(57)【要約】  動物にアスタキサンチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、その動物における酸化ストレスを低減または予防する方法を記載する。アスタキサンチンと、場合によってはビタミンＥとを含む組成物も記載し、その組成物は動物における酸化ストレスの低減または予防に有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物にアスタキサンチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、前記動物における酸化ストレスを低減または予防する方法。
【請求項２】
前記組成物がビタミンＥをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化ストレスが、運動、感染、外傷、または太陽光曝露のうち少なくとも１つに起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化ストレスが運動に起因する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記動物が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物がイヌである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記動物がネコである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
動物に有効量のアスタキサンチンを投与することを含む、酸化ストレスから回復中の前記動物を処置する方法。
【請求項９】
前記酸化ストレスが運動に起因する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組成物がビタミンＥをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
動物における酸化ストレスの低減または予防に有効である、アスタキサンチンを含む組成物。
【請求項１２】
ビタミンＥをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
物質が動物における酸化ストレスに及ぼす効果を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）前記物質を前記動物に投与するステップと、
ｂ）トレーニング前に前記動物における酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、
ｃ）運動処方に従って前記動物をトレーニングするステップと、
ｄ）トレーニング後に酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、
ｅ）トレーニング前およびトレーニング後の酸化ストレスの前記指数における差を比較して少なくとも１つの結果を得るステップと、
ｆ）前記結果を、前記物質が投与されていない対照動物から得た結果と比較するステップと
を含み、ここで、前記結果が前記物質で処置された動物の結果と前記対照動物の結果との間で異なるならば、前記物質は酸化ストレスに効果を有するとみなされる方法。
【請求項１４】
酸化ストレスの前記指数が、マロンジアルデヒドの血漿濃度、Ｆ−２イソプロスタンの血漿濃度、ビタミンＥの血漿濃度、クレアチンキナーゼ活性、または酸素ラジカル吸収能のうち１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
動物にアスタキサンチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、動物における白内障形成の開始を低減または遅延する方法。
【請求項１６】
前記組成物がビタミンＥをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
動物にアスタキサンチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、動物における炎症を低減する方法。
【請求項１９】
前記炎症が変形性関節症に関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物がビタミンＥをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
動物にアスタキサンチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、前記動物における免疫応答を増強する方法。
【請求項２３】
前記組成物がビタミンＥをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]これは、２００４年４月１６日に出願された米国仮出願第６０／５６２８１５号の利益を主張するものであり、その米国仮出願の開示は本明細書によってその全体が参照により組み込まれている。これは、本出願と同時に出願された米国出願（番号はまだ割り当てられていない）にも関する。その米国出願の全内容も参照により組み込まれている。
【発明の分野】
【０００２】
[0002]本発明は、一般に、アスタキサンチンおよび／またはビタミンＥの補給によって、動物における酸化ストレスを低減および／または予防するのに有効な方法および組成物に関する。
【発明の背景】
【０００３】
[0003]細胞は多様な有機分子の酸化からエネルギーを得て、酸素はこの機能を果たす生化学反応での主な酸化剤である。酸素を使用する代謝反応に起因する酸化ストレスは、無傷細胞でのプロオキシダント／抗酸化剤系の平衡状態での撹乱とみなすことができる。細胞は、正常な好気代謝の間に酸化剤を絶えず発生して解毒する無傷のプロオキシダント／抗酸化剤系を有する。追加の酸化イベントが起こるとき、プロオキシダント系は抗酸化剤系に勝り、このことは、脂質、タンパク質、炭水化物、および核酸を含めた細胞構成要素に酸化的損傷を招くおそれがある。軽度の慢性的な酸化ストレスは、これらの系に関与するタンパク質を誘導または抑制することによって、ならびにグルタチオンおよびビタミンＥのような抗酸化物質の細胞貯蔵を枯渇させることによって、抗酸化剤系を改変するおそれがある。重い酸化ストレスは、最後に細胞死をもたらすおそれがある。
【０００４】
[0004]プロオキシダント／抗酸化剤系の不均衡は、放射線、環境汚染物質および投与された薬物の代謝、ならびに疾患または感染に対する免疫系の応答を含めたいくつかの異なる酸化的攻撃誘発に起因するおそれがある。多くの有毒酸化物質は侵入生物を攻撃するために発生することから、免疫応答が特に重大である。ラジカルと呼ばれる多様な化学物質は、これらの過程に役割を有する。ラジカル種は、不対スピンの状態を有する１つまたは複数の軌道電子を含む任意の原子である。ラジカルは、酸素もしくは一酸化窒素のような小さな気体分子のこともあるし、また、タンパク質、炭水化物、脂質、もしくは核酸のような生体高分子の一部のこともある。ラジカル種のあるものは他の生体分子と非常に反応性が高く、また通常の三重項状態の分子状酸素のような他のものは比較的不活性である。
【０００５】
[0005]酸化ストレスに関して関心対象であるのは、部分還元された酸素産物と、それら由来のラジカルおよび非ラジカル種との反応である。一酸化窒素の反応に由来する多様な活性窒素も、酸化ストレスに重要な役割を演じる。
【０００６】
[0006]酸化ストレスは、ヒトおよび動物の疾患に関係があるとされている。しかし、細胞は、酸化ストレスに対する多数の防御メカニズムを有し、そのメカニズムは細胞損傷の予防に作用する。多くの食物成分は、抗酸化ビタミンおよび無機質を含めた保護剤と、天然抗酸化剤の作用を増強できるであろう食品添加剤との重要な供給源である。酸化ストレスにおける抗酸化剤の有効性は、ストレスを引き起こす特異的分子と、細胞または細胞外におけるそれらの分子の供給源の位置とに依存することがある。
【０００７】
[0007]激しい運動は、いくつかの方法で酸化ストレスにかなり寄与しうる。大部分の個体は、人生のある時期に身体労作の後に痛みおよび疲労を経験したことがある。激しい頻繁な運動を経験した動物では、酸化ストレスの作用は動作に対して負の作用を有し得る。
【０００８】
[0008]激しい運動は、身体にいくつかの生理学的変化を招く。第１に、大気汚染のような環境からの酸化傷害に対する曝露が増加する以外に、好気呼吸が劇的に増加することによって、スーパーオキシドアニオンの発生が１０倍以上に増加する（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ、Ｂ．（１９９４）Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ：  ａ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｖｉｅｗ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．５２：２５３〜２６５）。第２に、筋肉および関節の炎症は激しい運動に起因することが多く、よって、免疫応答に仲介される活性化好中球の「酸化バースト」特性が起きる間に組織への好中球の浸潤およびその後の活性酸素の放出が誘発される。
【０００９】
[0009]ヒトにおいて高まった抗酸化剤摂取は、特定の形の癌を発現するリスクを減少させて免疫機能を高めると報告された。イヌにおける老化過程および運動のような病理学的および生理学的過程に及ぼす食物からの抗酸化剤の摂取効果が、科学文献で報告された。ビタミンＥおよびＣの摂取の高まりが、免疫機能、フリーラジカル形成、およびフリーラジカルスクラバーに及ぼす作用も報告された。
【００１０】
[0010]白内障は、糖尿病のような代謝障害が原因で、および光に対する曝露に続く水晶体の酸化から、発現するおそれがある。したがって、酸化ストレスは白内障の形成に直接寄与する。白内障形成の初期段階に脂質過酸化（ＬＰＯ）の主産物（ジエン複合体、セトジエン）が蓄積するが、その後の段階ではＬＰＯ蛍光性最終産物が優占的である（Ｂａｂｉｚｈａｙｅｖら（２００４）Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．５（３）：１２５〜１３９）。水晶体混濁は組織中のＬＰＯ蛍光性最終産物の蓄積と相関し、減少した還元型グルタチオンは水晶体タンパク質のスルフヒドリル基の酸化をもたらす（Ｂａｂｉｚｈａｙｅｖら（２００４）Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．５（３）：１２５〜１３９）。ＬＰＯ産物を硝子体に直接注射すると白内障の形成が誘導されることが示された（Ｂａｂｉｚｈａｙｅｖら（２００４）Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．５（３）：１２５〜１３９）。このように、過酸化物による水晶体線維膜の損傷は、白内障の発現を開始すると思われる（Ｂａｂｉｚｈａｙｅｖら（２００４）Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．５（３）：１２５〜１３９）。変形性関節症（ＯＡ）も酸化ストレスに関係する。一酸化窒素、スーパーオキシドアニオン、および過酸化水素を含めたフリーラジカルは、関節軟骨に対する損傷を担う酵素の上方制御をもたらす。これらの酵素（ＭＭＰ）は、コラーゲン、エラスチン、およびゼラチンに特異的である。
【００１１】
[0011]不対電子を有する酸素ラジカルは酸素代謝の正常な部分として産生される。これらの反応性分子は、例えばタンパク質、核酸（すなわちＤＮＡ）、および／または膜に損傷を引き起こすおそれがあり、その損傷は、重い細胞障害および動物全体での疾患を招くおそれがある。この過程は、老化過程、消耗性疾患、および癌に関連していた。
【００１２】
[0012]酸化損傷または酸化ストレスに特に易損性であり得る動物には、非常に活動的な動物がある。例えば、コンディションのよい競技犬は健康な動物であり、驚異的な酸素消費速度のおかげで、あまり運動をしない対応動物よりも多くのフリーラジカルを毎日発生する。免疫機能、代謝中間体、抗酸化剤の組織貯蔵、およびフリーラジカル産生によって誘導される抗酸化酵素の変化は、あまり運動をしない動物よりも競技犬の方が大きい。
【００１３】
[0013]重労働をするイヌを調査した以前の研究から、運動が脂質過酸化の安定副産物であるイソプロスタンの結晶濃度の有意な増加に関連したことが明らかとなった。まさにこれらの研究が、運動中に血漿ビタミンＥ濃度が減少することも実証した。さらなる研究は、これらのパラメータに及ぼすビタミンＥ補給の効果を調べた。ビタミンＥの補給は、運動に関連した血漿ビタミンＥ濃度の下落の減少または緩和を助けたが、血漿イソプロスタンの上昇を減らさなかった。
【００１４】
[0014]アスタキサンチンは、いくつかの供給源で見出すことができる混合カロテノイドであり、藻類に高濃度存在する。この色素は、紫外線曝露による損傷から藻類生物を保護する。培養細胞および動物全体（マウス）でアスタキサンチンの免疫刺激性が実証された。アスタキサンチンは日光曝露後の皮膚の発赤を減らすと実証されたことから、日焼け止めローションにも使用される。アスタキサンチンの補給は、トレーニングを受けていないヒト対象での増加した持久性にも関連していた。
【発明の概要】
【００１５】
[0015]ある態様では、本発明は、動物における酸化ストレスを低減または予防する方法に関し、その方法は、アスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを含む有効量の組成物をその動物に投与することを含む。本発明の追加の態様は、アスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを含む組成物に関し、その組成物は動物における酸化ストレスの低減または予防に有効である。
【００１６】
[0016]一態様では、本発明は、アスタキサンチン、またはアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む組成物と、動物における酸化ストレスを低減または予防する方法とを提供し、その方法は、アスタキサンチン、またはアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物をその動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、アスタキサンチン、またはアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することによって、酸化ストレスから回復中の動物を処置する方法を提供する。
【００１７】
[0017]別の態様では、本発明は、動物における酸化ストレスに及ぼす物質の効果を評価する方法を提供し、その方法は、（ａ）その動物にその物質を投与するステップと、（ｂ）トレーニングの前にその動物における酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、（ｃ）運動処方に従ってその動物をトレーニングするステップと、（ｄ）（ｂ）および（ｄ）における酸化ストレスの指数の差を比較して少なくとも１つの結果を得るステップと、（ｆ）（ｅ）で得られた結果をその物質が投与されていない対照動物で得られた結果と比較するステップとを含み、ここで、（ｅ）で得られた結果がその物質で処置された動物の結果と、対照動物の結果との間で異なるならば、その物質は酸化ストレスに効果を有するとみなされる。
【００１８】
[0018]別の態様では、本発明は、アスタキサンチン、またはアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することによって、動物における免疫応答を増強し、動物における変形性関節症に関連する炎症および疼痛を低減し、かつ動物における白内障を予防または処置する方法も提供する。
【００１９】
[0019]本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および実施例を参照することによって了解されるであろう。
【例示的な実施形態の詳細な説明】
【００２０】
[0020]本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載されたような特定のシステムまたは工程パラメータの例に限定されないものとする。それは、これらのパラメータがもちろん変動し得るからである。本明細書に使用した用語は、本発明の特定の実施形態を記載することだけを目的とし、いかなる方法によっても本発明に関していかなる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００２１】
[0021]上記および本開示にわたり採用したように、以下の用語は別に指示しない限り以下の意味を有するものとする。
【００２２】
[0022]「有効量」は、特定の生物学的結果を実現するために有効であり得る、本明細書に記載したような化合物、物質、組成物、および／または投薬形態の量を指す。そのような結果には、酸化ストレスの低減および／または予防があり得るが、それに限定されるわけではない。例えば本発明の態様による組成物の摂取をもたらすことによって、そのような有効な活性を実現できる。
【００２３】
[0023]「哺乳動物」は、乳腺によって分泌される乳汁で幼動物を育て、普通は程度の差はあるが毛で覆われた皮膚を有する温血高等脊椎動物の任意の一クラスを指し、非排他的にネコおよびイヌを含む。
【００２４】
[0024]「酸化ストレス」は、過剰の酸化剤および／または抗酸化剤レベルの減少を特徴とする状態を指す。細胞酸化剤には、１つまたは複数の酸素ラジカル（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、および／またはペルオキシラジカル）、例えば過酸化水素および一重項酸素のような非ラジカル活性酸素、炭素ラジカル、窒素ラジカル、および硫黄ラジカルがあり得るが、それに限定されるわけではない。酸化ストレスの状態の結果、例えば細胞の損傷、細胞の能力障害、および／または細胞死が生じる。
【００２５】
[0025]本明細書および添付の特許請求の範囲に使用するように、単数形である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、状況が明らかに別様を規定しない限り複数の指示対象を含む。
【００２６】
[0026]さらに、本明細書に使用するような用語「約」は、指示された値よりも１０％大きい値から１０％小さい値の範囲を指示することを意図する。このように、約５％は４．５％から５．５％の値の範囲を包含することを意図する。
【００２７】
[0027]別に定義しない限り、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって通例了解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものに類似または等しいいくつかの方法および物質を本発明の実施に使用できるが、好ましい物質および方法を本明細書に記載する。
【００２８】
[0028]本明細書に記載した全ての数値範囲は、本明細書に包含される範囲および特定の完全体の全ての組合せおよびサブ組合せを含む。
【００２９】
[0029]本発明のある態様によると、動物におけるフリーラジカルの産生を増加させるモデルとして運動を利用した。
【００３０】
[0030]本発明は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはネコ、最も好ましくはイヌに関する。
【００３１】
[0031]本明細書に使用するような「ビタミンＥ」は、アルファ−トコフェロールを含めて、トコフェロールの他の異性体および関連化合物であるトコトリエノールも含めた、類似の生物学的抗酸化活性を有する関連化合物の群のうち任意のものを指す。その分子は親油性であり、細胞膜に存在できる。本発明のある態様によると、アルファ−トコフェロールが好ましい形態であり得る。
【００３２】
[0032]本明細書に使用するように、「アスタキサンチン」は、幅広い生物に天然に存在する混合カロテノイドを指す。アスタキサンチンを合成的に製造することもできる。アスタキサンチンの供給源には、エビ、ザリガニ、カニ、およびロブスターを含めた甲殻類；例えばサケを含めた魚類；桃色酵母キサントフィロミセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）；ならびに微細藻類ヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）があるが、それに限定されるわけではない。本発明のある好ましい実施形態では、アスタキサンチンの供給源はＣｙａｎｏｔｅｃｈ（カイルアコナ、ハワイ州）から入手できるＮａｔｕＲｏｓｅ（登録商標）である。
【００３３】
[0033]本明細書に使用するように、「食料」は、食品として使用できるか、食品として使用するために調製できる任意の物質を指す。本明細書に使用するように、「食品」は、本質的にタンパク質、炭水化物、および／または脂肪から成る物質であり、成長、修復、および生命過程を維持するために、ならびにエネルギーを供給するために生物の体内で使用される。食品は、無機質、ビタミン、および調味料のような補助物質も含有することがある。食品という用語は、ヒトまたは動物が摂取するのに適した飲料を含む。本明細書に使用するように、「医薬品」は、医薬である。医薬品は、薬剤とも呼ばれることがある。本明細書に使用するように、「栄養補助食品」は、飲食物を補助することを意図する製品である。栄養補助食品は、以下の食物成分の任意の１つまたは任意の組合せを保有または含有することがある：ビタミン、無機質、ハーブまたは他の植物性薬品、アミノ酸、一日合計摂取量を増やすことによって飲食物の補助に使用するための栄養物（器官または腺由来の酵素または組織を含むがそれに限定されるわけではない）、濃縮物、代謝物、構成物、または抽出物。
【００３４】
[0034]本発明の実施形態によると、アスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを動物に投与することを含む方法が提供され、その方法は、その動物における酸化ストレスの低減および／または予防に有効である。本発明の態様によると、その方法は、有効量のアスタキサンチンの投与を含む。本発明の別の態様によると、その方法はアスタキサンチンとビタミンＥとの両方の投与を含む。好ましくは、アスタキサンチンおよび／またはビタミンＥは、飲食物、食品、食料、栄養補助食品、または医薬組成物に入れて、例えば本明細書に記載したように動物に投与できる。
【００３５】
[0035]本発明の好ましい実施形態によると、その方法は、動物における酸化ストレスからの回復を促進するのに有効である。特に好ましい実施形態によると、その方法は運動による酸化ストレスからの回復を促進するのに有効である。
【００３６】
[0036]本発明のある態様によると、その方法および組成物は、動物に抗加齢効果を有することがあり、よって動物の長寿の促進に有用であり得る。本発明の組成物および方法は、炎症、変形性関節症、白内障形成、弱い免疫系、外傷、感染、および早老を例とするが、それに限定されるわけではない、酸化ストレスに関連する有害な状態を逆転、予防、または低減するのにも有用である。その組成物および方法は、正常な免疫系の機能を高めるのにさらに有用である。
【００３７】
[0037]本発明の任意の理論または任意の特定の作用様式に限定されることなく、２つの抗酸化剤であるアスタキサンチンおよびビタミンＥは種々の種類の酸化ストレスに対して異なる効力を有することがあると考えられている。ビタミンＥは、運動が誘導する酸素代謝の上昇に関連した膜脂質の酸化に対して最も有効であり得る。アスタキサンチンは、運動後２４時間に増加した免疫細胞の活性によって引き起こされる酸化ストレスに対して最も有効であり得る。これらの観察は、もしもこれら２つの抗酸化剤が組み合わされたならば、少なくとも相加作用の、可能性があることには相乗作用の潜在性があることを示唆している。
【００３８】
[0038]本発明のある態様を例示するために、アラスカそり犬を３日連続で３０マイル走らせ、Ｆ−２イソプロスタンのようなバイオマーカーを運動前、運動後、運動後２４時間、運動後４８時間に測定した。これらの運動する動物でのフリーラジカルの発生速度は平均的な家庭のペットよりも大きいので、フリーラジカル曝露の年数の作用を数日から数週間という短期間でシミュレートした。これらの運動するイヌからの血液分析から、イソプロスタン、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、および尿酸（ＵＡ）の有意な増加と共に、血漿ビタミンＥおよびセルロプラスミンの有意な減少が実証された。プロスタグランジンをフリーラジカルに曝露すると、プロスタグランジンはイソプロスタンに変換するが、イソプロスタンは数時間安定であり、商業的に入手できるＥＬＩＳＡキットによって容易に測定される。さらに、免疫細胞の活性が運動後の脂質酸化マーカーの濃度を増加させることが示された。
【００３９】
[0039]イヌ１２匹（雑種のアラスカそり犬（ハスキーとポインターの交雑））の３群に、基本食として商業的に入手できる鶏肉、米配合Ｐｒｏ  Ｐｌａｎ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅドッグフードを給餌し、マルトデキストリン約０．５ｇから成るプラセボ、アスタキサンチン約２ｍｇ、またはビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）約４００ｍｇのいずれかを各群に給餌した。Ｐｒｏ  Ｐｌａｎ（登録商標）ドッグフードはミズーリ州セントルイスのＮｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａ  Ｐｅｔ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる。イヌを１週間に３回６週間にわたり運動ホイールでトレーニングした。６週目にイヌを４日間休ませてから、３日間連続して運動させた。１日目に運動前に、３日目に運動直後に、ならびに運動後２４時間および４８時間に血液試料を採取した。血液試料から得た血漿についてマロンジアルデヒド、Ｆ−２イソプロスタン、およびビタミンＥの濃度と、クレアチンキナーゼ活性および酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）とを分析した。
【００４０】
[0040]脂質酸化および免疫機能の数個の指数に及ぼすビタミンＥ、アスタキサンチン、またはプラセボを補給する効果を調べた。一般的な抗酸化剤であることからビタミンＥを選択し、ビタミンＥは他の抗酸化剤を比較するためのベンチマークを提供した。アスタキサンチンは、微細藻類から採集されるものを含むが、それに限定されるわけではないいくつかの供給源から得ることができる混合カロテノイドである。アスタキサンチンは細胞の脂質区画および水区画の両方に可溶であり、よって、ビタミンＥ（脂肪のみに可溶）またはビタミンＣ（水のみに可溶）のどちらよりも広い分布を有する。アスタキサンチンはビタミンＥの４倍のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸素ラジカル吸収能を有する。アスタキサンチンは、脂質過酸化を予防してフリーラジカルを捕捉することにビタミンＥまたはビタミンＣよりも強力であるとも報告されている。
【００４１】
[0041]本発明のある態様によると、ビタミンＥおよびアスタキサンチンのような抗酸化剤の摂食パターンが同定される。これらの抗酸化剤は、運動しているイヌにおけるフリーラジカル誘導性変化からの最適の防御をもたらす。各抗酸化剤を個別に、次に他の抗酸化剤と組み合わせて測定することによって、任意の相加作用または相乗作用を観察でき、細胞膜およびサイトゾルの両方を防御できる抗酸化剤系を開発できる。
【００４２】
[0042]本発明の実施形態によると、動物での酸化ストレスに及ぼす組成物の効果を評価する方法が提供され、その方法は、ａ）その動物にその組成物を投与するステップと、ｂ）トレーニング前にその動物における酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、ｃ）運動処方に従ってその動物をトレーニングするステップと、ｄ）トレーニングの後に酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、ｅ）ｂ）およびｄ）における酸化ストレスの指数の差を、その組成物を投与されていない対照動物における同様の差と比較するステップとを含み、ここで、ｅ）における結果が、その組成物で処置された動物の結果と、対照動物の結果との間で異なるならば、その組成物は酸化ストレスに効果を有するとみなされる。好ましくは、運動処方は、運動ホイール、トレッドミル、および／または水泳プールで動物をトレーニングすることを含む。運動ホイールの使用は、一定の速度および距離に対応する１つまたは複数の設定を採用することによって、研究者が動物の身体運動を標準化することを可能にする。トレッドミルも、研究者が速度および傾斜のようなパラメータを設定できるようにすることによって、そのような制御および標準化を可能にできる。水泳処方も標準化できる。好ましくは、酸化ストレスの指数は、マロンジアルデヒドの血漿濃度、Ｆ−２イソプロスタンの血漿濃度、ビタミンＥの血漿濃度、クレアチンキナーゼ活性、または酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）のうち１つまたは複数から選択できる。
【００４３】
[0043]本発明の実施形態によると、アスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを含む組成物が提供され、その組成物は動物における酸化ストレスの低減および／または予防に有効である。本発明の態様によると、その組成物は有効量のアスタキサンチンを含む。本発明の別の態様によると、その組成物はアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む。
【００４４】
[0044]本発明の好ましい態様によると、その組成物は動物における酸化ストレスの回復を促進するために有効である。特に好ましい実施形態によると、その組成物は運動による酸化ストレスからの回復を促進するために有効である。他の実施形態では、その組成物は酸化ストレスに関連する望ましくない生理学的状態を処置、遅延、または予防するために有効である。例には、変形性関節症、白内障形成、低減したかまたは無防備状態の免疫応答、および正常な免疫応答の頑健性を増加させることがあるが、それに限定されるわけではない。
【００４５】
[0045]本発明のある態様によると、本発明の組成物は、例えば飲食物、食品、食料、栄養補助食品、または動物用治療製品としても有用であり得る。その組成物は、意図される使用に適すると選択された担体、希釈剤、または賦形剤を場合によっては含むことがある。
【００４６】
[0046]例えば経口、胃内、または経幽門のように経腸的にその組成物を投与できる。その組成物の作用を修飾できる多くの因子、例えば体重、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、対象の状態、ならびに反応の感受性および重症度を当業者は考慮することができる。１日１回または毎食１回のように連続的または定期的に投与を実施できる。
【００４７】
[0047]本発明のある態様は、（例えば国立研究会議、１９８５、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｏｇｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．または米国飼料検査官協会、公式刊行物１９９６に記載されているような）完全バランス食と組み合わせて好ましくは使用する。すなわち、本発明のある態様によるアスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを含む組成物を、高品質の市販食品と共に好ましくは使用する。本明細書に使用するように、「高品質市販食品」は、例えばイヌに関する上記の国立研究会議の勧告に示されるように８０％以上の主栄養素消化性を生むために製造された飲食物を指す。他の動物には同様の高度栄養基準が使用されるであろう。
【００４８】
[0048]本発明の多様な態様に使用される、最も適するであろう物質の投与量は、投与形態、選択された特定の物質、およびその投与を受ける特定の動物の生理学的性質によって変化するであろう。本発明のある態様によると、ビタミンＥについての好ましい１日投与量の範囲は、動物１匹あたり１日あたり約１５から約５００ｍｇ、さらに好ましくは動物１匹あたり１日あたり約１５０から約４５０ｍｇ、さらに好ましくは動物１匹あたり１日あたり約４００ｍｇであり得る。アスタキサンチンに関する好ましい１日投与量の範囲は、動物１匹あたり１日あたり約０．００１から約４０ｍｇであり得る。ある実施形態では、その量は動物１匹あたり１日あたり約０．００１から約１０ｍｇである。他の実施形態では、その量は動物１匹あたり１日あたり約１から約４０ｍｇである。なお他の実施形態では、その量は動物１匹あたり１日あたり約１から約２０ｍｇである。ある好ましい実施形態では、その量は動物１匹あたり１日あたり約０．１から約８ｍｇ、さらに好ましくは、動物１匹あたり１日あたり約２ｍｇである。
【００４９】
[0049]本発明の別の態様によると、動物における酸化ストレスを低減および／または予防するために有用な栄養補助食品が提供され、その補助食品はアスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを含む。その栄養補助食品は、非限定的に液状、固形、または粉末形態を含めた任意の便利な形態であり得る。固体形態の補助食品には、丸剤、ビスケット、またはごちそう（ｔｒｅａｔ）があるが、それに限定されるわけではない。
【００５０】
[0050]本発明のある実施形態によると、動物に給餌する前に「希釈」が必要な、高レベルのアスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを有する食料として栄養補助食品を形成させることができる。その補助食品は、非限定的に固形（例えば粉末）、半固形（例えば食品様稠度／ゲル）、または液体を含めた任意の形態であり得る。その補助食品を任意の適切な方式で動物に投与できる。例えばその液体形態を食品と好都合に混合するか、または例えば、スプーンもしくは管様装置を介して、動物に直接給餌できる。ある実施形態では、その補助食品はアスタキサンチンおよびビタミンＥの両方の構成要素が高いこともあるし、また、所要濃度のアスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを別々にまたは任意の適切な組合せで有する２つ以上の構成要素の組合せパックのこともある。
【実施例】
【００５１】
[0051]以下の実施例で本発明をさらに実証する。実施例１は実際の実施例であり、実施例２〜６は、予言的実施例である。これらの実施例は、例示を目的とし、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００５２】
実施例１
材料および方法
[0052]実験開始前１カ月間および実験期間全体にわたり全てのイヌを同じ基本食（鶏肉、米配合Ｐｕｒｉｎａ  Ｐｒｏ  Ｐｌａｎ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）で維持した。各イヌを個別に給餌して、最適なボディコンディションスコア４／１０に維持した。ボディコンディションスコア４／１０は、これらのイヌが細身であるがやせ細っていないことを示す（１は非常に痩せている、１０は著しく肥満）。
【００５３】
[0053]そり犬３６匹をアラスカ州ＳａｌｃｈａのＮｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａ施設で飼育した。これらの犬を１２匹の３群に分け、各群の齢、性別および能力の分布が類似しているようにした。帽子からくじを引いて、各群に処置をランダムに割り当てた。群「Ａ」にビタミンＥ約４００ｍｇ／日を割り当て、群「Ｂ」にアスタキサンチン約２ｍｇ／日を割り当て、群「Ｃ」にプラセボとしてマルトデキストリン約５００ｍｇを割り当てた。イヌの給餌、世話、およびトレーニングの責任者は、研究が終了するまで処置の正体を知らなかった。検査開始の６週間前にイヌを処置した。この期間の間も、１週間あたり２回のセッションでこれらのイヌに軽くトレーニングを行った。トレーニングセッションは、犬用ウォーキングホイールにつないだ直径４０フィートの円の中を時速１４キロメートルで２時間歩行することから成った。
【００５４】
[0054]検査を６日間かけて行った。１日目に運動前の血液試料を全てのイヌから採取した。２日目に５００ポンドの重さの四輪バギー（ＡＴＶ）を引きながらイヌを１２ｋｍ走らせた。３日目にドッグホイールでイヌを１６マイル歩かせた。４日目にイヌに再びＡＴＶを１２キロメーター引かせた。４日目の運動直後に血液試料を抜き取った。追加の血液試料を運動の２４時間および４８時間後に再度抜き取った。運動中および回復中に測定したパラメータでの変化を調べるために、この試料採取スケジュールを計画した。頚静脈穿刺によって試料を得て、抗凝固剤としてＥＤＴＡナトリウムを含む真空ガラス試験管に集めた。一旦採取してから、１０分間を超えずに試料を氷上で保存してから、４℃で１０分間毎分１００００回転（ＲＰＭ）で遠心分離した。血漿を凍結用バイアルに移し、そのバイアルのデッドスペースを気体窒素に置換して保存中のさらなる酸化を減少させた。次に、バイアルに蓋をして液体窒素に入れて直ちに急冷した。これらのバイアルを液体窒素から回収し、分析まで−７０℃で保存した。各血漿試料について、標準的なＨＰＬＣを用いてマロンジアルデヒド濃度を、質量分析計および標準ＥＬＩＳＡを利用してＦ２−イソプロスタン濃度を、標準ＨＰＬＣを利用してビタミンＥ濃度を、および酸化ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ検査キット、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｃｏ．）を分析した。
【００５５】
[0055]Ｆ２イソプロスタンおよびＣＫのデータは、繰り返しのある二元配置ＡＮＯＶＡを用いて評価した。Ｂｏｎｎｅｆｅｒｒｏｎｉ法によって補正した繰り返しのあるｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて事後比較を行った。統計的有意水準をｐ＜０．０５に設定した。他のデータもＡＮＯＶＡを用いて評価した。下記の表のデータに関して使用した略語「ｓｅ」は、標準誤差を指す。
【００５６】
結果
[0056]血漿ビタミンＥ。表１はビタミンＥに関する血漿値を示す。血漿ビタミンＥ濃度は、全ての時間にわたりビタミンＥ処置群で最も大きかった。任意の時間に関してプラセボのイヌおよびアスタキサンチン（ＡＴＸ）処置されたイヌの間で血漿ビタミンＥ濃度に有意差は存在しなかった。全処置群の血漿ビタミンＥ濃度は経時的に増加傾向にあった。全てのビタミンＥの濃度は分析を行った研究室によって確認されたイヌの正常範囲の最小を十分に上回って維持された。
【００５７】
【表１】
2007532121.tif 000002
【００５８】
[0057]血漿マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）。表２は血漿マロンジアルデヒドの値を示す。３つの処置群の間の唯一の差が運動後２４時間で観察され、そのときアスタキサンチンの値がプラセボの値およびビタミンＥの値のどちらよりも低かった。
【００５９】
【表２】
2007532121.tif 000003
【００６０】
[0058]表３は、各時間に関するベースラインからのＭＤＡの変化を示す。プラセボ群では、全ての運動後の試料は運動前の値に比べて上昇していた。アスタキサンチン群では運動前と運動後のＭＤＡ値の間に差はなかったが、運動２４時間後の値は運動前の値よりも有意に低かった。この群では運動４８時間後までにＭＤＡ値の変化がベースラインに戻った。ビタミンＥ群ではＭＤＡ値の変化は運動前から運動後にかけて下落し、運動の２４時間および４８時間後の試料ではベースラインに戻った。
【００６１】
【表３】
2007532121.tif 000004
【００６２】
[0059]血漿Ｆ２−イソプロスタン（Ｆ２Ｉ）。表４は、血漿Ｆ２Ｉに関する値を示す。任意の処置群内で運動前および運動後の試料の間に血漿Ｆ２−イソプロスタン濃度に有意な増加はなかった。プラセボ群は運動２４時間後にＦ２Ｉの増加を示した。運動４８時間後までにその値はベースライン値に戻った。アスタキサンチン群のＦ２Ｉ値は運動直後、運動２４時間後、および運動４８時間後の測定値ではベースライン値よりも下落した。ビタミンＥ群では、運動前、運動後、および運動２４時間後についてのＦ２Ｉ値は相互に有意差がなかった。ビタミンＥ処置群では、運動４８時間後の値は他の時間よりも有意に低かった。
【００６３】
[0060]３群の間にいくつかの有意差が存在した。プラセボ群に比べて、アスタキサンチン群は、運動直後および運動２４時間後に低いＦ２Ｉ値を有した。ビタミンＥのＦ２Ｉの値は、プラセボの値と差がなかったが、例外として運動２４時間後の時間では値がさらに低かった。アスタキサンチンのＦ２Ｉ値とビタミンＥのＦ２Ｉ値の間の唯一の有意差は、運動直後に生じた。この時間では、アスタキサンチンの値はビタミンＥの値よりも低かった。
【００６４】
【表４】
2007532121.tif 000005
【００６５】
[0061]血漿総酸化ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）。表５は、血漿の総ＯＲＡＣ値を示す。プラセボ群では、ＯＲＡＣ値は運動前から運動後に増加し、運動後２４時間にわたり上昇を保った。プラセボのＯＲＡＣ値は運動４８時間後までにベースライン値に戻った。アスタキサンチン群では運動前および運動後の間でＯＲＡＣに変化はかなった。アスタキサンチン群ではＯＲＡＣ値は２４時間試料および４８時間試料でベースライン値の下に下がった。ビタミンＥ群では、ＯＲＡＣ値は運動前から運動後にかけて下がり、次に運動２４時間後に上昇してベースライン値に戻り、運動４８時間後にベースラインの下に再び下がった。全ての時間にわたって、処置内の血漿総ＯＲＡＣ値の変化は、ＭＤＡに関して得られたものに類似している。
【００６６】
【表５】
2007532121.tif 000006
【００６７】
[0062]血漿クレアチンキナーゼ（ＣＫ）。表６は、血漿ＣＫ値を示す。３群全てで血漿ＣＫ値は運動前から運動後にかけて増加し、残り全ての時間に上昇を保った。アスタキサンチン群は、全ての時間でビタミンＥ群よりも低いＣＫ値も有したが、例外として運動２４時間後にはこれら２群の間に有意差はなかった。本実験で測定した値のどれもＣＫの正常範囲を超えなかった。
【００６８】
【表６】
2007532121.tif 000007
【００６９】
[0063]ビタミンＥ処置群は、試料を採取した各時間について最高濃度のビタミンＥを維持した。全ての群は、全ての時間で血漿ビタミンＥの増加を示した。これは、運動中に脂肪動員が増加し、それに付随して、貯蔵されたビタミンＥが循環中のリポタンパク質に取り込まれることが生じたことを原因とすることができる。低レベル長期運動中のイヌでの血漿脂肪酸およびトリグリセリドの増加が血漿ビタミンＥの増加に付随することが以前に実証された（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、ＡＪら、Ｊ  Ｎｕｔｒ．１２４（１２追補）：２７５４Ｓ〜２７５９Ｓ（１９９４）。プラセボおよびアスタキサンチン群は、イヌについて確認された低い正常限界を超えたビタミンＥ濃度を維持した（６０未満は一般に幾分低いとみなされるであろう）が、ビタミンＥ処置群で運動中に観察されたＭＤＡの下落は、食餌にみられたベースラインレベルを超えてビタミンＥを補給することに利点があり得ることを示唆している。
【００７０】
[0064]ＭＤＡ値の変化から、ビタミンＥの補給は運動中の酸化損傷に対する防御を助けることができるが、アスタキサンチンの補給は運動から回復する最初の２４時間の間にそのような損傷に対して防御できることが示唆される。これらの結果は、これらの２つの抗酸化剤が種々の種類の酸化ストレスに対して異なる有効性を有し得ることを示唆している。ビタミンＥは、運動が誘導する酸素代謝上昇に関連する膜脂質酸化に対して最も有効であり得る。アスタキサンチンは、運動後２４時間に増加した免疫細胞活性によって引き起こされる酸化ストレスに対して最も有効であり得る。これらの観察は、２つの抗酸化剤が組み合わされるならば相乗作用の潜在性があることを示唆する。
【００７１】
[0065]アスタキサンチンは、運動直後および運動２４時間後までの間にフリーラジカルからイヌを防御することが分かった。アスタキサンチンは、運動中および回復の最初の２４時間にＦ２Ｉによって測定されたように過酸化損傷に対する防御を助けた。ビタミンＥ処置されたイヌも、運動２４時間後にプラセボを給餌したイヌよりも改善を示した。Ｆ２Ｉは、ＭＤＡによって測定されたもの以外の供給源からの脂質過酸化の尺度となる。ここで収集されたＦ２Ｉデータは、アスタキサンチンが運動中にビタミンＥよりも良好に免疫細胞および細胞内オルガネラを防御できることを示唆している。Ｆ２Ｉは免疫細胞の副産物であることから、アスタキサンチンの防御のタイミングは、その効果の多くが免疫細胞の機能調節を介して仲介されることを示唆している。
【００７２】
[0066]アスタキサンチン群およびビタミンＥ群の両方は、これらの処置が脂質過酸化の阻害に最も成功した時間にＯＲＡＣの減少を示した。ビタミンＥおよびアスタキサンチンのＯＲＡＣ値が運動中および運動２４時間後にそれぞれ下落した１つの原因は、補給された抗酸化剤がこれらの時間に消費されてしまい、脂質過酸化を含むようになったからであり得る。
【００７３】
[0067]ＣＫ値がほぼ全ての測定についてアスタキサンチン群で最も低かったという事実は、この補助食品が運動中にビタミンＥおよびプラセボのどちらよりも良好に損傷から筋細胞膜を防御していることを示唆している。この研究で運動は正常範囲を超えた血漿ＣＫの上昇を誘導しなかった。
【００７４】
[0068]プラセボ群に比べて、ビタミンＥおよびアスタキサンチン処置の両方は運動に関連した酸化ストレスに対して改善した防御を示した。ビタミンＥは、運動中にマロンジアルデヒド産生に対して最も有効であり、運動後最初の２４時間の間のＦ−２イソプロスタン産生に対して最も有効と思われる。アスタキサンチン補給は、運動後最初の２４時間によりよくＭＤＡ産生を減少させ、運動中および回復の最初の２４時間中にイソプロスタン産生をよりよく抑制した。これらの結果は、ビタミンＥおよびアスタキサンチンが異なる細胞区画または経路で相互に作用することを示唆している。これらの結果は、これら２つが組み合わされるならば、少なくとも相加作用、可能性があることには相乗作用の潜在性も示している。
【００７５】
[0069]ビタミンＥ補給は、プラセボ群と比較したとき運動中に減少したマロンジアルデヒド濃度を招いた。アスタキサンチン補給は、ビタミンＥ群およびプラセボ群と比較したときに運動２４時間後のマロンジアルデヒドの減少に関連した。ＯＲＡＣ（総抗酸化状態の指数である酸素ラジカル吸収能）は、測定した任意の時間に関してビタミンＥおよびアスタキサンチン補給とのどちらによっても改善しなかった。クレアチンキナーゼ活性（筋細胞膜損傷の指数）およびＦ−２イソプロスタン（プロスタグランジンからの脂質過酸化の尺度）濃度は、アスタキサンチン処置群のみで、運動直後および運動２４時間後の試料のみに有意差を示した。ここで、それらの値はビタミンＥ群およびプラセボ群のどちらで測定された値よりも低かった。これらの結果は、アスタキサンチンおよびビタミンＥの両方が運動中のイヌにおける酸化損傷に対していくらか防御効果を示すことを指示した。アスタキサンチンは、ビタミンＥよりも長い時間にわたり広い範囲の防御を示した。本明細書に記載した結果は、ビタミンＥおよびアスタキサンチンの組合せが、少なくとも相加的であって、相乗的であり得る効果を有する場合があると示唆している。このように、運動、感染、または外傷を含めるが、それに限定されるわけではない酸化ストレッサーを経験し得るイヌを意図した食餌にアスタキサンチンを含ませることが推奨される。
【００７６】
実施例２
[0070]アスタキサンチンとビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）との組合せを含む組成物を動物に投与して、運動に起因する酸化ストレスに及ぼす効果を決定する。
【００７７】
[0071]処置の開始１カ月前および処置の全期間にわたり、同じ基本食（鶏肉、米配合Ｐｕｒｉｎａ  Ｐｒｏ  Ｐｌａｎ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）でイヌを維持する。商業的に入手できる鶏肉、米配合Ｐｒｏ  Ｐｌａｎ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅドッグフードを基本食として２群のイヌに給餌でき、マルトデキストリン約０．５ｇから成るプラセボ、またはアスタキサンチン約２ｍｇおよびビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）約４００ｍｇの組合せのいずれかを各群に給餌する。Ｐｒｏ  Ｐｌａｎ（登録商標）ドッグフードは、ミズーリ州セントルイスのＮｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａ  Ｐｅｔ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる。イヌを１週間に３回運動ホイールで６週間トレーニングする。６週間目にイヌを４日間休ませてから、連続して３日間運動させる。１日目に運動前に、３日目に運動直後に、運動２４時間後および４８時間後に血液試料を採取する。血液試料から得た血漿のマロンアルデヒド、Ｆ−２イソプロスタン、およびビタミンＥの濃度、クレアチンキナーゼ活性、ならびに酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）を分析する。酸化ストレスの測定値の減少および／または抗酸化状態の測定値の増加は、所定の処置の抗酸化効果を指示する。
【００７８】
実施例３
[0072]生理学的レベルのアスタキサンチンを補給したイヌ水晶体上皮細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実施できる。この研究は、アスタキサンチンが紫外（ＵＶ）線でストレスを与えたときのイヌ水晶体上皮でのフリーラジカル形成および脂質過酸化産物を有意に減少することができることを実証するであろう。アスタキサンチンを補給したイヌ水晶体上皮細胞にＵＶ線を用いてストレスを与えた場合、細胞死は有意に少ないであろう。細胞死の減少に加えて、フリーラジカル形成と脂質過酸化産物との減少によって、アスタキサンチンの補給がイヌにおける白内障の形成のリスクまたは重症度を低減することが示されることを、これらの結果は指示するであろう。
【００７９】
実施例４
[0073]ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行って白内障発生と闘う際のアスタキサンチンの有益効果を実証することもできるであろう。モデル研究では、４０匹のイヌを選択して、対照群またはＡＡＦＣＯが推奨するレベルの抗酸化剤を投与されている処置群のいずれかに無作為に割り付けることができよう。治療群にアスタキサンチンを投与するであろうし、ビタミンＥ、ルテイン、ゼアキサンチン、および亜鉛のうち１つまたは複数も投与することができる。処置時間（例えば２年間の研究）の終わりに、対照群は有意に大きい白内障形成を有すると示されるであろうし、白内障の重症度は細隙灯試験によって評価されるように有意に大きいであろう。
【００８０】
実施例５
[0074]ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行って、アスタキサンチンが免疫系の機能を改善または増強することを明らかにすると実証できる。免疫機能を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、当業者に周知である。多くのプロトコルが公知であり、そのような免疫機能の評価の実施に使用できる。そのようなプロトコルの例は、多様な学術論文または教科書から入手できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９９。
【００８１】
［0075］免疫機能に及ぼすアスタキサンチン補給の効果を評価するために、イヌにアスタキサンチンおよび／またはビタミンＥを含む食餌を１６週間与えることができる。使用したアスタキサンチンの量は、動物１匹あたり１日あたり０、１、５、１０、２０および４０ｍｇであり得る。様々なアッセイを行って免疫機能を評価できる。
【００８２】
[0076]例えば、あるアッセイでは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をポリクローナル抗血清、またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、もしくはアメリカヤマゴボウマイトジェンでｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激することができる。リンパ球増殖を任意の公知の方法で評価する。
【００８３】
[0077]別のｉｎ  ｖｉｔｒｏのリンパ球増殖試験では、刺激する間にＰＢＭＣ培養の培地にアスタキサンチンを直接添加して、アスタキサンチンがアスタキサンチン不在下で観察された増殖よりも有意に大きく細胞の増殖を増加させることを実証できる。
【００８４】
[0078]別のアッセイでは、アスタキサンチンの補給を含む食餌を与えられた動物から単離したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞について、ＮＫ細胞細胞傷害性を評価する。ＮＫ細胞アッセイは、アスタキサンチンを給餌されなかった対照動物とは対照的に、アスタキサンチンを含む食餌を与えられた動物では、ＮＫ細胞傷害性が有意に増加したことを実証するであろう。
【００８５】
[0079]アスタキサンチンを補給した食餌を与えられた動物で、遅延型過敏症も評価することができる。これらのアッセイでは、対照動物およびアスタキサンチンを含む食餌を与えられた動物に、生理食塩水、マイトジェン、またはジステンパーウイルスワクチンの皮膚注射を行う。次に、マイトジェン、ウイルス、および対照に対する皮膚反応を測定して動物を評価する。アスタキサンチンを含む食餌を与えられた動物では、対照動物でみられる反応よりも、ウイルスおよびマイトジェンの方が皮膚反応は頑健である。
【００８６】
[0080]対照動物およびアスタキサンチンを含む食餌を与えられた動物の、抗原に対する免疫反応の頑健性も評価することができる。例えば、対照動物およびアスタキサンチンを含む食餌を与えられた動物の、抗原に対する抗体の力価を測定することができる。アスタキサンチンを含む食餌を与えられた動物は、対照動物よりも高い抗体力価を有するであろう。
【００８７】
実施例６
[0081]変形性関節症（ＯＡ）は酸化ストレスとも関連する。ＯＡは関節軟骨への損傷を特徴とする。この損傷は、コラーゲン、エラスチン、およびゼラチンに特異的な酵素（ＭＭＰ）によって仲介される。これらの酵素の上方制御は、一酸化窒素、スーパーオキシドアニオン、および過酸化水素を含めるが、それに限定されるわけではないフリーラジカルに引き起こされることが示された。
【００８８】
[0082]アスタキサンチンを補給した飲食物が変形性関節症における炎症および関連痛を低減することを示すことができる。対照群または動物１匹あたり１日あたり１、５、１０、２０、もしくは４０ｍｇのアスタキサンチンを含む食餌を与えられた群のいずれかに無作為に割り付けたイヌ２４匹の群によって、食物中のアスタキサンチンの有益効果を実証する研究を行うことができるであろう。処置の１２週間目に、血漿および滑液の試料をそれぞれの動物から採取し、総抗酸化活性、ならびにマロンアルデヒド、プロスタグランジン、イソプロスタン、ＭＭＰおよびＴＩＭＰのレベルをアッセイする。追加的に、イヌの歩行は、標準的な床反力計分析を用いて評価することができる。生化学分析は、アスタキサンチンの補給が（血漿および滑液の両方における）イソプロスタン、総抗酸化活性、およびＭＭＰの減少をもたらすことを示すであろう。処置したイヌは、対照と比較した場合に歩行の有意な改善を示すであろう。これらの結果は、アスタキサンチンがイヌのＯＡの進行を改善または遅延することを示すであろう。
【００８９】
[0083]本文書で引用または記載した各特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明細書によってその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００９０】
[0084]本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は、本発明に様々な変更および修飾を加えて、本発明を様々な使用法および状態に必要に応じて変更を加えて適合させることができる。それとして、これらの変更および修飾は、添付の特許請求の範囲と適切に、公正にあらゆる点で等価な範囲内にあり、そうあることを意図される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月17日(2006.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌまたはネコにおける酸化ストレスを処置、低減、または予防する薬剤の製造における、アスタキサンチンおよびビタミンＥを含む組成物の使用。
【請求項２】
前記酸化ストレスが、運動、感染、外傷、または太陽光曝露のうち少なくとも１つに起因する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記酸化ストレスが運動に起因する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
物質がイヌまたはネコにおける酸化ストレスに及ぼす効果を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）前記物質を前記イヌまたはネコに投与するステップと、
ｂ）トレーニング前に前記イヌまたはネコにおける酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、
ｃ）運動処方に従って前記イヌまたはネコをトレーニングするステップと、
ｄ）トレーニング後に酸化ストレスの１つまたは複数の指数を測定するステップと、
ｅ）トレーニング前およびトレーニング後の酸化ストレスの前記指数における差を比較して少なくとも１つの結果を得るステップと、
ｆ）前記結果を、前記物質が投与されていない対照のイヌまたはネコから得た結果と比較するステップと
を含み、ここで、前記結果が前記物質で処置されたイヌまたはネコの結果と前記対照のイヌまたはネコの結果との間で異なるならば、前記物質は酸化ストレスに効果を有するとみなされる方法。
【請求項５】
酸化ストレスの前記指数が、マロンジアルデヒドの血漿濃度、Ｆ−２イソプロスタンの血漿濃度、ビタミンＥの血漿濃度、クレアチンキナーゼ活性、または酸素ラジカル吸収能のうち１つまたは複数を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
動物における白内障形成の開始を低減または遅延する薬剤の製造における、アスタキサンチンおよびビタミンＥを含む組成物の使用。
【請求項７】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
動物における変形性関節症に関連する炎症を低減する薬剤の製造における、アスタキサンチンおよびビタミンＥを含む組成物の使用。
【請求項９】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
動物における免疫応答を増強する薬剤の製造における、アスタキサンチンおよびビタミンＥを含む組成物の使用。
【請求項１１】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
イヌまたはネコにおける酸化ストレスを低減または予防する方法であって、前記動物にアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記酸化ストレスが運動、感染、外傷、または太陽光曝露のうち少なくとも１つに起因する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸化ストレスが運動に起因する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酸化ストレスから回復中のイヌまたはネコを処置する方法であって、前記動物にアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記酸化ストレスが運動に起因する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
動物にアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することを含む、動物における白内障形成の開始を低減または遅延する方法。
【請求項１８】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
動物にアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することを含む、動物における変形性関節症に関連する炎症を低減する方法。
【請求項２０】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物にアスタキサンチンおよびビタミンＥを含む有効量の組成物を投与することを含む、前記動物における免疫応答を増強する方法。
【請求項２２】
前記動物がイヌまたはネコである、請求項２１に記載の方法。
【国際調査報告】
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