(57)【要約】本発明は、内皮前駆細胞の発見に基づく。本発明の開示により、ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ−２とＣＤ４５に免疫反応性である内皮前駆細胞が提供される。状況によっては、本発明により提供される細胞は、ＣＤ１４と免疫反応する。これらの細胞は、インビボで内皮細胞または平滑筋細胞に分化することができる。培養物は、移植後、成体の脈管構造に完全に生着する。本発明は、内皮前駆細胞の培養物、例えば、インビトロ培養物を特徴とする。
2007528222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの末梢血に由来する細胞を含む、インビトロ細胞培養物であって、該培養物中の該細胞は、
ａ．Ｔｉｅ−２＋またはＶＥＧＦＲ−２＋であり；
ｂ．ＣＤ１４４−およびＣＤ４５＋であり；
ｃ．培養物中で培養することができ；ならびに
ｄ．インビボで増殖し、内皮細胞および平滑筋細胞に分化することができる、
インビトロ細胞培養物。
【請求項２】
前記培養物中の前記細胞が、少なくとも２週間生存できる、請求項１に記載の培養物。
【請求項３】
前記培養物中の前記細胞が、少なくとも４週間生存できる、請求項１に記載の培養物。
【請求項４】
前記培養物が付着培養物である、請求項１に記載の培養物。
【請求項５】
インビボで内皮細胞または平滑筋細胞に分化するヒト前駆細胞の集団を生成する方法であって、ヒト末梢血由来の細胞の集団からＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、およびＴｉｅ−２＋またはＶＥＧＦＲ−２＋である細胞を選択する工程を包含する、方法。
【請求項６】
多能性前駆細胞を被験体に移植する方法であって、
ａ．多能性のヒトＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、およびＴｉｅ−２＋またはＶＥＧＦＲ−２＋前駆細胞を含むインビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞はインビボで内皮細胞または平滑筋細胞に分化する多能性を維持している、工程；および
ｂ．前記細胞を前記被験体に移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
前記被験体が血管障害に罹患している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被験体において損傷した血管を再増殖させる方法であって、多能性のヒトＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、およびＴｉｅ−２＋またはＶＥＧＦＲ−２＋前駆細胞の集団を含む組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここで、該細胞はインビボで内皮細胞または平滑筋細胞に分化する多能性を維持している、方法。
【請求項９】
前記組成物が血管に直接投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が動脈床に直接投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記血管が静脈または動脈である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が血管障害に罹患している、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
血管移植片を内皮細胞化させる方法であって、該血管移植片を、多能性のヒトＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、およびＴｉｅ−２＋またはＶＥＧＦＲ−２＋前駆細胞の集団を含む組成物と接触させる工程を包含し、ここで、該細胞はインビボで内皮細胞または平滑筋細胞に分化する多能性を維持している、方法。
【請求項１４】
前記移植片が人工血管移植片である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記移植片が同種移植片である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記移植片が同系移植片である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記血管移植片がインビトロ、インビボ、またはエキソビボで接触させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記血管移植片が被験体への移植の前に前記組成物と接触させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管移植片が被験体への移植の後に前記組成物と接触させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管移植片が静脈または動脈である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトの末梢血由来の細胞を含むインビトロ細胞培養物であって、該培養物中の該細胞は、
ａ．ＶＥＧＦＲ−２＋；ＣＤ１４＋、ＣＤ１４４−、およびＣＤ４５＋であり；
ｂ．培養物中で培養することができ；ならびに
ｃ．インビボで増殖し、内皮細胞に分化することができる、
インビトロ細胞培養物。
【請求項２２】
前記培養物中の前記細胞が、少なくとも２週間生存できる、請求項２１に記載の培養物。
【請求項２３】
前記培養物中の前記細胞が、少なくとも４週間生存できる、請求項２１に記載の培養物。
【請求項２４】
前記培養物が付着培養物である、請求項２１に記載の培養物。
【請求項２５】
インビボで内皮細胞に分化するヒト前駆細胞の集団を生成する方法であって、ヒト末梢血由来の細胞の集団からＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、およびＶＥＧＦＲ−２＋である細胞を選択する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前駆細胞を被験体に移植する方法であって、
ａ．ヒトＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、およびＶＥＧＦＲ−２＋前駆細胞を含むインビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞はインビボで内皮細胞に分化する能力を維持している、工程；および
ｂ．該細胞を該被験体に移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記被験体が血管障害に罹患している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験体の損傷した血管を再増殖させる方法であって、ＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、およびＶＥＧＦＲ−２＋前駆細胞の集団を含む組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここで、該細胞はインビボで内皮細胞に分化する能力を維持している、方法。
【請求項２９】
前記組成物が血管に直接投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が動脈床に直接投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記血管が静脈または動脈である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が血管障害に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
血管移植片を内皮細胞化させる方法であって、前記血管移植片を、多能性のヒトＣＤ１４４−、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、およびＶＥＧＦＲ−２＋前駆細胞の集団を含む組成物と接触させる工程を包含し、ここで、該細胞はインビボで内皮細胞に分化する能力を維持している、方法。
【請求項３４】
前記移植片が人工血管移植片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記移植片が同種移植片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記移植片が同系移植片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記血管移植片がインビトロ、インビボ、またはエキソビボで接触させられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記血管移植片が被験体への移植の前に前記組成物と接触させられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記血管移植片が被験体への移植の後に前記組成物と接触させられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記血管移植片が静脈または動脈である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は前駆細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血管形成は、既存の脈管構造からの新しい血管の発生（脈管新生）のプロセスであり、一方、脈管形成は、インサイチュで分化する内皮前駆細胞からの血管の形成をいう。最近まで、血管形成は成体での脈管新生のみを意味すると考えられ、脈管形成は胚発生に限定されると考えられてきた。しかし、循環している内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の存在により、成体においても出生後脈管形成が生じることの証拠がもたらされた。虚血性損傷からの組織の再生のための治療用ツールとしてのＥＰＣの可能性が示唆されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、内皮細胞に分化することができる前駆細胞の供給源が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、内皮前駆細胞の発見に基づく。前駆細胞は多能性である。前駆細胞は、例えば、インビボまたはインビトロで、内皮細胞または平滑筋細胞に分化することができる。したがって、本発明は、内皮前駆細胞の培養物、例えば、インビトロ培養物を特徴とする。培養物は付着培養物である。あるいは、培養物中の細胞は浮遊状態である。細胞は、造血組織、例えば、血液（例えば、末梢血または骨髄）に由来する。組織は、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタに由来する。細胞は、ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ−２とＣＤ４５に免疫反応性であり、ＣＤ１４４とは免疫反応しない。状況によっては、ＶＥＧＦＲ＋細胞はＣＤ１４とも免疫反応する。細胞はインビトロで増殖させられる。細胞は、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍またはそれ以上に増殖することができ、内皮細胞または平滑筋細胞に分化する能力を維持することができる。
【０００５】
本発明はさらに、ＶＥＧＦＲ−２＋またはＴｉｅ−２＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞、あるいは、ＶＥＧＦＲ−２＋ＣＤ１４＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞を提供し、そしてこれらの細胞を被験体に移植することによって、被験体に前駆細胞または前駆細胞の子孫を移植する方法を特徴とする。移植によっては、臨床的有益性、例えば、特定の血管障害の１つ以上の症状の緩和がもたらされる。血管障害は、当該分野で公知の方法を使用して医師によって診断される。
【０００６】
損傷した血管は、ＶＥＧＦＲ−２＋またはＴｉｅ−２＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞を含む組成物、あるいは、ＶＥＧＦＲ−２＋ＣＤ１４＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞を含む組成物を被験体に投与することによって再増殖させられる。これらの組成物は、血管（例えば、静脈または動脈）に、あるいは動脈床に直接投与される。あるいは、これらの組成物は全身的に投与される。
【０００７】
血管移植片は、血管移植片をＶＥＧＦＲ−２＋またはＴｉｅ−２、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞を含む組成物、あるいは、ＶＥＧＦＲ−２＋ＣＤ１４＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞を含む組成物と接触させることによって内皮細胞化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚｅｄ）させられる。血管移植片は静脈である。あるいは、血管移植片は動脈である。移植片は人工血管移植片、同種移植片、または同系移植片である。移植片は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで接触させられる。血管移植片は、被験体への移植の前に接触させられる。あるいは、移植片は、被験体への移植後に組成物と接触させられる。
【０００８】
血管を再増殖させるか、または血管移植片を内皮細胞化させるによって、血管または移植片が、前駆細胞で処置されていない血管または移植片と比較して、血管または移植片が多量の内皮細胞を有していることが意味される。例えば、処置された血管または移植片は、処置されていない血管または移植片と比較して大きな血管径と中膜厚を有する。
【０００９】
ＶＥＧＦＲ−２＋またはＴｉｅ−２＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞は、インビボで、内皮細胞または平滑筋細胞に分化する能力を維持する。一方、ＶＥＧＦＲ−２＋ＣＤ１４＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ１４４−前駆細胞は、インビボで、内皮細胞に分化する能力を維持する。被験体は、例えば、哺乳動物であり、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。被験体は、血管障害または血管組織の損傷に罹患している。例えば、被験体は、末梢動脈障害、動脈瘤、腎（腎臓）動脈障害、レイノー現象、バージャー病、末梢静脈障害、静脈瘤、静脈内血塊に罹患している。移植および／または再増殖によって、臨床的有益性、例えば、特定の血管障害の１つ以上の症状の緩和がもたらされる。血管障害は、当該分野で公知の方法を使用して医師によって診断される。
【００１０】
他の場所で明確に定義されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が統制する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定するようには意図されない。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、ヒトの末梢血の中の明確な前駆細胞の集団の予想外の発見に基づく。これは、インビトロで培養することができ、前駆細胞の表現形を維持することができる。さらに、これらの細胞をマトリゲル上でインビトロで培養すると、これらは、細管様構造を形成することができる。これらの細胞は、動脈が損傷している動物に移植されると、内皮細胞および／または平滑筋細胞への機能的な分化を示した。
【００１３】
血管障害には、世界中で顕著な罹患率および死亡率のある、広い範囲の急性の状態と慢性の状態のものが含まれる。内皮細胞の移植は、虚血によって損傷した組織の処置においては、非常にすばらしい治療能力を有している。血管障害には、循環系に影響を及ぼす任意の状態が含まれる。これは、動脈、静脈、およびリンパ管の疾患から、循環に影響を及ぼす血液疾患にまでの範囲に及ぶ。血管障害の例としては、末梢動脈障害、動脈瘤、腎（腎臓）動脈障害、レイノー現象、バージャー病、末梢静脈障害、静脈瘤、静脈内血塊が挙げられる。
【００１４】
冠動脈疾患は、少なくとも２つのグループにカテゴリー分類することができる。急性の冠動脈疾患としては心筋梗塞が挙げられ、慢性の冠動脈疾患としては慢性冠動脈虚血、動脈硬化症、うっ血性心不全、狭心症、アテローム性動脈硬化症、および心筋肥大が挙げられる。他の冠動脈疾患としては、脳卒中、心筋梗塞、拡張型心筋症、再狭窄、冠状動脈疾患、心不全、不整脈、狭心症、または高血圧が挙げられる。
【００１５】
急性の冠動脈疾患によって、心臓への血液の供給の突然の遮断が生じ、これによって心臓組織には酸素や栄養分が届かなくなり、結果として心臓組織の損傷および死が生じる。対照的に、慢性の冠動脈疾患は、時間とともに心臓組織への酸素および血液の供給が段階的に減少し、これによって心臓組織の進行性の損傷が生じ、最終的には死に至ることを特徴とする。内皮前駆細胞のインビトロおよびインビボでの増殖および分化をうまく行うことは、内皮細胞の移植に、および遺伝子治療用のビヒクルに有用である。
【００１６】
本発明によって、インビボで内皮細胞および／または平滑筋細胞に分化することができる、末梢血由来の多能性内皮前駆細胞を生成するための方法が提供される。
【００１７】
（内皮前駆細胞）
本発明によって、内皮前駆細胞（本明細書中ではＥＰＣと呼ばれる）が提供される。ＥＰＣ細胞は、本発明の方法を使用して増殖するように誘導することができる未分化の細胞である、ＥＰＣは自己維持（ｓｅｌｆ−ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）することができ、その結果、どの細胞分裂によっても、少なくとも１つの娘細胞がまたＥＰＣ細胞となる。ＥＰＣ細胞は１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、またはそれ以上に増殖させることができる。
【００１８】
ＥＰＣの表現形は、これらの細胞が約束された造血細胞のマーカーであるＣＤ４５を発現することを明らかに示している。さらに、ＥＰＣは、ＶＥＧＦＲ−２および／またはＴｅｉ−２と免疫反応性であり、カドヘリン５（ＣＤ１４４）とは非免疫反応性である。状況によっては、ＥＰＣはＣＤ１４と免疫反応する。ＣＤ１４とは免疫反応しないＥＰＣは、インビボでは、内皮細胞または平滑筋細胞に分化することができる。別に、ＣＤ１４と免疫反応する細胞は、内皮細胞だけに分化することができる。ＥＰＣは多能性前駆細胞である。多能性前駆細胞によって、細胞が１つ以上のタイプの細胞に分化することができることが意味される。例えば、細胞は、内皮細胞または平滑筋細胞に分化することができる。
【００１９】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、特異的チロシンキナーゼ受容体を介して作用する。特異的チロシンキナーゼ受容体には、ＶＦＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４が含まれ、これらは、胚血管形成および造血に不可欠なシグナルを伝達する。ＶＥＧＦは３つの受容体全てに結合するが、最大の生物学的機能はＶＥＧＦＲ−２によって媒介され、ＶＥＧＦＲ−１の役割は現在は不明である。ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ４によるシグナル伝達は、リンパ腺の内皮細胞の発達に重要であることが知られており、ＶＥＧＦＲ３によるシグナル伝達は、内皮細胞にリンパ球内皮細胞様表現形を付与し得る。ＶＥＧＦＲは、血管の増殖の刺激、血管緊張低下、血管透過性の誘導、内皮細胞の移動、増殖、および生存に不可欠なプロセスについてのシグナルをリレーする。内皮細胞は全ての異なるＶＥＧＦ−Ｒを発現する。胚発生の間には、１つの前駆細胞である、血管芽細胞が造血系と脈管系の両方を生じ得ることが報告されている。
【００２０】
Ｔｉｅ−２は内皮特異的受容体チロシンキナーゼであり、アンギオポエチン１の受容体である。これはＩ型膜タンパク質であり、活発に増殖している血管の内皮において主に発現され、最も早く発見された哺乳動物の内皮細胞系統のマーカーであり得る。Ｔｉｅ−２はおそらく、内皮細胞の増殖と分化の調節に関係しており、血管の形成の間に内皮細胞の特別な方向付けを指示し得る。
【００２１】
ＣＤ１４抗原は、リポ多糖（ＬＰＳ）とＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）の複合体についての高親和性受容体である。ＣＤ１４抗原は、ＣＤ１４、ＴＬＲ４、およびＭＤ−２から構成される機能性のヘテロマーであるＬＰＳ受容体複合体の一部である。ＣＤ１４は、末梢血の中のほとんどのヒトの単球およびマクロファージ上、他の体液および種々の組織、例えば、リンパ節および脾臓の上で強く発現される。ＣＤ１４は、ヒト好中球および骨髄樹状細胞の亜集団上では、おそらく、弱く発現される。
【００２２】
ＣＤ４５抗原はチロシンホスファターゼであり、これは白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても知られている。ＣＤ４５は、赤血球系細胞、血小板、およびそれらの前駆細胞を除く、造血系を起源とする全てのヒト細胞上に存在する。ＣＤ４５分子にはＴ細胞とＢ細胞の活性化が必要であり、これは、細胞の活性化状態によって少なくとも５つのイソ型で発現される。
【００２３】
ＣＤ１４４はまた、カドヘリン５またはＶＥ−カドヘリンとも呼ばれ、細胞接着分子のカドへリンファミリーに属する１４０ｋＤａのタンパク質である。ＣＤ１４４抗原は内皮細胞に特異的であり、そして、内皮組織内の接合部位の細胞間の裂隙部位に存在する。カドヘリン５分子は、脈管内皮の透過特性において役割を果たすことができる。
【００２４】
血液は、任意の動物、例えば、魚類、爬虫類、鳥類、両生類、および哺乳動物、例えば、好ましくは、齧歯類、および例えば、マウスおよびヒトから得ることができる。
【００２５】
ＶＥＧＦＲ−１＋、ＶＥＧＦＲ−２＋、およびＴｉｅ−２＋細胞は、それぞれ、血液中の単核細胞の全集団のおよそ３．０±０．２％、０．８±０．５％、２．０±０．３％を占める。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は、単球の全集団のおよそ２．０±０．５％を占め、そして血液中の単核細胞の０．０８±０．０４％を占める。
【００２６】
ＥＰＣは、長期培養物中でインビトロで維持することができる。ＥＰＣは、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、またはそれ以上、培養物中で継代培養することができる。
【００２７】
（内皮前駆細胞の単離）
本発明は、内皮前駆細胞または平滑筋前駆細胞の集団を単離する方法に関する。細胞の集団は、ポジティブ選択の手段によって、またはいずれかの順序でのポジティブ選択とネガティブ選択の両方の混合によって単離される。前駆細胞の集団が精製される。精製されたＥＰＣの集団には、それから細胞が単離された細胞の粗集団よりも明らかに多い割合のＥＰＣの集団が含まれる。
【００２８】
例えば、精製手順によって、集団全体に対してＥＰＣは、少なくとも５倍の増加、好ましくは少なくとも１０倍の増加、より好ましくは少なくとも１５倍の増加、最も好ましくは少なくとも２０倍の増加が、そして状況によっては、少なくとも２５倍の増加が導かれるはずである。精製されたＥＰＣの集団には、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３５％、そして最適には少なくとも５０％のＥＰＣが含まれるはずである。
【００２９】
本明細書中に記載される方法によっては、７５％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは８５％まで、最も好ましくは９０％まで、そして最適には９５％までを幹細胞が占める混合物を導くことができる。このような方法は、９９％、９９．９０％、そしてさらには１００％をＥＰＣが占める混合物を生じることができる。したがって、本発明の精製された集団には、上記のような自然界に存在している集団よりも有意に高いレベルのＥＰＣが含まれる。
【００３０】
精製されたＥＰＣの集団は、ＥＰＣに特徴的な抗原を発現する幹細胞の集団を含む細胞の粗混合物を、抗原の細胞外部分に特異的に結合する分子と接触させることによって単離される。このような技術は、ポジティブ選択として知られている。ＥＰＣのこれらの分子への結合によって、抗原を発現しない混入している細胞とＥＰＣを十分に識別することができ、混入している細胞から幹細胞を単離することができる。抗原はＶＥＧＦＲであることが好ましく、より好ましくはＶＥＧＦＲ−２である。
【００３１】
混入している細胞から前駆細胞を分離するために使用される分子は、ＥＰＣに特徴的な抗原に特異的に結合する任意の分子であり得る。分子は、例えば、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、または受容体である抗原の場合には、受容体のリガンドであり得る。例えば、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＦＬＫ−１）の場合には、リガンドはＶＥＧＦである。
【００３２】
本発明の特有の単離された細胞は、それらのＣＤ４５＋状態と、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（例えば、ＶＥＧＦＲ−２）の保有によって他の細胞から分離される。細胞は、Ｃｉｖｉｎ，米国特許第４，７１４，６８０号、同第４，９６５，２０４号、同第５，０３５，９９４号、および同第５，１３０，１４４号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号、およびＬｏｋｅｎら米国特許第５，１３７，８０９号（これらの全ては、それらの全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されている技術のような、細胞を分離するための従来技術によって単離することができる。したがって、例えば、ＣＤ４５特異的モノクローナル抗体またはＶＥＧＦＲ特異的抗体を、ニトロセルロース、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空線維膜、磁気ビーズ、およびプラスチック製のペトリ皿のような固体支持体上に固定することができる。その後、細胞集団全体が固体支持体の上を通過させられるか、またはビーズに添加される。
【００３３】
結合分子に結合した細胞は、残っている細胞懸濁液から固体支持体を物理的に分離することによって、細胞懸濁液から取り出される。例えば、結合していない細胞は、幹細胞を固体支持体に結合させるために十分な時間の後、生理学的緩衝液で溶出させることも、また洗浄することもできる。
【００３４】
結合した細胞は、固相および結合分子の性質に主に依存して、任意の適切な方法によって固相から分離される。例えば、結合した細胞は激しい攪拌によってプラスチック製のペトリ皿から溶出させられ得る。あるいは、結合した細胞は、酵素による「ニッキング」または固相と抗体との間の酵素に敏感な「スペーサー」配列の消化によって溶出させることができる。アガロースビーズに結合させられた適切なスペーサー配列は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている。
【００３５】
溶出された富化させられた細胞の画分は、その後、遠心分離によって緩衝液で洗浄され、従来技術にしたがって後で使用されるまで低温で生存している状態で保存される。細胞はまた、例えば、レシピエントに静脈内注射されることによって、すぐに使用される場合もある。
【００３６】
固相支持体に付着したままである細胞は、使用される抗体によって認識されるマーカーを含む細胞である。したがって、抗ＣＤ４５抗体が使用されると、その後、得られる集団はＣＤ４５＋細胞について大幅に富化させられる。使用される抗体がＶＦＧＦＲである場合には、得られる集団はＶＦＧＦＲ＋細胞が大幅に富化させられる。この集団は、その後、他のマーカーに対する抗体がそれに付着している固相を使用する工程を繰り返し行うことによって、他のマーカーについて富化させることができる。
【００３７】
ＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋細胞を選別するための別の方法は、フローサイトメトリーによる方法であり、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによって製品名ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒとして製造されている選別装置のような蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）による方法が最も好ましい。この技術によって、その上に抗ＣＤ４５抗体を有している細胞が、そのような色素に結合させられた抗ＣＤ４５抗体によって特定の蛍光色素でタグ化される。同様に、細胞のＶＥＧＦＲマーカーは、他の色素に結合させられた抗ＶＥＧＦＲ抗体によって別の蛍光色素でタグ化される。染色された細胞が機器の上に置かれると、細胞の流れがアルゴンレーザー光線によって方向付けられ、蛍光色素が励起されて光を発する。この発光は、光学フィルターのセットによって蛍光色素の発光波長に特異的な光電子倍増管（ＰＭＴ）によって検出される。ＰＭＴによって検出されたシグナルは、その自身のチャネルにおいて増幅され、種々の異なる形態（例えば、柱状グラフ、点表示、または曲線表示）でコンピューターによって表示される。したがって、１つの波長で発光する蛍光細胞は、特異的な蛍光色素標識された試薬と反応する分子であり、一方、非蛍光細胞または異なる波長で発光する蛍光細胞はこの分子を発現しないが、他の波長で蛍光を発する蛍光色素標識された試薬と反応する分子を発現し得る。フローサイトメーターはまた、細胞によって発現される蛍光の量（蛍光強度）を表示する点において半定量的でもある。これは、比較の意味では、細胞によって発現される分子の数に関係する。
【００３８】
フローサイトメーターはまた、非蛍光パラメーター、例えば、細胞容量、または、それがレーザー光線を通過する際に細胞によって散乱させられた光を測定するために、取り付けられる。細胞容量は、通常、直接測定される。光散乱ＰＭＴによって、前角（前方散乱；ＦＳＣ）または直角（側方散乱；ＳＳＣ）のいずれかで細胞によって散乱させられた光が検出される。ＦＳＣは、通常は大きさの指標であり、一方、ＳＳＣは、細胞の複雑さの指標であるが、いずれのパラメーターも他の要因による影響を受け得る。
【００３９】
好ましくは、フローサイトメーターには、１つ以上のＰＭＴ発光検出器が取り付けられる。さらなるＰＭＴによって、他の発光波長を検出することができ、１つ以上の蛍光色素を同時に、個々の別々のチャネルにおいてそれぞれ検出することができる。コンピューターによりそれぞれのチャネル、または個々のパラメーターと別のパラメーターとの相関関係を分析することができる。通常、ＦＡＣＳ機器と共に使用される蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（これは、５２５ｎｍに発光ピークを有している）（緑）、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）（これは、５７５ｎｍに発光ピークを有している）（赤−オレンジ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（これは、６２０ｎｍに発光ピークを有している）（赤）、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（これは６６０ｎｍに発光ピークを有している）（赤）、Ｒ−フィコエリスリンＣｙ５（ＲＰＥ−Ｃｙ５）（これは、６７０ｎｍに発光ピークを有している）（赤）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（これは、６５５〜７５０ｎｍに発光ピークを有している）（深紅）が挙げられる。
【００４０】
これらおよび他のタイプのＦＡＣＳ機器は、異なる特性の細胞を異なる容器に屈折させることによって、種々の画分を物理的に分離するさらなる能力を有し得る。
【００４１】
出発物質、例えば、骨髄、末梢血、または臍帯血のＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋集団を単離するための任意の他の方法もまた、本発明にしたがって使用することができる。本発明の種々の亜集団（例えば、ＣＤ１４＋、Ｔｉｅ２＋、ＣＤ１４４−）を同様の様式で単離することができる。
【００４２】
粗細胞集団が上記のように精製される前またはその後のいずれかに、前駆細胞の集団が当該分野で公知の方法によってさらに濃縮される場合がある。例えば、前駆細胞は、ＥＰＣに特徴的な１つ以上の抗原についてのポジティブ選択によって富化させることができる。このような抗原としては、例えば、ＣＤ１４またはＴｉｅ−２が挙げられる。
【００４３】
上記の方法の特に好ましいバリエーションにおいては、血液がドナーの循環している末梢血から直接採血される。血液は、固相に結合させた結合分子（例えば、ＥＰＣを捕捉するための抗体ＶＥＧＦＲ−２）を含むカラム全体に連続的に浸透させられる。前駆細胞が除去された血液は、アフェレーシス療法のような当該分野で公知の方法によって、すぐにドナーの循環系に戻される。血液は、十分な数の前駆細胞がカラムに結合するまでこの方法で処理される。その後、幹細胞が当該分野で公知の方法によってカラムから単離される。この方法により、数少ない末梢血前駆細胞をきわめて多量の血液から回収することができ、ドナーの費用がかからず、骨髄の採取の痛みもなく、そしてそれに伴う麻酔、無痛覚症、輸血、および感染のリスクもない。
【００４４】
（培養条件）
ＥＰＣは、本明細書中に記載される方法を使用して培養され、増殖させられる。細胞は、密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することによって末梢血から得られる。
【００４５】
細胞懸濁液は、細胞を維持することができる任意の容器、特に、培養フラスコ、培養プレート、またはローラーボトル、そして具体的には、２５ｃｍ２の培養フラスコのような小さい培養フラスコに播種される。懸濁液の中で培養された細胞は、およそ５×１０４から２×１０５細胞／ｍｌ（例えば、１×１０５細胞／ｍｌ）で再懸濁される。固定された担体の上にプレートされる細胞は、およそ２〜３×１０３１０細胞／ｃｍ２でプレートされる。状況に応じて、培養プレートは、コラーゲンのようなマトリックスタンパク質でコーティングされる。細胞は、細胞の代謝に必要な補助物質（例えば、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラル、およびトランスフェリンのようなタンパク質など）を含む細胞増殖をサポートすることができる任意の公知の培養培地（ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などを含む）に入れることができる。培養培地にはまた、酵母、細菌、および真菌の混入を防ぐための抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を含めることもできる。培養培地には、ウシ、ウマ、ニワトリなどに由来する血清が含まれる場合がある。
【００４６】
培養のための条件は、生理学的条件に近づけるべきである。培養培地のｐＨは、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８の間、約ｐＨ７から７．８の間、またはｐＨ７．４）に近づけるべきである。生理学的温度は、約３０℃から４０℃の間の範囲である。ＥＰＣは、約３２℃から約３８℃の間の温度（例えば、約３５℃から約３７℃）で培養される。
【００４７】
状況によっては、培養培地には、少なくとも１種の増殖を誘導する（「細胞分裂促進」増殖因子が補充される。「増殖因子」は、ＥＰＣに対して成長効果、増殖を誘導する効果、分化を誘導する効果、または栄養効果を有している、タンパク質、ペプチド、または他の分子である。「増殖を誘導する成長因子」は、ＥＰＣを増殖させる栄養素であり、これには、細胞に対して栄養効果または増殖誘導効果を発揮するために細胞の表面上の受容体に結合する任意の分子が含まれる。増殖を誘導する成長因子としては、ＥＧＦ、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、ＶＥＧＦおよびそれらの組み合わせが挙げられる。増殖因子は、通常、約１ｆｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で培養培地に添加される。約１から１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、通常は十分である。試料滴定アッセイは、特定の増殖因子の最適濃度を決定するために容易に行うことができる。
【００４８】
成長因子および栄養素の生物学的効果は、一般的には、細胞表面受容体に対する結合によって媒介される。多数のこれらの因子の受容体が同定されており、特異的受容体についての抗体および分子プローブを利用することができる。ＥＰＣは、分化の全ての段階で増殖因子受容体の存在について分析することができる。多くの場合には、特定の受容体の同定によって、外来の増殖因子または栄養素の添加を伴う特異的な発達経路に沿って細胞をさらに分化させることにおいて使用するためのストラテジーについての指針が提供される。
【００４９】
一般的には、インビトロでは約３〜１０日後に、ＥＰＣの培養培地が、培地を吸引し、培養フラスコに新しい培地を添加することによって再び補給される。状況によっては、吸引された培地が回収され、濾過され、続けてＥＰＣを継代培養するための馴化培地として使用される。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、またはそれ以上の馴化培地が使用される。
【００５０】
ＥＰＣ細胞培養物は、再度増殖を開始するように容易に継代培養することができる。例えば、インビトロでは３〜７日後に、培養フラスコが十分に揺らされ、その後、ＥＰＣは５０ｍｌの遠心分離管に移され、低速で遠心分離される。培地は吸引され、ＥＰＣは少量の培養培地中に再懸濁される。その後、細胞は数えられ、所望される密度で再度プレートされて、増殖が再開させられる。この手順を毎週繰り返すことができ、その結果、それぞれの継代においては、生存している細胞の数は対数的に増加する。この手順は、所望される数のＥＰＣが得られるまで続けて行うことができる。
【００５１】
ＥＰＣおよびＥＰＣの子孫は、それらが必要になるまで、任意の当該分野で公知の方法によって低温保存することができる（例えば、米国特許第５，０７１，７４１号、ＰＣＴ国際公開第９３／１４１９１号、同第９５／０７６１１号、同第９６／２７２８７号、同第９６／２９８６２号、および同第９８／１４０５８号、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、６５  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．２５２４−２５３６（１９９３）を参照のこと）。ＥＰＣは、特定の低温保存剤を含む等張溶液、好ましくは、細胞培養培地の中に懸濁させることができる。このような低温保存剤としては、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどが挙げられる。これらの低温保存剤は、５〜１５％（例えば、８〜１０％）の濃度で使用される。細胞は、−１０℃から−１５０℃（例えば、−２０℃から−１００℃、または−７０℃から−８０℃）の温度に徐々に凍結させられる。
【００５２】
（内皮前駆細胞の分化）
培養条件に応じて、ＥＰＣは内皮細胞または平滑筋細胞へと分化させることができる。
【００５３】
ＥＰＣは、分化を誘導する成長因子を含む培養培地中の固定された担体上で、内皮細胞または平滑筋細胞ＥＰＣへと分化させることができる。ＥＰＣの分化はまた、増殖を誘導する生物学的事象のカスケードを活性化させる当該分野で公知の任意の方法によっても誘導することができ、これにはイノシトール三リン酸および細胞内Ｃａ２＋の遊離、ジアシルグリセロールの遊離、ならびに、プロテインキナーゼＣおよび他の細胞キナーゼの活性化などが含まれる。ホルボールエステル、分化を誘導する成長因子、および他の化学的シグナルでの処理によって分化を誘導することができる。ＥＰＣの増殖のための増殖を誘導する成長因子（上記を参照のこと）の代わりに、分化を誘導する成長因子を、ＥＰＣの分化に影響を与えるために培養培地に添加することができる。他の分化を誘導する成長因子としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）などが挙げられる。
【００５４】
分化した内皮細胞または平滑筋細胞は、当該分野で公知の免疫細胞化学的技術を使用して検出される。免疫細胞化学（例えば、二重標識免疫蛍光および免疫ペルオキシダーゼ法）では、内皮細胞または平滑筋細胞の、細胞の特徴または表現形の特性を区別するために、細胞タンパク質を検出する抗体が使用される。内皮細胞についての細胞マーカーとしては、例えば、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ１４４、ＣＤ１４１、ＣＤ１０６、またはＣＤ１４２が挙げられ、一方、平滑筋細胞についての細胞マーカーとしては、Ｆｌｋが挙げられる。免疫細胞化学はまた、ＣＤ３１およびｅ−ＮＯＳのような内皮細胞遺伝子の発現を検出することによって内皮細胞を同定するために使用することもできる。
【００５５】
インサイチュハイブリダイゼーション組織化学もまた、内皮遺伝子のｍＲＮＡに特異的なｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して行うことができる。これらの技術は、特異的表現形の同定を促進するために、免疫細胞化学的方法と組み合わせることができる。必要であれば、上記で議論された抗体および分子プローブを、細胞の同定を助けるために、それぞれ、ウェスタンブロットおよびノーザンブロット手順に適応することができる。
【００５６】
（内皮前駆細胞の移植）
損傷した血管への新しい細胞の移植には、損傷した血管組織、例えば、静脈、動脈、毛細血管を修復する能力があり、それによって血管機能を回復させることができる。しかし、移植の目的に適している細胞がないことによって、それによってもたらされるこの手順の全ての可能性が妨げられる。「適している」細胞は、以下の基準の１つ以上を満たす細胞である：（１）多数を得ることができる；（２）必要に応じて、遺伝的物質を挿入するためにインビトロで増殖させることができる；（３）永久に生存することができ、移植されると、血管の修復を促進することができる；ならびに（４）免疫原性ではない、好ましくは、患者自身の組織から、または適合するドナーから得られたものである。血管障害の処置におけるＥＰＣの使用は、動物モデルを使用して実証することができる。
【００５７】
ＥＰＣは、異常な血管または冠不全の兆候を有している任意の動物に投与される。ＥＰＣは、宿主に対して異種であるドナー組織から調製することができる。異種移植を成功させるためには、移植された組織に対する免疫応答を軽減させるかまたは排除するいくつかの方法が通常使用される。したがって、ＥＰＣレシピエントは、シクロスポリンのような免疫抑制剤の使用によって、または局所投与される免疫抑制剤を使用する局所免疫抑制ストラテジーによってのいずれかで、免疫抑制することができる。局所免疫抑制は、Ｇｒｕｂｅｒ，５４  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １−１１（１９９２）に開示されている。米国特許第５，０２６，３６５号には、局所免疫抑制に適しているカプセル化方法が開示されている。
【００５８】
免疫抑制技術を使用することに代わるものとしては、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、３１７  Ｎａｔｕｒｅ  ２３０−２３４（１９８５）によって教示されている胚性幹細胞における相同組み換えを使用した遺伝子の置き換えまたはノックアウトの方法と、細胞株での遺伝子の置き換えまたはノックアウトにまで拡大された方法（Ｚｈｅｎｇら、８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０６７−８０７１（１９９１））を、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子の除去のためにＥＰＣに行うことができる。ＭＨＣの発現が欠失しているＥＰＣは、同種の、そしておそらくは、異種である組織適合性バリアをも超えて、レシピエントを免疫抑制する必要なく、富化させられた内皮細胞の集団を移植することができる。ドナー細胞の抗原性を低下させるための組み換え方法の使用についての一般的な概要および基準もまた、Ｇｒｕｂｅｒ，５４  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １−１１（１９９２）によって開示されている。表面の修飾により移植片の免疫原性を低下させる例示的なアプローチは、ＰＣＴ国際公開第９２／０４０３３号およびＰＣＴ／９９／２４６３０に開示されている。あるいは、移植片の免疫原性は、ＭＨＣ抗原が変化させられているかまたは欠失させられているトランスジェニック動物からＥＰＣを調製することによって低下させることもできる。
【００５９】
ＥＰＣは、マイクロカプセル化（例えば、参考として本明細書中に援用される米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号を参照のこと）およびマイクロカプセル化（例えば、それぞれが参考として本明細書中に援用される米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号、および同第４，９６８，７３３号、ならびにＰＣＴ国際公開第９２／１９１９５号および同第９５／０５４５２号を参照のこと）を含む、公知のカプセル化技術によってカプセル化することができ、宿主に因子を送達するために使用することができる。マイクロカプセル化は、米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号；同第４，９７６，８５９号；同第４，９６８，７３３号；同第５，８００，８２８号、およびＰＣＴ国際公開第９５／０５４５２号に記載されており、これらはそれぞれが参考として本明細書中に援用される。デバイスの中の細胞の数は変動し得る；好ましくは、個々のデバイスには１０３個〜１０９個の細胞（例えば、１０５個〜１０７個の細胞）が含まれる。複数のマイクロカプセル化デバイスを宿主に埋め込むことができる。
【００６０】
レシピエントの組織と同種である組織から調製されたＥＰＣは、レシピエントの組織適合性のタイプと厳密に適合させるために、周知の組織分類の方法によって使用について試験される。
【００６１】
ＥＰＣは、しばしば、レシピエント自身の血液または骨髄から調製することができる。このような場合には、ＥＰＣは切り取られた組織から作成することができ、上記の方法を使用してインビトロで増殖させることができる。細胞数が適切に増加させられると、ＥＰＣを回収することができ、必要であれば遺伝的に修飾することができ、そしてレシピエントの血管への直接の注射のために準備することができる。
【００６２】
ＥＰＣは、血管移植片を形成することができる血管に投与され、その結果、細胞は近隣の血管細胞とともに正常な結合を形成し、移植された内皮細胞または既存の内皮細胞との接触を維持することができる。このように、移植されたＥＰＣは、疾患および加齢が原因で損傷した血管組織を再度構築させる。
【００６３】
宿主の血管組織への移植片の機能的な一体化は、種々の機能を回復させることに対する移植片の有効性を試験することによって評価することができる。
【００６４】
移植に使用されるＥＰＣをインビトロで増殖させる能力はまた、エキソビボでの遺伝子治療にも有効である。したがって、ＥＰＣによって、エキソビボでの遺伝子治療試験においてビヒクルとして使用される内皮細胞を取り出し、増殖させる別の方法が提供される。
【００６５】
（内皮前駆細胞の遺伝的修飾）
ＥＰＣは形質転換されていない初代細胞であるが、これらは、連続細胞株の特徴を有している。未分化の状態では、ＥＰＣは分裂し続け、したがって、遺伝的修飾の標的である。いくつかの実施形態においては、遺伝的に修飾された細胞は、上記の方法のいずれかによって内皮細胞または平滑筋細胞に分化するように誘導される。
【００６６】
用語「遺伝的修飾」は、外来ＤＮＡの意図的な導入によるＥＰＣの遺伝子型の安定な、または一時的な変更を意味する。ＤＮＡは合成のものである場合も、また自然界から導かれたものである場合もあり、そしてこれには、遺伝子、遺伝子の一部、または他の有用なＤＮＡ配列が含まれ得る。用語「遺伝的修飾」は、本明細書中で使用される場合は、自然界でのウイルス活性、自然界での遺伝子組み換えなどによって生じるような、自然に生じる変更が含まれるようには意味されない。
【００６７】
細胞の任意の有用な遺伝的修飾は、本発明の範囲内である。例えば、ＥＰＣは、成長因子などの生物学的活性のある物質を生成するように、またはそれらの生成を増加させるように修飾することができる。１つの実施形態においては、生物学的活性のある物質は、遺伝的差異を調節する転写因子のような転写因子である。別の実施形態においては、生物学的活性のある物質は、非細胞分裂促進増殖因子であり、例えば、ｖ−ｍｙｃ、ＳＶ−４０ラージＴ、またはテロメラーゼである。
【００６８】
遺伝的修飾は、ウイルスベクター（レトロウイルス、修飾されたヘルペスウイルス、へルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなど）での感染、または当該分野で公知の方法を使用するトランスフェクション（リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションなど）のいずれかによって行われる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。例えば、キメラ遺伝子構築物には、ウイルス、例えば、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；または哺乳動物細胞特異的プロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、ドーパミン細胞のマーカー）、ＤＢＨ、フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）、ＣｈＡＴ、ＧＦＡＰ、ＮＳＥ、ＮＦタンパク質（ＮＥ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈなど）（これらは、所望されるタンパク質をコードする構造遺伝子の発現を指示する））が含まれ得る。さらに、ベクターには、薬物選択マーカー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含めることができる。これは、試験遺伝子と同時に感染させられると、タンパク質合成の阻害因子であるゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与する。
【００６９】
ＥＰＣは、発現ベクターでのトランスフェクションを使用して遺伝的に修飾することができる。１つのプロトコールにおいては、遺伝子を含むベクターＤＮＡは、０．１×ＴＥ（１ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）の中に、４０μｇ／ｍｌの濃度になるように稀釈される。２２μｌのＤＮＡが、使い捨ての滅菌の５ｍｌのプラスチックチューブの中の２５０μｌの２×ＨＢＳ（２８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭのデキストロース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ）に添加される。３１μｌの２ＭのＣａＣｌ２がゆっくりと添加され、混合液は室温で３０分間（ｍｉｎ）インキュベートされる。この３０分間のインキュベーションの間に、細胞は４℃で５分間、８００ｇで遠心分離される。細胞は、２０倍容量の氷冷されたＰＢＳに再懸濁させられ、１×１０７個の細胞のアリコートに分けられる。これは再び遠心分離される。細胞の個々のアリコートは、１ｍｌのＤＮＡ−ＣａＣｌ２懸濁液に再懸濁させられ、室温で２０分間インキュベートされる。その後、細胞は増殖培地の中に稀釈され、５％〜７％のＣＯ２の中で３７℃で６〜２４時間インキュベートされる。細胞は再び遠心分離され、ＰＢＳ中で洗浄され、そして１０ｍｌの増殖培地に４８時間戻される。
【００７０】
ＥＰＣはまた、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を使用して遺伝的に修飾される。標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションについては、細胞が機械的に分離されて単細胞懸濁液とされ、５０％の細胞集密度（５０，０００〜７５，０００細胞／ｃｍ２）で組織培養物処理皿にプレートされ、一晩付着させられる。１つのプロトコールにおいては、修飾されたリン酸カルシウムトランスフェクション手順が以下のように行われる：滅菌のＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のＤＮＡ（１５〜２５μｇ）がＴＥで４４０μＬに稀釈され、６０μＬの２ＭのＣａＣｌ２（１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨが５．８にされたもの）がＤＮＡ／ＴＥ緩衝液に添加される。全部で５００μＬの２×ＨｅＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水；２７５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭのデキストロース、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液粉末、ｐＨ６．９２）が、この混合物に一滴ずつ添加される。混合物は、室温で２０分間静置される、細胞は、１×ＨｅＢＳで軽く洗浄され、１ｍｌのリン酸カルシウム沈殿させられたＤＮＡ溶液がそれぞれのプレートに添加され、細胞が３７℃で２０分間インキュベートされる。このインキュベーション後、１０ｍｌの培地が細胞に添加され、プレートはインキュベーター（３７℃、９．５％のＣＯ２）の中にさらに３〜６時間入れられる。ＤＮＡと培地は、インキュベーション時間が終わると吸引によって除去され、細胞が３回洗浄され、その後、インキュベーターに戻される。
【００７１】
遺伝的修飾が生物学的活性のある物質の生成のためである場合には、この物質は、所定の血管障害の処置に有用である物質であり得る。ＥＰＣは、生物学的活性のある物質、例えば、成長因子、成長因子受容体を発現するように遺伝的に修飾される。例えば、細胞が増殖を誘導する成長因子または分化を誘導する成長因子を分泌するように細胞を遺伝的に修飾することが所望される場合がある。
【００７２】
遺伝的に修飾されたＥＰＣは、細胞治療または遺伝子治療のために、遺伝的修飾された細胞によって生成される生物学的活性のある分子が必要であるレシピエントのＣＮＳに移植することができる。移植技術は以下に詳細に記載される。
【００７３】
あるいは、遺伝的修飾されたＥＰＣは、移植の前にインビトロで種々の分化プロトコールに供することができる。一旦細胞が分化させられると、これらは再び、所望されるタンパク質の発現についてアッセイされる。所望される表現形を有している細胞を単離することができ、これを、遺伝的修飾された細胞によって発現されるタンパク質または生物学的活性のある分子が必要であるレシピエントに移植することができる。
【００７４】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらに限定はされない。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
（一般的方法）
（末梢血からのＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞の単離）
ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、またはＴｉｅ−２のいずれかを発現する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒトの血液軟膜のＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を使用して単核細胞を単離することによって最初に得た。ＰＢＭＣをいくつかのチューブに分けて入れ、それぞれが４０×１０６個の細胞を含むようにした。１５μｌの抗ＶＥＧＦＲ−１抗体（４μｇ／ｍｌ）、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（２０μｇ／ｍｌ）、または抗Ｔｉｅ−２抗体（５μｇ／ｍｌ）（抗体の詳細については表１を参照のこと）をそれぞれのチューブに添加し、室温で３０分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、細胞を１０μｌの１：１０稀釈した二次ヤギ抗マウスモノクローナル抗体で標識した。細胞を、ストリンジェントなゲートを使用してフローサイトメトリーによって選別して、高度に精製されたこれらの細胞の集団を得た。
【００７６】
（末梢血からのＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の単離）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な手順にしたがって、健常なヒトのボランティアの血液からＦｉｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は、蛍光活性化細胞選別方法によって単離した。染色は以下のように行った：ＰＢＭＣを、最初に、抗ＣＤ３抗体でコーティングされた磁気粒子（ＤＹＮＡＬ，ノルウェー）とともにインキュベートして、Ｔリンパ球を除去した。この手順は製造業者によって記載されているように行った。残りの細胞をいくつかのチューブに分けて入れ、それぞれが２０×１０６個の細胞を含むようにした。１５μｌの抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（２０μｇ／ｍｌ、Ｒｅｌｉａｔｅｃｈ，ドイツ）をそれぞれのチューブに添加し、室温で３０分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、細胞を、２０μｌの１：１０稀釈した二次ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，スウェーデン）と２０μｌのＰＥ結合抗ＣＤ１４抗体（４μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国）で標識した。ストリンジェントなゲートを使用した細胞の選別の間に、高度に精製されたＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋画分、ならびに、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−画分を、さらなる分析のために回収した。
【００７７】
（ウェスタンブロッティング）
ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞（それぞれの集団について１×１０６個の細胞）の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ニトロセルロース膜に移し、そして抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（１：２００）で免疫ブロットした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウス二次抗体のＦ（ａｂ’）２断片（１：２０００）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）を、結合した抗体を同定するためにＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに使用した。
【００７８】
（フローサイトメトリー、表現形分類、および細胞培養）
内皮前駆細胞の表現形分類は、造血細胞および内皮細胞上で発現される特異的マーカーに対する抗体のアレイを使用して、以前に記載された１５ように行った（表１）。抗ＶＥＧＦＲ−２はＲｅｌｉａＴｅｃｈ（ドイツ）から入手し；抗ＶＥＧＦＲ−１はＲ＆Ｄ（英国）から；抗ＡｃＬＤＬはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（米国）から；抗フォン・ヴィレブランド因子−ＨＬＡ、抗ＣＤ１４２、および抗ＨＬＡクラスＩはＤＡＫＯ（デンマーク）から；抗α−アクチンおよび抗線維芽細胞抗体はＳｅｒｏｔｅｃ（スウェーデン）から；抗ＣＤ１４４、抗ＣＤ１４１、ヒト核抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ（スウェーデン）から、そしてＵｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓはＳｉｇｍａ（スウェーデン）から入手した。全ての他の抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（米国）から購入した。特定のマーカーについては、細胞内染色をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％のサポニンを使用して細胞の透過性を上昇させた後に行った。対応するコントロールのイソ型を、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の非特異的結合の評価のために使用した。細胞は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔｅｒ）上で分析した。選別したＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２細胞を、フィブロネクチンでコーティングした組織培養プレートの上で、５ｍＭのＬ−グルタミンと１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）を含む内皮選択培地ＭＣＤＢ  １３１（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，米国）中で培養した。培地には、さらに、内皮細胞成長培地（ＥＧＭ−２）シングルコート（ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）を補充した。ヒトの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓから購入し、推奨される、ＥＧＭ−２−ＭＶシングルコートを補充したＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で培養した。ＨＵＶＥＣは、表現形分析および毛細血管形成アッセイにおいてコントロールとして使用した。
【００７９】
ＦＡＣＳで選別した細胞をサイトスピンを使用してガラススライド上に置いた。免疫細胞化学を酵素染色によって行った。細胞を以下の抗体：抗ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）、抗ＣＤ１４１（トロンボモジュリン）（いずれも、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国による）、抗ＶＥＧＦＲ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，英国）、および内皮一酸化窒素合成酵素（ｅ−ＮＯＳ）に対する抗体（全ての抗体を１：５０希釈で使用した）で室温で１時間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、二次ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体（１：５００）で染色した。アビジン−ペルオキシダーゼ手順を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（ＩｍｍｕｎＫｅｍｉ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン）を使用して、製造業者によって記載されているように行った。ＡＣＥ（赤色の染色を生じる）またはＤＡＢＮｉｃｋｅｌ（茶／黒色の染色を生じる）基質キットを発色現像液として使用した。多数の細胞がＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−集団から得られたので、これらの細胞をさらに、先に記載された１６ようにフローサイトメトリーによって、単球および内皮細胞上で発現される特異的マーカーに対する抗体のアレイを使用して特性決定した（表３）。ＦＩＴＣ結合アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，米国）、フォン・ヴィレブランド因子に対する抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ，デンマーク）、α−アクチン、線維芽細胞（Ｓｅｒｏｔｅｃ，スウェーデン）、およびＵｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ（Ｓｉｇｍａ，スウェーデン）を使用した。全ての他の抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（米国）から購入した。対応するコントロールのイソ型を、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の非特異的結合の評価のために使用した。細胞をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔｅｒ）上で分析した。
【００８０】
いくつかの実験については、選別したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞をフィブロネクチン（２０μｇ／ｍｌ）をコーティングした組織培養プレート上で、内皮選択培地ＥｎｄｏＣｕｌｔＴＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ）の中で培養した。これらの培養物を、増殖および形態について観察した。１週間の培養後、細胞をガラス上でサイトスピンし、ＶＥ−カドヘリンの発現について染色した。
【００８１】
ヒトの大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓから購入し、推奨される培地の中で培養した。ＨＡＥＣを、表現形の分析と細管形成アッセイにおいてコントロールとして使用した。
【００８２】
（透過型電子顕微鏡）
細胞を、２４ウェルプレートの中で膜フィルター上で増殖させた。電子顕微鏡分析を、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｈｕｄｄｉｎｇｅ（スウェーデン）で電子顕微鏡についての中心となる設備で行った。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞を、２４ウェルプレート中の膜フィルター上で別々に増殖させた。膜を２％のグルタルアルデヒド中に固定し、蒸留水で軽くリンスし、７０％のエタノール中に１０分間入れ、そして９９．５％のエタノール中に１５分間入れ（全て４℃で）、乾燥させた。固定後、膜を切り、０．１５Ｍのカコジル酸ナトリウム、１％の四酸化オスミウム、および３ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）を含む緩衝液中で４℃で１時間固定させた。その後、ウェルを０．１５Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中で軽くリンスし、上記のようにエタノールで脱水し、スパー樹脂（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＤ，Ｅｓｓｅｘ，英国）に包埋した。切片を、酢酸ウラニル、その後、クエン酸鉛で対比させ、Ｌｅｏ  ９０６（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）透過型電子顕微鏡において８０ｋＶで試験した。
【００８３】
（移動アッセイ）
新しく単離したＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞（５×１０４個）を、それぞれの細胞タイプについて、３．０μｍの孔径を有している４つのフィブロネクチンでコーティングされたＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートに添加した。内皮前駆細胞の移動を、５％のウシ胎児血清を含む培地中で、下部チャンバーに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含まない条件、ならびに、０ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌの種々の濃度の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む条件でアッセイした。細胞を２２時間移動させた。移動した細胞を回収し、血球計数器において数えた。同様の実験を、アンジオポイエチン−２（Ｔｉｅ−２のリガンド）を、０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、および３００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用して行った。それぞれの実験を３連のウェルで行い、４回繰り返した。
【００８４】
新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞（５×１０４個）を、全て３．０μｍの膜孔径を有している４つのフィブロネクチンでコーティングされたＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートに添加した。細胞の移動を、５％のウシ胎児血清を含む培地中で、下部チャンバーに５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）または３００ｎｇ／ｍｌの単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）を含まない条件、またはそれらを含む条件でアッセイした。細胞を２２時間移動させた。移動した細胞を回収し、血球計数器において数えた。それぞれの実験を３連のウェルで行い、４回繰り返した。
【００８５】
（ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の集団による血管由来成長因子の分泌）
成長因子の分泌を評価するために、新しく単離した細胞を、成長因子および血清を含まない培地の中で７２時間培養した。全ての培養物から上清を回収し、さらに分析するまで−７０℃で保存した。馴化培地を、血管由来成長因子、ＶＥＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、および間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）についてアッセイした。これらの成長因子は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によってアッセイした。
【００８６】
（インビトロでの血管形成アッセイ）
毛細管様の細管構造の形成を、原則として先に記載された１６ように、マトリゲルでコーティングしたマルチウェルプレートにおいて評価した。新しく単離したＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞を、マトリゲルでコーティングしたマルチウェルプレート中の増殖培地に３０×１０４個の細胞／ｍｌの密度で播種し、３７℃でインキュベートした。細管構造の形成を、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３０００  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して２２時間後に調べた。
【００８７】
新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞による毛細管様構造の形成を、インビトロでの血管形成の評価のために頻繁に使用されるＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｍマウス肉腫から抽出した可溶化基底膜調製物中でアッセイした。２４ウェルプレートを２００μｌのマトリゲル（５％のＣＯ２中で３７℃で３０分間予めゲル状にした）でコーティングし、細胞を、重合させたマトリックス上に、５×１０４個の細胞／ウェルの密度で播種した。得られた管様構造を、細胞を５％のＣＯ２中で３７℃で１週間培養した後、位相差顕微鏡を使用して調べた。ＨＡＥＣをポジティブコントロール細胞として使用した。
【００８８】
（インビトロでの細胞侵襲アッセイ）
再構成させた基底膜マトリゲルからの細胞侵襲を、以前に報告された１７方法によってアッセイした。移動した細胞を、×１００倍の倍率で光学顕微鏡下で５つの異なる領域において数えた。それぞれの実験を３連のウェルで行い、４回繰り返した。
【００８９】
（ＦＡＣＳによって選別したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のレンチウイルスでの形質導入）
組み換え体であるレンチウイルスベクターを、先に記載された１７３プラスミド発現システムを使用して生成した。形質導入のために、ＦＡＣＳで選別した細胞を、１ｍｌの培養培地を含む１０ｍｌのチューブに移し、０．１のＭＯＩの濃縮されたｐＨＲ’ＥＦ１−ＧＦＰＳＩＮビリオンとともに、５％のＣＯ２雰囲気下で一晩３７℃でインキュベートした。ウイルスのインキュベーションの後、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、ヌードマウスの露出させた大腿動脈に直接注入した（下記を参照のこと）。ＧＦＰの発現を検出するために、同じ形質導入手順にしたがって、形質導入した細胞を６ウェルプレート中で培養し、形質導入の６日後に蛍光顕微鏡によって観察した。
【００９０】
（マウス）
右大腿動脈のバルーン損傷を以下のように行った：体重２０〜２５ｇのｎｕｄｅ  Ｃ５７ｂｌａｃｋマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｍ＆Ｂ，デンマーク）をイソフルランで麻酔し、腹部横切開によって大動脈分岐部のレベルまで右大腿動脈を露出させた。マイクロクランプ（Ｓ＆Ｔ，スイス）を下部大動脈、左腸骨動脈、および右大腿動脈の遠位部分の上に配置した。２Ｆ  Ｆｏｇａｒｔｙバルーンカテーテル（Ｂａｘｔｅｒ）を右大腿動脈に挿入し、膨張させ、回転させながら３回前後に動かした。膨張は、カニューレと、１ｍｌのリンガー溶液によって、微小切開部分から自由に流出させて行った。１００μｌのＭＣＤＢ培地中の細胞（５×１０５細胞／動物）（ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋、ｎ＝１０；ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＥ−２−、ｎ＝１０）を同じカニューレから染み込ませ、１５〜２０分間、新しく損傷させた動脈床の中でインキュベートした。一方、コントロール移植マウスには、培養培地だけを投与した（マウス、ｎ＝６）。インキュベーション後、結合していない細胞を吸引し、カテーテルを抜き取り、微小切開を１１−０ナイロン（Ｓ＆Ｔ，スイス）結節縫合によって縫合した。マイクロクランプを取りはずすことによって血流を回復させた。全ての動物への手順は、機関のガイドライン、スウェーデンのＨｕｄｄｉｎｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌの実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に則って行った。動物を、ヒトの細胞の移植の２週間後および４週間後に屠殺し、右大腿動脈を組織病理学的試験のために回収した。血管をＯ．Ｃ．Ｔ．に包埋し、液体窒素で凍結させた。
【００９１】
インビボでのヒトＶＥＧＦＲ−２＋細胞およびＴｉｅ−２＋細胞中でのＤＮＡ合成の活性化を明らかにするために、チミジンアナログであるＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ，スウェーデン）を、終了の１２時間前および２４時間前に、１００ｍｇ／ｋｇ体重で１回ｉ．ｐ．注射として投与した。
【００９２】
（免疫組織化学）
マウスの動脈内にヒト細胞を局在化させるために、５μｍの凍結切片を抗ＧＦＰ抗体（１：５０）で染色した。免疫ペルオキシダーゼ手順をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（ＩｍｍｕｎＫｅｍｉ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン）を使用して、製造業者によって記載されているように行った。ＡＣＥ（赤色の染色を生じる）基質キットを発色現像液として使用し、ヘマトキシリンで対比染色した。さらに、マウス抗ヒト核モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ，米国）を使用して、免疫蛍光１８によってマウスの動脈中のヒト細胞を検出した。移植されたヒト細胞の表現形を、ヒト核に対する抗体（１：５０）と抗ＶＥ−カドヘリン抗体（１：１００）での二重染色によって検出した。この後、二次抗マウスサブクラス特異的ＦＩＴＣ抗体またはテキサスレッド結合抗体（１：５００）で染色した。内皮細胞化を、ヒトＡＣＥポジティブ細胞に覆われた表面と全発光表面の割合として計算した。組織形態学（１つのグループについて６匹の動物、６つの切片／大腿動脈）については、動脈の横切片をヘマトキシリン／エオシンで染色し、血管径、中膜の面積、および中膜に対する内膜の面積の比を調べた。
【００９３】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
全ＲＮＡを３つのヒト−マウスキメラ大腿動脈（１つはＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞を投与したマウスであり、１つは擬似移植したマウス）から、移植の４週間後に、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダ）を使用して抽出した。ヒト特異的プライマーを使用して、ヒトＣＤ３１およびｅ−ＮＯＳを、ヒト細胞を移植したマウスの動脈の中で検出した。新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞もまた、ｅ−ＮＯＳの発現について試験した。ＡＢＬを内因性の参照遺伝子として使用した。プライマーのセットは、ＣｙｂｅｒＧｅｎｅ（Ｈｕｄｄｉｎｇｅ，スウェーデン）によって商業的に合成された。プライマー配列は、
【００９４】
【数１】
2007528222.tif 000003
ＰＣＲ反応は先に記載された１９ように行った。
【００９５】
（統計分析）
適切である場合には、結果を平均±ＳＤとして表した。対応のないｔ検定を、ＥＰＣ移植したグループおよび擬似（媒体のみで）処置したグループの間での比較のために使用した。ｐ＜０．０５を有意と考えた。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を、グループ間での比較のために使用した。ｐ＜０．０５を有意と考えた。
【００９６】
（実施例２）
（末梢血由来のＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞は単球／マクロファージ系統に属する）
ＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞は、それぞれ、血液中の単核細胞の集団全体のおよそ３±０．２％、０．８±５％、および２±０．３％を占めることが明らかになった。これらの３つの集団の表現形の分析により、複数のタイプの細胞の混合物が、主に、単球／マクロファージ細胞系統に属することが明らかになった（表１）。新しく単離したＶＥＧＦＲ−１＋細胞およびＴｉｅ−２＋細胞は、内皮細胞マーカーであるＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）は発現しなかった。しかし、新しく単離したＶＥＧＦＲ−２＋細胞の小さい割合がこのマーカーを発現した。さらに、３つの集団の全てはＣＤ４５マーカーを発現しており、これは、これらの細胞が造血起源のものであることを示している。ＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞は、それらのそれぞれのマーカーについてポジティブに染色された（図１Ａ〜Ｃ）。新しく単離したＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞の電子顕微鏡による実験により、表現形の分析による発見がさらにサポートされた。３つの集団の全部に、単核単球、マクロファージ、リンパ球、および多形核細胞を含む細胞の混合物が含まれていた（図１Ｄ〜Ｆ）。
【００９７】
【表１−１】
2007528222.tif 000004
【００９８】
【表１−２】
2007528222.tif 000005
（実施例３）
（培養されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞は内皮細胞マーカーだけを示す）
フィブロネクチンでコーティングされた培養ウェル上でのこれらの細胞の培養により、付着細胞（８０％）と非付着細胞（２０％）の２つの集団が示された。１週間後、非付着細胞を廃棄した。これは内皮細胞について記載した条件下ではさらに培養することはできなかった。２週間の培養後、ＶＥＧＦＲ−２＋培養物およびＴｉｅ２＋培養物中の付着細胞の大部分は内皮細胞マーカーであるＣＤ１４４、ＣＤ１４１を発現し、活性化されると、ＣＤ１０６とＣＤ１４２を発現した（表２）。電子顕微鏡を使用したさらなる分析によってこれらの細胞の内皮形態を確認すると、開口、バイベル・パラーデ小体、および内皮細胞に典型的な堅い結合部分の存在が明らかになった（図１Ｇ〜Ｉ）。一方、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞の小さい画分しか２週間後には付着したままではなく、さらなる分析のために十分な細胞を得ることはできなかった。ＶＥＧＦＲ−２＋細胞もＴｉｅ−２＋細胞も、培養物中では増殖しなかった。しかし、これらの集団は、＞４週間の間、増殖せずに培養物で生存した状態で維持することができた。
【００９９】
（表２  ２週間の培養後のＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞の表現形の特徴）
【０１００】
【表２】
2007528222.tif 000006
（実施例５）
（ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞は移動能力と侵襲能力を有しており、細管様構造を形成する）
新しく単離したＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞は、ＶＥＧＦとアンジオポイエチン−２に向かって移動したが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞は移動しなかった（図２ＡおよびＢ）。しかし、マトリゲルに添加したＶＥＧＦＲ−１＋細胞の６０％、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞の７０％、そしてＴｉｅ−２＋細胞の６５％が、侵襲アッセイにおいて下部チャンバーに移動し、このことは、３つの細胞タイプの全てが侵襲能力を有していることを示している（図２Ｃ）。マトリゲルの中では、これらの新しく単離した細胞は、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞だけが細管様構造を形成することができ、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞はそのような能力を有していないことが示された（図２Ｄ〜Ｇ）。ＨＵＶＥＣをコントロールとして使用した。本発明者らのインビトロでの実験では、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞は、表現形の上でも、形態学的にも似ている内皮細胞であることを示していたが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞は内皮様の特徴を示さなかった。したがって、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞の、バルーン損傷した動脈の再内皮細胞化に関与するインビボでの機能的能力をさらに分析した。
【０１０１】
（実施例６）
（ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞は剥離したマウスの大腿動脈の効率のよい再生に関与しており、インビボで増殖した）
実験用の血管形成術手順を、ヌードマウスの大腿動脈に行った。この介入の直後、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞またはＴｉｅ−２＋細胞を新しく損傷させた動脈床に局所注入した。移植された血管は、血栓の兆候は示さなかった。ヒト核抗体の特異性を、正常なヒトおよびマウスの動脈を使用して最初に決定した。ヒト細胞は黒色に染色された（図３Ａ）。コントロールのマウスの動脈はヒト核抗体では染色されなかった（図３Ｂ）。移植の２週間後には、ヒトＶＥＧＦＲ−２＋細胞は播種されたバルーン損傷させられた大腿動脈の内腔表面で検出された（ＤＡＢ−Ｎｉ−ポジティブ、図３Ｃ）。移植の４週間後には、高度な再生が見られ、およそ７５±８％の病変がヒトＶＥＧＦＲ−２＋細胞で覆われていた。同様に、Ｔｉｅ−２＋細胞が移植後２週間および４週間に検出された（図３Ｄ）。Ｔｉｅ−２＋細胞を移植した動物は、移植の４週間後には、高度な再生を示し、病変のおよそ７０±５％がヒトＴｉｅ−２＋細胞で覆われていた。
【０１０２】
マウスの動脈内でのヒト細胞の存在を、今一度、免疫蛍光試験において確認した（図３Ｅ〜Ｆ）。インビボでのＥＣ表現形を、フォン・ヴィレブランド因子に対する抗体とＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）に対する抗体での染色によって確認した（図４ＡおよびＢ）。それぞれの切片を、ヒト細胞を宿主細胞と区別するために、抗ヒト核抗体で二重染色した（黄色い染色は二重にポジティブである細胞を示している）。興味深いことに、移植されたヒト細胞は、播種された動脈の内腔表面だけではなく、間質中膜においても見ることができた。α−アクチンに対する抗体で標識した場合には、中膜の中の細胞はポジティブに染色され、これは平滑筋細胞の存在を示していた（図４Ｇ〜Ｉ）。したがって、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞はいずれも、インビボでは、内皮細胞だけではなく、平滑筋細胞にも分化した。ＶＥＧＦＲ−２＋細胞もＴｉｅ−２＋細胞も、インビトロでは増殖しなかったが（データは示さない）、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞の増殖についての証拠を得るために、ＢｒｄＵの取り込み試験を、８匹の動物（ＶＥＧＦＲ−２＋：ｎ＝４、Ｔｉｅ−２＋：ｎ＝４）において行った。７日目での組織の分析は、移植されたヒト細胞中での広範囲に及ぶＢｒｄＵの取り込みを示した。抗ＢｒｄＵ抗体と抗ヒト核抗体の両方でＤＮＡを染色したので、同じ組織切片の二重染色はできなかった。したがって、連続する切片を抗ＢｒｄＵ（茶色）抗体と抗ヒト核抗体（黒色）で染色して、移植された細胞の増殖を示した（図５Ａ〜Ｆ）。これらの研究結果は、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２＋細胞は損傷した動脈を再生させるだけではなく、インビボでは増殖もすることを示している。
【０１０３】
（実施例７）
（内皮前駆細胞での再内皮細胞化によっては、マウスの大腿動脈のバルーン損傷後に新生内膜の増殖は生じなかった）
損傷した動脈のセグメントの横断面を、移植の２週間後およびよび４週間後に、組織形態学的変化について調べた。マウスの大腿動脈の中でのバルーン損傷手順によって、病変の動脈セグメントの膨張を生じさせ、その結果、血管の直径は顕著に大きくなり、損傷させていないコントロールの動脈についての０．３６２±０．０６０ｍｍから、媒体だけと一緒にインキュベートした損傷させた血管については０．６０１±０．０３６ｍｍにまでなった。この拡大は、ヒト細胞を移植したマウスの大腿動脈においては見られなかった（図５Ｇ）。断片の中膜面積の０．０２０±０．００４から０．０１０±０．００９ｍｍ２までの減少が、損傷した動脈において観察された。中膜面積の薄層化は、ＶＥＧＦＲ−２細胞およびＴｉｅ−２細胞を移植した動脈においては見られなかった（図５Ｈ）。ＥＰＣの播種によって媒介される再内皮細胞化によっては、損傷の２週間後、４週間後、または６週間後には、大腿動脈において新生内膜形成は生じなかった。実際、中膜に対する血管内膜の面積比は、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２を移植した血管セグメントにおいては、有意には高くなかった（Ｉ／Ｍ比：正常な損傷させていない動脈  ０．０１±０．０１、媒体のコントロール  ０．０２±０．０１、ＶＥＧＦＲ−２＋  ０．０２±０．０１；Ｔｉｅ−２＋  ０．０２±０．０１，ｐ＝ｎｓ）。
【０１０４】
（実施例８）
（ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−の特性決定）
ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞が単球の集団全体のおよそ２±０．５％（図１Ａ）を占め、血液中のＰＢＭＣの０．０８±０．０４％を占めることが明らかになった。免疫細胞化学分析によっては、新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞画分はｅ−ＮＯＳを発現しないことが明らかにされた（図６Ｂ）。しかし、新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は、ｅ−ＮＯＳ、フォン・ヴィレブランド因子、およびトロンボモジュリンを発現していたが（図６Ｃ）、ＶＥ−カドヘリンは発現していなかった。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞上でのＶＥＧＦＲ−２受容体の発現は、この集団の溶解物が、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体で免疫ブロットした場合には、およそ２００ｋＤａの予想されたバンドを生じ、これはＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の集団においては存在しなかったかまたはわずかに発現されていたという事実によってさらにサポートされた（図６Ｄ）。さらに、ｅ−ＮＯＳ  ｍＲＮＡはＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞中では強く発現されていたが、ＶＥＧＦＲ−２ネガティブ画分においては、かすかなｅ−ＮＯＳ  ｍＲＮＡのバンドしか見ることができなかった（図６Ｅ）。本発明者らは、このかすかなバンドが、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の集団の中に少数のＶＥＧＦＲ−２＋細胞が混入しているとの理由から起こり得るとの事実を排除することはできなかった。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−集団によって発現される表現形マーカーを表３に示す。いずれの集団もＣＤ４５マーカーを発現し、このことは、これらの細胞が造血起源であることを示している。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養インサート上で培養したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞の電子顕微鏡による分析によっては、基底膜の形成、バイベル・パラーデ小体の存在、および内皮細胞の特徴である堅い結合が明らかにされた（図７Ａ〜Ｃ）。一方、ネガティブな画分はこれらの特徴を示さなかった。
【０１０５】
ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は、フィブロネクチンでコーティングした培養ウェル上で培養した場合には、３日間の培養後にコロニーを形成した。これらのコロニーは、その後数日のうちに、固まった丸い細胞の中心から、一見成長した平たい長く伸びた細胞へと形態を変化させた。一方、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２集団は、２週間の間、若干丸い細胞として付着したままであったが、クラスターは形成しなかった（図７Ｄ）。２つの集団のいずれも、本実験で使用した培養条件下では広範囲の増殖能力は示さなかった。培養したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は、１週間の培養後にＶＥ−カドヘリンを発現していたが（図７Ｄ）、ＶＥＧＦＲ−２−画分は培養の間のいずれの時点でも、このマーカーを発現することはなかった。
【０１０６】
【表３】
2007528222.tif 000007
（実施例９）
（ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋末梢血細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−末梢血細胞のインビトロでの機能的能力）
明らかに多数の新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞が、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞と比較して、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に対して移動した（図８Ａ）（それぞれ、ｐ＝０．００９およびｐ＝０．０４７）。２つの集団によって生成された血管由来成長因子には有意な相違はなかった。いずれの集団もＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを生成したが、ＳＤＦ−１またはＦＧＦは生成しなかった。
【０１０７】
しかし、成長因子のレベルは、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−集団と比較して、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋集団において高かった（図８Ｂ）。マトリゲルの中では、３日間培養した細胞は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞だけではなくＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞も、細管様構造を形成することができた（図８Ｃ）。ＨＡＥＣをコントロールとして使用した。
【０１０８】
したがって、インビトロでのデータは、新しく単離したＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞が、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞と比較して内皮様の特徴を示すことを示している。
【０１０９】
（実施例１０）
（ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は内皮細胞へと分化し、剥離されたマウスの大腿動脈を効率よく再生する）
ＧＦＰを発現するレンチウイルス粒子に対する２つの細胞集団の暴露によっては、一貫して、＞７０％の形質導入効率が導かれた。ヒト細胞の動脈切片のスクリーニングは、高い自己蛍光が原因で、ＧＦＰ＋細胞を視覚化することが困難であることを示した。したがって、酵素をベースとする免疫組織化学染色を、抗ＧＦＰ抗体を使用して行い、ＧＦＰ＋細胞を検出した。
【０１１０】
この抗体を使用すると、擬似移植したマウスおよびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−を移植したマウスにおいては、ＧＦＰ−ポジティブである領域は見られなかった（図９Ａ〜Ｃ）。しかし、ＧＦＰ−ポジティブ細胞（赤）を有している動脈の内膜表面の範囲が、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞を移植したマウスにおいて移植の２週間後にすでに見られた（図９Ｄ）。ＧＦＰ−ポジティブである領域は、播種の４週間後に回収された血管においては明らかに増大していた（図９ＥおよびＦ）。さらに、ヒト細胞もまた、免疫蛍光を使用して抗ヒト核抗体によって同定した。ヒト核抗体の特異性を、最初に正常なヒト動脈およびマウス動脈を使用して決定した。ヒト細胞−核は赤色に染色された（図１０Ａ）。コントロールマウスの動脈は、ヒト核抗体では染色されなかった（図５Ｂ）。移植の４週間後、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋ヒト細胞を投与したマウスにおいては高い程度の再生が見られ、病変のおよそ７０±８％が、ヒト細胞（赤）で覆われていたが（図１０Ｃ）、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞を移植したマウスにおいては覆われていなかった（図１０Ｄ）。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞を移植した動物は、剥離した動脈、脾臓、肺、または循環においても、移植の２週間後または４週間後には、これらの細胞の存在は示さなかった（データは示さない）。インビボでの内皮細胞の表現形を、ＶＥ−カドヘリンに対する抗体での染色（緑）によって確認し、それぞれの切片を、抗ヒト核抗体で二重染色して、ヒト細胞（赤）を検出した。二重染色された細胞は黄色に染色された（図１０Ｅ）。
【０１１１】
損傷した動脈切片の横断切片を、組織形態学的変化について移植の２週間後および４週間後に調べた。マウスの大腿動脈でのバルーン損傷手順によって、病変の動脈セグメントの膨張を生じさせ、その結果、血管内径を顕著に大きくし、損傷させていないコントロールの動脈についての０．３０１±０．０４１ｍｍから、媒体だけまたはＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−と一緒にインキュベートした損傷させた血管については、それぞれ、０．６０１±０．０４３ｍｍおよび０．６３１±０．０２８ｍｍにまでなった（ｐ＜０．００１）。この拡大は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞を移植したマウスの大腿動脈においては見られなかった（０．４０４±０．０８ｍｍ）。横断面の中膜面積の０．０２８±０．０１０から０．０１２±０．００７ｍｍ２までの減少が、損傷した動脈において観察された。中膜面積の薄層化は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞を移植した動脈においては見られなかった（０．０３３±０．０１３）。これらの細胞によって媒介される再内皮細胞化によっては、損傷の２週間後または４週間後には、大腿動脈において新生内膜形成は生じなかった。中膜に対する血管内膜の面積比は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋を移植した血管セグメントにおいては、有意には高くなかった（Ｉ／Ｍ比：正常な損傷させていない動脈  ０．０３±０．００９、媒体のコントロール  ０．０２±０．００８、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−  ０．０２±０．００９；ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋  ０．０４±０．０２，ｐ＝ｎｓ）。
【０１１２】
（実施例１１）
（ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞を移植したマウスにおけるヒト内皮特異的遺伝子の転写）
移植した細胞の生着を、移植したマウスの中でのヒト遺伝子の発現を決定することによって確認した。ヒト細胞の移植後１ヶ月で屠殺したマウスの大腿動脈を、ヒト内皮特異的遺伝子ＣＤ３１およびｅ−ＮＯＳに特異的なプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＣＤ３１およびｅ−ＮＯＳプライマーは、それらがそれぞれのマウス遺伝子を増幅しなかったので、ヒトに特異的な種であった（図１１Ａ）。これらの結果は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞を投与したマウスに由来する動脈について得られたが、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞を移植したマウスにおいては得られなかった。これらのデータは、移植したヒトＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞が損傷したマウスの動脈に生着したことを示している。
【０１１３】
（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中に詳細に開示されているが、これは例示の目的のための例であり、以下に添付される特許請求の範囲の範囲に関する限定とは意図されない。具体的には、種々の置換、変更、および改変を、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対して行うことができることが、発明者らによって企図される。核酸出発物質、目的のクローン、またはライブラリーのタイプの選択は、当業者にとっては、本明細書中に記載された実施形態の知識にしたがって当業者が日常的に行われている事柄であると考えられる。他の局面、利点、および改変も、以下の特許請求の範囲内であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、およびＴｉｅ−２抗体で染色した際に、ＶＥＧＦＲ−１＋、ＶＥＧＦＲ−２＋、およびＴｉｅ−２＋細胞がそれらのそれぞれの表面マーカーについてポジティブであったことを示す一連の蛍光顕微鏡写真（４０倍）である。図１Ｄ〜Ｉは、新たに選別したＶＥＧＦＲ−１＋細胞、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞、およびＴｉｅ−２＋細胞の集団に、単核の単球（Ｍ）、マクロファージ（Ｍ）、リンパ球（Ｌ）および多核白血球（ＰＭＮ）を含む細胞の混合物が含まれていることを示す一連の電子顕微鏡写真である。Ｇ〜Ｉは、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞およびＴｉｅ−２＋細胞が内皮細胞に分化したことを示すＴＥＭ顕微鏡写真であり、（Ｇ）バイベル・パラーデ小体（丸い、矢印）および内皮細胞に典型的な堅い結合（矢印）の存在、ならびに、（Ｈ、Ｉ）開口（矢印）を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、ＶＥＧＦおよびａｎｇ−１に向かって移動すること、およびこれらの細胞の３つの集団の全てが、マトリゲル細胞浸潤アッセイにおいて浸潤能を示したことを示している、棒グラフである。結果は、±ＳＥＭとして示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、ＶＥＧＦおよびａｎｇ−１に向かって移動すること、およびこれらの細胞の３つの集団の全てが、マトリゲル細胞浸潤アッセイにおいて浸潤能を示したことを示している、棒グラフである。結果は、±ＳＥＭとして示されている。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、ＶＥＧＦおよびａｎｇ−１に向かって移動すること、およびこれらの細胞の３つの集団の全てが、マトリゲル細胞浸潤アッセイにおいて浸潤能を示したことを示している、棒グラフである。結果は、±ＳＥＭとして示されている。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、マトリゲル中で毛細管様の細管を形成したことを示している写真である。ＨＵＶＥＣがコントロール細胞として使用された。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、マトリゲル中で毛細管様の細管を形成したことを示している写真である。ＨＵＶＥＣがコントロール細胞として使用された。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、マトリゲル中で毛細管様の細管を形成したことを示している写真である。ＨＵＶＥＣがコントロール細胞として使用された。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋であるが、ＶＥＧＦＲ−１＋細胞が、マトリゲル中で毛細管様の細管を形成したことを示している写真である。ＨＵＶＥＣがコントロール細胞として使用された。
【図３】図３は一連の写真である。ＡおよびＢ、ヒト核抗体によって、ヒトにおいては細胞が染色された（黒）が、コントロールであるマウスの動脈においては染色されなかった。バルーンで損傷させたマウスの大腿動脈に由来する切片の免疫組織化学染色は、４週目では、播種された動脈（Ｃ）ＶＥＧＦＲ−２＋細胞（矢印）の、２週目では、Ｔｉｅ−２＋細胞（矢印）の、管腔表面での移植されたヒトの局在化を示している。もとの倍率は６０倍である。Ｅ、正常なヒトの動脈、Ｆ、ヒトＴｉｅ−２＋細胞が移植された損傷させられたマウスの動脈、およびＧ、抗ヒト核抗体での、擬似移植されたマウスの動脈の免疫蛍光染色（矢印）。
【図４】図４は、移植されたヒト細胞のＥＣ表現形を、ヒト核抗体と、Ａ、ＶＥＧＦＲ−２＋細胞についてはフォン・ヴィレブランド因子に対する抗体（二重ポジティブ細胞は黄色に染色される、矢印）、そしてＢ、Ｔｉｅ−２＋細胞についてはＶＥ−カドヘリンに対する抗体を用いて、二重染色によって確認したことを示す一連の写真である。α−アクチンに対する抗体で標識された場合は、培地中の細胞（緑色のフィラメント状の染色パターン）はポジティブに染色され、このことは、平滑筋細胞の存在を示している。もとの倍率は６０倍である。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｆは、７日目の組織の分析によってインビボでＶＥＧＦＲ−２＋を移植されたヒト細胞およびＴｉｅ−２＋を移植されたヒト細胞への多数のＢｒｄＵの取り込みが明らかになったことを示す一連の写真である。ＡおよびＢは、擬似移植されたマウスの動脈についての代表的な連続する切片であり、そしてＣ〜Ｆは、抗ＢｒｄＵ（茶色の細胞）とヒト核抗体（黒）で染色された移植されたマウスの動脈の代表的な連続する切片であり、それぞれ、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞中での増殖を示している。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｆは、７日目の組織の分析によってインビボでＶＥＧＦＲ−２＋を移植されたヒト細胞およびＴｉｅ−２＋を移植されたヒト細胞への多数のＢｒｄＵの取り込みが明らかになったことを示す一連の写真である。ＡおよびＢは、擬似移植されたマウスの動脈についての代表的な連続する切片であり、そしてＣ〜Ｆは、抗ＢｒｄＵ（茶色の細胞）とヒト核抗体（黒）で染色された移植されたマウスの動脈の代表的な連続する切片であり、それぞれ、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞中での増殖を示している。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｆは、７日目の組織の分析によってインビボでＶＥＧＦＲ−２＋を移植されたヒト細胞およびＴｉｅ−２＋を移植されたヒト細胞への多数のＢｒｄＵの取り込みが明らかになったことを示す一連の写真である。ＡおよびＢは、擬似移植されたマウスの動脈についての代表的な連続する切片であり、そしてＣ〜Ｆは、抗ＢｒｄＵ（茶色の細胞）とヒト核抗体（黒）で染色された移植されたマウスの動脈の代表的な連続する切片であり、それぞれ、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞中での増殖を示している。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｆは、７日目の組織の分析によってインビボでＶＥＧＦＲ−２＋を移植されたヒト細胞およびＴｉｅ−２＋を移植されたヒト細胞への多数のＢｒｄＵの取り込みが明らかになったことを示す一連の写真である。ＡおよびＢは、擬似移植されたマウスの動脈についての代表的な連続する切片であり、そしてＣ〜Ｆは、抗ＢｒｄＵ（茶色の細胞）とヒト核抗体（黒）で染色された移植されたマウスの動脈の代表的な連続する切片であり、それぞれ、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞中での増殖を示している。
【図５Ｅ】図５Ａ〜Ｆは、７日目の組織の分析によってインビボでＶＥＧＦＲ−２＋を移植されたヒト細胞およびＴｉｅ−２＋を移植されたヒト細胞への多数のＢｒｄＵの取り込みが明らかになったことを示す一連の写真である。ＡおよびＢは、擬似移植されたマウスの動脈についての代表的な連続する切片であり、そしてＣ〜Ｆは、抗ＢｒｄＵ（茶色の細胞）とヒト核抗体（黒）で染色された移植されたマウスの動脈の代表的な連続する切片であり、それぞれ、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞中での増殖を示している。
【図５Ｆ】図５Ａ〜Ｆは、７日目の組織の分析によってインビボでＶＥＧＦＲ−２＋を移植されたヒト細胞およびＴｉｅ−２＋を移植されたヒト細胞への多数のＢｒｄＵの取り込みが明らかになったことを示す一連の写真である。ＡおよびＢは、擬似移植されたマウスの動脈についての代表的な連続する切片であり、そしてＣ〜Ｆは、抗ＢｒｄＵ（茶色の細胞）とヒト核抗体（黒）で染色された移植されたマウスの動脈の代表的な連続する切片であり、それぞれ、移植されたＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＴｉｅ−２細胞中での増殖を示している。
【図５Ｇ】図５Ｇは、マウスの大腿動脈の中でのバルーン損傷手順によって、媒体だけとともにインキュベートされた損傷した血管においては病変の動脈セグメントの膨張が生じたが、ヒト細胞が移植されたマウスの大腿動脈においては病変の動脈断片の膨張は生じなかったことを示す棒グラフである。断面の中膜面積の減少は、損傷した動脈において観察されたが、ＶＥＧＦＲ−２細胞およびＴｉｅ−２細胞が移植された動脈においては観察されなかった。
【図５Ｈ】図５Ｈは、マウスの大腿動脈の中でのバルーン損傷手順によって、媒体だけとともにインキュベートされた損傷した血管においては病変の動脈セグメントの膨張が生じたが、ヒト細胞が移植されたマウスの大腿動脈においては病変の動脈断片の膨張は生じなかったことを示す棒グラフである。断面の中膜面積の減少は、損傷した動脈において観察されたが、ＶＥＧＦＲ−２細胞およびＴｉｅ−２細胞が移植された動脈においては観察されなかった。
【図６Ａ】図６は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の特徴を示す一連のグラフおよび写真である。Ａ、末梢血単核細胞からのＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のフローサイトメトリーによる選別により、Ｔリンパ球は激減した。
【図６Ｂ】図６は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の特徴を示す一連のグラフおよび写真である。Ｂ、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞は内皮の一酸化窒素合成酵素（ｅ−ＮＯＳ）は発現しなかった。
【図６Ｃ】図６は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の特徴を示す一連のグラフおよび写真である。Ｃ、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は、ｅ−ＮＯＳ（黒）、フォン・ヴィレブランド因子（赤）、およびトロンボモジュリン（赤）のようないくつかの内皮特異的マーカーを発現したが、ＶＥ−カドヘリンは発現しなかった。細胞をヘマトキシリンで対比染色した。
【図６Ｄ】図６は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の特徴を示す一連のグラフおよび写真である。Ｄ、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞由来の溶解物のＶＥＧＦＲ−２に対する抗体でのウェスタンブロッティングによっては、およそ２００ｋＤａの予想されたバンドが生じた（レーン１および２）が、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞（レーン３）とコントロールである二次抗体（レーン４）はバンドを生じなかった。
【図６Ｅ】図６は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋およびＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の特徴を示す一連のグラフおよび写真である。Ｅ、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞においては、ｅ−ＮＯＳのｍＲＮＡの強い発現が、そしてＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞においては弱い発現が検出された。
【図７】図７は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のインビトロでの形態学的特性決定を示す一連の写真である。Ａ、ＴＥＭ顕微鏡写真は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞について、内皮細胞に典型的な堅い結合の存在（矢印、棒；２μｍ）、Ｂ、バイベル・パラーデ小体の存在（矢印、棒；０．５μｍ）、およびＣ、基底膜の存在（Ｍ、棒；１μｍ）、Ｄ、培養物中のＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞はコロニーを形成しないが、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞は最初に丸い細胞からなるコロニーを形成し、その１週間後、１つの細長い細胞に成長することが明らかになったことを示している。１週間の培養後には、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞だけがＶＥ−カドヘリンを発現していた。
【図８Ａ】図８ＡおよびＢは、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のインビトロでの移動と細管形成能力を示す散布図である。Ａ、５０ｎｇ／ｍｌの濃度の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と３００ｎｇ／ｍｌの単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含まない条件と、それらを含む条件下での移動アッセイにおいては、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞と比較して、明らかに多数のＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞がＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に移動した。
【図８Ｂ】図８ＡおよびＢは、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のインビトロでの移動と細管形成能力を示す散布図である。Ｂ、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦ−２＋細胞の集団は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−集団と比較して、血管由来成長因子、ＶＥＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をより高いレベルで生成した。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞はマトリゲルの中で毛細管様細管を形成したが、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦ−２−細胞は形成しなかったことを示している一連の写真である。ヒトの大動脈細胞（ＨＡＥＣ）がコントロール細胞として使用された。
【図９】図９は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のインビボでの生着能力を示す一連の写真である。抗緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）抗体での、バルーン損傷させたマウスの大腿動脈由来の切片の免疫組織化学染色により、Ａ、擬似移植されたＧＦＰポジティブである領域の局在化はないこと、および、Ｂ、播種された動脈の管腔表面のＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−が移植された細胞が示された。Ｃ、切片はコントロールである二次抗体での染色を示している。Ｄ、２週間目の有意な数のＧＦＰ−ポジティブである（赤）ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞（矢印）、そしてＥおよびＦ、４週間目の有意な数のＧＦＰ−ポジティブである（赤）ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞が、これらの細胞が移植された動物において見られた。もとの倍率は６０倍であった。
【図１０】図１０は、移植後のＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の検出のための免疫蛍光染色を示す一連の写真である。Ａ、正常なヒトの動脈中にはヒト核抗体で染色された細胞（赤）があったが、Ｂ、コントロールの損傷させた擬似移植したマウスの動脈にはなかった。Ｃ、バルーン損傷させたマウスの大腿動脈は、４週目には、播種された大動脈（赤色の細胞、矢印）の管腔表面で移植されたヒトＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞の局在化を示した。Ｄ、しかし、４週間目には、移植されたＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞の局在化は観察されなかった。Ｅ、移植されたヒト細胞の内皮細胞表現形が、ヒト核抗体とＶＥ−カドヘリンに対する抗体での二重染色によって確認された（二重ポジティブである細胞は黄色く染色された、矢印）。もとの倍率は６０倍であった。
【図１１】図１１は、ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞とＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞のインビボでの生着能力および機能的能力を示すウェスタンブロットの写真である。マウスの動脈の中でのヒトの内皮特異的遺伝子の転写。ヒトＣＤ３１とｅ−ＮＯＳは、ヒトＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋細胞が移植されたバルーン損傷させられたマウスの大腿動脈の中で検出されたが、擬似移植されたマウス、またはＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２−細胞が移植されたマウスにおいては検出されなかった。ＡＢＬがハウスキーピング遺伝子として使用された。
【図１Ａ】
2007528222.tif 000008
【図１Ｂ】
2007528222.tif 000009
【図１Ｃ】
2007528222.tif 000010
【図１Ｄ】
2007528222.tif 000011
【図１Ｅ】
2007528222.tif 000012
【図１Ｆ】
2007528222.tif 000013
【図１Ｇ】
2007528222.tif 000014
【図１Ｈ】
2007528222.tif 000015
【図１Ｉ】
2007528222.tif 000016
【図２Ａ】
2007528222.tif 000017
【図２Ｂ】
2007528222.tif 000018
【図２Ｃ】
2007528222.tif 000019
【図２Ｄ】
2007528222.tif 000020
【図２Ｅ】
2007528222.tif 000021
【図２Ｆ】
2007528222.tif 000022
【図２Ｇ】
2007528222.tif 000023
【図３Ａ】
2007528222.tif 000024
【図３Ｂ】
2007528222.tif 000025
【図３Ｃ】
2007528222.tif 000026
【図３Ｄ】
2007528222.tif 000027
【図３Ｅ】
2007528222.tif 000028
【図３Ｆ】
2007528222.tif 000029
【図３Ｇ】
2007528222.tif 000030
【図４Ａ】
2007528222.tif 000031
【図４Ｂ】
2007528222.tif 000032
【図４Ｃ】
2007528222.tif 000033
【図５Ａ】
2007528222.tif 000034
【図５Ｂ】
2007528222.tif 000035
【図５Ｃ】
2007528222.tif 000036
【図５Ｄ】
2007528222.tif 000037
【図５Ｅ】
2007528222.tif 000038
【図５Ｆ】
2007528222.tif 000039
【図５Ｇ】
2007528222.tif 000040
【図５Ｈ】
2007528222.tif 000041
【図６Ａ】
2007528222.tif 000042
【図６Ｂ】
2007528222.tif 000043
【図６Ｃ】
2007528222.tif 000044
【図６Ｄ】
2007528222.tif 000045
【図６Ｅ】
2007528222.tif 000046
【図７】
2007528222.tif 000047
【図８Ａ】
2007528222.tif 000048
【図８Ｂ】
2007528222.tif 000049
【図８Ｃ】
2007528222.tif 000050
【図９Ａ】
2007528222.tif 000051
【図９Ｂ】
2007528222.tif 000052
【図９Ｃ】
2007528222.tif 000053
【図９Ｄ】
2007528222.tif 000054
【図９Ｅ】
2007528222.tif 000055
【図９Ｆ】
2007528222.tif 000056
【図１０Ａ】
2007528222.tif 000057
【図１０Ｂ】
2007528222.tif 000058
【図１０Ｃ】
2007528222.tif 000059
【図１０Ｄ】
2007528222.tif 000060
【図１０Ｅ】
2007528222.tif 000061
【図１１】
2007528222.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007528222000001.app
【国際調査報告】
2007528222.tif 000063
2007528222.tif 000064
2007528222.tif 000065