(57)【要約】本発明は、ＨＩＦ転写因子に特異的に結合し得るコア配列を含む、二本鎖ＨＩＦデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子、そのような分子を含む組成物、ならびにＨＩＦ転写因子による遺伝子転写の調節と関連する種々の疾患および状態の処置におけるそれらの使用に関する。本発明において、ＨＩＦ転写因子に特異的に結合する数セットの転写因子デコイ（ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ）、特に、転写因子ＨＩＦ−１に特異的に結合する転写因子デコイ（ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ）および／または転写因子ＨＩＦ−２に特異的に結合する転写因子デコイ（ＨＩＦ−２  ｄｓＯＤＮ）が、系統的に開発され、試験され、そして改良された。
2007512847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本のセンス鎖および一本のアンチセンス鎖を含むＨＩＦ二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子であって、該センス鎖は、５’から３’方向に式ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の配列を含み、
ＣＯＲＥは配列ＡＣＧＴＧ（配列番号１２６）であり、
ヌクレオチドの位置が負（−）の番号によって表されるＦＬＡＮＫ１は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そして
ヌクレオチドの位置が正（＋）の番号によって表されるＦＬＡＮＫ２は、少なくとも約５０％のＧＣ含量を有し、
そしてここで、該ｄｓＯＤＮ分子は、ＨＩＦに特異的に結合し得る、
ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２】
前記ＦＬＡＮＫ２は、位置＋１にＧ以外のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項３】
前記ＦＬＡＮＫ２は、位置＋１にヌクレオチドＡを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項４】
前記ＦＬＡＮＫ２は、位置＋３にヌクレオチドＡまたはＧを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項５】
前記ＦＬＡＮＫ２は、位置＋２に任意のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項６】
前記ＦＬＡＮＫ１は、位置−１にＡ以外のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項７】
前記ＦＬＡＮＫ１は、位置−１にヌクレオチドＴまたはＣを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項８】
前記ＦＬＡＮＫ１は、位置−３にＧ以外のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項９】
前記ＦＬＡＮＫ１は、位置−３にヌクレオチドＴを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１０】
前記ＦＬＡＮＫ１は、位置−４にヌクレオチドＧを有する、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１１】
前記ＦＬＡＮＫ１は、少なくとも６ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１２】
前記ＦＬＡＮＫ１は、少なくとも７ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１３】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列は、少なくとも１４ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１４】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１５】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列は、１４〜２８ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１６】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列は、１６〜２４ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１７】
前記センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、改変された骨格を有し、該改変された骨格は、別の結合によって置換された一個以上のホスホジエステル結合を含む、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１８】
ホスホチオエート結合、ホスホジチオエート結合、およびホスホアミデート結合からなる群より選択される結合によって置換された一個以上のホスホジエステル結合を含む、請求項１４に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１９】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２は、表２Ａおよび表２Ｂに列挙される配列から選択される、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２０】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２は、番号８９３（配列番号１６１）、番号８９５（配列番号１６２）、番号９８５（配列番号２０７）、番号９８７（配列番号２０８）、番号９６３（配列番号１９６）、番号９９３（配列番号２１１）、および番号９９５（配列番号２１２）のデコイ配列の群から選択される、請求項１９に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２１】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２は、番号８９５（配列番号１６２）のデコイ配列である、請求項２０に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２２】
前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２は、番号９８５（配列番号２０７）のデコイ配列である、請求項２０に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２３】
番号８９３（配列番号１６１）、番号８９５（配列番号１６２）、番号９８５（配列番号２０７）、番号９８７（配列番号２０８）、番号９６３（配列番号１９６）、番号９９３（配列番号２１１）、および番号９９５（配列番号２１２）のデコイ配列の群から選択される、請求項１に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２４】
番号８９５（配列番号１６２）のデコイ配列である、請求項２３に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２５】
番号９８５（配列番号２０７）のデコイ配列である、請求項２３に記載のｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２６】
ＨＩＦ転写因子によって調節される遺伝子の転写を調節するための方法であって、該方法は、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｄｓＯＤＮ分子を該遺伝子を含む細胞の核に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記ＨＩＦ転写因子はＨＩＦ−１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
インビボで行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
エキソビボで行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子は、前記細胞においてエピソーム複製し得る、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子は、組成物として送達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物はリポソームを含み、前記ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮは該リポソームの内腔中にある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記リポソームは脂質およびウイルスの外殻タンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮは、圧力媒介トランスフェクションによって前記細胞の核に導入される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物宿主におけるＨＩＦ調節性遺伝子転写と関連する疾患または状態の予防または処置のための方法であって、該方法は、該哺乳動物の細胞にインビボまたはエキソビボで有効量の二本鎖ＨＩＦデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を導入する工程を包含し、該ｄｓＯＤＮ分子は、ＨＩＦ転写因子に特異的に結合し得るコア配列を含む、方法。
【請求項３６】
前記ＨＩＦ転写因子はＨＩＦ−１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｄｓＯＤＮ分子は、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｄｓＯＤＮ分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患または状態は癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌は、腎臓癌、膵臓癌、結腸癌、および肺癌からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
付加的な抗脈管形成因子の投与をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記付加的な抗脈管形成因子は、抗ＥＧＦ因子、抗ＶＥＧＦ因子、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、血管標的化因子、およびインテグリンのアンタゴニストからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記付加的な抗脈管形成因子は、ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）；アンギオスタチン；エンドスタチン；Ｐａｎｚｅｍ（登録商標）（２−メトキシエストラジオール、ＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、およびサリドマイドからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患または状態は炎症性疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または状態は、その病態に低酸素状態が関与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患または状態は、心臓血管疾患または脳卒中である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患または状態は、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、および角膜の新生血管形成からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患または状態は、病的な血管増殖と関連する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患または状態は、筋骨格の障害である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｄｓＯＤＮ分子およびキャリアを含む組成物。
【請求項５０】
前記キャリアは細胞の核内の送達を促進する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物はリポソーム組成物である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ｄｓＯＤＮ分子はリポソームの内腔中にある、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記リポソームは、脂質およびウイルスの外殻タンパク質を含む、請求項５２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）オリゴヌクレオチドデコイ分子、およびＨＩＦ関連の疾患もしくは病的状態の処置におけるＨＩＦオリゴヌクレオチドデコイ分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）は、組織内の酸素添加の変化に対する適応応答を媒介する、ヘテロダイマーの転写因子である。３種のＨＩＦのサブタイプが現在公知であり（ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、ＨＩＦ−３）；ＨＩＦ−１およびＨＩＦ−２は、保存されるＨＲＥを介して遺伝子調節に影響することが示されている。ＨＩＦ−１は、構成的に発現されるＨＩＦ−１βサブユニットおよび高度に調節されるＨＩＦ−１αサブユニットからなるヘテロダイマーである。ＨＩＦ−１αの合成は酸素非依存性であり；しかし、分解は主に酸素依存性の機構を通して調節される。活性化されたＨＩＦ−１αサブユニットは、核内へ移動し、ＡＲＮＴ（アリールレセプター核内トランスロケーター）サブユニットと二量体化して、活性な転写因子ＨＩＦ−１を形成する。ＨＩＦ−１は、多くの遺伝子のエンハンサーもしくはプロモーター中に存在する低酸素応答性エレメント（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＨＲＥ、もしくは５’−ＡＣＧＴＧ−３’（配列番号１２６））を認識し、ＨＲＥの発現をもたらす。
【０００３】
ＨＩＦ−１結合部位を含むシス作用低酸素応答性エレメントの存在、ＨＩＦ−１α非発現細胞における遺伝子の低酸素誘導性発現の減少、またはフォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）非発現細胞もしくはＨＩＦ−１α発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞における増加された発現のいずれかに基づいて、６０個より多い推定の直接的なＨＩＦ−１標的遺伝子が同定されている。
【０００４】
推定のＨＩＦ−１調節性遺伝子としては、アドレノメデュリン、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、自己分泌運動性因子（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）、カテプシン、内分泌腺由来ＶＥＧＦ、エンドグリン、エンドセリン−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、フィブロネクチン１、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−Ｐ−デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、インスリン様増殖因子２、インスリン様増殖因子結合タンパク質１および２、ケラチン１４、ケラチン１８、およびケラチン１９、多剤耐性１、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、ＮＯシンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１、ピルビン酸キナーゼＭ、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子レセプター、ＶＥＧＦレセプター２、ならびにビメンチンが挙げられる（非特許文献１）。
【０００５】
いくつかのＨＩＦ−１標的遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現は、ほとんどの細胞型において低酸素によって誘導されるが、ＨＩＦ−１標的遺伝子の大多数について、発現は低酸素によって細胞型に特異的な様式で誘導される。
【０００６】
低酸素による転写誘導は、Ｂｅｃｋら（非特許文献２）によって、ＥＰＯの３’隣接領域において最初に同定され特徴付けられた。Ｂｅｃｋらは、トランスフェクションおよび変異誘発によって、この誘導に関与する領域を定義した。Ｓｅｍｅｎｚａら（非特許文献３）によって、低酸素に対する応答に関与するさらに特定のヌクレオチド配列が特徴付けられ、ＥＰＯを発現していない細胞にまで拡大された。これらの著者らは、解糖の経路中の３つの遺伝子の隣接配列の機能解析によって、ＨＩＦ誘導に関与する配列をＧ／ＹＡＣＧＴＧＣ  Ｇ／Ｔ（配列番号１）と定義した。この共通配列は、以後の著者らによって標準的な低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）として認められた。しかし、以後の著者らはしばしば、彼らの特定の目的の低酸素調節性遺伝子の解析に基づいて、このＨＲＥ配列を、種々の隣接した残基を有する、５塩基対のコアＡＣＧＴＧ（配列番号１２６）としてより狭義に定義する（例えば、非特許文献４；および非特許文献５を参照）。
【０００７】
ＨＩＦ−１は、癌生物学のきわめて重大な局面（新脈管形成、細胞の生存、グルコース代謝および浸潤が挙げられる）に関係する遺伝子の転写を活性化する。腫瘍内低酸素および遺伝子改変はＨＩＦ−１αサブユニットの過剰発現をもたらし得、これは数種の癌の種類において増加した患者の死亡率と関連している。ＨＩＦ−１およびＨＩＦ−１の経路は、抗癌薬の開発の標的として提案されている（非特許文献１）。
【０００８】
二本鎖ＨＩＦ−１オリゴデオキシヌクレオチドデコイ（ｄｓＯＤＮ）分子は、ＨＩＦ−１の生物学的役割を調査するために用いられている。以下の配列：
【０００９】
【化１】
2007512847.tif 000003
および
【００１０】
【化２】
2007512847.tif 000004
を有するＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子は、ＷａｎｇおよびＳｅｍｅｎｚａ（非特許文献６；非特許文献７）によって記載された。ＨＩＦ−１デコイ分子はまた、Ｏｉｋａｗａら（非特許文献８）；ならびに、ＹａｎｇおよびＺｏｕ（非特許文献９）において開示された。
【非特許文献１】Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．，２００３年、第３巻、ｐ．７２１−７３２
【非特許文献２】Ｂｅｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１年、第２６６巻、第２４号、ｐ．１５５６３−６
【非特許文献３】Ｓｅｍｅｎｚａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年、第２６９巻、第３８号、ｐ．２３７５７−６３
【非特許文献４】Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，２０００年、第３５０巻、第１部、ｐ．３０７−１２
【非特許文献５】Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２年、第２７７巻、４９、ｐ．４７０１４−２１
【非特許文献６】ＷａｎｇおよびＳｅｍｅｎｚａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年、第２６８巻、ｐ．２１５１３−２１５１８
【非特許文献７】ＷａｎｇおよびＳｅｍｅｎｚａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２３０−１２３７
【非特許文献８】Ｏｉｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１年、第２８９巻、ｐ．３９−４３
【非特許文献９】ＹａｎｇおよびＺｏｕ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１年、第２８１巻、Ｆ９００−８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＦ転写因子（例えば、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２）に特異的に結合し得るコア配列を含む二本鎖ＨＩＦデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子、そのような分子を含む組成物、ならびに、ＨＩＦ（例えば、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２転写因子）による遺伝子転写の調節と関連する種々の疾患および病的状態の処置におけるそれらの使用に関する。
【００１２】
一つの局面において、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有するｄｓＯＤＮ分子に関し、このｄｓＯＤＮ分子において、センス鎖は５’から３’方向に式ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の配列を含み、この式において、
ＣＯＲＥは、配列ＡＣＴＧＴ（配列番号１２６）であり、
ヌクレオチドの位置が負（−）の番号によって示されるＦＬＡＮＫ１は、少なくとも６個のヌクレオチド長であり、そして
ヌクレオチドの位置が正（＋）の番号によって示されるＦＬＡＮＫ２は、少なくとも約５０％のＧＣ含量を有し、そして
上記のｄｓＯＤＮ分子は、ＨＩＦへの特異的な結合が可能である。
【００１３】
特定の実施形態において、ＦＬＡＮＫ２は、位置＋１にＧ以外のヌクレオチドを有する。
【００１４】
別の特定の実施形態において、ＦＬＡＮＫ２は、位置＋１にヌクレオチドＡを有する。
【００１５】
さらに別の実施形態において、ＦＬＡＮＫ２は、位置＋３にヌクレオチドＡまたはＧを有する。
【００１６】
さらなる実施形態において、ＦＬＡＮＫ２は、位置＋２に任意のヌクレオチドを有する。
【００１７】
なおさらなる実施形態において、ＦＬＡＮＫ１は、位置−１にＡ以外のヌクレオチドを有する。
【００１８】
異なる実施形態において、ＦＬＡＮＫ１は、位置−１にヌクレオチドＴまたはＣを有する。
【００１９】
別の実施形態において、ＦＬＡＮＫ１は、位置−３にＧ以外のヌクレオチドを有する。
【００２０】
さらに別の実施形態において、ＦＬＡＮＫ１は、位置−３にヌクレオチドＴを有する。
【００２１】
さらなる実施形態において、ＦＬＡＮＫ１は、位置−４にヌクレオチドＧを有する。
【００２２】
さらなる実施形態において、ＦＬＡＮＫ１は、少なくとも６個、または少なくとも７個のヌクレオチド長である。
【００２３】
なおさらなる実施形態において、上記のＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列は、少なくとも１４個、または少なくとも１６個、または１４個〜２８個、または１６個〜２４個のヌクレオチド長である。
【００２４】
全ての実施形態において、一方もしくは両方の鎖は、改変された骨格を有し得、そして／または改変されたヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
さらなる特定の実施形態において、上記のＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列は、表２Ａおよび表２Ｂに列挙される配列から選択され、より優れた結合特性を有する配列が好ましい。
【００２６】
本明細書において特に含まれるのは、番号８９３（配列番号１６１）、番号８９５（配列番号１６２）、番号９８５（配列番号２０７）、番号９８７（配列番号２０８）、番号９６３（配列番号１９６）、番号９９３（配列番号２１１）、および番号９９５（配列番号２１２）のデコイ配列からなる群より選択されるＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列である。
【００２７】
特定の位置、置換、および他の変数は別々に記載されるが、そのような変数の任意の組合せおよび全ての組合せが明確に包含されることが理解される。従って、例えば、列挙されるヌクレオチドの任意の組合せをＦＬＡＮＫ１およびＦＬＡＮＫ２に含む、任意のＣＯＲＥ配列と組み合わせたｄｓＯＤＮデコイ分子は、明確に本発明の範囲内にある。
【００２８】
別の局面において、本発明は、ＨＩＦ（例えば、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２）転写因子によって調節される遺伝子の転写を調整するための方法に関し、この方法は、そのような遺伝子を含む細胞の核内に本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子を導入する工程を包含する。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物の宿主における、ＨＩＦ調節性の遺伝子転写と関連する疾患または状態の予防もしくは処置のための方法に関し、この方法は、ＨＩＦ転写因子（例えば、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２）への特異的な結合が可能なコア配列を含む、有効量の二本鎖ＨＩＦデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を、インビボもしくはエキソビボでその哺乳動物の細胞に導入する工程を包含する。
【００３０】
なおさらなる局面において、本発明は、本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）に関する。
【００３１】
本明細書においてｄｓＯＤＮ分子によって標的にされる特定の疾患および状態としては、癌、炎症性疾患、病態に低酸素症を含む疾患、心臓血管疾患、脳卒中、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、角膜の新生血管形成、病原性血管増殖と関連する状態、筋骨格障害、ならびに、病態がＨＩＦによって活性化される遺伝子転写を伴う、他の疾患および状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４））ならびにＭａｒｃｈ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２））は、本出願において用いられる用語の多くのものへの一般的な指針を当業者に提供する。
【００３３】
用語「二本鎖」は、ワトソン−クリック型塩基対のみによって互いに連結される二本の相補的なヌクレオチド鎖を含む、核酸分子を指すように用いられる。この用語は、二本の相補鎖によって形成される二本鎖領域に加えて、一本鎖の突出部を含む分子を特に含む。
【００３４】
用語「オリゴヌクレオチドデコイ」、「二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ」、「オリゴデオキシヌクレオチドデコイ」、および「二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドデコイ」は、交換可能に用いられ、標的となる転写因子に結合しその生物学的機能を妨げる二本鎖領域を含む、短い核酸分子を指す。従って、用語「ＨＩＦオリゴヌクレオチドデコイ」、「二本鎖ＨＩＦオリゴヌクレオチドデコイ」、「ＨＩＦオリゴデオキシヌクレオチドデコイ」、および「二本鎖ＨＩＦオリゴデオキシヌクレオチドデコイ」は、交換可能に用いられ、ＨＩＦ転写因子に結合しその生物学的機能を妨げる二本鎖領域を含む、短い核酸分子を指す。用語「二本鎖」は、ワトソン−クリック型塩基対によって互いに連結される二本の相補的なヌクレオチド鎖を含む、核酸分子を指すように用いられる。用語「ＨＩＦデコイ」およびその同意語は、ＨＩＦ−１オリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子およびＨＩＦ−２オリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子を、特に含む。ＨＩＦ−１デコイおよびＨＩＦ−２デコイを含む全てのＨＩＦデコイは、二本の相補鎖によって形成される二本鎖領域に加えて、一本鎖の突出部を含むデコイ分子を特に含む。加えて、この用語は、二本鎖領域に加えて、二本の鎖が３’および／または５’末端で互いに共有結合で連結される、ＨＩＦオリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子を特に含む。
【００３５】
用語「ＨＩＦ−１」は、本明細書において最も広義に用いられ、ＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１βヘテロダイマーおよびそのサブユニットを含む、任意の動物種の、全ての天然に存在するＨＩＦ分子を含む。
【００３６】
用語「転写因子結合配列」は、転写因子が結合する短いヌクレオチド配列である。この用語は、転写が一つ以上の転写因子によって調節される遺伝子の調節領域において代表的に見出される、天然に存在する結合配列を特に含む。この用語はさらに、天然には存在しないが、内因性遺伝子の結合部位への転写因子の結合を競合的に阻害し得る、人工（合成）の配列を含む。
【００３７】
用語「結合親和力」とは、対応するオリゴヌクレオチドデコイに所定の転写因子がどれほど強く結合するかを指し、全てが以下に記載される、電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）またはＴｒａｎｓＡｍアッセイを含む、種々の実験的アプローチによって測定され得る。
【００３８】
用語「競合比」とは、（実施例において記載される）ＴｒａｎｓＡｍアッセイにおいて、それ自体と競合する定義される配列と比較された場合の、転写因子の結合および保持についてこの定義配列と競争する試験デコイ配列の能力である。例えば、配列ＡがＴｒａｎｓＡｍプレートに結合される場合、配列Ｂについての競合比は、競合配列Ｂを含むウェルの吸光度を競合する配列を含むウェルの吸光度で除算したものと等しい。より小さい比は、その転写因子に結合するより高い競合能力を指す。
【００３９】
用語「特異的な結合」は、本明細書において、特定のデコイ分子がその標的転写因子に結合し、任意の他の転写因子には有意には結合しないことを意味するように用いられる。ＨＩＦデコイ分子の場合において、特異的な結合は、ＨＩＦファミリーの一つより多いメンバー（例えば、ＨＩＦ−１およびＨＩＦ−２）にデコイが結合することを可能にするが、このデコイは、ＨＩＦファミリーのメンバーでない転写因子に有意に結合するべきではない。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、句「改変されたヌクレオチド」とは、組成および／または構造が天然のヌクレオチドおよびヌクレオチド三リン酸と異なる、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド三リン酸を指す。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、用語「５’側の」または「５’の」および「３’側の」または「３’の」とは、核酸に関する特定の方向を指す。核酸は、その二つの末端が５’側（５’）または３’側（３’）のいずれかとして区別されるような、明瞭な化学的方向を有する。核酸の３’末端は、末端のペントース糖の３’の炭素に結合する遊離のヒドロキシル基を含む。核酸の５’末端は、末端のペントース糖の５’の炭素に結合する遊離のヒドロキシル基またはリン酸基を含む。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、用語「突出部」とは、二本の鎖の末端が共伸長せず、一方の鎖の５’末端が反対の相補鎖の３’末端を越えて伸長するような、平滑末端を有さない二本鎖の核酸分子を指す。直鎖の核酸分子が、０個、１個、または２個の５’突出部を有する可能性がある。
【００４３】
用語「アポトーシス」および「アポトーシス作用」は、広義で用いられ、代表的には一つ以上の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における規則的または制御された形態の細胞死を指す。特徴的な細胞変化としては、細胞質の凝縮、細胞膜の微絨毛の消失、核の分裂、染色体ＤＮＡの分解、またはミトコンドリアの機能の消失が挙げられる。この作用は、例えば、細胞生存度アッセイ、ＦＡＣＳ解析、またはＤＮＡ電気泳動によって、決定され得、測定され得る。
【００４４】
用語「癌」および「癌性の」とは、調節されない細胞増殖によって代表的に特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、白血病、芽腫および肉腫が挙げられるが、それらに限定されない。そのような癌の特定の例としては、膵臓癌、結腸直腸癌、胃腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、他形グリア腫、子宮頸部癌、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、肝癌、ならびに頭部癌および頸部癌が挙げられる。好ましい実施形態において、癌は、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌を含む。
【００４５】
用語「処置」とは、治療的処置、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）措置または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指し、処置の目的は、標的となる病的状態もしくは障害を、予防するまたは遅らせる（和らげる）ことである。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能であろうと検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の範囲の縮減、疾患の安定化された（すなわち、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患の状態の改善または緩和、および（部分的もしくは全体的な）寛解が挙げられるが、それらに限定されない。処置を必要とする者は、既にこの障害を有する者ならびにこの疾患を有する傾向がある者、またはこの障害が予防されるべき者を含む。腫瘍（例えば、癌）の処置において、治療因子は、直接的に腫瘍細胞の病理を軽減し得るか、または他の治療因子（例えば、放射線および／もしくは化学療法）による、処置に対して腫瘍細胞をより感受性にし得る。
【００４６】
「被験体」は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００４７】
用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指すように、本明細書において用いられる。哺乳動物として分類される任意の動物としては、ヒト、高等霊長類、げっ歯類、家庭の動物および飼育動物、動物園の動物、競技用の動物、もしくは愛玩動物（例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、用語「細胞傷害性因子」とは、細胞の機能を阻害もしくは妨害し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法薬、および、トキシン（例えば、低分子トキシン、または、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性なトキシン（それらの断片および／もしくは変異体を含む））を包含することを意図される。
【００４９】
用語「化学療法薬」は、癌の処置において有用な化合物を指すように、本明細書において用いられる。化学療法薬の例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：アルキル化薬（例えば、チオテパおよびシクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ））；スルホン酸アルキル類（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン類（例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ），カルボコン、メチュアドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミン類ならびにメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）類（アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチルオロメラミンを含む）；アセトゲニン類（特に、ブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）の合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）類（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログであるＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード類（例えば、クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド（ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、エンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質類（例えば、カリキアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）（特に、カリキアミシン（１Ｉ、およびカリキアミシン２Ｉ１、例えば、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）を参照））；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネミシン；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）ならびにネオカルチノスタチン発色団および関係する色素タンパク質であるエンジイン抗生物質色素体）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）類、アクチノマイシン、アスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイ��ン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロマイシン、キラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタジン（ｅｎｏｃｉｔａｄｉｎｅ）、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン類（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補充物質（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドフォスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エデトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エフロールニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）類（例えば、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）類）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトザントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；��ェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）：リゾキサン（ｒｈｉｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａ、およびアンギジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロフォスファミド；チオテパ；タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）類（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドキサタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチン、およびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトザントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチン酸；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびに、上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体。抗エストロゲン物質（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ），ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体）および抗アンドロゲン物質（例えば、フルタミド、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド、およびゴセレリン、ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる）のような、腫瘍へのホルモンの作用を調節するかまたは阻害するように作用する抗ホルモン因子もまた、この定義に含まれる。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、用語「炎症性疾患」または「炎症性障害」とは、代表的には好中球の化学走性によって引き起こされる、炎症をもたらす病理学的状態を指す。そのような障害の例としては、以下のものが挙げられる：炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬、湿疹、およびアトピー性皮膚炎）；全身性強皮症および全身性硬化症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する応答（例えば、クローン病および腫瘍性大腸炎）；虚血性再灌流障害（外科的組織再灌流傷害、心筋の虚血性状態（例えば、心筋梗塞、心停止、心臓外科手術後の再灌流、および経皮的経管的冠動脈形成後の絞窄）、脳卒中、ならびに腹大動脈動脈瘤が挙げられる）；脳卒中に対して二次性の脳水腫；頭部外傷；循環血液量減少性ショック；窒息；成人呼吸促進症候群；急性肺障害；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症（ＭＳ）；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；ループス腎炎；自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、脈管炎）；白血球の漏出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、敗血症もしくは外傷に対して二次性の多臓器傷害症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；糸球体腎炎を含む抗原−抗体複合体仲介性疾患；セプシス；サルコイドーシス；組織／臓器移植に対する免疫病理学的応答；肺の炎症（例えば、胸膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、および嚢胞性線維症）；など。好ましい兆候としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：関節リウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、通風性関節炎、および他の関節炎状態、慢性炎症、自己免疫糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリトマトーデス、成人呼吸促進症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症性疾患、対宿主性移植片反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、および発熱（ｐｙｒｅｓｉｓ）、ならびに炎症および炎症と関係する傷害と関係する任意の疾患または障害。
【００５１】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明において、ＨＩＦ転写因子に特異的に結合する数セットの転写因子デコイ（ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ）、特に、転写因子ＨＩＦ−１に特異的に結合する転写因子デコイ（ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ）および／または転写因子ＨＩＦ−２に特異的に結合する転写因子デコイ（ＨＩＦ−２  ｄｓＯＤＮ）が、系統的に開発され、試験され、そして改良された。
【００５２】
第一に、一連のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子が、そのコア配列（位置１〜５と称される）ならびに近接する５’配列および３’配列（５’配列については位置−１〜−４と称され、３’配列については位置＋１〜＋３と称される）にすべての可能な塩基を用いて合成された。各々のｄｓＯＤＮ配列は、デコイがそのＨＩＦ標的に結合することがどれほどよく予測されるかのスコアを提供する生命情報科学的方法を用いて解析された。続いて、これらのＨＩＦデコイの、ＨＩＦ転写因子に結合しその活性を遮断する能力が、慣例的な結合アッセイ（例えば、競合的結合アッセイ）において決定された。この慣例的な結合アッセイとしてはＴｒａｎｓＡＭＴＭ法（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられ、ＴｒａｎｓＡＭＴＭ法は、以下の実施例において記載されるように、ＥＬＩＳＡを基礎とする、転写因子活性化を検出し定量するための方法であり、予測される結合親和力と実際の結合親和力とが比較される。このデータは図１８に示され、以下に論議される。
【００５３】
加えて、コア配列に近接する３’および５’の隣接部分（ｆｌａｎｋ）の長さならびに組成の、結合親和力への効果が調査された。
【００５４】
最後に、骨格の置換の、ＨＩＦデコイの結合親和力への効果を評価するために、一連の実験が行われた。
【００５５】
これらの構造−機能研究は、種々のＨＩＦ関連疾患の処置のための有望な候補である、優れた特性を有する一連のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の同定をもたらす。
【００５６】
（１．ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の設計）
一実施形態において、本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子は、ワトソン−クリック型塩基対形成によって互いに結合する二本のオリゴヌクレオチド鎖からなる。代表的にはこの二本の鎖の全てのヌクレオチドが塩基対形成に参加するが、このことは必要条件ではない。一つ以上（例えば１〜３個または１個もしくは２個）のヌクレオチドが塩基対形成に関係していないオリゴヌクレオチドデコイ分子もまた、包含される。加えて、二本鎖デコイは３’および／または５’の一本鎖突出部を含み得る。
【００５７】
別の実施形態において、本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子は、ワトソン−クリック型塩基対形成によって互いに結合し、加えて、３’末端もしくは５’末端のいずれかまたは両方で互いに共有結合し、ダンベル型構造または環状の分子を生じる二本のオリゴヌクレオチド鎖を含む。この共有結合は、例えば、ホスホジエステル結合または他の結合基（例えば，ホスホチオエート結合、ホスホジチオエート結合、またはホスホアミデート結合）によって提供され得る。
【００５８】
一般に、本発明のｄｓＯＤＮ分子は、ＨＩＦ転写因子（例えば、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２）に特異的に結合し得る、５’および／または３’配列によって挟まれるコア配列を含み、このコア配列は、約５〜１４個の塩基対、または約６〜１２個の塩基対、または約７〜１０個の塩基対からなり；隣接配列は、約２〜１０塩基対長、または約２〜８塩基対長、または約６〜１０塩基対長、または約７〜１０塩基対長、または約８〜１０塩基対長、または約６〜８塩基対長、または約７〜８塩基対長である。この分子は代表的には、約１２〜２８塩基対長、好ましくは約１４〜２４塩基対長の、完全にもしくは部分的に相補的な二本の鎖からなる二本鎖領域（コア配列および隣接配列を含む）を含む。特定の実施形態において、５’隣接配列は少なくとも約６塩基対長であるが、３’隣接配列は少なくとも約６塩基対長、または少なくとも約７塩基対長である。
【００５９】
コア配列（その長さ、配列、塩基改変、および骨格構造を含む）を変化させることにより、ＨＩＦデコイ分子の結合親和力を変化させることが可能である。加えて、隣接配列の変化は、ＨＩＦデコイ分子のインビボでの安定性に真の影響を及ぼし、ＨＩＦデコイ分子のインビボでの安定性を有意に増加させ得、結合親和力および／または結合特異性に影響し得る。特に、ＨＩＦデコイ分子の形状／構造は、コア結合配列に隣接する配列を変化させることによって変化され得、改善された安定性および／または結合親和力をもたらし得る。このＤＮＡの形状および構造は、塩基対の配列、ＤＮＡの長さ、ヌクレオチドの骨格および性質（すなわち、天然のＤＮＡ  対  改変された糖または塩基）によって影響される。従って、この分子の形状および／または構造は、他のアプローチによっても（例えば、全長、この分子内の完全に相補性な二本鎖領域の長さを変化させることによって、コア配列および隣接配列中の変更によって、骨格構造を変化させることによって、ならびに塩基改変によって）変化され得る。
【００６０】
本発明のデコイ分子中に存在するヌクレオチド配列は、改変されたヌクレオチドもしくは異常なヌクレオチドを含んでもよく、代替的な骨格の化学的性質を有してもよい。合成ヌクレオチドは、種々の方法で改変され得る（例えば、Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：９９７−１０００（１９９０）を参照）。従って、酸素は、窒素、硫黄、もしくは炭素で置換されてもよく；リンは炭素で置換されてもよく；デオキシリボースは他の糖で置換されてもよく、または、個々の塩基は非天然の塩基で置換されてもよい。従って、ヌクレオチド間結合の架橋しない酸素原子の（ホスホロチオエート結合を生成するための）硫黄基による置換は、ｄｓＯＤＮ分子のヌクレアーゼ耐性を増加させることにおいて有用となっている。硫黄による改変の数と本発明中のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の安定性および特異性との関係を決定する実験が、以下の実施例において示される。
【００６１】
各々の場合において、上記の改変の、ＨＩＦ転写因子に対するオリゴヌクレオチドデコイの結合能力および結合親和力への効果、融解温度およびインビボでの安定性への効果、ならびに任意の有毒性生理学的効果について、任意の変化が評価される。そのような改変は、当該分野において周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての広範な適用が見出されており、従って、これらの改変の安全性および結合親和力の保持は、十分に確立される（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１５１０−１５１３（１９９３）を参照）。
【００６２】
改変されたヌクレオチドの例は、以下のものであるが、それらに限定されない：４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン３−メチルシチジン５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボナルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル（ｒｉｂｏｆｕｒａｎｓｙｌ）−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステルウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウリジンキューオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイルスレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３−３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン（ａｐｃ３）ｕ、およびワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）。
【００６３】
加えて、これらのヌクレオチドは、例えばホスホルアミデート結合によって、互いに結合され得る。この結合は、架橋する酸素（−Ｏ−）がアミノ基（−ＮＲ−）で置換され、ここで、Ｒは代表的には水素または低級アルキル群（例えば、メチルもしくはエチル）であるような、天然のホスホジエステル結合のアナログである。他の結合（例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエートなど）もまた、可能である。
【００６４】
本発明のデコイはまた、ポリヌクレオチド構造中に一般的に存在する、改変された形態もしくはアナログの形態のリボース糖または改変された形態もしくはアナログの形態のデオキシリボース糖を含み得る。そのような改変としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：２’が置換された糖類（例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロ−リボース、および２’アジド−リボース）、カルボン酸糖アナログ、α−アノマー糖類、エピマー糖類（例えば、アラビノース）、キシロース類、リキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式アナログ、および無塩基性ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）。
【００６５】
概して、本発明のオリゴヌクレオチドデコイは、好ましくは約５０％より多く、さらに好ましくは約８０％より多く、最も好ましくは約９０％より多くの、従来のデオキシリボースヌクレオチドからなる。
【００６６】
本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮデコイは、その局在化、精製を容易にするため、またはその特定の特性を改善するために、さらに改変され得る。例えば、このデコイ分子の細胞核への送達を改善するために、核局在化シグナル（ＮＬＳ）がこのデコイ分子に連結され得る。
【００６７】
加えて、本発明のＨＩＦデコイ分子は、例えば以下の引用文献において記載されるように、キャリア分子（例えば、ペプチド、タンパク質、もしくは他の型の分子）と結合され得る：Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １６，３８３−３９１（２００１）；Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：８７−９３（１９９９）；Ｇａｌｌａｚｚｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４，１０８３−１０９５（２００３）；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１，７０８−７１７（２００３）。
【００６８】
本発明のＨＩＦデコイ分子は、送達、分配、特定の細胞型の標的化を改善するため、または細胞障壁の通過を容易にするために、送達ビヒクルを含むようにさらに誘導体化され得る。そのような送達ビヒクルとしては、細胞浸透増強剤、リポソーム、リポフェクチン、デンドリマー、ＤＮＡインターカレーター、およびナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
治療的適用のために、全てのＨＩＦの種を標的とする、特異的な高結合親和性ＨＩＦデコイ分子を開発することは有益である。
【００７０】
例えばＴＦ結合部位マトリックス系を用いる生命情報科学的方法は、ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子を設計する工程における最初のツールとして有用であった。しかし、実施例において提供されるデータから明らかであるように、そのような解析は、標的ＨＩＦ転写因子に強く結合し、その生物学的活性を阻害することにおいて効果的であるデコイ分子の設計における、開始点でしかなかった。非常に効果的なＨＩＦ機能のインヒビターを設計するために、生命情報科学的解析の後に、広範囲の実験的な構造−機能研究が行われなければならない。
【００７１】
（２．ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の合成）
本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮデコイ分子は、市販の自動合成機を用いて、標準的なホスホジエステル化学またはホスホルアミデート化学によって合成され得る。実施例において記載される特定のｄｓＯＤＮ分子は、自動ＤＮＡ合成機（Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて合成されている。これらのデコイは、カラムクロマトグラフィーによって精製され、凍結乾燥され、そして培養培地中に溶解された。各々のデコイの濃度は、分光測光的に決定された。
【００７２】
（３．ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の特徴付け）
本発明のＨＩＦデコイ分子は、ゲルシフトアッセイまたは電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイにおいて、最初に便宜よく試験されて特徴付けられ得る。このアッセイは転写因子のＤＮＡへの結合を検出するための迅速かつ高感度な方法を提供する。このアッセイは、タンパク質とＤＮＡとの複合体が、非変性ポリアクリルアミドゲルの中を、遊離の二本鎖オリゴヌクレオチドよりゆっくりと移動するという観察に基づいている。このゲルシフトアッセイは、転写因子結合部位を含む３２Ｐ末端標識化ＤＮＡフラグメントと共に、精製されたタンパク質またはタンパク質の複合混合物（例えば、核抽出物）をインキュベートすることによって行われる。次いで、この反応生成物は、それから非変性ポリアクリルアミドゲルで解析される。結合部位についての転写因子の特異性は、目的のタンパク質に対する結合部位を含むオリゴヌクレオチドまたはスクランブルされたＤＮＡ配列のオリゴヌクレオチドのいずれかの過剰量を用いる競合実験によって確立される。この複合体に含まれるタンパク質の同一性は、このタンパク質を認識する抗体を用い、次いでＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体の低下した移動度、または放射性標識オリゴヌクレオチドプローブへのこの複合体の結合の分断のいずれかを探すことによって確立される。
【００７３】
ＨＩＦデコイがＨＩＦ転写因子に結合しその活性を遮断する能力は、従来の結合アッセイ（例えば、競合的結合アッセイ）において決定され得る。従来の結合アッセイとしては、転写因子活性化を検出し定量するためのＥＬＩＳＡを基礎とする方法である、ＴｒａｎｓＡＭＴＭ法（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。簡単に述べると、標的配列（本発明の場合、ＥＰＯプロモーターのＨＩＦ結合部位）がプレート上に固定され、デコイ：プレート結合配列のモル比として計算された種々の濃度でのデコイの存在下または非存在下で、ＨＩＦを含む核抽出物がウェルの中でインキュベートされる。ポジティブコントロールのウェルは、プレート上の標的ＤＮＡと同じ配列を有するデコイを含む。得られるデータは、試験デコイの吸光度とポジティブコントロールデコイの吸光度との比として表される。従って、より低い比はより優れた結合を表す。このアッセイにおいて、代表的には、約１．５までのスコアは非常に優れた競合的インヒビター（結合）特性の指標と見なされ、約１．２以下のスコアは、最適と見なされている。約２以上の比のデコイ分子は、概して弱い競合インヒビターと見なされる。
【００７４】
ＨＩＦデコイがＨＩＦ活性を遮断する能力は、インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて、例えば、以下の実施例において記載されるように、癌細胞における低酸素誘導性ＨＩＦ活性を低下させるＨＩＦデコイの能力を試験することによって、さらに評価されてもよい。
【００７５】
インビボでの効力は、最初に動物モデル（例えば、ヒトの癌細胞を用いるネズミの異種移植モデル）において試験され得る。これに続き、特定の標的疾患の動物モデルにおける試験が行われ得、続いて、この特定の疾患の処置における安全性および効力を評価するための臨床試験が行われ得る。種々の腫瘍モデルにおけるこれらの効力研究の結果は、以下の実施例において表される。
【００７６】
（４．ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の使用）
先に議論されるように、ＨＩＦ−１は、新脈管形成および解糖ならびに転移を含む腫瘍の成長において重要な役割を果たすことが示されており、抗癌治療戦略の潜在的な標的として同定されている（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．３：７２１−７３２（２００３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：２８２−９０（２００２）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６８８−９５（２００２）；Ｗｅｌｓｈら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２：２３５−４３（２００３））。ＨＩＦ−１は、乳癌において過剰発現されること、および、さらに浸潤性の腫瘍と潜在的に関連することが示されている（Ｂｏｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：３０９−３１４（２００１））。加えて、ＨＩＦ−１は、炎症と腫瘍形成との間の重要な結合として、最近同定されている（Ｊｕｎｇら、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０３−０３２９ｆｊｃ、２００３年９月４日オンライン公開）。脳腫瘍、乳癌、子宮頚部癌、食道癌、口腔咽頭癌、および卵巣癌の生検におけるＨＩＦ−１αの過剰発現は、処置の不全および死亡率と相関する。増加したＨＩＦ−１活性は、腫瘍の進行を促進し、ＨＩＦ（例えば、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２）の阻害は、癌治療への新規のアプローチを表し得る。従って、ＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２を本発明のデコイ分子によって遮断することは、癌の予防および処置における有用性を見出し、単独でまたは他の処置オプションとの併用で、新しい抗癌戦略を提供する。本発明のｄｓＯＤＮ分子を投与することによるＨＩＦ−１および／またはＨＩＦ−２の阻害はまた、他の癌治療（例えば、放射線治療および／または化学療法薬を用いる処置）の効力を増強し得る。特定の癌標的としては、固形腫瘍の悪性疾患および非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
以下の実施例に示されるように、本発明のＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子は、種々の細胞ベースのアッセイおよび異種移植モデルにおいて腫瘍の成長を効果的に阻害し、従って、種々の腫瘍の処置のための有望な抗癌薬である。この腫瘍としては、膵臓癌、結腸癌、および肺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
加えて、ＨＩＦ−１は、一般的に低酸素状態が主要な局面である疾患（例えば、心臓疾患および脳卒中（Ｇｉａｃｃｉａら、Ｎａｔ．Ｒａｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：８０３−８２２（２００３）））、ならびに慢性肺疾患の標的として同定されている。従って、本発明のＨＩＦデコイ分子はまた、例えば（虚血性心臓血管疾患を含む）心臓血管疾患（例えば、心筋虚血、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋症、心臓肥大、および脳卒中）のような、低酸素状態関連の疾患および病理学的状態の予防および処置のために用いられ得る。
【００７９】
ＨＩＦデコイ分子はさらに、米国における失明の主要な原因である糖尿病性網膜症を含む眼科学において有用性を見出す。さらなる眼科学的標的としては、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および移植と関連する角膜の新生血管形成が挙げられる。
【００８０】
ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子は、例えば、乾癬、角膜新生血管形成、感染、または外傷と関連する、病的な血管増殖の予防および処置においてさらなる用途を見出す。
【００８１】
増加した新脈管形成もまた、滑膜炎、および関節炎における骨の形成機能の、重要な要素である。炎症性関節炎の動物モデルにおける新脈管形成のインヒビターの症状発現前研究は、新生血管形成の阻害が炎症および関節の損傷を減少させ得るという仮説を支持する。従って、さらなる治療標的として、関節炎（例えば、関節リウマチ（ＲＡ））を含む炎症性疾患、および筋骨格障害が挙げられる。さらなる詳細については、例えば、ＷａｌｓｈおよびＨａｙｗｏｏｄ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２（８）：１０５４−６３（２００１）を参照されたい。加えて、腫瘍の成長と同様に、子宮内膜移植片は、新生血管形成が確立し、成長し、浸潤することを必要とする。この過程は、本発明のＨＩＦデコイによって遮断され得る。Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９５５：８９−１００（２００２）もまた参照されたい。
【００８２】
ＨＩＦ（例えば、ＨＩＦ−１）関連疾患のさらなる詳細については、例えば、Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｋ．，Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８８：１４７４−１４８０（２０００）を参照されたい。
【００８３】
（５．ＨＩＦ  ｄｓＯＤＮ分子の送達）
本発明のＨＩＦデコイの送達の一つの可能な様式は、例えば米国特許第５，９２２，６８７号および同第６，３９５，５５０号（これらの開示の全体が本明細書によって特に参考として援用される）において記載されるような、圧力媒介トランスフェクションである。簡単に述べると、ＨＩＦデコイ分子は、このデコイ核酸を細胞の細胞外環境に置き、そして細胞の周囲および細胞外環境でインキュベーション圧を確立することによって、組織内の細胞へ送達される。このインキュベーション圧の確立は、細胞による核酸の取り込みを促進し、細胞核への局在化を高める。
【００８４】
より具体的には、組織および細胞外環境を含む密封された囲いが定められ、インキュベーション圧は、この密封された囲いの中で確立される。好ましい実施形態において、この囲いの境界は、標的組織（標的細胞を含む組織）が等方性の圧力に供され、次いで膨張したり外傷を経験したりしないような、囲いの手段によって実質的に定められる。別の実施形態において、この囲いの境界の一部は組織によって定められる。そして、組織の膨張および外傷を予防するために、非弾性シースのような保護手段が組織の周囲に位置される。このインキュベーション圧は適用方法に依存するが、大気圧より約３００ｍｍＨｇ〜１５００ｍｍＨｇ高いインキュベーション圧、または大気圧より少なくとも約１００ｍｍＨｇ高いインキュベーション圧は、概して多くの適用に適している。
【００８５】
最大のトランスフェクション効率を達成するために必要とされるインキュベーション期間は、インキュベーション圧および標的組織の型のようなパラメータに依存する。一部の組織（例えば、ヒト血管組織）については、低圧（約０．５ａｔｍ）での分単位（＞１０分）でのインキュベーション期間が、８０〜９０％のトランスフェクション効率を達成するために十分である。他の組織（例えば、ラット大動脈組織）については、高圧（約２ａｔｍ）での時間単位（＞１時間）でのインキュベーション期間が、８０〜９０％のトランスフェクション効率を達成するために必要である。
【００８６】
この型の送達のために適切な哺乳類動物の標的組織としては、血管組織（特に動脈において移植片として用いられる血管）心臓、骨髄、ならびに正常結合組織および腫瘍結合組織、肝臓、生殖器−泌尿器系、骨組織、筋、胃腸器官、内分泌器官および外分泌器官、滑膜組織、ならびに皮膚が挙げられる。本発明の方法は、器官の一部へ、器官全体へ、または生物体全体へ、適用され得る。一実施形態において、核酸溶液は患者の標的領域（例えば、腎臓）へ注入され得、そしてその患者は加圧室（ｐｒｅｓｓｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）において圧力に供される。
【００８７】
他の適用について、本発明のＨＩＦデコイは、他の従来の技術によって投与され得る。例えば、レトロウイルスによるトランスフェクション、リポソームの形態におけるトランスフェクションは、トランスフェクションに適した公知の方法のうちのものである。詳細については、Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １１：２０５−２１０（１９９３）；または、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４７４−８４７８（１９９３）をまた参照されたい。リポソーム中で投与される場合、内腔におけるデコイ濃度は、概して、１デコイあたり約０．１μＭ〜約５０μＭの範囲内にあり、より通常には、約１μＭ〜約１０μＭ、最も通常には約３μＭである。
【００８８】
投与は、一連の処置が数日間から数ヶ月間、または治療がもたらされるまでもしくは疾患の状態の軽減が達成されるまで続くので、処置されるべき疾患の状態の重篤度および応答性に依存的である。最適な投与計画は、患者の体内の薬物蓄積量の計測から計算され得る。当業者は、最適用量、投与方法、および反復率を容易に決定し得る。最適用量は、各々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化し得る。概して、用量は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇである。当業者は、体液または組織内での薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復率を容易に概算し得る。有効量は、送達される特定のデコイ分子の効力に加えて、標的疾患、送達の経路、使用される処方、その疾患の深刻さ、処置されるべき患者の年齢、性別、および全体的な状態に依存する。
【００８９】
デコイは、各々のデコイまたはデコイの混合物を含む組成物として投与され得る。通常は、混合物は６種類までのデコイ分子を含み、より通常では４種類まで、さらに通常では２種類までのデコイ分子を含む。
【００９０】
癌の治療において、ＨＩＦデコイ分子の投与は、他の処置のオプションと併用されてもよい。他の処置のオプションとしては、外科手術、化学療法的抗癌薬を用いる処置、および／または放射線治療が挙げられる。
【００９１】
ＨＩＦデコイを用いる癌の処置は、特に、抗新脈管形成因子（新脈管形成インヒビター）（例えば、抗ＥＧＦ因子および抗ＶＥＧＦ因子、マトリックスプロテイナーゼインヒビター、脈管標的化因子、インテグリンのアンタゴニストなど）との併用治療を包含する。固形腫瘍は生活組織の領域および壊死組織の領域を含むことが公知である。抗新脈管形成因子によって腫瘍への血液の供給を遮断することは、癌組織全体に重篤な低酸素状態をもたらす。低酸素状態がＨＩＦを誘発することが公知であるので、低酸素状態を増進させることによる新脈管形成の阻害は、ＨＩＦデコイ処置の治療の窓（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を増加させる。
【００９２】
市販または開発中の新脈管形成インヒビターとしては、例えば、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）；アンギオスタチン；エンドスタチン；Ｐａｎｚｅｍ（登録商標）（２−メトキシエストラジオール、ＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、およびサリドマイドが挙げられる。併用治療は、有効量の減少をもたらし得、このことは、換言すると、毒性の副作用または他の合併症を減少させ得る。
【００９３】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかである。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
（ＨＩＦデコイ分子の設計および試験）
（設計）
初めに、ＨＩＦ−１結合ＤＮＡの共通配列を、ＨＩＦ−１に関係するＤＮＡ−タンパク質相互作用についての刊行物より選択し、ＢｉｏＢａｓｅ  ＴＲＡＮＳＦＡＣ（バージョン７．２およびバージョン８．２）データベースにおいて要約される、公開された配列のセットから選んだ。これらの共通配列が対応する調節領域の局在を確認し、伸長された隣接ゲノムＤＮＡ配列を、最新のゲノムデータベースより検索した（表１を参照）（ヒトに関して、２００３年７月バージョン；マウスに関して、２００３年２月バージョン；ラットに関して、２００３年６月バージョン）。
【００９５】
（表１．同定されたＨＩＦ−１結合部位および対応する隣接配列）
【００９６】
【表１−１】
2007512847.tif 000005
【００９７】
【表１−２】
2007512847.tif 000006
（コア共通結合部位のマトリックスの構築）
ＨＩＦのコア結合部位付近の塩基組成を定義するために、上記の利用可能なＨＩＦ−１コア結合配列に基づくコア結合部位を、計算的にアラインメントした。そのアラインメントに基づいて、このコアおよび直接隣接する領域の両方についての塩基組成を計算的に記載する、表もしくは「マトリックス」を作成した（図１を参照）。この解析を、ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースの最新のバージョン（８．２、２００４年６月）を用いて行った（例えば、Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：３１８−２２（１９９９）；Ｋｎｕｐｐｅｌら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：１９１−８（１９９４）；Ｍａｔｙｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３７４−８（２００３）；Ｓｃｈａｃｈｅｒｅｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：１０５３−７（２００１）を参照）。ＴＲＡＮＳＦＡＣは、ＤＮＡ−ＴＦ結合についての位置−重量−マトリックスを集積する。Ｍａｔｃｈツール（Ｋｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３５７６−３５７９（２００３））は、結合親和力を計算的に予測するために、これらのマトリックスを用いる。図１は、所定の塩基が所定の位置に見出される確率を統計学的に示唆する。
【００９８】
（ＨＩＦ−１結合モチーフの結晶構造の解析）
ＨＩＦ−１は、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーに属する。（ＨＩＦ−１ａサブユニットについての合計８２６中の）位置３０から位置７０までに位置するアミノ酸は、ＤＮＡ認識およびＤＮＡ結合親和力に関与する。ＨＩＦ−１に関するＤＮＡ結合モチーフの結晶構造は存在しないが、同様のＤＮＡ結合モチーフを共有する他のｂＨＬＨメンバーの利用可能な構造の情報が、有用な構造の情報を提供する（Ｍｉｃｈｅｌら、Ｔｈｅｏｒ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｃ．１０１：５１−５６（１９９９）；Ｍｉｃｈｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ＆  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  １８：１６９−１７９（２０００）；Ｍｉｃｈｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７８：７３−８３（２００２））。これらの研究は、ＨＩＦ−１の結合モチーフ内に位置する数個の残基の重要性を示唆した。公知のコア結合配列は、ＣＧＴＧ（配列番号１３４）であるが、中心のコアＡＣＧＴＧ（配列番号１２６）がＨＩＦ−１複合体（ＨＩＦ−１αおよびＡＲＮＴ）の最大限の結合のために必須であること、ならびにこのコアからすぐ５’側の上流の塩基組成もまた、ＨＩＦ−１結合の特異性および親和性のために非常に重要であることが見出されている。ＤＮＡフットプリント研究もまた、５’側の上流領域がＨＩＦ−１誘導性遺伝子発現のために重要であり得ることを示唆した。従って、５’側の隣接部分の配列および長さが変化する候補のデコイを設計し、試験した。
【００９９】
（最初のＨＩＦ−１ａデコイの配列）
公開されたＨＩＦ−１結合の研究からの知識、利用可能なＨＩＦ−１コア結合配列からの知識、計算的なコア結合マトリックスからの知識、ｂＨＬＨファミリーについての結晶構造のモデルからの知識、および（他の転写因子に結合し得るデコイを排除するための）特定の生命情報科学のアプローチからの知識に基づいて、１セットのデコイを最初のスクリーニングのために生成した（表２Ａを参照）。これらのデコイは、「変異デコイ」、「スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）デコイ」、５’末端もしくは３’末端で異なる長さを有するデコイ、および、コア領域でもしくはコア領域に隣接して代替的な塩基組成を有するデコイを含む。
【０１００】
（表２Ａ．スクリーニングのための最初の配列）
【０１０１】
【表２Ａ−１】
2007512847.tif 000007
【０１０２】
【表２Ａ−２】
2007512847.tif 000008
【０１０３】
【表２Ａ−３】
2007512847.tif 000009
上記の表２Ａにおいて互いに隣に並べられる配列（例えば、８０１／８０２；８０３／８０４など）は、相補的であり、一つの二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの２本の鎖を形成する。
【０１０４】
表２Ｂは、調製されたデコイ配列の異なる表記であり、よりよい理解のために、コア配列を並置して示す：
（表２Ｂ−デコイ配列のアラインメント）
【０１０５】
【表２Ｂ−１】
2007512847.tif 000010
【０１０６】
【表２Ｂ−２】
2007512847.tif 000011
【０１０７】
【表２Ｂ−３】
2007512847.tif 000012
（ＴｒａｎｓＡＭキットを用いる最初のスクリーニング）
ＨＩＦ−１αを含む複合体のためのオリゴヌクレオチドの相対的な親和力を評価するために、ＨＩＦ−１  ＴｒａｎｓＡＭアッセイ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、カタログ番号４７０９６）を利用した。製造者の指示書に従ってアッセイを行った。簡単に述べると、低酸素応答性エレメント（ｈｙｐｏｘｉａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＨＲＥ）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、９６ウェルのプレートに固定した。ＨＩＦ−１α複合体を含む核抽出物をインキュベートし、固定されたオリゴヌクレオチドに結合させた。結合していない物質を洗い流し、結合したＨＩＦ−１αをＨＩＦ−１αを特異的に認識する抗体を用いて検出した。この抗ＨＩＦ−１α抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された二次抗体によって検出し、各ウェル内のＨＲＰの量を、比色定量法の基質反応を用いて測定し、マイクロプレート分光光度計を用いて読み取った。
【０１０８】
プレートに固定されたＨＲＥエレメントへのＨＩＦ−１αの結合に対して候補のデコイ分子が競合する能力を測定し、相対的な結合親和力を示すために比較した。ＨＩＦ−１αを含む複合体への結合のために競合するように、候補のデコイを（プレートに固定化されたオリゴの量に相対的な）漸増するモル比で加えた。このアッセイに加えられたデコイの量は、０．６２５倍、１．２５倍、２．５倍、５倍、１０倍および２０倍のモル過剰量を含む。高い親和力でＨＩＦ−１αに結合し得る、競合するデコイを含むウェルは、ＨＩＦ−１αに対して低い親和力を有するデコイと比較して、より低い吸光度読み取り値を与える。次いで、すべての可能性があるデコイを比較し、それらのデコイの相対的な結合親和力を評価するために、ランク付けした。
【０１０９】
（ＴｒａｎｓＡＭの結果の解析）
異なるデコイ濃度を用いてスクリーニングを行った。各ＵＶ吸光度読み取り値について、サンプル  対  野生型コントロールの吸光度読み取り値の比を計算することによって、正規化をおこなった。その結果を表３において要約する。より大きな比は、野生型コントロールと比較した場合の、ＨＩＦ−１αとの結合のより低い競合を表す。より小さな（１．０より小さいか、もしくは１．０に近い）比は、より良い結合もしくはより良い競合を表す。
【０１１０】
【表３−１】
2007512847.tif 000013
【０１１１】
【表３−２】
2007512847.tif 000014
中心コアならびに５’の隣接配列および３’の隣接配列を、以下のように番号付ける：
【０１１２】
【化３】
2007512847.tif 000015
コア配列の番号を強調し、５’の隣接配列を負の番号で標識し、３’の隣接配列を正の番号で標識した。
【０１１３】
図１７は、感受性のプロットであり、センス鎖の位置−４から位置＋３へわたる種々のヌクレオチド塩基の置換の、ＨＩＦオリゴヌクレオチドデコイ分子の結合親和性への効果を示す。
（１）このデータは、最大限の結合親和性のために、コア配列（位置１〜５）は、ＡＣＧＴＧ（配列番号１２６）でなければならないことを示す。位置＋１に「Ａ」を有するデコイの優れた結合親和性は、著しく新しく、予想外の知見である。
（２）別の重要な知見は、位置＋１に「Ｇ」を有することは、結合親和性を著しく低下させ、従って避けられるべきであることである。
（３）位置−１に「Ａ」を有するデコイもまた、弱められた結合を示した。
（４）位置−２にＴもしくはＡを有するデコイは、弱められた結合を示した。
（５）位置−３に「Ｔ」を有するデコイは、優れた結合親和性を有する。
（６）位置＋５にＡもしくはＧを有するデコイは、増大された親和性を有する。
（７）このデータはまた、位置−４もしくは＋２での塩基組成について特別な要求が存在せず、従って本明細書中のデコイ分子はこれらの位置で任意の塩基を含み得ることを、明確に示す。
（８）隣接する５’配列の比較は、ＧＣＡＧまたはＧＧＡＧまたはＧＣＡＴまたはＣＣＣＴまたはＣＣＧＴの塩基組成が、低い競合（例えば、野生型デコイと比べてより大きい比）をもたらし得ることを示唆する。
（９）本発明者らが比を分類するならば、より良い競合（例えば、より小さい比）を有するデコイは、大部分が位置「−４」および「−１」に各々塩基「Ｇ」および塩基「Ｔ」を共有する（図３）。より良い競合デコイのために、コア（ＡＣＧＴＧ；配列番号１２６）のすぐ前の４塩基は、「ＧＣＧＴ」（配列番号１２７）のようである（図２）。図２はまた、各々、位置「−４」での「Ｇ」と位置「−１」での「Ｇ」との組合せ、同じく、位置「−３」での「Ａ」と位置「−２」での「Ａ」との組合せが、結合親和性に有利にはならないことを、示唆する。
【０１１４】
（ＥＭＳＡによる確認）
ＨＩＦゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を以下のように行った。共通ＨＩＦ結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてγ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）から調製された１マイクログラムの核抽出物を、競合する、標識されていないＨＩＦ二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）もしくはスクランブルされたｄｓＯＤＮの存在下または非存在下で、３５ｆｍｏｌの放射性標識プローブと共にインキュベートした。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭのＫＣＬ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＮＰ−４０、０．０２５％のＢＳＡおよび１μｇのポリ−ｄＩｄＣからなる２０μｌの反応容積中で、室温にて３０分間インキュベーションを行った。この反応物を、６％のポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動に供し、乾燥させた。乾燥させたゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、画像化し定量した。この放射性標識オリゴヌクレオチドプローブに結合された複合体中に含まれるＨＩＦタンパク質の同一性を、ＨＩＦファミリーの各々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に、この反応物を５分間プレインキュベートし、放射性標識プローブを添加することによって、同定した。
【０１１５】
選択されるデコイの結合は、従来のＥＭＳＡ法によって確認される。
【０１１６】
図１８は、予測される結合と観察される競合比との間の関係を示す。生命情報科学的アプローチが、任意の所定のデコイがＨＩＦ（例えば、ＨＩＦ−１）に結合する能力を正確に予測するならば、予測されたデータ  対  実際のデータのプロットは、優れた相関係数を有する直線となる。しかし、図１８が示すように、予測されるデコイ分子の結合／競合と実際のデコイ分子の結合／競合との間には、比較的低い相関関係が存在する。図１８において、配列は数個のカテゴリーに分けられる。ＨＩＦ−１によって調節される遺伝子由来の天然の配列を、丸として示し；設計されたデコイ配列をひし形として示し；特定の構造活性関係（ＳＡＲ）問題を試験するために特別に設計された配列は三角であり；そして、四角は、弱い結合をするものと意図されるコントロールもしくは変異型の配列を表す。
【０１１７】
いくつかの顕著な例は、予測される結合スコア０．９９７を有する配列８５７である。この配列８５７は、２．５倍のモル過剰である３より大きい実際のスコアを有する。配列８．５９は、０．９７８の予測されるスコア、および２．５倍のモル過剰である２．４２の実際のスコアを有する。最もよく結合するもの（比が１より小さい）の比較は、０．９３８ほど低くからほとんど１（０．９９）までの予測されるスコアを有する。
【０１１８】
予測されるスコアと絶対的なスコアとの間のこの低い相関関係は、ＨＩＦデコイ分子の設計における、隣接配列の長さおよび組成の効果の解析を含む、実際の構造−機能研究の必要性を強調する。
【０１１９】
（実施例２）
（結合特性への５’隣接配列の長さの効果）
以下の表４は、全てが最適のコアおよび公知の望ましい３’隣接配列を含む、一連のデコイ分子の比較を示す。これらの配列の間の主要な相違は、５’隣接配列の長さである。７個以上の塩基の５’隣接部分を有する多数の付加的なデコイもまた解析し、最適のコアおよび望ましい３’隣接部分を有する付加的なデコイの全てが、１．２５またはより好ましい範囲にスコア（競合比）を有することを見出した。従って、５個以下の塩基の５’隣接部分は、一般的に、望ましいＨＩＦ結合を支持するために十分ではない。６塩基を有する３’隣接部分は望ましい結合を示し得るが、３’隣接領域において７個以上の塩基を有する配列は、一般的に、はるかに好ましい結合特性を有する。この研究の結果はまた、３’隣接配列中の位置＋１ではＡについての選択性が存在するが、Ｇはこの位置では好まれないことを、示唆する。加えて、３’隣接配列中では、より高いＧＣ含有量についての選択性が存在する。
【０１２０】
【表４−１】
2007512847.tif 000016
【０１２１】
【表４−２】
2007512847.tif 000017
（実施例３）
（結合親和性への骨格の置換の効果）
骨格のホスホジエステル結合（ＰＯ）に硫黄置換を有さない単一のデコイ配列（８９５／８９６）の結合親和性を、３’末端を始点としてホスホジエステル結合に６個までの硫黄置換を有するデコイ配列と比較する、一連の実験を行った。３’末端を始点としてホスホジエステル結合に６個までの硫黄置換を有するデコイ配列を、ハイブリッド骨格としてのＨ、および３’末端を始点とする置換の数で標識した。例えば、Ｈ３は、３’末端を始点として第１、第２、第３の結合位置に置換を有するハイブリッド骨格を示す。全てのホスホジエステル結合が置換されている場合、その分子をＰＳと称する。
【０１２２】
【表５】
2007512847.tif 000018
表５に列挙されるデータは、完全なホスホジエステル骨格である８９５／８９６  ＰＯ／ＰＯと比較して、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、およびＰＳ、ならびに混合鎖であるＨ３／Ｓ、ＰＳ／ＰＯ、およびＨ５ＰＯの全てが、十分な結合を維持することを示す。十分に機能しなかった唯一の置換は、Ｈ１であった。従って、本発明のデコイは、改変された骨格を有するデコイを包含する。
【０１２３】
（実施例４）
（ＨＩＦデコイ分子はＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１β複合体に結合する）
（方法）
ＨＩＦ−１αゲルシフトアッセイを、以下のように行った。ＨＩＦ−１αＤｅｃｏｙ（５’ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＧ  ３’（配列番号１３０））に対するＨＩＦ−１α結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてγ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。酸素正常状態または低酸素状態のいずれかのＭｉａＰａＣａ（膵臓腫瘍細胞株）から調製された５μｇの核抽出物を、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−１βのいずれかに特異的な抗体の存在下または非存在下で、３５ｆｍｏｌの放射性標識プローブと共にインキュベートした。このインキュベーションを、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．６、１００ｍＭのＫＣＬ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．２ＭのＰＭＳＦ、０．２Ｍのオルトバナジン酸ナトリウムおよび１μｇのポリ−ｄＩｄＣ（Ｒｏｃｈｅ）からなる２０μｌの反応容積中で、室温にて３０分間行った。この反応物を、５％のポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動に供し、乾燥させた。乾燥させたゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、画像化し定量した。この放射性標識オリゴヌクレオチドプローブに結合された複合体中に含まれるＨＩＦ−１αタンパク質の同一性を、ＨＩＦ−1αファミリーの各々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に、この反応物を５分間プレインキュベートすることによって同定した後、放射性標識プローブを添加した。
【０１２４】
（結果）
低酸素状態に暴露される場合、ＨＩＦα放射性標識プローブに結合するタンパク質複合体が誘導される。図３に示すように、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１βの両方に対する抗体は、バンドをスーパーシフト（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ）し得、これらの抗体がその標的に特異的に結合し、従ってこの複合体の運動性を低下させることを示す。このことは、このバンドがＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１βヘテロダイマーからなることを示す。
【０１２５】
以下の全ての実施例において、ＨＩＦデコイ分子は、ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３（上位鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号１３４）：相補鎖−ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ（配列番号１３５））である。
【０１２６】
（実施例５）
（ＨＩＦデコイはＨＩＦに結合してＨＩＦを遮断するが他のＴＦを阻害しない）
（方法）
ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３が、その標的であるＨＩＦ−１ならびに他の非標的のＴＦに結合し、従ってそれらの活性を遮断する能力を、実施例４に記載される低酸素状態で誘導された細胞由来の核抽出物を用いて、ＴｒａｎｓＡＭＴＭ法プレートアッセイ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８）によって決定した。
【０１２７】
簡単に述べると、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のプロモーター領域由来のＨＩＦ−１結合部位を含むオリゴヌクレオチドを、９６ウェルのプレートに固定した。低酸素状態で誘導された、ＢｘＰＣ３細胞、ＨＴ２９細胞、ＭｉａＰａｃａ細胞およびＳＨＰ−７７細胞由来の核抽出物（５マイクログラム）を、１０倍のモル過剰のＨＩＦデコイ（８９５：８９６Ｈ３）の存在下または非存在下でこれらのウェルに加え、インキュベートして、このＨＩＦ−１が固定されたＥＰＯ結合部位に結合させた。洗浄の工程に続いて、プレートに結合されたＨＩＦ−１の量を、ＨＩＦ−１αに特異的な抗体を用いてインキュベートし、続いて抗ＨＩＦ−１α抗体を検出するためのＨＲＰ結合二次抗体を用いてインキュベートすることによって、測定した。ペルオキシダーゼの量を、分光器的に測定した。デコイの非存在下における結合の量は、抽出物中の最大のＨＩＦ−１結合を表す。このデコイの存在下における結合の減少を用いて、このデコイがＨＩＦ−１の結合について競合する能力を測定する。これらの結果を、図４に示す。
【０１２８】
同様のアッセイを、非標的の転写因子である、ＮＦ−κＢ、ＳＰ−１、およびＨＦＹＡに特異的なＴｒａｎｓＡＭＴＭキットを用いて行った。全てのアッセイを、競合するＨＩＦデコイ８９５：Ｈ３を（固定されたオリゴヌクレオチドに比較して）１０×モル過剰で加えて、製造者の指示書に従って行った。それらの結果を図５に示す。
【０１２９】
（結果）
ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３は、試験された４種の細胞株の全てについて、核抽出物中でのＨＩＦ結合について、固定されたＥＰＯプロモーター結合部位と競合することが可能であった。図５に示すように、標的のＴＦに対するデコイは、固定された標的結合部位への結合について競合することが可能であったが、ＨＩＦデコイはこれらの非標的の転写因子のいずれの結合をも遮断することは出来なかった。
【０１３０】
（実施例６）
（ＨＩＦデコイはＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１βを二つの天然のプロモーターに結合させることについて競合する）
この研究の目的は、ＨＩＦ−１αデコイが、二つの天然のプロモーターであるエリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトランスフェリンレセプター由来のＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１β複合体の結合について、競合し得ることを、ゲルシフトアッセイを用いて示すことであった。
【０１３１】
（方法）
ＨＩＦ−１αゲルシフトアッセイを、以下のように行った。トランスフェリンレセプター由来のＨＩＦα結合部位（５’ＣＧＣＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＧ  ３’；配列番号１３１）もしくはエリスロポエチン（ＥＰＯ）プロモーター（５’ＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡ  ３’；配列番号１３２）内に含まれるＨＩＦα結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてγ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。低酸素状態のＳＨＰ−７７細胞（小細胞肺癌腫瘍細胞株）から調製された５μｇの核抽出物を、競合する未標識ＨＩＦα二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ（ＯＤＮ）の漸増するモル量の存在下または非存在下で、３５ｆｍｏｌの放射性標識プローブと共にインキュベートした。このインキュベーションを、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．６、１００ｍＭのＫＣＬ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．２ＭのＰＭＳＦ、０．２Ｍのオルトバナジン酸ナトリウム、および１μｇのポリ−ｄＩｄＣ（Ｒｏｃｈｅ）からなる２０μｌの反応容積中で、室温で３０分間行った。この反応物を、５％のポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動に供し、乾燥させた。乾燥したゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、画像化し定量した。この放射性標識オリゴヌクレオチドプローブに結合された複合体中に含まれるＨＩＦαタンパク質の同一性を、ＨＩＦαファミリーの各々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に、この反応物を５分間プレインキュベートすることによって前もって同定した後、放射性標識プローブを添加した（データは示さず）。
【０１３２】
（結果）
図６に示すように、ＨＩＦ−１αデコイは、ＨＩＦαの結合について、試験された二つの天然のプロモーターから効果的に競合することが可能であった。ＥＰＯプロモーターの場合において、ＨＩＦαデコイは、２０倍のモル過剰で、ＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１β複合体の結合について効果的に競合することが可能であった（より低い濃度はこの時点においては試験されない）。トランスフェリンレセプターのプロモーターについては、ＨＩＦ−１αデコイは、２０倍のモル過剰で、ほとんどのＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１β複合体の結合について、効果的に競合することが可能であった。
【０１３３】
（結論）
低酸素状態に暴露された場合に高レベルのＨＩＦ−１α転写因子を発現するように腫瘍細胞を誘導すること、およびその複合体をゲルシフトアッセイを用いて同定することが可能であった。ＨＩＦ−１αデコイは、二つの天然のプロモーターであるエリスロポエチンおよびトランスフェリンレセプター由来のＨＩＦ−１α結合部位から離れてＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１β複合体の結合について、競合することが可能であった。
【０１３４】
（実施例７）
（ＨＩＦデコイは転写因子Ｏｃｔ−１に結合しない）
ＨＩＦ-１αデコイが偏在性の転写因子であるＯｃｔ−１に結合しないことを示すために、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を用いて研究を行った。
【０１３５】
（方法）
Ｏｃｔ−１ゲルシフトアッセイを、以下のように行った。Ｏｃｔ−１結合部位（５’ＴＧＴＣＧＡＡＴＧ  ＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡ  ３’；配列番号１３３）を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてγ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＭｉａＰａＣａ細胞から調製された５μｇの核抽出物を、競合する未標識ＨＩＦ−１α二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ（ＯＤＮ）の漸増するモル量の存在下または非存在下で、３５ｆｍｏｌの放射性標識プローブと共にインキュベートした。このインキュベーションを、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭのＫＣＬ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、６％のグリセロール、０．１％のＮＰ−４０、０．０２％のＢＳＡおよび１μｇのポリ−ｄＩｄＣ（Ｒｏｃｈｅ）からなる２０μｌの反応容積中で、室温で３０分間行った。この反応物を、６％のポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動に供し、乾燥させた。乾燥させたゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、画像化し定量した。この放射性標識オリゴヌクレオチドプローブに結合された複合体中に含まれるＯｃｔ−１タンパク質の同一性を、Ｏｃｔ−１オリゴヌクレオチドが取り除かれた結合された複合体をスクランブルされた配列に対して競合させることによって、同定した。
【０１３６】
（結果）
図７に示すように、無関係な転写因子であるＯｃｔ−１のその特異的な結合部位への結合は、ＨＩＦ−１αデコイによって阻害されなかった。
【０１３７】
（実施例８）
（ＨＩＦデコイを用いる癌細胞の処理は低酸素誘導性のＨＩＦ活性を誘導する）
（方法）
ＨＴ−２９（ヒト結腸癌）、ＭｉａＰａＣａ２およびＢｘＰｃ３（ヒト膵臓癌）、ならびにＳＨＰ−７７（ＮＳＣＬＣ）腫瘍細胞株を、ＡＴＣＣから得、そして適切な培地中で５％のＣｏ２中に維持した。ＨＩＦ活性を、これらの細胞を１％のＯ２条件において２４時間までインキュベートすることによって、または、ＢｅｈｒｏｏｚおよびＩｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３３：１５１−６０（１９９７））によって報告されるように、２６０μＭのＣｏＣｌ２の培地への添加によって、誘導した。ＨＩＦデコイがこれらの細胞においてＨＩＦ活性を遮断する能力を測定するために、これらの細胞を、１０分間の６ｐｓｉでの加圧処理を用いて、様々な量のＨＩＦ−１デコイ８９５：８９６Ｈ３でトランスフェクトした。核抽出物を、このデコイの添加の２４時間後にこれらの細胞から調製した。
【０１３８】
核抽出物中の活性ＨＩＦ−１の量を、ゲルシフトアッセイを用いて定量した。ＨＩＦαデコイ（５’ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＧ  ３’；配列番号１３０）に対するＨＩＦα結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてγ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。酸素正常状態または低酸素状態のいずれかの、ＭｉａＰａＣａ（膵臓の）腫瘍細胞、ＳＨＰ−７７（小細胞肺癌）腫瘍細胞、ＨＴ−２９（結腸）腫瘍細胞、もしくはＢｘＰｃ−３（膵臓の）腫瘍細胞から調製された５μｇの核抽出物を、３５ｆｍｏｌの放射性標識プローブと共にインキュベートした。このインキュベーションを、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．６、１００ｍＭのＫＣＬ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．２ＭのＰＭＳＦ、０．２Ｍのオルトバナジン酸ナトリウム、および１μｇのポリ−ｄＩｄＣ（Ｒｏｃｈｅ）からなる２０μｌの反応容積中で、室温で３０分間行った。この反応物を、５％のポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動に供し、乾燥させた。乾燥させたゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、画像化し定量した。この放射性標識オリゴヌクレオチドプローブに結合された複合体中に含まれるＨＩＦ−１αタンパク質の同一性を、ＨＩＦ−１αファミリーの各々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に、この反応物を５分間プレインキュベートすることによって同定し、放射性標識プローブを添加した。
【０１３９】
培地中へ分泌されるｈｕＶＥＧＦの量を、正確に製造者（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ  ５５４１３）によって記載されるとおりにｈｕＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。これらの細胞を収集し、ｍＲＮＡを、再度正確に製造者によって記載されるとおりにＲＮＡｅａｓｙＴＭ  ９６ウェルキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．２７２２０  Ｔｕｒｎｂｅｒｒｙ  Ｌａｎｅ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ  ９１３５５）を用いて調製した。ＶＥＧＦのｍＲＮＡの量を、β−アクチンのｍＲＮＡの量に対して、製造者の指示書のとおりにＡＢＩ  ＳＤＳ  ２．２ソフトウェアを備えるＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ−７９００ＨＴサイクラーにおける定量的ＰＣＲを用いて、定量した。
【０１４０】
（結果）
ゲルシフトによって測定されるＨＩＦ−１αの活性、およびＥＬＩＳＡによって測定される分泌されるＶＥＧＦは、全ての細胞株において低酸素状態によって増加した（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０１４１】
図７に示すように、ゲルシフトアッセイにおいて、ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３の上昇する濃度での腫瘍細胞のトランスフェクションは、ＨＩＦ−１共通結合部位（５’ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＧ  ３’、配列番号１３０）へのＨＩＦ−１の結合を低下させた。
【０１４２】
（実施例９）
（異種移植研究におけるＨＩＦデコイの効力）
（異種移植腫瘍モデル）
６〜８週齢のｎｕ／ｎｕマウスに、ヒトの腫瘍細胞株を皮下移植した。腫瘍が１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３の容積に達した場合、これらの腫瘍を各々の群が同等の平均容積を有するように無作為に６〜１５個の群に分け、そして、動物を、背側に挿入されるＡｌｚｅｔ浸透ミニポンプを介した連続的な皮下送達によって、または、ボーラスな腹腔内注射もしくは静脈内注射によって、処置する。全てのデコイを、生理食塩水中に再懸濁し、研究ごとに適切なビヒクルのコントロールを含めた。
【０１４３】
移植の日に、細胞を収集し、ＦＢＳを含まない培養培地中で二回リンスし、計数し、そして１ｍｌあたり５０，０００，０００個〜１００，０００，０００個の細胞の懸濁液を得るように適切に希釈した（必要であれば、移植の直前に、細胞を５０％のＭａｔｒｉｇｅｌで１：２に希釈した）。マウスに、正中線のすぐ傍の腹部の腹側において３×１０６個〜５×１０６個の細胞を皮下注射した。全てのマウスの体重を計測し、腫瘍が触知可能かつカリパスを用いて計測されることが可能となった後３日〜７日毎に、カリパス計測を行った。その長さおよび幅を、計測された腫瘍の容積を計算するために用いた。腫瘍の体積を、計算式（Ｖ＝（長さ×（幅）２／２））を用いて決定した。
【０１４４】
（腫瘍の分析）
各々の実験の最後（処置開始の１〜６週間後）に、動物を麻酔下の全採血によって安楽死させ、各々の群からの腫瘍（および他の組織）を採取し、重量を計測し、そして１０％の中性緩衝化ホルマリン中で固定するかもしくは液体窒素中で急速（ｓｎａｐ）凍結した。固定された組織を、低酸素症、アポトーシス、血管（ＣＤ−３１検出）、ＨＩＦ−１、ＶＥＧＦなどのような種々のマーカーの組織学的解析のために処理した。血清サンプルを、先に記載されるように、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットを用いるＥＬＩＳＡによって、ｍＶＥＧＦレベルおよびｍＥＰＯレベルについて解析した。
【０１４５】
（ＨＴ−２９結腸異種移植腫瘍における効力の研究）
結腸癌の処置のための標準的な治療法の一つは、５−ＦＵである。ＨＴ−２９腫瘍を有するマウスに送達されるＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３を、５−ＦＵ単独、および５−ＦＵとの組合せと比較する研究を行った。
【０１４６】
デコイを、毎日の５ｍｇ／ｋｇ／日での腹腔内注射によって投与し、５−ＦＵを投与した。ＨＩＦデコイ（毎日の５ｍｇ／ｋｇ／日での腹腔内注射）を用いる処置は、腫瘍の成長の速度を減少させた（図１０）。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を、計算式（＝（（処置の最後での処置される腫瘍の大きさ−処置の最初での処置される腫瘍の大きさ）／（処置の最後でのビヒクルの腫瘍の大きさ−処置の最初でのビヒクルの腫瘍の大きさ）−１）＊１００）を用いて計算した。５−ＦＵ（１週間あたり２回、２５ｍｇ／ｋｇ／投与で、静脈内（ｉ．ｖ．）の尾の静脈注射による）を用いた場合に５１％のＴＧＩを観察し、二つの薬剤を組み合わせた場合に５８％のＴＧＩを観察した。
【０１４７】
（ＨＩＦデコイはアポトーシスを増加させる）
生理食塩水処置した４個のコントロール腫瘍、およびＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３処置した群由来の４個の腫瘍を、固定し、切片を作成し、断片化された染色体ＤＮＡを蛍光ＦＩＴＣ標識を用いて検出するためにＴｕｍｏｒＴＡＣＳＴＭ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８７７）を用いてアポトーシス小体を染色した。核の対比染色を、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色を用いて行った。ＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．）を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  Ｐｌｕｓ顕微鏡を用いて、腫瘍の中心断面から１０×倍率で無作為に５枚の画像を取得することによって、この染色の画像化を行った。ＩｍａｇｅＰＲＯソフトウェアを用いてアポトーシスの定量を行った。存在する核の数を、Ｈｏｅｓｃｈｔの蛍光を捕捉することにより決定し、ＴｕｍｏｒＴＡＣＳＴＭによってもまた染色された核の数を、アポトーシス細胞の比率として見なした。ＨＩＦデコイ処置は、アポトーシス細胞の数の２．５倍の増加をもたらした（図１１）。
【０１４８】
第二の研究において、ＨＴ−２９腫瘍を有するマウスに、ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３を皮下注入によって連続的に送達される１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与した。腫瘍を凍結し；ｍＲＮＡを標準的な方法を用いて調製し、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを上に記載されるように定量した。処置された動物の腫瘍中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの量に、有意な減少（ｐ＝０．００７５  Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ）が存在した（図１２）。
【０１４９】
（実施例１０）
（ＡｖａｓｔｉｎＴＭを用いる併用処置）
腫瘍の新脈管形成の阻害が、その腫瘍をより低酸素状態にし、ＨＩＦの量を増加させ、それによってＨＩＦデコイについての治療の窓（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を増加させることを、仮定した。このことは、ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３と新脈管形成因子との併用治療が、より治療的であることを含意する。この仮説を検証するために、ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３を、２群の動物に、２種の用量（３０ｍｇ／ｋｇ／日および４５ｍｇ／ｋｇ／日）で、連続的な注入によって投与した。抗新脈管形成因子ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（抗ＶＥＧＦ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、２群のマウスに０．４ｍｇ／ｋｇ／投与（低用量）および２ｍｇ／ｋｇ／投与（最大用量）の用量で毎週２回静脈内注射によって送達した。第六群においては、低用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭおよび低用量のＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３の両方を用いた。この研究の結果を、図１３に示す。８日間の処置の後、３０ｍｇ／ｋｇ／日のデコイ処置群は、２４％のＴＧＩを示し、４５ｍｇ／ｋｇ／日のデコイ処置群は、５２％のＴＧＩを示した。この用量は、低用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭと３０ｍｇ／ｋｇ／日のデコイとを合わせた場合と同じであった。低用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭ単独は、３９％のＴＧＩをもたらし、高用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭ単独は、６３％のＴＧＩをもたらした。
【０１５０】
これらのデータは、高用量のデコイでのＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３処置が、５０％より大きい腫瘍抑制を与えることを示す。この抑制のレベルは、ＡｖａｓｔｉｎＴＭを用いた場合に見られる抑制のレベルと同様であり、この実験において、ＡｖａｓｔｉｎＴＭを用いる併用治療は、さらなる効果を有した。
【０１５１】
（実施例１１）
（さらなる腫瘍モデルにおける効力の研究）
（ＳＨＰ−７７における効力の研究）
先の実施例に記載されるように、細胞を増殖させ、移植した。ＨＩＦ１デコイ８９５：８９６Ｈ３を、２群の動物に、２種の用量（３０ｍｇ／ｋｇ／日および４５ｍｇ／ｋｇ／日）で、連続的な注入によって投与した。抗新脈管形成因子であるＡｖａｓｔｉｎＴＭ（抗ＶＥＧＦ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、２群のマウスに、０．４ｍｇ／ｋｇ用量（低用量）および２ｍｇ／ｋｇ用量（最大用量）の用量で毎週２回静脈内注射によって送達した。第六群においては、低用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭおよび低用量のＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３の両方を用いた。この研究の結果を、図１４に示す。わずか７日間の処置の後に、４５ｍｇ／ｋｇ／日のＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３の効果は、低用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭを用いた場合に見られる効果と同等もしくはそれより高く、併用群は高用量のＡｖａｓｔｉｎＴＭを用いた場合に見られる効果と同様であった。これらのマウスからの血漿を分析し、ＶＥＧＦのレベルを計測した。全ての処置について、ＶＥＧＦの有意な用量依存性減少が存在し、この効果は併用処置において最も高かった。
【０１５２】
（ＭｉａＰａＣａ２における効力の研究）
Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いるＭｉａＰａＣａ２マウスの異種移植モデルを、記載されるように確立した。動物群を２８日間３種の用量（１．７ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、および１５ｍｇ／ｋｇ／日）のＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３で処置した一つの研究において、ＴＧＩの用量依存性の増加が存在し、このＴＧＩの増加は、図１５の左のパネルに示すように、１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で有意（ｐ＝０．０１３９  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）であった。
【０１５３】
循環するｍｕＶＥＧＦのレベルをまた、１５ｍｇ／ｋｇ／日の動物において計測し、これまでのように、図１５の右のパネルに示すように、生理食塩水処置されたコントロールのｍｕＶＥＧＦのレベルからの、ｍｕＶＥＧＦのレベルの有意な減少が存在した。
【０１５４】
最後に、生理食塩水処置された動物および１５ｍｇ／ｋｇ／日の処置をした動物からの大きさが匹敵する腫瘍（１群あたり３個）を固定し、処理し、製造者（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｎｎｅｎｗａｌｄ  ２，８２３７２  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって記載されるように、Ｍ３０  ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ抗体を用いて染色した。ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ抗体は、ヒトのサイトケラチン１８（ＣＫ１８）細胞骨格タンパク質の、カスパーゼによって分割されたホルマリン耐性のエピトープに、特異的に結合し、かつ全てのアポトーシスの段階にある細胞のマーカーである。これまでのように画像を捕捉し、ＮＩＨ製のＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した。得られたデータ（図１６）は、ＨＩＦデコイ８９５：８９６Ｈ３処置されたＭｉａＰａＣａ２腫瘍におけるアポトーシスの有意（ｐ＝０．０２９９  Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ）な増加を示した。
【０１５５】
上記の実施例において示される試験に基づいて、ＨＩＦのｄｓＯＤＮ分子の好ましい群は、番号８９５、９８５、９８７、９６３、９９３、および９９５のデコイの群から選択されるセンス鎖を含む。
【０１５６】
本開示を通して引用される全ての引用文献は、本明細書によって明白に参考として援用される。
【０１５７】
本発明は特定の実施形態を参照することによって説明されているが、本発明はそれに限定されない。本明細書において表される結果に基づいて、当業者は、特定の適用の最適なデコイを設計するために、種々のさらなる改変が可能であり、過度の実験をすることなく行われ得ることを、理解する。全てのそのような改変および変更は、本明細書の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、本発明のＨＩＦデコイ配列のコア領域および直接隣接する領域の両方についての塩基組成を計算的に記載する、マトリックスである。
【図２】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図２Ａ】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図２Ｂ】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図２Ｃ】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図２Ｄ】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図２Ｅ】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図２Ｆ】図２は、結合親和力によって分類された本発明のＨＩＦデコイ分子を、結合親和力と相関する特定の共有される配列を強調して示す。
【図３】図３は、本発明の代表的なＨＩＦデコイがＨＩＦ活性の強力なインヒビターであることを示す。
【図４】図４は、ＨＩＦデコイが、核抽出物において、ＨＩＦ結合について固定されたＥＰＯプロモーター結合部位と競合し得ることを示す。
【図５】図５は、ＨＩＦデコイが他の転写因子を阻害しないことを示す。
【図６】図６は、ＨＩＦデコイが、ＨＩＦα／ＨＩＦβ複合体への結合についてＥＰＯおよびトランスフェリンレセプターのプロモーターと効果的に競合することを示す。
【図７】図７は、無関係の転写因子であるＯｃｔ−１のその特異的な結合部位への結合が、上記のＨＩＦデコイによって阻害されないことを示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、（Ａ）ゲルシフトによって計測されるＨＩＦα活性、および（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって計測される分泌されるＶＥＧＦが、試験された細胞株において、低酸素によって増加されたことを示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、（Ａ）ゲルシフトによって計測されるＨＩＦα活性、および（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって計測される分泌されるＶＥＧＦが、試験された細胞株において、低酸素によって増加されたことを示す。
【図９】図９は、ＨＩＦデコイが、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株、結腸癌細胞株、および膵臓癌細胞株においてＨＩＦ−α活性を遮断することを示す。
【図１０】図１０は、低用量のＨＩＦデコイが、ＨＴ−２９結腸腫瘍細胞株の増殖を阻害することを示す。
【図１１】図１１は、ＨＩＦデコイが、ＨＴ−２９結腸腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することを示す。
【図１２】図１２は、ＨＩＦデコイがＨＴ−２９結腸腫瘍細胞株においてＶＥＧＦのレベルを減少させることを示す。
【図１３】図１３は、ＨＴ−２９結腸腫瘍細胞株の増殖を阻害することにおけるＨＩＦデコイの効力を、ＡｖａｓｔｉｎｅＴＭ（ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）と比較して、およびＡｖａｓｔｉｎｅＴＭとの組合せにおいて示す。
【図１４】図１４は、ＨＩＦデコイが、ＳＣＬＣ腫瘍の成長および血清のｍＶＥＧＦレベルを阻害することを示す。
【図１５】図１５は、膵臓の異種移植におけるＨＩＦデコイの用量依存的な効力を示す。
【図１６】図１６は、ＨＩＦデコイが、ＭｉａＰａＣａ膵臓腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することを示す。
【図１７】図１７は、感受性のプロットであり、センス鎖の位置−４から位置＋３にわたっての種々のヌクレオチド塩基置換の、ＨＩＦオリゴヌクレオチドデコイ分子の結合親和力への効果を示す。
【図１８】図１８は、予測される結合と観察される競合比との間の関係を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月3日(2006.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007512847.tif 000080
2007512847.tif 000081
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