(57)【要約】本発明は、哺乳動物において免疫応答の持続時間および強さを増進する免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む。上記ＨＩＶ抗原は、外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する不活化全ＨＩＶウイルスであり得る。あるいは、上記ＨＩＶ抗原は、不活化全ＨＩＶウイルスまたはｐ２４抗原であり得る。キットもまた提供され、その構成要素は組合わせた場合に本発明の免疫原性組成物を産生する。本発明はまた、免疫原性組成物を、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを組み合わせる工程により製造する方法を提供する。本発明は、哺乳動物にＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを含む免疫原性組成物を投与してこの哺乳動物における免疫応答を増進することにより哺乳動物を免疫する方法を、さらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物であって、以下：
（ａ）外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する不活化全ＨＩＶウイルス
（ｂ）イミュノマー；および
（ｃ）アジュバント
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＶウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ＨＩＶウイルスがＨＺ３２１株ウイルスである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記単離された核酸分子が、ホスホロチオエート骨格を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記ＨＩＶウイルスが前記核酸分子と結合体化する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記イミュノマーがＣｐＧイミュノマーである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記イミュノマーがＣｐＧを含まないイミュノマーである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記アジュバントがヒトでの使用に適切である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記アジュバントがフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントがマイコバクテリア細胞壁成分およびモノホスホリル脂質Ａを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントがミョウバンを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記組成物がβケモカイン産生を増進する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記増進されたβケモカイン産生が非特異的βケモカイン産生である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記増進されたβケモカイン産生がＨＩＶ特異的βケモカイン産生である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記βケモカインがＲＡＮＴＥＳである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が哺乳動物においてＨＩＶ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体産生を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記組成物が哺乳動物においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記組成物がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
キットであって、以下：
（ａ）外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する不活化全ＨＩＶウイルス；
（ｂ）イミュノマー；および
（ｃ）アジュバント
を備え、該キット成分は、組合わせた場合に請求項１に記載の免疫原性組成物を産生する、キット。
【請求項２０】
請求項１に記載する免疫原性組成物を製造する方法であって、以下：
（ａ）外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する不活化全ＨＩＶウイルス；
（ｂ）イミュノマー；および
（ｃ）アジュバント
を組み合わせる工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記組合せる工程がエクスビボにおいてである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組合せる工程がインビボにおいてである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物を免疫する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を該哺乳動物に投与することより、該哺乳動物の免疫応答を増進する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
ＡＩＤＳを阻害する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物において免疫応答を増進する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物が霊長類である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記霊長類が幼仔の固体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記霊長類が妊娠している固体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記霊長類がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒトがＨＩＶセロネガティブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒトがＨＩＶセロポジティブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物が齧歯類である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が前記哺乳動物に２回以上投与される、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が前記哺乳動物に２回以上投与される、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が皮下、筋肉内または粘膜内に投与される、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景情報）
本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ならびに、より詳細にはＡＩＤＳを予防および処置における使用のための免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、全世界で３０００万人を超えるヒトが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＡＩＤＳの原因であるウイルスに感染している。ＨＩＶの流行は急速に全世界に広まっているが、ＨＩＶ感染個体の約９０％は、サハラ以南のアフリカおよび東南アジア地域を含む開発途上国に住んでいる。ウイルス負荷量を減少させ、かつＡＩＤＳへの進行を遅延する抗ウイルス治療薬物が、最近入手できる。しかしながら、これらの薬物は、開発途上国で使用されるには、非常に高すぎる。このように世界的なＡＩＤＳの流行を抑えるために効果的な予防ワクチンおよび治療ワクチンを開発する差し迫った必要性が依然としてある。
【０００３】
今日まで、ＨＩＶは、効果的なワクチンの開発には困難な標的であることが証明されている。ＨＩＶの早い変異性向のために、現在世界の様々な地域において優勢なエピトープが異なる多くの株が存在する。さらに、特定の感染個体において、ＨＩＶウイルスは、エピトープに変異を発現させて宿主免疫系の制御から免れ得る。ｐ２４コア抗原由来のエピトープを含む、広いスペクトルの保存されたエピトープを認識する免疫系を刺激する改良されたＨＩＶワクチンを開発する必要性が依然としてある。
【０００４】
１９９０年代に３０を超える異なるＨＩＶ−１ワクチン候補が、ヒト臨床試験に参入した。これらのワクチンは、種々の体液性および細胞性の免疫応答を誘発し、これらの免疫応答は、特定のワクチン成分に依存して、型および強さが異なる。ＨＩＶ感染に対する防御と関連する特定の免疫応答を強く誘発するＨＩＶワクチン組成物の開発の必要性が依然としてある。
【０００５】
防御的ＨＩＶ応答の性質は、ＨＩＶに繰返し曝露されているにもかかわらず感染されないままの個体、またはＡＩＤＳの発生がなく、長年ＨＩＶに感染している個体の研究により扱われてきた。これらの研究は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞がＨＩＶ感染および引き続く疾患の進行に対する防御とよく相関することを示してきた。抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答に加えて、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答がＨＩＶ初期感染および疾患の進行を予防するのに重要であると考えられる。効果的な抗ウイルス免疫応答の間、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞がウイルス感染細胞を直接屠殺し、そして抗ウイルス活性を有するサイトカインを分泌する。
【０００６】
βケモカイン系はまた、ＨＩＶ初期感染および疾患の進行に対する防御に重要であると考えられる。ＨＩＶのほとんどの一次単離物による免疫細胞の感染は、ウイルスＣＣＲ５との相互作用を必要とし、その通常の生物学的役割は、βケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対する主要なレセプターである。ＣＣＲ５レセプターの発現の減少を生じる遺伝子多型は、ＨＩＶ感染に対する抵抗性を提供することを示した。さらに、曝露された個体および培養された細胞の両方において、βケモカインレベルとＨＩＶ感染に対する抵抗性との間に有意な相関が示された。βケモカインは、ＨＩＶのＣＣＲ５への結合と競争するか、または干渉して表面ＣＣＲ５をダウンレギュレートすることを含む、いくつかの機序によりＨＩＶ感染性をブロッキングし得ることが示唆されている。
【０００７】
ＨＩＶ初期感染および疾患の進行の予防におけるβケモカインの重要性のために、有効なＨＩＶ免疫原性組成物は、高レベルのβケモカイン産生を、感染前および感染性ウイルスへの応答の両方において誘導すべきである。βケモカイン産生を誘導することができるＨＩＶ免疫原性組成物が記載されている。しかしながら、高レベルのβケモカイン産生を刺激し、強くかつ耐久性のあるＨＩＶ特異的Ｔｈ１細胞性免疫応答およびＨＩＶ特異的細胞傷害性活性のある体液性免疫応答を誘導する免疫原性組成物は、記載されていない。
【０００８】
特定の型のＨＩＶ特異的免疫応答を誘発する組成物は、他の重要な防御的応答を誘発しないかも知れない。例えば、非特許文献１（Ｄｅｍｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３７：１９９〜２０４（１９９９））は、ＨＩＶ−１ｇｐ１６０エンベロープ抗原、免疫刺激性ＤＮＡ配列およびミョウバンアジュバントを含有するワクチンを記載し、それは、抗原特異的Ｔｈ１型サイトカイン応答を誘導するにもかかわらず、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導することはできなかったことを記載する。さらに、エンベロープ抗原のみを含有するワクチンは、より高度に保存されたＨＩＶのコアタンパク質に対する免疫応答を誘導するとは考えられない。
【非特許文献１】Ｄｅｍｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３７．１９９９  ，ｐ１９９〜２０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、感染個体においてＨＩＶ感染を予防すること、または少なくともＡＩＤＳへの進行を遅延させることのいずれかを補助する、免疫原性組成物および方法についての必要性は存在する。本発明は、この必要性に応え、そしてさらに関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物において免疫応答能力を増進するために使用され得る免疫原性組成物を提供する。本発明の免疫原性組成物は、誘導される免疫応答の広範さ、型、強さおよび持続時間を増進し得る。上記免疫原性組成物は、最適化されたＨＩＶ抗原、イミュノマーを含有する単離された核酸分子および必要に応じてアジュバントを含む。上記ＨＩＶ抗原は、外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する不活化全ＨＩＶウイルスであり得る。上記ＨＩＶ抗原はまた、Ｌ２粒子のようなプロテアーゼ欠損ＨＩＶ粒子であり得る。あるいは、上記ＨＩＶ抗原は、不活化全ＨＩＶウイルスであり得るか、またはｐ２４抗原、ｎｅｆ、ｇｐ４１などを含む、選択されたＨＩＶ抗原もしくはペプチドの組合せであり得る。
【００１１】
アジュバントが存在する本発明の免疫原性組成物においては、そのアジュバントは、ヒトへの投与に適切であり得る。例示的なアジュバントは、フロイント不完全アジュバントである。
【００１２】
本発明の免疫原性組成物は、哺乳動物においてβケモカインレベル、インターフェロン−γ（ＩＦＭγ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターロイキン１５（ＩＬ１５）の産生、および／またはＨＩＶ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体産生をさらに増進し得る。本発明の免疫原性組成物はまた、哺乳動物においてＨＩＶ特異的ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞を増大し、ＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答および非細胞傷害性の抑制的Ｔリンパ球応答を増進し得る。
【００１３】
ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを含むキットもまた提供される。そのキットの成分は、組合わされた場合に本発明の免疫原性組成物を産生する。
【００１４】
本発明はまた、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを組合わせる工程により免疫原性組成物を製造する方法を提供する。上記成分は、免疫原性組成物に到達するまでエクスビボで、またはインビボで組合わされ得る。
【００１５】
本発明はまた、ＨＩＶ抗原、単離されたイミュノマー含有核酸分子および必要に応じてアジュバントを含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与することにより、その哺乳動物を免疫する方法を提供する。ＨＩＶ抗原、単離されたイミュノマー含有核酸分子および必要に応じてアジュバントを含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与して、その哺乳動物における免疫応答を増進することによりＡＩＤＳを阻害する方法もまた、提供される。本発明の方法にいて、上記哺乳動物は、ヒトのような霊長類、または齧歯類であり得る。上記方法の特定の実施形態では、上記霊長類は妊娠している母親または幼年である。ヒトは、ＨＩＶセロネガティブまたはＨＩＶセロポジティブであり得る。上記免疫原性組成物は、哺乳動物に２回以上そして皮下、筋肉内および粘膜内を含む種々の投与経路により、有利に投与され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＩＶ抗原、イミュノマー含む単離された核酸分子および必要に応じてアジュバントを含む免疫原性ＨＩＶ組成物を、提供する。一緒に使用するための、そのような組成物の成分を含むキットもまた、提供される。本発明はまた、ＨＩＶ抗原単独と比較して、免疫された哺乳動物において、免疫応答を増強するように、そのような組成物、またはそのような組成物の成分で哺乳動物を免疫する方法を提供する。有利なことに、本発明の組成物はまた、ＨＩＶ特異的ＣＤ４Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し得、広いスペクトルのＨＩＶエピトープに対して強力なＴｈ１免疫応答を生じ、強いＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答を提供する。従って、本発明の免疫原性組成物は、ＨＩＶ感染の予防および／または感染した個体においてＡＩＤＳへの進行を遅延させるために有用である。上記組成物および方法は、保存されたＨＩＶエピトープに特異的な強力なＴｈ１細胞性免疫応答および液性免疫応答を誘発し、ＨＩＶ特異的ＣＤ４Ｔヘルパー細胞、ＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘発し、ケモカインおよびサイトカイン（例えば、βケモカイン、インターフェロンγ、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、αデフェンシンなど）の産生を促進し、そして記憶細胞を増加させるために使用され得る。そのようなワクチンは、種々の投与経路で投与され得る。そのようなワクチンは、ＨＩＶの母児感染を予防するため、新生児、幼仔および危険性の高い個体のワクチン接種のため、ならびに感染した個体のワクチン接種のために使用され得る。そのようなワクチンはまた、他のＨＩＶ治療（ヌクレアーゼインヒビターとプロテアーゼインヒビターと、例えばＴ２０のようなウイルスの侵入をブロッキングする因子との種々の組合わせによる坑レトロウイルス治療を含む（ＡＲＴ））と組合わせて使用され得る（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：１６３３〜１６４２（２００３））。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＩＶ」とは、ＨＩＶの全ての形態、亜種および変種をいい、より古い用語  ＨＴＬＶＩＩＩおよびＬＡＶと同義である。ＨＩＶを伝播する能力を有するか、またはＨＩＶウイルスに永久に感染した種々の細胞株が開発され、ＡＴＣＣに寄託されている。これらの細胞株は、ＨｕＴ７８細胞およびＨｕＴ７８誘導体Ｈ９ならびに受託番号ＣＣＬ  ２１４、ＴＩＢ  １６１、ＣＲＬ  １５５２およびＣＲＬ  ８５４３を含み、それらは米国特許第４，７２５，６６９号およびＧａｌｌｏ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２５６：４６（１９８７）に記載される）。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「不活化全ＨＩＶウイルス」とは、未処理で不活化されたＨＩＶウイルスをいう。不活化ＨＩＶとは、感染および／または複製ができないウイルスをいう。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「外側エンベロープタンパク質」とは、膜貫通タンパク質ｇｐ４１に対して、膜を超えて突出しているレトロウイルスの膜糖タンパク質の部分をいう。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「外側エンベロープタンパク質を欠失するＨＩＶウイルス」とは、ＨＩＶ粒子の調製物または外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失するが上記ウイルスの遺伝的により保存された部分（例えば、ｐ２４およびｇｐ４１）を含有するＨＩＶ遺伝子産物をいう。外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失するＨＩＶはまた、本明細書でＲＥＭＵＮＥＴＭともいう。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＩＶ  ｐ２４抗原」とは、ＨＩＶのｇａｇ領域の遺伝子産物をいい、ｐ２４と命名される約２４，０００ダルトンの見かけの相対的分子量を有することで特徴づけられる。用語「ＨＩＶ  ｐ２４抗原」とはまた、ｐ２４の免疫学的活性を有するｐ２４の改変体および断片をいう。当業者は、例えば、その免疫学的活性を破壊せずに、その安定性またはバイオアベイラビリティーを増加させるか、またはその精製を容易にする天然のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログの付加、欠失または置換などのようなｐ２４の適切な改変を決定し得る。同様に、当業者は、ｐ２４の免疫学的活性を有するｐ２４の適切な断片を決定し得る。ｐ２４の免疫学的に活性な断片は、６残基のポリペプチドから完全長から1個のアミノ酸を引いたポリペプチドを有し得る。他のＨＩＶ遺伝子産物によりコードされる他のＨＩＶ抗原としては、ＨＩＶ  ｐ２４抗原についての上記の抗原と同様な断片または改変体が挙げられ得る。他の例示的なＨＩＶ抗原としては、例えば、ｇｐ４１、ｎｅｆなどが挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「イミュノマー」とは、３’末端で結合され、結果として２つの５’末端を有するオリゴヌクレオチドになる、より小さな２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをいう。上記より小さい２つのイミュノマーのオリゴヌクレオチドは、同一配列または非同一配列および／あるいは同一長または非同一長であり得るが、一般には同一である。その免疫促進活性に加えて、イミュノマーは、３’−３’結合を含み、従って遊離の３’末端はなく、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を増加する。上記のイミュノマーのより小さいオリゴヌクレオチドは、一般に２つの５’末端を形成するよう一緒に結合された少なくとも約５または６ヌクレオチドであるが、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または上記イミュノマーのより小さいオリゴヌクレオチドより長くさえあり得る。当業者は、抗原単独で見られるよりはより大きな免疫応答を刺激するのに十分なイミュノマーの長さおよび／または配列を容易に決定し得る。従って、１つの実施形態では、イミュノマーは、それらの３’末端を介して結合される２つの同一のオリゴヌクレオチドを含む。イミュノマーはまた、改変塩基を含み得る。イミュノマーは、例えば以下に記載される：
【００２３】
【化１】
2007523884.tif 000002
【００２４】
これらの各々は、本明細書に参考として援用されている。そのようなイミュノマーは、ＣｐＧを含む免疫刺激的配列より、より強力な免疫刺激性を有し得る。イミュノマーは、抗原と組合わせで投与される場合、哺乳動物において免疫応答を増進する。イミュノマーは、下に記載のようにＣｐＧイミュノマーまたはＣｐＧフリーのイミュノマーであり得る。例示的なイミュノマーは実施例ＸおよびＸＩに記載される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧイミュノマー」とは、上に記載したように、具体的にはＣｐＧモチーフを含むイミュノマーをいう。従って、ＣｐＧイミュノマーは、２つの同一または非同一のより小さなオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、そこではより小さいオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧフリーのイミュノマー」とは、具体的にはＣｐＧモチーフを除外したイミュノマーである。従って、ＣｐＧフリーのイミュノマーとは、同一または非同一のより小さな２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり、このより小さいオリゴヌクレオチドのいずれもＣｐＧモチーフを含まない。
【００２７】
イミュノマーは、改変塩基を含み得る（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、上述、２００１）。例えば、イミュノマーは，ＣｐＧのアナログを含み得る。例えば、イミュノマーは、Ｙと命名されるデオキシシトシンのピリミジンアナログを含み得る。イミュノマーの使用に特に有用なデオキシシチジンアナログは、デオキシ−５−ヒドロキシシチジンまたはデオキシ−Ｎ４−エチルシチジンである。別の実施形態では、イミュノマーは、Ｒと命名されるグアニンのプリンアナログを含み得る。特に有用なデオキシグアニンアナログは、７−デアザグアニンである。従って、イミュノマーは、ＹｐＧモチーフ、ＣｐＲモチーフ、またはＹｐＲモチーフを含み得るが、ここでＹおよびＲは、それぞれシトシンおよびグアニンのアナログである。
【００２８】
イミュノマーを形成するためのより小さな２つのオリゴヌクレオチドを結合する方法は、以前に以下に記載されている：
【００２９】
【化２】
2007523884.tif 000003
【００３０】
当業者は、これらおよび他の方法が、その３’末端を介して、２つの遊離の５’末端を生成するオリゴヌクレオチドを結合するのに使用され得ることを、容易に認識する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「免疫刺激的配列」または「ＩＳＳ」とは、抗原と組合わせて投与される場合、哺乳動物において免疫応答を増進する能力を有するメチル化されていないＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列をいう。免疫促進的配列とは、例えば国際公開公報第９８／５５４９５号に記載されている。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「イミュノマー含有核酸分子」とは、イミュノマーを含有する、線状、環状、分枝状単鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ核酸またはＲＮＡ核酸をいう。イミュノマー含有核酸分子は、単一のイミュノマーを含み得る。核酸分子はまた、もし遊離の５’末端の１つもしくは両方が別の核酸配列の５’末端と結合して、付加的イミュノマーの結合に別の潜在的な３’末端を生成する場合、１より多いイミュノマーを含み得る。そのような核酸分子は、イミュノマーに加えて、６塩基または６塩基対より長い長さであり得、そして一般に約１５塩基または塩基対より大きく、例えば約２０塩基または約２０塩基対より大きく、長さが数ｋｂであってもよい。そのようなイミュノマー含有核酸が環状である場合、または５’−５’結合を必要とする複数のイミュノマーを含んでいる場合、遊離の５’末端が、５’−５’結合が、短いイミュノマー（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：９６６〜９７４（２００２）およびＹｕら、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：２５８５〜２５８８（２０００））に見られるように、核酸に埋めこまれたイミュノマーの免疫刺激的活性に干渉しない限り例えば、以下に記載されるように結合されることが理解される：Ｋａｄｉｍａｌｌａら、上述、２００２およびＹｕら、上述、２０００。イミュノマー含有核酸は、ＤＮＡワクチンとしての使用のための１以上のＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を、さらに含む。
【００３３】
イミュノマーまたはイミュノマー含有核酸分子は、本明細書で開示されるように例えば、化学的にオリゴヌクレオチドを合成することにより、および、３’末端を介してオリゴヌクレオチドを化学的に結合することにより生成され得る。さらにイミュノマーまたはイミュノマー含有核酸分子は、イミュノマーまたはイミュノマー含有核酸２つの半分を、組換え的に合成することおよび３’末端を介して２つの半分を化学的に結合することにより生成され得る。
【００３４】
イミュノマーは、天然のもしくは改変されたヌクレオチド、または天然のもしくは非天然のヌクレオチド結合を含み得る。当業者に既知の改変としては、例えば、３’ＯＨ基または、５’ＯＨ基の改変、ヌクレオチド塩基の改変、糖成分の改変およびリン酸基の改変が挙げられる。非天然のヌクレオチド結合としては、例えばホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合があり得、この結合は、ヌクレアーゼ分解に対する核酸分子の耐性を増加させる。種々の改変および結合が、例えば国際公開公報第９８／５５４９５号に記載されている。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」とは、免疫原性因子に添加される場合、その混合物に暴露されたときに受容宿主における因子に対する免疫応答を、非特異的に増進または増強する物質をいう。アジュバントとしては、例えば、水中油滴型エマルジョン、油中水滴型エマルジョン、ミョウバン（アルミニウム塩）、リポソームおよびマイクロ粒子（例えば、ポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼン、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸）が挙げられ得る。アジュバントはまた、例えばスクワレン混合物（ＳＡＦ−Ｉ）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラトキシンＢサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびに免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３〜８７５に記載されている免疫刺激複合体）が挙げられ得る。獣医学的使用のためおよび動物における抗体産生のために、フロイントのアジュバント（完全および不完全の両方）のマイトジェン成分が使用され得る。ヒトにおいて、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）は、特に有用なアジュバントである。種々の適切なアジュバントが当該分野では周知であり、例えば、ＷａｒｒｅｎおよびＣｈｅｄｉｄ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８：８３（１９８８）に概観されている。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ＡＩＤＳ」とは、ＨＩＶ感染の症候期をいい、後天性免疫不全症候群（通常ＡＩＤＳとして公知）およびＡｄｌｅｒ、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．２９４：１１４５（１９８７）に記載されているような「ＡＲＣ」またはＡＩＤＳ関連症候群挙げられる。ＡＩＤＳの免疫学的症状発現および臨床的症状発現は、当該分野で周知であり、例えば免疫不全から発生する日和見感染および癌が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＩＤＳを阻害する」とは、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの症状に関連して免疫原性組成物の有益な予防的効果または治療的効果をいう。そのような有益な効果としては、例えば、ＨＩＶに曝露された個体の初期感染を予防または遅延させること；ＨＩＶに感染した個体においてウイルス負荷を低減させること；ＨＩＶ感染の無徴候相を延長させること；ウイルスレベルが抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）を介して低下されたＨＩＶ感染患者において低いウイルス負荷を維持すること；薬物未処置患者およびＡＲＴで処置された患者において、ＨＩＶ特異的および非特異的の両方でＣＤ４Ｔ細胞のレベルを増加させるか、またはＣＤ４Ｔ細胞の減少を抑制し、ＡＩＤＳの個体において全体として健康またはクオリティオブライフを増強すること；ならびにＡＩＤＳの個体の寿命予測を延ばすことが挙げられる。臨床医は、処置がＡＩＤＳを阻害するのに有効かどうかを決定するために、免疫の効果を、処置前の患者の状態または未処置患者の予測される状態とを比較する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語、免疫応答に関して「増進する」とは、免疫原性組成物が、ＨＩＶ抗原単独を含む組成物が誘発するより大きな免疫応答を誘発することを意味することが企図されている。免疫原性組成物が３つの成分、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む場合、この免疫原性組成物は、免疫原性組成物の３成分のうちのいずれかの２成分を含む組成物が同じ量および続く同じ免疫スケジュールで投与されるより大きな免疫応答を誘発する。本発明の免疫原性組成物の成分は、相乗的に作用し得る。増進された免疫応答は、例えば、記憶細胞を増進するケモカインおよび／またはサイトカイン産生の増加、記憶細胞の増加、ＩｇＧ２ｂ産生の増加、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性の増大、βケモカインもしくはＩＬ１５などの産生増加があり得る。増進された免疫応答の例として、本発明の免疫原性組成物は、ＣＤ４細胞（ヘルパー機能）およびＣＤ８細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球；ＣＴＬ）の両方によりγインターフェロンの産生を増加させ得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「βケモカイン」とは、ＲＡＮＴＥＳ，マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）およびマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）を含む、小さい化学誘引性ポリペプチドのクラスのメンバーをいう。βケモカインの物理的性質および機能的性質については、当該分野において周知である。
【００４０】
増進されたβケモカイン産生の場合において、そのβケモカイン産生は、「ＨＩＶ特異的βケモカイン産生」であり得、それはＨＩＶ抗原によるＴ細胞の刺激への応答におけるβケモカインの産生をいう。あるいは、またはさらに、増進されたβケモカイン産生は、「非特異的βケモカイン産生」であり得、それはＨＩＶ抗原によるＴ細胞の刺激の不存在下におけるβケモカインの産生をいう。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、一緒に使用されるために包装されまたは特徴づけられた成分をいう。例えば、キットは、３つの別個の容器にＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含み得る。あるいは、キットは１つの容器に任意の２つの成分を含み得、そして１つ以上の別個の容器に第３成分および任意の付加的な成分を含み得る。必要に応じて、キットは、哺乳動物への投与に適切な免疫原性組成物を配合するために成分を組合わせる説明書をさらに含む。
【００４２】
本発明は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。上記免疫原性組成物は、その組成物を投与された哺乳動物において免疫応答を増進する。一つの実施形態では、上記免疫原性組成物は、哺乳動物においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増進する。別の実施形態では、上記免疫原性組成物は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を増進する。
【００４３】
一つの実施形態では、上記免疫原性組成物のＨＩＶ抗原は、不活化全ＨＩＶウイルスであり、それは当該分野で公知の方法により調製され得る。例えば、ＨＩＶウイルスは、感染個体の末梢血の標本から培養により調製され得る。ＨＩＶウイルスの例示的な培養方法において、末梢血からの単核細胞（例えばリンパ球）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配の間ヘパリン化された静脈血の標本を重層化することおよびその標本を遠心分離することにより得られ得る。上記単核細胞は、次いで収集され、植物性ヘマトグルチニンで２、３日間活性化され、そして適切な培地で、好ましくはインタ−ロイキン２（ＩＬ２）で補填された培地で、培養される。上記ウイルスは、細胞中のウイルス粒子の存在を検出する、逆転写酵素のアッセイ、ｐ２４についての抗原補足アッセイ、免疫蛍光または電子顕微鏡により検出され得るが、これらの全ては、当業者には周知の方法である。
【００４４】
不活化全ＨＩＶ粒子を単離する方法は、例えばＲｉｃｈｉｅｒｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１１９〜１２９（１９９８）および米国特許第５，６６１，０２３号および同第５，２５６，７６７号に記載されている。１つの実施形態では、上記ＨＩＶウイルスは、１９７６年ザイールにおいて感染した個体由来のＨＺ３２１単離体であり、それについてはＣｈｏｉら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３：３５７〜３６１（１９９７）に記載されている。
【００４５】
ウイルスを非感染性にする種々の方法は、当該分野においては公知である（例えば、Ｈａｎｓｏｎ，ＭＥＤＩＣＡＬ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ  ＩＩ（１９８３）ｄｅ  ｌａ  ＭａｚａおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照のこと）。例えば、上記ウイルスは化学品または加熱もしくは照射などの物理的条件での処理により不活性化され得る。好ましくは、上記ウイルスは、因子またはそのウイルスの免疫原性的性質を維持する因子で処理される。例えば、上記ウイルスは、βプロピオラクトンまたはγ線照射あるいはβプロピオラクトンおよびγ線照射の両方で処理され得、ウイルスを不活化するのに十分な用量および時間で処理され得る。
【００４６】
別の実施形態では、上記免疫原性組成物におけるＨＩＶ抗原は、外側エンベロープを欠失している不活化全ＨＩＶウイルスであり、それは当該分野で公知の方法により調製され得る。外側エンベロープタンパク質を欠失している不活化全ウイルスを調製するために、上記単離されたウイルスは、外側エンベロープタンパク質を除去するように処理される。そのような除去は好ましくは、ウイルス粒子の膨潤および収縮の原因となる物理的な方法と組合わせてウイルスを繰返し凍結および解凍することにより達成され得るが、他の物理的方法または非物理的方法、例えば超音波など単独または組み合わせによってもまた、用いられ得る。
【００４７】
さらに別に実施形態では、免疫原性組成物のＨＩＶ抗原は、１つ以上の実質的に精製されたＨＩＶの遺伝子産物である。そのような遺伝子産物としては、ｇａｇ遺伝子（ｐ５５、ｐ３９、ｐ２４、ｐ１７およびｐ１５）、ｐｏｌ遺伝子（ｐ６６／ｐ５１およびｐ３１〜３４）および膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１；ならびにｎｅｆタンパク質によりコードされるそれらの産物が挙げられる。これらの遺伝子産物は、単独または他のＨＩＶ抗原との組合わせで使用され得る。上記ＨＩＶ抗原はまた、免疫応答を発現しないＨＩＶ遺伝子産物のペプチド断片であり得る。
【００４８】
実質的に精製されたＨＩＶ遺伝子産物は、実質的に精製されたＨＩＶｐ２４抗原または他のＨＩＶ抗原および遺伝子産物であり得る。ｐ２４および他のＨＩＶ抗原は、当該分野において公知の生化学的方法によりウイルスから実質的に精製され得るか、または当該分野において周知の方法により細菌細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞のような宿主生物における適切な遺伝子をクローニングおよび発現することにより、調製され得る。あるいは、ｐ２４抗原またはｐ２４の免疫学的活性を維持する改変体もしくは断片および他のＨＩＶ抗原またはそれらの改変もしくは断片は、自動ペプチド合成のような当該分野で周知の方法を使用して、合成され得る。ｐ２４の改変体もしくは断片がｐ２４の免疫学的活性を維持するか否か、または他のウイルス抗原が、それぞれの免疫学的活性を維持するか否かの決定は、例えば当該分野で公知の従来のリンパ球増殖アッセイ（ＬＰＡ）（実施例ＩＩＩを参照のこと）によるか、哺乳動物を免疫し、そして生じた免疫応答を比較するか、またはｐ２４抗体に結合することに関してｐ２４と競争する改変体あるいは断片の能力または他のＨＩＶ抗原のそれぞれの抗体に対する結合に関してＨＩＶ抗原と競争する改変体あるいは断片の能力を試験することにより分析されるような以前に免疫されたＰＢＭＣのインビトロでの増殖を刺激する能力により、なされ得る。
【００４９】
さらに別の実施形態では、上記免疫原性組成物のＨＩＶ抗原は、プロテアーゼ欠損ＨＩＶ（米国特許第６，３２８，９７６号および同第６，５５７，２９６号を参照のこと）の実質的に精製された遺伝子産物である。
【００５０】
ＨＩＶ−１の複製プロセスは、５〜１０塩基対あたり約１のエラー率である。全体のウイルスゲノムが、ちょうど１０，０００より少ない塩基対であるので、複製周期当たり、約１塩基対のエラー率で生じる。この高い変異率は、任意のヒト体内でのウイルスの広範な可変性および集団全体に一様にひろがる広い可変性に寄与する。
【００５１】
この可変性は、記載された３種のＨＩＶ−１改変体を生じ、「クレード」と呼ばれる約１０の亜種のウイルスを生じた。これらの識別は、エンベロープタンパク質（特に可変性である）の構造に基づいている。Ｍ（主要な）改変体は、世界的規模で最も流行性のあるものである。Ｍ改変体内では、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫがあり、このＡからＥまでのクレードは世界的に広く主要な感染を示す。クレードＡ、ＣおよびＤは、アフリカで優勢である。クレードＢは、ヨーロッパ、南北アメリカおよび東南アジアで、最も流行性である。クレードＥおよびＣは、アジアで優勢である。これらのクレードは、３５％ほど相互と異なる。
【００５２】
流行について根深い因果関係を有するＨＩＶ−１の非常に高い変異率から二つの重要な結果が存在する。第１に、高い変異率は、ウイルスが薬物治療による制御から逃れることが可能になる機序の１つである。これらの新しいウイルスは、耐性種を示す。高い変異率はまた、ウイルスが、免疫成分により認識される構造を変化させることにより、患者の免疫系から逃れることができるようにする。この広範の可変性について加えられるべき重要性は、上記ウイルスがまた、ワクチンによる制御から逃れることができ、エンベロープタンパク質に基づくワクチンは効果がないようになることである。
【００５３】
構造において最も大きな改変は、エンベロープタンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１に見られる。より少ない改変は、種々の内部タンパク質で見られる。本明細書で開示されるように、ＲＥＭＵＮＥは、そのｇｐ１２０タンパク質なしの全ウイルスから作製された免疫原であるが、ＨＩＶ−１ウイルスの高度に保存されたエピトープのほとんどを含有する免疫原である。これらのエピトープの数および変異のより低い頻度は、ＲＥＭＵＮＥのような外側エンベロープタンパク質を欠失しているＨＩＶウイルスが個体内で、より大きな成功の機会を有する免疫応答を刺激することを意味する。さらに、上記ＨｕＴ７８細胞株は、保存された抗原（世界的に見られるクレードにおけるほとんどの改変体に渡って維持されている）に関してクレードＡおよびＧの両方を含む、非常に早期の種のＨＩＶウイルスに故意に感染させられ、そしてこのＨｕＴ  ７８  ＨＩＶ感染細胞株は、ＨＩＶ抗原として使用されるウイルスを提供した。従って、外側エンベロープタンパク質も欠失する複数の早期クレードを有するＨＩＶウイルスを免疫のために使用することは、ほとんどの患者に認識され得る保存された抗原を提供することにより、クレード間で有効であり得る。
【００５４】
上記ＨＩＶ抗原およびイミュノマーは一緒に混合され得、共有結合または非共有結合により結合され得る。抗原と核酸分子とを結合する方法は、当該分野で公知であり、例示的な方法は、国際公開公報第９８／５５４９５号に記載され入ている。
【００５５】
イミュノマーのオリゴヌクレオチド成分は、例えば、オリゴヌクレオチド合成、ＰＣＲ、大きな核酸分子の酵素的分解または化学的分解および従来のポリヌクレオチド単離手順を含む、当該分野で周知の方法を使用して調製され得る。１以上の改変塩基または結合を含むオリゴヌクレオチドを含む、イミュノマーのオリゴヌクレオチド成分を産生する方法は、例えば、国際公開公報第９８／５５４９５号に記載されている。
【００５６】
当業者は、特定のイミュノマーが同じ種、または同様の免疫応答を示す当該分野で公知の種の哺乳動物を、特定のイミュノマー含有組成物で免疫することにより特定の哺乳動物における所望の免疫応答を増進するのに有効であるか否かを、容易に決定し得る。次いで、当該分野において公知の種々のアッセイは、誘導される免疫応答の特性を特徴づけるためおよび比較するために使用され得る。例えば、ヒトへの投与のための免疫原性組成物を含有する最適化されたイミュノマーは、ヒトまたはヒヒ、チンパンジー、マカクザルまたはサルのような非ヒト霊長類のいずれかにおいて例えば，ＬＰＡ、ＥＬＩＳＰＯＴおよび／または産生されるＩｇＧ１／Ｇ２の比により、その免疫活性を評価することにより、決定され得る。
【００５７】
本発明の免疫原性組成物は、ヒトにおいて安全であることが実証されているアジュバントのようなアジュバントをさらに含み得る。例示的なアジュバントとしては、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）がある。別の例示的なアジュバントは、マイコバクテリウムの細胞壁成分および市販されているアジュバントＤＥＴＯＸＴＭのようなモノホスホリル脂質Ａがある。別の例示的なアジュバントは、ミョウバンである。免疫原性組成物においてアジュバントの調製および処方は、当該分野で周知である。
【００５８】
必要に応じて、本発明の免疫原性組成物は、滅菌水もしくは緩衝化生理食塩水を含む、他の薬学的に受容可能な成分を含み得るか、またはそれらとともに処方され得る。薬学的に受容可能な成分は、例えば安定化、溶解化、乳化、緩衝化または免疫原性組成物の滅菌性を維持するように作用する任意の化合物であり得、哺乳動物への投与に適合性があり、その免疫原性組成物を、企図する目的について無効にはしない。そのような成分および使用は当該分野では周知である。
【００５９】
本発明はまた、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを含むキットを提供する。そのキットの成分は、組合わされる場合、哺乳動物において免疫応答を増進する免疫原性組成物を産生する。
【００６０】
上記キットの成分は、エクスビボで組合わされ、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを含む免疫学的組成物を産生する。あるいは、任意の２つの成分が、エクスビボで組合わされ、第３成分は、インビボで免疫組成物が形成されるように投与される。例えば、ＨＩＶ抗原をアジュバントに乳化し、溶解し、混合しもしくは吸着させ、イミュノマーの注入に先立って、またはその後に、哺乳動物に注入し得る。同様に、上記キットの各成分は、別々に投与され得る。当業者は、ＨＩＶ抗原と、イミュノマーと、必要に応じてアジュバントとを、哺乳動物において免疫応答を増進するように組合わせおよび投与する種々の方法があることを理解する。以下に、さらに詳細に議論されるが、本発明の免疫学的組成物は、当該分野で周知の方法（筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻内、経口もしくは粘膜経由を含むが、限定されない）で局所的にまたは全身的に投与される得る。
【００６１】
本明細書に開示されるように、ＲＥＭＵＮＥは、大多数の患者において、強度および持続時間の程度は変わるが、免疫原性であることが見出されている（実施例ＶＩＩＩ）。従って、外側エンベロープタンパク質を欠失するＨＩＶを含む免疫原性組成物は、ＲＥＭＵＮＥのようなＩＦＡアジュバントと組合わせて、ＨＩＶに感染した患者の大多数において免疫応答を誘導するために使用され得る。本発明の免疫原性組成物は、ＲＥＭＵＮＥＴＭのようなＨＩＶ免疫原に対する免疫応答の強さおよび能力を増進し、それによりワクチンの治療的および／または予防的効能を増進する。増進された免疫応答は、例えば、ＨＩＶ−１特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ケモカインおよび／またはサイトカインの産生を増加し得、記憶細胞の増加、全体的な抗体産生の増加、より詳細にはＩｇＧ２ｂ産生の比率、細胞傷害性Ｔリンパ球活性の増加、βケモカインの増加またはＩＬ１５産生などがあり得る。従って、本発明の免疫原性組成物は、ＴＨ１サイトカインプロフィール（高いＩＦＮ−γ、高いＩｇＧ２／ＩｇＧ１比率）を増進するために使用され得る。本明細書で開示される場合に、本発明の免疫原性組成物は、相乗的に作用し得る。例えば、本発明の免疫原性組成物は、上記免疫原性組成物成分のペアの組合せの効果を追加することにより、期待されていたよりもβケモカインのより高濃度の産生を誘発することにより、βケモカイン産生を増進する。
【００６２】
記憶細胞は、感染の初期の急性状態に続き、長期間の免疫を維持するために必要である。感染の初期急性段階に引き続き、収縮期の間に、感染性因子に対して誘導された顕著な量の免疫細胞が、アポトーシスにより破壊され、わずかに生存する細胞のみが記憶細胞になり得る。従って、アポトーシスからＨＩＶ特異的ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を保護することは、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ヘルパーＴ記憶細胞およびＣＤ８  ＣＴＬ記憶細胞の両方の増加を促進する。本発明の免疫原性組成物は、記憶細胞を増加するために使用され得、それにより長期間のヘルパー機能および細胞性免疫を促進する。本発明の免疫原性組成物は、アポトーシスを減少させることによるか、または記憶細胞の生存を促進する因子を刺激することにより、記憶細胞の数を増加するのに使用され得る。
【００６３】
本発明の免疫原性組成物は、ＴＨ２応答をＴＨ１応答へシフトするために使用され得、それにより、より強力なＣＤ８＋応答を含む、細胞性免疫応答を増加した。従って、本発明の免疫原性組成物は、患者において免疫応答を強化し、そうでなければ弱く応答するのみ、その応答を細胞性免疫に変換するために使用され得る。本発明の免疫原性組成物は、従って、免疫原性組成物において使用される類似したＨＩＶ抗原に弱く応答した患者において免疫応答の強さおよび持続時間を増加するのに使用され得る。
【００６４】
本発明の免疫原性組成物は、その組成物を投与した哺乳動物において、免疫応答、例えば増進したβケモカイン、および／またはＩＬ１５、ＩＦＮ、ＩＬ２、ＴＮＦα産生、増加したＨＩＶ特異的ＣＤ４ヘルパー細胞、ＩｇＧ２ｂ抗体産生，ＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）産生、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生などを増進するのに有効である。２０００年５月５日に出願された米国特許出願第０９／５６５，９０６号および国際公開公報第００／６７７８７号（それぞれ本明細書に参考として援用されている）、そして以下の実施例ＩおよびＩＩＩに記載されているように、βケモカインＲＡＮＴＥＳの生産は、上記組成物を投与した哺乳動物由来のＴ細胞（例えばリンパ節細胞または末梢血細胞）の上清のＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出および定量され得る。抗原特異的βケモカイン産生を決定するために、免疫哺乳動物由来のＴ細胞は、抗原提示胸腺細胞との組合わせによりＨＩＶ抗原で刺激され、その上清においてβケモカインレベルを測定し得る。非特異的βケモカイン産生を決定するために免疫哺乳動物からのＴ細胞上清または血液サンプルまたは血漿サンプルのいずれかがアッセイされ得る。同様に、他のβケモカイン（例えばＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）の産生は、市販のＥＬＩＳＡアッセイを使用して製造者の説明に従って検出および定量され得る。
【００６５】
サイトカイン（例えば、インターフェロン、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＴＮＦα、ＩＬ１０およびＩＬ７）産生を、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡまたは細胞内サイトカイン染色により測定する方法は、当業者には周知である（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＡＩＤＳ  １７：１１２１〜１１２６（２００３）を参照のこと）。
【００６６】
本発明の免疫原性組成物は、上記組成物を投与した哺乳動物においてＨＩＶ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体産生を、さらに増進し得る。ＩｇＧ２ｂ抗体の高いレベルは、Ｔｈ１型応答と関連するが、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳへの進行に対する防御と関連する。従って、本発明はＴＨ１応答を増加し得る組成物を提供する。
【００６７】
本発明の免疫原性組成物は、その組成物を投与した哺乳動物において、ＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を、さらに増進する能力を有し得る。本発明の免疫原性組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を増加し得る。
【００６８】
ＣＤ＋４Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、細胞性免疫に重要な古典的ＣＤ４ヘルパー応答として特徴づけられる。ＩＦＮおよびＩＬ２の両方を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞は、もっとも効果的であり得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の代表であり、細胞溶解活性に非常に相関性がある。ＩＦＮおよびＴＦＮαを産生する細胞は、非常に効果的であり得る。ＣＴＬ活性は、有効な予防的または治療的坑ＨＩＶ免疫応答の重要な成分である。ＣＴＬ応答が、本発明の免疫原性組成物を投与した後に増進されるか否かを決定する方法は、当該分野において周知であり、細胞溶解アッセイ、およびＬＰＡアッセイ（例えば、Ｄｅｍｌら、上述（１９９９）に記載されている；実施例ＩＩＩを参照のこと）、ならびにＣＤ８特異的ＩＦＮ−γ産生のためのＥＬＩＳＡアッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（米国出願第０９／５６５，９０６号および国際公開公報第００／６７７８７号および下記の実施例ＩおよびＩＩを参照のこと）、細胞表面マーカーに対する種々の抗体を使用する細胞内染色およびＦＡＣＳ分析を使用することを含む。
【００６９】
本発明はまた、個体を免疫する方法を提供する。本方法は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントを含む免疫原性組成物を、哺乳動物に投与することにより個体における免疫応答を増進する工程から構成される。上記免疫原性組成物の成分は、如何なる順序、組み合わせにても、免疫原性組成物がエクスビボまたはインビボで形成されるように投与され得る。
【００７０】
特定の実施形態では、上記ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバントは、ほぼ同じ時間、およびほぼ同じ部位に投与される。しかしながら、相互に数分内にまたは数時間内にこの組成物を投与することはまた、免疫応答を誘導する免疫原性組成物を提供することにおいて有効であり得る。さらに哺乳動物において異なる部位に上記成分を投与することはまた、免疫応答を増進する免疫原性素晴雨物を提供するのに有効であり得る。当業者は、成分を個別に投与するのに適切な時間および部位について、即ち、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよび必要に応じてアジュバント成分を十分な免疫応答を提供するために、種々の時間および部位に別々に成分を投与し、そしてその免疫応答を測定することにより、容易に決定し得る。上記免疫原性組成物はまた、所望の場合、複数回、例えば２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上または所望の回数、ＨＩＶ特異的免疫応答を刺激および増進するために投与され得る。
【００７１】
本発明の免疫原性組成物は、ＡＩＤＳを阻害する（例えば、ＨＩＶに曝露された個体の初期感染を予防すること、ＨＩＶに感染した個体におけるウイルス負荷を減少すること、ＨＩＶ感染の無症状相を延長すること、ＡＩＤＳを有する個体の全体的な健康またはクオリティオブライフを増加すること、またはＡＩＤＳを有する個体の予測寿命を延長すること）ために、ヒトに投与され得る。本明細書で開示される場合、ＨＩＶ抗原、イミュノマーを含む単離された核酸分子および必要に応じてアジュバントを含む免疫原性組成物の哺乳動物への投与は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳへの進行に対する防御に関連する免疫応答を刺激する。
【００７２】
特に、上記免疫原性組成物は、任意の個別の成分の組み合わせにより、またはＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバンドを含む３成分組成物中の、その免疫原性組成物の任意の２成分により期待されるより、より有効に免疫応答を増進する。さらに、上記免疫原性組成物は、Ｔｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）およびＴｈ１型抗体同型（例えば、ＩｇＧ２ｂ）を含む、強力なＴｈ１免疫応答を促進する。従って、本発明の免疫原性組成物は、セロネガティブな個体に投与される場合、ＨＩＶ感染を予防し、ウイルス負荷を減少し、感染の無症状相を延長し、セロポジティブの個体の健康および寿命に対して良い方に影響するワクチンとして有効である。
【００７３】
ＨＩＶウイルスに曝露された個体は、通常血清においてＨＩＶに特異的な特定の抗体を発現する。そのような個体を、ＨＩＶに対して「セロネガティブ」である個体と対比して、「セロポジティブ」という。現在のＨＩＶ特異的抗体の存在は、市販のアッセイシステムにより決定され得る。
【００７４】
現在、上記ウイルスに対する抗体の存在を検出する血清学的な試験が、感染を決定するのに最も広く使用される方法である。そのような方法は、しかしながら、個体がウイルスにかかったがまだ免疫応答を作動していない場合には、偽陰性であり、そして胎仔が抗体を獲得し、母親からウイルスを獲得していない場合には偽陽性という結果になる。血清学的な試験が、感染の徴候を提供する場合、事実上感染したとしてセロポジティブを試験する全てのヒトを考慮することが必要である。さらに、セロネガティブということが分かった特定の個体は、公知のキャリアと接触するような特定の他の感染の徴候が、満たされた場合、事実上感染したものとして処置され得る。
【００７５】
本発明の免疫原性組成物は、ＨＩＶセロネガティブまたはセロポジティブである個体に投与され得る。セロポジティブ個体において、プロテアーゼインヒビターのように、抗ウイルス剤での処置を含む、処置法の１部分として上記組成物を投与することが望ましくあり得る。処置法における抗ウイルス剤およびその使用は、当該分野で周知であり、特定の個体に対する適切な処置法は、熟練した臨床医により決定され得る。
【００７６】
米国特許出願第０９／５６５，９０６号および国際公開公報第００／６７７８７号に記載され、そして本明細書に、および以下の実施例ＩＶに開示されるように、本発明の上記免疫原性組成物の霊長類胎仔または霊長類新生児への投与は、強い坑ＨＩＶ免疫応答を生じ、胎仔および幼児の免疫系が、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳへの進行から子供を防御するべきであるこのような組成物に対して免疫応答を作動することができることを示している。従って、本発明の免疫原性組成物は、胎仔、幼仔、小児または成人に対してＨＩＶ伝播を阻害するために、予防的ワクチンまたは治療的ワクチンとしてＨＩＶ感染妊婦の母体に、投与され得る。
【００７７】
本発明の方法において、投与されるべき上記免疫原性組成物の用量、またはそれらの成分は、所望の免疫応答が刺激されるのに有効であるように選択される。一般に、単回投与のために処方された免疫原性組成物は、約１〜２００μｇのタンパク質抗原の間の量を含む。免疫原性組成物は一般的に、ヒトのような霊長類に投与するために約１００μｇのタンパク質抗原を含む。米国特許出願第０９／５６５，９０６号および国際公開公報第００／６７７８７号に記載され、そして本明細書に開示され、以下の実施例ＩＶに示されるように、免疫原性組成物中約１００μｇのＨＩＶ抗原は、霊長類において強力な免疫応答を誘発する。約１０μｇのＨＩＶ抗原は、齧歯類に対する投与には適切である。当業者は、本発明の免疫原性組成物中に含まれるＨＩＶ抗原の免疫応答を刺激するのに十分な適切な量を、容易に決定でき得る。
【００７８】
本発明の免疫原性組成物は、約５μｇから約１００μｇのイミュノマーをさらに含み得、および所望の場合には１０ｍｇまでのイミュノマーを、含み得る。例えば、ヒトへの投与の用量には、以下があり得る：
【００７９】
【化３】
2007523884.tif 000004
【００８０】
米国特許出願第０９／５６５，９０６号および国際公開公報第００／６７７８７号に以前に記載されているように、ＨＩＶ抗原１に対して少なくとも５の核酸分子の重量比は、免疫応答を誘発するより低い率より有効であった。当業者は、免疫応答を誘発するＨＩＶ抗原に対するイミュノマーの適切または最適化された比率を、容易に決定できる。例えば、ＨＩＶ抗原に対するイミュノマーの適切または最適化された比率を決定するためにその比率は、変えられ得るし、その免疫応答は、本明細書に開示する方法で、測定され得る。齧歯類において、免疫原性組成物中のイミュノマーの有効な量は、５μｇから、５０μｇより多く（例えば約１００μｇ）である。霊長類においては、約５００μｇのイミュノマーは、免疫原性組成物において適切である。当業者は、所望の免疫応答を誘発するためのイミュノマーの適切な量を、容易に決定し得る。
【００８１】
全ての免疫原性組成物と同様、免疫学的に有効な量は、実験的に決定されるが、例えば、齧歯類および非ヒト霊長類のような動物モデルにおいて免疫学的に有効な量に基き得る。考慮されるべき要因としては、抗原性、処方（例えば、アジュバントの容量、型）、投与経路、投与されるべき免疫容量の数、物理的状態、固体の体重および年齢などが挙げられる。そのような要因は、ワクチン分野においては周知であり、過度な実験をしなくても、そのような決定をすることができる免疫学者の熟練の範囲内である。
【００８２】
本発明の免疫原性組成物は、当該分野で任意の公知の方法（例えば、筋肉内、皮内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻内、経口または他の粘膜内が挙げられるが、限定されない）により局所的に、または全身的に投与され得る。上記免疫原性組成物は、適切な非毒性の薬学的キャリアにより投与され得るか、またはマイクロカプセル化にまたは徐放性インプラントとして処方され得る。本発明の免疫原性組成物は、所望により、所望の免疫応答を得るために複数回投与され得る。適切な投与経路、処方および免疫スケジュールは当業者により決定され得る。
【００８３】
本発明の種々の実施形態の活性を実質的に影響しない改変はまた、本明細書で提供される発明の定義の範囲内であることが理解される。従って、以下の実施例は本発明を説明するよう意図され、限定されないよう企図される。
【実施例】
【００８４】
（実施例１  ＨＩＶ免疫原性組成物によるサイトカイン、抗体およびケモカイン応答の誘発）
本実施例は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む免疫原性組成物が、哺乳動物において，ＩＦＮ−γ産生（Ｔｈ１（ＣＤ８）およびＴｈ２（ＣＤ４ヘルパー）サイトカイン）、抗体応答、およびβケモカイン産生の強力な刺激剤であることを示すことが企図される。従って、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む免疫原性組成物は、ＨＩＶ感染および疾患の進行に対して防御するために重要である型の強力な免疫応答を媒介し、これはこれらの組成物が有効な予防ワクチンおよび治療ワクチンであることを示す。
【００８５】
（イミュノマー）
【００８６】
【化４】
2007523884.tif 000005
【００８７】
（免疫）
上記ＨＩＶ−１抗原を、本質的に以前に記載されているように調製する（国際公開公報第００／６７７８７号）。簡単にいうと、ＨＩＶ抗原を、ｅｎｖＡ／ｇａｇＧ組換えウイルス（Ｃｈｏｉら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  １３：３５７〜３６１（１９９７））を含む、亜型「Ｍ」として特性付けられたＺａｉｒｉａｎウイルス単離物（ＨＺ３２１）で慢性的に感染したＨｕｔ７８の培養物から得られたウイルス粒子から調製する。上記ｇｐ１２０は、２工程の精製プロセスの間に欠損する。上記抗原を、βプロピオラクトンの添加および５０ｋＧγでのガンマ照射により、不活化する。ウエスタンブロットおよびＨＰＬＣ分析を、この抗原の調製（Ｐｒｉｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．１９：３０〜５２（１９９５））において、ｇｐ１２０の非検出レベルを示すのに使用する。インビトロ実験のために、ネイティブなｐ２４を、好ましくは、精製ＨＩＶ−１抗原から２％トリトンＸ−１００で溶解し、そして次いで、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓ樹脂で精製する。クロマトグラフィーを、ｐＨ＝５．０で行い、ｐ２４は、直線塩勾配で溶出する。最終生成物の純度を、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）電気泳動および逆相高速液体クロマトグラフィーの両方で評価し、一般に＞９９％であることを見出す。上記イミュノマーを最終容量の少なくとも５％の容量に希釈したＨＩＶ−１抗原に添加する。
【００８８】
ＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）を、ＩＦＡ（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）中、１０ｍｇ／ｍｌのｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を再懸濁して、調製する。１部の表面活性剤Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ８０（高純度マンニドモノレート（ｍａｎｎｉｄｅ  ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）、Ｓｅｐｐｉｅ、Ｐａｒｉｓ）を、９部のＤｒａｋｅｏｌ  ６ＶＲ軽鉱物油（Ｐａｎｒｅｃｏ、Ｋａｒｎｅｓ  Ｃｉｔｙ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）に添加して、ＩＦＡまたはＩＳＡ５１（登録商標）を、配合する。上記ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１抗原を、ＰＢＳで２００μｇ／ｍｌに希釈し、等容量のＣＦＡまたはＩＦＡでイミュノマーと共にか、またはイミュノマーなしで乳化する。
【００８９】
病原体フリーの施設で維持されたＣ５７Ｂ１マウスに、皮内に１００μｌの乳化液を注入する。各動物に、ＣＦＡ、ＩＦＡのいずれかの中で１〜１０μｇの不活化ＨＩＶ−１抗原、１０〜１００μｇのイミュノマーまたはＩＦＡ＋１０〜１００μｇのイミュノマーを投与する。ＣＦＡ中のＨＩＶ−１抗原で感作された動物は、代わりにＩＦＡ中のＨＩＶ−１抗原で追加免疫される以外は、おなじ処置法を使用して、２週間後、尾の根元に皮下で追加免疫をする。マウスを感作し、イミュノマーの存在下で、ＨＩＶ−１抗原で追加免疫する。ネガティブコントロールに、生理食塩水または生理食塩水中のＩＦＡを投与する。２８日目に、上記動物をサイトカイン、ケモカインまたは抗体分析のために屠殺する。
【００９０】
（抗原特異的抗体についてのＥＬＩＳＡ）
研究の最後に、免疫された動物から心臓穿刺により全血を収集する。そのＳＳＴ試験管を８００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。血清を、等分し、−２０℃でアッセイまで保存する。ＰＶＣプレート（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｂｉｐｈｅｎｙｌ  ｐｌａｔｅｓ、Ｆａｌｃｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、Ｃａｌｉｆｏｎｉａ）を、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌのネイティブｐ２４でコートし、４℃で一晩保存する。プレートを、各ウエルに２００μｌの４％ＢＳＡのＰＢＳを加え、１時間ブロッキングする。血清を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで、１：１００で希釈し、その後４倍ごと順次、希釈をする。２連で、１００μｌの希釈血清を添加し、室温で２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ブロットして乾燥した。検出２次抗体（ヤギまたはラットの抗マウスＩｇＧビオチン、ヤギまたはラットの抗マウスＩｇＧ１ビオチン、ヤギまたはラットの抗マウスＩｇＧ２ａビオチン、例えば、Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をＰＢＳ中１％ＢＳＡで希釈する。１００μｌの希釈した２次抗体を各ウエルに添加し、室温でさらに１時間インキュベートする。過剰の２次抗体を洗浄した後、ストレプトアビジンビオチンＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を各ウエルに５０μｌづつ加え３０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、３回洗浄する。ＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を青がかった緑色に発色するまで添加する。１％ＳＤＳを添加してその反応を停止し、そしてそのプレートの４０５ｎｍの吸収を読む。
【００９１】
５０％抗体力価として報告される抗体応答は、各所定のサンプルについての最大結合（最高光学読取り）の５０％に等しい希釈の逆数である。その吸光度の値（４０５ｎｍにおけるＯＤ）を、対数目盛りで抗体希釈に対してプロットし、シグモイド様の用量応答曲線を得る。最大結合の５０％を、最高ＯＤ値に０．５を掛けて計算する。その５０％値は、曲線上に位置し、それに対応するｘ軸の値が、抗体希釈として報告される。
【００９２】
（サイトカインおよびケモカイン分析のためのＥＬＩＳＡアッセイ）
排液管系リンパ節（浅鼡径リンパ節および膝窩リンパ節）を追加免疫後２週間で免疫動物から単離する。これらのリンパ節の単一細胞懸濁液を、滅菌７０μｍメッシュスクリーンを使用して機械的解離により調製する。Ｔ細胞をリンパ節細胞からパンニング法により精製する。簡単に言うと、ペトリ皿（１００×１５ｍｍ）を、２０μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩｇＧで、室温で４５分間、予備コートする。そのペトリ皿を氷冷ＰＢＳで２回、そして氷冷２％ヒトＡＢ血清ＰＢＳ溶液で１回洗浄する。１×１０７個のリンパ節細胞を、予備洗浄したプレートに加え、そして４℃で９０分間インキュベートする。非接着性細胞（富化されたＴ細胞）を、その後収集し、そして滅菌５０ｍｌ円錐形試験管に移す。上記プレートを、２回洗浄し、非接着細胞と組合わせる。上記細胞を、次いで遠心分離し、細胞ペレットを完全培地に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する（２５ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌグルタミン、１００μｇストレプトマイシンおよび５×１０−６Ｍ  βメルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ  １６４０中、５％ヒトＡＢ血清）。
【００９３】
Ｃ５７ＢＬマウス由来のγ線照射胸腺を、抗原提示細胞として使用する。２×１０５個の富化されたＴ細胞および５×１０５胸腺細胞を、９６丸底プレートの各ウエルに添加する。上記ＨＩＶ−１抗原およびネイティブｐ２４を、完全培地に１０μｇ／ｍｌに希釈する。一方、ｃｏｎ  Ａは５μｇ／ｍｌである、１００μｌの各抗原またはＴ細胞変異原を、３連で添加する。それらのプレートを、５％ＣＯ２、３７℃で、７２時間インキュベートする。上清を回収し、−７０℃でアッセイまで保存する。上記サンプルについて、マウスサイトカインおよびケモカインに特異的な市販のキット（例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、ＩＬ−４、ＩＦＮーγおよびＲＡＮＴＥＳについてのアッセイをする。
【００９４】
（統計的方法）
マンホイットニー  Ｕ  ノンパラメトリック統計を、群を比較するために使用する。全てのｐ値は、両側検定である。
【００９５】
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）は、現在、細胞性免疫応答を刺激することが知られている最も強力なアジュバントである。しかしながら、ＣＦＡは、安全性の面からヒトにおける使用には適切なアジュバントではない。従って、ＨＩＶ免疫原性組成物における使用のためのイミュノマーとＩＦＡとの組合わせは、ヒト治療に安全で有効なワクチンを提供する。
【００９６】
ＩＦＮ−γに対する用量に関連する免疫応答を試験するために、異なる濃度のイミュノマーを含むＩＦＡ中で乳化した不活化ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１抗原でＣ５７ＢＬマウスを免疫する。
【００９７】
ＨＩＶ−１抗原に対してもまた、抗体応答を追加免疫し得るか否かを試験するために、血清を、ｐ２４抗原に対する、全ＩｇＧおよびＴｈ２アイソタイプ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）抗体応答についてアッセイする。
【００９８】
従って、本発明の免疫原性組成物は、個体におけるβケモカイン産生を増進するために使用され得る。βケモカインレベルとＨＩＶ感染および疾患の進行からの防御との強い関連性のために、本発明の組成物は、ＡＩＤＳを阻害する他に記載されている組成物より有効であり得る。
【００９９】
（実施例２  ＨＩＶ免疫原性組成物によるＣＤ４およびＣＤ８免疫応答の誘発）
本実施例は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む免疫原性組成物で免疫した後に、強力なＣＤ４ヘルパー機能、ＣＤ８ＨＩＶ特異的Ｔｈ１型免疫応答およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１抗体の高い比率へのシフトを誘導することを示すことが企図されている。ＣＤ８＋、細胞傷害性Ｔリンパ球による抗原特異的応答は、ＨＩＶの初期感染および疾患の進行を予防するのに重要な因子である。従って、この実施例は、本発明の免疫原性組成物が、有効な予防的ワクチンおよび治療的ワクチンである証拠を、さらに提供する。
【０１００】
ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびＩＦＡを、実施例Ｉで記載されるように、本質的に調製される。Ｃ５７ＢＬマウスを、実施例Ｉに記載のように本質的に免疫し、そしてＥＬＩＳＰＯＴおよびｐ２４抗体分析のために２８日目に屠殺する。ｐ２４抗体分析を、本質的に実施例Ｉに記載のように行う。
【０１０１】
（バルクＴ細胞および精製されたＴ細胞集団由来のγインターフェロンについてのＥＬＩＳＰＯＴ）
ＲＰＭＩ  １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）中で細かく刻みそして滅菌した細かいメッシュのナイロンスクリーンを通すことにより単一細胞懸濁液を、免疫したマウスの脾臓から調製する。上記脾細胞をフィコール勾配遠心分離法により精製する。ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を磁気ビーズ減耗法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により単離する。２×１０７個の細胞を、ウサギ抗マウスＣＤ４またはラット抗マウスＣＤ４あるいはウサギ抗マウスＣＤ８またはラット抗マウスＣＤ８のいずれかの５μｇで染色する。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、氷冷ＰＢＳ中２％ヒトＡＢ血清で洗浄する。ヤギ抗マウスＩｇＧでコートした、予備洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＤＹＮＡＬ、Ｏｌｓｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を、細胞懸濁液に添加し、一定の速さで混合しながら４℃で２０分間インキュベートする。
【０１０２】
精製したＣＤ４脾細胞、ＣＤ８脾細胞および非欠損脾細胞を完全培地（Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、ＬグルタミンおよびβＭＥを含むＲＰＭＩ  １６４０中５％不活化ヒトＡＢ血清）に５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイについて使用して、個別のＩＦＮ−γ分泌細胞を数える。簡単にいうと、９６ウエルのニトロセルロース底ミクロ力価プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）を、１ウエルあたり４００ｎｇウサギ抗マウスＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でコートする。４℃で一晩インキュベーションの後、プレートを滅菌ＰＢＳで洗浄し、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、Ｌグルタミンおよびβ−ＭＥを含むＲＰＭＩ  １６４０中５％ヒトＡＢ血清で、室温で１時間ブロッキングする。プレートを滅菌ＰＢＳで洗浄し、各ウエルに５×１０５個の脾細胞（精製したＣＤ４、精製したＣＤ８または非欠損）を３連で添加し、一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を培地、ＯＶＡ（トリたまご卵白アルブミン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、ネイティブｐ２４またはｇｐ１２０−欠損ＨＩＶ−１抗原と共に培養する。ＣＤ４精製脾細胞およびＣＤ８精製脾細胞を、２０単位／ｍｌの組換えラットＩＬ−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む完全培地でアッセイする。
【０１０３】
結合していない細胞を洗浄したあと、１ウエル当たり４００ｎｇのポリクローナルウサギ抗マウスＩＦＮγを添加し、室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧビオチン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で染色する。滅菌ＰＢＳで十分に洗浄をしたあと、アビジンアルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、そして室温でさらに１時間インキュベートする。上記スポットに発色性アルカリホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加して発色させ、ＩＦＮ−γ細胞を、明るい３０００光源を装備した解剖顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）（４０倍）を使用して計数する。
【０１０４】
（統計的方法）
マンホイットニー  Ｕ  ノンパラメトリック  統計を、群を比較するために使用する。Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関を、ＣＤ４γインターフェロン産生とＣＤ８γインターフェロン産生との関係を調べるために実施する。全てのｐは、両側検定である。
【０１０５】
非欠損脾細胞によるＩＦＮ−γ産生および精製ＣＤ４＋または精製ＣＤ８＋集団によるＩＦＮ−γ産生を調べる。ＣＤ４＋細胞によるＩＦＮ−産生は、特徴的なＴｈ１免疫応答であり、一方ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞溶解性活性と相互に関連がある。ｐ２４に特異的な全ＩｇＧ，ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂもまた、調べる。
【０１０６】
要約すれば、この実施例は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む免疫原性組成物が、強力なＨＩＶ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ＨＩＶ特異的免疫応答を生成するために使用され得ることを示す。ＣＤ４Ｔヘルパー細胞の誘導は、ＣＤ８エフェクター細胞の生成のために重要であり得る。ＣＤ８Ｔ細胞は、いくつかの機序により、ＨＩＶウイルスに対してエフェクターとして機能し得、この機序には直接的な細胞溶解（ＣＴＬ）活性およびβケモカインおよび他のよく特定されていない因子のような抗ウイルス抑制因子の放出によることなどが挙げられる。従って、本明細書に記載される組成物は、ＨＩＶワクチンとしての使用について他に記載された組成物より優れている。
【０１０７】
（実施例ＩＩＩ  異なる免疫原性組成物および免疫スケジュールにより誘発される免疫応答の比較）
本実施例は、イミュノマー含有核酸が、（ＨＩＶ抗原とアジュバントの投与１週間前に、哺乳動物を感作するのに使用される場合より、ＨＩＶ抗原とアジュバントを同時に投与した場合に防御的な免疫応答ＲＡＮＴＥＳ産生およびＨＩＶ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体産生を含む）を誘発するのにより有効であることを示すことが企図される。この実施例はまた、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む組成物が、抗原依存性リンパ球増殖を、ＨＩＶおよびＩＦＡのみを含む組成物より、より有効に促進することを示す。
【０１０８】
ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびＩＦＡは、本質的に実施例Ｉに記載されるように調製される。Ｃ５７ｂＢＬマウス（少なくとも１群３匹）を、表１に示される以下の組成物で７日目に免疫する。表１に示されるように、０日目に感作する。
【０１０９】
【表１】
2007523884.tif 000006
【０１１０】
本質的には、実施例Ｉに記載されるように、サイトカイン、ケモカイン、および抗体分析、ならびにリンパ球の増殖の分析のために２１日目で動物を屠殺する。
【０１１１】
（リンパ球増殖アッセイ）
単一細胞懸濁液を、免疫動物の排液管系リンパ節から調製する。Ｂ細胞を、パンニングによりリンパ節細胞から消失させる。簡単に言うと、リンパ節細胞を、抗マウスＩｇＧをプレコートしたペトリ皿で９０分間インキュベートする。非接着性細胞（富化されたＴ細胞）を収集し、完全組織培養培地に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。富化されたＴ細胞を、ｐ２４またはＨＩＶ−１抗原と共にγ照射した胸腺細胞の存在下で、３７℃、５％ＣＯ２で、４０〜４８時間、培養する。サンプルをトリチウム化チミジンでパルスし、さらに１６時間インキュベートする。細胞を回収し、トリチル化チミジンの取り込みをβシンチレーションカウンターで計数する。
【０１１２】
Ｔ細胞におけるサイトカイン産生（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１βおよびＭＩＰ−１αのようなＩＦＮ−γおよびβケモカイン）を、当業者に周知の方法で決定され得る。ｐ２４に特異的なＩｇＧ，ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂの全ての血清レベルもまた、調べる。さらに、ｐ２４抗原およびｐｇ１２０欠損ＨＩＶに対するＴ細胞増殖応答を調べる。
【０１１３】
従って、本発明の免疫原性組成物は、ＨＩＶ特異的Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）および体液性応答（ＩｇＧ２抗体）を有効に誘発し得、かつ非特異的およびＨＩＶ特異的βケモカイン産生の両方を増進し得る。上記免疫原性組成物に対するこれらの応答は、強いＨＩＶ特異的リンパ球増殖応答と相関する。
【０１１４】
（実施例ＩＶ  ＨＩＶ免疫原性組成物による霊長類の免疫）
本実施例は、ＨＩＶ抗原、イミュノマーおよびアジュバントを含む免疫原性組成物が、霊長類においてＨＩＶ特異的免疫応答を増進するのに有効であることを示すことが企図されている。
【０１１５】
３匹のヒヒの胎仔に、５００μｇのイミュノマーを有するＩＦＡ中にｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１（１００μｇ全タンパク質、１０ｐ２４単位と等価）を含む免疫原性組成物を、子宮内に注入する。４週間後、胎仔を同じ処置法を使用して追加免疫する。
【０１１６】
新生ヒヒからの末梢血単核細胞を収集し、そしてｐ２４およびＨＩＶ−１抗原に対する増殖的応答をアッセイする。
【０１１７】
ＨＩＶ特異的抗体、サイトカインおよびβケモカインの産生もまた、同じヒヒで測定する。これらの結果は、齧歯類についての上述の実施例Ｉ〜ＩＩＩに記載の免疫原性組成物により誘発される免疫応答の型が、霊長類においてもまた誘発されることを示す。
【０１１８】
これらの結果は、本発明のＨＩＶ免疫原性組成物および方法が、霊長類においてＨＩＶ特異的免疫応答を刺激するのに有効であることを実証する。さらにこれらの結果は、胎仔および幼仔が本発明の免疫原性組成物に対する強いＨＩＶ免疫応答を誘発することができることを実証する。これはこれらの組成物が、ＨＩＶの母仔伝染を予防し、幼仔ワクチンとしても有用であることを示す。
【０１１９】
（実施例Ｖ  マウスモデルにおけるイミュノマーとの組合わせた不活化ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ免疫原によるワクチン接種に対する免疫応答）
本実施例は、マウスモデルにおけるＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−１免疫原（ＩＦＡ中に乳化された抗原）の免疫原性を増進するイミュノマーの能力の特性分析を記載する。  
【０１２０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）に、以下に示すように注入する。１群あたりの数は、一般に少なくとも８〜１０マウスである。
【０１２１】
１）ＰＢＳ
２）マウス１匹当たり３０μｇのイミュノマー＝１．５ｍｇ／ｋｇ
３）イミュノマー（９０μｇの最高用量）＝４．５ｍｇ／ｋｇ
４）ＨＩＶ−１免疫原（１０μｇ）
５）ＨＩＶ−１免疫原＋イミュノマー（１０μｇ、３０μｇ、９０μｇ）
６）ＨＩＶ−１免疫原＋イミュノマー３０μｇ
上記ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１抗原を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２００μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、イミュノマーと共にまたはイミュノマーなしで、等容量のＩＦＡで乳化する。上記イミュノマーを、乳化前に最終容量の少なくとも５％の容量で、希釈ＨＩＶ−１抗原に添加する。
【０１２２】
初期の単回皮内注入を、０時間に行い、２週間後に皮内注入を行う。上記マウスを追加免疫後２週間後に屠殺する。使用したＨＩＶ−１免疫原は、ＩＦＡ中の不活化ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ抗原である。
【０１２３】
（免疫学的分析）
新鮮な脾臓単核細胞を単離し、そしてインビトロで４日間刺激する（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０〜８７６（１９９８）。その単離された細胞を、培地において単独；ネイティブｐ２４抗原とともに；またはＨＩＶ−１抗原とともに、刺激する。
【０１２４】
種々のサイトカインの産生についてＥＬＩＳＡ法を使用して評価する。アッセイされる例示的なサイトカインとしては、例えば、本明細書に開示されるようにおよび以前に記載されたようにＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＭＩＰ１α、ＭＩＰβ、ＲＡＮＴＥＳ、αデフェンシンが挙げられ、これらは当業者に周知の方法によりアッセイされる。
【０１２５】
ＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球におけるｐ２４抗原およびＨＩＶ−１抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、実施例ＩおよびＩＩに記載のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価する。
【０１２６】
ｐ２４抗原、ＨＩＶ−１抗原およびＬＰＳ特異的リンパ球増殖を、周知の方法を使用して標準的な増殖アッセイにおいて評価する。
【０１２７】
（実施例ＶＩ  予めＨＩＶ−１免疫原で免疫したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣにより生成されたＨＩＶ特異的免疫応答に対するイミュノマーのインビトロ効果）
本実施例は、ＩＦＡ中の不活化ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１抗原（ＲＥＭＵＮＥ）で処置された患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、インビトロでのＨＩＶ特異的免疫応答を増進するイミュノマーの能力についての評価を記載する。
【０１２８】
以下の群の患者を試験する：１５人のＨＩＶ感染し、かつＨＡＡＲＴ＋ＲＥＭＵＮＥで処置された患者；１５人のＨＩＶ感染し、かつＨＡＡＲＴ処置された患者。上記患者について、疾患の期間、ＣＤ４計数、ＨＩＶウイルス血症、プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）の不存在／存在について整合する。全血（５３０ｍｌ）を、ＥＤＴＡ含有試験管に、引き続く分析のために静脈穿刺により採血する。イミュノマーを以下の濃度でＰＢＭＣに添加する：０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ。
【０１２９】
種々の抗原（例えばＨＩＶ抗原、ｐ２４抗原、ＨＩＶ−１抗原、ｅｎｖペプチド、ｇａｇペプチド；およびフルー（コントロール抗原））に特異的な応答を測定する。他のＨＩＶ抗原もまた、所望により測定し得る。ＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球における抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、実施例ＩおよびＩＩに記載されるようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価する。抗原特異的リンパ球増殖をまた、標準的増殖アッセイにおいて評価する。
【０１３０】
ＲＡＮＴＥＳ、αデフェンシンの産生を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）法で，ＣＤ８＋において細胞内染色をすることにより評価する。所望であれば、他のサイトカインまたは他の細胞型を、アッセイし得る。
【０１３１】
（実施例ＶＩＩ  トリメラ（Ｔｒｉｍｅｒａ）マウスモデルにおけるＨＩＶ特異的免疫応答に対するイミュノマーのインビボでの効果）
本実施例は、イミュノマーを含むＨＩＶ免疫原性組成物の効果を決定するためのトリメラマウスの使用を記載する。
【０１３２】
トリメラマウスモデルを、ＨＩＶ抗原との組み合わせられる場合のイミュノマーの効果を試験するために使用する。誘導された免疫応答および防御的免疫の両方を、モニターし得る。トリメラマウスを、以前に記載されたように生成する（ＲｅｉｓｎｅｒおよびＤａｇａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２〜２４６（１９９８）；Ｉｌａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１０２〜１０９（２００２）；米国特許第６，２５４，８６７号；ＷＯ  ９７／４７６５４）。簡単に言うと、正常マウス宿主を、致死的な分割用量の全身照射により、免疫不全にする。そのマウスを、次いでＴ細胞欠損マウスＳＣＩＤ骨髄により、放射線防御にし、ヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）の腹腔内注入により、トリメラマウスに変換する。トリメラマウスにおいて、ヒト細胞の移植を、ＣＤ３または他のようなヒトＴ細胞マーカーの蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析により証明する。
【０１３３】
トリメラマウスを、ＡＩＤＳのモデルとしてＨＩＶで感染させる。簡単に言うとトリメラマウスを１以上の株のＨＩＶ−１で感染させる。コントロール動物は、培地のみ（ＨＩＶ−１なし）を注入したマウスであり、かつＰＢＭＣを注入していないマウスである。マウスを、共培養実験において、血漿中のＨＩＶ−１  ＲＮＡレベル、プロウイルスＤＮＡの存在および活性ウイルスを決定することにより，ＨＩＶ−１感染について種々の時点で評価する。プロウイルスＨＩＶ−１  ＤＮＡの存在を、ｇａｇのようなＨＩＶ−１配列のＰＣＲにより実証する。
【０１３４】
免疫応答を刺激するためのイミュノマーを含む免疫原性組成物を試験するために、トリメラマウスに、ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１を、少なくとも１つのイミュノマーとともに、またはイミュノマーなしで、およびアジュバントと共にまたはアジュバントなしで注入する。抗原とイミュノマーの種々の比率を、例えば、実施例Ｖに記載されるように使用し、最適化された免疫応答について試験し得る。あるいは、上の組成物を、ヒト自己単球由来の樹状細胞（ＤＣ）にパルスし、そしてこれらＤＣをトリメラマウスに注入する。必要に応じて、マウスを類似の組成物で追加免疫し得る。
【０１３５】
免疫に引き続いて、血液および腹膜リンパ球を収集する。ＨＩＶ抗原特異的免疫グロブリンの存在を、決定する。さらに特定の細胞性抗ＨＩＶ応答を、上記マウスから単離されたヒトリンパ球において決定する。例えば、トリメラマウスから回収したヒトリンパ球におけるＩＦＮ−γ産生を、ＨＩＶ−１抗原に曝露した後で決定する。イミュノマー存在下でのＨＩＶ抗原に対する増進した免疫学的な応答を、決定する。
【０１３６】
感染性ＨＩＶでの接種前に、マウスを種々の組成物で免疫すること以外は、同様な様式で防御的免疫を、モニターする。その後のウイルス血症のレベルに影響する種々の組成物の能力を、上述のように測定する。最も有効なワクチンは、ウイルスの循環の最も有効な制御をおよび／または生存を延ばすことを提供するワクチンである。
【０１３７】
（実施例ＶＩＩＩ  ＨＩＶ感染患者のＲＥＭＵＮＥＴＭによる免疫）
本実施例は、ＨＩＶ感染患者のＲＥＭＵＮＥＴＭ（ＩＦＡにおけるＧＰ１２０欠損ＨＩＶ−１抗原）による免疫を記載し、大多数の患者が、強さおよび持続期間は異なるが、免疫応答を作動することを実証する。この特定の研究の目的は、非常に活性の強いレトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）（インジナビル／ＺＤＶ／３ＴＣ）と組合わせて、ＲＥＭＵＮＥで処置した後、ＨＩＶ−１特異的免疫応答をフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）＋ＨＡＡＲＴと比較して、評価することであった。
【０１３８】
研究プロトコルは、ランダマイズされ、２重盲検、２腕（ｔｗｏ  ａｒｍ）、平行群の、アジュバントコントロールされた多中心性研究（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｓｔｕｄｙ）であった。被験体数（全体および各処置について）は、分析処理する意図のある４３人の評価し得る患者（２２  ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴ；２１  ＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴ）を含む５２人の患者でランダマイズされた。診断および包括の基準は、ＣＤ４計数が＞３５０細胞／μＬで、以前にＨＩＶプロテアーゼインヒビターまたはラミブジン（３ＴＣ）の使用が以前にないＨＩＶ−１感染患者であった。試験製品の用量および試験製品の投与の様式は、ＲＥＭＵＮＥ（ＨＩＶ−１免疫原）；１０単位（１０μｇ／ｍｌ  ｐ２４含有量に等しい）、１．０ｍｌ容量で提供されるＩＭ（バッチ番号８１５５〜０１５および８１５５〜０１７）であった。処置の時間については、患者がＨＡＡＲＴを３２週間受けた。ＲＥＭＵＮＥまたはＩＦＡプラセボ（コントロール）を、４週目、１６週目および２８週目に投与された。参考治療の用量および参考治療の投与の様式は、アジュバントコントロールであった；ＩＦＡプラセボ（バッチ番号：８１４４〜００６および８１６０〜００５）を使用した。
【０１３９】
１次有効性の基準は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＨＩＶ−１抗原刺激に対するリンパ球の増殖（ＬＰ）応答であった。２次有効性の基準としては、ＰＢＭＣにおけるネイティブｐ２４およびＢａＬ  ＨＩＶ−１抗原刺激に対するＬＰ応答；ＰＢＭＣにおけるネイティブｐ２４およびＨＩＶ抗原刺激に対するケモカイン応答；ｇａｇ  ＣＴＬ活性（一サブセットの患者）；ＣＤ４細胞計数およびＣＤ４の割合の変化；血漿ＲＮＡおよびＰＢＭＣ  ＤＮＡとして測定されるウイルス容量の変化；ならびにＨＩＶ−１抗原およびｐ２４抗原に対するＤＴＨ皮膚試験応答が挙げられる。使用した統計方法は、処置が意図された患者におけるフィッシャー正確検定（両側）および両側マンホイットニー検定であった。
【０１４０】
１次分析は、応答比率を、２つの時点において、基礎と比較して５倍のＨＩＶ−１抗原に対する刺激インデックス（ＳＩ）として定義した。結果は、ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴ群において１４／２２（６４％）応答者およびＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴ群で４／２１（１９％）の応答者がいたことを示した（ｐ＝０．００５）。２次分析は、応答比率を、２つの時点において、基礎と比較して３倍のＢＡＬ型ＨＩＶ−１抗原および／またはｐ２４抗原に対するＳＩとして定義する。結果は、ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴ群において１５／２２（６８％）応答者およびＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴ群で５／２１（２４％）の応答者がいたことを示した（ｐ＝０．００６）。ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴを受けた被験体の中でＨＩＶ−１（ＨＺ３２１）抗原に対するＬＰ応答の大きさは、ＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴを受けた被験体のものより大きく（ｐ＝０．００２８）、処置前値の幾何学的平均に対して、最初の注入後に測定されたＳＩの幾何学的平均の各被験体の比率として定義される。
【０１４１】
ＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴ群と比較して、ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴにおけるネイティブｐ２４（ｐ＝０．０００２）およびＨＩＶ−１  ＢａＬ抗原（ｐ＝０．００７）に対して統計的に有意なＬＰ応答があった。上記の２つの群の間には、抗原（カンジダ、ストレプトキナーゼ、破傷風）を回復するＬＰ応答に差はなかった。ＨＩＶ−１抗原に刺激されたＰＢＭＣによるＭＩＰ−１β産生は、ＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴ群と比較して、ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴ群において有意に（３２週目においてｐ＋０．０００７）増強された。ＩＦＡ＋ＨＡＡＲＴ群と比較して、ＲＥＭＵＮＥ＋ＨＡＡＲＴ群においてより大きなＤＴＨ皮膚応答率であり、ＨＩＶ−１については（５３％対９％）ネイティブｐ２４抗原については（４７％対０％）であった。
【０１４２】
ＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビルの投与は、応答者の数および応答の大きさの両方に関してＨＩＶ−１抗原に対するリンパ球増殖（ＬＰ）応答の有意な刺激となった。応答比率を、２つの時点において、基礎と比較して５倍のＨＩＶ−１抗原に対する刺激インデックスとして定義し、ＩＦＡ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル群（４／２１、１９％）より、ＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル群（１４／２２、６４％）の方が有意に高い応答者の数（ｐ＝０．００５）であった。
【０１４３】
ＲＥＭＵＮＥを受けた被験体の高い割合が、ネイティブｐ２４抗原に対して強いＬＰ応答を生じた。これは、ＲＥＭＵＮＥが、より保存されたＨＩＶコア抗原に、特異的に応答し得ることを実証した。ＩＦＡでの処置は、如何なる抗原に対しても、ＨＩＶ−１特異的免疫応答を刺激しなかった。ＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビルは、精製ネイティブｐ２４に対して、有意に（ｐ＝０．０００２）高いリンパ球増殖応答を、生じた。
【０１４４】
ＲＥＭＵＮＥの投与は、ＨＩＶ−１（ＨＺ３２１）免疫抗原および、クレードＢであるＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−１  ＢａＬ抗原に対するＬＰ応答を刺激した。これは、ＲＥＭＵＮＥにより生成された免疫応答がクレードを交差しており（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）、免疫因子に限らないことを実証した。ＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビルは、ＩＦＡ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビルと比較して、ＨＩＶ−１  ＢａＬ抗原に対して、有意に（ｐ＝０．００７）高いリンパ球増殖応答比率を産生した。
【０１４５】
抗原刺激ＭＩＰ−１βの産生は、ＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル群において、研究期間全体にわたり有意に増加し（３２週でｐ＝０．０００７）、ＩＦＡ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル群においては研究期間に変化しなかった。両群の被験体は、ＣＤ４細胞計数において有意に増加し、血漿ＨＩＶ  ＲＮＡおよびプロウイルスＨＩＶ  ＤＮＡコピー数において有意に減少することを示した。ＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル群において、ＨＩＶ  ＲＮＡ再発に対する時間分析において再発の危険性がより少ない傾向であった；１６週目と３２週目との間で、ＩＦＡ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル被験体の１２／２１（５７％）に対して、再発したＲＥＭＵＮＥ＋ＺＤＶ／３ＴＣ／インジナビル被験体は６／２２（２７％）であった（ｐ＝０．０８、対数順位試験）。ＲＥＭＵＮＥのようなＨＩＶ抗原および１以上のイミュノマーを含む本発明の免疫原性組成物を投与することにより、より強い、より時間の長い応答が期待される。
【０１４６】
これらの結果は、大多数の患者において、ＲＥＭＵＮＥが、免疫応答を刺激することを実証する。
【０１４７】
（実施例ＩＸ  ＨＩＶ感染患者のＲＥＭＵＮＥＴＭおよびイミュノマーによる免疫）
本実施例は、ＨＩＶ感染患者のＲＥＭＵＮＥおよびイミュノマーによる免疫を記載する。
【０１４８】
ＲＥＭＵＮＥとイミュノマーおよび／または高度に活性なレトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）（インジナビル／ＺＤＶ／３ＴＣ）との組み合わせで処置した後、ＨＩＶ−１特異的免疫応答を、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）＋イミュノマーおよび／またはＨＡＡＲＴと比較して、評価する目的で研究を行う。
【０１４９】
方法論は、ランダマイズされた、２重盲検、２腕（ｔｗｏ  ａｒｍ）、平行群の、アジュバントコントロールされた研究を使用する。ＨＩＶ−１感染患者の診断および包括の基準は、ＣＤ４計数が＞３５０細胞／μＬで、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターまたはラミブジン（３ＴＣ）の使用が以前にない患者である。患者の選択の他の基準も使用し得る。投与の上記試験製品、用量および様式は、ＲＥＭＵＮＥ（ＨＩＶ−１免疫原）；１０単位（１０μｇ／ｍｌ  ｐ２４含有量に等しい）、１．０ｍｌ容量の提供されるＩＭ。イミュノマーの用量、約１〜５ｍｇ／ｋｇで投与する。高いかまたは低い他の用量のイミュノマーもまた、免疫応答の有効な増進のために試験し得る。ＨＡＡＲＴによる患者の処置の期間については、患者はＨＡＡＲＴを３２週間受ける。ＲＥＭＵＮＥまたはＩＦＡプラセボ（コントロール）およびイミュノマーを、４週目、１６週目および２８週目に投与する。参考治療の用量および参考治療の投与の様式は、アジュバントコントロールであり、そこではＩＦＡプラセボを使用する。
【０１５０】
評価の基準は、有効性および安全性について、実施例ＶＩＩＩに記載される基準と同様である。さらに、免疫応答を決定するためのアッセイとしては、本明細書で開示され、実施例Ｉ〜ＩＩＩおよびＶに記載されるように、例えばインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２抗体比、サイトカイン産生のＥＬＩＳＡアッセイ、リンパ球増殖アッセイ、脾細胞刺激などが挙げられ得る。
【０１５１】
イミュノマーとＲＥＭＵＮＥまたは他のＨＩＶ抗原の組合わせは、イミュノマーなしのＨＩＶ抗原と比較して免疫応答を増進することが期待される。従って、本実施例の免疫応答は、実施例ＶＩＩＩで観察される応答より、より強いおよび／またはより長い持続期間が期待される。
【０１５２】
本実施例は、ＨＩＶ感染患者において、免疫応答を刺激するために、ＨＩＶ抗原をイミュノマーと共に投与する、増進した効果を記載する。
【０１５３】
（実施例Ｘ  ＨＩＶ−１抗原とイミュノマーは、ＨＩＶ特異的免疫を誘発する）
本実施例は、ＨＩＶ特異的免疫を刺激するためのＨＩＶ抗原とイミュノマーの使用を記載する。
【０１５４】
ＨＩＶ−１免疫原は、ＨＩＶ−１特異的免疫応答を誘導すること；免疫刺激的シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドが、細胞性免疫応答の強力な刺激剤であることが以前に報告されている、フロイント不完全アジュバントＩＦＡ）と共に配合されたｇｐ１２０欠損不活化全ウイルスワクチン候補である。イミュノマーアジュバント（ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ）との組合わせで、ＨＩＶ−１免疫原を増進した免疫原性を生成する可能性を、マウスモデルにおいて研究した。引き続く実験において，ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＩＦＡ（ＨＩＶ−１抗原）＋ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭなしで、ｇｐ１２０欠損不活化全ウイルスにより誘発され得ることを証明した。
【０１５５】
これらの研究において、使用されたＨＩＶ−１免疫原は、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）と共に配合したｇｐ１２０欠損不活化全ウイルスワクチンであった。本実験を、実施例Ｖに記載のように、本質的に実施した。この免疫原は、ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する。ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭは、免疫刺激的オリゴヌクレオチドであり、また本明細書ではイミュノマーといい、新規な構造および合成免疫改変モチーフを含んでいた。このイミュノマーは、明らかな免疫刺激的プロフィールを誘導する。
【０１５６】
図２は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭイミュノマーの概略図を示し、またＨＹＢ２０５５ともいう。ＨＹＢ２０５５は、新規構造および合成免疫刺激的モチーフＣｐＲからなる第２世代免疫刺激的オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）である。このイミュノマーは、ＴＬＲ９によるシグナル伝達により免疫系を刺激し、Ｔｈ１免疫応答を誘導する。上記イミュノマーは、増進した代謝安定性を示す。健康なボランティアにおけるフェーズＩ試験を、終了した。
【０１５７】
これらのマウス研究は、マウスモデルにおける、ＩＦＡ（ＨＩＶ−１免疫原）中のＨＩＶ−１不活化全ウイルスワクチンの免疫原性を増進する、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ（ＨＹＢ２０５５）の能力を評価することから始められた。これらの研究はまた、ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとの組合せで使用されるＩＦＡ（ＨＩＶ−１抗原）なしで、不活化全ウイルスにより誘発され得るか否かについて試験した。
【０１５８】
簡単に言うと、Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）（０日および１４日）に、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（ＨＩＶ−１抗原）＋３用量のＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ（９０、３０、または１０μｇ／マウス）中、１０μｇのＨＩＶ不活化全ウイルスと共に、あるいはＨＩＶ不活化全ワクチン（ＩＦＡなしのＨＩＶ−１抗原、１０μｇ／マウス）およびＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ（９０μｇ／マウス）とで免疫した。ＨＩＶ−１免疫原単独、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ単独またはＰＢＳで免疫した動物をコントロールとして使用した（１群当たり８〜１０）。マウスイミュノマー（ＨＹＢ  ２０４８）を、参考化合物として使用した。マウスを２８日目に屠殺した。ＨＩＶ−１抗原、ｐ２４刺激サイトカイン産生およびＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞について、新鮮な脾臓単核細胞を評価した。ｐ２４抗体産生について、血清で評価した。
【０１５９】
図３に示されるように、ＨＩＶ−１免疫原は、ＨＩＶ特異的ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α，ＭＩＰ１β、ＩＬ−１０およびＩＬ−５産生を誘導する。表２は、ＨＩＶ−１免疫原とＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとの組合わせが、Ｔｈ１型応答の方向へサイトカインプロフィールを変化させたことを示す。免疫原を、ＳＣで投与した。示される値は平均値である。
【０１６０】
【表２】
2007523884.tif 000007
【０１６１】
同様な分析が表３に示され、それはまたＩＬ−５に対するＩＦＮ−γの比率を示す。刺激は、ＨＩＶ−１抗原であった。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５を、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１６２】
【表３】
2007523884.tif 000008
【０１６３】
図４は、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより用量依存性の様式で増進することを示す。使用したイミュノマーの量を、カッコ内（μｇ／マウス）に示す。同様な結果が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１βおよびＩＬ−１０について見られた。図５は、ＨＩＶ−１免疫原誘導のＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＩＬ−１０およびＩＬ−５の産生レベルに対するＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの効果を示す。図６は、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ（マウス１匹当たり９０μｇのＡｍｐｌｉｖａｘＴＭについて示されたデータ）により増進されるのを示す。同様な結果が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１βおよびＩＬ−１０について見出された。図７に示されるように、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭは、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞に対する増進効果を有する。免疫原は、皮下に投与された。使用されたイミュノマーの量はカッコ内に示される（μｇ／マウス）。
【０１６４】
図８は、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより用量依存的な様式で増進されたことを示す。使用したイミュノマーの量を、カッコ内に示す（μｇ／マウス）。図９は、ＨＩＶ特異的ＲＡＮＴＥＳ産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより用量依存的な様式で増進されたことを示す。図１０は、ＨＩＶ特異的ＭＩＰ１α産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより用量依存的な様式で増進されたことを示す。使用したイミュノマーの量を、カッコ内に示す（μｇ／マウス）。図１１は、ＨＩＶ特異的ＭＩＰ１β産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより用量依存的な様式で増進されたことを示す。使用したイミュノマーの量を、カッコ内に示す（μｇ／マウス）。図１２は、ＨＩＶ特異的ＩＬ−１０産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより用量依存的な様式で増進されたことを示す。使用したイミュノマーの量を、カッコ内に示す（μｇ／マウス）。図１３は、ＨＩＶ特異的ＩＬ−５産生が、皮下投与されたＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより減少したことを示す。使用されたイミュノマーの量を、カッコ内に示す（μｇ／マウス）。
【０１６５】
図１４は、マウスにおけるＡｍｐｌｉｖａｘＴＭのＨＩＶ−１免疫原誘導ｐ２４抗体力価に対する効果を示す。使用されたイミュノマーの量は、括弧内に示される。図１５は、ＩＦＡ（ＨＩＶ−１免疫原）中の不活化全ＨＩＶ−１ワクチンが、皮下（ＳＣ）投与および筋肉内（ＩＭ）投与の際にＨＩＶ特異的サイトカイン産生を誘導したことを示す。
【０１６６】
図１６は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭが、ＩＦＡでの乳化前または乳化後に添加され得、そしてＩＦＮ−γ産生を増進し得ることを示す。図１７は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭがＩＦＡでの乳化前、または乳化後に添加され得、そしてＲＡＮＴＥＳ産生を増進し得ることを示す。表４に示されるように、ＨＩＶ−１免疫原とＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとの組合わせは、Ｔｈ１型応答の方向へサイトカインプロフィールをシフトさせる。
【０１６７】
【表４】
2007523884.tif 000009
【０１６８】
図１８は、不活化全ＨＩＶ−１ワクチンとＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとで、ＩＦＡなしで皮下的に免疫したマウスにおいてＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生を惹起したことを示す。図１９は、不活化全ＨＩＶワクチンとＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとで、ＩＦＡなしで皮下的に免疫したマウスにおいてＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を惹起したことを示す。図２０は、不活化全ＨＩＶ−１ワクチンとＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとで、ＩＦＡなしで皮下的に免疫したマウスにおいてＨＩＶ特異的ＲＡＮＴＥＳ産生を惹起したことを示す。
【０１６９】
ＨＩＶ−１抗原とＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとの組合わせで、皮下に免疫したＣ５７／ＢＬ６マウスは、ＨＩＶ−１免疫原単独、またはＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ単独と比較した場合、ｐ２４抗体、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ（ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞がＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γを産生する量および数の両方）、ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β）およびＩＬ−１０のＨＩＶ特異的産生を有意に増進したことを示した。重要なことには、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭによる増進は、ＨＩＶ−１抗原がＩＦＡと乳化していなかった場合でも観察された。
【０１７０】
ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ＋ＨＩＶ−１免疫原およびＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ＋ＨＩＶ−１抗原の組合わせの両方による免疫は、ＨＩＶ−１免疫原単独、またはＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ単独と比較して、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γおよびｐ２４特異的ＩＦＮ−γ，ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＩＬ−１０の産生ならびにＩＦＮ−γ産生細胞の数を、有意に増進した。ＨＩＶ−１免疫原と、またはＨＩＶ−１抗原とＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとの組合わせにより免疫したマウスにおいて、観察された免疫応答の大きさは比較し得るものであった。
【０１７１】
これらの結果は、ＨＩＶ−１免疫原＋ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭによる免疫が、ＨＩＶ−１免疫原単独、またはＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ単独と比較して、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ，ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＩＬ−１０の産生ならびにＩＦＮ−γ産生細胞の数を、増進したことを示す。ＨＩＶ−１抗原とＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ（ＩＦＡなしで）とで免疫したマウスにおいて観察された免疫応答の大きさは、ＨＩＶ−１免疫原（ＨＩＶ−１抗原＋ＩＦＡ）とＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとで得られた応答に匹敵した。ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭは、不活化全ウイルスワクチンと共同して、ＩＦＡの使用に依存せずに強いＨＩＶ特異的免疫応答を誘発する。
【０１７２】
Ａｍｐｌｉｖａｘは、ＨＩＶ−１免疫原またはＨＩＶ−１抗原と共同してＩＦＡの使用に依存せずに強いウイルス特異的免疫応答を誘発する。ＨＩＶ−１＋Ａｍｐｌｉｖａｘの組合わせの強い免疫原性は、ＨＩＶ感染患者のための治療用ワクチンとしてのその使用を保証する。
【０１７３】
（実施例ＸＩ  ヒト末梢血単核細胞を使用したインビトロＨＩＶ特異的免疫応答に対する、ＨＩＶ免疫源とイミュノマーとの組み合わせの効果）
本実施例は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるインビトロＨＩＶ特異的免疫応答に対する、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの効果を記載する。
【０１７４】
これらの研究は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭが、抗レトロウイルス処置ＨＩＶ感染患者由来のヒトＰＢＭＣのインビトロＨＩＶ特異的免疫応答を増加するか否かを評価するために開始された。ここでその患者は、不活化全ＨＩＶ−１ワクチンで免疫したか、または免疫されなかった。
【０１７５】
ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの、抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）で処置したＨＩＶ＋患者から単離されたＰＢＭＣのＨＩＶ抗原刺激を増進する能力についてエクスビボで調査した。患者は、免疫されていないか、またはＨＩＶ−１免疫原で以前に免疫されていた。両方の患者群は、比較し得るＣＤ４計数、ＨＩＶ血漿ウイルス血症、感染期間およびＡＲＴを有した。結果は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭが、ＨＩＶ−１免疫原でワクチン接種した患者において、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて産生される全スポットにより測定されたように、より強いＨＩＶ特異的細胞媒介性免疫応答およびαデフェンシン産生細胞のより高い割合を、誘導したことを示した。両方の効果は、１μｇ／ｍｌのＡｍｐｌｉｖａｘＴＭを使用したときに、最も明確であった。
【０１７６】
簡単に言うと、患者に、６〜２４用量の不活化全ＨＩＶワクチン（ＲＥＭＵＮＥ（登録商標）＝ＨＩＶ−１免疫原）を接種した。最後の用量は、採血の６〜８ヶ月前に与えた。非接種患者については、ＣＤ４、ＨＩＶウイルス血症およびＨＡＡＲＴ曝露について整合させた。ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭを、ＰＢＭＣに４種の濃度（０、０．１、１．０および１０μｇ／ｍｌ）で添加した。細胞をＨＩＶ−１、ｎｐ２４、ｇａｇおよびフルー抗原で刺激した。ＣＤ８＋、ＩＦＮ−γ産生細胞の評価を、ＥＬＩｓｐｏｔにより行った。αデフェンシン産生細胞の分析は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）法により行った。
【０１７７】
図２１は、αデフェンシン産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が、エクスビボで添加したＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより増加することを示す。図２２は、ＲＥＭＵＮＥ（登録商標）により処置した患者およびＨＩＶ陽性コントロール（ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭなし）における、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図２３は、エクスビボで添加した０．１μｇ／ｍｌのＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの存在下におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図２４は、エクスビボで添加した１μｇ／ｍｌのＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの存在下におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図２５は、エクスビボで添加した１０μｇ／ｍｌのＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの存在下におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【０１７８】
図２６は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを示す。ＨＹＢ２０５５を１μｇ／ｍｌで使用した。
【０１７９】
予備的なデータを、ＨＡＡＲＴナイーブ患者においてＲＥＭＵＮＥ（登録商標）（ＨＩＶ−１免疫原＋ＩＦＡ）について生成した。その試験が、完了する場合、１０，０００〜４０，０００コピー／ｍｌの範囲のＨＩＶ−１  ＲＮＡおよび３５０細胞／μＬより上のＣＤ４細胞を有する、５０人のＨＩＶ−１陽性被験体を、モニターする。患者を以下の３群にランダマイズした：ＲＥＭＵＮＥ（登録商標）（ＩＦＡ中のＨＩＶ−１免疫原）；ＩＦＡアジュバント；または生理食塩水。
【０１８０】
ＣＤ４Ｔ細胞における表現型の変化（図２７）およびＣＤ８Ｔ細胞についての表現型の変化（図２８）を、抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）ナイーブ患者における（ＲＥＭＵＮＥ（登録商標））１回目の注入の後に観察した。最初の２、３人の患者の予備的データが示される。さらなる患者について同様に分析した。
【０１８１】
薬物ナイーブＨＩＶ＋患者における進行中の臨床試験からの予備的データは、ＨＩＶ−１免疫原がまた、この患者集団においてＨＩＶ特異的免疫応答の生成についてのポジティブな効果を有することを示唆する。ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの潜在的な増進効果を、これらの同じ患者における回転臨床試験（ｒｏｌｌ  ｏｖｅｒ  ｔｒｉａｌ）においてＡｍｐｌｉｖａｘＴＭをＨＩＶ−１免疫原にワクチンの一部として添加することにより試験する。
【０１８２】
この出願の全体を通して、種々の刊行物を参考としている。これらの刊行物の全体の開示は、本願の明細書で、本発明に属する技術の状態をより完全に記載するために、参考として援用される。
【０１８３】
本発明は、開示された実施形態を参考として記載されているが、当業者は、詳細な特定の実験が本発明の単なる説明的なものであることを容易に理解する。種々の改変が本発明の趣旨から離れずになされ得ることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１−１】図１−１は、イミュノマーを形成するためにオリゴヌクレオチドと結合する例示的なリンカーの化学構造を示す（Ｙｕら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４５４０〜４５４８（２００２）；Ｙｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４４６０〜４４６９（２００２）。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続き。
【図２】図２は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭとしても知られている、イミュノマーＨＹＢ２０５５の概略図を示す。
【図３】図３は、ＨＩＶ−１免疫原によるＨＩＶ特異的サイトカイン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）およびＩＬ−５の誘導を示す。上記免疫原を、皮下投与した。「＊」は、生理食塩水に対する有意性を示す。
【図４】図４は、ＨＩＶ−１免疫原誘導のＨＩＶ特異的インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生がＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより容量依存的な様式で増進されるのを示す。「＊」は、ＨＩＶ免疫原単独に対する有意性を示す。
【図５】図５は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭのＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＩＬ−１０およびＩＬ−５の産生レベルに及ぼす効果を示す。上記免疫原を、皮下投与した。「＊」は、生理食塩水に対する有意性を示す。
【図６】図６は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより増進されたＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生を示す。同様な結果が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１ΒおよびＩＬ−１０について見出された。上記免疫原を、皮下投与した。「＊」は、生理食塩水に対する有意性を示す。
【図７】図７は、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞に関するＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの増進された効果を示す。上記免疫原を、皮下投与した。「＊」は、ＨＩＶ免疫原単独に対する有意性を示す。
【図８】図８は、ＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生がＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより容量依存的な様式で増進されたことを示す。上記免疫原を、皮下投与した。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原単独に対する有意性を示す。
【図９】図９は、ＨＩＶ特異的ＲＡＮＴＥＳ産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより容量依存的な様式で増進されたことを示す。免疫原は皮下に投与された。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原単独に対する有意性を示す。
【図１０】図１０は、ＨＩＶ特異的ＭＩＰ−１α産生がＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより容量依存的な様式で増進されたことを示す。免疫原を、皮下投与した。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原単独に対する有意性を示す。
【図１１】図１１は、ＨＩＶ特異的ＭＩＰ−１β産生がＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより容量依存的な様式で増進されたことを示す。免疫原を、皮下投与した。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原単独に対する有意性を示す。
【図１２】図１２は、ＨＩＶ特異的ＩＬ−１０産生がＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより容量依存的な様式で増進されたことを示す。免疫原を、皮下投与した。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原単独に対する有意性を示す。
【図１３】図１３は、ＨＩＶ特異的ＩＬ−５産生が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭを皮下（ＳＣ）で与えることにより、減少したことを示す。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原単独に対する有意性を示す。
【図１４】図１４は、マウスにおけるＨＩＶ−１免疫原誘導ｐ２４抗体力価に関するＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの効果を示す。免疫原を、皮下投与した。
【図１５】図１５は、ＩＦＡ（ＨＩＶ−１免疫原）中の不活化全ＨＩＶ−１ワクチンが、皮下（ＳＣ）投与および筋肉内（ＩＭ）投与の際にＨＩＶ特異的サイトカイン産生を誘導したことを示す。
【図１６】図１６は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭがＩＦＡによる乳化前または乳化後に添加され得、そしてＩＦＮ−γ産生を増進し得ることを示す。
【図１７】図１７は、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭがＩＦＡによる乳化前または乳化後に添加され得、そしてＲＡＮＴＥＳ産生を増進し得ることを示す。
【図１８】図１８は、不活化全ＨＩＶ−１ワクチン抗原が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭと共に、ＩＦＡなしで皮下に免疫したマウスにおいてＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生を惹起したことを示す。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原（ＩＭ）に対する有意性を示す。ＨＩＶ抗原は、ＩＦＡなしの不活化全ＨＩＶワクチンである。
【図１９】図１９は、不活化全ＨＩＶ−１ワクチン抗原が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭと共に、ＩＦＡなしで皮下に免疫したマウスにおいてＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を惹起したことを示す。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原（ＩＭ投与）に対する有意性を示す。ＨＩＶ抗原は、ＩＦＡなしの不活化全ＨＩＶワクチンである。
【図２０】図２０は、不活化全ＨＩＶ−１ワクチン抗原が、ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭと共に、ＩＦＡなしで皮下に免疫したマウスにおいてＨＩＶ特異的ＲＡＮＴＥＳ産生を惹起したことを示す。「＊」は、ＨＩＶ−１免疫原（ＩＭ投与）に対する有意性を示す。ＨＩＶ抗原は、ＩＦＡなしの不活化全ＨＩＶワクチンである。
【図２１】図２１は、αデフェンシン産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が、エクスビボで添加されたＡｍｐｌｉｖａｘＴＭにより増加することを示す。
【図２２】図２２は、ＲＥＭＵＮＥ（登録商標）処置患者およびＨＩＶポジティブコントロール（０μｇ／ｍｌ  ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭ）におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図２３】図２３は、エクスビボで添加された０．１μｇ／ｍｌ  ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの存在下におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図２４】図２４は、エクスビボで添加された１μｇ／ｍｌ  ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの存在下におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図２５】図２５は、エクスビボで添加された１０μｇ／ｍｌ  ＡｍｐｌｉｖａｘＴＭの存在下におけるＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図２６】図２６は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイを示す。ＨＹＢ２０５５を、１μｇ／ｍｌで使用した。
【図２７】図２７は、抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）ナイーブ患者におけるＲＥＭＵＮＥ（登録商標）の初回注入後のＣＤ４Ｔ細胞における表現型変化を示す。
【図２８】図２８は、ＡＲＴナイーブ患者におけるＲＥＭＵＮＥ（登録商標）の初回注入後のＣＤ８Ｔ細胞における表現型変化を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2007523884.tif 000024
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2007523884.tif 000028
【図１９】
2007523884.tif 000029
【図２０】
2007523884.tif 000030
【図２１】
2007523884.tif 000031
【図２２】
2007523884.tif 000032
【図２３】
2007523884.tif 000033
【図２４】
2007523884.tif 000034
【図２５】
2007523884.tif 000035
【図２６】
2007523884.tif 000036
【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月27日(2006.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物であって、以下：
（ａ）不活化全ＨＩＶウイルス；および
（ｂ）イミュノマー
を含む、組成物。
【請求項２】
前記不活化全ＨＩＶウイルスが、外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ＨＩＶウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記ＨＩＶウイルスがＨＺ３２１株ウイルスである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記単離された核酸分子が、ホスホロチオエート骨格を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ＨＩＶウイルスが前記核酸分子と結合体化する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記イミュノマーがＣｐＧイミュノマーである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記イミュノマーがＣｐＧを含まないイミュノマーである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントがヒトでの使用に適切である、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントがフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントがマイコバクテリア細胞壁成分およびモノホスホリル脂質Ａを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントがミョウバンを含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記組成物がβケモカイン産生を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記組成物が哺乳動物においてＨＩＶ特異的ＩｇＧ２抗体産生を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記組成物が哺乳動物においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記組成物がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を増進する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記組成物がＨＩＶ特異的ＣＤ４ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記組成物がＣＤ４ヘルパーＴリンパ球記憶細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球記憶細胞を増加する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記組成物がＨＩＶ感染個体においてＡＩＤＳへの進行を遅延させる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記組成物がＨＩＶに感染した個体においてウイルス負荷を低減する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記組成物がＡＩＤＳに感染した個体の平均余命を延ばす、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
キットであって、以下：
（ａ）不活化全ＨＩＶウイルス；および
（ｂ）イミュノマー
を備え、該キット成分は、組合わせた場合に請求項１に記載の免疫原性組成物を産生する、キット。
【請求項２４】
前記不活化全ＨＩＶウイルスが外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
さらにアジュバントを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１に記載する免疫原性組成物を製造する方法であって、以下：
（ａ）不活化全ＨＩＶウイルス；および
（ｂ）イミュノマー
を組み合わせる工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記不活化全ＨＩＶウイルスが外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０を欠失する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アジュバントが前記不活化全ＨＩＶウイルスと前記イミュノマーと組合わせられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
非ヒト哺乳動物を免疫する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を該非ヒト哺乳動物に投与することより、該非ヒト哺乳動物の免疫応答を増進する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
ＡＩＤＳを阻害する組成物であって、哺乳動物に投与するために処方された請求項１に記載の免疫原性組成物を含む、組成物。
【請求項３１】
ＨＩＶ感染の無症候期を延ばす、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記哺乳動物が霊長類である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記霊長類が幼仔の個体である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記霊長類が子供である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記霊長類が妊娠している個体である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記霊長類がヒトである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ヒトがＨＩＶセロネガティブである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ヒトがＨＩＶセロポジティブである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物が前記哺乳動物に２回以上投与されるために処方された、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物が皮下、筋肉内または粘膜内に投与されるために処方された、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４１】
前記哺乳動物が霊長類である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記霊長類が幼仔の個体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記霊長類が子供である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記霊長類が妊娠している個体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が前記哺乳動物に２回以上投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が皮下、筋肉内または粘膜内に投与される、請求項２９に記載の方法。