(57)【要約】ターゲット化合物の存在下または不在下、標識リガンドのカクテル溶液を用いる、多重化結合アッセイのためのマイクロアレイおよび方法を提供する。本発明の方法は、マイクロアレイ様式を用いて、複数ターゲットに対して化合物をスクリーニングすることを可能にする。
2007530919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイを用いてターゲット化合物をプロファイリングまたはスクリーニングする方法であって：ａ）複数の受容体マイクロスポットを基体上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し、ここで、該カクテル溶液は、１）それぞれ所定の濃度の標識リガンドのみを含有するか、または２）ターゲット化合物の存在下、それぞれ所定の濃度の標識リガンドを含有し；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；さらにｄ）各標識リガンドまたは前記ターゲット化合物のその対応する受容体への結合プロファイルを特定する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記受容体が、膜結合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記受容体が、グアニンヌクレオチド結合タンパク質共役受容体（GPCR）、リガンド依存性イオンチャネル受容体、チロシンキナーゼ受容体、セリン／トレオニンキナーゼ受容体、またはグアニル酸シクラーゼ受容体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロアレイ中のGPCRが、機能性、生理機能、ファミリー、病理、組織分布、突然変異誘発、または進化的歴史のいずれかによってお互いに関連するものであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記カクテル溶液中の前記標識リガンドが、特定の結合親和定数で受容体に容易に結合できる化学分子または生物学的分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記カクテル溶液が、結合バッファー中に標識リガンドの集合を含有し、各リガンドが前記マイクロアレイ中の少なくとも１つの受容体に特異的に結合する特性を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
マイクロアレイを用いて標識リガンドの結合親和性を特定する方法であって：ａ）複数の受容体マイクロスポットを基体上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し、ここで、前記カクテル溶液は、１）それぞれ異なる濃度の標識リガンドのみを含有するか、または２）過剰量の対応リガンドの存在下、それぞれ異なる濃度の標識リガンドを含有し；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；さらにｄ）各標識リガンドのその対応する受容体への結合親和性を特定する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
化合物またはターゲットをプロファイリングまたはスクリーニングする方法であって：ａ）複数の受容体マイクロスポットを固体表面上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し、ここで、化合物が、前記カクテル溶液中に存在するかまたは存在しない；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；さらにｄ）各標識リガンドのその対応する受容体への結合に対抗する、前記化合物の効力を特定する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
化合物またはターゲットをプロファイリングまたはスクリーニングする方法であって：ａ）複数の受容体マイクロスポットを固体表面上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；ｄ）各受容体の総結合シグナルを特定し；ｅ）続いて、化合物を含有する第２の溶液を前記アレイに接触させ；さらに、ｆ）各受容体に予め結合した標識リガンドのうち前記化合物によって置換されたものの量を特定する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
プローブ要素の受容能力を少なくとも２倍にするために、２色検出技術と組み合わせて、単一マイクロスポット内に一緒に固定化させた少なくとも２つの受容体を提供することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2003年7月11日出願でタイトル「GPCRアレイ用の多重化結合アッセイ」の米国仮特許出願第60/486,592号、および2003年8月12日出願でタイトル「GPCR用の多重化結合アッセイ」の米国特許出願第10/639,718号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、共に譲渡された2001年10月9日出願の米国特許出願第09/974,415号および2001年5月14日出願の米国特許出願第09/854,786号に関連する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、固体表面で行われる生物学的、生化学的または化学的結合アッセイに関するものである。より詳細には、本発明は、生物学的種、生化学的または化学的化合物の多重化スクリーニングおよびプロファイリング(multiplexed screening and profiling)のためのＧタンパク質共役受容体(GPCR)の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体（GPCR）は、薬剤ターゲットの最も重要な部類に相当し−−現在の薬剤の約50%はGPCRを標的にするものであり；最も売れている上位50の薬剤の約20％がGPCRを標的にしており；年間の医薬品売上げで235億ドルより多くがこのターゲット類に対する医薬品によるものである（非特許文献１および２）。GPCRは、痛み、喘息、炎症、肥満、癌、ならびに心血管、代謝、胃腸および中枢神経系の疾患を含む、ほとんど全ての主な薬剤分類または疾患分野に関連する。GPCRを標的にする薬剤の大きな重要性は、−外因性シグナルの細胞内反応への変換を担う細胞表面受容体としての−GPCRの生理学的役割にある（非特許文献３）。ヒトゲノムには、約400-700のGPCRが存在し；約200のGPCRに対するリガンドが発見されている（非特許文献４）。GPCR配列の間にアミノ酸レベルでの保存はほとんどないが、全てのGPCRが、７つの別個の疎水性膜貫通領域（それぞれ20-30アミノ酸長）、細胞外N末端、および細胞内C末端から成る特徴的なモチーフを持つ。
【０００５】
薬剤ターゲットとしてのGPCRの成功は、天然リガンドの対応GPCRに対する結合が、適当な低分子薬剤を用いて調節できるという事実によるものである。（非特許文献２）。しかしながら、そのような生理学的に重要なターゲット類への異常な結合は重大な副作用につながり得るため、それら薬剤の効果的な操作が重要である。GPCRに関する構造データは限られており、理論的薬剤設計はかなりの挑戦である。非標的GPCRに対して結合しない薬剤を設計することはほとんど不可能である。現在、選択性研究は薬剤発見プロセスで下流工程として行われる−この段階で不都合な結合のために化合物を捨てることは、薬剤発見プロセスをお金と時間の掛かるものにする。これらの点、およびヒトゲノムのシーケシングの結果として最近発見されたいわゆる「オーファン(orphan)」GPCRが有用なターゲットになり得る(非特許文献５)という強い可能性を考えると、多数のGPCRに対して同時にスクリーニングすることを可能にする技術への強い必要性がある。
【０００６】
Ｇタンパク質共役受容体の薬剤ターゲットとしての重要性を受けて、GPCRに対する化合物をスクリーニングするための広範囲の技術が開発されている（例えば非特許文献６を参照）。ターゲット同定率の上昇(非特許文献７および８)および化合物ライブラリサイズの増大は、新規なGPCRスクリーニング技術の開発を促進させ続けている（非特許文献９）。これらアッセイは、細胞ベースのアッセイと、GPCR-膜ベースのアッセイとに分類できる。その関心およびおびただしい数の現在および将来のGPCRターゲットにも関わらず、多数のGPCRを同時に研究するために記載された方法はほとんどない。最近、２つのグループの研究者が、バーコードをつけた基体上の一過性トランスフェクト細胞集合またはGPCRトランスフェクト細胞のアレイを多重化化合物スクリーニングに使用できることを主張している（非特許文献１０および１１）。
【０００７】
DNAマイクロアレイによって提供される並行分析の有用性（例えば非特許文献１２を参照）は、タンパク質アレイの開発を刺激した（例えば非特許文献１３を参照）。遺伝子発現プロファイリングの類似物としてのタンパク質存在度プロファイリングの使用の域を超えて、タンパク質アレイは、タンパク質−低分子およびタンパク質−タンパク質相互作用の高度に並行した研究の可能性を提示する（非特許文献１４−１７）
薬剤設計へのコンビナトリアルアプローチの重要性は実感されているが、コンビナトリアルケミストリーの生物学的同等物−タンパク質マイクロアレイを用いたマルチターゲットスクリーニング−はそうではない。マルチターゲットスクリーニングは、化学リガンド空間に対する生物学的ターゲット空間の効果的なマッチングの可能性を最大にする。タンパク質マイクロアレイは、必然的に、同時に多数のタンパク質に対して化合物を試験するのに適しているが、タンパク質チップを用いる多重化バイオアッセイの基本的側面のいくつかはまだ実証されていない。そのような基本的側面の１つは、多重化競合結合アッセイ用の標識リガンドのカクテルの必要性である。非特異結合、交差反応性、および標識リガンドを選択するための一般的ガイドラインを欠くことによる問題が、標識リガンドカクテルを用いることの実現可能性を試験することを科学者に思いとどまらせている。従って、タンパク質アレイは、それに対する標識リガンドがそのカクテル中に存在しないような−不必要な要素を含有し得る。このことは、タンパク質マイクロアレイの実用的な多重化能力を制限する。GPCRのためにこの一般的方法論の開発よりも重要かつ適切なものは存在しない。従って、GPCRマイクロアレイを用いる多重化結合アッセイ形式を提供できる新規な方法への要望が存在する。
【非特許文献１】Drews, J., "Drug Discovery: A Historical Perspective" Science 2000, 287, 1960-1963
【非特許文献２】Ma, P., and Zemmel, R., "Value of Novelty" Nat. Rev. Drug Discov. 2002, v.1, 571-572
【非特許文献３】Haga, T., and Berstein, G., eds., G-Protein-Coupled Receptors, CRC Press, Boca Raton, FL, 1999
【非特許文献４】Pierce, K. L., et al., "Seven-Transmembrane Receptors." Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002, v.3, 639-650
【非特許文献５】Howard, A.D., et al., "Orphan G-Protein-Coupled Receptors and Natural Ligand Discovery." TiPS 2001, V.22, 132-140
【非特許文献６】Hemmila, I.A., and Hurskainen, P., "Novel Detection Strategies for Drug Discovery," Drug Discov. Today 2002, 7, S152-S156
【非特許文献７】Venter, J.C., et al. "The Sequences of the Human Genome," Science 2001, v.291, 1304-1351
【非特許文献８】Hopkins, A.L., and Groom, C.R., "The Druggable Genome," Nat. Rev. Drug Discov. 2002, v.1, 727-730
【非特許文献９】Schreiber, S.L., "Target-Oriented and Diversity-Oriented Organic Synthesis in Drug Discovery," Science 2000, v.287, 1964-1968
【非特許文献１０】Ziauddin, J., and Sabatini, D.M., "Microarrays of Cells Expressing Defined cDNAs," Nature 2001, v.411, 107-110
【非特許文献１１】Beske, O.E., and Goldbard, S., "High-throughput Cell Analysis Using Multiplexed Array Technologies," Drug Discov. Today 2001, v.7, s131-s135
【非特許文献１２】Schena, M., et al. "Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray," Science 1995, v.270, 467-470
【非特許文献１３】Mitchell, P., "A perspective on Protein Microarrays," Nat. Biotechnol. 2002, v.20, 225-229
【非特許文献１４】MacBeath, G., and Schreiber, S.L., "Printing Proteins as Microarrays for High-throughput Function Determination," Science 2000, v.289, 1760-1763
【非特許文献１５】Schweitzer, B., et al. "Immunoassays with Rolling Circle DNA Amplification: A Versatile Platform for Ultrasensitive Antigen Detection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, v.97, 10113-10119
【非特許文献１６】Fang, Y., et al. "Membrane Protein Microarrays," J. Am. Chem. Soc. 2002, v.124, 2394-2395
【非特許文献１７】Fang, Y., et al. "G Protein-Coupled Receptor Microarrays," Chem. Biochem. 2002, v.3, 987-991
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、自己集合(self-assembled)標識リガンドカクテルの使用を含む多重化化合物プロファイリングまたはスクリーニングのための受容体マイクロアレイの使用について記載する。結合アッセイに基づくマルチ−GPCRターゲットスクリーニングは、自己集合リガンドカクテルの使用を必要とする。本発明はまた、並行Kd特定(parallel Kd determination)のための飽和アッセイ、多数のGPCRターゲットに対する単一化合物の並行IC50特定（例えば、選択的効力）または対応するGPCRターゲットに対する多数の化合物の並行IC50特定（例えば、相対的効力）のための競合結合アッセイ、ならびに、化合物スクリーニングのための競合結合アッセイおよび置換アッセイ等の、いくつかの多重化アッセイ形式を開示する。多重化結合アッセイを用いた化合物の選択的スクリーニングおよびプロファイリングは、GPCRマイクロアレイの主要用途の１つである。
【０００９】
本発明の１つの態様によると、主題のGPCRのマイクロアレイは、多重化化合物スクリーニングおよびプロファイリングに適している。本マイクロアレイは、位置決めされた配置で基体上に配列された複数のGPCRを含む。第１の実施形態では、（ヒトゲノムにおける）全ての公知のオーファンGPCRが、単一のアレイに含まれる。第２の実施形態では、代表的インデックスアレイ(representative index array)が、GPCRの各サブファミリーから選択されるGPCRメンバーを含んでいてよい。第３の実施形態では、選択性パネルアレイ(selectivity panel array)が、いくつかの関連GPCRサブファミリーから選択される少なくとも１つの単一のGPCRメンバーを含むものであってよい。選択されたGPCRメンバーは、特定の生理学的または薬理学的機能、あるいは特定組織系のいずれかに関連する。第４の実施形態では、突然変異誘発アレイが、GPCR、およびその変異体または突然変異体、あるいは異なる種を起源とする対応するGPCRから構成される。
【００１０】
本発明の方法およびアッセイ形式は、標識リガンドに対する試験化合物の競合的結合を含む間接的結合アッセイにおいてプロファイリングおよびスクリーニングを行うために、標識リガンドがその対応する受容体と結合する飽和能力(saturation capability)を利用する。
【００１１】
本発明に基づくマルチターゲット結合アッセイは、対応する受容体と自己集合可能な標識リガンドを含有するカクテルを用いる。本発明は、少なくとも１つの標識リガンドのカクテル溶液を含む。カクテル溶液中の標識リガンドは、マイクロアレイ中の各GPCRマイクロスポット要素に対するそれらの個々の結合能力に基づき選択される。各標識リガンドは、所望の結合親和性（例えば、0.1nMから20nM）および少なくとも50%から60%の結合特異性、ならびにアレイ中の他のGPCR要素との極小の交差反応性（例えば10％以下）で、少なくとも１つのGPCR要素と結合する必要がある。
【００１２】
多重化結合アッセイはいくつかの理由により技術的に挑戦的なものであるため、本発明は、標識リガンド結合特異性および親和性、アッセイバッファー適合性、存在物適合性(content suitability)、検出およびデータ分析に関連する問題に対する可能な解決方法に取り組む。本明細書に記載のデータは、任意の種類のタンパク質アレイで、多重化結合アッセイの使用について初めて実証したものと考える。
【００１３】
ある実施形態では、マイクロアレイにおける各マイクロスポットは、１種類のみのプローブ受容体を含む。別の実施形態では、各マイクロスポットは、生体膜中の主な種類のプローブ受容体（例えば、その受容体を過剰発現する細胞株から得られたGPCR膜調製物）を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのマイクロスポットは、少なくとも２種類の検出可能なプローブ受容体を含んでいてよい。好ましくは、異なる種類の受容体を検出する方法は、異なるタグで標識した異なる標識リガンドを同時に用いることを含む；タグは物理的または化学的にお互いに識別可能なものであってよい。各標識リガンドは、検出可能な受容体の１つと特異的に結合する。
【００１４】
支持基体に結合した様々なGPCR種を有するGPCRアレイ装置も開示する；そのような受容体種として、例えば、ニューロテンシン受容体サブタイプ１、モチリン受容体、δ２オピオイド受容体、オピオイド様受容体サブタイプ１、アセチルコリン受容体サブタイプ１（M1）、およびCHOまたはHEK細胞株の対照細胞膜等が挙げられる。
【００１５】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の詳細な説明で明らかにされる。前述の概要および以下の詳細な説明、ならびに実施例は、本発明の単なる例示であり、特許請求項に係る発明を理解するための概略を提供することを意図する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
I．定義
本発明を詳細に述べる前に、本発明は、特定の組成物、試薬、プロセス工程、または装置に必ずしも限定されず、改変され得る。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられているように、その文脈が明らかに他のものを指示しない限り、名詞の単数形は複数の対象物を含む。また、本明細書で用いられている専門用語は、特定の実施形態のみについて説明することを目的としており、限定を意図していないことを理解すべきである。本明細書で用いられている全ての技術的および科学的用語は、文脈が他のものを定義しない限り、本発明が属する分野の当業者によって慣習的に理解される通常の意味を有する。
【００１７】
用語「リガンド」は、特定の結合親和定数で受容体に容易に結合できる化学分子または生物分子を称する。
【００１８】
用語「標識リガンド」は、蛍光標識、放射性同位体標識、ハプテン標識（例えば、ビオチン）または金ナノ粒子で標識したリガンドを称する。
【００１９】
用語「カクテル溶液」は、様々な標識リガンドまたは様々な化合物の混合物を含有する媒体（例えば、緩衝溶液または水溶液）を称する。あるいは、いくつかの実施形態では、リガンドと化合物の両方が溶液中に一緒に存在する。
【００２０】
本明細書で用いられている用語「化合物」、「ターゲット」、または「ターゲット化合物」は、検出されるべき生物分子、生化学的または化学的存在物、分子、または薬剤候補を称する。
【００２１】
用語「生物学的分子」または「生体分子」は、例えば、修飾されたまたは修飾されていない、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質または糖類を含む、任意の種類の生物学的存在物を称する。
【００２２】
用語「同系の」、「対応する」または「対の」は、ある分子の別の分子に対する相互部分を称する；特に、所定の受容体に特異的に結合し得るリガンドをリガンド−受容体対と称する。
【００２３】
用語「バイオスポット」または「マイクロスポット」は、生物学的または化学的プローブを含む基体表面上の分離または規定された領域、部位またはスポットを称する。
【００２４】
用語「受容体マイクロスポット」は、膜結合タンパク質の沈着物を含むマイクロスポットを称する。受容体として、GPCR、リガンド依存性イオンチャネル受容体、チロシンキナーゼ受容体、セリン／トレオニンキナーゼ受容体、またはグアニル酸シクラーゼ受容体が挙げられる。
【００２５】
用語「GPCR」は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質共役受容体を称する。GPCRは、天然配列または修飾配列のいずれを有するものであってもよい。
【００２６】
用語「GPCR膜」または「GPCR膜断片」は、膜層内に埋め込まれたGPCRを有する生体膜または細胞膜断片、あるいはミセル内に再構成されたGPCRを有するミセルを称する。
【００２７】
用語「GPCRマイクロスポット」は、Ｇタンパク質共役受容体（GPCR）の沈着物を含むマイクロスポットを称する。対応するマイクロスポットは、「プローブマイクロスポット」と称され、それらマイクロスポットは空間的に指定可能な態様で配列されてマイクロアレイを形成する。
【００２８】
用語「プローブ」または「受容体プローブ」は、B. Phimister (Nature Genetics 1999, 21 supplement, pp.1-60)によって推奨されている専門語に従って、基体表面に固定化された受容体分子（例えばGPCR）を称する。好ましくは、プローブは空間的に指定可能な態様で配列されてマイクロスポットのアレイを形成する。アレイが関心試料に暴露された場合、試料中の分子はその結合パートナー（すなわちプローブ）に選択的かつ特異的に結合する。プローブに対する「ターゲット」の結合が、その「ターゲット」分子の濃度および特定プローブに対するその親和性により定められる程度で生じる。
【００２９】
本明細書で用いられている用語「基体」または「基体表面」は、安定な支持体を形成できる固体、半固体、または多孔性物質（例えば、マイクロまたはナノスケールの微細孔）を称する。基体表面は、例えば、ガラス、セラミック、金属、ポリマー、プラスチックまたはそれらの組合せ等を含む、様々な材質から選択できる。
【００３０】
本明細書で用いられている用語「機能化(functionalization)」は、基体表面上に複数の官能基を提供するための固体状基体の修飾に関連する。本明細書で用いられている表現「機能化表面」は、基体表面上に複数の官能基を有するように修飾された基体表面を称する。表面は、アミン提示機能性(amine-presenting functionality)（例えば、γ-アミノプロピルシラン（GAPS）コーティング）を有していてもよく、あるいは、例えばキトサンおよびポリ（エチレンイミン）のようなアミン提示ポリマー(amine presenting polymer)で被覆してもよい。
【００３１】
II．説明
以前、我々は、従来のロボットピンプリンティング技術および受容体を過剰発現する細胞株由来のGPCRを含有する細胞膜調製物を用いて、GPCRマイクロアレイを製造できることについて記載した（例えば、米国特許出願第09/974,415号（米国特許公開第2002/0019015号 A1）、および米国特許出願第09/854,786号（米国特許公開第2002/0094544号 A1）を参照。それらの内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）。また、我々は、特定の表面化学的性質を提示する基体上の生体膜マイクロアレイを製造する方法について記載した（米国特許出願第10/300954号を参照。参照によって本明細書に組み込まれる）。これらの種類のアレイは、周囲条件下で（すなわち、流動条件下または湿式条件下でなく）作成でき、約４℃で保管し、さらにその後長期間に亘りその機能性を維持できる。
【００３２】
そのようなアレイは、化合物プロファイリングおよびスクリーニングに有用であるが、多重化適用の可能性は容易には達成できなかった。GPCRマイクロアレイは理論的には複数のGPCRを同時に分析するのに適しているが、多くの論点および関連する問題がこの構想を現実にするのを妨げた。第１に、DNAマイクロアレイを用いるDNAハイブリダイゼーションとは異なり、GPCRとリガンドとの間の相互作用はかなり複雑である。GPCRに対するリガンドは非常に多種多様であり、生体アミン、ペプチドおよびタンパク質、脂質、ヌクレオチド、興奮性アミノ酸およびイオン、小さな化学化合物等が挙げられる（Morris, A.J., and Malbon, C.C., "Physiological Regulation of G-Protein-linked Signaling," Physiol. Rev. 1999, 79, 1373-1430）。特定のGPCRは、細胞株中の少なくとも１つの三量体Ｇタンパク質に結合できる。GPCRに対するアゴニストの結合親和性は、その受容体のＧタンパク質とのカップリング状態に依存する。受容体と結合する化合物は、例えばアゴニズム、アンタゴニズム、スーパーアゴニズム(super-agonism)またはインバースアゴニズム(inverse agonism)のような様々な機能性を有するであろう。関連する結合部位は、同じ受容体に結合する異なる化合物において異なるかもしれない。
【００３３】
第２に、アッセイ開発のために、バッファー適合性および最適化も検討する必要がある。例えば、いくつかのGPCR-リガンド相互作用は、例えばMg2+またはMn2+のような特定の二価陽イオンの存在に強く依存する。バッファー組成物は、膜タンパク質の機能性に影響するのみならず、アレイ中の受容体に対するリガンドまたは化合物の結合親和性にも影響し得る。さらには、バッファー組成物は、表面上に固定化された受容体含有脂質膜の安定性および装填(packing)に対する負の影響も有する可能性があり、従って、アレイ性能およびアッセイの信頼性を低下させ得る。
【００３４】
第３に、標識リガンドの選択は、より重要でないとしても同様のことが言える。理想的な標識リガンドは、低濃度での標識リガンドの使用を可能にしさらに厳しい洗浄方法を可能にするために、高い親和性で、かつ同じマイクロアレイ中の他の受容体との極小の交差反応で、対応する受容体に対してのみ結合する必要がある。しかしながら、高い親和性は、リアルタイム蛍光測定に関する要求ではない。経験的データは、GPCRマイクロアレイ用途のための理想的蛍光リガンドが、例えば比較的親水性であり、低い有効電荷（好ましくは、負に荷電しているか中性である）、良好な光安定性、高い結合親和性（低いKd、好ましくは、0.5nM〜10nNのnM範囲内）、アレイ中の所定の受容体に対する高い特異性（50％以上または60％以上）、および同じマイクロアレイ中の他の受容体に対する極小の交差反応を有するといった、特定の特性を有する必要があることを示唆する。
【００３５】
ヌクレオチドマイクロアレイ（例えば、逆転写によって標識cDNAを作成するために色素−ホスホラミダイトでRNAを標識する）を用いる場合とは異なり、タンパク質マイクロアレイのための標識リガンドカクテルを設計するための万能溶液としてどの様式も適用できない。DNA−塩基対合に類似する単純コードを受容体−リガンド相互作用が欠くことが、高度多重化化合物プロファイリングのためのタンパク質マイクロアレイの実現の妨げとなった。特異性および交差反応のための基本的ガイドラインを設定し、さらに選択方法に最高の厳密さを用いることが、化合物スクリーニングへのタンパク質マイクロアレイの現実的な使用を可能にする。
【００３６】
これらの論点に対処し、さらに一貫して信頼できる多重化結合アッセイを達成するために、前述の基準に適合しそれらを組み込んだ本発明を提案する。本発明の一般的概念の説明として、図１は、GPCRマイクロアレイと共に標識リガンドのカクテル溶液を用いる多重化競合結合アッセイの概略図を示す。
【００３７】
図１において、３種類の受容体（マイクロスポットの各列に１つずつ）が、アレイ中の支持体表面に固定化される。このアレイに、３つの標識リガンドを含有する「カクテル」溶液を試験化合物と共に添加する。受容体ＡおよびＢに対応するリガンドＡおよびＢは、そのスペクトル蛍光発光の特徴(spectral fluorescence signature)において同じまたは類似であるフルオロフォア(fluorophore)を用いて標識される。受容体Ｃに対応するリガンドは、リガンドＡおよびＢを標識したフルオロフォアと区別可能な励起および発光スペクトルを示す異なる種類のフルオロフォアで標識される。一旦カクテル溶液を添加すると、２つの可能な状況が表現される。第１の状況では、試験化合物はいずれの受容体タンパク質にも結合しないため、特異的阻害は全く観察されない。第２の状況では、同系の受容体Ｃへの対応標識リガンドの結合に対する試験化合物による特異的阻害によって、シグナル強度に低下が観察される。従って、試験化合物は受容体Ｃへの結合を特異的に阻害する。
【００３８】
本発明の利点は、速度の高まりおよび迅速なターゲット同定への要望のため今日特に核心となっている多重化および小型化を促進する。複数の受容体に対する結合情報を得ることは本質的に強力な技術であり；本発明を用いて、例えば、単一受容体に対する複数の化合物ならびに複数の受容体に対する複数の化合物のような、多次元的構造−活性相関を達成できる。
【００３９】
結合アッセイは通常、タンパク質／ペプチドプロファイリングの用途に向けられる。そのようなアッセイの最新の実施例は、所定の配置で表面上に関心タンパク質分子を固定化することを含む（例えば、Wilson, D.S. and Nock, S., "Functional Protein microarrays," Curr. Opinion in Chemical Biology 2001, 6, 81-85; Zhu, H., et al., "Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips," Science 2001, 293, 1201-2105を参照）。抗体プローブのアレイは、血中のタンパク質存在量を測定するため、サイトカイン存在量を測定するため、ならびに白血球／白血球の表現型を捕獲するために、タンパク質プロファイリングを行うのに使用されている。抗原プローブのアレイは、自己免疫抗体およびアレルギー性を測定するためにリバース免疫アッセイ(reverse immunoassay)に用いられている。
【００４０】
他に、生体高分子、特に生体ポリマーを、シークエンシング、フィンガープリンティング、およびマッピングする方法および装置も提案する。
【００４１】
例えば、米国特許第6,416,952号(Pirrung et al.,)は、蛍光標識したポリペプチドターゲットを用いて検出するために公知配列を有する複数のポリペプチドを用いることに関連する。Pirrungらによって開発された方法は、上述した多重化適用に関連する複雑さを考慮しておらず、おそらくそのような目的に実現可能ではないであろう。さらに、それらの基本骨格は、試料中のペプチド／タンパク質の直接結合プロファイルアッセイのために主に構成されている。一方、本発明は、ある受容体と結合する所定の標識リガンドの効力に対する、アレイ上の同じ受容体に結合する小さな生物学的、生化学的または化学的分子または化合物（例えば、分子量≦〜10,000ダルトン、好ましくは約100-5000ダルトン）の競合力を利用する、間接結合アッセイに関する。さらには、Pirrungらの基本骨格は、
マイクロアレイ中のプローブポリペプチドの数が、試料中の検出されるべき利用可能なターゲットポリペプチド分子の数を圧倒するような設計に頼る。一方、本発明は、標識リガンドがマイクロアレイ中の対応プローブ受容体に結合するような可逆的結合システムを利用する。特に、（プロファイリングまたはスクリーニング試験において）プローブ受容体は、好ましくは、標識リガンドの結合によって飽和され得る。
【００４２】
組合せ的な「数」の観点から、ある群のタンパク質（例えば、〜700 GPCR）に関して生物学的ターゲット空間を調査(map)する試みは、巨大な化学リガンド空間を調査する試みよりも実際に取り扱いやすい。この主要ターゲットタイプを化合物ライブラリと適合させる可能性を顕著に高めることによって、GPCRマイクロアレイが薬剤発見および基礎研究のための重要なツールとして出現することを予測する。
【００４３】
Ｉ．主題のGPCRマイクロアレイ
DNAマイクロアレイにおいてアレイ設計のために考慮しなければならない何万という遺伝子とは異なり、より少ない数のGPCR−ヒトゲノムは約400-700 GPCRを含む−が存在する。科学者は、約200のGPCRに関連するリガンドを発見した。その天然アゴニストが未確認である受容体は、「オーファン」GPCRと称される。１つの実施形態では、公知および／またはオーファンGPCRの全てを表面に配列して、完全インデックスアレイ(full index array)を形成する；そのようなアレイは、ターゲットの同定、天然アゴニストの同定、および化合物スクリーニングに用いることができる。別の実施形態では、全てのGPCRの各サブファミリーの１つのサブファミリーメンバーをアレイに一緒に配列して代表的インデックスアレイを形成することができる；そのようなアレイは、化合物スクリーニングに用いることができ、さらには、ファミリーGPCRに対して化合物を分類するのにより適している。
【００４４】
可能性のある薬剤化合物の、同じ器官、組織または単細胞中の他のGPCRに対する標的GPCRへの選択性は、薬剤開発の間に考慮および観察すべき非常に重要な因子である。現在、ほとんど全てのHTS技術が、１度に単一ターゲットをスクリーニングすることに関連する。GPCRアレイは、様々な受容体に対する複数の関心化合物の選択性を評価するのに使用できる。本発明の１つの実施形態では、GPCRの単一またはいくつかの関連するサブファミリーを表面上に配列してもよい；そのようなアレイは、好ましくは、化合物の薬理学的プロファイリングおよび選択的スクリーニング用である。
【００４５】
図２Ａ−Ｃは、マイクロタイターウェルプレート（別名マイクロプレートとも称する）の底の拡大分解図を示す。図２Ａは、マイクロプレートの概略図である。図２Ｂは、脂質膜に、好ましくは流動的に結合し、または埋め込まれた、小規模の所定のGPCRを図示する。マイクロスポットのアレイを形成するマイクロプレート中のウェルの底面に、所定の配置で膜を沈着および固定化させる。図２Ｃは、概念方向付けとして、受容体タンパク質分子のＮ−末端側がウェルの底の固体支持体から離れるように方向付けして固定化および配列されたGPCRを含む脂質膜を示す。好ましくは、膜中のGPCR分子は、特定の三量体Ｇタンパク質と結合する。
【００４６】
好ましい実施形態では、類似の特定の組織分布、または生理学的および薬理学的な特定の役割を共有するGPCRを１つの表面上に配列させる；そのようなアレイは、化合物の選択性スクリーニングに好ましい。いくつかのGPCRは、好ましくは、あるタイプの組織に分布する。例えば、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン２受容体、ヒスタミン２受容体、セロトニン４受容体、およびプロスタグランジン受容体を含むいくつかの受容体は、胃腸系に顕著に分布するが、一方、セロトニン１Ａ／１Ｄおよび２Ａ／２Ｃ受容体、ニューロテンシン１および２受容体、オピオイド受容体（ミュー（μ）、デルタ（δ）、カッパ（κ）、ORL-1）、およびドーパミン２／３受容体を含むいくつかの受容体は、中枢神経系に顕著に分布する（Stadel, J.M., et al. TIPS 1997, v.18, 430-437）。同様に、いくつかの受容体は、公知の生理学的および薬理学的機能に関連する。例えば、ケモカインに対するあるGPCRは、HIV感染の補因子として作用する（Feng, Y., et al., Science 1996, v.272, 872-876; Deng, H.K., et al. nature 1996, v.381, 664-666）。さらには、セロトニン１Ａ、アデノシンＡ １／２およびアンギオテンシン受容体を含むいくつかの受容体は、不安および高血圧において重要な役割を果たすが、一方、オピオイド受容体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体およびニューロペプチドＦＦ受容体を含むいくつかの受容体は疼痛管理に関連する。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、GPCRおよびその生理学上重要なまたは任意の変異体を表面上に配列させる；そのようなアレイは、好ましくは、構造活性相関の研究、ならびに所定のヒト疾患または癌において重要な役割を果たすGPCR変異体に対する高度に特異的な薬剤化合物のスクリーニングに適している。いくつかのGPCRおよびその変異体は、ある腫瘍の発生に関連する。例えば、ロドプシンの特定の変異は、網膜色素変性症に関連するが、バソプレシンＶ２の特定の変異は、Ｘ連鎖性腎性尿崩症に関連する(Stadel, J.M., et al., Trends in Pharamaco. Sciences 1997, v.18, 430-437)。
【００４８】
別の実施形態では、個人の関心GPCRを表面上に配列させる；そのようなカスタムアレイは、それら独自の化合物の選択性スクリーニングを提供するのに用いることができる。
【００４９】
II.標識リガンド
対応GPCRに関連する機能性の観点から、リガンドは、アンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニスト、またはインバースアゴニストを含む群より選択することができる。リガンドは、天然のアゴニストであっても、あるいは合成化学的、生化学的または生理学的化合物又は分子であってもよい。化学的同定または構造の観点から、リガンドは、ヌクレオチド、ヌクレオシド、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド、有機または無機化合物、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、脂質、または修飾脂質であってよい。
【００５０】
多重化結合アッセイにおいて、リガンドは対応する受容体タンパク質に容易に結合する必要があり、また標識してもよい。ある実施形態に基づき、リガンドが標識される場合、リガンドは、様々な最先端の技術または方法論によって検出可能なものでなければならない。標識は、用いられる所望の検出技術に基づき選択され、例えば、蛍光、放射能検出、化学または生物発光、蛍光アップコンバージョン、または他の技術が挙げられる。好ましくは、標識は蛍光色素（例えば、Bodipy-フルオレセイン、Bodipy-TMR、ローダミン、Texas-Red、Cy-3、Cy-5、またはフルオレセイン）である。あるいは、標識は、例えばP32、S35またはI125のような放射性同位体である。例えばビオチンのような別の標識種に関して、検出技術は、標識ストレプトアビジン、抗ビオチン抗体、あるいはストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体−被覆粒子（例えば、金ナノ粒子であり、共鳴光散乱を検出に用いる）であってよい。
【００５１】
第２の実施形態において、グレーティング付き導波路(grating-coupled waveguide)、表面プラズマ共鳴、または他の質量ベースのバイオセンサーシステムを用いるエバネッセント場検出器に基づく直接結合アッセイを用いることができる。この場合、リガンドは標識してもしなくてもよい。任意の標識種を直接結合アッセイ用に用いることができる。特定の実施形態では、標識は、検出感度の向上に有用である十分な質量または光学特性を有する種であってよい。例えば、約1nmから約45nm、あるいは約100nmまでの径を有する金粒子をリガンドに結合させることができる。
【００５２】
本発明の多重化結合アッセイを効率的に動かすには、標識リガンドは上述したいくつかの重要な特性を満たさなければならない。GPCRマイクロアレイ用途のための理想的な蛍光標識リガンドは、比較的親水性で、低い有効電荷を有し、良好な光安定性を有し、アレイ中の対応する受容体に対する約55％以上または60％以上の特異性をもって数nMレベルの結合親和性（Kd）を有する必要がある。また、リガンドは、他の種類の受容体に対して極小の交差活性を示す必要がある。
【００５３】
III．標識リガンドカクテル溶液
通常、本発明に基づき、１以上の標識リガンドを含有するカクテル溶液を多重化結合アッセイで用いる。カクテル溶液中の各標識リガンドは、アレイ中の対応GPCRのみに結合する必要がある。例えば、Cy5-ナルトレキソンはフルオレセイン-ナルトレキソン（例えば、Molecular Probes, Inc.から市販されている）よりもより親水性であり、Kdの1-4倍の濃度で〜90％の特異性をもって2.5nMのKdでδ２オピオイド受容体に結合することができ、さらに、例えばニューロテンシン受容体（NTR1）、ニューロキニン受容体サブタイプ２（NK2）、モチリン受容体（MOTR）、ならびにβ１、β２およびα２Ａアドレナリン受容体のような、多数の受容体に対して極小の交差活性を有するため、Cy5-ナルトレキソンはδ２オピオイド受容体の標識リガンドとして働く。同様に、Bodipy-TMR-モチリン1-16(BT-MOT16)は、比較的親水性でありかつ生理学的ｐＨで中性電荷を有し、Kdの1-4倍の濃度で〜75％の特異性をもって〜3nMのKdでMOTRに結合することができ、さらに、例えばニューロテンシン受容体（NTR1）、δ２オピオイド受容体、ニューロキニン受容体サブタイプ２（NK2）、ならびにβ１、β２およびα２Ａアドレナリン受容体のような、多数の受容体に対して極小の交差活性を有するため、BT-MOT16はモチリン受容体のための標識リガンドとして選択される。
【００５４】
あるいは、リガンドが所望の親和性および特異性をもっていくつかの異なる受容体と結合する場合は、単一タイプの標識リガンドをいくつかの異なる受容体に用いることも可能である。例えば、Bodipy-TMR-CGP 12177は、類似の親和性（1-1nMのKd）で、β１およびβ２アドレナリン受容体に特異的に結合することが報告されている（Fang, Y., et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 2394-2395; Baker, J.G., et al., Brit. J. Pharmacol. 2002, 139, 232-242）。
【００５５】
多重結合アッセイのために、標識リガンドがマイクロアレイにおいてその対応する受容体に結合した後、同様の強度を有することは必要ではない。様々な化合物濃度の関数としての各受容体のデータ分析は、絶対シグナル強度、相対シグナル強度、または２つの異なる色素を用いる場合はレシオメトリック分析(ratiometric analysis)を含む、様々な方法で行うことができる。カクテル中の標識リガンドは、アゴニストおよび／またはアンタゴニストであってよく；カクテル中の各リガンドの濃度は、総結合シグナルならびに特異性を最大にするため、対応受容体に対するリガンドのkd値に比較的近い値である必要がある。好ましくは、標識リガンドの濃度は、Kd値の約〜0.7または1から4倍であろう。カクテル中の標識リガンドは、異なる蛍光色素部分（例えば、ローダミン-、Bodipy-TMR-、Cy3-、Cy5-等）で標識してよく；検出器はマルチチャンネル蛍光スキャナー（例えば、FITC、Cy3、TR、Cy5チャンネル）でよい。概して、多重化結合アッセイは、「普遍的」なバッファー条件、および、他のリガンドおよび受容体の存在下で各リガンドがその同系の特異性を維持するような標識リガンドカクテルを必要とする。それらの必要性は、普遍的結合条件の体系的な検討、ならびに、適切な蛍光標識、標識結合のための同系リガンドおよび標識化の化学反応等の注意深い検討を要求する。
【００５６】
IV．使用方法
本明細書に記載の実施例は、蛍光マイクロアレイスキャナー（例えばGenepix）が利用可能なため、蛍光ベースの検出を利用しているが、他の種類の検出も利用できる。例えば、放射能ベースの検出は、高解像度のphosphorimager（例えば、Typhoon 9410, Amersham Biosciences）を用いて実現可能であり、非特異結合の問題を減らすため、蛍光ベースの検出よりも優れたデータを提供することさえ可能である。
【００５７】
１．並行Kd特定のための多重化飽和アッセイ
多重化飽和アッセイを用いて、標識リガンドのその対応する受容体に対する結合定数（すなわちKd）を同時に測定できる。このアッセイでは、標識リガンドカクテルを用い；各標識リガンドは、同じアレイ中の他の受容体に対して全くないかまたは極小の交差活性で、アレイ中のそれ自体の対応GPCRに対して特異的に結合する。過剰な非標識対応リガンドの不在下および存在下様々な濃度で標識リガンドカクテルを含有するバッファー溶液と共に、２つのサブセットのマイクロアレイを別個にインキュベートする。標識リガンドのみとインキュベートした第１のセットのアレイの蛍光シグナルから、標識リガンド（同じ濃度の）および過剰な非標識リガンドと共にインキュベートした第２のセットのアレイの蛍光シグナルを引くことによって特異的結合の量を特定した。スキャッチャード分析を用いてKdを算出した。
【００５８】
例えば、ヒトモチリン受容体（MOTR）、ニューロテンシン受容体サブタイプ１（NTR1）およびδ２／オピオイド受容体（δ２，OP1）から成るマイクロアレイに対する、BT-モチリン1-16（BT-MOT16）、Cy5-ニューロテンシン2-13（Cy5-NT）およびCy5-ナルトレキソンの結合を図３に示す。図３Ａにおけるプロットは、NTR1と反応した標識リガンドの結合曲線を示す；図３Ｂは、標識リガンドのOP1との反応を示す；図３Ｃは、MOTRと反応した標識リガンドの結合曲線を示す。図３Ａおよび３Ｂの反応は、Cy5チャンネルで観察したが、図３ＣはCy3チャンネルで観察した。
【００５９】
各リガンドのその対応受容体に対するkd値を算出するため、受容体（OP1、MOTRおよびNTR1）を有するマイクロアレイを、過剰な非標識リガンド（それぞれ〜2μMの濃度のMOT、ナルトレキソン、NT）の不在下または存在下、カクテル溶液（Cy5-Nal、BT-MOTおよびCy5-NTのそれぞれを0.26、0.64、1.6、4、10および25nMの濃度で含む）で処理する。カクテル単独の存在下でのシグナルから、さらに過剰量の非標識リガンドを含む溶液で処理した場合のシグナルを引くことによって、特異的結合を特定した。コンピュータープログラム（例えばPrism（商標））を用いてKd値を計算する。
【００６０】
２．単一化合物の選択的効力を評価するための多重化競合結合アッセイ
多重競合結合アッセイを用いて、カクテル中の各標識リガンドに対抗する、マイクロアレイ中のその対応GPCRに対する単一化合物の「選択的効力(selective potency)」を特定することができる。このアッセイでは、標識リガンドカクテルを用いる；各標識リガンドは、同じアレイ中の他の受容体に対して全くないかまたは極小の交差活性で、アレイ中のそれ自体の対応GPCRに特異的に結合する。さらには、複数のサブアレイを、予め定めた一定濃度の標識リガンドカクテルの存在下、様々な濃度の所定の化合物で別個に処理する。各受容体マイクロスポットの蛍光強度を化合物濃度の関数として検討し、IC50値を後で抽出した。
【００６１】
Cy5-ナルトレキソンのδ２への結合、Cy5-NTのNTR1への結合およびBT-MOT16のMOTRへの結合に対抗する、単一化合物、ナルトレキソンの選択的効力を、MOTR、NTR1およびδ２から成るマイクロアレイを用いて検討した。図４Ａ−Ｃは、本発明の方法の実施形態に基づき実施した実験の結果を示す。図４Ａは、ナルトレキソンによる、Cy5-ナルトレキソンとOP1受容体との間の結合反応への濃度依存的阻害プロフィールを示す。図４Ｂおよび４Ｃはそれぞれ、BT-MOT16とMOTとの結合反応、およびCy5-NTとNTR1との結合反応への濃度依存的阻害プロフィールを示す。各図面は、２重実験から得られたデータを示す。カクテル溶液中の３つの標識リガンドのそれぞれの濃度は：BT-MOT16 5nM；Cy5-NT 5nM；Cy5-ナルトレキソン 2.5nMである。
【００６２】
３．複数の化合物の相対的効力を評価するための多重化競合結合アッセイ
多重化競合結合アッセイを用いて、マイクロアレイにおける対応GPCRへのカクテル溶液中の各標識リガンドの結合に対抗する、複数化合物の相対的効力を特定することができる。そのようなアッセイでは、同じアレイ中の他の受容体に対する極小の交差結合で、用いた濃度範囲内（例えば、図６に示すように、別の方法を用いて、またはGPCRマイクロアレイを用いる最初のスクリーニングを用いることによって、μM濃度まで）で各化合物がそれ自体の受容体に対して特異的に結合することを予め特定することができる。前述したように、標識リガンドのカクテル溶液を用いる。各標識リガンドは、同じアレイ中の他の受容体に対して全くないかまたは極小の交差活性で、アレイ中のそれ自体の対応GPCRに特異的に結合する。サブアレイを、それぞれ固定濃度の標識リガンドのカクテル溶液の存在下、様々な濃度の非標識化合物の溶液で別個かつ個別に処理する。各受容体マイクロスポットの蛍光強度を化合物のカクテルの濃度の関数として検討し、化合物に関するIC50値を算出する。２セットの実験を実施する。第１セットは、３つの化合物（NTR1に対してニューロテンシン、MOTRに対してモチリン、そしてδ２に対してナルトレキソン）を用いることを含む。第２セットは、３つの化合物（NTR1に対してニューロメディンＮ、δ２に対してエンドモルフィンII、そしてMOTRに対してモチリン）を用いることを含む。
【００６３】
MOTR、NTR1およびδ２を有するマクロアレイを用いて、δ２へのCy5-ナルトレキソンの結合親和性、NTR1へのCy5-NTの結合親和性、およびMOTRへのBT-MOT16の結合親和性に対抗する、これら化合物の相対的効力を評価する。結果を添付の図５Ａ−Ｃのグラフに要約する。IC50値の多重化評価は、MOT、NTR1およびOP1受容体から成るマイクロアレイを標識リガンドのカクテル（Cy5-Nal、BT-MOT、Cy5-NT）および非標識リガンド混合物で処理することによって得られた。非標識リガンド混合物は、ニューロテンシン、モチリンおよびナルトレキソン、またはニューロメディンＮ、モチリンおよびエンドモルフィンIIを含有する。以前の実験から、各リガンドはGPCRマイクロアレイ中の受容体の１つのみに結合することが分かっている。混合物のプロットを各受容体に関して分類して、それらの異なる親和性を際立たせる。モチリンは２つの混合物に含まれていたため、２つのプロットをモチリンによる阻害に関して示す。
【００６４】
４．標識リガンドのカクテル溶液を用いた、化合物スクリーニングのための多重化競合結合アッセイ
多重化競合結合アッセイを、カクテル溶液中の少なくとも１つの標識リガンドのその対応GPCRとの結合を潜在的に阻害可能である化合物をスクリーニングするのに用いることができる。そのようなアッセイに基づき、標識リガンドのカクテル溶液を提供する。各標識リガンドは、同じアレイ中の他の受容体に対して全くないかまたは極小の交差活性で、アレイ中のその対応するGPCRに特異的に結合する。さらには、各サブアレイを、固定濃度の標識リガンドのカクテル溶液の存在下、固定濃度（通常〜１μM）の少なくとも１つの化合物で個別に処理する。１方はMOTRおよびNTR1プローブを有するマイクロアレイで他方はδ２およびβ１受容体を有するマイクロアレイに対して、化合物をスクリーニングする本発明の２つの実施例の結果を図６に示す。結果は、蛍光標識リガンドのその対応受容体との結合が、その受容体自体の公知リガンドによってのみ特異的に阻害され得ることを示す。
【００６５】
５．単一標識リガンドを用いた、化合物スクリーニングのための多重競合結合アッセイ
化合物スクリーニングのための多重化結合アッセイの簡易化変形に基づき、所望の親和性で同じサブアレイ中の少なくとも２つの受容体と特異的に結合できる単一の標識リガンドを用いる。１つの実施例では、化合物選択性スクリーニングのため、アドレナリン受容体サブファミリー（β１、β２およびα２Ａ）から選択される３つのGPCRメンバーを有するマイクロアレイを使用できる。蛍光標識CGP 12177リガンド分子は、アレイ中のβ１およびβ２と結合でき、従って、この種のリガンドを用いて２つの受容体をモニターする。結果は、アドレナリン受容体を標的とする薬剤化合物ICI 118 511が、β２（4.8nMのKi）に対してβ１（80nMのKi）よりも顕著に高い親和性を有することを示唆する。これらの発見は、関連科学文献に報告されているデータと一致する。図３−７からのデータに関して、１以上の標識リガンドが１つより多くの受容体に結合する（例えば、受容体サブファミリーごとに１つの標識受容体）ように特別に設計された標識リガンドカクテルを用いる方法も提案する。
【００６６】
６．化合物スクリーニングのための多重化置換アッセイ
化合物スクリーニングのための別の多重化結合アッセイは、GPCR分子に予め結合した蛍光標識リガンドを用いることを含む。この様式のアッセイは、推定リガンドを含有する溶液で処理する前に、標識リガンドと共にGPCRマイクロアレイをインキュベートすることを含む。この種のアッセイは、標識リガンドのその対応GPCRへの高い親和性によって実現可能である。物質移動制限再結合（mass transport limited rebinding）は、標識リガンドの解離速度をかなり低下させるため、結合事象はアッセイの間に亘り実質的に不可逆的である。しかしながら、競合リガンドを含有する溶液でのアレイの処理は、結合したリガンドの置換をもたらし得る。実施例のデータを図８Ａ−Ｄに要約する。
【００６７】
V．多重化能力の向上
本発明は、マイクロアレイの総合的な多重化能力を高める方法についても記載する。そのような方法は、96ウェルまたは384ウェルマイクロタイタープレートの底に配列された複数の生物学的プローブを有する、マイクロタイタープレートに配置したマイクロアレイに関して実際的に有用であろう。マイクロプレートのウェルの底面での空間的制限のため、限られた量の生物学的プローブしか同時に固定化および分析できない。例えば、384ウェルプレートでは、〜0.136cm2のみがアレイを沈着させるのに利用できる。384ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルが、それぞれ３重で3-4受容体を配列し；あるいは最大でウェル当たり約20要素配列するのに使用できるのみであることは、容易に計算できる。この限定された数の要素は、統計的信頼性のために三重または四重でアレイ中の各種類のプローブを用いて、約5-10の範囲で観念的に番号付けするプローブ受容体の選択性パネルを有する高処理能力スクリーニング用途に通常不十分である。
【００６８】
本発明は、生物学的マイクロアレイのためのプローブの受容能力を少なくとも倍増させることを可能にする２色検出アプローチと少なくとも組み合わせて、単一マイクロスポット内に共に固定化された少なくとも２つの受容体の使用を含む。その新規なアプローチは、GPCRマイクロアレイの観点から記載されているが、一般的概念は、単に１種または１種類のマイクロアレイ用途に必ずしも限定されない。プローブ要素を用いる任意のタイプの生物学的マイクロアレイは本発明の方法から恩恵を受けるであろう。本発明の特定の実施形態では、少なくとも２つの生物学的ターゲットを混合し、その混合物を用いてマイクロアレイを製造する。得られたマイクロアレイは、多重化に関して最小で２倍の受容能力を有する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも２色検出を有する系を利用する。２色検出系は、例えば、異なる標識タグで標識した２つの混合標識リガンドのカクテルを用い、かつ各標識リガンドは各マイクロスポット中の１つのプローブのみに特異的に結合する。タグは、物理的および化学的特性において異なるものであってよい。好ましくは、それらタグは蛍光色素である。別の実施形態では、それらタグは、異なる質量または発光（散乱）特性を生じさせるナノ粒子である。ほとんどの既存の蛍光画像化技術（例えば、FITC、Cy3、Texas RedおよびCy5）は、４チャンネルに限定されるため、４つのプローブを各マイクロスポットに設定できる。しかしながら、このプローブの数は、本発明を必ずしも制限しない。マイクロアレイ用途の技術は進歩するため、より多くの数のプローブをマイクロスポットごとに組み込むことが可能であろう。
【００７０】
図１０に示すように、このアプローチの概念実行の裏付けが実証された。この発明の利点として、２つの受容体を混合するために各マイクロスポットにおける最大結合部位は減少するが、アッセイ感度の有意な低下およびアレイ中の受容体に結合するリガンドの薬理学的特性の顕著な変化を全く経験しないで、約200倍程度まで、マイクロプレート中のマイクロアレイの多重化能力を高め、さらに、プリンティングの前に２つの受容体を混合することによって２つの受容体間のプリンティングおよびアッセイ変動性を低減することが可能なことが挙げられる。
【００７１】
従って、繰返すが、本発明は、リガンドまたは化合物をプロファイリングまたはスクリーニングするための主題のGPCRマイクロアレイおよび方法に関するものである。主題の多重化GPCRマイクロアレイは：位置決めされた配置で基体上に配列された複数のGPCR；前記GPCRは、a)GPCRの各サブファミリーのメンバーであるか、またはｂ）GPCRのいくつかの関連サブファミリーから選択される少なくとも単一メンバーであるか、またはｃ）GPCRおよびその変異体または異なる種に由来するその対応GPCRである。前記マイクロアレイ中のGPCRは、機能性、生理機能、ファミリー、病理、組織分布、突然変異誘発、または進化的歴史のいずれかによって、お互いに関連する。
【００７２】
ある実施形態に基づき、本発明の方法は：ａ）複数の受容体マイクロスポットを基体上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し、ここで、前記カクテル溶液は、１）それぞれ異なる濃度の標識リガンドのみを含有するか、または２）過剰量の対応リガンドの存在下、それぞれ異なる濃度の標識リガンドを含有し；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；さらにｄ）各標識リガンドのその対応する受容体への結合親和性を特定する；工程を含む。受容体はグアニンヌクレオチド結合タンパク質共役受容体（GPCR）、リガンド依存性イオンチャネル受容体、チロシンキナーゼ受容体、セリン／トレオニンキナーゼ受容体、またはグアニル酸シクラーゼ受容体である。GPCRは生体膜と結合しており、それは、i）GPCRを含む細胞膜断片、またはii）再構成GPCRを含むリポソームまたはミセルの何れかである。前記カクテル溶液中の標識リガンドは、特定の結合親和定数で受容体に容易に結合できる化学分子または生物学的分子である。
【００７３】
別の実施形態では、化合物またはターゲットをプロファイリングまたはスクリーニングする方法は：ａ）複数の受容体マイクロスポットを固体表面上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し、ここで、１または複数の化合物が、前記カクテル溶液中に存在するかまたは存在しない；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；さらにｄ）各標識リガンドのその対応する受容体への結合に対抗する、前記化合物の効力を特定する；工程を含む。
【００７４】
あるいは、本発明の方法は：ａ）複数の受容体マイクロスポットを固体表面上に提供してアレイを形成し；ｂ）それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する受容体と結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；ｄ）各受容体の総結合シグナルを測定し；ｅ）連続して、化合物を含有する第２の溶液を前記アレイに接触させ；さらに、ｆ）各受容体に予め結合した標識リガンドのうち前記化合物によって置換されたものの量を特定する；工程を含む。
【００７５】
多重化結合アッセイを用いて化合物をスクリーニングまたはプロファイリングするために、本発明の方法は：ａ）複数のGPCRマイクロスポットを固体表面上に提供してアレイを形成し；ｂ）化合物の存在下または不在下において、それぞれ前記アレイ中の少なくとも１つの対応する対応GPCRと結合する親和性を有する標識リガンドのカクテル溶液を調製し；ｃ）前記カクテル溶液を前記アレイに接触させ；さらにｄ）標識リガンドに対抗する、化合物のその対応する受容体への結合プロファイルを特定する；工程を含む。
【００７６】
別の実施形態では、化合物をスクリーニングまたはプロファイリングする方法は：ａ）複数の受容体マイクロスポットを固体表面上に提供してアレイを形成し；ｂ）少なくとも１つの化合物を含有する溶液を調製し；ｃ）前記溶液を前記アレイに接触させ；前記化合物の前記受容体に対する結合を検出し；さらにｄ）前記化合物のその対応する受容体に対する結合プロファイルを特定する；工程を含む。
【００７７】
本発明を、一般的に記載すると共に実施例によって詳細に記載した。当業者は、本発明が開示の特定実施形態に必ずしも限定されないことを理解するであろう。特許請求の範囲により特定される本発明の範囲またはその等価物の範囲を逸脱することなく変更および変形を行うことができ、本発明の範囲内において用いることができる既知のまたは開発されるであろう等価成分を含む。従って、その変化が本発明の範囲から逸脱しない限り、その変化も本発明に含まれると解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、多重化競合結合アッセイがGPCRマイクロアレイと共に標識リガンドのカクテル溶液を用いる本発明の実施形態の概略図である。
【図２】図２（Ａ−Ｃ）は、96ウェルマイクロプレート中のGPCRマイクロアレイの概略図である。
【図３】図３（Ａ−Ｃ）は、GPCRマイクロアレイを用いた蛍光リガンドの多重化飽和アッセイおよびKd特定を示す、濃度依存的な総結合および非特異結合のグラフである。GPCRマイクロアレイは３つの受容体：ヒトニューロテンシン受容体サブタイプ１（NTR1）、δ２オピオイド受容体（OP1）、およびモチリン受容体（MOTR）を有する。３つの蛍光標識リガンドのカクテル溶液は：NTR1に対するCy5-ニューロテンシン2-13(Cy5-NT)、OP1に対するCy5-ナルトレキソン、およびMOTRに対するBodipy-TMR-モチリン1-16（BT-MOT）を含む。これら３つのリガンドのマイクロアレイにおける対応受容体との結合のKd値は、NTR1に対するCys-NTの結合では約2.5nMであり、OP1に対するCy5-ナルトレキソンの結合では約1.9nMであり、MOTRに対するBT-MOTの結合では約3nMであることが分かった。これらKd値は、単一GPCRマイクロアレイまたは他の同様のアッセイ技術を用いて単独で得られた値と実質的に同じであった。
【図４】図４（Ａ−Ｃ）は、カクテル標識リガンド（Cy5-NT、BT-MOTおよびCy5-ナルトレキソン）に対抗する、マイクロアレイ中のδ２（OP1）（Ａ）、MOTR（Ｂ）、およびNTR1（Ｃ）に対するナルトレキソンの選択的効力の特定(selective potency determination)を示す。GPCRマイクロアレイは、３つの受容体：ヒトニューロテンシン受容体サブタイプ１（NTR1）、δ２オピオイド受容体（OP1）、およびモチリン受容体（MOTR）を有する。リガンドのカクテル溶液は、３つの蛍光標識リガンド：NTR1に対するCy5-NT、OP1に対するCy5-ナルトレキソン、およびMOTRに対するBT-MOTを含有する。これら３つの受容体に対するナルトレキソンの選択的効力は、文献に報告されているものと一致する。ナルトレキソンはδ２のみに対するアンタゴニストであることが分かっている。
【図５】図５（Ａ−Ｃ）は、本発明に基づき、競合結合アッセイおよびカクテル標識リガンドを用いてＧＰＣＲマイクロアレイへのカクテル化合物の多重化効力特定(multiplexed potency determination)を示す濃度依存的阻害グラフである。この場合、それぞれ対応受容体にのみ特異的に結合するいくつかの化合物を混合し、相対的効力評価に用いる。GPCRマイクロアレイは、３つの受容体：ヒトニューロテンシン受容体サブタイプ１（NTR1）、δ２オピオイド受容体（OP1）、およびモチリン受容体（MOTR）を有する。リガンドのカクテル溶液は、３つの蛍光標識リガンド：NTR1に対するCy5-NT、OP1に対するCy5-ナルトレキソン、およびMOTRに対するBT-MOTを含有する。得られたIC50は、科学文献に報告されているものに類似する。
【図６】図６（ＡおよびＢ）は、本発明に基づく多重化競合結合アッセイを用いた多重化化合物スクリーニングのデータを示すグラフである。図６Ａは、NTR1およびMOT受容体を有するマイクロアレイに対するカクテル溶液中のBodipy-TMR-モチリン1-16（BT-MOT）およびCy5-ニューロテンシン2-13(Cy5-NT)の結合の選択的阻害に関する棒グラフを示す。BT-MOTおよびCy5-NTは、それぞれMOTRおよびNTR1受容体に結合することが分かっているリガンドである。過剰量の非標識ニューロテンシン（NT）（1μM）を用いた場合、MOTRマイクロスポットに対する結合は抑制される。過剰量のMOT（1μM）の存在下で、MOTRマイクロスポットに対する結合は抑制される。両方の非標識リガンドが存在する場合、両方のGPCRに対する結合の抑制が観察される。BT-MOTおよびCy5-MOTの結合は、それぞれCy3およびCy5チャンネルでGenePix 4000Aスキャナー(Axon Instruments)を用いて観察される。図６Ｂは、β１およびδ２受容体のマイクロアレイに対する、BT-CGP 12177およびCy5-ナルトレキソンの結合の選択的阻害を示す。BT-CGPは、アレイ中のβ１受容体に対してのみ特異的に結合できる；Cy5-ナルトレキソンは、δ２受容体に対してのみ特異的に結合できる。ナルトレキソンはδ２リガンドに対するアンタゴニストであるが、CGP 12177はβ１受容体に対する部分的アゴニストである。２つのチャンネル（Cy3およびCy5）のシグナルを、１μMの異なる化合物（CGP 12177、ナルトレキソン、およびそれらの両方）の関数として評価する。
【図７】図７（ＡおよびＢ）は、本発明に基づく単一標識リガンド競合結合アッセイを用いた多重化化合物スクリーニングのデータを示すグラフである。図７Ａは、アドレナリン受容体ファミリーのアレイに対する選択的結合および阻害に関する２つの擬似カラー蛍光画像(false-color fluorescence image)を示す。図７Ａ（i）は、BT-CGP（5nM）を含有する溶液で処理した、β１、β２およびα２Ａアドレナリン受容体から成る３つの列を有するマイクロアレイの蛍光画像である。図７Ａ（ii）は、BT-CGP（5nM）およびICI 118551（10nM）を含有する溶液での処理後のアレイの画像である。図７Ｂは、結合（BT-CGP）および阻害（ICI 118551の存在下）のヒストグラム分析を示すグラフである。
【図８】図８（Ａ−Ｄ）は、化合物スクリーニングのために置換アッセイを行った方法に基づく一連の擬似カラー画像を示す。β１アドレナリン受容体、NTR1、およびドーパミンＤ１受容体の複合的アレイを用いる。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、BT-NT（2nM）と共にインキュベートする前後のマイクロアレイの蛍光画像である。図８Ｃおよび８Ｄは、非標識化合物による、予め結合したBT-NTの置換を示す蛍光画像である。最初に、マイクロアレイをBT-NT（2nM）の溶液と共にインキュベートし、洗浄し、乾燥し、さらに画像化する。さらにその後、CGP 12177（10μM）またはNT（10μM）のいずれかを含有する第２の溶液と共にインキュベートする。
【図９】図９は、2μMのニューロテンシンおよび2μMのモチリンの不在下（上段）および存在下（下段）、様々な濃度（16/16、8/8、4/4、2/2、1/1、0.5/0.5nM）でのCy5-ニューロテンシン2-13およびBT-モチリン1-16の結合後、マイクロアレイ中の３列のマイクロスポットの一連の擬似カラー蛍光画像を示す。各列は、４つの複製マイクロスポットを有する。左から右の順番に、それぞれの列は、ａ）MOTR、ｂ）NTR1、およびｃ）NTR1およびMOTRの混合物を含む。
【図１０】図１０（Ａ−Ｄ）は、Cy3およびCy5検出チャンネルでの、マイクロアレイにおけるMOTRおよびNTR1／MOTRに対するCy5-ニューロテンシン2-13およびBT-モチリン1-16カクテルの飽和結合曲線を示す。図１０Ａは、ニューロテンシンおよびモチリンの混合物の不在下（総シグナル）または存在下（非特異的シグナル）における、MOTRを含むマイクロスポットに対するBT-モチリン1-16の相対的結合親和性を示す。図１０Ｂは、図１０Ａに示すデータのスキャッチャードプロットを示す。図１０Ｃは、ニューロテンシンおよびモチリンの混合物の不在下（総シグナル）または存在下（非特異的シグナル）における、MOTRおよびNTR1の混合物を含むマイクロスポットに対するBT-モチリン1-16の相対的結合親和性を示す。図１０Ｄは、図１０Ｃに示すデータのスキャッチャードプロットを示す。MOTR；およびMOTRとNTR1との混合物：を用いてBT-モチリン1-16に関して得られたKd値はお互いに類似する；しかしながら、総結合部位は、MOTR/NTR1混合物を用いた場合よりも、MOTR単独を用いた場合にほぼ２倍高い値であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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