であってもよく、典型的に、胃腸疾患、皮膚病、呼吸器系疾患、リウマチ様疾患または歯周病である。治療因子は、典型的に、薬物、例えば、抗炎症剤（例えば、スルファサラジン（sulphur salasine））、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾロン）、抗生物質（例えば、アモキシシリンもしくはエンロフロキサシン）またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、アンプレナビル（amprenavir））である。治療因子は、ＩｇＡ関連障害を処置するために使用することができる当該分野において公知の任意の薬物であってもよく、または先に考察されたスクリーニング方法によって同定される因子であってもよい。
【００７４】
治療的処置は、動物の細菌叢の変化を生じ得る。特に、動物の細菌叢は、ＩｇＡを分解することができるプロテアーゼの産生を減少するように改変することができる。そのような変化は、典型的に、動物の胃腸系において生じ、プレバイオティックスまたはプロバイオティクスのような因子を動物に投与することによって、行うことができる。
【００７５】
治療因子は、多様な様式で、例えば、経口的、頭蓋内、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内（intrademally）、および皮下に投与することができる。治療因子を含有する医薬組成物は、通常、使用されている特定の投与態様に依存する適切な薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と共に処方される。例えば、非経口処方は、通常、薬学的および生理学的に許容可能な液体、例えば、ビヒクルとして生理食塩水、平均塩類溶液などを使用する注入可能な液体である。一方、経口処方は、固体、例えば、錠剤もしくはカプセル剤、または液体の溶液もしくは懸濁液であってもよい。好適な実施形態では、治療因子は、動物用の食餌、例えば、動物用の飲料水または食物の形で動物に投与される。
【００７６】
動物に与えられる治療因子の量は、処置される状態、処置下にある動物の性質および処置下にある状態の重症度を含む様々な因子に依存する。典型的な１日投与量は、特異的阻害剤の活性、処置しようとする動物の年齢、重量および状態、疾患のタイプおよび重症度ならびに投与回数および経路に従って、ｋｇあたり約０．１〜５０ｍｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／１ｋｇ体重である。好ましくは、１日投与量レベルは５ｍｇ〜２ｇである。
【００７７】
カスタマイズされた食物
１つの態様では、本発明は、ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のためにカスタマイズされた食餌に関する。好適な実施形態では、カスタマイズされた食物は、コンパニオンアニマルまたはペット、例えば、イヌ用である。そのような食物は、例えば、ウエットペットフード、セミモイストペットフード、ドライペットフードおよびペットトリートの形態であってもよい。ウエットペットフードは、一般に６５％を超える水分含有量を有する。セミモイストペットフードは、典型的に、２０〜６５％の間の水分含有量を有し、湿潤剤および微生物の増殖を防止するための他の成分を含むことができる。ドライペットフードはキブルとも呼ばれ、一般に、２０％未満の水分含有量を有し、そのプロセシングとして、典型的に、押し出し成形、乾燥および／または加熱によるベーキングが挙げられる。ドライペットフードの成分として、一般に、シリアル、穀類、肉、家禽、脂肪、ビタミンおよび鉱物が挙げられる。成分は、典型的に混合され、押し出し成形機／調理器具を介して出される。次いで、生成物を典型的に形成および乾燥し、乾燥後、乾燥生成物に風味付けおよび脂肪を被覆または噴霧してもよい。
【００７８】
従って、本発明は、ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物に適切なカスタマイズされた食物の調製を可能にし、ここで、カスタマイズされた動物用食物の処方は、ＩｇＡ関連障害を防止もしくは軽減し、および／またはＩｇＡ関連障害の一因となるかもしくは悪化する構成要素を含まない成分を含んでなる。そのような成分は、ＩｇＡ関連障害を防止または軽減することが当該分野において公知である任意の成分であってもよい。あるいは、スクリーニング方法は、本明細書において考察されるように、そのような成分を同定することができる。カスタマイズされた動物用食物の調製は、電子的手段、例えば、コンピュータシステムを使用することによって、行うことができる。
【００７９】
１つの実施形態では、カスタマイズされた食物は、第２の食餌感受性の可能性を最小限にするために、食物タンパク質のプロフィールを改変するように処方することができる。カスタマイズされた食物は、低アレルギー性であり得るか、あるいは忍容性が乏しいかまたはアレルギーを生じる成分、例えば、グルテン含有穀類、例えば、コムギ、特定のタンパク質供給源、例えば、動物タンパク質、ミルク（ラクトース）、卵、ダイズ、ピーナツ、貝・甲殻類、果物もしくは木の実を含み得ない。
【００８０】
別の実施形態では、カスタマイズされた食物を、ＩｇＡ関連障害を防止もしくは軽減するのに役立つ機能的または有効な成分を含むように処方してもよい。そのような成分は、免疫機能を刺激するか、もしくはＩｇＡの分解に対して保護するような化合物であってもよく、例えば、β−グルカンまたはグルタミンであってもよい。あるいは、外因性ＩｇＡを、例えば、コロストラムまたは卵を使用して、食餌の形で経口的に投与してもよい。これらは、病原体、例えば、病原性大腸菌（E.coli）（例えば、ＥＰＥＣ）、カンピロバクター（Campylobacter）またはサルモネラ（Salmonella）に対して高度免疫されていてもよい。
【００８１】
機能的または有効な成分は消化管バリア機能を改善することによって、ＩｇＡ関連障害を防止または軽減するのに役立ち得、例えば、機能的成分は、プレバイオティック、プロバイオティックまたはオリゴ糖であってもよい。１つの態様では、カスタマイズされた食物は、ＩｇＡ関連皮膚病を防止または軽減するように処方される。そのような食物は、皮膚の状態を改善する機能的成分、例えば、ビタミンＣ、タウリン、クルクミンまたはアロエベラ（aloe vera）を含んでなり得る。皮膚サポート食餌の１つの特定の例については、国際特許出願第PCT/GB02/02538号明細書に記載されている。カスタマイズされた食物に添加することができる他の有効成分として、ルテイン、リコピン、β−カロテン、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。
【００８２】
本発明はまた、ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物に適した食物を、動物、動物の所有者または動物に給餌することを担う人に提供することを含んでなるカスタマイズされた動物用食物を提供する方法に関し、ここで、当該動物は、本発明の方法によって、ＩｇＡ関連障害にかかり易いことが決定されている。本発明の１つの態様では、カスタマイズされた食物は、一覧に作成され、一覧から供給されるものであって、即ち、カスタマイズされた食物は、注文により作製されるのではなく、予め製造される。従って、本発明のこの態様に従えば、カスタマイズされた食物は、１つの特定の動物に対して特異的に設計されるのではなく、その代わりに、１つを超える動物に適切である。例えば、カスタマイズされた食物は、ＩｇＡ関連障害にかかり易い任意の動物に適切であり得る。あるいは、カスタマイズされた食物は、ＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のサブグループ、例えば、特定の品種、サイズまたは生活環の動物に適切であり得る。別の実施形態では、食物は、個々の動物の栄養要件を満たすようにカスタマイズされ得る。
【００８３】
本発明の好適な態様では、カスタマイズされた食物はイヌに適切である。１つの実施形態では、カスタマイズされた食物は、基本食餌およびＩｇＡ関連障害にかかり易い動物のために特異的に設計される免疫サポートグレイビーを含んでなる。グレイビーは、有効成分、例えば、クルクミン、アロエベラ（aloe vera）、タウリン、ビタミンＣ、ルテイン、リコピン、β−カロテン、ＥＰＡ、ＤＨＡまたは本明細書において考察されるような他の任意の機能的成分を含んでなり得る。
【００８４】
別の実施形態では、カスタマイズされた食物は１次キブルおよび２次キブルよりなる。１次キブルは、食餌感受性を最小限にするために、典型的に、非刺激性成分、例えば、魚類由来のタンパク質およびイネ由来の炭水化物を含有する。従って、１次キブルは、成分、例えば、タンパク質、脂肪、リノール酸およびアラキドン（arichodonic）酸、鉱物ならびにビタミンを含んでなり得る。２次キブルは、典型的に、食物に対して惹起する免疫応答を防止するのに役立つ有効または機能的成分を含んでなる。従って、２次キブルは、成分、例えば、アロエベラ（aloe vera）、クルクミン、タウリン、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ビタミンＣまたは本明細書において考察されるような他の任意の有効もしくは機能的成分を含んでなり得る。カスタマイズされた食物は、典型的に、１次キブルが２次キブルよりも多量に存在する１次および２次キブルの混合物である。例えば、カスタマイズされた食物は、６０％〜９９％の１次キブル、例えば、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％１次キブルよりなり得、ここで、カスタマイズされた食物の残りは２次キブルである。好ましくは、カスタマイズされた食物は、約９０％の１次キブルおよび約１０％の２次キブルよりなる。
【００８５】
バイオインフォマティクス
ＩｇＡ変異体の配列は、電子形式、例えば、コンピュータデータベースで記憶させることができる。従って、本発明は、ＩｇＡ対立遺伝子変異体配列に関する情報を含んでなるデータベースを提供する。データベースは、対立遺伝子変異体に関するさらなる情報、例えば、対立遺伝子変異体とＩｇＡ関連障害との関連のレベルまたは集団における対立遺伝子変異体の頻度を含むことができる。本発明の１つの態様では、データベースは、適切である食物構成要素およびＩｇＡの特定の対立遺伝子変異体を有する動物には適切でない食物構成要素に関する情報をさらに含んでなる。
【００８６】
本明細書に記載のデータベースを使用して、ＩｇＡ関連障害に対する動物の感受性を決定することができる。そのような決定は、電子的手段、例えば、コンピュータシステム（例えば、ＰＣ）を使用することによって、行うことができる。典型的に、該決定は、動物の遺伝子データをコンピュータシステムに入力し；当該遺伝子データを、ＩｇＡ対立遺伝子変異体に関する情報を含んでなるデータベースと比較し；この比較に基づいて、ＩｇＡ関連障害に対する動物の感受性を決定することによって、行われる。
【００８７】
本発明はまた、プログラムをコンピュータ上で稼動させる場合に、本発明の方法のすべての工程を実施するためのプログラムコード手段を含んでなるコンピュータプログラムを提供する。当該プログラムをコンピュータ上で稼動させる場合に、本発明の方法を実施するためのコンピュータ読み取り可能な媒体上に記憶されたプログラムコード手段を含んでなるコンピュータプログラムもまた提供される。搬送波上にプログラムコード手段を含んでなるコンピュータプログラム製品であって、コンピュータシステム上で実行される場合、本発明の方法を実施するようにコンピュータシステムを指示する、上記コンピュータプログラム製品がさらに提供される。
【００８８】
図６において例示されるように、本発明または、本発明に従う方法を実施するように配置される装置を提供する。装置は、典型的に、コンピュータシステム、例えば、ＰＣを含んでなる。１つの実施形態では、コンピュータシステムは：動物由来の遺伝子データを受け取るための手段２０；データと、ＩｇＡ対立遺伝子変異体に関する情報を含んでなるデータベース１０とを比較するためのモジュール３０；および前記比較に基づいて、ＩｇＡ関連障害に対する動物の感受性を決定するための手段４０を含んでなる。
【００８９】
食物の製造
本発明の１つの実施形態では、カスタマイズされた動物用食物の製造は、電子的に制御することができる。典型的に、動物に存在するＩｇＡ対立遺伝子変異体に関する情報は、電子的に処理され、カスタマイズされた動物用食物の処方が作成され得る。次いで、カスタマイズされた動物用食物の処方を使用して、電子製造指示書を作成し、食物製造装置の操作を制御することができる。これらの工程を行うために使用される装置は、典型的に、コンピュータシステム、例えば、ＰＣを含んでなり、これは、栄養情報を処理して、カスタマイズされた動物用食物の処方を作成するための手段５０；電子製造指示書を作成して、食物製造装置の操作を制御するための手段６０；ならびに食品製造装置７０を含んでなる。
【００９０】
本発明において使用される食品製造装置は、典型的に、１つもしくはそれ以上の次の構成要素：ドライペットフード成分のための容器；液体のための容器；混合機；形成具および／または押し出し形成機、カットオフデバイス；調理手段（例えば、オーブン）；冷却機；包装手段；ならびに標記手段を含んでなる。乾燥成分容器は、典型的に、底部に開口部を有する。この開口部は、容積調節エレメント、例えば、回転式ロックによって覆われ得る。容積調節エレメントは、電子製造指示書に従って開放および閉鎖し、乾燥成分のペットフードへの添加を調節することができる。
【００９１】
ペットフードの製造において典型的に使用される乾燥成分としては、トウモロコシ、コムギ、肉および／または家禽肉ミールが挙げられる。ペットフードの製造に典型的に使用される液体成分としては、脂肪、獣脂および水が挙げられる。液体容器は、例えば、電子製造指示書によって制御され、測定された量の液体をペットフードに添加することができるポンプを含有してもよい。
【００９２】
１つの実施形態では、乾燥成分容器および液体容器は、混合機に結合され、指定された量の乾燥成分および液体を混合機に送達する。混合機は、電子製造指示書によって制御することができる。例えば、混合の期間または速度を制御することができる。次いで、混合された成分は、典型的には形成具または押し出し形成機に送達される。形成具／押し出し形成機は、混合された成分を要求された形状に形成するために使用することができる当該分野において公知の任意の形成具または押し出し形成機であってもよい。典型的に、混合された成分は、圧力下で制限された開口部を介して押し込まれ、連続ストランドを形成する。ストランドが押し出されるとき、それは、カットオフデバイス、例えば、ナイフによって、片（キブル）に切断され得る。キブルは、典型的に、例えば、オーブンにおいて調理される。調理時間および温度は、電子製造指示書によって制御することができる。調理時間は、食物に所望される水分含有量を生成するために、変更することができる。次いで、調理されたキブルを、冷却機、例えば、１つもしくはそれ以上のファンを含有するチャンバに移すことができる。
【００９３】
食物製造装置は、包装装置を含んでもよい。包装装置は、典型的に、食物を、容器、例えば、プラスチックもしくは紙製のバッグまたは箱に包装する。装置はまた、典型的に、食物が包装された後に、食物を標記するための手段を含んでなることができる。ラベルは、情報、例えば：成分リスト；栄養情報；製造の日付；賞味期限；重量；ならびに食品が適切である種および／または品種を提供することができる。
【００９４】
以下の実施例によって、本発明を例示する。
【実施例１】
【００９５】
材料および方法
サンプルの回収
十二指腸粘膜の内視鏡生検は、胃腸疾患の検査のためにブリストル大学臨床獣医学部（Department of Clinical Veterinary Science, University of Bristol）に進呈されたイヌから入手した。胃十二指腸鏡検査は、GIF-XQ230フレキシブルビデオ内視鏡（オリンパス・キーメド（Olympus Keymed）、Southend-on-Sea、英国）を使用して、実施した。FB-25K生検鉗子（オリンパス・キーメド（Olympus Keymed））を使用して、尾側十二指腸曲のレベルで複数の粘膜生検を採取した。生検を、1.0 mlクリオチューブ（NUNC、フィッシャーサイエンティフィックLtd.（Fischer Scientific Ltd.）、Loughborough、Leicestershire）におき、液体窒素において急速凍結し、−７０℃で貯蔵した。
【００９６】
ＲＮＡ／ＤＮＡの単離
２つの内視鏡生検（全組織質量９〜１６mg）を、ＲＮＡ単離キット由来の400μｌの溶解緩衝液を含有する緑色リボライザー（Ribolyser）チューブ（リボライザー・システム（Ribolyser System）、サーモハイベイド（Thermo-Hybaid）、Ashford、Middlesex、英国）に添加し（下記を参照のこと）、４５秒間、6.0 m/sで処理し、生検をホモジナイズした。この溶解物を、100μｌのヌクレアーゼを含まない水にＲＮＡを溶出させたことを除いて、製造者のプロトコルの通りに、RNeasy単離システム（RNeasy Isolation System）（キアゲンLtd．（Qiagen Ltd.）、Crawley、英国）を介して、処理した。この手順により、全ＲＮＡおよび有意量のゲノムＤＮＡの混合物が生成される。ヌクレアーゼを含まない水のネガティブコントロールを、抽出手順を介して通過させた。サンプルを、使用前に−７０℃で保存した。
【００９７】
DNase消化
上記で詳述した抽出由来の50μｌのＲＮＡ／ＤＮＡ混合物に対し、DNase消化を行った。溶液中、およびさらにＲＮＡをさらに精製するために使用されるその後のキアゲン（Qiagen）カラム上の両方において、DNase消化を行った。溶液中でのDNase消化は、製造者の指示通りに、50μｌの抽出混合物を５単位の増幅用グレードDNase1（インビトロジェンLtd.（Invitrogen Ltd.））で処置することによって、行った。処置したＲＮＡから任意の残留DNaseまたはＥＤＴＡを取り出すために、ＲＮＡクリーンアッププロトコルを使用して、溶液を、RNeasy単離システム（キアゲンLtd.（Qiagen Ltd.））に２回目の通過させた。このカラム上で、RNaseフリーDNaseセット（キアゲンLtd.（Qiagen Ltd.））を使用して、２回目のDNase消化を行った。
【００９８】
プライマーの設計
クローニングされたＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の産物のプライマーを、イヌα鎖（登録番号：L36871）のジェンバンク（GenBank）配列に対してプライマー３（www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi.）を使用して設計したが、これを表１に示す。順方向プライマーはエキソン１の３’末端に局在し、逆方向プライマーはエキソン２の５’末端に局在して、それらは共に、５５０ｂｐのＤＮＡ産物およびｃＤＮＡを伴う３００ｂｐの産物を産生した。α鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ配列をクローニングするのに適切なイヌの同定のためのプライマーならびにプローブの配列は、イヌ内視鏡十二指腸粘膜生検由来のα鎖転写物の定量化のために先に使用されており、これらを表１に示す（α鎖の組１）。
【００９９】
プライマーのこの本来の組は、順方向プライマーが第１および第２のエキソン間の接続部に及ぶように設計した。プライマーの第２の組を、順方向プライマーが第１のエキソン（α鎖の組２）に局在するように同じプローブ配列を伴うプライマー３を使用して、設計した。プライマーおよびプローブの組を、プライマーのアニーリング温度が６０℃であり、プローブがより８〜１０℃高く、８０〜２００塩基長の産物が得られるように、設計した。プライマー−ダイマー形成を最小限にするために、最大の自己相補性を６とし、最大の３’自己相補性を２とした。
【０１００】
【表２】
2007502106.tif 000003
【０１０１】
ＲＴ−ＰＣＲ
25μｌの最終容積において5μｌのＲＮＡ、4.5 mM Mg2+ならびにそれぞれ200 nMおよび100 nMの濃度でプライマーおよびプローブを使用し、プラチナ定量ＲＴ−ＰＣＲサーモスクリプト（Thermoscript）TMワンステップシステム（インビトロジェンLtd（Invitrogen Ltd））を使用して、α鎖の遺伝子特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施した。サーモスクリプト（Thermoscript）酵素混合物を２単位のプラチナTaq DNAポリメラーゼ（インビトロジェンLtd.（Invitrogen Ltd.））で置換することによって、ＲＴ反応が認められなくなった。抽出手順由来のネガティブコントロール、ならびにヌクレアーゼを含まない水のコントロールを、すべてのサンプル稼動物と共に含めた。55℃で20分間の初期インキュベーション（α鎖）、続いて、95℃で5分間、次いで、95℃で10秒間、60℃で１５秒間の４５サイクルを伴うiCycler IQ（バイオ−ラッド・ラボラトリーズLtd（Bio-Rad Laboratories Ltd）、Hercules、カリフォルニア州）において、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、その間、蛍光データを回収した。すべての反応物を氷上で調合し、初期インキュベーション温度で保持されたiCyclerに配置し、プライマー−ダイマー形成を最小限にした。閾値サイクル（Ｃｔ値）を、サンプルの蛍光がベースラインの蛍光の平均から１０標準偏差に対応する閾値レベルを超える場合のサイクルとして算出した。
【０１０２】
5μｌのＲＮＡを先に記載のように使用し、プラチナ定量ＲＴ−ＰＣＲサーモスクリプト（Thermoscript）TMワンステップシステム（インビトロジェンLtd（Invitrogen Ltd））を使用して、クローニングのための産物を産生させるためのＲＴ−ＰＣＲを実施した。サーモスクリプト（Thermoscript）酵素混合物を、5μｌのＲＮＡ／ＤＮＡ混合物を伴う２単位のプラチナTaq DNAポリメラーゼ（インビトロジェンLtd.（Invitrogen Ltd.））で置換することによって、ＤＮＡ増幅を実施した。初期インキュベーション後、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルを実施し、続いて、７２℃で５分間の最終インキュベーションが実施されるようにして、より長い産物のために、ＰＣＲプロトコルを変更した。２％アガロースゲル電気泳動を使用して、これらの産物を分離し、適切にサイズ分類されたバンドをゲルから切り出し、次いで、製造者の指示に従い、QIAquick PCR精製キット（キアゲンLtd.（Qiagen Ltd.）、Crawley、英国）を使用して、精製した。
【０１０３】
産物のクローニングおよび配列決定
化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）を使用し、製造者の指示通りにTOPO TAクローニングキット（インビトロジェンLtd.（Invotrogen Ltd.））を使用して、精製されたＰＣＲ産物をクローニングした。白色／青色コロニー選択後、ポジティブなクローンを１晩サブ培養し、製造者の指示通りに、キアゲン（Qiagen）プラスミドミニ・プレップ・キット（Mini Prep Kit）（キアゲンLtd.（Qiagen Ltd.））を使用して、プラスミドを精製した。反応混合物（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）あたり少なくとも４つのクローンを各イヌについて精製し、配列決定のために、配列決定サービス（Sequencing Service）（ダンディ大学生命科学部（School of Life Sciences, University of Dundee）、Dundee、スコットランド）に送付した。オミガ２．０（Omiga 2.0）（アクセルリス（Accelrys）、Cambridge、英国）を使用して、配列結果をジェンバンク（GenBank)配列と共に整列させた。
【０１０４】
結果
ＩｇＡ発現
イヌ十二指腸粘膜由来のＩｇＡ ｍＲＮＡの発現の２峰パターンについては、プライマーの組１を使用して、先に示した（図１Ａ）（ピータース，I.R.（Peters, I. R.）、C.R．ヘルプス（C. R. Helps）、R.M.バット（R. M. Batt）、M.J.デイ（M. J. Day）、およびE.J.ホール（E. J. Hall.）2003。イヌ十二指腸粘膜由来のα鎖、ｐＩｇＲおよびＪ鎖をコードするｍＲＮＡの定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定（Quantitative real-time RT-PCR measurement of mRNA encoding alpha-chain, pIgR and J-chain from canine duodenal mucosa）J Immunol Methods 275:213）。定量データを確認するために、プライマーの第２の組を設計した（表１）。驚くべきことに、プライマーの組２を使用した場合、２峰分布が消失した（図１Ｂ）。２つのプライマーの組は、図３に示されるように、エキソン１および２の間の接続部に及ぶ順方向プライマーの位置のみが異なる。これらの結果は、すべてのサンプルに類似の量のα鎖ｍＲＮＡが存在するが、組１の順方向プライマーは、いくらかのサンプルにおいてｍＲＮＡのかなりの部分を検出しないことを示した。従って、任意の配列の差異が存在するかどうかを決定するために、この領域を包含するｇＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方のセグメントを増幅するプライマーの組を設計した。
【０１０５】
配列決定データ
イヌα重鎖遺伝子の第２のエキソンの５’末端に対する４つの代替的配列を同定し、このうち３つはこれまでに記載されていなかった（図２）。変異体は、Ａ〜Ｄと命名され、変異体Ａは、ジェンバンク（GenBank）配列に類似であり、従って、該変異体をプライマーの組１を使用して検出した。同じ変異体を伴う個体間で異なる一塩基多型が１７９位に存在するが、この多型は、コードされるアミノ酸を変更しない（図４）。
【０１０６】
変異体間の主な差異は、第２のエキソンに対するスプライスアクセプター部位の位置であった。スプライスアクセプター部位におけるこの差異は、５４７位での一塩基多型によるものであり、第２のエキソンに対するスプライスアクセプター部位の消失を生じた（図２）。このポイントでのデオキシアデノシンの存在は、５４９位（変異体ＣおよびＤ）からｍＲＮＡをコードすることをもたらす一方、この位置でのデオキシスレオニン（deoxythreonine）の存在は、９塩基短い転写物を伴い、５５８位（変異体ＡおよびＢ）からコードすることをもたらした。
【０１０７】
最も短い変異体は、５５８位にデオキシスレオニン（deoxythreonine）多型を有するが、第２のエキソンの５’末端内に９塩基欠失（５６３〜５７１位）を有し、この欠失後に３つのさらなる塩基（５７６〜５７８位）を有する変異体Ｂであった。この変異体はまた、他の変異体と比較して、５８２、５８３、５９２および６０６位に、他の塩基の差異を有し、これにより、予想されたアミノ酸配列の変更が生じた。変異体ＣおよびＤ間の主な差異は、変異体Ｂにおけるものと類似の５７６〜５７８位間での３塩基付加の存在であり、変異体Ｄを４種のうちで最も長いものにした。
【０１０８】
それぞれの個々のイヌにおいて見出される変異体の組み合わせを、表２において詳細に示す。これらの結果から、１を超える変異体がいくつかの個々のイヌにおいて検出され得ることが示され、ヘテロ接合の個体が存在することが示唆される。*および＋の場合を除いて、両ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ産物において配列が検出されたように、個体が有する両変異体が転写される証拠も存在する。これらは、それぞれ、ｇＤＮＡ（*）およびｃＤＮＡ（＋）産物においてのみ見出された。すべての変異体は、イヌ４８においてのみ見出された変異体Ｄを除く２もしくはそれ以上の個体において見出された。
【０１０９】
【表３】
2007502106.tif 000004
【実施例２】
【０１１０】
材料および方法
ＤＮＡサンプル
頬細胞をイヌから、滅菌サイトロジーブラシ（cytology brush）（ロケット・メディカル（Rocket Medical）、カタログ番号Ｒ５７４８３）を頬の内側で６回回転させることによって、回収した。次いで、ブラシを、それらの個々の包装紙の中に戻し、室温で最低２時間、乾燥させた。ＤＮＡを、バカル・スワブ・スピン（Buccal Swab Spin）プロトコルに従って、キアゲン（Qiagen）QIAamp DNAブラッド・ミニ・キット（Blood Mini Kit）（カタログ番号５１１０４）を使用して、抽出した。100μｌのｄＨ2０を使用してＤＮＡを溶出させ、次いで、−２０℃で貯蔵した。
【０１１１】
ＰＣＲ増幅
α鎖についてのジェンバンク（GenBank）配列（アクセッション番号：L36871）に対してプライマー３（www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi）を使用して、プライマーを設計した。順方向プライマーはエキソン１の３’末端に局在し、逆方向プライマーはエキソン２の５’末端に局在して、それらは共に、５５０ｂｐのＤＮＡ産物を産生した。オリゴ（oligo）は、シグマジェノシス（Sigma-Genosys）から入手し、脱塩し、0.025μＭの合成スケールで使用した。50μｌ ＰＣＲ反応は、25 pmolの各（oligo）ならびに各イヌサンプル由来の50 ngのＤＮＡならびに赤色のローディングダイおよび1.5mM MgClを含有する25μｌのユーロジェンテック・ホットゴールドスター（Eurogentec HotGoldstar）ＰＣＲマスターミックス（mastermix）（PK-0073-02R）を使用して、行った。
【０１１２】
熱循環は、次のサイクリング条件を使用するハイブリッド（Hybrid）MBS 0.2S PCRマシンを使用して実施した：９５℃で１０分間のインキュベーション、続いて、９５℃で３０秒間、６４℃（１サイクルあたり−１℃）で４５秒間および７２℃で９０秒間の１０サイクル、続いて、９５℃で３０秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で９０秒間の２８サイクル。５μｌのそれぞれのＰＣＲサンプルおよび１μｌのゲルスター（Gelstar）核酸ゲル染色（バイオホイッタカー・モレキュラー・アプリケーションズ（BioWhittaker Molecular Applications）、カタログ番号５０５３５）を、２％アガロース（インビトロジェン（Invitrogen）、カタログ番号１５５１０−０２７）ゲル上、100 mVで泳動させ、産物について確認した。首尾よいＰＣＲ産物を、９６ウェルＰＣＲクリーンアップ・プレート（ミリポア（Millipore）、カタログ番号（MANU03010））を使用し、標準的な方法に従って、精製した。50μｌのＨ2Ｏを伴うエキストラ・ウォッシュ・フェーズ（extra wash phase）を添加し、マスターミックス（mastermix）から赤色染料を取り出した。ナノドロップ（Nanodrop）分光光度計上で１μｌの精製されたＰＣＲ産物を使用して、サンプルを定量した。ナノドロップ（Nanodrop）２．４．７ａソフトウェア上で核酸サンプルＤＮＡ−５０を使用して、解析を行った。
【０１１３】
ＤＮＡ配列決定
クイック・スタート（Quick Start）キットを伴うCEQ2000ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング（CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing）（ベックマン・コールター（Beckman Coulter）、P/N608120）と共に25 fmolの精製されたＰＣＲ産物を使用して、サイクルシークエンシングを実施した。3μｌのＤＴＣＳクイック・スタート・マスター・ミックス（quick Start Master Mix）、ＰＣＲ工程（5 pmol）において使用される1μｌの順方向または逆方向プライマーならびに調整可能な容積のＤＮＡテンプレートならびにｄＨ2Ｏを使用して、20μｌ反応を行った。熱循環は、ＰＣＲ工程において使用されるのと同じＰＣＲマシンを使用するが、次の条件下で実施した：９６℃で２０秒間、５０℃で２０秒間および６０℃で４分間の３０サイクル。これらのサイクル後、サンプルをエタノール沈殿に供し、真空ポンプを４０分間使用して、乾燥のためにエバポレートした。サンプルを40μｌの脱イオンホルムアミドに再懸濁し、１滴の鉱油を頂部にセットした。ＬＦＲキャピラリー方法を使用して、サンプルをベックマン（Beckman）CEQ2000シークエンサー（Sequencer）上で稼動させた。配列トレースを、CEQ2000XL DNA解析システム（Analysis System）ソフトウェア・バージョン４．３．９を使用して、解析した。
【０１１４】
結果
イヌ品種内のＩｇＡ対立遺伝子の分布について調べるために、異なる１１品種の１８３匹のイヌのＩｇＡ遺伝子型を決定した。各イヌ品種のＩｇＡ遺伝子型を以下の表３に示す。試験したすべての５４匹のジャーマン・シェパード・ドッグは、変異体Ｃについてホモ接合であった。
【０１１５】
【表４】
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【実施例３】
【０１１６】
材料および方法
テンプレート
イヌＤＮＡサンプルの対立遺伝子同一性を、５’−３’エキソヌクレアーゼ（「タックマン（TaqMan）」）アッセイを使用して、決定した。イヌゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。ＤＮＡを、直接的単離物としてか、または極めて希薄なサンプルの場合において使用し、ゲノミフィ（GenomiPhi）TMＤＮＡ増幅キット（アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences））を使用して、増幅した。アッセイは、50〜100 ng/μｌの濃度でＤＮＡを使用して、実施した。
【０１１７】
反応
反応は、次のものを使用して行った：12.5μｌのタックマン・ユニバーサル（TaqMan Universal）ＰＣＲマスター・ミックス（Master Mix）、AmpErase UNG（アップライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、Warrington、英国）を含まない；1μｌの各オリゴヌクレオチド（10 pm /μｌストック溶液）（シグマジェノシス（Sigma Genosys）、Cambs、英国）；1μｌタックマン（TaqMan）プローブ（5 pm /μｌストック溶液）（シグマジェノシス（Sigma Genosys）、Cambs、英国）；9.5μｌのヌクレアーゼを含まない水；および1μｌのテンプレートＤＮＡ。プローブを、６ＦＡＭで５’、およびＴＡＭＲＡで３’標識した。反応は、ABI 7700配列検出システム（Sequence Detection System）において、６３℃にまで上昇させたアニーリング温度を除いて、デフォルトのＰＣＲ条件を使用して、実施した。プライマーおよびプローブの配列を表４に示す。
【０１１８】
【表５】
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*表は、２つの逆方向プライマーに対する訂正された配列を示す。予め与えられた不正確な配列は：GCACACTGACCTGTTCCAATCTC（対立遺伝子Ｂ逆方向プライマー）；およびGGGCTGGCTTCTGTAGTGACA（対立遺伝子Ｃ逆方向プライマー）であった。
【０１１９】
結果
異なる１０品種由来の９５匹のイヌのＩｇＡ遺伝子型を、「タックマン（TaqMan）」アッセイ方法によって決定した。各イヌ品種のＩｇＡ遺伝子型を表５に示す。試験したすべての１０匹のジャーマン・シェパード・ドッグは、変異体Ｃについてホモ接合であった。
【０１２０】
【表６】
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【実施例４】
【０１２１】
食餌感受性のイヌのパネルにおけるＩｇＡ遺伝子型の分布を決定した。食餌感受性イヌは、断続的な軟便を生じ、食餌操作に応答し、その食餌感受性は食物特異的ではないイヌとして、規定される。実施例３に記載のように、「タックマン（TaqMan）」アッセイを使用して、遺伝子型決定を行った。
【０１２２】
結果
食餌感受性パネルの遺伝子型を、実施例３由来のイヌの「無作為」集団由来の遺伝子型と比較した（表６）。食餌感受性のイヌのパネル内の最も一般的な遺伝子型はＡＣ（３０％）およびＢＣ（３５％）であった。特定の遺伝子型と食餌感受性との間に関連性があるかどうかを調べるために、二項検定を行った。表７は、各対立遺伝子を伴う各サンプルにおけるイヌの百分率、およびサンプル間の差異のｐ値（２峰分布に基づく）を示す。食餌感受性のイヌのパネルのうち、８０％は、１つもしくはそれ以上の変異体Ｃ対立遺伝子を有した。比較では、イヌの無作為集団の僅か３９％しか、１つもしくはそれ以上の変異体Ｃ対立遺伝子を有さなかった。食餌感受性と変異体Ｃの存在との間の関連性は、統計的に有意である（ｐ＝０．００）。これらの結果から、１つもしくはそれ以上の変異体Ｃ対立遺伝子の存在は、非特異的食餌感受性に対する感受性と相関関係があることが示される。
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
【表８】
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【０１２５】
考察
複数のＩｇＡサブクラスが、ヒト、霊長類およびウサギ目において同定されているが、マウス、ウシおよびイヌでは、これまで、単一のサブクラスしか特徴付けされていない。２種のヒトサブクラス（ＩｇＡ1およびＩｇＡ2）は、ＣＨ1およびＣＨ2ドメイン間のヒンジ領域の長さの差異によって規定される。イヌにおいて先に同定された単一のＩｇＡサブクラスは、ヒトのＩｇＡ1サブクラスに類似の予想されたアミノ酸配列を伴うヒンジ領域を有する。
【０１２６】
ヒトＩｇＡ1の延長されたヒンジ領域の存在は、免疫グロブリン分子により大きな可撓性を付与し、抗原の結合を容易にするが、ＩｇＡ2と比較して、プロテアーゼによる切断をより受けやすくする。ヒトＩｇＡ2に存在するヒンジ領域の短縮化は、５’末端付近の第２のエキソンからの３９塩基対欠失による（図５）。これは、スプライス部位のシフトによっては生じないが、免疫グロブリンクラスター内の個別の遺伝子座位による。
【０１２７】
イヌＩｇＡにおいて同定された４つの変異体のうち、変異体Ａ、ＣおよびＤは、最も大きな配列類似性を共有し、ｍＲＮＡの長さの差異は、スプライスアクセプターにおける多型による。変異体Ｂは、変異体Ａに類似の最も短いｍＲＮＡ配列を有するが、また、他の変異体と比較して、より多数の塩基多型を伴う第２のエキソンの５’末端方向への塩基欠失を有する。従って、変異体Ａ、ＣおよびＤは、１つの遺伝座位（ヒトＩｇＡ1に類似）で対立遺伝子変異体であり、変異体Ｂは、第２の遺伝子座位内でコードされ、従って、第２のＩｇＡサブクラス（ＩｇＡ2に類似）を意味し得ることが可能である。
【０１２８】
ジャーマン・シェパード・ドッグ（ＧＳＤ）は、特に、多くの炎症性ならびに免疫介在性消化器系疾患の傾向がある。個別の研究において解析されたすべての１６のＧＳＤは、プライマーの組１によって試験される場合、ｍＲＮＡの「低い」発現を有し、変異体Ａを発現するものがないことが示唆される。従って、疾患および関連のＩｇＡ欠損症に対するＧＳＤの感受性は、この品種内に存在する特定のＩｇＡ変異体に関連するようである。
【０１２９】
本研究では、変異体Ｃのみが、試験したＧＳＤのすべてにおいて見出された（即ち、すべてのＧＳＤは変異体Ｃに対しホモ接合であった）。このことは、変異体Ｃ対立遺伝子の存在によって、ジャーマン・シェパード・ドッグが、他の品種におけるよりもＧＳＤにおいてより優勢であることが公知である胃腸障害および他のＩｇＡ関連障害にかかり易くなることが示唆される。変異体Ｃはまた、おそらく、分子がより分解を受けやすくすることによって、ＩｇＡの欠損症を生じ得る。さらに、非特異的食餌感受性イヌのパネルに対する試験は、無作為集団における３９％のイヌと比較して、８０％が１つもしくはそれ以上の変異体Ｃ対立遺伝子を有することを示した。このことから、変異体Ｃ対立遺伝子の存在によって、胃腸疾患に対する感受性を増加することが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】十二指腸生検におけるｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量化を示す。左側（Ａ）のグラフは、プライマーの組１を使用して生成されるトレースを表し、２峰分布の発現を示す。サンプルは、相対的に「高い」（●）または「低い」（■）量のα鎖ｍＲＮＡのいずれか一方を含有した。右側のグラフは、プライマーの組２を使用する場合のトレースの重複を示し、類似の量のα鎖ｍＲＮＡがすべてのサンプルに存在し、組１における順方向プライマーは、いくつかのサンプルにおいてｍＲＮＡのかなりの部分を検出しないことを示唆する。
【図２】４つの配列決定された変異体およびそれらのジェンバンク（GenBank）配列Ｌ３６８７１との関係を示す。番号付けはジェンバンク（GenBank）配列のエキソン１の第１塩基から開始する。一塩基多型（ＣまたはＴ）（Ａ）は、予想されたアミノ酸配列を変更しない同じ変異体を有する個体間に存在する。可変数のＣＴ反復（Ｄ）が、第２のエキソンのスプライス部分の前のイントロン配列に存在する。塩基５４７（ＴまたはＡ）における一塩基多型（Ｅ）は、スプライスアクセプターの消失が発生し、長いヒンジ変異体（ＦからＨ）または短いヒンジ変異体（ＧからＨ）のいずれかが生じる。第１のエキソンは塩基３０６で終了し（Ｂ）、それは、重鎖の第１ドメインに対応する。配列決定されたすべてのイヌのイントロン配列における４塩基は、ジェンバンク（GenBank）配列のそれに一致しない（Ｃ）。
【図３】ＩｇＡ変異体に対するｍＲＮＡ配列を、リアルタイムＰＣＲにおいて使用されるプライマーの組の位置と共に示す。位置は、ジェンバンク（GenBank）配列のエキソン１の第１塩基から番号付けされている。組１における順方向プライマーの位置は、変異体ＣおよびＤの９塩基付加を含み、従って、このテンプレートを効率的にはプライムしない。組２における順方向プライマーは、すべての変異体からフラグメントを増幅することができる。ＲＮＡの長さに差異を認めることができ、変異体Ｂは最も短く、Ｄは最も長い。
【図４】配列決定されたｍＲＮＡに基づきＩｇＡ変異体に対して予想されたアミノ酸配列を示す。位置Ａは、コードされるアミノ酸に影響を及ぼさない第１のエキソンにおける（Ａ−Ｔ）多型に対応する。アミノ酸の差異を太字で強調する。変異体Ｂは最も短いヒンジ（７ＡＡ）を有し、変異体Ｄは最も長いヒンジ（１３ＡＡ）を有する。
【図５】ヒトＩｇＡ1およびＩｇＡ2をコードするｍＲＮＡのアラインメントを示す。ヒトＩｇＡサブクラスをコードするｍＲＮＡ配列を整列して、このサブクラスのより短いヒンジを生じるＩｇＡ2の３９ｂｐ欠失の位置を表す。イヌのヒンジ変異体とは対照的に、この欠失は第２のエキソンの最初の塩基を含むが、５’末端からの５塩基である。
【図６】本発明による方法を実施するように配置される装置の例示を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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