(57)【要約】  本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに関する。本発明はまた、癌、好ましくはＢ細胞悪性腫瘍、特にＢ細胞慢性リンパ性白血病もしくは非ホジキンリンパ腫、自己免疫疾患、炎症性疾患、IgE依存性アレルギー疾患、またはそれらの１以上の症状を治療、予防、管理、または改善するための単剤療法としての、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントの使用も提供する。本発明は、本発明の抗体を投与して治療用抗体のエフェクター機能を高めることにより、治療用抗体の治療効果を増大させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の抗体を投与することにより、ワクチン組成物の効力を増大させる方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性で天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記抗体が2B6抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記2B6抗体がヒト化されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ヒト化2B6が、配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号18、配列番号20、または配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖のFcドメインに少なくとも1つの改変をさらに含んでなる、請求項１または５に記載の抗体
【請求項７】
前記抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419、または421位に少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖のFcドメインが、247位にロイシン、421位にリシン、および270位にグルタミン酸を有するか、または392位にトレオニン、396位にロイシン、および270位にグルタミン酸を有するか、または255位にリシン、396位にロイシン、および270位にグルタミン酸を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記フラグメントがF(ab')2フラグメントまたはF(ab)フラグメントである、請求項１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が異種ポリペプチドと機能的に連結されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が治療薬にコンジュゲートされている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記治療薬が細胞毒素である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
Ig-FcとFcγRIIBとの結合をブロックする、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体がリツキシン（Rituxin）より効果的に腫瘍増殖を低下させる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントの重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１８】
重鎖をコードする第１の核酸分子と軽鎖をコードする第２の核酸分子を含んでなるベクターであって、上記重鎖および軽鎖が請求項１に記載の抗体またはフラグメントのものである、上記ベクター。
【請求項１９】
発現ベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１７のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２１】
異種プロモーターと機能的に連結された第１の核酸および同じまたは異なる異種プロモーターと機能的に連結された第２の核酸を含有する宿主細胞であって、第１の核酸および第２の核酸がそれぞれ請求項１に記載の抗体の重鎖および軽鎖をコードするものである、上記宿主細胞。
【請求項２２】
FcγRIIB特異的抗体を遺伝子組換えにより産生する方法であって、(i)請求項２０に記載の宿主細胞を、上記抗体の発現に好適な条件下に、培地中で培養するステップ、および(ii)上記抗体を上記培地から回収するステップ、を含んでなる上記方法。
【請求項２３】
FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する第１の重鎖-軽鎖対、および腫瘍抗原と特異的に結合する第２の重鎖-軽鎖対を含んでなる二重特異性抗体。
【請求項２４】
患者の癌を治療する方法であって、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを治療上有効な量で上記患者に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が2B6抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がヒト化されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記2B6抗体がヒト化されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト化2B6が、配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号18、配列番号20、または配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
2B6抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419、または421位に少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項２６または２９に記載の方法。
【請求項３１】
2B6抗体の重鎖のFcドメインが、247位にロイシン、421位にリシン、および270位にグルタミン酸を有するか、または392位にトレオニン、396位にロイシン、および270位にグルタミン酸を有するか、または255位にリシン、396位にロイシン、および270位にグルタミン酸を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚癌または膵臓癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
１以上のさらなる癌治療法を施すことを含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
さらなる癌治療法が化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または外科手術からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が好中球と検出可能に結合しない用量で該抗体を投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
被験者のＢ細胞性悪性腫瘍またはその１以上の症状を治療または改善する方法であって、それを必要とする被験者に、治療上有効な量のFcγRIIB特異的抗体を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項３８】
FcγRIIB特異的抗体がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
治療上有効な量のFcγRIIB特異的抗体の投与により、前記被験者の生存が長くなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験者がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
FcγRIIB特異的抗体が2B6または3H7である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
2B6または3H7がヒト化されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｂ細胞性悪性腫瘍がＢ細胞リンパ性白血病または非ホジキンリンパ腫である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
FcγRIIB特異的抗体が治療薬または薬物にコンジュゲートされている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
治療薬が異種ポリペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
治療薬がFcγRIIB以外の細胞表面受容体と免疫特異的に結合する抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
治療薬が腫瘍関連抗原と免疫特異的に結合する抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験者に、１以上のＢ細胞性悪性腫瘍に対する標準的または実験的療法を治療上有効な量で施すことをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記療法の少なくとも1つが抗体療法、サイトカイン療法、化学療法、造血幹細胞移植、Ｂ細胞介在性療法、生物学的療法、放射線療法、ホルモン療法、または外科手術である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
標準的または実験的療法を、FcγRIIB特異的抗体またはその抗原結合フラグメントの投与前、投与と同時、または投与後に施す、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験者が、Ｂ細胞性悪性腫瘍に対する１以上の標準的または実験的療法によりあらかじめ治療されていたが、FcγRIIBアンタゴニストまたはその抗原結合フラグメントの投与により治療されていなかった、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
FcγRIIB特異的抗体を静脈内、皮下、筋内、経口、または鼻腔内に投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
(i) 治療上有効な量の、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、および(ii) 製薬上許容される担体、を含んでなる医薬組成物。
【請求項５４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記抗体が2B6抗体である、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記抗体がヒト化されている、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記2B6抗体がヒト化されている、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ヒト化2B6が、配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号18、配列番号20、または配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
2B6抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419、または421位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項５３または５８に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
2B6の重鎖のFcドメインが、247位にロイシン、421位にリシン、および270位にグルタミン酸を有するか、または392位にトレオニン、396位にロイシン、および270位にグルタミン酸を有するか、または255位にリシン、396位にロイシン、および270位にグルタミン酸を有する、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
１種以上のさらなる抗癌剤をさらに含んでなる、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
抗癌剤が化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、または免疫療法剤である、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
Ｂ細胞性悪性腫瘍の予防、治療、管理、または改善に有効な量の１種以上のFcγRIIB特異的抗体、および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項６４】
さらに１種以上の化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、または生物学的療法剤を含んでなる、請求項６３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性で、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに関する。本発明はまた、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントを、癌、好ましくはＢ細胞性悪性腫瘍、特にＢ細胞慢性リンパ性白血病または非ホジキンリンパ腫、自己免疫疾患、炎症性疾患、IgE依存性アレルギー疾患、またはそれらの１以上の症状を治療、予防、管理、または改善するための単剤療法として使用することも包含する。本発明はまた、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントを他の癌治療法と組み合わせて使用することも包含する。本発明は、癌（例えばＢ細胞性悪性腫瘍）、自己免疫疾患、炎症性疾患、IgE依存性アレルギー疾患、またはそれらの１以上の症状を治療、予防、管理、または改善するのに有効な量の抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はさらに、治療用抗体のエフェクター機能を高めるために本発明の抗体を投与することにより治療用抗体の治療効果を増大する方法を提供する。本発明はまた、本発明の抗体をワクチン組成物とともに投与することによりワクチン組成物の効力を増大する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
2.1  Fc受容体および免疫系におけるその役割
抗体-抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、様々な応答をもたらし、それはエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒、および食作用）から免疫調節シグナル（例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節）にまで及ぶ。全てのこれらの相互作用は、抗体または免疫複合体のFcドメインと、造血性細胞上の特殊な細胞表面受容体との結合を介して開始される。抗体と免疫複合体により生じる細胞応答の多様性は、Fc受容体の構造的不均一性からもたらされる。Fc受容体は、細胞内シグナル伝達に介在すると思われる、構造的に関係のあるリガンド結合ドメインを共有する。
【０００３】
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであるFc受容体は、免疫グロブリン分子のFc部分と結合することができる表面糖タンパク質である。このファミリーの各メンバーは、Fc受容体の鎖上の認識ドメインを介して１以上のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Fc受容体は免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性によって定義される。IgGに対するFc受容体はFcγR、IgEに対するFc受容体はFcεR、そしてIgAに対するFc受容体はFcαRと呼ばれる。個別の補助細胞は異なるアイソタイプの抗体に対するFc受容体を有し、抗体のアイソタイプはどの補助細胞が所与の応答に関わりうるかを決定する（Ravetch J.V.ら 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92；Gerber J.S.ら 2001 Microbes and Infection, 3:131-139；Billadeau D.D.ら 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109):161-1681；Ravetch J.V.ら 2000, Science, 290:84-89；Ravetch J.V.ら, 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4):553-60に概説されている）。様々なFc受容体、それを発現する細胞、およびそのアイソタイプ特異性を表１にまとめて示す（「免疫生物学：健康と病気における免疫系（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease）」, 第4版. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから引用）。
【０００４】
Fcγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのC2セットに関係する細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを持つ内在性膜糖タンパク質である。３種のFcγRが知られており、それぞれFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）と呼ばれる。３種の受容体は異なる遺伝子によりコードされる。しかし、３種のファミリーメンバー間の高度な相同性は、これらが共通の祖先から、恐らくは遺伝子複製により生じたことを示唆する。本発明は特にFcγRII（CD32）に焦点を合わせる。
【０００５】
FcγRII（CD32）
FcγRIIタンパク質は40KDaの内在性膜糖タンパク質であり、単量体Igに対して低親和性（106M-1）であるので、複合体化したIgGとだけ結合する。この受容体は、最も広く発現されているFcγRであり、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含む全ての造血細胞上に存在する。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を２つしかもっておらず、従って、IgGに対してFcγRIより遥かに低い親和性を有する。３種のヒトFcγRII遺伝子（FcγRII-A、FcγRII-BおよびFcγRII-C）が存在し、それらは全て凝集体または免疫複合体のIgGと結合する。
【０００６】
FcγRII-A（CD32A）とFcγRII-B（CD32B）の細胞質ドメイン内には明確な相違があるので、受容体ライゲーションに対して２つの機能的に異質の応答が生じる。基本的な相違は、A-アイソタイプが細胞活性化（例えば、食作用および呼吸バースト）に至る細胞内シグナル伝達を開始するのに対して、B-アイソタイプは抑制的シグナル（例えば、Ｂ細胞活性化の抑制）を開始することにある。
【０００７】
FcγRを介するシグナル伝達
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にFcγRを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソタイプ間の構造的差異からもたらされる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の２つの異なるドメイン、すなわち、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ITAM）および免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ITIM）が、この異なる応答の原因である。これらの構造への異なる細胞質酵素の動員がFcγR介在性細胞応答の結果を指令する。ITAM含有FcγR複合体はFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAを含むが、ITIM含有複合体はFcγRIIBを含むにすぎない。
【０００８】
ヒト好中球はFcγRIIA遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介するFcγRIIAクラスター形成は、ITAMリン酸化を容易にする受容体関連キナーゼとともにITAMを凝集するように作用する。ITAMリン酸化はSykキナーゼのドッキング部位として作用し、その活性化は下流の基質（例えば、PI3K）の活性化をもたらす。細胞活性化により前炎症性メディエーターが放出される。
【０００９】
FcγRIIB遺伝子はＢリンパ球上に発現され、その細胞外ドメインはFcγRIIAと96％同一であって、区別できない様式でIgG複合体と結合する。FcγRIIBの細胞質ドメインにITIMが存在することで、FcγRの抑制サブクラスが規定される。最近、この抑制の分子的原理が確立された。活性化FcγRとともにライゲートされると、FcγRIIBのITIMはリン酸化され、イノシトールポリリン酸5'-ホスファターゼ（SHIP）のSH2ドメインを引き付け、これがホスホイノシトールメッセンジャー（ITAM含有FcγRを介するチロシンキナーゼ活性化の結果として放出される）を加水分解し、その結果、細胞内Ca++の流入を抑制する。従って、FcγRIIBの架橋は、FcγRライゲーションに対する活性化応答を弱め、かつ細胞応答性を抑制する。このようにしてＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌が停止する。
【表１】
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【００１０】
2.2  関連疾患
2.2.1  癌
新生物または腫瘍は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物の塊であり、良性または悪性でありうる。良性腫瘍は一般的に局在化した状態のままである。悪性腫瘍はまとめて癌と呼ばれる。用語「悪性」は一般的に、腫瘍が近隣の身体構造に侵入してそれを破壊し、そして離れた部位に広がって死を引き起こしうることを意味する（RobbinsおよびAngell, 1976, 「基礎病理学（Basic Pathology）」, 第2版, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.68-122を参照）。癌は身体の多くの部位に生じうるのであって、その起源に応じて異なる挙動を示す。癌性細胞は、その起源となる身体部分を破壊し、次いで他の身体部分に拡大し、そこで新しい増殖を開始してさらに破壊を引き起す。
【００１１】
毎年120万人以上の米国人が癌を発症している。癌は米国における死因の第２位であり、もし現在の傾向が続くと、癌は2010年には第１の死因になると予想される。肺癌および前立腺癌が米国における男性の癌死因のトップである。肺癌および乳癌が米国における女性の癌死因のトップである。米国の男性２人に１人は、人生のある時期に癌と診断されうる。米国の女性３人に１人は、人生のある時期に癌と診断されうる。
【００１２】
癌の療法はまだ見出されていない。現在の治療選択肢、例えば手術、化学療法および放射線療法は、しばしば効果がないか、または重症の副作用を示す。
【００１３】
2.2.1.1  Ｂ細胞性悪性腫瘍
Ｂ細胞性悪性腫瘍（限定するものではないが、Ｂ細胞リンパ腫および白血病を含む）は米国では発生率の高い新生物疾患である。米国では１年当たりおよそ55,000件の新しいリンパ腫の症例が認められ（1998年のデータ）、１年当たり25,000人が死亡すると推定される。これは、米国人口における癌発生率の4％、全癌関連死亡の4％に当たる。リンパ系新生物の改定された欧州-米国分類（1994年REAL分類、改定1999年）は、リンパ腫をその起源に基づいて、Ｂ細胞系リンパ腫、Ｔ細胞系リンパ腫、またはホジキンリンパ腫と分類した。Ｂ細胞系リンパ腫が、米国で診断された非ホジキンリンパ腫（NHL）の最も一般的な型である（Williams, Hematology 第6版 (Beutlerら編), McGraw Hill 2001）。
【００１４】
慢性リンパ性白血病（CLL）は、小さい、成熟しているように見えるリンパ球が血液、骨髄、およびリンパ組織に蓄積することを特徴とする新生物疾患である。CLLは米国において100,000件当たり2.7件の発症率である。リスクは加齢とともに、特に男性において増加する。CLLは全癌の0.8％を占め、最も一般的な成人白血病であって全白血病の30％にあたる。ほぼ全ての症例（＞98％）において、罹病細胞はＢリンパ球系統に属する。非白血病性変異型である小リンパ性リンパ腫は、全リンパ腫の5〜10％を構成し、B-CLLの患者の患部リンパ節の特徴と区別が付かない組織学的、形態学的および免疫学的特徴を有する（Williams, 2001）。
【００１５】
慢性リンパ性白血病の経過はいくつかの病期に分けられる。初期には、慢性リンパ性白血病は不活性の疾患であって、長いライフスパンを有する小型の、成熟した、機能的に無能な悪性Ｂ細胞の蓄積を特徴とする。最終的に悪性Ｂ細胞の倍化時間が短縮して、患者は次第に症状を示すようになる。化学療法薬による治療は症状を緩和しうるものの、患者の全生存期間はほんのわずかに延長されるだけである。慢性リンパ性白血病の最終段階は重症の貧血および／または血小板減少により特徴付けられる。この時点で生存期間中央値は２年未満である（Foonら, 1990, Annals Int. Medicine 113:525）。細胞増殖の速度が非常に遅いので、慢性リンパ性白血病は化学療法剤による治療に抵抗する。
【００１６】
最近、遺伝子発現の研究により、リンパ増殖性疾患においてアップレギュレートされうるいくつかの遺伝子が同定された。Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL）患者において、また、大部分の非ホジキンリンパ腫患者において過剰発現されると考えられる１つの分子はCD32Bである（Alizadehら, 2000, Nature 403:503-511；Rosenwaldら, 2001, J. Exp. Med. 184:1639-1647）。しかし、B-CLLでのCD32Bの役割は不明である。なぜなら、CD32BはB-CLL細胞の小割合に低密度で発現されたと報じられたからである（Damleら, 2002, Blood 99:4087-4093）。CD32BはＢ細胞系の表面抗原であって、Ｂ細胞新生物におけるその過剰発現は該抗原を治療用抗体の好適な標的とする。さらに、CD32Bは阻害性受容体のカテゴリーに属し、そのライゲーションはネガティブなシグナルを送達する。それ故に、CD32Bに対する抗体は、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を含むメカニズムによってだけでなく、アポトーシスシグナルを誘発することによっても、腫瘍細胞を排除するように機能すると考えられる。CD32Bはその対応物CD32A（活性化Fcγ受容体）と高い相同性があるので、この分子の１つの型を選択的に認識するが他の型を認識しない抗体の作製はずっと妨げられてきた。
【００１７】
2.2.1.2  癌治療法
現在、癌治療法は患者の新生物細胞を根絶するための外科手術、化学療法、ホルモン療法および／または放射線療法を含みうる（例えば、Stockdale, 1998, 「癌患者管理の原理（Principles of Cancer Patient Management）」, Scientific American: Medicine, vol.3, RubensteinおよびFederman編、第12章、第IV節を参照）。癌治療法はまた、生物学的療法または免疫療法をも含みうる。これらの手法は全て、患者に大きい欠点を課することとなる。例えば、外科手術は、患者の健康状態によっては禁忌であるか、または患者に受入れられない。さらに、外科手術は完全には新生物組織を除去することができない。放射線療法は、新生物組織が放射線に対して正常組織より高い感受性を有するときにのみ有効であり、かつ放射線療法はしばしば厳しい副作用を誘引しうる。ホルモン療法は稀に単剤として投与され、それは単独で有効でありうるが、他の療法により癌細胞の大部分を除去した後に、癌の再発を予防または遅延するために使用することが多い。生物学的療法／免疫療法は数が限られており、発疹もしくは腫脹、インフルエンザ様症候（発熱、悪寒および疲労を含む）、消化管の問題、またはアレルギー反応などの副作用を生じうる。
【００１８】
化学療法については、癌治療法に利用しうる様々な化学療法剤が存在する。癌化学療法剤の大部分は、DNA合成を直接、またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成を阻害することにより間接的に、抑制して、DNA複製および随伴する細胞分裂を防止することにより作用する（例えば、Gilmanら, Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第8版, Pergamom Press, New York, 1990を参照）。これらの薬剤はアルキル化剤（例えばニトロソ尿素）、代謝拮抗物質（例えばメトトレキセートおよびヒドロキシ尿素）、ならびに他の薬剤（例えばエトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなど）を含み、必ずしも細胞周期特異的でないが、DNA複製に対するそれらの効果によってS期の細胞を死滅させる。他の薬剤、具体的にはコルヒチンおよびビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン）は、微小管の組み立てを妨害して有糸分裂を停止させる。化学療法プロトコルは一般的に、治療効力を増加させるために化学療法剤を併用して投与することを含む。
【００１９】
様々な化学療法剤の利用可能性にもかかわらず、化学療法は多数の欠点を有する（例えば、Stockdale, 1998,「癌患者管理の原理（Principles Of Cancer Patient Management）」 Scientific American Medicine, vol.3, RubensteinおよびFederman編、第12章、第10節を参照）。ほとんど全ての化学療法剤は毒性があり、化学療法は、重症の吐気、骨髄抑制、免疫抑制などの顕著な、しばしば危険な副作用を起こす。さらに、化学療法剤を併用しても多くの腫瘍細胞は化学療法剤に耐性があるか、または耐性を発現する。実際、治療プロトコルで使用される特定の化学療法剤に耐性のある細胞は、他の薬物にも耐性であることがしばしば立証されており、その化学療法剤が特定の処置に使用される薬物の作用機構と異なる機構で作用する場合でもそうである。この現象は多剤耐性と呼ばれる。このように、薬物耐性があるため、多くの癌は標準的な化学療法処置プロトコルに不応であることがわかっている。
【００２０】
Ｂ細胞性悪性腫瘍は一般的に単剤化学療法、併用化学療法および／または放射線療法を用いて治療する。これらの治療は死亡率を低減し、かつ／または生存率を改善することができるにもかかわらず、重大な副作用を伴う。様々な形態の治療に対するＢ細胞性悪性腫瘍の応答は多岐にわたる。例えば、非ホジキンリンパ腫の適切な臨床病期分類が考えられる症例では、フィールド放射線療法が満足な治療を提供しうる。しかし、ある特定の患者は応答がなく、治療に抵抗する疾患再発が時間の経過につれて起こり、特にこの疾患の最も攻撃的な変異型となって起こる。患者のほぼ半数は該疾患により死亡する（Devesaら, 1987, J. Nat'l Cancer Inst. 79:701）。
【００２１】
不応性Ｂ細胞新生物を治療するための研究療法には、自己および同種骨髄または幹細胞の移植ならびに遺伝子治療が含まれる。最近、Ｂ細胞特異的抗原を標的とするモノクローナル抗体を用いる免疫療法がＢ細胞新生物の治療に導入されている。放射性核種、毒素、または他の治療薬を標的に向けるためのモノクローナル抗体の使用は、かかる薬剤を選択的に腫瘍部位に送達させ、従って正常組織に対する毒性を限定できるという可能性を与える。
【００２２】
代替的な癌治療法が大いに必要とされており、特に標準的な癌治療法、例えば外科手術、放射線療法、化学療法、およびホルモン療法に不応であることがわかっている癌の治療においてそうである。有望な代替法は免疫療法であり、この方法では癌細胞が癌抗原特異的抗体によって特異的に標的化される。免疫応答の特異性をつけることに向けて大きな努力が払われており、例えばハイブリドーマ技術が腫瘍選択的モノクローナル抗体の開発を可能にしており（Green M.C.ら, 2000 Cancer Treat Rev., 26:269-286；Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(suppl. 14):43-51を参照）、ここ数年間で、米国食品医薬品局（Food and Drug Administration）は癌治療用の最初のモノクローナル抗体を承認した：非ホジキンリンパ腫（NHL）用のリツキシン（Rituxin）（抗CD20）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL）用のキャンパス（Campath）（抗CD52）、および転移性乳癌用のハーセプチン（Herceptin）［抗(c-erb-2/HER-2)］(Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res., 3: 86-90)。NHLおよびB-CLLはＢ細胞新生物の最も一般的な形態のうちの２つである。これらの抗体は臨床上の効力を実証したが、それらの使用に副作用が伴わないわけではない。例えば抗体依存性細胞性細胞傷害（「ADCC」）を媒介する、抗体エフェクター機能の能力は、このような治療に対する妨げとなる。さらに、リツキシンとキャンパスについては、少なくとも半数の患者において応答がなく、かつ一部の応答患者はその後の治療に対して不応でありうる。
【００２３】
癌、特にＢ細胞性悪性腫瘍のための、とりわけ標準的な癌治療法およびリツキシンなどの新しい免疫療法に対して不応である患者に対する、代替療法が必要とされている。
【００２４】
2.2.2  炎症性疾患と自己免疫疾患
炎症は、身体の白血球と化学物質が我々の身体を外来物質（例えば細菌およびウイルス）による感染から保護するプロセスである。通常、罹患部位の痛み、腫脹、熱および赤みを特徴とする。サイトカインおよびプロスタグランジンとして知られる化学物質がこのプロセスを制御し、順序づけられた自己制御式のカスケードで血液または罹患組織中に放出される。この化学物質の放出は損傷または感染の部位への血流を増加し、そして赤みと熱をもたらす。いくつかの化学物質は組織への体液の漏出を起こして、腫脹をもたらす。この保護プロセスは神経を刺激し、痛みを起こさせる。これらの変化は、関連した領域で限られた期間だけ起こるときは、身体に有益に働く。
【００２５】
自己免疫疾患および／または炎症性疾患では、戦うべき外来物質が存在しないのに免疫系が炎症性応答を惹起し、身体の通常の防御免疫系が間違って自己を攻撃することによりそれ自身の組織を損傷する。多くの異なる自己免疫疾患があり、身体を様々な方法で冒している。例えば、多発性硬化症の個体では脳が冒され、クローン病の個体では腸が冒され、そして慢性関節リウマチの個体では様々な関節の滑膜、骨および軟骨が冒される。自己免疫疾患が進行するにつれて、１以上のタイプの身体組織の破壊、異常な器官の増殖、または器官機能の変化が生じうる。自己免疫疾患は、１つの器官もしくは組織だけを冒すこともあり、また、複数の器官と組織を冒すこともある。自己免疫疾患により通常冒される器官および組織としては、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（例えば、甲状腺または膵臓）、筋肉、関節、および皮膚が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、自己免疫内耳疾患、炎症性腸疾患、関節炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーヴズ病、自己免疫肝炎、家族性腺腫様ポリープ症および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００２６】
慢性関節リウマチ（RA）および若年性慢性関節リウマチは炎症性関節炎のタイプである。関節炎は、関節における炎症を説明する一般用語である。全てではないが、いくつかのタイプの関節炎は誤って指図された炎症の結果である。慢性関節リウマチに加えて、炎症に関連した他のタイプの関節炎としては、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎関節炎、および痛風性関節炎が挙げられる。慢性関節リウマチは、身体の両側の関節（例えば、両方の手、手首または膝）で起こる慢性関節炎のタイプである。この対称性が慢性関節リウマチを他のタイプの関節炎から区別するのに役立つ。関節を冒すだけでなく、慢性関節リウマチは皮膚、眼、肺、心臓、血液または神経を冒すこともある。
【００２７】
慢性関節リウマチは、世界の人口の約1％が罹り、身体障害になる可能性がある。米国における慢性関節リウマチの発生はおよそ290万人である。女性は男性より２〜３倍多く発生する。慢性関節リウマチを発症しやすい年齢は25〜50歳である。若年性慢性関節リウマチは、71,000人の若い米国人（18歳以下）が罹患しており、少年より少女のほうが６倍多く発症している。
【００２８】
慢性関節リウマチは、身体の免疫系が関節の潤滑液を分泌する滑膜を異物として誤って認識する場合に起こる自己免疫疾患である。炎症が生じ、関節内および関節周囲の軟骨と組織が損傷を受けるかまたは破壊される。重症の事例では、この炎症が他の関節組織および周囲の軟骨にまで広がり、この場合には炎症が骨と軟骨を侵食または破壊して、関節を変形させる。身体は損傷した組織を瘢痕組織と置き換え、その結果、関節内の正常な空間は狭小になって、骨を互いに融合させる。慢性関節リウマチは硬直、腫脹、疲労、貧血、体重減少、発熱、そしてしばしば身体障害の苦痛をもたらす。慢性関節リウマチのいくつかの共通した症状としては、覚醒時の１時間以上継続する関節硬直；特定の指または手首の腫脹；関節周囲の軟組織の腫脹；および関節の両側の腫脹が挙げられる。腫脹は痛みを伴うかまたは伴わずに起こることもあり、かつ進行して悪化するかまたは進行前に数年間同じ状態で留まることもある。
【００２９】
慢性関節リウマチの診断は、複数の要因の組み合わせに基づいて行われ、それらの要因としては、痛みのある関節の具体的な位置と対称性、朝の関節硬直の存在、皮膚下の瘤および小節（リウマチ小節）の存在、慢性関節リウマチを示すＸ線検査の結果、および／またはリウマチ因子と呼ばれる血液検査の陽性結果が挙げられる。慢性関節リウマチを患う人の、全部ではないにしても、多くは、リウマチ様因子抗体を血液中に有する。リウマチ様因子は慢性関節リウマチを患っていない人にも存在しうる。他の疾患もリウマチ様因子を血液中に産生することがある。このような訳で、慢性関節リウマチの診断は複数の要因の組み合わせに基づいて行われ、血液中のリウマチ様因子の存在だけによることはない。
【００３０】
前記疾患の典型的な経過は持続的であるが変動する関節症状の１つであって、ほぼ10年後に患者の90％は骨と軟骨に構造的障害を示しうる。少数の人々は完全に消失する短期の病気を有し、他の少数の人々は多くの関節変形と、時には該疾患の他の徴候を伴うきわめて重症の疾患を有する。炎症プロセスは関節内の骨と軟骨の侵食または破壊を生じる。慢性関節リウマチでは、自己免疫周期の持続的抗原提示、Ｔ細胞刺激、サイトカイン分泌、滑膜細胞活性化、および関節破壊が認められる。この疾患は個人だけでなく社会に対しても大きな影響を与え、苛酷な痛み、機能障害および身体障害だけでなく、数百万ドルに価する保健費用および賃金損失も生じる（例えば、NIHウェブサイトおよびNIAIDウェブサイトを参照）。
【００３１】
関節炎に現在利用しうる治療法は、抗炎症薬または免疫抑制薬の投与による関節の炎症の軽減に重点が置かれている。関節炎の第１選択（first line）の治療薬は、通常、抗炎症薬、例えばアスピリン、イブプロフェンおよびCox-2阻害剤（例えば、セレコキシブおよびロフェコキシブ）である。「第２選択薬物」（second line drug）は、金、メトトレキセートおよびステロイドを含む。これらは十分確立された関節炎の治療薬であるが、これら第１および第２選択の治療薬だけでは、ごく僅かな患者しか鎮静化しない。最近、慢性関節リウマチの病因の理解が進んで、メトトレキセートが、組換え可溶性受容体またはサイトカインに対する抗体と併用されるようになった。例えば、腫瘍壊死因子（TNF）αに対する組換え可溶性受容体およびモノクローナル抗体が、関節炎の治療でメトトレキセートと併用されている。しかし、メトトレキセートと抗TNFα薬（例えばTNF-αに対する組換え可溶性受容体）の組み合わせで治療した患者のほぼ50％しか臨床上有意な改善を示さない。多数の患者は治療にも関わらず不応性のままである。慢性関節リウマチを患う患者には困難な治療上の課題が依然として残っている。多くの現行療法は高い頻度で副作用を発生するか、または疾患の進行を完全には食い止められない。今までのところ、どの治療も理想的でなく、治癒はあり得ない。もっと効果的に慢性関節リウマチおよび他の自己免疫疾患を治療する新規治療薬が必要とされている。
【００３２】
2.2.3  アレルギー
免疫が介在するアレルギー（過敏症）反応は、アレルギー症状を発現させる根本的メカニズムによって４つの型（I〜IV）に分類される。Ｉ型アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球からの血管作用性物質（例えばヒスタミン）のIgE媒介放出により特徴付けられる。これらの物質の放出とその後のアレルギー症状の発現は、アレルゲンに結合したIgEの、肥満細胞および好塩基球の表面上のその受容体への架橋により開始される。Ｉ型アレルギー反応を呈する個体では、２回目のアレルゲンへの曝露が、IgE産生に必要な３細胞相互作用に記憶ＢおよびＴ細胞が関わる結果として、アレルゲンに特異的なIgE抗体を高レベルで産生させる。産生された高レベルのIgE抗体は、アレルゲン結合IgEによる肥満細胞および好塩基球上のIgE受容体の架橋を増加させ、これがひいては、これらの細胞の活性化と、Ｉ型アレルギー疾患の臨床徴候に関与する薬理学的メディエーターの放出をもたらす。
【００３３】
IgEに対する親和性の異なる２種の受容体が同定されかつ特徴付けられている。高親和性受容体（FcεRI）は肥満細胞および好塩基球の表面上に発現される。低親和性受容体（FcεRII/CD23）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球およびランゲルハンス細胞を含む、多くの細胞型上に発現される。高親和性IgE受容体は３つのサブユニット（α、βおよびγ鎖）から成る。複数の研究は、α鎖だけがIgEの結合に関与しており、β鎖とγ鎖（膜貫通タンパク質または細胞質タンパク質のいずれかである）はシグナル伝達イベントに必要であることを実証している。IgEが肥満細胞および好塩基球上のFcεRIと結合するために必要なIgE構造の同定は、IgE依存性アレルギーを治療または予防するためのストラテジーを考える上で最も重要である。例えば、IgE受容体結合部位が解明されれば、IgEと受容体担持細胞との結合をin vivoでブロックするペプチドまたは小分子を同定することができるだろう。
【００３４】
現在、IgE依存性アレルギー反応は、抗ヒスタミン剤や副腎皮質ステロイドなどの薬物を用いて治療され、この療法は、肥満細胞および好塩基球から放出される血管作用性物質の効果を相殺することにより、アレルギー反応に関連する症状を軽減しようとするものである。高用量の抗ヒスタミン剤と副腎皮質ステロイドは有害な副作用（例えば、中枢神経系の障害、便秘など）がある。従って、Ｉ型アレルギー反応を治療するための他の方法が必要とされる。
【００３５】
Ｉ型アレルギー障害を治療するための１つのアプローチはモノクローナル抗体の産生であり、該抗体は血清中の可溶性（遊離の）IgEと反応し、IgEが肥満細胞および好塩基球上のその受容体と結合するのをブロックし、そして受容体結合型IgE（すなわち、これらは非アナフィラキシー誘発性である）とは結合しないものである。２種のこのようなモノクローナル抗体が、IgE依存性アレルギー反応の治療のための臨床開発の進んだ段階にある（例えば、Chang, T. W., 2000, Nature Biotechnology 18: 157-62を参照）。
【００３６】
IgE依存性アレルギー反応の最も有望な治療の１つは、内在性IgEの適当な非アナフィラキシー誘発性エピトープに対する能動免疫である。Stanworthら（米国特許第5,601,821号）は、異種担体タンパク質にカップリングさせたヒトIgEのCεH4ドメインから誘導したペプチドを、アレルギー用のワクチンとして利用する方法を記載している。しかし、このペプチドは、天然の可溶性IgEと反応する抗体の産生を誘導しないことが示された。さらに、Hellman（米国特許第5,653,980号）は、全長CεH2-CεH3ドメイン（ほぼ220アミノ酸長）と外来担体タンパク質との融合に基づく抗IgEワクチン組成物を提案した。しかし、Hellmanが提案した抗IgEワクチン組成物により誘導される抗体は、アナフィラキシーを起こす可能性が大である。というのは、IgE分子のCεH2とCεH3ドメインのいくつかの部分に対する抗体は、肥満細胞および好塩基球の表面上のIgE受容体と架橋し、アナフィラキシーのメディエーターを産生させることがわかったからである（例えば、Stadlerら, 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102:121-126を参照）。従って、アナフィラキシー抗体を誘導しないIgE依存性アレルギー反応を治療するための必要性が依然として存在する。
【００３７】
アナフィラキシー誘導に対する大きな関心から、Ｉ型アレルギー障害の治療への他のアプローチが開発されるようになり、このアプローチは、動物に投与したとき抗IgEポリクローナル抗体の産生を誘導しうるミモトープ（mimotope）から成る（例えば、Rudolfら, 1998, Journal of Immunology 160:3315-3321を参照）。Kricekら（国際公開第WO 97/31948号）は、ファージディスプレイペプチドライブラリーをモノクローナル抗体BSWI7によりスクリーニングし、IgE受容体結合のコンフォメーションを模倣しうるペプチドミモトープを同定した。これらのミモトープは、遊離の天然IgEと反応するが受容体結合型IgEとは反応せず、しかもIgEがその受容体と結合するのをブロックするポリクローナル抗体を誘導するために使用しうると予想される。Kricekらは、IgE分子のいずれの部分とも相同性がなく、従って本発明に開示したペプチドとは異なるペプチドミモトープを開示している。
【００３８】
当技術分野の概説から明らかなように、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、またはアレルギーなどの疾患を治療または予防する現行方法の治療効力を増大させる必要性が依然として存在する。特に、癌の治療に利用される治療用抗体のエフェクター機能、特に細胞傷害性効果を増大させる必要がある。現在の技術水準は、アレルギー障害を（例えば、抗体療法またはワクチン療法により）治療または予防するうえでも不十分である。
【発明の開示】
【００３９】
３．発明の概要
FcγRIIAとFcγRIIBの細胞外ドメインは95％同一であり、従ってこれらは多数のエピトープを共有する。しかし、FcγRIIAとFcγRIIBは非常に異なる活性を示す。基本的な相違は、FcγRIIAが食作用および呼吸バーストなどの細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開始するのに対して、FcγRIIBは抑制するシグナル伝達を開始することにある。本発明以前において、本発明者らの知るところでは、ヒト細胞上に発現される天然ヒトFcγRIIAと天然ヒトFcγRIIBの相違を識別する抗体の存在は同定されていない；免疫応答をモジュレートする上でのその特有な活性と役割を考えると、天然ヒトFcγRIIBを認識して天然ヒトFcγRIIAを認識しない抗体が必要である。本発明は、部分的に、このような天然ヒトFcγRIIB特異的抗体の発見に基づくものである。
【００４０】
本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIA、さらに特に天然ヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性で、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIB、さらに特に天然ヒトFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。好ましくは本発明の抗体は天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと結合する。本発明のある特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合する親和性より少なくとも２倍高い親和性でFcγRIIBと結合する。本発明の他の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合する親和性より少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍、少なくとも106倍、少なくとも107倍、または少なくとも108倍高い親和性でFcγRIIBと結合する。好ましい実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合する親和性より100倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、または108倍高い親和性でFcγRIIBと結合する。好ましくは、これらの結合親和性は、凝集IgGでなく単量体IgGにより測定され、結合は可変ドメインを介する（例えば、Fabフラグメントは全免疫グロブリン分子と類似した結合特性を有する）。
【００４１】
一実施形態においては、本発明によるFcγRIIB特異的抗体は、Pulfordら, 1986 Immunology 57:71-76に開示されたKB61と名付けられたモノクローナル抗体、またはWeinrichら, 1996, Hybridoma 15:109-116に開示されたII8D2と名付けられたモノクローナル抗体ではない。他の特定の実施形態においては、本発明によるFcγRIIB特異的抗体は、モノクローナル抗体KB61またはモノクローナル抗体MAbII8D2と同じエピトープと結合しないおよび／またはモノクローナル抗体KB61またはモノクローナル抗体MAbII8D2と結合について競合しない。好ましくは、本発明によるFcγRIIB特異的抗体は、FcγRIIB2アイソタイプのアミノ酸位置135〜141に対応するアミノ配列Ser-Asp-Pro-Asn-Phe-Ser-Ileと結合しない。
【００４２】
本発明は、当技術分野で公知の特異性を評価する標準的方法により測定して、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本発明は、例えば、ウェスタンブロット、BIAcoreまたはラジオイムノアッセイにより測定して、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本発明は、例えば、FcγRIIB結合に対して直線範囲で、ELISAアッセイにより測定して、FcγRIIAと結合するも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本発明の一実施形態においては、本発明は、ELISAアッセイで測定してFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する、哺乳動物系で産生された単離された抗体またはそのフラグメントに関する。
【００４３】
特定の実施形態においては、本発明は、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関し、上記抗体の定常ドメインはさらに少なくとも１以上のFc活性化受容体に対して増大した親和性を有する。さらに他の特定の実施形態においては、上記Fc活性化受容体はFcγRIIIである。
【００４４】
本発明の一実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントはFcγRIIBのIgG結合部位をブロックし、例えばブロッキングELISAアッセイにおいて、凝集した標識IgGとFcγRIIBとの結合をブロックする。ある特定の実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、ELISAブロッキングアッセイにおいて、凝集した標識IgGの結合を少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、または99.9％ブロックする。さらに他の特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは上記ELISAアッセイにおいて、上記凝集した標識IgGの結合を完全にブロックする。
【００４５】
本発明の他の実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIBのIgG結合部位をブロックし、二重染色FACSアッセイで測定して、上記凝集した標識IgGとFcγRIIBとの結合をブロックする。
【００４６】
本発明は、FcγRIIBの活性をモジュレートする（すなわち、アゴニスト作用を示すかまたはアンタゴニスト作用を示す）抗体の使用を包含する。本発明の一実施形態においては、本発明の抗体はFcγRIIBの少なくとも1つの活性にアゴニスト作用を示す、すなわちシグナル伝達を誘発する。作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明のアゴニスト性抗体はFcγRIIBのクラスター形成を模倣して、FcγRライゲーションに対する活性化応答の鈍化および細胞応答の抑制をもたらす。
【００４７】
本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は少なくともFcγRIIBの少なくとも1つの活性にアンタゴニスト作用を示し、すなわち、シグナル伝達を遮断する。例えば、本発明の抗体は凝集IgGとFcγRIIBとの結合をブロックする。
【００４８】
本発明は、FcεRIにより誘導される肥満細胞活性化を抑制する抗体を提供する。本発明はさらに、単球細胞においてFcγRIIA介在性マクロファージ活性化を抑制する抗FcγRIIB抗体を提供する。本発明はまた、Ｂ細胞受容体介在性シグナル伝達を抑制する抗FcγRIIB抗体も提供する。
【００４９】
ある特定の実施形態においては、抗FcγRIIB抗体はFcγRIIBのリガンド結合部位をブロックする。さらなる特定の実施形態においては、ブロッキング活性は免疫複合体により誘発される活性化のネガティブ調節をブロックし、その結果、免疫応答を増大することができる。さらなる特定の実施形態においては、免疫応答の増大は抗体依存性細胞応答を増加させる。他の特定の実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体はFcγRIIB受容体とＢ細胞および／またはFc受容体との架橋をブロックし、Ｂ細胞、肥満細胞、樹状細胞、またはマクロファージを活性化させる。
【００５０】
本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメント、特にFcγRIIAと比較してFcγRIIBに対する特異性をもつ新規モノクローナル抗体、を製造する方法を包含する。本発明の抗体またはそのフラグメントは、当技術分野で公知の抗体を製造するためのいずれかの方法により、特に当技術分野で公知の培養ハイブリドーマ細胞からの分泌、化学合成または組換え発現法により製造することができる。ある特定の実施形態においては、本発明は、遺伝子組換えによりFcγRIIB特異的抗体を産生する方法に関し、前記方法は、(i)培地中で上記抗体を発現するのに好適な条件下で、異種プロモーターと機能的に連結された第１の核酸分子および同じまたは異なる異種プロモーターと機能的に連結された第２の核酸分子を含有する宿主細胞を培養するステップ（ただし、第１の核酸と第２の核酸はそれぞれFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの重鎖および軽鎖をコードするものである）、および(ii)上記抗体を上記培地から回収するステップ、を含んでなる。他の実施形態においては、本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗FcγRIIBモノクローナル抗体を産生する方法を提供し、前記方法は、(a)１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウスを、精製したFcγRIIBまたはその免疫原性フラグメントを用いて免疫感作するステップ、(b)上記１以上のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を作製するステップ、(c)上記ハイブリドーマ細胞株を、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ細胞株についてスクリーニングするステップ、を含んでなる。本発明は上記方法により産生されるいずれの抗体も包含する。ある特定の実施形態においては、本発明はFcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗FcγRIIBモノクローナル抗体を産生する方法を提供し、前記方法は、(a)１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウスを、精製したFcγRIIBまたはその免疫原性フラグメントを用いて免疫感作するステップ、(b)上記マウスを、免疫応答を誘発させるのに十分な時間にわたり追加免疫するステップ、(c)上記１以上のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を作製するステップ、(d)上記ハイブリドーマ細胞株を、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ細胞株についてスクリーニングするステップ、を含んでなる。好ましい実施形態においては、上記マウスを４ヶ月の期間にわたって少なくとも４回追加免疫する。本発明の一実施形態においては、上記マウスの免疫応答を増大させることが当技術分野で知られているアジュバントと混合しておいた精製FcγRIIBを用いて、上記マウスを免疫感作する。本発明のある特定の実施形態においては、上記免疫原性フラグメントはFcγRIIBの可溶性細胞外ドメインである。ハイブリドーマ細胞株は、当技術分野で公知の標準技術（例えば、ELISA）を用いてスクリーニングすることができる。
【００５１】
本発明のある特定の実施形態においては、抗FcγRIIB抗体はモノクローナル抗体、合成抗体、組換えで産生した抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、細胞内発現抗体、または上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントである。
【００５２】
好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体、より好ましくはヒト化またはヒト抗体である。特に好ましい実施形態においては、本発明の抗体はヒトFcγRIIB、特に天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと結合する。他の特定の実施形態においては、本発明の抗体はヒトFcγRIIB、特に天然ヒトFcγRIIBの１以上のエピトープを特異的にまたは選択的に認識する。本発明の他の実施形態は、本発明の抗体のFcγRIIBに対する親和性を増大させるためのファージディスプレイ技法の使用を包含する。当技術分野で公知のいずれかのスクリーニング方法（例えば、ELISA）を用いてFcγRIIBに対して増加した結合力をもつ突然変異型抗体を同定することができる。他の特定の実施形態においては、当技術分野で周知の抗体スクリーニングアッセイ（例えば、BIACOREアッセイ）を用いて本発明の抗体をスクリーニングして、3x10-3s-1より低いKoffをもつ抗体を同定する。
【００５３】
ある好ましい実施形態においては、本発明はATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するそれぞれクローン2B6または3H7により産生されたモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化もしくは他の遺伝子操作抗体を提供する。他の特定の実施形態においては、本発明はATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するそれぞれクローン1D5、2El、2H9、2D11、および1F2により産生されるモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化もしくは他の遺伝子操作抗体を提供する。他の実施形態においては、本発明はクローン2B6または3H7により産生されたモノクローナル抗体と結合について競合しかつFcγRIIA、好ましくは天然ヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、好ましくは天然ヒトFcγRIIBと結合する、および／またはクローン2B6または3H7から産生されたモノクローナル抗体と同じFcγRIIBのエピトープと結合しかつFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに本発明は、ATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するそれぞれハイブリドーマ細胞株2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2を提供する。ある特定の実施形態においては、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍またはその１以上の症状を予防、治療、管理または改善するための、2B6、3H7、1D5、2El5、2H9、2D11、または1F2抗体、またはそのキメラ、ヒト化または他の遺伝子操作抗体の使用を提供する。ある特定の実施形態においては、遺伝子操作で作られた抗体はFc領域に１以上の突然変異を含む。Fc領域の１以上の突然変異は、改変された抗体依存性エフェクター機能、他のFc受容体（例えば、Fc活性化受容体）との改変された結合、改変されたADCC活性、または改変されたC1q結合活性、または改変された補体依存性細胞傷害活性、またはそれらのいずれかの組み合わせをもつ抗体をもたらす。ある好ましい実施形態においては、ヒト化2B6は、配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号18、配列番号20、または配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。他の好ましい実施形態においては、ヒト化2B6またはヒト化3H7抗体の重鎖のFcドメインは遺伝子操作されて、位置240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419、または421に他のアミノ酸による少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる。さらに好ましい実施形態においては、ヒト化2B6の重鎖のFcドメインは、ロイシンを位置247に、リシンを位置421におよびグルタミン酸を位置270に；トレオニンを位置392に、ロイシンを位置396に、およびグルタミン酸を位置270に；またはリシンを位置255に、ロイシンを位置396に、およびグルタミン酸を位置270に有する。本発明のある特定の実施形態においては、該抗体はクローン2B6または3H7により産生されたモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化もしくは他の遺伝子操作抗体ではない。
【００５４】
本発明のある特定の実施形態においては、ヒト化2B6抗体を提供し、上記ヒト化2B6抗体は配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号20のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでなり、ここでヒト化2B6抗体の重鎖のFcドメインはロイシンを位置247に、リシンを位置421に、およびグルタミン酸を位置270に；またはグルタミン酸を位置270に、アスパラギン酸を位置316に、およびグリシンを位置416に有する。
【００５５】
本発明はまた本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドも包含する。一実施形態においては、本発明はFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントの重鎖または軽鎖をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、上記核酸を含んでなるベクターにも関する。本発明はさらに、重鎖をコードする第１の核酸分子および軽鎖をコードする第２の核酸分子を含んでなるベクターを提供し、上記重鎖および軽鎖はFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメント由来である。ある特定の実施形態においては、上記ベクターは発現ベクターである。本発明はさらに、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドのベクターを含有する宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明は、寄託されてATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するそれぞれハイブリドーマクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2により産生される抗体の重鎖および軽鎖またはそれらの部分（例えばCDR、可変ドメインなど）およびそれらのヒト化抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００５６】
活性化および抑制Fc受容体、例えば、FcγRIIAおよびFcγRIIBは、バランスのとれたこれらの受容体の機能と好適な細胞免疫応答のために極めて重要である。本発明はFc受容体シグナル伝達経路におけるこのようなバランスと調節制御の失調に関連する疾患を治療するための本発明の抗体の使用を包含する。従って、本発明のFcγRIIB抗体は免疫応答を調節する上での用途、例えば自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、またはアレルギー反応に関係する免疫応答を抑制する上での用途を有する。本発明のFcγRIIB抗体はまた、ある種のエフェクター機能を改変して、例えば治療用抗体依存性細胞傷害を高めるために使用することもできる。
【００５７】
本発明の抗体は、例えば、一実施形態では、単剤療法として癌を予防または治療するために有用である。ある好ましい実施形態においては、本発明の抗体を黒色腫の治療および／または予防に用いる。他の実施形態においては、本発明の抗体は癌を予防または治療するために、特に細胞傷害活性をもつ癌抗原特異的治療用抗体の細胞傷害活性を強化して腫瘍細胞死滅を増大させるおよび／または抗体依存性細胞性細胞傷害活性（「ADCC」）、補体依存性細胞傷害活性（「CDC」）もしくは治療用抗体の食作用を増大させる上で有用である。本発明は、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者における癌を治療する方法であって、上記患者に、治療上有効な量の、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する第１の抗体またはそのフラグメント、および上記癌抗原と特異的に結合しかつ細胞傷害性である第２の抗体を投与することを含む上記方法を提供する。本発明はまた、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者における癌を治療する方法であって、FcγRIIA、好ましくは天然ヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、特に天然ヒトFcγRIIBと特異的に結合しかつ、抗体が単量体であるときは、その定常ドメインがさらに１以上のFc活性化受容体、例えばFcγRIIIAに対して増加した親和性を有する抗体またはそのフラグメント、および上記癌抗原と特異的に結合し細胞傷害性である抗体の治療上有効な量を上記患者に投与することを含む、上記方法を提供する。ある特定の実施形態においては、上記Fc活性化受容体はFcγRIIIAである。特定の実施形態においては、本発明の抗体は、該抗体が好中球と検出可能な程度に結合しない用量で投与される。
【００５８】
本発明の他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体はＢ細胞悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病の予防または治療に有用である。従って、本発明は、FcγRIIBと特異的に結合して好ましくはFcγRIIAと特異的に結合しない抗体、ならびにかかる抗体の誘導体、類似体および抗原結合フラグメントを単独でまたは１以上の他の治療薬と組み合わせて投与することにより、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療、管理、予防または改善する方法を提供する。特定の実施形態においては、被験者の癌は１以上の実験的療法、特にリツキサン治療に不応性である。本発明の方法は、Ｂ細胞疾患、例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の領域を含む濾胞性リンパ腫、小細胞型リンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、およびびまん性小切れ込み細胞型リンパ腫の治療、管理、予防、または改善に用いることができる。
【００５９】
他の実施形態においては、本発明は治療薬または薬物にコンジュゲートされたFcγRIIB特異的抗体の使用を提供する。抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされ得る治療薬の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、毒素、放射性元素、および代謝拮抗物質が挙げられる。
【００６０】
一実施形態においては、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍の標準的または実験的治療レジメン（例えば、化学療法、放射免疫療法、または放射線療法）と組み合わせたFcγRIIB特異的抗体の使用を提供する。かかる併用療法は標準的または実験的治療の有効性を高めることができる。Ｂ細胞悪性腫瘍の予防、治療、管理、または改善のためにFcγRIIB特異的抗体またはその抗原結合フラグメントと併用するのに特に有用な治療薬の例としては、限定するものではないが、リツキサン、インターフェロンα、および抗癌剤が挙げられる。FcγRIIB特異的抗体またはその抗原結合フラグメントと併用するのに特に有用な化学療法剤としては、限定するものではないが、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然物、およびホルモンが挙げられる。本発明の併用療法は、治療または予防効果を達成するためにＢ細胞悪性腫瘍の被験者に投与される抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量を少なくし、かつ／またはその投与回数を減らすことが可能である。
【００６１】
他の実施形態においては、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメントの使用はＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者の生存を長引かせることができる。
【００６２】
他の実施形態においては、本発明は、細胞傷害性抗体で治療される被験者において抗体依存性細胞傷害効果を増大させる方法であって、本発明の抗体またはそのフラグメントを、上記細胞傷害性抗体の細胞傷害効果を増大させるのに十分な量で上記患者に投与することを含む、上記方法を提供する。さらに他の実施形態においては、本発明は、細胞傷害性抗体で治療される被験者において抗体依存性細胞傷害効果を増大させる方法であって、抗体が単量体であるときは、さらにFc活性化受容体に対して増大した親和性を有する本発明の抗体またはそのフラグメントを、上記細胞傷害性抗体の細胞傷害効果を増大させるのに十分な量で上記患者に投与することを含む、上記方法を提供する。さらに他の実施形態においては、本発明はさらに１以上のさらなる癌治療法の実施を含む方法を提供する。
【００６３】
本発明は、抗体の治療活性を増強するための本発明の抗体と治療用抗体（細胞死滅を介してその治療効果を媒介する）との併用を包含する。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体は、抗体介在性エフェクター機能を高めることにより抗体の治療活性を増強する。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は、食作用および標的腫瘍細胞のオプソニン作用を高めることにより細胞傷害性抗体の治療活性を増強する。本発明のさらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、標的腫瘍細胞の破壊における抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ADCC）を高めることにより抗体の治療活性を増強する。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体はADCCを高めるためにFc融合タンパク質と併用される。
【００６４】
いくつかの実施形態においては、本発明は、抗体の治療活性を増強するための本発明の抗体と治療用抗体（細胞死滅を介してその治療効果を媒介するものではない）との併用を包含する。特定の実施形態においては、本発明は、治療的アポトーシスを誘導する抗体（アゴニスト活性をもつ）、例えば抗Fas抗体と本発明の抗体との併用を包含する。治療的アポトーシス誘導抗体は、当技術分野で知られている、アポトーシス経路をモジュレートするいずれかのデス受容体、例えばTNFR受容体ファミリーメンバーまたはTRAILファミリーメンバーに特異的でありうる。
【００６５】
本発明は、マクロファージ介在性腫瘍細胞進行および転移をブロックするための本発明の抗体の利用を包含する。本発明の抗体は、マクロファージ浸潤が起こる固形腫瘍の治療に特に有用である。本発明のアンタゴニスト性抗体は、腫瘍部位に局在化するマクロファージの集団を低減または排除することにより、腫瘍細胞転移を制御する、例えば低減または排除するのに特に有用である。本発明はさらに、マクロファージ以外のFcγRIIBを発現する免疫エフェクター細胞、例えば樹状細胞を効果的に枯渇させるかまたは排除する抗体を包含する。本発明の抗体を用いる免疫エフェクター細胞の効果的枯渇または排除は、エフェクター細胞の集団の50％、60％、70％、80％、好ましくは90％、最も好ましくは99％を低減させる。特定の実施形態においては、本発明の抗体を、該抗体と好中球との結合が検出できない用量にて投与する。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体は、黒色腫細胞の腫瘍を含む非造血性起源の腫瘍を治療するのに特に有用である。
【００６７】
いくつかの実施形態においては、本発明は、本発明の抗体と治療用抗体の併用を包含し、該治療抗体は、腫瘍細胞それ自体上に発現されないが、周囲の反応性の、腫瘍を支持する非悪性細胞（腫瘍間質を含む）上に発現される腫瘍抗原と免疫特異的に結合するものである。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、繊維芽細胞上の腫瘍抗原、例えば繊維芽細胞活性化タンパク質（FAP）と免疫特異的に結合する抗体と併用される。
【００６８】
本発明は、患者の自己免疫疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に１種以上の本発明の抗体を治療上有効な量で投与することを含む上記方法を提供する。本発明はまた、患者の自己免疫疾患を治療する方法であって、さらに上記患者に１種以上の抗炎症剤および／または１種以上の免疫調節剤を治療上有効な量で投与することを含む上記方法も提供する。
【００６９】
本発明はまた、患者の炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に１種以上の本発明の抗体を治療上有効な量で投与することを含む上記方法も提供する。本発明はまた、患者の炎症性疾患を治療する方法であって、さらに上記患者に１種以上の抗炎症剤および／または１種以上の免疫調節剤を治療上有効な量で投与することを含む上記方法も提供する。
【００７０】
本発明は、被験者のワクチン組成物に対する免疫応答を増大する方法であって、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントおよびワクチン組成物を、上記ワクチン組成物に対する免疫応答を増大させるのに有効な量で上記被験者に投与することを含む上記方法を提供する。本発明の抗体を用いて、ワクチン組成物の抗原に対する体液性および／または細胞性応答を増大することができる。本発明の抗体は当技術分野で公知のいずれかのワクチンと併用することができる。本発明は、特定の障害を予防または治療するための本発明の抗体の使用であって、１以上の特定の抗原に対する増大した免疫応答が疾患または障害を治療または予防するのに有効である上記使用を包含する。
【００７１】
本発明はさらに、患者のIgE依存性アレルギー疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、治療上有効な量の本発明のアゴニスト性抗体を投与することを含む上記方法を提供する。本発明はまた、患者のIgE依存性アレルギー疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、本発明の抗体を、IgE依存性アレルギー疾患を治療または予防するために使用される他の治療用抗体またはワクチン組成物と組み合わせて投与することを含む上記方法も提供する。
【００７２】
本発明はまた、感染性病原体に対する免疫療法を高める方法であって、本発明の抗体を、既に病原体（例えばHIV、HCVまたはHSV）に感染している患者に投与して、感染した細胞のオプソニン作用および食作用を増大させる上記方法も提供する。
【００７３】
本発明は、アポトーシス介在シグナル伝達が損なわれている疾患（例えば癌、自己免疫疾患）を治療する方法を提供する。特定の実施形態においては、本発明はFas介在アポトーシスに欠陥がある疾患を治療する方法であって、本発明の抗体を抗Fas抗体と組合わせて投与することを含む上記方法を包含する。
【００７４】
本発明は、生物学的サンプル中のFcγRIIBの存在を特異的に（すなわちFcγRIIAではなくFcγRIIBを）検出するための本発明の抗体の使用を包含する。
【００７５】
他の実施形態においては、本発明は、被験者における自己免疫疾患を診断する方法であって、(i)被験者からの生物学的サンプルを本発明の抗体の有効量と接触させるステップ、および(ii)上記抗体またはそのフラグメントの結合を検出するステップを含んでなり、ここで上記の検出可能マーカーのバックグラウンドまたは標準レベルを超える検出は上記被験者が自己免疫疾患を有することを示す上記方法を提供する。
【００７６】
本発明はさらに、(i)治療上有効な量の、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント；および(ii)製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、(i)治療上有効な量の、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント；および(ii)癌抗原と特異的に結合する細胞傷害性抗体；および(iii)製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７７】
本発明のある特定の実施形態においては、本発明の方法により使用する医薬組成物を提供するものであり、上記医薬組成物はＢ細胞悪性腫瘍またはその１以上の症状を予防、治療、管理または改善するのに有効な量の抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメント、および製薬上許容される担体を含んでなる。本発明はまた、本発明の方法により使用する医薬組成物を提供するものであり、上記医薬組成物は抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合フラグメント、FcγRIIBアンタゴニスト以外の予防または治療薬、および製薬上許容される担体を含んでなる。
【００７８】
3.1  定義
本明細書に使用される用語「FcγRIIBと特異的に結合する」および類似の用語は、FcγRIIBまたはそのフラグメントと特異的に結合しかつ他のFc受容体（特にFcγRIIA）と特異的に結合しない抗体またはそのフラグメント（または他のいずれかのFcγRIIB結合分子）を意味する。さらに、当業者であれば、FcγRIIBと特異的に結合する抗体はその可変ドメインを介して結合することを理解するであろう。FcγRIIBと特異的に結合する抗体がその可変ドメインを介して結合する場合、それは凝集していない（すなわち単量体である）ことを当業者は理解するであろう。FcγRIIBと特異的に結合する抗体は、例えばイムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で公知の他のアッセイにより測定して、他のペプチドまたはポリペプチドとより低い親和性で結合してもよい。好ましくは、FcγRIIBまたはその断片と特異的に結合する抗体またはフラグメントは他の抗原と交差反応しない。FcγRIIBと特異的に結合する抗体またはフラグメントは、例えば、イムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で公知の他のアッセイにより同定することができる。抗体またはそのフラグメントが、実験技法、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（RIA）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定して、いずれの交差反応性抗原と結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと結合する場合に、それはFcγRIIBと特異的に結合するといえる。抗体特異性に関する考察は、例えば、Paul編, 1989, 「基礎免疫学、第2版（Fundamental Immunology Second Edition）」, Raven Press, New York p.332-336を参照されたい。
【００７９】
本明細書に使用される用語「天然FcγRIIB」は、細胞の表面上に内因的に発現されかつ該表面に存在するFcγRIIBを意味する。いくつかの実施形態においては、「天然FcγRIIB」は哺乳動物細胞において組換えにより発現されたタンパク質を包含する。好ましくは、天然FcγRIIBは細菌細胞すなわち大腸菌において発現されたものではない。最も好ましくは、天然FcγRIIBは変性されておらず、生物学的に活性なコンフォメーションである。
【００８０】
本明細書に使用される用語「天然FcγRIIA」は、細胞の表面上に内因的に発現されかつ該表面に存在するFcγRIIAを意味する。いくつかの実施形態においては、「天然FcγRIIA」は哺乳動物細胞において組換えにより発現されたタンパク質を包含する。好ましくは、天然FcγRIIAは細菌細胞すなわち大腸菌において発現されたものではない。最も好ましくは、天然FcγRIIAは変性されておらず、生物学的に活性なコンフォメーションである。
【００８１】
本明細書においてタンパク質性物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、および抗体）に関して使用する用語「類似体」は、第２のタンパク質性物質と類似のまたは同一の機能を有するタンパク質性物質を意味するが、必ずしも第２のタンパク質性物質と類似のまたは同一のアミノ酸配列を含んでリ、第２のタンパク質性物質と類似のまたは同一の構造を有する必要はない。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質性物質は、次の条件の少なくとも1つを満たす第２のタンパク質性物質を意味する：(a) タンパク質性物質が、第２のタンパク質性物質のアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する；(b) タンパク質性物質が、第２のタンパク質性物質の少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、または少なくとも150個連続したアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる；および(c) タンパク質性物質が、第２のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる。第２のタンパク質性物質と類似の構造をもつタンパク質性物質は、第２のタンパク質性物質と類似の二次、三次または四次構造を有するタンパク質性物質を意味する。ポリペプチドの構造は、当業者に公知の方法により決定することができ、これらの方法としては、限定するものではないが、ペプチド配列決定、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、円二色性、および結晶学的電子顕微鏡検査が挙げられる。
【００８２】
２つのアミノ酸配列のまたは２つの核酸配列の同一性％を決定するためには、該配列を最適な比較を行うためにアライメントする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列と最適なアラインメントとなるように、第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入してもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列の或る位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められていれば、該分子はその位置において同一となる。２つの配列間の同一性％は、両配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝オーバーラップする同一位置の数／総位置数ｘ100％）。一実施形態においては、２つの配列は同じ長さである。
【００８３】
２つの配列間の同一性％の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて行うこともできる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい例は、限定するものではないが、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268とその改訂版KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムはAltschulら, 1990, J. MoI. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索をNBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝100、ワード長さ＝12を用いて実行し、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質をXBLASTプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝50、ワード長さ＝3を用いて実行し、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的用のギャップ付きアライメントを得るために、Gapped BLASTをAltschulら, 1997, Nuclear Acids Res. 25:3389-3402に記載の通り利用することができる。あるいは、PSI-BLASTを用いて分子間の遠縁関係を検出する反復検索を実行することができる（同上文献）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを使用するとき、それぞれのプログラムの（例えば、XBLASTおよびNBLASTの）デフォルトパラメーターを利用することができる（例えば、NCBIウェブサイトを参照）。配列比較に使用される他の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、1988、CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部分であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合は、PAM120 weight residue table、12のギャップ長ペナルティ、4のギャップペナルティを用いることができる。
【００８４】
２つの配列間の同一性％は、ギャップを伴うまたは伴わない上記の技法と類似の技法を用いて決定することができる。同一性％を計算する際に、典型的には正確なマッチだけを数える。
【００８５】
本明細書に使用される、非タンパク質性物質に関しての用語「類似体」は、第１の有機または無機分子と類似または同一の機能を有しかつ構造的に第１の有機または無機分子と類似する第２の有機または無機分子を意味する。
【００８６】
本明細書に使用される用語「アンタゴニスト」は、FcγRIIBの発現などの他の分子の機能、活性および／または発現をブロック、抑制、低減または中和することを特徴とするいずれかのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、大分子、または小分子（10kD未満）を意味する。様々な実施形態においては、アンタゴニストは他の分子の機能、活性および／または発現を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などの対照と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％低下させる。
【００８７】
本明細書に使用される用語「抗体」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体（camelized antibody）、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、細胞内発現抗体（intrabody）、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体および抗-抗Id抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性フラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IGA1およびIgA2）またはサブクラスであってもよい。
【００８８】
本明細書に使用される用語「Ｂ細胞悪性腫瘍」はＢ細胞性リンパ増殖性疾患を意味する。Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞起源の腫瘍を含む。Ｂ細胞悪性腫瘍には、限定するものではないが、リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球白血病、多発性骨髄腫、ホジキンおよび非ホジキン病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の領域をもつ濾胞性リンパ腫、小リンパ球リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性小切れ込み細胞型リンパ腫が含まれる。
【００８９】
本明細書に使用される用語「癌」は、細胞の異常な無制御増殖から生じる新生物または腫瘍を意味する。本明細書において、癌は明確に白血病およびリンパ腫を含む。用語「癌」は、遠隔部位に転移する能力を有して、非癌細胞とは異なる表現型形質（例えば、軟寒天のような三次元基体でのコロニーの形成、あるいは三次元基底膜における管状ネットワークもしくは網状マトリックスまたは細胞外マトリックス調製物の形成）を示す細胞に関係した疾患を意味する。非癌細胞は軟寒天においてコロニーを形成したり、三次元基底膜において明確な球状構造物または細胞外マトリックス調製物を形成したりしない。癌細胞は、その発生中に様々な機構を介してではあるが、特徴あるセットの機能的能力を獲得する。かかる能力として、アポトーシスの回避、増殖シグナルの自給自足、抗増殖シグナルに対する非感受性、組織浸潤／転移、無限の増殖能力、および持続的血管新生が挙げられる。用語「癌細胞」の意味は前悪性および悪性の癌細胞を包含する。いくつかの実施形態においては、癌は、局在したままの良性腫瘍を意味する。他の実施形態においては、癌は、近隣の身体構造に侵入して破壊しかつ遠隔部位に拡大する悪性腫瘍を意味する。さらに他の実施形態においては、癌は特定の癌抗原と関連している。
【００９０】
抗体を含むポリペプチドまたはタンパク質との関連で本明細書に使用される用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書に使用される用語「誘導体」はまた、改変されている（すなわち、いずれかのタイプの分子のポリペプチドまたはタンパク質との共有結合により改変されている）ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との連結などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、限定するものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む当業者に公知の技術を用いる化学的改変により改変することができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが誘導された元のポリペプチドまたはタンパク質と類似のまたは同一の機能を持つ。
【００９１】
FcγRIIBとの関連で本明細書に使用される用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加（すなわち、突然変異）により改変されている、FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、FcγRIIBポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体、またはFcγRIIBポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体フラグメントのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態においては、抗体誘導体またはそのフラグメントは１以上のCDR中にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む。抗体誘導体は、非誘導体抗体と比較して、実質的に同じ結合、より強い結合、または弱い結合を有してもよい。特定の実施形態においては、CDRの1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加（すなわち突然変異）されている。本明細書に使用されるFcγRIIBに関連する用語「誘導体」はまた、改変されている（例えば、FcγRIIBポリペプチドへのいずれかのタイプの分子の共有結合により改変されている）、FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、FcγRIIBポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体、またはFcγRIIBポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体フラグメントも意味する。例えば、限定するものではないが、FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドのフラグメント、抗体、または抗体フラグメントは、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との連結などにより改変することができる。FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、抗体、もしくは抗体フラグメントの誘導体は、当業者に公知の技法を用いる化学的改変によって改変することができ、それらの技法には、限定するものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれる。さらに、FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、抗体、または抗体フラグメントの誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含有してもよい。一実施形態においては、抗体誘導体は親抗体と類似のまたは同一の機能を有する。他の実施形態においては、抗体誘導体または抗体フラグメントは、未改変の抗体と比較して、改変された活性を有する。例えば、誘導体抗体またはそのフラグメントは、そのエピトープとより堅固に結合することができるか、またはタンパク分解に対してより抵抗性である。
【００９２】
本明細書に使用される用語「障害」および「疾患」は互換的に使用され、被験者の状態を意味する。特に、用語「自己免疫疾患」は「自己免疫障害」と互換的に使用され、被験者自身の細胞、組織および／または器官に対する被験者の免疫反応によって引き起こされる細胞、組織および／または器官の損傷により特徴付けられる被験者の状態を意味する。用語「炎症性疾患」は用語「炎症性障害」と互換的に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症により特徴付けられる被験者の状態を意味する。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害により生じても生じなくてもよい。従って、いくつかの障害は自己免疫障害と炎症性障害の両方により特徴付けることができる。
【００９３】
本明細書に使用される用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原分子上の領域を意味する。
【００９４】
本明細書に使用される用語「断片」または「フラグメント」は、他のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ酸残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、少なくとも150個連続したアミノ酸残基、少なくとも175個連続したアミノ酸残基、少なくとも200個連続したアミノ酸残基、または少なくとも250個連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態において、ポリペプチドの断片またはフラグメントは、そのポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。好ましくは、抗体フラグメントはエピトープ結合フラグメントである。
【００９５】
本明細書に使用される用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１以上のCDRを含んでなる免疫グロブリンを意味する。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、もし存在するのであれば、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約85〜90％、好ましくは約95％以上同一でなければならない。従って、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、恐らくはCDRを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」はヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含んでなる抗体である。例えば、ヒト化抗体は典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。その理由は、例えば、キメラ抗体の全可変領域が非ヒトであることによる。ドナー抗体は「ヒト化」のプロセスによって「ヒト化」されたと言われる。なぜなら、得られるヒト化抗体が、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるからである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基がマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の（所望の特異性、親和性、および能力を有する）超可変領域残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（FR）残基が対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体またはドナー抗体中に見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は抗体性能をさらに改善するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、ここで、超可変領域の全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、そしてFRの全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のFRである。場合によっては、ヒト化抗体は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加（すなわち、突然変異）の導入により改変されている、免疫グロブリン（典型的には、FcγRIIBポリペプチドと免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリン）の定常領域（Fc）の少なくとも一部分も含む。いくつかの実施形態においては、ヒト化抗体は誘導体である。かかるヒト化抗体は１以上の非ヒトCDR中にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む。ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体と比較したとき、実質的に同じ結合、より強い結合、またはより弱い結合を有しうる。特定の実施形態では、CDRの1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されている（すなわち突然変異している）。抗体をヒト化することのさらなる詳細については、欧州特許EP 239,400、EP 592,106、およびEP 519,596；国際公開WO 91/09967およびWO 93/17105；米国特許5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886、および6,407,213；ならびにPadlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；Roguskaら, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973；Tanら, 2002, J. Immunol. 169:1119-25；Caldasら, 2000, Protein Eng. 13:353-60；Moreaら, 2000, Methods 20:267-79；Bacaら, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84；Roguskaら, 1996, Protein Eng. 9:895-904；Coutoら, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s；Coutoら, 1995, Cancer Res. 55:1717-22；Sandhu, 1994, Gene 150:409-10；Pedersenら, 1994, J. MoI. Biol. 235:959-73；Jonesら, 1986, Nature 321:522-525；Reichmannら, 1988, Nature 332:323-329；およびPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照されたい。
【００９６】
本明細書に使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関わる抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基24-34（Ll）、50-56（L2）および89-97（L3）ならびに重鎖可変ドメインの31-35（Hl）、50-65（H2）および95-102（H3）；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基26-32（Ll）、50-52（L2）および91-96（L3）ならびに重鎖可変ドメインの26-32（Hl）、53-55（H2）および96-101（H3）；ChothiaおよびLesk, 1987, J. MoI. Biol. 196:901-917）を含む。Eph099B-208.261およびEph099B-233.152のCDR残基は表１に掲げられている。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書に規定した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９７】
本明細書に使用される用語「免疫調節薬」とその変種は宿主の免疫系をモジュレートする薬剤を意味する。ある特定の実施形態においては、免疫調節薬は免疫抑制薬である。ある特定の他の実施形態においては、免疫調節薬は免疫刺激薬である。免疫調節薬には、限定するものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣剤（mimetic agent）、および有機分子が含まれる。
【００９８】
本明細書に使用される用語「管理」は、疾患の治癒をもたらさない予防薬または治療薬の投与から被験者が獲得する有益な効果を意味する。ある特定の実施形態においては、疾患の進行または悪化を防止するように疾患を「管理」するために、被験者に１種以上の予防薬または治療薬を投与する。
【００９９】
本明細書に使用される用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、DNAおよびRNA分子の組合せ、またはハイブリッドDNA/RNA分子、およびDNAまたはRNA分子の類似体を含む。このような類似体は、例えば、限定するものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチド類似体を用いて、作製することができる。このような類似体はまた、DNAまたはRNA分子に有益な属性（例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜通過能力の増加）を与える改変骨格を有するDNAまたはRNA分子を含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖、二本鎖であってもよいし、一本鎖と二本鎖の両部分を含有してもよく、そして三本鎖部分を含有してもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
【０１００】
本明細書に使用される用語「予防」は、予防薬または治療薬の投与から得られる、被験者の疾患の１以上の症状の発生および／または再発または発症の予防を意味する。
【０１０１】
本明細書に使用される用語「予防薬」は、疾患の予防に、または疾患の再発または拡大の予防に使用される薬物を意味する。予防上有効な量は、過剰増殖性疾患（特に癌）の再発もしくは拡大、または過剰増殖性疾患の素因がある（例えば、遺伝的に癌の素因があるまたは先に発癌物質に曝された）患者におけるその発生、を予防するのに十分な、予防薬の量を意味しうる。予防上有効な量はまた、疾患の予防において予防上の利益を与える予防薬の量を意味してもよい。さらに、本発明の予防薬に関する予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える予防薬単独の、または他の薬物と組み合わせたときの量を意味する。本発明のFcγRIIB抗体の量との関連で用いる場合、この用語は、全体的な予防を改善する量、または他の予防薬（例えば、治療用抗体）の予防効力もしくは他の予防薬との相乗効果を高める量も包含しうる。ある特定の実施形態においては、用語「予防薬」はアゴニスト性FcγRIIB特異的抗体を意味する。他の実施形態においては、用語「予防薬」はアンタゴニスト性FcγRIIB特異的抗体を意味する。ある特定の他の実施形態においては、用語「予防薬」は癌化学療法剤、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法（例えば、免疫療法）、および／または本発明のFcγRIIB抗体を意味する。他の実施形態においては、２種以上の予防薬を組み合わせて投与することができる。
【０１０２】
本明細書に使用される用語「副作用」は、予防薬または治療薬の望ましくない有害作用を包含する。有害作用は常に望ましくないが、望ましくない作用が必ずしも不利ではない。予防薬または治療薬からの有害作用は有害または不快または危険でありうる。化学療法からの副作用としては、限定するものではないが、胃腸毒性、例えば、早期および後期形成性下痢および膨満、吐き気、嘔吐、摂食障害、白血球減少症、貧血、好中球減少、無力症、腹部けいれん、熱、尖痛、体重減少、脱水、脱毛症、呼吸困難、不眠症、めまい、粘膜炎、口内乾燥、および腎不全、ならびに便秘、神経および筋肉効果、腎および膀胱に対する一過性もしくは持続性障害、インフルエンザ様症状、体液うっ滞、および一過性もしくは持続性不妊症が挙げられる。放射線療法からの副作用としては、疲労、口渇、および食欲不振が挙げられる。生物学的療法／免疫療法による副作用としては、限定するものではないが、投与部位における発疹または腫脹、インフルエンザ様症状、例えば熱、悪寒および疲労、消化管の問題およびアレルギー反応が挙げられる。ホルモン療法の副作用としては、限定するものではないが、吐き気、不妊症の問題、うつ病、食欲不振、眼の問題、頭痛、および体重変動が挙げられる。患者が一般的に経験するさらなる望ましくない作用は数多くあり、当技術分野で公知である、例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるthe Physicians' Desk Reference（第56版、2002）を参照されたい。
【０１０３】
本明細書に使用される用語「一本鎖Fv」または「scFv」は、抗体のVHおよびVLドメインを含んでなる抗体フラグメントを意味し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、該FvポリペプチドはさらにVHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーを有し、上記リンカーはscFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。scFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore編. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。特定の実施形態においては、scFvは二重特異性scFvおよびヒト化scFvを含む。
【０１０４】
本明細書に使用される「被験者」および「患者」は互換的に使用される。本明細書に使用される被験者は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サルおよびヒト）などの哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０１０５】
本明細書に使用される「治療上有効な量」は、FcγRIIBに関連する疾患または障害およびFc受容体シグナル伝達経路の調節の低下に関係する疾患を治療または管理するために、または他の療法（例えば、治療用抗体、ワクチン療法または予防法など）の治療効力を高めるために十分な治療薬の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延または最小限にする、例えば癌の拡大を遅延または最小限にするために十分な治療薬の量を意味してもよい。治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える治療薬の量を意味してもよい。さらに、本発明の治療薬の治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える、例えば疾患を治療または管理するのに十分な治療用抗体の治療効力を高めるために十分な、治療薬単独の量、または他の治療薬と組み合わせたときの量を意味する。本発明のFcγRIIB抗体の量との関連で用いる場合、この用語は、全体的な治療を改善し、望まない作用を軽減するかまたは回避し、または他の治療薬の治療効力または他の治療薬との相乗作用を高める量を包含しうる。
【０１０６】
本明細書に使用される用語「治療」は、Fc受容体シグナル伝達経路における調節の低下に関係する疾患もしくは障害の症状を根絶、低減もしくは改善すること、または他の療法（例えば、治療用抗体、ワクチン療法もしくは予防）の治療効力を高めることを意味する。いくつかの実施形態においては、治療は１種以上の治療薬の投与に起因する原発性、局限性、または転移性癌の根絶、除去、改善、または制御を意味する。ある特定の実施形態においては、かかる用語は癌を患う被験者に１種以上の治療薬を投与することにより得られる癌の広がりの最小化もしくは遅延を意味する。他の実施形態においては、かかる用語は疾患の原因となる細胞の排除を意味する。
【０１０７】
本明細書に使用される用語「組み合わせて」は、２種以上の予防薬および／または治療薬の使用を意味する。用語「組み合わせて」の使用は、予防薬および／または治療薬を、疾患（例えば過増殖性細胞疾患、とりわけ癌）を患う被験者に投与する順序を制限しない。第１の予防または治療薬は、第２の予防または治療薬を投与する前（例えば1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、または12週前）に、投与すると同時に、または投与した後（例えば1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、または12週後）に、疾患に罹患した、罹患している、もしくは罹患しやすい被験者に投与することができる。予防薬または治療薬は、本発明の薬剤が他の薬剤と一緒に作用して、それらの薬剤を別のやり方で投与したときより向上した利益が得られるような順序でかつ時間間隔内で、被験者に投与する。どのような追加の予防薬または治療薬も、追加の他の予防薬または治療薬と共に任意の順序で投与しうる。
【０１０８】
４．図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については本明細書の最後に記載する。
【０１０９】
５．好ましい実施形態の説明
5.1  FcγRIIB特異的抗体
本発明は、FcγRIIA、好ましくはヒトFcγRIIA、さらに好ましくは天然ヒトFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIB、さらに好ましくは天然ヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）またはそのフラグメントを包含する。代表的な抗体は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国仮特許出願第2004/0185045号および米国仮出願第60/569,882号に開示されている。本発明は、癌、特にＢ細胞悪性腫瘍などの疾患、またはその１以上の症状の予防、治療、管理または改善における、FcγRIIB特異的抗体、その類似体、誘導体または抗原結合フラグメント（例えば、FcγRIIB特異的抗体の１以上の相補性決定領域（CDR））の使用を包含する。好ましくは本発明の抗体は、天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと結合する。ある特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合するよりも２倍、４倍、６倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、または108倍高い親和性でFcγRIIBと結合する。さらに他の実施形態においては、本発明は、当技術分野で公知のおよび本明細書に開示した標準的方法を用いてFcγRIIBともっぱら結合しかつFcγRIIAに対する親和性を有しないFcγRIIB抗体の使用を包含する。好ましい実施形態においては、抗体はヒトのものであるか、またはヒト化されている。
【０１１０】
さらに他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体はさらにFc活性化受容体、例えば、FcγIIIA、FcγIIIBなどと結合しない。一実施形態においては、本発明によるFcγRIIB特異的抗体はPulfordら, 1986, (Immunology, 57: 71-76)が開示したKB61と呼ばれるモノクローナル抗体またはWeinrichら, 1996, (Hybridoma, 15(2): 109-6)が開示したMAbII8D2と呼ばれるモノクローナル抗体ではない。特定の実施形態においては、本発明のFcγRIIB特異的抗体は、モノクローナル抗体KB61もしくはII8D2と同じエピトープと結合せず、かつ／またモノクローナル抗体KB61もしくはII8D2と結合について競合しない。好ましくは、本発明のFcγRIIB特異的抗体はFcγRIIb2アイソフォームの位置135-141に対応するアミノ酸配列SDPNFSIと結合しない。
【０１１１】
特定の実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントはFcγRIIBの少なくとも１つの活性にアゴニスト作用を示す。本発明の一実施形態においては、上記活性はＢ細胞受容体介在シグナル伝達の抑制である。他の実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体はＢ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、またはFcγRIIBシグナル伝達経路中の１以上の下流シグナル伝達分子の活性を抑制する。さらに他の実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体は、FcγRIIBのリン酸化またはSHIP動員を増大する。本発明のさらなる実施形態においては、アゴニスト性抗体はＢ細胞受容体介在シグナル伝達経路におけるMAPキナーゼ活性またはAkt動員を抑制する。他の実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体は、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIB介在抑制にアゴニスト作用を示す。特定の実施形態においては、上記抗体はFcεRIが誘導する肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を抑制する。他の実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体は、FcγRIIBのリン酸化を刺激し、SHIPの動員を刺激し、SHIPのリン酸化およびShcとのその会合を刺激し、またはMAPキナーゼファミリーメンバー（例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38など）の活性化を抑制する。さらに他の実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体はp62dokのチロシンリン酸化およびSHIPおよびrasGAPとのその会合を増大する。他の実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体は単球またはマクロファージのFcγR介在食作用を抑制する。
【０１１２】
他の実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIBの少なくとも1つの活性にアンタゴニスト作用を示す。一実施形態においては、上記活性はＢ細胞受容体介在シグナル伝達の活性化である。特定の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体は、Ｂ細胞活性、Ｂ細胞増殖、抗体産生、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における１以上の下流シグナル伝達分子の活性を増大する。さらに他の特定の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体はFcγRIIBのリン酸化またはSHIP動員を減少する。本発明のさらなる実施形態においては、アンタゴニスト性抗体はＢ細胞受容体介在シグナル伝達経路におけるMAPキナーゼ活性またはAkt動員を増大する。他の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体はFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB介在抑制にアンタゴニスト作用を示す。特定の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体はFcεRIが誘導する肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を増大する。他の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体はFcγRIIBのリン酸化を抑制し、SHIP動員を抑制し、SHIPリン酸化およびShcとのその会合を抑制し、MAPキナーゼファミリーメンバー（例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38など）の活性化を増大する。さらに他の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体はp62dokのチロシンリン酸化およびそのSHIPおよびrasGAPとのその会合を抑制する。他の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体は単球またはマクロファージのFcγR介在食作用を増大する。他の実施形態においては、本発明のアンタゴニスト性抗体は脾臓マクロファージによるオプソニン化粒子のクリアランス、食作用を防止する。
【０１１３】
他の実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントは１つの細胞集団を標的化するが、他の細胞集団を標的化しないように利用することができる。いずれの理論にも捉われないが、本発明者らは、FcγRIIBが好中球において従来考えられていたほど高濃度で発現されないことを発見した。高濃度の抗FcγRIIB抗体は好中球と反応する。しかし抗FcγRIIBの濃度が低下するともに好中球反応性は急速に消失する。低濃度の抗FcγRIIB抗体において、CD20＋Ｂ細胞との反応性は保存された。かくして、本発明の抗体と好中球との反応性を、好中球または血小板などの無関係な集団に影響を与えないように、低下させることができる。従って、本発明のある特定の実施形態においては、本発明の抗体はその標的集団を完全に認識するが、他の細胞を認識しないレベルで使用することができる。
【０１１４】
本発明の抗体には、限定するものではないが、モノクローナル抗体、合成抗体、組換えで作られた抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F（ab'）フラグメント、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、細胞内発現抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。特に、本発明の方法に使用される抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、免疫グロブリン分子がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子が含まれる。抗体類似体にはまた、FcγRIIB特異的Ｔ細胞受容体、例えばキメラＴ細胞受容体（例えば、米国特許出願公開第2004/0043401号を参照）、一本鎖抗体に連結された一本鎖Ｔ細胞受容体（例えば、米国特許第6,534,633号を参照）、およびタンパク質スカフォールド（例えば、米国特許第6,818,418号を参照）が含まれる。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体類似体はモノクローナル抗体でない。
【０１１５】
本発明の方法に使用される抗体は、鳥類および哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含むいずれの動物起源由来であってもよい。好ましくは、抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書に使用される「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーからまたはヒト遺伝子から抗体を発現するマウスから単離された抗体が含まれる。
【０１１６】
本発明の方法に使用される抗体は単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはさらに多重特異性でありうる。多重特異性抗体は、FcγRIIBの様々なエピトープと免疫特異的に結合してもよいし、またはFcγRIIBのエピトープならびに異種エピトープ（例えば異種ポリペプチドもしくは固相支持材料）の両方と免疫特異的に結合してもよい。例えば、国際公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793；Tutt,ら、1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号、第4,714,681,号、第4,925,6480号、第5,573,920号、および第5,601,819号；およびKostelnyら、1992, J. Immunol. 148:1547-1553；Todorovskaら、2001, Journal of Immunological Methods、248:47-66を参照されたい。
【０１１７】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は多重特異性であって、かかる抗体はFcγRIIBに対する特異性、および癌抗原に対するまたは、例えば特定の疾患もしくは障害を治療もしくは予防する上で死滅されるように設計された、細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞などの免疫細胞）に特異的な他のいずれかの細胞表面マーカーに対する特異性、あるいは他のFc受容体（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIIBなど）に対する特異性を備える。
【０１１８】
ある特定の実施形態においては、本発明の抗体は、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体から誘導される。抗体2B6および3H7を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection（10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209）に2002年8月13日、ブダペスト条約（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約）に基づいて寄託され、それぞれ受託番号PTA-4591（2B6を産生するハイブリドーマ）およびPTA-4592（3H7を産生するハイブリドーマ）と名付けられており、これらは本明細書に参照により組み入れられる。特定の実施形態においては、本発明は、配列番号28のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖をもつ抗体を包含する。ある好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒトのものであるか、またはヒト化されていて、好ましくはクローン3H7または2B6により産生される抗体のヒト化型である。
【０１１９】
本発明はまた、限定するものではないが、ATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960およびPTA-5959を持つクローン1D5、2El、2H9、2D11および1F2から誘導されたFcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIB、より好ましくは天然ヒトFcγRIIBと特異的に結合する他の抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用も包含する。上記の同定されたクローンを産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection（10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209）に2004年5月7日、ブダペスト条約に基づいて寄託されており、これらは本明細書に参照により組み入れられる。好ましい実施形態においては、上記抗体はキメラ化またはヒト化されている。
【０１２０】
特定の実施形態においては、本発明の方法に使用される抗体は、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するそれぞれクローン2B6または3H7により産生される抗体または該抗体の抗原結合フラグメント（例えば、１個以上の相補性決定領域（CDR）、好ましくは６個のCDRの全てを含んでなるもの、例えば重鎖CDR3を含む）である。特定の実施形態においては、本発明に使用される抗体は、ATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を持つそれぞれクローン1D5、2El、2H9、2D11、および1F2により産生される抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、１個以上の相補性決定領域（CDR）、好ましくは６個全てのCDRを含んでなるもの、例えば重鎖CDR3を含む）である。他の実施形態においては、本発明の方法に使用される抗体は、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を持つそれぞれクローン2B6または3H7から産生されるマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、かつ／または、ELISAアッセイもしくは他の適当な競合イムノアッセイにより測定して、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を持つそれぞれクローン2B6または3H7から産生されるマウスモノクローナル抗体と競合し、そしてまた、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと結合する。他の実施形態においては、本発明の方法に使用される抗体は、ATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を持つそれぞれクローン1D5、2El、2H9、2D11、および1F2から産生されるマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、かつ／または、ELISAアッセイもしくは他の適当な競合イムノアッセイにより測定して、ATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を持つそれぞれクローン1D5、2El、2H9、2D11、および1F2から産生されるマウスモノクローナル抗体と競合し、そしてまた、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと結合する。
【０１２１】
本発明はまた、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体またはそのフラグメントを包含する。本発明はさらに、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のCDRのアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％,または少なくとも99％同一である１以上のCDRのアミノ酸配列を含む上記抗体または抗体フラグメントを包含する。２つのアミノ酸配列の同一性％の決定は、BLASTタンパク質検索を含む当業者に公知のいずれかの方法により決定することができる。
【０１２２】
本発明はまた、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントの使用を包含し、ここで上記抗体または抗体フラグメントは、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる。好ましい実施形態においては、本発明はFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖および／または可変重鎖のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる可変軽鎖および／または可変重鎖を含んでなる、上記抗体または抗体フラグメントを提供する。他の好ましい実施形態においては、本発明はFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のCDRのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる１以上のCDRを含む、上記抗体またはそのフラグメントを提供する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定するものではないが、フィルターに結合したDNAとの6x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中での約45℃におけるハイブリダイゼーション、続いて0.2xSSC/0.1％SDS中での約50〜65℃における１回以上の洗浄が含まれ、高ストリンジェントな条件としては、例えばフィルターに結合したDNAとの6xSSC中での約45℃におけるハイブリダイゼーション、続いて0.1xSSC/0.2％SDS中での約60℃における１回以上の洗浄が含まれ、他のストリンジェントな条件は当業者に公知である（例えば、本明細書に参照により組み入れられるAusubel, F. M.ら, 編 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol.1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY、6.3.1-6.3.6および2.10.3頁を参照）。
【０１２３】
抗体の定常ドメインは、提案された抗体機能について、特に、必要とされるエフェクター機能について選択することができる。いくつかの実施形態においては、抗体の定常ドメインはヒトIgA、IgE、IgGまたはIgMドメインである。
【０１２４】
本発明の方法に使用される抗体には、改変された、すなわち任意のタイプの分子と抗体との共有結合により改変された、誘導体が含まれる。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより改変されている抗体が含まれる。多数の化学的修飾のいずれかを公知技法により実施してもよく、それらの技法には、限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれる。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含有することができる。
【０１２５】
さらに、本発明の抗体は、当業者に周知の技術を利用して抗イディオタイプ抗体を作製するために利用することができる（例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7: 437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438を参照）。本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を採用する方法を提供する。
【０１２６】
本発明は、ラクダ化単一ドメイン抗体を含めて、単一ドメイン抗体を包含する（例えば、Muyldermansら, 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230；Nuttallら, 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253；ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開第WO 94/04678号および第WO 94/25591号；米国特許第6,005,079号を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。一実施形態においては、本発明は単一ドメイン抗体を形成するような改変を伴う２つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【０１２７】
本発明の方法はまた、半減期（例えば、血清半減期）が哺乳動物（好ましくはヒト）において15日より長い、好ましくは20日より長い、25日より長い、30日より長い、35日より長い、40日より長い、45日より長い、2ヶ月より長い、3ヶ月より長い、4ヶ月より長い、または5ヶ月より長い抗体またはそのフラグメントの使用も包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体またはそのフラグメントのより長い半減期は、哺乳動物における上記抗体または抗体フラグメントのより高い血清抗体価をもたらし、従って、上記抗体または抗体フラグメントの投与回数を減らし、かつ／または投与すべき上記抗体または抗体フラグメントの濃度を低下させる。in vivo半減期の増加した抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術により作製することができる。例えば、in vivo半減期の増加した抗体またはそのフラグメントは、FcドメインとFcRn受容体の間の相互作用に関わることが同定されているアミノ酸残基を改変する（例えば、置換、欠失または付加する）ことにより作製することができる。本発明の抗体は、Wardら（米国特許第6,277,375 B1号を参照）に記載された生物学的半減期を増加する方法により操作しうる。例えば、本発明の抗体は、in vivoまたは血清半減期が増加するように、Fc-ヒンジドメインにおいて操作することができる。
【０１２８】
in vivo半減期の増加した抗体またはそのフラグメントは、抗体または抗体フラグメントにポリマー分子、例えば高分子量ポリエチレングリコール（PEG）を結合することにより作製することができる。PEGは上記抗体または抗体フラグメントに、多機能性リンカーを用いてまたは用いないで、PEGと上記抗体または抗体フラグメントのN-またはC-末端との部位特異的コンジュゲーションにより、またはリシン残基上のε-アミノ基を介して、結合させることができる。生物学的活性の最小限の低下をもたらす直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化が使用されるだろう。コンジュゲーションの程度をSDS-PAGEおよび質量分析により厳重にモニターして、PEG分子と抗体の適正なコンジュゲーションを確実にする。未反応PEGは抗体-PEGコンジュゲートから、例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより、分離することができる。
【０１２９】
本発明の抗体はまた、実質的に免疫原性応答を伴うことなく哺乳動物循環系中に注入できる組成物を得るために、Davisら（米国特許第4,179,337号を参照）に記載される方法およびカップリング剤により改変することができる。
【０１３０】
本発明はまた、フレームワークまたはCDR領域に突然変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）をもつ本発明の抗体のいずれかのアミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの使用も包含する。好ましくは、これらの抗体の突然変異は、それらが免疫特異的に結合するFcγRIIIBに対する抗体の結合力および／または親和性を維持するかまたは増大させる。当業者に公知の標準技法（例えば、イムノアッセイ）を用いて特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１３１】
本発明はさらに、本明細書に開示したまたは当技術分野で公知の方法を用いて抗体の糖鎖含量を改変することを含む、本発明の抗体のエフェクター機能を改変する方法を包含する。
【０１３２】
当業者に公知の標準技法を用いて抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができ、上記技術としては、例えばアミノ酸置換をもたらす位置指定突然変異誘発およびPCRを介する突然変異誘発が挙げられる。好ましくは、その誘導体は、もとの抗体またはそのフラグメントに対して、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、2個未満のアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態においては、該誘導体は１個以上の推定上の非必須アミノ酸残基においてなされる保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３３】
ヒトにおける抗体のin vivo用途およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの用途では、ヒト、キメラまたはヒト化抗体を使用することが好ましい。完全なヒト抗体がヒト被験者の治療処置には特に所望される。ヒト抗体は当技術分野で知られる様々な方法により作ることができ、それには、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法が含まれる。また米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；および国際公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照されたい；これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１３４】
5.1.1  ヒト化抗体
好ましい実施形態においては、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、所定の抗原と結合することができ、かつ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワークおよび実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するCDRを含む抗体、その変異体またはフラグメントである。ヒト化FcγRIIB特異的抗体は、全てのまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のCDR領域に対応し、かつ全てのまたは実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的に全てを含むものである。好ましくは、本発明のヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の一部分も含む。本発明のヒト化抗体の定常ドメインは、提案された抗体機能、特に必要とされるエフェクター機能、について選択することができる。いくつかの実施形態においては、抗体の定常ドメインはヒトIgA、IgE、IgGまたはIgMドメインである。特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体が治療を目的としておりかつ抗体のエフェクター機能が必要とされる場合には、ヒトIgG定常ドメイン、とりわけIgG1およびIgG3アイソタイプの定常ドメインを使用する。代わりの実施形態において、本発明のヒト化抗体が治療を目的としており、かつ抗体のエフェクター機能が必要とされない場合には、IgG2およびIgG4アイソタイプを使用する。ヒト化FcγRIIB特異的抗体は、2004年5月10日および2004年6月21日にそれぞれ出願された米国特許出願第60/569,882号および第60/582,043号に開示されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態においては、該抗体は軽鎖ならびに少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。他の実施形態においては、該抗体はさらに、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含んでもよい。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含むいずれかのクラスの免疫グロブリン、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むいずれかのアイソタイプから選択することができる。いくつかの実施形態においては、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが望まれる場合は補体結合定常ドメインであり、かつクラスは典型的にはIgG1である。他の実施形態において、かかる細胞傷害活性が望ましくない場合は、定常ドメインはIgG2クラスのものでありうる。ヒト化抗体は２種以上のクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは当技術分野の通常の技量の範囲内である。
【０１３６】
ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナーCDRまたは共通フレームワークを少なくとも1つの残基の置換、挿入または欠失により突然変異誘発させて、その部位のCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたはドナー抗体に一致しないようにしてもよい。しかし、かかる突然変異は広範囲でないことが好ましい。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは95％以上が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列の残基に一致するであろう。ヒト化抗体は当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができ、それらの方法としては、限定するものではないが、CDRグラフト化（欧州特許EP 239,400；国際公開WO 91/09967；および米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）または露出表面残基のヒト化（resurfacing）（欧州特許EP592,106およびEP519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7 (6):805-814；およびRoguskaら, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973）、チェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）、および以下の刊行物に開示された技法を含む：例えば、米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公開WO 9317105、Tanら, 2002, J. Immunol. 169:1119-25、Caldasら, 2000, Protein Eng. 13:353-60、Moreaら, 2000, Methods 20:267-79、Bacaら, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguskaら, 1996, Protein Eng. 9:895-904、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu, 1994, Gene 150:409-10、Pedersenら, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73、Jonesら, 1986, Nature 321:522-525、Riechmannら, 1988, Nature 332:323、ならびにPresta, 1992, Curr. OP. Struct. Biol. 2:593-596。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基をCDRドナー抗体からの対応する残基で置換して、抗原結合を改変しうる（好ましくは改善しうる）。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により同定され、例えばCDRおよびフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を確認し、そして配列比較を行って特定位置の普通でないフレームワーク残基を確認することにより同定する（例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号；米国公開第2004/0049014号および第2003/0229208号；米国特許第6,350,861号；第6,180,370号；第5,693,762号；第5,693,761号；第5,585,089号および第5,530,101号；ならびにRiechmannら, 1988, Nature 332:323を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０１３７】
本発明は、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域の１以上のCDRの１以上の領域がFcγRIIAよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するそれぞれクローン2B6または3H7により産生されたモノクローナル抗体）の１以上のCDRの類似部分により置換されている、FcγRIIBに特異的なヒト化抗体分子の使用を提供する。他の実施形態においては、ヒト化抗体は2B6または3H7と同じエピトープに結合する。最も好ましい実施形態においては、ヒト化抗体はドナーマウス抗体と同じエピトープに特異的に結合する。当業者は本発明が一般に抗体のCDRグラフト化を包含することを理解するであろう。従って、ドナーおよびアクセプター抗体は同じ種の動物から誘導することができ、同じ抗体クラスまたはサブクラスからさえ誘導してもよい。しかし通常は、ドナーおよびアクセプター抗体は異なる種の動物から誘導されることが多い。典型的にはドナー抗体はげっ歯類MAbなどの非ヒト抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【０１３８】
いくつかの実施形態においては、少なくとも1つのドナー抗体からのCDRをヒト抗体にグラフトする。他の実施形態においては、重鎖および／または軽鎖可変領域のそれぞれの少なくとも２つ、好ましくは３つ全てのCDRをヒト抗体にグラフトする。CDRはKabatのCDR、構造ループCDRまたはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも1つのCDRをグラフトした重鎖および少なくとも1つのCDRをグラフトした軽鎖を含んでなるヒト化FcγRIIB抗体を包含する。
【０１３９】
ある好ましい実施形態においては、ヒト化FcγRIIB特異的抗体のCDR領域をFcγRIIBに特異的なマウス抗体から誘導する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヒト化抗体は、アクセプター抗体（すなわち、ドナーモノクローナル抗体の結合特性を保持するために必要であるヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域）の改変（アミノ酸の欠失、挿入、改変を含むがこれらに限らない）を含むものである。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載したヒト化抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然のヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列からなる必要はなく、様々な改変を含むものであって、かかる改変には、限定するものではないが、ヒト化抗体の特性を改変する（例えば、マウスFcγRIIB特異的抗体と同じ標的に対して特異的であるヒト化抗体領域の結合特性を改善する）アミノ酸欠失、挿入、改変が含まれる。最も好ましい実施形態においては、非ヒトフレームワーク残基の大規模導入を回避しかつヒトにおけるヒト化抗体の最小限の免疫原性を確実なものにするため、フレームワークに対して最小数の改変を行う。ドナーモノクローナル抗体は、好ましくはFcγRIIBと結合するクローン2B6および3H7（それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有する）により産生されたモノクローナル抗体である。
【０１４０】
特定の実施形態においては、本発明はFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するCDRグラフト抗体の使用を包含し、ここで上記CDRグラフト抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、クローン2B6および3H7から産生されたモノクローナル抗体）からの残基と、を含む重鎖可変領域ドメインを含んでなる。他の特定の実施形態においては、本発明はFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するCDRグラフト抗体の使用を包含し、ここで上記CDRグラフト抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、クローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2から産生されたモノクローナル抗体）からの残基と、を含む軽鎖可変領域ドメインを含んでなる。
【０１４１】
好ましくは、ヒト化抗体は天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと結合する。本発明のヒト化抗FcγRIIB抗体は、CDR1（配列番号1または配列番号29）および／またはCDR2（配列番号2または配列番号30）および／またはCDR3（配列番号3または配列番号31）のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域、および／またはCDR1（配列番号8または配列番号38）および／またはCDR2（配列番号9、配列番号10、配列番号11、または配列番号39）および／またはCDR3（配列番号12または配列番号40）のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域を有する。
【０１４２】
特定の実施形態においては、本発明はＢ細胞悪性腫瘍または１以上のその症状の予防、治療、管理または改善における2B6または3H7のCDRを含むヒト化抗体の使用を包含する。特に、配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号18、配列番号20または配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインをもつ抗体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または１以上のその症状の予防、治療、管理または改善に使用される。特定の実施形態においては、本発明は配列番号37のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインをもつヒト化抗体の、Ｂ細胞悪性腫瘍または１以上のその症状の予防、治療、管理または改善における使用を包含する。さらに他の好ましい実施形態においては、ヒト化抗体はさらにFc活性化受容体、例えばFcγIIIA、FcγIIIBなどとは結合しない。
【０１４３】
ある特定の実施形態においては、VH領域がヒト生殖系VHセグメントからのFRセグメントVH1-18（Matsudaら, 1998, J. Exp. Med. 188:2151062）およびJH6（Ravetchら, 1981, Cell 27(3 Pt. 2): 583-91）と、配列番号1、配列番号2、または配列番号3のアミノ酸配列を有する2B6 VHの１以上のCDR領域とからなる、ヒト化2B6抗体を提供する。一実施形態においては、2B6 VHは配列番号24のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態では、ヒト化2B6抗体はさらにVL領域を含んでなり、このVL領域はヒト生殖系VLセグメントのFRセグメントVK-A26（Lautner-Rieskeら, 1992, Eur. J. Immunol. 22:1023-1029）およびJK4（Hieterら, 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22）と、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、および配列番号12のアミノ酸配列を有する2B6 VLの１以上のCDR領域からなる。一実施形態においては、2B6 VLは配列番号18、配列番号20、または配列番号22のアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
他の特定の実施形態においては、VH領域がヒト生殖系VHセグメントからのFRセグメントと配列番号37のアミノ酸配列を有する3H7 VHのCDR領域とからなるヒト化3H7抗体を提供する。他の特定の実施形態においては、ヒト化3H7抗体はさらに、ヒト生殖系VLセグメントのFRセグメントと配列番号46のアミノ酸配列を有する3H7 VLのCDR領域からなるVL領域を含んでなる。
【０１４５】
特に、天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと免疫特異的に結合するヒト化抗体であって、2B6または3H7のCDR配列を次の組み合わせのいずれかを含む（あるいは、からなる）上記抗体を提供する：VH CDR1およびVL CDR1；VH CDR1およびVL CDR2；VH CDR1およびVL CDR3；VH CDR2およびVL CDR1；VH CDR2およびVL CDR2；VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR3およびVH CDR1；VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR3およびVL CDR3；VHl CDR1、VH CDR2およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3；または本明細書に開示したVH CDRおよびVL CDRの任意の組合せ。
【０１４６】
5.1.2  ヒト抗体
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生産することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を無作為にまたは相同組換えによりマウス胚性幹細胞中に導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞中に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによりヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより、別々にまたは同時に非機能性にすることができる。特にJH領域のホモ接合性欠失は内因性抗体の産生を阻止する。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作出する。次いでキメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作る。通常の手法によりトランスジェニックマウスを選択した抗原（例えば本発明のポリペプチドの全部または一部）により免疫感作する。抗原に対するモノクローナル抗体は免疫化トランスジェニックマウスから通常のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞分化中に再配列し、次いでクラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このような技術を用いると、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を生産することが可能である。このヒト抗体を生産する技法の概要については、LonbergおよびHuszar（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産する技法ならびにこのような抗体を生産させるプロトコルの詳細な考察については、例えば、国際公開WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735；および米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号を参照されたい。これらの特許は参照により本明細書にその全文が組み入れられる。さらに、Abgenix社（Freemont、CA）やMedarex社（Princeton、NJ）などの会社は、上述した技法と同様の技法を用いて、選択した抗原に対するヒト抗体の供給を請け負うことができる。
【０１４７】
5.1.3  キメラ抗体
キメラ抗体は、その抗体の様々な部分が異なる免疫グロブリン分子から誘導された分子であり、例えば、非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体である。本発明は、ATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するそれぞれ2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2のキメラ抗体を提供する。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202；Oiら, 1986, BioTechniques 4:214；Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；および米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号を参照のこと、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。非ヒト種からの１以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を含むキメラ抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製でき、それらの技術には、例えばCDR-グラフト化（EP 239,400；国際公開WO 91/09967；および米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）または露出表面残基のヒト化（resurfacing）（EP 592,106；EP519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7:805；およびRoguskaら, 1994, PNAS 91:969）、およびチェーンシャフリング（chain shuffling）（米国特許第5,565,332号）が含まれる。上記の参考文献は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１４８】
しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換して、抗原結合を改変しうる（好ましくは改善しうる）。これらのフレームワーク置換は当技術分野で周知の方法により同定され、例えば、CDRおよびフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を確認し、配列比較を行って特定位置の普通でないフレームワーク残基を確認することにより同定する（例えば、米国特許第5,585,089号；およびRiechmannら, 1988, Nature 332:323を参照のこと、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０１４９】
5.1.4  Fc領域の改変
本発明は、米国特許出願公開第2005/0037000号および第2005/0064514号；米国特許第5,624,821号および第5,648,260号ならびに欧州特許第EP 0 307 434号（これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に開示されたような、抗体エフェクター機能を変える１以上のアミノ酸改変を含んでなるFc定常ドメインを有する抗体を包含する。これらの抗体は、アミノ酸改変のない匹敵する抗体と比較して、改善されたADCC活性（すなわち、2倍、10倍、100倍、500倍など）を示しうる。
【０１５０】
本発明は、１以上のFcγRに対する抗体の結合親和性を改変する、好ましくはFc領域の、改変を含んでなる抗体を包含する。１以上のFcγRに対する結合が改変された抗体に改変する方法は、当技術分野で公知であり、例えばPCT公開WO 04/029207、WO 04/029092、WO 04/028564、WO 99/58572、WO 99/51642、WO 98/23289、WO 89/07142、WO 88/07089、ならびに米国特許第5,843,597号および第5,642,821号を参照されたい；これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。いくつかの実施形態においては、本発明は、活性化FcγR（例えばFcγRIIIA）に対して改変された親和性を有する抗体を包含する。好ましくは、かかる改変はまた、改変されたFc介在エフェクター機能を有する。Fc介在エフェクター機能に影響を与える改変は当技術分野で公知である（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国特許第6,194,551号を参照のこと）。本発明の方法に従って改変され得るアミノ酸としては、限定するものではないが、プロリン329、プロリン331、およびリシン322が挙げられる。プロリン329、プロリン331およびリシン322はアラニンと置換することが好ましいが、いずれか他のアミノ酸による置換も考えられる。国際公開WO 00/42072および米国特許第6,194,551号を参照されたい；これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１５１】
ある特定の実施形態においては、Fc領域の改変はFc領域に１以上の突然変異を含む。Fc領域の１以上の突然変異は、抗体介在性エフェクター機能の改変、他のFc受容体（例えば、Fc活性化受容体）との結合の改変、ADCC活性の改変、またはC1q結合活性の改変、または補体依存性細胞傷害活性の改変、またはそれらのいずれかの組合せをもつ抗体をもたらす。いくつかの実施形態においては、本発明はアミノ酸改変を次の1以上の位置に有する変異型Fc領域を含んでなる分子を包含する：119、125、132、133、141、142、147、149、162、166、185、192、202、205、210、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、227、229、231、232、233、235、240、241、242、243、244、246、247、248、250、251、252、253、254、255、256、258、261、262、263、268、269、270、272、274、275、276、279、280、281、282、284、287、288、289、290、291、292、293、295、298、301、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、315、316、317、318、319、320、323、326、327、328、330、333、334、335、337、339、340、343、344、345、347、348、352、353、354、355、358、359、360、361、362、365、366、367、369、370、371、372、375、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、404、406、407、408、409、410、411、412、414、415、416、417、419、420、421、422、423、424、427、428、431、433、435、436、438、440、441、442、443、446、または447。Fc部分の遺伝子操作は、腫瘍細胞の細胞介在死滅および／または補体介在死滅の増加をもたらすことが好ましい。
【０１５２】
本発明は、以下の表２に掲げた突然変異のいずれかから成るか、またはいずれかを含む変異型Fc領域を含んでなる分子を包含する。
【表２】
2007532139.tif 000004
2007532139.tif 000005
2007532139.tif 000006
【０１５３】
さらに他の実施形態においては、本発明は３以上のアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含する。かかる変異体の非限定的な例を以下の表３に示す。本発明は、本明細書に開示したような１以上のアミノ酸改変をさらに含んでなる表３に示した突然変異体を包含する。
【表３】
2007532139.tif 000007
2007532139.tif 000008
2007532139.tif 000009
【０１５４】
特定の実施形態においては、変異型Fc領域は、ロイシンを247位に、リシンを421位に、およびグルタミン酸を270位に（MgFc31/60）；トレオニンを392位に、ロイシンを396位に、およびグルタミン酸を270位に（MgFc38/60）；トレオニンを392位に、ロイシンを396位に、グルタミン酸を270位に、およびロイシンを243位に（MgFc38/60/F243L）；ヒスチジンを419位に、ロイシンを396位に、およびグルタミン酸を270位に（MGFc51/60）；ヒスチジンを419位に、ロイシンを396位に、グルタミン酸を270位に、およびロイシンを243位に（MGFc51/60/F243L）；リシンを255位に、およびロイシンを396位に（MgFc55）；リシンを255位に、ロイシンを396位に、およびグルタミン酸を270位に（MGFc55/60）；リシンを255位に、ロイシンを396位に、グルタミン酸を270位に、およびリシンを300位に（MGFC55/60/Y300L）；リシンを255位に、ロイシンを396位に、グルタミン酸を270位に、およびロイシンを243位に（MgFc55/60/F243L）；グルタミン酸を370位に、ロイシンを396位に、およびグルタミン酸を270位に（MGFc59/60）；グルタミン酸を270位に、アスパラギン酸を316位に、およびグリシンを416位に（MgFc71）；ロイシンを243位に、プロリンを292位に、イソロイシンを305位に、およびロイシンを396位に（MGFc74/P396L）；グルタミンを297位に有するか、または個々の置換のいずれかの組合せを有する。
【０１５５】
5.1.5  糖鎖の改変
本発明はまた、オリゴ糖含量が改変されている抗体を提供する。本明細書に使用されるオリゴ糖は、２以上の単糖類を含有する糖鎖を意味し、本明細書においてこれらの２つの用語は互換的に使用することができる。本発明の糖鎖部分は、当技術分野で一般的に使用される命名法で記載される。糖鎖化学の総説については、例えば、Hubbardら, 1981 Ann. Rev. Biochem., 50:555-583を参照されたい；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。この命名法では、例えば、Manはマンノースを表し；GlcNacは2-N-アセチルグルコサミンを表し；Galはガラクトースを表し；Fucはフコースを表し、そしてGlcはグルコースを表す。シアル酸は短縮記号により記載され、NeuNAcは5-N-アセチルノイラミン酸、そしてNeuNGcは5-グリコールノイラミン酸を表す。
【０１５６】
一般的に、抗体は糖鎖成分を重鎖定常領域の保存された位置に含有し、ヒトIgGの最大30％はグリコシル化Fab領域を有する。IgGはCH2ドメインに存在するAsn297に単一のＮ結合バイアンテナ型糖鎖（biantennary carbohydrate）構造を有する（Jefferisら, 1998, Immunol. Rev. 163:59-76；Wrightら, 1997, Trends Biotech 15:26-32）。ヒトIgGは典型的には次の構造の糖鎖を有する：GlcNAc(フコース)-GlcNAc-Man-(ManGlcNAc)2。しかし、IgG間で糖鎖含量の変動が起こり、これが機能の変化をもたらす。例えば、Jassalら, 2001 Bichem. Biophys. Res. Commun. 288:243-9；Groeninkら, 1996 J. Immunol. 26:1404-7；Boydら, 1995 Mol. Immunol. 32:1311-8；Kumpelら, 1994, Human Antibody Hybridomas, 5: 143-51を参照されたい。本発明は、Asn297に結合した糖鎖成分に変化のある抗体を包含する。一実施形態においては、その糖鎖成分はガラクトースおよび／またはガラクトース-シアル酸を一方または両方の末端GlcNAcおよび／または第３GlcNacアーム（GlcNacを二分する）に有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は１以上の選択された糖基、例えば１以上のシアル酸残基、１以上のガラクトース残基、１以上のフコース残基を実質的に含まない。１以上の選択された糖基を実質的に含まない抗体は、当業者に公知の通常の方法を用いて作製することができ、例えば、所定の糖基を抗体の糖鎖成分に付加する能力を欠く宿主細胞中で本発明の抗体を組換えにより産生させ、それにより組成物中の抗体の約90〜100％が糖鎖成分に結合された所定の糖基を欠くようにする。かかる抗体を調製するための代替方法は、例えば、１以上の所定の糖基の付加を防止するかまたは低下させる条件のもとで細胞を培養するか、または１以上の所定の糖基を翻訳後除去することを含む。
【０１５８】
特定の実施形態においては、本発明は、組成物中の抗体の約80〜100％がその糖鎖成分上にフコースを欠いている、例えばAsn297上にその糖鎖結合を欠いている、実質的に均一な抗体調製物を製造する方法を包含する。該抗体は、例えば、(a)フコース代謝に欠陥があり、発現されたタンパク質をフコシル化する能力の低下した、遺伝子操作宿主細胞を使用し；(b)フコシル化を防止または低減する条件のもとで該細胞を培養し；(c)例えばフコシダーゼ酵素を用いて、フコースを翻訳後除去する；または(d)フコシル化されていない産物を選択するように抗体を精製する、ことにより製造することができる。最も好ましくは、所望の抗体をコードする核酸を、そこに発現された抗体をフコシル化する能力の低下した宿主細胞において発現させる。好ましい宿主細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、例えば、Lec13 CHO細胞（レクチン耐性CHO突然変異細胞株；Ribka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1):51-62；Ripkaら, 1986 Arch. Biochem. Biophys. 249(2):533-45）、CHO-K1、DUX-B11、CHO-DP12またはCHO-DG44であり、これらは抗体を実質的にフコシル化しないように改変されている。かくして、細胞は、酵素が細胞中で低減した活性および／または低下した発現レベルを有するように、フコシルトランスフェラーゼ酵素の、またはフコースをＮ結合オリゴ糖へ付加するのに関わる他の酵素もしくは基質の、改変された発現および／または活性を示しうる。フコース含量の変化した抗体を製造する方法については、例えば、WO 03/035835およびShieldsら, 2002, J. Biol. Chem. 277 (30):26733-40を参照のこと；両方とも本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態においては、改変された糖鎖修飾は、１以上の次のことをモジュレートする：抗体の可溶化、抗体の細胞下輸送および分泌の促進、抗体アセンブリーの促進、立体配置の完全性、および抗体介在性エフェクター機能。特定の実施形態においては、改変された糖鎖修飾は、糖鎖修飾を欠く抗体と比較して、抗体介在性エフェクター機能を高める。抗体介在性エフェクター機能の変化をもたらす糖鎖修飾は当技術分野で周知である（例えば、Shields R. L.ら, 2001, J. Biol. CHEM. 277(30):26733-40；Davies J.ら, 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74(4):288-294を参照）。他の特定の実施形態においては、改変された糖鎖修飾は本発明の抗体とFcγRIIB受容体との結合を増大する。本発明の方法による糖鎖修飾の改変には、例えば、抗体の糖鎖含量の増加または抗体の糖鎖含量の減少が含まれる。糖鎖含量を改変する方法は当業者に公知であり、例えば、Wallickら, 1988, Journal of Exp. Med. 168(3):1099-1109；Taoら, 1989 Journal of Immunology, 143(8):2595-2601；Routledgeら, 1995 Transplantation, 60(8):847-53 ；Elliottら 2003; Nature Biotechnology, 21:414-21；Shieldsら 2002 Journal of Biological Chemistry, 277(30):26733-40を参照のこと；これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１６０】
いくつかの実施形態においては、本発明は、１以上のグリコシル化部位を含む抗体を包含し、１以上の糖鎖成分は抗体と共有結合している。他の実施形態においては、本発明はFc領域に１以上のグリコシル化部位および１以上の修飾を含む抗体を包含し、かかる抗体は先に開示され、また当業者に公知である。好ましい実施形態では、Fc領域の１以上の修飾は、野生型Fc領域を含む抗体と比較して、活性化性FcγR（例えば、FcγRIIIA）に対する抗体の親和性を高める。Fc領域に１以上のグリコシル化部位および／または１以上の修飾をもつ本発明の抗体は増大した抗体介在性エフェクター機能、例えば増大したADCC活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明はさらに抗体の糖鎖成分と直接的にまたは間接的に相互作用することがわかっているアミノ酸の１以上の修飾を含む抗体を包含し、それらのアミノ酸は、限定するものではないが、位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299、および301のアミノ酸を含む。抗体の糖鎖成分と直接的にまたは間接的に相互作用するアミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、Jefferisら, 1995 Immunology Letters, 44:111-7を参照されたい；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１６１】
本発明は、１以上のグリコシル化部位を抗体の１以上の部位に導入することにより、好ましくは抗体の機能性（例えば、FcγRIIBとの結合活性）を変化させることなく、改変されている抗体を包含する。グリコシル化部位を本発明の抗体の可変領域および／または定常領域に導入することができる。本明細書に使用される「グリコシル化部位」には、オリゴ糖（すなわち、互いに連結された２以上の単糖を含有する糖鎖）が特異的に共有結合する、抗体中のいずれか特定のアミノ酸配列が含まれる。オリゴ糖側鎖は典型的には抗体主鎖とＮまたはＯ結合のいずれかにより連結される。Ｎ結合グリコシル化はオリゴ糖成分がアスパラギン残基の側鎖と結合していることを意味する。Ｏ結合グリコシル化はオリゴ糖成分がヒドロキシアミノ酸、例えばセリン、トレオニンと結合していることを意味する。本発明の抗体は、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化部位を含めて、１以上のグリコシル化部位を含みうる。当技術分野で公知のＮ結合またはＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位も本発明に従って利用できる。本発明の方法に従って有用なＮ結合グリコシル化部位の例は、アミノ酸配列：Asn-X-Thr/Ser（ここで、Xは任意のアミノ酸であり、Thr/Serはトレオニンまたはセリンを示す）である。このような部位は、本発明が関わる技術分野で周知の方法を用いて、本発明の抗体に導入することができる。例えば、"In Vitro Mutagenesis" Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson,ら W. H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp.106-116を参照されたい；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。本発明の抗体にグリコシル化部位を導入するための代表的な方法は、所望のAsn-X-Thr/Ser配列が得られるように抗体のアミノ酸配列を改変するか、または突然変異させることを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態においては、本発明はグリコシル化部位を加えるかまたは欠失することにより本発明の抗体の糖鎖含量を改変する方法を包含する。抗体の糖鎖含量を改変する方法は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第6,218,149号；EP 0 359 096 B1；米国公開US 2002/0028486；WO 03/035835；米国公開US 2003/0115614；米国特許第6,218,149号；米国特許第6,472,511号を参照されたい；これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。他の実施形態においては、本発明は本発明の抗体の糖鎖含量を抗体の１以上の内在性糖鎖成分を欠失させることにより改変する方法を包含する。
【０１６３】
いくつかの特定の実施形態において、本発明は、CDR2領域のＮグリコシル化コンセンサス部位Asn50-Val-Serが改変されて50位のグリコシル化が排除されている、改変されたFcγRIIB抗体の使用を包含する。特定の作用機構に捉われるものでないが、グリコシル化部位の除去は、抗体生産におけるの潜在的変動ならびに医薬用途における潜在的免疫原性を限定しうる。特定の実施形態においては、本発明は、50位のアミノ酸が改変された（例えば、欠失または置換された）ヒト化FcγRIIB抗体の使用を包含する。他の特定の実施形態においては、本発明はさらに、51位にアミノ酸改変（例えば、欠失または置換）を有する抗体の使用を包含する。ある特定の実施形態において、本発明は、50位のアミノ酸がチロシンで置き換えられたヒト化FcγRIIB抗体の使用を包含する。他のさらに特定の実施形態においては、本発明は、50位のアミノ酸がチロシンで置き換えられかつ51位のアミノ酸がアラニンで置き換えられたFcγRIIB抗体の使用を包含する。
【０１６４】
5.1.6  FcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニスト
FcγRIIB特異的抗体、その類似体、誘導体、または抗原結合フラグメントの本発明の方法および組成物における使用に加えて、他のFcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニストを本発明の方法に従って使用することができる。FcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニストとしては、限定するものではないが、免疫細胞（好ましくはＢ細胞）により発現されるFcγRIIBポリペプチドの機能、活性および／または発現をブロック、抑制、低減または中和する、タンパク質性分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド（例：可溶性FcγRIIBポリペプチド））、ペプチド、融合タンパク質（例えば、治療用成分にコンジュゲートされた可溶性FcγRIIBポリペプチド）、核酸分子（例えば、FcγRIIBアンチセンス核酸分子、三重らせん、RNAiを媒介するdsRNA、またはタンパク質性分子をコードする核酸分子）、有機分子、無機分子、小有機分子、薬物、および小無機分子が挙げられる。いくつかの実施形態においては、本発明の方法によって使用するFcγRIIBアゴニストまたはアンタゴニストは小有機分子、薬物またはアンチセンス分子でない。FcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニストは当技術分野で周知のまたは本明細書に記載の技法を用いて同定することができる。
【０１６５】
本発明の予防用および治療用化合物としては、限定するものではないが、タンパク質性分子、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質（翻訳後修飾されたタンパク質を含む）、抗体など；小分子（1000ダルトン未満）、無機または有機化合物；核酸分子、例えば、二本鎖または一本鎖DNA、二本鎖または一本鎖RNA、３重らせん核酸分子が挙げられる。予防用および治療用化合物は、いずれの公知の生物（限定するものではないが、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む）由来または合成分子のライブラリー由来のものであってもよい。
【０１６６】
ある特定の実施形態においては、FcγRIIBアンタゴニストはＢ細胞悪性腫瘍を患う被験者におけるFcγRIIBポリペプチドの機能、活性および／または発現を低下させる。他の実施形態においては、FcγRIIBアンタゴニストはFcγRIIBポリペプチドと直接結合し、Ｂリンパ球の活性および／または機能を直接または間接にモジュレートする。特定の実施形態では、FcγRIIBアンタゴニストはＢ細胞悪性腫瘍を患う被験者におけるＢ細胞増殖を、本明細書に記載のまたは当業者に周知の標準的なin vivoおよび／またはin vitroアッセイにより測定して、抑制するかまたは低下させる。特定の実施形態においては、FcγRIIBアンタゴニストは、本明細書に記載のまたは当業者に周知の標準的なin vivoおよび／またはin vitroアッセイにより測定して、Ｂ細胞悪性腫瘍を患う被験者におけるリンパ球、特に末梢血Ｂ細胞の枯渇を媒介する。他の実施形態においては、FcγRIIBアンタゴニストは抗体依存性細胞傷害（ADCC）を利用することによりＢリンパ球の活性および／または機能を直接または間接にモジュレートする。
【０１６７】
好ましい実施形態においては、FcγRIIBアンタゴニストとして利用するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（抗体および融合タンパク質を含む）は、これらのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対する免疫反応の可能性を少なくするために、該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのレシピエントと同じ生物種に由来するものである。他の好ましい実施形態においては、被験者がヒトであるとき、FcγRIIBアンタゴニストとして利用するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドはヒト由来であるか、またはヒト化されている。
【０１６８】
FcγRIIBアンタゴニストとして機能するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸分子は、本発明の方法に従って、Ｂ細胞悪性腫瘍を患う被験者に投与される。さらに、FcγRIIBアンタゴニストとして機能するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの誘導体、類似体、断片または変異体をコードする核酸分子を、本発明の方法に従ってＢ細胞悪性腫瘍を患う被験者に投与することができる。好ましくは、かかる誘導体、類似体、変異体および断片は全長の野生型タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのFcγRIIBアンタゴニスト活性を保持するものである。
【０１６９】
5.2  抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチド（すなわち、無関係なポリペプチドまたはその部分、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも100アミノ酸のポリペプチド）と組換えにより融合されたまたは化学的にコンジュゲートされた（共有結合および非共有結合によるコンジュゲーションを含む）抗体を包含する。融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起こってもよい。抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲートさせることにより、該抗体を、in vitroまたはin vivoで、例えば異種ポリペプチドを特定の細胞型にターゲティングするために用いることができる。異種ポリペプチドと融合されたまたはコンジュゲートされた抗体はまた、当技術分野で公知の方法を用いて、in vitroイムノアッセイおよび精製法に使用することができる。例えば、PCT公開WO 93/2 1232；EP 439,095；Naramuraら, Immunol. Lett., 39:91-99, 1994；米国特許第5,474,981号；Gilliesら, PNAS, 89:1428-1432, 1992；およびFellら, J. Immunol., 146:2446-2452, 1991を参照されたい；これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１７０】
さらに抗体を治療薬または所与の生物学的応答を改変する薬物成分とコンジュゲートさせることができる。治療薬または薬物成分は古典的な化学療法剤に限定されると考えるべきではない。例えば、薬物成分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質としては、限定するものではないが、毒素、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素（すなわち、PE-40）、またはジフテリア毒素、リシン、ゲロニン（gelonin）、およびヤマゴボウ（pokeweed）抗ウイルスタンパク質、腫瘍壊死因子などのタンパク質、α-インターフェロン（IFN-α）、β-インターフェロン（IFN-β）を含むがこれらに限らないインターフェロン、神経成長因子（NGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、アポトーシス剤（例えば、TNF-α、TNF-β、PCT公開WO 97/33899に開示されたAIM I）、AIM II（PCT公開WO 97/34911を参照）、Fasリガンド（Takahashiら, J. Immunol., 6:1567-1574, 1994）、およびVEGI（PCT公開WO 99/23105）、血栓薬または抗血管新生薬（例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン）、または生物学的応答改変剤、例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF））、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、または増殖因子（例えば、成長ホルモン（GH）；プロテアーゼ、またはリボヌクレアーゼが挙げられる。
【０１７１】
抗体をペプチドなどのマーカー配列と融合させて精製を容易にすることができる。好ましい実施形態においては、マーカーアミノ酸配列はヘキサ-ヒスチジンペプチドであって、例えば、ほかにもあるが、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）として提供されるタグであり、これらの多くは市販されている。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824, 1989に記載の通り、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは融合タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応するヘマグルチニン"HA"タグ（Wilsonら, Cell, 37: 767 1984）および「flag」タグ（Knappikら, 1994, Biotechniques, 17(4):754-761）が挙げられる。
【０１７２】
本発明はさらに、抗体フラグメントと融合されたまたはコンジュゲートされた異種ポリペプチドを含有する組成物の使用を含む。例えば、異種ポリペプチドをFabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、またはそれらの部分と融合またはコンジュゲートさせることができる。ポリペプチドを抗体部分と融合またはコンジュゲートさせる方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；国際公開WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenaziら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539；Zhengら, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVilら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341（上記参考文献は参照によりその全てが組み入れられる）を参照されたい。
【０１７３】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子-シャフリング、モチーフ-シャフリング、エキソン-シャフリング、および／またはコドン-シャフリング（まとめて「DNAシャフリング」と呼ぶ）の技術により作製することができる。DNAシャフリングを用いて本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を改変することができる（例えば、さらに高い親和性およびさらに低い解離速度をもつ抗体またはそのフラグメント）。一般的には、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号、ならびにPattenら, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hansson,ら, 1999, J. Mol. Biol. 287:265；ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, BioTechniques 24:308を参照されたい（これらの特許および開示は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。抗体またはそのフラグメント、またはコードされた抗体またはそのフラグメントは、組換えに先立って、エラープローンPCRによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法に供することにより、改変することができる。抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの１以上の部分（該部分はFcγRIIBと特異的に結合する）を、１以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、セクション、パーツ、ドメイン、フラグメントなどと組み換えることもできる。
【０１７４】
本発明はまた、診断薬もしくは治療薬または血清半減期の増加が所望されるいずれか他の分子とコンジュゲートされた抗体を包含する。抗体を診断に用いて、例えば、臨床試験法の一部として疾患、障害または感染の発生または進行をモニターすることにより、例えば所与の治療レジメンの効力を確認することができる。抗体を検出可能な物質とカップリングさせることにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属が挙げられる。検出可能な物質を、直接的に抗体とまたは間接的に中間体（例えば、当技術分野で公知のリンカー）を介して、当技術分野で公知の技術によりカップリングまたはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明に従って診断薬として使用するために抗体とコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照のこと。かかる診断および検出は、抗体を様々な酵素を含む検出可能な物質とカップリングすることにより実施することができ、それらの酵素としては、限定するものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子団複合体、例えば、限定するものではないが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチン；蛍光物質、例えば、限定するものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン；発光物質、例えば、限定するものではないが、ルミノール；生物発光物質、例えば、限定するものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン；放射性物質、例えば、限定するものではないが、ビスマス（213Bi）、炭素（14C）、クロム（51Cr）、コバルト（57Co）、フッ素（18F）、ガドリニウム（153Gd、159Gd）、ガリウム（68Ga、67Ga）、ゲルマニウム（68Ge）、ホルミウム（166Ho）、インジウム（115In、113In、112In、111In）、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、ランタン（140La）、ルテチウム（177Lu）、マンガン（54Mn）、モリブデン（99Mo）、パラジウム（103Pd）、リン（32P）、プラセオジウム（142Pr）、プロメチウム（149Pm）、レニウム（186Re、188Re）、ロジウム（105Rh）、ルテニウム（97Ru）、サマリウム（153Sm）、スカンジウム（47Sc）、セレン（75Se）、ストロンチウム（85Sr）、イオウ（35S）、テクネチウム（99Tc）、タリウム（201Tl）、スズ（113Sn、117Sn）、トリチウム（3H）、キセノン（133Xe）、イッテルビウム（169Yb、175Yb）、イットリウム（90Y）、亜鉛（65Zn）；様々なポジトロン放出断層撮影に用いるポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。
【０１７５】
抗体は、治療成分、例えば細胞毒（例えば、細胞増殖抑制薬または殺細胞薬）、治療薬または放射性元素（例えば、α線-エミッタ、γ線-エミッタなど）とコンジュゲートさせることができる。細胞毒または細胞傷害薬は細胞に有害な薬剤である。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体が挙げられる。治療薬としては、限定するものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis-ジクロロジアミン白金(II)（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名称ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、および抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１７６】
さらに、抗体は、治療成分、例えば放射性物質または大環状キレート剤（放射性金属イオン（上記放射性物質の例を参照）のコンジュゲーションに有用）とコンジュゲートさせることができる。ある特定の実施形態においては、大環状キレート剤は、抗体とリンカー分子を介して結合することができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"-テトラ酢酸（DOTA）である。このようなリンカー分子は当技術分野では公知であり、Denardoら, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Petersonら, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmermanら, 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943-50に記載されていて、それぞれ、参照によりその全てが組み入れられる。
【０１７７】
このような治療成分を抗体とコンジュゲートさせる技術は周知であり、例えば、Amonら「癌治療法における薬物の免疫ターゲティング用モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), 1985, pp.243-56, Alan R. Liss, Inc.；Hellstromら「薬物送達用の抗体（Antibody For Drug Delivery）」, Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら (編), 1987, pp.623-53, Marcel Dekker, Inc. )；Thorpe 「癌治療における細胞傷害薬の抗体担体：総説（Antibody Careeres  Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）」, Monoclonal Angibodies '84 : Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編), 1985, pp.475-506)；「癌治療における放射性標識抗体の治療用途の分析、結果、ならびに将来予測（Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), 1985, pp.303-16, Academic Press；および Thorpeら, Immunol. Rev., 62:119-58, 1982を参照されたい。
【０１７８】
抗体またはそのフラグメントは、治療成分をコンジュゲートさせてまたはコンジュゲートさせずに、単独でまたは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて、治療薬として投与することができる。
【０１７９】
あるいはまた、抗体を第２の抗体とコンジュゲートさせて、Segalが米国特許第4,676,980号に記載した抗体へテロコンジュゲートを作製することができる；この特許は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１８０】
抗体はまた固相支持体に結合させることもでき、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。このような固相支持体としては、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１８１】
5.3  本発明のモノクローナル抗体の作製と特徴付け
モノクローナル抗体は当技術分野で公知の様々な技法を用いて調製することができ、かかる技法としては、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技法、またはそれらを組み合わせた利用が挙げられる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えばHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988)；Hammerling,ら, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp.563-681（Elsevier, N. Y., 1981）（これらは共に、参照によりその全てが組み入れられる）に教示される技法を含むハイブリドーマ技法を用いて、作製することができる。本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術を介して作製される抗体に限定されるものでない。用語「モノクローナル抗体」は、いずれかの真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を意味し、抗体を作製する方法から誘導される抗体を意味するものでない。
【０１８２】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製しかつスクリーニングする方法はルーチンな技術であって、当技術分野で周知である。非限定的な例では、マウスを目的の抗原またはかかる抗原を発現する細胞により免疫する。免疫応答が検出されたら、例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出されたら、マウス脾臓を摘出して脾細胞を単離する。次いで脾細胞を周知の技術により適当なミエローマ細胞と融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。その後ハイブリドーマクローンを、抗原と結合できる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含有する腹水は、マウス腹腔に陽性ハイブリドーマクローンを接種することにより得ることができる。
【０１８３】
ある特定の実施形態においては、本発明は、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は以下のステップを含んでなる：１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウス（米国特許第5,877,396号および米国特許第5,824,487号を参照）をヒトFcγRIIBの精製した細胞外ドメイン（アミノ酸1〜180）により免疫するステップ；上記マウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を作製するステップ；上記ハイブリドーマ細胞株を、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ細胞株について、スクリーニングするステップ。他の特定の実施形態においては、本発明は、FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合するFcγRIIBモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法はさらに以下のステップを含んでなる：１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウスを精製したFcγRIIBまたはその免疫原性フラグメントにより免疫するステップ；上記マウスを、免疫応答を引き出すのに十分な回数だけ追加免疫するステップ；上記１以上のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を作製するステップ；FcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ細胞株について、上記ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングするステップ。本発明の一実施形態においては、上記マウスを、免疫応答を高めることが当技術分野で知られたアジュバントと混合されている精製FcγRIIBを用いて免疫感作する。本発明の方法で使用しうるアジュバントとしては、限定するものではないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、全細菌（BCG、コリネバクテリウム（Corynebacterium parvum）、サルモネラ（Salmonella minnesota））および細胞壁骨格を含む細菌成分、トレハロースジミコレート（trehalose dimycolate）、モノホスホリルリピドA、結核菌のメタノール抽出性残留物（MER）、完全または不完全フロイントアジュバント；ウイルスアジュバント；化学アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、ヨード酢酸およびコレステリルヘミスクシネート；裸のDNAアジュバントが挙げられる。本発明の方法で使用しうる他のアジュバントとしては、コレラ毒素、パラポックス（parapox）タンパク質、MF-59（Chiron Corporation；Biegら, 1999, Autoimmunity, 31(1):15-24も参照、これは本明細書に参照により組み入れられる)、MPL（登録商標）（Corixa Corporation；また、Lodmell D. I.ら, 2000 Vaccine, 18:1059-1066；Ulrichら, 2000, Methods in Molecular Medicine, 273-282；Johnsonら, 1999, Journal of Medicinal Chemistry, 42:4640-4649；Baldridgeら, 1999 Methods, 19:103-107も参照、これらは全て本明細書に参照により組み入れられる）、RC-529アジュバント（Corixa Corporation；Corixa社のアミノアルキルグルコサミニド-4-リン酸（AGP）化学ライブラリーからのリード化合物、www.corixa.comも参照）、およびDETOXTMアジュバント（Corixa Corporation；DETOXTMアジュバントはMPL（登録商標）アジュバント（モノホスホリルリピドA）およびミコバクテリウム細胞壁骨格を含む；Etonら, 1998, Clin. Cancer Res, 4(3):619-27；およびGubta R.ら, 1995, Vaccine, 13(14):1263-76も参照、これらは両方とも本明細書に参照により組み入れられる）が挙げられる。
【０１８４】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術により作製することができる。例えば、FabおよびF(ab')2フラグメントは、免疫グロブリン分子のタンパク分解切断により、パパイン（Fabフラグメントをもたらす）またはペプシン（F(ab')2フラグメントをもたらす)などの酵素を用いて得ることができる。F(ab')2フラグメントは完全な軽鎖、ならびに重鎖の可変領域、CH1領域および少なくとも一部のヒンジ領域を含有する。
【０１８５】
例えば、抗体は当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を担うファージ粒子の表面にディスプレイされる。特定の実施形態においては、このようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメイン（例えばFabおよびFvまたはジスルフィド結合安定化Fv）をディスプレイさせることができる。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、標識した抗原または固相表面もしくはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて、選択または同定することができる。この方法に使用されるファージは典型的にはfdおよびM13を含む糸状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに遺伝子組換えにより融合されたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを作るために利用しうるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら, J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995；Amesら, J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995；Kettleboroughら, Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994；Persicら, Gene, 187:9-18, 1997；Burtonら, Advances in Immunology, 57:191-280, 1994 ；PCT出願PCT/GB 91/01134 ；PCT公開WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；および米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号および第5,969,108号に記載された方法が挙げられ；これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１８６】
上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択の後、ファージからの抗体コード領域を単離し、これを用いて全抗体（ヒト抗体を含む）またはいずれか他の所望のフラグメントを作製し、そして所望の宿主（例えば、以下に詳述する哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）に発現させることができる。例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換えにより作製する技術も、当技術分野で公知の方法、例えば、PCT公開WO92/22324；Mullinaxら, BioTechniques, 12 (6):864-869, 1992；およびSawaiら, AJRI, 34:26-34, 1995；およびBetterら, Science, 240:1041-1043, 1988（これらはそれぞれ参照によりその全てが組み入れられる）に開示される方法を用いて利用することもできる。一本鎖Fvおよび抗体を作製するために利用しうる技術の例は、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号；Hustonら, Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991；Shuら, Proc Natl Acade Sci USA, 90:7995-7999, 1993；およびSkerraら, Science, 240:1038-1040, 1988に記載の技術を含む。
【０１８７】
ファージディスプレイ技法を用いてFcγRIIBに対する本発明の抗体の親和性を高めることができる。この技法は、本発明のコンビナトリアル法に利用しうる高親和性抗体を得るのに有用でありうる。親和性成熟（affinity maturation）と呼ばれる技法は、もとの抗体または親抗体と比較したとき、より高い親和性で抗原と結合する抗体を同定するために、突然変異誘発またはCDRウォーキングとFcγRIIBまたはその抗原性フラグメントを用いる再選択を採用する（例えば、Glaserら, 1992, J. Immunology 149:3903を参照）。単一ヌクレオチドよりむしろ全コドンを突然変異誘発すると、アミノ酸変異の半ランダム化レパートリーが得られる。変異体クローン（それぞれは単一CDR中の単一アミノ酸変化により異なっている）のプールから成るライブラリーが構築され、該ライブラリーは各CDR残基に対してそれぞれ可能なアミノ酸置換を提示する変異体を含有する。抗原に対する結合親和性が増加した突然変異体は、固定化した突然変異体を標識抗原と接触させることにより、スクリーニングすることができる。当技術分野で公知のスクリーニング方法を用いて、抗原に対する結合力が増加した変異型抗体を同定することができる（例えば、ELISA）（Wuら, 1998, Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037；Yeltonら, 1995, J. Immunology 155:1994を参照）。軽鎖をランダム化するCDRウォーキングも可能である（Schierら, 1996, J. Mol. Bio. 263:551を参照）。
【０１８８】
本発明の抗体をエピトープマッピングによりさらに特徴付けて、FcγRIIAと比較してFcγRIIBに対して最大の特異性を有する抗体を選択することができる。抗体のエピトープマッピング法は当技術分野で周知であり、本発明の方法の範囲に包含される。ある特定の実施形態においては、FcγRIIBの１以上の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングする際に用いることができる。特定の実施形態においては、融合タンパク質は、ヒトIgG2のFc部分に融合されたFcγRIIBの領域のアミノ酸配列を含有する。それぞれの融合タンパク質は、以下の表４に示すように、受容体のある特定領域と、同族受容体（例えばFcγRIIA）からの対応領域とのアミノ酸置換および／または置き換えをさらに含んでいてもよい。pMGX125およびpMGX132はFcγRIIB受容体のIgG結合部位を含有し、前者はFcγRIIBのＣ末端を有し、後者はFcγRIIAのＣ末端を有するので、Ｃ末端結合を区別するために用いることができる。その他は、IgG結合部位のFcγRIIA置換およびFcγIIAもしくはFCγIIBのいずれかのＮ末端を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役立ちうる。
【０１８９】
表４  モノクローナル抗FcγRIIB抗体のエピトープを研究するために利用することができる融合タンパク質のリスト
残基172-180はFcγRIIAおよびBのIgG結合部位に属する。FcγRIIA配列由来の特定のアミノ酸は太字で示す。Ｃ末端配列APSSSは配列番号57であり、Ｃ末端配列VPSMGSSSは配列番号58である。
【表４】
2007532139.tif 000010
【０１９０】
融合タンパク質は本発明の抗FcγRIIB抗体との結合を確認する生物学的アッセイ、例えばELISAに用いることができる。他の実施形態において、エピトープ特異性のさらなる確認は、FcγRIIA配列由来の残基で置き換えた特定の残基をもつペプチドを用いることによって行うことができる。
【０１９１】
本発明の抗体は、該抗体とFcγRIIBとの相互作用を特徴づける（定量化することを含む）ための当技術分野で公知の免疫学的または生化学的方法を用いて、FcγRIIBとの特異的結合について特徴づけることができる。本発明の抗体とFcγRIIBとの特異的結合は、例えば、限定するものではないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析を含む免疫学的または生化学的方法を用いて測定することができる。本発明の抗体の免疫特異的結合および交差反応性を分析するために利用しうるイムノアッセイとしては、限定するものではないが、そのいくつかを挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられる。かかるアッセイは慣例的であり、当技術分野では周知である（例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０１９２】
本発明の抗体はまた、該抗体とFcγRIIBとの相互作用の動力学的パラメーターを特徴付けるための当技術分野で公知の表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイを用いて検定することもできる。市販されているSPR測定装置、例えば、限定するものではないが、Biacore AB（Uppsala、Sweden）から入手しうるBIAcore装置；Affinity Sensors（Franklin、MA.）から入手しうるIAsys装置；Windsor Scientific Limited（Berks、UK）から入手しうるIBISシステム；Nippon Laser and Electronics Lab（北海道、日本）から入手しうるSPR-CELLIAシステム；およびTexas Instruments（Dallas、TX）から入手しうるSPR Detector Spreetaを本発明に使用することができる。SPRに基づく技法の概要については、Mulletら, 2000, Methods 22: 77-91；Dongら, 2002, Review in MoI. Biotech., 82: 303-23；Fivashら, 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101；Richら, 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照されたい；これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。さらに米国特許第6,373,577号；第6,289,286号；第5,322,798号；第5,341,215号；第6,268,125号に記載されたタンパク質-タンパク質相互作用を測定するためのSPR測定装置およびSPRに基づく方法のいずれも本発明の方法に使用することができ、これらの全ては本明細書に参照によりそれらの全てが組み入れられる。
【０１９３】
簡単に説明すると、SPRに基づくアッセイは、結合対の一方のメンバーを表面上に固定化し、溶解状態の結合対の他方のメンバーとのその相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む。SPRは、複合体形成または解離時に生じる表面近くの溶媒の屈折率の変化を測定することに基づく。固定化の起こる表面がセンサーチップであり、SPR技法の心臓部となる。センサーチップは金の薄層をコーティングしたガラス表面から成り、分子と表面との結合を最適化するように設計された特殊な表面域の基礎を形成する。様々なセンサーチップがとりわけ上記各社から市販されていて、それらは全て本発明の方法に使用することができる。センサーチップの例としては、BIAcore AB, Inc.から入手しうるセンサーチップ、例えば、Sensor Chip CM5、SA、NTA、およびHPAが挙げられる。本発明の分子は、当技術分野で公知のいずれの固定化方法および化学を用いてセンサーチップの表面上に固定化してもよく、それらとしては、限定するものではないが、アミン基を介する直接共有結合、スルフヒドリル基を介する直接共有結合、アビジンをコーティングした表面とのビオチン結合、糖基とのアルデヒドカップリング、およびヒスチジンタグを介するNTAチップとの結合が挙げられる。
【０１９４】
本発明は、本発明の抗体の機能（特に、FcγRIIBシグナル伝達をモジュレートする活性）を同定するためのある特定の特性決定アッセイを用いて、本発明の方法により得られた抗体を特徴付けることを包含する。例えば、本発明の特性決定アッセイは、FcγRIIBのITIMモチーフ中のチロシン残基のリン酸化を測定するか、またはＢ細胞受容体により生じるカルシウム動員の抑制を測定する。本発明の特性決定アッセイは細胞に基づくアッセイでも、無細胞アッセイでもよい。
【０１９５】
当技術分野では、肥満細胞でのFcγRIIBと高親和性IgE受容体FcεRIとの共凝集が、抗原により誘導される脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の抑制をもたらすことは十分に確立されている（Metcalfe D. D.ら 1997, Physiol. Rev. 77:1033；Long E. O. 1999 Annu Rev. Immunol 17:875）。このシグナル伝達経路の分子的詳細は最近解明された（Ott V. L., 2002, J Immunol. 162(9):4430-9）。ひとたびFcεRIと共凝集すると、FcγRIIBはそのITIMモチーフ中のチロシン上で速やかにリン酸化され、次いでSrc Homology-2含有イノシトール-5-ホスファターゼ（SHIP）、SH2ドメイン含有イノシトールポリリン酸5-ホスファターゼを動員し、これが順にリン酸化されてShcおよびp62dokと会合する（p62dokは、アダプター分子のファミリーのプロトタイプであって、シグナル伝達ドメイン、例えばアミノ末端プレクストリン相同性ドメイン（PHドメイン）、PTBドメイン、およびPXXPモチーフおよび多数のリン酸化部位を含有するカルボキシ末端領域を含む）（Carpinoら, 1997, Cell, 88:197；Yamanshiら, 1997, Cell, 88:205）。
【０１９６】
本発明は、１以上のIgE介在性応答をモジュレートする際の本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けることを包含する。好ましくは、IgEに対する高親和性受容体とFcγRIIBに対する低親和性受容体とを同時発現する細胞株を、IgE介在性応答をモジュレートする際の本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けるのに使用しうる。特定の実施形態においては、ラット好塩基球性白血病細胞株（RBL-2H3；Barsumian E. L.ら 1981 Eur. J. Immunol. 11:317、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）由来の細胞を全長ヒトFcγRIIBでトランスフェクトして、本発明の方法に使用する。RBL-2H3はよく特徴づけられたラット細胞株で、IgE介在性細胞活性化の後のシグナル伝達機構を研究するために広く使われている。FcγRIIBは、RBL-2H3細胞内で発現されてFcεRIと共凝集すると、FcεRIにより誘導されるカルシウム動員、脱顆粒、およびサイトカイン産生を抑制する（Malbecら, 1998, J. Immunol. 160:1647；Daeronら, 1995 J. Clin. Invest. 95:577；Ottら, 2002 J. of Immunol. 168:4430-4439）。
【０１９７】
いくつかの実施形態においては、本発明は、本発明の抗FcγRIIB抗体を、FcεRIにより誘導される肥満細胞活性化の抑制について特徴づけることを包含する。例えば、FcγRIIBによりトランスフェクトされているラット好塩基球性白血病細胞株（RBL-H23; Barsumian E. L.ら 1981 Eur. J. Immunol. 11:317）由来の細胞をIgEで感作し、ウサギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントにより刺激してFcεRIを単独で凝集させるか、または全ウサギ抗IgGにより刺激してFcγRIIBとFcεRIを共凝集させる。この系において、下流シグナル伝達分子の間接的モジュレーションを、感作および刺激した細胞に本発明の抗体を添加することによりアッセイすることができる。例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化とSHIPの動員およびリン酸化、MAPキナーゼファミリーメンバー（ERKL、Erk2、JNK、またはp38を含む）の活性化；ならびにP62dokのチロシンリン酸化とSHIPおよびRasGAPとのその会合をアッセイすることができる。
【０１９８】
本発明の抗体によるFcεRI誘導肥満細胞活性化の抑制を測定するための代表的なアッセイは、RBL-H23細胞をヒトFcγRIIBでトランスフェクトするステップ；RBL-H23細胞をIgEにより感作するステップ；ならびにRBL-H23細胞をウサギ抗マウスIgGのF(ab')2で刺激する（対照として、FcεRIを単独で凝集させてFcERI介在シグナル伝達を誘発するため）か、またはRBL-H23細胞を全ウサギ抗マウスIgGで刺激する（FcγRIIBとFcεRIを共凝集させて、FcERI介在シグナル伝達の抑制をもたらすため）ステップを含んでなる。全ウサギ抗マウスIgG抗体で刺激された細胞は、本発明の抗体とともにさらにプレインキュベートしてもよい。本発明の抗体とプレインキュベートされた細胞および本発明の抗体とプレインキュベートされていない細胞のFcεRI依存性活性を測定し、これらの細胞におけるFcεRI依存性活性のレベルを比較すると、本発明の抗体によるFcεRI依存性活性のモジュレーションが示される。
【０１９９】
以上記載した代表的アッセイを利用して、例えば、FcγRIIB受容体とのリガンド（IgG）結合をブロックする抗体、およびFcγRIIBとFcεRIの共凝集を防止することによりFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB介在抑制にアンタゴニスト作用を示す抗体を同定することができる。このアッセイは同様に、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を高める抗体、およびFcγRIIBとFcεRIの共凝集を促進することによりFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB介在抑制にアゴニスト作用を示す抗体を同定する。
【０２００】
好ましい実施形態においては、FcεRI依存性活性は、少なくとも１以上の次の活性である：下流シグナル伝達分子のモジュレーション（例えば、FcγRIIBのリン酸化状態のモジュレーション、SHIP動員のモジュレーション、MAPキナーゼ活性のモジュレーション、SHIPのリン酸化状態のモジュレーション、SHIPとShc会合のモジュレーション、p62dokのリン酸化状態のモジュレーション、p62dokとSHIP会合のモジュレーション、p62dokとRasGAP会合のモジュレーション、カルシウム動員のモジュレーション、脱顆粒のモジュレーション、およびサイトカイン産生のモジュレーション。さらに他の好ましい実施形態においては、FcεRI依存性活性はセロトニン放出および／または細胞外Ca++流入および／またはIgE依存性肥満細胞活性化である。当業者には公知であるように、FcγRIIBとFcεRIの共凝集はFcγRIIBチロシンリン酸化を刺激し、SHIP動員を刺激し、SHIPチロシンリン酸化およびShcとの会合を刺激し、そしてMAPキナーゼファミリーメンバー（Erk1、Erk2、JNK、p38を含むがこれらに限らない）の活性化を抑制する。また、当業者には公知であるように、FcγRIIBとFcεRIの共凝集はp62dokのチロシンリン酸化の増加、ならびにSHIPおよびRasGAPとのその会合を刺激する。
【０２０１】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体は、好ましくは細胞に基づくアッセイで、肥満細胞または好塩基球の脱顆粒をモニタリングおよび／または測定することにより、IgE介在性応答をモジュレートするその能力について特徴付けられる。好ましくは、このようなアッセイに用いる肥満細胞または好塩基球は、当業者に公知の標準的な組換え法でヒトFcγRIIBを含有するように作製しておく。特定の実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体はIgE介在性応答をモジュレートするその能力について、細胞に基づくβ-ヘキソサミニダーゼ（顆粒に含まれる酵素）放出アッセイで特徴付けられる。肥満細胞と好塩基球からのβ-ヘキソサミニダーゼ放出は急性のアレルギーおよび炎症症状における一次事象である（Aketaniら, 2001 Immunol. Lett. 75:185-9；Aketaniら, 2000 Anal. Chem. 72:2653-8）。セロトニンおよびヒスタミンを含む他の炎症性メディエーターの放出をアッセイして、本発明の方法に従ってIgE介在性応答を測定することもできる。特定の作用機構に拘束されるものではないが、肥満細胞および好塩基球からの顆粒（β-ヘキソサミニダーゼを含有する顆粒など）の放出は、細胞内カルシウム濃度に依存するプロセスであり、FcγRIと多価抗原との架橋により開始される。
【０２０２】
IgE介在性応答を媒介する際の本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けるための代表的なアッセイは、β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイであって、次のステップを含む：ヒトFcγRIIBによりRBL-H23細胞をトランスフェクトするステップ；マウスIgE単独によりまたはマウスIgEおよび本発明の抗FcγRIIB抗体により細胞を感作するステップ；細胞を様々な濃度のヤギ抗マウスF(ab)2（好ましくは0.03μg/mL〜30μg/mLの範囲）により約1時間刺激するステップ；上清を回収するステップ；細胞を溶解するステップ；上清中に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を比色アッセイにより、例えばp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いて、測定するステップ。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性は全活性に対する放出された活性の％として表される。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、抗原のみ；IgEのみ；IgEと本発明の抗FcγRIIB抗体；を用いて処置した細胞を比較する。特定の作用機構により拘束されるものではないが、細胞をマウスIgEのみで感作してポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab)2フラグメントによりチャレンジすると、ポリクローナル抗体がFcγRIと結合したマウスIgEの軽鎖を認識するので、FcγRIの凝集と架橋が起こり、これが順に肥満細胞の活性化および脱顆粒をもたらす。他方、細胞をマウスIgEと本発明の抗FcγRIIB抗体で感作してポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab)2フラグメントによりチャレンジすると、FcγRIとFcγRIIBの架橋が起こり、FcγRIにより誘導される脱顆粒の抑制をもたらす。いずれの場合にも、ヤギ抗マウスF(ab)2は用量依存的なβ-ヘキソサミニダーゼ放出を誘導する。いくつかの実施形態においては、FcγRIIB受容体と結合しかつFcγRIと架橋した抗FcγRIIB抗体は抑制経路の活性化に影響を与えず、すなわち、抗FcγRIIB抗体の存在下では脱顆粒のレベルに変化がない。他の実施形態では、抗FcγRIIB抗体は、抗FcγRIIB抗体が結合したとき、抑制受容体FcγRIIBのより強い活性化を媒介し、FcγRIとの効果的架橋およびホモ凝集FcγRIIBの抑制経路の活性化を可能にする。
【０２０３】
本発明はまた、本発明の抗FcγRIIB抗体がIgE介在性細胞応答に及ぼす効果を、当業者に公知の方法を用いたカルシウム動員アッセイを使用して、特徴付けることを包含する。代表的なカルシウム動員アッセイは、次のステップを含む：好塩基球または肥満細胞をIgEにより感作するステップ；細胞をカルシウム指示薬（例えばFura 2）とともにインキュベートするステップ；上記のように細胞を刺激するステップ；細胞内カルシウム濃度を例えばフローサイトメトリーによりモニタリングおよび／または定量化するステップ。本発明は、細胞内カルシウム濃度を当業者に公知の方法（例えば、Immunology Letters, 2001, 75:185-9；British J. of Pharm, 2002, 136:837-45；J. of Immunology, 168:4430-9およびJ. of Cell Biol., 153(2):339-49を参照されたい；これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）によりモニタリングおよび／または定量化することを包含する。
好ましい実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体はIgE介在性細胞活性化を抑制する。他の実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体は、FcγRIIBにより調節される抑制経路をブロックするか、またはFcγRIIB上のリガンド結合部位をブロックし、したがって免疫応答を高める。
【０２０４】
ヒト肥満細胞の研究は、好適な長期ヒト肥満細胞培養物が存在しないことによって限定されていた。最近、２種の新規の幹細胞因子依存性ヒト肥満細胞株（LAD1およびLAD2と呼ばれる）が肥満細胞肉腫/白血病患者由来の骨髄吸引液から確立された（Kirshenbaumら, 2003, Leukemia research, 27:677-682、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。両方の細胞株はFcεRIと複数のヒト肥満細胞マーカーを発現することが記載されている。本発明は、IgE介在性応答に対する本発明の抗体の効果を評価するための本発明の方法においてLAD1およびLAD2細胞を使用することを包含する。特定の実施形態においては、上記のような、細胞に基づくβ-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイをLAD細胞に用いて、本発明の抗FcγRIIB抗体によるIgE介在性応答のモジュレーションを確認することができる。代表的なアッセイとしては、ヒト肥満細胞、例えばLAD1をキメラヒトIgE抗ニトロフェノール（NP）で初回感作し、そしてBSA-NP多価抗原によりチャレンジし、そして上清中に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼを測定することにより細胞の脱顆粒をモニタリングする（Kirshenbaumら, 2003, Leukemia research, 27:677-682、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ヒト肥満細胞が、当技術分野で公知の標準方法（例えばFACS染色）を用いて測定したとき、低い内在性FcγRIIB発現を示す場合は、本発明の抗FcγRIIB抗体により媒介される抑制経路の活性化の差をモニタリングおよび／または検出することは困難であるかもしれない。従って、本発明は、サイトカインおよび特定の増殖条件を用いてFcγRIIB発現をアップレギュレートしうる代替方法を包含する。FcγRIIBはヒト単球細胞株、例えばTHP1およびU937（Tridandapaniら, 2002, J. Biol. Chem., 277(7):5082-5089）ならびに一次ヒト単球（Pricopら, 2001, J. of Immunol., 166:531-537）においてIL4により高度にアップレギュレートされることが記載されている。U937細胞のジブチリル環状AMPによる分化（differentiation）はFcγRIIの発現を増加させると記載されている（Cameronら, 2002 Immunology Letters 83,171-179）。従って、本発明の方法に利用するヒト肥満細胞における内在性FcγRIIBの発現は、検出の感度を上げるために、サイトカイン（例えば、IL-4、IL-13）を用いてアップレギュレートすることができる。
【０２０６】
本発明はまた、本発明の抗FcγRIIB抗体を、Ｂ細胞受容体（BCR）介在性シグナル伝達の抑制について特徴付けすることを包含する。BCR介在性シグナル伝達は、Ｂ細胞の活性化および増殖、抗体産生などの少なくとも１以上の下流の生物学的応答を含みうる。FcγRIIBとBCRの共凝集は、細胞周期進行および細胞生存の抑制を招く。さらに、FcγRIIBとBCRの共凝集はBCR介在性シグナル伝達の抑制をもたらす。
【０２０７】
具体的には、BCR介在性シグナル伝達は、次の少なくとも１以上を含む：下流シグナル伝達分子のモジュレーション、例えば、FcγRIIBのリン酸化状態、SHIP動員、Btkおよび／またはPLCγの局在化、MAPキナーゼ活性、Akt（抗アポトーシスシグナル）の動員、カルシウム動員、細胞周期進行、および細胞増殖。
【０２０８】
BCRシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制の多数のエフェクター機能はSHIPにより媒介されるが、最近、SHIP欠損マウス由来のリポ多糖(LPS)活性化Ｂ細胞は、カルシウム動員、Ins(1,4,5)P3産生、およびErkおよびAktリン酸化の顕著なFcγRIIB介在性抑制を示すことが実証されている（Brauweiler A.ら, 2001, Journal of Immunology, 167(1):204-211）。従って、ex vivoでSHIP欠損マウス由来のＢ細胞を用いて、本発明の抗体を特徴付けることができる。本発明の抗体によるBCRシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制を確認するための代表的なアッセイは、次のステップを含む：SHIP欠損マウスから脾Ｂ細胞を単離するステップ、上記細胞をリポ多糖により活性化するステップ、および上記細胞をF(ab')2抗IgMにより刺激してBCRを凝集させるか、または抗IgMにより刺激してBCRをFcγRIIBと共凝集させるステップ。インタクトの抗IgMにより刺激してBCRをFcγRIIBと共凝集させた細胞を、本発明の抗体とともにさらにプレインキュベートすることができる。細胞のFcγRIIB依存性活性を当技術分野で公知の標準技術により測定することができる。本発明の抗体とともにプレインキュベートしておいた細胞のFcγRIIB依存性活性のレベルを、プレインキュベートしていない細胞のそれと比較すると、本発明の抗体によるFcγRIIB依存性活性のモジュレーションが示される。
【０２０９】
FcγRIIB依存性活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーによる細胞内カルシウム動員の測定、Aktおよび／またはErkのリン酸化の測定、BCRを介するPI（3,4,5）P3の蓄積の測定、またはＢ細胞のFcγRIIB介在性増殖の測定を含みうる。
【０２１０】
これらのアッセイを用いて、例えば、FcγRIIB受容体に対するリガンド（IgG）結合部位をブロッキングすることにより、BCRシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制をモジュレートする抗体、およびFcγRIIBとBCRの共凝集を防止することにより、BCRシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制にアンタゴニスト作用を示す抗体を同定することができる。また、これらのアッセイを用いて、FcγRIIBとBCRの共凝集を高める抗体、およびBCRシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制にアゴニスト作用を示す抗体を同定することもできる。
【０２１１】
本発明は、ヒト単球/マクロファージにおけるFcγRII介在性シグナル伝達について、本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けることに関する。FcγRIIBと、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を担う受容体との共凝集は、SHIPをそのエフェクターとして用いてFcγR介在食作用をダウンレギュレートするように作用する（Tridandapaniら 2002, J. Biol. Chem. 277(7):5082-9）。FcγRIIAとFcγRIIBとの共凝集は、FcγRIIBのITIMモチーフ上のチロシン残基の速やかなリン酸化をもたらし、SHIPのリン酸化、SHIPとShcとの会合、および120および60〜65kDaの分子量を有するタンパク質のリン酸化の増強を招く。さらに、FcγRIIAとFcγRIIBとの共凝集は、細胞制御に関与しかつアポトーシスを抑制するように働くセリン-トレオニンキナーゼであるAktのリン酸化のダウンレギュレーションをもたらす。
【０２１２】
本発明はさらに、本発明の抗FcγRIIB抗体を、ヒト単球/マクロファージにおけるFcγR介在性食作用の抑制について特徴付けることを包含する。例えば、ヒト単球細胞株THP-1由来の細胞を、FcγRIIに対するマウスモノクローナル抗体IV.3のFabフラグメントおよびヤギ抗マウス抗体で刺激する（FcγRIIA単独で凝集させるため）か、または全IV.3マウスモノクローナル抗体およびヤギ抗マウス抗体で刺激する（FcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させるため）。この系では、刺激した細胞に本発明の抗体を加えて、下流シグナル伝達分子のモジュレーション、例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化、SHIPのリン酸化、SHIPとShcとの会合、Aktのリン酸化、および120および60〜65kDaの分子量を有するタンパク質のリン酸化をアッセイすることができる。さらに、単球細胞株のFcγRIIB依存性食作用効率を本発明の抗体の存在下および不在下で直接測定することができる。
【０２１３】
本発明の抗体によるヒト単球/マクロファージにおけるFcγR介在性食作用の抑制を確認するための他の代表的アッセイは、次のステップを含む：THP-1細胞を、IV.3マウス抗FcγRII抗体のFabおよびヤギ抗マウス抗体を用いて刺激する（FcγRIIAを単独で凝集させ、かつFcγRIIA介在性シグナル伝達を誘発させるため）か、またはマウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体を用いて刺激する（FcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させ、かつFcγRIIA介在性シグナル伝達を抑制するため）ステップ。マウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体により刺激された細胞を、本発明の抗体とさらにプレインキュベートしてもよい。本発明の抗体とプレインキュベートされている刺激された細胞と、本発明の抗体とプレインキュベートされていない細胞のFcγRIIA依存性活性を測定し、これらの細胞におけるFcγRIIA依存性活性のレベルを比較すると、本発明の抗体によるFcγRIIA依存性活性のモジュレーションが示される。
【０２１４】
上記の代表的アッセイを利用して、例えば、FcγRIIB受容体のリガンド結合をブロックし、かつFcγRIIBとFcγRIIAの共凝集を防止することによりFcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制にアンタゴニスト作用を示す抗体を同定することができる。このアッセイは同様に、FcγRIIBとFcγRIIAの共凝集を高め、かつFcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制にアゴニスト作用を示す抗体を同定する。
【０２１５】
本発明の他の実施形態においては、本発明は、以前に記載された方法（Tridandapaniら, 2000, J. Biol. CHEM. 275: 20480-7）を用いて、THP-1細胞がフルオレセイン化IgG-オプソニン化ヒツジ赤血球（SRBC）を貪食する能力を測定することにより、本発明の抗体の機能を特徴付けることに関する。例えば、食作用を測定するための代表的アッセイは次のステップを含む：THP-1細胞を本発明の抗体またはFcγRIIと結合しない対照抗体で処理するステップ；上記細胞の活性レベルを比較するステップ；ここで細胞の活性の差（例えば、ロゼット形成活性（IgGコーティングSRBCと結合するTHP-1細胞の数）、接着活性（THP-1細胞と結合したSRBCの総数）、および食作用速度）が本発明の抗体によるFcγRIIA依存性活性のモジュレーションを示すこととなる。このアッセイを用いて、例えば、FcγRIIB受容体のリガンド結合をブロックし、かつ食作用のFcγRIIB介在性抑制にアンタゴニスト作用を示す抗体を同定することができる。このアッセイはまた、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB介在性抑制を高める抗体も同定することができる。
【０２１６】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体はヒト単球/マクロファージにおけるFcγRIIB依存性活性を、少なくとも１以上の次の方法でモジュレートする：下流シグナル伝達分子のモジュレーション（例えば、FcγRIIBのリン酸化状態のモジュレーション、SHIPリン酸化のモジュレーション、SHIPおよびShc会合のモジュレーション、Aktのリン酸化のモジュレーション、およそ120および60〜65kDaの他のタンパク質のリン酸化のモジュレーション）および食作用のモジュレーション。
【０２１７】
本発明は、治療用抗体のエフェクター細胞機能に及ぼす抗体の効果（例えば、治療用抗体の腫瘍特異的ADCC活性を高める能力）を同定するための当業者に公知のアッセイを用いて、本発明の抗体を特徴付けることを包含する。本発明の方法に従って使用しうる治療用抗体としては、限定するものではないが、抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体、抗微生物抗体（例えば、細菌および単細胞寄生生物）が挙げられ、その例は本明細書（第5.4.6節）に開示される。特に、本発明は、本発明の抗体を、治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）のFcγR介在性エフェクター細胞機能に対する効果について特徴付けることを包含する。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例としては、限定するものではないが、抗体依存性細胞性細胞傷害、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、C1q結合、および補体依存性細胞性細胞傷害が挙げられる。エフェクター細胞機能活性を測定するための、当業者に公知のどのような細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを用いてもよい（エフェクター細胞アッセイについては、Perussiaら, 2000, Methods Mol. Biol. 121:179-92；Baggioliniら, 1998 Experientia, 44(10):841-8；Lehmannら, 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2):229-42；Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45:147-64；Munnら, 1990 J. Exp. Med., 172:231-237、Abdul-Majidら, 2002 Scand. J. Immunol. 55:70-81；Dingら, 1998, Immunity 8:403-411を参照のこと、これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２１８】
本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）における治療用抗体のFcγR介在性ADCC活性に対するその効果について、当業者に公知の標準方法のいずれかを用いてアッセイすることができる（例えば、Perussiaら, 2000, Methods Mol. Biol. 121:179-92を参照）。本明細書に使用される用語「抗体依存性細胞性細胞傷害」および「ADCC」は、当技術分野で慣例的な通常の意味を持ち、FcγRを発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞などの単球細胞およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を引き起こすin vitro細胞介在性反応を意味する。原則として、活性化FcγRをもつエフェクター細胞はどれもADCCを媒介するためのトリガーとなる。ADCCを媒介するための一次細胞はFcγRIIIだけを発現するNK細胞であるが、単球は、その活性化、局在化、または分化の状態に応じて、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現することができる。造血細胞上のFcγR発現の概説については、例えば、Ravetchら, 1991, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92を参照のこと、これは参照により本明細書にその全てが組み入れられる。
【０２１９】
エフェクター細胞は１以上のFcγRを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、該細胞は少なくともFcγRIIIを発現してADCCエフェクター機能を果たすものである。本発明の方法に使用しうるエフェクター細胞は、限定するものではないが、末梢血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球および好中球を含み、PBMCおよびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞はその天然の供給源、例えば本明細書に記載の血液またはPBMCから単離することができる。好ましくは、本発明のADCCアッセイに使用されるエフェクター細胞は末梢血単核球（PBMC）であり、これは、好ましくは正常なヒト血液から当業者に公知の標準方法を用いて、例えばFicoll-Paque密度勾配遠心分離法を用いて精製される。例えば、PBMCは、全血液をFicoll-Hypaque上に重層し、細胞を500gで室温にて30分間遠心することにより単離することができる。白血球層をエフェクター細胞として採取する。本発明のADCCアッセイに使用される他のエフェクター細胞は、限定するものではないが、単球由来のマクロファージ（MDM）を含む。本発明の方法でエフェクター細胞として使用されるMDMは、好ましくは、凍結ストックとして入手するか、または新鮮なものを利用する（例えば、Advanced Biotechnologies（MD）から）。最も好ましい実施形態においては、洗ってきれいにした（elutriated）ヒト単球を本発明のエフェクター細胞として使用する。洗ってきれいにしたヒト単球は活性化受容体FcγRIIIAおよびFcγRIIAならびに抑制受容体FcγRIIBを発現する。ヒト単球は市販されていて、凍結ストックとして入手し、10％ヒトAB血清を含有する基本培地中でまたはサイトカインを含むヒト血清を含有する基本培地中で解凍してもよい。これらの細胞におけるFcγRの発現レベルは、例えばFACS分析を用いて、直接測定することができる。あるいはまた、該細胞を培養してマクロファージに成熟させることもできる。FcγRIIBの発現レベルはマクロファージで増加しうる。FcγRの発現レベルを測定するのに使用しうる抗体は、限定するものではないが、抗ヒトFcγRIIA抗体、例えばIV.3-FITC；抗FcγRI抗体、例えば32.2 FITC；および抗FcγRIIIA抗体、例えば3G8-PEを含む。
【０２２０】
本発明のADCCアッセイで使用される標的細胞は、限定するものではないが、乳癌細胞株、例えばATCC受託番号HTB-30をもつSK-BR-3（例えば、Trempら, 1976, Cancer Res. 33-41を参照）；Ｂリンパ球；バーキットリンパ腫から誘導された細胞、例えばATCC受託番号CCL-86をもつRaji細胞（例えば、Epsteinら, 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34:231-240を参照）、ATCC受託番号CCL-213をもつDaudi細胞（例えば、Kleinら, 1968, Cancer Res. 28: 1300-10を参照）；卵巣癌細胞株、例えばATCC受託番号HTB-161をもつOVCAR-3（例えば、Hamilton, Youngら、1983を参照）、SK-OV-3、PA-1、CAOV3、OV-90、およびIGROV-1（NCIレポジトリーから入手可能；Benardら, 1985, Cancer Research, 45:4970-9；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）が挙げられる。標的細胞はアッセイされる抗体の抗原結合部位により認識されねばならない。本発明の方法に使用する標的細胞は、癌抗原の低度、中度、または高度の発現レベルを有してもよい。癌抗原の発現レベルは、当業者に公知の慣用方法、例えばFACS分析を用いて測定することができる。例えば、本発明は、卵巣癌細胞、例えばIGROV-1（Her2/neuが様々なレベルで発現される）またはOV-CAR-3（ATCC受託番号HTB-161；SK-BR-3乳癌細胞株より低いHer2/neu発現により特徴付けられる）の使用を包含する。本発明の方法に標的細胞として使用しうる他の卵巣癌細胞株としては、OVCAR-8（Hamiltonら, 1983, Cancer Res. 43:5379-89、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）；SK-OV-3（ATCC受託番号HTB-77）；Caov-3（ATCC受託番号HTB-75）；PA-I（ATCC受託番号CRL-1572）；OV-90（ATCC受託番号CRL-11732）；およびOVCAR-4が挙げられる。本発明の方法に使用することができる他の乳癌細胞株としては、BT-549（ATCC受託番号HTB-122）、MCF7（ATCC受託番号HTB-22）、およびHs578T（ATCC受託番号HTB-126）が挙げられ、これらは全てNCIレポジトリーおよびATCCから入手することができ、本明細書に参照により組み入れられる。本発明の方法に使用することができる他の細胞株としては、限定するものではないが、CCRF-CEM（白血病）；HL-60（TB、白血病）；MOLT-4（白血病）；RPMI-8226（白血病）；SR（白血病）；A549（非小細胞肺）；EKVX（非小細胞肺）；HOP-62（非小細胞肺）；HOP-92（非小細胞肺）；NC1-H226（非小細胞肺）；NC1-H23（非小細胞肺）；NC1-H322M（非小細胞肺）；NC1-H460（非小細胞肺）；NC1-H522（非小細胞肺）；COLO 205（大腸）；HCC-2998（大腸）；HCT-116（大腸）；HCT-15（大腸）；HT29（大腸）；KM12（大腸）；SW-620（大腸）；SF-268（CNS）；SF-295（CNS）；SF-539（CNS）；SNB-19（CNS）；SNB- 75（CNS）；U251（CNS）；LOX IMVl（黒色腫）；MALME-3M（黒色腫）；M14（黒色腫）；SK-MEL-2（黒色腫）；SK-MEL-28（黒色腫）；SK-MEL-5（黒色腫）；UACC-257（黒色腫）；UACC-62（黒色腫）；IGR-OVl（卵巣）；OVCAR-3、4、5、8（卵巣）；SK-OV-3（卵巣）；786-0（腎）；A498（腎）；ACHN（腎）；CAKl-I（腎）；SN12C(腎）；TK-IO（腎）；UO-31（腎）；PC-3C（前立腺）；DU-145（前立腺）；NCl/ADR-RES（乳房）；MDA-MB-231/ATCC（乳房）；MDA-MB-435（乳房）；DMS 114（小細胞肺）；およびSHP-77（小細胞肺）が挙げられ、これらは全てNCIから入手することができ、本明細書に参照により組み入れられる。
【０２２１】
治療用抗体のADCC活性に及ぼす本発明の抗体の効果を測定するための代表的アッセイは、51Cr放出アッセイに基づくものであり、次のステップを含む：標的細胞を[51Cr]Na2CrO4（この細胞膜透過性分子は標識付けに常用されているが、それは、該分子が細胞質タンパク質と結合して、細胞から遅い速度で自然放出されるが、標的細胞の溶解後には大量に放出されるからである）で標識するステップ；好ましくは、標的細胞が１以上の腫瘍抗原を発現して、標的細胞の細胞表面上に発現された腫瘍抗原と免疫特異的に結合する１以上の抗体により標的細胞をオプソニン化するステップ；本発明の抗体、例えば2B6、3H7の存在下または不在下で、マイクロタイタープレートにおいて、オプソニン化された放射性標識標的細胞をエフェクター細胞と、標的細胞対エフェクター細胞の好適な比で組み合わせるステップ；細胞の混合物を好ましくは16〜18時間、好ましくは37℃でインキュベートするステップ；上清を回収するステップ；および上清サンプル中の放射活性を分析するステップ。その後、本発明の抗体の存在下または不在下での治療用抗体の細胞傷害性を、例えば、次式により決定する：比溶解％＝（実験的溶解−抗体非依存性溶解／最大溶解−抗体非依存性溶解）×100％。標的：エフェクター細胞比または抗体濃度を変えることによってグラフを作成することができる。
【０２２２】
さらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）について、以前に記載された方法（例えば、Dingら, Immunity, 1998 ,8:403-11を参照；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に従い特徴付けられる。
【０２２３】
いくつかの実施形態においては、本発明はin vitroアッセイおよび／または動物モデルにおいて治療用抗体のADCC活性を高める際の本発明の抗体の機能を特徴付けることを包含する。
【０２２４】
特定の実施形態においては、本発明は卵巣癌モデルおよび／または乳癌モデルを用いて腫瘍特異的ADCCを高める上での本発明の抗体の機能を測定することを包含する。
【０２２５】
好ましくは、本発明のADCCアッセイは、少なくとも1つの癌抗原の発現により特徴付けられる（癌抗原の発現レベルは使用する癌細胞株間で様々である）、２以上の癌細胞株を用いて実施される。特定の作用機構に拘束されるものではないが、癌抗原の発現レベルが様々である２以上の細胞株においてADCCアッセイを実施すると、本発明の抗体の腫瘍クリアランスの厳格性の判定が可能になる。一実施形態においては、本発明のADCCアッセイは、癌抗原の発現レベルが異なっている癌細胞株を用いて行われる。
【０２２６】
代表的アッセイにおいては、OVCAR3卵巣癌細胞株は腫瘍抗原Her2/neuおよびTAG-72を発現する腫瘍標的として役立ち；活性化FcγRIIIAおよびFcγRIIAと抑制FcγRIIBを発現するヒト単球はエフェクターとして使用することができ；そして腫瘍特異的マウス抗体ch4D5およびchCC49は腫瘍特異的抗体として使用することができる。OVCAR-3細胞はATCC（受託番号HTB-161）から入手することができる。好ましくは、OVCAR-3細胞は0.01mg/mlウシインスリンを補充した培地中で増殖させる。5x106個の生存OVCAR-3細胞を、年齢と体重を一致させたヌード胸腺欠損マウスにMatrigel（Becton Dickinson）とともに皮下（s.c）注射する。腫瘍の推定重量は式：長さ×(幅)2/2により計算することができ、好ましくは3グラムを超えない。足場依存性腫瘍を6〜8週後に単離し、腫瘍1g当たり1μgのコラゲナーゼ（Sigma）と5mg/mL RNaseを加えることにより細胞を解離させ、細胞ストレーナーおよびナイロンメッシュを通過させて細胞を単離する。次いで細胞を凍結して、異種移植モデルを確立するための皮下注射に備えて長期保存する。
【０２２７】
CC49と4D5抗体を分泌するハイブリドーマは、ATCC受託番号HB-9459およびCRL-3D463から入手可能であり、重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列は公知である（Murrayら, 1994 Cancer 73 (35): 1057-66；Yamamotoら, 1986 Nature, 319:230-4；共に本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。好ましくは、4D5およびCC49抗体を当業者に公知の標準方法を用いてキメラ化し、ヒトFc配列（例えば、IgG1のヒト定常領域）をマウス抗体の可変領域にグラフトしてエフェクター機能を与えるようにする。キメラ4D5およびCC49抗体はそれらの可変領域を介して標的細胞株と結合し、また、それらのFc領域を介してヒトエフェクター細胞上に発現されるFcγRと結合する。CC49はTAG-72（多くの腺癌細胞および卵巣癌上に高度に発現される高分子量ムチン）に対するものである（Lottichら, 1985 Breast Cancer Res. Treat. 6(l):49-56；Mansiら, 1989 Int. J. Rad. Appl. Instrum B. 16(2):127-35；Colcherら, 1991 Int. J. Rad. Appl. Instrum B. 18:395- 41；これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。4D5はヒト上皮増殖因子受容体2に対するものである（Carterら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-9）。その後本発明の抗体を利用して、抑制FcγRIIBをブロックすることにより腫瘍特異的抗体のADCC活性の向上を調べることができる。特定の作用機構に捉われるものではないが、少なくとも１つの活性化FcγR、例えばFcγRIIAを発現するエフェクター細胞が活性化されると、抑制受容体（FcγRIIB）の発現が高まり、これは、FcγRIIAのADCC活性を抑制するので、腫瘍のクリアランスを制限する。しかし、本発明の抗体はブロッキング抗体（すなわち、抑制シグナルが活性化されるのを防止する抗体）として作用し、従って活性化シグナル、例えばADCC活性がより長期間にわたり持続して、強力な腫瘍クリアランスをもたらす。
【０２２８】
好ましくは、ADCC活性の向上に使用する本発明の抗体は、そのFcγRとの結合が減少する（最も好ましくは消失する）ように、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むべく改変されている。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、定常ドメインと活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA）との結合を、本発明の野生型抗体と比較して低減させる一方で、最大限のFcγRIIBブロッキング活性を保持する、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むように改変されている。本発明の抗体は当業者に公知のまたは本明細書に記載のいずれの方法によっても改変させることができる。エフェクター機能を破壊することがわかっているいずれかのアミノ酸改変を、米国特許出願第60/439,498号（2003年1月9日出願）；および第60/456,041号（2003年3月19日出願）（共に本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）などに開示された、本発明の方法に従って使用することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体を、265位が改変されるように、例えば265位がアラニンで置換されるように、改変する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体のマウス定常領域を、265位のアミノ酸のアラニンによる置換を含む対応するヒト定常領域と交換して、エフェクター機能を消失させる一方、FcγRIIBブロッキング活性を維持する。IgG1重鎖の265位の単一アミノ酸変化は、ELISAアッセイに基づいて、FcγRとの結合を顕著に低減させ、腫瘍塊の縮小をもたらしたことが示されている（Shieldsら、2002, J. Biol. Chem., 276(9):6591-604；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。他の実施形態においては、本発明の抗体を、297位を改変する、例えば297位をグルタミンで置換するように改変して、Ｎ結合グリコシル化部位を排除する（例えば、Jefferiesら, 1995, Immunol, lett 44: 111-7；Lundら, 1996, J. Immunol., 157:4963-69；Wrightら, 1994, J. Exp. Med. 180:1087-96；Whiteら, 1997, J. Immunol. 158:426-35を参照；これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。この部位における改変はFcγRとの全ての相互作用を排除すると報じられている。好ましい実施形態においては、本発明の抗体のマウス定常領域を、265および／または297位のアミノ酸の置換を含む対応するヒト定常領域と交換して、エフェクター機能を排除する一方で、FcγRIIBブロッキング活性を維持するようにする。
【０２２９】
本発明の抗体の存在下または不在下で腫瘍特異的抗体のADCC活性を測定するための代表的アッセイは、非放射性ユウロピウムに基づく蛍光アッセイ（BATDA、Perkin Elmer）であり、次のステップを含む：標的細胞を蛍光増強エステルのアセトキシルメチルエステル（該エステルの加水分解により細胞膜との親水性リガンド(TDA)を形成する）で標識するステップ（この複合体は細胞を離れられず、エフェクターによる細胞の溶解時にだけ放出される）；標識した標的を、抗腫瘍抗体と本発明の抗体の存在下でエフェクター細胞に加えるステップ；標的とエフェクター細胞の混合物を6〜16時間、好ましくは37℃にてインキュベートするステップ。ADCC活性の程度は、放出されてユウロピウム（DELFIA試薬；PerkinElmer）と相互作用するリガンドの量を測定することによってアッセイすることができる。リガンドとユウロピウムは、非常に安定な高度に蛍光性のキレート（EuTDA）を生成し、測定された蛍光は溶解された細胞の数に正比例する。比溶解％は、式式により求めることができる：（実験的溶解−抗体非依存性溶解／最大限の溶解−抗体非依存性溶解）×100％。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、蛍光に基づくADCCアッセイの感度が治療用抗体のADCC活性を検出するには低すぎる場合、本発明は、放射性に基づくADCCアッセイ、例えば51Cr放出アッセイを包含する。放射性に基づくアッセイを、蛍光に基づくADCCアッセイの代わりに、またはそれと組み合わせて実施しうる。
【０２３１】
本発明の抗体を特徴付けるための51Cr放出アッセイの代表例は、次のステップを含む：OVCAR-3細胞などの1〜2x106個の標的細胞を51Crで標識するステップ；標的細胞を、抗体4D5とCC49を用いて本発明の抗体の存在下および不在下でオプソニン化し、そして5 x 103個の細胞を96ウェルプレートに加えるステップ（好ましくは、4D5とCC49は1〜15μg/mLの濃度とする）；オプソニン化した標的細胞を単球由来のマクロファージ（MDM）（エフェクター細胞）に加えるステップ（好ましくは、10:1〜100:1の比）；細胞の混合物を16〜18時間37℃にてインキュベートするステップ；上清を回収するステップ；および上清の放射活性を分析するステップ。次いで、本発明の抗体の存在下および不在下での4D5とCC49の細胞傷害性を、例えば次式を用いて求める：比溶解％＝（実験的溶解−抗体非依存性溶解/（最大溶解−抗体非依存性溶解）×100％。
【０２３２】
いくつかの実施形態においては、本発明のFcγRIIB抗体のin vivo活性を異種移植ヒト腫瘍モデルで確認する。腫瘍は前記の癌細胞株のいずれかを用いて確立することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍を２つの癌細胞株（癌抗原の低発現を特徴とする第１の癌細胞株と、同じ癌抗原の高発現を特徴とする第２の癌細胞株）を用いて確立する。その後、腫瘍のクリアランスは、当業者に公知の方法を用いて、第１および第２の癌細胞株上の癌抗原と免疫特異的に結合する抗腫瘍抗体と、ヒト単球およびMDMをエフェクター細胞として養子移入された適当なマウスモデル、例えばBalb/cヌードマウスモデル（例えば、Jackson Laboratories, Taconic）を利用して、判定することができる。次いで前記の抗体のいずれかをこの動物モデルで試験して、腫瘍クリアランスにおける本発明の抗FcγRIIB抗体の役割を評価することができる。本発明に使用することができるマウスとしては、例えばFcγRIII-/-（FcγRIIIAがノックアウトされる）；Fcγ-/-ヌードマウス（FcγRIおよびFcγRIIIAがノックアウトされる）；またはヒトFcγRIIBノックインマウスまたはトランスジェニックノックインマウス（マウス染色体１のfcgr2およびfcgr3遺伝子座が不活性化され、該マウスがヒトFcγRIIA、ヒトFcγRIIA、ヒトFcγRIIB、ヒトFcγRIIC、ヒトFcγRIIIA、およびヒトFcγRIIIBを発現する）が挙げられる。
【０２３３】
本発明の抗体のin vivo活性を試験するための代表的方法は、次のステップを含む：癌抗原の発現を特徴とする癌細胞株を用いて異種移植マウスモデルを確立するステップ；および、腫瘍クリアランスを媒介する上での、癌細胞株に発現された癌抗原に特異的な抗体に対する本発明の抗体の効果を判定するステップ。好ましくは、そのin vivo活性は２つの癌細胞株（第１の癌細胞株は第１の癌抗原が低レベルで発現されることを特徴とし、第２の癌細胞株は同じ癌抗原が第１の癌細胞株と比較して高いレベルで発現されることを特徴とする）を用いて並行して試験する。従って、これらの実験は腫瘍クリアランスにおける本発明の抗体の役割の評価の厳格性を高めるだろう。例えば、腫瘍をIGROV-1細胞株により確立し、そしてHer2/neu特異的抗体の腫瘍クリアランスにおける本発明の抗FcγRIIB抗体の効果を評価する。異種移植腫瘍モデルを確立するためには、5x106個の生存細胞、例えばIGROV-1、SKBR3を、例えばマウス（例えば、8匹の年齢と体重を一致させた雌性ヌード胸腺欠損マウス）に、例えばMatrigel（Becton Dickinson）を用いて、例えば皮下に、注射する。腫瘍の推定重量は式：長さ×(幅)2/2により計算することができ、好ましくは3グラムを超えない。IGROV-1細胞の皮下注射は急速増殖する腫瘍を生じさせ、一方腹腔内経路は腹膜癌腫症を誘発し、マウスは2ヶ月で死亡する（Benardら, 1985, Cancer Res. 45: 4970-9）。IGROV-1細胞は５週以内に腫瘍を形成するので、腫瘍細胞注射後の1日目に、エフェクターとしての単球を、Her2/neuに特異的な治療用抗体（例えばCh4D5）および本発明の抗体（例えば前記のキメラ2B6または3H7）とともに、腹腔内に同時注射する。好ましくは、抗体はマウス体重（mbw）1g当たりそれぞれ4μgを注射する。最初の注射に続いて、抗体の注射を毎週、４〜６週間にわたって2μg/wkにて行う。ヒトエフェクター細胞を２週に１回補充する。マウスの１グループには治療用抗体を投与せず、抗腫瘍抗体および抗FcγRIIB抗体に対するアイソタイプ対照抗体としてN297A突然変異を含むキメラ4D5およびヒトIgG1を注射する。マウスを4グループに分けて、週3回モニ
ターする。
【０２３４】
以下の表５は、本発明による腫瘍クリアランス研究の代表的な設定条件である。表５に示すように、６グループ（各グループ８匹のマウス）が腫瘍クリアランスにおける本発明の抗体の役割を試験するのに必要であり、その際、１つの標的とエフェクター細胞の組合せが使用され、また、２つの異なる抗体濃度の組合せが使用される。グループＡでは腫瘍細胞だけを注射し；グループＢでは腫瘍細胞と単球を注射し；グループＣでは腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体（ch4D5）を注射し；グループＤでは腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体、および抗FcγRII抗体を注射し；グループＥでは腫瘍細胞、単球および抗FcγRIIB抗体を注射し；グループＦでは腫瘍細胞、単球、Ch4D5（N297A）、およびヒトIgG1を注射する。当業者は、様々な抗体濃度の様々な抗体組合せを、記載した腫瘍モデルで試験できることを理解するであろう。好ましくは、乳癌細胞株（例えばSKBR3）を用いる研究を上記の実験と並行して実施する。
【表５】
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【０２３５】
異種移植腫瘍モデルの終点は、腫瘍のサイズ、マウスの体重、生存期間および癌の組織化学的および組織病理学的試験に基づいて、当業者に公知の方法を用いて決定する。表５のマウスのグループをそれぞれ評価する。好ましくはマウスを週３回モニターする。腫瘍増殖の判定基準は、腹部膨張、腹腔の明白な塊の存在でありうる。好ましくは、接種後の日数に対する腫瘍重量の概算値を計算する。グループＤのマウスの上記判定基準の、他のグループとの比較は、腫瘍クリアランスの向上における本発明の抗体の役割を規定するであろう。好ましくは、抗体で処置した動物は、対照グループの後さらに２ヶ月間観察下に置かれる。
【０２３６】
代わりの実施形態においては、エフェクター細胞を養子移入するのではなく、マウスエフェクター細胞上にヒトFcγRIIBを発現するヒトFcγRIIB「ノックイン」マウスを、本発明の抗体のin vivo活性を確立するために用いることができる。ヒトFcγRIIBを発現する創始者マウスは、マウスFcγRIIB遺伝子座へのヒトFcγRIIBの「ノックイン」により作製することができる。次いで創始者をヌードバックグラウンドと戻し交配することができ、ヒトFcγRIIB受容体を発現する。得られるマウスエフェクター細胞は内在性の活性化FcγRIAおよびFcγRIIIAならびに抑制ヒトFcγRIIB受容体を発現する。
【０２３７】
本発明の抗体のin vivo活性はさらに、ヒト一次腫瘍由来の細胞（例えば、ヒト一次卵巣および乳癌由来の細胞）を有する異種移植マウスモデルで試験することができる。癌患者からの腹水および胸膜浸出液サンプルをHer2/neuの発現について当業者に公知の方法を用いて試験する。卵巣癌患者からのサンプルは、腹水を6370gで20分間4℃にて遠心沈降させ、赤血球を溶解し、細胞をPBSで洗浄することにより処理する。腫瘍細胞においてHer2/neuの発現が確認されたら、異種移植腫瘍モデルを確立するための皮下接種用に２つのサンプル、中度および高度の発現体を選択する。次いで単離した腫瘍細胞をマウス中に腹腔内注射して細胞を増殖させる。10匹ほどのマウスに腹腔内注射し、それぞれのマウス腹水をさらに２匹のマウスに継代して、合計20匹のマウスから腹水を取得し、それを用いると80匹のマウスのグループに注射することができる。胸膜浸出液サンプルも腹水と同様の方法を用いて処理することができる。胸膜浸出液サンプルからのHer2/neu+腫瘍細胞をマウスの右上および左上の乳房パッドに注射する。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、腹水または胸膜浸出液サンプル中の新生物細胞の割合が他の細胞サブセットと比較して低い場合は、新生物細胞をin vitroで増やすことができる。他の実施形態においては、腫瘍細胞を、CC49抗体（抗TAG-72）でコーティングした磁性ビーズを用いて、以前に記載された通りに精製することができる（例えば、Barkerら, 2001, Gynecol. Oncol. 82:57,63を参照、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。簡単に説明すると、CC49抗体でコーティングした磁性ビーズを用いて卵巣腫瘍細胞を分離し、37℃にて一夜インキュベーションして細胞をビーズから分離する。いくつかの実施形態においては、腫瘍細胞がTAG-72抗原を欠くのであれば、抗体カクテル、例えばStem Cell Technologies, Inc.（カナダ）から提供される抗体カクテルを用いるネガティブ枯渇（negative depletion）を利用して腫瘍細胞を富化してもよい。
【０２３９】
他の実施形態においては、Her2/neuのほかに、他の腫瘍マーカーを用いて、非腫瘍細胞からの腹水および胸膜浸出液サンプルから得られる腫瘍細胞を分離することができる。胸膜浸出液または乳房組織の場合には、最近、CD44（接着分子）、B38.1（乳癌／卵巣癌特異的マーカー）、CD24（接着分子）をマーカーとして利用しうることが報じられた（例えば、Al Hajj,ら, 2003, Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 100:3983,8を参照のこと；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。腫瘍細胞が精製されたら、これを増やすためにマウスに皮下注射することができる。
【０２４０】
好ましくは、患者の腹水および胸膜浸出液に対して免疫組織化学および組織化学的手法を実施して、新形成の構造的特徴を分析する。このような方法は当業者に公知であって、本発明に包含される。モニターしうるマーカーは、例えばサイトケラチン（炎症性および間葉細胞から卵巣新生物および中皮細胞を同定するため）；カルレチニン（Her2neu陽性新生物細胞から中皮細胞を分離するため）；およびCD45（サンプル中の細胞集団の残りから炎症性細胞を分離するため）を含む。続いてのさらなるマーカーは、CD3（Ｔ細胞）、CD20（Ｂ細胞）、CD56（NK細胞）、およびCD14（単球）を含む。当業者は、上記の免疫組織化学および組織化学的手法が、本発明の方法に用いるいずれの腫瘍細胞にも同様に応用しうることを理解するであろう。腫瘍細胞の皮下接種後に、マウスの臨床的および解剖学的変化を追跡する。必要により、マウスを剖検して、全腫瘍負荷を特定の器官局在化と関係づけてもよい。
【０２４１】
特定の実施形態においては、腫瘍はIGROV-I、OVCAR-8、SK-B、およびOVCAR-3細胞などの癌細胞株ならびにヒト卵巣癌腹水および乳癌患者からの胸膜滲出液を用いて確立される。腹水は試験しようとする抗体に対する腫瘍標的とエフェクターの両方を含有することが好ましい。ヒト単球をエフクターとして移入してもよい。
【０２４２】
本発明の抗体のin vivo活性はまた、FcγRIIBを発現する細胞を注射した動物モデル、例えばBalb/cヌードマウスで試験することもでき、上記細胞としては、限定するものではないが、ATCC受託番号HTB-30をもつSK-BR-3（例えば、Trempら, 1976, Cancer Res. 33-41を参照）；Ｂリンパ球；バーキットリンパ腫由来の細胞、例えば、ATCC受託番号CCL-86をもつRaji細胞（例えば、Epsteinら, 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240を参照）、ATCC受託番号CCL-213をもつDaudi細胞（例えば、Kleinら, 1968, Cancer Res. 28: 1300-10を参照）；卵巣癌細胞株、例えば、ATCC受託番号 HTB-161をもつOVCAR-3（例えば、Hamilton, Youngら, 1983を参照）、SK-OV-3、PA-I、CAOV3、OV-90、およびIGROV-I（NCIレポジトリーから入手可能、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるBenardら, 1985, Cancer Research, 45:4970-9）が挙げられる。
【０２４３】
本発明の抗体のin vivo 活性を測定するための代表的アッセイは次のステップを含む：Balb/cヌード雌マウス（Taconic、MD）に0日目にFcγRIIB発現細胞（5x106個のDaudi細胞など）を、例えば皮下経路で、注射する。マウス（例えば、1グループ5匹のマウス）に、陰性対照としてPBS（陰性対照）、ch4.4.20（抗FITC抗体）を腹腔内注射し、また、陽性対照として本明細書に開示した他の癌治療用抗体、例えばリツキサン(例えば、10μg/gにて)または10μg/gのch2B6を0日目から出発して毎週１回腹腔内注射する。マウスを例えば注射後毎週２回観察し、腫瘍サイズ（長さおよび幅）を、例えばカリパスを用いて、測定する。腫瘍重量（mg）は式：（長さ×幅2）/2を用いて概算する。
【０２４４】
好ましくは、本発明の抗体は、少なくとも14日、少なくとも21日、少なくとも28日、または少なくとも35日の期間にわたって同じ用量、例えば10μg/gを投与したとき、癌治療用抗体と比較して、腫瘍を縮小させる効力の増加がみられる。最も好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、癌治療用抗体を同用量で投与したときと比べて、腫瘍サイズを少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍縮小させる。さらに他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は腫瘍を完全に消滅させる。
【０２４５】
5.3.1  抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の抗体（例えば、ATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をもつそれぞれクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2D11、または1F2から産生されたマウスモノクローナル抗体）、または本発明の免疫感作法により産生された他のモノクローナル抗体、およびそれらのヒト化抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびに上記ポリヌクレオチドの生産方法も含む。
【０２４６】
本発明は、ATCC受託番号PTA-4591をもつ、配列番号27に開示された2B6抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、ATCC受託番号PTA-4591をもつ、配列番号25に開示された2B6抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０２４７】
本発明の方法はまた、様々なストリンジェンシー、例えば、高度のストリンジェンシー、中度のまたは低度のストリンジェンシー条件のもとで、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。ハイブリダイゼーションは様々なストリンジェンシーの条件下で実施することができる。例示であって限定するものでないが、低度のストリンジェンシーの条件を用いる手順は次の通りである（ShiloおよびWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792も参照）。DNAを含有するフィルターを、6時間40℃で、35％ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl（pH 7.5）、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液中で前処理する。ハイブリダイゼーションは同じ溶液中で行うが、次のように変更する：0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％（wt/vol）硫酸デキストラン、および5〜20 X 106cpm 32P-標識プローブの使用。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で18〜20時間40℃にてインキュベートし、次いで1.5時間55℃にて2X SSC、25mM Tris-HCl（pH 7.4）、5mM EDTA、および0.1％SDSを含有する溶液中で洗浄する。洗浄液を新鮮な溶液と取り替え、さらに1.5時間60℃にてインキュベートする。フィルターをブロットして乾燥し、オートラジオグラフィーのために露光する。必要であれば、フィルターを65〜65℃で３回目の洗浄をして、フィルムに再露光する。使用しうる低度のストリンジェンシーの他の条件は当技術分野で周知である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションに使用される）。例示であって限定するものでないが、高度のストリンジェンシー条件を用いる手順は次の通りである。DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを8時間から一夜、65℃で、6X SSC、50mM TRIS-HCL（pH 7.5）、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAから成るバッファー中で実施する。フィルターを48時間、65℃で、100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20 X 106cpmの32P標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中でハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を37℃で1時間、2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll、および0.01％BSAを含有する溶液中で実施する。次いで、50℃で45分間、0.1X SSC中で洗浄した後、オートラジオグラフィーにかける。使用しうる高度のストリンジェンシーの他の条件は当技術分野で周知である。このようなストリンジェンシーの適当な条件の選択は当技術分野で周知である（例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版 , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照；またAusubelら編, Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, （著作権）1987-1997, Current Protocols, （著作権）1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.も参照；特に、Dyson, 1991, 「核酸の固定とハイブリダイゼーション分析（Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis）」 Essential Molecular Biology : A Practical Approach, Vol. 2, T. A. Brown編, pp.111-156, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UKを参照）。
【０２４８】
ポリヌクレオチドは当技術分野で公知のいずれかの方法により得ることができるし、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は当技術分野で公知のいずれかの方法により決定することができる。
【０２４９】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源（例えば、抗体を発現するいずれかの組織または細胞、例えば本発明の抗体（例：2B6または3H7）を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞、から単離された核酸、好ましくはポリA+RNA、から作製されたcDNAライブラリー）からの核酸から、Ig特異的プローブとのハイブリダイゼーションおよび／または配列の3'および5'末端とハイブリダイズしうる合成プライマーを用いるPCR増幅により、または同定すべき特定の遺伝子配列、例えば抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローン、に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングにより、作製することができる。次いでPCRにより作製された増幅核酸を、複製可能なクローニングベクター中に当技術分野で周知のいずれかの方法を用いてクローニングすることができる。
【０２５０】
抗体のヌクレオチド配列が決定されたら、抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を遺伝子操作する当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、位置指定突然変異誘発、PCRなどを用いて遺伝子操作して（例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照、これらは両方とも本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製する、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を行うことができる。
【０２５１】
特定の実施形態においては、１以上のCDRを、ルーチンの組換えDNA技術を用いてフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は天然のまたは共通のフレームワーク領域であってよく、そして好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストは、例えば、Chothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479を参照）。好ましくは、フレームワーク領域とCDRの組み合わせにより作製されるポリヌクレオチドは、上記抗体がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、先に考察したように、１以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内になされ、そして好ましくは、そのアミノ酸置換が本発明の抗体のFcγRIIBとの結合を改善する。ATCC受託番号PTA-5963およびPTA-5964をそれぞれ有する代表的なプラスミド、pMGx608（フレームワークとしてヒトVH1-18およびJH6生殖系配列、2B6マウスCDRおよびヒトIgG1Fc定常領域をもつヒト化2B6重鎖を含有するpCI-neo [Invitrogen, Inc.]）およびpMGx611（フレームワークとしてヒトVK-A26およびJK4、定常領域としてヒトκ、ならびにCDR2にN50→YおよびV51→Aをもつマウス2B6軽鎖CDRをもつヒト化2B6軽鎖を含有するpCI-neo）は、ブダペスト条約に基づいて2004年5月7日にAmerican Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)にそれぞれ寄託され、そしてこれらは本明細書に参照により組み入れられる。これらの重鎖および軽鎖により形成される抗体をh2B6YAと名付けた。
【０２５２】
他の実施形態においては、当技術分野で利用しうるヒトライブラリーまたはいずれかの他のライブラリーを当技術分野で公知の標準技術によりスクリーニングして、本発明の抗体をコードする核酸をクローニングしてもよい。
【０２５３】
5.3.2  抗体の組換え発現
本発明の抗体をコードする核酸配列が得られれば、抗体を産生するためのベクターを、組換えDNA技術により当技術分野で周知の技術を用いて作製することができる。当業者に周知の方法を利用して、抗体をコードする配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えが挙げられる（例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照）。
【０２５４】
抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、通常の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿法）により宿主細胞に導入し、トランスフェクトした細胞を次いで通常の技術により培養して本発明の抗体を産生させることができる。特定の実施形態においては、抗体の発現を構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターにより制御する。
【０２５５】
本発明の組換え抗体を発現するために利用する宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）、または好ましくは、特に組換え免疫グロブリン分子全体を発現するためには、真核生物細胞とすることができる。特に、ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとともに用いる場合の哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO））は免疫グロブリンに対して有効な発現系である（Foeckingら, 1998, Gene 45:101；Cockettら, 1990, Bio/Technology 8:2）。
【０２５６】
様々な宿主-発現ベクター系を利用して本発明の抗体を発現することができる。このような宿主-発現系とは抗体のコード配列を産生し、続いてそれを精製することができる媒体を意味するが、また、適当なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされると本発明の抗体をin situで発現することができる細胞も意味する。これらとしては、限定されるものでないが、微生物、例えば免疫グロブリンコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌（E.coli）および枯草菌（B. subtilis））；免疫グロブリンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびタバコモザイクウイルス（TMV））に感染させたか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、リンパ球（lymphotic cells）（米国特許第5,807,715号を参照）、Per C.6細胞（Crucellが構築したラット網膜細胞））が挙げられる。
【０２５７】
細菌系においては、発現する抗体に対して意図される用途に依って多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するためにこのようなタンパク質を大量に産生させる場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが所望される。このようなベクターとしては、限定されるものでないが、大腸菌（E.coli）発現ベクターpUR278（抗体コード配列を個々にベクター中にlacZコード領域とインフレームでライゲーションして、融合タンパク質が産生されるようにする）（Rutherら, 1983, EMBO J. 2: 1791）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられる。pGEXベクターを利用して、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在のもとでの溶出により容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含み、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から切り離されるように設計されている。
【０２５８】
昆虫系においてはオートグラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）（AcNPV）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして利用する。ウイルスはヨウトガ（Spondptera frugiperda）細胞中で増殖させる。抗体コード配列を個々にウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローニングしてAcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置する。
【０２５９】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三つ組（tripartite）リーダー配列とライゲーションすることができる。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイルスゲノムにin vitroまたはin vivo組換えにより挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、E1またはE3領域）での挿入により、感染した宿主中に生存しかつ免疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照）。特定の開始シグナルも、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンはインサート全体の翻訳を保証するために所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のもので、天然および合成のいずれであってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増大させることができる（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照）。
さらに、挿入配列の発現をモジュレートするかまたは遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾しかつプロセシングして、宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要でありうる。別個の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対する特徴的かつ特異的な機構を有する。発現対象の外来性タンパク質の正しい修飾とプロセシングを保証するために、適当な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核生物宿主細胞を用いてもよい。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものでないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7030およびHs578Bstが挙げられる。
【０２６０】
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生させるためには、安定な発現が好ましい。例えば、安定して本発明の抗体を発現する細胞株を遺伝子操作により作製することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使うよりもむしろ、宿主細胞を適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるDNAおよび選択マーカーを用いて形質転換することができる。外来性DNAを導入した後に、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切替えてもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を与え、細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組込んで増殖してフォーカスを形成するのを可能にするので、続いて細胞をクローニングして細胞株にまで増殖させることができる。この方法を有利に用いて本発明の抗体を発現する細胞株を遺伝子操作で作製することができる。このように遺伝子操作で作製した細胞株は、本発明の抗体と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物をスクリーニングしかつ評価する上で特に有用である。
【０２６１】
多くの選択系を利用することができ、限定されるものでないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子をそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞において使用することができる。また、以下の遺伝子を選択の基礎として、抗代謝産物耐性を用いることができる：メトトレキセート耐性を与えるdhfr（Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo（Clinical Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215)；ならびにハイグロマイシン耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30: 147）。組換えDNA技術の分野で公知かつ利用しうる方法は、Ausubelら編, 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；Dracopoliら(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY. 12および13章；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
【０２６２】
本発明の抗体の発現レベルはベクター増幅により増大させることができる（総説として、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3, Academic Press、New York、1987を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルが増大するとマーカー遺伝子のコピー数は増大しうる。増幅領域は抗体のヌクレオチド配列を伴っているので、抗体の産生も増大するであろう（Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２６３】
宿主細胞を、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターを用いて同時トランスフェクションすることができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドを等しく発現することができる同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを用いてもよい。このような状況では、軽鎖は重鎖の前に配置して、毒性のある遊離の重鎖が過剰になるのを避けるべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322: 52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197）。重鎖および軽鎖をコードする配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０２６４】
本発明の抗体が組換えにより発現されると、これを当技術分野で公知の抗体を精製するためのいずれかの方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡに続いて特異的抗原に対する親和性により、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質を精製するためのいずれかの他の標準技術により精製することができる。
【０２６５】
5.4  予防および治療方法
本発明は、抗体に基づく療法であって、１以上の本発明の抗体を動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトに投与することを含み、疾患、障害、または感染症に関連する症状、FcγRIIBの異常なレベルまたは活性に関連する症状、および／または、FcγRIIB活性に関連する免疫機能を改変するかもしくは第２の治療用抗体の細胞傷害活性を増大させるかもしくはワクチン組成物の効力を増大させることにより治療可能な症状を、予防、治療、または改善するための上記療法を包含する。いくつかの実施形態においては、１以上の本発明の抗体の投与による治療は、１以上の治療の適用、例えば、限定されるものでないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法と組み合わせて行われる。
【０２６６】
抗体は、当技術分野で公知または本明細書に記載した製薬上許容される組成物として提供することができる。以下に詳しく説明するように、本発明の抗体は、癌を治療するための方法（特に受動免疫療法または癌ワクチンの効力を増大するための）、自己免疫疾患、炎症性障害、またはアレルギーを治療するための方法（例えば、アレルギーを治療するためにワクチンの効力を増大するための）に使用することができる。
【０２６７】
FcγRIIB（CD32B）は以下の組織型で発現することが見出されている：脂肪、Ｂ細胞、骨、脳、軟骨、結腸、内分泌、眼、胎児、消化管、尿生殖器、胚細胞、頭頚部、腎、肺、リンパ節、リンパ細網、乳腺、筋肉、神経、卵巣、膵臓、ランゲルハンス島、脳下垂体、胎盤、網膜、皮膚、軟部組織、滑膜、および子宮（the Cancer Genome Anatomy Project of the National Cancer Instituteから入手したデータ）。従って、本発明の抗体はこれらの組織のいずれかにおけるFcγRIIBの活性にアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を及ぼすために用いることができる。例えば、FcγRIIBは胎盤で発現されるので、胎児へのIgGの輸送およびまた免疫複合体のスカベンジングにある役割を果たしうる（Lydenら, 2001, J. Immunol. 166:3882-3889）。本発明のある特定の実施形態においては、抗FcγRIIB抗体を流産促進薬として用いることができる。
【０２６８】
本発明者らは、好中球は意外にも顕著なレベルのFcγRIIBを発現しないことを見出した。従って、本発明は、腫瘍細胞またはマクロファージなどの非好中球細胞型と結合しかつそれらに対する活性を有するが、好中球と検出しうるレベルで結合しないかまたはそれに対して活性を有しない量のCD32特異的抗体を含むものである、これらの方法に使用するための方法および医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体を用いてマクロファージまたはCD32B発現腫瘍細胞などのCD32B＋細胞を枯渇させることができる。
【０２６９】
疾患、障害、もしくは感染症の予防薬および／または治療薬として機能する本発明の抗体を、疾患、障害、もしくは感染症に関連する１以上の症状を治療、予防または改善するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトに投与することができる。本発明の抗体を、FcγRIIBの異常レベルまたは活性に関連するか、かつ／またはFcγRIIB活性に関連する免疫機能を改変することにより治療可能な疾患、障害、もしくは感染症を治療、予防または管理するのに有用な１以上の他の予防薬および／または治療薬と組み合わせて投与することができる。ある特定の実施形態においては、本発明の１以上の抗体を哺乳動物、好ましくはヒトに、癌治療に有用な他の１以上の治療薬とともに同時に投与する。用語「同時に」は、予防薬または治療薬を正確に同じ時点に投与することに限定されるのでなく、むしろ本発明の抗体と他の薬剤を被験者に連続的かつ本発明の抗体が他の薬物と一緒に作用しうるような時間間隔内に投与して、それらがそのように投与されなかった場合よりも増加した利益を与えることを意味する。例えば、それぞれの予防薬または治療薬を同じ時点で投与するかまたは異なる時点でいずれかの順序で続けて投与してもよい；しかし、もし同じ時点で投与しない場合、それらは十分近い時点で投与して所望の治療効果または予防効果をもたらすようにするべきである。それぞれの治療薬を別々に、いずれの適当な剤形で、そしていずれの好適な経路により投与してもよい。
【０２７０】
様々な実施形態においては、予防薬または治療薬を1時間未満だけ離して、約1時間離して、約1時間〜約2時間離して、約2時間〜約3時間離して、約3時間〜約4時間離して、約4時間〜約5時間離して、約5時間〜約6時間離して、約6時間〜約7時間離して、約7時間〜約8時間離して、約8時間〜約9時間離して、約9時間〜約10時間離して、約10時間〜約11時間離して、約11時間〜約12時間離して、24時間以下離してまたは48時間以下離して投与する。好ましい実施形態においては、２以上の成分を同じ患者通院の際に投与する。
【０２７１】
本明細書中で提供される投与量と投与頻度は、治療上有効かつ予防上有効との用語に包含される。投与量と投与頻度はさらに、典型的には、それぞれの患者に特有の因子によって、投与される特定の治療薬または予防薬、癌の重症度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に依存して変化しうる。医師はこのような因子を考慮することにより、そして例えば文献に報告されかつPhysician's Desk Reference（第56版、2002）に推奨される投与量に従って、好適な治療計画を選択することができる。
【０２７２】
本発明の抗体はまた、FcγRIIBが、例えば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大させ、かつ免疫応答を増大させるために機能するのを促進する他のモノクローナルもしくはキメラ抗体、Fc融合タンパク質と組み合わせて、またはリンホカイン、サイトカインまたは造血性増殖因子（例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-10およびTGF-βなど）と併用して、有利に用いることができる。ある特定の実施形態においては、サイトカインを抗FcγRIIB抗体とコンジュゲートする。
【０２７３】
本発明の抗体はまた、例えば、以下の第5.4.6節および第5.4.5節に詳しく記載するように、疾患、障害、もしくは感染症を治療するために用いる１以上の薬物、例えば抗癌剤、抗炎症性薬または抗ウイルス薬と一緒に有利に用いることができる。
【０２７４】
5.4.1  癌
本発明の抗体は単独で、または当技術分野で公知の他の治療用抗体と一緒に用いて原発性腫瘍の増殖または癌性細胞の転移を抑制もしくは低減することができる。一実施形態においては、本発明の抗体を癌免疫療法に用いる抗体と一緒に用いることができる。本発明は、このような免疫療法の効力を、治療用抗体のエフェクター機能（例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン作用など）の効力を増大させることにより強化するための、本発明の抗体の他の治療用抗体との併用を包含する。特定の作用機構により束縛されることを意図しないが、本発明の抗体は、好ましくは単球およびマクロファージ上のFcγRIIBをブロックして、例えば、FcγRの活性化を介する腫瘍のクリアランスを強化することにより、治療上の利益である腫瘍特異的抗体の臨床上の効力を増大させる。従って、本発明は、癌抗原と特異的に結合しかつ細胞傷害性である他の抗体と組み合わせて投与するときに、ある癌抗原により特徴付けられる癌を予防または治療する方法を提供する。本発明の抗体は、特に細胞傷害活性をもつ癌抗原特異的治療用抗体の細胞傷害活性を強化して本発明の抗体による腫瘍細胞死滅を強化する上で、および／または例えば治療用抗体のADCC活性またはCDC活性を増大する上で、癌の予防または治療に有用である。本発明のある特定の実施形態においては、本発明の抗体をFc融合タンパク質とともに投与する。特定の実施形態においては、本発明の抗体は、単独でまたは細胞傷害性治療用抗体と組み合わせて投与すると、原発性腫瘍の増殖または癌細胞の転移を、本発明の上記抗体の不在のもとでの原発性腫瘍の増殖または転移と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％だけ抑制または低減する。好ましい実施形態においては、細胞傷害性治療用抗体と組み合わせた本発明の抗体は、原発性腫瘍の増殖または癌の転移を、上記抗体の不在のもとでのその増殖または転移と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％だけ抑制または低減する。
【０２７５】
正常状態から悪性状態への移行は、遺伝的およびエピジェネティックな変化を含む多段階プロセスである。実際、この進行を容易にする多数の変化が細胞調節回路に起こって、それにより腫瘍細胞は、通常、組織ホメオスタシスを調節する終末分化と静止状態との連帯を免れうるようになる。ある特定の遺伝子は癌細胞の浸潤および転移潜在性と関係付けられ、そのような遺伝子とは例えばCSF-1（コロニー刺激因子1またはマクロファージコロニー刺激因子）である。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、CSF-1は腫瘍部位へマクロファージを動員して腫瘍の進行を促進することにより、腫瘍進行および転移を媒介しうる。マクロファージは、恐らく血管形成因子、例えばチミジンホスホリラーゼ、血管内皮由来増殖因子の分泌；増殖因子、例えば腫瘍細胞上で傍分泌因子として作用しうる上皮増殖因子などの増殖因子の分泌により、腫瘍進行および転移を媒介する上で栄養的役割を有し、従って、血管中への腫瘍細胞遊走および浸潤を促進すると考えられる（例えば、Linら, 2001, J. Exp. Med. 193(6):727-739；Linら, 2002, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasam 7(2):147-162；Schollら, 1993, Molecular Carcinogenesis, 7:207-11；Clynesら, 2000, Nature Medicine, 6(4):443-446；Fidlerら, 1985, Cancer Research, 45:4714-26を参照）。
【０２７６】
本発明は、本発明の抗体を用いてマクロファージ介在性腫瘍細胞進行および転移をブロックすることを包含する。本発明の抗体は、マクロファージ浸潤が起こる固形腫瘍を治療する上で特に有用である。本発明のアンタゴニスト性抗体は、腫瘍部位に局在化するマクロファージの集団を低減または排除することにより、腫瘍細胞転移を制御、例えば低減または排除するのに特に有用である。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は単独で腫瘍細胞転移を制御するために使用される。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、単独で投与すると、本発明のアンタゴニスト性抗体は、マクロファージ上の抑制性FcγRIIBと結合し、そして効果的にマクロファージの集団を縮小し、従って腫瘍細胞進行を制限する。FcγRIIBは活性化した単球および腫瘍浸潤性マクロファージを含むマクロファージ上に優先的に発現するので、本発明のアンタゴニスト性抗体は腫瘍部位に局在するマクロファージを低減するか、または好ましくは排除する。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、限定されるものでないが、乳癌、子宮癌および卵巣癌を含む、CSF-1の過剰発現により特徴付けられる癌の治療に使用される。
【０２７７】
本発明はさらに、FcγRIIBを発現するマクロファージ以外の免疫細胞、例えば樹状細胞およびＢ細胞を効果的に除去または排除する抗体を包含する。本発明の抗体を用いる免疫細胞の効果的な除去または排除は、免疫細胞の集団の50％、60％、70％、80％、好ましくは90％、そして最も好ましくは99％までの低減でありうる。従って、本発明の抗体は、単独で、または第２の抗体、例えば、抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体、および抗微生物抗体などの治療用抗体と組み合わせて治療効力を増大させる。いくつかの実施形態においては、治療用抗体は癌細胞または炎症性細胞に対して特異性を有する。他の実施形態においては、第２抗体は正常細胞と結合する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体をFcγRIIBを発現する免疫細胞を除去するために単独で使用する場合、細胞集団が再分布して、残りの細胞が効率的に活性化Fc受容体を有することになり、FcγRIIBによる抑制は軽減される。
【０２７８】
本発明の方法および組成物により治療または予防することができる癌および関係する障害としては、限定されるものでないが、以下が挙げられる：白血病（例えば、限定されるものでないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病（例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病（erytroleukemia leukemias）および脊髄異形成症候群）、慢性白血病（例えば、限定されるものでないが、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病））；赤血球増加症（polycythemia vera）；リンパ腫（例えば、限定されるものでないがホジキン病、非ホジキン病）；多発性骨髄腫（例えば、限定されるものでないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、単発性形質細胞腫および髄外形質細胞腫）；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性モノクローナル免疫グロブリン血症；重鎖病；骨および結合組織肉腫（例えば限定されるものでないが、骨肉腫（bone sarcoma）、骨肉腫（osteosarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（hemangiosarcoma）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫）；脳腫瘍（例えば限定されるものでないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫）；乳癌（例えば、限定されるものでないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状腺乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌）；副腎癌（例えば、限定されるものでないが、褐色細胞腫および副腎皮質性癌）；甲状腺癌（例えば、限定されるものでないが乳頭性または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌）；膵臓癌（例えば、限定されるものでないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍）；下垂体癌（例えば、限定されるものでないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症）；眼癌（例えば、限定されるものでないが、眼黒色腫（例えば虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫、および網膜芽細胞腫））；膣癌（例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、腺癌、および黒色腫）；外陰部癌（例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病）；頸癌（例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌）；子宮癌（例えば、限定されるものでないが、子宮内膜癌および子宮肉腫）；卵巣癌（例えば、限定されるものでないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍）；食道癌（例えば、限定されるものでないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌）；胃癌（例えば、限定されるものでないが、腺癌、肉芽腫性（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、散在拡���型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫）；結腸癌；直腸癌；肝臓癌（例えば、限定されるものでないが、肝細胞性癌および肝芽腫、胆嚢癌（例えば、限定されるものでないが、腺癌））；胆管癌（例えば、限定されるものでないが、乳頭状癌、結節型および散在型）；肺癌（例えば、限定されるものでないが、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌）；精巣癌（例えば、限定されるものでないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非精上皮腫、胚性癌、テラトーマ癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍））；前立腺癌（例えば、限定されるものでないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫）；陰茎癌；口腔癌（例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌）；基底癌；唾液腺癌（例えば、限定されるものでないが、腺癌、粘膜表皮性癌、および腺様嚢胞癌）；咽頭癌（例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、およびいぼ状）；皮膚癌（例えば、限定されるものでないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌および黒色腫（表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端部黒子黒色腫））；腎臓癌（例えば、限定されるものでないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂および／または子宮））；ウィルムス腫瘍；膀胱癌（例えば、限定されるものでないが、移行細胞癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫）。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、骨膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原生癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる（このような障害の総説としては、Fishmanら, 1985, Medicine, 第2版, J. B. Lippincott Co. , Philadelphia、およびMurphyら, 1997, Informed Decisions : The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照）。
【０２７９】
従って、本発明の方法と組成物はまた、様々な癌もしくは他の異常増殖性疾患の治療または予防に有用であり、それらの疾患としては（限定されるものでないが）、以下が挙げられる：癌（例えば、膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌；例えば扁平上皮細胞癌）；リンパ系統の造血性腫瘍（例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）；骨髄球性系統の造血性腫瘍（例えば、急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病）；間葉起源の腫瘍（例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫）；他の腫瘍（例えば、黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠腫）；中枢および末梢神経性系の腫瘍（例えば、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫）；間葉起源の腫瘍（例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫）；および他の腫瘍（例えば、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌）。アポトーシスにおける異常により生じる癌を本発明の方法と組成物により治療することも意図される。このような癌としては、限定されるものでないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異をもつ癌、ホルモン依存性の乳房、前立腺および卵巣腫瘍、ならびに前癌病変、例えば家族性腺腫様ポリープ症、および骨髄形成異常症候群が挙げられる。特定の実施形態においては、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、もしくは子宮における悪性腫瘍または異常増殖性変化（例えば、化生および異形成症）、または過剰増殖性障害を本発明の方法と組成物により治療または予防する。他の特定の実施形態においては、肉腫、黒色腫、もしくは白血病を本発明の方法と組成物により治療または予防する。
【０２８０】
癌抗原と関係する癌は、癌抗原と結合しかつ細胞傷害性である抗体と組み合わせて、本発明の抗体の投与により治療または予防することができる。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体は、特定の癌抗原に対する抗体の、抗体依存性細胞傷害性効果を増大する。例えば、限定されるものでないが、以下の癌抗原と関係する癌は、本発明の抗体により治療または予防することができる：KS 1/4汎癌抗原（PerezおよびWalker, 1990, J. Immunol. 142:32-37；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415）、卵巣癌抗原（CA125）（Yuら, 1991, Cancer Res. 51(2):48-475）、前立腺酸性リン酸（prostatic acid phosphate）（Tailorら, 1990, Nucl. Acids Res. 18 (1) : 4928）、前立腺特異的抗原（HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910；Israeliら, 1993, Cancer Res. 53:227-230）、黒色腫関係抗原p97（Estinら, 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44）、黒色腫抗原gp75（Vijayasardahlら, 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380）、高分子量黒色腫抗原（HMW-MAA）（Nataliら, 1987, Cancer 59:55-3；Mittelmanら, 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144））、前立腺特異的膜抗原、癌胎児抗原（CEA）（Foonら, 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294）、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結腸直腸腫瘍関係抗原、例えば：CEA、TAG-72（Yokataら, 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408）、C017-1A（Ragnhammarら, 1993, Int. J. Cancer 53:751-758）；GICA 19-9（Herlynら, 1982, J Clin. Immunol. 2: 135）、CTA-1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原38.13、CD19（Ghetieら, 1994, Blood 83: 1329-1336）、ヒトB-リンパ腫抗原-CD20（Reffら, 1994, Blood 83:435-445）、CD33（Sgourosら, 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430）、黒色腫特異的抗原（例えばガングリオシドGD2（Salehら, 1993, J. Immunol., 151,3390-3398）、ガングリオシドGD3（Shitaraら, 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380）、ガングリオシドGM2（Livingstonら, 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044）、ガングリオシドGM3（Hoonら, 1993, Cancer Res. 53: 5244- 5250））、細胞表面抗原の腫瘍特異的移植型（TSTA）（例えばウイルスにより誘導された腫瘍抗原、例えばT-抗原DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、腫瘍胎児性抗原-α-フェトプロテイン（例えば結腸、膀胱腫瘍胎児性抗原のCEA（Hellstromら, 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188））、分化抗原（例えばヒト肺癌抗原L6、L20（Hellstromら, 1986, Cancer Res. 46:3917-3923））、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原-Gp37（Bhattacharya-Chatterjeeら、1988、J. of Immun. 141:1398-1403）、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原（例えばEGFR（上皮増殖因子受容体））、HER2抗原（p185HER2）、多形性上皮ムチン（PEM）（Hilkensら, 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359）、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1（Bernhardら, 1989, Science 245:301-304）、分化抗原（Feizi, 1985, Nature 314:53-57）（例えば、胎性赤血球および一次内胚葉に見出されるＩ抗原、胃腺癌に見出されるI（Ma）、乳上皮に見出されるM18およびM39、骨髄性細胞に見出されるSSEA-1、結腸直腸癌に見出されるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、およびD156-22、TRA-1-85（血液型H）、結腸腺癌に見出されるC14、肺腺癌に見出されるF3、胃癌に見出されるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞に見出されるLey、TL5（血液型A）、A431細胞に見出されるEGF受容体、膵臓癌に見出されるE1シリーズ（血液型B）、胚性癌細胞に見出されるFC10.2、胃腺癌、腺癌に見出されるCO-514（血液型Lea）、腺癌に見出されるNS-10、結腸腺癌に見出されるCO-43（血液型Leb）、G49、EGF受容体、（血液型群ALeb/Ley）、結���癌に見出される19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に見出されるT5A7、黒色腫に見出されるR24、胚性癌細胞に見出される4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、ならびに4〜8細胞胚に見出されるSSEA-3、SSEA-4。他の実施形態においては、抗原は皮膚Ｔ細胞リンパ腫から得たＴ細胞受容体由来ペプチドである（Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照）。
【０２８１】
本発明の抗体を当技術分野で公知のいずれかの治療癌抗体と併用して治療効力を増大させることができる。例えば、本発明の抗体を、癌治療での治療上の効用が示されている表７の抗体のいずれかとともに用いることができる。本発明の抗体は、上記治療癌抗体の少なくとも一つの抗体介在性エフェクター機能を増大させることにより治療癌抗体の治療効力を増大させる。ある特定の実施形態においては、抗体は、上記治療癌抗体の補体依存性カスケードを増強することによりその治療効力を増大させる。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は、標的化した腫瘍細胞の食作用とオプソニン作用を増強することによりその治療効力を増大させる。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は、標的化した腫瘍細胞の破壊における抗体依存性細胞介在性細胞傷害（「ADCC」）を増強することによりその治療効力を増大させる。
【０２８２】
本発明の抗体は、生得および獲得免疫応答のアクチベーターとして開発されたか（Coley Pharmaceuticals）または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）系製品と併用することもできる。例えば、本発明は、癌を治療および／または予防するための本発明の方法と組成物における、CpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）の使用を包含する（Warrenら, 2002, Semin Oncol., 29 (1 Suppl 2):93-7；Warrenら, 2000, Clin Lymphoma, 1(1):57-61も参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２８３】
本発明の抗体を、治療効果を細胞死滅を介して仲介するのではない治療用抗体と併用し、抗体の治療活性を強化することができる。特定の実施形態においては、本発明はアゴニスト活性を有する治療的アポトーシス誘導抗体、例えば抗Fas抗体との併用での本発明の抗体の使用を包含する。抗Fas抗体は当技術分野で公知であり、例えば、Jo2（Ogasawaraら, 1993, Nature 364:806）およびHFE7（Ichikawaら, 2000, Int. Immunol. 12:555）を含む。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、FcγRIIBは、抗Fas介在性アポトーシスを促進することが示唆されており、例えば、Xuら, 2003, Jounal of Immunology, 171: 562-568を参照されたい。実際、FcγRIIBの細胞外ドメインはFas受容体に対する架橋剤として役立ち、機能性複合体を形成させてFas依存性アポトーシスを促進することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は抗Fas抗体とFcγRIIBの相互作用をブロックし、Fas介在性アポトーシス活性の低減をもたらす。Fas介在性アポトーシス活性の低下をもたらす本発明の抗体は、望ましくない副作用、例えば肝毒性を有する抗Fas抗体と組み合わせると特に有用である。他の実施形態においては、本発明の抗体は抗Fas抗体とFcγRIIBの相互作用を増大させ、Fas介在性アポトーシス活性の増大をもたらす。アゴニスト活性を有する治療的アポトーシス誘導抗体と本発明の抗体との組合せは、増大した治療効力を有する。
【０２８４】
本発明の方法で用いる治療的アポトーシス誘導抗体は、アポトーシス経路をモジュレートすることが当技術分野で公知のいずれかの細胞死受容体、例えば、TNFR受容体ファミリーに特異的であってもよい。
【０２８５】
本発明は、傷害されたアポトーシス介在シグナル伝達による疾患、例えば、癌、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態においては、本発明は不十分なFas介在アポトーシスによる疾患を治療する方法を包含し、該方法は本発明の抗体を抗Fas抗体と組み合わせて投与することを含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態においては、本発明のアゴニスト性抗体は、黒色腫細胞の腫瘍をはじめとする非造血性由来の腫瘍を治療するのに特に有用である。特定の作用機構に束縛されるものではないが、本発明のアゴニスト性抗体の効力は、部分的には、黒色腫細胞の腫瘍をはじめとする非造血性由来の腫瘍がFcγRIIBを発現することによる、FcγRIIB抑制経路の活性化に起因する。最近の実験は、実際、黒色腫細胞におけるFcγRIIBの発現は、抗腫瘍抗体との直接的な相互作用により（例えば、抗腫瘍抗体のFc領域と結合することにより）細胞質内に依存する方法で腫瘍増殖をモジュレートすることを示している（Cassardら, 2002, Journal of Clinical Investigation, 110(10):1549-1557）。
【０２８７】
いくつかの実施形態においては、本発明は、腫瘍細胞それ自身に発現されないでむしろ腫瘍間質を含む周囲の反応性かつ腫瘍支持性非悪性細胞に発現される腫瘍抗原と免疫特異的に結合する治療用抗体と、本発明の抗体との併用を包含する。腫瘍間質は、新血管を形成する内皮細胞および腫瘍脈管構造を取り囲む間質繊維芽細胞を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗体を、内皮細胞上の腫瘍抗原と免疫特異的に結合する抗体と併用する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体を、繊維芽細胞上の腫瘍抗原、例えば繊維芽細胞活性化タンパク質（FAP）と免疫特異的に結合する抗体と併用する。FAPは、限定されるものでないが、肺癌、乳癌、および結腸直腸癌をはじめとする多くの固形腫瘍の間質繊維芽細胞に強く発現する95KDaのホモダイマーII型糖タンパク質である（例えば、Scanlanら, 1994, Proc. Natl. Acad. USA, 91:5657-61；Parkら, 1999, J. Biol. Chem., 274:36505-12；Rettigら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3110-3114；Garin-Cheseaら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7235-7239を参照)。FAPと免疫特異的に結合する抗体は当技術分野で公知であって本発明の範囲に包含され、例えば、Wuestら, 2001, Journal of Biotechnology, 159-168；Mersmannら, 2001, Int. J. Cancer, 92:240-248；米国特許第6,455,677号を参照されたい（これらの全ては参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）。
【０２８８】
最近、IgEは腫瘍増殖のメディエーターであることが示唆されていて、実際、IgEを標的化した即時型過敏性およびアレルギー炎症応答は抗腫瘍応答に関わる可能性がある天然の機構であることが提案されている（総説として、例えば、Millsら, 1992, Am. Journal of Epidemiol. 122:66-74；Erikssonら, 1995, Allergy 50:718-722を参照）。実際、最近の研究は、IgEを腫瘍細胞に与えると腫瘍増殖が低減され、いくつかの事例では腫瘍拒絶が起こることを示している。その研究によれば、IgEを与えた腫瘍細胞は治療ポテンシャルを持つだけでなく、生得免疫エフェクター機構およびＴ細胞依存性適応性免疫応答の活性化をはじめとする長期の抗腫瘍免疫をもたらす（Realiら, 2001, Cancer Res. 61:5516-22を参照；これは参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）。本発明のアンタゴニスト性抗体は、IgEを介した癌治療の効力を増強するために、IgEの投与と組み合わせて、癌を治療および／または予防するために使用することができる。特定の作用機構に束縛されものでないが、本発明の抗体は腫瘍のIgE治療の治療効力を、抑制経路をブロックすることにより増強する。本発明のアンタゴニスト性抗体は、(i)腫瘍増殖の遅延を増大させること；(ii)腫瘍進行の速度の低下を増大させること；(iii)腫瘍拒絶を増大させること；または(iv)IgE単独による癌の治療と比較して保護免疫を増大させることにより、IgEを介した癌治療の治療効力を増強することができる。
【０２８９】
癌治療薬ならびにそれらの投与量、投与経路および推奨される用法は当技術分野で公知であって文献に記載されている。例えば、Physician's Desk Reference（第56版、2002）を参照されたい（これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２９０】
5.4.1.1  Ｂ細胞性悪性腫瘍
本発明は抗FcγRIIB抗体を動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトに投与して、Ｂ細胞性悪性腫瘍もしくはその１以上の症状を予防、治療、管理または改善することを含む療法を包含する。これらの療法は現行の療法を越える向上をもたらす。ある特定の事例においては、現行療法に不応である患者を本発明の方法を用いて治療することができる。いくつかの実施形態においては、１以上の本発明の抗体の投与による療法を、限定されるものでないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法などの１以上の療法の適用と組み合わせる。
【０２９１】
本発明は、Ｂ細胞性悪性腫瘍、またはその１以上の症状に対する現行の単剤療法または併用療法より優れた予防および治療プロファイルを提供する治療プロトコルを包含する。本発明は、Ｂ細胞性悪性腫瘍、もしくはその１以上の症状を予防、治療、管理、または改善するためのFcγRIIB抗体に基づく療法を提供する。特に本発明は、Ｂ細胞性悪性腫瘍、もしくはその１以上の症状を予防、治療、管理、または改善するための予防および治療プロトコルを提供し、該プロトコルはFcγRIIB特異的抗体、その類似体、誘導体または抗原断片をそれを必要とする被験者に投与することを含んでなる。
【０２９２】
本発明のアゴニスト性抗体は、Ｂ細胞性悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病を治療または予防するのに有用である。他のＢ細胞性悪性腫瘍には小リンパ球リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性小型切れ込み細胞リンパ腫、ほとんどの濾胞性リンパ腫およびいくつかのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）が含まれる。FcγRIIBは、悪性リンパ腫、特にＢ細胞非ホジキンリンパ腫での染色体転座による脱調節の標的である（Callanan M. B.ら, 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(1):309-314を参照）。従って、本発明の抗体は、いずれかのＢ細胞系統の慢性リンパ性白血病を治療または予防するのに有用である。Ｂ細胞系統の慢性リンパ性白血病については、Freedmanが総説している（Freedman, 1990, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4:405による総説を参照）。いずれの作用機構に束縛されることも意図しないが、本発明のアゴニスト性抗体は、Ｂ細胞増殖および／もしくは活性化を抑制してＢ細胞性悪性腫瘍を抑制または予防する。本発明はまた、Ｂ細胞性悪性腫瘍を予防および／または治療するための当技術分野で公知の他の療法（例えば、化学療法および放射線療法）と本発明のアゴニスト性抗体との併用も包含する。本発明はまた、Ｂ細胞性悪性腫瘍を予防および／または治療するための当技術分野で公知の他の抗体と本発明のアゴニスト性抗体との併用も包含する。例えば、本発明のアゴニスト性抗体は、Goldenbergら（米国特許第6,306,393号）により開示されている抗C22もしくは抗CD19抗体；抗CD20抗体、抗CD33抗体、または抗CD52抗体と併用することができる。
【０２９３】
本発明の抗体はまた、例えば、限定されるものでないが、Oncoscint（標的：CEA）、Verluma（標的：GP40）、Prostascint（標的：PSMA）、CEA-SCAN（標的：CEA）、リツキシン（Rituxin）（標的：CD20）、ハーセプチン（Herceptin）（標的：HER-2）、キャンパス（Campath）（標的：CD52）、Mylotarge（標的：CD33）、LymphoCide（CD22）、Lymphocide Y-90（CD22）およびゼバリン（Zevalin）（標的：CD20）と併用することができる。
【０２９４】
5.4.2  自己免疫疾患および炎症性疾患
本発明のアゴニスト性抗体を用いて自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を治療または予防することができる。本発明は、被験者における自己免疫性もしくは炎症性障害に関連する１以上の症状を予防、治療、または管理する方法を提供し、該方法は上記被験者に治療上有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む。本発明はまた、被験者における炎症性障害に関連する１以上の症状を予防、治療、または管理する方法であって、上記被験者に治療上有効な量の１以上の抗炎症剤を投与することをさらに含む方法も提供する。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する１以上の症状を予防、治療、または管理する方法であって、上記被験者に治療上有効な量の１以上の免疫調節剤を投与することをさらに含む方法も提供する。第5.4.5節は、抗炎症剤および免疫調節剤の非限定的な例を提供する。
【０２９５】
本発明の抗体はまた、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を治療および／または予防するための当技術分野で公知のいずれかの抗体と併用することもできる。炎症性障害を治療もしくは予防するために使用される抗体またはFc融合タンパク質の非限定的な例を表6Aに示し、そして自己免疫障害を治療もしくは予防するために使用される抗体またはFc融合タンパク質の非限定的な例を表6Bに示す。本発明の抗体は、例えば、表6Aおよび表6Bに示す治療用抗体またはFc融合タンパク質の治療効力を増大させることができる。例えば、限定されるものでないが、本発明の抗体は表6Aもしくは表6Bの抗体またはFc融合タンパク質のいずれかにより処置される被験者の免疫応答を増大させることができる。
【０２９６】
本発明の抗体はまた、例えば限定されるものでないが、オルトクローン（Orthoclone）OKT3、レオプロ（ReoPro）、ゼナパックス（Zenapax）、シムレクト（Simulec）、リツキシマブ（Rituximab）、シナジス（Synagis）およびレミケード（Remixade）と併用することもできる。
【０２９７】
本発明の抗体を、生得および獲得免疫応答のアクチベーターとして開発されたか（Coley Pharmaceuticals）または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）に基づく製品と併用することもできる。例えば、本発明は、自己免疫性もしくは炎症性障害を治療および／または予防するための本発明の方法と組成物における、CpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）の使用を包含する（Weeratnaら, 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71、これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２９８】
本発明の抗体を投与することにより治療できる自己免疫障害の例としては、限定されるものでないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スプルー皮膚炎（celiac sprue-dermatitis）、慢性疲労免疫機能障害症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギヤン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分別脊椎関節症、未分別関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染または慢性細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。本明細書の第3.1節に記載の通り、いくつかの自己免疫障害は炎症性症状と関連している。例えば、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害と考えられる障害の間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害としても特徴付けられる。本発明の方法によって予防、治療または管理することができる炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分別脊椎関節症、未分別関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染または慢性細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。
【０２９９】
本発明のある特定の実施形態においては、本発明の抗体を用いて一方の性でより一般的な自己免疫性疾患を治療することができる。例えば、女性でのグレーヴズ病の優勢はFcγRIIBの発現に関連している（Estienneら, 2002, FASEB J. 16:1087-1092を参照）。
【０３００】
本発明の抗体を用いて炎症性障害を患う動物、特に哺乳動物が経験する炎症を軽減することもできる。特定の実施形態においては、抗体は動物の炎症を、上記抗体を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％まで軽減することができる。他の実施形態においては、抗体の組合せは動物の炎症を、上記抗体を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％まで軽減することができる。
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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5.4.3  アレルギー
本発明は、それを必要とする被験者におけるIgE依存性および／またはFcγRI介在性アレルギー障害を治療もしくは予防する方法であって、上記被験者に治療上有効な量の本発明のアゴニスト性抗体またはそのフラグメントを投与することを含む上記方法を提供する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体は、急性および遅発性アレルギー応答に寄与するFcεRI誘導性肥満細胞活性化を抑制するのに有用である（Metcalfe D.ら 1997, Physiol. Rev. 77:1033）。好ましくは、本発明のアゴニスト性抗体は、当技術分野で使用されているIgE依存性アレルギー障害を治療もしくは予防する通常の方法と比較して、増大された治療効力および／または低下した副作用を有する。IgE依存性アレルギー障害を治療および／または予防する通常の方法としては、限定されるものでないが、抗炎症剤（例えば、経口および吸入による喘息用の副腎皮質ステロイド）、抗ヒスタミン薬（例えば、アレルギー鼻炎およびアトピー性皮膚炎用）、システイニルロイコトリエン（例えば、喘息治療用）；抗IgE抗体；および特定の免疫療法または脱感作が挙げられる。
【０３０１】
IgE依存性アレルギー応答の例としては、限定されるものでないが、喘息、アレルギー鼻炎、胃腸アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、アトピー性皮膚炎、じんま疹、アナフィラキシー、または糸球体腎炎が挙げられる。
【０３０２】
本発明は、FcγRIおよびヒトFcγRIIBと複合体を形成する分子、すなわちFcγRIおよびヒトFcγRIIBと特異的に結合するように遺伝子操作で作製した分子、例えば免疫グロブリンを包含する。好ましくは、このような分子は、IgEおよびFcγRIが介在する障害に治療効力を有する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、これらの遺伝子操作した分子の治療効力は、部分的には、肥満細胞および好塩基球機能を抑制するその能力に起因する。
【０３０３】
特定の実施形態においては、FcγRIおよびヒトFcγRIIBと特異的に結合する分子は、FcγRIに対する結合部位およびFcγRIIBに対する結合部位を含むキメラ融合タンパク質である。このような分子は、当業者に公知の標準的な組換えDNA法に従って遺伝子操作で作製することができる。好ましい特定の実施形態においては、本発明の方法に用いるキメラ融合タンパク質はhuFcγを抗FcγRIIBモノクローナル抗体のF(ab')単鎖のC末端領域と連結するためのブリッジとして使われる領域と融合した本発明の抗FcγRIIBモノクローナル抗体のF(ab')単鎖を含む。本発明の方法に用いるキメラ融合タンパク質の一例は以下を含む：VL/CH(FcγRIIB)-ヒンジ-VH/CH(FcγRIIB)-リンカー-CHε2-CHε3-CHε4。キメラ分子用のリンカーは長さが５、10、好ましくは15アミノ酸であってもよい。リンカーの長さを変えて分子のFcγRIIBおよびFcεRIとの結合を最適化してもよい。リンカーの長さを変化させることで該分子のFcγRIIBおよびFcγRI両者への最適な結合が得られる。特定の実施形態においては、リンカーは15アミノ酸リンカーであり、配列：(Gly4Ser)3から成る。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、フレキシブルなペプチドリンカーは鎖対合を容易にしかつ起こりうる再フォールディングを最小化し、そしてこのリンカーはまた、キメラ分子が２つの受容体、すなわち、細胞上のFcγRIIBおよびFcγRIに到達してそれらを架橋することを可能にするであろう。好ましくは、キメラ分子を、適合しうるプロモーター（例えばサイトメガロウイルスプロモーター）とともに哺乳動物発現ベクター（例えばpCI-neo）中にクローニングする。本発明の方法に従って調製される融合タンパク質は、FcεRI（CHε2CHε3）に対する結合部位およびFcγRIIB（VL/CL、-ヒンジ-VH/CH）に対する結合部位を含有しうる。本発明の方法に従って調製される融合タンパク質をコードする核酸を、好ましくは、293細胞にトランスフェクトして、分泌されるタンパク質を当技術分野で公知の通常の方法を用いて精製する。
【０３０４】
キメラ分子のヒトFcεRIおよびFcγRIIBの両方との結合は、FcγRとの結合を決定するための当業者に公知の通常の方法を用いて評価することができる。好ましくは、本発明のキメラ分子は、例えば抗原が駆動する脱顆粒および細胞活性化の抑制を阻害することにより、IgEが介在する障害を治療する上での治療効力を有する。IgEが駆動するFcεRIを介する肥満細胞脱顆粒をブロックする上での本発明のキメラ分子の効力は、ヒトに用いる前に、ヒトFcεRαおよびヒトFcγRIIBを発現するように遺伝子操作されているトランスジェニックマウスにおいて確認してもよい。
【０３０５】
本発明は、IgE依存性および／もしくはFcγRI介在性アレルギー障害を治療および／または予防するための二重特異性抗体の使用を提供する。二重特異性抗体（BsAb）は、通常、別の抗原上の２つの異なるエピトープと結合する。BsAbには臨床応用の可能性があり、ウイルス、ウイルス感染細胞および細菌病原体を標的化するため、ならびに血栓崩壊薬を血栓に送達するために使用されている（Cao Y., 1998 Bioconj. Chem 9:635-644；Koelemijら, 1999, J. Immunother., 22,514-524；Segalら, Curr. Opin. Immunol., 11,558-562）。BsIgGおよび他の関係する二重特異性分子を作製する技術は利用可能である（例えば、Carterら, 2001 J. of Immunol. Methods, 248,7-15；Segalら, 2001, J. of Immunol. Methods, 248,7-15を参照、これらは参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）。本発明は、抗FcγRIIB抗体の１つのF(ab')および利用しうるモノクローナル抗huIgE抗体の１つのF(ab')を含有する二重特異性抗体を提供し、同じ細胞の表面上の２つの受容体、FcγRIIBおよびFcεRIを凝集する。当技術分野で公知のおよび本明細書に開示したいずれの手法を用いて本発明の方法に使用する二重特異性抗体を作製してもよい。特定の実施形態においては、BsAbを、先に記載のように、抗FcγRIIB抗体と抗huIgE抗体のF(ab')フラグメントを化学的に架橋することにより作製しうるのであって、例えば、Glennieら, 1995, Tumor Immunobiology, Oxford University press, Oxford, p.225を参照されたい（これは参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）。F(ab')フラグメントを、ペプシンによる限定されたタンパク分解により作製し、メルカプトエタノールアミンにより還元してフリーのヒンジ領域スルフヒドリル（SH）基をもつFab'フラグメントを得ることができる。Fab'(SH)フラグメント上のSH基を過剰のO-フェニレンジマレイミド（O-PDM）を用いてアルキル化して遊離マレイミド基（mal）を得てもよい。２つの調製物Fab'(mal)およびFAB'(SH)を適当な比、好ましくは1:1で組み合わせてヘテロダイマー構築物を作製してもよい。BsAbをサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、当業者に公知の技術を用いてHPLCにより特徴付けることができる。
【０３０６】
特に、本発明は、FcγRIIAと結合するよりも大きい親和性でFcγRIIBと結合する第１の重鎖-軽鎖対およびIgE受容体と結合する第２の重鎖-軽鎖を含む二重特異性抗体を包含し、ただし上記第１の重鎖-軽鎖対が最初にFcγRIIBと結合するものとする。本発明の二重特異性抗体は、FcγRIIBとの結合がIgE受容体との結合に確かに先行するように、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて遺伝子操作で作製することができる。当業者であれば、二重特異性抗体を、例えば、IgE受容体と結合する親和性よりも高い親和性で上記二重特異性抗体がFcγRIIBと結合するように遺伝子操作することを理解するであろう。さらに、二重特異性抗体を、当技術分野で公知の技術により遺伝子操作して、抗体のヒンジサイズの長さを、例えばリンカーを付加することにより増大させて、同じ細胞上のIgE受容体およびFcγRIIB受容体との結合にフレキシビリティーをもつ二重特異性抗体を得ることができる。
【０３０７】
本発明の抗体はまた、IgE依存性アレルギー障害を治療もしくは予防するための当技術分野で公知の他の治療用抗体または薬物と組み合わせて用いることもできる。例えば、本発明の抗体を次のいずれかと組み合わせて用いることができる：アゼラスチン、アステリン（Astelin）、ジプロピオン酸ベクロメタゾン吸入薬、バンセリル（Vanceril）、ジプロピオン酸ベクロメタゾン鼻吸入薬／スプレー薬、バンセナーゼ（Vancenase）、ベコナーゼ・ブデソニド鼻吸入薬／スプレー薬、リノコート・セチリジン、ジルテック・クロルフェニラミン、シュードエフェドリン、デコナミン（Deconamine）、スダフェド（Sudafed）、クロモリン、ネイサルクロム（Nasalcrom）、インタル（Intal）、オプチクロム（Opticrom）、デスロラタジン、クラリネックス、フェキソフェナジンおよびシュードエフェドリン、アレグラD、フェキソフェナジン、アレグラ・フルニソリド鼻スプレー、ネイサリド（Nasalide）・プロピオン酸フルチカゾン鼻吸入薬／スプレー薬、フロナーゼ（Flonase）・プロピオン酸フルチカゾン経口吸入薬、フロベント、ヒドロキシジン、ビスタリル（Vistaril）、アタラックスロラタジン、シュードエフェドリン、クラリチンD、ロラタジン、クラリチン、プレドニゾロン（prednisolone）、プレドニゾロン（Prednisolone）、ペジアプレド（Pediapred）経口液、メドロール・プレドニゾン、デルタゾン、プレドサロメテロール液（Liquid Predsalmeterol）、セレベント・トリアムシノロンアセトニド吸入薬、アズマコート・トリアムシノロンアセトニド（Azmacort triamcinolone acetonide）鼻吸入薬／スプレー薬、ナサコート（Nasacort）、またはナサコートAQ（NasacortAQ）。本発明の抗体を、生得および獲得免疫応答のアクチベーターとして開発されているか（Coley Pharmaceuticals）または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）系製品と併用することができる。例えば、本発明は、IgE依存性アレルギー障害を治療および／または予防するための本発明の方法と組成物におけるCpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）の使用を包含する（Weeratnaら, 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71も参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３０８】
本発明は、アレルギー障害を治療するための当技術分野で公知のいずれかの治療用抗体、例えば、XolairTM（オマリズマブ；Genentech）；rhuMAB-E25（BioWorld Today, Nov. 10, 1998, p.1；Genentech）；CGP-51901（ヒト化抗IgE抗体）などとの組み合わせた本発明の抗体の使用を包含する。
【０３０９】
さらに、本発明は、当技術分野で公知のアレルギー障害を治療するための他の組成物と組み合わせた本発明の抗体の使用を包含する。特に、Carsonら（米国特許第6,426,336号；米国特許出願US 2002/0035109 Al；米国特許出願US 2002/0010343）により開示されている方法および化合物は、参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【０３１０】
5.4.4  免疫調節剤と抗炎症剤
本発明は自己免疫疾患および炎症性疾患を治療する方法であって、本発明の抗体と他の治療薬とを併用した投与を含む法を提供する。免疫応答調節剤の例は、限定されるものでないが、メトトレキセート、ENBREL、REMICADETM、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド抗生物質（例えば、FK506（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（MP）、副腎皮質ステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（sirolimus）、ミゾリビン、デオキシスパーガリン（deooxyspergualin）、ブレキナール（brequinar）、マロノニトリロアミンド（malononitriloaminde）（例えば、leflunamide）、Ｔ細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターが挙げられる。
【０３１１】
抗炎症剤は、炎症性および自己免疫障害の治療において成功をおさめており、現在、このような障害のための一般的かつ標準の治療薬となっている。当業者に周知のいずれの抗炎症剤を本発明の方法に使用してもよい。抗炎症剤の非限定的な例としては、非ステロイド抗炎症剤（NSAID）、ステロイド抗炎症剤、βアゴニスト、抗コリン薬、およびメチルキサンチンが挙げられる。NSAIDの例としては、限定されるものでないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（CELEBREXTM）、ジクロフェナク（VOLTARENTM）、エトドラク（LODINETM）、フェノプロフェン（NALFONTM）、インドメタシン（INDOCINTM）、ケトララク（ketoralac）（TORADOLTM）、オキサプロジン（DAYPROTM）、ナブメントン（nabumentone）（RELAFENTM）、スリンダク（CLINORILTM）、トルメンチン（tolmentin）（TOLECTINTM）、ロフェコキシブ（VIOXXTM）、ナプロキセン（ALEVETM、NAPROSYNTM）、ケトプロフェン（ACTRONTM）およびナブメトン（RELAFENTM）が挙げられる。このようなNSAIDはシクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、COX-1および／またはCOX-2）を阻害することにより機能する。ステロイド抗炎症剤の例としては、限定されるものでないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（DECADRONTM）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（DELTASONETM）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン（azulfidine）、およびエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンが挙げられる。
【０３１２】
5.4.5  抗癌剤および治療用抗体
特定の実施形態においては、本発明の方法は、１以上の血管新生阻害剤の投与を包含し、血管新生阻害剤とは、例えば、限定されるものでないが、以下のものである：アンギオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）；抗血管原性抗トロンビンIII；アンギオザイム（Angiozyme）；ABT-627；Bay12-9566；ベネフィン；ベバシズマブ；BMS-275291；軟骨由来阻害剤（CDI）；CAI；CD59補体フラグメント；CEP-7055；Col3；コンブレタスタチンA-4；エンドスタチン（コラーゲンXVIIIフラグメント）；EGFrブロッカー/インヒビター（イレッサ（登録商標）、タルセバ（登録商標）、エルビタックス（登録商標）、およびABX-EGF）；フィブロネクチンフラグメント；Gro-β；ハロフジノン；ヘパリナーゼ；ヘパリン六糖フラグメント；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）；IM-862；インターフェロンα/β/γ；インターフェロン誘導性タンパク質（IP-10）；インターロイキン-12；クリングル5（プラスミノーゲンフラグメント）；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤（TIMP）；2-メトキシエストラジオール；MMI270（CGS 27023A）；MoAb IMC-1C11；ネオバスタット；NM-3；パンゼム；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；血小板因子-4（PF4）；プリノマスタット（Prinomastat）；プロラクチン16KDフラグメント；プロリフェリン（Proliferin）関連タンパク質（PRP）；PTK787/ZK222594；レチノイド；ソリマスタット（Solimastat）；スクアラミン；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；テトラヒドロコルチゾール-S；テトラチオモリブデネート；サリドマイド；トロンボスポジン1（TSP-1）；TNP-470；形質転換増殖因子β（TGF-b）；バスキュロスタチン（Vasculostatin）；バソスタチン（Vasostatin）（カルレティキュリンフラグメント）；ZD6126；ZD6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）；およびビスホスホネート。
【０３１３】
本発明の抗体と組み合わせて本発明の様々な実施形態（本発明の医薬組成物および投与剤形およびキットを含む）において使用することができる抗癌剤としては、限定されるものでないが、以下が挙げられる：アシビシン（acivicin）；アクラルビシン（aclarubicin）；アコダゾール塩酸塩（acodazole hydrochloride）；アクロニン（acronine）；アドゼレシン（adozelesin）；アルデスロイキン（aldesleukin）；アルトレタミン（altretamine）；アンボマイシン（ambomycin）；アメタントロン酢酸塩（ametantrone acetate）；アミノグルテチミド（aminoglutethimide）；アムサクリン（amsacrine）；アナストロゾール（anastrozole）；アントラマイシン（anthramycin）；アスパラギナーゼ（asparaginase）；アスペルリン（asperlin）；アザシチジン（azacitidine）；アゼテパ（azetepa）；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット（batimastat）；ベンゾデパ（benzodepa）；ビカルタミド（bicalutamide）；ビスアントレン塩酸塩（bisantrene hydrochloride）；ビスナフィドジメシラート（bisnafide dimesylate）；ビゼレシン（bizelesin）；ブレオマイシン硫酸塩（bleomycin sulfate）；ブレキナールナトリウム（brequinar sodium）；ブロピリミン（bropirimine）；ブスルファン（busulfan）；カクチノマイシン（cactinomycin）；カルステロン（calusterone）；カラセミド（caracemide）；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン（carboplatin）；カルムスチン（carmustine）；カルビシン塩酸塩（carubicin hydrochloride）；カルゼルシン（carzelesin）；セデフィンゴール（cedefingol）；クロラムブシル（chlorambucil）；シロレマイシン（cirolemycin）；シスプラチン（cisplatin）；クラドリビン（cladribine）；クリスナトールメシラート（crisnatol mesylate）；シクロホスファミド（cyclophosphamide）；シタラビン（cytarabine ）；デカルバジン（dacarbazine）；ダクチノマイシン（dactinomycin）；ダウノルビシン塩酸塩（daunorubicin hydrochloride）；デシタビン（decitabine）；デキソルマプラチン（dexormaplatin）；デザグアニン（dezaguanine）；デザグアニンメシラート（dezaguanine mesylate）；ジアジコン（diaziquone）；ドセタキセル（docetaxel）；ドキソルビシン（doxorubicin）；ドキソルビシン塩酸塩（doxorubicin hydrochloride）；ドロロキシフェン（droloxifene）；ドロロキシフェンクエン酸塩（droloxifene citrate）；ドロモスタノロンプロピオン酸塩（dromostanolone propionate）；デュアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキセート（edatrexate）；エフロルニチン塩酸塩（eflornithine hydrochloride）；エルサミトルシン（elsamitrucin）；エンロプラチン（enloplatin）；エンプロメート（enpromate）；エピプロピジン（epipropidine）；エピルビシン塩酸塩（epirubicin hydrochloride）；エルブロゾール（erbulozole）；エソルビシン塩酸塩（esorubicin hydrochloride）；エストラムスチン（estramustine）；エストラムスチンリン酸ナトリウム（estramustine phosphate sodium）；エタニダゾール（etanidazole）；エトポシド（etoposide）；エトポシドリン酸塩（etoposide phosphate）；エトプリン（etoprine）；ファドロゾール塩酸塩（fadrozole hydrochloride）；ファザラビン（fazarabine）；フェンレチニド（fenretinide）；フロキシウリジン（floxuridine）；フルダラビンリン酸塩（fludarabine phosphate）；フルオロウラシル（fluorouracil）；フルロシタビン（flurocitabine）；フォスキドン（fosquidone）；フォストリエシンナトリウム（fostriecin sodium）；ゲムシタビン（gemcitabine��；ゲムシタビン塩酸塩（gemcitabine hydrochloride）；ヒドロキシ尿素（hydroxyurea）；イダルビシン塩酸塩（idarubicin hydrochloride）；イフォスファミド（ifosfamide）；イルモフォシン（ilmofosine）；インターロイキンII（組換えインターロイキンII、またはrIL2を含む）、インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-1a；インターフェロンγ-1b；イプロプラチン（iproplatin）；イリノテカン塩酸塩（irinotecan hydrochloride）；ランレオチド酢酸塩（lanreotide acetate）；レトロゾール（letrozole）；ロイプロリド酢酸塩（leuprolide acetate）；リアロゾール塩酸塩（liarozole hydrochloride）；ロメトレキソールナトリウム（lometrexol sodium）；ロムスチン（lomustine）；ロソキサントロン塩酸塩（losoxantrone hydrochloride）；マソプロコール（masoprocol）；メイタンシン（maytansine）；メクロレタミン塩酸塩（mechlorethamine hydrochloride）；メゲストロール酢酸塩（megestrol acetate）；メレンゲストロール酢酸塩（melengestrol acetate）；メルファラン（melphalan）；メノガリル（menogaril）；メルカプトプリン（mercaptopurine）；メトトレキセート（methotrexate）；メトトレキセートナトリウム（methotrexate sodium）；メトプリン（metoprine）；メツレデパ（meturedepa）；ミチンドミド（mitindomide）；ミトカルシン（mitocarcin）；ミトクロミン（mitocromin）；ミトギリン（mitogillin）；ミトマルシン（mitomalcin）；ミトマイシン（mitomycin）；ミトスパー（mitosper）；ミトタン（mitotane）；ミトキサントロン塩酸塩（mitoxantrone hydrochloride）；ミコフェノール酸（mycophenolic acid）；ノコダゾール（nocodazole）；ノガラマイシン（nogalamycin）；オルマプラチン（ormaplatin）；オキシスラン（oxisuran）；パクリタキセル（paclitaxel）；ペガスパルガーゼ（pegaspargase）；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン（pentamustine）；ペプロマイシン硫酸塩（peplomycin sulfate）；ペルホスアミド（perfosfamide）；ピポブロマン（pipobroman）；ピポスルファン（piposulfan）；ピロキサントロン塩酸塩（piroxantrone hydrochloride）；プリカマイシン（plicamycin）；プロメスタン（plomestane）；ポルフィマーナトリウム（porfimer sodium）；ポルフィロマイシン（porfiromycin）；プレドニムスチン（prednimustine）；プロカルバジン塩酸塩（procarbazine hydrochloride）；ピューロマイシン（puromycin）；ピューロマイシン塩酸塩（puromycin hydrochloride）；ピラゾフリン（pyrazofurin）；リボプリン（riboprine）；ログレチミド（rogletimide）；サフィンゴル（safingol）；サフィンゴル塩酸塩（safingol hydrochloride）；セムスチン（semustine）；シムタラゼン（simtrazene）；スパルフォセートナトリウム（sparfosate sodium）；スパルソマイシン（sparsomycin）；スピロゲルマニウム塩酸塩（spirogermanium hydrochloride）；スピロムスチン（spiromustine）；スピロプラチン（spiroplatin）；ストレプトニグリン（streptonigrin）；ストレプトゾシン（streptozocin）；スルフェヌル（sulofenur）；タリソマイシン（talisomycin）；テコガランナトリウム（tecogalan sodium）；テガフール（tegafur）；テロキサントロン塩酸塩（teloxantrone hydrochloride）；テモポルフィン（temoporfin）；テニポシド（teniposide）；テロキシロン（teroxirone）；テストラクトン（testolactone）；チアミプリン（thiamiprine）；チオグアニン（thioguanine）；チオテパ（thiotepa）；チアゾフリン（tiazofurin）；チラパ���ミン（tirapazamine）；トレミフェンクエン酸塩（toremifene citrate）；トレストロン酢酸塩（trestolone acetate）；トリシリビンリン酸塩（triciribine phosphate）；トリメトレキセート（trimetrexate）；トリメトレキセートグルクロン酸塩（trimetrexate glucuronate）；トリプトレリン（triptorelin）；ツブロゾール塩酸塩（tubulozole hydrochloride）；ウラシルムスタード（uracil mustard）；ウレデパ（uredepa）；バプレオチド（vapreotide）；ベルテポルフィン（verteporfin）；ビンブラスチン硫酸塩（vinblastine sulfate）；ビンクラスチン硫酸塩（vincristine sulfate）；ビンデシン（vindesine）；ビンデシン硫酸塩（vindesine sulfate）；ビネピジン硫酸塩（vinepidine sulfate）；ビングリシネート硫酸塩（vinglycinate sulfate）；ビンロイロシン硫酸塩（vinleurosine sulfate）；ビノレルビン酒石酸塩（vinorelbine tartrate）；ビンロシジン硫酸塩（vinrosidine sulfate）；ビンゾリジン硫酸塩（vinzolidine sulfate）；ボロゾール（vorozole）；ゼニプラチン（zeniplatin）；ジノスタチン（zinostatin）；ゾルビシン塩酸塩（zorubicin hydrochloride）。他の抗癌剤としては、限定されるものでないが、以下が挙げられる：20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3；5-エチニルウラシル；アビラテロン（abiraterone）；アクラルビシン（aclarubicin）；アシルフルベン（acylfulvene）；アデシペノール（adecypenol）；アドゼレシン（adozelesin）；アルデスロイキン（aldesleukin）；全てのTKアンタゴニスト；アルトレタミン（altretamine）；アンバムスチン（ambamustine）；アミドックス（amidox）；アミフォスチン（amifostine）；アミノレブリン酸（aminolevulinic acid）；アンルビシン（amrubicin）；アンサクリン（amsacrine）；アナグレリド（anagrelide）；アナストロゾール（anastrozole）；アンドログラホリド（andrographolide）；血管新生阻害剤；アンタゴニストD；アンタゴニストG；アンタレリックス（antarelix）；抗背方化形態発生タンパク質-1（anti-dorsalizing morphogenetic protein-1）；抗アンドロゲン薬、前立腺癌薬；抗エストロゲン薬；抗ネオプラストン薬（antineoplaston）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシン酸塩（aphidicolin glycinate）；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；ara-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（asulacrine）；アタメスタン（atamestane）；アトリムスチン（atrimustine）；アキシナスタチン1（axinastatin 1）；アキシナスタチン2（axinastatin 2）；アキシナスタチン3（axinastatin 3）；アザセトロン（azasetron）；アザトキシン（azatoxin）；アザチロシン（azatyrosine）；バッカチン（baccatin）III誘導体；バラノール（balanol）；バチマスタット（batimastat）；BCR/ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン（benzochlorins）；ベンゾイルスタウロスポリン（benzoylstaurosporine）；βラクタム誘導体；βアレチン（β-alethine）；βクラマイシンB（betaclamycin B）；ベツリン酸；bFGF阻害薬；ビカルタミド（bicalutamide）；ビスアントレン（bisantrene）；ビスアジリジニルスペルミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド（bisnafide）；ビストラテンA（bistratene A）；ビゼレシン（bizelesin）；ブレフラート（breflate）；ブロピリミン（bropirimine）；ブドチタン（budotitane）；ブチオニンスルホキシミン（buthionine sulfoximine）；カルシポトリオール（calcipotriol）；カルホスチンC（calphostin C）；カンプトテシン誘導体；カナリポックス（canarypox）IL-2；カペシタビン（capecitabine）；カルボキサミド-アミノ-トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン（carzelesin）；カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）；カスタノスペルミン（castanospermine）；セクロピンB（cecropin B）；セトロレリックス（cetrorelix）；chlorlns；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト（cicaprost）；cis-ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシン（collismycin）A；コリスマイシン（collismycin）B；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン（crambescidin）816；クリスナトール（crisnatol）；クリプトフィシン（cryptophycin）8；クリプトフィシンA誘導体；キュラシンA；シクロペンタントラキノン（cyclopentanthraquinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクホスファート（cytarabine ocfosfate）；細胞溶解性因子；サイトスタチン（cytostatin）；ダクリキシマ
ブ（dacliximab）；デシタビン（decitabine）；デヒドロジデムニン（dehydrodidemnin）B；デスロレリン（deslorelin）；デキサメタゾン（dexamethasone）；デキシホスファミド（dexifosfamide）；デキスラゾキサン（dexrazoxane）；デキスベラパミル（dexverapamil）；ジアジコン（diaziquone）；ジデムニン（didemnin）B；ジドックス（didox）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシチジン；ジヒドロタキソール、9-；ジオキサマイシン（dioxamycin）；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン（dolasetron）；ドキシフルリジン（doxifluridine）；ドロロキシフェン（droloxifene）；ドロナビノール（dronabinol）；デュオカルマイシン（duocarmycin）SA；エブセレン（ebselen）；エコムスチン（ecomustine）；エデルホシン（edelfosine）；エドレコロマブ（edrecolomab）；エフロルニチン（eflornithine）；エレメン（elemene）；エミテフル（emitefur）；エピルビシン（epirubicin）；エプリステリド（epristeride）；エストラムスチン（estramustine）類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール（etanidazole）；エトポシド（etoposide）リン酸塩；エキセメスタン（exemestane）；ファドロゾール（fadrozole）；ファザラビン（fazarabine）；フェンレチニド（fenretinide）；フィルグラスチム（filgrastim）；フィナステリド（finasteride）；フラボピリドール（flavopiridol）；フレゼラスチン（flezelastine）；フルアステロン（fluasterone）；フルダラビン（fludarabine）；フルオロダウノルニシン塩酸塩（fluorodaunorunicin hydrochloride）；ホルフェニメキス（forfenimex）；ホルメスタン（formestane）；ホストリエシン（fostriecin）；ホテムスチン（fotemustine）；ガドリニウムテキサヒドリン（gadolinium texaphyrin）；硝酸ガリウム（gallium nitrate）；ガロシタビン（galocitabine）；ガニレリックス（ganirelix）；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン（gemcitabine）；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム（hepsulfam）；ヘルグリン（heregulin）；ヘキサメチレンビスアセタミド；ヒペリシン（hypericin）；イバンドロン酸（ibandronic acid）；イダルビシン（idarubicin）；イドキシフェン（idoxifene）；イドラマントン（idramantone）；イルモフェシン（ilmofosine）；イロマスタット（ilomastat）；イミダゾアクリドン（imidazoacridones）；イミキモド（imiquimod）；免疫刺激性ペプチド；インスリン様増殖因子-1受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン（iobenguane）；ヨードドキソルビシン（iododoxorubicin）；イポメアノール（ipomeanol）、4-；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン（irsogladine）；イソベンガゾール（isobengazole）；イソホモハリコンドリン（isohomohalicondrin）B；イタセトロン（itasetron）；ジャスプラキノリド（jasplakinolide）；カハラリド（kahalalide）F；ラメラリン-N-トリアセタート（lamellarin-N triacetate）；ランレオチド（lanreotide）；レイナマイシン（leinamycin）；レノグラスチム（lenograstim）；レンチナン硫酸塩（lentinan sulfate）；レプトールスタチン（leptolstatin）；レトロゾール（letrozole）；白血病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン（leuprorelin）；レバミソール（levamisole）；リアロゾール（liarozole）；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド（lissoclinamide）7；ロバプラチン（lobaplatin）；ロンブリシン（lombricine）；ロメトレキソール（lometrexol）；ロニダミン（lonidamine）；ロソキサントロン（losoxantrone）；ロバスタチン（lovastatin）；ロキソリビン（loxoribine）；ルルトテカン（lurtotecan）；ルテチウムテキサフィリン（lutetium texaphyrin）；リソフィリン（lysofylline）；溶解性ペプチド；マイタンシン（maitansine）；マンノスタチン（mannostatin）A；マリマスタット（marimastat）；マソプロコル（masoprocol）；マスピン（maspin）；マトリリシン（matrilysin）阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル（menogaril）；メルバロン（merbarone）；メテレリン（meterelin）；メチオニナーゼ（methioninase）；メトクロプラミド（metoclopramide）；MIF阻害剤；ミフェプリストン（mifepristone）；ミルテホシン（miltefosine ）；ミリモスチム（mirimostim）；ミスマッチ２本鎖RNA；ミトグアゾン（mitoguazone）；ミトラクトール（mitolactol）；マイトマイシン（mitomycin）類似体；ミトナフィド（mitonafide）；ミトトキシン繊維芽細胞増殖因子-サポリン（mitotoxin fibroblast growth factor-saporin）；ミトキサントロン（mitoxantrone）；モファロテン（mofarotene）；モルグラモスチム（molgramostim）；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質A+マイコバクテリウム細胞壁 sk；モピダモル（mopidamol）；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍サプレッサー1に基づく療法；マスタード抗癌剤；マイカペルオキシド（mycaperoxide）B；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（myriaporone）；N-アセチルジナリン；N-置換ベンズアミド；ナファレリン（nafarelin）；ナグレスチプ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン（naloxone+pentazocine）；ナパビン（napavin）；ナフテルピン（naphterpin）；ナルトグラスチム（nartograstim）；ネダプラチン（nedaplatin）；ネモルビシン（nemorubicin）；ネリドロン酸（neridronic acid）；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド（nilutamide）；ニサマイシン（nisamycin）；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物抗酸化薬；ニトルリン（nitrullyn）；O-6-ベンジルグアニン（O-6-benzylguanine）；オクトレオチド（octreotide）；オキセノン（okicenone）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン（onapristone）；オンダンセトロン（ondansetron）；オンダンセトロン（ondansetron）；オラシン（oracin）；経口サイトカインインデューサー；オルマプラチン（ormaplatin）；オサテロン（osaterone）；オキサリプラチン（oxaliplatin）；オキサウノマイシン（oxaunomycin）；パクリタキセル（paclitaxel）；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（palauamine）；パルミトイルリゾキシン（palmitoylrhizoxin）；パミドロン酸（pamidronic acid）；パナキシトリオール（panaxytriol）；パノミフェン（panomifene）；パラバクチン（parabactin）；パゼリプチン（pazelliptine）；ペガスパルガーゼ（pegaspargase）；ペルデシン（peldesine）；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン（pentostatin）；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン（perflubron）；ペルホスファミド（perfosfamide）；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン（phenazinomycin）；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル（picibanil）；ピロカルピン塩酸塩（pilocarpine hydrochloride）；ピラルビシン（pirarubicin）；ピリトレキシム（piritrexim）；プラセチン（placetin）A；プラセチン（placetin）B；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金-トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム（porfimer sodium）；ポルフィロマイシン（porfiromycin）；プレドニゾン（prednisone）；プロピルビスアクリドン（propyl bis-acridone）；プロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害剤；プロテインAに基づく免疫調節剤；タンパク質キナーゼC阻害剤；タンパク質キナーゼC阻害剤（微細藻類の）；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン（purpurin）；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体；rafアンタゴニスト；ラルチトレキセド（raltitrexed）；ラモセトロン（ramosetron）；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤（ras farnesyl protein transferase inhibitors）；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；脱メチル化レテルリプチン（retelliptine demethylated）；レニウムRe186エチドロン酸塩（rhenium Re 186 etidronate）；リゾキシン（rhizoxin）；リボザイム；RIIレチンアミド（RII retinamide）；ログレチミド（rogletimide）；ロヒツキン（rohitukine）；ロムルチド（romurtide）；ロキニメキス（roquinimex）；ルビギノンB1（rubiginone B1）；ルボキシル（ruboxyl）；サフィンゴル（safingol）；セントピン（saintopin）；SarCNU；サルコフィトール（sarcophytol）A；サルグラモスチム（sargramostim）；Sdi 1模倣物；セムスチン（semustine）；老化誘導阻害剤（senescence derived inhibitor）1；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン（sizofiran）；ソブゾキサン（sobuzoxane）；ナトリウムボロカプテート（sodium borocaptate）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン（somatomedin）結合タンパク質；ソネルミン（sonermin）；スパルフォシン酸（sparfosic acid）；スピカマイシン（spicamycin）D；スピロムスチン（spiromustine）；スプレノペンチン（splenopentin）；スポンジスタチン（spongistatin）1；スクアラミン（squalamine）；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド（stipiamide）；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン（sulfinosine）；超活性血管作用性腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（suradista）；スラミン（suramin）；スワインソニン（swainsonine）；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン（tallimustine）；タモキシフェンメチオジト（tamoxifen methiodide）；タウロムスチン（tauromustine）；タザロテン（tazarotene）；テコガランナトリウム；テガフール（tegafur）；テルラピリリウム（tellurapyrylium）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン（temoporfin）；テモゾロミド（temozolomide）；テニポシド（teniposide）；テトラクロロデカオキシド（tetrachlorodecaoxide）；テトラゾミン（tetrazomine）；サリブラチン（thaliblastine）；チオコラリン（thiocoraline）；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン（thymalfasin）；サイモポエチン受容体アゴニスト；サイモトリナン（thymotrinan）；甲状腺刺激ホルモン（thyroid stimulating hormone）；スズエチルエチオプルプリン（tin ethyl etiopurpurin）；チラパザミン（tirapazamine）；二塩化チタノセン；トプセンチン（topsentin）；トレミフェン（toremifene）；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン（tretinoin）；トリアセチルウルジン；トリシリビン（triciribine）；トリメトレキセート（trimetrexate）；トリプトレリン（triptorelin）；トロピセトロン（tropisetron）；ツロステライド（turosteride）；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン（tyrphostins）；UBC 阻害剤；ウベニメックス（ubenimex）；泌尿生殖器洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド（vapreotide）；バリオリン（variolin）B；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレゾル（velaresol）；ベラミン（veramine）；ベルジン（verdins）；ベルテポルフィン（verteporfin）；ビノレルビン（vinorelbine）；ビンキサルチン（vinxaltine）；ビタキシン（vitaxin）；ボロゾール（vorozole）；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチン（zeniplatin）；ジラスコルブ（zilascorb）；およびジノスタチンスチマラマー（zinostatin stimalamer）。好ましいさらなる抗癌剤は5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０３１４】
本発明の方法に使用することができる治療用抗体の例としては、限定されるものでないが、以下が挙げられる：HERCEPTIN（登録商標）（トラスツズマブ）（Genentech, CA）（転移性乳癌の患者を治療するためのヒト化抗HER2モノクローナル抗体である）；レオプロ（登録商標）（アブシキシマブ）（Centocor）（血栓形成の予防用の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体（血小板上）である）；ZENAPAX（登録商標）（ダクリズマブ）（Roche Pharmaceuticals、Switzerland）（急性腎異種移植片拒絶の予防用の免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体である）；PANOREXTM（エドレコロマブ）（マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体である）（Glaxo Wellcome/Centocor）；BEC2（マウス抗イディオタイプ（GD3エピトープ）IgG抗体である）（ImClone System）；Erbitux（登録商標）（セツキシマブ）（キメラ抗EGFR IgG抗体である）（ImClone System）；VITAXINTM（ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体である）（Applied Molecular Evolution/MedImmune）；Campath 1H/LDP-03（ヒト化抗CD52 IgG1抗体である）（Leukosite）；Smart M195（ヒト化抗CD33 IgG抗体である）（Protein Design Lab/Kanebo）；RITUXANTM（リツキシマブ）（キメラ抗CD20 IgG1抗体である）（IDEC Pharm/Genetech、Roche/Zettyaku）；LYMPHOCIDETM（エプラツズマブ）（ヒト化抗CD22 IgG抗体である）（Immunomedics）；ICM3（ヒト化抗ICAM3抗体である）（ICOS Pharm）；IDEC-114（霊長類化抗CD80抗体である）（IDEC Pharm/Mitsubishi）；ZEVALINTM（放射標識したマウス抗CD20抗体である）（IDEC/Schering AG）；IDEC-131（ヒト化抗CD40L抗体である）（IDEC/Eisai）；IDEC-151（霊長類化抗CD4抗体である）（IDEC）；IDEC-152（霊長類化抗CD23抗体である）（IDEC/Seikagaku）；SMART抗CD3（ヒト化抗CD3 IgGである）（Protein Design Lab）；5G1.1（ヒト化抗補体因子5（C5）抗体である）（Alexion Pharm）；Humira（登録商標）（ヒト抗TNF-α抗体である）（Abbott Laboratories）；CDP870（ヒト化抗TNF-αFabフラグメントである）（Celltech）；IDEC-151（霊長類化抗CD4 IgG1抗体である）（IDEC Pharm/SmithKline Beecham）；MDX-CD4（ヒト抗CD4 IgG抗体である）（Medarex/Eisai/Genmab）；CDP571（ヒト化抗TNF-αIgG4抗体である）（Celltech）；LDP-02（ヒト化抗α4β7抗体である）（LeukoSite/Genentech）；オルソクローンOKT4A（ヒト化抗CD4 IgG抗体である）（Ortho Biotech）；ANTOVATM（ヒト化抗CD40L IgG抗体である）（Biogen）；ANTEGRENTM（ヒト化抗VLA-4 IgG抗体である）（Elan）；およびCAT-152（ヒト抗TGF-β2抗体である）（Cambridge Ab Tech）。
【０３１５】
本発明の抗体と併用することができる治療用抗体の他の例を表７に掲げる。
【表７】
2007532139.tif 000016
2007532139.tif 000017
2007532139.tif 000018
【０３１６】
5.4.6  ワクチン療法
本発明は、被験者でのワクチン組成物に対する免疫応答を増大させる方法を提供し、該方法は、上記被験者にFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントおよびワクチン組成物を投与することを含み、上記抗体またはそのフラグメントが上記ワクチン組成物に対する免疫応答を増大させることを特徴とする。ある特定の実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、ワクチンが標的としている抗原の抗原提示および／または抗原プロセシングを増大させることにより上記ワクチン組成物に対する免疫応答を増大させる。当技術分野で公知のいずれのワクチン組成物も、本発明の抗体またはそのフラグメントと組み合わせて有用である。
【０３１７】
一実施形態においては、本発明は本発明の抗体の、当技術分野で公知のいずれかの癌ワクチン、例えば、CanvaxinTM（Cancer Vax, Corporation、黒色腫および結腸癌）；Oncophage（HSPPC-96；Antigenics；転移性黒色腫）；HER-2/neu癌ワクチンなどとの併用も包含する。本発明の方法および組成物で使用される癌ワクチンは、例えば、抗原特異的ワクチン、抗イディオタイプワクチン、樹状細胞ワクチン、またはDNAワクチンとすることができる。本発明は、本発明の抗体の、Segalら（米国特許第6,403,080号、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）が記載した細胞に基づくワクチンとの併用を包含する。本発明の抗体と一緒に用いる細胞に基づくワクチンは自家性または同種異系であってもよい。簡単に説明すると、Segalらが記載した癌に基づくワクチンはGenitrix, LLCのオプソノカイン（Opsonokine）（TM）製品に基づく。オプソノカイン（Opsonokine）（TM）は遺伝子操作により作製したサイトカインであり、腫瘍細胞と混合すると自動的に細胞の表面に付着する。「飾られた（decorated）」細胞をワクチンとして投与すると、細胞上のサイトカインはレシピエント体内の重要な抗原提示細胞を活性化する一方、その抗原提示細胞が腫瘍細胞を取り込むことを可能にする。次いで抗原提示細胞は「キラー」Ｔ細胞に身体全体の同様の腫瘍細胞を見付けて破壊するように指示する。このようにして、オプソノカイン（Opsonokine）（TM）製品は腫瘍細胞を強力な抗腫瘍免疫療法薬に変換する。
【０３１８】
一実施形態において本発明は、本発明の抗体の、当技術分野で公知のいずれかのアレルギーワクチンとの併用も包含する。本発明の抗体は、例えば、Linhartら（2000, FASEB Journal, 16 (10): 1301-3、これは参照により組み入れられる）により記載されている、花粉アレルギーに対するワクチン接種に利用される大オオアワガエリ（major timothy）花粉アレルゲンをコードする組換えハイブリッド分子と併用することができる。さらに本発明の抗体は、Hornerら（2002, Allergy, 57 Suppl, 72:24-9、これは参照により組み入れられる）により記載されている、DNAに基づくワクチン接種と併用することができる。本発明の抗体は、Choiら（2002, Ann. Allergy Asthma Immunology, 88 (6):584-91）およびBarlanら（2002, Journal Asthma, 39 (3):239-46）（両方とも、参照により本明細書にその全文が組み入れられる）により記載されている、カルメット・ゲラン杆菌（「BCG」）ワクチン接種と組み合わせて、IgE分泌をダウンレギュレートするために使用することができる。本発明の抗体は食物アレルギーを治療する上で有用である。特に本発明の抗体は、ワクチンまたは当技術分野で公知の他の免疫療法（Hourihaneら, 2002, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2 (3):227-31を参照）と組み合わせて、ピーナッツアレルギーを治療するために使用することができる。
【０３１９】
本発明の方法および組成物は、抗原に対する免疫が所望される場合にワクチンと併用することができる。このような抗原は当技術分野で公知のいずれの抗原であってもよい。本発明の抗体は、例えば感染病原体、罹患したかまたは異常な細胞（例えば、限定されるものでないが、細菌（例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性細菌、スピロヘータ、ミコバクテリア属、リケッチア属、クラミジア属など）、寄生虫、真菌（例えば、カンジダアルビカンス、アスペルギルス属など）、ウイルス（例えば、DNAウイルス、RNAウイルスなど）、または腫瘍）に対する免疫応答を増大させるために使用してもよい。ウイルス感染は、限定されるものでないが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）；A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、または他の肝炎ウイルス；サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス-1（-2、-3、-4、-5、-6）、ヒトパピローマウイルスウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、パラインフルエンザウイルス（PIV）、エプスタイン・バーウイルス、ヒトメタニューモウイルス（HMPV）、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（SARS）またはいずれか他のウイルス感染を含む。
【０３２０】
本発明は、本発明の抗体、抗原およびサイトカインの組み合わせを含む方法およびワクチン組成物を包含する。好ましくは、該サイトカインはIL-4、IL-10、またはTGF-βである。
【０３２１】
本発明は、ワクチン組成物の抗原に対する体液性および／または細胞依存性応答を増大させるための本発明の抗体の使用を包含する。本発明はさらに、特定の抗原または抗原群に対する免疫応答の増大が疾患もしくは障害を治療または予防するために有効である場合、その特定の障害を予防または治療するための本発明の抗体の使用も包含する。このような疾患および障害は、限定されるものでないが、ウイルス感染、例えばHIV、CMV、肝炎、ヘルペスウイルス、麻疹など、細菌感染、真菌および寄生虫感染、癌、ならびに特定の抗原に対する免疫応答を増大させることにより治療または予防に影響されやすい他の疾患または障害を含む。
【０３２２】
5.5  組成物および投与方法
本発明は、本発明の抗体を含んでなる方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患、障害もしくは感染症に関連する１以上の症状を治療、予防、および改善する方法であって、被験者に有効な量の本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子、または本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を投与することによる方法も提供する。好ましい態様においては、抗体または融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている(すなわち、実質的にその効果を限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を含まない)。特定の実施形態においては、被験者は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザルおよびヒト）である。好ましい実施形態においては、被験者はヒトである。
【０３２３】
様々な送達系が公知であり、本発明の抗体を含む組成物を投与するために利用することができ、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、抗体もしくは融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、核酸のレトロウイルスそのは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。
【０３２４】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体の標的化した送達のために本発明の抗体をリポソームに入れて製剤化する。リポソームは、同心円状に配置された、水相を封入するリン脂質二重層から構成される小胞である。リポソームは典型的には様々なタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤を含む。リポソームの成分は生物膜の脂質配置と同様に二重層の立体配置に置かれる。リポソームは、部分的に、その生体適合性、低免疫原性、および低毒性の故に、特に好ましい送達媒体である。リポソームの調製方法は当技術分野で公知であり、本発明の範囲に含まれる。例えば、Epsteinら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688；Hwangら, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4；米国特許第4,485,045号および第4,544,545号を参照；これらは全て参照により本明細書にその全文が組み入れられる。
【０３２５】
本発明はまた、長い血清半減期、すなわち長い循環時間をもつリポソームを調製する方法、例えば米国特許第5,013,556号に開示された方法も包含する。本発明の方法に使用される好ましいリポソームは循環から速やかに取り除かれない、すなわち、単核の貪食細胞系（MPS）に取込まれることはない。本発明は、当業者に公知の方法を用いて調製される立体的に安定化されたリポソームを包含する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、立体的に安定化されたリポソームは巨大かつ非常にフレキシブルな親水性部分を有する脂質成分を含有し、これがリポソームの血清タンパク質との望ましくない反応を低減させ、血清成分によるオプソニン化を低減させ、そしてMPSによる認識を低減させる。立体的に安定化したリポソームは、好ましくはポリエチレングリコールを用いて調製される。リポソームおよび立体的に安定化したリポソームの調製については、例えば、Bendasら, 2001 BioDrugs, 15(4):215-224；Allenら, 1987 FEBS Lett. 223:42-6；Klibanovら, 1990 FEBS Lett., 268:235-7；Blumら, 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029:91-7；Torchilinら, 1996, J. Liposome Res. 6:99-116；Litzingerら, 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190:99-107；Maruyamaら, 1991, Chem. Pharm. Bull., 39:1620-2; Klibanovら, 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allenら, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13:285-309を参照；これらはすべて参照により本明細書にその全文が組み入れられる。本発明はまた、特定の器官を標的化する（例えば、米国特許第4,544,545号を参照）、または特定の細胞を標的化する（例えば、米国特許出願公開第2005/0074403号を参照）ように工夫されたリポソームも包含する。本発明の組成物および方法に使用するための特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により作製することができる。リポソームを、所定の孔サイズのフィルターを通して押出し、所望の直径を有するリポソームを得る。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のフラグメント、例えば、F(ab')をリポソームと、以前に記載された方法を用いてコンジュゲートしてもよい（例えば、Martinら, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288を参照、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。
【０３２６】
本発明の抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。免疫リポソームは、本発明の抗体もしくはそのフラグメントが共有結合または非共有結合によりリポソーム表面と結合していることを特徴とするリポソーム組成物を意味する。抗体をリポソーム表面と結合する化学反応は当技術分野で公知であり、本発明の範囲に包含され、例えば、米国特許第6,787,153号；Allenら, 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44；Hansenら, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239:133-44を参照されたい；これらは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。最も好ましい実施形態においては、本発明の方法と組成物に使用する免疫リポソームをさらに立体的に安定化させる。好ましくは、本発明の抗体を共有結合または非共有結合により、リポソームの脂質二重層に安定に定着させた疎水性アンカーと結合させる。疎水性アンカーの例としては、限定されるものでないが、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルイノシトール（PI）が挙げられる。抗体と疎水性アンカーの間の共有結合を達成するために、当技術分野で公知の生化学手法のいずれを用いてもよく、例えば、J. Thomas August（編）, 1997, Gene Therapy : Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA., p.399-435を参照されたい（これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。例えば、抗体分子の官能基を、疎水性アンカーと結合しているリポソーム上の活性基と反応させてもよく、例えば、抗体上のリシン側鎖のアミノ基を、水溶性カルボジイミドを用いて活性化した、リポソームと結合しているN-グルタリルホスファチジルエタノールアミンとカップリングさせることができ；または還元した抗体のチオール基を、ピリジルチオプロピオニル-ホスファチジルエタノールアミンなどのチオール反応性アンカーを経由してリポソームとカップリングさせることができる。例えば、Dietrichら, 1996, Biochemistry, 35:1100-1105；Loughreyら, 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901:157-160；Martinら, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288；Martinら, 1981, Biochemistry, 20:4429-38を参照されたい（これらはすべて参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体を含む免疫リポソーム製剤は、抗体を標的細胞、すなわち、抗体が結合するFcγRIIB受容体を含む細胞の細胞質へ送達するので、特に治療薬として有効である。免疫リポソームは、好ましくは、血液、特に標的細胞中で長い半減期を有し、標的細胞の細胞質内部に移行することができ、それにより治療薬の消失またはリソソーム内経路による分解を避ける。
【０３２７】
本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む免疫リポソームを包含する。いくつかの実施形態においては、免疫リポソームはさらに１以上の本明細書に開示したさらなる治療薬を含む。
【０３２８】
本発明の免疫リポソーム組成物は、１以上の小胞形成性脂質、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体、および場合によっては親水性ポリマーを含む。小胞形成性脂質は、好ましくは、２つの炭化水素鎖、例えばアシル鎖と、極性ヘッド基を有する脂質である。小胞形成性脂質の例としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどのリン脂質、および糖脂質、例えば、セレブロシド、ガングリオシドが挙げられる。本発明の製剤に有用なさらなる脂質は当業者に公知であり、本発明の範囲に包含される。いくつかの実施形態においては、免疫リポソーム組成物はさらに、リポソームの血清半減期を増大させる親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールおよびガングリオシドGM1を含む。親水性ポリマーをリポソームにコンジュゲートする方法は当技術分野で周知であり、本発明の範囲に包含される。免疫リポソームおよびそれらを調製する方法の総説としては、例えば、米国特許出願公開第2003/0044407号；PCT国際公開第WO 97/38731号、Vingerhoeadsら, 1994, Immunomethods, 4:259-72；Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7):791-799；Abraら, 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2):1-3；Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2):267-281；Bendasら, 2001 BioDrugs, 14 (4):215-224；J. Thomas August, 編, 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA., p.399-435を参照されたい（これらは全て参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。
【０３２９】
本発明の抗体を投与する方法としては、限定されるものでないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および口腔経路）が挙げられる。特定の実施形態においては、本発明の抗体を筋肉内、静脈内、または皮下に投与する。組成物をいずれかの都合のよい経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよく、かつ他の生物学的活性薬と一緒に投与してもよい。投与は全身に対してでもまたは局所に対してであってもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエーロゾル化剤を用いる製剤の使用により肺投与を利用することもできる。例えば、米国特許第6,019,968号；同第5,985,320号；同第5,985,309号；同第5,934,272号；同第5,874,064号；同第5,855,913号；同第5,290,540号；および同第4,880,078号；ならびにPCT公開WO 92/19244；同WO 97/32572；同WO 97/44013；同WO 98/31346；および同WO 99/66903を参照されたい（これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。
【０３３０】
本発明はまた、本発明の抗体を、密閉容器、例えば、アンプルまたは小袋（サシェ）中にパッケージし、抗体の量を表示して提供する。一実施形態においては、本発明の抗体を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて供給し、そして例えば水または生理食塩水を用いて被験者に投与するために適当な濃度に再調製してもよい。好ましくは、本発明の抗体を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末として密閉容器に入れて少なくとも5mg、さらに好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、または少なくとも75mgの単位用量にて供給する。凍結乾燥した本発明の抗体はそのもとの容器中で2〜8℃の間で貯蔵するべきであり、かつ抗体は、再調製後12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与するべきである。別の実施形態においては、本発明の抗体を、液体剤形で、密閉容器に入れて、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、抗体の液体剤形を、密閉容器に入れて、抗体が少なくとも1mg/ml、さらに好ましくは少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも150mg/ml、少なくとも200mg/mlで供給する。
【０３３１】
障害に関連するの１以上の症状の治療、予防または改善のために有効であると考えられる本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤で用いるべき正確な用量はまた、投与経路、および病状の重篤度にも依存するであろうし、また医師の判断およびそれぞれの患者の環境によって決定するべきである。有効な用量をin vitroまたは動物モデル試験系から誘導した用量-応答曲線から推定することもできる。
【０３３２】
本発明に包含される抗体について患者に投与される投与量は、典型的には、0.0001mg/kg〜100mg/kg患者体重である。好ましくは、患者に投与される投与量は、0.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kgまたは0.01〜0.10mg/kg患者体重である。一般的に、外来性ポリペプチドに対する免疫応答のために、ヒト抗体はヒト体内において他種由来の抗体より長い半減期を有する。従って、ヒト抗体は投与量の低減および投与頻度の低減がしばしば可能である。さらに、例えば、脂質化などの修飾により抗体の取込みおよび組織浸入を増大させることにより、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与の量と頻度を低減させることができる。
【０３３３】
一実施形態においては、患者に投与される本発明の抗体の投与量は単剤療法として用いるとき、0.01mg〜1000mg/日である。他の実施形態においては、本発明の抗体を他の治療組成物と一緒に用い、患者に投与される投与量は上記抗体を単剤療法として用いるときより小さい。
【０３３４】
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所投与することが所望される場合がある；これは、例えば、限定されるものでないが、局所注入により、注射により、またはシラスティック（sialastic）メンブランなどのメンブランまたは繊維をはじめとする多孔質、非孔質、またはゼラチン状材料からなるインプラントを用いて達成することができる。好ましくは、本発明の抗体を投与するときには、抗体または融合タンパク質を吸着しない材料を使うように注意しなければならない。
【０３３５】
他の実施形態においては、組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-BeresteinおよびFidler (編), Liss, New York, pp.353-365 (1989)；Lopez-Berestein, 同文献, pp.3 17-327 を参照；一般的には同文献を参照）。
【０３３６】
さらに他の実施形態においては、組成物を制御放出または持続放出系で送達することができる。当業者に公知のいずれかの技術を利用して、本発明の１以上の抗体を含む持続放出製剤を製造することができる。例えば、米国特許第4,526,938号；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/20698；Ningら, 1996,「持続放出ゲルを用いるヒト結腸癌異種移植片の腫瘍内放射線免疫療法（Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel）」 Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songら, 1995, 「長循環エマルジョンの抗体介在性肺ターゲティング（Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions）」 PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, 「心血管応用のためのbFGF抗体に対する生分解性ポリマー担体（Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application）」 Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLamら, 1997, 「局所送達のための、組換えヒト化モノクローナル抗体のマイクロカプセル化（Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery）」 Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい（これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。一実施形態においては、ポンプを制御放出系に用いる（Langer, 前掲；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507；およびSaudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。他の実施形態においては、ポリマー材料を用いて抗体の制御放出を達成することができる（例えば「制御放出の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；「制御放出薬生体利用能、医薬品設計と性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）」, Smolen およびBall (編), Wiley, New York (1984)；RangerおよびPeppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照；またLevyら, 1985, Science 228:190；Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howardら, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照；米国特許第5,679,377号；同第5,916,597号；同第5,912,015号；同第5,989,463号；同第5,128,326号；PCT公開WO 99/15154；およびPCT公開WO 99/20253を参照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、限定されるものでないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸（PLA）、ポリ(乳酸-コ-グリコリド)（PLGA）、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに他の実施形態においては、制御放出系を治療標的（例えば、肺）の近位に配置して、その結果、全身用量の一部分しか必要としないようにすることができる（例えば、Goodson, 「制御放出の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, 前掲, vol. 2, pp.115-138 (1984)を参照）。他の実施形態においては、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物を、Dunnら（米国特許第5,945,155号を参照）に従い使用する。この特定の方法は、生物活性材料のポリマー系からのin situ制御放出の治療的効果に基づく。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者体内のいずれの場所で行ってもよい。他の実施形態においては、非ポリマー持続送達系を使用���、この場合、被験者体内の非ポリマー性インプラントを薬物送達系として利用する。体内に移植すると、インプラントの有機溶媒は組成物から周囲組織液中に散逸、分散または浸出して非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降し、固体のミクロ多孔質マトリックスを形成する（米国特許第5,888,533号を参照）。
【０３３７】
制御放出系は、Langer（1990, Science 249:1527-1533）による総説に考察されている。当業者に公知のいずれの技術を用いて本発明の１以上の治療薬を含む持続放出製剤を作ってもよい。例えば、米国特許第4,526,938号；国際公開WO 91/05548および同WO 96/20698；Ningら, 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189；Songら, 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLamら, 1997, Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい（これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。
【０３３８】
特定の実施形態においては、本発明の組成物が抗体をコードする核酸である場合、核酸をin vivo投与してそのコードされた抗体の発現を促進することができ、その投与はそれを適当な核酸発現ベクターの部分として構築し、細胞内に取込まれるように投与することにより、例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第4,980,286号を参照）、または直接インジェクションにより、または微粒子ボンバードメントにより（例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤を用いてコーティングして、または核に侵入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること（例えば、Joliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照）などによる。あるいは、核酸を細胞内に導入して相同的組換えにより発現のために宿主細胞DNAに組込んでもよい。
【０３３９】
抗体について、被験者に投与される治療上または予防上有効な投与量は、典型的には、0.1mg/kg〜200mg/kg被験者体重である。好ましくは、被験者に投与される投与量は、0.1mg/kg〜20mg/kg被験者体重、そしてさらに好ましくは1mg/kg〜10mg/kg被験者体重である。本発明の抗体の投与の用量と頻度はまた、例えば脂質化などの修飾による抗体または融合タンパク質の取込みおよび組織浸入（例えば、肺中への）の増大によって低減することもできる。
【０３４０】
本発明の抗体の治療上または予防上有効な量を用いる被験者の治療は、単一治療または、好ましくは、シリーズの治療を含むことができる。好ましい例においては、被験者を約0.1〜30mg/kg体重の本発明の抗体を用いて、毎週１回、約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、さらに好ましくは約3〜7週間、そしてなおさらに好ましくは約4、5、または6週間の範囲で治療を行う。他の実施形態においては、本発明の医薬組成物を１日１回、１日２回、または１日３回投与する。他の実施形態においては、医薬組成物を週１回、週２回、２週に１回、月１回、６週に１回、２月に１回、年２回または年１回投与する。治療に使用する抗体の有効な投与量は、特定の治療のコースにわたって増加または減少させてよいことも理解されるであろう。
【０３４１】
5.5.1  医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物（例えば、不純なまたは非殺菌の組成物）および単位剤形の調製に利用することができる医薬組成物（すなわち、被験者または患者に投与するのに好適である組成物）を含む。そのような組成物は、本明細書に開示した予防および／もしくは治療薬またはこれらの薬剤と製薬上許容される担体の組合せの、予防上または治療上有効な量を含む。好ましくは、本発明の組成物は本発明の抗体および製薬上許容される担体の予防上または治療上有効な量を含む。
【０３４２】
ある特定の実施形態において医薬組成物は、FcγRIIAが結合する親和性よりも高い親和性でFcγRIIBと結合する治療上有効な量の抗体またはそのフラグメント、特異的に癌抗原と結合する細胞傷害性抗体、および製薬上許容される担体を含む。他の実施形態においては、上記医薬組成物はさらに１以上の抗癌剤を含む。
【０３４３】
特定の実施形態においては、用語「製薬上許容される」は連邦または州政府の規制当局により認可されたかまたは米国薬局方もしくは他の一般的に認められた動物そして特にヒトにおける使用に対する薬局方に掲げられたことを意味する。用語「担体」は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤、または治療薬を投与するのに用いるビヒクルを意味する。このような製薬担体は、水および油などの無菌液体であってもよく、石油、動物、植物または合成起源、例えばピーナッツオイル、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの無菌液体が含まれる。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は好ましい担体である。生理食塩水およびブドウ糖およびグリセロール水溶液もまた、特に注射溶液のための液体担体として利用することができる。好適な製薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望であれば、組成物はまた、小量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤などの剤形とすることができる。
【０３４４】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位剤形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、密閉容器、例えばアンプルまたは小袋（サシェ）に入れ、活性薬の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合、無菌製薬グレードの水または生理食塩水の入った点滴ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を注射により投与する場合、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供して、その成分が投与前に混合されるようにすることができる。
【０３４５】
本発明の組成物を、中性または塩形態として製剤化してもよい。製薬上許容される塩としては、限定されるものでないが、アニオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるアニオンと形成した塩、およびカチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたカチオンと形成した塩が挙げられる。
【０３４６】
本発明はまた、Ｂ細胞性悪性腫瘍、もしくはその１以上の症状の予防、治療、管理、または改善での使用のための、FcγRIIBアンタゴニストを含んでなる医薬組成物およびキットも提供する。特に、本発明は、FcγRIIBアンタゴニスト、類似体、誘導体または抗FcγRIIB抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含んでなる医薬組成物およびキットを提供する。
【０３４７】
5.5.2  遺伝子治療
特定の実施形態においては、抗体または融合タンパク質をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子治療によって疾患、障害、もしくは感染症に関連する１以上の症状を治療、予防、または改善する。遺伝子治療とは、発現されるかまたは発現されうる核酸の被験者への投与により実施する療法を意味する。本発明のこの実施形態においては、核酸は、治療または予防効果を仲介する、それがコードする抗体または融合タンパク質を産生する。
【０３４８】
当技術分野で利用しうるいずれの遺伝子治療用の方法も本発明に従って使用することができる。方法の例を以下に記載する。
【０３４９】
遺伝子治療の方法の一般的総説としては、Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11 (5) :155-215；およびScholl, 2003, J. Biomed Biotechnol 2003:35-47を参照されたい。組換えDNA技術の技術分野で公知の利用可能な方法は、Ausubelら (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０３５０】
好ましい態様においては、本発明の組成物は抗体をコードする核酸を含み、上記核酸は好適な宿主中において抗体を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、抗体コード領域と機能しうる形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは、誘導可能、構成的、かつ場合によっては、組織特異的である。他の特定の実施形態においては、抗体コード配列およびいずれか他の所望の配列がゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域につなげられ、その結果、抗体をコードする核酸の染色体内発現が可能である核酸分子が使用される（KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；ならびにZijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０３５１】
他の好ましい態様においては、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、上記核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能しうる形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは、誘導可能、構成的、かつ場合によっては、組織特異的である。他の特定の実施形態においては、融合タンパク質のコード配列およびいずれか他の所望の配列がゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域につなげられし、その結果、融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現が可能である核酸分子が使用される。
【０３５２】
核酸の被験者体内への送達は、直接的（この場合には被験者を核酸または核酸を運ぶベクターに直接曝す）または間接的（この場合には細胞を最初に核酸にin vitroで形質転換し、次いで被験者中に移植する）のいずれであってもよい。これらの２つの手法は、それぞれ、in vivoまたはex vivo遺伝子治療として知られる。
【０３５３】
特定の実施形態においては、核酸配列が直接in vivoに投与され、そこで発現してコードされた産物を産生する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより実施することができる；例えば、それを適当な核酸発現ベクターの一部分として構築し、そして細胞内に取込まれるように投与することにより、例えば、欠陥もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使った感染により（米国特許第4,980,286号を参照）、または裸のDNAの直接インジェクションにより、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤を用いてコーティングし、リポソーム、ミクロ粒子、もしくはマイクロカプセル内に封入し、またはそれらを核に侵入することが知られるペプチドと連結して投与することにより、受容体を介するエンドサイトーシスを受けるリガンドと連結して投与すること（これにより受容体を特異的に発現する細胞型を標的化する）（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）などによる。他の実施形態においては、核酸-リガンド複合体（このリガンドはエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含む）を形成させて、核酸にリソソーム分解を回避させることができる。さらに他の実施形態においては、特異的受容体を標的化することにより、in vivoで核酸を細胞特異的取込みおよび発現に向かわせることができる（例えば、PCT公開WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188；WO 93/20221を参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、そして発現のために宿主細胞DNA内に相同組換えによって組込ませることができる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；およびZijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０３５４】
特定の実施形態においては、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを用いる。例えばレトロウイルスベクターを利用することができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNA中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子治療に利用する抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を１以上のベクター中にクローニングして、ヌクレオチド配列の被験者中への送達を容易にする。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesenら（1994, Biotherapy 6:291-302）に見出すことができ、これは、化学療法にさらに耐性のある幹細胞を作る目的でmdr 1遺伝子を造血幹細胞へ送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献には：Clowesら, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kleinら, 1994, Blood 83:1467-1473；SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114がある。
【０３５５】
アデノウイルスは、遺伝子治療に利用しうる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達する媒体として特に魅力がある。アデノウイルスは天然に呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起す。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染することができるので有利である。KozarskyおよびWilson（Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, 1993）はアデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を発表している。Boutら（Human Gene Therapy, 5:3-10,1994）は、遺伝子をアカゲザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの利用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの利用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434；Rosenfeldら, 1992, Cell 68 :143-155；Mastrangeliら, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT公開W0 94/12649；ならびにWangら, 1995, Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい実施形態においては、アデノウイルスベクターを利用する。
【０３５６】
アデノ随伴ウイルス（AAV）も遺伝子治療における利用が報じられている（例えば、Walshら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第5,436,146号を参照）。
【０３５７】
遺伝子治療に対する他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介するトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、遺伝子を組織培養物中の細胞に導入することを含む。通常、導入の方法は、選択可能なマーカーの細胞への導入を含む。次いで細胞を選択に付して、取り出されかつ導入した遺伝子を発現する細胞を単離する。次いでこれらの細胞を被験者に送達する。
【０３５８】
この実施形態においては、核酸を細胞中に導入した後に、得られた組換え細胞をin vivo投与する。このような導入は、当技術分野で公知のいずれかの方法により行うことができ、そのような方法としては、例えば、限定されるものでないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体依存性遺伝子導入（chromosome-mediated gene transfer）、マイクロセル依存性遺伝子導入（microcell mediated gene transfer）、スフェロプラスト融合などが挙げられる。外来遺伝子を細胞中に導入するための多数の技術は当技術分野で公知であり（例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohenら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；およびClin. Pharma. Ther. 29:69-92,1985を参照）、レシピエント細胞の必要な発達および生理学的機能が破壊されないことを条件として本発明に従って利用することができる。その技術は核酸の細胞への安定な導入を提供して、核酸が細胞により発現され、そして好ましくはその細胞子孫に遺伝してかつ発現されるものでなければならない。
【０３５９】
得られる組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。細胞の使用予想量は、所望の効果、患者状態などに依存し、当業者が決定しうる。
【０３６０】
遺伝子治療の目的で核酸を導入する相手の細胞は、いずれの所望の、利用しうる細胞型を包含してもよく、限定されるものでないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものを含む。
【０３６１】
好ましい実施形態においては、遺伝子治療に使用される細胞は被験者にとって自己のものである。
【０３６２】
組換え細胞を遺伝子治療に使用する一実施形態においては、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞中に導入して、それらがその細胞またはその子孫により発現されるようにし、次いでその組換え細胞をin vivoで投与して治療効果を与える。特定の実施形態においては、幹細胞または前駆細胞を用いる。単離してin vivoで維持することができるいずれの幹細胞および／または前駆細胞も潜在的に、本発明のこの実施形態に従って利用することができる（例えば、PCT公開WO 94/08598；StempleおよびAnderson, 1992, Cell 7 1:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A :229；ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照）。
【０３６３】
特定の実施形態においては、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と機能しうる形で連結された誘導性プロモーターを含み、それにより適当な転写誘導物質の存在または不在を制御することにより核酸の発現を制御することができる。
【０３６４】
5.5.3  キット
本発明は、本発明の抗体を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な１以上の他の予防薬または治療薬を、医薬パックまたはキット中に含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。場合によってはこのような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式であって、ヒト投与用の製造、使用または販売についての行政当局による認可を表示する注意書きを添付してもよい。
【０３６５】
本発明は、上記の方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態においては、キットは１以上の本発明の抗体を含む。他の実施形態においては、キットはさらに、癌の治療用に有用な１以上の他の予防薬または治療薬を、１以上の容器中に含む。他の実施形態においては、キットはさらに、癌に関連する１以上の癌抗原と結合する１以上の細胞傷害性抗体を含む。ある特定の実施形態においては、他の予防薬または治療薬は化学療法薬である。他の実施形態においては、予防薬もしくは治療薬は生物学的医薬またはホルモン療法薬である。
【０３６６】
5.6  治療上の有用性の特徴付けおよび実証
本発明の医薬組成物または予防薬もしくは治療薬の複数の態様は、好ましくは、in vitro、例えば細胞培養系で試験し、次いでin vivo、例えば動物モデル生物で、例えばげっ歯類動物モデル系で所望の治療活性について試験した後に、ヒトに使用する。例えば、特定の医薬組成物の投与が適応するかどうかを確認するために用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイであって、患者組織サンプルを培養し、医薬組成物に曝すかまたはそれ以外の様式で接触させ、そして組織サンプルに対するこのような組成物の効果、例えば、軟寒天中での増殖および／もしくはコロニー形成あるいは３次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成の抑制または減少を観察する上記アッセイを含む。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、治療上最も有効な予防分子または治療分子をそれぞれの個々の患者に対して特定することができる。あるいは、患者からの細胞を培養する代わりに、治療薬および方法を、腫瘍細胞または悪性細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。様々な特定の実施形態においては、in vitroアッセイを、自己免疫性または炎症性障害に関わる細胞型（例えば、Ｔ細胞）の代表的細胞を用いて実施し、本発明の医薬組成物がこのような細胞型に対して所望の効果を有するかを確認することができる。当技術分野で標準的な多数のアッセイを用いて、このような生存および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖は、3H-チミジン取り込みを測定することにより、直接細胞計数より、プロトオンコジーン（例えば、fos、myc）もしくは細胞周期マーカーなどの公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および／またはコロニー形成または３次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成の減少などに基づいて視覚的に評価することができる。さらなるアッセイとしては、当技術分野で公知のものおよび実施例に記載したラフト結合、CDC、ADCCおよびアポトーシスアッセイが挙げられる。
【０３６７】
予防薬および／または治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系としては、限定されるものでないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の特定の実施形態においては、予防薬および／または治療薬の組合せをマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用されていて、当業者に周知である。予防薬および／または治療薬は、反復して投与することができる。予防薬および／または治療薬を投与する時間的計画、およびこのような薬剤を別々にまたは混合物として投与するかどうかなどの手段についてのいくつかの態様は、様々でありうる。
【０３６８】
本発明の方法に使用する好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上にFcγRを発現するトランスジェニックマウス、例えば、米国特許第5,877,396号（これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）に記載されたいずれかのマウスモデルである。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、限定されるものでないが、ヒトFcγRIIIAを有するマウス、ヒトFcγRIIAを有するマウス、ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIIAを運ぶマウス、ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIAを有するマウスが挙げられる。
【０３６９】
本発明の予防薬および／または治療薬の動物モデルでの試験が終わると、それらを臨床試験で試験してそれらの効力を立証することができる。臨床試験は、当業者に公知の通常の方法論に従って成立させることができるのであって、本発明の組成物の最適の投与量と投与経路だけでなく毒性プロファイルも常套的な実験を利用して立証することができる。
【０３７０】
本発明の併用療法の抗炎症性活性は、当技術分野で公知のものおよびCrofford L. J.およびWilder R. L.（「動物の関節炎と自己免疫（Arthritis and Autoimmunity in Animals）」 in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCartyら (編), 第30章 Lee and Febiger, 1993)に記載の炎症性関節炎の様々な実験動物モデルを利用して決定することができる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的かつ自発性動物モデルもまた、本発明の併用療法の抗炎症性活性を評価するために利用することができる。以下に例としていくつかのアッセイを挙げるが、これらに限定されるものではない。
【０３７１】
当技術分野で公知かつ広く利用される関節炎または炎症性疾患用の主な動物モデルとしては、アジュバント誘導関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに抗原誘導関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデルが挙げられ、これらは全て、Crofford L. J. and Wilder R. L. （「動物の関節炎と自己免疫（Arthritis and Autoimmunity in Animals）」 in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCartyら (編), 第30章 Lee and Febiger, 1993、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）に記載されている。
【０３７２】
本発明の併用療法の抗炎症性活性は、カラゲナン誘導関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラゲナンが誘導する関節炎は、ウサギ、イヌおよびブタにおける慢性関節炎または炎症の研究にも利用されている。定量的な組織形態計測的評価を用いて治療効力を決定する。このようなカラゲナン誘導関節炎モデルを利用する方法は、Hansra P.ら,「ラットにおけるカラゲナン誘導関節炎（Carrageenan-induced Arthritis in the Rat）」, Inflammation, 24(2):141-155, (2000)に記載されている。また、ザイモサンが誘導する炎症動物モデルも通常利用されかつ当技術分野で公知である。
【０３７３】
本発明の併用療法の抗炎症性活性はまた、カラゲナン誘導性のラットの足浮腫（paw edema）の抑制を、Winter C. A.ら,「抗炎症剤用アッセイとしての、カラゲナンが誘導するラット後足浮腫（Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs）」Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962)に記載の方法の改変法を用いて測定することにより評価することもできる。このアッセイはほとんどのNSAIDの抗炎症性活性に対する一次in vivoスクリーニングとして使われていて、ヒト効力を予測すると考えられている。試験予防薬または治療薬の抗炎症性活性は、ビヒクルを投与した対照グループと比較した試験グループの後足重量増加の抑制％として表現される。
【０３７４】
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを用いて、本発明の併用療法の効力を評価することもできる（Kimら, 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537；Strober, 1985, Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S）。潰瘍性大腸炎およびクローン病は動物に誘導することができるヒト炎症性腸疾患である。硫酸化多糖体（限定されるものでないが、アミロペクチン、カラゲーン、アミロペクチン硫酸およびデキストラン硫酸を含む）または化学刺激剤（限定されるものでないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）および酢酸を含む）を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導することができる。
【０３７５】
喘息についての動物モデルを利用して、本発明の併用療法の効力を評価することもできる。このようなモデルの一例は、マウス養子移入モデルであり、このモデルでは、TH1またはTH2レシピエントマウスのエーロアレルゲン吸入誘発により、気道へのTHエフェクター細胞の遊走が起こり、激しい好中球（TH1）および好酸球（TH2）肺粘膜炎症性応答を起こす（Cohnら, 1997, J. Exp. Med. 186:1737-1747）。
【０３７６】
自己免疫障害用の動物モデルを利用して、本発明の併用療法の効力を評価することもできる。自己免疫障害、例えばＩ型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス、および糸球体腎炎に対する動物モデルが開発されている（Flandersら, 1999, Autoimmunity 29:235-246；Kroghら, 1999, Biochimie 81:511-515；Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19:12-24）。
【０３７７】
さらに、当業者に公知のいずれかのアッセイを利用して、本明細書に開示した自己免疫および／もしくは炎症性疾患に対する併用療法の予防効力および／または治療効用を評価してもよい。
【０３７８】
本発明の予防プロトコルおよび／または治療プロトコルの毒性および効力は、細胞培養または実験動物における、例えば、LD50（集団の50％に対する致死用量）およびED50（集団の50％における治療上有効な用量）を確認するための標準的な製薬上の手順により確認することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表現される。大きな治療指数を示す予防薬および／または治療薬が好ましい。毒性副作用を表す予防薬および／または治療薬を使用することはできるが、このような薬物を罹患組織の部位に到達させる送達系を設計して非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それにより、副作用を軽減するように注意しなければならない。
【０３７９】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトに使用する予防薬および／または治療薬の投与量の範囲を処方するのに利用することができる。このような薬物の投与量は、好ましくは、ED50を含みかつ毒性がほとんどないか無毒の循環濃度の範囲内にある。投与量は、利用する投与剤形および投与経路に依存してこの範囲で変えることができる。本発明の方法に使用するいずれの薬物に対しても、治療上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大半値抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルで処方してもよい。このような情報を利用して、ヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０３８０】
本発明に従って使用される療法の抗癌活性はまた、当技術分野で公知でありかつRelevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development（1999, FiebigおよびBurger編）； Contributions to Oncology（1999, Karger）；The Nude Mouse in Oncology Research（1991, Boven and Winograd編）；およびAnticancer Drug Development Guide（1997 Teicher編）（これらは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）に記載されている、癌研究用の様々な実験動物モデル、例えばSCIDマウスモデルもしくはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片を有するヌードマウス、動物モデル、例えば、ハムスター、ウサギなどを用いることにより決定することもできる。
【０３８１】
本発明のプロトコルと組成物は、ヒトで使用する前に、好ましくは、in vitroで、次いでin vivoで、所望の治療活性または予防活性について試験する。治療薬と方法は、腫瘍細胞または悪性細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野で標準的な多くのアッセイを利用してこのような生存および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖は3H-チミジン取り込みを測定することにより、直接細胞計数により、プロトオンコジーン（例えば、fos、myc）または細胞周期マーカーなどの公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および／もしくはコロニー形成または３次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成の減少などに基づいて視覚的に評価することができる。
【０３８２】
治療に用いる化合物は、限定されるものでないが、ヒトで試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含む好適な動物モデル系で、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。次いで、化合物を適当な臨床試験に使用することができる。
【０３８３】
さらに、当技術分野で公知のいずれかのアッセイを用いて、本明細書に開示した併用療法の予防および／または治療効用を、癌、炎症性障害、もしくは自己免疫疾患の治療または予防について評価することができる。
【０３８４】
5.7  診断方法
標識した本発明の抗体を診断目的に用いて、疾患、障害もしくは感染症を検出、診断、またはモニターすることができる。本発明は、疾患、障害もしくは感染症、特に自己免疫疾患を検出または診断する方法であって、(a)被験者の細胞または組織サンプル中のFcγRIIBの発現を、FcγRIIBと免疫特異的に結合する１以上の抗体を用いてアッセイするステップ；および(b)抗原のレベルを対照レベル、例えば正常組織サンプル中のレベルと比較するステップを含み、ここで抗原の対照レベルと比較した抗原のアッセイされたレベルの増大は疾患、障害または感染症を示すものである方法を提供する。
【０３８５】
本発明の抗体を使用し、生物学的サンプル中のFcγRIIBレベルを本明細書に記載したかまたは当業者に公知の古典的免疫組織学的方法を用いて評価することができる（例えば、Jalkanenら, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985；Jalkanenら, 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096を参照）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）を含む。好適な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、酵素標識、例えばアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えばヨウ素（125I, 131I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（121In）、およびテクネチウム（99mTc）；発光標識、例えばルミノール；および蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミンが挙げられる。
【０３８６】
本発明の一態様は、ヒトにおける疾患、障害、または感染症の検出および診断である。一実施形態においては、診断は、a)被験者にFcγRIIBと免疫特異的に結合する標識抗体の有効量を投与する（例えば、非経口、皮下、または腹腔内に）ステップ；b)投与後の一定時間の間、標識抗体が被験者体内の各部位に選択的に濃縮してそこでFcγRIIBが発現される（そして非結合標識分子がバックグラウンドレベルまでクリアされる）のを待つステップ；c)バックグラウンドレベルを測定するステップ；およびd)被験者中の標識抗体を検出して、バックグラウンドレベルを超える標識抗体の検出が、被験者が疾患、障害または感染症を有することを示すようにするステップを含む。この実施形態に従って、抗体を、当業者に公知のイメージングシステムを用いて検出可能であるイメージング部分により標識する。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系に対してあらかじめ決定した標準値と比較することをはじめとする、様々な方法により決定することができる。
【０３８７】
被験者のサイズと使用するイメージングシステムが、診断イメージを生成するために必要なイメージング部分の量を決定するであろうことは当技術分野で理解されるであろう。ヒト被験者に対する放射性同位体部分の場合、注射される放射能の量は通常約5〜20ミリキュリーの99mTcであろう。標識した抗体を次いで選択的に特定のタンパク質を含有する細胞の位置に蓄積させる。in vivo腫瘍イメージングは、S. W. Burchielら, 「放射標識した抗体とそのフラグメントの免疫薬物動態学（Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments）」第13章 in Tumor Imaging :The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. BurchielおよびB. A. Rhodes, 編, Masson Publishing Inc. (1982)に記載されている。
【０３８８】
使用する標識のタイプおよび投与様式を含む複数の変数に依存して、標識した分子が被験者体内の部位に選択的に濃縮しうるため、および非結合標識分子がバックグラウンドレベルまでクリアされるための投与後の時間間隔は、6〜48時間または6〜24時間または6〜12時間である。他の実施形態においては、投与後の間隔は5〜20日または5〜10日である。
【０３８９】
一実施形態においては、疾患、障害または感染症のモニタリングを、例えば最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年などで疾患、障害または感染症の診断方法を繰返すことによって実施する。
【０３９０】
被験者中の標識した分子の存在は、in vivo走査のための当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。これらの方法は、使用する標識のタイプに依存する。当業者は特定の標識を検出するための適当な方法を決定することができよう。本発明の診断に利用しうる方法と装置としては、限定されるものでないが、コンピューター断層撮影（CT）、陽電子放出断層撮影（PET）などの全身走査、磁気共鳴イメージング（MRI）、およびソノグラフィーが挙げられる。
【０３９１】
特定の実施形態においては、分子を放射性同位体により標識し、患者において放射線応答外科機器（Thurstonら、米国特許第5,441,050号）を用いて検出する。他の実施形態においては、分子を蛍光化合物により標識し、患者において蛍光応答走査機器を用いて検出する。他の実施形態においては、分子を陽電子放出性金属により標識し、患者において陽電子放出断層撮影を用いて検出する。さらに他の実施形態においては、分子を常磁性標識により標識し、患者において磁気共鳴イメージングを用いて検出する。
【実施例】
【０３９２】
6.  実施例
6.1  モノクローナル抗体の調製
マウスモノクローナル抗体は、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592をもつクローン3H7または2B6からそれぞれ産生させた。FcγRIIAと結合するよりも大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を作製した。トランスジェニックFCγRIIAマウス（Dr. Ravetch 研究室, Rockefeller Universityにおいて作製された）を、ヒトFcγRIIB受容体の細胞外ドメインである残基1〜180をコードするcDNAを用いてトランスフェクトしておいた293細胞の上清から精製したFcγRIIBを用いて免疫感作した。これらのマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を作り、そしてFcγRIIAと結合するよりも大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体についてスクリーニングした。
【０３９３】
6.2  抗体スクリーニングおよび特徴付け
6.2.1  材料と方法
ハイブリドーマ培養からの上清を、FcγRIIAまたはFcγRIIBに対する免疫活性についてELISAアッセイを用いてスクリーニングする。それぞれの場合で、プレートを100ng/ウェルのFcγRIIAまたはFcγRIIBを用いてコーティングする。特定の受容体に対する抗体の結合はヤギ抗マウスHRPコンジュゲート抗体により650nmにおける吸収をモニターして検出する。
【０３９４】
ブロッキングELISA実験においては、ハイブリドーマ上清からの抗体についての、凝集IgGとFcγRIIBとの結合をブロックする能力をモニターする。プレートを適当な「ブロッキング剤」を用いてブロックし、洗浄バッファー（PBS＋0.1％Tween）を用いて３回洗浄する（200μl/ウェル）。プレートをハイブリドーマ上清と１時間37℃でプレインキュベートする。ブロッキングに続いて、固定した量の凝集ビオチン化ヒトIgG（1μg/ウェル）をウェルに加え、凝集物をFcγRIIB受容体と結合させる。この反応は、２時間37℃にて実施する。次いで検出をモニターし、さらに洗浄の後、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を用いて処理して結合した凝集IgGを検出する。650nmにおける吸収は結合した凝集IgGと比例する。
【０３９５】
β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイにおいては、ハイブリドーマ上清からの抗体の、Fｃγが誘導するβ-ヘキソサミニダーゼの放出を抑制する能力をモニターする。RBL-2H3細胞をヒトFcγRIIBを用いてトランスフェクトし；細胞を、0.03μg/mL〜30μg/mLの範囲の様々な濃度のヤギ抗マウスF(ab)2フラグメントを用いて刺激し；マウスIgE単独（0.01μg/mLにて）を用いて、または抗FcγRIIB抗体を用いて感作する。１時間37℃でインキュベートした後、細胞を遠心し；上清を回収し；そして細胞を溶解させる。上清に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を、比色アッセイでp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いて測定する。放出β-ヘキソサミニダーゼ活性を、全活性と比較しての放出された活性の％として表現する。
【０３９６】
BIAcore分析：CD32A-H131、CD32A-R131またはCD32Bとの抗体結合をBIAcore 3000バイオセンサー（Biacore AB、Uppsala、Sweden）において表面プラズモン分析により293H細胞に発現した受容体の可溶性細胞外ドメインを用いて分析した。捕捉抗体であるヤギ抗マウスFc特異的抗体のF(ab')2フラグメント（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）をCM-5センサーチップ上に、製造業者の推奨する手順に従って固定した。簡単に説明すると、センサーチップ表面上のカルボキシル基を、0.2M N-エチル-N-(3ジエチルアミノ-プロピル)カルボジイミドと0.05M N-ヒドロキシ-スクシンイミドを含有する溶液を注入することにより活性化した。次いでF(ab')2フラグメントを、1OmM酢酸ナトリウム、pH 5.0中の活性化したCM-5表面全体に流速5μl/分にて420秒間注入し、その後1Mエタノールアミンを用いて不活性化した。結合実験は、10mM Hepes、pH 7.4、150mM NaCl,および0.005％ P20界面活性剤を含有するHBS-Pバッファー中で実施した。各モノクローナル抗体をCM-5チップ上で、300nM抗体溶液を流速5μl/分にて240秒間注入することにより捕捉し、その後、単量体可溶性受容体を100nMの濃度および流速50μl/分にて120秒間で注入し、そして解離時間を180秒とした。F(ab')2GAM表面の再生を50mMグリシン、pH 1.5および50mM NaOHのパルス注入により実施した。基準曲線は、捕捉抗体の無い固定されたF(ab')2GAM表面全体にそれぞれの可溶性受容体を注入することによって得た。基準曲線を差引いて、応答を捕捉抗体の同じレベルに対して標準化した。捕捉抗体に対する可溶性受容体の結合の動力学的パラメーターを得るために、対応するIgGとの対応する濃度における結合曲線を差引いた。得られた曲線を別々のka/kdフィットにより分析した。ＫＤ値を２つの異なる濃度において４曲線の平均として計算した。
【０３９７】
FACS分析：FcγRIIBを発現するCHO細胞を様々な抗体を用いて染色してFACSにより分析する。一シリーズの実験において、細胞を直接標識してモノクローナル抗体が受容体を認識するかを確認する。
【０３９８】
ブロッキングFACS実験においては、ハイブリドーマ上清からの抗体の、凝集IgGとFcγRIIBとの結合をブロックする能力をモニターする。各サンプルについて約100万個の細胞（FcγRIIBを発現するCHO細胞）を、氷上で30分間2μｇのアイソタイプ対照（マウスIgG1）とともに、または2B6または3H7抗体とともにインキュベートする。細胞をPBS+1％BSAを用いて１回洗浄し、そして1μgの凝集ビオチン化ヒトIgGとともに30分間氷上でインキュベートする。細胞を洗浄し、二次抗体、すなわち結合した抗体を検出するためのヤギ抗マウスFITC、および結合した凝集ビオチン化ヒトIgGを検出するためのストレプトアビジン-PEコンジュゲートを加えて、氷上で30分間インキュベートする。細胞を洗浄してFACSにより分析する。
【０３９９】
Ｂリンパ球を、FcγRIIBおよびCD20の存在を検出するために染色する。各サンプルに対する200μLの「バッフィコート」を氷上で2μgのアイソタイプ対照またはモノクローナル抗体、2B6もしくは3H7とともにインキュベートする。細胞を１回PBS+1％BSAを用いて洗浄して1μlのヤギ抗マウス-PE抗体とともに30分間氷上でインキュベートする。細胞を１回洗浄してCD20-FITC抗体（2μg）をサンプルに加え、氷上で30分間インキュベートする。全てのサンプルをPBS+1％BSAを用いて１回洗浄し、そしてFACSにより分析する。
【０４００】
ヒトPBMCを、2B6、3H7、およびIV.3抗体を用いて染色し、次いでヤギ抗マウス-シアニン（Cy5）コンジュゲート抗体により染色した（Ｂリンパ球とコンジュゲートした抗CD20-FITC、単球とコンジュゲートした抗CD14-PE、NK細胞とコンジュゲートした抗CD56-PE、および顆粒球とコンジュゲートした抗CD16-PEを用いる二重染色）。
【０４０１】
ADCCアッセイ：Her2/neu抗原を発現する4〜5×106個の標的細胞（IGROV-1またはSKBR-3細胞）を、ビス(アセトキシメチル)2,2':6',2''-テルピリジン-t-6''-ジカルボキシラート（DELFIA BATDA試薬、Perkin Elmer/Wallac）を用いて標識する。BATDA試薬を細胞に加え、混合物を37℃にて好ましくは5％CO2のもとで、少なくとも30分間インキュベートする。次いで細胞を生理学的バッファー、例えば0.125mMスルフィンピラゾールを含むPBS、および0.125mMスルフィンピラゾールを含有する培地を用いて洗浄する。標識した標的細胞をエフェクター細胞、例えばPBMCに、約50:1、75:1、または100:1のエフェクター：標的比となるように加える。PBMCを、全血をFicoll-Hypaque（Sigma）上に重層し、室温で30分間500gにて遠心回転することにより単離した。白血球層をユウロピウムに基づくADCCアッセイ用のエフェクターとして回収した。凍結したかまたは新しく単離した清浄化単球（Advanced Biotechnologies, MD）をエフェクターとして腫瘍標的細胞株とともに100:1〜10:1の様々なエフェクター：標的比で用いて、抗体の濃度を1〜15μg/mlで力価測定する。凍結ストックとして得てサイトカインにより刺激した単球をADCCアッセイにおけるエフェクター細胞として用いる。もし凍結単球が最適な作用をすればそれを通常通りに使用し、そうでなければ新しい細胞を使用する。MDMは、培養中の単球の生存と分化を増大させることが知られるサイトカインGM-CSFまたはM-CSFを用いる処理により調製する。MDMをサイトカインを用いて刺激し、様々なFcγR（I、IIA、IIB、およびIIIA）の発現をFACS分析により確認する。
【０４０２】
エフェクターと標的細胞を、少なくとも２時間、16時間まで、37℃にて、5％CO2下で、標的細胞上に発現されるHer2/neu抗原に特異的な抗腫瘍抗体の存在のもとで、かつ抗FcγRIIB抗体の存在または不在のもとでインキュベートする。N297A突然変異を含有するように遺伝子操作されているキメラ4D5抗体を陰性対照として用いるが、それはこの抗体が腫瘍標的細胞と可変領域を介して結合するからである。この部位のグリコシル化が喪失すると、抗体のFc領域とFcγRとの結合は無くなる。市販されるヒトIgG1/kは抗FcγRIIB抗体に対するアイソタイプ対照として役立つ。細胞上清を回収して酸性ユウロピウム溶液（例えば、DELFIAユウロピウム溶液、Perkin Elmer/Wallac）に加える。形成されるユウロピウム-TDAキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計（例えば、Victor 1420、Perkin Elmer/Wallac）で定量する。最大放出（MR）と自発性放出（SR）とを、標的細胞の1％TX-100および培地単独とのインキュベーションによりそれぞれ確認する。抗体非依存性細胞傷害性（AICC）を、抗体の不在のもとでの標的およびエフェクター細胞のインキュベーションにより測定する。それぞれのアッセイは好ましくは３重で実施する。平均％比溶解は、実験的放出(ADCC-AICC)/(MR-SR)×100として計算する。
【０４０３】
6.2.2  3H7クローンから産生されるモノクローナル抗体の特徴付け
ハイブリドーマ培養物の様々なバッチの直接結合：ハイブリドーマ培養物の様々なバッチのFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合を、ELISAアッセイを用いて比較した（図1A）。上清番号1、4、7、9、および3を特異的結合について試験し、その結合を市販抗体であるFL18.26と比較した。図lA（左パネル）に示すように、クローン7からの上清がFcγRIIBと最大の結合を有し、この結合は、飽和条件のもとで市販抗体とFcγRIIBとの結合より約4倍強い。しかし、クローン7からの上清は、FcγRIIAに対して右パネルに見られるようにほとんど親和性がないが、市販抗体はFcγRIIAと少なくとも4倍、より強く結合する。
【０４０４】
3H7クローンから産生される抗体とFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合：粗製3H7上清および精製3H7上清の結合を測定した（図1B）。それぞれの場合で、上清を70μg/mlの濃度で供給し、6倍まで希釈した。図1Bに示すように、飽和条件のもとで、3H7上清はFcγRIIAと結合するより4倍強くFcγRIIBと結合する。プロテインGカラムを用いて精製すると、3H7上清のそれぞれの免疫原との絶対的結合が改善される。
【０４０５】
3H7クローンから産生される抗体による、FcγRIIBに対する凝集ヒトIgG結合のブロッキング：もしハイブリドーマ上清中に存在する抗体がIgG結合部位においてFcγRIIBと結合してIgG結合をブロックすれば、凝集IgGは受容体と結合できず、従って650nmにおける吸収を検出することはできない。抗体は事実上、FcγRIIB上のIgG結合部位をブロックする「ブロッキング剤」である。対照として、ブロッキングなし、対照上清、および3H7クローンからの上清を用いてELISAを実施した。図2に示すように、3H7上清は完全にIgG結合をブロックしたが、それは、650nmにおける吸収を欠くことから明らかなように、凝集IgGが受容体と結合することができないからである。しかし、対照上清はIgG結合をブロックせず；凝集IgGは650nmでの記録により明らかなように受容体と結合する。対照上清はブロッキングなしで行った状況に類似する。
【０４０６】
3H7クローンから産生される抗体の、細菌および哺乳動物FcγRIIBに対する直接結合の比較：図３に示すように、3H7クローンからの上清は哺乳動物および細菌FcγRIIBと同じ程度に結合する。飽和条件のもとで、3H7上清は細菌および哺乳動物FcγRIIBと、FcγRIIAと結合するより約3倍強く結合する。このように、3H7クローンからのモノクローナル抗体は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）されている哺乳動物FcγRIIBと特異的に結合することができる。
【０４０７】
3H7クローンから産生される抗体とFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIIAとの直接結合：3H7細胞株由来のハイブリドーマ培養からの上清の、FcγRIIA、FcγRIIIAおよびFcγRIIBとの直接結合をELISAアッセイを用いて比較した(図４)。
【０４０８】
クローン3H7から産生した抗体はFcγRIIIAに対する親和性がなく、かつFcγRIIAと結合するより4倍大きい親和性でFcγRIIBと結合する。
【０４０９】
6.2.2.1  2B6クローンから産生されるモノクローナル抗体の特徴付け
FcγRIIに対する他の３種の市販モノクローナル抗体と比較した、2B6クローンから産生される抗体の直接結合の比較：クローン2B6から産生される抗体とFcγRIIAおよびFcγRIIBとの結合を、FcγRIIに対する３種の他の市販抗体であるAT10、FL18.26、およびIV.3のものと、ELISAアッセイで比較する。図5Aに見られるように、クローン2B6から産生される抗体は、他の市販抗体より最大4.5倍強くFcγRIIBと結合する。さらに、クローン2B6から産生される抗体は、FcγRIIAに対して最小の親和性しか有しないが、他の３種の市販抗体が、FcγRIIAと飽和しうる様式でクローン2B6からの抗体がFcγRIIAと結合するより2倍大きい親和性で結合する（図5B）。
【０４１０】
クローン2B6から産生される抗体による、FcγRIIBに対する凝集ヒトIgG結合のブロッキング：クローン2B6から産生される抗体の、FcγRIIBに対する凝集ヒトIgGの結合をブロックする能力を、ブロッキングELISAアッセイにより調べ、クローン3H7から産生される抗体のそれと比較した。図6Aに示すように、対照上清はIgG結合部位でFcγRIIBと結合せず、凝集IgGが受容体と結合できるので、従って650nmにおける吸収は最大である。しかし、クローン3H7はIgG結合を75％までブロックする。クローン2B6はIgG結合部位を完全にブロックし、凝集IgGは受容体と結合できないので、非常に高い希釈率でさえ、650nmにおける吸収が検出されない。図6Bはデータ棒グラフで示す。
【０４１１】
二重染色FACSアッセイを用いたFcγRIIBとの結合における2B6抗体と凝集IgGの競合：二重染色FACSアッセイを用いて、クローン2B6から産生される抗体を、全長哺乳動物FcγRIIBによりトランスフェクトしたCHO細胞において特徴付けた。
【０４１２】
図7Cに示すように、CHO細胞においては、細胞をモノクローナル抗体とともにプレインキュベートした後には、ビオチン化凝集IgGに対する染色が観察されないので、クローン2B6から産生される抗体は、凝集IgGとFcγRIIB受容体との結合を効果的にブロックする。細胞は下段右パネルでのみ染色され、ほとんどの細胞が2B6クローンからのモノクローナル抗体と結合したことを示す。IgG1をアイソタイプ対照として用いた対照実験である図7Aにおいて、すなわち細胞をアイソタイプ標識したIgGによって染色すると、モノマーIgGはFcγRIIBと検出可能な親和性で結合しないので、染色は観察されないが、図7Bにおいては、FcγRIIBと結合することができる凝集IgGによって、細胞の約60％は染色される。
【０４１３】
表面プラズモン共鳴分析によるCD32Bに対する特異性と選択性：ヒトCD32B対CD32Aに対する特異性と相対的親和性を表面プラズモン共鳴分析により研究した。全ての抗体をヤギ抗マウス抗体の固定したF(ab')2フラグメントによりチップ表面上に捕捉した。可溶性単量体形態のヒトCD32A-H131、CD32A-R131またはCD32Bを注入し、捕捉した抗体との相互作用をモニターした。図8A〜Cに示す通り、2B6はCD32Bと相互作用し（パネルA）、CD32Aとの検出される結合は見られなかった（パネルBおよびC）。よく特徴付けられている市販の抗huCD32抗体であるKB61も比較のアッセイに用いた。KB61は両方の受容体との結合を示した。それ故に2B6は専らCD32Bと反応し、検出しうるCD32A認識は見られない。
【０４１４】
6.2.3  FACS分析
モノクローナル抗FcγRIIB抗体およびCD20はヒトＢリンパ球を共染色する：二重染色FACSアッセイを利用してヒトＢリンパ球においてクローン2B6および3H7から産生される抗体を特徴付けした。Ｂリンパ球集団を選択するために、細胞をFITCとコンジュゲートした抗CD20抗体を用いて染色し、さらにヤギ抗マウスペルオキシダーゼを用いて標識したクローン3H7および2B6から産生される抗体を用いて染色した。横軸は抗CD20抗体蛍光の強度を表し、縦軸はモノクローナル抗体蛍光の強度を表す。図9BおよびCに示すように、細胞を抗CD20抗体ならびにクローン2B6および3H7から産生された抗体で二重染色したが、クローン2B6から産生される抗体はクローン3H7から産生される抗体より強い染色を示した。図9Aはアイソタイプ対照であるマウスIgG1の染色を示す。
【０４１５】
FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色：安定してFcγRIIBを発現するCHO細胞を、IgG1アイソタイプ対照（図10A；左パネル）を用いて、または3H7ハイブリドーマからの上清（図10A；右パネル）を用いて染色した。ヤギ抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を二次抗体として利用した。次いで細胞をFACSにより分析した；3H7ハイブリドーマからの上清を用いて染色した細胞は強い蛍光シグナルおよび右へのピークシフトを示し、3H7ハイブリドーマから産生された上清によるCHO細胞でのFcγRIIBの検出を示す。2B6ハイブリドーマから産生された上清を用いて染色した細胞も、IgG1を用いて染色した細胞と比較して、顕著な蛍光と右へのピークシフトを示し、2B6ハイブリドーマから産生した上清によるCHO細胞でのFcγRIIBの検出を示す。
【０４１６】
hyFcγRIIBを発現するCHO細胞を、抗CD32B抗体、2B6または3H7とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、そして9μg/mlの凝集ヒトIgGを氷上の細胞に加えた。ヒト凝集IgGを、FITCとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgGにより検出した。サンプルをFACSにより分析すると、2B6または3H7を用いて標識した細胞は凝集ヒトIgGの存在のもとで顕著な蛍光ピークを示した（図11）。2B6抗体は、左にシフトした蛍光ピークシフトにより明らかなように、凝集IgGの結合を完全にブロックした。しかし、3H7抗体は、中程度の蛍光ピークにより示されるように、凝集IgGの結合を部分的にブロックした。他の抗体、1D5、1F2、2El、2H9、および2D11は凝集IgGの結合をブロックしなかった。ヤギ抗マウスPEコンジュゲート抗体を用いた別のセットのサンプルにおいて、細胞上の受容体と結合した各抗体の量も検出した（挿入図）。
【０４１７】
細胞表面上のCD32Bの認識：細胞上に発現したCD32BをCD32Aから区別する能力およびヒト細胞株上の天然CD32B分子を認識する抗体の能力を試験する実験を行った。抗体の特異性を評価するために、2B6およびpan-抗CD32抗体であるFLI 8.26を、ヒトCD32A-R131もしくはCD32Bタンパク質をコードする発現ベクターを用いて安定してトランスフェクトした293-HEKヒト細胞、Daudi、RajiおよびTHP-1について、FACS分析で試験した（図12A〜J）。
【０４１８】
2B6は、CD32Bを用いてトランスフェクトした293-HEKならびにDaudiおよびRaji細胞（CD32Bを発現するバーキットリンパ腫由来のリンパ芽球腫株）と反応する一方、専らCD32A（H131型）を発現することが知られているTHPl単球細胞株を染色しなかった。対照的に、FLI 8.26は全ての細胞株と反応し、CD32AとCD32Bの間で選択性を示さなかった。
【０４１９】
2B6、3H7、およびIV.3抗体を用いたヒト末梢血白血球でのFACSプロファイル：抗FcγRIIB抗体およびIV.3抗体のFACSプロファイルはヒト造血細胞で発現される２種のFcγRIIアイソタイプであるIIBおよびIIAの間を区別するそれらの能力を示す。IV.3（FcγRIIを明確にするために用いた一次抗体（市販品）の１つ）は、FcγRIIAとの優先的結合を示す。
【０４２０】
主要なヒト造血細胞型の間のアイソフォーム発現には特徴的かつ機能的に顕著な相違が存在する。ヒトＢリンパ球は専らhuFcγRIIBアイソフォームを発現する一方、ヒト単球は主にhuFcγRIIAアイソフォームを発現する。顆粒球はFcRγIIAについて強陽性であり、限られた証拠はFcγRIIBがこの集団において辺縁に発現することを示唆する（Pricopら, 2000, J.Immunol. 166:531-537）。さらに抗FcγRIIB抗体の反応性を特徴付けるために、huPBLを抗FcγRIIB抗体である2B6および3H7を用いて、ならびに受容体のFcγRIIAアイソタイプを優先的に（独占的にではない）認識するIV.3を用いて染色し、白血球集団をFSC対SSCゲーティングに基づいて選択し（図13）かつ特異的マーカーを用いて同定した（図13）：CD20（Ｂ細胞）、CD56またはCD16（NK細胞、リンパ球ゲート）、CD14（単球）およびCD16（顆粒球、顆粒球ゲート）。CD20陽性細胞（Ｂ細胞）は2B6、3H7により均一に染色された。IV.3も大部分のCD20陽性細胞を染色した。CD16/CD56陽性NK細胞については染色が観察されなかった一方、一部分のCD14（単球）およびCD16（顆粒球）陽性細胞だけが2B6、3H7により染色された。対照的に、IV.3は非常に大部分のCD14陽性単球および全部のCD16陽性顆粒球を強く染色した（図13）。一方の2B6および3H7と他方のIV.3の間との反応性のこの示差的パターンは、新規のモノクローナル抗体がFcγRIIBと強く反応するがFCγRIIAと反応しないことを示す一方、IV.3はin vivoでFcγRIIAとFcγRIIBアイソフォームの間を区別できないことを示す。
【０４２１】
6.2.4  2B6によるB-ヘキソサミニダーゼ放出の抑制
即時型過敏性反応のモジュレーションにおける抗CD32B抗体の潜在的役割を試験するために、活性化受容体（FcεRI）および抑制性受容体（FcγRIIB）の共凝集を誘導する効果を調べた。IgE依存性肥満細胞活性化の原因となる機構を研究するために設計されたアレルギーモデルとして、当技術分野で広く利用されているラット好塩基性白血病細胞株、RBL-2H3をモデル系として選んだ（Ottら, 2002, J. Immunol. 168:4430-9）。FcγRIIBを発現するトランスフェクトされたRBL細胞を、0.01μg/mlのマウス抗DNP IgEを含有する新鮮培地に懸濁し、96ウェルプレートに2×104細胞／ウェルの濃度でまいた。CO2の存在のもとで37℃にて一晩インキュベーションした後、細胞を予め加温した放出バッファー（10mM HEPES、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.4mMリン酸二水素ナトリウム、5.6mMグルコース、1.8mM塩化カルシウム、1.3mM硫酸マグネシウムおよび0.04％ BSA、pH7.4）を用いて２回洗浄し、そしてキメラ4-4-20抗体と複合体化したBSA-DNP-FITCまたはキメラD265A 4-4-20抗体と複合体化したBSA-DNP-FITCの希釈系列を100μlバッファー／ウェルで用いて、2B6抗体、1F2抗体またはマウスIgG1アイソタイプ対照の存在のもとで37℃にて処理した。あるいは細胞をポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントを用いてチャレンジし、FcγRIを凝集させた（Genzyme）。ポリクローナル抗体がFcγRIと結合したマウスIgE抗体の軽鎖を認識するので、FcγRの架橋が起こる。この実験を図14Aに図解した。
【０４２２】
30分後に細胞を氷上に置いて反応を停止させた。それぞれのウェルから50μlの上清を取出して細胞を浸透圧によって溶解させた。細胞溶解物をp-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド（5mM）とともに90分間インキュベートし、反応をグリシン（0.1M、pH 10.4）を用いて停止し、そして3分後に405nmでの吸収を測定した。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼの％を全培地OD／全上清OD／全上清＋全細胞溶解物ODとして計算した。
【０４２３】
結果：活性化受容体により引き起こされた炎症性またはアレルギー性応答を制限するch2B6の能力を試験するために、F(ab')2フラグメントを用いて活性化受容体または抑制および活性化受容体の組合せを上記のように凝集させた。細胞をIgEだけで感作したとき、ポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントはFcεRIと結合したマウスIgEの軽鎖を認識し、これらの活性化受容体を凝集させ、そしてβ-ヘキソサミニダーゼ放出（脱顆粒のマーカー（Aketaniら, 2001, Immunol. Lett. 75:185-9））はIgEの増加とともに増大した（図14B）。対照的に、細胞を2B6または1F2によるインキュベーション後にIgEを用いて感作すると、F(ab')2フラグメントは、事実上、ラットFcεRIとCD32Bを共架橋し、無関係なマウスIgG1アイソタイプ対照に合わせた抗体を用いて予めインキュベートした感作した細胞と比較してβ-ヘキソサミニダーゼ放出の顕著な減少をもたらす。バックグラウンドレベルを越える脱顆粒は、抗CD32B抗体単独で処理した細胞では検出されなかった（データは示してない）。それ故にヒト抑制受容体であるCD32Bはラット好塩基球のネガティブシグナルを誘導することができ、これらのトランスフェクト細胞が抗ヒトCD32B抗体を研究するためのモデルとなることを実証する。
【０４２４】
抗CD32B抗体もかかる反応を改善することができるかどうかを試験するために、抑制受容体と活性化受容体との協働（co-engagement）をCD32Bのブロックにより阻止した。これらの受容体の協働は、抗原が抗原性エピトープを介して表面結合型IgEと、および抗原自体と複合体化した抗原特異的IgGのFc決定基を介してCD32Bと同時に相互作用するときに、生理的に起こると考えられる（図15A）。この状況を模倣するために、RBL-2H3モデルを操作してIgE、IgG、または両方と複合体化しうる抗原代理体を作り出すことによりFcεRIとCD32Bの協働を実現した。HuCD32B＋RBL-2H3細胞をマウスIgE抗DNPモノクローナル抗体を用いて感作した。チャレンジ抗原であるBSA-DNPをさらにFITCとコンジュゲートして4-4-20（マウス抗フルオレセイン抗体）のキメラ型（そのFc部分はヒトIgG1 Fcに置換されてヒトCD32Bと最適な結合を可能にする）により認識されるさらなるエピトープを得た。265位に突然変異（アスパラギン→アラニン）を有するヒトIgG1 Fcを用いた4-4-20のキメラ型も作製した。このキメラD265A 4-4-20抗体は、CD32BをはじめとするFcγRと結合する能力を欠く。BSA-DNP-FITCはIgE感作RBL-2H3細胞からのβ-ヘキソサミニダーゼの用量依存性放出を誘導した（図15C）。
【０４２５】
チャレンジ抗原がキメラD265A 4-4-20と複合体化したBSA-DNP-FITCである場合に同じ程度の脱顆粒が観察され、BSA-DNP-FITC-キメラD265A 4-4-20は予想されたようにCD32Bを活性化受容体へと動員することができないことを示した。キメラ4-4-20と複合体化したBSA-DNP-FITCの存在のもとで、β-ヘキソサミニダーゼ放出の著しい低下が観察された（図15B）。従って、多価抗原はFcεRIを凝集し続いて脱顆粒させることができる一方、IgGと複合体化した代理抗原はCD32Bを共凝集して脱顆粒の減少をもたらす。FcγRを同時に動員する機会を最小限にしつつCD32Bをブロックするために、2B6のF(ab)2フラグメントを調製し、細胞を、免疫複合化抗原による活性化の前に2B6 F(ab)2とともにプレインキュベートした。これらの条件下で、β-ヘキソサミニダーゼ放出の％は多価抗原だけで処理した細胞で観察された最高レベルまで回復した（図15C）。高い濃度の免疫複合化抗原では、なお脱顆粒の低下が観察されたが、これは恐らくch4-4-20と2B6 F(ab)2との間のCD32BのFc結合部位についての競合によるのであろう。これらのデータは、2B6がCD32BのFc結合部位を機能的にブロックし、IgG複合体化抗原による活性化受容体と抑制受容体の共ライゲーションを阻止できることを示す。提案した作用機構は免疫複合体が介在する細胞活性化の調節に利用することができよう。
【０４２６】
6.2.5  in vitro ADCCアッセイ
6.2.5.1  ch4D5はPBMCを用いる卵巣癌および乳癌細胞株の有効なADCCを媒介する
IGROV-1、OVCAR-8、およびSKBR-3細胞がHer2/neu抗原を発現するかどうかを確認するために、細胞を、精製4D5またはch4D5抗体を用いて氷上で染色し；非結合抗体をアジ化ナトリウム含有PBS/BSAバッファーを用いて洗浄除去し、そして4D5またはch4D5の結合を、それぞれPEとコンジュゲートしたヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒト抗体（Jackson Laboratories）により検出した。無関係なIgG1抗体（Becton Dickinson）を非特異的結合についての対照として使った。図16A〜Cに示すように、卵巣腫瘍細胞株は乳癌細胞株より弱くHer2/neu抗原を発現し、これらの細胞株を並行して評価することにより、本発明の抗FcγRIIB抗体による腫瘍クリアランスの強度が決定されるであろう。
【０４２７】
ヒト単球は、活性化受容体と抑制性受容体の両方を発現する、ADCCに関わるエフェクター集団である。FcγRの発現をFACS分析により複数ロットの凍結単球を用いて試験した（これらの細胞を用いた理由は腫瘍クリアランスにおけるch2B6の役割を研究するためのエフェクターとして養子移入しうるからである）。市販の清浄化凍結単球を10％ヒトAB血清を含有する基本培地中、ならびにヒト血清および25〜50ng/ml GM-CSFを有する基本培地中で解凍した。細胞を直接染色するか、または7〜8日間マクロファージに成熟させ（MDM）、プラスチックを外し、次いでIV.3-FITC（抗huFcγRIIA）、32.2-FITC（抗FcγRI）、CD16-PE（Pharmingen）または3G8（抗FcγRIII）-ヤギ抗マウスPE、3H7（抗FcγRIIB）、および単球用のCD14マーカー（Pharmingen）、ならびに対応するアイソタイプ対照を用いて染色した。新しく解凍した単球および培養単球でのFcγR発現を示す２人のドナーからのMDMの代表的なFACSプロファイルを図17A〜Cに示す。
【０４２８】
これらの結果は、FcγRIIBが単球（ドナーに依って5〜30％）で軽度に発現されることを示す。しかし、この発現は、マクロファージに成熟するにつれて増加する。予備的データは、ヒト腫瘍標本中の腫瘍浸潤マクロファージがFcγRIIBについて陽性に染色されることを示す（データは示していない）。FcγRのパターンおよび形態学的にマクロファージに分化する能力は、凍結単球の複数ロットで再現性のあることが見出された。これらのデータは、この細胞供給源が養子移入実験用に十分であることを示す。
【０４２９】
ch4D5はPBMCを用いる卵巣癌および乳癌細胞株の有効なADCCを媒介する：抗Her2/neu抗体のADCC活性をユウロピウムに基づくアッセイで試験した。卵巣細胞株であるIGROV-1、および乳癌細胞株であるSKBR-3を、ヒトPBLをエフェクター細胞とする4時間アッセイにおける標識した標的として用いた。図18AおよびBは、ch4D5がHer2/neuを発現する標的の溶解の仲介において機能的に活性であることを示す。抗Her2/neu抗体のADCC活性に対する本発明の抗体の効果を続いて測定する。
【０４３０】
6.2.5.2  キメラ抗CD32抗体ch2B6はin vitroで抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を媒介する
キメラ抗CD32B抗体（ch2B6）およびその非グリコシル化型（ch2B6Agly）を、CD32Bを発現するＢ細胞リンパ腫株であるDaudiおよびRajiに対するin vitro抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）を媒介する能力について試験した。ヒト化抗CD32B抗体（h2B6）およびその非グリコシル化型（hu2B6YA）もDaudi細胞において試験した。
【０４３１】
抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を評価するためのプロトコルは以前に記載されたもの（Dingら, 1998, Immunity）および本明細書に記載したものと同様である。簡単に説明すると、CD32Bを発現するＢ細胞リンパ腫株であるDaudiおよびRajiからの標的細胞を、ユーロピウムキレートビス(アセトキシメチル)2,2':6',2''-テルピリジン-6,6''二炭酸（DELFIA BATDA試薬, Perkin Elmer/Wallac）またはインジウム-111を用いて標識した。次いで標識した標的細胞を、キメラ抗CD32B（ch2B6）または非グリコシル化キメラ抗CD32B（ch2B6Agly）抗体のいずれかを用いて図20および21に示した濃度において、あるいはch2B6、ch2B6Agly、hu2B6およびhu2b6YAを図21に示したように用いてオプソニン化（コーティング）した。Ficoll-Paque（Amersham Pharmacia）勾配遠心分離により単離した末梢血単核球（PBMC）をエフェクター細胞として用いた（エフェクター：標的比は75：1）。37℃、5％CO2にて3.5時間のインキュベーション後に、細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液（DELFIAユーロピウム溶液、Perkin Elmer/Wallac）に加えた。形成されたユーロピウム-TDAキレートの蛍光を時間分解蛍光測定器（Victor2 1420、Perkin Elmer/Wallac）またはガンマカウンター（Wizard 1470、Wallac）で定量した。最大放出（MR）および自発性放出（SR）はそれぞれ、標的細胞の2％Triton X-100とのインキュベーションおよび培地単独でのインキュベーションにより測定した。抗体非依存性細胞性細胞傷害（AICC）は抗体の非存在のもとでの標的およびエフェクター細胞のインキュベーションにより測定した。各アッセイは3回反復で実施した。平均％比溶解は次式で計算した：(ADCC - AICC)/(MR-SR)×100。
【０４３２】
図20および21に示したように、キメラ抗CD32B抗体ch2B6はin vitroでCD32Bを発現するＢ細胞リンパ腫株であるDaudiおよびRajiに対するADCCを、約10ng/mlより高い濃度で媒介する。この抗体の非グリコシル化型であるch2B6Agly（Fc受容体と相互作用することができない）は本アッセイにおける活性が低下するので、この活性はFc依存性であると思われる。図22に示したように、ヒト非グリコシル化型はFc受容体と相互作用することができる。
【０４３３】
6.2.6  in vivo ADCCアッセイ
6.2.6.1  ヒト腫瘍細胞株を用いた異種移植マウスモデルにおけるFcγRIIB抗体の活性
６〜８週齢メスBalb/cヌードマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME；Taconic）を用いて異種移植卵巣癌および乳癌モデルを確立する。マウスはBIOCON, Inc. Rockville, Maryland（添付プロトコルを参照）で維持する。マウスを、腹水由来卵巣細胞および胸膜浸出液由来乳癌細胞を腫瘍供給源として用いた異種移植モデル用のバイオセーフティレベル-2施設で飼育する。マウスをこれらの実験のために4グループに分け、週３回モニターする。マウスの重量と生存期間を記録し、そして腫瘍増殖についての判定基準は腹部膨張および触知可能な腫瘍とする。明らかな不快の徴候を示すかまたは腫瘍重量が5グラムに達したマウスを二酸化炭素により安楽死させ、解剖する。抗体で処理した動物は、対照グループの後、さらに２ヶ月間観察下に置く。
【０４３４】
腫瘍細胞株を用いた異種移植腫瘍モデルの確立：異種移植腫瘍モデルを確立するために、5×106個の生IGROV-1またはSKBR-3細胞を３匹の年齢と体重をそろえたメスヌード胸腺欠損マウスにマトリゲル（Becton Dickinson）とともに皮下注射する。腫瘍の推定重量を、式：長さ×（幅）2/2により計算して3グラムを超えないようにする。増殖のための細胞のin vivo継代に当たっては、足場に依存する腫瘍を単離し、その細胞を、腫瘍1グラム当たり1μgのコラゲナーゼ（Sigma）を37℃にて一晩加えることによりばらばらにする。
【０４３５】
IGROV-1細胞の皮下注射は増殖の速い腫瘍を生じる一方、腹腔内経路はマウスを2ヶ月で死亡させる腹膜癌腫症を誘導する。IGROV-1細胞は５週以内に腫瘍を形成するので、腫瘍細胞注射後の1日目にエフェクターとしての単球を、マウス体重（mbw）1グラム当たりそれぞれ4μgの治療用抗体ch4D5およびch2B6とともに、腹腔内に同時注射する（表８）。最初の注射の後、抗体の注射を週１回、４〜６週間行う。ヒトエフェクター細胞は２週に１回補充する。マウスの１グループには治療用抗体を投与しないが、それぞれ抗腫瘍抗体およびch2B6抗体に対するアイソタイプ対照抗体としてのch4D5 N297AおよびヒトIgG1を注射する。
【表８】
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【０４３６】
表８に示されるように、１種類の標的とエフェクターの組合せと、２つの異なる抗体濃度の組合せによる腫瘍クリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の役割を試験するために、8マウスの6グループをそれぞれ必要とする。各グループは、A）腫瘍細胞、B）腫瘍細胞および単球、C）腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体ch4D5、D）腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体ch4D5、および抗FcγRIIB抗体（例えば、ch2B6）、E）腫瘍細胞、単球、および抗FcγRIIB抗体（例えば、ch2B6）、ならびにF）腫瘍細胞、単球、ch4D5 N297A、およびヒトIgG1である。様々な抗体濃度の組合せを類似のスキームで試験することができる。
【０４３７】
乳癌細胞株であるSKBR-3を用いる研究を、Her2neuを過剰発現するSKBR-3細胞としてのIGROV-1モデルと並行して実施する。これは腫瘍クリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の役割の評価の厳密さを増大させるであろう。IGROV-1細胞を用いる腫瘍クリアランス研究の結果に基づいて、他の標的による将来の実験の実験設計に改変を加える。
【０４３８】
異種移植腫瘍モデルの終点は、表８に示した各グループについての腫瘍のサイズ（マウス体重）、生存期間、および組織学報告に基づいて決定する。マウスを週３回モニターし；腫瘍増殖の判定基準は腹部膨張、腹腔中の触知可能な塊の存在である。接種後日数に対する腫瘍重量の推定値を計算する。表８のグループＤマウスと他のグループのマウスからの３つの判定基準に基づいて、腫瘍クリアランスの増大における抗FcγRIIB抗体の役割が明らかになるであろう。明らかな痛みの徴候を示すかまたは5グラムの腫瘍重量に達したマウスを二酸化炭素を用いて安楽死させ、解剖する。抗体で処理した動物はこの時点の後、２ヶ月間観察する。
【０４３９】
6.2.6.2  ヒト原発性卵巣癌および乳癌由来の細胞を有する異種移植マウスモデルにおけるFcγRIIB抗体のin vivo活性
癌腫症の患者由来の浸出液から単離した腫瘍細胞を移入することにより、原発性卵巣癌および乳癌からの原発性腫瘍を確立する。これらの研究を臨床に置き換えるために、異種移植モデルを、２人の卵巣癌患者および２人の乳癌患者からの、腹水および胸膜浸出液由来の腫瘍細胞をそれぞれ用いて評価する。乳癌細胞の供給源としての胸膜浸出液、および悪性乳房組織の移植を用いて異種移植マウスモデルが成功裏に確立されている；例えば、Sakakibaraら, 1996, Cancer J. Sci. Am. 2:291を参照されたい（これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。これらの研究により原発性細胞の腫瘍クリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の広範囲の適用が確認されるであろう。腫瘍クリアランスを、抗腫瘍抗体ch4D5および抗FcγRIIB抗体（例えばch2B6を用いて）、ヒト単球を養子移入されたBalb/cヌードマウスモデルにおいて試験する。
【０４４０】
ヒト腹水および胸膜浸出液由来の原発性腫瘍細胞：卵巣癌の患者からの腹水および乳癌患者から胸膜浸出液は、St. Agnes Cancer Center, Baltimore, Marylandにより提供される。患者からの腹水および胸膜浸出液は40-50％が腫瘍細胞を含有し、高発現のHer2neu+腫瘍細胞を含有するサンプルを用いて異種移植モデルを確立する。
【０４４１】
異種移植腫瘍モデルを確立する前に、腹水および胸膜浸出液サンプルを新生物細胞上のHer2/neuの発現について試験する。腫瘍モデルの確立に影響を与えうる、他の細胞サブセットに対する新生物細胞のパーセンテージを確認する。卵巣癌および乳癌の患者からの、それぞれ腹水および胸膜浸出液を通常通りに分析して新生物細胞上のHer2/neu+の発現レベルを確認する。FACS分析を用いて臨床サンプル中のHer2/neu+新生物細胞のパーセンテージを確認する。高いペーセンテージのHer2/neu+新生物細胞をもつサンプルを選択してBalb/cマウスにおける腫瘍の惹起に用いる。
【０４４２】
組織化学と免疫化学：組織化学と免疫組織化学を卵巣癌の患者の腹水および胸膜浸出液について実施し、新生物の構造的特性を分析する。モニターするマーカーは、サイトケラチン（炎症性および間葉細胞からの卵巣新生物および中皮細胞を同定するため）；カルレチニン（Her2/neu陽性新生物細胞と中皮を分離するため）；およびCD45（炎症性細胞をサンプル中の残りの細胞集団から分離するため）である。それらに続くさらなるマーカーはCD3（Ｔ細胞）、CD20（Ｂ細胞）、CD56（NK細胞）、およびCD14（単球）を含む。
【０４４３】
免疫組織化学染色用に、凍結切片およびパラフィン固定組織を標準技術により準備する。凍結ならびに脱パラフィンした切片を同様の染色プロトコルで染色する。スライドを3％過酸化水素水中に漬けて組織の内在性ペルオキシダーゼをクエンチし、PBSによって5分間洗浄する。切片をブロッキングし、ブロッキング血清中の一次抗体ch4D5を30分間加えた後に、サンプルをPBSにより３回洗浄する。ビオチンとコンジュゲートした抗ヒト二次抗体を加えて30分後にスライドをPBS中で5分間洗浄する。アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Vector Labs）を30分間加え、続いて洗浄する。スライドを新鮮な基質DAB溶液中でインキュベートすることにより発色させ、反応を水道水で洗浄することにより停止させる。HE染色のために、スライドを脱パラフィンし、次いで種々のアルコール濃度で水和させる。スライドを水道水で洗浄し、ヘマトキシリン中に5分間置く。過剰の染色を酸アルコール、続いてアンモニア、および水を用いて除去する。スライドをエオジン中に置き、続いてに90〜100％アルコールより洗浄して脱水する。最後に、スライドをキシレン中に置き、長期保存のための固定液を用いてマウントする。全ての場合で、腫瘍細胞のパーセンテージをパパニコロウ染色により決定する。
【０４４４】
組織化学染色：２人の異なる卵巣癌患者からの腹水をヘマトキシリン−エオジン（HE）およびギムザにより染色して、腫瘍細胞および他の細胞型の存在を分析した。組織化学染色の結果を図19に示す。
【０４４５】
マウスモデル：卵巣癌患者からのサンプルを、腹水を6370gにて20分間、4℃で遠心沈降し、赤血球を溶解した後、細胞をPBSにより洗浄することで処理する。各サンプル中のHer2/neu+腫瘍細胞のパーセンテージに基づいて中程度および高度に発現する２サンプルを選択し、皮下接種して異種移植モデルを確立し、腫瘍のクリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の役割を評価する。腫瘍細胞は無処理の腹水の細胞サブセットの40〜50％を占め、精製後にほぼ10〜50×106の腫瘍細胞が腹水2リットルから得られたと報告されている（Barkerら, 2001, Gynecol. Oncol. 82:57-63）。単離された腹水細胞をマウスに腹腔内注射して細胞を増殖させる。約10匹のマウスに腹腔内注射し、そしてそれぞれのマウス腹水をさらに各2マウス中に継代して全20マウスから腹水を得て、これを用いて80マウスのグループに注射する。胸膜浸出液を腹水と同様な方法で扱い、マトリゲル中のHer2neu+腫瘍細胞を左右上部乳房に注射する。腫瘍細胞の皮下接種後、マウスを臨床および解剖学的変化について観察する。必要であれば、マウスを解剖して、全腫瘍量と特定器官局在化との相関を調べる。
【０４４６】
6.2.7  ch2B6抗体の腫瘍増殖に対する効果
実験設計：Balb/cメスヌードマウス（Taconic、MD）に、0日目に5×106 個のDaudi細胞を皮下注射した。マウス（1グループ当たり5匹のマウス）に、0日目から始めて週1回、PBS（陰性対照）、10μg/g ch4.4.20（抗FITC抗体、陰性対照）、10μg/gリツキサン（陽性対照）または10μg/g ch2B6の腹腔内注射も行った。注射後に週2回マウスを観察し、腫瘍サイズ（長さと幅）をカリパスで測定した。腫瘍サイズ（mg）を次式により求めた：（長さ×幅2）/2。
【０４４７】
結果：図23に示すように、Daudi細胞はBalb/cメスヌードマウスで腫瘍細胞注射後21日目付近から皮下腫瘍を形成する。35日目、PBS（5マウスのうち5匹）または10μg/g ch4.4.20（5マウスのうち5匹）を投与されたマウスに皮下腫瘍を検出した。腫瘍は、10μg/gリツキサン（5マウスのうち1匹）を投与されたマウスでは稀にしか検出されず、そして10μg/g ch2B6（5マウスのうち0匹）を投与されたマウスでは全く検出されなかった。
【０４４８】
6.2.8  マウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対する2B6変異体の効果
実験設計：8週齢Balb/c FoxNlメスマウス（Taconic, Germantown, NY）に0日目に5×106個のDaudi細胞を皮下注射し、かつ腹腔内に2B6抗体変異体（ch2B6、chN297Q、h2B6、h2B6YA、h2B6YA 31/60、h2B6YA 38/60、h2B6YA 55/60、またはh2B6 YA 71；2.5μg、7.5μg、または25μgにて）、リツキシマブ（陽性対照；2.5μg、7.5μg、25μg、または250μgにて）またはPBS（陰性対照）を注射した。次いでマウスを抗体またはPBSで42日目まで週１回（全部で7回の注射）処理し、そして腫瘍サイズを週2回カリパスで測定した。腫瘍重量は次式を用いて求めた：（幅2×長さ）/2。
【０４４９】
結果：抗CD32BmAb変異体のin vivo腫瘍細胞増殖の予防における効力を評価するために、Balb/c FoxNlマウスにDaudi細胞および抗CD32BmAb変異体を同時に注射した（図24A〜G）。陽性対照、リツキシマブによる処理は、用量に依存する様式で腫瘍細胞増殖を顕著に低減した（図24A）。抗CD32B mAb 2B6の3種の変異体（キメラ2B6（ch2B6）、ヒト化2B6（h2B6）およびFv領域の変異体（h2B6YA））は全て、腫瘍増殖を遅延させるのに有効であった（図24B）。h2B6YA変異体は2.5μg（0.1μg/gm）の用量で腫瘍増殖に著しい低下を示した。同じ用量のリツキシマブは腫瘍増殖の防止にそれほど有効でなかった。Fc突然変異を有する4種のh2B6YA mAb変異体（h2B6YA 31/60、h2B6YA 38/60、h2B6YA 55/60、およびh2B6YA 71）を分析して、in vivo抗腫瘍活性を改善することができるかを確認した。突然変異体h2B6YA 31/60、h2B6YA 38/60、およびh2B6YA 55/60は、野生型Fcを保持するh2B6YAと同等以上に機能した（図24C、D、E、およびF）。突然変異体h2B6YA 71は用量依存性の活性を示した（図24G）。腫瘍細胞増殖を2.5μgおよび25μgの用量で遅延させた；しかし7.5μg用量では腫瘍増殖に対する効果は小さいかまたは全くなかった（図24G）。
【０４５０】
これらの結果は、h2B6YA 31/60およびh2B6YA 55/60がch2B6またはh2B6YAと比較してin vivo抗腫瘍活性を改善したことを実証するものである。
【０４５１】
6.2.9  CD20およびCD32Bに対するDaudiのex vivo染色
実験設計：Daudi腫瘍を、25μgのh2B6またはh2B6YAを用いて処理したマウスから採取した。CD20およびCD32B発現をin vitroで増殖させたDaudi細胞のものと比較した。FACS分析を第6.2.1節に記載の通り実施した。
【０４５２】
結果：図25A〜Iに示したように、in vivoで増殖させた細胞は抗CD32B処置後ですらCD20およびCD32B発現を維持していた。
【０４５３】
6.3  B-CLL細胞上のCD32Bの発現
CD32B特異的抗体がB-CLL患者から単離した細胞上のCD32Bと反応する能力を、単離した細胞を染色することによりFACS分析で試験した。
【０４５４】
患者からＢ細胞を単離するプロトコル：正常なドナーおよびＢ細胞新生物患者由来の末梢血白血球から単核白血球をFicoll-Paque PLUS（Amersham Pharmacia Biotech）勾配遠心分離を用いて単離し、液体窒素中でアリコートとして凍結保存した。各患者から新しく単離したPBMCのアリコートを、10％ヒト血清を含有するPBS中で洗浄し、直後に標準的なFACS分析によりCD32B発現について分析した。リンパ節生検標本から単一細胞懸濁液を同様な方法で調製し、直ちに分析し、そして液体窒素中で凍結保存する。
【０４５５】
各サンプルから２つのサイトスピンスライドを得て、１つをメイ・グリュンワルド・ギムザ（MGG）により直ちに染色して形態学評価を行った。分析の前に、患者細胞のアリコートを解凍し、解凍時に生存を評価し、もし必要があれば（回復時の生存＜80％）、Ficoll-Paque PLUS遠心分離に供した。腫瘍細胞の量は、FACS分析で抗κまたはλ鎖抗体を用いることによりクローン性から評価した。白血球表現型決定は直接コンジュゲートした抗CD3、CD20、CD56、CD14、およびCD16抗体および適当なFSCおよびSCCゲーティングを用いることにより実施した。B-CLL Ｂ細胞をさらにCD5、CD23、CD25、CD27、CD38、CD69、およびCD71について分析した（Damleら、2002、 Blood 99:4087-4093；Chiorazzi & Ferrarini、2003、Ann Rev Immunol 21:841-894）。バイアル数、1バイアル当たりの細胞数、および凍結保存前後の細胞生存率、腫瘍細胞数または白血球表現型を記録するコンピューター上の記録を継続した。
【０４５６】
FACS分析のプロトコル：細胞を抗CD32Bモノクローナル抗体である2B6、次いで二次（Cy5コンジュゲート）ヤギ抗マウス(Fab)2フラグメント抗体とともにインキュベートした。洗浄後、FITCまたはPEとコンジュゲートした系統特異的な抗体（抗CD3、CD19、CD20およびCD5）を加え、サンプルを２色フォーマットでFACSCaliburを用いて分析した。CD32Bを発現せずかつ2B6抗体と反応しないCD3陽性細胞（Ｔ細胞）を内部対照として用いた。CD20、CD19およびCD5抗体はＢ細胞系統部分集団を同定する。予備研究を10人より多い健常なヒト被験者で実施し、CD20陽性により同定したドナーのＢ細胞との反応性に基づいて、個々の抗CD32B抗体の量を較正した。各抗体に対して、力価測定実験において100％反応性および最高MCF値を与えた抗体の最小量を選択し、その後使用した。
【０４５７】
結果：図26に示した通り、B-CLL患者から単離したＢ細胞は抗CD32B抗体により強く染色された。全ての5人の患者からの細胞は一致してCD32B陽性であり、2B6抗体と反応性であるが、Ｂ細胞系統マーカーは様々な程度で発現するだけである。本結果はCD32BがB-CLLの患者から単離したＢ細胞上で発現されることを示す。
【０４５８】
6.4  非ホジキンリンパ腫の患者からのリンパ節中のCD32Bの発現
非ホジキンリンパ腫の患者からのリンパ節中のCD32Bの発現を研究するために、組織学的およびFACS分析判定基準に基づいてＢ細胞新生物の診断が確定した患者からの一連のリンパ組織について、組織学的分析および免疫組織化学を実施した。
【０４５９】
組織標本：凍結リンパ節はCooperative Human Tissue Network(CHTN), Mid-Atlantic Division（Charlottesville, Virginia）から得た。ドライアイス中の該組織を受け取り、到着の際に２つに分けて、一方は腫瘍の組織病理学的分析用とし、他方は免疫組織化学分析用とした。
【０４６０】
組織病理学的分析および免疫組織化学
全１１例において、10％中性緩衝化ホルマリン（NBF）中で固定し、組織プロセッサー（Miles Scientific）でパラフィン固定した。パラフィン固定の後、組織ブロックをLeicaミクロトーム（Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois）を用いて5ミクロンの切片とした。切片をスライド上に置き、キシレンを用いて脱パラフィンし、そしてヘマトキシリン−エオジン（HE）組織染色プロトコルに進めた（Luna, Histopathologic Methods and Color Atlas Of Special Stains and Tissue Artifacts 1992 American Histolabs, Inc., Publications Division, Kolb Center, 7605-F Airpark Road, Gaithersburg, MD 2087）。Daudi Ｂ細胞（Ｂ細胞リンパ腫に関わる悪性腫瘍細胞株）を陽性対照として用いた。正常な扁桃腺およびリンパ節をさらなる対照として用いて、正常組織内のCD20およびCD32Bを発現する細胞の分布を把握した。
【０４６１】
これらのサンプルの残りの一部分を凍結金型（cryomold）に入れてOCTクライオコンパウンド（Tissue-Tek）で包埋した。ブロックの準備ができると、それぞれをクライオスタット（Leica Microsystems）で6ミクロンに薄切した。スライドを4℃アセトン中において10分間固定した。固定後の数時間、スライドを風乾し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて洗浄した。次いで内因性ペルオキシダーゼ活性を0.3％過酸化水素溶液中での30分間のインキュベーションによりブロックした。スライドをPBS中で洗浄し、2％正常ヒト血清中の10％正常ヤギ血清を用いて30分間インキュベートした。このステップの後、スライドを２グループに分けた。２種のモノクローナル抗体：抗CD20抗体（1F5-ハイブリドーマ、ATCC番号HB-9645、Macrogenics社で精製）およびマウスモノクローナル抗CD32B抗体である2B6を並行して同じ組織に用いてインキュベートした。各グループを一方のモノクローナル抗体およびそれぞれのアイソタイプ対照（2B6/抗CD32Bグループに対してはIgG1（BD Biosciences, San Jose, California）ならびに1F5/抗CD20グループに対してはIgG2a（BD Biosciences））とともにインキュベートした。マウスIgG1およびマウスIgG2aはそれぞれ抗CD32Bおよび抗CD20に対するアイソタイプ対照として用いた。室温にて１時間インキュベートした後、スライドをPBSで洗浄し、そしてペルオキシダーゼ標識二次抗体ヤギ抗マウスとインキュベートした（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania）。PBSを用いて洗浄した後、切片をアミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）および過酸化水素中でインキュベートした（Koretzら, 1987, Histochemistry 86:471-478）。ヘマトキシリンをカウンター染色として用いた。
【０４６２】
抗CD20とCD32Bの発現について低拡大倍率の光学顕微鏡で以下の判定基準に基づいてスコアを付けた：ゼロ（-）のスコアは反応性が検出されなかったことを意味し；プラス／マイナス（+/-）のスコアは1〜10％の細胞に反応が検出されたことを意味し；１プラス（+）は10〜30％陽性細胞に相当し；２プラス（++）は30〜70％の陽性細胞をもつ組織であり；そして３プラス（+++）は70％〜100％の陽性細胞をもつ組織である。
【０４６３】
結果：
両方の陽性対照、すなわち、Ｂ細胞リンパ腫に関わる悪性腫瘍細胞株（Daudi細胞；図27A〜B）およびリンパ組織を含有することがわかっている正常組織（扁桃腺：図28A〜C；リンパ節：図29A〜C）は免疫組織化学により抗CD32Bおよび抗CD20抗体に対して陽性に反応した。正常な扁桃腺組織およびリンパ節は、抗CD32B抗体と抗CD20抗体に対して異なる様式で染色される。胚中心を有するリンパ濾胞は抗CD20と反応する一方、胚中心を囲む該濾胞中の細胞は抗CD32Bと反応する。このように、形態学的相違はこれらの２種の抗体を用いる免疫組織化学により検出することができる。
【０４６４】
CHTNから得た全ての10リンパ節および１つの脾臓（11例）を分析した。図30A〜57Dを参照されたい。結果を表９にまとめた。
【表９】
2007532139.tif 000020
【０４６５】
8例はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、2例は小リンパ球リンパ腫、そして1例はマントル細胞リンパ腫／びまん性小型切れ込み細胞リンパ腫であった。小型リンパ球リンパ腫カテゴリーにおいて1例は形質細胞様特性を有していた。全てのヘマトキシリン−エオジン（HE）染色スライドを検討して診断の確認を行った。
【０４６６】
CD20の発現は18％の事例において陰性であり、約30％の事例で弱陽性であり、そして残りの50％の事例において中／強陽性であった。CD32Bが80％の事例において検出され、そして2事例だけで陰性であることが見出された。
【０４６７】
結論：CD32B発現はNHL試験例の80％で検出された。CD32Bの発現がCD20より多くの細胞で検出される場合が多かった。CD32BはNHL治療の有用な標的でありうる。
【０４６８】
6.5  CD32B特異的モノクローナル抗体のスクリーニング
CD32B特異的抗体を、Ｂ細胞リンパ腫株およびＢ細胞性悪性腫瘍の患者由来の細胞における反応性、ラフト結合、CDC、およびアポトーシスの誘導についてスクリーニングする。患者からの細胞の単離および反応性スクリーニングは上記の通り行う。
【０４６９】
ラフト結合：特殊化した膜微小ドメイン中への抗原の再分布を引き起こす抗体の能力の指標である、脂質ラフト結合は、0.5％ TX-100により4℃にて溶解後の界面活性剤不溶性細胞画分中に回収される抗体の量を測定することにより都合よく決定される（Veriら, 2001, Mol Cell Bio 21:6939-6950; Craggら, 2004,  Blood 103:2738-43）。典型的な実験では、細胞を氷上で目的の抗体を用いてコーティングして洗浄する。アリコートを適当な二次抗体を用いてさらに架橋する。ペレット化した細胞をTX-100界面活性剤分画化に供す。並行サンプルをグルコピラノシド（脂質ラフトを破壊することが知られている界面活性剤）を用いて、またはSDS系Laemmliサンプルバッファーを用いて直接的に可溶化し、細胞に結合している抗体の全量を取得する。不溶性画分をSDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより分析する。さらなる架橋の有無での脂質ラフトの再分布を、密度測定比較により記録する。
【０４７０】
CDC：CDCを、当技術分野で公知のいくつかの方法の１つ、例えばFACS分析におけるヨウ化プロピジウム（PI）排除（Craggら, 2004, Blood 103:2738-43）または慣習的な放射標識放出（例えば、51Crおよび111In放出）により評価する。簡単に説明すると、細胞を目的の抗体の力価量とともに15分間37℃にてインキュベートし、次いで補体供給源として血清（20％最終濃度）を加え、そしてさらに5分間インキュベーションを続行した後に分析を行う。ヒト血清はばらつきが大きいので、Pel凍結ウサギ血清を補体の標準的な供給源として利用する。プールした正常なヒトAB血清も調製する。品質保証のために、血清の各バッチを赤血球溶解でウサギ血清に対して試験する。
【０４７１】
アポトーシス：可溶性またはプレートに固定した抗CD32B抗体により誘導されるアポトーシスを、標準的なFACSに基づく手法によりアネキシンV膜移行および多色分析のPI染色（Craggら, 2004, Blood 103:2738-43）を用いて調べ、目的の集団（例えばCy5-CD19）を同定する。簡単に説明すると、細胞を種々の時間間隔（2〜18時間）で遊離溶液中または96ウェルプレート上に固定した目的の抗体の力価量を用いて処理する。次いで細胞を、穏やかに掻きとるか、かつ／または遠心分離することにより回収し、1μg/mlのFITC-アネキシンV＋10μg/mlのPIを用いて染色して早期アポトーシスと二次的なネクローシスとを区別する。
【０４７２】
6.6  リンパ腫のマウス腫瘍異種移植モデルにおけるin vivo腫瘍クリアランス研究
リンパ腫のマウスモデルにおける腫瘍を阻止する能力は、臨床研究に進める抗体の可能性を決定するための重要な判定基準である。
【０４７３】
いくつものよく特徴付けられたバーキットリンパ腫細胞株をNHLのモデルとして利用することができる（Epsteinら, 1966, J Natl Cancer Inst 37:547-559；Kleinら, 1968, Cancer Res 28:1300-1310；Kleinら, 1975, Intervirology 5:319-334；Nilssonら, 1977, Intl J Cancer 19:337-344；Ohsugiら, 1980, J Natl Cancer Inst 65:715-718）。リンパ腫形成の異種移植モデル形成は以前に報告されたモデルと同様にヌードマウスにおいて確立されている（Valleraら, 2003, Cancer Biother Radiopharm 18:133-145；Vuistら, 1989, Cancer Res 49:3783-3788）。
【０４７４】
簡単に説明すると、バーキットリンパ腫細胞株、Daudi（5〜10×106細胞）を免疫不全nu/nuマウス系統中に皮下移植する。該BALB/c nu/nuマウス系統はエフェクター細胞として養子移入した健全なドナー由来の精製ヒトPBMCと一緒に使用する。ヒトPBMCでの支配的なエフェクター細胞集団は、それらのCD16A（FcγRIIIa）を経由してADCCを引き起こすNK細胞により代表される。マウスCD16A遺伝子がノックアウトされかつヒトCD16Aを発現するように遺伝子操作したnu/nuマウス系統も利用される。このCD16A-/-huCD16Atg、nu/nuマウスは、ヒト細胞の養子移入の必要なしにヒトFc受容体との関係で抗腫瘍活性の試験を可能にする。
【０４７５】
選択したキメラ抗体を1、4、7、および15日目に腹腔内注射することで、マウスを処理する。4μg／g体重の開始用量を用いるが、さらなる用量を試験して本モデルにおける抗体の相対的効能を確かなものとする。リツキサンおよびキャンパス（Campath）を比較のために使用しうる。さらに、リツキサンまたはキャンパスとの併用療法の潜在的相乗作用も研究する。これらの研究において、腫瘍増殖および罹患率をモニターして抗体処理群ならびに対照グループを比較する。瀕死状態になるかまたは研究完了時に、マウスを直ちに屠殺する。次いで腫瘍を切除し肉眼および顕微解剖を実施する。パラフィン包埋切片での細胞病理研究および凍結切片の免疫組織化学研究を実施して腫瘍および細胞浸潤物の形態学的および免疫学的評価を行う。
【０４７６】
本発明は、本発明の個々の態様の１つの説明を意図して記載された特定の実施形態により限定されるものでなく、機能的に同等な方法および成分は本発明の範囲に包含される。実際、本明細書に示したものおよび記載したものに加えて、本発明の様々な改変が、上記の説明と添付図面から当業者には明らかであろう。かかる改変は添付した請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【０４７７】
本明細書に引用した様々な参考文献の開示は参照によりその全文が組み入れられる。
【０４７８】
本出願は2004年4月16日；2004年6月21日；2004年6月21日；および2005年2月18日にそれぞれ出願された米国特許仮出願第60/562,804号；第60/582,044号；第60/582,045号；および第60/654,713号の優先権を主張するものであり、これらの全てを参照することにより本明細書にそのまま組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０４７９】
【図１Ａ】3H7クローンから産生された抗体とFcγRIIBおよびFcγRIIAとの直接結合を示す。いくつかのハイブリドーマ培養物から得た抗体とFcγRIIとの直接結合を、市販の抗FcγRII抗体のそれと、該受容体をコーティングしたプレートのELISAアッセイで比較した。様々な希釈（1:10）の上清をプレート上でインキュベートした。結合した抗体をヤギ抗マウスHRPコンジュゲート抗体により検出し、その吸収を650nmでモニターした。
【図１Ｂ】3H7クローンから産生された抗体とFcγRIIBおよびFcγRIIAとの直接結合を示す。3H7ハイブリドーマ培養物から得た、粗製型（右のパネル）および精製型（左のパネル）の抗体（図1AのSup.7）とFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合を、図1Aと同じELISAアッセイを用いて比較した。
【図２】3H7ハイブリドーマから産生された抗体および凝集ビオチン化ヒトIgGのFcγRIIBとの結合における競合を示す。FcγRIIBとの結合について凝集ビオチン化ヒトIgGと競合する3H7抗体の能力を、ブロッキングELISA実験により測定した。FcγRIIBをコーティングしたELISAプレートを3H7抗体含有上清および同じハイブリドーマ細胞由来であるが抗体を含有しない上清（陰性対照）とともにインキュベートした。200ng/ウェルから開始して様々な希釈（1:3）の凝集ビオチン化ヒトIgGをプレートに加え、結合した凝集物をストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートにより検出し、反応をTMBにより現像して吸収を650nmでモニターした。
【図３】3H7抗体の、細菌系または哺乳動物系で産生されたFcγRIIBとの直接結合の比較を示す。3H7抗体とFcγRIIBとの直接結合はELISAアッセイを用いて測定した。細菌または哺乳動物が産生したFcγRIIBとの結合を比較した。抗体タイトレーションはそのままの上清から開始し、続いて1:10希釈を行った。結合した抗体をヤギ抗マウスHRPコンジュゲート抗体により検出し、反応をTMBにより現像してその吸収を650nmでモニターした。
【図４】3H7抗体とFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAとの直接結合を示す。精製3H7抗体と、哺乳動物系で発現されたFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAとの直接結合を、ELISAアッセイにより比較した。ELISAプレートに３種の受容体（100ng/ウエル）をコーティングした。精製3H7抗体の様々な希釈液を、コーティングしたプレート上でインキュベートした。ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート抗体を、結合した特異的抗体の検出に使用し、反応をTMBにより現像して吸収を650nmにてモニターした。
【図５】クローン2B6由来の精製抗体のFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合能を、FcγRIIに対する３種の市販のモノクローナル抗体と比較して示す。2B6抗体のFcγRIIA（上右パネル）およびFcγRIIB（上左パネル）との結合を、FcγRIIに対する３種の他の市販抗体と比較した。使用したELISAフォーマットは図４に記載したものと同じである。
【図６】クローン2B6から産生された抗体および凝集ビオチン化ヒトIgGとFcγRIIBとの結合における競合を示す。図6Aは、FcγRIIBとの結合について、クローン2B6由来の上清中に存在する抗体が凝集ビオチン化ヒトIgGと競合する能力を、ブロッキングELISA実験により測定した。2B6抗体競合能力を、ハイブリドーマからの陰性上清および3H7抗体のそれと比較した。FcγRIIBをコーティングしたELISAプレートを様々な希釈（1:10）の上清とともにインキュベートした。洗浄後、プレートを一定量の凝集ビオチン化ヒトIgG（1mg/ウエル）とともにインキュベートし、結合した凝集物をストレプトアビジン-HRPコンジュゲートにより検出した。反応をTMBにより現像して吸収を650nmでモニターした。図6Bは、図6Aに記載したのと同じブロッキングELISAを、精製2B6抗体を用いて実施し、使用したブロッキング抗体のある濃度（4mg/ウエル）から得たデータを棒グラフで表した。FcγRIIBとの凝集ヒトIgG結合をブロックする2B6能力をマウスIgG1アイソタイプ対照と比較した。
【図７】二重染色FACSアッセイを用いて確認した、FcγRIIBとの結合における2B6抗体と凝集ビオチン化ヒトIgGの競合を示す。二重染色FACSアッセイを実施し、全長哺乳動物FcγRIIBにより安定してトランスフェクトしておいたCHO-K1細胞を用いて2B6抗体を特徴付けた。図7Aでは、トランスフェクタント細胞を、マウスIgG1アイソタイプ対照を用いて染色し、次いでヤギ抗マウスFITCコンジュゲート抗体およびストレプトアビジン-PEを用いて染色した。図7Bでは、トランスフェクタント細胞を、マウスIgG1アイソタイプ対照を用いて染色した後に凝集ビオチン化ヒトIgGを用いて染色し、そしてヤギ抗マウスFITCコンジュゲート抗体を用いて標識して結合モノクローナル抗体を検出し、かつストレプトアビジン-PEコンジュゲートを用いて標識して結合凝集物を検出した。図7Cでは、細胞を2B6抗体で染色し、抗体を洗浄により除去し、そして細胞を凝集ビオチン化ヒトIgGとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスFITCコンジュゲート抗体を用いて標識して結合モノクローナル抗体を検出し、かつストレプトアビジン-PEコンジュゲートを用いて標識して結合凝集物を検出した。
【図８】表面に結合させたCD32B（パネルＡ）、CD32A(H131)（パネルＢ）、およびCD32A(R131)（パネルＣ）への2B6およびKB6.1抗体結合のBiacore分析を示す。
【図９】ヒトＢリンパ球のモノクローナル抗FcγRIIB抗体およびCD20同時染色を示す。ヒト血液から得た細胞（バッフィーコート）を、抗CD20-FITCコンジュゲート抗体（Ｂリンパ球集団を選択するため）ならびに3H7および2B6を用いて染色した。結合した抗FcγRIIB抗体をヤギ抗マウスPEコンジュゲート抗体により検出した。図9Aでは、細胞を抗CD20-FITC抗体およびマウスIgG1アイソタイプ対照で同時染色した。図9Bでは、細胞を抗CD20-FITC抗体および3H7抗体で同時染色した。図9Cでは、細胞を抗CD20-FITC抗体および2B6抗体で同時染色した。
【図１０Ａ】FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色を示す。CHO/IIＢ細胞をマウスIgG1アイソタイプ対照（左パネル）および3H7抗体（右パネル）で染色した。
【図１０Ｂ】FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色を示す。CHO/IIＢ細胞をマウスIgG1アイソタイプ対照（左パネル）および2B6抗体（右パネル）で染色した。細胞に結合した抗体をヤギ抗マウスPEコンジュゲート抗体で標識した。
【図１１】FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色を示す。huFcγRIIBを発現するCHO細胞を、各パネルの上部に示した抗CD32B抗体とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、9μg/mlの凝集ヒトIgGを氷上の細胞に加えた。ヒト凝集IgGをヤギ抗ヒトIgG FITCコンジュゲートにより検出した。サンプルをFACSにより分析した。点線はアイソタイプ対照＋ヤギ抗huIgG-FITC、細い実線はアイソタイプ対照＋凝集ヒトlgG＋ヤギ抗ヒトlgG-FITC、太い実線は抗CD32B抗体＋凝集ヒトlgG＋ヤギ抗ヒトlgG-FITCをそれぞれ示す。別のセットのサンプルでヤギ抗マウスPEコンジュゲート抗体を用いて、細胞上の受容体と結合したそれぞれの抗体の量も検出した（挿入図）。
【図１２】CD32B特異的抗体2B6およびCD32A/B反応性抗体FLI 8.26を用いた、形質転換細胞株におけるCD32B発現のフローサイトメトリー分析を示す。細胞株は、CD32A（A、B）またはCD32B（C、D）を発現する形質転換293H細胞、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（E、F）およびRaji（G、H）、ならびに単球株THP-I（I、J）である。
【図１３】2B6、3H7およびIV.3抗体を用いたヒトPBMCの染色を示す。ヒトPBMCを、パネルの左側に示した2B6、3H7、およびIV.3抗体、次いでヤギ抗マウス-シアニン(Cy5)コンジュゲート抗体で染色した。Ｂリンパ球については抗CD20-FITCコンジュゲートを、単球については抗CD14-PEコンジュゲートを、NK細胞については抗CD56-PEコンジュゲートを、そして顆粒球については抗CD16-PEコンジュゲートを用いて二色染色した。
【図１４】β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイを示す。図14Aはβ-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイの模式図である。ヒトFcγRIIBを発現するトランスフェクタントをマウスIgEで感作し、ポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントによりチャレンジしてFcγRIを凝集させた。ポリクローナル抗体はFcγRIと結合したマウスIgE抗体の軽鎖を認識する能力があるので架橋が起こる。また、マウスIgEで感作しかつ2B6抗体とともにプレインキュベートしたトランスフェクタントをポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントによりチャレンジしてFcγRIをFcγRIIBと架橋させた。図14Bは、huFcγRIIBを発現するRBL-2H3細胞におけるヤギ抗マウスF(ab)2フラグメント（GAMF(ab)2）により誘導されたβ-ヘキソサミニダーゼ放出を示す。マウスIgE（0.01μg/ml）およびIgG1により、または精製2B6抗体（3μg/ml）パネルにより感作した後、細胞を様々な濃度のGAMF(ab)2（0.03μg/ml〜30μg/ml）で刺激した。37℃にて1時間保持した後、上清を採取して細胞を溶解した。上清中に放出されたおよび細胞内のβ-ヘキソサミニダーゼ活性をp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いる比色アッセイにより測定した。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性は、全活性に対する放出活性の％として表した。
【図１５】2B6はCD32BのFc結合部位を機能的にブロックすることができ、かつ活性化および抑制受容体の共ライゲーションを防止する。A．実験モデルの模式図。BおよびC．RBL-2H3/CD32Ｂ細胞を、ヒトIgG1の存在下にBSA-DNP-FITC複合体で刺激した。その際、BSA-DNP-FITCは3μg/mlの2B6のF(ab)2フラグメントの存在下または不在下でキメラD265A4-4-20と複合体形成させた(B)。また、細胞をヒトIgG1の存在下にBSA-DNP-FITC複合体で刺激した。この場合は、BSA-DNP-FITCを3μg/mlの2B6のF(ab)2フラグメントの存在下または不在下にキメラ4-4-20と複合体形成させた(C)。30分後、上清を集めて細胞を溶解した。上清中に放出されたおよび細胞内のβ-ヘキソサミニダーゼ活性をp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いる比色アッセイにより測定した。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を、全活性に対する放出活性の％として表した。
【図１６】卵巣癌および乳癌細胞株はHer2/neuを様々なレベルで発現することを示す。図16Aは精製ch4D5による卵巣IGROV-1の染色、図16Bは精製4D5抗体による卵巣OVCAR-8の染色、そして図16Cは精製ch4D5とその後のフィコエリトリン（PE）にコンジュゲートされたヤギ抗ヒト抗体による乳癌SKBR-3細胞の染色を示す。関連アイソタイプ対照IgG1を抗Her2neu抗体による染色の左に示す。
【図１７】溶出した単球は全てのFcγRを発現することを示す。図17Aはドナー１から得たMDMを示す。図17Bはドナー２から得たMDMを示す；ヒト血清またはヒト血清とGMCSF中で増やした。図17Cは解凍して直ちに染色した単球を示す。単球から誘導されたマクロファージをヒトFcγR受容体に特異的な抗体で染色した。それぞれのプロットにおける黒色のヒストグラムはバックグラウンド染色を示す。各パネル中の白色のヒストグラムは特異的抗ヒトFcγR抗体を用いた染色を示す。
【図１８】ch4D5がPBMCを用いる卵巣および乳癌細胞株の有効なADCCを媒介することを示す。抗体非依存性溶解を差引いた比溶解を、図18Aは卵巣癌細胞株IGROV-1（エフェクター：標的比75:1にて）について、そして図18Bは乳癌細胞株SKBR-3（エフェクター：標的比50:1にて）について、それぞれ表示した様々な濃度のch4D5を用いて示した。
【図１９】ヒト卵巣腹水の組織化学的染色は腫瘍細胞および他の炎症性細胞を示す。図19Aは卵巣腫瘍患者の腹水のH&E染色を示す。３つの新生物細胞を不規則なサイズと形状、分散した細胞質、および不規則な濃度の核により同定することができる。図19Bは重症卵巣腫瘍の患者からの未処理腹水のギムザ染色を示し、短い矢印により示した背中合わせに位置する２つの中皮細胞を示す。また、長い矢印で示した５つの悪性上皮細胞のクラスターも示される。赤血球がバックグラウンドに見られる。図19Cは重症卵巣腫瘍の他の患者のギムザ染色を示し、中皮細胞、リンパ球、および上皮新生物細胞（矢印）から成る細胞のクラスターを示す。
【図２０】Daudi細胞におけるch2B6および非グリコシル化ch2B6のin vitro ADCCアッセイを示す。ch2B6抗体はCD32Bを発現するdaudi細胞においてin vitro ADCCを媒介する。
【図２１】Raji細胞におけるch2B6および非グリコシル化ch2B6のin vitro ADCCアッセイを示す。ch2B6抗体はCD32Bを発現するRaji細胞においてin vitro ADCCを媒介する。
【図２２】Daudi細胞におけるキメラおよびヒト化2B6抗体のin vitro ADCCアッセイを示す。インジウム-111で標識したDaudi細胞はch2B6、ch2B6 N297Q、hu2B6、またはhu2B6YAによりオプソニン化された。
【図２３】個々のマウスにおける概算腫瘍サイズを示す。注射日を矢印により示した。
【図２４Ａ−Ｂ】マウスにおいてリツキサン(Rituxan)および2B6変異体が腫瘍増殖に及ぼす効果を示す。A：リツキシマブ(Rituximab)。B：ch2B6、ch2B6 N297Q、h2B6およびh2B6 YA。
【図２４Ｃ−Ｄ】マウスにおいて2B6変異体が腫瘍増殖に及ぼす効果を示す。C：h2B6YA。D：h2B6YA 31/60。
【図２４Ｅ−Ｆ】マウスにおいて2B6変異体が腫瘍増殖に及ぼす効果を示す。図24E：h2B6YA 38/60。F：h2B6YA 55/60。G：h2B6YA 71。
【図２４Ｇ】マウスにおいて2B6変異体h2B6YA 71が腫瘍増殖に及ぼす効果を示す。
【図２５】CD20およびCD32Bに対するDaudiのex vivo染色を示す。Daudi腫瘍はh2B6（図25B、E、H）またはh2B6YA（図25C、F、I）を用いて処置したマウスから採取した。CD20（図25G、H、I）およびCD32B（図25D、E、F）発現を、in vitroで増殖させたDaudi細胞（図25A、D、G）のそれらと比較した。
【図２６】５人の異なる患者からのB-CLL細胞上の表面膜マーカーの発現を示す。B-CLLと診断した患者由来のPBMCをFicoll-Paque密度勾配遠心分離を用いて単離し、CD32Bの発現をCD3、CD19、CD20またはCD5（後の３人の患者）と共に分析した。細胞をCD32B検出用の2B6抗体、次いでCy5-標識ヤギ抗マウスIgGのF(ab)'2フラグメント、およびCD3を用いて染色し、そしてCD19、CD20、またはCD5に対するFITCまたはPE-標識マウス抗体を直接用いて対比染色した。染色した細胞をFACSCalibur（Becton Dickinson）により分析した。
【図２７】DaudiＢ細胞の免疫組織化学的染色を示す。A：抗CD32B抗体；40x倍率。B：抗CD20抗体；40x倍率。
【図２８】正常な扁桃組織の免疫組織化学的染色を示す。A：H-E染色；10x倍率。陰窩（短い矢印）および胚中心（長い矢印）を有するリンパ小節の部分が観察された。B：抗CD32B；40x倍率。胚中心を囲む濾胞の陽性細胞。C：抗CD20；40x倍率。リンパ濾胞は抗CD20と反応する胚中心細胞を示した。
【図２９】正常なリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。A：H-E染色；4x倍率。胚中心を有する小リンパ濾胞が観察された。B：抗CD32B；4x倍率。胚中心はCD32Bに対する陽性細胞の環によって限局されていた。C：抗CD20；4x倍率。胚中心の細胞は抗CD20と反応した。
【図３０】患者1（MG04-CHTN-19）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。正常なリンパ節の構造を変化させる散在型の浸潤を伴う悪性プロセスの確証が観察された。このプロセスは、クロマチン増加性核と乏しい細胞質をもつ大きく不規則な細胞のシートをもたらした。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図３１】患者1（MG04-CHTN-19）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。4x倍率の連続セクションはCD32B（A：抗CD32B抗体）およびCD20（B：抗CD20抗体）を発現する細胞の分布パターンの相違を示した。
【図３２】患者1（MG04-CHTN-19）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。アイソタイプ対照は各試験抗体の左側にある。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図３３】患者2（MG04-CHTN-22）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。悪性腫瘍細胞は正常リンパ節組織（矢印）がまだ存在する領域へ向けて浸潤しかつ増殖しつつあった。リンパ濾胞は見られなかった。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図３４】患者2（MG04-CHTN-22）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。CD32bおよびCD20を発現する細胞の細胞分布と細胞数の相違が見られた。A：抗CD32B抗体；4x倍率。B：抗CD20抗体；4x倍率。
【図３５】患者2（MG04-CHTN-22）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。アイソタイプ対照および右側にそれらの対応する試験抗体。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図３６】患者3（MG04-CHTN-26）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。新生物細胞が濾胞性およびびまん性組織学的パターンで分布していた。高倍率の写真には不規則でクロマチン増加性の核をもつ大細胞が存在した。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図３７】患者3（MG04-CHTN-26）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。さらに多くの新生物細胞が抗CD32b（A）より抗CD20（B）と反応した。A：抗CD32B；4x倍率。B：抗CD20；4x倍率。
【図３８】患者3（MG04-CHTN-26）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。アイソタイプ対照は各試験抗体の左側にある。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図３９】患者4（MG04-CHTN-27）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。大サイズでクロマチン増加性の核をもつ細胞の散在性増殖による正常リンパ節の置換が見られた。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図４０】患者4（MG04-CHTN-27）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。新生物細胞は抗CD32Bに対してより大きい親和性を有する。A：抗CD32B 抗体；4x倍率。B：抗CD20抗体；4x倍率。
【図４１】患者4（MG04-CHTN-27）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図４２】患者5（MG05-CHTN-03）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。この腫瘍はびまん性パターンで組織化され、クロマチン増加性核をもつ中〜大細胞から構成されていた。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図４３】患者5（MGO5-CHTN-O3）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。腫瘍細胞は抗CD32Bと強く反応した（A）。A：抗CD32B抗体；4x倍率。B：抗CD20抗体；4x倍率。
【図４４】患者5（MG05-CHTN-03）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20 抗体（1F5）；10x倍率。
【図４５】患者6（MG05-CHTN-05）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。分散した小型の正常リンパ球と混ざり合った、丸い核をもつ大型の細胞の増殖に付随的な、このリンパ節の主にびまん性の浸潤が見られた。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図４６】患者6（MG05-CHTN-05）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。抗CD20がこのリンパ腫症例において細胞と強く結合し（パネルB）、一方いくつかの細胞は抗CD32Bと反応した（パネルA）。A：抗CD32B抗体；4x倍率。B：抗CD20抗体；4x倍率。
【図４７】患者6（MG05-CHTN-05）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。図47D.抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図４８】患者7（MG04-CHTN-30）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。丸い好塩基性の核と乏しい細胞質をもつ小リンパ球によるびまん性浸潤を伴うリンパ節が見られた。細胞学的異形は存在しなかった。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図４９】患者7（MG04-CHTN-30）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。アイソタイプ対照および右側にそれらの対応する試験抗体。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20 抗体（1F5）；10x倍率。
【図５０】患者8（MG04-CHTN-31）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。丸い核と乏しい細胞質をもつ大〜中型の細胞によりその正常な構造が完全に置換されたリンパ節が見られた。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図５１】患者8（MG04-CHTN-31）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。アイソタイプ対照および右側にそれらの対応する試験抗体。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20 抗体（1F5）；10x倍率。
【図５２】患者9（MG04-CHTN-36）由来の脾臓の免疫組織化学的染色を示す。この 脾臓は赤色脾髄の大量の関与を示した。高倍率の写真では、乏しい細胞質をもつ大〜中型の悪性腫瘍細胞が見られた。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図５３】患者9（MG04-CHTN-36）由来の脾臓の免疫組織化学的染色を示す。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図５４】患者10（MG04-CHTN-41）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。このリンパ節は小節の形成を示唆する構造を少ししか提示しないが、主にびまん性であった。高倍率の写真では、これらの細胞は小さく、僅かに不規則な核を有していた。A：H&E染色；4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図５５】患者10（MG04-CHTN-41）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図５６】患者11（MG04-CHTN-05）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。このリンパ節は大細胞型の悪性リンパ腫の特徴を示した。該腫瘍はびまん性パターンで分布する大細胞の変化がない増殖を示した。A：H&E染色：4x倍率。B：H&E染色；10x倍率。C：H&E染色；20x倍率。
【図５７】患者11（MG04-CHTN-05）由来のリンパ節の免疫組織化学的染色を示す。A：アイソタイプ対照（IgG1）；10x倍率。B：抗CD32B抗体（m2B6）；10x倍率。C：アイソタイプ対照（IgG2a）；10x倍率。D：抗CD20抗体（1F5）；10x倍率。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ−Ｄ】
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【図２４Ｅ−Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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