(57)【要約】組成物が、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを用いて化学架橋されている、コラーゲンタンパク質及び脱灰骨基質を含んでなる組成物について、記載される。架橋反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で行うことが可能である。コラーゲンは、多孔質の基質または足場中にあることが可能である。ＤＢＭは、コラーゲン中に分散している粒子の形状であることが可能である。また、組成物の製造方法であって、コラーゲンスラリーを所望の形に流し込み、凍結乾燥させて、多孔質の足場を形成し、そして架橋剤を含んでなる溶液を浸透させる方法についても記載する。該組成物を、組織（例えば、軟組織または骨）工学用移植物として用いることが可能である。
2007500043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱灰骨基質（ＤＢＭ）とコラーゲンタンパク質とを含んでなる、化学架橋されている組成物。
【請求項２】
組成物がカルボジイミド架橋剤を用いて化学架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カルボジイミド架橋剤が、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で化学架橋されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
１またはそれより多くの成長因子をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が、２〜９５重量％のＤＢＭを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が、５５〜８５重量％のＤＢＭを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ＤＢＭが、コラーゲン中に分散しているＤＢＭの粒子を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
コラーゲンタンパク質が、多孔質の足場中にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ＤＢＭが、多孔質の足場中に分散しているＤＢＭの粒子を含んでなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＤＢＭ粒子が、５ｍｍ以下の平均粒子サイズである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＢＭ粒子が、５３〜８５０μｍの範囲の平均粒子サイズである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロキシピリジニウム、ヒドロキシリシルピリジニウム及びホルマリンからなる群より選択される化合物により化学架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が、照射によって架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が、光酸化によって架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が、酵素的過程を介して架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
コラーゲンタンパク質が、組織トランスグルタミナーゼの作用を介して架橋されている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が、リシルオキシダーゼを用いて架橋されている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
組成物が、脱水温熱処理によって架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物が、酸性条件下で架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
コラーゲンタンパク質が、ｅ−ビーム照射、ガンマ線照射または光を用いて架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
コラーゲンタンパク質が、パルス光を用いて架橋されている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
スペーサーをさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
スペーサーが、ポリオキシアルキレンアミンスペーサーまたはポリエチレングリコールスペーサーである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が、ビニルピロリジノンまたはメタクリル酸メチルをさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
コラゲナーゼ阻害剤、成長因子、抗体、メタロプロテイナーゼ、細胞接着断片、及びその組み合わせからなる群より選択される添加剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
添加剤が、コラーゲンまたはＤＢＭと結合している、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
添加剤が、コラーゲンまたはＤＢＭと結合していない、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が、糖化またはグリコシル化によって架橋されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
架橋が、ペントシジン架橋である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
架橋が、イプシロン（ガンマ−グルタミル）リシン架橋である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
コラーゲンタンパク質及び脱灰骨基質を含んでなる組成物の製造方法であって、組成物を架橋することを含んでなる、上記方法。
【請求項３３】
組成物が、カルボジイミド架橋剤を用いて化学架橋されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
カルボジイミドが、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
組成物が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で化学架橋されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＮＨＳが、１：２〜２：５のＥＤＣ／ＮＨＳ比で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＮＨＳが、１：２、２：３または２：５のＥＤＣ／ＮＨＳ比で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
コラーゲンスラリー中に脱灰骨基質の粒子を分散させ、該スラリーを型の腔に流し込み、そして流し込んだスラリーを凍結乾燥させて、コラーゲンタンパク質及び脱灰骨基質の粒子を含んでなる多孔質の足場を形成させることをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
スラリーが水溶性スラリーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
架橋が、
カルボジイミド架橋剤を、多孔質の足場の孔に浸透させること；及び、
カルボジイミド架橋剤を、コラーゲンタンパク質及び／またはＤＢＭと反応させて、架橋を形成させること；
を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
架橋が、ｉｎ  ｖｉｖｏにて非架橋基質を培養し、細胞の機構によるコラーゲンの架橋が可能になることによって生じる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４２】
脱灰骨基質（ＤＢＭ）及びコラーゲンタンパク質を含んでなる組成物を哺乳動物に移植することを含んでなる治療方法であって、該組成物が架橋されている、上記方法。
【請求項４３】
組成物が、カルボジイミド架橋剤を用いて化学架橋されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
組成物が、哺乳動物の脊椎に移植される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
組成物が、哺乳動物の椎間腔に移植される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
組成物が、外傷性傷害部位に移植される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
組成物が、頭蓋顎顔面の腔に移植される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物がヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
脱灰骨基質（ＤＢＭ）とコラーゲンタンパク質とを含んでなる、アミド結合を介して架橋されている組成物。
【請求項５０】
１またはそれより多くの成長因子をさらに含んでなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
組成物が、２〜９５重量％のＤＢＭを含んでなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
組成物が、５５〜８５重量％のＤＢＭを含んでなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
組成物が、コラーゲンタンパク質中に分散しているＤＢＭの粒子を含んでなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
コラーゲンタンパク質が、多孔質の足場中にある、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
組成物が、多孔質の足場中に分散しているＤＢＭの粒子を含んでなる、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
ＤＢＭ粒子が、５ｍｍ以下の粒子サイズである、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
ＤＢＭ粒子が、５３〜８５０μｍの範囲の粒子サイズである、請求項５５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００３年７月２５日に出願された、米国特許出願第１０／６２６，５７１の優先権を主張する。該出願の全体は、参照によって本明細書に記載されているものとする。
【０００２】
背景
技術分野
本出願は、概して、生体人工装置に関する。そして具体的には、化学架橋結合しているコラーゲンを主とするキャリアーであって、脱灰骨基質（ＤＢＭ）を含んでなるキャリアーに関する。そして本出願は、例えば骨誘導移植物などの移植物としてのこれらの材料の使用に関する。
【０００３】
技術の背景
種々の材料が、外傷または疾患によって失われた骨または軟組織を修復あるいは再生するのに用いられている。典型的には、移植可能な骨修復材料は、骨形成に関与する細胞の遊走、増殖及びそれに続く分化のための多孔質基質（すなわち、足場）を提供した。このアプローチによって提供される組成物は、浸潤性の骨成長のための安定な構造を提供したが、一方で、それらは、骨細胞増殖または骨再生を促進しなかった。
【０００４】
これに続くアプローチでは、骨欠損部に移植される場合に、浸潤性の骨内部成長のための足場だけでなく、骨細胞の複製及び分化の活性誘導をも提供する、生理活性タンパク質を含有する骨修復基質が、用いられた。概して、これらの骨誘導組成物は、骨の浸潤性成長及び付着依存性細胞のための足場を提供する基質と、骨誘導タンパク質源とからなる。該基質は、コラーゲン、ポリ乳酸、あるいは生分解性多孔質セラミックなどの無機材料を含む多様な材料から選択されてもよい。骨形成の過程を介して新生骨の形成を誘導することが見いだされた二つの具体的な物質としては、脱灰骨の粒子または粉末、及び、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられる。
【０００５】
幅広く多様な組成物が、組織工学に用いられているが、一方で、骨及び軟組織の修復及び再生を加速及び促進し、移植物を受け入れる患者に対しより迅速な回復及びより良い結果を可能とするような改善または増強に対する必要性が、依然として存在する。
【０００６】
発明の概要
本発明の第一の側面によると、該脱灰骨基質（ＤＢＭ）及びコラーゲンタンパク質を含んでなる組成物であって、架橋されている組成物が、提供される。該組成物は、カルボジイミドを用いて化学架橋されることが可能である。カルボジイミドは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であることが可能である。該組成物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で、カルボジイミドを用いて化学架橋されることが可能である。該組成物は、１またはそれより多くの成長因子をさらに含むことが可能である。コラーゲンタンパク質は、多孔質の足場中にあることが可能である。ＤＢＭは、粒子の形状であることが可能である。例えば、該組成物は、コラーゲンタンパク質を含んでなる多孔質の足場中に分散しているＤＢＭの粒子を含んでなることが可能である。ＤＢＭ粒子は、５ｍｍ以下の平均粒子サイズであることが可能である。例えば、ＤＢＭ粒子は、５３〜８５０ｇｍの範囲の平均粒子サイズを有する。
【０００７】
本発明の第二の側面によると、組成物を架橋することを含んでなる、コラーゲンタンパク質と脱灰骨基質とを含んでなる組成物を作製する方法が、提供される。該組成物は、カルボジイミドを用いて化学架橋されることが可能である。カルボジイミドは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であることが可能である。該組成物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で、カルボジイミドを用いて化学架橋されることが可能である。ＮＨＳが用いられる場合、ＮＨＳは、１：２〜２：５のＥＤＣ／ＮＨＳ比で存在することが可能である。例えば、ＮＨＳは、１：２、２：３または２：５のＥＤＣ／ＮＨＳ比で存在することが可能である。反応は、緩衝溶液などのｐＨ調整された環境にて、行われても、または行われなくてもよい。本発明の本側面による方法は、コラーゲンスラリー中に脱灰骨粒子を分散させ、スラリーを型の腔に流し込み、そして流し込んだスラリーを凍結乾燥させて、脱灰骨基質の粒子を含んでなる多孔質のコラーゲン足場を形成させることをさらに含んでなることが可能である。例えば、スラリーは、コラーゲンタンパク質とＤＭＢ粒子とを含んでなる水溶性スラリーであることが可能である。該スラリーは、酸性ｐＨであることが可能である。本発明の本側面によると、架橋するとは、カルボジイミド架橋剤を多孔質のコラーゲン足場の孔に浸透させ、そしてカルボジイミド架橋剤をコラーゲンタンパク質の分子と反応させて架橋を形成することを、含んでなることが可能である。
【０００８】
本発明の第三の側面によると、脱灰骨基質（ＤＢＭ）とコラーゲンタンパク質とを含んでなる組成物であって、架橋されている組成物を、哺乳動物に移植することを含んでなる治療方法が、提供される。該組成物は、カルボジイミドを用いて化学架橋されることが可能である。該組成物は、整形外科的用途（application）において用いられることが可能である。例えば、該組成物は、哺乳動物の脊椎に、または哺乳動物の椎間腔に移植されることが可能である。該哺乳動物は、ヒトであることが可能である。
【０００９】
本発明の第四の側面によると、組成物がアミド結合を介して架橋されている、脱灰骨基質（ＤＢＭ）及びコラーゲンタンパク質を含んでなる組成物が、提供される。該組成物は、コラーゲンタンパク質中に分散しているＤＢＭの粒子を含んでなることが可能である。該コラーゲンタンパク質は、多孔質の足場中にあることが可能である。ＤＢＭ粒子は、５ｍｍ以下の平均粒子サイズであることが可能である。例えば、ＤＢＭ粒子は、５３〜８５０μｍの範囲の平均粒子サイズを有することが可能である。
【００１０】
詳細な説明
本発明の一つの実施態様によると、細胞遊走のための骨伝導基質を提供し、そして患者に移植後の持続期間が延長された、コラーゲンキャリアー中にＤＢＭを含んでなる組成物が提供される。本発明のさらなる実施態様によると、化学架橋法が、コラーゲン及びＤＢＭを含んでなる組成物を架橋するために、提供される。架橋中、コラーゲン分子は、コラーゲン分子上に存在する反応基を介して、互いに架橋されることが可能である。また、架橋中、コラーゲン分子は、ＤＢＭ上の反応表面基の存在により、ＤＢＭと架橋されることも可能である。結果として、移植後より長期間持続する骨伝導基質であって、骨形成されるにつれてｉｎ  ｖｉｖｏにてなお代謝回転することが可能な骨伝導基質が、提供される。この方法はまた、基質に加えられるＤＭＢの量の調節、及び結果として得られる組成物の材料取り扱い適性の最適化を、可能にする。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様によると、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを、該組成物を化学架橋するために用いることが可能である。図１は、カルボジイミドを用いたアミド架橋タンパク質基質の形成を、図解する。図１に示されるように、第一タンパク質分子上の遊離カルボン酸基は、カルボジイミドと反応して、Ｏ−アシルイソウレア基を形成する。カルボン酸基は、例えば、コラーゲン分子のグルタミン酸またはアスパラギン酸残基上にあることが可能である。次いで、結果として得られるＯ−アシルイソウレア基は、第二タンパク質分子上のアミン基と反応して、架橋を形成することが可能である。該アミン基は、例えば、コラーゲン分子のヒドロキシリシン残基上にあることが可能である。
【００１２】
コラーゲン分子間の架橋について、先に論じたが、架橋はまた、ＤＭＢとコラーゲンとの間にも形成されることが可能である。例えば、脱灰骨基質表面上のカルボン酸基は、カルボジイミドと反応することが可能であり、次いで、結果として得られるＯ−アシルイソウレア基は、コラーゲン分子上のアミン基と反応することが可能である。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様によると、コラーゲン基質は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下でカルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）を用いて架橋することが可能である。架橋反応中のＮＨＳ添加により、それによって架橋反応速度を増加させることが可能であって、ＮＨＳを用いずに形成された組成物よりも高い架橋密度のコラーゲン／ＤＢＭ組成物が得られる。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様によると、コラーゲン基質は、緩衝化または調整されたｐＨ条件下で、ＥＤＣを用いて架橋されることが可能である。種々の架橋条件が、国際公報第ＷＯ  ８５／０４４１３において開示されている。架橋条件の例としては、これに限定されないが、カルボジイミド濃度１０〜３００ｍＭ、反応温度２〜４０℃、ｐＨ  ２〜１１、及び反応時間約１〜約９６時間が挙げられる。反応条件のさらなる例としては、カルボジイミド濃度２０〜２００ｍＭ、反応温度１０〜３５℃、ｐＨ  ３〜９、及び反応時間約２〜４８時間が挙げられる。反応条件の例としては、さらに、カルボジイミド濃度５０〜１５０ｍＭ、反応温度２０〜３０℃、ｐＨ  ４〜６．５、及び反応時間約４〜約２４時間が挙げられる。
【００１５】
ＥＤＣについて先に開示してはいるが、他のカルボジイミド架橋剤（非限定的にシアナミドが挙げられる）もまた、本発明の実施態様にしたがって用いられることが可能である。
【００１６】
成長因子、細胞、可塑剤、及びカルシウムもしくはリン酸塩を含有する化合物もまた、本発明の実施態様にしたがって骨誘導組成物に加えられることが可能である。
【００１７】
化学架橋法は、基質に加えられるＤＢＭの量、及び材料取り扱い特性を、ＤＢＭの骨誘導能に有意な影響を及ぼさずに最適化することを可能にする。この架橋法は、水分を含ませた時にその形を維持することが可能であって、そして水分を含ませた時に圧縮後にその高さを取り戻すことが可能な、コラーゲン／ＤＢＭ組成物の産生を、可能にする。
【００１８】
本発明の実施態様にしたがったコラーゲン／ＤＢＭ組成物は、種々の形にカットすることが可能であり、そして多様な移植物の形状に適合させるために巻かれる（rolled）場合、その構造を維持する。該組成物は、６〜１０週間の期間、移植部位内で無傷のままであることが可能である。しかしながら、この期間は、移植部位、及び患者間の多様性に依存する。天然成分であるコラーゲンは、細胞の付着及び遊走を可能にし、そして欠損部位に存在する細胞によって再構築され得る。
【００１９】
さらなる実施態様によると、該組成物は、小さなコラーゲンスポンジの形状であることが可能である。これらのスポンジは、欠損部位に単独で充填されるか、あるいは骨または軟組織修復のための同種移植片または自家移植片と組み合わされることが、可能である。小さなコラーゲンスポンジは、例えば、立方体または直方体の形であることが可能である。該スポンジは、２〜１０ｍｍの寸法であることが可能である。さらに、該スポンジを、微細なサイズに粉砕し、そして生理食塩液または別の希釈液と組み合わせて、ペースト材料を作出することが、可能である。このペーストは、骨または軟組織修復のために、創傷部位に注射または充填されることが可能である。
【００２０】
さらに、本発明の実施態様にしたがったＤＢＭとコラーゲンとを含んでなる組成物の移植は、骨誘導性と骨伝導性の双方を有する、骨形成を促進するための組成物を、提供する。
【００２１】
本発明の例示的な実施態様によると、コラーゲンタンパク質は、多孔質の足場中にある。コラーゲン基質は、例えば、多孔質または半多孔質スポンジの形状であることが可能である。あるいは、コラーゲン基質は、膜、繊維様構造、粉末、フリース、粒子または繊維の形態であってもよい。多孔質の足場は、骨内部成長のための骨伝導基質を提供することが可能である。
【００２２】
ＤＢＭは、任意のサイズまたは形の粒子の形状であることが可能である。例えば、平均直径が５ｍｍまでのＤＢＭ粒子を、本発明の一つの実施態様にしたがって用いることが可能である。本発明のさらなる実施態様によると、平均直径が２〜４ｍｍのＤＢＭ粒子を用いることが可能である。本発明の別の実施態様によると、ＤＢＭは、平均直径が５３〜８５０μｍの粒子の形状であることが可能である。しかしながら、より大きな粒子またはより小さな粒子もまた、組成物の望ましい特性に応じて、用いられることが可能である。組成物中のＤＢＭはまた、塊（blook）または細長い片（strip）の形状であることも可能である。
【００２３】
コラーゲン源は、移植物を受け入れる哺乳動物に対して同種間または異種間であることが可能である。コラーゲンの源は、ヒトまたは動物源に由来してもよく、あるいは細胞株または細菌から発現される組換え形態であることが可能である。組換えコラーゲンは、酵母、または任意の原核細胞由来であってもよい。コラーゲンは、任意の公知の方法によって組織から抽出されてもよい。コラーゲンタンパク質は、任意の種類のコラーゲンであることが可能である。
【００２４】
本発明の実施態様にしたがった組成物は、任意の量の脱灰骨基質（ＤＢＭ）を含んでなることが可能である。ＤＢＭの量は、組成物中の所望の特性を達成するために、変えることが可能である。本発明の一つの実施態様によると、該組成物は、ＤＢＭとコラーゲン立体を合わせた重量に基づいて、２〜９５重量％（ｗｔ％）のＤＢＭを含んでなることが可能である。本発明のさらなる実施態様によると、該組成物は、ＤＢＭとコラーゲン立体を合わせた重量に基づいて、５５〜８５重量％（ｗｔ％）のＤＢＭを含んでなることが可能である。
【００２５】
本発明の実施態様にしたがった骨誘導性の骨修復組成物はまた、１またはそれより多くの成長因子を含むことが可能である。１またはそれより多くの成長因子は、コラーゲン基質の内部または周上に存在することが可能である。例えば、サイトカイン類またはプロスタグランジン類は、多孔質もしくは半多孔質コラーゲン基質の内部または周上に、あるいはＤＢＭ粒子の内部または周上に存在してもよい。成長因子は、天然起源であっても、あるいは慣用の方法を用いて遺伝子組換え技術または別の方法により作出されてもよい。このような成長因子は、市販もされている。２またはそれより多くの成長因子の組み合わせを、移植物の骨誘導活性または生物活性をさらに増強するために、骨誘導組成物に適用してもよい。
【００２６】
用い得る成長因子の例としては、これに限定されないが：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３などのトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）；トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；インスリン様成長因子−ＩまたはＩＩ；インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）；インターフェロン；腫瘍壊死因子；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；及び、成長因子または成長因子様効果を呈する他の分子、が挙げられる。本発明の一つの実施態様によると、成長因子は、可溶性成長因子であることが可能である。
【００２７】
成長因子を、コラーゲン基質の形成に先立ってコラーゲンに組み入れてもよい。あるいは、成長因子を、水溶性または非水溶性溶液中で、コラーゲン基質上に吸着させてもよい。例えば、成長因子を含んでなる溶液を、コラーゲン基質中に浸透させてもよい。さらなる実施態様によると、成長因子を含んでなる溶液を、真空浸透を用いてコラーゲン基質中に浸透させてもよい。
【００２８】
成長因子（単数または複数）は、液状で、コラーゲン脱灰骨基質組成物に送達されることが可能である。しかしながら、成長因子は、及びコラーゲン脱灰骨基質組成物の周上または内部への再構成及び投与に先立って、乾燥状態で提供されることもまた可能である。コラーゲンの周上または内部に存在する成長因子は、多孔質または半多孔質基質の空隙の容量内で存在してもよい。徐放性キャリアー内に含有される成長因子もまた、コラーゲン−脱灰骨基質組成物に組み入れてよい。
【００２９】
多孔質のコラーゲン足場を形成する任意の公知の方法を、用いることが可能である。例えば、足場を形成するために、スラリー（例えば、水溶性スラリー）状のＤＢＭ及びコラーゲンを、所望の形を有する型の腔に流し込み、そして凍結乾燥させることが可能である。乾燥した足場を型から取り出した後、次いで、架橋を形成するために、カルボジイミド架橋剤を組成物の孔に浸透させ、そしてコラーゲン基質及びＤＢＭと反応させることが可能である。
【００３０】
以下は、架橋されたコラーゲン／ＤＢＭ組成物を形成するのに用いられることが可能な反応法の非限定的な例についての記載である。
【００３１】
反応法１
濃度１０〜３００ｍＭのＥＤＣ水溶液を、多孔質コラーゲン／ＤＢＭ組成物に加え、そして１〜４８時間反応させて、コラーゲン架橋を引き起こすことが可能である。
【００３２】
反応法２
ｐＨ４．０〜６．５のＭＥＳ緩衝液に溶かした濃度１０〜３００ｍＭのＥＤＣを、多孔質コラーゲン／ＤＢＭ組成物に加え、そして１〜４８時間反応させて、コラーゲン架橋を引き起こすことが可能である。
【００３３】
反応法３
ＥＤＣ／ＮＨＳ比が１：２〜２：５（例えば、１：２、２：３または２：５）の、ＮＨＳを伴った濃度１０〜３００ｍＭのＥＤＣ水溶液を、多孔質コラーゲン／ＤＢＭ組成物に加え、そして１〜４８時間反応させて、コラーゲン架橋を引き起こすことが可能である。
【００３４】
反応法４
ＥＤＣ／ＮＨＳ比が１：２〜２：５（例えば、１：２、２：３または２：５）の、ＮＨＳを伴った、ｐＨ４．０〜６．５のＭＥＳ緩衝液に溶かした濃度１０〜３００ｍＭのＥＤＣを、多孔質コラーゲン／ＤＢＭ組成物に加え、そして１〜４８時間反応させて、コラーゲン架橋を引き起こすことが可能である。
【００３５】
本発明の例示的な実施態様によると、化学架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、骨移植片代用品として（例えば、空隙充填剤として）用いることが可能である。化学架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）に移植することが可能である。本発明の一つの実施態様によると、化学架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、哺乳動物の脊椎に移植することが可能である。本発明のさらなる実施態様によると、化学架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、哺乳動物の椎間腔に移植することが可能である。
【００３６】
（実験例）
コラーゲンスポンジを、６０％ＤＢＭ、４０％コラーゲンスラリーから製造した。コラーゲンスラリー及びＤＢＭ粒子を合わせ、混和して、均一な濃度にした。この混合物を、型に注ぎ込み、凍結し、そして凍結乾燥した。乾燥したスポンジを、室温にて一晩、架橋溶液に曝露した。架橋溶液は、１００ｍＭ  ＥＤＣ水溶液からなった。架橋後、スポンジを、水で５回すすいだ。スポンジを凍結し、次いで凍結乾燥した。次いで、スポンジを、ポーチ（pouch）内に詰め、そしてＥ−ビーム照射を介して滅菌した。
【００３７】
次いで、スポンジを、無胸腺ラット筋肉内ポーチモデル（後肢）に４週間移植した。次いで、試料を外植し、組織切片を作製し、そして切片をヘマトキシリン（Ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシンで染色した。試料の組織切片の撮影像を、図２〜７に示す。
【００３８】
図２は、第一のスポンジの切片像である。該像は、２０Ｘの倍率にて撮影された。スポンジ１は、８０％ＤＢＭと２０％コラーゲンとからなった。該スポンジは、ＤＢＭ粒子をコラーゲンスラリーと組み合わせることによって、作られた。得られた混合物を、型に注ぎ込み、凍結し、そして凍結乾燥してスポンジの形状にした。該スポンジを、１００ｍＭ  ＥＤＣ水溶液に一晩曝露した。結果として得られた架橋されているスポンジを、水で数回そそぎ、凍結し、そして凍結乾燥した。この最終産物を、２５ｋＧｙの線量でのＥ−ビーム照射を介して滅菌した。次いで、移植試料を、３ｍｍの立方体に切り取った。これらの立方体に、生理食塩液数滴で水分を含ませ、そして無胸腺ラットの後肢の筋肉ポーチ内に移植した。筋肉ポーチを抱合して閉じ、そして動物を、拘束されない条件下で４週間維持した。次いで、動物を屠殺し、そして試料を、周辺の筋肉組織とともに取り出した。外植片を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。試料を、標準的なパラフィン包埋技術によって処理し、切片作製し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。切片を、２０Ｘ対物レンズを用いて標準的な光学顕微鏡下で眺め、骨形成活性または軟骨形成活性について解析した。
【００３９】
図２では、軟骨形成活性（Ｃ）の存在が、ＤＢＭ粒子内に見られる。新生骨（Ｎ）の小さな領域もまた、残余のコラーゲンスポンジ（Ｓ）と同様に、見られる。
【００４０】
図３は、第二のスポンジ（スポンジ２）の切片像である。図３に示される像は、２０Ｘ倍率にて撮影された。スポンジ２は、８０％ＤＢＭ及び２０％コラーゲンからなった。スポンジ２は、ＤＢＭ粒子をコラーゲンスラリーと組み合わせることによって、作られた。結果として得られた混合物を、型に注ぎ込み、凍結し、そして凍結乾燥してスポンジの形状にした。該スポンジを、１０ｍＭ  ＥＤＣ水溶液に一晩曝露した。得られた架橋されたスポンジを、水で数回そそぎ、凍結し、そして凍結乾燥した。得られた産物を、２５ｋＧｙの線量でのＥ−ビーム照射を介して滅菌した。移植試料を、３ｍｍの立方体に切り取った。これらの立方体に、生理食塩液数滴で水分を含ませ、そして無胸腺ラットの後肢の筋肉ポーチ内に移植した。筋肉ポーチを抱合して閉じ、そして動物を、拘束されない条件下で４週間維持した。次いで、動物を屠殺し、そして試料を、周辺の筋肉組織とともに取り出した。外植片を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。試料を、標準的なパラフィン包埋技術によって処理し、切片作製し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。切片を、２０Ｘ対物レンズを用いて標準的な光学顕微鏡下で眺め、骨形成活性または軟骨形成活性について解析した。
【００４１】
図３では、線維組織（Ｆ）及びＤＢＭ粒子（ＤＢＭ）の存在が、見られる。ＤＢＭを再構築している巨細胞（Ｇ）の存在もまた、図３において見られる。
【００４２】
図４は、第二のスポンジ（スポンジ２）の別の切片像である。この像もまた、２０Ｘの倍率にて撮影された。図４では、血管（ＢＶ）の存在が、ＤＢＭ粒子（ＤＢＭ）内に見られる。残余のコラーゲンスポンジ（Ｓ）もまた、図４において見られる。
【００４３】
図５は、第二のスポンジ（スポンジ２）のさらな切片像である。この像もまた、２０Ｘの倍率にて撮影された。図５では、未発達の骨髄形成（Ｃ）が、ＤＢＭ粒子（ＤＢＭ）間に見られる。
【００４４】
図６は、第三のスポンジの切片像である。この像もまた、２０Ｘの倍率にて撮影された。このスポンジは、６０％ＤＢＭ及び４０％コラーゲンからなった。スポンジ３は、ＤＢＭ粒子をコラーゲンスラリーと組み合わせることによって、作られた。次いで、得られた混合物を、型に注ぎ込み、凍結し、そして凍結乾燥してスポンジの形状にした。該スポンジを、１００ｍＭ  ＥＤＣ水溶液に一晩曝露した。得られた架橋されたスポンジを、水で数回そそぎ、凍結し、そして凍結乾燥した。この最終産物を、２５ｋＧｙの線量でのＥ−ビーム照射を介して滅菌した。移植試料を、３ｍｍの立方体に切り取った。これらの立方体に、生理食塩液数滴で水分を含ませ、そして無胸腺ラットの後肢の筋肉ポーチ内に移植した。筋肉ポーチを抱合して閉じ、そして動物を、拘束されない条件下で４週間維持した。次いで、動物を屠殺し、そして試料を、周辺の筋肉組織とともに取り出した。外植片を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。試料を、標準的なパラフィン包埋技術によって処理し、切片作製し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。切片を、２０Ｘ対物レンズを用いて標準的な光学顕微鏡下で眺め、骨形成活性または軟骨形成活性について解析した。
【００４５】
図６では、骨芽様細胞（Ｏ）に覆われた脱灰骨基質（ＤＢＭ）粒子が、見られる。
【００４６】
図７は、第四のスポンジの切片像である。この像もまた、２０Ｘの倍率にて撮影された。図７に示されるスポンジは、４０％ＤＢＭ及び６０％コラーゲンからなった。該スポンジは、ＤＢＭ粒子をコラーゲンスラリーと組み合わせることによって、作られた。次いで、結果として得られた混合物を、型に注ぎ込み、凍結し、そして凍結乾燥してスポンジの形状にした。該スポンジを、１００ｍＭ  ＥＤＣ水溶液に一晩曝露した。結果として得られた架橋されているスポンジを、水で数回そそぎ、凍結し、そして凍結乾燥した。この最終産物を、２５ｋＧｙの線量でのＥ−ビーム照射を介して滅菌した。移植試料を、３ｍｍの立方体に切り取った。これらの立方体に、生理食塩液数滴で水分を含ませ、そして無胸腺ラットの後肢の筋肉ポーチ内に移植した。筋肉ポーチを抱合して閉じ、そして動物を、拘束されない条件下で４週間維持した。次いで、該動物を屠殺し、そして試料を、周辺の筋肉組織とともに取り出した。外植片を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。試料を、標準的なパラフィン包埋技術によって処理し、切片作製し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。切片を、２０Ｘ対物レンズを用いて標準的な光学顕微鏡下で眺め、骨形成活性または軟骨形成活性について解析した。
【００４７】
図７では、新生骨（Ｎ）の小さな領域を伴った脱灰骨基質（ＤＢＭ）が、見られる。加えて、残余のコラーゲンスポンジ（Ｒ）もまた、図７において見られる。
【００４８】
図２〜７の像は、本明細書に記載されるような架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物が、骨形成促進のための骨誘導及び骨伝導組成物を提供するために、移植物として用いられることが可能なことを、実証している。
【００４９】
本発明のさらなる実施態様によると、脱灰骨基質（ＤＢＭ）とコラーゲンタンパク質とを含んでなる組成物であって、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロキシピリジニウム、ヒドロキシリシルピリジニウム及びホルマリンからなる群より選択される化合物により化学架橋されている組成物が、提供される。
【００５０】
また、脱灰骨基質（ＤＢＭ）とコラーゲンタンパク質とを含んでなる組成物であって、照射（例えば、ｅ−ビームまたはガンマ線照射）、光（例えば、紫外線光、または適切な起爆装置を用いた他の波長の光）により或いは光酸化を介して架橋されている組成物が、提供される。光を架橋のために用いる場合、パルス光を用いてもよい。コラーゲン基質はまた、脱水温熱条件下または酸性条件下でも架橋されることが可能である。例えば、組成物は、該組成物を高温で真空にすることによって脱水温熱条件下にて架橋することが可能である。
【００５１】
また、組成物は酵素的過程を用いて架橋されてもよい。例えば、コラーゲンは、リシルオキシダーゼまたは組織トランスグルタミナーゼを用いて架橋されてもよい。リシルオキシダーゼは、リシン中のイプシロンアミノ基の酸化的脱アミノ反応を介してコラーゲンを架橋することによって作用する、金属タンパク質である。
【００５２】
また、コラーゲン基質は糖化（すなわち、グルコース及びリボースなどの糖を減じることによる、コラーゲンのアミン基の非酵素的架橋）またはグリコシル化（すなわち、グルコースとコラーゲンの非酵素的結合であって、隣接するタンパク質分子間の非可逆的架橋を形成させる一連の化学反応を生じる）によっても架橋することが可能である。例えば、架橋は、ペントシジン架橋（すなわち、リシン残基及びアルギニン残基の非酵素的糖化によって生じる架橋）であってもよい。あるいは、コラーゲン中の架橋は、イプシロン（ガンマ−グルタミル）リシン架橋であることが可能である。
【００５３】
架橋は、細胞によって駆動してもよい。例えば、架橋は、ｉｎ  ｖｉｖｏにて非架橋基質を培養し、細胞の機構によってコラーゲンの架橋を可能にすることによって行ってもよい。
【００５４】
架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、組織形成を促進するために、哺乳動物に移植することが可能である。例えば、架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、骨形成を促進するために、哺乳動物に移植することが可能である。あるいは、架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物を、軟組織形成を促進するために、哺乳動物に移植することが可能である。架橋されているコラーゲン／ＤＢＭ組成物は、整形外科用途（orthopaedic applications）、頭蓋顎顔面用途（craniomaxillofacial applications）において、及び外傷性傷害に対して、用いられることが可能である。
【００５５】
スペーサーは、架橋中に、コラーゲン／ＤＢＭ組成物に組み入れられることが可能である。スペーサーの例としては、これに限定されないが、ポリオキシアルキレンアミン（例えば、Ｈｕｎｔｓｍａｎ・コーポレーションの登録商標である、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標））、ポリエチレングリコールまたはポリマースペーサーが挙げられる。
【００５６】
ビニルピロリジノン及びメタクリル酸メチルもまた、コラーゲン／ＤＢＭ組成物に組み入れられてもよい。
【００５７】
コラゲナーゼ阻害剤、成長因子、抗体、メタロプロテイナーゼ、細胞接着断片、もしくはその組み合わせなどの、結合性または非結合性添加剤もまた、架橋されているコラーゲンＤＢＭ組成物に組み入れられることが可能である。例えば、これらの添加剤のうちの１またはそれより多くを、添加剤がコラーゲンまたはＤＢＭと結合するようになるように、架橋の前または途中に、組成物に組み入れてもよい。
【００５８】
前述の明細書は、例示の目的で提供される実施例とともに、本発明の原理を教示するが、一方で、形態及び詳細の種々の変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなく行われることが可能であることが、当業者によって、本開示を読むことによって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明にしたがった、カルボジイミド架橋剤を用いたアミド架橋タンパク質基質の形成を、図解する。
【図２】図２は、ラットに移植されたコラーゲン／ＤＢＭスポンジの組織切片像である。
【図３】図３は、ラットに移植されたコラーゲン／ＤＢＭスポンジの組織切片像である。
【図４】図４は、ラットに移植されたコラーゲン／ＤＢＭスポンジの組織切片像である。
【図５】図５は、ラットに移植されたコラーゲン／ＤＢＭスポンジの組織切片像である。
【図６】図６は、ラットに移植されたコラーゲン／ＤＢＭスポンジの組織切片像である。
【図７】図７は、ラットに移植されたコラーゲン／ＤＢＭスポンジの組織切片像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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