(57)【要約】  本発明は、野生型生物と比べて、改変されたケトラーゼおよび改変されたβ−シクラーゼ活性を有する遺伝子的に改変された生物を培養することによってケトカロテノイドを製造するための方法に関する。本発明はまた、その遺伝子的に改変された生物、食料および飼料としての該生物の使用、およびケトカロテノイド抽出物を生成するための該生物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子的に改変された非ヒト生物を培養することによってケトカロテノイドを製造する方法であって、該非ヒト生物は、野生型と比べて、改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性を有し、該改変されたβ−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって引き起こされる、上記方法。
【請求項２】
前記野生型として、既にケトラーゼ活性を有する非ヒト生物を使用し、かつ前記遺伝子改変によって野生型と比べてケトラーゼ活性の増加が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケトラーゼ活性を増加させるために、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比べて増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子発現を増加させるために、ケトラーゼをコードする核酸が前記生物に挿入される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ケトラーゼをコードする核酸として、配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号4のアミノ配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むケトラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型として、ケトラーゼ活性を有しない非ヒト生物を用いる、かつ前記遺伝子改変によって野生型と比べてケトラーゼ活性が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子導入によってケトラーゼを発現する遺伝子的に改変された生物が用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現を引き起こすために、ケトラーゼをコードする核酸が前記生物へ挿入される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号4の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むケトラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号3の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項５または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記野生型として、既にβ−シクラーゼ活性を有する生物を使用する、かつ前記遺伝子改変によって野生型と比べてβ−シクラーゼ活性の増加が生じる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記β−シクラーゼ活性を増加させるために、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を、野生型と比べて増加させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現を増加させるために、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼをコードする核酸が前記生物に挿入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記野生型として、β−シクラーゼ活性を有しない生物を使用する、かつ野生型と比べて前記遺伝子改変によりβ−シクラーゼ活性が生じる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼを遺伝子導入により発現する、遺伝子的に改変された生物が用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子発現を引き起こすために、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼをコードする核酸が前記生物に挿入される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号1の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項１３または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ヒト生物が、野生型と比べて増加されたまたは引き起こされた水酸化酵素活性をさらに有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記水酸化酵素活性をさらに増加または引き起こすために、水酸化酵素をコードする核酸の遺伝子発現が野生型と比べて増加または引き起こされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子発現を増加または引き起こすために、水酸化酵素をコードする核酸が前記生物に挿入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
水酸化酵素をコードする前記核酸として、配列番号6のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号６の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含む水酸化酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号5の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物が、野生型と比べて、HMG−CoA還元酵素活性、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性、1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸合成酵素活性、1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性、イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性、ゲラニル二リン酸合成酵素活性、ファルネシル二リン酸合成酵素活性、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性、フィトエン合成酵素活性、フィトエンデサチュラーゼ活性、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性、crtISO活性、FtsZ活性およびMinD活性からなる群から選択される少なくとも一つの活性の増加されたまたは引き起こされた活性をさらに有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性の少なくとも一つをさらに増加または引き起こすために、HMG−CoA還元酵素をコードする核酸、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸、1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸合成酵素をコードする核酸、1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸リダクトイソメラーゼをコードする核酸、イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼをコードする核酸、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、フィトエン合成酵素をコードする核酸、フィトエンデサチュラーゼをコードする核酸、ゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸、crtISOタンパク質をコードする核酸、FtsZタンパク質をコードする核酸およびMinDタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される少なくとも一つの核酸の遺伝子発現が、野生型と比べて増加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸の少なくとも一つの遺伝子発現を増加または引き起こすために、HMG−CoA還元酵素をコードする核酸、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸、1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸合成酵素をコードする核酸、1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸リダクトイソメラーゼをコードする核酸、イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼをコードする核酸、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、フィトエン合成酵素をコードする核酸、フィトエンデサチュラーゼをコードする核酸、ゼータ−カロテンデサチュラーゼをコードする核酸、crtISOタンパク質をコードする核酸、FtsZタンパク質をコードする核酸およびMinDタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される少なくとも一つの核酸が前記非ヒト生物に挿入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記HMG−CoA還元酵素をコードする核酸として、配列番号8のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号8の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むHMG−CoA還元酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号7の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸として、配列番号10のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号10の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含む(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号9の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸合成酵素をコードする核酸として、配列番号12のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号12の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含む1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸合成酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号11の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸リダクトイソメラーゼをコードする核酸として、配列番号14のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号14の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含む1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸リダクトイソメラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号13の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼをコードする核酸として、配列番号16のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号16の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むイソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号15の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸として、配列番号18のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号18の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号17の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸として、配列番号20のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号20の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号19の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸として、配列番号22のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号22の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号21の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
フィトエン合成酵素をコードする核酸として、配列番号24のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号24の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むフィトエン合成酵素をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
配列番号23の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
フィトエンデサチュラーゼをコードする核酸として、配列番号26のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号26の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むフィトエンデサチュラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号25の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸として、配列番号28のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号28の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４７】
配列番号27の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
crtISOタンパク質をコードする核酸として、配列番号30のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号30の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むcrtISOタンパク質をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４９】
配列番号29の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
FtsZタンパク質をコードする核酸として、配列番号32のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号32の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むFtsZタンパク質をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項５１】
配列番号31の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
MinDタンパク質をコードする核酸として、配列番号34のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号34の配列とアミノ酸レベルで少なくとも20%の同一性を有する配列、を含むMinDタンパク質をコードする核酸が挿入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項５３】
配列番号33の前記配列を含む核酸が挿入される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子的に改変された生物は培養した後に回収され、その後前記ケトカロテノイドが該生物から単離される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
出発生物として、または自然に、または遺伝的相補もしくは代謝経路の再調節によってカロテノイドを生成することができる生物が、前記生物として用いられる、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
用いられる前記生物が、微生物または植物である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
用いられる前記微生物が、細菌、酵母、藻類または菌類である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記微生物が、エシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、パラコッカス（Paracoccus）、ノストック（Nostoc）、シネコシスチス（Synechocystis）属のシアノバクテリウム（cyanobacterium）、カンディダ（Candida）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、ファフィア（Phaffia）、ピチア（Pichia）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、アシュビア（Ashbya）、ニューロスポラ（Neurospora）、ブラケスレア（Blakeslea）、フィコマイセス（Phycomyces）、フザリウム（Fusarium）、ヘマトコッカス（Haematococcus）、フェダクチルム・トリコルナツム（Phaedactylum tricornatum）、ボルボックス（Volvox）またはデュナリエラ（Dunaliella）からなる群から選択される請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
用いられる前記生物が植物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
用いられる前記植物が、ヒユ科（Amaranthaceae）、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）、キョウチクトウ科（Apocynaceae）、キク科(Asteraceae)、ツリフネソウ科（Balsaminaceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、メギ科（Berberidaceae）、アブラナ科(Brassicaceae)、アサ科（Cannabaceae）、スイカズラ科（Caprifoliaceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）、キク科(Compositae)、ウリ科（Cucurbitaceae）、アブラナ科(Cruciferae)、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、マメ科(Fabaceae)、リンドウ科（Gentianaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、イネ科(Gramineae)、モクレン科（Illiaceae）、シソ科（Labiatae）、シソ科（Lamiaceae）、マメ科（Leguminosae）、ユリ科（Liliaceae）、アマ科（Linaceae）、ミゾカクシ科（Lobeliaceae）、アオイ科（Malvaceae）、モクセイ科（Oleaceae）、ラン科（Orchidaceae）、ケシ科（Papaveraceae）、イソマツ科（Plumbaginaceae）、イネ科(Poaceae)、ハナシノブ科（Polemoniaceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、キンポウゲ科（Ranunculaceae）、バラ科（Rosaceae）、アカネ科（Rubiaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、ナス科（Solanaceae）、ノウゼンハレン科（Tropaeolaceae）、セリ科（Umbelliferae）、クマツヅラ科（Verbanaceae）、ブドウ科（Vitaceae）またはスミレ科（Violaceae）から選択される植物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
用いられる前記植物が以下の植物属：マリーゴールド属（Marigold）、タゲテス・エレクタ（Tagetes erecta）、クジャクソウ（Tagetes patula））、アカシア属（Acacia）、トリカブト属（Aconitum）、フクジュソウ属（Adonis）、ウサギギク属（Arnica）、オダマキ属（Aqulegia）、アスター属（Aster）、ゲンゲ属（Astragalus）、ツリガネカズラ属（Bignonia）、キンセンカ属（Calendula）、リュウキンカ属（Caltha）、ホタルブクロ属（Campanula）、カンナ属（Canna）、ヤグルマギク属（Centaurea）、ニオイアラセイトウ属（Cheiranthus）、キク属（Chrysanthemum）、ミカン属（Citrus）、フタマタタンポポ属（Crepis）、クロッカス属（Crocus）、カボチャ属（Curcurbita）、エニシダ属（Cytisus）、デロニア属（Delonia）、オオヒエンソウ属（Delphinium）、ナデシコ属（Dianthus）、アフリカキンセンカ属（Dimorphotheca）、ドロニクム属（Doronicum）、ハナビシソウ属（Eschscholtzia）、レンギョウ属（Forsythia）、カイエンナッツ属（Fremontia）、ガザニア属（Gazania）、ゲルセミウム属（Gelsemium）、ゲニスタ属（Genista）、リンドウ属（Gentiana）、ゼラニウム属（Geranium）、ガーベラ属（Gerbera）、ダイコンソウ属（Geum）、グレビレア属（Grevillea）、マルバナハシャギク属（Helenium）、ヒマワリ属（Helianthus）、ミスミソウ属（Hepatica）、ハナウド属（Heracleum）、ハイビスカス属（Hisbiscus）、キクイモモドキ属（Heliopsis）、オトギリソウ属（Hypericum）、オオゴンソウ属（Hypochoeris）、ツリフネソウ属（Impatiens）、アヤメ属（Iris）、ジャカランダ属（Jacaranda）、ヤマブキ属（Kerria）、キングサリ属（Laburnum）、レンリソウ属（Lathyrus）、センボンヤリ属（Leontodon）、ユリ属（Lilium）、アマ属（Linum）、ミヤコグサ属（Lotus）、トマト属（Lycopersicon）、オカトラノオ属（Lysimachia）、ロウバイ属（Maratia）、ウマゴヤシ属（Medicago）、ミゾホオズキ属（Mimulus）、スイセン属（Narcissus）、マツヨイグサ属（Oenothera）、モクセイ属（Osmanthus）、ペチュニア属（Petunia）、カナメモチ属（Photinia）、ホオズキ属（Physalis）、フィテウマ属（Phyteuma）、キジムシロ属（Potentilla）、トキワサンザシ属（Pyracantha）、キンポウゲ属（Ranunculus）、ツツジ属（Rhododendron）、バラ属（Rosa）、オオハンゴンソウ属（Rudbeckia）、セネキオ属（Senecio）、マンテマ属（Silene）、メナモミ属（Silphium）、シロガラシ属（Sinapsis）、ナナカマド属（Sorbus）、レダマ属（Spartium）、テコマ属（Tecoma）、トレニア属（Torenia）、バラモンジン属（Tragopogon）、キンバイソウ属（Trollius）、ノウゼンハレン属（Tropaeolum）、チューリップ属（Tulipa）、フキタンポポ属（Tussilago）、ハリエニシダ属（Ulex）、スミレ属（Viola）またはジニア属（Zinnia）から選択される植物である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ケトカロテノイドが、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、3−ヒドロキシエキネノン、3’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビンおよびアドニキサンチンからなる群から選択される請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
遺伝子的に改変された非ヒト生物であって、ここで該遺伝子改変が、
Ａ  野生型生物が既にケトラーゼ活性を有している場合に、該野生型と比べてケトラーゼ活性を増加させる、および
Ｂ  野生型生物がケトラーゼ活性を有しない場合に、該野生型と比べてケトラーゼ活性を生じさせる、
ならびに、該遺伝子改変が、
Ｃ  野生型生物が既にβ−シクラーゼ活性を有している場合に、該野生型と比べてβ−シクラーゼ活性を増加させる、および
Ｄ  野生型生物がβ−シクラーゼ活性を有しない場合に、該野生型と比べてβ−シクラーゼ活性を生じさせる、
ならびに、Ｃに従って増加された該β−シクラーゼ活性またはＤに従って生じる該β−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって引き起こされる、上記遺伝子的に改変された非ヒト生物。
【請求項６４】
前記出発生物として、自然にまたは遺伝的相補によってカロテノイドを生成することが可能である、請求項６３に記載の遺伝子的に改変された生物。
【請求項６５】
微生物または植物からなる群から選択される、請求項６３または６４のいずれかに記載される遺伝子的に改変された生物。
【請求項６６】
前記微生物が細菌、酵母、藻類または菌類からなる群から選択される、請求項６５に記載の遺伝子的に改変された生物。
【請求項６７】
前記微生物が、エシェリキア、エルウィニア、アグロバクテリウム、フラボバクテリウム、アルカリゲネス、パラコッカス、ノストック、シネコシスチス属のシアノバクテリウム、カンディダ、サッカロマイセス、ハンセヌラ、ピチア、アスペルギルス、トリコデルマ、アシュビア、ニューロスポラ、ブラケスレア、フィコマイセス、フザリウム、ヘマトコッカス、フェダシチルム・トリコルナツム、ボルボックスまたはデュナリエラからなる群から選択される、請求項６６に記載の遺伝子的に改変された生物。
【請求項６８】
前記植物が、用いられるヒユ科、ヒガンバナ科、キョウチクトウ科、キク科(Asteraceae)、ツリフネソウ科、シュウカイドウ科、メギ科、アブラナ科(Brassicaceae)、アサ科、スイカズラ科、ナデシコ科、アカザ科、キク科(Compositae)、ウリ科、アブラナ科(Cruciferae)、トウダイグサ科、マメ科(Fabaceae)、リンドウ科、フウロソウ科、イネ科(Gramineae)、モクレン科（Illiaceae）、シソ科（Labiatae）、シソ科（Lamiaceae）、マメ科（Leguminosae）、ユリ科（Liliaceae）、アマ科、ミゾカクシ科、アオイ科、モクセイ科、ラン科、ケシ科、イソマツ科、イネ科(Poaceae)、ハナシノブ科サクラソウ科キンポウゲ科、バラ科、アカネ科、ゴマノハグサ科、ナス科、ノウゼンハレン科、セリ科、クマツヅラ科、ブドウ科およびスミレ科から選択される、請求項６５に記載の遺伝子的に改変された植物。
【請求項６９】
前記植物が、用いられる以下の植物属：マリーゴールド属、タゲテス・エレクタ、クジャクソウ、アカシア属、トリカブト属、フクジュソウ属、ウサギギク属、オダマキ属、アスター属、ゲンゲ属、ツリガネカズラ属、キンセンカ属、リュウキンカ属、ホタルブクロ属、カンナ属、ヤグルマギク属、ニオイアラセイトウ属、キク属、ミカン属、フタマタタンポポ 属、クロッカス属、カボチャ属、エニシダ属、デロニア属、オオヒエンソウ属、ナデシコ属、アフリカキンセンカ属、ドロニクム属、ハナビシソウ属、レンギョウ属、カイエンナッツ属、ガザニア属、ゲルセミウム属、ゲニスタ属、リンドウ属、ゼラニウム属、ガーベラ属、ダイコンソウ属、グレビレア属、マルバナハシャギク属、ヒマワリ属、ミスミソウ属、ハナウド属、ハイビスカス属、キクイモモドキ属、オトギリソウ属、オオゴンソウ属、ツリフネソウ属、アヤメ属、ジャカランダ属、ヤマブキ属、キングサリ属、レンリソウ属、センボンヤリ属ユリ属、アマ属、ミヤコグサ属、トマト属、オカトラノオ属、ロウバイ属、ウマゴヤシ属、ミゾホオズキ属、スイセン属、マツヨイグサ属、モクセイ属、ペチュニア属、カナメモチ属、ホオズキ属、フィテウマ属、キジムシロ属、トキワサンザシ属、キンポウゲ属、ツツジ属、バラ属、オオハンゴンソウ属、セネキオ属、マンテマ属、メナモミ属、シロガラシ属、ナナカマド属、レダマ属、テコマ属、トレニア属、バラモンジン属、キンバイソウ属、ノウゼンハレン属、チューリップ属、フキタンポポ属、ハリエニシダ属、スミレ属またはジニア属から選択される、請求項６８に記載の遺伝子的に改変された植物
【請求項７０】
請求項６３〜６９のいずれか一項に記載された遺伝子的に改変された生物の、飼料または食品としての使用。
【請求項７１】
ケトカロテノイド含有抽出物の生産のためまたはサプリメント飼料もしくはサプリメント食品の生産のための、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載された遺伝子的に改変された生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型と比べて改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性を有する遺伝子的に改変された生物を培養することによってケトカロテノイドを製造する方法、この遺伝子的に改変された生物、ならびにケトカロテノイド抽出物を生産するための該生物の食料および飼料としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは、細菌、藻類、菌類および植物で新規に合成される。ケトカロテノイド、すなわち、少なくとも一つのケト基を含むカロテノイド（例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、3−ヒドロキシエキネノン、3’−ヒドロキシ−エキネノン、アドニルビンおよびアドニキサンチンなど））は、いくつかの藻類および微生物によって二次代謝産物として生成される天然の抗酸化剤および色素である。
【０００３】
これらの着色特性によって、このケトカロテノイド、特にアスタキサンチンは、特に、マス、サケ、およびエビの養殖場において動物栄養中の着色助剤として用いられる。
【０００４】
アスタキサンチンの製造は今日では主に化学合成法によって行われている。天然のケトカロテノイド（例えば、天然のアスタキサンチンなど）は今日では、藻類（例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis））を培養するか、または遺伝子操作で最適化した微生物を発酵させ、その後単離することによるバイオテクノロジー方法で少量得られる。
【０００５】
従って、天然のケトカロテノイドを製造するための経済的なバイオテクノロジー方法が非常に重要である。
【０００６】
ケトラーゼおよび対応するタンパク質配列をコードする核酸は、種々の生物から単離されており、例えば、アグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）由来のケトラーゼをコードする核酸(欧州特許第735137号、登録番号: D58420)、アルカリゲネス エスピー. PC−1（Alcaligenes sp. PC−1）由来のケトラーゼをコードする核酸(欧州特許第735137、登録番号: D58422)、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis） Flotow em.WilleおよびHaematoccus pluvialis, NIES−144由来のケトラーゼをコードする核酸(欧州特許第725137号、WO 98/18910およびLotanら、FEBS Letters 1995, 364, 125−128, 登録番号: X86782およびD45881)）、パラコッカス・マルクシ（Paracoccus marcusii）由来のケトラーゼをコードする核酸(登録番号: Y15112)、シネコシスティス（Synechocystis） エスピー. PC6803株由来のケトラーゼをコードする核酸(登録番号: NP_442491)）、ブラジリヒゾビウム（Bradyrhizobium） エスピー.由来のケトラーゼをコードする核酸(登録番号: AF218415) ならびにノストック（Nostoc） エスピー. PCC 7120由来のケトラーゼをコードする核酸(Kanekoら、DNA Res. 2001, 8(5), 205 − 213; 登録番号: AP003592, BAB74888)などのように注釈されている。
【０００７】
欧州特許第735137号には、アグロバクテリウム・オーランティアカムまたはアルカリゲネス エスピー. PC−1のケトラーゼ遺伝子(crtW)を微生物に挿入することによって、例えば大腸菌（E. coli）のような微生物でキサントフィルを製造する方法を記載する。
【０００８】
欧州特許第725137号、WO 98/18910、Kajiwaraら(Plant Mol. Biol. 1995, 29, 343−352)およびHirschbergら(FEBS Letters 1995, 364, 125−128)から、ヘマトコッカス・プルビアリスのケトラーゼ遺伝子(crtW、crtOまたはbkt)を大腸菌に挿入することによってアスタキサンチンを製造する方法が知られている。
【０００９】
Hirschbergら(FEBS Letters 1997, 404, 129−134)は、ヘマトコッカス・プルビアリスのケトラーゼ遺伝子(crtO)の挿入によるシネココッカス(Synechococcus)でのアスタキサンチンの製造法を記載する。Sandmannら(Photochemistry and Photobiology 2001, 73(5), 551−55)は、類似の方法であるが、カンタキサンチンの作製に導き、微量のアスタキサンチンのみを生成する方法を記載する。
【００１０】
WO 98/18910およびHirschbergら(Nature Biotechnology 2000, 18(8), 888−892)は、ヘマトコッカス・プルビアリスのケトラーゼ遺伝子(crtO)をタバコに挿入することによってタバコの花の蜜腺にケトカロテノイドを合成する方法を記載する。
【００１１】
WO 01/20011は、脂肪種子植物（例えば、ナタネ、ヒマワリ、ダイズおよび麻）の種子においてケトカロテノイド（特に、アスタキサンチン）を生成するためのDNA構築物（種子特異的プロモーターおよびヘマトコッカス・プリビアリスのケトラーゼを用いる）を記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先行技術および特にアスタキサンチンの製造について記載される方法において記載されるケトカロテノイドの製造のためのすべての方法は、一方で収量が未だに十分ではなく、他方でトランスジェニック生物が、大量のヒドロキシル化された副産物（例えば、ゼアキサンチンおよびアドニキサンチン）を産生するという不都合を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、遺伝子的に改変された非ヒト生物を培養することによってケトカロテノイドを製造するための方法を利用可能にする目的、または上記先行技術の不都合の程度をより低下させるかまたは該不都合をもはや有さずケトカロテノイドを生成するか、またはより高い収率で所望のケトカロテノイドを生成する、遺伝子改変された非ヒト生物をさらに利用可能にする目的に基づく。
【００１４】
従って、野生型と比べて改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性を有する遺伝子的に改変された非ヒト生物を培養することによってケトカロテノイドを製造する方法が見出され、この改変されたβ−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって引き起こされる。
【００１５】
「野生型と比べて改変されたケトラーゼ活性」とは、出発生物または野生型がケトラーゼ活性を有しない場合に、好ましくは「野生型と比べて引き起こされたケトラーゼ活性」を意味するものとして理解される。
【００１６】
「野生型と比べて改変されたケトラーゼ活性」とは、出発生物または野生型がケトラーゼ活性を有する場合に、好ましくは「野生型と比べて増加されたケトラーゼ活性」を意味するものとして理解される。
【００１７】
「野生型と比べて改変されたβ−シクラーゼ活性」とは、出発生物または野生型がβ−シクラーゼ活性を有しない場合に、好ましくは「野生型と比べて引き起こされたβ−シクラーゼ活性」を意味するものとして理解される。
【００１８】
「野生型と比べて改変されたβ−シクラーゼ活性」とは出発生物または野生型がβ−シクラーゼ活性を有する場合に、好ましくは「野生型と比べて増加されたβ−シクラーゼ活性」を意味するものとして理解される。
【００１９】
本発明による非ヒト生物（例えば、微生物もしくは植物）は好ましくは、出発生物として、自然にカロテノイド（例えば、β−カロテンもしくはゼアキサンチン）を生成することが可能であるか、または遺伝子改変（例えば、代謝経路の再調節もしくは相補）によって、カロテノイド（例えば、β−カロテンもしくはゼアキサンチン）を生成することが可能である。
【００２０】
いくつかの生物は、出発生物もしくは野生型生物として、既にケトカロテノイド（例えば、アスタキサンチンもしくはカンタキサンチン）を生成することが可能である。これらの生物、例えば、ヘマトコッカス・プリビアリス、パラコッカス・マーキュシイ、キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、クロロコッカム、ファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma）、フェザント−アイ（pheasant's−eye）、ネオクロリス・ウィムメリ（Neochloris wimmeri）、プロトシフォン・ボトリオイデス（Protosiphon botryoides）、スコチエルロプシス・オーシスチホーミス（Scotiellopsis oocystiformis）、セネデスムス・バキュオラトゥス（Scenedesmus vacuolatus）、クロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorela zofingiensis）、アンキストロデスムス・ブラウニイ（Ankistrodesmus braunii）、ユーグレナ・サンギネ（Euglena sanguinea）およびバチルス・アトロフェウス（Bacillus atrophaeus）は既に、出発生物または野生型生物として、ケトラーゼ活性およびβ−シクラーゼ活性を有する。
【００２１】
本発明によると用語「野生型」とは、対応する出発生物を意味するものとして理解される。
【００２２】
この関連において、用語「生物」とは、非ヒト出発生物(野生型)もしくは本発明による遺伝子的に改変された非ヒト生物またはその両方を意味するものとして理解されうる。
【００２３】
好ましくは、特に、植物または野生型を明確に帰属することはできない場合、それぞれの場合において「野生型」とは、ケトラーゼ活性を増加させるかもしくは生じさせるための参照生物、下記の水酸化酵素活性を増加させるかもしくは生じさせるための参照生物、下記のβ−シクラーゼ活性を増加させるかもしくは生じさせるための参照生物、下記のHMG−CoA還元酵素活性を増加させるための参照生物、下記の(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性を増加させるための参照生物、下記の1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸合成酵素活性を増加させるための参照生物、下記の1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性を増加させる、下記の
イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性を増加させるための参照生物、下記のゲラニル二リン酸合成酵素活性を増加させるための参照生物、下記のファルネシル二リン酸合成酵素活性を増加させるための参照生物、下記のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を増加させるための参照生物、下記のフィトエン合成酵素活性を増加させるための参照生物、下記のフィトエンデサチュラーゼ活性を増加させるための参照生物、下記のゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性を増加させるための参照生物、下記のcrtISO活性を増加させるための参照生物、下記のFtsZ活性を増加させるための参照生物、下記のMinD活性を増加させるための参照生物、下記のε−シクラーゼ活性を減少させるための参照生物、および下記の内在性β−水酸化酵素活性を減少させるための参照生物、ならびにケトカロテノイドの含量を増加させるための参照生物を意味するものと理解される。
【００２４】
この参照生物は、野生型として、既にケトラーゼ活性を有する微生物、好ましくはヘマトコッカス・プルビアリスに関する。
【００２５】
この参照生物は、野生型として、既にケトラーゼ活性を有さない微生物、好ましくはブラケスレアに関する。
【００２６】
この参照生物は、野生型として、既にケトラーゼ活性を有する植物、好ましくは、ナツザキフクジュソウ（Adonis aestivalis）、アドニス・フラメヌス（Adonis flammeus）またはアドニス・アヌス（Adonis annuus）、特に好ましくはナツザキフクジュソウ（Adonis aestivalis）に関する。
【００２７】
この参照生物は、野生型として、既に花弁にケトラーゼ活性を有しない植物、好ましくはタゲテス・エレクタ（Tagetes erecta）、クジャクソウ（Tagetes patula）、ミントマリーゴールド（Tagetes lucida）、タゲテス・プリングレイ（Tagetes pringlei）、タゲテス・パルメリイ（Tagetes palmeri）、シオザキソウ（Tagetes minuta）またはタゲテス・カンパニュラータ（Tagetes campanulata）、特に好ましくは、タゲテス・エレクタ（Tagetes erecta）に関する。
【００２８】
ケトラーゼ活性とは、ケトラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【００２９】
ケトラーゼとは、カロテノイドの場合により置換されたβ−イオノン環上にケト基を導入する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００３０】
特に、ケトラーゼとは、β−カロテンをカンタキサンチンに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００３１】
従ってケトラーゼ活性とは、一定の時間内にタンパク質ケトラーゼによって反応したβ−カロテンの量または形成されたカンタキサンチンの量を意味するものと理解される。
【００３２】
本発明による方法の一つの実施形態において、用いられる出発生物は、野生型または出発生物として、既にケトラーゼ活性を有する非ヒト生物、例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス、パラコッカス・マーキュシイ、キサントフィロマイス・デンドロロウス、バチルス・サーキュランス、クロロコッカム、ファフィア・ロドザイマ、フェザント−アイ、ネオクリロス・ウィムメリイ、プロトシフォン・ボトリオイデス、スコチエロプシス・オーシスチホーミス、セネデスムス・バクキュオラトゥス、クロレラ・ゾフィンジエンシス、アンキストロデスムス・ブラウニイ、ユーグレナ・サンギネ、またはバチルス・アトロフェウスである。この実施形態において、この遺伝子改変によって野生型または出発生物と比べて、ケトラーゼ活性の増加を引き起こす。
【００３３】
野生型と比べて増加したケトラーゼ活性によって、一定の時間内にタンパク質ケトラーゼによって反応したβ−カロテンの量または形成されたカンタキサンチンの量は、野生型と比べて増加される。
【００３４】
好ましくは、ケトラーゼ活性のこの増加は野生型ケトラーゼ活性の、少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%である。
【００３５】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるケトラーゼ活性の測定は、好ましくは以下の条件下で行われる。
【００３６】
植物材料または微生物材料におけるケトラーゼ活性の測定は、Fraserらの方法(J. Biol. Chem. 272(10): 6128−6135, 1997) に従って行われる。植物抽出物または微生物抽出物中のケトラーゼ活性は、脂質(ダイズレシチン)および界面活性剤(コール酸ナトリウム)の存在下で、基質であるβ−カロテンおよびカンタキサンチンを用いて測定される。ケトラーゼアッセイに由来する基質／生成物の比率を、HPLCによって決定する。
【００３７】
種々の方法、例えば、翻訳およびタンパク質レベルでの阻害性調節機構のスイッチをオフにするか、または野生型と比べてケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させる、例えば、アクチベータによってケトラーゼ遺伝子を誘導するか、もしくは上記生物にケトラーゼをコードする核酸を挿入することによって、ケトラーゼ活性を増加させることができる。
【００３８】
ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加は、本実施形態における本発明により上記生物自体の内在性ケトラーゼの発現を操作することを意味するものと理解される。このことは、例えば、ケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーターDNA配列を改変することによって達成することができる。少なくとも内在性ケトラーゼ遺伝子の発現率を改変させるか、または好ましくは増加させる上記改変は、DNA配列の欠失または挿入によって実施できる。
【００３９】
上記のように少なくとも一つの内在性のケトラーゼの発現を、内在性の刺激物を
用いることによって改変することが可能である。これは特有の生理学的条件によって、すなわち外因性基質を用いることによって行うことができる。
【００４０】
さらに、少なくとも一つの内在性ケトラーゼ遺伝子の増加した発現は、レギュレータタンパク質によって達成することができる。このレギュレータタンパク質は、野生型生物において生じないか、または改変され、かつケトラーゼ遺伝子のプロモーターと相互作用する。
【００４１】
このようなレギュレータは、DNA結合ドメインおよび転写アクチベータドメインからなるキメラタンパク質（例えば、WO 96/06166に記載される）でありうる。
【００４２】
好ましい実施形態において、野生型と比べたケトラーゼ活性の増加は、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって行われる。
【００４３】
さらに好ましい実施形態において、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加は、上記生物へのケトラーゼをコードする核酸の導入によって行われる。
【００４４】
本発明による遺伝子導入生物において、本実施形態においては野生型と比べて少なくとも一つのさらなるケトラーゼ遺伝子が存在する。本実施形態において、本発明による遺伝子的に改変された生物は好ましくは、ケトラーゼをコードする少なくとも一つの外因性(すなわち、異種の)核酸、またはケトラーゼをコードする少なくとも二つの内在性核酸を有する。
【００４５】
本発明による方法の別の好ましい実施形態において、用いられる出発生物は、野生型ととして、ケトラーゼ活性を有しない非ヒト生物であり、例えばブラケスレア、マリーゴールド、タゲテス・エレクタ、ミントマリーゴールド、シオザキソウ、タゲテス・プリングレイ、タゲテス・パルメリーおよびタゲテス・カンパニュラータである。
【００４６】
好ましい本実施形態において、上記遺伝子改変によって、上記生物にケトラーゼ活性が生じる。好ましい実施形態において本発明による遺伝子的に改変された生物は、遺伝子的に改変されていない野生型と比べて、ケトラーゼ活性を有し、かつ好ましくは遺伝子導入によりケトラーゼを発現することが可能である。
【００４７】
好ましい本実施形態において、好ましくは、上記のケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加と同様にケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を生じさせることは、出発生物にケトラーゼをコードする核酸を挿入することによって行われる。
【００４８】
このために、両実施形態において、原則として各ケトラーゼをコードする核酸である各ケトラーゼ遺伝子を用いることができる。
【００４９】
本明細書中に記載されるすべての核酸は、例えば、RNA配列、DNA配列またはcDNA配列でありうる。
【００５０】
真核生物源に由来するイントロンを含むゲノムケトラーゼ配列において、宿主生物が、対応するケトラーゼを発現できないか、または発現できるようにすることできない場合に、好ましくは、既にプロセシングされた核酸配列（例えば、対応するcDNA）を用いる。
【００５１】
本発明による方法に用いることができるケトラーゼをコードする核酸および対応するケトラーゼの例としては、例えば以下に由来する配列である：
ヘマトコッカス・プルビアリス、特にヘマトコッカス・プルビアリス・フロトウ・イーエム・ウイル（Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille）に由来する配列(登録番号: X86782; 核酸: 配列番号3, タンパク質：配列番号4)、
ヘマトコッカス・プルビアリス, NIES−144 (登録番号: D45881; 核酸: 配列番号35, タンパク質：配列番号36)、
アグロバクテリウム・オーランティアカム (登録番号: D58420; 核酸: 配列番号37, タンパク質：配列番号38)、
アルカリゲネス  エスピーイーシー.（Alicaligenes spec.） (登録番号: D58422; 核酸: 配列番号39, タンパク質：配列番号40)、
パラコッカス・マルクシイ(登録番号: Y15112; 核酸: 配列番号41, タンパク質：配列番号42)、
シネコシスチス（Synechocystis） エスピー. PC6803株 (登録番号: NP442491; 核酸: 配列番号43, タンパク質：配列番号44)、
ブラジリゾビウム  エスピー.（Bradyrhizobium sp.） (登録番号: AF218415; 核酸: 配列番号45, タンパク質：配列番号46)、
ノストックエスピー.（Nostoc sp.） PCC7120株(登録番号: AP003592, BAB74888; 核酸: 配列番号47, タンパク質：配列番号48)、
ヘマトコッカス・プルビアリス (登録番号: AF534876, AAN03484; 核酸: 配列番号49, タンパク質: 配列番号50)
パラコッカス  エスピー. MBIC1143（Paracoccus sp. MBIC1143） (登録番号: D58420, P54972; 核酸: 配列番号51, タンパク質: 配列番号52)
ブレブンジモナス・オーランティアカ（Brevundimonas aurantiaca） (登録番号: AY166610, AAN86030; 核酸: 配列番号53, タンパク質: 配列番号54)
ノデュラリア・スピミゲナ NSOR10 （Nodularia spumigena NSOR10） (登録番号: AY210783, AAO64399; 核酸: 配列番号55, タンパク質: 配列番号56)
ノストック・パンクチホルムATCC 29133 （Nostoc punctiforme ATCC 29133） (登録番号: NZ_AABC01000195, ZP_00111258; 核酸: 配列番号57, タンパク質: 配列番号58)
ノストック・パンクチホルムATCC 29133 (登録番号: NZ_AABC01000196; 核酸: 配列番号59, タンパク質: 配列番号60)
ディノコッカス ラジオデュランス R1 （Deinococcus radiodurans R1） (登録番号: E75561, AE001872; 核酸: 配列番号61, タンパク質: 配列番号62)、
シネココッカス  エスピー. WH 8102 （Synechococcus sp. WH 8102）、
核酸:登録番号 NZ_AABD01000001, 塩基対1,354,725−1,355,528(配列番号75), タンパク質: 登録番号ZP_00115639 (配列番号76) ((注)推定タンパク質)、
あるいは、上記の配列に由来する配列であって、例えば以下のもの：
配列番号64もしくは66の配列のケトラーゼおよび配列番号63もしくは配列番号65の対応するコード核酸配列であって、例えば、配列番号58もしくは配列番号57の配列の変異／突然変異によって生じる核酸配列、
配列番号68もしくは70の配列のケトラーゼおよび配列番号67もしくは配列番号69の対応するコード核酸配列であって、例えば、配列番号60もしくは配列番号59の配列の変異／突然変異によって生じる核酸配列、
配列番号72または74の配列のケトラーゼおよび配列番号71または配列番号73の対応するコード核酸配列であって、例えば、配列番号76もしくは配列番号75の変異または突然変異によって生じる核酸配列。
【００５２】
さらに、本発明による方法に用いられうる天然のケトラーゼおよびケトラーゼ遺伝子の例は、例えば、そのゲノム配列が公知である種々の生物から、上記配列を含み、特に配列番号4および／もしくは48および／もしくは58および／もしくは60の配列を有するデータベースに由来するアミノ酸配列または対応する逆翻訳された核酸配列の同一性を比較することによって容易に見出すことができる。
【００５３】
さらに、天然のケトラーゼおよびケトラーゼ遺伝子の例は、上記の核酸配列、特にそのゲノム配列が公知ではない種々の生物に由来する配列番号3および／または47および／または57および／または59の配列から出発しながら、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション法によってさらに容易に見出すことができる。
【００５４】
このハイブリダイゼーションを、中位の（低ストリンジェンシー）条件または好ましくはストリンジェントな（高ストリンジェンシー）条件下で行いうる。
【００５５】
本明細書中のすべての核酸に用いるこのようなハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., のMolecular Cloning (A Laboratory Manual),第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31−9.57またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1−6.3.6.に記載されている。
【００５６】
例えば、洗浄工程間の条件を低ストリンジェンシー条件（50℃ で2× SSCを用いる）と高ストリンジェンシー条件（50℃ 、好ましくは65℃ で0.2× SSC を用いる）(20× SSC: 0.3Mクエン酸ナトリウム, 3M 塩化ナトリウム, pH 7.0)とによって制限される条件範囲から選択できる。
【００５７】
さらに、洗浄工程間の温度を、室温である22℃での中位の条件から、65℃でのストリンジェントな条件まで上げることができる。
【００５８】
塩濃度および温度の2つのパラメータは、同時に変えることができ、またこの2つのパラメータのうち1つを一定に保ち、もう1つのパラメータだけを変えることもできる。ハイブリダイゼーションの間の、変性剤としては例えば、ホルムアミドまたはSDSを使用することもできる。50%ホルムアミドの存在下において、ハイブリダイゼーションは好ましくは42℃で行う。
【００５９】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程のある典型的な条件を以下の結果として得た：
(1) 例えば、以下のハイブリダイゼーション条件、
(i)  65℃で4× SSC、または
(ii)  45℃で6× SSC、または
(iii)  68℃で6× SSC、100mg/mlの変性サカナ精子DNA、または
(iv)  68℃で6× SSC、0.5% SDS、100mg/mlの変性させた断片化サケ精子DNA、または
(v)  42℃で6× SSC, 0.5% SDS、100mg/mlの変性させた断片化サケ精子DNA、50%ホルムアミド、または
(vi)  42℃で50%ホルムアミド、4× SSC、または
(vii)  42℃で50% (vol/vol)ホルムアミド、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1% Ficoll、0.1%ポリビニルピロリドン、50mMリン酸ナトリウムバッファpH6.5、750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、または
(viii)  50℃で2× SSCもしくは4× SSC (中位の条件) 、または
(ix)  42℃で30%〜40% ホルムアミド、2× SSCもしくは4× SSC(中位の条件)。
【００６０】
(2)例えば、以下の各10分間の洗浄工程、
(i)  50℃で0.015M NaCl／0.0015M クエン酸ナトリウム／0.1% SDS、または
(ii)  65℃で0.1× SSC、または
(iii)  68℃で0.1× SSC、0.5% SDS、または
(iv)  42℃で0.1× SSC、0.5% SDS、50%ホルムアミド、または
(v)  42℃で0.2× SSC、0.1% SDS、または
(vi)  65℃で2× SSC (中位の条件)。
【００６１】
本発明による方法の好ましい実施形態において、配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号4とアミノ酸レベルで少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する配列、を含みかつケトラーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する。
【００６２】
同時に、上記の配列は、他の生物に由来する配列の同一性比較によって上記のように見いだされうる天然のケトラーゼ配列、または配列番号4の配列から開始しながら合成変異（例えば、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失）によって改変された合成ケトラーゼ配列でありうる。
【００６３】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態において、配列番号48のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで該配列番号48の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する配列、を含みかつケトラーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸を用いる。
【００６４】
同時に、上記の配列は、上記のように他の生物に由来する配列の同一性比較によって見出されうる天然のケトラーゼ配列または配列番号48の配列から開始しながら合成変異（例えば、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失）によって改変された合成ケトラーゼ配列でありうる。
【００６５】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態において、配列番号58のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号58の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する配列、を含みかつケトラーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する。
【００６６】
同時に、上記の配列は、上記のように他の生物に由来する配列の同一性比較によって見出されうる天然のケトラーゼ配列または配列番号58の配列から開始しながら合成変異（例えば、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失）によって改変された合成ケトラーゼ配列でありうる。
【００６７】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態において、配列番号60のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号60の配列とアミノ酸レベルで、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する配列、を含みかつケトラーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する。
【００６８】
同時に、上記の配列は、上記のように他の生物に由来する配列の同一性比較によって見出されうる天然のケトラーゼ配列または配列番号60の配列から開始しながら合成変異（例えば、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失）によって改変された合成ケトラーゼ配列でありうる。
【００６９】
用語「置換」とは、本明細書中すべてのタンパク質について、一つ以上のアミノ酸によって一つ以上のアミノ酸を置換することを意味するものと理解される。好ましくは、置換されたアミノ酸が元のアミノ酸の性質と類似した性質を有する「保存的置換」（例えば、AspによるGluの置換、AsnによるGlnの置換、IleによるValの置換、IleによるLeuの置換、ThrによるSerの置換）を行う。
【００７０】
欠失とは、直接結合によるアミノ酸の置き換えである。欠失の好ましい位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメインの間の連結部である。
【００７１】
挿入とは、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の挿入であり、直接結合は、形式上一つ以上のアミノ酸によって置き換えられる。
【００７２】
２つのタンパク質間の同一性は、各場合において、タンパク質の全長にわたるアミノ酸の同一性を意味するものと理解され、特にこの同一性は、以下にセットしたパラメータを用いたClustal法(Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151−1)を使用するInformax (USA)のVector NTI Suite 7.1 Softwareを用いた比較によって計算される：
多重アライメントパラメータ：
ギャップ・オープニング・ペナルティ  10
ギャップ・エクステンション・ペナルティ  10
ギャップ・セパレーション・ペナルティ・レンジ  8
ギャップ・セパレーション・ペナルティ  オフ
アライメント・ディレイの同一性%  40
残基特異的ギャップ（Residue specific gap）  オフ
親水性残基ギャップ（Hydrophilic residue gap）  オフ
トランジション・ウェイング（Transition weighing）  0
ペアワイズ・アライメント・パラメータ:
FASTアルゴリズム  オン
K−タプル・サイズ  1
ギャップ・ペナルティ  3
ウインドウ・サイズ  5
ベスト・ジアゴナルの数（Number of best diagonals）  5
従って、アミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有するタンパク質とは、その配列を、決定された配列と比較したとき、特に上記のプログラム対数を用いた上記パラメータセットにより少なくとも70%の同一性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００７３】
従って、例えば、配列番号4または48または58または60の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有するタンパク質とは、その配列を配列番号4または48または58または60の配列と比較したとき、特に上記のプログラム対数を用いた上記パラメータセットにより少なくとも70%の同一性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００７４】
適切な核酸配列を、例えば、遺伝暗号に従ったポリペプチド配列の逆翻訳によって得ることができる。
【００７５】
好ましくは、頻繁に用いられるこれらのコドンは、上記生物特異的なコドン出現頻度に従って逆翻訳に使用される。このコドン出現頻度は、目的の生物の他の既知遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定することができる。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、配列番号3の配列を含む核酸を上記植物に挿入する。
【００７７】
さらに、特に好ましい実施形態において、配列番号48の配列を含む核酸を上記植物に挿入する。
【００７８】
さらに、特に好ましい実施形態において、配列番号58の配列を含む核酸を上記植物に挿入する。
【００７９】
さらに、特に好ましい実施形態において、配列番号60の配列を含む核酸を上記植物に挿入する。
【００８０】
前述のすべてのケトラーゼ遺伝子はさらに、ヌクレオチド構造単位から化学合成（例えば、二重らせんの個々の重複した相補的核酸構造単位の断片縮合）によって、それ自体既知の方法で調製できる。オリゴヌクレオチドの化学合成を例えば、ホスホアミダイト法によるそれ自体既知の方法で行うことができる (Voet, Voet、第2版、Wiley Press New York, pp. 896−897)。合成オリゴヌクレオチドの付加およびDNAポリメラーゼのKlenow断片によるギャップの充填および連結反応および一般的なクローニング方法は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００８１】
前述したように、本発明による方法に用いられる非ヒト生物は野生型と比べて、改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性を有する。この改変されたβ−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって引き起こされる。
【００８２】
本発明による方法の一つの実施形態において、用いられる出発生物は、野生型または出発生物として、既にβ−シクラーゼ活性を有する非ヒト生物である。本実施形態において、上記遺伝子改変は、野生型または出発生物と比べて、β−シクラーゼ活性の増加をもたらす。この増加されたβ−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって引き起こされる。
【００８３】
β−シクラーゼ活性とは、β−シクラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【００８４】
β−シクラーゼとは、リコピンの末端線状残基をβ−イオノン環へと変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００８５】
特に、β−シクラーゼとは、γ−カロテンをβ−カロテンに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００８６】
従って、β−シクラーゼ活性とは、タンパク質β−シクラーゼによって一定の時間内に反応したγ−カロテンの量または形成されたβ−カロテンの量を意味するものと理解される。
【００８７】
野生型と比べて増加したβ−シクラーゼ活性によって、一定の時間内にタンパク質β−シクラーゼによって反応したリコピンもしくはγ−カロテンの量またはリコピンから形成されたγ−カロテンの量もしくはγ−カロテンから形成したβ−カロテンの量は、野生型と比べて増加される。
【００８８】
好ましくは、このβ−シクラーゼ活性の増加は、野生型β−シクラーゼ活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%に達する。
【００８９】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるβ−シクラーゼ活性の測定は、好ましくは以下の条件下で行われる。
【００９０】
β−シクラーゼの活性は、FraserおよびSandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992) 9−15) に従ってin vitroで測定される。バッファとしてリン酸カリウム (pH 7.6)、基質としてリコピン、パプリカのストロマのタンパク質、NADP+、NADPHおよびATPを一定量の生物抽出物に加える。
【００９１】
特に好ましくは、β−シクラーゼ活性の測定を、Bouvier、d’HarlingueおよびCamara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346(1) (1997) 53−64)による以下の条件下で行う。
【００９２】
in−vitroアッセイを250μlの容量で行う。このバッチは、50mMリン酸カリウム (pH7.6)、異なる量の生物抽出物、20nMリコピン、250μgのパプリカ有色体間質細胞タンパク質、0.2mM NADP+、0.2mM NADPHおよび1mM ATPを含む。NADP／NADPHおよびATPを、インキュベーション培地に加える直前に、1 mgのTween 80を加えた10 mlのエタノールに溶解する。30℃で60分間の反応時間の後、この反応をクロロホルム／メタノール(2:1)を添加し終了させる。クロロホルムに抽出した反応生成物をHPLCによって分析した。
【００９３】
放射性基質を用いた代替的なアッセイは、FraserおよびSandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992) 9−15)に記載される。
【００９４】
種々の方法、例えば、発現およびタンパク質レベルで阻害調節機構のスイッチをオフにすることによって、あるいは配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比べて増加させることによって、β−シクラーゼ活性を増加させることができる。
【００９５】
同様に種々の方法、例えば、アクチベータによるβ−シクラーゼ遺伝子の誘導、あるいは一つ以上のβ−シクラーゼ遺伝子コピーの挿入、すなわち、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼをコードする少なくとも一つの核酸を上記生物へ挿入することによって、野生型と比べてβ−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させることができる。
【００９６】
β−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加とは、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含む上記生物自体の内在性β−シクラーゼの発現を操作することもまた意味するものと本発明により理解される。
【００９７】
この操作は、例えば、β−シクラーゼをコードする遺伝子のプロモーターDNA配列の改変によって達成できる。遺伝子の発現率を増加させるこのような改変を、例えば、DNA配列の欠失または挿入によって行うことができる。
【００９８】
上記のように、外因性刺激物を用いることによって内在性β−シクラーゼの発現を改変することは可能である。これは特定の生理学的条件、すなわち外来物質の投与によって行うことができる。
【００９９】
さらに、内在性β−シクラーゼ遺伝子の改変または増加した発現は、非形質転換生物には生じない、このβ−シクラーゼ遺伝子のプロモーターと相互作用する、レギュレータタンパク質によって達成できる。
【０１００】
このようなレギュレータは、DNA結合ドメインおよび転写アクチベータドメインからなるキメラタンパク質（例えば、WO 96/06166に記載される）でありうる。
【０１０１】
好ましい実施形態において、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼをコードする少なくとも一つの核酸を上記生物に挿入することによって、β−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させる。
【０１０２】
本発明のトランスジェニック生物において、本実施形態において、野生型と比べて少なくとも一つのさらなるβ−シクラーゼ遺伝子が存在する。本実施形態において、本発明による遺伝子的に改変された生物は好ましくは、β−シクラーゼをコードする少なくとも一つの外因性(すなわち、異種)の核酸、またはβ−シクラーゼをコードする少なくとも二つの内在性核酸を有する。
【０１０３】
本発明による方法の別の好ましい実施形態において、用いられる出発生物は野生型として、β−シクラーゼ活性を有さない非ヒト生物である。このあまり好ましくない実施形態において、遺伝子改変によって上記生物にβ−シクラーゼ活性を生じさせる。本実施形態において、遺伝子的に改変されていない野生型と比べて本発明による遺伝子的に改変された生物は、β−シクラーゼ活性を有し、好ましくは遺伝子導入によりβ−シクラーゼを発現することができる。
【０１０４】
好ましい本実施形態において、β−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を上記のように増加させることと同様に、好ましくはβ−シクラーゼをコードする核酸を上記出発生物に挿入することによって、β−シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を引き起こす。
【０１０５】
このために、両実施形態において、原則として任意のβ−シクラーゼ遺伝子、すなわち、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼをコードする任意の核酸が用いられうる。
【０１０６】
真核生物源に由来するイントロンを含むゲノムβ−シクラーゼ核酸配列を用いる場合、宿主生物が、対応するβ−シクラーゼを発現することができず、また発現させることもできない場合に、好ましくは既にプロセシングされた核酸配列（例えば、対応するcDNA）が用いられる。
【０１０７】
特定の好ましいβ−シクラーゼは、トマトの有色体特異的β−シクラーゼである(AAG21133) (核酸: 配列番号1; タンパク質: 配列番号2)。
【０１０８】
本発明により用いられうるβ−シクラーゼ遺伝子は、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性有する配列を含み、かつβ−シクラーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸である。
【０１０９】
β−シクラーゼおよびβ−シクラーゼ遺伝子のさらなる例は、例えば、上記のようにゲノム配列が既知である種々の生物から、アミノ酸配列または配列番号2を含むデータベースから逆翻訳された対応する核酸配列の相同性を比較することによって、容易に見出すことができる。
【０１１０】
β−シクラーゼおよびβ−シクラーゼ遺伝子のさらなる例は、例えば、そのゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号1から出発しながら、ハイブリダイゼーションおよびPCR技術によって、それ自体知られた方法でさらに容易に見出すことができる。
【０１１１】
さらに特定の好ましい実施形態において、前記β−シクラーゼ活性を増加させるために、配列番号2の配列のβ−シクラーゼのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を生物に導入する。
【０１１２】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝子暗号によるポリペプチド配列の逆翻訳によって得ることができる。
【０１１３】
好ましくは、逆翻訳のために上記生物特異的コドン出現頻度に従って頻繁に用いられるコドンが用いられる。このコドン出現頻度は、目的とする生物の他の既知遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定できる。
【０１１４】
特に好ましい実施形態において、配列番号1の配列を含む核酸を上記生物に導入する。
【０１１５】
前述のすべてのβ−シクラーゼ遺伝子はさらに、ヌクレオチド構造単位から化学合成、例えば、二重らせんの個々の重複した相補的核酸構造単位の断片縮合によって、それ自体既知の方法で調製できる。オリゴヌクレオチドの化学合成を例えば、ホスホアミダイト法による既知の方法で行うことができる (Voet, Voet、第2版、Wiley Press New York, pages 896−897)。合成オリゴヌクレオチドの付加およびDNAポリメラーゼのKlenow断片によるギャップの充填および連結反応および一般的なクローニング方法は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０１１６】
好ましい実施形態において、野生型と比べて、改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性に加えて、改変された水酸化酵素活性を有する非ヒト生物を培養する。
【０１１７】
「野生型と比べて改変された水酸化酵素活性」とは、出発生物または野生型が水酸化酵素活性を有していない場合に、「野生型と比べて引き起こされた水酸化酵素活性」を好ましくは意味するものと理解される。
【０１１８】
「野生型と比べて改変された水酸化酵素活性」とは、出発生物または野生型が水酸化酵素活性を有している場合に、「野生型と比べて増加された水酸化酵素活性」を好ましくは意味するものと理解される。
【０１１９】
従って、好ましい実施形態において、野生型と比べて、改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性に加えて、引き起こされたまたは増加した水酸化酵素活性を有する非ヒト生物を培養する。
【０１２０】
水酸化酵素活性とは、水酸化酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０１２１】
水酸化酵素とは、カロテノイドの場合により置換されたβ−イオノン環にヒドロキシル基を導入する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１２２】
特に、水酸化酵素とは、β−カロテンをゼアキサンチンに、またはカンタキサンチンをアスタキサンチンに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１２３】
従って、水酸化酵素活性とは、タンパク質水酸化酵素により一定の時間内に反応したβ−カロテンもしくはカンタキサンチンの量または形成されたゼアキサンチンもしくはアスタキサンチンの量を意味するものと理解される。
【０１２４】
野生型と比べて増加した水酸化酵素活性により、一定の時間内にタンパク質水酸化酵素によって反応したβ−カロテンもしくはカンタキサンチンの量または形成されたゼアキサンチンもしくはアスタキサンチンの量は野生型と比べて増加される。
【０１２５】
好ましくは、この水酸化酵素活性の増加は、野生型の水酸化酵素活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%に達する。
【０１２６】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物における水酸化酵素活性の測定は、好ましくは以下の条件下で行なわれる。
【０１２７】
水酸化酵素の活性は、Bouvierら(Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320−328)に従ってin vitroで測定される。モノガラクトシルグリセリドおよびジガラクトシルグリセリドとともにフェレドキシン、フェレドキシン−NADP酸化還元酵素、カタラーゼ、NADPHおよびβ−カロテンを、一定量の生物抽出物に加える。
【０１２８】
特に好ましくは、水酸化酵素活性の決定を、Bouvier、Keller、d’HarlingueおよびCamaraによる以下の条件下で行う(Xanthophyll biosynthesis: molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L.; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320−328):
このin vitroアッセイを、0.250 mlの容量で行う。このバッチは、50mM リン酸カリウム(pH 7.6)、0.025mg ホウレン草のフェレドキシン、0.5単位のホウレン草のフェレドキシン−NADP+酸化還元酵素、0.25mM NADPH、0.010mg β−カロテン (0.1mg Tween 80中で乳化)、0.05mMのモノガラクトシルグリセリドとジガラクトシルグリセリド(1:1)との混合物、1単位のカタラーゼ、0.2 mgのウシ血清アルブミンおよび異なる容量の生物抽出物を含む。この反応混合物を、30℃で2時間インキュベートする。この反応生成物を、有機溶媒（例えば、アセトンまたはクロロホルム／メタノール (2:1) ）を用いて抽出し、そしてHPLCによって測定する。
【０１２９】
種々の方法、例えば、発現およびタンパク質レベルでの阻害性調節機構のスイッチをオフにするか、または野生型と比べて水酸化酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加または引き起こすことによって、水酸化酵素活性を増加または引き起こさせることができる。
【０１３０】
例えば、アクチベータまたは一つ以上の水酸化酵素遺伝子コピーを挿入する、すなわち、上記生物に水酸化酵素をコードする少なくとも一つの核酸を挿入することによって水酸化酵素遺伝子を誘導して、野生型と比べて水酸化酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加または引き起こさせることができる。
【０１３１】
水酸化酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加とは、本発明により上記生物自体の内在性水酸化酵素の発現を操作することを意味するものと理解される。
【０１３２】
この操作は、例えば、水酸化酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA配列を改変することによって達成することができる。内在性水酸化酵素遺伝子の発現率を増加させるこの改変は、例えばDNA配列の欠失または挿入によって実施できる。
【０１３３】
上記のように、内在性の水酸化酵素の発現を、外因性の刺激物を用いることによって改変することが可能である。これは特有の生理学的条件、すなわち外来物質の投与によって行うことができる。
【０１３４】
さらに、内在性水酸化酵素遺伝子の引き起こされたまたは増加した発現は、非形質転換生物において生じないレギュレータタンパク質とこの酸化酵素遺伝子のプロモーターとの相互作用によって達成することができる。
【０１３５】
このようなレギュレータは、DNA結合ドメインおよび転写アクチベータドメインからなるキメラタンパク質でありうる（例えば、WO 96/06166に記載される）。
【０１３６】
好ましい実施形態において、水酸化酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加または引き起こしは、上記生物へ水酸化酵素をコードする少なくとも一つの核酸を挿入することによって行うことができる。
【０１３７】
このためには、原則として任意の水酸化酵素遺伝子、すなわち、水酸化酵素をコードする任意の核酸が用いられうる。
【０１３８】
真核生物源に由来するイントロンを含むゲノム水酸化酵素配列を用いた場合、宿主植物が、対応する水酸化酵素を発現できないか、または発現させることができない場合に、好ましくは、既にプロセシングされた核酸配列（例えば、対応するcDNA）を用いる。
【０１３９】
水酸化酵素遺伝子の例は、以下のとおりである。
【０１４０】
ヘマトコッカス・プルビアリスの水酸化酵素をコードする核酸、登録番号 AX038729, WO 0061764); (核酸: 配列番号77, タンパク質: 配列番号78)、
ならびに以下の登録番号の水酸化酵素：
|emb|CAB55626.1, CAA70427.1, CAA70888.1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443.1, NP_194300.1, NP_200070.1, AAG10430.1, CAC06712.1, AAM88619.1, CAC95130.1, AAL80006.1, AF162276_1, AAO53295.1, AAN85601.1, CRTZ_ERWHE, CRTZ_PANAN, BAB79605.1, CRTZ_ALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1, ZP_00094836.1, AAC44852.1, BAC77670.1, NP_745389.1, NP_344225.1, NP_849490.1, ZP_00087019.1, NP_503072.1, NP_852012.1, NP_115929.1, ZP_00013255.1。
【０１４１】
さらに特定の好ましい水酸化酵素はトマトの水酸化酵素である(登録番号Y14810) (核酸: 配列番号5; タンパク質: 配列番号6)。
【０１４２】
本発明の好適なトランスジェニック生物において、好ましい本実施形態においては、野生型と比べて、少なくとも一つのさらなる水酸化酵素遺伝子が存在する。
【０１４３】
好ましい実施形態において、上記遺伝子的に改変された生物は、例えば、水酸化酵素をコードする少なくとも一つの外因性核酸または水酸化酵素をコードする少なくとも二つの内在性核酸を有する。
【０１４４】
好ましくは、上記の好ましい実施形態において、用いられる水酸化酵素遺伝子は、配列番号6のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号6の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、かつ水酸化酵素の酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸である。
【０１４５】
水酸化酵素および水酸化酵素遺伝子のさらなる例は、例えば、上記のようなゲノム配列が既知である種々の生物から、アミノ酸配列または配列番号6を有するデータベースに由来する対応する逆翻訳核酸配列の相同性比較によって容易に見出すことができる。
【０１４６】
水酸化酵素および水酸化酵素遺伝子のさらなる例は、例えば、上記のようなそのゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号5の配列から出発しながら、それ自体知られた方法のハイブリダイゼーションまたはPCR技術によってさらに容易に見出すことができる。
【０１４７】
さらに特定の好ましい実施形態において、水酸化酵素活性を増加させるために、配列番号6の配列の水酸化酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を上記生物に導入する。
【０１４８】
適切な核酸配列を例えば、遺伝暗号に従ったポリペプチド配列の逆翻訳によって得ることができる。
【０１４９】
好ましくは、生物特異的コドン出現頻度に従って頻繁に用いられるコドンを、この逆翻訳に用いる。このコドン出現頻度は、目的の生物の他の既知遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定できる。
【０１５０】
特に好ましい実施形態において、配列番号5の配列を含む核酸を上記生物に導入する。
【０１５１】
前述のすべての水酸化酵素遺伝子はさらに、ヌクレオチド構造単位から化学合成、例えば、二重らせんの個々の重複した相補的核酸構造単位の断片縮合によって、それ自体既知の方法で調製できる。オリゴヌクレオチドの化学合成を例えば、ホスホアミダイト法による既知の方法で行うことができる (Voet, Voet、第2版、Wiley Press New York, pages 896−897)。合成オリゴヌクレオチドの付加およびDNAポリメラーゼのKlenow断片によるギャップの充填およびまた連結反応および一般的なクローニング方法は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０１５２】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性を有し、ケトラーゼ活性を有さない遺伝子改変される非ヒト生物を本発明による方法に用いる。この遺伝子的に改変された非ヒト生物は野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼにより増加されたβ−シクラーゼ活性および引き起こされたケトラーゼ活性を有する。
【０１５３】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性もケトラーゼ活性も有しない遺伝子的に改変される非ヒト生物を本発明による方法にさらに用いる。この遺伝子的に改変された生物は野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼによって引き起こされたβ−シクラーゼ活性および引き起こされたケトラーゼ活性を有する。
【０１５４】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性およびケトラーゼ活性を有する遺伝子的に改変される非ヒト生物を、本発明による方法にさらに用いる。この遺伝子的に改変された生物は野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼによって増加されたβ−シクラーゼ活性および増加したケトラーゼ活性を有する。
【０１５５】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性を有しかつ、ケトラーゼ活性および水酸化酵素活性を有しない遺伝子的に改変される非ヒト生物を、本発明による方法に用いる。この遺伝子的に改変された生物は野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼによって増加されたβ−シクラーゼ活性、ならびに引き起こされたケトラーゼ活性および引き起こされた水酸化酵素活性を有する。
【０１５６】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性、水酸化酵素活性を有し、かつケトラーゼ活性を有しない遺伝子的に改変される非ヒト生物を本発明による方法に用いる。この遺伝子的に改変された生物は野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼによって増加されたβ−シクラーゼ活性、増加された水酸化酵素活性および引き起こされたケトラーゼ活性を有する。
【０１５７】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性、水酸化酵素活性およびケトラーゼ活性を有しない遺伝子的改変される非ヒト生物を本発明による方法にさらに用いる。この遺伝子的に改変された生物は野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼによって引き起こされたβ−シクラーゼ活性、ならびに引き起こされた水酸化酵素活性および引き起こされたケトラーゼ活性を有する。
【０１５８】
特に好ましくは、出発生物として、β−シクラーゼ活性、水酸化酵素活性およびケトラーゼ活性を有する遺伝子的に改変される非ヒト生物を本発明による方法にさらに用いる。この遺伝子的に改変された生物は、野生型と比べて、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列を含むβ−シクラーゼ活性によって増加されたβ−シクラーゼ活性、増加された水酸化酵素活性および増加されたケトラーゼ活性を有する。
【０１５９】
さらに好ましい実施形態において、野生型と比べて、HMG−CoA還元酵素活性、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性、1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性、1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性、イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性、ゲラニル二リン酸合成酵素活性、ファルネシル二リン酸合成酵素活性、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性、フィトエン合成酵素活性、フィトエンデサチュラーゼ活性、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性、crtISO活性、FtsZ活性およびMinD活性からなる群から選択される少なくとも一つの活性の増加した活性をさらに有する遺伝子的に改変された非ヒト生物を培養する。
【０１６０】
HMG−CoA還元酵素活性とは、HMG−CoA還元酵素 (3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−補酵素A還元酵素)の酵素活性を意味するものと理解される。
【０１６１】
HMG−CoA還元酵素とは、3−ヒドロキシ−3−メチル−グルタリル−補酵素Aをメバロン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１６２】
従って、HMG−CoA還元酵素活性とは、タンパク質HMG−CoA還元酵素によって一定の時間内に、反応する3−ヒドロキシ−3−メチル−グルタリル−補酵素Aの量または形成されるメバロン酸の量を意味するものと理解される。
【０１６３】
野生型と比べて増加したHMG−CoA還元酵素活性によって、一定の時間内にタンパク質HMG−CoA還元酵素によって反応した3−ヒドロキシ−3−メチル−グルタリル−補酵素Aの量または形成されたメバロン酸の量は、野生型と比べて増加する。
【０１６４】
好ましくは、このHMG−CoA還元酵素活性の増加は、野生型のHMG−CoA還元酵素活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%に達する。
【０１６５】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるHMG−CoA還元酵素活性の測定は、好ましくは、以下の条件下で行なわれる。
【０１６６】
凍結させた生物材料を、乳鉢に入れた液体窒素中で乳棒で強く砕き、粉々にしてホモジェナイズし、そして1:1〜1:20の比で抽出バッファを用いて抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、利用できる生物材料中の酵素活性に依存する。典型的に、この抽出バッファは、50mM HEPES−KOH (pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% (v/v) Triton X−100、2mM ε−アミノカプロン酸、10%グリセロール、5mM KHCO3からなりうる。抽出の直前に、2mM DTTおよび0.5mM PMSFを加える。
【０１６７】
HMG−CoA還元酵素の活性を、公表された記載に従って測定できる (例えば、Schaller, Grausem, Benveniste, Chye, Tan, SongおよびChua, Plant Physiol. 109 (1995), 761−770; Chappell, Wolf, Proulx, Cuellar and Saunders, Plant Physiol. 109 (1995) 1337−1343)。生物組織を、冷バッファ(100mM リン酸カリウム(pH 7.0)、4mM MgCl2、5mM DTT)中でホモジェナイズし抽出しうる。このホモジェナイズしたものを4℃において10,000g で15分間遠心分離する。次いでこの上清を100,000gで45〜60分間、さらに遠心分離する。この上清およびミクロソーム画分のペレット (100mM リン酸カリウム(pH 7.0)および50mM DTTに再懸濁した後)中のHMG−CoA還元酵素活性を決定する。この上清溶液および懸濁液(この懸濁液のタンパク質含有量は約1〜10μgに相当する)のアリコートを、30℃で15〜60分間、理想的には26μlの容量の、3mM NADPHおよび20μM (14C)HMG−CoA (58μCi/μM)を加えた100mM リン酸カリウムバッファ(pH 7.0)中でインキュベートする。この反応を、5μlのメバロノラクトン (1 mg/ml)および6 N HClを添加することによって停止させる。添加後、この混合物を室温で15分間インキュベートする。この反応中に形成された (14C)−メバロン酸を125μlの飽和リン酸カリウム溶液(pH 6.0)および300μlの酢酸エチルを加えることによって定量する。この混合物をよく混合し、遠心分離する。放射能は、シンチレーション測定によって決定できる。
【０１６８】
lytBまたはIspHとも称される(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性とは、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０１６９】
(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素とは、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸をイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１７０】
従って、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性とはタンパク質(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素によって一定の時間内に、反応する(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸の量または形成されるイソペンテニル二リン酸および／もしくはジメチルアリル二リン酸の量を意味するものと理解される。
【０１７１】
野生型と比べて増加した(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性によって、タンパク質(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素によって一定の時間内に反応した(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸の量または形成されたイソペンテニル二リン酸および／もしくはジメチルアリル二リン酸の量は、野生型と比べて増加される。
【０１７２】
好ましくは、この(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性の増加は、野生型の(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%に達する。
【０１７３】
本発明による遺伝子的に改変された非ヒト生物および野生型または参照生物における(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性の測定は、好ましくは、以下の条件下で行なわれる。
【０１７４】
凍結させた生物材料を、乳鉢に入れた液体窒素中で乳棒で強く砕き、粉々にしてホモジェナイズし、そして1:1〜1:20の比で抽出バッファを用いて抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、利用できる生物材料の酵素活性に依存する。典型的に、この抽出バッファは、50mM HEPES−KOH (pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% (v/v) Triton X−100、2mM ε−アミノカプロン酸、10%グリセロール、5mM KHCO3からなりうる。抽出の直前に、2mM DTTおよび0.5mM PMSFを加える。
【０１７５】
(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブタ−2−エニル二リン酸還元酵素活性の測定は、免疫額的検出によって行うことができる。特異的抗体の調製法がRohdichおよび共同研究者らによって記載された(Rohdich, Hecht, Gartner, Adam, Krieger, Amslinger, Arigoni, BacherおよびEisenreich: Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH (LytB) protein, Natl. Acad. Natl. Sci. USA 99 (2002), 1158−1163)。触媒活性を決定するために、Altincicekおよび共同研究者ら(Altincicek, Duin, Reichenberg, Hedderich, Kollas, Hintz, Wagner, Wiesner, BeckおよびJomaa: LytB protein catalyzes the terminal step of the 2−C−methyl−D−erythritol−4−phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis; FEBS Letters 532 (2002,) 437−440)は、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチル−ブト−2−エニル二リン酸からイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸への還元をモニターするin vitro系を記載する。
【０１７６】
1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性とは、1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０１７７】
1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素とは、ヒドロキシエチル−ThPPおよびグリセルアルデヒド3−リン酸を1−デオキシ−D−キシロース5−リン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１７８】
従って、1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性とは、タンパク質1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素によって一定の時間内に反応するヒドロキシエチル−ThPPおよび／もしくはグリセルアルデヒド3−リン酸の量または形成される1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸の量を意味するものと理解される。
【０１７９】
野生型と比べて増加した1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性によって、一定の時間内にタンパク質1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素によって反応したヒドロキシエチル−ThPPおよび／もしくはグリセルアルデヒド3−リン酸の量または形成された1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸の量は野生型と比べて増加される。
【０１８０】
好ましくは、この1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性の増加は、野生型の1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%になる。
【０１８１】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物における1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸合成酵素活性の測定は、好ましくは、以下の条件下で行なわれる。
【０１８２】
凍結させた生物材料を、乳鉢に入れた液体窒素中で乳棒で強く砕き、粉々にしてホモジェナイズし、そして1:1〜1:20の比で抽出バッファを用いて抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、利用できる生物材料の酵素活性に依存する。典型的に、この抽出バッファは、50mM HEPES−KOH (pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% (v/v) Triton X−100、2mM ε−アミノカプロン酸、10%グリセロール、5mM KHCO3からなりうる。抽出の直前に、2mM DTTおよび0.5mM PMSFを加える。
【０１８３】
D−1−デオキシキシルロース−5−リン酸合成酵素(DXS)活性を測定するための反応溶液(50〜200μl)は、100mM Tris−HCl (pH 8.0)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3mM ATP、1mM チアミン二リン酸、0.1% Tween−60、1mM フッ化カリウム、30μM (2−14C)−ピルビン酸 (0.5μCi)、0.6mM DL−グリセルアルデヒド3−リン酸からなる。上記生物抽出物を、この反応溶液中において37℃で1〜2時間インキュベートする。次いでこの反応を、80℃で3分間加熱することによって停止させる。13,000回転／分で5分間の遠心分離の後、この上清を蒸発させ、その残渣を50μlのメタノールに再懸濁し、薄層クロマトグラフ用のTLCプレート(シリカ−ゲル 60, Merck, Darmstadt)にアプライし、そしてN−プロピルアルコール／酢酸エチル／水(6：1：3；v／v／v)で分離する。この過程において、(2−14C)−ピルビン酸の放射性標識したD−1−デオキシキシルロース−5−リン酸（またはD−1−デオキシキシルロース)が分離する。定量をシンチレーションカウンタによって行う。この方法は、HarkerおよびBramleyに記載された (FEBS Letters 448 (1999) 115−119)。あるいは、Querolおよび共同研究者らのDXS合成酵素活性を決定するための蛍光アッセイが記載されている(Analytical Biochemistry 296 (2001) 101−105)。
【０１８４】
1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性とは、1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼとも称される1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【０１８５】
1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼとは、1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸を2−C−メチル−D−エリトリトール4−リン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１８６】
従って、1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性とは、タンパク質1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼによって一定の時間内に、反応した1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸の量または形成された2−C−メチル−D−エリトリトール4−リン酸の量を意味するものと理解される。
【０１８７】
野生型と比べて増加した1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性によって、一定の時間内にタンパク質1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼによって反応した1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸の量または形成された2−C−メチル−D−エリトリトール4−リン酸の量は、野生型と比べて増加される。
【０１８８】
好ましくは、この1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性の増加は、野生型の1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%になる。
【０１８９】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物における1−デオキシ−D−キシロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ活性の測定は、好ましくは、以下の条件下で行なわれる。
【０１９０】
凍結させた生物材料を、乳鉢に入れた液体窒素中で乳棒で強く砕き、粉々にしてホモジェナイズし、そして1:1〜1:20の比で抽出バッファを用いて抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、利用できる生物材料の酵素活性に依存する。典型的に、この抽出バッファは、50mM HEPES−KOH (pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% (v/v) Triton X−100、2mM ε−アミノカプロン酸、10%グリセロール、5mM KHCO3からなりうる。抽出の直前に、2mM DTTおよび0.5mM PMSFを加える。
【０１９１】
例えば、酵素によって合成されうるD−1−デオキシキシルロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ(DXR)の活性を100mM Tris−HCl (pH 7.5)、1mM MnCl2、0.3mM NADPHおよび0.3mM 1−デオキシ−D−キシルロース−4−リン酸からなるバッファ中で測定する (Kuzuyama, Takahashi, WatanabeおよびSeto: Tetrahedon letters 39 (1998) 4509−4512)。この反応は上記生物抽出物の添加によって開始される。この反応容量は典型的に0.2〜0.5 mlの量でありえ；37℃で30〜60分間インキュベーションを行う。この間に、NADPHの酸化を光度計によって340 nmでモニターする。
【０１９２】
イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性とは、イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【０１９３】
イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼとは、イソペンテニル二リン酸をジメチルアリルリン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０１９４】
従って、イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性とは、タンパク質イソペンテニル二リン酸D−△−イソメラーゼによって一定の時間内に、反応するイソペンテニル二リン酸の量または形成されるジメチルアリルリン酸の量を意味するものと理解される。
【０１９５】
野生型と比べて増加したイソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性によって、一定の時間内にタンパク質イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼにより反応するイソペンテニル二リン酸の量または形成されるジメチルアリルリン酸の量は、野生型と比べて増加される。
【０１９６】
好ましくは、このイソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性の増加は、野生型のイソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性の少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも500%、特に少なくとも600%になる。
【０１９７】
本発明による遺伝子的に改変された生物および野生型または引用される生物におけるイソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ活性の測定は、好ましくは、以下の条件下で行なわれる。
【０１９８】
凍結させた生物材料を、乳鉢に入れた液体窒素中で乳棒で強く砕き、粉々にしてホモジェナイズし、そして1:1〜1:20の比で抽出バッファを用いて抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、利用できる生物材料の酵素活性に依存する。典型的に、この抽出バッファは、50mM HEPES−KOH (pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% (v/v) Triton X−100、2mM ε−アミノカプロン酸、10%グリセロール、5mM KHCO3からなりうる。抽出の直前に、2mM DTTおよび0.5mM PMSFを加える。
【０１９９】
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPPイソメラーゼ)の活性の測定は、Fraserおよび共同研究者らによって示される方法に従って行うことができる(Fraser, Romer, Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, SchuchおよびBramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit−specific manner; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002), 1092−1097, based on Fraser, Pinto, Holloway and Bramley, Plant Journal 24 (2000), 551−558)。酵素測定のために、基質として0.5μCiの(1−14C)IPP(イソペンテニルピロリン酸) (56 mCi/mmol, Amersham plc)を用いたインキュベーションを、1mM DTT、4mM MgCl2、6mM MnCl2、3mM ATP、0.1% Tween 60、1mM フッ化カリウムを加えた約150〜500μlの容量の0.4 M Tris−HCl (pH 8.0)で行う。抽出物をバッファと混合し(例えば、1：1の比で)、そして28℃で少なくとも5時間インキュベートする。次いで約200μlのメタノールを加え、濃塩酸（終濃度25%）を添加することによって、酸加水分解を37℃で約1時間行う。その後、2回の抽出を石油エーテル(10% ジエチルエーテルと混合したもの)を用いて行う(それぞれ500μl)。ハイパーフェーズ（hyperphase）のアリコートの放射能をシンチレーションカウンターによって測定する。この酵素比活性を5分間の短時間のインキュベーションの間に決定できる。それは短時間の反応が反応副生成物の形成を抑制するためである (LutzowおよびBeyer: The isopentenyl phosphate △−isomerase and its relation to the phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts; Biochim. Biophys. Acta 959 (1988), 118−126を参照のこと)。
【０２００】
ゲラニル二リン酸合成酵素活性とは、ゲラニル二リン酸合成酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０２０１】
ゲラニル二リン酸合成酵素とは、イソペンテニル二リン酸およびジメチルアリルリン酸をゲラニル二リン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２０２】
従って、ゲラニル二リン酸合成酵素活性とは、タンパク質ゲラニル二リン酸合成酵素によって一定の時間内に、反応したイソペンテニル二リン酸および／もしくはジメチルアリルリン酸の量または形成されたゲラニル二リン酸の量を意味するものと理解される。
【０２０３】
したがって、野生型と比較して増加したゲラニル二リン酸合成酵素活性により、一定時間内にタンパク質ゲラニル二リン酸合成酵素によって反応するイソペンテニル二リン酸および/またはジメチルアリルリン酸の量あるいは生じるゲラニル二リン酸の量は、野生型と比較して増加する。
【０２０４】
このゲラニル二リン酸合成酵素活性の増加は、野生型のゲラニル二リン酸合成酵素活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２０５】
本発明の遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるゲラニル二リン酸合成酵素活性は以下の条件下で測定することが好ましい。
【０２０６】
凍結した生物材料を乳鉢中の液体窒素中で乳棒で激しく粉砕することによってホモジネートし、1：1から1：20の比の抽出バッファーで抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定及び定量が可能であるように、入手可能な生物材料の酵素活性に左右される。典型的に、抽出バッファーは50mM HEPES-KOH（pH 7.4）、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-アミノカプロン酸、10％グリセロール、5mM KHCO3から構成され得る。抽出直前に、2mM DTTと0.5mM PMSFを添加する。
【０２０７】
ゲラニル二リン酸合成酵素（GPP合成酵素）の活性は、（Bouvier, Suire, d’Harlingue, BackhausおよびCamara：Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant Journal 24 (2000) 241-252に従って）生物抽出物の添加後に50mM Tris-HCl（pH 7.6）、10mM MgCl2、5mM MnCl2、2mM DTT、1mM ATP、0.2％ Tween-20、5μM（14C）IPPおよび50μM DMAPP（ジメチルアリルピロリン酸）中で測定することができる。例えば、37℃で2時間のインキュベーション後に、反応産物を（Koyama, FujiおよびOgura:Enzymatic hydrolysis of polyprenyl pyrophosphates, Methods Enzymol. 110(1985), 153-155に従って）脱リン酸化処理し、薄層クロマトグラフィーおよび取り込まれた放射能の測定によって分析する（Dogbo, Bardat, QuennemetおよびCamara: Metabolism of plastid terpenoids: In vitro inhibition of phytoene synthesis by phenethyl pyrophosphate derivates, FEBS Letters 219(1987) 211-215）。
【０２０８】
ファルネシル二リン酸合成酵素活性はファルネシル二リン酸合成酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０２０９】
ファルネシル二リン酸合成酵素は、2分子のイソペンテニル二リン酸を、ジメチルアリル二リン酸と生じたゲラニル二リン酸と共にファルネシル二リン酸に順次変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２１０】
したがって、ファルネシル二リン酸合成酵素活性は、タンパク質ファルネシル二リン酸合成酵素によって一定時間で反応したジメチルアリル二リン酸および/またはイソペンテニル二リン酸の量あるいは生じたファルネシル二リン酸の量を意味するものと理解される。
【０２１１】
したがって、野生型と比較して増加したファルネシル二リン酸合成酵素活性により、一定時間内でタンパク質ファルネシル二リン酸合成酵素によって反応するジメチルアリル二リン酸および/またはイソペンテニル二リン酸の量あるいは生じるファルネシル二リン酸の量は、野生型と比較して増加する。
【０２１２】
このファルネシル二リン酸合成酵素活性の増加は、野生型のファルネシル二リン酸合成酵素活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２１３】
本発明の遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるファルネシル二リン酸合成酵素活性は以下の条件下で測定することが好ましい。
【０２１４】
凍結した生物材料を乳鉢中の液体窒素中で乳棒で激しく粉砕することによってホモジネートし、1：1から1：20の比の抽出バッファーで抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定及び定量が可能であるように、入手可能な生物材料の酵素活性に左右される。典型的に、抽出バッファーは50mM HEPES-KOH（pH 7.4）、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-アミノカプロン酸、10％グリセロール、5mM KHCO3から構成され得る。抽出直前に、2mM DTTと0.5mM PMSFを添加する。
【０２１５】
ファルネシルピロリン酸合成酵素（FPP合成酵素）の活性は、JolyおよびEdwardsの手順（Journal of Biological Chemistry 268 (1993), 26983-26989）に従って測定することができる。その後、酵素活性を10mM HEPES (pH 7.2)、1mM MgCl2、1mM ジチオトレイトール、20μM ゲラニルピロリン酸および40μM（1-14C）イソペンテニルピロリン酸（4 Ci/mmol）からなるバッファー中で測定する。反応混合液は37℃でインキュベートし、反応は2.5N HCl（19μg/mlのファルネソールを含む70％エタノール中）の添加によって停止する。こうして反応産物は37℃での酸加水分解によって30分以内に加水分解される。混合液を10％ NaOHの添加によって中和し、ヘキサンと共に振とうすることによって抽出する。ヘキサン相のアリコートは、取り込まれた放射能を測定するためにシンチレーションカウンターによって測定することができる。
【０２１６】
あるいは、生物抽出物および放射性標識したIPPのインキュベーション後に、反応産物をベンゼン/メタノール（9：1）を用いた薄層クロマトグラフィー（シリカゲルSE60, Merck）によって分離する。放射性標識された産物を溶出し、放射能が（Gaffe, Bru, Causse, Vidal, Stamitti-Bert, CardeおよびGallusci: LEFPS1, a tomato farnesyl pyrophosphate gene highly expressed during early fruit development; Plant Physiology 123 (2000) 1351-1362に従って）測定される。
【０２１７】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性は、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０２１８】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素は、ファルネシル二リン酸およびイソペンテニル二リン酸をゲラニルゲラニル二リン酸へ変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２１９】
したがって、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性は、タンパク質ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素によって一定時間で反応したファルネシル二リン酸および/またはイソペンテニル二リン酸の量あるいは生じたゲラニルゲラニル二リン酸の量を意味するものと理解される。
【０２２０】
野生型と比較して増加したゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性により、一定時間内にタンパク質ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素によって反応するファルネシル二リン酸および/またはイソペンテニル二リン酸の量あるいは生じるゲラニルゲラニル二リン酸の量は、野生型と比較して増加する。
【０２２１】
このゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性の増加が、野生型のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２２２】
本発明の遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性は以下の条件下で測定することが好ましい。
【０２２３】
凍結した生物材料を乳鉢中の液体窒素中で乳棒で激しく粉砕することによってホモジネートし、1：1から1：20の比の抽出バッファーで抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、入手可能な生物材料の酵素活性に左右される。典型的に、抽出バッファーは50mM HEPES-KOH（pH 7.4）、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-アミノカプロン酸、10％グリセロール、5mM KHCO3から構成され得る。抽出直前に、2mM DTTと0.5mM PMSFを添加する。
【０２２４】
ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（GGPP合成酵素）の活性の測定値は、DogboおよびCamaraによって記載された方法（Biochim. Biophys. Acta 920 (1987), 140-148: Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinity chromatography）に従って測定することができる。このために、バッファー（50mM Tris-HCl(pH 7.6)、2mM MgCl2、1mM MnCl2、2mM ジチオトレイトール、（1-14C）IPP（0.1μCi、10μM）、15μM DMAPP、GPPまたはFPP）を総量約200μlの生物抽出物に添加する。インキュベーションは30℃で1〜2時間（またはそれ以上）で実施することができる。反応は0.5mlのエタノールおよび0.1mlの6N HClの添加によって停止する。37℃で10分間のインキュベーション後、反応混合液を6N NaOHで中和し、1mlの水と混合し、4mlのジエチルエーテルと共に振とうすることによって抽出する。エーテル相のアリコート（例えば0.2ml）において、放射能の量はシンチレーションカウンターによって測定することができる。あるいは、酸加水分解後に、放射性標識したプレニルアルコールを振とうすることによってエーテル中に抽出し、HPLC(Spherisorb ODS-1の25cmカラム、5μm；メタノール/水（90：10；v/v）を用いて1ml/分の流速で溶出)を用いて分離し、（Wiedemann, MisawaおよびSandmann: Purification and enzymatic characterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Erwinia uredovora after expression in Escherichia coli; Archives Biochemistry and Biophysics 306 (1993), 152-157による）放射能モニターによって定量することができる。
【０２２５】
フィトエン合成酵素活性はフィトエン合成酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【０２２６】
特に、フィトエン合成酵素は、ゲラニルゲラニル二リン酸をフィトエンに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２２７】
したがって、フィトエン合成酵素活性は、タンパク質フィトエン合成酵素によって一定の時間で反応したゲラニルゲラニル二リン酸の量または生じたフィトエンの量を意味するものと理解される。
【０２２８】
野生型と比較して増加したフィトエン合成酵素活性により、一定の時間内にタンパク質フィトエン合成酵素によって反応するゲラニルゲラニル二リン酸の量または生じるフィトエンの量は、野生型と比較して増加する。
【０２２９】
このフィトエン合成酵素活性の増加が、野生型のフィトエン合成酵素活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２３０】
本発明の遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるフィトエン合成酵素活性は以下の条件下で測定することが好ましい：
凍結した生物材料を乳鉢中の液体窒素中で乳棒で激しく粉砕することによってホモジネートし、1：1から1：20の比の抽出バッファーで抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、入手可能な生物材料の酵素活性に左右される。典型的に、抽出バッファーは50mM HEPES-KOH（pH 7.4）、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-アミノカプロン酸、10％グリセロール、5mM KHCO3から構成され得る。抽出直前に、2mM DTTと0.5mM PMSFを添加する。
【０２３１】
フィトエン合成酵素（PSY）の活性は、Fraserおよび共同研究者らによって提供された方法（Fraser, Romer, Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, SchuchおよびBramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner; Fraser, Pinto, HollowayおよびBramley, Plant Journal 24 (2000) 551-558を基礎とするProc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002), 1092-1097）に従って測定することができる。酵素測定のために、1mM DTT、4mM MgCl2、6mM MnCl2、3mM ATP、0.1% Tween 60、1mM フッ化カリウムを含む0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中で、基質である（3H）ゲラニルゲラニルピロリン酸（15 mCi/mM, American Radiolabeled Chemicals, St. Louis）と共にインキュベーションする。生物抽出物をバッファーと混合する（例えば、295μlバッファーが総量500μlで抽出物と混合される）。混合液を少なくとも5時間28℃でインキュベートする。次いで、フィトエンをクロロホルムと共に振とうすることによって2回抽出する（それぞれにつき500ml）。反応中に生じた放射性標識されたフィトエンを、シリカプレート上でメタノール/水（95：5；v/v）を用いた薄層クロマトグラフィーによって分離する。フィトエンはシリカプレート上で（少量のヨウ素結晶を加熱することによる）ヨウ素に富む雰囲気中で同定することができる。標準フィトエンを参照として用いる。放射性標識した産物の量は、シンチレーションカウンター中で測定することによって決定する。あるいは、フィトエンは放射能検出器（Fraser, AlbrechtおよびSandmann: Development of high performance liquid chromatographic systems for the separation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specific enzymatic reactions; J. Chromatogr. 645 (1993) 265-272）を具備するHPLCによって定量することもできる。
【０２３２】
フィトエンデサチュラーゼ活性はフィトエンデサチュラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【０２３３】
フィトエンデサチュラーゼは、フィトエンをフィトフルエンに、および/またはフィトフルエンをζ-カロテン（ゼータカロテン）に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２３４】
したがって、フィトエンデサチュラーゼ活性は、タンパク質であるフィトエンデサチュラーゼによって特定の時間で反応したフィトエンまたはフィトフルエンの量あるいは生じたフィトフルエンまたはζ-カロテンの量を意味するものと理解される。
【０２３５】
したがって、野生型と比較して増加したフィトエンデサチュラーゼ活性により、一定の時間内にタンパク質フィトエンデサチュラーゼによって反応するフィトエンまたはフィトフルエンの量あるいは生じるフィトフルエンまたはζ-カロテンの量は、野生型と比較して増加する。
【０２３６】
このフィトエンデサチュラーゼ活性の増加が、野生型のフィトエンデサチュラーゼ活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２３７】
本発明の遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるフィトエンデサチュラーゼ活性は以下の条件下で測定することが好ましい。
【０２３８】
凍結した生物材料を乳鉢中の液体窒素中で乳棒で激しく粉砕することによってホモジネートし、1：1から1：20の比の抽出バッファーで抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、入手可能な生物材料の酵素活性に左右される。典型的に、抽出バッファーは50mM HEPES-KOH（pH 7.4）、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-アミノカプロン酸、10％グリセロール、5mM KHCO3から構成され得る。抽出直前に、2mM DTTと0.5mM PMSFを添加する。
【０２３９】
フィトエンデサチュラーゼ（PDS）の活性は、（Romer, Fraser, Kiano, Shipton, Misawa, SchuchおよびBramley: Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants; Nature Biotechnology 18 (2000) 666-669に従って）不飽和化カロテンへ放射性標識した（14C）-フィトエンを挿入することによって測定することができる。放射性標識したフィトエンはFraser（Fraser, De la Rivas, Mackenzie, Bramley: Phycomyces blakesleanus CarB mutants: their use in assays of phytoene desaturase; Phytochemistry 30 (1991), 3971-3976）に従って合成することができる。標的組織の色素体の膜は、総量１ml中に10mM MgCl2と1mM ジチオトレイトールとを含む100 mM MESバッファー（pH 6.0）と共にインキュベートすることができる。5％(v/v)のアセトン濃度を超えてはならない場合は、アセトンに溶解した(14C)-フィトエン（各場合に、1回のインキュベーションにつき毎分約100000崩壊）を添加する。この混合液を約6〜7時間、暗所下、28℃で振とうしながらインキュベートする。その後、色素を約5mlの（10％ジエチルエーテルと混合した）石油エーテルを用いて3回抽出し、HPLCで分離して定量する。
【０２４０】
あるいは、フィトエンデサチュラーゼの活性は、Fraserら（Fraser, Misawa, Linden, Yamano, KobayashiおよびSandmann: Expression in Escherichia coli, purification, and reactivation of the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase, Journal of Biological Chemistry 267 (1992), 19891-9895）に従って測定することができる。
【０２４１】
ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性は、ゼータ-カロテンデサチュラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【０２４２】
ゼータ-カロテンデサチュラーゼは、ζ-カロテンをニューロスポリンに、および/またはニューロスポリンをリコピンに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２４３】
したがって、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性は、タンパク質であるゼータ-カロテンデサチュラーゼによって反応したζ-カロテンまたはニューロスポリンの量あるいは生じたニューロスポリンまたはリコピンの量を意味するものと理解される。
【０２４４】
野生型と比較して増加したゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性により、一定の時間内にタンパク質ゼータ-カロテンデサチュラーゼによって反応するζ-カロテンまたはニューロスポリンの量あるいは生じるニューロスポリンまたはリコピンの量が、野生型と比較して増加する。
【０２４５】
このゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性の増加が、野生型のゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２４６】
本発明の遺伝子的に改変された生物および野生型または参照生物におけるゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性は以下の条件下で測定することが好ましい。
【０２４７】
凍結した生物材料を乳鉢中の液体窒素中で乳棒で激しく粉砕することによってホモジネートし、1：1から1：20の比の抽出バッファーで抽出する。この特定の比は、線形測定範囲内での酵素活性の測定および定量が可能であるように、入手可能な生物材料の酵素活性に左右される。典型的に、抽出バッファーは50mM HEPES-KOH（pH 7.4）、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-アミノカプロン酸、10％グリセロール、5mM KHCO3から構成され得る。抽出直前に、2mM DTTと0.5mM PMSFを添加する。
【０２４８】
ζ-カロテンデサチュラーゼ（ZDSデサチュラーゼ）の測定のための分析は、0.2M リン酸カリウム（pH 7.8、約1mlのバッファー量）中で実施することができる。測定のための分析方法は、Breitenbachと共同研究者らによって公表された（Breitenbach, Kuntz, TakaichiおよびSandmann: Catalytic properties of an expressed and purified higher plant type x-carotene desaturase from Capsicum annuum; European Journal of Biochemistry. 265(1):376-383, 1999）。各分析バッチは、0.4Mリン酸カリウムバッファー（pH7.8）中に懸濁されている3mgのホスファチジルコリン、5μgのζ-カロテンまたはニューロスポリン、0.02％ブチルヒドロキシトルエン、10μgのデシルプラストキノン（1mM メタノール原液）および生物抽出物を含む。生物抽出物の量は、線形測定範囲での定量を可能にするために、存在するZDSデサチュラーゼ活性の量に調整しなければならない。インキュベーションは、典型的には、約28℃、暗所下で激しく振とうしながら（毎分200回転）約17時間実施する。カロチノイドは、50℃で10分間、振とうしながら4mlのアセトンを添加することによって抽出する。この混合液からカロチノイドは石油エーテル相へ（10％はジエチルエーテルへ）移動する。ジエチルエーテル/石油エーテル相は窒素下で蒸発され、カロチノイドを20μl中に再度溶解させて、HPLCによって分離し定量する。
【０２４９】
crtISO活性はcrtISOタンパク質の酵素活性を意味するものと理解される。
【０２５０】
crtISOタンパク質は、7,9,7',9’-テトラ-シス-リコピンを全トランス-リコピンへ変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２５１】
したがって、crtISO活性は、crtISOタンパク質によって一定の時間で反応した7,9,7',9’-テトラ-シス-リコピンの量または生じた全トランス-リコピンの量を意味するものと理解される。
【０２５２】
したがって、野生型と比較して増加したcrtISO活性により、一定の時間内にcrtISOタンパク質によって反応する7,9,7',9’-テトラシス型リコピンの量または生じるオールトランス型リコピンの量は、野生型と比較して増加する。
【０２５３】
このcrtISO活性の増加が、野生型のcrtISO活性の少なくとも5％、好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも100％、より一層好ましくは少なくとも300％、なお一層好ましくは少なくとも500％、特に少なくとも600％になることが好ましい。
【０２５４】
FtsZ活性は、FtsZタンパク質の生理学的活性を意味するものと理解される。
【０２５５】
FtsZタンパク質は、細胞分裂および色素体分裂促進作用を有し、かつチューブリンタンパク質と相同性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【０２５６】
MinD活性は、MinDタンパク質の生理学的活性を意味するものと理解される。
【０２５７】
MinDタンパク質は、細胞分裂において多機能的な役割を有するタンパク質を意味するものと理解される。これは膜関連ATPアーゼであり、細胞内で極から極への揺動運動を示すことができる。
【０２５８】
さらに、非メバロン酸経路の酵素の活性の増加は、所望のケトカロテノイド最終産物の更なる増加をもたらし得る。この酵素の例は、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトール合成酵素、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼおよび2-C-メチル-D-エリトリトール-2,4-シクロ二リン酸合成酵素である。これに対応する遺伝子の遺伝子発現の改変により、言及した酵素の活性を増加させることができる。当該タンパク質の濃度の変化は、抗体および適切なブロッティング技術によって標準的な手法で検出することができる。
【０２５９】
HMG-CoA還元酵素活性および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素活性および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素活性および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ活性および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ活性および/またはゲラニル二リン酸合成酵素活性および/またはファルネシル二リン酸合成酵素活性および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性および/またはフィトエン合成酵素活性および/またはフィトエンデサチュラーゼ活性および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性および/またはcrtISO活性および/またはFtsZ活性および/またはMinD活性の増加を、様々な方法で、例えば、発現およびタンパク質レベルで阻害調節機構のスイッチをオフにすることによって、あるいはHMG-CoA還元酵素をコードする核酸および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする核酸および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸および/またはイソペンテニル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸および/またはゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸および/またはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸および/またはフィトエン合成酵素をコードする核酸および/またはフィトエンデサチュラーゼをコードする核酸および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸および/またはcrtISOタンパク質をコードする核酸および/またはFtsZタンパク質をコードする核酸および/またはMinDタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を、野生型と比較して増加させることによって、実施することができる。
【０２６０】
同様に、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする核酸および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸および/またはイソペンテニル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸および/またはゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸および/またはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸および/またはフィトエン合成酵素をコードする核酸および/またはフィトエンデサチュラーゼをコードする核酸および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸および/またはcrtISOタンパク質をコードする核酸および/またはFtsZタンパク質をコードする核酸および/またはMinDタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比較して増加させることは、様々な方法で、例えば、アクチベータによる、HMG-CoA還元酵素遺伝子および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子および/またはゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはフィトエン合成酵素遺伝子および/またはフィトエンデサチュラーゼ遺伝子および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子および/またはcrtISO遺伝子および/またはFtsZ遺伝子および/またはMinD遺伝子の誘導によって実施することができる。あるいは、HMG-CoA還元酵素遺伝子および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子および/またはゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはフィトエン合成酵素遺伝子および/またはフィトエンデサチュラーゼ遺伝子および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子および/またはcrtISO遺伝子および/またはFtsZ遺伝子および/またはMinD遺伝子の1以上のコピーの挿入によって、すなわち、HMG-CoA還元酵素をコードする少なくとも1つの核酸および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする少なくとも1つの核酸および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする少なくとも1つの核酸および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする少なくとも1つの核酸および/またはゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸および/またはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコード��る少なくとも1つの核酸および/またはフィトエン合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸および/またはフィトエンデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの核酸および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの核酸および/またはcrtISOタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸および/またはFtsZタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸および/またはMinDタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を、植物に挿入することによってこれを実施することができる。
【０２６１】
HMG-CoA還元酵素および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼおよび/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼおよび/またはゲラニル二リン酸合成酵素および/またはファルネシル二リン酸合成酵素および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素および/またはフィトエン合成酵素および/またはフィトエンデサチュラーゼおよび/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼおよび/またはcrtISOタンパク質および/またはFtsZタンパク質および/またはMinDタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現の増加は、本発明に従って、生物自身の内因性HMG-CoA還元酵素および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼおよび/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼおよび/またはゲラニル二リン酸合成酵素および/またはファルネシル二リン酸合成酵素および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素および/またはフィトエン合成酵素および/またはフィトエンデサチュラーゼおよび/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼの発現の操作、ならびに/あるいは生物自身のcrtISOタンパク質および/またはFtsZタンパク質および/またはMinDタンパク質の発現の操作をも意味するものと理解される。
【０２６２】
これは例えば、対応のプロモーターDNA配列の改変によって達成することができる。遺伝子の発現率の増加をもたらす前記改変は、例えばDNA配列の欠失または挿入によって実施することができる。
【０２６３】
好ましい実施形態では、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはフィトエン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはフィトエンデサチュラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはcrtISOタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはFtsZタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現の増加および/またはMinDタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現の増加は、植物への、HMG-CoA還元酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはフィトエン合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはフィトエンデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはcrtISOタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはFtsZタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によって、および/またはMinDタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸の挿入によってなされる。
【０２６４】
このために、原則的には任意のHMG-CoA還元酵素遺伝子または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子またはゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子またはファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子またはフィトエン合成酵素遺伝子またはフィトエンデサチュラーゼ遺伝子またはゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子またはcrtISO遺伝子またはFtsZ遺伝子またはMinD遺伝子を用いることができる。
【０２６５】
真核生物源由来のイントロンを含む、HMG-CoA還元酵素のゲノム配列または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素のゲノム配列または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素のゲノム配列または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼのゲノム配列またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼのゲノム配列またはゲラニル二リン酸合成酵素のゲノム配列またはファルネシル二リン酸合成酵素のゲノム配列またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のゲノム配列またはフィトエン合成酵素のゲノム配列またはゼータ-カロテンデサチュラーゼのゲノム配列またはcrtISOのゲノム配列またはFtsZのゲノム配列またはMinDのゲノム配列を用いながら、宿主植物が対応するタンパク質を発現することができないかまたは発現しうるようにできない場合には、対応するcDNA等の既にプロセシングされた核酸配列を用いるべきである。
【０２６６】
本発明による好適なトランスジェニック生物において、この野生型と比較して好適な実施形態では、少なくとも一つの更なるHMG-CoA還元酵素遺伝子および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子および/またはゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子および/またはフィトエン合成酵素遺伝子および/またはフィトエンデサチュラーゼ遺伝子および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子および/またはcrtISO遺伝子および/またはFtsZ遺伝子および/またはMinD遺伝子が存在する。
【０２６７】
この好ましい実施形態では、遺伝子的に改変された植物は、例えばHMG-CoA還元酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはHMG-CoA還元酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/または(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくは(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくは1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/または1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくは1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはファルネシル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはフィトエン合成酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはフィトエン合成酵素をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはフィトエンデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはフィトエンデサチュラーゼをコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはcrtISOタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはcrtISOタンパク質をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはFtsZタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはFtsZタンパク質をコードする少なくとも2つの内因性核酸、および/またはMinDタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸もしくはMinDタンパク質をコードする少なくとも2つの内因性核酸を有する。
【０２６８】
HMG-CoA還元酵素遺伝子の例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のHMG-CoA還元酵素をコードする核酸である登録番号NM_106299（核酸：配列番号7、タンパク質：配列番号8）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のHMG-CoA還元酵素遺伝子である：P54961, P54870, P54868, P54869, O02734, P22791, P54873, P54871, P23228, P13704, P54872, Q01581, P17425, P54874, P54839, P14891, P34135, O64966, P29057, P48019, P48020, P12683, P43256, Q9XEL8, P34136, O64967, P29058, P48022, Q41437, P12684, Q00583, Q9XHL5, Q41438, Q9YAS4, O76819, O28538, Q9Y7D2, P54960, O51628, P48021, Q03163, P00347, P14773, Q12577, Q59468, P04035, O24594, P09610, Q58116, O26662, Q01237, Q01559, Q12649, O74164, O59469, P51639, Q10283, O08424, P20715, P13703, P13702, Q96UG4, Q8SQZ9, O15888, Q9TUM4, P93514, Q39628, P93081, P93080, Q944T9, Q40148, Q84MM0, Q84LS3, Q9Z9N4, Q9KLM0。
【０２６９】
(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子の例は、シロイヌナズナ由来の(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素（lytB/ISPH）をコードする核酸である、登録番号AY168881（核酸：配列番号9、タンパク質：配列番号102）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来の(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子である：T04781, AF270978_1, NP_485028.1, NP_442089.1, NP_681832.1, ZP_00110421.1, ZP_00071594.1, ZP_00114706.1, ISPH_SYNY3, ZP_00114087.1, ZP_00104269.1, AF398145_1, AF398146_1, AAD55762.1, AF514843_1, NP_622970.1, NP_348471.1, NP_562001.1, NP_223698.1, NP_781941.1, ZP_00080042.1, NP_859669.1, NP_214191.1, ZP_00086191.1, ISPH_VIBCH, NP_230334.1, NP_742768.1, NP_302306.1, ISPH_MYCLE, NP_602581.1, ZP_00026966.1, NP_520563.1, NP_253247.1, NP_282047.1, ZP_00038210.1, ZP_00064913.1, CAA61555.1, ZP_00125365.1, ISPH_ACICA, EAA24703.1, ZP_00013067.1, ZP_00029164.1, NP_790656.1, NP_217899.1, NP_641592.1, NP_636532.1, NP_719076.1, NP_660497.1, NP_422155.1, NP_715446.1, ZP_00090692.1, NP_759496.1, ISPH_BURPS, ZP_00129657.1, NP_215626.1, NP_335584.1, ZP_00135016.1, NP_789585.1, NP_787770.1, NP_769647.1, ZP_00043336.1, NP_242248.1, ZP_00008555.1, NP_246603.1, ZP_00030951.1, NP_670994.1, NP_404120.1, NP_540376.1, NP_733653.1, NP_697503.1, NP_840730.1, NP_274828.1, NP_796916.1, ZP_00123390.1, NP_824386.1, NP_737689.1, ZP_00021222.1, NP_757521.1, NP_390395.1, ZP_00133322.1, CAD76178.1, NP_600249.1, NP_454660.1, NP_712601.1, NP_385018.1, NP_751989.1。
【０２７０】
1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素の例は、トマト（Lycopersicon esculentum）由来の1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする核酸である登録番号AF143812（核酸：配列番号103、タンパク質：配列番号12）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来の1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子である：AF143812_1, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF182286_1, NP_193291.1, T52289, AAC49368.1, AAP14353.1, D71420, DXS_ORYSA, AF443590_1, BAB02345.1, CAA09804.2, NP_850620.1, CAD22155.2, AAM65798.1, NP_566686.1, CAD22531.1, AAC33513.1, CAC08458.1, AAG10432.1, T08140, AAP14354.1, AF428463_1, ZP_00010537.1, NP_769291.1, AAK59424.1, NP_107784.1, NP_697464.1, NP_540415.1, NP_196699.1, NP_384986.1, ZP_00096461.1, ZP_00013656.1, NP_353769.1, BAA83576.1, ZP_00005919.1, ZP_00006273.1, NP_420871.1, AAM48660.1, DXS_RHOCA, ZP_00045608.1, ZP_00031686.1, NP_841218.1, ZP_00022174.1, ZP_00086851.1, NP_742690.1, NP_520342.1, ZP_00082120.1, NP_790545.1, ZP_00125266.1, CAC17468.1, NP_252733.1, ZP_00092466.1, NP_439591.1, NP_414954.1, NP_752465.1, NP_622918.1, NP_286162.1, NP_836085.1, NP_706308.1, ZP_00081148.1, NP_797065.1, NP_213598.1, NP_245469.1, ZP_00075029.1, NP_455016.1, NP_230536.1, NP_459417.1, NP_274863.1, NP_283402.1, NP_759318.1, NP_406652.1, DXS_SYNLE, DXS_SYNP7, NP_440409.1, ZP_00067331.1, ZP_00122853.1, NP_717142.1, ZP_00104889.1, NP_243645.1, NP_681412.1, DXS_SYNEL, NP_637787.1, DXS_CHLTE, ZP_00129863.1, NP_661241.1, DXS_XANCP, NP_470738.1, NP_484643.1, ZP_00108360.1, NP_833890.1, NP_846629.1, NP_658213.1, NP_642879.1, ZP_00039479.1, ZP_00060584.1, ZP_00041364.1, ZP_00117779.1, NP_299528.1。
【０２７１】
1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の例は、シロイヌナズナ由来の1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸である登録番号AF148852（核酸：配列番号13、タンパク質：配列番号14）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来の1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子である：AF148852, AY084775, AY054682, AY050802, AY045634, AY081453, AY091405, AY098952, AJ242588, AB009053, AY202991, NP_201085.1, T52570, AF331705_1, BAB16915.1, AF367205_1, AF250235_1, CAC03581.1, CAD22156.1, AF182287_1, DXR_MENPI, ZP_00071219.1, NP_488391.1, ZP_00111307.1, DXR_SYNLE, AAP56260.1, NP_681831.1, NP_442113.1, ZP_00115071.1, ZP_00105106.1, ZP_00113484.1, NP_833540.1, NP_657789.1, NP_661031.1, DXR_BACHD, NP_833080.1, NP_845693.1, NP_562610.1, NP_623020.1, NP_810915.1, NP_243287.1, ZP_00118743.1, NP_464842.1, NP_470690.1, ZP_00082201.1, NP_781898.1, ZP_00123667.1, NP_348420.1, NP_604221.1, ZP_00053349.1, ZP_00064941.1, NP_246927.1, NP_389537.1, ZP_00102576.1, NP_519531.1, AF124757_19, DXR_ZYMMO, NP_713472.1, NP_459225.1, NP_454827.1, ZP_00045738.1, NP_743754.1, DXR_PSEPK, ZP_00130352.1, NP_702530.1, NP_841744.1, NP_438967.1, AF514841_1, NP_706118.1, ZP_00125845.1, NP_404661.1, NP_285867.1, NP_240064.1, NP_414715.1, ZP_00094058.1, NP_791365.1, ZP_00012448.1, ZP_00015132.1, ZP_00091545.1, NP_629822.1, NP_771495.1, NP_798691.1, NP_231885.1, NP_252340.1, ZP_00022353.1, NP_355549.1, NP_420724.1, ZP_00085169.1, EAA17616.1, NP_273242.1, NP_219574.1, NP_387094.1, NP_296721.1, ZP_00004209.1, NP_823739.1, NP_282934.1, BAA77848.1, NP_660577.1, NP_760741.1, NP_641750.1, NP_636741.1, NP_829309.1, NP_298338.1, NP_444964.1, NP_717246.1, NP_224545.1, ZP_00038451.1, DXR_KITGR, NP_778563.1。
【０２７２】
イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子の例は、Cunnningham, F.X.Jr.およびGantt, E.（Identification of multi-gene families encoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologous complementation in Escherichia coli, Plant Cell Physiol. 41 (1), 119-123 (2000)）によって公表されたフクジュソウ（Adonis palaestina）クローンApIPI28(ipiAa1)由来のイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする核酸である登録番号AF188060（核酸：配列番号15、タンパク質：配列番号16）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のイソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子である：Q38929, O48964, Q39472, Q13907, O35586, P58044, O42641, O35760, Q10132, P15496, Q9YB30, Q8YNH4, Q42553, O27997, P50740, O51627, O48965, Q8KFR5, Q39471, Q39664, Q9RVE2, Q01335, Q9HHE4, Q9BXS1, Q9KWF6, Q9CIF5, Q88WB6, Q92BX2, Q8Y7A5, Q8TT35  Q9KK75, Q8NN99, Q8XD58, Q8FE75, Q46822, Q9HP40, P72002, P26173, Q9Z5D3, Q8Z3X9, Q8ZM82, Q9X7Q6, O13504, Q9HFW8, Q8NJL9, Q9UUQ1, Q9NH02, Q9M6K9, Q9M6K5, Q9FXR6, O81691, Q9S7C4, Q8S3L8, Q9M592, Q9M6K3, Q9M6K7, Q9FV48, Q9LLB6, Q9AVJ1, Q9AVG8, Q9M6K6, Q9AVJ5, Q9M6K2, Q9AYS5, Q9M6K8, Q9AVG7, Q8S3L7, Q8W250, Q94IE1, Q9AVI8, Q9AYS6, Q9SAY0, Q9M6K4, Q8GVZ0, Q84RZ8, Q8KZ12, Q8KZ66, Q8FND7, Q88QC9, Q8BFZ6, BAC26382, CAD94476。
【０２７３】
ゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子の例は、シロイヌナズナ由来のゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸である登録番号Y17376（Bouvier, F., Suire, C., d’Harlingue, A., Backhaus, R.A. and Camara, B.; Molecular cloning of geranyl phosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant J. 24 (2), 241-252 (2000)）（核酸：配列番号17、タンパク質：配列番号18）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子である：Q9FT89, Q8LKJ2, Q9FSW8, Q8LKJ3, Q9SBR3, Q9SBR4, Q9FET8, Q8LKJ1, Q84LG1, Q9JK86。
【０２７４】
ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子の例は、Cunillera, N.、Arro, M.、Delourme, D.、Karst, F.、Boronat, A.およびFerrer, A.（Arabidopsis thaliana contains two differentially expressed farnesyl phosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996)）によって公表されたシロイヌナズナ由来のファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸である登録番号U80605（核酸：配列番号19、タンパク質：配列番号112）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子である：P53799, P37268, Q02769, Q09152, P49351, O24241, Q43315, P49352, O24242, P49350, P08836, P14324, P49349, P08524, O66952, Q08291, P54383, Q45220, P57537, Q8K9A0, P22939, P45204, O66126, P55539, Q9SWH9, Q9AVI7, Q9FRX2, Q9AYS7, Q94IE8, Q9FXR9, Q9ZWF6, Q9FXR8, Q9AR37, O50009, Q94IE9,Q8RVK7, Q8RVQ7, O04882, Q93RA8, Q93RB0, Q93RB4, Q93RB5, Q93RB3, Q93RB1, Q93RB2, Q920E5。
【０２７５】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子の例は、Bonk, M.、Hoffmann, B.、Von Lintig, J.、Schledz, M.、Al-Babili, S.、Hobeika, E.、Kleinig, H.およびBeyer, P.（Chloroplast import of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differential fates prior to membrane binding and oligomeric assembly, Eur. J. Biochem. 247 (3), 942-950 (1997)）によって公表されたシロガラシ（Sinaps alba）由来のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸である登録番号X98795（核酸：配列番号21、タンパク質：配列番号114）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子である：P22873, P34802 ,P56966, P80042, Q42698, Q92236, O95749, Q9WTN0, Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3, Q9AYN2, Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4, Q9SXZ5, Q9AVJ7, Q9AYN1, Q9AVJ4, Q9FXR7, Q8LSC5, Q9AVJ6, Q8LSC4, Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6, Q9SST9, Q9AVJ0, Q9AVI9, Q9FRW3, Q9FXR5, Q94IF0, Q9FRX1, Q9K567, Q93RA9, Q93QX8, CAD95619, EAA31459。
【０２７６】
フィトエン合成酵素遺伝子の例は、Misawa, N.、Nakagawa, M.、Kobayashi, K.、Yamano, S.、Izawa, Y.、Nakamura, K.およびHarashima, K.（Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990)）によって公表されたエルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）由来のフィトエン合成酵素をコードする核酸である登録番号D90087（核酸：配列番号23、タンパク質：配列番号24）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のフィトエン合成酵素遺伝子である：CAB39693, BAC69364, AAF10440, CAA45350, BAA20384, AAM72615, BAC09112, CAA48922, P_001091, CAB84588, AAF41518, CAA48155, AAD38051, AAF33237, AAG10427, AAA34187, BAB73532, CAC19567, AAM62787, CAA55391, AAB65697, AAM45379, CAC27383, AAA32836, AAK07735, BAA84763, P_000205, AAB60314, P_001163, P_000718, AAB71428, AAA34153, AAK07734, CAA42969, CAD76176, CAA68575, P_000130, P_001142, CAA47625, CAA85775, BAC14416, CAA79957, BAC76563, P_000242, P_000551, AAL02001, AAK15621, CAB94795, AAA91951, P_000448。
【０２７７】
フィトエンデサチュラーゼ遺伝子の例は、Misawa, N.、Nakagawa, M.、Kobayashi, K.、Yamano, S.、Izawa, Y.、Nakamura, K.およびHarashima, K.（Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990)）によって公表されたエルウィニア・ウレドボラ由来のフィトエンデサチュラーゼをコードする核酸である登録番号D90087（核酸：配列番号25、タンパク質：配列番号26）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子である：AAL15300, A39597, CAA42573, AAK51545, BAB08179, CAA48195, BAB82461, AAK92625, CAA55392, AAG10426, AAD02489, AAO24235, AAC12846, AAA99519, AAL38046, CAA60479, CAA75094, ZP_001041, ZP_001163, CAA39004, CAA44452, ZP_001142, ZP_000718, BAB82462, AAM45380, CAB56040, ZP_001091, BAC09113, AAP79175, AAL80005, AAM72642, AAM72043, ZP_000745, ZP_001141, BAC07889, CAD55814, ZP_001041, CAD27442, CAE00192, ZP_001163, ZP_000197, BAA18400, AAG10425, ZP_001119, AAF13698, 2121278A, AAB35386, AAD02462, BAB68552, CAC85667, AAK51557, CAA12062, AAG51402, AAM63349, AAF85796, BAB74081, AAA91161, CAB56041, AAC48983, AAG14399, CAB65434, BAB73487, ZP_001117, ZP_000448, CAB39695, CAD76175, BAC69363, BAA17934, ZP_000171, AAF65586, ZP_000748, BAC07074, ZP_001133, CAA64853, BAB74484, ZP_001156, AAF23289, AAG28703, AAP09348, AAM71569, BAB69140, ZP_000130, AAF41516, AAG18866, CAD95940, NP_656310, AAG10645, ZP_000276, ZP_000192, ZP_000186, AAM94364, EAA31371, ZP_000612, BAC75676, AAF65582。
【０２７８】
ゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子の例は、Al-Babili, S.、Oelschlegel, J.およびBeyer, P.（A cDNA encoding for beta carotene desaturase (Accession No. AJ224683) from Narcissus pseudonarcissus L.. (PGR98-103), Plant Physiol. 117, 719-719 (1998)）によって公表されたラッパズイセン（Narcissus pseudonarcissus L.）由来のゼータカロテンデサチュラーゼをコードする核酸である登録番号AJ224683（核酸：配列番号119、タンパク質：配列番号28）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のゼータ-カロテンデサチュラーゼである：Q9R6X4, Q38893, Q9SMJ3, Q9SE20, Q9ZTP4, O49901, P74306, Q9FV46, Q9RCT2, ZDS_NARPS, BAB68552.1, CAC85667.1, AF372617_1, ZDS_TARER, CAD55814.1, CAD27442.1, 2121278A, ZDS_CAPAN, ZDS_LYCES, NP_187138.1, AAM63349.1, ZDS_ARATH, AAA91161.1, ZDS_MAIZE, AAG14399.1, NP_441720.1, NP_486422.1, ZP_00111920.1, CAB56041.1, ZP_00074512.1, ZP_00116357.1, NP_681127.1, ZP_00114185.1, ZP_00104126.1, CAB65434.1, NP_662300.1。
【０２７９】
crtISO遺伝子の例は、Isaacson, T.、Ronen, G.、Zamir, D.およびHirschberg, J.（Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls in plants; Plant Cell 14 (2), 333-342 (2002)）によって公表されたトマト由来のcrtISOをコードする核酸である登録番号AF416727（核酸：配列番号29、タンパク質：配列番号122）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のcrtISO遺伝子である：AAM53952。
【０２８０】
FtsZ遺伝子の例は、Moehs, C.P.、Tian, L.、Osteryoung, K.W.およびDellapenna, D.（Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001)）によって公表されたセンジュギク(Tagetes erecta)由来のFtsZをコードする核酸である登録番号AF251346（核酸：配列番号31、タンパク質：配列番号32）、および更に、以下の登録番号を有する他の生物由来のFtsZ遺伝子である：CAB89286.1, AF205858_1, NP_200339.1, CAB89287.1, CAB41987.1, AAA82068.1, T06774, AF383876_1, BAC57986.1, CAD22047.1, BAB91150.1, ZP_00072546.1, NP_440816.1, T51092, NP_683172.1, BAA85116.1, NP_487898.1, JC4289, BAA82871.1, NP_781763.1, BAC57987.1, ZP_00111461.1, T51088, NP_190843.1, ZP_00060035.1, NP_846285.1, AAL07180.1, NP_243424.1, NP_833626.1, AAN04561.1, AAN04557.1, CAD22048.1, T51089, NP_692394.1, NP_623237.1, NP_565839.1, T51090, CAA07676.1, NP_113397.1, T51087, CAC44257.1, E84778, ZP_00105267.1, BAA82091.1, ZP_00112790.1, BAA96782.1, NP_348319.1, NP_471472.1, ZP_00115870.1, NP_465556.1, NP_389412.1, BAA82090.1, NP_562681.1, AAM22891.1, NP_371710.1, NP_764416.1, CAB95028.1, FTSZ_STRGR, AF120117_1, NP_827300.1, JE0282, NP_626341.1, AAC45639.1, NP_785689.1, NP_336679.1, NP_738660.1, ZP_00057764.1, AAC32265.1, NP_814733.1, FTSZ_MYCKA, NP_216666.1, CAA75616.1, NP_301700.1, NP_601357.1, ZP_00046269.1, CAA70158.1, ZP_00037834.1, NP_268026.1, FTSZ_ENTHR, NP_787643.1, NP_346105.1, AAC32264.1, JC5548, AAC95440.1, NP_710793.1, NP_687509.1, NP_269594.1, AAC32266.1, NP_720988.1, NP_657875.1, ZP_00094865.1, ZP_00080499.1, ZP_00043589.1, JC7087, NP_660559.1, AAC46069.1, AF179611_14, AAC44223.1, NP_404201.1。
【０２８１】
MinD遺伝子の例は、Moehs, C.P.、Tian, L.、Osteryoung, K.W.およびDellapenna, D.（Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development; Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001)）によって公表されたセンジュギク由来のMinDをコードする核酸である登録番号AF251019（核酸：配列番号33、タンパク質：配列番号34）、および更に、以下の登録番号を有するMinD遺伝子である：NP_197790.1, BAA90628.1, NP_038435.1, NP_045875.1, AAN33031.1, NP_050910.1, CAB53105.1, NP_050687.1, NP_682807.1, NP_487496.1, ZP_00111708.1, ZP_00071109.1, NP_442592.1, NP_603083.1, NP_782631.1, ZP_00097367.1, ZP_00104319.1, NP_294476.1, NP_622555.1, NP_563054.1, NP_347881.1, ZP_00113908.1, NP_834154.1, NP_658480.1, ZP_00059858.1, NP_470915.1, NP_243893.1, NP_465069.1, ZP_00116155.1, NP_390677.1, NP_692970.1, NP_298610.1, NP_207129.1, ZP_00038874.1, NP_778791.1, NP_223033.1, NP_641561.1, NP_636499.1, ZP_00088714.1, NP_213595.1, NP_743889.1, NP_231594.1, ZP_00085067.1, NP_797252.1, ZP_00136593.1, NP_251934.1, NP_405629.1, NP_759144.1, ZP_00102939.1, NP_793645.1, NP_699517.1, NP_460771.1, NP_860754.1, NP_456322.1, NP_718163.1, NP_229666.1, NP_357356.1, NP_541904.1, NP_287414.1, NP_660660.1, ZP_00128273.1, NP_103411.1, NP_785789.1, NP_715361.1, AF149810_1, NP_841854.1, NP_437893.1, ZP_00022726.1, EAA24844.1, ZP_00029547.1, NP_521484.1, NP_240148.1, NP_770852.1, AF345908_2, NP_777923.1, ZP_00048879.1, NP_579340.1, NP_143455.1, NP_126254.1, NP_142573.1, NP_613505.1, NP_127112.1, NP_712786.1, NP_578214.1, NP_069530.1, NP_247526.1, AAA85593.1, NP_212403.1, NP_782258.1, ZP_00058694.1, NP_247137.1, NP_219149.1, NP_276946.1, NP_614522.1, ZP_00019288.1, CAD78330.1。
【０２８２】
上記の好適な実施形態において、用いるHMG-CoA還元酵素遺伝子が、配列番号8のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号8の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつHMG-CoA還元酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０２８３】
HMG-CoA還元酵素およびHMG-CoA還元酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号8を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０２８４】
HMG-CoA還元酵素およびHMG-CoA還元酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号7の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０２８５】
さらに特定の好適な実施形態において、HMG-CoA還元酵素活性を増加させるために、配列番号8に記載のHMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０２８６】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０２８７】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０２８８】
特に好適な実施形態において、配列番号7の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０２８９】
上述の好適な実施形態において、用いる(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子が、配列番号10のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号10の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつ(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０２９０】
(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素および(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号10を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０２９１】
(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素および(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号9の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０２９２】
さらに特定の好適な実施形態において、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素活性を増加させるために、配列番号10に記載の(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０２９３】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０２９４】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０２９５】
特に好適な実施形態において、配列番号9の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０２９６】
上述の好適な実施形態において、用いる1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子が、配列番号12のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号12の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつ1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０２９７】
1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素および1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号12を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０２９８】
1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素および1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号11の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０２９９】
さらに特定の好適な実施形態において、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素活性を増加させるために、配列番号12に記載の1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３００】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３０１】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３０２】
特に好適な実施形態において、配列番号11の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３０３】
上述の好適な実施形態において、用いる1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子が、配列番号14のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号14の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつ1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３０４】
1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼおよび1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号14を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３０５】
1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼおよび1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号13の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３０６】
さらに特定の好適な実施形態において、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ活性を増加させるために、配列番号14に記載の1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３０７】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３０８】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３０９】
特に好適な実施形態において、配列番号13の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３１０】
上述の好適な実施形態において、用いるイソペンテニル-D-イソメラーゼ遺伝子が、配列番号16のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導され、アミノ酸レベルで配列番号16の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつイソペンテニル-D-イソメラーゼの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３１１】
イソペンテニル-D-イソメラーゼおよびイソペンテニル-D-イソメラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号16を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３１２】
イソペンテニル-D-イソメラーゼおよびイソペンテニル-D-イソメラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号15の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３１３】
さらに特定の好適な実施形態において、イソペンテニル-D-イソメラーゼ活性を増加させるために、配列番号16に記載のイソペンテニル-D-イソメラーゼのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３１４】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３１５】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３１６】
特に好適な実施形態において、配列番号15の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３１７】
上述の好適な実施形態において、用いるゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子が、配列番号18のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号18の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつゲラニル二リン酸合成酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３１８】
ゲラニル二リン酸合成酵素およびゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号18を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３１９】
ゲラニル二リン酸合成酵素およびゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号17の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３２０】
さらに特定の好適な実施形態において、ゲラニル二リン酸合成酵素活性を増加させるために、配列番号18に記載のゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３２１】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３２２】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３２３】
特に好適な実施形態において、配列番号17の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３２４】
上述の好適な実施形態において、用いるファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子が、配列番号20のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号20の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつファルネシル二リン酸合成酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３２５】
ファルネシル二リン酸合成酵素およびファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号20を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３２６】
ファルネシル二リン酸合成酵素およびファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号19の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３２７】
さらに特定の好適な実施形態において、ファルネシル二リン酸合成酵素活性を増加させるために、配列番号20に記載のファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３２８】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３２９】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３３０】
特に好適な実施形態において、配列番号19の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３３１】
上述の好適な実施形態において、用いるゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子が、配列番号22のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号22の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３３２】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号22を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３３３】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号21の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３３４】
さらに特定の好適な実施形態において、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を増加させるために、配列番号22に記載のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３３５】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３３６】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３３７】
特に好適な実施形態において、配列番号21の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３３８】
上述の好適な実施形態において、用いるフィトエン合成酵素遺伝子が、配列番号24のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号24の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつフィトエン合成酵素の酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３３９】
フィトエン合成酵素およびフィトエン合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号24を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３４０】
フィトエン合成酵素およびフィトエン合成酵素遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号23の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３４１】
さらに特定の好適な実施形態において、フィトエン合成酵素活性を増加させるために、配列番号24に記載のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３４２】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３４３】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３４４】
特に好適な実施形態において、配列番号23の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３４５】
上述の好適な実施形態において、用いるフィトエンデサチュラーゼ遺伝子が、配列番号26のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号26の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつフィトエンデサチュラーゼの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３４６】
フィトエンデサチュラーゼおよびフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号26を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３４７】
フィトエンデサチュラーゼおよびフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号25の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３４８】
さらに特定の好適な実施形態において、フィトエンデサチュラーゼ活性を増加させるために、配列番号26に記載のフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３４９】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３５０】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３５１】
特に好適な実施形態において、配列番号25の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３５２】
上述の好適な実施形態において、用いるゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子が、配列番号28のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号28の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつゼータ-カロテンデサチュラーゼの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３５３】
ゼータ-カロテンデサチュラーゼおよびゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号28を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３５４】
ゼータ-カロテンデサチュラーゼおよびゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号119の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３５５】
さらに特定の好適な実施形態において、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性を増加させるために、配列番号28に記載のゼータ-カロテンデサチュラーゼのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３５６】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３５７】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３５８】
特に好適な実施形態において、配列番号119の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３５９】
上述の好適な実施形態において、用いるCrtISO遺伝子が、配列番号30のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号30の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつCrtISOの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３６０】
CrtISOおよびCrtISO遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号30を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３６１】
CrtISOおよびCrtISO遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号29の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３６２】
さらに特定の好適な実施形態において、CrtISO活性を増加させるために、配列番号30に記載のCrtISOのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３６３】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３６４】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３６５】
特に好適な実施形態において、配列番号29の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３６６】
上述の好適な実施形態において、用いるFtsZ遺伝子が、配列番号32のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号32の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつFtsZの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３６７】
FtsZおよびFtsZ遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号32を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３６８】
FtsZおよびFtsZ遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号31の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３６９】
さらに特定の好適な実施形態において、FtsZ活性を増加させるために、配列番号32に記載のFtsZのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３７０】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３７１】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３７２】
特に好適な実施形態において、配列番号31の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３７３】
上述の好適な実施形態において、用いるMinD遺伝子が、配列番号34のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで配列番号34の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、かつMinDの酵素性質を有するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【０３７４】
MinDおよびMinD遺伝子のその他の例は、例えば、上述されるように、配列番号34を含むデータベースからのアミノ酸配列または逆翻訳した対応の核酸配列を相同性比較することによって、ゲノム配列が知られている種々の生物から容易に見出すことができる。
【０３７５】
MinDおよびMinD遺伝子のその他の例は、例えば、ゲノム配列が知られていない種々の生物の配列番号33の配列から出発して、上述されるように、それ自体公知の手法のハイブリダイゼーション技術およびPCR技術によって容易に見出すことができる。
【０３７６】
さらに特定の好適な実施形態において、MinD活性を増加させるために、配列番号34に記載のMinDのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸が生物に挿入される。
【０３７７】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって取得可能である。
【０３７８】
これには、生物特有のコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンが用いられることが好ましい。コドン使用頻度は、興味の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター分析を用いて容易に決定することができる。
【０３７９】
特に好適な実施形態において、配列番号33の配列を含む核酸が生物に挿入される。
【０３８０】
上述した全てのHMG-CoA還元酵素遺伝子、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素遺伝子、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素遺伝子、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子、ゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子、フィトエン合成酵素遺伝子、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ遺伝子、crtISO遺伝子、FtsZ遺伝子またはMinD遺伝子は、それ自体公知の手法でヌクレオチド構造ユニットから化学合成（例えば、二重螺旋の個々の重複した相補的核酸構造ユニットの断片縮合等）によってさらに調製することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホアミダイト法（Voet, Voet, 第2版, Wiley Press New York, 896-897頁）に従って公知の手法で化学合成することができる。合成オリゴヌクレオチドの付加、DNAポリメラーゼのクレノー断片を用いたギャップの充填、連結反応および一般的なクローニング方法は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０３８１】
配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70％の同一性を有する配列を含む、ケトラーゼをコードする核酸、β-水酸化酵素をコードする核酸、β-シクラーゼをコードする核酸、ならびにHMG-CoA還元酵素をコードする核酸、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素をコードする核酸、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする核酸、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする核酸、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、フィトエン合成酵素をコードする核酸、フィトエンデサチュラーゼをコードする核酸、ゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸、crtISOタンパク質をコードする核酸、FtsZタンパク質をコードする核酸、および/またはMinDタンパク質をコードする核酸は、以下で「作用遺伝子」とも称する。
【０３８２】
遺伝子的に改変された非ヒト生物の作製は、下に記載されるように、例えば作用遺伝子を含む個別の核酸構築物（発現カセット）の挿入、あるいは最高2個もしくは3個の作用遺伝子または4個以上の作用遺伝子を含む複数の構築物の挿入によって行うことができる。
【０３８３】
生物は、本発明によれば、好ましくは野生型または出発生物として、自然に、あるいは代謝経路の再調節および/または遺伝的相補によって、カロテノイド、特にβ-カロテンおよび/またはゼアキサンチンおよび/またはネオキサンチンおよび/またはビオラキサンチンおよび/またはルテインを産生することができる生物を意味するものと理解される。
【０３８４】
野生型または出発生物として更に好適な生物は、既に水酸化酵素活性を有しており、その結果、野生型または出発生物としてゼアキサンチンを産生することができる。
【０３８５】
好適な生物は、植物または微生物（例えば細菌、酵母、藻類または真菌等）である。
【０３８６】
用いられる細菌は、例えばエルウィニア（Erwinia）由来のcrt遺伝子を有するエシェリキア（Escherichia）属の細菌等のように、カロテノイド産生生物のカロテノイド生合成の関わる遺伝子の挿入によってキサントフィルを合成することができる細菌、ならびに、例えばエルウィニア属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ノストック属、またはシネコシスチス（cynechocystis）属のシアノバクテリア等のような、キサントフィルを合成することができる細菌の両者であり得る。
【０３８７】
好適な細菌は、大腸菌（Echerichia coli）、エルウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）、エルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）、アグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）PC-1、フラボバクテリウム  エスピーR1534株、シアノバクテリウム  シネコシスチス・エスピーPCC6803、パラコッカス・マーキュシイ（Paracoccus marcusii）またはパラコッカス・カロテネイファシエンス（Paracoccus caroteneifaciens）である。
【０３８８】
好適な酵母は、カンディダ（Candida）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、ピキア（Pichia）またはファフィア（Phaffia）である。特に好適な酵母は、キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）またはファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma）である。
【０３８９】
好適な真菌は、アスペルギウス（Aspergullus）、トリコデルマ（Trichoderma）、アシュビア（Ashbya）、ニューロスポラ（Nuerospora）、ブラケスレア（Blakeslea）、特に、ブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、フィコマイセス（Phycomyces）、フザリウム（Fusarium）、またはIndian Chem. Engr. Section B. Vol. 37, No. 1, 2（1995）第15頁表6に記載される他の真菌である。
【０３９０】
好適な藻類は、例えばヘマトコッカス（Haematococcus）属、フェダクチルム・トリコルナツム（Phaedactylum tricornatum）、ボルボックス（Volvox）属またはデュナリエラ（Dunaliella）属の藻類などの緑藻類である。特に好適な藻類は、ヘマトコッカス・プビアリス（Haematococcus puvialis）またはデュナリエラ・バーダウィル（Dunaliella bardawil）である。
【０３９１】
本発明の方法を実施するのに利用可能な更なる微生物およびその作製は、例えば本明細書で参照とされるDE-A-199 16 140から公知である。
【０３９２】
特に好適な植物は、ヒユ科（Amaranthaceae）、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）、キョウチクトウ科（Apocynaceae）、キク科（Asteraceae）、ツリフネソウ科（Balsaminaceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、メギ科（Berberidaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、アサ科（Cannabaceae）、スイカズラ科（Caprifoliaceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、アカザ科（Cannabaceae）、キク科（Compositae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、アブラナ科（Cruciferae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、マメ科（Fabaceae）、リンドウ科（Gentianaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、イネ科（Graminae）、モクレン科（Illiaceae）、シソ科（Labiatae）、シソ科（Lamiaceae）、マメ科（Leguminosae）、ユリ科（Liliaceae）、アマ科（Linaceae）、ミゾカクシ科（Lobeliaceae）、アオイ科（Malvaceae）、モクセイ科（Oleaceae）、ラン科（Orchidaceae）、ケシ科（Papaveraceae）、イソマツ科（Plumbaginaceae）、イネ科(Poaceae)、ハナシノブ科（Polemoniaceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、キンポウゲ科（Ranunculaceae）、バラ科（Rosaceae）、アカネ科（Rubiaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、ナス科（Solanaceae）、ノウゼンハレン科（Tropaeolaceae）、セリ科（Umbelliferae）、クマツヅラ科（Verbanaceae）、ブドウ科（Vitaceae）またはスミレ科（Violaceae）から選択される植物である。
【０３９３】
極めて好適な植物は、以下の植物属：マリーゴールド属（Marigold）、タゲテス・エレクタ（Tagetes erecta）、クジャクソウ（Tagetes patula）、アカシア属（Acacia）、トリカブト属（Aconitum）、フクジュソウ属（Adonis）、ウサギギク属（Arnica）、オダマキ属（Aqulegia）、アスター属（Aster）、ゲンゲ属（Astragalus）、ツリガネカズラ属（Bignonia）、キンセンカ属（Calendula）、リュウキンカ属（Caltha）、ホタルブクロ属（Campanula）、カンナ属（Canna）、ヤグルマギク属（Centaurea）、ニオイアラセイトウ属（Cheiranthus）、キク属（Chrysanthemum）、ミカン属（Citrus）、フタマタタンポポ属（Crepis）、クロッカス属（Crocus）、カボチャ属（Curcurbita）、エニシダ属（Cytisus）、デロニア属（Delonia）、オオヒエンソウ属（Delphinium）、ナデシコ属（Dianthus）、アフリカキンセンカ属（Dimorphotheca）、ドロニクム属（Doronicum）、ハナビシソウ属（Eschscholtzia）、レンギョウ属（Forsythia）、カイエンナッツ属（Fremontia）、ガザニア属（Gazania）、ゲルセミウム属（Gelsemium）、ゲニスタ属（Genista）、リンドウ属（Gentiana）、ゼラニウム属（Geranium）、ガーベラ属（Gerbera）、ダイコンソウ属（Geum）、グレビレア属（Grevillea）、マルバナハシャギク属（Helenium）、ヒマワリ属（Helianthus）、ミスミソウ属（Hepatica）、ハナウド属（Heracleum）、ハイビスカス属（Hisbiscus）、キクイモモドキ属（Heliopsis）、オトギリソウ属（Hypericum）、オオゴンソウ属（Hypochoeris）、ツリフネソウ属（Impatiens）、アヤメ属（Iris）、ジャカランダ属（Jacaranda）、ヤマブキ属（Kerria）、キングサリ属（Laburnum）、レンリソウ属（Lathyrus）、センボンヤリ属（Leontodon）、ユリ属（Lilium）、アマ属（Linum）、ミヤコグサ属（Lotus）、トマト属（Lycopersicon）、オカトラノオ属（Lysimachia）、ロウバイ属（Maratia）、ウマゴヤシ属（Medicago）、ミゾホオズキ属（Mimulus）、スイセン属（Narcissus）、マツヨイグサ属（Oenothera）、モクセイ属（Osmanthus）、ペチュニア属（Petunia）、カナメモチ属（Photinia）、ホオズキ属（Physalis）、フィテウマ属（Phyteuma）、キジムシロ属（Potentilla）、トキワサンザシ属（Pyracantha）、キンポウゲ属（Ranunculus）、ツツジ属（Rhododendron）、バラ属（Rosa）、オオハンゴンソウ属（Rudbeckia）、セネキオ属（Senecio）、マンテマ属（Silene）、メナモミ属（Silphium）、シロガラシ属（Sinapsis）、ナナカマド属（Sorbus）、レダマ属（Spartium）、テコマ属（Tecoma）、トレニア属（Torenia）、バラモンジン属（Tragopogon）、キンバイソウ属（Trollius）、ノウゼンハレン属（Tropaeolum）、チューリップ属（Tulipa）、フキタンポポ属（Tussilago）、ハリエニシダ属（Ulex）、スミレ属（Viola）またはジニア属（Zinnia）よりなる群から選択され、特に、マリーゴールド属、タゲテス・エレクタ、クジャクソウ、トマト属、バラ属、キンセンカ属、ホオズキ属、ウマゴヤシ属、ヒマワリ属、キク属、アスター属、チューリップ属、スイセン属、ペチュニア属、ゼラニウム属、ノウゼンハレン属またはフクジュソウ属よりなる群から選択されることが好ましい。
【０３９４】
本発明の方法では、ケトカロテノイドの製造のために、生物の回収および好ましくは該生物からのさらなるケトカロテノイドの単離が、遺伝子的に改変された生物の培養工程の後に続く。
【０３９５】
生物の回収は、各生物に応じたそれ自体公知の手法で実施される。液体栄養培地中での醗酵によって培養される細菌、酵母、藻類または真菌等の微生物あるいは植物細胞は、例えば、遠心分離するか、デカントするかまたは濾過することによって分離することができる。植物はそれ自体公知の手法で栄養培地上で生育され、同様に回収される。
【０３９６】
遺伝子的に改変された微生物の培養は、酸素の存在下、少なくとも約20℃の培養温度（例えば20℃〜40℃など）で、かつ約6〜9のpHで実施されることが好ましい。遺伝子改変した微生物の場合、十分な細胞密度が得られるまで、微生物の培養が、最初に酸素の存在下、複合培地（例えばTBまたはLB培地等）中、約20℃以上の培養温度で、かつ約6〜9のpHで行われることが好ましい。酸化反応をより良く制御することを可能にするために誘導性プロモーターを使用することが好ましい。培養は、ケトラーゼ発現の誘導後、酸素の存在下で12時間〜3日間続けられる。
【０３９７】
回収した生物資源からのケトカロテノイドの単離は、それ自体公知の手法、例えば抽出、および適切な場合にはさらに化学的または物理的精製処理（例えば、沈殿法、結晶学、熱分離処理等、例えば精留処理または物理的分離処理等、例えばクロマトグラフィー等）によって実施される。
【０３９８】
下記のように、ケトカロテノイドは本発明に従って遺伝子改変された植物中で、好ましくは例えば、種子、葉、果実、花などの様々な植物組織、特に花葉で特異的に産生され得る。
【０３９９】
収穫した花葉からのケトカロテノイドの単離は、それ自体公知の手法、例えば乾燥およびその後の抽出、ならびに適切な場合にはさらに化学的または物理的精製処理（例えば、沈殿法、結晶学、熱分離処理等、例えば精留処理または物理的分離処理等、例えばクロマトグラフィー等）によって実施される。花葉からのケトカロテノイドの単離は、例えば、好ましくはアセトン、ヘキサン、エーテルまたは第3級メチルブチルエーテル等の有機溶媒によって実施される。
【０４００】
特に花葉からの、ケトカロテノイドの単離における別の方法が、例えばEggerおよびKleinig(Phytochemistry (1967) 6, 437-440)ならびにEgger (Phytochemistry (1965) 4, 609-618)に記載されている。
【０４０１】
ケトカロテノイドが、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、アドニルビンおよびアドニキサンチンよりなる群から選択されることが好ましい。
【０４０２】
特に好適なケトカロテノイドはアスタキサンチンである。
【０４０３】
用いられる生物に応じて、ケトカロテノイドは遊離形態で、あるいは脂肪酸エステルまたはジグルコシドとして得られる。
【０４０４】
本発明による方法で、ケトカロテノイドは、植物の花葉において、脂肪酸とのモノエステルまたはジエステルの形態で得られる。検出されたいくつかの脂肪酸は、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸およびラウリン酸である（KamataおよびSimpson (1987) Comp. Biochem. Physiol. Vol. 86B(3), 587-591）。
【０４０５】
ケトカロテノイドの産生は、植物全体、あるいは好適な実施形態では特に有色体を含む植物組織中で生じ得る。好適な植物組織は、例えば根、種子、葉、果実、花、ならびに特に花弁とも呼ばれる花葉および蜜線である。
【０４０６】
本発明による方法の特に好適な実施形態では、花でケトラーゼを最も高率で発現する遺伝子改変植物が用いられる。
【０４０７】
これが花特異的プロモーターの制御下で生じるケトラーゼの遺伝子発現によってなされることが好ましい。例えばこのために、上述される核酸が植物における花特異的プロモーターと機能的に連結した核酸構築物中に下記で詳述されるように挿入される。
【０４０８】
本発明の方法のさらに特に好適な実施形態では、果実でケトラーゼを最も高率で発現する遺伝子改変植物が用いられる。
【０４０９】
これが果実特異的プロモーターの制御下で生じるケトラーゼの遺伝子発現によってなされることが好ましい。例えばこのために、上述される核酸が植物における果実特異的プロモーターと機能的に連結された核酸構築物中に下記で詳述されるように挿入される。
【０４１０】
本発明の方法のさらに特に好適な実施形態では、種子でケトラーゼを最も高率で発現する遺伝子改変植物が用いられる。
【０４１１】
これが種子特異的プロモーターの制御下で生じるケトラーゼの遺伝子発現によってなされることが好ましい。例えばこのために、上述される核酸が植物における種子特異的プロモーターと機能的に連結した核酸中に下記で詳述されるように挿入される。
【０４１２】
有色体への標的化は機能的に連結した有色体輸送ペプチドによって行われる。
【０４１３】
以下、一例として、ケトラーゼ活性が増加したかまたは生じた遺伝子改変植物ならびにβ-シクラーゼ活性が増加したかまたは生じた遺伝子改変植物の生産が記載される。β-シクラーゼ活性の改変は、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70％の同一性を有する配列、を含んでなるβ-シクラーゼによって引起される。
【０４１４】
例えば、水酸化酵素活性、HMG-CoA還元酵素活性、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エニル二リン酸還元酵素活性、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素活性、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ活性、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ活性、ゲラニル二リン酸合成酵素活性、ファルネシル二リン酸合成酵素活性、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性、フィトエン合成酵素活性、フィトエンデサチュラーゼ活性、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性、crtISO活性、FtsZ活性および/またはMinD活性などのさらなる活性の増加は、対応する作用遺伝子を用いて同様に実施することができる。
【０４１５】
遺伝子改変を組合せて、個別にまたは複数の構築物によって形質転換を行うことができる。
【０４１６】
トランスジェニック植物の生産は、ケトラーゼをコードするおよびβ-シクラーゼをコードする上記の核酸を含み、植物中での転写および翻訳を保証する1以上の調節シグナルと機能的に連結されている核酸構築物を用いた出発植物の形質転換によって行われることが好ましい。その際、前記核酸は配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入または欠失によってこの配列から誘導される、配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70％の同一性を有する配列をコードするものである。
【０４１７】
あるいは、トランスジェニック植物の生産が、2つの核酸構築物を用いた出発植物の形質転換によって実施されることが好ましい。第1の核酸構築物は、植物中での転写および翻訳を保証する1以上の調節シグナルと機能的に連結されているケトラーゼをコードする上述の核酸の少なくとも１つを含む。第2の核酸構築物は、植物内での転写および翻訳を保証する1以上の調節シグナルと機能的に連結されているβ-シクラーゼをコードする上述の核酸の少なくとも1つを含み、該核酸は、配列番号2のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入または欠失によってこの配列から誘導される、配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70％の同一性を有する配列をコードするものである。
【０４１８】
作用遺伝子が植物内での転写および翻訳を保証する調節シグナルの1以上と機能的に連結されているこれらの核酸構築物は、以下で発現カセットとも称される。
【０４１９】
調節シグナルが植物内での転写および翻訳を保証するプロモーターの1以上を含むことが好ましい。
【０４２０】
発現カセットは調節シグナル、すなわち宿主細胞内での作用遺伝子の発現を制御する調節核酸配列を含む。好適な実施形態によれば、発現カセットは上流（すなわちコード配列の5’末端）にプロモーターを含み、下流（すなわち3’末端）にポリアデニル化シグナルを含み、かつ適切な場合には、その間に位置する作用遺伝子のコード配列と共に上述の遺伝子の少なくとも1つと機能しうる形で連結しているさらなる調節要素を含む。機能しうる形の連結とは、コード配列の発現においてプロモーター、コード配列、ターミネーターおよび適切な場合には別の調節要素が意図されるようにその機能を発揮することができるような、各調節要素の一連の配置を意味するものと理解される。
【０４２１】
以下、植物用の好適な核酸構築物、発現カセットおよびベクター、トランスジェニック植物を生産する方法、ならびにトランスジェニック植物自体が例示目的で記載される。
【０４２２】
機能しうる形の連結に好ましい配列は、以下のものに限定されるものではないが、アポプラスト中、液胞中、色素体中、ミトコンドリア中、小胞体（ER）中、細胞核中、脂肪体中または他のコンパートメント中での細胞下局在化を保証するための標的配列、ならびにタバコモザイクウイルス由来の5’ガイド配列等（Gallieら, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711）の他の翻訳エンハンサーである。
【０４２３】
発現カセットのプロモーターとして、原則的には植物内での外来遺伝子の発現を制御することができる任意のプロモーターが適切である。
【０４２４】
「構成性」プロモーターは、多数の、好ましくは全ての組織中で、植物の発生の間比較的長期間にわたって、好ましくは植物の発生の間常に、発現を保証するプロモーターを意味する。
【０４２５】
特に植物プロモーターまたは植物ウイルスが起源であるプロモーターを用いることが好ましい。特に、好適なプロモーターはCaMVカリフラワーモザイクウイルスの35S転写産物（Franckら(1980) Cell 21:285-294; Odellら(1985) Nature 313:810-812; Shewmakerら(1985) Virology 140:281-288; Gardnerら(1986) Plant Mol Biol 6:221-228）、19S CaMVプロモーター（US 5,352,605; WO 84/02913; Benfeyら(1989) EMBO J 8:2195-2202）、シロイヌナズナ由来のトリオースリン酸輸送体（TPT）プロモーター（登録番号AB006698、塩基対53242〜55281）（bp 55282からはじめるこの遺伝子は、「リン酸/トリオースリン酸輸送体」またはゴマノハグサモザイクウイルス由来の34Sプロモーター（登録番号X16673、塩基対1〜554）によって注釈される）のものである。
【０４２６】
他の適当な構成性プロモーターはpdsプロモーター（Peckerら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 4962-4966）または「ルビスコ小サブユニット（SSU）」プロモーター（US 4,962,028）、レグミンBプロモーター（GenBank 登録番号X03677）、アグロバクテリウム由来のノパリン合成酵素のプロモーター、TRダブルプロモーター、アグロバクテリウム由来のOCS（オクトピン合成酵素）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorf Sら(1995) Plant Mol Biol 29:637-649）、ユビキチン1プロモーター（Christensenら(1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruceら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696）、Smasプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（US 5,683,439）、コムギ由来の液胞ATPアーゼサブユニットのプロモーターまたはプロリンリッチタンパク質のプロモーター（WO 91/13991）、Pnitプロモーター（Y07648.L, Hillebrandら(1998), Plant. Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrandら(1996), Gene, 170, 197-200）および植物内でのその構成性発現が当業者に知られている遺伝子の別のプロモーターである。
【０４２７】
発現カセットは、植物中での作用遺伝子の発現を特定の場所で適時に調節することができる化学的に誘導可能なプロモーター（概説論文: Gatzら(1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108）を含み得る。このタイプのプロモーター、例えばPRP1プロモーター（Wardら(1993) Plant Mol Biol 22:361-366）、サリチル酸によって誘導可能なプロモーター（WO 95/19443）、ベンゼンスルホンアミドによって誘導可能なプロモーター（EP 0 388 186）、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーター（Gatzら(1992) Plant J 2:397-404）、アブシジン酸によって誘導可能なプロモーター（EP 0 335 528）またはエタノールもしくはシクロヘキサノンによって誘導可能なプロモーター（WO 93/21334）等を同様に用いることができる。
【０４２８】
さらに、例えば、PRP1遺伝子の病原体誘導性プロモーター（Wardら(1993) Plant Mol Biol  22:361-366）、トマト由来の熱誘導性hsp70またはhsp80プロモーター（US 5,187,267）、ジャガイモ由来の低温誘導性α-アミラーゼプロモーター（WO 96/12814）、光誘導性PPDKプロモーターまたは損傷誘導性pinIIプロモーター（EP375091）などの、生物ストレスまたは無生物ストレスによって誘導されるプロモーターが好ましい。
【０４２９】
病原体誘導性プロモーターには、病原体の攻撃の結果として誘導される遺伝子、例えばPRタンパク質、SARタンパク質、b-1,3-グルカナーゼ、キチナーゼ等の遺伝子のプロモーターが含まれる（例えば、Redolfiら(1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknesら(1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineauら(1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Mattonら(1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssichら(1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssichら(1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chenら(1996) Plant J 10:955-966; ZhangおよびSing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warnerら(1993) Plant J 3:191-201; Siebertzら(1989) Plant Cell 1:961-968(1989)）。
【０４３０】
また損傷誘導性プロモーターには、pinII遺伝子（Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duanら(1996) Nat Biotech 14:494-498）、wun1およびwun2遺伝子（US 5,428,148）、win1およびwin2遺伝子（Stanfordら(1989) Mol Gen Genet 215:200-208）、システミン遺伝子（McGurlら(1992) Science 225:1570-1573）、WIP1遺伝子（Rohmeierら(1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Ekelkampら(1993) FEBS Letters 323:73-76）、MPI遺伝子（Corderokら(1994) The Plant J 6(2):141-150）等のプロモーターが含まれる。
【０４３１】
さらに適当なプロモーターは、例えば果実熟成特異的プロモーター（例えばトマト由来の果実熟成特異的プロモーター（WO 94/21794, EP 409 625）等）等である。発生依存型プロモーターは、その一部として、組織特異的プロモーターを含む。これは、個々の組織の形成は本来的に発生依存的な様式で起こるからである。
【０４３２】
さらに、例えばカロテノイドまたはその前駆体の生合成が生じる組織または植物の一部での発現を確実にするプロモーターが特に好ましい。好適なプロモーターは、例えば葯、子房、花弁、萼片、花、葉、茎、種子および根ならびにその組合せに対して特異的なプロモーターである。
【０４３３】
球根または塊茎、貯蔵根または根特異的プロモーターは、例えばジャガイモ由来のパタチンプロモータークラスI（B33）またはカテプシンDインヒビターのプロモーターである。
【０４３４】
葉特異的プロモーターは、例えばジャガイモ由来のサイトゾルFBPアーゼのプロモーター（WO 97/05900）、ルビスコ（リブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ）のSSUプロモーター（小サブユニット）またはジャガイモ由来のST-LSIプロモーター（Stockhausら(1989) EMBO J 8:2445-2451）である。
【０４３５】
花特異的プロモーターは、例えばフィトエン合成酵素プロモーター（WO 92/16635）またはP-rr遺伝子のプロモーター（WO 98/22593）、シロイヌナズナ由来のAP3プロモーター、CHRCプロモーター（ククミス・サティバス（Cucumis sativus）由来の有色体特異的カロテノイド関連タンパク質(CHRC)遺伝子プロモーター、登録番号AF099501、塩基対1〜1532）、EPSP_合成酵素プロモーター（ペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida）由来の5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素プロモーター、登録番号M37029、塩基対1〜1788）、PDSプロモーター（ソラヌム・リコペルシクム（Solanum lycopersicum）由来のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子プロモーター）、登録番号U46919、塩基対1〜2078）、DFR-Aプロモーター（ぺチュニア・ハイブリダ由来のジヒドロフラボノール4還元酵素遺伝子Aプロモーター、登録番号X79723、塩基対32〜1902）またはFBP1プロモーター（ペチュニア・ハイブリダ由来の花結合タンパク質1遺伝子プロモーター、登録番号L10115、塩基対52〜1069）である。
【０４３６】
葯特異的プロモーターは、例えば5126プロモーター（US 5,689,049、US 5,689,051）、glob-lプロモーターまたはg-zeinプロモーターである。
【０４３７】
種子特異的プロモーターは、例えば、ACP05プロモーター（アシルキャリアタンパク質遺伝子、WO 9218634）、アラビドプシス由来のプロモーターAtS1およびAtS3（WO 9920775）、ソラマメ（Vicia faba）由来のLeB4プロモーター（WO 9729200およびUS 06403371）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のナピンプロモーター（US 5608152；EP 255378；US 5420034）、ソラマメ由来のSBPプロモーター（DE 9903432）またはトウモロコシプロモーターEnd1およびEnd2（WO 0011177）である。
【０４３８】
植物内での発現に適切な別のプロモーターはRogersら(1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardlら(1987) Gene 61:1-11およびBergerら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406に記載されている。
【０４３９】
本発明による方法においては、構成的、種子特異的、果実特異的、花特異的及び特に花弁特異的なプロモーターが特に好ましい。
【０４４０】
発現カセットの作成は、通常の組換え技法及びクローニング技法に従って、好ましくは適切なプロモーターと少なくとも1種の前記作用遺伝子との融合、並びに好ましくはプロモーターと核酸配列との間に挿入された核酸との融合によって行われ、ここで該核酸は、色素体特異的輸送ペプチド及びポリアデニル化シグナルをコードする。上記の発現カセットの作成については、例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載され、またT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) 及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)にも記載されている。
【０４４１】
色素体輸送ペプチドをコードする好適に挿入された核酸は、色素体中の局在を保証し、特に有色体中における局在を保証する。
【０４４２】
核酸配列が作用遺伝子産物の融合タンパク質をコードする発現カセットもまた、用いることができ、ここで該融合タンパク質の一部はポリペプチドの移行を制御する輸送ペプチドである。有色体に特異的な輸送ペプチドが好ましく、このペプチドは、有色体中で該作用遺伝子が移行した後、作用遺伝子産物の一部から酵素的に除去される。
【０４４３】
特に、前記輸送ペプチドは、色素体ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）トランスケトラーゼ又は別の輸送ペプチド（例えば、ルビスコ（rbcS）の小サブユニットの輸送ペプチドもしくはフェレドキシンNADPオキシドレダクターゼ及びイソペンテニル二リン酸塩イソメラーゼ-2の輸送ペプチド）もしくはその機能的同等物に由来することが好ましい。
【０４４４】
Ncol切断部位中にATGコドンを有するKpnI/BamHIフラグメントとしてタバコの色素体トランスケトラーゼの色素体輸送ペプチドにある、3つの読み枠中に存在する3カセットの核酸配列は、好ましくは以下の核酸配列である。
【０４４５】
pTP09
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHI
pTP10
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHI
pTP11
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI
色素体輸送ペプチドのさらなる例として、アラビトプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）に由来する色素体イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ-2（IPP-2）の輸送ペプチド及びエンドウ（pea）に由来するリブロース二リン酸カルボキシラーゼ（rbcS）の小サブユニットの輸送ペプチド(Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts. Nucl. Acids Res. 16: 11380)が挙げられる。
【０４４６】
本発明の核酸は合成的に作成し、もしくは自然に取得し又は合成及び自然の核酸構成物質の混合物を含むことが可能であり、該核酸は様々な生物の様々な異種遺伝子部分からなることが可能である。
【０４４７】
上述のとおり、好ましくは植物に由来する、コドンを有する合成ヌクレオチド配列が望ましい。植物に由来するこれらの好適なコドンは、最も関心のある植物種中で発現している最高のタンパク質頻度（protein frequency）を有するコドンから同定することが可能である。
【０４４８】
発現カセットの作成において、ヌクレオチド配列を取得するために様々なDNAフラグメントを操作することが可能であり、該ヌクレオチド配列は、便宜上正しい方向に読まれ、正しい読み枠を備えている。DNAフラグメント相互の結合のため、該フラグメントにアダプター又はリンカーを付加することができる。
【０４４９】
便宜上、前記プロモーター領域及びターミネーター領域は、この配列への挿入を行うための1つ又はそれ以上の制限部位を含むリンカー又はポリリンカーを転写方向に提供されることが可能である。一般的に、該リンカーは1から10、通常1から8、好ましくは2から6の制限部位を有する。一般に、該リンカーは調節領域内で、100bp以下、多くの場合60bp以下であるが少なくとも5bpの大きさを有する。該プロモーターは、宿主植物に対して天然もしくは同種、又は外来もしくは異種のいずれであってもよい。発現カセットは、好ましくは５’- ３’転写方向に該プロモーター、コーディング核酸配列又は核酸構築物及び転写終結領域を含む。様々な終結領域は任意に、相互に交換することができる。
【０４５０】
ターミネーターの例として、以下のものが挙げられる。35Sターミネーター (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res. 16: 11380)、nosターミネーター(Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1982;1(6):561-73)又はocsターミネーター(Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, van Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J. 3: 835-846)。
【０４５１】
さらに、適切な制限切断部位を利用することができるようにさせ、又は不要なDNA    もしくは制限切断部位を除去する操作を用いることができる。例えば転位及びトランスバージョンなどの挿入、欠失又は置換が可能である場合、in vitro突然変異誘発、「プライマー修復」、制限又は連結（ライゲーション）を用いることが可能である。
【０４５２】
例えば、制限、「チューイング・バック」、又は「平滑末端」とするための突出部の充填などの適切な操作を用いて、ライゲーションに利用することが可能なフラグメントの相補末端を作成することができる。
【０４５３】
好適なポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナルであり、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に由来するT-DNAポリアデニル化シグナル、特にTiプラスミドpTiACH5（Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff）のT-DNAの遺伝子3（オクトピン合成酵素）又はその機能的同等物に本質的に対応する植物のポリアデニル化シグナルである。
【０４５４】
外来遺伝子の植物ゲノムへの移入は、形質転換と呼ばれる。
【０４５５】
この目的を達するため、形質転換及び植物組織又は植物細胞からの植物の形質転換及び再生のためにそれ自体周知な方法を、転移又は安定な形質転換のために利用することができる。
【０４５６】
植物の形質転換のための適切な方法としては、ポリエチレングリコールで誘導されたDNAの取り込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃を使用した微粒子銃法-「パーティクルボンバートメント」法、エレクトロポレーション、DNAを含む溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション及び上記の、アグロバクテリウムが介在する遺伝子移入がある。上記のプロセスは、例えばB. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 及び Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)に記載されている。
【０４５７】
好ましくは、発現される構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換に適したベクター、例えばpBin19（Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711）又は特に好ましくは、pSUN2、pSUN3、pSUN4 又はpSUN5 (WO 02/00900)にクローン化される。
【０４５８】
発現プラスミドを用いて形質転換されたアグロバクテリウムは、植物の形質転換のための周知の方法で使用することができる。例えば、傷をつけられた葉又は葉の一片をアグロバクテリウムの溶液に浸し、その後適切な培地中で培養する方法がある。
【０４５９】
下記でトランスジェニック植物とも呼ばれる遺伝子的に改変を行った植物の好適な作出のために、融合発現カセットがベクター中にクローン化される。該ベクターには、例えばpBin19又は、特にpSUN5及びpSUN3があり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）への形質転換に適している。そのようなベクターを用いて形質転換されたアグロバクテリウムは、その後植物、特に作物の形質転換のための周知の方法で用いることが可能である。例えば、傷をつけられた葉又は葉の一片をアグロバクテリウムの溶液に浸し、その後適切な培地中で培養する方法がある。
【０４６０】
アグロバクテリウムによる植物の形質転換は、特にF.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp.15-38から周知である。該傷をつけられた葉又は葉の一片の形質転換された細胞から、周知の方法でトランスジェニック植物を再生することが可能であり、該トランスジェニック植物は発現カセットに組み込まれた1つ又はそれ以上の遺伝子を含む。
【０４６１】
本発明による作用遺伝子を1つ又はそれ以上用いた宿主植物の形質転換のために、発現カセットは、挿入として組換えベクターに組み込まれ、ここで該ベクターDNAは、例えば複製のための配列又は組込みのための配列などの付加的な機能調節シグナルを含む。適切なベクターについては、特にMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, pp.71-119 (1993)に記載されている。
【０４６２】
上述の組換え技法及びクローニング技法を用いて、発現カセットを適当なベクターにクローン化することができる。該クローン化によって、例えば大腸菌中における発現カセットの増殖が可能となる。適切なクローニングベクターは、特にpJIT117 (Guerineau et al. (1988) Nucl. Acids Res.16:11380)、pBR332、pUCシリーズ、M13mp シリーズ及びpACYC184である。特に適切なベクターは、大腸菌中でもアグロバクテリウム中でも複製することができるバイナリベクターである。
【０４６３】
例として、増大したケトラーゼ活性又は引き起こされたケトラーゼ活性及び増大したβ-シクラーゼ活性又は引き起こされたβ-シクラーゼ活性を有する、本発明による遺伝子改変した微生物の産出について、下記により詳細に記載される。該改変β-シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、又はアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2とアミノ酸レベルで少なくとも70％の同一性を有する配列を含む、β-シクラーゼによって生じる。
【０４６４】
増大する更なる活性には、例として以下の活性が挙げられる。すなわち、水酸化酵素活性、HMG-CoA還元酵素活性、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エチル二リン酸還元酵素活性、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素活性、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ活性、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ活性、ゲラニル二リン酸合成酵素活性、ファルネシル二リン酸合成酵素活性、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性、フィトエン合成酵素活性、フィトエンデサチュラーゼ活性、ゼタ-カロテンデサチュラーゼ活性、crtISO活性、FtsZ活性及び/又はMinD活性である。これらの活性は、対応する作用遺伝子を用いて同じように増加させることができる。
【０４６５】
ケトラーゼ、β-水酸化酵素又はβ-シクラーゼをコードする上述の核酸、及びHMG-CoA還元酵素をコードする核酸、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エチル二リン酸還元酵素をコードする核酸、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素をコードする核酸、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼをコードする核酸、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする核酸、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸、フィトエン合成酵素をコードする核酸、フィトエンデサチュラーゼをコードする核酸、ゼータ-カロテンデサチュラーゼをコードする核酸、crtISOタンパク質をコードする核酸、FtsZタンパク質をコードする核酸及び/又はMinDタンパク質をコードする核酸は、好ましくは、調節核酸配列の遺伝子調節下において、本発明による酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物、及び少なくとも1つのこれらの発現構築物を含むベクターに挿入される。
【０４６６】
好ましくは、本発明による構築物は、各々のコーディング配列から５’上流にプロモーターを、３’下流にターミネーター配列を含み、適当であれば、更に通常の調節要素を含む。すなわち、各々の場合、該構築物は、作用遺伝子に機能しうる形で結合されている。「機能しうる形での結合」は、プロモーター、コーディング配列（作用遺伝子）、ターミネーター及び、適当であれば、さらなる調節要素の連続的配置を意味すると理解される。この場合、各々の調節要素は、目的のコーディング配列の発現においてその機能を果たすことができる。
【０４６７】
機能しうる形で結合できる配列の例としては、標的配列及び翻訳エンハンサー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。さらなる調節要素は、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。
【０４６８】
人工的な調節配列に加えて、実際の作用遺伝子の前に天然の調節配列がさらに存在することができる。遺伝子改変によって、この自然調節は、適当であれば、スイッチを切られることが可能であり、該遺伝子の発現は増加又は減少する。しかし、該遺伝子構築物は、さらにより単純な構築物にすることも可能である。すなわち、付加的な調節シグナルは構造遺伝子の前に挿入されず、またその遺伝子を調節する天然のプロモーターは除去されない。この代わりに、天然の調節配列は変異され、もはや調節は起こらず、遺伝子の発現が増加又は減少する。該核酸配列は、該遺伝子構築物の1つ又はそれ以上のコピーに含めることができる。
【０４６９】
微生物中で利用可能なプロモーターの例として、以下のもの：cos-、 tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、 trc-、ara-、SP6-、ラムダ-PL-、ラムダ-PR-プロモーターが挙げられる。これらは、グラム陰性菌中で有効に用いられる。グラム陽性菌のプロモーターとしてamy及びSPO2、又は酵母のプロモーターとしてADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDHが挙げられる。例えばlight-などの誘導プロモーターの使用が特に好ましく、特にPrPlプロモーターなどの温度誘導性プロモーターが好ましい。
【０４７０】
原理上は、調節配列を有する全ての天然のプロモーターを用いることができる。さらに、合成プロモーターもまた有効に用いることができる。
【０４７１】
前記調節配列は、核酸配列及びタンパク質発現の選択的発現を可能としなければならない。これは例えば、宿主生物に依存して、遺伝子が誘導の後にのみ発現又は過剰発現すること、又は該遺伝子が速やかに発現及び/又は過剰発現することを意味することができる。
【０４７２】
この場合、調節配列又は因子は、好ましくは発現を確実に促し、これによって発現を増加させ又は減少させる。従って、調節要素の増強は、プロモーター及び/又は「エンハンサー」などの強い転写シグナルを用いることによって転写レベルで有効に起こることが可能となる。しかしさらに、例えばmRNAの安定性の改善によって、翻訳を増大させることもまた可能である。
【０４７３】
発現カセットの作成は、適切なプロモーターと、上記の核酸配列及びターミネーター又はポリアデニル化シグナルとの融合によって行われ、該核酸配列は、ケトラーゼ、β-水酸化酵素、β-シクラーゼ、HMG-CoA還元酵素、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エチル二リン酸還元酵素、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ、ゲラニル二リン酸合成酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、フィトエン合成酵素、フィトエンデサチュラーゼ、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ、crtISOタンパク質、FtsZタンパク質及び/又はMinDタンパク質をコードする。この目的のために、通常の組換え技法及びクローニング技法が用いられる。これらの技法は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) 及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) に記載されている。
【０４７４】
適切な宿主生物中で発現させるための組換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、宿主特異的ベクターに有利に挿入され、宿主中での該遺伝子の最適な発現が可能となる。ベクターは当業者に周知であり、例えば“Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., Ed, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)から推察することができる。プラスミド以外のベクターはまた、ファージ、SV40、CMV、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド及び線状DNA又は環状DNAなどの当業者に周知の他の全てのベクターを意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物中で自律的に複製され又は染色体的に複製されることが可能である。
【０４７５】
適切な発現ベクターの例として、pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 及びpRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)などの通常の融合発現ベクターを挙げることができる。これらのベクター中では、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE-結合タンパク質又はタンパク質Aが組換え標的タンパク質と融合している。
【０４７６】
非融合タンパク質発現ベクターは、pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) 及びpET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89)、又はpBluescript及び pUC ベクターなどである。
【０４７７】
酵母S. cerevisiae中の発現のための酵母発現ベクターは、pYepSec1 (Baldari et al.,(1987)Embo J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943)、 pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123)及びpYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)である。
【０４７８】
糸状菌などを含む、他の真菌中における使用に適したベクター及び該ベクターの構築方法については、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Ed., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeに詳細に説明されている。
【０４７９】
培養された昆虫細胞中（例えば、Sf9細胞）におけるタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ(Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) 及びpVLシリーズ(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)      を含む。
【０４８０】
原核細胞及び真核細胞のためのさらに適切な発現系については、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第16章及び第17章に記載されている。
【０４８１】
本発明による発現構築物又はベクターの補助を得て、遺伝子改変した生物を産生することができる。例えば、この生物は本発明によるベクターを少なくとも1つ用いて形質転換されている。
【０４８２】
有利には、上述の本発明による組換え構築物は、適切な宿主系に挿入されて発現する。これに関しては、該核酸を各発現系で発現させるために、例えば共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどのなじみのクローニング方法及びトランスフェクション方法が、当業者に好適に周知となっている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997には、適切な系が記載されている。
【０４８３】
成功裏に形質転換された生物の選択をマーカー遺伝子によって行うことができ、この遺伝子は同様にベクター又は発現カセットに含まれている。これらのマーカー遺伝子の例として、抗生物質耐性遺伝子及び形質転換された細胞の染色を引き起こす発色反応を触媒する酵素が挙げられる。その後、これらは自動細胞選別によって選択することができる。
【０４８４】
適切な抗生物質耐性遺伝子（例えばG418又はハイグロマイシン）を運ぶベクターを用いて成功裏に形質転換された微生物は、適切な抗生物質含有培地又は栄養培地によって選択することができる。細胞表面に提示されたマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによる選択に利用することができる。
【０４８５】
宿主生物と、RNAポリメラーゼ/プロモーター系を有するプラスミドなどのプラスミド、ウイルスもしくはファージ、ファージ8又は他の溶原性ファージ又はトランスポゾンなどの該生物に適したベクター、及び/又は他の有効な調節配列とを組み合わせて、発現系を形成する。
【０４８６】
本発明はさらに、遺伝子的に改変された非ヒト生物に関する。該遺伝子改変は、
A  野生型生物が既にケトラーゼ活性を有している場合、野生型と比較してケトラーゼ活性を増加させる、及び
B  該野生型生物がケトラーゼ活性を有していない場合、野生型と比較してケトラーゼ活性を生じさせる、
及び、該遺伝子改変は、
C  野生型生物が既にβ-シクラーゼ活性を有している場合、野生型と比較してβ-シクラーゼ活性を増加させる、及び
D  該野生型生物がβ-シクラーゼ活性を有していない場合、野生型と比較してβ-シクラーゼ活性を生じさせる、
及びCによって増加し又はDによって生じたβ-シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、又はアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで該配列番号2の配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含む、β-シクラーゼによって生じる。
【０４８７】
上記に説明したように、野生型と比較したケトラーゼ活性の増加（Aによる）又は発生（Bによる）は、好ましくはケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加によって起こる。
【０４８８】
さらに好適な実施形態においては、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加は、ケトラーゼをコードする核酸の、該生物への挿入によって行われる。
【０４８９】
本発明によるトランスジェニック生物において、この実施形態においては、野生型と比較して、少なくとも1つのさらなるケトラーゼ遺伝子が存在している。この実施形態においては、本発明による遺伝子改変した生物は、好ましくはケトラーゼをコードする外因性（すなわち、異種）核酸を少なくとも1つ有し、又はケトラーゼをコードする内因性核酸を少なくとも2つ有する。
【０４９０】
この目的のために、原則的には任意のケトラーゼ遺伝子、すなわちケトラーゼをコードする任意の核酸を使用することができる。
【０４９１】
ケトラーゼをコードする好適な核酸については、本発明による方法において上記に記載されている。
【０４９２】
好ましくは、上述のβ-シクラーゼ活性の増加又は発生は、野生型と比較して、β-シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加によって行われる。該β-シクラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列、又はアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで該配列番号2の配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含む。
【０４９３】
好適な実施形態においては、β-シクラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加は、
該生物へβ-シクラーゼをコードする核酸を少なくとも1つ挿入することによって行われ、該β-シクラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列、又はアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで該配列番号2の配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含む。
【０４９４】
本発明によるトランスジェニック生物においては、この実施形態において、野生型と比較して、少なくとも1つのさらなるβ-シクラーゼ遺伝子が存在している。この実施形態において、本発明による遺伝子改変した生物は、好ましくはβ-シクラーゼをコードする外因性（＝異種）核酸を少なくとも1つ有し、又はβ-シクラーゼをコードする内因性核酸を少なくとも2つ有する。
【０４９５】
この目的のために、原則的には任意のβ-シクラーゼ遺伝子、すなわちβ-シクラーゼをコードする任意の核酸を使用することが可能であり、該β-シクラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列、又はアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、アミノ酸レベルで該配列番号2の配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含む。
【０４９６】
好適なβ-シクラーゼ遺伝子は上に説明される。
【０４９７】
特に、好適に遺伝子改変した生物はさらに、上述のとおり、野生型生物と比較して増加した又は発生した水酸化酵素活性を有する。さらに好適な実施形態は、本発明による方法において上記に説明される。
【０４９８】
さらに、特に好ましくは、遺伝子改変した非ヒト生物は、上述のとおり、野生型と比較して、下記に列挙した群から選択される、少なくとも1つのさらに増加した活性をさらに有する。該活性が選択される群は、HMG-CoA還元酵素活性、(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エチル二リン酸還元酵素活性、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸合成酵素活性、1-デオキシ-D-キシロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼ活性、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ活性、ゲラニル二リン酸合成酵素活性、ファルネシル二リン酸合成酵素活性、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性、フィトエン合成酵素活性、フィトエンデサチュラーゼ活性、ゼータ-カロテンデサチュラーゼ活性、crtISO活性、FtsZ活性、及びMinD活性からなる。さらに好適な実施形態は、上記の本発明による方法において上に説明される。
【０４９９】
本発明による生物は、好ましくは、野生型生物又は出発生物として、自然に、又は遺伝子相補性によって及び/又は代謝経路の再調節によって、カロテノイド、特にβ-カロテン及び/又はゼアキサンチン及び/又はネオキサンチン及び/又はビオラキサンチン及び/又はルテインを生成することが可能である生物を意味すると理解される。
【０５００】
野生型生物又は出発生物としてさらに好適な生物は、既に水酸化酵素活性を有し、これによって野生型生物又は出発生物として、ゼアキサンチンを生成することが可能である。
【０５０１】
好適な生物は、例えば、細菌（バクテリア）、酵母、藻類又は真菌などの微生物又は植物である。
【０５０２】
カロテノイド産生生物のカロテノイド生合成遺伝子の挿入のため、使用されるバクテリアは、エルウィニア（Erwinia）に由来するcrt遺伝子を含む、エシェリキア属（Escherichia）などのキサントフィルを合成できるバクテリア、又はエルウィニア属（Erwinia）などの自らキサントフィルを合成できるバクテリア、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、パラコッカス（Paracoccus）、ノストック（Nostoc）、又はラン藻属（Synechocystis）のシアノバクテリア、のいずれであってもよい。
【０５０３】
好ましいバクテリアは、大腸菌（Escherichia coli）、エルウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）、エルウィニア・ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）、アグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）、アルカリゲネス（Alcaligenes）sp.PC-1、フラボバクテリウム（Flavobacterium）sp.R1534株、シアノバクテリウムラン藻（cyanobacterium Synechocystis）sp.PCC6803、パラコッカス・マルクシイ（Paracoccus marcusii）又はパラコッカス・カロテネイファシエンス（Paracoccus caroteneifaciens）である。
【０５０４】
好ましい酵母は、カンディダ（Candida）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、ピチア（Pichia）又はファフィア（Phaffia）である。特に好ましい酵母は、キサントフィロマイセス・デンドロホス（Xanthophyllomyces dendrorhous）又はファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）である。
【０５０５】
好ましい菌類は、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、アシュビア（Ashbya）、ニューロスポラ（Neurospora）、ブラケスレア（Blakeslea）、特にブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、フィコマイセス（Phycomyces）、フザリウム（Fusarium）又はIndian Chem. Engr. Section B. Vol. 37, No. 1, 2 (1995)の15頁、表6に記載のさらなる菌類である。
【０５０６】
好ましい藻類は、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ファエダクチルム・トリコルナツム（Phaedactylum tricornatum）、ボルボックス属（Volvox）又はデュナリエラ属（Dunaliella）の藻類などの緑藻類である。特に好ましい藻類は、ヘマトコッカス・ピュヴィアリス（Haematococcus puvialis）又はデュナリエラ・バルダウィル（Dunaliella bardawil）である。
【０５０７】
さらに利用可能な微生物及び本発明の方法を実施するための該微生物による生産は、例えばDE-A-199 16 140から周知であり、この文献を本明細書中で参照する。
【０５０８】
特に好ましい植物は、下記の科から選択される植物である。ヒユ科（Amaranthaceae）、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）、キョウチクトウ科（Apocynaceae）、キク科(Asteraceae)、ツリフネソウ科（Balsaminaceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、メギ科（Berberidaceae）、アブラナ科(Brassicaceae)、アサ科（Cannabaceae）、スイカズラ科（Caprifoliaceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）、キク科(Compositae)、ウリ科（Cucurbitaceae）、アブラナ科(Cruciferae)、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、マメ科(Fabaceae)、リンドウ科（Gentianaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、イネ科(Gramineae)、モクレン科（八角茴香）（Illiaceae）、シソ科（Labiatae）、シソ科（Lamiaceae）、マメ科（Leguminosae）、ユリ科（Liliaceae）、アマ科（Linaceae）、ミゾカクシ科（Lobeliaceae）、アオイ科（Malvaceae）、モクセイ科（Oleaceae）、ラン科（Orchidaceae）、ケシ科（Papaveraceae）、イソマツ科（Plumbaginaceae）、イネ科(Poaceae)、ハナシノブ科（Polemoniaceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、キンポウゲ科（Ranunculaceae）、バラ科（Rosaceae）、アカネ科（Rubiaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、ナス科（Solanaceae）、ノウゼンハレン科（Tropaeolaceae）、セリ科（Umbelliferae）、クマツヅラ科（Verbanaceae）、ブドウ科（Vitaceae）またはスミレ科（Violaceae）。
【０５０９】
極めて、特に好ましい植物は、下記の植物属からなる群から選択される。マリーゴールド属（Marigold）、万寿菊（Tagetes erecta）、クジャクソウ（Tagetes patula）、アカシア属（Acacia）、トリカブト属（Aconitum）、フクジュソウ属（Adonis）、ウサギギク属（Arnica）、オダマキ属（Aquilegia）、アスター属（Aster）、ゲンゲ属（Astragalus）、ツリガネカズラ属（Bignonia）、キンセンカ属（Calendula）、リュウキンカ属（Caltha）、ホタルブクロ属（Campanula）、カンナ属（Canna）、ヤグルマギク属（Centaurea）、ニオイアラセイトウ属（Cheiranthus）、キク属（Chrysanthemum）、ミカン属（Citrus）、フタマタタンポポ属（Crepis）、クロッカス属（Crocus）、カボチャ属（Curcurbita）、エニシダ属（Cytisus）、デロニア属（Delonia）、オオヒエンソウ属（Delphinium）、ナデシコ属（Dianthus）、アフリカキンセンカ属（Dimorphotheca）、ドロニクム属（Doronicum）、ハナビシソウ属（Eschscholtzia）、レンギョウ属（Forsythia）、カイエンナッツ属（Fremontia）、ガザニア属（Gazania）、ゲルセミウム属（Gelsemium）、ゲニスタ属（Genista）、リンドウ属（Gentiana）、ゼラニウム属（Geranium）、ガーベラ属（Gerbera）、ダイコンソウ属（Geum）、グレビレア属（Grevillea）、マルバナハシャギク属（Helenium）、ヒマワリ属（Helianthus）、ミスミソウ属（Hepatica）、ハナウド属（Heracleum）、ハイビスカス属（Hisbiscus）、キクイモモドキ属（Heliopsis）、オトギリソウ属（Hypericum）、オオゴンソウ属（Hypochoeris）、ツリフネソウ属（Impatiens）、アヤメ属（Iris）、ジャカランダ属（Jacaranda）、ヤマブキ属（Kerria）、キングサリ属（Laburnum）、レンリソウ属（Lathyrus）、センボンヤリ属（Leontodon）、ユリ属（Lilium）、アマ属（Linum）、ミヤコグサ属（Lotus）、トマト属（Lycopersicon）、オカトラノオ属（Lysimachia）、ロウバイ属（Maratia）、ウマゴヤシ属（Medicago）、ミゾホオズキ属（Mimulus）、スイセン属（Narcissus）、マツヨイグサ属（Oenothera）、モクセイ属（Osmanthus）、ペチュニア属（Petunia）、カナメモチ属（Photinia）、ホオズキ属（Physalis）、フィテウマ属（Phyteuma）、キジムシロ属（Potentilla）、トキワサンザシ属（Pyracantha）、キンポウゲ属（Ranunculus）、ツツジ属（Rhododendron）、バラ属（Rosa）、オオハンゴンソウ属（Rudbeckia）、セネキオ属（Senecio）、マンテマ属（Silene）、メナモミ属（Silphium）、シロガラシ属（Sinapsis）、ナナカマド属（Sorbus）、レダマ属（Spartium）、テコマ属（Tecoma）、トレニア属（Torenia）、バラモンジン属（Tragopogon）、キンバイソウ属（Trollius）、ノウゼンハレン属（Tropaeolum）、チューリップ属（Tulipa）、フキタンポポ属（Tussilago）、ハリエニシダ属（Ulex）、スミレ属（Viola）またはジニア属（Zinnia）。特に好ましくは、マリーゴールド属（Marigold）、万寿菊（Tagetes erecta）、クジャクソウ（Tagetes patula）、トマト属（Lycopersicon）、バラ属（Rosa）、キンセンカ属（Calendula）、ホオズキ属（Physalis）、ウマゴヤシ属（Medicago）、ヒマワリ属（Helianthus）、キク属（Chrysanthemum）、アスター属（Aster）、チューリップ属（Tulipa）、スイセン属（Narcissus）、ペチュニア属（Petunia）、ゼラニウム属（Geranium）、ノウゼンハレン属（Tropaeolum）又はフクジュソウ属（Adonis）の植物からなる群から選択される。
【０５１０】
極めて、特に好ましい遺伝子改変した植物は、マリーゴールド属（Marigold）、万寿菊（Tagetes erecta）、クジャクソウ（Tagetes patula）、フクジュソウ属（Adonis）、トマト属（Lycopersicon）、バラ属（Rosa）、キンセンカ属（Calendula）、ホオズキ属（Physalis）、ウマゴヤシ属（Medicago）、ヒマワリ属（Helianthus）、キク属（Chrysanthemum）、アスター属（Aster）、チューリップ属（Tulipa）、スイセン属（Narcissus）、ペチュニア属（Petunia）、ゼラニウム属（Geranium）、ノウゼンハレン属（Tropaeolum）の植物属から選択され、該遺伝子改変した植物は、ケトラーゼをコードする遺伝子組み換え核酸を少なくとも1つ含む。
【０５１１】
トランスジェニック植物、該植物の再生物質、及び該植物の細胞、組織又は器官、特に果実、種子、花及び花弁は、本発明のさらなる対象である。
【０５１２】
上述のとおり、遺伝子改変した植物は、ケトカロテノイド、特にアスタキサンチンの生産に用いられる。
【０５１３】
ヒト及び動物が摂取可能な、本発明による遺伝子改変した生物であって、増加したケトカロテノイド、特にアスタキサンチン、含有物を有する、特に花弁などの、特に植物又は植物の部分である前記生物もまた、直接、又は食品もしくは飼料、又は飼料及び食品のサプリメント（栄養補給剤）としてそれ自体周知の加工後に用いることができる。
【０５１４】
さらに、遺伝子改変した生物を、該生物のケトカロテノイド含有抽出物の生産及び/又は飼料及び食品のサプリメントの生産に用いることができる。
【０５１５】
遺伝子改変した生物は、野生型と比較して、増加したケトカロテノイド含有物を有する。
【０５１６】
増加したケトカロテノイド含有物は、通常、増加した総ケトカロテノイド含有物を意味すると理解される。
【０５１７】
しかし、増加したケトカロテノイド含有物はまた、特に、総カロテノイド含有物を不可避的に増加させる必要のない、好適なケトカロテノイドの改変された含有物を意味すると理解される。
【０５１８】
特に好適な実施形態において、本発明による遺伝子改変した植物は、野生型と比較して増加したアスタキサンチン含有物を有する。
【０５１９】
この場合、増加した含有物はまた、生じたケトカロテノイド、又はアスタキサンチン含有物を意味すると理解される。
【０５２０】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらの一般的な実験条件、組換えDNAの配列分析に限定されるものではない。
【０５２１】
組換えDNA分子のシークエンシングは、Licor (MWG Biotech, Ebersbachから市販) のレーザー蛍光DNAシークエンサーを用いて、サンガー法(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467)に従って行われる。
【実施例】
【０５２２】
実施例１：
ノストック（Nostoc sp.）PCC 7120に由来するNOSTケトラーゼの全一次配列をコードするDNAの増幅
ノストック（Nostoc sp.）PCC 7120に由来するNOSTケトラーゼをコードする該DNAを、ノストック（Nostoc sp.）PCC 7120 (“Pasteur Culture Collection of Cyanobacterium”の菌株)からPCRによって増幅した。
【０５２３】
ノストック（Nostoc sp.）PCC 7120の懸濁培養液からゲノムDNAを調製するため、ノストック（Nostoc sp.）PCC 7120の細胞は遠心分離によって回収され、液体窒素中で凍結され、乳鉢中で微粉砕された。該懸濁培養液は、連続照明及びBG 11培地(1.5 g/lのNaNO3、0.04 g/l のK2PO4x3H2O、0.075 g/lのMgSO4xH2O、0.036 g/lのCaCl2x2H2O、0.006 g/lのクエン酸、0.006 g/lのクエン酸アンモニウム第二鉄、0.001 g/l のEDTA 二ナトリウムマグネシウム、0.04 g/lの Na2CO3、1mlの微量金属混合物“A5+Co”(2.86 g/l のH3BO3、1.81 g/l のMnCl2x4H2o、 0.222 g/lのZnSO4x7H2O、0.39 g/lのNaMoO4X2H2O、0.079 g/lのCuSO4x5H2O、0.0494 g/lのCo(NO3)2x6H2O))中における25℃での連続振盪(150 rpm)によって1週間成長させたものである。
【０５２４】
ノストック（Nostoc）PCC7120からDNAを単離するためのプロトコル:
10 mlの液体培地から該バクテリアの細胞を、8000 rpmで10分間の遠心分離によってペレット化した。その後、乳鉢を用いて該バクテリアの細胞は液体窒素中で微粉砕され、挽かれた。該細胞物質は、1 ml の10mM Tris HCl (pH 7.5)中で再懸濁され、エッペンドルフ反応容器(容積2 ml)に移された。100μlのプロテインキナーゼK(濃度:20 mg/ml)を添加した後、該細胞懸濁液は、3時間、37°Cでインキュベートされた。その後、該懸濁液は、500μlのフェノールを用いて抽出された。13,000 rpmで5分間の遠心分離の後、上部の水相は新しい2 mlエッペンドルフ反応容器に移された。フェノールを用いた抽出は、3回繰り返された。DNAは、1/10容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)及び0.6容量のイソプロパノールの添加によって沈殿させられ、その後70％エタノールで洗浄された。該DNAペレットは室温で乾燥され、25μlの水に取り上げて加熱によって65℃で溶解した。
【０５２５】
ノストック（Nostoc）PCC 7120に由来するケトラーゼをコードする核酸は、センス特異的プライマー（NOSTF、配列番号79）及びアンチセンス特異的プライマー（NOSTG、配列番号80）を用いてNostoc sp. PCC 7120から「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）によって増幅された。
【０５２６】
使用されたPCR条件は以下のとおりであった：
全一次配列からなるケトラーゼタンパク質をコードするDNAを増幅するためのPCRは、50μlの反応バッチ中で行われ、該反応バッチ中には以下のものが含まれていた。
【０５２７】
- 1 μlのノストック（Nostoc sp.）PCC 7120 DNA （上記のとおり調製）
- 0.25 mM のdNTPs
- 0.2 mMのNOSTF (配列番号79)
- 0.2 mM のNOSTG (配列番号80)
- 5μlの10X PCR バッファ(TAKARA)
- 0.25μlのR Taq ポリメラーゼ(TAKARA)
- 25.8μlの蒸留水
PCRは、下記のサイクル条件下で行われた：
1X 94℃       で2分
35X 94℃で1分
55℃で1分
72℃で3分
1X 72℃で10分
配列番号79及び配列番号80を用いたPCR増幅の結果、全一次配列（配列番号81）からなるタンパク質をコードする805 bpのフラグメントが生じた。標準方法を用いて、増幅産物はPCRクローニングベクターpGEM-T (Promega)中にクローン化され、クローンpNOSTF-Gが得られた。
【０５２８】
M13F及びM13Rプライマーを用いたクローンpNOSTF-Gのシークエンシングによって、データベース登録AP003592のDNA配列88,886-89,662と同一の配列が確認された。このヌクレオチド配列は、独立した増幅実験において再生され、これによって使用されたノストック（Nostoc sp.）PCC 7120中のヌクレオチド配列を表す。
【０５２９】
従って、このクローンpNOSTF-Gは、発現ベクターpJIT117へのクローニングに用いられた(Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380)。このクローニングは、pNOSTF-Gから799 BpのSphI フラグメントを単離し、SphI-切断ベクターpJIT117中にライゲーションすることによって行われた。rbcS輸送ペプチドとのN-末端翻訳融合として、Nostoc sp. PCC 7120のケトラーゼを正しい方向に含むクローンは、pJNOSTと呼ばれる。
【０５３０】
実施例２：
大腸菌中でのゼアキサンチン合成のための、プラスミドpMCL-CrtYIBZ/idi/gpsの構築
pMCL-CrtYIBZ/idi/gpsの構築は、pMCL-CrtYIBZ及びpMCL-CrtYIBZ/idiの中間段階を経る3つのステップで行われた。ベクターとして、高コピー数のベクターと適合性があるプラスミドpMCL200が使用された(Nakano, Y., Yoshida, Y., Yamashita, Y. and Koga, T.; Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors; Gene 162 (1995), 157-158)。
【０５３１】
実施例2.1.: pMCL-CrtYIBZの構築
バクテリアであるエルウィニア・ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）によって生合成遺伝子crtY、crtB、crtI及びcrtZ が生じ、PCRによって増幅された。エルウィニア・ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）(DSM 30080)に由来するゲノムDNAは、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Brunswick)によってサービス単位で作成された。PCR反応は、製造者の使用説明書(Roche, Long Template PCR: Procedure for amplification of 5-20 kb targets with the expand long template PCR system) に従って行われた。エルウィニア・ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）の生合成クラスタの複製のためのPCR条件は、以下のとおりであった。
【０５３２】
マスター混合物1:
- 1.75μl のdNTPs (最終濃度350μM)
- 0.3 μM のプライマー Crt1 (配列番号82)
- 0.3 μM のプライマー Crt2 (配列番号83)
- 250 〜 500 ngのDSM 30080ゲノムDNA
総量が50μlとなるまでの蒸留水
マスター混合物2:
- 5μlの10x PCRバッファ1 (最終濃度1x、1.75 mM Mg2+を含む)
- 10x PCRバッファ2 (最終濃度1x、2.25 mM Mg2+を含む)
- 10x PCRバッファ3 (最終濃度1x、2.25 mM Mg2+を含む)
- 0.75μlのExpand Long Template Enzyme Mix (最終濃度2.6ユニット)
総量が50μlとなるまでの蒸留水
2つのバッチ「マスター混合物1」及び「マスター混合物2」が共にピペットで取られた。PCRは、下記のサイクル条件下で、総量50μlで行われた：
1X 94℃で2分
30X 94℃で30秒
58℃で1分
68℃で4分
1X 72℃で10分
配列番号82及び配列番号83を用いたPCR増幅の結果、遺伝子CrtY(タンパク質: 配列番号85)、遺伝子CrtI (タンパク質:配列番号86)、遺伝子crtB (タンパク質: 配列番号87)及び遺伝子CrtZ (iDNA)をコードするフラグメント（配列番号84）が生じた。標準方法を用いて、増幅産物はPCRクローニングベクターpCR2.1 (Invitrogen)中にクローン化され、クローンpCR2.1-CrtYIBZが得られた。
【０５３３】
プラスミドpCR2.1-CrtYIBZはSalI及びHindIIIで切断され、結果として生じたSalI/HindIIIフラグメントが単離され、ライゲーションによってSalI/HindIII-切断ベクターpMCL200に移された。pMCL 200にクローン化されたpCR2.1-CrtYIBZから得たSalI/HindIIIフラグメントは、4624bp長であり、CrtY、CrtI、crtB及びCrtZ遺伝子をコードし、D90087(配列番号84)中の位置2295から位置6918の配列に対応する。遺伝子CrtZは、その内因性プロモーターによって遺伝子CrtY、CrtI及びCrtBの読み取り方向とは逆に転写される。結果として生じるクローンは、pMCL-CrtYIBZと呼ばれる。
【０５３４】
実施例2.2.: pMCL-CrtYIBZ/idiの構築
遺伝子idi (イソペンテニルリン酸イソメラーゼ;IPPイソメラーゼ)は、大腸菌からPCRを用いて増幅された。idiプロモーターをもつ全idi遺伝子及びリボソーム結合部位をコードする核酸は、センス特異的プライマー（５’- idi 配列番号88）及びアンチセンス特異的プライマー（３’- idi 配列番号89）を用いて大腸菌から「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）によって増幅された。
【０５３５】
PCR条件は、以下のとおりであった。
【０５３６】
DNA増幅のためのPCRは、50μlの反応バッチ中で行われ、該反応バッチ中には以下のものが含まれていた。
【０５３７】
- 1 μlの大腸菌 TOP10 懸濁液
- 0.25 mM のdNTPs
- 0.2 mM の５’- idi （配列番号88）
- 0.2 mM の３’- idi （配列番号89）
- 5μlの10X PCR バッファ (TAKARA)
- 0.25μlのR Taq ポリメラーゼ(TAKARA)
- 28.8μlの蒸留水
PCRは、下記のサイクル条件下で行われた。 
1X 94℃で2分
20X 94℃で1分
62℃で1分
72℃で1分
1X 72℃で10分
配列番号88及び配列番号89を用いたPCR増幅の結果、全一次配列（配列番号90）からなるタンパク質をコードする679 bpのフラグメントが生じた。標準方法を用いて、増幅産物はPCRクローニングベクターpCR2.1 (Invitrogen)中にクローン化され、クローンpCR2.1- idiが得られた。
【０５３８】
該クローンpCR2.1-idiのシークエンシングによって、公表された配列AE000372の位置8774から位置9440と相違ない配列が確認された。この領域は、プロモーター領域、潜在的なリボソーム結合部位及びIPPイソメラーゼの全「読み取り枠」を含む。pCR2.1-idiにクローン化されたフラグメントは、idi遺伝子の５’-末端へのXhoI切断部位の挿入及び３’-末端へのSalI-切断部位の挿入により、全長679 bpを有する。
【０５３９】
従ってこのクローンは、idi遺伝子のベクターpMCL-CrtYIBZ中へのクローニングに用いられた。クローニングは、XhoI/SalIフラグメントのpCR2.1-idiからの単離及びXhoI/SalI-切断ベクターpMCL-CrtYIBZ中へのライゲーションによって行われた。結果として生じたクローンは、pMCL-CrtYIBZ/idiと呼ばれる。
【０５４０】
実施例2.3.: pMCL-CrtYIBZ/idi/gpsの構築
遺伝子gps(ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素;GGPP合成酵素)は、アルカエオグロバス・フルギデュス（Archaeoglobus fulgidus）からPCRによって増幅された。アルカエオグロバス・フルギデュス（Archaeoglobus fulgidus）に由来するgpsをコードする核酸は、センス特異的プライマー（５’- gps 配列番号92）及びアンチセンス特異的プライマー（３’- gps 配列番号93）を用いて「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）によって増幅された。
【０５４１】
アルカエオグロバス・フルギデュス（Archaeoglobus fulgidus）に由来するDNAは、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Brunswick)によってサービス単位で作成された。PCR条件は、以下のとおりであった。
【０５４２】
全一次配列からなるGGPP合成酵素タンパク質をコードするDNAを増幅するためのPCRは、50μlの反応バッチ中で行われ、該反応バッチ中には以下のものが含まれていた。
【０５４３】
- 1 μlのアルカエオグロバス・フルギデュス（Archaeoglobus fulgidus）DNA
- 0.25 mMのdNTPs
- 0.2 mMの５’- gps（配列番号92）
- 0.2 mM の３’- gps （配列番号93）
- 5μlの10X PCR バッファ (TAKARA)
- 0.25μlのR Taq ポリメラーゼ(TAKARA)
- 28.8μlの蒸留水
PCRは、下記のサイクル条件下で行われた。 
1X 94℃で2分
20X 94℃で1分
56℃で1分
72℃で1分
1X 72℃で10分
PCR並びに配列番号92のプライマー及び配列番号93のプライマーによって増幅されたDNAフラグメントは、それ自体周知の方法を用いてアガロースゲルから溶出され、制限酵素NcoI及び HindIIIを用いて切断された。ここから、全一次配列（配列番号94）からなるタンパク質をコードする962 bpのフラグメントが結果として生じた。標準方法を用いて、NcoI/HindIII-切断増幅産物はベクターpCB97-30中にクローン化され、クローンpCB-gpsが得られた。
【０５４４】
該クローンpCB-gpsのシークエンシングによって、公表された配列AF120272とは1ヌクレオチド異なるアルカエオグロバス・フルギデュス（A. fulgidus）に由来するGGPP合成酵素の配列が確認された。gps遺伝子にNcoI-切断部位を挿入することによって、GGPP合成酵素の第2コドンが改変された。公表された配列AF120272においては、CTG（位置4-6）はロイシンをコードする。配列番号92及び配列番号93の2つのプライマーを用いた増幅によって、この第2のコドンはバリンをコードするGTGに改変された。
【０５４５】
従って、該クローンpCB-gpsは、ベクターpMCL-CrtYIBZ/idi中へのgps遺伝子のクローニングに用いられた。クローニングは、KpnI/XhoIフラグメントをpCB-gpsから単離すること並びにKpnI-及びXhoI-切断ベクターpMCL-CrtYIBZ/idi中へのライゲーションによって行われた。クローン化されたKpnI/XhoIフラグメント（配列番号94）は、Prrn16プロモーターと共に、rbcLの最小の５’-UTR配列、GGPP合成酵素をN-末端で伸ばすrbcLの最初の6コドン、及びgps遺伝子の３’にpsbA配列を有する。これによって、GGPP合成酵素のN末端は、天然のアミノ酸配列Met-Leu-Lys-Glu （AF120272
のアミノ酸1から4）の代わりに、改変アミノ酸配列： Met-Thr-Pro-Gln-Thr-Ala-Met-Val-Lys-Gluを有する。この結果、位置3のロイシン（AF120272中）で始まる組換えGGPP合成酵素は、アミノ酸配列において同一であり、さらなる改変を有さない。rbcL配列及びpsbA配列が、Eiblら(Plant J. 19. (1999), 1-13)による参考文献に記載のとおりに用いられた。結果として生じたクローンは、pMCL-CrtYIBZ/idi/gpsと呼ばれる。
【０５４６】
実施例３：
組換え大腸菌株中におけるゼアキサンチンの生体内変換
ゼアキサンチンの生体内変換のため、異種相補によりゼアキサンチンを生成するよう備えられた組換え大腸菌株が作出される。プラスミドpNOSTF-G及びpMCL-CrtYIBZ/idi/gpsを用いた相補実験のための宿主細胞として、大腸菌TOP10株が使用された。
【０５４７】
ゼアキサンチンを高濃度に合成することを可能にする大腸菌株を作出するために、プラスミドpMCL-CrtYIBZ/idi/gpsが構築された。該プラスミドは、エルウィニア・ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）の生合成遺伝子crtY、crtB、 crtI及びcrtY、アルカエオグロバス・フルギデュス（Archaeoglobus fulgidus）から得たgps遺伝子（ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素）、並びに大腸菌から得た遺伝子idi（イソペンテニルリン酸イソメラーゼ）を有する。この構築物を用いて、カロテノイドの高濃度蓄積の律速段階及びその生合成前駆物質が除去された。この事実は、幾つかのプラスミドを用いた同様の方法において、Wang et al.によって前に説明されている(Wang, C.-W., Oh, M.-K. and Liao, J.C.; Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthin production in Escherichia coli, Biotechnology and Bioengineering 62 (1999), 235-241)。
【０５４８】
大腸菌TOP10の培養物は、2つのプラスミドpNOSTF-G及びpMCL-CrtYIBZ/idi/gpsを用いる、それ自体周知の方法で形質転換され、30℃又は37℃のLB培地中で一晩培養された。同様に、アンピシリン(50μg/ml)、クロラムフェニコール(50μg/ml) 及びイソプロピルβ-チオガラクトシド（1 mmol）が、通常の方法で一晩添加された。
【０５４９】
組換え株からのカロテノイドの単離のため、細胞はアセトンで抽出され、該有機溶媒は乾燥するまで蒸発させられて、カロテノイドはHPLC のC30カラムによって分離された。下記のプロセス条件が設定された。
【０５５０】
分離カラム: Prontosil C30カラム、250 x 4.6 mm、(Bischoff, Leonberg)
流速: 1.0 ml/分
溶離液:   溶離液A - 100％ メタノール
溶離液B - 80％ メタノール、0.2％ 酢酸アンモニウム
溶離液C - 100％ t-ブチルメチルエーテル
2007502605.tif 000002
検出: 300-500 nm
スペクトルは、フォトダイオードアレイ検出器を用いて溶出ピークから直接決定された。単離された物質は、標準サンプルと比較した、その吸収スペクトル及び保持時間によって同定された。
【０５５１】
実施例４：
前の実施例と同様に、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille.）に由来するケトラーゼを発現する大腸菌株が作出された。この目的のために、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille.）に由来するケトラーゼの全一次配列をコードするcDNAが増幅され、実施例1と同じ発現ベクター中にクローン化された。
【０５５２】
ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille.）に由来するケトラーゼをコードするcDNAは、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）("Collection of algal cultures of the University of Gottingen"の192.80株)の懸濁培養液のPCRによって増幅された。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）(192.80株)懸濁培養液から全RNAを調製するため、該細胞は回収され、液体窒素中で凍結され、乳鉢中で微粉砕された。該懸濁培養液は、間接昼光を用いて室温で、ヘマトコッカス培地(1.2 g/l の酢酸ナトリウム、2 g/lの酵母エキス、0.2 g/lのMgCl2x6H2O, 0.02 CaCl2x2H2O; pH 6.8; オートクレーブ後400 mg/lのL-アスパラギン、10 mg/l のFeSO4xH2O添加)中において2週間成長させたものである。その後、100 mgの凍結、微粉砕された藻類細胞は、反応容器に移され、0.8 mlのTrizolバッファ(LifeTechnologies)に取りあげられた。該懸濁液は、0.2 mlのクロロホルムを用いて抽出された。12 000 gで15分間の遠心分離後、水性の上清が取り除かれ、新たな反応容器に移されて等量のエタノールで抽出された。RNAは、等量のイソプロパノールで沈殿され、75％エタノールで洗浄され、そのペレットはDEPC水に溶解された（室温で、1/1000容量のピロ炭酸ジエチルを有する水で一晩インキュベーションし、その後オートクレーブ処理した）。該RNA濃度は光度的に測定された。
【０５５３】
cDNA合成のため、2.5μgの全RNAが60℃で10分間変性され、氷上で2分間冷却され、アンチセンス-特異的プライマーPR1 (gcaagctcga cagctacaaa cc)を用いる使用説明書に従ってcDNAキット(Ready-to-go-you-prime-beads、Pharmacia Biotech)を用いてcDNAに転写された。
【０５５４】
ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）(192.80株)に由来するケトラーゼをコードする核酸は、センス-特異的プライマーPR2 (gaagcatgca gctagcagcgacag)及びアンチセンス-特異的プライマーPR1を用いて、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅された。
【０５５５】
PCR条件は、以下のとおりであった。
【０５５６】
全一次配列からなるケトラーゼタンパク質をコードするcDNAの増幅のためのPCRは、50 mlの反応バッチ中において行われ、、該反応バッチ中には以下のものが含まれていた。
【０５５７】
- 4 mlのヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）cDNA 
(上記のとおり調製)
- 0.25 mM のdNTPs
- 0.2 mM のPR1 
- 0.2 mM のPR2 
- 5 mlの10X PCRバッファ(TAKARA)
- 0.25 mlのR Taqポリメラーゼ(TAKARA)
- 25.8 mlの蒸留水
PCRは下記のサイクル条件下で行われた。
【０５５８】
1X 94℃で2分
35X 94℃で1分
53℃で2分
72℃で3分
1X 72℃で10分
PR1及びPR2を用いたPCR増幅の結果、全一次配列からなるタンパク質をコードする1155 bpのフラグメントが生じた。
【化１】
2007502605.tif 000003
【０５５９】
標準の方法を用いて、PCRクローニングベクターpGEM-Teasy (Promega)中に増幅産物がクローン化され、クローンpGKETO2が得られた。
【０５６０】
T7プライマー及びSP6プライマーを用いたクローンpGKETO2のシークエンシングによって、公表された配列X86782の、73、 114及び119の3つのコドンにおいて各1塩基のみ異なる配列が確認された。これらのヌクレオチド交換は、独立の増幅実験において再生され、これによって、使用されたヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）192.80株中のヌクレオチド配列を表す。
【０５６１】
このクローンは、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）のケトラーゼの発現に使用された。大腸菌株の形質転換、その培養及びカロテノイドプロファイルの分析は、実施例3に記載のとおりに行われた。
【０５６２】
表1は、細菌で生成されたカロテノイド量の比較を表す。
【表１】
2007502605.tif 000004
実施例５：
ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme ）ATCC 29133に由来するNP196ケトラーゼの全一次配列をコードするDNAの増幅
ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme） ATCC 29133に由来するNP196ケトラーゼをコードする該DNAは、ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme ）ATCC 29133(“American Type Culture Collection”の菌株)からPCRによって増幅された。
【０５６３】
ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme）ATCC 29133懸濁培養液からゲノムDNAを調製するため、該細胞は遠心分離によって回収され、液体窒素中で凍結され、乳鉢中で微粉砕された。該懸濁培養液は、連続照明及びBG 11培地(1.5 g/lのNaNO3、0.04 g/l のK2PO4x3H2O、0.075 g/lのMgSO4xH2O、0.036 g/lのCaCl2x2H2O、0.006 g/lのクエン酸、0.006 g/lのクエン酸アンモニウム第二鉄、0.001 g/l のEDTA 二ナトリウムマグネシウム、0.04 g/lの Na2CO3、1mlの微量金属混合物“A5+Co”(2.86 g/l のH3BO3、1.81 g/l のMnCl2x4H2o、 0.222 g/lのZnSO4x7H2o、0.39 g/lのNaMoO4X2H2O、0.079 g/lのCuSO4x5H2O、0.0494 g/lのCo(NO3)2x6H2O))中における25℃での連続振盪(150 rpm)によって1週間成長させたものである。
【０５６４】
ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme）ATCC 29133からDNAを単離するためのプロトコル:
10 mlの液体培地から該バクテリアの細胞を、8000 rpmで10分間の遠心分離によってペレット化した。その後、乳鉢を用いて該バクテリアの細胞は液体窒素中で微粉砕され、挽かれた。該細胞物質は、1 ml の10mM Tris HCl (pH 7.5)中で再懸濁され、エッペンドルフ反応容器(容積2 ml)に移された。100μlのプロテインキナーゼK(濃度:20 mg/ml)を添加した後、該細胞懸濁液は、3時間、37°Cでインキュベートされた。その後、該懸濁液は、500μlのフェノールを用いて抽出された。13,000 rpmで5分間の遠心分離の後、上部の水相は新しい2 mlエッペンドルフ反応容器に移された。フェノールでの抽出は、3回繰り返された。DNAは、1/10容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)及び0.6容量のイソプロパノールの添加によって沈殿させられ、その後70％エタノールで洗浄された。該DNAペレットは室温で乾燥され、25μlの水に溶かされ、65℃での加熱によって溶解した。
【０５６５】
ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme）ATCC 29133に由来するケトラーゼをコードする核酸は、センス特異的プライマー（NP196-1、配列番号100）及びアンチセンス特異的プライマー（NP196-2、配列番号101）を用いたノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme）ATCC 29133の「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）によって増幅された。
【０５６６】
PCR条件は以下のとおりであった：
全一次配列からなるケトラーゼタンパク質をコードするDNAを増幅するためのPCRは、50μlの反応バッチ中で行われ、該反応バッチ中には以下のものが含まれていた。
【０５６７】
- 1μlのノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme）ATCC 29133DNA 
(上記のとおり調製)
- 0.25 mMの dNTPs
- 0.2 mMのNP196-1 (配列番号100)
- 0.2 mMのNP196-2 (配列番号101)
- 5μlの10X PCRバッファ(TAKARA)
- 0.25μlのR Taqポリメラーゼ(TAKARA)
- 25.8μlの蒸留水
PCRは下記のサイクル条件下で行われた。
【０５６８】
1X 94℃で2分
35X 94℃で1分
55℃で1分
72℃で3分
1X 72℃で10分
配列番号100及び配列番号101を用いたPCR増幅の結果、全一次配列（NP196、配列番号102）からなるタンパク質をコードする792 bpのフラグメントが生じた。標準方法を用いて、増幅産物はPCRクローニングベクターpCR 2.1 (Invitrogen)中にクローン化され、クローンpNP196が得られた。
【０５６９】
M13Fプライマー及びM13Rプライマーを用いたクローンpNP196のシークエンシングによって、標準の開始コドンATGを生成するために位置140,571のGがAに置換されていることを除いては、データベース登録NZ_AABC01000196（公表されたデータベース登録とは逆向き）のDNA配列140,571-139,810と同一の配列が確認された。このヌクレオチド配列は、独立した増幅実験において再生され、これによって使用されたノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme ATCC 29133）中のヌクレオチド配列を表す。
【０５７０】
従って、このクローンpNP196は、発現ベクターpJIT117(Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380)中のクローニングに用いられた。
【０５７１】
pJIT117は、35Sターミネーターを、アグロバクテリウム・ツメファシネス（Agrobacterium tumefaciens）のTi プラスミドpTi15955 のOCSターミネーター(オクトピン合成酵素) (データベース登録X00493の位置12,541から12,350まで、Gielen ら(1984) EMBO J. 3 835-846)に置換することによって改変された。
【０５７２】
プラスミドpHELLSGATE（データベース登録AJ311874, Wesleyら(2001) Plant J. 27 581-590、標準方法によって大腸菌から単離）、並びにプライマーOCS-1（配列番号133）及びOCS-2（配列番号134）を用いたPCRによって、OCSターミネーター領域を含むDNAフラグメントが作成された。
【０５７３】
PCR条件は、以下のとおりであった。
【０５７４】
オクトピン合成酵素（OCS）ターミネーター領域（配列番号106）を含むDNAを増幅するためのPCRは、50μlの反応バッチ中で行われ、該反応バッチ中には以下のものが含まれていた。
【０５７５】
- 100 ngのpHELLSGATEプラスミドDNA
- 0.25 mMのdNTPs
- 0.2 mMのOCS-1 (配列番号104)
- 0.2 mMのOCS-2 (配列番号105)
- 5μlの10X PCRバッファ(Stratagene)
- 0.25μlのPfuポリメラーゼ(Stratagene)
- 28.8μlの蒸留水
PCRは下記のサイクル条件下で実施された。 
1X 94℃で2分
35X 94℃で1分
50℃で1分
72℃で1分
1X 72℃で10分
210 bpの増幅産物は、標準方法を用いてPCRクローニングベクターpCR 2.1 (Invitrogen)中にクローン化され、プラスミドpOCSが得られた。
【０５７６】
クローンpOCSのシークエンシングによって、アグロバクテリウム・ツメファシネス（Agrobacterium tumefaciens ）のTi プラスミドpTi15955(データベース登録X00493)上の位置12,541 から12,350までの配列部分に対応する配列が確認された。
【０５７７】
クローニングは、pOCS から210 bpのSalI-XhoIフラグメントを単離し、SalI-XhoI-切断ベクターpJIT117中にライゲーションすることによって行われた。
【０５７８】
このクローンはpJOと呼ばれ、発現ベクターpJONP196中へのクローニングに用いられた。
【０５７９】
クローニングは、pNP196から782 BpのSphIフラグメントを単離し、SphI-切断ベクターpJO中にライゲーションすることによって行われた。rbcS輸送ペプチドとのN-末端翻訳融合として、ノストック・パンクティフォルム（Nostoc punctiforme）のNP196ケトラーゼを正しい方向に含むクローンは、pJONP196と呼ばれる。
【０５８０】
実施例 6：
リコペルシコン・エスクレンタム（ Lycopersicon esculentum ）およびタゲテス・エレクタのノストック・パンクチホルムATCC 29133（ Nostoc punctiforme ATCC 29133 ）のNP196ケトラーゼを構成的に発現する発現ベクターの調製
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタのノストック・パンクチホルムに由来するNP196ケトラーゼの発現を、アラビトプシス・タリアナ（ Arabidopsis thaliana ）の構成的なプロモーターFNR (フェレドキシン−NADPH 酸化還元酵素、データベース登録 AB011474、70127〜69493位置; WO03／006660)の制御下で行った。
【０５８１】
このFNR遺伝子は、第69492塩基対で開始し、「フェレドキシン−NADP+ 還元酵素」と注釈される。この発現をエンドウの輸送ペプチドrbcSと共に行った( Andersonら、1986, Biochem J. 240：709−715 )。
【０５８２】
アラビトプシス・タリアナのFNRプロモーター領域を含むDNA断片を、ゲノムDNA（標準的な方法に従ってアラビトプシス・タリアナから単離したもの)ならびにプライマーのFNR−1 (配列番号107)およびFNR−2 (配列番号108)を用いたPCRによって調製した。
【０５８３】
このPCR条件は、以下のとおりであった：
FNRプロモーター断片FNR (配列番号109)を含むDNAを増幅するためのPCRを、50μlの反応バッチで行った。このバッチは以下を含んだ：
− 100ngのアラビトプシス・タリアナのゲノムDNA
− 0.25mM dNTP
− 0.2mM FNR−1 (配列番号107)
− 0.2mM FNR−2 (配列番号108)
− 5μlの10× PCRバッファ(Stratagene)
− 0.25μlのPfuポリメラーゼ(Stratagene)
− 28.8μlの蒸留水。
【０５８４】
このPCRを、以下のサイクル条件下で行った：
1×94℃で2分間
35×94℃で1分間
50℃で1分間
72℃で1分間
1×72℃で10分間。
【０５８５】
652 bpの増幅生成物を、標準的な方法を用いてPCRクローニングベクターpCR 2.1 (Invitrogen)にクローン化し、そしてプラスミドpFNRを得た。
【０５８６】
このクローンpFNRの配列決定によって、アラビトプシス・タリアナの第五染色体(データベース登録 AB011474 ) 第70127〜69493位の配列部分に対応した配列を確認した。
【０５８７】
このクローンをpFNRと称し、そして発現ベクターpJONP196 (実施例5に記載)にクローニングするために用いた。
【０５８８】
このクローニングを、pFNRから644 bpのSmaI−HindIII断片を単離し、そしてEcl136II−HindIIIで切断したベクターpJONP196にライゲーションして行った。元のプロモーターd35Sに代えてプロモーターFNRおよびrbcS輸送ペプチドとのN−末端融合体として正しい向きで断片NP196を含むクローンを、pJOFNR：NP196と称する。
【０５８９】
リコペルシコン・エスクレンタムのノストックに由来するNP196ケトラーゼのアグロバクテリウムによる形質転換のための、発現カセットの調製をバイナリーベクターpSUN3 (WO02／00900)を用いて行った。
【０５９０】
発現ベクターMSP105を調製するために、pJOFNR：NP196に由来する1,839 bpのEcoRI−XhoI断片を、EcoRI−XhoIで切断したベクターpSUN3とライゲートした。この発現ベクターMSP105は、断片FNRプロモーター（FNRプロモーター）(635 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウに由来するrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP196 KETO CDS（ノストック・パンクチホルムNP196 ケトラーゼをコードする）(761 bp)、断片OCSターミネーター（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）(192 bp)を含む。
【０５９１】
タゲテス・エレクタのノストック・パンクチホルムに由来するNP196ケトラーゼを有する発現ベクターのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現カセットの調製を、バイナリーベクターpSUN5 (WO02／00900)を用いて行った。
【０５９２】
タゲテス発現ベクターMSP106の調製のために、pJOFNR：NP196に由来する1,839 bpのEcoRI−XhoI断片を、EcoRI−XhoIで切断したベクターpSUN5とライゲートした。MSP106は、断片FNRプロモーター（FNRプロモーター）(635 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP196 KETO CDS (761 bp)（ノストック・パンクチホルム NP196 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０５９３】
実施例 7：
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタにおけるノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するNP196ケトラーゼの花特異的な発現のための発現ベクターの調製
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタにおけるノストック・パンクチホルムに由来するNP196ケトラーゼの発現を、エンドウの輸送ペプチドrbcSと共に行った (Andersonら、1986, Biochem J. 240：709−715)。この発現を、ペチュニア・ハイブリダ（ Petunia hybrida ）の花特異的プロモーターEPSPS (データベース登録 M37029： ヌクレオチド領域7〜1787; Benfeyら、(1990) Plant Cell 2： 849−856)の制御下で行った。
【０５９４】
ペチュニア・ハイブリダのEPSPSプロモーター領域 (配列番号112)を含むDNA断片を、ゲノムDNA (標準的な方法でペチュニア・ハイブリダから単離したもの)ならびにプライマーEPSPS−1 (配列番号110) およびEPSPS−2 (配列番号111)を用いてPCRによって調製した。
【０５９５】
このPCR条件は以下のとおりであった：
EPSPSプロモーター断片(データベース登録 M37029： ヌクレオチド領域7〜1787)を含むDNAを増幅するためのPCRを、50μlの反応バッチで行った。この反応バッチは、以下を含む：
− 100ngのアラビトプシス・タリアナのゲノムDNA
− 0.25mM dNTP
− 0.2mM EPSPS−1 (配列番号110)
− 0.2mM EPSPS−2 (配列番号111)
− 5μlの10× PCRバッファ(Stratagene)
− 0.25μlのPfuポリメラーゼ(Stratagene)
− 28.8μlの蒸留水。
【０５９６】
このPCRを以下のサイクル条件下で行った：
1×94℃で2分間
35×94℃で1分間
50℃で1分間
72℃で2分間
1×72℃で10分間。
【０５９７】
1773 Bpの増幅生成物を標準的な方法を用いて、PCRクローニングベクターpCR 2.1 (Invitrogen)にクローン化し、そしてプラスミドpEPSPSを得た。
【０５９８】
クローンpEPSPSの配列決定によって、公開されたEPSPS配列(データベース登録 M37029： ヌクレオチド領域7〜1787)とは、２つの欠失(配列M37029の46〜58位におけるctaagtttcagga塩基；配列M37029の1422〜1429位におけるaaaaatat塩基)および塩基の交換(配列M37029の1447位のGに代えてT；配列M37029の1525位のCに代えてA；配列M37029の1627位のGに代えてA)が異なるだけの配列であることを確認した。この２つの欠失および配列M37029の1447位および1627位における２つの塩基の交換は、独立した増幅実験で再現された。従って、これは用いたペチュニア・ハイブリダ植物の実際のヌクレオチド配列を示す。
【０５９９】
従って、このクローンpEPSPSを発現ベクターpJONP196 (実施例5に記載)にクローニングするために用いた。
【０６００】
このクローニングを、pEPSPSから1763 bpのSacI−HindIII断片を単離し、そしてSacI−HindIIIで切断したベクターpJ0NP196にライゲーションして行った。元のプロモーターd35Sに代えてプロモーターEPSPSを含むこのクローンを、pJOESP：NP196と称する。この発現カセットはrbcS輸送ペプチドとのN−末端融合体として正しい向きで断片NP196を含む。
【０６０１】
リコペルシコン・エスクレンタムのノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するEPSPS−制御NP196ケトラーゼのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現ベクターの調製を、バイナリーベクターpSUN3 (WO02／00900)を用いて行った。
【０６０２】
発現ベクターMSP107を調製するために、pJOESP：NP196に由来する2.961 KB bpのSacI−XhoI断片を、SacI−XhoIで切断したベクターpSUN3とライゲートした。この発現ベクターMSP107は、断片EPSPS  EPSPSプロモーター(1761 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP196 KETO CDS (761 bp)（ノストック・パンクチホルム NP196 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０６０３】
タゲテス・エレクタのノストック・パンクチホルムに由来するEPSPS−制御NP196ケトラーゼのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現ベクターの調製を、バイナリーベクターpSUN5 (WO02／00900)を用いて行った。
【０６０４】
発現ベクターMSP108の調製のために、pJOESP：NP196に由来する2,961 KB bpのSacI−XhoI断片を、SacI−XhoIで切断したベクターpSUN5とライゲートした。この発現ベクターMSP108は、断片EPSPS（EPSPSプロモーター）(1761 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP196 KETO CDS (761 bp)（ノストック・パンクチホルム NP196 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０６０５】
実施例 8：
ノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するNP195ケトラーゼの完全な一次配列をコードするDNAの増幅
ノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するNP195ケトラーゼをコードするDNAを、ノストック・パンクチホルム ATCC 29133 (「American Type Culture Collection」株)からPCRによって増幅した。ノストック・パンクチホルム ATCC 29133の懸濁培養に由来するゲノムDNA の調製法を、実施例5に記載した。
【０６０６】
ノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するケトラーゼをコードする核酸を、センス鎖−特異的プライマー(NP195−1、配列番号113)およびアンチセンス鎖−特異的プライマー(NP195−2 配列番号114)を用いた「ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)」によって、ノストック・パンクチホルム ATCC 29133から増幅した。
【０６０７】
このPCR条件は、以下のとおりであった：
完全な一次配列からなるケトラーゼタンパク質をコードするDNAを増幅するためのPCRを、50μlの反応バッチで行った。この反応バッチは、以下を含んだ：
− 1μlのノストック・パンクチホルム ATCC 29133 DNA (上記のように調製したもの)
− 0.25mM dNTP
− 0.2mM NP195−1 (配列番号113)
− 0.2mM NP195−2 (配列番号114)
− 5μlの10× PCRバッファ(TAKARA)
− 0.25μlのR Taqポリメラーゼ(TAKARA)
− 25.8μlの蒸留水。
【０６０８】
このPCRを以下のサイクル条件下で行った：
1×94℃で2分間
35×94℃で1分間
55℃で1分間
72℃で3分間
1×72℃で10分間
配列番号113および配列番号114を用いたPCR増幅によって、完全な一次配列(NP195, 配列番号115)からなるタンパク質をコードする819 bpの断片を生じた。標準的な方法を用いて、この増幅生成物をPCRクローニングベクターpCR 2.1 (Invitrogen)にクローン化し、そしてクローンpNP195を得た。
【０６０９】
M13FプライマーおよびM13Rプライマーを用いたクローンpNP195の配列決定によって、データベース登録 NZ_AABC010001965の55,604〜56,392に由来するDNA配列と、55,604位のTが、標準的な開始コドンであるATGを作製するためにAと置換されていたことを除いて同一である配列が確認された。このヌクレオチド配列は、独立した増幅実験において再現されたため、用いたノストック・パンクチホルム ATCC 29133のヌクレオチド配列を示す。
【０６１０】
従って、このクローンpNP195を発現ベクターpJ0 (実施例5に記載)にクローニングするために用いた。このクローニングを、pNP195から809 BpのSphI断片を単離し、そしてSphIで切断したベクターpJOにライゲーションして行った。このクローンは、rbcS輸送ペプチドとのN−末端融合タンパク質として正しい向きでノストック・パンクチホルムのNP195ケトラーゼを含み、pJONP195と称される。
【０６１１】
実施例 9：
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタにおけるノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するNP195ケトラーゼの構成的な発現のための発現ベクターの調製
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタにおけるノストック・パンクチホルムに由来するNP195ケトラーゼの発現を、アラビトプシス・タリアナの構成的なプロモーターFNR (フェレドキシン−NADPH 酸化還元酵素、データベース登録 AB011474、70127位〜69493位; WO03／006660)の制御下で行った。このFNR遺伝子は、第69492塩基対で開始し、「フェレドキシン−NADP+ 還元酵素」と注釈される。この発現をエンドウの輸送ペプチドrbcSと共に行った (Anderson ら、1986, Biochem J. 240：709−715)。
【０６１２】
従って、このクローンpFNR (実施例 6に記載される)を、発現ベクターpJONP195 (実施例 8に記載される)にクローニングするために用いた。
【０６１３】
このクローニングを、pFNRから644 bpのSma−HindIII断片を単離し、Ecl136II−HindIIIで切断したベクターpJONP195にライゲーションすることによって行った。このクローンは、元のプロモーターd35Sに代えてプロモーターFNRおよびrbcS輸送ペプチドとのN−末端融合体として正しい向きで断片NP195を含み、pJOFNR：NP195と称される。
【０６１４】
リコペルシコン・エスクレンタムのノストック・パンクチホルムのNP195ケトラーゼのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現カセットの調製を、バイナリーベクターpSUN3 (WO02／00900)を用いて行った。
【０６１５】
発現ベクターMSP109の調製のために、pJOFNR：NP195に由来する1,866 bpのEcoRI−XhoI断片を、EcoRI−XhoIで切断したベクターpSUN3とライゲートした。この発現ベクターMSP109は、断片FNRプロモーター  FNRプロモーター(635 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP195 KETO CDS (789 bp)（ノストック・パンクチホルム NP195 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０６１６】
タゲテス・エレクタのノストック・パンクチホルム・パンクチホルムに由来するNP195ケトラーゼを含む発現ベクターのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現カセットの調製をバイナリーベクターpSUN5 (WO 02／00900)を用いて行った。
【０６１７】
タゲテス発現ベクターMSP110の調製のために、pJOFNR：NP195に由来する1,866 bpのEcoRI−XhoI断片を、EcoRI−XhoIで切断したベクターpSUN5とライゲートした。この発現ベクターMSP110は、断片FNRプロモーター  FNRプロモーター(635 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP195 KETO CDS (789 bp)（ノストック・パンクチホルム NP195 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０６１８】
実施例 10：
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタにおけるノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するNP195ケトラーゼの花特異的な発現のための発現ベクターの調製
リコペルシコン・エスクレンタムおよびタゲテス・エレクタにおけるノストック・パンクチホルムに由来するNP195ケトラーゼの発現を、エンドウの輸送ペプチドrbcS (Andersonら、1986, Biochem J. 240：709−715)と共に行った。この発現をペチュニア・ハイブリダに由来する花特異的プロモーターEPSPS (データベース登録 M37029： ヌクレオチド領域7〜1787位; Benfeyら(1990) Plant Cell 2： 849−856)の制御下で行った。
【０６１９】
従って、このクローンpEPSPS (実施例 7に記載される)を、発現ベクターpJONP195 (実施例 8に記載される)にクローニングするために用いた。
【０６２０】
このクローニングを、pEPSPS から1763 bpのSacI−HindIII断片を単離し、そしてSacI−HindIIIで切断したベクターpJ0NP195にライゲーションすることによって行った。このクローンは、元のプロモーターd35Sに代えてプロモーターEPSPSを含み、pJOESP：NP195と称される。この発現カセットは、rbcS輸送ペプチドとのN−末端融合体として正しい向きで断片NP195を含む。
【０６２１】
リコペルシコン・エスクレンタムのノストック・パンクチホルム ATCC 29133に由来するEPSPS−制御NP195ケトラーゼのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現ベクターの調製を、バイナリーベクターpSUN3 (WO02／00900)を用いて行った。
【０６２２】
発現ベクターMSP111の調製のために、pJOESP：NP195に由来する2,988 KB bpのSacI−XhoI断片を、SacI−XhoIで切断したベクターpSUN3とライゲートした。この発現ベクターMSP111は、断片EPSPS（EPSPSプロモーター）(1761 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP195 KETO CDS (789 bp)（ノストック・パンクチホルム NP195 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０６２３】
タゲテス・エレクタのノストック・パンクチホルムに由来するEPSPS−制御NP195ケトラーゼのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現ベクターの調製をバイナリーベクターpSUN5 (WO02／00900)を用いて行った。
【０６２４】
発現ベクターMSP112の調製のために、pJOESP：NP195に由来する2,988 KB bpのSacI−XhoI断片を、SacI−XhoIで切断したベクターpSUN5とライゲートした。この発現ベクターMSP112は、断片EPSPS  EPSPSプロモーター(1761 bp)、断片rbcS TP断片（エンドウのrbcS輸送ペプチド）(194 bp)、断片NP195 KETO CDS (789 bp)（ノストック・パンクチホルム NP195 ケトラーゼをコードする）、断片OCSターミネーター(192 bp)（オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル）を含む。
【０６２５】
実施例 11：
リコペルシコン・エスクレンタムに由来するクロマトブラスト（chromatoplast）−特異的β−水酸化酵素の花特異的な過剰発現のための発現カセットの調製
タゲテス・エレクタのリコペルシコン・エスクレンタムに由来するクロマトブラスト−特異的β−水酸化酵素の発現を、ペチュニアに由来する花特異的プロモーターEPSPSの制御下で行う(実施例 7)。ターミネーター・エレメントとして、ビシア・ファバ（Vicia faba）に由来する LB3を用いる。このクロマトブラスト−特異的β−水酸化酵素の配列を、RNA単離、逆転写およびPCRによって調製した。
【０６２６】
ビシア・ファバに由来するLB3ターミネーター配列の調製のために、ビシア・ファバ組織からゲノムDNAを、標準的な方法で単離し、そしてプライマーPR206およびプライマーPR207を用いたゲノムPCRに使用する。このLB3 DNA断片を増幅するためのPCRを、50μlの反応バッチで行う。この反応バッチは、以下のものを含む：
− 1μlのcDNA (上記のように調製したもの)
− 0.25mM dNTP
− 0.2μM  PR206 (配列番号116) 
− 0.2μM  PR207 (配列番号117) 
− 5μlの10× PCRバッファ(TAKARA)
− 0.25μlのR Taqポリメラーゼ(TAKARA)
− 28.8μlの蒸留水。
【０６２７】
PR206およびPR207を用いたPCR増幅によって、LBターミネーターを含む0.3 kbの断片を生じる。この増幅生成物を、クローニングベクターpCR−BluntII (Invitrogen)にクローン化する。プライマーT7およびプライマーM13を用いた配列決定によって、配列番号118の配列と同一である配列を確認する。このクローンを、pTA−LB3と称し、ベクターpJIT117 (以下を参照のこと)にクローニングするために用いる。
【０６２８】
β−水酸化酵素配列の調製のために、トマトに由来する全RNAを調製する。このために、100 mgの凍結し、粉砕された花を、反応容器に移し、0.8mlのTrizolバッファ(LifeTechnologies)にとる。この懸濁液を0.2 mlのクロロホルムで抽出する。12,000 gで15分間の遠心分離の後、この水溶性の上清を取り出し、新しい反応容器に移し、そして等量のエタノールを用いて抽出する。このRNAを等量のイソプロパノールを用いて沈殿させ、75% エタノールで洗浄し、そしてこのペレットをDEPC水(1000分の1量のジエチルピロカーボネートを用いて室温で一晩インキュベートし、その後オートクレーブしたもの)に溶解する。このRNA濃度を、光度計によって決定する。cDNA合成のために、2.5 ugの全RNAを、60℃で10分間変性させ、氷上で2分間冷却し、そして取扱説明書に従ってcDNAキット(Ready−to−go−you−prime−beads, Pharmacia Biotech)を用いて、cDNAのアンチセンス鎖−特異的プライマー(PR215 配列番号119)を使用して転写させる。
【０６２９】
続くPCR反応の条件は、以下のとおりである：
β−水酸化酵素をコードするVPR203−PR215 DNA断片を増幅するためのPCRを、50μlの反応バッチで行う。この反応バッチは、以下を含んだ：
− 1μlのcDNA (上記のように調製したもの)
− 0.25mM dNTP
− 0.2μM  VPR203 (配列番号120) 
− 0.2μM  PR215 (配列番号119) 
− 5μlの10× PCRバッファ(TAKARA)
− 0.25μlのR Taqポリメラーゼ(TAKARA)
− 28.8μlの蒸留水
VPR203およびPR215を用いたPCR増幅によって、β−水酸化酵素をコードする0.9 kbの断片を生じる。この増幅生成物クローニングベクターpCR−BluntII (Invitrogen)にクローン化する。プライマーT7およびプライマーM13を用いた配列決定によって、配列番号121の配列と同一である配列を確認する。このクローンを、pTA−CrtR−b2と称し、ベクターpCSP02 (以下を参照のこと)にクローニングするために用いる。
【０６３０】
ペチュニアに由来するEPSPSプロモーター配列を、プラスミドMSP107 (実施例 7を参照のこと)ならびにプライマーVPR001およびプライマーVPR002を使用するPCR増幅によって調製する。このEPSPS−DNA断片を増幅するためのPCRを、50μlの反応バッチで行う。この反応バッチは、以下を含む：
− 1μlのcDNA (上記のように調製したもの)
− 0.25mM dNTP
− 0.2μM  VPR001 (配列番号122) 
− 0.2μM  VPR002 (配列番号123) 
− 5μlの10× PCRバッファ(TAKARA)
− 0.25μlのR Taqポリメラーゼ(TAKARA)
− 28.8μlの蒸留水。
【０６３１】
VPR00およびVPR002を用いたPCR増幅によって、EPSPSプロモーターをコードする1.8 kbの断片を生じる。この増幅生成物をクローニングベクターpCR−BluntII (Invitrogen)にクローン化する。プライマーT7およびプライマーM13を用いた配列決定によって、配列番号124の配列と同一の配列を確認する。このクローンを、pTA−EPSPSと称し、ベクターpCSP03 (以下を参照のこと) にクローニングするために用いる。
【０６３２】
第一のクローニング工程を、クローニングベクターpCR−BluntII (Invitrogen)に由来するpTA−LB3から、0.3 kbのPR206−PR207 EcoRI−XhoI断片を単離し、そしてEcoRI−XhoIで切断したベクターpJIT117とライゲーションすることによって行う。このクローンは、0.3 kbのターミネーターLB3を含み、pCSP02と称する。
【０６３３】
第二のクローニング工程を、クローニングベクターpCR−BluntII (Invitrogen)に由来するpTA−CrtR−b2から、0.9 kbのVPR003−PR215 EcoRI−HindIII断片を単離し、そしてEcoRI−HindIIIで切断したベクターpCSP02とライゲーションすることによって行う。このクローンは、0.9 kbのβ−水酸化酵素断片CrtR−b2を含み、pCSP03と称する。このライゲーションにより、ターミネーターLB3とβ−水酸化酵素断片CrtR−b2との間に転写融合を生じる。
【０６３４】
第三のクローニング工程を、クローニングベクターpCR−BluntII (Invitrogen)に由来するpTA−EPSPSから、1.8 kbのVPR001−VPR002 NcoI−SacI断片を単離し、そしてNcoI−SacIで切断したベクターpCSP03とライゲーションすることによって行う。このクローンは、1.8 kbのEPSPSプロモーター断片を含み、pCSP04と称される。このライゲーションにより、EPSPSプロモーターとβ−水酸化酵素断片CrtR−b2との間に転写融合を生じる。pCSP04は、断片断片EPSPS (1792 bp)（EPSPSプロモーター）、断片crtRb2 (929 bp)（β−水酸化酵素 CrtRb2）、断片LB3 (301 bp)（LB3ターミネーター）を含む。
【０６３５】
タゲテス・エレクタのアグロバクテリウムによる形質転換のための発現ベクターにおける水酸化酵素−過剰発現カセットをクローニングするために、このβ−水酸化酵素カセットを、3103 bpのEcl136II−XhoI断片として単離する。3’末端の充填(30℃で30分間)を標準的な方法(Klenow充填)によって行なう。
【０６３６】
この発現ベクターを、pCSEbhydと称する。
【０６３７】
実施例 12：
プロモーターP76の制御下のリコペルシコン・エスクレンタムに由来する有色体−特異的リコピンβ−Cシクラーゼの花特異的な発現およびEPSPSプロモーター制御下のノストック・パンクチホルム ATCC 29133由来するケトラーゼNP196の花特異的な発現のための発現ベクターの調製
鋳型としてアラビトプシス・タリアナに由来するゲノムDNAを用いたPCRによるプロモーターP76 (配列番号125)の単離。
【０６３８】
この単離のために、オリゴヌクレオチドプライマーP76順方向(配列番号126)およびオリゴヌクレオチドプライマーP76逆方向(配列番号127)を用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、5’リン酸残基を伴い合成中に供給した。
【０６３９】
P76順方向5’−CCCGGGTGCCAAAGTAACTCTTTAT−3’
P76逆方向5’−GTCGACAGGTGCATGACCAAGTAAC−3’
このゲノムDNAを、示されたとおりに(Galbiati Mら、Funct. Integr. Genomics 2000, 20 1：25−34) アラビトプシス・タリアナから単離した。
【０６４０】
このPCR増幅を以下のとおりに行なった：
最終容量25μl中、
80ngのゲノムDNA
1×Expand Long Template PCRバッファ
2.5mM  MgCl2
各350μM  dATP, dCTP, dGTP, dTTp
各300nM  各プライマー
2.5 単位のExpand Long Template ポリメラーゼ
以下の温度プログラムを用いる：
94℃で120秒間を1サイクル
94℃で10秒間、
48℃で30秒間および
68℃で3分間を35サイクル
68℃で10分間を1サイクル。
【０６４１】
このPCR生成物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、そしてこの1032 bpの断片を、ゲル溶出によって単離する。
【０６４２】
ベクターpSun5を、制限酵素EcoRVで消化し、さらにアガロースゲル電気泳動によて精製し、そしてゲル溶出によって回収する。
【０６４３】
精製したPCR生成物を上記のように処理したベクターにクローン化する。
【０６４４】
この構築物を、p76として示す。アラビドプシス（Arabidopsis）に由来するプロモーターP76を示す1032 bp長の断片を配列決定した(配列番号131)。
【０６４５】
ターミネーター35STを、制限酵素KpnIおよびSmaIを用いて消化することによって、pJIT 117から得る。この方法で生じた969 bpの断片をアガロースゲル電気泳動を用いて精製し、そしてゲル溶出によって単離する。
【０６４６】
ベクターp76をさらに、制限酵素のKpnIおよびSmaIを用いて消化する。生じた7276bpの断片をアガロースゲル電気泳動を用いて精製し、そしてゲル溶出によって単離する。
【０６４７】
上記のようにして得た35ST 断片を上記のように処理したベクターp76にクローン化する。
【０６４８】
生じたベクターを、p76_35STと示す。
【０６４９】
ビージーン（Bgene）(配列番号128)の単離を、リコペルシコン・エスクレンタムのゲノムDNAを鋳型として用いたPCRによって行った。
【０６５０】
このPCRに、オリゴヌクレオチドプライマー・ビージーン順方向(配列番号129)およびオリゴヌクレオチドプライマー・ビージーン逆方向(配列番号130)を用いた。このオリゴヌクレオチドを、5’リン酸残基を伴い合成中に供給した。
【０６５１】
配列番号129：ビージーン順方向：5’−CTATTGCTAGATTGCCAATCAG−3’
配列番号130：ビージーン逆方向：5’−ATGGAAGCTCTTCTCAAG−3’
このゲノムDNAを報告されるように(Galbiati Mら、Funct. Integr. Genomics 2000, 20 1：25−34) 、リコペルシコン・エスクレンタムから単離した。
【０６５２】
このPCR増幅を以下のとおりに行った：
最終容量25μl中、
80 ngのゲノムDNA
1×Expand Long Template PCRバッファ
2.5mM  MgCl2
各350μMのdATP, dCTP, dGTP, dTTp
各300nMの各プライマー
2.5単位のExpand Long Template ポリメラーゼ。
【０６５３】
以下の温度プログラムを用いた：
94℃で120秒間を1サイクル
94℃で10秒間、
48℃で30秒間および
68℃で3分間を35サイクル
68℃で10分間を1サイクル。
【０６５４】
このPCR生成物を、アガロースゲル電気泳動を用いて単離し、そして1665 bpの断片をゲル溶出によって単離した。
【０６５５】
上記ベクターp76_35STを制限酵素のSmaIで消化し、そしてさらにアガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲル溶出によって回収する。
【０６５６】
この精製したPCR生成物を、上記のように処理したベクターにクローン化する。
【０６５７】
この構築物を、pBと示す。トマトのビージーンを示す1486 bp長の断片を、配列決定した。このヌクレオチド配列は、データベース登録 AF254793 (配列番号 1)と同一である。
【０６５８】
pBを制限酵素のPmeIおよびSspIで消化し、そしてプロモーターP76、ビージーンおよび35STを含む3906bpの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、ゲル溶出によって回収する。
【０６５９】
MSP108 (実施例 7)を制限酵素 Ecl126IIを用いて消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そしてゲル溶出によって回収する。
【０６６０】
pBに由来するプロモーターP76、ビージーンおよび35STを含む、精製した3906bpの断片を上記のように処理したベクターMSP108にクローン化する。
【０６６１】
この構築物をpMKP1と示す。
【０６６２】
実施例 13：
遺伝子導入したリコペルシコン・エスクレンタム植物の調製および分析
トマト植物の形質転換および再生を、報告されたLingらの方法(Plant Cell Reports (1998), 17：843−847)に従って行った。種々のマイクロトム（Microtom）について、高濃度のカナマイシン(100mg／l)を用いて選択を行った。
【０６６３】
形質転換のための出発外植片として、7〜10日齢のマイクロトム(Microtom)系統の苗木の子葉および胚軸を用いた。発芽のために、MurashigeおよびSkoogによる培養培地（2%スクロース含有、pH 6.1）(1962： MurashigeおよびSkoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473−)を用いた。21℃でわずかな明かり(20〜100 μE)を用いて発芽を行った。7〜10日後、子葉を斜めに分割し、胚軸を約5〜10 mmの長さの切片に切断し、そしてMSBN培地(MS, pH 6.1, 3%スクロース + 1mg／lのBAP, 0.1mg／lのNAA)に置いた。このMSBN培地は、前日に懸濁培養したトマト細胞でコートした。このトマト細胞を、泡が入らないようにして滅菌したろ紙でカバーした。上記培地上での外植片の前培養を、3〜5日間行った。アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404（Agrobacterium tumefaciens LBA4404）株の細胞を、上記プラスミドを用いてそれぞれ形質転換した。それぞれの場合において、バイナリーベクターでそれぞれ形質転換させたアグロバクテリウム株を、カナマイシン(20mg／l)含有YEB培地中、28℃で一晩培養し、そしてこの細胞を遠心分離した。この細菌のペレットをMS液体培地(3%スクロース, pH 6.1)を用いて再懸濁し、そして光学濃度を0.3 (600 nmにおいて)に調節した。前培養した外植片を、この懸濁液に移し、わずかに振動させながら室温で30分間インキュベートした。その後、この外植片を滅菌したろ紙を用いて乾燥させ、3日間共培養する(21℃で)ために前培養培地に戻した。
【０６６４】
共培養の後、この外植片をMSZ2培地(MS pH 6.1 + 3%スクロース、2mg／lのゼアチン、100mg／lのカナマイシン、160mg／lのチメンチン（timentin）)に移し、21℃における弱条件(20〜100μE、光周期16 h／8 h)で、選択的な再生のために保存した。新芽が形成されるまで、2〜3週間ごとに外植片の移動を行った。外植片から小さな新芽を切り離し、MS (pH 6.1 + 3%スクロース) 160mg／lのチメンチン、30mg／lのカナマイシン、0.1mg／lのIAAに植え付けることは可能であった。植え付けた植物を、温室に移動させた。
【０６６５】
上記の形質転換法に従って、以下の発現構築物を用いて、以下の系統を得た：
MSP105を用いて：msp105−1、msp105−2、msp105−3を得た。
【０６６６】
MSP107を用いて：msp107−1、msp107−2、msp107−3を得た。
【０６６７】
MSP109を用いて：msp109−1、msp109−2、msp109−3を得た。
【０６６８】
MSP111を用いて：msp111−1、msp111−2、msp111−3を得た。
【０６６９】
実施例 14： 
遺伝子導入したタゲテス植物の調製
タゲテスの種子を滅菌し、発芽培地(MS培地; MurashigeおよびSkoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473−497) pH 5.8、2%スクロース)に置く。発芽を28℃／20〜200μE／3〜16週間の温度／光／時間間隔、好ましくは、21℃、20〜70 mE、4〜8週間で行う。
【０６７０】
それまでに発生したin vitroの植物のすべての葉を回収し、葉の中心の主脈を横断して切断する。そのようにして得た10〜60 mm2の大きさの葉の外植片を、室温でおよそ2時間、MS液体培地中で、調製の間保存する。
【０６７１】
任意の所望されるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株、好ましくは非常に毒性の強い株、例えば、適切なバイナリープラスミド（選択マーカー遺伝子（好ましくは、barもしくはpat）および一つ以上の形質遺伝子またはレポーター遺伝子を含む）を有するEHA105を、一晩培養し、上記の葉の材料と共培養するために用いる。細菌株の培養を以下のように行うことができる：適切な株の個々のコロニーを、25mg／lのカナマイシンを含むYEB (0.1% 酵母エキス、0.5% 牛肉エキス、0.5% ペプトン、0.5%スクロース、0.5%硫酸マグネシウム７水和物)に接種し、そして28℃で16〜20時間培養する。その後、この細菌懸濁液を回収し、6000 gで10分間遠心分離し、約0.1〜0.8のOD600を生じるようにMS液体培地に再懸濁する。この懸濁液を、上記の葉の材料と共培養するために用いる。
【０６７２】
共培養する直前に、その中に上記の葉が保存されているMS培地を、細菌懸濁液と置換する。アグロバクテリウム懸濁液中での葉のインキュベーションを、室温でわずかに振とうさせながら30分間行った。その後、感染させた外植片を、増殖レギュレーター（例えば、3mg／lのベンジルアミノプリン(BAP)および1mg／lのインドール酢酸 (IAA)）を含むアガー（例えば、0.8% 植物アガー(Duchefa, NL)−固体化MS培地）上に置く。培地上の葉の向きは関係ない。外植片の培養を1〜8日間、好ましくは6日間行い、この培養については以下の条件で行うことができる；光強度：30〜80 μMol／m2×秒間、温度：22〜24℃、16／8時間の明／暗変化。その後、この共培養した外植片を、新しいMS培地（好ましくは同一の増殖レギュレーターを含む）に移す。この第二の培地はさらに、細菌の増殖を抑制するための抗生物質を含む。この目的に200〜500mg／lの濃度のチメンチンが非常に適している。第二の選択的構成成分として、形質転換の結果を選択するための構成成分を使用する。1〜5mg／lの濃度のホスフィノスリシンが非常に効率的に選択するが、他の選択的構成成分もまた、用いられる方法によってありうる。
【０６７３】
それぞれ1〜3週間後、新しい培地への外植片の移動を、新芽および小さな芽が伸びるまで行う。次いで、これらをチメンチンおよびPPT または増殖レギュレーターを含む代替的な構成成分（すなわち、例えば、0.5mg／lのインドール酪酸 (IBA)および0.5mg／lのジベレリン酸GA3）を含む同一の基礎培地に根付かせるために移動させる。根付いた新芽は、温室へ移動させることができる。
【０６７４】
記載した方法に加えて、以下の有利な改変が可能である：
・外植片を細菌に感染させる前に、これらを上記の培地上で1〜12日間、好ましくは3〜4日間、共培養のために前培養することができる。その後、感染、共培養および選択的再生を上記のように行う。
【０６７５】
・再生のpH（一般的にpH 5.8 )を、pH 5.2まで下げることができる。そうすることによって、アグロバクテリウムの増殖の制御を改良することができる。
【０６７６】
・再生培地にAgNO3 (3〜10mg／l)を添加することによって、再生自体を含む培養の条件を改良する。
【０６７７】
・フェノール形成を減少させ、かつ当業者に公知である構成成分（例えば、クエン酸、アスコルビン酸、PVP および非常に多くの別の構成成分）は、培養にポジティブな効果をもたらす。
【０６７８】
・培養用液体培地をさらに、全工程に用いることができる。培養はまた、液体培地上に配置する商業的に利用可能な担体上でインキュベートすることができる。
【０６７９】
上記の形質転換法に従って、以下の発現構築物を用いて以下の系統を得た：
MSP106を用いて、msp106−1, msp106−2, msp106−3を得た。
【０６８０】
MSP108を用いて、msp108−1, msp108−2, msp108−3を得た。
【０６８１】
MSP110を用いて、msp110−1, msp110−2, msp110−3を得た。
【０６８２】
MSP112を用いて、msp112−1, msp112−2, msp112−3を得た。
【０６８３】
pCSEbhydを用いて、csebhyd−1, csebhyd−2, csebhyd−3を得た。
【０６８４】
pMKP1.を用いて、mkp1−1, mkp1−2, mkp1−3を得た。
【０６８５】
実施例 15：
植物材料に由来するカロテノイドエステルの酵素リパーゼ−触媒加水分解およびそのカロテノイドの同定
一般的な作業方法：
a)乳鉢中で粉砕された植物材料(例えば、花弁材料) (30〜100mgの生組織重量)を、100% アセトンを用いて抽出する(500μlで3回；それぞれ振とうさせながら約15分間)。この溶媒を蒸発させる。その後、カロテノイドを495μlのアセトンにとり、4.95 mlのリン酸カリウムバッファ(100mM、pH 7.4)を加え、そしてこの溶液をよく混合する。次いで、約17 mgの胆汁塩(Sigma)および149 μlのNaCl／CaCl2溶液 (3M NaClおよび75mM CaCl2)の添加を行う。この懸濁液を、37℃で30分間インキュベートする。カロテノイドエステルの酵素による加水分解のために、595μlのリパーゼ溶液(50mg／mlのカナダ・ルゴサ(Candida rugosa)に由来するリパーゼ7型(Sigma))を加え、振とうしながら37℃でインキュベートする。約21時間後、37℃で少なくとも5時間の新たなインキュベーションの際に595μlのリパーゼの添加をさらに行った。その後、約700mgのNa2SO4をこの溶液に溶解する。1800μlの石油エーテルの添加の後、激しく混合することによって、カロテノイドを有機相に抽出する。振とうによるこの抽出を、有機相が無色のままである間、繰り返し行う。この石油エーテルの画分を混合し、そして石油エーテルを蒸発させる。遊離カロテノイドを、100〜120μlのアセトンにとる。HPLCおよびC30逆相カラムによって、遊離カロテノイドを、保持時間およびUV−VISスペクトルに基づいて同定できる。
【０６８６】
用いる胆汁塩または胆汁酸塩は、コール酸およびデオキシコール酸の1：1の混合物である。
【０６８７】
b)少量のカロテノイドエステルのみが植物材料内に存在する場合に、取り上げのための作業方法
代替的に、カロテノイドエステルの加水分解を、薄層クロマトグラフィーによる分離の後、カナダ・ルゴサに由来するリパーゼによって達成できる。このために、50〜100mgの植物材料を、約750μlのアセトンを用いて3回抽出する。この溶媒抽出物を、真空でロータリーエバポレーター(40〜50℃に上昇した温度に耐えうる)によって濃縮する。次いで、300μlの石油エーテル：アセトン (5：1の比)の添加、および徹底的な混合を行う。懸濁した材料を遠心分離(1〜2分間)によって沈殿させる。この上相を新しい反応容器に移す。この残りの残渣をさらに、200μlの石油エーテル：アセトン(5：1の割合)を用いて抽出し、そして懸濁した材料を遠心分離によって取り除く。この2つの抽出物を合わせ(500μl容量)、そしてこの溶媒を蒸発させる。この残渣を30μl の石油エーテル：アセトン (5：1の比)に懸濁し、薄層プレート(シリカゲル 60, Merck)にアプライする。1回以上のアプリケーションが、分取／分析工程に必要とされる場合、それぞれ50〜100mg の生体組織重量を有する複数のアリコートを、薄層クロマトグラフィーによる分離のために上記の方法で用意しなければならない。
【０６８８】
この薄層プレートを、石油エーテル：アセトン (5：1の割合)中で現像する。カロテノイドのバンドを、これらの色によって視覚的に同定することができる。個々のカロテノイドのバンドを、こそぎ取り、そして分取／分析工程のためにプールすることができる。アセトンを用いて、カロテノイドをこのシリカ材料から溶出し；この溶媒を真空で蒸発させる。カロテノイドエステルの加水分解のために、この残渣を495μlのアセトンに溶解させ、17mgの胆汁塩(Sigma)、4.95mlの0.1M リン酸カリウムバッファ(pH 7.4) および149μl (3M NaCl、75mM CaCl2)を加える。完全に混合した後、この溶液を37℃で30分間平衡化させる。次いで、595μlのカナダ・ルゴサのリパーゼ(Sigma、5mM CaCl2中50mg／mlのスットク溶液)の添加を行う。37℃で振とうしながらリパーゼとともに一晩、インキュベーションを行う。約21時間後、等量のリパーゼをさらに加え、この混合物を37℃で振とうしながら少なくとも5時間、さらにインキュベートする。次いで700mgのNa2SO4 (無水)の添加を行い、この混合物を1800μlの石油エーテルを用いて約1分間振とうすることによって抽出し、そしてこの混合物を3500回転／分で5分間、遠心分離する。この上相を新しい反応容器に移し、そしてこの上相が無色になるまで、振とうしながら抽出を繰り返す。合わせた石油エーテル相を真空で濃縮する(40℃〜50℃の温度が可能である)。この残渣を120μlのアセトンに溶解する（必要であれば超音波を用いる）。溶解したカロテノイドをC30カラムを用いたHPLCによって分離し、そして基準物質によって定量することができる。
【０６８９】
実施例 16：
遊離型カロテノイドのHPLC分析
実施例 15の作業方法によって得たサンプルの分析を以下の条件下で行う：
以下にHPLC条件を示した。
【０６９０】
分離カラム：Prontosil C30カラム, 250×4.6mm, (Bischoff, Leonberg, Germany)
流速：  1.0ml／分
溶出剤：溶出剤A − 100 % メタノール
溶出剤B − 80% メタノール、0.2% 酢酸アンモニウム
溶出剤C − 100% t−ブチルメチルエーテル
検出：300〜530 nm
2007502605.tif 000005
本発明によって形成されるカロテノイドのある典型的な保持時間は、例えば、以下のとおりである：
ビオラキサンチン11.7分間、アスタキサンチン17.7分間、アドニキサンチン19分間、アドニルビン（adonirubin）19.9分間、ゼアキサンチン21分間。
【配列表】
2007502605000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月14日(2006.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子的に改変された非ヒト生物を培養することによってケトカロテノイドを製造する方法であって、該非ヒト生物は、野生型と比べて、改変されたケトラーゼ活性および改変されたβ−シクラーゼ活性を有し、該改変されたβ−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって生じる、上記方法。
【請求項２】
前記野生型として、既にケトラーゼ活性を有する非ヒト生物が使用される、かつ前記遺伝子改変によって野生型と比べてケトラーゼ活性の増加が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケトラーゼ活性を増加させるために、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比べて増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子発現を増加させるために、ケトラーゼをコードする核酸が前記生物に挿入される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ケトラーゼをコードする核酸として、配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号4のアミノ配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むケトラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型として、ケトラーゼ活性を有しない非ヒト動物を使用する、かつ前記遺伝子改変によって野生型と比べてケトラーゼ活性が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子導入によってケトラーゼを発現する遺伝子的に改変された生物が用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現を引き起こすために、ケトラーゼをコードする核酸が前記生物へ挿入される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号4の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むケトラーゼをコードする核酸が挿入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子的に改変された非ヒト生物であって、ここで該遺伝子改変が、
Ａ  野生型生物が既にケトラーゼ活性を有している場合に、該野生型と比べてケトラーゼ活性を増加させる、および
Ｂ  野生型生物がケトラーゼ活性を有しない場合に、該野生型と比べてケトラーゼ活性を生じさせる、
ならびに、該遺伝子改変が、
Ｃ  野生型生物が既にβ−シクラーゼ活性を有している場合に、該野生型と比べてβ−シクラーゼ活性を増加させる、および
Ｄ  野生型生物がβ−シクラーゼ活性を有しない場合に、該野生型と比べてβ−サイクレース活性を生じさせる、
ならびに、Ｃに従って増加された該β−シクラーゼ活性またはＤに従って生じる該β−シクラーゼ活性は、配列番号2のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導される、該配列番号2の配列とアミノ酸レベルで少なくとも70%の同一性を有する配列、を含むβ−シクラーゼによって引き起こされる、上記遺伝子改変された非ヒト生物。
【国際調査報告】
2007502605.tif 000218
2007502605.tif 000219
2007502605.tif 000220
2007502605.tif 000221
2007502605.tif 000222
2007502605.tif 000223