(57)【要約】  ２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（プロリン−ＣＣＩ−７７９）、ならびに（ａ）構造（Ａ）［この構造中、Ｒ1およびＲ2は、水素であり、または一緒になって構造（Ｂ）（この構造中、Ｒ3およびＲ4は、各々独立して、水素または線状もしくは分枝状Ｃ1〜6アルキルである）を形成し、または一緒になってＣ5〜7シクロアルキルを形成し、または一緒になって構造（Ｃ）（この構造中、Ｒ5は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびフェニルから選択される）を有する環状ボロネートを形成する］を有する２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸の活性化エステル誘導体とラパマイシンまたはプロリン−ラパマイシンとを適する有機溶媒中、有効量の細菌リパーゼの存在下で反応させる段階、ならびに（ｂ）段階（ａ）から得られた中間体を脱保護して、ＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９を生じさせる段階を含む、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステルまたは２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９およびプロリン−ＣＣＩ−７７９）の位置特異的調製方法を開示する。2007532650.tif 000019
2007532650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（プロリン−ＣＣＩ−７７９）。
【請求項２】
（ａ）ラパマイシンまたはプロリン−ラパマイシンと、構造：
【化１】
2007532650.tif 000014
［式中、
Ｒ1およびＲ2は、水素であり、または一緒になって構造：
【化２】
2007532650.tif 000015
（Ｒ3およびＲ4は、各々独立して、水素または線状もしくは分枝状Ｃ1〜6アルキルを表す）
を有するケタールを形成し、または一緒になってＣ5〜7シクロアルキルを形成し、または一緒になって構造：
【化３】
2007532650.tif 000016
（Ｒ5は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびフェニルから選択される）
を有する環状ボロネートを形成する］
を有する２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸の活性化エステル誘導体とを、適する有機溶媒中、有効量の微生物リパーゼの存在下で反応させる段階；ならびに
（ｂ）段階（ａ）から得られた中間体を脱保護して、ＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９を生じさせる段階
を含む、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステルまたは２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９およびプロリン−ＣＣＩ−７７９）を位置特異的に調製する方法。
【請求項３】
前記活性化エステルが、構造：
【化４】
2007532650.tif 000017
（式中、Ｒは、水素またはメチルであり、ならびにＲ1およびＲ2は、請求項２において定義したとおりである）
を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化エステルが、ビニルエステルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化エステルが、ビニルエステル（Ｉ）およびビニルエステル（ＩＩ）：
【化５】
2007532650.tif 000018
から成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
使用される細菌リパーゼが、微生物であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehei）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、リゾープス・デレマ（Rhizopus delemar）からのリパーゼである、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
使用されるリパーゼが、シュードモナス・セパシアからのリパーゼＰＳまたはＰＳ−Ｃである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
適する有機溶媒が、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、エチルエーテル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＭｅＣＮ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3、iＰｒ2Ｏ、ヘキサン、ジオキサン、またはこれらの溶媒を含む混合物である、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
無水ＭｇＳＯ4および無水Ｎａ2ＳＯ4から成る群より選択される乾燥剤の添加を段階（ａ）にさらに含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）における反応にモレキュラーシーブを適用することをさらに含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ａ）における反応が、２０℃から７５℃の温度で行われる、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
脱保護段階（ｂ）が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよび２−メチルペンタン−２，５−ジオールまたはこれらの混合物から成る群より選択されるアルコール系溶媒にボロネート保護ＣＣＩ−７７９またはボロネート保護プロリン−ＣＣＩ−７７９を溶解することを含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ケタール保護ＣＣＩ−７７９またはケタール保護プロリン−ＣＣＩ−７７９のための脱保護段階（ｂ）が、低温希酸中、水混和性有機溶媒の存在下で行われる、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
酢酸エチル中の塩化トリメチルシリルおよびイミダゾールを使用してプロリンラパマイシンをビスシリル化して、３１，４２−ビス−トリメチルシリルプロリンを形成する段階；
希酸条件下で３１，４２−ビス−トリメチルシリルプロリンラパマイシンの４２位を単一脱保護して、３１−トリメチルシリルプロリンラパマイシンを生じさせる段階；
塩化メチレン中で混合無水物と３１−トリメチルシリルプロリンラパマイシンおよびジメチルアミノピリジンとを反応させる段階；ならびに
その生成物を加水分解して、プロリン−ＣＣＩ−７７９を生じさせる段階
を含む、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（プロリン−ＣＣＩ−７７９）を調製する方法。
【請求項１５】
請求項２から１３のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（プロリン−ＣＣＩ−７７９）。
【請求項１６】
請求項１または１５に記載の、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステル（プロリン−ＣＣＩ−７７９）および生理適合性担体を含む組成物。
【請求項１７】
請求項２から１３のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９）。
【請求項１８】
請求項１７に記載の、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９）および生理適合性担体を含む組成物。
【請求項１９】
請求項１６または１８に記載の組成物および前記組成物のための容器を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９）は、インビトロモデルにおいても、インビボモデルにおいても腫瘍成長に対して有意な阻害効果を実証した、ラパマイシンのエステル誘導体である。ＣＣＩ−７７９を含むラパマイシンのヒドロキシエステルの調製および使用は、米国特許第５，３６２，７１８号および同第６，２７７，９８３号に記載されている。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシンの４２位でのエステル化は、以前、ラパマイシンとアシル化剤の直接反応によって行われた。しかし、ラパマイシンは、３１位および４２位に２つの第二ヒドロキシル基を有するので、４２−モノアシル化生成物の選択的合成を達成するためにこれら２つの官能中心（functional centers）を区別する試みは、やはり難題を呈した。現在、ＣＣＩ−７７９の位置選択的調製プロセスは、少なくとも５つの段階を含む（米国特許第６，２７７，９８３号、国際特許公開パンフレット第０１／２３３９５号）。先ず、ラパマイシンをシリル化剤で処理して、ラパマイシン３１，４２−ビス−シリルエーテルを形成し、次にその４２−シリルエーテル保護基を選択的に除去して、ラパマイシン４２−ＯＨ−３１−シリルエーテルを生じさせる。次に、この遊離４２−ＯＨを、２，４，６−トリクロロベンジル混合２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボン酸無水物でアシル化し、２つの後続脱保護段階により所望のＣＣＩ−７７９を生じさせる。
【０００３】
ＣＣＩ−７７９は、酵素、ｍＴＯＲ（哺乳動物のラパマイシンの標的、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン関連タンパク質［ＦＲＡＰ］としても知られている）を阻害する細胞質タンパク質ＦＫＢＰに結合し、それと複合体を形成する。ｍＴＯＲのキナーゼ活性の阻害により、サイトカイン誘発細胞増殖；細胞周期のＧ１期を調節する幾つかの重要なタンパク質のｍＲＮＡの翻訳；およびＧ１からＳへの細胞周期の進行の抑制を導くＩＬ−２誘発転写をはじめとする、様々なシグナル伝達経路が阻害される。ＣＣＩ−７７９は、中枢神経系の癌、白血病、乳癌、前立腺癌、黒色腫、神経膠腫およびグリア芽細胞種の抑制をはじめとする、多用途に有効であることが実証されている。
【０００４】
必要とされているのは、ＣＣＩ−７７９およびその類似体の、より効率的な位置特異的製造方法である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、ＣＣＩ−７７９のプロリン類似体（２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのプロリン−ラパマイシン４２−エステルまたはプロリン−ＣＣＩ−７７９）およびそれを合成する方法を提供する。プロリン−ＣＣＩ−７７９は、腫瘍学および他の関連適用（免疫抑制、抗炎症、抗増殖および抗腫瘍）に有用な活性薬物である。
【０００６】
１つの態様において、プロリン−ＣＣＩ−７７９の合成は、プロリンラパマイシンのビスシリル化、３１，４２−ビス−トリメチルシリルプロリンラパマイシンの単一脱保護、モノシリルプロリンラパマイシンのアシル化、その後の加水分解によって達成される。
【０００７】
もう１つの態様において、本発明は、ＣＣＩ−７７９を得るために、有機溶媒中の細菌リパーゼおよび２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸の活性化エステル誘導体を使用するラパマイシンの位置特異的アシル化、その後の脱保護を含む、二段階酵素的プロセスを提供する。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明の方法は、プロリン−ラパマイシンからのプロリンＣＣＩ−７７９、ラパマイシンファミリーの中のラパマイシンと密接に関連している化合物、の合成を可能にする。
【０００９】
本発明の他の態様および利点は、当業者には容易に明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ラパマイシンジヒドロキシエステルのプロリン類似体およびその使用を記載するものである。１つの実施形態において、本発明は、コア構造：
【化６】
2007532650.tif 000003
により特徴づけられるプロリンＣＣＩ−７７９を提供する。本発明は、さらに、ラパマイシンジヒドロエステルのプロリン類似体を合成する方法を提供する。１つの実施形態では、プロリンラパマイシンが出発原料として使用される。ラパマイシンおよびその調製は、１９７５年１２月３０日発行の米国特許第３，９２９，９９２号に記載されている。あるいは、ラパマイシンは、市場で購入することができる［Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標），  Ｗｙｅｔｈ］。プロリンラパマイシンおよびその調製は、記載されている。例えば、欧州特許第０５９０７０３号参照。
【００１１】
１つの実施形態では、プロリンラパマイシンをビスシリル化して、３１，４２−ビス−トリメチルシリルプロリンラパマイシンを形成する。この変換に使用することができるシリル化剤としては、例えば、市販のクロロアルキルシラン、例えばクロロトリメチルシラン、クロロトリエチルシラン、クロロトリプロピルシランまたはクロロトリイソプロピルシランが挙げられる。１つの実施形態において、シリル化剤はクロロトリメチルシランである。より嵩高いシリル化剤を使用してもよいが、そうした薬剤は、後続の反応における酸性媒体中での脱保護に、より長い時間を必要とする。さらに、酸性媒体中での反応時間が長いほど、多くの分解副産物が形成される。もう１つの実施形態では、塩化トリメチルシリルと適する有機塩基および適する有機溶媒を用いて低温でシリル化反応を行って、３１，４２−ビス−トリメチルシリルプロリンラパマイシンを形成する。１つの実施形態において、反応温度は約０から５℃である。他の実施形態では、より低温で反応を行い、その結果、反応時間はより長くなる。例えばＤＭＦをはじめとする適する有機溶媒は、容易に選択することができる。１つの実施形態において、酢酸エチルが溶媒である。同様に、適する有機塩基は、当該技術分野において公知のもの、例えばイミダゾール、１−メチルイミダゾール、トリアルキルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、の中から容易に選択することができる。１つの実施形態において、塩基はイミダゾールであり、その結果、本明細書に記載の条件下、１時間未満で反応は完了する。
【００１２】
希酸条件下、０から５℃での４２位における単一脱保護により、３１−トリメチルシリルプロリンラパマイシンを生じさせる。
【００１３】
４−ジメチルアミノピリジンまたは同様の触媒の存在下、塩化メチレン中、−１５から−１０℃で２，４，６−トリクロロベンゾイル混合２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボン酸無水物を使用することによりモノシリル化プロリンラパマイシンのアシル化を達成して、中間体を得る。もう１つの実施形態では、モノシリルプロリンラパマイシンを、４−ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基触媒の存在下で、２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボン酸の酸塩化物とカップリングさせる。例えば、数ある中でもＮ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンなどの他の第三有機塩基をはじめとする他の有機触媒を、４−ジメチルアミノピリジンの代わりに使用してもよい。
【００１４】
１つの実施形態において、アシル化反応用の溶媒は塩化メチレンである。他の実施形態では、ＴＨＦ、ジエチルエーテルまたはｔ−ブチルメチルエーテルが使用される。この反応は、０℃未満の温度で行うことができる。１つの実施形態において、反応は−１０℃またはそれ以下で行う。１つの実施形態において、モノシリルプロリンラパマイシンは、塩化メチレン中、−１２℃で、混合無水物およびジメチルアミノピリジンとカップリングさせて、中間生成物を得る。
【００１５】
もう１つの実施形態において、アシル化は、米国特許出願公開第２００５／００３３０４６号Ａ１（２００５年２月１０日発行）に記載されているとおり行うことができる。従って、１つの実施形態では、モノシリルプロリンラパマイシンのアシル化を、４−ジメチルアミノピリジンまたは同様の触媒の存在下、塩化メチレン中、−１１から−５℃で２，４，６−トリクロロベンジル混合フェニルボリナン無水物を使用することにより達成して、中間体を得る。もう１つの実施形態において、フェニルボリナンは、２−フェニル−１，３，２−ジオキソボリナン−５−カルボン酸である。さらにもう１つの実施形態において、フェニルボリナンは、２−フェニル−１，３，２−ジオキサボリナン−４−イルであり、この場合のフェニルは、場合によっては置換されている。さらにもう１つの実施形態において、フェニルボリナンは、５−メチル−２−フェニル−１，３，２−ジオキサボリナン−５−カルボン酸である。
【００１６】
さらなる実施形態において、前記フェニル基は、アルキル、例えばＣ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5またはＣ6アルキルで置換されている。他のアリール−（「フェニル−」を含む）ボロン酸をこの反応に用いてもよい。これらには、一、二または三置換アリールボロン酸が挙げられ、この場合の置換基は、同じであるか、異なる。アリール基の置換基としては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ（例えば、フェノキシ）、アラルキル、ニトロ、シアノ、および縮合フェニル、例えばナフタリルボロン酸が挙げられる。基としてまたは基の一部（例えば、アルコキシもしくはアラルキル）として使用される場合の用語アルキルは、１から１２個の炭素原子、例えば１〜６個の炭素原子の−アルキル部分を包含する。基としてのまたは基の一部（例えば、アラルキルもしくはアリールオキシ）としての用語アリールは、６〜１０個の炭素原子のもの、例えばフェニルまたはナフチルをはじめとする芳香族基を意味する。
【００１７】
１つの実施形態において、アシル化反応のための溶媒は、塩化メチレンである。他の実施形態では、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、またはｔ−ブチルメチルエーテルが使用される。この反応は、０℃未満の温度で行うことができる。１つの実施形態において、この反応は、−１０℃またはそれ以下で行われる。１つの実施形態では、モノシリルプロリンラパマイシンを、塩化メチレン中、−１２℃で混合無水物およびジメチルアミノピリジンとカップリングして、中間生成物を得る。
【００１８】
適する溶媒（例えばＴＨＦ）および温度での緩やかな酸水解により、ＣＣＩ−７７９のプロリン類似体を生じさせる。１つの実施形態では、希無機酸、例えば硫酸、塩酸またはリン酸が使用される。もう１つの実施形態では、希硫酸水溶液が使用される。濃度は、０．１Ｎから約３Ｎの範囲内である。１つの実施形態において、これらの条件下ではアセタール保護基とシリル保護基の両方が同時に加水分解されるので、濃度は２Ｎである。より希薄な酸性条件下では、加水分解の完了に、より長い時間がかかる。１つの実施形態において、この段階は、２５℃もしくはそれ以下、または約０から５℃で行われる。
【００１９】
例えば、クロマトグラフィー、その後の（例えばエーテル処理による）最終的な結晶化をはじめとする当業者には公知の方法によって精製を達成して、精製プロリンＣＣＩ−７７９を生じさせる。
【００２０】
もう１つの実施形態において、本発明は、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９）およびプロリン−ＣＣＩ−７７９を調製するための新規プロセスを提供する。ＣＣＩ−７７９を調製するためのプロセスを以下で説明する。しかし、プロリン−ＣＣＩ−７７９は、以下で説明するように、プロリンラパマイシンから同プロセスにより調製してもよい。
【００２１】
この合成は、２つの段階を必要とする。第一の段階は、有機溶媒中、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸誘導体の活性化エステルでのラパマイシンの細菌リパーゼ触媒アシル化である。この反応は、高度に位置選択的であり、その結果、ほぼ定量収率で、モノ−４２−アシル化生成物（すなわち、保護ＣＣＩ−７７９）が排他的に形成される。その後の脱保護により、ＣＣＩ−７７９が卓越した総収率で得られる。化学的調製と比較して、この化学−酵素的経路は、より簡単な手順で、より高い収率をもたらす。さらに、この方法は、ラパマイシンの３１−ＯＨ基を保護する段階を一切必要としない。
【００２２】
以下の図式は、この酵素的ＣＣＩ−７７９調製を図示するものである。後に続く実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明を例示するためのものであり、本開示または特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものと解釈すべきでない。ラパマイシンおよびその調製は、１９７５年１２月３０日発行の米国特許第３，９２９，９９２号に記載されている。あるいは、ラパマイシンは、市場で購入することができる［Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標），  Ｗｙｅｔｈ］。
【化７】
2007532650.tif 000004
【００２３】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸側鎖の適切な活性化エステルの特定が、このリパーゼ触媒アシル化の成功の鍵になることが判明した。本発明者らは、対応するエノールエステル、特にビニルエステルが、最高活性および最大収率をもたらすことを発見した。しかし、他のアシル化試薬、例えば、メチル、エチルエステル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリフルオロエチルエステルおよびＮ−スクシンイミジルエステルも、使用することができる。プロピオン酸の２つのビスヒドロキシル基における保護基は、反応においても重要な役割を果たす。１つの実施形態では、環状ケタールおよび環状ボロネートを使用する。しかし、他の保護基を、酵素の活性部位にこの側鎖を適応させることができる小ささの保護基の中から選択してもよい。
【００２４】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸の活性化エステルは、下記式：
【化８】
2007532650.tif 000005
［式中、
Ｒは、水素またはメチルであり、Ｒ1およびＲ2は、水素であり、または一緒になって構造：
【化９】
2007532650.tif 000006
（Ｒ3およびＲ4は、各々独立して、水素または線状もしくは分枝状Ｃ1〜6アルキルを表す）
を有するケタールを形成し、または
一緒になってＣ5〜7シクロアルキルを形成し、または一緒になって構造：
【化１０】
2007532650.tif 000007
（Ｒ5は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびフェニルから選択される）
を有する環状ボロネートを形成する］
の構造を有する。本発明のプロセスを説明するために、イソプロピリデンケタール（Ｉ）またはメチルボロネート（ＩＩ）保護基を有するビニルエステル（Ｒ＝Ｈ）を選択した。
【化１１】
2007532650.tif 000008
【００２５】
１つの実施形態において、本発明のプロセスの第一段階は、細菌起源のリパーゼの存在下、適する有機溶媒中、最適な温度のもとで一定時間、ラパマイシンをビニルエステル（Ｉ）または（ＩＩ）と反応させることによって行う。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「細菌リパーゼ」、すなわち、細菌起源のリパーゼは、非真核生物源、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehei）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudonionas fluorescens）、リゾープス・デレマ（Rhizopus delemar）から元来単離された酵素を包含する。しかし、本発明で使用するために選択される酵素は、元来の供給源から直接単離および精製されたものである必要はなく、合成もしくは組換えで、または他の適する手段により調製されたものであってもよい。幾つかの市場の供給業者から様々なこれらの酵素を入手することができる。さらに、これらの酵素の製剤は、様々な供給業者による異なる商品名での異なる細菌起源の粗製、不完全精製、精製または固定化された状態で使用することができる。
【００２７】
１つの実施形態では、Ａｍａｎｏ（天野エンザイム株式会社）からの固定化形態のリパーゼＰＳであるリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩが、本発明の方法において使用される。しかし、他のリパーゼを本発明での使用に選択してもよい。こうしたリパーゼは、６０％より高い、７５％より高い、または９０％より高い、ラパマイシンから保護ＣＣＩ−７７９中間体への転化率をもたらす。さらなる実施形態において、こうしたリパーゼは、リパーゼにより触媒される加水分解によって生じる有意な量のｓｅｃｏ誘導体の形成を回避する。
【００２８】
リパーゼは、有効な触媒量、すなわち、ラパマイシンの４２−ヒドロキシルのアシル化を妥当な反応速度で有効に触媒する量で使用される。この酵素を（ラパマイシンの量を基準にして）約２５から約３００重量％の量で使用できることは、当業者には理解されるであろう。１つの実施形態において、この酵素は、約５０から約２５０重量％、約５０から約２００重量％、または約７５から約１５０重量％の量で使用される。
【００２９】
適する有機溶媒としては、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、エチルエーテル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＭｅＣＮ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3、iＰｒ2Ｏ、ヘキサン、ジオキサン、またはこれらの溶媒を含む混合物が挙げられるが、それらに限定されない。１つの実施形態では、ＴＢＭＥ（ｔ−ブチルメチルエーテル）が使用される。出発時に出発ラパマイシンのすべてまたは一部を有効に溶解することができ、妥当な速度で反応を進行させることができる量で溶媒が使用されることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＴＢＭＥなどの溶媒は、少なくとも４重量容量（wt volume）（すなわち、ラパマイシンの量の４倍（４Ｘ）より過剰である容量）から約１０重量容量、または約５から８重量容量の量で使用することができる。
【００３０】
ＴＢＭＥは、残留水（約０．０５％）を含有することがあり、この残留水は、ラパマイシンをいわゆるｓｅｃｏ−誘導体、マクロラクトン環開環産物に分解し得る。この副反応を最小限にするために、反応系において低水分量を維持する。１つの実施形態では、無水溶媒がリパーゼ触媒の標準的な市販製剤と共に使用される。もう１つの実施形態では、リパーゼ溶液中に存在する水の量を乾燥剤の添加によって調整することにより、水分量を制御することができる。さらにもう１つの実施形態では、モレキュラーシーブを使用して、水分を制御することができる。モレキュラーシーブが反応を遅速させるであろうから、埋め合わせるためにより多くの酵素を添加してもよく、またはより長い反応時間を用いてもよい。モレキュラーシーブを使用する場合、５Åシーブが特に望ましい。しかし、数ある中でも４Åおよび３Åをはじめとする他のシーブサイズを容易に利用することができる。適するモレキュラーシーブは、様々な市場の供給業者から入手することができる。さらにもう１つの実施形態では、含水率を制御するために、乾燥剤、例えば、数ある中でもＭｇＳＯ4、Ｎａ2ＳＯ4を使用することができる。
【００３１】
この反応は、望ましくない副生成物の形成を低減するために十分低いが、過度に長い反応時間を必要とするほど低くはない温度で行われる。この酵素的プロセスに適する温度は、約２０℃から約７５℃、約３０℃から約６５℃、または約４０℃から約５５℃の範囲内であり得る。１つの実施形態において、ＴＢＭＥを溶媒として使用すると、４５℃の反応温度で反応を進行させることができる。こうした条件下での反応は、実質的に４８時間以内に完了（転化率＞９９％）へと進行し得る。しかし、本明細書に記載するように、より低いまたはより高い温度を用いることができ、ならびに反応時間の長さを変化させることができる。もう１つの実施形態では、必要に応じて、約１２時間から１２０時間、１８時間から９６時間、２４時間から７２時間または約３０時間から６０時間、反応を進行させることができる。反応時間の長さは、本発明での制限事項ではない。さらなる実施形態において、この反応は、すべての出発原料が消費されるまで、Ｎ2下で行われる。反応は、様々な技法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニターすることができる。あるいは、当業者は、他のモニター法を用いることができる。
【００３２】
１つの実施形態において、ラパマイシン、（ラパマイシンの量を基準にして）１００重量％リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩおよび２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸のイソプロピリデンケタール保護ビニルエステル（Ｉ）を無水ＴＢＭＥ中、４５℃で４８時間混合することにより、濾過による酵素の除去後、ケタール保護ＣＣＩ−７７９が収率＞９８％で得られた。
【００３３】
もう１つの実施形態において、本プロセスは、ラパマイシン、１６０重量％リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩおよび２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸のメチルボロネート保護ビニルエステル（ＩＩ）を無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）中、４５℃で６０時間混合することにより、濾過による酵素の除去後、環状メチルボロネート保護ＣＣＩ−７７９が、回収ラパマイシンを基に高収率で得られた。
【００３４】
ラパマイシンの４２位に、ケタールまたはボロネートのいずれかで保護されている２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸を、酵素的に導入した後、得られた中間体のその後の脱保護によりＣＣＩ−７７９を得ることができる。
【００３５】
ボロネート誘導体の場合、ボロネート保護基の除去は、アルコール系溶媒の使用により実現することができる。本発明のこの実施形態において、適するアルコール系溶媒は、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよび２−メチルペンタン−２，５−ジオール、またはこれらの溶媒の混合物から容易に選択することができる。１つの実施形態において、この酵素反応から得られた粗生成物をＭｅＯＨに溶解し、ＣＣＩ−７７９のボロネート部分が、ＭｅＯＨとの交換により揮発性ジメチルボロネートを形成し、その後、それを減圧下で溶媒と共に蒸発させる。残存する残留物は、所望のＣＣＩ−７７９と共に多少の未反応ラパマイシンを含有し、これは、シリカゲルクロマトグラフィーなどの一般的な方法によって分離することができる。
【００３６】
ケタール保護基の除去は、穏やかな酸性条件下で達成することができる。一般に、米国特許第６，２７７，９８３号およびそこに引用されている文献に掲載されている手順に従ってもよい。１つの実施形態において、脱保護は、単層酸水溶液／有機溶媒系、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の希硫酸、例えば約０から５℃で２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4／ＴＨＦ中で行うことができる。しかし、この反応は、完了に約３日またはそれ以上かかり、反応完了後に水性媒体から生成物を回収するために溶媒抽出を必要とする。
【００３７】
もう１つの実施形態において、この酸によって促進される脱保護は、他の水混和性溶媒、例えばアセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール中で行うことができる。これらの溶媒は、単独で使用することができ、またはアセトニトリルとｎ−プロパノールまたはイソプロパノールとの混合物として使用することができる。混合する溶媒の比率は、約５部のアセトニトリルと１部のプロパノール（ｖ／ｖ）から、約１部のアセトニトリルと５部のプロパノールまで、本明細書に記載するように変化させることができる。この比率は、本発明を限定する事項ではない。上記溶媒またはそれらの混合物が反応媒体として使用されるとき、１つの実施形態では硫酸水溶液が使用される。これは、米国特許第５，３６２，７１８号に記載されているように、塩酸水溶液などの他の酸を利用したとき生成される不純物の形成を最小にするためである。硫酸水溶液の濃度は、３Ｎから０．２５Ｎ、約２Ｎから０．３５Ｎ、または約１．５Ｎから０．５Ｎの範囲内であり得る。この反応は、温度約２５℃またはそれ以下、約−５℃から約１０℃、または約０℃から約５℃で行うことができる。反応が完了したら、その粗生成物は、米国特許第６，２７７，９８３号（国際特許公開パンフレット第０１／２３３９５号）に記載されているような溶媒抽出によって、または氷冷（０℃から５℃）リン酸緩衝液への反応混合物の添加による沈殿によって回収することができる。１つの実施形態において、リン酸緩衝液の濃度は、約２Ｍから０．０５Ｍ、１Ｍから０．１Ｍ、または０．５Ｍから０．１５Ｍの範囲内であり、ｐＨ値は、６から９、または７．５から８．５の範囲内である。１つの実施形態において、脱保護は、ｎ−プロパノールと１．２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4とで、０℃から５℃で行い、反応は２４時間以内に完了し、その後、氷水浴で冷却したリン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８）への反応混合物の添加により、その粗製物をオフホワイトの粉末として回収する。もう１つの実施形態において、脱保護は、ＭｅＣＮ−ｎ−プロパノールの混合溶媒（２．５／１．５  ｖ／ｖ）中、０℃から５℃で行い、０．６Ｎ H2ＳＯ4の存在下、反応は２８時間で終了した。その生成物を、リン酸緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ７．８）への反応混合物の添加により、オフホワイトの粉末として回収する。
【００３８】
もう１つの実施形態において、ＣＣＩ−７７９は、ＴＨＦ中の２Ｎ Ｈ2ＳＯ4水溶液を使用する酵素的反応混合物の直接加水分解により、粗製ケタール保護ＣＣＩ−７７９の単離を伴わずに得ることができる。このプロセスでは、上で説明したような酵素的反応を行う。反応が完了したら、酵素を濾過して除去し、２容量のＴＨＦで洗浄し、その後、その混合物を一定容量に濃縮し、ＴＨＦで希釈する。０〜５℃で一定の時間にわたって２Ｎ Ｈ2ＳＯ4で処理した後、ＣＣＩ−７７９を高収率で単離することができる。
【００３９】
本発明の合成経路は、米国特許第５，３６２，７１８号および同第６，２７７，９８３号に掲載されている合成方法論に勝る幾つかの明瞭な利点をもたらす。これらの利点としては、二段階の操作しか必要としない処理の容易さ、および所望の４２−エステルの改善された総収率が挙げられる。例えば、米国特許第５，３６２，７１８号に記載されている合成方法論は、イソプロピリデンケタール保護ＣＣＩ−７７９を収率３５％で生じさせ、米国特許第６，２７７，９８３に記載されている合成方法論は、収率８５％で生じさせるのに対し、本明細書に記載の二段階酵素的プロセスは、ほぼ定量的な収率で生成物を生じさせる。
【００４０】
もう１つの実施形態において、本発明は、本明細書に記載する同じ酵素的プロセスにより、プロリン−ラパマイシンからプロリン−ＣＣＩ−７７９（ＣＣＩ−７７９と密接に関連している化合物）を調製するプロセスを提供する。プロリン−ラパマイシン（ラパマイシン発酵粗製物からの小成分）は、１つのアミノ酸単位が構造的に異なるだけであり、すなわち、ラパマイシンにおけるピペコリン酸の代わりに、それがプロリンによって置換されている。プロリンラパマイシン、プロリン−ＣＣＩ−７７９およびその誘導体は、欧州特許第５８９７０３号に記載されている。
【化１２】
2007532650.tif 000009
【００４１】
本発明に従って調製した結果としてのＣＣＩ−７７９およびプロリンＣＣＩ−７７９は、薬学的組成物において有用である。こうした組成物は、ラパマイシンまたはその誘導体について当該技術分野において説明されている任意の適切な方法によって配合することができる。
【００４２】
本明細書に記載の活性化合物を含有する経口配合薬は、錠剤、カプセル、バッカル形、トローチ、ロゼンジおよび経口液、懸濁液または溶液をはじめとする、従来から使用されているあらゆる経口形態を包含し得る。カプセルは、本活性化合物（複数を含む）と不活性充填剤および／または希釈液、例えば薬学的に許容されるデンプン（例えば、トウモロコシ、馬鈴薯もしくはタピオカデンプン）、糖、人口甘味料、粉末セルロース（例えば、結晶性および微結晶性セルロース）、小麦粉、ゼラチン、ゴムなど、との混合物を含有し得る。有用な錠剤型配合薬は、従来どおりの圧縮、湿式造粒または乾式造粒法によって製造することができ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギン酸、アカシアゴム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、スクロース、ソルビトール、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、タルク、乾燥デンプンおよび粉末糖をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、薬学的に許容される希釈液、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、界面改質剤（界面活性剤を含む）、懸濁化剤または安定剤を利用することができる。１つの実施形態において、界面改質剤は、非イオン性およびアニオン性界面改質剤を含む。界面改質剤の代表例としては、ポロキサマー１８８、塩化ベンズアルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化蝋、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、およびトリエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における経口配合薬は、活性化合物（複数を含む）の吸収を変化させるために、標準的な遅延または持効性配合を利用することができる。この経口配合は、必要に応じて適切な量の可溶化剤または乳化剤を含有する水またはフルーツジュースへの活性成分の投与からも成り得る。
【００４３】
１つの実施形態において、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステルの経口配合薬は、米国特許出願第２００４−００７７６７７号Ａ１に（米国特許出願番号１０／６６３，５０６も）記載されている（これらは、本明細書に参照して組み込まれる）。こうした経口配合薬は、湿式造粒プロセスを使用して調製された顆粒を含有する。同様の経口配合薬を、本発明のプロリン−ＣＣＩ−７７９を使用して調製することができる。
【００４４】
場合によっては、本化合物をエーロゾルの形態で気道に直接投与することが望ましいこともある。
【００４５】
本化合物は、非経口または腹腔内投与することもできる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としてのこれらの活性化合物の溶液または懸濁液は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中での分散液を調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の成長を防止するために保存薬を含有する。
【００４６】
注射使用に適する剤形としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。すべての場合、剤形は、無菌でなければならず、および容易に注射可能な程度に流動性でなければならない。製造および保管条件下で安定でなければならず、ならびに細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、適切なそれらの混合物ならびに植物油などを含む溶媒または分散媒体であり得る。
【００４７】
１つの実施形態において、注射用配合薬は、米国特許公開第２００４−０１６７１５２号Ａ１に（米国特許出願番号１０／６２６，９４３も）記載されている（これらは、本明細書に参照して組み込まれる）。プロリン−ＣＣＩ−７７９についての同様の非経口配合薬は、容易に調製することができる。
【００４８】
もう１つの実施形態において、本発明において有用な注射用配合薬は、上に記載したような非経口的に許容される溶媒および抗酸化剤を含有するＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９補助溶媒濃縮物、ならびにＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９、非経口的に許容される共溶媒、抗酸化剤、希釈溶媒および界面活性剤から成る、ＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９を含有する非経口配合薬を提供する。本発明において有用な所定配合薬はいずれも、各種成分から成る多数の配合成分を含有し得る。１つの実施形態において、非経口的に許容される溶媒としては、非アルコール系溶媒、アルコール系溶媒またはそれらの混合物を挙げることができる。適する非アルコール系溶媒の例としては、例えば、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシドもしくはアセトニトリルまたはそれらの混合物が挙げられる。「アルコール系溶媒」は、その配合薬のアルコール系溶媒成分として１つまたはそれ以上のアルコールを含有することができる。本発明の配合薬において有用な溶媒の例としては、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール１０００、またはこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。これらの補助溶媒が特に望ましい。これらの補助溶媒のために発生する酸化およびラクトン開裂による分解の程度がより低いからである。さらに、エタノールとプロピレングリコールを併せて、より可燃性が低い生成物を生成することができるが、その混合物中のエタノールの量が多いほど、結果として、一般には化学的安定性が良好となる。混合物中、３０から１００％  ｖ／ｖのエタノールの濃度が好ましい。
【００４９】
もう１つの実施形態において、非経口的に許容されるアルコール系補助溶媒中でのＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９の安定性を、その配合薬への抗酸化剤の添加により向上させる。許容される抗酸化剤としては、クエン酸、ｄ，ｌ−α−トコフェロール、ＢＨＡ、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アルコルビン酸、没食子酸プロピルおよびこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。一般に、本発明のこの実施形態において有用な非経口配合薬は、抗酸化剤成分（複数を含む）を補助溶媒濃縮物の０．００１％から１％ｗ／ｖ、または０．０１％から０．５％ｗ／ｖの範囲にわたる濃度で含有するであろうが、それより低いまたは高い濃度が望ましいこともある。１つの実施形態では、ｄ，ｌ−α−トコフェロールが、補助溶媒濃縮物の０．０１から０．１％ｗ／ｖ、または０．０７５％ｗ／ｖの濃度で使用される。
【００５０】
他の実施形態において、本発明の配合薬の抗酸化剤成分は、キレート活性も示す。こうしたキレート剤の例としては、例えば、クエン酸、酢酸およびアスコルビン酸（これらは、本配合薬において古典的抗酸化剤およびキレート剤、両方として機能し得る）が挙げられる。他のキレート剤としては、溶液中の金属イオンに結合することができるような材料、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、その塩、またはグリシンなどのアミノ酸が挙げられ、これらはＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９の安定性を向上させることができる。さらに他の実施形態では、キレート活性を有する成分を単なる「抗酸化剤成分」として本発明の配合薬に含める。１つの実施形態において、キレート剤として作用するとき、そうした金属結合性成分は、本明細書において提供する抗酸化剤成分の濃度範囲の低限で使用される。加えて、そうしたキレート剤を本発明の抗酸化剤成分の一部として他の酸化剤と併用してもよい。例えば、許容される配合薬は、クエン酸とｄ，ｌ−α−トコフェロールの両方を含有し得る。当業者は、本明細書において提供する情報を基に、選択される抗酸化剤（複数を含む）の最適濃度を容易に決定することができる。
【００５１】
有利なことに、本発明において有用な非経口配合薬の一定の実施形態において、水性輸液または血液での希釈によるＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９の沈殿は、その希釈溶液に含有されている界面活性剤の利用により防止することができる。この希釈物の最も重要な成分は、非経口的に許容される界面活性剤である。１つの特に望ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。しかし、当業者は、胆汁酸の塩（タウロコール酸塩、グリココール酸塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩など）の中から他の適する界面活性剤を容易に選択することができ、これは、場合によってはレシチンと併用される。あるいは、エトキシル化植物油、例えばＰＥＧ化ヒマシ油［例えば、ＰＥＧ−３５ヒマシ油、例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬという名でＢＡＳＦから市販されているもの］、ビタミンＥトコフェロールプロピレングリコールスクシネート（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ＴＧＰＳ）、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ならびにポリソルベートファミリーの他のメンバー、例えばポリソルベート２０または６０を希釈液中で界面活性剤として使用することができる。希釈液の他の成分としては、水；エタノール；ポリエチレングリコール３００、ポリエチレン４００、ポリエチレン６００、ポリエチレン１０００、またはこれらのポリエチレングリコールの１つまたはそれ以上のを含有するブレンド；プロピレングリコール；ならびに溶液の浸透圧を調整するための他の非経口的に許容される補助触媒もしくは薬剤、例えば、塩化ナトリウム、ラクトース、マンニトールまたは他の非経口的に許容される糖、ポリオールおよび電解質を挙げることができる。界面活性剤は、希釈溶液の２から１００％ｗ／ｖ、５から８０％ｗ／ｖ、１０から７５％ｗ／ｖ、１５から６０％ｗ／ｖ、または少なくとも５％ｗ／ｖ、または少なくとも１０％ｗ／ｖを構成すると予想される。
【００５２】
本発明において有用な非経口配合薬は、単一の溶液として調製することができる。もう１つの実施形態において、本発明において有用な非経口配合薬は、ＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９、アルコール系溶媒および抗酸化剤を含有する補助溶媒濃縮物として調製することができ、その後、それを、希釈溶媒および適する界面活性剤を含有する希釈液と併せる。使用の前に、その補助溶媒濃縮物を、希釈溶媒および界面活性剤を含む希釈液と混合する。ＣＣＩ−７７９またはプロリンＣＣＩ−７７９を本発明に従って補助溶媒濃縮物として調製するとき、その濃縮物は、０．０５ｍｇ／ｍＬから、２．５ｍｇ／ｍＬから、５ｍｇ／ｍＬから、１０ｍｇ／ｍＬから、または２５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬまでの濃度のＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９を含有することができる。その濃縮物と希釈液とを１部の希釈液に対して約１部の濃縮物まで混合して、１ｍｇ／ｍＬから、５ｍｇ／ｍＬから、１０ｍｇ／ｍＬから、２０ｍｇ／ｍＬから、約２５ｍｇ／ｍＬまでのＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９の濃度を有する非経口配合薬を得ることができる。例えば、非経口配合薬中のＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９の濃度は、約２．５から１０ｍｇ／ｍＬであり得る。本発明は、補助溶媒濃縮物中のＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９の濃度がより低い配合薬の使用、およびＣＣＩ−７７９またはプロリン−ＣＣＩ−７７９濃度を最低検出レベルに低下させた非経口配合薬まで、１部の濃縮物と１部より多い希釈液（例えば、約１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５または１：９ ｖ／ｖなどの比率での濃縮物：希釈液）を混合する配合薬の使用も包含する。
【００５３】
１つの実施形態において、抗酸化剤は、その配合薬の約０．０００５から０．５％ｗ／ｖを構成し得、界面活性剤は、その配合薬の約０．５％から約１０％ｗ／ｖを構成し得、およびアルコール系溶媒は、その配合薬の約１０％から約９０％ｗ／ｖを構成し得る。
【００５４】
本発明において有用な非経口配合薬は、直接注射による投与、または静脈内注入用の滅菌輸液への添加による投与に適する剤形を製造するために使用することができる。
【００５５】
本開示の目的のため、経皮投与は、上皮および粘膜組織をはじめとする体表をおよび身体の内層を越えて通過するすべての投与を包含すると理解される。こうした投与は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を使用して、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁液、溶液および座剤（直腸および膣座剤）で行うことができる。
【００５６】
経皮投与は、活性化合物と、その活性化合物に対して不活性であり、皮膚に対して非毒性であり、全身吸収用の薬剤を皮膚経由で血流に送達することができる担体とを含有する経皮パッチの使用により達成することができる。担体は、クリーム、軟膏、ペースト、ゲルおよび密封デバイス（occlusive devices）など、任意の数の形態をとることができる。クリームおよび軟膏は、粘稠液であってもよいし、または水中油型もしくは油中水型の半固体乳剤であってもよい。活性成分を含有する石油または親水性石油に分散された吸収性粉末から成るペーストも好適であり得る。血流への活性成分の放出のために、様々な密封デバイス、例えば、担体と共にもしくは伴わずに活性成分を収容しているレザバーを覆う半透膜、または活性成分を含有するマトリックスを使用することができる。他の密封デバイスは文献において公知である。
【００５７】
座剤配合薬は、座剤の融点を変化させる蝋の添加を伴うまたは伴わないカカオ脂、およびグリセリンをはじめとする、伝統的な材料から製造することができる。水溶性座剤基剤、例えば様々な分子量のポリエチレングリコールも、使用することができる。
【００５８】
さらに、本発明は、本発明に従って製造され、適する送達方法による投与のために配合されたプロリン−ＣＣＩ−７７９またはＣＣＩ−７７９を収容しているパッケージングおよびキットを提供する。ビン、バイアル、ブリスターパックなどをはじめとする様々な適する容器が当業者には公知である。こうしたパッケージングおよびキットは、例えば使用説明書、注射器、アプリケータなどをはじめとする他の構成要素をさらに収容し得る。
【００５９】
以下の実施例は、プロリンＣＣＩ−７７９の製造を説明するものである。本発明がこれらの実施例において提供する試薬および条件に限定されないことは、上述の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【００６０】
プロリンＣＣＩ−７７９の合成
【化１３】
2007532650.tif 000010
この実施例は、上に提供した図式に図示されているＣＣＩ−７７９のプロリン類似体の合成方法を説明するものである。
【００６１】
Ａ．３１，４２−ビス（トリメチルシリル）プロリンラパマイシン（化合物Ｂ）の調製
三つ口５０ｍＬフラスコに、プロリンラパマイシン（図式中の化合物Ａ）（１．４７ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）、イミダゾール（０．４５ｇ、６．６ｍｍｏｌ、４当量）および酢酸エチル（２２．５ｍＬ）を充填した。その混合物を磁気的に（magnetically）攪拌すると濁ってきた。混合物を０〜５℃に冷却した。窒素保護下、塩化トリメチルシリル（０．６２ｇ、５．７ｍｍｏｌ、３．５当量）を注射器により０．５時間かけて添加し、添加している間は温度を０〜５℃に維持した。注射器を２．５ｍＬの酢酸エチルですすぎ、その混合物を０．７５時間（０．７５ｈ）保持すると、白色の沈殿が形成された。反応は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（３０：７０  アセトン：ヘプタン溶離剤）によってモニターした。ＴＬＣサンプルは、０．２５ｍＬ 飽和重炭酸ナトリウムおよび１０滴の酢酸エチルへの３〜４滴の反応混合物のクエンチングにより調製した。その混合物を振盪し、静置した。上部有機層を出発原料（プロリンラパマイシン）に対してスポットした。反応が完了したとき、もはや出発原料は存在しなかった。
【００６２】
Ｂ．３１−トリメチルシリルプロリンラパマイシン、化合物Ｅ、の調製
上記の反応が完了したら、２〜３滴の反応混合物を取り出し、３１，４２−ビス（トリメチルシリル）プロリンラパマイシン対照標準物質として後続段階のために確保した。５０ｍＬフラスコに、温度を０〜５℃に維持しながら、０．５Ｎ 硫酸（４．５ｍＬ）を０．５時間かけて添加した。混合物は、あまり濁ってこなかった。混合物を２．５時間保持し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、３０：７０  アセトン：ヘプタン  溶離剤）によってモニターした。ＴＬＣサンプルは、０．２５ｍＬ 飽和重炭酸ナトリウムおよび１０滴の酢酸エチルへの３〜４滴の反応混合物のクエンチングによって調製した。その反応アリコートを振盪し、静置した。上部有機層を３１，４２−ビス（トリメチルシリル）プロリンラパマイシン対照に対してスポットした。反応が完了したとき、３１，４２−ビス（トリメチルシリル）プロリンラパマイシンは、実質的に存在しなかった。酢酸エチル（５ｍＬ）を添加し、層を分離した。下部水性層を酢酸エチル（７．５ｍＬ）で抽出した。併せた有機層は、ブライン（７．５ｍＬ）での洗浄、飽和重炭酸ナトリウム（６ｍＬ）での洗浄、その後、水（３ｘ７．５ｍＬ）での洗浄と、この順に洗浄した。最後の水洗のｐＨは、６〜７であった。有機層をブライン（７．５ｍＬ）で再び洗浄し、硫酸ナトリウム（４ｇ）で２０分間乾燥させた。その混合物を２５０ｍＬフラスコへと濾過し、濃縮乾固させた。その固体を室温、高真空下（１０ｍｍＨｇまたはそれ以下）で２０時間乾燥させた。重量＝１．５ｇのオフホワイトの泡沫。
【００６３】
Ｃ．中間体、化合物Ｆ、の調製：
攪拌機を装備した三つ口１００ｍＬフラスコに、塩化メチレン（７．５ｍＬ）中の２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボン酸、化合物Ｃ（０．６３ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を充填した。ジイソプロピルエチルアミン（０．７７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を添加し、その後、塩化メチレン（１ｍＬ）ですすいだ。塩化２，４，６−トリクロロベンゾイル（０．８５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を添加し、その後、塩化メチレン（１．５ｍＬ）ですすいだ。その混合物を室温で４．５時間保持した。その溶液を−１２±２℃に冷却した。
【００６４】
塩化メチレン（８ｍＬ）中の３１−トリメチルシリルプロリンラパマイシン、化合物Ｅ（１．５１ｇ）を溶解し、１００ｍＬフラスコに添加した。塩化メチレン（２ｍＬ）をすすぎ液として添加した。塩化メチレン（３ｍＬ）中のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．７７ｇ、６．８ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、温度を−１２±２℃に維持しながら２．５時間かけてその１００ｍＬフラスコに添加した。塩化メチレン（１ｍＬ）をすすぎ液として添加した。その混合物を１６時間保持し、０．２５ｍＬ 水および０．２ｍＬ 酢酸エチルへの３〜４滴の反応混合物のクエンチングにより、ＨＰＬＣによってモニターした。ＨＰＬＣサンプルは、上部有機層の２滴を取り出し、ＨＰＬＣバイアル内、窒素雰囲気下でサンプルをブロー乾燥させ、移動相を用いて再び溶解することによって調製した。
ＨＰＬＣカラム：  ＣＳＣ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ／ＢＤＳ  ５μｍ
移動相：  ６８．５％  ジオキサン：水 ＋ ０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4
波長：  λ＝２８０ｎｍ
流量：  １ｍＬ／分
時間：  ６０分
保持時間：  化合物Ｅ    〜１４．０から１４．５分
化合物Ｆ    〜３３．４から３３．８分
反応が完了したとき、出発原料の０．５％未満が存在した。その反応混合物を水（６ｍＬ）でクエンチングした。塩化メチレン（１０ｍＬ）を添加し、層を分離した。水性層を塩化メチレン（１０ｍＬ）で抽出した。併せた有機層を、０．５Ｎ 硫酸（１２ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（６ｍＬ）および水（３ｘ１０ｍＬ）でこの順に洗浄した。最後の水洗のｐＨは、６〜７であった。その透明な黄色の溶液を濃縮して泡沫にした。その固体を室温、高真空下（１０ｍｍＨｇまたはそれ以下）で２４時間乾燥させた。重量＝１．８８ｇの黄色の泡沫。
【００６５】
Ｄ．粗製プロリンＣＣＩ−７７９の調製
攪拌機を装備した一つ口５０ｍＬフラスコに、ＴＨＦ（１８．８ｍＬ、１０容量）中の化合物Ｆを充填し、その後、０〜５℃（または約−２．５℃）に冷却した。２Ｎ 硫酸（９．４ｍＬ、５容量）を２．５時間かけて添加した。添加完了後、その混合物を２．５℃に温め、その後、４５時間保持した。０．２５ｍＬ 飽和重炭酸ナトリウムおよび０．２５ｍＬ 酢酸エチルへの３〜４滴の反応混合物のクエンチングによる反応をＨＰＬＣによってモニターした。ＨＰＬＣサンプルは、上部有機層の５滴を取り出し、ＨＰＬＣバイアル内、窒素雰囲気下でサンプルをブロー乾燥させ、移動相を用いて再び溶解することによって調製した。
ＨＰＬＣカラム：  ＣＳＣ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ／ＢＤＳ  ５μｍ
移動相：  ６８．５％  ジオキサン：水 ＋ ０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4
波長：  λ＝２８０ｎｍ
流量：  １ｍＬ／分
時間：  ６０分
保持時間：  化合物Ｆ                  〜３３．４から３３．８分
脱シリル化化合物Ｆ        〜１０．５から１１．５分
（中間体）
プロリンＣＣＩ−７７９    〜５．０から５．５分
化合物Ｆの脱シリル化中間体が最初に形成された。この反応が完了したとき、そのシリル化類似体の０．５％未満が残存した。酢酸エチル（２７ｍＬ）およびブライン（７．５ｍＬ）を添加し、層を分離した。水性層を酢酸エチル（１０ｍＬ）で抽出した。併せた有機層をブライン（１０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（７．５ｍＬ）および水（３ｘ７．５ｍＬ）でこの順に洗浄した。最後の水洗のｐＨは、６〜７であった。その混合物を硫酸ナトリウム（５ｇ）で３０分間乾燥させ、２５０ｍＬフラスコへと濾過し、濃縮乾固させた。重量＝１．５８ｇの黄色の泡沫。
【００６６】
Ｅ．粗製プロリンＣＣＩ−７７９のクロマトグラフ精製
シリカゲルカラム（３１．６ｇ、６０Å、２００〜４００メッシュ）（２２ｃｍの長さ×２．５ｃｍの直径）を用意し、１５：８５  アセトン：ＨＰＬＣ用ヘキサン（１Ｌ）でコンディショニングした。アセトン（１．５８ｍL）中の黄色の粗製プロリンＣＣＩ−７７９（１．５８ｇ）を調製し、クロマトグラフに供した。残りの１５：８５ アセトン：ヘキサン混合物、続いて２５：７５  アセトン：ヘキサン（４Ｌ）でそのカラムを溶離した。陽性画分を併せ、濃縮乾固させた。得られた泡沫を３５℃で乾燥させ、高真空（すなわち、１０ｍｍＨｇまたはそれ以下）で２４時間乾燥させた。重量＝１．１２ｇの薄黄色の泡沫。
【００６７】
Ｆ．プロリンＣＣＩ−７７９のエーテル処理
一つ口５０ｍＬフラスコに、プロリンＣＣＩ−７７９（１．１２ｇ）を充填し、エーテル（１．５ｍＬ）に溶解した。その混合物を２時間保持した。エーテルを揮散させ、泡沫を得た。その泡沫を３５℃、高真空下（１０ｍｍＨｇまたはそれ以下）で１２時間乾燥させ、その後、室温で一晩（１２時間）乾燥させた。重量＝１．０９ｇ。1Ｈ ＮＭＲ（５００および６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ５．４５（Ｈ−１）、６．１２（Ｈ−２）、６．２７（Ｈ−３）、６．４１（Ｈ−４）、６．２０（Ｈ−５）、３．６６（Ｈ−７）、１．１４および１．８６（Ｈ−８）、４．０２（Ｈ−９）、１．１９および１．８１（Ｈ−１０）、１．５２（Ｈ−１１）、２．０３（Ｈ−１２）、３．２３および３．５４（Ｈ−１８）、１．７６（Ｈ−１９）、２．２０および１．８９（Ｈ−２１）、４．２２（Ｈ−２２）、４．８７（Ｈ−２５）、２．２８および２．７０（Ｈ−２６）、３．２２（Ｈ−２８）、５．１１（Ｈ−２９）、４．０４（Ｈ−３１）、４．１７（Ｈ−３２）、２．２５（Ｈ−３４）、０．９８５および１．３８（Ｈ−３５）、２．２２（Ｈ−３６）、１．７６（Ｈ−３７）、０．９６１および１．１１（Ｈ−３８）、１．３１（Ｈ−３９）、０．７２６および１．９０（Ｈ−４０）、３．１４（Ｈ−４１）、４．４６（Ｈ−４２）、１．２２および１．８１（Ｈ−４３）、０．８８８および１．６０（Ｈ−４４）、１．６０（Ｈ−４５）、３．０５（Ｈ−４６，ＯＣＨ3）、０．６９７（Ｈ−４７）、６．４８（Ｈ−４８）、０．８２１（Ｈ−４９）、１．７６（Ｈ−５０）、約５．１〜５．３（Ｈ−５１）、３．１７（Ｈ−５２，ＯＣＨ3）、０．７５５（Ｈ−５３）、０．９６６（Ｈ−５４）、０．８０５（Ｈ−５５）、３．２９（Ｈ−５６，ＯＣＨ3）、３．４６（Ｈ−５９）、１．０１（Ｈ−６０）、約４．３〜４．７（Ｏ−６１）。13Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １３９．１２（Ｃ−１）、１３０．５３（Ｃ−２）、１３２．４９（Ｃ−３）、１２７．０８（Ｃ−４）、１２７．２１（Ｃ−５）、１３７．１２（Ｃ−６）、８１．９３（Ｃ−７）、４０．４０（Ｃ−８）、６５．８３（Ｃ−９）、２９．４５（Ｃ−１０）、２５．８７（Ｃ−１１）、３４．２１（Ｃ−１２）、９９．２５（Ｃ−１３）、１９８．１７（Ｃ−１５）、１６５．５５（Ｃ−１６）、４７．０１（Ｃ−１８）、２４．０４（Ｃ−１９）、２８．９３（Ｃ−２１）、５８．５０（Ｃ−２２）、１７０．４４（Ｃ−２３）、７３．２４（Ｃ−２５）、３９．９６（Ｃ−２６）、２０７．６７（Ｃ−２７）、４４．５１（Ｃ−２８）、１２３．９２（Ｃ−２９）、１３６．５６（Ｃ−３０）、７５．８４（Ｃ−３１）、８４．８６（Ｃ−３２）、２０９．４９（Ｃ−３３）、４０．７６（Ｃ−３４）、３９．２０（Ｃ−３５）、３５．０５（Ｃ−３６）、３２．７３（Ｃ−３７）、３８．４２（Ｃ−３８）、３２．０６（Ｃ−３９）、３６．０１（Ｃ−４０）、８０．１２（Ｃ−４１）、７５．９２（Ｃ−４２）、２９．２５（Ｃ−４３）、３０．２４（Ｃ−４４）、１０．２７（Ｃ−４５）、５５．４８（Ｃ−４６，ＯＣＨ3）、１５．４６（Ｃ−４７）、１５．５９（Ｃ−４９）、１４．４１（Ｃ−５０）、５６．５６（Ｃ−���２，ＯＣＨ3）、１２．６７（Ｃ−５３）、２１．５０（Ｃ−５４）、１４．８９（Ｃ−５５）、５７．２７（Ｃ−５６，ＯＣＨ3）、１７４．２２（Ｃ−５７）、４９．９０（Ｃ−５８）、６３．５９および６３．９８（Ｃ−５９）、１６．８２（Ｃ−６０）。ＭＳ［Ｍ＋ＮＨ4+］１０３３．５、［ＥＳＩ（＋），Ｍ＋Ｎａ+］１０３８．７。
【００６８】
以下の実施例は、ＣＣＩ−７７９の位置特異的製造を説明するものである。実施例２は、本発明において有用なビニルエステルの製造を説明するものである。しかし、本発明は、これらのビニルエステルまたはこれらの製造方法に限定されない。ビニルエステルの生成に適する代替方法は、当業者には良く知られている。実施例３は、実施例２のビニルエステルを使用するＣＣＩ−７７９の位置特異的製造を説明するものであり、実施例４は、実施例２のビニルエステルを使用するプロリン−ＣＣＩ−７７９の位置特異的製造を説明するものである。本発明がこれらの実施例において提供する試薬および条件に限定されないことは、上述の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【実施例２】
【００６９】
ビニルエステルの合成：
Ａ．Ｉの合成
【化１４】
2007532650.tif 000011
ＭｅＯＨ（１６ｍＬ）中のＰｄＣｌ2（７０８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、ＬｉＣｌ（１６８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を、その混合物が透明な溶液になるまで還流させながら加熱し、その後、ＭｅＯＨを減圧下で除去し、酢酸ビニル（１０ｍＬ）を添加し、その溶液を濃縮乾固させた。その後、残留物を酢酸ビニル（２０ｍＬ）に再び溶解し、酢酸ビニル（２８０ｍＬ）中の２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（３４．８ｇ、２００ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。その後、その混合物を一晩（約１６時間）穏やかに還流させた。その溶液を減圧下で濃縮し、この残留物にヘプタン（１５０ｍＬ）を添加し、黒色の沈殿をセライトのパッドによる濾過によって除去した。そのヘプタン溶液を濃縮し、残留物を減圧下で蒸留して、ビニルエステルＩを無色の液体として得た（３０．１ｇ、７５％）。
【００７０】
Ｂ．ＩＩの合成：
ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）中のＩ（１０ｇ）の溶液を室温で４時間、Ｈ2ＳＯ4水溶液（２０ｍＬ、０．２５Ｎ）で処理した。その後、その混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ブライン、２．５％  ＮａＨＣＯ3、そしてブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させた。濾過し、約６０ｍＬに濃縮し、その後、（ＭｅＢＯ）3（２．２ｍＬ）を上述の溶液に一滴ずつ添加した。その混合物を室温で１．５時間攪拌し、ヘキサン（６０ｍＬ）で希釈し、ＭｇＳＯ4（３ｇ）を添加し、その混合物をさらに１０分間攪拌した。濾過および濃縮により油性残留物を生じさせ、それを減圧下で蒸留して、ＩＩを無色の液体として得た（７．２ｇ、７８％）。
【実施例３】
【００７１】
ＣＣＩ−７７９の合成
【化１５】
2007532650.tif 000012
Ａ．中間体Ａを経由したＣＣＩ−７７９の合成
方法１：
無水ＴＢＭＥ（３６ｍＬ）中のラパマイシン（６ｇ）、ビニルエステルＩ（２ｇ）、リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（６ｇ）の混合物をＡｒ2下で２日間、４５℃で加熱した。その混合物を室温に冷却し、酵素を濾過によって除去し、濾液を濃縮し、攪拌しながらその油性残留物をヘプタンに添加した。その後、そのバッチを２時間、−１５℃に冷却し、固体をブーフナー漏斗で回収し、冷ヘプタンで洗浄し、Ａをオフホワイトの固体として得た、粗収率：９８％。ＭＳ（ＥＩ）：１０７０
【００７２】
氷水浴で０℃に冷却したｎ−ＰｒＯＨ（２４ｍＬ）に溶解した上述の粗製Ａ（６ｇ）、この溶液にＨ2ＳＯ4水溶液（１２ｍＬ、１．２Ｎ）を添加した。その混合物を２４時間、０℃で攪拌し、その後、冷リン酸緩衝液（３００ｍＬ、ｐＨ＝７．８）に添加し、その固体をブーフナー漏斗で回収し、ＤＩ水で洗浄し、真空下で乾燥させ、ヘキサン−アセトンで溶離するシリカゲルカラム精製によってＣＣＩ−７７９を白色の固体として生じさせた（５．２ｇ、９０％）。ＭＳ（ＥＩ）：１０３０
【００７３】
方法２：
無水ＴＢＭＥ（１５０ｍＬ）中のラパマイシン（３０．０ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）、ビニルエステルＩ（１０．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）、リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（３０ｇ）およびモレキュラーシーブ（５Å）（１０．０ｇ）の混合物をＡｒ2下で４８時間、４２〜４３℃で加熱した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）を添加して沈殿を溶解し、その混合物を室温に冷却した。酵素を濾過によって除去し、ＴＨＦ（２００ｍＬ）で洗浄し、濾液を約６０ｍＬに濃縮し、ＴＨＦ（３２０ｍＬ）で希釈した。その後、その溶液を０〜５℃に冷却し、Ｈ2ＳＯ4（１８０ｍＬ、２Ｎ）を１時間かけて１滴ずつ添加した。その混合物を０〜５℃で４８時間、またはＴＬＣによりモニターしてＡが消失するまで、攪拌した。その混合物をブライン（３００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。併せた有機層をＨ2Ｏ、５％  ＮａＨＣＯ3、その後、ブラインで洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ4）。溶媒を蒸発させることによって、薄黄色を帯びた半固体を得、それをフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン、２：１）によって精製して、ＣＣＩ−７７９を白色の固体として得た（３０．７７ｇ、２段階終わって９１％）。
【００７４】
Ｂ．中間体Ｂを経由したＣＣＩ−７７９の合成：
無水ＴＢＭＥ（４５ｍＬ）中のラパマイシン（３ｇ）、ビニルエステルＩＩ（１．２ｇ）、リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（５ｇ）の混合物をＡｒ2下で６０時間、４５℃で加熱した。その混合物を室温に冷却し、酵素を濾過によって除去し、濾液を濃縮し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）をその残留物に添加し、濃縮乾固させた。ヘキサン−アセトンで溶離する粗製物のシリカゲルカラム精製によって、ＣＣＩ−７７９を白色の固体（２．３ｇ）として生じさせ、ラパマイシン（０．８１ｇ）を回収した。収率は、回収したラパマイシンに基づき９３％である。
【実施例４】
【００７５】
プロリン−ＣＣＩ−７７９の合成
本発明の酵素的手順は、実施例２、ラパマイシンからのＣＣＩ−７７９の合成のための手順Ａにおいて説明したのと本質的に同じ条件下での、プロリン−ラパマイシンからのプロリンＣＣＩ−７７９の合成にも適用することができる。
【化１６】
2007532650.tif 000013
【００７６】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が制限されることはない。実際、上述の説明および付随する図から、当業者には、本明細書に記載のものに加えて本発明の様々な変形が明らかとなろう。そうした変形は、添付の特許請求の範囲の中に入ると解釈される。
【００７７】
さらに、値は近似値であり、説明のために提供していることは、理解されるはずである。
【００７８】
特許、特許出願、出版物、手順などが本出願のいたるところで引用されているが、これらの開示は、それら全文が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と参考文献の間に矛盾が存在し得る程に、本明細書においてその開示の言語は管理されている。
【国際調査報告】
2007532650.tif 000020
2007532650.tif 000021
2007532650.tif 000022
2007532650.tif 000023