(57)【要約】  医薬化合物を製造するための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬化合物を製造するための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用。
【請求項２】
痛みの調節のための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用。
【請求項３】
痛みを調節する化合物を同定するための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用。
【請求項４】
十分な量のＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を、個体に投与することを含む、痛みを軽減する方法。
【請求項５】
医薬品として使用するための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体。
【請求項６】
痛みを予防または治療するための医薬品として使用するための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体。
【請求項７】
医薬化合物は、痛みを予防または治療するための化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
化合物は、痛みを軽減するか、または止める、請求項３に記載の使用。
【請求項９】
痛みを調節、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法であって、
ａ．２つのサンプルを提供する工程、
ｂ．ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含む１つのサンプルと、化合物とを接触させる工程、
ｃ．化合物の存在下で、ＰＡＭ活性を測定する工程、
ｄ．化合物の非存在下で、ＰＡＭ活性を測定する工程、および、
ｅ．ｃ）によるＰＡＭ活性と、ｄ）によるＰＡＭ活性とを比較する工程
を含む、上記方法。
【請求項１０】
ＰＡＭは、ヒトＰＡＭである、請求項１、２、３もしくは８のいずれか一項に記載の使用、または、請求項４もしくは９のいずれか一項に記載の方法、または、請求項５もしくは６に記載のＰＡＭ。
【請求項１１】
ＰＡＭは、単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項１、２、３もしくは８のいずれか一項に記載の使用、または、請求項４もしくは９のいずれか一項に記載の方法、または、請求項５もしくは６に記載のＰＡＭ。
【請求項１２】
ＰＡＭはポリペプチドである、請求項１１に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１３】
ＰＡＭは、配列番号２に記載の配列またはそれらのフラグメントを含む、または、それからなるポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメント、または、配列番号１に記載の配列またはそれらのフラグメントを含む、または、それからなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメントである、請求項１１または１２に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１４】
ＰＡＭはポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１５】
ＰＡＭは、配列番号１に記載のＰＡＭの機能的フラグメントをコードする配列、または、その配列の一部を含む、または、それからなるポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１６】
機能的フラグメントまたは誘導体は、アデニリルシクラーゼ活性を阻害することができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１７】
アデニリルシクラーゼは、アデニリルシクラーゼＩ、ＶまたはVI型である、請求項１６に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１８】
機能的フラグメントは、ヒトＰＡＭの、好ましくは配列番号２に記載のヒトＰＡＭの、アミノ酸４００〜１４００、好ましくは４４６〜１０６２、４９９〜１０６５または１０２８〜１２３１、より好ましくは１０００〜１３００、さらにより好ましくは１０００〜１１００、さらにより好ましくは１０２８〜１０６５を含む、または、それからなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項１９】
フラグメントは、配列番号１７〜２３に記載のポリペプチドのいずれか一つを含む、または、それからなる、請求項１６に記載の使用、方法またはＰＡＭ。
【請求項２０】
ＰＡＭを発現する、好ましくは組換えＰＡＭを発現する細胞が用いられる、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
その改変されていない状態と比較して低いＰＡＭ活性を有する改変された細胞が用いられる、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＡＭノックアウト細胞が用いられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＡＭ活性は、直接測定される、請求項９、２０または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＡＭ活性の測定は、それらのアデニレートシクラーゼと相互作用する能力、好ましくはアデニレートシクラーゼを不活性化する能力に関する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＡＭ活性は、間接的に測定される、請求項９、２０または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
痛みを調節する化合物を同定する方法であって、
ａ．試験化合物として、ＰＡＭの活性を調節する化合物を選択すること、および、
ｂ．上記試験化合物を被検体に投与して、痛みが調節されているかどうかを測定すること
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＭ（Ｍｙｃ関連タンパク質）の使用に関する。本発明のその他の形態は、医薬のスクリーニング方法、および、痛みを治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
痛みは、実際の、または潜在的な組織のダメージに反応して起こる複雑で主観的な感覚であり、それに対する感情的な応答である。急性の痛みは、潜在的な、または実際の外傷を示す生理学的なシグナルである。慢性の痛みは、体性性（器質性）または心因性のいずれかであり得る。慢性の痛みはしばしば、自律神経性の徴候を伴うか、または、その後に自律神経性の徴候が続くため、場合によっては、うつ状態に陥る。
【０００３】
体性性の痛みは、侵害受容性、炎症性、または、神経障害性によるものと考えられる。侵害受容性疼痛は、体性または内臓の痛みを感じる神経線維の継続的な活性化と同じと判断されている。神経障害性の痛みは、神経系の機能障害から生じる；末梢神経系、ＣＮＳ、または、その両方における異常な体性感覚のプロセスによって持続すると考えられている。（痛みのメカニズムの総論については、例えば、ＳｃｈｏｌｚおよびＷｏｏｌｆ，２００２年；ＪｕｌｉｕｓおよびＢａｓｂａｕｍ，２００１年，ＷｏｏｌｆおよびＭａｎｎｉｏｎ，１９９９年；Ｗｏｏｄ，Ｊ.Ｄ.，２０００年；ＷｏｏｌｆおよびＳａｌｔｅｒ，２０００年を参照）。
【０００４】
慢性の痛みは、個人が被る、加えて社会的、経済的な途方もない費用を発生させる。現存する薬理学的な痛みの治療は、有効性と安全性の両方に関してはなはだ満足のいくものではない。
【０００５】
これまで、痛みの治療には、２つのクラスの鎮痛薬が主として用いられている：非オピオイド鎮痛薬、大部分がアセトアミノフェンとＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）、および、オピオイド（麻酔性）アゴニスト（ここにおいて、「オピオイド」は、ＣＮＳ中の特異的なオピオイド受容体に結合し、アゴニスト作用を生じさせる天然または合成物質の一般名称である）。遺憾ながら、両方の鎮痛薬クラスであるオピオイドおよび非オピオイドは、いくつかの不要な副作用がある。オピオイドの最も重篤な副作用は、呼吸器系を阻害する可能性と、長期の治療の後に依存症になる可能性である（Ｓｃｈａｉｂｌｅ  Ｈ.Ｇ.，Ｖａｎｅｇａｓ  Ｈ.，２０００年）。一方で、非オピオイドの主要なクラスであるＮＳＡＩＤは、多種多様な潰瘍や出血のような胃腸の合併症、加えて腎臓障害を誘導する可能性がある（Ｓｃｈａｉｂｌｅ  Ｈ.Ｇ.，Ｖａｎｅｇａｓ  Ｈ.，２０００年）。米国では毎年、従来のＮＳＡＩＤによって引き起こされる重度の胃腸の合併症のために約１６,０００人の患者が死亡していると推測されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最先端の痛みの治療に関連する深刻な欠点を考慮すると、痛みを調節する薬物の新規のクラスの多大な必要性がある。特別には、急速に進む痛みの神経生物学の理解と、最先端の治療の欠点がない有効な治療を提供するという未だ満たされていない臨床上の必要性との間にある大きなギャップを考慮すると、新規の鎮痛薬のクラスに関する新しい標的の発見に努力を向ける必要がある。従って、本発明の目的は、痛みを調節する薬物の新しいクラスを開発し、提供する新しい手段を提供することである。
【０００７】
この目的は、痛みを調節する医薬化合物を製造するための、ＰＡＭまたはそれらの機能
的フラグメントもしくは誘導体の使用によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、侵害受容過程におけるＰＡＭの関連と、その痛みを減少させる能力を初めて実証した発明者等の発見に基づく。機能的な、という用語は、ＰＡＭが、細胞内のｃＡＭＰレベルを低める、または、ＡＣと相互作用する能力を意味し；より好ましくは、この用語は、ＰＡＭが、ＡＣ活性を阻害する、さらにより好ましくはその痛みを減少させる能力能力を意味する。
【０００９】
ＰＡＭのフラグメントは、対応する野生型より短いあらゆるポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、例えば、登録番号ＡＣＣ３９９２８（配列番号１）、ＮＰ＿０５５８７２、ＮＭ＿０１５０５７、ＡＦ０７５５８７（配列番号２）に記載の配列のいずれか一つに記載のホモサピエンス（ｈｓ）ＰＡＭより短いあらゆるポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または、登録番号ＮＴ＿０２４５２４.１１に記載の配列の２４６７９８６１〜２４９６２２４５位のポリヌクレオチド（配列番号３）より短いあらゆるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドであり得る。
【００１０】
ＰＡＭまたはＰＡＭフラグメントの誘導体としては、ＰＡＭの機能を有するアミノ酸もしくはヌクレオチド配列のあらゆる改変体、または、化学的もしくは生物学的な改変のようなその他のあらゆる種類の改変体が可能であり、例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを安定化すること（例えばホスホロチオエート修飾）、または、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの所定の細胞への特異的なターゲティングを可能にすること、または、その細胞への進入もしくは細胞による摂取を容易にすること（例えば細胞浸透性のホスホペプチド、または、例えばアンテナペディア／ペネトラチン、ＴＡＴ、およびシグナル−ペプチドベースの配列に基づく細胞浸透性のペプチドベクターへのカップリング；または、特異的なトランスポーターもしくはインポーターに関するリガンドの一部へのカップリング）が挙げられる。
【００１１】
ＰＡＭまたはそれらのフラグメントもしくは誘導体は、ポリペプチド、または、ポリヌクレオチドのいずれかの形態で用いることができる。それらの必要な部位へのターゲティングと細胞への進入を確実にする、または、容易にするのに適した改変または添加剤が有用である。一方で、それらの脊髄へのターゲティングを確実にするために、適切なカテーテルなどを用いた脊髄内への適用のような局所的な適用なども考えられる。その他の有用な添加剤としては、それらの安定化等のための塩、緩衝液などが挙げられる。
【００１２】
ＰＡＭポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントもしくは誘導体は、例えば、細胞内の発現を確実にする、好ましくは細胞へのターゲティングも確実にする適切なベクターに挿入することができる。細胞型に特異的な発現は、当業界で既知のニューロン特異的な遺伝子の適切なプロモーター／エンハンサーを用いて確実にすることができる。また、ＰＡＭのオリゴヌクレオチドの使用も可能である。
【００１３】
本発明は、発明者等の脊髄および後根神経節（ＤＲＧ）内での感作メカニズムにおけるＰＡＭの驚くべき関連を初めて実証した研究に基づく。
【００１４】
ＰＡＭ（Ｍｙｃ関連タンパク質）は、５１０ｋＤａの巨大タンパク質である。ＰＡＭのタンパク質、ゲノムおよびコードポリヌクレオチド配列は当業界で既知であり、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，ベセスダ，メリーランド州２０８９４，米国；www.ncbi.nhm.nih.gov）データベースより、登録番号ＡＡＣ３９９２８（コード配列；配列番号１）、ＡＦ０７５５８７（タンパク質配列；配列番号２）で公けに利用可能である。ヒトＰＡＭは、染色体１３ｑ２２上に位置する；そのゲノム配列は、ＮＴ＿０２４５２４.１１（始点：２４６７９８６１位；終点：２４９６２２４５位；配列番号３）で、公けに利用可能である。あるいは、これらのタンパク質およびコード配列は、ＫＩＡＡ０９１６、タンパク質登録番号ＮＰ＿０５５８７２（タンパク質配列）、および、ＮＭ＿０１５０５７（コード配列）で、公けに利用可能である。
【００１５】
ラットＰＡＭについて、以下のＥＳＴ−クローンをコードする配列が公けに利用可能である：
ＡＷ９２１３０３（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ９６０〜１３９４に対応する；配列番号４）
ＡＷ９１８７１１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８１８８〜８６３２に対応する；配列番号５）
ＢＱ２０１４８５（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８９６６〜９６３３に対応する；配列番号６）
ＢＥ１１２８８１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１０３１１〜１０８３０に対応する；配列番号７）
ＡＷ４４１１３１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４１５２に対応する；配列番号８）
ＢＦ４０９８７２（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４８０７に対応する；配列番号９）。
【００１６】
ＰＡＭはもともと、ＭｙｃのＮ末端における転写活性化ドメインと特異的に相互作用する能力によって同定された（Ｇｕｏ  Ｑ.等，１９９８年）。ＰＡＭは近年、強力なＡＣ活性阻害剤と説明されているが（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ  Ｋ.，Ｐｉｅｒｒｅ  Ｓ.，Ｐａｔｅｌ  Ｔ.Ｂ.：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｃ(ＰＡＭ)ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ.  Ｊ.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年１２月１４日；２７６(５０)：４７５８３〜９）、侵害受容過程および感作におけるそれらの機能に関する証拠は未だ示されていない。
【００１７】
むしろ、ＰＡＭは、シナプス前部の成長の調節において役割を果たすと考えられている：ＰＡＭのｍＲＮＡは、海馬、歯状回および小脳などの特定の解剖学的な領域で高度に発現されることがわかっている。成体ラットおよびマウスの脳におけるＰＡＭおよびＭｙｃ発現の両方は、小脳の成熟したプルキンエ細胞、ならびに、海馬の顆粒および錐体細胞に限定される（Ｒｕｐｐｅｒｔ  Ｃ．等，１９８６年；Ｙａｎｇ  Ｈ．等，２００２年）。しかしながら、これら細胞型のいずれも、痛みのプロセシングおよび感作に関与することはわかっていない。
【００１８】
ショウジョウバエにおけるＰＡＭ相同体（ｈｉｇｈｗｉｒｅ）、および、Ｃ.エレガンスにおけるＰＡＭ相同体（ｒｐｍ−１）は、シナプス前終末の組織化（Ｚｈｅｎ等，２０００年）、シナプスの成長の調節（Ｗａｎ等，２０００年）、シナプス形成、ならびに、軸索成長およびターゲティング（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等，２０００年）において重要な役割を果たすことが示されている。これらの発見により、ｈｉｇｈｗｉｒｅ、ｒｐｍ−１およびそれらの哺乳動物相同体ＰＡＭは、シナプスの成長の負の調節因子として作用する可能性があるという仮説に至った（Ｃｈａｎｇ等，２０００年；Ｊｉｎ  Ｙ．２００２年）。それに沿って、小脳、海馬および歯状回におけるＰＡＭ発現の劇的な増加が、これら構造体における主要なシナプス形成期の際に観察された（Ｙａｎｇ等，２００２年）。
【００１９】
齧歯類における脳の発達の際に、ＰＡＭ発現は、誕生直後に開始し、最初の２週間の間中アップレギュレートされ、その後、ＰＡＭ発現は、成人期の間中高いレベルを保つ（Ｙａｎｇ等，２００２年）。これまで、脊髄およびＤＲＧにおけるＰＡＭの発現および調節、ならびに、痛みの感作メカニズムおよび調節におけるその機能についてはわかっていない。
【００２０】
これまで、ヒトＰＡＭは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）シグナル伝達の強力な調節因子であり、数種のアデニリルシクラーゼ（ＡＣ；Ｅ.Ｃ.４.６.１.１）アイソフォームの酵素活性をナノモル濃度で阻害する（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）ことが実証されている。
【００２１】
遍在的なサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のセカンドメッセンジャーシステムは、細胞外の刺激を細胞内のシグナルおよび応答に翻訳する様々なシグナル変換メカニズムの一つである。細胞外の刺激を受けると、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、三量体ＧＴＰ結合調節タンパク質（Ｇタンパク質）を介して細胞質膜に結合した酵素またはイオンチャンネルを調節する。ＧＰＣＲによって活性が調節される酵素の一つは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）、ｃＡＭＰ生成酵素である。このようにして、入ってくる細胞外の刺激は、細胞内のメディエイターであるサイクリックＡＭＰの細胞内の濃度に影響を与える。ｃＡＭＰレベルの上昇は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を刺激し、特異的な細胞内の標的タンパク質をリン酸化し、それによってそれらの活性を改変することによって細胞に影響を与える。
【００２２】
それぞれのタイプの細胞は、特徴的な一連のＧＰＣＲ、これらＧＰＣＲによって調節される酵素、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の特異的なサブセットおよび標的タンパク質を有し、これらは、比較的非特異的な、または一般的に生じるプレイヤー（例えば遍在的なｃＡＭＰ）と共に作用して、各細胞が、入ってくる細胞外シグナルに対してそれらに特有の応答を生じさせるようにできる。例えば、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）セカンドメッセンジャーは、シナプス形成性の調節において主要な役割を果たすことがわかっている（Ｂａｉｌｅｙ等，１９９６年；Ｘｉａ等，１９９７年；Ｂｒａｎｄｏｎ等，１９９７年）；一方で、ｃＡＭＰは、代謝プロセスおよび細胞の増殖に関与する。このようにして、遍在的なｃＡＭＰメッセンジャーシステムの役割と、その様々な成分は、様々な組織および細胞型の様々な特殊化に従って多様である。
【００２３】
本発明のさらなる形態は、痛みの調節のための、ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用に関する。この調節は、好ましくは軽減または予防または全体的な抑制である。
【００２４】
その上、本発明は、痛みを調節する化合物を同定するためのＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用を包含する。上記調節する化合物は、好ましくはＰＡＭを活性化する化合物である。より好ましくは、それらは、痛みを予防する、減らす、または、止める能力を有する。
【００２５】
上記化合物は、例えば、それらの以下の能力によって同定することが可能である；
ａ）ＰＡＭの機能を活性化または増強する能力（すなわち、その、細胞内ｃＡＭＰレベルを低める能力、ＡＣのようなその他のファクター（特にＡＣ）と相互作用する能力、ＡＣを阻害する能力、または、その痛みの感覚を低める能力）、または、
ｂ）ＰＡＭをＲＮＡレベルで活性化する能力（すなわち、ＰＡＭ転写の活性化、または、転写物の安定化によって）、または、
ｃ）ＰＡＭをタンパク質レベルで活性化する（すなわち、ＰＡＭの翻訳またはその翻訳後プロセシングの活性化によって；ＰＡＭの翻訳後修飾調節によって、または、その安定の活性化もしくはその分解の阻害によって）。
【００２６】
この観点で、ＰＡＭ（または、そのフラグメントまたはそれらの誘導体）は、ポリペプチド、または、オリゴもしくはポリヌクレオチドのいずれかとして用いることができる。
【００２７】
本発明のその他の形態は、十分な量のＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を個体に投与することを含む、痛みを減らす方法に関する。
【００２８】
投与は、ＰＡＭの作用部位（ＤＲＧまたは脊髄）へのターゲティングを可能にする方法で適切に予備的に行われるべきであり、例えば、必要な部位へのＰＡＭ誘導体またはそれらをターゲティングする製剤の全身投与、または、ＰＡＭまたはそれらのフラグメントもしくは誘導体の局所的な（例えば脊髄内の）適用によってなされる。
【００２９】
本発明のその他の形態は、痛みを調節、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法に関し、以下の工程を含む：
ａ．２つのサンプルを提供する工程、
ｂ。ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含む１つのサンプルと、化合物とを接触させる工程、
ｃ．化合物の存在下で、ＰＡＭ活性を決定する工程、
ｄ．化合物の非存在下で、ＰＡＭ活性を決定する工程、および、
ｅ．ｃ）によるＰＡＭ活性と、ｄ）によるＰＡＭ活性とを比較する工程。
【００３０】
ＰＡＭは、本発明の様々な形態に係る特定の目的が実現されるようなあらゆる配列から得られたものが利用可能である。好ましくは、ＰＡＭは、ヒトＰＡＭである。
【００３１】
本発明の様々な形態に関して、ＰＡＭが、単離されたポリペプチド、または、オリゴもしくはポリヌクレオチドである場合も好ましい。本発明の様々な形態の環境で「単離された」とは、自然源から少なくとも部分的に精製されているか、または、組換えＰＡＭ（これらは当然ながら、精製されていてもよいし、または部分的に精製されていてもよい）を意味する。
【００３２】
アッセイとは、生物学的プロセスをモニターすることができるあらゆるタイプの分析方法のことである。薬物のスクリーニングで使用するためには、このようなアッセイは、再現可能でなければならず、好ましくは拡張可能で、頑強でもある。このようなアッセイは、好ましくは、化学物質の、痛みを調節する（好ましくは減少させる）および／または痛みを予防する能力に関するハイスループットスクリーニングに適している。このアッセイのタイプは、例えば用いられるＰＡＭのタイプ（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれか）と、「読み出し」、すなわちＰＡＭ活性が測定される方法によって様々である（以下を参照）。
【００３３】
このようなアッセイの様々なタイプが一般的に当業界で既知であり、商業的な供給元から市販されている。適切なアッセイは、標識された構成要素と標識されていない構成要素との相互作用を測定するための（例えば、ＰＡＭまたはそれらのフラグメントは、標識することができ、それらのＡＣとの相互作用は、モニターすることができる）、放射性同位体分析、または、蛍光分析、例えば蛍光偏光分析を包含する（例えば、パンベラ（Ｐａｎｖｅｒａ）、パーキン・エルマー・ライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（例えばＬＡＮＣＥ）、または、パッカード・バイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（例えば、ＨＴＲＦまたはアルファスクリーン(ＡＬＰＨＡｓｃｒｅｅｎ)TM）によって商業的に供給されているもの）。
【００３４】
さらなる例としては、細胞に基づくアッセイが挙げられ、この場合、細胞系は、対象の組換えタンパク質を、安定して（誘導的に、または非誘導的に；染色体の、またはエピソームの）、または、一時的に発現する。これらのアッセイは、例えばレポーター遺伝子アッセイを含み、この場合、特定のプロモーター、または、シグナル変換カスケードの構成要素のシグナル伝達経路の調節が、レポーター酵素の活性に従って測定され、このレポーター酵素の発現は、前記特定のプロモーターの制御下にある。このタイプのアッセイにとって、組換え細胞系は、それ自体が調査されるか、または、調査中のシグナル伝達カスケードによって調節される特定のプロモーターの制御下に、レポーター遺伝子が含まれるように構築されていなければならない。適切なレポーター酵素は、当業界で一般的に既知であり、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ（例えば、パッカード・リージェント（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）より市販されている）、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。適切な細胞系は、アッセイ目的に応じて様々であるが、たいていは、トランスフェクトが簡単であり、培養が簡単な細胞系が挙げられ、例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＩＨ−３Ｔ３などである。
【００３５】
細胞内イオン濃度を測定するアッセイとしては、例えばＦＬＩＰＲ（蛍光測定イメージングプレートリーダー、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から市販されている）アッセイが挙げられ、この場合、冷却ＣＣＤカメラと連結されたアルゴンレーザー光源は、３８４ウェルプレートで、細胞（例えば、ニューロンの細胞、または、例えば、組換えもしくは自然に特定のイオンチャンネルを発現する細胞などの細胞）内で、一過性のイオンシグナル（例えばＣａ2+など）を同時測定することを可能にする。ＦＬＩＰＲアッセイは、例えば、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４のような所定の蛍光色素を用いた細胞内のカルシウムのモニタリング、または、ＢＣＥＣＦもしくはＢＣＰＣＦもしくは特異的なＦＬＩＰＲアッセイキットを用いた細胞内のｐＨのモニタリング、または、例えばＤｉＢＡＣもしくは特異的なＦＬＩＰＲアッセイキットを用いた膜電位の変化の検出、または、膜の分極のモニタリングを可能にする。その他の細胞内のイオン、例えば亜鉛またはナトリウムをモニタリングするために、当業界で既知のその他の色素を用いることができる。その他のタイプのアッセイ、および、その他のタイプの読み出しは、一般的に当業者既知である。
【００３６】
ｃＡＭＰレベルの測定のためには、例えばアルファスクリーン、蛍光偏光法またはＨＴＲＦ技術が適切である。
【００３７】
イオンチャンネル活性（これは、例えば細胞内のイオン濃度を制御するため、細胞内のイオン濃度の測定に用いることができる）の測定のためには、例えば、膜電位感応性アッセイおよび色素を用いることができ、例えば、ＤｉＢＡＣ、または、ＦＬＩＰＲ技術に基づくモレキュラーデバイスの膜電位分析キット；ＦＬＩＰＲ技術を用いたミトコンドリア膜の分極を測定するＪＣ−１色素；細胞内のカルシウム濃度測定のための、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４のようなイオン感応性色素、または、モレキュラーデバイスのカルシウム分析キット；細胞内のナトリウムを測定するための、ナトリウム感受性色素（例えばモレキュラープローブス製）；細胞内のカリウム濃度を決定するための、パッチ−クランピングに基づくアッセイ、または、原子吸光分光分析法に基づくルビジウムイオン流出測定などを用いることができる。さらに、細胞内の特定の変化および状態を検出するための自動装置および分析方法は当業者既知であり、例えばアキュメン・バイオサイエンス（ＡＣＵＭＥＮ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製のアキュメン（Ａｃｕｍｅｎ）検出器（適切に標識された目的物の分布の３次元再構築を可能にする蛍光ベースのレーザースキャニングリーダー）が挙げられる。
【００３８】
ＰＡＭポリペプチドは、好ましくは配列番号２に記載の配列を含む、または、それからなるポリペプチドであるか、または、配列番号１または３に記載の配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
【００３９】
ＰＡＭポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１または３に記載の配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチドであるか、または、上記のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる配列を含む、または、それからなるポリヌ
クレオチドである。
【００４０】
ストリンジェンシーとは、２本の一本鎖の核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニールの特異性に影響を与える反応条件を説明する。ストリンジェンシー、すなわち反応の特異性は、特に、反応に用いられる温度と緩衝液条件に依存する：ストリンジェンシー、すなわち特異性は、例えば、反応温度を高める、および／または、反応緩衝液のイオン強度を低めることによって増加させることができる。低いストリンジェント条件（すなわち低い反応およびハイブリダイゼーション特異性）とは、例えば、室温で、２×ＳＳＣ溶液中で、ハイブリダイゼーションが行われる場合に生じる。高いストリンジェンシー条件は、例えば、６８℃、０.１×ＳＳＣ、および、０.１％ＳＤＳ溶液中でのハイブリダイゼーション反応を含む。
【００４１】
本発明の様々な形態の範囲内のストリンジェンシー条件下におけるハイブリダイゼーションは、好ましくは、以下のように理解される：
１）標識されたプローブと解析しようとする核酸サンプルとを、６５℃で、または、オリゴヌクレオチドプローブの場合、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二本鎖のアニーリング温度または融解温度より５℃低い温度で（アニーリング温度および融解温度は、以下では同義語とする）一晩、５０ｍＭトリス（ｐＨ７.５）、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０.５ｍｇ／ｍｌの変性サケまたはニシン精子ＤＮＡ中で、ハイブリダイズする。
２）２×ＳＳＣ中で、室温で１０分間洗浄する。
３）１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度）で、３０分間洗浄する。
４）０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度）で、３０分間洗浄する。
【００４２】
ハイブリダイゼーションプローブとしての使用するためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドであり、好ましくはＤＮＡフラグメントであって、長さが、１５〜３０個、好ましくは２０個のヌクレオチドを有する。アニーリング温度は、式Ｔｍ＝２×（Ａ＋Ｔの数）＋４×（Ｇ＋Ｃの数）℃に従って決定される。
【００４３】
２×ＳＳＣ、または、０.１×ＳＳＣ（または、その他のあらゆる種類のＳＳＣ希釈液）を製造するためには、例えば、２０×ＳＳＣ溶液を適宜希釈する。２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ／０.３Ｍクエン酸Ｎａ×２Ｈ2Ｏからなる。
【００４４】
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、上記ポリヌクレオチドは、必要に応じて、電気泳動による分離を行った後に（次に：サザンブロット(ＤＮＡ)、または、ノーザンブロット(ＲＮＡ)）、または、電気泳動による分離を行わないで（次に：スロットまたはドットブロット）、適切なメンブレン（例えばナイロンまたはニトロセルロースメンブレン）にトランスファーする。ハイブリダイゼーションは、適切に標識されたプローブを用いて行われる。適切な標識技術は、例えば、放射性標識、または、蛍光色素を用いた標識である。上記プローブは、一本鎖ポリリボまたはポリデスオキシリボヌクレオチドであり、自然状態では一本鎖であるか、または、通常は二本鎖で変性によって一本鎖にされる。このプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡサンプル（これらも一本鎖状態である）に、塩基対形成によって結合する。
【００４５】
ＰＡＭフラグメントは、好ましくは上記の配列番号１、２または３に含まれるフラグメントであり、その誘導体は、好ましくは、上記の配列番号１、２もしくは３、または、それらのフラグメントから得られる。
【００４６】
それらの機能的フラグメントまたは誘導体は、好ましくは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性、より好ましくはＡＣのＩ、ＶまたはVI型の活性を阻害することができる。
【００４７】
本発明の様々な形態の好ましい実施形態によれば、ＰＡＭの機能的フラグメントまたは誘導体は、ヒトＰＡＭ配列の、好ましくは配列番号２に記載のヒトＰＡＭ配列の、アミノ酸４００〜１４００、好ましくは４４６〜１０６２、４９９〜１０６５または１０２８〜１２３１、より好ましくは１０００〜１３００、さらにより好ましくは１０００〜１１００、さらにより好ましくは１０２８〜１０６５を含む、もしくは、それからなり、または、それらが上記それぞれのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされる場合、特別には、配列番号２もしくは３に記載の配列に含まれる場合である。
【００４８】
ＰＡＭの機能的フラグメントまたは誘導体が、ポリヌクレオチドである場合、それらは、上記のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、または、それからなる場合が好ましい。より特定には、それらが、ヒトＰＡＭｃｄｓの１４８２〜３３３２位（アミノ酸４４６〜１０６２をコードする）、または、１６４１〜３３４１（アミノ酸４９８〜１０６６をコードする）、または、３２２８〜３８３９（アミノ酸１０３８〜１２３１をコードする）を含む、または、それからなる場合が好ましい。上記フラグメントが得られるヒトＰＡＭｃｄｓが、配列番号２に記載の配列を有する場合がさらにより好ましい。
【００４９】
痛みを調節する化合物を同定するための本発明の方法の好ましい一実施形態によれば、ＰＡＭを発現する細胞、好ましくは組換えＰＡＭを発現する細胞が用いられる。
【００５０】
上記細胞は、あらゆるタイプの細胞が可能であり、例えば、真核性または原核性の単細胞生物（例えば細菌、例えばＥ.ｃｏｌｉ、または、酵母、例えばＳ．ポンベ（Ｓ.ｐｏｍｂｅ）またはＳ．セレビジエ（Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、または、多細胞生物から得られた細胞系（例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＨＯなど）が挙げられ、なかでも哺乳動物細胞系が好ましい。
【００５１】
その他の好ましい実施形態によれば、改変されていない状態と比較して低いＰＡＭ活性を有する改変された細胞が用いられる。この方法において、このような細胞は、それらの痛みを調節する（好ましくは減少させる）および／または痛みを予防する能力に関して試験しようとする化学物質が、低められた、または完全に止められたＰＡＭ活性を増強する、または回復させることができる場合、試験することができる。
【００５２】
上記改変は、あらゆるタイプの改変（安定な、または、一過性の、好ましくは安定な）が可能であり、それにより、ＰＡＭ活性（すなわち、それらの細胞内ｃＡＭＰレベルを低める能力、ＡＣのようなその他のファクター、特別にはＡＣと相互作用する能力、ＡＣを阻害する能力、または、痛みの感覚を低める能力）の減少、ＰＡＭ転写物の定常状態レベルの減少（すなわち、ＰＡＭ転写の活性化、または、転写物の安定化によって）、または、ＰＡＭタンパク質の定常状態レベルの減少（すなわち、ＰＡＭの翻訳、または、その翻訳後プロセシングの活性化によって；ＰＡＭの翻訳後修飾の調節によって、または、その安定化の活性化によって、または、その分解の阻害によって）が起こる。これは、例えば、ＰＡＭの優性の負変異体、ＰＡＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉコンストラクトを用いることによって、機能的またはゲノムＰＡＭノックアウト（これらは、例えば誘導型が可能である）を生成することによって、または、当業界既知のその他の適切な技術によって達成することができる。上記の技術の総論としては、例えば、以下を参照：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ２３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５２，ジョン・ワイリー＆サンズ社(Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．)；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５年），編集者：Ａ.Ｌ.Ｊｏｙｎｅｒ，ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０００年；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９９６年；Ｓｃｈｅｒｒ等，２００３年。好ましい実施形態によれば、ＰＡＭノックアウト細胞が用いられる。ノックアウトを作製するのに適した細胞系は当業界周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ２３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５２，ジョン・ワイリー＆サンズ社；または、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．(１９９５年)編集者．Ａ.Ｌ.Ｊｏｙｎｅｒ，ＩＲＬプレスが挙げられる。
【００５３】
ＰＡＭ活性は、例えば、その（または、そのフラグメントおよび誘導体の）ＡＣと相互作用する、または、ＡＣを不活性化する能力によって直接測定してもよいし、または、例えば、その（または、そのフラグメントおよび誘導体の）細胞内のｃＡＭＰレベルを低める能力、ニューロン内のイオン濃度を調節する能力、または、その痛みの感覚を調節する、特別には減少させる能力によって間接的に決定してもよい。上記のパラメーターを測定するのに適した技術は当業界周知である(上記も参照)：ｃＡＭＰレベルは、例えば、ＨＴＲＦまたはアルファスクリーンTMによって測定することができ、イオン濃度は、例えば、パッチ−クランピングまたは適切な色素によって推定することができ、痛みの感覚は、例えば、ホルマリン試験、または、機械刺激もしくは温熱性痛覚過敏の試験、または、ホットプレート試験などによって測定することができる。
【００５４】
本発明のその他の形態は、痛みを調節する化合物を同定する方法に関し、以下を含む：
ａ）試験化合物として、ＰＡＭの活性を調節する化合物を選択すること、および、
ｂ）前記試験化合物を被検体に投与して、痛みが調節されているかどうかを測定すること。
【００５５】
被検体は、痛みを知覚する能力を有するあらゆる被検体が可能であり、好ましくは哺乳動物であり、すなわちヒト以外の哺乳動物またはヒト（すなわち、患者の研究の範囲内で）のいずれかである。
【００５６】
以下で、本発明を実施例と図によってより詳細に説明する。しかしながら、これら実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例：ＰＡＭ発現パターンおよび機能の調査
１．動物切片標本の製造：
野生型スプラギー・ダーレー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、チャールス・リバー・ウィガ社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｉｇａ  ＧｍｂＨ，ズルツフェルト，ドイツ）から購入した。実験の前は、動物は、えさと水を自由に摂取できるようにした。それらを環境と光を制御した部屋（２４＋０.５℃）で維持した。各動物は、１回の実験のみで用いられた。全ての実験において、意識のある動物を研究するための倫理ガイドラインに従い、その手法は、地域倫理委員会で認証された。殺した後に、成体ラットを、０.１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７.２）中の４％パラホルムアルデヒドで、１時間潅流することによって固定した。組織を、クライオスタットを用いて、水平面で厚さ１４〜１６μｍの切片標本にした。切片標本を、スーパーフロスト・プラス・スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｌｉｄｅｓ）（フィッシャー・サイエンティフィック社(Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ.)，ピッツバーグ，ペンシルベニア州）にマウントし、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５８】
２．リボプローブの製造：
リボプローブを、これまで説明した通りにして作成した（Ｙａｎｇ等，２００２年）。ラットＰＡＭのアンチセンス、および、センスリボプローブを、プラスミドをＨｉｎｄIII（アンチセンス）およびＢａｍＨＩ（センス）で線状化した後に、それぞれＴ７およびＴ３ポリメラーゼを用いて得た（Ｙａｎｇ等，２００２年を参照）。インビトロでの転写を、製造元（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州）の推奨に従って、［３５Ｓ］ＵＴＰ−αＳ（ＩＣＮ，アーバイン，カリフォルニア州）、線状化したＰＡＭｃＤＮＡ、ＮＴＰの存在下で、３７℃で１時間行った。ＲＮＡの転写物を、ＲＮＡプローブ精製キット（Ｐｅｑｕｌａｂ，エルランゲン，ドイツ）を用いて精製した。
【００５９】
３．インサイチュハイブリダイゼーション：
インサイチュハイブリダイゼーションを、前述した通りに行った（Ｙａｎｇ等，２００２年）：切片標本を、０.１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７.２）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、０.２５％無水酢酸と０.１Ｍトリエタノールアミンで前処理し、０.２×ＳＳＣでリンスし、アルコール濃度を連続的に高めて脱水させた。切片標本を、プレハイブリダイゼーション溶液（５０％脱イオン化ホルムアミド、０.６Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０.０２５％ピロリン酸ナトリウム、０.０２％フィコール、０.０２％ＢＳＡ、０.０２％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭのＤＴＴ、および、熱変性させた異種核酸（０.００５％の酵母ｔＲＮＡ、タイプＸ、０.０５％の酵母全ＲＮＡ、タイプＩ、０.０５％サケ精巣ＤＮＡ、タイプIII））で、室温で２時間プレハイブリダイズさせ；ハイブリダイゼーション溶液（２.５×１０６ｃｐｍ／切片標本）、５０％脱イオン化ホルムアミド、および、５０％ハイブリダイゼーション緩衝液［０.６Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０.０２５％ピロリン酸ナトリウム、０.０２％フィコール、０.０２％ＢＳＡ、０.０２％ポリビニルピロリドン、熱変性させた異種核酸（０.００５％の酵母ｔＲＮＡ、タイプＸ、０.００５％の酵母全ＲＮＡ、タイプＩ、０.０５％サケ精巣ＤＮＡ、タイプIII）、１００ｍＭのＤＴＴ、０.０００５％ポリアデニル酸、１０％硫酸デキストランを含む］中で、５０℃で一晩、リボプローブとハイブリダイズさせた。切片標本を、ＲＴ（室温）で、２×、１×、０.５×ＳＳＣでリンスした。２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）中で消化させた後、切片標本を、室温で、１×ＲＮアーゼ緩衝液、２×、１×、０.５×ＳＳＣ中で、および、４５℃で、０.１×ＳＳＣ中で一晩洗浄した。切片標本をアルコール濃度を連続的に高めて脱水させ、コダック（Ｋｏｄａｋ）のバイオマックスＭＲフィルム（Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲ  ｆｉｌｍ）(コダック，ロチェスター，ニューヨーク州)に−８０℃で３〜７日間露光した。
【００６０】
４．抗体の生成、および、免疫蛍光法による染色：
ヒトＰＡＭのアミノ酸残基１３５〜１５３および４６０１〜４６１４（それぞれ配列番号１に対応する）からなるペプチド（バイオトレンド（ＢｉｏＴｒｅｎｄ），ケルン，ドイツ）を用いて、抗血清をウサギで商業的に生成させた。その抗血清を、標準的な手法に従って、バイオトレンド（ケルン，ドイツ）で商業的に生産させた。脊髄とＤＲＧの切片におけるＰＡＭの分布をモニターするために、切片を、０.１％トリトンＸ−１００中で５分間浸透させた。切片を、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、次に、抗ＰＡＭ抗血清（１：５０希釈）と共に１時間インキュベートした。続いて、これを、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のＦＩＴＣ標識したヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。次に、切片をＰＢＳで洗浄し、フルオマウント(ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ)TMを用いてマウントした。
【００６１】
５.ＲＴ-ＰＣＲ：
ラットの脊髄およびＤＲＧからの全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出によって単離した（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７年）。全ＲＮＡ２μｇを、０.６μＭのそれぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマーとアニールし、逆転写酵素（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）を用いて３７℃で３０分間逆転写した。次に、即座にｃＤＮＡを増幅に用いた。ラットＧＡＤＰＨの増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＡＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧ−３’（センス；配列番号１０）、および、５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ−３’（アンチセンス；配列番号１１；Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ等，２０００年）であった。ＡＣアイソフォームを増幅するためのプライマーを、Ｂｅｋ等によって公開されているようにして選択した（Ｂｅｋ等，２００１年）。ラットＰＡＭのためのプライマーは、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＧＴＧＡＴＧＣＴ−３’（センス；配列番号１２）、および、５’−ＣＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’（アンチセンス；配列番号１３）であった。そのＰＣＲ産物は、ヒトＰＡＭｃＤＮＡヌクレオチド１３６９２〜１４０６４に対応する。それに対応するラット配列は、ＥＳＴクローンＡＷ４４１１３１（配列番号８）から得た。半定量ＰＣＲのために、ＳＡＷＤＡＹ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｑｌａｂ，エルランゲン，ドイツ）を用いた。最初の９５℃で５分間での変性工程の後に、９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、および、７２℃で１０秒間の３０サイクルを行い、その後に、最終の７２℃で１０分の伸長工程を行った。定量ＰＣＲを、ＴａｑｍａｎTMシステムおよび試薬（アプライド・バイオシステムズ，ヴァイターシュタット，ドイツ）を製造元の説明書に従って用いて行った。
【００６２】
６．全長ＰＡＭの精製：
以前に公開されたように、ただし数箇所を改変してＰＡＭ精製を行った（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等。２００１年）。簡単に言えば、ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。４０個の１５０ｍｍ培養皿の密集した細胞を、１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを用いて回収し、４００×ｇで５分間沈殿させた。細胞を、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのベンズアミジン、５μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含むＴＥＤ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させ、超音波破砕を２×５秒間行い溶解させた。ホモジネートを、２７０００×ｇで、４℃で３０分間で遠心分離し、上清を、Ｑ−セファロースＸＫ１６カラム（アマシャム・ファルマシア(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ)，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、製造元の説明書に従って、ＴＥＤ中で、１５０〜３５０ｍＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出させた。標準的な手法に従ってウェスタンブロッティングで分画を解析した；陽性の分画をプールし、そのＮａＣｌ濃度を１Ｍに調節した。次に、タンパク質を、フェニル−セファロースＸＫ１６カラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、製造元の説明書に従って、ＴＥＤ中の３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。流出液分画および洗浄分画にＰＡＭが含まれていた。それらをプールし、製造元の説明書に従って、セントリコン(Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ)５０（アミコン(Ａｍｉｃｏｎ)，ビバリー，マサチューセッツ州）を用いて緩衝液を上述の１００ｍＭのＮａＣｌを含むＴＥＤ緩衝液で交換した。次に、タンパク質を、モノＳ（Ｍｏｎｏ  Ｓ）５／５ＦＰＬＣカラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、製造元の説明書に従って、ローディング緩衝液（ＴＥＤ中、１００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。流出液を回収し、モノＱ（Ｍｏｎｏ  Ｑ）５／５ＦＰＬＣカラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にアプライした。タンパク質を、ＴＥＤ中の１５０〜４００ｍＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出させた。陽性の分画をプールし、セントリコン(Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ)５０（アミコン(Ａｍｉｃｏｎ)，ビバリー，マサチューセッツ州）を用いて緩衝液を５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＤＴＴと交換し、−８０℃で保存したで。保存したＰＡＭは、３週間以内に用いた。
【００６３】
７．組換えＧｓαの発現および精製：
ヘキサヒスチジルタグを有する構成的に活性なＧｓαのＱ２１３Ｌ突然変異体（Ｇｓα＊）を、発現させ、Ｇｒａｚｉａｎｏ等，１９９１年で説明されている通りに精製した。Ｇｓα＊の最大活性化を確認するために、ＡＣ活性分析で使用する前に、ＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）の存在下で、３０分間、Ｇタンパク質を、１μＭのＧＴＰγＳとインキュベートした。
【００６４】
８．アデニリルシクラーゼ活性アッセイ（ＡＣ活性アッセイ）：
脊髄を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）、１ｍＭのＥＧＴＡ中で溶解させ、ＫａｓｓｉｓおよびＦｉｓｈｍａｎによって説明された通りに細胞膜を調製した。アリコートを使用するまで−８０℃で保存した。ＡＣ活性分析を、以前に説明された通りに、容積１００μｌで、室温で１５分間、１００μＭのＭｇＣｌ2の存在下で行った（Ｐａｔｅｌ等，２００２年）。Ｇｓα＊（８０ｎＭ）、または、フォルスコリン（１００μＭ）を用いて、膜中のＡＣ酵素活性（タンパク質１０μｇ）を刺激した。
【００６５】
９．ＰＡＭのアンチセンス、および、センスオリゴヌクレオチドの脊髄における搬送：
ラットを、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）と、ミダゾラム（０.５〜１ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）で麻酔した。椎骨Ｔｈ１３からＬ３までの脊柱の上で皮膚を切開した。Ｌ２〜３周辺の筋肉組織を取り除いた。Ｌ３の棘突起を除去し、Ｌ２で椎弓切除術を施した。次に、ポリエチレン製カテーテル（ＩＤ０.２８ｍｍ、ＯＤ０.６１ｍｍ）を、カテーテルの先端がＴｈ９〜１０に達するように硬膜外腔に挿入した。カテーテルをシアノアクリレート系接着剤で固定し、頚部の領域で外部に露出させ、皮膚を縫合した。
【００６６】
１０．ＰＡＭオリゴヌクレオチドの注入：
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の配列を、以下のようにラットＰＡＭ配列から選択した。センス：５’−ＧＡＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣ−３’（配列番号１４）、アンチセンス：５’−ＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１５）、および、３つの突然変異（３Ｍ−ａｓ；突然変異は下線で示した）を含むアンチセンスＯＤＮ：５’−ＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＴＣＡＧＴＡ−３’（配列番号１６）。外科手術の３日後に、ラットを「自由行動系」（ＣＭＡ，ストックホルム，スウェーデン）の状態に置き、アンチセンス（ｎ＝５）、または、センス（ｎ＝５）オリゴヌクレオチド（人工髄液中、２.５ｍｇ／ｍｌ）をカテーテルを通じて、微量注入ポンプ（ＣＭＡ，ストックホルム，スウェーデン）を用いて、０.０５〜０.１μｌ／分の低速で、１００時間注入した。
【００６７】
１１．ホルマリン試験：
注入を止めた後１５分以内に、ホルマリン試験を行った。５％ホルムアルデヒド溶液５０μｌを、１本の後肢の背面の皮下に（ｓ.ｃ.）注射した。ホルマリン注射の直後に開始して、１分間のインターバルで６０分間まで、フリンチ行動をカウントした。５分間のインターバルのフリンチ行動を、１分あたりの平均フリンチ行動として要約した。グループ間の侵害受容の挙動を比較するために、フリンチ行動の、１時間の観察期間の第二相の合計を、スチューデントのｔ検定で処理した。αを０.０５に設定した。
【００６８】
ホルマリン試験の最後にラットを殺し、腰髄および後根神経節（ＤＲＧ）を切り出し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる解析まで−８０℃で保存した。ＰＡＭ発現を決定するために、脊髄切片を、上記の抗ＰＡＭ抗体を用いて免疫組織化学的に解析した。
【００６９】
１２．ザイモサン誘発性の炎症；
炎症を誘発させるために、０.０３Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７.５）３０μ
ｌに懸濁したザイモサンＡ２.５ｍｇ（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）を、右の後肢の足底の中央部の領域に皮下注射した。このような足底内部へのザイモサン注射は、信頼できる温熱性および機械刺激痛覚過敏ラットのモデルを誘導することがわかっている（ＭｅｌｌｅｒおよびＧｅｂｈａｒｔ，１９９７年）。ラットを、ザイモサン注射の２４〜９６時間後に、深いイソフルラン麻酔下で心臓穿刺を行うことにより殺した。腰髄および後根神経節（ＤＲＧ）を切り出し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる解析まで−８０℃で保存した。
【００７０】
１３．結果：
上記の発明者等によるＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーションを用いた実験で、ＰＡＭは、成体ラットの脊髄の感覚ニューロン、同様に、後根神経節（ＤＲＧ）で発現されることがが初めて実証された。ＲＴ−ＰＣＲによれば、ＰＡＭのｍＲＮＡは、脊髄と後根神経節とで発達を通して（Ｅ１４〜成体）同様のレベルで検出された。ＰＡＭ発現は、ウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲで示されるように、ラットのザイモサン処理の２４〜４８時間後にアップレギュレートされる。
【００７１】
脊髄とＤＲＧで発現される主要なアデニリルシクラーゼアイソフォームは、それぞれＡＣ５および６型、ならびに、ＡＣ４および６型である。脊髄をザイモサン処理した後は、ＡＣアイソフォーム発現における主要な変化は観察されなかった。従って、脊髄およびＤＲＧからの膜調製物におけるＧαｓによって刺激されたＡＣ活性は、ＰＡＭによって阻害された。その結果として、成体ラットにおいて、ＰＡＭに対するセンスオリゴヌクレオチドではなくアンチセンスでの処理により、ホルマリンで誘発される足のフリンチ行動が増加したことを発見した。従って、ＰＡＭに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したラットの脊髄におけるｃＡＭＰの蓄積は、コントロールラットと比較して上昇した。
【００７２】
精製されたＰＡＭを脊髄溶解産物へ添加することにより、コントロールとザイモサン処理動物からの脊髄溶解産物のＧαｓで刺激されたＡＣ活性が阻害された（図５ｂ）。３０ｎＭのＧαｓで刺激されたＡＣ活性は、コントロール動物の脊髄溶解産物において５０％、ザイモサンで９６時間処理されたラットから得られた溶解産物で７０％減少した。
【００７３】
脊髄でＰＡＭが発現されるかどうかを測定するために、第一のインサイチュハイブリダイゼーションを行った。これにより、成体ラットの脊髄の白質ではなく灰白質の至る所に、ＰＡＭのｍＲＮＡに関する明らかなシグナルが検出された（図１）。脊髄およびＤＲＧでＰＡＭを発現する細胞集団をより正確に明らかにするために、ヒトＰＡＭのアミノ酸残基１３５〜１５３および４６０１〜４６１４に対応するペプチドを用いて、ＰＡＭに対する抗体を作成した。免疫組織化学的な解析により、ＰＡＭは、抗ＧＦＡＰ免疫反応性ではなく、抗ＮｅｕＮ免疫反応性と共存することが明らかになった（図２ａ）。より特定には、ＰＡＭ発現は、後角ニューロンで優勢に検出されたが（図２ａ）、ニューロンではない細胞集団では極めてわずかなＰＡＭ発現しか示さなかった。特に、ＤＲＧニューロンでは、高いＰＡＭ発現を検出することができた（図２ｂ）。ここで、ＰＡＭの免疫反応性は、軸索に、同様に、直径が大きいニューロンと小さいニューロンの両方の細胞体に存在していた（図２ｂ）。興味深いことに、抗ヒストン抗体で共染色することによって実証されたように、細胞の核では、ＰＡＭは検出されなかった（図２ｂ）。脊髄でも観察されるように、ＧＦＡＰ発現細胞では、ＰＡＭ発現は、検出されなかった。
【００７４】
ラットおよびマウスの発達中に、脳におけるＰＡＭ発現は差異的に調節されるために（Ｙａｎｇ等，２００２年）、発明者等は、ラットの脊髄およびＤＲＧの発達中にＰＡＭのｍＲＮＡ発現も変化するかどうかを調査した。この目的を達成するために、ＰＡＭのｍＲＮＡ発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。ＰＡＭのｍＲＮＡは、後期胚形成期（Ｅ１６）から、誕生直後まで（Ｐ０.５；図３）、脊髄とＤＲＧで高度に発現されることを発見した。興味深いことに、発現は、誕生直後に胚発生の３０〜４０％に減少し、続いて、成人期中は一定を保った（図３）。
【００７５】
次に、脊髄におけるＰＡＭ発現は、侵害受容の刺激によって調節されるかどうかを試験した。そこで、成体ラットの後肢へのザイモサンおよびホルマリン注射の後に、脊髄のＰＡＭ発現をモニターした。ザイモサン処理の２４および４８時間後に、ＰＡＭのｍＲＮＡが約２倍アップレギュレートされた（図４ａ）。それにより、ザイモサン注射の２４時間後に、ＰＡＭ発現は、タンパク質レベルでアップレギュレートされ、９６時間上昇し続けた（図４ｂ）。ザイモサン注射の９６時間後に、ＰＡＭのｍＲＮＡ発現は減少した。このＰＡＭのｍＲＮＡ発現における減少は、タンパク質レベルには反映されていなかった（図４ａおよびｂを比較）。特に、ラットの脊髄においても、ホルマリン注射の１時間後にＰＡＭのｍＲＮＡがアップレギュレートされた（図４ｃ）。
【００７６】
ＰＡＭは、アデニリルシクラーゼ１、５および６型の強力な阻害剤であることがわかっているため（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）、ＰＡＭが、脊髄およびＤＲＧ溶解産物中でＡＣ活性を阻害できるかどうかを調ベた。脊髄において、２種の主要なＡＣアイソフォームが半定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出された。これらのＡＣアイソフォームは、５および６型である（図５ａ）。特に、アイソフォームはいずれも、ナノモル濃度のＰＡＭで阻害される（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）。ザイモサン注射の２４〜９６時間後に、脊髄におけるＡＣアイソフォーム発現パターンは、有意に改変されなかった。興味深いことに、ホルマリン注射の１時間後に、ＡＣアイソフォーム発現におけるシフトが検出された（図５ａ）。ＡＣ５型のｍＲＮＡは、ダウンレギュレートされ、ＡＣ３および９型のｍＲＮＡはアップレギュレートされる。
【００７７】
上記の実験により示されたように、精製されたＰＡＭを脊髄溶解産物へ添加することにより、脊髄調製物において、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性が阻害された。３０ｎＭのＰＡＭの添加により、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性が、コントロール動物の脊髄溶解産物において４９％減少した（図５ｂ）。ザイモサン注射の９６時間後の、ラットから得られた脊髄溶解産物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性は、ＰＡＭの阻害に対して、未処理動物と比較して高い感受性を示した（３０ｎＭで、７０％阻害；図５ｂ）。それに対して、ホルマリンで１時間処理された動物からの脊髄溶解産物におけるＰＡＭによるＡＣ活性の阻害の程度は、より少なかった（３０ｎＭで２５％阻害；図５ｂ）。
【００７８】
ＤＲＧにおいて、優勢に発現されたＡＣアイソフォームは、ＡＣ４および６型である（図５ａ）。ＤＲＧ溶解産物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性は、脊髄溶解産物と比較して３０ｎＭのＰＡＭの存在下で３２％減少した（図５ｂ）。
【００７９】
脊髄の侵害受容伝達におけるＰＡＭの可能性のある役割を試験するために、ホルマリン分析を行う前に、動物に、ＰＡＭのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、腰髄内へのカテーテルにより注入した。免疫組織化学で観察されたように、脊髄ニューロンにおいて、ＰＡＭ発現は減少した（図６ａ）。ＰＡＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの注入により、ホルマリン注射後の侵害刺激反応が、ＰＡＭのセンス処理と比較して顕著に増加した（ｐ＝０.００７；図６ｂおよびｃ）。ＰＡＭのアンチセンス処理ラットにおける痛覚過敏には、足をなめる挙動、および噛みつき挙動の増加が伴った。ＰＡＭは、ＡＣ活性阻害剤であるため（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）、センスおよびアンチセンスＯＤＮで処理されたラットの脊髄溶解産物における、基礎的なＧαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性を測定した。この実験により、アンチセンスで処理したラットにおいて、基礎的なＡＣ活性の顕著な増加（２０.７％）が示された（表１）。それに対して、Ｇαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性において顕著な変化は検出されず、これは、ＯＤＮ処理によってＡＣの総量が変化しなかったことを示す（表１）。
【００８０】
上記の実験より、ＰＡＭは、脊髄とＤＲＧニューロンの両方の細胞体と軸索に局在化していることが示された（図２ａ，ｂ）。細胞核では、ほんのわずかな免疫活性しか検出できず、これは、ニューロンおよびガン細胞系において、ＰＡＭに関する機能が異なることを示している。
【００８１】
持続的な侵害受容の刺激の後の中枢性感作は、脊髄におけるニューロンおよびシナプスの変化に基づく（ＷｏｏｌｆおよびＣｏｓｔｉｇａｎ  １９９９年；ＷｏｏｌｆおよびＳａｌｔｅｒ２０００年；ＪｉおよびＷｏｏｌｆ  ２００１年）。発明者等による、ＰＡＭは、脊髄およびＤＲＧの感覚ニューロンで発現されるという発見により、ＰＡＭは、脊髄の侵害受容過程の際のシナプスの変化に関与する可能性があるという新たな仮説が構築された。上記の、ＰＡＭは、侵害受容の刺激の後にアップレギュレートされるという発見（図４ａ）は、この、脊髄の侵害受容過程の際のシナプスの変化においてＰＡＭは役割を果たす可能性があるという仮説を裏付けている。
【００８２】
さらに、発明者等の、ＰＡＭは、脊髄およびＤＲＧの知覚神経で発現されるという驚くべき発見により、同様に、脊髄およびＤＲＧにおいて、ＰＡＭは、ＡＣ活性を阻害することができるかどうかという疑問に至った。
【００８３】
上記の実験より、ＰＡＭは、脊髄調製物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性の有力な阻害剤であることが初めて示された（図５ｂ）。ＡＣ活性は、３０ｎＭのＰＡＭを添加した後に、５０％減少した。抑制性Ｇタンパク質のαサブユニット、Ｇαｉを用いて匹敵する阻害を達成するために、２００〜８００ｎＭのＧαｉを用いなければならない（Ｗｉｔｔｐｏｔｈ等，１９９９年）。ザイモサンで９６時間処理された動物の脊髄調製物において、ＰＡＭの阻害作用はいっそう強く（図５ｂ）、ザイモサン注射の後に、脊髄における内因性ＰＡＭの量が上昇したことで説明することができる（図４ａ，ｂ）。ホルマリンで処理した動物からの脊髄調製物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性の阻害（２５％阻害）は、コントロール動物またはザイモサンで処理した動物と比較してそれほど顕著ではなかった（それぞれ５０％および７５％）。
【００８４】
特に、ホルマリンで１時間処理した動物において、ＡＣアイソフォーム発現におけるシフトを観察した（図５ａ）。ＡＣ３および９型はアップレギュレートされるが、ＡＣ５型は、ダウンレギュレートされた。これまで、ＰＡＭが、ＡＣ３および９型の阻害剤であるかどうかはわかっていない。それゆえに、これらアイソフォームは、ＰＡＭによって阻害されないか、または、試験されたＰＡＭ濃度が、阻害作用を達成するには低すぎる可能性がある。ＰＡＭは、５１０ｋＤａの巨大タンパク質であるため、３０ｎＭを超えるＰＡＭ濃度を試験することは技術的に不可能である。それにもかかわらず、図５ｂに示される用量反応曲線によれば、試験された脊髄調製物において、より高いＰＡＭ濃度により、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性のより強い阻害が引き起こされる可能性がある。
【００８５】
興味深いことに、ＰＡＭは、ＤＲＧにおいて、脊髄調製物においてより有効性が弱いＡＣ酵素活性の阻害剤であった。脊髄およびＤＲＧ調製物においてＰＡＭの阻害効率が異なるのは、観察されたＡＣアイソフォーム発現の差による可能性が最も高い。脊髄で発現される主要なＡＣアイソフォームは、５および６型であり、いずれもＰＡＭによって強く阻害される（図５ａ；（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年））。ＤＲＧにおいて、ＡＣ４および６型は、優勢なＡＣアイソフォームである（図５ａ）。ＰＡＭがＡＣ４型を阻害するかどうかはわかっていないため、このアイソフォームは、ＰＡＭによって阻害されないか、または、それに加えて、試験されたＰＡＭ濃度が、阻害作用を達成するには低すぎる。しかしながら、図５ｂに示される用量反応曲線によれば、ＤＲＧ調製物において、より高いＰＡＭ濃度により、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性のより強い阻害が引き起こされる可能
性が高いようである。
【００８６】
しかしながら、最も驚くべきことは、ＰＡＭ活性は、試験動物の侵害受容の挙動に影響を与えるという発見であった：これは、基礎的なＡＣ活性における顕著な増加（表１）、および、より重要なことは、ホルマリン注射後、侵害刺激反応がＰＡＭのセンス処理と比較して顕著に増加したこと（図６ｂおよびｃ）、その際、脊髄におけるＰＡＭの内因性の発現は、動物にＰＡＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入することによって減少したこと（図６ａ）を示す発明者等の実験によって初めて実証された。
【００８７】
１４．ＰＡＭの鎮痛作用の測定
上述したＰＡＭの鎮痛作用に関する証拠は、例えば、以下の仮想的実験によって裏付けることができるだろう：例えば急性の痛みのホルマリンモデルにおけるＰＡＭの鎮痛作用は、例えば、アミノ酸残基１０２８〜１０６５に対応するペプチドの髄腔内への適用によって直接決定することができるだろう。このペプチドは、酵母ツーハイブリッドシステムとＡＣ活性分析で測定されるように、ＰＡＭ−アデニリルシクラーゼの相互作用に介在できることが発見された最小の領域を示す。このペプチドは、バイオポーター（ｂｉｏｐｏｒｔｅｒ）リポフェクション試薬（Ｐｅｑｌａｂ，ドイツで市販されている）との複合体として適用され得る。このアプローチにより、ペプチドを組織に進入させ、ＡＣに対する生理学的なＰＡＭの作用を模擬することが可能になる。
【００８８】
文献
Bailey C.H., Bartsch D., Kandel E.R.: Toward a molecular definition of long-term memory storage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996 Nov 26;93(24):13445-52；
Brandon E.P., Idzerda R.L., McKnight G.S.: PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Curr. Opin. Neurobiol. 1997 Jun;7(3):397-403;
Bek M.J., Zheng S., Xu J., Yamaguchi I., Asico L.D., Sun X.G. and Jose P.A.(2001) Differential expression of adenylyl cyclases in the rat nephron. Kidney Int 60, 890-899;
Chang Q. and Balice-Gordon R.J.(2000) Highwire, rpm-1, and futsch: balancing
synaptic growth and stability. Neuron 26, 287-290; 
Chomczynski, P., Sacchi, N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162,(1987) 156-159;
Graziano M.P., Freissmuth M. and Gilman A.G.(1991) Purification of recombinant Gs alpha. Methods Enzymol 195,192-202;
Guo Q., Xie J., Dang C.V., Liu E.T., Bishop J.M.: Identification of a large Myc-binding protein that contains RCC1-like repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998 Aug 4;95(16):9172-7)；
Jin Y. (2002) Synaptogenesis: insights from worm and fly. Curr Opin Neurobiol 12, 71-79.)；
Julius and Basbaum“Molecular mechanisms of nociception”, Nature, volume 413,
13. September 2001, pp.203-209; 
Kassis, S., and Fishman, P.H.(1982) J Biol Chem 257(9), 5312-5318; Meller S.T., Gebhart G.F. (1997), intraplantar zymosan as a reliable, quantifiable model of thermal and mechanical hyperalgesia in the rat; Eur.J. Pain 1, 43-52;
Nair, B.G., Parikh, B., Milligan, G., and Patel, T.B. (1990) J Biol Chem 265(34), 21317-21322;
【００８９】
Patel T.B., Wittpoth C., Barbier A.J., Yigzaw Y. and Scholich K. (2002) Functional analyses of type V adenylyl cyclase. Methods Enzymol 345, 160-187. Snyder S.H.(1985) Adenosine as a neuromodulator. Annu Rev Neurosci 8, 103-124.
Ruppert C., Goldowitz D., and Wille W. (1986), Proto-oncogene-c-mycis expressed in cerebellar neurons at different developmental stages, Embo J5, 1897-1901;
Schaefer A.M., Hadwiger G.D. and Nonet M.L. (2000) rpm-1, a conserved neuronal
gene that regulates targeting and synaptogenesis in C. elegans. Neuron 26, 345-356);
Schaible H.G., Vanegas H.: How do we manage chronic pain? Baillieres Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. 2000 Dec;14(4):797-811;
Scherr M., Morgan M.A., Eder M., Gene Silencing Mediated by Small Interfering RNAs in Mammalian Cells, Curr Med Chem. 2003, Feb; 10(3): 245-256;
Scholich K., Pierre S., Patel T.B.: Protein associated with myc (PAM) is a potent inhibitor of adenylyl cyclase. J.Biol.Chem. 2001, Dec 14；276(50):47583-9;
Scholz and Woolf“Can we conquer pain”, Nature neuroscience supplement, volume 5, November 2002, pp.1062-1067; 
Snyder S.H.(1985), Adenosine as a neuromodulator. Annual Reviews of Neuroscience 8, 103-104;
Trajkovic V, Samardzic T, Stosic-Grujicic S, Ramic Z, Mostarica Stojkovic M. Muramyl dipeptide potentiates cytokine-induced activation of inducible nitric oxide synthase in rat astrocytes. Brain Res. 2000 Nov 10;883(1):157-63；
Wan H.I., DiAntonio A., Fetter R.D., Bergstrom K., Strauss R. and Goodman C. S. (2000) Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron 26, 313-329.)
Wittpoth C., Scholich K., Yigzaw Y., Stringfield T.M. and Patel T.B. (1999), Regions on adenylyl cyclase that are necessary for inhibition of activity by beta gamma G(iα) subunits of heterotrimeric G proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7723-7730;
Wood, J.D.“Pathobiology of Visceral Pain: Molecular Mechanisms and Therapeutic Implications II. genetic approaches to pain therapy", American Journal pf Physiological Gastrointestinal Liver Physiology, 2000, volume 278, G507-G512;
Woolf and Mannion“Neuropathic pain：aetiology, symptoms mechanisms, and management", The LANCET, volume 353, June 5, 1999, pp.1959-1964；
Woolf J. and Salter M.W.“Neuronal Plasticity: Increasing the Gain in Pain”, Science, volume 288, June 9, 2000, pp.1765-1768;
Xia Z., Storm D.R.: Calmodulin-regulated adenylyl cyclases and neuromodulation. Curr. Opin. Neurobiol. 1997 Jun；7(3)：391-6;
Yang H., Scholich K., Poser S., Storm D., Patel T.B., Goldowitz D.: Developmental expression of protein associated with myc (PAM) in the rodent brain. Brain Res Dev Brain Res 136, 2002, 35-42；
Zhen M., Huang X., Bamber B. and Jin Y.(2000) Regulation of presynaptic terminal organization by C. elegans RPM-1, a putative guanine nucleotide exchanger with a RING-H2 finger domain. Neuron 26, 331-343);
上に列挙した文献は、この参照により開示に含まれる。
【００９０】
実験方法に関する標準的な文献：
特に他の規定がない限り、実験方法は、以下の標準的な文献で列挙された標準的な方法に従って行われた、または、行うことができる：
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.545 pp or Current Protocols in Molecular Biology;
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M.Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;
Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press
Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function; D. Accili, Wiley-Liss., USA, 2000; ISBN: 0-471-35057-5.
Antisense Therapeutics, S. Agrawal, Humana Press, USA, 1996, ISBN: 0-89603-305-8.
【００９１】
用いられた略語：
ＡＣ、アデニリルシクラーゼ；Ｇｓα、アデニリルシクラーゼの促進性Ｇタンパク質のαサブユニット、Ｇαｓ＊、Ｇαｓの構成的に活性な（Ｑ２１３Ｌ）突然変異体；Ｇαｉ、抑制性Ｇタンパク質Ｇｉのαサブユニット；Ｇβγ、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のβγサブユニット；ＰＡＭ、Ｍｙｃ関連タンパク質；ＲＣＣ１、染色体凝縮の調節因子；ＴＥＤ、５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ；ＯＤＮ、オリゴデオキシヌクレオチド；ＲＴ、室温；
【００９２】
〔図面〕
図１：ＰＡＭは、脊髄ニューロンで高度に発現される。脊髄の水平切片標本を用いたインサイチュハイブリダイゼーションを、上述したように、ラットＰＡＭに対するセンスまたはアンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。
図２：ＰＡＭは、ＤＲＧニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
パネルＡ：ラットの脊髄切片標本の免疫組織化学的な解析。切片標本を、抗ＰＡＭ抗体（緑）、および、抗ＮｅｕＮまたは抗ＧＦＡＰ（赤）で染色し、ニューロンまたはグリア細胞をそれぞれ可視化した。両方のシグナルの重ね合わせは、右のパネルに示される。対物を２０×に拡大した。
パネルＢ：ラットＤＲＧ切片標本の免疫組織化学的な解析。切片標本を、抗ＰＡＭ抗体（緑）、および、抗Ｎｅｕ６８、抗ヒストンまたは抗ＧＦＡＰ（赤）で染色し、それぞれニューロン、核またはグリア細胞を可視化した。両方のシグナルの重ね合わせは、右のパネルに示される。対物を４０×に拡大した（ただし、ヒストン染色は、６３×に拡大した）。
図３：ＰＡＭは、ＤＲＧおよび脊髄において、異なる発生段階で差異的に発現される。定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑｍａｎTM）を用いて、１６日齢のラット胎児（Ｅ１６）、出生後の日数が０.５（Ｐ０.５）、３（Ｐ３）、５（Ｐ５）、９（Ｐ９）のラット、および、成体ラットの脊髄およびＤＲＧのＲＮＡ（４０ｎｇ）中のＰＡＭを検出した。少なくとも３回の決定の平均±ＳＥＭを示す。
【００９３】
図４：ＰＡＭは、ラットの脊髄において、ザイモサンおよびホルマリン処理の後にアッ
プレギュレートされた。
パネルＡ：コントロール動物、または、ザイモサンで処理して２４時間、４８時間および９６時間後の動物からの脊髄のＲＮＡ（４０ｎｇ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ解析。下部のパネルは、７回の実験の平均±ＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定：＊ｐ＜０.００１。
パネルＢ：コントロール動物、または、ザイモサンで処理して２４時間、４８時間および９６時間後の動物のラットの脊髄溶解産物（４０μｇ）を用いた、抗ＰＡＭ抗体および抗ＥＲＫ１／２を用いた、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたウェスタンブロット解析。
パネルＣ：コントロール動物、または、ホルマリンで１時間処理した動物からの脊髄のＲＮＡ（４０ｎｇ）を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。
【００９４】
図５：ＰＡＭは、脊髄溶解産物中でＧαｓで刺激されたＡＣ活性を阻害する。
パネルＡ：ＲＴ−ＰＣＲを用いて、脊髄およびＤＲＧのＲＮＡ（４０ｎｇ）におけるＡＣアイソフォーム発現を決定した。
パネルＢ：材料および方法で説明したように、脊髄またはＤＲＧの溶解産物（１０μｇ）を、８０ｎＭのＧαｓの存在下で、ＡＣ活性に関して分析した。三連で行われた少なくとも３回の測定の平均±ＳＥＭを示す。
図６：ＰＡＭに対するアンチセンスＯＤＮの髄腔内への適用により、侵害受容の挙動が増加する。
パネルＡ：説明されているように、成体ラットに、センスおよびアンチセンスＯＤＮを髄腔内投与した。ホルマリン処理の後に、脊髄を除去し、抗ＰＡＭ抗体（緑）、または、抗ＮｅｕＮ（赤）を用いて免疫組織学的な解析で処理した。
パネルＢ：材料の章において説明されているように、センスまたはアンチセンスＯＤＮで処理した動物のホルマリンアッセイ。
１時間にわたるフリンチ行動の合計を示す。少なくとも４回の測定の平均±ＳＥを示す。
パネルＣ：材料の章において説明されているように、センスまたはアンチセンスＯＤＮで処理した動物のホルマリンアッセイ。
１時間にわたるフリンチ行動の回数を示す。少なくとも４回の測定の平均±ＳＥを示す。
【００９５】
図７：ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＣ３９９２８（タンパク質配列；配列番号１）。ＡＦ０７５５８７（コード配列；配列番号２）による、ヒトＰＡＭのタンパク質、ゲノムおよびコードヌクレオチド配列。ヒトＰＡＭは、染色体１３ｑ２２上に位置する；そのゲノム配列は、ＮＴ＿０２４５２４.１１（始点：２４６７９８６１位；終点：２４９６２２４５位；配列番号３）で公開された形で利用可能である；
図７Ｃは、２４６７９８６１〜２４９６２２４５位の連続した配列を示す。
図８：ラットＰＡＭに関するＥＳＴ−クローンをコードする配列：
図８Ａ：ＡＷ９２１３０３（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ９６０〜１３９４に対応する；配列番号４）
図８Ｂ：ＡＷ９１８７１１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８１８８〜８６３２に対応する；配列番号５）
図８Ｃ：ＢＱ２０１４８５（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８９６６〜９６３３に対応する；配列番号６）
図８Ｄ：ＢＥ１１２８８１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１０３１１〜１０８３０に対応する；配列番号７）
図８Ｅ：ＡＷ４４１１３１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４１５２に対応する；配列番号８）
図８Ｆ：ＢＦ４０９８７２（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４８０７に対応する）。（配列番号９）
【００９６】
図９：Ｇｕｏ等，１９８８年／Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ等，ＪＢＣ  １９９９年、および、Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，ＪＢＣ  ２００１年）によるヒトＰＡＭのドメイン構造の概観。
図１０：ラットＰＡＭ  ＲＴ  ＰＣＲのためのＰＣＲのためのプライマー。
図１１：ラットＰＡＭ発現を阻害するためのアンチセンスオリゴデスオキシヌクレオチド、および、コントロールオリゴヌクレオチド。
図１２：本発明の環境で使用するための、様々なＰＡＭｈｓポリペプチド。これらのポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドから得られたフラグメントである。
【００９７】
図１３：本発明の環境で使用するための、異なるＰＡＭｈｓポリヌクレオチド。
図１３Ａ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの１３１７〜４３６６位を含む、配列番号１７に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２４）；
図１３Ｂ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの１４８２〜３３３２位を含む、配列番号１８に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２５）；
図１３Ｃ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの１６４１〜３３４１位を含む、配列番号１９に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２６）；
図１３Ｄ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３１４２〜４０４６位を含む、配列番号２０に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２７）；
図１３Ｅ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３１４２〜３４４６位を含む、配列番号２１に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２８）；
図１３Ｆ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３２２８〜３８３９位を含む、配列番号２２に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２９）；
図１３Ｇ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３２２８〜３３４１位を含む、配列番号２３に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３０）；
図１４：上記の発見に係る脊髄およびＤＲＧのニューロンにおけるＰＡＭシグナル伝達経路の仮説を示す概観。
【００９８】
表１
アンチセンス処理ラットの脊髄溶解産物において、基礎的なＡＣ活性は上昇する。上述したように、脊髄溶解産物（２０μｇ）を、８０ｎＭのＧαｓ、または、１００μＭのフォルスコリンの非存在下、または存在下でＡＣ活性に関して分析した。グループあたり少なくとも３匹のラットからの脊髄溶解産物の平均ＡＣ活性±ＳＥＭ（それぞれ三連で２回測定された）を示す（ｎｓ＝有意差なし）。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ＰＡＭは、脊髄ニューロンで高度に発現される。
【図２Ａ】ＰＡＭは、ＤＲＧニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
【図２Ｂ】ＰＡＭは、ＤＲＧニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
【図３】ＰＡＭは、ＤＲＧおよび脊髄において、異なる発生段階で差異的に発現される。
【図４】ＰＡＭは、ラットの脊髄において、ザイモサンおよびホルマリン処理の後にアップレギュレートされた。
【図５】ＰＡＭは、脊髄溶解産物中でＧαｓで刺激されたＡＣ活性を阻害する。
【図６】ＰＡＭに対するアンチセンスＯＤＮの髄腔内への適用により、侵害受容の挙動が増加する。
【図６−１】図６の続きである。
【図７】ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＣ３９９２８（タンパク質配列；配列番号１）、ＡＦ０７５５８７（コード配列；配列番号２）による、ヒトＰＡＭのタンパク質、ゲノムおよびコードヌクレオチド配列である。
【図７−１】図７の続きである。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図７−４】図７−３の続きである。
【図７−５】図７−４の続きである。
【図７−６】図７−５の続きである。
【図７−７】図７−６の続きである。
【図７−８】図７−７の続きである。
【図７−９】図７−８の続きである。
【図７−１０】図７−９の続きである。
【図７−１１】図７−１０の続きである。
【図７−１２】図７−１１の続きである。
【図７−１３】図７−１２の続きである。
【図７−１４】図７−１３の続きである。
【図７−１５】図７−１４の続きである。
【図７−１６】図７−１５の続きである。
【図７−１７】図７−１６の続きである。
【図７−１８】図７−１７の続きである。
【図７−１９】図７−１８の続きである。
【図７−２０】図７−１９の続きである。
【図７−２１】図７−２０の続きである。
【図７−２２】図７−２１の続きである。
【図７−２３】図７−２２の続きである。
【図７−２４】図７−２３の続きである。
【図７−２５】図７−２４の続きである。
【図７−２６】図７−２５の続きである。
【図７−２７】図７−２６の続きである。
【図７−２８】図７−２７の続きである。
【図７−２９】図７−２８の続きである。
【図７−３０】図７−２９の続きである。
【図７−３１】図７−３０の続きである。
【図７−３２】図７−３１の続きである。
【図７−３３】図７−３２の続きである。
【図７−３４】図７−３３の続きである。
【図７−３５】図７−３４の続きである。
【図７−３６】図７−３５の続きである。
【図７−３７】図７−３６の続きである。
【図７−３８】図７−３７の続きである。
【図７−３９】図７−３８の続きである。
【図７−４０】図７−３９の続きである。
【図７−４１】図７−４０の続きである。
【図７−４２】図７−４１の続きである。
【図７−４３】図７−４２の続きである。
【図７−４４】図７−４３の続きである。
【図７−４５】図７−４４の続きである。
【図７−４６】図７−４５の続きである。
【図７−４７】図７−４６の続きである。
【図７−４８】図７−４７の続きである。
【図７−４９】図７−４８の続きである。
【図７−５０】図７−４９の続きである。
【図７−５１】図７−５０の続きである。
【図７−５２】図７−５１の続きである。
【図７−５３】図７−５２の続きである。
【図７−５４】図７−５３の続きである。
【図７−５５】図７−５４の続きである。
【図７−５６】図７−５５の続きである。
【図７−５７】図７−５６の続きである。
【図７−５８】図７−５７の続きである。
【図７−５９】図７−５８の続きである。
【図７−６０】図７−５９の続きである。
【図７−６１】図７−６０の続きである。
【図７−６２】図７−６１の続きである。
【図７−６３】図７−６２の続きである。
【図７−６４】図７−６３の続きである。
【図７−６５】図７−６４の続きである。
【図７−６６】図７−６５の続きである。
【図７−６７】図７−６６の続きである。
【図７−６８】図７−６７の続きである。
【図７−６９】図７−６８の続きである。
【図７−７０】図７−６９の続きである。
【図８】ラットＰＡＭに関するＥＳＴ−クローンをコードする配列である。
【図８−１】図８の続きである。
【図９】Ｇｕｏ等，１９８８年／Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ等，ＪＢＣ  １９９９年、および、Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，ＪＢＣ  ２００１年）によるヒトＰＡＭのドメイン構造の概観である。
【図１０】ラットＰＡＭＲＴ−ＰＣＲのためのＰＣＲプライマーである。
【図１１】ラットＰＡＭ発現を阻害するためのアンチセンスオリゴデゾキシヌクレオチド、および、コントロールオリゴヌクレオチドである。
【図１２】本発明の環境で使用するための、様々なＰＡＭｈｓポリペプチド。これらのポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドから得られたフラグメントである。
【図１２−１】図１２の続きである。
【図１３】本発明の環境で使用するための、異なるＰＡＭｈｓポリヌクレオチドである。
【図１３−１】図１３の続きである。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１４】上記の発見によるＰＡＭシグナル伝達である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−１】
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【図７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図７−３３】
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【図７−３４】
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【図７−３５】
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【図７−３６】
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【図７−３７】
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【図７−３８】
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【図７−３９】
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【図７−４０】
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【図７−４１】
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【図７−４２】
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【図７−４３】
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【図７−４４】
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【図７−４５】
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【図７−４６】
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【図７−４７】
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【図７−４８】
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【図７−４９】
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【図７−５０】
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【図７−５１】
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【図７−５２】
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【図７−５３】
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【図７−５４】
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【図７−５５】
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【図７−５６】
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【図７−５７】
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【図７−５８】
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【図７−５９】
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【図７−６０】
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【図７−６１】
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【図７−６２】
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【図７−６３】
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【図７−６４】
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【図７−６５】
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【図７−６６】
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【図７−６７】
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【図７−６８】
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【図７−６９】
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【図７−７０】
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【図８】
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【図８−１】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２−１】
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【図１３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007513060.tif 000282
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