(57)【要約】  モノクローナル抗体ＲＭ２によって規定される新規な炭水化物抗原であるβ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ジシアリル−Ｌｃ４は、ヒト前立腺癌で発現するが、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）や正常な前立腺では発現しない。モノクローナル抗体ＲＭ２または類似の特異性を有する他の抗体は、生検サンプル、前立腺全切除術検体の免疫組織学による前立腺癌の診断、患者の血清中に含まれるＲＭ２抗原の定量に有用である。【選択図】図１
2007530977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の診断方法であって、以下に示すエピトープ構造を有するＲＭ２抗原の有無またはそのレベルの上昇を、前立腺癌が疑われる患者に由来する検体において検出することを含む前記方法
【化１】
2007530977.tif 000007
（式中、Ｒは担体を表す）。
【請求項２】
前記検体を、ＲＭ２抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗体と接触させ、抗体の抗原への特異的結合によって前記抗原の有無を検出することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗体が、ポリクローナル抗体、一本鎖ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、キメラ抗体、一本鎖キメラ抗体、キメラ抗体断片、リサーフェスド抗体、リサーフェスド一本鎖抗体、リサーフェスド抗体断片、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体、及びヒト化抗体断片からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗体がモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記検体が前立腺生検サンプルである、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検体が前立腺全切除術（total prostatectomy）検体である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検体が血清サンプルである、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原の有無を、免疫組織学；ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のウェスタンブロット分析；前記抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体；表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法；または原子間力顕微鏡検査法によって検出する、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
前記検体が前立腺生検サンプルであり、前記抗原の有無を免疫組織学、前記抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法、または、原子間力顕微鏡検査法によって検出する、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記検体が前立腺全切除術検体であり、前記抗原の有無を免疫組織学、前記抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法、または、原子間力顕微鏡検査法によって検出する、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
前記検体が血清サンプルであり、前記抗原の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロット分析によって検出する、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前立腺癌の診断キットであって、
（ａ）以下に示すエピトープ構造を有するＲＭ２抗原に特異的に結合する少なくとも１つの部分であって、前立腺癌が疑われる患者から取得した検体に由来する前記部分
【化２】
2007530977.tif 000008
（式中、Ｒは担体を表す）、
（ｂ）当該キットを用いて前立腺癌を診断するための説明書、
（ｃ）任意に、前記部分の前記抗原への特異的結合によって前記抗原の有無を検出する手段
を含む前記キット。
【請求項１７】
前記ＲＭ２抗原に特異的に結合する部分が抗体である、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、一本鎖ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、キメラ抗体、一本鎖キメラ抗体、キメラ抗体断片、リサーフェスド抗体、リサーフェスド一本鎖抗体、リサーフェスド抗体断片、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体、及びヒト化抗体断片からなる群より選択される、請求項１６記載のキット。
【請求項１９】
前記ＲＭ２抗原に特異的に結合する部分が抗体である、請求項１６記載のキット。
【請求項２０】
前記ＲＭ２抗原に特異的に結合する部分がモノクローナル抗体である、請求項１６記載のキット。
【請求項２１】
前記ＲＭ２抗体に特異的に結合する部分が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項１６記載のキット。
【請求項２２】
前記検体が前立腺生検サンプルである、請求項１６または１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
前記検体が前立腺全切除術検体である、請求項１６または１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記検体が血清サンプルである、請求項１６または１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記抗原の有無を、免疫組織学；ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のウェスタンブロット分析；前記抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体；表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法；または原子間力顕微鏡検査法によって検出する、請求項１６記載のキット。
【請求項２６】
前記検体が前立腺生検サンプルであり、前記抗原の有無を免疫組織学、前記抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法、または、原子間力顕微鏡検査法によって検出する、請求項１７記載のキット。
【請求項２７】
前記検体が前立腺全切除術検体であり、前記抗原の有無を免疫組織学、前記抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法、または、原子間力顕微鏡検査法によって検出する、請求項１７記載のキット。
【請求項２８】
前記検体が血清サンプルであり、前記抗原の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロット分析によって検出する、請求項１７記載のキット。
【請求項２９】
前記検体が体内分泌物由来のサンプルであり、前記抗原の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロット分析によって検出する、請求項１７記載のキット。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項２６記載のキット。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項２７記載のキット。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの抗体が、ＲＭ２モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対するものである、請求項２８記載のキット。
【請求項３３】
ＲＭ２抗原を含む、単離された前立腺組織サンプル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特定の炭水化物抗原をヒト前立腺癌関連抗原として同定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
米国における前立腺癌は２．７５分毎に診断され、２３０，０００件以上の新たな症例が毎年発生している。前立腺癌は男性の間で最もよく診断される癌であり（新規癌症例全体の３２％以上）、推定２９，９００人の男性が前立腺癌で毎年亡くなっている。前立腺癌は、米国ではあらゆる種類の癌の中で最も発病率が高くなっている。似たような動向が他の先進国でも認められている。
【０００３】
前立腺特異的抗原（prostate-specific antigen；ＰＳＡ）が現在前立腺癌の診断に利用されており、その理由は、血清中の抗原レベルの増加（＞６．１ｎｇ／ｍｌ）が当該疾患と関連することが多いためである。しかしながら、ＰＳＡはタンパク質抗原であり、前立腺癌だけでなく正常な前立腺にも見られる。ＰＳＡレベルの増加は良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）や前立腺炎とも関連しており、従って、前立腺癌の決定的な指標ではない。
【０００４】
異常な糖鎖形成（細胞表面における異常な炭水化物鎖の形成）は多くの種類の癌で発生する。異常糖鎖形成のパターンと、特定の種類の癌に関連する特定のグリコシルエピトープの発現とを診断基準として利用し、多種類のヒトの癌の診断が行われている。
【０００５】
ヒト前立腺癌と関連して発現するが、正常な前立腺またはＢＰＨとは関連せずに発現する異常な炭水化物鎖について検索が行われている。本発明はこのような構造の同定に関するものであり、当該構造は「ＲＭ２抗原」（β１，４−ＧａｌＮＡｃ−ジシアリル−Ｌｃ４）と呼ばれ、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＲＭ２に特異的に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、腎細胞癌（ＲＣＣ）抗原に関する従前の検索結果を前立腺癌の研究に応用したものである。元々は、ＲＣＣ細胞株ＴＯＳ１を免疫原として使用してＲＣＣと反応するｍＡｂを取得し、このｍＡｂを「ＲＭ２」と命名した。ＲＭ２によって認識される抗原の構造は、後からβ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ジシアリル−Ｌｃ４と同定されたのである（図１）。ＲＣＣは比較的珍しい種類の癌であり、ＲＣＣの全てがこの構造を発現するわけではない。泌尿生殖器系の臓器は共通の胚発生をたどるため、ＲＭ２抗原の発現について、様々な病期に相当する３５例の前立腺癌症例にて系統的な検査を行った。これら３５例の全てにおいて、ｍＡｂ  ＲＭ２に対する陽性の反応性、即ち、ＲＭ２抗原の存在が示された。１８例が中または強陽性であり、１７例が弱陽性であった。３５例全ての正常腺では陰性または非常に弱い染色が観察され、６例のＢＰＨ症例では染色が観察されなかった。中央値グリーソンスコア（悪性度の指標）は、中／強陽性例および弱陽性例でそれぞれ８および７であった。
【０００７】
ＢＰＨにおけるＲＭ２のネガティブ発現は、ＲＭ２の診断応用にとって特別な関連がある。ＰＳＡアッセイでは、僅か〜中程度の上昇値（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）であればＢＰＨと関連する場合が多い。ＲＭ２はＢＰＨでは発現しないため、前立腺癌をＢＰＨと識別するＲＭ２の識別能は、ＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲で上昇した男性の中から血清ＲＭ２試験を利用して生検症例を選択する上で極めて有用である。根治前立腺切除術検体９例のうち、５例で中／強陽性（ｍ／ｓ）染色が認められ、４例で弱陽性（ｗ）染色が認められた。５例のｍ／ｓ染色のうち４例は病理学的に臓器非限局性であり、これに対し、４例のｗ染色のうち４例とも臓器限局性であった。検査した症例数は少ないものの、ＲＭ２陽性と病理学的病期との間には明らかな相関がある（ｐ＜０．０２）。臨床的に限局性の前立腺癌において病理学的病期を予測することは、治療の選択肢（即ち、根治前立腺切除術か放射線療法か）を選択する上で非常に重要である。これらのデータから、臨床的に限局性の前立腺癌における病理学的病期を予測するのにもＲＭ２が有用である可能性は明らかである（病理学的に臓器非限局性の癌は当時の根治前立腺切除術の約４０％で認められる）。
【０００８】
当時のデータによれば、ＰＳＡ試験を受けた男性患者の大半が４〜１０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ値を示した。しかも、この範囲のＰＳＡ値を有する患者のうち僅か２５％が生検によって前立腺癌であることが判明し、即ち、「高」ＰＳＡ値を示す患者の７０％より多くが前立腺癌ではなかったのである。この試験を世界規模で使用することは、金銭、時間および労力の甚だしい浪費を意味し、かつ、患者の心理的ストレスを意味する。
【０００９】
このような理由から、ヒト前立腺癌と関連して発現するが、正常な前立腺またはＢＰＨとは関連せずに発現する特定の抗原を見出すことが、非常に重要な医学上の進歩となる。本発明は前立腺癌の診断方法を提供するものであり、当該方法は、以下に示すエピトープ構造を有するＲＭ２抗原の有無またはそのレベルの上昇を、前立腺癌が疑われる患者に由来する検体において検出することを含む
【００１０】
【化１】
2007530977.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒは担体を表す）。
【００１２】
好適な実施態様では、ＲＭ２抗原に特異的に結合する抗体によってＲＭ２抗原を検出する。より好適な実施態様では、当該抗体はＲＭ２モノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明は、また、前立腺癌の診断キットを提供するものであり、当該キットには
（ａ）以下に示すエピトープ構造を有するＲＭ２抗原に特異的に結合する少なくとも１つの部分であって、前立腺癌が疑われる患者から取得した検体に由来する前記部分
【００１４】
【化２】
2007530977.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒは担体を表す）、
（ｂ）当該キットを用いて前立腺癌を診断するための説明書、
（ｃ）任意に、前記部分の前記抗原への特異的結合によって前記抗原の有無を検出する手段
が含まれる。
発明の詳細な説明
Ａ．ＲＭ２抗原および抗体  ヒトの腫瘍の特徴は、スフィンゴ糖脂質または糖タンパク質のいずれかに結合する特定の炭水化物抗原を発現する点にある（Hakomori, S. 1989 Adv. Cancer Res. 52, 257-331; Hakomori, S. 1996 Cancer Res. 56, 5309-5318）という一般的な概念に基づいて、ＲＣＣで高度に発現する低移動性ガングリオシドの存在を実証した（Saito, S., Orikasa, S., Ohyama, C., Satoh, M., and Fukushi, Y. (1991) Int. J. Cancer 49, 329-334）。モノクローナル抗体ＲＭ２は、マウスをＲＣＣ細胞株ＴＯＳ１で免疫し、ＲＣＣ組織に発現した低移動性ガングリオシドを認識する抗体を分泌するハイブリドーマのクローニングを繰り返すことで樹立した（Saito, S., Levery, S.B., Salyan, M. E. K., Goldberg, R. I., and Hakomori, S. 1994 J. Biol. Chem. 269, 5644-5652）。さらに、ｍＡｂ  ＲＭ２によって認識される抗原（「ＲＭ２抗原」と呼ぶ）の構造に関する系統的研究を一次元および二次元１Ｈ−ＮＭＲ並びに質量分析にて行ったところ、当該抗原がβ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ジシアリル−Ｌｃ４であることが明らかとなった（図１）。当該構造は極めて新規であり、「ガングリオシリーズ（ganglio-series）」（図１の領域１）群と「ジシアリルラクトシリーズ（disialyl lacto-series）１型鎖」（図１の領域２）群とからなる（Ito, A., Levery, S. B., Saito, S., Satoh, M., and Hakomori, S. 2001 J. Biol. Chem. 276, 16695-16703）。
Ｂ．前立腺癌関連抗原としてのＲＭ２抗原  泌尿生殖器系の組織および臓器は個体発生的に関連しているため、本発明者らは、ＲＣＣで発現する抗原が、発病率と死亡率が高い他の泌尿生殖器系の癌（特に前立腺癌）でも発現する可能性があると仮定した。４０例の前立腺癌症例からの生検サンプルについて予備研究を行った。生検サンプルには癌の全段階が含まれ、その大部分は症状が進行した段階である。即ち、生検サンプルの約６６％を「臓器非限局性」前立腺癌患者から取得した。標準的な組織学手法で組織をホルマリン固定およびパラフィン包埋した。４０サンプルのうち、３５サンプルで構造の良好な保存が認められ、免疫組織学の結果を評価することができた。これら３５サンプルの全てにおいて、ＲＭ２抗体に対する陽性の反応性が認められた。１８例が中または強陽性であり、１７例が弱陽性であった。これらの症例を以下に示す。
生検検体
１．中／強陽性例（１８例）
・年齢（中央値）：７２．５歳
・ＰＳＡ値（中央値）：４０ｎｇ／ｍｌ（範囲：２．５〜３７９７ｎｇ／ｍｌ）
・グリーソンスコア（中央値）：８（全１８例に対して）
３例でスコア６
５例でスコア７
３例でスコア８
７例でスコア９
・臨床病期
限局度（Ｔ）
Ｔ２以下：６例
Ｔ３以上：１２例
転移有り
Ｄ２期（所属リンパ節を超えて骨または遠隔リンパ節へ転移）：５例
Ｄ１期（所属リンパ節へ転移）：１例
転移無し
Ｔ１ｃ〜Ｔ４Ｎ０Ｍ０：１２例
（Ｔ１ｃ：４例、Ｔ２：２例、Ｔ３：５例、Ｔ４：１例）
２．弱陽性例（１７例）
・年齢（中央値）：７１歳
・ＰＳＡ値（中央値）：３７ｎｇ／ｍｌ（範囲：７〜１７２３ｎｇ／ｍｌ）
・グリーソンスコア（中央値）：７（全１７例に対して）
３例でスコア６
７例でスコア７
４例でスコア８
３例でスコア９
・臨床病期
限局度（Ｔ）
Ｔ２以下：６例
Ｔ３以上：１１例
転移有り
Ｄ２期（所属リンパ節を超えて骨または遠隔リンパ節へ転移）：４例
Ｄ１期（所属リンパ節へ転移）：１例
転移無し
Ｔ１ｃ〜Ｔ３Ｎ０Ｍ０：１２例
（Ｔ１ｃ：３例、Ｔ２：３例、Ｔ３：６例）
根治前立腺切除術検体（全９例）
・年齢（中央値）：６５歳
・ＰＳＡ（中央値）：６．１ｎｇ／ｍｌ（範囲：４．４〜１３．２ｎｇ／ｍｌ）
１．中／強陽性例（５例）
・グリーソンスコア７：３例
・グリーソンスコア８：１例
・グリーソンスコア９：１例
・臓器非限局型（ｐＴ３以上）：４例
・臓器限局型（ｐＴ２以下）：１例
２．弱陽性例（４例）
・グリーソンスコア８：２例
・グリーソンスコア９：２例
・臓器限局型（ｐＴ２以下）：４例
Ｃ．腫瘍細胞の糖タンパク質としてのＲＭ２抗原  ＲＭ２抗原は、上記Ａ．節に記載したように、元々はスフィンゴ糖脂質（ジシアロガングリオシド）として見出されたものである。しかしながら、腫瘍細胞に存在するこの抗原の一部は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後にウェスタンブロット分析を行うことで検出可能である。簡単に言うと、細胞を氷上へ置き、氷冷ＰＢＳで洗浄して細胞溶解バッファー（２０ｍＭトリス  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、５０ｍＭ  ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）で溶解した。抽出物を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより清澄化した。等量のタンパク質を含む溶解産物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、次いでＨｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Amersham Biosciences）へ転写した。膜を１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでブロックし、次いで一次抗体と共にインキュベートした。結合した抗体を、適当なペルオキシダーゼ結合二次抗体、次いで増感化学発光検出装置（ＥＣＬ、Boehringer Mannheim）を用いて検出した。
【００１６】
重要な点は、糖タンパク質抗原がスフィンゴ糖脂質抗原よりも容易に細胞から放出されることである。血清検査の際に診断プローブとして用いられる多くの腫瘍関連抗原は、スフィンゴ糖脂質ではなく糖タンパク質である。
Ｄ．前立腺癌の診断方法：  本発明は前立腺癌の診断方法を提供するものであり、当該方法は、以下に示すエピトープ構造を有するＲＭ２抗原の有無またはそのレベルの上昇を、前立腺癌が疑われる患者に由来する検体において検出することを含む
【００１７】
【化３】
2007530977.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒは担体を表す）。
【００１９】
当該方法は、悪性前立腺癌からＢＰＨを識別するのに特に有用である。
【００２０】
適切な担体としては、（ｉ）糖タンパク質にＮ−結合またはＯ−結合したラクトサミン鎖、（ｉｉ）スフィンゴ糖脂質中の４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ、（ｉｉｉ）他の任意の天然または合成担体分子などが挙げられる。
【００２１】
前立腺癌を診断する際に使用に適した検体としては、前立腺癌組織の生検材料、前立腺全切除術（total prostatectomy）検体、血清などが挙げられる。
【００２２】
本発明によれば、前立腺癌の診断方法は、ＲＭ２抗原の有無またはそのレベルの上昇が前立腺癌の発生と相関する検体において、当該抗原の有無またはそのレベルの上昇を検出できる方法であれば、どのような方法でもよい。ＲＭ２抗原の有無またはそのレベルの上昇を検出する方法の例としては、「サンドイッチ」イムノアッセイ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法などが挙げられる。
【００２３】
ＰＳＡ分析で実施されているような二重モノクローナルアッセイ（McCormack RT, et al, “Molecular forms of prostate-specific antigen and the human kallikrein gene family: a new era”, Urology 45(5):729-44, 1995; Karazanashvili G, Abrahamsson PA, “Prostate specific antigen and human glandular kallikrein 2 in early detection of prostate cancer”, J. Urology 169(2):445-457, 2003）を利用した「サンドイッチ」法を用いると、ウェスタンブロット分析から明らかなように、ＲＭ２抗原に対して反応性の４９ｋＤａの糖タンパク質が、腫瘍細胞から放出される主な糖タンパク質であることが判明した。さらに、ＲＭ２を用いたウェスタンブロット分析により、微量の糖タンパク質バンド（８８ｋＤａ、９８ｋＤａ、１３０ｋＤａ）も各種前立腺癌細胞株で検出された（図５Ａおよびその説明を参照）。これらのＲＭ２反応性糖タンパク質は、アンドロゲン依存性のＬＮＣａｐ細胞およびアンドロゲン非依存性のＰＣ３細胞の双方で認められた。ＲＭ２の他に、これらの前立腺癌細胞株で発現するＲＭ２以外のエピトープに対するモノクローナル抗体を組み合わせれば、二重モノクローナル抗体アッセイを利用した効率の良いサンドイッチ法の設計に有用である。
【００２４】
エレクトロスプレーイオン化やマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析の著しい進歩により、これらの方法を応用して特定の癌を有する患者の血清中の腫瘍関連糖タンパク質が分析されている（例えば、Johnson PJ, et al, “Structures of disease-specific serum alpha-fetoprotein isoforms”, Br. J. Cancer 83(10):1330-1337, 2000; Poon TC, et al, “Comprehensive proteomic profiling … of hepatocellular carcinoma and its subtypes”,  Clin. Chem. 49(5):752-760, 2003）。この線に沿うと、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（表面増感レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析）が糖タンパク質抗原の特性決定に有用である（Merchant M, Weinberger SR, “Recent advancements in surface-enhanced laser desorption/ionization-tim of flight-mass spectrometry”, Electrophoresis 21:1164-1167, 2000）。実際、患者血清中のＲＭ２糖タンパク質は、ゲル上に付着させた抗体によって捕捉することができ、その後、吸着抗原を溶出させてＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。
【００２５】
表面プラズモン共鳴分光法は高感度であり、弱い相互作用を検出することが可能である（Matsuura K, et al, “A quantitative estimation of carbohydrate-carbohydrate interaction … by surface plasmon resonance”, J. Am. Chem. Soc. 122(30):7406-7407, 2000; Hernaiz MJ, et al, “A model system mimicking glycosphingolipid clusters to quantify carbohydrate self-interactions by surface plasmon resonance”, Angew. Chem Intl. Ed. 41(9):1554-1557, 2002）。これは、表面プラズモン層に付着させた抗体へ結合させることにより患者血清中の抗原を測定する有望な方法である。例えば、金膜上に付着させたＲＭ２抗体のＦａｂ誘導体（「自己集合単層（self-assembled monolayer）」；ＳＡＭ）を用いて、患者血清中に存在する抗原を検出する。
【００２６】
好適な方法では、検体にＲＭ２抗原と特異的に結合する部分を接触させ、次いで、当該部分のＲＭ２抗原への特異的結合を検出することによって抗原の有無を検出する。ＲＭ２抗原と特異的に反応する部分の例は、ＲＭ２抗原に特異的に結合する抗体である。
【００２７】
本発明の意味においては、抗体は、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等）、キメラ抗体、リサーフェスド（resurfaced）抗体、ヒト化抗体などを含むものと解する。
【００２８】
ＲＭ２抗原に対するポリクローナル抗体は、当業者であれば、多種多様な温血動物（ウマ、ウシ、各種家禽、ウサギ、マウス、ハムスター、ラット等）から容易に生成可能である。例えば、哺乳動物（マウス、ハムスター、ウサギ等）を、抗体応答を当該哺乳動物に惹起する免疫原性を有する形態のＲＭ２抗原で免疫することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体価を検出することで監視可能である。免疫化の後、抗血清を取得し、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。
【００２９】
本発明の方法では、好ましくはモノクローナル抗体を使用する。ＲＭ２抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、従来慣用の技術を利用すれば容易に生成可能である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（1975）によって最初に開発されたハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497）によってモノクローナル抗体を産生することができる（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、米国特許第４，５４３，４３９号、米国特許第４，４１１，９９３号（いずれも引用により本明細書に含まれるものとする）も参照されたい。さらに、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol（監修）, 1980およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane（監修）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988も参照されたい）。その他の技術を利用してモノクローナル抗体を構築することも可能である（例えば、William D. Huse et al., 1989 “Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,” Science 246:1275-1281, L. Sastry et al., 1989 “Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library,” Proc Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732; Kozbor et al., 1983 Immunol. Today 4, 72 re the human B-cell hybridoma technique; Cole et al. 1985 Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy, Allen R. Bliss, Inc., pp. 77-96 re the EBV-hybridoma technique to produce human monoclonal antibodiesを参照されたい。また、Michelle Alting-Mees et al., 1990 “Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas,” Strategies in Molecular Biology 3:1-9も参照されたい）。ＲＭ２抗原と特異的に反応する抗体の産生についてハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００３０】
本明細書中、用語「抗体」とは、ＲＭ２抗原と特異的に反応する抗体断片を含むものとする。従来慣用の技術を用いて抗体を断片化し、完全な抗体について上述したのと同様の方法で有用性について断片をスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理してＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理してジスルフィド架橋を還元すれば、Ｆａｂ’断片を産生することができる。
【００３１】
一本鎖抗体は、可変重鎖および可変軽鎖をリンカーで繋ぐことで産生可能である（例えば、Huston et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883およびBird et al. 1988 Science, 242, 423-426（いずれも引用により本明細書に含まれるものとする）を参照されたい）。
【００３２】
本発明は、キメラ抗体誘導体、即ち、ヒト以外の動物の可変領域とヒトの定常領域とを組み合わせた抗体分子も意図する。キメラ抗体分子としては、例えば、マウス、ラットまたはその他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインとヒト定常領域とを組み合わせたものなどを挙げることができる。キメラ抗体を作製する多種多様の方法が現在までに記載されており、これらの方法を用いて、選択した抗原を分化細胞または腫瘍細胞の表面上で認識する免疫グロブリン可変領域を含有するキメラ抗体を作製することができる。例えば、Morrison et al., 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851; Takeda et al., 1985, Nature 314, 452；Cabilly et al., 米国特許第４，８１６，５６７号；Boss et al., 米国特許第４，８１６，３９７号；Tanaguchi et al., 欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号；欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。
【００３３】
本発明はさらに、リサーフェスドモノクローナル抗体の使用も意図する。抗体をリサーフェスドさせる方法は文献に記載されており、例えば、米国特許第５，６３９，６４１号（引用により本明細書に含まれるものとする）を参照されたい。
【００３４】
ヒト化抗体も本発明の方法で使用可能である。抗体をヒト化する方法は当該技術分野で周知であり、文献にも記載されている（例えば、Padlan, E. et al. 1991 Molecular Immunology, vol. 28, pp. 489-498、米国特許公開第２００２．００３４７６５Ａ１号、米国特許公開第２００４／００５８４１４Ａ１号）。
【００３５】
従って、本発明の方法での使用に適した抗体としては、ポリクローナル抗体、一本鎖ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、キメラ抗体、一本鎖キメラ抗体、キメラ抗体断片、リサーフェスド抗体、リサーフェスド一本鎖抗体、リサーフェスド抗体断片、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体、ヒト化抗体断片などが挙げられる。
【００３６】
本発明での使用に特に好適なのは、ＲＭ２ｍＡｂとその断片である。モノクローナル抗体ＲＭ２とその作製方法は、Saito, S., Levery, S.B., Salyan, M.E.K., Goldberg, R.I., and Hakomori, S. 1994 J. Biol. Chem. 269, 5644-5652（引用により本明細書に含まれるものとする）に記載されている。
【００３７】
抗体のＲＭ２抗原への特異的結合を検出する方法は当該技術分野で周知であり、免疫組織学；ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のウェスタンブロット分析；当該抗原に結合する一次抗体に対する標識二次抗体；表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法；原子間力顕微鏡検査法などが挙げられる。
Ｅ．前立腺癌の診断キット  本発明は、また、前立腺癌の診断キットを提供するものであり、当該キットには
（ａ）以下に示すエピトープ構造を有するＲＭ２抗原に特異的に結合する少なくとも１つの部分であって、前立腺癌が疑われる患者から取得した検体に由来する前記部分
【００３８】
【化４】
2007530977.tif 000006
【００３９】
（式中、Ｒは担体を表す）、
（ｂ）当該キットを用いて前立腺癌を診断するための説明書、
（ｃ）任意に、前記部分の前記抗原への特異的結合によって前記抗原の有無を検出する手段
が含まれる。
【００４０】
適切な担体は上述した担体である。
【００４１】
ＲＭ２抗原に特異的に結合する適切な部分は、診断方法での使用のところで記載したもののうちいずれでもよい。
【００４２】
検出に適した手段は、診断方法のところで記載した手段である。
【００４３】
説明書には、診断アッセイに適した検体の種類、例えば診断方法のところで上述したものなどが含まれる。
Ｆ．物質の組成：  本発明は、また、ＲＭ２抗原を含む単離または精製された前立腺組織サンプルを提供するものである。当該組織サンプルは、当該技術分野で公知の方法で単離および／または精製したものである。スフィンゴ糖脂質抗原および糖タンパク質抗原の単離方法は、Hakomori S & Kannagi R, “Carbohydrate antigens in higher animals”, Handbook of Experimental Immunology; Vol. 1: Immunochemistry（Weir DM, Herzenberg LA, Blackwell C, Herzenberg LA監修）第４版、Blackwell Scientific Publications（オックスフォード、ボストン）第９章（９．１〜９．３９頁）に概要が記載されている。先に指摘したように、抗原は糖タンパク質である（Ｍｒ〜５０ｋＤａ）。このことは、スフィンゴ糖脂質抗原は糖タンパク質抗原に比べて高レベルには放出されない場合が多いため、重要である。
【００４４】
組織サンプルは、精製・単離されていてもいなくても、ＲＭ２抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体の作製に使用することができ、抗体の作製は当該技術分野で周知の方法で行うことができる。例えば、Saito, S., Levery, S.B., Salyan, M.E.K., Goldberg, R.I., and Hakomori, S. 1994 J. Biol. Chem. 269, 5644-5652（引用により本明細書に含まれるものとする）を参照されたい。
【００４５】
刊行物および特許出願は全て、個々の刊行物または特許出願を具体的かつ個別に援用する旨記載したように同程度に本明細書中で援用されるものである。本発明を明確にし、かつ、理解する目的で例示および例を挙げていくらか詳細に記載してきたものの、ある一定の変更および改変が添付の特許請求の範囲を超えることなく実施し得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ＲＭ２抗原の構造を示す図である。
【図２Ａ−Ｃ】図２は、各種グリーソンスコアを有する前立腺癌の生検サンプルにおける、ＲＭ２抗原発現の免疫組織学的パターンを示す図である。図Ａ：サンプル１（グリーソンスコア５＋４）。図Ｂ：サンプル２（グリーソンスコア４＋５）。図Ｃ：サンプル３（グリーソンスコア５＋４）。倍率は２００倍。
【図２Ｄ−Ｆ】図２は、各種グリーソンスコアを有する前立腺癌の生検サンプルにおける、ＲＭ２抗原発現の免疫組織学的パターンを示す図である。図Ｄ：サンプル４（グリーソンスコア３＋３）。図Ｅ：サンプル５（グリーソンスコア４＋３）。図Ｆ：サンプル６（グリーソンスコア４＋３）。倍率は２００倍。
【００４７】
正常腺では、陰性またはごく弱いＲＭ２免疫染色が認められた。
【図３】図３は、根治前立腺切除術検体におけるＲＭ２抗原発現の免疫組織学的パターンを示す図である。図Ａ：サンプル１（グリーソンスコア３＋４）。図Ｂ：サンプル２（グリーソンスコア４＋４）。図Ｃ：サンプル３（グリーソンスコア４＋５）。倍率は２００倍。ｍｓ：中／強、ｗ：弱、ＲＰ：根治前立腺切除術。
【図４】図４は、根治前立腺切除術検体由来のＢＰＨ例（図Ａ）および正常前立腺例（図Ｂ）におけるＲＭ２抗原発現の免疫組織学的パターンを示す図である。ＲＭ２免疫染色はＢＰＨでは認められず、正常腺ではごく弱いＲＭ２免疫染色が認められた。倍率は１００倍。
【図５】図５は、前立腺癌細胞株のＲＭ２によるウェスタンブロット分析を示す図である。図Ａ：ＲＭ２による免疫染色。図Ｂ：マウスＩｇＭによる免疫染色（陰性対照）。１．ＰＣ３（５μｇ）、２．ＬＮＣａｐ（５μｇ）、３．ＰＣ３（１０μｇ）、４．ＬＮＣａｐ（１０μｇ）、５．ＰＣ３（１５μｇ）、６．ＬＮＣａｐ（１５μｇ）、７．ＰＣ３（２０μｇ）、８．ＬＮＣａｐ（２０μｇ）、Ｍ：サイズマーカー。ＲＭ２は４９ｋＤａの糖タンパク質を主要バンドとして検出し、他にも複数のバンドがＬＮＣａｐおよびＰＣ３で検出された。
【図１】
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【図５】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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