(57)【要約】本発明はＣＭＶ（cucumbermosaic virus）抵抗性連関分子マーカーおよびこれの用途に関するものとして、より具体的には植物体のＣＭＶ抵抗性の形質と連関程度が極めて高い配列を有する核酸、前記核酸の一部の塩基配列を含むプライマーおよびこれらを利用して、ＣＭＶ抵抗性植物体を検出する方法を提供する。本発明に伴う分子マーカーは、ＣＭＶを植物体に直接接種しなくとも迅速かつ正確にＣＭＶ抵抗性植物体を検出することができ、さらには、ＣＭＶ抵抗性植物体の遺伝型を決定することができる長所がある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸。
【請求項２】
配列番号２または配列番号２２の塩基配列のうちで選ばれる一連の塩基配列を含むＣＭＶ（cucumber mosaic virus）の抵抗性植物体検出用のプライマー。
【請求項３】
前記プライマーは配列番号１および配列番号２３ないし配列番号２８からなる群より選ばれる塩基配列を有することを特徴とする請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
請求項１の核酸または請求項２のプライマーを含むＣＭＶ抵抗性植物体検出用のキット。
【請求項５】
請求項１の核酸または請求項２のプライマーの存在下で植物体のゲノムＤＮＡを分析することを含むＣＭＶ抵抗性植物体の検出方法。
【請求項６】
前記分析はＲＦＬＰ（restrictionfragment length polymerphism）、ＲＡＰＤ（randomlyamplified polymorphic DNA）、ＤＡＦ（DNAamplification fingerprinting）、ＡＰ−ＰＣＲ（arbitrarilyprimed PCR）、ＳＴＳ（sequence taggedsite）、ＥＳＴ（expressed sequencetag）、ＳＣＡＲ（sequencecharacterized amplified regions）、ＩＳＳＲ（inter-simple sequence repeat amplication）、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformationpolymorphism）からなる群より選ばれるいずれか一つの方法で行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物体は胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇からなる群より選ばれることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項１の核酸または請求項２のプライマーの存在下で植物体のゲノムＤＮＡを分析することを含むＣＭＶ抵抗性植物体の遺伝子型（genotype）を決定する方法。
【請求項９】
前記分析はＲＦＬＰ（restrictionfragment length polymerphism）、ＲＡＰＤ（randomlyamplified polymorphic DNA）、ＤＡＦ（DNAamplification fingerprinting）、ＡＰ−ＰＣＲ（arbitrarilyprimed PCR）、ＳＴＳ（sequence taggedsite）、ＥＳＴ（expressed sequencetag）、ＳＣＡＲ（sequencecharacterized amplified regions）、ＩＳＳＲ（inter-simple sequence repeat amplication）、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformationpolymorphism）からなる群より選ばれるいずれか一つの方法で行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物体は胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇からなる群より選ばれることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
組織培養により無性繁殖され、配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を含むＣＭＶ抵抗性植物体。
【請求項１２】
前記植物体は胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１１に記載のＣＭＶ抵抗性植物体。
【請求項１３】
ＣＭＶ抵抗性植物体から収得され、配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＭＶ（cucumbermosaic virus）抵抗性連関分子の表示およびその用途に関し、詳細には植物体のＣＭＶ抵抗性形質と連関程度がかなり高い配列を有する核酸、前記核酸の一部の塩基配列を含むプライマーおよびこれらを用いてＣＭＶ抵抗性植物体を検出する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
胡瓜モザイクウィルス（cucumbermosaic virus；以下‘ＣＭＶ’と称する。）は、植物ウィルスの中でも寄主範囲が最も広い植物病原ウィルスとして、全世界的に双子葉および単子葉の約９００種余りの植物に大きな経済的被害を与えている。植物がＣＭＶに感染されると、葉、茎および果実にモザイク症状が現れる。特に、病気にかかった葉は小さくなってしわくちゃになり、葉脈に沿って乖離が生じるようになる。果実には緑色の濃淡のモザイクが現われ、ごつごつして、商品価値が落ちる。
【０００３】
一方、病抵抗性品種を育種するためには、病抵抗性因子を有する他品種から継続的な逆交配を通じてその因子を導入しなければならず、導入段階毎に抵抗性のテストを経て選抜しなければならず、こうした選抜段階から前記の病抵抗性因子と密接に連関している分子マーカー（molecular marker）を利用すれば、大変便利なはずである。したがって、分子マーカーを利用したＣＭＶ診断方法および形質転換を通じたＣＭＶ抵抗性品種の開発に関する多様な技術が開発されてきた。
【０００４】
例えば、大韓民国特許出願第２０００−００２５６９９号においては、ククモウィルス（Cucumovirus）のグループに属するＣＭＶ、ピーナッツの萎縮ウィルスおよびトマトのエスパミウィルスをワンセットの遺伝子増幅用のプライマーとして診断し得るククモウィルス診断用プライマーの塩基配列およびこれを利用した遺伝子診断および同定方法を開示している。大韓民国特許登録第０２９３５６７号においては、国内で分離されたＣＭＶ外皮タンパク質の遺伝子をトマトに形質転換させる、ＣＭＶに対する抵抗性系統の開発方法を開示している。また、大韓民国特許出願第１９９３−００２９６０５号には、作物に病気を引き起こすＣＭＶに対する抵抗性を有する形質転換作物を製造するために、ＣＭＶ外皮タンパク質の遺伝子ＲＮＡを攻撃する金槌型ライボゾームが記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記の通り、ＣＭＶ抵抗性の診断およびＣＭＶ抵抗性を有する植物開発に関する従来技術は、全てＣＭＶ外皮タンパク質の遺伝子をその対象にし、植物体固有のＣＭＶ抵抗性因子に対する技術開発は報告されたことがない。
【０００６】
したがって、ＣＭＶ抵抗性因子を有する植物体系統からの前記ウィルス抵抗性関連分子マーカーの開発および開発された分子マーカーを利用し、植物体におけるＣＭＶ感染の有無を診断する方法の開発が切実に要求されてきた。
【０００７】
本発明は、前記のような要求から案出されたもので、ＣＭＶ抵抗性形質と連関程度が極めて高い塩基配列を有する分子マーカーおよびその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を提供する。
【０００９】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は配列番号２または配列番号２２の塩基配列の中で選ばれる一連の塩基配列を含むＣＭＶ抵抗性植物体検出用のプライマーを提供する。
【００１０】
また、本発明における他の目的を達成するために、本発明は前記の核酸またはプライマーを含むＣＭＶ抵抗性植物体検出用のキットを提供する。
【００１１】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の核酸またはプライマーの存在の基で植物体のゲノムＤＮＡを分析することを含むＣＭＶ抵抗性植物体を検出する方法および前記の植物体の遺伝子型（genotype）を決定する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明における他の目的を達成するために、本発明は組織培養によって無性繁殖され、配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を含有するＣＭＶ抵抗性植物体およびそれから収得された種子を提供する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は植物体のＣＭＶの抵抗性形質と連関程度が高い分子マーカー（以下、‘ＣＭＶの抵抗性連関分子の表示’とする。）を提供する。本発明において提供するＣＭＶの抵抗性連関分子の表示は、配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を含む。前記において、核酸はＲＮＡ、ＤＮＡおよびｃＤＮＡを全て含み、好ましくはＤＮＡをいう。本発明の分子マーカーはＣＭＶの抵抗性形質と密接に連関された塩基配列であり、ＣＭＶの抵抗性遺伝子とかなり近接して位置するので、前記の塩基配列が表すいかなる多形性を使用しても植物体のＣＭＶの抵抗性の有無を把握することができる。
【００１４】
さらに、本発明の分子マーカーは、前記の核酸の塩基配列の中で選ばれる一連の塩基配列を含むＣＭＶの抵抗性植物体の検出用のプライマーを含む。前記のプライマーは、配列番号２または配列番号２２の塩基配列の中で選ばれる、好ましくは少なくとも１０個以上、より好ましくは１２個以上の一連の塩基配列を持つことができる。本発明のプライマーは、ＲＦＬＰ（restriction fragment length polymerphism）、ＲＡＰＤ（randomly amplified polymorphic DNA）、ＤＡＦ（DNA amplification fingerprinting）、ＡＰ−ＰＣＲ（arbitrarily primed PCR）、ＳＴＳ（sequence tagged site）、ＥＳＴ（expressed sequence tag）、ＳＣＡＲ（sequence characterized amplifiedregions）、ＩＳＳＲ（inter-simplesequence repeat amplication）、ＡＦＬＰ（amplifiedfragment length polymorphism）、ＣＡＰＳ（cleavedamplified polymorphic sequence）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）等のように当業界に公知された多様なＤＮＡの多形性分析に適するようにデザインすることができる（Jordan et al., Theor. Appl. Genet., 106:559-567、2003; Martins M.、R. et al.、Plant Cell Reports, 22:71-78、2003; Williams, J. G. K. et al.、Nucl. Acids Res.、18: 6531-6535、1990; Michelmore, R. W.、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9828-9832、1991; Martins et al.、Plant Cell Rep.、22:71-79、2003; Orita etal.、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:2766-2770、1989）。
【００１５】
ＤＡＦ分析のためには、５−８個の塩基で構成されたプライマーをデザインして使用することができる。例えば、ＳＴＳ分析のためのプライマーはＲＦＬＰ表示の末端の塩基配列と一致するようにデザインすることができ、ＳＣＡＲ分析のためのプライマーはＲＡＰＤ表示の末端の塩基配列に基づいてデザインすることができる。また、ＣＡＰＳ分析のためのプライマーは適切な制限酵素の部位が含まれるようにデザインできる。好ましくは本発明において提供するプライマーは、配列番号１および配列番号２３ないし配列番号２６で構成された群より選ばれる塩基配列を有することができる。また、本発明のプライマーは、ＣＭＶの抵抗性形質に連関した多形性検出に影響を与えない範囲内で変形（例：付加、缺失、置換）することができる。好ましくは、配列番号２または配列番号２２の塩基配列の中で選らばれる最少の１２個の一連の塩基配列に任意の塩基を付加および／または置換して変形することができる。例えば、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有することができる。
【００１６】
本発明の分子マーカーは、ＣＭＶの抵抗性植物体の検出に極めて有用に用いられる。したがって、本発明は前記の核酸または前記のプライマー存在下で植物体のゲノムＤＮＡを分析することを含むＣＭＶの抵抗性植物体の検出方法を提供する。前記の方法はこれに制限されるものではないものの、ＲＦＬＰ（restriction fragment length polymerphism）、ＲＡＰＤ（randomly amplified polymorphic DNA）、ＤＡＦ（DNA amplification fingerprinting）、ＡＰ−ＰＣＲ（arbitrarily primed PCR）、ＳＴＳ（sequence tagged site）、ＥＳＴ（expressed sequence tag）、ＳＣＡＲ（sequence characterized amplifiedregions）、ＩＳＳＲ（inter-simplesequence repeat amplication）、ＡＦＬＰ（amplifiedfragment length polymorphism）、ＣＡＰＳ（cleavedamplified polymorphic sequence）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）等のような当業界に公知された多様なＤＮＡ多形性分析を用いて行うことができる（Jordanet al., Theor. Appl. Genet., 106:559-567、2003; Martins M.、R. et al.、Plant Cell Reports, 22:71-78、2003; Williams, J. G. K. et al.、Nucl. Acids Res.、18: 6531-6535、1990; Michelmore, R. W.、et al.、Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 88:9828-9832、1991; Martinset al.、Plant Cell Rep.、22:71-79、2003; Orita et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770、1989）。好ましくはＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、またはＣＡＰＳ分析であることもあり得る。
【００１７】
具体的に、前記の方法は下記の段階を含むＣＡＰＳ分析を通じて行うことができる。
（ａ）ＣＭＶの抵抗性および罹病性植物体から得た各ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２または配列番号２２の塩基配列の中で選ばれる一連の塩基を含むプライマーを用いてＰＣＲを行う段階；
（ｂ）ＰＣＲ産物を制限酵素で切断する段階；
（ｃ）切断されたＤＮＡ断片らをアガロスゲルにローディングして、電気泳動する段階；および
（ｄ）電気泳動が完了したゲルのＤＮＡバンド様相を比較する段階。
【００１８】
前記の（ａ）段階のプライマーは、好ましくは配列番号２３ないし配列番号２８からなる群より選ばれ得る。好ましくは、配列番号２３／２４；配列番号２３／２５；配列番号２３／２６；および配列番号２７／２８からなる群より選ばれるプライマーの組み合わせを用いることができる。さらに、前記の（ｂ）段階の制限酵素は、配列番号２または配列番号２２の塩基配列内に存在する制限酵素であれば、制限無く用いることができ、好ましくはＸｂａＩまたはＥｃｏＲＩを用いることができる。
【００１９】
さらに、前記の方法は下記の段階を含むＲＡＰＤ分析を通じて行うことができる。
（ａ）ＣＭＶ抵抗性および罹病性植物体から得た各ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２で記載される塩基配列を増幅し得るプライマーを利用してＰＣＲを行う段階；
（ｂ）ＰＣＲ産物をアガロスゲルにローディングして電気泳動する段階；および
（ｃ）電気泳動が完了したゲルのＤＮＡバンド様相を比較する段階。
【００２０】
前記の（ａ）段階のプライマーは、配列番号２で記載される核酸を増幅するために、当業者がデザインできる全ての塩基配列を有することができ、好ましくは配列番号１で記載される塩基配列を有することができる。
【００２１】
したがって、前記方法は下記の段階を含むＲＦＬＰ分析を通じて行うことができる。
（ａ）ＣＭＶ抵抗性および罹病性植物体から得た各ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断する段階；
（ｂ）切断されたＤＮＡ断片をアガロスゲル上で電気泳動する段階；
（ｃ）ゲル上のＤＮＡをナイロン膜へと転移させる段階；
（ｄ）配列番号２で記載される塩基配列を有する核酸を探針としてサザンブロットを行う段階；および
（ｅ）Ｘ−ｒａｙフィルム上に露出させ、ＤＮＡバンド様相を比較する段階。
【００２２】
前記方法に用いられ得る制限酵素は、当業界に公知された制限酵素であれば、制限無く用いることができ、好ましくはＤＮＡの多形性を誘発する制限酵素を用いることができる。より好ましくはＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩからなる群より選択される酵素を用いることができる。
【００２３】
また、本発明の分子マーカーは、ＣＭＶ抵抗性植物体の遺伝子型（genotype）決定に用いられる。したがって、本発明は、本発明の核酸またはプライマーの存在の下で植物体のゲノムＤＮＡを分析することを含むＣＭＶ抵抗性植物体の遺伝子型を決定する方法を提供する。前記方法は当業界に公知された多様なＤＮＡの多形性分析を通じて行える。具体的な方法は上述したとおりである。
【００２４】
本発明の方法が適用できる植物体は、これに制限されないものの、胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇を含む。
【００２５】
さらに、本発明は配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸または前記核酸の塩基配列の中より選ばれる一連の塩基配列が含まれたプライマーを含むＣＭＶ抵抗性植物体検出用キットを提供する。前記キットには前記核酸またはプライマーを利用してＣＭＶ抵抗性植物体の検出に必要な実験過程（例：ＰＣＲ、サザンブロット等）および結果確認に必要な種々の試薬、例えば、ＰＣＲ反応混合物、制限酵素、アガロス、混成化および／または電気泳動に必要な緩衝溶液等が追加して含まれる。
【００２６】
さらに、本発明は植物体のＣＭＶ抵抗性形質と密接に連関されている分子マーカーの配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を含むＣＭＶの抵抗性植物体を提供する。前記のＣＭＶ抵抗性植物体はＣＭＶに対して抵抗性形質を示す植物体を指す。前記植物体には、これに制限はされないものの、胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇が含まれる。好ましくは唐辛子の場合もあり得る。さらに、本発明に対して提供するＣＭＶ抵抗性植物体は植物の器官、組織、細胞、種子およびカルスを含む。本発明に伴うＣＭＶ抵抗性植物体のＣＭＶ抵抗性の遺伝の有無を調査した結果、前記ＣＭＶ抵抗性は優性の単一遺伝子により決定されるものであることが究明された。
【００２７】
本発明のＣＭＶ抵抗性植物体は、当業界で公知された一般的な組織培養方法で無性繁殖が可能である。例えば、器官発生による微細増殖法（形成された器官がない葉、葉柄、茎節、子葉、子葉軸等の組織を培養して、新たな芽を前記組織の表面に誘導する方法）またはカルス誘導を通じた再分化方法等で無性繁殖ができる。さらに、本発明は、前記ＣＭＶの抵抗性植物体から収得され、配列番号２または配列番号２２の塩基配列からなる核酸を含む種子を提供する。
【発明の効果】
【００２８】
前記の通り、本発明は、ＣＭＶ抵抗性の形質と連関程度が極めて高い遺伝子塩基配列を有する分子マーカーを提供することにより、鑑別の誤謬が殆ど無く効率的にＣＭＶ抵抗性植物体を鑑別できるようにする。さらに、本発明に伴う分子マーカーおよびこれを利用した検出方法は、ＣＭＶを植物体に直接接種せずに迅速かつ正確にＣＭＶ抵抗性植物体を検出することができ、さらには、ＣＭＶ抵抗性植物体の遺伝型を決定できる長所がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明を説明するためのみのものであり、本発明の権利範囲を本実施例に限定しようとするものではない。
【００３０】
＜実施例１＞
ＣＭＶ抵抗性唐辛子植物体の馴化および分子マーカー開発のための交配集団作成とＣＭＶ抵抗性の遺伝様式究明
多様な唐辛子植物体にＣＭＶを接種して、抵抗性植物体をスクリーニングした。その結果、アルジエン草系統のうち一つの植物体がＣＭＶ抵抗性として確認された。選ばれた植物体を‘ＦＰ１１’と命名した。選ばれたＦＰ１１のＣＭＶ抵抗性の遺伝の有無をテストするために、自家受粉の集団および交配集団を作成した。前記交配集団は、ＦＰ１１を罹病性系統であるＦＰ１４と交配させて作成した。交配されたＦ１の種子を播種して自家受粉させ、Ｆ２集団を作り、再び各々のＦ２植物体を自家受粉させ、Ｆ３集団を作った。Ｆ２とＦ３集団を対象にＣＭＶ抵抗性をテストした結果、ＣＭＶ抵抗性はＦ２集団において３：１の比率で遺伝され、Ｆ３世代でホモ（homo）とヘテロ（hetero）の比率が１：２で分離された。これよりＣＭＶ抵抗性は優性の単一遺伝子により決定されることが確認された。
【００３１】
＜実施例２＞
植物体からＤＮＡ分離
ＤＮＡ抽出はプリンス等の方法（Prince,J.P., et al., HortScience 32;937-939,1997）を変形して行った。−８０℃で保管した唐辛子の葉を液体窒素を利用して磨砕し、２５ｍｌのＤＮＡ抽出バッファ（７Ｍウレア、０．３５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０５Ｍ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、０．２５％ sarkosyl、５％ ペノル、０．２％ sodiumbisulfate）と混合した。以降、０．７５ｍｌの２０％ＳＤＳを入れ、６５℃で１０分毎に揺さぶりながら３０分間培養した。
【００３２】
クロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）の溶液を５０ｍｌのチューブの端部まで充填させ、１５分間攪拌した。混合液を５，０００ｒｐｍに１５分間遠心分離し、収得された上澄み液を木綿布（cheesecloth）を利用して新たな５０ｍＭのチューブに移した。以降、前記チューブに同一の嵩のイソプロパノールを添加し、混合した後、一時間ＤＮＡを浸漬させた。Ｕ字状のパステウルのピペットを利用して沈殿されたＤＮＡを採取し、１．５ｍｌのマイクロチューブに入れ、７０％のエタノールを添加して、ＤＮＡを再浸漬させた。室温で３０−４０分間乾燥させた。前記乾燥されたＤＮＡペレットに６００−７００μｌのＴＥバファ（１０ｍＭTris−Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して、６５℃で１時間培養した。遠心分離過程を３回繰り返した。以降、ＤＮＡを１．５ｍｌのチューブに移し、ＲＮａｓｅ（１００μｌ／ｍｌ）を添加して、ＲＮＡを除去した。精製されたＤＮＡの最終濃度は蛍光計を利用して測定した。
【００３３】
＜実施例３＞
ＣＭＶ抵抗性連関ＲＡＰＤのプライマーの選抜
ＣＭＶ抵抗性形質と連関したＤＮＡ分子マーカーを選抜するために、ＲＡＰＤ（Williams、J. G. K. et al.、Nucl. Acids Res. 18、6531-6535、1990）とＢＳＡ（BulkedSegregant Analysis）方法（Michelmore、R. W. et al.、Proc. Nat. Acad. Sci.、88:9828-9832、1991）を用いた。前記実施例１のＦ２集団からのＣＭＶ抵抗性検定結果を基に抵抗性Ｆ２植物体１０個体のＤＮＡプール（pool）と感受性Ｆ２植物体１０固体のＤＮＡプールを作って、プールで作られたＤＮＡ濃度が２０ｎｇ／μｌとなるように調整し、これを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った。このとき、ＲＡＰＤプライマーのために、Ｏｐｅｒｏｎ  ＲＡＰＤ  １０−ｍｅｒキット（Operon、Alameda、CA、USA）の中でシリーズＡからシリーズＴまでの約４００個のプライマーを対象にＰＣＲ反応が良好に引き起こされるプライマーを１４７個選抜し、選抜されたプライマーを用いて、抵抗性ＤＮＡプールと感受性ＤＮＡプール間に特異的に異なって増幅されるバンドを探索した。
【００３４】
ＰＣＲ反応組成物は、１Ｘ ＰＣＲバファ、６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰ０．３ｍＭ、プライマー ０．６ｐＭ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．６Ｕｎｉｔ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Takara、Japan）を混合して、総嵩を２５μｌに調整した。ＰＣＲ増幅は９４℃で４分間鋳型ＤＮＡを変性させ、９４℃で１分間、３６℃で１分３０秒間および７２℃で１分５０秒間を一サイクルとして計４５回繰り返し、７２℃で５分間反応させ、終結した。その結果、図１で見る通り、ＯＰＣ−０７のプライマー（配列番号１）を利用したＰＣＲで１個の抵抗性プール（pool）にのみ特異的に現われる分子マーカーを選抜した。
【００３５】
前記分子マーカーがＣＭＶ抵抗性形質とどの程度連関されているかを調べるために、抵抗性植物体と罹病性植物体およびこれらのＦ１世代、さらに、抵抗性Ｆ２の１８３固体および罹病性Ｆ２の６４固体に対して再びＲＡＰＤ分析を行った。その結果、図２ａおよび図２ｂで見るとおり、前記分子マーカーが１００％同伴分離（co-segregation）されることが確認できた。
【００３６】
＜実施例４＞
ＲＡＰＤ分子マーカーのクローニングと塩基配列決定
配列番号１で記載される塩基配列を有するＯＰＣ−０７プライマー（１０ｍｅｒ）を利用して増幅されたＤＮＡをゲルから分離・精製して、ｐＧＥＭ−Ｔベクトル（Promega社）にクローニングした。クローニングされたプラスミドを電気衝撃方法で大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入し、抗生剤が含まれている培地から形質転換体を選抜した。選抜された形質転換体から組み換えのプラスミドを分離し、前記プラスミド内に挿入されたＤＮＡの塩基配列を分析した。決定された塩基配列を配列番号２で記載した。
【００３７】
＜実施例５＞
ＣＡＰＳ分子マーカーへの転換およびインバスＰＣＲを行うためのサザンブロット実施
抵抗性植物体と罹病性植物体のゲノムＤＮＡを用意して、ＤＮＡ制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断した後、アガロズゲールに電気泳動した。ナイロンのメンブレーンにＤＮＡを移動させ、実施例４で増幅されたＣＭＶ抵抗性の特異的なＤＮＡ（配列番号２）を探針とし、サザンブロットを行った。その結果を図３に示した。図３で見るとおり、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶに対して多形性を示し、ＨｉｎｄIIIに対しては多形性が表れなかった。前記ＲＦＬＰ分析結果を基にＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶ制限酵素をインバスＰＣＲとＣＡＰＳ分子マーカー転換に用いた。
【００３８】
＜実施例６＞  
ＣＭＶ抵抗性遺伝子の近接ＤＮＡ塩基配列の決定
実施例５の結果（図３）を基に実施例４で分析されたＲＡＰＤの分子マーカーの塩基配列の一部を用いてプライマーを製作した。製作されたプライマーの塩基配列を下記の表１に示した。
【００３９】
【表１】
2007509626.tif 000003
【００４０】
前記の表１に記載されたプライマーを用いて抵抗性植物体で当業界に公知された方法（Sambrook J. and D. W. Russel. 2001. Molecular Cloning. 3rd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York.）にしたがってインバスＰＣＲを行った。
【００４１】
まず、ＨｉｎｄIIIで切断したゲノムＤＮＡをＴ７ＤＮＡリガーゼ（ligase）で処理して、円形に接合させ、これを鋳型にし、配列番号５および配列番号６のプライマーの組み合わせを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を配列番号４および配列番号９のプライマーの組み合わせを用いて、ネステド（Nested）ＰＣＲで再増幅した。その結果、約９００ｂｐ大のＰＣＲ産物を得た。前記ＰＣＲ産物の塩基配列をプライマーウォーキング（primer walking）方法で分析した。前記塩基配列を配列番号２の塩基配列に連結し、両末端にＨｉｎｄIII部位を有する１．８ｋｂの塩基配列を得た。以降、前記１．８ｋｂ大の塩基配列を基に配列番号１０および配列番号１１のプライマーを製作した。前記配列番号１０および配列番号１１のプライマーの組み合わせを用い、ＥｃｏＲＶで切断し、円形接合させたゲノムＤＮＡを鋳型にして、再びインバスＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基配列を前記１．８ｋｂ大の塩基配列に連結し、両末端にＥｃｏＲＶ部位を有する３．４ｋｂ大の塩基配列を得た。再び同一の方法でＸｂａＩで切断し、円形接合させたゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号１３および配列番号１４のプライマーを用いて、インバスＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基配列を分析し、これを前記３．４ｋｂ大の塩基配列に連結した。その結果、配列番号２の塩基配列を含む約５．６ｋｂ長の塩基配列が決定された。これの塩基配列を配列番号２２で記載した。
【００４２】
＜実施例７＞
ＣＡＰＳ分子マーカーへの転換  
前記配列番号２２の塩基配列において公知されたＤＮＡの塩基配列の制限酵素の部位を調べ、抵抗性植物体および罹病性植物体のゲノムＤＮＡの制限酵素の部位を比較して、二つのゲノムＤＮＡ間に多形性を示す制限酵素のＸｂａＩ（Ｔ'ＣＴＡＧ＿Ａ）、ＥｃｏＲＩ（Ｇ'ＡＡＴＴ＿Ｃ）およびＥｃｏＲＶ（ＧＡＴ'ＡＴＣ）をＣＡＰＳに用いる制限酵素として選び、適切な長さの制限パターンを示すＤＮＡ断片を増幅できるように位置付けしたプライマーを製作した。つまり、配列番号２２の塩基配列の中で選ばれる一連の塩基配列で構成されたプライマーを４個製作した（下記の表２参照）。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
配列番号２３と２４、配列番号２３と２５および配列番号２３と２６の組み合わせのプライマーを利用し、抵抗性植物体および罹病性植物体、そして、これらのＦ２集団から抽出されたＤＮＡを鋳型として用い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃で１分；５８℃で１分；および７２℃で２分を一サイクルとして、計３５回繰り返して行った後、７２℃で１０分間反応させ、終結した。以後、増幅されたＤＮＡを実施例６から選ばれた制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶ）で切断して、アガロズゲルに電気泳動し、遺伝子型、つまり、ホモ（ＲＲ）とヘテロ（Ｒｒ）型が区分されるか否かを確認した。
【００４５】
配列番号２３と２４のプライマーの組み合わせで、ＰＣＲを行った結果を図４に示した。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の大きさは１．０ｋｂであった。増幅されたＤＮＡ断片をＸｂａＩで切断した結果、罹病性と抵抗性親のバンドのパターンが異なることが確認できた。さらに、このバンドパターンが実施例１においてＦ３病抵抗性をテストして予測したＦ２植物体の遺伝型と同伴分離されることを確認することができた。
【００４６】
配列番号２３と２５のプライマーの組み合わせでＰＣＲを行った結果を図５に図示した。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の大きさは１，４７７ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（Ａ）とＸｂａＩ（Ｂ）にそれぞれ切断した結果、罹病性と抵抗性親のバンドのパターンが異なることが見られる。さらに、このバンドのパターンが実施例１における病抵抗性の結果と同伴分離されることを確認することができた。
【００４７】
配列番号２３と２６のプライマーの組み合わせでＰＣＲを行った結果を図６に示した。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の大きさは１，８４６ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断した結果、罹病性と抵抗性親のバンドのパターンが異なることが見られ、このバンドパターンも実施例１における病抵抗性の結果と同伴分離されることを見られることができた。
【００４８】
前記結果は、配列番号２２で記載される塩基配列のうち任意の一連の塩基配列をプライマーで製作し、ＰＣＲを行い、その結果から得たＰＣＲ産物を配列番号２２内に存在する制限酵素で切断する場合、ＣＭＶ抵抗性の遺伝子の存在の有無およびその状態（遺伝型）、つまり、ホモまたはヘテロであるか否かを区分できることを表すものである。つまり、配列番号２２で記載される塩基配列がＣＭＶ抵抗性遺伝子とかなり近接していることにより、前記塩基配列が表すいかなる多形性を用いてもＣＭＶ抵抗性遺伝子の存在の有無の把握に用いられる。
【００４９】
＜実施例８＞
ＣＡＰＳ分子マーカーへの転換可能な一連の最少の塩基配列の数の決定
実施例６で決定された配列番号２２の塩基配列においてＣＡＰＳ分子マーカーへの転換可能な最も少ない一連の塩基配列の数を決定するために、次の実験を行った。このため、配列番号２３（Forward [SCC07S3]:5'-GTAGTAGGGTACGGACTCATA-3'）の塩基配列を配列番号２７（Forward [SCC07S3-change]:5'-gGTAGTAGGGTACG-3'）の塩基配列に、さらに、配列番号２５（Reverse [CR1541-3]:5'-GGAGTTTCATCATATGAAGCC-3'）の塩基配列を配列番号２８（Reverse[CR1541-3-change]:5'-gGGAGTTTCATCAgc-3'）の塩基配列にそれぞれ変形した（小文字は任意の付加／置換）。前記の変形された配列番号２７および配列番号２８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させ、９４℃で１分；５０、５２、５４、５６または５８℃で１分；および７２℃で２分を一サイクルとし、計４０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させ、終結した。増幅されたＤＮＡ断片の大きさは１，４７７ｂｐであった。以降、増幅されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロズゲルに電気泳動した結果、図７に示した通りに、罹病性と抵抗性親のバンドのパターンが異なることが見られて、このバンドパターンも実施例１における病抵抗性の結果と同伴分離されることが確認できた。
【００５０】
前記結果から配列番号２２の塩基配列から選ばれる最少１２個の一連の塩基配列を変形させたプライマーもＣＭＶ抵抗性を検出するためのＣＡＰＳマーカーで有用であることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１はオペロンプライマー（ＯＰＣ−０４ないしＯＰＣ−０８およびＯＰＣ−１０）を利用して、胡瓜モザイクウィルス抵抗性ＤＮＡプール（pool）（Ｒ）と罹病性ＤＮＡプール（Ｓ）を鋳型に用いて、ＲＡＰＤ分析を行った結果を示す写真。
【図２】図２ａおよび図２ｂはＯＰＣ−０７のプライマー（配列番号１）を用いて抵抗性植物体（Ｒ０）およびそのＦ１（Ｒ１）、罹病性植物体（Ｓ０）およびそのＦ２（Ｓ１）、抵抗性Ｆ２および罹病性のＦ２に対してＲＡＰＤ分析を行った結果を示す写真。
【図３】図３はＯＰＣ−０７のプライマーにより増幅されたＤＮＡ切片（配列番号２）を探針にしてＲＦＬＰ分析を行った結果。Ｒ：抵抗性植物体Ｓ：罹病性植物体
【図４】図４は配列番号２３および配列番号２４のプライマーを利用してＣＡＰＳ分析を行った結果を示す写真。
【図５】図５は配列番号２３および配列番号２５のプライマーの組み合わせを用いてＣＡＰＳ分析を行った結果を示す写真。Ａ：ＥｃｏＲＩで切断した場合Ｂ：ＸｂａＩで切断した場合
【図６】図６は配列番号２３および配列番号２６のプライマーの組み合わせを利用してＣＡＰＳ分析を行った結果を示す写真。
【図７】図７は配列番号２７および配列番号２８のプライマーの組み合わせを利用してＣＡＰＳ分析を行った結果を示す写真。
【００５２】
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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