(57)【要約】本発明は、スキャフォールドなしで実際の移植手術時に使用可能であり、培養によって生産され得、分化能に富む、人工組織または複合体を提供することを課題とする。本発明はまた、置換および被覆などを利用した組織修復・再生のための治療法および医薬を提供することを課題とする。本発明において細胞外マトリクス産生促進因子を含む培地中での培養という特定の培養条件によって細胞を培養することによって組織化が進展し、培養皿から剥離しやすくなるという現象を見出したことにより解決された。さらに本発明は剥離後浮遊培養を続けることにより組織の自己収縮を調節することが可能で、３次元形状の調節が可能な人工組織を提供した。本発明はまた、積層化を必要としない移植可能な人工組織の生産方法を提供する。本発明は、細胞外マトリクスに富み、移植時に補助固定手段を必要とせず、生物学的結合が優良であるという有利な点において特徴的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な人工組織。
【請求項２】
第三次元方向に生物学的に結合されている（integrated）、請求項１に記載の人工組織。
【請求項３】
周囲との生物学的結合能（integration capability）を有する、請求項１に記載の人工組織。
【請求項４】
前記生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含む、請求項３に記載の人工組織。
【請求項５】
細胞を含む、請求項１に記載の人工組織。
【請求項６】
実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、請求項１に記載の人工組織。
【請求項７】
実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、請求項１に記載の人工組織。
【請求項８】
前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項７に記載の人工組織。
【請求項９】
前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのすべてを含む、請求項７に記載の人工組織。
【請求項１０】
前記細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む、請求項７に記載の人工組織。
【請求項１１】
前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンを含む、請求項７に記載の人工組織。
【請求項１２】
前記細胞マトリクスは、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩを含み、コラーゲンは、前記組織のうち５％〜２５％を構成し、該コラーゲンＩと該コラーゲンＩＩＩとの比率は、１：１０〜１０：１である、請求項７に記載の人工組織。
【請求項１３】
前記細胞外マトリクスと細胞とが一体化して三次元構造をとっている、請求項７に記載の人工組織。
【請求項１４】
前記細胞外マトリクスが前記組織中に分散して配置される、請求項７に記載の人工組織。
【請求項１５】
細胞外マトリクスが分散して配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる、請求項１に記載の人工組織。
【請求項１６】
異種、同種異系、同系または自家である、請求項１に記載の人工組織。
【請求項１７】
スキャフォールドフリーである、請求項１に記載の人工組織。
【請求項１８】
細胞を移植するために使用される、請求項１に記載の人工組織。
【請求項１９】
大型である、請求項１に記載の人工組織。
【請求項２０】
少なくとも約２０ｍｍ３の体積を有する、請求項１に記載の人工組織。
=任意の大きさにする方法。
【請求項２１】
可撓性である、請求項１に記載の人工組織。
【請求項２２】
伸縮性を有する、請求項１に記載の人工組織。
【請求項２３】
心臓の拍動運動に耐え得る、請求項１に記載の人工組織。
【請求項２４】
三次元方向すべてにおいて、生物学的結合がある、請求項１に記載の人工組織。
【請求項２５】
前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される生物学的結合を含む、請求項２４に記載の人工組織。
【請求項２６】
臨床適用することができる組織強度を有する、請求項１に記載の人工組織。
【請求項２７】
前記強度は、破断強度において、約０．０２Ｎ〜約２Ｎである、請求項２６の人工組織。
【請求項２８】
前記強度は、自己支持性を有するに十分である、請求項２６に記載の人工組織。
【請求項２９】
前記自己支持性は、０．０５〜３．０ｍｍ角の先端を有するピンセットで前記人工組織をつまみあげたときに、実質的に破壊されないことを特徴とする、請求項２８に記載の人工組織。
【請求項３０】
前記自己支持性は、手でつまみあげたときに破壊されないことを特徴とする、請求項２８に記載の人工組織。
【請求項３１】
前記臨床適用が意図される部分は、心臓を含む、請求項２６に記載の人工組織。
【請求項３２】
前記臨床適用が意図される部分は、椎間板、半月、軟骨、骨、靭帯または腱を含む、請求項２６に記載の人工組織。
【請求項３３】
前記組織は軟骨、骨、椎間板、半月、靭帯または腱であり、前記人工組織が該関節内組織の欠損部に移植された後、補助固定手段なしでも、該人工組織が残存していることを特徴とする、請求項２６に記載の人工組織。
【請求項３４】
人工組織を生産するための方法であって、
Ａ）細胞を提供する工程；
Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；
Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程；および
Ｄ）前記細胞を該容器から分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記分離する工程において、自己収縮を惹起する刺激が加えられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記刺激は、物理的な刺激または化学的刺激を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記物理的な刺激は、前記容器の振動、ピペッティングまたは前記容器の変形操作を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記分離する工程は、アクチン調節物質の添加を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記アクチン調節物質は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記容器は、スキャフォールドフリーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞は、まず単層培養される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞外マトリクス産生促進因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌで存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞は、１ｃｍ２あたり、５×１０４細胞〜５×１０６細胞で配置され、前記細胞外マトリクス産生促進因子がアスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩であり、該アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで提供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記人工組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記剥離および自己収縮は、容器に物理的刺激を与えることにより達成される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記剥離および自己収縮は、容器に化学的刺激を与えることにより達成される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記十分な時間は、少なくとも３日間である、請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
前記十分な時間は、少なくとも３日間であり、最大で自然に剥離する期間である、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
前記自然に剥離する期間は、少なくとも４０日間である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記人工組織を分化させる工程、をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５５】
前記分化は、骨分化、軟骨分化、脂肪分化、皮下組織または腱靭帯組織への分化を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸２リン酸を含む培地中で行われる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記培地はさらに、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸２リン酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸を含む培地中で行われる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記培地はさらに、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記分化工程は、前記剥離工程の前または後に行われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記分化工程は、前記剥離工程より後に行われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞は、３継代以上の細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞は、３継代〜８継代の細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞は、１ｃｍ２あたり、５×１０４細胞〜５×１０６細胞で提供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞は、筋芽細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞は、脂肪細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞は、滑膜細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞は、間葉系幹細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６９】
前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、滑膜、腱、骨または骨髄由来である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記人工組織を複数作製し、該複数の人工組織を接触させて一体化させる工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項７１】
細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物であって、
Ａ）該細胞を維持するための成分；および
Ｂ）細胞外マトリクス産生促進因子、
を含む、組成物。
【請求項７２】
前記細胞外マトリクス産生促進因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌで存在し、あるいはアスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで存在する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
生体の部分を補強、修復または再生するための、細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）。
【請求項７５】
周囲との生物学的結合能を有する、請求項７５に記載の複合体。
【請求項７６】
前記生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含む、請求項７４に記載の複合体。
【請求項７７】
実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、請求項７４に記載の複合体。
【請求項７８】
実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、請求項７４に記載の複合体。
【請求項７９】
前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、請求項７８に記載の複合体。
【請求項８０】
前記細胞外マトリクスと細胞とが一体化して三次元構造をとっている、請求項７８に記載の複合体。
【請求項８１】
細胞外マトリクスが表面に配置される、請求項７８に記載の複合体。
【請求項８２】
細胞外マトリクスが分散して表面に配置される、請求項７８に記載の複合体。
【請求項８３】
細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる、請求項７４に記載の複合体。
【請求項８４】
前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む、請求項７８に記載の複合体。
【請求項８５】
異種、同種異系、同系または自家である、請求項７４に記載の複合体。
【請求項８６】
前記部分は、袋状臓器を含む、請求項７４に記載の複合体。
【請求項８７】
前記袋状臓器は、心臓を含む、請求項８６に記載の複合体。
【請求項８８】
前記部分は、骨または軟骨組織を含む、請求項７４に記載の複合体。
【請求項８９】
前記部分は、無血管組織を含む、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９０】
前記部分は、椎間板、半月、靭帯または腱を含む、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９１】
前記補強は、前記人工組織を、前記部分を置換することまたは前記部分を被覆するように配置することあるいはその両方によって達成される、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９２】
前記部分の伸縮に対して抵抗性を有する、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９３】
生物学的結合を有する、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９４】
前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９５】
前記人工組織は、細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって形成される、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９６】
自己支持性を有する、請求項７４に記載の複合体。
【請求項９７】
生体の部分を補強するための方法であって、
Ａ）細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程；および
Ｂ）該複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間該複合体を保持する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
前記結合は、細胞外マトリクスと細胞外マトリクスとの結合によって達成される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記複合体は、周囲との生物学的結合能を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
前記複合体は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複合体は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのすべての細胞外マトリクスを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
細胞外マトリクスが表面に配置される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０８】
細胞外マトリクスが分散して表面に配置される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１０】
細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：２〜２：１の範囲内の比率に収まる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１１】
異種、同種異系、同系または自家である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
前記部分は、袋状臓器を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１３】
前記袋状臓器は、心臓を含む、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
前記複合体は、前記部分の伸縮に対して抵抗性を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１５】
前記複合体は、生物学的結合を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１６】
前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養して前記複合体を形成する工程をさらに包含する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１８】
前記部分は心臓であり、該心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記部分は、無血管障害部分を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記部分は、血行が障害を受けている部分を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記部分は、骨または軟骨を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記部分は、椎間板、半月、靭帯または腱を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記部分は骨または軟骨であり、該骨または軟骨は、損傷を受けているかまたは変性していることを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記部分は骨または軟骨であり、該骨または軟骨は、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性または腱変性を有することを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記十分な時間は、少なくとも１０日である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２６】
前記複合体は、自己支持性を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記複合体は、周囲との生物学的結合能（integration capability）を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２８】
前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２９】
他の人工組織をさらに移植する工程を包含する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
前記人工組織は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１３２】
前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
生体の部分を処置するための方法であって、
Ａ）細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程；および
Ｂ）該生体の部分の状態が改善するに十分な時間保持する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３４】
前記処置は、心臓、骨、軟骨、靭帯、腱、椎間板または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するものであることを特徴とする、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記複合体は、自己支持性を有する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記複合体は、周囲との生物学的結合能（integration capability）を有する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３７】
前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３８】
前記置換されるまたは被覆される部分に他の人工組織をさらに移植する工程を包含する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３９】
前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４１】
前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
所望の厚さを有する人工組織を生産するための方法であって、
Ａ）細胞を提供する工程；
Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；
Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程；および
Ｄ）物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、
を包含する、方法。
【請求項１４３】
前記物理的刺激は、前記人工組織と前記容器との間にずり応力を引き起こす刺激、容器の底面変形、容器の振動、またはピペッティングを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記化学的刺激は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を使用する、請求項１４２記載の方法。
【請求項１４５】
前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記所望の厚さの調整は、前記アクチン脱重合促進因子と前記アクチン重合促進因子との比率を調節することによって達成される、請求項１４４記載の方法。
【請求項１４８】
前記人工組織を複数作製し、該複数の人工組織を接触させて一体化させる工程をさらに包含する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４９】
移植可能な人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織。
【請求項１５０】
前記移植可能な人工組織は、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、請求項１４９に記載の複合組織。
【請求項１５１】
実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、請求項１４９に記載の複合組織。
【請求項１５２】
前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、請求項１５１に記載の複合組織。
【請求項１５３】
前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンをすべて含む、請求項１５１に記載の複合組織。
【請求項１５４】
前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料を含む、請求項１４９に記載の複合組織。
【請求項１５５】
前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、請求項１５４に記載の複合組織。
【請求項１５６】
前記移植可能な人工組織と、前記他の人工組織とは、生物学的に結合される、請求項１４９に記載の複合組織。
【請求項１５７】
前記生物学的結合は、細胞外マトリクスを介する、請求項１５６に記載の複合体。
【請求項１５８】
所望の厚さを有する人工組織を生産するために使用される組成物であって、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、組成物。
【請求項１５９】
前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、請求項１５８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療の分野に関する。より詳細には、移植後も機能する人工組織、複合体ならびにその製造法およびその利用法に関する。本発明の人工組織は、生物学的結合能を有する。
【背景技術】
【０００２】
近年、重症臓器不全や難治性疾患に対し、遺伝子工学や細胞組織工学、再生医学等を駆使した再生型治療が新しい治療法として注目され、２１世紀における先端医療の最重要かつ最難関な研究テーマの一つとして、世界的に多くの研究者が精力的に取り組んでいる。
【０００３】
推定される再生（組織工学）医療関連の市場は、新エネルギー・産業技術総合開発機構の資料では世界で約４８兆円、日本国内が約５兆円、組織工学関連製品のみに限っても世界で約１０兆円とされており、この分野の次世代の新産業としての世界の期待は大きい。
【０００４】
本発明者らも、筋骨格組織および循環器組織領域において再生型治療の開発に取り組み、細胞移植と増殖因子との併用法、組織工学による組織移植再生法を報告してきた。しかし、このような細胞移植や組織移植による再生医療を行うためには、自己由来の細胞源の確保が急務かつ最重要である。筋骨格系組織の細胞には自己修復力の高いものが多く、幹細胞としての機能を有する細胞の存在が報告されてきている。
【０００５】
骨格筋（Ｊａｎｋｏｗｉｓｋｉ  ＲＪ，Ｈｕａｎｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：６４２−６４７，２００２＝非特許文献５）、脂肪（Ｗｉｃｋｈａｍ  ＭＱ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２００３，４１２，１９６−２１２＝非特許文献６）、臍帯血（Ｌｅｅ  ＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０３：１６６９−７５＝非特許文献７）、腱（Ｓａｌｉｎｇｃａｒｎｂｏｒｉｂｏｏｎ  Ｒ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２８７：２８９−３００，２００２＝非特許文献８）、骨髄（Ｐｉｔｔｅｒｇｅｒ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３−１４７，１９９９＝非特許文献９）、滑膜（非特許文献１＝Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００１  ４４：１９２８−４２）などに由来する細胞が、未分化で多様な細胞へ分化する能力を有することが明らかとなってきた。
【０００６】
従来、これまで組織修復、再生をめざした細胞治療を行う場合、細胞の集積の維持、細胞増殖、分化機能の安定化、さらには治療部位にかかる力学的ストレスからの保護などのために大多数の研究では生体スキャフォールド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）が使用されてきた。しかしスキャフォールドの多くは生物（動物）材料、生体高分子材料等を含有し、それらの材料の使用が生体に及ぼす安全性は長期にわたっては予測しきれない問題があった。
【０００７】
基盤材料を用いない細胞移植方法としては、非特許文献３などにおいて報告されるように、岡野らのグループによる温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。
【０００８】
このようなナノバイオインターフェース技術では、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を、細胞培養用のシャーレ等プラスチック成型体に固定すると、ポリマー表面は３１℃を境に親水性⇔疎水性に可逆的に変化する。つまり３１℃以上ではシャーレ表面は疎水性なので、細胞などが付着できる状態になる。この状態では、細胞は細胞外マトリックス（例えば、接着因子（“のり”のような機能を持ったタンパク質））を繰り出し、シャーレ表面に接着し、増殖させることができる（非特許文献２〜４）。
【０００９】
しかし、３１℃以下ではシャーレ表面は親水性に変化するので、それまで付着していた細胞は、接着因子を保持したまま非常に剥がれやすくなる。これはそれまで吸着していたシャーレの表面それ自体が、３１℃以下では無くなってしまうからである。
【００１０】
このように温度応答性ポリマーを固定化したシャーレ（例えば、商品名：ＵｐＣｅｌｌおよびＲｅｐＣｅｌｌ）を用いて細胞培養・剥離を行っても、細胞外マトリクスなどが三次元レベルで適切に配置されず、真の意味での移植可能な人工組織は生産されてこなかった（非特許文献２〜４）。
【００１１】
さらに、特許文献１（ＷＯ００／５１５２７）および特許文献２（ＷＯ０３／０２４４６３）では、アルギン酸ゲルを用いて半透膜上で細胞を培養することが報告されているが、この組織は、細胞外マトリクスとの一体性が悪く、スキャフォールドフリーではなく、自己組織化が行われておらず、自己支持性もなく、分化誘導能がなくなっており、三次元化という意味で形態学的な可塑性が減失しており、従って、細胞移植をするという意味でも好ましい組織とはいえない。
【００１２】
スキャフォールドの使用は、特に、移植医療では、副作用の問題から重要視されており、このようなスキャフォールドを使用しない技術の登場が待ち焦がれられている。
【００１３】
従来のシートの調製方法では、あまり大型のものができないこと、三次元方向にわたり生物学的結合を持った人工組織はできないことなどの欠点があり、しかもシート調製が終わった後に培養基材からはがすとぼろぼろになるなどの欠点があった。
【００１４】
従って、移植手術に耐え得る、実際の手術に使用可能な、培養によって生産され得る人工組織を提供することが渇望されている。
【００１５】
従来の技術によって調製された人工組織は、組織培養の後培養基材からの単離が困難であり、大型の組織片を作製することが実質上不可能であった。従って、従来の組織シートのような人工組織は、サイズ、構造、機械的強度などの面で医療用途における使用に耐えないという問題点があった。従来技術によって調製された人工組織は、調製自体が困難であることから、供給数が限定されているという問題点も指摘されている。
【特許文献１】WO00/51527
【特許文献２】WO03/024463
【非特許文献１】De Bari C, Dell'AccioF, Tylzanowski P, Luyten FP., Arthritis Rheum.2001 44:1928-42
【非特許文献２】Okano T,YamadaN,Sakai H,Sakurai Y., J Biomed Mater Res.1993;27:1243−1251
【非特許文献３】Kushida A, Yamato M,Konno C, Kikuchi A, Sakurai Y, Okano T., J Biomed. Mater. Res. 45:355−362,1999
【非特許文献４】Shimizu T,Yamato M, Akutsu T et al., Circ Res.2002 Feb 22;90(3):e40
【非特許文献５】Ｊａｎｋｏｗｉｓｋｉ  ＲＪ，Ｈｕａｎｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：６４２−６４７，２００２
【非特許文献６】Ｗｉｃｋｈａｍ  ＭＱ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２００３，４１２，１９６−２１２
【非特許文献７】Ｌｅｅ  ＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０３：１６６９−７５
【非特許文献８】Ｓａｌｉｎｇｃａｒｎｂｏｒｉｂｏｏｎ  Ｒ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２８７：２８９−３００，２００２
【非特許文献９】Ｐｉｔｔｅｒｇｅｒ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３−１４７，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、移植手術に使用可能な、培養によって生産され得る人工組織を提供することを課題とする。
【００１７】
特に、本発明は、三次元形態を有し、自己支持性を有する人工組織を、スキャフォールドフリーで、分化誘導能を可能であれば保持したままの状態で提供することを課題とする。
【００１８】
本発明はまた、組織における損傷を治療する場合のような、置換療法の必要性および周囲を被覆する必要がある状況において、その治療法および医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題は、一部、本発明において細胞外マトリクス産生促進因子を含む培地での培養という特定の培養条件によって細胞を培養することによって組織化が進展し、培養皿から剥離し易くなるという性質をもつ人工組織を見出したことによって解決された。
【００２０】
上記課題はまた、本発明によって提供される人工組織が、例えば、スキャフォールドを必要とせず、自己支持性を有し、三次元化が容易であり、形態可塑性もあり、周囲との生物学的接着能に優れ、分化誘導能を有するなどの性質を持つことによって置換療法においておよび損傷部位を被覆する治療法において有効であることを見出したことによって解決された。
【００２１】
本発明はまた、積層化を必要とせず、生物学的結合能を有する、移植可能な人工組織の生産方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、物理的刺激または化学的刺激を調節することによって所望の厚みに人工組織を調節することができることを見出したことによって上記課題を解決した。
【００２３】
本発明者らは脂肪由来細胞、滑膜由来細胞などの種々の細胞を用いた細胞治療システムとして、スキャフォールドを用いずに培養細胞および細胞自身が産生するマトリックスのみから構成される三次元人工組織の作成を可能とした。
【００２４】
本発明の人工組織は多様な形状へ構築させることが可能であり、しかも十分な強度を有するために移植などの外科的操作も容易で、本発明では、例えば、１０６〜１０８個と多量の細胞を、組織移植の要領で容易に確実に局所へ供給することが可能である。
【００２５】
またマトリックス内には、コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩＩ型）、フィブロネクチン、ビトロネクチン等の細胞接着因子が豊富に存在する。特に、この細胞接着因子は、このマトリックスを通じて一体化している。
【００２６】
従ってその組織は、移植周囲との生物学的接着性に非常に優れており、複合体および移植先の組織は、きわめて短時間で生物学的に癒合する。さらにこの人工組織は培養条件を変化させることにより骨や軟骨組織への誘導が可能である。このような分化誘導の保持という性質もまた、本発明者らが初めて見出した本発明の人工組織の特徴である。このような人工組織は安全でかつ効率の良い、細胞治療システムにおいて有用である。
【００２７】
本発明の一つの目的として、このような人工組織を用いた関節組織再生技術の臨床応用がある。本発明は、上記のような人工組織または細胞とそれに由来する成分との複合体を提供することによって、特にこれまでに治療が困難であった骨膜および骨皮質が共に欠損した部位の骨再生、そして軟骨下骨に達しない部分層軟骨損傷、および無血管野あるいは血行不良部位の半月、腱、靭帯、椎間板、心筋などの損傷の治療法の開発が可能になった。
【００２８】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）移植可能な人工組織。
（２）第三次元方向に生物学的に結合されている（integrated）、項目１に記載の人工組織。
（３）周囲との生物学的結合能（integration capability）を有する、項目１に記載の人工組織。
（４）前記生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含む、項目３に記載の人工組織。
（５）細胞を含む、項目１に記載の人工組織。
（６）実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目１に記載の人工組織。
（７）実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目１に記載の人工組織。
（８）前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目７に記載の人工組織。
（９）前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのすべてを含む、項目７に記載の人工組織。
（１０）前記細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む、項目７に記載の人工組織。
（１１）前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンを含む、項目７に記載の人工組織。
（１２）前記細胞マトリクスは、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩを含み、コラーゲンは、前記組織のうち５％〜２５％を構成し、該コラーゲンＩと該コラーゲンＩＩＩとの比率は、１：１０〜１０：１である、項目７に記載の人工組織。
（１３）前記細胞外マトリクスと細胞とが一体化して三次元構造をとっている、項目７に記載の人工組織。
（１４）前記細胞外マトリクスが前記組織中に分散して配置される、項目７に記載の人工組織。
（１５）細胞外マトリクスが分散して配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる、項目１に記載の人工組織。
（１６）異種、同種異系、同系または自家である、項目１に記載の人工組織。
（１７）スキャフォールドフリーである、項目１に記載の人工組織。
（１８）細胞を移植するために使用される、項目１に記載の人工組織。
（１９）大型である、項目１に記載の人工組織。
（２０）少なくとも約２０ｍｍ３の体積を有する、項目１に記載の人工組織。
=任意の大きさにする方法。
（２１）可撓性である、項目１に記載の人工組織。
（２２）伸縮性を有する、項目１に記載の人工組織。
（２３）心臓の拍動運動に耐え得る、項目１に記載の人工組織。
（２４）三次元方向すべてにおいて、生物学的結合がある、項目１に記載の人工組織。
（２５）前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される生物学的結合を含む、項目２４に記載の人工組織。
（２６）臨床適用することができる組織強度を有する、項目１に記載の人工組織。
（２７）前記強度は、破断強度において、約０．０２Ｎ〜約２Ｎである、項目２６の人工組織。
（２８）前記強度は、自己支持性を有するに十分である、項目２６に記載の人工組織。
（２９）前記自己支持性は、０．０５〜３．０ｍｍ角の先端を有するピンセットで前記人工組織をつまみあげたときに、実質的に破壊されないことを特徴とする、項目２８に記載の人工組織。
（３０）前記自己支持性は、手でつまみあげたときに破壊されないことを特徴とする、項目２８に記載の人工組織。
（３１）前記臨床適用が意図される部分は、心臓を含む、項目２６に記載の人工組織。
（３２）前記臨床適用が意図される部分は、椎間板、半月、軟骨、骨、靭帯または腱を含む、項目２６に記載の人工組織。
（３３）前記組織は軟骨、骨、椎間板、半月、靭帯または腱であり、前記人工組織が該関節内組織の欠損部に移植された後、補助固定手段なしでも、該人工組織が残存していることを特徴とする、項目２６に記載の人工組織。
（３４）人工組織を生産するための方法であって、
Ａ）細胞を提供する工程；
Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；
Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程；および
Ｄ）前記細胞を該容器から分離する工程、
を包含する、方法。
（３５）前記分離する工程において、自己収縮を惹起する刺激が加えられる、項目３４に記載の方法。
（３６）前記刺激は、物理的な刺激または化学的刺激を含む、項目３５に記載の方法。
（３７）前記物理的な刺激は、前記容器の振動、ピペッティングまたは前記容器の変形操作を含む、項目３６に記載の方法。
（３８）前記分離する工程は、アクチン調節物質の添加を含む、項目３４に記載の方法。
（３９）前記アクチン調節物質は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、項目３８に記載の方法。
（４０）前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
（４１）前記アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
（４２）前記容器は、スキャフォールドフリーである、項目３４に記載の方法。
（４３）前記細胞は、まず単層培養される、項目３４に記載の方法。
（４４）前記細胞外マトリクス産生促進因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む、項目３４に記載の方法。
（４５）前記アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで存在する、項目４４に記載の方法。
（４６）前記ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌで存在する、項目４４に記載の方法。
（４７）前記細胞は、１ｃｍ２あたり、５×１０４細胞〜５×１０６細胞で配置され、前記細胞外マトリクス産生促進因子がアスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩であり、該アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで提供される、項目３４に記載の方法。
（４８）前記人工組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む、項目３４に記載の方法。
（４９）前記剥離および自己収縮は、容器に物理的刺激を与えることにより達成される、項目４８に記載の方法。
（５０）前記剥離および自己収縮は、容器に化学的刺激を与えることにより達成される、項目４８に記載の方法。
（５１）前記十分な時間は、少なくとも３日間である、項目３４に記載の方法。
（５２）前記十分な時間は、少なくとも３日間であり、最大で自然に剥離する期間である、項目３４に記載の方法。
（５３）前記自然に剥離する期間は、少なくとも４０日間である、項目５２に記載の方法。
（５４）前記人工組織を分化させる工程、をさらに含む、項目３４に記載の方法。
（５５）前記分化は、骨分化、軟骨分化、脂肪分化、皮下組織または腱靭帯組織への分化を含む、項目５４に記載の方法。
（５６）前記骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸２リン酸を含む培地中で行われる、項目５５に記載の方法。
（５７）前記培地はさらに、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目５６に記載の方法。
（５８）前記軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸２リン酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸を含む培地中で行われる、項目５５に記載の方法。
（５９）前記培地はさらに、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目５８に記載の方法。
（６０）前記分化工程は、前記剥離工程の前または後に行われる、項目５４に記載の方法。
（６１）前記分化工程は、前記剥離工程より後に行われる、項目５４に記載の方法。
（６２）前記細胞は、３継代以上の細胞を含む、項目３４に記載の方法。
（６３）前記細胞は、３継代〜８継代の細胞を含む、項目３４に記載の方法。
（６４）前記細胞は、１ｃｍ２あたり、５×１０４細胞〜５×１０６細胞で提供される、項目３４に記載の方法。
（６５）前記細胞は、筋芽細胞を含む、項目３４に記載の方法。
（６６）前記細胞は、脂肪細胞を含む、項目３４に記載の方法。
（６７）前記細胞は、滑膜細胞を含む、項目３４に記載の方法。
（６８）前記細胞は、間葉系幹細胞を含む、項目３４に記載の方法。
（６９）  前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、滑膜、腱、骨または骨髄由来である、項目６８に記載の方法。
（７０）  前記人工組織を複数作製し、該複数の人工組織を接触させて一体化させる工程をさらに包含する、項目３４に記載の方法。
（７１）細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物であって、
Ａ）該細胞を維持するための成分；および
Ｂ）細胞外マトリクス産生促進因子、
を含む、組成物。
（７２）前記細胞外マトリクス産生促進因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む、項目６８に記載の方法。
（７３）前記ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌで存在し、あるいはアスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで存在する、項目７２に記載の方法。
（７４）生体の部分を補強、修復または再生するための、細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）。
（７５）周囲との生物学的結合能を有する、項目７５に記載の複合体。
（７６）前記生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含む、項目７４に記載の複合体。
（７７）実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目７４に記載の複合体。
（７８）実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目７４に記載の複合体。
（７９）前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目７８に記載の複合体。
（８０）前記細胞外マトリクスと細胞とが一体化して三次元構造をとっている、項目７８に記載の複合体。
（８１）細胞外マトリクスが表面に配置される、項目７８に記載の複合体。
（８２）細胞外マトリクスが分散して表面に配置される、項目７８に記載の複合体。
（８３）細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる、項目７４に記載の複合体。
（８４）前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む、項目７８に記載の複合体。
（８５）異種、同種異系、同系または自家である、項目７４に記載の複合体。
（８６）前記部分は、袋状臓器を含む、項目７４に記載の複合体。
（８７）前記袋状臓器は、心臓を含む、項目８６に記載の複合体。
（８８）前記部分は、骨または軟骨組織を含む、項目７４に記載の複合体。
（８９）前記部分は、無血管組織を含む、項目７４に記載の複合体。
（９０）前記部分は、椎間板、半月、靭帯または腱を含む、項目７４に記載の複合体。
（９１）前記補強は、前記人工組織を、前記部分を置換することまたは前記部分を被覆するように配置することあるいはその両方によって達成される、項目７４に記載の複合体。
（９２）前記部分の伸縮に対して抵抗性を有する、項目７４に記載の複合体。
（９３）生物学的結合を有する、項目７４に記載の複合体。
（９４）前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される、項目７４に記載の複合体。
（９５）前記人工組織は、細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって形成される、項目７４に記載の複合体。
（９６）自己支持性を有する、項目７４に記載の複合体。
（９７）生体の部分を補強するための方法であって、
Ａ）細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程；および
Ｂ）該複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間該複合体を保持する工程、
を包含する、方法。
（９８）前記結合は、細胞外マトリクスと細胞外マトリクスとの結合によって達成される、項目９７に記載の方法。
（９９）前記複合体は、周囲との生物学的結合能を有する、項目９７に記載の方法。
（１００）前記生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含む、項目９９に記載の方法。
（１０１）前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目９７に記載の方法。
（１０２）前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目９７に記載の方法。
（１０３）前記複合体は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目１０２に記載の方法。
（１０４）前記複合体は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのすべての細胞外マトリクスを含む、項目１０２に記載の方法。
（１０５）前記細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む、項目１０２に記載の方法。
（１０６）前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンを含む、項目１０２に記載の方法。
（１０７）細胞外マトリクスが表面に配置される、項目９７に記載の方法。
（１０８）細胞外マトリクスが分散して表面に配置される、項目９７に記載の方法。
（１０９）細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる、項目９７に記載の方法。
（１１０）細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：２〜２：１の範囲内の比率に収まる、項目９７に記載の方法。
（１１１）異種、同種異系、同系または自家である、項目９７に記載の方法。
（１１２）前記部分は、袋状臓器を含む、項目９７に記載の方法。
（１１３）前記袋状臓器は、心臓を含む、項目１１２記載の方法。
（１１４）前記複合体は、前記部分の伸縮に対して抵抗性を有する、項目９７に記載の方法。
（１１５）前記複合体は、生物学的結合を有する、項目９７に記載の方法。
（１１６）前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される、項目１１５に記載の方法。
（１１７）細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養して前記複合体を形成する工程をさらに包含する、項目９７に記載の方法。
（１１８）前記部分は心臓であり、該心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う、項目９７に記載の方法。
（１１９）前記部分は、無血管障害部分を含む、項目９７に記載の方法。
（１２０）前記部分は、血行が障害を受けている部分を含む、項目９７に記載の方法。
（１２１）前記部分は、骨または軟骨を含む、項目９７に記載の方法。
（１２２）前記部分は、椎間板、半月、靭帯または腱を含む、項目９７に記載の方法。
（１２３）前記部分は骨または軟骨であり、該骨または軟骨は、損傷を受けているかまたは変性していることを特徴とする、項目９７に記載の方法。
（１２４）前記部分は骨または軟骨であり、該骨または軟骨は、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性または腱変性を有することを特徴とする、項目９７に記載の方法。
（１２５）前記十分な時間は、少なくとも１０日である、項目９７に記載の方法。
（１２６）前記複合体は、自己支持性を有する、項目９７に記載の方法。
（１２７）前記複合体は、周囲との生物学的結合能（integrationcapability）を有する、項目９７に記載の方法。
（１２８）前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目９７に記載の方法。
（１２９）他の人工組織をさらに移植する工程を包含する、項目９７に記載の方法。
（１３０）前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目１２６に記載の方法。
（１３１）前記人工組織は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目９７に記載の方法。
（１３２）前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、項目１３０に記載の方法。
（１３３）生体の部分を処置するための方法であって、
Ａ）細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程；および
Ｂ）該生体の部分の状態が改善するに十分な時間保持する工程、
を包含する、方法。
（１３４）前記処置は、心臓、骨、軟骨、靭帯、腱、椎間板または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するものであることを特徴とする、項目１３３に記載の方法。
（１３５）前記複合体は、自己支持性を有する、項目１３３に記載の方法。
（１３６）前記複合体は、周囲との生物学的結合能（integrationcapability）を有する、項目１３３に記載の方法。
（１３７）前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目１３３に記載の方法。
（１３８）前記置換されるまたは被覆される部分に他の人工組織をさらに移植する工程を包含する、項目１３３に記載の方法。
（１３９）前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目１３８に記載の方法。
（１４０）前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目１３３に記載の方法。
（１４１）前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、項目１３９に記載の方法。
（１４２）所望の厚さを有する人工組織を生産するための方法であって、
Ａ）細胞を提供する工程；
Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；
Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程；および
Ｄ）物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、
を包含する、方法。
（１４３）前記物理的刺激は、前記人工組織と前記容器との間にずり応力を引き起こす刺激、容器の底面変形、容器の振動、またはピペッティングを含む、項目１４２に記載の方法。
（１４４）前記化学的刺激は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を使用する、項目１４２記載の方法。
（１４５）前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、項目１４４に記載の方法。
（１４６）前記アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、項目１４４に記載の方法。
（１４７）前記所望の厚さの調整は、前記アクチン脱重合促進因子と前記アクチン重合促進因子との比率を調節することによって達成される、項目１４４記載の方法。
（１４８）前記人工組織を複数作製し、該複数の人工組織を接触させて一体化させる工程をさらに包含する、項目１４２に記載の方法。
（１４９）移植可能な人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織。
（１５０）前記移植可能な人工組織は、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目１４９に記載の複合組織。
（１５１）実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目１４９に記載の複合組織。
（１５２）前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目１５１に記載の複合組織。
（１５３）前記細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンをすべて含む、項目１５１に記載の複合組織。
（１５４）前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料を含む、項目１４９に記載の複合組織。
（１５５）前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、項目１５４に記載の複合組織。
（１５６）前記移植可能な人工組織と、前記他の人工組織とは、生物学的に結合される、項目１４９に記載の複合組織。
（１５７）前記生物学的結合は、細胞外マトリクスを介する、項目１５６に記載の複合体。
（１５８）所望の厚さを有する人工組織を生産するために使用される組成物であって、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、組成物。
（１５９）前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、項目１５８に記載の組成物。
（１６０）前記アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、項目１５８に記載の組成物。
【００２９】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、スキャフォールド（足場、基盤材料）フリーの人工組織または複合体を提供する。このようなスキャフォールドフリーの人工組織を提供することによって、移植後の経過に優れた治療法および治療剤が提供される。
【００３１】
本発明はまた、スキャフォールドフリーの人工組織という点により、生物製剤における長期にわたる規制の問題の一つである、スキャフォールド自体の混入に起因する問題を一挙に解決する。また、スキャフォールドがないにもかかわらず、治療効果は従来のものに比べても遜色ないどころか、より良好である。
【００３２】
このほか、スキャフォールドを用いた場合に、スキャフォールド内の移植細胞の配向性、細胞間接着性の問題、スキャフォールド自体の生体における変化（炎症惹起）およびスキャフォールドのレシピエント組織への生着性などの問題を解決することができる。
【００３３】
本発明の人工組織および複合体はまた、自己組織化しており、内部において生物学的結合が行われているという点で、従来の細胞治療とも一線を画すことができる。
【００３４】
本発明の人工組織および複合体はまた、三次元形態を容易に形成することができ、所望の形態に容易に設計することができることから、その汎用性に留意されるべきである。
【００３５】
本発明の人工組織および複合体は、周囲の組織、細胞などのレシピエント組織との生物学的結合を有することから、術後の定着がよく、細胞が局所に確実に供給されるなどの優れた効果が奏される。本発明の効果としては、このような生物学的結合性の良好さから、他の人工組織などと複合組織を形成することによって複雑な治療を行うことができる点にもある。
【００３６】
本発明の別の効果は、人工組織および複合体として提供した後、分化誘導をかけることができるという点にある。あるいは、人工組織および／または複合体として提供する前に、分化誘導をかけて、そのような人工組織および／または複合体を形成することができいる点にもある。
【００３７】
本発明の他の効果は、細胞移植という観点から、従来の細胞のみの移植、シートを用いた移植などと比べて、三次元レベルでの組織置換が可能、被覆することによる総合的な細胞供給などの効果が奏される点にある。
【００３８】
本発明によって、生物学的結合能を有し、移植可能な人工組織が提供される。このような組織は、上記特徴および効果を有することによって、従来人工物での移植処置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明の人工組織は、組織内およびレシピエント組織との間で生物学的結合を有しており、実際に移植治療において機能する。このような人工組織は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。本発明の人工組織または複合体は、移植時の周囲の組織、細胞などと生物学的に結合する能力を十分に有し（好ましくは細胞外マトリクスによる）、従って、術後の経過に優れる。このような三次元レベルで瀰漫性に生物学的結合能を有する人工組織は、従来存在しておらず、従って、本発明は、従来の人工組織では達成できなかった治療効果を奏することになる。
【００３９】
さらに、本発明により、疾患部分を充填し、置換させること、および／または疾患部位を被覆することによって治療効果をもたらす医療処置が可能となった。
【００４０】
また、本発明は、他の人工組織（例えば、ハイドロキシアパタイトでできた人工骨、微線維性コラーゲン医療材料など）とともに用いることにより、他の人工組織と生物学的に結合することによって、従来では達成できなかった人工組織の定着の向上が得られた。
【００４１】
本発明の人工組織は、組織全体にフィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスまたは細胞接着因子が微慢性に分布し、一方細胞シート工学では培養細胞のシャーレへの接着面に細胞接着因子は局在している。そして最たる違いは細胞シート工学ではシートの主体は細胞であり、シートは接着因子のノリを底面に付けた細胞の塊に近いものであるが、本発明者らの人工組織は文字通り細胞外マトリックスが細胞を包んだ「組織」であるという点が従来のものとは顕著に異なるといえる。
【００４２】
スキャフォールド（基盤）材料を用いない細胞移植方法としては、東京女子医大のグループによる温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。本発明はこのような問題を解決した。
【００４３】
本研究で開発する細胞・マトリックス複合体は細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるFeeder細胞の使用無しに10層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術は世界的に見当たらない。また、滑膜細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科的操作が可能となる強度を保持する複合体の作成も可能であり、本発明は、世界的に見ても、細胞移植を確実にかつ安全に行うための独創的で画期的な手法となるという点でも効果を有するといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００４５】
(用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００４６】
（再生医療）
本明細書において使用される「再生」（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）とは，個体の組織の一部が失われた際に残った組織が増殖して復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し，不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には，生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し，さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨、心臓および末梢神経の再生医療がある。軟骨、神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてきた。近年、これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞（体性幹細胞）の存在が報告され、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はすべての組織に分化する能力をもった細胞であり、それを用いた腎臓、肝臓などの複雑な臓器の再生が試みられているが実現には至っていない。
【００４７】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。細胞としては、例えば、初代培養の細胞が用いられ得るが、継代培養した細胞もまた使用され得る。好ましくは、継代が３代〜８代経由した細胞が用いられる。本明細書において、細胞密度は、単位面積（例えば、ｃｍ２）あたりの細胞数で表すことができる。
【００４８】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。
【００４９】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞（例えば、脂肪由来、骨髄由来）などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００５０】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００５１】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような間葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、間葉系由来の細胞が使用され得る。
【００５２】
本発明の人工組織、複合体、三次元構造体を構成する細胞としては、例えば、上述の外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する分化細胞または幹細胞が使用され得る。このような細胞としては、例えば、間葉系の細胞が挙げられる。ある実施形態では、このような細胞として、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、線維芽細胞、滑膜細胞などが使用され得る。このような細胞としては、分化細胞をそのまま利用したり、幹細胞をそのまま利用することもできるが、幹細胞から所望される方向に分化させた細胞を使用することができる。
【００５３】
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉に見出される幹細胞をいう。本明細書ではＭＳＣと略されることがある。ここで、間葉とは、多細胞動物の発生各期に認められる、上皮組織間の間隙をうめる星状または不規則な突起をもつ遊離細胞の集団と，それに伴う細胞間質によって形成される組織をいう。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞、脂肪細胞への分化能を有する。間葉系幹細胞は、患者から採取した骨髄細胞等を培養または増殖、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させるために使用され、または歯槽骨、関節症等の骨、軟骨、関節などの再建材料として使用されており、その需要は大きい。従って、本発明の間葉系幹細胞または分化した間葉系幹細胞を含む人工組織、複合体または三次元構造体は、これらの用途において構造体が必要である場合に特に有用である。
【００５４】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。組織についていう場合、単離された組織とは、その組織以外の物質（例えば、人工組織または複合体の場合は、その人工組織を作製するに際して使用された物質、スキャフォールド、シート、コーティングなど）が実質的に含まれていない状態の組織をいう。本明細書において、単離されたとは、好ましくは、スキャフォールドが含まれていないこと（すなわち、スキャフォールドフリー）をいう。従って、単離された状態では、培地など本発明の人工組織または複合体を生産する際に使用される成分は入っていてもよいことが理解される。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００５５】
本明細書において「スキャフォールドフリー（足場フリー、基盤材料なし；ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」とは、人工組織を生産するときに従来使用されている材料（基盤材料＝スキャフォールド）を実質的に含まないことをいう。そのようなスキャフォールドの材料としては、例えば、化学高分子化合物、セラミック、あるいは多糖類、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸などの生物製剤などを挙げることができるがそれらに限定されない。スキャフォールドとは、実質的に固形であり、細胞または組織を支持することができる強度を含む材料をいう。
【００５６】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
【００５７】
本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、胚性幹細胞に改変（例えば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にある。
【００５８】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００５９】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、細胞生物において、同一の機能・形態をもつ細胞集団をいう。多細胞生物では、通常それを構成する細胞が分化し、機能が専能化し、分業化がおこる。従って細胞の単なる集合体であり得ず，ある機能と構造を備えた有機的細胞集団，社会的細胞集団としての組織が構成されることになる。組織としては、外皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の組織は、生物のどの臓器または器官由来の組織でもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明が対象とする組織としては、骨、軟骨、腱、靭帯、半月、椎間板、骨膜、血管、血管様組織、心臓、心臓弁、心膜、硬膜などの組織が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
本明細書において「細胞シート」とは、単層の細胞から構成される構造体をいう。このような細胞シートは、少なくとも二次元の方向に生物学的結合を有する。生物学的結合を有するシートは、製造された後、単独で扱われる場合でも、細胞相互の結合が実質的に破壊されないことが特徴である。そのような生物学的結合には、細胞外マトリクスを介した細胞間の結合が含まれる。このような細胞シートは、部分的に２、３層構造を含むものであってもよい。
【００６１】
本明細書において「人工組織」とは、天然の状態とは異なる組織をいう。本明細書において、代表的には、人工組織は、細胞培養によって調製される。生物の中に存在する形態の組織をそのまま取り出してきたものは本明細書では人工組織とはいわない。従って、人工組織は、生体に由来する物質および生体に由来しない物質を含み得る。本発明の人工組織は、通常細胞および／または生体物質で構成されるが、それ以外の物質を含んでいてもよい。より好ましくは、本発明の人工組織は、実質的に細胞および／または生体物質のみで構成される。このような生体物質は、好ましくはその組織を構成する細胞に由来する物質（例えば、細胞外マトリクスなど）であることが好ましい。
【００６２】
本明細書において「移植可能な人工組織」とは、人工組織のうちで、実際の臨床において移植することができ、移植後も少なくとも一定期間移植された部位において組織としての役割を果たすことができる人工組織をいう。移植可能な人工組織は通常、十分な生体適合性、十分な生体定着性などを有する。
【００６３】
移植可能な人工組織において十分な強度は、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その強度を設定することができる。この強度は、自己支持性に十分な強度があり、移植される環境に応じて設定することができる。そのような強度は、後述の応力、歪み特性を測定したり、クリープ特性インデンテーション試験を行うことによって測定され得る。強度はまた、最大荷重を観察することによって評価され得る。
【００６４】
移植可能な人工組織において十分な大きさは、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その大きさを設定することができる。この大きさは、移植される環境に応じて設定することができる。
【００６５】
しかし、移植される場合は少なくとも一定の大きさを有することが好ましく、そのような大きさは、通常、面積について少なくとも１ｃｍ２であり、好ましくは少なくとも２ｃｍ２であり、より好ましくは少なくとも３ｃｍ２である。さらに好ましくは少なくとも４ｃｍ２であり、少なくとも５ｃｍ２であり、少なくとも６ｃｍ２であり、少なくとも７ｃｍ２であり、少なくとも８ｃｍ２であり、少なくとも９ｃｍ２であり、少なくとも１０ｃｍ２であり、少なくとも１５ｃｍ２であり、あるいは少なくとも２０ｃｍ２であり得るが、それらに限定されず、面積は、用途に応じて１ｃｍ２以下または２０ｃｍ２以上であり得る。本発明の本質は、どのような大きさ（面積、容積）のものでも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
【００６６】
容積で表す場合は、上記大きさは、少なくとも２ｍｍ３であり得、少なくとも４０ｍｍ３であり得るがそれに限定されず、２ｍｍ３以下であっても、４０ｍｍ３以上であってもよいことが理解される。
【００６７】
移植可能な人工組織において十分な厚みは、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その厚みを設定することができる。この厚みは、移植される環境に応じて設定することができる。５ｍｍを超えてもよい。心臓へ移植する場合は、この最低限の厚みさえ有していればよいが、他の用途が意図される場合、厚みはより厚い方がよい場合があり得、そのような場合、例えば、少なくとも２ｍｍ、より好ましくは少なくとも３ｍｍ、さらに好ましくは５ｍｍであることが意図される。例えば、骨、軟骨、靭帯、腱などに適用される場合、心臓と同様に、通常、少なくとも約１ｍｍであり得、例えば、少なくとも２ｍｍ、より好ましくは少なくとも３ｍｍ、さらに好ましくは５ｍｍおよびそれ以上でも、１ｍｍ未満であってもよい。本発明の本質は、どのような暑さの組織または複合体でも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
【００６８】
移植可能な人工組織において十分な生体適合性は、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その生体適合性の程度を設定することができる。通常、所望される生体適合性としては、例えば、炎症などを起こさず、免疫反応を起こさずに、周囲組織と生物学的結合を行うことなどが挙げられるが、それらに限定されない。場合によって、例えば、角膜などでは、免疫反応を起こしにくいことから、他の臓器において免疫反応を起こす可能性がある場合でも、本発明の目的では生体適合性を有するとすることができる。生体適合性のパラメータとしては、例えば、細胞外マトリクスの存否、免疫反応の存否、炎症の程度などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体適合性は、移植後における移植部位での適合性を見ること（例えば、移植された人工組織が破壊されていないことを確認する）によって判定することができる（ヒト移植臓器拒絶反応の病理組織診断基準  鑑別診断と生検標本の取り扱い（図譜）腎臓移植、肝臓移植および心臓移植  日本移植学会  日本病理学会編、金原出版株式会社（１９９８）を参照）。この文献によれば、Grade 0、１A、１B、２、３A、３B、４に分けられ、Grade 0（no acute rejection）は、生検標本に急性拒絶反応、心筋細胞障害などを示す所見がない状態である。Grade１A（focal, mild acute rejection）は、局所的、血管周囲または間質に大型リンパ球が浸潤しているが、心筋細胞傷害は無い状態である。この所見は、１つまたは複数の生検標本で認められる。Grade1B（diffuse, mild acute rejection）は、血管周囲、間質またはその両方に大型リンパ球がよりびまん性に浸潤しているが、心筋細胞傷害は無い状態である。Grade2（focal, moderate acute rejection）は、明瞭に周囲と境界された炎症細胞浸潤巣がただ一箇所で見出されるような状態である。炎症細胞は、大型の活性化されたリンパ球からなり、好酸球をまじえることもある。心筋構築の改変を伴った心筋細胞傷害が病変内に認められる。Grade３A（multifocal, moderate acute rejection）は、大型の活性化したリンパ球からなる炎症細胞浸潤巣が多発性に形成され、好酸球をまじえることもある状態である。これらの多発性の炎症性の炎症細胞浸潤巣の２箇所以上が心筋細胞傷害を伴っている。ときに、心内膜への粗な炎症細胞浸潤を伴っている。この浸潤巣は生検標本のひとつまたは複数の標本で認められる。Grade3B（multifocal, borderline severe acute rejection）は、３Aで見られた炎症細胞浸潤巣がより融合性またはびまん性となり、より多くの生検標本で認められる状態である。大型リンパ球および好酸球、ときに好中球を交える炎症細胞浸潤とともに、心筋細胞傷害がある。出血はない。Grade４（severe acute rejection）は、活性化したリンパ球、好酸球、好中球を含む多彩な炎症細胞浸潤がびまん性に認められる。心筋細胞傷害と心筋細胞壊死とは常に存在する。浮腫、出血、血管炎も通常認められる。「Quilty」効果とは異なる心内膜への炎症細胞浸潤が通常認められる。かなりの期間、免疫抑制剤で強力に治療されている場合には、細胞浸潤よりも浮腫と出血とが顕著となり得る。
【００６９】
移植可能な人工組織において十分な生体定着性は、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その生体定着性の程度を設定することができる。生体適合性のパラメータとしては、例えば、移植された人工組織と移植された部位との生物学的結合性などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体定着性は、移植後における移植部位での生物学的結合の存在によって判定することができる。本明細書において好ましい生体定着性とは、移植された人工組織が移植された部位と同じ機能を発揮するように配置されていることが挙げられる。
【００７０】
本明細書において「自己支持性」とは、組織（例えば、人工組織）の少なくとも１点が空間上に固定されるときに、その人工組織が実質的に破壊されない特性をいう。本明細書において、自己支持性は、０．５〜３．０ｍｍの太さの先端を有するピンセットで組織（例えば、人工組織）をつまみあげた（好ましくは、１〜２ｍｍの太さの先端を有するピンセット、１ｍｍの太さの先端を有するピンセットで組織をつまむ；ここで、ピンセットは、先曲がりであることが好ましい）ときに、実質的に破壊されないことによって観察される。そのようなピンセットは、市販されており、例えば、夏目製作所などから入手可能である。ここで採用される、つまみ上げる力は、通常、医療従事者が組織をハンドリングする際に掛ける力に匹敵する。従って、自己支持性は、手でつまみあげたときに破壊されないという特長によっても表現することが可能である。そのようなピンセットとしては、例えば、先曲がり先細無鈎ピンセット（例えば、夏目製作所から販売される番号Ａ−１１（先端は１．０ｍｍの太さ）、Ａ−１２−２（先端は０．５ｍｍの太さ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。先曲がりのほうが人工組織を摘み上げやすいが、先曲がりであることに限定されない。
【００７１】
例えば、関節における処置を行う場合、置換が主に行われるが、そのような場合に使用される本発明の人工組織は、強度として、上記最低限の自己支持性を有するだけで十分であり、その後は、含まれる細胞が罹患部の細胞に置換され、マトリックスを形成することにより力学的強度を増し、治癒が進む。また、本発明は、人工関節とともに使用され得ることが理解される。
【００７２】
本発明では、自己支持性は、実際に人工組織を作製したときの支持性を評価することも重要である。本発明の人工組織を作製する際、容器中に細胞のシートが作製され、そのシートを容器より剥離する際に従来の技術では、シートが破壊されていた（自己支持性がない）。従って、従来技術では、移植可能な人工組織は実質的に作製できず、特に、大型の人工組織が必要な局面では、従来技術は役に立たなかったといえる。本発明の技術を用いれば、人工組織を作製する際に、剥離の前の単層のシートの状態において、容器から分離する時点ですでに十分耐え得る強度、すなわち、自己支持性を有することから、本発明の人工組織は、実質的に任意の局面に応用可能であることが理解される。ここで、単層とは、部分的に２〜３層構造を有し得る層を含むことをいうことが理解される。また、通常、人工組織の作製および剥離後は、その人工組織の強度および自己支持性は、上昇することが本発明において観察されたことから、本発明においては、自己支持性は、作製時における評価が一つの重要な局面であり得ることが理解される。本発明では、当然、移植局面での強度も重要であることから、作製後ある程度時間が経過した後の自己支持性を評価することも重要であり得る。従って、このような関係式をもとに、当業者は、使用される時期を見越して逆算して、出荷の時の強度、タイミングを設定することができることが理解される。
【００７３】
本明細書において「膜状組織」とは、「平面状組織」ともいい、膜状の組織をいう。膜状組織には、骨膜、心膜、硬膜、角膜などの器官の組織が挙げられる。
【００７４】
本明細書において「臓器」と「器官」（ｏｒｇａｎ）とは、互換的に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、関節、骨、軟骨、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。このような臓器または器官はまた、表皮系、膵実質系、膵管系、肝系、血液系、心筋系、骨格筋系、骨芽系、骨格筋芽系、神経系、血管内皮系、色素系、平滑筋系、脂肪系、骨系、軟骨系などの器官または臓器が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７５】
本明細書において「袋状臓器」とは、三次元方向に一定の広がりを持ち、その臓器の内部は管状の組織によって外部と接続され得る臓器をいい、例えば、心臓、肝臓、腎臓、胃、脾臓などが挙げられる。
【００７６】
１つの実施形態では、本発明が対象とする器官は、椎間板、軟骨、関節、骨、半月、滑膜、靭帯、腱などが挙げられるがそれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、血管、血管様組織、心臓、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨である。さらに別の好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、心臓、心臓弁、心膜および血管である。別の好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、上記の他、骨格筋、脂肪などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７７】
本明細書において、ある部分（例えば損傷部位）の周囲に人工組織、三次元構造体などを、「巻く」とは、その人工組織などを、その部分を被覆するように（すなわち、損傷などがかくれるように）配置することをいい、その部分を「被覆するように配置」すると交換可能に用いられる。ある部分を被覆するように配置したかどうかは、その部分と配置された人工組織または三次元構造体などとの間の空間的配置を確認することによって判定することができる。好ましい実施形態では、巻く工程によって、ある部位にはその人工組織などが一回転するように巻き付けられることができる。
【００７８】
本明細書において「置換する」とは、病変部（生体の部位）を置換する、病変部にもともとある細胞などが、本発明の人工組織または複合体によって供給される細胞などによって置き換えられることをいう。置換が適切な疾患としては、例えば、断裂している箇所などが挙げられるがそれらに限定されない。置換するとは、別の表現では、「充填」するともいえる。
【００７９】
本明細書において「人工組織と部分とが生物学的に結合するに十分な時間」は、その部分と人工組織との組み合わせによって変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応じて適宜容易に決定することができる。このような時間としては、例えば、術後１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、人工組織は、好ましくは実質的に細胞およびそれに由来する物質のみを含むことから、特に術後に摘出する物質が必要であるというわけではないので、この十分な時間の下限は特に重要ではない。従って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえるが、実質的には極端に長い場合は、実質的に補強が完了したといえる。
【００８０】
本明細書において「免疫反応」とは、移植片と宿主との間の免疫寛容の失調による反応をいい、例えば、超急性拒絶反応（移植後数分以内）（β−Ｇａｌなどの抗体による免疫反応）、急性拒絶反応（移植後約７〜２１日の細胞性免疫による反応）、慢性拒絶反応（３カ月以降の細胞性免疫による拒絶反応）などが挙げられる。
【００８１】
本明細書において免疫反応を惹起するかどうかは、ＨＥ染色などを含む染色、免疫染色、組織切片の検鏡によって、移植組織中への細胞（免疫系）浸潤について、その種、数などの病理組織学的検討を行うことにより判定することができる。
【００８２】
本明細書において「石灰化」とは、生物体で石灰質が沈着することをいう。
【００８３】
本明細書において生体内で「石灰化する」かどうかは、アリザリンレッド染色、カルシウム濃度を測定することによって判定することができ、移植組織を取り出し、酸処理などにより組織切片を溶解させ、その溶液を原子吸光度などの微量元素定量装置により測定し、定量することができる。
【００８４】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
【００８５】
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【００８６】
本明細書において「エキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。
【００８７】
本明細書において「細胞に由来する物質」とは、細胞を起源とする物質すべてをいい、細胞を構成する物質の他、細胞が分泌する物質。代謝した物質などをが含まれるがそれらに限定されない。代表的な細胞に由来する物質としては、細胞外マトリクス、ホルモン、サイトカインなどが挙げられるがそれらに限定されない。細胞に由来する物質は、通常、その細胞およびその細胞の宿主に対して有害な影響をもたらさないことから、そのような物質は人工組織、三次元構造体などに含まれていても通常悪影響を有しない。
【００８８】
本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、通常細胞が産生し、従って生体物質の一つである。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。ここで、代表的な細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などを挙げることができるがそれらに限定されず、細胞接着を担う細胞外マトリクスであれば、種々のものが本発明において利用され得る。
【００８９】
本発明の１つの実施形態では、本発明の人工組織、三次元構造体などは、細胞外マトリクス（たとえば、エラスチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型など）、ラミニンなど）は、移植が企図される器官の部位における細胞外マトリクスの組成に類似することが有利であり得る。本発明において、細胞外マトリクスは、細胞接着分子を包含する。本明細書において「細胞接着分子」（Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または「接着分子」とは、互換可能に使用され、２つ以上の細胞の互いの接近（細胞接着）または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、細胞と細胞の接着（細胞間接着）に関する分子（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と，細胞と細胞外マトリックスとの接着（細胞−基質接着）に関与する分子（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に分けられる。本発明の人工組織、三次元構造体は、通常、このような細胞接着分子を含む。従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）も包含され、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における細胞接着分子または細胞接着分子の概念に入る。
【００９０】
本発明において特に注目されるのは、本発明の人工組織または複合体が、細胞およびその細胞自体が精製する（自己由来の）細胞外マトリクスを含むことである。従って、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などが配合された複雑な組成を有することが特徴である。このような細胞由来成分が配合された人工組織は従来提供されていない。このような配合を有する人工組織は、人工材料を使用した場合は実質的に不可能に近く、このような配合をしていること（特に、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩなど）の配合自体がネイティブな配合であるといえる。
【００９１】
より好ましくは、細胞外マトリクスは、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型など）、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンをすべて含む。特に、ビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンが配合された人工組織はこれまで提供されておらず、従って、その点でもすでに、本発明の人工組織または複合体は新規なものであることが理解される。
【００９２】
本明細書において、細胞外マトリクスが「配置される」とは、本発明の人工組織に関して言及するとき、その人工組織中に細胞外マトリクスが存在することをいう。そのような配置は、目的とする細胞外マトリクスを免疫染色などによって染色して、可視化することによって観察することができることが理解される。
【００９３】
本明細書において細胞外マトリクスが「分散して」配置される、とは、局在化しないで存在することをいう。そのような細胞外マトリクスの分散は、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、通常約１：１０〜１０：１、代表的には約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる分散をいい、好ましくは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：２〜２：１の範囲内の比率に収まる分散をいう。より好ましくは、どのセクションにおいてもほぼ同等の比率に収まることが有利であるがそれに限定されない。局所化されず、分散して細胞外マトリクスが表面に存在することによって、本発明の人工組織は、周囲に対して満遍なく生物学的結合能を有し、従って、移植後の経過に優れるという効果を奏する。
【００９４】
細胞間接着に関しては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの分子（ＮＣＡＭ、Ｌ１、ＩＣＡＭ、ファシクリンＩＩ、ＩＩＩなど）、セレクチンなどが知られており、それぞれ独特な分子反応により細胞膜を結合させることも知られている。従って、１つの実施形態では、本発明の人工組織、三次元構造体などは、このようなカドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する分子などの組成もまた、移植が意図される部位と同程度の組成であることが好ましい。
【００９５】
このように多種多様な分子が細胞接着に関与しており、それぞれの機能は異なっていることから、当業者は、目的に応じて、適宜本発明の人工組織、三次元構造体に含まれるべき分子を選択することができる。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周知であり、例えば、細胞外マトリックス−臨床への応用―メディカルレビュー社に記載されている。
【００９６】
ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼイション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１）、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれに限定されない。このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。従って、本発明の組織片において用いられる接着因子としては、そのような細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達するものが好ましい。細胞活性化により、組織片としてある組織または臓器における損傷部位に適用された後に、そこに集合した細胞および／または組織もしくは臓器にある細胞の増殖を促すことができるからである。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼイション法というアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。
【００９７】
細胞接着分子としては、例えば、組織固着性の細胞系に広く知られる細胞接着分子としてカドヘリンがあり、カドヘリンは、本発明の好ましい実施形態において使用することができる。一方，非固着性の血液・免疫系の細胞では，細胞接着分子としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（ＬＦＡ−３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１など）；インテグリンファミリー分子（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ１、ＶＬＡ２、ＶＬＡ３、ＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＶＬＡ６など）；セレクチンファミリー分子（Ｌ−セレクチン，Ｅ−セレクチン，Ｐ−セレクチンなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、そのような分子は、血液・免疫系の組織または臓器を処置するための特に有用であり得る。
【００９８】
細胞接着分子は、非固着性の細胞が特定の組織で働くためにはその組織への接着が必要となる。その場合，恒常的に発現するセレクチン分子などによる一次接着、それに続いて活性化されるインテグリン分子などの二次接着によって細胞間の接着は段階的に強くなると考えられている。従って、本発明において用いられる細胞接着分子としては、そのような一次接着を媒介する因子、二次接着を媒介する因子、またはその両方が一緒に使用され得る。
【００９９】
本明細書において「アクチン調節物質」とは、細胞内のアクチンに対して直接的または間接的に相互作用して、アクチンの形態または状態を変化させる機能を有する物質をいう。アクチンへの作用に応じて、アクチン脱重合促進因子とアクチン重合促進因子とに分類されることが理解される。そのような物質としては、例えば、アクチン脱重合促進因子として、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１（ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、ＡＤＦ（ａｃｔｉｎ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を挙げることができ、例えば、アクチン重合促進因子として、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，ＬＰＡ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびＴＧＦβなどを挙げることができるがそれらに限定されないことが理解される。そのようなアクチン調節物質には、以下のようなアッセイによって同定される物質が含まれる。本明細書において、アクチンへの相互作用の評価は、アクチン染色試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）などによりアクチンを可視化した後、顕鏡し、アクチン凝集や細胞伸展を観察することによってアクチンの凝集、再構成および／または細胞伸展速度の向上という現象が確認されることによって判定される。これらの判定は、定量的または定性的に行われ得る。このようなアクチン調節物質は、人工組織の分離を促進または重層化の促進をさせるために本発明において利用される。本発明において用いられるアクチン調節物質が生体に由来する場合、その由来は何でもよく、例えば、ヒト、マウス、ウシなどの哺乳動物種があげられる。
【０１００】
上記のようなアクチン重合に関与する因子は、例えば、Rho関連でアクチンの重合制御であり、以下が挙げられる（例えば、「細胞骨格・運動がわかる」（編集/三木裕明）羊土社を参照のこと）。
【０１０１】
アクチン重合（Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１４：  １８０１−１８０９，  ２００１を参照のこと）
ＲｈｏＡ→ｍＤｉ→プロフィリン⇒アクチン重合
ＲｈｏＡ→ＲＯＣＫ／Ｒｈｏ→ＬＩＭキナーゼ→コフィリンをリン酸化（抑制）⇒アクチン重合
Ｒａｃ１→ＩＲＳｐ５３→ＷＡＶＥ２→プロフィリン、Ａｒｐ２／３⇒アクチン重合
ｃｄｃ４２→Ｎ−ＷＡＳＰ→プロフィリン、Ａｒｐ２／３⇒アクチン重合
ｃｄｃ４２→Ｄｒｆ３→ＩＲＳｐ５３→Ｍｅｎａ⇒アクチン重合
（以上において、→はリン酸化などのシグナル伝達経路を示す。）本発明では、このような経路に関与する任意の因子を使用することができる。
【０１０２】
アクチン脱重合
Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ→コフィリンの脱リン酸化（活性化）⇒アクチン脱重合
コフィリンのＬＩＭキナーゼ活性によるリン酸化とＳｌｉｎｇｓｈｏｔによる脱リン酸化のバランスでアクチンの脱重合を制御している。コフィリンを活性化させる他の因子としては、ＣＡＰ（ｃｙｃｌａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＡＩＰＩ（ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  １）が同定されており、これらは、任意のものを使用することができることが理解される。
【０１０３】
ＬＰＡ（リゾフォスファチジン酸）は、どのような鎖長のものでも使用することができる。
【０１０４】
ケモカインとしては、任意のものを使用することができるが、好ましくは、インターロイキン８、ＭＩＰ−１、ＳＤＦ−１などを挙げることができる。
【０１０５】
ＴＧＦβとしては、任意の物を使用することができるが、好ましくは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３を使用することができる。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は、細胞外マトリクス産生促進作用も有することから、本発明においては、留意して使用することができいる。
【０１０６】
本明細書において「組織強度」とは、組織または器官の機能を示すパラメータをいい、その組織または器官の物理的強度である。組織強度は一般に、引っ張り強さ（例えば、破断強度、剛性率、ヤング率など）を測定することによって判定することができる。そのような一般的な引っ張り試験は周知である。一般的な引っ張り試験によって得られたデータの解析により、破断強度、剛性率、ヤング率などの種々のデータを得ることができ、そのような値もまた、本明細書において組織強度の指標として用いることができる。本明細書では、通常、臨床適用することができる程度の組織強度を有することが必要とされる。
【０１０７】
ここで、本発明の人工組織、三次元構造体などが有する引っ張り強さは、応力・歪み特性を測定することによって測定することができる。手短に述べると、試料に荷重を加え、例えば、１ｃｈは歪み、２ｃｈは荷重の各々のＡＤ変換器（例えば、ＥＬＫ−５０００）に入力して、応力および歪みの特性を測定することによって引っ張り強さを決定することができる（図４６）。引っ張り強さはまた、クリープ特性を試験することによっても達成することができる。クリープ特性インデンテーション試験とは、一定の荷重を加えた状態で時間とともにどのように伸びていくかを調べる試験である。微小な素材、薄い素材などのインデンテーション試験は、先端の半径０．１〜１μｍ程度の、例えば、三角錐の圧子を用いて実験を行う。まず、試験片に対して圧子を押し込み、付加を与える。そして、試験片に数十ｎｍから数μｍ程度押し込んだところで、圧子を戻し除荷する。このような試験方法によって得られる荷重除荷曲線を図４７に示す。この曲線から得られた負荷荷重と押し込み深さの挙動とによって硬さ、ヤング率などを求めることができる。
【０１０８】
本発明の人工組織は、引っ張り強度は弱くてもいい。引っ張り強度は、細胞・細胞外マトリクス比率におけるマトリクス比率を上げる強くなり、細胞比率を上げると弱くなる。本発明は、必要に応じて強度も自由に調整できることが特徴の一つである。移植される組織に対して相対的に近似して強くも弱くもできることが特徴である。従って、そのような任意の場所に応じて目的と設定することができることが理解される。
【０１０９】
本明細書において「生理活性物質」（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞または組織に作用する物質をいう。生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものである。本明細書では、生理活性物質はタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。本発明において、生理活性物質は、本発明の人工組織の移植の際に、定着を促進するためなどに使用され得る。
【０１１０】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。
【０１１１】
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。
【０１１２】
サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【０１１３】
サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性を有してさえいれば、本発明の治療法または医薬の好ましい実施形態において使用することができる。
【０１１４】
従って、１つの実施形態において、本発明は、このようなサイトカインまたは増殖因子（例えば、ＢＭＰ−２など）を、移植部位（例えば、軟骨損傷部位）に本発明の人工組織または三次元構造体と同時に投与することによって、人工組織または三次元構造体の定着および移植部位の機能向上が見られることが明らかにされ、そのような併用療法を提供する。
【０１１５】
本明細書において「分化」とは、細胞、組織または器官のような生物の部分の状態の発達過程であって、特徴のある組織または器官を形成する過程をいう。「分化」は、主に発生学（ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ）、発生生物学（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）などにおいて使用されている。１個の細胞からなる受精卵が分裂を行い成体になるまで、生物は種々の組織および器官を形成する。分裂前または分裂が十分でない場合のような生物の発生初期は、一つ一つの細胞や細胞群が何ら形態的または機能的特徴を示さず区別することが困難である。このような状態を「未分化」であるという。「分化」は、器官のレベルでも生じ、器官を構成する細胞がいろいろの違った特徴的な細胞または細胞群へと発達する。これも器官形成における器官内での分化という。従って、本発明の人工組織、三次元構造体は、分化した状態の細胞を含む組織を用いてもよい。
【０１１６】
本発明の人工組織を作製する場合、分化が必要な場合は、組織化を始める前に分化させてもよく、組織化の後に分化させても良い。
【０１１７】
本明細書において「分化因子」とは、「分化促進因子」ともいい、分化細胞への分化を促進することが知られている因子（例えば、化学物質、温度など）であれば、どのような因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げることができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質（例えば、ステロイド、抗生物質など）などまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。代表的な分化因子としては、細胞生理活性物質が挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のうち代表的なものとしては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１８】
具体的な分化因子としては、以下が挙げられる。これらの分化因子は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
【０１１９】
Ａ）角膜：上皮増殖因子（ＥＧＦ）；
Ｂ）皮膚（ケラチノサイト）：ＴＧＦ−β、ＦＧＦ−７（ＫＧＦ：ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ
Ｃ）血管内皮：ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）
Ｄ）腎臓：ＬＩＦ、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ
Ｅ）心臓：ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ
Ｆ）肝臓：ＨＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ
Ｇ）臍帯内皮：ＶＥＧＦ
Ｈ）腸管上皮：ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１１
Ｉ）神経：神経成長因子（ＮＧＦ）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ
Ｊ）グリア細胞：ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＥＧＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６
Ｋ）末梢神経細胞：ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、
Ｌ）肺（肺胞上皮）：ＴＧＦ−β、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＫＧＦ、ＨＧＦ
Ｍ）胎盤：成長ホルモン（ＧＨ）、ＩＧＦ、プロラクチン、ＬＩＦ、ＩＬ−１、アクチビンＡ、ＥＧＦ
Ｎ）膵臓上皮：成長ホルモン、プロラクチン
Ｏ）膵臓ランゲルハンス氏島細胞：ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＲＨ（ｔｈｙｒｏｒｏｐｉｎ）
Ｐ）滑膜細胞：ＦＧＦ、ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）
Ｑ）骨芽細胞：ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、ＦＧＦ
Ｒ）軟骨芽細胞：ＦＧＦ、ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）、ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ
Ｓ）網膜細胞：ＦＧＦ、ＣＮＴＦ（絨毛神経栄養因子＝ｃｉｌｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）
Ｔ）脂肪細胞：インスリン、ＩＧＦ、ＬＩＦ
Ｕ）筋肉細胞：ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ。
【０１２０】
本明細書において「骨分化」とは、任意の細胞を骨に分化させることをいう。そのような骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸２リン酸の存在下で促進されることが知られる。骨形成因子（ＢＭＰ、（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７））、を付加してもよい。骨形成が促進されるからである。
【０１２１】
本明細書において「軟骨分化」とは、任意の細胞を軟骨に分化させることをいう。そのような軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸２リン酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸の存在下で促進されることが知られる。骨形成因子（ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７））、ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）、ＦＧＦ、ＴＮＦ−αなどを付加してもよい。軟骨形成が促進されるからである。
【０１２２】
本明細書において「脂肪分化」とは、任意の細胞を脂肪に分化させることをいう。そのような脂肪分化は、インスリン、ＩＧＦ、ＬＩＦおよびアスコルビン酸２リン酸の存在下で促進されることが知られる。
【０１２３】
本明細書において「移植片」、「グラフト」および「組織グラフト」は、交換可能に用いられ、身体の特定部位に挿入されるべき同種または異種の組織または細胞群であって、身体への挿入後その一部となるものをいう。従って、本発明の人工組織、三次元構造体は、移植片として用いることができる。移植片としては、例えば、臓器または臓器の一部、血管、血管様組織、皮片、心臓、心臓弁、心膜、硬膜、関節膜、骨片、軟骨片、角膜骨片、歯などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、移植片には、ある部分の欠損部に差し込んで欠損を補うために用いられるものすべてが包含される。移植片としては、そのドナー（ｄｏｎｏｒ）の種類によって、自己（自家）移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（同種異系移植片）（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、異種移植片が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２４】
本明細書において自己移植片（組織、細胞、臓器など）または自家移植片（組織、細胞、臓器など）とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する移植片（組織、細胞、臓器など）をいう。本明細書において「自己移植片（組織、細胞、臓器など）」というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片（組織、細胞、臓器など）をも含み得る。本明細書では、このような自己との表現は、被験体に由来すると交換可能に使用される。従って、本明細書では、ある被験体に由来しないとの表現は、自己ではない（すなわち、非自己）と同一の意味を有する。
【０１２５】
本明細書において「同種移植片（同種異系移植片）（組織、細胞、臓器など）」とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される移植片（組織、細胞、臓器など）をいう。遺伝的に異なることから、同種異系移植片（組織、細胞、臓器など）は、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような移植片（組織、細胞、臓器など）の例としては、親由来の移植片（組織、細胞、臓器など）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の人工組織は、同種異系移植片でも使用可能であり、良好な治療成績が立証されているという意味で注目されるべきである。
【０１２６】
本明細書において「異種移植片（組織、細胞、臓器など）」とは、異種個体から移植される移植片（組織、細胞、臓器など）をいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植片（組織、細胞、臓器など）は異種移植片（組織、細胞、臓器など）という。
【０１２７】
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植片（組織、細胞、臓器など）または移植体（組織、細胞、臓器など）を受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植片（組織、細胞、臓器など）または移植体（組織、細胞、臓器など）を提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。
【０１２８】
本発明の人工組織形成技術を用いれば、どのような細胞に由来する人工組織でも使用することができる。なぜなら、本発明の方法により形成された人工組織（例えば、膜状組織、器官など）は、治療目的に損傷のない程度の組織損傷率を保持しつつ（すなわち、低く保ちながら）、目的の機能を発揮することができるからである。従って、従来そのままの組織または臓器自体を移植物として使用するしかなかった状況にあった。このような状況において、細胞から三次元的に結合した組織を形成することができたことによって、そのような三次元的な人工組織を用いることが可能になったことは、従来技術では達成することができなかった本発明の格別の効果の一つといえる。
【０１２９】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０１３０】
本発明の人工組織、三次元構造体、組織グラフトで必要に応じて使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。また、拒絶反応を起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、新外科学体系、第１２巻、臓器移植（心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて）（改訂第３版）、中山書店に記載されている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）、「タクロリムス」（プログラフ）、「アザチオプリン」（イムラン）、「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）、「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の医薬と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしも必要ではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の再生・治療方法の前または後にも投与され得る。
【０１３１】
本発明で用いられる細胞は、どの生物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）由来の細胞でもよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細胞が用いられる。最も好ましい実施形態において、ヒト由来の細胞が用いられる。通常は、宿主と同じ種の細胞を用いることが好ましい。
【０１３２】
本発明が対象とする被験体と、人工組織との組合せとしては、例えば、心疾患（例えば、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症など）を起こした心臓への移植、心膜パッチ、脳外科手術時の硬膜移植、心筋梗塞、下肢、上肢などへの血管移植、関節損傷または変性、軟骨損傷または変性、骨壊死、半月損傷または変性、椎間板変性、靭帯損傷または変性、骨折、骨欠損を有する患者への関節、軟骨、骨の移植、損傷した角膜を有する患者に本発明の角膜を移植することなどが挙げられるがそられに限定されない。
【０１３３】
本発明が対象とする組織は、生物のどの臓器または器官でもよく、また、本発明が対象とする組織は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
【０１３４】
本明細書において「可撓性」の人工組織とは、外的環境からの物理的刺激（例えば、圧力）などに対して、抵抗性を有することをいう。可撓性を有する人工組織は、移植される部位が、自律的にまたは他からの影響で運動したり変形したりする場合に好ましい。
【０１３５】
本明細書において「伸縮性」を有する人工組織とは、外的環境からの伸縮性の刺激（例えば、拍動）に対して抵抗性を有する性質をいう。伸縮性を有する人工組織は、移植される部位が伸縮性の刺激を伴う場合好ましい。そのような伸縮性の刺激を伴う部位としては、例えば、心臓、筋肉、関節、軟骨、腱などが挙げられるがそれらに限定されない。１つの実施形態では、心臓の拍動運動に耐え得る程度の伸縮性が要求され得る。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、用語「部分」とは、任意の身体中の部分、組織、細胞、器官を指す。そのような部分、組織、細胞、器官としては、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、幹細胞によって治療され得る部分が挙げられるが、それらに限定されない。特異的なマーカーであれば、核酸分子（ｍＲＮＡの発現）、タンパク質、細胞外マトリクス、特定の表現型、細胞の形状などどのようなパラメータでも使用することができる。従って、本明細書において具体的に記載されていないマーカーであっても、その部分由来であることを示すことができるマーカーであれば、どのようなマーカーを利用して、本発明の人工組織を判定してもよい。このような部分の代表例としては、例えば、心筋以外の心臓の部分、間葉系幹細胞またはそれに由来する細胞を含む部分、組織、器官、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、線維芽細胞、滑膜細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３７】
軟骨組織などを見る場合、以下のようなマーカーを指標にすることができる。
【０１３８】
Ｓｏｘ９とは、（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿０００３４６）であり、軟骨細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Kulyk WM, Franklin JL, Hoffman LM.   Sox9 expression during chondrogenesis in micromass cultures of embryonic limb mesenchyme. Exp Cell Res. 2000 Mar15;255(2):327-32.）。
【０１３９】
Ｃｏｌ  ２Ａ１  とは、（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿００１８４４）であり、軟骨細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Kulyk WM, Franklin JL, Hoffman LM.   Sox9 expression during chondrogenesis in micromass cultures of embryonic limb mesenchyme. Exp Cell Res. 2000 Mar15;255(2):327-32.）。
【０１４０】
アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）とは、（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿００１１３５）であり、軟骨細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Kulyk WM, Franklin JL, Hoffman LM. Sox9 expression during chondrogenesis in micromass cultures of embryonic limb mesenchyme. Exp CellRes. 2000 Mar 15;255(2):327-32.）。
【０１４１】
骨シアロタンパク質（Ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）とは、（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿００４９６７）であり、骨芽細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Haase HR, Ivanovski S, Waters MJ, Bartold PM.   Growth hormone regulates osteogenic marker mRNA expression in human periodontal fibroblasts and alveolar bone-derived cells. J Periodontal Res. 2003 Aug;38(4):366-74.）。
【０１４２】
オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）とは、（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ１９９１７３）であり、骨芽細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Haase HR, Ivanovski S, Waters MJ, Bartold PM.   Growth hormone regulates osteogenic marker mRNA expression in human periodontal fibroblasts and alveolar bone-derived cells. J Periodontal Res. 2003 Aug;38(4):366-74.）。
【０１４３】
ＧＤＦ５とは、（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿０００５５７）であり、靱帯細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Wolfman NM, Hattersley G, Cox K, Celeste AJ, Nelson R, Yamaji N,Dube JL, DiBlasio-Smith E, Nove J, Song JJ, Wozney JM, Rosen V. Ectopic induction of tendon and ligament in rats by growth and differentiation factors5, 6, and 7, members of the TGF-beta gene family. J Clin Invest. 1997 Jul15;100(2):321-30.）。
【０１４４】
Six1とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ＿０05982）であり、靱帯細胞に特異的なマーカ−である（Dreyer SD, Naruse T, Morello R, Zabel B, Winterpacht A, Johnson RL, Lee B, Oberg KC.Lmx1b expression during joint and tendon formation: localization and evaluation of potential downstream targets. Gene Expr Patterns. 2004 Jul;4(4):397-405.）。このマーカーは主にmRNAの存在を見ることによって確認することができる。
【０１４５】
スクレラキシス（Scleraxis）とは、（ヒト：アクセッション番号BK000280）であり、靱帯細胞に特異的なマーカ−である（BrentAE, Schweitzer R, Tabin CJ. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell.2003 Apr 18;113(2):235-48.）。このマーカーは主にmRNAの存在を見ることによって確認することができる。
【０１４６】
本明細書中で使用される場合、「成体の心筋以外の部分」、「成体の心臓以外の部分」はまた、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、幹細胞などを含む成体の心筋に由来する細胞または成体心臓に由来する細胞に特徴的なマーカー（本明細書においてそれぞれ「非成体心筋マーカー」または「非成体心臓マーカー」という）を一定レベル、例えば、特異的に発現するものの少なくとも約１００％未満、好ましくは約８０％未満、より好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは、約２５％未満、場合によっては約１％未満発現することによって同定することができる。このようなマーカーとしては、ミオシン重鎖IIA、ミオシン重鎖IIB、ミオシン重鎖IID(IIＸ)、ＣＤ５６、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ｍｙｏｇｅｎｉｎなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において具体的に記載されていない非成体心臓マーカーであっても、成体心臓以外の由来であることを示すことができるマーカーであれば、どのようなマーカーを利用して、本発明の人工組織を判定してもよい。
【０１４７】
ここで、ミオシン重鎖IIa（ヒト：アクセッション番号NM_017534；配列番号１および２）、ミオシン重鎖IIb（ヒト：アクセッション番号NM_017533；配列番号３および４）、ミオシン重鎖IId(IIｘ)（ヒト：アクセッション番号NM_005963；配列番号５および６）とは、であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである（HavenithMG, Visser R, Schrijvers−van Schendel JM, Bosman FT. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry.1990;93(5):497−9）。このマーカーは、主にタンパク質の存在を見ることによって確認することができる。ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIbおよびミオシン重鎖IId(IIｘ)に対する抗体としては、たとえば、Sigmaから入手可能なMY−32などがあり、この抗体は、骨格筋特異的で心筋は染めない（Webster C, Pavlath GK, Parks DR, Walsh FS, Blau HM, Exp Cell Res. 1988 Jan;174(1):252−65；およびHavenith MG, Visser R, Schrijvers−van Schendel JM, Bosman FT, 1990;93(5):497−9）。
【０１４８】
ＣＤ５６とは、（ヒト：アクセッション番号U63041；配列番号７および８）であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
【０１４９】
ＭｙｏＤとは、（ヒト：アクセッション番号X56677；配列番号９および１０）であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
【０１５０】
Ｍｙｆ５とは、（ヒト：アクセッション番号NM_005593；配列番号１１および１２）であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
【０１５１】
ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ヒト：アクセッション番号BT007233；配列番号１３および１４）とは、であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
【０１５２】
他の実施形態では、他の組織に特異的な別のマーカーを利用することができる。そのようなマーカーとしては、例えば、胚性幹細胞についてはＯｃｔ−３／４、ＳＳＥＡ−１、Ｒｅｘ−１、Ｏｔｘ２などが挙げられ；内皮細胞についてはＶＥ−カドヘリン、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−１、ＰＥＣＡＭ１、ｖＷＦ、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１、Ｓｃａ−１などが挙げられ；骨格筋について上述のもののほか骨格筋αアクチンなどが挙げられ；神経細胞についてＮｅｓｔｉｎ、Ｇｌｕレセプター、ＮＭＤＡレセプター、ＧＦＡＰ、ニューレグリン−１などが挙げられ；造血細胞系についてｃ−ｋｉｔ、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１、Ｓｃａ−１、ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＦＯＧなどが挙げられる。
【０１５３】
本明細書中で使用される場合、用語「由来する」とは、ある種の細胞が、その細胞が元々存在していた細胞塊、組織、器官などから分離、単離、または抽出されたこと、あるいはその細胞を、幹細胞から誘導されたことを意味する。
【０１５４】
本明細書中で使用される用語「心臓に適用可能な」とは、適用された心臓が拍動するような能力を意味する。このような心臓に適用可能な組織は、拍動する場合の伸縮に耐え得る強度を有することになる。ここでは、心臓への適用可能性は、心筋への適用可能性を含む。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、用語「三次元構造体」とは、マトリクスが三次元配向され細胞が三次元に配列しており、細胞間の結合および配向を保持している細胞を含む、三次元方向に広がる物体を指す。
【０１５６】
本明細書において「生物学的結合」（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）とは、生物学的存在（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）相互の関係に言及する場合、２つの生物学的存在の間に生物学的になんらかの相互作用があることをいう。そのような相互作用としては、例えば、生体分子（例えば、細胞外マトリクス）を介した相互作用、情報伝達を介した相互作用、電気的相互作用（電気信号の同期などの電気的結合）が挙げられるがそれらに限定されない。生物学的結合には、人工組織内部の生物学的結合と、ある人工組織が、周囲（たとえば、移植後の周囲組織、周囲細胞など）と有する生物学的結合とがある。相互作用を確認する場合は、その相互作用の特性によって適切なアッセイ方法を用いる。例えば、生体分子を介した物理的相互作用を確認する場合は、人工組織、三次元構造体などの強度（例えば、引っ張り試験）を確認する。情報伝達を介した場合は、シグナル伝達がなされるかどうかを、遺伝子発現などを介して確認する。あるいは、電気的な相互作用の場合は、人工組織、三次元構造体などにおける電位の状況を測定し、一定の波をもって電位が伝播しているかどうかを見ることによって確認することができる。本発明において、通常生物学的結合は、三次元すべての方向に生物学的結合を有する。好ましくは、三次元すべての方向にほぼ均等に生物学的結合を有することが有利であることがあるが、別の実施形態では、二次元方向にほぼ均等に生物学的結合を有するが、第三の方向にはすこし弱い生物学的結合を有する人工組織、三次元構造体なども使用され得る。あるいは、細胞外マトリクスを介した生物学的結合の場合は、細胞外マトリクスを染色してその染色度を観察することもできる。インビボで生物学的結合を観察する方法としては、軟骨を用いた結合実験がある。この実験では、軟骨の表面を切除しコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ＥＢ  ｅｔ  ａｌ．，J Bone Joint Surg Am. 1996 May;78(5):721-33 ）で消化して、目的とする組織をその切除された表面に移植して７日程度培養して、その後の結合を組織学的に観察する（図１８を参照のこと）。このような軟骨を用いた実験によって、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を測定することができることが理解される。
【０１５７】
本発明の人工組織、三次元構造体などは、医薬品として提供され得るが、あるいは、動物薬、医薬部外品、水産薬および化粧品等として、公知の調製法により提供され得る。
【０１５８】
従って、本発明が対象とする動物は、臓器または器官を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒトが対象とされ得る。移植治療において限界があるからである。
【０１５９】
本発明が医薬として使用される場合、本発明の医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１６０】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない
本発明の処置方法において使用される医薬（人工組織、併用される医薬化合物など）の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、組織の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１６１】
本明細書中、「投与する」とは、本発明の人工組織、三次元構造体などまたはそれを含む医薬を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与することを意味する。本発明の人工組織は、以下のような治療部位（例えば、障害心臓など）への導入方法，導入形態および導入量が使用され得る。すなわち、本発明の人工組織および三次元構造体の投与方法としては、例えば心筋梗塞、狭心症等で虚血性の障害を受けた心筋組織の障害部位への直接貼付、貼付後に縫合、挿入等の方法があげられる。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、人工組織などが直接手術によって提供され、他の薬剤は静脈注射によって与えられる場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１６２】
本明細書において「補強」とは、意図される生体の部分の機能を改善させることをいう。
【０１６３】
本明細書において「指示書」は、試薬の取り扱い、使用方法、調合方法、人工組織の作成方法、収縮方法など、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１６４】
本明細書において「細胞外マトリクス産生促進因子」とは、細胞の細胞外マトリクスの産生を促進する任意の因子をいう。本発明において、細胞外マトリクス産生促進因子を細胞シートに添加すると、その細胞シートを培養容器からの剥離が促進される環境を提供し、そのようなシートが三次元方向に生物学的結合する。ここで、生物学的結合は、組織中の細胞と細胞外マトリクスとの結合および細胞外マトリクス同士の結合を含む。ここで、自己収縮によりさらに三次元化が促進される。そのような因子としては、代表的には、細胞外マトリクスの分泌を促進するような因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３など）が挙げられる。本発明において、代表的な細胞外マトリクス産生促進因子としては、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩が挙げられる。好ましくは、このような細胞外マトリクス産生促進因子は、適用が意図される部分の細胞外マトリクスの組成成分および／またはその量に類似するように細胞外マトリクスの分泌を促す成分（単数または複数）であることが好ましい。そのような細胞外マトリクス産生促進因子が複数の成分を含む場合は、そのような複数成分は、適用が意図される部分の細胞外マトリクスの組成成分および／またはその量に類似するように組成され得る。
【０１６５】
本明細書において「アスコルビン酸またはその誘導体」には、アスコルビン酸およびその類似体（例えば、アスコルビン酸２リン酸など）、およびその塩（例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩など）が含まれる。アスコルビン酸は、Ｌ体であることが好ましいがそれに限定されない。
【０１６６】
(発明を実施するための最良の形態）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１６７】
一つの局面において、本発明が提供する人工組織および複合体は、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表されるタンパク質分解酵素による損傷を受けていない。そのため、基材から剥離された人工組織および複合体は、細胞−細胞間、細胞−細胞外マトリクス間、および細胞外マトリクス−細胞外マトリクス間ののタンパク質による結合が保持された強度ある細胞塊として回収することができ、三次元構造体としての細胞−細胞外マトリックス複合体としての機能を何ら損なうことなく保有している。トリプシン等の通常のタンパク質分解酵素を使用した場合、細胞−細胞間のおよび細胞−細胞外マトリックス間の結合は殆ど保持されておらず、従って細胞は個々に分かれた状態となって剥離される。その中でタンパク質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞、基材間の基底膜様タンパク質を殆ど破壊してしまい、得られる三次元構造体および人工組織は強度の弱いものである。
【０１６８】
本発明の方法においては、人工組織または三次元構造体の使用目的に合わせて培養時間を設定すればよい。培養した人工組織または三次元構造体を支持体材料から剥離回収するには、培養された細胞シートまたは三次元構造体を単独で、若しくは高分子膜に密着させて剥離することができる。なお、人工組織または三次元構造体を剥離することは細胞を培養していた培養液において行うことも、その他の等張液において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。また、単層の細胞シートを作製する場合は、必要に応じ細胞シートまたは三次元構造体を密着させる際に使用する高分子膜としては、例えば、親水化処理が施されたポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロースおよびその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、和紙等の紙類、ウレタン、スパンデックス等のネット状・スリキネット状高分子材料を挙げることができる。ここで、ネット状、ストッキネット状高分子材料であれば人工組織および複合体は自由度が増し、収縮弛緩機能を更に増大させることができる。本発明における細胞の人工組織および三次元構造体の製法は特に限定されるものではないが、例えば、上記した高分子膜に密着した培養細胞シートを利用することで製造することができる。
【０１６９】
本発明の人工組織および複合体を高収率で剥離、回収する目的で、細胞培養支持体を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、さらにはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。加えて、必要に応じて人工組織および三次元構造体は、培養容器の底面の変形、等張液等で洗浄して剥離回収してもよい。基材から剥離された人工組織、または三次元構造体は、特定方向に引き伸ばすことで、さらに配向された三次元構造体となる。その引き伸ばす方法は、何ら制約されるものではないが、テンシロンなどの引っ張り装置を用いる方法、あるいは、単純にピンセットで引っ張る方法等が挙げられる。配向させることで、三次元構造体自身の動きに方向性を持たせることができ、このことは、例えば、特定の臓器の動きに合わせて、人工組織あるいは三次元構造体を重ね合わせることを可能とするため、人工組織あるいは三次元構造体を臓器に適用する場合に効率が良い。
【０１７０】
上述の方法により得られた人工組織および複合体は、従来の方法では得られなかったものである。
【０１７１】
本発明の人工組織および複合体は、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩなど）、ビトロネクチン、フィブロネクチンなど細胞外マトリクスなどの接着因子を豊富に含むために、周囲の組織に生着する。それにより、移植細胞を移植部位に安定して生着させることができる。これまでの細胞移植では、スキャフォールドなしでの細胞移植はもちろんのこと、追加の安定化処置（例えば、パッチの縫い付け、スキャフォールの使用など）を用いた細胞移植においても、細胞の安定した移植先での生着は、従来困難であったが、本発明を用いれば、安定化させることが容易になった。細胞のみの場合は、他の組織による補強、スキャフォールド自身の固定などが必要であったが、本発明の方法を用いれば、そのような必要なしに、人工組織または複合体の中に含まれている多分化能を有し得る細胞を別途の固定なしに安定して移植部にとどめさせることができる。
【０１７２】
（細胞外マトリクス産生促進因子による人工組織の調製）
別の局面において、本発明は、人工組織を生産するための方法を提供する。この人工組織生産法は、Ａ）細胞を提供する工程；Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；およびＣ）該容器中の該細胞を、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程、を包含する。
【０１７３】
ここで用いられる細胞は、どのような細胞であってもよい。細胞を提供する方法は、当該分野において周知であり、例えば、組織を摘出してその組織から細胞を分離する方法、あるいは、血液細胞などを含む体液から細胞を分離する方法、あるいは、細胞株を人工培養によって調製する方法などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において使用される細胞は任意の幹細胞または分化細胞であり得るが、特に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、骨髄細胞などを用いることができる。本明細書において使用される間葉系幹細胞としては、例えば、脂肪組織由来の幹細胞、骨髄由来の幹細胞などを用いることができる。
【０１７４】
本発明の人工組織生産法では、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液が使用される。このような細胞外マトリクス産生促進因子としては、例えば、アスコルビン酸またはその誘導体などが挙げられ、例えば、アスコルビン酸２リン酸、Ｌ−アスコルビン酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１７５】
本発明において使用される細胞培養液は、目的とする細胞が増殖する限りどのような培地であってもよいが、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを適宜グルコース、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）またはヒト血清、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を加えたものが使用され得る。
【０１７６】
本発明の方法において使用される容器は、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する限り、当該分野において通常使用されるような容器を用いることができ、例えば、シャーレ、フラスコ、型容器など、好ましくは底面積が広い（例えば、１ｃｍ２以上）容器が使用され得る。その容器の材質もまた、どのような材料を利用してもよく、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど）、シリコーンなどが用いられ得るがそれらに限定されない。
【０１７７】
好ましい実施形態では、本発明の人工組織生産法では、さらに、生産された人工組織を分離する工程を包含し得る。本明細書において「分離する」とは、本発明の人工組織が容器中で形成された後、その容器からその人工組織を分離することをいう。分離は、例えば、物理的手段（例えば、培地のピペッティングなど）、化学的手段（物質の添加）などによって達成することができる。本発明では、タンパク質分解酵素処理などの積極的に人工組織に対して侵襲を与えずに、人工組織の周囲に物理的手段または化学的手段によって刺激を与えることによって人工組織を分離することができるという点で従来達成できなかった簡便さおよびそれによってもたらされる人工組織の傷のなさなどの移植片としての性能の高さという効果を奏することに留意すべきである。
【０１７８】
好ましい実施形態では、本発明は、人工組織化された細胞を分離する工程、をさらに包含する。ここで、より好ましい実施形態では、この分離する工程は、人工組織を収縮させる刺激を加えることができる。物理的な刺激（例えば、ピペッティング）を含む。このような物理的刺激は、作製された人工組織に直接作用しないことが本発明において好ましい特徴である。このように人工組織に直接作用させないことによって、人工組織の損傷を抑えることができるからである。あるいは、分離する工程は、アクチン調節物質の添加のような化学的手段を含む。このようなアクチン調節物質は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む。例えば、アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１(actin-interacting-protein 1)、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)などを挙げることができる。他方、アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびTGFβなどを挙げることができる。
【０１７９】
理論に束縛されることを望まないが、これらのアクチン調節物質は、アクト−ミオシン系の細胞骨格の収縮または弛緩を引き起こし、それにより、細胞自体の収縮または伸縮を調節することになり、結果として、容器の底面から、人工組織自体が分離することを促進または遅延する作用になると考えられる。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、単層培養された細胞から作製されることが特徴の一つである。単層培養するにもかかわらず、結果として、種々の厚みを持つ人工組織を構築することができるようになったということは、従来の例えば、温度応答性シートなどを用いた場合に複数のシートを重ね合わせないと厚い組織が構成できなかったということからは予想できなかった効果であるといえる。フィーダー細胞が不要で、十層以上の細胞の重層化が可能な三次元化の方法は、本発明が初めて達成したものである。スキャフォールドを用いない細胞移植方法としては、非特許文献３による温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。
【０１８１】
本研究で開発する細胞・マトリックス複合体は細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるFeeder細胞の使用無しに10層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術は世界的に見当たらない。また、滑膜細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科的操作が可能となる強度を保持する複合体の作成も可能であり、本法は、世界的に見ても、細胞移植を確実にかつ安全に行うための独創的で画期的な手法となる可能性がある。
【０１８２】
好ましい実施形態では、本発明の人工組織生産法に用いられる細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸２リン酸を含む（Hata R, Senoo H.J Cell Physiol. 1989; 138(1):8-16参照）。本発明では、アスコルビン酸２リン酸を一定量以上加えることによって、細胞外マトリクスの生産が促進され、その結果、得られる人工組織または複合体が硬化され、剥離しやすくなる。この後、剥離の刺激を与えることによって自己収縮が行われる。このようなアスコルビン酸を加えて培養した後、組織が硬化し、剥離しやすくなる性質を獲得することは、Ｈａｔａらの報告には記載されていない。理論に束縛されないが、一つの顕著な相違点として、Ｈａｔａらは、使用した細胞密度が顕著に異なるという点にある。また、Ｈａｔａらは、硬化効果を示唆すらしておらず、このような硬化および収縮効果、および剥離しやすくなるという効果は、本発明によって初めて見出されたものであり、本発明の人工組織は、従来製造されてきたものとは硬化、収縮、剥離などの手順を経て生産されている点で、少なくとも全く異なるものであるということができる。
【０１８３】
培養物を剥がしたときに収縮し、三次元化、重層化などが促進されたということは驚くべき効果である。そのようなことは、従来報告されていない。
【０１８４】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるアスコルビン酸２リン酸は、通常少なくとも０．０１ｍＭで存在し、好ましくは少なくとも０．０５ｍＭで存在し、さらに好ましくは少なくとも０．１ｍＭで存在する。より好ましくは少なくとも０．２ｍＭの濃度で存在することが好ましい。さらに好ましくは、０．５ｍＭの濃度、さらにより好ましくは１．０ｍＭの濃度で存在することが好ましい。ここでは、０．１ｍＭ以上であればどのような濃度でも用いることができるが、好ましくは、１０ｍＭ以下であることが所望され得る局面も存在し得る。
【０１８５】
ある好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸２リン酸またはその塩およびＬ−アスコルビンまたはその塩を含む。
【０１８６】
好ましい実施形態では、本発明の人工組織生産法では、培養した工程に続き、Ｄ）人工組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む。剥離は、物理的な刺激（例えば、容器の角に棒などで物理的刺激（ずり応力印加、ピペッティング、容器の変形など）を与えるなど）を行うことによって促進することができる。自己収縮は、このような剥離の後、物理的刺激が与えられる場合、自然に起こる。化学的刺激の場合は、自己収縮および剥離が並行して生じる。自己収縮により、特に第三次元方向（シート上の組織に関する場合、二次元方向と鉛直な方向）の生物学的結合が促進される。このようにして製造されることから、本発明の人工組織は、三次元構造体という形態をとるといえる。
【０１８７】
本発明の人工組織生産法では、十分な時間とは、目的とする人工組織の用途によって変動するが、好ましくは少なくとも３日間を意味する（例示的な期間としては、３〜７日間を挙げることができる）。
【０１８８】
別の実施形態において、本発明の人工組織生産法は、人工組織を分化させる工程、をさらに含み得る。分化させることによって、所望の組織により近い形態を採らせることができるからである。そのような分化としては、例えば、軟骨分化、骨分化を挙げることができるがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸２リン酸を含む培地中で行われ得る。より好ましくは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ類）を加える。このようなＢＭＰ２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７は、骨の形成をより促進するからである。
【０１８９】
別の実施形態において、本発明の人工組織生産法は、人工組織を分化させる工程であって、分化としては、例えば、軟骨分化を行う形態が挙げられる。好ましい実施形態では、軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸２リン酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸を含む培地中で行われ得る。より好ましくは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）を加える。このようなＢＭＰは、軟骨の形成をより促進するからである。
【０１９０】
本発明において留意されるべき点として、骨および軟骨などの種々の分化細胞への分化能を有する組織を製造できることがある。軟骨組織への分化は、これまで他のスキャフォールドフリーの人工組織では困難であった。ある程度の大きさが必要な場合は、従来では、スキャフォールドと共培養し、三次元化させて、軟骨分化培地を入れることが必要であった。従来では、スキャフォールドフリーで軟骨分化させることは困難であった。本発明において、初めて、人工組織中の軟骨分化も可能になった。これはかつて実証されていない結果であって、本発明の特徴的な効果の一つである。組織再生を目指す細胞治療においてスキャフォールドなしに有効かつ安全に、十分な大きさの組織を用いて治療を行う方法は困難であった。本発明は、この意味では、顕著な効果を達成するといえる。特に、軟骨など、従来では不可能であった、分化細胞でも自在に操れるようになったという点でその意義は深い。従来であれば、例えば、ペレット状に細胞を集めて、その細胞塊を分化させて２ｍｍ３程度のものを作ることはできていたが、このような大きさを超える場合は、スキャフォールドを使用せざるを得ない。
【０１９１】
本発明の人工組織作製法に含まれる分化工程は、前記細胞の提供の前または後に行われ得る。
【０１９２】
本発明において使用される細胞は、初代培養のものを使用することができるが、それに限定されず、継代した細胞（例えば、３代以上）を用いることもできる。好ましくは、継代した細胞を用いる場合、細胞は、４継代以上の細胞を用いることが好ましく、より好ましくは、５継代以上の細胞を用い、さらに好ましくは、６継代以上の細胞を用いることが有利である。細胞密度の上限が、継代数を一定程度上げるに従って上がっていくことから、より密な人工組織を作製することができると考えられるからであるが、それに限定されず、むしろ、一定範囲の継代数（例えば、３代〜８代）が適切であるようである。
【０１９３】
本発明では、細胞は、好ましくは、５．０×１０４／ｃｍ２以上の細胞密度で提供されるがそれに限定されない。細胞密度を十分上げることによって、より強度の高い人工組織を提供することができるからである。ただし、下限は、これよりも低くあり得ることが理解される。当業者は、本明細書の記載に基づき、そのような下限を規定することができることが理解される。
【０１９４】
１つの実施形態において、本発明において使用され得る細胞としては、例えば、筋芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織または骨髄由来）を用いることができるが、それらに限定されない。このような細胞は、例えば、心臓、骨、軟骨、腱、靭帯、関節、半月などに適用可能である。
【０１９５】
（人工組織および複合体）
別の局面において、本発明は、人工組織または複合体を提供する。本明細書では、本発明の人工組織は、移植可能な人工組織である。これまでも細胞培養によって人工組織を作製することが試みられているが、いずれも、大きさ、強度、培養容器からの剥離のときの物理的損傷などによって移植に適した人工組織とはなっていなかった。本発明は、上述のような細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって、大きさ、強度などの点で問題が無く、剥離させるときに特に困難を伴わない組織培養方法が提供された。このような組織培養法が提供されたことによって、初めて移植可能な人工組織が提供されたことになる。
【０１９６】
別の局面において、本発明は、細胞と、該細胞に由来する成分とを含む複合体を提供する。ここで、好ましくは、この複合体は、実質的に細胞と該細胞に由来する成分からなることが理解される。ここで、本発明の複合体は、生体の部分を補強、修復または再生するために提供される。
【０１９７】
本明細書において、「複合体」とは、細胞と、他の成分とが何らかの相互作用によって、複合体化したものを指す。従って、本発明の複合体は、人工組織様の外観を呈することが多く、その意味で、人工組織と指すものが重複することが理解される。
【０１９８】
本発明は、スキャフォールドフリーの人工組織または複合体を提供する。このようなスキャフォールドフリーの人工組織を提供することによって、移植後の経過に優れた治療法および治療剤が提供される。
【０１９９】
本発明はまた、スキャフォールドフリーの人工組織という点により、生物製剤における長期にわたる規制の問題の一つである、スキャフォールド自体の混入に起因する問題を一挙に解決する。また、スキャフォールドがないにもかかわらず、治療効果は従来のものに比べても遜色ないどころか、より良好である。
【０２００】
このほか、スキャフォールドを用いた場合に、スキャフォールド内の移植細胞の配向性、細胞間接着性の問題、スキャフォールド自体の生体における変化（炎症惹起）およびスキャフォールドのレシピエント組織への生着性などの問題を解決することができる。
【０２０１】
本発明の人工組織および複合体はまた、自己組織化しており、内部において生物学的結合が行われているという点で、従来の細胞治療とも一線を画すことができる。
【０２０２】
本発明の人工組織および複合体はまた、三次元形態を容易に形成することができ、所望の形態に容易に設計することができることから、その汎用性に留意されるべきである。
【０２０３】
本発明の人工組織および複合体は、周囲の組織、細胞などの移植後環境との生物学的結合を有することから、術後の定着がよい、細胞が良好の供給されるなどの優れた効果が奏される。本発明の効果としては、このような生物学的結合性の良好さから、他の人工組織などと複合組織を形成することによって複雑な治療を行うことができる点にもある。
【０２０４】
本発明の別の効果は、人工組織および複合体として提供した後、分化誘導をかけることができるという点にある。あるいは、人工組織および／または複合体として提供する前に、分化誘導をかけて、そのような人工組織および／または複合体を形成することができいる点にもある。
【０２０５】
本発明の他の効果は、細胞移植という観点から、従来の細胞のみの移植、シートを用いた移植などと比べて、置換性がよい、被覆することによる総合的な細胞供給などの効果が奏される点にある。
【０２０６】
本発明によって、生物学的結合能を有し、移植可能な人工組織が提供される。このような組織は、上記特徴および効果を有することによって、従来人工物での移植処置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明の人工組織は、組織内および他の組織との間での生物学的結合を有しており、実際に移植治療において機能する。このような人工組織は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。本発明の人工組織は、移植後の周囲の組織、細胞などと生物学的に結合する能力を有し（好ましくは細胞外マトリクスによる）、従って、術後の経過に優れる。このような生物学的結合能を有する人工組織は、従来存在しておらず、従って、本発明は、従来の人工組織では達成できなかった治療効果を奏することになる。
【０２０７】
さらに、本発明により、疾患部分を充填し、置換させること、および／または疾患部位を被覆することによって治療効果をもたらす医療処置が可能となった。
【０２０８】
また、本発明は、他の人工組織（例えば、ハイドロキシアパタイトでできた人工骨など、微線維性コラーゲン医療材料など）とともに用いることにより、他の人工組織と生物学的に結合することによって、従来では達成できなかった人工組織の定着の向上が得られた。
【０２０９】
本発明の人工組織は、組織全体にフィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスまたは細胞接着因子が分布、一方細胞シート工学では培養細胞のシャーレへの接着面に細胞接着因子は局在している。そして最たる違いは細胞シート工学ではシートの主体は細胞であり、シートは接着因子のノリを底面に付けた細胞の塊といえるが、本発明者らの人工組織は文字通り細胞外マトリックスが細胞を包んだ「組織」であるという点が従来のものとは顕著に異なるといえる。
【０２１０】
スキャフォールド（基盤）材料を用いない細胞移植方法としては、非特許文献３に記載される温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。本発明はこのような問題を解決した。
【０２１１】
本研究で開発する細胞・マトリックス複合体は細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるFeeder細胞の使用無しに10層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術は世界的に見当たらない。また、滑膜細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科的操作が可能となる強度を保持する複合体の作成も可能であり、本発明は、世界的に見ても、細胞移植を確実にかつ安全に行うための独創的で画期的な手法となるという点でも効果を有するといえる。
【０２１２】
好ましい実施形態では、本発明の人工組織は、周囲との生物学的結合能（integrationcapability）を有する。ここで、周囲とは、代表的には、移植される環境をいい、例えば、組織、細胞などを挙げることができる。周囲の組織、細胞などの生物学的結合能は、例えば、顕微鏡写真、物理的試験、生物学的マーカーの染色などによって確認することができる。従来の人工組織は、移植された環境にある組織などの親和性は少なく、生物学的結合能が発揮できるなどとは想定すらされていなかった。むしろ、従来の人工組織は、生体の持つ再生能力に依拠し、自己細胞などが集積し、再生するまでの橋渡しの役割を果たしており、従って、恒久的な使用は意図されていなかった。従って、本発明の人工組織は、真の意味で移植治療を構成することができると解釈されるべきである。従って、本発明において言及される生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含むことが好ましい。そのような接着能は、組織片（例えば、軟骨片）とのインビトロ培養アッセイ（図１８を参照）によって測定することができる。
【０２１３】
本発明が対象とする「疾患」としては、変性、壊死、損傷などを伴う任意の疾患をいい、例えば、変形性関節症、骨軟骨損傷、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性または腱変性、組織に傷害がある任意の心疾患であり得る。そのような心疾患としては、心不全、難治性心不全、心筋梗塞、心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症などが挙げられる。本発明の併用療法は、組織傷害の再生を目的とする限り、心臓以外の臓器の傷害を再生するためにも適用され得る。特定の実施形態において、本発明の方法が対象とする疾患は、難治性心不全である。
【０２１４】
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないようにするか、そのような状態を低減した状態で生じさせるかまたはその状態が起こることを遅延させるように処置することをいう。
【０２１５】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。本明細書では「根治的治療」とは、病的過程の根源または原因の根絶を伴う治療をいう。従って、根治的治療がなされる場合は、原則として、その疾患の再発はなくなる。
【０２１６】
本明細書において「予後」とは、予後の処置ともいい、ある疾患または障害について、治療後の状態を診断または処置することをいう。
【０２１７】
好ましい実施形態では、本発明の人工組織または複合体は、三次元方向に生物学的に結合されている。ここで、生物学的結合は、本明細書において他の場所において説明されており、例えば、細胞外マトリクスによる物理的結合、電気的結合などが挙げられるがそれらに限定されない。特に、細胞を含む好ましい実施形態では、組織内の細胞外マトリクスが生物学的に結合されていることが重要である。そのような生物学的に結合された状態の人工組織は、これまでに提供されていないことから、この実施形態の本発明の人工組織は、構造上も新規であるといえる。さらに、周囲との生物学的結合能を有する好ましい実施形態では、移植後も生体の一部を構成することができる人工組織を提供するという点で、従来になかった人工組織であるといえる。本発明は、一旦凍らせて、細胞を死滅させたような真の意味での細胞が含まれていない人工組織を提供することができる。このような場合でも、周囲との接着性を有するという点は依然としてユニークである。
【０２１８】
１つの実施形態において、本発明の人工組織は、従来の人工組織とは、細胞を含むという点で異なるということができる。特に、細胞密度が、例えば、最大５×１０６／ｃｍ２までも含めることができるという点でその高密度性が留意されるべきである。組織として移植するというよりは、細胞を移植するのに適しているという点で注目されるべきである。
【０２１９】
好ましくは、本発明の人工組織または複合体は、実質的に細胞または該細胞に由来する物質から構成される。実質的に細胞および細胞に由来する物質（例えば、細胞外マトリクス）のみから構成されることによって、生体適合性および生体定着性を上げることができる。ここで、「実質的に・・・構成される」とは、細胞とその細胞に由来する物質とを含み、他に有害な影響（ここでは、主に、移植への悪影響）を与えない限り、他の物質を含んでいてもいいと定義され、本明細書においてはそのように理解されるべきである。そのような有害な影響を与えない物質は、当業者に公知であるか、または簡単な試験を行うことによって確認することができる。代表的には、厚生労働省、ＦＤＡなどにおいて認可されている任意の添加成分、細胞培養に伴う成分などを挙げることができるがそれらに限定されない。ここで、細胞に由来する物質は、代表的に細胞外マトリクスを含む。特に、本発明の人工組織または複合体では、細胞と細胞外マトリクスが適切な割合で含まれていることが好ましい。そのような適切な割合とは、例えば、細胞と細胞外マトリクスとの比が１：３〜２０：１の範囲、細胞と細胞外マトリクスの比率によって組織の強度が調節されるので、細胞移植の用途および移植先での力学環境に応じて細胞と細胞外マトリクスとの比を調節して使用することができる。好ましい比率は、目的とする処置によって変動するが、そのような変動は、当業者には自明であり、目的とする臓器における細胞および細胞外マトリクスの比率を調査することによって、推定することができる。
【０２２０】
好ましくは、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される人工組織は、これまでに知られておらず、従って、本発明は、全く新規の人工組織を提供するといえる。
【０２２１】
好ましくは、本発明を構成する細胞外マトリクスとしては、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンなどを挙げることができる。好ましくは、このような種々の細胞外マトリクスは、列挙したものすべて含まれていることが好ましく、それらは一体化して混合されていることが好ましい。あるいは、これらは、全体にわたって細胞外マトリクスが散在していることが好ましい。このような分布は移植された場合に環境との適合性および親和性を向上させるという点で格別な効果を奏する。本発明では、特に、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ型）をはじめ、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどが含まれていることにより、基質への細胞接着、細胞伸展、および細胞走化性を促進する、細胞間マトリクスの接着も促進されるという特徴を有することで知られている。しかし、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ型）、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどが一体化されて含まれているような人工組織はこれまで提供されていなかった。理論に束縛されることを希望しないが、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ型）、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどは、周囲との生物学的結合能を発揮するのに役割を果たしていると考えられる。従って、好ましい実施形態では、本発明の人工組織または複合体においてビトロネクチンが分散して表面に配置されていることが有利である。移植後の接着、定着、安定性が格段に異なると考えられるからである。
【０２２２】
フィブロネクチンもまた、本発明の人工組織または複合体において配置されることが好ましい。フィブロネクチンは、細胞接着，細胞の形の制御，細胞移動を調節する役割を有することが知られている。しかし、フィブロネクチンが発現しているような人工組織はこれまで提供されていなかった。理論に束縛されることを希望しないが、フィブロネクチンもまた周囲との生物学的結合能を発揮するのに役割を果たしていると考えられる。従って、好ましい実施形態では、本発明の人工組織においてフィブロネクチンもまた分散して表面に配置されていることが有利である。移植後の接着、定着、安定性が格段に異なると考えられるからである。
【０２２３】
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞外マトリクスを人工組織または複合体に配置することは、本発明の人工組織生産方法によって、容易に達成されることが理解されるが、作製方法としてはそれに限定されないことが理解される。
【０２２４】
より好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞外マトリクスは、分散して配置されることが有利である。そのような分散形態での細胞外マトリクスの配置は、従来の人工組織では、不可能であったことであり、本発明により初めて提供されることが理解される。
【０２２５】
好ましい実施形態において、人工組織または複合体に分散して配置される細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まることが好ましい。分布密度の測定は、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、免疫染色などを挙げることができる。
【０２２６】
好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：２〜２：１、さらに好ましくは約１．５：１〜１．５：１の範囲内の比率に収まる。細胞外マトリクスの配置の分散は、均等に分散されていることが有利である。従って、好ましくは、ほぼ均一に分散されていてもよいが、それに限定されない。
【０２２７】
１つの実施形態において、本発明において配置される細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどを含み得る。
【０２２８】
別の実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、異種細胞、同種異系細胞、同系細胞または自家細胞を用いることができる。本発明では、同種異系細胞であっても、特に、間葉系細胞を用いた場合、免疫拒絶などの有害な副反応がほとんど生じないことが分かった。従って、本発明は、エキソビボのような治療の他、免疫拒絶抑制剤などを使用せずに、他人の細胞を用いて人工組織を生産して利用するという治療法に途を啓くことになる。
【０２２９】
１つの好ましい実施形態において、本発明の人工組織または複合体が含む細胞は、幹細胞であっても分化細胞であっても両方を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、本発明の三次元構造体が含む細胞は、間葉系細胞である。理論に束縛されないが、間葉系細胞が好ましいのは、間葉系細胞自体が心臓など臓器と適合性が優れているからであり、種々の組織または臓器などへ分化する能力を有し得るからである。
【０２３０】
そのような間葉系細胞は、間葉系幹細胞であっても間葉系の分化細胞であってもよい。
【０２３１】
本発明において使用される間葉系細胞としては、例えば、骨髄、脂肪細胞、滑膜細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において使用される間葉系幹細胞としては、例えば、脂肪組織由来の幹細胞、骨髄由来の幹細胞などを用いることができる。
【０２３２】
好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞は、人工組織または複合体が適用される被験体に由来する細胞であることが有利である。このような場合、本明細書において使用される細胞は自己細胞ともいわれるが、自己細胞を用いることによって、免疫拒絶反応を防ぐかまたは低減することができる。
【０２３３】
あるいは、別の実施形態では、本発明において使用される細胞は、人工組織または複合体が適用される被験体に由来しない細胞であってもよい。この場合、好ましくは、免疫拒絶反応を防ぐ手段が講じられることが好ましい。
【０２３４】
本発明の人工組織または複合体は、医薬として提供されていてもよい。あるいは、本発明の人工組織または複合体は、医師などが医療現場で調製してもよく、または、医師が細胞を調製した後、その細胞を第三者が培養して三次元構造体として調製し、手術に用いてもよい。この場合、細胞の培養は、医師でなくても、細胞培養の当業者であれば実施することができる。従って、当業者であれば、本明細書における開示を読めば、細胞の種類および目的とする移植部位に応じて、培養条件を決定することができる。
【０２３５】
別の実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、単離されていることが好ましい。単離とは、この場合、培養に用いたスキャフォールド、支持体、培養液などから分離されていることを意味する。スキャフォールドなどの物質が実質的に存在しないことによって、本発明の人工組織は、移植後の免疫拒絶反応、炎症反応などの有害反応を抑えることができる。
【０２３６】
本発明の人工組織の底面積は、例えば、１ｃｍ２〜２０ｃｍ２であり得るが、それに限定されず、１ｃｍ２以下でもよく、２０ｃｍ２以上でもいい。本発明の本質は、どのような大きさ（面積、容積）のものでも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
【０２３７】
好ましい実施形態において、本発明の人工組織は、肉厚である。肉厚とは、通常移植対象の部位を被覆するに十分な強度を有する程度の厚みをいう。そのような面積は、例えば、少なくとも約５０μｍ以上であり、より好ましくは、少なくとも約１００μｍ以上であり、少なくとも約２００μｍ以上であり、少なくとも約３００μｍ以上であり、さらに好ましくは少なくとも約４００μｍ以上であり、あるいは少なくとも約５００μｍまたは約１ｍｍであることがさらに好ましい。場合によっては、３ｍｍ以上および５ｍｍ以上の厚さのものも作製できることが理解される。あるいは、このような厚さは、１ｍｍ未満であってもよい。本発明の本質は、どのような厚さの組織または複合体でも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
【０２３８】
本発明は、スキャフォールドフリーの人工組織または複合体を提供する。このようなスキャフォールドフリーの人工組織を提供することによって、移植後の経過に優れた治療法および治療剤が提供される。
【０２３９】
本発明はまた、スキャフォールドフリーの人工組織という点により、生物製剤における長期にわたる規制の問題の一つである、スキャフォールド自体の混入に起因する問題を一挙に解決する。また、スキャフォールドがないにもかかわらず、治療効果は従来のものに比べても遜色ないどころか、より良好である。
【０２４０】
このほか、スキャフォールドを用いた場合に、スキャフォールド内の移植細胞の配向性、細胞間接着性の問題、スキャフォールド自体の生体における変化（炎症惹起）およびスキャフォールドのレシピエント組織への生着性などの問題を解決することができる。
【０２４１】
本発明の人工組織および複合体はまた、自己組織化しており、内部において生物学的結合が行われているという点で、従来の細胞治療とも一線を画すことができる。
【０２４２】
本発明の人工組織および複合体はまた、三次元形態を容易に形成することができ、所望の形態に容易に設計することができることから、その汎用性に留意されるべきである。
【０２４３】
本発明の人工組織および複合体は、周囲の組織、細胞などの移植後環境との生物学的結合を有することから、術後の定着がよい、細胞が確実に供給されるなどの優れた効果が奏される。本発明の効果としては、このような生物学的結合性の良好さから、他の人工組織などと複合組織を形成することによって複雑な治療を行うことができる点にもある。
【０２４４】
本発明の別の効果は、人工組織および複合体として提供した後、分化誘導をかけることができるという点にある。あるいは、人工組織および／または複合体として提供する前に、分化誘導をかけて、そのような人工組織および／または複合体を形成することができいる点にもある。
【０２４５】
本発明の他の効果は、細胞移植という観点から、従来の細胞のみの移植、シートを用いた移植などと比べて、置換性がよい、被覆することによる総合的な細胞供給などの効果が奏される点にある。
【０２４６】
本発明によって、生物学的結合能を有し、移植可能な人工組織が提供される。このような組織は、上記特徴および効果を有することによって、従来人工物での移植処置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明の人工組織は、組織内および環境との間で生物学的結合を有しており、実際に移植治療において機能する。このような人工組織は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。本発明の人工組織は、移植後の周囲の組織、細胞などと生物学的に結合する能力を有し（好ましくは細胞外マトリクスによる）、従って、術後の経過に優れる。このような生物学的結合能を有する人工組織は、従来存在しておらず、従って、本発明は、従来の人工組織では達成できなかった治療効果を奏することになる。
【０２４７】
さらに、本発明により、疾患部分を充填し、置換させること、および／または疾患部位を被覆することによって治療効果をもたらす医療処置が可能となった。
【０２４８】
また、本発明は、他の人工組織（例えば、ハイドロキシアパタイトでできた人工骨、微線維性コラーゲン医療材料など）とともに用いることにより、他の人工組織と生物学的に結合することによって、従来では達成できなかった人工組織の定着の向上が得られた。このような組織は、複合組織という。
【０２４９】
本発明の人工組織または複合体は、組織全体にフィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスまたは細胞接着因子が分布、一方細胞シート工学では培養細胞のシャーレへの接着面に細胞接着因子は局在している。そして最たる違いは細胞シート工学ではシートの主体は細胞であり、シートは接着因子のノリを底面に付けた細胞の塊といえるが、本発明者らの人工組織は文字通り細胞外マトリックスが細胞を包んだ「組織」であるという点が従来のものとは顕著に異なるといえる。
【０２５０】
スキャフォールド（基盤）材料を用いない細胞移植方法としては、非特許文献３による温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。本発明はこのような問題を解決した。
【０２５１】
本研究で開発する細胞・マトリックス複合体は細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるFeeder細胞の使用無しに10層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術は世界的に見当たらない。また、細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科的操作が可能となる強度を保持する複合体の作成も可能であり、本発明は、世界的に見ても、細胞移植を確実にかつ安全に行うための独創的で画期的な手法となるという点でも効果を有するといえる。
【０２５２】
別の実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、可撓性である。可撓性であることによって、特に、運動性の臓器の補強に適切となる。そのような臓器としては、例えば、心臓、血管、筋肉などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５３】
別の実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、伸縮性を有する。伸縮性を有することによって、伸び縮みする臓器、例えば、心臓、筋肉などにおける適用が可能となる。このような伸縮性は、従来の方法で調製された細胞シートなどでは達成されなかった性質である。好ましくは、本発明の人工組織または複合体は、心臓の拍動運動に耐え得る強度を有する。そのような拍動運動に耐え得る強度とは、例えば、少なくとも天然の心筋が有する強度の少なくとも約５０％以上、好ましくは少なくとも約７５％以上、より好ましくは少なくとも約１００％以上であることが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５４】
好ましい実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、三次元方向すべてに生物学的結合がある。従来の方法で調製された人工組織は、二次元方向には生物学的結合がある程度見られるものがあったが、三次元方向にあった組織は調製されていない。従って、本発明の人工組織は、このように三次元方向すべての生物学的結合を有することによって、どのような用途においても実質的に移植可能という性質がもたらされる。
【０２５５】
本発明の人工組織または複合体において指標となる生物学的結合としては、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合、細胞間情報伝達の存在が挙げられるがそれらに限定されない。細胞外マトリクスの相互作用は細胞間の接着を顕微鏡で適宜染色して観察することができる。電気的結合は、電位を測定することによって観察することができる。
【０２５６】
好ましい実施形態において、本発明の人工組織は、臨床適用することができる組織強度を有する。臨床適用することができる組織強度は、適用が意図される部位に応じて変動する。そのような強度は、当業者が本明細書の開示を参照して、当該分野における周知技術を参酌することによって決定することができる。本発明の人工組織は、引っ張り強度は弱くてもいい。そのような引っ張り強度は、細胞・細胞外マトリクス比率におけるマトリクス濃度をあげると強くなり、細胞比率を上げると弱くなる。本発明は、必要に応じて強度も自由に調整できることが特徴の一つである。移植される組織に対して相対的に近似して強くも弱くもできることが特徴である。従って、そのような任意の場所に応じて目的と設定することができることが理解される。
【０２５７】
別の実施形態において、本発明の人工組織または複合体の強度は、自己支持性を有するに十分であることが好ましい。従来の人工組織は、作製後、自己支持性を有していなかった。従って、従来の人工組織を移動させると、少なくとも一部が損傷していた。しかし、本発明の技術を用いた場合、自己支持性を有する人工組織が提供された。従って、本発明は、従来技術では提供できなかった人工組織を提供する。そのような自己支持性は、０．５〜３ｍｍの先端（好ましくは、１〜２ｍｍの太さの先端、さらに好ましくは１ｍｍの太さの先端）を有するピンセットで組織をつまみあげたときに、実質的に破壊されないことが好ましい。ここで、実質的に破壊されないとは、目視によって確認することができるが、上記条件にてつまみ上げた後に、例えば、水漏れ試験を行ったときに、水が漏れないことなどによって確認することができる。あるいは、上述のような自己支持性は、ピンセットではなく、手でつまみあげたときに破壊されないことによっても確認することができる。
【０２５８】
特定の実施形態において、上記臨床適用が意図される部分としては、骨、関節、軟骨、半月、腱、靭帯、腎臓、肝臓、滑膜、心臓などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の人工組織に含まれる細胞の由来は、臨床適用される用途に影響されないことが特徴である。
【０２５９】
また、組織が軟骨である場合、人工組織が該関節内組織の欠損部に移植された後人工的に固定することなく（例えば、２、３分後）、該人工組織が残存していることによって、接着性を検定することができる。
【０２６０】
別の局面において、本発明は、細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物を提供する。この細胞培養組成物は、細胞を維持または増殖させるための成分（例えば、市販される培地など）；および細胞外マトリクス産生促進因子を含む。このような細胞外マトリクス産生促進因子に関する説明は、上述の人工組織生産法において詳述した。従って、この細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸またはその誘導体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、アスコルビン酸１リン酸またはその塩、アスコルビン酸２リン酸またはその塩、Ｌ−アスコルビン酸またはその塩など）を含む。ここで、本発明の培養組成物において含まれるアスコルビン酸２リン酸またはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで存在するか、あるいは濃縮培養組成物の場合は、調製時に少なくとも０．１ｍＭとなるように含まれている。あるいは、アスコルビン酸類は、０．１ｍＭ以上であれば、ほとんど効果は変わらないようである。０．１ｍＭであれば十分であるといえる。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３であれば、１ｎｇ／ｍｌ以上、代表的には、１０ｎｇ／ｍｌの量が十分であり得る。
【０２６１】
あるいは、本発明は、このような細胞外マトリクス産生促進因子を備える、人工組織生産のための組成物を提供し得る。
【０２６２】
本発明の人工組織生産法に用いられる細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸２リン酸を含む（Hata R, Senoo H.J Cell Physiol. 1989; 138(1):8-16参照）。本発明では、アスコルビン酸２リン酸を一定量以上加えることによって、細胞外マトリクスの生産が促進され、その結果、得られる人工組織または複合体が硬化され、剥離しやすくなる。この後、剥離の刺激を与えることによって自己収縮が行われる。しかも、このようなアスコルビン酸を加えて培養した後、組織が硬化し、剥離しやすくなる性質を獲得することは、Ｈａｔａらの報告には記載されていない。理論に束縛されないが、一つの顕著な相違点として、Ｈａｔａらは、使用した細胞密度が顕著に異なるという点にある。また、Ｈａｔａらは、硬化効果を示唆すらしておらず、このような硬化および収縮効果、および剥離しやすくなるという効果は、本発明によって初めて見出されたものであり、本発明の人工組織は、従来製造されてきたものとは硬化、収縮、剥離などの手順を経て生産されている点で、少なくとも全く異なるものであるということができる。
【０２６３】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるアスコルビン酸２リン酸は、通常少なくとも０．０１ｍＭで存在し、好ましくは少なくとも０．０５ｍＭで存在し、さらに好ましくは少なくとも０．１ｍＭで存在する。より好ましくは少なくとも０．２ｍＭの濃度で、さらに好ましくは少なくとも０．５ｍＭの濃度で存在することが好ましい。さらに好ましくは最低限度の濃度は、１．０ｍＭであり得る。
【０２６４】
細胞密度については、特に限定されないが、１つの実施形態において、細胞は、１ｃｍ２あたり、５×１０４細胞〜５×１０６細胞で配置される。この条件は、例えば、筋芽細胞に適用され得る。この場合、細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸類として、少なくとも０．１ｍＭ提供されることが好ましい。厚い人工組織が作成可能であるからである。この場合、濃度を増やすと、細胞外マトリクスで密な人工組織が形成される。少ない場合は、細胞外マトリクス量が減少するが、自己支持性は保たれる。
【０２６５】
（置換および被覆のための人工組織）
別の局面において、本発明は、動物の生体の部分を補強するための人工組織または複合体を提供する。このような補強を行うことができる人工組織または複合体は、本発明の人工組織生産法によって初めて達成された技術である。本発明の人工組織または複合体は、自己支持性を有することから、従来提供されなかったような用途（例えば、充填（置換）補強、全体の補強、漏れのない補強、被覆など）にも使用可能である。特に、充填、置換補強（すなわち、細胞供給）が顕著に改善されたという点では、本発明は顕著な効果を奏する。また、分化誘導をかけることができるという点でもその適用範囲は拡大する。
【０２６６】
本発明の特定の実施形態において、上記補強は、上記部分を被覆するように本発明の人工組織を配置することによって達成され得る。従来の方法で提供される人工組織は、このような、置換および／または被覆による処置が不可能であったことから、本発明の人工組織または複合体は、従来技術で達成不可能であった用途を提供することになる。
【０２６７】
従って、そのような特定の実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、上記部分の伸縮に対して抵抗性を有する。
【０２６８】
好ましい実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、生物学的結合を有することが有利である。
【０２６９】
別の好ましい実施形態において、生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合、細胞間の情報伝達のうち少なくとも１つを含む。
【０２７０】
別の好ましい実施形態において、本発明の補強用人工組織は、細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって形成される。
【０２７１】
別の実施形態において、本発明の補強用人工組織または複合体は、処置該当される動物（例えば、ヒト）に由来する細胞（自己細胞）を含む。より好ましくは、本発明の補強用人工組織は、処置該当される動物（例えば、ヒト）に由来する細胞（自己細胞）のみを細胞として含む。
【０２７２】
本発明の補強または置換方法が対象とするものは、例えば、軟骨全層損傷；軟骨部分損傷；骨軟骨損傷；骨壊死；変形性関節症；半月損傷；靭帯修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）腱（アキレス腱を含む）修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）；腱板修復（特に、陳旧性、変性断裂など）；骨折遷延治癒；偽関節；骨格筋修復・再生；心筋再生（変性部または壊死部などの修復促進）などを行うことができる。
【０２７３】
（置換および被覆を用いた治療法）
別の局面において、本発明は、動物の生体の部分を補強するための方法を提供する。この方法は、Ａ）人工組織または複合体を、該部分を置換するようにおよび／または被覆するように配置する工程；およびＢ）該人工組織または複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間保持する工程、を包含する。ここで、ある部分を置換するように配置するとは、代表的には、罹患部を必要に応じて掻爬（ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ、ｃｕｒｅｔａｇｅ）し、罹患部に本発明の人工組織または複合体を配置して、置換が促進されるように静置することをいう。このような置換は、細胞の充填を目的としており、当該分野において公知の技術を組み合わせて用いることができる。ここで、ある部分を被覆するように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。ここで、十分な時間は、その部分と人工組織との組み合わせによって変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応じて適宜容易に決定することができる。このような時間としては、例えば、術後１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、人工組織は、好ましくは実質的に細胞およびそれに由来する物質のみを含むことから、特に術後に摘出する物質が必要であるというわけではないので、この十分な時間の下限は特に重要ではない。従って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえるが、実質的には極端に長い場合は、実質的に補強が完了したといえ、特に限定する必要はない。本発明の人工組織はまた、自己支持性を有することから、ハンドリングが楽で、実際の処置時に破壊されず、手術も容易であるという特徴も有する。
【０２７４】
別の実施形態において、本発明の補強方法では、上記部分は、袋状臓器（例えば、心臓、肝臓、腎臓など）を含むことが好ましい。そのような袋状組織の補強には、置換または被覆が必要である。置換または被覆のための用途で抵抗可能な人工組織は、本発明によって初めて提供された。従って、本発明の補強方法は、従来達成されなかった画期的な方法を提供することになる。
【０２７５】
あるいは、上記部分は、骨または軟骨を含み得る。そのような例としては、半月、靭帯、腱などを挙げることができるがそれに限定されない。本発明の方法は、心臓、骨、軟骨、靭帯、腱または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するために利用され得る。
【０２７６】
特に、本発明の補強方法では、本発明の人工組織または複合体は、上記部分の伸縮に対して抵抗性を有する。このような伸縮の例としては、心臓の拍動運動、筋肉の収縮などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２７７】
別の好ましい実施形態では、本発明の補強方法では、本発明の人工組織または複合体は、生物学的結合（例えば、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合、細胞間の情報伝達など）を含む。この生物学的結合は、三次元方向すべてにおいて有されていることが好ましい。
【０２７８】
別の好ましい実施形態において、本発明の補強方法は、細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養して本発明の人工組織または複合体を形成する工程をさらに包含する。このような細胞外マトリクス産生促進因子の存在下での培養を包含する方法の移植・再生技術は、従来提供されていなかった方法であり、このような方法によって、従来治療が不可能とされていた疾患（例えば、軟骨損傷、難治性骨折など）を治療することができるようになった。
【０２７９】
好ましい実施形態において、本発明の補強方法において、本発明の人工組織または複合体において使用される細胞は、移植が意図される動物に由来する細胞（すなわち、自己細胞）である。自己細胞の使用により、免疫拒絶反応などの有害な副作用を回避することができる。
【０２８０】
別の好ましい実施形態では、本発明の補強方法が対象とする部分は心臓である。
【０２８１】
本発明の治療方法が対象とするものは、例えば、軟骨全層損傷；軟骨部分損傷；骨軟骨損傷；骨壊死；変形性関節症；半月損傷；靭帯修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）腱（アキレス腱を含む）修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）；腱板修復（特に、陳旧性、変性断裂など）；骨折遷延治癒；偽関節；骨格筋修復・再生；心筋再生（虚血性疾患による壊死部の修復促進）などを行うことができる。
【０２８２】
一部の臓器について、特定の疾患、障害および状態は、その治療について根本的な治療が困難といわれるものがある（例えば、難治性心疾患など）。しかし、本発明の上述のような効果によって、従来では不可能とされていた処置が可能となり、根本的な治療にも応用することができることが明らかとなった。したがって、本発明は、従来の医薬で達成不可能であった有用性を有するといえる。
【０２８３】
このように、本発明は、動物の生体の部分を処置するための方法であって、Ａ）人工組織または複合体を、該部分を被覆するように配置する工程；およびＢ）該生体の部分の状態が改善するに十分な時間該人工組織を保持する工程、を包含する、方法を提供する。このような状態の改善は、処置されるべき部分の機能に応じて判定することができる。例えば、心臓であれば、心機能（心拍、血流など）を見ることによって状態の改善を判定することができる。骨であれば、レントゲン、ＣＴスキャンなどによって骨形成を観察することによって状態の改善を判定することができる。骨の場合、その強度を測定したり、ＭＲＩにより骨髄および／または骨質の評価を行うことによって状態の改善を判定することができる。軟骨・半月であれば、関節鏡検査により関節表面を観察することができる。さらに、関節鏡視下にて生体力学検査を行うことによって状態の改善を判定することができる。また、ＭＲＩによって修復状態を確認することによって状態の改善を判定することも可能である。靭帯に関しては、関節制動性検査により動揺性が存在するかどうかを確認することによって判定することができる。また、ＭＲＩによって組織の連続性を確認することによって状態の改善を判定することができる。いずれの組織の場合も、組織生検を行い組織学的評価を行うことによって状態が改善したかどうかを確認することができる。
【０２８４】
好ましい実施形態において、この処置は、心臓、骨、軟骨、靭帯、腱または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するものである。好ましくは、この人工組織は、自己支持性を有する。これらの人工組織または複合体としては、当業者は、本明細書において、上述した任意の形態およびその改変体を用いることができる。
【０２８５】
（併用療法）
別の局面において、本発明は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７など）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦなどのようなサイトカインと人工組織とを併用することによる再生療法を提供する。
【０２８６】
本発明で使用されるサイトカインは、いくつかすでに市販されているが（例えば、ＢＭＰ（山之内製薬）、ｂＦＧＦ２（科研製薬）、ＴＧＦ−β１（研究用としてＲ＆Ｄ）、ＩＧＦ（藤沢薬品）、ＨＧＦ−１０１（東洋紡（株））等）、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。あるサイトカインを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該あるサイトカインを得ることもできる。或いは、遺伝子工学的手法によりそのサイトカインをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組み換えサイトカインを得ることができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、４４０（１９８９）、特開平５−１１１３８３号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、，１６３；９６７（１９８９）等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物細胞などを用いることができる。このようにして得られたサイトカインは、天然型サイトカインと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよい。患者への導入方法としては、例えば、本発明においてサイトカインの導入方法として、安全かつ効率の良い遺伝子導入法であるセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）リポソーム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３０、１４４０−１４４８（１９９３）、実験医学、１２、１８２２一１８２６（１９９４））、電気的遺伝子導入法、ショットガン方式遺伝子導入法、超音波を用いる遺伝子導入法等があげられる。別の好ましい実施形態では、上記サイトカインは、タンパク質形態として投与されることができる。
【０２８７】
（所望の厚さを有する人工組織の生産方法）
別の局面において、本発明は、所望の厚さを有する人工組織または複合体を生産するための方法を提供する。この方法は、Ａ）細胞を提供する工程；Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子（例えば、アスコルビン酸類、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３など）を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織または複合体のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織または複合体を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程；およびＤ）物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、を包含する。ここで、細胞の提供、細胞の配置、刺激および人工組織または複合体とする工程は、本発明の人工組織または複合体を生産する方法において詳細に説明されており、任意の実施形態を採ることができることが理解される。
【０２８８】
次に、使用される物理的または化学的な刺激としては、例えば、ピペッティング、アクチン調節物質の使用などを挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、ピペッティングであり得る。ピペッティングは、操作が容易であり、有害物質を使用しないからである。あるいは、使用される化学的刺激としては、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子などを挙げることができる。そのようなアクチン脱重合促進因子は、ADF（actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)などを挙げることができる。あるいは、アクチン重合促進因子としては、LPA（lysophosphatidic acid)、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、chemokineおよびTGFｂなどを挙げることができる。そのようなアクチンの重合または脱重合は、アクチンへの作用を見ることによって、観察することができ、任意の物質について、そのような作用を検定することが可能である。本発明の人工組織を生産する際に、所望の厚さを達成するために、そのように検定されて同定された物質を用いてもよいことが理解される。例えば、本発明において、所望の厚さの調整は、アクチン脱重合促進因子とアクチン重合促進因子との比率を調節することによって達成される。
【０２８９】
（複合組織）
別の局面において、本発明はまた、移植可能な人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織を提供する。ここで、他の人工組織としては、本発明の範囲に入る人工組織またはそれに入らない人工組織（すなわち従来の人工組織）のいずれであってもよい。従来の人工組織（例えば、人工骨、微線維性コラーゲン医療材料など）は、生物学的結合能を有していないかまたは有してもほとんど実用に耐えなかったことから、このような複合組織を形成することは不可能であった。従って、本発明を使用すれば、例えば、骨に軟骨を組み合わせて治療することができることが理解される。あるいは、骨などの欠損には、特に、骨軟骨複合体の治療において、人工骨（例えば、ネオボーンなどのハイドロキシアパタイト構成物、微線維性コラーゲン医療材料など）と本発明の人工組織または複合体との複合組織を用いることによって、骨の部分は、人工骨によって、その表層にある軟骨については人工組織によって同時に治療され得ることから、本発明の人工組織または複合体を人工骨と結合させて治療することができることが理解される。ここで、本発明の移植可能な人工組織または複合体は、例えば、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成され、より好ましくは、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される。ここで使用される細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ，コラーゲンＩＩＩ，ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される。
【０２９０】
本明細書において「複合組織」とは、本発明の人工組織または複合体と、他の人工組織（本発明の人工組織または複合体を含む）との複合体化した組織をいう。従って、そのような複合組織は、複数の組織治療に用いることが可能である。たとえば、そのような複合組織は、軟骨および骨の両方の治療に使用することが可能である。
【０２９１】
巨大な軟部組織の欠損（例えば、半月など）があった場合に、他の人工組織（微線維性コラーゲン医療材料（例えば、ＣＭＩ（Ａｍｇｅｎ，  ＵＳＡ）、インテグラン（日本臓器）、ヒアルロン酸ゲル、コラーゲンゲル、アガロースゲル、アルギネートゲル、ビーズ）に本発明の人工組織を結合させることによって、他の人工組織と移植組織との生物学的結合を促進させることができる。
【０２９２】
好ましくは、本発明の複合体において、移植可能な人工組織と、他の人工組織とは、生物学的に結合される。このような結合は、２つの組織を接触させて培養することによって作製することができる。このような生物学的結合は、細胞外マトリクスを介する。
【０２９３】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２９４】
本実施例において、動物の取り扱いは、大阪大学において規定される基準を遵守し、動物愛護精神に則って実験を行った。
【０２９５】
（実施例１：滑膜細胞）
本実施例では、種々の滑膜細胞を用いて、人工組織を作製した。以下に説明する。
【０２９６】
＜細胞の準備＞
ブタ（ＬＷＤ三元交配種、細胞採取時には２〜３月齢のものを使用）膝関節より滑膜細胞を採取し、コラゲナーゼ処理後、10%FBS−DMEM培地（ＨｙＣｌｏｎｅから入手可能、ＤＭＥＭはＧＩＢＣＯから入手したものを使用）にて培養および継代を行った。継代数について、滑膜細胞においては10継代にても多分化能を有するという報告もあることから、本実施例においては最大10継代まで使用したが、用途に応じてそれ以上の継代細胞も用いることが理解される。実際に人体に移植する場合には自家移植であるが、十分な細胞数の確保しつつ、感染等の危険性を軽減するために培養期間の短縮する必要がある。
【０２９７】
これらを考慮して、種々の継代細胞を用いた。実際に行った細胞は、初代培養細胞、１継代、２継代、３継代、４継代、５継代、６継代、８継代、１０継代のものを実験した。これらを用いて、人工組織を用いた。
【０２９８】
＜人工組織の作製＞
35mm皿、60mm皿または100mm皿（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、セルカルチャー皿・マルチウェルセルカルチャープレート）の上に4.0x106個の滑膜細胞を2mlの10%FBS−DMEM培地にまきこんで培養した。その際にアスコルビン酸を添加した。皿、アスコルビン酸および細胞の濃度は、以下のとおりである。
皿：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、細胞培養皿・マルチウェル細胞培養プレート
アスコルビン酸２リン酸：０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、および５ｍＭ
細胞数：５×１０４細胞／ｃｍ２、１×１０５細胞／ｃｍ２、２．５×１０５細胞／ｃｍ２、４．０×１０５細胞／ｃｍ２、５×１０５細胞／ｃｍ２、７．５×１０５細胞／ｃｍ２、１×１０６細胞／ｃｍ２、５×１０６細胞／ｃｍ２、および１×１０７細胞／ｃｍ２
予定培養期間まで、2回／週で培地交換を行った。培養期間に達したら、皿周囲を全周性に100μlのピペットマンでピペッティングを行いながら、細胞シートと皿を分離した。分離できたら皿を軽く揺することにより細胞シートを可能な限り平坦にした。その後培地を１ml追加し、細胞シートを完全に浮遊させ、２時間放置することにより細胞シートが収縮をおこし、３次元化することにより人工組織を作製した（図１）。
【０２９９】
（ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色）
細胞における支持体の定着・消長を観察するために、ＨＥ染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを１０分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを３０秒間行った。その後、流水水洗を５分行い、塩酸エオジン１０倍希釈液で２分間染色し、脱水し、透徹し、封入する。
【０３００】
（各種細胞外マトリクス）
１）凍結ストックから、５μｍ厚の切片を作製する。
【０３０１】
２）−２０℃で５−１０分間にわたり、アセトン中でこの切片を固定する（パラフィンブロックは、パラフィン除去し再水和する必要がある）
３）内因性ペルオキシド活性は、メタノール中０．３％Ｈ２Ｏ２中で２０分間室温でブロックする（１ｍｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２＋９９ｍｌメタノール）
４）ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
【０３０２】
５）モノクローナル一次抗体（各種細胞外マトリクスに対するマウスまたはウサギ抗体）（１μｌ抗体＋２００μｌＰＢＳ／スライド）と４℃で湿式チャンバー内で一晩インキュベートする。
【０３０３】
６）翌日ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
【０３０４】
７）抗マウスおよび抗ウサギのｎｏ．１ビオチン化結合を、３０分−１時間室温で適用する（３滴を直接スライドにたらす）。
【０３０５】
８）ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
【０３０６】
９）ストレプトアビジンＨＲＰ  ｎｏ．２を、ＬＳＡＢについてたらし１０１５分間浸す。
【０３０７】
１０）ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
【０３０８】
１１）ＤＡＢをたらす（５ｍｌ  ＤＡＢ＋５μｌ  Ｈ２Ｏ２）
１２）茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
【０３０９】
１３）水中に５分ほど浸す。
【０３１０】
１４）ＨＥを３０秒−１分間浸す。
【０３１１】
１５）数回洗浄する。
【０３１２】
１６）イオン交換水で１回洗浄する。
【０３１３】
１７）８０％エタノールで１分洗浄する。
【０３１４】
１８）９０％エタノールで１分洗浄する。
【０３１５】
１９）１００％エタノールで１分洗浄する。（３回）
２０）キシレンで３回×１分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
【０３１６】
２１）発色を見る。
【０３１７】
その結果の一例を、図１に示す。図１右に示されるように、細胞外マトリックス産生促進因子としてアスコルビン酸２リン酸を添加した場合、細胞の重層化はわずかに認められるのみである。他方、シート状のこの細胞を培養底面より剥離させ自己収縮させることにより、左に示されるように、重層化が進展し三次元化が促進されることが観察された。図１左に示されるように、滑膜細胞を用いた場合でも、孔のない大きな組織が作製された。この組織は、図１左に示すように、厚みがあり、細胞外マトリクスに富む組織であった。また、アスコルビン酸２リン酸が０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび５ｍＭの場合の人工組織の拡大図を図２において示す。示されるように、０．１ｍＭ以上添加した場合、細胞外マトリックスの形成が促進したことが分かる（図２）。図３は、培養日数が、３日、７日、１４日および２１日の人工組織の拡大図を示す。示されるように、培養３日ですでに、剥離が可能になる程度に組織が強固になることが分かる（図３）。培養日数が増すと、細胞外マトリクス密度は変動し、増加していく。
【０３１８】
これらが、培養皿底面より剥離し自己収縮をさせた人工組織であった。人工組織はシート状で作製され、皿から剥離した後に放置すると、自己収縮を起こし、三次元化が進む。組織所見により、細胞が幾層にもわたり点在して重層化しているのがわかる。
【０３１９】
次に細胞外マトリクスを含む種々のマーカーを染色した。
【０３２０】
細胞外マトリクス染色の結果を図４に示す。種々の細胞外マトリクス（コラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、フィブロネクチン、ビトロネクチンなど）が存在したことがわかる。免疫染色で、コラーゲンIおよびIIIは強く染色されたが、コラーゲンIIの染色は一部に限局していた。強拡でみると、コラーゲンは、核から少し離れた部位で染色されており、細胞外マトリックスであることが確認できる。一方、細胞接着因子として重要とされているフィブロネクチン、ビトロネクチンは、強拡でみると、コラーゲンとは異なり、核に密接する領域にも染色されており、細胞周囲にも存在することが確認できる。
【０３２１】
また、人工組織の作製には、３〜８継代が好ましいようであるが、どのような継代でも使用可能なようである。
【０３２２】
対比例として、正常組織およびコラーゲンスポンジ（ＣＭＩ，Ａｍｇｅｎ、ＵＳＡ）での染色例を示す。図５は、正常組織（正常滑膜組織、腱組織、軟骨組織、皮膚および半月組織）を示す。図６は、対比例として用いた市販のコラーゲンスポンジの染色例を示す。左からフィブロネクチン、ビトロネクチン、ネガティブコントロール、およびＨＥ染色を示す。示されるように、従来の人工組織は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンでは染色されない。このことから、本発明の人工組織は、従来の人工組織とは異なり、また、既存のコラーゲンスキャフォールドでは、フィブロネクチンおよびビトロネクチンの接着因子は含まれておらず、その意味でも、本発明の組織の独創性が明らかになる。どの細胞外マトリクスでも染色されない。正常組織と本実施例の人工組織とを比べると、人工組織の癒合の様子が自然に近いことが確認される。
【０３２３】
なお、本発明の人工組織は、水分除去のための濾紙に接触させたところ、濾紙に接着し、手で剥離することが困難であった。
【０３２４】
さらに、コラーゲンの濃度を見るために、コラーゲン含有量測定を行った。その結果を図７および図８に示す。示されるように、ヒドロキシプロリンの量から、０．１ｍＭ以上のアスコルビン酸２リン酸を加えたときに、コラーゲンの生産が有意に促進されることが明らかになった。産生量は、培養期間にほぼ比例していた（図８）。
【０３２５】
（実施例２：コラーゲン産生の測定）
次に、本発明の人工組織の移植により、細胞外マトリクスであるコラーゲンが十分産生されているかどうかを確認した。以下のプロトコールを使用した。
【０３２６】
＜方法＞
培養期間：３日、７日、１４日、２１日、２８日
アスコルビン酸２リン酸の濃度：0mM、0.1mM、1mM、5mMで
の条件を用いて、滑膜由来人工組織を作製した。
【０３２７】
この人工組織の培養液に、６Ｎ  ＨＣｌを加え、１０５℃で１８時間加水分解し、クロラミンＴにて酸化後、Ehrlich's Reagent Solution（ｐ−ジメチルアミノ−ベンズアルデヒド２ｇ+６０％過塩素酸３ｍｌ；イソプロパノールを３：１３になるように希釈して作製）にて発色させ吸光度を測定した。
【０３２８】
＜結果＞
１）  コラーゲン産生量について、アスコルビン酸については、0mM<< 5mM < 1mM ≦ 0.1mMであった。コラーゲン産生という観点においては、至適濃度は0.１〜1mMであった（図７および８）。
【０３２９】
２）培養期間についてみると、コラーゲン産生という観点においては、時間依存的にコラーゲン産生量が増加していることが明らかになった。
【０３３０】
（実施例３：皿の大きさ、細胞数および継代数の影響）
次に、皿の大きさおよび継代数の影響を調べた。
【０３３１】
図９には、細胞数および継代数の相違による人工組織の形成の様子を示す。いずれの場合でも、試験したすべての濃度において人工組織が形成されたことが示される。
【０３３２】
上記実施例１の条件を用いて、皿の大きさ（３５ｍｍ、６５ｍｍ、１００ｍｍ）および継代数（５〜７）の細胞を用いて、同様の実験を行った（図１０）。
【０３３３】
その結果を図９および図１０に示す。図９は、継代数を変化させた場合の人工組織の様子を示し、図１０は、皿の大きさによる変化を示す。このように、どのような皿であっても、継代数であっても、同様に人工組織が形成されることが明らかになった。
【０３３４】
図９に示されるように、細胞数については、マトリックス産生という観点からみると、基本的には多い方が良いと考えられるが、多すぎると細胞の収縮力が強くなりすぎて培養開始翌日には自然に剥がれることがわかる。したがって、より大型の人工組織を作製する場合は、比較的薄い濃度で播種することが好ましいようであることが明らかになった。特に、人工組織の強度などをコントロールする場合は、比較的薄い濃度であることが好ましいようである。示されるように、５継代であれば5.0x105/cm2では剥がれてしまい、2.5x105/cm2では自然に剥がれない。６継代以上でも.7.5x105/cm2では剥がれてしまうが、5.0x105/cm2でははがれなかった。従って、本発明の好ましい人工組織を作製するためには十分数の細胞を確保する必要があり、ある程度の細胞継代が必要であるようである。４継代のものも試作したが、４0x105/cm2では剥がれた。このように、継代数と密接な関係がありそうであり、用途に応じて種々の人工組織を作製することができる。これらの結果から、移植に耐える好ましい細胞としては、５継代の細胞を４.0x105/cm2で培養する条件を採用すればよいようであるが、それには限定されないようである。
【０３３５】
同様に他の細胞でも、細胞濃度により強度を調整することができることが実証される。滑膜細胞は、実施例１に記載される条件に基づき、筋芽細胞は、実施例２８に記載される条件に基づき、あるいは実施例１２に記載される条件に基づき脂肪由来細胞に基づき、人工組織を作製し、細胞密度による強度への影響を観察することができる。
【０３３６】
（実施例４：力学的特性の測定）
次に、実施例１において、４×１０６細胞／ｃｍ２の細胞を３週間アスコルビン酸２リン酸を添加して培養して、剥離後４８時間たったものを使用して、力学的特性を調べた。本発明の人工組織の力学的特性を測定した。そのプロトコールを以下に示す。
【０３３７】
まず、力学的特性を、引っ張り試験により試験した。
【０３３８】
実験装置の外観を図１１および図１２に示す。図１２は、裸の状態で試験片把持部を示す。この装置に示すように、人工組織の両端を試験片把持部に保持させる。人工組織には、測定が簡単なようにマーカーを付す。図１３に、マーカーが付された様子を示す。図１４には、試験片把持部の拡大図を示す。図１５に、人工組織の破断実験後の様子を示す。
【０３３９】
人工組織を図のようにはさみ、マーカーをおいて引張試験を行う。最大荷重が１．８９Ｎ、ヤング率１９．２ＭＰａであった。参考として、最大張力は、通常、皮膚が最大荷重は軟骨で０．７から１．２ＭＰａであり、皮膚で１．１ＭＰａであった。ヤング率は軟骨が１０ＭＰａ皮膚が３５ＭＰａであった。このように、本発明の人工組織は、皮膚および軟骨などと同様の力学強度を有し、外科的にハンドリングに耐えうるものであることが明らかになった。
【０３４０】
実験結果を図１６および図１７に示す。示される結果から、最大荷重は、それぞれ、１．８９Ｎ、１．９Ｎであることが明らかになった。ヤング率（接線係数）は、１９．２ＭＰａであることが明らかになった。
【０３４１】
（実施例５：自己支持性の判定）
次に、自己支持性の判定実験を行った。ピンセットとして、先曲がり先細無鈎ピンセットＡ−１１（ステンレス製、全長１２０ｍｍ、先曲がり２０ｍｍ、先端は０．１ｍｍのもの；夏目製作所）を用いて人工組織を挟み、試験した。自己支持性を有するか否かは、目視により判断した。片が複数になったものは自己支持性を有しないと判断した。この判定は、他のピンセット、例えば、別の種類のピンセットとして先曲がり先細無鈎ピンセットＡ−１２−２（ステンレス製・ボッチ付、全長１００ｍｍ、先端は０．０５ｍｍのもの；夏目製作所）を用いて別の実験者が行った場合でも、同様の結果が見出された。
【０３４２】
自己支持性の判断は、人工組織の剥離時および剥離後に保存した後のものを試験することができる。
【０３４３】
上記実施例などに記載されるように、心筋細胞、筋芽細胞、滑膜細胞について、アスコルビン酸を含む細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で作製した人工組織はいずれも、自己支持性を有していた。これに対して、このような因子の非存在下で作製した人工組織は、剥離時にすでにピンセットでつまみあげることが困難であり、自己支持性が全くないことが確認された。
【０３４４】
従って、１）周囲のピペッティングの際に簡単に剥がれるかどうか；および２）はがれたシートの辺縁を軽くさわるだけで、さらにシートが簡単にはれるかどうかというこの２点さえクリアできれば、あとは自然に拘縮するので十分な強度になるようであることが判明した。
【０３４５】
従って、自己支持性は、本発明の方法によって初めて獲得された性質であるといえる。
【０３４６】
（実施例６：骨分化誘導）
本実施例では、骨分化誘導を行った場合でも本発明の人工組織が機能するかどうかを確認した。
【０３４７】
まず、はじめから骨分化誘導培地（10% FBS−DMEM+０．１μM デキサメタゾン、10mM βグリセロホスフェート、0.2mM アスコルビン酸２リン酸)にて培養し、骨分化誘導させた滑膜細胞から人工組織を作製した。
【０３４８】
また、骨分化誘導をかけずに三次元の人工組織を作製し、その後、培地を骨分化誘導培地に換えてさらに培養することにより、人工組織に石灰沈着骨が生じることを確認した。その結果を、図１８に示す。
【０３４９】
外見上も分化誘導を掛けない人工組織は、透明なのにくらべ、骨形成した人工組織は白色である。アリザリンレッド（Alizarin Red）には強く染色され、アルカリホスファターゼ（ALP）染色もコントロールに比べ強く染色されている。このように、滑膜細胞による人工組織が骨分化能を有することが確認できる。
【０３５０】
（実施例７：軟骨分化誘導）
次に、本発明の人工組織の製造方法において、軟骨分化誘導が使用可能かどうか確認した。
【０３５１】
（培養条件）
細胞密度：４×１０４／ｃｍ２
条件：ＣＯ２  ５％，  ａｉｒ  ９５％，  ３７℃
この培地を用いて、以下の軟骨分化誘導培地を用いて、培養を行い、人工組織を作製した。
【０３５２】
軟骨分化誘導培地：ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）  １０％、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）６．２５μｇ／ｍｌ、デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ）  １０−７Ｍ、アスコルビン酸（ＷＡＫＯ）５０μｇ／ｍｌ，ピルビン酸（ＳＩＧＭＡ）  １００μｇ／ｍｌ。
【０３５３】
その結果を、図１９には軟骨に誘導した例を示す。写真は左より通常の培地、軟骨分化誘導培地、軟骨分化誘導培地＋ＢＭＰ−２、軟骨分化誘導培地＋ＴＧＦ−ｂ１で人工組織を培養したものである。いずれにおいてもアルシアンブルー染色にて青く染まり軟骨様マトリックス産生の亢進が確認できるが、その効果はＢＭＰ−２添加群にて著明である。染色性の定量化の結果を図２０に示す。
【０３５４】
人工組織における軟骨関連遺伝子の発現（アグリカン、Ｃｏｌ  ＩＩ、Ｓｏｘ９）を図２１に示す。人工組織を通常の培地（一番左の列）から軟骨分化誘導培地（中央列）に換えると軟骨分化マーカーであるSox9遺伝子の発現が亢進し、さらに  軟骨分化誘導培地＋BMP-2で培養すると Collagen II遺伝子発現も亢進し、より強力な軟骨分化が確認できた。図２２は同じ分化誘導刺激を加えた際の軟骨分化反応を単層培養滑膜細胞と三次元人工組織化した滑膜細胞とで比較したものである。左より奇数列が単層培養、偶数列が三次元人工組織であり、同じ培養条件でペアで比較している。軟骨分化誘導培地、あるいは軟骨分化誘導培地＋BMP-2の刺激を加えた場合、軟骨分化マーカー遺伝子の発現は人工組織においてより著明に発現していることが確認され、三次元化された人工組織は強い軟骨分化能を持つことが確認された。
【０３５５】
（実施例８：軟骨修復）
次に、軟骨修復が可能であるかどうかを確認した。ここでは、同種異系の人工組織を使用した。
【０３５６】
人工組織の接着能の有無を確認するため、豚軟骨片上に同種の人工組織を移植した。人工組織は、細胞数4.0x106個／35mm 皿、アスコルビン酸１ｍＭ、培養期間７〜１４日間という条件で作製した。軟骨片に径６mmの創を作成し、上層帯をメスにて切除し、コンドロイチナーゼＡＢＣ（１U/1ml）を添加し、５分間処理した。人工組織を径６mmとなるように採型・移植し、７日間器官培養した。人工組織は、軟骨片接着面と密に接着し、接着面にフィブロネクチンが集結していた（図２３）。
【０３５７】
次に、豚軟骨移植を施行した。上記同様、生体の大腿骨内果部に径６mmの創を作成し、上層帯をメスにて切除し、コンドロイチナーゼABC（１U/1ml）を添加し、５分間処理した後に同種人工組織を径６mmとなるように採型・移植し、10日間飼育した。その結果を、図２４に示す。図２５は、図２４で示した人工組織と軟骨接着メントの培養部の強拡大図である。図２５左には、ＨＥ染色の様子を示し、中には抗フィブロネクチン抗体で染色した写真を示し、図２５右には、抗ビトロネクチン抗体で染色した写真を示す。人工組織と軟骨組織との接着面は、矢印で示すように、細胞を介した接着ではなく、人工組織のマトリクスと軟骨のマトリクスとが直接接着していることが明らかになった。接着面にはフィブロネクチンおよびビトロネクチンが集積していることがわかる。つまりこれら接着因子が人工組織と被移植組織の接着に関与していることが示唆される。従って、本発明は、従来の人工組織、あるいは細胞よりも、天然での癒合が顕著であるという点でも特徴的であることがわかる。
【０３５８】
さらに、１ヶ月後の組織所見では、図２６に示されるように、人工組織は、軟骨損傷部は生物学的に結合しており、炎症を起こさずに定着していたことが確認された。周囲の組織との癒合を観察したところ、生物学的結合がなされていたことが明らかになった。人工組織の表層部は、図２７に示されるように、繊維芽細胞様の細胞主体であったが、深層部では、図２８に示されるように、軟骨様細胞が主体であった。このことから、移植された人工組織は深層部において経時的に軟骨様組織へと分化していくことが示される。いずれの時期においても顕著な拒絶反応は認められず、同種移植の際に危惧された拒絶反応は認められなかった。
【０３５９】
従って、同種異系の人工組織を用いた移植処置により、副作用なく処置可能であることが分かった。
【０３６０】
（実施例９：半月修復）
次に、本発明の人工組織が半月修復においても使用可能かどうかを確認した。
【０３６１】
上記実施例６同様、同種の人工組織を、細胞数4.0x106個／35mm皿、アスコルビン酸２リン酸１ｍＭ、培養期間７〜１４日間という条件で作製した(図２９）。半月に径5.5mmの欠損を作成した後に、人工組織を移植した。人工組織が生着するまでの保護として、コラーゲンシート（ニプロ（株））を用いて欠損部を被覆し(図３０)、１ヶ月後間飼育した。以下にプロトコールを示す。
【０３６２】
（麻酔）
1５〜17週齢の豚（LWD三元交配種）に対してケタラール20mg/kg+ セラクタール10mg/kgを後頚部より筋注を行った。その後耳静脈より輸液ルートを確保後、気管内挿管により気道確保を行い、ディプリバン0.5mg/kg/hrの持続注入により麻酔の維持を行った。術後の感染予防のため抗生剤（セファメジン1g）を投与した。
【０３６３】
（手術）
体位をとり、滅菌ドレープにより術野を清潔とした後、傍内側膝蓋アプローチにより膝関節内に侵入。内側関節包を同定した後その中央部で切離。助手が下腿を屈曲＋外旋させ、さらに前方引き出しを行うことで内側半月の前角部を展開。同部にφ6.5mmの円柱型の欠損をモザイクプラスティーDP（Smith & Nephew）により作成した（図２９）。欠損部に人工組織を充填した（図３０）。人工組織が生着するまでの保護のため、コラーゲンシート（ニプロ（株））を半月の周囲に巻きつけ縫合により固定を行った。止血を確認した後、切離した内側側副靭帯を修復し、関節包、皮下、表皮を縫合。膝関節屈曲位にてギプス固定とし、手術を終了した。
【０３６４】
（評価法）
肉眼所見、組織学的検討により行った。
【０３６５】
（結果）
術後４週の肉眼所見（図３１）および組織学的所見（図３２）により人工組織を充填した群において修復が有意に改善を認めた。
【０３６６】
組織像では、注目すべきことに、移植後４週で人工組織内にエオジン陽性が認められ、半月組織様のマトリクスの形成を認め、また、隣接する半月組織との生物学的結合は完了していた。
【０３６７】
（実施例１０：ブタの腱・靭帯組織の修復）
本実施例において、ブタにおいて腱・靭帯組織を対象とする修復手術を行う。腱・靭帯組織の損傷状態を確認し、その際に滑膜細胞を一部採取して、滑膜細胞を培養し、実施例１に記載されるようなプロトコールを用いて人工組織を作製する。
【０３６８】
次に、手術時に、腱・靭帯組織の損傷部位の周囲を切除して、新鮮化した後、上記のように作製した人工組織を配置する。その際、人工組織は接着因子を有することから、縫合する必要なしに癒合する。そのプロトコールを以下に示す。
【０３６９】
（麻酔）
１５〜１７週齢の豚（ＬＷＤ三元交配種）に対してケタラール２０ｍｇ／ｋｇ  ＋  セラクタール１０ｍｇ／ｋｇを後頚部より筋注を行った。その後耳静脈より輸液ルートを確保後、気管内挿管により気道確保を行い、ディプリバン  ０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの持続注入により麻酔の維持を行った。術後の感染予防のため抗生剤（セファメジン１ｇ）を投与した。
【０３７０】
（手術）
体位をとり、滅菌ドレープにより術野を清潔とした後、傍内側膝蓋アプローチにより膝関節内に侵入。内側関節包の剥離を進め内側側副靭帯を同定し、モザイクプラスティーＤＰ（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ）によりφ３．５ｍｍの欠損部を内側側副靭帯の大腿骨付着部より１横指遠位に作成した。欠損部に人工組織を充填した後関節包により被覆。止血を確認した、関節包、皮下、表皮を縫合。膝関節軽度屈曲位にてギプス固定とし、手術を終了した。
（評価法）
組織学的検討はＦｒａｎｋらの方法に基づき行った（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１３；９２３−９，１９９５）。
（結果）
術後６週で肉眼所見および組織学的所見により人工組織を充填した群において修復が有意に改善していた。
【０３７１】
（実施例１１：ブタの骨の修復）
本実施例では、ブタにおいて骨の修復実験を行う。実施例１に記載されるようなプロトコールを用いて、滑膜細胞を採取および培養し、人工組織を作製する。
【０３７２】
次に、この人工組織を、シート状のものを骨に適用する。主に骨膜組織と同様に骨皮質を被覆することによって患部に適用する。その結果、滑膜細胞を用いた人工組織は、骨の修復に効果があることがわかる。そのプロトコールを以下に示す。
【０３７３】
（麻酔）
１５〜１７週齢の豚（ＬＷＤ三元交配種）に対してケタラール２０ｍｇ／ｋｇ  ＋  セラクタール１０ｍｇ／ｋｇを後頚部より筋注を行った。その後耳静脈より輸液ルートを確保後、気管内挿管により気道確保を行い、ディプリバン  ０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの持続注入により麻酔の維持を行った。術後の感染予防のため抗生剤（セファメジン１ｇ）を投与した。
【０３７４】
（手術）
体位をとり、滅菌ドレープにより術野を清潔とした後、第２中足骨上に縦切開を加え侵入。第２中足骨の骨膜をメスにより可及的に切除、中足骨表面を露出した。中足骨表面に横１．５ｃｍ×縦３ｃｍの開窓を骨ノミにて行った後、開窓部の骨表面を広げた人工組織で被覆した。人工組織の接着を確認し、皮下および表皮を縫合。下腿ギプス固定とし手術を終了した。
【０３７５】
（評価法）
レントゲン撮影。マイクロＣＴ。組織学的検討
（結果）
術後４週の評価において、人工組織を被覆した群において開窓部における骨形成の有意な亢進を確認した。
【０３７６】
（実施例１２：脂肪由来組織）
次に、脂肪組織由来の細胞を用いて人工組織を作製した。
【０３７７】
Ａ）細胞は、以下のようにして採取した。
【０３７８】
１）膝関節の脂肪パッド（ｆａｔーｐａｄ）より検体を採取した。
【０３７９】
２）この検体をＰＢＳを用いて洗浄した。
【０３８０】
３）この検体をできるだけ細かく鋏で切り刻んだ。
【０３８１】
４）コラゲナーゼ（０．１％）１０ｍｌを加え、３７℃水浴にて1時間振盪した。
【０３８２】
５）ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ補充）を同量加えて、７０μｌのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅなどから入手可能）に通した。
【０３８３】
６）フィルターを通った細胞およびフィルターに残った残渣を１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ５ｍｌに入れて２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎなどから入手可能）において培養した。
【０３８４】
７）フラスコの底面に張り付いた細胞（間葉系幹細胞を含む）を取り出して以下の人工組織作製に供した。
【０３８５】
Ｂ）人工組織の作製法
次に、この脂肪由来の細胞を用いて人工組織を作製した。アスコルビン酸２リン酸は、０ｍＭ（なし）、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍＭの条件を用いた。作製は、上記滑膜細胞を作製した方法（実施例１に記載される）に準じて行った。初期の播種条件としては、５×１０４細胞／ｃｍ２を用いた。結果を図３３に示す。培養日数は１４日間を採用した。脂肪組織由来の細胞からも人工組織は作成され、滑膜細胞由来人工組織と同様にフィブロネクチンおよびビトロネクチンが豊富に存在していた。またコラーゲンI, IIIについても同様豊富に発現していた。
【０３８６】
アスコルビン酸２リン酸  ０ｍＭ：接線係数（ヤング率）０．２８
アスコルビン酸２リン酸  １．０ｍＭ：接線係数（ヤング率）１．３３
Ｃ）移植実験
次に、この人工組織を実施例８（軟骨修復）、実施例９（半月修復）に記載されるように、移植実験に供する。その結果、脂肪細胞が、滑膜細胞由来の人工組織と同様に、修復機能を有することがわかる。
【０３８７】
Ｄ）脂肪からの人工組織の骨軟骨への分化誘導
本実施例で作製した骨または軟骨の人工組織を、軟骨または骨に分化誘導させた、その結果を図３４に示す。左の実験は骨分化実験の結果を示す。上段は人工組織、下段は単層培養である。人工組織は骨分化誘導培地にてアルザリンレッド陽性反応を呈し、骨分化が確認できた。右の実験は軟骨分化誘導実験で人工組織は軟骨分化誘導培地＋BMP-2の刺激によりアルシアンブルー陽性の軟骨様組織へと分化した。つまり、脂肪由来人工組織も滑膜細胞由来人工組織と同様に骨・軟骨への分化能を保持していることが判明した。
【０３８８】
（実施例１３：人工組織の形状の多様性）
本実施例では、ブタにおける人工組織の形状による機能の相違を観察する。この実施例では、人工組織をシート状に貼り付ける以外に、丸めて患部に移植しても効果を有し得ることを確認する。このことにより、欠損部の形状等に応じたテイラーメイド手術が可能かどうかを確認する。
【０３８９】
本実施例では、球状に丸めた形状および線状にした場合、あるいは管状にした場合に移植可能かどうかを調べた。この人工組織は、接着因子を有することから縫合する必要はないことが確認される。
【０３９０】
（実施例１４：ヒト滑膜細胞を用いた処置）
次に、半月板損傷患者からの滑膜細胞採取、さらに人工組織の作製が可能であるかどうかを本実施例において確認する。
【０３９１】
（滑膜細胞の採取）
ヒト患者であって、画像により軟骨損傷または半月板損傷と診断された患者の精査として、腰椎麻酔または全身麻酔下において、関節鏡検査を施行する。その際に、数十ｍｇ滑膜を採取する。採取した滑膜を５０ｍｌの遠心管（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、その後、１０ｃｍ径の培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、滅菌した鋏刀を用いて細かく切断する。切断物を、さらに、０．１％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍｌを加えて、３７℃恒温槽中で１時間３０分振盪する。溶解液に予め採取しておいた自己血清またはウシ血清（ＦＢＳ）を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）を１０ｍｌ加えて、コラゲナーゼを不活化し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を沈降させる。その後、血清入り培地５ｍｌを再度加え、７０μｌフィルター（Ｆａｌｃｏｎ社製）に通し、２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移して３７℃に保温したＣＯ２インキュベータ内において培養する。
【０３９２】
（滑膜細胞の継代培養）
初期培養において、１週間に２回培地交換を行い、コンフルエントの状態になれば、細胞継代を行う。初期継代として、培地を吸引した後、ＰＢＳを用いて洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を加えて、５分間放置する。その後、血清入り培地を加え、用怪物を５０ｍｌ遠心分離管（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、１５００ｒｐｍ×５分間遠心分離後、沈澱に血清入り培地１５ｍｌを加え、１５０ｃｍ２培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）に細胞を播く。以後の継代は、１：３の細胞比となるよう継代を施行し、４〜５継代となるまで同様の操作を行う。
【０３９３】
（人工組織の作製）
４〜５継代の滑膜細胞をトリプシン・ＥＤＴＡによって処理し、滑膜細胞４．０×１０６個を０．２ｍＭアスコルビン酸２リン酸含有血清入り培地２ｍｌに溶解し、３５ｍｌ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）にて３７℃に保温したＣＯ２インキュベータにて７日間培養する。これにより、培養細胞−細胞外マトリクス複合体が形成される。この複合体は、移植手術予定の２時間以上前に周囲をピペッティングすることによって機械的に培養皿から剥離させる。剥離後は、培養細胞−細胞外マトリクス複合体は拘縮し、直径約１５ｍｍ、厚さ約０．１ｍｍの三次元組織となる。
【０３９４】
（実施例１５：ヒト脂肪細胞からの人工組織の作製）
局所麻酔により、ヒト患者の採取予定部（例えば、膝関節周囲）に小切開を加え、脂肪細胞数十ｍｇを採取する。採取した脂肪細胞は、滑膜細胞と同様の処理を行うことによって、三次元の人工組織を作製することができる。
【０３９５】
（実施例１６：人工組織の関節軟骨損傷部への移植）
実施例１４または実施例１５において作製した人工組織を実際に移植する。ヒト被検体を腰椎麻酔または全身麻酔後、関節内を関節鏡視下にあるいは少皮切にて展開する。軟骨損傷部を確認した後、軟骨損傷の大きさを測定し、モザイクプラスティーハーベスティングシステム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｅｗ社製）および歯科用エクスプローラーを用いて、損傷した軟骨を完全に含む形で、骨軟骨境界部において軟骨を剥離するように円形に切除する。軟骨欠損部に人工組織を移植する。人工組織は、移植後数分で欠損部母床と接着するが、力学的ストレスが強くかかる部位が病巣部の場合は、初期固定を強固に得るために、フィブリンのりを用いて固定を補強することができるがそれに限定されないようである。固定後は、関節包、皮下組織および皮膚を層層に縫合する。閉創後、関節はギブスあるいは装具にて２〜３週間固定する。その後、可動域訓練を開始する。病巣が下肢の荷重関節（膝、足関節等）にある場合では、荷重は６〜８週間で全荷重とする。
【０３９６】
その結果、以下のような症状の回復が見出される：荷重、および運動時の関節疼痛の軽減；関節水腫の消失；関節可動域の回復；関節周囲筋力の回復；変形性関節症の予防など。このように、本発明の人工組織は、顕著な副作用もなく、欠損部位の機能をも改善することが観察される。
【０３９７】
（実施例１７：半月板損傷部への移植）
次に、実施例１４または実施例１５において作製した人工組織を実際に半月板損傷部に移植する。
【０３９８】
ヒト被検体の腰椎麻酔または全身麻酔後、関節鏡視下にて半月板損傷部を確認する。人工組織を損傷半月板の断裂部に充填し、その後損傷半月板と人工組織とを一塊にして縫合する。全操作を、関節鏡視下に行う。術後は、膝装具を２〜３週間装着する。その後、可動域訓練を開始する。全荷重は、５〜６週間後とする。
【０３９９】
その結果、以下のような症状の回復が見出される：膝関節の荷重、および運動時の関節疼痛の軽減；関節水腫の消失；関節可動域の回復；関節周囲筋力の回復；活動性の回復、スポーツ復帰；変形性関節症の予防。このように、本発明の人工組織は、顕著な副作用もなく、欠損部位の機能をも改善することが観察される。
【０４００】
（実施例１８：アキレス腱への移植）
実施例１４または実施例１５において作製した人工組織をアキレス腱損傷部位に移植する。
【０４０１】
ヒト被検体を腰椎麻酔または全身麻酔した後、アキレス腱傍内側切開により展開する。アキレス腱変性断裂部を確認した後に新鮮化し、その断端部に人工組織を移植する。移植後は、通常のアキレス腱縫合術を行い、さらに縫合部表層を人工組織で被覆して縫合固定する。閉創後下肢ギプス固定を４週間行う。全荷重は、６〜８週間後とする。
【０４０２】
その結果、以下のような症状の回復が見出される：活動レベルの回復（歩行よりスポーツレベルまで）；疼痛の軽減；再断裂可能性の低下。このように、本発明の人工組織は、顕著な副作用もなく、欠損部位の機能をも改善することが観察される。
【０４０３】
（実施例１９：難治性偽関節の処置）
次に、難治性偽関節を実施例１４または実施例１５において作製した人工組織を用いて処置する。難治性偽関節の一つとして、本来は骨折治療の際に細胞の供給源となる骨膜が重度な外傷によって欠損していることが挙げられる。このような場合、人工組織の移植が適切であると考えられる。
【０４０４】
ヒト被検体を麻酔後、骨折部を展開し、骨折部を新鮮化する。一度プレートまたは髄内釘により内固定を行い、骨膜が欠損した骨折部に人工組織を被覆する。人工組織は、隣接する骨膜組織と縫合固定する。閉創後、骨折部隣接関節にわたりギプス固定を３〜４週間行う。下肢骨の場合、荷重は６〜８週間とする。
【０４０５】
その結果、以下のような症状の回復が見出される：疼痛の消失；関節周囲筋力の回復；
活動レベルの回復。このように、本発明の人工組織は、顕著な副作用もなく、欠損部位の機能をも改善することが観察される。
【０４０６】
（実施例２０：腱板損傷部への移植）
次に、腱板損傷部への移植実験を試みた。人工組織は、実施例１に記載されるように作製した。ヒト被検体を全身麻酔したのちに三角筋縦割アプローチにて展開し腱板損傷部を同定した。
【０４０７】
腱板損傷部を確認した後に新鮮化し、通常の腱板修復術を行う。その後に修復腱板部の表層に人工組織を被覆する。閉創後は肩関節を２−３週間装具安静に。可動域訓練はその後開始。６週で可動域制限を解除する。
【０４０８】
その結果、以下のような症状の回復が見出される：肩関節疼痛（特に夜間痛）の軽快；関節可動域の回復；肩周囲筋力の回復；活動性の回復。このように、本発明の人工組織は、顕著な副作用もなく、欠損部位の機能をも改善することが観察される。
【０４０９】
（実施例２１：人工組織作成前後での細胞分化誘導の可能性の検討）
次に、ヒト滑膜細胞を用いた人工組織の製造を示す。その模式図を図３５に示す。
【０４１０】
ヒト滑膜細胞を用いた人工組織の製造過程を図３５及び図３６の上段に示す。図３５は分化誘導のかかったヒト滑膜細胞からの人工組織の製造を示し、図３６はまず人工組織を作成し、それに分化誘導をかける工程の模式図である。分化誘導には、ヒト滑膜細胞を、０．１μＭのデキサメタゾン、１０ｍＭβ−グリセロホスファテートおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸を含むＤＭＥＭ培地中に加えて１４日間培養するという条件を使用した。これを人工組織として、アリザリンレッドおよびアルカリホスファターゼ染色を行った。染色結果は図３５および図３６の下段に示す。図３５は、いずれの例でも人工組織は作成され、Alzarin red,ALP染色陽性の骨分化反応を呈していた。したがって人工組織作成の前後いずれにおいても組織分化誘導を計ることが可能なことが判明した。
【０４１１】
（実施例２２：人工組織作成時の分化時期の検討：ヒトの場合）
次に、脂肪組織由来の細胞を用いて人工組織を作製した。
【０４１２】
Ａ）細胞は、以下のようにして採取した。
【０４１３】
１）膝関節の脂肪パッド（ｆａｔーｐａｄ）より検体を採取した。
【０４１４】
２）この検体をＰＢＳを用いて洗浄した。
【０４１５】
３）この検体をできるだけ細かく鋏で切り刻んだ。
【０４１６】
４）コラゲナーゼ（０．１％）１０ｍｌを加え、３７℃水浴にて1時間振盪した。
【０４１７】
５）ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ補充）を同量加えて、７０μｌのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅなどから入手可能）に通した。
【０４１８】
６）フィルターを通った細胞およびフィルターに残った残渣を１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ５ｍｌに入れて２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎなどから入手可能）において培養した。
【０４１９】
７）フラスコの底面に張り付いた細胞（間葉系幹細胞を含む）を取り出して以下の人工組織作製に供した。
【０４２０】
Ｂ）人工組織の作製法
次に、この脂肪由来の細胞を用いて人工組織を作製した。アスコルビン酸２リン酸は、０ｍＭ（なし）、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍＭの条件を用いた。作製は、上記滑膜細胞を作製した方法（実施例１に記載される）に準じて行った。初期の播種条件としては、５×１０４細胞／ｃｍ２を用いた。
【０４２１】
この細胞を用いて、実施例２１に記載されるような条件を用いて分化時期の重要性について検討した。
【０４２２】
その結果、脂肪細胞由来のものであっても、同様に、分化時期は、本発明の人工組織に対して特に影響しないことが明らかになった。
【０４２３】
（実施例２３：生物学的結合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）の確認）
従来のコラーゲンゲルを用いた場合に移植後に生物学的結合を確実にできないことが知られている。本実施例において、従来のコラーゲンゲル（商品名３％タイプＩコラーゲン、高研（株）、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてその中に滑膜細胞（105細胞／ｍｌ）を包埋し、軟骨欠損部に移植すると図３７のようにコラーゲンゲルと隣接軟骨間の結合が不十分で亀裂を認めた。
【０４２４】
他方、本発明で製造した実施例１において製造されるような人工組織をインビボでブタ体内に導入すると、図３８に示されるように、組織学上、生物学的結合が成立していることが分かる。
【０４２５】
（実施例２４：人工組織製造における剥離条件の検討）
次に、本発明の人工組織の製造方法において、物理的剥離（機械的剥離、例えば、ピペッティングによる）の代わりに、化学的剥離条件が使用可能かどうか確認した。
【０４２６】
（培養条件）
細胞密度：４×１０４／ｃｍ２
条件：ＣＯ２  ５％，  ａｉｒ  ９５％，  ３７℃
培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２  （ＦＢＳ  １０％）にＴＧＦβ１  １０ｎｇ／ｍｌを添加した。
【０４２７】
この培地を用いて、実施例１４および実施例１５において記載されるような条件で、培養を行い、人工組織を作製した。
【０４２８】
単層培養細胞を培養皿から剥離させる際にＴＧＦ−βを加えるとさらに細胞がはがれやすくなった。
【０４２９】
使用した培地：ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）  １０％、ＩＴＳ＋  Ｐｒｅｍｉｘ  （インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）６．２５μｇ／ｍｌ、デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ）  １０−７Ｍ、アスコルビン酸（ＷＡＫＯ）  ５０μｇ／ｍｌ，  ピルビン酸（ＳＩＧＭＡ）  １００μｇ／ｍｌ。
【０４３０】
その結果を示す。図１９の一番右の列がTGF-βを添加した場合であるが、単層培養中に既に細胞は培養皿より剥がれてしまい、うまく人工組織を作成することができなかった一例である。また図３９は単層培養で出来た組織をTGF-βを添加することにより物理刺激なく組織を剥離させた結果である。これらの結果はTGF-βの培養細胞剥離効果を示したものといえる。
【０４３１】
（実施例２５：アクチン調節物質）
アクチン脱重合作用を有することで知られるジヒドロサイトカラシンＢおよびＹ２７６３２（山之内製薬）を用いて、人工組織の収縮への影響を検討した。
【０４３２】
単層培養でできた滑膜由来人工組織を培養皿より剥離させた後の組織をジヒドロサイトカラシンBおよびY27632存在下の培地中で培養した。培養時間ごとの半径の推移を図４０に示す。示されるように、これらの脱重合作用を有する薬剤の添加により、収縮が遅延した。ジヒドロサイトカラシンＢ（３μＭ）およびＹ２７６３２（１０μＭ）は、アクチン重合阻害剤の代表例であり、サイトカラシンＤなどの他のアクチン重合阻害剤も同様に作用することが当業者には理解される。
【０４３３】
（実施例２６：人工組織と人工骨とによる複合組織である人工骨軟骨柱の作製）
１２ｗｅｌｌの培養皿を用いて人工組織を作製した。
【０４３４】
９６ｗｅｌｌの培養皿に径５ｍｍｘ６ｍｍの円柱状の人工骨（ＮＥＯ  ＢＯＮＥ：  ＭＭＴ社）をおき、その上に人工組織を移植し、培地（ＤＭＥＭ，  １０％ＦＢＳ）を１００μｌいれ、２時間培養させ、人工組織と人工骨とを接着させて複合組織を作製した。
【０４３５】
この複合体を、軟骨誘導培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ，  ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン２リン酸、５００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２）で１４日間培養し、作製した。
【０４３６】
その結果を図４１に示す。
【０４３７】
示されるように、他の人工組織（例えば、人工骨）と見事に癒合していることが明らかになる。従って、本発明の人工組織は、それ以外の人工組織と複合組織を形成させて利用することもできることが理解される。
【０４３８】
（実施例２７：コラーゲンスキャフォールドに貼り付けた人工組織での複合組織）
次に、実施例２６におけるＮＥＯＢＯＮＥに代えて、微線維性コラーゲン医療材料であるコラーゲン人工組織（ＣＭＩ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍｅｎｉｓｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ）  コラーゲンスポンジ、Ａｍｇｅｎ，ＵＳＡ）を貼り付けた人工組織を作製した。その結果（拡大写真）を図４２に示す。本発明の人工組織がＣＭＩの表面において生物学的に結合していることが観察される。このように、従来の人工組織である微線維性コラーゲン医療材料を用いても、本発明の人工組織が複合組織を形成することが明らかになった。
【０４３９】
（実施例２８：筋芽細胞による人工組織作製）
次に、筋芽細胞を用いた場合の、アスコルビン酸またはその誘導体による人工組織作製への影響を検討した。人工組織生産は、実施例１に準じた。
【０４４０】
筋芽細胞を十分量増殖させた後、５×１０６の細胞数を、培養した。培養には、ＳｋＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ））という培地を使用した。次に、アスコルビン酸２リン酸（０.５mM）、アスコルビン酸１リン酸マグネシウム塩（０.１mM）、L−アスコルビン酸Na（０.１mM）を投与し、培養開始４日後に脱着させた。コントロールとして、アスコルビン酸類を添加しない培養系で培養した人工組織を作製した。
【０４４１】
（結果）
アスコルビン酸類を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織よりも、脱着が格段に容易となっており、しかも、無添加の培養系では、数ｍｍ程度の大きさまでしか培養されず、それを超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。しかも、はがすことが実質的に困難であり、移植可能な人工組織を提供できなかった（図４３）。これに対し、本発明のアスコルビン酸類を添加した培地で培養した人工組織は、移植可能な程度の大きさに成長し、容易に人工組織を単離することができた（図４４）。生物学的結合を見たところ、細胞外マトリクスによる相互作用がかなり進んでいることが判明した（図４５）。
【０４４２】
（実施例２９：アスコルビン酸類の存在下で培養した人工組織の効果）
実施例２８においてアスコルビン酸類の存在下で作製した人工組織を、拡張型心筋症マウスに移植した。ラットの左前下行枝（ＬＡＤ）を２週間結紮することによって、２８匹のラットにおいて、損傷心臓を作製する。損傷心臓に本発明の人工組織を移植するもの、しないものを作製する。コントロールとして、心臓に損傷を与えないラットも作製する。
【０４４３】
ラットを麻酔し、手術後１４日目および２８日目に、心機能をモニターする。１２−ＭＨｚで操作する環状アレイ変換器を備えた超音波機器（Ｓｏｎｏｓ５５００）を使用して、エンドカルジオグラフィを実施する。Ｂ画像化モードおよびＭ画像化モードにおける胸骨傍短軸画像および胸骨傍長軸画像を実施した。前壁圧に加えて、全体的パラメーター（例えば、左心室拡張末期直径、左心室収縮末期直径、内径短縮率および駆出率）を測定する。
【０４４４】
移植後２週間後および４週間後、過量のペントバルビタールによってラットを殺傷し、その心臓を切除し、１０％ホルマリンで固定し、そしてパラフィン中に包埋する。低温槽を使用することによって、心臓の長手軸方向に沿って心底から心尖まで、一連の５ｍｍ厚切片を調製し、その後、標準的組織学のために処理する。
【０４４５】
移植したラットすべてが完治し、通常のラットと同様の生存期間生存する。従って、本発明は、特定の細胞外マトリクス産生促進因子の存在によって、従来難治性といわれた疾患をも完治させることができることが判明する。
【０４４６】
（実施例３０：併用療法）
上記実施例で作成された人工組織と遺伝子治療の併用療法を施行した。これは併用療法により人工組織移植部の血管新生を促進し、移植人工組織の生着促進、人工組織内部の細胞壊死を抑制する目的である。
【０４４７】
（方法）
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は文献（Kaneda Y,Iwai K, Uchida T. Increased expression of DNA co−introduced with nuclearprotein in adult rat liver. Science. 1989;243:375−378）の記載に従っておこなった。以下に簡潔に示す。DNA溶液200μlを加え、30秒間振盪し、37度恒温槽に30秒間静置する。これを8回繰り返す。5秒間超音波処理をし、30秒間振盪する。0.3mlのBSSを加え、37度恒温槽で振盪する。不活化したHVJを加え、氷上で10分間置く。37度恒温槽にて1時間振盪する。超遠心チューブに60％と30％のショ糖溶液をそれぞれ1ml、6mlで重層し、HVJリポソーム液をのせ、BSSをチューブの付近まで加える。62,800g、4度で1.5時間超遠心する。30%ショ糖溶液層のすぐ上を回収し、４度に保存し、遺伝子導入に用いた。
【０４４８】
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（Ueda H, Sawa Y, Matsumoto K et al. Gene Transfection of HepatocyteGrowth Factor Attenuates reperfusion Injury in the Heart. Ann Thorac Surg.1999;67:1726−1731）。実施例３０において作製した人工組織をもちいる。ＬＡＤの結紮することにより作成された心筋梗塞モデルに3つの異なる治療1）細胞シート群2）遺伝子治療群3）併用療法群4）コントロール群を作成し、心機能、心筋組織の変化を検討した。
【０４４９】
（結果）
人工組織を移植した群、併用療法群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに併用療法をした群では心筋梗塞部分に血管新生を認め、移植細胞の生着が改善していることが確認できる。
【０４５０】
（結論）
人工組織と遺伝子治療とを併用することにより心機能改善効果とさらに血管新生効果と細胞保護効果があり、より心機能の改善が認められる。
【０４５１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０４５２】
本発明は、従来治療が困難であった疾患の根本的な治療方法、技術、医薬、医療デバイスを提供するという有用性を有する。特に、天然に近い状態への回復を促進するという意味において、画期的な治療および予防を提供し、そのために使用される医薬、細胞、組織、組成物、システム、キットなどの提供において本発明は有用であることが理解される。
【０４５３】
本発明がターゲットとする骨・軟骨を中心とした関節組織修復・再生のニーズであるが、骨再生のターゲットとなる骨折患者数は年間数十万人にのぼり、また軟骨再生治療の主要なターゲットとなる変形性関節症の潜在患者数は３０００万人とも言われており、潜在するマーケットは巨大であり、周辺産業における有用性は高い。骨・軟骨を中心とした関節組織を対象とした再生医療研究は世界で激烈な競争が開始されているが、本発明の人工組織は、患者などの生体より採取した細胞から作成される、安全でかつ独創的なマテリアルであり、副作用などの点からも有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【０４５４】
【図１】図１は、滑膜細胞を用いた人工組織作成例を示す。
【図２】図２は、アスコルビン酸２リン酸が０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび５ｍＭの場合のの人工組織の組織像を示す。０．１ｍM以上加えた場合、マトリックスの染色性が添加しない場合に比して亢進している。
【図３】図３は、培養日数が、３日、７日、１４日および２１日の人工組織の組織像を示す。示されるように、３日後でも人工組織は形成されるがマトリックス成分は疎であり、培養日数とともにマトリックス成分が増えていくことが確認できる。
【図４】図４は、滑膜細胞の人工組織の細胞外マトリクス染色例を示す。
【図５】図５は、正常組織（正常滑膜組織、腱組織、軟骨組織、および半月組織）の染色例を示す。
【図６】図６は、対比例として用いた市販のコラーゲンスポンジの染色例を示す。左からフィブロネクチン、ビトロネクチン、非ＩｇＧ染色ネガティブコントロール、およびＨＥ染色を示す。
【図７】図７は、コラーゲン含有量測定を行った結果を示す。アスコルビン酸２燐酸を０，１ｍＭ以上加えるといずれの培養時期においても有意に人工組織内のコラーゲン量が増大しているが、０．１、１、５ｍＭでの差は認められない。
【図８】図８は、コラーゲン含有量測定を行った結果を示す。アスコルビン酸２燐酸を０，１ｍＭ以上加えるといずれの培養時期においても有意に人工組織内のコラーゲン量が増大しているが、０．１、１、５ｍＭでの差は認められない。
【図９】図９は、異なる皿の大きさでの人工組織の作製の様子を示す。Ｐは継代数を示し、写真の中の数字は、細胞数／ｃｍ２を示す。
【図１０】図１０は、異なる継代数の細胞での人工組織の作製の様子を示す。＊は３５ｍｍ皿での培養、＊＊は６０ｍｍ皿での培養、＊＊＊は１００ｍｍ皿での培養を示す。
【図１１】力学的特性を測定する装置例を示す。
【図１２】力学的特性を測定する装置の試験片把持部を示す。
【図１３】力学的特性を測定する装置の拡大図を示す。試験片にはマーカーが付されている。
【図１４】図１４は、試験片把持部の拡大図を示す。
【図１５】図１５、人工組織の破断実験後の様子を示す。
【図１６】本発明の人工組織（滑膜組織由来）の力学的特性試験結果（伸び）を示す。
【図１７】本発明の人工組織（滑膜組織由来）の力学的特性試験結果（歪み）を示す。
【図１８】本発明の骨化誘導実験の例および結果を示す。上半分に、骨分化誘導のスキームを示す。誘導は、０．１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロホスファテート、および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸２リン酸の存在下で行った。左下の図は、コントロールを示し、左中の図は、骨分化したサンプルの写真を示す。真ん中の図は、アリザリンレッドで染色した写真である。右下の図は、コントロールをＡＬＰ染色した図を示す。右中の図は、骨分化したサンプルのＡＬＰ染色の結果を示す。
【図１９】本発明の人工組織の軟骨分化の結果を示す。写真は左より通常の培地、軟骨分化誘導培地、軟骨分化誘導培地＋BMP-2、軟骨分化誘導培地＋TGF−ｂ１で人工組織を培養したＡ）本発明の人工組織およびＢ）単層培養物である。Ａ）本発明の人工組織は、Ｂ）単層培養物よりもアルシアンブルー染色の染色が増加していた。さらに、ＴＧＦβの添加の結果、人工組織が、機械的刺激なしに容器から剥離した。
【図２０】図２０は、図１９および３９に示される軟骨分化刺激を加えたときの、本発明の人工組織と単層細胞シートとのアルシアンブルー判定量染色の結果である。
【図２１】図２１は、軟骨分化誘導刺激を加えた際の人工組織の軟骨マーカー遺伝子発現（アグリカン、Ｃｏｌ  ＩＩ、Ｓｏｘ９、Ｂ−アクチン）結果を示す。
【図２２】図２２は、図１９および２１における、滑膜細胞の人工組織およびその単層培養物内の、軟骨分化刺激における軟骨分化マーカーの比較を示す。
【図２３】
【図２３】図２３は、本発明の人工組織のインビボでの軟骨移植実験方法およびその結果を示す。上部パネルに移植培養の方法を示す。人工組織は、部分損傷軟骨においてインビトロで接着させた。表在性帯を取り除き、コンドロイチナーゼＡＢＣで消化した（Ｈｉｎｚｉｋｅｒ  ＥＢ，ＪＢＪＳ，１９９６）。左下の図は、×４０の写真を示し、右下の図は×２００の図を示す。示されるように、損傷面に密に密着している様子がわかる。
【図２４】本発明の軟骨移植実験の例および結果を示す。これは、部分損傷軟骨への人工組織の接着を示す。左には、１０日目の細胞（間葉系幹細胞）を示す。左側上には×４０の拡大写真および左側下には×２００の拡大写真を示す。
【図２５】本発明の人工組織の軟骨移植実験における癒合を示す。１０日目の様子が例示される。右にはＨＥ染色が示され、中にはフィブロネクチン染色が示され、左にはビトロネクチン染色が示される。
【図２６】図２６に示されるように、同様に、人工組織が炎症を起こさずに定着していたことを示す図である。人工組織を軟骨損傷部へ移植後１ヶ月の組織像である。人工組織内に炎症細胞の浸潤は認められない。また人工組織の表層部は線維芽細胞様細胞が多数を占めている（図２７において拡大）が、深層部分では軟骨細胞様細胞が多数を占めており（図２８において拡大）、移植後の人工組織の軟骨への分化誘導（特に深層で）が示唆される。
【図２７】図２６の表層部の拡大図である。示されるように、人工組織の表層部は線維芽細胞様細胞が多数を占めている。
【図２８】図２６の深層部の拡大図である。深層部分では軟骨細胞様細胞が多数を占めている。従って、移植後の人工組織の軟骨への分化誘導（特に深層で）が示唆される。
【図２９】本発明の人工組織の半月修復実験結果を示す。左には、半月が露出するように大腿骨および前角部の部分を開いた図を示す。右には、直径６ｍｍの欠損を作製した結果を示す。
【図３０】本発明の人工組織の半月修復実験結果を示す。左には、滑膜由来の人工組織（左下）を欠損部に入れる前の様子を示し、右には、滑膜由来の人工組織を欠損部に充填した後の写真を示す。
【図３１】本発明の人工組織の半月修復実験結果を示す。術後４週の肉眼像を示す。上には、半月の様子を示す。相対する軟骨表面に摩擦等による変性、損傷所見なしとなり、回復したことが示された。左下および右下には、シートを除去した後の修復部を示す。
【図３２】本発明の人工組織の半月修復実験結果を示す。組織像が示される。上には、実寸大の写真を示し、左下には、修復部実質部を示す。右下には、隣接半月との境界部を示す。左下および右下とも倍率は２００倍である。修復部はエオジン陽性の半月組織様のマトリックス形成がなされており、また隣接する半月組織とは生物学的結合が完了している。
【図３３】脂肪由来人工組織の骨（左）および軟骨（右）誘導活性である。
【図３４】図３３は、脂肪細胞由来の三次元化組織の染色写真である。右からビトロネクチン、フィブロネクチン、ＨＥ染色を示す。
【図３５】デキサメタゾンおよびβグリセロホスファテートを単層培養時に加え、分化誘導を組織の剥離以前におこなった人工組織の例である。
【図３６】デキサメタゾンおよびβグリセロホスファテートを３次元人工組織作成後に加えて骨分化誘導をかけた一例である。
【図３７】コラーゲンゲル包埋滑膜細胞の軟骨欠損への移植後の組織像である。コラーゲンゲルと隣接軟骨間の結合が不十分で亀裂を認めた（矢印）。
【図３８】本発明の人工組織を用いた場合の、移植後の生物学的結合の組織像である。組織上は生物学的結合を認める。
【図３９】ＴＧＦ−βの単層培養組織への剥離誘導効果の別の例である。一番右の列がＴＧＦ−ｂ添加群で、この群のみ添加により単層培養組織は物理刺激を必要とせず培養皿から剥離した。
【図４０】図４０は、ジヒドロサイトカラシンＢまたはＹ２７６３２を添加または添加なしでの、培養時間ごとの直径の推移すなわち収縮・剥離の様子を示す。
【図４１】図４１は、人工骨と、本発明の人工組織との癒合を示す写真である。
【図４２】図４２は、微線維性コラーゲン医療材料であるコラーゲン人工組織（ｃｍｉ  コラーゲンスポンジ、Ａｍｇｅｎ，ＵＳＡ）を貼り付けた人工組織の拡大写真を示す。
【図４３】アスコルビン酸なしでの人工組織生産法で生産されたシートを示す。
【図４４】本発明の人工組織生産法におけるアスコルビン酸ありでの人工組織生産法で生産された人工組織を示す。
【図４５】図４４に示す人工組織におけるＨＥ染色を示す。
【図４６】応力および歪みの特性を測定することによって引っ張り強さを決定するための手法を示す。
【図４７】荷重除荷曲線を得るための方法を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０４５５】
（配列表の説明）
配列番号１は、ミオシン重鎖IIa（ヒト：アクセッション番号NM_017534）の核酸配列を示す。
配列番号２は、ミオシン重鎖IIa（ヒト：アクセッション番号NM_017534）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ミオシン重鎖IIb（ヒト：アクセッション番号NM_017533）の核酸配列を示す。
配列番号４は、ミオシン重鎖IIb（ヒト：アクセッション番号NM_017533）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ミオシン重鎖IId(IIｘ)（ヒト：アクセッション番号NM_005963）の核酸配列を示す。
配列番号６は、ミオシン重鎖IId(IIｘ)（ヒト：アクセッション番号NM_005963）のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＣＤ５６（ヒト：アクセッション番号U63041）の核酸配列を示す。
配列番号８は、ＣＤ５６（ヒト：アクセッション番号U63041）のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトＭｙｏＤの核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｘ５６６７７）を示す。
配列番号１０は、配列番号９の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号１１は、ヒト筋原性因子５（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５）（ＭＹＦ５）の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＮＭ＿００５５９３）を示す。
配列番号１２は、配列番号１１の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号１３は、ヒトミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）（筋原性因子４）の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＢＴ００７２３３）を示す。
配列番号１４は、配列番号１３の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号１５は、Ｓｏｘ９（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿０００３４６＝軟骨細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１５の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号１７は、Ｃｏｌ  ２Ａ１（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿００１８４４＝軟骨細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号１８は、配列番号１７の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号１９は、Ａｇｇｒｅｃａｎ（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿００１１３５＝軟骨細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号２０は、配列番号１９の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号２１は、Ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿００４９６７＝骨芽細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号２２は、配列番号２１の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号２３は、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿１９９１７３＝骨芽細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号２４は、配列番号２３の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号２５は、ＧＤＦ５（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿０００５５７＝靱帯細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号２６は、配列番号２５の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号２７は、Six1（ヒト：アクセッション番号  ＮＭ＿０05982＝靱帯細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号２８は、配列番号２７の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号２９は、Scleraxis（ヒト：アクセッション番号  BK＿000280＝靱帯細胞に特異的なマーカ−）の核酸配列を示す。
配列番号３０は、配列番号２９の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月22日(2007.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な人工組織。
【請求項２】
人工組織を生産するための方法であって、
Ａ）細胞を提供する工程；
Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；
Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程；および
Ｄ）前記細胞を該容器から分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物であって、
Ａ）該細胞を維持するための成分；および
Ｂ）細胞外マトリクス産生促進因子、
を含む、組成物。
【請求項４】
生体の部分を補強、修復または再生するための、細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）。
【請求項５】
生体の部分を補強するための方法であって、
Ａ）細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程；および
Ｂ）該複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間該複合体を保持する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
生体の部分を処置するための方法であって、
Ａ）細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程；および
Ｂ）該生体の部分の状態が改善するに十分な時間保持する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
所望の厚さを有する人工組織を生産するための方法であって、
Ａ）細胞を提供する工程；
Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；
Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程；および
Ｄ）物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
移植可能な人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織。
【請求項９】
所望の厚さを有する人工組織を生産するために使用される組成物であって、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、組成物。
【国際調査報告】
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