(57)【要約】本発明は、PPARδ活性のバイオマーカーとしてのPDK4の使用、ならびにPPARδ活性の制御不全と関係する疾患、たとえば異常脂質血症、肥満、またはインスリン抵抗性などを診断する方法、PPARδ活性の制御不全と関係する疾患を患う患者の処置をモニターする方法、およびPPARδ活性を調節する化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのPDK4。
【請求項２】
筋肉におけるPPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのPDK4。
【請求項３】
PPARδ活性の制御不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのPDK4。
【請求項４】
PDK4のmRNA発現レベルを定量する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法。
【請求項５】
対照と比較したPDK4のmRNA発現レベルを決定する段階を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
a）宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b）PDK4のmRNA発現レベルを定量する段階、
を含む、宿主において、試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法。
【請求項７】
対照と比較したPDK4のmRNA発現レベルを決定する段階を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
a）PPARδ活性の調節因子で処置した患者から単離した筋細胞からRNAを精製する段階、および
b）PDK4のmRNA発現を測定する段階、
を含む、PPARδ活性の制御不全と関連する疾患に罹患した患者の処置をモニターするための方法。
【請求項９】
対照と比較したPDK4のmRNA発現レベルを決定する段階を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項4〜9のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
【請求項１１】
PPARδ活性の制御不全を含む疾患の処置のための薬物の調製のための、請求項4〜9のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物の使用。
【請求項１２】
PDK4のタンパク質発現レベルを定量する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法。
【請求項１３】
対照と比較したPDK4のタンパク質発現レベルを決定する段階を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
a）宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b）PDK4のタンパク質発現レベルを定量する段階、
を含む、宿主において、試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法。
【請求項１５】
対照と比較したPDK4のタンパク質発現レベルを決定する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
a）PPARδ活性の調節因子で処置した患者から単離した筋細胞からタンパク質を精製する段階、および
b）PDK4のタンパク質発現を測定する段階、
を含む、PPARδ活性の制御不全と関連する疾患に罹患した患者の処置をモニターするための方法。
【請求項１７】
対照と比較したPDK4のタンパク質発現レベルを決定する段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
請求項12〜17のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
【請求項１９】
PPARδ活性の制御不全を含む疾患の処置のための薬物の調製のための、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物の使用。
【請求項２０】
PPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのPDK4の使用。
【請求項２１】
筋肉におけるPPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのPDK4の使用。
【請求項２２】
PPARδ活性の制御不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのPDK4の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）は、核内ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。PPARは、遺伝子発現を制御し、複数の代謝経路をコントロールするリガンド活性化転写因子である。3つのサブタイプ、PPARα、PPARδ（PPARβとしても知られる）、およびPPARγが記載されている。PPARδは遍在的に発現している。PPARαは、肝臓、腎臓、および心臓において主に発現している。少なくとも2つの主要なPPARγのアイソフォームが存在する。PPARγ1は大部分の組織において発現しており、より長いアイソフォームであるPPARγ2は、ほぼもっぱら脂肪組織において発現している。PPARは、グルコースおよび脂質の恒常性および代謝の制御、エネルギー平衡、細胞分化、炎症、並びに心血管イベントを含む、様々な生理反応を調節する。
【０００２】
冠動脈疾患の全患者の約半分は、低濃度の血漿高密度脂質タンパク質コレステロール（HDL-C）を有する。HDLのアテロプロテクティブ（atheroprotective）機能は、およそ25年前に初めて強調され、HDLレベルに影響を与える遺伝的および環境的要因の探究を刺激した。HDLの保護機能は、コレステロール逆輸送と呼ばれるプロセスにおけるその役割に由来する。HDLは、動脈壁のアテローム硬化性損傷における細胞を含む、末梢組織における細胞からのコレステロールの除去を媒介する。HDLは次に、そのコレステロールを胆汁への変換および排泄のために、肝臓およびステロール代謝器官に搬送する。フラミンガム研究に由来するデータは、HDL-Cレベルが、LDL-C（低密度脂質タンパク質コレステロール）レベルと関係なしに、冠動脈疾患リスクの前兆となることを示した(Gordon et al., Am. J. Med. 1977, 62, 707-714)（非特許文献1）。35 mg/dlより少ないHDL-Cを有する20歳およびそれ以上の米国人のうちの推定年齢調整罹患率は、16%（男性）および5.7%（女性）である。HDL-Cの実質的な増加は、現在のところ、様々な処方におけるナイアシンによる処置によって達成されている。しかしながら、多大な副作用が、このアプローチの治療可能性を制限している。
【０００３】
米国において2型糖尿病患者と診断された1400万人のうち90％もの人が体重超過または肥満であり、2型糖尿病患者のうち高い割合が異常な濃度のリポタンパク質を有する。総コレステロール ＞240 mg/dlの割合は、糖尿病の男性で37%、女性で44%である。LDL-C ＞160 mg/dlについてのそれぞれの比率は、それぞれ31%および44%であり、HDL-C ＜35 mg/dlについては、それぞれ28% および11%である。糖尿病は、インスリンの作用への応答における部分的障害のために、血液中のグルコースレベルをコントロールする患者の能力が低下する疾患である。II型糖尿病（T2D）は、インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）とも呼ばれ、先進国における全ての糖尿病患者の80〜90%を苦しめている。T2Dにおいては、膵臓のランゲルハンス島はインスリンを産生し続ける。しかしながら、インスリン作用の標的器官、主として筋肉、肝臓、および脂肪組織が、インスリン刺激に対する甚大な抵抗性を示す。身体は非生理的に高いレベルのインスリンを産生することによって補償し続け、それが、膵臓のインスリン産生能力の消耗および不全によって、疾患の後期において最終的に減少する。従ってT2Dは、インスリン抵抗性、異常脂質血症、高血圧、内皮機能不全、および炎症性アテローム硬化症を含む、複数の併存疾患と関連する心血管代謝症候群である。
【０００４】
異常脂質血症および糖尿病の第一選択処置は、一般的に、低脂肪および低グルコースの食餌、運動、ならびに減量を含む。しかしながら、コンプライアンスは中程度である可能性があり、疾患が進行するに従い、例えば、異常脂質血症用のスタチンおよびフィブラートなどの脂質調節性剤、ならびに例えば、インスリン抵抗性用のスルホニル尿素またはメトホルミンなどの低血糖症薬による、様々な代謝性欠陥の処置が必要となる。患者を彼ら自身のインスリンに対して再感作することによって、血中のグルコースおよびトリグリセリドのレベルを正常に回復させ、多くの場合において、外来性のインスリンへの要求性を不要にするかまたは軽減する、有望な新しい種類の薬剤（インスリン感作物質）が最近導入された。ピオグリタゾン（Actos（商標））およびロシグリタゾン（Avandia（商標））は、チアゾリジンジオン（TZD）類のPPARγアゴニストに属し、それらの種類のうちで最初にいくつかの国においてNIDDM用として認可を受けたものである。しかしながら、これらの化合物は、まれであるが重度の肝臓毒性（トログリタゾン（troglitazone）について見られるような）を含む副作用を欠点として有する。それらは、患者の体重もまた増加させる。従って、さらに安全で副作用の発生率がより低い、新たな、より効果的な薬剤が緊急に必要である。最近の研究は、PPARδのアゴニズムが、向上した治療可能性を示す化合物をもたらすであろう証拠を提供し、すなわちそのような化合物は、現行の処置と比較して、HDL-C上昇に対する優れた効果によって、かつインスリンレベルの正常化に対する追加的なプラス効果によって、脂質プロファイルを改善するはずである（Oliver et al; Proc Nat Acad Sci USA 2001; 98: 5306-11）（非特許文献2）。最近の観察もまた、インスリン感作に対する独立したPPARα介在効果が、トリグリセリドを減らすことにおけるその周知の役割に加えて存在することを示唆する（Guerre-Millo et al;  J Biol Chem 2000; 275: 16638-16642）（非特許文献3）。従って、選択的PPARδアゴニストまたは追加的なPPARα活性を有するPPARδアゴニストは、PPARγアゴニストにおいて見られる体重増加などの副作用を伴わずに、優れた治療上の効能を示す可能性がある。
【０００５】
本発明は、PPARδ調節のためのマーカー、ならびにPPARδ活性の制御不全と関係する疾患を診断する方法、PPARδ活性の制御不全と関係する疾患を患う患者の処置をモニターする方法、およびPPARδ活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【０００６】
【非特許文献１】Gordon et al., Am. J. Med. 1977, 62, 707-714
【非特許文献２】Oliver et al; Proc Nat Acad Sci USA 2001; 98: 5306-11
【非特許文献３】Guerre-Millo et al; J Biol Chem 2000; 275: 16638-16642
【発明の開示】
【０００７】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ・アイソエンザイム4（PDK4）をコードする遺伝子が直接のPPARδ標的遺伝子として同定され、この遺伝子はPPARδ用のバイオマーカーとして用いることができる。PDK4は飢餓に対する代謝反応に関係している。
【０００８】
PDK4は既にPPARαの標的遺伝子として記載されている（Sugden et al., Diabetes. 2001; 50 (12): 2729-36）。しかしながら、本発明はPDK4遺伝子に対するPPARδの寄与が、特定の組織および細胞において、少なくともPPARαと同じくらいの大きさであることを示す。特に筋細胞において、PDK4遺伝子は主にPPARδによって活性化される。
【０００９】
本発明は、PPARδ調節を検出またはモニターするためのマーカーとしてのPDK4の使用を提供する。好ましくは、PDK4は、筋細胞におけるPPARδ調節を検出またはモニターするためのマーカーとして用いられる。PDK4は、筋細胞における毒性を決定するためにもまた用いられてもよい。筋細胞は、骨格筋細胞または心筋細胞でもよい。
【００１０】
本明細書に用いられる「調節」という用語は、PPARδの転写活性の活性化または阻害と関連がある。従って、PDK4はPPARδ活性の調節のためのマーカーとしての機能を果たす可能性がある。
【００１１】
本明細書に用いられる「マーカー」という用語は、核酸またはポリペプチを指す。
【００１２】
本発明は、PPARδ活性の制御不全を伴う疾患、たとえば異常脂質血症、肥満、またはインスリン抵抗性などを診断するためのマーカーとしてのPDK4にもまた関する。従って、PDK4はPPARδ活性の調節を検出するマーカーとして機能する可能性がある。
【００１３】
本発明は、PDK4 mRNAの発現レベルを定量化する段階を含む、宿主においてPPARδの活性を検出またはモニターする方法をさらに提供する。マウスPDK4の代表的なcDNAが配列番号：1に示されている。
【００１４】
以上に記載されている方法の1つの態様において、PDK4のmRNA発現レベルは対照と比較して決定される。
【００１５】
宿主は、動物、組織、細胞または、インビトロ転写を含む、RNA転写が可能な任意のその他の生物系であってもよい。好ましくは、動物は非ヒト動物である。対照は、異なる宿主におけるPDK4のmRNA発現のレベルでもよい。
【００１６】
さらに、本発明は、以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法を提供する、
a）宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b）PDK4のmRNA発現レベルを定量化する段階。
【００１７】
以上に記載されている方法の1つの態様において、PDK4のmRNA発現レベルは対照と比較して決定される。
【００１８】
宿主は、動物、組織、細胞または、インビトロ転写を含む、RNA転写が可能な任意のその他の生物系であってもよい。好ましくは、動物は非ヒト動物である。対照は、処置前の前記宿主もしくは異なる宿主、および／または前処置レベルの常態にするための妥当な処置期間後の前記宿主であり得る、未処置の宿主における、PDK4のmRNA発現のレベルである。以上に記載されている方法の好ましい態様において、PPARδ活性を調節する化合物は、アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００１９】
本発明は、以下の段階を含む、PPARδ活性の制御不全と関連する疾患、たとえば異常脂質血症、肥満、またはインスリン抵抗性などに罹患した患者の処置をモニターするための方法を提供する：
a）PPARδ活性の調節因子で処置した患者から単離した筋細胞からmRNAを精製する段階、および
b）PDK4のmRNA発現を測定する段階。
【００２０】
以上に記載されている方法の1つの態様において、PDK4のmRNA発現レベルは対照と比較して決定される。
【００２１】
宿主は、動物、組織、細胞または、インビトロ転写を含む、RNA転写が可能な任意のその他の生物系であってもよい。好ましくは、動物は非ヒト動物である。対照は、処置前の前記宿主もしくは異なる宿主、および／または前処置レベルの常態にするための妥当な処置期間後の前記宿主であり得る、未処置の宿主における、PDK4のmRNA発現のレベルである。
【００２２】
本発明は、以上に記載されている方法によって同定された化合物、およびPPARδ活性の制御不全を伴う疾患、たとえば異常脂質血症、肥満、またはインスリン抵抗性などの処置のための薬物の調製のための、以上に記載されている方法によって同定された化合物の使用にもまた関する。
【００２３】
PDK4 mRNAの発現レベルを測定するためのいくつかの方法を用いることができる。ノーザンブロット法およびデンシトメトリーによるバンドの定量化などの方法は、それらが十分に正確でない可能性があるものの、当技術分野において周知であり、使用される可能性がある。その他の方法には、ジーンチップ、マイクロアレイ解析、ドットブロット法、または種々の定量PCR法の使用が含まれる。好ましくは、Taqmanまたはリアルタイム定量PCRが用いられる。PDK4の転写される配列のうち任意の部分をプローブとして用いてもよい。好ましい態様において、PDK4のmRNA発現レベルは、表2に記載されている順方向プライマーおよび逆方向プライマー（配列番号：4および5）を用いて、リアルタイム定量PCRによって決定される。好ましくは、筋細胞におけるPDK4のmRNA発現レベルが定量化される。
【００２４】
本発明は、PDK4タンパク質の発現レベルを定量化する段階を含む、宿主においてPPARδの活性を検出またはモニターする方法をさらに提供する。配列番号：3は、マウスPDK4のタンパク質配列を示す。
【００２５】
以上に記載されている方法の1つの態様において、PDK4のタンパク質発現レベルは対照と比較して決定される。
【００２６】
宿主は、動物、組織、細胞または、インビトロ翻訳を含む、タンパク質翻訳が可能な任意のその他の生物系であってもよい。好ましくは、動物は非ヒト動物である。対照は、異なる宿主におけるPDK4のタンパク質発現のレベルである。
【００２７】
これに加えて、本発明は、以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法を提供する、
a）宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b）PDK4のタンパク質発現レベルを定量化する段階。
【００２８】
以上の方法の1つの態様において、PDK4のタンパク質発現レベルは対照と比較して決定される。
【００２９】
宿主は、動物、組織、細胞または、インビトロ翻訳を含む、タンパク質翻訳が可能な任意のその他の生物系であってもよい。好ましくは、動物は非ヒト動物である。対照は、処置前の前記宿主もしくは異なる宿主、および／または前処置レベルの常態にするための妥当な処置期間後の前記宿主であり得る、未処置の宿主における、PDK4のタンパク質発現のレベルである。宿主は担体で処置されていてもよい。担体は、化合物が溶解または再懸濁される溶媒であり得る。以上に記載されている方法の好ましい態様において、PPARδ活性を調節する化合物は、アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００３０】
さらに、本発明は、以下の段階を含む、PPARδ活性の制御不全と関連する疾患、たとえば異常脂質血症、肥満、またはインスリン抵抗性などに罹患した患者の処置をモニターするための方法も提供する：
a）PPARδ活性の調節因子で処置した患者から単離した筋細胞からタンパク質を精製する段階、および
b）PDK4のタンパク質発現を測定する段階。
【００３１】
以上の方法の1つの態様において、PDK4のタンパク質発現レベルは対照と比較して決定される。
【００３２】
宿主は、動物、組織、細胞または、インビトロ翻訳を含む、タンパク質翻訳が可能な任意のその他の生物系であってもよい。好ましくは、動物は非ヒト動物である。対照は、処置前の前記宿主もしくは異なる宿主、および／または前処置レベルの常態にするための妥当な処置期間後の前記宿主であり得る、未処置の宿主における、PDK4のタンパク質発現のレベルである。
【００３３】
PDK4タンパク質の発現レベルを測定するためのいくつかの方法を用いることができる。これらの方法には、二次元ゲル分離、質量分析、抗体結合技法（ELISA、ウエスタンブロット）、および免疫沈降が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、筋細胞におけるPDK4のタンパク質発現レベルが定量化される。
【００３４】
本発明はまた、以上に記載されている方法によって同定された化合物、および、PPARδ活性の制御不全を伴う疾患、たとえば異常脂質血症、肥満、またはインスリン抵抗性などの処置のための薬物の調製のための、以上に記載されている方法によって同定された化合物の使用にも関する。
【００３５】
本発明を一般的に記載したため、説明する目的でのみ本明細書に含まれ、別段の特定のない限り限定することを意図しない具体的な実施例を、以下の図に関連して参照することによって、同じことがより適切に理解されると考えられる。
【００３６】
実施例
実施例において言及される市販の試薬は、特に示さない限り、製造者の説明書に従って用いた。
【００３７】
実施例1：マイクロアレイ実験
細胞培養：C2C12細胞（ATCC: CRL1772）
細胞を、10%加熱不活化ウシ胎児血清（FCS）を補足したDMEM（5mMグルコース）中で培養した。完全培地は、使用前に0.2μmの細孔を介して濾過した。分化は、6穴ディッシュにおいて、細胞がコンフルエントに達した際に培地（DMEM高グルコース、2% FCS）を血清枯渇させることによって行った。細胞培養は次に、90%に加湿した95%空気−5%CO2の滅菌環境において、37℃で5日間インキュベートして、分化させた。
【００３８】
PPARリガンドは100% DMSOに溶解し、培地にDMSOの最終濃度が0.1%（容積/容積）に調整されるように加え、細胞をリガンドと共に20時間、標準的な増殖条件下でインキュベートした。各々の条件につき3回反復を行った。
【００３９】
RNA抽出
RNA抽出手順は、QiagenのQIAschredderおよびRNeasyキットによって行った。
【００４０】
試料あたり約1×106個のペレット化された細胞を、RLTを含む350μlのチオシアン酸グアニジンに再懸濁した。試料をQIAschredderカラムにロードし、最高速度で2分間遠心分離して、溶解物を均質化した。より良い結合条件のためにフロースルーに350μlのエタノールを加えてから、試料をRNeasyスピンにアプライした。最初の洗浄段階のために、350μl RW1緩衝液をカラムにピペットで入れた。次に70μlのRDD緩衝液と穏やかに混合した10μlのDNase溶液をカラムの上にアプライし、室温で15分間インキュベートしてゲノムDNAを除去した。DNaseは、350μlのRW1緩衝液で洗い流した。次いで、500μl RPE緩衝液を添加することによる、2回の精製的洗浄段階を行った。RNAを水に溶出し、-70℃で貯蔵した。
【００４１】
cDNA合成
cDNAは、Roche Diagnosticsより供給されたcDNA合成系キットを用い、製造者のマニュアルに従って合成した。合成の間中、これは氷上で作用させた。
【００４２】
第一鎖合成のために、21μlの最終反応容量に対して、2μlのオリゴd(T7)T24プライマー（5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24VN3'、200 pmol/μl）および再蒸留水を最大20μgのRNAに加えた。サーマルサイクラーにおける70℃で10分間のインキュベーションおよびRNAへのプライマーのハイブリダイゼーションの後、2μlのAMV逆転写酵素および4μlのdNTP配合物（10mM）を加えた。補充的な8μlのRT緩衝液、4μlのDTT（0.1mM）、および1μlのRNase阻害剤を、混合液中にピペットで加えた。続いて、42℃でのインキュベーションを60分間持続した。
【００４３】
第二鎖合成試薬を、第一鎖反応チューブ中に直接加えた。第二鎖酵素混和物はDNA/RNAハイブリッドのRNA中にニックを挿入するためのRNaseを含み、その6.5μlを混合物にアプライした。これにより、DNAポリメラーゼIのための3'OHプライマーが提供される。DNAポリメラーゼIもまた、大腸菌（E. coli）リガーゼと同様に、第二鎖酵素カクテル中に存在する。さらに、1.5μlのdNTP混合物、30μlの第二鎖緩衝液、および72μlの再蒸留水を加えて穏やかに混合した。反応混合物を、16℃で2時間インキュベートした。20μl加えたT4ポリメラーゼは、16℃で5分間のインキュベーション後、cDNAの末端を確実に平滑末端化した。その後、試料をRNaseで処理してRNA鋳型を除去し（37℃で30分間）、プロテイナーゼKで処理した（37℃、30分間）。
【００４４】
cDNAの精製
QIAquick PCR精製キットを用いた精製は、Quiagenより供給された。
【００４５】
850μlのPB緩衝液をcDNA反応チューブに加え、混合した。試料をQIAquickカラムにアプライし、13000 rpmで30秒間遠心分離した。750μlのPE緩衝液をカラムに加えてcDNAを洗浄した。次いで最高速度での追加的な遠心段階を行い、それによってカラムを完全に乾燥させた。DNAを溶出させるために、50μl〜80μlのEB緩衝液（10 mM Tris-Cl、pH8.5）をメンブランの中央に加え、試料を13000 rpmで1分間遠心分離した。
【００４６】
cDNAの質を、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって調べた。
【００４７】
100 bpから＞10000 bpまでのスメアが出現した。合成されたcDNAの量および純度は、260 nmおよび280 nmでの吸光度を分光光度計で測定することにより決定した。
【００４８】
濃度は、以下のように計算した： c[μg/ml] = A260×50×D、（50: dsDNA特異的係数、D: 希釈係数)。cDNAは、1.8〜2.1のA260/A280比を持つ。
【００４９】
インビトロ転写（IVT）
この段階は、AmbionのMEGAscript T7キットを用いて行った。
【００５０】
各々の試料から5μgのcDNAを鋳型として使用し、ATP、GTP、CTP、UTP （Ambion）ならびにビオチン化したCTP（Bio-11-CTP、ENZO）およびUTP（Bio-15-UTP, ENZO）と混合した。RTを、T7酵素配合物により37℃で4時間行った。転写産物を、QiagenのRNeasyキットにより、RNA抽出のためのものと同じ手順に従って、試料のいかなるDNAse処理もなしに、精製した。
【００５１】
IVT産物の断片化
15μgのIVT由来RNAを、200 mM Tris-酢酸、pH8.1、500 mM KOAc、150 mM MgOAc中で、95℃で35分間、小容量（20μl〜30μl）において断片化した。
【００５２】
チップの取扱い（DNA Micro-array Protocols V3-200.1. M Wilhelm-Seiler、U Certaを参照）
【００５３】
前処理溶液をGenechipに最初にアプライした（6.25μl アセチル化BSA（20μg/μl），12.5μl サケ精子DNA (10μg/μl)、125μl 2×MES Hyb緩衝液、106.25μl H20）。Genechipは、40℃で15分間、回転架台（rotisserie）において60 rpmの回転をさせながらインキュベートした。
【００５４】
ハイブリダイゼーションのため、試料を以下のように調製した：15μgの断片化RNAを、BioB、BioC、BioD、Cre（内部基準）を含む 2.5μlの対照ストック配合物、2.5μlのサケ精子DNA (10μg/μl)、6.25μlのアセチル化BSA（20μg/μl）、125μlの2×MES-Hyb緩衝液、91.25μlのH20と混合する。マイクロアレイは次に45℃で一晩、回転架台において回転（60 rpm）させながらインキュベートした。
【００５５】
試料を取り外し、-20℃で貯蔵した。マイクロアレイを、フルイディクス（fluidics）において5分間、6 SSPEで洗浄した。次に230μlのMES-洗浄緩衝液をチップにアプライし、それを45℃で30分間、60 rpmでインキュベートした。
【００５６】
染色は、チップを15分間、次の溶液でインキュベートすることにより行った：125μlの2×染色緩衝液、91.25のアセチル化BSA、2.5μlのストレプトアビジン(1mg/ml)。
【００５７】
染色溶液を除去し、マイクロアレイをフルイディクスStationにおいて5分間、6×SSPEで洗浄し、増幅溶液：125μlの2×染色緩衝液、99μlのH2O、1μlのビオチン化抗ストレプトアビジン(500μg/ml)、25μlのアセチル化BSA(20μg/ml)で処理した。回転架台において60 rpm、40℃で30分間、インキュベーション。フルイディクスStationにおける6×SSPEでの洗浄の後、マイクロアレイはフィコエリトリン溶液（125μlの2×染色緩衝液、91.25μlのH2O、31.25μlのアセチル化BSA、2.5μlのフィコエリトリン(1mg/ml)）により60 rpm、40℃でインキュベートした。
【００５８】
溶液: 
12×MESストック: 70.4 g MES遊離酸一水和物、193.3 g MESナトリウム塩、pHを6.6に調整する、トリデスト（tridest）H2Oで1000 mlに調整する
2×MES-Hyb緩衝液: 8.3ml 12×MESストック、17.7 ml 5M NaCl、4ml 0.5M EDTA、0.1 ml 10% Tween 20、19.9 ml トリデストH2O
MES-洗浄緩衝液: 83.3 ml 12×MESストック、5.2 ml 5M NaCl、1 ml 10% Tween 20、トリデストH2Oで1000 mlに調整する
6×SSPE Tween: 300 ml 20×SSPE、1 ml 10% Tween 20、トリデストH2Oで1000 mlに調整する
2×染色緩衝液: 41.7 ml 12×MESストック、92.5 ml 5M NaCl、2.5 ml 10% Tween 20、113.3 ml トリデストH2O
【００５９】
走査は、Affymetrixスキャナを用いて行い、結果をAffymetrixのGene Chipソフトウェアにて得た。
【００６０】
チップデータ解析
データをRace Aソフトウェア(Bioinformatic Roche)を用いて解析した。各々の条件について3つ組を用い、各々の条件について、対照（未処理細胞試料）を基準として比較を計算した。各々の遺伝子の解析についていくつかの判断基準：各々の条件におけるp値、コール平均（Call average）、和平均差（Sum average difference）、変化係数（Change Factor）、および分散を考慮して、被験化合物によって調節されている、統計的に最も関係する遺伝子のリストを得た。
【００６１】
結果
新規な選択的PPARδバイオマーカー遺伝子をAffymetrixマイクロアレイ実験によって同定した（図1参照）：PDK4（ピルビン酸デヒドロゲナーゼアイソエンザイム4）（配列番号：2）。このマーカー遺伝子は、PPARα活性とPPARδ活性とを識別することを可能にする。
【００６２】
試験されたリガンドは、PPARαアゴニスト（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリック酸（fenofibric acid）））、PPARδアゴニスト（C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-アセティック）およびPPARδ-αコアゴニスト（B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸）であった。
【００６３】
表1および図1に示されているように、PPARδアゴニスト（C）およびPPARδ-αコアゴニスト（B）によって誘発される、同定されたマーカー遺伝子PDK4の反応は、PPARα特異的リガンド（A）によって誘発された反応よりも大きい。
【００６４】
（表１）PPARリガンド：A 300μM、B 100nM、C 500nMによって誘導され、Affymetrixマイクロアレイによって測定された、C2C12マウス筋細胞におけるPDK4遺伝子発現の倍数変化（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリック酸）はPPARαアゴニスト、B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸はPPARδ-αコアゴニスト、C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-アセティックは、PPARδアゴニストである）
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【００６５】
実施例2：定量PCR
C2C12マウス筋細胞の培養、RNA抽出、cDNA合成および精製は、実施例1に記載されているように行った。
【００６６】
PCRプライマー設計
プライマー対は、Medline由来のmRNA/cDNA配列に基づき、PE Applied BiosystemsのソフトウェアPrimer express 1.0を用いて設計した。各々のプライマーの判断基準は、19ヌクレオチド〜21ヌクレオチドの間の長さ、60℃±1℃の融解温度、40%から60%までの範囲のG/C含量、およびヘアピンまたはプライマー二量体のような二次構造の回避である。さらに、単位複製配列の長さは、より短い単位複製配列がより長いものよりもより能率的に増幅し、反応条件により認容性を有するようにコントロールした（通常〜100 bp）。プライマーは、DEPC処理水（Ambion）に100μM濃縮溶液になるよう溶解し、-20℃で貯蔵した。
【００６７】
（表２）遺伝子S12（内部対照）およびPDK4の順方向および逆方向プライマー。
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【００６８】
Corbett RG3000およびABI 7000を用いたqPCR
RT-PCRを、QiagenのQuantitech SYBR Greenキットを用い、製造者のマニュアルに従って行った。各々の構成成分を96穴プレートに加えた：25μlのマスターミックス、0.16μlの各々のプライマー（100μl保存液）、22.7μl H2Oおよび2μl cDNA。
【００６９】
蛍光色素SYBRグリーンIは、二本鎖DNAのマイナー・グルーブに結合し、サイクルごとのDNA量の測定を可能にする。プログラムは、3つの異なる段階から成る：最初の鋳型の変性およびTaq DNAポリメラーゼの熱活性化（95℃、15分）、サイクリング（95℃ 変性、60℃ プライマー−鋳型アニーリング、72℃ 伸長、蛍光収集）、および最後の融解（融解曲線 55℃〜95℃、0.5℃段階の測定）。融解曲線は、特異的増幅産物と非特異的増幅産物（プライマー二量体）との間の識別を可能にする。
【００７０】
リアルタイムPCRを用いた相対的定量化
相対的定量化は、基準遺伝子に対する標的遺伝子の相対的な発現に基づく。蛍光がバックグラウンド蛍光を越える点として定義される閾値蛍光の概念は、遺伝子発現の正確かつ再現性のある定量化を可能にする。閾値蛍光に達するサイクル数は、ct値と呼ばれる。増幅反応の対数期の間、ct値と最初の分子数の対数との間の線形関係が得られる。従って、定量化はこの段階で信頼性があり、構成成分のいかなる限定効果によっても影響されない。対照または未処理試料における、内部基準のct値と比較した標的遺伝子の相対的ct値は、Δct.対照 = Ct対照の基準- ct対照の標的として、処理を受けた未知の試料においては、Δct.試料= Ct試料の基準 - ct試料の標的として表される。
【００７１】
理論的なPCR反応は、N=N0×2n（N：増幅した分子の数、N0：分子の最初の数、n：増幅サイクルの数）の公式により表され、そこで基数の2は、最適な効率を表す（サイクルごとに1つの倍加）。この数式により、ct値の代わりに、mRNAのコピー数で差次的発現を説明することができる：理論的効率を含む指数関数値、2Δctが採用される。
【００７２】
定量的研究のための内部基準として、リボゾームタンパク質S12遺伝子発現を用いた。それは、全ての試料において、構成的にかつ同じレベルで発現している。蛍光閾値の設定は、light cyclerソフトウエアによって決定した。得られたct値（1つの試料につき二重に、条件あたり2つの試料）は、Microsoft Excel中にエクスポートし、上述のように解析した。
【００７３】
結果
Affymetrixマイクロアレイ実験（図1参照）で同定された新規な選択的PPARδバイオマーカー遺伝子（配列番号：2）は、qPCR（quantitative polymerase chain reaction）によって確かめられた。
【００７４】
試験されたリガンドは、PPARαアゴニスト（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリック酸））、PPARδアゴニスト（C：rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-アセティック）および2つのPPARδ-αコアゴニスト（B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸、およびD：(2-メチル-4-{メチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチル]-アミノ}-フェノキシ)-酢酸）であった。
【００７５】
表3および図2に示されているように、PPARδアゴニスト（C）およびPPARδ-αコアゴニスト（BおよびD）によって誘発されたマーカー遺伝子PDK4の反応は、PPARα特異的リガンド（A）によって誘発された反応よりも大きい。
【００７６】
（表３）qPCRによって測定された、C2C12においてPPARリガンド：A 300μM、B 100nM、C 500nM、D 500nMによって誘導されたC2C12マウス筋細胞におけるPDK4遺伝子発現の倍数変化（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリック酸）はPPARαアゴニスト、B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸はPPARδコアゴニスト、C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-アセティックは、PPARδアゴニスト、D：(2-メチル-4-{メチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチル]-アミノ}-フェノキシ)-酢酸は、PPARδ-αコアゴニストである）
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【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】表1中のPPARリガンド（A 300μM、B 100nM、C 500nM）によってC2C12マウス筋細胞に誘導され、Affymetrixマイクロアレイによって測定された、PDK4遺伝子発現の倍数変化のグラフ表示。PDK4：ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ・アイソエンザイム4 uced脂肪因子[PPARδ活性についてのマーカー]、A: 2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリック酸）[PPARαアゴニスト]; B: {2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸 [PPARδ-αコアゴニスト]; C: [rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-アセティック[PPARδアゴニスト]。
【図２】表3中のPPARリガンド（A 300μM、B 100nM、C 500nM、D 500nM）によってC2C12マウス筋細胞に誘導され、qPCRによって測定された、PDK4遺伝子発現の倍数変化のグラフ表示。PDK4：ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ・アイソエンザイム4 [PPARδ活性に対するマーカー]、A: 2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリック酸）[PPARαアゴニスト]; B: {2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸 [PPARδ-αコアゴニスト]; C: [rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-アセティック[PPARδアゴニスト]； D：(2-メチル-4-{メチル- [4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチル]-アミノ}-フェノキシ)-酢酸[PPARδ-αコアゴニスト]。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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