(57)【要約】  アデノウィルスに対する治療的及び予防的処置法。更に詳細には、ＣＴＣ−９６の抗ウィルス有効量を対象者に対し局所的に投与することによって、該対象者におけるアデノウィルスの治療的処置を実行する方法。更に、対象者におけるアデノウィルス感染に対する予防処置法であって、ＣＴＣ−９６の抗ウィルス有効量を、該対象者に対し局所的に予防投与することによって、該対象者がアデノウィルスによって感染される確率を抑えることによって実行する予防法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウィルスに感染した対象者の治療的処置法であって、ＣＴＣ−９６の抗アデノウィルス有効量を該対象者に投与することを含む治療法。
【請求項２】
前記アデノウィルス感染症は、アデノウィルス由来の角結膜炎である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＴＣ−９６は局所的に投与される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記アデノウィルス感染症は呼吸器感染症である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＴＣ−９６は鼻腔を通じて投与される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＴＣ−９６は、鼻腔噴霧又は点鼻によって投与される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
アデノウィルスによる感染に対して感受性を持つ対象者の予防的処置法であって、ＣＴＣ−９６の、抗アデノウィルス予防有効量を該対象者に投与することを含む予防法。
【請求項８】
前記対象者が感受性を持つ感染症は角結膜炎である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＴＣ−９６は局所的に投与される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記対象者が感受性を持つ感染症は呼吸器感染症である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＴＣ−９６は鼻腔を通じて投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＴＣ−９６は、鼻腔噴霧又は点鼻によって投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
アデノウィルスによって感染された対象者の治療的又は予防的処置法であって、ＣＴＣ−９６の抗アデノウィルス有効量を該対象者に対して投与することを含み、疾患は、急性発熱性咽頭炎、急性呼吸器病、急性出血性膀胱炎、流行性角結膜炎、胃腸炎、肝炎、髄膜脳炎、百日咳様症候群、咽頭結膜熱、小児肺炎、及び成人肺炎からなるグループから選ばれることを特徴とする、治療又は予防法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願に対する相互参照】
【０００１】
本出願は、２００３年６月３０日出願の米国特許仮出願第６０／４８４，２３４号及び２００４年６月３０日出願の連番不明の特許出願の優先権を主張する。なお、上記特許文書を、参照することにより本出願に含める。
【背景技術】
【０００２】
通常、アデノウィルスは、眼、呼吸及び消化管に感染するが、その他の器官、例えば、肝臓、膀胱、膵臓、中枢神経系その他にも感染する可能性がある。ヒト・アデノウィルスには、５０を越える血清型があり、この内少なくとも２４種が病原体と特定されている。アデノウィルスは、初期感染以後、特に免疫抑制患者では数ヶ月留まることが示されている。
【０００３】
【表１】
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【０００４】
＊下線で強調した血清型は、試験を行ったところＣＴＣ−９６に感受性を持つことが示された。
【０００５】
アデノウィルス関連性疾患の例
アデノウィルスは、その治療法が知られていない、眼の急性ウィルス疾患のもっとも普遍的な原因である。米国及び国際的にアデノウィルスによって引き起こされる流行性角結膜炎(EKC)の実際の蔓延率及び発生率は未知である。なぜなら、一般開業医や検眼士が大抵の症例を見ているのであるが、この感染は、多くの医学当局によって報告の必要無しとされているからである。ＥＫＣは伝染力が高く、流行病として起こる傾向がある。
【０００６】
ＥＫＣは、一般的には１〜３週以内に寛解する自己抑制的疾患ではあるが、患者は、発症してから１０〜１４日以上高い感染性を持ち続けることがある(1)。ＥＫＣの症状としては、結膜の赤味、眼瞼の腫脹又は赤味、眼からの分泌液流出、両眼瞼の接着、眼の痛み又は不快、明光忌避、又は眼の異物感が挙げられる。重篤な症例では、症例の３分の１に膜様、又は擬似膜様結膜炎が見られ、これは、結膜の肉芽形成及び瞼球癒着形成（眼球結膜と眼瞼結膜との癒着）に至ることがある(2;3)。ＥＫＣにおいては、膜及び擬似膜の両方とも、瀰漫性で、微細な上層角膜炎から、上皮損傷、上皮下部の濁りに渡る、明瞭な角膜拡散を伴って現れる(2;3)。症例の２０〜５０％において、角膜の濁りは、数週から、数ヶ月、数年まで持続することがある(1;3)。この現象は、視力を著しく下げ、眩輝症状を招く(2)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在のところ、アデノウィルスに対する、特異的な、直接の抗ウィルス化学療法は無い。角膜の傷害を制限するためにコルチコステロイドを使用してもよいが、前述の副作用があるのみならず、ウィルスの完全除去を妨げる可能性がある。(3;4)
【課題を解決するための手段】
【０００８】
我々は、ヒト・アデノウィルス治療において、特に、アデノウィルスによる角結膜炎の治療と予防目的のために、更には呼吸器病の治療において効果的な方法を発見した。それが治療目的のものであれ、予防目的のものであれ、アデノウィルスによる角結膜炎の治療は、局所投与によって実現することが可能である。呼吸器病の治療は、注入又は、鼻腔投与、即ち、噴霧又は鼻腔滴下によって実施してもよい。本明細書で用いる場合、「治療的処置」という表現は、既に病気に罹っている対象者に対する処置を意味する。本明細書で用いる「予防処置」という表現は、ウィルスに感染はされていないが、病気に罹りやすい、又は、病気に罹る可能性が高い状況にある、例えば、他の住人が既にその病気に感染している家庭にいる対象者に対する処置を意味する。我々はまた、インビトロにおいて、ＣＴＣ−９６が１、２、３、４、５、及び７型に対して効果があることを示し、かつ、表１に掲げたアデノウィルス性疾患に対するＣＴＣ−９６の有効性を実証した。更に詳細には、我々は、化合物ＣＴＣ−９６の、抗アデノウィルス的な治療又は予防有効量を局所的に投与することによって、眼において、アデノウィルス性角結膜炎疾患の著しい低下を実現することが可能であることを発見した。
【０００９】
本明細書で用いる場合、「治療的」という言葉は、既にアデノウィルスに感染している対象者を治療するために本発明の方法を用いることを意味する。本明細書で用いる場合、「予防的」という用語は、アデノウィルスに暴露される可能性のある対象者を、そのウィルスに対する感染から保護する、又は、そのウィルスに感染する確率を下げるために本発明の方法を用いることを意味する。
【００１０】
化合物ＣＴＣ−９６は下記の構造を有する。
【００１１】
【化１】
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【００１２】
ここで、Ｒ１及びＲ１’はメチルであり、Ｒ２及びＲ２’は水素であり、並びにＲ３及びＲ３’はメチルであり、並びにＸ及びＸ’はそれぞれ
【００１３】
【化２】
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【００１４】
であり、並びにＱ’はＢｒである。
【００１５】
ＣＴＣ−９６は、米国特許第５，７５６，４９１号に記載される方法によって調製してもよい。なお、この文書の内容を引用することにより本明細書に含める。
【００１６】
一般に、この化合物は、水溶液として局所に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
我々は、アデノウィルス５型を用いて、ヒトのアデノウィルス感染をウサギの眼において再現することが可能であることを実証し、また、ＣＴＣ−９６を用いて優れた抗ウィルス活性と、結膜炎の治療を示した。これを、我々は独特と考える。なぜなら、このウィルス及び、眼の病理的現象に対する効果的な薬剤は無いからである。更に、我々は、組織培養でＨｅＬａ細胞において、アデノウィルス１、２、３、４、５、及び７型に対するＣＴＣ−９６の効力を示した。上記のヒト・ウィルスは動物モデルでは育成されないものであるから、これは、アデノウィルスの広範な型に対するＣＴＣ−９６の優れた効能を実証するものとなる。アデノウィルスのいくつかの血清型に対するＣＴＣ−９６の効力を調べるために、下記の工程を実施した。
【００１８】
１．  接種時Ｈｅｌａ細胞は集密段階であった。
【００１９】
２．  米国基準菌株保存機関(ATCC)由来、Ad1 Kmetz, Ad2 Wolf, Ad3 Holyfield, Ad4 Harris, Ad7a Josephのウィルス保存液(4 x 105 pfu/ml; 4 x 104/0.1 ml)の既知の濃度からウィルス希釈液を調製した。このウィルス接種は、約１．０の感染多重度(m.o.i.)でウィルス感染を実現した。
【００２０】
３．  各Ａｄ血清型１００μｌをＨｅｌａ細胞を含む培養物に接種した。
【００２１】
４．  吸着期に５００、２５０、１００、５０、１０、及び０μｇ／ｍｌのドキソビル濃度を希釈プロトコルに従って培養液にて調製した。
【００２２】
５．  ウィルスを３７℃、５％ＣＯ２・水蒸気雰囲気において１時間吸着させた。
【００２３】
６．  吸着後、ウィルス接種体を全てのウェルから取り出し、各２ウェルに、５００、２５０、１００、５０、１０、及び０μｇ／ｍｌ濃度の１ｍｌのドキソビルを上に重層した。
【００２４】
７．  プレートを３７℃、５％ＣＯ２・水蒸気雰囲気において２４時間インキュベーションした。
【００２５】
８．  ２４時間後、プレートを洗浄した。
【００２６】
９．  各ウェルをドキソビル無添加の新鮮な組織培養液１ｍｌで再び満たした。
【００２７】
１０．  細胞をウェルから掻き落とした。
【００２８】
１１．  次に、培養液及び細胞を−７５℃に凍結させ力価評価に備えた。
【００２９】
１２．  各Ａｄ血清型について、ドキソビル濃度及び薬剤無添加コントロールの二重サンプルを解凍し、力価評価を行った。
【００３０】
１３．  ウィルス力価を各薬剤濃度において求めた。
【００３１】
ＣＴＣ−９６は、抗ウィルス剤として相当の利点を有する。ａ）その独特の作用様式のために、ＣＴＣ−９６は、最近使用の薬剤に対して耐性を持つ、ヘルペス及びＨＩＶウィルス突然変異株に対しても効果的である。ｂ）本薬剤は、ヘルペスウィルスにおいて２種類の異なるウィルス標的に対して作用するので、ＣＴＣ−９６耐性突然変異株の発生は極めて稀と考えられること、及び、ｃ）ＣＴＣ−９６は抗炎症性を持つので、本剤の使用は、ヘルペスウィルス及びアデノウィルス治療におけるステロイドの使用に取って代わることになる。ステロイドは、投与された部位の免疫反応を修飾し、病原体に対する組織の感受性を高める。
【００３２】
効力実験
培養したアデノウィルス１、２、３、４、５、及び７型に対するＣＴＣ−９６の効力
【００３３】
ＣＴＣ−９６の抗アデノウィルス活性を、ＨｅＬａ細胞、ヒト子宮頸ガン細胞系統（実験級アデノウィルスに対する通常の宿主）による標準細胞培養と、抗ウィルス・プラーク低下アッセイとによって評価した。ＣＴＣ−９６は、ウィルスを細胞感染前に薬物に暴露した場合、ウィルス成長に対して抑制（予防的）作用を持つ。
【００３４】
図１は、アデノウィルス５型ウィルスにおいて、該ウィルスをＨｅＬａ細胞感染前にＣＴＣ−９６に直接暴露した後の力価を示す。
【００３５】
図１にグラフとして示したデータは下記のようにして得られた。各種濃度のＣＴＣ−９６を、濃縮ヒト・アデノウィルス（アデノウィルス５型（Ad5））と混合し、３７℃で６０分インキュベートした。次に、分液を培養液にて５００倍に希釈した。１００μｌの、この希釈試料にＨｅｌａ細胞を暴露して感染を誘発した。細胞単層を、３７％、５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートし、次に、洗浄、掻き落とし、超音波破壊、遠心し、上清を連続希釈した。これら連続希釈液を、インディケータＨｅＬａ細胞単層の上にプレートし、６０分間吸着させ、吸引し、メチルセルロース重層を細胞上にプレートし、次に細胞を３７％で３日間インキュベートした。培養物を、１％メチレンブルーでカウンタ染色し、乾燥させ、プラークをカウントした。結果は、平均±ＳＤ（誤差バーが見えない場合、それらはデータ点内部に含まれる）で表す。
【００３６】
ＣＴＣ−９６はまた、アデノウィルス感染細胞を、その後で該薬剤に暴露した場合ウィルス成長が抑制されることから見て取れるように、治療効果を持つ可能性がある。図２は、ヒト・アデノウィルス５型（Ad5）感染ＨｅＬａ細胞をＣＴＣ−９６に暴露した後に得られたウィルス力価を示す。これらのデータは下記のようにして得られた。アデノウィルスは、ＨｅＬａ細胞単層に対して３７％で６０分間吸着させ、その上に、ＣＴＣ−９６の連続希釈液を単層に重層した。次に、単層を、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。次に単層を洗浄、掻き落とし、超音波破壊、遠心し、上清を連続希釈した。これら連続希釈液を、インディケータＨｅＬａ細胞単層の上にプレートし、６０分間吸着させ、吸引し、メチルセルロース重層を細胞上にプレートし、次に細胞を３７％で３日間インキュベートした。培養物を、１％メチレンブルーでカウンタ染色し、乾燥させ、プラークをカウントした。結果は、平均±ＳＤ（誤差バーが見えない場合、それらはデータ点内部に含まれる）で表す。
【００３７】
ヒト・アデノウィルス、アデノウィルス５型(Ad5)によって感染させたウサギ眼球の、３種類のＣＴＣ−９６治療／投与処方による臨床結果、及び、プラークアッセイによるウィルス力価とを評価した。「１日目」に、我々の作製した、角結膜炎誘発のための結膜・角膜肉芽形成用プロトコルに従って、１０５ｐｆｕのアデノウィルスを導入することによって動物をヒト・アデノウィルス５型に感染させた。接種後８日目までに全ての動物において臨床的結膜炎が観察された。次に、動物を無作為にグループ分けし、下記の実験グループに、二重盲検試験においてＣＴＣ−９６又はプラシーボを投薬した。
(1) プラシーボ（希釈液のみ）、１日９回、２１日間（ウサギ４匹）
(2) ＣＴＣ−９６、５０μｇ／ｍｌ、１日９回、２１日間（ウサギ４匹）
(3) ＣＴＣ−９６、５０μｇ／ｍｌ、１日６回、２１日間（ウサギ４匹）
(4) ＣＴＷ、２５μｇ／ｍｌ、１日６回、２１日間（ウサギ４匹）
【００３８】
臨床的な病状進行と寛解を、最初の薬剤投与後１、３、７、１０、１３、１８、２１、２４、２８、及び３１日目にスリットランプ顕微鏡観察によって評価した。角膜炎の重度は、臨床等級システム(5)を用いて定量した。
【００３９】
２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの投与は、病気の重度の進行を阻止した。５０μｇ／ｍｌを１日６回又は９回投与２１日間投与は、２１日目までに臨床病状の完全寛解をもたらし、一方、プラシーボ治療動物は更に１０日間症状を示し続けた。
【００４０】
アデノウィルス誘発による角結膜炎の、ＣＴＣ−９６による治療の結果を図３に示す。図３のデータは下記のようにして得られた。我々の作製した、角結膜炎誘発のための結膜・角膜肉芽形成用プロトコルに従って、１０６ｐｆｕのアデノウィルスを導入することによってウサギをヒト・アデノウィルス５型に感染させた。接種後８日目に、ＣＴＣ−９６又はプラシーボを含む点眼薬による治療を開始した。基質の角膜炎について調べ、Ｗａｎｄｅｒ等(5)の角膜疾患スケールに従って点数評価した。下記は、「結膜炎定量基準」である。
【００４１】
結膜患部の面積       結膜炎の重度
０：正常角膜       ０：正常結膜
＋１：患部≦２５％     ＋１：軽度の結膜感染
＋２：患部＞２５％，≦５０％     ＋２：中度の結膜感染／結膜水腫
＋３：患部＞５０％、≦７５％     ＋３：重度の結膜感染／結膜水腫
＋４：患部＞７５％、≦１００％   ＋４：擬似膜有り
【００４２】
ヒト・アデノウィルス、アデノウィルス５型に感染させたウサギ眼球に対するＣＴＣ−９６治療の効力について、ＨｅＬａ細胞集密的単層に対して、涙液フィルム培養物を吸着させ、その後培養体からアデノウィルスを回収することによって評価した。５０μｇ／ｍｌのＣＴＣ−９６を１日当たり６又は９回投与することによって、眼球に存在するウィルスの数は急激に減少し、１３日目迄にはウィルスは検出されなくなったが、一方、プラシーボで治療した眼球では２４日目までずっとウィルスが検出された。図４は、ウサギの眼をＣＴＣ−９６又はプラシーボで治療した後のアデノウィルスの力価を示す。これらのデータは下記の処理手順によって得られたものである。我々の作製した、角結膜炎誘発のための結膜・角膜肉芽形成用プロトコルに従って、１０６ｐｆｕのアデノウィルスを導入することによってウサギをヒト・アデノウィルス５型に感染させた。接種後８日目に、ＣＴＣ−９６又はプラシーボを含む点眼薬による治療を開始した。涙液フィルムからのアデノウィルスの回収は、ＨｅＬａ細胞の集密的単層におけるプラークアッセイによって評価した。データは、平均±ＳＤで表す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、細胞感染前にＣＴＣ−９６暴露させた後のヒト・アデノウィルスの力価のグラフである。
【図２】図２は、ヒト・アデノウィルス感染細胞をＣＴＣ−９６に暴露させた後のウィルス力価のグラフである。
【図３】図３は、アデノウィルスによって誘発された角結膜炎に対する、ＣＴＣ−９６による治療効果を示すグラフである。
【図４】図４は、アデノウィルスに感染したウサギ眼球に対する、ＣＴＣ−９６による治療後の、アデノウィルス力価を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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