(57)【要約】  本発明は植物性エストロゲンの８−プレニルナルニゲン製造法、この方法による生成製剤及び女性のホルモン依存性骨粗鬆と閉経期症候群及び更年期症候群防止治療用の薬生成に８−プレニルナルニゲンの使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
手続きが
a．ナリニゲニンのジアセチル化、
ｂ．トリブチルホスフィン及びジイソプロピルアゾジカルボン酸エステル使用のプレニル化、
ｃ．ユーロピウム（ＩＩＩ）―fod使用のプレニル側鎖転位及び
ｄ．メタノール／水中炭酸カリウム使用の加溶媒分解
を含む８−プレニルナルニゲン合成法で、この手続きがクロマトグラフィーを含まない方法。
【請求項２】
請求項１の方法で生成の８−プレニルナルニゲン製剤。
【請求項３】
女性の閉経期症候群及び更年期症候群でのホルモン依存性骨粗鬆防止と治療用薬生成に関して、その生成に使用の８−プレニルナルニゲン製剤の純度が少なくとも９５％である８−プレニルナルニゲンの使用。
【請求項４】
女性のホルモン依存性骨粗鬆と閉経期症候群と更年期症候群防止治療用の薬生成で請求項２による８−プレニルナルニゲンの使用。
【請求項５】
女性の閉経期症候群及び更年期症候群でのホルモン依存性骨粗鬆防止治療用の薬生成に関して８−プレニルナルニゲン使用により、子宮増殖へのこの薬剤の影響がエストラジオールの１／５以下であり、８―プレニルナルニゲンとエストラジオールの骨量減少比較では同程度の影響がある８−プレニルナルニゲンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は８―プレニルナリンゲニン製造法、本法により生成の製剤および薬製造使用に向けるものである。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン補充療法は更年期症候群治療（短期）及びホルモン依存性骨粗鬆症防止と治療（短期と長期）に用いる。ホルモンとしてはエストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニールエストラジオール又は共役エステロゲンがある。これらエステロゲンは全て更年期症候群治療とホルモン依存性骨粗鬆症防止に有効であるが、子宮組織に非解離的増殖効果を示す。この増殖は子宮内膜症や子宮体癌リスクの増大と関連し、プロゲスチンを子宮へのエストロゲンの影響の相殺に時々必要とするため、膣からの出血をもたらす。それ故更年期症状を治療し、骨粗鬆防止又は治療するが、子宮増殖への影響は最低か非常に低くしか作用しないエストロゲンの医療的必要性が明らかに存在する。このようなエステロゲンによる継続治療では子宮組織レベルでのプロゲスチンによる相殺を必要としない。いくつかの合成抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（Tamoxifen）やラロキシフェン（Raloxifen）が合成され、一定の組織選択性を示した。（エバンス及びターナー（Evans and Turner）ボーン（Bone）、１７巻、１８１Ｓ−１９０Ｓ頁（１９９５年））。又植物二次代謝生成化合物が特定され、例えばイソフラボン、リグナンやその他であるエストロゲン活性を示された。しかしこれら植物性エストロゲンは非常に弱いエステロゲンで、臨床効果にはむしろ多量の一日投与量が必要なように思われる。植物性エステロゲンの高摂取により女性乳ガンのリスクがかなり減少することが示されたため（イングラム等（Ingram et al）、１９９７年、ランセット（The Lancet）、３５０巻、９９０−９９４頁）、エステロゲン効果に組織選択性を示し、継続的治療計画で相殺的プロゲスチンを活性化せずに更年期症候群を治療し、且つホルモン依存性骨粗鬆症を防止できる植物性エストロゲンの発見が望まれる。
ホップ（フムルスルプルス）の球果由来の植物性エステロゲン、８−プレニルナリンゲニンがイソフラボンゲニステインのエステロゲン活性の少なくとも一桁強い顕著な活性を持つことが報告された。８−プレニルナリンゲニンは最も強力な植物性エステロゲンであるので、この化合物は明らかに製剤用の良い候補である。しかし８−プレニルナリンゲニンは動物研究で望ましい組織選択性を示さず、骨粗鬆防止用量で子宮成長に大きく影響することが報告された。（宮本等（Miyamoto et al）、１９９８年、プランタメディカ（Planta Medica）、５１６−５１９頁）。この結果によるとこの化合物は望ましい医薬候補として選ばれないだろう。
【発明の開示】
【０００３】
驚いたことに合成による比較的純粋な８−プレニルナリンゲニン製剤を用いた動物研究で８−プレニルナリンゲニンが骨と子宮に選択的に影響することが明らかになった。このものでは骨粗鬆症防止は用量に依存するが、子宮成長と子宮内膜刺激に対する影響は最小で投与量に独立でもある。この製剤の子宮成長への影響は、８−プレニルナリンゲニンとエストラジオールが骨粗鬆症防止に同じ効果を示す用量で比較すると、エストラジオールの１／５、おそらく１／１０以下である。子宮成長と骨粗鬆症防止効果の比の計算例を以下に示す。エストラジオール０．４μｇ／ｋｇ／ｄでの子宮重量への影響は８―プレニルナリンゲニン１８ｍｇ／ｋｇ／ｄと同等で、用量比は１８０００：０．４＝１：４５０００となる。エストラジオール４μｇ／ｋｇ／ｄでの骨粗鬆症への影響は８―プレニルナリンゲニン１８ｍｇ／ｋｇ／ｄと同等で、用量比は１８０００：４＝１：４５００となる。これらデータは実施例１と実施例２により測定し、通常の統計限界内の変動できる。この計算をヒトの状態に延長すると、８−プレニルナリンゲニンによる女性治療での骨保護用量は経口エストラジオール用量０．１−０．２ｇ／ｄに等しく、その結果無効レベル以下の対子宮エストロゲン効果となる。このことは閉経期及び更年期症候群を膣からの出血再発なしで治療できることを意味する。
【０００４】
８−プレニルナルニゲン（５，７−ジヒドロキシー２−（４−ヒドロキシフェニル）―８−（３−メチルー２−ブテニル）クロマンー４−オン）は以下の構造を有する。
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【０００５】
４−ヒドロキシフェニル基は２Ｓ（−）か２Ｒ（＋）位のいずれかである。鏡像異性体の一つかラセミ体の一つのいずれかを使用できる。子宮成長と骨粗鬆症防止への影響を実施例２に記載のようにラットで測定できる。（子宮重量、子宮内膜組織像及び骨密度測定）。
８−プレニルナルニゲン製剤はゲスター等（Gester et al）（２００１年、テトラヘドロン（Tetrahedron）、５７巻、１０１５−１０１８頁）が記載の方法に基づく方法で合成するが、いくつかの改良を含む。本発明の一実施形態はそれ故以下の手続きによる８−プレニルナルニゲン合成法であるが、
a   ナリンゲニンのジアセチル化と生成物の結晶化、
ｂ  トリブチルホスフィンとジイソプロピルアゾジカルボン酸エステルを用いるプレニル化と生成物の結晶化、
ｃ  ユーロピウム（ＩＩＩ）fodを触媒と用いるプレニル側鎖の転移と溶媒留去後の残留生成物、及び
ｄ  メタノール／水中での炭酸カリウムを用いた加溶媒分解、抽出と種々洗浄法による生成物からなり、この手続きはクロマトグラフィーを含まない。
記載法は経済的な理由で拡大生産に不適な方法である。
【０００６】
本発明は又本発明法で製造の８−プレニルナリンゲニン製剤に関する。本製剤は少なくとも純度９５％である。純度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＬＰＣ）で決定できる。
本発明の更なる実施形態では女性の骨粗鬆症、閉経期症候群と更年期症候群防止治療薬製造に８−プレニルナルニゲンを使用し、製造に使用の８−プレニルナルニゲン製剤は少なくとも純度９５％である。
本発明は又女性の骨粗鬆症、閉経期症候群と更年期症候群防止治療薬製造への本発明法により合成の８−プレニルナルニゲン製剤を使用することに関する。
閉経期症候群と更年期症候群としては例えばほてり、情緒変調、寝汗及び膣の乾燥がある。
本発明薬の投与は容認型の投与や同様の効用を作用する試薬のいずれかにより実施できる。従って投与は例えば経口、経鼻、非経口、局所的、経皮的、直腸、舌下、筋肉内、皮下又は静脈内で、例えば錠剤、座薬、丸薬、軟カプセル剤や硬カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、エアロゾルや類似物のような固体、半固体、凍結乾燥粉末、液体投与型で、好ましくは正確な用量を簡便に投与できる単位用量の形で行う。組成は在来の薬担体又は賦形剤と８−プレニルナルニゲンを活性薬として含有し、更にその他の薬剤、医薬剤、担体、補助剤などを含むことができる。
【０００７】
通常意図投与形態によるが薬容認組成は重量で約１％乃至約９９％の８−プレニルナルニゲンと重量で９９％乃至１％の一つ以上の適切な薬賦形剤を含有する。好ましくは組成は重量で約５％乃至７５％の８−プレニルナルニゲンと残りは適切な薬賦活剤である。
好ましい投与経路は治療疾患状態の重症度により調節可能な利便な一日投与量計画を用いて経口で行う。この経口投与には８−プレニルナルニゲン含有の薬容認組成は通常使用の賦活剤のいずれかを取り入れて形成する。この賦活剤としては、例えば医薬グレードのマンニトール、乳糖、澱粉、アルファ化澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロースエーテル誘導体、ブドウ糖、ゼラチン、サッカロース、クエン酸塩、シクロデキストリン、没食子酸プロピル及び類似物のような無毒で化学的適合性の充填剤、結合剤、錠剤分解物質、緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤、潤滑剤、風味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤及び類似物を含む。この組成形状としては溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、放出持続性処方及び類似物がとれる。
【０００８】
好ましくはこの組成形状としてはカプセル、カプレットか錠剤がとれ、それ故乳糖、サッカロース、リン酸ジカルシウムや類似物のような希釈剤、クロスカルメローセナトリウム及びその誘導体のような錠剤分解物質、ステアリン酸マグネシウムや類似物のような潤滑剤及び澱粉、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースエーテル誘導体や類似物のような結合剤を含有する。
８−プレニルナルニゲンは例えば体内で徐々に溶解する担体、例えばポリオキシエチレングリコールとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ１０００（９６％）とＰＥＧ４０００（４％）やプロピレングリコールと処理した約０．５乃至約５０％の活性成分を用いた座薬に処方できる。
液体薬として投与可能な組成も、例えば８−プレニルナルニゲン（約０．５％乃至約２０％）と任意の薬補助剤を担体、例えば水、生理食塩水、Ｄ―グルコース水溶液、シクロデキストリン水溶液、グリセロール、エタノール及び類似物に溶解や分散などで形成し、溶液や懸濁液を形成できる。
【０００９】
もし望むならば本発明の薬組成は例えばクエン酸、ソルビタンモノラウリン酸エステル、トリエタノールアミンオレイン酸塩、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのような湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、酸化防止剤及び類似物のような少量の助剤を含有できる。
この用量形態作成の実際的方法は既知であり、この技術の熟知者には明白である。例えばレミントン医薬科学１８版（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.）（マック出版社（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア州（Pennsylvania）、１９９０年）参照。投与組成はいずれにせよ女性の骨粗鬆症や閉経期症候群と更年期症候群防止と治療に医薬的有効な量の８−プレニルナルニゲンを含有する。
医薬的有効量の８−プレニルナルニゲンを投与するが、その量は年齢、体重、一般的健康、食習慣、投与形態と時期、排泄頻度、複合薬、特定病状の重症度及びホストが受ける治療を含む種々た因子に依存して変化する。通常医薬的に有効な一日投与量は一日に体重ｋｇ当たり８−プレニルナルニゲン約０．５乃至約２５．０ｍｇ、好ましくは一日に体重ｋｇ当たり約１ｍｇ乃至約１０ｍｇ、最も好ましくは一日に体重ｋｇ当たり約２乃至約５ｍｇである。
【実施例１】
【００１０】
８−プレニルナルニゲンの合成法
全合成法は４段階からなる。
ステップ１：ナルゲニンのアセチル化
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【００１１】
ナルゲニン（種々の供給業者からバルク商品として入手可能）１００ｇをピリジン（分析グレード）２００ｇと室温で混合し、無水酢酸（分析グレード）７５ｇを９０分間冷却下、攪拌しながら滴下する。この工程修了時にジアセチル化物が沈殿し始めるが、攪拌を更に１５分間続ける。次いで混合物を氷冷水１Ｌに注ぎ沈殿を濾別する。次いで湿潤生成物を０．１規定塩酸３２０ｍｌ、次いで氷冷水で洗浄する。水湿潤生成物をメタノール３５０ｍｌと煮沸し、２度濾過し、最後にメタノール５０ｍｌで洗浄する。生成物を４０℃で一夜真空乾燥する。生成物の純度は８２．５％以上である。収量はジアセチル化物（Ｉ）約１０７ｇである。
【００１２】
ステップ２：ジアセチル化物（Ｉ）のプレニル化
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【００１３】
Ｉを１０６．９ｇと３−メチルー２−ブテンー１−オール（９８％）３６．２ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（分析グレード、モレキュラーシーブ上で乾燥）２６７０ｍｌと混合し、窒素下０℃に冷却する（氷浴）。トリブチルホスフィン（９８％）７４ｇを窒素下で加える。ジイソプロピルアゾジカルボン酸エステル（９７％）９５．８ｇの乾燥ＴＨＦ溶液４２５ｍｌを１２０分間０℃で滴下する。反応完了後ＴＨＦを蒸留除去し、油状残渣をトルエン５００ｍｌに取り入れる。この溶液を水１５０ｍｌずつで二回、０．８Ｍ炭酸ナトリウム１５０ｍｌずつで五回洗浄する。相分離後トルエンを蒸留除去し、油状残渣をターシャリーブチルメチルエーテル３００ｍｌか他の適切溶剤に溶解する。―１０℃で種結晶添加によりプレニル化物（ＩＩ）が１−２時間後に沈殿し始める。結晶化を完了するため冷却下に攪拌を更に１６時間継続する。次いで生成物を濾過しエーテル８０ｍｌか適切な溶剤で洗浄し、４０℃で一夜真空乾燥する。収量は３９．１ｇで収率３０．７％に相当する。生成物純度は７８％以上である。
【００１４】
ステップ３：ＩＩのクライゼン転移
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【００１５】
生成物ＩＩを３６ｇ、Ｅｕ（ＩＩＩ）―fod（９９％）４．４ｇ及びクロロベンゼン（合成グレード）１８０ｍｌを混合し、約５時間７５−８０℃で加熱する。反応をＨＰＬＣで追跡し反応終了後溶剤を蒸留により除去する。得られた生成物ＩＩＩをステップ４にそのまま使用する。湿潤生成物収量は４１ｇである。
ステップ４：脱アセチル化
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【００１６】
湿潤生成物ＩＩＩ４１ｇをメタノール４１０ｍｌと脱イオン水２０ｍｌと混合する。炭酸カリウム２．２５ｇを加え反応混合物を４０℃で約１８時間加温する。反応完了後水４００ｍｌを加え、混合物を１Ｍ塩酸でｐＨ７に調整する。これにより最終化合物ＩＶが沈殿する。次いでメタノールを４０℃で蒸留により除去し、沈殿物含有水相をターシャリーブチルメチルエーテル３００ｍｌか他の適切溶剤で抽出する。抽出は各１００ｍｌで二回繰り返す。有機相を一緒にし水２００ｍｌで洗浄し、次いで濃縮乾燥する。次いで粗生成物をジクロロメタン２５０ｍｌ中で攪拌し、濾過し再度ジクロロメタン２５０ｍｌで洗浄し、４０℃で乾燥する。次に粗生成物をターシャリーブチルメチルエーテル２５０ｍｌか他の適切溶剤に溶解後、濾過により不溶物を除去し濃縮する。残渣を少量のジクロロメタンに懸濁し、濾過し、濾過物を４０℃で一夜真空乾燥する。収量は１５．９ｇ、わずかに黄味の粉末、その純度は９５％以上である。
【実施例２】
【００１７】
卵巣摘出ラットにおけるエストラジオールの骨密度と子宮重量に対する影響
研究対象
溶液（安息香酸ベンジル／トウゴマ油対エタノール／落花生油及び安息香酸ベンジル／トウゴマ油対ベンジルアルコール／ごま油）
研究の説明
全部で年齢１２−１４週の雌スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラット５６匹を用いた。４９匹の動物を無作為に７グループに分けた。第三媒体のベンジルアルコール／ごま油を投与したグループ８（動物７匹）を１３日後に本研究に加えた。７グループを卵巣摘出（ＯＶＸ）し一グループを偽手術（ＳＨＡＭ）した。動物は皮下で一日一回、一週間に５回（月曜日から金曜日）以下のように処置した。グループ１（ＳＨＡＭグループ）とグループ２（ＯＶＸグループ）には安息香酸ベンジル／トウゴマ油媒体（０．５ｍｌ／ｋｇ、Ｂ／Ｒ）を与えた。グループ３−グループ６にはそれぞれＢ／Ｒ中媒体の１７β―エストラジオール（シグマ社（Sigma））を０．２、０．４、１．２及び４．０μg／０．５ｍｌ／ｋｇ与えた。グループ７にはエタノール／落花生油媒体（Ｅ／Ａ）中の１７β―エストラジオール（シグマ社（Sigma））を１．２μg／０．５ｍｌ／ｋｇを、グループ８にはベンジルアルコール／ゴマ油媒体（ＢＡＳ／Ｓ）中の１７β―エストラジオール半水化物（シェリングＡＧ（Schering AG）ベルリン（Berlin））を１．２μg／０．５ｍｇ／ｋｇを投与した。処置は外科手術したその日から始め４週間継続した。研究終了時に近位頸骨の生体外骨密度（ＢＭＤ）を測定し、血清エストラジオールを決定した。更に子宮重量をはかった。
【００１８】
結論
週５回４週間投与した場合１７β―エストラジオールの保護的に最適な皮下投与量は４．０μg／ｋｇ／ｄであるように思われる。この投与量により近位頸骨の全骨密度と小柱骨密度でのＯＶＸ誘導による減少を防ぎ、相対的子宮重量の低下を防ぎ且つＳＨＡＭ重量減少を媒体グループレベルに維持する。
表１  初期体重と最終体重及び４週間処置後の体重変化
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【００１９】
表２  ４週間処置後の近位頸骨の全骨密度と小柱骨密度及び相対的子宮重量
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【実施例３】
【００２０】
卵巣摘出ラットにおける植物性エストロゲン２Ｓ（−）８−ＰＮの骨密度と子宮重量に対する影響
本研究の目的は年齢３ヶ月の卵巣摘出ラットに対する２Ｓ（−）８−プレニルナルニゲン（８−ＰＮ）による４週間処置での骨と子宮への影響を調べることである。２Ｓ（−）８−ＰＮを投与量レベル０．６７ｍｇ／ｋｇ、１．７７ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇで皮下（ｓ．ｃ．）で一日一回、一週間に七回投与した。研究終了時に子宮重量と頸骨の生体外骨密度（ＢＭＤ）を測定した。
研究の説明
全部で年齢１３−１４週の雌スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラット３０匹を本研究に用いた。動物を一グループ６匹のラットで無作為に５グループに分けた。グループ１は偽手術（ＳＨＡＭ）し、グループ２−グループ５は卵巣摘出（ＯＶＸ）した。
手術前動物の平均体重は２７１ｇ（ＳＤ９，ＳＥ２）であった。媒体又は試験物質による処置は手術したその日から始めた。ＳＨＡＭグループの動物は皮下でこの媒体の３０％ヒドロキシプロピルーβ―デキストリンを受け、ＯＶＸグループでは皮下でこの媒体か２Ｓ（−）８−ＰＮを名目投与量０．６７ｍｇ／ｋｇ／ｄ、１．７７ｍｇ／ｋｇ／ｄ又は１８ｍｇ／ｋｇ／ｄで受けた。治療は４週間継続した。投与頻度は一週間に７回であった。最終投与の一日後に動物を犠牲にした。本研究終了時に左脛骨を近位頸骨での生体外ＢＭＤ測定（末梢骨定量的ＣＴ（ｐＱＣＴ））のために切除し、子宮を絶対的重量と相対的重量を決定するため切除した。更に２Ｓ（−）８−プレニルナルニゲン濃度決定用の試料をその作成時と使用最終日にその日に全投与溶液から採取した。体重、相対的子宮重量とＢＮＤデータを一元配置分散分析で分析した。
【００２１】
生体外骨デンシトメトリー
骨密度測定をｐＱＣＴ（ＸＣＴ−９６０Ａ、ストラテック（Stratec）、ドイツ（Germany））で実施した。骨試料を測定前に解凍した。近位頸骨（骨端成長板下２mm）の１mm厚さ部分６個をボクセルサイズ０．１４８mmを用いて０．５mm間隔で走査した。全骨密度と小柱骨密度（ｍｇ／ｃｍ３）を測定した。骨デンシトメトリー後試料を生理食塩水飽和ガーゼに包み戻し、−２０℃で保存した。
相対的子宮重量は体重のパーセントとして計算した。
試験後の組織学的検査を実施した。フォルマリン固定の子宮をパラフィンに包埋後、５μｍ横断面に切断し、ヘマトキシリンエオシンで染色した。次いで断面から管腔上皮細胞高さを定量評価した。
【００２２】
結果の要旨
結果を図１と図３及び以下の表に示す。
表３  体重
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【００２３】
表４  相対的子宮重量（％）
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【００２４】
表５  左近位頸骨での生体外骨デンシトメトリーのパラメーター
全ＢＭＤ（ｍｇ／ｃｍ３）
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【００２５】
小柱ＢＭＤ（ｍｇ／ｃｍ３）
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【００２６】
この用量範囲内では２Ｓ（−）８−ＰＮの投与量に応じ近位頸骨骨幹端おけるＯＶＸ誘導の全ＢＭＤと小柱ＢＭＤ減少を防止する。最大投与量１８ｍｇ／ｋｇ／ｄでＯＶＸ誘導の影響は完全に阻害された。
この用量範囲内では２Ｓ（−）８−ＰＮでは卵巣摘出に比し相対的子宮重量増加は二倍以下である。ＳＨＡＭグループに比し相対的子宮重量は大いに減少した。（０．００５４−０．０６５％対０．１９４％）。
卵巣摘出ラットのＺＫ２２２６６０による処置により管腔上皮細胞高さに１．７７ｍｇ／ｋｇと１８ｍｇ／ｋｇで弱い刺激を与えた。
２Ｓ（−）８−ＰＮの骨粗鬆阻害と子宮重量増加に対する影響を１７β―エストラジオールのデータと比較すると、２Ｓ（−）８−ＰＮの子宮への影響は１７β―エストラジオールに比し骨への同じ有効投与量で遙かに低い。
【実施例４】
【００２７】
卵巣摘出ラットにおける８−プレニルナルニゲン（ラセミ体）、２Ｓ（−）８−プラニルナルニゲン及びエストラジオール半水化物の骨密度と子宮重量に対する影響
本研究の目的は年齢３ヶ月の卵巣摘出ラットにおけるプレニルナルニゲン（ラセミ体）と２Ｓ（−）８−プレニルナルニゲンの骨と子宮への影響を同じ処方を用いてエストラジオールの影響とを直接比較することである。更に二種媒体（油状と水溶液）でのエストラジオール半水化物の影響をその処方の影響を知るために調べた。
本物質投与を皮下（ｓ．ｃ．）で卵巣摘出したその日に始め、一週間に７回行った。研究終了時に子宮重量と頸骨の骨密度（ＢＭＤ）を測定した。
【００２８】
研究の説明
年齢１２−１４週の雌スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラット４１匹を一グループの動物６―８匹で無作為に６グループに分けた。５グループは卵巣摘出（ＯＶＸ）し、一グループは偽手術（ＳＨＡＭ）した。処置は手術をしたその日から始まり２８日間続いた。動物を皮下で以下のように一日一回、一週間７回処置した。グループ１（ＳＨＡＭ媒体グループ）とグループ２（ＯＶＸ媒体グループ）には３０％ヒドロキシプロピルーβ―シクロデキストリン媒体（ＨＰ−β―ＣＤ）を与えた。グループ３とグループ４にはそれぞれ安息香酸ベンジル／トウゴマ油媒体（Ｂ／Ｒ）とＨＰ−β―ＣＤ媒体中のエストラジオール半水化物を４μg／ｋｇ／ｄで投与した。グループ５とグループ６には両者ともＨＰ−β―ＣＤ媒体中の２Ｓ（−）８−プレニルナルニゲンと８−プレニルナルニゲンラセミ体を２０ｍｇ／ｋｇ／ｄで投与した。本研究終了時に左脛骨を生体外ＢＭＤのために切除した。物質濃度をその使用初日と使用最終日に全投与溶液から採取した。体重、相対的子宮重量とＢＭＤデータを実施例２に記載のように一元配置分散分析で分析した。
使用媒体は
媒体１（グループ１とグループ２で使用）：３０％ヒドロキプロピルーβ―シクロデキストリン、０．３％食塩（重量／体積）と５％エタノールの減菌水、ｐＨ７．４。
媒体２（グループ４，グループ５及びグループ６の投与溶液作成時に使用）：３０％ヒドロキプロピルーβ―シクロデキストリンと０．３％食塩（重量／体積）の減菌水、ｐＨ７．４。
媒体３（グループ３の投与溶液作成時に使用）：安息香酸ベンジル／トウゴマ油（Ｂ／Ｒ）１＋４、体積／体積。
【００２９】
結果
結果を図２と以下の表に示す。
表６  体重（ｇ）
2007507462.tif 000014
【００３０】
表７  相対的子宮重量
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【００３１】
表８左近位頸骨の小柱密度（ｍｇ／ｃｍ３）
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【００３２】
２Ｓ（−）８−プラニルナルニゲンと８−プレニルナルニゲンラセミ体によるＯＶＸ誘導の骨粗鬆阻害、ＯＶＸ誘導体重増加の減少及び子宮重量増加に対する影響を同じ媒体（ＨＰ−β―ＣＤ）中のエストラジオールの場合と比較すると、２Ｓ（−）８−プラニルナルニゲンの影響は子宮重量と体重増加に対し骨に同じ有効用量では遙かに小さい。この所見は以前の研究結果と一致する。（実施例２参照）。
８−プレニルナルニゲンラセミ体の影響は２Ｓ（−）８−プレニルナルニゲンと同様である。
【実施例５】
【００３３】
エステロゲンレポーターマウスＥＲＥ−ｌｕｃモデルにおける化合物２Ｓ（−）―８−プレニルナルニゲン（２Ｓ（−）―８−ＰＮ）のエストロゲン活性（シアナ等（Ciana et al.）、モレキュラーエンドクリノロジー（Molecular Endocrinology）、１５巻、１０１４頁、２００１年）
目的と実験計画
本研究では最近生成のＥＲＥ−ｌｕｃマウスの前立腺、肝臓、骨及び脳での１７−β―エストラジオール、ゲニステイン、ラロキシフェン及び８−ＰＮのエストロゲン活性を比較した。実験的ノイズを避けるため雄動物を用いた。更にもう少し活性な８−ＰＮ鏡像異性体の２Ｓ（−）形を用いた。８−ＰＮと２Ｓ（−）鏡像異性体間の薬理的パターンには体外テストでも体内テストでも定性的な差は観察されなかった。従って本試験で観察の２Ｓ（−）―８−ＰＮの効果はラセミ体の８−ＰＮをも表す。実験方法は以下の通りである。
年齢２ヶ月の雄ヘテロ接合体ＥＲＥ−ｌｕｃマウス４５匹を各実験グループに割り当てる前に、二週間大豆無しの餌を与え、次いで全マウスに腹腔内（i.p.）で以下化合物の含有油状溶液２５０μｌを注射した。
実験グループ１：媒体
実験グループ２：１７−β―エストラジオールを１．５μg／ｋｇ
実験グループ３：２Ｓ（−）−８−ＰＮを３０ｍｇ／ｋｇ
実験グループ４：ラロキシフェンを５μｇ／ｋｇ
実験グループ５：ゲニステインを３０ｍｇ／ｋｇ。
処置は各三匹のマウスの実験グループで行い三回繰り返した。（それ故数字は全部で動物９匹での重複決定値の平均を表す）。
注射６時間後にマウスを頸部転位により犠牲にし、臓器を解剖してドライアイスで凍結した。以下の臓器、前立腺、肝臓、骨及び脳を酵素アッセイによりルシフェラーゼ活性を分析した。
【００３４】
結果
データは一グループ当たり試料数９の平均値と標準偏差を表す
肝臓
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【００３５】
骨
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【００３６】
脳
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【００３７】
前立腺
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【００３８】
全体比較用分散分析（ＡＮＯＶＡ）をテューキー（Tukey）検定により一対比較で行った。全統計的手法はシスタット（Systat）とサス（SAS）により実施した。（＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００３９】
結論
各化合物に用いた用量では肝臓での２Ｓ（−）―８−ＰＮのエストロゲン活性は他化合物とほぼ同じであった。脳では（多分実験的変動が大なため）いずれの化合物でも有意な影響は認められなかった。しかし２Ｓ（−）―８−ＰＮでは骨と前立腺で他化合物に比し遙かに強い作用薬特性を示した。これは明らかに８−ＰＮのエストロゲン活性が骨と前立腺組織が特異的であることを示す。全化合物の共通な参照として殆ど同じ肝臓エストロゲン活性をもたらす用量で、骨組織と前立腺組織でのエストロゲン効果を評価すると、８−ＰＮはエストラジオールの２倍に拡大する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】偽手術と媒体（３０％ヒドロキシプロピルーβ―シクロデキストリン）で処置するか卵巣摘出（ＯＶＸ）し且つ媒体又は８−プレニルナルニゲン０．６７ｍｇ／ｋｇ、１．７７ｍｇ／ｋｇ又は１８ｍｇ／ｋｇで処置したラットの小柱骨密度（灰色柱）と相対的子宮重量（黒色正方形）を示す。
【図２】実施例３で記載の処置を行ったラットの小柱骨密度（灰色柱）と相対的子宮重量（黒色正方形）を示す。８−ＰＮは８−プレニルナルニゲンを表し、Ｅｓｔｒはエストラジオール半水化物を表す。
【図３】２Ｓ（−）８ＰＮ名目投与量１，３及び３０ｍｇ／ｋｇでの各管腔上皮高さを示す。
【図４】実施例３に記載の処置を行ったラットの各管腔上皮高さを示す
【図５】２Ｓ（−）８−プレニルナルニゲンと２Ｒ（＋）８−プレニルナルニゲンの比較を示す。エストラジオール半水化物０．０１５ｍｇ／ｋｇ、２Ｓ（−）８ＰＮを３／１０／３０ｍｇ／ｋｇ又は２Ｒ（＋）８ＰＮを３／１０／３０ｍｇ／ｋｇで処置したラットの管腔上皮高さを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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