(57)【要約】  敗血症、癒着形成、創傷、臓器不全、慢性疾患、感染に起因する一般的な炎症性症状、損傷と切開に起因する瘢痕化、およびそれらの組合せを含む（しかしそれらに限られない）症状における、炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、発生を遅延させ、あるいは軽減させる方法。
2007517769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、発生を遅延させ、あるいは軽減させる方法であって、薬剤担体中の治療上有効な量の少なくとも１つの組織保護性サイトカインを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの組織保護性サイトカインが、化学修飾されたエリスロポエチンまたは突然変異されたエリスロポエチンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化学修飾されたエリスロポエチンがｉ）シアル酸部分が不足しているエリスロポエチン；ii）少なくともシアル酸部分を有しないエリスロポエチン；iii）少なくともＮ−リンクのまたはＯ−リンクの炭水化物を有しないエリスロポエチン；iv）少なくとも１つのグリコシダーゼによる自然のエリスロポエチンの処理により、少なくとも炭水化物含量が減少したエリスロポエチン；ｖ）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有するエリスロポエチン；vi）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有し、化学的に還元されたエリスロポエチン；vii）少なくとも１つ以上の修飾されたアルギニン残基を有するエリスロポエチン；viii）少なくとも１つ以上の修飾されたリジン残基、またはエリスロポエチン分子のＮ末端アミノ基の修飾を有するエリスロポエチン；ix）少なくとも１つの修飾されたチロシン残基を有するエリスロポエチン；ｘ）少なくとも１つの修飾されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を有するエリスロポエチン；xi）少なくとも１つの修飾されたトリプトファン残基を有するエリスロポエチン；xii）少なくとも１つのアミノ基が除去されたエリスロポエチン；xiii）エリスロポエチン分子中のシスチン架橋の少なくとも１つに少なくとも1つの開裂を有するエリスロポエチン；またはxiv）短縮されたエリスロポエチン、から成る群より選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
化学修飾されたエリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項３記載の方法。
【請求項５】
化学修飾されたエリスロポエチンがカルバミル化されたエリスロポエチンを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
突然変異エリスロポエチンが次の突然変異：
【表１】
2007517769.tif 000011
の１つ以上からなる群より選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項７】
突然変異エリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項６記載の方法。
【請求項８】
炎症性サイトカインがインターロイキンまたはＴＮＦを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
炎症性サイトカインがＴＮＦである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
炎症性サイトカインの影響が、発熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全、およびインシュリン抵抗性を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物において炎症性サイトカインの影響に関連した症状を治療し、予防し、または発生を遅延させる方法であって、薬剤担体中の治療上有効な量の少なくとも１つの組織保護性サイトカインを投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの組織保護性サイトカインが化学修飾されたエリスロポエチンまたは突然変異エリスロポエチンを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
化学修飾されたエリスロポエチンが：ｉ）シアル酸部分が不足しているエリスロポエチン；ii）少なくともシアル酸部分を有しないエリスロポエチン；iii）少なくともＮリンクのまたはＯ−リンクの炭水化物を有しないエリスロポエチン；iv）少なくとも１つのグリコシダーゼによる自然のエリスロポエチンの処理により、少なくとも炭水化物含量が減少したエリスロポエチン；ｖ）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有するエリスロポエチン；vi）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有し、化学的に還元されたエリスロポエチン；vii）少なくとも１つ以上の修飾されたアルギニン残基を有するエリスロポエチン；viii）少なくとも１つ以上の修飾されたリジン残基、またはエリスロポエチン分子のＮ末端アミノ基の修飾を有するエリスロポエチン；ix）少なくとも１つの修飾されたチロシン残基を有するエリスロポエチン；ｘ）少なくとも１つの修飾されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を有するエリスロポエチン；xi）少なくとも１つの修飾されたトリプトファン残基を有するエリスロポエチン；xii）少なくとも１つのアミノ基が除去されたエリスロポエチン；xiii）エリスロポエチン分子中のシスチン架橋の少なくとも１つに少なくとも1つの開裂を有するエリスロポエチン；またはxiv）短縮されたエリスロポエチン、から成る群より選ばれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
化学修飾されたエリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
化学修飾されたエリスロポエチンがカルバミル化されたエリスロポエチンを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
突然変異エリスロポエチンが次の突然変異：
【表２】
2007517769.tif 000012
の１つ以上からなる群より選ばれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
突然変異エリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
炎症性サイトカインの影響に関連した症状が、敗血症、癒着、創傷、炎症、または慢性病を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物において炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、発生を遅延させ、あるいは軽減させるために有効な量の少なくとも１つの組織保護性サイトカインを含む医薬品組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの組織保護性サイトカインが化学修飾されたエリスロポエチンまたは突然変異エリスロポエチンを含む、請求項１９記載の医薬品組成物。
【請求項２１】
化学修飾されたエリスロポエチンがｉ）シアル酸部分が不足しているエリスロポエチン；ii）少なくともシアル酸部分を有しないエリスロポエチン；iii）少なくともＮリンクのまたはＯ−リンクの炭水化物を有しないエリスロポエチン；iv）少なくとも１つのグリコシダーゼによる自然のエリスロポエチンの処理により、少なくとも炭水化物含量が減少したエリスロポエチン；ｖ）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有するエリスロポエチン；vi）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有し、化学的に還元されたエリスロポエチン；vii）少なくとも１つ以上の修飾されたアルギニン残基を有するエリスロポエチン；viii）少なくとも１つ以上の修飾されたリジン残基、またはエリスロポエチン分子のＮ末端アミノ基の修飾を有するエリスロポエチン；ix）少なくとも１つの修飾されたチロシン残基を有するエリスロポエチン；ｘ）少なくとも１つの修飾されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を有するエリスロポエチン；xi）少なくとも１つの修飾されたトリプトファン残基を有するエリスロポエチン；xii）少なくとも１つのアミノ基が除去されたエリスロポエチン；xiii）エリスロポエチン分子中のシスチン架橋の少なくとも１つに少なくとも1つの開裂を有するエリスロポエチン；またはxiv）短縮されたエリスロポエチン、から成る群より選ばれる、請求項２０記載の医薬品組成物。
【請求項２２】
化学修飾されたエリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項２１記載の医薬品組成物方法。
【請求項２３】
化学修飾されたエリスロポエチンがカルバミル化されたエリスロポエチンを含む、請求項２２記載の医薬品組成物方法。
【請求項２４】
突然変異エリスロポエチンが次の突然変異：
【表３】
2007517769.tif 000013
の１つ以上からなる群より選ばれる、請求項２０記載の医薬品組成物。
【請求項２５】
突然変異エリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項２４記載の医薬品組成物。
【請求項２６】
炎症性サイトカインがインターロイキンまたはＴＮＦを含む、請求項１９記載の医薬品組成物。
【請求項２７】
炎症性サイトカインがＴＮＦである、請求項２６記載の医薬品組成物。
【請求項２８】
炎症性サイトカインの影響が、発熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全、およびインシュリン抵抗性を含む、請求項１９記載の医薬品組成物。
【請求項２９】
哺乳動物において炎症性サイトカインに関連した症状を治療し、予防し、または発生を遅延させるために有効な量の少なくとも１つの組織保護性サイトカインを含む医薬品組成物。
【請求項３０】
少なくとも１つの組織保護性サイトカインが化学修飾されたエリスロポエチンまたは突然変異エリスロポエチンを含む、請求項２９記載の医薬品組成物。
【請求項３１】
化学修飾されたエリスロポエチンが：ｉ）シアル酸部分が不足しているエリスロポエチン；ii）少なくともシアル酸部分を有しないエリスロポエチン；iii）少なくともＮリンクのまたはＯ−リンクの炭水化物を有しないエリスロポエチン；iv）少なくとも１つのグリコシダーゼによる自然のエリスロポエチンの処理により、少なくとも炭水化物含量が減少したエリスロポエチン；ｖ）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有するエリスロポエチン；vi）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有し、化学的に還元されたエリスロポエチン；vii）少なくとも１つ以上の修飾されたアルギニン残基を有するエリスロポエチン；viii）少なくとも１つ以上の修飾されたリジン残基、またはエリスロポエチン分子のＮ末端アミノ基の修飾を有するエリスロポエチン；ix）少なくとも１つの修飾されたチロシン残基を有するエリスロポエチン；ｘ）少なくとも１つの修飾されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を有するエリスロポエチン；xi）少なくとも１つの修飾されたトリプトファン残基を有するエリスロポエチン；xii）少なくとも１つのアミノ基が除去されたエリスロポエチン；xiii）エリスロポエチン分子中のシスチン架橋の少なくとも１つに少なくとも1つの開裂を有するエリスロポエチン；またはxiv）短縮されたエリスロポエチン、から成る群より選ばれる、請求項３０記載の医薬品組成物。
【請求項３２】
化学修飾されたエリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項３１記載の医薬品組成物。
【請求項３３】
化学修飾されたエリスロポエチンがカルバミル化されたエリスロポエチンを含む、請求項３２記載の医薬品組成物。
【請求項３４】
突然変異エリスロポエチンが次の突然変異：
【表４】
2007517769.tif 000014
の１つ以上からなる群より選ばれる、請求項３０記載の医薬品組成物。
【請求項３５】
突然変異エリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している、請求項３４記載の医薬品組成物。
【請求項３６】
炎症性サイトカインの影響に関連した症状が、敗血症、癒着、創傷、炎症、または慢性病を含む、請求項２９記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症および関連する合併症の治療、予防、発病の遅延、および／または影響を軽減させる方法を目的とする。特に本発明は、組織保護性サイトカインの敗血症に関する合併症、癒着形成および臓器不全の治療、予防、遅延および／または軽減のための使用を目的とする。更に、本発明の組織保護性サイトカインはまた、感染に起因する一般的な炎症性症状の合併症の治療、予防、遅延および／または軽減も意図している。
【背景技術】
【０００２】
ホスト（host）には、いくつかの戦略が、感染、免疫抗原のチャレンジ、炎症、および外傷に対応するために存在する。ホストがこれらのチャレンジへの対応を試みる１つの機構が、サイトカイン（細胞間調節因子の役割をする非抗体タンパク質）の上方制御によるものである。炎症性サイトカインとして知られているいくつかのサイトカインは、チャレンジ源とチャレンジにより被害を受けたホスト細胞とをホストから取り除くことを期待して、その病気を強化することにより、ホストに対するチャレンジに対抗する。炎症性サイトカインにはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１８などのインターロイキン（ＩＬ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれるが、それらに限られない。
【０００３】
放出されると炎症性サイトカインは、損傷部位で、抗体とその補体の放出を増加させ、Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化し、血管壁への血小板の癒着をもたらし、またリンパ球とマクロファージの血管外放出をもたらす効果がある。これらの変化が損傷部位に、発熱、組織損傷、腫瘍壊死、他のサイトカインおよび免疫調節の誘導、およびアポトーシスを含む局所的環境をもたらす。この局所的応答は、ホストに対する挑戦源に対してだけでなく、炎症性サイトカイン応答の周辺部内のホストの細胞に対しても毒性がある。したがって、全身レベルで、重症の感染または重大な外傷の間などに、ホストに発熱、炎症、組織破壊、およびある場合にはショックと死を生じるなどするため、これらの炎症性サイトカインの多くがホストに有害であっても驚くべきことではない。
【０００４】
様々な炎症性サイトカインの作用の代表がＴＮＦである。ＴＮＦは、マクロファージ、単球、リンパ系細胞および繊維芽細胞を含む多くの細胞型により、炎症、感染および他の環境のチャレンジに応じて生成される炎症性サイトカインである。ＴＮＦは、発熱、ショック、組織損傷、腫瘍壊死、摂食障害、他のサイトカインおよび免疫調節性分子の誘導、細胞増殖、分化およびアポトーシスを含む広い範囲の細胞応答を誘発する。放出されると、ＴＮＦは損傷部位で、抗体とその補体の放出の増大、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、血小板の血管壁への癒着、およびリンパ球とマクロファージの血管外放出、の効果を有する。全身では、ＴＮＦは視床下部および肝臓に作用する。ＴＮＦは視床下部を刺激して、コルチコトロピン放出ホルモンを放出させ、食欲を抑制し、および発熱させる。ＴＮＦに応答して、肝臓は急性期応答を開始し、これがＣ反応性タンパク質、凝固因子および補体因子を含むいくつかのタンパク質の合成をもたらす。さらに、ＴＮＦはインスリン抵抗性を引き起こす。損傷または感染の起こった一定の領域では、ＴＮＦが特定の感染因子を除去し、特定の損傷に対して身体の免疫応答を適合させるために決定的に重要である。
【０００５】
しかし、全身レベルでは、ＴＮＦならびに他の炎症性サイトカインがより高い濃度または長時間存在する可能性があり、ＴＮＦが身体に有害な作用を有する可能性がある。高濃度では、ＴＮＦがＩＬ−１および１Ｌ−６カスケードを活性化して、それが悪液質（消耗）をもたらす。さらに、ＴＮＦは全身性の浮腫、低蛋白血症および好中球減少症を引き起こす可能性があり、それが散在性血管外凝固および最終的には多臓器不全をもたらす可能性がある。癌のような慢性疾病では、ＴＮＦがさらにホスト内の重大な内在的機能を妨害する可能性がある。例えば、ＴＮＦは、内在性エリスロポエチンがホストのヘマトクリットを維持する能力を妨害して、慢性疾患に伴う貧血（ＡＣＤ）と呼ばれる症状をもたらす可能性がある。組換えエリスロポエチンによる典型的な治療経過では、炎症性サイトカインの効果を打ち消すことができず、そのため、ホストの正常なヘマトクリットを維持するだけのために高用量の組換えエリスロポエチンを投与することが必要になる。用量の増加に伴う追加費用の他に、血栓症のようなエリスロポエチン用量の増加による有害な副作用の危険性がさらに存在する。下に詳述する疾患に加えて、ＴＮＦを含み、しかしそれに限られない炎症性サイトカインは、慢性炎症、バクテリア敗血症性ショック、バクテリア毒性ショック、移植片対ホスト疾病、およびＨＩＶ感染とＡＩＤＳなどの疾病に関係している。
【０００６】
敗血症
敗血症は任意の種類の、例えば、バクテリア、ウイルス、寄生生物、または真菌による感染に対する身体の反応である。感染の部位は、通常は肺、尿路、腹部および骨盤である。ある場合には、しかし、感染の実際の部位を探知することができない。敗血症は、以前は全身炎症反応であると考えられたが、現在では敗血症はプロトロンビン異常体質および繊維素溶解作用障害も含むことが認識されている。
【０００７】
一旦敗血症が始まれば、広範囲の炎症および凝結が全身に生じる。健康体では感染と戦いまた身体を癒すために免疫モジュレーターが放出されるが、敗血症では、過多の免疫レギュレーターが放出される。ＴＮＦ、インターロイキン−１およびインターロイキン−１８などの炎症性サイトカインの放出によって内皮層の炎症、中核温度の上昇、食欲不振および貧血が引き起こされる。さらに、血管内層の炎症が血液凝固過程を活性化する。敗血症が身体のプロテインＣの自然な生産を減少させ、プロテインＣは血液凝固を調節しまた炎症を制御するため、形成された凝血を分解する身体能力を抑圧する。この抑圧が、重要臓器、四肢、指、および足指中での凝固をもたらし、それは次には、臓器不全または壊疽を引き起こす。
【０００８】
敗血症は様々な程度に出現する可能性がある。急性器官機能不全または臓器不全をもたらす場合に起こる重症の敗血症の場合には、身体の正常な防御反応が過励起状態になり、全身にわたる広範囲の炎症および小さな血管中の血液凝固をもたらす可能性がある事象のカスケードが作動される。重症の敗血症の患者が循環系機能不全を経験する場合は、敗血症性ショックが生じる。この機能不全は血圧降下を引き起こし、それは次に重要臓器から十分に酸素を含んだ血液供給を奪う。毒血症は血流自体に感染を有する敗血症である。実際、毒血症は少なくとも１つの器官に虚血、すなわち血液供給不足、をもたらす。例えば、腎臓への血流が相当の期間危険なまでに低下する場合には、虚血性の急性腎不全（ＡＲＦ）が発症する可能性がある。低下した血流はまた、影響を受ける器官中での壊死、すなわち組織死、を引き起こす。
【０００９】
敗血症の原因を同定することができるならば、敗血症の多くの患者が治療に反応するであろう。一旦特定されると、感染の原因に特異的な治療処置が開始される。既知の治療には、抗生物質の使用、感染したまたは壊死した組織の外科的切除、活性化タンパク質を増加させる薬剤、およびステロイド（敗血症性ショックの場合）が含まれる。例えば、感染の原因が特定されるまでは、敗血症治療の典型的なコースには、広域抗生物質の投与が含まれる。しかしながら、感染の原因および／または範囲が確認できない敗血症の場合には、敗血症患者の死亡率は比較的高いままに留まっている。
【００１０】
敗血症の重症度に応じて、抗感染剤、ドレーン技術（draining technique）、液体、ノルエピネフリンおよびフェニレフリンなどの平均動脈血圧（ＭＡＰ）を上昇させる薬剤、ドーパミンなどの腎機能を改善する薬剤、ドブタミンおよびエピネフリンなどの酸素送達および酸素消費を増加させる薬剤、呼吸を支援する人工呼吸器および腎不全用の透析、を治療の過程に用いてもよい。さらに、ショックと敗血症の後に起こる免疫応答に有益な作用があることが示された薬物には、ＡＴＰ−ＭｇＣｌ2、非抗凝固性ヘパリン、カルシウムチャネル遮断薬、クロロキン、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ＰＡＦ拮抗薬、抗炎症性サイトカイン、成長因子、食事操作、抗ＴＮＦ抗体、活性化プロテインＣ（Xigris [登録商標], Eli Lilly, Indianapolis, Indiana）および性ホルモンが含まれる。症状を早急に診断し速やかに治療する場合に敗血症からの回復が最大である。
【００１１】
商品名・ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標、Ortho Biotech Inc., Raritan, NJから）、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標、Amgen, Inc., Thousand Oaks,CAから）、およびＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮ（Roche, Basel, Switzerlandから）として市販されている組換えエリスロポエチン（ｒｈｕ−ＥＰＯ）も、敗血症と関係する様々な症状の治療に関連して最近研究されている。さらに、U.S. Patent Publication No. 2003/0083251は、虚血性ＡＲＦの患者を治療するために、腎尿細管細胞の再生および腎尿細管細胞のアポトーシスの予防を支援するためのｒｈｕ−ＥＰＯの使用を広く開示している。更に、U.S. Patent Publication No. 2002/0061849には、１つ以上の器官中の非虚血症状の炎症の治療を支援するためのｒｈｕ−ＥＰＯの使用が広く開示されている。しかし、エリスロポエチンの赤血球造血作用−ヘマトクリット増加、血管収縮、血小板の超活性化、凝固誘発活性、および血小板産生の増加−のために、ｒｈｕ−ＥＰＯによる治療は、敗血症に随伴する、重要臓器、四肢、手指および足指の広範囲の凝固がある場合には、さらなる危険をもたらす。
【００１２】
癒着
敗血症に加えて、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインは、癒着、異常な線維状バンド、または器官と身体の他の構造の間の結合、の形成にも関連付けられてきた。癒着は敗血症の合併症である可能性または敗血症に関連している可能性があるが、また独立に生じる可能性もある。例えば、癒着は手術、外傷、感染、化学療法および放射線照射の結果として生じる場合がある。実際、癒着はほとんど避けられない手術の結果である、すなわち、腹部手術を受けたことがある患者の約９３パーセントが、ある程度癒着に罹患する（以前に腹部手術を経験していなかった患者の約１０．４パーセントの癒着形成と比較して）。D. Menzies and H. Ellis, Intestinal Obstruction from Adhesions-How Big is the Problem?, ANN. R. COLL. SurG. ENGL.72 :60-3 (1990)を参照のこと。
【００１３】
癒着の形成が激痛を引き起こし、また患者の器官または他の構造に対する不自然な圧力または張力を加える場合がある。例えば、身体の腹部の癒着の結果、患者の腸が器官または身体の他の構造の間に捉えられ、または押し込められることになる。ある場合には、腸が、近くの癒着により塞がれるかまたは著しく通りにくくされる可能性がある。
【００１４】
身体の２つの部分間のこれらの異常な結合の形成により、多数の他の症状が引き起される。例えば、帝王切開は出産のより一般的な方法になりつつあるが、この大きな腹部手術を受ける女性が癒着を形成し、その結果慢性の骨盤痛を経験することになりやすい。さらに、女性生殖器官を含む癒着が、不妊と性交困難を引き起こす可能性がある。
【００１５】
癒着を予防し治療することに関して、例えばデキストラン、コルチコステロイド、ホスファチジルコリン、ホスホリパーゼ阻害剤、非ステロイド系抗炎症剤、プロテオグリカン、ヘパリン、および組織プラスミノゲン活性化因子などの多くの薬剤が研究されてきた。例えば、C. L. Kowalczyk and M. P. Diamond, The Management of Adhesive Disease, in PERITONEAL ADHESIONS 315-324 (K. H. Treutner and V. Schumpelick, eds., 1997)を参照のこと。それらの全てではないが、これらの薬剤の幾つかは、血液凝固と繊維素溶解を妨害するその能力のために癒着の治療に有効であると信じられている。しかしながら、大多数のこれらの薬剤についての臨床体験は出血性合併症によって制限されている。さらに、ヒアルロン酸誘導体が、手術後の癒着を、特に腹腔内領域で予防することが示されている。例えば、J. M. Becker et al., Prevention of Postoperative Abdominal Adhesions by a Sodium Hyaluronate-based Bioresorbable Membrane: A Prospective, Randomized, Double-blind Multicenter Study, in J. AM. COLL. SURG. 183 297- 306(1996)を参照のこと。更に、β−グルカンは、拮抗的に単球と好中球上のレセプターへ高親和性で結合するグルコースポリマーであるが、ウィスターラット中で実験的に発症させた腹部内敗血症後の癒着の頻度を減少させる効果があることが示された：A. Bedirli et al., Prevention of Intraperitoneal Adhesion Formation Using Beta-Glucan After Ileocolic Anastomosis in a Rat Bacterial Peritonitis Model, in Am.J. SURG. 185 339-343 (2003)。
【００１６】
癒着の治療の進め方として手術も用いられる。一般に、医師が器官または身体の他の部分から癒着を切り離すために手術を行なうことになる。しかしながら、癒着が多くの場合手術の併発症であるとすれば、癒着を除去する手術がしばしば新しい癒着の形成をもたらす。いくつかの外科手術手順には手術の影響を受ける領域に隣接する器官上にスリーブ（sleeve）を配置することが含まれ、このようにしてこれらの器官を含む癒着の予防を補助する一方で、そのような手続きが複合した結果をもたらしてきた。さらに、器官スリーブにはスリーブを除去する追加の手術が必要である。
【００１７】
したがって、癒着に関する意識が高まったにもかかわらず、治療方法の研究は、限られた成功しか納めていない。多くの医師が癒着の治療に取り組むのに気が進まないかまたはできない。また、多くの保険会社は、せいぜいわずかに成功するだけの治療の代価の支払いを望まない。
【００１８】
創傷の治癒
治癒は、損傷を受けた組織の完全性を再建する身体の本質的な過程である。この過程は、しばしば外傷、手術、圧力（褥瘡）、熱傷、糖尿病などの様々な原因に起因する皮膚の創傷、潰瘍または損傷によって観察される。創傷の重大度は創傷が皮膚に浸透する程度によって特徴づけられる。ステージＩの創傷は、発赤または変色、温感、および膨潤または硬さにより特徴づけられる。ステージIIの創傷、部分層創傷は皮膚の表皮および上部真皮に浸透する。ステージIIIの創傷、全層創傷は、皮膚の真皮に浸透するが、より深い器官から皮膚を隔てる膜には浸透しない。ステージIVの創傷は、その下の筋肉または骨への損傷を含む。
【００１９】
創傷はすべて同じ過程：炎症、上皮形成、血管形成およびマトリックスの蓄積、を経て治癒するが、傷の治癒し易すさは、大きくは傷の重大度、および負傷した個人の健康に依存する。一般に、ステージIおよびステージIIの創傷は、上皮細胞がその下にある真皮によって再生されて治癒する。しかし、ステージIIIおよびIVの創傷は瘢痕の産生を通じて治癒する。ＴＮＦなどの炎症性サイトカインは創傷の治癒に役割を果たすのであるが、しかしＴＮＦは治癒する創傷中のコラーゲンの蓄積に、そして最終的には創傷の治癒に必要な時間、および修復された組織の強度に対して悪影響を有すると推測されている。
【００２０】
いくつかの治療学および治療方法が、身体が創傷を治癒させるのを支援するためにこれまでに開発されている。いくつかの化合物が、創傷治癒に対して治療効果を持つと考えられている。それには、成長因子（上皮成長因子。インスリン様成長因子、ヒト成長ホルモン、線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、インターロイキン６、およびインターロイキン１０）、栄養サプリメント（アルギニン、グルタミン、ビタミンＣ、ビタミンＢ５、ブロメライン、クルクミン、亜鉛、銅）およびハーブサプリメント（アロエベラ、センテラ）が含まれるが、それらに限られない。更に、身体が創傷を治癒するのを支援するために、高圧酸素療法、渦流浴療法、超音波治療法、電気刺激および磁気療法を含むがそれに限られない様々な治療方法が利用されてきた。
【００２１】
創傷が適切に治癒しないか、全く治癒しない場合は、幾つかの合併症を引き起こす。その主なものは瘢痕化と感染である。創傷の重大度に依存して、身体が創傷を治癒する際に瘢痕組織を生成する。瘢痕の審美的な問題の外に、瘢痕はその重大度に依存して個体の運動を害する可能性がある。さらに、創傷は、バクテリアおよび他の感染因子が身体に侵入する機会を与える。感染の重大度に依存して、感染が全身に広がり敗血症または毒血症を引き起こすことになる可能性がある。
【００２２】
Ｒｈｕ−ＥＰＯは、無作為の虚血性皮膚弁についてのラット・モデルにおいて、それが有する治癒効果の可能性について研究されてきた。例えば、ｒｈｕ−ＥＰＯが虚血性皮膚弁損傷について壊死を減少させ、好中球の侵入を減らして、体温上昇を防ぐことが示されている。M. Buemi et al., Recombinant Human Erythropoitein Influences Revsacularization and Healing in a Rat Model of Random Ischaemic Flaps, ACTA DERM VENEREOL, 82 :411-417(2002)を参照のこと。この発見は、ｒｈｕ−ＥＰＯ投与が、損傷の初期および後期の両方で、炎症反応を減少させ、虚血の皮膚弁中の毛細管の密度を増加させて損傷部位のより早期の修復を可能にすることにより創傷治癒過程を改善できることを示唆する。しかしながら、上に述べたように、ｒｈｕ−ＥＰＯは赤血球造血活性を有するため、これらの症状の治療のためのｒｈｕ−ＥＰＯの使用が、治癒過程によって既に開始されたよりも大きな程度の凝固または合併症を引き起こす可能性がある。
【００２３】
まとめると、１つの薬剤または治療戦略も、敗血症患者の管理、敗血症の開始、癒着の形成、創傷治癒、または一般的な炎症性の症状に対して十分な価値があることが実証されたことは無い。実際、敗血症および関連する症状に関する死亡率は高いままである。毎年およそ２１５，０００人が重症の敗血症によって死亡し、また重症の敗血症を発症する患者の３人に１人が、一か月以内に死亡することになる。また、症状に対する認識の高まりと診断の感度、免疫無防備の患者の数、侵襲性処置の使用、抵抗菌の数、および高齢者人口の増加により、今後敗血症患者が上昇すると予想される。さらに、癒着および一般の炎症性症状に関連した慢性的疼痛が、好結果を生む治療戦略がないために、多くの場合治療されていない。
【００２４】
したがって、炎症性サイトカインの影響を、その作用領域を限定しさらにその全身性の影響に対処する目的で、治療し、予防し、発生を遅延し、また軽減させるための方法および療法の必要性が従来技術に存在する。特に炎症性サイトカインの、敗血症、癒着、創傷、慢性病の症状、および一般の炎症症状における影響を治療し、予防し、発生を遅延し、軽減させる必要性が存在する。さらに、虚血状態にある組織の損傷を修復または予防する能力を有する方法論を提供することが有益であろう。
【００２５】
発明の開示
本発明は、少なくとも１つの組織保護性サイトカインを治療上有効な量だけ投与することにより、敗血症、癒着、一般的炎症症状、およびそれらの組合せを、治療し、予防し、発生を遅延し、および／または影響を軽減させる方法を目標とする。さらに、本発明は、少なくとも１つの組織保護性サイトカインを用いる、損傷と切開に関係した瘢痕化の予防または軽減に関する。その少なくとも１つの組織保護性サイトカインは組織保護機能を有する任意の組織保護性サイトカインであってよい。ある実施態様では、しかしながら、少なくとも１つの組織保護性サイトカインは化学修飾されたＥＰＯである。別の実施態様では、化学修飾されたＥＰＯはカルバミル化されたＥＰＯである。
【００２６】
本発明のある実施態様は、哺乳動物において、炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、発生を遅延し、または軽減させる方法に関する。他の実施態様は、炎症性サイトカインの影響に関連した症状を治療し、予防し、発生を遅延する方法に関する。炎症性サイトカインの影響に関連した症状のいくつかの例には、敗血症、癒着、創傷、炎症または慢性病が含まれる。これらの方法は、薬剤担体中の治療上有効な量の１つ以上の組織保護性サイトカインを投与する工程を含んでもよい。
【００２７】
さらに、本発明はまた、本明細書中に記述された方法で用いることのできる医薬品組成物を目標とする。例えば、ある実施態様は、哺乳動物において炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、発生を遅延し、または軽減させることに有効な量の少なくとも１つの組織保護性サイトカインを含む医薬品組成物を目的とする。別の実施態様は、哺乳動物において炎症性サイトカインに関連した症状を治療し、予防し、発生を遅延するのに有効な量の少なくとも１つの組織保護性サイトカインから成る医薬品組成物を目的とする。
【００２８】
本発明中で用いられるいくつかの組織保護性サイトカインは化学修飾されたエリスロポエチンまたは突然変異エリスロポエチンであってよい。
【００２９】
化学修飾されたエリスロポエチンを用いるいくつかの実施態様においては、化学修飾されたエリスロポエチンが、下記：ｉ）シアル酸部分が不足しているエリスロポエチン；ii）少なくともシアル酸部分を有しないエリスロポエチン；iii）少なくともＮ−リンクのまたはＯ−リンクの炭水化物を有しないエリスロポエチン；iv）少なくとも１つのグリコシダーゼによる自然のエリスロポエチンの処理により、少なくとも炭水化物含量が減少したエリスロポエチン；ｖ）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有するエリスロポエチン；vi）少なくとも１つ以上の酸化された炭水化物を有し、化学的に還元されたエリスロポエチン；vii）少なくとも１つ以上の修飾されたアルギニン残基を有するエリスロポエチン；viii）少なくとも１つ以上の修飾されたリジン残基、またはエリスロポエチン分子のＮ末端アミノ基の修飾を有するエリスロポエチン；ix）少なくとも１つの修飾されたチロシン残基を有するエリスロポエチン；ｘ）少なくとも１つの修飾されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を有するエリスロポエチン；xi）少なくとも１つの修飾されたトリプトファン残基を有するエリスロポエチン；xii）少なくとも１つのアミノ基が除去されたエリスロポエチン；xiii）エリスロポエチン分子中のシスチン架橋の少なくとも1つに少なくとも１つの開裂を有するエリスロポエチン；またはxiv）短縮された（trucated）エリスロポエチン；の１つ以上を含んでいてもよい。別の実施態様では、化学修飾されたエリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している。化学修飾されたエリスロポエチンがさらにカルバミル化されたエリスロポエチンを含んでいてもよい。
【００３０】
同様に、突然変異エリスロポエチンを含むいくつかの実施態様では、突然変異エリスロポエチンを次：
【００３１】
【表５】
2007517769.tif 000003
の突然変異の１つ以上から選択してもよい。
【００３２】
別の実施態様では、突然変異エリスロポエチンにエリスロポエチンの赤血球造血作用が不足している。
【００３３】
炎症性サイトカインの２つの例はインターロイキンおよびＴＮＦである。炎症性サイトカインの１つ以上の影響には、発熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全、およびインシュリン抵抗性が含まれ得る。本発明のさらなる特徴および利点についてより詳しく以下に記述する。
【００３４】
本発明のさらなる特徴および利点を、以下に記載する図面と共に提供する次の詳細な説明により、確認することができる：
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、敗血症、および敗血症関連症状、癒着、創傷治癒、および慢性病を含むがそれに限られない症状における、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、遅延させ、または軽減させるための新規な組成物を目的とする。組織保護性サイトカインによって処置される炎症性サイトカインの影響には、発熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全およびインシュリン抵抗性が含まれるがこれらに限られない。本発明の組成物は、脳膜炎の場合などの、感染に起因する１以上の器官または組織中の炎症性症状の治療、予防、遅延または影響の軽減も目的としている。特に本発明は、敗血症、癒着、創傷治癒、慢性病および炎症性症状を含む症状における炎症性サイトカインの影響の治療に好結果をもたらす組織保護性サイトカインを含む組成物を目標とする。
【００３６】
さらに本発明の組成物は、損傷による瘢痕化を治療し、予防し、および／または外観を軽減させることに役立つ。例えば、本発明の組織保護性サイトカインを腹部手術と共に用いる場合には、瘢痕化が相当減少する。ある実施態様では、本発明の組織保護性サイトカインを外科的切開による瘢痕化を予防するために用いる。
【００３７】
本発明の組成物
組織保護能力を示す任意のサイトカインを本発明において使用することを意図する。本発明の組成物にはエリスロポエチンが含まれる。例えば、本発明の適当な組織保護性サイトカインは、例えばα、β、アシアロ、その他多数の型で存在するＥＰＯ分子であってよい。αおよびβ型は同じ効力、生物活性および分子量を有するがわずかに炭水化物成分が異なり、一方アシアロ型は炭水化物成分から末端のシアル酸が除去されたαまたはβ型である。
【００３８】
さらに、敗血症、敗血症に関連する症状および一般的な炎症性症状を治療し、予防し、開始を遅延し、および／または影響を軽減させることができる任意の組織保護性サイトカインを同様に目標とする。本明細書で用いる語句「組織保護性サイトカイン」とは、任意のサイトカインであって、エリスロポエチンの組織保護活性を有するエリスロポエチン誘導体を指す。好ましくは、組織保護性サイトカインは、エリスロポエチンの赤血球造血作用のうちの少なくとも１つ以上を欠く。最も好ましくは、組織保護性サイトカインは、エリスロポエチンの赤血球造血作用をすべて欠く。例えば、薬理学的属性（半減期の減少）またはエリスロポエチンレセプターホモ二量体に結合する構造的な能力に影響する化学的方法または突然変異方法を用いてエリスロポエチンを修飾することによりこれを遂行することができる。本発明よる使用にふさわしい組織保護性サイトカインの限定されない例には、Internal Publication No.Wo/02053580、およびU.S. Patent Publication No. 2002/0086816および2003/0072737で開示された組織保護性サイトカインが含まれる。それら全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３９】
さらに、本発明による使用のための組織保護性サイトカインは、少なくとも１つのアルギニン、リジン、チロシン、トリプトファンまたはシステイン残基、あるいはカルボキシル基が修飾されたＥＰＯ分子を含んでいてもよく、本発明による組織保護性サイトカインとしての使用が意図されている。これらの残基はInternational Publication No. Wo/02053580で開示されているように、グアニジン化、アミジン化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、アシル化（アセチル化またはサクシニル化）、ニトロ化、またはそれらの混合によって化学的に修飾されていてもよい。
【００４０】
したがって、本発明の組織保護性サイトカインはカルバミル化されたＥＰＯでよい。背景技術で議論したように、毒血症の併発症の可能性のある急性腎不全の治療に関連してｒｈｕ−ＥＰＯが研究されてきた。しかしながら、ｒｈｕ−ＥＰＯは赤血球造血活性、すなわち体内のヘマトクリットレベルおよび血小板の超活性化を維持する能力を有するので、その投与により赤血球が増加しまた血小板が活性亢進となり、血液濃密化および血栓症の危険の増加をもたらす。したがって、ｒｈｕ−ＥＰＯを使用すれば、恐らく敗血症の結果生じる広範囲の凝固を悪化させることになろう。
【００４１】
ｒｈｕ−ＥＰＯおよび選択された他の修飾されたＥＰＯ分子と異なり、カルバミル化ＥＰＯは、２００４年４月２６日出願のＰＣＴ出願PCT/US04/013099（その全体を本明細書に組み入れる）に指摘されているように、赤血球造血活性を保持せず、古典的ホモ二量体エリスロポエチンレセプターと結合しない。しかし、カルバミル化ＥＰＯは、好都合にも内在性ＥＰＯの組織保護機能を維持している。カルバミル化ＥＰＯの保存されている組織保護機能は、ＰＣＴ出願PCT/US04/013099で開示されているように、組織保護レセプター複合体との相互作用によって媒介されると信じられている。したがって、カルバミル化ＥＰＯを、敗血症、癒着、創傷治癒、慢性病および一般的炎症性症状を含み、しかしそれに限られない症状において、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、発生を遅延し、および／または軽減させるために、エリスロポエチンの投与に伴うさらなる凝固の危険をもたらすことなく、用いることができる。さらに本発明のカルバミル化ＥＰＯ分子は壊死を防止するのに有効であるため、本発明のカルバミル化ＥＰＯ分子は特に、発作、心筋梗塞、精神能力の劣化、および年齢関連性の症状を起こしやすい患者における敗血症、癒着、および一般的な炎症性症状の、治療、予防、発生の遅延、および／または影響の軽減に有益である。
【００４２】
したがって、本発明の組織保護性サイトカインは、ＥＰＯ分子の少なくとも１つ以上のリジン残基またはＮ末端基（この出願のためにそれらを「サイト」とも呼ぶ）が変化した修飾されたＥＰＯであってよい。その修飾は、リジン残基またはＮ末端アミノ基とアミノ基修飾剤との反応によるものであってよい。例えば、下記の一般的反応スキームが、ＥＰＯなどのタンパク質をカルバミル化する１つの方法を代表している：
【化１】
2007517769.tif 000004
【００４３】
別の実施態様では、ＥＰＯ分子上の１つ以上のリジン残基がシアン酸イオンとの反応によってカルバミル化されてもよい。例えば、１つ以上のリジン残基が4−スルホフェニルイソチオシアン酸とインキュベーションすることにより修飾されてもよい。さらに別の実施態様中においては、ＥＰＯ分子上の１つ以上のリジン残基がアルキルイソシアン酸、アリルイソシアン酸、またはアリルチオイソシアン酸によってそれぞれ、アルキルカルバミル化、アリルカルバミル化、またはアリルチオカルバミル化される。さらに別の実施態様中では、１つ以上のリジン残基が、反応性アルキルカルボン酸またはアリルカルボン酸の誘導体、例えば無水酢酸、無水コハク酸または無水フタル酸によってアルキル化される。修飾されたリジン残基をさらに化学的に還元してもよい。
【００４４】
１つ以上のリジン残基を、残基をトリニトロベンゼンスルフォン酸またはその塩と反応させることによりカルバミル化してもよい。またさらに別の実施態様では、１つ以上のリジン残基を、グリオキサールまたはグリオキサール誘導体、例えばメチルグリオキサールまたは３−デオキシグルコソン、との反応により修飾して対応するα−カルボキシアルキル誘導体を形成してもよい。
【００４５】
本発明に合致するカルバミル化の他の方法を用いてもよい。例えばPlapp et al., J. BIOL.CHEM.,246:939-945 (1971)に開示された方法は、本発明のカルバミル化ＥＰＯを作成する適当な方法である。カルバミル化の別の方法の例についてSatake et al, 1990, Biochim.Biophys.Acta 1038:125-9が議論しており、その場合エリスロポエチン中のリジン残基の６つがカルバミル化された。
【００４６】
また、上に述べたように、本発明によりＥＰＯの任意の形を用いることができる。したがって例として、ある実施態様では、カルバミル化されるＥＰＯ分子はα型であり；別の実施態様では、カルバミル化されるＥＰＯ分子はβ型であり；またさらに別の実施態様では、カルバミル化されるＥＰＯ分子はアシアロ型である。
【００４７】
カルバミル化過程は、好ましくは赤血球造血活性を実質的に減少させるか完全に除去するのに十分な時間のあいだ行われる。ある実施態様では、カルバミル化過程を、サイトの少なくとも約９０パーセントを除去するのに十分な時間のあいだ行なう。別の実施態様では、カルバミル化過程をサイトの少なくとも約９５パーセントを除去するのに十分な時間行なう。さらに別の実施態様では、カルバミル化過程をサイトの１００パーセントを除去するのに十分な時間行なう。あるいは、ある実施態様では少なくとも６つのリジン残基、別の実施態様では少なくとも７つのリジン、および別の実施態様では少なくとも８つのリジン残基をカルバミル化するのに十分な時間のエリスロポエチンのカルバミル化としてこれを見ることができる。十分なカルバミル化が起きるのに必要な時間は変化する可能性がある。例えば、十分なカルバミル化が、約６〜２４時間まで、約１０〜２０時間まで、または約１６時間までの期間のあいだに起こる可能性がある。
【００４８】
本発明に用いるための組織保護性サイトカインをさらに、タンパク質限定加水分解、アミノ基の除去、および／または、Satake et al, 1990, Biochim.Biophys.Acta 1038: 125-9（参照によりその全体を本明細書に組み入れられる）に開示されている分子生物学技術によるアルギニン、リジン、チロシン、トリプトファンまたはシステイン残基の突然変異的置換によって得ることができる。例えば、適当な組織保護性サイトカインは、次：
【００４９】
【表６】
2007517769.tif 000005
のサイトにサイト突然変異を有する、少なくとも１つ以上の突然変異されたＥＰＯを含む。
【００５０】
上記の修飾の例が、同時係属中のU.S. Patent Publication Nos. 2003/0104988, 2002/0086816および2003/0072737（参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）に記述されている。本明細書中で使用する突然変異タンパク質命名法では、変化させられたアミノ酸を、まず自然のアミノ酸を１文字コードで表し、ＥＰＯ分子中の位置をその後に続け、続いて置換されたアミノ酸を１文字コードで表す。例えばＳ１００Ｅは、１００番目のアミノ酸のセリンがグルタミン酸に変化したヒトＥＰＯ分子を指す。
【００５１】
別の実施態様では、もしサイト突然変異が次
【００５２】
【表７】
2007517769.tif 000006
の突然変異を含まなければ、組織保護性サイトカインは、上記のサイト突然変異の１つ以上を含んでいてもよい。
【００５３】
またさらに別の実施態様では、組織保護性サイトカインが、次
【００５４】
【表８】
2007517769.tif 000007
のようなサイト突然変異の組合せを含んでもよい。
【００５５】
さらに別の実施態様では、組織保護性サイトカインが、上の組合せのいずれも含まない。別の実施態様では、組織保護性サイトカインは、もしサイト突然変異が次：N24K/N38K/N83Kおよび／またはA30N/H32Tの置換の組合せのいずれも含んでいないならば、上に示したサイト突然変異のうちのいずれを含んでいてもよい。
【００５６】
一定の修飾または修飾の組合せが、突然変異タンパク質のＥＰＯレセプターまたは第二のレセプターなどのレセプターと結合する能力の柔軟性に影響する可能性がある。そのような修飾または修飾の組合せの例には次
【００５７】
【表９】
2007517769.tif 000008
のようなものが含まれるが、しかしそれらに限らない。
【００５８】
対応する突然変異は、ヒト成長ホルモンに有害であると当業者に知られている。したがって、ある実施態様では、組織保護性サイトカインは、突然変異タンパク質のレセプターとの結合能力の柔軟性に影響する可能性のある１つ以上の修飾または修飾の組合せを含まない。そのような組織保護性サイトカインのそれ以上の議論は、同時係属中の２００３年７月１日出願のU.S. Patent Application No 10/612,665, attorney docket no. 10165- 022-999,題名"Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection, Restoration, and Enhancement of Responsive Cells, Tissues, and Organs"に含まれており、参照によりその全ての開示は本明細書に組み入れられる。
【００５９】
さらに、本発明における使用にふさわしい組織保護性サイトカインには、２００３年９月９日にattorney docket no. 20528.0006として出願されたInternational Application No. US03/028073、題名"Long Acting Erythropoietins that Maintain Tissue Protective Activity of Endogeneous Erythropoietin"（これの全体は参照により本明細書に組み入れられる）において開示された長時間作用性の化学修飾されたＥＰＯ分子が含まれる。例えば、本発明における使用にふさわしい組織保護性サイトカインには、Ｎ−リンクしたオリゴ糖鎖またはＯ−リンクしたオリゴ糖鎖の少なくとも１つに対して少なくとも１つの化学修飾を受けたＥＰＯが含まれる。その化学修飾には酸化、硫酸化、リン酸化、ＰＥＧ化、またはそれらの組合せが含まれる。ある実施態様では化学修飾をうけるＥＰＯ分子はα型である。別の実施態様では化学修飾をうけるＥＰＯ分子はβ型である。さらに別の実施態様では化学修飾を受けるＥＰＯ分子はアシアル型である。さらに別の実施態様では、化学修飾されるＥＰＯ分子はＡＲＡＮＥＳＰ(Amgen, Thousand Oaks, CA)またはＣＥＲＡ(Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, NJ)でもよい。
【００６０】
様々なホスト発現ベクターシステムを本発明の組織保護性サイトカインを生成するために利用することができる。例えば、組織保護性サイトカインがＥＰＯ分子をベースとする場合、様々なホスト発現系を用いることができる。そのようなホスト発現系とは、ＥＰＯを生成し続いて精製する媒体を意味するだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換されたかまたはトランスフェクションされたとき、修飾されたエリスロポエチン遺伝子産物をインサイチュー（in situ）で表示する細胞を意味してもよい。これらにはバクテリア、昆虫、植物、ヒトのホストシステムを含む哺乳動物：例えばＥＰＯコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム；組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコ・モザイクウイルスＴＭＶ）に感染したかまたはエリスロポエチン関連分子をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞システム；あるいは、哺乳動物細胞ゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを包含する組換え発現コンストラクトを保有する、例えばＨＴ１０８０、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、などのヒト細胞システムを含む哺乳動物細胞システム；が含まれるが、それらに限られない。
【００６１】
さらに、ホスト細胞系統は、挿入された配列の発現をモジュレートするかまたは望みの特異的な方法で遺伝子産物を修飾しプロセシングするものを選択すればよい。そのようなタンパク質生成物の修飾およびプロセシングがタンパク質の機能にとって重要である可能性がある。当業者に知られているように、種々のホスト細胞がタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特異的な機構を有している。発現された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証するために適切な細胞系統またはホストシステムを選択することができる。この目的のために、転写一次産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を所持する真核生物ホスト細胞を用いてもよい。ヒトのホスト細胞を含むそのような哺乳動物ホスト細胞には、ＨＴ１０８０、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８が含まれるが、しかしこれらに限られない。
【００６２】
組換えタンパク質を長期間に亘り高い収率で産生するためには、安定した発現が好ましい。例えば、組換え組織保護性サイトカイン関連分子の遺伝子産物を安定して発現する細胞系統をエンジニアリングしてもよい。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位その他の適切な発現制御エレメントおよび選択可能なマーカーにより制御されるＤＮＡにより、ホスト細胞を形質転換することができる。外来性ＤＮＡを導入した後に、エンジニアリングした細胞を豊富化した培地（enriched media）で１〜２日間成長させ、次に選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、細胞に選択に対する抵抗性を与え、細胞がその染色体へ安定してプラスミドを組み込み、成長してフォッシ（foci）を形成し、次にクローニングされて細胞系統へ発展することを可能にする。この方法はＥＰＯ突然変異タンパク質関連分子の遺伝子産物を発現する細胞系統をエンジニアリングするために有利に用いることができる。そのようにエンジニアリングされた細胞系統は、ＥＰＯ関連分子の遺伝子産物の機能に影響する化合物の選別および評価に特に有用である。
【００６３】
あるいは、安定した細胞系統またはクローニングされた微生物のゲノムに異種のＤＮＡ調節要素を、挿入された調節要素が内在性エリスロポエチン突然変異タンパク質遺伝子と作動的に連結するように挿入することにより、細胞系統または微生物内の内在性ＥＰＯ突然変異タンパク質遺伝子の発現特性を修飾することができる。例えば、通常「転写的に沈黙している」内在性ＥＰＯ突然変異タンパク質遺伝子、すなわち細胞系統中で正常では発現されないか、極めて低レベルでのみ発現されるＥＰＯ遺伝子が、発現遺伝子産物の発現をその細胞系統または微生物において促進することができる調節要素の挿入により活性化される可能性がある。あるいは、転写的に沈黙している内在性ＥＰＯ遺伝子が、様々な細胞タイプに働く無差別の調節要素の挿入により活性化される可能性もある。
【００６４】
異種の調節要素を、安定した細胞系統またはクローニングされた微生物に、当業者に周知の、またFrench Patent No. 2646438、U.S. Patent Nos.4,215,051および5,578,461、ならびにInternational Publication Nos. W093/09222およびW091/06667（これらの全開示を参照により本明細書に組み入れる）にも記述されている標的相同組換えなどの技術を用いて、内在性エリスロポエチン遺伝子に作動的に連結するように挿入することもできる。
【００６５】
医薬品組成物
本発明はまた、本発明の組織保護性サイトカインを含む医薬品組成物に関する。本発明の組織保護性サイトカインは、細胞死から組織を保護する能力と同様に、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインの影響を改善する能力も好都合に有するので、このサイトカインは、脳卒中および心筋梗塞などの様々な組織損傷の危険もある個人の敗血症、癒着、創傷、慢性病および炎症性の症状の処置を目標にしている。
【００６６】
さらに、本発明の組織保護性サイトカインはさらに、アルツハイマー病、パーキンソン病その他の精神的能力の悪化も経験している個人の敗血症、癒着、創傷および一般的炎症性症状の治療を目標とする。
【００６７】
本発明の医薬品組成物は、本発明の治療上有効な量の組織保護性サイトカインを、好ましくは精製された形で含む。ここに用いられる用語「治療上有効な量」とは、いかなる医学療法にも伴う合理的な利益／リスク比で希望する効果および性能を提供する無害であるが十分な組織保護性サイトカインの量を意味する。
【００６８】
製剤は、投与方法に適したものでなければならない。言い変えれば、本発明の医薬品組成物は、本発明の組織保護性サイトカインを、標的とする炎症性サイトカインの影響：すなわち熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全、インシュリン抵抗性、または炎症性サイトカインと関係する症状、すなわち敗血症、癒着、創傷治癒、慢性病または炎症性症状が、適切な用量と戦略を用いるならば治療可能となるような量だけ含む。また、より詳細に以下に議論するように、医薬品組成物は毒にならない用量を与えるべきである。
【００６９】
ある実施態様では、化学修飾されたエリスロポエチンまたは突然変異エリスロポエチンが本発明の医薬品組成物中に含まれる。別の実施態様では、化学修飾されたエリスロポエチンはカルバミル化ＥＰＯである。カルバミル化ＥＰＯは、少なくとも１つ以上の修飾されたリジン残基または修飾されたＮ末端基を有するＥＰＯ分子であってよい。別の実施態様では、突然変異されたエリスロポエチンはＳ１００Ｅでよい。さらに、本発明は、上述の本発明の任意の方法によって生成された組織保護性サイトカインの混合物を本発明の医薬品組成物に使用することを意図する。例えば、本発明の医薬品組成物は、１つ以上のリジン残基を修飾した結果である少なくとも１つのカルバミル化ＥＰＯ、およびエリスロポエチン内のアミノ基をＳ１００Ｅのように修飾した結果である少なくとも１つの突然変異ＥＰＯを含む。
【００７０】
本発明の医薬品組成物は、治療上有効な量の組織保護性サイトカインおよび適当な量の薬学的に許容される担体を含み、それによって患者への適切な投与のための剤形を提供してもよい。特別の実施態様において、語句「薬学的に許容される」とは、動物における、より詳細にはヒトにおける使用のために、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方または他の一般に認められている外国の薬局方にリストされていることを意味する。用語「担体」とは、それと共に治療薬を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体を指す。
【００７１】
そのような薬剤担体は、水中の食塩溶液および、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油その他などの石油、動物、植物または合成物起源の油を含む油、などの滅菌液体でよい。医薬品組成物を静脈内投与する場合、食塩溶液が好ましい担体である。食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセリン溶液は、液体担体として特に注射用溶液のためにも使用することができる。適当な医薬品賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールその他が含まれる。
【００７２】
本発明の医薬品組成物はさらに小量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤その他の剤形をとることができる。
【００７３】
本発明の化合物を中性または塩の形で処方することができる。薬学的に許容される塩には、フリーのアミノ基と形成された、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などに由来する塩、および、フリーのカルボキシル基と形成された、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩が含まれる。
【００７４】
治療と投与の方法
前述の組織保護性サイトカインおよび組織保護性サイトカインを含む医薬品組成物は、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインの影響の治療または予防処置、予防、遅延、および軽減を目標とする。これらの影響には、発熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全およびインシュリン抵抗性が含まれる。例えば、後に実施例４において示すように、本発明の組織保護性サイトカインが炎症性サイトカインの放出に関連した発熱、正常な中核温度以上の中核温度の上昇を減少させた。図６に示すように、組織保護性サイトカイン（カルバミル化エリスロポエチン）の投与により、ラットにＬＰＳを投与して生じた発熱の５０％を越える減少が起こった。組織保護性サイトカインを、敗血症および癒着などの敗血症に関連する症状などの炎症性サイトカインに関連する症状を治療し、予防し、遅延させ、軽減させるために投与することができる。
【００７５】
さらに、本発明の組織保護性サイトカインは１以上の器官または組織中の炎症性症状の治療および予防を目標とする。器官には、気道および肺、腎臓および尿路システム、ならびに前立腺が含まれるが、しかしこれらに限られない。本明細書に用いられる用語「炎症性症状」とは、特異的なＴリンパ球または抗体の抗原との反応などの機構が、炎症細胞および内在性仲介化学物質の動員を引き起こす症状を指す。ある場合には、器官または組織の正常な機能が血管透過性の増加および／または内臓平滑筋の収縮によって変えられることになる。
【００７６】
したがって、本発明の組織保護性サイトカインを、器官または組織の正常な機能が変化する炎症性症状を治療および／または予防するために用いることもできる。これらの症状には、アレルギー、リウマチ性疾患、およびウイルス、真菌および細菌感染を含む感染などの虚血に関連しない症状だけでなく、虚血に関連する症状も含まれる。さらに、損傷または感染は急性であってもまたは慢性であってもよい。ある実施態様では、本発明の組織保護性サイトカインは、非虚血症状における、すなわち問題の器官および／または組織に実質的に正常な血液供給がある場合の炎症性症状を治療および／または予防する際に用いることを目標にする。
【００７７】
さらに、本発明の組織保護性サイトカインを創傷の治癒を向上させるために用いることができる。これは、治療に必要な時間の短縮、瘢痕化の外観の縮小あるいは完全除去、合併症の危険を減らすこと、あるいは他の点で治癒の質を改善することにより、達成できる。例えば、切開が生ずるのに先立って、そのときに、またはその後に本発明の組織保護性サイトカインを使用すれば、切開由来の瘢痕化を、完全に除去することはできないにせよ、劇的に縮小させられる可能性がある。外科的処置に加えて、本発明の組織保護性サイトカインは、外傷（鈍傷および切傷）、圧迫（褥瘡）、熱傷、および糖尿病または血管不全などの疾病を含みこれらに限られない症状に起因する傷を処理することに役立つ。
【００７８】
さらに、本発明の組織保護性サイトカインおよび医薬品組成物をＴＮＦなどの炎症性サイトカインの影響に対処するために用いてもよい。図７ａおよび７ｂに示すように、本発明の組織保護性サイトカインは、損傷または感染性薬剤に応答して起こる炎症性サイトカイン、ＩＬ−６およびＴＮＦ、の上方制御をそれぞれ軽減させることができる。本発明の組織保護性サイトカインを、発熱、消耗、嗜眠、貧血、浮腫、虚血、臓器不全およびインシュリン抵抗性のような炎症性サイトカインの影響を治療し、予防し、軽減させ、または除去するために治療用の用量分投与してもよい。組織保護性サイトカインが炎症性サイトカインの上方制御を妨害するとすれば、本発明の組織保護性サイトカインは、炎症性サイトカインによって妨害された内在的な機能を、直接それらの内在的機能に影響することなく回復することができる。さらに、本発明の組織保護性サイトカインを、相乗効果をもたらすため、炎症性サイトカイン関連症状の他の既知の治療処置と同時に投与してもよい。例えば、癌または他の慢性病に関連した貧血の処置には、患者のヘマトクリットを回復するための通常の治療用用量の組換えエリスロポエチン、および炎症性サイトカインの影響を打ち消すための本発明の組織保護性サイトカインの治療用用量、の投与が含まれてもよい。これが、そのような慢性病においてより低用量の組換えエリスロポエチンの使用を可能にし、それによって塞栓事故の危険を大幅に減少させる。
【００７９】
本発明の組織保護性サイトカインを系統的または長期投与、急性処置、および／または断続的投与に用いてもよい。ある実施態様では、本発明の医薬品組成物を、標的の細胞、組織または器官を保護または増強するために慢性的に投与する。別の実施態様では、本発明の医薬品組成物を急性に、すなわち損傷中の単一治療のために投与してもよい。さらに別の実施態様では、本発明の医薬品組成物を周期的に投与する。
【００８０】
本発明の組成物を損傷に先立って投与してもよい。したがって、本発明の組織保護性サイトカインを外科手術に先立って、敗血症を予防し、敗血症の発症を遅延させ、および／または、敗血症による合併症を軽減させるために投与してもよい。例えば、本発明の組織保護性サイトカインを腹部手術に先立って患者に与えてもよい。また、手短に上に述べたように、本発明の組織保護性サイトカインを手術に先立って投与することが、敗血症、癒着および一般的炎症性症状に効果があるだけではなく、さらにそれが手術による痕跡の外観を縮小するかあるいは完全に除去する可能性がある。
【００８１】
さらに、本発明の組成物を損傷の時またはその後すぐに投与してもよい。したがって、大きな腹部手術を受ける患者に、敗血症から生じる合併症、癒着または一般的な炎症性症状を予防し、発病を遅らせ、あるいは軽減させるために、外科手術の時またはそのすぐ後に本発明の組織保護性サイトカインを与えてもよい。本発明の組織保護性サイトカインが、もし損傷中にまたはその後に投与されれば、さらに手術による瘢痕化の外観を縮小させ、または完全に除去する可能性がある。
【００８２】
例えば、本発明の組織保護性サイトカインを洗浄の目的に用いてもよく、例えば、傷を洗浄中に、敗血症から生じる合併症、癒着または一般的な炎症性症状を治療、予防、発病の遅延、また軽減させるために本発明の組織保護性サイトカインを含む食塩水を投与してもよい。さらに、本発明の組織保護性サイトカインを、敗血症の合併症、癒着、および／または一般的な炎症性症状を予防し、発病を遅らせ、および／または軽減させるために、帝王切開の後で妊婦に与えてもよい。別の実施例として、本発明の組織保護性サイトカインを化学療法中の患者に、敗血症、癒着または一般的炎症性症状を回避するために与えてもよい。
【００８３】
ある実施態様では、本発明の組織保護性サイトカインを、敗血症から生じる合併症、癒着または一般的な炎症性症状を予防し、発病を遅らせ、あるいは軽減させるために、損傷の時静脈内に、およびその後所定期間の間皮下に投与する。例えば、本発明の組成物を損傷の時に約１０μg／kgの量で静脈内に、続いて割当時間の間１０μg／kg皮下に投与してもよい。
【００８４】
敗血症診断が陽性である場合には、本発明の組成物を、敗血症を治療し、患者を安定させ、また敗血症症状がより重大な段階、例えば重症の敗血症または敗血症性ショック、に進行するのを防ぐために毎日投与してもよい。さらに、本発明の組織保護性サイトカインを、International Publication No. WO 2004/004656（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）に掲載されたものを含む既知の抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤その他と共に投与してもよい。
【００８５】
組成物の投与は非経口的、すなわち消化管経由以外の方法によるものであってもよい。例えば、非経口的投与は静脈注射、腹腔内注射、動脈内、筋肉内、皮内、あるいは皮下投与を含んでいてもよい。組成物を吸入または粘膜を介して、例えば、口内、鼻内、直腸内、膣内、舌下、粘膜下および経皮、によって投与してもよい。さらに、本発明の組織保護性サイトカインを、治療を必要とする領域へ局所的に、潅流液の使用により；例えば手術後の創傷被覆材と共に局所投与により；注射により；カテーテルにより；坐薬により；またはインプラント（インプラントは、シラスティック膜などの膜または繊維を含む多孔性の、非多孔性の、あるいはゼラチン状の物質である）により；などによって投与してもよい。上に議論した投与方法の組合せも本発明の意図するところである。
【００８６】
ある実施態様では、本発明の医薬品組成物の投与は非経口的である。そのような投与は、約０．０１pg〜約５mg、好ましくは約１pg〜約５mgの用量で行なってよい。ある実施態様では、用量は約５００pg〜約５mgである。別の実施態様では、用量は約１ng〜約５mgである。また別の実施態様では、用量は約５００ng〜約５mgである。さらに別の実施態様では、用量は約１μg〜約５mgである。例えば、用量は約５００μg〜約５mgであってもよい。別の実施態様では、用量は約１mg〜約５mgである。そのような組成物は水性・非水性の滅菌注射剤溶液または懸濁液を含んでいてもよく、それらは酸化防止剤、緩衝液、制菌剤、および組成物を目指す受容者の血液と実質的に等張にする溶質を含んでいてもよい。本発明のこの局面では、医薬品組成物がさらに水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油およびそれらの混合物を含んでいてもよい。
【００８７】
非経口的投与に適合した医薬品組成物を、単回用量のまたは複数回用量の容器、例えば、密閉したアンプルおよびバイアル瓶に入れて提供してもよく、また滅菌液体担体、例えば注射用滅菌食塩水、のみを使用直前に加えればよい凍結乾燥（凍結して乾燥した）状態で格納してもよい。滅菌粉末、顆粒および錠剤から即席の注入溶液および懸濁液を調製しもよい。ある実施態様では、救急車、緊急処置室および戦場状況による緊急使用のために本発明の持続作用性ＥＰＯの注射溶液を含む自動注射器を提供することができる。
【００８８】
静脈内投与
ある実施態様では、本発明の医薬品組成物を、人間への静脈内投与に適合した医薬品組成物として、型通りの手順に従って調製する。例えば、医薬品組成物は、滅菌等張緩衝水溶液中における溶液形であってよい。必要な場合は、医薬品組成物がさらに溶解剤および／または注入部位の痛みを緩和するリドカインなどの局所麻酔剤を含んでいてもよい。例えば、配合成分は、別に供給するか、または用量単位の形で一緒に混合して、例えば乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮剤として、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋などの密封容器に入れて供給してもよい。本発明の医薬品組成物を注入液により投与しようとする場合、滅菌した医薬品級の水または食塩水を入れた注入液ボトルを組成物を調剤するために用いてもよい。そして、医薬品組成物を注入液により投与しようとするときは、配合成分を混合するための滅菌食塩水のアンプルを提供し、投与に先立って混合してもよい。
【００８９】
経口投与
当業者は、経口投与に本発明の医薬品組成物を、カプセルまたは錠剤；粉末または顆粒；溶液、シロップまたは懸濁液（水性または非水性の液体中の）；食用の泡またはホイップ；エマルジョン；あるいはそれらの組合せとして適用できることを認識するであろう。経口製剤は、重量で約１０パーセント〜約９５パーセントの活性成分を含んでいてもよい。ある実施態様では、活性成分が経口製剤中に重量で約２０パーセント〜約８０パーセント量含まれている。また別の実施態様では、経口製剤中が重量で約２５パーセント〜約７５パーセントの量の活性成分を含む。
【００９０】
錠剤または硬いゼラチンカプセルは、ラクトース、デンプンまたはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸またはその塩を含んでいてもよい。柔らかいゼラチンカプセルは、植物油、ワックス、脂肪、半固体と液体のポリオール、またはそれらの混合物を含んでいてもよい。溶液およびシロップは水、ポリオール、糖またはそれらの混合物を含んでいてもよい。
【００９１】
さらに、経口投与を目的とする活性薬剤は、胃腸管内で活性薬剤の分解および／または吸収を遅延させる材料で覆われるかまたはそれと混合されてもよい。例えば、活性薬剤は、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリンまたはそれらの組合せと混合されるか、またはそれで覆われてもよい。このようにして、長時間にわたる活性薬剤の徐放を達成することができ、また必要なら、胃内で分解されないように活性薬剤を保護することができる。経口投与用医薬品組成物を、特異的なｐＨまたは酵素条件によって胃腸の特定の場所で活性薬剤の放出を促進するように調製してもよい。
【００９２】
経皮的投与
経皮的投与に適合した医薬品組成物を、受容者の表皮と長時間密接に接触を続ける目的で、個々のパッチとして提供してもよい。さらに、局所的投与に適した医薬品組成物を、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、油、点眼薬、口内錠、トローチ、および口内洗浄液、ならびにそれらの組合せとして提供してもよい。皮膚、口、目または他の外部組織に対する局所投与を目的とする場合、好ましくは局所軟膏またはクリームを用いる。また、軟膏中に調製した場合、活性成分、即ち長時間作用性ＥＰＯをパラフィンのまたは水混和性の軟膏基剤と共に用いてもよい。あるいは活性成分を、水中油ベースまたは油中水ベースのクリーム中に調製してもよい。局所投与が点眼薬の形である場合、本発明の医薬品組成物が好ましくは活性成分を含んでおり、それは適当な担体、例えば水性溶媒に溶解するか懸濁している。
【００９３】
鼻および肺への投与
鼻および肺への投与に適合した医薬品組成物は、粉末（好ましくは約２０μm〜約５００μmの粒径を有する）などの固体の担体を含んでいてもよい。粉末を、鼻に近接して保持された粉末容器から鼻を通した迅速な吸入により投与してもよい。別の実施態様において、本発明による鼻への投与を意図した医薬品組成物が、液体の担体、例えば鼻内スプレーまたは点鼻液を含んでいてもよい。好ましくは、本発明の医薬品組成物を鼻腔へ直接投与する。
【００９４】
直接の肺吸入を、マウスピースを通した中咽頭の中への深い吸入により、および加圧されたエアロゾル、ネブライザー、または注入器（それらは活性成分の所定用量を提供するように構成することができる）を含むがそれらに限られない他の特に適合された装置により、遂行することができる。肺吸入を意図した医薬品組成物には、活性成分の水性または油性溶液が含まれていてもよい。好ましくは、本発明の医薬品組成物を深い吸入によって中咽頭へ直接投与する。
【００９５】
直腸内および膣内投与
直腸内投与に適合した医薬品組成物を坐薬または浣腸剤として提供することができる。ある実施態様において、本発明の坐薬は、重量で約０．５パーセント〜１０パーセントの活性成分を含む。別の実施態様において、坐薬は、重量で約１パーセント〜約８パーセントの活性成分を含む。さらに別の実施態様において、活性成分が坐薬中に重量で約２パーセント〜約６パーセント存在する。本発明のこの局面では、本発明の医薬品組成物が、トリグリセリドなどの従来からの結合剤および担体を含んでいてもよい。
【００９６】
膣内投与に適合した医薬品組成物をペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤として提供してもよい。
【００９７】
潅流投与
本発明の医薬品組成物をまた潅流を用いて、すなわち器官または組織に液体をポンピングにより（特に血管経由で）投与してもよい。そのような実施態様では、医薬品組成物は好ましくは約０．０１pM〜約３０pM、好ましくは約１５pM〜約３０nMの本発明の組織保護性サイトカインを有する。ある実施態様において、潅流溶液は、ウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液（約７．４〜約７．５のｐＨおよび約３２０mOSm/Lの重量オスモル濃度を有する）である。それは約１Ｕ（１０ng）/ml〜約２５Ｕ（２５０ng）/mlの本発明のＥＰＯ化合物；５％ヒドロキシエチルデンプン（好ましくは約２００，０００〜約３００，０００の分子量を有し、エチレングリコール、エチレンクロロヒドリン、塩化ナトリウムおよびアセトンを実質的に含まない）；２５mM ＫＨ２ＰＯ４；３mM グルタチオン；５mM アデノシン；１０mM グルコース；１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液；５mM グルコン酸マグネシウム；１．５mM ＣａＣｌ２；１０５mM グルコン酸ナトリウム；２００，０００ユニットのペニシリン；４０ユニットのインシュリン；１６mg デキサメタゾン；および１２mgのフェノールレッドを含む。ＵＷ溶液についてU.S. Patent No.4,798,824（その全体を参照により本明細書に組み入れる）に詳細に議論されている。
【００９８】
局所投与
本発明の医薬品組成物を、治療を必要とする領域へ局所的に投与することが望ましい。そのような投与を、手術中の局所注入により；、例えば手術後に創傷被覆材と共に局所投与することにより；注射により；カテーテルにより；坐薬により；またはインプラントにより達成することができる。なお前記インプラントはシラスティック膜などの膜またはファイバーを含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料である。
【００９９】
制御放出システム
さらに、経皮的投与に関連して簡潔に上に議論したように、本発明の組織保護性サイトカインを制御放出システムにより送達してもよい。例えば、組織保護性サイトカインを、静脈注入、植え込み型浸透ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与してもよい。そのような制御放出システムを治療の標的、すなわち標的細胞、組織、器官、の近くに置くことができ、これにより全身に対する用量の一部しか必要でなくなる。
【０１００】
投薬
上の投与方法のための好ましく有効で無毒な用量の選択は、当業者に公知の要因に基づいて当業者により決定されることになる。これらの要因の例としては、組織保護性サイトカインの特有の形；生物学的利用性、新陳代謝、半減期その他（当業者に与えられている）などの組織保護性サイトカインの薬物動力学的パラメーター；治療する症状；健常者が得ることになる利益；患者の体重；投与方法；投与の頻度、すなわち慢性的、急性的、断続的；併用薬剤；および投与された医薬品の効能に影響する周知の他の要因、が挙げられる。したがって、治療担当医の判断および個々の患者の状況によって正確な用量を決定するべきである。
【０１０１】
治療キット
本発明はさらに、本発明の医薬品組成物の１つ以上の成分によって満たされた１つ以上の容器を含む薬用パックまたはキットを提供する。ある実施態様では、有効な量の組織保護性サイトカインおよび薬学的に許容される担体を一回量バイアルまたは他の容器に入れてもよい。
【０１０２】
本発明の医薬品組成物を非経口投与に適合させる場合、例えば、組成物を凍結乾燥した状態で貯蔵してもよい。したがって、キットは凍結乾燥した組成物、滅菌液体担体、および注入用注射器を含むことになる。
【０１０３】
ある実施態様では、キットは、投与者が各治療機会毎に特定量の材料を量り分けて、特定量の担体を加えるように、数回の治療に十分な凍結乾燥材料を含むアンプルを含む。別の実施態様では、キットは、各々が特定量の凍結乾燥材料を含む複数のアンプルおよび各々が特定量の担体を含む複数の容器を含んでもよい。そうすれば投与者は各治療機会毎に測定または計量しないで、単に１つのアンプルと１つの担体容器の内容を混合するだけでよい。またさらに別の実施態様では、キットは、本発明の組織保護性サイトカインの注射剤溶液を含む自動注入器を含む。さらに別の実施態様では、キットは、少なくとも１つの凍結乾燥組成物を有するアンプル、少なくとも１つの担体溶液の容器、少なくとも１つの局所麻酔剤を有する容器および少なくとも１本の注射器（その他）を含む。アンプルおよび容器は好ましくは密封される。
【０１０４】
本発明の医薬品組成物が注入によって投与される場合には、キットは、好ましくは、少なくとも１つの医薬品組成物を有するアンプル、および少なくとも１個の医薬品級の滅菌水または食塩水を有する注入剤瓶を含む。
【０１０５】
本発明によるキットは、さらに、少なくとも１つのマウスピース、あるいは、加圧されたエアロゾル、ネブライザーもしくは注入器などの特に直接の肺吸入用に適合された装置を含んでもよい。本発明のこの局面では、キットは、医薬品組成物を含む直接の肺吸入用の装置、またはその装置および本発明の組織保護性サイトカインの水性または油性溶液の少なくとも１つのアンプルを含んでもよい。
【０１０６】
本発明の組織保護性サイトカインが、経口、経皮的、直腸内、膣内、または鼻内に適合されている場合、キットは好ましくは、活性成分を含む少なくとも１つのアンプルおよび少なくとも１つの投与援助用具を含む。投与援助用具の例には、計量スプーン（経口投与用）、滅菌クリーニングパッド（経皮的投与用）および鼻用アスピレーター（鼻への投与用）が含まれるがそれらに限られない。そのようなキットは、組織保護性サイトカインの１回量（急性治療）または複数量の用量（長期間の治療）を含むことになる。
【０１０７】
さらに、キットに１以上の型の溶液が備えられてもよい。例えば、本発明の組織保護性サイトカインをアルブミン溶液およびポリソルバート溶液として作成してもよい。キットがポリソルバート溶液を含んでいる場合、語句「アルブミンフリー」が、キットのメインパネルにはもちろん、好ましくは容器ラベルに記載される。
【０１０８】
さらに、キットはまた、薬剤または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知を含んでいてもよい。その通知は、政府機関によるヒトへの投与のための製造、使用または販売の承認を示す。
【０１０９】
敗血症／炎症の治療可能性を決定するための分析
本発明はまた、組織保護性サイトカインが、敗血症、癒着、および感染に起因する炎症を、有効に治療し、予防し、発病を遅延させ、あるいは合併症を減少させることができるかどうかを決定するための分析を意図する。実験室で制御された、敗血症誘導、癒着誘導、または炎症反応誘導を含む任意の分析を、本発明の目標とする。
【０１１０】
例えば、本発明による適当な分析は、Sprague Dawleyラットの盲腸を露出させ、腸閉塞を回避するために回盲弁のすぐ末梢側で結紮する盲検試験を含んでもよい。そして盲腸を穿孔し、穏やかに圧搾して少量の糞便を外に押し出し、次に腹腔に戻す。器官中へ糞便を放出すると、感染が引き起され、それが次には、敗血症、癒着、炎症、またはそれらの組合せを誘発する。その後、腹部を縫合する。好ましくはラットを、少なくとも食塩水を投与される１つの群およびテストされる組織保護性サイトカインを投与されるもう１つの群を含む群へ分別する。結紮の時に、動物の様々な群に、所定量の食塩水または組織保護性サイトカインを、好ましくは静脈内に与える。選択した処置、すなわち食塩水または組織保護性サイトカインの皮下投与、を結紮処理後の所定時間のあいだ行うことができる。さらに、この研究は切開したが、感染させなかった一群のラットを含んでもよい。
【０１１１】
その後、癒着と疾患スコアのために動物を観察する。表１は、癒着の生成に基づいて動物を評価する方法を与える。
【０１１２】
【表１０】
2007517769.tif 000009
【０１１３】
各癒着にポイント１を与えて、累積的癒着スコアを計算する。ある実施態様では、累積的癒着スコアは８以下が好ましい。別の実施態様では、累積的癒着スコアは約５以下である。さらに別の実施態様では、累積的癒着スコアは約３以下である。
【０１１４】
疾患スコアを各動物について様々な因子に基づいて計算してもよい。このスコアに用いられる因子には歩行姿勢、ロープにぶら下がる能力、周辺に関する探索行動、発泡パッドの壁をよじ登ること、毛の直立などの身体応答、酸素供給、および形成された癒着の数などの行動因子が含まれるがしかしそれらに限られない。例えば、ラットが病気の場合には、動物は歩行の間身体を丸めて、自分の周辺を探索しないであろう。さらに、病気のラットの心拍数は不正確であるが、一方で健康なラットは通常約３００回／分の心拍数を有する。表２は、治療のために用いられる組織保護性サイトカインの有効性を評価するために各動物に病状に関してスコアをつける方法を与える。
【０１１５】
【表１１】
2007517769.tif 000010
【０１１６】
続ければ、１４以上の累積的疾患スコアは動物の死を意味し、一方ではるかに低いスコアは、動物が比較的健康であることを表す。ある実施態様では、敗血症を誘発された動物は、本発明の少なくとも１つの組織保護性サイトカインによる８日間の治療後には、約５以下の疾患スコアを有する。別の実施態様では、動物は治療後に約４以下の疾患スコアを有する。また別の実施態様では、動物は治療後に約２以下の疾患スコアを有する。さらに別の実施態様では、動物は治療後に約１以下の疾患スコアを有する。
【０１１７】
実施例
次の限定されない実施例は、本発明の好ましい実施態様の単なる例示であって、本発明を制限するように解釈するべきではなく、本発明の範囲は添付した請求項により定義される。もし他に示さなければ、割合は重量による。
【０１１８】
実施例１
ラット腹部敗血症モデルを用いた盲検試験
Sprague Dawleyラットの盲腸を露出させ、腸閉塞を回避するために回盲弁のすぐ末梢側で結紮し、１８ゲージ針で２度穿孔し、穏やかに圧搾して少量の糞便を押し出し、次に腹腔に戻した（糞便は腹膜中に導入され、感染を引き起こした）。腹部を３−０の絹製縫合糸で閉じ合わせた。
【０１１９】
動物を２つの群に割り付けた：
【０１２０】
群１：敗血症を誘導され、食塩水で処置された（ｎ＝８）。結紮の時に、群１の動物は１００μlの食塩水を静脈内に与えられた。続いて８日間、または死に至るまで毎日皮下に生理食塩水投与（１００μl）が行われた。
【０１２１】
群２：敗血症を誘導され、カルバミル化ＥＰＯで処置された（ｎ＝８）。結紮の時に、動物は１００μlの食塩水中の１０μg/kgのカルバミル化ＥＰＯ（赤血球造血活性を効果的に除去するように調製された）を静脈内に与えられた。続いて１００μl食塩水中の１０μg/kgの用量で８日間（または死に至るまで）毎日皮下処置が行われた。
【０１２２】
罹患率および死亡率
群１では、動物の約５０パーセント未満が８日後に生き残った。群２では、しかし、図１にグラフとして示すように、生存率は約５０パーセントより大きかった。詳しく言えば、処置1日後に、群２の動物の約８０パーセントの生存率と比較して、群１の動物は約６０パーセントの生存率であった。しかし３日後には、群１の生存率は、約２５パーセントの生存率と著しく低下した、それにもかかわらず群２動物の生存率は約６０パーセントより大であった。したがって、本発明のカルバミル化ＥＰＯを投与された動物は食塩水を投与された動物よりはるかに高い生存率を有していた。
【０１２３】
累積癒着スコア
好気性および嫌気性培養のために腹水と潰瘍から標本を得た。好気性培養については、試料をＥＭＢ寒天培地の血液上２４時間３７℃でインキュベーションした。嫌気性培養については、試料を嫌気性血液寒天培地上に乗せ、Ｇａｓ−Ｐａｋジャー中２４時間３７℃でインキュベーションした。成長しているコロニーを標準の細菌学の技術により同定した。
【０１２４】
死亡した動物を４時間以内に検死し、死因を記録した。本出願の先に記載した表１を用いて、各動物の損傷２４時間後の累積的癒着スコアを計算し、次に群に対して平均した（図２にグラフとして示す）。詳しくは、群１の平均合計スコアが約１０であった。しかし、群２の平均合計スコアは約６であった。要するに、本発明のカルバミル化ＥＰＯを投与された動物は食塩水を投与された動物より癒着が少なかった。
【０１２５】
疾患スコア
疾患スコアを、本出願の先に於いて表２に記載したようにして計算し、結果を図３にグラフとして図示する。詳しく言えば、処置1日後に群２の動物の約３の平均疾患スコアと比較して、群１の動物の平均疾患スコアは約９であった。５日後には、群１の動物は、約１２の平均疾患スコアを有し、一方で群２の動物は約５以下の平均疾患スコアを有していた。
【０１２６】
瘢痕化
切開からの痕跡化についてもラットを視覚により検査した。群２ラットの方が群１のラットより、より少ない痕跡化を有していた。
【０１２７】
実施例２
ラット腹部敗血症モデルを用いた盲検試験
Sprague Dawleyラットの盲腸を露出させ、腸閉塞を回避するために回盲弁のすぐ末梢側で結紮し、１８ゲージ針で２度穿孔し、穏やかに圧搾して少量の糞便を押し出し、次に腹腔に戻した（糞便は腹膜に導入され、感染を引き起こした）。腹部を３−０の絹製縫合糸で閉じ合わせた。
【０１２８】
動物を３つの群に割り付けた：
【０１２９】
群１：上述のように開腹したが、敗血症を誘起させなかった（ｎ＝６）。
【０１３０】
群２：敗血症を誘起され、食塩水で処置された（ｎ＝８）。結紮の時に、群２の動物は１００μlの食塩水を静脈内に与えられた。続いて８日間（または死に至るまで）毎日皮下に生理食塩水（１００μl）を投与された。
【０１３１】
群３：敗血症を誘起され、カルバミル化ＥＰＯ（ｎ＝８）で処置された。結紮の時に、動物は１００μlの食塩水中の１０μg/kgのカルバミル化ＥＰＯを静脈内に与えられた。続いて１００μl食塩水中の１０μg/kgの用量で８日間（または死に至るまで）毎日皮下処置が行われた。
【０１３２】
累積癒着スコア
好気性および嫌気性培養のために腹水と潰瘍から標本を得た。好気性培養については、試料をＥＭＢ寒天培地の血液上２４時間３７℃でインキュベーションした。嫌気性培養については、試料を嫌気性血液寒天培地上に乗せ、Ｇａｓ−Ｐａｋジャー中２４時間３７℃でインキュベーションした。成長しているコロニーを、標準の細菌学の技術により同定した。
【０１３３】
死亡した動物を４時間以内に検死し、死因を記録した。本出願の先に記載した表１を用いて、各動物の損傷２４時間後の累積的癒着スコアを計算し、次に群に対して平均した（図４にグラフとして示す）。詳しくは、群１、２および３の平均合計スコアは、それぞれ約２、約１０および約６よりすくなかった。したがって、本発明のカルバミル化ＥＰＯを投与された動物は食塩水を投与された動物より癒着が少なかった。
【０１３４】
腫瘍壊死因子の研究
カルバミル化ＥＰＯの癒着を減少させる能力の背後にある機構を決定する努力の中で、ある期間後に動物の血液中に存在する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレベルを、ラットＴＮＦαの検出が可能であるR&D Systems(＃RTA00)から得たＥＬＩＳＡを用いて各群について検査した。図５に示すように、ＴＮＦの量の差は２４時間後には３つの群の間で著しく異なることはない。３時間後（炎症のピーク）、システムにおけるＴＮＦの量が３つの群すべてに対して減少した。これらの結果は、一般に容認されている癒着の背後の機構、すなわち炎症反応は正確な機構でない可能性があることを示唆する。実際、ＴＮＦ研究が、癒着の背後の機構は細胞死によるものかもしれないことを示唆する、また、本発明のカルバミル化ＥＰＯが組織保護機能を有しているため、細胞壊死が減少したために癒着が投与により減少するのかもしれない。
【０１３５】
瘢痕化
外観検査により、群３のラットは、群１および２よりも瘢痕化が十分に少なかった。
【０１３６】
実施例３
腹部敗血症モデルを用いた盲検試験
Sprague Dawleyラットの盲腸を露出させ、腸閉塞を回避するために、回盲弁のすぐ末梢部で結紮し１８ゲージ針で２度穿孔し、穏やかに圧搾して少量の糞便を押し出し、次に腹腔に戻した（糞便は腹膜に導入され、感染を引き起こした）。腹部を３〜０番手の絹製縫合糸で閉じ合わせた。
【０１３７】
動物を４つの群に割り付けた：
【０１３８】
群１：上述のように開腹したが、敗血症を誘起させなかった（ｎ＝６）。
【０１３９】
群２：敗血症を誘起され、食塩水で処置された（ｎ＝８）。結紮の時に、群２の動物は１００μlの食塩水を静脈内に与えられた。続いて８日間（または死に至るまで）毎日皮下に食塩水を投与（１００μl）された。
【０１４０】
群３：敗血症を誘起され、ｒｈｕ−ＥＰＯで処置された（ｎ＝８）。結紮の時に、動物は１００μlの食塩水中の１０μg/kgのｒｈｕ−ＥＰＯを静脈内に与えられた。続いて８日間（または死に至るまで）毎日１００μlの食塩水中の１０μg/kgの用量で毎日皮下処置を受けた。
【０１４１】
群４：敗血症を誘起され、カルバミル化ＥＰＯで処置された（ｎ＝８）。結紮の時に、動物は１００μlの食塩水中の１０μg/kgのカルバミル化ＥＰＯを静脈内に与えられた。続いて８日間（または死に至るまで）毎日１００μlの食塩水中の１０μg/kgの用量で毎日皮下処置を受けた。
【０１４２】
罹患率および死亡率
結紮１日後、群１（シャム）の動物のすべてが生き残った。一方群２の動物はいずれも生き残らなかった。群４の５匹の動物に比較して、群３の動物（ｒｈｕ−ＥＰＯ）の２匹のみが生き残った。したがって、本発明のカルバミル化ＥＰＯを投与された動物は食塩水またはｒｈｕ−ＥＰＯを投与された動物よりはるかに高い生存率を有していた。
【０１４３】
瘢痕化
外観検査により、群４のラットは、群１〜３よりも瘢痕化が十分に少なかった。
【０１４４】
実施例４
ラットにおけるリポ多糖誘導応答
この実施例の目的は、リポ多糖（ＬＰＳ）によって引き起こされた敗血症様症状に対するカルバミル化エリスロポエチンの有効性を決定することであった。ＬＰＳは、動物に敗血症様の応答（中核温度の上昇およびサイトカインの誘導）を引き起こすバクテリアの表面に存在するエンドトキシンである。オスSprague/Dawleyラット（３００〜３５０ｇ）に２４０μg/kgを腹腔内に投与した。その後、動物に食塩水（ｎ＝６）または１０μg/kgのカルバミル化エリスロポエチン（ｎ＝６）を静脈内に処置した。その後、中核体温に対するＬＰＳの濃度依存性の影響を測定した。あるいは、適用経路が中核温度を区別して変化させるかどうかを判断するために、カルバミル化エリスロポエチン（２μl中に５μg/kg）を直接脳室内に投与した(Seeley et al, (1996) Horm Metab Res. 28 : 664-8)。最初の２４時間の間、中核温度をモニターすることにする。ある場合には、後にサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−６）を分析するために血液を取り出した。Seeley et al,(1996)Horm Metab Res. 28 : 664-8。
【０１４５】
中核温度
ＬＰＳによって誘起された敗血症様症状の一部として、ＬＰＳを投与された動物は２相性発熱を経験する。発熱の第１相は、罹患した個体の血圧および覚醒状態の増大を伴う明確な体温上昇により特徴付けられる。しかし発熱の第２相はそれほど明確ではなく、正常血圧または低血圧のいずれか、ならびに嗜眠および眠気を伴う。発熱の相は身体が病気と格闘するために利用する戦略の転換を表わすと理論付けられている(Romanovsky et al., Am. J. Physiol, 271 : R244-R253, 1996)。本実施例において、ＬＰＳ処理された動物へのカルバミル化エリスロポエチンの投与は、図６に示すように発熱の両方の相を減少させる結果となった。
【０１４６】
ＴＮＦおよびＩＬ−６の血清レベル
カルバミル化エリスロポエチンのＬＰＳに対する発熱応答を調整する能力はさらに、図７（ａ）および図７（ｂ）に示すように、それのＴＮＦおよびＩＬ−６などの発熱性のサイトカインの存在量を抑制する能力に関連付けられた。ＥＬＩＳＡを用いてラットから採取した血清内のＴＮＦおよびＩＬ−６の存在量を決定した。図７（ａ）および７（ｂ）の双方が、カルバミル化エリスロポエチンによる処置が炎症誘導性のサイトカイン、ＩＬ−６およびＴＮＦの存在量を著しく減少させたことを実証している。
【０１４７】
カルバミル化エリスロポエチンの末梢対中枢投与
カルバミル化エリスロポエチンの視床下部に対する直接効果を除外するために、上に指摘した方法によりカルバミル化エリスロポエチンを脳室内に投与した。図８（ａ）および図８（ｂ）に示すように、カルバミル化エリスロポエチンを末梢および中枢に投与した場合の間の中核温度低下には相関が無かった。これらの結果およびカルバミル化エリスロポエチンの発熱性サイトカインに対する効果に照らしてみれば、カルバミル化エリスロポエチンが発熱性サイトカインの抑制を通じてその中核温度に効果をもたらすように見える。これは、カルバミル化エリスロポエチンなどの組織保護性サイトカインが慢性の疾病（消耗、嗜眠、貧血、その他）におけるこれらのサイトカインの影響を調整し、改善し、または予防するのに役立つことを示唆している。
【０１４８】
実施例５
エリスロポエチンアナログのラットの虚血性皮膚弁損傷に対する影響
虚血性皮膚弁創傷の回復へのカルバミル化エリスロポエチンの作用を測定するために、虚血性創傷弁モデルを実施した。オスのSprague/Dawleyラット（３００〜３５０ｇ）を、イソフルランを用いて麻酔した。次にラットの背中で長さ９ｃｍおよび幅３ｃｍの皮膚弁を切開した。皮膚弁は皮膚、皮下層および皮筋層を含んでいた。切開後に、Buemi, M., et al., (2002) Acta Derm. Venereol. 82: 411-417; Sarau, A., et al.,(2003) Laryngoscope. 113 : 85-89に記載の通りに、弁を持ち上げ、次にその基盤に直ちに再縫合した。動物にエリスロポエチンアナログ、カルバミル化ＥＰＯを、手術後直ちに、１日目に、２日目に、および分析の間は隔週に（皮下に、０．３μg/kg）投与した。動物の体重を量り、また創傷を毎週写真に撮った。Buemi, M.,et al.,(2002) Acta Derm.Venereol.82: 411-417。治癒した傷の面積を、その後、処置３４日後に撮影した動物の写真に基づいて、定量化した。図９に示すように、カルバミル化エリスロポエチンを投与されたラットは、同じ期間食塩水で処理されたラットより大きなパーセントの傷が治癒した。
【０１４９】
本出願に記載し請求する本発明は、本明細書に開示された特別の実施態様によって範囲が制限されてはならない。何故ならば、これらの実施態様は本発明のいくつかの局面の実例解説を目的とするからである。詳しくいえば、当業者は、上記の実施例はカルバミル化ＥＰＯを用いて実施されたが、本発明の任意の組織保護性サイトカインについて同様の結果が期待されるであろうということを認識するであろう。任意の等価な実施態様が本発明の範囲内になることを意図する。確かに、本明細書に示され記述されたものに加えて、本発明の様々な改変は、先の記述から当業者にとって明白になるであろう。そのような改変がまた、添付した請求項の範囲内に含まれることを意図するものである。先の本文に引用された特許および特許出願はすべて、特に参照によりそれらの全体を、ここに組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）およびその後の生理食塩水または本発明の組織保護性サイトカインによる処置後のSprague Dawleyラットの生存率のグラフ表示である；
【図２】図２は、ＣＬＰおよびその後の生理食塩水または本発明の組織保護性サイトカインによる処置の後のSprague Dawleyラットの癒着スコアのグラフ表示である；
【図３】図３は、ＣＬＰおよびその後の生理食塩水または本発明の組織保護性サイトカインによる処置を受けたSprague Dawleyラットの疾患スコアのグラフ表示である；
【図４】図４は、敗血症導入および非導入のＣＬＰおよびその後の生理食塩水および本発明の組織保護性サイトカインによる処置の後のSprague Dawleyラットの癒着スコアのグラフ表示である；
【図５】図５は、敗血症導入および非導入のＣＬＰおよびその後の生理食塩水または本発明の組織保護性サイトカインによる処置の後のSprague Dawleyラットの血清ＴＮＦレベルのグラフ表示である；
【図６】図６は、リポ多糖（ＬＰＳ）により誘発された敗血症後に食塩水または組織保護性サイトカインで処置されたSprague Dawleyラットの２４時間の間の中核体温を表示する図表である。
【図７Ａ】図７（ａ）は、ＬＰＳにより誘起された敗血症の後に、生理食塩水または本発明の組織保護性サイトカインにより処置されたSprague Dawleyラットの血清中のＩＬ−６レベルを表示する図である；
【図７Ｂ】図７（ｂ）は、ＬＰＳにより誘起された敗血症の後に、生理食塩水または本発明の組織保護性サイトカインにより処置されたSprague Dawleyラットの血清中のＴＮＦレベルを表示する図である；
【図８Ａ】図８（ａ）は、ＬＰＳにより誘起された敗血症の後に、組織保護性サイトカインにより末梢を処置されたSprague Dawleyラットの中核体温を表示する図である。
【図８Ｂ】図８（ｂ）は、ＬＰＳにより誘起された敗血症の後に、組織保護性サイトカインにより中枢を処置されたSprague Dawleyラットの中核体温を表示するする図である。
【図９】図９は、虚血皮膚弁テストを受け、続いて食塩水または組織保護性サイトカインで処置された３４日後のSprague Dawleyラットにおいて治癒した損傷のパーセンテージのグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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