(57)【要約】本発明は、ガン治療、より詳細には、急性骨髄性白血病治療における病理学上の幹細胞を根絶するための薬品の調製での、特定のアミノ酸配列、そのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはＣＤＲフラグメントを含む２種のキメラ抗ＣＤ４４抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１による少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む転移構造物。
【請求項４】
配列番号１、３および５によってコードされるアミノ酸配列およびそのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはＣＤＲフラグメントを含むキメラ抗ＣＤ４４抗体。
【請求項５】
配列番号２、４および６およびそのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはＣＤＲフラグメントを含むキメラ抗ＣＤ４４抗体。
【請求項６】
配列番号１、３および７によってコードされるアミノ酸配列およびそのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはＣＤＲフラグメントを含むキメラ抗ＣＤ４４抗体。
【請求項７】
配列番号２、４および８およびそのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはＣＤＲフラグメントを含むキメラ抗ＣＤ４４抗体。
【請求項８】
抗ＣＤ４４抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３〜７のいずれか１つによるキメラ抗体。
【請求項９】
キメラ抗ＣＤ４４抗体は、生薬仲介物と結合される、請求項３〜８のいずれか１つによるキメラ抗体。
【請求項１０】
ガン治療において病理学上の幹細胞を根絶するための薬品の調製における、請求項３〜９のいずれか１つによるキメラ抗ＣＤ４４抗体の使用。
【請求項１１】
ガン治療においてエクスビボで病理学上の幹細胞を特定的に根絶し、正常な幹細胞を保存するための薬品の調製における、請求項１０による使用。
【請求項１２】
前記幹細胞は、白血病幹細胞である、請求項１０または１１による使用。
【請求項１３】
白血病細胞を分化させ、白血病幹細胞を根絶するための薬品の調製における、請求項３〜９のいずれか１つによるキメラ抗ＣＤ４４抗体の使用。
【請求項１４】
前記幹細胞は、乳ガンまたは大腸ガンの幹細胞である、請求項１０または１１による使用。
【請求項１５】
前記キメラ抗ＣＤ４４抗体は、治療当たり１０〜１０００ｍｇの用量での低速注入によって投与される、請求項１０〜１４のいずれか１つによる使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン、より詳細には、白血病に対するキメラ抗体治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々のタイプの白血病が識別され得る；リンパ芽球白血病（これは、特に、急性リンパ芽球白血病（acute lymphoblastic leukaemias：ＡＬＬ）またはリンパ腫を含む）および骨髄芽球白血病（これは、特に、急性骨髄芽球白血病（acute myeloblastic leukaemias：ＡＭＬ）を含む）。ＡＭＬは、白血病の事例のほぼ半分を示し（すなわち、１年にフランスでは約１０００の新しい事例、米国では６０００の新しい事例がある）、発生率は、４０年にわたり指数関数的に増えてきている。ＡＭＬは、未成熟段階での骨髄細胞の分化の阻害に対応し、骨髄の浸潤および芽細胞の血液循環によって伝達され、その細胞学的特徴は、Ｍ１からＭ７に分類される異なるＡＭＬサブタイプを規定し（仏−米−英（ＦＡＢ）の分類）、最も頻度が高いのは、タイプＭ１からＭ５である。
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では、白血病クローンは、大きな自己再生能を有する希少な白血病幹細胞（leukaemic stem cell：ＬＳＣ）から生じる階層性として体系化され、ＬＳＣは、相異なるＡＭＬサブタイプを規定する、骨髄分化の種々の段階で抑止された白血病芽球を生じさせる。
【０００４】
１９７８年に、Leo Sachsは、非特許文献１において、マウスの白血病細胞は、生理学的な生育および分化の因子の存在下に分化するように誘導され得ることを公表した。この結果は、ヒト白血病細胞において確認され、首尾良く、インビボで、骨髄造血の２つの分化誘導物質であるレチノイン酸およびＧ−ＣＳＦにより置き換えられた。残念なことに、広範な研究にも拘わらず、完全な緩解は、２つのＡＭＬサブタイプ（ｔ（８；２１）の転座を有するＡＭＬ３およびＡＭＬ２）においてのみ得られる。本発明者らは、以前に、ＣＤ４４のライゲーションが、骨髄分化妨害の種々のレベル（ＡＭＬ１〜ＡＭＬ５）を逆転させることを示した（非特許文献２）。ＡＭＬ芽球の分化は、以下によって明示された：
−  酸化的破壊のような酸化還元機能を生む能力、
−  系統の抗原（lineage antigen）の発現増加、および
−  細胞学的改変（分化された骨髄細胞の全特徴）。
【０００５】
また、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）とのＣＤ４４のライゲーションも、ＴＨＰ−１、ＮＢ４およびＨＬ６０細胞系の終端の分化を誘導し得、これは、それぞれ、ＡＭＬ５（単芽球のサブタイプ）、ＡＭＬ３（前骨髄サブタイプ）およびＡＭＬ２（骨髄芽球サブタイプ）の興味深いモデルである。次いで、大規模なアポトーシス細胞死がＮＢ４細胞において誘導され得るが、ＴＨＰ−１およびＨＬ６０細胞では非常に穏やかなアポトーシス細胞死が誘導されるだけである。
【０００６】
白血病幹細胞（ＬＳＣ）は、自己再生能、すなわち、母細胞に類似する娘細胞を生じさせる能力によって全ての他のＡＭＬ細胞から区別される。大きな自己再生能は、ＬＳＣの固有の特性であり、白血病の進行に必須として示される。
【０００７】
実験的には、ヒトＬＳＣは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウス（提供者のＡＭＬ型を忠実に繰り返す疾患を発症する）への移植によって確認される。それらは、移植の際に白血病クローンを開始する能力を有するので、それらは、ＳＬ−ＩＣ（SCID-Leukaemia Initiating Cell）と呼ばれる。これらのＳＬＣは、ＡＭＬ細胞母集団の０．１〜１％を示しながらＣＤ３４＋ｃｄ３８−細胞フラクション内に排他的に存在するので、それらは、他の白血病細胞から明確に区別される。そして、このことは、全てのＡＭＬサブタイプにおいて真である。
【０００８】
要約すると、新しい治療によりＡＭＬを治癒させるために、ＬＳＣが、効果的にターゲット化され、根絶されなければならない。
【０００９】
ＡＭＬの従来の治療法は化学療法であるが、それは、６０〜８５％の患者において最初の完全な緩解を誘導することに成功するものの、依然として、大部分のＡＭＬ患者を治癒させることができず（５年生存率：３７％）、ＡＭＬ患者の長期生存において進歩はほとんどなされていない（特に、５５〜６０歳を超える成人では、５年生存率は１５％である）。この状況は、アポトーシス促進剤（三酸化ヒ素）、アンチセンス戦略（抗ＢＣＬ２）および抗転写誘導物質（anti-inducer of transcription）（ＤＮＡメチラーゼ、ヒストン・アセチル化剤）を用いる新しいターゲット化された治療アプローチを開発する努力を促した。しかしながら、現在利用されている大部分の治療戦略は、循環している細胞（cycling cell）をターゲットとし、ＳＬ−ＩＣは静止状態である。これは、新しいアプローチが見出されなければならないことを示している。
【００１０】
本発明者らの過去の研究により、抗ＣＤ４４抗体を必要とする、白血病細胞を特異的にターゲットにし、これらの細胞の分化を誘導する新しい治療処置が生まれた（Charrad et al.Nature Medicine,1999年）。「分化療法（differentiation therpy）」と呼ばれるこのような治療は、従来の治療（化学療法）と組み合わせてレチノイン酸を分化誘導分子として用い、ＡＭＬ３サブタイプを有する患者を治療するために用いられた。
【００１１】
さらなる実験により、本発明者らは、特定の抗ＣＤ４４抗体、Ｈ９０（Ｐ２４５とも呼ばれる）を選択するに至った。これは、白血病細胞を分化することができるだけではなく、白血病幹細胞を根絶することもできる。事実、この抗ＣＤ４４抗体は、ヒト白血病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを完全に治癒させた（Jin L． et al． 2003）。化学療法は痛みを伴う治療であるので、この抗体は、単剤療法において単独で用いられることによって化学療法と置き換わる可能性がある。
【００１２】
しかしながら、この抗体はマウスの抗ＣＤ４４抗体であり、人間におけるその使用は制限されるだろう。実際に、注入されるマウスの抗体は、患者による、ＨＡＭＡ（Human Anti-Mouse Antibodies：ヒトの抗マウス抗体）として知られているこの外来タンパク質に対する応答を結果として生じ得る。このＨＡＭＡの進展は、抗体毎に可変であり得るが、一旦、ＨＡＭＡが現れると、マウス抗体の投与は全ての効果を喪失する。
【非特許文献１】レオ・サハ（Leo Sachs）著，「Ｎａｔｕｒｅ」，１９７８年，８月１０日，第２７４巻，第５６７１号，ｐ．５３５−５３９
【非特許文献２】「Ｎａｔ  Ｍｅｄ．」，１９９９年６月，第５巻，第６号，ｐ．６６９−６７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、改善された活性、特には改善された分化活性を有するキメラ抗ＣＤ４４抗体を開発した。
【００１４】
したがって、本発明は、ガン、より詳細には白血病に対する単剤療法に有用な２種のキメラ抗ＣＤ４４抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明による２種のキメラ抗ＣＤ４４抗体は、ヌクレオチド配列番号１、３および５または配列番号１、３および７によってそれぞれコードされるアミノ酸配列を含む（対応するアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４および６および配列番号２、４および８である）。本発明はまた、それらのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはＣＤＲｓ（Complementary Determining Regions）フラグメントおよびヌクレオチド配列番号１、配列番号３、配列番号５、アミノ酸配列番号２、配列番号４、配列番号６および前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む転移構造物（transfer construct）に及ぶ。
【００１６】
第１のキメラ抗ＣＤ４４抗体またはそのフラグメントは、ガンマ１によりキメラ化された抗ＣＤ４４抗体に関連する。このガンマ１構造物は、初期活性に加えて、強いＡＤＣＣ（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity：抗体依存性細胞障害活性）およびＣＤＣ（Complement-Dependent Cytotoxicity：補体依存性細胞障害活性）の成分を提供し得る。
【００１７】
逆に、第２のキメラ抗ＣＤ４４抗体またはそのフラグメントは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣをほとんどまたは全く有しないガンマ４構造物に対応する。さらに、この後者の構造物は、弱い炭水化物成分を有するという利点も有する（所定の反応、特には、異種免疫化（heteroimmunization）反応または非特異的バインディングを回避することを可能にする）。さらに、免疫毒性に関するこの特定の中立性に起因して、かつ、それ自体の分化治療活性に加えて、ガンマ４構造物は、あらゆる補足的な治療薬または粒子（放射性同位体、細胞毒性化合物．．．）と連結され得るターゲット分子としての利点によって用いられ得た。
【００１８】
さらに、ガンマ４キメラ抗体の半減期は、２０〜２５日程度であり、これは、完全に安全である。
【００１９】
有利には、組換えバキュロウイルスを用いるこのような抗体の発現は、糖の組成に関して完全に制御される。
【００２０】
好ましくは、キメラ抗体全体が用いられる。実際に、治療用の抗体は、通常、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメント化された抗体または小構造物（ｓｃＦｖ等）の形態よりも抗体全体として用いられる場合により効果的である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、キメラ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２２】
さらに、本発明は、ガン治療において病理学上の幹細胞を根絶するための薬品の調製における本発明によるキメラ抗ＣＤ４４抗体の使用に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、ガン治療において、エキスビボで、病理学上の幹細胞を特異的に根絶し、正常な幹細胞を保存するための薬品の調製における本発明によるキメラ抗ＣＤ４４抗体の使用に関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、患者の病理学上の幹細胞を根絶する方法であって、病理学上の幹細胞のみが根絶されるように抗原−抗体反応を可能にする条件下に本発明によるキメラ抗ＣＤ４４抗体を該患者に投与する工程を包含する、方法に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、エキスビボで、白血病またはガンの患者の組織サンプルからの病理学上の幹細胞を特異的に根絶し、正常な幹細胞を保存する方法であって、抗原−抗体反応を可能にする条件下に、該組織サンプルを、本発明による少なくとも１種のキメラ抗ＣＤ４４抗体と接触させる工程を包含する、方法に関する。このような方法は、骨髄細胞の母集団を浄化するために適応させられる。
【００２６】
前記薬品／方法は、病理学上の幹細胞、特に白血病細胞およびガン細胞から出される病理学上の細胞の発生を回避する。
【００２７】
上記のように、分化療法は、白血病幹細胞を根絶するために化学療法の使用を必要とする。本発明によるキメラ抗ＣＤ４４抗体の使用は、あらゆる化学療法を必要とすることなく改善された効率で白血病細胞の分化を誘導するだけではなく白血病幹細胞の根絶をも誘導する。
【００２８】
本発明による薬品は、治療あたり約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００〜４００ｍｇ程度の用量で投与されてよい。治療の回数は、薬品の効果を高めるために増加または減少し、かつ／または（長期にわたり）繰り返され得る。
【００２９】
キメラ・ガンマ４抗体は毒性ではないので、その用量は、容易に増加させられ、患者に適合させられてよい。
【００３０】
薬品の製造は、あらゆる適切な医薬製剤、特に、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末体、懸濁液、経口溶液、注射用溶液の形態であってよい。投与は、好ましくは、低速注入（slow infusion）によって行われてよい。
【００３１】
本発明に従って用いられる薬品は、所望の製剤に適合するあらゆる適切な化合物または賦形剤、特には、薬学的に不活性なあらゆる賦形剤をさらに含んでもよい。
【００３２】
有利には、適切な製剤は、注射（好ましくは静脈内注射）用の生理食塩水溶液である。
【００３３】
本発明による薬品によって治療され得る病理学上の細胞は、白血病細胞、病理学上の幹細胞、より詳細には、白血病幹細胞および乳ガンまたは大腸ガンの幹細胞である。
【００３４】
実際、他のガンでは、ＡＭＬのように、腫瘍クローンも、希少なガン細胞の大規模な増殖および自己再生によって維持されるという証拠が増えている。大抵のガン細胞中にＣＤ４４も存在するので、ＣＤ４４のライゲーションは、このような腫瘍幹細胞を根絶するのにも効果的であり得、これにより、それは、ＡＭＬ以外のいくつかのガンにも治療効果を有し得る。
【００３５】
本発明は、純粋に例示の目的のために与えられた、以下の実施例によって、図面を参照しながら例示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、過度の実験を行うことなく、本出願によって与えられた開示（開示、実施例、請求の範囲および図面を含む）および従来技術による手段から当業者によって実現され得るあらゆる代替の実施形態も含む。
【００３７】
（実施例１：抗ＣＤ４４モノクローナル抗体は、白血病（腫瘍）幹細胞を根絶する）
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス白血病モデルおよび移植されたＰＭＬ−ＲＡＲマウスが用いられる。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス白血病モデルは、独特のモデルであり、ヒトＡＭＬの全サブタイプ（ＡＭＬ３を除く）の病状を忠実に繰り返し、最も重要には、大規模な増殖および自己再生能により与えられ、白血病クローンの維持の原因となるヒト白血病幹細胞の非常に小さい部分母集団の運命をモニタリングすることを可能にする。
【００３８】
（材料および方法）
（ＡＭＬ細胞）
新しいまたは凍結されたＡＭＬ末梢血細胞が、フィコール密度勾配遠心分離によって濃厚にされ、５％のウシ胎仔血清を含有するIscove’s Modified Dulbecco’s medium（ＩＭＤＭ）で洗浄された。
【００３９】
（ＡＭＬ細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植）
８〜１２週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが、ＡＭＬ細胞を尾部静脈注射する直前に、１３７Ｃｓ源からの３７５または４００ｃＧｙにより亜致死的に放射線照射される。マウスは、ヒト幹細胞成長因子（stem cell factor：ＳＣＦ）およびｈｕＩＬ３／ｈｕ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＰＩＸＹ３２１）の融合タンパク質を一日おきに腹腔内注射としてマウス当たり１０μｇおよび７μｇの濃度でそれぞれ受け入れる。
【００４０】
（白血病幹細胞（ＬＳＣ）のアッセイ）
ＡＭＬのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植は、ＣＤ３４＋＋  ＣＤ３８陰性の免疫表現型を表示する、白血病幹細胞（ＬＳＣ）の希少な母集団（白血病クローン内に存在し、これを支持する）の増殖および制限された分化によるものであることが証明された(Bonnet and Dick, Nature Medicine 3:730-737, 1997)。したがって、ＡＭＬの移植の成功は、ＬＳＣの存在を証明する。示された時点（４〜８週）において、移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄における白血病浸潤の百分率は、種々の時間点での膝関節からの吸引（吸引液あたり平均１０６）によって評価される。白血病の母集団は、ｍＡｂｓのパネルを用いて造血特異抗原（ＣＤ４５）および分化抗原（ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１１ｂ）にラベリングされる。ＣＤ１９の欠如は、分化された細胞が、移植されたＡＭＬサンプルに含まれる正常な造血幹細胞に由来しない指標と考えられる。
【００４１】
（結果）
【００４２】
【表１】
2007513610.tif 000002
【００４３】
これまでに行われた４つの別個の実験は、非常に再現性のある方法で、Ｐ２４５が、一次被移植者において大部分のＡＭＬ細胞を根絶するために非常に効率的であることを明瞭に示す（表１）。これは、表２に示されるように、部分的には、終端の分化の誘導に起因し得る。しかしながら、さらにおよびおそらく主として、それは、二次的な移植アッセイに示されるように（表１）、大部分の白血病幹細胞の根絶に起因する。これらの結果は、インビボでＡＭＬ幹細胞を根絶することが可能であることを示しており、毒性も他の所望でない副作用も観察されないことが指摘されるべきである。長期生存についてのＰ２４５の効果がさらに調査された。さらに、正常な幹細胞についてのＰ２４５の効果も研究された。最も興味深いことに、予備実験では、正常なＣＤ３４＋臍帯血細胞の移植についてのＰ２４５の阻害効果は観察されなかった。これは、Ｐ２４５がインビボで選択的にＡＭＬ幹細胞を根絶したことを示す。
【００４４】
【表２】
2007513610.tif 000003
【００４５】
移植されたＰＭＬ−ＲＡＲマウスにより、本発明者らは、ＡＭＬ３サブタイプ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植され得ない唯一のもの）のモデル上での、ＣＤ４４をターゲットとする分子のインビボでの効果を調査することができた。マウスＣＤ４４へのｍＡｂｓは処理できなかったので、ＨＡの治療効果が調査され、レチノイン酸の治療効果（これは、ＡＭＬ芽球の完全な終端分化および移植されたＰＭＬ−ＲＡＲマウスの完全な緩解を誘導する）と比較された。得られた結果（表３に要約される）は、投与の４日後に、ＨＡは、疾患に特有の脾腫を排除するためにレチノイン酸と同程度の効果を有し、それはまた、骨髄における白血病芽球の浸潤を減少させることに成功したことを明瞭に示す。この効果は、ＨＡ用量依存性である。分化された顆粒球前駆体の出現は、インビトロで行うように、かつレチノイン酸と同様に、ＨＡがＡＭＬ芽球の終端分化を誘導することを強く示唆する。集約すると、これらの結果は、第１の期間において、ＣＤ４４のライゲーションは、インビボでＡＭＬ細胞を根絶するために同様の効率的な手段であり、ＡＭＬにおいてＣＤ４４をターゲットとする治療法を開発するための新しい基礎を提供することを示す。
【００４６】
【表３】
2007513610.tif 000004
【００４７】
（実施例２：バキュロウイルス−Ｓｆ９細胞系でのマウス抗体Ｈ９０のキメラ化および発現−ＩｇＧ１の発現）
（出発材料）
Ｈ９０ハイブリドーマの５×１０６個の細胞の２種のペレット（ドライアイス上）が用いられた。Ｈ９０モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１カッパである。
【００４８】
ＷＯ９５／２０６７２およびＬｉｅｂｙらによる論文（Blood, 15 june 2001, vol. 97, n°12, p.3820-3828）に記載された《Ｂａｃｕｌｏｍａｂ》技術が用いられた。
【００４９】
（１．重および軽可変領域の単離）
（全ＲＮＡの単離）
Qiagenの抽出キット（Ref.74 104）が、供給者によって記載されたプロトコールに従って用いられた。
【００５０】
（相補ＤＮＡの合成）
上記のように抽出された全ＲＮＡについて逆転写が行われた。用いられた転写酵素は、QiagenからのOmniscriptである（Ref.205 111）。
【００５１】
（ＶＨおよびＶＬの増幅）
用いられた技術は、「Chardes, T., Villard, S., Ferrieres, G., Piechaczyk, M., Cerutti, M., Devauchelle, G.,  B. Pau. 1999 Efficient and direct sequencing of mouse variable regions from any immunoglobulin gene family. FEBS Lett. 452, 386-394」に記載された技術に由来する。
【００５２】
軽または重可変領域を確認およびクローニングするために、１８のＰＣＲが並行して行われる。次いで、約４００ｂｐのフラグメントがプラスミドpGEMTeasyにクローニングされ、その後に配列が決定される。この配列決定は、MWGBiotech社によって行われる。
【００５３】
（ａ．ＶＬ領域の増幅）
（結果）
１回目の試行：２種のクローンが研究された：
−  Ｈ９０  ３２ＬＳ  Ｃ１  １５
−  Ｈ９０  ３２ＬＳ  Ｃ１  １８
配列の分析は、クローン１５および１８が免疫グロブリン可変領域をエンコードしないことを示す。したがって、相補ＤＮＡのさらなる調製が行われ（改変プロトコール）、ＰＣＲ産物がクローニングされ、分析された。
【００５４】
２回目の試行：４種のクローンが得られた：
−  Ｈ９０  ３ＬＳ  Ｃ１  ５
−  Ｈ９０  ３ＬＳ  Ｃ１  ７
−  Ｈ９０  ２２ＬＳ  Ｃ１  １２
−  Ｈ９０  ２２ＬＳ  Ｃ１  １６
クローン１２および１６は、カッパ偽遺伝子（マウス（Mus musculus）免疫グロブリンを異常位置に再配置したカッパ鎖ｍＲＮＡ）に対応する。
【００５５】
誘導されたクローンＨ８０  ３ＬＳ  Ｃ１  ７は、機能性のＶＬ−カッパ可変領域（配列番号１および２）に対応する。したがって、このクローンが、バキュロウイルス転移ベクターｐＢＨＵＣｋ４７に挿入されることになる。
【００５６】
（ｂ．ＶＨ領域の増幅）
重可変領域を単離するために同一の技術が用いられる。１８回のＰＣＲが行われた。
【００５７】
（結果）
１回目の試行：１種のクローンが分析された：
−  Ｈ９０  １９ＨＳ  Ｃ１  ９。
【００５８】
このクローンの配列の分析は、それがマウス偽遺伝子（フレームシフトを読む）に対応することを示す。
【００５９】
２回目の試行：新しい相補ＤＮＡが合成され、ＰＣＲ分析のために用いられた。
【００６０】
２種のクローンは、分析された：
−  Ｈ９０  １７ＨＳ  Ｃ１  ２３
−  Ｈ９０  １７ＨＳ  Ｃ１  ２８。
【００６１】
これら２種のクローンは、確かに、マウス・ガンマ１の可変領域に対応する；不運なことに、Ｎ末端配列の約１／３は見あたらなかった。しかしながら、ＩＭＧＴについての配列の分析によって、複製起点の最も見込みのある胚系（germinal line）を確認することができ、したがって、他のＰＣＲプライマーを設計することができた。
【００６２】
最新のアプローチに基づいて、本発明者らは、新しいクローン：Ｈ９０  ３ＨＳ  クローン１５を単離した。
【００６３】
配列の分析は、正しいマウスＶＨ領域を示す（配列番号３および４）。これは、バキュロウイルスの転移ベクターに導入されたクローンである。
【００６４】
（２．重および軽可変領域の転移ベクターへの挿入）
ＰＣＲプライマーは、これらのＶＨおよびＶＬを増幅し、上流に位置するシグナル配列および下流に位置するカッパまたはガンマ１構造物領域を有する相（phase）でのそれらの挿入を可能にするように設計された。
【００６５】
得られた構造物は、再度、配列決定により検査された。
【００６６】
（３．ＩｇＧ１の形態のＨ９０抗体を発現する組み換え型ウイルスの構成）
Ｈ９０抗体の重領域は、プラスミド構造物Ｈ９０  ３ＨＳ  クローン１５から単離され、次いで、ヒトγ１重鎖の発現を可能にする転移ベクターｐ１１９Ｃｇ１に挿入された。ガンマ１構造物領域の配列が与えられた（配列番号５および６）。
【００６７】
（４．組み換えウイルスの取得）
Ｓｆ９細胞が、（ｉ）精製されたウイルスＤＮＡおよび（ｉｉ）上記のＶＨおよびＶＬ領域（配列番号１および３）を含有する２種の転移ベクターのＤＮＡにより同時遺伝子導入（cotransfect）された。
【００６８】
５日にわたる２８℃でのインキュベーション後に生成されたウイルスは、溶解プラーク（lysis plaque）技術によってクローニングされた。９種の単離されたクローンが増幅され、抗体発現は、ＥＬＩＳＡによって検証された。全てのクローンが陽性であることが分かった。相補分析のためにクローンＢ２９５４、Ｂ２９５５、Ｂ２９５７およびＢ２９５８が選ばれた。
【００６９】
（５．製造された抗体の特異性の検証）
抗体を発現する４種のウイルスクローンが再増幅され、組み換え型抗体のヒトＣＤ４４に対する特異性を検証するために約５ｍＬの培養液上清が分析された。
【００７０】
（６．組み換え型ウイルスのゲノムの検証）
４種のウイルスクローンのＤＮＡが抽出され、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、次いで、サザンブロットによって分析された。重および軽鎖に特異的な２種のプローブ：Ｃγ１プローブおよびカッパプローブが連続して用いられた（図１）。
【００７１】
（実施例３：バキュロウイルス−Ｓｆ９細胞系でのマウス抗体Ｈ９０のキメラ化および発現−ＩｇＧ４の発現）
マウス抗ＣＤ４４抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域は、実施例２に記載されたようにしてＨ９０ハイブリドーマから単離された。
【００７２】
（１．ＩｇＧ４の形態でＨ９０抗体を発現する組み換え型ウイルスの構成）
Ｈ９０抗体の重領域は、プラスミド構造物Ｈ９０  ３ＨＳ  クローン１５から単離され、次いで、ヒトγ４重鎖の発現を可能にする転移ベクターｐ１１９Ｃｇ４に挿入された。ガンマ４構造物領域の配列が与えられる（配列番号７および８）。
【００７３】
（２．組み換えウイルスの取得）
Ｓｆ９細胞は、上記のＶＨ（ｐ１１９Ｃｇ４）およびＶＬ（ｐＢＨＵＣｋ４７）可変領域をそれぞれ含有する２種の転移ベクター（組み換えバキュロウイルス）およびウイルスＤＮＡにより同時遺伝子導入された。５日にわたる２８℃でのインキュベーションの後、生じたウイルは、溶解プラーク技術によってクローニングされた。１０種の単離されたウイルスクローンが増幅された。抗体産生は、ＥＬＩＳＡによって検証された（捕捉抗体：抗Ｆｄγ１、バインディングサイト、ペルオキシダーゼ・ラベリングされたヒト抗カッパ抗体（Sigma）による視覚化）
（ＥＬＩＳＡの結果）
単離されたウイルスクローンの全てが抗体を生じさせた。
【００７４】
【表４Ａ】
2007513610.tif 000005
【００７５】
（３．組み換え型ウイルスのゲノムの検証）
抗体を発現する４種のウイルスクローンのゲノムが検証された（クローン  Ｂ３６６７、Ｂ３６６８、Ｂ３６６９およびＢ３６７０）。増幅の後、培養液上清中に含まれるウイルスは、３０分にわたり３５０００ｒｐｍで沈降させられた（ＴＬＡ１００、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）。続いて、これらのウイルスのＤＮＡが抽出され、精製され、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化された。消化産物は、アガロースゲル上で分離され、次いで、ヒト重および軽鎖に特異的な２種のプローブとハイブリッドを形成させられた（図２）。
【００７６】
これらクローンのうちの２つ（Ｂ３６６８およびＢ３６６９）は、期待されたゲノム組成に対応する制限およびハイブリッド形成プロファイルを示す。組み換えＨ９０γ４抗体の製造および精製のために単一の組み換え（Ｂ３６６９）が増幅され、次いで、滴定された。
【００７７】
抗体のＣＤ４４に関する特異性が検証された。
【００７８】
（４．抗体産生および精製）
Ｓｆ９細胞が、血清不含有培地（ＳＢ５／６培地、Dr.Gerard Devauchelle（Saint Christol Les Ales、フランス）によって供給された）での培養に適合させられた。
【００７９】
産生のために、Ｓｆ９細胞は、約５０００００細胞／ｍｌの密度で、４００ｍＬの最終容積の回転瓶内に播種された。細胞は、直ちに、２ＰＦＵ／細胞の感染多重度でＢ３６６９ウイルスにより感染させられ、次いで、２８℃でインキュベートされた。
【００８０】
感染の４日後、培養液は、３０００ｒｐｍで遠心分離にかけられた。上清が除かれ、使用まで−８０℃で収容された。
【００８１】
培養液上清中に含まれる抗体は、タンパク質Ａの精製の従来の技術に従って精製される。簡単には、培地のｐＨは、８．５に調整され、次いで、この培地は、０．５μｍのミリ孔のカートリッジによりろ過され、その後に、タンパク質Ａのカラム（High Trap ProtA FF，Amersham）上に装填された。カラムが１００ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）により洗浄された後、抗体は、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）により溶出された。集められたフラクションは、２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）により中和される（溶出液３容積当たりＴｒｉｓ１容積）。
【００８２】
抗体は、Macrosep 30K（Pall）上に濃縮された。調製物は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ、１０％ポリアクリルアミドゲル上の移動および銀染色によって分析された。
【００８３】
（実施例４：キメラ抗ＣＤ４４抗体の分化活性）
（ヒト・ガンマ１／ガンマ４によりキメラ化されたＨ９０）
ヒト・ガンマ１によりキメラ化されたＨ９０の分化活性の研究が、骨髄性白血病細胞系ＴＨＰ−１およびＮＢ４について行われた。この研究は、Florence Smadja-Joffeによる刊行物（Blood January 2002, vol 99, number 1 - Blood August 2000, vol 96, number 3）において既に記載されている分化基準を用いて行われた。この従前の研究は、最も信頼性の高い分化パラメータは、骨髄分化特異抗原、例えば、ＣＤ１１ｂ（顆粒球およびマクロファージの両方の分化の間に増加する）、ＣＤ１４（単球分化特異的）および／またはＣＤ１５（顆粒分化の途中において大部分増加するが、より低い頻度ではあるが、単球分化の途中でも増加する）のレベルの増加であることを示した。
【００８４】
（結果）
ＴＨＰ−１およびＮＢ４細胞は、確立された細胞系であり、ＡＭＬ５およびＡＭＬ３サブタイプのそれぞれのモデルである（Charrad et al Blood 2002）。これらの細胞系は、３日にわたり種々の形態の分化誘導抗ＣＤ４４抗体Ｈ９０により処理された：マウスのもの、またはヒト・ガンマ１鎖によりキメラ化されたもの、または、ヒト・ガンマ４鎖によりキメラ化されたもの（ｃｈ−ｈｕｍａｎガンマ１鎖およびｃｈ−ｈｕｍａｎガンマ１鎖Ｈ９０としてそれぞれ設計された）。これら形態の各１つが、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で用いられた。分化抗原ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５およびＣＤ１４のレベルは、ＦＩＴＣ（fluorocein isothiocyanate：フルオレセインイソチオシアネート）接合型特異的モノクローナル抗体およびフローサイトメトリー分析を用いることによって評価された。それは、陽性細胞の百分率および平均蛍光強度（全て、ＦＩＴＣ接合型イソタイプ適合型ＩｇＧによりラベリングされた細胞の値に対する相対値）によって表される。Ｈ９０の相異なる形態は、それらが、少なくとも１または２の分化抗原、陽性細胞の百分率または平均蛍光強度のいずれかの増加された表現を引き起こすならば、分化を誘導することができると考えられた。
【００８５】
表４に示される結果は、ヒト・ガンマ１およびヒト・ガンマ１をキメラ化したＨ９０分子の両方がマウスのものより、ＴＨＰ−１およびＮＢ４細胞の両方の分化を誘導することに対して効果的であることを示す。実際に、ＴＨＰ−１細胞では、それらは、のＣＤ１５陽性細胞の百分率、ＣＤ１５蛍光強度により多い増加およびＣＤ１４陽性細胞の百分率のより多い増加を引き起こす。同様に、ＮＢ４細胞では、それらは、マウスＨ９０体よりＣＤ１５の発現を増加させ、それらは、ＣＤ１１ｂのレベルを増加させるのにマウスＨ９０と同程度に効果的であった；ヒト・ガンマ４によりキメラ化されたＨ９０は、この点で、ヒト・ガンマ１によりキメラ化されたＨ９０より効果的であった。
【００８６】
【表４Ｂ】
2007513610.tif 000006
【００８７】
これに加えられるのは、ガンマ１構造物のＦＣ部によって誘導されるＣＤＣ細胞毒性活性および特にはＡＤＣＣ細胞毒性活性である。
【００８８】
キメラＰ２４５（Ｈ９０）の細胞毒性活性が「インビトロ」で、以前に記載された２種のＡＭＬ系について研究され、Ｐ２４５、Ａ３Ｄ８およびＨｅｒｍｅｓ３を含む他の抗ＣＤ４４抗体と比較された。
【００８９】
ＴＨＰ１およびＮＢ４について、キメラ化されたガンマ１抗体の強い細胞毒性能が観察された。第４日に、細胞毒性は８０％を超える。この活性は、キメラ化された抗体によってのみ現れる；マウス抗体はいずれもこの特性を持たない。これは、ＡＭＬ５に苦しむ患者からの細胞によっても観察される。
【００９０】
単芽球タイプのＡＭＬ５細胞は、ターゲット細胞およびエフェクター細胞の両方である。このＡＭＬ５細胞がターゲット細胞であるのは、それらがＣＤ４４レセプターを発現するからである。ＡＭＬ５細胞がエフェクター細胞であるのは、単球として、それらが、ＡＤＣＣ現象を生じさせるガンマ・グロブリン、特にはガンマ１ためのＦｃレセプターを有するからである。ＡＤＣＣ現象は、前骨髄球ＡＭＬ３細胞の場合にはなく、ＡＭＬ３細胞は、ターゲット細胞であるのみである。
【００９１】
このＡＤＣＣ活性はまた、「インビトロ」で、ＮＫ細胞を用いて細胞毒性について研究された（従来のアッセイ）。
【００９２】
ガンマ４構造物については、分化活性のみが観察され、細胞毒性はなかった。
【００９３】
（実施例５：生薬仲介物（vector）の製剤−乳剤）
LIPOID E-80、Vit Eおよびステアリルアミンは、直接的に油相に溶解する。これに対して、ポロキサマー（poloxamer）およびグリセロールは、直接的に水相に溶解する。油相および水相は、マグネチックスターラを用いて別々に調製され、ろ過され、７０℃の温度に加熱される。２相は、マグネチックスターラを用いて混合される。温度は、８５℃に上げられる。混合物は、PolytronまたはUltraturraxにより３〜５分にわたり均質にされる。温度は、急速に２０℃に下げられる。乳液は、５分にわたり高圧ホモジナイザー（microfluidizer）に通される。温度は、急速に２０℃にされる。ｐＨは、０．１Ｍの塩酸により所望の値に調整される。乳液は、０．４５μｍのフィルタによりろ過され、窒素雰囲気下に、シリコン化ガラスのボトル収容され、オートクレーブ内で滅菌される。
【００９４】
４０分子までのＩｇＧが一つの単独油カチオン液滴に接合され得ることが示された。
【００９５】
結論として、この生薬仲介物は、ＡＭＬ細胞上の抗体部位の数を増加させ、抗ＣＤ４４抗体の半減期を改善することが示された。
【００９６】
（実施例６：本発明による治療）
薬品の製剤（２０ｍＬのフラスコ、凍結乾燥）：
−  有効成分：１００ｍｇの凍結乾燥されたＰ２４５
−  賦形剤：サッカロース、ポリソルベート、リン酸モノナトリウム（monosodic phosphate）、リン酸ジナトリウム（disodic phosphate）。
【００９７】
この製剤は、＋２〜＋８℃に、パッケージングした状態で１８ヶ月にわたり維持され得る。凍結はさせない。
【００９８】
一旦調製されると、薬品は、３時間だけ保存され得る。
【００９９】
（治療）
５ｍｇ／ｋｇが低速注入により（例えば、２時間）注入される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、４種のウイルスクローン：Ｂ２９５４、Ｂ２９５５、Ｂ２９５７、Ｂ２９５８のＤＮＡのサザンブロットに関連する。第１、第２および第３のスライドは、それぞれ、ＢＥＴ着色、Ｃγ１プローブおよびカッパプローブとのハイブリッド形成に対応する。
【図２】図２は、別の４種のウイルスクローン：Ｂ３６６７、Ｂ３６６８、Ｂ３６６９、Ｂ３６７０のＤＮＡのサザンブロットに関連する。第１、第２および第３のスライドは、それぞれ、ＢＥＴ着色、カッパプローブおよびガンマプローブとのハイブリッド形成に対応する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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