(57)【要約】  本発明は哺乳動物細胞、特に胚性幹細胞においてインビトロおよびインビボで心筋再生を誘起するのに有用な式（Ｉ）の化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造：
【化１】
2007517831.tif 000032
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびＣ０−２アルキルアリールからなる群から選択されるメンバーであり、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、ヘテロシクロアルキルおよび−Ｏ−アリールからなる群から別個に選択される０−２個のＲ１ａ基で置換されるか、もしくはＲ１ａ基が隣接する環原子にある場合、これらは場合によっては一緒に、−Ｏ−（ＣＨ２）１−２−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）３−４−からなる群から選択されるメンバーを形成するか、またはＲ１は場合によってはそれが結合する窒素と一緒に複素環を形成し、場合によってはＣ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−４アルキルヒドロキシおよびＣ０−２アルキルアリールで置換され；
各Ｒ１ｂ基は水素およびＣ１−４アルキルから別個に選択されるメンバーであり；
Ｒ２はＣ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびＣ０−２アルキルアリールからなる群から選択されるメンバーであり、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）および−Ｏ−アリールからなる群から別個に選択される０−２個のＲ２ａ基で置換されるか、またはＲ２ａ基が隣接する環原子にある場合、これらは場合によっては一緒に、−Ｏ−（ＣＨ２）１−２−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）３−４−をからなる群から選択されるメンバーを形成し；そして
各Ｒ２ｂ基は水素およびＣ１−４アルキルからなる群から別個に選択されるメンバーであり；そして
Ｒ３は水素であるか、またはＲ２は場合によってはＲ３および双方が結合する窒素と一緒に複素環を形成し、場合によってはＣ１−４アルキルまたはＣ０−２アルキルアリールで置換される）
を有する式Ｉの化合物。
【請求項２】
Ｒ１が：
【化２】
2007517831.tif 000033
【化３】
2007517831.tif 000034
【化４】
2007517831.tif 000035
【化５】
2007517831.tif 000036
および
【化６】
2007517831.tif 000037
からなる群から選択されるメンバーである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が
【化７】
2007517831.tif 000038
である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が：
【化８】
2007517831.tif 000039
【化９】
2007517831.tif 000040
【化１０】
2007517831.tif 000041
【化１１】
2007517831.tif 000042
【化１２】
2007517831.tif 000043
【化１３】
2007517831.tif 000044
【化１４】
2007517831.tif 000045
【化１５】
2007517831.tif 000046
【化１６】
2007517831.tif 000047
および
【化１７】
2007517831.tif 000048
からなる群から選択されるメンバーである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が水素である請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２およびＲ３および双方が結合する窒素が複素環を形成する請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
該複素環が：
【化１８】
2007517831.tif 000049
および
【化１９】
2007517831.tif 000050
からなる群から選択されるメンバーである請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
該化合物が下記の構造：
【化２０】
2007517831.tif 000051
を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２が：
【化２１】
2007517831.tif 000052
【化２２】
2007517831.tif 000053
【化２３】
2007517831.tif 000054
および
【化２４】
2007517831.tif 000055
からなる群から選択されるメンバーである請求項１または請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
該化合物が：
【化２５】
2007517831.tif 000056
【化２６】
2007517831.tif 000057
【化２７】
2007517831.tif 000058
および
【化２８】
2007517831.tif 000059
からなる群から選択されるメンバーである請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１または請求項１０の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳動物細胞を請求項１に記載の化合物と接触させ、それにより哺乳動物細胞を心筋系統の細胞に分化させること：
を含むミオカルディオジェネシス（myocardiogenesis）を誘起する方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の該化合物が薬学的に許容される担体中にある請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物細胞が哺乳動物にある請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
接触の工程が化合物の哺乳動物への経口投与である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
接触の工程が化合物の哺乳動物への静脈内投与である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
接触の工程が化合物の哺乳動物への皮下投与である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
接触の工程が化合物の哺乳動物への腹腔内投与である請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
さらに哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化を検出することを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化の検出が心筋細胞マーカー遺伝子の発現を検出することによる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
心筋細胞マーカー遺伝子が心房性ナトリウム利尿因子をコードする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化の検出が心臓筋肉細胞特異的転写因子の発現を検出することによる請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
心臓筋肉特異的転写因子がＭＥＦ２およびＮｋｘ２.５からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化の検出が心臓筋肉収縮に関与するモータータンパク質の発現を検出することによる請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
モータータンパク質がサルコメアミオシン重鎖モータータンパク質である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化の検出が心臓特異的遺伝子の発現を検出することによる請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
心臓特異的遺伝子がＧＡＴＡ−４である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物細胞が胚性幹細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
胚性幹細胞がマウスから単離されている請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
胚性幹細胞がＲ１胚性幹細胞である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物細胞が胚性癌細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項３２】
癌細胞がマウスから単離されている請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
マウス癌細胞がＰ１９胚性癌細胞である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物細胞が霊長類胚性幹細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物細胞がヒト胚性幹細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物細胞をさらに心筋再生増強タンパク質と接触させる請求項１２に記載の方法。
【請求項３７】
心筋再生増強タンパク質が心筋再生に関与する成長因子である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物細胞が固体支持体に付着している請求項１２に記載の方法。
【請求項３９】
固体支持体が３次元マトリックスである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
固体支持体が平板表面である請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物細胞を請求項１に記載の化合物と接触させ、それにより哺乳動物細胞を心筋系統の細胞に分化させること：
を含む心筋再生を誘起する方法。
【請求項４２】
哺乳動物細胞が哺乳動物にある請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
接触の工程が化合物の哺乳動物への経口投与である請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
接触の工程が化合物の哺乳動物への静脈内投与である請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
接触の工程が化合物の哺乳動物への皮下投与である請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
接触の工程が化合物の哺乳動物への腹腔内投与である請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物細胞を請求項１に記載の化合物と接触させ、それにより哺乳動物細胞を心筋系統の細胞に分化させること：
を含む心臓筋肉障害を処置する方法。
【請求項４８】
心臓筋肉障害が損傷した心筋に関連する請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
心臓筋肉障害が心筋症である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
さらに該障害を有する個体に心筋系統の細胞を投与し、それにより障害を処置することを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
投与が外科的移植による請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は２００４年１月１６日出願の米国仮特許出願第６０／５３７１４４号に対する優先権を主張し、その教示はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（発明の背景）
心臓疾患は全世界で重大な問題であり、さまざまな疾病および状態を包含する。例えば心筋症は心臓がその血液を送る能力を喪失し、そして場合によっては心臓のリズムが乱れ、不規則な心拍、すなわち不整脈に至る心筋の疾患である。心筋症は全ての年齢層の数万人のアメリカ人を冒し、そして心臓移植の主たる原因である。症状は進行性である傾向があり、そして時にかなり急速に悪化する。
【０００３】
心臓筋肉の発達および機能の理解は幹細胞を使用することにより容易になる。幹細胞は自己再生および適切なシグナルに応答して特殊化した細胞に分化する能力を有する多分化能細胞である。例えばSpradling et al., Nature, 414：98-104（2001）参照。たいていの組織は器官への傷害時に損傷部位で増殖および分化することができる内因性幹／祖先細胞を有する。しかしながら成体の心臓は主に有糸分裂を終了したおよび最終分化した細胞から構成される。心臓幹細胞特性を有する心筋の細胞の亜集団が最近同定されたが、その限定的な利用性が治療適用を妨げている。例えばBeltrami et al., Cell, 114：763-776（2003）参照。骨髄のようなその他の組織から誘導された幹細胞は動物モデルにおいて心臓の損傷を修復できることが示されているが、不十分な分化および体細胞との融合の可能性により心臓修復におけるその使用が限定されている。例えばFerrari et al., Science, 279：1528-30（1998）参照。
【０００４】
多能性胚性幹（ＥＳ）細胞は機能的心筋細胞の可能性のある無制限の供給源を代表する。かかる心筋細胞は心臓疾患におけるＥＳ細胞の治療的適用を促す可能性があり、そして心筋細胞分化および心臓発達の分子機構を探るための重要な手段を提供する。しかしながら今日までのところ、ＥＳ細胞の心筋細胞へのインビトロ分化は十分に定義されていない、不十分な、そして比較的非選択的な過程を伴う。例えばBoheler et al., Circ. Res., 91：189-201（2002）参照。
【０００５】
したがって、ＥＳ細胞を心筋細胞への分化を誘起および指示するための組成物および方法に関する必要性は当分野では認識されている。インビボおよびインビトロでＥＳ細胞の心筋系統の細胞への分化を誘起することができる小型分子が特に必要とされている。本発明はこれらおよびその他の必要性を満足させる。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明はＥＳ細胞の心筋系統の細胞への分化を誘起および指示するための新規組成物および方法を提供する。
【０００７】
本発明の１つの実施態様は以下の構造を有する式Ｉの化合物を提供する：
【化１】
2007517831.tif 000002
式Ｉ中、Ｒ１は限定するものではないが水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびＣ０−２アルキルアリールを含む官能基であり、別個に選択され、そして限定するものではないがハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、ヘテロシクロアルキルおよび−Ｏ−アリールを含む官能基である０−２個のＲ１ａ基で置換されるか、もしくはＲ１ａ基が隣接する環原子にある場合、これらは場合によっては一緒に、限定するものではないが、−Ｏ−（ＣＨ２）１−２−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）３−４−を含む官能基を形成するか、またはＲ１は場合によってはそれが結合する窒素と一緒に複素環を形成し、場合によってはＣ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−４アルキルヒドロキシおよびＣ０−２アルキルアリールで置換され；各Ｒ１ｂ基は別個に選択され、そして限定するものではないが、水素およびＣ１−４アルキルを含む官能基である。式Ｉ中、Ｒ２は限定するものではないが、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびＣ０−２アルキルアリールを含む官能基であり、０−２個のＲ２ａ基で置換される。Ｒ２ａ基は別個に選択され、そして限定するものではないがハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）および−Ｏ−アリールを含む官能基であるか、またはＲ２ａ基が隣接する環原子にある場合、これらは場合によっては一緒に、限定するものではないが、−Ｏ−（ＣＨ２）１−２−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）３−４−を含む官能基を形成し；そして各Ｒ２ｂ基は別個に選択され、そして限定するものではないが、水素およびＣ１−４アルキルを含む官能基である。式Ｉ中、Ｒ３は典型的には水素であるか、またはＲ３は場合によってはＲ２および双方が結合する窒素と一緒に複素環を形成し、場合によっては例えばＣ１−４アルキルまたはＣ０−２アルキルアリールで置換される。
【０００８】
本発明の化合物は全ての薬学的に許容されるその塩、異性体、溶媒和物、水和物およびプロドラッグを含む。
【０００９】
別の実施態様では、本発明は心筋再生を誘起する方法を提供する。哺乳動物細胞を式ＩまたはＩＩの化合物と接触させ、その結果哺乳動物細胞が心筋系統の細胞に分化する。接触の工程はインビボまたはインビトロでよい。心筋再生を誘起するその能力に鑑みて、式ＩまたはＩＩの化合物は心筋症および不整脈のような心臓筋肉障害の処置ならびに例えば心臓発作からもたらされる心臓の筋肉組織の損傷の修復に有用である。
【００１０】
本発明の別の実施態様は哺乳動物細胞を式Ｉの化合物と接触させ、その結果哺乳動物細胞が心筋系統の細胞に分化することにより心臓筋肉障害を処置する方法を提供する。哺乳動物細胞をさらに心筋再生に好ましい別の化合物またはタンパク質と接触させることができる。インビトロで哺乳動物細胞を式ＩまたはＩＩの化合物と接触させる場合、分化した細胞を処置できる障害を有する個体に投与し、それにより障害を処置する。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞を固体支持体（例えば３次元マトリックスまたは平板表面）に結合させるかまたは心筋の損傷部位に注射する。
【００１１】
いくつかの実施態様では、インビボで哺乳動物細胞を式ＩまたはＩＩの化合物と接触させる。インビボで哺乳動物細胞を式ＩまたはＩＩの化合物と接触させる場合、接触の工程は化合物の哺乳動物への経口、静脈内、皮下または腹腔内投与によるものでよい。
【００１２】
いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化が検出される。いくつかの実施態様では、心筋再生マーカー遺伝子、例えば心房性ナトリウム利尿因子（「ＡＮＦ」）の発現を検出することにより、哺乳動物細胞の心筋芽細胞(myocardioblast)への分化を検出する。別の実施態様では、心臓筋肉細胞特異的転写因子（例えばＭＥＦ２またはＮｋｘ２.５またはホメオドメイン転写因子ＨＯＰ）の発現を検出することにより、哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化を検出する。別の実施態様では、心臓筋肉特異的遺伝子（例えばミオシン軽鎖２ＶまたはｅＨＡＮＤ）の発現を検出することにより、哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化を検出する。さらに別の実施態様では、ＧＡＴＡ−４のような心臓特異的遺伝子の発現を検出することにより、またはサルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）のような心筋収縮能に関与する遺伝子の発現により哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化を検出する。別の実施態様では、当分野において周知である標準的な技術を用いて心臓筋肉の拍動を観察することにより分化を検出することができる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞は幹細胞（例えば胚性幹細胞または胚性癌細胞）である。いくつかの実施態様では、幹細胞をマウス（例えばマウス未分化Ｒ１胚性幹細胞またはマウス癌Ｐ１９細胞）または霊長類（例えばヒト）から単離する。
【００１４】
前記の方法のいくつかの実施態様では、哺乳動物細胞に投与する化合物はカルジオゲノールＡ、Ｂ、ＣもしくはＤ、または１つまたはそれより多いカルジオゲノールＡ、Ｂ、ＣもしくはＤを含む組成物である。
【００１５】
本発明のその他の実施態様および利点は以下の詳記した記載から明らかであろう。
【００１６】
（図面の簡単な説明）
図１  ＡＮＦプロモーターレポーターアッセイを用いる心筋再生に関するハイスループットアッセイ。この図はルシフェラーゼを発現するＡＮＦプロモーターレポータープラスミドを抱く安定したＰ１９クローンを用いて得られたデータを示す。グラフはＰ１９細胞に関して標準的な心筋再生分化条件（ＥＢ形成および１％ＤＭＳＯでの処置（Skerjank IS, Trends Cardiovasc Med, 9：139-143（1999）参照）の下で数日後、このＰ１９クローンからのルシフェラーゼシグナルが５から７倍増加したことを示している。
【００１７】
図２  ０.２５μＭカルジオゲノールＣで処理したＥＳＣ（ＡからＥ）およびＰ１９ＣＬ６細胞（Ｆ）における心臓筋肉マーカーの免疫染色：（Ａ）および（Ｆ）ミオシン重鎖（緑）；（Ｂ）ＧＡＴＡ−４（赤）；（Ｃ）ＭＥＦ２（赤）；（Ｄ）Ｎｋｘ２.５（赤）；ならびに（Ｅ）ミオシン重鎖（緑）およびＭＥＦ２（赤）。細胞核をＤＡＰＩ（青）で染色した。４％パラホルムアルデヒド（Sigma）で細胞を２０分間固定した。０.３％ Triton Ｘ−１００および６％ウマ血清を含有するＰＢＳ（Gibco）中で細胞染色を実施した。以下の希釈で１次抗体を使用した：ミオシン重鎖（ＭＨＣ）マウスモノクローナル抗体ＭＦ２０（Developmental Studies Hybridoma Bank、１：２００）、ウサギポリクローナル抗ＧＡＴＡ−４抗体（Santa Cruz Biotech、１：３００）、ウサギ抗ＭＥＦ２抗体（Santa Cruz Biotech、１：１００）およびヤギ抗Ｎｋｘ２.５抗体（Santa Cruz Biotech、１：１００）。２次抗体はＣｙ２コンジュゲート抗マウス（１：３００）、またはＣｙ３コンジュゲート抗ウサギもしくは抗ヤギ抗体（Jackson ImmunoResearch、１：５００）であった。細胞核をＤＡＰＩ（Roche）で染色した。画像を２００倍の倍率のNikon Eclipes ＴＥ２０００ 顕微鏡で撮影した。二重または三重標識画像をMetamorphに集めた。
【００１８】
図３  カルジオゲノールＣ処置していないＥＳＣの免疫染色（対照）。（Ａ）ＭＨＣ（緑）および核（青）。（Ｂ）ＧＡＴＡ−４（赤）および核（青）。各々図２Ａおよび２Ｅと比較する。
【００１９】
図４  この図は哺乳動物細胞において心筋再生を誘起するために用いることができる本発明のさらなる化合物の一覧を示す。
【００２０】
（本発明の詳細な説明）
Ｉ．序文
本発明は哺乳動物細胞を心筋系統の細胞に分化させるための化合物、組成物および方法を提供する。さらに具体的には、本発明は哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化に有用である式ＩおよびＩＩの化合物を提供する。いくつかの実施態様では、式ＩまたはＩＩの化合物を含む組成物が提供される。別の実施態様では、哺乳動物細胞における心筋再生を誘起する方法が提供される。本発明の方法に従ってインビボまたはインビトロで筋形成を誘起することができる。
【００２１】
ＩＩ．定義
特記しない場合、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は一般的に本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で用いる用語ならびに有機および分析化学の実験手順は当分野において周知のものであり、そして一般に用いられる。
【００２２】
「アルキル」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、特記しない場合、直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはその組み合わせを意味し、これは指定された炭素原子数を有して（すなわちＣ１−Ｃ１０は１から１０個の炭素を意味する）、完全に飽和、単または多不飽和でよく、そして二価および多価ラジカルを含み得る。飽和炭化水素ラジカルの例にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等の類似体および異性体のような基が挙げられる。不飽和アルキル基は１つまたはそれより多い二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例にはビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２,４−ペンタジエニル、３−（１,４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高級類似体および異性体が挙げられる。「アルキル」なる用語は特記しない場合、「ヘテロアルキル」として以下にさらに詳細に定義されるアルキルのこれらの誘導体を含むことをも意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【００２３】
「アルキレン」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示されるようなアルカンから誘導される２価のラジカルを意味し、さらに「ヘテロアルキレン」として以下に記載されるこれらの基を含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は１から２４個の炭素原子を有し、これらの基は１０個またはそれより少ない炭素原子を有し、これは本発明で好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は短鎖アルキルまたはアルキレン基であり、これは一般的には８個またはそれより少ない炭素原子を有する。
【００２４】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）なる用語はその従来の意味で用いられ、そして酸素原子、アミノ基またはイオウ原子の各々を介して分子の残りに結合したこれらのアルキル基を意味する。
【００２５】
「ヘテロアルキル」なる用語はそれ自体または別の用語と組み合わせて、特記しない場合、記載された数の炭素原子ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される１から３個のヘテロ原子からなる安定した直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはその組み合わせを意味し、そしてここで窒素およびイオウ原子は場合によっては酸化されていてよく、そして窒素ヘテロ原子は場合によっては四級化されていてよい。ヘテロアルキル基の任意の内部位置に（複数の）ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳを置いてよい。アルキル基が分子の残りに結合する位置を含むヘテロアルキル基の任意の内部位置にヘテロ原子Ｓｉを置いてよい。例には−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ３）２、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、２個までのヘテロ原子が連続してよい。同様に、「ヘテロアルキレン」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−により例示されるようにヘテロアルキルから誘導される２価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基に関しては、ヘテロ原子は鎖末端の一方または双方を占めることもできる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。なおさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の向きは考慮していない。
【００２６】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」なる用語はそれ自体または別の用語と組み合わせて、特記しない場合、「アルキル」および「ヘテロアルキル」各々の環状のものを示す。加えて、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は複素環が分子の残りに結合する位置を占めることができる。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例には１−（１,２,５,６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル等が挙げられる。
【００２７】
「ハロ」または「ハロゲン」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、特記しない場合、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」のような用語はモノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」なる用語はトリフルオロメチル、２,２,２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル等を含むことを意味する。
【００２８】
「アリール」なる用語は特記しない場合、単環または互いに縮合されたもしくは共有結合により連結された多環（３環まで）でよい多不飽和の、典型的には芳香族、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」なる用語はＮ、ＯおよびＳから選択される０から４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を意味し、ここで窒素およびイオウ原子は場合によっては酸化されていて、そして（複数の）窒素原子は場合によっては四級化されている。ヘテロアリール基はヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定例にはフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。前記で記載したアリールおよびヘテロアリール環系の各々に関する置換基は以下に記載する許容される置換基の群から選択される。
【００２９】
簡潔にするために、「アリール」なる用語はその他の用語と組み合わせて用いる場合（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、前記で定義したアリールおよびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」なる用語はアリール基が、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子により置換されているアルキルを含むこれらのアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）に結合しているこれらのラジカルを含むことを意味する（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル等）。
【００３０】
前記の用語の各々（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は示されたラジカルの置換および非置換の形態の双方を含むことを意味する。ラジカルの各々の型に関する好ましい置換基を以下に提供する。
【００３１】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルと称されるこれらの基を含む）に関する置換基は０から（２ｍ’＋１）（ここでｍ’はかかるラジカルの炭素原子の全数である）の範囲の数で：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される種々の基でよい。Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は各々別個に水素、非置換（Ｃ１−Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリール、１−３個のハロゲン、非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基で置換されたアリール、またはアリール−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を意味する。Ｒ’およびＲ”が同一の窒素原子に結合している場合、これらは窒素原子と組み合わされて５−、６−、または７−員環を形成する。例えば−ＮＲ’Ｒ”は１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味する。置換基の前記の記載から、「アルキル」なる用語がハロアルキル（例えば−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）のような基を含むことを意味することは当業者に理解されよう。
【００３２】
同様に、アリールおよびヘテロアリール基に関する置換基はさまざまであり、そして０から芳香族環系の空の原子価の全数までの範囲の数で：−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびペルフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され；そしてここでＲ’、Ｒ”およびＲ”’は別個に水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルならびに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択される。
【００３３】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子の２個の置換基は場合によっては式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−（式中ＴおよびＵは別個に−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、そしてｑは０から２の整数である）の置換基で置換されていてよい。これに代えて、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子の２個の置換基は場合によっては式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中ＡおよびＢは別個に−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、そしてｒは１から３の整数である）の置換基で置換されていてよい。そのように形成された新しい環の単結合の１つは場合によっては二重結合で置換されていてよい。これに代えて、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子の２個の置換基は場合によっては式−（ＣＨ２）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔ−（式中ｓおよびｔは別個に０から３の整数であり、そしてＸは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で置換されていてよい。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−の置換基Ｒ’は水素または非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
【００３４】
本明細書で用いる「ハロ」または「ハロゲン」なる用語はＣｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩ置換基を意味する。「ハロアルキル」等の用語は、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩ原子で置換された少なくとも１つの水素原子を有する脂肪族炭素ラジカルを意味し、異なるハロ原子の混合物を含む。トリハロアルキルは例えばトリフルオロメチルおよび好ましいラジカルのようなものを含む。
【００３５】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）なる用語はその従来の意味で用いられ、そして酸素原子、アミノ基またはイオウ原子の各々を介して分子の残りに結合したこれらのアルキル基を意味する。
【００３６】
本明細書で用いる「ヘテロ原子」なる用語は酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）およびイオウ（Ｓ）を含むことを意味する。
【００３７】
「薬学的に許容される塩」なる用語は本明細書で記載する化合物で見出される特定の置換基に依存して、比較的無毒な酸または塩基と製造される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が相対的に酸性の官能基を含有する場合、無溶媒でまたは適当な不活性溶媒中のいずれかで、かかる化合物の中性形態を十分量の望ましい塩基と接触させることにより塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノもしくはマグネシウム塩、または類似の塩が挙げられる。本発明の化合物が相対的に塩基性の官能基を含有する場合、無溶媒でまたは適当な不活性溶媒中のいずれかで、かかる化合物の中性形態を十分量の望ましい酸と接触させることにより酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素、リン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、硫酸、硫酸一水素、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような無機酸に由来するもの、および酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的無毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギニン塩等のようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸等のような有機酸の塩もまた含まれる（例えば、Berge et al., 「Pharmaceutical Salts,」 Journal of Pharmaceutical Science, 66：1-19（1977）参照）。本発明の特定の具体的な化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性および酸性官能基の双方を含有する。
【００３８】
塩を塩基または酸と接触させ、そして従来の様式で親化合物を単離することにより化合物の中性形態を再生することができる。化合物の親形態は極性溶媒中の溶解性のような特定の物理学的特性において種々の塩形態で異なるが、その他の点では塩は本発明の目的のための化合物の親形態と等しい。
【００３９】
塩形態に加えて、本発明はプロドラッグの形態である化合物を提供する。本明細書で記載する化合物のプロドラッグは生理学的条件下で容易に化学変化を起こして本発明の化合物を提供する。これらの化合物である。加えて、エキソビボ環境でプロドラッグを化学的または生化学的方法により本発明の化合物に変換することができる。例えばプロドラッグを適当な酵素または化学的試薬と共に経皮パッチリザーバーに入れると、ゆっくりと本発明の化合物に変換することができる。
【００４０】
本発明の特定の化合物は非溶媒和形態および水和物を含む溶媒和形態で存在し得る。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と等しく、そして本発明の範囲内に包含されると解釈される。本発明の特定の化合物は多結晶性または無晶性形態で存在し得る。一般に、全ての物理学的形態は本発明により企図される使用に関して等しく、そして本発明の範囲内に包含されると解釈される。
【００４１】
本発明の特定の化合物は不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し；ラセミ体、ジアステレオ異性体、幾何異性体および個々の異性体は全て本発明の範囲内に包含されると解釈される。
【００４２】
本発明の化合物はかかる化合物を構成する１つまたはそれより多い原子の原子同位体を非自然的な割合で含有し得る。例えば、化合物は例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）のような放射活性同位体で化合物を放射標識することができる。本発明の化合物の全ての同位体種は放射活性であってもなくても、本発明の範囲内に包含されると解釈される。
【００４３】
本明細書で用いる「心筋再生」は祖先または前駆細胞の心臓筋肉細胞（すなわち心筋細胞）への分化および心臓筋肉組織の増殖を意味する。祖先または前駆細胞は例えば胚性幹細胞のような多能性幹細胞でよい。祖先または前駆細胞は心筋系統になることが予め決まっている細胞（例えば心筋細胞プレ細胞）または予め決まっていない細胞（例えば多分化能成人幹細胞）でよい。
【００４４】
本明細書で用いる「幹細胞」は、複数の細胞型に分化することができる任意の自己再生多能性細胞もしくは多分化能細胞または祖先細胞もしくは前駆細胞を意味する。本発明の方法において使用するのに適当な幹細胞は心筋系統の細胞、例えば心筋細胞に分化することができるものを含む。本発明の方法において使用するのに適当な幹細胞には、例えば胚性幹細胞（「ＥＳＣ」）および胚性癌（「ＥＣ」）細胞が挙げられる。多能性胚性幹細胞は神経細胞、筋肉細胞、血液細胞等を含む全ての型の組織に分化することができる。例えばSpradling et al.（2001）参照。
【００４５】
本明細書で用いる「分化する」または「分化」は前駆または祖先細胞（すなわち幹細胞）が特定の細胞型、例えば心筋細胞に分化する過程を意味する。分化した細胞は、その特定の細胞型に関して独特なまたは特有の多くの特徴により同定される。例えば分化した細胞は遺伝子発現およびタンパク質発現のそのパターンにより同定され得る。典型的には、心筋系統の細胞は、例えばサルコメアミオシン重鎖、ミオシン軽鎖２Ｖ、ｅＨＡＮＤおよびＡＮＦのような遺伝子を発現する。例えば、Small et al., Cell, 110：725-735（2002）； Shin et al., Cell, 110：725-35（2002）参照。ＭＥＦ２、Ｎｋｘ２.５またはホメオドメイン転写因子ＨＯＰのような心臓筋肉細胞特異的転写因子もまた典型的には心筋系統の細胞により発現される。例えば、Edmondson et al., Development, 1251-1263（1994）；  Lin et al., Science, 276：1404-1407（1997）参照。心筋細胞分化に関与する別の転写因子には、例えばＧＡＴＡ４（例えば、Grepin et al., Development, 124：2387-95（1997）参照）が挙げられる。その他の心臓筋肉特異的遺伝子を利用して分化をモニタリングおよび決定することができることは当業者には認識されよう。
【００４６】
「心筋細胞マーカー遺伝子」は発達中の心筋細胞により、または極まれにその他の細胞型により独特に発現される遺伝子であり、そのためにマーカー遺伝子は、細胞が心筋細胞であるかどうかの決定に有用である。心筋細胞マーカー遺伝子の例は、心臓の筋細胞において主として合成され、そしていくつかの心筋再生転写因子の下流標的であるポリペプチドホルモンであるＡＮＦである。
【００４７】
心筋再生の誘起に関連して本明細書で用いる「固体支持体」は、幹細胞を培養することができる３次元マトリックスまたは平板表面を意味する。固体支持体を天然発生物質（すなわちタンパク質ベース）または合成物質から誘導することができる。例えば天然発生物質に基づくマトリックスは自己骨断片か、または例えば、Clokie et al., J. Craniofac. Surg. 13（1）：111-21（2002）およびIsaksson, Swed. Dent. J. Suppl., 84：1-46（1992）に記載されるような市販により入手可能な代用骨から構成され得る。適当な合成マトリックスは例えば、米国特許第５０４１１３８号、第５５１２４７４号および第６４２５２２２号に記載されている。例えばポリグリコール酸、ポリオルソエステル、またはポリ無水物のような生分解性人工ポリマーを固体支持体に用いることができる。炭酸カルシウム、アラゴナイト、および多孔質セラミック（例えば高密度ヒドロキシアパタイトセラミック）もまた固体支持体で使用するのに適当である。ポリプロピレン、ポリエチレングリコールおよびポリスチレンのようなポリマーもまた固体支持体に用いることができる。３次元マトリックスである固体支持体で培養および分化した細胞は典型的にはマトリックスの全表面で、例えば内部および外部で成長する。平板である固体支持体で培養および分化した細胞は典型的には単層で成長する。「固体支持体」なる用語はまた式Ｉの化合物の調製の局面でも用いられる。この局面では、「固体支持体」はビーズのような適当な溶媒に部分的に可溶性か、または完全に不溶性でよいポリマー支持体を意味し、そして例えば反応物質または反応の試薬を結合させるために用いる。適当な固体支持体には、限定するものではないが、ＰＡＬ樹脂、Wang樹脂およびポリスチレン樹脂が挙げられる。
【００４８】
本明細書で用いる「培養すること」とは、細胞が増殖し、分化し、そして老化を回避することができる条件下で細胞を維持することを意味する。例えば本発明において、培養した胚性幹細胞は増殖し、そして心筋細胞系統の細胞に分化する。適切な成長因子、すなわち心筋細胞の発達を促進または増強するタンパク質を含有する成長因子カクテルを含有する成長培地中で細胞を培養することができる。
【００４９】
ＩＩＩ．本発明の化合物およびその製造方法
Ａ．式Ｉの化合物
１つの態様では、本発明は以下の構造を有する式Ｉの化合物を提供する：
【化２】
2007517831.tif 000003
式Ｉ中、Ｒ１は限定するものではないが水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびＣ０−２アルキルアリールを含む官能基であり、別個に選択され、そして限定するものではないがハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１ｂ,Ｒ１ｂ）、ヘテロシクロアルキルおよび−Ｏ−アリールを含む官能基である０−２個のＲ１ａ基で置換されるか、もしくはＲ１ａ基が隣接する環原子にある場合、これらは場合によっては一緒に、限定するものではないが、−Ｏ−（ＣＨ２）１−２−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）３−４−を含む官能基を形成するか、またはＲ１は場合によってはそれが結合する窒素と一緒に複素環を形成し、場合によってはＣ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−４アルキルヒドロキシおよびＣ０−２アルキルアリールで置換され；各Ｒ１ｂ基は別個に選択され、そして限定するものではないが、水素およびＣ１−４アルキルを含む官能基である。式Ｉ中、Ｒ２は限定するものではないが、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびＣ０−２アルキルアリールを含む官能基であり、別個に選択され、そして限定するものではないがハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２ｂ,Ｒ２ｂ）および−Ｏ−アリールを含む官能基である０−２個のＲ２ａ基で置換されるか、またはＲ２ａ基が隣接する環原子にある場合、これらは場合によっては一緒に、限定するものではないが、−Ｏ−（ＣＨ２）１−２−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）３−４−を含む官能基を形成し；そして各Ｒ２ｂ基は別個に選択され、そして限定するものではないが、水素およびＣ１−４アルキルを含む官能基である。式Ｉ中、Ｒ３は水素であるか、またはＲ３は場合によってはＲ２および双方が結合する窒素と一緒に複素環を形成し、場合によっては例えばＣ１−４アルキルまたはＣ０−２アルキルアリールで置換される。
【００５０】
本発明の化合物は全ての薬学的に許容されるそれの塩、異性体、溶媒和物、水和物およびプロドラッグを含む。
【００５１】
１つの実施態様では、Ｒ１は限定するものではないが、以下の：
【化３】
2007517831.tif 000004
【化４】
2007517831.tif 000005
【化５】
2007517831.tif 000006
【化６】
2007517831.tif 000007
および
【化７】
2007517831.tif 000008
を含む官能基である。
【００５２】
好ましい実施態様では、Ｒ１は
【化８】
2007517831.tif 000009
である。
【００５３】
１つの実施態様では、Ｒ２は限定するものではないが、以下の：
【化９】
2007517831.tif 000010
【化１０】
2007517831.tif 000011
【化１１】
2007517831.tif 000012
【化１２】
2007517831.tif 000013
【化１３】
2007517831.tif 000014
【化１４】
2007517831.tif 000015
【化１５】
2007517831.tif 000016
【化１６】
2007517831.tif 000017
【化１７】
2007517831.tif 000018
および
【化１８】
2007517831.tif 000019
を含む官能基である。
【００５４】
特定の好ましい実施態様では、Ｒ３は水素である。しかしながら、別の実施態様ではＲ２およびＲ３および双方が結合する窒素が複素環を形成する。適当な複素環の例には、限定するものではないが以下の：
【化１９】
2007517831.tif 000020
および
【化２０】
2007517831.tif 000021
が挙げられる。
【００５５】
好ましい実施態様では、本発明の化合物は以下の一般的な構造：
【化２１】
2007517831.tif 000022
を有する。
【００５６】
前記の式ＩＩでは、Ｒ２は式Ｉに関して前記で定義したとおりである。好ましい実施態様では、式ＩおよびＩＩのＲ２は、限定するものではないが、以下の：
【化２２】
2007517831.tif 000023
【化２３】
2007517831.tif 000024
【化２４】
2007517831.tif 000025
および
【化２５】
2007517831.tif 000026
を含む。
【００５７】
本発明の好ましい化合物には、限定するものではないが、以下の（これは本明細書では各々カルジオゲノールＡ、Ｂ、ＣおよびＤと称する）：
【化２６】
2007517831.tif 000027
【化２７】
2007517831.tif 000028
【化２８】
2007517831.tif 000029
および
【化２９】
2007517831.tif 000030
が含まれる。
【００５８】
本発明のその他の好ましい化合物には、限定するものではないが図４で示すこれらの例示する化合物が含まれる。
【００５９】
以下および特に実施例で示すインビトロおよびインビボスクリーニング方法を用いて、心筋再生を誘起するその能力に関して式ＩおよびＩＩの化合物を容易にスクリーニングすることができる。
【００６０】
Ｂ．化合物の製造
本発明の化合物を固相または液相合成のいずれかで製造することができる。
１．固相合成
【００６１】
式ＩおよびＩＩの化合物の固相合成に関する方法は本明細書にて実施例Ｉで、およびDing et al., J. Am. Chem. Soc., 124（8）：1594（2002）、Ding et al., J. Am. Chem. Soc., 124（49）：14520-14521（2002）ならびに２００３年１０月１５日出願の米国特許出願第１０／６８７２２０号、２００１年１０月１２日出願の米国特許出願第６０／３２８７６３号、２００１年１１月２０日出願の米国特許出願第６０／３３１８３５号、２００２年１月７日出願の米国特許出願第６０／３４６４８０号、２００２年１月１０日出願の米国特許出願第６０／３４８０８９号、および２００２年１０月１２日出願の米国特許出願第１０／２７００３０号（代理人整理番号第２１２８８−０００３４０号）にて論じられており、その全ての開示は全目的に関して出典明示により本明細書の一部とする。
【００６２】
一般に、２−エタノールアミンを還元的アミノ化により（４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ）メチルポリスチレン樹脂（ＰＡＬ−樹脂）に結合させる。ＰＡＬ−樹脂（１ｇ、１.１ミリモル）をＤＭＦ（４ｍｌ）中に懸濁し、次いでエタノールアミン（５.５ミリモル）、酢酸（０.６５ｍｌ、１.１３ミリモル）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（７２０ｍｇ、３.４ミリモル）を溶液に加える。混合物を室温で穏やかに約１２時間振盪する。次いで得られた樹脂を例えばＤＭＦ（１０ｍｌ、３回）、メタノール（１０ｍｌ、３回）およびジクロロメタン（１０ｍｌ、３回）で洗浄する。次いでアニリン結合樹脂を１−ブタノール（５ｍｌ）中２,４−ジクロロピリミジン（２.２ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（０.５ｍｌ、３ミリモル）と８０℃で１２時間反応させる。次いで得られた樹脂を前記で記載したように洗浄する。
【００６３】
ピリミジン結合ＰＡＬ−樹脂（１００ｍｇ、０.１ミリモル）を例えばブタノール１ｍｌ中種々の芳香族アミン（１.０ミリモル）と混合する。反応混合物を１２０℃で約１２時間加熱して望ましい生成物を生じる。次いで得られた樹脂を前記で記載したように洗浄し、そしてＣＨ２Ｃｌ２：ＴＦＡ：Ｍｅ２Ｓ：Ｈ２Ｏ／４５：４５：５：５（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ、０.５ｍｌ）を用いて室温でおよそ２時間切断する。溶液を収集し、そして真空下で乾燥させて望ましい粗製生成物を得る。次いで例えば溶媒としてＨ２Ｏ（０.１％ＴＦＡ含有）およびＭｅＣＮを用いる製造用ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、粗製生成物は容易に精製される。
【００６４】
類似の固相合成技術を用いてその他の式ＩおよびＩＩの化合物を製造できることは当業者には容易に明らかになろう。
【００６５】
２．液相合成
実施例１に示す液相合成により本発明の化合物を調製することができる。典型的には、式Ｉの化合物の液相合成は、最初に当業者に公知の適切な反応条件下で（２,４−ジクロロプリンのような）２,４−ジハロヘテロアリールを適当な（ヒドロキシエチルアミノ基のような）置換基と置換することを伴う。続いてこれを当業者に公知の適切な反応条件下で第２の適当な（適当に置換されたアニリン（例えば（４−フェニルアミノ）アニリン、４−フェノキシアニリン、４−メトキシアニリン、４−アミノ−トランス−スチレン等）のような）置換基で置換する。当業者に公知の（調製用ＲＰ−ＨＰＬＣのような）標準的な方法を用いて本発明の化合物を精製することができる。
【００６６】
ＩＶ．心筋再生を誘起するための化合物／組成物の使用
本発明の組成物を用いて哺乳動物細胞における心筋再生を誘起することができる。一般的に言えば、哺乳動物細胞を式Ｉの化合物と接触させ、その結果哺乳動物細胞が心筋系統の細胞に分化する。インビボまたはインビトロのいずれかで哺乳動物細胞を式Ｉの化合物（またはその組成物）と接触させることができる。例えばカルジオゲノールＣを、傷害を受けたかまたは不調な心臓筋肉に静脈内にまたは手術中の直接投与により直接投与することができる。
【００６７】
Ａ．心筋再生のインビボ誘起
式Ｉの化合物およびその組成物を都合よく用いてインビボで心筋再生を誘起することができる。本発明の化合物および組成物を個体、例えばヒトのような哺乳動物に、哺乳動物細胞の心筋系統の細胞への分化を誘起するのに有効な量で投与する。心筋再生を誘起するその能力を鑑みて、式Ｉの化合物は急性心臓疾患における損傷した心筋の修復に、および心筋症のような障害を処置するのに有用である。好ましい実施態様では、本発明の化合物および組成物を用いて、心臓筋肉組織の発達を研究する目的で心筋細胞を作成する。別の好ましい実施態様では、損傷または弱化した心臓筋肉組織の修復または増大を必要とする対象の処置の間に本発明の化合物および組成物を用いる。別の実施態様では、本発明の組成物を用いて、損傷または弱化していない心臓筋肉組織の増大または増強を望む対象を処置する。かかる対象には、例えば心臓疾患または障害の危険性を有するものが含まれ得る。
【００６８】
本発明の組成物を単独でまたはその他の化合物および治療計画と組み合わせて用いて心筋再生を誘起できることは当業者には理解されよう。例えば式Ｉの化合物を精製されたまたは合成された成長因子および心臓筋肉組織の発達を増強するその他の薬剤またはその組み合わせと併用して投与することができる。
【００６９】
組成物の有効量は、組成物の投与に付随して生じる何らかの副作用の存在、性質および程度；組成物のＬＤ５０；ならびに種々濃度での組成物の副作用により決定される。典型的には、投与される組成物の量は体重ｋｇあたり約０.０１から約２０ｍｇ、さらに典型的にはｋｇあたり約０.０５から約１５ｍｇ、なおさらに典型的にはｋｇあたり約０.１から約１０ｍｇの範囲である。
【００７０】
例えば静脈内注入、経口、腹腔内、または皮下により組成物を投与することができる。経口投与が好ましい投与方法である。化合物の製剤はアンプルおよびバイアルのような単位投与用または多回投与用密閉容器でありうる。
【００７１】
本発明の組成物は典型的には個体または対象に投与する前に薬学的に許容される担体と共に製剤される。薬学的に許容される担体は投与される特定の組成物（例えばカルジオゲノールＣ）により、および組成物を投与するために用いられる特定の方法によりある程度決定される。したがって、本発明の医薬組成物の多様な適当な製剤がある。（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989参照）。
【００７２】
経口投与に適当な製剤は（ａ）水、生理食塩水またはＰＥＧ４００のような希釈剤に懸濁し有効量の式Ｉの化合物のような液体溶液；（ｂ）各々液体、固体、顆粒またはゼラチンとして予め決定された量の活性成分を含有するカプセル、小袋、または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；および（ｄ）適当なエマルジョンからなってよい。錠剤形態は１個またはそれより多い以下のものを含み得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド性シリコンジオキシド、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびその他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合した担体。ロゼンジ形態は着香剤、例えばスクロース中に活性成分を含み、そしてトローチはゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアエマルジョンのような不活性基剤中に活性成分を含み、ゲル等は活性成分に加えて当分野において公知の担体を含有することができる。
【００７３】
本発明の組成物を例えば静脈内注入、腹腔内、または皮下のようなその他の投与経路に適当な製剤にすることができる。製剤には例えば、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性、等張無菌注射用溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。注射溶液および懸濁液を無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００７４】
本発明の局面で患者に投与される用量は患者に長時間にわたって有利な治療的応答を起こすのに十分であるべきである。例えば本発明の組成物を投与して心筋症を処置または予防する場合、患者に投与される用量は、心臓筋肉がリズミカルに収縮する能力の低下を予防、遅延または逆行させるのに十分であるべきである。用量は用いられる特定の組成物の有効性および患者の症状、ならびに処置される患者の体重または表面積により決定される。投与量はまた特定の患者における特定の組成物の投与に付随して生じる何らかの副作用の存在、性質および程度により決定される。
【００７５】
Ｂ．心筋再生のインビトロ誘起
インビトロで心筋再生を誘起するのに本発明の組成物を都合よく用いることができる。哺乳動物細胞が心筋系統の細胞に分化するときに、哺乳動物細胞を組成物と接触させる。
【００７６】
１．適当な細胞
心筋系統の細胞に分化する細胞を任意の適当な哺乳動物から誘導することができる。例えば、細胞を例えばマウス、ラット、モルモットおよびウサギのような齧歯類；例えばイヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシおよびヤギのような非齧歯類哺乳動物；例えばチンパンジーおよびヒトのような霊長類から得ることができる。分化する細胞は初代細胞でよいか、または培養物中に維持された細胞でよい。細胞を培養物中に維持する場合、典型的にはこれらを培養の１２代から１５代継代の間で本発明の化合物／組成物と接触させる。本発明の方法において用いる細胞の初代培養を確立するための技術および方法は当業者に公知である（例えばHumason, Animal Tissue Techniques, 4th ed., W. H. Freeman and Company（1979）、およびRicciardelli et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 25：1016（1989）参照）。
【００７７】
骨髄またはその他のＭＳＣ供給源中のその他の細胞から多能性間葉性幹細胞を単離することによりヒト間葉性幹細胞（ＭＳＣ）を得ることができる。骨髄細胞を腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨またはその他の髄腔から得ることができる。ヒト間葉性幹細胞のその他の供給源には孵化卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児および青年の皮膚、血液、脂肪組織、および筋衛星細胞が挙げられる。典型的には、間葉性幹細胞を含有する組織標本からの細胞を（１）分化せずに間葉性幹細胞成長を刺激する、および（２）間葉性幹細胞のみの基質表面への選択的付着を可能にする成長因子を含有する成長培地中で培養する。細胞を適当な時間培養した後、非付着物を基質表面から除去し、したがって間葉性幹細胞の集団を広げる。したがって、造血細胞または分化した間葉細胞のいずれかに関連するマーカーを含まない付着性の骨髄または骨膜細胞の陽性選択により均質なＭＳＣ集団が得られる。
【００７８】
好ましくは、本発明の化合物で接触させる哺乳動物細胞は幹細胞、特に胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。ヒトおよび動物ＥＳＣの単離のための方法は当分野において周知である。例えばBrook FA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94：5709-12（1997）； Grounds et al., J. Histochem. and Cytochem., 50：589-610（2002）； Reubinoff, Nat. Biotech., 18：399-404（2000）参照。哺乳動物胚性幹細胞は、例えばマウスＲ１細胞およびヒト胚性幹細胞を含む。
【００７９】
２．一般的な培養方法
哺乳動物細胞（例えばＥＳＣ）を式Ｉの化合物単独で、別の式Ｉの化合物と組み合わせて、単一の混合物中で一緒にもしくは逐次的のいずれかで、またはその他の成長因子の存在下で接触させることができる。化合物の量、例えば任意のカルジオゲノールＡ、Ｂ、ＣまたはＤおよび成長因子の量を調整して特定の細胞型における分化の誘起を促進させることができることは当業者には理解されよう。例えば細胞に接触させるカルジオゲノールの量は典型的には約０.０１μＭ（５２ｎｇ／ｍｌ）から約１０μＭ（２.６μｇ／ｍｌ）、さらに典型的には約０.０２μＭから約５μＭ、なおさらに典型的には約０.０５μＭから約１μＭ、なおさらに典型的には約０.０７５μＭから約０.５μＭ、および最も典型的には約１μＭである。
【００８０】
本発明のこの態様は細胞培養の分野の通常の技術を利用する。当業者は公知の方法論（例えばFreshney et al., CULTURE OF ANIMAL CELLS（3rd ed. 1994）参照）を用いて適当な細胞培養方法および条件を決定することができる。一般に細胞培養環境には細胞成長のための基質、細胞密度および細胞収縮、気相、培地および温度のような因子の検討が含まれる。
【００８１】
細胞のインキュベーションは一般に細胞成長に最適であることが解っている条件下で実施される。かかる条件には、例えばおよそ３７℃の温度およびおよそ５％ＣＯ２を含有する湿気を含んだ大気を挙げることができる。インキュベーションの期間は非常に広範であり、望まれる結果に依存する。一般にインキュベーションは細胞が適当に発現するまで持続するのが好ましい。３Ｈチミジンの取り込みまたはＢｒｄＵ標識を用いて増殖を測定するのが都合がよい。
【００８２】
プラスチック皿、フラスコまたはローラーボトルを用いて本発明の方法に従って細胞を培養することができる。適当な培養容器には、例えばマルチウェルプレート、ペトリ皿、組織培養チューブ、フラスコ、ローラーボトル等が挙げられる。
【００８３】
細胞型に基づいて経験的に決定された最適密度で細胞を成長させる。細胞を典型的には１２−１５代継代し、そして１５代の継代の後、廃棄する。
【００８４】
温度の地域差を考慮して、培養された細胞を通常適当な温度、例えば細胞が得られた動物の体温を提供するインキュベーター中で増殖させる。一般的に、３７℃は細胞培養に好ましい温度である。たいていのインキュベーターはおよそ大気の状態にまで加湿してある。
【００８５】
気相の重要な構成成分は酸素および二酸化炭素である。典型的には、大気の酸素張力を細胞培養に用いる。培養容器は通常インキュベーター内の大気に通じており、気体透過性キャップを用いることにより、または培養容器の密閉を妨げることにより気体の交換を可能にする。二酸化炭素は細胞培地中のバッファーと一緒にｐＨ安定化に役割を果たし、そして典型的にはインキュベーター中１−１０％の濃度で存在する。好ましいＣＯ２濃度は典型的には５％である。
【００８６】
確定された細胞培地は包装された、予め混合された粉末または予め滅菌された溶液として利用される。通例用いられる培地の例には、ＭＥＭ−α、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、イスコフ完全培地、またはマッコイ（例えばGibcoBRL／Life Technologies CatalogueおよびReference Guide； Sigma Catalogue参照）が挙げられる。典型的にはＭＥＭ−αまたはＤＭＥＭを本発明の方法において使用する。確定された細胞培地はしばしば５−２０％血清、典型的には熱不活性化血清、例えばヒト、ウマ、ウシ、およびウシ胎仔血清で補充される。典型的には、１０％ウシ胎仔血清を本発明の方法において使用する。培養培地は通常緩衝化されて、細胞を好ましくは約７.２から約７.４のｐＨで維持する。その他の培地への補充物には典型的には、例えば抗生物質、アミノ酸および糖、ならびに成長因子が挙げられる。
【００８７】
Ｃ．心筋再生の検出
インビボまたはインビトロでの本発明の組成物の投与の後、限定するものではないが：心筋細胞特異的タンパク質の発現を検出すること、心臓筋肉細胞特異的転写因子の発現を検出すること、心臓筋肉機能に必須のタンパク質の発現を検出すること、および心臓筋肉細胞の拍動を検出することを含む多くのさまざまな方法により心筋再生の誘起を検出することができる。心筋細胞特異的タンパク質および心臓筋肉細胞特異的転写因子の具体例を本明細書に記載する。
【００８８】
１．心筋細胞特異的タンパク質の検出
心臓筋肉細胞分化の発現を心臓筋肉細胞特異的タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを測定することにより検出することができる。特定の心臓筋肉細胞特異的タンパク質のレベルを免疫組織化学的染色、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等のようなイムノアッセイを用いて、特定の心筋細胞特異的タンパク質またはそのフラグメントに選択的に結合する抗体で都合よく測定できる。イムノアッセイでタンパク質特異的抗体を用いるタンパク質の検出は当業者に公知である（例えばHarlow & Lane, Antibodies： A Laboratory Manual（1988）, Coligan, Current Protocols in Immunology（1991）； Goding, Monoclonal Antibodies： Principles and Practice（2d ed. 1986）；および Kohler & Milstein, Nature 256：495-497（1975）参照）。ｍＲＮＡの測定に関しては、増幅、例えばＰＣＲ、ＬＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、ドットブロッティングが好ましい。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを例えば直接的または間接的に標識した検出剤、例えば蛍光または放射活性標識した核酸、放射活性または酵素標識した抗体を用いて検出する。これらのアッセイは当業者に周知であり、そして例えばAusubel, et al. ed. Current Protocols in Molecular Biology（2001）に記載されている。
【００８９】
典型的には、心臓筋肉細胞タンパク質ＡＮＦの発現を用いて分化し心筋細胞を検出する。ＡＮＦは心臓の筋細胞において主に合成されるポリペプチドホルモンであり、そしていくつかの心筋再生転写因子の下流標的であり；特異的心筋細胞「マーカー」遺伝子と考えられている（Boer, Exp. Cell Res., 207：421-29（1993））。例えばＡＮＦプロモーター領域を容易に検出できるタンパク質またはその活性を容易に検出できるルシフェラーゼのような酵素の上流のレポータープラスミドに挿入することにより、ＡＮＦ遺伝子の活性化を測定することができる。これらの環境におけるレポーター遺伝子の発現のレベルの増加は心筋細胞の分化の指標となる。
【００９０】
ａ）免疫組織化学的検出
例えば心筋細胞特異的遺伝子を検出するための細胞の直接的な免疫組織化学的染色のために、細胞を適当な密度で９６ウェルアッセイプレートに播種し、そして適切な量の式Ｉの化合物（例えばカルジオゲノールＡ）で、単独でかまたはその他の成長因子を伴ってかのいずれかで適切な時間処理する。次いで細胞を１０％ホルマリン溶液中で固定する。固定された細胞を再度洗浄し、そして当業者に公知の方法を用いて目的のタンパク質に特異的な試薬（例えばタンパク質に特異的な抗体、または酵素レポーター遺伝子を用いる場合、例えば蛍光方法によりレポーター遺伝子酵素の存在下でその検出可能性が変化する試薬）で染色する（例えばHarlow & Lane, 1988, supra； Coligan, 1991, supra； Goding, 1986, supra；および Kohler & Milstein, 1975, supra参照）。細胞の写真画像を撮影し、そして心筋細胞特異的遺伝子を発現する陽性細胞を画像から手作業で計数する。
【００９１】
２．心臓筋肉細胞特異的転写因子の検出
レポーター遺伝子アッセイを用いて心臓筋肉細胞特異的転写因子の発現を検出することができる。種々のレポーター遺伝子アッセイが当業者に周知である。例えばNew et al., Phytother. Res., 17：439-48（2003）； Schenborn et al, Mol. Biotechnol., 13：29-44（1999）参照。例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子をレポーター遺伝子アッセイにおいて用いることができる。レポーター構築物は典型的には一過性に、または安定して細胞にトランスフェクトされる。相当する遺伝子のプロモーター領域は典型的には適切なプライマーでＰＣＲにより増幅される。得られたＰＣＲ産物を適当なクローニングベクターに挿入し、増幅し、そして配列決定する。得られたプラスミドを適切な制限酵素により消化し、そして得られたフラグメントを、レポーター遺伝子を含むベクターに挿入する。
【００９２】
ａ）一過性にトランスフェクトされた細胞
一過性にトランスフェクトされた細胞を用いるレポーター遺伝子アッセイのために、典型的には細胞を成長培地２ｍｌ中およそ３００００セル／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、そして一晩または適当な時間インキュベートする。適当なトランスフェクション試薬を用いてプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトする。８時間後、トランスフェクトされた細胞を９６ウェルアッセイプレート（例えばCorning）に播種し、そして適切な量の式Ｉの化合物（例えばカルジオゲノールＡ）で処理する。細胞を４日間インキュベートし、次いで当業者に公知の方法を用いて細胞のレポーター遺伝子活性を検定する。
【００９３】
ｂ）安定してトランスフェクトされた細胞
安定してトランスフェクトされた細胞を用いるレポーター遺伝子アッセイのために、典型的には細胞を成長培地２ｍｌ中およそ３００００セル／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、そして一晩または適当な時間インキュベートする。適切な量のレポータープラスミドおよび選択マーカーを含むベクター（例えば抗生物質抵抗性遺伝子）を適切なトランスフェクション試薬を用いて細胞にコトランスフェクトする。適切なインキュベーション時間の後、細胞を１０ｃｍ培養皿に播種し、そして適切な量の抗生物質を培養培地に加える。適切な間隔で新鮮な抗生物質を加える。抗生物質抵抗性コロニーをプールして安定してトランスフェクトされた細胞を生じる。トランスフェクトされた細胞を９６ウェルアッセイプレート（例えばCorning）にプレートし、そして適切な量の式Ｉの化合物（例えばカルジオゲノールＡ）で処理する。細胞を４日間インキュベートし、次いで当業者に公知の方法を用いて細胞のレポーター遺伝子活性を検定する。
【００９４】
３．分化した心筋細胞の投与
当業者に公知の任意の手段により分化した心筋細胞を対象に投与することができる。本発明の１つの実施態様では、無処置の固体支持体（例えば３次元マトリックスまたは平板表面）上の分化した心筋細胞を例えば外科的な移植により対象に投与することができる。これに代えて、対象に例えば静脈内、皮下または腹腔内投与する前に、分化した心筋細胞をマトリックスから剥がすことができ、すなわちプロテアーゼでの処理による。
【００９５】
本発明のいくつかの実施態様では、胚性幹細胞を抽出し、そして続いてマトリックスと接触させて増殖させ、そして心筋系統の細胞に分化させる。細胞を処置される対象、すなわち自己から抽出することができる（それにより移植の免疫基盤の拒絶を回避する）か、または第２の対象、すなわち異種からでよい。いずれの場合も、細胞の投与を適切な免疫抑制処置と組み合わせることができる。
【００９６】
本発明の方法に従って分化した心筋細胞を当分野において公知の任意の手段により対象に投与することができる。適当な投与の手段には、例えば静脈内、皮下、腹腔内、および外科的な移植が挙げられる。心筋細胞を直接心臓筋肉に注射するか、または局所的に例えば心臓の手術の間に適用することができる。
【００９７】
細胞を例えば抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性、等張無菌注射用溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液のような投与に適当な製剤にすることができる。注射溶液および懸濁液を無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００９８】
外科的な移植のために、典型的には分化した細胞を無処置の固体支持体、例えば３次元マトリックスまたは平板表面に残す。マトリックスまたは平板表面を対象の適切な部位に手術により移植する。例えば心臓筋肉組織の一部の置換を必要とする患者は手術により移植された無処置の固体支持体上の分化した細胞を有し得る。
【００９９】
心臓筋肉細胞の減少または機能不全による状態の処置または予防において投与される細胞の有効量を決定するために、医師は細胞毒性、移植反応、疾患の進行、および抗細胞抗体の産生を評価する。投与に関して、種々の濃度での心筋細胞の副作用を考慮して、患者の主要部のおよび全体的な健康に適するように、本発明の方法に従って分化した心筋細胞を有効量で投与して対象に心臓筋肉細胞を提供することができる。単一のまたは分割した用量により投与を達成することができる。
【０１００】
実施例
限定するものではないが請求の範囲に記載されている発明を説明するために以下の実施例を提示する。
【０１０１】
１．実施例１：
カルジオゲノールＡ、Ｂ、ＣおよびＤの合成および特徴付け
合成に使用する全ての化学物質をAldrichから購入した。２,４−ジクロロピリミジン（２００ｍｇ、１.３４ミリモル）をエタノール５ｍｌに溶解し、そしてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２８２μｌ（１.６２ミリモル）およびエタノールアミン９０ｍｇ（１.４７ミリモル）を溶液に加えた。次いで反応混合物を５０℃で１２時間加熱して、２−クロロ−４−（１−ヒドロキシルエチルアミノ）−ピリミジン（収率８０％）を得た。２−クロロ−４−（１−ヒドロキシルエチルアミノ）−ピリミジン２０ｍｇ（０.１２ミリモル）を１−ブタノール（１ｍｌ）に溶解し、そして４−（フェニルアミノ）アニリン４２.４ｍｇ（０.２３ミリモル）を加えた。反応混合物をマイクロ波反応装置中２００℃で１５分間加熱してカルジオゲノールＡ（収率８５％）を得た。同様に、４−フェノキシアニリン４２.７ｍｇ（０.２３ミリモル）、４−メトキシアニリン２８.４ｍｇ（０.２３ミリモル）または４−アミノ−トランス−スチルベン４５.０ｍｇ（０.２３ミリモル）の使用により各々カルジオゲノールＢ（収率８０％）、Ｃ（収率９０％）またはＤ（収率７５％）を得る。化合物を調製用ＨＰＬＣにより、溶媒としてＨ２Ｏ（０.１％ＴＦＡ含有）およびＭｅＣＮを用いて５％から９０％ＭｅＣＮの直線グラジエントで１０分間精製した。望ましいピークを収集し、そして凍結乾燥して最終生成物が得られた。
【０１０２】
カルジオゲノールＡ： 1H NMR（400MHz, DMSO）： δ（ppm）3.44（m, 2H）, 3.57（m, 2H）, 6.20（d, 1H, J=7.2）, 6.83（t, 1H, J=7.2）, 7.08（m, 5H）, 7.23（t, 2H, J=8.3）, 7.34（d, 2H, J=7.7）, 7.67（d, 1H, J=6.6）, 8.25（s, 1H）, 8.95（s, 1H）, 10.18（s, 1H）.  高分解能質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）：計算値 [MH+]（C18H20N5O）322.1662、実測値 322.1660.
【０１０３】
カルジオゲノールＢ： 1H NMR（400MHz, DMSO）： δ（ppm）3.45（m, 2H）, 3.56（m, 2H）, 6.24（d, 1H, J=7.2）, 7.03（m, 5H）, 7.14（t, 1H, J=7.4）, 7.40（t, 2H, J=7.5）, 7.55（d, 2H, J=8.6）, 7.73（d, 1H, J=7.0）, 8.97（s, 1H）, 10.30（s, 1H）.  高分解能質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）：計算値 [MH+]（C18H19N4O2）323.1502実測値 323.1498.
【０１０４】
カルジオゲノールＣ： 1H NMR（400MHz, DMSO）： δ（ppm）3.42（m, 2H）, 3.55（m, 2H）, 3.72（s, 3H）, 6.21（d, 1H, J=7.2）, 6.97（d, 2H, J=8.9）, 7.41（d, 2H, J=8.4）, 7.66（d, 1H, J=7.1）, 8.93（s, 1H）, 10.07（s, 1H）. 高分解能質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）：計算値 [MH+]（C13H17N4O2）261.1346実測値 261.1342.
【０１０５】
カルジオゲノールＤ： 1H NMR（400MHz, DMSO）： δ（ppm）3.48（m, 2H）, 3.62（m, 2H）, 6.26（d, 1H, J=7.2）, 7.27（m, 3H）, 7.38（t, 2H, J=7.5）, 7.61（m, 6H）, 7.77（d, 1H, J=7.0）, 9.00（s, 1H）, 10.35（s, 1H）. 高分解能質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）：計算値 [MH+]（C20H21N4O）333.1710実測値 333.1711.
【０１０６】
前記の液相合成方法に加えて、本発明の化合物を以下のような固相合成方法を用いて作成することもできる：
【０１０７】
一般的に、還元的アミノ化により２−エタノールアミンを（４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ）メチルポリスチレン樹脂（ＰＡＬ−樹脂）に結合させた。ＰＡＬ−樹脂（１ｇ、１.１ミリモル）をＤＭＦ（４ｍｌ）に懸濁し、そして次にエタノールアミン（５.５ミリモル）、酢酸（０.６５ｍｌ、１.１３ミリモル）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（７２０ｍｇ、３.４ミリモル）を溶液に加えた。混合物を室温で１２時間穏やかに振盪した。次いで得られた樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ、３回）、メタノール（１０ｍｌ、３回）およびジクロロメタン（１０ｍｌ、３回）で洗浄した。次いでアニリン結合樹脂を１−ブタノール（５ｍｌ）中２,４−ジクロロピリミジン（２.２ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（０.５ｍｌ、３ミリモル）と８０℃で１２時間反応させた。次いで得られた樹脂を前記したように洗浄した。
【０１０８】
ピリミジン結合ＰＡＬ樹脂（１００ｍｇ、０.１ミリモル）をブタノール１ｍｌ中の種々芳香族アミン（１.０ミリモル）と混合した。反応混合物を１２０℃で１２時間加熱して望ましい生成物を生じる。次いで得られた樹脂を前記したように洗浄し、そしてＣＨ２Ｃｌ２：ＴＦＡ：Ｍｅ２Ｓ：Ｈ２Ｏ／４５：４５：５：５（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ、０.５ｍｌ）を用いて室温で２時間切断した。溶液を収集し、そして真空下乾燥させて望ましい粗製生成物を得た。次いで調製用ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、溶媒としてＨ２Ｏ（０.１％ＴＦＡ含有）およびＭｅＣＮを用いて粗製生成物を精製することができる。
【０１０９】
実施例２：
心筋再生誘起分子に関する細胞培養およびハイスループットスクリーニング
Ｐ１９胚性癌（ＥＣ）細胞（ＡＴＣＣより）を７.５％新生ウシ血清および２.５％ＦＢＳ（Gibco）を含有するＭＥＭ−アルファ中、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。Ｐ１９ＣＬ６細胞（Dr. Michael SchneiderおよびDr. Nakamura Teruyaから贈呈）を、１０％ＦＢＳ（Gibco）を含有するＭＥＭ−アルファ中、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。ＰＣＲプライマー（５’−ｃｃｇａｃｇｃｇｔｇａａａｃａｔｃａｃａｔｔｇｇｔｔｇｃｃｔｔおよび５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃａｃｔｃｔｃｔｇｇｔｔｔｃｔｃｔｃｔｃ）を用いることにより、ラットＡＮＦプロモーター領域を含有するフラグメント（〜７００塩基対）を増幅し、次いでＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてＰＧＬ３−ＢＶルシフェラーゼレポータープラスミドにサブクローニングした。標準的な、Ｐ１９細胞に関する心筋再生分化条件下で（ＥＢ形成および１％ＤＭＳＯでの処理（Skerjank IS, Trends Cardiovasc Med, 9：139-143（1999）参照）、レポータープラスミドを抱く安定したＰ１９クローンによりルシフェラーゼシグナルの５から７倍増加（図１）が得られた。この細胞系を用いて以下の方法に従って単層形式で１０００００化合物の複素環ライブラリーをスクリーニングした。１０３個の細胞を３８４−ウェルプレートの各ウェルにインキュベーション培地（５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ−アルファ）１００μｌと共にプレートした；次いで１ｍＭ化合物溶液５００ｎｌを各ウェルに加えた。３日間の化合物処理の後、培地をさらに化合物を加えていないものと交換した。化合物処理の７日後、Bright-Gloルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ＥＢの不在下でルシフェラーゼ活性を＞４倍上方調節するおよそ８０個の化合物を同定した。
【０１１０】
ＭＨＣは心臓筋肉収縮能に寄与する必須のモータータンパク質の１つであり、そして分化に関する二次アッセイとして使用した。前記したスクリーニングアッセイにおいて同定された８０個のうち３５個の化合物はまたＰ１９ＣＬ６細胞においてサルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現を誘起した。Ｐ１９ＣＬ６細胞系は心筋再生に関して高い能力を有するＰ１９  ＥＣ細胞のサブクローンである。Habara-Ohkubo, Cell Struct. Funct., 21：101-110（1996）参照。抗ＭＨＣ抗体（ＭＦ２０）で細胞を免疫染色することによりＰ１９ＣＬ６細胞におけるＭＨＣ発現を測定した（図２Ｆ）。
【０１１１】
実施例３；
心筋再生誘起活性を有する化合物としてのカルジオゲノールＡ、Ｂ、ＣおよびＤの同定
前記の実施例において同定された３５個の化合物のうち、４つのジアミノピリミジン、カルジオゲノールＡ−Ｄ（表１）がＭＨＣ発現の誘起において最も強力であった。
【表１】
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【０１１２】
表１のカルジオゲノールの最適活性を以下のような一連の「＋」の記号で示す：＋＋：１０−２５％の細胞が７日後にＭＨＣに関して陽性である；＋＋＋：２５−４０％の細胞が７日後にＭＨＣに関して陽性である；＋＋＋＋：４０−５５％の細胞が７日後にＭＨＣに関して陽性である。
【０１１３】
これらの化合物が一般的な心筋再生誘起薬剤であることを確認するために、未分化Ｒ１マウスＥＳＣに及ぼすその効果を分析した。培養培地中白血病阻止因子（ＬＩＦ）を添加してＲ１マウスＥＳＣを多能性状態で維持することができる。胚性幹細胞系Ｒ１をゼラチンコートした組織培養皿中、１５％ＥＳ血清代替添加物を含有するKnockout ＤＭＥＭ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Gibco）、１％非必須アミノ酸ストック、１％ヌクレオシドストック、０.１ｍＭベータ−メルカプトメタノール（Specialty Media）および１０００単位／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＩＦ、Chemicon）を伴って培養した。
【０１１４】
分化のために、Ｒ１細胞を単層でゼラチンコートした３８４ウェルまたは９６ウェルプレートに１０％ＦＢＳおよび０.２５μＭ化合物を含有するＤＭＥＭ１００μｌを伴ってプレートした。ＬＩＦは分化の間は存在しなかった。培養の７日後（３日は化合物を伴い、そして次にさらに化合物を加えることなく培地を交換した後、さらに４日）、顕微鏡下で拍動する心臓筋肉の存在が肉眼観察された。ＭＨＣの発現に加えて（図２Ａ）、抗−ＧＡＴＡ４抗体を用いる免疫蛍光染色により心臓特異的遺伝子ＧＡＴＡ−４が検出された（図２Ｂ）。ＧＡＴＡ−４は発達中の心臓に限定される転写因子であり、そしてその過剰発現はＰ１９細胞における心筋再生を増強する（Grepin et al., Development, 124：2387-95（1997）； Chadron et al., Cell and Dev. Biol., 10：85-91（1999）； Gag et al., Nature, 424：443-447（2003））。図３に示すように、未分化Ｒ１マウスＥＳＣではＭＨＣもＧＡＴＡ−４も発現されない。化合物処理により有意な細胞死を伴わない細胞増殖が示されるということも観察されたが、これはこの過程がその他の系統の細胞死を伴う心臓前駆細胞に関する単なる選択ではないことを示している。
【０１１５】
実施例４：
カルジオゲノールＣは胚性幹細胞における心筋再生の強力なインデューサーである
カルジオゲノールＣはピリミジンＣ２位置でｐ−メトニム（metonym）アニリン置換を有し、そしてＥＳＣからＭＨＣ陽性心筋細胞の分化の誘起に関して０.１μＭのＥＣ５０を有して非常に強力である。カルジオゲノールＣは、２５μＭ以上の濃度でのみ有意な細胞毒性を示し、Ｒ１細胞を０.２５μＭ化合物で３日間処理し、そしてさらに化合物を含まない培地中で４日間培養した後、５０％以上の細胞がＭＨＣに関して陽性に染色され、そして９０％以上の細胞がＧＡＴＡ−４に関して陽性であり、これはＧＡＴＡ−４がＭＨＣよりも早期に発現されるという以前の観察に合致している。Boheler et al., Circ. Res., 91：189-201（2002）参照。さらに、カルジオゲノールＣで処理したＲ１細胞には多くの拍動する部分があり、これはこれらのＭＨＣ陽性細胞が機能的な心臓筋肉を形成することができることを実証している。これらの結果は、大部分の細胞集団がカルジオゲノールＣにより誘起されて心臓の系統に（凝集およびＥＢ形成の不在下で）分化したことを示している。これは凝集およびＥＢの形成によりＥＳＣの心筋再生を誘起する現在の標準的な方法（これは結果的に細胞集団の５％にしか心筋細胞を形成しない）と対照的である。Boheler et al.,（2002）参照。
【０１１６】
実施例５：
カルジオゲノールＣを用いて分化したＥＳＣにおける心臓筋肉細胞特異的転写因子の検出
カルジオゲノールＣの活性をさらに特徴付けるために、心臓筋肉細胞特異的転写因子ＭＥＦ２およびＮｋｘ２.５の発現を試験した（図２ＣおよびＤ）。ＭＥＦ２ファミリーのメンバーは筋肉発達に必須である。例えばEdmondson, et al., Development, 1251-1263（1994）；  Lin et al., Science, 276：1404-1407（1997）参照。Ｎｋｘ２.５はＧＡＴＡ−４と一緒に複数の心臓筋肉特異的遺伝子（例えばミオシン軽鎖２Ｖ、心房性ナトリウム利尿因子、ｅＨＡＮＤおよびホメオドメイン転写因子ＨＯＰ）の発現を調節する。例えばSmall et al., Cell, 110：725-735（2002）； Shin et al., Cell, 110：725-35（2002）参照。さらに、標的とされたＮｋｘ２.５遺伝子の妨害は胚致死性であり、そして心臓発達の停止に至る。例えばLyons et al., Genes Dev., 9：1654-66（1995）参照。およそ９０％のカルジオゲノールＣ処理細胞はＭＥＦ２およびＮｋｘ２.５に関して陽性に染色され、さらにこれによりＥＳＣがカルジオゲノールＣにより心臓筋肉に分化することが確認される。
【０１１７】
本明細書に引用された全ての出版物および特許出願は、各々の個々の出版物または特許出願が具体的に、そして別個に本明細書の一部であると示されているかのように、出典明示により本明細書の一部とする。
【０１１８】
前記の発明は理解を明らかにする目的のために説明および例示によりいくぶん詳細に記載されているが、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の教示に鑑みて特定の変更および修飾をそこに作成し得ることは当業者に容易に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ＡＮＦプロモーターレポーターアッセイを用いる心筋再生に関するハイスループットアッセイ。この図はルシフェラーゼを発現するＡＮＦプロモーターレポータープラスミドを抱く安定したＰ１９クローンを用いて得られたデータを示す。グラフはＰ１９細胞に関して標準的な心筋再生分化条件（ＥＢ形成および１％ＤＭＳＯでの処置（Skerjank IS, Trends Cardiovasc Med, 9：139-143（1999）参照）の下で数日後、このＰ１９クローンからのルシフェラーゼシグナルが５から７倍増加したことを示している。
【図２】０.２５μＭカルジオゲノールＣで処理したＥＳＣ（ＡからＥ）およびＰ１９ＣＬ６細胞（Ｆ）における心臓筋肉マーカーの免疫染色：（Ａ）および（Ｆ）ミオシン重鎖（緑）；（Ｂ）ＧＡＴＡ−４（赤）；（Ｃ）ＭＥＦ２（赤）；（Ｄ）Ｎｋｘ２.５（赤）；ならびに（Ｅ）ミオシン重鎖（緑）およびＭＥＦ２（赤）。細胞核をＤＡＰＩ（青）で染色した。４％パラホルムアルデヒド（Sigma）で細胞を２０分間固定した。０.３％ Triton Ｘ−１００および６％ウマ血清を含有するＰＢＳ（Gibco）中で細胞染色を実施した。以下の希釈で１次抗体を使用した：ミオシン重鎖（ＭＨＣ）マウスモノクローナル抗体ＭＦ２０（Developmental Studies Hybridoma Bank、１：２００）、ウサギポリクローナル抗ＧＡＴＡ−４抗体（Santa Cruz Biotech、１：３００）、ウサギ抗ＭＥＦ２抗体（Santa Cruz Biotech、１：１００）およびヤギ抗Ｎｋｘ２.５抗体（Santa Cruz Biotech、１：１００）。２次抗体はＣｙ２コンジュゲート抗マウス（１：３００）、またはＣｙ３コンジュゲート抗ウサギもしくは抗ヤギ抗体（Jackson ImmunoResearch、１：５００）であった。細胞核をＤＡＰＩ（Roche）で染色した。画像を２００倍の倍率のNikon Eclipes ＴＥ２０００ 顕微鏡で撮影した。二重または三重標識画像をMetamorphに集めた。
【図３】カルジオゲノールＣ処置していないＥＳＣの免疫染色（対照）。（Ａ）ＭＨＣ（緑）および核（青）。（Ｂ）ＧＡＴＡ−４（赤）および核（青）。各々図２Ａおよび２Ｅと比較する。
【図４】この図は哺乳動物細胞において心筋再生を誘起するために用いることができる本発明のさらなる化合物の一覧を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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