(57)【要約】【課題】【解決手段】生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物が開示されている。このようなリバースターンミメティック構造体は、広範囲の分野（診断薬および治療薬としての使用を含む）にわたって、有用性を有する。本発明のリバースターンミメティック構造体を含むライブラリもまた、生物学的に活性なメンバーを同定するためにそれをスクリーニングする方法と同様に、開示されている。本発明はまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路が変調した疾患（例えば、癌（特に、直腸結腸癌）、血管形成術に伴う再狭窄、腎多嚢胞病、異常血管形成疾患、関節リウマチ、結節硬化症、アルツハイマー病、毛髪の成長、潰瘍性大腸（結腸）炎）を阻止または治療するためにこのような化合物を使用することに関する。【選択図】  図１８
2007532674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）を有する化合物およびそれの立体異性体：
【化１】
2007532674.tif 000442
ここで、Ａは、−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｂは、−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｄは、−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｅは、−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｇは、−（ＸＲ7）ｎ−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−また
は−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｗは、−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−または存在せず、
Ｙは、酸素、イオウまたは−ＮＨ−であり、
ＸおよびＺは、独立して、窒素またはＣＨであり、
ｎ＝０または１である；
そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、同一または異なり、アミ
ノ酸側鎖部分またはその誘導体、該分子の残部、リンカーおよび固体支持体から独立して
選択される。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、独立して、アミノＣ2〜5アル
キル、グアニジノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜4アルキルグアニジノＣ2〜5アルキル、ジＣ1〜4
アルキルグアニジノＣ2〜5アルキル、アミジノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜4アルキルアミジノ
Ｃ2〜5アルキル、ジＣ1〜4アルキルアミジノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、フェニ
ル、置換フェニル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒ
ドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、
パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ
、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ベン
ジル、置換ベンジル（ここで、該ベンジル上の置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、
グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミ
ノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、
シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ナフチ
ル、置換ナフチル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒ
ドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、
パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ
、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ビス
−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ
、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジ
アルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アル
コキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ
以上から選択される）、ピリジル、置換ピリジル（ここで、該置換基は、独立して、アミ
ノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4
ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3ア
ルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそ
れ以上から選択される）、ピリジルＣ1〜4アルキル、置換ピリジルＣ1〜4アルキル（ここ
で、該ピリジン置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミ
ダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ
1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スル
フリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ピリミジルＣ1〜4ア
ルキル、置換ピリミジルＣ1〜4アルキル（ここで、該ピリミジン置換基は、独立して、ア
ミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1
〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜
3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個また
はそれ以上から選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1〜4アルキル、置換トリアジン
−２−イル−Ｃ1〜4アルキル（ここで、該トリアジン置換基は、独立して、アミノ、アミ
ジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキ
ルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ
、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上か
ら選択される）、イミダゾルＣ1〜4アルキル、置換イミダゾルＣ1〜4アルキル（ここで、
該イミダゾール置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミ
ダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ
1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スル
フリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、イミダゾリニルＣ1
〜4アルキル、Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0〜4アルキル、ヒドロキシＣ2〜5アル
キル、Ｃ1〜5アルキルアミノＣ2〜5アルキル、ヒドロキシＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜5アルキ
ルアミノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜5ジアルキルアミノＣ2〜5アルキル、Ｎ−アミジノピペリ
ジニルＣ1〜4アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ0〜2アルキルからなる群より選
択される請求項１に記載の化合物 。
【請求項３】
Ａが、−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが、−（ＣＨＲ5）−
であり、Ｅが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが、−（ＸＲ7）n−であり、以下の一般式（Ｉ
Ｉ）を有する請求項１に記載の化合物。
【化２】
2007532674.tif 000443
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、請求項１で定義したとおりで
ある。
【請求項４】
Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−
であり、Ｅが、−（ＺＲ6）−であり、Ｇが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−であり、以下の
一般式（ＩＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【化３】
2007532674.tif 000444
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ9、ＷおよびＸは、請求項１で定義したとおりであり
、そしてＺは、窒素またはＣＨ（ＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素である）である。
【請求項５】
Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−
であり、Ｅが、−（ＺＲ6）−であり、Ｇが、（ＸＲ7）n−であり、以下の一般式（ＩＶ
）を有する請求項１に記載の化合物。
【化４】
2007532674.tif 000445
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、請求項１で定義したとおりで
あり、Ｚは、窒素またはＣＨである（Ｚが窒素であるとき、ｎは、０であり、そしてＺが
ＣＨであるとき、Ｘは、窒素であり、そしてｎは、０ではない）。
【請求項６】
前記化合物が、以下の一般式（ＶＩ）を有する請求項５に記載の化合物。
【化５】
2007532674.tif 000446
ここで、Ｒaは、フェニル基、１個以上の置換基を有する置換フェニル基（ここで、１
個以上の置換基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、ア
ミダゾニル基、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフ
ルオロＣ1〜4アルキル基、Ｃ1〜4アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキ
シ基、シアノ基、スルフリル基およびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択され
る）、ベンジル基、１個以上の置換基を有する置換ベンジル基（ここで、１個以上の置換
基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニル基
、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4
アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シアノ基、スルフリル基お
よびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、または、８〜１１個の環員
を有する二環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜
３個のヘテロ原子を有し得、
Ｒbは、５〜７個の環員を有する単環式アリール基であり、これは、窒素、酸素または
イオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得、その化合物中のアリール環は、ハ
ライド、ヒドロキシル基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群
より選択される１個以上の置換基を有し得、
Ｒcは、飽和または不飽和のＣ1〜6アルキル基、Ｃ1〜6アルコキシ基、パーフルオロＣ1
〜6アルキル基であり、
そしてＸ1、Ｘ2、およびＸ3は、同一または異なり、独立して、水素、ヒドロキシルお
よびハライドから選ばれる。
【請求項７】
Ｒaは、フェニル基、１個以上の置換基を有する置換フェニル基（ここで、１個以上の
置換基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニ
ル基、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ
1〜4アルキル基、Ｃ1〜4アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シ
アノ基、スルフリル基およびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、ベ
ンジル基、１個以上の置換基を有する置換ベンジル基（ここで、１個以上の置換基は、独
立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニル基、Ｃ1〜4
アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル
基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シアノ基、スルフリル基およびヒド
ロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、ナフチル基、キノリニル基またはイ
ソキノリニル基であり、そしてＲbが、フェニル、ピリジルまたはピペリジルであり、こ
れらの全てが、ハライド、ヒドロキシル基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコ
キシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る、請求項６に記載の化
合物。
【請求項８】
下記一般式（ＶＩＩ）を有する化合物：
【化６】
2007532674.tif 000447
ここで、（ＶＩ）は下記一般式を有し：
【化７】
2007532674.tif 000448
前記式中、Ｒaはフェニル基；１個以上の置換基を有する置換フェニル基（この時、１個
以上の置換基は、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4ア
ルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4
アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルおよびヒドロキ
シル基の１個またはそれ以上から独立して選択される）；ベンジル基；１個以上の置換基
を有する置換ベンジル基（この時、１個以上の置換基は、アミノ、アミジノ、グアニジノ
、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン
、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフ
リルおよびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から独立して選択される）；または、窒
素、酸素、または硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子を有し得る８〜１１個の環員
を有する二環式アリール基であり；
Ｒbは５〜７個の環員を有する単環式アリール基であり、窒素、酸素、または硫黄から
選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得、かつ、前記化合物中のアリール環がハライド
、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、および低級アルコキシ基からなる群より選択され
る１個またはそれ以上の置換基を有し得；
Ｒcは、飽和または不飽和のＣ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、パーフルオロＣ1-6アル
キル基であり；および
Ｘ1、Ｘ2、およびＸ3は、同一または異なって、かつ、水素、ヒドロキシル、およびハ
ライドから独立して選択され；
Ｙは、Ｒa、Ｒb、Ｒc、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3から選択される基の酸素、硫黄、または窒素
であり；
Ｒ10は、リン酸エステル、ヘミスクシネート、ヘミマレート、ホスホリルオキシメチル
オキシカルボニル、ジメチルアミノアセテート、ジメチルアミノアルキルカルバメート、
ヒドロキシアルキル、アミノ酸、グルコシル、置換されたかもしくは置換されていないピ
ペリジンオキシカルボニル、またはそれらの塩であり；
一般式（ＶＩＩ）を有する化合物はホスファターゼまたはカルボキシラーゼの基質とし
て作用でき、それによって一般式（ＶＩ）を有する化合物に転換される。
【請求項９】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9が、固体支持体または固体支持体
誘導体に結合される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9が、固体支持体または固体支持体
誘導体に結合される、請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9が、固体支持体または固体支持体
誘導体に結合される、請求項３に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容されるキャリアを含む
医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、化合物の安全有効量を含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む、化合物のライブ
ラリ。
【請求項１５】
生物学的に活性な化合物を同定する方法であって、前記生物学的に活性な化合物を検出
またはスクリーニングするために、請求項１４に記載のライブラリを標的に接触させるこ
とを含む方法。
【請求項１６】
結合分析を行う方法であって、
（ａ）第一活性化補助因子および相互作用蛋白質を含み、前記第一活性化補助因子がＬ
ＸＸＬＬ、ＬＸＸＬＩ、またはＦＸＸＦＦ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の結
合モチーフを含む組成物を準備するステップと、
（ｂ）前記第一活性化補助因子および前記相互作用蛋白質を試験化合物と結合させるス
テップと、
（ｃ）前記化合物の存在下で、前記第一活性化補助因子と前記相互作用蛋白質との間の
結合の変性を検出するステップとを含む方法であり、
ここで、前記試験化合物は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物から選択され
ることを特徴とする結合分析を行う方法。
【請求項１７】
前記相互作用蛋白質が、転写因子または第二活性化補助因子である請求項１６に記載の
方法。
【請求項１８】
前記相互作用蛋白質が、ＲＩＰ１４０；ＳＲＣ−１（ＮＣｏＡ−１）；ＴＩＦ２（ＧＲ
ＩＰ−１；ＳＲＣ−２）；ｐ（ＣＩＰ；ＲＡＣ３；ＡＣＴＲ；ＡＩＢ−１；ＴＲＡＭ−１
；ＳＲＣ−３）；ＣＢＰ（ｐ３００）；ＴＲＡＰｓ（ＤＲＩＰｓ）；ＰＧＣ−１；ＣＡＲ
Ｍ−１；ＰＲＩＰ（ＡＳＣ−２；ＡＩＢ３；ＲＡＰ２５０；ＮＲＣ）；ＧＴ−１９８；お
よびＳＨＡＲＰ（ＣｏＡＡ；ｐ６８；ｐ７２）からなる群より選択されるものである請求
項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記相互作用蛋白質が、ＴＡＬ１；ｐ７３；ＭＤｍ２；ＴＢＰ；ＨＩＦ−１；Ｅｔｓ−
１；ＲＸＲ；ｐ６５；ＡＰ−１；Ｐｉｔ−１；ＨＮＦ−４；Ｓｔａｔ２；ＨＰＶ Ｅ２；
ＢＲＣＡ１；ｐ４５（ＮＦ−Ｅ２）；ｃ−Ｊｕｎ；ｃ−ｍｙｂ；Ｔａｘ；Ｓａｐ １；Ｙ
Ｙ１；ＳＲＥＢＰ；ＡＴＦ−１；ＡＴＦ−４；Ｃｕｂｉｔｕｓ；Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ
；Ｇｌｉ３；ＭＲＦ；ＡＦＴ−２；ＪＭＹ；ｄＭａｄ；ＰｙＬＴ；ＨＰＶ Ｅ６；ＣＩＴ
ＴＡ；ＴａＴ；ＳＦ−１；Ｅ２Ｆ；ｊｕｎＢ；ＲＮＡ ヘリカーゼ Ａ；Ｃ／ＥＢＰβ；Ｇ
ＡＴＡ−１；Ｎｅｕｒｏ Ｄ；Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｉｍｉａ；Ｅ１Ａ；ＴＦＩＩＢ；
ｐ５３；Ｐ／ＣＡＦ；Ｔｗｉｓｔ；Ｍｙｏ Ｄ；ｐｐ９Ｏ ＲＳＫ；ｃ−Ｆｏｓ；およびＳ
Ｖ４０Ｌａｒｇｅ Ｔからなる群より選択されるものである請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記相互作用蛋白質が、ＥＲＡＰ１４０；ＲＩＰ１４０；ＲＩＰ１６０；Ｔｒｉｐ１；
ＳＷＩ１（ＳＮＦ）；ＡＲＡ７０；ＲＡＰ４６；ＴＩＦ１；ＴＩＦ２；ＧＲＩＰ１；およ
びＴＲＡＰからなる群より選択されるものである請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記相互作用蛋白質が、ＶＰ１６；ＶＰ６４；ｐ３００；ＣＢＰ；ＰＣＡＦ；ＳＲＣ１
ＰｖＡＬＦ；ＡｔＨＤ２Ａ；ＥＲＦ−２；ＯｓＧＡＩ；ＨＡＬＦ−１；Ｃ１；ＡＰ−１
；ＡＲＦ−５；ＡＲＦ−６；ＡＲＦ−７；ＡＲＦ−８；ＣＰＲＦ１；ＣＰＲＦ４；ＭＹＣ
−ＲＰ／ＧＰ；およびＴＲＡＢ１からなる群より選択されるものである請求項１６に記載
の方法。
【請求項２２】
前記第一活性化補助因子が、ＣＢＰまたはｐ３００である請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物
または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、腫瘍を有する哺乳動物被検体に、前記
哺乳動物被検体内の腫瘍成長を阻害する有効量で投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記腫瘍が、癌性である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記腫瘍が、直腸結腸癌である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
癌を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請求項１〜８のいずれ
か一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、前記癌を治療ま
たは予防する有効量で投与することを含む、癌を治療または予防する方法。
【請求項２７】
前記癌が、直腸結腸癌である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物または前記組成物が、抗腫瘍薬と一緒に投与される請求項２６に記載の方法
。
【請求項２９】
前記抗腫瘍薬としては、５−ＦＵ、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンＣ、テ
ガフール、ラルチトレキセド、カペシタビン、およびイリノテカンからなる群より選択さ
れる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
血管形成術に伴う再狭窄を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成
物を、前記再狭窄を阻止する有効量で投与することを含む、血管形成術に伴う再狭窄を治
療または予防する方法。
【請求項３１】
腎多嚢胞病を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請求項１〜８
のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、前記腎
多嚢胞病を治療する有効量で投与することを含む、腎多嚢胞病を治療または予防する方法
。
【請求項３２】
異常血管形成疾患を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請求項
１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、
前記異常血管形成疾患を治療する有効量で投与することを含む、異常血管形成疾患を治療
または予防する方法。
【請求項３３】
関節リウマチ疾患を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請求項
１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、
前記関節リウマチ疾患を治療する有効量で投与することを含む、関節リウマチ疾患を治療
または予防する方法。
【請求項３４】
潰瘍性大腸（結腸）炎を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請
求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物
を、前記潰瘍性大腸（結腸）炎を治療する有効量で投与することを含む、潰瘍性大腸（結
腸）炎を治療または予防する方法。
【請求項３５】
結節硬化症（ＴＳＣ）を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請
求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物
を、前記ＴＳＣを治療または予防する有効量で投与することを含む、ＴＳＣを治療または
予防する方法。
【請求項３６】
ＫＳＨＶ関連腫瘍を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請求項
１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、
前記ＫＳＨＶ関連腫瘍を治療または予防する有効量で投与することを含む、ＫＳＨＶ関連
腫瘍を治療または予防する方法。
【請求項３７】
毛髪の成長を調節する方法であって、それが必要な被験体に、請求項１〜８のいずれか
一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、毛髪の成長を調節
する有効量で投与することを含む、毛髪の成長を調節する方法。
【請求項３８】
アルツハイマー病を治療または予防する方法であって、それが必要な被験体に、請求項
１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成物を、
前記アルツハイマー病を治療または予防する有効量で投与することを含む、アルツハイマ
ー病を治療または予防する方法。
【請求項３９】
神経突起伸長を促進する方法であって、神経細胞を、神経突起伸長を促進する有効量の
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に記載の組成
物に接触させることを含む、神経突起伸長を促進する方法。
【請求項４０】
神経幹細胞の分化を促進する方法であって、神経幹細胞を、神経幹細胞の分化を促進す
る有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１３に
記載の組成物に接触させることを含む、神経幹細胞の分化を促進する方法。
【請求項４１】
癌細胞のアポトーシスを促進する方法であって、癌細胞を、癌細胞のアポトーシスを促
進する有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２もしくは１
３に記載の組成物に接触させることを含む、癌細胞のアポトーシスを促進する方法。
【請求項４２】
細胞内のスルビビン発現を阻害する方法であって、スルビビンを発現する細胞を、スル
ビビン発現を阻害する有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項
１２もしくは１３に記載の組成物に接触させることを含む、細胞内のスルビビン発現を阻
害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年４月１６日に出願された米国特許出願番号１０／８２６、９７２
の一部継続出願であり、前記米国出願は２００４年３月１７日に出願された米国特許出願
番号１０／８０３，１７９の一部継続出願であり、その米国出願は２００３年４月９日に
出願された米国特許出願番号１０／４１１，８７７（現在放棄された）の一部継続出願で
あり、それは２００２年３月１日に出願された米国特許出願番号１０／０８７，４４３（
現在放棄された）の一部継続出願であり、それは２００１年１０月１２日に出願された米
国特許出願番号０９／９７６，４７０（現在放棄された）の一部継続出願である。本出願
は２００２年１０月１１日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＫＲ０２／０１９０１に
、さらに優先権を主張する。これらの出願に開示したことは、その全体が引用によってこ
こに挿入される。
【０００２】
本発明は、リバースターンミメティック（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｕｒｎ  ｍｉｍｅｔｉｃ
ｓ）構造体およびこれと関連した化学ライブラリに関する。本発明は、また医学的症状、
例えば、癌疾患の治療への適用と、該ミメティックを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療薬としての潜在的な活性について分子をランダムにスクリーニングすることは、長
年にわたって行われており、その結果、多数の重要な薬剤が発見されている。分子生物学
および計算機化学の進歩により、「合理的薬剤設計(rational drug design)」と称するこ
とに関心が高まっているものの、このような技術は、初期に予測された程には、高速では
なく、または信頼できないことが判明している。それゆえ、最近では、ランダム薬剤スク
リーニングに関心が戻っている。この目的のために、コンビナトリアル・ケミストリー・
ライブラリの発展に基づく新しい技術および生物学的に活性なメンバーの探索においてこ
のようなライブラリをスクリーニングすることが特に進歩している。
【０００４】
一般に、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリは、単に、分子の収集物である
。このようなライブラリは、そのライブラリ内の化学種ごとに変わるだけでなく、それら
のライブラリメンバーを作成し、かつどのメンバーが対象生体標的と相互作用するかを同
定するために使用される方法ごとにも、変わる。この分野は、依然として未成熟であるの
に対して、ライブラリを作成しスクリーニングする方法は、既に、極めて多様で精巧にな
っている。例えば、種々のコンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリの最近の概説で
は、多数のこのような技術を記載しており（Ｄｏｌｌｅ，Ｊ．Ｃｏｍ．Ｃｈｅｍ．，２（
３）：３８３〜４３３，２０００）、これには、タグ化および未タグ化のライブラリメン
バーの使用が挙げられる（Ｊａｎｄａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：１０７７９〜１０７８５，１９９４）。
【０００５】
初期には、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリは、一般に、ペプチドまたは
ヌクレオチド起源のメンバーに限られていた。この目的のために、Ｈｏｕｇｈｔｅｎらの
技術は、「二重規定反復(dual-defined iterative)」方法と呼ばれるものの一例を説明し
ており、この方法は、スプリット合成技術によって、可溶性コンビナトリアルペプチドラ
イブラリを編集する（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５４：８４〜８６，１９９１；Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１，１９９２；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４０５〜４１２，１９９３）。この技術により、何千万ものメ
ンバーを含む可溶性ペプチドライブラリが得られた。このようなライブラリは、オピオイ
ドペプチド、例えば、メチオニン−およびロイシン−エンケファリン（Ｄｏｏｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５２，１５０９〜１５１７，１９９３）の同
定で有効であることが明らかとなっており、また、Ｎ−アシル化ペプチドライブラリは、
アセタリン（これは、強力なオピオイドアンタゴニストである）を同定するのに使用され
ている（Ｄｏｏｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０
８１１〜１０８１５，１９９３）。さらに最近では、全てのＤ−アミノ酸オピオイドペプ
チドライブラリが構築されており、ミュー（“μ”）オピオイドレセプタに対する鎮痛活
性についてスクリーニングされている（Ｄｏｏｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０
１９〜２０２２，１９９４）。
【０００６】
ペプチドおよびヌクレオチド起源のメンバーを含むコンビナトリアル・ライブラリは、
非常に有益であるのに対して、依然として、当該技術分野において、異なる起源のメンバ
ーを含むライブラリが必要とされている。例えば、伝統的なペプチドライブラリは、大体
において、ライブラリメンバーを作成するために、単に、そのアミノ酸配列を変える。ペ
プチドの二次構造が生物学的活性に重要であることがよく知られているのに対して、この
ようなペプチドライブラリは、そのライブラリメンバーに対して、束縛二次構造を与えな
い。
【０００７】
この目的のために、一部の研究者は、さらに束縛された二次構造を提供しようとして、
ジスルフィド架橋でペプチドを環化した（Ｔｕｍｅｌｔｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
０６７−６８，１９９４；Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．７：３００〜３
０６，１９９４）。しかしながら、このような環化ペプチドは、一般に、依然として、極
めて可撓性であり、生体利用能に乏しく、それゆえ、成功が限られている。
【０００８】
さらに最近では、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドで見られるリバースター
ンの二次構造を非常によく模倣した非ペプチド化合物が開発されている。例えば、Ｋａｈ
ｎの米国特許第５，４４０，０１３号およびＫａｈｎの公開ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４９
４、ＰＣＴ ＷＯ０１／００２１０Ａ１およびＰＣＴ ＷＯ０１／１６１３５Ａ２は、リバ
ースターンの三次元構造を模倣する立体配置的に束縛された非ペプチド化合物を開示して
いる。その他、 Ｋａｈｎの米国特許第５，９２９，２３７号およびその部分継続出願で
ある米国特許第６，０１３，４５８号はまた、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク
質のリバースターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物を開示して
いる。立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックの合成および同定ならびにそ
れらを疾患に適用することは、Ｏｂｒｅｃｈｔにより、十分に検討されている（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４，１〜６８，１９９９）。
【０００９】
立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックの合成および同定は、著しく進歩
しているものの、当該技術分野において、ペプチドの二次構造を模倣する小分子が依然と
して必要とされている。また、当該技術分野において、このようなメンバーを含むライブ
ラリだけでなく、生物学的に活性なライブラリメンバーを同定するために、これらのライ
ブラリメンバーを合成し、対象標的、特に、生物標的に対してスクリーニングする技術が
必要とされている。
【００１０】
本発明は、また、これらの要求を満たし、さらに、生物学的に活性なペプチドおよびタ
ンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物を提
供することにより、関連した利点を与える。
【００１１】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞増殖、発癌および発達を含めた種々のプロセスを調節
する（Ｍｏｏｎら、１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３，１５７〜１６２：Ｍｉ
ｌｌｅｒら、１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，７８６０〜７８７２：Ｎｕｓｓｅ ａｎ
ｄ Ｖａｒｍｕｓ，１９９２，Ｃｅｌｌ ６９，１０７３〜１０８７：Ｃａｄｉｇａｎ ａ
ｎｄ Ｎｕｓｓｅ，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１，３２８６〜３３０５：Ｐｅｉｆ
ｅｒ ａｎｄ Ｐｏｌａｋｉｓ，２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，１６０６〜１６０９：
Ｐｏｌａｋｉｓ ２０００，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４，１８３７〜１８５１）。Ｗｎｔシ
グナル伝達経路は、種々の生物体において、極めてよく研究されている。Ｗｎｔシグナル
変換によるＴＣＦ４／β−カテニン媒介転写の活性化は、その生物学的機能において、重
要な役割を果たすことが見出されている（Ｍｏｌｅｎａａｒら、１９９６，Ｃｅｌｌ ８
６，３９１〜３９９：Ｇａｔら、１９９８ Ｃｅｌｌ ９５，６０５〜６１４：Ｏｒｆｏｒ
ｄら、１９９９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４６，８５５〜８６８：Ｂｉｅｎｚ ａｎｄ
Ｃｌｅｖｅｒｓ，２０００，Ｃｅｌｌ １０３：３１１〜２０）。
【００１２】
Ｗｎｔシグナルなしでは、癌抑制遺伝子である腺腫様結腸ポリポシス（ＡＰＣ）は、セ
リンキナーゼグリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）−３βおよびβ−カテニンと同時
に相互作用する（Ｓｕら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，１７３４〜１７３７：Ｙ
ｏｓｔら、１９９６ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０，１４４３〜１４５４：Ｈａｙａｓｈｉら
、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，２４２〜２４７：
Ｓａｋａｎａｋａら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５
，３０２０〜３０２３：Ｓａｋａｎａｋａ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ，１９９９，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４，１４０９０〜１４０９３）。ＧＳＫ−３βによるＡＰＣのホス
ホリル化は、ＡＰＣとβ−カテニンとの相互作用を調節し、これは、順に、β−カテニン
のシグナル伝達機能を調節し得る（Ｂ．Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２
，１０２３，１９９６）。Ｗｎｔシグナル伝達は、β−カテニンを安定化し、これにより
、核に転位でき、この場所で、リンパ増大因子（ＬＥＦ１）／Ｔ細胞因子（ＴＣＦ４）フ
ァミリーの転写因子のメンバーと相互作用する（Ｂｅｈｒｅｎｓら、１９９６ Ｎａｔｕ
ｒｅ ３８２，６３８〜６４２：Ｈｓｕら、１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
８，４８０７〜４８１８：Ｒｏｏｓｅら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，１９２３〜
１９２６）。
【００１３】
最近では、ｃ−ｍｙｃ（公知の発癌遺伝子）は、β−カテニン／ＴＣＦ４−媒介転写の
標的遺伝子であることが明らかとなっている（Ｈｅら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１
１５０９〜１５１２：Ｋｏｌｌｉｇｓら、１９９９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９
，５６９６〜５７０６）。多くの他の重要な遺伝子は、サイクリンＤ１およびメタロプロ
テイナーゼ（これらもまた、発癌に関与している）を含めて、ＴＣＦ４／β−カテニン転
写経路により調節されることが確認されている（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９９，Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ １８，２８８３〜２８９１：Ｓｈｔｕｔｍａｎら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１１，５５２２〜５５２７：Ｔｅｔｓｕ ａｎｄ 
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９９９ Ｎａｔｕｒｅ，３９８，４２２〜４２６）。
【００１４】
さらに、Ｗｎｔシグナル伝達のいくつかの下流メディエータの過剰発現は、アポトーシ
スを調節することが発見されている（Ｍｏｒｉｓら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，７９５０〜７９５４：Ｈｅら、１９９９，Ｃｅｌｌ ９
９，３３５〜３４５：Ｏｒｆｏｒｄら、１９９９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４６，
８５５〜８６８：Ｓｔｒｏｖｅｌ ａｎｄ Ｓｕｓｓｍａｎ，１９９９，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
．Ｒｅｓ．，２５３，６３７〜６４８）。ヒトの直腸結腸癌細胞におけるＡＰＣの過剰発
現は、アポトーシスを誘発し（Ｍｏｒｉｓら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，７９５０〜７９５４）、β−カテニンの異所発現は、細胞外
マトリックスへの付着の損失に関連したアポトーシスを阻害した（Ｏｒｆｏｒｄら、１９
９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４６，８５５〜８６８）。ＴＣＦ４の優性ネガティブ
変異体の発現によるＴＣＦ４／β−カテニン転写の阻害は、Ｗｎｔ−１媒介の細胞生存を
阻止し、細胞をアポトーシス刺激（例えば、抗癌剤）に感受性にした（Ｓｈａｏｑｉｏｎ
ｇ Ｃｈｅｎら、２００１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５２，１，８７〜９６）、ま
た、ＡＰＣ変異は、構成的なスルビビンの発現（周知の抗アポトーシスタンパク質）を可
能にすることにより、アポトーシスを阻害する（Ｔａｏ Ｚｈａｎｇら、２００１，Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，８６６４〜８６６７）
Ｗｎｔ遺伝子の変異は、ヒトの癌では発見されていないものの、ＡＰＣまたはβ−カテ
ニンの変異は、大部分の直腸結腸癌の場合と同様に、ＴＣＦ４の不適当な活性化、ｃ−ｍ
ｙｃの過剰発現および新生物成長の発生を引き起こす（Ｂｕｂｉｎｆｅｌｄら、１９９７
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７９０〜１７９２：Ｍｏｒｉｎら、１９９７，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２７５，１７８７−１７９０：Ｃａｓａら、１９９９，Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ．
Ｄｉｆｆｅｒ．１０，３６９−３７６）。直腸結腸癌の８５％では、癌抑制遺伝子（ＡＰ
Ｃ）は、失われるか不活性化され、種々の他の癌でも、同様である（Ｋｉｎｚｌｅｒ ａ
ｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７，１５９〜１７０）。ＡＰＣの主
要な役割は、Ｗｎｔシグナル変換カスケードの負の調節因子という役割である。この経路
の中心的な特徴は、大きいＡｘｉｎベースの複合体（これは、ＡＰＣを含む）との相互作
用によるβ−カテニンの細胞質ゾルプールの安定性および局在性の変調を含む。この相互
作用により、β−カテニンのホスホリル化が起こり、それにより、それを分解について標
的化する。
【００１５】
ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００は、初期には、まず、転写因子ＣＲＥＢ
との関連によって（Ｃｈｒｉｖｉａら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６５，８５５〜８５
９）、後に、アデノウイルス形質転換タンパク質Ｅ１Ａとの相互作用によって（Ｓｔｅｉ
ｎら、１９９０，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６４，４４２１〜４４２７：Ｅｃｋｎｅｒら、１９９
４，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．，８，８６９〜８８４）、タンパク質相互作用アッセイで同定
された。ＣＢＰは、転写活性化補助因子機能を含めた種々の細胞機能に関与している可能
性があった（Ｓｈｉｋａｍａら、１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，
２３０〜２３６：Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，
３８３，２２〜２３）。ＣＢＰ／ｐ３００は、ｓｉａｍｏｉｓプロモーター（公知のＷｎ
ｔ標的）のβ−カテニン媒介活性化を増強する（Ｈｅｃｈｔら、２０００，ＥＭＢＯ Ｊ
．１９，８，１８３９〜１８５０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
β−カテニンは、ＣＢＰのＣＲＥＢ結合ドメインと直接相互作用し、そしてβ−カテニ
ンは、ＣＢＰと相乗作用して、ＴＣＦ４／β−カテニンの転写活性化を刺激する（Ｋｅｎ
−Ｉｃｈｉ Ｔａｋｅｍａｒｕ ａｎｄ Ｒａｎｄａｌｌ Ｔ．Ｍｏｏｎ，２０００，Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４９，２，２４９〜２５４）。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この背景から、Ｗｎｔ経路のＴＣＦ４／β−カテニンおよびＣＢＰ複合体は、細胞増殖
、発癌および細胞アポトーシスなどを調節する標的分子として、取り出すことができる。
すなわち、ＣＢＰを阻害することにより、ＴＣＦ４／β−カテニン転写経路を阻止する化
合物が必要とされている。従って、これは、癌（特に、直腸結腸癌）の治療に使用できる
。本発明は、この必要に対処している。
【００１８】
本発明は、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構
造を模倣する新しいタイプの立体配置的に束縛された化合物に関する。本発明はまた、こ
のような化合物を含有するライブラリだけでなく、その合成およびスクリーニングを開示
している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の化合物は、以下の一般式（Ｉ）およびそれの立体異性体を有する：
【００２０】
【化８】
2007532674.tif 000003
【００２１】
ここで、Ａは、−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは、−（ＣＨＲ4）−
または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは、−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅ
は、−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは、−（ＸＲ7）ｎ−、−（ＣＨＲ7
）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは、−Ｙ
（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ２）−または存在せず、Ｙは、酸素、イオ
ウまたは−ＮＨ−であり、ＸおよびＺは、独立して、窒素またはＣＨであり、ｎ＝０また
は１である；そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、同一または
異なり、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体、該分子の残部、リンカーおよび固体支持体
から独立して選択される。
【００２２】
ある実施形態では、Ａが、−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄ
が、−（ＣＨＲ5）−であり、Ｅが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが、−（ＸＲ7）ｎ−であ
り、そして本発明の化合物は、以下の一般式（ＩＩ）を有する。
【００２３】
【化９】
2007532674.tif 000004
【００２４】
ここで、Ｗ、Ｘ, Ｙおよびｎは、上で定義したとおりであり、そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、
Ｒ5およびＲ7は、以下の詳細な説明で定義したとおりである。
【００２５】
Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−
であり、Ｅが、−（ＺＲ6）−であり、Ｇが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−である実施形態
において、本発明の化合物は、以下の一般式（ＩＩＩ）を有する。
【００２６】
【化１０】
2007532674.tif 000005
【００２７】
ここで、Ｗ、ＸおよびＹは、上で定義したとおりであり、そしてＺは、窒素またはＣＨ
であり（ＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素である）、そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6およびＲ
9は、以下の詳細な説明で定義したとおりである。
【００２８】
Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−
であり、Ｅが、−（ＺＲ6）−であり、Ｇが、（ＸＲ7）ｎ−である実施形態において、本
発明の化合物は、以下の一般式（ＩＶ）を有する。
【００２９】
【化１１】
2007532674.tif 000006
【００３０】
ここで、Ｗ、Ｘ, Ｙ およびｎは、上で定義したとおりであり、Ｚは、窒素またはＣＨ
であり（Ｚが窒素であるとき、ｎは、０であり、そしてＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素
であり、そしてｎは、０ではない）、そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6およびＲ7は、以下の詳
細な説明で定義したとおりである。
【００３１】
ある実施態様において、本発明の化合物は下記一般式（ＶＩ）を有する：
【００３２】
【化１２】
2007532674.tif 000007
【００３３】
ここで、Ｒaは、フェニル基、１個以上の置換基を有する置換フェニル基（ここで、１
個以上の置換基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、ア
ミダゾニル基、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフ
ルオロＣ1〜4アルキル基、Ｃ1〜4アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキ
シ基、シアノ基、スルフリル基またはヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択され
る）、ベンジル基、１個以上の置換基を有する置換ベンジル基（ここで、１個以上の置換
基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニル基
、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4
アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シアノ基、スルフリル基ま
たはヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、または、８〜１１個の環員
を有する二環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜
３個のヘテロ原子を有し得る。Ｒbは、５〜７個の環員を有する単環式アリール基であり
、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得、その
化合物中のアリール環は、ハライド、ヒドロキシル基、シアノ基、低級アルキル基および
低級アルコキシ基からなる群から選択される１個以上の置換基を有し得る。Ｒcは、飽和
または不飽和のＣ1〜6アルキル、Ｃ1〜6アルコキシ、パーフルオロＣ1〜6アルキルであり
、そしてＸ1、Ｘ2、およびＸ3は、同一または異なり、独立して、水素、ヒドロキシル、
ハライドから選ばれる。
【００３４】
本発明は、また、式（Ｉ）の１つ以上の化合物を含むライブラリを用いるプロドラッグ
に関するものである。プロドラッグは酵素的および／または化学的加水分解によって、吸
収の途中又は後に体内に活性薬物を放出するように設計される。プロドラッグアプローチ
は、水に溶解性がより高い化合物へ化学的誘導体化することによって水への溶解性が低い
薬物の経口生体利用性または静脈（ｉ．ｖ．）投与を向上させる効果的な手段である。ヒ
ドロキシル基を有する薬物の水溶性を増加させるために最もよく用いられるプロドラッグ
アプローチは、イオン化可能な基、例えば、リン酸エステル基、カルボキシレート基、ア
ルキルアミノ基を含むエステルを製造するものである（Ｆｌｅｉｓｈｅｒなど、Ａｄｖａ
ｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１１５−１３０、１９９６；
Ｄａｖｉｓなど、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、７２４７−７２５３、２００２、Ｇｏｌｉｋ
など、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１８３７−１８４２、１９９６）
。
【００３５】
ある実施態様において、本発明のプロドラッグは下記一般式（ＶＩＩ）を有する：
【００３６】
【化１３】
2007532674.tif 000008
【００３７】
ここで、（ＶＩ）は、前述のような一般式（ＶＩ）であり；Ｙは、Ｒa、Ｒb、Ｒc、Ｘ1
、Ｘ2およびＸ3から選択される基の酸素、硫黄、または窒素であり；Ｒ10は、リン酸エス
テル、ヘミスクシネート、ヘミマレート、ホスホリルオキシメチルオキシカルボニル、ジ
メチルアミノアセテート、ジメチルアミノアルキルカルバメート、ヒドロキシアルキル、
アミノ酸、グルコシル、置換されたかもしくは置換されていないピペリジンオキシカルボ
ニル、またはそれらの塩であり；前記プロドラックはホスファターゼまたはカルボキシラ
ーゼの基質として作用でき、それによって一般式（ＶＩ）を有する化合物に転換される。
【００３８】
いくつかの実施態様において、一般式（ＶＩＩ）のＲ10は、アミノ酸基またはホスホア
ミノ酸基ではない。
【００３９】
本発明はまた、上記式（Ｉ）の化合物を含むライブラリだけでなく、このようなライブ
ラリを合成する方法およびそれをスクリーニングして生体活性化合物を同定する方法に関
する。本発明の化合物を含有する組成物もまた、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈
剤と組み合わせて、開示されている。
【００４０】
本発明はまた、少なくとも一つの一般式（Ｉ）化合物を含有するライブラリを用いて、
生物学的に活性な化合物を同定する方法に関する。関連態様において、本発明は、（ａ）
第一活性化補助因子および相互作用蛋白質を含有し、この際、前記第一活性化補助因子が
ＬＸＸＬＬ、ＬＸＸＬＩ、またはＦＸＸＦＦ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の
結合モチーフを含有する組成物を準備し、（ｂ）前記第一活性化補助因子および前記相互
作用蛋白質を試験化合物と結合させ、（ｃ）前記一般式（Ｉ）を有する化合物の存在
下で、前記第一活性化補助因子と前記相互作用蛋白質との間の結合の変性を検出すること
を含む、結合分析を行う方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路と関連した疾患を予防または治療する方法を提
供する。本発明の化合物または組成物を用いて治療または予防可能な疾患としては、腫瘍
または癌（例えば、ＫＳＨＶ−関連腫瘍）、血管形成術に伴う再狭窄、多嚢胞性腎病、異
常血管形成疾患、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、結節硬化症、脱毛、およびアルツハイマ
ー病が挙げられる。該方法は、目的とする結果が得られる有効量で、本発明の化合物また
は組成物を被験体に投与することを含む。
【００４２】
関連した局面において、本発明は、さらに、神経突起伸長、神経幹細胞の分化、および
癌細胞のアポトーシスを促進する方法を提供する。該方法は、本発明の化合物または組成
物を所望の結果が得られる有効量で、適切な細胞に投与することを含む。
【００４３】
本発明のこれらの局面および他の局面は、添付の図面および以下の詳細な説明を参照す
ると、明らかとなる。この目的のために、本明細書中では、種々の参考文献が述べられて
おり、これらは、特定の手順、化合物および／または組成物をさらに詳細に記述しており
、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。
図１は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。
【００４４】
図２は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。
【００４５】
図３は、ＳＷ４８０細胞について本発明の化合物ＡのＩＣ50を測定したグラフであり、
ここで、ＳＷ４８０細胞に対する細胞増殖阻害は、そのＩＣ50値を得るために、実施例４
で調製された化合物の種々の濃度で、測定された。具体的には、該試験化合物Ａによるホ
タルおよびレニラルシフェラーゼ活性の阻害の程度を決定した。結果として、ＳＷ４８０
細胞増殖に対する該試験化合物ＡのＩＣ50は、表４で開示されているように、見出された
。詳細な手順は、実施例６で開示されたものと同じである。
【００４６】
図４．ＰＣ−１２細胞は、コートされた皿で培養し、５０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）中で１０日間分化した（実施例７で開示されたものと同じである）。（Ａ、Ｂ）ベ
クターが形質転換されたＰＣ−１２細胞（Ａ）およびｗｔＰＳ−１を過剰発現するＰＣ−
１２細胞（Ｂ）は、ＮＧＦで１０日後、広範囲な神経突起伸長を示す。（Ｃ）変異ＰＳ−
１／Ｌ２８６Ｖを発現するＰＣ−１２細胞は、同一の培養条件下で、有意な神経突起を示
さない。（Ｄ、Ｅ）（実施例７で開示されたものと同じである）ＧＡＰ−４３の免疫蛍光
分析、神経突起伸長の分子マーカーは、ＰＣ−１２細胞においてベクターが形質転換され
たものおよびＰＳ−１／ＷＴの過剰発現（Ｅ）、神経突起においてＧＡＰ−４３に対する
強い染色（Ｄ）を示す。（Ｆ）神経突起伸長の欠乏は、変異細胞において弱いＧＡＰ−４
３免疫染色に対応している。データは少なくとも２つの独立した実験を示す。（Ｇ）分化
した細胞は、Ｔｏｐｆｌａｓｈ、ＴＣＦ／β−カテニンレポーター構築で形質変換された
。細胞は、溶解され、ルシフェラーゼ活性は、（実施例７で開示されたものと同様に）、
形質転換の６時間後に測定した。データは、３つの独立した実験の平均値（±ＳＤ）を表
す。星印は、Ｐ＜０．０５を示す。
【００４７】
図５．化合物Ｄは、ＰＣ−１２過剰発現変異ＰＳ−１／２８６Ｖ細胞において、不足し
た神経分化を表現型の発現上で訂正する。変異細胞を、分化期間途中に、ＮＧＦ以外に１
０μＭの化合物Ｄに暴露した（Ｍｉｎｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９８，１１７１４（２００１））。（Ａ）神経突起伸長および延長は、化合物
Ｄで処理時、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖを過剰発現するＰＣ−１２細胞で観察された。（Ｂ）
ＧＡＰ−４３（グリーン）は、変異細胞において顕著に上昇し、また神経突起で見られる
。（Ｃ）ＰＣ−１２細胞における神経突起伸長の定量。二つの細胞径よりもさらに大きい
神経突起の長さを有する変異細胞数は、ＰＣ−１２細胞におけるベクターで形質転換され
たものおよび過剰発現するＰＳ−１／ＷＴの数よりも１０％未満であった。決められた神
経突起の長さを有する変異体ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞の数は、１０μＭの化合物Ｄで処
理した後、著しく増加した。結果としては、３つの独立した実験の平均値（±ＳＤ）を表
す。星印は、Ｐ＜０．０５を示す。
【００４８】
図６．Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２（ＥｐｈＢ２）受容体発現。免疫蛍光分析およびＲＴ−ＰＣ
Ｒを行って、（実施例７で開示されたものと同じである）ＥｐｈＢ２受容体発現を見つけ
た。（Ａ、Ｂ）ＥｐｈＢ２受容体は、ベクターで形質転換されたものおよび過剰発現のＰ
Ｓ−１／ＷＴ細胞の神経突起で明確に見られる。染色の強度は、高発現量と相互に関連づ
ける。（Ｃ）これに対して、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ ＰＣ−１２細胞は、ＥｐｈＢ２受容
体発現が著しく減少した。（Ｄ）化合物Ｄで変異細胞を処理すると、ＥｐｈＢ２受容体発
現が増加するが、これは、神経突起伸長の点に集中される。（Ｅ）ＥｐｈＢ２受容体発現
は、以前に転写段階で制御されることが明らかとなっている（Ｇｕｏら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．１７，４２１２（１９９７））。レーン１、ベクターで形質転換されたＰＣ−１
２細胞、レーン２、過剰発現ＰＳ−１／ＷＴ細胞、レーン３、 過剰発現変異ＰＳ−１／
Ｌ２８６Ｖ細胞 、レーン４、化合物Ｄで処理された変異細胞。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、過
剰発現変異ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞におけるＥｐｈＢ２受容体に対するメッセージが、
ベクターで形質転換され、かつ過剰発現のｗｔＰＳ−１ ＰＣ−１２細胞の両方における
ものよりも減少することを示している。１０μＭの化合物Ｄによる処理は、ＥｐｈＢ２メ
ッセージを上方制御する。ＧＡＰＤＨは、内部統制を用いる。
【００４９】
図７．化合物Ｄは、Ｇ1の細胞を停止させる。ＦＡＣＳ分析は、化合物Ｄ（２５μＭ）
（右）またはコントロール０．５％ＤＭＳＯ（左）で、２４時間の間処理されたＳＷ４８
０（下パネル）およびＨＣＴ１１６（上パネル）細胞に対して行った。５．５×１０6細
胞は、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で固定および着色させた。Ｂ。化合物Ｄは、結腸癌
細胞株におけるカスパーゼを選択的に活性化した。正常結腸細胞ＣＣＤ１８Ｃｏ（右グラ
フ）とともに、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６（左グラフ）細胞（１０5）は、コントロ
ール（０．５％ＤＭＳＯ）または化合物Ｄ（２５μＭ）で処理した。処理２４時間後、細
胞を溶解し、カスパーゼ−３／７酵素活性を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、処理
されたサンプル（化合物Ｄまたはコントロール）からブランク（コントロール、細胞なし
）の単位価を引いた後、プロットした。
【００５０】
図８．化合物Ｄは、容量依存的な方法で軟寒天中のコロニー増殖を減少させる。増加す
る濃度の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（０．５−３２μＭ）および化合物Ｄ（０．
２５−５μＭ）は、３重ウエルのＳＷ４８０に添加した（５０００細胞／ウエル）。細胞
を洗浄し、軟寒天成長培地に懸濁させた。８日後、コロニーの数（６０μＭ径以上のコロ
ニー）を数え、化合物濃度に対してプロットした。３つの決定の平均値±ＳＥが示された
。化合物の不在下でコントロールのコロニー数は、１，６３７±７１であった。
【００５１】
図９．Ａ．化合物Ｃは、ヌードマウスモデルの腫瘍成長を減少させる。Ｂ．化合物Ｃは
、ヌードマウスモデルの体重を少し減少させる。
【００５２】
図１０．スルビビン転写活性は、Ｗｎｔ１で上昇調節したものの、化合物Ｄでノウトダ
ウン（ｋｎｏｕｔ−ｄｏｗｎ）した。ルシフェラーゼ活性化の百分率は、Ｗｎｔ１および
化合物Ｄの不在下で、あるいは、Ｗｎｔ１、化合物Ｄまたは両方の存在下で、野生型、Ｃ
ＢＰ＋／−、およびｐ３００＋／−３Ｔ３細胞で測定された。
【００５３】
図１１．化合物Ａ（右グラフ）および化合物Ｄ（左グラフ）は、ＳＷ４８０細胞のスル
ビビンルシフェラーゼレポーターの活性を阻害する。スルビビンプロモータの制御下にあ
るルシフェラーゼ活性を、様々な濃度において化合物Ａまたは化合物Ｄで処理されたＳＷ
４８０細胞で測定した。
【００５４】
図１２．ＲＴ−ＰＣＲ分析は、化合物Ｄの処理がスルビビン遺伝子の発現程度を減少さ
せることを示す。
【００５５】
図１３．化合物Ｄは、スルビビンプロモータと様々な蛋白質との結合を減少させる。化
合物Ｄ（２５μＭ）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）で１８日間処理されたＳＷ
４８０細胞に対するＣｈＩＰアッセイを行った。
【００５６】
図１４．化合物Ｄは、翻訳レベルでスルビビン発現を減少させる。ビヒクル（０．５％
ＤＭＳＯ）単独、１０μＭもしくは２５μＭ化合物Ｄ、または５μＭ ５−Ｆｕで処理さ
れた細胞抽出物のウエスタンブロット分析は、スルビビン６Ｅ４モノクローナル抗体（Ｃ
ｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。Ｂ。スルビビン免
疫蛍光顕微鏡検査法。培養された化合物を固定し、抗スルビビングリーンで着色した。Ｃ
。スルビビン免疫蛍光顕微鏡検査法。化合物Ｄで処理されたＳＷ４８０細胞を固定し、抗
スルビビングリーンで着色した。
【００５７】
図１５．化合物Ｄは、スルビビン発現の阻害を通じて、カスパーゼ３活性（但し、カス
パーゼ２活性ではない）を活性化する。スルビビン遺伝子を含有する構造物の形質転換の
存在下または不在下で培養された細胞は、スタウスポリン（stausporine）（０．５μＭ
）、化合物Ｄ（２．５μＭまたは５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した。これら
の細胞の中、カスパーゼ２およびカスパーゼ３活性を測定した。
【００５８】
図１６．化合物Ｄは、スルビビン発現の阻害を通じて、細胞死を促進する。スルビビン
遺伝子を含有する構造物の形質転換体の存在下または不在下で培養された癌細胞は、スタ
ウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した。
これらの細胞の細胞死を測定した。
【００５９】
図１７．化合物Ｄは、Ｇ0段階の細胞数を増加させる。スルビビン遺伝子を含有する構
造物の形質転換体の存在下または不在下で培養された癌細胞は、スタウスポリン（０．５
μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した。ＦＣＡＳ分析は、こ
れらの細胞に対して行い、Ｇ0段階の細胞の百分率を示した。
【００６０】
図１８は、プロドラッグＡを静脈内大量（ｂｏｌｕｓ）注射後の時間の経過にともなう
マウス血漿内のプロドラッグＡおよびその母化合物の濃度の変化を示す。
【００６１】
本発明は、生物学的ペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣
する立体配置的に束縛された化合物（これはまた、本明細書中にて、「リバースターンミ
メティック」とも呼ばれている）およびそれに関連した化学ライブラリに関する。
【００６２】
本発明のリバースターンミメティック構造体は、生物学的に活性な薬剤として有用であ
り、これには、診断薬、予防薬および／または治療薬としての使用が挙げられる（が、こ
れらに限定されない）。本発明のリバースターンミメティック構造体ライブラリは、この
ような用途の生物学的に活性な薬剤の同定に有用である。本発明を実施する際に、これら
のライブラリは、数十から数百、数千（またはそれ以上）の個々のリバースターン構造体
（これはまた、本明細書中にて、「メンバー」とも呼ぶ）を含有し得る。
【００６３】
本発明の１つの観点では、以下の式（Ｉ）を有するリバースターンミメティック構造体
およびそれの立体異性体が開示されている：
【００６４】
【化１４】
2007532674.tif 000009
【００６５】
ここで、Ａは、−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは、−（ＣＨＲ4）−
、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは、−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは、
−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは、−（ＸＲ7）ｎ−、−（ＣＨＲ7）−
（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは、−Ｙ（Ｃ
＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−または存在せず、Ｙは、酸素、イオウま
たは−ＮＨ−であり、ＸおよびＺは、独立して、窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１
である；そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、同一または異な
り、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体、該分子の残部、リンカーおよび固体支持体から
独立して選択される。
【００６６】
ある実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、独立して
、アミノＣ2〜5アルキル、グアニジノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜4アルキルグアニジノＣ2〜5
アルキル、ジＣ1〜4アルキルグアニジノＣ2〜5アルキル、アミジノＣ2〜5アルキル、Ｃ1
〜4アルキルアミジノＣ2〜5アルキル、ジＣ1〜4アルキルアミジノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜
3アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミ
ジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキ
ルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ
、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上か
ら選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、該ベンジル上の置換基は、独立して
、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、
Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、
ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から
選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミ
ジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキ
ルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ
、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上か
ら選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、該置換基
は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アル
キルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4
アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキ
シルの１個またはそれ以上から選択される）、ピリジル、置換ピリジル（ここで、該置換
基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4ア
ルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1
〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒド
ロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ピリジルＣ1〜4アルキル、置換ピリジ
ルＣ1〜4アルキル（ここで、該ピリジン置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニ
ジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハ
ロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カ
ルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される
）、ピリミジルＣ1〜4アルキル、置換ピリミジルＣ1〜4アルキル（ここで、該ピリミジン
置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1
〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル
、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたは
ヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1〜4ア
ルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ1〜4アルキル（ここで、該トリアジン置換基は、
独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキル
アミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アル
キル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシル
の１個またはそれ以上から選択される）、イミダゾールＣ1〜4アルキル、置換イミダゾー
ルＣ1〜4アルキル（ここで、該イミダゾール置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グ
アニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1〜4アルキルアミノ、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ
、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜3アルコキシ、ニトロ
、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択さ
れる）、イミダゾリニルＣ1〜4アルキル、Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0〜4アルキ
ル、ヒドロキシＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜5アルキルアミノＣ2〜5アルキル、ヒドロキシＣ2
〜5アルキル、Ｃ1〜5アルキルアミノＣ2〜5アルキル、Ｃ1〜5ジアルキルアミノＣ2〜5ア
ルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ1〜4アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ0
〜2アルキルからなる群から選択される。
【００６７】
ある実施形態では、ＥのＲ1、Ｒ2、Ｒ6、およびＧのＲ7、Ｒ8およびＲ9は、同一または
異なり、前記化合物の残部を示し、そしてＡのＲ3、ＢのＲ4またはＤのＲ5は、アミノ酸
側鎖部分またはその誘導体から選択される。本明細書中で使用する「前記化合物の残部」
との用語は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8および／またはＲ9位置でリバースターンミ
メティック構造体に共有結合した任意の部分、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、
アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語はまた、アミノ酸側鎖部分お
よびそれらの誘導体を含む。
【００６８】
他の実施形態では、ＡのＲ3、ＤのＲ5、ＥのＲ6、およびＧのＲ7、Ｒ8およびＲ9は、同
一または異なり、前記化合物の残部を示し、ＢのＲ1、Ｒ2およびＲ4の１以上もまた、あ
る観点において、これらの全部は、アミノ酸側鎖を表す。この場合、「前記化合物の残基
」との用語は、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8および／またはＲ9位置でリバースターンミメテ
ィック構造体に共有結合した任意の残基、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、アミ
ノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語はまた、アミノ酸側鎖部分および
それらの誘導体を含む。
【００６９】
本明細書中で使用する「前記化合物の残部」との用語は、リバースターンミメティック
構造体に共有結合した任意の残基、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、アミノ酸、
ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語はまた、アミノ酸側鎖部分およびそれら
の誘導体を含む。本発明のある観点において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8
および／またはＲ9の少なくとも一つは、化合物の残部を示すことができる。本発明のあ
る観点において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4の１以上は、アミノ酸残基またはそれらの誘導体を
示す。
【００７０】
本明細書中で使用する「アミノ酸側鎖部分」との用語は、天然に生じるタンパク質中で
存在しているアミノ酸側鎖部分を示し、これには、表１で確認した天然に存在するアミノ
酸側鎖部分が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の他の天然に存在するアミノ
酸側鎖部分には、３，５−ジブロモチロシン、３，５−ジヨードチロシン、ヒドロキシリ
ジン、γ−カルボキシグルタメート、ホスホチロシンおよびホスホセリンが挙げられるが
、これらに限定されない。それに加えて、本発明を実施する際には、グリコシル化アミノ
酸側鎖もまた使用され得、これには、グリコシル化トレオニン、セリンおよびアスパラギ
ンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
【表１】
2007532674.tif 000010
【００７２】
天然に存在するアミノ酸側鎖部分に加えて、本発明のアミノ酸側鎖部分には、また、そ
れらの種々の誘導体を含む。本明細書中で使用するアミノ酸側鎖部分の「誘導体」には、
天然に存在するアミノ酸側鎖部分の改変体および／または変形体を含む。例えば、アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンのアミノ酸側鎖部分は、一
般に、低級アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分として、分類され得る。アミ
ノ酸側鎖部分の誘導体には、他の直鎖または分枝、環式または非環式の置換または非置換
で飽和または不飽和の低級アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分を含む。
【００７３】
本明細書中で使用する「低級アルキル部分」は、１〜１２個の炭素原子を含有し、「低
級アリール部分」は、６〜１２個の炭素原子を含有し、そして「低級アラルキル部分」は
、７〜１２個の炭素原子を含有する。それゆえ、１実施形態では、このアミノ酸側鎖誘導
体は、Ｃ1〜12アルキル、Ｃ6〜12アリールおよびＣ7〜12アリールアルキルから選択され
、好ましい１実施形態では、Ｃ1〜7アルキル、Ｃ6〜10アリールおよびＣ7〜11アリールア
ルキルから選択される。
【００７４】
本発明のアミノ酸側鎖誘導体は、さらに、低級アルキル、アリールおよびアリールアル
キル部分の置換誘導体を含有し、ここで、この置換基は、以下の化学部分の１個またはそ
れ以上から選択されるが、これらに限定されない：−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ
ＯＲ、−ＣＯＮＨ2、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＳＯ2Ｒ、−Ｓ
Ｏ2Ｈ、−ＳＯＲおよびハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを含めて）であって、ここで
、Ｒの各存在は、独立して、直鎖または分枝、環式または非環式の置換または非置換で飽
和または不飽和の低級アルキル、低級アリールおよび低級アラルキル部分から選択される
。さらに、本発明の環式の低級アルキル、アリールおよびアリールアルキル部分には、ナ
フタレンだけでなく、複素環化合物（例えば、チオフェン、ピロール、フラン、イミダゾ
ール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、３−ピロリン、ピロリジン、ピリジン、
ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリンおよびカルバゾール）が挙げられる。アミ
ノ酸側鎖部分誘導体には、さらに、低級アルキルおよびアラルキル部分のアルキル部分の
ヘテロアルキル誘導体が含まれ、これには、アルキルホスホネートおよびアラルキルホス
ホネートならびにアルキルシランおよびアラルキルシランが含まれるが、これらに限定さ
れない。
【００７５】
代表的なＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9部分には、具体的には、
−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＲ、−ＣＯＮＲＲ、−
ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−ＳＯ2Ｒおよび−ＣＯＳＲを含むが、これらに限定されず
、ここで、Ｒの各存在は、上で定義したとおりである。
【００７６】
さらに他の実施形態では、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体（またはＲ1、Ｒ2、Ｒ3
、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9の場合、その化合物の残部）に加えて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9は、この化合物と他の部分または化合物との連結を促
進するリンカーであってもよい。例えば、本発明の化合物は、診断アッセイまたはスクリ
ーニングアッセイで使用するために、１種またはそれ以上の公知化合物（例えば、ビオチ
ン）と結合されてもよい。さらに、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9
は、その化合物を固体支持体（例えば、固相ペプチド合成で使用される支持体）と接合す
るリンカーであってもよく、あるいは、その支持体それ自体であってもよい。この実施形
態では、他の部分または化合物との連結または固体支持体との連結は、好ましくは、Ｒ1
、Ｒ2、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9位置であり、さらに好ましくは、Ｒ1またはＲ2位置である。
【００７７】
Ａが、−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが、−（ＣＨＲ5）−
であり、Ｅが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが、−（ＸＲ7）ｎ−である実施形態において
、本発明のリバースターンミメティック化合物は、以下の一般式（ＩＩ）を有する：
【００７８】
【化１５】
2007532674.tif 000011
【００７９】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、上で定義したとおりである。
好ましい実施形態では、Ｒ1、Ｒ2およびＲ7は、化合物の残部であり、そしてＲ3またはＲ
5は、アミノ酸側鎖部分から選択される。
【００８０】
Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−
であり、Ｅが、−（ＺＲ6）−であり、Ｇが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−である実施形態
において、本発明のリバースターンミメティック化合物は、以下の一般式（ＩＩＩ）を有
する。
【００８１】
【化１６】
2007532674.tif 000012
【００８２】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ9、ＷおよびＸは、上で定義したとおりであり、そし
てＺは、窒素またはＣＨである（ＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素である）。好ましい実
施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ9は、化合物の残部であり、そしてＲ4は、アミノ酸
側鎖部分から選択される。
【００８３】
さらに特定の実施形態では、Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ4）−で
あり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが、−（ＺＲ6）−であり、Ｇが、（ＸＲ7）ｎ−
であり、そして本発明のリバースターンミメティック化合物は、以下の一般式（ＩＶ）を
有する。
【００８４】
【化１７】
2007532674.tif 000013
【００８５】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、上で定義したとおりであり、
そしてＺは、窒素またはＣＨである（Ｚが窒素であるとき、ｎは、０であり、そしてＺが
ＣＨであるとき、Ｘは、窒素であり、そしてｎは、０ではない）。好ましい実施形態では
、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ7は、化合物の残部であり、そしてＲ4は、アミノ酸側鎖部分か
ら選択される。ある観点において、Ｒ6またはＲ7は、ＺおよびＸがＣＨのとき、それぞれ
、アミノ酸側鎖部分から選択される。
【００８６】
これらの化合物は、適当な出発成分分子（以下、「成分片」と呼ぶ）を利用することに
より、製造され得る。要約すると、式（Ｉ）を有するリバースターンミメティック構造体
の合成では、第１および第２成分片をカップリングし、複合第１−第２中間体を形成し、
もし必要なら、第３および／または第４成分片をカップリングし、複合第３−第４中間体
を形成し（または、もし市販されているなら、単一の第３中間体を使用してもよい）、複
合第１−第２中間体および第３−第４中間体（または第３中間体）は、次いで、カップリ
ングされて、例えば、第１−第２−第３−第４中間体（または、第１−第２−第３中間体
）を形成し、これを環化して、本発明のリバースターンミメティック構造体が得られる。
あるいは、式（Ｉ）のリバースターンミメティック構造体は、個々の成分片を、溶液中に
て段階的に、または固相ペプチド合成で一般的に実施されているような固相合成により、
いずれかで連続的にカップリングすることにより、製造することができる。
【００８７】
本発明のリバースターンミメティック構造体を調製するための具体的な成分片およびそ
の組立体は、図１に例示されている。例えば、「第一成分片」は、以下の式Ｓ１を有する
：
【００８８】
【化１８】
2007532674.tif 000014
【００８９】
ここで、Ｒ2は、上で定義したとおりであり、そしてＲは、ペプチド合成で使用するの
に適当な保護基である。この保護基は、固相合成を可能にするために、高分子支持体に結
合されていてもよい。適当なＲ基には、アルキル基を含み、好ましい実施形態では、Ｒは
、メチル基である。図１において、Ｒ基の一つは、高分子（固体）支持体であり、図面に
おいて「Ｐｏｌ」と表す。このような第一成分片は、ＣＨ（ＯＲ）2−ＣＨＯとＨ2Ｎ−Ｒ
2の還元アミノ化により、または、Ｈ2Ｎ−Ｒ2とＣＨ（ＯＲ）2−ＣＨ2−ＬＧ（ここで、
ＬＧは、離脱基、例えば、ハロゲン（Ｈａｌ）基を意味する）との置換反応により、容易
に合成され得る。
【００９０】
本発明の「第二成分片」は、以下の式Ｓ２を有する：
【００９１】
【化１９】
2007532674.tif 000015
【００９２】
ここで、Ｐは、ペプチド合成で使用するのに適当なアミノ保護基であり、Ｌ1は、ヒド
ロキシルまたはカルボキシル活性化基であり、Ｒ4は、上で定義したとおりである。好ま
しい保護基には、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル（ＢＯＣ）、メチルオキシカルボニル（ＭＯＣ）、９Ｈ−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル（ＦＭＯＣ）およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）を含む。Ｎ−保護ア
ミノ酸は、市販されている。例えば、ＦＭＯＣアミノ酸は、種々の供給源から入手できる
。第二成分片を第一成分片と反応させるために、Ｌ１は、カルボキシル活性化基であり、
また、カルボキシル基のカルボキシル活性化基への変換は、カルボキシル基の活性化につ
いて、当該分野において公知の方法で容易に達成され得る。適当な活性化カルボン酸には
、酸ハロゲン化物（ここで、Ｌ1は、ハロゲン、例えば塩素または臭素）、酸無水物（こ
こで、Ｌ1は、アシル基（例えば、アセチル）である）、反応性エステル（例えば、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびペンタフルオロフェニルエステル）および他の
活性化中間体（例えば、カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ））を使用するカップリング反応で形成される活性中間体を含む。従って、市販され
ているＮ−保護アミノ酸は、当業界の技術者に公知の手段によって、カルボキシル活性化
基へ変換することができる。
【００９３】
アミノ酸のアジド誘導体を第二成分片として供する場合、このような化合物は、Ｚａｌ
ｏｏｍら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５１７３〜７６，１９８１）で開示された反応
により、対応するアミノ酸から製造され得る。
【００９４】
あるいは、本発明の第一成分片は、以下の式Ｓ１’を有し得る。
【００９５】
【化２０】
2007532674.tif 000016
【００９６】
ここで、Ｒは、上で定義したとおりであり、そしてＬ2は、脱離基（例えば、ハロゲン
原子またはトシル基）である。
【００９７】
本発明の第二成分片は、以下の式Ｓ２’を有し得る。
【００９８】
【化２１】
2007532674.tif 000017
【００９９】
ここで、Ｒ2、Ｒ4およびＰは、上で定義したとおりである。
【０１００】
本発明の「第三成分片」は、以下の式Ｓ３を有し得る：
【０１０１】
【化２２】
2007532674.tif 000018
【０１０２】
ここで、Ｇ、Ｅ、Ｌ1およびＬ2は、上で定義したとおりである。適当な第三成分片は、
種々の供給源から市販されているか、または有機化学における任意の公知方法により製造
できる。
【０１０３】
図１において、式（Ｉ）の化合物は、Ａは、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは、−（ＣＨＲ
4）−であり、Ｄは、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは、−（ＣＲ6）−である。カルボニル基
が位置Ｂにあり、そしてＲ基が位置Ｂにある一般式（Ｉ）の化合物、すなわち、Ａは、−
（ＣＨＲ3）−であり、Ｂは、−
（Ｃ＝Ｏ）−である化合物は、図２に示すように、図１に示すような方法により製造でき
る。図２はまた、第１−第２中間体片と反応しないうちに、第４成分片を第３成分片に結
合させるよりは、第１−第２−第３成分中間体に第４成分片を添加することを例示してい
る。その他、図２は、Ｄは、−（ＣＨＲ5）−（図１の−（Ｃ＝Ｏ）ではない）であり、
Ｅは、−（Ｃ＝Ｏ）（図１の−（ＣＨＲ6）−ではない）である本発明による化合物の製
造を例示している。最終的に、図２は、ＧがＮＲ7である化合物の製造を例示する。
【０１０４】
従って、上で例示したとおり、一般式（Ｉ）を有するリバースターンミメ
ティック構造体は、第１成分片を第２成分片と反応させて複合第１−第２中間体を形成し
、続いて、複合第１−第２中間体を順次に第３成分片と反応させて第１−第２−第３−第
４中間体を形成し、次いで、この中間体を環化して、リバースターンミメティック構造体
を得ることにより、合成され得る。
【０１０５】
本発明の代表的な成分片の合成は、製造実施例および加工実施例で記述されている。
【０１０６】
式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のリバースターンミメティック構造体は、それらの成分片
を適当に修飾すること以外は、上で開示したモジュラー成分合成と類似の技術により、製
造され得る。
【０１０７】
本発明のリバースターンミメティック構造体は、生物学的に活性な薬剤（例えば、診断
薬、予防薬および治療薬）として有用である。例えば、本発明によるリバースターンミメ
ティック構造体は、温血動物において細胞シグナル伝達転写因子関連ペプチドを調節する
のに用いることができ、これは、この動物に、一般式（Ｉ）の化合物の有効量を投与する
工程を含む方法により行われる。
【０１０８】
さらに、本発明のリバースターンミメティック構造体はまた、温血動物のＰＴＢドメイ
ンにペプチドが結合するのを阻害するのに、温血動物のイオンチャンネルおよびＧタンパ
ク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を変調するのに、および温血動物のサイトカインを変調す
るのに、有効でもあり得る。
【０１０９】
ところで、一般式（Ｉ）の化合物（特に、式（ＶＩ）の化合物）は、Ｗｎｔシグナル伝
達経路により変調された疾患（例えば、癌、特に、直腸結腸癌）を阻止または治療するの
に有効であることが見出された。
【０１１０】
【化２３】
2007532674.tif 000019
【０１１１】
ここで、Ｒaは、フェニル基、１個以上の置換基を有する置換フェニル基（ここで、１
個以上の置換基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、ア
ミダゾニル基、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフ
ルオロＣ1〜4アルキル基、Ｃ1〜4アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキ
シ基、シアノ基、スルフリル基またはヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択され
る）、ベンジル基、１個以上の置換基を有する置換ベンジル基（ここで、１個以上の置換
基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニル基
、Ｃ1〜4アルキルアミノ基、Ｃ1〜4ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ1〜4
アルキル基、Ｃ1〜3アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シアノ基、スルフリル基ま
たはヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、または、８〜１１個の環員
を有する二環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜
３個のヘテロ原子を有し得る。Ｒbは、５〜７個の環員を有する単環式アリール基であり
、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得、その
化合物中のアリール環は、ハライド、ヒドロキシル基、シアノ基、低級アルキル基および
低級アルコキシ基からなる群から選択される１個以上の置換基を有し得る。Ｒcは、飽和
または不飽和のＣ1〜6アルキル、Ｃ1〜6アルコキシ、パーフルオロＣ1〜6アルキルであり
、そしてＸ1、Ｘ2、およびＸ3は、同一または異なり、独立して、水素、ヒドロキシル、
ハライドから選ばれる。
【０１１２】
ほかの観点において、本発明の目的は、一般式（ＶＩ）を有する化合物の安全かつ有効
な量および薬学的に許容されるキャリアを含有する医薬組成物を提供することにある。こ
の組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路（特に、ＴＣＦ４−β−カテニン−ＣＢＰ複合体）
により変調される障害を処置するのに使用できる。
【０１１３】
さらに、本発明は、本発明の上記組成物を使用することにより腫瘍細胞の増殖を阻止す
る方法；本発明の上記組成物を使用することにより腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する方
法；本発明の上記組成物を使用することによりＴＣＦ４−β−カテニン−ＣＢＰ複合体に
より変調される疾患を治療する方法；ならびに他の抗癌剤（例えば、５−フルオロウラシ
ル（５−ＦＵ）、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンＣ、テガフール、ラルチト
レキセド、カペシタビンおよびイリノテカンなど）と共に本発明の組成物を投与すること
により癌（例えば、直腸結腸癌）を治療する方法を提供することにある。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、以下のような（６Ｓ，１０Ｒ）−
立体配置を有する：
【０１１５】
【化２４】
2007532674.tif 000020
【０１１６】
ここで、ＲaおよびＲbは、上で定義した同じ意味を有する。
【０１１７】
本発明のまた他の態様において、一般式（Ｉ）を有する化合物から由来するプロドラッ
グを開示する。前記プロドラッグは一般的に水溶性を増加させ、それにより一般式（Ｉ）
を有する化合物の生体利用性を増加させる。ある実施態様において、本発明の前記プロド
ラッグは下記一般式（ＶＩＩ）を有する：
【０１１８】
【化２５】
2007532674.tif 000021
【０１１９】
ここで、（ＶＩ）は前述のような一般式（ＶＩ）であり；Ｙは、Ｒa、Ｒb、Ｒc、Ｘ1、
Ｘ2およびＸ3から選択される基の酸素、硫黄、または窒素であり；Ｒ10はリン酸エステル
、ヘミスクシネート、ヘミマレート、ホスホリルオキシメチルオキシカルボニル、ジメチ
ルアミノアセテート、ジメチルアミノアルキルカルバメート、ヒドロキシアルキル、アミ
ノ酸、グルコシル、置換されたかもしくは置換されていないピペリジンオキシカルボニル
、またはそれらの塩であり；前記プロドラックはホスファターゼまたはカルボキシラーゼ
の基質として作用でき、それによって一般式（ＶＩ）を有する化合物に転換される。いく
つかの実施態様において、一般式（ＶＩＩ）のＲ10は、アミノ酸基またはホスホアミノ酸
基ではない。
【０１２０】
本発明の別の観点では、本発明のリバースターンミメティック構造体を含むライブラリ
が開示されている。本発明のライブラリは、一旦、組み立てられると、生体活性を有する
個々のメンバーを識別するために、スクリーニングされ得る。これらのライブラリの生体
活性メンバーについてのこのようなスクリーニングは、例えば、そのライブラリのメンバ
ーの結合活性を評価する工程またはライブラリメンバーが機能アッセイに対して有する効
果を評価する工程を含んでも良い。スクリーニングは、通常、これらのライブラリメンバ
ー（またはライブラリメンバーのサブセット）を目的の標的（例えば、抗体、酵素、レセ
プタまたは細胞株）と接触させることにより、達成される。ライブラリメンバー（これら
は、目的の標的と相互作用できる）は、本明細書中にて、「生体活性ライブラリメンバー
」または「生体活性ミメティック」と呼ばれている。例えば、生体活性ミメティックは、
抗体またはレセプタに結合できるか、酵素を阻害できるか、または、例えば細胞系に関連
した機能応答を誘発またはアンタゴナイズできるライブラリメンバーであってもよい。言
い換えれば、本発明のライブラリのスクリーニングは、どのライブラリメンバーが１個以
上の目的の生物学的標的と相互作用できるかを決定する。さらに、相互作用が起こるとき
、その生体活性ミメティックは、次いで、それらのライブラリメンバーから同定され得る
。このライブラリから単一（または限定数）の生体活性ミメティックを同定すると、リバ
ースターンミメティック構造体が得られ、これらは、それ自体、生体活性であり、それゆ
え、診断薬、予防薬または治療薬として有用であり、さらに、これらの分野でのリード化
合物の同定を著しく促進するのに使用され得る。
【０１２１】
本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、本発明の第一、第二および第三
成分片と組み合わせて、公知のペプチド合成技術を使用して、達成され得る。さらに具体
的には、立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックのＮ−末端および／または
Ｃ−末端には、アミノ酸配列が付加され得る。この目的のために、これらのミメティック
は、固体支持体（例えば、ＰＡＭ樹脂）上で、公知技術（例えば、Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｓｔｅ
ｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ 
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ．，Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ，III．を参照）により、またはシリル連結樹脂上にて、アルコール結合（Ｒａ
ｎｄｏｌｐｈら、Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５７１２−１４，１９９５を参
照すること）により、合成され得る。
【０１２２】
それに加えて、溶液合成技術および固相合成技術の両方の組合せは、本発明のペプチド
ミメティックを合成するのに利用され得る。例えば、固体支持体は、この配列に立体配置
的に束縛されたリバースターンを加える点まで、その直鎖ペプチド配列を合成するのに利
用され得る。溶液合成技術により予め合成された適当な立体配置的に束縛されたリバース
ターンミメティック構造体は、次いで、その固相合成の次の「アミノ酸」として加えられ
得る（すなわち、この立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックは、Ｎ−末端
およびＣ−末端の両方を有するが、その直鎖ペプチドに加えられる次のアミノ酸として、
利用され得る）。この配列に、この立体配置的に束縛されたリバースターンミメティック
構造体を取り込むと、次いで、追加アミノ酸が加えられ得、その固体支持体に結合された
ペプチドが完成する。あるいは、これらの直鎖Ｎ−末端およびＣ−末端保護ペプチド配列
は、固体支持体上で合成され、その支持体から除去され、次いで、公知の溶液カップリン
グ技術を使用して、溶液中にて、この立体配置的に束縛されたリバースターンミメティッ
ク構造体にカップリングされ得る。
【０１２３】
本発明の他の観点では、これらのライブラリを構成する方法が開示されている。伝統的
なコンビナトリアル・ケミストリー技術（例えば、Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．３７：１２３３〜１２５１，１９９４を参照）により、基本分子足場に試薬を連続的
に組み合わせることで、膨大な数の化合物を迅速に調製することが可能となる。コンビナ
トリアル技術は、天然に生じるアミノ酸から誘導されたペプチドライブラリを構築するの
に使用されている。例えば、２０種の適当に保護した異なるアミノ酸の２０種の混合物を
取り出し、そして各々を２０種のアミノ酸のうちの１種とカップリングすることにより、
４００種（すなわち、２０2）のジペプチドのライブラリが作り出される。この手順を７
回繰り返すと、約２６０億（すなわち、２０8）のオクタペプチドから構成されるペプチ
ドライブラリが調製される。
【０１２４】
具体的には、本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知のペプチド合
成技術（例えば、以下のような［４，４，０］リバースターンミメティックライブラリの
一般図式）を使用して、達成され得る。
【０１２５】
【化２６】
2007532674.tif 000022
【０１２６】
本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知技術により、ＦｌｅｘＣｈ
ｅｍ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｂｌｏｃｋ（これは、９６ウェルプレートを有する）を使用して、
達成した。上記図式では、「Ｐｏｌ」は、ブロモアセタール樹脂（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃ
ｈｅｍＴｅｃｈ）を示し、詳細な手順は、以下で説明する。
【０１２７】
（段階１）
ブロモアセタール樹脂（３７ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＲ2−アミンのＤＭ
ＳＯ溶液（１．４ｍＬ）を、９６ウェルプレートを有するＲｏｂｂｉｎｓブロック（Ｆｌ
ｅｘＣｈｅｍ）に入れた。その反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、１２時間振盪した。この樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯ
Ｈで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。
【０１２８】
（段階２）
前記樹脂に、市販のＦｍｏｃアミノ酸（４当量）、ＰｙＢｏｂ（４当量）、ＨＯＡｔ（
４当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）のＤＭＦ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で
、１２時間振盪した後、この樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄
した。
【０１２９】
（段階３）
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加え、その反応混合
物を、室温で、３０分間振盪した。この脱保護工程を再度繰り返し、前記樹脂をＤＭＦ、
ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂に、ヒドラジン酸（４当量）、
ＨＯＢｔ（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加え、前記反応混合物を、室
温で、１２時間振盪した。前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗
浄した。
【０１３０】
（段階４ａ（この場合、ヒドラジン酸は、ＭＯＣカーバメートである））
段階３で得た樹脂を、室温で、１８時間にわたって、ギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で
処理した。前記樹脂を濾過で除去した後、濾液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を
使用して、減圧下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。前記生成物を５０％水／アセ
トニトリルで希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。
【０１３１】
（段階４ｂ（この場合、Ｆｍｏｃヒドラジン酸を使用して、活性イソシアネートによっ
て尿素を製造する））
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加え、前記反応混合
物を、室温で３０分間振盪した。前記脱保護工程を再度繰り返し、前記樹脂をＤＭＦ、Ｍ
ｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応前にＤＣＭで膨潤した樹脂に、ＤＣＭ
中のイソシアネート（５当量）を加えた。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、
前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂を室温で
１８時間にわたって、ギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で処理した。前記樹脂を濾過で除去
した後、濾液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を使用して、減圧下にて濃縮し、オ
イルとして生成物を得た。前記生成物を５０％水／アセトニトリルで希釈し、次いで、凍
結後に凍結乾燥した。
【０１３２】
（段階４ｃ（この場合、Ｆｍｏｃヒドラジン酸を使用して、活性カーバメートによって
尿素を製造する））
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加え、前記反応混合
物を、室温で、３０分間振盪した。前記脱保護工程を再度繰り返し、前記樹脂をＤＭＦ、
ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応前にＤＣＭで膨潤した樹脂に、ＤＣ
Ｍ中のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５当量）およびジイソプロピルエチルアミ
ン（５当量）を加えた。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭ
Ｆ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂に、室温で１２時間にわた
って、ＤＣＭ中の第一級アミンを加え、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで
、ＤＣＭで洗浄した。反応後、前記樹脂を、室温で１８時間にわたってギ酸（各ウェルに
１．２ｍＬ）で処理した。前記樹脂を濾過で除去した後、濾液をＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡ
ＶＡＮＴ］を使用して、減圧下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。前記生成物を５
０％水／アセトニトリルで希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。
【０１３３】
これらのブロックライブラリを作成するために、製造実施例で説明した手順に従って、
重要な中間体ヒドラジン酸を合成した。
【０１３４】
表２Ａおよび表２Ｂは、本発明に従って製造できる［４，４，０］リバースターンミメ
ティックライブラリを示し、その代表的な製造は、実施例４で示す。
【０１３５】
【表２Ａ】
2007532674.tif 000023
【０１３６】
2007532674.tif 000024
【０１３７】
2007532674.tif 000025
【０１３８】
2007532674.tif 000026
【０１３９】
2007532674.tif 000027
【０１４０】
2007532674.tif 000028
【０１４１】
2007532674.tif 000029
【０１４２】
2007532674.tif 000030
【０１４３】
2007532674.tif 000031
【０１４４】
2007532674.tif 000032
【０１４５】
2007532674.tif 000033
【０１４６】
2007532674.tif 000034
【０１４７】
2007532674.tif 000035
【０１４８】
2007532674.tif 000036
【０１４９】
2007532674.tif 000037
【０１５０】
2007532674.tif 000038
【０１５１】
2007532674.tif 000039
【０１５２】
2007532674.tif 000040
【０１５３】
2007532674.tif 000041
【０１５４】
2007532674.tif 000042
【０１５５】
2007532674.tif 000043
【０１５６】
2007532674.tif 000044
【０１５７】
2007532674.tif 000045
【０１５８】
2007532674.tif 000046
【０１５９】
2007532674.tif 000047
【０１６０】
【表２Ｂ】
2007532674.tif 000048
【０１６１】
2007532674.tif 000049
【０１６２】
2007532674.tif 000050
【０１６３】
2007532674.tif 000051
【０１６４】
2007532674.tif 000052
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【０３１２】
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【０３１３】
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【０３１４】
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【０３１５】
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【０３１６】
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【０３１７】
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【０３１８】
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【０３１９】
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【０３２０】
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【０３２１】
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【０３２２】
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【０３２３】
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【０３２４】
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【０３２５】
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【０３２８】
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【０３２９】
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【０３３０】
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【０３３１】
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【０３３２】
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【０３３３】
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【０３３４】
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【０３３５】
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【０３３６】
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【０３３７】
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【０３３８】
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【０３３９】
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【０３４０】
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【０３４１】
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【０３４２】
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【０３４３】
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【０３４４】
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【０３４５】
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【０３４６】
2007532674.tif 000234
【０３４７】
2007532674.tif 000235
【０３４８】
2007532674.tif 000236
【０３４９】
2007532674.tif 000237
【０３５０】
2007532674.tif 000238
【０３５１】
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【０３５２】
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【０３５３】
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【０３５４】
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【０３５５】
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【０３５６】
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【０３５７】
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【０３５８】
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【０３５９】
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【０３６０】
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【０３６１】
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【０３６２】
2007532674.tif 000250
【０３６３】
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【０３６４】
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【０３６５】
2007532674.tif 000253
【０３６６】
2007532674.tif 000254
【０３６７】
2007532674.tif 000255
【０３６８】
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【０３６９】
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【０３７０】
2007532674.tif 000258
【０３７１】
2007532674.tif 000259
【０３７２】
2007532674.tif 000260
【０３７３】
2007532674.tif 000261
【０３７４】
2007532674.tif 000262
【０３７５】
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【０３７６】
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【０３７７】
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【０３７８】
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【０３７９】
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【０３８０】
2007532674.tif 000268
【０３８１】
2007532674.tif 000269
【０３８２】
2007532674.tif 000270
【０３８３】
2007532674.tif 000271
【０３８４】
2007532674.tif 000272
【０３８５】
2007532674.tif 000273
【０３８６】
2007532674.tif 000274
【０３８７】
2007532674.tif 000275
【０３８８】
2007532674.tif 000276
【０３８９】
2007532674.tif 000277
【０３９０】
2007532674.tif 000278
【０３９１】
2007532674.tif 000279
【０３９２】
2007532674.tif 000280
【０３９３】
2007532674.tif 000281
【０３９４】
2007532674.tif 000282
【０３９５】
2007532674.tif 000283
【０３９６】
2007532674.tif 000284
【０３９７】
2007532674.tif 000285
【０３９８】
2007532674.tif 000286
【０３９９】
2007532674.tif 000287
【０４００】
2007532674.tif 000288
【０４０１】
2007532674.tif 000289
【０４０２】
2007532674.tif 000290
【０４０３】
加えて、本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、以下のような［４，３
，０］リバースターンミメティックライブラリの一般的スキームを使用して、達成され得
る。
【０４０４】
【化２７】
2007532674.tif 000291
【０４０５】
本発明の二環式テンプレートライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知技術に
より、ＦｌｅｘＣｈｅｍ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｂｌｏｃｋ（これは、９６ウェルプレートを有
する）を使用して、達成した。上記図式では、「Ｐｏｌ」は、ブロモアセタール樹脂（Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）を示し、詳細な手順を、以下で説明する。
【０４０６】
（段階１）
ブロモアセタール樹脂（１．６ｍｍｏｌ／ｇ）およびＲ１アミンのＤＭＳＯ溶液（２Ｍ
溶液）を、９６ウェルＲｏｂｂｉｎｓブロック（ＦｌｅｘＣｈｅｍ）に入れた。前記反応
混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃
で１２時間振盪した。前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄し
た。
【０４０７】
（段階２）
前記樹脂に、市販のＦｍｏｃアミノ酸（４当量）、ＰｙＢｏｂ（４当量）、ＨＯＡｔ（
４当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）のＤＭＦ溶液を加えた。アミノ酸反応混合物を、室
温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗
浄した。
【０４０８】
（段階３）
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加えた。前記反応混
合物を室温で３０分間振盪した後、前記脱保護工程を再度繰り返し、次いで、ＤＭＦ、メ
タノールで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂に、ヒドラジンカルバモイルク
ロライド（４当量）、ＨＯＢｔ（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加えた
。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し
、次いで、ＤＣＭで洗浄した。
【０４０９】
（段階４）
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加えた。前記反応混
合物を室温で３０分間振盪した後、前記脱保護工程を再度繰り返し、次いで前記樹脂をＤ
ＭＦ、メタノールで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応前にＤＣＭで膨潤した樹脂
に、ＤＣＭ中のＲ1イソシアネート（５当量）を加えた。前記反応混合物を室温で１２時
間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。
【０４１０】
（段階５）
前記樹脂を室温で１８時間にわたってギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で処理した。前記
樹脂を濾過で除去した後、濾液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を使用して、減圧
下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。これらの生成物を５０％水／アセトニトリル
で希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。
【０４１１】
表３は、本発明に従って調製され得る［４，３，０］リバースターンミメティックライ
ブラリを示し、その代表的な製造を実施例５で示す。
【０４１２】
【表３】
2007532674.tif 000292
【０４１３】
2007532674.tif 000293
【０４１４】
2007532674.tif 000294
【０４１５】
2007532674.tif 000295
【０４１６】
2007532674.tif 000296
【０４１７】
2007532674.tif 000297
【０４１８】
2007532674.tif 000298
【０４１９】
2007532674.tif 000299
【０４２０】
2007532674.tif 000300
【０４２１】
本発明のさらに他の観点では、生体活性についてライブラリをスクリーニングし、生体
活性ライブラリメンバーを単離する方法を提供している。
【０４２２】
さらに他の観点では、本発明は結合アッセイを行う方法を提供するものである。この方
法は、第一活性化補助因子、相互作用蛋白質、および試験化合物を含めた組成物を準備す
ることを含む。前記第一活性化補助因子のアミノ酸構造は、ＬＸＸＬＬ、ＬＸＸＬＩ、ま
たはＦＸＸＦＦ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の結合モチーフを含有する。こ
の方法はまた、化合物の存在による前記第一活性化補助因子と前記相互作用蛋白質との間
の結合の変性を検出することと、その後、試験化合物の結合への影響を見つけ出すことを
さらに含む。
【０４２３】
アッセイは、試験化合物が二つの蛋白質間の結合に及ぼす影響を測定できる方法であれ
ば、いずれの方法で行われてもよい。このようなアッセイが当業界に多く知られており、
本発明の方法に用いられ得るが、いわゆる、２ハイブリッドシステムおよびスプリットハ
イブリッドシステムが挙げられる。
【０４２４】
２ハイブリッドシステムとこのシステムを用いてアッセイを行う多くの方法は、例えば
米国特許第６、４１０、２４５号に開示されている。スプリットハイブリッドシステムは
、例えば、Ｈｓｉｕ−Ｍｉｎｇ Ｓｈｉｕ ら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９３：１３８９６〜１３９０１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｏｈｎ Ｄ．Ｃｒ
ｉｓｐｉｎｏ．ら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，３：１〜２０，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １
９９９に開示されている。スプリットハイブリッドシステムにおいて、融合蛋白質が用い
られるが、この際、蛋白質Ｘは、ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合部位（ｐＬｅｘＡ）に融合され、
蛋白質Ｙは、転写活性化剤であるＶＰ１６（ｐＳＨＭ．１−ＬａｃＺ）に融合される。ｌ
ｅｘＡ−ＸおよびＶＰ１６−Ｙ間の相互作用は、テトラサイクリンリプレッサー蛋白質（
ＴｅｔＲ）の発現を導く。ＴｅｔＲは、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の転写を妨げ、細胞が
ヒスチジンの欠けている培地で成長できないようにする。蛋白質間相互作用の崩壊は、テ
トラサイクリンリプレッサーの発現を閉鎖することにより、細胞がそのような培地で成長
する能力を回復させるであろう。従って、本発明の化合物は、成長中の細胞に添加されて
もよく、若し、その添加が細胞が培地で成長する能力を回復させれば、その化合物は、蛋
白質間相互作用の有効な分断剤と認められる。
【０４２５】
スプリットハイブリッド系を形成するのに必要な酵母菌としては、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｍ
．Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ．ら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ １５（７）：３８１３〜３８２２，Ｊｕｌｙ １９９５に開示された２ハイブリッ
ド体であるＬｅｘＡ／ＶＰ１６構成物が用いられ得る。スプリットハイブリッドシステム
の有用な変更は、Ｔａｋｅｍａｒｕ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｍｏｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ｊ．ｏｆ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．１４９：２４９〜２５４によって活用された。
【０４２６】
他のアッセイ形式もまた適している。ＡＰ−１に対するレポーター遺伝子アッセイ、例
えばＥＬＩＳＡが挙げられるが、例えば、ＩＬ−２転写阻害剤を探すために、ＣＤ３およ
びＣＤ２８で刺激後、Ｔ−細胞株によるＩＬ−２の産生を遮断する。直接結合アッセイ（
活性化補助因子とこれらのパートナーとの間）は、表面プラスモン共鳴分光器（Ｂｉａｃ
ｏｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ，ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ）またはＥＬＩＳＡによって行うことができる。
【０４２７】
転写制御因子としては、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣｌ
、ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が例示されるが、これに制限されるもので
はない（例えば、Ｒｏｂｙｒ ら．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：
３２９〜３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ら．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．２３：２５５〜２７５；Ｌｅｏ ら．（２０００）Ｇｅｎｅ２４５：１〜１１
；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｐｏｌ．４６：７７〜８９；ＭｃＫｅｎｎａ ら．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ 
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３〜１２；Ｍａｌｉｋ ら．（２０００）Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７〜２８３；ａｎｄ Ｌｅｍｏｎ ら．
（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９〜５０４を参照）。
他の転写制御因子としては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−
６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰならびにＴＲＡＢ
１が例示されるが、これに制限されるものではない（例えば、Ｏｇａｗａら．（２０００
）Ｇｅｎｅ ２４５：２１〜２９；Ｏｋａｎａｍｉら．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌ
ｓ １：８７〜９９；Ｇｏｆｆら．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８〜３０９
；Ｃｈｏ ら．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９〜４２９；Ｕｌ
ｍａｓｏｎ ら．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５
８４４〜５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ら．（２０００）Ｐｌａｎｔ 
Ｊ．２２：１〜８；Ｇｏｎｇ ら．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３
３〜４４； および Ｈｏｂｏ ら．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ+ｃｉ
．ＵＳＡ ９６：１５，３４８〜１５，３５３）。
【０４２８】
好ましい実施形態において、前記転写活性化補助因子は、ヒト転写活性化補助因子であ
る。他の好ましい実施形態において、前記転写活性化補助因子は、ヒストン・アセチルト
ランスフェラーゼ活性を有する活性化補助因子のｐ３００／ＣＢＰファミリーメンバーで
ある。ｐ３００は、例えば、Ｅｃｋｎｅｒ ら．（１９９４）により開示され、ＣＢＰは
、ＢａｎｎｉｓｔｅｒおよびＫｏｕｚａｒｉｄｅｓ（１９９６）により開示されている。
本発明の目的のために、ｐ３００／ＣＢＰの引用は、ヒトのｐ３００の対立および合成変
異体に言及し、他の哺乳動物の変異体およびその対立および合成変異体に言及するのみな
らず、前記ヒトおよび哺乳動物のｐ３００の形態のフラグメントに言及する。このアッセ
イの一つの観点において、相互作用蛋白質が、転写因子または第二活性化補助因子である
。
【０４２９】
このアッセイの一つの観点において、前記相互作用蛋白質は、下記の中のいずれか一つ
である：ＲＩＰ１４０；ＳＲＣ−１（ＮＣｏＡ−１）；ＴＩＦ２（ＧＲＩＰ−１；ＳＲＣ
−２）；ｐ（ＣＩＰ；ＲＡＣ３；ＡＣＴＲ；ＡＩＢ−１；ＴＲＡＭ−１；ＳＲＣ−３）；
ＣＢＰ（ｐ３００）；ＴＲＡＰｓ（ＤＲＩＰｓ）；ＰＧＣ−１；ＣＡＲＭ−１；ＰＲＩＰ
（ＡＳＣ−２；ＡＩＢ３；ＲＡＰ２５０；ＮＲＣ）；ＧＴ−１９８；およびＳＨＡＲＰ（
ＣｏＡＡ；ｐ６８；ｐ７２）。このアッセイの他の観点において、前記相互作用蛋白質は
、下記の中のいずれか一つである：ＴＡＬ１；ｐ７３；ＭＤｍ２；ＴＢＰ；ＨＩＦ−１；
Ｅｔｓ−１；ＲＸＲ；ｐ６５；ＡＰ−１；Ｐｉｔ−１；ＨＮＦ−４；Ｓｔａｔ２；ＨＰＶ
Ｅ２；ＢＲＣＡ１；ｐ４５（ＮＦ−Ｅ２）；ｃ−Ｊｕｎ；ｃ−ｍｙｂ；Ｔａｘ；Ｓａｐ 
１；ＹＹ１；ＳＲＥＢＰ；ＡＴＦ−１；ＡＴＦ−４；Ｃｕｂｉｔｕｓ；Ｉｎｔｅｒｒｕｐ
ｔｕｓ；Ｇｌｉ３；ＭＲＦ；ＡＦＴ−２；ＪＭＹ；ｄＭａｄ；ＰｙＬＴ；ＨＰＶ Ｅ６；
ＣＩＴＴＡ；ＴａＴ；ＳＦ−１；Ｅ２Ｆ；ｊｕｎＢ；ＲＮＡ ヘリカーゼ Ａ；Ｃ／ＥＢＰ
βＧＡＴＡ−１；Ｎｅｕｒｏ Ｄ；Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｉｍｉａ；Ｅ１Ａ；ＴＦＩＩ
Ｂ；ｐ５３；Ｐ／ＣＡＦ；Ｔｗｉｓｔ；Ｍｙｏ Ｄ；ｐｐ９Ｏ ＲＳＫ；ｃ−Ｆｏｓ；およ
びＳＶ４０Ｌａｒｇｅ Ｔ。このアッセイの他の観点において、前記相互作用蛋白質は、
下記の中のいずれか一つである：ＥＲＡＰ１４０；ＲＩＰ１４０；ＲＩＰ１６０；Ｔｒｉ
ｐ１；ＳＷＩ１（ＳＮＦ）；ＡＲＡ７０；ＲＡＰ４６；ＴＩＦ１；ＴＩＦ２；ＧＲＩＰ１
；およびＴＲＡＰ。このアッセイの他の観点において、前記相互作用蛋白質は、下記の中
のいずれか一つである：ＶＰ１６；ＶＰ６４；ｐ３００；ＣＢＰ；ＰＣＡＦ；ＳＲＣ１ 
ＰｖＡＬＦ；ＡｔＨＤ２Ａ；ＥＲＦ−２；ＯｓＧＡＩ；ＨＡＬＦ−１；Ｃ１；ＡＰ−１；
ＡＲＦ−５；ＡＲＦ−６；ＡＲＦ−７；ＡＲＦ−８；ＣＰＲＦ１；ＣＰＲＦ４；ＭＹＣ−
ＲＰ／ＧＰ；およびＴＲＡＢ１。本発明のまた他の観点において、前記第一活性化補助因
子は、ＣＢＰまたはｐ３００である。
【０４３０】
試験化合物は、以下の化合物の中から選択される。例えば、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、
（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＶＩ）、および（ＶＩａ）を有する化合物。典型的には、試験
化合物は、様々な濃度において検討されるが、これらの濃度は、部分的にはアッセイ条件
に応じて選択され、アッセイ条件の例を挙げると、第一活性化補助因子および相互作用蛋
白質の濃度である。約０．１から１０μＭ範囲の濃度が典型的である。ある観点において
、このアッセイが、二つの蛋白質間の結合相互作用に影響を及ぼす二つの化合物の相対的
な効用を評価するということであるが、この二つの化合物の少なくとも一つは本発明によ
る化合物である。より有効な化合物が、化合物構造と化合物活性との間の関係を研究する
のに参照化合物となり得る。
【０４３１】
本発明のライブラリを、種々の技術および方法により、生体活性についてスクリーニン
グした。一般に、このスクリーニングアッセイは、（１）ライブラリのミメティックを目
的の生体標的（例えば受容体）と接触させて、そのライブラリのミメティックと標的との
間の結合を起こすことにより、そして（２）適当なアッセイ（例えば、Ｌａｍら（Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５４：８２〜８４，１９９１）またはＧｒｉｍｉｎｓｋｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ １２：１００８〜１０１１，１９９４）により開示された熱量測定アッセ
イ）（これらの両方は、本明細書中で参考として援用される）により、その結合事象を検
出することにより、実行され得る。好ましい実施形態では、これらのライブラリメンバー
は、溶液中にあり、その標的は、固相に固定化される。あるいは、このライブラリは、固
相に固定化され得、それを溶液中で標的と接触させることにより、調べられ得る。
【０４３２】
以下の表４は、本発明のライブラリから選択された生体活性試験用化合物およびそれら
のＩＣ50値（これらは、実施例６で記述したように、レポーター遺伝子アッセイで測定さ
れる）を示す。
【０４３３】
【表４】
2007532674.tif 000301
【０４３４】
2007532674.tif 000302
【０４３５】
2007532674.tif 000303
【０４３６】
2007532674.tif 000304
【０４３７】
2007532674.tif 000305
【０４３８】
2007532674.tif 000306
【０４３９】
2007532674.tif 000307
【０４４０】
2007532674.tif 000308
【０４４１】
2007532674.tif 000309
【０４４２】
2007532674.tif 000310
【０４４３】
2007532674.tif 000311
【０４４４】
2007532674.tif 000312
【０４４５】
2007532674.tif 000313
【０４４６】
2007532674.tif 000314
【０４４７】
2007532674.tif 000315
【０４４８】
2007532674.tif 000316
【０４４９】
2007532674.tif 000317
【０４５０】
2007532674.tif 000318
【０４５１】
2007532674.tif 000319
【０４５２】
2007532674.tif 000320
【０４５３】
2007532674.tif 000321
【０４５４】
2007532674.tif 000322
【０４５５】
2007532674.tif 000323
【０４５６】
2007532674.tif 000324
【０４５７】
2007532674.tif 000325
【０４５８】
2007532674.tif 000326
【０４５９】
2007532674.tif 000327
【０４６０】
2007532674.tif 000328
【０４６１】
2007532674.tif 000329
【０４６２】
2007532674.tif 000330
【０４６３】
2007532674.tif 000331
【０４６４】
2007532674.tif 000332
【０４６５】
2007532674.tif 000333
【０４６６】
2007532674.tif 000334
【０４６７】
2007532674.tif 000335
【０４６８】
2007532674.tif 000336
【０４６９】
2007532674.tif 000337
【０４７０】
2007532674.tif 000338
【０４７１】
2007532674.tif 000339
【０４７２】
2007532674.tif 000340
【０４７３】
2007532674.tif 000341
【０４７４】
2007532674.tif 000342
【０４７５】
2007532674.tif 000343
【０４７６】
2007532674.tif 000344
【０４７７】
2007532674.tif 000345
【０４７８】
2007532674.tif 000346
【０４７９】
2007532674.tif 000347
【０４８０】
2007532674.tif 000348
【０４８１】
2007532674.tif 000349
【０４８２】
本発明によれば、一般式（Ｉ）の化合物（特に、一般式（ＶＩ）の化合物）は、それが
ＣＢＰに特異的に結合するために、癌細胞におけるＣＢＰ媒介転写活性を阻害できること
が発見されており、それは、ＳＷ４８０細胞のＣＢＰを本発明の化合物で免疫沈降するこ
とにより、裏付けられる。
【０４８３】
本発明の化合物は、また、ＳＷ４８０細胞でのスルビビン発現を阻害でき、従って、癌
細胞の発癌活性を阻害できる。本発明の化合物は、癌細胞を阻害するのに使用でき、それ
ゆえ、細胞増殖を調節するのに有用となる。このような結果を確証して、本発明の化合物
は、さらに、ＳＷ４８０細胞でのカスパーゼ−３活性を誘発でき、従って、細胞において
アポトーシス活性を誘発できることを示す。本発明の化合物はまた、細胞においてアポト
ーシスを誘発するのに有利に使用できる。
【０４８４】
癌細胞での発癌活性を確認するために、以下の方法により、インビトロＭＴＳ細胞毒性
アッセイを試験した。
【０４８５】
（１）細胞毒性試験
ＳＷ４８０細胞またはＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルマイクロプレート（１０4個の細
胞／ウェル）に入れ、そして３７℃で、２４時間インキュベートした。これらの細胞を、
２４時間にわたって、種々の濃度のＴＣＦ４化合物で処理した。各ウェルに２０μｌのＭ
ＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、そして３７℃で、２時間インキュベートした。マイ
クロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、４９０ｎ
ｍの吸光度を読み取ることにより、細胞生存度を測定し、各濃度での化合物の細胞毒性を
算出した。
【０４８６】
（２）成長阻害アッセイ
ＳＷ４８０細胞またはＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルマイクロプレート（１０4個の細
胞／ウェル）に入れ、そして３７℃で、２４時間インキュベートした。各ウェルに、２０
μｌの［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシフェニ
ル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩］（ＭＴＳ）溶液（
Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、３７℃で２時間インキュベーションした後の吸光度（ネガティ
ブ・コントロール）を読み取った。次いで、これらの細胞を、４８時間にわたって、種々
の濃度のＴＣＦ４化合物で処理した。各ウェルに、２０μｌのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を加え、そして３７℃で、２時間インキュベートした。マイクロプレート読み取り装
置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、４９０ｎｍの吸光度を読み取るこ
とにより、細胞生存度を測定し、各濃度での化合物の細胞毒性を算出した。
【０４８７】
選択したライブラリ化合物についての発癌活性の結果を表５に示した。表５の化合物番
号は、表４の化合物番号と関係ない。
【０４８８】
【表５】
2007532674.tif 000350
【０４８９】
2007532674.tif 000351
【０４９０】
2007532674.tif 000352
【０４９１】
2007532674.tif 000353
【０４９２】
2007532674.tif 000354
【０４９３】
2007532674.tif 000355
【０４９４】
2007532674.tif 000356
【０４９５】
2007532674.tif 000357
【０４９６】
2007532674.tif 000358
【０４９７】
2007532674.tif 000359
【０４９８】
2007532674.tif 000360
【０４９９】
2007532674.tif 000361
【０５００】
2007532674.tif 000362
【０５０１】
2007532674.tif 000363
【０５０２】
2007532674.tif 000364
【０５０３】
2007532674.tif 000365
【０５０４】
2007532674.tif 000366
【０５０５】
2007532674.tif 000367
【０５０６】
2007532674.tif 000368
【０５０７】
2007532674.tif 000369
【０５０８】
2007532674.tif 000370
【０５０９】
2007532674.tif 000371
【０５１０】
2007532674.tif 000372
【０５１１】
2007532674.tif 000373
【０５１２】
2007532674.tif 000374
【０５１３】
2007532674.tif 000375
【０５１４】
2007532674.tif 000376
【０５１５】
2007532674.tif 000377
【０５１６】
2007532674.tif 000378
【０５１７】
2007532674.tif 000379
【０５１８】
2007532674.tif 000380
【０５１９】
2007532674.tif 000381
【０５２０】
2007532674.tif 000382
【０５２１】
2007532674.tif 000383
【０５２２】
2007532674.tif 000384
【０５２３】
2007532674.tif 000385
【０５２４】
2007532674.tif 000386
【０５２５】
2007532674.tif 000387
【０５２６】
2007532674.tif 000388
【０５２７】
2007532674.tif 000389
【０５２８】
2007532674.tif 000390
【０５２９】
2007532674.tif 000391
【０５３０】
2007532674.tif 000392
【０５３１】
2007532674.tif 000393
【０５３２】
2007532674.tif 000394
【０５３３】
ほかの観点では、本発明は、一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）、一般
式（ＩＶ）または一般式（ＶＩ）の構造を有する化合物を含有する医薬組成物を提供する
。これらの組成物は、後述する様々な方法（例えば、癌またはアルツハイマー病の治療）
に用いられ得る。
【０５３４】
本発明による医薬組成物は、目的とする投与方法に応じて剤形化することができる。投
与方法としては、非経口（例えば静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（
局所）、経粘膜、および直腸投与のような投与が例示される。非経口、皮内または皮下投
与に用いられる液剤または懸濁剤としては、以下の成分を含んでも良い：滅菌希釈液（例
えば、注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロ
ピレングリコール、またはその他の合成溶媒）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールま
たはメチルパラベン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウ
ム）、キレート剤（例えば、エチルジアミン四酢酸）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、ま
たはリン酸塩）、および等張化剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。そ
の他、ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節することが
できる。非経口剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製
複数回投与バイアルに封入することができる。
【０５３５】
注射用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と、滅菌注射
液または分散液の即時調整用製剤のための滅菌粉末とを含む。静脈内投与の場合、適切な
キャリアとしては、生理食塩水、静菌水、クレモフォア（Cremophor） ＥＬ（商標）（Ｂ
ＡＳＥ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を挙げら
れる。いかなる場合でも、前記組成物は、滅菌状態でなければならず、また容易に注射可
能な程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵の状態下で安定でなければならず
、バクテリアおよび真菌などの微生物に汚染されずに保存されなければならない。前記キ
ャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピ
レングリコール、および液相ポリエチレングリコールなど）、そしてこれらの適合した混
合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン
などの被覆物の使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持により、また界面活性剤の
使用により維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（
例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール）に
より達成することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、ポリアルコ
ール、（例えば、マニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム））を含有することが好ま
しい。注射用組成物の遅延吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アル
ミニウムおよびゼラチン）を前記組成物に含有させることにより行われる。
【０５３６】
滅菌注射剤は、必要に応じて、上述した成分の単独または組合せと共に、適切な溶媒中
に、必要な量で、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）または（ＶＩ）の構造
を有する化合物である活性化合物を混入させた後、濾過による滅菌により調製することが
できる。一般に、分散液は、上述したものから必要な他の成分と分散媒体とを含有する滅
菌媒介体中に活性化合物を混入させて調製する。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場
合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥させて、予め滅菌−濾過された溶液か
らの追加の所望の成分および活性成分の粉末を調製するものである。
【０５３７】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含有する。これらは、ゼラ
チンカプセル中に封止され、あるいは錠剤中に押し込まれることができる。経口治療の投
与目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に混入されることができ、錠剤、トローチ、
またはカプセルの形態で用いられ得る。経口組成物はまた、うがい薬で用いるための流動
性キャリアを用いて調製することができ、ここで、流動キャリア中の前記化合物は、経口
的に適用され、ヒュっと音を出したり、吐かれたりまたは飲み込まれたりする。薬学的に
適合性な結合剤および／または補助剤物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸
薬、カプセル、トローチは、以下の成分または類似性質の化合物のいずれかのものを含有
することができる：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカント、またはゼラチ
ン）、賦形剤（例えば、デンプン、ラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモ
ゲル（Primogel）、またはコーンスターチ）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム
またはステロッツ（Sterotes））、流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、甘
味剤（例えば、スクロース、サッカリン）、または香料添加剤（例えば、ペパーミント、
メチルサリチル酸、またはオレンジ・エッセンス）を含有することができる。
【０５３８】
吸入投与の場合、化合物は、適切な噴射剤（例えば、二酸化炭素などのガス）または噴
霧剤を含有する、加圧容器またはディスペンサーからエアゾールスプレーの形態で供給さ
れる。
【０５３９】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与の
場合、浸透しようとするバリアに好適な浸透剤が剤形に用いられる。このような浸透剤は
、一般に当該分野において公知となっており、また例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆
汁塩、フシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは座薬の使用により
達成される。経皮投与の場合、活性化合物は、一般に当該分野において公知となっており
、軟膏、膏薬またはクリームの形態に剤形化される。
【０５４０】
化合物はまた、座薬（例えば、カカオ脂およびグリセリドなどの通常の座薬の基剤とと
もに）または直腸投与のための停留浣腸剤の形態に調製することができる。
【０５４１】
１実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化した運搬
システムを含む、制御された放出剤形のように、身体からの速い除去に対して前記化合物
を保護するキャリアと共に調製される。生分解性、生体適合性高分子、例えば、エチレン
酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、および
ポリ乳酸が用いられ得る。このような剤形の調製方法は、当該分野における技術者にとっ
ては自明なことである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ 
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手することができる。リポソーム懸濁
剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染された細胞を標的にされたリポソー
ムを含む）はまた、薬学的に許容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば
、米国特許第４，５２２，８１１号に開示されたように、当該分野の技術者にとって公知
の方法により調製することができる。
【０５４２】
投与の容易性および用量の均一性のために、投与量単位の形態で経口的または非経口的
組成物を剤形化することがさらに有利である。ここで用いられる投与量単位の形態とは、
治療対象の患者のための単一容量に好適な物理的に区別された単位を意味し、それぞれの
単位は、必要な薬学的キャリアと関連して所望の治療効果を得るために、計算された所定
量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位の形態についての明細書は、前記活性化合
物の独特な特徴、達成しようとする特別な治療効果、および個々の治療のためそのような
活性化合物を混合する技術に固有な制限により指示されるか、あるいはこれらによって直
接依存する。
【０５４３】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％が致死
する容量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な容量）を測定するた
めの、細胞培養または実験動物の標準的製薬手続きによって決定することができる。毒性
と治療効果間の用量比は治療指数であり、また、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表
すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が用
いられ得るが、感染されなかった細胞に可能な損傷を最小化するために、感染された組織
の部位にこのような化合物を運び、これによって副作用を減らす運搬システムをデザイン
するために注意を払わなければならない。
【０５４４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用される投与量の範
囲を公式化するのに用いてもよい。このような化合物の投与量は、毒性が殆どまたは全く
ないＥＤ５０を含む循環する濃度の範囲内とすることが好ましい。投与量は、使用された
剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変化することができる。本発明の方法で用い
られるいかなる化合物に対しても、治療に有効な用量を、最初は、細胞培養アッセイから
算定することができる。用量は、循環血漿濃度を達成するために、動物モデルにおいて公
式化することができるが、これは、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最
大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む。このような情報は、ヒトに有用な用
量をさらに正確に決定するために用いられる。血漿濃度は、例えば、ＨＰＬＣによって測
定することができる。
【０５４５】
例えば、特定の実施形態において、本発明の適当な医薬組成物は、単位剤形で経口投与
に適切なもの、例えば、約１ｍｇ〜約１ｇの本発明の化合物を含有する錠剤またはカプセ
ル剤である。ほかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、静脈内注射、皮下注射ま
たは筋肉内注射に適当なものである。患者は、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの
本発明の化合物の静脈内用量、皮下用量または筋肉内用量を受け得る。この静脈内用量、
皮下用量および筋肉内用量は、大量注射により、与えられ得る。あるいは、この静脈内用
量は、一定時間にわたる連続注入により、与えられ得る。あるいは、患者は、毎日非経口
用量にほぼ等しい毎日経口用量を受け、その組成物は、１日あたり、１〜４回で、投与さ
れる。
【０５４６】
以下の表は、ヒトにおける治療用途または予防用途のために、この化合物またはそれら
の薬学的に許容可能な塩を含有する代表的な製薬剤形を示す。
[表] 
2007532674.tif 000395
【０５４７】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（ＶＩ）の化合物を含有する
医薬組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が変調した障害、具体的に、癌、より具体的には
、直腸結腸癌を治療するのに使用できる。
【０５４８】
本発明の一観点では、本発明は、δおよびμオピオイドレセプタへの放射性標識化エン
ケファリン誘導体の結合を阻害する化合物を提供する。従って、本発明のリバースターン
ミメティックは、レセプタ作用薬および潜在性鎮痛薬として用いられ得る。
【０５４９】
本発明の別の観点では、本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。このよ
うな方法は、腫瘍細胞の成長を阻害する有効量で、一般式（Ｉ）を有する化合物、特に、
一般式（ＶＩ）の化合物を、腫瘍を有する患者（例えば、哺乳動物被検体）に投与する工
程を含む。化合物または組成物は、腫瘍の大きさが治療しなかったものよりも、化合物ま
たは組成物の治療を受けた患者において統計的に顕著に小さい場合、腫瘍の成長を阻害す
る。
【０５５０】
腫瘍成長に対する本発明による特定な化合物または組成物の阻害効果は、当該分野にお
いて公知となった任意の適宜方法により特徴づけられてもよい。例えば、スルビビン発現
に対する化合物または組成物の効果を測定することができる。スルビビン発現を下方制御
する化合物または組成物は、腫瘍成長に対する阻害効果をおそらく示す。その他、腫瘍細
胞株を用いたアッセイ（例えば、ＳＷ４８０細胞を用いた軟寒天アッセイ）および腫瘍成
長の動物モデル（例えば、腫瘍細胞を移植したヌードマウスおよび Ｍｉｎマウスモデル
）はまた、実施例において詳述するように、所定の化合物または組成物の腫瘍の成長に対
する阻害効果を評価するのに用いられ得る。腫瘍成長に対する他の例示的な動物モデルま
たは異種移植片は、乳癌（Ｇｕｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：４６７８〜８４，２
００２；Ｌｕら，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．５７：１８３〜９２
，１９９９）、膵癌（Ｂｏｕｖｅｔら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：１５３４〜４０，
２００２）、卵巣腫瘍（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．４９：９３〜１００，２００２；Ｂａｏら，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ
．７８：３７３〜９，２０００）、黒色腫（Ｄｅｍｉｄｅｒｍら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
．６１：２２９４〜３００，２００１）、直腸結腸癌（Ｂｒｏｗｎら，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．
Ｓｃｉ．４５：１５７８〜８４，２０００；Ｔｓｕｎｏｄａら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ 
Ｒｅｓ．１９：１１４９〜５２，１９９９；Ｃａｏら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
．５：２６７〜７４，１９９９：Ｓｈａｗｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐ
ｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２０１〜８，１９９５；ＭｃＧｒｅｇｏ
ｒら，Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ．Ｒｅｃｔｕｍ．３６：８３４〜９，１９９３；Ｖｅｒｓｔｉ
ｊｎｅｎら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１９３〜２００，１９８８）、肝細
胞癌（Ｌａｂｏｎｔｅら，Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．１８：７２〜８５，２０００）、お
よび胃癌（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：２４３〜７，２０
００）に関するものを含む。
【０５５１】
腫瘍成長を阻害する化合物または組成物は、例えば、腫瘍が残留する組織に応じて、適
切な経路を経て腫瘍を有する患者に投与することができる。適切な用量は、上述したよう
に、当該分野において公知となった知識および技術を用いて決定することができる。腫瘍
成長に対する化合物または組成物の治療効果はまた、当該分野において公知となった方法
を用いてモニターされ得る。様々な方法としては、例えば、結腸鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査
、生体検査、コンピュータ断層撮影法、超音波、磁気共鳴映像法、および陽電子放出断層
撮影法を含み、直腸結腸癌の進行および／または成長を監視するのに用いられ得る。卵巣
癌の進行および／または成長を監視する方法としては、例えば、超音波、コンピュータ断
層撮影法、磁気共鳴映像法、胸部Ｘ線、腹腔鏡検査法、組織検査が挙げられる。
【０５５２】
本発明の関連する観点では、本発明は癌の治療または予防方法を提供する。このような
方法は、被験体の癌を治療または予防する有効量で、一般式（Ｉ）を有する化合物または
組成物、特に、一般式（ＶＩ）を有する化合物または組成物を、それを必要とする被験体
に投与する工程を含む。癌の治療は、癌の進行（例えば、癌の成長および転移）を減少ま
たは除去することを含むものと理解される。癌の予防は、癌の開始を防止または遅延する
ことを含むものと理解される。様々な類型の癌が、本発明によって治療または予防され得
る。これらには、肺癌、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、神経膠
腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病を含むが、これらに制限されるものではない。
【０５５３】
治療を必要とする患者としては、様々な類型の癌に罹ったヒトもしくは非ヒト霊長類ま
たは他の動物であってもよい。予防を必要とする患者としては、癌が発生する危険のある
ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の動物であってもよい。癌を診断し、また癌の危険が
大きい個々の患者をスクリーニングする方法は、当該分野において公知となっており、ま
た本発明で用いられ得る。例えば、直腸結腸癌は、糞便潜血検査、Ｓ状結腸鏡検査、結腸
鏡検査、空気注腸造影、および仮想結腸鏡検査によって診断することができる。直腸結腸
癌の危険が高い個々の患者は、一つ以上の直腸結腸癌の危険因子、例えば、強い家族歴の
直腸結腸癌またはポリープ、公知となった家族歴の遺伝性直腸結腸癌症候群、個人歴の腺
腫性ポリープ、および個人歴の慢性炎症性大腸炎を有する。
【０５５４】
癌の治療または予防に有用な一般式（Ｉ）の化合物は、当該分野において公知となった
適切な方法により同定することができる。上述したように、腫瘍成長の阻害効果のための
化合物を選択するのに使用される方法がまた用いられ得る。投与経路、所定の化合物の投
与量、治療の効果は、当該分野において公知となった知識および技術を用いて決定するこ
とができる。このような決定において考慮すべき因子としては、例えば、治療する癌の類
型および段階が挙げられる。
【０５５５】
癌の治療および予防に有用な一般式（Ｉ）の化合物は、抗腫瘍薬との組合せで投与する
ことができる。抗腫瘍薬は、腫瘍成長を阻害する化合物を参照する。例示的な抗腫瘍薬と
しては、フルオロラウシル；５−フルオロ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン（
５−ＦＵ）、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンＣ、テガフール、ラルチトレキ
セド、カペシタビン、およびイリノテカンが挙げられる（Ａｒａｎｇｏら，Ｃａｎｓｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１，２００１ ４９１０〜４９１５）。抗腫瘍薬との組合せで投与
された一般式（Ｉ）の化合物は、必ずしも化合物および抗腫瘍薬が同時に投与されること
を必要としない。化合物および薬剤は、一度に、これらの両方が同一の癌細胞に対して効
果を及ぼす限り、独立して投与してもよい。
【０５５６】
本発明のさらに他の関連する観点では、本発明は癌細胞のアポトーシスを誘発する方法
を提供する。このような方法は、これらの細胞のアポトーシスを誘発する有効量で、一般
式（Ｉ）、特に（ＶＩ）の化合物を癌細胞に接触させる工程を含む。アポトーシスを行う
癌細胞の数が、化合物の不在下よりも、化合物の存在下で統計的に顕著に多い場合、化合
物はアポトーシスを誘発する。このような化合物は、培養された癌細胞株、異種移植片、
または動物癌モデルを使用して、当該分野において公知となった方法（例えば、カスパー
ゼ活性および／または細胞死を測定）により同定することができる。好ましくは、前記化
合物は、正常細胞よりも、癌細胞においてアポトーシスを誘発するのにさらに活性である
。様々な組織起源の癌細胞が、本発明により治療可能である。
【０５５７】
本発明の別の観点では、Ｗｎｔシグナル伝達経路が変調した障害を治療する方法が開示
され、該方法は、患者に、一般式（Ｉ）を有する化合物、特に、一般式（ＶＩ）の化合物
の安全有効量を投与する工程を含む。本発明の化合物を含有する医薬組成物もまた、この
目的に使用できる。このことに関連して、本発明では、一般式（Ｉ）を有する化合物、特
に、一般式（ＶＩ）の化合物またはそれらを含有する医薬組成物が、ＴＣＦ４−β−カテ
ニン−ＣＢＰ複合体（これは、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関連した癌細胞の過剰発現を開
始する原因となると考えられている）が変調した障害を治療するのに使用できることが見
出されている。それゆえ、一般式（Ｉ）を有する化合物 、特に、一般式（ＶＩ）の化合
物を使用して、ＴＣＦ−４−βカテニン−ＣＢＰ複合体が変調した障害を治療する方法を
提供することは、本発明の別の観点である。
【０５５８】
本発明は、スルビビン発現を阻害する化合物および方法をまた提供する。スルビビンは
、ＴＣＦ／β−カテニン経路の標的遺伝子であり、より具体的には、ＴＣＦ／β−カテニ
ン／ＣＢＰ経路の標的遺伝子である。これは、蛋白質のＩＡＰ（アポトーシス蛋白質の抑
制剤）ファミリーのメンバーである。スルビビンと関連した生物学的活性は、細胞サイク
ル入口と出口を調節するＧ2／Ｍにおいて高度に発現；細胞サイクル相によって微小管、
中心体（centrosome）、セントロメア、中心体（midbody）と関連；カスパーゼ（例えば
、カスパーゼ３、７および９）との直接または間接の相互作用を通じた抗アポトーシスと
を含む。癌と関連して、スルビビンは、腫瘍細胞に広範囲かつ高度に発現されるが、正常
組織細胞では、殆どまたは全く発現されない。また、腫瘍がスルビビンを発現した癌患者
は、全体的な生存率が減少することが観察された。さらに、スルビビンの発現程度は、他
の癌のマーカー、例えば、Ｋｉ６７、ＰＮＣＡ、ｐ５３、ＡＰＣなどと相互関連されてい
る。
【０５５９】
スルビビン発現への本発明による特定の化合物の影響は、当該分野において公知となっ
た方法によって特徴づけられる。このような方法は、転写または翻訳レベルにおいてスル
ビビン発現を特徴付ける方法を含む。転写レベルでのスルビビン発現を特徴づける例示的
な方法は、ｃＤＮＡ微小配列、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、クロマ
チン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、スルビビンプロモータによって推進されたレポーター活性の
アッセイである。翻訳レベルでのスルビビン発現を特徴づける例示的な方法は、ウエスタ
ンブロット分析、免疫化学およびカスパーゼ活性である。これらの例示的な方法の詳細は
、下記実施例において見いいだされるであろう。
【０５６０】
上述したように、本発明は、スルビビン発現を阻害する方法を提供する。このような方
法は、スルビビン発現を阻害する有効量で、本発明の化合物をスルビビン発現細胞に接触
させる工程を含む。細胞内のスルビビン発現が、化合物の不在下よりも、化合物の存在下
で減少する場合、その化合物はスルビビン発現を阻害する。スルビビン発現細胞は、例え
ば、肺癌、乳癌、胃癌、膵癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、神経膠腫、黒色腫、直腸結腸癌、
リンパ腫、および白血病からのまたは中の細胞を発現させる腫瘍細胞を含む。化合物をス
ルビビン発現細胞に接触させる工程は、インビトロ、生体外、インビボにおいて行うこと
ができる。スルビビン発現を阻害するのに有用な化合物を、同定することができ、また、
本発明による特定の化合物の効果は、上述したように当該分野において公知となった適切
な方法によって特徴づけられる。
【０５６１】
本発明の化合物は、スルビビンの発現を阻害することが明らかとなっている。Ｂｌａｎ
ｃ−Ｄｒｕｄｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：９８７（２００２）は、スルビビン
が平滑筋細胞アポトーシスの重要な制御因子であり、これは、病理学的血管壁再構築で重
要であることを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、血管形成術に関連した
再狭窄を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明の
リバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発
明は、再狭窄を治療し、すなわち、再狭窄に罹った被験体に本発明のリバースターンミメ
ティックを投与すると、再狭窄の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形
態では、本発明は、再狭窄を予防し、すなわち、新規または追加の再狭窄を発症すると予
測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、予想される再
狭窄の重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験
体である。
【０５６２】
本発明の化合物は、ＴＣＦ／β−カテニン転写を阻害することが明らかとなっている。
Ｒｏｄｏｖａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２９５７７（２００２）は、ＰＫＤ
−１プロモータがβ−カテニン／ＴＣＦ経路の標的であることを明らかにしている。従っ
て、本発明の他の観点は、腎多嚢胞病を治療または予防する方法を提供し、該方法は、そ
れが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程
を含む。１実施形態では、本発明は、腎多嚢胞病を治療し、すなわち、腎多嚢胞病に罹っ
た被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、腎多嚢胞病の重症度、範
囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、腎多嚢胞病を予防し、す
なわち、新規または追加の腎多嚢胞病を発症すると予測されている被験体に本発明のリバ
ースターンミメティックを投与すると、予想される腎多嚢胞病の重症度、範囲または程度
などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６３】
本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。
Ｈａｎａｉら、Ｊ：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．１５８：５２９（２００２）は、公知の抗血管原
性因子であるエンドスタチンがＷｎｔのシグナル伝達を阻害することを明らかにしている
。従って、本発明の他の観点は、異常血管形成疾患を治療または予防する方法を提供し、
該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を
投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、異常血管形成疾患を治療し、すなわち
、異常血管形成疾患に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると
、異常血管形成疾患の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本
発明は、異常血管形成疾患を予防し、すなわち、新規または追加の異常血管形成疾患を発
症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、異
常血管形成疾患の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被
験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６４】
本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。
Ｓｅｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）９７：２７９１（２０００）は、関節リウマチ疾
患に罹った哺乳動物がＲＡ滑膜組織においてＷｎｔおよびＦｚの高い発現を示すことを明
らかにしている。従って、本発明の他の観点は、関節リウマチを治療または予防する方法
を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安
全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、関節リウマチ疾患を治療し
、すなわち、関節リウマチ疾患に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを
投与すると、関節リウマチ疾患の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形
態では、本発明は、関節リウマチ疾患を予防し、すなわち、新規または追加の関節リウマ
チ疾患を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与
すると、関節リウマチ疾患の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意
に、この被験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６５】
本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。
Ｕｔｈｏｆｆら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１９：８０３（２００１）は、（クローン病
患者と比較して）潰瘍性大腸炎では、乱れたおよびｆｚ（Ｗｎｔ経路分子）の差次的上方
制御が起こることを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、潰瘍性大腸炎を治
療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースタ
ーンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、潰瘍
性大腸炎を治療し、すなわち、潰瘍性大腸炎に罹った被験体に本発明のリバースターンミ
メティックを投与すると、潰瘍性大腸炎の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他
の実施形態では、本発明は、潰瘍性大腸炎を予防し、すなわち、新規または追加の潰瘍性
大腸炎を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与
すると、潰瘍性大腸炎の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、
この被験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６６】
本発明の化合物は、Ｗｎｔ経路のＴＣＦ／カテニンのシグナルを阻害することが明らか
となっている。従って、本発明の他の観点は、結節硬化症（ＴＳＣ）を治療または予防す
る方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティッ
クの安全有効量を投与する工程を含む。ＴＳＣを有する被験体は、典型的に脳、心臓、腎
臓、および他の組織において多発性局所性病変を示す（例えば、Ｇｏｍｅｚ，Ｍ．Ｒ．Ｂ
ｒａｉｎ Ｄｅｖ．１７（ｓｕｐｐｌ）：５５〜５７（１９９５））。哺乳類細胞の研究
は、ＴＳＣ１（ハマルチンを発現する）およびＴＳＣ２（ツベリンを発現する）の過剰発
現が、細胞増殖を負に調節し、また、Ｇ1／Ｓ停止を誘発することが明らかとなっている
（例えば、Ｍｉｌｏｌｏｚａ，Ａ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：１７２１〜１
７２７（２０００））。他の研究は、ハマルチンおよびツベリンが β−カテニン分解複
合体のレベルで作用し、また、より具体的には、これらの蛋白質がβ−カテニン分解複合
体に加わることにより、β−カテニンの安定性および活性を負に調節することが明らかと
なっている（例えば、Ｍａｋ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（８）：５
９４７〜５９５１．（２００３））。β−カテニンは、膜結合型カドヘリンファミリのメ
ンバーとの結合を通じて細胞粘着に関与し、また、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路の主要
な成分として、細胞増殖および細胞分化に関与する９５−ｋＤａ蛋白質である（例えば、
Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：６７２〜
６７８（２００１））。この経路の間違い調節は、ヒトおよび齧歯動物において腫瘍を発
生させることが明らかとなっている。本発明は、β−カテニンの活性および、特に他の蛋
白質とのその相互作用を調節する化合物を提供し、従って、ＴＳＣの治療に使用される化
合物を提供する。１実施形態では、本発明は、ＴＳＣを治療し、すなわち、ＴＳＣに罹っ
た被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、ＴＳＣの重症度、範囲ま
たは程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、ＴＳＣを予防し、すなわち、
新規または追加のＴＳＣを発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミ
メティックを投与すると、ＴＳＣの予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる
。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６７】
本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。
カポジ肉腫関連ヘルパス・ウィルス（ＫＳＨＶ）潜伏関連核抗原（ＬＡＮＡ）は、原発性
滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）および多中心性キャッスルマン病のようなカポジ肉腫（ＫＳ）
およびβ−細胞腫瘍を含めた全てのＫＳＨＶ関連腫瘍において発現される。Ｆｕｊｉｍｕ
ｒｏ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（３）：３００〜３０６（２００３）
は、ＬＡＮＡが、外見上では、負の調節ＧＳＫ−３βの再分配によって、β−カテニンの
安定化作用を果たすことを明らかにしている。本発明は、β−カテニン蛋白質相互作用、
例えば、β−カテニン／ＴＣＦ複合体の形成を阻害する化合物および方法を提供する。従
って、本発明の化合物は、β−カテニン／ＴＣＦ複合体のＬＡＮＡ−誘発性蓄積および少
なくとも部分的なＫＳＨＶ感染の結果を妨げる。従って、本発明の他の観点は、カポジ肉
腫関連ヘルパス・ウィルス（ＫＳＨＶ）の感染による症状を治療または予防する方法を提
供する。そのような症状には、カポジ肉腫（ＫＳ）および原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ
）を含めたＫＳＨＶ関連腫瘍を含む。該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバー
スターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、
ＫＳＨＶ関連腫瘍を治療し、すなわち、ＫＳＨＶ関連腫瘍に罹った被験体に本発明のリバ
ースターンミメティックを投与すると、腫瘍の重症度、範囲または程度などが少なくなる
。他の実施形態では、本発明は、ＫＳＨＶ関連腫瘍を予防し、すなわち、新規または追加
のＫＳＨＶ関連腫瘍を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメテ
ィックを投与すると、ＫＳＨＶ関連腫瘍の予想される重症度、範囲または程度などが少な
くなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６８】
ＬＥＦ／ＴＣＦ ＤＮＡ結合蛋白質は、活性化したβ−カテニン（Ｗｎｔシグナルの生
成物質）と共に作用して、下流標的遺伝子を転写活性化する。ＤｓａＣｕｐｔａ，Ｒ．お
よびＦｕｃｈｓ，Ｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６（２０）：４５５７〜６８（１９９
９）は、細胞運命の変化と分化が起こった場合、毛髪発生およびサイクリングにおいて特
定時間に活性化したＬＥＦ／ＴＣＦ複合体の重要性を明らかにしている。さらに、皮膚形
態形成において、β−カテニンは、毛嚢形成、マウスでの「毛皮」表現型の原因となる、
その過剰発現において必須的であることが明らかとなっている（Ｇａｔ，Ｕ．ら，Ｃｅｌ
ｌ ９５：６０５〜６１４（１９９８）およびＦｕｃｈｓ，Ｅ．Ｈａｒｖｅｙ  Ｌｅｃｔ
，９４：４７〜４８（１９９９）。また、参照、Ｘｉａ，Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１０８６３〜１０８６８（２００１））。本発明の化合
物は、Ｗｎｔシグナルの発現を阻害し、また、β−カテニン複合体の形成を妨げることが
明らかとなっている。従って、本発明は、それが必要な被験体に、本発明のリバースター
ンミメティックの安全有効量を投与することを含む、毛髪の成長を調節する方法を提供し
、ここで、前記量は、被験体において毛髪の成長を調節するのに有効である。任意に、こ
の被験体は、哺乳動物被験体である。
【０５６９】
本発明は、アルツハイマー病を治療または予防するのに有用な化合物を提供する。アル
ツハイマー病（ＡＤ）は、進行性痴呆のある神経変性病である。この疾患は、脳における
三つの主な構造変化、すなわち、ｉ）細胞内蛋白質沈着物（また、神経原線維変化、ＮＥ
Ｆとして知られている）、ｉｉ）栄養失調の神経炎で取り囲まれているアミロイド斑と呼
ばれる細胞外蛋白質沈着物、ｉｉｉ）神経びまん性を伴う。
【０５７０】
本発明の化合物または組成物は、プレセニリン−１変異に起因する神経分化の欠陥を治
癒し、また、神経前駆体集団がアルツハイマーの脳で神経に分化する数または速度を少な
くすることができる。プレセニリンは、その作用が、ノッチおよびアミロイド前駆体蛋白
の輸送、ターンオーバーおよび開裂と関連した膜貫通蛋白質である。プレセニリン−１（
ＰＣ−１）におけるミスセンス変異は、早期発症の家族性アルツハイマー病と関連してい
る（Ｆｒａｓｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．６７，８９（２００１））。
本発明の化合物は、ＰＣ−１家族性アルツハイマー変異の個々の患者のみならず、一般の
アルツハイマー病患者にとっても適用可能である。
【０５７１】
その他、本発明は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安
全有効量を投与することを含むアルツハイマー病の治療または予防方法であって、前記量
は、被験体においてアルツハイマー病を治療または予防するのに有効であるアルツハイマ
ー病の治療または予防方法を提供する。アルツハイマー病の治療は、アルツハイマー病の
症状特性の徴候を減少または除去するか、あるいはこの疾患の進行を遅延させることを含
むものと理解される。アルツハイマー病の予防は、この疾患の発病を予防または遅延させ
ることを含むものと理解される。
【０５７２】
治療を必要とする被験体は、アルツハイマー病の様々な段階にあるヒトもしくは非ヒト
霊長類また他の動物であってもよい。アルツハイマー病の診断方法としては、神経心理学
的措置、機能的画像化措置、生物学的マーカー、および頭脳組織の検死が挙げられ、当該
分野において公知となっている（例えば、Ｄｉｎｓｍｏｒｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｓｔｅｏｐａ
ｔｈ，Ａｓｓｏｃ．９９（９ Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１〜６，１９９９；Ｋｕｒｚら，Ｊ．
Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ．６２：１２７〜３３，２００２；Ｓｔｏｒｅ
ｙら，Ｆｒｏｎｔ Ｖｉｏｓｃｉ．７：ｅ１５５〜８４，２００２；Ｍａｒｉｎら，Ｇｅ
ｒｉａｔｒｉｃｓ，５７：３６〜４０，２００２；Ｋｒｉｌ ａｎｄ Ｈａｌｌｉｄａｙ，
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４８：１６７〜２１７，２００１：Ｇｕｒｗｉｔ
ｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３８６，２０００；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｐａ
ｈｎ ａｎｄ Ｈｏｃｋ．Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．２４９ Ｓｕｐｐｌ．３：３７〜４２；Ｆｏｘ ａｎｄ Ｒｏｓｓｏｒ，Ｒｅｖ
．Ｎｅｕｒｏ．（Ｐａｒｉｓ）１５５ Ｓｉｐｐｌ．４：Ｓ３３〜７，１９９９）。予防
を必要とする被験体は、アルツハイマー病が発症する危険性のあるヒトもしくは非ヒト霊
長類また他の動物、例えば、この疾患の原因である特定の遺伝子（例えば、アミロイド前
駆体蛋白、プレセニリン−１、およびプレセニリン−２をエンコードする遺伝子）および
／またはこの疾患への発病に伴って生じる遺伝子（例えば、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子
）の変異を有する個々の患者であってもよい（Ｒｏｃｃｈｉら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂ
ｕｌｌ．６１：１〜２４，２００３）。
【０５７３】
一般式（Ｉ）の構造を有する化合物は、当該分野において公知となった適切な方法によ
ってアルツハイマー病を治療または予防するために、その活性をスクリーニングされても
よい。このようなスクリーニングは、最初は、インビトロ培養細胞（例えば、実施例８に
おけるＰＣ−１２細胞）を使用して行うことができる。プレセニリン−１変異によって生
じる神経分化の欠陥を治癒することができる化合物は、アルツハイマー病に対する様々な
動物モデルを使用してさらにスクリーニングすることができる。あるいは、一般式（Ｉ）
の構造を有する化合物は、アルツハイマー病の動物モデルにおいて直接試験することがで
きる。多くのモデルシステムが、当該分野において公知となっており、また本発明におい
て使用され得る（Ｒｏｗａｎら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ
．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５８：８２１〜８，２００３；Ｓａｎｔ’Ａｎｇｅｌｏら，Ｎｅ
ｕｒｅｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：１００９〜１５，２００３；Ｗｅｉｎｅｒ Ｈａｒｖ
．Ｒｅｖ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４：３０６〜１６，１９９７）。アルツハイマー病の
治療または予防に対する選択された化合物の効果は、アルツハイマー病の進行を分析する
ために、当該分野において公知となった方法によって、特徴づけまたは監視することがで
きるが、これらの方法には、該疾患の診断について上述したものを含む。
【０５７４】
本発明はまた、神経突起伸長を促進する方法を提供する。該方法は、神経突起伸長を促
進する有効量で、一般式（Ｉ）による化合物を神経に接触させる工程を含む。該方法は、
神経変性疾患（例えば、緑内障、黄斑変性、パーキンソン病、およびアルツハイマー病）
および神経系の損傷を治療するのに有用である。神経細胞の神経突起の長さが、化合物の
不在下よりも、化合物の存在下で統計的に顕著に長ければ、その化合物は、神経突起伸長
を促進する。このような化合物は、インビトロ培養細胞（例えば、ＰＣ−１２細胞、神経
芽細胞種Ｂ１−４細胞）（Ｂｉｔａｒら，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２９８：２３
３〜４２，１９９９；Ｐｅｌｌｉｔｔｅｒｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．４５
：３６７〜７６，２００１；Ｓａｔｏｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．２５８：５０〜３，１９９９：Ｈｉｒａｔａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｓａｗａ，
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３２：４１５〜２５，１９９７：Ｃｈａｕｖｅｔら，Ｇｌｉａ
１８：２１１〜２３，１９９６：Ｖｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉ
ｏｌ．５：１６８〜７８，１９９４；Ｋｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９０；４７４８〜５２，１９９３；Ｓｋｕｂｉｔｚら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１１３７〜４８，１９９１；Ｏ’Ｓｈｅａら，Ｎｅｕｒｏｎ ７：２３１〜７，１９
９１；Ｒｙｄｅｌ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８５：１２５７〜６１，１９９８）を使用するか、あるいは、外植片（Ｋａｔｏら，
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３１：１４３〜７，１９８３；Ｖａｎｈｅｍｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．２：７７６〜８２，１９９０；Ｃａｒｒｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．１２：５６７〜７８，１９９４）を使用して同定することができる。本
発明による化合物で神経細胞を接触させることは、インビトロまたはインビボにおいて行
うことができる。得られた処理した神経細胞は、インビトロで生成されれば、必要とする
組織に移植することができる（Ｌａｃｚａら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．
Ｐｒｏｔｏｃ．１１：１４５〜５４．２００３；Ｃｈｕら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ
３４３：１２９〜３３，２００３；Ｆｕｋｕｎａｇａら，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎ
ｔ ８：４３５〜４１，１９９９）。
【０５７５】
本発明はまた、神経幹細胞の分化を促進する方法も提供し、前記方法は、神経幹細胞の
分化を促進するのに有効な量で、一般式（Ｉ）による化合物を神経幹細胞に接触させる工
程を含む。該方法は、神経変性疾患（例えば、緑内障、黄斑変性、パーキンソン病、およ
びアルツハイマー病）および神経系の損傷を治療するのにも有用である。「神経幹細胞」
は、適切な条件下で、神経細胞、星状細胞、または乏突起膠細胞に分化できる、クローン
化可能細胞、未分化細胞、多能性細胞を意味する。神経幹細胞が化合物の不在下よりも、
化合物の存在下で統計的に顕著に高い分化程度を示すと、その化合物は神経幹細胞の分化
を促進する。このような化合物は、インビトロ培養幹細胞または動物モデルと関係したア
ッセイを用いて確認され得る（Ａｌｂｒａｎｃｈｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．２５：７２５〜３０，２００３；Ｄｅｎｇら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８２：３７
３〜８２，２００３；Ｍｕｎｏｚ−Ｅｌｉａｓら，Ｍｕｎｏｚ−Ｅｌｉａｓら，Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ ２１：４３７〜４８，２００３；Ｋｕｄｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．６６：２８９〜９５，２００３；Ｗａｎら，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．１１６：
４２８〜３１，２００３；Ｋａｎｗａｍｏｒｉｔａら，Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ １５：１７８
〜８２，２００２：Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
Ｔｒａｎｓ．３１；４５〜９，２００３：Ｐａｃｈｅｒｎｉｋら，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔ
ｒ．Ｄｅｖ．４２：３１７〜２６，２００２；Ｆｕｋｕｎａｇａら，同上）。神経幹細胞
は、培養された幹細胞、その源組織から新たに分離した幹細胞またはその源生物体内の幹
細胞であってもよい。従って、本発明による化合物を神経幹細胞に接触させることは、イ
ンビトロ（培養したまたは新たに分離した幹細胞の場合）またはインビボ（その源生物体
内の幹細胞の場合）で行ってもよい。得られた分化した神経細胞は、インビトロで生成さ
れると、必要とする組織に移植されてもよい（Ｌａｃｚａら，同上；Ｃｈｕら，同上；Ｆ
ｕｋｕｎａｇａら，同上）。このような組織は、外傷または神経変性病に罹った脳組織ま
たは他の神経組織を含む。
【実施例】
【０５７６】
以下の実施例は、本発明の化合物、組成物および使用方法を説明するが、これに制限さ
れるものではない。
【０５７７】
製造実施例１
（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−Ｒ3−ヒドラジノ）−酢酸の製造）
（１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジンの製造
【０５７８】
【化２８】
2007532674.tif 000396
【０５７９】
２Ｌの二口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよびカルシウムチューブを取り付け
た。硫酸メチルヒドラジン（２０ｇ、１３９ｍｍｏｌ、Ｒ3はメチル）のＴＨＦ（３００
ｍＬ）溶液を加え、ＤｉＢｏｃ（３３ｇ、１５３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を加えた。激し
く攪拌しつつ、２時間にわたって、滴下漏斗を経由して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液
（５００ｍＬ）を滴下した。６時間後、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（３９ｇ、１５３ｍｍｏｌ）のＴ
ＨＦ溶液をゆっくりと加えた。得られた懸濁液を、０℃で、６時間攪拌した。その混合物
を酢酸エチル（ＥＡ，５００ｍＬ）で抽出し、その有機層を保持した。この溶液を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。精製することなく、次の段階に進んだ
。
【０５８０】
１Ｌの二口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよびカルシウムチューブを取り付け
た。先の工程の生成物のＭｅＯＨ（３００ｍＬ）溶液を加え、氷浴中にて磁気攪拌しつつ
、滴下漏斗を経由して、濃ＨＣｌ（３０ｍＬ、１２Ｎ）をゆっくりと加え、そして一晩攪
拌した。その混合物をＥＡ（１０００ｍＬ）で抽出し、その有機層を保持した。この溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。その残留物をｎ−ヘキサンお
よびＥＡで再結晶して精製して、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（３２．２ｇ、
８３％）を得た。
【０５８１】
【数１】
2007532674.tif 000397
【０５８２】
（２）（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステルの製造
【０５８３】
【化２９】
2007532674.tif 000398
【０５８４】
１Ｌの二口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよび還流冷却器（これは、カルシウ
ムチューブに接続されている）を取り付けた。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジン
（２０ｇ、７５ｍｍｏｌ）のトルエン（３００ｍＬ）溶液を加えた。ブロモ酢酸ｔ−ブチ
ル（２２ｇ、１１１ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）溶液をゆっくりと加えた。ＣＳ2
ＣＯ3（４９ｇ、１４９ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。激しく攪拌しつつ、ＮａＩ（１
１ｇ、７４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。その反応混合物を、還流温度で、１日にわた
って攪拌した。生成混合物を濾過し、ＥＡ（５００ｍＬ）で抽出した。この溶液を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。その生成物をクロマトグラフィー（こ
れは、ヘキサン：ＥＡ＝２：１の溶液を使う）で精製して、（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチ
ル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステル（１９．８ｇ、７０％）を得た。
【０５８５】
【数２】
2007532674.tif 000399
【０５８６】
（３）（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸の製造
【０５８７】
【化３０】
2007532674.tif 000400
【０５８８】
１Ｌの二ッ口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよび還流冷却器（これは、カルシ
ウムチューブに接続されている）を取り付けた。（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラ
ジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステル（２０ｇ、５２ｍｍｏｌ）を加えた。氷水浴中にて激し
く攪拌しつつ、ＨＣｌ溶液（１５０ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）をゆっくりと加えた
。その反応混合物を、室温で、１日間攪拌した。その溶液を、減圧下にて、４０℃で、完
全に濃縮した。飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１００ｍｌ）を加え、その水層をジエチルエー
テル（１００ｍＬ）で洗浄した。０℃で、濃ＨＣｌをゆっくりと滴下した（ｐＨ２〜３）
。その混合物を抽出し、その有機層を保持した（５００ｍＬ、ＭＣ）。この溶液を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。その残留物をｎ−ヘキサンおよび酢酸
エチルで再結晶化して精製して、（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸（
１２ｇ、７２％）を得た。
【０５８９】
【数３】
2007532674.tif 000401
【０５９０】
製造実施例２
（Ｎ−Ｍｏｃ−Ｎ’−Ｒ7−ヒドラジノ）−酢酸の製造
（１）（Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ）−酢酸エチルエステルの製造
【０５９１】
【化３１】
2007532674.tif 000402
【０５９２】
ＭＯＣ−ＮＨ−ＮＨ2（５０ｇ、０．５５ｍｏｌ）をＤＭＦ（３００ｍｌ）に溶解し、
次いで、その反応容器に、ブロモ酢酸エチル（６８ｍｌ、０．５５５ｍｏｌ）、炭酸カリ
ウム（７７ｇ、０．５５５ｍｏｌ）を加えた。その混合物を、５０℃で、５時間温めた。
その反応が完結した後、この混合物を濾過し、そしてＥｔＯＡｃで希釈し、ブラインで洗
浄した（３回）。その粗生成物をカラム（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４／１）で精
製して、７２の無色オイルを得た。
【０５９３】
（２）［Ｎ−Ｒ7−Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ］−酢酸エチルエステルの
調製
【０５９４】
【化３２】
2007532674.tif 000403
【０５９５】
前記エチルエステル（１０ｇ、０．０５ｍｏｌ）、炭酸カリウム（６．９ｇ、０．０５
ｍｏｌ）およびＲ7−ブロマイド（１４．１ｇ、０．０６ｍｏｌ）をＤＭＦ（２００ｍｌ
）に溶解し、その混合物を、５０℃で、５時間温めた。その反応が完結した後、この混合
物を濾過し、そしてＥＡで希釈し、そしてブラインで洗浄した（３回）。その粗生成物を
クロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４／１）で精製した。
【０５９６】
（３）［Ｎ−Ｒ7−Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ］−酢酸
【０５９７】
【化３３】
2007532674.tif 000404
【０５９８】
アルキル化エチルエステル（９．５ｇ、０．０３ｍｏｌ）をＴＨＦ／水（１／１、ｍｌ
）に溶解し、そして０℃で、２Ｎ ＮａＯＨ（２８．３ｍｌ）溶液を加えた。その混合物
を、室温で、２時間攪拌した。出発物質のエステルがＵＶで検出されなくなった後、この
溶液をＥＡで希釈し、次いで、分離した。水層を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３〜４まで酸性化し
、化合物をＤＣＭで抽出した（３回）。合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、そして蒸
発させて、黄色固形物を得た。
【０５９９】
（実施例１）
【０６００】
【化３４】
2007532674.tif 000405
【０６０１】
（１）Ｎβ−Ｍｏｃ−Ｎα−ベンジル−ヒドラジノグリシンの製造：
【０６０２】
【化３５】
2007532674.tif 000406
【０６０３】
この化合物は、文献手順に従って製造した。（Ｃｈｅｇｕｉｌｌａｕｍｅら、Ｓｙｎｌ
ｅｔｔ ２０００，３，３３１）。
【０６０４】
（２）１−メトキシカルボニル−２，８−ジベンジル−６−メチル−４，７−ジオキソ
−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジンの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびベンジルアミンのＤ
ＭＳＯ（２．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合
物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、
１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭ
で洗浄して、第１成分片を得た。
【０６０５】
この樹脂に、Ｆｍｏｃ−アラニン（４当量、市販されている、第２成分片）、ＨＡＴＵ
［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）
のＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室
温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで
、ＤＭＦで洗浄した。
【０６０６】
この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分
間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで
洗浄した。
【０６０７】
前記で製造した樹脂に、Ｎβ−Ｍｏｃ−Ｎα−ベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量
、製造実施例２の化合物（３）、ここで、Ｒ7はベンジル、第三成分片）、ＨＯＢＴ［Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｍＴｅｃｈ］（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加
えた。その反応混合物を、室温で、３時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭ
Ｆ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、室温で、減圧下にて乾
燥した。
【０６０８】
この樹脂を、室温で、１８時間にわたって、ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。この樹脂
を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
【０６０９】
【数４】
2007532674.tif 000407
【０６１０】
（実施例２）
【０６１１】
【化３６】
2007532674.tif 000408
【０６１２】
（１）Ｎ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライドの製造
【０６１３】
【化３７】
2007532674.tif 000409
【０６１４】
ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中のＮ−メチルヒドラジンカルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−
イルメチルエステル（１０７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ3飽和水溶液１５ｍｌ
との氷冷二相混合物を、単一部分としてトルエン（１．０３ｍｌ、２ｍｍｏｌ）中の１．
９３Ｍのホスゲンを加えつつ、迅速に攪拌した。この反応混合物を３０分間攪拌し、その
有機相を集め、その水相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し
、濾過し、そして減圧下にて濃縮して、泡沫状固形物として、カルバモイルクロライド１
２８ｍｇ（９７％）を得た。［注意：ホスゲン蒸気は、非常に毒性である。フード内で使
用すべし］。この生成物を、さらに精製することなく、以下の固相合成で使用した。
【０６１５】
（２）２，５−ジメチル−７−ベンジル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２
，４］トリアゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびベンジルアミンのＤ
ＭＳＯ（１．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合
物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、
１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭ
で洗浄して、第１成分片を得た。
【０６１６】
この樹脂に、Ｆｍｏｃ−アラニン（３当量、市販されている、第２成分片）、ＨＡＴＵ
［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（３当量）およびＤＩＥＡ（３当量）
のＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室
温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで
、ＤＭＦで洗浄した。このようにして、第２成分片を第１成分片に加えた。
【０６１７】
この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分
間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで
洗浄した。
【０６１８】
前記で製造した樹脂に、前記工程（１）で得たＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジ
ノカルボニルクロライド（５当量、複合第３および第４成分片）、ＤＩＥＡ（５当量）の
ＤＣＭ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過に
より集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。
【０６１９】
この樹脂に、ＤＭＦ（樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）中の２０％ピペリジンを加えた。こ
の反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣ
Ｍで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。
【０６２０】
この樹脂を、室温で、４時間にわたって、ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）
およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。次いで、その樹脂を濾過により集め、Ｄ
ＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、室温で、減圧下にて
乾燥した。
【０６２１】
この樹脂を、室温で、１４時間にわたって、ギ酸で処理した。この樹脂を濾過で除去し
た後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
【０６２２】
【数５】
2007532674.tif 000410
【０６２３】
実施例３
（２，５，７−トリメチル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリア
ゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造）
ブロモアセタール樹脂を、ベンジルアミン溶液の代わりにメチルアミン溶液と反応させ
ることを除いては、実施例２と同じ手順に従って、表題化合物を製造する。
【０６２４】
【数６】
2007532674.tif 000411
【０６２５】
実施例４
（２−メチル−５−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−７−ナフチルメチル−３，６
−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カ
ルボン酸ベンジルアミドの製造）
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびナフチルメチルアミ
ンのＤＭＳＯ（１．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反
応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０
℃で、１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、
ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を得た。
【０６２６】
この樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（３当量）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅ
ｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（３当量）およびＤＩＥＡ（３当量）のＮＭＰ（Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間
振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗
浄した。このようにして、第２成分片を第１成分片に加えた。
【０６２７】
この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分
間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで
洗浄した。
【０６２８】
前記で製造した樹脂に、Ｎ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライ
ド（５当量）、ＤＩＥＡ（５当量）のＤＣＭ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、
４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭ
Ｆで洗浄した。
【０６２９】
この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）を加えた。こ
の反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣ
Ｍで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。
【０６３０】
この樹脂を、室温で、４時間にわたって、ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）
およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。次いで、その樹脂を濾過により集め、Ｄ
ＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、室温で、減圧下にて
乾燥した。
【０６３１】
この樹脂を、室温で、１４時間にわたって、ギ酸で処理した。この樹脂を濾過で除去し
た後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
【０６３２】
【数７】
2007532674.tif 000412
【０６３３】
実施例５
（２−メチル−６−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−８−ナフチル−４，７−ジオ
キソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン
酸ベンジルアミドの製造）
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびナフチルアミンのＤ
ＭＳＯ（２．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合
物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、
１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭ
で洗浄した。
【０６３４】
この樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（４当量）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅ
ｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）のＮＭＰ（Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間
振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗
浄した。
【０６３５】
この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分
間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで
洗浄した。
【０６３６】
前記で製造した樹脂に、Ｎβ−Ｆｍｏｃ−Ｎα−ベンジル−ヒドラジノグリシン（４当
量）、ＨＯＢＴ［Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ］（４当量）およびＤＩＣ（４当
量）のＤＭＦ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、３時間振盪した後、その樹脂を
濾過により集め、ＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。この樹脂に、ＤＭＦ中の
２０％ピペリジン（樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）を加えた。この反応混合物を、室温で、
８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭ
Ｆで洗浄した。
【０６３７】
この樹脂を、室温で、４時間にわたって、ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）
およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。次いで、その樹脂を濾過により集め、Ｄ
ＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、減圧下にて、室温で
、乾燥し、その樹脂を、室温で、１８時間にわたって、ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。
この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を
得た。
【０６３８】
【数８】
2007532674.tif 000413
【０６３９】
実施例６
ＳＷ４８０細胞に対するＩＣ50の測定およびその細胞株での細胞毒性試験についてバイ
オアッセイ
この実施例で用いた試験化合物（化合物Ａ）は、実施例４で調製した。
【０６４０】
【化３８】
2007532674.tif 000414
【０６４１】
ａ．（レポーター遺伝子アッセイ）
ＳＷ４８０細胞を、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（商標）トランスフェク
ト試薬（Ｑｉａｇｅｎ，３０１３０７）を使って、トランスフェクトした。トランスフェ
クトの前日に、細胞を簡単にトリプシン処理し、そしてトランスフェクトの日に５０〜８
０％集密になるように、６ウェルプレート（５×１０5個の細胞／ウェル）にプレートし
た。
【０６４２】
４マイクログラム（ＴＯＰＦｌａｓｈ）および１マイクログラム（ｐＲＬ−ｎｕｌｌ）
のＤＮＡを、無血清培地１５０μｌで希釈し、スーパーフェクト（商標）トランスフェク
ト試薬３０μｌを加えた。このＤＮＡ−スーパーフェクト混合物を、室温で、１５分間イ
ンキュベートし、次いで、さらに３時間のインキュベーション中にて、この複合体に、１
０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ（１ｍｌ）を加えた。複合体が形成した一方、細胞を抗体なしでＰ
ＢＳで２回洗浄した。
【０６４３】
このＤＮＡ−スーパーフェクト（商標）トランスフェクト試薬の複合体を細胞に適用し
た後、３７℃で、５％ＣＯ2で、３時間インキュベートした。インキュベーション後、１
０％ＦＢＳを有する回収培地を加えて、最終容量を１．１８ｍｌにした。３時間のインキ
ュベーション後、これらの細胞を収集し、そして９６ウェルプレート（３×１０4個の細
胞／ウェル）に再び播種した。３７℃で、５％ＣＯ2で、一晩インキュベーションした後
、これらの細胞を、２４時間にわたって、試験化合物Ａで処理した。最後に、その活性を
ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ１９６０）で検査した。
【０６４４】
図３は、ＳＷ４８０細胞に対する上記化合物ＡのＩＣ50の測定結果を図示している。
【０６４５】
ｂ．スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ
以下で列挙した細胞に対する上記化合物Ａの成長阻害効果を、スルホローダミンＢアッ
セイにより測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌの培地中のＳＷ４８
０細胞をプレートし、そして２４時間付着させた。これらのウェルに化合物Ａを加えて、
所望の最終濃度にし、それらのプレートを、３７℃で、４８時間インキュベートした。次
いで、各ウェルに冷（４℃）１０％トリクロロ酢酸１００μｌを穏やかに加えることによ
り、これらの細胞を固定し、続いて、４℃で、１時間インキュベートした。プレートを脱
イオン水で５回洗浄し、そして風乾した。次いで、１５分間にわたって、ウェルに、ＳＲ
Ｂ溶液（１％酢酸（ｖ／ｖ）中で０．４％のＳＲＢ（ｗ／ｖ））１００μｌを加えること
により、これらの細胞を染色した。染色後、これらのプレートを、１％酢酸で５回、素早
く洗浄して、未結合染料を除去し、そして風乾させた。結合した染料を、これらのプレー
トを読み取る前に、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ１０．５）で可溶化した。モ
レキュラーデバイスを使って、５１５ｎｍの波長で、プレート読み取り装置にて、その光
学密度（ＯＤ）を読み取った。成長の阻害は、相対生存度（対照の％）で示し、そしてＧ
Ｉ50は、ログ／プロビット変換後の濃度応答曲線から計算した。
【０６４６】
表６は、実施例４で得た化合物Ａのインビトロ細胞毒性（ＳＲＢ）アッセイデータを示
す。表６の数値は、μｇ／ｍｌである。
【０６４７】
【表６】
2007532674.tif 000415
【０６４８】
2007532674.tif 000416
【０６４９】
実施例７
Ｍｉｎマウスモデル
本発明の選択された化合物（化合物Ｂおよび化合物Ｃ）は、これらの抗癌剤として効能
を評価するために、Ｍｉｎマウスモデルにおいて評価した。
【０６５０】
【化３９】
2007532674.tif 000417
【０６５１】
Ｍｉｎマウスモデルは、これらの種類の効能を試験するために、広く用いられるモデル
である。様々な処理後、これらのマウスの小腸と結腸に形成されるポリープの数を測定し
た（表７）。データは、両化合物共に約３００ｍｐｋで投与される場合、ビヒクルのみで
処理したコントロールマウスに比べてｍｉｎマウスにおいてポリープの数が減少したこと
を示す。
【０６５２】
【表７】
2007532674.tif 000418
【０６５３】
実施例８
プレセニリン−１変異に起因する神経細胞分化におけるＣＢＰ／β−カテニン相互作用
救助欠陥の化学遺伝子の抑制
下記化合物（化合物Ｄ）が、この実施例において使用された：
【０６５４】
【化４０】
2007532674.tif 000419
【０６５５】
材料および方法
プラスミド．ＴＯＰＦＬＡＳＨおよびＦＯＰＦＬＡＳＨレポーター構築物を、ＤＨ５α
適格細胞に、標準プロトコルによって形質転換した。トランスフェクションアッセイに用
いられたプラスミドは、ＥｎｏｄＦｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎ
ｃｉａ，ＣＡ）を用いて分離および精製した。
【０６５６】
ＰＣ−１２細胞培養。ＰＣ−１２細胞は、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清、４．５
ｇ／Ｌブドウ糖、２ｍＭＬ−グルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０
μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンが加えられたＲＰＭＩ１６４０において維持
された。
【０６５７】
細胞分化．細胞培養皿は、一晩中、０．２５ｍｇ／ｍｌコラーゲン（Ｃｏｈｅｎｓｉｏ
ｎ，ＣＡ）、１０μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ．Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）および１２μｇ／ｍｌのポリエチレンアミン（ＩＣＮ，Ｌａ Ｍｅｓａ
，ＣＡ）でプレコートした。細胞は、コートされた皿において１５，０００細胞／ｃｍ2
で培養され、５０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
を含む、減少した血清（１％ウシ胎仔血清）の培地において、１０日間インキュベートし
て、神経様表現型に分化した。ＮＧＦを含む培地は、２〜３日毎に交換した。
【０６５８】
化合物Ｄによる処置．β−カテニン／ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤である化合物Ｄを
、ＤＭＳＯにストック濃度１００ｍＭで溶解した。分化したＰＣ−１２／Ｌ２８６Ｖ細胞
は、４時間の間、この化合物の増加する濃度で処置した。この処置期後、トランスフェク
ションが開始された。細胞分化実験のために、化合物Ｄが全体分化時期を通じてＮＧＦと
共に１０μＭの濃度で加えられた。
【０６５９】
トランスフェクション。ＰＣ−１２細胞は、６０−ｍｍ皿で培養して分化した。１０日
間の分化期末に、細胞は６０−ｍｍ皿当たり２μｇのレポーター構築物であるＴＯＰＦＬ
ＡＳＨおよびＦＯＰＦＬＡＳＨで遺伝子導入された。トランスフェクションは、スーパー
フェクト（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメーカの指示に従って行われた。
【０６６０】
ルシフェラーゼ分析．トランスフェクションの６時間後、１００μｌの細胞培養溶解試
薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で細胞を溶解し、微小遠心管に掻き入れた
。その後、管を１２０００ｒｐｍで暫く（約１０秒間）遠心分離して、細胞残屑のペレッ
トが得られた。ルシフェラーゼ活性は、２０μｌの細胞溶解物および１００μｌのルシフ
ェラーゼ定量法（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの基質について測定した。ルシフェラーゼ活性は
、Ｐａｃｋａｒｄ ＬｕｍｉＣｏｕｎｔ．（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて測
定した。ルシフェラーゼの定量は、３重に行われ、少なくとも３回の独立した実験で繰り
返された。
【０６６１】
免疫蛍光検査．細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ2の密度で、６−ウエル培養皿中の滅
菌コートされた２２×２２ｍｍカバースリップにプレートした。上述したように、１０日
間の分化が開始された。分化した細胞は、その後−２０℃で１５分間メタノールで固定さ
れた。続けて、これをＰＢＳ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間インキュベ
ートした。カバースリップを、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２受容体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＧａｐ−４３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に
対する抗体と共に、３７℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００で連続洗浄した後、ＦＩＴＣに共役した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ 
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を適用した。全てのスライドイメージが
、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００直立顕微鏡に装着されたＮｉｋｏｎ ＰＣＭ２０
００レーザ走査共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して得られ
た。
【０６６２】
神経突起伸長の定量．細胞計数を、６つの無作為に選択された顕微鏡視野（１０ｘ）で
行った。それぞれの視野において、細胞の総数のみならず、細胞体の長さよりも２倍大き
い神経突起を見せる細胞が測定された。そのような伸長の細胞数は、細胞の全数の割合と
して表した。数値は、３つの独立した実験からの重複から得られたものである。
【０６６３】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＥｐｈｒｉｎＢ２（ＥｐｈＢ２）受容体に対するｍＲＮＡレベルを分析
するために、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．ＭＤ）を用いて分化した細胞から分離した。２μｇ ＲＮＡが、任
意の６量体（５０ｎｇ）を有する全容積２０μｌ中において、スーパースクリプト（Ｓｕ
ｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）II逆転写システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
を用いて、メーカの指示に従い逆転写された。ＰＣＲを、５μｌ ｃＤＮＡ、１００ｐｍ
ｏｌのプライマー、１００μＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｘ Ｔａｑ 緩衝液、および１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2を有する５０μｌ容積中で行った。反応混合物は、８０℃で１０分間加熱し、そ
の後、Ｔａｑを入れた。ｃＤＮＡｓを、２５（ＥｐｈＢ２受容体）または１５（ＧＡＰＤ
Ｈ）サイクル間増幅した。増幅の１回転は、９４℃で１分で構成され、６０℃で２分、お
よび７２℃で２分からなり、最終延長時間は、７２℃で１０分である。ＰＣＲ生産物は、
２％ゲルで臭化エチジウムによって染色され、電気泳動で分析されて目に見えるようにし
た。ＥｐｈＢ２受容体のＰＣＲプライマーは、５’−ＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＣ
ＧＡＴＡＣ−３’および５’−ｔｃｔａｃｃｇａｃｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｔｃａ−３’を
用いた。ＧＡＰＤＨのためのプライマー対は、５’−ＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧ
ＴＧＧＡ−３’および５’−ＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’であった
。
【０６６４】
結果
ラットＰＣ−１２細胞は、神経堤系統に由来し、神経成長因子（ＮＧＦ）処置で神経突
起を有する交感神経様神経細胞に分化を被る（Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７３，２４２４（１９７６））。ＰＣ−１
２細胞基盤モデルを用いて、早期発症のＦＡＤ関連ＰＣ−１変異であるＰＳ−１／Ｌ２８
６Ｖの、ＴＣＦ／β−カテニンに媒介された転写および神経分化に対する影響が特徴づけ
られた。ＴＣＦ／β−カテニン／ＣＢＰで媒介される転写を特定的にブロッキングすると
、神経分化におけるＰＳ−１によって誘導された欠陥が軽減することが証明された。
【０６６５】
野生型ＰＳ−１（ＰＳ−１／ＷＴ）または変異ＰＳ−１（ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ）のう
ちどちらか一方を安定的に過剰発現させるＰＣ−１２細胞およびベクターのみをトランス
フェクトさせたコントロール細胞株（Ｇｕｏら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，８，３７９（
１９９６））が、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リジンおよびポリエチレンアミンをコートした
皿にプレートされた。５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを１０日間処理することにより、分化が誘
導された。過剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞またはベクターがトランスフェクトされた
細胞は、広範囲な軸索形成を示すのに対して（ＡＴＣＣからのＰＣ−１２細胞クローンと
類似している）、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞は、ただ、短くて太い軸索形成のみを示
した（図４Ａ−Ｃ）。しかも、ベクターがトランスフェクトされたＰＣ−１２コントロー
ルおよびＰＳ−１／ＷＴ細胞は、神経分化マーカーＧＡＰ−４３の広範囲な発現を示すの
に対して（Ｇｏｒｇｅｌｓら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．８３，５９（１９８７））
（図４のＤ、Ｅ）、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞は本質的にこのマーカーがなかった（図４
のＦ）。
【０６６６】
ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異の、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナルに対する効果を
評価するために、我々は、ＮＧＦ処理されたＰＣ−１２細胞を、ＴＯＰＦｌａｓｈ、Ｗｎ
ｔ／β−カテニンシグナルレポーター構築物で一時的にトランスフェクトさせた（Ｍｏｒ
ｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１７８７（１９９７））。図４のＦに示すように、過
剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞は、ベクターコントロール細胞と比べて、同じ水準のＴ
ＣＦ／β−カテニンシグナルを有する。しかしながら、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞は
、ＴＯＰＦｌａｓｈの発現が顕著に（１０倍）増加することを示した。対照的に、負の制
御レポーター構築物であるＦＯＰＦｌａｓｈは有意な差を示さなかった。
【０６６７】
ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞中の調節が困難なＴＣＦ／β−カテニンシグナルが、分
化の欠陥および神経突起伸長の原因であると仮定された。この仮定を試験するために、Ｔ
ＣＦ／β−カテニンシグナルの特定の小分子抑制剤である化合物Ｄを用いた（Ｅｍａｍｉ
ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。この小分子は、選択的に、β−カテニ
ン／ＣＢＰ相互作用を妨害するものの、β−カテニン／ｐ３００の相互作用は妨げず、Ｔ
ＣＦ／β−カテニン転写のサブセットを遮断する。ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞を１０
μＭの化合物ＤおよびＮＧＦで処理すると、ＴＣＦ／β−カテニンレポーター遺伝子転写
が減少し、過剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞で見られるように（図５Ａ、Ｂ）、未処理
の細胞と比べて（図４Ｃ）、本質的に正常である神経突起伸長および分化を導いた（図５
Ａ）。また、化合物Ｄで処理したＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異は、ＰＳ−１／ＷＴおよびベ
クターがトランスフェクトされた細胞に着色されたものと同様の強度のＧＡＰ−４３を示
した（図４Ｂ）。化合物Ｄが処理された変異細胞が、ベクターコントロールまたはＰＳ−
１／ＷＴ細胞のと同様の神経突起を示すことを証明するために、細胞体の長さの二倍より
大きい神経突起を有する細胞数を数えた。化合物Ｄで処理すると、神経突起を有する細胞
の百分率を、ベクターがトランスフェクトされたものおよび過剰発現されるＰＳ−１／Ｗ
Ｔ細胞のものと同様な水準に実質的に増加させる（図５Ｃ）。ＴＣＦ／β−カテニン／Ｃ
ＢＰによって媒介される転写を妨げると、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異体に起因する神経突
起伸長および神経分化での多くの表現型の欠陥を修正させるという結論が得られた。
【０６６８】
Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２受容体（ＥｐｈＢ２）は、シナプス形成に関係しており（Ｗｉｌｋ
ｉｎｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，１５５（２００１））、Ｅｐｈｒ
ｉｎ Ａファミリーは、最近になって、海馬状隆起樹状突起棘形態学で役割を果たすこと
が明らかになった（Ｍｕｒａｉら，Ｎａｔ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６，１５３（２００３）
）。集中したＥｐｈＢ２発現が観察されたが、これは、ベクターおよびＰＳ−１／ＷＴが
トランスフェクトされた細胞において神経プロセスと共に位置決めされたのに対して（図
６Ａ、Ｂ）、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞は、非常に弱くて拡散したＥｐｈＢ２シグナ
ルを示した（図６Ｃ）。ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞における増加されたＴＣＦ／β−
カテニンシグナルは、ＲＴ−ＰＣＲに示すように、それ自身が減少したＥｐｈＢ２発現を
示した（図６Ｅ、レーン３）。また、１０μｍの化合物Ｄの添加は、これらの細胞におい
てＥｐｈＢ２発現のみならず（図６Ｄ）、ＥｐｈＢ２メッセージの増加をもたらした（図
６Ｅ、レーン４）。これらの結果は、Ｂａｔｌｌｅらによるデータと一致しており（Ｂａ
ｔｌｌｅら，Ｃｅｌｌ １１１，２５１（２００２））、彼らは、最近、ＥｐｈＢ２／Ｅ
ｐｈＢ３受容体およびこれらのリガンドＥｐｈｒｉｎ Ｂ１の発現が、結腸陰窩中で、Ｔ
ＣＦ／β−カテニン転写を通じて逆に調整されることと、適切な調節が、適切な細胞増殖
、分化、分類において重要であることを明らかにした。我々は、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変
異が増加したＴＣＦ／β−カテニンシグナルを通じて、ＥｐｈＢ２受容体の発現を減少さ
せ、これは、化合物Ｄで媒介されるβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用の阻害によって修正さ
れることに関する証拠を提示する。
【０６６９】
実施例９
化合物Ｄは、Ｇ１／Ｓ段階停止を引き起こし、カスパーゼ活性を活性化させる
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ分析のために、大体、５×１０6の化合物Ｄで処理された細胞またはベクター
処理された細胞が、７０％冷却されたエタノールによって固定され、最小限３０分間−２
０℃で保管した。細胞は、１Ｘ ＰＢＳで一回洗浄し、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）溶
液（８５μｇ／ｍｌプロピジウムヨウ化物、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，１０ｍｇ
／ｍｌ ＲＮＡｓｅ）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。各サンプルにおいて
、１０，０００個の染色された細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ Ｘ
Ｌ−ＭＣＬフローサイトメトリーを用いて得ており、細胞サイクルの別の段階にある細胞
の百分率は、Ｅｘｐｏ３２ＡＤＣソフトウェア（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ，３３１９６）によって決定された。
【０６７０】
カスパーゼ３活性アッセイ
ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、およびＣＣＤ１８Ｃｏ細胞が、ウエル当たり１０5細胞（
９６ウエルプレート）で処理前、２４時間の間プレートされた。各ウエルに、２５μＭの
化合物Ｄまたはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）が加えられた。処理後、２４時間で細
胞は溶解され、カスパーゼ−３／７活性キット（Ａｐｏ−Ｏｎｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕ
ｓ ｃａｓｐａｓｅ−３／７ ａｓｓａｙ，＃Ｇ７７９０５，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてカ
スパーゼ活性を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、実験測定値からブランク（コント
ロール、細胞なし）の単位価を引いて得られた。
【０６７１】
化合物Ｄは、Ｇ1／Ｓ段階停止を引き起こし、カスパーゼ活性を活性化させる
サイクリンＤ１遺伝子の発現の阻害は、細胞サイクルのＧ1／Ｓ段階での停止を引き起
こすことが明らかとなっている（Ｓｈｉｎｔａｎｉら，「唾液腺の腺様嚢胞癌におけるＲ
Ｂ経路（Ｒｂ−ｐ１６ＩＮＫ４Ａ−ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）の稀な変更」、Ａｎｔｉｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．２０：２１６９〜７５（２０００））。ＨＣＴ１１６（図７Ａ、上パネ
ル）およびＳＷ４８０（図７Ａ、下パネル）細胞は、２４時間の間、化合物Ｄ（２５μＭ
）（図７Ａ、右）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）（図７Ｂ、左）で処理された
。細胞は、次いで、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色され、ＦＡＣＳ細胞蛍光計数器
でＤＮＡ含量を分析した。予想通り、コントロール細胞（図７Ａ、左）は、正常にサイク
リングするのに対して、化合物Ｄで処理された細胞（図７Ａ、右）は、細胞周期のＧ1／
Ｓ段階での蓄積が増加することが示された。そこで、化合物Ｄが、Ｇ1段階で細胞を停止
させたと言える。
【０６７２】
カスパーゼは、システインプロテアーゼであり、一般に、アポトーシスの刺激によって
誘発される細胞の一定の集団内で活性化する。ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、および野生型
のコロニー細胞（ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞）におけるアポトーシス誘起を評価するために、細
胞を化合物Ｄ（２５μＭ）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）のどちらか一方を２
４時間の間処理し、次いで、カスパーゼ−３／７活性を分析した。
【０６７３】
図７Ｂに示すように、化合物Ｄは、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞と比べて、ＳＷ４８０およびＨ
ＣＴ１１６細胞におけるカスパーゼ−３／７経路を特定的かつ顕著に活性化させる。
【０６７４】
実施例１０
化合物Ｄは、形質転換した直腸結腸細胞の増殖を減少させる
軟寒天アッセイ
軟寒天コロニー形成アッセイを、ＳＷ４８０細胞で前述された手続き（Ｍｏｏｄｙら，
「血管活性腸管ペプチド拮抗薬は、非小細胞肺癌細胞の成長を阻害する」、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：４３４５〜４９（１９９３））を少し変形し
て実施した。
【０６７５】
６ウエルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｓｋｉｄ
ｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の各ウエル（３５ｍｍ）は、ウシ胎仔血清１０％を含有するＤＭＥ
Ｍ培地中の０．８％ボトム寒天１ｍｌでコートされた。これが、固化した後、各ウエルに
、０．４％のトップ寒天、１０％のウシ胎仔血清、２倍濃縮された化合物、および５，０
００個の単一生存細胞を含有するＤＭＥＭ培地１ｍｌを加えた。前記培養は、３７℃で、
湿気のある５％ＣＯ2中でインキュベートした。軟寒天でのコロニーは、毎日モニターし
、８日間のインキュベーション後に写真を撮った。６０μｍ径を超えるコロニーの数を数
えた。
【０６７６】
化合物Ｄは、形質転換した直腸結腸細胞の増殖を減少させる
軟寒天コロニー形成アッセイを、化合物Ｄ（０．２５−５μＭ）および５−フルオロウ
ラシル（５−ＦＵ）（０．５−３２μＭ）で処理されたＳＷ４８０細胞を用いて行った。
図８Ａに示すように、化合物Ｄはコロニー形成数において、投与量に相関関係があること
が認められる。化合物Ｄおよび５−ＦＵのＩＣ50値は、それぞれ０．８７±０．１１μＭ
および１．９８±０．１７μＭであった。このため、化合物Ｄは、カスパーゼ活性を増加
させており、β−カテニンシグナルを活性化させる変異によって形質転換した直腸結腸細
胞のインビトロ増殖を減少させた。
【０６７７】
実施例１１
化合物Ｃは、ヌードマウスモデルにおける腫瘍成長を減少させる
ＳＷ６２０細胞（９×１０6細胞／マウス）を０日目にヌードマウスの皮下に移植した
。マウスに１日目から化合物Ｃを一日おきに３００ｍｇ／ｋｇずつ４回腹腔内注射した後
、２１日目まで一日おきに２００ｍｇ／ｋｇずつ腹腔内注射した。化合物Ｃは、ベクター
コントロールマウスと比べて、処理されたマウスで腫瘍成長を減少させ（図９Ａ）、ベク
ター対照マウスと比べて、処理されたマウスの体重を少し減少させた（図９Ｂ）。
【０６７８】
実施例１２
化合物Ｄは、スルビビン発現を阻害する
化合物Ｄのスルビビン発現に対する効果は、転写および翻訳レベルで研究された。転写
レベルで用いられた方法には、ｃＤＮＡ微小配列分析、ＲＴ−ＰＣＲ、スルビビン・レポ
ーター活性のアッセイ、およびクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を含む。翻訳レベルで用
いられた方法には、ウエスタンブロット分析、免疫化学を含む。
【０６７９】
スルビビンプロモータの制御下にあるルシフェラーゼを含むプラスミドが構成されて、
野生型、ＣＢＰ＋／−、またはｐ３００＋／−３Ｔ３細胞へトランスフェクトされた。そ
の結果である図１０は、Ｗｎｔ１が３種類の細胞の全てにおいてスルビビン遺伝子の発現
を刺激することを示すのに対して、化合物Ｄは、スルビビン遺伝子の発現を縮小させ、こ
れらの細胞でのＷｎｔ１によるスルビビン遺伝子発現の刺激を減少させることを示してい
る。同様に、化合物Ｄおよびその類似体（化合物Ａ）は、ＳＷ４８０細胞のスルビビン発
現を阻害することを示した（図１１）。
【０６８０】
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＳＴ）に備えられたプロトコルによって行った。ＲＴ−ＰＣＲ
反応のための全てのＲＮＡ鋳型を、化合物Ｄ（２５μＭ）またはコントロール（０．５％
ＤＭＳＯ）で処理した細胞から、処理２４時間後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉ
ａｇｅｎ）を用いて抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いられたプライマーは、５’−ＡＧ
ＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣ−３’および５’−ＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＧＣ
ＡＧＴＴＴＣＣ−３’である。表８は、分析の結果を示す。０．５未満の比率は、化合物
Ｄの処理による遺伝子発現の有意な減少を示すのに対して、１．５以上の比率は、遺伝子
発現の有意な増加を示す。約１の比率は、変化なしを意味する。表８および図１２に示す
ように、スルビビン遺伝子の発現は、コントロールと比べて化合物Ｄの存在下で著しく減
少した。
【０６８１】
【表８】
2007532674.tif 000420
【０６８２】
化合物Ｄ（２５μＭ）または対照体（０．５％ＤＭＳＯ）で処理されたＳＷ４８０細胞
に対するＣｈＩＰアッセイを行った。図１３に示すように、スルビビンプロモータは、コ
ントロール処理細胞において、ＣＢＰ、β−カテニン、Ｔｃｆ４およびアセチル化ヒスト
ンによって発生した。化合物Ｄによる処理は、これらの全ての蛋白質のスルビビンプロモ
ータとの結合を減少させた。
【０６８３】
翻訳レベルにおいて、スルビビン発現に対する化合物Ｄの効果を特徴づけるため、ビヒ
クル（０．５％ＤＭＳＯ）単独、１０μＭもしくは２５μＭの化合物Ｄ、または５μＭの
５−Ｆｕで処理された細胞抽出物に対して、スルビビン６Ｅ４モノクローナル抗体（Ｃｅ
ｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ウエスタンブロット分析を
行った。その結果は（図１４Ａ）、化合物Ｄの両濃度の全て、および５−Ｆｕによる処理
は、スルビビン蛋白質の量を減少させたことを示す。両濃度の化合物Ｄの処理は、５−Ｆ
ｕと一緒に処理したよりも、さらに効率よくスルビビン発現を減少させ、化合物Ｄを高濃
度（すなわち、２５μＭ）で処理することがさらに効果的であった。
【０６８４】
化合物Ｄの翻訳レベルでのスルビビン発現に対する効果は、免疫蛍光顕微鏡検査法を用
いてさらに調査された。化合物Ｄの不在下で、スルビビンは、有糸分裂紡錘体に位置して
いるが、これは、スルビビンが染色体分離に関係するという概念と一致する（図１４Ｂ）
。このような発現パターンは、ＳＷ４８０細胞を化合物Ｄで処理した後、スルビビン蛋白
質が殆どまたは全く探知されなかった（図１４Ｃ）。
【０６８５】
実施例１３
様々な化合物のスルビビンおよびＴＣＦ４発現に対する効果
一般式（Ｉ）を有する様々な化合物のスルビビンおよびＴＣＦ４発現に対する効果が特
徴づけられた。その結果を、表９に示す。
【０６８６】
【表９】
2007532674.tif 000421
【０６８７】
2007532674.tif 000422
【０６８８】
2007532674.tif 000423
【０６８９】
2007532674.tif 000424
【０６９０】
2007532674.tif 000425
【０６９１】
2007532674.tif 000426
【０６９２】
2007532674.tif 000427
【０６９３】
2007532674.tif 000428
【０６９４】
実施例１４
化合物Ｄは、スルビビン発現を阻害して、アポトーシスを促進する
化合物Ｄのアポトーシスに対する効果およびその効果におけるスルビビンの役割を決定
するために、化合物Ｄまたはコントロールで処理された培養された腫瘍細胞中のカスパー
ゼ２および３の活性を測定した。その結果（図１５）は、（１）化合物Ｄ（２．５μＭま
たは５．０μＭ）は、カスパーゼ３活性を活性化させるものの、カスパーゼ２の活性を活
性化させてはいない；（２）スタウスポリン（０．５μＭ）は、カスパーゼ２および３の
活性を両方増加させた；（３）スタウスポリンおよび化合物Ｄの共同処理は、カスパーゼ
３の活性を共同作用して刺激したものの、カスパーゼ２の活性を共同作用として刺激して
はいない；そして（４）スルビビン遺伝子でトランスフェクトさせた場合、スタウスポリ
ンまたは化合物Ｄの処理によって誘導されたカスパーゼ３の活性化、およびスタウスポリ
ンおよび化合物Ｄの共同処理によるカスパーゼ３の活性の共同作用刺激を減少させたこと
を示す。前記結果は、化合物Ｄがスルビビン遺伝子の発現を抑制することによって、カス
パーゼ３の活性を刺激することを示唆する。
【０６９５】
化合物Ｄのアポトーシスに対する効果およびその効果におけるスルビビンの役割を調べ
るために、スタウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両
方で処理された培養された腫瘍細胞の細胞死を測定した。その結果（図１６）は、化合物
Ｄおよびスタウスポリン両方共に細胞死を促進させ、スルビビン遺伝子でトランスフェク
トさせた場合、スタウスポリン、化合物Ｄ、または両方で処理によって誘導された細胞死
の増加を減少させたことを示す。前記結果は、化合物Ｄが、スルビビン遺伝子の発現を抑
制することによって、アポトーシスを促進することを示唆する。
【０６９６】
化合物Ｄの細胞周期に対する効果およびその効果におけるスルビビンの役割を調べるた
めに、スルビビン遺伝子を含む構成体でトランスフェクトされたもの、またはされなかっ
た培養され、かつスタウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれ
らの両方で処理した腫瘍細胞に対して、ＦＣＡＳ分析を行った。その結果（図１７）は、
化合物Ｄおよびスタウスポリンが共にＧ0段階の細胞数を増加させ、細胞内でスルビビン
の過剰発現は、スタウスポリン、化合物Ｄ、またはこれらの両方で処理した効果を減少さ
せたことを示す。前記結果において、化合物Ｄが細胞周期に影響を及ぼすことは、少なく
とも部分的にはスルビビン遺伝子の発現を抑制することによって行われるということを示
唆する。
【０６９７】
実施例１５
プロドラッグの製造および活性
（１）フェニル基のリン酸化によるプロドラッグの製造のための一般的な手続き
出発物質のフェノール（２６．０６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１３０ｍｌ）に
溶解させ、次に室温でトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１０．９ｍｌ、７８．１８ｍｍｏｌ
）を添加した。その反応混合物を５℃に冷却し、その後、ＰＯＣｌ3（１２．２ｍｌ、１
３０．３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。添加が終わった後、その混合物を室温に温め、
その温度で５時間の間攪拌した。反応が終結した後に、その混合物をセライトパッド（ｃ
ｅｌｉｔｅ−ｐａｄ）フィルタ漏斗に注いでＴＥＡ−ＨＣｌ塩を除去した。有機物を５℃
で水（１３０ｍｌ）で希釈し、次に重炭酸ナトリウム（５０ｇ）を用いてｐＨ７〜８に調
整し、生じた塩基性溶液を室温で一晩攪拌した。生じた水層をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）
で洗浄し、その後、凍結乾燥した。粗生成物をメチレンクロライド（１００ｍｌ）に溶解
し、次いで室温で１時間放置した。無機塩をセライトパッドを用いた濾過によって除去し
、その後溶媒を除去した。粗生成物を再結晶化（ＥＡ／エーテル）により精製し、オフホ
ワイト色の固体としてのリン酸化生成物を得た。
【０６９８】
（２）リン酸エステルの遊離形態に対する典型的な後処理手続き
得られた塩基性水層を洗浄した後に、その溶液を１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ３〜４に酸
性化し、その後、リン酸エステル遊離形態をクロロホルム（３００ｍｌ）で二度抽出した
。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、その粗生成物を再結晶によって精製した。
【０６９９】
（３）遊離形態からジナトリウム形態への転換方法
Ａ．滴定法
遊離形態のリン酸エステルを滴定によって、ジナトリウム塩形態に転換し得るが、これ
は多くの無機塩基を用いることができる。例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、
および水酸化ナトリウムが、ジナトリウム形態を生産するために本実験で用いられ得る。
他のカチオンは、異なるジ塩（二塩）形態を作るのに用いられ得る。
【０７００】
１．滴定のための分析法および道具
ａ．道具：ＴｉｔｒａＬａｂ（ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ  ＣＯＰＥＮＨＡＧＥＮ）
電極：ｐＨＧ２０１ｐＨガラス電極（ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ  ＣＯＰＥＮＨＡＧＥＮ、
９４５−４６２）
ＫＣｌ塩−ブリッジ溶液とのＲＥＦ２０１参照電極（ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ  ＣＯＰＥ
ＮＨＡＧＥＮ、９４５−４６３）
滴定剤：１０Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3
ビュレットの速度（滴定の速度）：１５％（＝１．５ｍｌ／分）
サンプル：蒸溜水（３０ｍｌ）に溶解した５０ｍｇ
ｂ．結果
【０７０１】
【表ａ】
2007532674.tif 000429
【０７０２】
Ｂ．有機ナトリウムドナー使用
無機塩基を用いる滴定の基本的な欠点は、水を必ずその溶媒として用いなければならな
いという点である。したがって、通常の有機溶媒に大量に溶解するナトリウムドナーを検
索することがその問題を解決する最も容易な方法である。酢酸ナトリウムおよびエチルヘ
キサン酸ナトリウムのような様々な試薬がテストされてジナトリウム塩形態を作るのに有
用であることが分かった。
【０７０３】
表１０は、本発明のプロドラッグから選択された生体利用性テストに関する化合物およ
びそれらのＩＣ50値を示すが、これは実施例６に記述されたようなレポーター遺伝子アッ
セイ法（ＲＧＡ）およびＭＴＳによる癌誘発性活性またはスルホロダミンＢ測定法によっ
て測定される。表１０の化合物の番号は表４または表５のものとは関係がない。
【０７０４】
【表１０】
2007532674.tif 000430
【０７０５】
2007532674.tif 000431
【０７０６】
2007532674.tif 000432
【０７０７】
実施例１６
選択されたプロドラッグの可溶性
プロドラッグの可溶性テストの一般的手続き
各々のプロドラッグの約２ｍｇを下記に指示された通り１ｍｌのＪＰ１またはＪＰ２溶
液に溶解した。３７℃の温度でインキュベートした後に、０時間、２時間、２０時間に２
００μLのサンプルを取り出した。取り出されたサンプルは、０．４５μｍの注射器フィ
ルタを介して濾過し、ＨＰＬＣシステムによって分析した。
【０７０８】
【表ｂ】
2007532674.tif 000433
【０７０９】
下記表１１は選択されたプロドラッグの可溶性テスト結果を示す。表１１の化合物の番
号は表４、５、または１０の番号とは関係がない。
【０７１０】
【表１１】
2007532674.tif 000434
【０７１１】
2007532674.tif 000435
【０７１２】
実施例１７
ジメチル−カルバミン酸４−［２−アリル−１ベンジルカルバモイル−８−（２，４−
ジフルオロ−ベンジル）−４．７−ジオキソ −オクタヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］
［１，２，４］トリアジン−６−イルメチル］−フェニルエステルの製造
【０７１３】
【化４１】
2007532674.tif 000436
【０７１４】
ジメチルホルムアミド中の出発物質（ＳＭ）（８．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）および炭
酸カリウム（５．８ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にジメチルカルバミルクロリド（
３．０ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩攪拌し、その後、ＥｔＯＡ
ｃに溶解し、水で５回洗浄した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで
乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をそのままのＥｔＯＡｃでシリカゲルでクロトグラフィ
分離し、生成物（４．２ｇ、３２％）を得た。得られた生成物を質量分光法およびＮＭＲ
によって分析したデータは次の通りである。
【０７１５】
【数９】
2007532674.tif 000437
【０７１６】
実施例１８
炭酸４−［２−アリル−１−ベンジルカルバモイル−８−（２，４−ジフルオロ−ベン
ジル）−４，７−ジオキソ −オクタヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］ト
リアジン−６−イルメチル］−フェニルエステル４−ニトロ−フェニルエステル（２）の
製造
【０７１７】
【化４２】
2007532674.tif 000438
【０７１８】
ＴＨＦ（４０ｍｌ）中の２−アリル−８−（２，４−ジフルオロ−ベンジル）−６−（
４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］
［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸−ベンジルアミン（１）（２ｇ、３．４７ｍ
ｍｏｌ）の攪拌溶液にトリエチルアミン（０．９７ｍｌ、６．９５ｍｍｏｌ）および４−
ニトロフェニルクロロホルメート（０．７ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一
晩攪拌後に、溶媒を減圧下で除去した。粗化合物をクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯ
Ａｃ  １：１）で精製して、その化合物（１．５９ｇ、６２％）を得た。精製化合物をＴ
ＬＣシステムおよびＮＭＲによって分析したデータは下記のようになる：
ＴＬＣシステム：Ｒf＝０．３（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ  １：１）
【０７１９】
【数１０】
2007532674.tif 000439
【０７２０】
実施例１９
（２−ジメチルアミノ−エチル）−カルバミン酸４−［２−アリル−１−ベンジルカル
バモイル−８−（２，４−ジフルオロ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−オクタヒドロ−
ピラジン［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−６−イルメチル］−フェニルエステ
ル塩酸塩（３）の製造
ＤＨＦ（２５ｍｌ）中の炭酸４−［２−アリル−１−ベンジルカルバモイル−８−（２
，４−ジフルオロ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−オクタヒドロ−ピラジノ［２，１−
ｃ］［１，２，４］トリアジン−６−イルメチル］−フェニルエステル４−ニトロ−フェ
ニルエステル（２）（１．２ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＮ、Ｎ−ジメチルエチ
レンジアミン（０．２６ｍｌ、２．４３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩攪拌後に、溶
媒を減圧下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、水、ブラインで洗浄した。有機層を
Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。粗化合物をクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：
ＥｔＯＡｃ  １：１；ＥｔＯＡｃ；ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ、９：１）で精製した。その化
合物に水を注いで１Ｎ水性ＨＣｌによってｐＨ５−６に維持してＨＣｌ塩を作り、その後
、凍結乾燥して、化合物（０．７５ｇ、６０％）を得た。精製化合物をＴＬＣシステムお
よびＮＭＲによって分析したデータは下記のようになる：
ＴＬＣシステム：Ｒf＝０．３５（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ、９：１）
【０７２１】
【数１１】
2007532674.tif 000440
【０７２２】
実施例２０
単一静脈内大量注射後のプロドラッグＡのマウス生体内ＰＫ研究
（動物実験）
薬物を、１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０中の１０ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌで調製した。ＩＣＲマ
ウスに対して研究を行った。尾静脈を介した静脈内大量注射後、血液サンプルは数回の時
点で下大静脈（inferior vena cava）から得て遠心分離によって血漿に分離した。血漿サ
ンプルは分析される時まで−２０℃で保存した。出血時間の時点は３、６、９、１７、３
４、６７、１３４、２０２、３０２分であった。Ｎ＝４。
【０７２３】
（サンプル準備）
検量線のために対照群マウス血漿の９８μＬ分量を２μＬの薬物ストック溶液、２μＬ
内部標準ストック溶液、５μｇ／ｍＬの内部標準に添加した。較正サンプルの最終濃度は
、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった。動物実験から
の血漿サンプルに対して、１００μＬの血漿を２μＬ内部標準に添加した。その後、すべ
てのサンプルを５００μＬのアセトニトリル、５００μＬのエチルアセテートおよび１０
０μＬのＤＷに添加した。サンプルを１０分間混合して遠心分離した。上澄液を他のチュ
ーブに移して蒸発させた。２００μＬの４０％アセトニトリルを添加して、元に戻してＬ
Ｃ−ＭＳシステムで分析した。
【０７２４】
（結果）
プロドラッグＡの静脈内大量注射後の時間の経過にともなうマウス血漿内のプロドラッ
グＡおよびその母化合物の濃度の変化は図１８に示す。四角形：母化合物；ダイヤモンド
：プロドラッグＡ。
【０７２５】
【化４３】
2007532674.tif 000441
【０７２６】
以上、本発明の特定の実施の形態について説明したが、本発明の要点および範囲を逸脱
しない限り、様々な変形が可能である。従って、本発明は、添付した請求の範囲によって
のみ制限されるものである。
【０７２７】
米国特許出願第１０／０８７，４４３号（２００２年３月１日出願）、および米国特許
出願第０９／９７６，４７０号（２００１年１０月１２日出願）を含めて、明細書および
／または書誌事項に言及された前記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、
外国出願、外国特許出願、および非特許公開は、本明細書中で援用される。
【０７２８】
本発明の特定な実施形態がここに説明目的で記載されているが、本発明の精神および範
囲から逸脱することなく、様々な変形がなされてもよいことが、前述から理解できるであ
ろう。したがって、本発明は、添付の請求の範囲を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０７２９】
【図１】図１は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。
【図２】図２は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。
【図３】図３は、ＳＷ４８０細胞について本発明の化合物ＡのＩＣ50を測定したグラフである。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ−Ｂは、ＰＣ−１２細胞における神経突起伸長に関する図である。
【図４Ｃ−Ｆ】図４Ｃ−Ｆは、ＰＣ−１２細胞における神経突起伸長に関する図である。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＰＣ−１２細胞における神経突起伸長に関する図である。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ−Ｂは、ＰＣ−１２過剰発現変異ＰＳ−１／２８６Ｖ細胞における神経突起伸長に関する図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＰＣ−１２過剰発現変異ＰＳ−１／２８６Ｖ細胞における神経突起伸長に関する図である。
【図６Ａ−Ｄ】図６Ａ−Ｄは、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２（ＥｐｈＢ２）受容体発現を示す図である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２（ＥｐｈＢ２）受容体発現を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、化合物Ｄが、Ｇ1の細胞を停止させることを示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、化合物Ｄが、Ｇ1の細胞を停止させることを示すグラフである。
【図８】図８は、化合物Ｄが、容量依存的な方法で軟寒天中のコロニー増殖を減少させることを示すグラフである。
【図９】図９は、化合物Ｃがヌードマウスモデルに当てる影響を示すグラフである。
【図１０】図１０は、３Ｔ３細胞におけるスルビビンレポーター遺伝子に対するＷｎｔ１刺激を示すグラフである。
【図１１】図１１は、化合物Ａおよび化合物ＤがＳＷ４８０細胞のスルビビンルシフェラーゼレポーターの活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、化合物Ｄの処理がスルビビン遺伝子の発現程度を減少させることを示す図である。
【図１３】図１３は、化合物Ｄが、スルビビンプロモータと様々な蛋白質との結合を減少させることを示す図である。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ−Ｂは、化合物Ｄが、翻訳レベルでスルビビン発現を減少させることを示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、化合物Ｄが、翻訳レベルでスルビビン発現を減少させることを示す図である。
【図１５】図１５は、化合物Ｄが、スルビビン発現の阻害を通じて、カスパーゼ３活性を活性化することを示すグラフである。
【図１６】図１６は、化合物Ｄが、スルビビン発現の阻害を通じて、細胞死を促進することを示すグラフである。
【図１７】図１７は、化合物Ｄが、Ｇ0段階の細胞数を増加させることを示すグラフである。
【図１８】図１８は、プロドラッグＡを静脈内大量注射後の時間の経過にともなうマウス血漿内のプロドラッグＡおよびその母化合物の濃度の変化を示す。
【図１】
2007532674.tif 000449
【図２】
2007532674.tif 000450
【図３】
2007532674.tif 000451
【図４Ａ−Ｂ】
2007532674.tif 000452
【図４Ｃ−Ｆ】
2007532674.tif 000453
【図４Ｇ】
2007532674.tif 000454
【図５Ａ−Ｂ】
2007532674.tif 000455
【図５Ｃ】
2007532674.tif 000456
【図６Ａ−Ｄ】
2007532674.tif 000457
【図６Ｅ】
2007532674.tif 000458
【図７Ａ】
2007532674.tif 000459
【図７Ｂ】
2007532674.tif 000460
【図８】
2007532674.tif 000461
【図９】
2007532674.tif 000462
【図１０】
2007532674.tif 000463
【図１１】
2007532674.tif 000464
【図１２】
2007532674.tif 000465
【図１３】
2007532674.tif 000466
【図１４Ａ−Ｂ】
2007532674.tif 000467
【図１４Ｃ】
2007532674.tif 000468
【図１５】
2007532674.tif 000469
【図１６】
2007532674.tif 000470
【図１７】
2007532674.tif 000471
【図１８】
2007532674.tif 000472
【国際調査報告】
2007532674.tif 000473
2007532674.tif 000474
2007532674.tif 000475
2007532674.tif 000476
2007532674.tif 000477