(57)【要約】 定量、位置判定、同定、追跡、および診断のために目的物に共有結合または非共有結合により固定できるサブミクロンサイズの粒子または標識について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）ポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；
b）前記鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、前記第１材料および前記第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学プロセスを伴い；
c）工程a）を繰り返し；そして
d）前記第２材料および前記鋳型を、前記ポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、少なくとも2つの遊離した金属ナノ粒子を生成させる
ことを含む方法。
【請求項２】
前記遊離した金属ナノ粒子が10〜300 nmの長さおよび15〜300 nmの幅を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、工程b）およびc）を繰り返すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型がアルミナである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該第２材料が金属である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該第２材料がAgである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記金属がAuである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２材料がAgである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型がアルミナである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記離脱が、強酸による処理、続いて強塩基による処理を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記強酸が硝酸であり、前記強塩基がNaOHである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記電気性沈着が、パルスめっき、パルス電流めっき、逆パルス電流めっき、および二重パルスめっきよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、工程c）に際して短かいSAM分子を供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記離脱が、SERS活性分子を供給する溶液の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
a）ポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；
b）前記鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、前記第１材料および前記第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学プロセスを伴い；
c）工程a）を繰り返し；そして
d）前記第２材料および前記鋳型を、前記ポア結合したセグメント状ナノ粒子から酸処理により離脱させて、少なくとも2つの遊離した多孔質金属ナノ粒子を生成させる
ことを含む方法。
【請求項１６】
ナノ粒子コア、ラマン活性レポーター分子、SiO2封入剤、ならびに-SH基、-NH2基および-COO-基よりなる群から選択される反応性基を含む、SACN。
【請求項１７】
a）ナノ粒子を用意し；
b）ラマン活性レポーター分子を前記ナノ粒子と会合させ；
c）前記ナノ粒子をSiO2で封入し；そして
d）-SH基、-NH2基および-COO-基よりなる群から選択される反応性基を保有するように該SiO2を修飾することを含み、
これにより活性化SACNを製造する方法。
【請求項１８】
被分析体の検出方法であって、
a）生物試料を入手し；そして
b）被分析体に結合する生体分子を含むバイオコンジュゲートSACNと試料を接触させ；そして
c）前記バイオコンジュゲートSACNに結合した被分析体を検出する
ことを含む方法。
【請求項１９】
該生体分子と該被分析体が相補的ヌクレオチド配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該試料が、血液、血清、唾液、喀痰、涙液、汗、他の分泌液；尿、糞便；脳脊髄液、間質液、細胞抽出物、および細胞よりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
a）被分析体を含有する疑いのある試料と、被分析体に対する少なくとも１の特異的結合パートナーを、側方流動アッセイ表面上で接触させて、該試料中の被分析体に結合させ；
b）工程（a）の前、それと同時または後に、少なくとも１の被分析体結合パートナーをSACNと結合させ；そして
c）SERSシグナルを検出することによりシグナルの強度または存在によって該試料中の被分析体の存在を判定し、これにより該試料中に少なくとも１の被分析体が存在することを判定する
ことを含む方法。
【請求項２２】
a）CCDカメラに接続した顕微鏡を用意し；
b）細胞を用意し；
c）該細胞を、該細胞または該細胞の一部に特異的に結合しうる少なくとも１のSACNと接触させ；
d）該細胞と該カメラの間に波数フィルター装置を配置し；
e）複数のデータセットを取得し；そして
f）これらのデータセットを組み立てることを含み、
これによりSACNの空間プロフィールを取得する方法。
【請求項２３】
該波数フィルター装置が、モノクロメーター、ノッチフィルター、フィルターホイール、音響光学可変フィルター、フーリエ変換干渉フィルター、液晶可変フィルター、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記波数フィルター装置が液晶可変フィルターを含み、前記取得が
a）第１周波数でデータを取得し；そして
b）場合により第２周波数および後続周波数でデータを取得する
ことを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記取得が
a）モノクロメーターを通る位置の一点からの光を分散させ；
b）アレイ検出器でその点の完全ラマンスペクトルを取得し；そして
c）a）およびb）を多数の位置で繰り返す
ことを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記取得が
a）試料を１本の放射線で励起し；
b）その放射線の各空間ピクセルの完全スペクトルを取得し；そして
c）試料をその放射線で走査する
ことを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
a）コア／シェル型ナノ粒子；
b）このコア／シェル型ナノ粒子と会合した少なくとも１のラマン活性レポーター分子；および
c）SiO2封入剤
を含むナノ粒子。
【請求項２８】
さらに前記コア／シェル型ナノ粒子が、Au2Sコア／Auシェル粒子、Agコア／Auシェル粒子、シリカコア／Auシェル粒子、シリカコア／Agシェル粒子、アルミナコア／Auシェル粒子、アルミナコア／Agシェル粒子、TiO2コア／Auシェル粒子、およびTiO2コア／Agシェル粒子よりなる群から選択される、請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
a）異方性金属ナノ粒子；
b）この異方性金属ナノ粒子と会合したSERS活性レポーター分子；
c）該異方性金属ナノ粒子を封入するSiO2
を含むナノ粒子。
【請求項３０】
該異方性金属ナノ粒子が、回転楕円体、ロッド、円盤、角錐、立方体、円筒、ナノヘリックス、ナノスプリング、ナノリング、棒状ナノ粒子、矢状ナノ粒子、涙滴状ナノ粒子、テトラポッド状ナノ粒子、プリズム状、多孔質、および非幾何学的形状のナノ粒子よりなる群から選択される形状を有する、請求項２９に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
該ナノ粒子が非幾何学的形状であり、ナノロッドに近似する、請求項３０に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
該ナノ粒子が約250 nmの直径および約250 nmの長さを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
a）SACNナノ粒子であるイメージング剤を患者に投与し；
b）スペクトルイメージングを実施できるシステムを用いて患者を走査し；そして
c）患者の内部領域のスペクトルまたは画像を作成する
ことを含む方法。
【請求項３４】
前記システムが、点走査型共焦点顕微鏡、線走査システム、光干渉断層撮影システム、単一波長バンドのみを検出するシステム、励起光源およびフィルター画像検出を含む蛍光イメージングシステムよりなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該患者の領域が、患者の全身、脈管系、心臓、肝臓、脾臓、および消化器領域よりなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該スペクトルイメージングを実施できるシステムが持ち運び可能なシステムである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
a）異常な病理に関連する分子を標的とする複数のSACNを、その異常な病理を伴う患者に導入し、その際、異常な病理に関連する分子に該SACNが会合し；そして
b）会合した該SACNのイメージングを行うことを含み、
これにより異常な病理を診断しうる方法。
【請求項３８】
該異常な病理の位置が、消化管、心臓、肺、肝臓、頚部、胸部、および大腸を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記SACNがイメージングプローブと非共有結合により会合し、前記投与がイメージングプローブの導入を含み、前記SACNが組織または体液中へ解離する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
動物をSACNで標識する方法であって、SACNを動物に導入し、その際、前記導入が皮下埋込み、静脈内導入よりなる群から選択される方法。
【請求項４１】
さらに、該SACNまたは標識動物を検出することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（a）組織試料を、該組織試料に特異的に結合しうる少なくとも１の生体分子コンジュゲートSACN粒子と接触させ；そして
（b）組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子混合物のラマン画像を取得する
ことを含む方法。
【請求項４３】
該組織を１又はそれを越える追加の非SACN試薬と接触させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該追加試薬が、エオシン、ヘマトキシリン、およびヘマトキシリンとエオシンの組合わせよりなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、
（a）請求項４２の工程（a）の前に、組織試料のバックグラウンドラマン画像を取得し；そして
（b）このバックグラウンドスペクトルを、請求項４２の工程（b）で取得した組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子混合物のラマン画像から差し引く
ことを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
該組織を１又はそれを越える追加の非SACN試薬と接触させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記追加試薬が、エオシン、ヘマトキシリン、およびヘマトキシリンとエオシンの組合わせよりなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
さらに、ラマン画像を、細胞のサイズおよび形状を可視化するために濃色有機色素で染色した組織試料の画像と比較することを含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府ライセンス権利
米国政府は、本発明に支払い済みのライセンスを有し、限定された状況において、NIH／NCIが授与したGrant No. IR43CA111752-01およびNISTが授与したGrant No. 7ONAB1H3O28により提示される妥当な条件で特許権保有者が他者にライセンスを与えることをに対して要求する権利を有する。
【０００２】
本発明は一般に、定量、位置判定、同定または追跡のために目的物に共有結合または非共有結合により固定できるサブミクロンサイズの粒子または標識に関する。より具体的には、本発明は、表面増強分光法活性-複合ナノ粒子（surface enhanced spectroscopy-active composite nanoparticles, SACN）、それら粒子の製造方法、およびそれら粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
蛍光は、生体分子を追跡および定量する主な手段である。蛍光タグは、DNA配列決定、マイクロアレイを用いる遺伝子発現分析、フローサイトメトリーおよびその変法、RT-PCR、ならびに他の多数の用途に用いられている。特に関心がもたれ、かつ重要性が増している１用途は、細胞内イメージング（intracellular imaging）である。生体分子の結合／解離事象が蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）によりモニターされており、これによればフルオロフォア（fluorophore）とクエンチャー（quencher）の距離の事象誘導による変化が蛍光強度を変化させる。白血球上の表面抗体マーカーへのフルオロフォアの共有結合は、血球計算（cytometry）の基礎である；同様に、蛍光タグの結合は、細胞内のあらゆる細胞小器官と、細胞が行う実質的にすべてのプロセスを可視化するために用いられている。有機フルオロフォアには、それらの多数の強みにもかかわらず、幾つかの制限がある。（i）励起状態では基底状態よりも良好な酸化体であり、かつより良好な還元体であるので、それらはきわめて光退色（photobleaching）および光分解を受けやすい。（ii）蛍光発光包絡線（fluorescence emission envelope）が幅広く、スペクトル直交タグの数が制限される。（iii）その蛍光は典型的に可視領域で、すなわち生物試料が固有のバックグラウンド蛍光を示す領域で、励起される。（iv）異なる色のフルオロフォアは大幅に異なる構造と化学特性を有することが多く、結合と取扱いのための異なるプロトコルが必要となる。
【０００４】
蛍光ナノ粒子半導体（量子ドット）の開発は、蛍光ベースの光学検出タグの有用性を拡大した（Chan等, Science 1998, 281, 2016-18; Bruchez等, Science 1998, 281, 2013-16）。Chanら、ならびに本明細書に述べる他の特許、特許出願および刊行物すべての開示内容全体を本明細書に援用する。量子ドットは有機フルオロフォアよりはるかに少ない光退色を示し、可視領域ではより狭い発光バンド幅を有する。ただし、発光包絡線がより狭い結果、可視領域での励起包絡線がより狭くなる；その結果、複数のタグを励起するためには紫外線が必要となり、これは生体系にとって決して最適ではない。さらに、粒子が赤領域、特に近赤外領域で発光するのに伴って量子ドットのバンド幅がかなり広がり、したがって利用可能な色が著しく少なくなる。それにもかかわらず量子ドットは細胞内イメージング用として広く用いられ、有望な結果が得られている。最近の報告では、上皮細胞増殖因子の結合およびエンドサイトーシスと、エンドサイトーシスされた、または生細胞のビオチン化表面タンパク質に結合した量子ドットの長期イメージングを追跡するために、量子ドットを用いている。しかし、大部分の文献が細胞送達（cellular delivery）のために非標的法（non-targeted approach）を記載している。ペプチドトランスロケーションドメイン（peptide translocation domain）を利用して種々の比率の5色の量子ドットを細胞サブセットに導入して、10のユニークコード（unique code）が作成された。種々の報文が、量子ドットによりコードした後にマウス内に注射された細胞の追跡を記載しており、これにはリポフェクション試薬およびトランスダクションペプチドの使用が含まれる。アフリカツメガエル（Xenopus）胚の発達も、ミセル封入された量子ドットの注射後に追跡された。残念ながら、エンドサイトーシスされた量子ドットは隔離されてその後の細胞内標識に関与できず、トランスフェクションおよびエレクトロポレーションにより送達された量子ドットは凝集しがちである。マイクロインジェクションは凝集していない量子ドットの送達を可能とするが、多大な技能を要求する連続プロセスである。さらに、紫外線による長期イメージングは量子ドットの分解を引き起こし、その結果スペクトルのシフトと細胞毒性をもたらす。金属ナノ粒子を細胞内に導入することも記載されている。金属ナノ粒子を生細胞内部へ導入できることが1990年に示され、その際、細胞質内にマイクロインジェクションされた金コロイドの核内取込みを調べるために電子顕微鏡が用いられた（Feldherr等. J Cell Biol 1990, 1ll, 1-8; Feldherr等, J Cell Biol 1991, 115, 933-39）。この技術は、ペプチド修飾した金コロイドの核標的能を追跡するためのビデオ増強カラー顕微鏡を用いることにより進歩した。幾つかの報文は、AgおよびAuナノ粒子を生体分子で修飾することにより、それらの粒子からの強力なプラズモン共鳴を利用して、生細胞上の膜輸送タンパク質の動態をリアルタイムで追跡した。両技術とも光退色がないため、粒子の分解なしに長期イメージングが可能である。理論的には粒子のサイズ、形状および組成を制御して多重プラズモン共鳴イメージング実験（multiplexed plasmon resonance imaging experiment）を行うことができるが、実際には、特徴の広さと、すべての粒子を所与のサイズにするのが困難なこ���とが重なって、色数が2〜3に減少する。
【０００５】
ラマン散乱は単色の遠赤外線または近赤外線を用いて容易に励起され、光子エネルギーは生物試料の固有バックグラウンド蛍光を励起するには低すぎる。ラマンスペクトルは一般に200〜3500 cm-1の振動エネルギーに及び、かつ個々の振動は一般にきわめて狭いバンド幅、すなわち＜50 cm-1であるので、１ダース（またはそれ以上）のレポーターをすべて同時にの単一光源で測定することが想定できる；ただし、普通のラマンはきわめて弱く、生物分析化学に使用するにはその有用性が制限される。SERSの場合、貴金属（金、銀、銅）表面のナノスケールの粗面特徴にきわめて近接した分子が散乱効率を106〜1012倍増強する［増強係数（enhancement factor, EF）として知られる］。SERSは、個々の金属ナノ粒子に吸着した分子を検出するのにも使用でき、単一分子の検出を証明するために用いられている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、前記第１材料および前記第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子（segmented, pore-bound nanoparticle）を生成するファラデー電気化学プロセス（faradaic electrochemical process）を伴い；金属の沈着を繰り返し；そして前記第２材料および前記鋳型を、ポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、少なくとも2つの遊離金属ナノ粒子を生成させることを含む方法を提供する。本発明は、そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に第１金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第２金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第３材料を沈着させ、その際、前記第１材料および前記第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学プロセスを伴い；第１金属および第２金属を沈着させる工程を繰り返し；そして前記第３材料および前記鋳型を、ポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、前記第１金属および前記第２金属を各々が含む少なくとも2つの遊離金属ナノ粒子を生成させることを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明は、最適化されたSACNを製造する方法をも提供する。この最適化されたSACNは、SACNの製造過程で粒子表面に不可逆的に結合した物質を除去し、その際、そのスペクトルのバックグラウンドシグナルを、最適化されていない対応するSACNにより生じるスペクトルに比べて、低下させることを含む方法により製造される。
【０００８】
本発明は、SACN粒子を用いるアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを低下させることを含む方法をも提供する。この低下は、分析すべき試料、SACN粒子およびアッセイ容器よりなる群から選択される構成要素から不純物を除去することを含む。
【０００９】
本発明は、それぞれ異なるラマンタグを含む複数のSACN粒子を製造し；それらのラマンタグの強度比を測定し；最も弱い強度を有するタグの強度に標準化されたタグ強度を有する第２の複数のSACN粒子を製造し、これによりラマンスペクトルにおいて実質的に等しいピーク強度を有する複数のSACNを製造することを含む方法をも提供する。ある態様においては、タグ量を減少させたSACNを製造することによりタグを標準化し、その際、その減少量は最も弱い強度のタグの強度に対するそのタグの強度の比の逆数により決定される。他の態様においては、シランの量を増加させたSACNを製造することによりタグを標準化し、その際、その増加量は最も弱い強度のタグの強度に対するそのタグの強度の比の逆数により決定される。
【００１０】
本発明は、ナノ粒子コア、ラマン活性レポーター分子（Raman-active reporter molecule）、SiO2封入剤、ならびに-SH基、-NH2基および-COO-基よりなる群から選択される反応性基を含む、SACNをも提供する。本発明は、ナノ粒子を用意し；ラマン活性レポーター分子を前記ナノ粒子と会合させ；ナノ粒子をSiO2で封入し；そして-SH基、-NH2基および-COO-基よりなる群から選択される反応性基を保有するようにSiO2を修飾することを含み、これにより活性化されたSACNを製造する方法も提供する。
【００１１】
本発明は、ナノ粒子；前記ナノ粒子を伴うラマン活性レポーター分子；SiO2封入剤；ならびにタンパク質および核酸よりなる群から選択される生体分子を含む、バイオコンジュゲートSACN（bioconjugated SACN）も提供する。
【００１２】
本発明は、被分析体の検出方法であって、生物試料を入手し；そして被分析体に結合する生体分子を含むバイオコンジュゲートSACNと試料を接触させ；そして前記バイオコンジュゲートSACNに結合した被分析体を検出することを含む方法をも提供する。
【００１３】
本発明は、被分析体を含有する疑いのある試料と、被分析体に対する少なくとも１種類の特異的結合パートナーを、側方流動分析（lateral-flow assay）表面で接触させて、試料中の被分析体に結合させ；工程（a）の前、それと同時または後に、少なくとも１の被分析体結合パートナーをSACNと結合させ；そしてSERSシグナルを検出することによりシグナルの強度または存在によって試料中の被分析体の存在を判定し、これにより試料中に少なくとも１の被分析体が存在することを判定することを含む方法をも提供する。
【００１４】
本発明は、CCDカメラに接続した顕微鏡を用意し；細胞を用意し；細胞を、該細胞または該細胞の一部に特異的に結合しうる少なくとも１のSACNと接触させ；細胞とカメラの間に波数フィルター装置（wavenumber filtering device）を配置し；複数のデータセットを取得し；そしてこれらのデータセットを組み立てることを含み；これによりSACNの空間プロフィールを取得する方法をも提供する。
【００１５】
本発明は、金属ナノ粒子；ナノ粒子と会合した１種類より多いラマン活性レポーター分子；およびSiO2封入剤を含む、ナノ粒子をも提供する。
本発明は、HAuCl4を塩酸ヒドロキシルアミンと接触させ；さらに、工程a）から得られた溶液をクエン酸ナトリウム無水物およびNaBH4の混合物と接触させることことを含み；これにより金ナノ粒子を製造する方法をも提供する。本発明は、前記方法により製造した金ナノ粒子を用意し；ラマン活性レポーター分子を前記ナノ粒子と会合させ；そして該ナノ粒子をSiO2で封入し；それによりSACNを製造することを含む方法も提供する。
【００１６】
本発明は、異方性金属ナノ粒子；この異方性金属ナノ粒子と会合したSERS活性レポーター分子；異方性金属ナノ粒子を封入するSiO2を含む、ナノ粒子をも提供する。
本発明は、SACNナノ粒子であるイメージング剤を患者に投与し；スペクトルイメージングを実施できるシステムを用いて患者を走査（scan）し；そして患者の内部領域のスペクトルまたは画像を作成することを含む方法をも提供する。本発明は、異常な病理に関連する分子を標的とする複数のSACNを、その異常な病理を伴う患者に導入し、その際、異常な病理に関連する分子にSACNが会合し；そして会合したSACNの画像を得ることにより異常な病理を診断しうることを含む方法をも提供する。
【００１７】
本発明は、動物をSACNで標識する方法であって、SACNを動物に導入し、その際、導入が皮下埋込み、静脈内導入よりなる群から選択される方法をも提供する。本発明は、組織試料を、該組織試料に特異的に結合しうる少なくとも１種類の生体分子コンジュゲート（biomolecule-conjugated）SACN粒子と接触させ；そして（b）組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子混合物のラマン画像を取得することを含む方法をも提供する。
【００１８】
本発明は、コア／シェル型ナノ粒子、このコア／シェル型ナノ粒子と会合した少なくとも１種類のラマン活性レポーター分子、およびSiO2封入剤を含む、ナノ粒子をも提供する。
【００１９】
本発明は、そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、第１材料および第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学プロセスを伴い；金属沈着工程を繰り返し；そして前記第２材料および前記鋳型をポア結合したセグメント状ナノ粒子から酸処理により離脱させて、少なくとも2つの遊離した多孔質金属ナノ粒子（porous free metal nanoparticle）を生成させることを含む方法をも提供する。
【発明の開示】
【００２０】
表面増強分光法活性-複合ナノ粒子は、米国特許No. 6,514,767、表題“Surface Enhanced Spectroscopy-Active Composite Nanoparticles”、米国特許出願No. 10/345,821、2003年1月16日出願、表題“Surface Enhanced Spectroscopy-Active Composite Nanoparticles”、および米国特許出願No. 60/557,729、2004年3月29日出願、表題“Surface Enhanced Spectroscopy-Active composite Nanoparticles”に記載されており、これらをそれぞれ本明細書に援用する。
【００２１】
本発明は、表面増強分光法-活性複合ナノ粒子（Surface Enhanced Spectroscopy-Active Composite Nanoparticle、SACN）の新規な製造方法、および改良されたSACNの製造方法を提供する。そのようなナノ粒子はそれぞれ、SERS活性金属ナノ粒子、金属表面に近接した準単層、単層または多層の分光法活性種、およびポリマー、ガラス（SiO2）または他の誘電材料を含む封入シェルを含む。これは、分光法活性分子（本明細書において“レポーター”と呼ぶ）を金属ナノ粒子と封入剤の界面に配置したものである。代表的な態様において、SACNは（i）金属ナノ粒子コア（たとえばAuまたはAg）、（ii）ユニークな振動信号（vibrational signature）を発するラマン活性レポーター、および（iii）レポーター分子を適所に“閉じ込め”、一方では後続の生体分子固定化のための高適合性（highly compatible）表面をも提供するSiO2封入剤を含む。本質的にSERS不活性であるガラスコーティングはまた、粒子を凝集に対向して安定化し、かつ目的外の種が競合吸着するのを阻止する。ある態様においては、レポーターおよび封入剤をナノ粒子コアに逐次導入する。ある態様においては、封入剤がレポーター分子を含む。ある態様においては、SACNはさらにナノ粒子に隣接したポリマーコーティングを含む。
【００２２】
ナノ粒子コアは、当技術分野で既知のいかなるナノ粒子であってもよい。本明細書中で用いる用語“ナノ粒子”、“ナノ構造体”、“ナノ結晶”、“ナノタグ”、および“ナノ部材”は互換性をもって用いられ、約1〜約1000 nm（1〜1000 nmの任意の整数値を含む）の１寸法を有する粒子、一般に金属粒子を表わす。ある態様において、金属ナノ粒子コアは直径20〜200 nmの球状またはほぼ球状の粒子である。ある態様においてこの範囲は約2〜約50 nmであり、ある態様においては約20〜約50 nm（たとえば約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50 nm）である。異方性ナノ粒子は、長さと幅をもつ場合がある。ある態様において、異方性ナノ粒子の長さはナノ粒子が製造された孔（aperture）に相当する寸法である。異方性ナノ粒子の場合、ある態様において、ナノ粒子は350 nm又はそれより少ない直径（幅）をもつ。他の態様においてナノ粒子は250 nm又はそれより少ない直径をもち、ある態様においては100 nm又はそれより少ない直径をもつ。ある態様において、幅は15〜300 nmである。ある態様において、ナノ粒子は約10〜350 nmの長さをもつ。
【００２３】
ナノ粒子は当方性または異方性であってよい。ナノ粒子には、金属コロイドの中空または中実ナノ棒状体、磁性、常磁性、導電性または絶縁性のナノ粒子、合成粒子、ヒドロゲル（コロイドまたは棒）などが含まれる。ナノ粒子が多様な形状で存在しうることは、当業者に自明であろう。これには回転楕円体、ロッド、円盤、角錐、立方体、円筒、ナノヘリックス、ナノスプリング、ナノリング、ロッド状ナノ粒子、矢状ナノ粒子、涙滴状ナノ粒子、テトラポッド状ナノ粒子、プリズム状ナノ粒子、ならびに他の多数の幾何学的および非幾何学的形状のものが含まれるが、これらに限定されない。記載されている他のクラスのナノ粒子には、内部表面領域をもつものが含まれる。これらには、中空粒子および多孔質または半多孔質の粒子が含まれる。さらに、これらの形状の粒子を製造する方法、ある場合にはこれらの形状のSERS活性粒子を製造する方法が文献に記載されていることは理解される。粒子の形状およびアスペクト比がナノ粒子の物理的、光学的および電子特性に影響を与え得ることは認識されているが、具体的な形状、アスペクト比、または内部表面領域の存在／不存在はナノ粒子としての粒子の性質の決定に関連していない。
【００２４】
多くのSERS文献は（実験的なものおよび理論的なものの両方とも）、異方性粒子（ロッド、三角形、プリズム）は球と比較して高い増強をもたらす可能性があることを示唆している。たとえばいわゆる“アンテナ効果”から、曲率の高い領域ほどラマン増強が大きいであろうと予測される。Agプリズムおよび“枝分かれ”Au粒子を含めた異方性粒子の多数の報文が、最近記載されている。SACN形成のための構築ブロックとして用いられるそのような異方性粒子は、本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
異方性AuおよびAgナノロッド（nanorod）は、Nanobarcodes（登録商標）粒子の製造と同様な方法で、予め作製したアルミナ鋳型内への電着により製造できる。たとえばNicewarner-Pena, S. R.; Freeman, R. G.; Reiss, B. D.; He, L.: Pena, D. J.; Walton, I. D.; Cromer, R.; Keating, C. D.; Natan, M. J. “Submicrometer metallic barcodes”, Science 2001, 294, 137-141; Walton, I. D.; Norton, S. M.; Balasingham, A.; He, L.; Oviso, D. F. J.; Gupta, D.: Raju, P. A.; Natan, M. J.; Freeman, R. G. “Particles for multiplexed analysis in solution: detection and identification of striped metallic particles using optical microscopy”, Anal. Chem. 2002, 74, 2240-2247を参照。これらのNanobarcodes粒子は、予め作製したアルミナ鋳型内へ材料（一般にAuおよびAg）の交互層を沈着させることにより製造される。代表的な態様において、Nanobarcodes粒子はほぼ直径250 nm、長さ6ミクロンである。
【００２６】
SACNに用いる金属ナノ粒子を作成するためには、たとえば実施例１０に記載するように、比較的小さな直径のポア内に電着を行うことができる。ある態様においてポア直径は100 nm未満であり、ある態様においては10〜50 nmである。これらの寸法をもつ均一なアルミナ鋳型が、幾つかの研究グループにより報告されている。そのような鋳型が現在では市販されている。したがって一態様において本発明は、そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、第１材料および第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学プロセスを伴い；再び金属をポア内に沈着させ；そして第２材料および鋳型をポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、少なくとも2つの遊離した金属ナノ粒子を生成させることを含む方法を提供する。この態様において、ポア結合したセグメント状ナノ粒子は組成ABAをもち、Bおよび鋳型を離脱させると、2つのA粒子が生成する。沈着を繰り返して、組成(AB)nまたはA(BA)nをもつセグメントを生成させることができる。ここで、nは1〜1000のいずれかの整数であり、鋳型から離脱させるとn個またはn+1個のA粒子が生成する。
【００２７】
一態様において、この方法で製造したSACNはほぼ直径250 nm、長さ250 nmである。この方法の一例を実施例１０Ｂに記載する。図１５ＡおよびＢは、この方法で製造したSACNの図を示す。これらの粒子はロッド状に見えるが、図１６ＡおよびＢに示す拡大図からそれらが非幾何学的形状をもつことが明らかである。非幾何学的形状は、粒子を製造する際に金属（たとえばAu）と離脱される材料（たとえばAg）の間に平滑な界面がないことにより生じると考えられる。平滑な界面がないことは、2種類の金属が相互拡散して合金を形成し、その後、離脱工程で脱合金化が起きた結果であると考えられる。これらの非幾何学的粒子は、図１７ＡおよびＢに示すようにSERSに有用である。AuとAg（たとえば80:20のAu:Ag）を意図的に同時沈着させると、有意の合金化が起き、後続の酸誘導によるAgの溶解により、かなりの内部表面積を示すきわめて高度に孔蝕された表面が得られるであろう。レポーター分子がそのような内部部位に到達でき、これによりSERS活性ナノ構造間の電磁場増強を起こす程度において、そのような表面は改良されたSERS挙動を示すことができる。
【００２８】
ある態様において本発明は、そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に第１金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第２金属を沈着させ；前記鋳型のポア内に第３材料を沈着させ、その際、第１材料および第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学プロセスを伴い；第１金属および第２金属を沈着させる工程を繰り返し；そして第３材料および鋳型をポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、それぞれが第１金属および第２金属を含む少なくとも2つの遊離した金属ナノ粒子を生成させることを含む方法を提供する。この態様において、ポア結合したセグメント状ナノ粒子は組成ACBACをもち、Bおよび鋳型を離脱させると、2つのAC粒子が生成する。沈着を繰り返して、組成(ACB)nをもつセグメントを生成させることができる。ここで、nは1〜1000のいずれかの整数であり、鋳型から離脱させるとn個のAC粒子が生成する。ある態様において、金属の１つは磁性である。
【００２９】
ある態様によれば、金属は元素の周期表から選択される、一般に金属として知られる少なくとも１種類の元素を含む。金属は、主に単一元素を含むことができる。あるいは、金属は少なくとも2種類の元素の組合わせ、たとえば合金、たとえば二元合金であってもよい。金属は、11族金属（Cu、AgおよびAu）、またはSERSを支持することが当業者に知られている他のいずれかの金属を含む。
【００３０】
他の態様において、金属はたとえばAu2S/Auコア-シェル粒子の場合のように追加成分を含む。Au2S/Auコア-シェル粒子は広範囲で調整可能な近赤外光学共鳴をもつと報告されている（Averitt等, 1999年10月, JOSA B, Volume 16, Issue 10, 1824-1832）。あるいは、Agコア/Auシェル粒子、たとえばJ. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7961に記載のもの、またはAuコア/Agシェル粒子、またはSERS活性金属を含むいずれかのコア-シェル組合わせを使用できる。コア-シェル粒子に使用するのに適切な他の組合わせが本発明に含まれる：たとえばAu-またはAg-ナノ粒子官能化シリカ/アルミナコロイド、Au-またはAg-官能化TiO2コロイド、Auナノ粒子でキャッピングしたAuナノ粒子（たとえばMucic等, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12674を参照）、Auナノ粒子でキャッピングしたTiO2コロイド、金属シェル（“ナノシェル”）を備えたSiコアをもつ粒子、たとえば銀キャッピングしたSiO2コロイドまたは金キャッピングしたSiO2コロイド（たとえばJackson等, 2004 Proc Natl Acad Sci U S A, 101 (52): 17930-5を参照）。中空ナノ粒子、たとえば中空ナノ球体および中空ナノ結晶もSACNに使用できる。したがって本発明は、SERSについて活性であるコア-シェル粒子またはSERSについて活性である中空ナノ粒子を含む、SACNに使用するためのナノ粒子をも提供する。これらの粒子の改良されたSERSシグナルは、文献の手順に従ってこれらの粒子のバッチを製造し、そのSERSシグナルを本明細書に記載する金属粒子と比較することにより示される。
【００３１】
SACNの製造方法は、米国特許 No 6,514,767に開示されている。他の方法が、実施例のセクションを含む本明細書に開示されている。本明細書中に述べるSACNは、実施例８に説明するように、光安定性であり（シグナルブリーチング（signal bleaching）を示さない）、熱安定性であり、シグナルの直線性を示し、バッチ間再現性を示す。
【００３２】
本発明に使用するのに適切なラマン活性レポーターの例には、4-メルカプトピリジン(4-MP)；トランス-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)；キノリンチオール；4,4'-ジピリジル；1,4-フェニルジイソシアニド；メルカプトベンゾアミダゾール；4-シアノピリジン；ヨウ化l',3,3,3',3'-ヘキサメチルインドトリカルボシアニン；3,3'-ジエチルチアトリカルボシアニン；イソチオシアン酸マラカイトグリーン；ビス-(ピリジル)アセチレン；およびBodipyが含まれる。5つの異なるレポーターに関するデータを図１２に示す。それらのスペクトルに識別性があること、および各種について少なくとも１つのユニークなバンドがあることが明らかである。適切なラマン活性レポーターの他の特徴を後記する。
【００３３】
一態様において、本発明は１又はそれを越えるレポーターを含むSACNを提供する。そのようなSACNのひとつの製造を実施例３に記載する。一態様において、SACNは金属ナノ粒子コア、トランス-1,2-ビス(4-ピリジル)エチレンレポーター、および4-メルカプトピリジンレポーターを含む。
【００３４】
一般に普通のラマンには存在しないSERS支持体に関連するバックグラウンドシグナルがある。本発明は、SACNからのバックグラウンドシグナルを低下させる方法、および低いバックグラウンドシグナルを示す改良型SACNをも提供する。たとえば図１において1600 cm-1におけるバックグラウンドシグナルは〜7000カウントであり、一方、シグナルSはバックグラウンドシグナルより〜11,000カウント高い。測定がショットノイズ(N)限定であれば［N＝バックグラウンド1/2］、S/N＝130:1である。しかし、スペクトル中の残りのピークはこれより有意に低い。バックグラウンドを2.25倍低下させるとS/Nが50%改善され、これは弱いシグナルの解読に役立ち、一般に異なるスペクトルの識別性を改善するであろう。したがって本発明は、SACN粒子を用いるアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを低下させ、この低下が、分析すべき試料、SACN粒子、およびアッセイに関与する他の緩衝剤または関連材料よりなる群から選択される構成要素からSERS活性の強い不純物を除去することを含む方法をも提供する。痕跡量の不純物（コロイドAuの製造に用いる試薬中に存在するものであっても）が粒子表面に不可逆的に吸着する可能性があることは知られている。したがって、すべての材料、特にレポーターを、限外濾過、HPLC、蒸留、昇華、および／または再結晶によって厳密に精製すると、バックグラウンドシグナルを低下させることができる。
【００３５】
たとえば、側方流動イムノアッセイの場合、一般的な支持体はPVDF（ポリ二フッ化ビニリデン）およびニトロセルロースである。ニトロセルロースはラマンバックグラウンドに関して2つの理由で望ましいことが見いだされた。第１に、PVDFは、励起光源（785 nmのレーザー、試料において約200 mWの電力）に2分間連続暴露した後のバックグラウンド低下が示すように、若干の自己蛍光を示す（図３）。このバックグラウンドにはほとんどラマン特徴はないが、強度の変動性については小ピークを扱うよりも困難である。この低下の後ですら、長期間の照射にわたってラマン発光における光誘導の変化を示さない2つの別個のニトロセルロース源から得られるものより、全バックグラウンドが大きい。類似の現象が図４に見られる。この図は、ガラスが785 nm光で励起した際に弱いけれども測定可能なバックグラウンドラマンをもつことを示す。ラマンスペクトルは、2つの別個の業者より入手したガラススライドから取得した。それぞれの取得に１秒間の積算時間を用い、一方、石英スライドからのラマンバックグラウンドを得るためには5秒間の積算時間を用いた。石英スライドはベースラインより上にはほとんど認められないのに対し、各ガラススライドは測定可能なレベルのバックグラウンドをもつ。バックグラウンドをスペクトルから差し引くことはできるが、測定可能なバックグラウンドは積算時間を制限し、痕跡量のラマンレポーターの検出を妨害する可能性がある。
【００３６】
この効果を説明する他の例では、高度に精製した試薬で作成した粒子からのバックグラウンドを“製造したままの”試薬で作成した同等の組成のものと比較することができる。したがって本発明は、最適化SACNを調製することを含む、SACNにより発生するラマンスペクトルのバックグラウンドシグナルを低下させる方法を提供する。この最適化SACNはレポーター分子を含み、このレポーター分子は最適化SACNに取り込ませる前に精製される。この最適化SACNをで発生するラマンスペクトルのバックグラウンドシグナルは、最適化していない対応するSACNにより発生するスペクトルと比較して低下している。
【００３７】
ある態様において、本発明の改良型SACNは既知のSACNと比較して高いSERSシグナルを発する。ある粒子サイズおよび形状、ならびにある励起波長について、Ag粒子はしばしばAu粒子より大きなSERSシグナルを発する。Auコロイド合成の再現性を改良するとより良いSACN候補が得られると予想される。したがって本発明は、改良されたAuコロイド合成法を提供する。そのような方法の一例を実施例２に記載する。この方法は、NaBH4、クエン酸三ナトリウムおよびNH2OHの組合わせを金属の還元に用いる。この改良法は、他の方法（たとえば還元剤としてクエン酸塩のみを用いるAuコロイド合成の従来法）と比較してより容易であり、より単分散度の高い粒子が得られる。
【００３８】
他の態様において、SACNに使用するナノ粒子は、Freeman等, Journal of Physical Chemistry (1996), 100(2), 718-24のようにAgの準単層コーティングをAuナノ粒子の表面に沈着させる方法により製造される。そのようなコーティングナノ粒子を含むSACNを用いて、球状ナノ粒子からのSERSシグナルを約2倍増強できると予想される。
【００３９】
ある態様において、本発明はレポーター装填およびSACN上のSiO2コーティングを最適化する方法を提供する。各レポーターがSACNに効果的に取り込まれるためには、SiO2シェルが完成される前に、金属表面に最大量のレポーターが存在する条件を決定することが望ましい。
【００４０】
ある態様においては、ラマン標識部分をも供給できるSiO2-前駆物質分子を用いてSACNを製造する。この方法は、SACNからのSERSシグナルの増強を補助するものでなければならない。たとえば4-プロピルピリジントリメトキシシランはラマンレポーター（ピリジル基）を提供し、かつトリメトキシシランによりSiO2前駆物質として作用することができる。このSiO2前駆物質と標識はAu粒子上の空間に対して競合する必要がないので、標識のより高い表面被覆率が達成されるはずである。たとえば市販のシランは、単分子のレポーター／前駆物質として適用可能な既製のシラン源である。シランの例には、3-(2,4-ジニトロフェニルアミノ)プロピルトリエトキシシラン、2-シアノエチルトリメトキシシラン、およびp-アミノフェニルトリメトキシシラン、n-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4,5-ジヒドロイミダゾールが含まれる。
【００４１】
他の態様においては、ナノ粒子をラマン活性ポリマー、たとえば適切なポリスチレンコポリマー、ポリアセチレン、またはポリチォフェンでコーティングする。そのようなポリマーは、バイオコンジュゲーション（後記を参照）を容易にするために、またはSiO2前駆物質の結合のために、アミンまたはチオールのような反応性基を含むことが好都合であろう。
【００４２】
最小直径のSACNを製造するために、SiO2の厚みを小さくすることができる。典型的な態様において、SiO2シェルの厚さは1〜40 nmである。ある態様において、SiO2封入剤は5〜15 nmの厚さである。理論的にはSiO2シェルをいかなる任意の厚さにすることもできるが、これはコーティングの完全さの維持を犠牲にするかもしれない。ある態様においては、SiO2シェルが(i)金属コアおよびラマン標識分子を攻撃から保護すること；(ii)潜在的なスペクトル干渉物の金属表面への吸着を阻止すること；(iii)SiO2表面を生体官能化のために提供すること；および／または(iv)金属コア間のファンデルワールスにより誘発される凝集を阻止することが重要である。
【００４３】
球状ナノ粒子に基づいて、SACNと比較して改良されたシグナル強度をもつSACNは、単結晶AuまたはAgナノロッドを用いて製造できる。電着条件（過電圧、温度、添加剤など）がナノロッドの構造を決定し、そしてこの構造がナノロッドの物理的および機械的特性を決定する。ナノロッドが単結晶であれば、それらのSERSシグナルを有意に増強することができる可能性がある。エピタキシャル二次元（2D）核形成／成長機構にはきわめて低い過電圧での電着が必要であることは一般に知られている。最近、低い金属イオン濃度、低い過電圧、高い温度、およびめっき液への界面活性剤の添加により、単結晶Cu、AgおよびAuナノワイヤの電着が達成された。Wang等, J. Phys. Chcm. B 2004, 108, 841-845；Tian等, Nano Lett. 2003, 3, 919-923。
【００４４】
18nmおよび35 nmのポア直径の商業的に入手可能な鋳型を用いて、Auナノロッドを含む、長さ50〜100 nmの単結晶金属ナノロッドを合成できる。（111）配向成長および厚さ200 nmをもつ蒸着Agを支持体として使用できる。定電位モードで、電着中の過電圧を正確に制御するための参照電極を用いて、電着を実施できる。Auナノロッドの低速エピタキシャル2D核形成および成長のために、溶液組成および温度のような重要な条件を評定することができる。高分解能TEMはナノロッドの構造を解明し、Ｘ線回折は結晶配向の判定に使用できる。鋳型の利用を向上させるために、同じ（111）配向をもつ薄い（10〜20 nm）Agセグメントにより分離されたAuナノロッドを逐次めっきすることにより、ポア当たり複数の粒子を製造することができる。理論的には、この方法でポアを完全に充填することが可能であろう。鋳型は一般に50〜60μmの厚さであるので、長さ100 nmの粒子をポア当たり400個以上製造できるであろう。選択的にエッチングできるめっき基材として（111）Cu支持体を用いることにより、同じ（定電位）電着技術をAgナノロッドの合成に適用できる。
【００４５】
代替（かつ、おそらくより安価な）方法として、NikoobakhtおよびEI-Sayedが報告した溶液ベース法（solution-based method）を使用または応用して、Auナノロッドを製造できる。Nikoobakht, B. and El-Sayed, M. A.,“Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method”,Chem. Mater. 2003, 15, 1957-1962。溶液ベース法で製造したナノロッドのTEM画像を図５に示す。この試料において、平均的ナノロッドは10×50 nmのサイズであるが、ナノ立方体の形成により分かるように、粒子のサイズおよび形状にはかなりの変動がある。溶液ベース法は、より大きな容量に容易に拡張できる。
【００４６】
他の態様において本発明は、最適化SACNを製造することを含む、SACNにより発生するラマンスペクトルのバックグラウンドシグナルを低下させる方法を提供する。この最適化SACNは、SACNの製造過程で粒子表面に不可逆的に結合した物質を除去し、そのスペクトルのバックグラウンドシグナルを最適化していない対応するSACNにより発生するスペクトルと比較して低下させることを含む方法により製造される。一態様において、除去はSACN中間体を激しく酸化し、続いて穏やかに還元することにより達成される。除去は、金属ナノ粒子を酸化剤、たとえばUV生成したオゾン／酸素ラジカルの組合わせで処理し、続いて還元剤、たとえばエタノールで処理して、外因性有機体を除去することを含むものであってもよい。SERS活性金属表面を清浄にする例は、Ron等, Langmuir 1998, 14, 1116-1121に記載されている。一態様において、金属はAuである。この方法の途中で、Au表面は不安定な酸化金に変換され、続いてエタノールにより還元される。他の態様において、この方法は金属をUV生成したオゾン／酸素ラジカルの組合わせ（酸化剤）で処理し、続いてエタノール中のレポーター溶液で処理することを含み、これにより還元に際して直ちにレポーターを吸着させることができる。他の態様においては、エタノールを遠心分離により除去し、そして後続工程でレポーターを添加する。
【００４７】
場合によっては、バックグラウンドノイズに関与する種がアッセイに導入される。たとえば、試料の濾過および調製に用いるある膜が、SACN粒子を用いるアッセイのラマンスペクトルにバックグラウンドを導入することが見いだされた。したがって一態様において本発明は、SACN粒子のラマンスペクトルのバックグラウンドシグナルを低下させる方法であって、分析用試料を調製し、その調製が試料またはアッセイ系からバックグラウンドシグナルに関与する種を除去することを含む方法を提供する。他の態様において本発明は、SACN粒子のラマンスペクトルのバックグラウンドシグナルを低下させる方法であって、アッセイ構成要素からバックグラウンドシグナルに関与する種を除去することを含む方法を提供する。
【００４８】
SACNの用途
ハイスループット多重システムを用いて新規薬物を見いだすのが現在行われている研究領域である。自動化したコンビナトリアルケミストリーにより、数百万の新規構造体を製造することができる。これらの薬物の分析には、高生産性で高度に多重化された検知法が必要である。SACN技術の利用は、高度に多重化された方法を提供する。ラマン分光法はラマンピークの鮮鋭さのため標識-多重能を提供するのに理想的であり、SERSは多数のユニークな標識の好機を提供する。ある態様においては、ラマン活性分子と１以上の部分を共に含有する多数のSACNを用いて、多重アッセイを実施できる。これらの部分は試料流体内の１以上の検出可能物質に選択的に結合しうるものであり、一方、レポーター分子は流体内のSACN（したがって会合した部分）を同定するのに使用できる。個々のSACNは比較的小さく、かつ独立して同定できるターゲットの数は潜在的にかなり多い可能性があるので、多数の異なるSACNを含有させることにより、多数の個別アッセイを単一流体試料内で実施できる。
【００４９】
典型的なラマンスペクトルは3000 cm-1以上に及ぶ。図１を参照。一態様においては、構造関連性のあるレポーター分子を含む複数の異なるSACNを生成することにより、比較的狭い領域のスペクトルに焦点が集まる。たとえば、構造関連性のある一組のレポーター分子には、ピリジン、ピリジン-d5（重水素化ピリジン）、およびピリジン-15N、4-(メチルアミノ)ピリジン、4-アミノピリジン、4-メルカプトピリジン、4-ピリジンメタノール、4-ヒドロキシピリジン、ならびに2.3.5-トリメチルピリジンを含めることができる。ラマンスペクトルは振動モードに基づくので、化学構造のわずかな変化がユニークなラマンバンドを提示できる。したがって、単一のSERS活性構造体、たとえばナノ粒子を、構造関連性のある複数のレポーターで修飾して、それぞれがユニークなSERSスペクトルをもつが化学反応性は類似する複数のSACNを製造する。この方法はきわめて高いスペクトル分解能を必要とし、したがって大型および／または高価なモノクロメーターが必要となる可能性がある。
【００５０】
他の態様においては、全スペクトル（その小領域ではなく）を利用する。この態様では、全体として間隔の広い振動バンドをもつ複数のSACNを製造する。ある態様においては、コンピュータープログラムを利用してそれぞれ一定のスペクトル特性をもつSACNまたはレポーターの所与の群からの選択を行うのが好都合であろう。一態様においては、利用者指定スペクトル分離基準に基づいて複数のSACNまたはレポーターを選択するようにコンピュータープログラムを設計することができる。あるいは、スペクトル分離度に従って可能なSACNまたはレポーターの組を作成するようにコンピュータープログラムを設計することができる。全スペクトルウインドウにわたって振動バンドを示すと予想される単一クラスのレポーター分子はないので、この態様では多様な分子をレポーターとして使用する。分子の選択は、下記の4基準に従って行うことができる。
【００５１】
1.レポーターは、ラマン活性振動モード、すなわち振動中に分極率の変化を引き起こすモードをもつ。
2.レポーターは、いかなるSERS活性表面にも吸着する；すなわち△Gads＜＜0。
【００５２】
3.レポーターは、自由“スペクトル間隔”を最大にするために、可能な限り少ないバンドをもつ。N個の原子を含む非線状分子は、3N-6の許容振動（IR＋ラマン）を示す。明らかに、小さい分子ほど有用である。ただし、Nと△Gads（一般に大きい分子ほど負になる）のバランスをとる必要がある。
4.レポーターは、粒子合成およびキャッピングプロトコルの水性環境ならびにガラス形成化学自体に適合性である。
【００５３】
種々の分子のラマンスペクトルについて、まとめられた豊富な情報が利用可能である。たとえば下記を参照：Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds; 第4版, John Wiley & Sons. Inc: ニューヨーク; 1986; Lin-View, D.; Colthup, N. B.; Feld, M. S.; Grasselli, J. G. The Handbook of Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules; Academic Press; カリフォルニア州サンディエゴ; 1991 ; Socrates, G Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies, Table and Charts, 第3版, John Wiley & Sons. Ltd; チチェスター, 2001;. Workman, J., Jr. Handbook of Organic Compounds;, NIR, IR, Raman, and UV-Vis Spectra Featuring Polymers and Surfactants; Academic Press; カリフォルニア州サンディエゴ; 2001; VoI 3; Schrader, B. Raman/Infrared Atlas of Organic Compounds, 第2版, VCH Publishers; ニューヨーク州ニューヨーク, 1989; Hendra, P. J. and Agbenyega, J. K. The Raman Spectra of Polymers; John Wiley & Sons Ltd; チチェスター, 1993；すべてを本明細書に援用する。上記の基準を用いて、下記のクラスの候補レポーターがSACN用のレポーター分子として有用であると同定された。
【００５４】
有機分子：小さいサイズ、不飽和、ヘテロ原子、および電気陰性置換基は、すべてユニークな特徴をもたらす。既知のラマン特徴をもつものの例：ピリジン類、トリアジン類、ピリミジン類、ピロール類、オキサゾール類、イミダゾール類、フラン類、シアニド類、シアナミド類、およびそれらの誘導体（すなわち2-、3-、4-官能化されたもの)。アセチレン類、ニトロ／ニトロソ、-CCl2、および-CCl3はすべて、ユニークなフィンガープリントバンド（fingerprint band）を示す。イソチオシアネート(R-N=C=S)およびイソシアニド(R−N≡C)は、強いラマン散乱体であり、Auに吸着し、一般的ないかなる官能基も共有しないエネルギーにおいて振動し、かつその振動スペクトルはR-基の電気陰性度に強く依存するので、特に有用である。
【００５５】
有機／無機アニオン：きわめて単純なスペクトル（しばしば単一ピーク）は大きな利点である。単純なスペクトルを示すレポーターの例には、シアニド、SCN-、ClO3-、HCO2-、その他が含まれる。これらのうちあるものは、金属粒子の合成時に含有させることができる。たとえばコロイドAuは、HAuCl4に由来する強固に結合した残留Cl-をもつ。特にNaBH4のような強い還元剤を用いると、他の金属塩から出発することもできる。
【００５６】
遷移金属を含有する配位錯体および他の化合物：金属-配位子の結合は、比較的低いラマンシフト、すなわち200〜800 cm-1の振動特徴をもたらす卓越した条件である。配位子に基づく振動自体も非錯化状態に対してシフトし、可能な場合は金属の酸化還元状態を変化させると両バンドのエネルギーが移動する。SCN-のようなアンビデントな（ambidentate）配位子は金属イオンと金属表面を架橋しうるので、特に有用である。他の態様においては、１以上の強いSERS活性配位子（たとえば[Fe(CN)63-]もしくは[Fe(CN)64-]中のシアニド、または[Ru(bipy)32+]中の2,2'-ビピリジン(bipy)）を含有する錯体を使用できる。あるいは、有機金属種、すなわち１以上の金属-炭素結合を含むもの（たとえばフェロセン）は、強いラマンスペクトルを示すことができる。
【００５７】
混合原子価種：紺青（Prussian blue）およびWO3は、金属イオンの酸化還元状態の関数としてその振動スペクトルが変化する材料の例である。後者はH+（すなわちHxWO3を形成）、D+、またはLi+のインターカレーションにより連続調整できるので、特に重要である。
【００５８】
同位体：振動モードの減少された量を変化させるのは、そのエネルギーをシフトさせるための卓越した方法であり、これは同位体置換によって容易に達成できる。たとえば重水素化BPE、重水素化4,4'-ビピリジル、および重水素化ビス-(ビピリジル)アセチレン類；ならびにピリジン、ピリジン-d5（重水素化ピリジン）、ならびにピリジン-15N。
【００５９】
スペクトルの独立性は、バックグラウンド減算およびピーク検出ならびに古典的な直接最小２乗法などの方法を組み合わせた、スペクトルデコンボリューションソフトウェアを用いて簡便に評価できる。そのようなソフトウェアを用いると、候補レポーター分子を他の候補レポーターと対比して評価することができる。そのようなソフトウェアによれば、純レポータースペクトルを入力して、混合物中の各成分を定量する出力を得ることができる。
【００６０】
レポーターセットが選択されると、SACNのシグナル強度を正規化し、こうして粒子数当たり等しいシグナルをもつSACNを得ることができる。分子型フルオロフォアでは不可能なこの能力により、その測定につき可能な最大の動的範囲が確実となる。一態様において、正規化プロセスは2工程を含む。第１工程では、レポーターに関する同定の特徴の強度比を測定する。第２工程では、減少させた量のレポーターを含むSACN（最も弱いレポーターの強度に対するそれの強度比の逆数により定義される）を製造する；ただし、最低強度のシグナルを含むSACNを除く。この方法は低いレポーター濃度における直線的吸着を呈し、これを一連のレポーターについて決まった手順で観察する（実施例８も参照）。他の態様において、レポーター吸着の正規化は、SACN合成に際してナノ粒子表面のSiO2前駆物質（シラン）の量を増加させ、これによりレポーター吸着を減少させることによって達成できる。これらの方法により、実質的に等しいピーク強度をもつ複数のSACNが得られる。本明細書中で、ある態様において用いる実質的に等しいとは、互いに10%以内にあるピーク強度を表わす。他の態様において実質的に等しいとは互いに5%以内にあるピーク強度を表わし、さらに他の態様において実質的に等しいとは互いに１%以内にあるピーク強度を表わす。
【００６１】
本発明は、溶剤が到達しうる粒子部分に反応性基、たとえば-SH基、-NH2基、または-COO-基を含むSACNを含む。ある態様において、反応性基は封入剤と会合している。本発明はバイオコンジュゲートSACNの製造方法を提供し、これにはバイオコンジュゲーションのための反応性基を含むSACN、たとえばチオール活性SACNの製造が含まれる。SACNがSiO2で封入された態様の場合、表面シラノール基を誘導体化することができる。SACNのシリカシェルを、SiO2シェルの作成途中で（“直接修飾”）、またはシェルが完全に形成された後に（“後修飾”）、遊離スルフヒドリル基をもつように官能化することができる。シラノール基を修飾するための多数の反応が当業者に知られている。たとえば、SiO2表面を修飾して、アミン（アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS)との反応による）またはエトキシド（3-グリシジルオキシプロピル-トリメトキシシラン(GPTMS)）を存在させることができる。スルフヒドリル類、カルボキシルその他のコンジュゲーション可能部位を取り込ませるための試薬もある。チオール活性SACNの製造を実施例４に記載する。
【００６２】
チオール活性SACNは、生体分子、たとえばペプチド、タンパク質および核酸にコンジュゲートしたSACNの製造に有用である。抗体を結合させるには、アミン基を得るためにAPTMSを使用し、次いで抗体を結合させるためにカルボジイミド化学を利用できる。あるいはGPTMSを用いてエトキシド表面を形成してもよく、これには抗体上のアミンが直接反応するであろう。他の態様においては、ハロゲン化アルキル、ハロアセチルおよびハロゲン化ベンジル基を末端とするシランを、タンパク質中のシステイン基との反応に利用できる。バイオコンジュゲートSACNの製造を実施例５に記載する。ガラス表面の清浄度およびイオンの存在が誘導体化の達成に影響を及ぼす可能性がある。
【００６３】
ある態様においては、製造したままのSACNを本明細書の記載に従って使用してもよい。しかし他の態様においては、SiO2表面を“清浄化”または修飾（酸または塩基との反応が含まれる）した後、より良好な結果を得ることができる。
【００６４】
開発した各方法について、誘導体化レベルを制御するために、誘導体化試薬（たとえばシラン）および生体分子の力価を判定することができる。多数の市販品を含めた蛍光標識抗体を用いて、表面に存在する物質の量を測定できる。変数が最適化されるように、これをモニターすることができる。生体分子が反応性を維持しているかを判定するためには、生体分子に対する蛍光色素標識-結合パートナーを粒子と混合することができ、その際、コーティングしていない粒子を対照として使用する。たとえばストレプトアビジンコーティングしたSACNを蛍光色素標識ビオチンと混合することができる。得られた粒子を遠心分離し、上清を除去し、粒子の蛍光を測定することができる。
【００６５】
ある態様においては、ヘテロ二官能性架橋剤4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ-SMCC）を用いて、生体分子をチオール活性化レポーターに結合させる。この分子は、スルフヒドリル類に対して反応性であるマレイミド基および第一級アミンと優先的に反応するスルホ-NHSエステルの両方を含有する。この場合、簡単なワンポット反応を用いてストレプトアビジンを結合させることができ、大部分のタンパク質、アミンを末端とするオリゴヌクレオチド、または第一級アミンをもつ他の分子の結合に容易に適合させることができる。
【００６６】
表面にアミン官能基をもつSACNを無水コハク酸で処理することができ、これは第一級アミンと反応して遊離カルボン酸塩を残す。カルボジイミドは、ストレプトアビジンなどの生体分子上のアミンへの結合に使用できる。アミンコーティングした粒子を、ホモ二官能性結合剤、たとえばグルタルアルデヒドにより、生体分子上のアミンに結合させることもできる。他の方法は、まず2-イミノチオラン（Traut試薬）でタンパク質のアミンの一部をスルフヒドリルに変換し、次いでスルホ-SMCCを用いて粒子に結合させるものである。
【００６７】
一部は非特異的結合を減少させる目的で、バイオコンジュゲートSACNを精製してもよい。抗体コンジュゲートSACNの場合、遊離抗体は抗原に対してSACNと競合し、感度を低下させるであろう。一態様においては、遠心分離によりSACNを精製し、これには１回より多い遠心分離が含まれる。精製効率は、蛍光標識タンパク質のドーピングにより分光法で判定できる。蛍光色素はガラス表面と相互作用することが知られているので、結果を放射性標識タンパク質で確認することが必要であろう。接線流濾過装置をシリカコーティング粒子の精製およびコンジュゲートSACNの精製に使用できる。
【００６８】
SACNの非特異的結合（non-specific binding, NSB）の排除または減少が望ましい。SACNをガラススライド、マイクロウェルプレートおよび固定された細胞表面で試験することができる。種々のコンジュゲーションプロトコルおよび表面被覆率の各々がNSBに及ぼす影響のレベルを確認できる。たとえば、種々のpHおよび緩衝液に加えて、標準的な遮断剤（blocking agent）および洗浄用緩衝液、たとえばTween（登録商標）およびカゼインの効果を判定できる。一態様においては、本明細書に記載するものを含めた遮断剤で粒子を遮断することにより、NSBを減少させることができる。一態様において、遮断剤は実施例６に記載するようにBSAである。あるいは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールおよびデキストラン、ポリエチレンイミンならびにデンドリマー（すべて、低いNSBをもつことが知られている）等でのポリマーによるSiO2シェル誘導体化により、NSBを減少または排除できる。さらに、市販のマイクロアレイガラスコーティング試薬も使用できる。
【００６９】
一態様において、コンジュゲートSACNは、SACNとコンジュゲートした生体分子との間にスペーサー分子を含む。理論により拘束されるわけではないが、ある種のスペーサー分子、たとえばポリエチレングリコール(PEG)またはデキストランは、NSBを最小限に抑えると考えられる。スペーサー分子は、本明細書に記載する方法および当技術分野で既知の他の方法により、バイオコンジュゲートSACNに導入できる。たとえば、別個のPEGサブユニットをスルホ-SMCCに取り込ませる市販の架橋剤を使用できる。生体分子をこのPEGベースのリンカー（linker）に結合させることができる。同様に、官能性PEG分子を抗体と一緒にSACNに共コンジュゲートさせることができる。これに関してPEGは、裸のシリカ表面がアッセイに際して目的外の種に暴露されるのを最小限に抑えるスペーサーとして作用する。あるいは、まず二官能性PEG分子をSACNにコンジュゲートさせることができる。次いで、PEGの利用可能な官能基を、抗体その他の生体分子にさらにコンジュゲートさせるために使用できる。
【００７０】
一態様では、本発明においてターゲット被分析体を検出するためのアッセイ法およびキットが提供される。被分析体は、検出および／または測定に望まれるいかなる具体的な物質または成分であってもよい。目的とする被分析体には、たとえば下記のものが含まれる：抗原（たとえば細菌、ウイルスまたは原生動物などの生物に特異的な抗原）；抗体、これは感染、アレルギー反応またはワクチンに応答して誘導されるものを含む；ホルモン、タンパク質その他の生理的物質（たとえばヒト絨毛ゴナドトロピン、エストロゲン、プロゲスチン、テストステロン、コルチコステロイド、ヒト成長因子、ヘモグロビン、およびコレステロール）；核酸；多様な酵素；療法用化合物および違法薬物；不純物および環境汚染物質；または多数のいずれかの天然もしくは合成物質。
【００７１】
一態様において、本発明は、ELISAタイプのアッセイ法の代わりに使用できる、SACNを用いたサンドイッチイムノアッセイ法を提供する。酵素免疫測定法（ELISA）の分析技術および関連技術は、現在最も広く知られているイムノアッセイ法である。一般的なELISA法の工程は、一般にまず捕獲抗体を固体支持体に吸着させることを含む。試料と共にインキュベートすると、抗体-ターゲットタンパク質複合体が形成される。最終的なサンドイッチイムノアッセイ複合体は一般に指標酵素を含み、これにより抗原濃度を光学測定できる。しかし、SACNを用いるサンドイッチアッセイ型イムノアッセイ法では、指標酵素の代わりにSACNを用いて光学検出することができる。この態様では、正確に濃度が知られている特異的活性抗体種がそれらの表面に結合したバイオコンジュゲートSACNを調製し、バイオコンジュゲートSACNをBCAアッセイなどのタンパク質定量アッセイを含む結合アッセイ法により定量することができる。そのようなアッセイを実施例１１に示すように多重化することができる。
【００７２】
本発明方法は、生物由来の試料中の被分析体を検出するのに有用である。そのような試料には、血液または血清；唾液、喀痰、涙液、汗、または他の分泌液；尿または糞便；および生物由来の流体、たとえば脳脊髄液、間質液、細胞抽出物などが含まれるが、これらに限定されない。全血はSACNからのSERS測定に適切な媒質である。図２０を参照。
【００７３】
アッセイには最小体積の試料を用いる。ある態様では約1〜約500μLの試料体積、他の態様では約1〜約100μLの試料体積、他の態様では約5〜約50μLの試料体積、さらに他の態様では約10〜約30μLの試料体積が含まれる。状況が許せば、より大きな試料体積を使用できる；たとえば血液バンクにおける大量の血液のモニタリングの場合、試料体積はミリリットル規模であってもよい。状況が許せば、より小さな体積も使用できる；たとえば細胞に関するアッセイの場合、細胞の体積を使用できる。細胞内構成要素をターゲットとするアッセイの場合、細胞内構成要素の体積を使用できる。そのような細胞アッセイまたは細胞下アッセイの場合、体積は１ pL程度の小さいものでもよい。
【００７４】
本発明のアッセイ法は結合アッセイ、たとえばイムノアッセイに基づくが、これらに限定されない。そのような結合アッセイに伴う結合パターンには以下の結合対が含まれるが、これらに限定されない：抗体と抗原またはハプテン；ホルモンと受容体；ビオチンとアビジン；炭水化物とレクチン；エフェクターと受容体分子；酵素と補因子、基質またはインヒビター；アプタマーとそれらのターゲットおよび相補的ヌクレオチド配列。したがって、以下に含まれる記述および例は説明のためのものであって、提示した特定の用途に限定されるとみなすべきではない。
【００７５】
一態様において本発明には、少なくとも１の被分析体の存在を検出するための、下記の工程を含む方法が含まれる：（a）被分析体を含有する疑いのある試料と、被分析体に対する少なくとも１種類の特異的結合パートナーを、側方流動アッセイ表面で接触させて、試料中の被分析体に結合させ；（b）工程（a）の前、それと同時または後に、少なくとも１種類の被分析体結合パートナーをSACNと結合させて、コンジュゲートSACNを形成し；そして（c）SERSシグナルを検出することによりシグナルの強度または存在によって試料中の被分析体の存在を判定する。
【００７６】
一態様においては、試料を試料帯域上に配置する。試料は試料帯域を通り、次いで標識、たとえばコンジュゲートSACNを含む標識帯域を通って、濾過される。SACNは試料の被分析体に結合して複合体を形成し、次いで複合体は膜または検出ストリップに沿って移動する。SACN-被分析体の複合体が存在すると、膜上の検出帯域に固定化された少なくとも１種類の特異的結合パートナーに結合する。この特異的結合パートナーとのSACN標識複合体の形成により、検出可能なSERSシグナルが発生し、これはその試料中に被分析体が存在するという陽性結果の指標となる。被分析体がたとえばIL-5である場合、SACNをIL-5抗体にコンジュゲートさせ、対応するIL-5捕獲抗体を検出帯域に存在させることができる。側方流動アッセイを実施例１２に記載する。
【００７７】
一態様において、生物試料は細胞である。細胞は生細胞または死細胞のいずれであってもよい。ラマンスペクトル情報を含む細胞の画像を、多数の方法で得ることができる。目的物の完全画像が得られるように、顕微鏡をCCDカメラと接続することができる。次いで試料とカメラの間に波数フィルター装置、たとえばモノクロメーターまたは液晶可変フィルターを挿入する。フィルタリングデバイスは、各時点で狭いバンド幅の散乱放射線のみをカメラに到達させる。それぞれ狭いスペクトル範囲の散乱放射線を含む多重画像を収集する。画像の各点からのスペクトルをソフトウェア中で組み立てる。他の極端な例では、画像の一点からの光をモノクロメーターにより分散させ、その点の完全スペクトルをアレイ検出器で取得することができる。次いで、画像の各点が別個に取得されるように、目的物を走査する。次いでラマン画像をソフトウェア中で組み立てる。他の方法では、１本の放射線で試料を励起する線走査計測器（line scan instrument）を構築することができる。この線はCCDカメラの１軸に沿って空間画像を形成し、一方では同時に直交軸に沿ってスペクトル分散される。カメラのそれぞれの読出しにより、この線の各空間ピクセルの完全スペクトルが取得される。画像を完成させるために、試料全体をこの線で走査する。
【００７８】
したがって本発明によれば、細胞小集団に発現している細胞表面抗原性受容体に結合する抗体を用いて調製した抗体コンジュゲートSACNにより、細胞または細胞集団を同定することができる。細胞および細胞集団の同定は、サンドイッチ法により達成することもできる。たとえば実施例１３に、Her2受容体およびビオチン化抗マウス抗体を染色したSK-BR-3細胞にNeutrAvidinコンジュゲートSACNを適用したアッセイを記載する。増加しつつある化合物ライブラリーおよびほぼ毎日見いだされている新しい療法ターゲットと足並みをそろえるために、細胞ベースの新しいハイスループットスクリーニング技術が要望されている。たとえばVitra BiosciencesのCellPlex（商標）カードは、細胞アッセイを多重化できる。アッセイ方式を多能化しうる他の方法は、ユニークな識別子（identifier）で細胞をコード化するものである。これは細胞集団の同時試験を可能にし、これにより生産性が高まる。たとえば、細胞タイプAをSACNタイプ１でコードし、細胞タイプBをSACNタイプ2でコードする、などが可能である。これらの細胞を細胞アッセイの実施前に混和することができる。従来の蛍光法、たとえばGFPにより細胞アッセイは実施される。蛍光を読みとって実験結果を判定し、SERSによりラマン顕微鏡を用いて細胞タイプを解読し、またはラマン検出で細胞を選別することにより、最終的な分析が完了する。この方式により、混合細胞集団における表現型を調べることができる。
【００７９】
SACNを用いて細胞内ターゲットを検出することもできる。SACNを、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、エンドサイトーシス仲介法により細胞に導入できる。これには、両親媒性ペプチド、たとえばPEP-Iの使用、カチオン脂質系の試薬、たとえばLipofectamine（Invitrogen）の使用、ならびにミセルおよびトランスフェクション試薬、たとえばトランスフェリン、マンノース、ガラクトースおよびArg-Gly-Asp（RGD）、ならびに他の試薬、たとえばデンドリマー系試薬SuperFect (Qiagen）の使用が含まれる。細胞内で間接法を用いて、粒子が目的ターゲットに結合することを証明できる。プローブの特異性を証明するための最も簡単な方法は、免疫蛍光法を用いてSACNの位置を確認することである。生細胞内で細胞構造体（たとえばミトコンドリア、ゴルジ装置および小胞体）を標識するのに有用な多数の市販蛍光プローブがある。同一構造体を標的とする抗体をコンジュゲートすることにより、実際にそれらのターゲットを標識している粒子画分、および非特異的に結合している％を判定できる。SACNの位置を確認する他の方法は、蛍光タンパク質融合体、たとえばGFPおよびその類似体を用いるものである。
【００８０】
本発明は、医療診断において重要な特性を示すイメージング剤に関する。より具体的には、本発明はSACNを含むイメージング剤に関する。本発明のイメージング剤は、患者一般のイメージング、および／または患者において罹病組織の存在を特異的に診断するのに有用である。組成の選択により、SACNの励起および発光を633〜1000 nm、すなわち組織による吸収および散乱が最小の領域で起きるように調整できる。このイメージング法は、本発明のイメージング剤を患者に投与し、次いでスペクトルイメージングを行うことができるいずれかのシステム、たとえば点走査型共焦点顕微鏡、線走査システム、および光干渉断層システムを用いて患者を走査することにより実施できる。本発明のSACNは、単一波長バンドのみを検出するいずれかのイメージングシステム、前記リスト、および励起光源とフィルター画像検出を伴ういずれかの蛍光イメージングシステムにより見ることもできる。他の適切なイメージングシステムおよび方法は、HANDBOOK OF OPTICAL AND BIOMEDICAL DIAGNOSTICS, 編者Valery Tuchin (2004) Springerに記載されている。時間領域法、たとえば動的光散乱分光法および断層撮影法、飛行時間型イメージング、準弾性光散乱分光法、光子相関分光法、ドップラー分光法、ならびに拡散波分光法も含まれる。これらの方法はすべて、光子とそれらの時間サイン（time signature）に基づいた場所とを区別できる。SACNは蛍光物質などとは異なる時間サインをもつので、それらをこれらの方法で組織および他の標識と識別することができる。有用な計測器パラメーターは、変調光源および時間感受性検出器である。変調はパルス式または連続式であってよい。
【００８１】
走査により、患者の内部領域および／またはその領域の罹病組織のスペクトルまたは画像が得られる。患者の領域とは、患者の全身、または患者の特定のエリアもしくは部分を意味するものとする。本発明のイメージング剤は、脈管系、心臓、肝臓および脾臓の画像を得るために利用でき、また消化器領域もしくは他の体腔のイメージング、または組織解明、血液プールのイメージングのような当業者に自明の他の方法に利用できる。
【００８２】
本発明は、異常な病理に関連する分子を標的とする複数のSACNを体液に導入して、その異常な病理体に接触させ、その際、異常な病理に関連する分子にSACNが会合し；そして会合したSACNをインビボでイメージングすることを含む、異常な病理をインビボで診断する方法をも提供する。この方法は、プローブが到達できるいずれかの臓器、たとえば消化管、心臓、肺、肝頚部、胸部などに一般に適用できる。ある態様においては、SACNを内視鏡検査の場合のように内視鏡により、または注射針により導入でき、あるいは使い捨てチップまたはスリーブと共に使用できる。他の態様においては、SACNをイメージング探査子自体により直接導入することができる。たとえば個々の光ファイバーまたは光ファイバーの束をイメージングのために生体に導入して、神経、脳、微小血管、細胞のイメージング、ならびに生体内分布の解明に使用できることが証明されている。ゲルコーティングした光ファイバーはセンサーの文献中できわめて良く知られている。SACNをこのゲルに非共有結合により結合させると、導入した際に関連組織内に拡散させることができる。ファイバーを接触させる液相中へSACNが拡散するようにファイバーの外面にSACNを固定化するための多様な他の方法を考慮できる。
【００８３】
一態様において本発明は、SACNを動物に導入することを含む、動物をSACNで標識する方法を提供する。SACNを動物にいずれか適切な手段で、たとえば皮下埋込みにより、または静脈内へ導入し、適切な装置で検出することができる（１５を参照）。本発明は、動物の同定のために皮下に埋め込んだSACNを利用した、動物、たとえば家畜またはペットの同定システムおよび関連方法をも提供する。
【００８４】
以上の記述は本発明の説明にすぎないことを留意すべきである。当業者は本発明から逸脱することなく多様な変更および改変を考案できる。したがって本発明は、開示した本発明の範囲に含まれるそのような変更、改変および変形をすべて包含するものとする。
【００８５】
補足のために、本発明の種々の態様を下記の各番号の項目に示す：
１．下記を含む方法：
a）そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；
b）前記鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、第１材料および第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学的プロセスを伴い；
c）工程a）を繰り返し；そして
d）第２材料および鋳型をポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、少なくとも2つの遊離した金属ナノ粒子を生成させる。
【００８６】
２．  遊離した金属ナノ粒子が10〜300 nmの長さおよび15〜300の幅を有する、項目１の方法。
３．さらに、工程b）およびc）を繰り返すことを含む、項目１の方法。
【００８７】
４．鋳型がアルミナである、項目１の方法。
５．第２材料が金属である、項目１の方法。
６．第２材料がAgである、項目５の方法。
【００８８】
７．金属がAuである、項目１の方法。
８．第２材料がAgである、項目４の方法。
９．鋳型がアルミナである、項目８の方法。
【００８９】
１０．離脱が、強酸による処理、続いて強塩基による処理を含む、項目１の方法。
１１．強酸が硝酸であり、強塩基がNaOHである、項目１０の方法。
１２．電気的な沈着が、パルスめっき、パルス電流めっき、逆パルス電流めっき、および二重パルスめっきよりなる群から選択される、項目１の方法。
【００９０】
１３．さらに、工程c）に際して短かいSAM分子を供給することを含む、項目１の方法。
１４．離脱が、SERS活性分子を供給する溶液の使用を含む、項目１の方法。
１５．下記を含む方法：
a）そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に金属を沈着させ；
b）鋳型のポア内に第２材料を沈着させ、その際、第１材料および第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学的プロセスを伴い；
c）工程a）を繰り返し；そして
d）第２材料および鋳型をポア結合したセグメント状ナノ粒子から酸処理により離脱させて、少なくとも2つの遊離した多孔質金属ナノ粒子を生成させる。
【００９１】
１６．下記を含む方法：
a）そのポア直径が300 nm未満である鋳型のポア内に第１金属を沈着させ；
b）鋳型のポア内に第２金属を沈着させ；
c）鋳型のポア内に第３材料を沈着させ、その際、第１材料および第２材料のうち少なくとも一方の沈着は、ポア結合したセグメント状ナノ粒子を生成するファラデー電気化学的プロセスを伴い；
d）工程a）およびb）を繰り返し；そして
e）第３材料および鋳型をポア結合したセグメント状ナノ粒子から離脱させて、それぞれが第１金属および第２金属を含む少なくとも2つの遊離した金属ナノ粒子を生成させる。
【００９２】
１７．項目１６の方法。
１８．第２金属が磁性である、項目１６の方法。
１９．下記を含む方法：
最適化SACNを製造し、この最適化SACNは、SACNの製造過程で粒子表面に不可逆的に結合した物質を除去し、その際、そのスペクトルのバックグラウンドシグナルを最適化していない対応するSACNにより発生するスペクトルと比較して低下させることにより製造される。
【００９３】
２０．離脱が下記の工程を含む、項目１９の方法：
a）酸化および
b）還元。
【００９４】
２１．酸化が、SACNをUV生成したオゾン／酸素ラジカルと接触させることを含む、項目２０の方法。
２２．還元が、SACNをエタノールと接触させることを含む、項目２０の方法。
【００９５】
２３．レポーターの溶液がエタノール中のものであり、したがって還元に際して直ちにレポーターを吸着させることができる、項目２２の方法。他の態様においては、エタノールを遠心分離により除去し、後続工程でレポーターを添加する。
【００９６】
２４．下記を含む方法：
SACN粒子を用いるアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを低下させ、この低下が、分析すべき試料、SACN粒子およびアッセイ容器よりなる群から選択される構成要素から不純物を除去することを含む。
【００９７】
２５．下記を含む方法：
a）それぞれ異なるラマンレポーターを含む複数のSACN粒子を製造し；
b）それらのラマンレポーターの強度比を測定し；そして
c）最低強度をもつレポーターのものに正規化したレポーター強度をもつ第２の複数のSACN粒子を製造し、
これによりラマンスペクトルにおいて実質的に等しいピーク強度をもつ複数のSACNを製造する。
【００９８】
２６．レポーター量を減少させたSACNを製造することによりレポーターの強度を正規化し、その際、減少量は最低強度のレポーターの強度に対するそのレポーターの強度の比の逆数により決定される、項目２５の方法。
【００９９】
２７．シランの量を増加させたSACNを製造することによりレポーターの強度を正規化し、その際、増加量は最低強度のレポーターの強度に対するそのレポーターの強度の比の逆数により決定される、項目２５の方法。
【０１００】
２８．ナノ粒子コア、ラマン活性レポーター分子、SiO2封入剤、ならびに-SH基、-NH2基および-COO-基よりなる群から選択される反応性基を含む、SACN。
２９．下記を含む方法：
a）ナノ粒子を用意し；
b）ラマン活性レポーター分子をナノ粒子と会合させ；
c）ナノ粒子をSiO2で封入し；そして
d）-SH基、-NH2基および-COO-基よりなる群から選択される反応性基を保有するようにSiO2を修飾し、
これにより活性化SACNを製造する。
【０１０１】
３０．修飾が封入工程中の修飾を含む、項目２９の方法。
３１．修飾が封入工程後の修飾を含む、項目２９の方法。
３２．修飾がアミンを存在させる修飾を含む、項目２９の方法。
【０１０２】
３３．修飾がアミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）またはエトキシド（3-グリシジルオキシプロピル-トリメトキシシラン(GPTMS））との反応により達成される、項目３２の方法。
【０１０３】
３４．さらに、活性化SACNに生体分子を結合させ、これによりバイオコンジュゲートSACNを製造することを含む、項目２９の方法。
３５．生体分子が、タンパク質および核酸よりなる群から選択される、項目３４の方法。
【０１０４】
３６．結合が、活性化SACNと生体分子を、ヘテロ二官能性架橋剤4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル、無水コハク酸、カルボジイミド、ホモ二官能性リンカー、グルタルアルデヒド、2-イミノチオラン、およびこれらのうちいずれかの組合わせよりなる群から選択される化合物により反応させることを含む、項目３４の方法。
【０１０５】
３７．さらに、バイオコンジュゲートSACNを精製することを含む、項目３４の方法。
３８．精製が、遠心分離および接線流濾過よりなる群から選択される、項目３７の方法。
【０１０６】
３９．さらに、スペーサー分子をバイオコンジュゲートSACNに結合させることを含み、その際、スペーサー分子がナノ粒子と生体分子の間にある、項目３４の方法。
４０．スペーサー分子が、ポリエチレングリコールおよびデキストランよりなる群から選択される、項目３９の方法。
【０１０７】
４１．下記のものを含む、バイオコンジュゲートSACN：
a）ナノ粒子；
b）該ナノ粒子に会合したラマン活性レポーター分子；
c）SiO2封入剤；ならびに
d）タンパク質および核酸よりなる群から選択される生体分子。
【０１０８】
４２．タンパク質が抗体である、項目４１のバイオコンジュゲートSACN。
４３．さらに、ナノ粒子と生体分子の間にスペーサー分子を含む、項目４１のバイオコンジュゲートSACN。
【０１０９】
４４．スペーサー分子がポリエチレングリコールおよびデキストランよりなる群から選択される、項目４３のバイオコンジュゲートSACN。
４５．下記を含む、被分析体の検出方法：
a）生物試料を入手し；そして
b）被分析体に結合する生体分子を含むバイオコンジュゲートSACNと試料を接触させ；そして
c）バイオコンジュゲートSACNに結合した被分析体を検出する。
【０１１０】
４６．生体分子が抗原であり、被分析体が抗体である、項目４５の方法。
４７．生体分子および被分析体がペプチドまたはタンパク質である、項目４５の方法。
４８．生体分子と被分析体が、ホルモンと受容体から独立して選択される、項目４５の方法。
【０１１１】
４９．生体分子と被分析体が、ビオチンとアビジンから独立して選択される、項目４５の方法。
５０．生体分子と被分析体が、炭水化物とレクチンから独立して選択される、項目４５の方法。
【０１１２】
５１．生体分子と被分析体が、エフェクターと受容体分子から独立して選択される、項目４５の方法。
５２．生体分子と被分析体が、酵素と、補因子、基質およびインヒビターよりなる群から選択されるグループのメンバーとから独立して選択される、項目４５の方法。
【０１１３】
５３．生体分子と被分析体が相補的ヌクレオチド配列である、項目４５の方法。
５４．試料が、血液、血清、唾液、喀痰、涙液、汗、他の分泌液；尿、糞便；脳脊髄液、間質液、細胞抽出物、および細胞よりなる群から選択される、項目４５の方法。
【０１１４】
５５．下記を含む方法：
a）被分析体を含有する疑いのある試料を、被分析体に対する少なくとも１種類の特異的結合パートナーと側方流動アッセイ表面で接触させて、試料中の被分析体に結合させ；
b）工程a）の前、それと同時または後に、少なくとも１種類の被分析体結合パートナーをSACNと結合させ；そして
c）SERSシグナルを検出することによりシグナルの強度または存在によって試料中の被分析体の存在を判定し、これにより試料中に少なくとも１種類の被分析体が存在すると判定する。
【０１１５】
５６．下記を含む方法：
a）CCDカメラに接続した顕微鏡を用意し；
b）細胞を用意し；
c）細胞を、該細胞または該細胞の一部に特異的に結合しうる少なくとも１種類のSACNと接触させ；
d）細胞とカメラの間に波数フィルター装置を配置し；
e）複数のデータセットを取得し；そして
f）これらのデータセットを組み立て；
これによりSACNの空間プロフィールを取得する。
【０１１６】
５７．波数フィルター装置が、モノクロメーター、ノッチフィルター、フィルターホイール、音響光学可変フィルター、フーリエ変換干渉フィルター、液晶可変フィルター、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される、項目５６の方法。
【０１１７】
５８．波数フィルター装置が液晶可変フィルターを含み、取得が
a）第１周波数でデータを取得し；そして
b）場合により第２周波数および後続周波数でデータを取得する
ことを含む、項目５６の方法。
【０１１８】
５９．取得が
a）モノクロメーターを通る位置の一点からの光を分散させ；
b）アレイ検出器でその点における完全ラマンスペクトルを取得し；そして
c）a）およびb）を複数の位置で繰り返す
ことを含む、項目５６の方法。
【０１１９】
６０．取得が
a）試料を１本の放射線で励起し；
b）その放射線の各空間ピクセルの完全スペクトルを取得し；そして
c）試料をその放射線で走査する
ことを含む、項目５６の方法。
【０１２０】
６１．下記のものを含むナノ粒子：
a）金属ナノ粒子；
b）このナノ粒子と会合した１種類より多いラマン活性レポーター分子；および
c）SiO2封入剤。
【０１２１】
６２．１種類より多いラマン活性レポーター分子が4-メルカプトピリジンおよびトランス-4,4'-ビス(ピリジル)エチレンを含む、項目６１のナノ粒子。
６３．下記のものを含むナノ粒子：
a）コア／シェル型ナノ粒子；
b）このコア／シェル型ナノ粒子と会合した少なくとも１種類のラマン活性レポーター分子；および
c）SiO2封入剤。
【０１２２】
６４．さらにコア／シェル型ナノ粒子が、Au2Sコア／Auシェル粒子、Agコア／Auシェル粒子、シリカコア／Auシェル粒子、シリカコア／Agシェル粒子、アルミナコア／Auシェル粒子、アルミナコア／Agシェル粒子、TiO2コア／Auシェル粒子、およびTiO2コア／Agシェル粒子よりなる群から選択される、項目６３のナノ粒子。
【０１２３】
６５．下記を含む方法：
a）HAuCl4を塩酸ヒドロキシルアミンと接触させ；
b）さらに、工程a）から得られた溶液をクエン酸ナトリウム無水物およびNaBH4の混合物と接触させ；
これにより金ナノ粒子を製造する。
【０１２４】
６６．下記を含む方法：
a）項目６５の方法で製造した金ナノ粒子を用意し；
b）ラマン活性レポーター分子をこのナノ粒子と会合させ；そして
c）ナノ粒子をSiO2で封入し；
これによりSACNを製造する。
【０１２５】
６７．下記のものを含むナノ粒子：
a）異方性金属ナノ粒子；
b）この異方性金属ナノ粒子と会合したSERS活性レポーター分子；
c）異方性金属ナノ粒子を封入したSiO2。
【０１２６】
６８．異方性金属ナノ粒子が、回転楕円体、ロッド、円盤、角錐、立方体、円筒、ナノヘリックス、ナノスプリング、ナノリング、棒状ナノ粒子、矢状ナノ粒子、涙滴状ナノ粒子、テトラポッド状ナノ粒子、プリズム状、多孔質、および非幾何学的形状のナノ粒子よりなる群から選択される形状を有する、項目６７のナノ粒子。
【０１２７】
６９．  ナノ粒子が非幾何学的形状であり、ナノロッドに近似する、項目６８のナノ粒子。
７０．  ナノ粒子が約250 nmの直径および約250 nmの長さを有する、項目６９のナノ粒子。
【０１２８】
７１．下記を含む方法：
a）SACNナノ粒子であるイメージング剤を患者に投与し；
b）スペクトルイメージングを実施できるシステムを用いて患者を走査し；そして
c）患者の内部領域のスペクトルまたは画像を作成する。
【０１２９】
７２．システムが、点走査型共焦点顕微鏡、線走査システム、光干渉断層撮影システム、単一波長バンドのみを検出するシステム、励起光源およびフィルター画像検出を含む蛍光イメージングシステムよりなる群から選択される、項目７１の方法。
【０１３０】
７３．患者の領域が、患者の全身、脈管系、心臓、肝臓、および脾臓、消化器領域よりなる群から選択される、項目７１の方法。
７４．スペクトルイメージングを実施しうるシステムが携帯型システムである、項目７１の方法。
【０１３１】
７５．下記を含む方法：
a）異常な病理に関連する分子を標的とする複数のSACNを、その異常な病理を伴う患者に導入し、その際、異常な病理に関連する分子にSACNが会合し；そして
b）会合したSACNの画像を得て；
これにより異常な病理を診断することができる。
【０１３２】
７６．異常な病理の位置が消化管、心臓、肺、肝臓、頚部、胸部、および大腸を含む、項目７５の方法。
７７．SACNがイメージングプローブと非共有結合により会合し、投与がイメージングプローブの導入を含み、SACNが組織または体液中へ解離する、項目７１の方法。
【０１３３】
７８．動物をSACNで標識する方法であって、SACNを動物に導入し、その際、導入が皮下埋込み、静脈内導入よりなる群から選択される方法。
７９．  さらに、SACNまたは標識動物を検出することを含む、項目７８の方法。
【０１３４】
８０．下記を含む方法：
（a）組織試料を、該組織試料に特異的に結合しうる少なくとも１種類の生体分子コンジュゲートSACN粒子と接触させ；そして
（b）組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子混合物のラマン画像を取得する。
【０１３５】
８１．組織を１又はそれを越える追加の非SACN試薬と接触させる、項目８０の方法。
８２．追加試薬が、エオシン、ヘマトキシリン、およびヘマトキシリンとエオシンの組合わせよりなる群から選択される、項目８１の方法。
【０１３６】
８３．さらに下記を含む、項目８０の方法：
a）項目８０の工程（a）の前に、組織試料のバックグラウンドラマン画像を取得し；そして
b）このバックグラウンドスペクトルを、項目８０の工程（b）で取得した組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子混合物のラマン画像から差し引く。
【０１３７】
８４．組織を１又はそれを越える追加の非SACN試薬と接触させる、項目８３の方法。
８５．追加試薬が、エオシン、ヘマトキシリン、およびヘマトキシリンとエオシンの組合わせよりなる群から選択される、項目８３の方法。
【０１３８】
８６．さらに、ラマン画像を、細胞のサイズおよび形状を可視化するために濃色有機色素で染色した組織試料の画像と比較することを含む、項目８０の方法。
【実施例１】
【０１３９】
水素化ホウ素ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび塩酸ヒドロキシルアミンの組合わせを用いた、直径〜45 nmのAuコロイドの代表的な合成法を記載する。すべてのガラス器具を王水で洗浄し、18 MΩの水で厳密にすすぐ。反応を低温室で実施する。水中の0.01 % (w/w) HAuCl4・3H2O溶液、0.01 N NaOH中の8% (w/w)クエン酸ナトリウム2水和物溶液、0.01 N NaOH中の10-4 %水素化ホウ素ナトリウム溶液、および水中の400 mM塩酸ヒドロキシルアミン溶液を調製する。次いで、1 mLのクエン酸ナトリウム溶液を100μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液および500μLの0.01 N NaOHと混和することにより、クエン酸塩溶液と水素化ホウ素溶液の混合物を調製する。この混合物を調製した後、250 mLのエルレンマイヤーフラスコ内で200μLのヒドロキシルアミン溶液を100 mLのHAuCl4溶液に注入し、短時間撹拌する。20分後、水素化ホウ素／クエン酸塩混合物を、急速撹拌しているHAuCl4およびヒドロキシルアミンの溶液に注入する。混合物を撹拌渦の中心とフラスコ壁の間に注入した場合、最良の結果が得られる。
【実施例２】
【０１４０】
金ナノ粒子の製造。H2O中1%または2%濃度(w/v)でHauCl4・3H2O原液を調製する。これらの溶液を0 2μmの膜により濾過した後、低温室に入れる。また、露光を少なくするために、これらの液を入れたボトルを一般にアルミニウム箔で覆う。一般に下記の溶液を調製する：
1．H2O中の0.02% HauCl4  1.0 L
2．0.01 N NaOH中の32% (w/v)クエン酸ナトリウム無水物  5 mL
3．H2O中の1.6 M塩酸ヒドロキシルアミン  10 mL
4．1.0 N NaOH中の4% (w/v)NaBH4  10 mL（原液の希釈により調製）。
【０１４１】
溶液が室温に達した後、すべての反応を低温室で実施する。HauCl4溶液を2Lの丸底フラスコに入れ、撹拌を行うためにテフロン櫂付きガラス撹拌棒をフラスコに挿入する。1.0 mLのヒドロキシルアミン溶液をフラスコに添加し、撹拌する。ヒドロキシルアミンの添加直後に、4%原液の連続希釈により4×10-4% NaBH4溶液を調製する。これらの希釈を0.01 N NaOH中で行う。次いで1 mLの32%クエン酸ナトリウムを525μLの0.01 N NaOHおよび75μLの4×10-4 % NaBH4と混合する。ヒドロキシルアミン添加の20分後、1.0 mLのクエン酸塩／水素化ホウ素混合物を反応フラスコに激しく撹拌しながら添加する。
【実施例３】
【０１４２】
4-メルカプトピリジン(4-MP)およびトランス-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)の両方でタグ付けしたSACNのSERSスペクトル
材料：すべての調製に用いた水は、Barnstead nanopureシステムにより蒸留した18.2 MΩのものであった。3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS)、HAuCl4・3H2O、クエン酸三ナトリウム2水和物、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩酸ヒドロキシルアミン、トランス-1,2-ビス(4-ピリジル)エチレン(BPE)、4-メルカプトピリジン、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)、エチルアルコール、およびエタノール中の2 0 Mアンモニアを、Sigma-Aldrichから入手した。BPEを使用前に再結晶した。
【０１４３】
コロイドの調製：35 nmのコロイドAuをHAuCl4・3H2Oから製造した。4%クエン酸ナトリウム水溶液および400 mM塩酸ヒドロキシルアミン水溶液を合成直前に調製し、同様に0.001 N NaOH中の10-2 %水素化ホウ素ナトリウム溶液を調製した。この水素化ホウ素溶液の300μL部分を500μLのクエン酸塩および350μLのヒドロキシルアミンと混合し、直ちに200 mLの0.01 % HAuCl4に激しく撹拌しながら注入した。得られた粒子のサイズを透過型電子顕微鏡検査によりImageJソフトウェアを用いて測定した。
【０１４４】
SACNの製造：すべての反応をプラスチックフラスコ内で実施した。代表的な実験には35-nmのコロイド30 mlを用いた。40μLの1.0 mM APTMSを添加して15分間撹拌することにより、このコロイドをガラス親和性（vitreophilic）にした。ラマン標識混合物（600μLの10-5M 4-メルカプトピリジンおよび50μLの10-5 M BPE）を溶液に添加し、次いでこれをさらに15分間撹拌した。最後に1.2 mLの0.54 %ケイ酸ナトリウムを添加し、42時間反応させた。次いで溶液に120 mLのEtOHを添加し、続いて1 mLの2 Mアンモニア（エタノール中）および20μLのオルトケイ酸テトラエチル(TEOS)を添加した。この反応を１日間進行させた後、遠心分離により精製した。より薄いシェルまたは厚いシェルを得たい場合、このTEOS量を変更した。
【０１４５】
得られたSACNは、2種類の異なるラマン活性分子種4-MPとBPEの比率12:1の混合物を含有していた。633 nmの励起（トレースA）および785 nmの励起（トレースB）により得たこれらの4-MP/BPE-SACNのSERSスペクトルを図６にプロットする。比較のために、BPE-SACN（点線）および4-MP-SACN（実線）の特徴的なラマンスペクトルを図７にプロットする。785 nmの励起を用いて得た4-MP/BPE-SACNのスペクトルでは4-MPラマンシグナルの特徴が優勢であり、一方633 nmの励起を用いて得たスペクトルではBPEおよび4-MP両方のラマンシグナルの特徴が顕著であることが分かる。このように、2種類以上の異なるラマン活性分子種およびそれらの相対比率を慎重に選択することにより、励起波長に応じて異なるラマン散乱スペクトルを示すSACNを製造できる。これにより、さらに高いレベルの多重化能を得ることができる。
【実施例４】
【０１４６】
チオール活性SACNの製造
A．シリカの修飾：SiO2シェルの作成途中で（“直接修飾”）、またはシェルが完全に形成された後に（“後修飾”）、SACNのシリカシェルを官能化して、遊離スルフヒドリル基を保有させることができる。
【０１４７】
B．後修飾：標準プロトコルに従って、50 mLバッチのSACNを製造する。シリカ成長の全工程を行い、ただし最終遠心分離の後、わずか10 mLとなるようにSACNを水に再懸濁すべきである。損失を無視できると仮定すると、これにより元のコロイドから5倍濃度のSACNが残る。このSACNに40 mLのエタノールを添加する。適度の磁気撹拌下で、1 mLの濃NH4OH（30%, J.T. Baker #9733-01）を添加する。これを撹拌しながら、エタノール900μL、オルトケイ酸テトラエチル（TEOS, Sigma #333859）95μL、および(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン（MPTMS, Fluka #63800）5μLの溶液を調製する。この混合物100μL（有効量：9.5μLのTEOSおよび0.5μLのMPTMS）を撹拌SACNに添加し、一夜、反応を進行させる。遠心分離を繰り返すことにより精製する。エタノールおよび過剰の試薬を確実に完全に除去するために、遠心および水中へのペレットの再懸濁を最低3回行う。最終遠心の後、5 mL（10倍）となるように再懸濁する。
【０１４８】
C．直接修飾：この場合も、一般的条件を用いて最初に50 mLバッチのSACNを製造する。唯一の違いは、Stoeber成長工程にある。前記のように、1 mLの濃NH4OHを添加し、5分間撹拌する。次いで47.5μLのTEOSを2.5μLのMPTMSと混合し、これらをタグに添加する。一夜撹拌し、遠心分離により精製し、精製したタグを5 mL（10倍）となるように再懸濁する。
【実施例５】
【０１４９】
SACNのバイオコンジュゲーション
チオール活性化SACNと生体分子を、ヘテロ二官能性架橋剤4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ-SMCC、Pierce Biotechnology, Inc）により結合させる。この分子は、スルフヒドリル類に対して反応性であるマレイミド基および第一級アミンと優先的に反応するスルホ-NHSエステルの両方を含有する。この場合、簡単なワンポット反応を用いてストレプトアビジンを結合させることができ、大部分のタンパク質および第一級アミンをもつ他の分子の結合に容易に適合させる。
【０１５０】
コンジュゲーションの前にタグを濃縮することができる。前記のチオール活性化タグにコンジュゲートさせるためには、まず0.25 mgのストレプトアビジンを5 mLの2 mM PBS緩衝液（0.54 mM KCl, 27.6 mM NaCl, pH = 7.4）に添加する。チオール活性化タグ（5 mL, 10倍濃度）を添加し、十分に混合する。次いで1 mgのスルホ-SMCCを秤量し、それをタグおよびストレプトアビジンに添加する。直ちにボルテックスにより混合し、室温で回転させながら１時間反応させる。１時間後、タグを遠心分離により精製し、2 mM PBS緩衝液に再懸濁する。少量（最終濃度0.1 %）のBSAを添加して、遠心管壁への粒子の粘着を最小限に抑えることができる。この反応にはストレプトアビジンを用いているが、他のタンパク質（抗体を含めて）も同様な方法でコンジュゲートされた。反応をより制御する必要がある場合、タグに添加する前にタンパク質を“予備活性化”することができる。スルホ-SMCCのマレイミド基は水溶液中でかなり安定である（〜60時間）ので、生体分子をスルホ-SMCCと30〜120分間反応させることにより活性化し、続いて脱塩カラムで精製することができる。これによって本質的にマレイミド活性化した生体分子が作成され、これをそのままスルフヒドリル保有SACNに添加することができる。
【０１５１】
アビジンの代わりの類似体（ストレプトアビジンおよびNeutrAvidin(商標)）、および蛍光ビオシチンAlexa Fluor(登録商標)594（Molecular Probes # A 12922;“ビオシチン-594”）を用いて、SACNに結合した生体分子の数を定量できる。SACNの可視領域吸収が強いので、ストレプトアビジンの定量に一般的な比色法（ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼの使用を含む）を用いるのではなく、この高感度蛍光検出を利用することを勧める。この赤励起色素は、測定を妨害する可能性のある吸収をコロイド粒子がほとんど示さない領域において有用である。すべての蛍光測定をFluorolog-3（Jobin Yvon-Spexから）により行った。
【０１５２】
高吸収性SACNが蛍光測定値に影響を与えるかもしれないという懸念を軽減するために、2つの異なる形式で実験を行った。第１は最も直接的なものである；生体官能化粒子をビオシチン-594と共に一定時間（普通は2時間、光退色を避けるために遮光して）インキュベートした。次いで遠心分離を繰り返すことにより（色素量を慎重に調節すれば2回で十分）タグを精製し、それらの蛍光を測定する。
【０１５３】
タグからの直接蛍光測定値を得ることの逆は、タグに結合していない蛍光分子の量を測定することである。この場合も、慎重に選択した量の色素と共にタグをインキュベートし、１回だけ遠心分離する。上清を慎重に採集し、蛍光を測定する。次いでこの値を既知の元の色素濃度から差し引くことにより、粒子に結合した色素の量を判定することができる。注意すべき重要な１つの事項は、ビオシチンAlexa Fluor(登録商標)594は普通の遠心管の壁に速やかに吸着するので非粘着性のマイクロ遠心管（Corning Costar）を用いたことである。粒子がアビジン類似体の代わりに抗体にコンジュゲートしている場合、蛍光標識した二次抗体を用いて同様なプロトコルを採用できる。
【０１５４】
これらの定量法を用いて、他の反応性分子の添加により、タグにコンジュゲートする特定の生体分子の量を制御しうることが示された。図８に、種々の比率のNeutrAvidin（商標）およびウシ血清アルブミン（BSA）とコンジュゲートしたナノ粒子に結合したビオチン分子の数を示す。コンジュゲーション条件はすべての反応において等しく、生体分子の比率が唯一の変数であった。
【０１５５】
予想どおり、BSA量が多いほど結合ビオチンのレベルは低くなる。各NeutrAvidin（商標）（NAv）は2個のビオチンを結合できると仮定すると（粒子に結合することにより、4つの結合部位のうち若干量が遮断される可能性がある）、最高300〜400個のNeutrAvidin（商標）分子が各タグに結合する。しかし、純BSAにコンジュゲートした粒子を測定すると、計算では各ナノ粒子に10個未満のビオシチン-594分子が結合していることが示される。これは、粒子へのBSA（一般的な遮断試薬）のコンジュゲーションにより予想されるとおり非特異的結合のレベルがきわめて低いことと一致する。
【実施例６】
【０１５６】
非特異的結合特性
特性解明の第１工程として、ストレプトアビジンコーティングしたSACNがビオチン化BSAを特異的に結合するかを判定する簡単な実験を考案した。ポリスチレン製マイクロウェルプレートの8つのウェルをPBS中の0.5%溶液と共に30分間インキュベートすることにより、ビオチン化BSAまたはBSAでコーティングした。次いですべてのウェルをPBSで１分間、4回洗浄し、次いで1 mMのEDTA、0.1 %のBSAおよび0.01 %のZwittergent 3-08を含有するPBS緩衝液で30分間、遮断処理した。遮断液を各ウェルから吸引した後、20μLの試料および20μLのPBSを添加し、2時間インキュベートした。試料は、neutravidin（NAv）コーティングSACN、ストレプトアビジン（SAv）コーティングSACN、チオール修飾（ただしコンジュゲートしていない）SACN、およびシリカコーティングを官能化していない対照タグを含む。ウェルを遮断用緩衝液で15分間、続いてPBS（3回、5分間）および水（3回、1分間）で洗浄した。それらを乾燥させ、マイクロウェルプレートリーダーを用いて490 nmでの吸光度を測定することにより、結合したタグの量を定量した（データを示していない）。処理していないウェルの平均吸光度に基づいて、数値からバックグラウンドを差し引いた。NAvおよびSAvタグはビオチンコーティングしたウェルに高い特異性で結合し、BSAコーティングウェルへの非特異的結合をほとんど示さなかった。しかし、チオールコーティングしたタグおよび標準シリカコーティングしたタグは、すべてのウェルに低レベルの結合を示した。後続実験で、少量のBSAを粒子に添加し、遠心分離し、PBSに再懸濁して粒子を遮断処理することにより、この現象を避けうることが示された。SAvおよびNAvコンジュゲートしたタグがビオチンに特異的であると判定した後、各タグに存在するビオチン結合部位の数を2方法で測定した。蛍光ビオチン類似体であるビオシチンAlexa Fluor(登録商標)594をSACNと反応させた。適宜な洗浄工程の後、結合したフルオロフォアの数を直接測定法および蛍光減損法（fluorescence depletion）により判定した。これらの2方法で得た数値は一致した（図１２）が、直接蛍光測定の方が常に低い数値を示した。結合ビオチンの平均数は、最適反応条件下で、ナノ粒子当たり約700であった。
【実施例７】
【０１５７】
オリゴヌクレオチドのコンジュゲーション
前記と同じスルホ-SMCC化学を用いて、アミンを末端とするオリゴヌクレオチドをチオール修飾SACNに結合させた。結合および精製の後、色素標識した相補鎖をこれらの修飾粒子と共にインキュベートした。蛍光プローブの定量（遠心分離して未結合プローブを除去した後）により、各ナノ粒子に約15のオリゴヌクレオチドが結合したことが示された。オリゴヌクレオチドをNAvタグに直接結合させた。その際オリゴヌクレオチドは、タグへの結合のためのビオチン基を一端にもち、コンジュゲーションを効率的に直接測定しうるフルオロフォアを他端に備えていた。これによってナノ粒子に約15のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたものも産生された。前記と同じスルホ-SMCC化学を用いて、アミン修飾SACNをチオール末端基付き蛍光性オリゴヌクレオチドに結合させ、この場合も同様な結果を得た。
【実施例８】
【０１５８】
定量用光学タグに望まれる2つの特性は、それらが励起源に直線的に応答すること、および励起への長期暴露により比較的影響を受けないことである。第１の性質は、SACNについて、試料を種々の量の励起電力に暴露して得られたシグナルを測定することにより証明された。これらの結果を図９に示す。
【０１５９】
光安定性を証明するために、SACN試料を石英スライドに沈着させ、ラマン分光計の試料ホルダーに配置した。この実験について、分光計は647.1 nmで60 mWの電力を送達した。放射光を50×0.8 NAの顕微鏡対物レンズで集め、レイリー散乱を排除するためにホログラフィーノッチフィルターを通過させ、0.5 mのモノクロメーター内へ集束させ、液体窒素で冷却したCCDにより検出した。スペクトルを１時間毎に約6時間収集し、その間、試料を連続照射した。図１０に、試料からのシグナルを時間の関数としてプロットする。このデータは、これらの粒子がきわめて安定であり、6時間でシグナル損失がわずか20%であったことを示す。
【０１６０】
SACNの熱安定性も望まれる。これを証明するために、2バッチの1.5×BPE SACN（35 mL中）を１時間煮沸した。タグは50 mLから35 mLに濃縮されて約1.5倍濃度になった。煮沸の前と後に、UV-VisおよびSERSスペクトルを記録した。煮沸の前と後の吸光度およびSERSのわずかな相異は、大部分がわずかな濃度差によるものである。SACNは本質的に煮沸により影響を受けない。
【実施例９】
【０１６１】
バッチ間再現性の証拠
プロセスの最初から最後までのタグ製造の再現性を証明するために、合計6種類のコロイドを製造し、B〜Gと表示した。これらのコロイドを用い、各バッチについて同じプロトコルにより、合計13の異なるバッチのタグを調製した。これらのコロイドの（正規化）吸収スペクトルを図１１に示す。すべての工程を完了した後、それらはきわめて類似することが明らかである。
【０１６２】
各溶液の光学濃度を1.0に平衡化することにより濃度を正規化した後、785 nm 励起によりSERS応答を測定した。主ピーク（〜1200 cm-1）においてSERSシグナルをモニターした（示していない）。すべての試料を用いると、このグループのRSDは12.5%である。
有意の異常値１例を除くと、残り12の試料は7.5%のRSDを示す。
【実施例１０】
【０１６３】
A．直径18〜90 nmの異方性ナノロッドの製造
異なるポアサイズ（18〜90 nm）の市販の鋳型を異方性Auナノロッドの電着に用いた。厚さ約１μmの蒸着Agをめっき支持体として使用した。電着の直前に、鋳型を電気化学セル内へ組み込み、ポアを確実に適正に湿潤させるために真空下で１時間、Agめっき液に浸漬し、続いてポア内へ厚さ１μmの新鮮なAgを電着した。次いでAuとAgの交互ストライプからなるナノワイヤの電着を行った。市販のめっき液を用いた：Cyless Silver（Technic, Inc.）およびMicrofab Au 100（亜硫酸塩系のAu溶液、Enthone-OMI, Inc.から）。Auナノロッドの目的アスペクト比によりAuセグメントの長さを決定した；Agセグメントの長さは10〜200 nmであってよい；ポア当たりのストライプの総数は、目的とするAuナノロッド/ml（溶液）の最終（鋳型から離脱させた後）濃度により決定された。
【０１６４】
鋳型のポア直径に応じて、異なるめっき法を用いた。65〜90 nmのポア直径については、Nanobarcodes粒子用の半自動合成装置を定電流モードで使用した。１つの鋳型に59のストライプ（各ストライプは30 nmの長さ）を含むAuAgナノワイヤのめっきを逐次めっきすると、Agを除去した後、鋳型当たり3×l011のAuナノロッドが立証された。
【０１６５】
まずAg（支持体およびAgストライプ）を硝酸中で溶解し、続いてNaOH中で鋳型を溶解する、離型プロトコルを開発した。離型したAuナノロッドの凝集を阻止するために、鋳型の溶解に際してNaOHに短かいSAM分子（self-assembled monolayer、自己組織化単分子膜）を添加した。短かいチオール含有分子の例はメルカプトエタノール（ME）、メルカプトプロピオン酸（MPA）およびメルカプトエタンスルホン酸（MESA）である。これらの短分子をのちにラマンレポーター分子で置換した。より良い結果が得られた別法は、鋳型の溶解に際してNaOHにラマンレポーター分子を直接導入するものであった。4-メルカプトフェノール（MP）および2-キノリンチオール（QSH）の使用が有効であり、Auナノロッドについてラマンシグナルを示した。図１２は、QSH中で離型した65×30 nmおよび90×30 nmのAu粒子のラマンスペクトル示す。図１３は、MP中で離型した65×30 nmおよび90×30 nmのAu粒子のラマンスペクトル示す。
【０１６６】
定電流モードの電着は、ポア直径35 nm以下の鋳型には有効でなかった。種々のパルスめっき法（パルス電流、逆パルス電流および二重パルス）を使用できる。サブミクロン領域の穴直径をもつポリカーボネート製鋳型を用い、超音波撹拌を伴う逆電流電着を適用して、Au単結晶をシアン化物溶液から成長させるのに成功した。しかし、亜硫酸金溶液からは多様な逆パルス条件下で多結晶Auが沈着した：Dobrev, D; Vetter, J.; Angert, N.; Neumann, R.; Electrochimica Acta 2000, 45, 3117-3125。亜硫酸金溶液からのパルス定電位沈着はフォトレジストパターン形成構造体上への金属分布を改善するが、Auフィルムの特性（応力、純度、抵抗）には強い影響を及ぼさないことが以前に示されており、これは亜硫酸塩溶液中におけるAu/Au(I)対の不可逆性により説明された：Horkans, J.; Romankiw, L.T.; J. Electrochem. Soc. 1977, 124, 1499-1505。
【０１６７】
低速でのAuおよびAgストライプの成長を確実にするために、平均めっき電流が若干低くなるように（0.25〜1 mA/cm2）、パルスパラメーター（パルス電流、周波数およびデューティーサイクル）を変更した。下記のパルスめっき条件下で効果的なめっきが達成された：パルス電流2 mA/cm2、周波数範囲0.025〜2.5 Hz、およびデューティーサイクル0.1〜0.3。１実験内で同じパルス条件をAuおよびAgストライプの両方に用いた。多重チャネルポテンシオスタット／ガルヴァノスタット（Princeton Applied Research）を用いた；各ストライプのめっき後、手動で溶液を交換し、続いてすすぎ、次の溶液を補充した。19の交互Au/Agストライプをめっきし、Agを除去した後、鋳型（ポア直径35 nm）当たり3×El1のAuナノロッド、および鋳型（ポア直径18 nm）当たり1×El2のAuナノロッドが立証された。鋳型の厚さは50μmであるので、パルスめっきを自動化すると粒子数をさらに一桁増加させることができる。図１４は、ME中で離型した直径35 nmのAuナノロッドのTEM画像、およびMEをQSHで置換した後のナノロッドのラマンスペクトルを示す。
【０１６８】
B．250 nm×250 nmの異方性Au粒子の製造
パートAの粒子と同様にして、250 nm×250 nmのAu粒子を製造した。ポアサイズ250 nmのアルミナ製鋳型をAuナノ粒子の電着に用いた。厚さ約１μmの蒸着Agをめっき支持体として使用した。鋳型の追加シーリングのために厚さ5μmの新鮮なAgを穴に電着し、次いでAuとAgの交互ストライプ（それぞれ長さ250 nm）からなるナノワイヤの逐次電着を行った。市販のめっき液を用いた：Cyless Silver（Technic, Inc.）およびMicrofab Au 100（Enthone-OMI, Inc.）。9つのAuとAgのストライプをそれぞれ1 mAの定電流でめっきするために、Nanobarcodes粒子用の半自動合成装置を使用した。まずAg（支持体およびAgストライプ）を硝酸中で溶解し、続いて水酸化ナトリウム中で鋳型を溶解する、離型プロトコルを開発した。離型したAuナノ粒子の凝集を阻止するために、予めエタノール（EtOH）に溶解したチオール-ラマンレポーター分子4-メルカプトフェノール（MP）を、離型に際して水酸化ナトリウムに導入した。離型工程は下記のとおりであった：
1. 12 mlの40% HNO3, 60分
2. 2mlの28mM MP/EtOH + 8mlの3M NaOH/20% EtOH/80% H2O, 30分
3. 200μlの28mM MP/EtOH + 800μlの 3M NaOH/20% EtOH/80% H2O, 30分
4. 遠心分離：4200 rpm, 2分
5. 3回のすすぎ：200μlのMP/EtOH + 800μlのEtOH/H2O (1:4)
6. 遠心分離：4200 rpm, 1分, それぞれの後
SEM/TEM試料, それぞれ10μl
7. 0.1 mlの試料：H2Oで希釈して1 mlとする, UV-vis用
8. 2回のH2Oすすぎ, 遠心分離：6200 rpm, 各10分
9. ラマンの取得。
【０１６９】
離型後のAu粒子濃度は、5×109/mlであった。これらの金粒子をエタノールに再懸濁し、300μL部分をガラスコーティングに用いた。490μLのエタノール、160μLの18M水、10μLの30%水酸化アンモニウム、および40μLの純オルトケイ酸テトラエチル（TEOS）を、上記金粒子の部分に添加した。試料を音波処理し、最低設定の渦撹拌機に乗せて45分間混合した。次いで試料を18M水中で3回すすいだ。図１５ＡおよびＢは、得られた異方性粒子のSEM画像を示す。図１６ＡおよびＢは、１個の粒子の拡大図を示す。これらの粒子のラマンスペクトルを図１７ＡおよびＢに示す。
【実施例１１】
【０１７０】
IL 7のサンドイッチイムノアッセイ
マイクロアレイスライド上に捕獲用IL-7抗体をプリントすることにより、タンパク質マイクロアレイ実験をシミュレートした。スライド上の各スポットは約500μmであり、各ガラス支持体上に6回繰り返した（Telechem, Inc.によりプリント、カリフォルニア州サニーベール）。6つのスポットを独立して処理できるように、疎水性ペンを用いてガラススライド上に液体バリヤーを施した。ペンが乾いた後、スライドを10 mMリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の5%ウシ血清アルブミン（BSA）で少なくとも60分間、遮断処理した。すべてのインキュベーション工程および洗浄工程をオービタルロッカー（orbital rocker）またはシェーカー上で実施し、新たな溶液を添加する前に溶液をピペットで吸引した。遮断処理の後、スライドを0 5% BSA/PBSで3回、それぞれ5分間（3×5）洗浄した。抗原を0 5% BSA/PBS溶液中に調製し、アレイ上で45分ないし2時間インキュベートした後、再びアレイを0 5% BSA/PBS中で洗浄した（3×5）。次いでIL-7修飾SACN（neutravidinコーティングしたSACN上にビオチン化抗体を使用）をアレイ上で90分間インキュベートした。これに続いて0 5% BSA/PBS中で洗浄し（3×5）、PBSおよび水中で速やかにすすいだ。水すすぎの直後、スライドを窒素ガスのジェットで送風乾燥した。これらのアレイからのラマンスペクトルを、ダイオードレーザー（785 nm, 200 mW）ならびにOcean Optics USB-2000分光計およびソフトウェアにより取得した。ガラスアレイ上で取得したスペクトルについて代表的な積分時間は2秒であった。幅広いガラスバックグラウンドを除くために、すべてのスペクトルからバックグラウンドを差し引いた。最適化しない場合、10〜100 pg/mlの検出限界（図１８）が達成され、これは多くの市販の酵素イムノアッセイに匹敵する。次いで、3種類の異なる被分析体（オボアルブミン(Ova)、バチルス・グロビジイ（bacillus globigii, Bg）、およびC-反応性タンパク質(CRP)）をプロテインチップの隣接スポット上で試験することにより、多重アッセイが可能なことを証明した。各抗原に対する抗体を、異なるレポーター分子をもつSACNにコンジュゲートさせて、BPE-抗Bg、QSH-抗Ova、およびBodipy-抗CRP粒子を得た。前記の抗原に対する捕獲抗体を含有するスポットのアレイをこれら3抗原全部の混合物に暴露した。適宜すすいだ後、スポットを3種類すべての検出用SACNに暴露した。次いで各スポットからラマンスペクトルを収集した。そのデータは各スポットにおいて鮮明なシグナルを示し、たとえばCRPを捕獲するように設計したスポットは強いBodipyタグシグナルを与えた。
【実施例１２】
【０１７１】
Bot toxの側方流動イムノアッセイを、Tetracore, Inc.（メリーランド州ガイザースバーグ）の側方流動カートリッジを用いて行った。この実験では、デバイスを開き、それらの比色検出試薬（検出抗体にコンジュゲートしたコロイドAuを含む）を含有するパッドを取り除き、代わりに同じ抗体（Tetracoreにより供給）にコンジュゲートしたSACNを含むコンジュゲートを装入した。前記の計測器を用いてラマンスペクトルを収集した。このデータは抗原の存在下で最小の非特異的結合および効果的なコンジュゲート捕獲を示し、非最適化検出限界はそれらの市販品と類似する。結果を図１９に示す。
【実施例１３】
【０１７２】
SACNによるSK-BR3細胞の染色
チャンバースライド上で細胞を培養した。細胞をPBSでそれぞれ１分間、3回洗浄した。細胞を3.7%ホルムアルデヒド/PBSにより室温で10分間固定し、上記と同様に洗浄した。細胞を1 % BSA/PBSにより室温で20分間、遮断処理した。細胞を1μg/mlのマウス抗-her2抗体（遮断用緩衝液で希釈）と共に室温で30分間インキュベートし、次いで上記と同様に洗浄した。次いで細胞を1μg/mlのビオチン化抗マウスIgGと共に30分間インキュベートし、上記と同様に洗浄した。細胞を50μlの2×ストレプトアビジンコンジュゲートSACNと共に室温で１時間インキュベートし、上記と同様に洗浄した。Hoechest色素（1:500希釈）を添加し、細胞を5分間インキュベートした。細胞を上記と同様に洗浄した。PBS中の90%グリセロールを用いて細胞をカバーガラスで固定し、端をマニキュア液でシールした。図２１Ａは得られた試料の明視野画像およびSERS画像を示し、SACNが細胞表面および細胞内部の特異的位置に結合したことを証明する。
【実施例１４】
【０１７３】
組織試料中のSACNの検出
濃色有機色素により染色した組織試料の存在下でSACN粒子を検出することもできる。たとえば、ヘマトキシリンとエオシン（H & E）は細胞のサイズおよび形状を可視化するために用いる標準色素である。両分子とも可視領域で蛍光を示すので、慣用される免疫組織化学的方法を同一試料に使用するのが困難または不可能である。しかし、785 nmで励起すると最小のバックグラウンドが得られ、SACNが容易に可視化される。したがって、Zymedからのマウス組織アレイを標準的な組織病理学的プロトコルに従ってH & Eで処理し、強く着色したスポットを得た。幾つかのスポットをポリリシンで処理し、次いでBPE SACNで処理した。図２１Ｂは非処理スポットおよび処理スポットからのラマンスペクトルを示し、SACNがH & E染色のバックグラウンド上に容易に見えることを示す。したがって本発明は、組織試料に特異的に結合しうる少なくとも１種類の生体分子コンジュゲートSACN粒子と組織試料を接触させ；そして組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子の混合物のラマン画像を取得することを含む方法を提供する。この組織を、１種類以上の追加の非SACN試薬、たとえばエオシン、ヘマトキシリン、およびヘマトキシリンとエオシンの組合わせと接触させる。組織試料のバックグラウンドラマン画像が得られ、これを組織／生体分子コンジュゲートSACN粒子の混合物のラマン画像から差し引くことができる。さらに、細胞のサイズおよび形状を可視化するための濃色有機色素で染色しておいた（たとえばH & E染色）組織試料の画像を含むラマン画像と、前記のラマン画像を、さらに比較してもよい。
【実施例１５】
【０１７４】
SACNによる動物のインビボ標識
SACNをヌードマウスに2方法で注射した：a）血流中に循環させるために尾注射による；およびb）皮膚下に局在させるために皮下注射による。両方の場合とも、光学プローブを皮膚の上方に保持し、皮膚下から発せられるラマンシグナルを検出する。SACNのピークはバックグラウンドより上方に見られる。携帯型検出システムは励起用の785 nmレーザーを備えたAhura Corp.製であった。光ファイバーおよび光学ヘッド（InPhotonics Inc.製）により106 mWの光線を検体に送達した。ラマン散乱光を同じ光学ヘッドにより検出した。収集した光を二色フィルターにより第２の光ファイバーへ送る；これは、50ミクロンのスリットおよび溝1200 /mmの格子（750nmにブレーズ）を備えた分光計Ocean Optics USB2000に接続している。分光計のデータをラップトップコンピューターにより収集した。
【０１７５】
a）の場合、シグナルを約45分で検出した。この時点で、プローブをマウス肝臓の上方に保持した際にシグナルが検出された；図２２。SERSタグのスペクトルは、組織蛍光とレイリー後方散乱の混合であるバックグラウンドの上方に見られる。実際のバックグラウンド測定値は、皮膚上方のプローブの位置に依存する。プローブを皮膚と接触させると、スペクトルはより多くの組織蛍光を含む可能性がある。プローブを皮膚から遠ざける（offset）と、スペクトルはより多くのレイリー後方散乱を含む可能性がある。たとえば、マウスの肝臓の位置で取得したスペクトルと側腹部で取得したスペクトルの場合、バックグラウンドが異なる。バックグラウンドが変動する可能性があるので、バックグラウンド上方のピーク高さによりタグを定量できるSACNは有利である。
【０１７６】
b）の場合、シグナルを注射直後に検出した；図２３に示す。図２３は、SACNを用いなかったマウスから得た、側腹部で取得したスペクトルも含む。タグがマウス体内へ拡散するのに伴って、経時的にシグナルが減衰するであろう。この皮下スペクトルは、若干のバックグラウンド蛍光およびレイリー散乱も含むが、SACNシグナルはバックグラウンドよりはるかに強い。
【実施例１６】
【０１７７】
多重細胞イメージング実験
細胞系LNCaP、すなわちヒト前立腺癌に由来するアンドロゲン感受性付着細胞系を使用する。LNCaP細胞は、ATCC（メリーランド州ロックビル）から入手できる。LNCaP細胞は優れた前立腺癌モデルである。前立腺癌において重要なことが知られているバイオマーカー、たとえばアルファ-メチルアシル-CoAラセマーゼ（AMACR）および前立腺特異的抗原（PSA）に対する抗体が、多数市販されている。マーカーまたは対照として有用な他の抗体には、CDH l、CTNNB l、CCND l、HPN、TP53、CDKN l B、およびBCL2に対する抗体が含まれる。
【０１７８】
これらのマーカー対する抗体を、SACNにコンジュゲートさせる。LNCaP細胞を種々の化合物および条件で処理する、細胞標識およびイメージング実験を行う。細胞生存性に対する影響、および抗体コンジュゲートSACNの空間位置をモニターする。
【０１７９】
AMACR抗体およびPSA抗体の両方にコンジュゲートしたSACNを用いて、細胞系LNCaP、DU-145およびPC-3におけるAMACRおよびPSAのタンパク質発現を比較する；Kuefer等, Am J Pathol 2002, 161, 841-48に詳述。細胞をビカルタミド（bicalutamide）、すなわち前立腺癌処方薬処置の抗アンドロゲンクラスの経口医薬で処理する。ホルモン感受性腫瘍細胞系LNCaPは、ウェスタンブロット分析によれば細胞系DU-145およびPC-3の場合より強いAMACR発現を示す。LNCaP細胞をビカルタミドで処理すると、細胞におけるAMACRタンパク質発現は変化しないままであり、一方、アンドロゲンにより制御されることが知られている前立腺特異的抗原はタンパク質発現の低下を示す。SACNの空間位置決定を行う。細胞内イメージングの場合、表面標識実験と異なり、未結合タグを洗い去ることができない。したがってこれらの実験により、細胞内の特異的ターゲット（たとえば、このアッセイでは、ターゲットがダウンレギュレートされていない場合はPSAなど）に結合していない過剰のSACNに何が起きるかを理解することができる。
【０１８０】
Arnold等, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2004, 288, E573-E584は最近、一般用食品サプリメントであるデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）がLNCaP細胞の遺伝子およびタンパク質の発現に及ぼす効果の研究を発表した。彼らは、DHEAが細胞増殖に影響を及ぼし、PSAのタンパク質発現およびIGF受容体の数を増大させることを見いだした。PSA抗体にコンジュゲートしたSACN、および癌細胞における細胞増殖に関与することが示唆されている抗体、たとえばCCNDl（サイクリンDl）を用いて、この生物系を調べる。この細胞をDHEA、テストステロン、レチノイン酸、および17β-エストラジオール（E2）で処理し、細胞イメージング結果をArnoldらが報告したものと比較する。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】典型的なラマンスペクトルを示す。
【図２】5種類の異なる標識用分子を用いて作成したSACNの比較を示す。上から下へ：キノリンチオール、イソチオシアン酸マラカイトグリーン、メルカプトベンザミダゾール、ビス(4-ピリジル)エチレン、Bodipy。
【図３】PVDF、ニトロセルロースおよび側方流動膜に関する散乱強度-対-ラマンシフトを示す。
【図４】ガラスおよび石英表面に関する散乱強度-対-ラマンシフトを示す。
【図５】溶液ベース法で製造したナノロッドのTEM画像を示す。
【図６】633 nm励起（トレースA）および785 nm励起（トレースB）を用いて得た4-MP/BPE-SACNのSERSスペクトルを示す。
【図７】BPE-SACN（点線）および4 MP SACN（実線）のラマンスペクトルを示す。
【図８】種々の比率のNeutrAvidin（商標）およびウシ血清アルブミン（BSA）とコンジュゲートしたナノ粒子に結合したビオチン分子の数を示す。
【図９】試料を種々の量の励起電力に暴露した後のシグナルを測定することにより、SACNの直線性を示す。
【図１０】放射光に暴露したSACNに関する、試料からのシグナル-対-時間関数を示す。
【図１１】SACN製造に関するバッチ間再現性の証拠を示す。
【図１２】図１２Ａは、QSH中で離型した65×30 nmおよび90×30 nmのAu粒子の633 nm励起で得られたラマンスペクトルを示す。図１２Ｂは、QSH中で離型した65×30 nmおよび90×30 nmのAu粒子の785 nm励起で得られたラマンスペクトルを示す。
【図１３】MP中で離型した65×30 nmおよび90×30 nmのAu粒子の633 nm励起で得られたラマンスペクトルを示す。
【図１４】図１４Ａは、ME中で離型した直径35 nmのAuナノロッドのTEM画像を示す。図１４Ｂは、MEをQSHで置換し、633 nmで励起した際に得たラマンスペクトルを示す。
【図１５】図１５ＡおよびＢは、250 nm×250 nmのAu SACNのSEM画像を示す。
【図１６】図１６ＡおよびＢは、250 nm×250 nmのAu SACNのTEM画像を示す。
【図１７】図１７ＡおよびＢは、250 nm×250 nmのAu SACNの785 nmおよび633 nm励起で得られたラマンスペクトルを示す。
【図１８】IL-7を滴定するタンパク質マイクロアレイ-サンドイッチイムノアッセイ実験の結果を示す。
【図１９】Bot toxに関する側方流動イムノアッセイの結果を示す。
【図２０】SACNを含まない全血およびSACNを含む全血に関する、785 nm励起における散乱強度-対-ラマンシフトを示す。
【図２１】図２１ＡはSACN標識細胞の明視野画像およびSERS画像を示し、図２１Ｂは組織病理アッセイにおける未処理スポットおよび処理スポットからのラマンスペクトルを示す。
【図２２】マウスの尾にSACNを注射した45分後に肝臓上方で取得したスペクトルを示す。
【図２３】SACNを皮下注射した後に取得したスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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