(57)【要約】  哺乳類でのＩｇＥを介する疾患のＲＮＡ干渉による治療及び／又は予防のための組成物が、該組成物の使用方法とともに提供される。本発明の組成物は、関心のある標的細胞の表面に発現される標的となる細胞内に取り込み可能な抗原と特異的に結合する結合剤と、前記標的細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を発現できる遺伝子コンストラクトとを含み、これによって、前記標的抗原との結合の後、前記結合剤及び遺伝子コンストラクトが前記細胞内に取り込まれて、該遺伝子コンストラクトが放出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＩｇＥが介在する疾患において活性がある標的遺伝子の発現を低減することができる短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）と、
（ｂ）前記細胞の表面で発現する標的抗原に特異的に結合する結合剤とを含む組成物であって、
前記結合剤の前記標的抗原に結合することは、前記結合剤及びｓｉＮＡが前記標的細胞内に取り込まれ、その後、前記ｓｉＮＡが放出されることにつながる、組成物。
【請求項２】
（ａ）ＩｇＥが介在する疾患において活性がある標的遺伝子の発現を低減することができる短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を発現する遺伝子コンストラクトと、
（ｂ）前記細胞の表面で発現する標的抗原に特異的に結合する結合剤とを含む組成物であって、
前記結合剤が前記標的抗原に結合することは、前記結合剤及びｓｉＮＡが前記標的細胞内への取り込まれ、その後、前記ｓｉＮＡが放出されることにつながる、組成物。
【請求項３】
前記ｓｉＮＡは細胞特異的プロモーターの制御下にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターとからなるグループから選択されるプロモーターの制御下にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記遺伝子コンストラクトはウイルスベクターの中にパッケージングされる、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記結合剤はウイルスのカプシドタンパクである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記標的遺伝子は、ＩｇＥ、ＦｃεＲＩ及びＳＴＡＴ６からなるグループから選択される、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記標的遺伝子はＩｇＥで、前記標的細胞はＢ細胞である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記標的抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２２からなるグループから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記標的遺伝子はＦｃεＲＩで、前記標的細胞は、肥満細胞及び好塩球からなるグループから選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記標的抗原は、ＦｃεＲ１及びＣＸＣＲ４からなるグループから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記結合剤は、抗体又はその抗原結合断片と、低分子と、ホルモンと、サイトカインと、リガンドと、ペプチドと、ウイルスとからなるグループから選択される、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記結合剤は、抗ヒトＣＤ１９抗体、抗マウスＣＤ１９抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗マウスＣＤ２２抗体、抗ヒトＦｃεＲ１抗体、抗マウスＦｃεＲＩ抗体、抗ヒトＣＸＣＲ４抗体、抗マウスＣＸＣＲ４抗体及びこれらの抗原結合断片からなるグループから選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記結合剤は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合し、かつ、ＣＸＣＬ１２、ペプチド及び低分子からなるグループから選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記結合剤は２，２’［４，４’−［［アミノカルボニル］アミノ］ビス［Ｎ，４’−ジ［ピロール−２−カルボキシアミド−１，１’−ジメチル］］−６，８ナフタレンジスルホン酸］６ナトリウム塩と、［Ｔｙｒ５，１２，Ｌｙｓ７］−ポリフェムシンＩＩと、Ｎ−α−アセチル−ノナ−ｄ−アルギニン（Ａｒｇ）アミドと、ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００及びＡＭＤ０７０とからなるグループから選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記遺伝子コンストラクトはストレプトアビジン−ビオチン結合によって前記結合剤に連結される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ｓｉＮＡ又は遺伝子コンストラクトはリポソームに封入され、該リポソームは前記結合剤に結合している、請求項１又は２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記リポソームはペグ化リポソームである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リポソームはマレイミドリンカーによって前記結合剤に結合される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ｓｉＮＡ又は遺伝子コンストラクトは脂質又は高分子の担体に結合する、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記ｓｉＮＡは、５’非翻訳領域、コーディング領域、３’非翻訳領域及びプロモーター領域からなるグループから選択される前記標的遺伝子の領域を標的とする、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記ｓｉＮＡは、ＩｇＥ又はその一部をエンコードするｍＲＮＡ分子と、ＩｇＥプロモーター配列と、高親和性ＦｃεＲ１レセプターアルファサブユニットをエンコードするｍＲＮＡ分子と、高親和性ＦｃεＲ１レセプターベータサブユニットをエンコードするｍＲＮＡ分子と、ＦｃεＲ１レセプターアルファサブユニットプロモーター配列と、ＦｃεＲ１レセプターベータサブユニットプロモーター配列と、高親和性ＦｃεＲ１レセプターベータサブユニットの３’ＵＴＲと、ＩｇＥイプシロンドメイン１−４とからなるグループから選択される配列を標的とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ｓｉＮＡは１９ないし３０ヌクレオチドの長さである、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記ｓｉＮＡは１９ないし２５ヌクレオチドの長さである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ｓｉＮＡは、前記標的遺伝子の領域に対応するｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖を含む、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記ｓｉＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子とｓｈＲＮＡ分子とからなるグループから選択される、請求項１及び２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１ないし２６のいずれか１つに記載の組成物を患者に投与することを含む、ＩｇＥが介在する疾患の治療方法。
【請求項２８】
前記疾患は、アレルギー性鼻炎と、喘息と、アナフィラキシーと、蕁麻疹と、アトピー性皮膚炎と、食品アレルギーと、呼吸器系組織内の好酸球症の低減で利益がある疾患と、過敏性免疫反応を特徴とする疾患とからなるグループから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＩｇＥが介在する疾患の治療のための製造における請求項１ないし２６のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【請求項３０】
前記疾患は、アレルギー性鼻炎と、喘息と、アナフィラキシーと、蕁麻疹と、アトピー性皮膚炎と、食品アレルギーと、呼吸器系組織内の好酸球症の低減で利益がある疾患と、過敏性免疫反応を特徴とする疾患とからなるグループから選択される、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、免疫グロブリンε（ＩｇＥ）関連疾患のような疾患に関与する鍵となる経路で作用する遺伝子に対するＲＮＡｉに介在できる低分子核酸の標的送達に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー鼻炎（例えば枯草熱）、喘息、アナフィラキシー、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ、ｈｉｖｅｓ）、アトピー皮膚炎（慢性湿疹）及び食品アレルギーを含み、免疫グロブリンイプシロン（ＩｇＥ）として知られる抗体のクラスによって介在される、多くのアレルギー疾患がある。重篤なアトピー又はアレルギー患者は血清ＩｇＥレベルが亢進しているのが典型的である。このクラスの抗体は、発生過程でＩｇＥ産生の役割を引き受けた特別なクラスのＢ細胞によって産生される。いったん前記Ｂ細胞が抗原によって活性化されると、該細胞はＩｇＥ抗体を分泌し、該抗体はその後血液系及びリンパ系を循環して、肥満細胞及び好塩球上のＦｃεＲ１に結合する。
【０００３】
Ｂ細胞におけるＩｇＥ合成の誘導は、抗原（アレルギー反応ではしばしばアレルゲンとよばれる。）と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と、ＴＨ２細胞として知られるヘルパーＴ細胞のクラスとの相互作用が関与する。細胞表面にＩｇＥを発現するＢ細胞が、抗原又はアレルゲンと、前記抗原提示細胞と、ＴＨ２細胞とに特異的な結合をするとき、該Ｂ細胞は活性化されて、大量のＩｇＥ分子を合成し血液系に分泌し始める。
【０００４】
ＩｇＥは、組織内の肥満細胞及び循環中の好塩球の表面に存在する高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲ１）によって迅速に捕捉されるため、血液循環には非常に少量のＩｇＥしか存在しない。細胞に結合したＩｇＥのアレルゲンによる結合は、アレルギー反応を惹起するメディエータの放出を誘発する。ヒスタミン、ロイコトリエン及びプロスタグランジンと、（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＴＮＦ及びＧＭ−ＣＳＦを含む）サイトカインとを含むこれらのメディエータは、急性及び遅延性の両方の反応を惹起し、急性反応は即時過敏症とよばれ、遅延性反応は肥満細胞又は好塩球の活性化後２−２４時間で発生する後期反応とよばれる。即時過敏症は、脈管透過性の増大と、血管拡張と、気管支及び内臓の平滑筋の収縮と、局部炎症とを特徴とする。後期反応は、好酸球、好塩球、好中球及びリンパ球の炎症性浸潤を特徴とする。この後期反応の発作の繰り返しは組織損傷を起こす場合がある。
【０００５】
Ｂ細胞の活性化の過程で、ＴＨ２細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−５のようなサイトカインを放出する場合があるが、該サイトカインは、ヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン及びサイトカインを含むメディエータを放出するために好酸球を活性化でき、これによってアレルギー反応を亢進させる。したがって、アレルギー疾患はＴＨ２依存疾患と考えられる場合がある。
【０００６】
喘息は、ありふれた疾患で、先進国で罹患率が高い。喘息は、さまざまな刺激に対する気管気管支の反応亢進を特徴とし、主要な生理的障害は、自発性又は薬物関連性の場合がある可逆性気流制限であり、病理的主要所見は気道の炎症である。大部分の喘息は即時過敏症の一形態であることが確立している。臨床的には、喘息は外因性及び内因性に分類できる。
【０００７】
外因性喘息は、同定可能な沈降物があり、アトピー性で、職業的で、薬物誘発性であると考えられる場合がある。アトピー性喘息は、特異的ＩｇＥ産生を伴うＴＨ２タイプ免疫応答の増強に関係する。外因性喘息における気流障害は、気道の炎症による気管支の非特異的過敏症が原因である。アトピー性喘息では、気道の炎症を起こす免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０を分泌するＴＨ２クラスのＴ細胞によって惹起される。アトピー性喘息患者の肺由来のリンパ球は活性化されるときにＩＬ−４及びＩＬ−５を産生することが示されている。ＩＬ−４及びＩＬ−５は両方ともＴＨ２クラスのサイトカインであり、ＩｇＥ産生と、喘息における好酸球の関与に必要である。内因性又は潜在性喘息は、上気道感染後に発生することが報告されているが、中年又は老年の患者で新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）発生する場合があり、これらの患者では外因性喘息よりも治療が困難である。
【０００８】
喘息は誘発するアレルゲンを忌避することによって予防するのが理想的であるが、これはいつでも可能なことではないし、誘発するアレルゲンがいつでも簡単に同定されるわけではない。喘息の医学的治療は、炎症及び可逆的気道障害を低減するためのコルチコステロイド及び気管支拡張剤の使用を基本とする。慢性喘息では、コルチコステロイド治療は容認しがたい副作用を引き起こす。
【０００９】
喘息と類似の免疫異常を伴う別の疾患がアレルギー性鼻炎である。アレルギー性鼻炎は、ありふれた疾患で、人口の少なくとも１０％が罹患していると推測される。アレルギー性鼻炎は、花粉に対するアレルギーによって起こる季節性（枯草熱）の場合がある。非季節性又は通年性の鼻炎は、ハウスダストのダニ又は動物の鱗屑由来のような抗原に対するアレルギーによって起こる。
【００１０】
アレルギー性鼻炎における免疫応答異常は、アレルゲンに対して特異的なＩｇＥ抗体の過剰産生を特徴とする。炎症応答は、喘息のように気道の下部で起こるのではなく、むしろ鼻粘膜で起こる。喘息と同様に、患部組織での局所的な好酸球血症がアレルギー性鼻炎の主要所見である。この炎症の結果患者は、くしゃみ、鼻水及び鼻づまりを起こす。より重症の患者では炎症が、眼（結膜炎）、口蓋及び外耳に拡大する。生命の危険はないが、アレルギー性鼻炎は、身体の自由を非常に奪い、日常活動を妨げ、患者の労働能力に干渉する。現行の治療法は、抗ヒスタミン剤及び鼻の充血除去剤の使用と、そして喘息の場合と同じく、クロモグリク酸（ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）ナトリウムおよびコルチコステロイドの使用とを含む。
【００１１】
アトピー性湿疹としても知られるアトピー性皮膚炎は、通常は、アレルギー性鼻炎及び喘息のようなさまざまなアレルギー疾患の遺伝性素因を有する家族で発症する、慢性で再発性の掻痒性炎症皮膚疾患である。アトピー性皮膚炎は罹患率が増加し、人口の最大１５％が小児期にアトピー性皮膚炎を罹患している。主な徴候は、皮膚の乾燥と、顔、首及び四肢のヒダ（ｆｏｌｄｓ）に主に局発し、重篤な痒疹を伴う、皮膚炎（湿疹）とである。アトピー性皮膚炎は、生後五年以内に発症するのが典型的である。多くの患者では、この皮膚病は小児期に消失するが、徴候が成人になっても続く場合もある。さらに、患者の５０％は喘息を発病し、約７５％はアレルギー性鼻炎を発症する。アトピー性皮膚炎は世界中で最もありふれた形態の皮膚炎である。
【００１２】
アレルゲンはアトピー性皮膚炎において重要な役割を果たす。患者の約８０％はさまざまな食品性及び吸入性アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を有し、重症のアトピー性皮膚炎を罹患している患者の大半は、特に他の形態のアトピー疾患も併発している場合には、血清ＩｇＥレベルが亢進している。さらに、血液好酸球の循環レベルが亢進することがしばしばある。アトピー性皮膚炎では、皮膚の患部の真皮には、マクロファージ、Ｔ細胞及び好酸球が浸潤しており、慢性の患部では、肥満細胞の数が増加する。急性の患部はサイトカインのＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を発現する細胞が著しく多く、Ｔｈ２クラスのＴ細胞が優占的に集積していることを示す。さらに、アトピー性皮膚炎患者の循環Ｔ細胞は、正常人と比較してより多くのＩＬ−４及びＩＬ−５を産生する。ＩＬ−４は、抗体産生のＩｇＥアイソタイプへのスイッチと、ＴＨ２細胞の発生と、好酸球を動員する、内皮細胞上の接着分子の誘導とを引き起こす。ＩＬ−５は好酸球の発生及び分化に重要である。
【００１３】
アレルギー性接触皮膚炎は、ありふれた皮膚の非感染性炎症疾患である。接触皮膚炎では、身体が特定の抗原に感作されるまでは免疫反応が進行できない。前記抗原に皮膚がその後曝露されることと、Ｔ細胞によってこれらの抗原が認識されることとの結果、さまざまなサイトカインの放出と、Ｔ細胞の増殖及び動員とが起こり、最終的に皮膚炎（湿疹）が起こる。原因が同定できる場合には、除去だけでアレルギー性接触皮膚炎は治癒するであろう。活発な炎症の際には局所的なコルチコステロイドが有用である。
【００１４】
アナフィラキシー又は全身性即時過敏症においては、肥満細胞及び好塩球のメディエータが全身の血管床へのアクセスを得て、血管拡張及び血漿浸出を起こす。これがアナフィラキシーショックと呼ばれる血圧低下又はショックにつながるが、アナフィラキシーショックは致命的な場合がある。アナフィラキシーショックは、注射か、昆虫の刺創か、皮膚又は消化管粘膜のような上皮表面を通過する吸収かによって導入された抗原の全身的な存在に起因するのが通常である。治療法は、通常はエピネフリン全身投与で、これは前記メディエータの気管支収縮効果及び血管拡張効果を逆転できる。
【００１５】
ＳＴＡＴ（シグナルトランスジューサ及び転写アクチベータ）ファミリーのタンパク質は、多くの細胞タイプで豊富に発現する潜在型転写因子である。ＳＴＡＴ６は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３レセプターを介在するシグナルの伝達後に特異的に活性化される偏在転写因子であり、ＩｇＥを含むこれらのサイトカインによって調節される遺伝子についての収束点で作用する。ＳＴＡＴ６欠損マウスはＩｇＥ及びＴｈ２サイトカイン産生の顕著な低減を示し、気道炎症のモデルにおいて抗原誘発性気道過敏症を発症できない（非特許文献１）。ＳＴＡＴ６は有効なＴＨ２分化と、ＩｇＥ合成へのＢ細胞クラススイッチとに必須であることが証明されている。ＳＴＡＴ６に対するシス−エレメントの２本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の生体内でのリポソーム利用トランスフェクションは、マウスモデルにおける慢性及び急性の両方の接触皮膚炎を阻害することが示されている（非特許文献２）。これらの同一のＳＴＡＴ６デコイＯＤＮは、アトピー性皮膚炎のマウスモデルにおけるＩｇＥ介在公知アレルギー反応に顕著な阻害効果を有することも示されている（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｋｕｐｅｒｍａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８７：９３９−９４８、１９９８
【非特許文献２】Ｓｕｍｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７６３−１７７１、２００４
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｚｅｋｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７５３−６２−１７７１、２００４
【００１６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ウイルス攻撃及びトランスポゾン様因子に対する防衛機構としてたいていの真核生物によって利用される転写後ＲＮＡサイレンシング現象である。このＲＮＡサイレンシングの過程は、最初に、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）とよばれて植物で同定され、その後、Ｆｉｒｅ及びＭｅｌｌｏによって線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで観察された（非特許文献４）。ＲＮＡｉは、相補的なｍＲＮＡ配列と選択的に結合して対応するタンパク質の産生を阻害する、短鎖干渉核酸又はＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を分解の標的として利用することを伴う。より最近にはｓｉＲＮＡは、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）として知られる、プロモーター配列の新規メチル化及びサイレンシングを誘導できることが示された。
【非特許文献４】Ｆｉｒｅ及びＭｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１、１９９８
【００１７】
より具体的には、開始段階では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が酵素Ｄｉｃｅｒ（ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅファミリーのメンバー）によって長さ１９ないし２５ヌクレオチドの短鎖干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）に消化される。各ｓｉＲＮＡはアニールした２本の別々の１本鎖ヌクレオチドからなり、各鎖は２−３ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。エフェクター段階では、ｓｉＲＮＡの２重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）がヌクレアーゼ複合体と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。その後、前記ＲＩＳＣは前記複合体内のｓｉＲＮＡに相補的な内在性ｍＲＮＡを標的として、該内在性ｍＲＮＡを前記ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチド切断する。その後、前記内在性ｍＲＮＡの分解はエキソヌクレアーゼによって完了する。一部の生物では前記ＲＮＡｉ経路の中に、例えば、入力ｄｓＲＮＡｓのコピー形成か、前記ｓｉＲＮＡｓ自体の複製かによる、増幅段階が存在する場合がある。
【００１８】
３０ヌクレオチドを超える長鎖ｄｓＲＮＡ分子をたいていの哺乳類細胞にトランスフェクションすると、他の生物で見られる遺伝子特異的な抑制とは反対に、非特異的な遺伝子発現の抑制が起こる。これは、インターフェロン産生を含み、タンパク質産生の全体的な停止につながる抗ウイルス防衛機構の活性化によるものであると信じられている。しかしこの経路は、３０ヌクレオチド未満の長さのｄｓＲＮＡによっては活性化されないこと、及び、２１ないし２３ヌクレオチドの短鎖ｄｓＲＮＡｓは哺乳類細胞において特異的な遺伝子発現を低減するのに利用可能であることが示されている（非特許文献５及び６）。より最近には、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐらが、腫瘍遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡがマウスにおいて腫瘍を縮小するのに有効であることを証明した（非特許文献７）。
【非特許文献５】Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １７：９７４２−９７４７、２００１
【非特許文献６】Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ６８３６：４９４−４９８、２００１
【非特許文献７】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：２４３−２４７、２００２
【００１９】
ＲＮＡｉは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用のような他の遺伝子サイレンシング技術に比べて複数の利点がある。ＲＮＡｉ法は、ＯＤＮよりも特異的な遺伝子発現の阻害を起こし、はるかに低濃度の試薬でＯＤＮと同レベルのサイレンシングを誘導することができる。また、ｓｉＲＮＡはＯＤＮよりヌクレアーゼ分解に抵抗性がある。Ｂｅｒｔｒａｎｄら（非特許文献８）は、マウスにおいて、ｓｉＲＮＡサイレンシングがアンチセンス抑制より効果的であることを示した。
【非特許文献８】Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９６：１０００、２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ｓｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の１個の塩基対のミスマッチがサイレンシングを劇的に低下させる場合があるため、ｓｉＲＮＡの配列特異性は重要であることが示されている。したがって、関心のある遺伝子の発現を高度に抑制する効果を生じるためには、ｓｉＲＮＡｓが標的遺伝子に特異的であるように設計しなければならない。さらに、望ましくない副作用を回避するために、前記ｓｉＲＮＡを所望の標的に特異的に送達する送達システムを利用しなければならない。予め形成されたｓｉＲＮＡｓの体外からの送達か、ｓｉＲＮＡｓ又はｓｈＲＮＡｓのプロモーターを利用した発現かによるｓｉＲＮＡの送達が報告されている。ｓｉＲＮＡ分子の送達用遺伝子コンストラクトは、例えば、特許文献１に説明されている。哺乳類における生体内の細胞への短鎖ＲＮＡ断片の送達は、ＲＮＡの迅速な分解のために問題が多い。短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は前記ＲＮＡｉ２重鎖の構造を模倣して、ｓｈＲＮＡをエンコードする発現ベクターの送達後に細胞内で産生できる核酸分子である。ラットにおける生体内での遺伝子発現を低減するためのｓｈＲＮＡ発現プラスミドの使用は、非特許文献９に説明されている。
【特許文献１】米国特許第６，５７３，０９９号明細書
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：１０３９−１０４５、２００３
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の概要
簡潔に述べると、本発明は、ＲＮＡ干渉法による哺乳類における疾患の治療及び／又は予防用組成物と、該組成物の使用方法とを提供する。前記疾患はＩｇＥが介在する疾患であることが好ましい。１つの局面では、本発明の組成物は、（ａ）関心のある標的細胞の表面に発現する、細胞内に取り込み可能な標的抗原に特異的な結合をする結合剤と、（ｂ）前記標的細胞内での標的遺伝子の発現を抑制する、短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）とを含み、前記結合剤及びｓｉＮＡは、前記標的抗原と結合した後、前記細胞内に取り込まれ、前記ｓｉＮＡが放出される。
【００２２】
関連する局面では、本発明は、（ａ）関心のある標的細胞の表面に発現して、細胞内に取り込み可能な標的抗原に特異的な結合をする結合剤と、（ｂ）前記標的細胞内で標的遺伝子の発現を抑制するｓｉＮＡを発現することができる遺伝子コンストラクトとを含む組成物であって、前記結合剤及び遺伝子コンストラクトは、前記標的抗原に結合した後、前記細胞内に取り込まれ、前記ｓｉＮＡが前記遺伝子コンストラクトによって発現する、組成物を提供する。前記ｓｉＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ又は組織特異的なＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターの制御の下にあることが好ましい。
【００２３】
更なる局面では、本発明の組成物は、前記標的細胞内で標的遺伝子の発現を抑制するｓｉＮＡを発現することができる遺伝子コンストラクトを含み、該遺伝子コンストラクトはウイルスベクターの中にパッケージングされ、該ウイルスベクターは、前記細胞に感染すると、その遺伝物質を放出して、前記遺伝子コンストラクトの発現を可能にする。前記ウイルスベクターはアデノウイルス関連ベクターであることが好ましい。この局面では、ウイルスのカプシドタンパク質は結合剤として作用する場合がある。
【００２４】
一部の実施態様では、本発明の組成物に用いられる前記結合剤は、抗体か、その抗原結合断片かである。本発明の組成物に効果的に利用される場合がある他の結合剤は、細胞特異的リガンドと、細胞特異的レセプターに特異的に結合するペプチド又は低分子とを含む。ウイルス（カプシド）タンパク質も結合剤として利用される場合がある。
【００２５】
ある実施態様では、前記結合剤は、ｓｉＮＡ、遺伝子コンストラクト又はウイルスベクターと、以下の説明するストレプトアビジン−ビオチンリンカーによって連結される。別の実施態様では、前記ｓｉＮＡ、遺伝子コンストラクト又はウイルスベクターは、カチオン脂質担体のような脂質担体と複合体を形成し、該脂質担体が前記結合剤に連結する。関連する局面では、前記ｓｉＮＡ、遺伝子コンストラクト又はウイルスベクターはリポソームに封入され、前記結合剤又はその抗原結合部分が前記リポソームの表面に存在する。
【００２６】
本発明の組成物は、ＩｇＥが介在する疾患に関与する経路で作用する遺伝子の発現を低減する効果があることが好ましい。一つのかかる局面では、本発明の組成物に用いられるｓｉＮＡは、Ｂ細胞のようなＩｇＥを本来発現する細胞におけるＩｇＥ産生を抑制することができる。かかる組成物では、前記標的抗原はＢ細胞表面で発現する細胞内に取り込み可能な抗原であり、該抗原への複合体の結合が前記Ｂ細胞内への該複合体の取り込みにつながる。前記標的抗原はＣＤ１９又はＣＤ２２であることが好ましい。ＩｇＥの発現を抑制可能なｓｉＮＡの例は、配列番号１２−１００又は８２４−９１５に提供される標的配列に対応するｓｉＲＮＡ配列を含む。
【００２７】
更なる局面では、本発明の組成物に用いられるｓｉＮＡは、高親和性レセプターＦｃεＲ１の発現を抑制可能であり、前記結合剤は、肥満細胞又は好塩球の表面に発現する標的抗原であって、該標的抗原に結合した複合体の細胞内への取り込みを促進する標的抗原に特異的な結合をする。ある実施態様では、前記標的抗原はＦｃεＲ１自体であるが、これは、ＦｃεＲ１に結合した複合体は細胞内に取り込まれて分解されることが知られているからである。別の実施態様では、前記標的抗原はレセプターＣＸＣＲ４である。かかる組成物に効果的に利用される場合があるｓｉＮＡｓの例は、配列番号１０１−８２３に提供される標的配列に対応するｓｉＲＮＡ配列を含む。
【００２８】
別の局面では、本発明の組成物に用いられるｓｉＮＡはＳＴＡＴ６の発現を抑制でき、前記結合剤は、ＳＴＡＴ６を発現する細胞の表面に発現する標的抗原であって該標的抗原に結合する複合体の細胞内への取り込みを促進する標的抗原との特異的な結合をする。ＳＴＡＴ６の発現を抑制できる組成物の送達は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ及び肥満細胞のような造血細胞を標的とすることが好ましい。かかる細胞の細胞に局在する細胞内に取り込み可能な標的抗原は、例えば、インテグリンスーパーファミリーのメンバーと、細胞接着分子とを含む。ＳＴＡＴ６のｃＤＮＡ配列は配列番号９４２に提供され、ＳＴＡＴ６プロモーターの配列は配列番号９４３に提供される。一部の実施態様では、ＳＴＡＴ６の発現を抑制する本発明の組成物は、ＳＴＡＴ６遺伝子のノンコーディング非翻訳領域（ＵＴＲｓ）か、ＳＴＡＴ６プロモーター配列かに向けられたｓｉＮＡｓを含む。ＳＴＡＴ６の発現を抑制できるｓｉＮＡｓの例は、配列番号９４４−９８０に提供される標的配列に対応するｓｉＲＮＡ配列を含むが、このうち配列番号９７１−９８０の標的配列はＳＴＡＴ６プロモーターに向けられる。
【００２９】
更に別の局面では、前記遺伝子コンストラクト内のｓｉＮＡは、前記標的細胞に特異的なプロモーターと操作可能に連結され、標的以外の細胞内での遺伝子発現の抑制は低減される。例えば、免疫グロブリン重鎖プロモーター（配列番号９１６、ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＨＵＭＩＧＣＣ４）、ＣＤ１９プロモーター（配列番号９１７、ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿００１７７０、対応するゲノムコンティグのＩＤ  ＮＴ＿０２４８１２）、ＣＤ２０プロモーター（配列番号９１８、ｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤＮＭ＿０２１９５０、タンパク質配列のＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤＮＰ＿０６８７６９、対応するゲノムコンティグのＩＤ  ＮＣ＿００００１１）、ＣＤ２１プロモーター（配列番号９１９、ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＡＦ２９８２２４）又はＣＤ２２プロモーター（配列番号９２０、対応するゲノム配列ＨＳＵ６２６３１）を含むけれどもこれらに限定されない、Ｂ細胞特異的抗原の発現を駆動するプロモーターの使用は非Ｂ細胞での前記ｓｉＮＡの発現を防止するであろう。
【００３０】
代替的な実施態様では、本発明の組成物に利用されるｓｉＮＡは、ＩｇＥ鎖合成に必要なプロモーター（配列番号２）か、ＩｇＥレセプター遺伝子のプロモーター（配列番号５及び６、配列番号６はＩｇＥベータレセプターのプロモーターの代表的断片）かを標的とし、Ｂ細胞、肥満細胞又は好塩球のような標的細胞内への前記遺伝子コンストラクトの導入は、該標的細胞でのＩｇＥ又はＩｇＥレセプター遺伝子の転写遺伝子サイレンシングをもたらす。
【００３１】
追加の実施態様では、本発明の組成物に利用されるｓｉＮＡはＩｇＥ鎖合成に必要なリコンビナーゼのプロモーター配列又はコーディング配列を標的とし、Ｂ細胞のような標的細胞への前記遺伝子コンストラクトの導入は該細胞によるＩｇＥ合成の低減をもたらす。
【００３２】
更に別の実施態様では、本発明の組成物に利用されるｓｉＮＡｓは、サイレンシングされるべきＩｇＥ又はＩｇＥレセプターの遺伝子／エクソンを挟む遺伝子間領域／イントロン領域を標的とし、Ｂ細胞、肥満細胞又は好塩球のような標的細胞内への遺伝子コンストラクトの導入は、所望の遺伝子の部分的又は完全なサイレンシングをもたらす。好ましくは、標的領域内のユニークな部位に互いに近接して結合する複数のｓｉＮＡｓを本発明の組成物に利用することによって、遺伝子サイレンシングの程度が制御できる。
【００３３】
関連する局面では、本発明は、ＩｇＥが介在する疾患の予防及び治療のための方法であって、患者に本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明の方法を用いて治療できる場合があるＩｇＥ介在疾患は、アレルギー性鼻炎（例えば枯草熱）と、喘息と、アナフィラキシーと、蕁麻疹と、アトピー性皮膚炎（湿疹）と、食品アレルギーと、呼吸器系組織における好酸球血症の低減による利益がある疾患と、過敏症免疫反応を特徴とする疾患とを含むが、これらに限られない。
【００３４】
関連する局面では、本発明は、患者の好酸球血症の低減方法であって本明細書に開示される組成物の少なくとも１つを投与することを含む方法を提供する。好酸球血症の低減は、約２０％ないし約８０％の間で、好ましくは、８０％ないし１００％の間で、最も好ましくは、９０％ないし１００％の間でばらつきがある。肺の好酸球血症の低減の百分率は術前及び術後に気管支肺胞洗浄液中の好酸球の数を測定することによって決定することができる。
【００３５】
更なる局面では、本発明は、ＩｇＥが介在する特異的抗原に対する免疫応答を変調する方法であって、本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３６】
更に別の局面では、特異的抗原に対する免疫応答を予防するか、あるいは、その程度を軽減するための方法であって、前記特異的抗原と、本発明の組成物とを患者に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、前記特異的抗原はアレルゲンである。好ましくは、前記組成物は、特異的抗原に患者を感作するときか、曝露するときかに投与される。
【００３７】
本発明の以上の局面及びその他の局面は、以下の詳細な説明を参照すると明らかになるであろう。本明細書に開示される全ての参考文献は、それぞれが個別に取り込まれたのと同様に、引用によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００３８】
発明の詳細な説明
上述のとおり、本発明は一般的にはＩｇＥが介在する疾患の治療用の組成物及び方法に向けられる。一部の特異的な実施態様では、かかる疾患は、アレルギー性鼻炎（例えば枯草熱）と、喘息と、アナフィラキシーと、蕁麻疹と、アトピー性皮膚炎（湿疹）と、食品アレルギーと、呼吸器系組織における好酸球血症の低減によって利益がある疾患と、過敏症免疫反応を特徴とする疾患とからなるグループから選択される。
【００３９】
本発明の組成物は、（ａ）標的遺伝子に向けられた「裸の（ｎａｋｅｄ）」又は修飾された短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）か、該ｓｉＮＡを組織特異的プロモーターの制御の下で発現する遺伝子コンストラクトかと、（ｂ）関心のある標的細胞の表面に存在する標的抗原に特異的に結合する、抗体のような結合剤とを含む複合体を含む。前記標的抗原はある種の特異的生体分子を認識し細胞内に取り込むので、ｓｉＮＡ−抗体複合体又は遺伝子コンストラクト−抗体複合体と、前記標的抗原とが結合するとき、ｓｉＮＡ又は遺伝子コンストラクトが前記複合体から放出されて、ｓｉＮＡがＲＮＡ干渉によって前記標的遺伝子の発現を低減する。
【００４０】
本明細書で用いられるところの用語「標的遺伝子」とは、関心のあるポリペプチドをエンコードする領域を含むポリヌクレオチド、及び／又は、該ポリペプチドの発現に重要な、複製、転写、翻訳その他の過程を調節するポリヌクレオチド領域をいう。
【００４１】
本明細書で用いられるところの用語「短鎖干渉核酸分子」又はｓｉＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を変調することができるいずれかの核酸分子をいい、例えばインターフェロンを介するような非特異的な干渉を活性化しない限り、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、短鎖干渉ＤＮＡ（ｓｉＤＮＡ）と、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と、相補的ＲＮＡ／ＤＮＡ雑種と、修飾（半合成（ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ））塩基／ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体（核酸以外の分子とのコンジュゲートによってさらに修飾がなされる場合と、かかる修飾はなされない場合とを含む）と、カスタム（注文生産）で修飾された一次転写産物のマイクロＲＮＡ又は前駆体ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子と、長鎖（最大１ｋｂ又はそれ以上）のｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡ分子とを含む。ヘアピン領域は、短い場合（例えば６ヌクレオチド）もあれば、長い場合（長さは特定されない）もあり、標的細胞又は組織において効率的にスプライシングされるイントロンを含む場合もある。さらに、ｓｉＲＮＡの定義には、ある配向の複数のタンデム繰り返し配列（例えば、３回以上の短いセンス鎖の繰り返し配列）が含まれるが、これは、一部の系において強力なＲＮＡｉ様反応を誘発する場合があるからである。
【００４２】
本発明の組成物及び方法に有効に利用できるｓｉＮＡｓの例は、配列番号１２−９１５及び９４４−９８０に提供される標的ＤＮＡ配列に対応するものを含む。当業者は、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列とを比較するとき、ＲＮＡ配列はリボヌクレオチドを含むがＤＮＡ配列はデオキシリボヌクレオチドを含むこと、及び、ＤＮＡ配列でチミジンの位置にＲＮＡ配列ではウラシルが含まれるのが典型的であることを了解している。
【００４３】
用語ｓｉＲＮＡは本明細書においては短鎖干渉核酸分子のプロトタイプとして用いられる。
【００４４】
一部の実施態様では、ｓｉＮＡは、該ｓｉＮＡを含まれる核酸配列を転写するための役割を果たすプロモーター及びターミネーター配列を含む導入ＤＮＡから生成される。前記導入ＤＮＡは、共有結合で末端が閉じた（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ−ｃｌｏｓｅｄ）直鎖又は環状プラスミドか、ＰＣＲ産物かの形状の場合があり、これらのＤＮＡは原核生物由来のＤＮＡをほとんど又は全く含まないことが好ましい。ＤＮＡコンストラクトは、該コンストラクトの核への取り込みと発現とを促進するために、ＳＶ４０エンハンサー由来のもののような核局在配列を含む場合がある。プロモーターは、とＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって活性化されるタイプの場合がある。前者のタイプのプロモーターは、Ｕ６、ｔＲＮＡｖａｌ、Ｈ１と、これらをより高レベルの転写を達成するために改変したバージョンとを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって活性化されるプロモーターは、（広範に用いられるＣＭＶ又はＥＦ１αプロモーターのような）構成的な場合もあれば、単一の細胞、細胞タイプ、組織タイプ又は生化学的な事象において優占的なやり方で転写される場合もある。後者のプロモーターは、高レベル又は低レベル発現用に選択される場合がある。ヘアピン又はカスタムｍｉＲＮＡが用いられるとき、単一の特異的なプロモーターが利用される場合がある。相補的な標的領域に対する２本のカスタムマイクロＲＮＡが用いられるとき、あるいは、ｄｓＲＮＡが２本の別々の鎖から形成されるとき、構成的プロモーターと特異的プロモーターとの組み合わせか、特異的プロモーターの組み合わせかが用いられる場合がある。発現レベルが低減するが、消失しないことが望ましい状況では、完全に相同的か、不完全に相同的なアンチセンスｓｉＮＡｓを使うか、異なる転写活性のプロモーターを使うかによって達成される場合がある。代替的には、ｓｉＮＡは、ｓｉＮＡによって大きな影響を受けるｍＲＮＡの領域か、ｓｉＲＮＡによって不完全にしか影響を受けないｍＲＮＡの領域かのいずれかを標的とする場合があり、あるいは、より強力な干渉を達成するために単数又は複数の標的遺伝子又は経路に向けられた２種類または３種類以上のｓｉＮＡ配列が用いられる場合がある。
【００４５】
前記ｓｉＮＡは、前記標的遺伝子又はメッセージの５’末端非翻訳領域、コーディング領域又は３’末端非翻訳領域を標的とする場合がある。さらに、標的遺伝子のプロモーター領域か、通常は遺伝子の上流である領域かが、ＲＮＡｉが介助するヘテロクロマチン形成のための標的とされる場合がある。
【００４６】
ｓｉＮＡは、修飾されない場合もあれば、例えば国際公開公報ＷＯ０３／０７０９７０及びＷＯ０３／０７４６５４に説明されるとおり、ヌクレアーゼ分解耐性を増大させるために化学的に修飾される場合もある。したがって例えばｓｉＮＡのヌクレオチドの一部又は全部が、修飾核酸残基か核酸残基の類似体かを含む場合がある。前記修飾ｓｉＮＡのハイブリダイゼーション特性は、対応する未修飾ｓｉＮＡと比べて同程度か、あるいは、改善されている場合がある。かかる修飾は、人体内でのｓｉＮＡの安定性、寿命及び循環を変えることによって、生体内治療の有効性及び安全性を改善する場合もある。前記ｓｉＮＡの長さは、１９ないし３０ヌクレオチドの間（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド）であることが好ましく、１９ないし２５ヌクレオチドであることがより好ましく、２１ないし２３ヌクレオチドであることが最も好ましく、標的ＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡのようなヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なアンチセンス鎖を含む。前記ｓｉＮＡは、関心のあるヌクレオチド配列の一部を含むセンス鎖を含む場合もある。センス及びアンチセンス鎖は、ｄｓＲＮＡ分子のように別々で区別のできる配列の場合もあれば、例えばｓｈＲＮＡ分子のように連結されている場合もある。
【００４７】
当業者は、本明細書に開示された標的配列に対して向けられたｓｉＮＡｓの配列のささいな変化のために標的核酸に強力かつ特異的なハイブリダイゼーションをするｓｉＮＡｓになることを了解するであろう。例えば、本明細書に開示された配列と比べてヌクレオチド１ないし４個分５’末端又は３’末端にずれた標的配列に対して向けられたｓｉＮＡｓが有効な場合がある。ある標的領域についての２種類または３種類以上の変異体か、所望の遺伝子の内部及び周囲（例えば、エクソン、イントロン、プロモーター又は遺伝子間領域）の異なる領域を標的とする複数の異なるｓｉＮＡｓの組み合わせかを投与することが有用である。
【００４８】
前記ｓｉＮＡは、ＩｇＥが介在する疾患に関与する経路で機能を発揮する遺伝子又はヌクレオチド配列を標的とすることが好ましい。特定の実施態様では、本発明の組成物及び方法に用いられるｓｉＮＡは以下の（１）ないし（９）のサブ配列の１種類または２種類以上を標的とする。（１）イプシロン重鎖定常領域（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ８３９６５）のような、ＩｇＥ又はその一部をエンコードするｍＲＮＡ分子と、（２）ＩｇＥプロモーター配列（ＮＣＢＩヒトゲノムアッセンブリ第１４染色体座標１０４０３７９５４−１０４４２６８４４に対応する配列番号２）と、（３）高親和性ＦｃεＲ１レセプターアルファサブユニット（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ｅｎｔｒｙ  Ｘ０６９４８）をエンコードするｍＲＮＡ分子と、（４）高親和性ＦｃεＲ１レセプターベータサブユニット（配列番号４、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ  Ｄ１０５８３）と、（５）ＦｃεＲ１レセプターアルファサブユニットプロモーター配列（ＮＣＢＩヒト第１染色体座標１５６４７４２９６−１５６４８８９５０に対応する配列番号５）と、（６）（配列番号４の開始コドンの上流領域の配列番号６のような）ＦｃεＲ１レセプターベータプロモーターと、（７）ＦｃεＲ１ベータレセプターの３’末端ＵＴＲ（配列番号７、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ  ３ＨＳＡ０２５６７７−３ＵＴＲ）と、（８）ＩｇＥイプシロンドメイン１−４（それぞれ配列番号８−１１）と、（９）ＳＴＡＴ６遺伝子又はＳＴＡＴ６プロモーター配列のノンコーディング非翻訳領域（ＵＴＲｓ）とである。他の実施態様では、前記ｓｉＮＡは、免疫グロブリンクラススイッチ組み換えの原因となるリコンビナーゼのようにＩｇＥのプロセッシングに関与する分子に向けられる。
【００４９】
ｍＲＮＡ標的の適当な領域を選択する方法は従来技術に開示されている（例えば、Ｖｉｃｋｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：７１０８−７１１８，２００３；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４４９８，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８２００，２００１）。選択された標的配列は低濃度のｓｉＲＮＡによる下向き調節に敏感であることが好ましい。ｓｉＮＡの設計ガイドラインは、Ａｍｂｉｏｎ社の技術資料＃５０６（テキサス州、オースティンのＡｍｂｉｏｎ社から入手可能）に提供されるものを含み、以下に説明される。低濃度（例えば、ナノモル又はナノモル未満の濃度）のｓｉＲＮＡを使うことと、選択的スプライシングによる遺伝子産物で生じる配列を避けることとは、オフ・ターゲット（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ）で配列非特異的な効果を制限するために重要である。ある遺伝子が下向き調節されたか否か、及び、下向き調節の程度の評価は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、ウェスタンブロット法、フロー・サイトメトリー又はＥＬＩＳＡ法を用いて実施することができる。
【００５０】
関心のあるヌクレオチド配列を標的とするｓｉＮＡを含むか、あるいは、エンコードする遺伝子コンストラクト又は発現ベクターを調製する方法は、以下に詳細が示される。
【００５１】
本明細書で用いられるところの用語「結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）とは、標的細胞の表面で発現する標的抗原に特異的に結合する分子をいい、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む抗体と、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、可変部断片（Ｆｖ）、短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）及び重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）のような、抗体結合断片と、（天然又は修飾のいずれかの）低分子、ホルモン、サイトカイン、リガンド、ペプチド及びウイルスとを含むが、これらに限定されない。抗体及びその断片は、ヒトを含むいかなる種に由来する場合もあり、２個または３個以上の種由来の配列を利用するキメラタンパク質として形成される場合もある。したがって、本明細書で用いられるところの用語「結合剤」は、ヒト化抗体及び及び合板状（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を含む。
【００５２】
結合剤は、検出可能なレベル（例えばＥＬＩＳＡアッセイの限度内）で標的抗原と反応し、類似条件で無関係な抗原とは検出可能な反応性がない場合には、該標的抗原に「特異的に結合する」とされる。
【００５３】
抗体及びその断片は、当業者に知られたさまざまな技術のいずれかによって調製される場合がある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照せよ。一般に、抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）によって説明され、これを改良した、モノクローナル抗体の作成か、組み換え抗体産生を可能にするための適当な細菌又は哺乳類細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションか、タンパク質合成かを含む、細胞培養技術によって生産される場合がある。
【００５４】
オフ・ターゲットな効果を最小にするために、本発明の組成物及び方法に用いられる結合剤は細胞タイプ特異的であることが好ましい。例えば、ＩｇＥ発現に関与する遺伝子を標的とするｓｉＮＡを含む複合体については、結合剤はＣＤ１９及びＣＤ２２のようなＢ細胞上に存在する細胞内に取り込み可能な細胞表面抗原に特異的である。ＦｃεＲ１レセプターの発現に関与する遺伝子を標的とするｓｉＮＡを含む複合体については、結合剤は、ＦｃεＲ１レセプター自体か、ＣＸＣＲ４かのような、肥満細胞及び／又は好塩球上に存在する細胞内に取り込み可能な細胞表面抗原に特異的である。本発明に有用に用いられる場合がある結合剤の例は、抗ヒトＣＤ１９抗体、抗マウスＣＤ１９抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗マウスＣＤ２２抗体、抗ヒトＦｃεＲ１抗体、抗マウスＦｃεＲ１抗体、抗ヒトＣＸＣＲ４抗体、抗マウスＣＸＣＲ４抗体、抗トランスフェリン抗体及びこれらの抗原結合断片を含む。
【００５５】
本発明の組成物及び方法に効果的に利用される場合がある他の結合剤は、ＣＸＣＲ４特異的サイトカインリガンドのＣＸＣＬ１２（別名ＳＤＦ−１α）、ＣＸＣＬ１２由来のＣＸＣＲ４結合ペプチド、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する他のペプチド及びＣＸＣＲ４に結合する低分子又は薬物を含む。ＣＸＣＲ４に結合する薬物の１つの例は、ディスタマイシン類似体の２，２’［４，４’−［［アミノカルボニル］アミノ］ビス［Ｎ，４’−ジ［ピロール−２−カルボキシアミド−１，１’−ジメチル］］−６，８ナフタレンジスルホン酸］６ナトリウム塩、別名ＮＳＣ６５１０１６である。ＮＳＣ６５１０１６は、レセプターＣＸＣＲ４，ＣＣＲ５、ＣＣＲ３及びＣＣＲ１に対するサイトカインの結合を特異的に阻害することが示されている。さらに、ＮＳＣ６５１０１６のＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５との結合は、レセプターの細胞内への取り込みを誘導し、該レセプターのリサイクリングを遅らせることが証明されている（Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６４：６−１３，１９９８）。ＮＳＣ６５１０１６は抗炎症活性及び抗血管新生活性を有することも知られている。
【００５６】
ＣＸＣＲ４に結合するペプチドの１つの例であって、肥満細胞を標的する結合剤として本発明の組成物中で有用に使われる場合があるものは、Ｔ２２（［Ｔｙｒ５，１２，Ｌｙｓ７］−ポリフェムシンＩＩ；ムラカミら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１３８９−１３９３，１９９７）である。Ｔ２２は、ＣＸＣＲ４のブロッキングによってＨＩＶ−１単離物の感染を阻止することが知られているアメリカ産カブトガニ（ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ  ｃｒａｂｓ）の血球残渣から単離された、ポリフェムシンＩＩの１８個のアミノ酸からなる合成ペプチド類似体である。ＣＸＣＲ４との結合によって肥満細胞を標的とするために使用される場合がある結合剤の別の例は、ＣＸＣＲ４に高度の選択性があり、マイクロモル程度の低濃度でＨＩＶ−１株による感染をブロッキングすることが示されている、Ｎ−α−アセチル−ノナ−ｄ−アルギニン（Ａｒｇ）アミド（ＡＬＸ４０−４Ｃ；Ｄｏｒａｎｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１３９５−１４００，１９９７）である。肥満細胞を標的とする結合剤として有用に使われる場合がある他の低分子は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００（ヘテロ環ビシクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ）誘導体）及びＡＭＤ０７０を含むが、これらは両方ともカナダ、バンクーバーのＡｎｏｒＭＥＤ社から入手可能である。可溶性インヒビターのＡＭＤ３１００を用いるＣＸＣＲ４のブロッキングは、マウスモデルでの喘息型炎症と関連する病理学的パラメータの数値を低減し（Ｌｕｋａｃｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：１３５３−１３６０，２００２）、ＩＦＮ−γレセプター欠損マウスにおける自己免疫性関節炎を阻害する（Ｍａｔｔｈｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４６８６−４６９２，２００１）ことが示されている。
【００５７】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、遺伝子コンストラクトとストレプトアビジン−ビオチン結合によって連結された、抗体のような結合剤を含む。本明細書で用いられるところの用語「ストレプトアビジン」は、ストレプトアビジン及びアビジンの両方と、これらの誘導体又は類似体であってビオチンとの多価又は一価の高親和性結合が可能なものとを含む。ストレプトアビジン−ビオチン結合を含むコンジュゲートの調製技術は当業者に周知であり、例えば、米国特許第６，２８７，７９２及び６，２１７，８６９号明細書に説明されたものを含むが、該明細書は引用により本明細書に取り込まれる。ビオチンは、例えば、ビオチン−２１−ｄＵＴＰ（商標）（カリフォルニア州、パロアルト、ＢＤバイオサイエンス  クロンテック）を用いて前記遺伝子コンストラクトに取り込まれる場合があるが、ビオチン−２１−ｄＵＴＰは原子の２１個のスペーサアームを介してピリミジン環に共有結合でビオチンが結合したｄＴＴＰ類似体である。このビオチン標識遺伝子コンストラクトは、つぎに、当業者に周知な技術を用いて、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して前記ストレプトアビジン−抗体コンジュゲートに連結される。代替的には、ストレプトアビジン−ビオチンリンカーが結合剤を直接「裸の」ｓｉＮＡに連結するのに用いられる場合がある。
【００５８】
さらなる実施態様では、本発明は、抗体のような結合剤と、該抗体に例えばジスルフィド結合を介して共有結合で結合したポリカチオンのようなポリヌクレオチド結合コンポーネントとを含む複合体を提供する。ポリヌクレオチド結合コンポーネントとして利用される場合があるポリカチオンは、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンと、ヒストン、アビジン及びプロタミンのような塩基性タンパク質とを含む。前記ポリヌクレオチド結合コンポーネントは、前記遺伝子コンストラクトと該ポリヌクレオチド結合コンポーネントとに存在する、相反する荷電の間の静電引力のよって該遺伝子コンストラクトに結合する。したがって、前記抗体及び遺伝子コンストラクトはいずれも機能的な変化を起こすことなく結合する。抗体とポリヌクレオチド結合コンポーネントとの結合と、ポリヌクレオチド結合コンポーネントと遺伝子コンストラクトとの結合との両方とも、標的細胞内への複合体の取り込みの後で切断される。かかる複合体は、例えば米国特許第５，１６６，３２０号明細書に説明されるとおりに調製される場合がある。
【００５９】
本発明の遺伝子コンストラクトを結合剤に結合するために効果的に利用できる場合がある切断可能なポリマーリンカーは、米国特許第６，６２７，６１６号明細書に説明されている。
【００６０】
代替的には、ヘリカーゼその他のＲＮＡ結合タンパクが、結合剤又は抗体と連結される場合があり、裸のｓｉＮＡは投与前にヘリカーゼに連結される。かかるヘリカーゼ及びＲＮＡ結合タンパクの例は、Ｓａｓａｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８２：３２３−３３０，２００３と、Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：４６９−４７４，２００３と、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ３００１２７−ＭＣＰ２００，電子刊行日２００４年１月１２日とに提供される。代替的な実施態様では、本発明の遺伝子コンストラクトは、リポソーム又はポリマーに封入されるか、あるいは、脂質又はポリマーの担体に結合し、該担体は標的抗原に対して向けられた抗体のような結合剤に結合している。リポソーム内への前記遺伝子コンストラクトの封入は、エンドヌクレアーゼによる分解から前記コンストラクトを保護する。核酸分子及びタンパク質のような生物学的に活性のある分子をリポソーム又はポリマーに中に封入する方法と、核酸−脂質複合体（リポプレックス）及び核酸−ポリマー担体複合体（ポリプレックス）の調製方法とは当業者に周知である。例えば、米国特許第６，６２７，６１５、４，２４１，０４６、４，２３５，８７１及び４，３９４，４４８号明細書と、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２とを参照せよ。リポソームの作成、開発及び製造サービスは、例えば、Ｇｉｌｅａｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（カリフォルニア州、フォスターシティ）から入手可能である。リポソーム調製用の脂質は、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．社（アラバマ州、Ａｌａｂａｓｔｅｒ）から入手可能である。
【００６１】
こうして得られた、関心のある遺伝子コンストラクトを含むリポソーム担体は、例えば米国特許第５，２１０，０４０、４，９２５，６６１、４，８０６，４６６及び４，７６２，９１５号明細書に示されたような当業者に周知な技術を用いて、結合剤にコンジュゲーションされる。かかる方法は、アミド結合形成を介するコンジュゲーションと、ジスルフィド又はチオエーテル結合形成と、ビオチン−ストレプトアビジン結合という、３種類の機能的なクラスに分類されるリンカーの使用とを含む。好ましい実施態様では、引用によって本明細書に開示内容が取り込まれる、米国特許第６，３７２，２５０号明細書に説明されるマレイミドリンカーによって、リポソームは抗体のような結合剤に結合される。
【００６２】
好ましい実施態様では、本発明の組成物に用いられるリポソームは、ペグ化リポソームであり、該リポソームの表面は約２０００Ｄａのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の複数の鎖（最大数千本）とコンジュゲーションされる。結合剤が前記ＰＥＧ鎖の一部の先端にコンジュゲーションされる。前記リポソームの直径は、１００ｎｍないし１０μｍの範囲内であることが好ましい。かかるペグ化リポソームの調製および該リポソームへのモノクローナル抗体の結合とは、例えば、Ｓｈｉ及びＰａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７５６７−７５７２，２０００と、Ｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１２７５４−１２７５９，２０００に説明されるとおりに実施される。前記リポソームのペグ化は、該リポソームの安定性を増大させ、マクロファージのような細胞及びタンパク質への非特異的結合を阻止するはずである。ｓｈＲＮＡ発現プラスミドを封入し、モノクローナル抗体にコンジュゲーションされたペグ化リポソームを調製すること、及び、かかる組成物を脳腫瘍における遺伝子発現のサイレンシングに生体内で使用することは、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：１０３９−１０４５，２００３に説明される。
【００６３】
代替的には、本発明のｓｉＮＡ又は遺伝子コンストラクトは、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスのベクターにパッケージングされ、細胞に感染すると遺伝物質を放出して、コンストラクトの発現を可能にする。この実施態様では、ウイルスのカプシドタンパク質が結合剤として作用し、特定の細胞を前記ｓｉＮＡ又は遺伝子コンストラクトの標的にする。
【００６４】
アデノウイルス（ＡＶ）及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は自分の遺伝物質を宿主ゲノムにインテグレーションされず、遺伝子発現に宿主の複製を必要としない。したがってＡＶ及びＡＡＶベクター送達システムは宿主細胞内で異種遺伝子を迅速かつ効率的に一時的に発現させるのに好適である。ＡＡＶベクター送達システムは、嚢胞性繊維症の治療に有効であることが既に示されている（Ａｉｔｋｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９０７−１９１６，２００１）。本発明に効果的に利用できる場合があるＡＡＶベクター送達システムは、米国特許第６，６４２，０５１号明細書およびこれに引用された文献に説明されるものを含むが、これらに限定されない。例えば、アデノウイルスをＤＮＡ−ポリリジン複合体に結合させることと、選択的に標的にするために、レセプターを介するエンドサイトーシスを利用する戦略とによって、特定の細胞をアデノウイルスベクターの標的にする効率の改善が図られてきた。例えば、Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）と、Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ及びＣｕｒｉｅｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４９−５７（１９９６）とを参照せよ。代替的には、安定的なトランスフェクションが望ましい状況については、遺伝物質を宿主細胞のゲノムに挿入するウイルスベクターが用いられる場合がある。かかるベクターの例は、レンチウイルス、レトロウイルス、プラスミド及びＭＬＶのベクターを含む。遺伝子治療に適するレンチウイルスベクターの設計及び使用は、例えば、米国特許第６，５３１，１２３，６，２０７，４５５及び６，１６５，７８２号明細書に説明されるが、これらの開示内容は、引用によって本明細書に取り込まれる。トランスジェニックマウスでの遺伝子発現のサイレンシングにおけるレンチベクターで送達されたＲＮＡ干渉の利用はＲｕｂｉｎｓｏｎら、（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６，２００３）に説明される。
【００６５】
本発明は、本明細書に開示される組成物の治療に有効な量を投与することによる、ＩｇＥが介在する疾患の治療方法を提供する。
【００６６】
本明細書で用いられるところの用語「患者」とは、ヒトを含むがこれに限定されないいずれかの温血動物をいう。かかる患者は、病気にかかっている場合もあれば、検出可能な疾患がない場合もある。換言すると、本発明の方法は、疾患の予防又は治療に利用される場合がある。本発明の方法は、他の既知の治療方法と併用される場合もある。
【００６７】
一般に、本発明の組成物は、注射（例えば、皮内、筋注、静注又は皮下注射）によるか、経鼻的（例えば、吸引）にか、経口的にか、経皮的（皮膚上に局所適用）かによって投与される場合がある。１つの実施態様では、本発明の組成物は、肺につながる気道か肺の内部かの粘膜表面への送達に適する形状をしている。例えば、前記組成物は、エアロゾル状でか、喘息治療用に現在使用されているものと類似のネブライザーによってかで患者に送達するための液体処方に懸濁される場合がある。
【００６８】
治療法に利用するためには、本発明の組成物は生理学的に容認できる担体を追加的に含む場合がある。当業者に知られたいずれの適当な担体を本発明の組成物に利用してもよいが、担体のタイプは投与モードに応じて変わる。皮下注射のような非経口投与には、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス又はバッファーを含むことが好ましい。経口投与には、上記担体のいずれかか、マニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース及び炭酸マグネシウムのような固体担体を用いる場合がある。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ酪酸ガラクチド）も本発明の組成物用の担体として利用される場合がある。適当な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８及び５，０７５，１０９号明細書に開示される。バッファー、安定化剤、バイオサイド等のような他の成分も本発明の組成物に添加される場合がある。
【００６９】
治療される個々の疾患に応じて好ましい投与頻度及び効果的な用量は個人ごとに異なり、当業者によって決定される場合がある。用量は、１ｎＭないし１００ｎＭの濃度でｓｉＮＡを提供するのに十分であることが好ましい。本発明の組成物は、１回又は複数の回数に分割して投与される場合がある。本発明の組成物は、１種類または２種類以上の既知の治療剤とともに利用される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
以下の実施例は例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
【実施例１】
【００７１】
抗体とコンジュゲーションしたリポソームの調製
ペグ化リポソームの調製、遺伝子コンストラクトの封入及びモノクローナル抗体とのコンジュゲーションは以下のとおり実施される場合がある。
【００７２】
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、アラバマ州、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、１９．２マイクロモル）、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、０．２マイクロモル）、ジステアロリホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ２０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社、アラバマ州、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、０．６マイクロモル）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（３０ナノモル）が、クロロホルム／メタノール（２：１、体積比）に溶解された後、気化された。脂質は１ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に分散され、１０分間超音波処理された。スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡが前記脂質に添加され、リポソーム／ＤＮＡ分散液は１００μｌの体積で最終濃度２００ｍＭになるまでエバポレーションされた。前記分散液は４−５分間エタノール／ドライアイス中で凍結され、１−２分間４０°Ｃで溶解された。この凍結−溶解のサイクルが１０回繰り返された。前記リポソーム文才液は脂質濃度が４０ｍＭになるように希釈され、２段のポリカーボネートフィルター膜をそれぞれ１０回通すｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法による均一化を行った。膜胞の平均直径は、Ｍｉｃｔｒｔｒａｃ  Ｕｌｔｅｒｆｉｎｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（フロリダ州、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｌｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ社）を用いて決定される場合がある。
【００７３】
リポソームの外部に結合したプラスミドはＭｏｎｎａｒｄら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３２９：３９−５０，１９９７）によって説明されるとおり、ヌクレアーゼ消化によって除去される。未封入ＤＮＡの消化には、５ユニットの膵臓エンドヌクレアーゼＩと、５ユニットのエキソヌクレアーゼＩＩとが前記均一化処理後のリポソーム／ＤＮＡ混合液に５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ  ＤＴＴ中で添加される。３７°Ｃ１時間のインキュベーション後、反応は７ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により停止される。
【００７４】
標的抗原に特異的なモノクローナル抗体は、Ｈｕｗｙｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ    ９３：１４１６４−１４１６９，１９９６に説明されるとおり、４０：１のモル比の過剰な２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）を用いてチオール化される。つぎに、チオール化抗体は室温で終夜リポソームとインキュベーションされ、得られた免疫リポソームは、例えばゲルろ過クロマトグラフィー法によって、遊離モノクローナル抗体から分離される。
【実施例２】
【００７５】
ＩｇＥのＦｃ断片に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計
ヒトＩｇＥのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインをエンコードするＤＮＡは配列番号８、９、１０及び１１にそれぞれ提供される。
【００７６】
ｍＲＮＡの標的部位の候補は、合理的な設計原則に基づいて同定され、該原則は、標的アクセス可能性及び２次構造予測を含む。これらのそれぞれは、前記ｍＲＮＡ標的の発現抑制の再現性及び程度と、治療効果に要するｓｉＲＮＡ濃度とに影響を与える。さらに、ｓｉＲＮＡ２重鎖の熱力学的安定性（例えば、アンチセンスｓｉＲＮＡ結合エネルギー、内部安定性プロフィール及びｓｉＲＮＡ２重鎖末端の安定性の差）は、ＲＮＡ干渉の実現能力に相関する場合がある（Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８，２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａら、Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６，２００３）。Ｔｕｓｃｈｌの研究室によって提唱されたような経験則（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４４９８，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８２００，２００１）も用いられる。ｓｉＲＮＡ設計用のソフトウェア及びインターネットのインタラクティブなサービスは、Ａｍｂｉｏｎ社及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のウェッブサイトで利用可能である。Ｌｅｖｅｎｋｏｖａらは、ｓｉＲＮＡオリゴの設計及び優先順位付けのためのソフトウェアシステムを説明している（Ｌｅｖｅｎｋｏｖａら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０：４３０−４３２，２００４）。Ｌｅｖｅｎｋｏｖａのシステムはインターネット上で利用可能で、学術目的及び商業目的の両方で無料でダウンロードできる。本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ分子は、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＬｅｖｅｎｋｏｖａの勧告に基づくものであった。
【００７７】
本出願に開示されるｓｉＲＮＡオリゴの選択は、主として、ヒト配列に対するユニークさ（すなわち、ヒトのＵｎｉｇｅｎｅに対する単一の良好なヒットと、２番目に良好なヒットとに対するハイブリダイゼーション温度Ｔｍの差が大きいこと）と、ＧＣ含量（すなわち、ＧＣ含量の百分率が４０−６０％の範囲内の配列）とに基づくものであった。
【００７８】
選択的に、前記オリゴのハイブリダイゼーションの可能性についてのより詳細な理解のためには、ＲＮＡ標的アクセス可能性及び２次構造予測は、例えばＳｆｏｌｄソフトウェア（Ｄｉｎｇ  Ｙ及びＬａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｅ．（２００４）、Ｓｆｏｌｄソフトウェアを用いるｓｉＲＮＡの合理的設計、Ｉｎ：  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｋ．Ａｐｐａｓａｎｉ（Ｅｄ．），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｄｉｎｇ及びＬａｗｒｅｎｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：１０３４−１０４６，２００１；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：７２８０−７３０１，２００３）を用いて実行することができる。Ｓｆｏｌｄはインターネット上で利用可能である。ＲＮＡの２次構造決定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｅａｕｃａｇｅら編、２０００の第１１．２．１−１１．２．１０節に説明されている。
【００７９】
前記標的領域は、ＩｇＥのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４配列のようなｃＤＮＡ配列から選択される。標的配列及び位置の候補は、開始コドンの下流約５０−１００ヌクレオチドから開始するｃＤＮＡ配列において、特異的な２３ヌクレオチドモチーフ（ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ、ＮＡ（Ｎ２１）又はＢＡ（Ｎ２１）のような「Ｔｕｓｃｈｌ」パターン、ここで、Ｎはいずれかのヌクレオチド、ＡＡは本明細書では「標的モチーフリーダー」といい、ＢはＣ、Ｇ、Ｕである。Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３，２００２）を検索することによって同定されるのが典型的である。第２２及び２３番目のヌクレオチドはＴｕｓｃｈｌパターンの検索においては考慮する必要がないが、それは、該ヌクレオチドはニューロンナトリウム標的とアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖との塩基対合に関与しないからである。「センスｓｉＲＮＡ」は前記ＮＮリーダーを有さない標的配列を意味するものとして本明細書では用いられる。例えば、センスｓｉＲＮＡの配列は、ＴｕｓｃｈｌパターンＡＡ（Ｎ１９）ＴＴの（Ｎ１９）ＴＴに対応する（ヌクレオチド２３個のモチーフの場合では第３−２３番の位置）。
【００８０】
前記ｓｉＲＮＡｓは、非対称な２重鎖を形成するために、対照的な３’末端オーバーハングを有するように設計されることが好ましい。したがって、ＡＡ標的モチーフリーダーを有するｓｉＲＮＡｓについては、該ＡＡはアンチセンスｓｉＲＮＡのｄＴｄＴ又はＵＵオーバーハングと塩基対合する。ＢＡリーダーについては、該Ａは前記オーバーハングの最初のｄＴ又はＵと対合する。しかし、センス配列のオーバーハングは標的ｍＲＮＡの識別に影響を与えることなく変更できることが知られている。
【００８１】
前記アンチセンスｓｉＲＮＡは、前記ヌクレオチド２３個のモチーフの第１−２１番目の位置に相補的な配列として合成される。最も３’末端側のヌクレオチドは変更できるが、前記ヌクレオチド２３個のモチーフの第２番目の位置は標的配列に相補的なように選択される。これらの方法は当業者に周知である。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターからＲＮＡｓを効率的に発現させることが望ましい場合には、最初に転写されるヌクレオチドはプリンであるべきである。例えばｓｉＲＮＡは、標的モチーフＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮ（ここでＲはＡ又はＧで、ＹはＣ又はＵである。）に対応するように選択される場合がある。好ましくは、ｓｉＲＮＡｓは対称的な３’末端ＴＴオーバーハングを有するように設計される（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−６８８８，２００１）。
【００８２】
前記標的配列モチーフは、約３０−７０％のＧＣ含量、好ましくは、４０−６０％のＧＣ含量を有するように選択される。本明細書で用いられるところの「ＧＣ含量の百分率」は、ＡＡ標的モチーフリーダーについては［標的配列中のＧ又はＣのヌクレオチドの個数／２１］ｘ１００、ＢＡ標的モチーフリーダーについては［標的配列中のＧ又はＣのヌクレオチドの個数／２０］ｘ１００、ＮＢ標的モチーフリーダーについては［標的配列中のＧ又はＣのヌクレオチドの個数／１９］ｘ１００として計算される。
【００８３】
標的配列からのｓｉＲＮＡ２重鎖の選択に続いて、前記配列の熱力学的特性が、例えば上述したＳｆｏｌｄソフトウェアを用いて決定される。本明細書で用いられるところの「ＤＳＳＥ」とは、前記ｓｉＲＮＡ２重鎖の末端の安定性の差、すなわち、該２重鎖の両端の４個のヌクレオチド塩基対の５’末端アンチセンス鎖と５’末端センス鎖との自由エネルギーの平均の差をいう。機能を有するｓｉＲＮＡ２重鎖では５’アンチセンス領域より５’センス末端のほうが安定であるが、機能を有さないｓｉＲＮＡ２重鎖については逆であることが示されている（Ｋｈｖｏｒｏｖａら、Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６，２００３）。２本の鎖のうちの一方が優占的にＲＮＡｉを誘発するという意味で、ｓｉＲＮＡの２重鎖は機能的に非対称性であることが知られている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｃｅｌｌ  １５５：１９９−２０８，２００３）。
【００８４】
本明細書で用いられるところの「ＡＩＳ」とは、アンチセンス鎖の５’末端から９−１４番目の位置での２重鎖の平均内部安定性をいう。機能を有するｓｉＲＮＡ２重鎖と、機能を有さないｓｉＲＮＡ２重鎖とを比較すると、前者はこの理由で内部安定性が低いことが示される。この領域の可撓性が、標的切断（ｍＲＮＡは第９番目と第１０番目の位置の間で切断される。）及び／又はＲＩＳＣを再生するためのＲＩＳＣからの切断産物の解離に重要であるかもしれないと提唱されている。Ｋｈｖｏｒｏｖａら、Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６，２００３を参照せよ。
【００８５】
ＩｇＥのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインに対して向けられるｓｉＲＮＡ配列と、該配列の熱力学的特性とは、以下の基準によってさらに選択される。（ａ）４０％≦ＧＣ含量≦６０％、（ｂ）アンチセンスｓｉＲＮＡ結合エネルギー≦−１５ｋｃａｌ／モル、（ｃ）ＡＡＡＡ、ＣＣＣＣ、ＧＧＧＧ又はＵＵＵＵの少なくとも１つを有する標的配列の除外。ＮＮジヌクレオチドリーダーを有するｓｉＲＮＡｓについては、さらに以下の２つの基準が用いられる。（ｄ）ＤＳＳＥ＞ｋｃａｌ／モル（Ｚａｍｏｒｅ非対称則）と、（ｅ）ＡＩＳ＞−８．６ｋｃａｌ／モル（切断部位不安定則）。これは最低−３．６と最高−１３．６との中間点である（Ｋｈｖｏｒｏｖａら、２００３）。
【００８６】
ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインについての代表的なｓｉＲＮＡｓは配列番号８８６−９１５に提供される標的配列に対応するｓｉＲＮＡ配列である。
【００８７】
類似のやり方で、ヒトＦｃＩｇε高親和性レセプターα鎖標的配列（配列番号６４９−６８６）及びヒトＦｃＩｇε高親和性レセプターβ鎖標的配列（配列番号６８７−７０８）に対するｓｉＲＮＡ２重鎖が設計される。
【００８８】
１個の遺伝子だけを分解の標的にする可能性を高めるために、選択されたｓｉＲＮＡ配列は、Ｂｌａｓｔアルゴリズムを用いて、ヒト及びマウスの遺伝子ライブラリ（例えば、ＴＩＧＲ  ＧＩ、ＥＮＳＥＭＢＬＥヒトゲノム）に対してさらにユニークさがチェックされる。また、前記選択された配列に活性がある可能性を高めるために、塩基対合領域中にＳＮＰｓを有する標的に向けられる配列は除外される。
【実施例３】
【００８９】
ｓｉＲＮＡ２重鎖の合成及び試験
シランは、さまざまな方法、例えば、化学合成か、試験管内転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター又はＰＣＲで作成されたｓｉＲＮＡ発現カセットを用いる適切な鋳型から調製される場合がある。
【００９０】
ＲＮＡの化学合成法は当業者に周知であり、例えば、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５，１９８７と、Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５４３３，１９９０と、Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５と、Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７４：５９，１９９７とに説明されている。３’末端オーバーハングを有するヌクレオチド２１個のｓｉＲＮＡｓは、例えば、保護されたリボヌクレオシドホスホアミダイトとＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザとを用いて合成される場合があり、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルグ）と、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（コロラド州、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）と、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ），Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）と、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（マサチューセッツ州、Ａｓｈｌａｎｄ）と、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（テキサス州、オースティン）とのような、複数の供給者から商業的に入手可能である。その後、前記ｓｉＲＮＡ鎖は、必要な場合には使用前に脱保護され、アニーリングされて精製される。アニーリングは、例えば、１本鎖のヌクレオチド２１個のＲＮＡｓを、１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  酢酸マグネシウム中で１分間９０°Ｃでインキュベーションし、その後３７°Ｃ１時間インキュベーションすることによって実施される場合がある。前記溶液は、その後−２０°Ｃで保存される。有用なプロトコールは、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３，２００２に掲載されている場合がある。
【実施例４】
【００９１】
ＲＮＡｉ発現ベクター
ＩｇＥ又はＩｇＥレセプターＦｃεＲ１を標的とするｓｉＲＮＡ断片を生成する発現ベクターは、アニーリングされ、化学合成されたオリゴヌクレオチド対を適切なベクター（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ、ｐＳｉｒｅｎ）に連結するか、あるいは、ｓｉＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅するかによって構築される。ベクターからの発現のためには、ｓｉＲＮＡ配列は５’のＧ残基で開始するべきである。対称的な３’末端オーバーハングと、適当な制限酵素認識配列とが増幅中に追加される。増幅された配列は、例えば、ｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン、カリフォルニア州、サンジエゴ）にサブクローニングされる。
【００９２】
ＩｇＧ１（配列番号９１６，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＨＵＭＩＧＣＣ４）、ＣＤ１９（配列番号９１７，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿００１７７０、対応ゲノムコンティグＩＤ  ＮＴ＿０２４８１２）、ＣＤ２０、（配列番号９１８，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿０２１９５０、対応ゲノムコンティグＩＤ  ＮＣ＿００００１１）ＣＤ２１（配列番号９１９，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＡＦ２９８２２４、プロモーター及び５’ＵＴＲを含む）及びＣＤ２２（配列番号９２０，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿００１７７１  及びゲノム配列ＨＳＵ６２６３１）のプロモーターについてのデータベース配列から調製されたＢ細胞プロモーターと、チマーゼプロモーター（配列番号９２４，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿００１８３６、対応ゲノムコンティグＮＴ＿０２６４３７）、トリプターゼプロモーター（トリプターゼアルファ、配列番号９２１，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿００３２９３、プロモーター領域ＮＴ＿０３７８８７を含む対応するゲノムセグメントを有する；トリプターゼベータ１、配列番号９２２，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿００３２９４、プロモーター領域ＮＴ＿０３７８８７を含む対応するゲノムセグメントを有する；トリプターゼベータ２，配列番号９２３，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ  ＮＭ＿０２４１６４、プロモーター領域ＮＴ＿０３７８８７を含む対応するゲノムセグメントを有する）、又はＦｃεＲ１プロモーター（配列番号５及び６）とがＥＧＦＰのような蛍光レポーター遺伝子を含む発現ベクターにクローニングされ、それぞれ、Ｂ細胞特異的発現又は肥満細胞特異的発現を起こす能力があるかどうか、ヒト及びマウスのＢ及びＴ細胞株又は肥満細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ、ｎｏ．ＣＲＬ−８３０６）において試験される。これらの実験に基づいて、適切なプロモーターが選択され、ＩｇＥ特異的及びＦｃεＲ１特異的ＲＮＡｉベクターにサブクローニングされる。
【００９３】
代表的なＲＮＡｉベクターが図１に示される。前記ベクターは、Ａｍｂｉｏｎ社からのｐＳｉｌｅｎｃｅｒのような商業的に入手可能なベクター及び他の供給者からの相当するベクターに基づいて構築される場合がある。代替的に、ｓｈＲＮＡ発現カセットのみを含む、共有結合で末端が閉じた直鎖コンストラクトが使用される場合がある。これらのコンストラクトは、ＰＣＲか、制限酵素消化後に短鎖ヘアピンオリゴを連結してエンドヌクレアーゼ耐性の共有結合で末端が閉じた分子を作成するかによって作成される場合がある。さらなる実施態様では、これらのコンストラクトは、核への取り込みと該コンストラクトの発現とを促進するための核内局在配列を含む場合がある。
【実施例５】
【００９４】
ＲＮＡｉ誘発転写サイレンシング
ＩｇＥ発現の長期的抑制のためには、ＩｇＥ遺伝子発現の転写時遺伝子サイレンシングを誘発できる２本鎖ＲＮＡｉを核内で産生することによってＩｇＥの転写をサイレンシングすることは有利である。これは、ＩｇＥプロモーター又はＩｇＥプロモーターを活性化する転写因子のプロモーターに向けられるプロモーター配列を含む、核内で発現するＲＮＡｉコンストラクトをＢ細胞内に導入することによってなされる場合がある。ＲＮＡｉ依存クロマチンサイレンシングは、分裂酵母および植物の両方で証明されている（Ｍａｔｚｋｅ及びＭａｔｚｋｅによる総説、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１０６０−１０６１，２００３）。植物では、プロモーター配列を含む２本鎖ＲＮＡの合成が標的プロモーターの転写時遺伝子サイレンシング及びメチル化を誘発する（Ｍｅｔｔｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：５１９４−５２０１，２０００）。
【００９５】
発現カセットは、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターか、ＩｇＨ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１又はＣＤ２２のプロモーターのような組織特異的プロモーターかの制御下で核内でｓｉＲＮＡｓを発現するように設計される。（例えば、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ及びＴａｉｒａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４９７−５００，２００２と、Ｐａｕｌら、同上、５０５−５０８とを参照せよ。）前記カセットはＵ６ターミネーション配列も含む。所望のＩｇＥプロモーター配列又はＩｇＥ転写因子配列は、例えばｐＵ６プラスミドか、あるいは、かかるプラスミドの直鎖状誘導体かのような前記カセットにサブクローニングされる。核内への取り込みを促進するために、これらのコンストラクトは、核内局在配列を含むように加工される場合がある。プロモーターを含む配列の１回または２回以上の逆位ＤＮＡリピート及び／又はタンデムなＤＮＡを含むリピート短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡｓを産生すること、及び、２個の異なるプロモーターを用いて単一のコンストラクトでセンスプロモーターＲＮＡとアンチセンスプロモーターＲＮＡとを別々に合成することを含む、さまざまな戦略がテストされる場合がある。
【００９６】
ヘアピンｓｉＲＮＡ発現を構築するための基準は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ社の技術資料＃５０６（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、テキサス州、オースティン）に掲載されている場合がある。
【００９７】
核を標的とするｓｉＲＮＡベクターをトランスフェクションした細胞におけるクロマチンサイレンシングは、定量的ＰＣＲ、ノザンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、フロー・サイトメトリー及びウェスタンブロット法のような、遺伝子特異的なｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を検出する方法によって評価される。
【実施例６】
【００９８】
試験管内でのＩｇＥ及びＦｃεＲ１発現のｓｉＲＮＡよるサイレンシング
以下に詳細に説明するとおり、標的配列を下向き調節するｓｉＲＮＡｓ／ｓｈＲＮＡｓの能力は、標的メッセージをエンコードするｃＤＮＡと、テストされるｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡとをコトランスフェクションすることによって、モデルシステムでテストされる場合がある。かかるシステムは、トランスフェクションが容易な株細胞、例えば、ＨＥＫ２９３を含む。内在的に発現する標的遺伝子に対して選択されたｓｉＲＮＡ配列の活性は、商業的に入手可能なトランスフェクション試薬（例えば、リポフェクタミン２０００、インビトロジェン）か、エレクトロポレーション（ＢＴＸ  ＥＣＭ６００）か、ターゲットなしの脂質利用複合体か、ｓｉＲＮＡを含むトランスフェリンレセプター及びＣＤ１９特異的抗体−リポソーム複合体かを用いて、初代Ｂ細胞、肥満細胞又はこれらの細胞タイプ由来の株細胞にトランスフェクションを行うことによってテストされる場合がある。
【００９９】
ａ）Ｕ−２６６細胞におけるｓｉＲＮＡを介するサイレンシング
ヒトＩｇＥ細胞株のＵ−２６６ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．ＴＩＢ−９６）は細胞表面にＩｇＥを発現しＩｇＥを分泌する。細胞は、１．５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｐｓ及び１．０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムと、１５％ウシ胎仔血清を含むように調整された２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で１ｘ１０５ないし１ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で培養された。
【０１００】
上記実施例１に説明される手順にしたがって、抗ヒトトランスフェリンレセプター（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州、Ｃａｍａｒｉｌｌｏより購入）にコンジュゲーションされたＩｇＥ特異的ＲＮＡｉ用ベクターを含む免疫リポソームで処理される。前記免疫リポソーム処理のＩｇＥ発現への効果は定量的ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメトリー及びウェスタンブロット法で評価された。適当な抗体濃度は、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ発現ベクターを含む抗体−リポソーム複合体を用いる予備実験で予め決定される。
【０１０１】
前記処理の効果は、（ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメトリーによる）全ＩｇＥ産生（細胞及び培地）と、（ノザンブロット法、ＱＣ−ＰＣＲによる）ＩｇＥｍＲＮＡとを測定することによって、数日間にわたって監視される。
【０１０２】
ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡを介するサイレンシング
ヒト胚腎臓細胞株の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．ＣＲＬ−１１２６８）は、マウスＩｇＥの定常領域（以下、「ｍＩｇＥｃ」という。）か、マウスＦｃεＲ１βサブユニット（以下、「ｍＦｃεＲ１β」という。）かのいずれかに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドと、これらの標的に対するｓｈＲＮＡ配列を含むプラスミドとでコトランスフェクションをされ、ｍＩｇＥ及びｍＦｃεＲ１βのｍＲＮＡの発現の前記ｓｈＲＮＡによるサイレンシングを決定した。マウスＩｇＥｃＤＮＡ（配列番号９２５）と、マウスＦｃεＲ１βサブユニット（配列番号９３３）のｃＤＮＡとが、標準的なクローニング手順に従って哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローニングされた。ｍＩｇＥのｃＤＮＡに対する標的配列を含むｓｈＲＮＡコンストラクトは配列番号９２６−９２９（以下、それぞれＣ１ないしＣ４という。）に提示され、ｍＦｃεＲ１βサブユニットに対する標的配列を含むｓｈＲＮＡコンストラクトは配列番号９３４−９３７（以下、それぞれｗｉｓ４４４Ｔ、ｗｉｓ８１Ｔ、ｗｉｓ９６６Ｔ及びｗｉｓ７４２Ｔという。）に提示される。これらの配列は、製造者の指示に従って、Ｕ６プロモーターを含むｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミド（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州、オースティン）にクローニングされた。前記コンストラクトは、製造者によって説明されるとおり、センス方向に配向された標的配列と、ループ配列と、前記標的配列の相補体と、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネータ配列とからなるものであった。ｍＩｇＥのｃＤＮＡに対する標的Ｃ１と、ｍＦｃεＲ１βサブユニットに対するｗｉｓ４４４Ｔとを含む代表的なコンストラクトは、それぞれ、配列番号９３２と配列番号９３８として提供される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム及び１０％  ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で１ｘ１０５ないし１ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で培養された。前記細胞は製造者の指示に従って、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションされた。
【０１０３】
ｓｍＩｇＥｃのｃＤＮＡと、ｍＦｃεＲ１βのｃＤＮＡとのｈＲＮＡｓ存在下での発現は、リアルタイムＰＣＲ法を利用して、２４時間及び４８時間で測定された。図２は、ｓｈＲＮＡコンストラクトは全てｍＩｇＥｃの発現を低減することができ、Ｃ１が２４時間で８０％、４８時間で６０％と最大の低減効果をあったことを示す。ｍＦｃεＲ１βサブユニットについては、同時に投与された２種類のコンストラクト（ｗｉｓ８１及びｗｉｓ４４４）が効率的にＲＮＡｉ効果を誘導して、メッセージの９０％を超える低減をもたらした（図３）。
【０１０４】
２９３Ｔ細胞におけるマウスＩｇＥ及びマウスＦｃεＲ１βサブユニットへの前記ｓｈＲＮＡコンストラクトの阻害効果は、フロー・サイトメトリー法によっても測定された。ｍＩｇＥｃに対応するｃＤＮＡ（配列番号９２５）と、ｍＦｃεＲ１βのｃＤＮＡ（配列番号９３３）とは、ｐｄ２ＥＧＦＰベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローニングされ、関心のある遺伝子とＣ末端が不安定化されたＥＧＦＰとからなる融合タンパク質を生成する。ｓｈＲＮＡコンストラクトとのコトランスフェクションは上述のとおりに実施された。これらの融合タンパク質の発現はフロー・サイトメトリーで測定され、色素排除によって生細胞と考えられる細胞がＥＧＦＰ発現と、ｓｈＲＮＡ活性について解析された。
【０１０５】
図４に示すとおり、ｍＦｃεＲ１β／ＧＦＰ融合タンパク質によって得られた結果はＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた結果と一致した。ｓｈＲＮＡコンストラクトのｗｉｓ８１及びｗｉｓ４４４は、前記ｍＦｃεＲ１β／ＧＦＰ融合タンパク質の発現の低減が８０％を上回った。さらに、ｐＳｉｒｅｎベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、サンホセ）で構築された２個の追加のｍＦｃεＲ１β標的配列を含むコンストラクト（ｉｎｖ５０７及びｉｎｖ６３１、それぞれ、配列番号９３９及び配列番号９４１）も、少なくとも８０％融合タンパク質の発現を低減できたが、これに対して、対照実験は効果がなかった。反対に、ｍＩｇＥを標的とするｓｈＲＮＡコンストラクトによるｍＩｇＥｃ／ＧＦＰ融合タンパク質の発現の阻害は観察されなかったが、このクローンに改良Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を挿入することによって克服できるかもしれない。ｉｎｖ５０７コンストラクトの全配列（すなわち、センス配列、ループ配列、アンチセンス配列及びターミネータ）は、配列番号９４０に提供される。
【０１０６】
ｃ）マウスＩＧＥＬ  ｂ４細胞におけるｓｉＲＮＡを介するサイレンシング
ＩＧＥＬ  ｂ４（ＡＴＣＣ  ｎｏ  ＴＩＢ−１４１）細胞はマウスＩｇＥ分泌ハイブリドーマ株である。前記細胞は、４．５ｇ／Ｌ  グルコース、１．５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム及び１０％（ｖ／ｖ）  ウシ胎児血清を含む、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加ダルベッコ変法イーグル培地中で１０５ないし１０６細胞／ｍＬで培養される。ＩｇＥタンパク質は、蛍光標識にコンジュゲーションされた抗マウスＩｇＥ抗体（例えば、抗マウスＩｇＥ−ＰＥ）を用いる細胞表面及び細胞内の染色で検出できる。これらの細胞は、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法（例えば、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）マウスＩｇＥＥＬＩＳＡセット）によって容易に検出できる培養上清中に大量のＩｇＥを分泌する。
【０１０７】
ＩｇＥを標的とする短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡｓ（ＩｇＥ−ｓｈＲＮＡｓ、配列番号９２６−９２９）か、スクランブル化された対照かを発現するプラスミド（例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１）がＢＴＸ  ＥＣＭ６００（マサチューセッツ州、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ）を用いるエレクトロポレーションによってＩＧＥＬ  ｂ４細胞にトランスフェクションされた。細胞は、増強された緑蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するプラスミドをレポーターとしてコトランスフェクションされた。細胞は、エレクトロポレーションの２４、４８及び７２時間後にフロー・サイトメトリー（ＬＳＲ、ベクトン・ディキンソン）によって、トランスフェクション及びＩｇＥの発現低下について評価された。トランスフェクションされた細胞における発現低下を測定するために、平均蛍光強度（ＭＦＩ、ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）として、ｅＧＦＰ＋細胞におけるＩｇＥ発現が評価され、ＩｇＥ発現が記録された。
【０１０８】
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１でのＩｇＥ−Ｃ１ｓｈＲＮＡは、４８時間でのフロー・サイトメトリーで測定されたとおり（代表例は図５に示される）、ベクターだけの対照実験に対して、細胞内／細胞表面に結合するＩｇＥタンパク質の約３０％の低減を誘導する。
【０１０９】
ｄ）マウスＭＣ／９細胞におけるｓｉＲＮＡを介するサイレンシング
胎児肝由来のＩＬ−３依存マウス肥満細胞株である、ＭＣ／９細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬＲ−８３０６）は、４．５ｇ／Ｌ  グルコース、１．５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールと、ＩＬ−３供給源としての１０％ｖ／ｖ  ラットＴ−ＳＴＩＭ（ベクトン・ディキンソン  ＃３５４１１５）又は１０％ｖ／ｖ  ＷＥＨＩ−３上清と、１０％ｖ／ｖ  ウシ胎児血清とを含む、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加ダルベッコ変法イーグル培地中で培養された。細胞は２ｘ１０５−２ｘ１０６細胞／ｍＬで維持された。ＦｃεＲ１のアルファサブユニット（高親和性ＩｇＥレセプター）は、ＰＥがコンジュゲーションされた商業的に入手可能な抗体（クローンＭＡＲ−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１３−５８９８）を用いるフロー・サイトメトリーによってＭＣ／９細胞の細胞表面上で検出できる。本明細書で説明されるＦｃεＲ１コンストラクトによって標的とされるサブユニットは、実際にはベータサブユニットであるが、齧歯類では、ＦｃεＲ１の発現には３つのサブユニット（αβγ２）全て必要であるから、βの低減の代理測定値（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）として用いられた（商業的に入手可能な抗マウスＦｃεＲ１β抗体は存在しない。）。
【０１１０】
ＦｃεＲ１βを標的とする短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡｓ（ｍｕＦｃ−ｓｈＲＮＡｓ、配列番号９３４−９３７）か、スクランブル化された対照かを発現するプラスミド（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１）がエレクトロポレーション（ＢＴＸ  ＥＣＭ６００を使用）によってＭＣ／９細胞にトランスフェクションされた。細胞は、増強された緑蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をレポーターとして発現するプラスミドをコトランスフェクションされた。細胞は、エレクトロポレーションの２４、４８及び７２時間後にフロー・サイトメトリー（ＬＳＲ、ベクトン・ディキンソン）によってトランスフェクション及びＦｃεＲ１αの低減について評価された。トランスフェクションされた細胞における低減を測定するために、ｅＧＦＰ＋細胞でのＦｃεＲ１α発現が評価され、ＦｃεＲ１αの発現が平均蛍光強度（ＭＦＩ）として記録された。
【０１１１】
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１におけるｍｕＦｃ−ｗｉｓ８１ｓｈＲＮＡは、４８時間でのフロー・サイトメトリーにより、スクランブル化された対照に対して、細胞表面に結合したＦｃεＲ１αタンパクの約５０％の低減を誘導した（代表例は図６に示す。）。
【０１１２】
ｓｉＲＮＡは、哺乳類の遺伝子発現に非特異的な濃度依存効果を生じる場合があることが知られている（Ｓｃｈｅｒｅｒ及びＲｏｓｓｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：１４５７−１４６５，２００３；Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖら、ＲＮＡ  １０：１２−１８，２００４）。これらのオフ・ターゲット効果は、ユニーク配列を有するｓｉＲＮＡｓを選択して、ナノモル未満又はナノモルの濃度で用いることによって最小限にとどめることができる。上記の実験では、ｓｉＲＮＡ濃度は下向き調節及び非特異的効果について最適化される。非特異的効果は、マイクロアレイを利用する発現プロファイリングによって評価される。
【実施例７】
【０１１３】
マウスにおけるＩｇＥ発現のｓｉＲＮＡを介するサイレンシング
ＩｇＥ産生が、ミョウバン（Ａｌｕｍ）のようなＴｈ２を駆動するアジュバントに乳化されたオバルブミンで免疫されたマウスで誘導される。ＩｇＥ産生は、ＩｇＥについて血清をテストすることによって確認される。マウスは、ＩｇＨプロモーター−ＩｇＥ特異的ＲＮＡｉベクターを含む抗体−リポソーム複合体で処理される。ＩｇＥ産生はＥＬＩＳＡによって経時的に血清中で測定される。
【０１１４】
本発明の組成物がアレルギー性免疫応答の発症を阻害する能力は、喘息様アレルゲン特異的肺疾患のマウスモデルで調べられる。このアレルギー性疾患の重篤度は、気道に蓄積する好酸球の数と、血清中に検出されるＩｇＥのレベルとに反映される。
【０１１５】
Ｂａｌｂ／ｃＢｙＪマウスは、第０日及び第７日目に腹腔内経路で１ｍｇのミョウバンアジュバント中の１０μｇのオバルブミンを投与され、その後、第１４日及び第１８日目に経鼻経路で５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのオバルブミンを投与された。前記マウスは、安楽死処理されたマウスの気道を生理食塩水で洗浄し、洗浄液（気管支肺胞洗浄液、ＢＡＬ）を回収し、好酸球の数を計測することによって検出されるとおり、気道に好酸球を蓄積する。本発明の組成物は、鼻腔内チャレンジの前のさまざまな時点で前記マウスに静注によって投与され、オバルブミンでのチャレンジの３日後の血清ＩｇＥレベルと、回収されたＢＡＬ細胞中の好酸球の百分率とが決定され、対照マウスと対比される。
【０１１６】
好酸球は、アレルギー性喘息の気道に顕著な血液細胞である。好酸球の分泌産物はアレルギー性喘息の気道の粘液皮膜の腫脹及び炎症に寄与する。本発明の組成物の処置による肺好酸球の蓄積の減少は、該組成物が、気道、鼻粘膜及び上気道における好酸球血症に伴う炎症の低減に有用な場合があり、そのために、喘息と、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び湿疹のような類似疾患との重篤度を低下する場合があることを示す。
【実施例８】
【０１１７】
ＲＮＡｉの抑制
ヒト及びヒト以外の動物におけるＩｇＥが介在する疾患でのＩｇＥ産生を低減するためのｓｉＲＮＡの治療的使用は、抗原（アレルゲン）がもはや存在しないときには迅速に回復することが必要となる場合がある。植物ウイルス由来の抑制タンパクは、サイレンシングの抑制が確立された植物組織でのサイレンシングの回復と、新たな組織でのサイレンシングの開始の阻害とを可能にする。抑制タンパクをエンコードする植物ウイルス遺伝子は、ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス）、Ｐ２５（ポテトウイルスＸ）、２ｂ（キュウリモザイクウイルス）、カブクリンクルウイルスコートタンパク質及びｐ１９（シンビジウムえそ輪紋ウイルス、Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）を含む。
【０１１８】
一部の植物ウイルスのサイレンシング抑制タンパクは、培養ショウジョウバエ細胞において発現させるときに機能を有する（Ｒｅａｖｙ及びＭａｃＦａｒｌａｎｅ，Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＣＲＩ）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  １０００／２００１，ｐｐ．１２０−１２３）。脊椎動物及び無脊椎動物の宿主に感染するノダウイルスであるフロックハウスウイルス（ＦＨＶ）のＢ２遺伝子は、植物及びショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡサイレンシングを開始し、その標的となる（（Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１３１９−２１，２００２）。ワクシニアウイルスとヒトインフルエンザウイルスＡ、Ｂ及びＣとは、それぞれｄｓＲＮＡと結合して哺乳類のＩＦＮで調節される生来の抗ウイルス応答を阻害するウイルス抑制因子（Ｅ３ＬとＮＳＩ）をエンコードする（Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３５０−１３５５，２００４）。
【０１１９】
これらのＲＮＡｉのウイルス抑制因子の有効性は、実施例６及び７に説明されたとおり評価される場合がある。
【０１２０】
配列番号１−９８０は、添付する配列表に列挙される。添付する前記配列表に用いられるポリヌクレオチド及びポリペプチドのコードは、ＷＩＰＯ標準．２５（１９８８）、補遺２に準拠する。
【０１２１】
特許文献及び非特許文献を含む本明細書で引用された全ての文献は、引用によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明の代表的なＲＮＡｉベクターの概念図。
【図２】リアルタイムＰＣＲ法によって決定された、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｈＲＮＡｓによるＩｇＥ発現の阻害を示すグラフ。
【図３】リアルタイムＰＣＲ法によって決定された、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｈＲＮＡｓによるマウスＦｃεＲ１β発現の阻害を示すグラフ。
【図４】フロー・サイトメトリー法によって決定された、ｓｈＲＮＡｓによるマウスＦｃεＲ１β／ＧＦＰ融合タンパクの発現阻害を示すグラフ。
【図５】ｅＧＦＰレポータープラスミドと、ＩｇＥ発現のサイレンシングを起こすように設計されたｓｈＲＮＡコンストラクトを発現するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１プラスミドとをエレクトロポレーションしてから４８時間後のトランスフェクションされた（ｅＧＦＰ＋）ＩＧＥＬ  ｂ４細胞での細胞内ＩｇＥタンパク発現を示すグラフ。
【図６】ｅＧＦＰレポータープラスミドと、ＦｃεＲ１β発現のサイレンシングを起こすように設計されたｓｈＲＮＡコンストラクトを発現するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１プラスミドとをエレクトロポレーションしてから４８時間後のトランスフェクションされた（ｅＧＦＰ＋）ＩＧＥＬ  ｂ４細胞と、トランスフェクションされない（ｅＧＦＰ−）ＩＧＥＬ  ｂ４細胞とでの細胞表面でのＦｃεＲ１αタンパク発現を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007523159.tif 000009
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