(57)【要約】【課題】患者の生体サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づいた乳癌患者の予後診断を提供すること。【解決手段】一群の遺伝子の発現を分析して乳癌の予後診断をする方法。マイクロアレイなどの様々な媒体での遺伝子発現プロファイルが、このような媒体を含むキットに含められる。【選択図】図１Ａ
2007528218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の状態を評価するための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、乳癌の状態を示唆している、
方法。
【請求項２】
乳癌患者のステージを求めるための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、乳癌のステージを示唆している、
方法。
【請求項３】
乳癌患者の治療プロトコルを決定するための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨される療法の程度および種類を医師が決定できるように再発のリスクを十分に示唆している、
方法。
【請求項４】
乳癌患者を治療するための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発の高いリスクを示唆している、
方法。
【請求項５】
乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを交差検証するための方法において、
（ａ）統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップと、
（ｂ）サンプルの順番をランダムにするステップと、
（ｃ）１０％〜５０％のサンプルからのデータを除外するステップと、
（ｄ）残りのサンプルに対して、全ての変数について目的の因子を計算して、ｐ値カットオフ（ｐ）を満たす変数を選択するステップと、
（ｅ）前方検索を用いて予測モデルに適合する変数を選択し、所定の誤差率になるまでトレーニング誤差（training error）を評価するステップと、
（ｆ）残りの１０％〜５０％のサンプルに対して前記予測モデルを試験するステップと、
（ｇ）除外したサンプルの新しいセットでステップ（ｃ）‐（ｆ）を繰り返すステップと、
（ｈ）サンプルの１００％の試験が終わるまでステップ（ｃ）‐（ｇ）を繰り返して、分類結果を記録するステップと、
を含む、方法。
【請求項６】
乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを単独で検証する方法において、
（ａ）統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップと、
（ｂ）前記遺伝子発現データにおける供給元によるばらつき（source variabilities）を標準化するステップと、
（ｃ）既に選択されている全ての変数について目的の因子を計算するステップと、
（ｄ）前記サンプルに対して予測モデルを試験して分類結果を記録するステップと、
を含む、方法。
【請求項７】
乳癌患者の予後診断を可能にする再発ハザードスコア（Relapse Hazard Score）を生成する方法において、
（ａ）統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップと、
（ｂ）前記データに対してコックスの単変量回帰分析（univariate Cox's regression analysis）を適用して選択遺伝子を得るステップと、
（ｃ）標準コックス係数（standard Cox's coefficients）を用いて前記選択遺伝子に重み付けした発現レベルを適用して、再発ハザードスコアとして適用されうる予測モデルを得るステップと、
を含む、方法。
【請求項８】
乳癌予後診断患者レポートを作成する方法において、
（ａ）患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）前記サンプルの遺伝子発現を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果に対して再発ハザードスコア（Relapse Hazard Score）を適用するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得た前記結果を用いて前記レポート作成するステップと、
を含む、方法。
【請求項９】
組成物において、
（ｉ）配列番号１‐１１１、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓ、
からなる群から選択される少なくとも１つのプローブセットを含む、
組成物。
【請求項１０】
生体サンプルにおいて乳癌の予後診断を決定するアッセイを行うためのキットにおいて、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部を検出するための物質、
を含む、キット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットにおいて、
前記配列番号が３６‐９５である、キット。
【請求項１２】
請求項１０に記載のキットにおいて、
前記配列番号が９６‐１１１である、キット。
【請求項１３】
請求項１０に記載のキットにおいて、
前記配列番号が３６‐１１１である、キット。
【請求項１４】
請求項１０に記載のキットにおいて、
マイクロアレイ分析を行うための試薬をさらに含む、キット。
【請求項１５】
請求項１０に記載のキットにおいて、
前記核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、方法。
【請求項１６】
乳癌の状態を評価するための物品において、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部を検出するための物質、
を含む、物品。
【請求項１７】
請求項１６に記載の物品において、
前記配列番号が３６‐９５である、物品。
【請求項１８】
請求項１６に記載の物品において、
前記配列番号が９６‐１１１である、物品。
【請求項１９】
請求項１６に記載の物品において、
前記配列番号が３６‐１１１である、物品。
【請求項２０】
請求項１６に記載の物品において、
マイクロアレイ分析を行うための試薬をさらに含む、物品。
【請求項２１】
請求項１６に記載の物品において、
前記核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、物品。
【請求項２２】
請求項１、２、３、または４に記載の方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のマイクロアレイにおいて、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部、
を含み、
前記遺伝子の組合せが、生体サンプルにおける乳癌の状態または再発のリスクを特徴付けるのに十分である、
マイクロアレイ。
【請求項２４】
請求項２２に記載のマイクロアレイにおいて、
測定または特徴付けが、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現である、マイクロアレイ。
【請求項２５】
請求項２２に記載のマイクロアレイにおいて、
測定により、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られる、マイクロアレイ。
【請求項２６】
請求項２２に記載のマイクロアレイにおいて、
前記ｐ値が０．０５未満である、マイクロアレイ。
【請求項２７】
請求項２２に記載のマイクロアレイにおいて、
ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含む、マイクロアレイ。
【請求項２８】
請求項２２に記載のマイクロアレイにおいて、
１または複数の内部コントロール試薬をさらに含む、マイクロアレイ。
【請求項２９】
診断／予後診断ポートフォリオにおいて、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部、
を含み、
前記遺伝子の組合せが、生体サンプルにおける乳癌の状態または再発のリスクを特徴付けるのに十分である、
診断／予後診断ポートフォリオ。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポートフォリオにおいて、
測定または特徴付けが、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現である、ポートフォリオ。
【請求項３１】
請求項２９に記載のポートフォリオにおいて、
測定により、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られる、ポートフォリオ。
【請求項３２】
請求項２９に記載のポートフォリオにおいて、
前記ｐ値が０．０５未満である、ポートフォリオ。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、患者の生体サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づいた乳癌患者の予後診断に関連する。
【０００２】
〔発明の背景技術〕
リンパ節陰性（ＬＮＮ）乳癌患者の約６０％〜７０％は、局所（local）または局部（regional）療法のみで治癒している。ランセット（Lancet）（1998年）およびランセット（Lancet）（1998年）。医師が補助的療法を受けるべき患者を選択する際の助けとなるガイドラインが作成された。最も一般的に用いられている推奨は、ザンクトガレン基準（St. Gallen criteria）（ゴールドハーシュ（Goldhirsch）ら著（2003年））および国立衛生研究所（ＮＩＨ：National Institutes of Health）合意基準である。エイフェル（Eifel）ら著（2001年）。これらのガイドラインは、ＬＮＮ患者の８５％〜９０％が補助的全身療法の候補であると示唆している。
【０００３】
患者が適切な治療を確実に受けるために患者の病気が再発するリスクを具体的に特定する必要がある。現在、潜在的に危険な状態にある患者を特定できる診断器具は殆ど存在しない。遺伝子発現パターンを用いて、乳癌を臨床的に適切な異なるサブタイプに分類する。ペロウ（Perou）ら著(2000年)、ソルリー（Sorlie）ら著（2001年）、ソルリー（Sorlie）ら著（2003年）、グルーバーガー（Gruvberger）ら著（2001年）、バン・ビール（van't Veer）ら著（2002年）、ファン・デ・ビジュデール（van de Vijver）ら著（2002年）、アー（Ahr）ら著（2002年）、フアング（Huang）ら著(2003年)、ソティリオウ（Sotiriou）ら著（2003年）、ヲルフェル（Woelfle）ら著（2003年）、マ（Ma）ら著（2003年）、ラマズワミー（Ramaswamy）ら著（2003年）、チャン（Chang）ら著（2003年）、ソティリオウ（Sotiriou）ら著（2003年）、およびヘデンフォーク（Hedenfalk）ら著（2001年）。
【０００４】
現在、ＬＮＮ患者では、原発腫瘍を外科的に切除した後に補助的療法を行うべきか、およびどのタイプ（内分泌療法および／または化学療法）にするかの決定は、患者の年齢、閉経状態、腫瘍の大きさ、腫瘍の進行具合、およびステロイドホルモン受容体の状態に大きく依存する。これらの因子は、ザンクトガレン基準および国立衛生研究所（ＮＩＨ）合意基準などのガイドラインに説明されている。これらの基準に基づくと、８５％〜９０％を超えるＬＮＮ患者が、補助的全身療法を受けるべき候補である。治療法を選択する際のガイドとして、より良い予後診断因子を特定する必要があることは明らかである。
【０００５】
〔発明の概要〕
疾患の進行の複雑さを考慮して、広く利用できる予後マーカーを特定するために包括的なゲノムワイドな遺伝子発現の評価をここに報告する。テゥザニ（Ntzani）ら著（2003年）、およびワン（Wang）ら著（2004年）。
【０００６】
本発明は、乳癌の状態を評価する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップ、および配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップによって行われる。この方法において、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、乳癌の状態を示唆する。
【０００７】
本発明は、乳癌のステージを決定する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップ、および配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、乳癌のステージを示している。
【０００８】
本発明は、乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、再発を防止するために推奨される治療の程度および種類を医師が決定できる程度に再発のリスクを十分に示唆している。
【０００９】
本発明は、乳癌患者を治療する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、高い再発リスクを示唆し、患者のリスクが高い場合は、補助的療法で治療するステップを含む。
【００１０】
本発明は、乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを交差検証する方法を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップ（ａ）、サンプルの順序をランダムにするステップ（ｂ）、サンプルの約１０％〜５０％のデータを除外するステップ（ｃ）、残りのサンプルに対して、全ての変数に対して目的の因子を計算して、ｐ値カットオフ（ｐ）を満たす変数を選択するステップ（ｄ）、前方検索を用いて予測モデルに適合する変数を選択して、所定の誤差率になるまでトレーニング誤差（training error）を評価するステップ（ｅ）、除外された１０％〜５０％のサンプルに対して予測モデルを試験するステップ（ｆ）、除外した新しいサンプルのセットでステップ（ｃ）‐（ｆ）を繰り返すステップ（ｇ）、サンプルの１００％の試験が終わるまでステップ（ｃ）‐（ｇ）を繰り返して、分類結果を記録するステップ（ｈ）を含む。
【００１１】
本発明は、乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを単独で検証する方法を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップ（ａ）と、この遺伝子発現データにおける供給源によるばらつき（source variabilities）を標準化するステップ（ｂ）と、既に選択されている全ての変数に対して目的の因子を計算するステップ（ｃ）と、サンプルに対して予測モデルを試験して分類結果を記録するステップ（ｄ）を含む。
【００１２】
本発明は、乳癌患者の予後診断を可能にする再発ハザードスコアを生成する方法を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップ（ａ）と、このデータに対してコックスの単変量回帰分析（univariate Cox's regression analysis）を適用して選択遺伝子を得るステップ（ｂ）と、標準コックス係数（standard Cox's coefficients）を用いて選択遺伝子に重み付けした発現レベルを適用して、再発ハザードスコア（Relapse Hazard Score）として適用されうる予測モデルを得るステップを含む。
【００１３】
本発明は、乳癌予後診断患者レポートを作成する方法を包含する。この方法は、患者から生体サンプルを得るステップ（ａ）、このサンプルの遺伝子発現を測定するステップ（ｂ）、このステップ（ｂ）の結果に対して再発ハザードスコアを適用するステップ（ｃ）、このステップ（ｃ）で得た結果を用いてレポートを作成して、それにより患者レポートを作成するステップ（ｄ）を含む。
【００１４】
本発明は、配列番号１‐１１１、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓ、から選択される少なくとも１つのプローブセットの組成物を包含する。
【００１５】
本発明は、生体サンプルにおいて乳癌の予後診断を決定するアッセイを行うためのキットを含む。このキットは、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物（complement）、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。
【００１６】
本発明は、乳癌の状態を評価するための物品を包含する。この物品は、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。
【００１７】
本発明は、診断／予後診断のポートフォリオを包含する。このポートフォリオは、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物、またはその一部を含み、この組み合わせは、生体サンプルにおける乳癌の状態、または再発のリスクを特徴付けるのに十分である。
【００１８】
〔詳細な説明〕
本発明は、乳癌の状態を評価する方法を包含する。乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、乳癌の状態を示唆する。
【００１９】
本発明は、乳癌のステージを決定する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、乳癌のステージを示している。この方法は、対癌米国合同委員会のＴＮＭシステム（TNM system American Joint Committee on Cancer）（www.cancerstaging.org）、および類似の遺伝子発現プロファイルを有する患者に一致するステージの比較を含め、当分野で周知のあらゆる分類方法を利用する。
【００２０】
本発明は、乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、再発を防止するために推奨される治療の程度および種類を医師が決定できる程度に再発のリスクを十分に示唆している。
【００２１】
本発明は、乳癌患者を治療する方法を包含する。この方法は、乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含む。この方法では、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルは、高い再発リスクを示唆し、患者のリスクが高い場合は、補助的療法で治療するステップを含む。
【００２２】
前記した方法はいずれも、配列番号を、１‐３５、３６‐９５、９６‐１１１、または３６‐１１１とすることができる。好ましくは、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性患者に対しては配列番号を３６‐９５とし、ＥＲ陰性患者に対しては配列番号を９６‐１１１とする。
【００２３】
サンプルは、バルク組織の用意およびレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを含む、当分野で周知のあらゆる方法によって用意することができる。バルク組織は、生検または外科的試料から用意することができる。
【００２４】
上記した方法は、配列番号１１２‐１３２に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１１２‐１３２に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されたｍＲＮＡをコード化する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含むことができる。上記した方法は、サンプル内で構成的に発現される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することも含むことができる。
【００２５】
上記した方法は、サンプルのエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を決定することも含むことができる。ＥＲの状態は、ＥＲの状態を示す少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、サンプル中のＥＲの存在を測定すること、および免疫組織化学的に測定することを含め、当分野で周知のあらゆる方法で測定することができる。
【００２６】
上記した方法は、あらゆる生体源から得たサンプルと共に用いることができる。このサンプルは、原発腫瘍から得るのが好ましい。
【００２７】
上記した方法は、少なくとも４０％の特異性および少なくとも９０％の感受性を有するのが好ましい。
【００２８】
上記した方法は、遺伝子の発現パターンを、再発患者を示す遺伝子発現パターンと比較する場合に用いることができる。この比較は、パターン認識法を用いた遺伝子発現パターンの比較を含め、当分野で周知のあらゆる方法で行うことができる。パターン認識法は、コックスの比例ハザード分析（Cox's proportional hazards analysis）を含む当分野で周知のあらゆる方法とすることができる。
【００２９】
上記した方法は、所定のカットオフレベルが、サンプル中の発現が良性細胞または正常組織に対して少なくとも１．５倍以上の過剰発現または１．５倍少ない過少発現である場合に用いることができる。所定のカットオフレベルは、転移性細胞を有するサンプルにおいて、良性細胞または正常組織に対して少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現を有するのが好ましい。より好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。
【００３０】
上記した方法は、遺伝子発現がマイクロアレイまたは遺伝子チップで測定される場合に使用することができる。ここで使用するのに適した遺伝子チップおよびマイクロアレイも、本発明に包含される。このようなマイクロアレイは、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイとすることができ、１または複数の内部コントロール試薬をさらに含むことができる。
【００３１】
上記した方法は、サンプルから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅によって遺伝子発現を決定する場合に使用することができる。このＰＣＲは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）とすることもできる。ＲＴ‐ＰＣＲは、１または複数の内部コントロール試薬をさらに含むことができる。
【００３２】
上記した方法は、遺伝子発現を、その遺伝子によってコード化されるタンパク質を測定または検出することによって検知する場合に用いることができる。そのタンパク質に特異的な抗体による検出および遺伝子の特性の測定を含め、当分野で周知のあらゆる方法を用いることができる。適当な特徴には、限定するものではないが、ＤＮＡ増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異が含まれる。
【００３３】
本発明は、乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを交差検証する方法を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップ（ａ）、サンプルの順序をランダムにするステップ（ｂ）、サンプルの約１０％〜５０％のデータを除外するステップ（ｃ）、残りのサンプルに対して、全ての変数に対して目的の因子を計算して、ｐ値カットオフ（ｐ）を満たす変数を選択するステップ（ｄ）、前方検索を用いて予測モデルに適合する変数を選択して、所定の誤差率になるまでトレーニング誤差（training error）を評価するステップ（ｅ）、除外された１０％〜５０％のサンプルに対して予測モデルを試験するステップ（ｆ）、除外した新しいサンプルのセットでステップ（ｃ）‐（ｆ）を繰り返すステップ（ｇ）、サンプルの１００％の試験が終わるまでステップ（ｃ）‐（ｇ）を繰り返して、分類結果を記録するステップ（ｈ）を含む。
【００３４】
交差検証法は、ステップ（ｈ）で得た遺伝子発現データが、配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致するｍＲＭＡ、または表１０に示されている配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子によって表される場合に用いることができる。
【００３５】
本発明は、乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを単独で検証する方法を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップ（ａ）と、この遺伝子発現データにおける供給源によるばらつき（source variabilities）を標準化するステップ（ｂ）と、既に選択されている全ての変数に対して目的の因子を計算するステップ（ｃ）と、サンプルに対して予測モデルを試験して分類結果を記録するステップ（ｄ）を含む。
【００３６】
この単独の検証法は、ステップ（ｄ）で得た遺伝子発現データが、配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される：ｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子によって表される場合に用いることができる。
【００３７】
本発明は、乳癌患者の予後診断を可能にする再発ハザードスコアを生成する方法を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップ（ａ）と、このデータに対してコックスの単変量回帰分析（univariate Cox's regression analysis）を適用して選択遺伝子を得るステップ（ｂ）と、標準コックス係数（standard Cox's coefficients）を用いて選択遺伝子に重み付けした発現レベルを適用して、再発ハザードスコア（Relapse Hazard Score）として適用されうる予測モデルを得るステップを含む。
【００３８】
再発ハザードスコアは、以下の式で求めることができる。
【数１】
2007528218.tif 000003
この式において、
Ｉ＝１（Ｘ遺伝子レベル＞１０の場合）または０（Ｘ遺伝子レベル≦１０の場合）、
ＡおよびＢは、定数、
ｗiは、Ｘ遺伝子＋マーカーに対する標準化されたコックスの回帰係数、
ｘiは、ＥＲ＋マーカーの発現値（ｌｏｇ２のスケール）、
ｗjは、Ｘ遺伝子−マーカーに対する標準化されたコックスの回帰係数、
ｘjは、ＥＲ−マーカーの発現値（ｌｏｇ２のスケール）、
Ｘ遺伝子は、（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する；または（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される：ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される。
【００３９】
本発明は、乳癌予後診断患者レポートを作成する方法を包含する。この方法は、患者から生体サンプルを得るステップ（ａ）、このサンプルの遺伝子発現を測定するステップ（ｂ）、このステップ（ｂ）の結果に対して再発ハザードスコアを適用するステップ（ｃ）、このステップ（ｃ）で得た結果を用いてレポートを作成して、これにより患者レポートを作成するステップ（ｄ）を含む。このレポートは、患者集団に対するリスクの可能性および／または患者の結果の評価を含みうる。
【００４０】
本発明は、配列番号１‐１１１、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓ、から選択される少なくとも１つのプローブセットの組成物を包含する。この組成物は、配列番号３６‐９５、９６‐１１１、または３６‐１１１から選択される少なくとも１つのプローブセットを含むことができる。この組成物は、マクロアレイ分析を行うための試薬と、これらの核酸配列、それらの補完物、またはそれらの一部をアッセイする媒体をさらに含むことができる。
【００４１】
本発明は、生体サンプルにおいて乳癌の予後診断を決定するアッセイを行うためのキットを含む。このキットは、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。このキットは、マイクロアレイ分析を行うための試薬と、これらの核酸配列、それらの補完物、またはその一部をアッセイする媒体をさらに含むことができる。
【００４２】
本発明は、乳癌の状態を評価するための物品を包含する。この物品は、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。この物品は、マイクロアレイ分析を行うための試薬と、これらの核酸配列、それらの補完物、またはその一部をアッセイする媒体をさらに含むことができる。
【００４３】
ここで用いるマイクロアレイは、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物、またはその一部を含むことができる。この遺伝子の組合せは、生体サンプルにおける乳癌の状態または再発のリスクを特徴付けるのに十分である。
【００４４】
マイクロアレイの測定または特徴付けは、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現であるのが好ましい。マイクロアレイは、良性細胞または正常組織に対して、サンプル中で少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現である所定のカットオフレベルを検出できる。この所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織に対して、転移性細胞を有するサンプルで少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現を有するのが好ましい。より好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。
【００４５】
本発明は、診断／予後診断のポートフォリオを包含する。このポートフォリオは、配列番号１‐１１１に一致するｍＲＮＡ、または表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓから選択されるプローブセットによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子から選択される遺伝子の組合せの、単離された核酸配列、それらの補完物、またはその一部を含む。この遺伝子の組合せは、生体サンプルにおける乳癌の状態または再発のリスクを特徴付けるのに十分である。このポートフォリオは、良性細胞または正常組織に対して、サンプル中で少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現（under-expression）である所定のカットオフレベルを検出できる。この所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織に対して、転移性細胞を有するサンプルで少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現を有するのが好ましい。より好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。
【００４６】
配列番号１‐６５０を表１０に要約した。各配列番号１‐６５０において、マーカーは、ｐｓｉｄまたはアフィメトリックス・ジーン・チップ・デシグネーション（Affymetrix GeneChip Designation）によって識別され、所定の配列番号に一致するあらゆる変位体または対立遺伝子などをコード化する遺伝子を表している。このマーカーは、所定のｐｓｉｄに一致するプローブによって認識されるｍＲＮＡをコード化する遺伝子としても定義される。特定のマーカーを、以下に詳細に説明する。
【００４７】
配列番号４５のＭ８３は、米国特許出願公開第２００２０１１０５４７号、同第２００４０００９４９１号、および同第２００３０２３６３９２号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１４９７１６号、同ＷＯ０１７０９７９号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ０３０４２６６１号、同ＷＯ０３０１６４７５号、同ＷＯ２００４０６３３５５号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、および同ＷＯ２００４０３０６１５号に記載されている。
【００４８】
配列番号４３のＡＢＬＩＭ‐ｓは、米国特許出願公開第２００２０１３１９７１号、同第２００３００８７８１８号、同第２００３０１６６０６４号、同第２００３０２３６３９２号、および同第２００４０００５５６０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００３６１０７号、同ＷＯ０１５９０６３号、同ＷＯ０１６０８６０号、同ＷＯ０１７４４０５号、同ＷＯ０１７７２８８号、同ＷＯ０２０５９２７１号、同ＷＯ０２１２３２８号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０２２９０８６号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ２００４０２４０９７号、同ＷＯ２００４０３７９９６号、同ＷＯ２００４０３９９５６号、同ＷＯ２００４０４３３６１号、および同ＷＯ２００４０４７７２８号に記載されている。
【００４９】
配列番号５４のＡＴＡＤ２は、米国特許出願公開第２００２００６４８７２号、同第２００２００８５９９８号、同第２００２０１５０５８１号、同第２００２０１５６０１１号、同第２００２０１９２６７８号、同第２００３００６９１８０号、同第２００３００７３６２３号、同第２００３０１０４３６６号、同第２００４０００５５６０号、同第２００４００１３６６３号、および同第２００４００５８３４０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００６００７６号、同ＷＯ０１４２４６７号、同ＷＯ０１５５３２２号、同ＷＯ０１６０８６０号、同ＷＯ０１７０９７９号、同ＷＯ０１７９２８６号、同ＷＯ０１９６３８８号、同ＷＯ０２０５７４１４号、同ＷＯ０２０５９３７７号、同ＷＯ０２０６０３１７号、同ＷＯ０２０８６４４３号、同ＷＯ０２３１１９８号、同ＷＯ０２５０２７９号、同ＷＯ０３００４９８９号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ０３０４２６６１号、同ＷＯ０３０６２３７９号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、同ＷＯ２００４０４８９３８号、同ＷＯ２００４０４８９３８号、同ＷＯ２００４０６３３５５号、および同ＷＯ９９３８９７２号に記載されている。
【００５０】
配列番号４８のＣ１１ＯＲＦ９は、米国特許出願公開第２００３００６５１５７号および同第２００３００７３６２３号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００５６８８０号、同ＷＯ００５８４７３号、同ＷＯ０１５９０６３号、同ＷＯ０１７４４０５号、同ＷＯ０２０５９２６０号、同ＷＯ０２２９０８６号、同ＷＯ０３１０１２８３号、同ＷＯ２００４０３１４１３号、および同ＷＯ２００４０６０２７０号に記載されている。
【００５１】
配列番号４６のＣ３は、米国特許出願公開第２００４０００５５６０号および同第２００４００５８３４０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１０１９９９号、同ＷＯ００５５３５０号、同ＷＯ０１６０８６０号、同ＷＯ０１７５０６７号、同ＷＯ０１８８０８８号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０２９４６２９号、同ＷＯ０３０７８５７２号、同ＷＯ２００４０２８４７９号、同ＷＯ２００４０３０６１５号、同ＷＯ２００４０４１１７０号、および同ＷＯ２００４０６０２７０号に記載されている。
【００５２】
配列番号６５のＣＧＩ‐４１は、米国特許出願公開第２００３００７３６２３号および同第２００３００９６９８２号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５１４７７２号、同ＷＯ９９４０１００号、同ＷＯ０１５４４７２号、同ＷＯ０１５７１８８号、同ＷＯ０３０４６１５２号、および同ＷＯ２００４０６０２７０号に記載されている。
【００５３】
配列番号３６に記載のＣＬＮ８は、欧州特許第１１０４８０８Ｂ１号、米国特許出願第２００３００７３６２３号および同第２００４０００９４９１号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８４５４３７号、同ＷＯ９９３５１５８号、同ＷＯ０１４２４５１号、同ＷＯ０１９０３０４号、同ＷＯ０２０９０５２６号、同ＷＯ０２０９５０１０号、同ＷＯ０２１０２９９３号、同ＷＯ０２１０２９９４号、同ＷＯ０３００４６２２号、同ＷＯ０４０２４８９２号、および同ＷＯ０４０４１１７０号に記載されている。
【００５４】
配列番号６０に記載のＣＮＫ１は、米国特許出願公開第２００４００５８３４０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９３８９７２号および同ＷＯ２００４０３７９９６号に記載されている。
【００５５】
配列番号５７のＤＵＳＰ４は、米国特許出願公開第２００３００７３６２３号、同第２００３０１９４７０４号、同第２００４００５８３４０号、および同第２００４０１１０１９４号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１００８２８号、同ＷＯ０２０４５１４号、同ＷＯ０２０５９３７７号、同ＷＯ０２１０３３２０号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３００４９８９号、同ＷＯ２００４０１８６４１号、同ＷＯ２００４０２３９７３号、同ＷＯ２００４０３７９９６号、同ＷＯ２００４０３９９５６号、同ＷＯ２００４０４３３６１号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、同ＷＯ２００４０４８９３８号、および同ＷＯ９４２３０３９号に記載されている。
【００５６】
配列番号６２のＦＥＮ１は、米国特許第５８７４２８３号、米国特許出願公開第２００２０１５６０１１号、同第２００３００６９１８０号、同第２００３００７３６２３号、および同第２００３０１９４７０４号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１９６３８８号、同ＷＯ０３０１６４７５号、同ＷＯ０３０１６５００号、同ＷＯ０３０７２０３５号、同ＷＯ０３１０１２８３号、同ＷＯ２００４０２２０５９号、同ＷＯ２００４０３０６１５号、同ＷＯ２００４０３９９５６号、同ＷＯ２００４０４３３６１号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、同ＷＯ２００４０４８９３８号、同ＷＯ２００４０６０２７０号、および同ＷＯ２００４０７９０１４号に記載されている。
【００５７】
配列番号６３のＦＫＢＰ２は、米国特許出願公開第２００３００７３６２３号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０２０５９３７７号、同ＷＯ０２０７０７３７号、同ＷＯ０２０８１７３１号、同ＷＯ０２０８３８９８号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３０１６４７５号、同ＷＯ０３０５４１５２号、同ＷＯ２００４０３９９５６号、同ＷＯ２００４０４３３６１号、および同ＷＯ９２１９７４５号に記載されている。
【００５８】
配列番号３７のＧＰ７３は、米国特許出願公開第２００３００２２２３９号、同第２００３００７３６２３号、同第２００３０２３６３９２号、同第２００４０００９４７８号、同第２００４００３４１９６号、および同第２００４００５８３４０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００１２７０８号、同ＷＯ００６１６１０号、同ＷＯ００７８９６１号、同ＷＯ０１４０４６６号、同ＷＯ０１６０８６０号、同ＷＯ０１７７１６８号、同ＷＯ０１９４６２９号、同ＷＯ０２０５９２６０号、同ＷＯ０２０８３８７６号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３００４９８９号、同ＷＯ２００４０２４８９２号、同ＷＯ２００４０３１４１４号、および同ＷＯ２００４０５３０８１号に記載されている。
【００５９】
配列番号６１のＨ４ＦＨは、米国特許出願公開第２００２０１５１６８１号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００５５１７４号、同ＷＯ０１７５０６７号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３０１６４７６号、および同ＷＯ２００４０３９９４３号に記載されている。
【００６０】
配列番号３９のＩＬ‐１８は、米国特許第６０６０２８３号、米国特許出願公開第２００４０１１５６３６号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１９４６２９号、同ＷＯ０２０５７４１４号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０２２９０８６号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ０３０４２６６１号、および同ＷＯ９７２４４４１号に記載されている。
【００６１】
配列番号５６のＫＩＡＡ０７４８は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００２１９９１号、同ＷＯ０２０９４９８８号、および同ＷＯ２００４００３１６２号に記載されている。
【００６２】
配列番号６４のＫＰＮＡ２は、米国特許出願公開第２００２０１５１６８１号、同第２００２０１５６０１１号、同第２００３００６９１８０号、および同第２００４００５８３４０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７１２９６７号、同ＷＯ９９６４５７６号、同ＷＯ００５５１７４号、同ＷＯ０１４６６９７号、同ＷＯ０１７０９７９号、同ＷＯ０１９６３８８号、同ＷＯ０２０５７４１４号、同ＷＯ０２０５９３７７号、同ＷＯ０２０８６４４３号、同ＷＯ０２１０２２３５号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３０１０３３６号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ０３０２７２８５号、同ＷＯ０３０４２６６１号、同ＷＯ２００４０２４０９７号、同ＷＯ２００４０２４８９２号、同ＷＯ２００４０２８４７９号、同ＷＯ２００４０３７９９６号、同ＷＯ２００４０３９９５６号、同ＷＯ２００４０４３３６１号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、および同ＷＯ２００４０６３３５５号に記載されている。
【００６３】
配列番号６６のＭＧＣ１１３３５は、米国特許出願公開第２００３００７３６２３号、同第２００３０２１９７４４号、および同第２００３０２３６３９２号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１４４４４８号、同ＷＯ０１５３３１２号、同ＷＯ０１５７１８２号、同ＷＯ０１８８０８８号、同ＷＯ２００４０３０６１５号に記載されている。
【００６４】
配列番号５２のＯＲ１２Ｄ２は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１２７１５８号、同ＷＯ０２０６８６５２号、同ＷＯ０２０８１４９８号、同ＷＯ０２０８１５１７号、同ＷＯ０３００００７３５号、および同ＷＯ０３０９１３８８号に記載されている。
【００６５】
配列番号５３のＯＲＣ３は、米国特許出願公開第２００４００１３６６３号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８１００６７号、同ＷＯ９９５８６４２号、同ＷＯ００６００７８号、同ＷＯ０１７５０６７号、同ＷＯ０２０５９３７７号、同ＷＯ０２０７０７３７号、同ＷＯ０２１０２２３５号、および同ＷＯ０３０４２６６１号に記載されている。
【００６６】
配列番号５９のＰＬＫ１は、ドイツ特許第４３２９１７７号、米国特許出願公開第２００２００８１６５９号、同第２００２０１５１６８１号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００５５１７４号、同ＷＯ００５５３２０号、同ＷＯ０２０７０７３７号、同ＷＯ０２０８６４４３号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３００３９０６号、同ＷＯ０３０１６４７６号、同ＷＯ０３０１８８０７号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ０３０４２６６１号、同ＷＯ２００４０３０６１５号、同ＷＯ２００４０３７９９６号、同ＷＯ２００４０４２０２２号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、同ＷＯ２００４０４８９３８号、同ＷＯ２００４０６３３５５号、および同ＷＯ２００４０７００６２号に記載されている。
【００６７】
配列番号４２のＰＰＰ１ＣＣは、米国特許出願公開第２００３００７３６２３号、同第２００４００１３６６３号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３０１６４７６号、同ＷＯ００６３４３８号、同ＷＯ０１７０９７９号、同ＷＯ０２０２６２３号、同ＷＯ０２０３６７６６号、同ＷＯ０２０７４２３７号、同ＷＯ０２２８９９９号、同ＷＯ０３０１６４７５号、および同ＷＯ２００４０３０６１５号に記載されている。
【００６８】
配列番号５５のＳＭＣ４は、米国特許出願公開第２００２０１２３６１９号、同第２００２０１６８６３７号、および同第２００４００５８３４０号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９３８９７２号、同ＷＯ９９６４５７６号、同ＷＯ０１７５０６７号、同ＷＯ０１９０１５４号、同ＷＯ０２０４５１４号、同ＷＯ０２０５９３７７号、同ＷＯ０２０７４２３７号、同ＷＯ０２０８６４４３号、同ＷＯ０２１０２２３５号、同ＷＯ０３００３９０６号、同ＷＯ０３０１６４７５号、同ＷＯ０３０２５１３８号、同ＷＯ０３０４２６６１号、同ＷＯ２００３０９４８４８号、同ＷＯ２００４０２４８９２号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、同ＷＯ２００４０４８９３８号、同ＷＯ２００４０６３３５５号、および同ＷＯ２００４０７４３０１号に記載されている。
【００６９】
配列番号４４のＴＲＤＬ‐１は、米国特許第６１７１７８７号および同第６４４０６９４号、米国特許出願公開第２００２００５５４７４号、同第２００２００７２０８９号、同第２００２００８１６５９号、同第２００３００６５１５７号、同第２００３００７３６２３号、および同第２００３０２１９７６７号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７３３９０２号、同ＷＯ９９１２９６５号、同ＷＯ９９２６９７６号、同ＷＯ９９２８４６２号、同ＷＯ９９３３９８０号、同ＷＯ９９３５１７０号、同ＷＯ９９５０４１６号、同ＷＯ９９５４４６０号、同ＷＯ００２６２４４号、同ＷＯ００３２７７６号、同ＷＯ００５５３２０号、同ＷＯ０１２５２５６号、同ＷＯ０１７７２９１号、同ＷＯ２００４０２０５９３号、同ＷＯ２００４０２４８９２号、同ＷＯ２００４０３３６３７号、および同ＷＯ０４０３７９９６号に記載されている。
【００７０】
配列番号３８のＹｉｆｌｐは、米国特許出願公開第２００２０１３１９７１号、同第２００３０１６６０６４号、および同第２００４００３７８４２号、ならびに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９３３９８１号、同ＷＯ９９４７５４０号、同ＷＯ０１７３０２７号、同ＷＯ０２０６０３１７号、同ＷＯ０２０７０７３７号、同ＷＯ０２０７６４８８号、同ＷＯ０２０９５０１０号、同ＷＯ０２２４９５６号、同ＷＯ０３００４６２２号、同ＷＯ０３０３８０６３号、同ＷＯ０３０４２６６１号、同ＷＯ０３０５４１５２号、同ＷＯ０３０６４５８９号、同ＷＯ２００４０２４８９２号、同ＷＯ２００４０３７９９６号、同ＷＯ２００４０４７７２８号、および同ＷＯ２００４０４８９３８号に記載されている。
【００７１】
アフィメトリックス・ヒューマンＵ１３３ａ・ジーンチップ（Affymetrix Human U133a GeneChip）を利用し、補助的全身療法を受けなかった２８６人のリンパ節陰性（ＬＮＮ）乳癌患者から得た凍結腫瘍サンプルの全ＲＮＡを用いて２２，０００の転写物の発現を分析した。ゲノムワイドの遺伝子発現の測定により、腫瘍をサブクラスに分類でき、かつリンパ節陰性乳癌患者の個々人のリスク評価をする改善された手段をもたらす遺伝子活性のパターンを識別できることが分かった。
【００７２】
１１５の腫瘍のトレーニングセットにおいて、ＥＲ陽性患者の６０の遺伝子とＥＲ陰性患者の１６の遺伝子で構成される７６‐遺伝子シグネチャ（76-gene signature）を同定した。このシグネチャは、続く１７１人のＬＮＮ患者の個々の試験セットにおいて、９３％の感受性および４８％の特異性を示した。遺伝子プロファイルは、５年以内に遠隔転移が起きた患者（ハザード率（ＨＲ）：５．６７、９５％の信頼区間（ＣＩ）：２．５９〜１２．４）を特定する際に、たとえ多変量分析における従来の予後診断因子を修正した場合（ＨＲ：５．５５、ＣＩ：２．４６〜１２．５）でも、非常に有益である。７６‐遺伝子プロファイルはまた、８４人の閉経前患者（ＨＲ：９．６０、ｐ＝１．６×１０-4）、８７人の閉経後患者（ＨＲ：４．０４、ｐ＝１．７×１０-3）、および１０ｍｍ〜２０ｍｍの大きさの腫瘍を有する７９人の患者（ＨＲ：１４．１、ｐ＝２．３×１０-6）のサブグループ、および疾患の予後診断が特に困難な患者のグループにおいて、転移発生についての強力な予後診断因子を表した。
【００７３】
この実験で、全ての年齢および全ての大きさの腫瘍のグループの２８６人のＬＮＮ乳癌患者からの原発腫瘍の分析結果を得た。患者は、補助的全身療法を受けていないため、第１の多重遺伝子の予後診断の評価が、全身治療に関連した予測因子による寄与を混乱させる恐れがなく、個別の試験セットによって適切に確認され、腫瘍の大きさおよび年齢に制限されない。上記したアルゴリズムに基づいた遺伝子発現は、ＬＮＮ患者において、遠隔での再発の可能性を高い信頼性で予測することができる。
【００７４】
組織サンプルにおける特定の核酸配列の単なる存在の有無は、診断または予後診断の値を得るために極まれに検出されるだけである。他方、様々なタンパク質、ペプチド、またはｍＲＮＡの発現についての情報は、ますます重要とみなされるようになってきた。そのゲノム内で単独でタンパク質、ペプチド、またはｍＲＮＡ（遺伝子と呼ばれるような配列）を発現する可能性のある核酸配列の単なる存在は、所定の細胞内でタンパク質、ペプチド、またはｍＲＮＡが発現するか否かを決定するものではない。タンパク質、ペプチド、またはｍＲＮＡを発現できる所定の遺伝子がこれらを発現するか否か、および発現する場合にこのような発現が起こる程度は、様々な複合因子によって決まる。このような因子の理解および評価における困難さに関係なく、遺伝子発現のアッセイは、腫瘍発生、転移、アポトーシス、および他の臨床的に関連する現象などの重要な事象の発生について有用な情報を提供する。どの程度遺伝子が活性または不活性であるかの相対指標は、遺伝子発現プロファイルで確認できる。本発明の遺伝子発現プロファイルを用いて予後診断を行って、乳癌患者を治療することができる。
【００７５】
サンプルの用意では、患者サンプルを収集する必要がある。本発明の方法に用いる患者サンプルは、乳房サンプルの原発腫瘍から採取した上皮細胞などの病変細胞を含むと思われる患者サンプルである。また、サージカルマージンから得たサンプルも好ましい。しかしながら、最も好ましいのは、乳癌の外科手術で得たリンパ節から採取したサンプルである。レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ：Laser Capture Microdissection）技術は、試験する細胞を選択する１つの方法であり、細胞の種類の不均一性によって起こるばらつきを最小限にする。この結果、正常な細胞と癌性細胞との間の遺伝子発現の緩やかな変化または小さな変化を容易に検出することができる。サンプルには、抹消血から抽出した循環上皮細胞も含むことができる。このようなサンプルは、様々な方法によって得ることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６，１３６，１８２号に開示されている磁気分離技術である。目的の細胞を含むサンプルが得られたら、ＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡを増幅し、適当なポートフォリオの遺伝子について、好ましくはマイクロアレイによって遺伝子発現プロファイルを作成する。
【００７６】
遺伝子発現プロファイルを作成する好適な方法では、タンパク質またはペプチドをコード化できる遺伝子によって産生されたＲＮＡの量を決定するステップを含む。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）、競合ＲＴ‐ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、および他の関連した検査によって行うことができる。別個のＰＣＲ反応を用いてこれらの技術を行うことができるが、ｍＲＮＡから産生された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅し、これをマイクロアレイで分析するのが最も良い。様々な異なるアレイ構造およびその製造方法は、当業者に周知であり、米国特許第５，４４５，９３４号、同第５，５３２，１２８号、同第５，５５６，７５２号、同第５，２４２，９７４号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４７２，６７２号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５２９，７５６号、同第５，５４５，５３１号、同第５，５５４，５０１号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６５８，７３４号、および同第５，７００，６３７号に記載されている。
【００７７】
マイクロアレイ技術により、数千の遺伝子の安定状態のｍＲＮＡレベルを同時に測定して、これにより、制御されていない細胞増殖の開始、停止、または調節などの影響を特定するための強力なツールを提供することができる。現在、２つのマイクロアレイ技術が広く用いられている。第１の技術は、ｃＤＮＡアレイであり、第２の技術は、オリゴヌクレオチドアレイである。これらのチップの構造において相違が存在するが、実質的に全てのダウンストリームデータ解析および出力は同じである。このような解析の産物は、通常は、マイクロアレイ上の既知の位置で、ある核酸配列にハイブリダイズするサンプル中のｃＤＮＡ配列を検出するために用いる標識プローブから受け取る信号の強度の測定である。通常は、信号の強度は、サンプルの細胞中で発現されるｃＤＮＡ、従ってｍＲＮＡの量に比例する。このような様々な技術は、利用することができ、かつ有用である。遺伝子発現を決定するための好適な方法は、米国特許第６，２７１，００２号、同第６，２１８，１２２号、同第６，２１８，１１４号、および同第６，００４，７５５号に記載されている。
【００７８】
発現レベルの解析は、信号強度の比較によって行う。これは、試験サンプル中の遺伝子の発現強度の、コントロールサンプル中の発現強度に対する比率マトリックス（ratio matrix）を作成して行うのが最も良い。例えば、病変細胞の遺伝子発現強度を、同じ種類の正常な組織から得た発現強度と比較することができる（例えば、病変乳房組織サンプル 対 正常な乳房組織サンプル）。これらの発現強度の比率は、試験サンプルとコントロールサンプルとの間の遺伝子発現における倍数変化を示している。
【００７９】
また、遺伝子発現プロファイルは、様々な方法で表示することができる。最も一般的な方法では、未加工の蛍光強度または比率マトリックスを、列が試験サンプルで行が遺伝子を示すグラフィカル・デンドグラム（graphical dendogram）に配列させる。データは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近接するように配列する。各遺伝子の発現率は、カラーで表示する。例えば、１未満の比率（ダウンレギュレーションを示す）は、スペクトルの青の部分で表し、１より大きい比率（アップレギュレーションを示す）は、スペクトルの赤の部分で表す。市販のコンピュータソフトウエアプログラムを利用して、アジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies）のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ、およびＰａｒｔｅｋ（登録商標）のＰａｒｔｅｋ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（商標）およびＰａｒｔｅｋ Ｉｎｆｅｒ（商標）ソフトウエアを含め、このようなデータを表示することができる。
【００８０】
本発明の方法に用いる変調遺伝子（modulated genes）は、以下の例の部分で説明する。異なって発現する遺伝子は、乳癌が再発していない患者に比べて、乳癌が再発した患者でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされている。アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、検出可能な差異（これを測定するために用いるシステムにおけるノイズ部分を超えた）が、ある種のベースラインに対して遺伝子の発現量で見られることを指す相対語である。この場合、このベースラインは、非再発患者の測定された遺伝子発現である。次に、同じ測定方法を用いて、病変細胞（再発患者の）における目的の遺伝子が、ベースラインレベルに対してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。この文脈における病変は、細胞の無制限増殖で起こる体の機能の適切な能力を妨げるまたは妨害する、或いは妨害する可能性のある体の状態の変化を指す。ある人の遺伝子型または表現型のある点が疾患の存在と一致する場合、その人は疾患であると診断される。しかしながら、診断または予後診断を行う行為には、再発の可能性の決定などの疾患／病態の問題の決定や治療のモニタリングが含まれる。治療のモニタリングでは、遺伝子の発現を時間経過と共に比較して、遺伝子発現プロファイルが正常な組織に、より一致するパターンに変化したか、または変化しつつあるかを決定して、所定の治療のコースの影響について臨床的に判断する。
【００８１】
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションのレベルは、ハイブリダイズしたマイクロアレイのプローブの強度測定の倍数変化に基づいて区別するのが好ましい。２．０倍の差は、このような区別に好ましい（または、ｐ値が０．０５未満）。すなわち、ある遺伝子が、正常／非再発細胞に対して病変／再発細胞で異なって発現すると考えられる前に、病変細胞が、正常な細胞よりも少なくとも２倍の強度または２倍少ない強度を生成することが分かった。倍数の差が大きければ大きいほど、遺伝子は、診断または予後診断のツールとして使用するのが好ましい。本発明の遺伝子発現プロファイルのために選択する遺伝子は、臨床用実験器具を用いたバックグランドを超える量によって正常すなわち非変調遺伝子（no-modulated genes）が生成する信号と区別できる信号を生成する発現レベルを有する。
【００８２】
統計値を用いて、非変調遺伝子およびノイズと変調遺伝子を明確に区別することができる。統計的検定により、多様なサンプルのグループ間で最も著しく異なっている遺伝子を見出した。スチューデントのＴ検定は、２つのグループ間の著しい差を見出すために用いることができる統計的ロバスト検定の一例である。ｐ値が小さければ小さいほど、遺伝子が異なるグループ間で差を示している有力な証拠となる。それにもかかわらず、マイクロアレイが、一度に２つ以上の遺伝子を測定できるため、何万もの統計的検定を一度に実施することができる。このため、偶然に小さいｐ値を目にする可能性が低く、シダックの補正（Sidak correction）およびランダム化／順列実験を用いて、この調整を行うことができる。スチューデントのＴ検定による０．０５未満のｐ値は、遺伝子が著しく異なるという証拠である。より有力な証拠は、シダックの補正を行った後の０．０５未満のｐ値である。各グループに多数のサンプルがある場合、ランダム化／順列検定の後の０．０５未満のｐ値は、著しい差の最も有力な証拠である。
【００８３】
非変調遺伝子またはノイズの信号よりも大きい信号を生成する遺伝子を選択するために用いることができる別のパラメータは、絶対信号の差の測定値の使用である。変調遺伝子発現によって生成される信号は、正常すなわち非変調遺伝子発現によって生成される信号とは少なくとも２０％異なるのが好ましい（絶対ベース）。このような遺伝子は、正常すなわち非変調遺伝子の発現パターンとは少なくとも３０％異なる発現パターンを生成するのがさらに好ましい。
【００８４】
グループ中の遺伝子セットについて得た情報が、診断、予後診断、または治療の選択などの臨床的に適切な判断を行うための信頼できる基準を提供するように、遺伝子をグループに分けることができる。このような遺伝子セットは、本発明のポートフォリオを構成する。この場合、このポートフォリオによってサポートされる判断には、乳癌およびその再発の可能性が含まれる。大部分の診断的マーカーと同様に、正確な医療判断を十分に行うことができる最少数のマーカーを用いるのが望ましい。こうすることにより、別の分析を遅延させる治療の遅れや、時間と資源の無駄使いを防止することができる。
【００８５】
ポートフォリオ中の遺伝子の組合せが、個々の遺伝子またはランダムに選択された遺伝子の組合せに対して改善された感受性および特性を示すように、ポートフォリオを作成するのが好ましい。本発明との関連で、ポートフォリオの感受性は、正常な状態に対して病変状態で起こる遺伝子発現によって示される倍数差に反映されうる。特異性は、目的の状態と遺伝子発現の信号伝達との相関関係の統計的測定値に反映されうる。例えば、標準偏差を、このような測定値として用いることができる。ある遺伝子のグループをポートフォリオに入れるかの考慮では、発現の測定値における小さい標準偏差が、より大きな特異性に相関する。相関係数などの他のばらつきの測定値も用いることができる。
【００８６】
遺伝子発現ポートフォリオを作成するある方法では、株のポートフォリオの作成に広く用いられている平均分散アルゴリズムなどの最適化アルゴリズムを用いている。この方法は、米国特許出願公開第２００３０１９４７３４号に詳細が記載されている。本質的に、この方法では、この方法の使用者が受け取るリターン（例えば、生成される信号）のばらつきを最小限にすると共に、リターンを最適化するインプット（金融用途では株、ここでは、強度によって測定される発現）のセットを作成する必要がある。このような操作を行う場合、多くの市販のソフトウエアプログラムを利用することができる。本明細書では「ワグナー・ソフトウエア（Wagner Software）」と呼ばれる「ワグナー・アソシエイツ・平均分散最適化アプリケーション（Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application）」が好ましい。このソフトウエアは、「ワグナー・アソシエイツ・平均分散最適化ライブラリー（Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library）」の機能を用いて、マーコウイッツ・センス（Markowitz sense）における効率的なフロンティアおよび最適なポートフォリオを決定するのが好ましい。このタイプのソフトウエアを使用する際は、このソフトウエアが対象とする金融分析目的に使用される場合に株のリターンおよびリスクの測定が使用される要領で、マイクロアレイデータがインプットとして扱うことができるようにこのマイクロアレイデータを変換する必要がある。
【００８７】
ポートフォリオを選択するプロセスは、発見的ルールの適用を含むこともできる。このようなルールは、臨床結果を得るために用いる技術の理解および生物学に基づいて構築されるのが好ましい。発見的ルールは、最適化法からのアウトプットに用いるのがさらに好ましい。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散法は、乳癌患者で異なって発現した多数の遺伝子について、マイクロアレイデータに利用することができる。最適化法からのアウトプットは、末梢血および病変組織で発現するある種の遺伝子を含みうる最適化された遺伝子セットとすることができる。この試験方法に用いられるサンプルを末梢血から採取し、乳癌の場合に異なって発現するある種の遺伝子が、末梢血で異なって発現する場合、発見的ルールを用いることができ、ポートフォリオが、末梢血で異なって発現する遺伝子を除く効率的なフロンティアから選択される。もちろん、このルールは、例えばこのルールをデータの事前選択の際に利用して効率的なフロンティアの形成前に利用することもできる。
【００８８】
当生物学に必ずしも関連しなくてもよい他の発見的ルールを用いることもできる。例えば、ポートフォリオの所定パーセントのみを特定の遺伝子または遺伝子のグループによって表すことができるルールを適用することもできる。ワグナー・ソフトウエア（Wagner Software）などの市販のソフトウエアは、これらのタイプの発見的ルールに対応している。これは、例えば、１または複数の遺伝子を含むことのディザイラビリティに、正確さや精度以外の因子（例えば、予想ライセンス料）が影響を与える場合に有用であろう。
【００８９】
本発明の１つの方法では、様々な遺伝子について遺伝子発現プロファイル（またはポートフォリオ）を比較して予後診断を作成するステップを含む。ポートフォリオを含む各遺伝子の遺伝子発現プロファイルは、コンピュータ可読メディアなどのメディアに保存される。これは、様々な形態で行うことができる。例えば、疾患を示す信号（例えば、強度測定値）の範囲を入力する表を作成することができる。次に、実際の患者のデータをこの表の値と比較して、患者のサンプルが正常か、または病的であるかを決定することができる。より高度な実施形態では、発現信号（例えば、蛍光強度）のパターンをデジタル処理でまたはグラフに記録する。
【００９０】
次に、患者のサンプルと共に使用する遺伝子ポートフォリオからの遺伝子発現パターンを、この遺伝子発現パターンと比較する。次に、パターン比較ソフトウエアを用いて、患者のサンプルが疾患の再発を示すパターンを有しているか否かを決定することができる。もちろん、このような比較を用いて、患者が疾患を再発しそうにないか否かを決定することもできる。次に、サンプルの発現プロファイルを、対照細胞のポートフォリオと比較する。サンプルの発現パターンが乳癌の再発の発現パターンに一致している場合は（対抗する医療上の問題が存在しない）、再発患者を治療するように患者を治療する。サンプルの発現パターンが、正常／コントロール細胞からの発現パターンと一致している場合は、患者は、乳癌に対して陰性と診断される。
【００９１】
本発明の好適なポートフォリオは、配列番号１〜３５の遺伝子でできた３５‐遺伝子ポートフォリオ、ＥＲ陽性患者を予見するのに最もよく使用される配列番号３６〜９５の遺伝子でできた６０‐遺伝子ポートフォリオ、およびＥＲ陰性患者を予見するのに最もよく使用される配列番号９６〜１１１の遺伝子でできた１６‐遺伝子ポートフォリオである。配列番号３６〜１１１の遺伝子でできたポートフォリオが最も好ましい。この最も好適なポートフォリオは、ＥＲの状態にかかわらず、再発リスクの高い乳癌患者を、そうではない患者と区別するのに最適である。再発リスクの高い乳癌患者を特定したら、これらの患者に補助的療法を施すことができる。
【００９２】
本発明では、患者の遺伝子発現パターンを分析して乳癌患者の予後診断を決定するための最も好ましい方法は、コックスのハザード分析プログラム（Cox's hazards analysis program）を用いる。最も好ましくは、この分析は、Ｓ‐Ｐｌｕｓソフトウエア（インサイトフル・コーポレーション（Insightful Corporation）が販売）を用いて行う。このような方法を用いて、遺伝子発現プロファイルを、確実に再発を表すプロファイル（すなわち、プロファイル中の遺伝子の組合せの発現レベルが再発を示している）と比較する。閾値が設定されたコックスのハザードモデル（Cox's hazards model）を用いて、２つのプロファイル（既知の再発 対 患者）の類似性を比較し、患者のプロファイルが閾値を超えているか否かを決定する。患者のプロファイルが閾値を超えている場合は、その患者を再発するであろう患者に分類し、補助的療法などの治療を受けさせる。患者のプロファイルが閾値を超えていない場合は、その患者を非再発患者に分類する。線形識別分析、ロジスティック回帰、およびニューラルネットワークアプローチなどの他の分析ツールを用いて、同じ質問に答えることができる。
【００９３】
様々な既知のパターン認識法を利用することができる。以下に示す文献に例が記載されている。
・「加重投票（Weighted Voting）」、ゴルブ（Golub）ら著（1999年）
・「サポートベクターマシン（Support Vector Machines）」、スウ（Su）ら著（2001年）、ラマズワミー（Ramaswamy）ら著(2001年)
・「Ｋに最隣接（K-nearest Neighbors）」、ラマズワミー（Ramaswamy）ら著（2001年）
・「相関係数（Correlation Coefficients）」、バン・ビール（van't Veer）ら著（2002年）
【００９４】
本発明の遺伝子発現プロファイルは、癌の診断、予後診断、または治療のモニタリングに有用な他の非遺伝子診断法と共に用いることができる。例えば、場合によっては、上記した遺伝子発現に基づいた方法の診断力を、血清タンパク質マーカーなどの従来のマーカー（例えば、キャンサー・アンチゲン２７．２９（Cancer Antigen 27.29）（「CA 27.29」））のデータと組み合わせると有利である。ＣＡ ２７．２９のような分析物を含むこのようなマーカーの範囲が存在する。このような１つの方法では、血液を、治療を受けた患者から定期的に採取し、上記した血清マーカーの１つを用いてエンザイムイムノアッセイを行う。マーカーの濃度が、腫瘍の再発または治療の失敗を示唆する場合、遺伝子発現分析を行うことができるサンプル源を採取する。疑わしい腫瘤（mass）が存在する場合、細針吸引（ＦＮＡ）を行って、腫瘤から採取した細胞の遺伝子発現プロファイルを上記したように分析する。別法では、組織サンプルを、腫瘍を以前に除去した組織に近接した部分から採取することができる。この方法は、他の試験方法の結果が曖昧な場合に特に有用であろう。
【００９５】
本発明の物品には、治療、診断、予見、および他の疾患の評価に有用な遺伝子発現プロファイルの表現が含まれる。このようなプロファイルの表現は、装置によって自動的に読み取ることができるコンピュータ可読メディア（磁気的に、光学的に、など）などのメディアに圧縮することができる。この物品は、このようなメディアに圧縮された遺伝子発現プロファイルを評価するための取扱説明書も含むことができる。例えば、この物品は、上記した遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ取扱説明書を有するＣＤ ＲＯＭを含むことができる。この物品はまた、患者のサンプルの遺伝子発現データと比較できるように、内部にデジタル記録された遺伝子発現プロファイルも含むことができる。別法では、このようなプロファイルは、異なる表現形態に記録することができる。このような形態の１つにグラフ記録がある。上記したＰａｒｔｅｋ（登録商標）のＰａｒｔｅｋ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（商標）およびＰａｒｔｅｋ Ｉｎｆｅｒ（商標）ソフトウエアに含まれているようなクラスター化アルゴリズムが、このようなデータの視覚化に最も役立つであろう。
【００９６】
本発明に従って製造される異なるタイプの物品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために用いるメディアまたは定様式アッセイ（formatted assays）である。これらの物品は、例えば、相補的な配列またはプローブをマトリックスに結合するマイクロアレイを含むことができる。このマトリックスに、目的の遺伝子を示唆する配列が結合して、その存在を読み取ることのできる決定因子を作り出す。別法では、本発明に従った物品は、ハイブリダイゼーションを行うため、増幅を行うため、、および乳癌検出のために目的の遺伝子の発現レベルを示す信号の生成を行うため、の試薬キットにすることができる。
【００９７】
本発明に従って作られたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための定様式アッセイを含む。このようなキットは、アッセイを行うために必要な試薬や取扱説明書などの全てまたは一部の構成要素を含むことができる。
【００９８】
限定目的ではない以下に示す例によって、本発明をさらに例示する。本明細書に言及する全ての文献は、参照することを以って本明細書の一部とする。
【００９９】
例
本発明に従って分析された遺伝子は、通常は、タンパク質またはペプチドの産生をコードする完全長の核酸配列に関連する。当業者であれば、完全長の配列の同定が、解析の観点から必ずしも必要でないことを理解できよう。すなわち、配列の一部すなわちＥＳＴは、対応する遺伝子の遺伝子発現を評価するようにプローブをデザインできる既知の原理に従って選択することができる。
【０１００】
例１
サンプルの取扱およびマイクロアレイ作業
１９８０年〜１９９５年の間に治療を受け、全身ネオアジュバント療法を受けていないＬＮＮ患者から得た凍結腫瘍検体を、エラスムス・メディカル・センター（Erasmus Medical Center）（オランダのロッテルダムに所在)にある腫瘍バンクから選択した。全ての腫瘍サンプルは、ステロイドホルモン受容体測定のために２５の地域の病院から関連研究所に送られた。主な治療のガイドラインは、全ての病院で類似している。偏らないように腫瘍を選択した。品質管理の理由から、５年で２５％〜３０％、腫瘍が実質的に減少すると仮定して、４３６の浸潤性腫瘍サンプルを処理した。不良な臨床結果、中程度の臨床結果、および良好な臨床結果の患者が含まれている。サンプルは、不十分な腫瘍量（５３）、ＲＮＡの品質不良（７７）、またはチップの品質不良（２０）に基づいて除かれ、さらなる分析に用いることができる２８６のサンプルが残った。
【０１０１】
実験プロトコルは、施設内医療倫理委員会（institutional medical ethics committee）（ＭＥＣ番号０２．９５３）によって承認された。外科手術時の患者（乳房温存外科手術：２１９人、非定型的乳房切除術：６７人）の平均年齢は５２歳だった（２６歳〜８３歳の範囲）。施設内プロトコルに従って、２４８人（８７％）の患者に放射線療法を行った。乳房温存療法および放射線療法を受けた患者の比率は、ＬＮＮ患者にとって標準的である。この実験は、特定のタイプの外科手術または補助的放射線療法の潜在効果を試験することが目的ではないため、放射線療法を受けた、受けないにかかわらず患者を含めた。さらに、実験により、放射線療法が遠隔の再発に対して明確な効果がないことが示された。初期乳癌被験者（Early Breast Cancer Trialists）（1995年）。リンパ節陰性は、地域の病理学者によって病理検査に基づいている。フォーケンス（Foekens）ら（1989年）。
【０１０２】
含める前に、２８６全ての腫瘍サンプルに対して、十分な腫瘍（＞７０％）、およびＨ＆Ｅで着色した５μｍの凍結切片における腫瘍の均一な関与を有するかを確認した。ＥＲ（およびＰｇＲ）レベルを、リガンド結合アッセイまたはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）（フォーケンス（Foekens）ら（1989年））によって、または免疫組織化学によって測定した（９の腫瘍で）。ＥＲおよびＰＲについて患者を陽性または陰性に分類するために用いるカットオフ値は、１０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質または１０％陽性腫瘍細胞とした。術後のフォローアップには、最初の２年間の３ヵ月毎の検査、３年〜５年目の６ヶ月毎の検査、５年目以降の１２ヶ月毎の検査が含まれる。転移の診断の日付は、患者によって症状が報告された後の転移を確認した日、臨床サインを検出した日、または通常のフォローアップの日と定義した。生存患者（ｎ＝１９８）の平均フォローアップ期間は、１０１ヶ月だった（２０ヶ月から１７１ヶ月の範囲）。この２８６人の患者には、５年以内の遠隔転移の証拠を示す９３人（３３％）が含まれ、この９３人は、無遠隔転移生存者（ＤＭＦＳ）の分析で失敗としてカウントした。５人（２％）の患者は、疾患の証拠がなく死亡し、最後のフォローアップで検閲された。８３人（２９％）の患者は、以前の再発の後に死亡した。したがって、全生存者（ＯＳ）の分析で、合計で８８人（３１％）の患者が失敗だった。
【０１０３】
例２
例１で得たデータの遺伝子発現解析
全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ(カンプロ・サイエンティフィック社（Campro Scientific）、オランダのフェーネンダール（Veenendaal, Netherlands)に所在）を用いて、３０μｍの厚みの２０〜４０のクリオスタット切片（５０〜１００ｍｇ）から単離した。ビオチン標識ターゲットを、公開されている方法（アフィメトリックス（Affymetrix）社、カリフォルニア州、リプシュッツ（Lipshutz）ら(1999年)）を用いて用意し、アフィメトリックス・オリゴヌクレオチド・マイクロアレイＵ１３３ａ・ジーンチップ（Affymetrix oligonucleotide microarray U133a GeneChip）にハイブリダイズさせた。標準アフィメトリックス・プロトコルを用いてアレイをスキャンした。各プローブセットを、別個の遺伝子として扱った。発現値を、アフィメトリックス・ジーンチップ解析ソフトウエアＭＡＳ５．０（Affymetrix GeneChip analysis software MAS 5.0）を用いて求めた。平均強度が４０未満の場合、またはバックグランド信号が１００超の場合は、チップを取り除いた。チップの信号を標準化するために、プローブセットを目標強度である６００に合わせ、スケールマスクファイルを選択しなかった。
【０１０４】
例３
例２で同定した遺伝子の統計解析
遺伝子発現データをフィルタリングして、２つ以上のサンプルで「存在する」と言われる遺伝子を含めた。１７，８１９の遺伝子がこのフィルタを通過し、これらを階層クラスター化に用いた。クラスター化する前に、各遺伝子の発現レベルを、患者の平均発現レベルで除した。この標準化ステップは、遺伝子の発現の大きさの影響を制限し、これらの遺伝子をクラスター化分析において類似の発現パターンと同じグループに分類した。患者のサブグループを同定するために、これらの遺伝子とサンプルの両方について、ジーン・スプリング６．０（GeneSpring 6.0）を用いて平均関連階層クラスター化を行った。
【０１０５】
遠隔転移を発症した患者と５年間に亘って転移のない患者を区別する遺伝子を同定するために、２つの監視クラス予測法を用いた。第１の方法では、２８６人の患者を、８０人の患者のトレーニングセットおよび２０６人の患者の試験セットにそれぞれランダムに割り当てた。トレーニングセットと試験セットのランダムな選択によって著しい差および偏りが生じないように、これらの２つのセットに対するカプラン‐マイヤー生存曲線（Kaplan-Meier survival curves）（カプラン（Kaplan）ら(1958年)）を調べた。第２の方法では、患者を、ＥＲの状態によって階層化される２つのサブグループの一方に割り当てた（図１）。
【０１０６】
各患者のサブグループは、マーカーを選択するために別々に分析した。ＥＲ陽性サブグループの患者は、８０人の患者のトレーニングセットと、１２９人の患者の試験セットにそれぞれランダムに割り当てた。ＥＲ陰性サブグループの患者は、３５人の患者のトレーニングセットと、４２人の患者の試験セットにそれぞれランダムに分けた。各サブグループのトレーニングセットから選択したマーカーを組み合わせて１つのシグネチャを形成し、続く単独の検証でＥＲ陽性患者およびＥＲ陰性患者の両方について腫瘍の転移を予測した。
【０１０７】
統計的に信頼できるレベルとなるように、トレーニングセットのサンプルの大きさを再サンプリング法で決定した。簡単に述べると、トレーニングセットの患者の数を１５人で開始し、５つのステップで増大させた。所定の大きさのサンプルの場合、ランダムに選択された１０人の患者のトレーニングセットを作成した。遺伝子シグネチャを、各トレーニングセットから作成し、５年以内の遠隔転移を定義点とした受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の分析によって、特定の患者の試験セットで試験した。所定の大きさのサンプルに対するこの曲線の下側の領域（ＡＵＣ）の平均および変動係数（ＣＶ）を算出した。トレーニングセットに必要な最少数の患者を、平均ＡＵＣが水平域に達して１０のＡＵＣのＣＶが５％よりも低い点で選択した。
【０１０８】
遺伝子は、以下のように選択した。まず、コックスの単変量比例ハザード回帰（univariate Cox's proportional hazards regression）を用いて、発現（ｌｏｇ２のスケール）がＤＭＦＳの長さに相関する遺伝子を同定した。複数の試験の影響を軽減し、そして選択した遺伝子の強さを試験するために、コックスのモデル（Cox's model）を、トレーニングセットの患者のブートストラッピングで作成した。エフロン（Efron）ら（1981年）。簡単に述べると、それぞれが復元ランダム抽出された８０人の患者を有するように、トレーニングセットの４００のブートストラップサンプルを作成した。コックスのモデルを、各ブートストラップサンプルに対して実行した。ｐ値の上位５％と下位５％を除き、残りのブートストラップのｐ値の逆数を平均して、各遺伝子についてのブートストラップスコアを作成した。このスコアを用いて、遺伝子をランク分けした。複数の遺伝子シグネチャを作成するために、遺伝子マーカーの組合せを、ランク順に従って１回に１つの遺伝子を追加して調べた。定義点として５年以内の遠隔転移を用いるＲＯＣ解析を実施して、最大ＡＵＣ値に達するまで遺伝子の数を増大させて各シグネチャに対してＡＵＣの下側の領域を求めた。
【０１０９】
再発スコア（ＲＳ）を用いて、各患者の遠隔転移のリスクを算出した。このスコアを、標準化されたコックスの回帰係数を重みとして重み付けされた発現信号の線形の組合せとして定義した。
【数２】
2007528218.tif 000004
この式において、
Ｉ＝１（ＥＲレベル＞１０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質の場合）または０（ＥＲレベル≦１０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質の場合）、
ＡおよびＢは、定数、
ｗiは、ＥＲ＋マーカーの標準化されたコックスの回帰係数、
ｘiは、ＥＲ＋マーカーの発現値（ｌｏｇ２のスケール）、
ｗjは、ＥＲ−マーカーの標準化されたコックスの回帰係数、
ｘjは、ＥＲ−マーカーの発現値（ｌｏｇ２のスケール）である。
【０１１０】
１００％の感受性および最も高い特異性が得られるように、トレーニングセットのＲＯＣ曲線から閾値を決定した。３１３．５の定数Ａおよび２８０の定数Ｂの値は、ＥＲ陽性患者およびＥＲ陰性患者の両方に対してＲＳの閾値が０になるように選択した。ＲＳスコアが正の患者は、不良な予後診断のグループに分類し、ＲＳスコアが負の患者は、良好な予後診断のグループに分類した。遺伝子シグネチャおよびカットオフを、試験セットで検証した。カプラン‐マイヤー生存プロット（Kaplan-Meier survival plots）およびログランク検定（log-rank tests）を用いて、予測した高リスクグループと低リスクグループが遠隔転移になるまでの時間の差を評価した。オッズ比（ＯＲ）を、再発すると予測される患者と再発しないと予測される患者との間の遠隔転移のオッズの比として計算した。
【０１１１】
コックスの比例ハザード回帰を用いた単変量分析および多変量分析を、遺伝子シグネチャを有するまたは有しない個々の臨床変数に対して実施した。この結果から、ＨＲおよびその９５％の信頼区間（ＣＩ）が得られた。全ての統計解析を、Ｓ‐Ｐｌｕｓ６．１ソフトウエア（インサイトフル（Insightful）社、バージニア州）を用いて実施した。
【０１１２】
例４
例３で同定された遺伝子の経路分析
機能クラスを、予後診断シグネチャ遺伝子の各遺伝子に割り当てた。経路分析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ １．０ソフトウエア（インジェニュイティ・システムズ社（Ingenuity Systems）、カリフォルニア州）を用いて実施した。アフィメトリックスプローブ（Affymetrix probes）をインプットとして用いて、ソフトウエアによって構築した生物学ネットワークを検索した。プログラムによって見出された生物学ネットワークを、ＧＯ（Gene Ontology）オントロジー分類によって一般的な機能クラスに照らして評価した。予後診断シグネチャに２つ以上の遺伝子を有する経路を選択して評価した。
【０１１３】
例５
例１〜４の結果
患者および腫瘍の特徴
２８６人の患者の臨床的および病理学的特徴を表１に要約する。
【表１】
2007528218.tif 000005
【０１１４】
年齢または閉経状態に差はなかった。ＥＲ陰性トレーニンググループは、より大きな腫瘍の比率が僅かに高く、そして予想していたように、ＥＲ陽性トレーニンググループよりもグレードが不良の腫瘍が多かった。１７１人の患者（１２９人のＥＲ陽性患者と４２人のＥＲ陰性患者）の検証グループは、患者または腫瘍の特性の全てにおいて、合計２８６人の患者のグループと差がなかった。
【０１１５】
２つの方法を用いて、疾患の再発を示すマーカーを同定した。まず、２８６人の患者（ＥＲ陽性とＥＲ陰性の組合せ）の全てをトレーニングセットと試験セットにランダムに分けた。３５の遺伝子を、トレーニングセットの８０人の患者から選択し、遠隔転移の発症を予測するコックスのモデルを作成した。中程度の予後診断値が確認された。表２を参照されたい。監視されていないクラスター化分析によって、腫瘍ＥＲ状態に高い相関性を有する２つの顕著なサブグループが示された（カイ２乗検定 ｐ＜０．０００１）。図１Ｂは、まず患者を、ＥＲ状態に基づいてサブグループに分類する第２の方法を示している。
【表２】
2007528218.tif 000006
【０１１６】
マーカーを選択するために各サブグループを分析した。７６の遺伝子を、トレーニングセットの患者から選択した（６０がＥＲ陽性グループから、１６がＥＲ陰性グループから）（図２Ａの左のグラフを参照）。選択した遺伝子とＥＲ状態を総合して、癌の再発を予測するコックスのモデルを、全てのＬＮＮ患者に対して作成した。１７１人の患者の試験セットにおける７６‐遺伝子予測因子（76-gene predictor）の検証により、ＡＵＣ値が０．６９４、感受性が９３％（５２／５６）、そして特異性が４８％（５５／１１５）のＲＯＣが得られた（図２Ａの右のグラフを参照）。再発スコアが予後診断シグネチャの閾値よりも高い患者は、５年以内の遠隔転移の発症に対して１１．９倍のＯＲ（９５％ＣＩ：４．０４〜３５．１、ｐ＜０．０００１）を有する。対照として、ランダムに選択した７６の遺伝子セットを作成した。これらは、試験グループにおいて平均ＡＵＣ値が０．５１５、感受性が９１％、そして特異性が１２％のＲＯＣを生成した。このような遺伝子セットによって階層化された患者は、転移の発症についてオッズ比１．３（０．５０〜３．９０、ｐ＝０．８）を有し、ランダムな分類を示している。加えて、７６‐遺伝子シグネチャの関数としての全体の生存（ＯＳ）および無遠隔転移生存（ＤＭＦＳ）に対するカプラン‐マイヤー解析により、良好な予後を予測するグループと不良な予後を予測するグループとの間に、転移するまでに大きな有意な時間差が示された（図２を参照）。６０ヶ月および８０ヶ月において、良好な予後のグループと不良な予後のグループとの間のＤＭＦＳの絶対差はそれぞれ、４０％（９３％対５３％）および３９％（８８％対４９％）、そしてＯＳの絶対差はそれぞれ、２７％（９７％対７０％）および３２％（９５％対６３％）であった。
【０１１７】
７６‐遺伝子プロファイルは、８４人の閉経前患者（ＨＲ：９．６０）のサブグループ、８７人の閉経後患者（ＨＲ：４．０４）のサブグループ、および腫瘍の大きさが１０ｍｍ〜２０ｍｍの範囲７９人の患者（ＨＲ：１４．１）のサブグループにおいて、遠隔転移の発症の強力な予後診断因子も表している（図３を参照されたい）。
【０１１８】
コックスの単変量および多変量回帰分析を下の表３に要約した。
【表３】
2007528218.tif 000007
【０１１９】
７６‐遺伝子シグネチャ以外に、単変量分析でグレードのみが顕著であり、中程度／良好の差は、好ましいＤＭＦＳに関連していた。５年以内の腫瘍転移の発生についてのＨＲの多変量回帰推定は、５．５５（ｐ＜０．０００１）であり、７６‐遺伝子セットが、腫瘍転移の高リスクに強く関連した独立した予後診断シグネチャを表していることを示す。ＥＲ陽性患者およびＥＲ陰性患者に対して単変量分析および多変量分析を別々に行い、７６‐遺伝子シグネチャが、ＥＲ状態によって階層化されたサブグループにおける独立した予後診断変数であった。
【０１２０】
予後診断シグネチャにおける７６の遺伝子の機能（表４）を分析して、これらの遺伝子と生物学的経路を関連付けた。
【表４−１】
2007528218.tif 000008
【表４−２】
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【０１２１】
７６の遺伝子の内の１８の遺伝子は機能が未知であるが、細胞死、細胞周期、細胞増殖、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、および免疫応答などによって明確に表されるいくつかの経路または生化学活性が同定された（表５を参照）。
【表５】
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【０１２２】
カルパイン２、起源認識タンパク質（origin recognition protein）、二重特異性ホスファターゼ、Ｒｈｏ‐ＧＤＰ解離阻害剤、ＴＮＦスーパーファミリータンパク質、補体成分３、微小管関連タンパク質、プロテインホスファターゼ１、およびアポトーシス制御因子ＢＣＬ‐Ｇを含め、疾患の進行に関係する遺伝子を見出した。さらに、サイクリンＥ２（キオマルシ（Keyomarsi）ら（2002年））およびＣＤ４４（ヘレラ‐ガイオル（Herrera-Gayol）ら（1999年））などの既に特徴付けられている予後診断遺伝子は、遺伝子シグネチャに含まれている。
【０１２３】
例６
例１〜５の考察
あらゆる年齢およびあらゆる腫瘍の大きさのリンパ節陰性乳癌患者２８６人からの原発腫瘍の分析の結果を提供する。患者は、補助的全身療法を受けていないため、予後診断の多遺伝子評価は、混乱させる可能性のある全身治療に関連した予測因子による影響を受けない。
【０１２４】
この実験は、遠隔腫瘍再発を正確に予測する７６‐遺伝子シグネチャを明らかにした。このシグネチャは、年齢、腫瘍の大きさ、グレード、およびＥＲの状態に関係なく、全てのＬＮＮ乳房患者に利用することができる。ＤＭＦＳについてのコックスの多変量分析では、７６‐遺伝子シグネチャは、グレードを含む臨床変数よりも優れた唯１つの顕著な変数である。５年後、７６‐遺伝子シグネチャが良好な患者と７６‐遺伝子シグネチャが不良な患者との間のＤＭＦＳおよびＯＳにおける絶対差はそれぞれ、４０％および２７％であった。予後診断シグネチャが良好な患者の場合、５年以内に７％が遠隔転移を発症し、３％が死亡した。さらに検証される場合、ＬＮＮ患者の再発率が２５％とすると、この予後診断シグネチャは、３７％の陽性予測値および９５％の陰性予測値を生成するであろう。特に、このシグネチャは、Ｔ１腫瘍（２ｃｍ未満）の増大率に対する再発のリスクを決定する際に有効であろう。ザンクトガレン（St Gallen）ガイドラインおよびＮＩＨガイドラインとの比較は有益である。同じ数の高リスク患者が必要な治療を受けるようにすべきであるが、我々の７６‐遺伝子シグネチャは、低リスク患者の５２％のみに補助的全身化学療法を推奨し、ザンクトガレン（St Gallen）ガイドラインは、低リスク患者の９０％、ＮＩＨガイドラインは、低リスク患者の８９％に推奨する（表６を参照）。
【表６】
2007528218.tif 000011
【０１２５】
したがって、７６‐遺伝子シグネチャは、不必要な補助的全身療法を薦められる低リスクＬＮＮ患者の人数を減少させることができる。
【０１２６】
予後診断シグネチャにおける７６の遺伝子は、多数の機能クラスに属するため、異なる経路が疾患の進行につながるであろうことを示唆している。このシグネチャは、十分に特徴付けられた遺伝子および１８の未知の遺伝子を含んでいる。この発見は、他の予後診断因子と比べてこのシグネチャが優れた性能を有する説明となる。細胞死、細胞増殖、および転写調節に関与する遺伝子が、ＥＲの状態によって階層化された両方の患者グループで見つかっているが、ＥＲ陽性グループで選択された６０の遺伝子とＥＲ陰性グループで選択された１６の遺伝子は、重複していない。この結果は、疾患の進行の根源的な機構および不均一性の程度が、乳癌患者の２つのＥＲに基づいたサブグループで異なるという考えをサポートする。
【０１２７】
我々の結果とファン・デ・ビジュデール（van de Vijver）ら（2002年）による研究結果の比較は、用いた患者、技術、および物質が異なるため困難である。ファン・デ・ビジュデール（van de Vijver）らは、補助的全身療法を受けた、または受けていないリンパ節陰性および陽性の５３歳未満の女性患者のみを含む。さらに、この研究に用いたマイクロアレイプラットフォームは、アフィメトリックス（Affymetrix）とアジレント（Agilent）と異なっている。バン・ビール（van't Veer）（2002年）の研究の７０の遺伝子の場合、４８の遺伝子のみがアフィメトリックスＵ１３３ａアレイ（Affymetrix U133a array）に存在し、我々の場合は、７６の遺伝子の内の３８の遺伝子のみがアジレントアレイ（Agilent array）に存在する。２つのシグネチャの間に３‐遺伝子の重複が存在する（サイクリンＥ２、起源認識複合体、およびＴＮＦスーパーファミリータンパク質）。明白な違いにもかかわらず、両方のシグネチャは、腫瘍の再発に関与しうるいくつかの共通経路を同定する遺伝子を含む。この発見は、遺伝子要素には余剰が存在しうるが、有効なシグネチャが、特定の経路の表現を含む必要があるという考えをサポートする。
【０１２８】
ファン・デ・ビジュデール（van de Vijver）ら（2002年）の研究に比べて我々の研究が優れている点は、未治療のＬＮＮ患者の数が多く（１４１人に対して２８６人）、我々の７６‐遺伝子シグネチャが年齢、閉経状態、および腫瘍の大きさに関係ないことである。我々の患者の検証セットは、他のレポート（ランソホフ（Ransohoff）（2004年））の９０％に対して、トレーニングセットとの重複が一切ない。結論として、未治療ＬＮＮ患者の約３０〜４０％しか腫瘍を再発しないため、予後診断シグネチャは、低リスクの患者を識別して相当数の患者における過剰医療を防止する強力なツールを提供することができる。原発乳癌患者の補助的全身療法の推奨は、将来は、この予後診断シグネチャが指針になるであろう。全身療法の様々な方式の有効性に対する我々の遺伝子シグネチャの予測値を、補助療法として、または転移疾患患者において試験することができる。
【０１２９】
例７
ステージＩ／ＩＩの乳癌のバルク組織とレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションから得た乳癌遺伝子プロファイルの比較
遺伝子発現プロファイルは、様々な種類の癌において強力な診断および予後診断ツールであることが示されてきた。殆ど例外なく、バルク腫瘍ＲＮＡを用いてチップ上でハイブリダイゼーションさせる。ホルモン依存性腫瘍の発症および成長において、エストロゲンが重要な役割を果たしている。
【０１３０】
約７５％の乳癌が、タモキシフェン療法（補助的）の指標であり、かつ患者の結果に関係するエストロゲン受容体（ＥＲ）を発現する。
【０１３１】
乳房上皮細胞およびこれに関連した腫瘍形成においてエストロゲンによって引き起こされる機構を洞察するために、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）を用いて、２９人の早期原発乳房腫瘍の患者から腫瘍細胞の組織学的に均一な集団を採取し、ジーンチップ（GeneChip）発現分析を行った。これらの２９人の患者の内、腫瘍のサイトゾルに対する量的リガンド結合またはエンザイムイムノアッセイに基づき、１１人がＥＲ陰性、１７人がＥＲ陽性であった。比較のために、同じ２９人の患者のグループから単離したバルク組織ＲＮＡを用いて、遺伝子発現プロファイルも得た。
【０１３２】
新鮮凍結組織サンプルは、乳房腫瘍の外科的治療を受けたが、ネオアジュバント全身療法を受けていない２９人のリンパ節陰性乳癌患者（腫瘍の特徴、表２）から採取されたものである。各患者の組織サンプルに対して、我々はまず、Ｈ＆Ｅスライドを用いて細胞形態を評価した。クリオスタット部分に対してＬＣＭ（ＰＡＬＭ）を行って得た腫瘍細胞と、全クリオスタット部分すなわち同じ腫瘍のバルク組織の両方からＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルの質を、アジレント・バイオアナライザー（Agilent BioAnalyzer）で分析した。このＲＮＡサンプルを、約２２，０００のプローブセットを含むアフィメトリックス・ヒューマンＵ１１３Ａチップ（Affymetrix human U133A chip）にハイブリダイズさせた。蛍光発光を定量して、強度を標準化した。クラスター化分析（Clustering Analysis）および主成分分析（Principal Component Analysis）を用いて、類似の遺伝子発現プロファイルで患者をグループ分けした。ＥＲ陽性サンプルとＥＲ陰性サンプルとの間で異なって発現する遺伝子を選択した。
【０１３３】
標的の調製において、ＬＣＭで採取した乳癌細胞から単離した全ＲＮＡは、Ｔ７を用いた増幅を２回行ったが、バルク組織ＲＮＡは１回しか増幅を行わなかった。２１のコントロール遺伝子（表７）の発現レベルをＬＣＭデータセットとバルク組織セットとの間で比較して、線形増幅の忠実性を実証した。
【表７】
2007528218.tif 000012
得られた結果は、表８および図４〜図９に示した。
【表８】
2007528218.tif 000013
【０１３４】
図４は、５１２１の遺伝子に基づいた階層クラスター化であり、ＬＣＭおよびバルク組織サンプルがグローバルＲＮＡ発現プロファイルに基づいて完全に分けられていることを示している。図５は、ＬＣＭサンプルおよびバルク組織から単離されたＲＮＡにおける２１のコントロール遺伝子（表６）の発現レベルを示す棒グラフであり、ＬＣＭによって得られたＲＮＡに用いた追加の回の線形増幅がコントロール遺伝子の異なった発現を引き起こさなかったことを示している。図６は、データ分析経路であり、図７は、フィルタリングされた遺伝子セットを用いたＰＣＡ分析を示している。図８は、ＥＲ状態を用いて患者のサブグループを割り当てた円グラフである。ＬＣＭサンプルおよびバルク組織サンプルの両方において、ＥＲ陽性サブクラスターとＥＲ陰性サブクラスターとの間で異なって発現される遺伝子を、スチューデントのＴ検定で決定した。図９は、ＬＣＭサンプルのＥＲだけ、バルク組織のＥＲだけ、およびＬＣＭおよびバルク組織の両方に共通のＥＲに関連した遺伝子についてのジーンオントロジー（Gene Ontology）による経路分析の結果を示している一連の棒グラフである。
【０１３５】
簡単に述べると、得られた結果は、いくつかの重要な結論を示している。第１に、細胞増殖およびエネルギー代謝に関連した遺伝子は、バルク組織データセットとＬＣＭデータセットの両方におけるＥＲ陰性／ＥＲ陽性患者で異なって発現することが分かった。第２に、ＬＣＭによる乳癌細胞の質が高まったため、細胞表面受容体連鎖シグナル伝達、ＲＡＳシグナル伝達、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴシグナル伝達、およびアポトーシスに関与する遺伝子がＥＲの状態に関係することが分かった。これらの遺伝子は、バルクデータセットでは同定されなかった。第３に、マイクロダイセクションにより、上皮腫瘍細胞を検査する高感度法が可能になり、エストロゲン受容体に関連したシグナル伝達経路の洞察が可能となった。したがって、ここに記載する遺伝子発現プロファイルをＬＣＭ単離腫瘍細胞に利用することが、異なるバルク組織で得られる結果に見合っていることが明らかである。
【０１３６】
例８
乳癌における７６‐遺伝子予後診断シグネチャの検証および経路分析
この例８では、７６‐遺伝子シグネチャを用いて４つの異なる供給源から得た１３２人の患者の結果を予測する検証検査の結果を報告する。
【０１３７】
加えて、この遺伝子シグネチャのロバスト性を評価するために、この例８は、このシグネチャの代替可能な構成要素を同定し、このような代替物がいかに有効なシグネチャにおける重要な経路の同定につながるかを記載する。
【０１３８】
新鮮な凍結組織サンプルは、乳房腫瘍の外科的治療を受けたが、補助的全身療法を受けていない１３２人の患者から採取されたものである。使用する患者サンプルは、１９８０年〜１９９６年に採取されたものである（図１０）。各患者の組織サンプルについて、Ｈ＆Ｅスライドを用いて細胞形態を評価した。次に、全ＲＮＡサンプルを調製し、このサンプルの質を、アジレント・バイオアナライザー（Agilent BioAnalyzer）で分析した。このＲＮＡサンプルは、マイクロアレイ分析でも分析した。蛍光発光を定量して、その強度を標準化した。再発ハザードスコアを、７６‐遺伝子発現シグネチャの発現レベルに基づいて各患者について算出した。これらの患者を、結果が良好なグループと不良なグループに分けた。図１１および図１２を参照されたい。
【０１３９】
この遺伝子シグネチャのロバスト性を評価するために、２つの統計分析をデザインして使用した。図１３を参照されたい。第１に、遺伝子の選択、そして７６‐遺伝子シグネチャを見出すために用いたシグネチャ構築法を繰り返した。表８に示されているように、１１５人の患者の１０のトレーニングセットはそれぞれ、合計２８６人の患者からランダムに選択した。残りの患者は、試験セットに利用した。
【０１４０】
第２に、トレーニングセットの患者の数は、２８６人の患者の８０％に増大し、残りの２０％の患者を試験セットに用いた。この選択法を１０回繰り返した。両方の方法で、カプラン‐マイヤー生存曲線（Kaplan-Meier survival curves）を用いて、トレーニングセットと試験セットとの間には無疾患生存に有意差がないことを確認した。コックスの比例ハザード回帰を用いて、トレーニングセットのそれぞれから遺伝子を選択し、シグネチャを構築した。各シグネチャは、一致する試験セットで確認した。さらに、７６‐遺伝子予後診断シグネチャを、ＧＯオントロジー分類で複数の機能グループに割り当てた。このシグネチャの相当数の遺伝子を含む経路を選択した（ｐ値＜０．０５、＞２ヒット）。また、選択した経路は、異なるトレーニングセットに由来する全ての予後診断シグネチャで評価した。
【０１４１】
表９において、Ａは、１１５人の患者のトレーニングセットを用いた１０シグネチャからの結果を含み、Ｂは、患者の８０％のトレーニングセットを用いた１０シグネチャからの結果を含む。
【表９】
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【０１４２】
この例から得た結果は以下のとおりである。
・７６‐遺伝子シグネチャは、１３２人の別個の患者で検証に成功し、４つの異なる供給源からの１３２人のＬＮＮ乳癌患者で０．７５７のＡＵＣ値が得られた。このシグネチャは、８８％の感受性、４１％の特異性を示している。
・代替シグネチャの平均ＡＵＣは０．６４（９５％ＣＩ：０．５３〜０．７２）である。この結果は、７６‐遺伝子予測因子の結果（ＡＵＣ：０．６９）と一致している。７６‐遺伝子シグネチャで過度に表現された２１の経路が、全ての他の予後診断シグネチャでも見出され、共通の生物学的経路が腫瘍の再発に関与していることを示唆している。
・これらの結果は、遺伝子発現プロファイルが患者の結果のリスク評価を行うための強力な方法を提供できることを示唆している。このデータは、患者の腫瘍再発を量的に測定する分子予後診断アッセイの実現性を明らかにしている。
【０１４３】
本発明は、理解し易いように例示および例を用いて詳細に説明してきたが、この説明および例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１１】
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【０１４４】
参照文献
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【０１４５】
〔実施の態様〕
（１）乳癌の状態を評価するための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、乳癌の状態を示唆している、
方法。
（２）乳癌患者のステージを求めるための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、乳癌のステージを示唆している、
方法。
（３）実施態様（２）に記載の方法において、
前記ステージが、ＴＮＭシステムによる分類に一致する、方法。
（４）実施態様（２）に記載の方法において、
前記ステージが、類似の遺伝子発現プロファイルを有する患者に一致する、方法。
（５）乳癌患者の治療プロトコルを決定するための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨される療法の程度および種類を医師が決定できるように再発のリスクを十分に示唆している、
方法。
【０１４６】
（６）乳癌患者を治療するための方法において、
（ａ）乳癌患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発の高いリスクを示唆している、
方法。
（７）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記配列番号が１‐３５である、方法。
（８）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記配列番号が３６‐９５である、方法。
（９）ＥＲ陽性患者に予後診断を提供するために用いる実施態様（８）に記載の方法。
（１０）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記配列番号が９６‐１１１である、方法。
【０１４７】
（１１）ＥＲ陰性患者に予後診断を提供するために用いる実施態様（１０）に記載の方法。
（１２）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記配列番号が３６‐１１１である、方法。
（１３）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記サンプルを、バルク組織の用意およびレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションからなる群から選択される方法によって用意する、方法。
（１４）実施態様（１３）に記載の方法において、
前記バルク組織の用意を、生検または外科的試料から行う、方法。
（１５）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
（ｉ）配列番号１１２‐１３２に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１１２‐１３２に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップをさらに含む、
方法。
【０１４８】
（１６）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記サンプルで構成的に発現している少なくとも１つの遺伝子の発現ベルを測定するステップをさらに含む、方法。
（１７）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記サンプルのエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を決定するステップをさらに含む、方法。
（１８）実施態様（１７）に記載の方法において、
前記ＥＲの状態を、ＥＲの状態を示唆する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの測定によって決定する、方法。
（１９）実施態様（１７）に記載の方法において、
前記ＥＲの状態を、前記サンプルにおけるＥＲの存在の測定によって決定する、方法。
（２０）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記ＥＲの存在を、免疫組織化学的に測定する、方法。
【０１４９】
（２１）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記サンプルを原発腫瘍から得る、方法。
（２２）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
特異性が、少なくとも約４０％である、方法。
（２３）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
感受性が、少なくとも約９０％である、方法。
（２４）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記遺伝子の発現パターンを、再発患者を示唆する発現パターンと比較する、方法。
（２５）実施態様（２４）に記載の方法において、
前記発現パターンの比較を、パターン認識法を用いて行う、方法。
【０１５０】
（２６）実施態様（２５）に記載の方法において、
前記パターン認識法が、コックスの比例ハザード分析（Cox's proportional hazards analysis）の使用を含む、方法。
（２７）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して、前記サンプルで少なくとも１．５倍多い、または１．５倍少ない発現である、方法。
（２８）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して、転移細胞を有する前記サンプルで少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現を有する、方法。
（２９）実施態様（２８）に記載の方法において、
前記ｐ値が０．０５未満である、方法。
（３０）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
遺伝子発現を、マイクロアレイまたは遺伝子チップ上で測定する、方法。
【０１５１】
（３１）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記マイクロアレイが、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイである、方法。
（３２）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記マイクロアレイまたは遺伝子チップが、１または複数の内部コントロール試薬をさらに含む、方法。
（３３）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
遺伝子発現を、前記サンプルから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅によって決定する、方法。
（３４）実施態様（３３）に記載の方法において、
前記ＰＣＲが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）である、方法。
（３５）実施態様（３４）に記載の方法において、
前記ＲＴ‐ＰＣＲが、１または複数の内部コントロール試薬をさらに含む、方法。
【０１５２】
（３６）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
遺伝子発現を、前記遺伝子によってコード化されるタンパク質の測定または検出によって検知する、方法。
（３７）実施態様（３６）に記載の方法において、
前記タンパク質を、前記タンパク質に特異的な抗体によって検出する、方法。
（３８）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法において、
遺伝子発現を、前記遺伝子の特徴を測定して検出する、方法。
（３９）実施態様（３８）に記載の方法において、
測定する前記特徴を、ＤＮＡ増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異体からなる群から選択する、方法。
（４０）乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを交差検証するための方法において、
（ａ）統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップと、
（ｂ）サンプルの順番をランダムにするステップと、
（ｃ）１０％〜５０％のサンプルからのデータを除外するステップと、
（ｄ）残りのサンプルに対して、全ての変数について目的の因子を計算して、ｐ値カットオフ（ｐ）を満たす変数を選択するステップと、
（ｅ）前方検索を用いて予測モデルに適合する変数を選択し、所定の誤差率になるまでトレーニング誤差（training error）を評価するステップと、
（ｆ）残りの１０％〜５０％のサンプルに対して前記予測モデルを試験するステップと、
（ｇ）除外したサンプルの新しいセットでステップ（ｃ）‐（ｆ）を繰り返すステップと、
（ｈ）サンプルの１００％の試験が終わるまでステップ（ｃ）‐（ｇ）を繰り返して、分類結果を記録するステップと、
を含む、方法。
【０１５３】
（４１）実施態様（４０）に記載の方法において、
前記ステップ（ｈ）で得た前記遺伝子発現データが、
（ｉ）配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致する、
または（ｉｉ）表１０に示されている配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって表される、
方法。
（４２）乳癌患者の予後診断遺伝子発現プロファイルを単独で検証する方法において、
（ａ）統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップと、
（ｂ）前記遺伝子発現データにおける供給源によるばらつき（source variabilities）を標準化するステップと、
（ｃ）既に選択されている全ての変数について目的の因子を計算するステップと、
（ｄ）前記サンプルに対して予測モデルを試験して分類結果を記録するステップと、
を含む、方法。
（４３）実施態様（４２）に記載の方法において、
前記ステップ（ｄ）で得た遺伝子データが、
（ｉ）配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６7、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致する、
または（ｉｉ）表１０に示されている配列番号３、４、１０、１８、３７、４０、４２、４３、４５、５５、５８、６４、６７、７２‐７４、７６、８１、８５‐８６、８９、９７、１００‐１０１、１１０‐１１１、１２５、および１３２‐４４２、または２、３、５、１２、２０、２５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１１、１３２、１３９、１４２、１５０、１５１、１５３、１５４、１５８、１６１、１６３、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８１、１８２、１８３、１８６、１８８、１９０、１９２、２０４、２０６、２０７、２１２、２１５、２１８、２２１、２２３、２２５、２２８、２３１、２３２、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４６、２４８、２４９、２５５、２５７、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２８０、２８１、２８２、２８８、２９０、２９１、２９９、３０１、３０４、３０６、３１１、３１４、３１５、３１８、３２７、３２８、３３８、３４２、３４６、３４８、３５４、３６６、３６８、３７１、３７５、３８５、３８８、３９１、３９５、３９７、４０２、４０５、４０９、４２２、４２４、４２８、４２９、４３５、４３６、４４０、６５１、および４４３‐６５０に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって表される、
方法。
（４４）実施態様（４２）または（４３）に記載の方法によって得る遺伝子プロファイル。
（４５）乳癌患者の予後診断を可能にする再発ハザードスコア（Relapse Hazard Score）を生成する方法において、
（ａ）統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを得るステップと、
（ｂ）前記データに対してコックスの単変量回帰分析（univariate Cox's regression analysis）を適用して選択遺伝子を得るステップと、
（ｃ）標準コックス係数（standard Cox's coefficients）を用いて前記選択遺伝子に重み付けした発現レベルを適用して、再発ハザードスコアとして適用されうる予測モデルを得るステップと、
を含む、方法。
【０１５４】
（４６）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記再発ハザードスコアを以下の式を用いて求める、方法。
【数３】
2007528218.tif 000028
但し、
Ｉ＝１（Ｘ遺伝子レベル＞１０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質の場合）または０（Ｘ遺伝子レベル≦１０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質の場合）、
ＡおよびＢは定数、
ｗiは、Ｘ遺伝子＋マーカーに対する標準化されたコックスの回帰係数、
ｘiは、ＥＲ＋マーカーの発現値（ｌｏｇ２のスケール）、
ｗjは、Ｘ遺伝子−マーカーに対する標準化されたコックスの回帰係数、
ｘjは、ＥＲ−マーカーの発現値（ｌｏｇ２のスケール）、
Ｘ遺伝子は、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される。
（４７）乳癌予後診断患者レポートを作成する方法において、
（ａ）患者から生体サンプルを得るステップと、
（ｂ）前記サンプルの遺伝子発現を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果に対して再発ハザードスコア（Relapse Hazard Score）を適用するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得た前記結果を用いて前記レポートを作成するステップと、
を含む、方法。
（４８）実施態様（４７）に記載の方法において、
前記レポートが、患者集団に対するリスクの可能性および／または患者の結果の評価を含む、方法。
（４９）実施態様（４７）に記載の方法で作成される患者レポート。
（５０）組成物において、
（ｉ）配列番号１‐１１１、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓ、
からなる群から選択される少なくとも１つのプローブセットを含む、
組成物。
【０１５５】
（５１）生体サンプルにおいて乳癌の予後診断を決定するアッセイを行うためのキットにおいて、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部を検出するための物質、
を含む、キット。
（５２）実施態様（５１）に記載のキットにおいて、
前記配列番号が３６‐９５である、キット。
（５３）実施態様（５１）に記載のキットにおいて、
前記配列番号が９６‐１１１である、キット。
（５４）実施態様（５１）に記載のキットにおいて、
前記配列番号が３６‐１１１である、キット。
（５５）実施態様（５１）に記載のキットにおいて、
マイクロアレイ分析を行うための試薬をさらに含む、キット。
【０１５６】
（５６）実施態様（５１）に記載のキットにおいて、
前記核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、方法。
（５７）乳癌の状態を評価するための物品において、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部を検出するための物質、
を含む、物品。
（５８）実施態様（５７）に記載の物品において、
前記配列番号が３６‐９５である、物品。
（５９）実施態様（５７）に記載の物品において、
前記配列番号が９６‐１１１である、物品。
（６０）実施態様（５７）に記載の物品において、
前記配列番号が３６‐１１１である、物品。
【０１５７】
（６１）実施態様（５７）に記載の物品において、
マイクロアレイ分析を行うための試薬をさらに含む、物品。
（６２）実施態様（５７）に記載の物品において、
前記核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、物品。
（６３）実施態様（１）、（２）、（５）、または（６）に記載の方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップ。
（６４）実施態様（６３）に記載のマイクロアレイにおいて、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の補完物、またはそれら核酸配列の一部、
を含み、
前記遺伝子の組合せが、生体サンプルにおける乳癌の状態または再発のリスクを特徴付けるのに十分である、
マイクロアレイ。
（６５）実施態様（６３）に記載のマイクロアレイにおいて、
測定または特徴付けが、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現である、マイクロアレイ。
【０１５８】
（６６）実施態様（６３）に記載のマイクロアレイにおいて、
測定により、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られる、マイクロアレイ。
（６７）実施態様（６３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記ｐ値が０．０５未満である、マイクロアレイ。
（６８）実施態様（６３）に記載のマイクロアレイにおいて、
ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含む、マイクロアレイ。
（６９）実施態様（６３）に記載のマイクロアレイにおいて、
１または複数の内部コントロール試薬をさらに含む、マイクロアレイ。
（７０）診断／予後診断ポートフォリオにおいて、
（ｉ）配列番号１‐１１１に一致する、または、
（ｉｉ）表１０に示されている配列番号１‐１１１に一致するｐｓｉｄｓからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ｍＲＮＡをコード化する遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それら核酸配列の相補配列、またはそれら核酸配列の一部、
を含み、
前記遺伝子の組合せが、生体サンプルにおける乳癌の状態または再発のリスクを特徴付けるのに十分である、
診断／予後診断ポートフォリオ。
【０１５９】
（７１）実施態様（７０）に記載のポートフォリオにおいて、
測定または特徴付けが、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５倍少ない過少発現である、ポートフォリオ。
（７２）実施態様（７０）に記載のポートフォリオにおいて、
測定により、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られる、ポートフォリオ。
（７３）実施態様（７０）に記載のポートフォリオにおいて、
前記ｐ値が０．０５未満である、ポートフォリオ。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】分析のためのサンプルの選択の外観図、および２８６人のリンパ節陰性（ＬＮＮ）乳癌患者の遺伝子発現データの監視されていないクラスター化分析を示している。Ａは、分析のための患者のサンプルの選択のフローチャートである。ＥＲの状態を用いて、患者のサブグループを特定した。次に、各サブグループは、マーカーを選択するために別々に分析した。サブグループの患者に、トレーニングセットまたは試験セットを割り当てた。各サブグループから選択されたマーカーを結合して、１つのシグネチャを形成し、全体として試験セットの全ての患者の腫瘍再発を予測する。Ｂは、２８６人のＬＮＮ乳癌患者の遺伝子発現データの監視されていないクラスター化分析である。左側のグラフは、１７，８１９の情報価値のある遺伝子を示している。赤は、高い相対発現を示し、緑は、低い相対発現を示している。各列はサンプルであり、各行は遺伝子である。右のグラフは、２つの患者のサブグループ間で著しく異なって発現する、左のグラフから同定された２つの優勢な遺伝子クラスターの拡大図を示している。上側の遺伝子クラスターは、ＥＲ陽性サブグループで２８２のダウンレギュレートされた遺伝子のグループを有する。下側の遺伝子クラスターは、ＥＲ陽性サブグループで３３９のアップレギュレートされた遺伝子のグループによって表される。各樹状図の下部のラベルバーは、通常のアッセイによって測定される患者のＥＲの状態を示唆している。
【図２】７６‐遺伝子プロファイルの樹立、および無遠隔転移（ＤＭＦＳ）および全生存（ＯＳ）に対するカプランマイヤー分析を示すグラフである。Ａは、予後診断シグネチャの遺伝子の選択を示している。ＥＲ陽性グループおよびＥＲ陰性グループに対する遺伝子マーカーを、ＲＯＣ分析を用いて２つのトレーニングセットから選択した。６０の遺伝子がＥＲ陽性グループから、１６の遺伝子がＥＲ陰性グループからであり（左側のグラフ）、試験セットの１７１人の患者の分析から得た７６‐遺伝子シグネチャのＲＯＣ曲線である（右側のグラフ）。Ｂは、１７１人のＬＮＮ患者の検証セットにおけるＤＭＦＳ分析（左側のグラフ）およびＯＳ分析（右側のグラフ）を示している。各患者の失敗のリスクは、７６‐遺伝子シグネチャに基づいて評価し、閾値は、トレーニングセットによって決定した。差を調べるためにログランク検定を用いた。
【図３】ＬＮＮ患者のサブグループにおけるＤＭＦＳ分析およびＯＳ分析を示している。８４人の閉経前の患者（Ａ）、８７人の閉経後の患者（Ｂ）、腫瘍の大きさが１０〜２０ｍｍの７９人の患者（Ｃ）におけるＤＭＦＳ分析（左側のグラフ）およびＯＳ分析（右側のグラフ）を示している。結果は、検証セットの個々の患者からである。各患者の再発リスクは、７６‐遺伝子シグネチャに基づいて評価し、閾値は、トレーニングセットによって決定した。差を調べるためにログランク検定を用いた。
【図４】５１２１の遺伝子に基づいた階層クラスター化を示すグラフである。
【図５】２１のコントロール遺伝子（表７を参照）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図６】データ分析のフローチャートである。
【図７】フィルタリングされた遺伝子セットを用いたＰＣＡ分析を示すグラフである。
【図８】患者をサブグループに割り当てるために用いるＥＲの状態を表す円グラフである。ＬＣＭおよびバルク組織サンプルの両方でＥＲ陽性サブクラスターとＥＲ陰性サブクラスターとの間で異なって発現される遺伝子をスチューデントのＴ検定で決定した。
【図９】ＬＣＭサンプルだけ、バルク組織だけ、およびＬＣＭとバルク組織の両方に共通である、ＥＲに関連した遺伝子についてのジーンオントロジー（Gene Ontology）による経路分析の結果を示している一連の棒グラフである。
【図１０】独立した検証の結果を示すフローチャートである。このフローチャートは、１３２人の患者が４つの異なる供給源で集められたことを示している。再発ハザードスコアを、７６‐遺伝子シグネチャの発現レベルに基づいて各患者に対して計算した。患者を、良好な結果のグループと不良な結果のグループに分類した。
【図１１】検証検査のための患者および患者の腫瘍の臨床的および病理的特徴を示す表（Ａ）と、検証検査における７６‐遺伝子シグネチャのＲＯＣ曲線を示すグラフ（Ｂ）である。
【図１２】検証検査における１３２人の患者の分類結果を示す表（Ａ）およびグラフ（Ｂ）である。予測された良好な結果のグループと不良な結果のグループに対するカプランマイヤー生存曲線およびログランク検定をグラフ（Ｂ）に示している。
【図１３】経路分析の結果を示すフローチャートである。このフローチャートは、統計的分析のためにサンプルを選択するために用いる方法を示している。Ａでは、２８６人の患者を１１５人の患者のトレーニングセットおよび試験セットにランダムに分けている。Ｂでは、２８６人の患者を、患者の８０％をトレーニングセット、患者の２０％を試験セットにランダムに分けている。トレーニングセットは、遺伝子マーカーの選択および予後診断シグネチャの作成に用いた。試験セットは、検証に用いた。両方の手順を１０回繰り返した。
【図１４】ＧＯオントロジー分析の概要を示すグラフである。各バーは、７６‐遺伝子シグネチャで有意に過剰に表された経路を示している（ｐ＜０．０５）。代替のシグネチャの結果から標準偏差を計算した。Ａは、１１５人の患者のトレーニングセットを用いた１０のシグネチャからの結果を示している。Ｂは、患者の８０％のトレーニングセットを用いた１０のシグネチャからの結果を示している。
【図１】
2007528218.tif 000029
【図２】
2007528218.tif 000030
【図３】
2007528218.tif 000031
【図４】
2007528218.tif 000032
【図５】
2007528218.tif 000033
【図６】
2007528218.tif 000034
【図７】
2007528218.tif 000035
【図８】
2007528218.tif 000036
【図９】
2007528218.tif 000037
【図１０】
2007528218.tif 000038
【図１１】
2007528218.tif 000039
【図１２】
2007528218.tif 000040
【図１３】
2007528218.tif 000041
【図１４】
2007528218.tif 000042
【配列表】
2007528218000001.app
【国際調査報告】
2007528218.tif 000043
2007528218.tif 000044
2007528218.tif 000045
2007528218.tif 000046
2007528218.tif 000047