(57)【要約】  本発明は、顆粒球コロニー刺激因子とＰＥＧ部分とのコンジュゲートを提供する。これらのコンジュゲートは、ペプチドと修飾基の間に介在しペプチドと修飾基に共有結合している完全なグリコシル結合基を介して連結されている。これらのコンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼの作用により、グリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドの双方から形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチド上のアミノ酸残基またはグリコシル残基に修飾された糖部分を連結する。コンジュゲートを含む医薬製剤も提供される。コンジュゲートを調製するための方法も、本発明の範囲内である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の部分を含む顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【化１】
2007513189.tif 000066
（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
【化２】
2007513189.tif 000067
（式中、ａは０〜２０の整数である。）
【請求項３】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化３】
2007513189.tif 000068
（式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
【請求項４】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化４】
2007513189.tif 000069
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項５】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化５】
2007513189.tif 000070
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項６】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化６】
2007513189.tif 000071
（式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項７】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化７】
2007513189.tif 000072
【請求項８】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化８】
2007513189.tif 000073
【請求項９】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化９】
2007513189.tif 000074
（式中、ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基である。）
【請求項１０】
前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項９に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基が、配列番号：１の１３３位のトレオニンである、請求項１１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１３】
配列番号：１および配列番号：２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化１０】
2007513189.tif 000075
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは１であり、
ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０〜６の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０〜１００の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１からそれぞれ独立に選択され、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙのうちの少なくとも１つが１であり、
ＡＡは、前記Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基であり、
Ｓｉａ−（Ｒ）は、以下の式で表される。
【化１１】
2007513189.tif 000076
（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
【請求項１５】
前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
生理活性を有する顆粒球コロニー刺激因子ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
以下の部分を含むＧ−ＣＳＦペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、
【化１２】
2007513189.tif 000077
（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
（ａ）転移に適した条件のもとで、基質のＧ−ＣＳＦペプチドを、以下の式で表されるＰＥＧ−シアル酸供与体部分と、
【化１３】
2007513189.tif 000078
前記Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基上に前記ＰＥＧ−シアル酸を転移させる酵素と、に接触させる工程を含む方法。
【請求項１８】
Ｌ−Ｒ１が以下の式で表される、請求項１７に記載の方法。
【化１４】
2007513189.tif 000079
（式中、ａは０〜２０の整数である。）
【請求項１９】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１５】
2007513189.tif 000080
（式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
【請求項２０】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１６】
2007513189.tif 000081
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２１】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１７】
2007513189.tif 000082
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２２】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１８】
2007513189.tif 000083
（式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２３】
前記工程（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主中で前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させる工程、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主が昆虫細胞および哺乳動物細胞から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物に請求項１に記載のペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物における炎症性白血球産生を刺激する方法。
【請求項２６】
治療を必要とする被験者の感染症を治療する方法であって、前記被験者の前記状態を改善するのに有効な量の請求項１に記載のペプチドを前記被験者に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬製剤。
【請求項２８】
不溶性の組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質をリフォールディングさせる方法であって
（ａ）ＧＣＳＦタンパク質を可溶化する工程と、
（ｂ）酸化還元対を含む緩衝液に前記可溶性ＧＣＳＦタンパク質を接触させて前記ＧＣＳＦタンパク質をリフォールディングさせる工程と、を含み、
前記リフォールディングされたＧＣＳＦタンパク質が生物学的に活性である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年１２月３日出願の米国仮出願第６０／５２６７９６号、２００４年３月２３日出願の米国仮出願第６０／５５５８１３号、２００４年５月１１日出願の米国仮出願第６０／５７０２８２号、２００４年１月２６日出願の米国仮出願第６０／５３９３８７号、２００４年７月２９日出願の米国仮出願第６０／５９２７４４号、２００４年９月２９日出願の米国仮出願第６０／６１４５１８号、および２００４年１０月２９日出願の米国仮出願第６０／６２３３８７号に対する優先権を主張する。あらゆる目的のためにこれら各文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、好中性顆粒球前駆細胞および成熟好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する糖タンパク質である。臨床使用されている組換えヒトＧ−ＣＳＦの２種の型は、好中性顆粒球形成の強力な刺激剤であり、いくつかの好中球減少性の状態の感染性合併症を予防する際に有効であることが実証されている。骨髄抑制性治療からの好中球回復を促進するのにこれらを使用することができる。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦは、発熱性好中球減少症の発病率を低減させることにより、癌化学療法の罹患率、骨髄移植で支援した大量化学療法の罹患率、ならびに重度の慢性好中球減少症患者における感染症の発病率および持続期間を低減させる。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、心筋梗塞の発症後に投与されると治療効果を有することも最近示された。
【０００４】
１９８６年に日本および米国のグループによって、ヒト型のＧ−ＣＳＦがクローン化された（例えば、Ｎａｇａｔａ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：４１５〜４１８頁、１９８６年を参照のこと）。天然のヒト糖タンパク質は、２種類の型で存在しており、１つは１７５個のアミノ酸からなり、もう一方は１７８個のアミノ酸からなる。より豊富でより活性な１７５アミノ酸型は、組換えＤＮＡ技術による医薬品開発に使用されてきた。
【０００５】
大腸菌発現系で合成された組換えヒトＧ−ＣＳＦは、フィルグラスチムと呼ばれる。フィルグラスチムの構造は、天然の糖タンパク質と少し異なる。組換えヒトＧ−ＣＳＦのもう一方の型はレノグラスチムと呼ばれ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で合成される。
【０００６】
ｈＧ−ＣＳＦは、２つのＧ−ＣＳＦ分子および２つの受容体からなる２：２の複合体を形成することによって、Ｇ−ＣＳＦ受容体を二量体化する単量体のタンパク質である（Ｈｏｒａｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５（１５）：４８８６〜９６頁（１９９６年））。以下のｈＧ−ＣＳＦ残基は、Ｘ線による結晶研究によって受容体結合領域の部分として確認されている。すなわち、Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｌ１０８、Ｄ１０９、Ｄ１１２、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｑ１１９、Ｅ１２２、Ｅ１２３、およびＬ１２４である（例えば、Ａｒｉｔｏｍｉ他、（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７１３頁を参照のこと）。
【０００７】
市販型のｒｈＧ−ＣＳＦの薬理効果は短期間であり、しばしば、白血球減少性の状態の持続期間に対して１日１回以上投与しなければならない。循環半減期がより長い分子は、白血球減少症を軽減するのに必要な投与回数を低減させ、結果として起こる感染症を予防するはずである。現在利用可能なｒＧ−ＣＳＦ製品の別の問題は、用量依存的な骨痛の発生である。骨痛は、ｒＧ−ＣＳＦを用いた治療の著しい副作用として患者が経験するため、実質的にこの影響を示さない製品、または骨痛が引き起こされずに済む少ない用量で有効な製品によって、骨痛を引き起こさないｒＧ−ＣＳＦ製品を提供することが望ましいはずである。したがって、改良された組換えＧ−ＣＳＦ分子が必要なことは明らかである。
【０００８】
タンパク質工学により作製されたｈＧ−ＣＳＦの変異体が、報告されている（米国特許第５５８１４７６号、米国特許第５２１４１３２号、米国特許第５３６２８５３号、米国特許第４９０４５８４号、およびＲｉｅｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９０３４〜９０４１頁、１９９６年）。天然のポリペプチドと比べて少なくとも１つの付加的な糖鎖を導入するためのｈＧ−ＣＳＦおよび他のポリペプチドの修飾も、報告されている（米国特許第５２１８０９２号）。さらに、ＰＥＧ基の付加を含めて、天然のｈＧ−ＣＳＦのポリマー修飾も報告および研究されている（例えば、Ｓａｔａｋｅ−Ｉｓｈｉｋａｗａ他、（１９９２年）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  １７：１５７頁、Ｂｏｗｅｎ他、（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２７：４２５頁、米国特許第５８２４７７８号、米国特許第５８２４７８４号、ＷＯ９６／１１９５３号、ＷＯ９５／２１６２９号、およびＷＯ９４／２００６９号を参照のこと）。
【０００９】
糖タンパク質治療薬の薬物動態学的諸特性を改善するためにペプチド主鎖に合成ポリマーを付加することは当技術分野では公知である。ペプチドに結合される例示的なポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。ペプチド治療薬を誘導体化するためにＰＥＧを使用すると、ペプチドの免疫原性が低減されることが明らかにされている。例えば、米国特許第４１７９３３７号（Ｄａｖｉｓ他）では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールに結合させた酵素やペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の低減に加えて、問題のポリペプチドのＰＥＧコンジュゲートのサイズが増大することにより、循環におけるクリアランス時間が延長される。
【００１０】
ペプチドにＰＥＧおよびその誘導体を付加する主な態様は、ペプチドアミノ酸残基を介した非特異的結合である（例えば、米国特許第４０８８５３８号、米国特許第４４９６６８９号、米国特許第４４１４１４７号、米国特許第４０５５６３５号、およびＰＣＴ  ＷＯ８７／０００５６号を参照のこと）。ペプチドにＰＥＧを付加する別の態様は、グリコペプチド上のグリコシル残基の非特異的酸化を介する（例えば、ＷＯ９４／０５３３２号を参照のこと）。
【００１１】
これらの非特異的な方法では、ランダムにかつ非特異的に、ペプチド主鎖上の反応性残基にポリエチレングリコールが付加される。当然、ＰＥＧ分子のランダムな付加は、最終生成物の均質性の欠如、およびそのペプチドの生物活性または酵素活性が低減する可能性を含めて、欠点を有する。したがって、治療ペプチドを作製するためには、特異的に標識され、容易に特徴づけることができ、ほぼ均質な生成物を形成させる誘導体化戦略が優れている。このような方法が開発された。
【００１２】
特異的に標識された均質なペプチド治療薬は、酵素作用を通じてｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することができる。合成ポリマーまたは他の標識をペプチドに結合させるための一般的な非特異的方法とは異なり、酵素に基づく合成は、位置選択性および立体選択性という長所を有する。標識ペプチドの合成に使用するための酵素の主要な２種のクラスは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素を用いて、治療効果を有する部分を含むようにその後で修飾することができる糖を特異的に付加することができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび改変されたグリコシダーゼを用いて、修飾された糖をペプチド主鎖に直接転移させることができる（例えば、米国特許第６３９９３３６号、米国特許出願公開第２００３００４００３７号、２００４０１３２６４０号、２００４０１３７５５７号、２００４０１２６８３８号、および２００４０１４２８５６号を参照のこと。これら各文献を参照により本明細書に組み込む）。化学合成要素と酵素合成要素の双方を併用する方法も公知である（例えば、参照により本明細書に組み込むＹａｍａｍｏｔｏ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５〜４２２頁（１９９８年）および米国特許出願公開第２００４０１３７５５７を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
改良された治療用Ｇ−ＣＳＦの必要性に応えて、本発明は、治療上有効であり、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されていない同一または類似性の高いＧ−ＣＳＦペプチドに比べて改善された薬物動態学的パラメータおよび諸特性を有する、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを提供する。さらに、本発明は、経済的に、かつ工業規模で、本発明の改良されたＧ−ＣＳＦペプチドを製造するための方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
これまでに、１つまたは複数のポリエチレングリコール部分を用いて顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の制御された修飾を行うと、対応する天然の（ＰＥＧ化されていない）Ｇ−ＣＳＦに比べて改善された薬物動態学的諸特性を有する新規なＧ−ＣＳＦ誘導体が与えられることが発見されている（図３）。さらに、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦの薬理活性は、市販のモノＰＥＧ化されたフィルグラスチムとほぼ同じである（図４）。
【００１５】
例示的な実施形態では、本発明の「ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された」Ｇ−ＣＳＦ分子は、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドまたは非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドと、その構造内にポリエチレングリコール部分を含む酵素的に転移可能なサッカリル部分とのコンジュゲートを、酵素を用いて形成させることにより、作製される。ＰＥＧ部分は、直接（すなわち、２つの反応性基の反応によって形成される1つの基を介して）、またはリンカー部分、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルを介して、サッカリル部分に結合される。例示的に転移可能なＰＥＧ−サッカリル構造を図５に示す。
【００１６】
したがって、一態様では、本発明は、ＰＥＧ部分、例えばＰＥＧと、当業者に認知されているＧ−ＣＳＦと同様な、そうでなければ類似したｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有するペプチドとのコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、ＰＥＧ部分は、完全なグリコシル結合基を介してペプチドに共有結合している。例示的な完全なグリコシル結合基として、ＰＥＧにより誘導体化されるシアル酸部分が挙げられる。
【００１７】
例示的な一態様では、本発明は、以下の部分を含むＧ−ＣＳＦペプチドを提供する。
【００１８】
【化１】
2007513189.tif 000002
【００１９】
上式において、Ｄは、−ＯＨまたはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを示す。Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分であり、Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。通常、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。本明細書で示す修飾されたシアル酸構造において、ＣＯＯＨは、ＣＯＯ−および／またはその塩も示す。
【００２０】
別の態様では、本発明は、上記の部分を含むＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを作製する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）転移に適した条件のもとで、基質のＧ−ＣＳＦペプチドを、ＰＥＧ−シアル酸供与体と、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸残基またはグリコシル残基上にＰＥＧ−シアル酸を転移させる酵素と、に接触させる工程を含む。例示的なＰＥＧ−シアル酸供与体部分は以下の式を有する。
【００２１】
【化２】
2007513189.tif 000003
【００２２】
一実施形態では、宿主は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、植物細胞、細菌、または真菌である。
【００２３】
本発明の化合物の薬物動態学的諸特性は、ペプチドのグリコシル化部位の構造、数、または位置を改変することによって、容易に変更される。したがって、野生型には存在していないＯ−またはＮ−結合グリコシル化部位をＧ−ＣＳＦペプチド中に挿入する１種または複数の変異を加えることは、本出願の範囲内である。これらの変異体ならびにそれらのグリコシル化された最終生成物および中間体に対する抗体も、本発明の範囲内である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、完全なグリコシル結合基を通じてそれらに共有結合したＰＥＧ基部分の集団、例えば、ＰＥＧを有するＧ−ＣＳＦコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、その集団のほぼすべてのメンバーは、グリコシル結合基を介してペプチドのグリコシル残基に結合しており、各グリコシル残基は同じ構造を有している。
【００２５】
例示的な実施形態では、本発明は、完全なグリコシル結合基を通じてそれらに共有結合したＰＥＧ基部分の集団、例えば、ＰＥＧを有するＧ−ＣＳＦコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、その集団のほぼすべてのメンバーは、ペプチドのアミノ酸残基に結合しており、ポリマーが結合している各アミノ残基は同じ構造を有している。例えば、１つのペプチドが、Ｔｈｒに結合したグリコシル残基を含む場合は、その集団のペプチドのうちの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、より好ましくは９９．８％が、同じＴｈｒ残基に共有結合した同じグリコシル残基を有すると考えられる。上記の考察は、Ｏ−グリコシル化部位とＮ−グリコシル化部位の双方に対して同様に該当する。
【００２６】
薬剤組成物も提供される。この組成物は、製薬上許容される担体、ならびに非天然のＰＥＧ部分とグリコシル化または非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドとの共有結合性コンジュゲートを含む。
【００２７】
本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
略語
ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＰＰＧ、ポリプロピレングリコール；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセタート；Ｘｙｌ、キシロシル；ＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−ホスファート；Ｓｉａ、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミニル、ならびにそれらの誘導体および類似体。
【００２９】
定義
別段の定めが無い限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。核酸およびペプチドの合成には標準技術が使用される。これらの技術および手順は、本明細書の全体を通じて提供される、当技術分野の従来の方法および様々な一般的参考文献（一般には、参照により本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋ他、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと）に従って一般に実施される。本明細書で使用する命名法、ならびに後述する分析化学および有機合成における実験手順は、周知のものであり、当技術分野で一般に使用される。標準技術またはその改変法が、化学合成および化学的分析に使用される。
【００３０】
本明細書で記述するすべてのオリゴ糖は、非還元糖の名称または略語（すなわち、Ｇａｌ）、その後にグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与している還元糖の環の位置（２、３、４、６、または８）、次に、還元糖の名称または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）を書いて記述する。各糖はピラノースであることが好ましい。標準的な糖鎖生物学命名法の総説については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉ他編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照のこと。
【００３１】
オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であるかどうかに関わらず、還元末端および非還元末端を有しているとみなされている。一般に認められている命名法に従い、本明細書では、左側に非還元末端、右側に還元末端を書いてオリゴ糖を表現する。
【００３２】
「シアル酸」という用語は、炭素９個のカルボキシル化糖ファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される）である。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏ他、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７頁；Ｋａｎａｍｏｒｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９頁（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃや９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、および９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９位置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５〜４０頁（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９２年）を参照のこと。シアル酸付加手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０号で開示されている。
【００３３】
「顆粒球コロニー刺激因子」もしくは「顆粒球コロニー刺激因子ペプチド」、または「Ｇ−ＣＳＦ」もしくは「Ｇ−ＣＳＦペプチド」という用語は、任意の野生型もしくは突然変異型のペプチド、組換型、天然型、または天然のＧＣＳＦの活性と同じもしくはそれを模倣した活性を有するＧ−ＣＳＦの任意の断片を意味する。この用語は、一般に、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦミメティックも包含する。例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する。他の例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは配列番号：３〜１１から選択される配列を有する。
【００３４】
「顆粒球コロニー刺激因子活性」という用語は、それだけには限らないが、受容体結合および活性化、受容体結合の抑制、または野生型の顆粒球コロニー刺激因子の作用によって通常影響を及ぼされる任意の生化学反応もしくは生理反応を含めて、任意の活性を意味する。顆粒球コロニー刺激因子活性は、上記に定義した任意の顆粒球コロニー刺激因子ペプチドの作用から生じ得る。
【００３５】
「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介してそれらが相互に結合しているポリマーを意味し、代わりにポリペプチドとも呼ばれる。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンも含まれる。遺伝子でコードされていないアミノ酸も本発明で使用してよい。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療効果を有する部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用してよい。本発明で使用するアミノ酸はすべて、Ｄ型異性体でもＬ型異性体でもよい。一般にＬ型異性体が好ましい。さらに、他のペプチドミメティックも、本発明で有用である。本明細書では、「ペプチド」とは、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの双方を意味する。ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されたペプチドも含まれる。一般的な総説については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ、ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、２６７頁（１９８３年）を参照のこと。
【００３６】
「ペプチドコンジュゲート」という用語は、本発明で説明するように、ペプチドが修飾された糖に結合されている、本発明の化学種を意味する。
【００３７】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同じ様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードにコードされているもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同じ様に機能する化学化合物を意味する。本明細書では、「アミノ酸」という用語は、リンカー中にあろうとペプチド配列の成分であろうと、そのアミノ酸のＤ型異性体およびＬ型異性体の双方、ならびにこれら２種の異性体の混合物を意味する。
【００３８】
本明細書では、「修飾された糖」という用語は、本発明の方法においてペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に付加される、天然または非天然の糖を意味する。修飾された糖は、それだけには限らないが、糖ヌクレオチド（１リン酸型、２リン酸型、および３リン酸型）、活性化糖（例えば、グリコシルハライド、グリコシルメシラート）、および活性化されてもおらず、ヌクレオチドでもない糖を含めて、いくつかの酵素基質から選択される。「修飾された糖」は、「修飾基」によって共有結合的に官能化される。有用な修飾基には、それだけには限らないが、ＰＥＧ部分、治療効果を有する部分、診断用の部分、生体分子などが含まれる。修飾基は、天然、すなわち未修飾の糖ではないことが好ましい。修飾基による官能化の位置は、「修飾された糖」が酵素的にペプチドに付加されるのを妨げないように、選択される。
【００３９】
「水溶性」という用語は、水中でいくらかの検出可能な程度の溶解性を示す部分を意味する。水溶性を検出および／または定量化する方法は、当技術分野で周知である。例示的なＰＥＧ部分には、ペプチド、糖、ポリエーテル、ポリアミン、ポリカルボン酸などが含まれる。ペプチドは、混合配列を有するものでも、単一のアミノ酸から構成されるもの、例えば、ポリリシンでもよい。同様に、糖も、混合配列からなるものでも、単一の糖サブユニットから構成されるもの、例えば、デキストラン、アミロース、キトサン、およびポリシアル酸でもよい。例示的なポリエーテルは、ポリエチレングリコールである。ポリエチレンイミンは、例示的なポリアミンであり、ポリアクリル酸は、代表的なポリカルボン酸である。
【００４０】
「グリコシル結合基」という用語は、本明細書では、作用物質（例えば、ＰＥＧ部分、治療効果のある部分、生体分子）が共有結合しているグリコシル残基を意味する。本発明の方法では、「グリコシル結合基」は、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドに共有結合し、それによって、ペプチド上のアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に作用物質を結合させる。「グリコシル結合基」は、通常、ペプチドのアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に「修飾された糖」を酵素的に付加させることによって、「修飾された糖」から誘導される。「完全なグリコシル結合基」とは、コンジュゲートを結合する個々の糖モノマーが分解されていない、例えば、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化されていないグリコシル部分から誘導される結合基を意味する。本発明の「完全なグリコシル結合基」は、１つもしくは複数のグリコシル単位を付加することにより、または親となる糖構造体から１つもしくは複数のグリコシル単位を除去することにより、天然のオリゴ糖から誘導することができる。
【００４１】
「標的性部分」という用語は、本明細書では、身体の特定の組織または領域に選択的に局在化すると考えられる化学種を意味する。この局在化は、分子決定基の特異的認識、標的性作用物質または標的性コンジュゲートの分子サイズ、イオン性相互作用、疎水性相互作用などによって起こる。作用物質を特定の組織または領域に標的化する他の機序は、当業者に公知である。例示的な標的性部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
【００４２】
本明細書では、「製薬上許容される担体」には、コンジュゲートと混合したときにコンジュゲートの活性を保持し、被験者の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。例として、それだけには限らないが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤など標準的な薬剤用担体のうちの任意のものが挙げられる。他の担体として、滅菌液剤、被覆錠剤を含む錠剤、およびカプセル剤を挙げることができる。通常、このような担体は、デンプン、乳、糖、いくつかのタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性の脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または他の公知の賦形剤などの賦形剤を含有する。このような担体は、香料添加剤および着色添加剤または他の成分も含んでよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって調製される。
【００４３】
本明細書では、「投与すること」とは、経口投与、坐剤としての投与、局所的接触、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病巣内投与、鼻腔内投与、もしくは皮下投与、または徐放装置、例えばミニ浸透圧ポンプの被験者への埋め込みを意味する。投与は、非経口投与および経粘膜投与（例えば、口、鼻、膣、直腸、または経皮）を含めて、どんな経路によるものでもよい。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内が挙げられる。さらに、注射で腫瘍を治療しようとする場合、例えば、アポトーシスを誘発しようとする場合は、投与は、腫瘍への直接投与および／または腫瘍周辺の組織中への投与でよい。他の送達形態には、それだけには限らないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれる。「改善すること」または「改善する」という用語は、症状の緩和、寛解、もしくは低減、または患者の肉体的健康もしくは精神的健康の改善など任意の客観的または主観的パラメータを含めて、病状または病態の治療の成功を示す任意の徴候を意味する。症状の改善は、理学的検査および／または精神鑑定の結果を含めて、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。
【００４４】
「療法」という用語は、ある疾患に罹患しやすい可能性があるが、その疾患の症状をまだ経験および提示していない動物において、その疾患または病態が生じるのを防ぐこと（予防治療）、その疾患を抑制すること（発達を遅らせることもしくは阻止すること）、その疾患の症状または副作用からの軽減を提供すること（対症治療を含む）、ならびにその疾患を軽減すること（疾患の消退を引き起こすこと）を含めて、ある疾患または病態を「治療すること」またはそれらの「治療」を意味する。
【００４５】
「有効量」、「有効な量」、「治療有効量」、または文法的に等価な任意の用語は、ある疾患を治療するために動物に投与したときに、その疾患に対する治療を実施するのに十分である量を意味する。
【００４６】
「単離された」という用語は、その物質を作製するのに使用される成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。本発明のペプチドコンジュゲートの場合、「単離された」という用語は、そのペプチドコンジュゲートを調製するのに使用される混合物中で通常はその物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。「単離された」と「純粋な」は、同義的に使用される。通常、本発明の単離されたペプチドコンジュゲートは、好ましくはある範囲として示されるレベルの純度を有する。ペプチドコンジュゲートの純度範囲の下限は約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度の範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％より高い。
【００４７】
ペプチドコンジュゲートの純度が約９０％より高いとき、それらの純度も、好ましくはある範囲として示される。この純度の範囲の下限値は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。この純度の範囲の上限値は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または略１００％略１００％の純度である。
【００４８】
純度は、当業者に認知されている任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル上でのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）によって、測定される。
【００４９】
「集団のほぼすべてのメンバー」とは、本明細書では、選択された比率の、あるペプチドに付加される修飾された糖が、そのペプチド上の複数かつ同一の受容体部位に付加されているという、本発明のペプチドコンジュゲート集団の特徴を説明している。「集団のほぼすべてのメンバー」とは、修飾された糖に結合されるペプチド上の部位の「均質性」を説明しており、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明のコンジュケートに関する。
【００５０】
「均質性」とは、修飾された糖が結合される受容体部分の集合全体にわたる構造の一貫性を意味する。したがって、修飾された各糖部分が、他のすべての修飾された糖が結合されている受容体部位と同じ構造を有する受容体部位に結合されている本発明のペプチドコンジュゲートでは、そのペプチドコンジュゲートは、略１００％略１００％均質であると称される。均質性は、通常、ある範囲として示される。ペプチドコンジュゲートの均質性の範囲の下限値は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上限値は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％より高い。
【００５１】
ペプチドコンジュゲートが約９０％以上均質であるとき、それらの均質性も、好ましくはある範囲として示される。この均質性の範囲の下限値は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。この純度の範囲の上限値は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または略１００％略１００％の均質性である。ペプチドコンジュゲートの純度は、通常、当業者には公知の１種または複数の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動法などによって測定される。
【００５２】
グリコペプチド種に言及するときの「実質上同一のグリコフォーム」または「実質上同一のグリコシル化パターン」とは、当該のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されている受容体部分の比率に関係する。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびシアル酸付加されたその類似体の（以下に定義するように）ほぼすべてが本発明のペプチドコンジュゲートにおいてフコシル化されている場合、実質上同一のフコシル化パターンが存在する。出発原料が、グリコシル化された受容体部分（例えば、フコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含む場合があることが、当業者には理解されよう。したがって、算出されるグリコシル化比率は、本発明の方法によってグリコシル化される受容体部分、ならびに出発原料中で既にグリコシル化されている受容体部分を含むと考えられる。
【００５３】
上記の「実質上同一の」の定義における「実質上」という用語は、一般に、ある特定のグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを意味する。
【００５４】
置換基が従来の化学式によって指定され、左から右に書かれている場合、それらは、その構造を右から左に書くことにより得られるであろう化学的に同一な置換基も等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−も示すものとする。
【００５５】
「アルキル」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せ物を意味し、これらは、完全に飽和されているものでも、１価不飽和もしくは多価不飽和のものでもよく、２価の基および多価の基が含まれてよく、指定の炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例としては、それだけには限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、それだけには限らないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高次の同族体および異性体が挙げられる。「アルキル」という用語は、別段の注記の無い限り、「ヘテロアルキル」など以下により詳細に定義するアルキルの誘導体も含むことを意図されている。炭化水素基に限定されているアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００５６】
「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、それだけには限らないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で例示されるような、アルカンから誘導される２価の基を意味し、さらに、「ヘテロアルキレン」として以下に説明するような基も含む。一般的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有すると考えられ、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、通常、８個以下の炭素原子を有する。
【００５７】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄  原子を介して分子の残りの部分に結合されているアルキル基を意味する。
【００５８】
「ヘテロアルキル」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、指定された数の炭素原子とＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなり、その窒素原子および硫黄原子が場合によっては酸化されてよく、その窒素ヘテロ原子が場合によっては四級化されてよい、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せ物を意味する。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に存在しても、アルキル基が分子の残りの部分に結合されている位置に存在してもよい。例としては、それだけには限らないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３や−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、最大２個のヘテロ原子が連続していてよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、それだけには限らないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−で例示されるような、ヘテロアルキルから誘導される２価の基を意味する。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖の末端の一方または双方を占めてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキル結合基の場合、結合基の式が書かれる方向によっては、結合基の向きは示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の双方を表す。
【００５９】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状型を表す。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合されている位置を占めてもよい。シクロアルキルの例としては、それだけには限らないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、それだけには限らないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００６０】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルも含むことを意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、それだけには限らないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意図されている。
【００６１】
「アリール」という用語は、別段の定めが無い限り、多価不飽和な芳香族置換基を意味し、この置換基は、単環でも、相互に融合されまたは共有結合された多環（好ましくは１〜３個の環）でもよい。「ヘテロアリール」という用語は、その窒素原子および硫黄原子が場合によっては酸化されており、その１つまたは複数の窒素原子が場合によっては四級化されている、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）を意味する。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合されることができる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、および６−キノリルが挙げられる。上記に示したアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、後述の許容される置換基の群から選択される。
【００６２】
簡潔のために、他の用語と組み合わせて使うときの「アリール」という用語は（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記に定義したアリール環およびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、アルキル基中の炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば、酸素原子によって置換されているものを含めて（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）、アルキル基にアリール基が結合されているような基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意図されている。
【００６３】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）のそれぞれは、示された基の置換型と非置換型の双方を含むことを意図されている。各タイプの基に対して好ましい置換基を、以下に提供する。
【００６４】
（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含めた）アルキルおよびヘテロアルキル基に対する置換基は、総称的に「アルキル基置換基」と呼ばれ、これらは、それだけには限らないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ２）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２から、０から（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は、このような基の中の炭素原子の総数である）までの範囲の数で選択される様々な基のうちの１種または複数でよい。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、あるいはアリールアルキル基をそれぞれ独立に意味する。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含むときは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基のそれぞれが、これらの基のうちの複数が存在するときにされるのと同じように、Ｒ基のそれぞれは、独立に選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合されているとき、それらは、窒素原子と結合して５、６、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、それだけには限らないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図されている。置換基に関する上記の考察から、当業者には、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）やアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）など、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を含むように意図されていることが理解されよう。
【００６５】
アルキル基について説明した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基に対する置換基は、総称的に「アリール基置換基」と呼ばれる。これらの置換基は、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、０から芳香族環系上の空の原子価の総数までの範囲の数で選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択される。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含むときは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基のそれぞれが、これらの基のうちの複数が存在するときにされるのと同じように、Ｒ基のそれぞれは、独立に選択される。以下のスキームにおいて、記号Ｘは、前述の「Ｒ」を表す。
【００６６】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは、それぞれ独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’、または一重結合であり、ｑは０〜３の整数である）で表される置換基で場合によっては置換されてよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基のうちの２つが、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは、それぞれ独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−、または一重結合であり、ｒは１〜４の整数である）で表される置換基で場合によっては置換されてもよい。このようにして形成された新しい環の一重結合のうちの１つは、場合によっては、二重結合に置き換えられてよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基のうちの２つが、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは、それぞれ独立に０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）で表される置換基で場合によっては置換されてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、好ましくは、水素または置換もしくは非置換の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからそれぞれ独立に選択される。
【００６７】
本明細書では、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意図されている。
【００６８】
序論
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ上のグリカン構造を修飾するための方法を包含する。Ｇ−ＣＳＦは、活性化Ｔ−細胞、マクロファージ、内皮細胞、および間質線維芽細胞によって産生されるサイトカインとして当技術分野で周知である。Ｇ−ＣＳＦは、主として骨髄に作用して炎症性白血球の産生を増大させ、さらに、炎症作用の間に消費される好中球の補充を開始させる内分泌ホルモンとしても作用する。Ｇ−ＣＳＦは、化学療法の後の骨髄置換においても臨床応用されている。
【００６９】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のコンジュゲートを提供する。本発明は、顆粒球コロニー刺激活性を有するグリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドのコンジュゲートを提供する。これらのコンジュゲートは、治療効果を有する部分、診断用の部分、標的性部分など多様な化学種とさらに結合させることによって、さらに修飾してもよい。
【００７０】
本発明はさらに、Ｇ−ＣＳＦを改変および／または修飾するための方法も含む。Ｇ−ＣＳＦは、数多くの疾患の治療において価値ある手段であるが、前述したように、その臨床的有効性は、薬物動態が相対的に悪いため、妨げられている。
【００７１】
例示的な実施形態では、原因に関わらず、重度の慢性白血球減少症または相対的白血球減少症を治療する目的で末梢血前駆細胞移植において収集するための前駆細胞を動員するために、また、急性骨髄性白血病患者の治療を支援するために、放射線療法、化学療法、および骨髄移植のうちのいくつかのタイプを受ける癌患者において感染症を予防する目的で、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドを患者に投与することができる。さらに、本発明のポリペプチドコンジュゲートまたはポリペプチド組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患、ならびに細菌感染症の治療にも使用することができる。
【００７２】
Ｇ−ＣＳＦは、クローン化され、配列決定されている。例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、配列番号：１によって示されるアミノ酸配列を有する。本発明は、上記で論じたようにＧ−ＣＳＦの変異体として本発明書で示す配列に限定されないことが、当業者には容易に理解されよう。
【００７３】
すなわち、本発明はさらに、当技術分野で周知のように、Ｇ−ＣＳＦ変異体を包含する。決して本発明を限定しようとするものではないが、例として、あるＧ−ＣＳＦ変異体は、米国特許第６１６６１８３号で記載されており、そこでは、リシン残基の天然補完物を含み、１つまたは２つのポリエチレングリコール分子にさらに結合されているＧ−ＣＳＦが記載されている。さらに、米国特許第６００４５４８号、第５５８０７５５号、第５５８２８２３号、および第５６７６９４１号は、１７、３６、４２、６４、および７４位のシステイン残基のうちの１つまたは複数が、アラニンまたは代替としてのセリンによって置換されているＧ−ＣＳＦ変異体を記載している。米国特許第５４１６１９５号は、１７位のシステイン、２７位のアスパラギン酸、ならびに６５位および６６位のセリンが、それぞれセリン、セリン、プロリン、プロリンで置換されているＧ−ＣＳＦ分子を記載している。他の変異体は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５３９９３４５号で記載されている。さらに別の変異体は、配列番号：３〜１１から選択されるアミノ酸を有する。
【００７４】
本発明の修飾されたＧ−ＣＳＦ分子の発現および活性は、当技術分野で周知の方法、および例えば米国特許第４８１０６４３号に記載の方法によって解析することができる。例として、放射能標識したチミジンの取込みアッセイによって活性を測定することができる。手短に言うと、健康な提供者から得たヒト骨髄を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）を用いた密度分離にかけ、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、および抗生物質を含有するイスコフの培地（ＧＩＢＣＯ社、ラ  ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）に低密度の細胞を懸濁させる。約２×１０４個のヒト骨髄細胞を、約３７℃、大気中ＣＯ２濃度５％で約２日間、９６ウェルの平底プレートに入れた対照培地または本発明のＧ−ＣＳＦとともにインキュベートする。次に、培養物を０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ社、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、マサチューセッツ州）で約４時間パルス標識し、例えば、Ｖｅｎｔｕａ他（１９８３年、Ｂｌｏｏｄ  ６１：７８１頁）で記載されているようにして、取込み量を測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比較した、ヒト骨髄細胞中への３Ｈ−チミジン取込みの増大は、活性で存続可能なＧ−ＣＳＦ化合物の指標である。
【００７５】
前述したように、本発明のコンジュゲートは、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドまたは非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドへの修飾された糖の酵素的付加によって形成される。この修飾された糖は、Ｇ−ＣＳＦペプチドと糖上の修飾基の間に介在しているとき、例えば「完全なグリコシル結合基」と本明細書で呼び得るものになる。グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の精巧な選択性を用いて、本発明の方法は、１つまたは複数の特異的な位置に所望の基を有するペプチドを提供する。したがって、本発明によれば、修飾された糖は、Ｇ−ＣＳＦペプチド鎖上の選択された位置に直接結合されており、あるいは、修飾された糖は、グリコペプチドの糖部分に付加されている。修飾された糖が、グリコペプチドの糖にも、直接Ｇ−ＣＳＦペプチド主鎖のアミノ酸残基にも結合されているペプチドも、本発明の範囲内である。
【００７６】
公知の化学的および酵素的ペプチド合成戦略とは対照的に、本発明の方法は、実質上均質な誘導体化パターンを有するペプチドおよびグリコペプチドを構築することを可能にする。すなわち、本発明で使用する酵素は、一般に、Ｇ−ＣＳＦペプチドの特定のあるアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の組合せ物に対して選択的である。これらの方法は、修飾されたペプチドおよびグリコペプチドの大量生産にも実用的である。したがって、本発明の方法は、予め選択した均一な誘導体化パターンを有するグリコペプチドを大量調製するための実用的手段を提供する。これらの方法は、それだけには限らないが、細胞培養用の細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、もしくは原核細胞）またはトランスジェニック植物もしくは動物中で作製される間に不完全にグリコシル化されるグリコペプチドを含めて、治療ペプチドを修飾するのに特に良く適している。
【００７７】
本発明は、例えば、クリアランス速度の低減によって、または免疫もしくは細網内皮系（ＲＥＳ）による取込み速度の低減によって、治療効果の半減期を延長したグリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドおよび非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドのコンジュゲートも提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスキングし、それによって、そのペプチドに対する宿主の免疫応答を低減または消失させるための方法も提供する。標的性作用物質の選択的付加も、特定の標的性作用物質に特異的な特定の組織または細胞表面受容体にペプチドを導くのに使用することができる。
【００７８】
コンジュゲート
第１の態様では、本発明は、選択された修飾基とＧ−ＣＳＦペプチドとのコンジュゲートを提供する。
【００７９】
Ｇ−ＣＳＦペプチドと選択された部分の間の結合は、ペプチドと選択された部分の間に介在している完全なグリコシル結合基を含む。本明細書で論じるように、選択された部分は、糖単位に結合することができ、その結果、修飾された糖をＧ−ＣＳＦペプチドに付加させる適切なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「修飾された糖」を生じる本質的に任意の化学種である。修飾された糖の糖部分は、Ｇ−ＣＳＦペプチドと選択された部分の間に介在しているとき、「完全なグリコシル結合基」となる。完全なグリコシル結合基は、選択された部分で修飾された後に適切なトランスフェラーゼの基質となる、任意の単糖またはオリゴ糖から形成される。
【００８０】
本発明のコンジュゲートは、通常、以下の一般的な構造に対応すると考えられる。
【００８１】
【化３】
2007513189.tif 000004
式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｓは、ゼロではない正の整数を表し、ｔは０または正の整数である。「作用物質」は、通常、水溶性の部分、例えば、ＰＥＧ部分である。リンカーは、下記の多彩な結合基のうちの任意のものでよい。あるいは、リンカーは、一重結合または「ゼロ次の」リンカーでもよい。
【００８２】
例示的な実施形態では、選択された修飾基は水溶性のポリマー、例えば、ｍ−ＰＥＧである。この水溶性のポリマーは、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合しているグリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合している。本発明は、アミノ酸残基およびグリコシル残基がグリコシル結合基で修飾されているコンジュゲートも提供する。
【００８３】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、メトキシ−ポリエチレングリコールである。本発明で使用するポリエチレングリコールは、特定の型および分子量範囲にまったく限定されない。非分枝状ポリエチレングリコール分子の場合、分子量は、好ましくは５００〜１００，０００である。好ましくは２，０００〜６０，０００の分子量、より好ましくは約５，０００〜約３０，０００の分子量が使用される。
【００８４】
別の実施形態では、ポリエチレングリコールは、複数のＰＥＧ部分が結合されている分枝状ＰＥＧである。分枝状ＰＥＧの例は、米国特許第５９３２４６２号、米国特許第５３４２９４０号、米国特許第５６４３５７５号、米国特許第５９１９４５５号、米国特許第６１３３９０６号、米国特許第５１８３６６０号、ＷＯ０２／０９７６６号、Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２８３〜２８８頁（１９９４年）、およびＹａｍａｓａｋｉ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５〜２１２７頁、１９９８年で記載されている。その他の有用な分枝状ＰＥＧの構造が、本明細書で開示される。
【００８５】
例示的な実施形態では、分枝状ＰＥＧの各ポリエチレングリコールの分子量は、約２，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、４０，０００、または６０，０００ダルトン以上である。
【００８６】
本発明のペプチドは、少なくとも１つのＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化部位を含む。酵素的に付加されるグリコシル結合基を通じて形成されるコンジュゲートを提供することに加えて、本発明は、置換パターンが極めて均質なコンジュゲートを提供する。本発明の方法によって、本発明のコンジュゲートの集合全体における修飾された糖部分のほぼすべてが、構造的に同一のアミノ酸残基またはグリコシル残基の複数のコピーに結合されている、ペプチドコンジュゲートを形成させることができる。したがって、第２の態様では、本発明は、完全なグリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦに共有結合している水溶性のポリマー部分の集合を有する、ペプチドコンジュゲートを提供する。本発明の好ましいコンジュゲートでは、その集団のほぼすべてのメンバーは、グリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドのグリコシル残基に結合しており、グリコシル結合基が結合しているＧ−ＣＳＦの各グリコシル残基は同じ構造を有している。
【００８７】
水溶性ポリマー部分の集団がグリコシル結合基を介して共有結合しているペプチドコンジュゲートも提供される。好ましい実施形態では、水溶性ポリマー部分の集団のほぼすべてのメンバーは、グリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基に結合しており、グリコシル結合基が結合している各アミノ残基は同じ構造を有している。
【００８８】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦペプチドが、治療効果を有する部分、診断用の部分、標的性部分、毒性部分などに完全なグリコシル結合基を介して結合されている、前述したものに類似したコンジュゲートも提供する。前述した部分はそれぞれ、小分子、天然ポリマー（例えばポリペプチド）、または合成ポリマーでよい。
【００８９】
任意の配列を有する本質的に任意の顆粒球コロニー刺激因子ペプチドまたは作用物質が、本発明のコンジュゲートのペプチド成分として有用である。顆粒球コロニー刺激因子はクローン化され配列決定されている。例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、配列番号：１で示される配列を有する。
【数１】
2007513189.tif 000005
（配列番号：１）
【００９０】
別の例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、配列番号：２で示される配列を有する。
【数２】
2007513189.tif 000006
（配列番号：２）
【００９１】
別の例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、以下の配列番号：３〜１１で示される配列を有する。
【数３】
2007513189.tif 000007
（配列番号：３）
【数４】
2007513189.tif 000008
（配列番号：４）
【数５】
2007513189.tif 000009
（配列番号：５）
【数６】
2007513189.tif 000010
（配列番号：６）；
【数７】
2007513189.tif 000011
（配列番号：７）；
【数８】
2007513189.tif 000012
（配列番号：８）；
【数９】
2007513189.tif 000013
（配列番号：９）；
【数１０】
2007513189.tif 000014
（配列番号：１０）および
【数１１】
2007513189.tif 000015
（配列番号：１１）
【００９２】
本発明は、本明細書で示す配列に決して限定されない。
【００９３】
例示的な実施形態では、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドは、ＰＥＧ部分を含むグリコシル残基でグリコシル化されている、少なくとも１つのＯ−結合型グリコシル化部位を含む。ＰＥＧは、完全なグリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合している。このグリコシル結合基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合している。あるいは、このグリコシル結合基は、グリコペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に結合している。本発明は、グリコシル結合基がアミノ酸残基およびグリコシル残基の双方に結合しているコンジュゲートも提供する。
【００９４】
ＰＥＧ部分は、直接、または非グリコシルリンカー、例えば、置換もしくは非置換のアルキルや置換もしくは非置換のヘテロアルキルを介して、完全なグリコシルリンカーに結合している。
【００９５】
好ましい実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、化学式Ｉの式を有する部分を含む。
【００９６】
【化４】
2007513189.tif 000016
式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。本明細書で示す修飾されたシアル酸構造において、ＣＯＯＨは、ＣＯＯ−および／またはその塩も示す。
【００９７】
一実施形態では、Ｒ１−Ｌは以下の式を有する。
【００９８】
【化５】
2007513189.tif 000017
式中、ａは、０〜２０の整数である。
【００９９】
ある例示的な実施形態では、Ｒ１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する。
【０１００】
【化６】
2007513189.tif 000018
式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは、１〜２０の整数である。別の実施形態では、Ｒ１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する。
【０１０１】
【化７】
2007513189.tif 000019
式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。
【０１０２】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、Ｆａｃｔｏ  ＩＸペプチドコンジュゲートを提供する。
【０１０３】
【化８】
2007513189.tif 000020
式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。
【０１０４】
別の実施形態では、Ｒ１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する。
【０１０５】
【化９】
2007513189.tif 000021
式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。
【０１０６】
別の例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有する部分を含むペプチドを提供する。
【０１０７】
【化１０】
2007513189.tif 000022
Ｇａｌは、アミノ酸に結合しても、直接的または間接的に（例えば、グリコシル残基を介して）アミノ酸に結合しているグリコシル残基に結合してもよい。
【０１０８】
別の実施形態では、この部分は以下の式を有する。
【０１０９】
【化１１】
2007513189.tif 000023
ＧａｌＮＡｃは、アミノ酸に結合しても、直接的または間接的に（例えば、グリコシル残基を介して）アミノ酸に結合しているグリコシル残基に結合してもよい。
【０１１０】
さらに別の例示的な実施形態では、ペプチドは、以下の式による部分を含む。
【０１１１】
【化１２】
2007513189.tif 000024
式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、上記の構造体のそれぞれにおいて、ＤおよびＧは、本明細書で記述するものである。
【０１１２】
上記の化学種のうちの１種または複数が結合できる、Ｇ−ＣＳＦペプチドの例示的なアミノ酸残基としては、セリンおよびトレオニン、例えば、配列番号：１のトレオニン１３３が挙げられる。
【０１１３】
別の例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有するグリコシル残基を含むＧ−ＣＳＦコンジュゲートを提供する。
【０１１４】
【化１３】
2007513189.tif 000025
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数である。添字ｑは１である。添字ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０〜６の整数からそれぞれ独立に選択される。添字ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０〜１００の整数からそれぞれ独立に選択される。添字ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１からそれぞれ独立に選択され、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙのうちの少なくとも１つが１である。記号ＡＡは、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基を表す。
【０１１５】
記号Ｓｉａ−（Ｒ）は、以下の式を有する基を示す。
【０１１６】
【化１４】
2007513189.tif 000026
式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択される。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを示す。Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分を示す。Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。通常、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【０１１７】
別の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲート中のＰＥＧ修飾されたシアル酸部分は、以下の式を有する。
【０１１８】
【化１５】
2007513189.tif 000027
式中、添字「ｓ」は、０〜２０の整数を示し、ｎは、１〜２５００の整数である。好ましい実施形態では、ｓは１に等しく、ｍ−ＰＥＧ部分の分子量は約２０ｋＤである。
【０１１９】
さらに別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ修飾されたシアル酸は、以下の式を有する。
【０１２０】
【化１６】
2007513189.tif 000028
式中、Ｌは、シアル酸部分とＰＥＧ部分を連結する、置換もしくは非置換のアルキル、あるいは置換もしくは非置換のヘテロアルキルのリンカー部分である。
【０１２１】
好ましい実施形態では、上述のアスパラギン残基のうちの少なくとも２つ、より好ましくは３つ、より好ましくは４つが、上記に示すＮ結合型グリカン鎖によって官能化されている。
【０１２２】
本発明のコンジュゲートは、一価または多価（例えば、アンテナ構造）である完全なグリコシル結合基を含む。したがって、本発明のコンジュゲートは、選択された部分が一価のグリコシル結合基および多価の結合基を介してペプチドに結合している、双方の化学種を含む。複数の選択された部分が多価の結合基を介してペプチドに結合しているコンジュゲートも、本発明の範囲に含まれる。
【０１２３】
修飾された糖
本発明は、修飾された糖、修飾された糖ヌクレオチド、および修飾された糖のコンジュゲートを提供する。本発明の修飾された糖化合物において、糖部分は、好ましくは、糖、デオキシ糖、アミノ糖、またはＮ−アシル糖である。「糖」という用語およびその同義語の「サッカリル」、「砂糖」、および「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、およびポリマーを指す。糖部分も、修飾基によって官能化される。修飾基は、通常、糖上のアミン、スルフヒドリル、またはヒドロキシル、例えば、第１級ヒドロキシル部分との結合を通じて、糖部分に結合されている。例示的な実施形態では、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、例えば、アミンと修飾基の反応性誘導体との反応によって形成されるアミド、ウレタン、または尿素を介して結合されている。
【０１２４】
任意の糖を本発明のコンジュゲートの糖コアとして利用することができる。本発明の組成物の形成に有用である例示的な糖コアには、それだけには限らないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシアル酸が含まれる。その他の有用な糖には、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などのアミノ糖が含まれる。糖コアは、天然に存在する構造体でもよく、あるいは、修飾基を結合するための部位を生じるように修飾されたものでもよい。例えば、一実施形態では、本発明は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置換されているシアル酸誘導体を含むペプチドコンジュゲートを提供する。このアミンは、選択された修飾基の活性化類似体で容易に誘導体化される。
【０１２５】
以下の考察において、選択されたシアル酸誘導体の使用を参照することにより、本発明を例示する。考察の焦点は例示を明確にするためのものであること、および、説明される構造体および組成物は通常、糖の群、修飾された糖の群、活性化された修飾された糖の群、および修飾された糖の群のコンジュゲートの種類の全体に適用可能であることが、当業者には理解されよう。
【０１２６】
例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有する修飾された糖アミンを含むペプチドコンジュゲートを提供する。
【０１２７】
【化１７】
2007513189.tif 000029
式中、Ｇはグリコシル部分であり、Ｌは、結合またはリンカーであり、Ｒ１は修飾基である。例示的な結合は、グリコシル部分のＮＨ２と、修飾基上の相補的に反応する基との間で形成されるものである。したがって、例示的な結合には、それだけには限らないが、ＮＨＲ１、ＯＲ１、ＳＲ１などが含まれる。例えば、Ｒ１がカルボン酸部分を含むとき、この部分は、活性化され、グリコシル残基上のＮＨ２部分と結合して、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１の構造を有する結合を生じることができる。同様に、ＯＨ基およびＳＨ基は、それぞれ、対応するエーテル誘導体またはチオエーテル誘導体に変換され得る。
【０１２８】
例示的なリンカーとしては、アルキル部分およびヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーには、結合基、例えば、アシルベースの結合基、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などが含まれる。結合基は、本発明の化学種の成分間で、例えば、グリコシル部分とリンカー（Ｌ）、またはリンカーと修飾基（Ｒ１）との間で形成される結合である。その他の結合基は、エーテル、チオエーテル、およびアミンである。例えば、一実施形態では、リンカーは、グリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応によって対応するアミドに変換され、グリシンのアミンは、修飾基の活性化されたカルボン酸またはカルボナートとの反応によって対応するアミドまたはウレタンに変換される。
【０１２９】
別の例示的なリンカーは、ＰＥＧ部分、またはアミノ酸残基で官能化されたＰＥＧ部分である。ＰＥＧは、一方のＰＥＧ末端でアミノ酸残基を介してグリコシル基に結合し、もう一方のＰＥＧ末端を介してＲ１に結合している。あるいは、アミノ酸残基がＲ１に結合し、アミノ酸に結合していないＰＥＧ末端がグリコシル基に結合している。
【０１３０】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ１の例示的な化学種は、式−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１を有する。式中、添字ｓおよびｔは、それぞれ独立に０または１である。添字ａ、ｂ、およびｄは、それぞれ独立に０〜２０の整数であり、ｃは、１〜２５００の整数である。その他の類似のリンカーは、例えば、−Ｓ、−Ｏ、および−ＣＨ２で−ＮＨ部分が置換されている化学種をベースとしている。
【０１３１】
より具体的には、本発明は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ１が、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、およびＮＨＲ１である化合物を含むペプチドコンジュゲートを提供する。これらの式において、添字ａ、ｂ、およびｄは、０〜２０、好ましくは１〜５の整数からそれぞれ独立に選択される。添字ｃは、１〜２５００の整数である。
【０１３２】
例示的な実施形態では、Ｇはシアル酸であり、本発明の選択された化合物は、以下の式を有する。
【０１３３】
【化１８】
2007513189.tif 000030
【０１３４】
当業者には理解されるように、上記の例示的な化合物中のシアル酸部分は、それだけには限らないが、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、それらのＮ−アセチル誘導体などを含めて、他の任意のアミノ糖で置換することができる。
【０１３５】
別の例示的な実施形態では、糖の第１級ヒドロキシル部分が修飾基で官能化されている。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルを対応するアミンに変換し官能化させて、本発明の化合物を得ることができる。この実施形態の化学式には以下のものが含まれる。
【０１３６】
【化１９】
2007513189.tif 000031
【０１３７】
さらなる例示的な実施形態では、本発明は、６−ヒドロキシル位置が対応するアミン部分に変換されている修飾された糖を含む、前述したものなどのリンカー−修飾基カセットを有するペプチドコンジュゲートを提供する。これらの修飾された糖のコアとして使用できる例示的なサッカリル基には、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが含まれる。この実施形態の代表的な修飾された糖は、以下の式を有する。
【０１３８】
【化２０】
2007513189.tif 000032
式中、Ｒ３〜Ｒ５、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。Ｒ６は、前述したＯＲ１、ＮＨＲ１、またはＮＨ−Ｌ−Ｒ１である。
【０１３９】
本発明の選択されたコンジュゲートは、マンノース、ガラクトース、もしくはグルコース、または、マンノース、ガラクトース、もしくはグルコースの空間的配置を有する化学種をベースとしている。これらのコンジュゲートの一般式は以下のとおりである。
【０１４０】
【化２１】
2007513189.tif 000033
【０１４１】
別の例示的な実施形態では、本発明は、対応するヌクレオチド糖として活性化される、前述の化合物を提供する。修飾された形態で本発明において使用される例示的な糖ヌクレオチドには、１リン酸ヌクレオチド、２リン酸ヌクレオチド、もしくは３リン酸ヌクレオチド、またはその類似体が含まれる。好ましい実施形態では、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。例示的な実施形態では、リン酸ヌクレオチドは、Ｃ−１に結合している。
【０１４２】
したがって、グリコシル部分がシアル酸である例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有する化合物を用いて形成されるペプチドコンジュゲートを提供する。
【０１４３】
【化２２】
2007513189.tif 000034
式中、Ｌ−Ｒ１は、前述のとおりであり、Ｌ１−Ｒ１は、修飾基に結合したリンカーを表す。Ｌと同様に、Ｌ１で示される例示的なリンカー種には、結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分が含まれる。これらの実施形態の例示的な修飾された糖ヌクレオチド化合物を、図１および図２に示す。
【０１４４】
別の例示的な実施形態では、本発明は、本発明の修飾された糖と基質、例えば、ペプチド、脂質、アグリコンなどとの間で、より具体的には、修飾された糖とグリコペプチドまたは糖脂質のグリコシル残基との間で形成されるコンジュゲートを提供する。この実施形態では、修飾された糖の糖部分は、基質と修飾基の間に介在するグリコシル結合基となる。例示的なグリコシル結合基は、結合基を形成している１つまたは複数のグリコシル部分が、化学物質（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素的プロセス（例えば、オキシダーゼ）によって分解されていない、完全なグリコシル結合基である。本発明の選択されたコンジュゲートは、アミノ糖、例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミン部分に結合している修飾基を含む。このモチーフの例示的な修飾基−完全なグリコシル結合基カセットは、以下の式を有するものなどシアル酸の構造をベースとしている。
【０１４５】
【化２３】
2007513189.tif 000035
上式において、Ｒ１、Ｌ１、およびＬ２は、前述したとおりのものである。
【０１４６】
さらに別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは、基質と、サッカリル部分の６位炭素でリンカーを介して修飾基が結合しているサッカリル部分の１位との間で形成されている。したがって、この実施形態の例示的なコンジュゲートは以下の式を有する。
【０１４７】
【化２４】
2007513189.tif 000036
式中、各基は、前述したとおりのものである。前述の修飾されたサッカリル部分は、２、３、４、または５位の炭素原子においても基質に結合され得ることが、当業者には理解されよう。
【０１４８】
この実施形態の例示的な化合物には、以下の式を有する化合物が含まれる。
【０１４９】
【化２５】
2007513189.tif 000037
式中、Ｒ基および添字は、前述したとおりのものである。
【０１５０】
本発明は、６位炭素においてＬ−Ｒ１で修飾された糖ヌクレオチドも提供する。この実施形態の例示的な化学種には以下のものが含まれる。
【０１５１】
【化２６】
2007513189.tif 000038
式中、Ｒ基およびＬは、前述した部分を表す。添字「ｙ」は、０、１、または２である。
【０１５２】
本発明の別の例示的なヌクレオチド糖は、ＧＤＰマンノースの空間的配置を有する化学種をベースとしている。この実施形態の例示的な化学種は、以下の構造を有する。
【０１５３】
【化２７】
2007513189.tif 000039
【０１５４】
さらに別の例示的な実施形態では、本発明は、ＵＤＰガラクトースの空間的配置をベースとしたコンジュゲートを提供する。この実施形態の例示的な化合物は、以下の構造を有する。
【０１５５】
【化２８】
2007513189.tif 000040
【０１５６】
別の例示的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、グルコースの空間的配置をベースとしている。この実施形態の例示的な化学種は、以下の式を有する。
【０１５７】
【化２９】
2007513189.tif 000041
【０１５８】
修飾基Ｒ１は、それだけには限らないが、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療薬、診断薬などを含めて、いくつかの化学種のうちの任意のものでよい。例示的な修飾基の性質を以下により詳細に考察する。
【０１５９】
修飾基
水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に公知であり、本発明を実施するのに有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリアミノ酸、例えば、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリアクリル酸、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの化学種を包含する。本発明は、任意の水溶性ポリマーを用いて実施してよく、唯一の制約は、そのポリマーが、コンジュゲートの残りの部分が結合され得る箇所を含んでいなければならないことである。
【０１６０】
ポリマーを活性化するための方法も、ＷＯ９４／１７０３９号、米国特許第５３２４８４４号、ＷＯ９４／１８２４７号、ＷＯ９４／０４１９３号、米国特許第５２１９５６４号、米国特許第５１２２６１４号、ＷＯ９０／１３５４０号、米国特許第５２８１６９８号、さらにＷＯ９３／１５１８９号で確認することができ、また、活性化ポリマーとペプチド、例えば、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５号）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７号）、酸素運搬分子（米国特許第４４１２９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ他、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１〜４５頁（１９８５年））とを結合させる方法も各文献で確認できる。
【０１６１】
好ましい水溶性ポリマーは、ポリマーサンプル中のかなりの比率のポリマー分子が、ほぼ同じ分子量を有するものである。このようなポリマーは、「均一分散性」である。
【０１６２】
本発明は、ポリエチレングリコールコンジュゲートを参照することにより、さらに例示される。ＰＥＧの官能化および結合に関するいくつかの総説および研究論文が入手可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３頁（１９８５年）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０〜６５頁（１９８７年）；Ｗｏｎｇ他、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４頁（１９９２年）；Ｄｅｌｇａｄｏ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９〜３０４頁（１９９２年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５頁（１９９５年）；およびＢｈａｄｒａ他、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５〜２９頁（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子を調製し、反応性分子を用いてコンジュゲートを形成させるための手段は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５６７２６６２号は、直鎖状または分枝状のポリアルキレンオキシド、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリオレフィンアルコール、およびポリアクリロモルホリンから選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性で単離可能なコンジュゲートを開示している。
【０１６３】
米国特許第６３７６６０４号は、有機溶媒中でポリマーの末端ヒドロキシルとジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸とを反応させることによって、水溶性で非ペプチド性のポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリル炭酸エステルを調製するための方法を発表している。活性エステルは、タンパク質やペプチドなどの生物学的に活性な作用物質とのコンジュゲートを形成させるのに使用される。
【０１６４】
ＷＯ９９／４５９６４号は、生物学的に活性な作用物質と活性化された水溶性ポリマーを含むコンジュゲートを記述しており、その水溶性ポリマーは、少なくとも１つの末端が安定な結合によってそのポリマー主鎖に結合しているポリマー主鎖を含み、その少なくとも１つの末端は、近接した反応性基がその分枝部分に結合している分枝部分を含み、生物学的に活性な作用物質は、近接した反応性基のうちの少なくとも１つに結合している。他の分枝状ポリエチレングリコールが、ＷＯ９６／２１４６９号で記載されている。米国特許第５９３２４６２号では、反応性官能基を含む分枝状末端を含む分枝状ＰＥＧ分子を用いて形成されるコンジュゲートが記載されている。タンパク質やペプチドなどの生物学的に活性な化学種と反応して、ポリエチレングリコールと生物学的に活性な化学種とのコンジュゲートを形成させるために、遊離の反応性基が利用可能である。米国特許第５４４６０９０号では、二官能性のＰＥＧリンカー、およびＰＥＧリンカー末端のそれぞれにペプチドを有するコンジュゲートを形成させる際のその使用が記載されている。
【０１６５】
分解性のＰＥＧ結合を含むコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３およびＷＯ９９／１４２５９、ならびに米国特許第６３４８５５８号で記載されている。このような分解性の結合は、本発明で適用可能である。
【０１６６】
当業者に認知されている前述のポリマー活性化方法は、本発明において、本明細書で示す分枝状ポリマーを形成させるのに、また、それらの分枝状ポリマーを他の化学種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどに結合させるのにも有用である。
【０１６７】
本発明で有用である例示的なポリエチレングリコール分子には、それだけには限らないが、以下の式を有するものが含まれる。
【０１６８】
【化３０】
2007513189.tif 000042
式中、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、または−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である。添字「ｅ」は、１〜２５００の整数を表す。添字ｂ、ｄ、およびｑは、それぞれ独立に整数０〜２０を表す。記号ＺおよびＺ１は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＮＨ２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド、Ｓ−Ｒ９、活性化エステルのアルコール部分；−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ、または−（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ｓＣ（Ｙ１）Ｖを表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１、およびＵは、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１部分を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。添字ｐ、ｑ、ｓ、およびｖは、整数０〜２０からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールをそれぞれ独立に表す。
【０１６９】
他の例示的な実施形態では、ポリエチレングリコール分子は、以下のものから選択される。
【０１７０】
【化３１】
2007513189.tif 000043
【０１７１】
本発明のコンジュゲートを形成させるのに有用なポリエチレングリコールは、直鎖状または分枝状である。本発明で使用するのに適した分枝状ポリエチレングリコール分子には、それだけには限らないが、以下の式で示されるものが含まれる。
【０１７２】
【化３２】
2007513189.tif 000044
式中、Ｒ８およびＲ８’は、Ｒ８に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。Ａ１およびＡ２は、Ａ１に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。添字ｅ、ｆ、ｏ、およびｑは、前述したとおりのものである。ＺおよびＹは、前述したとおりのものである。Ｘ１およびＸ１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨからそれぞれ独立に選択されるメンバーである。
【０１７３】
他の例示的な実施形態では、分枝状ＰＥＧは、システイン、セリン、またはジリシンのコアをベースとしている。したがって、さらなる例示的な分枝状ＰＥＧには、以下のものが含まれる。
【０１７４】
【化３３】
2007513189.tif 000045
【０１７５】
さらに別の実施形態では、分枝状ＰＥＧ部分は、トリリシンペプチドをベースとしている。トリリシンは、１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所、ＰＥＧ化され得る。この実施形態の例示的な化学種は、以下の式を有する。
【０１７６】
【化３４】
2007513189.tif 000046
式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、それぞれ独立に選択された１〜２５００の整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、それぞれ独立に選択された１〜２０の整数である。
【０１７７】
本発明の例示的な実施形態では、ＰＥＧは、ｍ−ＰＥＧ（５ｋＤ、１０ｋＤ、または２０ｋＤ）である。例示的な分枝状ＰＥＧ種は、セリン−（ｍ−ＰＥＧ）２またはシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）２（式中、ｍ−ＰＥＧは２０ｋＤのｍ−ＰＥＧである）である。
【０１７８】
当業者には明らかであるように、本発明で有用な分枝状ポリマーには、前述した趣旨に基づく変形体が含まれる。例えば、上記に示したジリシン−ＰＥＧコンジュゲートは、３つの重合体サブユニットを含むことができ、第３のものは、上記の構造において未修飾として示されているαアミンに結合される。同様に、３つまたは４つの重合体サブユニットで官能化されたトリリシンの使用も、本発明の範囲内である。
【０１７９】
本発明の特定の実施形態は、以下のもの、
【０１８０】
【化３５】
2007513189.tif 000047
ならびに、以下のものなどこれらの化学種のカルボナートおよび活性エステルを含む。
【０１８１】
【化３６】
2007513189.tif 000048
【０１８２】
本明細書で説明する化合物を調製するのに有用な直鎖状ＰＥＧを活性化させるのに適した他の活性化基または脱離基には、それだけには限らないが、以下の化学種が含まれる。
【０１８３】
【化３７】
2007513189.tif 000049
【０１８４】
これらおよび他の化学種によって活性化されるＰＥＧ分子ならびに活性化ＰＥＧを作製する方法は、ＷＯ０４／０８３２５９号で説明されている。
【０１８５】
分枝状ポリマーのｍ−ＰＥＧアームのうちの１つまたは複数を、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０アルキルなどを有するＰＥＧ部分で置換できることが、当業者には理解されよう。さらに、上記の構造体は、α炭素原子と側鎖の官能基との間にアルキルリンカーを挿入することによって（または、炭素原子を除去することによって）、容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体および高級同族体、ならびに低級同族体は、本発明において有用な分枝状ＰＥＧのコアの範囲に含まれる。
【０１８６】
本発明書で説明する分枝状ＰＥＧ種は、以下のスキームで示すものなどの方法によって容易に調製される。
【０１８７】
【化３８】
2007513189.tif 000050
式中、ＸａはＯまたはＳであり、ｒは、１〜５の整数である。添字ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。
【０１８８】
すなわち、このスキームに従い、天然または非天然のアミノ酸を活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合ではトシラートと接触させ、側鎖のヘテロ原子Ｘａをアルキル化することによって１を形成させる。モノ官能化されたｍ−ＰＥＧアミノ酸を、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体とともにＮ−アシル化条件下におき、それによって、２の分枝状ｍ−ＰＥＧを構築する。当業者なら理解するように、トシラート脱離基は、任意の適切な脱離基、例えば、ハロゲン、メシラート、トリフラートなどに交換することができる。同様に、アミンをアシル化するのに利用する反応性カルボナートも、活性なエステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどに交換することができ、あるいは、酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミドやカルボニルジイミダゾールなどの脱水剤によってｉｎ  ｓｉｔｕで活性化することができる。
【０１８９】
例示的な実施形態では修飾基はＰＥＧ部分であるが、任意の修飾基、例えば、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療効果のある部分などを、適切な結合を通じてグリコシル部分に組み込むことができる。修飾された糖は、酵素的手段、化学的手段、またはそれらの組合せによって形成され、それにより、修飾された糖を生じる。例示的な実施形態では、これらの糖は、修飾部分の付加を可能にし、さらに、修飾された糖をＧ−ＣＳＦペプチドに結合させることができる酵素の基質として糖が機能することを可能にする任意の位置で活性アミンに置換されている。例示的な実施形態では、ガラクトサミンが修飾された糖であるとき、アミン部分は６位の炭素原子に結合している。
【０１９０】
水溶性ポリマーで修飾された化学種
糖部分が水溶性ポリマーで修飾されている、水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖種が、本発明において有用である。例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分を介して修飾されている糖基を有する。修飾された糖ヌクレオチド、例えば、糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体も、本発明の方法において有用である。例えば、（修飾基の付いていない）サッカリルアミンをペプチド（または他の化学種）に酵素的に結合させ、続いて、その遊離なサッカリルアミン部分を所望の修飾基に結合させることができる。あるいは、修飾された糖ヌクレオチドが、基質、例えば、ペプチド、グリコペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質などにあるサッカリル受容体に修飾された糖を転移させる酵素の基質として機能することもできる。
【０１９１】
糖コアがガラクトースまたはグルコースである一実施形態では、Ｒ５はＮＨＣ（Ｏ）Ｙである。
【０１９２】
例示的な実施形態では、修飾された糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分をベースとしている。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて以下に示すように、６−アミノ糖部分は、標準の方法によって容易に調製される。
【０１９３】
【化３９】
2007513189.tif 000051
【０１９４】
上記のスキームにおいて、添字ｎは、１〜２５００、好ましくは１０〜１５００、より好ましくは１０〜１２００の整数を表す。記号「Ａ」は、活性化基、例えば、ハロ、活性化エステルの成分（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、カルボナートの成分（例えば、ｐ−ニトロフェニルカルボナート）などを表す。他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖は、この方法および類似した方法によって容易に調製されることが、当業者には理解されよう。
【０１９５】
他の例示的な実施形態では、アミド部分は、ウレタンや尿素などの基に置き換えられる。
【０１９６】
さらに別の実施形態では、Ｒ１は、分枝状ＰＥＧ、例えば、前述した化学種のうちの１つである。この実施形態の例示的な化合物には以下のものが含まれる。
【０１９７】
【化４０】
2007513189.tif 000052
式中、Ｘ４は、結合またはＯである。
【０１９８】
さらに、前述したように、本発明は、直鎖状または分枝状の水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖を用いて形成されるペプチドコンジュゲートを提供する。例えば、以下に示す式を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【０１９９】
【化４１】
2007513189.tif 000053
式中、Ｘ４は、Ｏまたは結合である。
【０２００】
同様に、本発明は、６位の炭素が修飾されている修飾された糖種のヌクレオチド糖を用いて形成されるペプチドコンジュゲートも提供する。
【０２０１】
【化４２】
2007513189.tif 000054
式中、Ｘ４は、結合またはＯである。
【０２０２】
本発明の組成物を含むペプチドおよびグリコペプチド、脂質および糖脂質のコンジュゲートも提供される。例えば、本発明は、以下の式を有するコンジュゲートを提供する。
【０２０３】
【化４３】
2007513189.tif 000055
【０２０４】
水不溶性ポリマー
別の実施形態では、前述のものと類似して、修飾された糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートは、１種または複数の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された方式で治療ペプチドを送達するのに用いられるビヒクルとしてコンジュゲートを使用することによって例示される。高分子薬物の送達システムは、当技術分野で公知である。例えば、Ｄｕｎｎ他編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１年を参照のこと。実質上どの公知の薬物送達システムも本発明のコンジュゲートに適用可能であることが、当業者には理解されよう。
【０２０５】
代表的な水不溶性ポリマーとしては、それだけには限らないが、ポリホスファジン、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタラート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリメチルメタクリラート、ポリエチルメタクリラート、ポリブチルメタクリラート、ポリイソブチルメタクリラート、ポリヘキシルメタクリラート、ポリイソデシルメタクリラート、ポリラウリルメタクリラート、ポリフェニルメタクリラート、ポリメチルアクリラート、ポリイソプロピルアクリラート、ポリイソブチルアクリラート、ポリ（オクタデシルアクリラート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタラート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、およびポリビニルフェノール、ならびにそれらの共重合体が挙げられる。
【０２０６】
本発明のコンジュゲートにおいて有用な合成により修飾された天然ポリマーとしては、それだけには限らないが、アルキルセルロース、ヒドロキシルアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。合成により修飾された天然ポリマーの広範なクラスのうちの特に好ましいメンバーとしては、それだけには限らないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ならびにアクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、およびアルギン酸のポリマーが挙げられる。
【０２０７】
本明細書で説明するこれらおよび他のポリマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ワレントン（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ）、ペンシルベニア州）、Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州）、Ｆｌｕｋａ社（ロンコンコマ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ）、ニューヨーク州）、およびＢｉｏＲａｄ社（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）などの商業的供給業者から容易に入手することができ、あるいは、標準の技術を用いてこれらの供給業者から得たモノマーから合成することができる。
【０２０８】
本発明のコンジュゲートにおいて有用な代表的な生分解性のポリマーとしては、それだけには限らないが、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびそれらの共重合体、ポリエチレンテレフタラート、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらの混合物および共重合体が挙げられる。コラーゲン、プルロニックなどを含むものなど、ゲルを形成する組成物が特に有用である。
【０２０９】
本発明において有用なポリマーには、その構造の少なくとも１部分の内部に生体吸収性分子を有する水不溶性物質を含む「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。このようなポリマーの例は、水不溶性の共重合体を含むものであり、ポリマー鎖ごとに生体吸収性領域、親水性領域、および複数の架橋性官能基を有する。
【０２１０】
本発明の目的において、「水不溶性の物質」とは、水または水を含有する環境に実質上不溶性である物質を含む。したがって、共重合体の一部の領域または部分は親水性でも、さらには水溶性でもよいが、ポリマー分子は全体として、実質的な量としては水に溶解しない。
【０２１１】
本発明の目的において、「生体吸収性分子」という用語は、代謝もしくは分解され、通常の排出経路を通じて身体に再吸収および／または排除されることができる領域を含む。このような代謝産物または分解産物は、身体に対して実質上非毒性であることが好ましい。
【０２１２】
共重合体組成物が全体として水溶性に変えられない限りは、生体吸収性領域は疎水性でも親水性でもよい。したがって、生体吸収性領域は、ポリマーが全体として水不溶性のままであるという優先条件に基づいて選択される。したがって、相対的諸特性、すなわち、含まれる官能基の種類、ならびに、生体吸収性領域および親水性領域の相対的比率は、有用な生体吸収性組成物が水不溶性のままであることを確実にするように選択される。
【０２１３】
例示的な再吸収性ポリマーには、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリオキシアルキレンの合成により作製された再吸収性のブロック共重合体が含まれる（Ｃｏｈｎ他、米国特許第４８２６９４５号を参照のこと）。これらの共重合体は、架橋されておらず水溶性であり、したがって、身体は分解されたブロック共重合体組成物を排出することができる。Ｙｏｕｎｅｓ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６頁（１９８７年）、およびＣｏｈｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３〜１００９頁（１９８８年）を参照のこと。
【０２１４】
現在のところ好ましい生体吸収性ポリマーは、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリラクトン、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリアミノ酸、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカルボナート、ポリホスファジン、ポリリン酸エステル、ポリチオエステル、多糖、およびそれらの混合物から選択される１種または複数の成分を含む。さらにより好ましくは、生体吸収性ポリマーは、ポリヒドロキシ酸成分を含む。ポリヒドロキシ酸のうちでは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにそれらの共重合体および混合物が好ましい。
【０２１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで吸収される（「生体吸収される」）断片を形成することに加えて、本発明の方法で使用するのに好ましいポリマー被膜も、排出可能および／または代謝可能な断片を形成することができる。
【０２１６】
高次の共重合体も本発明で使用することができる。例えば、１９８４年３月２０日発行のＣａｓｅｙ他、米国特許第４４３８２５３号は、ポリグリコール酸およびヒドロキシル末端のポリアルキレングリコールのエステル転移反応から作製されるトリブロック共重合体を開示している。このような組成物は、再吸収性モノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。このような組成物の柔軟性は、ｔｅｔｒａ−ｐ−トリルオルトカルボナートなどの芳香族オルトカルボナートを共重合体構造に組み込むことによって調節される。
【０２１７】
乳酸および／またはグリコール酸をベースとする他のポリマーも利用することができる。例えば、１９９３年４月１３日発行のＳｐｉｎｕ、米国特許第５２０２４１３号は、オリゴマージオールまたはジアミン残基上にラクチドおよび／またはグリコリドを開環重合させ、続いて、ジイソシアナート、ジアシルクロリド、ジクロロシランなどの二官能化合物を用いて鎖伸長させることにより作製される、ポリラクチドおよび／またはポリグリコリドの連続して配置されたブロックを有する生分解性マルチブロック共重合体を開示している。
【０２１８】
本発明において有用な被膜の生体吸収性領域は、加水分解および／または酵素によって切断可能となるように設計することができる。本発明の目的において、「加水分解により切断可能」とは、水または水を含有する環境における加水分解に対して、共重合体、特に生体吸収性領域が影響を受けやすいことを意味する。同様に、本明細書では「酵素により切断可能」とは、内因性または外因性の酵素による切断に対して、共重合体、特に生体吸収性領域が影響を受けやすいことを意味する。
【０２１９】
体内に入ると、親水性領域は、処理されて排出可能および／または代謝可能な断片になり得る。したがって、親水性領域としては、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、多価アルコール、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコール、ポリアルキルオキサゾリン、多糖、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ならびにそれらの共重合体および混合物を挙げることができる。さらに、親水性領域は、例えば、ポリアルキレンオキシドでもよい。このようなポリアルキレンオキシドとしては、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ならびにそれらの混合物および共重合体を挙げることができる。
【０２２０】
ヒドロゲルの成分であるポリマーも、本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収することができるポリマー物質である。ヒドロゲル形成化合物の例としては、それだけには限らないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラゲナンおよび他の多糖、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体などが挙げられる。安定で、生分解性かつ生体吸収性のヒドロゲルを作製することができる。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１種または複数を示すサブユニットを含んでもよい。
【０２２１】
架橋によって完全性を調節することができる生体適合性ヒドロゲル組成物は公知であり、現在のところ、本発明の方法で使用するのに好ましい。例えば、Ｈｕｂｂｅｌｌ他、１９９５年４月２５日発行の米国特許第５４１００１６号および１９９６年６月２５日発行の第５５２９９１４号は、水溶性の系を開示しており、これらは、水溶性の中央のブロック部分が加水分解に対して不安定な２つの伸長部分の間にはさまれている架橋ブロック共重合体である。さらに、このような共重合体は、光重合性のアクリル酸官能基でエンドキャップされている。架橋されると、これらの系はヒドロゲルになる。このような共重合体の水溶性の中央ブロックはポリエチレングリコールを含んでよく、一方、加水分解に対して不安定な伸長部分は、ポリグリコール酸やポリ乳酸などのポリ（α―ヒドロキシ酸）でよい。Ｓａｗｈｎｅｙ他、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６：５８１〜５８７頁（１９９３年）を参照のこと。
【０２２２】
別の好ましい実施形態では、ゲルは、熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン尿素ヒドロゲル、およびそれらの組合せ物などの成分を含む熱可逆性ゲルが、現在のところ好ましい。
【０２２３】
さらに別の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リポソーム成分を含む。リポソームは、例えば１９８５年６月１１日発行のＥｐｐｓｔｅｉｎ他、米国特許第４５２２８１１号で記載されているような当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、無機溶媒中で適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を溶解させ、次に溶媒を蒸発させて容器の表面に乾燥した脂質の薄い被膜を残すことによって、調製することができる。次に、活性な化合物または薬剤として許容されるその塩の水溶液が、その容器中に導入される。次に、手動でその容器を回転させて、容器の側面から脂質物質を遊離させ、脂質凝集体を分散させ、それにより、リポソーム懸濁液を形成させる。
【０２２４】
上記に挙げた微粒子および微粒子の調製方法が、例として提供されるが、それらは、本発明で有用な微粒子の範囲を限定するためのものではない。様々な方法によって作製された一連の微粒子が本発明において有用であることは、当業者には明らかであろう。
【０２２５】
水溶性ポリマーに関して前述した構造の形態は、直鎖状と分枝状のどちらも、一般に、水不溶性ポリマーにも同様に適用できる。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分岐コアは、２つの水不溶性ポリマー部分で官能化することができる。これらの化学種を作製するのに使用される方法は、一般に、水溶性ポリマーを作製するのに使用される方法に極めて類似している。
【０２２６】
治療用グリコペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期も、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのＰＥＧ部分を用いて向上させることができる。例えば、タンパク質をＰＥＧで化学修飾（ＰＥＧ化）すると、それらの分子サイズが大きくなり、表面および官能基の接近容易性が低減される。各接近容易性は、タンパク質に結合されるＰＥＧのサイズに依存する。この結果、血漿半減期およびタンパク質分解に対する安定性が改善され、免疫原性および肝臓への取込みが低減される（Ｃｈａｆｆｅｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３〜１６５１頁（１９９２年）、Ｐｙａｔａｋ他、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３〜１２７頁（１９８０年））。インターロイキン−２をＰＥＧ化するとｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍力が増大されることが報告されており（Ｋａｔｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７〜１４９１頁（１９８７年））、また、モノクローナル抗体Ａ７由来のＦ（ａｂ’）２をＰＥＧ化すると、その腫瘍局在性が改善された（Ｋｉｔａｍｕｒａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７〜１３９４頁（１９９０年））。したがって他の好ましい実施形態では、本発明の方法によってＰＥＧ部分で誘導体化されたペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、非誘導体化ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期と比べて延長されている。
【０２２７】
ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大は、その量の増大率の範囲として最も良く表現される。増大率の範囲の下限は、約４０％、約６０％、約８０％、略１００％略１００％、約１５０％、または約２００％である。この範囲の上限は、約６０％、約８０％、略１００％略１００％、約１５０％、または、約２５０％より高い。
【０２２８】
例示的な実施形態では、本発明は、ＰＥＧ化されたＦＳＨ（図１、図２、および図５）を提供する。
【０２２９】
方法
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法も提供する。したがって、他の態様では、本発明は、選択された部分とＧ−ＣＳＦペプチドの間の共有結合性コンジュゲートを形成させる方法を提供する。さらに、本発明は、身体の特定の組織または領域に本発明のコンジュゲートを標的化させるための方法も提供する。
【０２３０】
例示的な実施形態では、コンジュゲートは、ＰＥＧ部分（またはＰＥＧ部分を含む酵素的に転移可能なグリコシル部分）とグリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドとの間で形成される。ＰＥＧは、Ｇ−ＣＳＦペプチドとＰＥＧ部分の双方の間に介在し、かつそれらに共有結合している完全なグリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに結合しており、あるいは、ＰＥＧ−非グリコシルリンカー（例えば、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル）構築体に結合している。この方法は、修飾された糖と、その修飾された糖が基質であるグリコシルトランスフェラーゼとを含有する混合物にＧ−ＣＳＦペプチドを接触させることを含む。反応は、修飾された糖とＧ−ＣＳＦペプチドの間に共有結合を形成させるのに十分な条件のもとで実施する。修飾された糖の糖部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖、活性化糖、およびヌクレオチドでもなく活性化もされていない糖から選択される。
【０２３１】
受容体ペプチド（グリコシル化もしくは非グリコシル化）は、通常、新規に合成され、あるいは、原核細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）中、または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌、もしくは植物の細胞など真核細胞中で組換えによって発現される。Ｇ−ＣＳＦペプチドは、完全長タンパク質でも断片でもよい。さらに、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、野生型ペプチドでも変異ペプチドでもよい。例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、１つまたは複数のＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化部位をペプチド配列に加える突然変異を含んでいる。
【０２３２】
例示的な実施形態では、Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸは以下の方法でＯ−グリコシル化され、水溶性ポリマーで官能化される。ペプチドは、利用可能なアミノ酸グリコシル化部位を用いて作製され、または、グリコシル化される場合は、アミノ酸が露出されるようにそのグリコシル部分がトリミングされる。例えば、セリンまたはトレオニンをα−１Ｎ−アセチルアミノガラクトシル化（ＧａｌＮＡｃ）し、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１を用いて、シアル酸−修飾基カセットによってＮＡｃ−ガラクトシル化ペプチドにシアル酸付加する。あるいは、ＮＡｃ−ガラクトシル化ペプチドをＣｏｒｅ−１−ＧａｌＴ−１によってガラクトシル化し、ＳＴ３ＧａｌＴ１を用いてシアル酸−修飾基カセットによってその生成物にシアル酸付加する。この方法による例示的なコンジュゲートは、以下の結合、すなわち、Ｔｈｒ−α−１−ＧａｌＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−α２，３−Ｓｉａ＊（Ｓｉａ＊はシアル酸−修飾基カセットである）を有する。
【０２３３】
複数の酵素およびサッカリル供与体を用いる、前述したもののような本発明の方法では、個々のグリコシル化工程は、別々に実施しても、「ワンポット」反応系で組み合わせてもよい。例えば、上述した３種の酵素を用いる反応では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＴ、ＳｉａＴ、およびそれらの供与体は、１つの容器中で混合してよい。あるいは、ＧａｌＮＡｃ反応を単独で実施し、ＧａｌＴとＳｉａＴの双方と適切なサッカリル供与体を１つの工程として加えてもよい。反応を行う他の態様は、各酵素および適切な供与体を順次添加し、「ワンポット」の形式で反応を実施するものである。前述した各方法を組み合わせると、本発明の化合物を調製するのに有用である。
【０２３４】
本発明のコンジュゲート、具体的にはＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＮ−結合型グリカンでは、Ｓｉａ−修飾基カセットは、α−２，６結合またはα−２，３結合でＧａｌに結合することができる。
【０２３５】
本発明の方法は、組換えによって作製される不完全なグリコシル化ペプチドの修飾法も提供する。本発明の方法で修飾された糖を使用すると、Ｇ−ＣＳＦペプチドをさらにグリコシル化し、同時に、例えば、ＰＥＧ部分や治療薬などで誘導体化することができる。修飾された糖の糖部分は、完全なグリコシル化ペプチドの受容体に適切に結合すると考えられる残基でも、所望の特性を有する別の糖部分でもよい。
【０２３６】
本発明の方法によって修飾されるＧ−ＣＳＦペプチドは、合成ペプチドでも野生型ペプチドでもよく、あるいは、それらは、部位特異的変異誘発など当技術分野で公知の方法によって作製される変異ペプチドでもよい。ペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型である。例示的なＮ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への修飾された糖の付加である。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、糖部分がアスパラギン側鎖に酵素的に付加するための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することにより、グリコシル化可能な部位が作り出される。Ｏ−結合型グリコシル化とは、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、またはキシロース）がヒドロキシアミノ酸のヒドロキシ側鎖に付加することを意味する。ヒドロキシアミノ酸は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用してよいが、好ましくは、セリンまたはトレオニンである。
【０２３７】
例えば、一実施形態では、Ｇ−ＣＳＦを哺乳動物の系で発現させ、シアリダーゼ処理によって末端のシアル酸残基をトリミングし、続いて、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を用いてＰＥＧ化することにより、修飾する。
【０２３８】
別の例示的な実施形態では、哺乳動物細胞で発現させたＧ−ＣＳＦを、最初にシアリダーゼで処理して末端のシアル酸残基をトリミングし、続いて、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を用いてＰＥＧ化し、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を用いてシアル酸付加する。
【０２３９】
哺乳動物の系で発現されたＧ−ＣＳＦを、シアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基をトリミングし、次に、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化し、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を用いてＰＥＧ化することもできる。
【０２４０】
さらに別の例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦを最初にシアリダーゼでは処理せず、修飾基−シアル酸カセットおよびＳＴ３Ｇａｌ３などの酵素を用いたシアル酸転移反応によってＧｌｙｃｏＰＥＧ化する。
【０２４１】
別の例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦを昆虫細胞で発現させ、以下の手順で修飾する。すなわち、適切なＮ−アセチルグルコサミン供与体およびＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖのうちの１種または複数を用いて、最初にＮ−アセチルグルコサミンをＧ−ＣＳＦに付加し、次に、ＰＥＧ−ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてＧ−ＣＳＦをＰＥＧ化する。
【０２４２】
酵母で産生されるＧ−ＣＳＦもＧｌｙｃｏＰＥＧ化することができる。例えば、Ｇ−ＣＳＦをエンドグリカナーゼで最初に処理してグリコシル基をトリミングし、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化し、次に、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を用いてＰＥＧ化する。
【０２４３】
ペプチドまたは他の構造体へのグリコシル化部位の追加は、アミノ酸配列が１つまたは複数のグリコシル化部位を有するようにアミノ酸配列を改変することによって、好都合に実現される。−ＯＨ基を提示している１種または複数の化学種、好ましくはセリンまたはトレオニン残基をＧ−ＣＳＦペプチドの配列内部に組み込むことによっても追加を行うことができる（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。突然変異によって、またはＧ−ＣＳＦペプチドを完全に化学合成することによって追加を行うことができる。Ｇ−ＣＳＦペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、具体的には、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、予め選択した塩基の位置で、そのペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって改変される。ＤＮＡ突然変異は、好ましくは、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。
【０２４４】
例示的な実施形態では、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャフリングすることによって追加される。ＤＮＡシャフリングプロトコールを用いて、候補のペプチドをコードしているポリヌクレオチドを改変することができる。ＤＮＡシャフリングは、関連遺伝子のプールのランダム断片化と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応法と同様のプロセスによる断片の再構築によって実施される、組換えおよび突然変異を繰り返すプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）、および、米国特許第５６０５７９３号、第５８３７４５８号、第５８３０７２１号、第５８１１２３８号を参照のこと。
【０２４５】
本発明は、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加し（またはそれから除去し）、その後に、そのペプチドの選択されたグリコシル残基うちの少なくとも１つに修飾された糖を結合させる手段も提供する。この実施形態は、例えば、ペプチド上に存在していない、または所望の量が存在していない選択されたグリコシル残基に修飾された糖を結合することが望ましいときに、有用である。すなわち、修飾された糖をペプチドに結合させる前に、酵素的または化学的結合によって、選択されたグリコシル残基をＧ−ＣＳＦペプチドに結合させる。別の実施形態では、グリコペプチドから糖残基を除去することによって、修飾された糖を結合させる前にグリコペプチドのグリコシル化パターンを改変する。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照のこと。
【０２４６】
グリコペプチド上に存在する任意の糖部分の付加または除去は、化学的または酵素的に遂行する。化学的脱グリコシル化は、好ましくは、ポリペプチド変異体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価な化合物に曝露させることによってもたらされる。この処理により、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大半またはすべての糖が切断されるが、ペプチドは損なわれずに残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２頁（１９８７年）およびＥｄｇｅ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１頁（１９８１年）で記載されている。ポリペプチド変異体上の糖部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０頁（１９８７年）で記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成することができる。
【０２４７】
グリコシル部分の化学的付加は、当業者に認知されている任意の方法によって実施される。糖部分の酵素的付加は、好ましくは、本明細書で説明する方法の変法により、本発明で使用する修飾された糖の代わりに天然のグリコシル単位を用いて実施される。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５８７６９８０号、第６０３０８１５号、第５７２８５５４号、および第５９２２５７７号で開示されている。
【０２４８】
選択されたグリコシル残基の例示的な付加位置としては、それだけには限らないが、（ａ）Ｎ−およびＯ−グリコシル化のためのコンセンサス部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体である末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン、およびヒスチジン、（ｄ）遊離のカルボキシル基、（ｅ）システインのものなど遊離のスルフヒドリル基、（ｆ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなど遊離のヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、あるいは（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において有用である例示的な方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）で記載されている。
【０２４９】
方法
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法も提供する。さらに、本発明は、ある疾患になる危険にさらされている被験者またはその疾患を罹患している被験者に本発明のコンジュゲートを投与することによって、疾患状態を予防、治癒、または改善する方法も提供する。
【０２５０】
したがって、本発明は、選択された部分とＧ−ＣＳＦペプチドの間の共有結合性コンジュゲートを形成させる方法を提供する。
【０２５１】
例示的な実施形態では、コンジュゲートは、水溶性ポリマー、治療効果のある部分、標的性部分、または生体分子とグリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドまたは非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドとの間で形成される。ポリマー、すなわち治療効果のある部分または生体分子は、ペプチドと修飾基（例えば、水溶性ポリマー）の間に介在しそれらの双方に共有結合しているグリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに結合している。この方法は、修飾された糖と、酵素、例えば、その修飾された糖を基質（例えば、ペプチド、アグリコン、糖脂質）に結合させるグリコシルトランスフェラーゼとを含有する混合物にＧ−ＣＳＦペプチドを接触させることを含む。反応は、修飾された糖とＧ−ＣＳＦペプチドの間に共有結合を形成させるのに適した条件のもとで実施する。
【０２５２】
受容体Ｇ−ＣＳＦペプチドは、通常、新規に合成され、あるいは、原核細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）中、または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌、もしくは植物細胞などの真核細胞中で組換えによって発現される。Ｇ−ＣＳＦペプチドは、完全長タンパク質でも断片でもよい。さらに、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、野生型ペプチドでも変異ペプチドでもよい。例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、１つまたは複数のＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化部位をペプチド配列に加える突然変異を含んでいる。
【０２５３】
本発明の方法は、組換えによって作製される不完全なグリコシル化ペプチドの修飾法も提供する。多くの組換えによって作製される糖タンパク質は、不完全にグリコシル化されており、望ましくない特性、例えば、免疫原性、ＲＥＳによる認識などを有する可能性がある糖残基を露出している。本発明の方法で修飾された糖を使用すると、ペプチドをさらにグリコシル化し、同時に、例えば、水溶性ポリマーや治療薬などで誘導体化することができる。修飾された糖の糖部分は、完全なグリコシル化ペプチドの受容体に適切に結合すると考えられる残基でも、所望の特性を有する別の糖部分でもよい。
【０２５４】
本発明において有用なペプチドを修飾する例示的な方法は、ＷＯ０４／０９９２３１、ＷＯ０３／０３１４６４、およびそれらの中で示されている参考文献で説明されている。
【０２５５】
例示的な実施形態では、本発明は、以下の部分を含むＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを作製する方法を提供する。
【０２５６】
【化４４】
2007513189.tif 000056
式中、Ｄは、−ＯＨまたはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを示す。Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分である。記号Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるリンカーを表す。通常、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。本発明の方法は、（ａ）基質のＧ−ＣＳＦペプチドを、ＰＥＧ−シアル酸供与体と、供与体に由来するＰＥＧ−シアル酸部分を基質Ｇ−ＣＳＦペプチドに転移させることができる酵素とに接触させる工程を含む。
【０２５７】
例示的なＰＥＧ−シアル酸供与体は、以下の式を有するものなどのヌクレオチド糖であり、
【０２５８】
【化４５】
2007513189.tif 000057
転移に適した条件のもとで、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基上にＰＥＧ−シアル酸を転移させる酵素である。
【０２５９】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを形成させる前に、基質Ｇ−ＣＳＦペプチドを宿主細胞で発現させる。例示的な宿主細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、植物細胞、細菌、または真菌である。
【０２６０】
本明細書で示す方法は、上記のセクションで説明した各Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートに適用可能である。
【０２６１】
本発明の方法によって修飾されるＧ−ＣＳＦペプチドは、合成ペプチドでも野生型ペプチドでもよく、あるいは、それらは、部位特異的変異誘発など当技術分野で公知の方法によって作製される変異ペプチドでもよい。ペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型である。例示的なＮ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への修飾された糖の付加である。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、糖部分がアスパラギン側鎖に酵素的に付加するための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することにより、グリコシル化可能な部位が作り出される。Ｏ−結合型グリコシル化とは、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、またはキシロース）がヒドロキシアミノ酸のヒドロキシ側鎖に付加することを意味する。ヒドロキシアミノ酸は、珍しいアミノ酸または非天然アミノ酸、例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用してよいが、好ましくは、セリンまたはトレオニンである。
【０２６２】
ペプチドまたは他の構造体へのグリコシル化部位の追加は、アミノ酸配列が１つまたは複数のグリコシル化部位を有するようにアミノ酸配列を改変することによって、好都合に実現される。−ＯＨ基を提示している１種または複数の化学種、好ましくはセリンまたはトレオニン残基をペプチドの配列内部に組み込むことによっても追加を行うことができる（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。突然変異によって、またはペプチドを完全に化学合成することによって追加を行うことができる。ペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、具体的には、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、予め選択した塩基の位置で、そのペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、改変される。ＤＮＡ突然変異は、好ましくは、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。
【０２６３】
例示的な実施形態では、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャフリングすることによって追加される。ＤＮＡシャフリングプロトコールを用いて、候補のペプチドをコードしているポリヌクレオチドを改変することができる。ＤＮＡシャフリングは、関連遺伝子のプールのランダム断片化と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応法と同様のプロセスによる断片の再構築によって実施される、組換えおよび突然変異を繰り返すプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）、および、米国特許第５６０５７９３号、第５８３７４５８号、第５８３０７２１号、第５８１１２３８号を参照のこと。
【０２６４】
グリコシル化部位を追加または除去する例示的な方法、および１つまたは複数のグリコシル構造を追加または除去する例示的な方法は、ＷＯ０４／０９９２３１号、ＷＯ０３／０３１４６４号、ならびに米国およびＰＣＴの関連出願で詳細に記載されている。
【０２６５】
本発明は、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基をＧ−ＣＳＦペプチドに付加し（またはそれから除去し）、その後に、そのペプチドの選択されたグリコシル残基うちの少なくとも１つに修飾された糖を結合させる手段も利用する。このような技術は、例えば、ペプチド上に存在していない、または所望の量が存在していない選択されたグリコシル残基に修飾された糖を結合することが望ましいときに、有用である。すなわち、修飾された糖をペプチドに結合させる前に、酵素的または化学的結合によって、選択されたグリコシル残基をＧ−ＣＳＦペプチドに結合させる。別の実施形態では、グリコペプチドから糖残基を除去することによって、修飾された糖を結合させる前にグリコペプチドのグリコシル化パターンを改変する。例えば、ＷＯ９８／３１８２６号を参照のこと。
【０２６６】
選択されたグリコシル残基の例示的な付加位置としては、それだけには限らないが、（ａ）Ｎ−結合型グリコシル化のためのコンセンサス部位、およびＯ−結合型グリコシル化のための部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体である末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン、およびヒスチジン、（ｄ）遊離のカルボキシル基、（ｅ）システインのものなど遊離のスルフヒドリル基、（ｆ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなど遊離のヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、あるいは（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において有用である例示的な方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０号、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）で記載されている。
【０２６７】
ＰＥＧ修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素によって、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドに結合される。１種または複数の、修飾された糖供与体、酵素、受容体ペプチドの濃度は、所望の程度の受容体修飾が達成されるまでグリコシル化が進行するように選択されることが好ましい。以下に論じる考察はシアリルトランスフェラーゼの場合で説明するが、通常、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。
【０２６８】
グリコシルトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴ糖構造体を合成するいくつかの方法が公知であり、通常、本発明に適用可能である。例示的な方法は、例えば、参照により本明細書に組み込むＷＯ９６／３２４９１号、Ｉｔｏ他、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３年）、米国特許第５３５２６７０号、第５３７４５４１号、第５５４５５５３号、ならびに本願の権利者が所有する米国特許第６３９９３３６号および第６４４０７０３号で記載されている。
【０２６９】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼの組合せ物を用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組合せ物を使用することができる。複数の酵素を使用する実施形態では、酵素および基質が、好ましくは最初の反応混合物中で混合され、あるいは、第２の酵素反応用の酵素および試薬が、最初の酵素反応が完了またはほぼ完了した後に反応媒体に添加される。１つの容器中で２種の酵素反応を順に実施することによって、中間種を単離する処置よりも全収率が改善される。さらに、余分な溶媒および副産物の洗浄および廃棄が軽減される。
【０２７０】
好ましい実施形態では、第１および第２の酵素はそれぞれグリコシルトランスフェラーゼである。他の好ましい実施形態では、１つの酵素はエンドグリコシダーゼである。追加の好ましい実施形態では、２つより多い酵素を使用して本発明の修飾された糖タンパク質を構築する。これらの酵素は、修飾された糖をペプチドに付加する前または後の任意の時点にＧ−ＣＳＦペプチド上の糖構造体を改変するのに使用される。
【０２７１】
別の実施形態では、この方法は、１つまたは複数のエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを利用する。グリコシダーゼは、通常、グリコシル結合を切断するのではなく形成させるように改変された変異体である。変異体グリカナーゼは、通常、活性部位の酸性アミノ酸残基をあるアミノ酸残基で置換されている。例えば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈであるとき、置換される活性部位残基は、通常、１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕ、またはそれらの組合せである。これらのアミノ酸は、通常、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置換される。
【０２７２】
変異体酵素は、通常、エンドグリカナーゼ加水分解工程の逆反応に類似した合成工程によって、反応を触媒する。これらの実施形態では、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴ糖構造体または単糖構造体）は脱離基を含み、反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基へのグリコシル供与体分子の付加とともに進行する。例えば、脱離基は、フルオリドなどのハロゲンでよい。別の実施形態では、脱離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらに別の実施形態では、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含んでよい。
【０２７３】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを作製するのに利用される各酵素は、触媒量で存在している。個々の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度、ならびに温度、時間、ｐＨ値などの反応条件に応じて変動する。予め選択された基質濃度および反応条件における所与の酵素の触媒量を決定するための手段は、当業者には周知である。
【０２７４】
上記の方法が実施される温度は、氷点をちょうど上回る温度から最も敏感な酵素が変性する温度までの範囲をとり得る。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、より好ましくは約２０℃〜約３７℃である。別の例示的な実施形態では、本発明の方法の１つまたは複数の構成要素が、好熱性酵素を用いて高温で実施される。
【０２７５】
受容体がグリコシル化されるのに十分な期間、反応混合物を維持し、それによって、所望のコンジュゲートを形成させる。多くの場合、コンジュゲートの一部を数時間後に検出することができ、回収可能な量が通常２４時間以内に得られる。反応速度は、選択された系に対して最適化されるいくつかの変動要因（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒体積）に依存していることが、当業者には理解される。
【０２７６】
本発明は、修飾ペプチドの工業規模の作製も提供する。本明細書では、工業規模では、通常、少なくとも１グラムの完成され精製されたコンジュゲートを作製する。
【０２７７】
以下の考察において、本発明は、グリコシル化ペプチドへの修飾されたシアル酸部分の結合によって例示される。例示的な修飾されたシアル酸は、ＰＥＧで標識される。ＰＥＧ修飾されたシアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に関する以下の考察の焦点は、例示を明確にするためのものであり、本発明がこれら２つのパートナーの結合に限定されることを意味するためのものではない。以下の考察は通常、シアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付加に適用可能であることが、当業者には理解される。さらに、以下の考察は、他のＰＥＧ部分、治療効果のある部分、および生体分子を含めて、ＰＥＧ以外の作用物質によるグリコシル単位の修飾にも同様に適用可能である。
【０２７８】
ＰＥＧ化またはＰＰＧ化された糖をペプチドまたはグリコペプチド上に選択的に導入するために、酵素的手法を使用することができる。この方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含む修飾された糖を利用し、また、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと併用される。所望の糖結合を作ると考えられるグリコシルトランスフェラーゼを選択し、修飾された糖を供与体基質として利用することによって、Ｇ−ＣＳＦペプチド主鎖、グリコペプチドの既存の糖残基、またはペプチドに付加された糖残基上に直接ＰＥＧまたはＰＰＧを導入することができる。
【０２７９】
シアリルトランスフェラーゼの受容体は、本発明の方法によって修飾しようとするＧ−ＣＳＦペプチド上に、天然の構造体として、または組換えにより、酵素的に、もしくは化学的にそこに配置されたものとして存在する。適切な受容体としては、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）、および当業者に公知の他の受容体が挙げられる（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４頁（１９７８年）を参照のこと）。
【０２８０】
一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼの受容体は、グリコペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ合成の際に修飾されるグリコペプチド上に存在する。特許請求の範囲の方法によって、グリコペプチドのグリコシル化パターンを前もって変えずに、これらのグリコペプチドにシアル酸付加することができる。あるいは、本発明の方法を使用して、適切な受容体を含まないペプチドにシアル酸付加をすることもできる。その際、当業者に公知の方法によって、最初にＧ−ＣＳＦペプチドを修飾して受容体を含むようにする。例示的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって、ＧａｌＮＡｃ残基を付加する。
【０２８１】
例示的な実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドに結合している適切な受容体、例えば、ＧｌｃＮＡｃにガラクトース残基を結合させることによって、ガラクトシル受容体を構築する。この方法は、修飾しようとするＧ−ＣＳＦペプチドを、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）と適切なガラクトシル供与体（例えばＵＤＰ−ガラクトース）とを含有する反応混合物とともにインキュベートすることを含む。反応は、ほぼ完了するまで進行させ、あるいは、予め設定した量のガラトース残基が付加された時点で終結させる。選択された糖受容体を構築する他の方法は、当業者には明らかであろう。
【０２８２】
さらに別の実施形態では、グリコペプチドが結合したオリゴ糖の全体または一部分を最初に「トリミング」し、シアリルトランスフェラーゼの受容体、または適切な受容体を得るために１つもしくは複数の適切な残基を付加させることができる部分を露出させる。グリコシルトランスフェラーゼやエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第５７１６８１２号を参照のこと）は、結合反応およびトリミング反応に有用である。
【０２８３】
以下の考察において、本発明の方法は、ＰＥＧ部分が結合している修飾された糖を用いて例示される。考察の焦点は、例示を明確にするためのものである。以下の考察は、修飾された糖が治療効果のある部分や生体分子などを有している実施形態にも同様に該当することが、当業者には理解されよう。
【０２８４】
修飾された糖を付加する前に糖残基が「トリミング」される本発明の例示的な実施形態では、高マンノースがトリミングされて、第１世代のバイアンテナ構造体になる。ＰＥＧ部分を有する修飾された糖が、「トリミング」によって露出された糖残基のうちの１つまたは複数に結合される。一実施例では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ部分に結合しているＧｌｃＮＡｃ部分を介して付加される。修飾されたＧｌｃＮＡｃは、バイアンテナ構造体の末端マンノース残基の１つまたは双方に結合される。あるいは、分枝状の化学種の末端の１つまたは双方に未修飾のＧｌｃＮＡｃを付加させることもできる。
【０２８５】
別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は、末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に結合している、ガラクトース残基を有する修飾された糖を介して、バイアンテナ構造体の末端マンノース残基の１つまたは双方に付加される。あるいは、１つまたは双方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に未修飾のＧａｌを付加させることもできる。
【０２８６】
さらに別の実施例では、修飾されたシアル酸を用いて、Ｇａｌ残基にＰＥＧ部分を付加させる。
【０２８７】
別の例示的な実施形態では、高マンノース構造体が「トリミング」されてマンノースを生じ、それからバイアンテナ構造が枝分かれする。一実施例では、ＰＥＧ部分は、ポリマーで修飾されたＧｌｃＮＡｃを介して付加される。あるいは、未修飾のＧｌｃＮＡが、マンノース、次いでＰＥＧ部分が結合したＧａｌに付加される。さらに別の実施形態では、未修飾のＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基が、順次、マンノース、次いでＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸部分に付加される。
【０２８８】
別の例示的な実施形態では、高マンノースが「トリミング」されて最初のマンノースが結合したＧｌｃＮＡｃを生じる。ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分を有するＧａｌ残基に結合している。あるいは、未修飾のＧａｌをＧｌｃＮＡｃに付加し、次いで、水溶性の糖で修飾したシアル酸を付加する。さらに別の実施例では、末端ＧｌｃＮＡｃをＧａｌと結合させ、続いて、ＰＥＧ部分を有する修飾されたフコースでＧｌｃＮＡｃをフコシル化する。
【０２８９】
高マンノースをトリミングして、ペプチドのＡｓｎに結合される最初のＧｌｃＮＡｃを得ることもできる。一実施例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーを有するＧｌｃＮＡｃに結合される。別の実施例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーを有するＧａｌで修飾される。さらに別の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃをＧａｌで修飾し、次いで、ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸をＧａｌに結合させる。
【０２９０】
他の例示的な実施形態は、それぞれ本明細書に参照により組み込む、本願の権利者が所有する米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号、第２００４００６３９１１号、第２００４０１３７５５７号、米国特許出願第１０／３６９９７９号、第１０／４１０９１３号、第１０／３６０７７０号、第１０／４１０９４５号、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号で説明されている。
【０２９１】
前述の実施例は、本明細書で説明する方法の権利の例示を提供する。本明細書で記述する方法によって、ほぼすべての所望の構造の糖残基を「トリミング」および構築することが可能である。修飾された糖は、前述したように糖部分の末端に付加させることもでき、あるいは、ペプチドコアと糖末端の間の介在物になることもできる。
【０２９２】
例示的な実施形態では、既存のシアル酸が、シアリダーゼによってＧ−ＣＳＦグリコペプチドから除去され、それによって、内在するガラクトシル残基のすべてまたは大半が露出される。あるいは、ペプチドまたはグリコペプチドを、ガラクトース残基、または末端がガラクトース単位であるオリゴ糖残基で標識する。ガラクトース残基の露出または付加に続いて、適切なシアリルトランスフェラーゼを用いて、修飾されたシアル酸を付加する。この手法をスキーム１に要約する。
【０２９３】
【化４６】
2007513189.tif 000058
【０２９４】
スキーム２に要約するさらに別の手法では、マスクされた反応性官能基がシアル酸上に存在している。マスクされた反応性基は、修飾されたシアル酸をＧ−ＣＳＦに付加するのに使用される条件によって影響されないことが好ましい。修飾されたシアル酸がＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合した後、マスク部分を除去し、Ｇ−ＣＳＦペプチドをＰＥＧなどの作用物質と結合させる。修飾された糖残基上のマスクされていない反応性基と反応することにより、作用物質は特異的にペプチドに結合される。
【０２９５】
【化４７】
2007513189.tif 000059
【０２９６】
本明細書で説明する任意の修飾された糖は、グリコペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に応じて、適切なグリコシルトランスフェラーゼとともに使用することができる（表１）。前述したように、ＰＥＧ化構造を導入するのに必要とされるグリコペプチドの末端糖は、発現する間に自然に導入されることがあり、あるいは、適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、またはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて発現後に作製することができる。
【０２９７】
【表１】
2007513189.tif 000060
【０２９８】
別の例示的な実施形態では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧを牛乳のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させ、それによって、修飾されたガラクトースを適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造体に転移させる。グリコペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳動物、昆虫、植物、または真菌などの発現系で起こり得るように、発現の間に生じることがあるが、必要に応じてシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼでグリコペプチドを処理することによって作製することもできる。
【０２９９】
別の例示的な実施形態では、ＧＮＴ１〜５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを利用して、ＰＥＧ化されたＧｌｃＮをグリコペプチド上の末端マンノース残基に転移させる。さらに別の例示的な実施形態では、Ｎ−結合型および／またはＯ−結合型グリカン構造体を酵素によってグリコペプチドから除去して、修飾された糖に続いて結合しているアミノ酸または末端グリコシル残基を露出させる。例えば、エンドグリカナーゼを用いてグリコペプチドのＮ−結合型構造体を除去して、グリコペプチド上のＧｌｃＮＡｃが結合したＡｓｎとして末端ＧｌｃＮＡｃを露出させる。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、露出されたＧｌｃＮＡｃ上にＰＥＧ−ガラクトース官能基を導入する。
【０３００】
代替の実施形態では、修飾された糖は、ペプチド主鎖に糖残基を転移させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼによって、Ｇ−ＣＳＦペプチド主鎖に直接付加される。この例示的な実施形態をスキーム３で説明する。本発明を実施するのに有用である例示的なグリコシルトランスフェラーゼには、それだけには限らないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ  Ｔ１〜１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが含まれる。この手法を使用することにより、任意の糖を欠くペプチド上に、あるいは、既存のグリコペプチド上に、修飾された糖を直接付加することが可能になる。いずれの場合も、修飾された糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって定められ、ペプチド主鎖上の特定の位置で起こり、化学的方法によるタンパク質ペプチド主鎖の修飾の最中に起こるようにランダムな方式では起こらない。ポリペプチド鎖中に適切なアミノ酸配列を人工的に作製することによって、グリコシルトランスフェラーゼ基質のペプチド配列を欠くタンパク質またはグリコペプチドに、一連の作用物質を導入することができる。
【０３０１】
【化４８】
2007513189.tif 000061
【０３０２】
前述した例示的な各実施形態では、修飾された糖をペプチドに結合した後に、１種または複数の追加の化学的または酵素的修飾工程を利用することができる。例示的な実施形態では、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を用いて、Ｇ−ＣＳＦペプチドに結合されている末端の修飾された糖にグリコシル単位（例えばフコース）を付加させる。別の実施例では、酵素反応を利用して、修飾された糖が結合することができなかった部位を「キャップ」する。あるいは、化学反応を利用して、結合された修飾された糖の構造を改変する。例えば、結合された修飾された糖を、その修飾された糖が結合しているペプチド成分との結合を安定化または不安定化させる作用物質と反応させる。別の実施例では、修飾された糖の成分を、ペプチドへの結合の後に脱保護する。修飾された糖がＧ−ＣＳＦペプチドに結合された後の段階で、本発明の方法において有用な一連の酵素的手順および化学的手順があることが、当業者には理解されよう。修飾された糖とペプチドのコンジュゲートのさらなる加工も本発明の範囲内である。
【０３０３】
酵素
アシル結合型コンジュゲートを形成する状況で前述した酵素の他に、他の酵素を利用する方法によって、コンジュゲートのグリコシル化パターンおよび出発基質（例えば、ペプチド、脂質）を加工し、トリミングし、さもなければ、修飾することができる。糖供与体を受容体に転移させる酵素を用いてペプチドおよび脂質を再構築する方法が、２００３年４月１７日公開のＤｅＦｒｅｅｓのＷＯ０３／０３１４６４Ａ２号で非常に詳細に考察されている。本発明の方法で有用な選択された酵素を簡単に要約して以下に示す。
【０３０４】
グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、グリコペプチド、脂質もしくは糖脂質、または、伸長中のオリゴ糖の非還元末端に、活性化された糖（供与体のＮＤＰ−糖またはＮＭＰ−糖）を段階的に付加させる触媒となる。Ｎ−結合型グリコペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質結合型オリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９によって、ひとまとめの転移とそれに続くコアのトリミングによって合成される。この場合、「コア」の糖の性質は、後続の付加物とはいくらか異なる。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当技術分野では公知である。
【０３０５】
本発明で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、修飾された糖を糖供与体として利用することができる限り、どれでもよい。このような酵素の例には、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼなどのルロワール経路のグリコシルトランスフェラーゼが含まれる。
【０３０６】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を使用する酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化し、または、任意の供給源から単離することができる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼが公知であり、それらのポリヌクレオチド配列が知られている。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列をそれから推測可能なグリコシルトランスフェラーゼをコードしているヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ、およびその他のものを含めて、公的に入手可能な様々なデータベースで確認することができる。
【０３０７】
本発明の方法で使用できるグリコシルトランスフェラーゼとしては、それだけには限らないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられる。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては、真核生物、ならびに原核生物から得られるものが挙げられる。
【０３０８】
グリコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡは、化学合成によって、適切な細胞もしくは細胞系統培養物に由来するｍＲＮＡの逆転写物のスクリーニングによって、適切な細胞に由来するゲノムライブラリーのスクリーニングによって、または、これらの手順の組合せによって、得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施することができる。プローブは、公知の手順に従って、蛍光基、放射性原子、または化学発光基などの検出可能な基で標識し、従来のハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。代替方法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）手順により、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列を得ることができる。Ｍｕｌｌｉｓ他、米国特許第４６８３１９５号、およびＭｕｌｌｉｓ他、米国特許第４６８３２０２号を参照のこと。
【０３０９】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを含むベクターで形質転換させた宿主細胞中で、グリコシルトランスフェラーゼを合成することができる。ベクターを用いて、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを増幅させ、かつ／または、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを発現させる。発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡ配列が、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現をもたらすことができる適切な制御配列に作動可能に連結している、複製可能なＤＮＡ構築体である。このような制御配列の必要性は、選択される宿主および選択される形質転換方法によって変わると考えられる。通常、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされるのは、複製起点によって通常与えられる、宿主中で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子のみである。
【０３１０】
例示的な実施形態では、本発明は、原核生物の酵素を利用する。このようなグリコシルトランスフェラーゼとしては、多くのグラム陰性細菌によって産生される、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が挙げられる（Ｐｒｅｓｔｏｎ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２３（３）：１３９〜１８０頁（１９９６年））。このような酵素には、それだけには限らないが、大腸菌やネズミチフス菌などの種のｒｆａオペロンのタンパク質が含まれ、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌）；ＥＭＢＬアクセッション番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２５７４０（大腸菌）、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２７１２９（大腸菌）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌））、ならびにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｕ０００３９（大腸菌）が挙げられる。アミノ酸配列が公知である他のグリコシルトランスフェラーゼとしては、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌、ネズミチフス菌、腸内サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍ）などの生物で特徴付けられているｒｆａＢや緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｒｈ１オペロンなどのオペロンによってコードされているものが挙げられる。
【０３１１】
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１、４−Ｄ−グルコース、ならびに、粘膜病原菌の淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬＯＳ中で同定されたＰｋ血液型の３糖配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６〜２４３頁（１９９４年））を含む構造体を作るのに関与しているグリコシルトランスフェラーゼも本発明で使用するのに適している。これらの構造体の生合成に関与しているグリコシルトランスフェラーゼをコードしている、髄膜炎菌および淋菌由来の遺伝子は、髄膜炎菌の免疫型Ｌ３およびＬ１（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９〜７４０頁（１９９５年））ならびに淋菌変異体Ｆ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１〜２１９０頁（１９９４年））から同定されている。髄膜炎菌では、３種の遺伝子、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢ、およびｌｇＥからなる部位が、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖中の糖の最後の３つを付加するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしている（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６〜７３頁（１９９６年））。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が実証され、提唱されているそれらのグリコシルトランスフェラーゼ機能に関して初めて直接的な証拠が提供された（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１〜２７６頁（１９９６年））。淋菌では、２種の追加の遺伝子、すなわち、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃをラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造体の末端ガラクトースの３位に付加するｌｇｔＤと、切り縮められたＬＯＳのラクトース成分に末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加し、それによって、Ｐｋ血液型の抗原構造を作り出すｌｇｔＣがある（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４年）、前掲）。髄膜炎菌では、分離した免疫型Ｌ１も、Ｐｋ血液型抗原を発現し、また、ｌｇｔＣ遺伝子を有することが示されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ他、（１９９５年）、前掲）。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）のグリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子は、米国特許第５５４５５５３号（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）でも記載されている。ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に由来するα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子も、特徴付けられている（Ｍａｒｔｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９〜２１３５６頁（１９９７年））。また、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシルトランスフェラーゼも本発明において有用である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０３１２】
フコシルトランスフェラーゼ
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者には公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容体糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素が挙げられる。ヌクレオチドを含まない糖を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼも、本発明において有用である。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、受容体糖は、例えば、オリゴ糖グリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ基のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適したフコシルトランスフェラーゼとしては、ヒトの乳から最初に特徴を明らかにされたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１〜１１頁（１９８９年）；Ｐｒｉｅｅｌｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６〜１０４６３頁（１９８１年）、およびＮｕｎｅｚ他、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６〜２０９５頁（１９８１年）を参照のこと）、ならびにヒト血清中に存在するＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）が挙げられる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、すなわちシアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも特徴を明らかにされている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換型も特徴を明らかにされている（Ｄｕｍａｓ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：４２５〜４２８頁（１９９１年）、およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ他、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８〜１３０３頁（１９９０年）を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９〜１７６頁（１９９０年）または米国特許第５３７４６５５号で記載されている方法によって、酵素的フコシル化を実施することができる。フコシルトランスフェラーゼを得るのに使用される細胞は、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系も含むと考えられる。
【０３１４】
ガラクトシルトランスフェラーゼ
実施形態の別の群では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３年）およびＹａｍａｍｏｔｏ他、Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９〜２３３頁（１９９０年）を参照のこと。ウシ由来（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０〜１４２９７頁（１９８９年））、マウス由来（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２２７〜８２３１頁（１９８９年））、ブタ由来（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎ他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１〜１０５頁（１９９５年））。他の適切なα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｂ血液型抗原の合成に関与しているものである（ＥＣ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６〜１１５１（１９９０年）（ヒト））。さらに別の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは、コアＧａｌ−Ｔ１である。
【０３１５】
β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼも本発明の方法で使用するのに適しており、例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ由来（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１〜２１７頁（１９８９年））、ヒト由来（Ｍａｓｒｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７〜６６３頁（１９８８年））、マウス由来（Ｎａｋａｚａｗａ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５〜１６８頁（１９８８年））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌ他、Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ．３８：２３４〜２４２頁（１９９４年））が挙げられる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来のもの、Ｃｈａｐｅｌｌ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９〜５２８頁（１９９４年））が挙げられる。
【０３１６】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物で有用な別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、シアリルトランスフェラーゼに対するシアル酸供与体であるＣＭＰ−シアル酸も産生すると考えられる。発明で使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６Ｇａｌ  ＮＡｃＩＩＩが挙げられる（本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：５〜１４頁（１９９６年）で記載されているものである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、２糖Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃの非還元末端Ｇａｌまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁（１９８１年）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２年）、およびＷｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁（１９９２年）を参照のこと。別の例示的な２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、２糖の非還元末端Ｇａｌまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Ｒｅａｒｉｃｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４頁（１９７９年）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４頁（１９９２年）を参照のこと。別の例示的な酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１頁（１９９４年）を参照のこと）。
【０３１７】
好ましくは、グリコペプチドの糖をグリコシル化する場合、シアリルトランスフェラーゼは、完全にシアル酸付加された糖構造体上で末端シアル酸の土台となる最も一般的な末端から２番目の配列であるＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列にシアル酸を転移させることができると考えられる（表２を参照のこと）。
【０３１８】
表２：受容体基質としてＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列を使用するシアリルトランスフェラーゼ
【０３１９】
【表２】
2007513189.tif 000062
１）Ｇｏｏｃｈｅｅ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ９：１３４７〜１３５５頁（１９９１年）
２）Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１０４〜１１０頁（１９９６年）
３）Ｇｉｌｂｅｒｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１〜２８２７６頁（１９９６年）
【０３２０】
特許請求の範囲の方法で有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれるＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩである。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃのＧａｌまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁（１９９２年）、Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ他、Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁（１９９１年））を参照のこと）、グリコペプチド中のアスパラギン結合オリゴ糖のシアル酸付加を司っている。シアル酸は、Ｇａｌに結合し、２つの糖の間にα結合が形成される。これらの糖の間の結合形成（結合）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間にある。この特定の酵素は、ラットの肝臓から単離することができる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２年））。ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉ他、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２〜２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４〜１４０１頁（１９９３年）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａ他、（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１〜９３８頁）ＤＮＡ配列が公知であり、組換え発現によってこの酵素を作製することを容易にしている。好ましい実施形態では、特許請求の範囲のシアル酸付加の方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０３２１】
本発明において有用な他の例示的なシアリルトランスフェラーゼとして、ＣＳＴ−ＩおよびＣＳＴ−ＩＩ、ならびにα（２，３）結合を形成するものを含めて、カンピロバクタージェジュニから単離されるものが挙げられる。例えば、ＷＯ９９／４９０５１を参照のこと。
【０３２２】
表２に記載したもの以外のシアリルトランスフェラーゼも、商業的に重要なグリコペプチドにシアル酸付加するための経済的かつ効率的な大規模プロセスにおいて有用である。これら他の酵素の有用性を調べるための簡単な試験として、様々な量の各酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）を、（１〜１０ｍｇ／ｍｌで）アシアロ−α１ＡＧＰと反応させて、問題のシアリルトランスフェラーゼがグリコペプチドにシアル酸付加する能力を、ウシのＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ、または両方のシアリルトランスフェラーゼに対して比較する。あるいは、他のグリコペプチドもしくはグリコペプチド、または、ペプチド主鎖から酵素的に遊離されたＮ−結合型オリゴ糖を、アシアロ−α１ＡＧＰの代わりにこの評価に使用することができる。ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉより効率的にグリコペプチドのＮ−結合型オリゴ糖にシアル酸付加する能力を有するシアリルトランスフェラーゼは、ペプチドにシアル酸付加するための実用的な大規模プロセスにおいて有用である。
【０３２３】
これらおよび追加のシアリルトランスフェラーゼを図１１に示す。図１１は、本明細書で示す修飾されたシアル酸種および未修飾のシアル酸を受容体に転移させるのに有用なシアリルトランスフェラーゼの表である。
【０３２４】
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明を実施する際、特に、ペプチドのＯ−結合型グリコシル化部位のアミノ酸にＧａｌＮＡｃ部分を結合させるのに有用である。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、それだけには限らないが、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９頁（１９９２年）およびＳｍｉｔｈ他、Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４年））、ならびにポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３年））が挙げられる。
【０３２５】
遺伝子工学によって、クローン化された遺伝子から酵素ＧａｌＮＡｃ  Ｔ１〜ＸＸなどのタンパク質を作製することは周知である。例えば、米国特許第４７６１３７１号を参照のこと。１つの方法は、十分なサンプルを収集し、次に、Ｎ末端配列決定によって酵素のアミノ酸配列を決定する。次に、この情報を用いて、昆虫細胞系統Ｓｆ９で発現されると十分に活性な酵素の合成をもたらした、完全長の（膜結合型）トランスフェラーゼをコードしているＤＮＡクローンを単離する。次に、１６種の異なるタンパク質の公知のグリコシル化部位の周囲のアミノ酸を半定量的に解析し、続いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成ペプチドのグリコシル化を調査することによって、その酵素の受容体特異性を決定する。この研究は、いくつかのアミノ酸残基がグリコシル化ペプチド部分で過剰であること、およびグリコシル化されたセリンおよびトレオニン残基の周囲の特定の位置の残基が、他のアミノ酸部分よりも受容体の効率に対してより著しい影響を及ぼし得ることを実証した。
【０３２６】
細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼ
別の実施形態では、本発明の方法で使用される酵素は、細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが公知であるが（例えば、米国特許第５０３２５１９号を参照のこと）、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と結合するとき、膜結合型である。これまで研究されている膜結合型酵素の多くは、内因性のタンパク質とみなされている。すなわち、それらは、超音波処理によっては膜から遊離されず、可溶化するために界面活性剤を必要とする。表面型のグリコシルトランスフェラーゼが、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の表面で確認されており、これらの表面型トランスフェラーゼは生理的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面型グリコシルトランスフェラーゼのより知られている機能は、細胞間認識のためのものである（Ｒｏｔｈ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ  ｔｏ  ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ、１９９０年）。
【０３２７】
細胞によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼを改変するための方法が開発されている。例えば、Ｌａｒｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２２７〜８２３１頁（１９８９年）は、細胞表面のオリゴ糖構造体およびそれらの同起源のグリコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化ｃＤＮＡ配列を単離するための遺伝的手法を報告している。ＵＤＰ−ガラクトースおよびβ．−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することが知られているマウス細胞系統から単離したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性について解析した。
【０３２８】
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：２７１３〜２７１７頁（１９９２年）は、β−ラクタマーゼを大腸菌の外表面に固着する方法を開示している。（ｉ）外膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外膜タンパク質の膜貫通部分、および（ｉｉｉ）完全に発達したβ−ラクタマーゼ配列からなる３種間の融合物が作製されて、活性な表面結合型β−ラクタマーゼ分子を生じる。しかし、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの方法は、原核細胞系のみに限定されており、著者が認識しているように、適切に機能するためには３種間の完全な融合が必要とされる。
【０３２９】
スルホトランスフェラーゼ
本発明は、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラギーナン、および関連化合物などの硫酸化多糖を含めて、硫酸化分子を含むペプチドを作製するための方法も提供する。適切なスルホトランスフェラーゼとしては、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（Ｆｕｋｕｔａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５〜１８５８０頁（１９９５年）によって記載されているニワトリｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｄｉｘｏｎ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２３９〜２４１頁（１９９５年）；ＵＬ１８９１８）、ならびにグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（Ｏｒｅｌｌａｎａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０〜２２７６頁（１９９４年）およびＥｒｉｋｓｓｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８〜１０４４３頁（１９９４年）で記載されているマウスｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２３０４で記載されているヒトｃＤＮＡ）が挙げられる。
【０３３０】
グリコシダーゼ
本発明は、野生型グリコシダーゼおよび変異型グリコシダーゼの使用も包含する。変異型β−ガラクトシダーゼ酵素は、α−グリコシルフルオリドをガラクトシル受容体分子に結合させることによって二糖類の形成を触媒することが明らかにされている（Ｗｉｔｈｅｒｓ、２００１年９月４日発行の米国特許第６２８４４９４号）。本発明において有用な他のグリコシダーゼとしては、例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ／シアリダーゼが挙げられる。
【０３３１】
固定化酵素
本発明は、固体および／または可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的な実施形態では、本発明の方法による完全なグリコシルリンカーを介してＰＥＧに結合されているグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧ−リンカー−酵素コンジュゲートは、場合によっては、固体支持体に結合されている。本発明の方法において固体に支持された酵素を使用することにより、反応混合物の精密な検査および反応生成物の精製が簡易になり、また、酵素を容易に回収することも可能になる。グリコシルトランスフェラーゼコンジュゲートは、本発明の方法で利用される。酵素および支持体の他の組合せ物は、当業者には明らかであろう。
【０３３２】
融合タンパク質
他の例示的な実施形態では、本発明の方法は、所望のグリコペプチドコンジュゲートの合成に関与している複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインに結合しているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインから構成されるものでよい。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖を形成する工程を触媒することができ、または、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与している反応を触媒することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与している酵素をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合させることができる。得られた融合タンパクは、次に、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、受容体分子への糖部分の転移も触媒することができる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列に結合された２種以上のサイクル酵素になることができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、２種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含む。例えば、５６４１６６８を参照のこと。本発明の修飾されたグリコペプチドは、様々な適切な融合タンパク質を利用することによって、容易に設計し製造することができる（例えば、１９９９年６月２４日にＷＯ９９／３１２２４号として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０号を参照のこと）。
【０３３３】
修飾された糖の調製
一般に、糖部分または糖部分−リンカーカセットと、ＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーカセット基は、反応性基の使用を通じて相互に結合され、それらは通常、結合プロセスによって、新しい有機官能基または非反応性化学種に変換される。糖の反応性官能基は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明を実施する際に有用な反応性基および反応の種類は、通常、バイオコンジュゲート化学の分野で周知のものである。反応性の糖部分を用いて利用可能な反応の現時点で好ましい種類は、比較的緩和な条件下で進行する反応である。これらには、それだけには限らないが、求核置換反応（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換反応（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加反応（例えば、マイケル反応、ディールス−アルダー反応）が含まれる。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２年で論じられている。
【０３３４】
糖の核または修飾基から張り出た有用な反応性官能基としては、それだけには限らないが、以下のものが挙げられる；
（ａ）それだけには限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、β−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族エステルを含めて、カルボキシル基および様々なその誘導体、
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができるヒドロキシル基、
（ｃ）例えば、アミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基でハライドが後に置換され、それによって、ハロゲン原子の官能基位置に新しい基を共有結合させることができるハロアルキル基、
（ｄ）ディールス−アルダー反応に参加することができる求ジエン体の基、例えば、マレイミド基、
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、もしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、または、グリニャール付加やアルキルリチウム付加などの機序を介して、その後に誘導体化することが可能であるようなアルデヒド基またはケトン基、
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するために、その後でアミンと反応させるためのスルホニルハライド基、
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換させ、またはハロゲン化アシルと反応させることができる、チオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化することができる、アミン基またはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加などを受けることができるアルケン、ならびに、
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。
【０３３５】
反応性官能基は、反応性の糖の核または修飾基を構築するために必要な反応に参加および干渉しないように選択することができる。あるいは、保護基の存在によって、反応に参加しないように反応性官能基を保護することもでできる。当業者なら、選択された一連の反応条件に干渉しないように特定の官能基を保護する方法を理解している。有用な保護基の例としては、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ他、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１年を参照のこと。
【０３３６】
以下の考察では、本発明を実施する際に有用な修飾された糖のいくつかの特定の例を説明する。例示的な実施形態では、修飾基が結合される糖の核としてシアル酸誘導体が利用される。シアル酸誘導体に基づいた考察の焦点は、例示を明確にするためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。例としてシアル酸を用いて説明する方法に類似した方法で、様々な他の糖部分を活性化および誘導体化できることが、当業者には理解されよう。例えば、いくつかの糖基質を挙げてみると、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびフコースなどを修飾するために多数の方法が利用可能であり、これらは、当業者に認知されている方法によって容易に修飾される。例えば、Ｅｌｈａｌａｂｉ他、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３頁（１９９９年）、およびＳｃｈａｆｅｒ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４頁（２０００年）を参照のこと。
【０３３７】
例示的な実施形態では、本発明の方法によって修飾されるＧ−ＣＳＦペプチドは、哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）またはトランスジェニック動物で作製されるグリコペプチドであり、したがって、不完全にシアル酸付加されたＮ−および／またはＯ−結合型オリゴ糖鎖を含む。シアル酸を欠き、末端ガラクトース残基を含むグリコペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化し、ＰＰＧ化し、さもなければ修飾されたシアル酸を用いて修飾することができる。
【０３３８】
スキーム４では、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルでアミノグリコシド１を処理し、糖アミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に変換する。付加物をアルドラーゼで処理してα−ヒドロキシカルボキシラート２を形成させる。ＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの作用によって、対応するＣＭＰ誘導体に化合物２を変換し、それに続いて、ＣＭＰ誘導体の接触水素添加により化合物３を得る。グリシン付加物の形成を介して誘導されるアミンは、化合物３を活性化されたＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と反応させることによるＰＥＧ結合の部位として利用され、それぞれ、４や５などの化学種を生じる。
【０３３９】
【化４９】
2007513189.tif 000063
【０３４０】
表３は、ＰＥＧ部分で誘導体化される糖１リン酸の代表的な例を示す。表３の化合物のうちのいくつかは、スキーム４の方法によって調製される。他の誘導体は、当業者に認知されている方法によって調製される。例えば、Ｋｅｐｐｌｅｒ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１１：１１ページ（２００１年）およびＣｈａｒｔｅｒ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１０：１０４９頁（２０００年）を参照のこと。他のアミン反応性のＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は、市販されており、または、当業者が容易に利用可能な方法によってそれらを調製することができる。
【０３４１】
【表３】
2007513189.tif 000064
【０３４２】
本発明を実施する際に有用な修飾された糖リン酸は、前述の位置だけでなく他の位置でも置換することができる。現時点で好ましいシアル酸の置換体を以下の式に示す。
【０３４３】
【化５０】
2007513189.tif 000065
式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、−ＣＨ２−、およびＮ（Ｒ）２（各Ｒは、Ｒ１〜Ｒ５からそれぞれ独立に選択されるメンバーである）から好ましくは選択される、結合基である。記号Ｙ、Ｚ、Ａ、およびＢはそれぞれ、Ｘを確認するために前述した群から選択される基を示す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ａ、およびＢは、それぞれ独立に選択され、したがって、同じものでも異なるものでもよい。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、Ｈ、ＰＥＧ部分、治療効果のある部分、生体分子、またはその他の部分を表す。あるいは、これらの記号は、ＰＥＧ部分、治療効果のある部分、生体分子、またはその他の部分に結合しているリンカーを表す。
【０３４４】
本明細書で開示されるコンジュゲートに結合される例示的な部分としては、それだけには限らないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療効果のある部分、診断用の部分、マンノース−６−ホスファート、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−ホスファート、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナリーオリゴ糖、ペプチドなどが挙げられる。様々な修飾基を糖部分に結合させる方法は、当業者には容易に利用可能である（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．、１９９２年；ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．６８０、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９７年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６年；およびＤｕｎｎ他編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１年）。
【０３４５】
リンカー基（架橋基）
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製は、糖残基にＰＥＧ部分を付加し、好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物を形成させることを含む。したがって、リンカー、例えば、ＰＥＧおよび糖を結合させるための架橋剤とＰＥＧおよび糖の反応によって形成されるものを使用することが多くの場合好ましい。修飾基を糖部分に結合させるのに使用することができる例示的な二官能化合物としては、それだけには限らないが、二官能性ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。糖を他の分子に結合させるための一般的手法は、文献で公知である。例えば、Ｌｅｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１８５６頁（１９８９年）；Ｂｈａｔｉａ他、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９年）；Ｊａｎｄａ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６頁（１９９０年）、およびＢｅｄｎａｒｓｋｉ他、ＷＯ９２／１８１３５を参照のこと。以下の考察では、反応性基は、新生の修飾された糖の糖部分上で好都合に処理される。考察の焦点は、例示を明確にするためのものである。この考察は、修飾基上の反応性基にも同様に関連していることが、当業者には理解されよう。
【０３４６】
様々な試薬が、修飾された糖の構成要素を分子内化学架橋で修飾するのに使用される（架橋試薬および架橋手順の総説については、Ｗｏｌｄ、Ｆ．、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１頁、１９７２年；Ｗｅｅｔａｌｌ、Ｈ．Ｈ．およびＣｏｏｎｅｙ、Ｄ．Ａ．、ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ．（ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編）３９５〜４４２頁、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９８１年；Ｊｉ、Ｔ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９頁、１９８３年；Ｍａｔｔｓｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３頁、１９９３年を参照のこと。これらはすべて、参照により本明細書に組み込む）。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性の架橋試薬から誘導される。ゼロ長架橋試薬は、外因性の物質を導入せずに、２つの内因性の化学基を直接結合することを含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、この部類に属する。別の例は、カルボジイミド、エチルクロロホルマート、ウッドワードの試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナート）、およびカルボニルジイミダゾールなど、カルボキシル基と第一級アミノ基の縮合を誘導し、アミド結合を形成させる試薬である。これらの化学試薬の他に、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）も、ゼロ長架橋試薬として使用してよい。この酵素は、通常、第一級アミノ基を基質として用いて、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でのアシル転移反応を触媒する。好ましいホモおよびヘテロ二官能試薬は、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的な基と反応し得る２つの同一部位または２つの異なる部位をそれぞれ含む。
【０３４７】
Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの精製
不溶性Ｇ−ＣＳＦのリフォールディング
細菌で発現される多くの組換えタンパク質は、細菌封入体中で不溶性の凝集体として発現される。封入体とは、細菌の細胞質および細胞周辺腔の双方に存在するタンパク質沈着物である（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２〜２０７頁（２００１年）を参照のこと）。組換えＧ−ＣＳＦタンパク質は細菌の封入体で発現される。また、活性なＧ−ＣＳＦタンパク質を作製するためにこれらのタンパク質をリフォールディングするための方法が、本明細書で提供される。
【０３４８】
Ａ．活性Ｇ−ＣＳＦのリフォールディング条件
細菌細胞から活性Ｇ−ＣＳＦタンパク質を作製するために、Ｇ−ＣＳＦタンパク質を細菌の封入体で発現させ、細菌を回収、破砕し、封入体を単離および洗浄する。一実施形態では、洗浄を３回行う。すなわち、ｐＨ６．０〜９．０の緩衝液（１価の塩、例えば、塩化ナトリウム；非イオン性界面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；イオン性界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム；およびＥＤＴＡ）で１回目の洗浄を行い、界面活性剤を含まない緩衝液中で２回目の洗浄を行い、Ｈ２Ｏ中で３回目の洗浄を行う。次に、封入体内部のタンパク質を可溶化する。変性剤、塩化グアニジアムもしくは尿素、極端なｐＨ、界面活性剤、またはこれらの任意の組合せを用いて、可溶化を行うことができる。一実施形態では、５〜６Ｍの塩酸グアニジンまたは尿素が、ＧＣＳＦを可溶化するのに使用される。別の実施形態では、ＤＴＴが加えられる。
【０３４９】
可溶化後、ＧＣＳＦタンパク質混合物から変性剤を取り除く。変性剤の除去は、リフォールディング緩衝液（ｂｕｆｆｅｔ）中に希釈する方法、またはバッファー交換法を含めて、様々な方法によって実施することができる。バッファー交換法には、透析、ダイアフィルトレーション、例えば、ろ過、および固体支持体上へのタンパク質の固定化が含まれる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２〜２０７頁（２００１年）を参照のこと）。上記の方法の任意のものを組み合わせて変性剤を除去することができる。
【０３５０】
ＧＣＳＦタンパク質中でのジスルフィド結合形成は、酸化還元対を含むリフォールディング緩衝液の添加によって促進される。酸化還元対としては、還元および酸化されたグルタチオン（−ＪＳＦ−Ｉ／ＧＳＳＧ）、システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧが挙げられる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２〜２０７頁（２００１年）を参照のこと）。一実施形態では、酸化還元対は１０：１の比のＧＳＨ／ＧＳＳＧである。
【０３５１】
リフォールディングは、例えば、ｐＨが６．０〜１０．０の範囲の緩衝液中で実施することができる。リフォールディング緩衝液は、リフォールディングを促進するための他の添加剤、例えば、Ｌ−アルギニン（０．４〜１Ｍ）；ＰＥＧ；尿素（１〜２Ｍ）や塩化グアニジウム（０．５〜１．５Ｍ）など低濃度の変性剤；および界面活性剤（例えば、Ｃｈａｐｓ、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ラウリルマルトシド、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含んでよい。
【０３５２】
リフォールディング後、ＧＣＳＦタンパク質を透析して、酸化還元対または他の望ましくない緩衝液成分を除去することができる。一実施形態では、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｅ）、グリセロール、および非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０を含む緩衝液を用いて、透析を実施する。透析後、イオン交換クロマトグラフィーにより、ＧＣＳＦタンパク質をさらに精製および／または濃縮することができる。一実施形態では、ＳＰ−セファロース陽イオン交換樹脂が使用される。
【０３５３】
リフォールディングされたタンパク質の生物活性が検出可能であるとき、タンパク質は正しくリフォールディングされていることが、当業者には認識されよう。ＧＣＳＦタンパク質の場合、様々な方法によって生物活性を測定することができる。例えば、生物学的に活性なＧＣＳＦタンパク質は、２００４年１月８日出願の米国特許出願第６０／５３５２８４号、２００４年２月１２日出願の第６０／５４４４１１号、および２００４年２月２０日出願の代理人識別番号０１９９５７〜０１８８２０ＵＳで記載されているＯ−結合型グリコシル化の基質である。これらの各文献は、あらゆる目的のために、本明細書に参照により組み込む。ＧＣＳＦタンパク質活性は、細胞増殖アッセイおよびラットでの白血球（ＷＢＣ）アッセイによって測定することもできる（同様に、あらゆる目的のために、本明細書に参照によりそれぞれ組み込む２００４年１月８日出願の米国特許出願第６０／５３５２８４号、２００４年２月１２日出願の第６０／５４４４１１号、および２００４年２月２０日出願の代理人識別番号０１９９５７〜０１８８２０ＵＳで記載されている）。増殖アッセイおよびＷＢＣアッセイは、リフォールディングされたＧＣＳＦタンパク質をＯ−結合型グリコシル化する前でも後でも実施することができる。
【０３５４】
本発明のコンジュゲートを単離するための他の方法
別法として、上記の方法で作製した生成物を、精製せずに使用することもできる。しかし、通常は、生成物を回収することが好ましい。薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜ろ過など、グリコシル化された糖を回収するための標準的な周知の技術を使用することができる。以下および本明細書に引用する文献で説明されているように、より好ましくは逆浸透膜による膜ろ過、または、１種もしくは２種のカラムクロマトグラフィー法を回収のために使用することが好ましい。例えば、分子量カットオフ値が約３０００〜１０，０００の膜による膜ろ過を用いて、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次に、ナノろ過または逆浸透法を用いて、塩類の除去および／または糖生成物の精製を行うことができる（例えば、ＷＯ９８／１５５８１号を参照のこと）。ナノフィルター膜は、使用する膜に応じて、１価の塩類を通過させるが多価の塩類および約１００〜約２０００ダルトンより大きい非荷電の溶質は保持する、ある種類の逆浸透膜である。したがって、典型的な適用例では、本発明の方法によって調製される糖は膜内に保持され、混入している塩は通過すると考えられる。
【０３５５】
修飾された糖タンパク質が細胞内で作製される場合は、第１の工程として、粒子状の破片、すなわち、宿主細胞または溶解された断片を、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去する。場合によっては、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いてタンパク質を濃縮し、続いて、イムノアフィニティークロマトグラフィー、（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、またはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含むマトリックスでの）イオン交換カラムによる分画、Ｂｌｕｅ−セファロース、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ  Ａ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、もしくはタンパク質Ａセファロース上でのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基を付加されたシリカゲル）、例えばセファデックスの分子ふるいもしくはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲルろ過、ポリペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフィー、およびエタノールもしくは硫酸アンモニウム沈殿から選択される１種または複数の工程によって、他の不純物からポリペプチド変異体を分離してよい。
【０３５６】
培養状態で作製される修飾されたグリコペプチドは、通常、細胞、酵素などから最初に抽出し、続いて、１種もしくは複数の濃縮、塩析、水系イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程を行うことによって単離される。さらに、修飾された糖タンパク質をアフィニティクロマトグラフィーによって精製してもよい。最後に、最終精製工程のためにＨＰＬＣを使用してよい。
【０３５７】
タンパク分解を阻害するために、前述の工程のいずれかに、プロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含めてよく、また、外因性の汚染菌の増殖を防止するために、抗生物質を含めてよい。
【０３５８】
別の実施形態では、本発明の修飾されたグリコペプチドを作製する系から得た上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて、最初に濃縮する。濃縮工程の後、適切な精製マトリックスに濃縮物を加えてよい。例えば、適切な親和性マトリックスは、ペプチドに対するリガンド、すなわち適切な支持体に結合されたレクチンまたは抗体分子を含んでよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ基が張り出たマトリックスまたは基材を使用してよい。適切なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または、タンパク質精で一般に使用される他のタイプのものが挙げられる。あるいは、陽イオン交換工程を使用してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０３５９】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばメチル基または他の脂肪族基が張り出たシリカゲルを使用する１種または複数のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチド変異体組成物をさらに精製してよい。前述した精製工程のうちの一部またはすべてを様々な組合せで実施して、均質な修飾された糖タンパク質を供給することもできる。
【０３６０】
大規模な発酵から得られる本発明の修飾されたグリコペプチドを、Ｕｒｄａｌ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１頁（１９８４年）によって開示されているものに類似した方法によって精製してよい。この参考文献では、分取ＨＰＬＣカラムで組換えヒトＩＬ−２を精製するための２回連続したＲＰ−ＨＰＬＣ工程を記載している。あるいは、アフィニティクロマトグラフィーなどの技術を利用して、修飾された糖タンパク質を精製してもよい。
【０３６１】
薬剤組成物
別の態様では、本発明は、薬剤組成物を提供する。この薬剤組成物は、製薬上許容される希釈剤、ならびに非天然のＰＥＧ部分、治療効果のある部分、または生体分子とグリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドとの共有結合性コンジュゲートを含む。ポリマー、すなわち治療効果のある部分または生体分子は、Ｇ−ＣＳＦペプチドとポリマー、すなわち治療効果のある部分または生体分子の双方の間に介在し、かつそれらに共有結合している完全なグリコシル結合基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに結合している。
【０３６２】
本発明の薬剤組成物は、様々な薬物送達システムで使用するのに適している。本発明で使用するのに適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ペンシルベニア州、第１７版．（１９８５年）に記載されている。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照のこと。
【０３６３】
例えば、局所、経口、経鼻、静脈、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内の投与を含めて、任意の適切な投与方法のために薬剤組成物を調製することができる。皮下注射などの非経口投与の場合は、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与の場合は、上記の担体のうちの任意のもの、または、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの固形担体を使用してよい。生分解性のマイクロスフェア（例えば、ポリラクタート、ポリグリコラート）も、本発明の薬剤組成物用の担体として使用してよい。適切な生分解性マイクロスフェアは、米国特許第４８９７２６８号および第５０７５１０９号で開示されている。
【０３６４】
一般に、薬剤組成物は、非経口的に、例えば静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性の担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与用の組成物を提供する。この組成物は、ｐＨ調整剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤など、近似的生理条件に必要な製薬上許容される補助剤を含んでよい。
【０３６５】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよく、または、滅菌ろ過してもよい。得られた水性液剤は、そのまま使用するために包装しても、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥した調製物は、投与する前に無菌の水性担体と混合する。調製物のｐＨは、通常、３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、標準の小胞形成脂質から形成させたリポソーム中に本発明のグリコペプチドを組み込むことができる。例えば、Ｓｚｏｋａ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０年）、米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号、および第４８３７０２８号で記載されているように、様々な方法が、リポソームを調製するのに利用可能である。様々な標的性作用物質（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を用いたリポソームの標的化は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４９５７７７３号および第４６０３０４４号を参照のこと）。
【０３６７】
標的性作用物質をリポソームに結合させるための標準的な方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、標的性作用物質を結合するために活性化され得る、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質成分、または、脂質誘導体化された本発明のグリコペプチドなど誘導体化された親油性化合物をリポソーム中に組み込むものである。
【０３６８】
標的化の機序は、通常、標的性部分が、標的、例えば、細胞表面の受容体との相互作用に利用可能となる様式で、標的性作用物質がリポソームの表面に位置していることを必要とする。本発明の糖は、リポソームが形成される前に、当業者に公知の方法（例えば、それぞれ長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸による、糖上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を用いて、脂質分子に結合させてよい。あるいは、膜形成時に、連結部分が最初に膜中に組み込まれるような形で、リポソームを作製してもよい。連結部分は、膜中に堅く埋め込まれ固定される親油性部分を有していなければならない。それは、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分も有していなければならない。後で加えられる標的性作用物質または糖と安定な化学結合を形成するのに化学的に適するように、反応性部分を選択する。いくつかの場合では、標的性作用物質を連結分子に直接結合させることが可能であるが、大半の場合、化学架橋の役目を果たす第３の分子を使用し、それによって、膜中の連結分子を標的性作用物質または糖と連結させ、それらを小胞表面から３次元的に離れて伸長させることがより適切である。
【０３６９】
本発明の方法によって調製される化合物は、診断試薬としても使用することができる。例えば、標識した化合物を用いて、炎症を有することが疑われる患者の炎症または腫瘍転移の領域を特定することができる。この用途のために、化合物を１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで標識することができる。
【０３７０】
本発明の薬剤組成物で使用される有効成分は、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦおよび、例えば排卵を増大させるろ胞刺激ホルモンの生物学的諸特性を有するその誘導体である。好ましくは、本発明のＧ−ＣＳＦ組成物は、非経口的に投与される（例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、またはＩＰ）。有効薬量は、治療対象の状態および投与経路に応じてかなり変動すると予想されるが、約０．１（〜７Ｕ）〜１００（〜７０００Ｕ）μｇ／ｋｇ体重の範囲の有効物質であると予想される。貧血状態の治療に好ましい用量は、１週３回、約５０〜約３００単位／ｋｇである。本発明はｉｎ  ｖｉｖｏの残存時間を延長させたＧ−ＣＳＦを提供するため、記載された投与量は、本発明の組成物を投与するとき、場合によっては減少される。
【０３７１】
以下の実施例は、本発明のコンジュゲートおよび方法を例示するために提供されるが、特許請求の範囲の発明を限定するためのものではない。
【実施例１】
【０３７２】
ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦのＧｌｙｃｏＰＥＧ化
ａ．アシアロ−顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過機で５００ｕＬに濃縮する。その溶液を、３００ｍＵ／ｍＬのノイラミニダーゼＩＩ（ビブリオ  コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））とともに、３２℃で１６時間インキュベートする。反応を観察するために、反応物を少量分取して適切な緩衝液で希釈し、ゲルＩＥＦを実施する。次に、反応物を予め洗浄したＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロースコンジュゲートに加え（反応体積８００μＬ／ｍＬ）、洗浄したビーズを４℃で２４時間、穏やかに回転させる。混合物を１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を集めた。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で３回、０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で１回、０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で１回、ビーズを洗浄し、上清をすべて集めてためる。上清を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３に対して、次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３に対してさらに２回、４℃で透析する。次に、透析した溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過機を用いて濃縮し、−２０℃で保管する。ゲルＩＥＦのための条件は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従って実施した。天然のＧ−ＣＳＦおよび脱シアル酸されたＧ−ＣＳＦを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって解析する。
【０３７３】
ｂ．Ｇ−ＣＳＦ−（α２，３）−シアリル−ＰＥＧの調製
脱シアル酸されたＧ−ＣＳＦを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。その溶液を、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ１とともに、３２℃で２日間インキュベートする。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量する。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ解析を用いて、反応生成物を解析する。天然のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって解析する。
【０３７４】
ｃ．Ｇ−ＣＳＦ−（α２，８）−シアリル−ＰＥＧの調製
α２，３−シアル酸付加Ｏ結合型グリカンを含有する、ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させる。その溶液を、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＣＳＴ−ＩＩとともに、３２℃で２日間インキュベートする。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量する。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ解析を用いて、反応生成物を解析する。天然のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって解析する。
【０３７５】
ｄ．Ｇ−ＣＳＦ−（α２，６）−シアリル−ＰＥＧの調製
Ｏ結合型ＧａｌＮａｃのみを含有するＧ−ＣＳＦを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させる。その溶液を、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ６ＧａｌＮａｃＩまたはＩＩとともに、３２℃で２日間インキュベートする。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量する。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ解析を用いて、反応生成物を解析する。天然のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって解析する。
【０３７６】
ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦを、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）シアリダーゼで処理し、次に、スーパーデックス７５でのサイズ排除によって精製し、ＳＴ３  Ｇａｌ１またはＳＴ３Ｇａｌ２、次いで、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ２０Ｋｄａで処理した。得られた分子をイオン交換およびゲルろ過によって精製し、また、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる解析によって、ＰＥＧ化が完了していることを明らかにした。これは、Ｏ−結合型グリカンのＧｌｙｃｏＰＥＧ化を初めて実証したものである。
【実施例２】
【０３７７】
組換えＧＣＳＦの発現、リフォールディング、および精製
・遠心分離によって細胞を回収し、上清を廃棄する。様々な培地上での増殖の結果を図９に示す。
・１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（１０ｍｌ／ｇで使用、溶解緩衝液）中に細胞沈殿物を再懸濁する。
・細胞を微細な流体にする（Ｍｉｃｒｏｌｌｕｉｄｉｚｅ）（フレンチプレスも同様に使える）。
・５，０００ＲＰＭ、４℃で３０分、遠心分離する。上清を廃棄する。
・沈殿物を溶解緩衝液中に再懸濁させ、上記と同じように遠心分離する。
・２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＴＸ−１００、１％  ＮａＤＯＣ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ中でＩＢを洗浄する。ピペッティングおよびボルテックス処理によって、沈殿物を再懸濁させる。５，０００ＲＰＭ、４℃で１５分、遠心分離する。この工程をもう１回繰り返す（合計２回洗浄）
・２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で沈殿物を２回洗浄して界面活性剤を除去する。上記と同じように遠心分離する。
・沈殿物をｄＨ２Ｏ中に再懸濁して一定量にし、上記と同じように遠心分離する。沈殿物を−２０℃で凍結する。
・ピペットを用いて、６Ｍ塩酸グアニジン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＤＴＴ中に２０ｍｇ／ｍｌでＩＢを再懸濁し、続いて、室温で２〜４時間回転させる。
・１４，０００ＲＰＭ、室温で１分間、可溶化したＩＢを遠心分離する。上清を取っておく。
・リフォールディング用緩衝液５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６、２４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭを用いて１：２０の比で上清を希釈する。
・ＫＣｌ、０．３ｍＭラウリルマルトシド、０．０５５％  ＰＥＧ３３５０、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．１Ｍ  ＧＳＳＧ、０．５Ｍアルギニン。４℃で一晩、ローテーター上でリフォールディングさせる。
・リフォールディング物を透析用のピアススネークスキン（７ｋＤａ  ＭＷＣＯ）に移す。透析緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ。少なくとも２００倍を超える量に対して、４℃で合計３回透析する。
・透析後、０．４５μＭフィルターに物質を通す。
・透析緩衝液でＳＰ−セファロースカラムを平衡化し、サンプルを添加する。透析緩衝液でカラムを洗浄し、最大１Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配を有する透析緩衝液で溶出させる。タンパク質は、通常、３００〜４００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出される。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥで物質を検査する（例えば、図１０を参照のこと）。
【実施例３】
【０３７８】
２つのポットで２種の酵素を用いる方法
以下の実施例は、各中間生成物が次の工程で使用される前に精製される、２つの連続した工程でのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製を例示する。
【０３７９】
ａ．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２による、Ｇ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（ｐＨ６．２）の調製
ＵＦフィルター（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）を用いた限外ろ過によって、容器に入れた緩衝液３．２ｍＬ中のＧ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ）を濃縮し、次いで、１ｍＬの２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ３）に溶解した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（４０μＬ、４ｍＭ）を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。
【０３８０】
２４時間後、ＭＡＬＤＩは、反応が完了したことを示した。ＳＥＣ（スーパーデックス７５およびスーパーデックス２００）およびＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ４．９および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）からなる溶出緩衝液を用いるＨＰＬＣ精製に直接反応混合物をかけた。回収したピークのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ５ＫＤａ  ＭＷＣＯフィルターを用いて約１５０μＬに濃縮し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ４．９および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）を用いて体積を１ｍｌに調整した。最終タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬ（Ａ２８０）、収率は１００％であった。サンプルを４℃で保管した。
【０３８１】
ｂ．精製されたＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）、およびマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＴＩ（ｐＨ６．２）を用いたＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
タンパク質１ｍｇを含有するＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ溶液を２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ３）中に入れてバッファー交換し、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（５ｍｇ、０．２５ｕｍｏｌ）を加えた。溶解後、ＭｎＣｌ２（１００ｍｃＬ、１００ｍＭ溶液）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１００ｍｃＬ、マウス酵素）を加え、反応混合物を３２℃で３日間、ゆっくりと揺り動かした。限外ろ過（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）によって反応混合物を濃縮し、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．９）で１回バッファー交換し、次に、濃縮して全体積を１ｍＬにした。次に、保持時間１３〜１８分のＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａ：２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋０．００５％ｔｗｅｅｎ−８０  ｐＨ４．５；Ｂ：２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋０．００５％ｔｗｅｅｎ−８０  ｐＨ４．５＋２Ｍ  ＮａＣｌ）、保持時間８．６分のＳＥＣ（スーパーデックス７５；ＰＢＳ−ｐＨ  ７．２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）（スーパーデックス７５、流速１ｍｌ／分）を用いて、生成物を精製した。所望の画分を回収し、濃縮して０．５ｍＬにし、４℃で保管した。
【実施例４】
【０３８２】
酵素の同時付加を用いてＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するためのワンポットの方法
以下の実施例は、酵素の同時付加を用いたワンポットでのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製を例示する。
【０３８３】
１．マウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（ｐＨ６．０）を用いたワンポットの方法
限外ろ過（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）によって、Ｇ−ＣＳＦ（３．２ｍＬの生成物調製緩衝液中に溶解した９６０μｇのタンパク質）を０．５ｍｌに濃縮し、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ３）で溶解して、全体積を約１ｍＬにし、またはタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２１μｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、８０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（６ｍｇ、０，３μｍｏｌ）、ならびにマウス酵素ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１２０μＬ）および１００ｍＭＭｎＣｌ２（５０Ｌ）を加えた。３２℃で４８時間、溶液を揺り動かし、標準のクロマトグラフィー条件を用いてＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製した。合計０．５ｍｇのタンパク質（Ａ２８０）が得られ、または、全収率約５０％であった。ＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの双方を用いた解析によって、生成物の構造を確認した。
【０３８４】
２．ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（ｐＨ６．０）を用いたワンポットの方法
１４．４ｍｇのＧ−ＣＳＦを濃縮して最終体積を３ｍＬにし、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ３、０．００４％Ｔｗｅｅｎ８０）でバッファー交換し、また、体積を１３ｍＬに調整した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（９０ｍｇ、１５０μモル）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（０．５９Ｕ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（９０ｍｇ）、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（０．４４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（６００ｍｃＬ）を加えた。得られた混合物を室温で６０時間放置した。次に、ＵＦ（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）および遠心分離によって、反応混合物を濃縮した。残留物（約２ｍＬ）を２５ｍＭＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶解させ、再度濃縮して最終体積を５ｍＬにした。ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを約１０〜２３分、ＳＥＣ（スーパーデックス７５、１７分、流速０．５ｍｌ／分）、さらにＳＥＣ（スーパーデックス２００、２３分、流速０．５ｍｌ／分）を用いてサンプルを精製して、３．６ｍｇ（全収率２５％）のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（Ａ２８０およびＢＣＡ法）を得た。
【実施例５】
【０３８５】
酵素の連続付加を用いてＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するためのワンポットの方法
以下の実施例は、酵素の連続付加を用いてワンポットでＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するための方法を例示する。
【０３８６】
１．ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦから出発
ａ．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を用いた、Ｇ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（ｐＨ６．２）の調製
ＵＦフィルター（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）を用いたｕｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによって、容器に入れた緩衝液３．２ｍＬ中のＧ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ）を濃縮し、次いで、１ｍＬの２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ３）に溶解した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（４０μＬ、４ｍＭ）を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。
【０３８７】
ｂ．Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ガラクトース、ＳＡ−ＰＥＧ−２０Ｋダルトン、および適切な酵素からのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
ＵＤＰ−ガラクトース（４ｍｇ、６．５μモル）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ（３２０μＬ、１６０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（８ｍｇ、０．４μモル）、ＳＴ３Ｇａｌ２（８０μＬ、０．０７ｍＵ）および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（８０μＬ）を、上記の工程ａから得られる、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）１．５ｍｌ中のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの粗製な反応混合物（１．５ｍｇ）に直接加えた。得られた混合物を３２℃で６０時間放置した反応混合物を遠心分離し、限外ろ過（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）によって０．２ｍＬに濃縮し、次に、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）で溶解して最終体積を１ｍＬにした。ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（保持時間１０〜１５分）を用いて生成物を精製し、スピンフィルター（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）を用いてピーク画分を濃縮し、さらにＳＥＣ（スーパーデックス７５、保持時間１０．２分）を用いて残留物を精製した。スピンフィルター（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）を用いて濃縮した後、ＰＢＳ、２．５％マンニトール、０．００５％ポリソルベート、ｐＨ６．５の調製緩衝液によって、タンパク質を１ｍＬに希釈し、タンパク質濃度が１ｍＬ当たり８５０ｍｃｇのタンパク質となるように調製した（Ａ２８０）。全収率は５５％であった。
【実施例６】
【０３８８】
酵素の同時付加を用いてＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するためのワンポットの方法
ａ．Ｇ−ＣＳＦ．からの出発
限外ろ過（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）によって、Ｇ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ、３．２ｍｌ）を濃縮し、２５ｍＭ  Ｍｅｓ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ３）で溶解した。Ｇ−ＣＳＦ溶液の全体積は約１ｍｇ／ｍｌとした。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、〜８０μＵ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（６ｍｇ）、コア１  ＧａｌＴ（１６０μＬ、８０μＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（６ｍｇ）、およびα２，３−（Ｏ）−シアリルトランスフェラーゼ（１６０μＬ、１２０μＵ）、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（４０μＬ）を加えた。得られた混合物を３２℃で４８時間インキュベートした  後述するように、ＩＥＸおよびＳＥＣを用いて精製を実施した。限外ろ過（ＭＷＣＯ  ５Ｋ）によって、生成物を含有する得られた画分を濃縮し、緩衝液で体積を約１ｍＬに調整した。タンパク質濃度は、Ａ２８０により０．３９２ｍｇ／ｍｌと測定され、Ｇ−ＣＳＦからの全収率は４０％となった。
【０３８９】
本明細書で記述する実施例および実施形態は、例示するためのものに過ぎないこと、また、それを考慮した様々な改変または変更が当業者には示唆され、また、それらは、本出願の趣旨および目的、ならびに添付の特許請求の範囲に包含されることが理解されよう。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０３９０】
【図１】Ｔｈｒ１３３（メチオニンが存在する場合はＴｈｒ１３４）で起こり得るグリコシル化の存在および位置を示す、Ｇ−ＣＳＦの構造図である。
【図２】ＰＥＧで誘導体化したサッカリル部分を付加する前にＴｈｒ１３３（メチオニンが存在する場合はＴｈｒ１３４）でグリコシル残基にＧａｌＮＡｃ部分を酵素的に付加することによって、Ｇ−ＣＳＦペプチド上の糖残基が改変される、本発明の例示的な実施形態を示すスキームである。
【図３】非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの「Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）」および酵素的にＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦのｉｎ  ｖｉｖｏでの残存期間を比較したグラフである。
【図４】図３で示す化学種の活性を比較したグラフである。
【図５】本発明者らが本発明のコンジュゲートを調製する際の例示的なＰＥＧ−グリコシル結合基前駆体（修飾された糖）を作製するための合成スキームである。
【図６】例示的なＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を示す図である。配列番号：１は、最初のアミノ酸がメチオニンであり、Ｔｈｒ１３４の位置にトレオニン残基がある、１７５アミノ酸変異体である。配列番号：２は、最初のメチオニンが欠けており、そのため、配列がＴで始まり、１３３位にトレオニン残基がある以外は、１７５アミノ酸変異体と同じ配列を有する１７４アミノ酸変異体である。
【図７】本発明の実施に際して有用である、いくつかの例示的な修飾された糖ヌクレオチドを示す図である。
【図８】本発明の実施に際して有用である、さらに別の例示的な修飾された糖ヌクレオチドを示す図である。
【図９】様々な培地で増殖させ、ＩＰＴＧを用いて誘導した、細菌における組換えＧＣＳＦの作製を示す図である。
【図１０】ＳＰ−セファロースクロマトグラフィーの後にリフォールディングされたＧＣＳＦのウェスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１１】本明細書で示す修飾されたシアル酸化学種および未修飾のシアル酸を受容体に転移させるのに役立つシアリルトランスフェラーゼの表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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