(57)【要約】  本発明は、治療に有効な量の、自己樹状細胞と自己非樹状細胞との融合により形成された融合細胞をインターロイキン-12と共に投与することによる癌の免疫療法のための方法および治療プロトコルに関する。
2007523901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌の治療または予防方法であって、治療に有効な量の
（a）（i）自己由来癌細胞と、（ii）該患者と同じクラスI MHCハプロタイプを有する樹状細胞と、を融合することにより形成された融合細胞、および
（b）インターロイキン-12、
を該患者に投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記癌細胞が手術または生検により患者から得られたものである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞が癌細胞と樹状細胞との融合の多くとも30分前に患者から得られたものである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記癌細胞が癌細胞と樹状細胞との融合の多くとも60分前に患者から得られたものである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞が癌細胞と樹状細胞との融合の多くとも120分前に患者から得られたものである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞が癌細胞と樹状細胞との融合の多くとも5時間前に患者から得られたものである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記癌細胞が樹状細胞との融合の前に細胞培養下で培養したものである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記融合細胞が約0.5〜約25％のポリエチレングリコールを含む培地内で樹状細胞および癌細胞をインキュベートすることにより得られる、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記培地が約2.5％のポリエチレングリコールを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記樹状細胞および前記癌細胞が一晩インキュベートされる、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
前記融合細胞が患者への投与の前に洗浄される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記融合細胞が、樹状細胞10個当たり約1個の癌細胞の比率で癌細胞および樹状細胞を一緒にインキュベートすることにより形成される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記融合細胞が、樹状細胞1個当たり3個の癌細胞の比率で癌細胞および樹状細胞を一緒にインキュベートすることにより形成される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記癌細胞が約50〜1,000Gyで照射される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が約300Gyで照射される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
投与するインターロイキン-12の量が患者の体重1kg当たり10ng〜100ngのインターロイキン-12である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
投与するインターロイキン-12の量が患者の体重1kg当たり約30ngのインターロイキン-12である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
インターロイキン12を患者に6〜12回投与する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記樹状細胞が患者由来の血液単球から得られたものである、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
血液単球を得るための方法が、約1％〜約10％の患者血清を含む培地内で、患者から得た白血球を培養することを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
血液単球を得るための方法が、GM-CSFおよびIL-4を含む培地内で、患者から得た白血球を培養することを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
前記白血球が高い付着能を有する白血球である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
GM-CSFの濃度が約10〜100ng/mlであり、IL-4の濃度が約10〜100 U/mlである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
GM-CSFの濃度が約10ng/mlであり、IL-4の濃度が約30 U/mlである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が更にTNF-αを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
TNF-αの濃度が約20ng/mlである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
TNF-αを5日間の培養後に加える、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記白血球を約7〜10日間培養する、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
前記白血球を7日間培養する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
インターロイキン-12が組換えヒトインターロイキン-12である、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
投与前に、インターロイキン-12単独の投与の影響をプリックテストにより検査する、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が患者に対する1以上の検査を更に含み、前記検査が、血液検査、検尿、検便、妊娠試験およびイメージング検査よりなる群から選ばれる、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
前記融合細胞がGM-CSF、IL-4およびTNF-αを含む培地内で培養される、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
GM-CSFの濃度が約10ng/ml〜約100ng/mlであり、IL-4の濃度が約10 U/ml〜約100 U/mlであり、TNF-αの濃度が約10ng/ml〜約100ng/mlである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
GM-CSFの濃度が10ng/mlであり、IL-4の濃度が30 U/mlであり、TNF-αの濃度が20 U/mlである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記融合細胞が微生物の汚染を伴わない、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が解熱剤を投与することを更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項３８】
解熱剤がサリチル酸、インドメタシン、インドメタシンナトリウム三水和物、サリチルアミド、ナプロキセン、コルヒチン、フェノプロフェン、スリンダク、ジフルニサル、ジクロフェナク、インドプロフェンまたはサリチルアミドナトリウムである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が免疫抑制剤を投与することを更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項４０】
免疫抑制剤がグルココルチコイド、ヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ミエリン塩基性タンパク質、抗Fc受容体モノクローナル抗体、抗IL2モノクローナル抗体、5-リポキシゲナーゼ阻害剤、ホスファチジン酸合成アンタゴニスト、血小板活性化因子アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、インターロイキン-10アゴニスト、ぺプチゲン物質、プロテインキナーゼC阻害剤、ホスホジエステラーゼIV阻害剤、一本鎖抗原結合タンパク質、補体因子阻害剤、スピロ環ラクタム、5-ヒドロキシトリプタミンアンタゴニストおよび抗TCRモノクローナル抗体よりなる群から選ばれる、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
免疫抑制剤がメチルプレドニゾロン、7-カパキソン、CHI-621、ダクリキシマブ、ブスピロン、カスタノスペルミン、CD-59、CMI-392、エブセレン、エデルフォシン、エンリモマブ（enlimomab）、ガラプチン（galaptin）、ICAM4、大環状ラクトン、メトキサトン（methoxatone）、ミゾリビン、OX-19、PG-27、シアロホリン、シロリムス、CD5ゲロニンまたはTOK-8801である、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
前記融合細胞を、生理食塩水を含む懸濁液として、患者の鼡径部に皮下注射する、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
融合細胞の治療に有効な量が約3×106〜3×107個の融合細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４４】
前記融合細胞を最大6回までの別々の投与として投与する、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記融合細胞およびインターロイキン-12を最大6サイクルで投与する、請求項1記載の方法。
【請求項４６】
前記サイクルが第1週と第2週からなる、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
（i）第1週が、治療的有効量の融合細胞を別個に投与し、ついで第1の治療的有効量のインターロイキン-12を投与し、ついで第2の治療的有効量のインターロイキン-12を投与することにより特徴づけられ、（ii）第2週が、融合細胞およびインターロイキン-12の投与中止により特徴づけられる、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、内皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ（神経膠腫）、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性白血病、真正赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症およびH鎖病よりなる群から選ばれる、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1．緒言
本発明は、自己由来樹状細胞と自己由来非樹状細胞との融合により形成された、治療に有効な量の融合細胞をインターロイキン-12と共に投与することによる癌の免疫療法のための方法および治療プロトコルに関する。
【背景技術】
【０００２】
2．発明の背景
癌を治療または予防するための有効な免疫療法組成物の開発に大きな関心が持たれている。そのような免疫療法アプローチの成功のためには、非常に強力な免疫応答を惹起しうると同時に標的腫瘍または感染細胞に特異的である組成物の開発が必要である。
【０００３】
2.1  免疫応答
免疫系の細胞は、2つの主要分化系統、すなわちリンパ球系統および骨髄系統、を介して多能性幹細胞から生じる。リンパ球系統はT細胞、B細胞およびナチュラルキラー細胞のようなリンパ球を産生し、一方、骨髄系統は単球、マクロファージおよび好中球ならびに他のアクセサリー細胞、例えば樹状細胞、血小板およびマスト細胞を産生する。リンパ球系統のT細胞には2つの主要型、すなわち、細胞傷害性Tリンパ球（「CTL」）およびヘルパーT細胞が存在し、これらは胸腺内で成熟し選択を受け、2つの表面マーカー、例えばCD8（CTL）またはCD4（ヘルパーT細胞）の1つの存在により区別される。
【０００４】
リンパ球は循環し、脾臓およびリンパ節のような二次リンパ器官に捕捉される傾向にある侵入性外来病原体および抗原を探索する。抗原は末梢において抗原提示細胞（APC）により取り込まれ、二次器官へ遊走する。T細胞とAPCとの相互作用は、B細胞および抗体産生の活性化ならびにCD8+ 細胞傷害性Tリンパ球（CD8+ CTL）の活性化およびサイトカインのT細胞産生の刺激を含むいくつかのエフェクター経路を始動させる。
【０００５】
ついでCTLは、元々その活性化を誘発したのと同じクラスI MHC分子および同じ抗原の標的細胞を殺す。CD8+ CTLは、癌および病原体に対する抵抗ならびに同種移植に対する拒絶において重要である（Terstappenら, 1992, Blood 79:666-677）。
【０００６】
抗原は、その起源が細胞内であるか細胞外であるかによって異なる2つの経路によりプロセシングされる。細胞内または内因性タンパク質抗原は、腫瘍細胞を含むほとんどの細胞型において発現されるクラスI主要組織適合複合体（MHC）分子によりCD8+ CTLに提示される。一方、細胞外抗原決定基は、例えば樹状細胞およびマクロファージのような「専門化（された）」または「プロ」APCの細胞表面上で、クラスII MHC分子によりCD4+「ヘルパー」T細胞に提示される（全般的には、W. E. Paul編, Fundamental Immunology. New York: Raven Press, 1984を参照されたい）。
【０００７】
クラスIおよびクラスII MHC分子は最も多型性の公知タンパク質である。MHC分子の更なる異質性度は、MHCハロタイプとして公知のクラスI MHC分子とクラスII MHC分子との組合せにより生じる。ヒトにおいては、単一染色体上に位置する3つの異なる遺伝子座であるHLA-A、HLA-BおよびHLA-CがクラスI分子をコードしている。T細胞受容体は、抗原ペプチドとMHC分子の多型性部分とを含む複合体に特異的に結合するため、T細胞は、異なる遺伝子型のMHC分子に遭遇した際には十分には応答しない。この特異性はMHC拘束性T細胞認識およびT細胞細胞傷害性の現象を引き起こす。
【０００８】
リンパ球は末梢において循環し、適当なシグナルに遭遇した際にリンパ器官において「感作」される（BretscherおよびCohn, 1970, Science 169: 1042-1049）。第1シグナルは、APCの表面上にクラスI MHC分子により提示された抗原ペプチドをT細胞受容体がつなぎ留めた後、T細胞受容体を介して受け取られる。第2シグナルは、CD4+ ヘルパーT細胞もしくは樹状細胞により産生される分泌性化学シグナルもしくはサイトカイン（例えば、インターロイキン-1（IL-1）、インターフェロン-γ、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）およびインターロイキン-12（IL-12））により、または細胞膜結合型共刺激分子、例えばB7（これは抗原提示細胞膜上に存在し、IgスーパーファミリーのメンバーであるCD28と称されるヘルパーT細胞の細胞表面上の補助受容体により認識される）により与えられる。インターフェロン-γおよびIL-12は、TH1として公知のヘルパーT細胞サブタイプに関連しており、CD8+ T細胞の発生を促進し、IL-4は、TH2として公知のTヘルパー細胞サブタイプに関連しており、B細胞の発生および活性化を促進して抗体を産生させる。
【０００９】
抗原提示中には抗原特異的相互作用に加えて抗原非特異的付着メカニズムも働く。これらはAPCへのTリンパ球の結合を安定化する。APC上の受容体分子、例えばICAM-1/CD54、LFA-3/CD58およびB7はT細胞上の対応補助受容体に結合する。
【００１０】
したがって、両方のシグナルを受け取るヘルパーT細胞は、増殖し種々のインターロイキンを分泌するように活性化される。両方のシグナルを受け取るCTLは、標的細胞を殺すように活性化される。しかし、共刺激の非存在下で第1シグナルを受け取るT細胞はアネルギー化されて寛容状態となる（Lambら, 1983, J. Exp. Med. 157: 1434-1447; Muellerら, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480; Schwarz, 1992, Cell 71: 1065-1068; MuellerおよびJenkins, 1995, Curr. Opin. Immunol. 7: 375-381）。
【００１１】
2.2  癌に対する免疫療法
細胞傷害性T細胞応答は、抗原腫瘍細胞の増殖の抑制のための最も重要な宿主応答である（Anichimiら, 1987, Immunol. Today 8 : 385-389）。実験動物腫瘍および自発性ヒト腫瘍での研究は、多数の腫瘍が、免疫応答を誘導しうる抗原を発現することを示している。いくつかの抗原は腫瘍に特有であり、いくつかは腫瘍および正常細胞の両方で見出される。いくつかの要因（例えば、関与する発癌物質の特異的型ならびに宿主の免疫適格性および潜伏期間を含む）が腫瘍の免疫原性に影響を及ぼす（Oldら, 1962, Ann. N. Y. Acad. Sci. 101: 80-106 ; Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer. Inst. 49: 493-504）。T細胞性免疫は、ウイルス誘発性腫瘍および化学誘発性腫瘍の拒絶のために臨床上重要であることが示されている（Kleinら, 1960, Cancer Res. 20: 1561-1572; Tevethiaら, 1974, J. Immunol. 13: 1417-1423）。
【００１２】
腫瘍に対する養子免疫療法は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を腫瘍担持宿主に投与する治療アプローチを意味し、これは、該細胞に直接的または間接的に定着腫瘍の退縮を引き起こさせるという目的を有する。腫瘍細胞または腫瘍抗原を有する樹立腫瘍および自発性腫瘍を担持する宿主の免疫化は、しばしば、無効であった。なぜなら、該腫瘍は既に免疫抑制応答を惹起していた可能性があるからである（Greenberg, 1987, Chapter 14, in Basic and Clinical Immunology, 6th ed., Stites, StoboおよびWells編, Appleton and Lange, pp. 186-196; Bruggen, 1993）。したがって、免疫療法の前に、腫瘍塊を縮小させ、腫瘍担持宿主内のすべてのT細胞を枯渇させる必要があった（Greenbergら, 1983, p.301-335, in"Basic and Clinical Tumor Immunology", Herbermann RR, Martinus Nijhoff編）。
【００１３】
進行腫瘍を担持する宿主が腫瘍特異的同系T細胞の移入により治療されうるモデル動物が開発されている（Muleら, 1984, Science 225: 1487-1489）。米国立癌研究所 (NCI)における研究は、いくつかのヒト癌を治療するために、末梢血リンパ球または腫瘍内浸潤リンパ球（TIL）（皮下リンパ節の生検からのT細胞培養物）の自己再注入を用いている（1987年9月1日付け発行のRosenberg, S. A., 米国特許第4,690,914号; Rosenbergら, 1988, N. Engl. J. Med., 319: 1676-1680）。例えば、IL-2の存在下にin vitroで増殖させたTILを癌患者に養子移入して、転移黒色腫を有する選ばれた患者において腫瘍退縮がもたらされている。IL-2中で増殖させた黒色腫TILはCD3+ 活性化Tリンパ球と同定されており、これは主として、特有のin vitro抗腫瘍特性を有するCD8+ 細胞である。多数の長期黒色腫TIL培養物は特異的クラスI MHC依存的かつT細胞抗原受容体依存的に自己腫瘍を細胞溶解する（Topalianら, 1989, J. Immunol. 142: 3714）。
【００１４】
ヒト癌の治療のためのこれらの方法の適用は、患者内に存在する腫瘍反応性リンパ球の特異的セットを単離し、これらの細胞をin vitroで多数にまで増殖させ、ついでこれらの細胞を複数の注入により宿主内に戻すことを含むであろう。IL-2の存在下で増殖させたT細胞は、生存のためにはIL-2に依存的であるため、細胞移入後のIL-2の注入はその生存を延長させ、培養T細胞の治療効力を増強する（Rosenbergら, 1987, N. Engl. J. Med. 316: 889-897）。しかし、高用量IL-2および活性化リンパ球治療の毒性は考慮すべきものであり、そのような毒性には高熱、低血圧、毛細管漏出症候群による内皮壁に対する損傷ならびに不整脈および心筋梗塞のような種々の有害な心臓事象が含まれる（Rosenbergら, 1988, N. Engl. J. Med. 319: 1676-1680）。さらに、TILを作製するのに要する技術的専門知識、必要な物質の量および重度の有害な副作用が、これらの技術の利用を、専門化された治療施設に限定してしまっている。
【００１５】
癌およびウイルス感染の治療においては、クラスI MHC-ペプチド複合体に特異的なCTLを使用することが可能であろう。in vivoでの感作を要することなくそれをin vitroで作製するための方法が求められている。これらには、適当な抗原でパルスされた樹状細胞（Inabaら, 1987, J. Exp. Med. 166: 182-194; Macatoniaら, 1989, J. Exp. Med. 169: 1255-1264; De Bruijnら, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 3013-3020）、ペプチドでローディングされたRMA-S細胞（多数の「空」細胞表面クラスI MHC分子を発現する突然変異細胞）（De Bruijnら, 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2963-2970; De Bruijnら, 1992, 前掲; Houbiersら, 1993, Eur. J. Immunol. 26: 2072-2077）およびマクロファージの食作用を受けたペプチドでローディングされたビーズ（De Bruijnら, 1995, Eur. J. Immunol. 25, 1274-1285）の使用が含まれる。
【００１６】
2.3  樹状細胞および癌免疫の誘導
樹状細胞は、専門化された抗原提示細胞として分類される免疫細胞である。それは全身、特に皮下に分布している。細菌、ウイルスまたは異物の場合、樹状細胞は細菌、ウイルスまたは異物の抗原性に関する情報をリンパ球に伝達し、リンパ球に、該抗原性を認識しそれに反応するよう指令する。したがって、樹状細胞は、生体を免疫学的に反応させる初期段階において重要な役割を果たしている。癌細胞も、それ自身の特異的抗原性を有し、これは細菌およびウイルスのような生物と同様に異物として認識されうる。しかし、患者の体内で生成し増殖する癌細胞は、樹状細胞のそのような作用を抑制する物質を産生する。癌細胞は、免疫により殺されないよう構成されている。
【００１７】
B細胞または樹状細胞と腫瘍細胞との融合はモデル動物において抗腫瘍免疫応答を惹起することが既に示されている（Guoら, 1994, Science, 263: 518-520; StuhlerおよびWalden, 1994, Cancer Immunol. Immuntother. 1994,39: 342-345; Gongら, 1997, Nat. Med. 3: 558-561; Celluzzi, 1998, J. Immunol. 160: 3081-3085; 1998年10月23日付けのGong, PCT公開WO 98/46785）。特に、腫瘍細胞と抗原提示細胞とのハイブリッドでの免疫化は種々のげっ歯類モデルにおいて防御免疫を引き起こすことが示されている。融合細胞は2種類の細胞機能、すなわち、癌抗原を産生する癌細胞の機能と、免疫応答を惹起する樹状細胞の機能を有する。
【００１８】
しかし、現在の治療方法は、防御免疫を刺激するものの、確立された疾患を既に有する患者を有効に治療しない可能性がある。言い換えると、癌患者への融合細胞の投与は、該疾患を排除するのに十分な免疫応答を常に刺激するわけではない。したがって、患者における既存の疾患、例えば癌または感染症を治療する、例えば退縮を引き起こすために使用しうる治療用組成物が必要とされている。
【００１９】
本明細書中の参考文献の引用または考察は、それが本発明の先行技術であると自認するものであると解釈されるべきではない。
【発明の開示】
【００２０】
3．発明の概要
本発明は、樹状細胞と腫瘍細胞とを含む融合細胞を組換えヒトインターロイキン-12（rhIL-12）と共に投与することによる、被験者において腫瘍特異的免疫を惹起させるための方法および組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子と共に投与される、自己樹状細胞と自己非樹状細胞との融合により形成された融合細胞を使用して癌を治療するための方法およびプロトコルに関する。本発明は部分的には、自己樹状細胞（DC）と自己非樹状細胞（例えば、腫瘍細胞）との融合細胞が、CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子と共に投与されると、癌に対する免疫応答を増強するという知見および証明に基づくものである。そのような融合細胞は、強力な免疫刺激効果と腫瘍細胞の特異的抗原性とを併せ持ち、それにより特異的かつ強力な免疫応答を惹起する。融合細胞を調製するために自己由来細胞を使用する場合には、免疫活性化因子IL-12の共投与はCTLおよび／または体液性応答の刺激を増強する。
【００２２】
本発明は更に、樹状細胞を患者から取り出し、ex vivoで癌抗原で処理し、ついで組換えヒトIL-12（rhIL-12）と共に患者の循環に戻す治療方法を提供する。
【００２３】
本発明は、組換えヒトインターロイキン-12と共に融合細胞を投与する方法を提供する。特に、本発明は、融合細胞および組換えヒトインターロイキン-12の投与のための特定の計画および投与量を提供する。本発明は更に、融合細胞を作製するための特定の方法、ならびに被験者に融合細胞を投与する前に融合細胞を処理するための特定の方法を提供する。
【００２４】
4．図面の説明
図1A〜C．FCの蛍光活性化セルソーター（FACS）分析。（A）DCをFITC標識抗CD80抗体で染色した。合計34％のDCが抗CD80モノクローナル抗体で染色された。（B）PKH26をグリオーマ細胞内に組み入れた。95％を超えるグリオーマ細胞がPKH26に陽性であった。（C）グリオーマ細胞にPKH26を組み入れた後、DCとグリオーマ細胞とを融合させた。DCをFITC標識抗CD80モノクローナル抗体で染色した。合計39.9％の細胞がPKH26およびCD80の両方に陽性であった。このことは、ほとんどのDCがグリオーマ細胞と融合されたことを示唆している。
【００２５】
図2A〜B．FCでの免疫化の抗腫瘍効果。（A）FC（白三角）、DC（黒三角）または対照としての照射親細胞（黒丸）を0日目および7日目に同系マウスに皮下注射した（各群n=11）。14日目に、1×106個の親細胞を側腹部に皮下接種した。照射親細胞を注射したすべてのマウスでは、接種した腫瘍細胞が2週間以内に大きな腫瘍を作った。これとは対照的に、FCで免疫したマウスのうち、6週間以内に死亡したものはいなかった。DCで免疫した11匹中6匹のマウスが、後に成長した触知可能な腫瘍を発生したが、FCで免疫した11匹のマウスのうち、触知可能な腫瘍を発生したものはいなかった。（B）0日目および7日目にFCで免疫した後、1×104個の腫瘍細胞を脳の右前頭葉に定位的（stereotactically）に接種した（14日目）。FCで免疫したマウスの半数が70日より長く生存した（黒三角；各群n=20；p < 0.001）（図2B）。すべての対照マウスは6週間以内に死亡した（黒丸）。
【００２６】
図3．FCおよびrIL-12で処置した後のマウスの生存。親細胞（1×104個）を右前頭葉に定位的に接種した（0日目）。5日目および12日目に、3×105個のFCを皮下接種した。5日目から1日おきに2週間にわたり（合計3.5pg/マウス）、数匹のマウスに0.5pg/100mlのrmlL-12または100mlの生理食塩水を腹腔内（i.p.）注射し、それらを70日間観察した。FCのみでのワクチン接種は腫瘍担持マウスの生存を延長しなかったが（黒三角；p > 0.05）、FCおよびrIL-12の両方でのワクチン接種は、対照と比べて生存を延長した（白三角；p = 0.01）。FCおよびrIL-12で処置された10匹中5匹のマウスは70日以上生存した。
【００２７】
図4．腫瘍担持マウスからの脾細胞の細胞傷害性。未処置マウス（黒丸）、rIL-12のみを注射されたマウス（白三角）、DCを2回（0日目および7日目；黒三角）注射されたマウス、FCで1回（0日目；白丸）または2回（0日目および7日目；黒四角）免疫したマウスならびにrIL-12およびFCで2回（0日目および7日目；白四角）免疫したマウスから、SPCを28日目に分離した。免疫マウス（特に、rIL-12を注射されFCで2回免疫したマウス）からの腫瘍細胞に対するCTL活性は、対照およびその他のものに比べて著しく増強された。処置マウスからのYac-1細胞に対する抗腫瘍活性は増強されたものの、対照と比べて著しくは増強されなかった（データは示してない）。
【００２８】
図5．FCでのワクチン接種およびT細胞サブセットの枯渇の後の定着皮下腫瘍の退縮。グリオーマ細胞およびFCの注射を受けたマウスに抗CD4（白三角）、抗CD8（黒三角）、抗アシアロGM1（白丸）または対照ラットIgG（黒四角）を投与することにより、リンパ球サブセットを枯渇させた。0日目および7日目に、FCを側腹部に皮下接種した。ついで、14日目に親細胞を反対側の側腹部に接種した。7日目、10日目、14日目および17日目にmAbを腹腔内注射した。CD8+ T細胞を枯渇させたマウス（黒三角）（各群n=4）においては、抗腫瘍効果は低下した。FCによりもたらされた防御はCD4+ TおよびNK細胞枯渇によっては損なわれなかった。対照マウスにはFCでワクチン接種しなかった（黒丸）。データは平均 + SDを表す。
【００２９】
図6A〜D．発生した脳腫瘍の免疫蛍光分析。未ワクチン接種マウスの腫瘍においては少数のCD4+およびCD8+ T細胞が存在した（図6A、B）。これとは対照的に、ワクチン接種されたマウスの腫瘍においては多数のCD4+およびCD8+ T細胞が見られた。浸潤性CD4+およびCD8+ T細胞の数はほぼ同じであった。SR-B10.A細胞はGFAPに陽性であった。
【００３０】
図7．PEG処理細胞のうち、FITC（緑）およびPKH-26（赤）の両方で染色された融合細胞。
【００３１】
図8．FACS分析。PKH-2GLおよびPKH-26の両方で染色された細胞（これはDC細胞とBNL細胞との融合体であると考えられた）は、高い前方散乱および高い側方散乱を伴う細胞スキャッタグラムの上方域に示されている。高いおよび中程度の前方散乱ならびに低い側方散乱の細胞画分は多数の未融合BNL細胞を含有し、低い前方散乱および低い側方散乱のものは未融合DCおよび未融合BNL細胞を含有していた。全スキャッタグラムにおいて占拠している二重陽性細胞の領域の広さから判断すると、非付着細胞の約30％は融合体であった。
【００３２】
図9．スキャッタグラム上でゲート化され抗原発現に関して調べられたPKH-2GLおよびPKH-26の両方に陽性である細胞画分のFACS分析。I-Ad/I-Ed（MCHクラスII）、CD80、CD86およびCD54分子（これらはDC上で見出される）が該融合体により発現された。
【００３３】
図10．平坦な細胞表面上に短い突起を発現するBNL細胞の走査電子顕微鏡検査。一方、DCは多数の長い樹状突起を有する。非付着融合細胞は大型で卵形であり、短い樹状突起を有する。
【００３４】
図11．DC/BNL融合体でのマウスのワクチン接種は、BALB/cマウスに接種されたBNL細胞でのチャレンジの拒絶を引き起こした。これとは対照的に、DCのみ又は照射BNL細胞のみの注射は腫瘍の発生および成長を妨げなかった。
【００３５】
図12．CTLのクロム-51放出アッセイ。BNL腫瘍に対するDC/BNL融合細胞のみでの処置の効果は有意ではなかった。しかし、DC/BNL融合体の注射およびそれに続くIL-12の投与は有意な抗腫瘍効果を惹起した。
【００３６】
図13．DC/BNL融合体で処置されたマウスに由来する脾細胞を使用して、BNL細胞に対する有意な細胞溶解活性が観察された。無地の棒線はBNL細胞であり、線影付きの棒線はC26細胞である。
【００３７】
図14．IL-12と共にDC/BNL融合体で処置されたマウスからの脾細胞は、BNL細胞に対して、DC/BNL融合体のみで処置されたマウスからの脾細胞より大きな細胞溶解活性を示した。
【００３８】
図15．CD4に対する抗体で処理された脾細胞の細胞溶解活性は有意に低下し、一方、CD8に対する抗体で処理された脾細胞は、イソタイプ同一抗体であるラットIgG2aで処理されたものとほぼ同じ細胞溶解活性を示した。
【００３９】
図16．ワクチン接種計画。1日目にFCを頚部リンパ節付近に皮内注射した。3日目および7日目にrhIL-12を同一部位に皮下注射した。このサイクルを2週間ごとに6週間にわたって繰り返した（上図）。進行性疾患またはグレード3もしくは4の主要臓器毒性が存在しない場合には、コース1中のrhIL-12の最終投与の2〜5週間後に開始する2回目の6週コースを患者に施すことが可能であった（下図）。
【００４０】
図17．FACScanを使用する融合効率の分析。（A）陰性対照。（B）PKH26をグリオーマ細胞内に組み入れた。グリオーマ細胞の93.0％がPKH26に陽性であった。（C）PKH2をDC内に組み入れた。DCの99.6％がPKH26に陽性であった。（D）染色されたグリオーマ細胞およびDCをPEGで融合させた。二重陽性細胞（66.2％）が融合細胞であることが確認された。数字は細胞の比率（％）を示す。縦軸：PKH26、横軸：PKH2。
【００４１】
図18．ケース1のMRIは、腫瘍が初回手術の2ヶ月後に再発したことを示している。FCの接種は腫瘍の成長を抑制しなかった。FCとrhIL-12とを使用する併用療法の後、T2強調画像上の腫瘍周辺の高強度域およびT1強調画像上の腫瘍のサイズが著しく減少した。再発腫瘍のT1強調（A）およびT2強調（B）画像。FCおよびrhIL-12での免疫後のT1強調（C）およびT2強調（D）画像。
【００４２】
図19．ケース3のMRIはT2強調画像上の腫瘍の周囲に高強度域を示している。（A）免疫前のT2強調画像。（B）FCおよびrIL-12での免疫後のT2強調画像。
【００４３】
図20．腫瘍標本に関する病理学的所見。再発腫瘍標本においては、原発性腫瘍と比べて、複数の核および幅広い細胞質を含有する多数の大きな腫瘍細胞が観察された。該腫瘍の領域内では強力なCD8+ Tリンパ球浸潤が観察されたが、CD4+ Tリンパ球浸潤は観察されなかった。ケース1（A、B）および6（C、D）における原発性および再発腫瘍のHE染色。ケース1（E、F）および6（G、H）における抗CD4および抗CD8モノクローナル抗体での再発腫瘍標本の免疫組織化学的染色。
【００４４】
図21．自己グリオーマ細胞に対するPBLの細胞溶解活性。初回免疫前（黒棒線）および初回免疫の8〜10週間後（白棒線）に採取した血液からPBLを分離した。2つのケース（ケース1および2）においては、処置後に自己腫瘍細胞に対する細胞溶解活性が上昇したが、他のケースにおいては、処置後に細胞溶解活性はほとんど存在しなかった。ケース6においては、処置後の細胞溶解活性は処置前の細胞溶解活性より低かった。エフェクター：標的の比は80：1であった。
【００４５】
図22．処置の前および後の患者の末梢循環におけるIFN-γ発現CD8+ Tリンパ球の検出のためのサイトカインフローサイトメトリー。代表的なケース（ケース9および15）が示されている。ケース15においては、処置後に二重陽性細胞の比率が増加した。
【００４６】
5．発明の詳細な説明
本発明は癌の治療のための方法および組成物を提供する。好ましい実施形態においては、本発明の方法は、インターロイキン-12（IL-12）、例えば組換えヒトインターロイキン-12（rhIL-12）と組合された融合細胞の投与を提供する。本発明の融合細胞は自己樹状細胞と自己非樹状細胞との融合により作製される。ついで、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を刺激する分子の治療的有効量と組合された該融合細胞を、それらの投与を要する被験者に投与する。好ましい実施形態においては、本発明は、IL-12と組合された融合細胞の治療的有効量を含む、癌を治療するための方法および組成物に関する。
【００４７】
本明細書に記載の方法を用いて、自己樹状細胞を、関心のある抗原（例えば、癌抗原）を含有する非樹状細胞に融合させることが可能である。得られた、樹状細胞と非樹状細胞とのハイブリッドを、抗原が関わっている病態（例えば、癌）に対する強力な組成物として使用することが可能である。このアプローチは、多数の癌の場合のように特異的抗原が容易には同定できない場合に特に有利である。例えば、ヒトの癌の治療の場合には、非樹状細胞は患者の腫瘍から直接入手することが可能である。このようにして作製された融合細胞組成物は、治療されている個々の腫瘍に対して非常に特異的である。
【００４８】
以下のセクションにおいては、そのような免疫療法用組成物に関する組成物および方法について説明する。特に、セクション5.1、5.2および5.3においては、本発明で使用するそれぞれ非樹状細胞、樹状細胞および融合細胞、ならびにそれらの単離、製造および／または作製のための方法を説明する。そのような組成物を使用して治療または予防されうる標的癌については後記のセクション5.6で説明する。セクション5.8、5.9および5.10においては、癌に対する治療用組成物としてのこれらの融合細胞の方法および使用を説明する。
【００４９】
5.1  非樹状細胞
本発明の非樹状細胞は、融合細胞-サイトカイン組成物において使用するための、関心のある抗原を含有する任意の細胞でありうる。そのような非樹状細胞は、所望の種々の被験者（患者）（例えば、癌患者の腫瘍）から単離されうる。非樹状細胞は、樹立された細胞系または初代細胞培養物に由来するものであってもよい。非樹状細胞の単離および調製のための方法を以下に詳しく説明する。
【００５０】
非樹状細胞の起源は、抗原が関連している疾患の性質に応じて選ばれうる。好ましくは、非樹状細胞は、治療される被験者にとって自己由来であるものである。すなわち、使用する細胞は、最終的な標的腫瘍の細胞（例えば、治療される患者の腫瘍細胞）からin vivoで入手される。しかし、非樹状細胞上に存在する少なくとも1つの抗原が、該標的腫瘍から入手した細胞に特異的な抗原である限り、および非樹状細胞が、治療される患者と同じクラスI MHCハプロタイプを有する限り、任意の非樹状細胞が使用されうる。したがって、本発明においては全癌細胞または他の非樹状細胞が使用されうるが、本方法を実施する前にそれらを単離し又はそれらの抗原を特徴づけ又は更にはそれらの抗原が何であるかを知る必要はない。
【００５１】
癌の治療または予防のためには、非樹状細胞は癌細胞である。この実施形態においては、本発明は、癌細胞により発現される抗原、例えば腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原を発現しそのような癌細胞に対する免疫応答を惹起しうる融合細胞を提供する。本発明の1つの実施形態においては、癌（複数の部位へ転移した癌を含む）から単離された任意の組織または細胞が非樹状細胞の製造に使用されうる。例えば、血液、リンパまたは他の体液中を循環する白血病細胞も使用されることが可能であり、固形腫瘍組織（例えば、生検からの一次組織）も使用されうる。本発明の方法に適した癌の具体例は後記セクション5.6に列挙する。
【００５２】
好ましい実施形態においては、腫瘍細胞は単離されたばかりのものではなく、その代わりにそれを培養して、樹状細胞と融合する腫瘍細胞を選別し、健常な非癌または未感染細胞が、融合される細胞に混入するのを防ぎ又は抑制する。
【００５３】
好ましい実施形態においては、本発明の非樹状細胞は、ハイブリッド細胞組成物のレシピエントとなる哺乳動物から外科的に摘出された腫瘍から単離されうる。使用前に、固形癌組織または凝集癌細胞を、標準的な技術により、好ましくは機械的に、単細胞浮遊液（単細胞懸濁液）に分散させるべきである。癌細胞を分散させるためには、酵素（例えば、コラゲナーゼおよびDNアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない）も使用されうる。さらにもう1つ好ましい実施形態においては、本発明の非樹状細胞は、初代細胞培養物、すなわち、身体から入手された原物の細胞の培養物から入手される。典型的には、融合細胞の形成には、約1×106〜1×109個の非樹状細胞が使用される。
【００５４】
1つの実施形態においては、融合細胞の形成には、約1×106〜1×109個の非樹状細胞が使用される。もう1つの実施形態においては、5×107〜2×108個の細胞が使用される。さらにもう1つの実施形態においては、5×107個の非樹状細胞が使用される。
【００５５】
癌または感染細胞または組織に由来する細胞系も非樹状細胞として使用されうる。ただし、該細胞系の細胞は、非樹状細胞上の関心のある抗原と同じ抗原決定基を有していなければならない。ヒト由来の癌または感染組織、細胞または細胞系が好ましい。
【００５６】
もう1つの実施形態においては、癌細胞である適当な非樹状細胞を調製するために、非癌細胞（好ましくは、抑制されることが望まれる癌と同じ細胞型のもの）を、該レシピエントから、あるいはそれほど好ましくはないが、意図されるレシピエントと少なくとも1つのMHC対立遺伝子を共有する他の個体から単離し、特有の又は類似した癌またはトランスフォーム状態を引き起こす物質で処理することが可能である。そのような物質には、限定的なものではないが、照射、化学発癌物質およびウイルスが含まれうる。該細胞を処理し、そのようにして得られた癌またはトランスフォームした細胞を増殖させるためには、標準的な技術を用いることが可能である。
【００５７】
あるいは、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原または病原体の抗原をコードする遺伝子が入手可能である場合には、意図されるレシピエント由来の適当な細胞型の正常細胞。当業者に理解されるとおり、場合によっては、このようにして2以上のそのような抗原がレシピエントの細胞において発現されることが可能であり、レシピエントの細胞における抗原遺伝子の形質転換またはトランスフェクションおよび後続の組換え発現を行うためには、任意の技術、例えばAusubelら編（1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）に記載されている技術を用いることが可能である。1以上のMHC分子をレシピエントと共有するこれらの非樹状細胞は、本発明の融合細胞の形成方法において使用するのに適している。
【００５８】
融合細胞および標的腫瘍または病原体感染細胞の作製のために使用する非樹状細胞は、その哺乳動物において免疫応答を惹起するためには、少なくとも1つの共通のMHC対立遺伝子を有していなければならない。最も好ましいのは、非樹状細胞が、意図されるレシピエントに由来する場合（すなわち、自己由来である場合）である。それほど好ましくはないが、非樹状細胞は非自己であるが、少なくとも1つのMHC対立遺伝子をレシピエントの癌細胞と共有する。非樹状細胞を同一または同系個体から入手する場合には、そのような細胞はすべて、同じクラスI MHCハプロタイプを有するであろう。それらのすべてが同一被験者から入手されるわけではない場合には、MHCハプロタイプは、当技術分野でよく知られた標準的なHLA型決定技術、例えば血清学的試験およびMHC遺伝子座のDNA分析により決定されうる。MHCハプロタイプの決定は、本発明の融合細胞の作製方法を行う前に実施する必要があるわけではない。
【００５９】
非樹状細胞、例えば、癌細胞の抗原性を有する抗原を含む細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により同定され単離されうる。例えば、癌または感染細胞は、形態学的方法、酵素アッセイ、増殖アッセイまたは発癌ウイルスの存在により同定されうる。関心のある抗原の特性が既知である場合には、非樹状細胞は、当技術分野で公知の任意の生化学的または免疫学的方法によっても同定または単離されうる。例えば、癌細胞または感染細胞は、手術、内視鏡検査、他の生検技術、アフィニティークロマトグラフィーおよび蛍光活性化細胞選別（例えば、該細胞により発現される抗原に対する蛍光標識抗体を使用するもの）により単離されうる。
【００６０】
クローン性の又は均一な又は精製された非樹状細胞集団を使用することは要求されない。細胞混合物中の相当な数の細胞が、標的化される腫瘍細胞上に存在する抗原を含有する限り、細胞の混合物が使用されうる。特定の実施形態においては、非樹状細胞および／または樹状細胞を精製する。
【００６１】
特定の実施形態においては、治療する被験者からの癌組織を手術中に又は生検により集める。集めた組織を、癌細胞を生存させたまま維持する。癌細胞は、好ましくは、融合細胞の作製の直前に集める。最も好ましくは、それらを融合細胞の作製の直前に腹水および胸膜液から集める。このようにして十分な量の悪性腫瘍細胞を得ることができない場合には、腹部もしくは胸部の液体からの又は針生検からの悪性腫瘍細胞の採取が可能かもしれない。
【００６２】
5.2  樹状細胞
樹状細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により、被験者の血液もしくは骨髄または二次リンパ器官（例えば、脾臓、リンパ節、扁桃、腸のパイエル板および骨髄が挙げられるが、これらに限定されるものではない）から単離または作製されうる。好ましくは、本発明の方法において使用するDCは、（または最終分化した）樹状細胞である。樹状細胞の起源は、好ましくは、ヒト血液単球である。
【００６３】
そのような起源から得られた免疫細胞は、典型的には、優勢に再循環するリンパ球およびマクロファージ（分化および成熟の種々の段階のもの）を含む。樹状細胞調製物は標準的な技術により富化（濃縮）されうる（例えば、Current Protocols in Immunology, 7.32.1-7.32.16, John Wiley and Sons, Inc., 1997を参照されたい）。1つの実施形態においては、例えば、DCは、T細胞および付着細胞の枯渇ならびにそれに続く密度勾配遠心分離により富化されうる。DCは、所望により、蛍光標識細胞の選別により、または抗CD83 MAb磁気ビーズを使用することにより、更に精製されうる。
【００６４】
あるいは、血液サンプルまたは骨髄中に存在するDC前駆体をサイトカイン、例えば顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）で処理することにより、比較的均一なDC集団が高収率で得られうる。そのような条件下、単球は、細胞増殖することなく樹状細胞へと分化する。TNFαのような物質での更なる処理はDCの最終分化を刺激する。
【００６５】
限定的なものではなく例示として挙げると、樹状細胞は以下のとおりに血液単球から入手されうる。末梢血液単球を標準的な方法（例えば、Sallustoら, 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118）により入手する。フィコール・パック（Ficoll-Paque）密度勾配遠心分離およびプラスチック付着を用いるバフィーコート調製または白血球除去血輸血パックにより、健常な献血者からの白血球を集める。成熟DCが望まれる場合には、DCを培養するために以下のプロトコルを用いることが可能である。細胞を37℃で4時間にわたりプラスチック皿に付着させる。非付着細胞を除去し、付着単球を、0.1μg/mlの顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）および0.05μg/mlのインターロイキン-4（IL-4）を含有する培地内で7日間培養する。成熟樹状細胞を調製するためには、5日目に腫瘍壊死因子αを加え、7日目に細胞を集める。
【００６６】
特定の実施形態においては、以下のプロトコルを用いる。第1に、骨髄を単離し、赤血球を塩化アンモニウム（Sigma, St. Louis, MO）で細胞溶解させる。リンパ球、顆粒球およびDCを骨髄細胞から枯渇させ、5％熱不活性化FBS、50μM 2-メルカプトエタノール、2mM グルタミン酸、100U/ml ペニシリン、100pg/ml ストレプトマイシン、10ng/ml 組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF; Becton Dickinson, San Jose, CA）および30U/ml 組換えマウスインターロイキン-4（IL-4; Becton Dickinson）を添加したRPMI 1640培地内で、24ウェル培養プレートに残りの細胞をまく（1×106細胞/ウェル）。第2に、培養の5日目に、非付着細胞およびゆるく付着している細胞を集め、100mmペトリ皿に再度まく（1×106細胞/ml；10ml/皿）。つぎに、RPMI培地中のGM-CSFおよびIL-4を該細胞に加え、1×106個のDCを3×106個の照射（50 Gy, Hitachi MBR-1520R, 線量率: 1.1 Gy/分）SR-B10.A細胞と混合する。48時間後、腫瘍細胞との融合のために細胞を集める。
【００６７】
このようにして得られた樹状細胞は細胞表面マーカーCD83を特徴的に発現する。また、そのような細胞は高レベルのMHCクラスII分子ならびに細胞表面マーカーCD1α、CD40、CD86、CD54およびCD80を特徴的に発現するが、CD14の発現を喪失している。他の細胞表面マーカーには、典型的には、T細胞マーカーCD2およびCD5、B細胞マーカーCD7ならびに骨髄性細胞マーカーCD13、CD32（FcγR II）、CD33、CD36およびCD63、ならびに多数の白血球関連抗原が含まれる。
【００６８】
所望により、樹状細胞の存在を確認するために、形態学的観察および免疫化学的染色のような標準的な技術を用いることが可能である。例えば、樹状細胞の純度は、前記の特徴的な細胞表面マーカー（例えば、CD83、HLA-ABC、HLA-DR、CDla、CD40および／またはCD54）の1以上に対する蛍光色素標識抗体を使用するフローサイトメトリーにより評価されうる。この技術は、未熟DCには存在するが成熟DCには存在しないCD14に対する蛍光色素標識抗体を使用して未熟DCと成熟DCとを区別するためにも使用される。
【００６９】
好ましい実施形態においては、当業者によく知られた任意の方法により上腕静脈から静脈血を集める。特定の実施形態においては、治療する被験者から60mlの血液を集める。集めた血液から白血球を分離し、高い付着能を有する白血球のみを集める（例えば、Kikuchiら, 2001, Cancer Immunol Immunother 50: 337-34を参照されたい）。高い付着能を有する白血球の培養のための典型的なプロトコルは以下のとおりである。簡潔に説明すると、フィコール・ハイパック（Ficoll-Hypaque）密度遠心分離を用いて末梢血から末梢血単核細胞を分離する。末梢血単核細胞をRPMI-1640（Sigma）に再懸濁させ、24ウェルクラスタープレートに付着させる。37℃で2時間後に非付着細胞を除去し、ついで、1％熱不活性化自己血清、10ng/ml 組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF; Becton Dickinson, San Jose, CA）、30U/ml 組換えマウスインターロイキン-4（IL-4; Becton Dickinson）および20ng/ml 腫瘍壊死因子α（TNF-α; Becton Dickinson）を添加したX-VIVO-15培地（BioWhittaker, Walkersville, MD）内で付着細胞を7日間培養する。該培養物に3日ごとに供給し、必要に応じて分割する。ついで半付着および非付着細胞を激しいピペッティングにより集め、融合のための樹状細胞として使用する。ある実施形態においては、50mM 2-メルカプトエタノール、2mM グルタミン酸、100U/ml ペニシリンおよび100mg/ml ストレプトマイシンも該培地内に存在する。GM-CSFおよびIL-4は白血球およびリンパ球の増殖または種々の機能の発現をもたらす。培養中、適当な被験者の血清を培地溶液内に10％の濃度まで加えて、異種抗原との接触を防ぐ。
【００７０】
ある実施形態においては、少なくとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのGM-CSFを添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、多くとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのGM-CSFを添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、10 ng/ml〜100 ng/ml、20 ng/ml〜80 ng/ml、30 ng/ml〜70 ng/ml、または40 ng/ml〜60 ng/mlのGM-CSFを添加した培地内で付着細胞を培養する。
【００７１】
ある実施形態においては、少なくとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのTNF-αを添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、多くとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのTNF-αを添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、10 ng/ml〜100 ng/ml、20 ng/ml〜80 ng/ml、30 ng/ml〜70 ng/ml、または40 ng/ml〜60 ng/mlのTNF-αを添加した培地内で付着細胞を培養する。
【００７２】
ある実施形態においては、少なくとも10 U/ml、20 U/ml、30 ng/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/mlまたは100 U/mlのIL-4を添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、多くとも10 U/ml、20 U/ml、30 ng/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/mlまたは100 U/mlのIL-4を添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、10 U/ml〜100 U/ml、20 U/ml〜80 U/ml、30 U/ml〜70 U/ml、または40 U/ml〜60 U/mlのIL-4を添加した培地内で付着細胞を培養する。
【００７３】
5.3  融合細胞の作製
非樹状細胞は以下のとおりに自己DCに融合されうる。細胞は、無菌条件下、融合前に洗浄されうる。融合は、当技術分野における任意の細胞融合技術により行うことができる。ただし、融合技術は、癌の治療のために哺乳動物に注射するのに適した融合細胞の混合物を与えるものでなければならない。特定の具体例においては、電気融合が用いられる。電気融合技術は当技術分野でよく知られている（StuhlerおよびWalden, 1994, Cancer Immunol. Immunother. 39: 342-345; Changら(編), Guide to Electroporation and Electrofusion. Academic Press, San Diego, 1992を参照されたい）。
【００７４】
特定の実施形態においては、以下のプロトコルを用いる。第1工程においては、約5×107個の腫瘍細胞および約5×107個の樹状細胞（DC）を0.3M グルコースに懸濁させ、電気融合キュベット内に移す。該細胞サンプルを100V/cmで5〜10秒間パルスすることにより、細胞-細胞コンジュゲートを形成させるために、該サンプルを誘電泳動的に整列させる。所望により、電場を「不均一化」させて該細胞を最高電界強度の領域へ導くために、誘電ワックスの滴を該電気融合キュベットの1つの側面上に適用することにより、整列を最適化することが可能である。第2の工程においては、融合パルスをかける。電気融合には種々のパラメーターが用いられうる。例えば、1つの実施形態においては、融合パルスは1〜3パルスでありうる。もう1つの実施形態においては、電気融合は、約25μFで500〜1500V/cm、好ましくは1,200V/cmを用いて達成される。
【００７５】
好ましい実施形態においては、ポリエチレングリコールの使用により、成熟樹状細胞を癌細胞と融合させる。簡潔に説明すると、樹状細胞を致死的照射癌細胞（300 Gy, Hitachi MBR-1520R, 線量率1.1 Gy/分）と混合する。ある実施形態においては、癌細胞を10 Gy、25 Gy、50 Gy、100 Gy、200 Gy、300 Gy、400 Gy、500 Gy、750 Gyまたは1,000 Gy照射する。ある実施形態においては、癌細胞を50〜500 Gy照射する。樹状細胞と癌細胞との比は、得られた樹状細胞および癌細胞の数に応じて、3：1〜10：1とする。ついで、ポリエチレングリコール（PEG; Sigma）の50％溶液500μlを60秒間滴下することにより、融合を開始させる。無血清RPMI培地の段階的添加により融合を停止させる。リン酸緩衝食塩水（PBS; Cosmo Bio）で3回洗浄した後、融合細胞を、GM-CSF、IL-4およびTNF-αの存在下、100mmペトリ皿中のRPMI培地内で24時間培養する。特定の実施形態においては、融合細胞を、10 ng/ml GM-CSF、30 U/ml IL-4および20 ng/ml TNF-αの存在下、RPMI培地内で24時間培養する。一晩の培養後、融合細胞を約1mLの生理食塩水に懸濁させ、被験者に皮下注射する。好ましい実施形態においては、融合細胞の懸濁液を鼡径部に注射する。なぜなら、この領域はリンパ節に富むからである。
【００７６】
もう1つの特定の実施形態においては、以下のプロトコルを用いる。まず、前記セクション5.2に記載のとおりに樹状細胞を調製する。樹状細胞培養の5日目に、非付着細胞およびゆるく付着している細胞を集め、100mmペトリ皿（1×106細胞/ml；10ml/皿）上で再プレーティングする。つぎにRPMI培地中のGM-CSFおよびIL-4を該細胞に加え、1×106個のDCを3×106個の照射（50 Gy, Hitachi MBR-1520R, 線量率: 1.1 Gy/分）SR-B10.A細胞と混合する。48時間後、ポリエチレングリコール（PEG; Sigma）の50％溶液500μlを60秒間滴下することにより、融合を開始させる。特定の実施形態においては、PEGの最終濃度は2.5％である。本発明のある実施形態においては、PEGの最終濃度は0.5％、1％、1.5％、2.5％、5％、10％、15％、20％または25％である。特定の実施形態においては、PEGの最終濃度は0.5％〜25％、1％〜20％、または5％〜15％である。無血清RPMI培地の段階的添加により融合を停止させる。GM-CSFおよびIL-4の存在下、100mmペトリ皿中のRPMI培地内でFCを48時間培養する。
【００７７】
もう1つの実施形態においては、樹状細胞と非樹状細胞とを前記のとおりに融合させる。ついで融合細胞を、CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子をコードする遺伝物質でトランスフェクトする。好ましい実施形態においては、該遺伝物質は、IL-12をコードするmRNAである。好ましいトランスフェクション法には、エレクトロポレーションまたはカチオン性高分子が含まれる。
【００７８】
ある実施形態においては、癌細胞を樹状細胞と、樹状細胞（DC）当たり1個の癌細胞、DC当たり2個の癌細胞、DC当たり3個の癌細胞、DC当たり4個の癌細胞、DC当たり5個の癌細胞、DC当たり6個の癌細胞、DC当たり7個の癌細胞、DC当たり8個の癌細胞、またはDC当たり10個の癌細胞の比率で融合させる。
【００７９】
抗原細胞および樹状細胞の集団内の融合細胞形成の度合は、当技術分野で公知の多数の診断技術により測定されうる。例えば、1つの実施形態においては、DCおよび腫瘍細胞をそれぞれ赤色および緑色の細胞内蛍光色素で標識した後、両方の色の発光によりハイブリッドを特徴づける。腫瘍細胞を含まないDC、およびDCを含まない腫瘍細胞のサンプル、ならびに電気融合を行わない腫瘍細胞 + DC混合物を、陰性対照として使用することが可能である。
【００８０】
1つの実施形態においては、この方法により調製された融合細胞は全細胞集団の約10および20％を構成する。さらにもう1つの実施形態においては、この方法により調製された融合細胞は全細胞集団の約5〜50％を構成する。
【００８１】
ある実施形態においては、少なくとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのGM-CSFを添加した培地内で融合細胞を培養する。ある実施形態においては、多くとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのGM-CSFを添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、10 ng/ml〜100 ng/ml、20 ng/ml〜80 ng/ml、30 ng/ml〜70 ng/ml、または40 ng/ml〜60 ng/mlのGM-CSFを添加した培地内で付着細胞を培養する。
【００８２】
ある実施形態においては、少なくとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのTNF-αを添加した培地内で融合細胞を培養する。ある実施形態においては、多くとも10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/mlまたは100 ng/mlのTNF-αを添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、10 ng/ml〜100 ng/ml、20 ng/ml〜80 ng/ml、30 ng/ml〜70 ng/ml、または40 ng/ml〜60 ng/mlのTNF-αを添加した培地内で付着細胞を培養する。
【００８３】
ある実施形態においては、少なくとも10 U/ml、20 U/ml、30 ng/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/mlまたは100 U/mlのIL-4を添加した培地内で融合細胞を培養する。ある実施形態においては、多くとも10 U/ml、20 U/ml、30 ng/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/mlまたは100 U/mlのIL-4を添加した培地内で付着細胞を培養する。ある実施形態においては、10 U/ml〜100 U/ml、20 U/ml〜80 U/ml、30 U/ml〜70 U/ml、または40 U/ml〜60 U/mlのIL-4を添加した培地内で付着細胞を培養する。
【００８４】
融合細胞が細菌またはウイルスで汚染されるのを防ぐために、細胞の培養および細胞の融合を、哺乳類細胞の培養のための専用の室内で行うことが可能である。これらの細胞が細菌に感染したり細菌の毒素で汚染されていないことを確認するために、これらの細胞を監視する。
【００８５】
ポリエチレングリコールまたは別の方法の使用により樹状細胞を癌細胞と融合させる場合には、癌細胞の一部が融合されうる（全部というわけではない）。そのような未融合癌細胞を被験者の体内に注射すると、好ましくない影響が生じうる。したがって、ある実施形態においては、投与前に癌細胞を照射する。これらの安全対策を講じることにより、融合細胞が微量の癌細胞で汚染されている場合であっても、癌細胞が活発に増殖する可能性はほとんどない。好ましい実施形態においては、融合前に癌細胞を照射する。
【００８６】
ある実施形態においては、癌細胞を樹状細胞と融合させる少なくとも10分前、30分前、60分前、2時間前、5時間前、10時間前または24時間前に、被験者から癌細胞を得る。ある実施形態においては、癌細胞を樹状細胞と融合させる多くとも10分前、30分前、60分前、2時間前、5時間前、10時間前または24時間前に、被験者から癌細胞を得る。ある実施形態においては、被験者から癌細胞を取得し、ついで、癌細胞を樹状細胞と融合する前に細胞系を樹立する。ある実施形態においては、癌細胞を樹状細胞と融合させる少なくとも10分前、30分前、60分前、2時間前、5時間前、10時間前または24時間前に、被験者から樹状細胞を得る。ある実施形態においては、癌細胞を樹状細胞と融合させる多くとも10分前、30分前、60分前、2時間前、5時間前、10時間前または24時間前に、被験者から樹状細胞を得る。
【００８７】
5.3.1  組換え細胞
もう1つの実施形態においては、樹状細胞を癌細胞と融合する代わりに、非樹状細胞を、癌の既知抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトする。ついで非樹状細胞を、組換え抗原を発現するものに関して選択し、CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激または誘導するサイトカインまたは分子と共に被験者に投与する。
【００８８】
遺伝子治療、つまり遺伝子導入による遺伝子の組換え発現は、被験者への核酸の投与を意味する。該核酸は、直接的に又はそのコード化タンパク質を介して間接的に、被験者において治療効果をもたらす。本発明は、（好ましくはヒトにとって）治療上重要なタンパク質をコードする遺伝物質、例えばDNAまたはmRNAを、本発明の方法に従い融合細胞内に導入して、該核酸が該融合細胞により発現されるようにし、ついで該組換え融合細胞を被験者に投与する、遺伝子治療の方法を提供する。
【００８９】
本発明の組換え融合細胞は、当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法において使用されうる。したがって、該細胞内へ導入される核酸は、任意の所望のタンパク質、例えば抗原タンパク質もしくはその一部、またはCTLおよび／もしくは体液性免疫応答を刺激するタンパク質をコードしうる。以下の説明はそのような方法の例示である。例示されている方法は、すべての利用可能な遺伝子治療法のごく一例を代表するに過ぎない、と当業者には容易に理解されるであろう。
【００９０】
遺伝子治療法の全般的総説としては、例えば、Lundstrom, 1999, J. Recept. Signal Transduct. Res. 19: 673-686 ; RobbinsおよびGhivizzani, 1998, Pharmacol. Ther. 80: 35-47; Pelegrinら, 1998, Hum. Gene Ther. 9: 2165-2175; HarveyおよびCaskey, 1998, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 512-518; GuntakaおよびSwamynathan, 1998, Indian J. Exp. Biol. 36: 539-535; DesnickおよびSchuchman, 1998, Acta Paediatr. Jpn. 40: 191-203; Vos, 1998, Curr. Opin. Genet. Dev. 8: 351-359; TarahovskyおよびIvanitsky, 1998, Biochemistry (Mosc) 63: 607-618; Morishitaら, 1998, Circ. Res. 2: 1023-1028; Vileら, 1998, Mol. Med. Today 4: 84-92; BranchおよびKlotman, 1998, Exp. Nephrol. 6: 78-83; Ascenzioniら, 1997, Cancer Lett. 118: 135-142; ChanおよびGlazer, 1997, J. Mol. Med. 75: 267-282を参照されたい。組換えDNA技術の分野で一般に知られた使用可能な方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; ならびにKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.に記載されている。
【００９１】
遺伝子治療において組換え細胞を使用する実施形態においては、被験者における発現が望まれる遺伝子を、それが該細胞により発現可能となるように融合細胞内に導入し、ついで治療効果を得るために該組換え細胞をin vivo投与する。
【００９２】
組換え融合細胞は、本開示を考慮すれば当業者に理解されるように、遺伝子治療のどのような適当な方法においても使用することができる。被験者に投与した組換え操作細胞の作用は、例えば、患者における予め選択された遺伝子の活性化または抑制（例えば、IL-12の活性化）を引き起こして、患者を冒している病態の改善をもたらしうる。
【００９３】
所望の遺伝子は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはウイルス感染のような方法によるトランスフェクションにより融合細胞内に導入される。通常、導入方法は、選択マーカーを含有するベクターの導入を含む。ついで、選択マーカーと導入遺伝子を含有するベクターを取り込んでおり該ベクターを発現している細胞を単離するための選択下に、該細胞を配置する。ついでそれらの細胞を患者に送達する。
【００９４】
この実施形態においては、所望の遺伝子を融合細胞内に導入した後、得られた組換え細胞をin vivo投与する。そのような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、該遺伝子配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含む（これらに限定されるものではない）当技術分野で公知の任意の方法により行われうる。外来遺伝子を細胞内に導入するための多数の技術が当技術分野で公知であり（例えば、LoefflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohenら, 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92を参照されたい）、レシピエント細胞の必要な発生的および生理的機能が損なわれない限り、本発明において使用されうる。該技術は、細胞への遺伝子の安定な導入をもたらして、該遺伝子が該細胞により発現され、好ましくは、その細胞子孫により受け継がれ発現されることを可能にするものであるべきである。
【００９５】
遺伝子治療を実施するための1つの一般的な方法は、レトロウイルスベクターを利用することによるものである（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599を参照されたい）。レトロウイルスベクターは、予め選択された遺伝子を取り込んでその遺伝子の発現をもたらすように修飾されたレトロウイルスである。天然のレトロウイルスDNA配列の多くはレトロウイルスベクターに必須ではないことが判明している。天然に存在するレトロウイルスDNA配列のごく一部だけが必要である。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび組込みに必要なシス作用性配列のすべてを含有しなければならない。これらのシス作用性配列としては以下のものが挙げられる：
a）該ベクターの各末端に位置する長末端反復配列（LTR）またはその一部、
b）マイナス鎖およびプラス鎖DNA合成のためのプライマー結合部位、ならびに
c）ビリオン内へのゲノムRNAの取り込みに必要なパッケージングシグナル。
【００９６】
遺伝子治療において使用する遺伝子をベクター内にクローニングする。これは、細胞内への該ベクターの感染または運搬により、細胞内への該遺伝子の送達を容易にする。
【００９７】
レトロウイルスベクターに関する更なる詳細は、化学療法に対する造血幹細胞の抵抗性を上昇させるためにmdr1遺伝子を造血幹細胞に運搬するためのレトロウイルスベクターの使用を記載しているBoesenら, 1994, Biotherapy 6: 291-302に見出されうる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している他の参考文献としては以下のものが挙げられる：Clowesら, 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiemら, 1994, Blood 83: 1467-1473; SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114。
【００９８】
肝臓、中枢神経系、内皮および筋肉に由来する非樹状細胞へ遺伝子を送達するためには、アデノウイルスが使用されうる。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染しうるという利点を有する。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を記載している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeldら, 1992, Cell 68: 143-155; およびMastrangeliら, 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234に見出されうる。
【００９９】
アデノ随伴ウイルス（AAV）を遺伝子治療に使用することが提案されている（Walshら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300）。アルファウイルスを遺伝子治療に使用することも提案されている（Lundstrom, 1999, J. Recept. Signal Transduct. Res. 19: 673-686）。
【０１００】
遺伝子治療における他の遺伝子送達方法には、哺乳類人工染色体（Vos, 1998, Curr. Op. Genet. Dev. 8: 351-359）、リポソーム（TarahovskyおよびIvanitsky, 1998, Biochemistry (Mosc) 63: 607-618）、リボザイム（BranchおよびKlotman, 1998, Exp. Nephrol. 6: 78-83）および三重らせんDNA（ChanおよびGlazer, 1997, J. Mol. Med. 75: 267-282）が含まれる。
【０１０１】
所望の遺伝子は細胞内に導入され、相同組換えにより、発現のために宿主細胞DNA内に組み込まれうる（KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstraら, 1989, Nature 342: 435-438）。
【０１０２】
特定の実施形態においては、遺伝子治療の目的で導入されるべき細胞内で組換え発現される所望の遺伝子は、適当な転写誘導物質の存在または非存在を制御することにより組換え遺伝子の発現が制御されうるよう、コード領域に機能しうる形で連結された誘導プロモーターを含む。
【０１０３】
好ましい実施形態においては、細胞内で組換え発現される所望の遺伝子は、その機能が本発明の方法に従い細胞運命の変化を誘発するかどうかには無関係に、Cre部位に隣接する。遺伝子機能がもはや必要でない場合には、組換え遺伝子を含む細胞は、例えば、誘導性または組織特異的なプロモーターに機能的に連結されたLoxコード配列を含有する核酸を供給することにより、あるいは核局在化シグナルに機能的に連結されたLoxタンパク質を供給することにより、Loxタンパク質に供される。Loxリコンビナーゼは、Cre配列（Hamiltonら, 1984, J. Mol. Biol. 178: 481-486）を組換えて、該過程中に介在配列を切り出すように機能し、それは、この実施形態によれば所望の遺伝子の核酸を含有する。前記方法は、組換え遺伝子発現を操作するために成功裏に用いられている（Fukushigeら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7905-7909）。あるいは、部位特異的組換えにより遺伝子の存在および発現を制御するために、FLP/FRT組換え系が使用されうる（BrandおよびPerrimon, 1993, Development 118: 401-415）。
【０１０４】
本発明の好ましい態様においては、B型肝炎またはC型肝炎主要抗原をコードする核酸を使用する遺伝子治療はウイルス性肝炎の治療に向けられる。
【０１０５】
5.4  免疫細胞活性化分子
本発明は、まず、樹状細胞と非樹状細胞との融合により誘導された融合細胞を、つぎに、細胞傷害性T細胞（CTL）応答を刺激または誘導しうるサイトカインまたは他の分子（例えば、インターロイキン-12（IL-12））を投与することを含む方法を提供する。
【０１０６】
IL-12は、免疫応答におけるエフェクター細胞の移動および適切な選択を調節するうえで重要な役割を果たしている。IL-12遺伝子産物は免疫応答をTヘルパー細胞のTH1サブセットへ偏向させ、CTL活性を強力に刺激する。好ましい実施形態においては、CTL刺激分子はIL-12である。高用量のIL-12は、全身投与された場合には毒性を示すため、IL-12は好ましくは局所投与される。他の投与方法は後記セクション5.7.1において説明する。
【０１０７】
IL-12応答性を維持しTH1系の関与を制御するためにはIL-12受容体b2（IL-12 R-b2）の発現が必要である。さらに、IL-12シグナル伝達はSTAT4の活性化（すなわち、STAT4のリン酸化の増加により測定される）およびインターフェロンγ（IFN-γ）の産生を引き起こす。したがって、1つの実施形態においては、本発明は、STAT4を活性化しうる、IL-12ではない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリーの使用により同定されるSTAT4の小分子活性化因子）の使用を含む。
【０１０８】
もう1つの実施形態においては、免疫刺激物質はIL-18である。さらにもう1つの実施形態においては、免疫刺激分子はIL-15である。さらにもう1つの実施形態においては、免疫刺激分子はインターフェロン-γである。
【０１０９】
もう1つの実施形態においては、治療すべき被験者に、CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激または誘導する本明細書に記載の分子またはサイトカインの任意の組合せを投与する。
【０１１０】
それほど好ましくはない実施形態においては、細胞傷害性T細胞プール、すなわち、TH1細胞亜集団を増強するために、抗IL-4抗体を加えてTH2細胞へのTヘルパー細胞の偏向を抑制し、それにより、Tヘルパー細胞のTH1サブセットへの選択圧を生み出すことが可能である。さらに、TH1細胞へ分化するようTH細胞を誘導するために、IL-12の投与と共に抗IL-4抗体を投与することが可能である。分化後、細胞を洗浄し、例えば平衡食塩水に再懸濁させ、好ましくは静脈内投与により、被験者に再導入することが可能である。
【０１１１】
本発明はまた、前記インターロイキンの変異体に関する。そのような変異体は、CTLおよび／または体液性免疫応答を促進するようアゴニスト（ミメティック（模擬体））として機能しうる改変されたアミノ酸配列を有する。変異体は、突然変異誘発、例えば離散（discrete）点突然変異またはトランケーションにより作製されうる。アゴニストは、該タンパク質の天然に存在する形態と実質的に同じ生物活性またはその一部を保有しうる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、関心のあるタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより、該タンパク質の天然に存在する形態の活性の1以上を抑制しうる。したがって、限られた機能の変異体での処理により、特異的な生物学的効果が惹起されうる。該タンパク質の天然に存在する形態の生物活性の一部を有する変異体での被験者の処理は、該タンパク質の天然に存在する形態での処理より少ない副作用を被験者において示しうる。
【０１１２】
CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激しうる分子の変異体は、突然変異体（例えば、トランケート型突然変異体）の組合せ（コンビナトリアル）ライブラリーをアゴニスト活性に関してスクリーニングすることにより同定されうる。1つの実施形態においては、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発により、変異体の多様化ライブラリーを作製し、それは多様化遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、個々のポリペプチドとして又はより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイの場合）として、潜在的タンパク質配列の縮重セットが発現されうるよう、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列内に酵素的に連結することにより、変異体の多様化ライブラリーを製造することが可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列からIL-12の潜在的変異体のライブラリーを製造するために使用しうる種々の方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で公知である（例えば、Narang, 1983, Tetrahedron 39: 3; Itakuraら, 1984, Annu. Rev. Biochem., 53: 323; Itakuraら, 1984, Science, 198: 1056; Ikeら, 1983, Nucleic Acid Res., 11: 477を参照されたい）。
【０１１３】
また、変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためのポリペプチドの多様化集団を作製するために、CTLおよび／または体液性免疫応答を促進しうるインターロイキンのコード配列の断片のライブラリーを使用することが可能である。例えば、1分子当たり約1回だけニック化（切れ目の生成）が生じる条件下、関心のあるコード配列の二本鎖PCR断片をヌクレアーゼで処理し、該二本鎖DNAを変性させ、該DNAを再生させて、異なるニック化産物からのセンス／アンチセンスペアを含みうる二本鎖DNAを形成させ、S1ヌクレアーゼでの処理により再形成二本鎖から一本鎖部分を除去し、生じた断片ライブラリーを発現ベクター内に連結することにより、コード配列断片のライブラリーを作製することが可能である。この方法により、関心のあるタンパク質の種々のサイズのN末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーが誘導されうる。
【０１１４】
点突然変異またはトランケーションにより作製された組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技術が当技術分野で公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられている技術は、典型的には、複製可能な発現ベクター内への遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーでの適当な細胞の形質転換、および該組合せ遺伝子の発現（これは、所望の活性の検出が、検出産物の遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下で行われる）を含む。該ライブラリー中の機能的突然変異体の度数を増加させる技術である反復アンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis）（REM）を、CTLおよび／または体液性免疫応答を促進しうるインターロイキンの変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組合せて用いることが可能である（ArkinおよびYourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7811-7815; Delgraveら, 1993, Protein Engineering, 6 (3): 327-331）。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態においては、融合細胞を組換えヒトインターロイキン-12と共に投与する。組換えヒトインターロイキンー12は、以前は細胞傷害性リンパ球成熟因子（CLMF）またはNK細胞刺激因子（NKSF）と呼ばれていたものであり、以下の刊行物（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている方法に従い作製される：Sternら, 1990, Proc Natl Acad Sci 87: 6808-6812; Gublerら, 1991, Proc Natl Acad Sci 88: 4143-4147; およびWolfら, 1991, J Immunol 146: 3074-3081。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態においては、併用免疫療法の前に、被験者がhIL-12に対して過敏性であるかどうかを判定するために、rhIL-12を被験者に投与する。特定の実施形態においては、rhIL-12を皮下注射することにより、hIL-12に対する過敏性を試験する。特定の実施形態においては、被験者がhIL-12に対して過敏性であるかどうかを試験するために、プリックテスト（prick test）を用いる。特定の実施形態においては、種々の濃度（例えば、1フェムトモル、10フェムトモル、100フェムトモル、1ピコモル、10ピコモル、100ピコモル、1ナノモル、10ナノモル、100ナノモル、1マイクロモル、10マイクロモル、100マイクロモル、1ミリモル、10ミリモルまたは100ミリモル）のhIL-12の溶液の滴を被験者の腕の皮膚に塗布する。その滴の位置の皮膚を針で刺し、皮膚の反応を5分間〜60分間にわたって観察する。皮膚の発赤および皮膚の発疹は過敏症反応の指標である。被験者におけるrhIL-12に対する考えられうる有害な反応の重症度およびrhIL-12の治療効力を、以下の試験を行うことにより評価する：血液学的試験、検尿および検便、ならびにCTスキャンなどのイメージング検査。rhIL-12の効力は、被験者における腫瘍サイズを測定することにより評価されうる。これまでに行った動物実験から、インターロイキン-12の投与の後で、実験的に移植された腫瘍のサイズの減少または消失が生じうることが示されている。
【０１１７】
ある実施形態においては、1回投与につき体重1kg当たり0 ng、20 ng、30 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ngまたは100 ngのインターロイキン-12を投与する。ある実施形態においては、1回投与につき体重1kg当たり10 ng〜25ng、25ng〜50 ng、50 ng〜75ng、75ng〜100 ng、10 ng〜100 ng、または25ng〜75 ngのインターロイキン-12を投与する。好ましい実施形態においては、1回投与につき体重1kg当たり30 ngのインターロイキン-12を投与する。
【０１１８】
5.5  免疫応答を測定するためのアッセイ
融合細胞-サイトカイン組成物は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、免疫原性に関してアッセイされうる。例えば、限定的なものではないが、以下の方法のうちの1つが用いられる。
【０１１９】
体液性免疫応答は、未処理対照における抗体の量に対する、治療被験者の血清中の標的抗原を認識する抗体の相対量を測定するための、ELISAを含む（これらに限定されるものではない）標準的な検出アッセイを用いて測定されうる。CTL応答は、本明細書に記載のクロム遊離アッセイを含む標準的なイムノアッセイを用いて測定されうる。より詳しくは、CTL応答は、刺激物質の非存在下におけるCTL活性に対する、刺激物質の投与後のCTL活性における測定可能な相違により測定される。
【０１２０】
5.5.1  MLTCアッセイ
融合細胞-サイトカイン組成物は、MLTCアッセイを用いて、免疫原性に関して試験されうる。例えば、1×107個の融合細胞をγ照射し、それをTリンパ球と混合する。種々の間隔で、4時間の51Cr放出アッセイ（Palladinoら, 1987, Cancer Res. 47: 5074-5079を参照されたい）においてTリンパ球を細胞傷害性に関して試験する。このアッセイにおいては、混合されたリンパ球培養物を標的細胞懸濁液に加えて、種々のエフェクター：標的（E：T）比（通常は1:1〜40:1）を得る。500μCiの51Cr/mlを含有する培地内で1×106個の標的細胞を37℃で1時間インキュベートすることにより、標的細胞を予め標識する。標識後に該細胞を3回洗浄する。各アッセイ点（E:T比）を3回繰り返して実施し、自発的51Cr放出（リンパ球をアッセイに加えない）および100％放出（細胞を界面活性剤で細胞溶解する）を測定するために適当な対照を含める。該細胞混合物を4時間インキュベートした後、200gで5分の遠心分離により該細胞をペレット化する。上清中に放出された51Crの量をγカウンターで測定する。試験サンプル中のcpmから自発的放出cpmを引き算したものを、全界面活性剤放出cpmから自発的放出cpmを引き算したもので割り算することにより、細胞毒性（％）を測定する。
【０１２１】
MHCクラスIカスケードを遮断するために、K-44ハイブリドーマ細胞（抗MHCクラスIハイブリドーマ）に由来する濃縮ハイブリドーマ上清を12.5％の最終濃度まで試験サンプルに加える。
【０１２２】
5.5.2  抗体応答アッセイ
本発明の1つの実施形態においては、ワクチン接種に応答して産生された抗体を抗体応答アッセイ（例えば、ELISA）で測定することにより、融合細胞の免疫原性を測定する。そのようなアッセイのための方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Section 2.1, Current Protocols in Immunology, Coliganら (編), John Wiley and Sons, Inc. 1997を参照されたい）。この実施形態の1つの様式においては、マイクロタイタープレート（96ウェルImmuno Plate II, Nunc）を、該組成物中で使用されている精製癌細胞または感染体の0.75μg/ml溶液（PBS中）50μl/ウェルで、4℃で16時間および20℃で1時間コートする。該ウェルを空にし、1ウェル当たり200μlのPBS-T-BSA（0.05％(v/v) TWEEN 20および1％(w/v)ウシ血清アルブミンを含有するPBS）で20℃で1時間ブロッキングし、ついでPBS-Tで3回洗浄する。ワクチン接種された動物（例えば、モデルマウスまたはヒト患者）からの50μl/ウェルの血漿またはCSFを20℃で1時間適用し、該プレートをPBS-Tで3回洗浄する。ついで、PBS-T-BSA中1:1,500に希釈された、ホースラディッシュペルオキシダーゼに適宜結合した、50μl/ウェルのヒツジ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリンと共に、および（更に3回の前記PBS-T洗浄の後）50μlのo-フェニレンジアミン（OPD）-H2O2基質溶液と共に、20℃で1時間インキュベートした後、抗原抗体活性を比色測定する。5分後に反応を150μlの2M H2SO4で停止させ、標準的な技術を用いて、492nm（参照620nm）で光度計で吸光度を測定する。
【０１２３】
5.5.3  サイトカイン検出アッセイ
融合細胞-サイトカイン組成物に対するCD4+ T細胞増殖応答は、特異的サイトカインのレベルの検出および定量により測定されうる。例えば、1つの実施形態においては、細胞内サイトカインは、融合細胞-サイトカイン組成物の免疫原性を試験するためにIFN-γ検出アッセイを用いて測定されうる。この方法の一例においては、融合細胞-サイトカイン組成物で治療された被験者からの末梢血単核細胞をペプチド抗原、例えばムチンペプチド抗原またはHer2/neu由来エピトープで刺激する。ついで細胞を、フローサイトメトリーにより検出されうるT細胞特異的標識抗体、例えばFITC結合抗CD8およびPerCP標識抗CD4抗体で染色する。洗浄後、細胞を固定し、透過促進させ、ヒトIFN-γ（PE-抗IFN-γ）に反応性の色素標識抗体と反応させる。標準的な技術を用いて、フローサイトメトリーによりサンプルを分析する。
【０１２４】
あるいは、T細胞を包囲する特異的サイトカインを検出するために、フィルターイムノアセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISPOT）を用いることが可能である。例えば、1つの実施形態においては、ニトロセルロースで裏打ちされたマイクロタイタープレートを精製サイトカイン特異的一次抗体、すなわち、抗IFN-γでコートし、他のタンパク質の非特異的結合によるバックグラウンドを排除するために該プレートをブロッキングする。融合細胞-サイトカイン組成物でワクチン接種した被験者から得た、サイトカイン分泌細胞を含有する、単核血液細胞のサンプルを、該マイクロタイタープレートのウェル上に希釈する。標識（例えば、ビオチン標識）された二次抗サイトカイン抗体を加える。ついで抗体サイトカイン複合体が検出されうる。すなわち、酵素結合ストレプトアビジンにより、サイトカイン分泌細胞が、視覚的な顕微鏡的方法または電子検出方法により「スポット」として現れるであろう。
【０１２５】
5.5.4  四量体染色アッセイ
もう1つの実施形態においては、抗原特異的T細胞を同定するために、「四量体染色」アッセイ（Altmanら, 1996, Science 274: 94-96）が用いられうる。例えば、1つの実施形態においては、特異的ペプチド抗原、例えば腫瘍特異的抗原を含有するMHC分子を多量体化して可溶性ペプチド四量体を得、例えばストレプトアビジンとの複合体化によりそれを標識する。ついでMHC複合体を、融合細胞組成物で治療した被験者から得たT細胞の集団と混合する。ついで、関心のある抗原（すなわち、腫瘍特異的抗原）を発現するT細胞を染色するために、ビオチンを使用する。
【０１２６】
細胞傷害性T細胞は、CD8陽性である免疫細胞であり、抗原提示細胞（APC）（これは標的細胞の抗原をプロセシングして、該抗原を提示している）により活性化されている。該抗原提示は、B-7/CTLA-4およびCD40のような共刺激分子の活性化と連携して、標的に対するT細胞の感作を引き起こし、該抗原を発現する細胞を破壊する。
【０１２７】
細胞傷害性T細胞は、一般には、TNF-β、パーフォリンおよびIL-2を分泌していることに加えてCD8を発現していることにより特徴づけられる。細胞傷害性T細胞応答は種々のアッセイにより測定されうる。例えば、そのようなアッセイには、本明細書中の実施例に示されている、未処理対照からのT細胞と比較した場合の、治療被験者からのT細胞を使用する51Cr遊離アッセイにおける標的細胞溶解の増強、および未処理被験者と比較した場合の、治療被験者におけるIFN-gおよびIL-2のレベルの増加の測定が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
5.6  標的癌
本発明の融合細胞を使用して治療または予防されうる癌および発癌性疾患には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：ヒト肉腫および癌腫、例えば腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、内皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ（神経膠腫）、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄組織球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）ならびに真正赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症、およびH鎖病。
【０１２９】
5.7  患者の選択ならびに考えられる副作用およびその治療
癌の治療のための種々の療法が開発されている。個々の患者に最適な治療は、個々の患者の癌のタイプおよび病期を考慮して選択されるべきである。併用免疫療法を含む臨床試験に登録される患者の基本的な選択基準は以下のとおりである。
【０１３０】
本発明においては、患者を選択するためには以下の加入基準を考慮すべきである：
1．既存の確立された抗癌療法を受けた患者のうち、満足しうる又は信頼しうる効果が得られず、その病変が進行中である患者。すなわち、外科手術、化学療法、放射線療法および他の確立された抗癌療法を受けた患者のうち、満足しうる又は信頼しうる効果が得られず、癌が進行中であるか又は将来進行すると予想される患者；
2．何からの理由により、既存の抗癌療法が適用され得ない患者；
3．病変の進行期ゆえに既存の抗癌療法のいずれもが適応されないが、ある程度は全身状態の若干の効能または回復が治療から期待されうる患者；
4．原因には無関係に、重篤な免疫不全が存在しない患者；および
5．少量の癌組織または細胞を安全かつ確実に集めることが可能であり、樹状細胞を集めるために一度に60mLの血液サンプルを採取することが可能な患者。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態においては、rhIL-12の考えられうる副作用の出現に関して被験者を連続的にモニタリングする。熟練した臨床家は、1回量または複数回量のrhIL-12の投与を受けた患者が経験するそのような副作用を認識するであろう。副作用で最もよく見られるのは、発熱、頭痛、悪心、悪寒、衰弱ならびに注射部位（皮膚下の注射の場合）の腫脹、発赤、刺激、掻痒および／または痛みである。また、患者は、血糖値および肝酵素の一過性上昇、ならびに白血球数の一過性減少を経験している。
【０１３２】
rhIL-12投与後にそれほどよくは見られない他の副作用には、筋肉痛および関節痛、不眠、眩暈、胃痛（腹痛）、下痢、嘔吐、食欲減退、咽頭炎、咳の増加、鼻水、発汗、痛み、全身不快感、便秘、口内炎、ならびに被験者の血液の凝固能の低下により挫傷または出血を容易に引き起こしうる、血小板（血液凝固を助ける細胞）の減少が含まれる。
【０１３３】
稀な場合に、複数の高用量のrhIL-12の投与を受けた後、患者は不安、錯乱、抑うつ、血便および嘔吐、腎機能不全、皮膚のひりひり感または疼き、息切れ、胃の不調、正常状態と比べて増加した血中酸、低血圧および高血圧を経験している。高用量のrhIL-12の静脈内投与を複数回受けた癌患者においては、死亡例が生じている。
【０１３４】
rhIL-12を使用する動物生殖研究が行われており、胎児の死亡、流産および胎児体重減少が生じている。これらの作用は、この性質の他の化合物で生じるものと合致している。生殖能に対するrhIL-12の効果を調べる研究は現在のところ行われていない。rhIL-12が人乳中に排出されるかどうかは知られていない。多数の薬物は乳中に排出されるため、授乳期の女性はrhIL-12の投与を受けるべきではない。
【０１３５】
突然変異原性研究はrhIL-12の影響を示していない。rhIL-12の発癌性を調べる研究は行われていない。
【０１３６】
動物またはヒトにおけるrhIL-12の研究においては、即時型の重篤な反応、例えばアレルギー反応、息切れ、喘鳴およびみみずばれは観察されていない。しかし、いずれかのタンパク質薬剤を投与された後には、そのような反応が生じうる。
【０１３７】
併用免疫療法を受けている被験者は、健康問題が新たに生じたらそれを医師に話すように指示される。最も好ましい実施形態においては、これらの副作用について被験者を詳細に監視する。症状が発生したら、熟練した臨床家は療法を軽減または中断し、あるいは適当な治療を開始するであろう。これまでに観察されていない他の予想外の副作用も生じうる。
【０１３８】
rhIL-12の使用は胎児にリスクを与える可能性がある。被験者が、妊娠の可能性のある女性である場合には、該被験者は、スクリーニング期間中に行われる妊娠検査（血液）を受けるように要求される。rhIL-12での治療中に被験者が妊娠した場合には、該被験者は研究担当医師に知らせなければならない。rhIL-12が人乳中に排出されるかどうかは知られていないため、被験者は、rhIL-12の投与を受けている間は乳児または小児に授乳してはいけない。
【０１３９】
本発明に含まれる免疫療法は他の副作用を有しうる。例えば、リンパ球は腫瘍特異的免疫応答の一部としてサイトカインを放出するが、これは、発熱、悪寒、不快感および腫瘍部位の灼熱感のような症状を引き起こしうる。これらの症状は癌組織における炎症反応であると解釈されうる。顕著な発熱が生じた場合には、熟練した臨床家に認識されるとおり、解熱剤での治療が行われうる。解熱剤は、発熱を緩和または軽減しうる物質であり、抗炎症剤は、炎症を相殺または抑制しうる物質である。そのような物質の具体例には、アスピリン（サリチル酸）、インドメタシン、インドメタシンナトリウム三水和物、サリチルアミド、ナプロキセン、コルヒチン、フェノプロフェン、スリンダク、ジフルニサル、ジクロフェナク、インドプロフェンおよびサリチルアミドナトリウムが含まれる。
【０１４０】
樹状細胞と癌細胞とを含む融合細胞は人工細胞であり、治療される患者にとっては異物であり、抗原がリンパ球に提示された後でそれが患者の体内で生存するとは予想されない。動物実験においては、融合細胞は生存せず、腫瘍を生成することは観察されていない。しかし、ヒトでの免疫療法において使用する融合細胞は、増殖を妨げ増殖能を排除するために、患者への投与前に照射されるべきである。癌免疫をin vivoで誘導する融合細胞の効力はその照射によってはほとんど影響されない。
【０１４１】
癌細胞の抗原性は、併用免疫療法を受けている被験者の正常細胞の抗原性と大部分で重複しうる。したがって、癌細胞が免疫学的に殺される場合には、癌が発生した器官の正常細胞も、自己免疫現象の誘導として公知の同じ免疫学的効果により損傷されうる。樹状細胞免疫療法とrhIL-12療法とを組合せる場合には、免疫反応が増強されると予想される。そのような現象が、併用免疫療法を受けている被験者において生じた場合には、癌性組織だけでなく正常組織も損傷されている可能性がある。現在、正常組織を損傷するのに十分に強力な自己免疫現象が、本明細書に記載の免疫療法を受けている患者において実際に生じるという証拠は存在しない。しかし、動物実験の結果は、この点を考慮すべきであることを示している。癌に対する治療効力および正常組織に対する損傷の重症度を考慮して、熟練した臨床家の判断に基づき、ステロイドのような免疫抑制剤の投与が必要であるとみなされる場合には、免疫抑制療法が行われうる。免疫抑制剤としては、とりわけ、グルココルチコイド（メチルプレドニゾロン）、ミエリン塩基性タンパク質（例えば、7-カパキソン）、抗Fc受容体モノクローナル抗体、ヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、抗IL2モノクローナル抗体（例えば、CHI-621およびダクリキシマブ）、ブスピロン（buspirone）、カスタノスペルミン（castanospermine）、CD-59（補体因子阻害剤）、5-リポキシゲナーゼ阻害剤（例えば、CMI-392）、ホスファチジン酸合成アンタゴニスト、エブセレン（ebselen）、エデルフォシン（edelfosine）、エンリモマブ（enlimomab）、ガラプチン（galaptin）、血小板活性化因子アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト（例えば、ICAM4）、インターロイキン-10アゴニスト、大環状ラクトン、メトキサトン（methoxatone）、ミゾルビン（mizoribine）、OX-19、ぺプチゲン剤、PG-27、プロテインキナーゼC阻害剤、ホスホジエステラーゼIV阻害剤、一本鎖抗原結合タンパク質、補体因子阻害剤、シアロホリン（sialophorin）、シロリムス（sirolimus）、スピロ環ラクタム、5-ヒドロキシトリプタミンアンタゴニスト、抗TCRモノクローナル抗体、CD5ゲロニンおよびTOK-8801が挙げられる。
【０１４２】
5.8  医薬製剤および投与方法
本発明の組成物製剤は、CTLおよび／または体液性免疫応答を刺激しうる分子（例えば、サイトカイン）と共に投与する融合細胞の有効な免疫量を含む。
【０１４３】
適当な融合細胞-サイトカイン組成物の製剤には、好ましくは液状溶液としての注、射剤が含まれる。
【０１４４】
本発明の組成物製剤を導入するための多数の方法を用いることが可能である。これには、皮下注射、リンパ管内、皮内、筋肉内、静脈内および乱切法（例えば分岐針を使用することによる、皮膚の最上層からの擦過）が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態においては、融合細胞-サイトカイン組成物を皮内に注射する。
【０１４５】
また、所望により、該組成物製剤は、少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、および／または該組成物の有効性を増強する化合物をも含みうる。補助物質の有効性は、融合細胞に対する抗体の誘導を測定することにより測定されうる。
【０１４６】
該組成物を投与する哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、限定的なものではないがウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、トリ（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含む非ヒト動物であってもよい。
【０１４７】
被験者における該併用療法に対する起こりうる有害反応の重症度およびその治療効力は以下の試験により評価されうる：血液検査、検尿および検便、ならびにCTスキャンなどのイメージング検査。rhIL-12の効力は、被験者における腫瘍サイズの変化を測定することにより評価されうる。当業者に理解されるとおり、これらの試験は、治療経過中、任意の時点で任意の組合せで行われうる。
【０１４８】
さらに、被験者に融合細胞を投与する前に、GM-CSF、IL-4およびTNF-αのようなサイトカインによる汚染を軽減するために該融合細胞を洗浄する。本発明の特定の実施形態においては、サイトカインによる汚染は106個の融合細胞当たりサイトカイン10-9グラム以上に達しない。好ましい実施形態においては、被験者に投与する融合細胞を約1mLの生理食塩水に懸濁させ、被験者に皮下注射する。注射部位としては、リンパ節に富む鼡径部が選ばれる。
【０１４９】
5.9  投与計画
ある実施形態においては、以下に記載するサイクルで融合細胞を数回投与することが可能である。本発明の種々の実施形態においては、投与当たり約104〜約109個の融合細胞を使用する。ある実施形態においては、投与当たりの融合細胞の数（後記を参照されたい）は約104〜約105個の融合細胞、約5×104〜約5×105個の融合細胞、約105〜約106個の融合細胞、約5×105〜約5×106個の融合細胞、約106〜約107個の融合細胞、約5×106〜約5×107個の融合細胞、約107〜約108個の融合細胞または約108〜約109個の融合細胞である。
【０１５０】
本発明の種々の実施形態においては、サイクル当たり約104〜約109個の融合細胞を投与する。ある実施形態においては、サイクル当たりの融合細胞の数（後記を参照されたい）は約104〜約105個の融合細胞、約5×104〜約5×105個の融合細胞、約105〜約106個の融合細胞、約5×105〜約5×106個の融合細胞、約106〜約107個の融合細胞、約5×106〜約5×107個の融合細胞、約107〜約108個の融合細胞または約108〜約109個の融合細胞である。
【０１５１】
本発明の種々の実施形態においては、治療計画当たり合計約104〜約109個以上の融合細胞を投与する。ある実施形態においては、投与する（すなわち、治療当たりの）融合細胞の合計数は約105〜約106個の融合細胞、約5×105〜約5×106個の融合細胞、約106〜約107個の融合細胞、約5×106〜約5×107個の融合細胞、約107〜約108個の融合細胞または約5×107〜約5×108個の融合細胞、約108〜約109個の融合細胞、約109〜約1010個の融合細胞である。特定の実施形態においては、治療当たりに投与する融合細胞の合計数は約3×106〜約3×107個の融合細胞である。
【０１５２】
ある実施形態においては、融合細胞およびrhIL-12の投与をサイクルで行う。各サイクルは、融合細胞の1回以上の投与およびrhIL-12の1回以上の投与から構成されうる。患者の治療は1以上のサイクルから構成されうる。ある実施形態においては、治療当たりのサイクル数は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。ある実施形態においては、投与をコース（course）で行う。各コースは2以上のサイクルから構成される。該治療は2以上のコースから構成されうる。それらのコースは、融合細胞またはrhIL-12の投与を行わない休止期間により中断されうる。ある実施形態においては、休止期間は少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、7週間、10週間、15週間または少なくとも20週間でありうる。ある実施形態においては、休止期間は多くとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、7週間、10週間、15週間または多くとも20週間継続しうる。
【０１５３】
特定の実施形態においては、各サイクルは2週間よりなる。サイクルの第1週においては、まず、1〜5×105個の融合細胞を投与し、ついで30ng/kgのrhIL-12を投与し、ついで更に30ng/kgのrhIL-12を投与する。特定の実施形態においては、該サイクルの第1週の3日目および7日目にrhIL-12を投与する。該サイクルの第2週においては、融合細胞もrhIL-12も投与しない。好ましい実施形態においては、被験者の治療は3サイクルよりなる。もう1つの好ましい実施形態においては、被験者の治療は4または5サイクルよりなる。特定の実施形態においては、該サイクルを6回繰り返す。サイクル数は患者の状態によって異なり、個々の状況に応じて当業者により決定されうる。
【０１５４】
ある実施形態においては、後記のとおり、融合細胞をサイクルにおいて7回投与する。ある実施形態においては、投与当たりの融合細胞の数（後記を参照されたい）は104〜約105個の融合細胞、5×104〜5×105個の融合細胞、105〜106個の融合細胞、5×105〜5×106個の融合細胞、106〜107個の融合細胞、5×106〜5×107個の融合細胞、または107〜108個の融合細胞である。ある実施形態においては、サイクル当たりの融合細胞の数（後記を参照されたい）は104〜105個の融合細胞、5×104〜5×105個の融合細胞、105〜106個の融合細胞、5×105〜5×106個の融合細胞、106〜107個の融合細胞、5×106〜5×107個の融合細胞、または107〜108個の融合細胞である。ある実施形態においては、投与する（すなわち、治療当たりの）融合細胞の合計数は105〜106個の融合細胞、5×105〜5×106個の融合細胞、106〜107個の融合細胞、5×106〜5×107個の融合細胞、107〜108個の融合細胞または5×107〜5×108個の融合細胞である。特定の実施形態においては、治療当たりに投与する融合細胞の合計数は3×106〜3×107個の融合細胞である。
【０１５５】
ある実施形態においては、融合細胞およびrhIL-12の投与をサイクルで行う。各サイクルは、融合細胞の1回以上の投与およびrhIL-12の1回以上の投与から構成されうる。患者の治療は1以上のサイクルから構成されうる。ある実施形態においては、治療当たりのサイクル数は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。ある実施形態においては、投与をコース（course）において行う。各コースは2以上のサイクルから構成される。該治療は2以上のコースから構成されうる。それらのコースは、融合細胞またはrhIL-12の投与を行わない休止期間により中断されうる。ある実施形態においては、該休止期間は少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、7週間、10週間、15週間または少なくとも20週間でありうる。ある実施形態においては、該休止期間は多くとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、7週間、10週間、15週間または多くとも20週間継続しうる。
【０１５６】
特定の実施形態においては、融合細胞およびrhIL-12をサイクルで投与する。各サイクルは2週間よりなる。サイクルの第1週においては、まず、1〜5×105個の融合細胞を投与し、ついで30ng/kgのrhIL-12を投与し、ついで更に30ng/kgのrhIL-12を投与する。特定の実施形態においては、該サイクルの第1週の3日目および7日目にrhIL-12を投与する。該サイクルの第2週においては、融合細胞もrhIL-12も投与しない。好ましい実施形態においては、被験者の治療は3サイクルよりなる。もう1つの好ましい実施形態においては、被験者の治療は4または5サイクルよりなる。特定の実施形態においては、該サイクルを6回繰り返す。サイクル数は患者の状態によって異なり、個々の状況に応じて当業者により決定されうる。
【０１５７】
該併用療法の経過の全体にわたり、被験者を詳細に監視する。治療を受けている被験者の状態を評価するために、いくつかの試験を行う。そのような試験には、血液学的試験、検尿および検便、ならびにCTスキャンなどのイメージング検査が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、併用免疫療法治療を受けている被験者の腫瘍のサイズを監視することにより、該治療の効力を試験することが可能である。
【０１５８】
併用免疫療法の経過の全体にわたり、治療を受けている被験者を、考えられうる副作用に関して監視する。rhIL-12の投与により引き起こされる副作用はセクション5.7に記載されている。
【０１５９】
特定の実施形態においては、投与を要する患者への投与の前に最大10日間、融合細胞を細胞培養下で維持する。特定の実施形態においては、10ng/ml GM-CSF（Becton Dickinson）、30U/ml IL-4（Becton Dickinson）および20ng/ml TNF-α（Becton Dickinson）を添加したX-VIVO-15培地（BioWhittaker, Walkersville, MD）内で融合細胞を維持する。
【０１６０】
もう1つの特定の実施形態においては、10ng/ml GM-CSF（Becton Dickinson）、30U/ml IL-4（Becton Dickinson）および20ng/ml TNF-α（Becton Dickinson）を添加したRPMI培地（Sigma, St. Louis, MO）内で融合細胞を維持する。この実施形態においては、融合細胞を各注射前に作製する必要はなく、該培養物から得られうる。
【０１６１】
5.10  有効量
前記組成物は、癌を治療または予防するための治療的有効量で被験者に投与されうる。治療的有効量は、そのような疾患または障害の症状を改善する（例えば、腫瘍の退縮を引き起こす又は開始させる）のに十分な融合細胞の量を意味する。本発明の組成物の有効量（免疫量）は、モデル動物試験系から導き出された用量応答曲線からも外挿されうる。医薬製剤中で使用する融合細胞の厳密な用量は、治療する疾患の個々のタイプによっても左右されるであろう。例えば、腫瘍を治療する場合には、腫瘍の侵襲性が、投与量を検討する場合の重要な考慮事項となる。他の重要な考慮事項は投与経路および患者の性質である。したがって、厳密な投与量は、標準的な臨床的技術に従い、臨床家の判断および各患者の状況（例えば、患者の免疫状態）に応じて決定すべきである。
【０１６２】
特定の実施形態においては、例えば、ヒトの腫瘍を治療するために、自己DCと融合した腫瘍細胞により形成された融合細胞-サイトカイン組成物を、該腫瘍から離れた部位、好ましくはリンパ組織付近に投与する。該組成物の投与は、投与当たり約1×108個の細胞を使用して、適当な間隔の後、例えば3〜6ヶ月ごとに反復されうる。
【０１６３】
したがって、本発明は、哺乳動物を免疫化し又は哺乳動物における癌を治療もしくは予防するための方法であって、本発明の融合細胞-サイトカイン組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法を提供する
本発明の好ましい実施形態においては、rhIL-12を、該物質を投与すべき被験者の体重1kg当たり約10ng〜約100ngの用量で投与する。もう1つの好ましい実施形態においては、rhIL-12の投与量は30ng/kg体重である。
【０１６４】
好ましい実施形態においては、注射当たり1〜5×105個の融合細胞を投与する。融合細胞の注射の前に、融合細胞の安全性を監視し、確認する。特定の実施形態においては、融合細胞を培養する培地のpHを測定する。該pHは7.0〜7.4であるべきである。特定の実施形態においては、融合細胞の形態学的特徴を顕微鏡検査により分析する。
【実施例】
【０１６５】
6.  実施例
6.1  樹状細胞とグリオーマ細胞による脳腫瘍に対するワクチン接種
本実施例では、グリオーマ細胞に融合させた樹状細胞を、免疫学的聖域である脳の腫瘍に対する治療に使用することを検討した。前もって融合細胞（FC）で免疫すると、側腹部または脳にグリオーマ細胞をチャレンジしたとき、結果的に腫瘍形成が防止された。この研究をCD8+ 細胞枯渇マウスで行ったときは、効力が低下した。治療モデルでは、腫瘍が脳に発生したあとでFCを皮下に注入した。FC単独の投与では、脳腫瘍担持マウスの生存に及ぼす効果が限られていた。しかし、重要なことだが、FCと組換えIL-12（rIL-12）を投与すると、脳腫瘍マウスの生存を著しく長期化することができた。また、免疫したマウス由来のグリオーマ細胞に対するCTL活性は、FCまたはrIL-12を単独で用いて得られた活性と比較して、FCとrIL-12の同時投与によって刺激された。こうしたデータは、融合細胞に基づくワクチン療法とrIL-12を併用することの治療効果を支持するものである。
【０１６６】
6.1.1  材料および方法
細胞系、薬剤および動物
マウスのグリオーマ細胞系SR-B10.Aは、100U/ml ペニシリン、0.1mg/ml ストレプトマイシン、および10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS; GIBCO, Gaithersburg, MD）を添加したDMEM（Cosmo Bio, Tokyo, Japan）中で単層培養物として維持した。Yac-1細胞は、RIKEN CELL BANK（つくば、日本）から入手して、10％FBSを含むRPMI 1640 (Cosmo Bio) 中に維持した。
【０１６７】
組換えマウスIL-12（rmIL-12）はGenetics Institute（Cambridge, MA）から入手した。
【０１６８】
雌B10.Aマウスは、Sankyo Laboratory Inc. (静岡、日本) から購入して、特別の病原体フリーの部屋で25±3℃にて飼育した。８週齢のマウスを使用した。
【０１６９】
樹状細胞と腫瘍細胞の融合
B10.Aマウスの長骨から骨髄を洗い流し、塩化アンモニウム（Sigma, St. Louis, MO）を用いて赤血球を溶解させた。その骨髄細胞からリンパ球、顆粒球およびDCを枯渇させ、その細胞を、5％熱不活性化FBS、50μM 2-メルカプトエタノール、2mM グルタミン酸、100U/ml ペニシリン、100pg/ml ストレプトマイシン、10ng/ml 組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF；Becton Dickinson, San Jose, CA) および30U/ml 組換えマウスインターロイキン-4 (IL-4; Becton Dickinson)を添加したRPMI 1640培地で24ウェル培養プレートにまいた（1×106個/ウェル）。培養5日目に、非付着細胞とゆるく付着している細胞を回収し、100mmペトリ皿（1×106個/ml；10ml/皿）に再度まいた。RPMI培地中のGM-CSFとIL-4を細胞に加え、1×106個のDCを3×106個の照射 (50 Gy, Hitachi MBR-1520R, 線量率: 1.1 Gy/分) SR-B10.A細胞と混合した。48時間後、500μlの50％ポリエチレングリコール（PEG; Sigma）溶液を60秒間滴下して融合を開始させた。その後無血清RPMI培地を段階的に添加して融合を停止させた。FCを100mmペトリ皿にてRPMI培地中GM-CSFおよびIL-4の存在下で48時間培養した。
【０１７０】
フローサイトメトリー
腫瘍細胞（3×106個）を回収して、リン酸緩衝食塩水（PBS; Cosmo Bio）で2回洗った。PKH26 (2μl; Sigma) を腫瘍細胞に加え、この混合物を室温で5分間保持した。次いで、500μlのFBSを加えて反応を停止させた。細胞をPBSで2回洗い、500μlのPBS中に再懸濁させた。DCおよびFCの単細胞懸濁液を調製し、バッファー（PBS中の1％BSA、0.1％アジ化ナトリウム）で洗い、該バッファー中に再懸濁させて、FITC標識抗マウスCD80モノクローナル抗体（Pharmingen, San Diego, CA）を用いて30分、4℃で染色した。FACScanフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて染色細胞を分析した。
【０１７１】
モデル動物
FCをPBSで2回洗ってから、PBS中に1×106個/mlの密度で懸濁させた。0日目と7日目に、FC（3×105個）をB10.Aマウスの側腹部に皮下接種した。続いて14日目に、腫瘍細胞（1×106個）を反対の側腹部に皮下接種した。脳腫瘍モデルでは、1×104個のSR-B10.A腫瘍細胞を、FCによる免疫後14日目に、同系マウスの脳の右前頭葉に定位的に接種した。
【０１７２】
治療モデルでは、1×104個の腫瘍細胞を脳に定位的に接種し（0日目）、続いて5日目と12日目にFC（3×105個）を皮下注入した。いくつかの実験では、rmIL-12を腹腔内注射した。死亡したマウスに対しては検死を行った。
【０１７３】
細胞溶解活性のアッセイ
活性化された脾細胞（SPC）の細胞溶解活性を51Cr放出アッセイでin vitroにて試験した。個々のマウス由来のSPCの単細胞懸濁液を10% FCS-RPMIで洗い、6ウェルプレート（Falcon Labware, Lincoln Park, NJ）にて1×107個/mlの密度で10% FCS-RPMI中に再懸濁させた。付着細胞を取り出した後、10U/mlの組換えヒトIL-2を1日おきに培養物に加えた。培養を開始してから4日後に細胞を回収し、細胞傷害性T細胞（CTL）活性を測定した。標的細胞を51Crと共に90分、37℃でインキュベートして標識し、次いでエフェクターリンパ球と共に4時間培養した。エフェクター：標的比を10：1から80：1までの範囲とした。全ての測定を3回繰り返して行い、溶解パーセントを次式により算出した：（実験cpm−自然発生cpm／最大cpm−自然発生cpm）×100％。
【０１７４】
抗体アブレーション研究
T細胞サブセットのin vivoアブレーションを以前に記載されたとおりに行った（Kikuchiら, 1999, Int J Cancer, 80:425-430）。簡単に説明すると、0日目と7日目に、FC（3×105個）をB10.Aマウスの側腹部に皮下接種した。続いて14日目に、腫瘍細胞（1×106個）を反対の側腹部に接種した。ラットモノクローナル抗体である抗mCD4 (ATCCハイブリドーマGK1.5)、抗mCD8 (ATCCハイブリドーマ56.6.73)、抗アシアロGMI (Wako Pure Chemicals, Tokyo, Japan) または正常ラットIgGを7、10、14および17日目に腹腔内注射した（0.5mg/注射/マウス)。
【０１７５】
免疫蛍光染色
腫瘍細胞（1×104個）を脳に定位的に接種し（0日目）、続いて3日目にFC（3×105個）または対照として照射グリオーマ細胞（3×105個）を皮下注入した。17日目にマウスを犠牲にした後、脳を固定バッファー（PBS中の1％パラホルムアルデヒドおよび0.1％グルタルアルデヒド）中で10分間固定した。切片（厚さ6μm）を最初の抗体として抗グリア原線維酸性タンパク質（anti-glial fibrillary acidic protein: 抗GFAP; Zymed Laboratories, San Francisco, CA)と4℃で一晩インキュベートした。一次抗体をFITCコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) により室温での2時間のインキュベーションにおいて検出した。続いて、切片を抗CD4-PE抗体(Pharmingen)または抗CD8-PE抗体(Pharmingen)と共に4℃で一晩インキュベートした。
【０１７６】
データ解析
腫瘍の大きさは2つのサンプルのｔ検定を用いて比較した。生存率はKaplan-Meier累積危険プロットの作成およびWilcoxon解析により評価した。p＜0.05で有意差があるとみなした。
【０１７７】
6.1.2  結果
グリオーマ細胞にPKH26を組み入れた後にDCとグリオーマ細胞を融合させた。図1Aは、DCの34％が抗CD80モノクローナル抗体で染色されたことを示している。グリオーマ細胞の95％以上がPKH26に対して陽性であった（図1B）。二重陽性細胞の比率（39.9％; 図1C）はCD80陽性DCの比率とほぼ同じであり、また、FCの10％はPKH26陰性であった。このことは、大部分のDCがグリオーマ細胞と融合したことを示唆している。
【０１７８】
前もってFCで免疫することが皮下グリオーマに及ぼす抗腫瘍効果について検討した。FC、DC、または対照としての照射親細胞（1×106個）を同系マウスに0日目と7日目に皮下注入した（各群n=11）。14日目に、1×106個の親細胞を反対の側腹部に皮下接種した。照射親細胞を注入した全てのマウスには、2週間以内に、接種した腫瘍細胞から大きな腫瘍が形成された。これらのマウスはすべてが6週間以内に死亡した。これとは対照的に、FCで免疫したマウスには、6週間以内に死亡したものはいなかった。DCで免疫した11匹のマウスのうち6匹が腫瘍を発生したが、FCで免疫した11匹のマウスはどれも触知可能な腫瘍を発生しなかった（図2A）。
【０１７９】
前もってFCで免疫することが脳のグリオーマに及ぼす抗腫瘍効果についても検討した。0日目と7日目にFCで免疫した後、1×104個の腫瘍細胞を脳の右前頭葉に定位的に接種した（14日目）。これらのマウスを70日間観察した。FCで免疫したマウスの半数は70日より長く生存した（各群n=20；p＜0.01）（図2B）。対照マウスはすべてが6週以内に死亡した。全マウスに対して検死を行った。死亡マウスには大きな腫瘍が発生していたが、生存マウスには発生していなかった。こうした知見は、FCによる免疫が側腹部および脳におけるグリオーマ細胞腫瘍の発生を防止することを示している。
【０１８０】
実験的な治療モデルとして、脳腫瘍の発生後にFCを注入した。1×104個の腫瘍細胞を同系マウスの脳の右前頭葉に定位的に接種した（0日目）。5日目と12日目に、3×105個のFCを皮下接種した。FCによるワクチン接種で腫瘍担持マウスの生存は延びたが（各群n=15；図3）、その差は有意でなかった（p＞0.05）。DCのみの接種は生存にいかなる影響も与えなかった（データは示してない）。その後、FCとrmIL-12の併用療法の抗腫瘍効果について調べた。1×104個の腫瘍細胞を同系マウスの脳に定位的に接種した（0日目）。5日目と12日目に、3×105個のFCを皮下接種した。全てのマウスに0.5μg/100μlのrmIL-12または100μlの食塩水を、5日目に開始して1日おきに2週間（合計3.5μg/マウス）腹腔内投与した。FCとrIL-12の両方をワクチン接種すると、対照と比較して生存が延びた（p=0.01；図3）。FCとrIL-12で治療した10匹のマウスのうち5匹は70日間にわたり生存した。対照マウスと、rmIL-12単独またはDCとrmIL-12の両方で治療したマウスとの生存率の差は統計的に有意でなかった（データは示してない）。これらの結果は、rmIL-12がFC組成物の抗腫瘍効果を増強することを実証している。
【０１８１】
CTL活性は51Cr放出アッセイで分析した。FC (0日目および/または7日目に)および/またはrIL-12 (7日目に開始して1日おきに10日間; 合計2.5pg/マウス)で免疫した後、未処置のマウスおよびFCで1回または2回免疫したマウスから脾細胞（SPC）を分離した。図4は、免疫したマウス（特に、rIL-12を注射しかつFCで2回免疫したマウス）由来の腫瘍細胞に対するCTL活性が対照やその他と比べて相当に増加していることを示しており、処置マウス由来のYac-1細胞に対する抗腫瘍活性は有意に増加していなかった（データは示してない）。これらの結果は、FCによるワクチン接種が抗腫瘍活性を引き出し、また、処置マウス由来のSPCの細胞溶解活性が腫瘍特異的であることを示唆している。
【０１８２】
さらに、グリオーマ細胞とFCを注入されたマウスに抗CD4、抗CD8、抗アシアロGMI、または対照ラットIgGを投与することによって、リンパ球のサブセットを枯渇させた。0日目と7日目に、FCを側腹部に皮下接種した。続いて、14日目に親細胞を反対の側腹部に接種した。7、10、14および17日目にモノクローナル抗体を腹腔内注射した。CD8+ T細胞を枯渇させたマウスでは抗腫瘍効果が低減していた（各群n=4；図5）。FCにより賦与された防御は、CD4+ T細胞またはNK細胞の枯渇によってはなくならなかった。これらの結果は、このモデルでのFCの抗腫瘍効果にはCD8+ T細胞が必要であることを実証している。 
実験的治療モデルにおいては、CD4+および/またはCD8+ T細胞が脳腫瘍に浸潤していたかどうかを検討した。脳腫瘍の免疫蛍光分析により、ワクチンを接種されていないマウスの腫瘍には少数のCD4+およびCD8+ T細胞しか存在しないことが示された（図6A、B）。対照的に、ワクチンを接種されたマウスの腫瘍には多数のCD4+およびCD8+ T細胞が検出できた（図6C、D）。以前に報告されたように、SR-B10.A細胞はGFAP陽性であった(10)。
【０１８３】
6.1.3  考察
グリオーマに対するワクチン接種のためのAPCとして遺伝子操作グリオーマ細胞を使用することができるが、その抗腫瘍効果はモデルマウスにおいて確立された脳腫瘍を消滅させるには十分でない (Aokiら, 1992, Proc Natl Acad Sci U S A, 89: 3850-4); Wakimoto, H.ら, 1996, Cancer Res, 56: 1828-33)。したがって、DCに基づいた組成物は、可能性のある脳腫瘍治療アプローチである。DCは抗原を拾い上げる能力を失っている。それゆえ、DCの使用には、DCにTAAを組み入れるための効果的な方法が必要である。これまでに、抗腫瘍免疫を引き出すためにDCを使用するいくつかの方法が検討されてきた。すなわち、腫瘍細胞から抽出されたタンパク質またはペプチドをDCにパルスする (Zitvogelら, 1996; Nairら, 1997, Int J Cancer, 70: 706-15; Tjandrawanら, 1998, J Immunother, 21: 149-57)；TAAをコードする遺伝子をDCにトランスフェクトする (Tutingら, 1998, J Immunol, 160: 1139-47)；DCを腫瘍細胞と共に培養する (CelluziおよびFalo, 1998)；ならびに、DCを腫瘍細胞と融合させる (Gongら, 1997, Nat Med, 3: 558-61; Gongら, 1998, Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 6279-83; Lespagnardら, 1998, Int J Cancer, 76: 250-8; Wangら, 1998, J Immunol, 161: 5516-24)；といった方法である。1) 未知のTAAに対する抗腫瘍免疫を引き出すためにFCを使用することができる、2) グリオーマの共通のTAAが同定されていない、および3) FCの抗腫瘍効果はDCと腫瘍細胞の混合物よりも徹底した治癒をもたらす、という理由のため、FCは悪性グリオーマの治療アプローチとして有利であるかもしれない。
【０１８４】
マウス皮下腫瘍モデルでの腫瘍細胞に対するFCの効果は以前に報告された (Gongら, 1997, Nat Med, 3: 558-61)が、脳でのその効果はわかっていない。本発明者らによる脳腫瘍モデルでは、FCによる全身的ワクチン接種により腫瘍細胞が拒絶反応に感受性となり、結果的に全身性免疫の確立と長期の生存をもたらした。中枢神経系（CNS）は一般的に、リンパ排液の欠如および血液脳関門（脳血管の内皮細胞同士の密着結合が細胞や抗体の通過に対して物理的バリアーを形成している）の性質のため、免疫学的聖域と考えられている (Cserr, H.F.およびKnopf, P.M., 1992, Immunol Today, 13: 507-12)。しかし、本研究では、FCによる全身ワクチン接種を用いて、確立された脳腫瘍を治療できることを明らかにする。したがって、脳は完全に免疫学的聖域というわけではないのかもしれないし、あるいはまた、特定の腫瘍が免疫系に対するバリアーを乗り越えて、全身性免疫と局所免疫との間にクロストークが生じるのかもしれない。
【０１８５】
本研究では、FC単独によるワクチン接種が脳腫瘍マウスの生存を長引かせた。したがって、本発明者らは、免疫処置計画および方法が、FCを刺激性サイトカインと一緒に注入することで改善される可能性がある、と推論した。実際、rmIL-12を投与すると、マウスグリオーマに対するFCの抗腫瘍効果が増強された。IL-12は、もともとナチュラルキラー細胞刺激因子または細胞傷害性リンパ球成熟因子と呼ばれていたもので、NK/リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞の溶解活性を増強し、特異的な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を促進し、活性化されたTおよびNK細胞の増殖因子として作用し、TおよびNK細胞からのIFN-γの生産を誘導し、また、血管新生阻害剤としても機能する (Brunda, M.J., 1994, J. Leukoc Biol, 55:280-8)。IL-12は悪性疾患の治療において免疫機能賦活剤として使用できる可能性があり、特定のマウス腫瘍の成長をかなり遅らせることがわかっている (Gatelyら, 1994, Int Immunol, 6: 157-67); Nastalaら, 1994, J Immunol, 153: 1697-706)が、rmIL-12の全身投与によって脳腫瘍マウスの生存が長くなることはなかった (Kikuchiら, 1999, Int J Cancer, 80: 425- 430)。このことは、FCとrmIL-12の併用療法の抗腫瘍効果が相乗効果でありうることを示している。対照マウス由来の脳腫瘍にはリンパ球がほとんど存在していなかった。しかし、重要なことに、FCで免疫すると、リンパ球の浸潤が実質的に増加した。加えて、腫瘍部位では、腫瘍由来の免疫抑制因子（例えば、TGF-β、IL-10、プロスタグランジンE2）の濃度が高くなっており、このことは、脳腫瘍の治療にはより強力なCTLが必要とされることを示している。
【０１８６】
DCはMHC制限的に特定の抗原に対してCD4+ T細胞を感作することができる。CD4+ T細胞は細胞傷害性Tリンパ球と抗原非特異的エフェクター免疫応答の両方のプライミングに極めて重要であり、CD4+およびCD8+ T細胞はいずれも抗腫瘍免疫において等しく重要であることが示唆される。以前に報告されたように、MC38およびDCと融合させた細胞の抗腫瘍効果はCD4+およびCD8+ T細胞によって媒介された (Gongら, 1997, Nat Med, 3: 558- 61)。しかし、本発明者らの結果は、FCの抗腫瘍効果にはCD8+ T細胞が必要であること、そしてCD4+ T細胞の役割ははっきりしない、ことを実証した。Okadaら (1998, Int J Cancer, 78: 196-201) は、脳腫瘍モデルにおいてペプチドパルス化DCの抗腫瘍効果にはCD8+ T細胞のみが必要であることを報告した (Okadaら, 1998, Int J Cancer, 78: 196-201)。したがって、DCの抗腫瘍効果を媒介する細胞型は共通したものではなく、むしろ実験モデルによるのかもしれない。組織病理学的所見は、脳腫瘍にCD4+およびCD8+ T細胞がどちらも存在することを示した。CTLは、FCによるワクチン接種を開始する前に、すでにプライミングされていたと推測することができる。すなわち、CD4+ T細胞は、FCで免疫する前に、CTLのプライミングをすでに終了しており、プレCTL（プライミングされたCTL）がFCにより刺激されて、結果的に活性化CTLの誘導と抗腫瘍活性の獲得をもたらした。
【０１８７】
要するに、本発明者らのデータは、モデルマウスにおいては、FCおよびrIL-12によるワクチン接種を用いて悪性グリオーマを治療できることを示唆している。本研究では、DCを樹立された腫瘍細胞系と融合させたが、臨床的適用の場合には、DCを摘出腫瘍材料または一次培養細胞と融合させるべきである。今後の研究の関心は、DCおよび一次培養ヒトグリオーマ細胞を用いて融合させた細胞の抗腫瘍活性を特徴づけることに集中するであろう。
【０１８８】
6.2  インターロイキン-12と組み合わせた腫瘍細胞-樹状細胞ハイブリッドによる治療
肝細胞癌（HCC）は世界中で、特にアジアおよびアフリカ諸国では、最も普通に見られる癌のひとつである。この疾患は他の国では稀であるが、最近の報告によれば、HCCは西欧諸国でも次第に増加傾向にある (El-Selagら, 1999, N. Engl. J. Med., 340: 745-750)。疫学的に予想される研究から、B型肝炎ウイルス（HBV）および/またはC型肝炎ウイルス（HCV）感染とHCCとの強い病因的関連性が実証されている (Ikedaら, 1993, Hepatology, 18: 47-5; Obataら, 1980, Int. J. Cancer, 25: 741-747; Saitoら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6547-6549)。日本では、HCC患者の約76％が慢性HCV感染にかかっており、彼らの78％が肝硬変を患っていた (Liver Cancer Study Group of Japan, 1998)。肝硬変が存在することによる機能保存の低下が、腫瘍の外科的切除を制限している。その結果、治療には癌化学療法、経カテーテル的動脈塞栓術、経カテーテル的動脈化学療法、経皮的エタノール注入、および経皮的マイクロ波凝固療法が用いられてきた。しかしながら、こうした療法後の再発率は高く (Liver Cancer Study Group of Japan, 1998; Taraoら, Cancer, 79: 688-694)、それはおそらく不十分な治療効果と、肝硬変を起こしている肝臓でのHCCの多中心的発生のためであろう。
【０１８９】
本研究では、HCC細胞の接種に先だって、HCC細胞に融合させたDCでワクチン接種することによってHCC腫瘍の成長が防止されることを明らかにする。さらに、確立されたHCC腫瘍をDC/HCCで治療するには、IL-12の同時投与が必要である。IL-12が融合細胞に基づく免疫療法の有効性を増強しうるということも重要である。
【０１９０】
6.2.1  材料および方法
マウス、腫瘍細胞系、サイトカイン、および抗体
雌BALB/cマウス（8〜10週齢）はNippon SLO (静岡、日本)から購入した。マウスHCC細胞系BNLは、親切にもS. Kuriyama博士 (奈良県立医科大学、奈良、日本)から提供された。BALB/cマウスの大腸癌細胞系C26は中外製薬（東京）から提供された。マウス組換えIL-12 (mrIL-12) は親切にもGenetics Institute（Cambridge, MA）から提供された。ヒト組換えIL-2 (hrIL-2) は親切にも塩野義製薬（東京）から提供された。ネズミCD4、CD8、H-2KdおよびI-Ad/I-Edに対するラットモノクローナル抗体はPharmingen（San Diego）から購入した。
【０１９１】
DCの調製
DCは、Inabaら(Inabaら, 1992, J. Exp. Med., 176: 1693-1702)の方法に変更を加えて、調製した。簡単に説明すると、雌BALB/cマウス（8〜10週齢）の大腿骨および脛骨から骨髄細胞を取得した。赤血球細胞を0.83％塩化アンモニウム溶液で処理して溶解させた。細胞を、ヒトγグロブリン(Cappel, Aurora, OH)をコーティングしたプレート上で37℃にて1時間インキュベートした (Yamaguchiら, 1997, Stem Cell, 15: 144-153)。非付着細胞を回収し、24ウェルプレート(105細胞/ml/ウェル)上で、10ng/mlのマウス組換え顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSP）(Becton-Dickinson, Bedford, MA)および60U/mmの組換えマウスIL-4 (Becton-Dickinson)を含有する培地にて培養した。5日間の培養後、付着していないかまたはゆるく付着している細胞を温和なピペッティングにより回収し、100mmペトリ皿に移した。一晩の培養後に、浮遊している細胞を集めたが、これには多くのDCが含まれていた。このようにして得られた細胞は樹状の特徴を備えており、MHCクラスI、クラスII CD80、CD86、CD54の細胞表面発現を示したが、CD4、CD8およびCD4SRの発現は示さなかった。
【０１９２】
DCとBNL細胞との融合
DCとBNL細胞との融合は、Gongら(Gongら, 1997, Nat. Med., 3: 558-561)の方法に変更を加えて行った。簡単に説明すると、BNL細胞を35 Gyで照射し、DCと1：3（BNL：DC）の比で混合し、その後遠心分離した。細胞ペレットを50％ポリエチレングリコール（PEG 1460, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)で37℃にて１分間処理し、その後PEG溶液を温かいRPMI 1640培地で希釈した。PEGで処理した細胞は、GM-CSFとIL-4を含む培地中で37℃にて一晩培養した。
【０１９３】
細胞のFACS分析
細胞融合の効率を測定するため、BNL細胞をPKH-26（赤色蛍光）で染色し、DCをPKH-2GL（緑色蛍光）で染色した。蛍光色素で染色した細胞をPEGで処理して、上記のように一晩培養した。融合体はまた、I-Ad/I-Ed、CD80、CD86およびCD54 (Pharmingen, San Diego)に対するモノクローナル抗体とコンジュゲートさせたフルオレセインイソチオシアネート（FITC）またはフィコエリシン（phycoerythin：PE）でも染色した。FACSCaliburフローサイトメーター(Becton-Dickinson, San Jose, CA)を用いて蛍光プロファイルを作成し、Cell Questソフトウェアパッケージ(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いてヒストグラムおよび密度プロットを作成した。
【０１９４】
走査電子顕微鏡検査
0.1Mリン酸バッファー(pH7.4)中の1.2％グルタルアルデヒドにより細胞を固定した。固定した細胞を、0.1％ポリ-L-リシンをコーティングしておいたスライドガラスに付着させ、次第に増加する濃度のエタノールで脱水し、酢酸イソアミルで処理し、液体CO2で臨界点乾燥させた。標本に金（真空蒸発させ、鉄をスパッタリングした金）のコーティングを行い、JSM-35走査電子顕微鏡(Japan Electric Optical Laboratory、東京、日本)を用いて10kVの加速電圧で観察した。
【０１９５】
融合体のマウスへの注入およびIL-12の投与
腫瘍予防研究では、DC/BNL融合体をリン酸緩衝食塩水(PBS)中に懸濁させ、マウスの尾静脈に2週間の間隔をおいて2回注入した（4×105個/マウス）。2回目の免疫を行った1週間後に、106個のBNL細胞を皮下注入することで腫瘍チャレンジを行った。腫瘍の大きさ（3mmを陽性とした）を測定することにより腫瘍の発生について各週、マウスを監視した。対照マウスには、DC/BNL融合体の代わりに、リン酸緩衝食塩水(PBS)、照射BNL細胞（105個/マウス）、DC（3×105個/マウス）、または照射BNL細胞とDCの混合物（4×105個/マウス、DC：BNL比3：1）を投与し、融合体を注入したマウスと同様に腫瘍の発生について検査した。各群10匹とした。
【０１９６】
治療研究では、マウスを4群に分けた。各群10匹のマウスにBNL細胞を皮下接種した。A群には、BNL細胞接種の3日および10日後にDC/BNL融合体を皮下注入した。0.3％ウシ血清アルブミンを含むPBS中に溶解したIL-12を、1回目の融合体接種の2、4および6日後に腹腔内注射し、2回目の接種の3および5日後にも腹腔内注射した。B群のマウスもA群のマウスと同様に処置したが、B群にはIL-12を投与しなかった。C群のマウスはA群のマウスと同様に処置したが、C群には融合体を投与しなかった。D群のマウスはA群のマウスと同様に処置したが、D群にはIL-12も融合体も投与しなかった。
【０１９７】
BNL細胞に対する脾細胞の溶解活性のアッセイ
脾細胞は、スチールメッシュ上で脾臓を穏やかに破壊し、低張処理で赤血球を枯渇させることにより取得した。マウスから得られた脾細胞を、50U/mlのヒト組換えIL-2を含む10％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を添加したRPMI-1640培地中で4日間培養した。BNL細胞（104個/ウェル）は51Crで標識し、96マルチウェルプレート中200μlの容量（3回反復）にて、10％熱不活性化FCSを添加したRPMI-1640培地中で脾細胞（エフェクター細胞）と共に、示したエフェクター：標的比にて37℃、4時間インキュベートした。インキュベーション後、100μlの上清を集め、次式を用いて比51Cr放出パーセントを計算した：51Cr放出パーセント＝100×（実験cpm−自然放出cpm）／（最大放出CPM−自然放出cpm）。ここで、最大放出は0.33N HClと共にインキュベートした標的細胞から得られたものであり、自然放出はエフェクター細胞の不在下でインキュベートした標的細胞から得られたものである。マウスCD4、CD8、H-2Kd、I-Ad/I-Edに対するラットモノクローナル抗体による溶解活性の妨害を評価するために、50ug/mlの各抗体を4時間のインキュベーション中に培養物に添加した。 
免疫組織化学的研究
免疫蛍光染色は直接免疫蛍光により行った。腫瘍組織の凍結切片を作り、アセトンを用いて室温で10分固定させた。PBSで洗った後、切片をPBS中の10％正常ヤギ血清中で室温にて20分インキュベートし、その後PBS中の10％正常ヤギ血清中でPEまたはFITC標識抗体と共に暗所で室温にて2〜3時間インキュベートした。切片をPBSで洗い、蛍光顕微鏡に載せて観察した。
【０１９８】
6.2.2  結果
DCとBNL細胞の融合体の特徴づけ
DCとBNL細胞を一緒に合わせて、PEGで処理し、一晩インキュベートした。PEG処理細胞から得られた非付着細胞と付着細胞は、位相差顕微鏡で観察すると、それぞれ、樹状の特徴と上皮の特徴を示した。非付着細胞は、FACS分析により、DCマーカーのI-Ad (MHCクラスII)とCD11cを発現した（データは示してない）。付着細胞がI-AdおよびCD11c発現について陰性であるという知見は、BNL細胞が付着細胞画分中に存在することを示した。
【０１９９】
PEG処理に先だって、DCをCD11cに対するFITCコンジュゲート抗体で処理し、BNL細胞をPKH-26で染色した。これらの細胞をPEG処理して融合させ、蛍光顕微鏡で観察した。PEG処理細胞の中にFITC（緑色）とPKH-26（赤色）の両方で染色された細胞が観察された（図7）。融合効率を測定するために、DCおよびBNL細胞をそれぞれ蛍光色素PKH-2GLおよびPKH-26で染色してから、PEGで処理した。FACS分析により、PKH-2GLとPKH-26の両方で染色された細胞（DCとBNL細胞の融合体とみなした）は、高い前方散乱と高い側方散乱を有する細胞スキャッタグラムの上方域に示される（図8）。高いおよび中程度の前方散乱と低い側方散乱の細胞画分は多くの未融合BNL細胞を含んでおり、低い前方散乱と低い側方散乱の細胞画分は未融合DCと未融合BNL細胞を含んでいた（図8）。スキャッタグラム全体に占める二重陽性細胞の領域の幅から判断して、非付着細胞の約30％は融合体であった。
【０２００】
融合体の表現型をFACSで分析した。PKH-2GLとPKH-26の両方に陽性の細胞画分をスキャッタグラムでゲートし、抗原発現を調べた。I-Ad/I-Ed (MCHクラスII)、CD80、CD86、およびCD54分子は、DC上に見られるものであるが、融合体により発現されていた（図9）。
【０２０１】
さらに、走査電子顕微鏡検査から、BNL細胞は平坦な細胞表面に短い突起を発現し、一方DCは長い樹状突起をもつことがわかった。非付着融合細胞は大きくて、短い樹状突起のある卵形であった（図10）。
【０２０２】
DC/BNL融合体によるワクチン接種が腫瘍発生の防止に及ぼす効果
DC/BNL融合体によるワクチン接種は、BALB/cマウスに接種したBNL細胞によるチャレンジの拒絶をもたらした。これに対して、DCのみまたは照射BNL細胞のみを注入しても、腫瘍の発生と成長を防止することができなかった（図11）。DCとBNL細胞の混合物（融合体の作製に用いた細胞数に相当する数）を注入すると、一時的に腫瘍の成長は止まったが、4週間後には、腫瘍が対照に匹敵する速度で成長した。DC/BNL融合体を前もって注入してもC26大腸癌細胞が拒絶反応を受けないという知見は、DC/BNL融合体により引き出される免疫がBNL細胞に特異的であることを示している（データは示してない）。
【０２０３】
DC/BNL融合体によるワクチン接種が予め確立されたBNL腫瘍の治療に及ぼす効果
DC/BNL融合体で処理する3日前にBNL細胞（106個/マウス）を接種した。BNL腫瘍に対するDC/BNL融合細胞単独での処置は、その効果の点で有意でなかった（図12）。さらに、IL-12 (200ng/マウス、腹腔内)単独の全身投与も、BNL細胞の成長に何の治療効果も及ぼさず、腫瘍は接種後7週間以内に全てのマウスで認められた。ところが、DC/BNL融合体の注入に続いてIL-12を投与すると、顕著な抗腫瘍効果が誘起された。7匹のマウスのうち4匹がBNL腫瘍の発生を示さなかった。すなわち、BNL細胞接種後7週間での腫瘍発生率は43％（3/7）であった。このプロトコルにおいてIL-12の用量を増加させても低下させても、抗腫瘍効果の改善は得られなかった。
【０２０４】
DC/BNL融合体とIL-12で処置したマウスにおけるBNL細胞に対する脾細胞の溶解活性
BNL細胞に対する顕著な細胞溶解活性が、DC/BNL融合体で処置したマウス由来の脾細胞を用いて観察された（図13）。DC/BNL融合体とIL-12の両方で処置したマウス由来の脾細胞は、DC/BNL融合体のみで処置したマウス由来の脾細胞と比べて、BNL細胞に対する細胞溶解活性が強かった。これに対して、C26大腸癌細胞に対する細胞溶解活性の証拠はまったくなかった（図14）。
【０２０５】
融合体によるワクチン接種により誘導されたエフェクター細胞の同定
DC/BNL融合体を用いて免疫したマウス由来の脾細胞を、CD4、CD8、H-2KdおよびI-Ad/I-Edに対する抗体の存在下で、BNL細胞に対する溶解活性について試験した。CD4に対する抗体で処理した脾細胞の溶解活性は著しく低下したが、CD8に対する抗体で処理した脾細胞の溶解活性は、アイソタイプが同一の抗体であるラットIgG2aで処理したものとほぼ同じ溶解活性を示した（図15A）。融合体処置マウス由来の脾細胞の溶解活性は、BNL細胞をI-Ad/I-Edに対する抗体で処理したとき顕著に阻害されたが、H-2Kdに対する抗体で処理したときは阻害されなかった。こうした結果は、DC/BNL融合体を用いた免疫により誘導されるエフェクター細胞がCD4+ CTLであり、細胞傷害性がMHCクラスII依存性であることを示唆している。
【０２０６】
融合体処置マウスにおいて成長するBNL腫瘍に関する免疫組織化学的研究
前もってDC/BNL融合体を注入したにもかかわらず成長するBNL腫瘍について、免疫組織化学的手法により、CD4+細胞の浸潤およびI-Ad/I-Edの発現、ならびにICAM-1を調べた。この研究では、DC/BNL融合体を2週間の間隔をおいて2回皮下注入した。融合体の2回目の注入の7日後にBNL細胞（109個/マウス）を皮下に接種した。
【０２０７】
小さな腫瘍が現れたとき、数匹のマウスを200ngのIL-12で1週間に3回処置した。3回目のIL-12投与の1日後に腫瘍を切除した。IL-12を投与した融合体処置マウスに形成された腫瘍中にCD4+細胞が検出された。これに対して、融合体のみで処置したマウスに形成された腫瘍にはCD4+細胞がほとんど見られなかった。I-Ad/I-Ed分子は、IL-12の投与を受けたマウスに形成されたBNL腫瘍により多く発現されていた。
【０２０８】
また、CD54（細胞間接着分子1；ICAM-1）もIL-12で処置したマウスのBNL腫瘍上に高レベルで発現されていた。これらの結果は、DC/BNL融合体を用いた免疫により誘導された、BNL細胞と反応性のエフェクター細胞がCD4+ CTLであることを示唆している。さらに、IL-12による処置が、MHCクラスIIおよびICAM-1分子の発現増加により、CD4+ CTLに対する腫瘍細胞感受性を引き出している。
【０２０９】
6.2.3  考察
DCは強力な抗原提示細胞であって、腫瘍抗原をナイーブT細胞に提示して、それらの細胞を該抗原に対して感作することができる (Grabbeら, 1995, Immunolo. Today, 16: 117-121; Shurin, M.R., 1996, Cancer Immunol., 43: 158-164)。癌免疫療法の目下の関心事は免疫治療剤としてのDCの利用である。DCは外因性抗原を処理して、CD4+ T細胞だけでなくCD8+ T細胞にも該抗原を提示することができるので、DCに腫瘍溶解液または抗原性ペプチド（腫瘍細胞表面上のMHC分子によって運ばれる）を負荷することによって誘発される抗腫瘍免疫は有望な抗腫瘍戦略となりうる (Pagliaら, 1996, J. Exp. Med., 183: 317-322; Mayordomoら, 1995, Nat. Med., 1: 1297-1302; Celluzziら, 1996, J. Exp. Med., 183: 283-287, Zivogelら, 1996, J. Exp. Med., 183: 87-97; Nestleら, 1998, Nat. Med., 4: 328-332; Porgadorら, 1995, J. Exp. Med., 182: 255-260)。
【０２１０】
腫瘍細胞に融合させたDCが抗腫瘍免疫を引き出すことはすでに報告されている (Gongら, 1997, Nat. Med. 3: 558-561)。この場合には、融合細胞が腫瘍抗原の抗原性エピトープをナイーブT細胞に提示し、これらの抗原に対してT細胞を感作する。その理由は、融合細胞が腫瘍細胞の抗原性エピトープを担持すると同時に、MHCクラスIおよびクラスII分子、共刺激分子(CD80、CD86)、ならびに細胞間接着分子-1（ICAM-1）の発現を保持するからである。 
自己由来のDCと腫瘍細胞とを融合させることにより、MHC制限のような抗腫瘍免疫の誘導に対する障害、腫瘍抗原のユニークな突然変異(Robbinsら, 1996, J. Exp. Med., 183: 1185-1192; Brandleら, 1996, J. Exp. Med., 183: 2501-2508)、および腫瘍特異的エピトープの多重性が取り除かれる。さらに、ペプチド-パルス化DCの問題、例えば、パルス化抗原性ペプチドのMHC分子に対する低親和性(Banchereauら, 1998, Nature, 392: 245-252)およびペプチド-パルス化MHCクラスI分子の短命(Cellaら, 1997, Nature, 388: 782-792)が、融合体に基づく免疫感作においては問題にならない。さらに、細胞融合に必要なBNL細胞の数がDCの半数から3分の1の数ですむ。必要となる腫瘍細胞の数が少ないということは、融合体に基づく免疫療法を臨床上用いる場合に有利である。DCの融合相手の供給源としては、腫瘍生検のときに得られる腫瘍細胞で十分でありうる。
【０２１１】
DC/癌細胞融合体を臨床上使用する場合には、PEGで処理することによるDCと腫瘍細胞との融合効率ならびに癌細胞の排除を評価することが重要である。非付着細胞はDCマーカーであるI-AdおよびCD11cを示したが、付着細胞は示さなかった。このことは、非付着細胞画分が融合細胞とDCを含み、大部分の付着細胞はDCと融合されなかったBNL細胞であることを示している。非付着細胞画分中には、位相差顕微鏡検査および走査電子顕微鏡検査により、DCより大きな多樹状細胞（multi-dendritic cells）が観察された。2色FACS分析からは、PEG処理した非付着細胞のおよそ30％がPKH-2GLとPKH-26の両方に陽性であることがわかった。両方の蛍光色素に陽性の細胞は、抗原提示に必要なMHCクラスII、CD80、CD86およびCD54を発現した。したがって、融合体はDCの能力によってBNL腫瘍抗原をナイーブT細胞に提示することができると予想される。BALB/cマウスのDC/BNLによる免疫感作は、BNL細胞チャレンジからの防御と関連していた。免疫したマウス由来の脾細胞はBNL細胞に対して顕著な溶解活性を示した。対照的に、脾細胞がC26マウス大腸癌細胞に対して溶解活性を示さないという知見は、抗腫瘍免疫がBNL細胞に特異的であることを示している。DCとBNL細胞の混合物（PEGで処理しなかった）を用いて免疫したマウスは、DC/BNL融合細胞で免疫したマウスよりもBNL細胞チャレンジからの防御が弱かった。Celluzzi, C.M.およびFalo, L.J. (1998, J. Immunol, 160, 3081-5) は、DC/B16メラノーマ細胞融合体と、DCおよびB16メラノーマ細胞の混合物との間に、抗腫瘍免疫の差はないと報じた。この矛盾は、BNL HCC細胞とB16メラノーマ細胞との抗原性の違いによるのかもしれない。
【０２１２】
IL-12は、もともとは細胞傷害性リンパ球成熟因子 (CLMF) (Sternら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6808-6812) またはナチュラルキラー細胞刺激因子 (NKSF) (Kobayashiら, 1989, J. Exp. Med., 170: 827-845)と呼ばれていた、ヘテロ二量体（p35/p40）のサイトカインである。IL-12はナイーブ前駆細胞のTH1細胞（抗腫瘍免疫を引き出す）への分化において非常に重要な役割を果たしている (Taharaら, 1995, Gene Ther., 2: 96-106; Dustinら, 1986, J. Immunol., 137: 245-254; Schmittら, 1994, Eur. J. Immunol., 24: 793-798)。高レベルのIL-12を産生する樹状細胞は、ナイーブヘルパーT細胞がTH1に分化するように誘導する (Macatoniaら, 1995, J. Immunol., 154: 5071-5079)。DC/BNL融合体とIL-12との組合せで処置したマウス由来の脾細胞は、BNL細胞に対して、DC/BNL融合体のみで処置したものよりも高い細胞溶解活性を示した（図14）。特定の抗原で刺激しかつCD80およびCD86を介して共刺激したヘルパーTリンパ球はIL-12受容体を発現する (Igarashiら, 1998, J. Immunol., 160: 1638-1646)。腫瘍ペプチドでパルスしたDCを用いて免疫し、かつIL-12を全身投与すると、有効な抗腫瘍免疫が引き出される (Zitvogelら, 1996, Anal. New York Acad. Sci., 795: 284-293)。IL-12によって誘導されたIFN-γは、プロテオソームの機能を高め、また、DCによる抗原提示の効率 (Griffinら, 1998, J. Exp. Med., 187: 97-104)、そしておそらくは融合細胞による抗原提示の効率も、増強するだろう。本研究では、IL-12のみを全身投与しても、予め確立されたBNL腫瘍に対して何の影響もなかった。IL-12処理によるCTLまたはNK細胞の非特異的活性化は、抗腫瘍活性を引き出すのに十分ではないようである。本研究はまた、DC/腫瘍細胞融合体を用いた免疫による特異的CTLの誘導、および誘導されたCTLのIL-12による活性化が有効な腫瘍特異的抗腫瘍免疫を生み出すことも実証している。さらに、DC/腫瘍細胞融合体はTh1状態を引き出すのに十分なIL-12を産生できないと予想される。ナイーブTヘルパー細胞に特定の抗原を提示するDCから産生され放出されたIL-12はTh1細胞を活性化する (Macatoniaら, 1995, J. Immunol., 154: 5071-5079)。IL-12を産生するDCの能力が細胞融合によって弱められる場合には、融合体で免疫した宿主へのIL-12の全身投与がTh1細胞の発生と特定のCTLの生成に役立ちうる。別の可能性として、融合体による抗原提示がTh2応答とIL-10（IL-12生産の阻害剤）の分泌を引き出すことが考えられる (Hinoら, 1996, Eur. J. Immunol., 26: 623-628)。IL-12の全身投与はTh2応答を阻害し、また、殺腫瘍性CTLを生成させる可能性がある。
【０２１３】
融合体で処置したマウス由来の脾細胞の細胞溶解活性は、脾細胞をCD4に対する抗体で処理し、標的細胞をI-Ad/I-Edに対する抗体で処理することにより、阻害された。これらの知見は、BNL特異的エフェクター細胞がCD4+ CTLであり、細胞傷害性がMHCクラスII依存性であることを示唆している (Shinohara N., 1987, Cellular Immunol., 107: 395-407; Ozdemirliら, 1992, J. Immunol., 149: 1889-1885; Yasukawaら, 1993, Blood, 81: 1527-1534)。DCは特定の腫瘍抗原をCD8+ CTLに提示し、殺腫瘍活性はMHCクラスI依存性である (Porgadorら, 1995, J. Exp. Med., 182: 255-260)。CD4+ CTLは一般的ではないが、CD4+ CTLはCD8+ CTLとほぼ同じ様式で作用する (Yasukawaら, 1993, Blood, 81: 1527-1534)。この研究では、細胞溶解活性がエフェクター細胞をCD8に対する抗体で処理しても、標的細胞をMHCクラスIに対する抗体で処理しても、阻害されなかった。BNL腫瘍上でのMHCクラスII（I-Ad/I-Ed）分子のin vivo発現は、BNL担持マウスをIL-12で処理したとき非常に増大した。この応答はインターフェロン-γ、腫瘍壊死因子(TNF)、またはインターロイキン-1の誘導によるのかもしれない (Gatelyら, 1994, Int. Immunol., 6: 157-167; Nastalaら, 1994, J. Immunol., 153: 1697-1706)。MHCクラスII分子の発現が増加すると、BNL腫瘍抗原からの抗原性ペプチドのCD4+ CTLへの曝露が増加する。さらに、BNL腫瘍組織によるICAM-1の発現も、腫瘍担持マウスをIL-12で処理することによりさらに増加した。この効果もIFN-γまたはIL-1の直接作用によるものであるか、またはIL-12によって間接的に誘発されるのであろう (Dustinら, 1986, J. Immunol., 137: 245-254)。これらの結果は、IL-12処理によってより効果的に、CTLが腫瘍の内皮細胞に付着して、腫瘍組織の中に移動することができる（これは、確立された病変に対する抗腫瘍活性の増加につながる）ことを示唆している。
【０２１４】
多中心性HCCの発生および度重なる再発は、ウイルス誘導肝硬変の患者にとって重大な問題である。したがって、HCCの発症を防止する方法が必要とされている。小さなHCCは超音波検査法で検出して、経皮的エタノール注入療法または外科的切除により治療することができる。新たなHCCの発生を防止しかつ残存する微小転移を治療するために、生検または切除により得られた腫瘍細胞をDCと融合させることができる。かくして、本実施例で示したように、自己由来のDCと腫瘍細胞との融合体で免疫すると同時にIL-12を投与する方法は、有望なHCCの治療方法となる。
【０２１５】
6.3  樹状細胞とグリオーマ細胞の融合体および組換えヒトインターロイキン-12によるグリオーマ患者のワクチン接種
概要
攻撃的な治療にもかかわらず、悪性度の高い星状細胞腫の患者の平均生存期間は約1年である。本研究では、悪性グリオーマの治療のために組換えヒトインターロイキン-12（rhIL-12）と組み合わせた樹状細胞とグリオーマ細胞の融合体を用いる免疫療法に対する安全性および臨床反応について検討した。本研究に参加したのは、15人の悪性グリオーマ患者であった。樹状細胞は末梢血から得た。培養自己由来グリオーマ細胞は、それぞれの場合に外科標本から確立した。ポリエチレングリコールを用いて樹状細胞とグリオーマ細胞から融合細胞を作製した。全ての患者に融合細胞（FC）を皮内注入した（1日目）。rhIL-12を3日目と7日目に同部位に皮下注射した。この治療に対する応答を臨床観察とX線所見により評価した。重大な有害作用は認められなかった。4人の患者では、核磁気共鳴画像により腫瘍サイズの50％を超える退縮が示された。1人の患者の応答は混合型であった。臨床反応は自己由来腫瘍に対する細胞溶解性T細胞の誘導と関連していた。これらの結果から、FCとrhIL-12は悪性グリオーマ患者において免疫反応と臨床的に有意な抗腫瘍効果とを安全に引き出すことが実証される。
【０２１６】
はじめに
悪性星状細胞腫は成人では最も普通に見られる原発性の脳腫瘍である。外科的切除、放射線療法、および細胞毒性化学療法を用いた攻撃的な治療にもかかわらず、悪性度の高い星状細胞腫の患者の平均生存期間は約1年である。したがって、生存を長引かせる新規治療法が必要とされている。免疫療法はそのような新規治療法のひとつであり、脳腫瘍をはじめとする様々なタイプの腫瘍に関して研究されている。
【０２１７】
樹状細胞（DC）は、T細胞を活性化するという特殊な能力を備えた、専門的な抗原提示細胞（APC）である。DCは高レベルの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）、接着分子および共刺激分子を発現する2。ヒトDCとマウスDCの効率的な単離および調製が可能になっている3 4。抗腫瘍免疫の誘導のためにDCを用いるいくつかの方法が検討されており、腫瘍細胞から抽出したタンパク質またはペプチドでパルスしたDC 5 6 7、腫瘍関連抗原（TAA）をコードする遺伝子でトランスフェクトしたDC 8、腫瘍細胞と共に培養したDC 9、および腫瘍細胞と融合させたDC 10 11 12 13などがある。これらのアプローチのいくつかではTAAが既知である必要がある。しかしながら、1)融合細胞（FC）は未知のTAAに対する抗腫瘍免疫を引き出すことができ、さらに、2)グリオーマのTAAはまだ同定されていないため、FCの採用は悪性グリオーマの有用な治療アプローチを提供する可能性がある。これに関して、FCによるワクチン接種は脳腫瘍マウスの生存を長引かせることがわかっている 11。
【０２１８】
以前に報告されたように、DCと培養自己由来グリオーマ細胞から作製したFCのフェーズI臨床試験の結果は、この治療が免疫応答を安全に引き出すことを示した14。しかしながら、この治療に関連した応答率の統計的有意性は示されなかった。マウス脳腫瘍モデルの研究では、組換えインターロイキン12（rIL-12）の全身投与がFCの抗腫瘍効果を高めることが実証された11。IL-12は、最初はナチュラルキラー細胞刺激因子または細胞傷害性リンパ球成熟因子として知られていたもので、ナチュラルキラー(NK)/リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞の溶解活性を高め、特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を促進し、活性化TおよびNK細胞の増殖因子として作用し、TおよびNK細胞からのIFN-γの産生をうながし、さらに血管新生の阻害剤としても作用する15。本研究では、rhIL-12および自己由来グリオーマ細胞と融合させた樹状細胞を接種した、15人の再発性悪性グリオーマ患者の結果について説明する。このアプローチの安全性、実施可能性、ならびに免疫応答および臨床応答について述べる。
【０２１９】
患者および方法
患者の選別
臨床試験のために、次の包括基準を用いて患者を選別した。すなわち、1)世界保健機構の基準に従う、組織学的に証明されたグリア芽細胞腫、未分化星状細胞腫、または他の悪性グリオーマ；2)カルノフスキー・パフォーマンス・ステイタス（Karnofsky performance status）≧70％；3)年齢≧19；4)腫瘍が放射線療法および/または化学療法にもかかわらず進行する；5)前もって4週間の間、抗腫瘍化学療法または放射線療法を受けていない；6)核磁気共鳴画像(MRI)またはコンピュータ断層写真(CT)により検出できる残留腫瘍；および7)培養自己由来腫瘍細胞が利用可能。全ての患者にインフォームドコンセント（説明と同意）を実施し、本研究について慈恵大学の倫理委員会による承認を得た。治療は慈恵大学の神経外科部で行った。患者の募集は2001年7月に開始した。29才から64才まで（平均45才）の15人の患者を登録した。彼らの特徴を表１にまとめてある。免疫療法中にステロイドは投与しなかった。中央値カルノフスキー・パフォーマンス・スケールは90％（70〜100％の範囲）であった。
【表１】
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【０２２０】
末梢血からの樹状細胞の取得
樹状細胞は、以前に記載されたとおりに末梢血から分離した14。簡単に説明すると、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離を用いて末梢血（50ml）から末梢血単核細胞（PBMC）を分離した。PBMCをRPMI 1640培地 (Sigma, St. Louis, MO)に懸濁させ、24ウェルクラスタープレートに付着させた。非付着細胞を37℃で2時間後に分離し、続いて付着細胞をX-VIVO15培地 (BioWhittaker, Walkersville, MD)中で9日間培養した。ただし、X-VIVO15培地には1％熱不活性化自己由来血清、10ng/mlの組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF; Becton Dickinson, San Jose, CA）、10U/mlの組換えヒトインターロイキン-4 (IL-4; Becton Dickinson)、および10ng/mlの腫瘍壊死因子-α (TNF-α; Becton Dickinson)を添加した。この培養物に3日ごとに新しい培地を供給し、必要に応じて分割した。その後、半付着および非付着細胞を激しくピペッティングして回収し、融合用のDCとして使用した。
【０２２１】
外科標本からの培養グリオーマ細胞の取得
腫瘍細胞の単細胞懸濁液は、以前に記載されたとおりに酵素的消化により取得した14。簡単に説明すると、それぞれの切除腫瘍を外科から集め、無菌条件下で取り扱った。壊死組織、脂肪組織、凝固した血液、正常に見える組織を除去し、残りの標本を外科用ナイフで小片に切り刻んだ。切り刻んだ組織を、ディスパーゼ(103U/ml; Goudou Inc., 東京, 日本)を入れたフラスコ内で室温にて30分間、機械的撹拌により解離させた。得られた混合物を、10％ウシ胎児血清（FCS, GIBCO, Gaithersburg, MD）を含むDulbecco's MEM (Cosmo Bio)中に1×105個/mlで再懸濁させた。この細胞を5％CO2中37℃で培養した。
【０２２２】
融合細胞の作製
以前に記載されたとおりにDCをグリオーマ細胞と融合させた14。簡単に説明すると、DCを致死的に照射した（300 Gy, Hitachi MBR-1520R, 線量率: 1.1 Gy/min）自己由来グリオーマ細胞と混合した。DCとグリオーマ細胞の比は、得られたDCとグリオーマ細胞の数に応じて、3：1から10：1とした。融合は、ポリエチレングリコール(PEG; Sigma)の50％溶液500μlを60秒間、滴下することで開始させた。融合を停止させるために、無血清RPMI培地を段階的に添加した。リン酸緩衝食塩水(PBS; Cosmo Bio)で3回洗った後、FCを100mmペトリ皿上にRPMI培地中GM-CSF、IL-4、およびTNF-αの存在下で24時間培養した。
【０２２３】
融合効率を測定するために、DCとグリオーマ細胞をそれぞれPKH-2 (Sigma) と PKH-26 (Sigma)で染色してから、上記のように融合させた。融合細胞をバッファー（PBS中の1％BSA、0.1％アジ化ナトリウム）中に再懸濁させ、FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使って解析した。二重陽性細胞が融合細胞であると判定した。融合効率は次のように算出した：融合効率＝二重陽性細胞／全細胞×100（％）。 
研究デザインおよびワクチン接種計画
本研究の主な終点は、FCとrhIL-12を用いたワクチン接種の実施可能性と毒性を評価することであった。二次的な終点は、ワクチン接種法によって誘発される免疫応答、X線応答、および臨床応答を評価することであった。本研究プロトコルは慈恵大学の倫理委員会により承認された。処置前に、全ての患者にインフォームドコンセントを提供し、1日目にFCを全患者に投与した。全部で3.6〜32.3×106個のFCを注入した。FCを0.3mlの生理食塩水中に懸濁させ、次いで頸部リンパ節の近くに皮内注入した。3日目と7日目に、rhIL-12 (30ng/kg、Wyeth Research (Cambridge, MA)から得た) を同部位に皮下注射した。この処置を2週間ごとに6週間繰り返した。進行性疾患または主要臓器へのグレード3もしくは4の毒性が認められないとき、1回目の6週コースで最後にrhIL-12を投与してから2〜5週間後に開始して、患者に2回目の6週コースを施すことができた（図16）。即時毒性と遅延毒性について患者をモニターし、48時間目に注入部位を検査した。全ての毒性は国立がん研究所の共通毒性基準（National Cancer Institute Common Toxicity Criteria）を用いてグレードごとに分類した。この処置に対する応答は臨床観察およびX線所見により評価した。処置前と最初の免疫感作の6週および10週後にMRIまたはCTを行って頭蓋内病変を評価した。その後2ヶ月おきにMRIまたはCTを実施した。腫瘍サイズはMRIまたはCTで認められた異常な拡大領域の体積として概算した。応答は次の4つのカテゴリーのうちの1つとして分類した：1)腫瘍全体の消失として定義される完全な応答(CR)；2)腫瘍サイズの50％以上の退縮として定義される部分的応答(PR)；3)腫瘍サイズの50％未満の減少または25％未満の増加として定義される変化なし(NC)；4)腫瘍サイズの25％以上の増加として定義される進行性疾患(PD)。
【０２２４】
細胞表面分析
PBMCをリン酸緩衝食塩水(PBS)中の1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％アジ化ナトリウム中に懸濁させ、抗ヒトCD3、CD4、CD8、CD16、CD19、およびCD56モノクローナル抗体 (Pharmingen, San Diego, CA) を用いて4℃で30分間染色した。染色した細胞をPBSで洗ってFACScanフローサイトメーターで分析した。
【０２２５】
51Cr放出アッセイ
末梢血リンパ球（PBL）の溶解活性を標準的な51Cr放出アッセイでin vitro試験した。PBLの単細胞懸濁液を10％ FCS-RPMIで洗い、6ウェルプレートにて同培地中に1×107個/mlの密度で再懸濁させた（0日目）。塩野義（大阪、日本）から提供された組換えヒトIL-2（10U/ml）を培養物に1日おきに添加した。培養開始の4日後、細胞を回収してCTL活性を調べた。標的細胞を51Crと共に37℃で90分間インキュベートして標識し、次いでエフェクターリンパ球と一緒に4時間培養した。リンパ球数が限られているため、エフェクター：標的比を80：1とした。全ての測定を3回繰り返して行い、溶解パーセントを次式により求めた：（実験cpm−自然発生cpm／最大cpm−自然発生cpm）×100％。
【０２２６】
インターフェロン-γ（IFN-γ）についての細胞内染色
PBLの単細胞懸濁液を10％ FCS-RPMIで洗い、6ウェルプレートにて同培地中に1×107個/mlの密度で再懸濁させた（0日目）。組換えヒトIL-2（10U/ml）を培養物に1日おきに添加した。培養開始の4日後、細胞を回収してCTL活性を調べた。PBLを、標識した抗ヒトCD8および抗ヒトIFN-γ抗体(Pharmingen)で染色したが、その際FIX AND PERM CELL PERMEABILIZATION REAGENTS (CALTAG Lab., Burlingame, CA)をメーカーの使用説明書に従って使用した。染色した細胞をPBSで洗ってFACScanフローサイトメーターで分析した。
【０２２７】
光学顕微鏡解析および免疫組織化学的解析
2ケース（ケース1および6）では、内部減圧のためにワクチン接種後に腫瘍を切除した。ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）を用いて染色したホルマリン固定パラフィン包埋切片の通常の光学顕微鏡評価に加えて、免疫病理学的検査も行った。パラフィンブロックの連続切片をアビジン-ビオチンイムノペルオキシダーゼ法により免疫染色した。腫瘍浸潤性リンパ球は抗CD4抗体と抗CD8抗体(Becton Dickinson)を用いて検出した。
【０２２８】
結果
ワクチンの製造および特徴づけ
融合効率（FE）を評価するために、DCとグリオーマ細胞をそれぞれPKH2およびPKH26で染色し、PEGにより融合させた。二重陽性細胞が融合細胞であると判定した。代表的なケースを図17に示す。二重陽性細胞（FC）の比率は66.2％であった。一方、PKH2陽性細胞（未融合腫瘍細胞）は1％より少なかった。このことは、患者に注入した細胞が主にFCと未融合DCから成ることを示唆している。PEGを用いないで融合させた場合には二重陽性細胞が検出されなかった（データは示してない）。
【０２２９】
ワクチンの投与
5人の患者に、FCとrhIL-12による皮内ワクチン接種を少なくとも2コース行った。ケース1、5および9には3コースのワクチン接種を施した。接種したFCの合計数は13.7×106個（平均）であり、3.6×106個から3.2×107個までの範囲であった（表2）。rhIL-12の合計投与量は15.7μg（平均）であり、6.0μgから37.8μgまでの範囲であった（表2）。
【０２３０】
ワクチン接種の毒性
FCとrhIL-12によるワクチン接種は全ての患者に十分に受け入れられた。重大な有害作用、自己免疫反応の臨床上の徴候、または通常の血液検査（リンパ球の絶対数を含む）の結果の大きな変化は認められなかった。4人の患者（ケース1、2、9および11）では一過性のグレード1の発熱が見られた。ケース7では、第2コースの治療の間に全身痙攣が1回発生した。痙攣と免疫療法の間に何らかの因果関係があったのか否かは不明のままである。13ケースでは、第1コースの間に2回目および/または3回目のFC免疫を行った後、注入部位に紅斑としこりが認められ、これは遅延型過敏性反応を示唆する。第2コースにおいては、全ての患者が注入部位に紅斑としこりを発生した。一過性の肝機能障害が6ケースに、白血球減少症が7ケースにそれぞれ発生したが、有害作用が原因で治療を断念した患者はいなかった。
【０２３１】
臨床上の応答
臨床応答データを表2に示す。4ケースが症状の悪化を経験した。ケース4、10および12では、第1コースのワクチン接種の終了時に患者の意識レベルが悪化した。ケース6では、本研究中に片側不全麻痺が悪化した。両ケースとも、ステロイド投与の必要性のため治療を中断した。残りの11人の患者では、臨床徴候が治療前に認められず、治療中に悪化しなかった。X線所見から、4人の患者は部分的応答を示した（PR；ケース1、2、9および15）ことがわかった。1人の患者は混合型の応答を示し（MR；ケース3）、2人の患者は安定した疾患を示した（ケース5および7）。
【表２】
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【０２３２】
ケース1では、術後の化学療法および放射線療法にもかかわらず、最初の手術の2ヶ月後に腫瘍が再発した（図18A、B）。rhIL-12を投与せずにFCを投与したが、腫瘍の成長には何の影響もなかった。したがって、FCとrhIL-12を用いる併用療法を2001年7月に開始した。T1強調画像（T1-weighted image）での腫瘍の大きさは、最初の免疫を行ってから4ヶ月までに70.2％減少した（図18C）。T2強調画像上の腫瘍のまわりの高強度域は、最初の免疫を行ってから4週間で減少した（図18D）。腫瘍の再発により、最初の免疫を行ってから6ヶ月後（2002年1月）に外科的摘出が必要となった。この標本を培養した後、DCと新たに確立されたグリオーマ細胞から作製したFCを用いた1コースのワクチン接種をrhIL-12と共に投与した。しかし、症状の悪化と腫瘍サイズの進行のために治療を中断した。患者3では、T2強調画像上の腫瘍のまわりの高強度域が最初の免疫後6週間で減少した（図19）が、T1強調画像での減少は明らかでなかった（データは示してない）。したがって、このケースはMRというカテゴリーに分類された。
【０２３３】
病理学的応答
ケース1および6では、成長している腫瘍を摘出するための手術を免疫後に行った。両ケースとも、再発性腫瘍標本（図20B、D）では、原発性腫瘍（図20A、C）と比べてより大きな腫瘍細胞（多数の核および拡張した細胞質を含む）が数多く観察された。これらの患者には、腫瘍領域へのCD8+ Tリンパ球の強力な浸潤も認められた（図20F、H）が、これはワクチン接種前に得られた腫瘍標本では明らかでなかった（データは示してない）。対照的に、CD4+ T細胞の浸潤は見られなかった（図20E、G）。
【０２３４】
免疫学的応答
7ケースにおいて免疫療法の前と後にFACScanを用いてPBLの表面表現型を分析した。CD3、4、8、16、19、および56の発現について分析した。療法の前と後でそれぞれの表面表現型の比率に大きな変化はなかった（データは示してない）。その後、免疫療法が自己由来グリオーマ細胞に対するPBLの応答に影響するかを分析した。PBLの細胞溶解活性は、ケース1〜8では標準的な51Cr放出アッセイを用いてin vitroで検査した。免疫前と免疫後8〜10週に採取した血液からPBLを分離した。2ケース（ケース1および2）では、自己由来腫瘍細胞に対する細胞溶解活性が処置後に増加していたが、他のケースでは、細胞溶解活性が処置後にほとんど存在していなかった（図21）。ケース6では、処置後の細胞溶解活性が処置前のそれより低かった。ケース9〜15では、PBLの細胞溶解活性をIFN-γの細胞内染色を用いてin vitroで検査した。ケース15では、二重陽性細胞の比率が処置後に増加したが、他のケースでは、二重陽性細胞の比率は処置前にも処置後にもほぼゼロであった（図22）。
【０２３５】
考察
グリオーマに対するワクチン接種のためのAPCとして遺伝子操作グリオーマ細胞を使用することができるが、その抗腫瘍効果はマウスモデルで確立された脳腫瘍を根絶するのに不十分である16 17。しかし、DCとグリオーマ細胞から作製した融合体を皮内注入すると、脳腫瘍マウスの生存が長期化する11。本研究では、FCを用いてグリオーマの免疫療法の臨床試験を行なった。以前に報告されているように、DCと培養自己由来グリオーマ細胞から作製したFCのフェーズI臨床試験の結果は、この処置が抗腫瘍免疫応答を安全に引き出すことを示した14。ところが、処置関連応答率の統計的有意差は報告されなかった。マウス脳腫瘍モデルでの研究は、rIL-12の全身投与がFCの抗腫瘍効果を増強することを実証した11。
【０２３６】
この方法の処置効率は30％（CR+PR/全ケース）であり、このことは、FCとrhIL-12の抗腫瘍効果がFC単独のそれよりも強力であることを示している。これらのデータは、マウス脳腫瘍モデルでの実験からの結果（ここでは、FCとrIL-12の投与が、FCまたはrIL-12単独の投与と比べて、脳腫瘍マウスの生存を著しく長引かせた11）と適合する。マウス脳腫瘍モデルでは、ワクチン接種マウスの腫瘍中に多くのCD4+およびCD8+ T細胞が検出された。本結果では、免疫後に切除した再発性腫瘍の病理学的所見から、CD8+ Tリンパ球の浸潤が明らかになったが、CD4+ Tリンパ球の浸潤は見られなかった。51Cr放出アッセイでは、抗腫瘍CTL活性がPRを示した2ケース（ケース1および2）においてワクチン接種後に増加していた。こうしたデータは、FCとrhIL-12の抗腫瘍効果が主にCD8+ 細胞傷害性Tリンパ球により誘導されることを実証している。反対に、ケース4および6では、自己由来グリオーマ細胞に対するCTL活性が処置後に低下していた。両ケースとも、症状の悪化と腫瘍サイズの進行のため療法を中断した。免疫学的応答が低下した理由として、以下が考えられる：1)免疫学的反応性を抑制する腫瘍の進行、および/または、2)ワクチン接種によって誘導された腫瘍に対する寛容性。
【０２３７】
興味深いことに、2ケース（ケース1および3）では、T2強調画像上の腫瘍のまわりの高強度域が最初の免疫を行った後4週間で低下し、ケース1では、この所見に続いて、T1強調画像上の腫瘍の縮小も見られた。FC単独で処置した8ケースのうち1ケースにおいて、T2強調画像上の腫瘍のまわりで高強度域が低下したことは以前に報告されている14。T2強調画像上の高強度域は、グリオーマ細胞が腫瘍周辺に移動することによって生じる。かくして、抗腫瘍免疫が引き出されると、結果的に、周辺に移動する腫瘍細胞の活動を停止または阻止することとなる。同様に、血管透過性が影響を受け、それによって腫瘍体積の減少に寄与する。
【０２３８】
rhIL-12はいくつかの臨床試験で悪性腫瘍患者において検討されている18。通常見られる毒性としては、発熱、寒気、肺への毒性、抑うつ、および胃腸の出血が挙げられる。分析室変化には、貧血、白血球減少症、および肝機能障害が含まれる。rhIL-12の最大許容量は以前には500〜1000ng/kgと報告されたが、本研究ではrhIL-12用量を30ng/kgとした。低用量のrhIL-12を投与した理由は、FCとrhIL-12が組み合わさって共働的に有害作用を引き起こした可能性があるからである。自己免疫反応のような重大な有害作用は認められなかった。
【０２３９】
本研究で説明した処置の利点としては、1)FCを用いて未知のTAAに対する抗腫瘍免疫を引き出すことができる、および2)自己免疫反応が誘導される証拠がない、ことが挙げられる。ひとつの欠点は、培養グリオーマ細胞が必要なことである。KuglerらはDCと新鮮な腎癌細胞との融合体を報告した12が、本発明者らはDCと培養グリオーマ細胞とを融合させた。本発明者らの方法では正常細胞との融合が回避され、その代わりに、最初の手術で切除した標本から確立されたグリオーマ細胞が融合相手として使用された。再発性腫瘍のTAAは培養腫瘍細胞のTAAとは同じでない可能性があり、これは、FCによって誘導されたCTLが培養腫瘍細胞のTAAと同じものを発現している腫瘍細胞だけを殺す「逸脱現象」（escape phenomenon）をもたらす。したがって、本発明者らの試験では逸脱現象が患者の疾病進行の一因であった可能性がある。
【０２４０】
rhIL-12およびFC（DCと培養自己由来グリオーマ細胞を含む）の本臨床試験の結果は、この処置が免疫応答を安全に引き出すことができ、しかも高い処置関連応答率が達成されることを示している。FCと高用量rhIL-12 (60〜100ng/kg)の組合せはより良い成果をあげるかもしれない。したがって、これまで重大な有害作用は何も観察されていないので、用量を次第に多くする研究が計画される。
【０２４１】
参考文献
1. Brandes A, Soesan M, Fiorentino MV. Medical treatment of high grade malignant gliomas in adults: an overview. Anticancer Res 1991; 11(2): 719-27. 
2. Steinman RM. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 1991; 9: 271-96. 
3. Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R,ら Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat Med 1998; 4(3): 328-32. 
4. Reeves ME, Royal RE, Lam JS, Rosenberg SA, Hwu P. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res 1996; 56 (24): 5672-7. 
5. Nair SK, Snyder D, Rouse BT, Gilboa E. Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen-presenting cells pulsed with tumor extracts. Int J Cancer 1997; 70(6): 706-15. 
6. Tjandrawan T, Martin DM, Maeurer MJ, Castelli C, Lotze MT, Storkus WJ. Autologous human dendriphages pulsed with synthetic or natural tumor peptides elicit tumor-specific CTLs in vitro. J Immunother 1998; 21(2): 149-57. 
7. Zitvogel L, Mayordomo JI, Tjandrawan T, DeLeo AB, Clarke MR, Lotze MT,ら Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associated cytokines. J Exp Med 1996; 183(1): 87-97. 
8. Tuting T, Wilson CC, Martin DM, Kasamon YL, Rowles J, Ma DI,ら Autologous human monocyte-derived dendritic cells genetically modified to express melanoma antigens elicit primary cytotoxic T cell responses in vitro: enhancement by cotransfection of genes encoding the Thl-biasing cytokines IL-12 and IFN-alpha. J Immunol 1998; 160(3): 1139-47. 
9. Celluzzi CM, Falo LD. Physical interaction between dendritic cells and tumor cells results in an immunogen that induces protective and therapeutic tumor rejection. J Immunol 1998; 160(7): 3081-5. 
10. Gong J, Chen D, Kashiwaba M, Kufe D. Induction of antitumor activity by immunization with fusions of dendritic and carcinoma cells. Nat Med 1997; 3(5): 558-61. 
11. Akasaki Y, Kikuchi T, Homma S, Abe T, Kufe D, Ohno T. Antitumor effect of immunizations with fusions of dendritic and glioma cells in a mouse brain tumor model. J Immunother 2001; 24: 106-13. 
12. Kugler A, Stuhler G, Walden P, Zoller G, Zobywalski A, Brossart P,ら Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids. Nat Med 2000; 6(3): 332-6. 
13. Wang J, Saffold S, Cao X, Krauss J, Chen W. Eliciting T cell immunity against poorly immunogenic tumors by immunization with dendritic cell-tumor fusion vaccines. J Immunol 1998; 161(10): 5516-24. 
14. Kikuchi T, Akasaki Y, Irie M, Homma S, Abe T, Ohno T. Results of a phase I clinical trial of vaccination of glioma patients with fusions of dendritic and glioma cells. Cancer Immunol Immunother 2001; 50(7): 337-44. 
15. Brunda M. Interleukin-12. J Leukoc Biol 1994; 55: 280-88. 
16. Aoki T, Tashiro K, Miyatake S, Kinashi T, Nakano T, Oda Y,ら Expression of murine interleukin 7 in a murine glioma cell line results in reduced tumorigenicity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89(9): 3850-4. 
17. Wakimoto H, Abe J, Tsunoda R, Aoyagi M, Hirakawa K, Hamada H. Intensified antitumor immunity by a cancer vaccine that produces granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4. Cancer Res 1996; 56(8): 1828-33. 
18. Leonard JP, Sherman ML, Fisher GL, Buchanan LJ, Larsen G, Atkins MB,ら Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood 1997; 90(7): 2541-8. 
【０２４２】
本発明は、記載した特定の実施形態（これらは本発明の個々の態様のひとつの説明とみなされる）によってその範囲を限定されるものではない。機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内である。実際、本明細書で説明したものに加えて、本発明の改変が前記の説明および添付の図面から当業者には明らかとなろう。そのような改変も特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０２４３】
本明細書で引用した全ての参考文献は、あらゆる目的のために、参照することによりそのまま本明細書に含めるものとする。
【０２４４】
関連出願
本出願は、2004年2月12日付け出願の米国特許出願第10/778,717号（その全体を参照により本明細書に組み入れるものとする）の優先権の利益を主張するものである。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】FCの蛍光活性化セルソーター（FACS）分析。（A）DCをFITC標識抗CD80抗体で染色した。合計34％のDCが抗CD80モノクローナル抗体で染色された。（B）PKH26をグリオーマ細胞内に組み入れた。95％を超えるグリオーマ細胞がPKH26に陽性であった。（C）グリオーマ細胞にPKH26を組み入れた後、DCとグリオーマ細胞とを融合させた。DCをFITC標識抗CD80モノクローナル抗体で染色した。合計39.9％の細胞がPKH26およびCD80の両方に陽性であった。このことは、ほとんどのDCがグリオーマ細胞と融合されたことを示唆している。
【図２】FCでの免疫化の抗腫瘍効果。（A）FC（白三角）、DC（黒三角）または対照としての照射親細胞（黒丸）を0日目および7日目に同系マウスに皮下注射した（各群n=11）。14日目に、1×106個の親細胞を側腹部に皮下接種した。照射親細胞を注射したすべてのマウスでは、接種した腫瘍細胞が2週間以内に大きな腫瘍を作った。これとは対照的に、FCで免疫したマウスのうち、6週間以内に死亡したものはいなかった。DCで免疫した11匹中6匹のマウスが、後に成長した触知可能な腫瘍を発生したが、FCで免疫した11匹のマウスのうち、触知可能な腫瘍を発生したものはいなかった。（B）0日目および7日目にFCで免疫した後、1×104個の腫瘍細胞を脳の右前頭葉に定位的に接種した（14日目）。FCで免疫したマウスの半数が70日より長く生存した（黒三角；各群n=20；p < 0.001）（図2B）。すべての対照マウスは6週間以内に死亡した（黒丸）。
【図３】FCおよびrIL-12で処置した後のマウスの生存。親細胞（1×104個）を右前頭葉に定位的に接種した（0日目）。5日目および12日目に、3×105個のFCを皮下接種した。5日目から1日おきに2週間にわたり（合計3.5pg/マウス）、数匹のマウスに0.5pg/100mlのrmlL-12または100mlの生理食塩水を腹腔内（i.p.）注射し、それらを70日間観察した。FCのみでのワクチン接種は腫瘍担持マウスの生存を延長しなかったが（黒三角；p > 0.05）、FCおよびrIL-12の両方でのワクチン接種は、対照と比べて生存を延長した（白三角；p = 0.01）。FCおよびrIL-12で処置された10匹中5匹のマウスは70日以上生存した。
【図４】腫瘍担持マウスからの脾細胞の細胞傷害性。未処置マウス（黒丸）、rIL-12のみを注射されたマウス（白三角）、DCを2回（0日目および7日目；黒三角）注射されたマウス、FCで1回（0日目；白丸）または2回（0日目および7日目；黒四角）免疫したマウスならびにrIL-12およびFCで2回（0日目および7日目；白四角）免疫したマウスから、SPCを28日目に分離した。免疫マウス（特に、rIL-12を注射されFCで2回免疫したマウス）からの腫瘍細胞に対するCTL活性は、対照およびその他のものに比べて著しく増強された。
【図５】FCでのワクチン接種およびT細胞サブセットの枯渇の後の定着皮下腫瘍の退縮。グリオーマ細胞およびFCの注射を受けたマウスに抗CD4（白三角）、抗CD8（黒三角）、抗アシアロGM1（白丸）または対照ラットIgG（黒四角）を投与することにより、リンパ球サブセットを枯渇させた。0日目および7日目に、FCを側腹部に皮下接種した。ついで、14日目に親細胞を反対側の側腹部に接種した。7日目、10日目、14日目および17日目にmAbを腹腔内注射した。CD8+ T細胞を枯渇させたマウス（黒三角）（各群n=4）においては、抗腫瘍効果は低下した。FCによりもたらされた防御はCD4+ TおよびNK細胞枯渇によっては損なわれなかった。対照マウスにはFCでワクチン接種しなかった（黒丸）。データは平均 + SDを表す。
【図６】発生した脳腫瘍の免疫蛍光分析。未ワクチン接種マウスの腫瘍においては少数のCD4+およびCD8+ T細胞が存在した（図6A、B）。これとは対照的に、ワクチン接種されたマウスの腫瘍においては多数のCD4+およびCD8+ T細胞が見られた。浸潤性CD4+およびCD8+ T細胞の数はほぼ同じであった。SR-B10.A細胞はGFAPに陽性であった。
【図７】PEG処理細胞のうち、FITC（緑）およびPKH-26（赤）の両方で染色された融合細胞。
【図８】FACS分析。PKH-2GLおよびPKH-26の両方で染色された細胞（これはDC細胞とBNL細胞との融合体であると考えられた）は、高い前方散乱および高い側方散乱を伴う細胞スキャッタグラムの上方域に示されている。高いおよび中程度の前方散乱ならびに低い側方散乱の細胞画分は多数の未融合BNL細胞を含有し、低い前方散乱および低い側方散乱のものは未融合DCおよび未融合BNL細胞を含有していた。全スキャッタグラムにおいて占拠している二重陽性細胞の領域の広さから判断すると、非付着細胞の約30％は融合体であった。
【図９】スキャッタグラム上でゲート化され抗原発現に関して調べられたPKH-2GLおよびPKH-26の両方に陽性である細胞画分のFACS分析。I-Ad/I-Ed（MCHクラスII）、CD80、CD86およびCD54分子（これらはDC上で見出される）が該融合体により発現された。
【図１０】平坦な細胞表面上に短い突起を発現するBNL細胞の走査電子顕微鏡検査。一方、DCは多数の長い樹状突起を有する。非付着融合細胞は大型で卵形であり、短い樹状突起を有する。
【図１１−ＡＢ】DC/BNL融合体でのマウスのワクチン接種は、BALB/cマウスに接種されたBNL細胞でのチャレンジの拒絶を引き起こした。これとは対照的に、DCのみ又は照射BNL細胞のみの注射は腫瘍の発生および成長を妨げなかった。
【図１１−ＣＤ】DC/BNL融合体でのマウスのワクチン接種は、BALB/cマウスに接種されたBNL細胞でのチャレンジの拒絶を引き起こした。これとは対照的に、DCのみ又は照射BNL細胞のみの注射は腫瘍の発生および成長を妨げなかった。
【図１２】CTLのクロム-51放出アッセイ。BNL腫瘍に対するDC/BNL融合細胞のみでの処置の効果は有意ではなかった。しかし、DC/BNL融合体の注射およびそれに続くIL-12の投与は有意な抗腫瘍効果を惹起した。
【図１３】DC/BNL融合体で処置されたマウスに由来する脾細胞を使用して、BNL細胞に対する有意な細胞溶解活性が観察された。無地の棒線はBNL細胞であり、線影付きの棒線はC26細胞である。
【図１４】IL-12と共にDC/BNL融合体で処置されたマウスからの脾細胞は、BNL細胞に対して、DC/BNL融合体のみで処置されたマウスからの脾細胞より大きな細胞溶解活性を示した。
【図１５】CD4に対する抗体で処理された脾細胞の細胞溶解活性は有意に低下し、一方、CD8に対する抗体で処理された脾細胞は、アイソタイプ同一抗体であるラットIgG2aで処理されたものとほぼ同じ細胞溶解活性を示した。
【図１６】ワクチン接種計画。1日目にFCを頚部リンパ節付近に皮内注射した。3日目および7日目にrhIL-12を同一部位に皮下注射した。このサイクルを2週間ごとに6週間にわたって繰り返した（上図）。進行性疾患またはグレード3もしくは4の主要臓器毒性が存在しない場合には、コース1中のrhIL-12の最終投与の2〜5週間後に開始する2回目の6週コースを患者に施すことが可能であった（下図）。
【図１７】FACScanを使用する融合効率の分析。（A）陰性対照。（B）PKH26をグリオーマ細胞内に組み入れた。グリオーマ細胞の93.0％がPKH26に陽性であった。（C）PKH2をDC内に組み入れた。DCの99.6％がPKH2に陽性であった。（D）染色されたグリオーマ細胞およびDCをPEGで融合させた。二重陽性細胞（66.2％）が融合細胞であると確認された。数字は細胞の割合（％）を示す。縦軸：PKH26、横軸：PKH2。
【図１８】ケース1のMRIは、腫瘍が初回手術の2ヶ月後に再発したことを示している。FCの接種は腫瘍の成長を抑制しなかった。FCとrhIL-12とを使用する併用療法の後、T2強調画像上の腫瘍周辺の高強度域およびT1強調画像上の腫瘍のサイズが著しく減少した。再発腫瘍のT1強調（A）およびT2強調（B）画像。FCおよびrhIL-12で免疫した後のT1強調（C）およびT2強調（D）画像。
【図１９】ケース3のMRIはT2強調画像上の腫瘍の周囲に高強度域を示している。（A）免疫前のT2強調画像。（B）FCおよびrIL-12で免疫した後のT2強調画像。
【図２０】腫瘍標本に関する病理学的所見。再発腫瘍標本においては、原発性腫瘍と比べて、複数の核および幅広い細胞質を含有する多数の大きな腫瘍細胞が観察された。該腫瘍の領域内では強力なCD8+ Tリンパ球浸潤が観察されたが、CD4+ Tリンパ球浸潤は観察されなかった。ケース1（A、B）および6（C、D）における原発性および再発腫瘍のHE染色。ケース1（E、F）および6（G、H）における抗CD4および抗CD8モノクローナル抗体での再発腫瘍標本の免疫組織化学的染色。
【図２１】自己グリオーマ細胞に対するPBLの細胞溶解活性。初回免疫前（黒棒線）および初回免疫の8〜10週間後（白棒線）に採取した血液からPBLを分離した。2つのケース（ケース1および2）においては、処置後に自己腫瘍細胞に対する細胞溶解活性が上昇したが、他のケースにおいては、処置後に細胞溶解活性はほとんど存在しなかった。ケース6においては、処置後の細胞溶解活性は処置前の細胞溶解活性より低かった。エフェクター：標的の比は80：1であった。
【図２２】処置の前および後の患者の末梢循環におけるIFN-γ発現CD8+ Tリンパ球の検出のためのサイトカインフローサイトメトリー。代表的なケース（ケース9および15）が示されている。ケース15においては、処置後に二重陽性細胞の比率が増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−ＡＢ】
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【図１１−ＣＤ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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