(57)【要約】  本発明は、ウイルス診断の領域に関し、特にエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）診断に関する。本発明によりＥＢＶ検出のための改良方法およびこの目的のために適した試薬が提供される。ｐ１８−ＶＣＡに由来し、急性ＥＢＶ感染および過去ＥＢＶ感染の識別を可能とするペプチド類が開示される。
2007523603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタインバーウイルスに比較的遠い過去から感染している個体からの抗体とは反応するが、エプスタインバーウイルスに急性感染したかあるいはエプスタインバーウイルスに近い過去から感染している個体からの抗体とは、反応しないかあるいは反応しても弱いことを特徴とする、エプスタインバーウイルスのウイルス性ｐ１８抗原由来のペプチド。
【請求項２】
ウイルス性ｐ１８抗原と比較して、Ｎ−末端側で短縮されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ウイルス性ｐ１８抗原と比較して、Ｎ−末端側で最大１００のアミノ酸が短縮されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
ウイルス性ｐ１８抗原と比較して、Ｎ−末端側で１０〜７０のアミノ酸が短縮されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドと、ウイルス性ｐ１８抗原のアミノ酸配列に一致しないさらなる１以上のアミノ酸を含むことを特徴とする、融合ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドおよび／または請求項６に記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、エプスタインバーウイルスに対する抗体の検出用診断薬。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドおよび／または請求項６に記載の融合ペプチドおよび／または請求項７に記載の診断薬を含むことを特徴とする、エプスタインバーウイルスに対する抗体検出用検査キット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドまたは請求項６に記載の融合ペプチドまたは請求項７に記載の診断薬を、検体と接触させ、生成した抗原抗体複合体を同定することを特徴とする、検体中のエプスタインバーウイルスに対する抗体を検出する方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのさらなるＥＢＶ抗原を、検体と接触させ、生成した抗原抗体複合体を同定することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらなるＥＢＶ抗原が、急性ＥＢＶ感染あるいは近い過去からＥＢＶ感染している個体からの抗体と反応することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらなるＥＢＶ抗原が、ＥＢＶ  ｐ１８、ｐ２３、ｐ７２、ｐ１３８およびｐ５４のウイルス性抗原から成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）急性ＥＢＶ感染、あるいは近い過去からのＥＢＶ感染、または
ｂ）過去のＥＢＶ感染、あるいは比較的遠い過去からのＥＢＶ感染
の有無を決定するための、エプスタインバーウイルスの修飾されたウイルスカプシド抗原の使用。
【請求項１４】
修飾されたウイルスカプシド抗原が、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドまたは請求項６に記載の融合ペプチドが、適当な宿主細胞で発現させて得られ得ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドまたは請求項６に記載の融合ペプチドをコードする核酸を含むベクターまたはプラスミド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターまたはプラスミドを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス診断、特にエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）診断の領域に関する。本発明により、ＥＢＶ感染を検出するための改良方法及びこの目的に適した試薬が提供される。エプスタインバーウイルスは、伝染性単核症の引き金であると考えられるヒトヘルペスウイルスである。ＥＢＶによる感染は、しばしば穏やかな徴候と共に無症状で起こるが、免疫抑制された人においては、重篤な悪性の症状をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）診断の重要性
急性ＥＢＶ感染症の症状は、他の病原体によって引き起こされる、あるいは他の原因による多くの臨床的状況とオーバーラップする可能性があるので、ＥＢＶ診断は識別診断をする上で大変、重要である。したがって、急性ＥＢＶ感染症は、初期ＨＩＶ感染症、風疹ウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、古典的な肝炎ウイルスによる感染症、トキソプラズマ症、レプトスピラ症、様々な向神経性病原体による感染症、および白血病あるいはリンパ腫と混同されることがある。それゆえ、明確なＥＢＶ血清学は、患者に対して大きな恩恵をもたらすものである。
【０００３】
ＥＢＶ血清学の諸問題
古典的なＥＢＶ血清学は、ウイルスカプシド抗原（ＶＣＡ）やＥＢＶ特異的核内抗原（ＥＢＮＡ）、特にＥＢＮＡ−１に応答するＩｇＧ抗体やＩｇＭ抗体の検出に基づいている。
【０００４】
様々なＥＢＶ抗原クラスの分類は、初期に必要とされるタンパク質（ＥＡ：早期抗原）、後期に必要とされるタンパク質（ＶＣＡ：ウィルスカプシド抗原）および潜伏性維持のための抗原（ＥＢＮＡ）を備えたウイルス増殖の生物学的サイクルに基づいている。これらの抗原クラスは、一次血清学的検査システム（ＥＢＶ感染細胞の免疫蛍光検査法）により、検出及び識別が可能である。血清学的検査システムのさらなるその後の開発は、すべてこの方法を保持し、ＥＢＮＡ、ＶＣＡおよびＥＡの抗体特異性を識別するのを可能としている。
【０００５】
ＶＣＡとＥＢＮＡのマーカーとしては、免疫蛍光検査法の中で初めて明確にされた。より最近の検査では、組換え法によって一般に調製されるＶＣＡ複合体の精製成分ｐ１８やｐ２３、あるいはＥＢＮＡ−１に相当するｐ７２が用いられる。ＥＢＮＡ−１抗原は初期感染後の遅い段階で形成して潜伏感染細胞を構築し、この潜伏状態を維持する要因のうちの１つである。これは、ＥＢＮＡ−１抗体は、初期感染に引き続く６ケ月以内の期間経過後に初めて形成されることを意味する。しかしながら、それと同時に、このマーカーが存在する場合には、最近の感染を診断により安全に除外することができることをも意味している。したがって、感染時期の特定のための重要なマーカーとして利用可能である。
【０００６】
ＥＢＶ血清学的診断は、古典的マーカーであるＶＣＡ−ＩｇＧ，ＶＣＡ−ＩｇＭおよびＥＢＮＡ−１抗体のみが検査される場合、しばしば曖昧かつ誤った結果に結びつくという、高度の多様性を持っている。したがって、例えば、すべての急性ＥＢＶ感染症が、検出可能なＶＣＡ−ＩｇＭ応答を示すとは限らない。その結果、ＶＣＡ−ＩｇＧおよびＶＣＡ−ＩｇＭの決定のみに基づく検査戦略は、この場合、誤った結論に繋がる。一方、まれではあるが、ＶＣＡ−ＩｇＭ応答が何ケ月も持続し、このために最近の感染と見せかけることがある。
【０００７】
ＥＢＮＡ−１抗体陽性であるということは、ＥＢＶに経過感染したことを示す証拠であり、ＶＣＡ−ＩｇＧ陽性と組み合わせることにより、唯一の明確な血清学的組み合わせとなる。ＥＢＮＡ−１抗体陰性（同時に、ＶＣＡ−ＩｇＧ陽性）は、急性ＥＢＶ感染を示すかもしれないし、あるいは免疫抑制の場合のように、二次的なＥＢＮＡ−１抗体の減少によって起こる場合がある。また、感染した患者の約５％は、検出可能なＥＢＮＡ−１抗体を生じないし、このため彼らの生涯に渡って、急性ＥＢＶ感染症の血清学的状態を見せかける。
【０００８】
したがって、急性ＥＢＶ感染症は、同時にＶＣＡ−ＩｇＧ陽性およびＥＢＮＡ−１抗体陽性であることから、安全に排除される。しかしながら、ＶＣＡ−ＩｇＧ陽性であって、ＥＢＮＡ−１抗体陰性の場合には、以下の３通りの症例に発生する断定できない組み合わせとなる。
１）最近のＥＢＶ感染のケース
２）細胞内免疫系の抑制による、経過感染およびＥＢＮＡ−１抗体の減少のケース
３）経過感染および同時期のＥＢＮＡ−１抗体生成の欠如（健常人の約５％に見られる）のケース
【０００９】
ケース２）およびケース３）は、例えば、実際の最近のＥＢＶ感染よりも、より頻繁に大病院で検査された患者で見られる。
【００１０】
ＥＢＶ血清学の重要なこの問題は、複雑な追加の検査によって、あるいは臨床データを伴う一定期間の反復検査によってのみ、今日、信頼性を持って解決することができている。
【００１１】
したがって、ＥＢＮＡ−１抗体の欠如は、新たな感染の指標として一般的に使用されている。上記したように、これは、ＥＢＮＡ−１抗体陰性のままであるＥＢＶ感染患者の場合、あるいは細胞内免疫系の抑制により、関連抗体が減少しているＥＢＶ感染患者の場合、深刻な誤解を招くことになる。定型的な診断で使われており、ＥＢＮＡ−１抗体を使用している現在の方法は、感染したばかりのＥＢＶ感染の診断を信頼に足るものとするものではない。
【００１２】
一方では、急性ＥＢＶ感染におけるＥＢＮＡ−１に対する１次抗体が陰性であること、および他方では、ＥＢＮＡ−１抗体が減少したり、ＥＢＮＡ−１抗体が欠如していることの識別は、ＥＢＶ血清学における重要な問題である。
この特別な問題は、血清学検査に関しての公表された評価法の殆どにおいて考慮されていない。ＥＢＶ感染検査の最大２０％は、曖昧であり、正しくない結果となっているものと推測しなければならない。ＥＢＶ感染検査は、特に腫瘍学、移植医学および妊娠中の看護にとって非常に重要である。
【００１３】
本発明の目的は、急性感染および過去感染を信頼性をもって識別することができるＥＢＶ感染検出試薬を提供することにある。
【００１４】
驚くべきことに、ウイルス性ＥＢＶカプシド抗原ｐ１８を修飾することによって、ＥＢＮＡ−１抗体と同様の確実性で感染後期の段階でのみ生成する抗体であって、免疫抑制されたヒトにおいて生成しないかあるいは減少するという問題を同程度に示さない抗体と反応するペプチドを得ることができる。
【００１５】
これらは、リーディング・フレームＢＦＲＦ３によってコードされるＥＢＶ−ｐ１８抗原に由来するペプチドである。この抗原はＶＣＡマーカーとして、大分前の１９８８年に報告されている（Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｒｉｎｋ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  ２１  （１９８８）  １３３  −  １４６）。
【００１６】
ｐ１８の分子量の決定、および遺伝子工学的方法によるタンパク質の調製、およびそれらの幾つかの免疫学的に活性な断片の使用は、ヨーロッパ公開特許（ＥＰ５７４０７５Ａ２）に記載されている。しかしながら、組換え抗原の性質、あるいは化学的に合成された断片の性質に関する記載は、最適の反応性に常に基づくものであった。  
【００１７】
組換え方法によって製造される精製された完全ｐ１８抗原に対するＩｇＧ抗体は、最近のＥＢＶ感染の場合でさえも検出されるので、急性感染と過去感染とを識別するのには不適当である。
【００１８】
驚くべきことに、例えばｐ１８抗原のＮ−末端領域を除外することにより、時間を関数とする抗体応答の識別が達成されることが、種々、検討の間に見出された：このＮ−末端側欠失ｐ１８は、感染のわずか数週間後に形成される抗体を認識する。
【００１９】
したがって、本発明は、エプスタインバーウイルスのウイルス性ｐ１８抗原に由来するペプチドに関し、該ペプチドは、比較的遠い過去からエプスタインバーウイルス感染している個体からの抗体に対して反応するか、あるいはエプスタインバーウイルスに急性感染あるいは近い過去からエプスタインバーウイルスに感染している個体からの抗体と反応しないか、あるいは反応しても弱い。
【００２０】
「ペプチド」なる表記は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含む。特に断りのない限り、ペプチドの長さについては制限がない。
【００２１】
本発明によるペプチドは、修飾されたｐ１８抗原である。つまり、本ペプチドはウイルス性ｐ１８である「野生型タンパク質」と同一ではない。もし、修飾されたペプチドが、比較的遠い過去からＥＢＶ感染している個体からの抗体に対しては反応するか、あるいはエプスタインバーウイルスに急性感染した、あるいは近い過去からエプスタインバーウイルスに感染している個体からの抗体とは反応しないか、あるいは弱く反応する限りにおいて、ウイルス性ｐ１８の修飾については特に制限されない。
【００２２】
本発明のペプチドがｐ１８に由来するという事実は、それが完全なウイルス性ｐ１８抗原の少なくとも１つのエピトープを有する、少なくとも１個の断片を含むことを意味する。比較的遠い過去からＥＢＶ感染している個体から得られた血清とインキュベーションすることによるラインアッセイ（Ｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ）（実施例３参照）において、陽性反応が得られる場合には、そのようなエピトープが存在している。
【００２３】
ウイルス性ｐ１８のアミノ酸配列を図７（配列番号：１）に示す。一般に、本発明のペプチドは、配列番号：１とは異なるアミノ酸配列を有している。本発明のペプチドは、好ましくは１以上の欠失および／または置換を含む。本発明のペプチドは、最も好ましくは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列に比べて、１以上の欠失を有している。アミノ酸がｐ１８のＮ−末端側のみならず、Ｃ−末端側および／またはｐ１８配列の内部の位置で欠失していてもよい。好ましくは、１以上の、ｐ１８のＮ−末端側アミノ酸が欠失していてもよい。
【００２４】
本発明のペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列の連続した、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２５個、さらに好ましくは少なくとも５０個、もっと好ましくは少なくとも７５個、さらにもっと好ましくは少なくとも１００個、最も好ましくは少なくとも１２５個のアミノ酸から成る、あるいは含むものである。
【００２５】
完全なｐ１８−ＶＣＡの少なくとも１つのエピトープは、感染後、抗体がそれに対して形成されるのであるが、本発明によるペプチド中には存在しないのが望ましい。
【００２６】
一般に、本発明のペプチドは、１から１００個のアミノ酸、好ましくは５から９０個のアミノ酸、より好ましくは１０から７０個のアミノ酸、さらに好ましくは１５から５０個のアミノ酸、さらにもっと好ましいのは２０から４０個のアミノ酸、最も好ましいのは約３０個のアミノ酸であって、ウイルス性ｐ１８抗原よりもそのＮ−末端側が短い。好ましい具体例として、本発明のペプチドは、配列番号:２のアミノ酸配列から成る。このアミノ酸配列は、配列番号:１における３１位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸に相当する。さらに好ましい態様では、本発明のペプチドは、以下のグループから選ばれるアミノ酸配列を実質的に含んでいる。
【００２７】
配列番号:１の２１位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２２位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２３位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２４位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２５位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２６位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２７位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２８位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の２９位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３０位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３２位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３３位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３４位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３５位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３６位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３７位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３８位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３９位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の４０位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列、および
配列番号:１の４１位アミノ酸から１７６位アミノ酸までのアミノ酸配列。
【００２８】
当業者は、もしアミノ酸が挿入、置換または欠失される場合、そのような配列の免疫学的性質は、ほんの僅かだけしばしば変わることも知っている。保存的としばしば看做される置換は、置換アミノ酸の化学的性質が置換されるアミノ酸のそれと類似している置換である。保存的と看做されるアミノ酸の組み合わせは、例えば、Ｇｌｙ／Ａｌａ、  Ａｓｐ／Ｇｌｕ、  Ａｓｎ／Ｇｌｎ、  Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ  およびＰｈｅ／Ｔｙｒである。
【００２９】
本発明のペプチドは、その機能性を失うことなくウイルス性ｐ１８より１個以上のＣ−末端側アミノ酸が短くてもよい。通常、１０個以下のアミノ酸、より好ましくは５個以下のアミノ酸、最も好ましくは２個以下のアミノ酸が、ｐ１８と比較して、Ｃ−末端側で存在しない。特定の開発では、該ペプチドは、実質的に以下の配列からなるグループから選ばれるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
配列番号:１の３１位アミノ酸から１６６位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１６７位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１６８位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１６９位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７０位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７１位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７２位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７３位アミノ酸までのアミノ酸配列、
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７４位アミノ酸までのアミノ酸配列、および
配列番号:１の３１位アミノ酸から１７５位アミノ酸までのアミノ酸配列。
【００３１】
しかしながら、ウイルス性ｐ１８と比較して、本発明のペプチドは、Ｃ−末端側で短縮されていないのが好ましい。
【００３２】
担体と好都合にカップリングさせる為のある種のリンカーを作成するために、Ｎ−末端側あるいはＣ−末端側で、付加的なアミノ酸あるいは化学的なグループを付加させることは可能である。そのようなリンカーは、概ね、１〜６０個のアミノ酸から成り、一般的には１〜１０個のアミノ酸から成る。しかしながら、担体あるいは固相へのペプチドの結合は、共有結合である必要はない。さらにまた、他のペプチドへのカップリングを達成するためにシステイン残基を付加することは可能である。
【００３３】
本発明のペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化あるいは燐酸化により、さらに修飾することができる。本発明は、例えば、塩類、アミド類、エステル類、Ｃ−末端アミド化誘導体あるいはＮ−末端アシル化誘導体等の機能的誘導体にも関する。
【００３４】
本出願における情報に基づき、当業者はある種のｐ１８誘導体が急性感染であるか、過去感染であるかを識別するのに適しているかどうかを容易に決めることができる。この目的達成のためには、例えば、与えられたｐ１８誘導体を実施例３に記載されたラインアッセイによって検査するだけでよい。
【００３５】
本発明のペプチドは、当業者に公知の種々の方法で製造することができる。概して、該ペプチドは、化学合成によって、あるいは適切な宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現によって製造される。
【００３６】
固相合成法あるいは液相合成法が、ペプチドの化学合成法として使用することができ、固相合成法が好ましい。ペプチドの化学合成法は、出版物［Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｏｎｄｅｔｔｉ：  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ペプチド合成），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６）；  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ペプチド、分析、合成、生物学）］，  Ｖｏｌｕｍｅ  １−３  （Ｅｄ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍａｉｅｎｈｏｆｅｒ）  １９７９，  １９８０，  １９８１  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）］に記載されている。
【００３７】
本発明によるペプチドの組換え合成のためには、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸が、最初に提供される。この核酸はＤＮＡあるいはＲＮＡであるが、ＤＮＡが好ましい。コーディング用核酸は、通常、コードされたペプチドを発現させることのできる適切な配列を含んでいるベクターあるいはプラスミドへ導入される。このタイプの適切な配列としては、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列およびプラスミドの複製を可能とする配列である。それらは原核生物あるいは真核生物における、発現用の発現プラスミドであることができる。当業者は、いろいろなプロモーター配列が使用されることを知っている。原核生物の発現プラスミドが好まれる。
【００３８】
さらに、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を含んでいるベクターあるいはプラスミドにも関する。ベクターとプラスミドの調製のための慣用的な方法が、出版物［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローング：実験マニュアル），  ２００１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．］に記載されている。さらに、ベクターまたはプラスミドは、適切な宿主微生物、例えば、哺乳動物細胞、あるいは好ましくは細菌へ導入され、次いで適当な条件下、培養して所望のペプチドの発現が起きるようにする。また、本発明は、ベクターあるいはプラスミドを含む細胞にも関する。本発明の別の態様としては、本発明のペプチドの製造法、すなわち、本発明の細胞を適当な条件下培養して、所望のペプチドを発現させ、随意、該ペプチドを回収する。発現が完了した後、ペプチドは当業者にそれ自体公知の方法で回収される。ペプチドの組換え発現に関する適当な方法が、出版物［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験マニュアル）］（上記参照）に記載されている。
【００３９】
ペプチドは、好ましくは単離された形で存在し、実質的に他のペプチドを含まない。本発明によるペプチドの純度は、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、最も好ましくは９９％超であり、これらの純度は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とその後のクーマシー染色によって決定される。
【００４０】
発現が完了した後、ペプチドは一般に精製される。当業者に公知の広範囲の精製方法を使用することができる。タンパク質やペプチドの精製方法は、出版物［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ． １８２，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（タンパク質精製の手引き），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９０  ｏｒ  Ｓｃｏｐｅｓ  Ｒ．Ｋ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（タンパク質精製），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  １９９４］に記載されている。
【００４１】
本発明のペプチドは、比較的遠い過去にエプスタインバーウイルス感染した個体からの抗体に対しては反応するが、エプスタインバーウイルスに急性感染した、あるいは近い過去からエプスタインバーウイルスに感染している個体からの抗体に対しては反応しないか、あるいは弱い反応しか示さない、という事実によって識別される。データは、好ましくは、ＩｇＧ抗体に関係するものである。
【００４２】
比較的遠い過去より感染歴のある個体からの血清は、以下に示す血清学的特性を有している。
ＥＢＮＡ−１−ＩｇＧ抗体：陽性
ｐ２３−ＩｇＧ抗体      ：陽性
ｐ５４−ＩｇＧ抗体      ：陰性
ｐ１３８−ＩｇＧ抗体    ：陰性  および
ｐ２３−ＩｇＧ抗体      ：陰性
【００４３】
本発明のペプチドは、こうした血清学的特性を持っている血清からの抗体と反応する。
【００４４】
概して、約１．５年遡る期間の感染は、「比較的遠い過去からの感染」として定義することができる。
【００４５】
ＥＢＶによる個体の感染は、伝染性単核症の臨床的症状が存在する場合には、「急性」と考えられる。近い過去に遡るＥＢＶ感染した個体からの血清は、以下に示す血清学的特性を持つ。
ＥＢＮＡ−１−ＩｇＧ抗体：陰性
ｐ５４−ＩｇＧ抗体及び／又はｐ１３８−ＩｇＧ抗体（ＥＡ）：陽性
ｐ２３−ＩｇＧ抗体（ＶＣＡ）：陽性  および
ｐ５４−ＩｇＭ抗体及び／又はｐ１３８−ＩｇＭ抗体及び／又はｐ−５４−ＩｇＭ抗体：陽性
【００４６】
本発明のペプチドは、これらの血清学的特性を持っている血清からの抗体に対しては、反応しないか、あるいは反応しても弱い。
【００４７】
一般に、約４週間遡る感染は、「近い過去に遡る感染」として定義できる。
【００４８】
本願明細書においてペプチドが抗体と「反応する」という表現は、ペプチドと抗体が互いに接触させられた後、ペプチドが１つ以上の抗体を有する抗原抗体免疫複合体を形成することを意味する。もし、ペプチドと抗体が互いに接触させられた後、抗原抗体複合体が形成されないか、あるいは弱い抗原抗体複合体だけが形成される場合には、ペプチドと抗体の反応は起きていないか、あるいは弱い反応が起きているだけである。ペプチドが抗体と反応するかどうかは、実施例３に記載したように、「ラインアッセイ」によって決定することができる。
【００４９】
本発明は、さらに、本発明の上記ペプチドとウイルス性ｐ１８抗原のアミノ酸配列に相当しない１個以上のアミノ酸配列との融合ペプチドに関する。広範囲の外来配列が関与していてもよい。しかしながら、外来アミノ酸と抗体との間の交差反応を避けるために数個のアミノ酸が融合ペプチドに包含されているのが好ましい。外来配列の例としては、発現ペプチド、例えばＮ−末端あるいはＣ−末端におけるオリゴヒスチジン鎖（６〜８個の連続したヒスチジン残基）のアフィニティー精製法を容易にするアミノ酸配列である。
【００５０】
本発明のさらに別の態様では、エプスタインバーウイルスに対する抗体の検出用診断薬であり、これは本発明のペプチドおよび／または本発明の融合ペプチドから成る。本願明細書における「診断薬」は、固相またはトレーサーを含む。固相は、例えば検査マイクロプレート、細胞、容器、細胞膜、フィルター、検査ストリップ、あるいはビーズなどの粒子を含む。ペプチドを固相表面あるいは固相へ結合させる方法は、当業者にそれ自体公知である。
【００５１】
トレーサーとしては、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、着色剤等である。本発明のペプチドまたは融合ペプチドは、使用目的に応じて標識してもよいし、標識しなくてもよい。標識は、あらゆる種類のものがあり、例えば、酵素的、化学的、蛍光性、発光性、あるいは放射性であってよい。
【００５２】
エプスタインバーウイルスに対する抗体は、例えば、本発明の診断薬を個体の血清と接触させて、生成した抗原抗体複合体を検出することによって検出することができる。したがって、本発明は、また、検体中のエプスタインバーウイルスに対する抗体の検出方法に関し、それは、本発明のペプチドあるいは融合ペプチドを、あるいは本発明の診断薬を検体と接触させて、生成した抗原抗体複合体を検出することから成るものである。
【００５３】
一般に、検体は個体からの体液である。好ましくは、検体は個体からの血清である。血清は、適当な液体で希釈することができる。
【００５４】
本発明方法においては、上記した診断薬が通常、使用される。診断薬の性質およびさらなる特徴に依存して、免疫化学反応はいわゆるサンドイッチ反応、凝集反応、競合反応あるいは阻害反応である。
【００５５】
本発明方法の好ましい形態として、本発明のペプチド又は融合ペプチドは、固相に固定される。次いで、その固相は調べようとする検体、例えば血清と接触させられ、その結果、抗原抗体複合体が形成される。その後、結合抗体を除去するために固相は１回もしくは数回、洗浄される。次に、固定化された抗原抗体複合体が同定される。この同定は、例えば、マーカーに結合させたいわゆる抗抗体によって実施することができる。したがって、洗浄後は、固相は西洋わさびペルオキシダーゼに結合した抗ＩｇＧ抗体と接触させることができる。この抗抗体は、固定化免疫複合体と結合する。結合した２次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼの酵素反応による公知方法で視覚化することができる。この２次抗体は、好ましくは、特異的にヒトＩｇＧを認識する。
【００５６】
本発明方法では、その上に１つ以上の抗原が固定化されている膜あるいは検査ストリップが、好ましく使用される。該方法の別の態様では、ＥＬＩＳＡ検査が実施される。そのような方法の操作は、当業者にそれ自体公知である。適切な検出法の概略は、出版物“Ｌａｂｏｒ  ｕｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｅ”  ［実習と診断］, Ｌ．  Ｔｈｏｍａｓ；  Ｄｉｅ  ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｍａｒｂｕｒｇ；  ＩＳＢＮ  ３  ９２１３２０  ２１  ６．に見ることができるであろう。
【００５７】
ＥＬＩＳＡを実施するためには、ペプチドあるいは複数のペプチドの混合物は、通常、固相に、例えば、マイクロタイタープレートに結合している。適当に希釈した検査すべき体液（血清）を、ペプチドまたは複数のペプチドが結合している固相と接触させる。次いで、抗原抗体複合体の生成に十分な時間、インキュベーションする。その後、結合しなかった成分は洗浄して除去する。免疫複合体の検出は、一般に、ヒト免疫グロブリンに特異的に結合し、標識（適当なマーカーに関しては上記参照）されている抗体を用いて実施される。基質を加えた後、視覚的に、光度測定により、分光測定により、発光測定により、あるいは電気化学的に容易に検出することができる生成物がしばしば形成される。
【００５８】
別の変法としては、競合的アッセイ法があるが、これもまた当業者には公知である。
【００５９】
本方法の特定の態様では、エプスタインバールウイルスのさらなる抗原を、検体と接触させ、生成した抗原抗体複合体を検出する。このさらなるＥＢＶ抗原は、最近の感染が特徴的である抗原が好ましい。このさらなる抗原は、ｐ１８、ｐ２３、ｐ１３８およびｐ５４から成るグループから好ましくは選択される。
本発明方法のさらに別の態様では、本発明のペプチドまたは融合ペプチドの他に、後期核抗原ＥＢＮＡ−１（ｐ７２）が使用される。
本発明方法のさらに別の態様では、本発明のペプチドまたは融合ペプチドの他に、ｐ７２、ｐ１８、ｐ２３、ｐ１３８および／またはｐ５４が使用される。
【００６０】
本発明のさらに別の態様は、エプスタインバーウイルスに対する抗体の検出用検査キットであり、該キットは本発明によるペプチドまたは融合ペプチドおよび／または上記した診断薬から成る。この検査キットは、本発明方法を実施するのに適したさらなる試薬、例えば２次抗体から成る組成物を含んでいてもよい。この検査キットは、好ましくは、固相を含んでいる。少なくとも本発明による１つのペプチドあるいは融合ペプチドが、その上に固定化されているウエスタンブロット検査ストリップが、特に好ましい。さらに、ＥＢＶ抗原は固定化することができ、例えばｐ１８、ｐ２３、ｐ７２、ｐ５４および／またはｐ１３８がそうである。検査ストリップは、ニトロセルロースのストリップであってよい。検査キットは、随意、濃縮した形態の洗浄液をさらに含んでいてもよい。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、急性ＥＢＶ感染／近い過去あるいは比較的遠い過去にまで遡るＥＢＶ感染／過去のＥＢＶ感染の有無を決定するための、エプスタインバーウイルスの修飾されたウイルスカプシド抗原の使用である。
本発明による好ましい使用の態様は、上記したペプチド、融合ペプチド、診断薬、検査キットおよび／または方法の好ましい態様に相当する。
本発明は、さらに、最近感染／近い過去にまで遡る感染および過去感染を血清学的に識別するための、エプスタインバーウイルスの修飾されたウイルスカプシド抗原の使用に関する。本発明は、さらに、ＥＢＶに対する抗体を検出するための、エプスタインバーウイルスの修飾されたウイルス性抗原の使用に関係する。最近感染および過去感染を識別することはむしろ可能である。本発明は、さらに、過去のＥＢＶ感染の検出のためのエプスタインバーウイルスの修飾されたウイルスカプシド抗原の使用に関する。最後に、本発明は、過去のＥＢＶ感染と最近のＥＢＶ感染を識別するためのエプスタインバーウイルスの修飾されたウイルスカプシド抗原の使用に関する。本発明の使用によれば、修飾されたウイルスカプシド抗原は、好ましくは、本発明によるペプチドあるいは融合ペプチドに相当する。上記した本発明の全ての好ましい変形は、本発明の使用に対しても適用できる。
【００６２】
本出願で記載されている全ての態様および好ましい実施形態は、非常に広範囲の様々の方法で互いに組み合わせることができる。本発明は、同様に、そのような組み合わせにも関する。
【００６３】
ＥＢＮＡ−１の他に、本発明は抗体が生成しないという欠点を持たない二次後期マーカーを提供する。ＥＢＮＡ−１とは対照的に、ｐ１８に対する抗体は細胞の免疫抑制の後でも失われない。したがって、本発明により修飾されたｐ１８に対するＩｇＧの同定は、信頼性を持って急性ＥＢＶを除外している。
【００６４】
例えば、免疫ブロット法等の適当な測定系で、修飾されたｐ１８を使用することによって、ＥＢＮＡ抗体の応答が変則的な場合でさえ、最近のＥＢＶ感染および過去のＥＢＶ感染を検出することが可能である。
【００６５】
図１は、修飾されたｐ１８抗原の使用による、ＥＢＶ診断の情報提供力における改善を示す。
【００６６】
上半分の図は、ＥＢＶに対する抗体を決定するための通常の免疫ブロットを概略的に示す。下半分の図は、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８（検査ストリップ上では、ｐ１８として示されている）を追加的に含む、本発明による試験を示す。マーカーｐ２３（ＶＣＡ）、ｐ５４（初期抗原）およびｐ１３８（初期抗原）は、新しい感染および過去の感染を区別できない血清陽性マーカーである。これらのマーカーに対する抗体反応は変わりうるので、異なるパターンの免疫反応を検出することができる。少なくとも１つのこれらのマーカーに対する抗体応答が陽性であるということは、「最近感染」および「過去感染」を識別することなく、「ＥＢＶに感染」との診断を下すことができる。ｐ７２（＝ＥＢＮＡ−１）に対する陽性ＩｇＧ応答は、「過去感染」との信頼性のある診断を下すことが可能である。従来の検査では、古典的な過去のＥＢＶ感染（Ａ１）は、ｐ７２−ＩｇＧ陽性に基づき正しく認識されるのに対して、ｐ７２−ＩｇＧ生成（Ａ２）がない過去のＥＢＶ感染、あるいはその後の２次ｐ７２−ＩｇＧの消失（Ａ３）を伴う過去のＥＢＶ感染は、まだｐ７２−ＩｇＧ応答を示さない真の最近のＥＢＶ感染とは識別することができない。したがって、ケースＡ２およびＡ３は、従来の検査では、概して正しく診断されていない。毎日の実務では、こうしたケースが、本当の最近ＥＢＶ感染よりも、さらに頻繁に起きている。
【００６７】
例えば、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８（図１では、「ｐ１８」として示されている。）を含む修飾検査（図面の下半分）を使うと、ｐ１８−ＩｇＧ（Ｂ）を欠く最近のＥＢＶ感染は、過去のＥＢＶ感染（Ａ１〜Ａ３）とは、ｐ７２−ＩｇＧがなくても明瞭に識別される。 
【００６８】
図２は、様々なペプチドの発現を示す。誘導後の発現Ｅ．ｃｏｌｉクロ−ン溶解液のクーマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す（参照：実施例１）。レーンは以下のバッチに相当する。
【００６９】
レーン１：Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８の発現（ｐ１８−３０）
レーン２：ｐＤＳベクター中での完全ｐ１８の発現
レーン３：ｐＱＥベクター中での完全ｐ１８の発現
レーン４：分子量マーカー
【００７０】
完全ｐ１８抗原の大きさの相違は、異なるＮ−末端側のアミノ酸に基づく；ｐＱＥベクターは付加的なヒスチジンタグを有する。Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８は、予想通りに、約４ｋＤａ低い分子量である。
【００７１】
図３は、免疫ブロット法におけるペプチドの反応性を示す。２つのｐ１８変異体を有する誘導Ｅ．ｃｏｌｉクローンの溶解液を、ゲル電気泳動によって分離し、次いでニトロセルロース膜（ウェスタンブロット法）に移す。
【００７２】
レーン１:ヒスチジンタグなしの完全ｐ１８
レーン２：ｐ１８−３０（短縮されたｐ１８バージョン）
【００７３】
ニトロセルロース膜は、ＥＢＶ陽性のヒト血清とインキュベーションされる；特異的に結合した抗体は、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートの抗ＩｇＧ２次抗体およびＴＭＢ染色によって視覚化された。
Ａ；最近のＥＢＶ感染患者の血清
Ｂ；過去のＥＢＶ感染患者の血清
【００７４】
図４は、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８の反応性について、ストリップ上で市販ＥＢＶ抗体検査（Ｖｉｒａｍｅｄ社，  Ｐｌａｎｅｇｇ（ドイツ）；製品名    ＶｉｒａＳｔｒｉｐｅ  ＥＢＶ）を用い、全長ｐ１８−ＶＣＡの反応性との比較を示す。
【００７５】
過去にＥＢＶ感染しているが、血清学上の問題（弱い抗体価、ＥＢＮＡ−１抗体の欠如；Ａ）がある患者の１０血清検体、および最近のＥＢＶ感染（Ｂ）患者の１０血清検体について、以下に示す２種類のＥＢＶ抗原検査ストリップを用いてそれぞれ検査した。
「Ｍｉｋｒｏｇｅｎ」ストリップは、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８とは離して、追加的にＥＢＶ抗原、すなわちＥＢＮＡ−１、ｐ２３（ＶＣＡ）およびｐ５４およびｐ１３８（ＥＡｓ）を含んでいる。
「Ｖｉｒａｍｅｄ」ストリップもまた、完全ｐ１８抗原とは離して、ＥＢＶタンパク質であるＥＢＮＡ−１、ＥＡ−ｐ５４およびｇｐ１２５（ＶＣＡ）を含んでいる。
【００７６】
図の左半分（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ検査）では、「ｐ１８」は、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８を示す。右半分 （Ｖｉｒａｍｅｄ検査）では、「ｐ１８」はウイルスの全長ｐ１８を示す。
過去感染（Ａ）の場合には、多かれ少なかれ明らかなｐ１８抗体反応が両方の検査で見られるはずである。
しかしながら、最近感染（Ｂ）後の患者血清では、Ｎ−末端側が短縮されたｐ１８による試験ではいずれの場合にも反応を示さないが、ＶｉｒａＳｔｒｉｐｅ（完全ｐ１８）を用いた場合、全ての検体において反応を示す。
【００７７】
図５は、本発明による試験と市販ＥＬＩＳＡシステムとの反応性に関する比較試験を示す。
【００７８】
最近のＥＢＶ感染（「急性」）患者の３２検体および過去（昔）のＥＢＶ感染患者の２５検体が、Ｎ−末端側が短縮されたｐ１８［ニトロセルロース検査ストリップ上での噴霧、Ｍｉｋｒｏｇｅｎ（図４の抗原ストリップ参照）］および通常のｐ１８−ＶＣＡ抗原を備えた市販のＥＬＩＳＡ（Ｓｏｒｉｎ社）で、それぞれ検査された。
【００７９】
２つの図では、それぞれの場合、２つの検査のＯＤ値が互いに対してプロットされている；ｘ軸はＮ−末端側で短縮されたｐ１８のバンド強度を示す；ｙ軸は、完全ｐ１８のＥＬＩＳＡ値を示す。ＥＬＩＳＡのＯＤ値は、慣用のＥＬＩＳＡ読み取り装置で測定され、０〜３．０の間にある；Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８を含むニトロセルロースのストリップが読み取られ、そのバンド強度はソフトウェア・プログラムによって決定された;ここで、目盛は０〜２００である；２つの追加の線は、それぞれの切捨てを表わす。
【００８０】
図６は、種々の検査フォーマットにおけるｐ１８の反応相関性を示す。実施例４（図５）における最近および過去に感染した血清の検査結果を、さらに通常のＶＣＡ−ｐ１８（Ｖｉｒａｍｅｄ社から入手）のストリップ検査で調べ、その結果をＶＣＡ−ＥＬＩＳＡ値およびＮ−末端側で短縮されたｐ１８の反応性と相関させた。
【００８１】
図の評価は、前述の例で記載した方法と類似の方法で実施した：ＥＬＩＳＡによるＯＤ値（０〜２．０）に関するｘ軸；２つのストリップ検査によるｐ１８反応性に関するｙ軸（丸印（○）は完全ｐ１８のＶｉｒａｍｅｄ；ドット印（・）はＮ−末端側で短縮されたｐ１８抗原）。
【実施例】
【００８２】
次の実施例は、本発明を詳細に説明する。
実施例１：完全ｐ１８およびＮ−末端側で短縮されたｐ１８抗原の組換え製法
【００８３】
ウイルス性完全ｐ１８と比較して、Ｎ−末端側で３０アミノ酸を欠く抗原の発現クローニングが、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８の一具体例として記載される。
【００８４】
ｐ１８抗原のアミノ酸３１−１７６をコードする領域が、ＰＣＲおよび単離されたＥＢＶ−ＤＮＡ（Ｂ９５−８株）からの対応オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅された。
（リーディングフレーム  ＢＦＲＦ３；遺伝子配列データベース登録による配列データ）
【００８５】
完全ｐ１８用プライマー：
５’−プライマー：
【００８６】
【表１】
2007523603.tif 000003
（配列番号３）
【００８７】
３’−プライマー：
【００８８】
【表２】
2007523603.tif 000004
（配列番号４）
【００８９】
短縮されたｐ１８用プライマー：
５’−プライマー：
【００９０】
【表３】
2007523603.tif 000005
（配列番号５）
【００９１】
３’−プライマー：
【００９２】
【表４】
2007523603.tif 000006
（配列番号６）
【００９３】
太字のヌクレオチドは、ｐ１８をコードする配列に相当する；イタリック体のヌクレオチドは、さらなるクローニング工程で使用された制限酵素インターフェース（ＧＧＡＴＣＣ−ＢａｍＨ１；  ＣＴＧＣＡＧ−Ｐｓｔ  Ｉ）を表す。
ＰＣＲは、標準的な方法（９４℃、１分間の変性；５５℃、１分間のプライマー結合；７２℃、１分間の合成；全部で４０サイクル）および標準緩衝液を用いて実施した。
【００９４】
ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動にかける際の正しいサイズ（完全ｐ１８に対しては約５３０ｎｔ、短縮されたｐ１８に対しては約４４０ｎｔ）かどうかをチェックした後、この２つの生成物は常法に従い洗浄し、脱塩し、次いでＢａｍＨ１およびＰｓｔ１で切断し、最後に発現ベクターｐＤＳ１の相当する位置に挿入した。
ｐＤＳ１はアンピシリン抵抗性および最適化されたｌａｃプロモーターを有するベクターであり、その後の翻訳は、ＢａｍＨ１およびＰｓｔ１の位置で始まり、正しいリーディングフレーム中でＰＣＲ生成物の正しい翻訳を与える。
他の発現システムもまた、適している。完全ｐ１８をコードする断片もまた、比較目的のために最後に、市販ベクターｐＱＥ３０（ＱＩＡＧＥＮ）に挿入される。
【００９５】
形質転換後、発現プラスミドと正しい挿入を有する大腸菌クローンは、標準的な方法により誘導され、その溶解液はＳＤＳゲル電気泳動およびその後のクーマシー染色によって分析された。
【００９６】
両方のバッチは、組換えｐ１８あるいはｐ１８誘導体の明らかな発現を示している。完全ｐ１８は約２２ｋＤａの分子量を持っており、Ｎ−末端側で３０個のアミノ酸が短縮されたタンパク質は、幾分低い発現収率ではあるが、約１８ｋＤａの大きさである。
完全ｐ１８のｐＱＥ３０による発現は、似たような範囲の収率であり、生成物は付加的に存在するヒスチジン残基のためにいくらか大きい（図２参照）。
【００９７】
実施例２：完全ｐ１８とそのＮ−末端側で短縮された抗原との反応性の比較
【００９８】
完全ｐ１８および短縮ｐ１８のクローン溶解液は、いったんゲル電気泳動で再び分離し、これをニトロセルロース膜に移し、種々のＥＢＶ陽性血清に対する反応性について調べた。
【００９９】
この目的のために、上記ニトロセルロース膜は、１００倍希釈された血清とインキュベーションされ、特異的抗体はペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体を用い、その後の染色反応により視覚化された。
緩衝液、希釈液およびインキュベーション時間は、ＥＢＶウェスタンブロット法である、Ｍｉｋｒｏｇｅｎ社で開発された「ｒｅｃｏｍＢｌｏｔ  ＥＢＶ」と同様にして実施された。
他のウェスタンブロット操作法あるいは染色法もまた、使用することができる。
【０１００】
最近（約３週間、遡る)の感染後の血清、および遠い過去（約１．５年、遡る)に感染した血清を、それぞれ検査した（図３参照）。
驚くべきことに、完全ｐ１８抗原は、短縮されたものと比較して、反応性において本質的な違いを有することが、ここで分かる：
遠い過去からの感染の場合には、両方の抗原変異体は、ほぼ同じ程度に反応する；しかしながら、最近の感染の血清の場合には、完全ｐ１８抗原だけが、充分な反応を示す。
【０１０１】
したがって、ＥＢＶ感染の時期を決めるために使用することができる２つのマーカー（ＥＢＮＡ−１の他に）が存在する。
【０１０２】
実施例３：市販のイムノドット検査薬による反応性の比較
【０１０３】
ｐ１８抗原の短縮変異体が、比較的大量に発現され、通常の方法により精製された；ここでの実質的な工程を以下に示す。
【０１０４】
−  発現物質を含む誘導された大腸菌細胞の溶菌；
−  ｐ１８の遠心分離による不溶性「封入体」としての分離；
−  種々の非イオン性界面活性剤による不溶性ペレットの洗浄； 
−  ｐ１８を含む残存ペレットの８Ｍ尿素緩衝液中への溶解；
−  様々なイオン交換クロマトグラフィー:ＤＥＡＥ、Ｑ−セファロース、Ｓ−セファロース（全てＰｈａｒｍａｃｉａ社から入手）
【０１０５】
このようにして、タンパク質は、＞９９％の純度で得ることができる。
【０１０６】
別法として、他の精製方法あるいは連続カラム工程もまた使用することができる。ｐＱＥ３０−ｐ１８製品を使用することにより、特にニッケルキレートカラムへの選択的結合を利用することができる。
【０１０７】
精製された生成物について、ＥＢＶ感染者からの抗体との反応性がラインアッセイで検討された。この目的のために、生成物は他の組換えＥＢＶ抗原（ＥＢＮＡ−１）、ｐ２３−ＶＣＡ、ｐ１３８−ＥＡ、ｐ５４−ＥＡ）と共に、いわゆる接触針（Ｉｍａｇｅｎｅ社の製品Ｉｓｏｆｌｏｗ）を用いて、ニトロセルロース膜上に細い線で塗布され、次いでさらに処理（膜状の非結合部分の飽和、マーカーの適用、細いストリップへの切断）されて検査ストリップが得られた。ラインアッセイの原理は、Ｍｉｋｒｏｇｅｎ社から市販されているイムノアッセイ「ｒｅｃｏｍＬｉｎｅ  ＥＢＶ  ＩｇＧ」（製品番号４５７２）と同じである。
【０１０８】
検査ストリップは、最近感染および過去感染の血清により検査された。この目的のために、検査ストリップを、１００倍希釈の血清と共にインキュベーションした。３回洗浄した後、ヒトＩｇＧ抗体（西洋ワサビペルオキダーゼコンジュゲート）と共にインキュベーションした。再び洗浄後（３回）、インキュベーションは、ＴＭＢ基質と共に実施された。切捨てコントロールバンドが確認できたら、直ちに基質溶液を除去し、検査ストリップを水洗した。 バンド強度が切り捨てコントロールバンドのそれと同等もしくはより強い場合には、反応は陽性であると考えられる。したがって、バンド強度が切捨値と同等以上の場合には、ペプチドは、抗体と反応する。反応が起こらない、あるいは起きても弱い反応であるとは、バンドが存在しないか、あるいは切捨て値よりも下の強度であるバンドを意味する。この検査において、検査ストリップ上のいわゆるコントロールバンドの弱い染色強度（切捨てバンド）が、抗原バンドの反応性を評価する限界として用いられ、切捨て値として定義される（参照：例えば、上記したＭｉｋｒｏｇｅｎ社の免疫アッセイ“ｒｅｃｏｍＬｉｎｅ  ＥＢＶ  ＩｇＧ”）。切捨てバンドのかすかな染色度は、全ての操作および患者検体において、特定の試薬を使用するので常に同じである。 
【０１０９】
上記した検査ストリップと類似しているが、ときには完全ｐ１８のような他のＥＢＶ抗原を含んでいる、Ｐｌａｎｅｇｇ社の市販のＶｉｒａｍｅｄストリップ検査（ＥＢＶ−ＶｉｒａＳｔｒｉｐｅ）が、比較のために実施された。
【０１１０】
免疫染色された検査ストリップを示す図４から明らかに証明されるように、完全ｐ１８（右側）あるいはそのＮ−末端側で短縮されたｐ１８（左側）は、過去にＥＢＶ感染した血清の両検査において、同様によく認識されており、その反応性は非常に似通っている。一方、最近のＥＢＶ感染者の血清の場合には、その違いは決定的である：通常のｐ１８を用いた比較試験において、この違いは、すべての場合において多かれ少なかれ認められる；短縮されたｐ１８抗原の検査ストリップでは、最近感染のどんな場合にも反応は見られない。
【０１１１】
このことは、ＥＢＶの状態を解釈するうえで、修飾されたｐ１８の価値および信頼度を今一度強調するものである。
【０１１２】
実施例４：市販ＥＬＩＳＡシステムを用いる反応性比較
【０１１３】
最近のＥＢＶ感染（「急性」）患者の３２血清検体および過去（昔）のＥＢＶ感染者の２５血清検体を、実施例３（ニトロセルロース検査ストリップ上での噴霧、ｐ１８のラインアッセイ）で得られた短縮ｐ１８および通常のＶＣＡ抗原を備えた市販ＥＬＩＳＡ（ＤｉａＳｏｒｉｎ社のエプスタインバーカプシド抗原ＥＴＩ−ＶＣＡ−Ｇ）を用いて、各場合について検査した（図５参照）。
【０１１４】
２つの図において、それぞれの場合における両検査のＯＤ値が一方に対してプロットされる。ｘ軸は、短縮されたｐ１８のバンド強度に相当する。ｙ軸は、完全ｐ１８のＥＬＩＳＡ値に相当する。
ＥＬＩＳＡのＯＤ値は、通常のＥＬＩＳＡ読み取り装置により測定され、その値は０と３．０の間にある；短縮されたｐ１８のニトロセルロース検査ストリップは、スキャナーに取り込まれ、バンド強度がソフトウエアプログラムにより測定された；ここでは、スケールは０から２００の値から成る。
２つの付加的な線は、それぞれの切捨てを表す。
【０１１５】
反応性における違いは、全く明白である：過去感染の場合、反応性の分布は、高度に似通っている−１つの検査において高度な陽性血清は、一般に、他の検査でも強い陽性であると認められる−すなわち、過去感染の場合、ＥＬＩＳＡ抗原および短縮されたｐ１８は、非常に似た反応をする。
【０１１６】
最近感染の場合の状況は、劇的に異なる：ＥＬＩＳＡ値の場合−過去感染の場合も同様であるが−全ての値は切り捨て値と高度の陽性値（ＯＤ３．０）の間にある；過去感染の場合の状況と比較して違いはない。
しかしながら、短縮されたｐ１８のＯＤ値は、殆どの場合、切捨て値以下であり、わずか２例だけが弱い陽性領域にある。このことは、最近感染および過去感染の場合、短縮されたｐ１８は異なる反応性を有することを極めて印象的に証明している。
【０１１７】
実施例５：種々の検査フォーマットにおけるｐ１８の反応性の比較検討
【０１１８】
さらなる研究では、実施例４の最近感染および過去感染の血清について、通常のＶＣＡ−ｐ１８（Ｖｉｒａｍｅｄ社から入手）を用いて検査ストリップでさらに検討し、その結果をＶＣＡ−ＥＬＩＳＡ値と実施例３の短縮されたｐ１８との反応性に相関させた（図６参照）。
【０１１９】
グラフの評価は、前の実施例に記述した方法と類似の方法で実施した：ＥＬＩＳＡのＯＤは、ｘ軸（０から３．０）に沿ってプロットされる；ｙ軸は２つの検査ストリップ（丸印（○）＝Ｖｉｒａｍｅｄ社から入手の完全ｐ１８、ドット印（・）＝短縮されたｐ１８抗原）。
【０１２０】
過去に感染した血清の場合には、血清はすべて−予想通りに−ＥＬＩＳＡ陽性であり、それと同時に、両検査ストリップにおいてもまた反応する；すなわち検査フォーマットによる影響はない。
しかしながら、最近感染の血清の場合には、短縮されたｐ１８の全く異なる反応が、もう一度見られる：ＥＬＩＳＡ値は、切捨て値から強い反応性を示す値までの領域で、ばらつき−予想されることではあるが−が見られる；同じパターンが完全ｐ１８を含む検査ストリップにおける血清によって証明される；一方、短縮されたｐ１８抗原は、陰性あるいは−２例ではあるが−弱い陽性領域にある。
【０１２１】
この評価法は、ＶＣＡマーカーによる過去感染および最近感染を識別するための、現在まで利用可能なＥＢＶ検査システムの無力さをもう一度非常に明白に実証しているのである。上記した手段によって、修飾されたｐ１８抗原（そのＮ−末端側で短縮されている）は、この識別を可能にしている。
【０１２２】
従って、短縮されたｐ１８の使用で、最近感染の診断用のさらに信頼できるマーカーが、殆どの場合に見出されており、このマーカーは、公知のＥＢＶマーカーと組み合わせることにより、血清学的ＥＢＶ状況の解釈に大きな改良と信頼性をもたらすものである。
【０１２３】
参照文献：
Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．  Ｄｉｅ  Ａｕｓｓａｇｅｍｏｅｇｌｉｃｈｋｅｉｔｅｎ  ｄｅｒ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ［エプスタインバーウイルス診断からの潜在的な情報］
Ｄｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎｉｓｔ  ３３：  ５５６−５９２  （１９９２）
【０１２４】
Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ：  Ｂｅｄｅｕｔｕｎｇ  ｕｎｄ  Ｍｏｅｇｌｉｃｈｋｅｉｔｅｎ  ｄｅｒ  Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ［検査室診断の重要性および可能性］ 
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｕｍｓｃｈａｕ  ５１：  ５５８−５６２  （１９９４）
【０１２５】
Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ｄｅｒ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｅｎ．  Ｔｅｉｌ  Ｉ：  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ  （ＥＢＶ）  ｕｎｄ  Ｚｙｔｏｍｅｇａｌｉｅｖｉｒｕｓ  （ＣＭＶ）  ［ヘルペスウイルスの診断  第１章：エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）］ 
ｍｔａ  １０，  ５０２−５０８  （１９９５）
【０１２６】
Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ｄｅｒ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｅｎ．  Ｔｅｉｌ  ＩＩ：    Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ−Ｖｉｒｕｓ  （ＨＳＶ），  Ｖａｒｉｚｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ−Ｖｉｒｕｓ  （ＶＺＶ）  ｕｎｄ  Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−６  （ＨＨＶ−６）  ［ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の診断  第２章：単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘・帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）およびヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）］
ｍｔａ  １０，  ５８７−５９３  （１９９５）
【０１２７】
Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．  Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｕｎｄ  ｒａｔｉｏｎｅｌｌｅ  ＥＢＶ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ［合理的および効果的なＥＢＶ診断］
Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  ４１，  ６２３−６３４  （１９９５）
【０１２８】
Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．  ＩｇＭ−ｅｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅｒ  ｕｎｄ  ｍｅｈｒｄｅｕｔｉｇｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｓｃｈｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ［ＩｇＭ−変わり得る、曖昧な診断薬マーカー］
Ｄｅｒ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｅ  ６：  ４４−５１  （１９９６）
【０１２９】
Ｔ．  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｃ．  Ｇａｓｓｍａｎｎ，  Ｖ．  Ｖｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ．［結合力測定：感染症の血清診断を改善させる基礎的な免疫学的機序の利用］
Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ４３：  １２５−１３５，  １９９７．
【０１３０】
Ｍ．  Ｋａｍｐｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ［補体活性化免疫蛍光測定法（ＡＣＩＦ）によるエプスタインバーウイルスの核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）に対する特異的抗体の測定］
Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２：  １−８  （１９９３）
【０１３１】
Ｍ．  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ，  Ｍ．  Ｋａｍｐｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ，  Ｇ． Ｍｕｒｒａｙ，  Ｉ． Ｈａｎｓｅｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ［急性エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染に対する体液免疫応答の変わりやすさ:血清学的マーカーの重要性評価］  
Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２：  ２９６−３０３  （１９９３）
【０１３２】
Ｈ．−Ｊ．  Ｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ［ＩｇＧ吸収によるエプスタインバーウイルスカプシド抗原特異的ＩｇＭ試験の検出感度の増大］
Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２：  ３７１−３７８  （１９９３）
【０１３３】
Ｖ．  Ｖｅｔｔｅｒ，  Ｌ．  Ｋｒｅｕｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ［ＶＣＡ−ＩｇＧ結合力の決定によるＥＢＮＡ−１１次抗体陰性の場合とＥＢＮＡ−１２次抗体陰性の場合の区別化］
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２：  ２９−３９  （１９９４）
【０１３４】
Ａ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｖ．  Ｖｅｔｔｅｒ，  Ｌ．  Ｋｒｅｕｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ［ウイルスカプシド抗原（ＶＣＡ）あるいは初期抗原（ＥＡ）に対するＩｇＧの結合力：より重要なエプスタインバーウイルス血清学のための有用マーカー］
Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４３：  ２３８−２４４  （１９９４）
【０１３５】
Ｇ．  Ｓｉｇｅｌ，  Ｍ．  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ，  Ｋ．  Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇ． Ｂａｕｅｒ［鼻咽頭癌の診断のための特異的マーカーではない、エプスタインバーウイルス初期抗原に対するＩｇＡ］
Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４３：  ２２２−２２７  （１９９４）
【０１３６】
Ｗ．  Ｋａｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ  ［急性エプスタインバーウイルス感染中の、水痘・帯状ヘルペスウイルス特異的ＩｇＡ応答の活性化］
Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４４：  ２５８−２６２  （１９９４）
【０１３７】
Ｃ．  Ｒａｐｐ，  Ｈ．  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ［活性Ｂ型肝炎ウイルス感染中のＥＢＮＡ−１抗体の減少。ＨＢＶ誘因一過性の細胞免疫抑制に対する診断上の問題と指針］
Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３：  ２３５−２４３  （１９９４）
【０１３８】
Ｃ．  Ａｌｐｅｒｓ，  Ｃ．  Ｓｃｈｅｉｄ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｕｅｒ  ［急性ＥＢＶ感染による、無関係ウイルスに対するＩｇＭ応答］
Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３：  ３０６−３１４  （１９９４） 
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、修飾されたｐ１８抗原の使用による、ＥＢＶ診断の情報提供力における改善を示す。
【図２】図２は、様々なペプチドの発現を示す。
【図３】図３は、免疫ブロット法におけるペプチドの反応性を示す。
【図４】図４は、Ｎ−末端側で短縮されたｐ１８の反応性について、全長ｐ１８−ＶＣＡの反応性との比較を示す。
【図５】図５は、本発明による試験と市販ＥＬＩＳＡシステムとの反応性に関する比較試験を示す。
【図６】図６は、種々の検査フォーマットにおけるｐ１８の反応相関性を示す。
【図７】図７は、ウイルス性ｐ１８のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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