(57)【要約】医療デバイス上の、タンパク質抵抗性成分および生物活性物質からなる溶出可能なコーティングを開示する。本発明の溶出可能なコーティングは、制御条件下で切断され得る不安定リンカーを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療デバイスをコーティングするための化合物であって、式：
【化１】
2007508912.tif 000013
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は治療効果を有する物質である）
を有する化合物。
【請求項２】
前記生物活性物質が、薬剤、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、プロテオグリカン、または抗体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記コポリマーが、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ＰＥＯとポリブタジエン、ＰＥＯとポリ（Ｎ−アセチルエチレンイミン）、ＰＥＯとフェニルボロン酸、ＰＥＯとポリウレタン、ＰＥＯとポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびＰＥＯとポリジメチルスルホキシドからなる群から選択されるポリマー単位からなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記親水性領域がポリエチレンオキシドからなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記疎水性領域が、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリブタジエン、ポリ（Ｎ−アセチルエチレンイミン）、フェニルボロン酸、ポリウレタン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびポリジメチルスルホキシドからなる群から選択されるポリマー単位からなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式：
【化２】
2007508912.tif 000014
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は治療効果を有する物質である）
を有する化合物を含んでなる医療デバイス。
【請求項７】
治療物を含んでなる表面コーティングで医療デバイスをコーティングする方法であって、
医療デバイスを、式：
Ｒ−Ｓ−Ｓ−コポリマー
（式中、Ｒは活性基であり、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域を有する）
を有する化合物でコーティングすることと、
該化合物でコーティングされた該医療デバイスをすすぐことと、
すすいだ該医療デバイスを、治療効果を有する生物活性物質と共にインキュベートすることによって、治療物を含んでなる表面コーティングで該医療デバイスをコーティングす
ることと
からなる方法。
【請求項８】
哺乳動物に生物活性化合物を送達する方法であって、
式：
【化３】
2007508912.tif 000015
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は治療効果を有する物質である）
を有する化合物を含んでなる医療デバイスを哺乳動物に施用することと、
該不安定リンカーを切断することによって、該生物活性化合物を送達することと
からなる方法。
【請求項９】
不安定リンカーの切断が、加水分解、放射線、超音波、酵素による方法、イオンによる方法、拡散、バリア介在性の拡散、競合的置換、およびリポソームの破壊からなる群から選択される方法で行われる、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（０００２）本発明は、化合物を送達する目的で、溶出可能なコーティングを医療デバイス上に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（０００１）本出願は、２００３年１０月２１日出願の米国仮特許出願第６０／５１３０５７号の特典を主張するものであり、同出願は参照として援用される。対応する先の米国出願は、２００４年１０月２０日に、溶出可能な表面コーティングという表題で、ジェニファー  エイ．ネフ（Jennifer A.Neff ）、カリン  ディー．カルドウェル（Karin D.Caldwell）、ヨナス  アンダーソン（Jonas Andersson ）、ボー  ニルソン（Bo Nilsson）、およびクリスチナ  ニルソン−エクダール（Kristina Nilsson-Ekdal）の名において出願され、整理番号３４８２．２．１であった。
【０００３】
（０００３）静脈内投与などによる薬物の全身的な投与では、治療する疾患が局在する可能性があっても、身体全体を処置する。したがって、ヒト患者または患畜の体腔中に埋め込み可能な医療デバイスを部分的にまたは完全に挿入することにより様々な病態を治療することが一般的になってきている。例えば、脈管系の治療の多くは、ステント、カテーテル、バルーン、ガイドワイヤ、カニューレなどのデバイスの挿入を伴う。脈管系に挿入し脈管系を通して操作するこれらのデバイスを使用する従来の薬物送達技術の潜在的な欠点の１つは、血管壁を冒し、または損傷する可能性があることである。損傷部位には血塊形成または血栓が生じることが多く、血管の狭窄（閉鎖）の原因となる。
【０００４】
（０００４）他の状態および疾患も、食道、気管、結腸、胆道、尿道、および身体の他の場所に挿入されたステント、カテーテル、カニューレ、および他のデバイスを用いて、または例えば、整形外科用のデバイス、インプラント、もしくは代替物を用いて治療することができる。
【０００５】
（０００５）このようなデバイスを用いた従来の薬物送達方法の他の欠点は、短期間（すなわちデバイス挿入後の最初の数時間および数日間）ならびに長期間（デバイス挿入の数週間後および数カ月後）にわたって生物活性物質を効果的に送達するのが困難なことである。薬物送達の目的でのステントの従来的な使用に伴う別の難点は、所望の生物活性物質、薬剤、または他の生物活性材料の送達速度についての正確な制御である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（０００６）医療処置の間または医療処置の後に、このような状態および疾患を治療または予防するために、例えば、通路、内腔、または血管などの身体の部分の突然の閉鎖および／または再狭窄を予防するために、適切な量の治療物質、薬物、または生物活性物質を直接身体の一部分に確実に送達するためのデバイスおよび方法を開発することが望ましい。
【０００７】
（０００７）従来の薬物送達技術の潜在的な欠点を考慮すると、身体内の場所を標的として活性物質、薬剤物質、または生物活性物質を制御して局所送達することを可能にするデバイス、方法、および製造方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（０００８）１実施形態は、式：
【化１】
2007508912.tif 000002
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は、薬剤もしくは薬物、または治療効果を有するその他の物質などのあらゆる物質である）
を有する、医療デバイスをコーティングするためのある種の化合物である。
【０００９】
（０００９）別の１実施形態は、式：
【化２】
2007508912.tif 000003
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は、薬剤もしくは薬物、または治療効果を有するその他の物質などのあらゆる物質である）
を有する、医療デバイスをコーティングするためのある種の化合物を含んでなる医療デバイスである。
【００１０】
（００１０）別の１実施形態は、式：
【化３】
2007508912.tif 000004
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は、薬剤もしくは薬物、または治療効果を有するその他の物質などのあらゆる物質である）
を有する、生物活性物質を含んでなる表面コーティングで医療デバイスをコーティングする方法である。
【００１１】
（００１１）別の１実施形態は、式：
【化４】
2007508912.tif 000005
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は、薬剤もしくは薬物、または治療効果を有するその他の物質などのあらゆる物質である）
を有する、生物活性物質を含んでなる表面コーティングを有する医療デバイスで、患者に生物活性化合物を送達する方法である。
【００１２】
（００１２）好ましい実施形態の他のシステム、方法、特徴、および利点は、以下の図面および説明を吟味すれば当業者には明らかであり、または明らかになるであろう。このようなさらなるシステム、方法、特徴、および利点は全て、この説明の中に含まれるものであり、好ましい実施形態の範囲内にあることが意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（００２２）好ましい実施形態は、埋め込み可能な医療デバイスのための生物活性化合物からなるコーティング、ならびに、身体内の場所を標的とする、生物活性物質の制御された局所送達の方法を提供するものである。本明細書で用いられる「制御された局所送達」は、一定の場所における生物活性物質の特徴的放出速度と定義される。
【００１４】
（００２３）１実施形態では、デバイスに、コポリマー、不安定リンカー、および生物活性物質からなるコーティングを施す。したがって、好ましい実施形態のコーティングは、以下の：
【化５】
2007508912.tif 000006
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は、薬剤もしくは薬物、または治療効果のある他の物質などのあらゆる物質である）
に示すように、医療デバイスに接着するためのコポリマー成分、不安定リンカー、および生物活性物質を提供する。好ましい実施形態には、式：
【化６】
2007508912.tif 000007
（式中、コポリマーは１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域からなり、不安定リンカーは制御された因子によって切断され得る結合であり、生物活性物質は、薬剤もしくは薬物、または治療効果のある他の物質などのあらゆる物質である）
を有するある種の化合物を含んでなる医療デバイスが含まれる。
【００１５】
（００２４）ある実施形態では、コーティングされる表面は疎水性である。好ましい表面の例として、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）など）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、シリコーン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニルのコポリマー、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）（ＰＥＳ）、ある種のポリウレタン、熱分解された材料、およびこれらの成分を含むコポリマーが含まれるがそれだけには限定されない。好ましい実施形態では、疎水性のより低い材料、および生分解性材料も企図される。これらの材料には、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡＣ）、酢酸セルロース、生分解性ポリマー、例えば（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）（ＰＤＯ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ポリアミノ酸、ポリエステルアミド、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、およびこれらの材料のコポリマーが含まれるがそれだけには限定されない。
【００１６】
（００２５）コーティング組成物を用いて、ステンレス鋼、ニチノール、タンタル、およびコバルトクロム合金などの金属をコーティングすることもできる。このような材料は、基体に対するコーティング組成物の安定した結合を実現するために前処理を必要とする
ことがあると認識されている。これらの前処理は当業者にはよく知られており、シラン処理またはプラズマ改質などの工程が関与することがある。該材料に、１つまたは複数の親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域を含むマルチブロックコポリマーの形態のコーティングを施す。疎水性領域は、疎水性結合により疎水性の表面に吸着され得る一方、親水性領域は流動体相の存在下で可動性を保つことができる。
【００１７】
（００２６）好ましい実施形態のコポリマーのコーティングを形成するのに好ましいコポリマーのユニットには、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ＰＥＯとポリブタジエン、ＰＥＯとポリ（Ｎ−アセチルエチレンイミン）、ＰＥＯとフェニルボロン酸、ＰＥＯとポリウレタン、ＰＥＯとポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびＰＥＯとポリジメチルスルホキシドが含まれるがそれだけには限定されない。前述したコポリマーのユニット対では、親水性領域がＰＥＯからなることが好ましい。このタイプのコポリマーのユニットを用いるコポリマー、およびタンパク質の吸着を防ぐためのコーティング材料へのこれらの適用については、以前に報告されている［２５〜３０、３１、ハン（Ｈａｎ）、１９９３年、＃４６］。
【００１８】
（００２７）ある実施形態では、コポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）鎖などの親水性のペンダントまたはダングリング領域からなる。コポリマーの他の領域は、ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）鎖などの疎水性領域からなる。さらに、連結基（Ｒ）は、コポリマーの親水性領域に隣接した一端に結合して、末端基が活性化されたポリマーを形成する。例えば、末端基の活性化されたポリマーは、一般式：
（Ｒ−ＰＥＯ）ａ（ＰＰＯ）ｂ      （１）
（式中、ａおよびｂは整数であり、同一でも異なっていてもよく、少なくとも１であり、好ましくは、ａは１〜６、ｂは１〜３であり、より好ましくは、ａは１〜２、ｂは１である）
を有するＰＥＯブロックとＰＰＯブロックの任意の配列の形態であってよい。該ポリマー性ブロックコポリマーのＰＥＯ（−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−）の含有量は１０重量％〜８０重量％、好ましくは５０重量％〜８０重量％、より好ましくは７０重量％〜８０重量％である。
【００１９】
（００２８）ＰＥＯ鎖またはＰＥＯブロックは、以下の一般式：
−（−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−）ｕ      （２）
（式中、ｕは、分子内の異なるＰＥＯブロックについて同一でも異なっていてもよい）
のものである。通常は、ｕは５０を超え、好ましくは５０〜１５０、より好ましくは８０〜１３０である。ＰＰＯブロックは以下の一般式：
−（−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−）ｖ      （３）
（式中、ｖは、分子内の異なるＰＰＯブロックについて同一でも異なっていてもよい）
のものである。通常は、ｖは２５を超え、好ましくは２５〜７５、より好ましくは３０〜６０である。
【００２０】
（００２９）コポリマーは分枝した構造であってもよく、他の構造（例えば、架橋構造、または分枝構造）およびコポリマーが疎水性の表面上に吸着して該表面を覆う能力に実質的に影響を及ぼさない置換基を含むことができる。例として、以降の段落に記載する以下のコポリマーが含まれる。
【００２１】
（００３０）別の１実施形態では、好ましい実施形態の末端基が活性化されたポリマーは、以下の式（４）のように、ペンダントＲ基を有するポリマー性トリブロックコポリマーの誘導体である。例えば、これらのトリブロックコポリマーは、ポリプロピレンオキシドの疎水性中央ブロックと、末端にＲ基のあるポリエチレンオキシドの親水性末端ブロックとを有し、式：
Ｒ−（−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−）ｘ−（Ｃ３Ｈ６−Ｏ−）ｙ−（−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−）ｚＨ
（４）
（式中、ｙは２５〜７５、好ましくは３０〜６０であり、ｘとｚは同一であることが好ましいが、異なっていてもよく、５０〜１５０、好ましくは８０〜１３０である）
で表すことができる。あるタイプのこれらのポリマー界面活性剤は、商業上は「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）」または「ＰＯＬＯＸＡＭＥＲＳ（商標）」と呼ばれており、例えばＢＡＳＦから市販されている。
【００２２】
（００３１）別の適切な種類のポリマー性ブロックコポリマーは、ａ＝１およびｂ＝１であるジブロックコポリマーであり、式：
Ｒ−ＰＥＯ−ＰＲＯ−Ｈ      （５）
（式中、ＰＥＯおよびＰＰＯは上記で定義される）
で表すことができる。
【００２３】
（００３２）他の適当な種類のポリマー性ブロックコポリマーは、（ＢＡＳＦから）市販されているＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）界面活性剤で代表され、式：
（Ｒ−（Ｏ−Ｃ２Ｈ４）ｕ−（Ｏ−Ｃ３Ｈ６）ｖ）２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（（−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−）ｖ−（−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−）ｕ−Ｈ）２      （６）
で表される。
【００２４】
（００３３）本明細書で用いられる「ＰＬＵＲＯＮＩＣ」または「ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ」は、式（１）で定義したブロックコポリマーを意味し、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）トリブロックコポリマー界面活性剤、ジブロック界面活性剤、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）界面活性剤、および定義した他のブロックコポリマー界面活性剤が含まれる。
【００２５】
（００３４）好ましい実施形態のコーティングでは、不安定リンカーがコポリマーと生物活性物質とを接続する。不安定リンカーは特定のメカニズムに曝されると選択的に切断され得る結合である。メカニズムの例には、加水分解、放射線、超音波、酵素によるもの、イオンによるもの、拡散、バリア介在性の拡散、競合的置換、およびリポソームの破壊が含まれるがそれだけには限定されない。不安定リンカーの構造は、切断のメカニズムに依存する。以前に開示されたように、特異的な官能基が親水性領域の遊離末端に結合して、末端基が活性化されたポリマーを形成する。特異的な官能基（Ｒ）は、最終的には、好ましい実施形態におけるコポリマーと生物活性物質との間の不安定リンカーとなる。
【００２６】
（００３５）多くの病的状態によりある種のプロテアーゼが産生またはアップレギュレーションされるようになるので、プロテアーゼに感受性のリンカーが特に有用である。こういったプロテアーゼによる切断を受けやすいリンカーを介して、薬物または治療用分子を医療デバイスに連結することにより、有害状態の開始または変化に応答して薬物を放出するデバイスを作製することができる。このように、このデバイスはフィードバック方式で働き、必要とされるときにのみ薬物を放出する。状態の変化に応答してより多くまたはより少ない薬物を放出するメカニズムを備えることも可能である。さらに、より遅い速度または速い速度で分解される配列を得るために、プロテアーゼ切断部位に隣接するアミノ酸残基を変えることが可能である。このことによって、デバイスがおかれる環境に対するリンカーの感受性を制御することにより、特定の条件に対する薬物溶出材料のフィードバック応答を微調整または制御することができるようになる。
【００２７】
（００３６）１例として、本発明は、動脈の炎症状態の増大に応答して抗炎症薬を放出するメカニズムを有するコーティングが施されたステントを製造するのに有用である。炎症は、ステントを埋め込んだ後の再狭窄において非常に重大な役割を果たすことが知られている。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、この過程の重要な部分であり、損傷に対する動脈の応答において重要な役割を果たしている。ＭＭＰ−９は、動脈損傷
の結果示差的にアップレギュレーションされ、ステント埋め込み後に実質的に増大することがわかっている。本発明は、ＭＭＰ−９の基質であるリンカーを介してステントの表面に抗炎症薬を連結する手段を提供するであろう。埋め込み後、組織の環境から炎症のレベルが許容できないほど上昇したとのシグナルが送られた場合／とき、抗炎症薬が放出されることになろう。
【００２８】
【表１】
2007508912.tif 000008
2007508912.tif 000009
【００２９】
（００３７）好ましい１実施形態では、特異的な官能基（Ｒ）は、ヒドラジン基、マレイミド基、チオピリジル基、チロシン残基、ビニルスルホン基、ヨードアセトイミド基、ジスルフィド基、または水性環境で安定でありコポリマーの表面上への吸着を大幅には妨害しない任意の他の反応基などの反応基のメンバーを含むことができる。
【００３０】
（００３８）Ｒは、金属イオンと結合するとヒスチジンタグの付いたタンパク質と強力な結合を形成するニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基など、タンパク質とイオン性の相互作用を生ずることのできる官能基からなるものでもよい。ＮＴＡで修飾されたＰｌｕｒｏｎｉｃｓは、本願に援用されるスチュワードら（Steward et al.）への米国特許第６９８７４５２号に記載されている。
【００３１】
（００３９）Ｒは、オリゴヌクレオチドでタグ付けされたタンパク質に結合することのできるオリゴヌクレオチドからなるものでもよい。オリゴヌクレオチドで修飾されたＰＬＵＲＯＮＩＣＳは、本願に援用されるネフら（Neff et al. ）へのＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０３３４１号に記載されている。
【００３２】
（００４０）好ましい１実施形態では、Ｒ基はＲ’−Ｓ−Ｓ基からなり、Ｒ’は生物活性物質の固定化のために置き換えるためのものである。したがって、好ましい実施形態の不安定リンカーは、ジスルフィド結合からなる。置換基Ｒ’は、（１）２−ベンゾチアゾリル、（２）５−ニトロ−２−ピリジル、（３）２−ピリジル、（４）４−ピリジル、（５）５−カルボキシ−２−ピリジル、および（６）（２）から（５）のうち任意のもののＮ−オキシドからなる群から選択される。好ましい末端基は、２−ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）である。これらの基とタンパク質およびポリペプチドとの反応性は、カールソンら（Carlsson et al. ）への米国特許第４１４９００３号明細書およびアクセンら（Axe n et al. ）への米国特許第４７１１９５１号明細書（いずれも本願に援用される）で
論じられている。上記に記載したように、末端基が活性化されたポリマー（ＥＧＡＰ）は、一般に、ブロックコポリマーのバックボーンと活性化基または反応性基とからなるある種の組成物である。
【００３３】
（００４１）好ましい実施形態には、生物活性物質の送達に影響を与えるためのＥＧＡＰコーティングの使用が含まれうる。この点では、好ましい実施形態のコーティングの第２の成分は、ＥＧＡＰの活性化された末端基を介して材料に結合する生物活性物質であってよい。本明細書で用いられる用語「生物活性物質」は、薬剤もしくは薬物、または治療効果のある他の物質などのあらゆる物質を意味するものである。一般的には、生物活性物質は、薬剤、タンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、オリゴヌクレオチド、タンパク質断片、タンパク質類似体、抗体、炭化水素、または他の天然もしくは合成の分子であってよい。タンパク質は、天然の供給源から得られたものでも、組換え生産されたものでもよい。さらに、これらのタンパク質の活性領域が同定されており、その領域を含む組換え生産されたフラグメントが使用されてもよい。ある１実施形態では、ＥＧＡＰ材料を使用して一表面上に複数の生物活性物質を固定化することができる。タンパク質の固定にＥＧＡＰを使用することは、カルドウェルら（Caldwell et al. ）により既に報告されている。しかし、カルドウェルらは、特異的なタンパク質−タンパク質相互作用および表面への細胞の付着を評価または促進する目的で、ＥＧＡＰを使用して生物学的に活性な表面を調製した［ネフ（Neff）、１９８８年  ＃１２；ネフ（Neff）、１９９９年  ＃１１；ウェブ（Webb）、２０００年  ＃８；リ（Li）、１９９６年  ＃１５；バシンスカ（Basinska）、１９９９年  ＃２１］。
【００３４】
（００４２）あるいは、好ましい実施形態のコーティングの生物活性物質成分は、体液から特定の成分を除去することのできる治療物であってもよい。例えば、血液から特定の成分を除去するために、第２の成分が抗体であってもよい。
【００３５】
（００４３）本発明を用いて送達することができる生物活性物質には、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（membrane cofactor protein ）（ＭＣＰ）、コンプスタチン（compstatin）、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、補体タンパク質のオリゴヌクレオチド阻害物質、ＶＣＰ、およびＳＰＩＣＥを含めた補体活性化調節因子；抗血栓薬、繊維素溶解薬、血栓溶解薬、トロンビン阻害薬、抗血小板薬を含めた凝固または血栓の調節物質；血管収縮阻害薬、血管拡張薬、高血圧治療薬、カルシウムチャンネル阻害薬、有糸分裂阻害薬、微小管阻害薬、アクチン阻害薬、抗増殖薬、遊走阻害薬、抗がん化学療法薬、抗炎症薬および免疫抑制薬、成長因子拮抗薬およびサイトカイン拮抗薬、成
長因子、サイトカイン、走化性物質、遺伝子治療用構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗酸化薬、抗微生物薬、殺菌薬、および抗ウィルス薬が含まれるが、それらだけには限定されない。
【００３６】
（００４４）修飾されたポリマー界面活性剤は、疎水性表面上のコポリマーの疎水性領域に吸着し、コポリマーの親水性ペンダント領域および結合している生物活性物質は表面から水性の環境へと垂れ下がる（ダングリングする）。トリブロックコポリマーを例に用いて、吸着した表面を以下の式で図示することができる。
【００３７】
【化７】
2007508912.tif 000010
【００３８】
（００４５）好ましい実施形態は、ＥＧＡＰを含む水溶液に基体を浸漬コーティングすることにより形成することができる。ＥＧＡＰ材料を水、バッファー、または水と有機溶剤（アルコールなど）の組合せにおける溶液中で材料に施用する。これらのコポリマーは両親媒性であるため、水溶液から疎水性材料上に自己集合する。疎水性ブロックは該材料と疎水結合を形成し、親水性ブロックは流動体相中で可動性を保っている。このようにして、親水性鎖はタンパク質および細胞の吸着を妨げるブラシ様の層を表面に形成する。
【００３９】
（００４６）ＥＧＡＰ材料を基体に結合させると、該材料はアリールジスルフィドを呈示する。少なくとも１つのイオウ官能基を含んでなる生物活性物質を、ＥＧＡＰ材料を含む基体と共にインキュベートする。求核反応により、生物活性物質はジスルフィド結合によってＥＧＡＰ材料に結合する。
【００４０】
（００４７）別例として、基体をＥＧＡＰ材料で浸漬コーティングした後に生物活性物質をヘテロ２官能性架橋剤と結合させることにより、好ましい実施形態を形成することもできる。上記の手順と同様に、ＥＧＡＰ材料を、水、バッファー、または水と有機溶剤（アルコールなど）の組合せにおける溶液中で材料に施用する。ＥＧＡＰ材料を基体に結合させると、該材料は活性化された末端基を呈示する。生物活性物質をヘテロ２官能性架橋剤と共にインキュベートし、したがって、生物活性物質は架橋性官能基を呈示する。架橋剤と結合した該生物活性物質を、次いで、ＥＧＡＰ材料と共にインキュベートして活性化した末端基と反応させる。したがって、ヘテロ２官能性架橋剤上の好ましい活性官能基は、ＥＧＡＰ材料上の末端のジスルフィドと反応するためのスルフヒドリル基、ならびに生物活性物質上の利用可能な官能基との反応性を有する任意の官能基である。この架橋剤が生物活性物質の活性を変化させず、穏やかな条件下で生物活性物質と反応できれば理想的である。このような架橋剤は、多くの製造業者から市販されている。好ましい架橋剤の例には、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、およびＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）が含まれる。
【００４１】
（００４８）好ましい実施形態の利点には、無害のコーティング方法を使用すること、厳しい環境条件ではないこと、有毒化学物質がないこと、有毒廃棄物がないことが挙げられる。好ましい実施形態には、生産工程に容易に組み入れることができ、高度な熟練者を
必要としない単純なコーティング方法が組み入れられている。
【００４２】
（００４９）好ましい実施形態の組成物は、血液と接触するあらゆる医療デバイスに用いることができる。本明細書に示される用語「医療デバイス」は、ヒトまたは動物の手術の過程で身体組織および／または体液と接触する表面を有するデバイスである。この定義には、バルーンカテーテル、Ａ／Ｖシャント、人工血管、ステント、ペースメーカーのリード、ペースメーカー、心臓弁、その他の血管または心臓に埋め込まれるものなど、ヒトまたは動物の身体で血液と接触して埋め込まれる内部人工器官が含まれる。この定義の範囲には、カテーテル、ガイドワイヤ、およびその他のモニタリングまたは修復の目的で血管内または心臓内に置かれるものなど、一時的に血管内で使用するためのデバイスも含まれる。医療デバイスは、恒久的埋め込みまたは一時的埋め込みのいずれを意図してもよい。このようなデバイスは、血管内カテーテルおよび他の医療用カテーテルにより送達されてもよいし、該カテーテルの中に組み入れられてもよい。
【００４３】
（００５０）好ましい実施形態の組成物は、ＥＣＣに用いるあらゆるデバイスに使用することができる。上記に述べたように、ＥＣＣは、心肺バイパス、血漿フェレーシス、血小板フェレーシス、白血球フェレーシス、ＬＤＬ除去、血液透析、限外ろ過、および血液灌流を含むがそれだけには限定されない、多くの医学的手法で用いられる。外科で用いる体外デバイスには、血液酸素付加装置、血液ポンプ、血液センサー、血液などを運ぶのに用いられ、後で患者に戻される血液と接触するチューブ材料が含まれる。
【００４４】
（００５１）以下の開示は、好ましい方法について説明するための特定の実施例である。この実施例は、範囲を制限しようとするものではなく、むしろ好ましい実施形態を例示するためのものである。
【実施例１】
【００４５】
（実施例１（Ａ））
放出可能なＲＣＡを備えた基体の調製−方法１
（００５２）リら（Li et al. ）が記載したように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８を誘導体化して末端ＰＤＳ基を組み入れる。この、ピリジルジスルフィドで活性化したＰｌｕｒｏｎｉｃ（ＥＧＡＰ−ＰＤＳ）をｐＨ７．４の１ｍＭ  ＥＤＴＡリン酸バッファー（ＰＢ）中に溶解し、次いで、ＣＧＰＱＧ−ＩＡＧＱの配列を有するポリペプチドと混合する。反応を室温で２時間進行させ、分光光度法でピリジル２−チオンの放出を３４３ｎｍで測定して反応をモニターする。生成物を透析により精製し、凍結乾燥により回収する。この手法を用いてペプチドとＥＧＡＰ−ＰＤＳの比を変化させて多数の反応を実施し、最も高率のＥＧＡＰ誘導化をもたらす比を決定する。
【００４６】
（００５３）上述のプロテアーゼ感受性リンカーで修飾したＥＧＡＰ（ＥＧＡＰ−ＰＳＬ）を、ＰＢ中に溶解する。コーティングする基体またはデバイスを、この溶液とともに３０分から終夜インキュベートする。コーティングした基体を洗浄し、次いで、ＥＤＣとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合物の４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）溶液と共に室温で１５分間インキュベートして、ペプチドのカルボキシル末端をアミン反応性の基に転換する。基体を洗浄し、次いで、目的のＲＣＡタンパク質またはペプチドをＭＥＳに溶解したものとともに室温で２時間インキュベートする。ＲＣＡは、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）、コンプスタチン、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、ＶＣＰ、またはＳＰＩＣＥのうち任意の１つであってよい。反応が完了した後、ヒドロキシルアミン（１０ｍＭ）を加えて、表面上に残留している全てのＮＨＳを加水分解して不活性化する。
【００４７】
（００５４）表面上のＲＣＡの量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定する。
（実施例１（Ｂ））
放出可能なＲＣＡを備えた基体の調製−方法２
（００５５）１％ＥＧＡＰ−ＰＤＳのＰＢ溶液を調製する。コーティングする基体を、３０分から終夜、この溶液中に浸す。コーティングした基体をＰＢで洗浄し、次いで、ＣＧＰＱＧ−ＩＡＧＱの配列を有するポリペプチドとともにインキュベートする。反応を室温で２時間進行させる。基体をＰＢで洗浄する。
【００４８】
（００５６）修飾した基体を洗浄し、次いで、ＥＤＣとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合物の４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）溶液と共に室温で１５分間インキュベートして、ペプチドのカルボキシル末端をアミン反応性の基に転換する。基体を洗浄し、次いで、目的のＲＣＡタンパク質またはペプチドをＭＥＳに溶解したものとともに室温で２時間インキュベートする。ＲＣＡは、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）、コンプスタチン、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、ＶＣＰ、またはＳＰＩＣＥのうちの任意の１つであってよい。反応が完了した後、ヒドロキシルアミン（１０ｍＭ）を加えて、表面上に残留している全てのＮＨＳを加水分解して不活性化する。
【００４９】
（００５７）表面上のＲＣＡの量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定する。
【実施例２】
【００５０】
（実施例２（Ａ））
放出可能なＲＣＡを備えた基体の調製−方法１
（００５８）ホら（Ho et al. ）が記載したように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８を誘導体化して末端ＮＴＡ基を組み入れる。このピリジルジスルフィドで活性化されたＰｌｕｒｏｎｉｃ（ＥＧＡＰ−ＮＴＡ）を２５ｍＭ  ＮｉＳＯ４中に溶解し、３０分間インキュベートする。Ｎｉ＋＋を帯びたＥＧＡＰ−ＮＴＡ（ＥＧＡＰ−ＮＴＡ−Ｎｉ）を回収し、サイズ排除カラムを用いて過剰のＮｉＳＯ４を除去する。次いで、ＥＧＡＰ−ＮＴＡ−Ｎｉを、ＨＨＨＨＨＨＧＰＱＧ−ＩＡＧＱの配列を有するポリペプチドと混合する。反応を室温で２時間進行させる。生成物を透析により精製し、コーティングするべき基体またはデバイスとともに３０分から終夜インキュベートする。コーティングされた基体を洗浄し、次いで、ＥＤＣとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合物の４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）溶液と共に室温で１５分間インキュベートして、ペプチドのカルボキシル末端をアミン反応性の基に転換する。基体を洗浄し、次いで、目的のＲＣＡタンパク質またはペプチドをＭＥＳに溶解したものとともに室温で２時間インキュベートする。ＲＣＡは、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）、コンプスタチン、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、ＶＣＰ、またはＳＰＩＣＥのうち任意の１つであってよい。
【００５１】
（００５９）表面上のＲＣＡの量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定する。
（実施例２（Ｂ））
放出可能なＲＣＡを備えた基体の調製−方法２
（００６０）ＥＧＡＰ−ＮＴＡの１％溶液を精製水で調製する。コーティングする基体を、３０分間〜終夜、この溶液に浸す。洗浄後、室温で３０分間、基体を２５ｍＭ  ＮｉＳＯ４とともにインキュベートする。基体を洗浄し、次いで、ＨＨＨＨＨＨＧＰＱＧ−Ｉ
ＡＧＱの配列を有するポリペプチドと共に室温で２時間インキュベートする。修飾された基体を洗浄し、次いで、ＥＤＣとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合物の４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）溶液と共に室温で１５分間インキュベートして、ペプチドのカルボキシル末端をアミン反応性の基に転換する。基体を洗浄し、次いで、目的のＲＣＡタンパク質またはペプチドをＭＥＳに溶解したものとともに室温で２時間インキュベートする。ＲＣＡは、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）、コンプスタチン、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、ＶＣＰ、またはＳＰＩＣＥのうち任意の１つであってよい。
【００５２】
（００６１）表面上のＲＣＡの量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定する。
【実施例３】
【００５３】
プロテアーゼにより誘発された感受性リンカーの切断の特性決定
（００６２）実施例１Ａまたは実施例１Ｂのいずれかに記載したようにして、ポリスチレンの微小球サンプルを、ＥＧＡＰ−ＰＳＬ構築物でコーティングする。コーティングした微小球サンプルを、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−１）を含む溶液に浸してインキュベートする。
【実施例４】
【００５４】
プロテアーゼにより誘発された感受性リンカーの切断ならびにＲＣＡ放出の特性決定
（００６３）実施例１Ａまたは実施例１Ｂのいずれかで記載したようにして、デバイスまたは基体をＥＧＡＰ−ＰＳＬ−ＲＣＡ構築物でコーティングする。コーティングした基体を、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−１）を含む溶液に浸してインキュベートする。
【実施例５】
【００５５】
ＥＧＡＰ−ＰＤＳでコーティングした基体上への組換えＲＣＡ−ＰＳＬ構築物の固定化
（００６４）タンパク質またはペプチドＲＣＡをそれぞれ組換え発現または合成し、Ｎ末端にプロテアーゼ感受性リンカー（ＰＳＬ）を含むようにする。ＲＣＡは、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）、コンプスタチン、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、ＶＣＰ、またはＳＰＩＣＥのうち任意の１つであってよい。プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼの切断標的である配列と、Ｎ末端付近に少なくとも１つのシステイン残基とを含むことになる。このようなペプチド配列の１例として、マトリックスメタロプロテイナーゼの標的であるＣＧＰＱＧ−ＩＡＧＱがある。基体をＥＧＡＰ−ＰＤＳでコーティングし、次いで、ＲＣＡ−ＰＳＬ構築物のＰＢ溶液とともに室温で２時間インキュベートする。基体を洗浄し、表面に結合したＲＣＡの量を、ＥＩＡにより測定する。
【実施例６】
【００５６】
ＥＧＡＰ−ＮＴＡでコーティングした基体上への組換えＲＣＡ−ＰＳＬ構築物の固定化
（００６５）タンパク質またはペプチドＲＣＡをそれぞれ組換え発現または合成し、Ｎ末端にプロテアーゼ感受性リンカー（ＰＳＬ）を含むようにする。ＲＣＡは、Ｈ因子、Ｈ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）、Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ−３、ＦＨＲ−４）、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）、コンプスタチン、補体タンパク質のモノクローナル抗体阻害物質、ＶＣＰ、またはＳＰＩＣＥのうち任意の１つであってよい。プロ
テアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼの切断標的である配列と、Ｎ末端にポリヒスチジンのタグとを含む。このようなペプチド配列の１例として、６ヒスチジンのタグが付いたＭＭＰの標的であるＨＨＨＨＨＨＧＰＱＧ−ＩＡＧＱがある。基体をＥＧＡＰ−ＮＴＡでコーティングし、次いで、５０ｍＭ  ＮｉＳＯ４と共に室温で３０分間インキュベートする。基体を洗浄し、次いでＲＣＡ−ＰＳＬ構築物のＰＢ溶液と共に室温で２時間インキュベートする。基体を洗浄し、表面に結合したＲＣＡの量を、ＥＩＡにより測定する。
【実施例７】
【００５７】
ＥＧＡＰを有する基体上へのＨ因子の固定化
（００６６）ＥＧＡＰ−ＰＤＳでコーティングした基体またはデバイスに、Ｈ因子を結合する。Ｈ因子はシステイン残基を多く含んでおり、そのうちのいくつかはＰＤＳ基を介して結合する部位として役立つ可能性がある［３３］。基体またはデバイスの表面上でＨ因子とＥＧＡＰとが組み合わさることにより、補体の活性化をダウンレギュレーションするように作用する。
【００５８】
（００６７）０．１〜４％のＥＧＡＰを含む水溶液またはバッファー塩を含む水溶液でデバイスまたは基体の表面を覆うことにより、該デバイスをＨ因子でコーティングする。これは、例えば、浸漬コーティング法を用いて遂行してもよい。３０分間から２４時間コーティングした後、水またはバッファーを用いて基体を洗浄する。Ｈ因子をｐＨ７．５のリン酸バッファー中に希釈し、次いでコーティングした基体に加える。２〜２４時間インキュベートした後、基体をバッファーで洗浄する。比較のために以下の対照を調製する。（１）基体を非修飾Ｆ１０８でコーティングし、続けて上記に記載したようにＨ因子とともにインキュベートし洗浄する、（２）基体をいかなる初期コーティングでも処理せずに、上記に記載したようにＨ因子と共にインキュベートし洗浄する、（３）基体を非修飾Ｆ１０８のみでコーティングする、（４）基体を非処理のままとする。それぞれの表面に結合したＨ因子の量を、市販のビオチン化抗Ｈ因子抗体と、検出用にＨＲＰで修飾したストレプトアビジンとを組み合わせて用いて、酵素免疫測定法により測定する。
【００５９】
（００６８）それぞれの基体を評価して、表面に結合したＨ因子が、全血、血漿、または血清と接触したときに補体の活性化を阻害する能力を測定する。これを遂行するために、２種類のアッセイを行う。一方は表面に何が付着しているかを決定するための表面の分析であり、他方は補体カスケードに関与する特定のタンパク質が活性化されているか否かを決定するための血液の分析である。基体に結合したＣ−３フラグメントの量は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で測定する。血液と基体の間の表面が接触した結果生成される流動体相のＣ３ａ、Ｃ１ｓ−Ｃ１ＮＡ、およびｓＣ５ｂ−９複合体の量は、ＥＩＡを用いてモニターする。
【００６０】
（００６９）以前の研究で、Ｈ因子は補体の活性化をダウンレギュレーションするために材料に施用できることが見出された。しかし、Ｈ因子を材料に結合させるのに用いられた方法は、それ自体が、補体を活性化するものであった。ＥＧＡＰ材料で材料をコーティングすると、Ｈ因子に結合するのに必要な部位を生成するが、補体の活性化を促進するわけではない。逆に、血液と接触するデバイスに施用されるポリスチレン（ＰＳ）および他の殆どの材料よりも生物学的活性の低い表面を生成する。
【００６１】
（００７０）以前に別の方法を用いて達成されたよりも多量の生物学的に活性なＨ因子を材料の表面に結合することが可能であると予想される。以前の研究では、ピリジルジスルフィド基またはスルフヒドリル基のいずれかを呈示する表面に結合したＨ因子の量を比較した。いずれの表面も、ポリアミンで修飾したＰＳをＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させて調製し、後者は続けて表面をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理して得られた。より大量のＨ因子が、ＳＰＤＰのみ
で修飾された材料と結合することがわかった。にもかかわらず、全体の生物学的活性はより低かった。これらの結果より、２つの表面上のＨ因子の立体配座が異なること、およびＳＰＤＰ修飾された表面では結合したＨ因子の生物学的活性の低下が引き起こされたことが示唆される。ＰＤＳ基はＨ因子の遊離システインに対する反応性がより高く、より高い結合効率をもたらす可能性がある。しかし、ＳＰＤＰ修飾された表面は、疎水性も高くなるようであり、この理由から、非特異的に結合するタンパク質の量が多くなり、かつタンパク質と材料との間の高い界面張力ゆえにＨ因子の活性が低下することになり得る。本明細書に記載されたＥＧＡＰの手法を用いると、ＰＤＳ基を材料の表面に組み入れることによって高い結合効率が達成されつつも、疎水性または変性作用を有する可能性がある表面を生成することはない。
【００６２】
（００７１）ＥＧＡＰを用いてＨ因子を材料に結合させると、該タンパク質と材料との間に柔軟なスペーサーが組み入れられることにより立体障害が減少する。このことにより、Ｈ因子が血液中または血漿中の標的タンパク質に結合するために接近しやすくなる。
【００６３】
（００７２）ＥＧＡＰコーティングにより、材料の表面に、Ｈ因子を材料から効果的に保護する高度に水和したブラシ様の層が生成される。これにより変性が防止され、天然タンパク質の立体配座および活性が保たれる。
【００６４】
（００７３）ＥＧＡＰコーティングは、非特異的なタンパク質の吸着を防止する。血液および血漿には、人工の材料に吸着すると補体の活性化を促進しうるタンパク質が多く存在する。例えば、フィブリノーゲンが材料の表面に吸着すると、活性化シグナルを発するような立体配座に変化するが、ＥＧＡＰはこのタイプの相互作用を防ぐことによって免疫系活性化のリスクを最小とする。Ｈ因子はＥＣＣ処置の間に起こり得るあらゆる活性化をダウンレギュレーションすることができるので、この系がＨ因子と組み合わさると、初期の活性化を防止し、ひいては予備的支援を組み入れることになる。
【実施例８】
【００６５】
スルフヒドリル反応基を組み入れるためのＨ因子の誘導
（００７４）Ｈ因子を、７〜６７％の範囲の様々な濃度のＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と共に室温で１時間インキュベートした。結合していないＳＰＤＰを、透析によって除去した。ＳＰＤＰで修飾されたＨ因子サンプルの活性を測定し、Ｈ因子がＩ因子の補助因子として働く能力を測定することにより非修飾のＨ因子の活性と比較した。Ｉ因子はＣ３ｂを切断して不活性のＣ３ｂ（ｉＣ３ｂ）にし、次いでＣ３ｃおよびＣ３ｄｇにすることにより不活性化する、別の補体活性調節因子である。このＩ因子の機能は、活性Ｈ因子の存在に依存する。修飾されたＨ因子の様々な溶液の活性を、Ｃ３ｂおよびＩ因子と組み合わせ、続いて以下のようにＣ３ｂの分解レベルを測定することにより決定した。１０μｇのＣ３ｂと０．６μｇのＩ因子のアリコートを、０．５、１、および２μｇの濃度のＨ因子サンプルとともに３７℃で６０分間インキュベートした。還元性の電気泳動サンプルバッファー中でサンプルを煮沸して反応を停止した。次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。不消化のＣ３ｂを１０μｇ含むアリコートを、対照としてそれぞれのゲルに加えた。ゲルをクーマシー染色し、スキャンし、ＮＩＨ−ｉｍａｇｅ  ｑｕａｎｔ（ソフトウェア名）を用いて各サンプル中のＣ３ｂの不消化α’鎖の量を評価した。
【００６６】
（００７５）結果を図１に示す。ＳＰＤＰのＨ因子に対する比、および各データポイントで試験したサンプルの数を凡例に示す。結果より、Ｈ因子は７％ＳＰＤＰで処理した後は影響を受けないが、高濃度では徐々に活性を失うことが示される。ＳＰＤＰ２８％またはそれより高い濃度では、完全に不活性のＨ因子が得られるが、２５％〜７％の濃度では部分的な不活性が得られる。
【実施例９】
【００６７】
（実施例９Ａ）
ＥＧＡＰおよびヘテロ２官能性架橋剤を用いた基体上へのＨ因子の固定化
（００７６）ヘテロ２官能性架橋剤を用いてＨ因子を活性化し、次いでＥＧＡＰでコーティングした基体またはデバイスに結合させる。基体またはデバイスの表面上でＨ因子とＥＧＡＰとが組み合わさることにより、補体の活性化をダウンレギュレーションするように作用する。
【００６８】
（００７７）０．１〜４％ＥＧＡＰを含む水またはバッファー溶液でデバイス表面を覆うことにより、デバイスまたは基体をＨ因子でコーティングする。これは、例えば、浸漬コーティング法を用いて遂行してもよい。３０分〜２４時間のコーティングの後、基体を水または緩衝塩を含む水を用いて洗浄する。例えばアミン基との反応性を有し、ＥＧＡＰ上に存在するピリジルジスルフィド基（ＰＤＳ）と直接結合させるのに用いることのできる官能基を備えたヘテロ２官能性架橋剤を用いて、Ｈ因子を活性化する。市販のこのような架橋剤の１つにＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）がある。この架橋剤は、該タンパク質上に、還元されてＥＧＡＰと直接反応するスルフヒドリル基を生じることができる、ピリジルジスルフィド基を組み入れる。Ｈ因子を、ｐＨ７．５のリン酸バッファー中でＳＤＰＤと３０〜６０分間反応させ、次いでＰＤ−１０カラムを用いて精製する。活性化されたタンパク質を、２５ｍＭ  ＤＴＴのｐＨ４．５酢酸バッファー溶液で処理する。ＰＤ−１０カラムを用いて精製し、このカラムでｐＨ７．５リン酸バッファーへの交換も実施する。生成物を、ＥＧＡＰでコーティングした基体で２〜２４時間インキュベートし、続けてバッファーで洗浄する。対照は、実施例１に記載したように調製する。表面に結合したＨ因子の量を、市販のビオチン化抗Ｈ因子抗体と検出用にＨＲＰで修飾したストレプトアビジンとを組み合わせて用いて、酵素免疫測定法により測定する。
【００６９】
（００７８）修飾された基体を評価して、表面に結合したＨ因子が、実施例１に記載された全血、血漿、または血清と接触するときに補体の活性化を阻害する能力を測定する。
（実施例９Ｂ）
ＥＧＡＰおよびヘテロ２官能性架橋剤を用いた基体上へのＨ因子の固定化
（００７９）ヘテロ２官能性架橋剤であるＳＰＤＰを用いてＨ因子を活性化し、次いでＥＧＡＰでコーティングした基体に結合させた。ＥＧＡＰを用いて、Ｈ因子を用量依存的に固定化することが可能であった。
【００７０】
（００８０）１％のＥＧＡＰを含む水溶液で基体を覆うことにより、Ｈ因子で基体をコーティングした。２４時間のコーティングの後、基体を水で洗浄した。同じ手順を用いＥＧＡＰの代わりにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８を用いて、対照のサンプルを調製した。アミン基に対する反応性を有し、ＥＧＡＰ上に存在するピリジルジスルフィド基（ＰＤＳ）と直接結合させるのに用いることのできる官能基を備えたヘテロ２官能性架橋剤を用いて、Ｈ因子を活性化した。この実施例では、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いた。Ｈ因子を、ＳＤＰＤのｐＨ７．５のＰＢＳ溶液と３０〜６０分間反応させ、次いでＰＤ−１０カラムを用いて精製した。該架橋剤は、該タンパク質上にピリジルジスルフィド基を効率よく組み入れた。ＥＧＡＰでコーティングした表面を、２５ｍＭ  ＤＴＴと３０分間インキュベートして還元し、次いで、表面を空気に曝さないよう注意しながら洗浄した。洗浄の直後、基体を、ＳＰＤＰで修飾した様々な濃度のＨ因子と２〜２４時間反応させ、最後にバッファーで洗浄した。表面に結合したＨ因子の量を、ビオチン化抗Ｈ因子抗体と検出用にＨＲＰで修飾したストレプトアビジンとを組み合わせて用いて、酵素免疫測定法により決定した。
【００７１】
（００８１）結果を図２に示したが、Ｈ因子が効率よく用量依存的に表面に結合することが示されている。Ｆ１０８でコーティングした対照サンプルに結合したＨ因子のレベルが低いことから（図３（Ｅ）を参照）、ＥＧＡＰでコーティングした表面への結合は、ＥＧＡＰ上の官能基により特異的に媒介されることが明らかである。
【００７２】
（００８２）以前の研究で、補体の活性化をダウンレギュレーションするためにＨ因子を材料に施用できることが見出された。しかし、Ｈ因子を材料に結合させるのに用いられた方法は、それ自体が補体を活性化させるものであった。ＥＧＡＰで材料をコーティングすると、Ｈ因子に結合するのに必要な部位を生成するが、補体の活性化を促進するわけではない。逆に、血液と接触するデバイスに施用されるポリスチレン（ＰＳ）および他の殆どの材料よりも生物学的活性の低い表面が得られる。
【００７３】
（００８３）ＥＧＡＰを用いて、以前に別の方法を用いて達成したよりも多量の生物学的に活性なＨ因子を材料の表面に結合させることが可能であることが予想される。以前の研究では、ピリジルジスルフィド基またはスルフヒドリル基のいずれかを呈示する表面に結合したＨ因子の量を比較した。いずれの表面も、ポリアミンで修飾したＰＳをＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させて調製し、後者は、続けて表面をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理して得られた。より大量のＨ因子が、ＳＰＤＰのみで修飾された材料と結合することがわかった。にもかかわらず、全体の生物学的活性はより低かった。これらの結果より、２つの表面上のＨ因子の立体配座が異なること、およびＳＰＤＰで修飾された表面では結合Ｈ因子の生物学的活性の低下が引き起こされたことが示唆される。ＰＤＳ基はＨ因子の遊離チオールに対する反応性がより高く、より高い結合効率をもたらす可能性がある。しかし、ＳＰＤＰで修飾された表面は、疎水性も高くなるようであり、この理由から、非特異的に結合するタンパク質の量が多くなり、タンパク質と材料との間の界面張力が強いゆえにＨ因子の活性が低下することになり得る。本明細書に記載されたＥＧＡＰの手法を用いると、非常にすぐれた反応性で官能基を材料表面に組み入れることが可能であり、それによって高い結合効率が達成されつつも、疎水性または潜在的に変性作用を有する表面を生成することはない。
【００７４】
（００８４）ＥＧＡＰを用いてＨ因子を材料に結合させると、該タンパク質と材料との間に柔軟なスペーサーが組み入れられることにより立体障害が減少する。これにより、Ｈ因子が血液中または血漿中の標的タンパク質に結合するためにより接近しやすくなる。さらに、ＥＧＡＰコーティングにより、Ｈ因子を材料から効果的に保護する、高度に水和したブラシ様の層が、材料の表面に生成される。これにより変性が防止され、天然タンパク質の立体配座および活性が保たれる。
【実施例１０】
【００７５】
ＥＧＡＰおよびＳＡＴＡ架橋剤を用いたＨ因子の固定化
（００８５）ヘテロ２官能性架橋剤であるＳＡＴＡを用いてＨ因子を活性化し、次いでＥＧＡＰでコーティングした基体またはデバイスに結合させた。このＥＧＡＰ−Ｈ因子コーティングは、ポリスチレン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、酢酸セルロース（ＣＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、シリコーン、およびポリウレタン（ＰＵ）を含めた様々な種類の材料に効率よく施用された。
【００７６】
（００８６）１％ＥＧＡＰを含む水溶液で表面を覆うことにより、Ｈ因子で基体またはデバイスをコーティングした。同じ手順を用いＥＧＡＰの代わりにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８を用いて対照サンプルを調製した。比較のためにコーティング未実施（ＵＮ）サンプルも含めた。２４時間のコーティング時間の後、基体をバッファーで洗浄した。ヘテロ２官能性架橋剤であるＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（ピアスサイエンティフィック（Pierce Scientific ））を用いて、Ｈ因子を活性化した。
この架橋剤のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル部分がＨ因子のアミン基と反応し、ＥＧＡＰ上に存在するピリジルジスルフィド基と直接結合させるのに用いることのできる保護されたスルフヒドリル基を組み入れる。ＳＡＴＡをＤＭＳＯ中に溶解し、次いで、Ｈ因子のｐＨ７．５ＰＢＳ溶液と３０〜６０分間反応させた。ＰＤ−１０カラムを用いて、活性化したＨ因子を精製した。次いで、Ｈ因子上の修飾された基を、ヒドロキシルアミンで処理することにより脱アセチル化して保護基を除去した。ＰＤ−１０カラム上で最終精製を行った。ＥＧＡＰでコーティングした基体を、修飾したＨ因子とともに終夜インキュベートし、次いでバッファーで洗浄した。表面に結合したＨ因子の量を、ビオチン化抗Ｈ因子抗体と検出用にＨＲＰで修飾したストレプトアビジンとを組み合わせて用いて、酵素免疫測定法により測定した。結果を図３に示したが、ＥＧＡＰ−Ｈ因子コーティングは、ポリエーテルエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＥ）、酢酸セルロース（ＣＡ）、およびポリスチレン（ＰＳ）を含めた様々な種類の材料に効率よく施用されたことが示される。
【実施例１１】
【００７７】
ＥＧＡＰおよびＨ因子でコーティングされた基体における補体活性化の低減
補体の活性化をＣ３Ａの生成により測定する
（００８７）ヘテロ２官能性架橋剤を用いてＨ因子を活性化し、次いでＥＧＡＰでコーティングした基体に結合させた。コーティングした基体および対照をヒト血清とともにインキュベートし、生成したＣ３ａの量を測定することにより補体活性化のレベルを評価した。ＥＧＡＰ−Ｈ因子でコーティングした基体では、対照に比べて補体活性化が低減された。さらに、ＥＧＡＰでコーティングした基体もＦ１０８でコーティングした基体も、非処理の基体より補体活性化が低減された。
【００７８】
（００８８）９６ウェルのポリスチレンプレートの各ウェルに１％ＥＧＡＰのＰＢＳ溶液３００μＬを加え、プレートを終夜室温で振盪機に入れておくことによりＨ因子でコーティングした。コーティング後、基体をＰＢＳで洗浄した。Ｈ因子を、３．５重量％ＳＰＤＰのＰＢＳ（ｐＨ７．５）溶液と１時間反応させ、次いで透析により精製した。ＥＧＡＰでコーティングした基体を、２５ｍＭ  ＤＴＴで１時間処理した。ＤＴＴを除去し、基体を空気に曝さないよう注意しながらプレートをＰＢＳ／ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）で洗浄した。洗浄後、基体を直ちにＳＰＤＰで活性化したＨ因子（１００μｇ／ｍＬ）と４℃で終夜反応させた。Ｈ因子溶液を除去し、基体をＰＢＳで洗浄した。対照として以下の基体、すなわち、非処理のＰＳ、Ｆ１０８でコーティングしたポリスチレン（結果は示さず）、ＥＧＡＰでコーティングしたＰＳ、ＥＧＡＰでコーティングした後で天然Ｈ因子と共にインキュベートしたＰＳを用いた。全ての基体を、１時間を上限として様々な時間、ヒト血清と共にインキュベートした。各インキュベーション時間の終わりに、血清にＥＤＴＡを加えて、それ以上補体が活性化されるのを止めた。各血清サンプル中のＣ３ａの量を、酵素免疫測定法により測定した。
【００７９】
（００８９）結果を下記の図４に示すが、ＥＧＡＰ−Ｈ因子コーティングは、対照に比べてＣ３ａの生成を効果的に阻害することが示されている。さらに、ＥＧＡＰコーティングのみでも、コーティングなしの基体に比べてＣ３ａの生成が低減された。
【実施例１２】
【００８０】
Ｈ因子のステンレス鋼およびニチノール上ヘの固定化
（００９０）ヘテロ２官能性架橋剤であるＳＡＴＡを用いてＨ因子を活性化し、次いで前処理してからＥＧＡＰでコーティングしたステンレス鋼デバイス上に結合させた。Ｈ因子は、ＥＧＡＰを介して有効にステンレス鋼に結合した。
【００８１】
（００９１）ステンレス鋼およびニチノールのステントデバイスを清浄にし、かつ／ま
たは前処理し、続いて実施例４に記載したようにＥＧＡＰおよびＨ因子でコーティングした。同じ手順を用いＥＧＡＰの代わりにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８を用いて対照サンプルを調製した。実施例４に記載したように、ＳＡＴＡを用いてＨ因子を活性化した。ＥＧＡＰでコーティングした基体を、修飾したＨ因子とともに終夜インキュベートし、次いでバッファーで洗浄した。表面に結合したＨ因子の量を、実施例４で記載したように酵素免疫測定法により決定した。ステンレス鋼の結果を図５に示すが、ＥＧＡＰ−Ｈ因子コーティングが該金属基体に有効に施用されたことが示されている。さらに、Ｆ１０８でコーティングしたステンレス上で測定されたＨ因子の量が少量であることから、ＥＧＡＰでコーティングした基体への結合は、ＥＧＡＰ上のＰＤＳ官能基により特異的に媒介されることが明らかである。
【実施例１３】
【００８２】
ＥＧＡＰおよび非修飾Ｆ１０８を用いた基体上へのＨ因子の固定化
（００９２）ＥＧＡＰと非修飾Ｆ１０８との組合せでコーティングした基体またはデバイスに、Ｈ因子を結合させる。Ｈ因子が結合する反応部位の数を変化させ、さらには基体またはデバイス上のＨ因子の表面密度を変化させるために、ＥＧＡＰと非修飾Ｆ１０８の比を変化させている。Ｈ因子の最適密度は、基体が補体の活性化をダウンレギュレーションする能力を測定することにより決定する。可能な最高密度のＨ因子がこのシステムに最適である可能性があるにもかかわらず、興味を呼ぶ可能性のあるペプチドおよび合成の補体制御因子の多くは、いくつかの有益な作用とともに、血小板および白血球などの関連のある血液成分に対し何らかの有害作用または未知の作用を有する可能性もある。このＥＧＡＰの手法は、このような相互作用を決定し、濃度がどのように該相互作用をもたらすかを決定するのに最適のシステムを提供する可能性がある。さらに、タンパク質は、組換えで生成されたものであれ天然供給源からの精製によって生成されたものであれ、最も高価なコーティング成分である。このため、望ましいレベルの性能を達成するために使用することができるタンパク質の最少量を決定することは有益である。このシステムにより、このレベルを効果的に決定し、引き続きこのレベルを高い信頼性をもって再現する方法がもたらされる。
【００８３】
（００９３）界面活性剤の全濃度が１％であり、以下の比率（０：１００、５：９５、１０：９０、２５：７５、５０：５０、７５：２５、１００：０）のＦ１０８とＥＧＡＰを含む一連の溶液をＰＢＳで調製する。基体を、これらの溶液で２４時間コーティングし、続いてＰＢＳで洗浄する。Ｈ因子をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中に希釈し、次いでコーティングした基体に加える。２〜２４時間のインキュベーションの後、基体をバッファーで洗浄する。各基体に結合しているＨ因子の量を、市販のビオチン化抗Ｈ因子抗体と検出用にＨＲＰで修飾したストレプトアビジンとを組み合わせて用いて、酵素免疫測定法により測定する。
【００８４】
（００９４）実施例５に記載したように、各基体を評価して、全血、血漿、または血清と接触したときに表面に結合しているＨ因子が補体活性化を阻害する能力を測定する。
【実施例１４】
【００８５】
ＥＧＡＰを用いた２以上の治療物の基体上への固定化
（００９５）この実施例では、ＥＧＡＰを用いて２以上の治療物を基体またはデバイス上に固定化するが、ここで各治療物は免疫系または止血系の異なる成分に影響を及ぼす。例えば、補体調節因子を凝固調節因子と組み合わせてもよい。ＥＧＡＰは、このような２つの因子を同時に固定化する簡単な方法を提供し、固相から２以上の治療用物質を送達する際に明らかに非常に重要であろうこれらの因子の比および密度を制御することを可能にする可能性がある。
【００８６】
（００９６）末端基の活性化の過程により異なる種類の末端官能基が生じる、２以上の種類のＥＧＡＰを調製する。これらをＥＧＡＰ−ＡおよびＥＧＡＰ−Ｂと呼ぶ。ＴＡおよびＴＢと呼ばれる２以上の治療物を、それぞれＥＧＡＰ−ＡおよびＥＧＡＰ−Ｂと優先的に反応するように修飾する。ＥＧＡＰ−ＡおよびＥＧＡＰ−Ｂを、ＥＧＡＰの全濃度を１％としてＰＢＳ中で予め決定した比率で組み合わせる。基体をこれらの溶液で２４時間コーティングし、引き続きＰＢＳで洗浄する。ＴＡをＥＧＡＰ−Ａに結合するのに必要とされるバッファー条件が、ＴＢをＥＧＡＰ−Ｂに結合するのに必要とされる条件と同じ場合は、ＴＡおよびＴＢをバッファー中に希釈し、コーティングした基体に同時に加える。異なるバッファー条件が必要とされる場合は、ＴＡおよびＴＢを順次基体に加える。対照を、実施例２に記載したように調製する。各表面に結合したＴＡおよびＴＢの量は、酵素免疫測定法により測定する。
【００８７】
（００９７）各基体を評価して、実施例２に記載したように、基体が全血と接触したときに、組み合わさって表面に結合しているＴＡおよびＴＢが補体活性化を阻害する能力を測定する。
【実施例１５】
【００８８】
ＥＧＡＰを用いた補体活性化制御因子および免疫捕捉剤の基体上への固定化
（００９８）この実施例では、ＥＧＡＰを用いて補体活性化制御因子および免疫捕捉剤（immunocapture agent ）で基体またはデバイスをコーティングする。免疫捕捉剤の目的は、自己免疫抗体、免疫グロブリン、免疫複合体、腫瘍抗原、または低密度リポタンパク質などの不用な成分を血液から除去することである。
【００８９】
（００９９）１変形形態では、実施例５に記載したようにして、補体活性化制御因子とともに免疫捕捉剤を固定する。他の変形形態では、デバイスの一部分をＥＧＡＰ／免疫捕捉剤でコーティングし、デバイスの別の一部分をＥＧＡＰ／補体活性化抑制因子でコーティングする。後者の変形形態では、デバイスを、実施例２に記載したようにＥＧＡＰでコーティングする。次いで、デバイスの第１の選択領域を、浸漬コーティングまたは該デバイスの包含される領域にタンパク質溶液を制御状態で添加することのいずれかにより、免疫捕捉剤を含む溶液と共にインキュベートする。次いで、第２の選択領域を、補体活性化制御因子を含む溶液で同様に処理する。
【実施例１６】
【００９０】
基体上への治療物および非修飾Ｆ１０８のコーティング
（０１００）この実施例では、前述の実施例のうちいずれかにおいて記載した１または複数の治療物で、デバイスの１領域をコーティングする。デバイスの残りの領域を、非修飾Ｆ１０８でコーティングする。
【００９１】
（０１０１）上記に記載した様々な方法および技術により、本発明を行うための数々の方法が提供される。言うまでもなく、記載された目標または利点は、全てが必ずしも本明細書に記載される任意の特定の実施形態によって達成されなくてもよいことを理解されたい。したがって、例えば、当業者であれば、この方法が、本明細書に教示される１または複数の利点を実現または最適化し、本明細書で教示または示唆されうる他の目標または利点を必ずしも実現しないやりかたで行うことができることを理解するであろう。
【００９２】
（０１０２）さらに、当業者であれば、様々な実施形態に由来する様々な特徴を相互交換可能であることを理解するであろう。同様に、当業者であれば、上記で論じた様々な特徴および工程、ならびにこのような特徴または工程のそれぞれについての他の周知の同等物を混合し調和させて、本明細書に記載された原理に従って方法を実行することができる。
【００９３】
（０１０３）本発明について、ある種の実施形態および実施例に照らして開示してきたが、当業者であれば、本発明は具体的に開示された実施形態を超えて他の代替実施形態および／または使用、ならびにそれらの明らかな修正形態および同等物にまで拡張されることを理解するであろう。したがって、本発明は、本明細書の好ましい実施形態を具体的に開示することにより制限しようとするのではなく、本明細書に添付した特許請求の範囲を参照することにより制限されるべきものである。
【００９４】
（０１０４）以降に挙げる参照文献は、本明細書の他の場所で参照されるあらゆる他の特許文献または出版物と同様、すべて全文が参照として本明細書に援用される。
【００９５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】非修飾Ｈ因子、および様々な濃度のＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＳＤ）で誘導したＨ因子の活性を示すグラフ。
【図２】末端基を活性化したポリマー（ＥＧＡＰ）を用いて、Ｈ因子を用量依存的にポリスチレン（ＰＳ）と結合させた結果として相対的吸光度を示すグラフ。
【図３Ａ】Ｈ因子をポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）上に固定化した結果として相対的吸光度を示すグラフ。
【図３Ｂ】Ｈ因子をポリウレタン（ＰＵ）上に固定化した結果として相対的吸光度を示すグラフ。
【図３Ｃ】Ｈ因子をポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）上に固定化した結果として相対的吸光度を示すグラフ。
【図３Ｄ】Ｈ因子を酢酸セルロース（ＣＡ）上に固定化した結果として相対的吸光度を示すグラフ。
【図３Ｅ】Ｈ因子をポリスチレン（ＰＳ）上に固定化した結果として相対的吸光度を示すグラフ。
【図４】非処理のＰＳ、ＥＧＡＰでコーティングしたポリスチレン、ＥＧＡＰでコーティングして天然Ｈ因子とともにインキュベートしたＰＳ、またはＥＧＡＰでコーティングしＳＰＤＰで修飾したＨ因子とともにインキュベートしたＰＳ、とともにインキュベートした血清サンプルのＣ３ａレベルを示すグラフ。
【図５】様々な基体、すなわち（Ａ）非処理のステンレス鋼、（Ｂ）前処理済ステンレス鋼、（Ｃ）Ｈ因子でコーティングしたステンレス鋼、（Ｄ）Ｈ因子でコーティングした前処理済ステンレス鋼、（Ｅ）Ｆ１０８でコーティングしてからＨ因子でコーティングした、前処理済ステンレス鋼、（Ｆ）ＥＧＡＰでコーティングしてからＨ因子でコーティングした前処理済ステンレス鋼、と結合させたＨ因子についてのＥＩＡの結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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