(57)【要約】【解決手段】ここで開示されているデバイスおよび方法は、表面増感コヒーレント反ストークスラマン分光法を用いて、核酸のような複数の被分析物を高分解能および高速応答時間で、検出する段階、同定する段階、および／または、定量化する段階に関する。本発明のある実施形態によれば、核酸のような被分析物２１０の少量の分子試料が、マイクロ流体チャネル、マイクロチャネル、またはナノチャネル１８５およびラマン活性な表面を含む試料セル１７５を通り、表面増感コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＳＥＣＡＲＳ）により検出される。本発明の他の実施形態は、被分析物の検出の装置に関する。
2007509322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析物を検出あるいは同定する方法であって、
ａ）少なくとも１つのラマン活性表面に約１０５分子より少ない被分析物をさらす段階と、
ｂ）第１の波長のレーザビームを、少なくとも１つの分子と前記表面との間の界面に照射する段階であって、前記分子が第２の波長の自然ストークスラマン放出と、第３の波長の自然反ストークスラマン放出とを生成する段階と、
ｃ）前記第２の波長の第２のビームを、ｂ）と実質的に同時に前記分子と表面との間の界面に照射する段階であって、前記第３の波長における前記分子からの前記反ストークスラマン放出の強度を増加させる段階と、
ｄ）ｂ）およびｃ）に続いて、前記第３の波長で界面からの前記反ストークス放出の強度の変化を検出または同定することにより、前記被分析物を検出または同定する段階と
を備える方法。
【請求項２】
少なくとも１つのラマン活性な表面に約１０４分子以下の被分析物をさらす段階
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのラマン活性な表面に約１０２分子以下の被分析物をさらす段階
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのラマン活性な表面に約１０分子以下の被分析物をさらす段階
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
チャネルを通って前記被分析物が移動する段階
をさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水性媒体中の前記被分析物を検出する段階および同定する段階
をさらに備える請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記表面が、金属または導電性材料でコーティングされたシリコン基板、金属または導電性のナノ粒子、金属または導電性の複数のナノ粒子の会合体、金属または導電性の複数のナノ粒子のコロイド、およびこれらの複数の組み合わせを含むグループから選択される要素によって提供される
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被分析物が、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、糖たんぱく質、リポたんぱく質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物質、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物質、共同因子、阻害物質、薬物、調合薬、栄養物、プリオン、毒素、毒、爆発的、殺虫剤、化学兵器、生体に有害な薬剤、バクテリア、ウイルス、放射性元素、ビタミン、複素環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発物質、麻酔剤、アンフェタミン、バルビツール酸塩、幻覚剤、廃棄物、および汚染物質を含むグループから選択される
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
被分析物が、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはたんぱく質である
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被分析物が核酸である
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被分析物が、ラマン活性な表面の近部に結合されている
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複数のラマン活性な表面が、複数の有機化合物によって共有結合的に修飾されている
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チャネルが、マイクロ流体チャネル、ナノチャネル、マイクロチャネル、およびこれらの複数の組み合わせを含むグループから選択される
請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
複数の前記ナノ粒子が、約１ｎｍと２μｍとの間の大きさである
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
複数の前記ナノ粒子の大きさが、約１０から５０ｎｍ、約５０から１００ｎｍ、約１０から１００ｎｍ、約１００ｎｍ、および約２００ｎｍを含むグループから選択される
請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
金属が、金、銀、銅、白金、アルミニウム、およびこれらの複数の組み合わせ
を含むグループから選択される
請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記ラマン検出デバイスが、複数のフォトダイオード、複数のアバランシェフォトダイオード、複数の電荷結合素子アレイ、複数のＣＭＯＳアレイ、複数の増強電荷結合素子、およびこれらの複数の組み合わせを含むグループから選択される
請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
被分析物の同一性を決定するために、被分析物の検出された強度を予め同定した被分析物と比較する段階
をさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１分子あたり約１０−２２ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１分子あたり約１０−２０ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１分子あたり約１０−１９ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１分子あたり約１０−１８ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１分子あたり約１０−１７ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１分子あたり約１０−１６ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１分子あたり約１０−１５ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１分子あたり約１０−１４ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１分子あたり約１０−１３ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１分子あたり約１０−１２ｃｍ２の光クロスセクションを有する
請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記被分析物が、１つ以上の識別可能なラマン標識によって標識化されている
請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記チャネルを通って前記被分析物を移動させるために電場をかける段階
をさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
被分析物の各型が、固有のラマン信号を生成する
請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
約１０３分子より少ない被分析物を検出するデバイスであって、
（ａ）第１の波長で電磁波の第１のビームを生成するための手段と、
（ｂ）前記第１の波長とは異なる波長の第２の波長で電磁波の第２のビームを生成するための手段と、
（ｃ）試料セルと、
（ｄ）前記試料セルに、前記被分析物およびラマン活性な表面を導入する手段と、
（ｅ）前記被分析物と前記ラマン活性な表面との間の界面上に、前記第１のビームと前記第２のビームとを集束させる光学素子と、
（ｆ）被分析物とラマン活性な表面との間の界面から放出される光の強度を検出する手段であって、前記放出を受ける位置に配置されている手段と
を備えるデバイス。
【請求項３３】
電磁波の第１のビームを生成する前記手段と、電磁波の第２のビームを生成する前記手段とが、２つのパルスレーザを有する
請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記光学素子が、顕微鏡対物レンズ、ミラー、プリズム、あるいはこれらの複数の組み合わせを有する
請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記試料セルが、
（ａ）外気から前記試料を隔離する材料の試料セル本体と、
（ｂ）電磁波に対して透明な材料の前記試料セル本体の窓と、
（ｃ）前記被分析物および追加的なラマン活性な表面を導入および取り除くための少なくとも１つのポート
を備える請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記試料セルに被分析物およびラマン活性な表面を導入するための前記手段が、マイクロ流体デバイスを有する
請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３７】
界面から放出された光の強度を検出する前記手段が、複数のフォトダイオード、複数のアバランシェフォトダイオード、複数の電荷結合素子アレイ、複数のＣＭＯＳアレイ、複数の増強電荷結合素子、およびこれらの複数の組み合わせを含むグループから選択される差分光検出デバイスである
請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３８】
約１０３分子より少ない被分析物を検出する装置であって、
ａ）反応チャンバと、
ｂ）前記反応チャンバと流体連通している第１のチャネルと、
ｃ）前記第１のチャネルと流体連通している第２のチャネルと、
ｄ）前記第１および第２のチャネルと流体連通している試料セルと、
ｅ）前記フロースルーセル内の、複数のナノ粒子、ナノ粒子の複数の会合体、ナノ粒子の複数のコロイド、または、金属コーティングされた多様性のある基板と、
ｆ）レーザと、
ｇ）前記フロースルーセルに操作可能に連結された、表面増感コヒーレント反ストークスラマン検出器と
を備える装置。
【請求項３９】
前記ラマン検出器がＣＣＤカメラまたはフォトダイオードアレイを有する
請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
前記ＣＣＤカメラまたはフォトダイオードアレイが、操作可能にデータ処理ユニットに連結されている
請求項３８に記載の装置。
【請求項４１】
前記データ処理ユニットがコンピュータを有する
請求項３８に記載の装置。
【請求項４２】
第１電極および第２電極と
をさらに備え、
複数の前記電極は、前記第１のチャネルから前記第２のチャネルに複数の単一被分析物を移動させる
請求項３８に記載の装置。
【請求項４３】
前記第１のチャネルがマイクロ流体チャネルである
請求項３８に記載の装置。
【請求項４４】
前記第２のチャネルがナノチャネルまたはマイクロチャネルである
請求項３８に記載の装置。
【請求項４５】
複数のナノ粒子が金属である
請求項３８に記載の装置。
【請求項４６】
金属が、銀、金、白金、銅、および／またはアルミニウムを含む
請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
ラマン検出器に操作可能に連結されており、流れが、試料セル内の金属コーティングされたナノ結晶ポーラスシリコン基板を通り過ぎるフロースルーセル
をさらに備える請求項３８に記載の装置。
【請求項４８】
金属コーティングされた基板が、集積チップまたは微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）に組み込まれている
請求項３８に記載の装置。
【請求項４９】
前記検出ユニットがレーザおよびＣＣＤカメラを有する
請求項３８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願のクロスリファレンス）本願は、２００３年１０月１７日に出願された米国特許出願第１０／６８８６８０号の一部継続であり、その開示内容が参照されて本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明の実施形態は、分光法により分子を分析する分野に関する。特に、本発明は、一般的に生物学、生化学、および化学実験に用いられる複数の方法および複数のデバイスに関し、そして特に、方法、装置、および複数の核酸のような複数のシーケンシング分子の検出、同定用の表面増感コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＳＥＣＡＲＳ）を利用した装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物製剤およびその他の複数の試料からの少数の分子の感度がよく正確な検出、および／または同定は、医療の診断、病理学、毒物学、環境サンプリング、化学分析、科学捜査、および他の多数の分野での幅広い使用の可能性を有するとらえどころのない目標であることが分かっている。ラマン分光法、および／または表面プラズモン共鳴を用いることによりこの目標を達成することが試みられている。光が注目している媒体を透過すると、その元の方向から若干量そらされる。この現象は散乱として知られている。散乱した光のいくらかは、ａ）媒体による光の吸収、ｂ）媒体中の電子の高エネルギー準位への励起、およびｃ）それに続いて起こる異なる波長での媒体からの光の放射によって、元の励起光から周波数が変動する。周波数の差が注目している媒体の分子振動のエネルギーレベルと一致した場合は、このプロセスは、ラマン散乱として知られている。光散乱の強度は、分子の構造と同様に、試料中の分子の濃度に依存しているものの、ラマン放射スペクトルの波長は、化学組成および試料中の光を吸収した分子の構造に特有のものである。ラマン散乱の放射光の波長が励起光の波長よりも長くなる場合は、これはストークスラマン散乱として知られている。ラマン散乱の放射光の波長が励起光の波長よりも短くなる場合は、これは、反ストークスラマン散乱として知られている。
【０００４】
ラマン相互作用が励起光ビームと試料中のここの分子との間で発生する確率は非常に低く、このため、感度が低く、ラマン分析の適用性は限定されたものとなる。"光クロスセクション"とは、特定の分子または粒子によって誘起されることにより発生する光学の事象の確率を示す用語である。フォトンが分子に衝突すると、幾何学的に分子上に衝突したいくつかのフォトンだけが、分子と光学的に相互作用する。クロスセクションは、幾何学的クロスセクションの倍数および光学の事象の確率である。光学の断面は、吸収クロスセクション（フォトン吸収プロセスの）、レイリー散乱クロスセクションまたは散乱クロスセクション（レイリー散乱の）、およびラマン散乱クロスセクション（ラマン散乱の）を含む。
【０００５】
少数の分子の光学的検出および分光法のためには、１分子あたり１０−１６ｃｍ２よりも大きいクロスセクションが望ましく、１分子あたり１０−２１ｃｍ２よりも大きいクロスセクションが必須である。典型的な自発的ラマン散乱技術は、１分子あたり約１０−３０ｃｍ２のクロスセクションを有しており、そのため、単独分子の検出には適していない。
【０００６】
銀の粗面近傍の分子が、最大６桁から７桁、ラマン散乱を増感させることが観察されている。この表面増感ラマン分光（ＳＥＲＳ）の効果は、金属表面が金属中の伝導電子の集合的なカップリングに起因する電磁波の発生に応答して、著しい光学共鳴を示す、プラズモン共鳴の現象と関連している。本質的に、金属表面は、電磁波の局所的な効果を高めるためのミニチュアの"アンテナ"として機能できる。そのような表面の近傍に位置する分子は、ラマン分光分析においてより大きな感度を示す。
【０００７】
ＳＥＲＳは通常、分光分析デバイスの試料セルの一部としての基板に付着させた金属の粗面フィルムを使用すること、または、試料セルに検査液の一部として金属ナノ粒子若しくは複数のコロイドを導入することのいずれかにより達成される。そして、試料は、これらの金属表面に付けられる。ＳＥＲＳ技術は、特定の分子（例えば、色素分子、アデニン、ヘモグロビン、およびチロシン）だけにではあるが、最大１０１４から１０１６倍の強い強度の増感を与えることができ、それは、単一分子の検出のレンジに近い（Kneippら、Physical  Review  E，  57（6）：R6281−R6284（1998）、NieらのScience、275：1102（1997）を参照）。しかしながら、他のほとんどの分子に対しては、ＳＥＲＳ技術を用いた増感は、単一分子の検出に必要な範囲よりもはるかに低い、１０３から１０６の範囲内に未だ、留まっている。
【０００８】
コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）は、中心周波数がそれぞれωｐおよびωｓであるポンプビームまたはストークスビームと組み合わせたラマン光を使用する４つの波の混合のプロセスである。１つの分子の中でωｐ―ωｓが、与えられた振動モードと共鳴する場合、強度が増感されたＣＡＲＳ信号は、２ωｐ―ωｓの反ストークス周波数での散乱光の結果から観察される。自然のラマン散乱とは異なり、ＣＡＲＳは高い感度であり、１つのフォトンの励起により誘起されたバックグラウンドの蛍光の存在下で検出されうる。（Chengら、J．Phys．Chem．  105、1277（2001）を参照。）ＣＡＲＳ技術は、単一分子の光学的な検出および分光のためにはまだ非常に小さいが、一分子あたり約１０−２５ｃｍ２の範囲において複数のクロスセクションをもたらす、約１０５の係数で強度増感を与える。
【０００９】
理論上は、仮にＣＡＲＳおよびＳＥＲＳ技術が組み合わされて使用された場合には、最大１分子あたり１０−２１から１０−１６ｃｍ２のクロスセクションが、複数の分子の広い範囲で確実に観察されうる。この範囲での増感は、単一分子の検出の範囲内で、確実に観察されうる。ＳＥＲＳとＣＡＲＳ、表面増感コヒーレント反ストークスラマン分光法（以下、ＳＥＣＡＲＳとする）の組み合わせは、金属薄膜を用いたＳＥＲＳ技術で明らかにされている（Chenら、Phys．Rev．Lett．  43、946（1979）；Y．R．Shen、The  Principles  of  Non−Linear  Optics、John  Willey＆Sons、1984、p．492を参照）。しかしながら、この金属薄膜技術を用いて観察された増感は、単一分子の検出を可能とする範囲内ではない。一般的に、ＳＥＲＳ金属フィルム技術を用いた増感は、金属粒子の懸濁液を用いた技術で観察された増感ほど大きくはない。さらに、１０９から１０１８またはそれ以上の係数でＳＥＣＡＲＳ増感を達成するためには、特定の状態が、分子の各タイプに精密に調整されなければならない。
【００１０】
少数の分子の検出のためにこれらの増感を実現することの問題の一部は、少数の分子を検出する能力が、それがバックグラウンドのノイズの問題と同程度の感度の問題である点にある。仮に、溶液中の特定の蛍光分子が検出された場合には、溶媒と関連付けられたバックグラウンドから間違いなく区別可能である。バックグラウンドの寄与を最小化するために、可能な限り最も少ない量の試料が用いられなければならない。これは、分子からの信号は試料の量から独立しているものの、バックグラウンドが試料の量に比例しているという事実のためである。それゆえに、少量の分子のラマン検出は、１０ｐＬかそれ以下の量の試料を使用してよい。少数の分子を検出するためのＳＥＣＡＲＳを用いた複数のデバイスおよびラマン分光法を用いた分子からの信号の増感を増やすための方法のために、必要性は存在している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明をよりよく理解するために、いくつかの実施例が単に一例として、そして、添付図面に関して説明される。
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係る、複数のビームを集中させ、また、試料からのラマン散乱光を集めるための様々な光学素子を使用する、同期化されたＳＥＣＡＲＳシステムの図である。
【００１３】
【図２】図１の試料セルの範囲を示す。図面のスケールがそのようなものであるため、ラマン活性な表面は、本発明の増感を可能とするために被被分析物から数十ナノメータの範囲内に配置される。
【００１４】
【図３】１００ナノモル濃度におけるデオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）のＳＥＣＡＲＳスペクトルである。これは、ｄＡＭＰの約１０００分子に対応する。Ａは、７３０ｃｍ−１（７８５ｎｍのポンプレーザで７４２ｎｍに対応している）におけるｄＡＭＰのＳＥＣＡＲＳ信号を表しており、約７００００カウント発生している。Ｂは、７８５ｎｍにおけるポンプレーザの信号を表している。Ｃは、８３３ｎｍにおけるストークレーザの信号を表している。複数のスペクトルは、１００ミリ秒で測定された。ポンプおよびストークスレーザは、およそ２ピコ秒でパルス発振される。ポンプレーザの平均出力は、約５００ｍＷであり、ストークスレーザの平均出力は約３００ｍＷであった。
【００１５】
【図４】同一の１００ナノモル濃度におけるデオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）の比較ＳＥＲＳスペクトルである。Ａは、７３０ｃｍ−１（７８５ｎｍのポンプレーザで８３３ｎｍに対応している）におけるｄＡＭＰのＳＥＲＳ信号を表しており、約１５００カウントだけ発生している。スペクトルは、１００ミリ秒で測定された。ポンプレーザは、連続発振モードで稼動した。ポンプレーザの平均出力は、約５００ｍＷであり、ストークスレーザは用いなかった。
【００１６】
【図５】１００ミリモル濃度におけるデオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）の比較ＣＡＲＳスペクトルである。Ａは、７３０ｃｍ−１（７８５ｎｍのポンプレーザで７４２ｎｍに対応している）におけるｄＡＭＰのＣＡＲＳ信号を表しており、約２５００カウントだけ発生している。Ｂは、７８５ｎｍにおけるポンプレーザの信号を示す。Ｃは、８３３ｎｍにおけるストークレーザの信号を示す。スペクトルは、また、１００ミリ秒で測定された。ポンプおよびストークスレーザは、約２ピコ秒でパルス発振された。ポンプレーザの平均出力は、約５００ｍＷであり、ストークスレーザの平均出力は、約３００ｍＷであった。１００ナノモル濃度のｄＡＭＰのＣＡＲＳスペクトルは、１００ミリ秒でのスペクトル測定時間においては取得できなかった。
【００１７】
【図６】９０ｐＭ濃度におけるｄＡＭＰおよびｄＧＭＰからのＳＥＣＡＲＳ信号である。
【００１８】
【図７】９０ｎｇ／μＬ濃度におけるアンジオテンシンＩペプチドからのＳＥＣＡＲＳ信号である。
【発明の開示】
【００１９】
（定義）本願の開示の目的のために、以下の複数の用語が以下の複数の意味で用いられる。定義されていない複数の用語は、それらの平易で普通の意味にしたがって用いられる。
【００２０】
本願では、"１つ"は、項目の１つまたは１つ以上を意味してよい。
【００２１】
本願では、"約"は、数値データの１０パーセント以内を意味する。例えば、"約１００"は、９０から１１０の間の値を意味してよい。
【００２２】
本願では、１つの項目の"多数"は、当該項目の２つまたはそれ以上を意味する。
【００２３】
本願では、"マイクロチャネル"は、１マイクロメータ（μｍ）と９９９μｍとの間の断面直径を有するどのようなチャネルであってもよく、さらに、"ナノチャネル"は、１ナノメータ（ｎｍ）と９９９ｎｍとの間の断面直径を有するどのようなチャネルであってもよい本発明のある実施形態においては、"ナノチャネルまたはマイクロチャネル"は、直径が約９９９μｍかそれ以下であってよい。"マイクロ流体チャネル"は、マイクロ流体フローにより液体が移動するチャネルである。チャネル直径、マイクロ流体フローの流体粘度および流速の効果は、当該技術分野で周知である。
【００２４】
本願では、"操作可能に連結"とは、装置および／またはシステムの２つ以上のユニット間の機能的な相互作用があることを意味する。例えば、仮に、核酸のような単一分子被被分析物２１０が試料セル１７５、ナノチャネル、マイクロチャネル、あるいはマイクロ流体チャネル１８５を通過するときに、単一分子被被分析物２１０を検出すべく、ラマン検出器１９５が配置されている場合に、ラマン検出器１９５は、フロースルーセル（試料セル）１７５、ナノチャネル、マイクロチャネル、あるいはマイクロ流体チャネル１８５に"操作可能に連結"されてよい。また、例えば、仮にコンピュータ２００が、ラマン検出器によって検出されたラマン信号上のデータを取得し、処理し、格納し、および／または送信することができる場合に、ラマン検出器１９５は、コンピュータ２００に"操作可能に連結"されてよい。
【００２５】
本願では、"被被分析物"２１０という用語は、検出および／または同定されるいかなる原子、化学物質、分子、化合物、組成物、あるいは注目している会合体をも意味する。
被被分析物の例には、これらには限られないが、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物質、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物質、共同因子、阻害物質、薬物、調合薬、栄養物、プリオン、毒素、毒、爆発物、殺虫剤、化学兵器、生体に有害な薬剤、放射性元素、ビタミン、複素環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発物質、麻酔剤、アンフェタミン、バルビツール酸塩、幻覚剤、廃棄物、および／または汚染物質を含む。本発明のある実施形態によれば、１またはそれ以上の被分析物は、以下に述べるように、１またはそれ以上のラマン標識によって標識化されてもよい。
【００２６】
"標識"という用語は、標識が付加された被分析物２１０を同定するために用いられうるいかなる原子、分子、化合物、または組成物を言及するために用いられる。本発明の様々な実施形態において、そのような付加は、共有あるいは非共有結合のいずれであってもよい。制限されることのない例においては、標識は、蛍光性、リン光性、発光性、エレクトロルミネセント、化学発光、またはいかなるバルキーな基であってもよく、ラマンあるいは他の分光装置の特性を示してもよい。
【００２７】
"ラマン標識"は、以下のものに限られないが、複数の合成分子、複数の色素、フィコエリトリンのような複数の天然顔料、Ｃ６０、バッキーボール、およびカーボンナノチューブのような複数の有機ナノ構造体、金または銀のナノ粒子またはナノプリズムのような金属ナノ構造体、および量子ドットなどのナノスケールの複数の半導体構造を含む、いかなる有機または無機分子、原子、錯体、またはラマン信号を検出可能に形成された構造体であってもよい。ラマン標識の多数の例が以下に開示されている。当業者は、そのような例に限られず、そして、"ラマン標識"は、ラマン分光によって検出できる、当業者に知られているいかなる有機または無機原子、分子、化合物、または構造を包含することを理解するであろう。
【００２８】
本願では、"ナノ結晶シリコン"という用語は、典型的には、１から１００ナノメータ（ｎｍ）の範囲の大きさ内の、ナノメータスケールのシリコン結晶を含むシリコンを言及する。"ポーラスシリコン"２２０は、エッチングされるか、または多孔質構造を形成するために別の方法で処理されたシリコンを言及する。
【００２９】
（表面増感コヒーレント反ストークスラマン分光法）本発明の一実施形態は、表面増感コヒーレント反ストークスラマン分光法（以下、ＳＥＣＡＲＳとする）、表面増感ラマン分光法（以下、ＳＥＲＳとする）とコヒーレント反ストークスラマン散乱（以下、ＣＡＲＳとする）の組み合わせを用いることによって少数の分子を検出する装置および方法に関する。本発明の装置および方法は、検出される、および／または同定される複数の分子とラマン活性表面との間の界面によって定義される標的領域での、異なる複数のラマン波長のストークス光およびポンプ光の双方が開始することを含む。少数の分子は、約１０７よりも少ない複数の分子、好ましくは約１０６よりも少ない複数の分子、好ましくは約１０５よりも少ない複数の分子、好ましくは約１０４よりも少ない複数の分子、好ましくは約１０３よりも少ない複数の分子、好ましくは約１０２よりも少ない複数の分子、好ましくは約１０よりも少ない複数の分子、好ましくは５よりも少ない複数の分子、好ましくは１分子、およびこれらの間の範囲の分子の数を含む。一実施形態においては、ラマン活性表面は、１つあるいはそれ以上のラマン検出ユニット１９５に操作可能に連結される。
【００３０】
図１を参照すると、一実施形態において、すなわち、ソース１２０および１２５のそれぞれからの電磁気的放射の波動１３０および１３５である、２つの入力励起ビームを、デバイスは提供する。これらのソースは、各々、一般的な光源、適切なフィルター、およびコリメータを備えてよく、あるいは好ましくは、これらのソースは、２つのダイオードレーザ、固体レーザ、イオンレーザ、あるいは同種のものによって提供されてよい。これらのレーザは、いかなる特定の大きさであってもよいが、マイクロデバイスの一部として本発明の方法が実施されることが望ましいので、マイクロレーザの使用が好ましい。適切なソースは、以下のものには限られないが、SpectraPhysics社のモデル１６６の５１４．５ｎｍのラインアルゴンイオンレーザ、６４７．１ｎｍのクリプトンイオンレーザ（Innova７０、Coherent）、３３７ｎｍの窒素レーザ（Laser  Science  Inc．）、３２５ｎｍのヘリウム−カドミウムレーザ（Liconox、米国特許第６１７４６７７号を参照）、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、および／または様々な種類のイオンレーザおよび／または色素レーザ、垂直キャビティ面発光レーザ（ＶＣＳＥＬ）（Honeywell，Richardson，TX、またはSchott  Southbridge，MA）、ナノワイヤレーザのような他の複数のマイクロレーザ（Huangら、Science  292、1897（2001）参照）、５３２ｎｍ波長の倍波長Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、あるいは、７００ｎｍと１０００ｎｍとの間のいかなる波長での倍波長Ｔｉ：サファイアレーザ３７０、あるいは発光ダイオードを含む。
【００３１】
表面増感ＣＡＲＳの信号強度は、入力ポンプレーザの強度に依存する。しかしながら、界面上の最大のレーザ強度は、しばしば光学的なダメージにより制限される。この理由のために、標準的な連続波のレーザビームよりも高いピーク出力を有する、より短いポンプパルスレーザビームを用いるのが好ましい。連続波（ＣＷ）レーザは、一般的に、高ピーク出力レベルにおいてマイクロワットからワットまでの出力を供給する一方で、パルスレーザは、同一の平均出力において稼動された場合に、高ピーク出力レベルにおいてキロワットからギガワットまでの出力を供給する。これにより、光学ダメージの閾値以下のままでより強い信号が生じる。パルス幅は、約１００ナノ秒から約８０フェムト秒の範囲にわたる。ピーク出力およびビームのスペクトルライン幅にもよるが、典型的には、約１００フェムト秒から約７ピコ秒のパルス幅で、最もよい結果が生じる。
【００３２】
パルスレーザビームあるいはＣＷレーザビームが用いられてもよい。また、レーザが用いられた場合には、入力ビームは、複数のビームのオーバラップを保証するために同期化されなければならない。これは、適切なレーザコントローラ、あるいは他の種類の複数の同期化電子機器によって達成されてよい。商業的に利用可能な使用されてよい電子機器の複数の例は、以下に限られないが、Lok-to-Clockデバイス（Spectra-Physics）、あるいはSynchroLockデバイス（Coherent）を含む。これらの複数の電子機器は、図には示していない、追加の複数のフォトダイオードおよびそれらの操作のための複数のビームスプリッタを必要としてもよい。他の実施形態では、１つのシングルレーザビームを入力し、異なる複数の波長に可変な２つの同期化されたビームを生成する光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）を用いる。
【００３３】
ポンプ波の波ベクトルは、表面位相整合状態を満たすように、調整することができる。
【数１】
2007509322.tif 000003
ここで、ｋ１は、第１のビームの波ベクトルであり、ｋ２は第２のビームの波ベクトルであり、ｋａ（ωａ）は、反ストークス信号の波ベクトルであり、そして、ｋ'（ωａ）は、表面ＥＭ波の波ベクトルである。
【００３４】
光のこれら２つのビームを試料に到達させるためには、いくつかの方法が存在する。図１に示したように、ＳＥＣＡＲＳデバイスの一つの実施例では、標準的な全分野における光学機器、またはミラー１４５と１５０との連続、およびダイクロイックミラー１５５、および／または入射ビーム１３０および１３５を試料セル中に導くプリズム１４０のような共焦点の光学機器のいずれかを使用してよい。ガラスあるいは水晶のような透明な物質で作成された（直角あるいは等辺の）半円筒形、あるいは対物レンズ１６０を通して、複数のビームは集束されてよい。そのような複数の集束レンズの例には、以下のものには限られないが、６Ｘ対物レンズ（Newport、モデルL６X）あるいは１００Ｘ対物レンズ（Nikon、Epi  100x  色消し）のような、Nikon社、Zeiss社、Olympus社、およびNewport社の複数の顕微鏡対物レンズが含まれる。集束レンズ１６０は、ラマン活性表面および被分析物を含む領域上への複数の励起ビームを集束させるため、また、試料からのラマン散乱光を集めるために用いられる。
【００３５】
これらの複数のビームは、複数のビームの特性を変化させ、または、偏光子、スリット、追加の複数のレンズ、ホログラフィックビームスプリッタ、および／または、ノッチフィルタ、モノクロメータ、ダイクロイックフィルタ、バンドパスフィルタ、複数のミラー、複数のバリアフィルタ、および複数の共焦点ピンホール、その他同種のもののようにバックグラウンドの信号を減少させる他の複数のデバイスを、任意に透過してよい。例えば、ホログラフィックビームスプリッタ（Kaiser  Optical  Systems，Inc．  モデルHB647-26N18）は、励起ビーム１３５および放出されたラマン信号に、直角の配置を生じさせる。ホログラフィックノッチフィルタ（Kaiser  Optical  Systems，Inc．）は、レイリー散乱放射を減少させるために用いてもよい。同様に、励起ビーム１３０および１３５は、例えばバンドパスフィルタ（Corion）を用いて、スペクトル的に浄化されてもよい。
【００３６】
複数の集束レンズは、図２ＡおよびＢにおいてより細部が示されている、光学的に透過な試料セル１７５内へ光１６５を集束する。図２ＡおよびＢに示しているように、通常２１０として示す検出されるべき被分析物と、より詳細については以下に述べているラマン活性表面との間の界面を含んでいる領域内に光は集束される。
【００３７】
本発明のある実施形態は、様々な形態のラマン表面の使用に関する。例えば、ラマン活性表面は、以下のものに限られないが、１つ以上のナノ結晶の層、および／または金属あるいは他の導電性物質でコーティングされたポーラスシリコンのような、金属表面２２０および２３０、あるいは２７０および２８０や、金属ナノ粒子のような粒子２４０や、金属ナノ粒子会合体のような粒子の会合体２５０や、金属ナノ粒子コロイドのような粒子のコロイド（イオン化合物２６０を持つコロイド２４０）や、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【００３８】
被分析物とラマン活性表面との間の界面から放出される放射１９０の反ストークスビームは、試料セルの外へ透過して、スペクトル分離のためのモノクロメータに操作可能に連結されている共焦点または標準的な光学機器によって集束される、位相がそろったビームとして伝播する。ビームはラマン検出ユニット１９５により検出される。反ストークスビームの高い指向性の出力は、強い傾向性のバックグラウンドが存在していたとしても、その検出を可能とする。
【００３９】
（ラマン検出ユニット)ラマン検出ユニットは、特に重要ではなく、特定の被分析物の少数の分子を検出するための十分な感度およびスピードを有する、どのような一般的な光学検出器であってもよい。冷却された電荷撮像素子（ＣＣＤ）アレイの感度に相当する感度で十分である。検出スピードは、ミリ秒からナノ秒の範囲内である。ラマン検出ユニットは、大きなあるいは小さな領域の検出器、複数の検出器のアレイ、あるいは同種のものを備える。そのような複数の検出器の例には、複数のフォトダイオード、複数のアバランシェフォトダイオード、複数のＣＣＤアレイ、複数の相補型ＭＯＳ（ＣＭＯＳ）アレイ、複数の増強ＣＣＤ、および同種のものを含む。ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、および複数のアバランシェフォトダイオードが好ましい。差動検出器１９５は、反ストークス波あるいはビーム１９０を横切る位置の光強度の変動を示す電気的な出力信号を生成する。強い吸収を決定するＳＥＣＡＲＳ効果は、検査されている試料中の物質によって決定される特定の角度、または強度で発生する。これらの複数の電気的な信号は、関連回路（図示しない）を通して情報処理および制御システムまたはコンピュータを含む適切なデータ分析装置（２００で総称される）へサンプリング／カウント、およびデジタル化されて入力される。
【００４０】
ラマン検出ユニット１９５の複数の例は、以下のものに限られないが、シングルフォトンカウントモデル（RCA  Model  C31034  あるいはBurle  Indus．  モデルC310342、米国特許第５３０６４０３号参照）として操作される、Spex  Model  1403  ヒ化ガリウム製の光電子増倍管を有するダブルグレーティング分光光度計、赤色増感を強化する電荷結合素子（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システム（Princeton  Instruments）を備えるＩＳＡ  ＨＲ−３２０分光器、フーリエ変換分光器（Michaelson社の複数の干渉計に基づく）、複数の電荷注入デバイス、アバランシェフォトダイオードを含む複数のフォトダイオードアレイ、複数のＩｎＧａＡｓ検出器、電子結合ＣＣＤ、強化したＣＣＤ、および／または複数のフォトトランジスタアレイを含む。
【００４１】
（情報処理およびシステムまたはコンピュータの制御、およびデータ分析)本発明のある実施形態において、装置は、情報処理システムあるいはコンピュータ２００を備えていてよい。開示された実施形態は、使用される情報処理システムまたはコンピュータ２００の種類によって制限されることはない。典型的な情報処理システムあるいはコンピュータは、情報を通信するためのバスおよび情報を処理するプロセッサを備える。本発明の一実施形態によれば、プロセッサは、限定されることはないが、インテル社（Santa  Clara、CA）から入手可能なペンティアム（登録商標）ＩＩファミリー、ペンティアム（登録商標）ＩＩＩファミリー、およびペンティアム（登録商標）４ファミリーを含む一群のペンティアム（登録商標）ファミリーから選択される。本発明の他の実施形態によれば、プロセッサは、セレロン（登録商標）、アイテニアム（登録商標）、あるいはペンティアムゼオン（登録商標）プロセッサ（インテル社、Santa  Clara、CA）であってもよい。本発明の他の様々な実施形態によれば、プロセッサは、インテル（登録商標）ＩＡ−３２、またはインテル（登録商標）ＩＡ−６４アーキテクチャのようなインテル（登録商標）アーキテクチャをベースにしていてもよい。また、他の複数のプロセッサが用いられてもよい。
【００４２】
情報処理および制御システム、またはコンピュータ２００は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）あるいは他の動的記憶装置デバイス、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）あるいは他の静的記憶装置、および磁気ディスクまたは光学ディスクおよびその対応するドライブのような、データ記憶デバイスをさらに備えてよい。情報処理および制御システム、またはコンピュータ２００は、メモリ、表示デバイス（例えば、ブラウン管または液晶表示装置（ＬＣＤ））、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス、トラックボール、または複数のカーソル指示キー）、および通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークインターフェースカード、すなわち、イーサネット（登録商標）、トークンリング、または他の種類のネットワークと接続するために用いられるインターフェースデバイス）のような、当該技術分野で周知であるいかなる周辺機器デバイスをさらに備えてもよい。
【００４３】
検出ユニット１９５からのデータは、プロセッサによって処理され、メインメモリのようなメモリにデータは格納される。また、複数の標準的な被分析物の複数の放出プロファイル上のデータも、メインメモリまたはＲＯＭ中に格納されている。プロセッサは、試料中の被分析物の型を同定するためにラマン活性表面と被分析物の複数の分子２１０の試料からの放出スペクトルを比較する。例えば、情報処理システムは、バックグラウンドの信号の除去、およびヌクレオチドの同定の一部としてオーバラップしている複数の信号が検出された場合の"ベースコーリング"の決定のような、複数の手順を実行する。別に備えられているコンピュータ２００が、所定の実施のために用いられることが好ましい。それゆえに、システムの機器構成は、本発明の異なる実施形態において様々である。
【００４４】
本願において開示されている複数の方法は、プログラムされたプロセッサの制御下において実行されてよいが、本発明の他の実施形態において複数の手順は、例えば、複数のフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、ＴＴＬロジック、あるいは、複数の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）のような、いかなるプログラマブルあるいはハードコートされたロジックにより、完全にまたは部分的に実行されてよい。さらに、開示されている複数の方法は、プログラムされた一般的な目的のコンピュータ２００の複数の構成要素、および／または、複数のカスタムハードウエアの構成要素のいかなる組み合わせで実行されてもよい。
【００４５】
データ収集の手順に続いて、データは、典型的には、データ分析手段に報告される。分析手順を容易にするために、検出ユニット１９５によって取得されたデータは、典型的には、上述したようなデジタルコンピュータを用いて解析される。典型的には、コンピュータは、収集したデータの解析および報告と同様に、検出ユニット１９５からのデータの受け取りと格納のために適切にプログラムされている。
【００４６】
本発明のある実施形態によれば、複数のカスタムデザインされたソフトウエアパッケージが、検出ユニット１９５から取得されたデータの解析に用いられる。本発明の他の実施形態によれば、データ解析は、情報処理システム、あるいはコンピュータ２００、および公的に利用可能な複数のソフトウエアパッケージを用いて実行される。ＤＮＡシーケンス分析のための利用可能なソフトウエアの限定されない例は、PRISM  ＤＮＡ  シーケンシング分析ソフトウエア（Applied  Biosystems、Foster  City、CA）、Sequencherパッケージ（Gene  Codes、Ann  Arbor、ＭＩ）、およびウエブサイトwww.nbif.org／links／1.4.1.phpでのNational  Biotechnology  Information  Facilityを通して利用可能な様々なソフトウエアパッケージを含む。
【００４７】
（ラマン活性な表面）（Ａ．ナノ粒子、会合体、およびコロイド）本発明のある実施形態によれば、ラマン活性表面は、単独で用いられるか、または、被分析物２１０の少数の分子から得られるラマン信号をさらに増感させるために、２３０を有する金属でコーティングされたポーラスシリコン基板２２０のような、他のラマン活性な表面と組み合わされた、金属ナノ粒子２４０によって提供される。本発明の様々な実施形態によれば、ＳＥＣＡＲＳ信号を供給するために利用できるいかなるナノ粒子が用いられてよいが、複数のナノ粒子は、銀、金、白金、銅、アルミニウム、あるいは他の複数の導電性材料である。銀あるいは金で作られた複数の粒子が特に好ましい。
【００４８】
複数の粒子またはコロイド表面は、様々な形状および大きさであってよい。本発明の様々な実施形態によれば、直径が１ナノメータ（ｎｍ）と２マイクロメータ（μｍ）との間の複数のナノ粒子が用いられる。本発明の他の実施形態によれば、直径が、２ｎｍから１μｍ、５ｎｍから５００ｎｍ、１０ｎｍから２００ｎｍ、２０ｎｍから１００ｎｍ、３０ｎｍから８０ｎｍ、４０ｎｍから７０ｎｍ、または、５０ｎｍから６０ｎｍの複数のナノ粒子が用いられる。本発明のある実施形態によれば、平均直径が１０から５０ｎｍ、５０から１００ｎｍ、あるいは約１００ｎｍの複数のナノ粒子が用いられる。仮に、金属でコーティングされたポーラスシリコン基板のような他のラマン活性表面と組み合わせて用いる場合には、複数のナノ粒子の大きさは、用いられる他の表面に依存する。例えば、２３０を有する金属コーティングされたポーラスシリコン２２０の複数のポアの直径は、複数のナノ粒子が複数のポアの中に収まるように選択される。
【００４９】
複数のナノ粒子は、いかなる通常のまたは不規則な形状の複数のナノ粒子であってもよいが、略球形、円筒形、三角形、棒状、刃状、複数の面を有する形状、プリズム、あるいは、尖った形状を有する。複数のナノ粒子を生成する複数の方法が知られている（米国特許第６０５４４９５号、米国特許第６１２７１２０号、米国特許第６１４９８６８号、LeeおよびMeisel、J．Phys．Chem．86、3391-3395、1982参照。）。複数のナノプリズムは、Jinらによる"Photoinduced  conversion  of  silver  nanospheres  to  nanoprisms"、Science  294、1901、2001に説明されている。また、複数のナノ粒子は、商業的供給源から取得できる（例えば、Nanoprobes  Inc．  Yaphank、NY、Polysciences，  Inc．  Warrington、PA）。
【００５０】
（コロイドおよび会合体）本発明のある実施形態によれば、ナノ粒子は、単独のナノ粒子２４０であり、および／または、ナノ粒子のランダムな複数のコロイド（イオン性化合物２６０を有する２４０）である。複数のナノ粒子の複数のコロイドは、ＮａＣｌのような複数のイオン性化合物２６０を、複数のナノ粒子２４０に加えることなどの標準的な手法により合成される（LeeおよびMeisel、J．Phys．Chem．86、3391（1982）、J．Hulteenら、"Nanosphere  Lithography：A  materials  general  fabrication  process  for  periodic  particle  array  surfaces"、J．Vac．Sci．Technol．A、13、1553-1558（1995）参照。）。
【００５１】
会合体は、２つの密接に接近しているナノ粒子の間の領域からのナノ粒子の欠乏に起因する誘引ポテンシャルが、非吸着ナノ粒子の添加により効果的に生じる結果である、"ディプレションメカニズム"によって反応が誘起される（J．Chem．Phys．110（4）、2280（1999）参照。）。
【００５２】
本発明の他の実施形態のよれば、複数のナノ粒子２４０は、ダイマー、トリマー、テトラマー、あるいは他の会合体のように、複数のナノ粒子２５０の特定の会合体を形成するために架橋されている。ＳＥＣＡＲＳ検出のための"複数のホットスポット"の形成は、特定の会合体２５０あるいは複数のナノ粒子の複数のコロイド（イオン性化合物２６０を有する２４０）に関連している。他の複数の実施形態においては、複数のナノ粒子２４０の同種の集団、および／または、複数の会合体２５０または複数のコロイド（イオン性化合物２６０を有する２４０）を用いるが、本発明のある実施形態では、複数の会合体あるいは異なる大きさの複数のコロイドの異種の混合を用いる。本発明のある実施形態においては、複数のナノ粒子２５０（ダイマー、トリマー等）の選択された数を含む複数の会合体は、ショ糖密度勾配溶液の超遠心分離法のような知られた複数の技術によって濃縮、あるいは浄化される。本発明の様々な実施形態によれば、大きさが、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００から１００ｎｍの大きさかそれ以上の、複数のナノ粒子会合体２５０または複数のコロイド（イオン性化合物を有する２４０）が用いられる。本発明の特定の実施形態によれば、複数のナノ粒子会合体２５０または複数のコロイド（イオン性化合物２６０を有する２４０）は、約１００ｎｍと約２００ｎｍとの間の大きさである。
【００５３】
複数のナノ粒子を架橋して複数の会合体を形成する複数の方法もまた当該技術分野で周知である（Feldheim、"Assemly  of  metal  nanoparticle  arrays  using  molecular  bridges"、The  Electrochemical  Society  Interface、Fall、2001、pp．22-25参照。）。例えば、複数の金のナノ粒子が、例えば、末端にチオールあるいはスルフヒドリル基を有する二官能基を有するリンカー化合物を用いて架橋される（Feldheim、2001）。本発明のいくつかの実施形態によれば、１つのリンカー化合物が、両末端をチオール基で誘導化される。複数の金のナノ粒子との反応において、リンカーは、リンカーの長さによって分離されるナノ粒子ダイマーを形成しうる。本発明の他の実施形態によれば、３、４あるいはそれ以上のチオール基を有する複数のリンカーが、同時に複数のナノ粒子に付加する際に使用される（Feldheim、2001）。複数のナノ粒子の過剰の使用は、複数のリンカー化合物が複数の架橋を形成し、複数のナノ粒子が沈殿することを抑制する。また、複数の銀ナノ粒子の会合体は、当該技術分野で周知である標準的な複数の合成手法により形成される。
【００５４】
本発明の他の実施形態によれば、複数のナノ粒子２４０、複数の会合体２５０、あるいは複数のコロイド（イオン性化合物２６０を有する２４０）は、被分析物２１０の分子試料に共有結合している。本発明の他の実施形態によれば、被分析物２１０の分子試料は、複数のナノ粒子２４０に直接結合している、あるいは、複数のナノ粒子会合体２５０に共有結合または非共有結合で複数のリンカー化合物に結合している。
【００５５】
また、被分析物２１０の分子を複数のナノ粒子、または他のラマン活性な表面に結合させるために、複数のナノ粒子を架橋するために知られている様々な手法が用いられる。被分析物２１０の分子を結合するために用いられる複数のリンカー化合物は、約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、８０、９０から１００ｎｍあるいはより長い長さまでの範囲のほとんどいかなる長さであってもよいことが意図されている。本発明のある実施形態によれば、異なる長さの複数のリンカーを用いる。
【００５６】
本発明の開示されている一実施形態によれば、被分析物２１０の分子は、分子−ナノ粒子の錯体を形成するためにチャネル１８５を下るにつれて、複数のナノ粒子２４０に結合する。本発明のある実施形態によれば、架橋反応が発生するために可能な時間の長さは、非常に限られる。そのような複数の実施形態においては、エポキシド基、アジド基、アリルアジド基、トリアジン基、またはジアゾ基のような、速い反応速度を有する高反応性の架橋基を利用する。本発明のある実施形態によれば、複数の架橋基は、レーザのような強い光にさらされることにより光活性化されてもよい。例えば、ジアゾまたはアジド化合物の光活性化により、それぞれ、高反応性のカルベンおよびナイトレン部分を有する構造となる。本発明のある実施形態によれば、複数の反応性基は、複数のナノ粒子２４０がそれぞれ架橋するよりも、被分析物２１０へ複数のナノ粒子２４０が結合することだけができるように、選択される。被分析物２１０へ結合できる反応性架橋基の選択および準備は当該技術分野で周知である。本発明の他の実施形態によれば、被分析物２１０それ自身が、例えば、複数の金のナノ粒子２４０に結合できるスルフヒドリル基で共有結合的に修飾されている。
【００５７】
本発明の他の実施形態によれば、ナノ粒子または他のラマン活性な表面は、アミノシラン、３−グリサイドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）、あるいはアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）などの、誘導体化シランによってコーティングされている。複数のシランの複数の末端基にある反応活性泣きは、複数のナノ粒子２４０の架橋した会合体の形成に用いられる。用いられる複数のリンカー化合物が、約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０から１００ｎｍあるいはより長い長さの、ほとんどいかなる長さであってもよいことが意図される。本発明のある実施形態によれば、異なる長さの複数のリンカーが用いられてもよい。また、そのような複数の誘導体化シランは、複数の標準的な手法を用いて被分析物２１０に共有結合される。
【００５８】
本発明のさらに他の実施形態によれば、複数のナノ粒子は、複数リンカー化合物に結合される前に様々な反応活性基によって修飾される。修飾された複数のナノ粒子は、Nanoprobes  Inc．（Yaphank、NY）から入手可能なＮａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子のように、商業的に利用可能である。Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子は、１つのナノ粒子あたりに、単一または複数のいずれかのマレイミド、アミン、または他の複数の基が結合した状態で得られる。また、Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子は、電場中で複数のナノ粒子の操作を容易にするために、正または負のいずれかに帯電した形態で利用可能である。そのように修飾された複数のナノ粒子は、ダイマー、トリマー、またはその他の複数のナノ粒子の会合体を提供する、様々な公知の複数のリンカー化合物に結合される。
【００５９】
複数のナノ粒子２５０の小さな会合体の生成という結果、および／または、溶液中で複数の被分析物が沈殿しないという結果となる限り、用いられるリンカー化合物の型は限られない。本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカー基は、フェニルアセチレンポリマーを含む（Feldheim、2001）。もう一つの方法としては、複数のリンカー基は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、またはその他の公知のポリマーを含む。使用される複数のリンカー化合物はポリマーに限られず、シラン、アルカン、誘導体化シラン、または誘導体化アルカンの他の複数の型をもまた含む。本発明の特定の実施形態によれば、アルカンやシランのような比較的単純な化学構造の複数のリンカー化合物が、被分析物によって放出されるラマン信号との相互作用を避けるために用いられる。
【００６０】
他の方法では、用いられる複数のリンカー化合物は、チオール基のような、単一の反応活性基を含む。単一の結合したリンカー化合物を含むナノ粒子は、例えば、２つの異なるナノ粒子に結合した複数のリンカー化合物の非共有的な相互作用による、自己会合してダイマーとなる。例えば、複数のリンカー化合物は複数のアルカンチオールを含む。チオール基が金のナノ粒子へ結合した後に続いて、アルカン基は、疎水的相互作用によって結合される傾向がある。本発明の他の実施形態によれば、複数のリンカー化合物は、各末端基に異なる機能の複数の基を含む。例えば、リンカー化合物は、１つの末端に金のナノ粒子への結合を可能とするスルフヒドリル基を含み、他の末端に他の複数のリンカー化合物への結合を可能とする異なる反応性基を含む。そのような複数の反応活性基の多くは当該技術分野で周知であり、現在の複数の方法および複数の装置で使用される。
【００６１】
本発明の他の実施形態によれば、被分析物２１０は、ナノ粒子２４０の表面の近傍に結合されているか、あるいはそうでなければ、ナノ粒子２４０の極めて近接（約０．２と１．０ｎｍとの間）に存在する。本願では、"近傍に結合された"とは、ラマン活性な表面に結合（共有結合、または非共有結合のいずれか）、または吸着している被分析物の分子試料を意味する。当業者は、ナノ粒子２４０への被分析物２１０の分子試料の共有結合が、ＳＥＣＡＲＳによる表面増感ラマン信号を生成するためには必要でないことを理解するであろう。
【００６２】
（ｂ．金属コーティングおよび非金属コーティングされたナノ結晶、および／または、ポーラスシリコン）ナノ結晶シリコンのような、粗面あるいは広い表面積の表面の生成のための様々な方法が当業者に公知である（例えば、Petrova-Kochら、"Rapid-thermal-oxidized  porous  silicon-the  superior  photoluminescent  Si"、Appl．Phys．Lett．61、943、1992；Edelbergら、"Visible  luminescence  from  nanocrystalline  silicon  films  produced  by  plasma  enhanced  chemical  vapor  deposition"、Appl．Phys．Lett．68、1415-1417、1996；Schoenfeldら、"Formation  of  Si  quantum  dots  in  nanocrystalline  silicon"、Proc．7th  Int．Conf．on  Modulated  Semiconductor  Structures、Madorid、pp．605-608、1995；Zhaoら、"Nanocrystalline  Si：a  material  constructed  by  Si  quantum  dots"、1st  Int．Conf．  on  Low  Dimensional  Structures  and  Devices、Singapore、pp．467-471、1995；Lutzenら、"Structural  characteristics  of  ultrathin  nanocrystalline  silicon  films  formed  by  annealing  amorphous  silicon"、J．Vac．Sci．Technology  B  16、2802-05、1998；米国特許第５７７００２２号、５９９４１６４号、６２６８０４１号、６２９４４４２号、６３００１９３号）。本願で開示した複数の手法および複数の装置は、粗面あるいは広い表面積の表面の生成の方法に限られるものではなく、公知のいかなる方法も用いられることが意図されている。
【００６３】
例えば、ナノ結晶シリコンを生成する複数の方法は、以下のものに限られることはないが、シリコンリッチな酸化物へのシリコン（Ｓｉ）注入およびアニーリング、金属核生成触媒を用いた固相結晶化、化学気相蒸着法、ＰＥＣＶＤ（プラズマ誘導化学気相蒸着法）、気相蒸発法、気相熱分解、気相光熱分解、電気化学エッチング、シランおよびポリシランのプラズマ分解、高圧液相還元酸化反応、アモルファスシリコン層の急速アニーリング、ＬＰＣＶＤ（低圧化学気相蒸着法）を用いたアモルファスシリコン層の蒸着の後にＲＴＡ（急速加熱アニール）サイクルを施す方法、シリコンアノードおよびシリコンのレーザアブレーションを用いたプラズマ電気アーク蒸着（米国特許第５７７００２２号、５９９４１６４号、６２６８０４１号、６２９４４４２号、６３００１９３号）を含む。プロセスに依存して、１から１００ｎｍあるいはより大きな大きさのいかなる大きさのＳｉ結晶が、チップ上の薄膜、個別の層、および／または会合した複数の結晶として形成されてよい。本発明のある実施形態によれば、基板２２０に結合したナノ結晶シリコンを含む薄膜が用いられてよい。
【００６４】
複数の実施形態は、出発物質の組成に制限されないが、本発明の他の実施形態によれば、他の複数の物質が利用され、唯一の必要条件としては、図２に例示したように、ラマン反応性金属でコーティングされることができる基板２２０あるいは２７０を形成することができなければならない物質であることが意図される。
【００６５】
本発明のある実施形態によれば、シリコン結晶および／またはポーラスシリコンのポアサイズの大きさおよび／または形は、例えば、２３０を有する金属でコーティングされたポーラスシリコン２２０のプラズモン共鳴周波数を最適化するために、予め定められた制限の範囲内で選択される（米国特許第６３４４２７２号参照。）。また、プラズモン共鳴周波数は、ポーラスシリコン２２０をコーティングしている金属層２３０の厚さを制御することにより調整される（米国特許第６３４４２７２号参照）。ナノスケールのシリコン結晶の大きさを制御する方法も知られている（例えば、米国特許第５９９４１６４号および６２９４４４２号参照）。
【００６６】
（１．ポーラスシリコン）上記で説明したように、粗面を有する基板２２０は、純粋なシリコンに限られず、また、窒化ケイ素、ゲルマニウム、および／またはチップ加工において知られている他の複数の材料を含んでいてよい。また、金属核生成触媒、および／またはドーパントのような、他の微量の物質が存在していてもよい。唯一の必要条件は、図２に例示したように、基板材料が、ラマン反応性金属、または他の導電性あるいは半導体材料２３０または２８０でコーティングされることのできる基板２２０または２７０を形成できなければならないということである。ポーラスシリコンは、最大７８３ｍ２／ｃｍ３の大きな表面積を有し、表面増感ラマン分光技術のための非常に大きな表面積を提供する。
【００６７】
当該技術分野では公知のように、ポーラスシリコン２２０は、電気化学セル中の希フッ化水素酸（ＨＦ）によるシリコン基板のエッチングにより生成される。ある場合においては、シリコンは、低電流密度でＨＦ中において初めにエッチングされる。初期の複数のポアが形成された後に、シリコンは、電気化学セルから取り除かれ、電気化学セル中で形成された複数のポアを広げるために非常に希釈されたＨＦ中でエッチングされる。また、シリコン基板の組成は、シリコンがドープされているか否か、ドーパントの種類、およびドーピングの度合に依存して、ポアサイズに影響する。シリコンポアサイズに対するドーピングの影響は当該技術分野で周知である。大きな生体分子の検出および／または同定を含む本発明の複数の実施形態においては、約２ｎｍから１００あるいは２００ｎｍのポアサイズが選択される。また、ポーラスシリコン中の複数のポアの配向についても、本発明の特定の実施形態においては選択される。例えば、１、１、１または１、１、０の結晶構造は、結晶軸に沿って対角線上には移行する複数のポアを有する一方で、エッチングされた１、０、０結晶構造は、結晶に対して垂直方向に配向する複数のポアを有する。ポアの配向の結晶構造の影響は、当該技術分野において周知である。また、結晶組成および気孔率は、ラマン信号を増感し、バックグラウンドのノイズを減少させるために、ポーラスシリコンの追加的な複数の特性を変化させることにより調整される。ポーラスシリコンの追加的な複数の特性は、当該技術分野において周知である（例えば、Cullisら、J．Appl．Phys．82、909−965（1997）、Collinsら、Physics  Today、50、24-31（1997）参照）。
【００６８】
本発明の様々な実施形態によれば、ポリメチルメタクリレートのような公知のレジスト化合物によりシリコン基板の一部分をコーティングすることにより、ＨＦエッチングから保護される。ＨＦエッチングするためのシリコン基板の選択した部分を露光するために役立つフォトリソグラフィーのようなリソグラフィー技術は、当該技術分野において周知である。選択エッチングが、ラマン分光法に用いられるポーラスＳｉチャンバの大きさおよび形状を制御するのに役立つ。本発明のある実施形態によれば、直径が約１μｍ（マイクロメータ）のポーラスシリコンチャンバーが用いられる。本発明の他の実施形態によれば、約１μｍの幅のポーラスシリコンの溝またはチャネルが用いられる。ポーラスシリコンチャンバーの大きさは限定されるものではなく、いかなる大きさまたは形状のポーラスシリコンチャンバーが使用されてもよいことが意図される。例えば、１μｍのチャンバの大きさは、大きさが１μｍの励起レーザによって役に立つ。
【００６９】
上記で開示された典型的な方法は、ポーラスシリコン基板２２０を生成するために限定されず、当該技術分野において周知のいかなる方法も使用されることが意図される。ポーラスシリコン基板２２０を作成するための複数の方法の限定されない例においては、シリコン基板またはメッシュの陽極エッチング、電気めっき、およびシリコン／酸素含有材料の蒸着の後に、制御されたアニーリングを施す方法を含む（例えば、Canham、"Silicon  quantum  wire  array  fabrication  by  electrochemical  and  chemical  dissolution  of  wafers"，Appl．Phys．Lett．57、1046、1990；米国特許第５５６１３０４号、６１５３４８９号、６１７１９４５号、６３２２８９５号、６３５８６１３号、６３５８８１５号、６３５９２７６号参照。）。本発明の様々な実施形態によれば、ポーラスシリコン層２２０は、バルクのシリコン、水晶、ガラス、および／またはプラスチックのような、１つ以上の補助層に結合している。ある実施形態によれば、窒化ケイ素のようなエッチストップ層がエッチングの深さを制御するために用いられる。
【００７０】
本発明の他の特定の実施形態によれば、金属コーティング２３０の前または後のいずれかにおいて、ポーラスシリコン基板２２０への複数の付加的な修飾が意図される。例えば、ポーラスシリコン基板２２０をエッチングした後に、当該技術分野において周知の複数の手法を用いて、酸化ケイ素、および／または二酸化ケイ素に酸化してよい。例えば、酸化は、ポーラスシリコン基板２２０の機械的強度および安定性を向上させるために用いられる。他の例としては、２３０を有する金属でコーティングされたシリコン基板２２０が、穴を残したまま、あるいは、付加的なラマン活性材料のような他の複数の材料で満たされた金属の外殻を残して、シリコン材料を除去するためにさらにエッチングされてもよい。
【００７１】
（２．シリコン基板の金属コーティング）シリコン基板２２０あるいは２７０は、金、銀、白金、銅、あるいはアルミニウムのような当業者に周知のいかなる方法によって、ラマン活性な金属でコーティングされる。限定的でない典型的な手法は、電気めっき、カソードエレクトロマイクグレーション、金属の蒸着およびスパッタ、メッキの触媒のための種結晶の使用（すなわち、金メッキのための銅／ニッケルシードの使用）、イオン注入、拡散、あるいはシリコン基板２２０あるいは２７０上への金属薄膜のメッキに関する当業者に周知の他のいかなる方法を含む（例えば、LopezおよびFauchet、"Erbium  emission  form  porous  silicon  one‐dimensional  photonic  band  gap  structures"、Appl．Phys．Lett．、77、3704-6（２０００）；米国特許第５５６１３０４号、６１７１９４５号、６３５９２７６号参照。）。他の限定的でない金属コーティングは、無電解メッキを含む（例えば、Goleら、"Patterned  metallization  of  porous  silicon  from  electroless  solution  for  direct  electrical  contact"、J．Electorchem．Soc．147、3785（2000）、参照。）。金属層の組成および／または厚さは、２３０を有する金属でコーティングされたシリコン２２０または２８０を有する２７０のプラズモン共鳴周波数を最適化するために制御される。
【００７２】
本発明の他の実施形態によれば、被分析物の検出に用いられるラマン活性な表面は、金属コーティング、ナノ結晶、金属コーティングされたナノ結晶の固定化された複数のコロイドと結合したポーラスシリコン基板、複数のポーラスシリコンナノ粒子のような、異なる複数の型のラマン活性な表面の組み合わせを含む。そのような構成は、溶液中の被分析物のための比較的狭いチャネルを有する、ラマン活性な金属の非常に広い表面積を有する。大きな複数のたんぱく質や複数の核酸のような、大きな複数の分析分子には好ましくはないものの、単一ヌクレオチドやアミノ酸のような、小さな分子のよりよい感度および検出を提供する。
【００７３】
（流路、チャネル、およびマイクロマシン技術（ＭＥＭＳ））図１に例示したように、本発明のある実施形態によれば、被分析物２１０の分子試料は、マイクロ流体チャネル、ナノチャネル、あるいはマイクロチャネル１８５、および／または試料セル１７５のような、流路またはチャネルを通って移動して、装置の検出ユニット１９５のそばを通り過ぎる。そのような複数の実施形態によれば、ラマン活性な表面および複数の被分析物は、より大きな装置、および／またはシステムに組み込まれる。ある実施形態によれば、ラマン活性な複数の表面は、マイクロマシンシステム（ＭＥＭＳ）に組み込まれる。
【００７４】
ＭＥＭＳは、機械的な複数の要素、複数のセンサ、複数のアクチュエータ、および電子機器を含む、統合されたシステムである。これらの構成要素の全ては、シリコンベースの、あるいは、同等の基板を含む、通常のチップ上に施される公知の微細加工技術によって製造される（例えば、Voldmanら、Ann．Rev．Biomed．Eng．1、401-425（1999））。ＭＥＭＳの複数のセンサ構成要素は、機械的、熱的、生物学的、化学的、光学的、および／または磁気的な現象を測定するために用いられる。電子機器は、複数のセンサからの情報を処理して、複数のポンプ、複数のバルブ、複数のヒーター、複数の冷却器、複数のフィルター等のよう複数のアクチュエータ構成要素を制御するので、その結果、ＭＥＭＳの機能を制御する。
【００７５】
（ａ．集積チップの製造）他の例としては、本発明のある実施形態によれば、２３０を有する金属でコーティングされたポーラスシリコン層２２０または２８０を有する非ポーラス層２７０は、チップ製造方法として知られている公知の複数の方法を用いて、ＭＥＭＳ半導体チップの試料セルの統合部分として、組み込まれている。他の複数の実施形態によれば、２３０チャンバを有する金属でコーティングされたポーラスシリコン２２０は、シリコン基板から切り出されて、チップ、および／または他のデバイスに組み込まれる。
【００７６】
さらに、ＭＥＭＳの電子的な複数の構成要素は、複数の集積回路（ＩＣ）プロセス（例えば、ＣＭＯＳ、バイポーラ、またはＢＩＣＭＯＳプロセス）を用いて製造されてよい。コンピュータチップ製造において知られている複数のフォトリソグラフィーおよびエッチング技術を用いてパターン化される。微細な機械的な複数の構成要素が、シリコン基板の複数の部分を選択エッチングする、あるいは、機械的、および／または電気機械の構成要素を形成するための新しい複数の構造層を加える、適当な"マイクロマシン"プロセス使用して製造される。ＭＥＭＳ加工の基本的な複数の手法は、基板上に材料の薄膜を蒸着する方法、フォトリソグラフィーイメージにより膜の上にパターンマスクを付ける方法、または他の公知の複数のリソグラフィー手法、および複数の膜の選択エッチング手法を含む。薄膜は、数ナノメータから１００マイクロメータの範囲の厚さを有する。使用される複数の蒸着方法は、化学気相蒸着法（ＣＶＤ）、電気めっき、エピタキシー、および熱酸化のような化学的な工程、並びに物理蒸着法（ＰＶＤ）および鋳造のような物理的な工程を含む。複数のナノ電気機械システムの製造のための複数の手法は、本発明のある実施形態に使用されている（例えば、Craighead、Science、290、1532-36（2000）参照。）。
【００７７】
（ｂ．マイクロ流体チャネルおよびマイクロチャネル）本発明のいくつかの実施形態によれば、ラマン活性な表面は、複数のマイクロ流体チャネル、複数のナノチャネル、および／または複数のマイクロチャネルのような、様々な流体で満たされた区画に結合されている。これらおよび装置の他の構成要素は、例えば、半導体チップ、および／またはマイクロキャピラリーまたはマイクロ流体チップで知られているチップの形状で、単一のユニットとして形成される。他の例としては、ラマン結成な表面は、シリコン基板から取り除かれ、装置の他の複数の構成要素に結合される。開示された装置には、シリコン、二酸化シリコン、窒化ケイ素、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、プラスチック、ガラス、水晶等を含む、そのようなチップに用いられるものとして知られているいかなる材料を用いてもよい。
【００７８】
本発明のある実施形態によれば、チャネル１８５は、約３ｎｍと約１μｍとの間の直径を有することが意図されている。本発明の特定の実施形態によれば、チャネル１８５の直径は、励起レーザビームよりもわずかに小さな大きさに選択される。複数のチップのバッチ製造のための複数の手法は、コンピュータチップ製造、および／またはマイクロキャピラリーチップ製造の分野において周知である。そのような複数のチップは、フォトリソグラフィーおよびエッチング、レーザアブレーション、射出成型、鋳造、分子ビームエピタキシー、ディップペンナノリソグラフィー、ＣＶＤ製造、電子ビームまたは集束イオンビーム技術、若しくはインプリンティング技術のような、当該技術分野において周知のいかなる手法によっても製造されてよい限定されない複数の例においては、流動性を有し、プラスチックやガラスのような、光学的に透明な材料を用いた従来の成型する手法、二酸化ケイ素のフォトリソグラフィーおよびドライエッチングする手法、二酸化ケイ素基板上のアルミニウム製マスクのパターンへポリメチルメタクリレートのレジストを用いた、電子ビームリソグラフィーの後に、反応性イオンエッチングを施す手法、本発明のある実施形態に用いられるナノ電気機械システムの製造のための複数の手法を含む（例えば、Craighead、Science、290、1532-36、2000、参照。）。微細加工された様々な形態の複数のチップが、Caliper  Technologies  Inc．（Mountain  View、CA）およびACLARA  BioSciences  Inc．（Mountain  View、CA）のような供給源から、商業的に利用可能である。
【００７９】
たんぱく質、ペプチド、核酸、ヌクレオチド、および同種のもののような、様々な単一生体分子にさらされる流体が満たされた複数の区画のために、例えば、疎水性から親水性の表面に変換するため、および／または表面への複数の分子の吸着を減少させるために、そのような複数の分子にさらされる表面はコーティングにより修飾されていてよい。ガラス、シリコン、水晶、および／または、ＰＤＭＳのような通常の複数のチップ材料の表面修飾は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６２６３２８６号参照）。そのような複数の修飾は、以下のものに限られないが、商業的に利用可能な複数のキャピラリーコーティング（Supelco、Bellafonte、PA）、ポリエチレンオキサイド、あるいはアクリルアミドのような、様々な複数の官能基が結合した複数のシラン、または当該技術分野において周知の他のいかなるコーティングを含んでよい。
【００８０】
被分析物２１０の検出を容易にするために、本発明の一実施形態によれば、励起状態における電磁波および使用される放射の周波数に透明な複数の材料を備える。ガラス、シリコン、水晶、あるいはラマン分光に用いられる周波数の範囲で一般的に透明な他のいかなる材料も、用いられてよい。いくつかの実施形態によれば、ナノチャネルまたはマイクロチャネル１８５は、ローディングチャンバー１８０の製造に用いられる同一の材料から、射出成型または他の公知の複数の手法を用いて、製造される。当該部品が導入するいかなる屈折も無視または補正できるので、試料セルにとっては、いかなる配置、形状、および大きさも可能である。レンズ１６０から出てきた集束した複数のビーム中の全ての光線が、光学的に透過な試料セル１７５をすばやく伝播し、そのためにいかなる屈折も受けないような配置が好ましい。光学的に透過な試料セル１７５およびチャネル１８５は、Keirら、1503-1508（2002）において開示されているような、マイクロ流体デバイスの一部である。
【００８１】
また、複数のマイクロキャピラリー電気泳動デバイスを含む、マイクロ流体デバイスの微細加工については、例えば、Jacobsenら（Anal．Biochem、209、278-283（1994））、Effenhauserら（Anal．Chem．66,2949-2953、（1994））、Harrisonら（Science、261、895-897（1993））、および米国特許第５９０４８２４号に述べられている。
【００８２】
（ｃ．ナノチャネル）複数のナノチャネル１８５のような、より小さな直径を有する複数のチャネルは、以下のものに限定されることはないが、直系を狭めるためにマイクロチャネル１８５の内側をコーティングする手法、あるいは、ナノリソグラフィーを用いる手法、集束電子ビーム、収束イオンビーム、または集束原子レーザを用いる手法を含む、公知の複数の手法により作成される。
【００８３】
複数のナノチャネル１８５の製造は、ナノスケールの製造に関する技術分野において周知のいかなる技術を用いてもよい。以下の述べる複数の手法は、単に、典型的な例に過ぎない。例えば、複数のナノチャネル１８５は、高スループット電子ビームリソグラフィーシステムを用いて作成される（例えば、NOVA  Scientific，Inc．Sturbridge、MAから商業的に利用可能である）。電子ビームリソグラフィーは、複数のシリコンチップ上に５ｎｍと同等くらいの外観を描画するのに使用される。複数のシリコン基板上にコーティングされたポリメチルメタクリレートのような、複数の感光性レジストは、マスクを使用せずにパターニングされる。電子ビームアレイは、電子ビームの安定性を向上させるために、フィールドエミッタクラスターとマイクロチャネルアンプリファイアとを結びつけるので、低電流において操作可能となる。本発明のいくつかの実施形態によれば、SoftMask（登録商標）コンピュータ制御システムが、シリコンまたは他のチップ上のナノスケールの外観の電子ビームリソグラフィーを制御するために用いられてよい。
【００８４】
本発明の他の実施形態によれば、複数のナノチャネル１８５は、集束原子レーザを用いて作成される（例えば、Blochら、"Optics  with  an  atom  laser  beam"、123-321（2001）参照。）。標準的な複数のレーザまたは集束電子ビームと同様に、集束原子レーザがリソグラフィーに用いられる。そのような複数の手法では、ミクロンスケール、またはナノスケールの構造さえもチップ上に作成することができる。本発明の他の実施形態によれば、複数のナノチャネル１０３を形成するために、ディップペンナノリソグラフィーが用いられてよい（例えば、Ivanisevicら、"Dip−Pen  Nanolithography  on  Semiconductor  Surfaces"、J．Am．Chem．Soc．123,7887-7889（2001）参照。）。ディップペンナノリソグラフィーは、シリコンチップのような表面に複数の分子を堆積させるのに、原子間力顕微鏡を使用する。１５ｎｍと同じぐらいの大きさの外観を、１０ｎｍの空間分解能で形成される。複数のナノスケールチャネル１８５は、一般的な複数のフォトリソグラフィー技術とディップペンナノリソグラフィーとの組み合わせを用いることにより形成される。例えば、レジストの層中のミクロンスケールの線は、標準的なフォトリソグラフィーを用いて形成される。ディップペンナノリソグラフィーを用いると、レジストの複数の端にレジスト化合物をさらに堆積させることにより線の幅（および、エッチング後のチャネル１８５の対応する直径）を狭める。より細い線のエッチングの後に、ナノスケールのチャネル１８５が形成される。他の例としては、原子間力顕微鏡が、ナノメータスケールの外観の形成のためにフォトレジストの除去のために用いられる。
【００８５】
本発明の他の実施形態においては、チップ上の複数のナノチャネル１８５を作るために、イオンビームリソグラフィが用いられる（例えば、Siegel、"Ion  Beam  Lithography"、VLSI  Electronics、Microstructure  Science、Vol．16、Einspruch  and  Watts  eds．Academic  Press、New  York、1987参照。）。精密に集束されたイオンビームは、マスクを使用せずにレジストの層上に複数のナノチャネル１８５のような、複数の外観を直接的に描画するために用いられる。他の例としては、幅のあるイオンビームが１００ｎｍの大きさと同程度の外観を形成するためのマスクと組み合わせて用いられる。例えば、フッ化水素酸を用いた化学エッチングが、レジストによって保護されていない暴露されたシリコンを除去するために用いられる。当業者は、上記で開示した複数の手法に限定されず、当該技術分野において周知のいかなる方法を用いても複数のナノチャネル１８５が形成されることを理解するであろう。
【００８６】
そのような複数の手法は、開示された複数の手法および複数の装置に容易に適用される。本発明のいくつかの実施形態においては、当該技術分野において公知の複数の手法を用いて、マイクロキャピラリーは、ローディングチャンバー１８０の製造に用いられたのと同一の材料から製造される。
【００８７】
本発明の一実施形態によれば、例えば、シリコンベースの材料のような適切な不活性材料で作られた、小型のマイクロ流体デバイスは、分析される複数の分子の試料のような試料中にインプリントされ、そして、ラマン活性な表面が試料セルの中に製造されるか、あるいは、試料セル中へ供給される。ガラス窓は、集束レーザスポットの視界を提供し、また、空気と反応しやすい分子にとっては重要なことだが、周囲の環境から溶液を密封する。セルは、不活性ガスで溶液をパージするポートを有していてよい。さらに、被分析物を含む試料が分析され、ラマン活性な複数のナノ粒子、複数の会合体、および複数のコロイドがセルに流入し、互いに接触すること、およびセルから流出することを可能とする大きさの複数のポートを有していてもよく、そのために、試料が分析の間中、継続的に補充されることを可能とし、最大の感度が保証される。
【００８８】
（ｄ．流路）本発明のある実施形態によれば、複数のナノ粒子２４０は、マイクロ流体工学、ナノ流体工学、流体力学における力、または電気浸透のような、当該技術分野において周知の手法を用いて、マイクロ流体チャネル、ナノチャネル、あるいは、マイクロチャネル１８５内へ操作される。例えば、本発明の一実施形態によれば、検出される被分析物２１０、および／または複数のナノ粒子、複数の会合体、または複数のコロイドは、ローディングチャンバー１８０を通って導入され、試料セル１７５、および／またはマイクロ流体チャネル、ナノチャネル、および／または複数のマイクロチャネル１８５を、溶媒のバルクのフローによって移動する。本発明の他の実施形態によれば、マイクロキャピラリー電気泳動が、被分析物２１０の試料セル１７５、および／またはマイクロ流体チャネル、ナノチャネル、および／またはマイクロチャネル１８５の輸送に用いられる。マイクロキャピラリー電気泳動は、一般的に、特定の分離媒体が充填されたまたはされていない、細いキャピラリーまたはチャネルの使用を含む。負に帯電した被分析物２１０のように、適切に帯電した複数の分子種の電気泳動は、例えば、検出ユニット側に正の電荷を印加し、反対側に負の電場を印加するように、電場を印加することに応答して発生する。電気泳動は、マイクロキャピラリーに同時に添加された複数の構成要素の混合物の大きさの分離のためにしばしば用いられるが、同程度の大きさの被分析物２１０の移送にも用いられうる。いくつかの被分析物２１０は他のものよりも大きく、そのためによりゆっくりと移動するために、試料セル１７５および／または流路１８５の長さ、および検出ユニット１９５を通過するのに対応する通過時間は、異なった種類の被分析物が検出されるかまたは同定される場合に、移動の差が被分析物２１０の順序で混同することを防止するために、最小限に維持される。他の例としては、マイクロキャピラリーを充填している分離媒体は、被分析物２１０の試料セル１７５および／または流路１８５への移動速度が類似しているか、または同一であるように選択される。マイクロキャピラリー電気泳動の複数の手法は、例えば、WoolleyおよびMathiesによって開示されている（Proc．Natl．Acad．Sci．USA、91、11348-352（1994）参照。）。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、帯電した複数のリンカー化合物または帯電した複数のナノ粒子２４０を使用することは、電気勾配の使用を通して、複数のナノ粒子２４０の操作を容易にする。本発明の他の実施形態によれば、試料セル１７５および／または流路１８５は、グリセロール溶液のような比較的高い粘度を有する水溶液を含む。そのような高い粘度を有する溶液は、流速を減少させ、例えば、被分析物２１０のナノ粒子２４０への架橋反応のための可能な反応時間を増加させる役目を果たす。本発明の他の実施形態によれば、試料セル１７５および／または流路１８５は、限定はされないが、複数の有機溶媒を含む非水溶液を含んでいてよい。
【００９０】
分析される被分析物の試料および金属粒子あるいは複数のコロイド表面は、様々な方法で試料セルに運ばれる。例えば、金属粒子またはコロイド表面は、分析される分子（または複数の分子）の試料へ運ばれ、分析される分子（または複数の分子）の試料は、金属粒子またはコロイド表面へ運ばれ、あるいは、分析される分子（または複数の分子）および金属粒子あるいはコロイド表面は、同時に運ばれる。図１および図２に示したように、分析される分子（または複数の分子）の試料、および／または金属粒子あるいはコロイド表面は、送り出す、あるいは他の方法で試料にチャネル１８５を通って試料セル中に流れ込むことを可能とするデバイスによって自動的に運ばれる。そのようなデバイスは、リニアな複数のマイクロ流体デバイスを含む。他の実施形態によれば、分析される分子（または複数の分子）の試料、および／または金属粒子、あるいはコロイド表面は、試料溶液の滴を、筒、ピペット、あるいは他のそのような手動でデバイスを運ぶものを用いて、直接試料セルに１滴落とすまたは複数の滴を落とすことにより手動で運ばれる。被分析物の分子試料およびラマン活性表面の供給の他の複数の手法もまた、可能である。被分析物の分子試料が、試料セル１７５を通って流れるにしたがって、分析の間中継続的に監視される反ストークスビーム１９０の出力は、部分的に変わる／変化する。
【００９１】
これらの図から明確に分かるように、ＳＥＣＡＲデバイスの光学計装は、検出され、および／またはＣＡＲＳ型のデバイスによって同定される被分析物（ＳＥＲＳ）に極めて近接したラマン活性な表面の導入のために供給される。リニアなマイクロ流体デバイスの一部として、複数のナノ粒子、複数の会合体、または複数のコロイドおよび分析される被分析物は、様々な方法で結合される。これらは、ａ）被分析物の分子試料を、ナノ粒子、会合体、またはコロイドに結合させ、または吸着させて、試料セルに流す段階と、ｂ）被分析物の分子試料を、セルの内側に固定化されたナノ粒子、会合体、またはコロイドを有する試料セル中に流す段階と、ｃ）ナノ粒子、会合体、またはコロイドおよび被分析物の分子試料を、流入したナノ粒子、会合体またはコロイドおよび流入した被分析物の分子試料を混合するための二股に分かれたマイクロ流体チャネルを有するデバイスを通して流し、被分析物の分子試料と複数のナノ粒子、複数の会合体、または複数のコロイドとが一度、完全に混合されたことの光学的測定を可能とする段階とを含む。
【００９２】
異なるいくつかの実施形態が、被分析物のほんの少数の分子の試料の検出および同定を可能とする正確な放出の配向を達成するために、以下のものに限られないが、様々な波長、導波管、ポンプビームの光学カップリング／選択、および同様のものの使用を含む、マイクロスケールのこの技術の達成のために想定される。上述したように、ラマン光の２つの分離した波長は、標的被分析物の振動エネルギー準位と一致するように、そして、高い指向性を有した出力の配向に一致するように選ばれなければならない。例えば、７３５ｃｍ−１におけるアデニン環のブリージングモード（breathing  mode）を調査するために、エネルギー準位の差が、７３５ｃｍ−１の振動エネルギー準位に一致するように、励起光は７８５ｎｍに調整され、ストークス光は８３３ｎｍに調整される。
【００９３】
（ラマン標識）本発明のある実施形態は、ラマン検出ユニット１９５によって測定を容易にするために、被分析物２１０の１つ以上の分子に標識を結合することを含む。
ラマン分光法に用いられる複数の標識の限定されない例は、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、テキサス赤色染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルバイロレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４'、５'−ジクロロ−２'、７'−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２'、４'、５'、７'−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、アミノアクリジン、量子ドット、カーボンナノチューブ、フラーレン、イソシアン化物などの有機シアン化合物類、および同様の化合物を含む。これらおよび他の複数のラマン標識は、商業的供給源から取得でき（例えば、Molecular  Probes、Eugene、OR；Sigma  Aldrich  Chemical  Co．St．Louis、MO）、および／または、当該技術分野において周知の技術によって合成できる（Chem.Commun．724（2003）参照。）。
【００９４】
複数の多環芳香族化合物は、当該技術分野において周知なように、複数のラマン標識として機能する。本発明の特定の実施形態において利用される他の複数の標識は、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リン、および硫黄を含む。本発明のある実施形態によれば、カーボンナノチューブが複数のラマン標識として利用される。ラマン分光法における複数の標識の使用については公知である（例えば、米国特許第５３０６４０３号および６１７４６７７号参照）。当業者は、使用される複数のラマン標識が、区別ができる複数のラマンスペクトルを生成し、異なる種類の複数の被分析物２１０に明確に隣接するか、または結合していることを理解するであろう。
【００９５】
複数の標識は被分析物２１０の分子（または複数の分子）に直接結合されているか、または複数の様々なリンカー化合物を介して結合されている。開示されている複数の手法において利用される複数の架橋試薬および複数のリンカー化合物は、さらに以下に詳述する。他の例としては、複数のラマン標識に共有結合している複数の分子は、標準的な商業的供給源から入手できる（例えば、Roche  Molecular   Biochemicals、Indianapolis、IN；Promega  Corp.  Madison、WI；Ambion,Inc.  Austin、TX；Amersham  Pharmacia  Biotech、Piscataway、NJ）。複数のヌクレオチドのような、他の複数の分子と反応して共有結合を形成するように設計された複数の反応基を含む複数のラマン標識は、商業的に入手可能である（例えば、Molecular  Probes、Eugene、OR）。複数の標識化された被分析物の合成のための複数の方法は公知である（例えば、米国特許第４９６２０３７号、５４０５７４７号、６１３６５４３号、６２１０８９６号参照）。
【００９６】
本発明の増感については、２つの主要な理論があるが、いずれについても良く理解されておらず、本発明の記述については重要ではない。
【００９７】
以上の記述から理解されるように、本発明のセンサの応答時間および本発明の手法は、差分検出デバイスの特性、およびその関連するサンプリングおよび複数の処理回路だけによって制限される。商業的に入手可能な統合プリアンプは、数ピコ秒の範囲の応答時間を提供する。これら超高速の応答時間は、検査または分析の間に生じる初期の過渡現象および他のシフトが監視されることを可能とし、また、急速な校正チェックがなされるのを許可する。本発明は、試料の関連構成物質と、金属、または半導体微粒子、若しくはコロイド表面との間で化学結合が達成されるのにかかる時間よりも短いという、とても短い時間スケールで望まれる反射特性を決定することを可能とする。
【００９８】
本発明の高分解能、高速応答時間、およびコンパクトなデザインは、特定の被分析物の少数の分子の検出および同定に役立つ、多数の生物学、生化学、および化学的な応用分野において、本発明の複数の手法および複数の装置が利用されることを可能とする。これらの複数のデバイスおよび複数の手法の１つの特定の応用は、核酸のらせん構造から順次開裂して生じた、少数の標識化された、または標識化されていない複数のヌクレオチド分子の検出および同定によって、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸の単一らせん構造のようなポリマーの配列を決定することである。例えば、ヌクレオチドおよび複数の金属粒子の双方が、マイクロチャネル中の水／バッファ溶液を介して、検出のための微小試料セルに導入される。
【００９９】
さらに特定の複数の特徴および本発明の実施を例示する、以下の複数の例が提供される。本発明の特定の複数の実施形態を示すこれらの複数の例は、本発明の範囲あるいは添付された特許請求の範囲に限定されるとは、解釈されない。
【０１００】
（例１、ＳＥＣＡＲＳ設定１）本構成は、２つのレーザを備える。１つのレーザは、ポンプレーザであって、ポンプビームを放出し、他方のレーザは、ストークスレーザであって、ストークスビームを放出する。ポンプレーザは、７６ＭＨｚ周期で１ピコ秒のパルス幅の１０ｎＪのパルスを生成する。ストークスレーザは、７６ＭＨｚ周期で１ピコ秒のパルス幅の６ｎＪのパルスを生成する。ポンプおよびストークスレーザは、２つのレーザによって生成される複数の出力パルスのタイミングを同期化する電子コントローラ（CoherentのSynchroLock  AP）に接続されることにより、同期化して動作する。Coherent（Santa  Clara、CA）から入手される２つのチタンサファイアレーザが、ポンプおよびストークスビームを供給する。２つのビームは、Chroma（Brattleboro、VT）によって製造された複数のダイクロイックミラーによって空間的に重ね合わせられる。複数のビームは、２つのビームのエネルギー準位の差が、標的の被分析物の所定の振動エネルギー準位に一致するように、特定の波長に調整される。複数のビームは、顕微鏡の対物レンズ（Zeiss）を介してマイクロ流体チャネルの検出窓領域上に伝達される。
【０１０１】
（反応チャンバ、マイクロ流体チャネル、およびマイクロチャネルの生成）Borofloatガラス基板（Precision  Glass  ＆  Optics、Santa  Ana、CA）が、濃縮ＨＦ（フッ化水素酸）中で短い時間プリエッチされ、プラズマ化学気相蒸着（ＰＥＣＶＤ）システム（PEII−A、Technics  West、San  Jose、CA）中でのアモルファスシリコン犠牲層の蒸着前に洗浄される。複数の基板は、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）が塗布され、フォトレジストがスピンコート（Shipley  1818、Marlborough、MA）され、そしてソフトベークされる。コンタクトマスクアライナー（Quintel  Corp.  San  Jose、CA）が、１つ以上のマスクデザインを有したフォトレジストの露光に用いられ、露光後のフォトレジストは、Micropositデベロッパーコンセントレイト（Shipley）と水との混合物を用いて除去される。現像された複数の基板はハードベークされ、ＰＥＣＶＤ反応装置中でＣＦ４（四フッ化炭素）プラズマを用いて露出したアモルファスシリコンが除去される。複数の基板は、反応チャンバ、およびマイクロ流体チャネル、またはマイクロチャネルを生成するために、濃縮ＨＦを用いて化学エッチングされる。残留フォトレジストは剥離され、アモルファスシリコンは除去される。
【０１０２】
複数のナノチャネルは、この手法のバリエーションによって形成される。上述した標準的なフォトリソグラフィーは、集積チップのミクロンスケールの構造物の形成に利用される。レジスト薄膜がチップ上にコーティングされる。原子間力顕微鏡／操作トンネルプローブチップが、チップ表面から５から１０ｎｍ幅のレジストの溝を除去するのに利用される。チップは希釈ＨＦによって、チップ表面にナノメータスケールの溝を形成するために、短い時間エッチングされる。本願の限定的でない例においては、５００ｎｍと１μｍとの間の直径を有するチャネルが生成される。
【０１０３】
複数のアクセスホールは、エッチングされた複数の基板にダイヤモンドドリルビット（Crystalite、Westerville、OH）で開けられる。完成したチップは、プログラムされた真空装置（Centurion  VPM、J.M.Ney、Yucaipa、CA）の中で、補助的にエッチングされて穴が開けられた２つのプレートをお互いに熱的に結合させることによって準備される。２５００ダルトンの分子量を遮断するナイロンフィルターが、エクソヌクレアーゼが反応チャンバからなくなることを防止するために反応チャンバとマイクロ流体チャネルとの間に挿入される。
【０１０４】
（ナノ粒子の生成）複数の銀のナノ粒子が、LeeおよびMeiselにしたがって生成される（J.Phys.Chem.86、3391-3395、1982参照。）。複数の金のナノ粒子が、Polyscience  Inc.（Warrington、PA）またはNanoprobes  Inc.（Yaphank、NY）から購入される。Polyscience  Inc.から入手可能な複数の金のナノ粒子は、５、１０、１５、２０、４０および６０ｎｍの大きさであり、Nanoprobes  Inc.からは、１．４ｎｍの大きさである。本願の限定されない例においては、６０ｎｍの複数の金のナノ粒子が用いられる。
【０１０５】
複数の金のナノ粒子は、鎖長範囲が５ｎｍから５０ｎｍの範囲のアルカンジチオールと反応する。複数のリンカー化合物は、複数の金のナノ粒子と反応するためのアルカンの両末端に、複数のチオール基を含む。複数のリンカー化合物へ過剰量のナノ粒子が用いられ、複数のリンカー化合物は、大きなナノ粒子の会合体の形成を避けるために、複数のナノ粒子にゆっくりと添加される。室温において２時間培養された後、複数のナノ粒子会合体は、１Ｍのスクロース中において超遠心分離法によって、複数の単一のナノ粒子から分離される。電子顕微鏡は、当該方法によって形成された複数の会合体が、１会合体あたり２から６のナノ粒子を含むことを明らかにしている。会合した複数のナノ粒子は、マイクロ流体フローによってマイクロチャネル中へ取り込まれる。マイクロチャネルの遠端部の狭窄により、所定の場所に複数のナノ粒子会合体が保持される。
【０１０６】
（ポーラス基板の生成）基板は、上述したように、陽極、電気化学エッチングにより生成された。より具体的には、基板は、エタノール、および溶液の全体積に基づいて約１５容量パーセント（容量で１５％のＨＦ）の濃度でＨＦを含む水性電解質溶液中で、高度にホウ素がドープされたｐ型シリコン基板をエッチングさせることによって、生成された。陽極酸化が、（白金カソードとシリコンアノードとの間の）セルの全域にわたって、コンピュータ制御された一定電流を加えることによって実行された。ポーラスシリコンの複数の層が、２つの異なる電流密度の設定の５つの期間から生成された１つのそのような設定は、５ｍＡ／ｃｍ２で２０秒間であり、気孔率が約４２％で約８０ｎｍの厚さの層が生成された。他の設定は、３０ｍＡ／ｃｍ２で１０秒間であり、気孔率が約６３％で約１６０ｎｍの厚さの層が生成された。形成された基板は、円形で、約１インチの直径であるディスク状であった。形成された基板は、一般的に均質と考えられるものの、基板の中心部分から基板の周辺部分までを比較した場合に、少しのばらつきがあった（例えば、気孔率、厚さ等）。そのような複数の層は、層が形成される工程の性質に起因する。基板の周辺部分に向かって励起された光に対して中心部分、または基板に向かって励起された（断面直径で約１マイクロメータの）光放出スペクトル光を比較した場合に、わずかなばらつきが明白である。
【０１０７】
（核酸の生成およびエクソヌクレアーゼ処理）人の染色体ＤＮＡは、Smbrookらの方法（1989）によって精製される。Ｂａｍ  Ｈ１での分解に続いて、ゲノムのＤＮＡ断片が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター（Stratagene  Inc．  La  Jolla、CA）の多重クローニング部位に挿入され、Ｏ１５７（Ｅ．ｃｏｌｉ．）の中で成長する。複数のアンピシリン含有アガロースプレートの上にメッキした後に、ただ一つのコロニーが選択されて、シーケンシングのために成長される。ゲノムのＤＮＡの一部である一本鎖ＤＮＡの挿入が、ヘルパーファージを用いた重感染によって助けられる。プロテイナーゼＫ：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液中での分解の後に、ＤＮＡはフェノールで抽出され、酢酸ナトリウム（ｐＨ6.5、約0.3Ｍ）および０．８のボリュームの２−プロパノールの添加により沈殿させられる。ＤＮＡを含む沈殿物は、トリス−ＥＤＴＡバッファ中で、使用されるまで−２０℃で保存することにより、再懸濁される。アガロースゲル電気泳動法は、精製されたＤＮＡのシングルバンドを示す。
【０１０８】
ゲノムＤＮＡの隣に挿入されて配置される公知のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）の配列と相補的である複数のＭ１３フォワードプライマーは、Midland  Certified  Reagent  Company（Midland、TX）から購入される。共有結合的に修飾される複数のプライマーは、オリゴヌクレオチドの５位末端に結合しているビオチンの部分を含む。ビオチン基は、（ＣＨ２）６スペーサを介して、プリマーの５'−リン酸基へ共有結合的に架橋する。複数の標識化されたビオチンプライマーは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクターから生成されたｓｓＤＮＡテンプレート分子と混成することを許可する。それから、複数のプライマー−テンプレート錯体は、Dorreらの方法（Bioimaging  5、139-152（1997））によって、複数のビーズをコーティングしているストレプトアビジンに結合される。適切なＤＮＡ希釈で、単一のプライマー−テンプレート錯体は、１つのビーズに結合される。単一のプライマーテンプレート錯体を含むビーズは、シーケンシング装置の反応チャンバに挿入される。
【０１０９】
プライマー−テンプレートは、修飾されたＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（United  States  Biochemical  Corp．  Cleveland、OH）を用いてインキュベートされる。反応混合物は、標識化されていないデオキシアデノシン−５'−三リン酸（ｄＡＴＰ）、およびデオキシグアノシン−５'−三リン酸（ｄＧＴＰ）、ジゴキシゲニンで標識化されたデオキシウリジン−５'−三リン酸（ジゴキシゲニンｄＵＴＰ）、並びにローダミンで標識化されたデオキシシチジン−５'−三リン酸（ローダミンｄＣＴＰ）を含む。重合反応は、３７℃で２時間の間、進められる。ジゴキシゲニン、およびローダミンで標識化された核酸が合成された後に、テンプレートのらせん構造が、標識化された核酸から分離され、テンプレートのらせん構造、ＤＮＡポリメラーゼ、および組み込まれていない複数のヌクレオチドが反応チャンバから洗い流される。本発明の他の実施形態のよれば、十号に用いられた全てのデオキシヌクレオシド三リン酸が標識化されていない。他の実施形態においては、複数の一本鎖の核酸は、相補的らせん構造の重合なしに、直接的に配列される。
【０１１０】
エクソヌクレアーゼ活性は、反応チャンバへエクソヌクレアーゼＩＩＩを添加することにより開始される。反応混合物は、ｐＨ８．０、３７℃で保持される。核酸の３'末端から複数のヌクレオチドが放出されると、マイクロ流体によって、マイクロ流体チャネルの下方に移送される。マイクロチャネルの入り口で、複数の電極によって作られた電気ポテンシャルの勾配が、複数のヌクレオチドが、マイクロ流体チャネルから出て、マイクロチャネルに流入することを促進する。複数のヌクレオチドは、充填された複数のナノ粒子を通るので、それらは、レーザからの励起光にさらされる。ラマン放出スペクトルは、以下に述べるように、ラマン検出器によって検出される。
【０１１１】
（ヌクレオチドのラマン検出）複数の分子の試料からのラマン散乱光は、同一の顕微鏡対物によって集束され、ダイクロイックミラーを通ってラマン検出器に向かう。ラマン検出器は、集束レンズ、分光器、およびアレイ検出器を備える。集束レンズは、分光器の入射スリットを通ったラマン散乱光を集束する。分光器（RoperScientific）は、その波長によって光を分散する回折格子を備える。分散される光は、アレイ検出器（RoperScientificの、背面受光ディープディプリション型ＣＣＤカメラ）上で取得される。アレイ検出器は、データ転送、および検出器の機能の制御のためのコンピュータに接続されているコントローラ回路に接続されている。
【０１１２】
ラマン検出器は、検出器を通り過ぎる、単一の、標識化されていない複数の分子の動きを検出、および同定できる。複数のナノ粒子がぎっしり詰まっているナノチャネル、またはマイクロチャネル中の領域を通る際に、複数の分子の試料が、励起および検出されるように、複数のレーザおよび検出器は配置される。複数のナノ粒子は、ラマン検出器のための複数の"ホットスポット"を形成するために架橋する。複数のヌクレオチドが、ナノ粒子のホットスポットを通過することにより、ラマン検出器の感度が、多数の桁のオーダで増加する。
【０１１３】
分析される分子（または複数の分子）の試料、および複数の金属ナノ粒子が、筒、ピペット、または他の同種の手動移送デバイスを用いて、試料セル中に直接、１滴または数滴の試料溶液を添加することにより、手動で移送される。
【０１１４】
分子（または複数の分子）の試料、およびコロイド性の複数の銀粒子は、別々にマイクロ流体チップに導入され、流れが検出窓に達する前に混合される。分子（または複数の分子）の試料および複数の銀コロイドの混合は、２つのレーザビームによって励起された場合に、ＳＥＣＡＲＳ信号を生成する。複数の電子が低エネルギー状態に戻ることに起因するラマン放出信号は、励起に用いられる同一の顕微鏡対物によって集められ、ビームの進路にある他のダイクロイックミラーが、信号をラマン分光器の検出器、すなわちアバランシェフォトダイオード検出器（ＥＧ＆Ｇ）の方向に向ける。信号アンプリファイア、およびアナログ−デジタル変換器が、信号をデジタル出力に変換するために用いられる。コンピュータが、デジタル出力の記録およびデータの数学的な処理のために用いられる。
【０１１５】
（例２、ＳＥＣＡＲＳ設定２）他のＳＥＣＡＲＳの設定においては、Spectra-Physics（Mountain  View、CA）のチタンサファイアレーザがパルスレーザビームを生成する。複数のレーザパルスは、Spectra-Physicsの光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）によって用いられ、２つの異なる波長の２つの同期化されたビームを生成する。ＯＰＯ内の光学結晶を調整することにより、２つのビームの間の波長差を変化させることができる。ＯＰＯによって生成された２つのビームは、マイクロ光学素子を用いて、マイクロ流体チャネルの検出窓領域へ伝播される。２つのビームの角度は、位相整合条件（Fayer、Ultrafast  Infrared  and  Raman  spectroscopy、Marcel-Dekker、（2001）参照）に合わせて設定され、その状態下で、ＳＥＣＡＲＳ信号は、最も効果的に生成される。コロイド性の複数の銀粒子は、既に、マイクロ流体チャネルの下側の表面（例えば、フッ化カルシウム、あるいはフッ化マグネシウムの窓）に結合されている。分子（または複数の分子）の試料がマイクロ流体チャネルに導入された場合に、分子（または複数の分子）は、表面に結合しているコロイド製の複数の銀粒子に一時的に吸着するか、または近傍に移動する。２つのビームによって分子が励起された場合には、移送がそろった一方向性のビームとしてＳＥＣＡＲＳ信号が生成される。ＳＥＣＡＲＳ信号の方向は、位相整合条件によって再び決定される。光電子増倍管（ＥＧ＆Ｇ）は、ＳＥＣＡＲＳ信号の方向に配置されており、信号を集める。アンプリファイア、Ａ／Ｄ変換器、およびコンピュータは、データ取得、表示、および処理に用いられる。
【０１１６】
（例３、ＳＥＣＡＲＳ設定３）他のＳＥＣＡＲＳの設定においては、複数の励起ビームが、２つのチタンサファイアレーザ（CoherentのMiraによって）によって生成される。双方のレーザからの複数のレーザパルスは、集められたビームと同一線上のダイクロマティック干渉フィルター（Chroma製またはOmega  Optical製）によって重ね合わされる。重ね合わされたビームは、顕微鏡対物（Nikon  ＬＵシリーズ）を通り、そして、複数の標的被分析物が配置されているラマン活性な基板上に集束される。ラマン活性な基板は、複数の金属ナノ粒子である。複数の被分析物は、塩化リチウム塩と混合される。複数の被分析物からのラマン散乱光は、同一の顕微鏡対物によって集束され、ラマン検出器に向けて第２のダイクロイックミラーによって反射される。ラマン検出器は、バンドパスフィルタ、集束レンズ、分光器、およびアレイ検出器を備える。バンドパスフィルタは、複数のレーザビームを減衰させ、被分析物からの信号を伝達する。集束レンズは、分光器の入射スリットを通ったラマン散乱光を集束させる。分光器（Acton  Research）は、その波長によって光を分散させる回折格子を備える。分散された光は、アレイ検出器（RoperScientificの、背面受光ディープディプリション型ＣＣＤカメラ）上で取得される。アレイ検出器は、データ転送、および検出器の機能の制御のためのコンピュータに接続されているコントローラ回路に接続されている。複数の結果は図３に示す。
【０１１７】
（比較の例４、ＳＥＲＳ設定１）図４は、単一のチタンサファイアレーザを用いることにより生成された。レーザは、連続波モードまたはパルスモードで、近赤外波長（７００ｎｍから１０００ｎｍ）の０．５から１．０Ｗのレーザビームを生成する。レーザビームは、ダイクロマティックミラーおよび顕微鏡対物を通過して、複数の標的被分析物が配置されているラマン活性な基板上に集束される。ラマン活性な基板は、複数の金属ナノ粒子または金属でコーティングされた複数のナノ構造体である。複数の被分析物は、塩化リチウム塩と混合される。複数の被分析物からのラマン散乱光は、同一の顕微鏡対物によって集束され、ラマン検出器に向かってダイクロイックミラーによって反射される。ラマン検出器は、ノッチフィルタ、集束レンズ、分光器、およびアレイ検出器を備える。ノッチフィルタ（Kaiser  Optical）は、レーザビームを減衰させ、被分析物からの信号を伝達する。集束レンズは、分光器の入射スリットを通ったラマン散乱光を集束させる。分光器（Acton  Research）は、その波長によって光を分散させる回折格子を備える。分散された光は、アレイ検出器（RoperScientificの、背面受光ディープディプリション型ＣＣＤカメラ）上で取得される。アレイ検出器は、データ転送、および検出器の機能の制御のためのコンピュータに接続されているコントローラ回路に接続されている。
【０１１８】
（比較の例５、ＣＡＲＳ設定１）ＣＡＲＳ設定においては、複数の励起ビームが２つのチタンサファイアレーザ（CoherentのMiraによって）によって生成される。双方のレーザからの複数のレーザパルスは、集められたビームと同一線上のダイクロマティック干渉フィルター（Chroma製またはOmega  Optical製）によって重ね合わされる。重ね合わされたビームは、顕微鏡対物（Nikon  ＬＵシリーズ）を通り、そして、複数の標的被分析物が配置されているラマン活性な基板上に集束される。ラマン活性な基板は使用されていない。複数の被分析物は直接試料セル中に導入される。複数の被分析物からのラマン散乱光は、同一の顕微鏡対物によって集束され、ラマン検出器に向けて第２のダイクロイックミラーによって反射される。ラマン検出器は、バンドパスフィルタ、集束レンズ、分光器、およびアレイ検出器を備える。バンドパスフィルタは、複数のレーザビームを減衰させ、被分析物からの信号を伝達する。集束レンズは、分光器の入射スリットを通ったラマン散乱光を集束させる。分光器（Acton  Research）は、その波長によって光を分散させる回折格子を備える。分散された光は、アレイ検出器（RoperScientificの、背面受光ディープディプリション型ＣＣＤカメラ）上で取得される。アレイ検出器は、データ転送、および検出器の機能の制御のためのコンピュータに接続されているコントローラ回路に接続されている。複数の結果は図５に示す。
【０１１９】
図４および５と図３とを比較すると、ＳＥＣＡＲＳ技術が、ＳＥＲＳ単独の場合と比べると、感度において２５フォールドの増加を示し、ＣＡＲＳ単独の使用の場合と比べると、感度において３０，０００，０００フォールドの増加を示している。この感度における３０，０００，０００フォールドの増加は、小数の分子（１０００、１００、あるいは１０分子以下、または、単一分子さえ）の検出を容易にする。
【０１２０】
上記の複数の例は、高分解能ＳＥＣＡＲＳデバイスおよび本発明の方法の新規性および有用性を示す。前述した本発明の好適な実施形態の詳細な説明は、単に理解の明確さのために与えられており、どのような不必要な限定も理解されるべきではなく、当業者にとっては変更は明確である。上記で説明した本発明の複数のバリエーションは、その範囲から離れることなしになされえ、そして、それゆえ、そのような限定のみが、添付した特許請求の範囲によって示されるようになされる。
【０１２１】
（例６）２つのチタンドープされたサファイア（Ｔｉ：サファイア）レーザが複数の高原として用いられた。複数のレーザ（ブランド名  Mira）は、Coherent（Santa  Clara、CA）から入手可能である。各Ｔｉ：サファイアレーザは、５３２ｎｍの６Ｗの出力光を生成するダイオード励起固体レーザ（ブランド名Verdi）によって励起された。ポンプレーザは、７８５ｎｍの光を生成するように調整された。ストークスレーザは、複数の標的分子の振動準位に一致するように調整された。例えば、ｄＧＭＰ分子を調査した場合には、ストークスレーザは８２７．７ｎｍに調整され、ＳＥＣＡＲＳ信号は、７４６．５ｎｍ（６５７ｃｍ−１に相当する）あたりで検出される。アンジオテンシンＩペプチド（New  England  Biolabs、Beverly、MAから入手した）を調査した場合には、ストークスレーザは８５２．４ｎｍに調整された。ＳＥＣＡＲＳ信号は、７２７．７ｎｍあたりで（１００７ｃｍ−１に相当する）放出された。
【０１２２】
複数の興味のある標的分子が、複数の銀のコロイド性ナノ粒子および塩化リチウム塩の混合物中において調査された。複数の銀のコロイドは、上述したように社内で合成された。信号は、複数の銀のコロイド性ナノ粒子および塩化リチウム塩の混合物を含む制御試料から集められた。制御の信号は、複数の試料から得られた信号から差し引かれた。
【０１２３】
図６は、９０ｐＭのｄＡＭＰおよびｄＧＭＰから集められた信号を示す。１００ｆＬ以下の集められた体積に基づいて、我々は、この濃度の集めた体積内に、平均で５分子以下の分子が存在していると推定した。図７は、９０ｎｇ／μＬの濃度のアンジオテンシンＩペプチドの強い信号を示す。これらの結果は、ＳＥＣＡＲＳが、複数のヌクレオチドおよび複数のペプチドを含む複数の分子の広範囲にわたって適用可能であることを示す。
【図１】
2007509322.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007509322.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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