(57)【要約】  本発明は、形質細胞疾患の重篤度を減じるための、または形質細胞疾患の治療のための方法を提供する。本方法は、形質細胞疾患に苦しむ個人に、NOTCHの細胞外部分またはJAG2に向けられた抗体を含む組成物を投与するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人における形質細胞疾患の重篤度を減じるための、または当該疾患の治療のための方法であって、悪性形質細胞を有する前記個人に、NOTCH1の細胞外部分またはJAG2に対して向けられた抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬上許容されるキャリア中に含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物の投与により、悪性形質細胞により産生される循環Igの低下を生じる、方法。
【請求項２】
前記抗体がNOTCH1の細胞外部分に対するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がJAG2に対するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体フラグメントが、scFv、Fab'およびF(ab')2から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記形質細胞疾患が、多発性骨髄腫または意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が抗-NOTCH1抗体A6である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が抗-JAG2抗体M2またはM8である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
形質細胞疾患を有する個人において所望の効果を達成するのに必要とされる細胞毒性剤の投与量を減らすための方法であって、前記個人に、前記細胞毒性剤と、NOTCH1の細胞外部分またはJAG2に対して向けられた抗体またはその抗原結合フラグメントを投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
前記抗体がNOTCH1の細胞外部分に対するものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がJAG2に対するものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体フラグメントが、scFv、Fab'およびF(ab')2から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記形質細胞疾患が、多発性骨髄腫または意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が抗-NOTCH1抗体A6である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が抗-JAG2抗体M2またはM8である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌性形質細胞と接触している繊維芽細胞によるIL-6またはVEGFの産生を減じるための方法であって、前記形質細胞を、NOTCH1の細胞外部分またはJAG2に対して向けられた抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物と接触させるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2003年11月26日に出願された米国仮出願第60/525,212号および2004年5月3日に出願された米国仮出願第60/567,469号に対する優先権を主張し、これらの開示は本明細書中に引用により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（MM）は、合衆国において二番目に多く発症する血液疾患である。約13,000の新規な症例が毎年診断されている。MMは、末梢分化したＢ細胞（即ち、形質細胞）を冒すクローナルな形質細胞増殖疾患である。化学治療法におけるある程度の進歩にも関わらず、この疾患は未だ不治であり、40ヶ月のMM患者の半分しか生存しない。MM同様、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（MGUS）は、血清および尿におけるモノクローナル免疫グロブリン、および骨髄におけるモノクローナル形質細胞の増加により特徴付けられる。しかし、MGUS患者はMMの臨床上の兆候を被らない。重要なことには、MGUSを有する患者の25%が骨髄腫を進行させる。
【０００３】
サイトカインインターロイキン-6（IL-6）は、MMにおいて悪性の形質細胞の増殖を促進する主要なサイトカインであると考えられている。高まったIL-6レベルが、骨髄腫患者における腫瘍量、骨破壊および他の腫瘍関連性の活性と直接関連しており（6）、MMにおけるIL-6の役割が示唆される。さらに、いくつかの研究により、骨髄腫細胞が間質細胞において、細胞接触に大きく依存した態様でIL-6の発現を誘導することが示されている（7）。それゆえ、IL-6産生の増加したレベルは、疾患に関連するIL-6調節の変異を反映すると考えられる。
【０００４】
IL-6遺伝子は、サイトカイン、IL-1、TNFアルファを含む種々のファクターにより、および近年立証されたようにNOTCH遺伝子産物により調節され得る。NOTCH遺伝子は、初め、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)にて同定され、膜貫通レセプターの進化上保存されたファミリーのメンバーであり、発生中の細胞運命を決定するのに役立つ（8）。脊椎動物においても無脊椎動物においても、NOTCH遺伝子は非拘束性ないし予め拘束された増殖細胞において、胚発生を通じて発現される（8）。胎児および成体の発生中、NOTCHの発現は成熟組織の増殖層において持続する（9、10）。
【０００５】
完全に処理されたNOTCHレセプターは、細胞質ドメイン(NIC)を含む膜貫通サブユニット(NTM)に非共有的に結合する細胞外サブユニット(NEC)から成る。NICのN末端配列は、IL-6遺伝子を調節することができる転写因子CBF1/RBP-Jkappaに関して高アフィニティの相互作用部位を含む（11）。膜貫通サブユニットのリガンド誘導性の切断が、ドロソフィラおよび哺乳動物細胞において立証されている。この切断により、NOTCHの全細胞内部位が放出され、これが核に入り、そしてCBF1などの転写因子と相互作用することができる（図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
MMの有効な治療を開発するためのいくつかのチーム/研究者等によるあらゆる努力にも関わらず、この疾患は未だ不治である。本疾患において用いられる治療は、この疾患を治療するのに限られた効力のみを許容する。従来の化学治療、主としてメルファランは過去において広く用いられていたが、同種骨髄移植（ABMT）と比較すると、38%を有するABMTと比べ、わずか14%の患者のみが完全な鎮静（CR）に達する。高投与量の化学治療を用いた場合、22-30%のCRが達成される。全身放射線治療と組み合わせると、43%のCRと非常に良好な患者反応が達成される。新規な治療的アプローチが今日試験されているが、それらは全てフェーズI/II段階にある。これらの化合物はサリドマイドおよびその誘導体(IMI)、プロテアーゼインヒビターPS341ベルケードおよび三酸化ヒ素である。しかし、この疾患は未だ不治である。いくつかのIMIdおよびPS341に関する種々の試みは、71%（しかし、わずか13%の患者しかパラプロテインの＞75%の低下を示さない）および47%（しかし、わずか30%の患者しかパラプロテインの＞75%の低下を示さない）のCR/PRを各々示す。従って、新規なアプローチが形質細胞疾患のより効果的な治療のために必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、形質細胞疾患の治療に対する新規な治療的アプローチのための方法を提供するものである。本方法は、NOTCH経路を干渉する剤の使用を含む。
一態様では、本発明により、NOTCHタンパク質、特にNOTCH1タンパク質の細胞外部分に対する抗体を投与するステップを含む、形質細胞疾患の重篤度を減じるための、または形質細胞疾患の治療のための方法が提供される。
【０００８】
他の態様では、本発明により、JAG2タンパク質に対する抗体を投与するステップを含む、形質細胞疾患の重篤度を減じるための、または形質細胞疾患の治療のための方法が提供される。JAG2タンパク質は、悪性形質細胞上に存在すると認められる表面タンパク質である。
他の態様では、本発明により、NOTCHタンパク質に対する抗体および/またはJAG2タンパク質に対する抗体を細胞毒性剤と組み合わせて投与するステップを含む、形質細胞疾患の重篤度を減らすための、または形質細胞疾患を治療するための方法が提供される。有用な化学治療剤の例は、ドキソルビシンである。
【０００９】
本発明により、MGUSおよびMMなどの形質細胞疾患の重篤度の軽減または当該疾患の治療のための方法が提供される。一態様では、形質細胞疾患の重篤度の軽減または当該疾患の治療は、悪性形質細胞により産生されるIgのレベルの低下として評価される。当該方法は、NOTCH経路を干渉することを含む。これは、あらゆる他の手段によるNOTCH-JAG2経路の干渉または当該経路の遮断および/またはNOTCH活性化の不活性化を含む。従って、本発明には、NOTCH経路のいずれかの段階を干渉して、NOTCHタンパク質の活性化を遮断する試薬が含まれる。一態様では、当該干渉剤は、この経路の細胞外成分に対して標的される。同様に、NOTCHの細胞内作用を干渉する剤を用いることもできる。
【００１０】
NOTCH経路を図１に示す。この経路はいくつかの部位にて干渉することができる。我々のデータは、NOTCHリガンド、JAG2の過剰発現が、MGUSを生じる形質細胞増多症(plasmacytosis)の進行および/またはMMにおける十分に悪性の形質細胞の増殖の原因たる役割を演ずる可能性があることを示唆する（図２）。JAG2の過剰発現は、NOTCHを活性化し、ミクロ環境においてLI-6の分泌および放出を駆動し、骨髄腫細胞の成長を支持する。ここで、NOTCH-JAG2経路を干渉するためのいくつかの潜在的な部位の例を図３に示す。一態様では、NOTCH1のJAG2に対する結合を干渉する剤、JAG2またはNOTCHに対して向けられた抗体等を用いることができる。概して、本発明の全ての剤は、NOTCHタンパク質の活性化、即ち、NOTCH ICの核内への移動を遮断することを目的とする（図３）。
【００１１】
一態様では、NOTCH経路を干渉するための剤は、NOTCHの細胞外部分（本明細書中、「NOTCH-EC」とも呼ぶ）に向けられた抗体である。つまり、この抗体を、形質細胞疾患の重篤度を減らすために、または形質細胞疾患の治療のために用いることができる。同様に、他の態様では、NOTCH経路を干渉する剤は、JAG2タンパク質に対する抗体である。
他の態様では、本発明により、NOTCHタンパク質に対する抗体および/またはJAG2タンパク質に対する抗体を、化学治療剤と組み合わせて投与するステップを含む、形質細胞疾患の重篤度を減らすための、または形質細胞疾患を治療するための方法が提供される。有用な化学治療剤の例は、ドキソルビシンである。
【００１２】
本発明の抗体は、JAG2またはNOTCHタンパク質の細胞外部分に特異的に結合して、NOTCH経路の活性化を阻害するポリクローナル、モノクローナル、または抗体フラグメント、例えば一本鎖Fv、Fab'、F(ab')2などであってよい。
JAG2またはNOTCH ECに向けられたポリクローナル抗体は、当該タンパク質で適当な対象を免疫化することにより調製することができる。種々のアジュバントを、宿主の種に応じて免疫学的反応を増すのに用いてよく、制限するものではなく、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、界面活性剤、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（弱毒ウシ型結核生菌）およびコリネバクテリウム・パルバム等が含まれる。免疫化された対象における抗体タイターは、標準的な方法、例えば、固定化されたタンパク質を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いるなどにより経時的にモニターすることができる。所望により、JAG2またはNOTCH ECペプチドに対して向けられた抗体分子を、哺乳動物から（例えば血液から）単離でき、次いで周知の方法、例えばIgGフラクションを得るためのタンパク質Ａクロマトグラフィー等により、さらに精製することができる。
【００１３】
JAG2またはNOTCH ECへ向けられたモノクローナル抗体も標準的な方法で作製することができる。簡単には、不死化細胞系統（典型的には骨髄腫）を、JAG2またはNOTCH ECで免疫化した哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾細胞）と融合し、次いで生じたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、JAG2またはNOTCH ECに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。典型的には、不死化細胞系統（例えば骨髄腫細胞系統）は、リンパ球と同じ哺乳動物種から得る。例えば、ネズミのハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫化したマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞系統と融合することにより作製することができる。好ましい不死化細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「HAT培地」）に感受性のあるマウス骨髄腫細胞系統である。多くの骨髄腫細胞系統のいずれか、例えばP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫系統を、標準的な方法に従い、融合パートナーとして用いてよい。これらの骨髄腫系統は、アメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、ロックビレ、エムディー(Rockville, Md)から入手できる。典型的には、HAT-感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞と、ポリエチレングリコール(「PEG」）を用いて融合する。融合から生じたハイブリドーマ細胞を次いで、融合されていないおよび生産力のない融合骨髄腫細胞を死滅させるHAT培地（非融合脾細胞は、それらは形質転換されないがゆえに、数日後に死亡する）を用いて選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ細胞を、JAG2またはNOTCH ECに結合する抗体に関してハイブリドーマ細胞上清を、例えば標準的なELISAアッセイを用いてスクリーニングすることにより検出する。ヒトのハイブリドーマを同様の方法で調製できる。
【００１４】
モノクローナル抗体を分泌しているハイブリドーマを調製するための別法は、組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をJAG2またはNOTCH-ECでスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を同定および単離することである。
【００１５】
抗体の抗原結合フラグメントも用いることができる。一例は、一本鎖抗体フラグメント、即ち、scFvである。これらは通常、全抗原結合部位を含み、特異的結合特性を保持する最小の抗体フラグメントである。scFvは、可変重(VH)および可変軽（VL）鎖免疫グロブリン遺伝子を、生物学的に不活性なフレキシブルなリンカーを用いて無作為に連結することにより作製される。scFv分子は、存在しているモノクローナル抗体から産生され得るが、ファージディスプレイライブラリーが今や、単一源からの多数のscFvを提供し、最適の結合特性を持つものを、提示されたscFvをコードしている遺伝子と共に同時に選択することを可能とする（1.Pavlinkova等、(1999) J Nucl Med, 40: 1536-1546; Viti等、(1999)癌Res, 59: 347-352; Winter等、(1994) Annu. Rev. Immunol, 12: 433-455; Clackson等、(1991) ネイチャー、352: 624-628; Hoogenboom等、(1998) 免疫テクノロジー、4: 1-20; ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ:ラボラトリーマニュア. San Diego: Academic Press, 1996)。
【００１６】
一態様では、形質細胞疾患の重篤度を減じるためのまたは当該疾患の治療のための方法が提供される。当該方法は、JAG2タンパク質またはNOTCH ECに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを、形質細胞疾患の重篤度を減じるのに充分な量で投与することを含む。抗体または抗体フラグメントは、当該分野の専門家の充分予測範囲内にある医薬上許容される製剤にて投与することができる。本発明のNOTCH経路干渉剤は、当該分野で公知のあらゆる標準的な方法により投与することができる。一態様では、当該剤は、適当な医薬キャリアにて静脈経路により投与する。これらの抗体は、悪性形質細胞により産生される循環Igのレベルを減じるのに有用である。それゆえ、形質細胞疾患の治療中のNOTCH-ECまたはJAG2に対する抗体の効果をモニターする一つの方法は、悪性形質細胞により産生される循環Igのレベルをモニターすることである。
【００１７】
本発明はまた、細胞毒性剤と抗-NOTCHまたは抗-JAG2抗体の組み合わされた使用に関するものである。細胞毒性剤の効果は、本発明の抗体と投与される場合、より低い投与量で観察され得ることが観察された。それゆえ、一態様では、抗-NOTCH ECまたは抗-JAG2抗体の投与による所望の効果を得るのに必要とされる化学治療剤の投与量を減じるための方法が提供される。これは、細胞毒性剤の使用に伴う副作用を減じるのに役立ち得る。他の態様では、抗-NOTCH-ECまたは抗-JAG2抗体の投与により、細胞毒性剤の所定の投与量にて、より大きな効果を得ることができる。多発性骨髄腫の処置のための現在の治療は、メスファラン、ドキソロブシン、デキサメタソン、サリドマイドおよび誘導体、レクリミド等を含む。これらは、標準的な経路により、同時または連続いずれかで投与することができる。
本発明を以下に示す実施例により記載するが、実施例は説明のためのものであって、いかにしても限定のためのものではない。
【実施例】
【００１８】
[実施例１]
本態様により、IL-6の分泌がMM細胞により誘発されることを立証する。IL-6の分泌がMMのコンテクストにおいてJAG2の過剰発現の直接的な結果であることを立証するために、我々は、繊維芽細胞および（既に示したようにJAG2を過剰発現する）我々の多発性骨髄腫細胞系統を用いる共培養インビトロアッセイを開発した。我々は、これらの実施例において、フィーダー層としてMRC5繊維芽細胞系統を用いた。培養ウェルにMRC5細胞を蒔いた。70%のコンフルエンスに際して、細胞を照射して、その成長を停止した。培養培地を、単独で培養したMRC5細胞、MM細胞系統と共培養したMRC5細胞、またはMM細胞系統との共培養だがインサートにより分離し、当該２つの細胞タイプ間の接触を回避したMRC5細胞に関して、回収した。IL-6レベルを培養培地においてアッセイした。図４に示すように、MRC5とMM細胞系統の共培養物はIL-6の分泌において3.5倍の増加を誘導したが、２つの細胞タイプ間を接触させなかった同じ共培養物は、わずかにIL-6の分泌をもたらすのみであり、IL6放出と骨髄腫細胞の増殖のための、ミクロ環境での直接的な接触の必要性が強調される。
【００１９】
[実施例２]
本態様では、抗-NOTCH1モノクローナル抗体を用いて、NOTCH経路を遮断した。この抗体（A6）は、NOTCH1ペプチドに対して産生され、JAG2のNOTCH1に対する結合を遮断すると認められる（図３）。アッセイは、実施例１に記載するものと同様であった。MRC5細胞を骨髄腫細胞系統と、増加量の抗-NOTCH1モノクローナル抗体(5、10、20、40μM)の存在下に共培養した。これらの実験の結果（図５Ａ）は、モノクローナル抗体を培養物に添加した場合にIL-6の放出が低下したことを示す。さらに、繊維芽細胞からのIL6の放出の低下は、培養培地に添加されたモノクローナル抗体の量に比例し、この剤が特異的な態様で当該放出を遮断し得たことを示す。つまり、NOTCHの活性化を遮断することにより、２つの細胞タイプの間の接触により誘導されるIL6の放出が低下する。IL-6の増加分泌の同様の効果が、MRC5細胞を他のMM細胞系統、RPMI8226と共培養した場合に認められ、共培養物を抗JAG2抗体(M8)とインキュベートした場合、IL-6の分泌は低下した（図５Ｂ）。同様に、JAG2のNOTCH1への結合を生じるペプチドに向けられた他の抗体およびこの結合を干渉する他の剤を用いることもできる。これらは、ここ（図３）に示す抗-NOTCH1 Mabと同様の効果を有する。
【００２０】
[実施例３]
本実施例では、SCIDマウスを用いて、インビボでのNOTCH経路の干渉の効果を立証した。SCID-Huマウスを以下のように得た。19-23週齢のヒト胎児の骨を、ワシントン、シアトルのワシントンの大学のバース・デフェクツ・ラボラトリー(Birth Defects Laboratory)から得た。これらの長い胎児の骨をCB17 SCIDマウスに皮下移植した。7つの凍結MM患者サンプルを別のSCIDマウス（光照射後の）からの胎児の骨に注射して、ヒトIgのレベルをモニターして、胎児骨におけるその後生じるMMの発生を評価した。移植された胎児骨を有するがMMサンプルを注射しなかったマウスを対照として用いた。血清を、眼出血によりマウスから得、Ig レベルをELISAアッセイにより評価した。Igを、7匹のマウスのうちの、５つの別個のMMサンプルに対応する5匹で検出した。加えて、胎児骨におけるMMの増殖に誘導される骨疾患を立証できた。
【００２１】
抗NOTCH1 MAbを、前記モデルに用いた。図6aおよび6bに示すように、抗NOTCH1 Mabは、処置されたマウスの2つの群で抗骨髄腫活性を示す。図６Ａに、１週間に２回処置したマウス、１週間に３回処置したマウス、およびあるアイソタイプ抗体で処置したマウスに関するデータを示す。図６Ｂに、非処置マウス、１週間に２回処置したマウス、１週間に３回処置したマウス、およびあるアイソタイプ抗体で処置したマウスに関するデータを示す。グループＡおよびＥは、二人の別人患者からの骨髄で注射したSCIDマウスに対応する。当該マウスにおけるIgの検出は、移植されたMM細胞によりIgが産生されるために、疾患の指標である。
【００２２】
グループＡでは、当該アイソタイプは上昇し、非特異的抗体の注射の効果がないことを示す。2×/週の注入をなした場合、Igは、マウス血液中に検出されるヒトigの量の50%まで低下し、即ち、当該疾患が50%の低下する。3×/週の注射をなした場合、初期の増加および次なる低下が観察される。
他のグループであるグループＥでは、当該対照は上昇するのが認められる。しかし、非特異的反応が、ここでは、当該アイソタイプを用いて認められる。2×および3×/週の両方において、僅かに増加し、後に低下した。これらの結果は、特定に個人によって、これらの抗体を用いて、当該個人を少なくとも安定化することができることを示す。
【００２３】
[実施例４]  
IL-6の放出を我々のインビトロアッセイで研究することに加えて、我々は、骨髄腫細胞との細胞対細胞接触の際の間質細胞によるVEGFおよびIGF-1の放出を試験した。我々は、間質細胞層として、我々のディッシィにおいて、MRC5細胞系統を用い、骨髄腫細胞系統をMRC5の表面において共培養し、2細胞系統間細胞対細胞接触を可能とした。これらの２つのサイトカインは、多発性骨髄腫の発生の重要なエレメントであることが示されている。図７Ａおよび７Ｂに示すように、我々は、MRC5細胞とMM細胞系統の間の共培養が、VEGFおよびIGF-1の分泌および放出を誘導することを示した。
【００２４】
IL-6、VEGFおよびIGF-1の分泌の誘導におけるJAG2の関与を評価するために、我々は、種々の濃度のJAG2ペプチドと共にMRC5細胞系統をインキュベートした。このペプチドは、相互作用に際してNOTCHを活性化させるJAG2の結合領域に対応する。我々は、この同じペプチドと共にRPMI8226細胞系統をもインキュベートした。図８Ａ−Ｃに示すように、IL-6、VEGFおよびIGF-1の分泌は、MRC5細胞系統と共にインキュベートした場合、JAG2結合ペプチドにより活性化されたが、MM細胞系統と共にインキュベートーした場合には刺激はなく、我々の誘導性傍分泌仮説と一致する。
【００２５】
公知のNOTCH標的遺伝子が、MM細胞系統とのMRC5細胞系統の共培養の際に活性化されるかどうかを試験するために、我々は、48時間の培養のためのインビトロシステムを確立した。この時間、両細胞系統（MRC5およびRPMI8226)を共培養した後、MM細胞を取り出し、RNAをMRC5細胞から抽出した。得られたRNAを半定量RT-PCR実験にて用いて、NOTCHの周知かつ典型的なターゲットであるHES-1遺伝子の潜在的転写活性化を測定した。図９Ａおよび９Ｂに示すように、HES-1転写のレベルは、共培養物中に用いたRPMI8226細胞の数に比例して増加し、MRC5単独と比較して、50万個のRPMI8226細胞を用いた場合は1.5倍増加し、100万個のRPMI8226細胞を用いて2倍増加した。
【００２６】
JAG2検出は全て、市場入手可能なポリクローナル抗体を用いて行った。加えて、JAG-NOTCH経路の干渉のために有用なモノクローナル抗体をさらに作製した。我々は、マウスを免疫化するためにJAG2結合ペプチドを用いた。このペプチドの配列は、NH2-CDENYYSATCNKFCRPRND-OH（配列番号１）である。簡単には、JAG2結合ペプチドを作製し、KLHと結合した。マウスをこの結合ペプチドで免疫化し、ポリクローナル抗体応答を生成した。血清を回収し、ELISAにより試験した。脾臓を当該動物から取り出し、当該細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマライブラリーを作製した。モノクローナル培養物を、単一の生存可能細胞に関するフローサイトメトリー細胞ソーティングを用いてハイブリドーマライブラリーから調製した。個々の培養物をELISAにより試験し、上清を我々のMM細胞系統において試験した。我々はELISAによりポジティブに反応する10のモノクローナルハイブリドーマを得た。これらのクローンのアイソタイピングは、4のIgG1、3のIgM、1のIgA、およびIgMとIgG1の混合シグナルを付与する2を示した。2Mab、M8(IgM)およびM2(IgG1)の精製を行った。これらの抗体はFACSにより評価されるように、RPMI細胞系統に対して結合することができた。（図１０）。従って、これらの抗体を形質細胞疾患の治療においてJAG-NOTCH経路の干渉のために用いることができる。これらのデータは、間質細胞におけるNOTCHタンパク質またはMM細胞におけるJAG2タンパク質のいずれかを標的し得ることを示す。
【００２７】
[実施例４]
本態様により、細胞毒性剤と抗-NOTCH-ECまたは抗-JAG2抗体の組合せた使用により、相乗効果が生じることを立証する。この態様を説明するために、抗-NOTCH-EC抗体または抗-JAG2抗体をドキソルビシン(DOX)と組み合わせて用いた。OPM2MM細胞を48時間、繊維芽細胞上で種々の濃度のDOXと共に培養した。図１１Ａに示すように、投与に依存する効果が、生存細胞の割合に関して（MTTアッセイにより）認められた。IC50は約1μMであると認められた。同じ実験を、40μg（27μg/ml）の抗NOTCH EC抗体の存在下に行った場合（図１１Ｂ）、IC50は、濃度のほぼ10倍少ない濃度、即ち0.1μMのDOXにて認められた。細胞を抗-NOTCH抗体単独（DOXを用いない）を用いてインキュベートした場合、40μgにおいて殺滅の効果は全く観察されなかった（図１１Ｃ）。同様に、図１１Ｄに示すように、細胞をDOXのみとインキュベートした場合、生存細胞の割合に関して効果は全く認められなかった。しかし、増加濃度の抗-JAG2を添加した場合、生存細胞の割合は低下することが認められた。ここでもまた、抗-JAG2抗体単独の効果は、これらの濃度の抗体で全く認められなかった（データは示さず）。これらの結果は、抗-JAG2または抗NOTCH-EC抗体および細胞毒性剤がMM細胞の殺滅において相乗効果を有することを示す。
特定の態様を本発明を説明するために示したが、これらの態様の通常の変更が当該分野の専門家に明らかであり、そのような変更は本発明の範囲内にあることが意図される。
【００２８】
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１１．Tamura K, Taniguchi Y, Minoguchi S, Sakai T, Tun T, Furukawa T, Honjo T.,Curr Biol. 5: 1416-23,1995
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】JAG2を発現している細胞#1（MM細胞）およびNOTCHを発現している細胞#2（間質細胞など）を用いたNOTCHの生理学的な活性化を図示したものである。Ａ：JAG2が細胞対細胞接触によりNOTCHに結合する。Ｂ：JAG2の結合により、NOTCHの細胞内部分（NOTCH-IC）のタンパク質分解性切断が生じる。Ｃ：一度切断されると、NOTCH-ICは核へと移動する。Ｄ：一度核内に入ると、NOTCH-ICは、CBF1などの下流エフェクターに結合し、例えばIL-6遺伝子の転写を活性化することができる。
【図２】MMにおける進行性の遺伝子現象。各ステージが各患者にて認識できるわけではないが、正常な形質細胞から、細胞が不死化されているが、形質転換されておらず、累積的に蓄積せず、または骨破壊を生じないMGUSへ；細胞が骨随（BM）ミクロ環境へと閉じ込められ、蓄積し、骨破壊を引き起こす随内骨髄腫へ；細胞がより迅速に増殖し、血液中（形質細胞白血病）または他の随外部位へと成長する髄外骨髄腫へ；細胞をインビトロにて増殖し得る骨髄腫細胞系統へと、順序だって進行すると考えられる。このモデルは、臨床上の進行に関連する遺伝子現象の起こり得るタイミングをまとめたものである。
【図３】NOTCH経路の遮断およびNOTCHの活性化のために試験した試薬の作用部位を図示したものである。抗-NOTCH1モノクローナル抗体は、JAG2への結合に関与するNOTCH1結合ペプチドに対して向けられる。抗-JAG2モノクローナル抗体は、NOTCH1の結合に関与するJAG2結合ペプチドに対して向けられる。
【図４】種々の培養条件の際のIL-6分泌の評価のためのELISAによるIL-6検出アッセイ。結果を、MRC5単独、K620(MM)とインサートの存在下に共培養されたMRC5（当該２つの細胞タイプの間に接触なし）、およびK620と共培養されたMRC5に関して示す。
【図５】図５Ａは、種々の共培養条件にて、MRC5単独、K620(MM)のみと、または、増加量の抗-NOTCH1 Mab A6(5、10、15、20、40μg)と共培養したMRC5のいずれかを用いたELISAによるIL-6アッセイを示す。IL-6の分泌は、用いたMabの量に対して反比例することが認められた。図５Ｂは、MRC5細胞単独、MM細胞、RPMI8226と共培養したMRC5細胞、および抗JAG2抗体(M8)の存在下にRPMI8226と共培養したMRC5細胞に関してIL-6分泌を測定した他の実験を示す。
【図６】２群の処置マウスにおける抗-NOTCH抗体の抗骨髄腫活性。X軸は週の時間を示し、Y軸はヒトIgのレベルを示す。図６ａは、対照抗体（アイソタイプ）で処置したマウス、１週間に２回抗体を受容したマウス、および一週間に３回抗体を受容したマウスに関するデータを示す。図６ｂは、処置しなかったマウスを有する他の群に関するデータを示す。
【図７】MM細胞系統およびMRC5細胞系統の共培養時のIL-6およびVEGF分泌。図７Ａは、MRC5細胞単独、インサートを用いない（「単独」とマークする）およびインサートを用いたK620(MM細胞）とのMRC5細胞のIL-6分泌に関するデータを示す。図７Ｂは、MRC5細胞単独、RPMI8226細胞（MM）単独、U26細胞(MM)単独、RPMI8226とのMRC5細胞およびU226とのMRC5に関するVEGF分泌のデータを示す。
【図８】指定濃度でのJAG2結合ペプチドCDENYYSATCNKFCRPRND（配列番号１）とのMRC5およびRPMI8226細胞系統のインキュベーションによるIL-6（図８Ａ）；VEGF（図８Ｂ）およびIGF-1（図８Ｃ）の分泌の誘導。
【図９】RPMI8226との共培養後のMRC5細胞から抽出したRNAを用いたHES-1発現に関する半定量PCR。RT-PCRの結果を図９Ａに示し、MRC5細胞単独またはMM細胞系統RPMI8226と培養されたものに関するHES-1の発現の倍増を図９Ｂに示す。0.5Mおよび1.0Mは、MRC5細胞の表面における培養においてセットされた細胞の数を示す（百万にて）。
【図１０】二次抗体単独、M2またはM8モノクローナル抗体のいずれかを用いるRPMI8226MM細胞のFACS分析。非濃縮ハイブリドーマ上清をこれらの実験に用いた。
【図１１】ドキソルビシン（DOX）単独または抗-NOTCHまたは抗-JAG2抗体の存在下にインキュベートしたOPM2細胞（MM）に関するIC50。OPM2(MM)細胞を、繊維芽細胞(MRC5)上で培養した。図１１Ａは、種々の濃度のDOXと共にインキュベートした細胞に関するIC50データを示す。図１１Ｂは、0.1M DOX、アイソタイプ抗体または抗NOTCH-EC抗体を用いた繊維芽細胞上OPM2細胞に関するIC50データを示す。図１１Ｃは、DOXを用いない抗-NOTCH抗体単独の効果に関するデータを示す。図１１Ｄは、単独で、DOXの存在下で、または抗-JAG2抗体(M8)と共にDOXの存在下に培養されたOMP2細胞に関するIC50値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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