(57)【要約】本発明は、本明細書に開示した式（I）の化合物ならびにこれらの化合物を含む薬学的組成物に関する。また、LPA受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性を有するそのような化合物の使用法であって、LPA受容体に対するLPA活性を阻害すること、LPA受容体活性を調節すること、癌を治療すること、細胞増殖を促進すること、創傷を治療すること、細胞、組織、または臓器においてアポトーシスを治療する、または機能を保存もしくは回復すること、細胞を培養すること、臓器または組織機能を保存すること、および皮膚病状態を治療することを含む方法も同様に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）の化合物：
2007508324.tif 000071
式中、
X1、X2、およびX3の少なくとも一つは(HO)2PS-Z1-もしくは(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-であるか、X1およびX2は一緒に結合して-O-PS(OH)-O-であるか、またはX1およびX3は一緒に結合して-O-PS(OH)-NH-であり；
X1、X2、およびX3の少なくとも一つはR1-Y1-A-で、ただしX1、X2、およびX3の二つがR1-Y1-A-である場合にそれぞれは同じもしくは異なっているか、またはX2およびX3は一緒に結合して-N(H)-C(O)-N(R1)-であり；
任意に、X1、X2、およびX3の一つはHであり；
Aは直接結合、kが0から30の整数である(CH2)k、またはOのいずれかであり；
Y1はlが1から30の整数である-(CH2)l-、-O-、
2007508324.tif 000072
であり；
Z1は-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-であり、ただしmは1から50の整数であるか、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2は-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-であり、ただしnは1から50の整数であるか、または-O-であり；
Q1およびQ2は独立にH2、=NR4、=O、Hと-NR5R6との組み合わせであり；
R1は、X1、X2、またはX3のそれぞれについて、独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2007508324.tif 000073
であり；かつ
R2、R3、R4、R5、R6、R7、およびR8は独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【請求項２】
Q1およびQ2がいずれもH2であり；
X1およびX2の一つが(HO)2PS-Z1-であり、ただしZ1はOであり；かつ
X1、X2、およびX3の一つがR1-Y1-A-であり、ただしAは直接結合でありかつY1は-CH2-である、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R1がC3からC21直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルである、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
R1がC7からC15直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルである、請求項2記載の化合物。
【請求項５】
化合物が、チオリン酸O-デシルエステル；チオリン酸O-ドデシルエステル；チオリン酸O-テトラデシルエステル；チオリン酸O-デカ-9-エニルエステル；チオリン酸O-ドデカ-9-エニルエステル；チオリン酸O-テトラデカ-9-エニルエステル；およびチオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステルからなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項６】
Q1およびQ2がいずれもH2であり；
X1およびX2の一つが(HO)2PS-Z1-であり、ただしZ1はCF2であり；かつ
X1、X2、およびX3の一つがR1-Y1-A-であり、ただしAは直接結合でありかつY1は-CH2-である、請求項1記載の化合物。
【請求項７】
R1がC3からC21直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルである、請求項6記載の化合物。
【請求項８】
R1がC7からC15直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルである、請求項6記載の化合物。
【請求項９】
化合物が、(1,1-ジフルオロ-ペンタデシル)ホスホン酸ジエチルエステルまたは(1,1-ジフルオロ-ペンタデシル)ホスホン酸である、請求項6記載の化合物。
【請求項１０】
Q1およびQ2がいずれもH2であり；
X1、X2、およびX3の一つが(HO)2PS-Z1-であり、ただしZ1はOであり；かつ
X1、X2、およびX3の二つがR1-Y1-A-であり、ただしそれぞれについてAは直接結合でありかつY1はOである、請求項1記載の化合物。
【請求項１１】
R1がC6からC24直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルである、請求項10記載の化合物。
【請求項１２】
R1がC8からC18直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルである、請求項10記載の化合物。
【請求項１３】
Q1およびQ2がいずれもH2であり；
X3がHであり；
X1およびX2の一方が(HO)2PS-Z1-であり、ただしZ1はOであり；かつ
X1およびX2の他方がR1-Y1-A-であり、ただしAは直接結合でありかつY1はlが1から30の整数である-(CH2)l-である、請求項1記載の化合物。
【請求項１４】
R1がアルキル-フェニル基である、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
化合物が、チオリン酸O-[7-(4-オクチル-フェニル)-ヘプチル]エステルである、請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
薬学的に許容される担体と、請求項1記載の化合物とを含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
LPA受容体に対するLPA活性を阻害する方法であって、
LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
LPA受容体のLPA誘導性活性を阻害するのに有効な条件下で、LPA受容体と化合物を接触させる段階を含む方法。
【請求項１８】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
LPA受容体がインビトロにある細胞上に存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
LPA受容体がインビボにある細胞上に存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
LPA受容体活性を調節する方法であって、
LPA受容体アゴニストまたはLPA受容体アンタゴニストいずれかとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
LPA受容体の活性を調節するのに有効な条件下で、LPA受容体と化合物を接触させる段階を含む方法。
【請求項２２】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
LPA受容体がインビトロにある細胞上に存在する、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
LPA受容体がインビボにある細胞上に存在する、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
癌を処置する方法であって、
LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
癌を処置するのに有効な様式で、患者に有効量の化合物を投与する段階を含む方法。
【請求項２６】
癌が、前立腺癌、卵巣癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
細胞増殖を促進する方法であって、
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
細胞のLPA受容体誘導性増殖を促進するのに有効な様式で、細胞上のLPA受容体と化合物を接触させる段階を含む方法。
【請求項２８】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
LPA受容体がインビトロにある細胞上に存在する、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
LPA受容体がインビボにある細胞上に存在する、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
創傷を処置する方法であって、
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
創傷部位に有効量の化合物を送達し、そこで該化合物が創傷の治癒を促進する細胞上のLPA受容体と結合し、それによりLPA受容体アゴニスト誘導性細胞増殖が刺激されて、創傷治癒が促進される段階を含む方法。
【請求項３２】
LPA受容体が、EDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
LPA受容体がインビトロにある細胞上に存在する、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
LPA受容体がインビボにある細胞上に存在する、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
細胞、組織または臓器において、アポトーシスを処置する、または機能を保存もしくは回復する方法であって、
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
細胞、組織または臓器と、細胞、組織または臓器において、アポトーシスを処置する、または機能を保存もしくは回復するのに有効な量の化合物を接触させる段階を含む方法。
【請求項３６】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
接触段階をインビトロで実施する、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
接触段階をインビボで実施する、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
接触段階が、アポトーシス、虚血、外傷、または再灌流傷害に関係する状態を患っている患者に化合物を投与する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
接触段階が、胃腸の混乱を患っている患者に化合物を投与する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
化合物が、チオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステルである、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
細胞をインビトロで培養する方法であって、
細胞を、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を含む培地中で培養する段階であって、該化合物がアポトーシスを防止する、または培養中の細胞を保存するのに有効な量で存在する段階を含む方法。
【請求項４３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
臓器または組織を保存する方法であって、
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
臓器または組織を臓器または組織機能を保存するのに有効な量の化合物を含む溶液で処理する段階を含む方法。
【請求項４６】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
臓器または組織が、消化管の臓器または組織を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
処理段階が、消化管の臓器または組織を化合物と接触させるのに有効な様式で、患者に化合物を投与する段階を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
化合物が、チオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステルである、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
臓器または組織機能を保存する方法であって、
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
臓器または組織機能を保存するのに有効な量の化合物を移植臓器または組織の受容者に投与する段階を含む方法。
【請求項５１】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
皮膚病状態を処置する方法であって、
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する請求項1記載の化合物を提供する段階；および
患者に化合物を含む組成物を局所投与する段階であって、該化合物が皮膚病状態を処置するのに有効な量で存在する段階を含む方法。
【請求項５３】
皮膚病状態がしわまたは脱毛である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
LPA受容体が、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
硫黄存在下で、(Y2O)2PO-Z11-Z13または(Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z13と、式（IX）
2007508324.tif 000074
の中間化合物を反応させる段階、続いて必要があれば脱保護する段階であって、ただし該反応段階および脱保護段階がいずれも式（I）の化合物を得るのに有効な条件下で実施され、X1、X2、およびX3の一つまたは二つは(HO)2PS-Z1-または(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-である段階を含む、請求項1記載の化合物を製造する方法：
(Y2O)2PO-Z11-Z13または(Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z13において、式中、
Z11は-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-であり、ただしmは1から50の整数であるか、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z12は-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-であり、ただしnは1から50の整数であるか、または-O-であり；
Z13はHもしくは第一脱離基であるか、または-Z11-Z13は一緒になって第一脱離基を形成し；かつ
Y2はHまたは保護基である；
式（IX）において式中、
X11、X12、およびX13の少なくとも一つはR11-Y11-A-で、ただしX11、X12、およびX13の二つがR11-Y11-A-である場合にそれぞれは同じもしくは異なっているか、またはX12およびX13は一緒に結合して-N(H)-C(O)-N(R11)-であり；
X11、X12、およびX13の少なくとも一つはOH、NH2、SH、または第二脱離基であり；
任意に、X11、X12、およびX13の一つはHであり；
Aは直接結合、kが0から30の整数である(CH2)k、またはOのいずれかであり；
Y11はlが1から30の整数である-(CH2)l-、-O-、
2007508324.tif 000075
であり；
Q1およびQ2は独立にH2、=NR13、=O、Hと-NR14R15との組み合わせであり；
R11は、X11、X12、またはX13のそれぞれについて、独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2007508324.tif 000076
であり；かつ
R12、R13、R14、R15、R16、およびR17は独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リゾホスファチジン酸（「LPA」）受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性を有するLPA誘導体、ならびに前立腺癌療法、卵巣癌療法、および創傷治癒を含むが、それらに限定されるわけではない、LPA誘導体の様々な治療的使用に関する。
【０００２】
本出願は2003年10月9日提出の米国特許仮出願第60/509,971号の先行する恩典を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本発明は、部分的に米国立衛生研究所（NIH）助成番号CA92160により資金供給を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
すべての非形質転換細胞はその生存および増殖のために成長因子を必要とする。ポリペプチド成長因子に加えて、成長因子様の特性を有する脂質群が新しく発見され、総称してリン脂質成長因子（PLGF）として知られている。ほとんどの静止細胞の増殖誘導における類似の薬理特性にもかかわらず（Jalink et al., 1994a; Tokumura, 1995; Moolenaar et al., 1997）。PLGFは構造上、二つの広い範疇にさらに分けることができる。第一の範疇は、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質メディエーター（GPM）を含む。例示的GPMには、LPA、ホスファチジン酸（PA）、環状ホスファチジン酸（環状-PA）、アルケニルグリセロールホスフェート（アルケニル-GP）、およびリゾホスファチジルセリン（LPS）が含まれる。第二の範疇は、スフィンゴイド塩基モティーフを有するスフィンゴ脂質メディエーター（SPM）を含む。例示的SPMには、スフィンゴシン-1-ホスフェート（SPP）、ジヒドロスフィンゴシン-1-ホスフェート、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）、およびスフィンゴシン（SPH）が含まれる。
【０００５】
LPA（Tigyi et al., 1991; Tigyi and Miledi, 1992）、PA（Myher et al., 1989）、アルケニル-GP（Liliom et al., 1998）、環状-PA（Kobayashi et al., 1999）、SPP（Yatomi et al., 1995）、およびSPC（Tigyi et al., 2000）は血清中で検出されている。これらの脂質メディエーターは同定され、特徴付けられている。それでもまだ、成長因子様特性を示す不明のPLGFが血清および血漿中に存在する（Tigyi and Miledi, 1992）。LPAは約20μMの濃度で、血清中に最も多く存在するPLGFである（Tigyi and Miledi, 1992; Jalink et al., 1993）。
【０００６】
真核細胞では、LPAは、主に小胞体（ER）の膜で行われるリン脂質生合成の早期における重要な中間体である（Bosch, 1974; Bishop and Bell, 1988）。ERにおいて、LPAはグリセロール-3-ホスフェートに対するアシル-CoAの作用から誘導され、さらにアシル化されてPAを生じる。LPAのPAへのアシル化の速度は非常に速いため、LPAは生合成部位にはほとんど蓄積しない（Bosch, 1974）。LPAはERに限定されているため、その代謝中間体としての役割はおそらく、シグナリング分子としての役割とは無関係である。
【０００７】
LPAは血清の成分であり、そのレベルは低いマイクロモル濃度（μM）の範囲である（Eicholtz et al., 1993）。LPAは凝血過程で活性化血小板によって放出されるため、このレベルが予想される。血清とは異なり、新鮮血または血漿中では検出不能である（Tigyi and Miledi, 1992; Eicholtz et al., 1993）。血清に存在するLPAはアルブミンに結合しており、全血清の熱安定性かつ透析不能な生物活性の大部分を担っている（Moolenaar, 1994）。アフリカツメガエル卵母細胞において塩化物の内向き電流の誘発を担う活性血清成分はLPA(18:0)であると同定された（Tigyi and Miledi, 1992）。アルブミン結合LPA(18:0)の大部分は、リゾ-PCに対するリゾホスホリパーゼD（PLD）の作用によるよりもむしろ、凝血過程で産生される。前者の経路は、ヘパリンまたはクエン酸塩およびデキストロースの作用により脱凝固した「老齢」血漿におけるLPAの存在を担っている（Tokumura et al., 1986）。 留意すべきもう一つの点は、LPAがEDTA処理した血漿中には存在しないことである。この事実は、血漿リゾホスホリパーゼはCA2+依存性であることを示唆するものである（Tokumura et al., 1986）。 
【０００８】
アルブミンの役割は、血清中に存在するホスホリパーゼの作用からLPAを保護することである（Tigyi and Miledi, 1992）。Tigyi and Milediは、アルブミンは血流中のLPAの担体としてはたらくだけでなく、その生理的半減期を延ばしもすることを示唆している。アフリカツメガエル卵母細胞での塩化物電流の誘発におけるLPAの作用を模する、まだ同定されていない血清中の脂質メディエーターがある。
【０００９】
LPA反応性細胞型は粘菌アメーバおよびアフリカツメガエル卵母細胞から哺乳類体細胞にわたる。したがって、LPAの供給源およびその放出は活性化血小板だけに限定されるものではないと考えられる。最近の実験により、ペプチド成長因子による刺激後、哺乳類の線維芽細胞は急速にLPAを産生し、続いてそれを細胞外媒質中に放出することが示された（Fukami and Takenawa, 1992）。
【００１０】
不明な細胞起源の比較的多量の生理活性LPAが卵巣癌患者の腹水中に存在するという証拠が得られており（Xu et al., 1995a）、そのような患者からの腹水は卵巣癌細胞に対して強力な有糸分裂促進活性を有することが知られている（Mills et al., 1988; Mills et al., 1990）。これが腫瘍細胞から細胞外液中に分泌されるのか、白血球によって分泌されるのか、またはより複雑な脂質から様々なホスホリパーゼの作用を介して産生されるのかは確立されていない。
【００１１】
GPMおよびSPMは、系統樹全般にわたる広範な細胞性反応を引き起こす（Jalink et al., 1993a）。LPAは、ニューロン（Jalink et al., 1993; Durieux et al., 1992）、血小板、通常のものならびに形質転換線維芽細胞（Jalink et al., 1990）、上皮細胞（van Corven et al., 1989; Moolenaar, 1991）、およびアフリカツメガエル卵母細胞（Tigyi and Miledi, 1992; Durieux et al., 1992; Fernhout et al., 1992）などの様々な細胞の細胞内貯蔵から生じる一過性Ca2+シグナルを誘導する。LPAは血小板凝集（Schumacher et al., 1979; Tokumura et al.,1981; Gerrard et al., 1979; Simon et al., 1982）および平滑筋収縮（Tokumura et al., 1980; Tokumura et al., 1994）を誘導し、静脈内投与により血圧の種依存性変化を引き起こす（Schumacher et al., 1979; Tokumura et al., 1978）。
【００１２】
LPAは、静止線維芽細胞に加えると、DNA合成および細胞分裂を刺激する（van Corven et al., 1989; van Corven et al., 1992）。LPAの増殖様効果はペプチド成長因子の存在を必要としない。この知見により、LPAは、細胞増殖を持続させるためにインスリンまたは表皮成長因子の存在を必要とするエンドセリンまたはバソプレシンと異なっている（Moolenaar, 1991）。留意すべき点は、Sp2骨髄腫細胞において、LPAはcAMPレベルの上昇によって仲介される有糸分裂阻害反応を担っていたことである（Tigyi et al., 1994; Fischer et al., 1998）。分裂促進経路とは異なり、分裂阻害経路は百日咳毒素（PTX）による影響を受けなかった。また、フォルスコリンおよびイソブチルメチルキサンチンの添加後、Sp2骨髄腫細胞におけるLPAの分裂阻害作用は相加的であった（Tigyi et al., 1994）。様々な細胞型において、LPAは、線維芽細胞の巣状接着およびストレスファイバーの形成を含む細胞骨格の変化を引き起こす（Ridley and Hall, 1992）。LPAはまた、発生中の神経突起の退縮を誘導することにより神経芽細胞腫分化の逆行および抑制も促進する（Jalink et al., 1994a; Jalink et al., 1994b）。ナノモル（nmol）量のLPA（Jalink and Moolenaar, 1992）を血清不足N1E-115神経芽細胞腫細胞に加えると、ただちに神経突起の退縮を引き起こし、急速であるが一過性に細胞体が丸くなった（Jalink et al., 1993b）。LPAを持続的に存在させると、神経芽細胞腫細胞はその未分化表現型を維持するが、有糸分裂に入ることはできない（Jalink et al., 1993b）。細胞周期の進行にはインスリン様成長因子などの他の因子が必要であった。細胞がいったん形態学的分化に入ってしまうと、LPAの添加はこの形態学的分化を逆行させる。したがって、LPA誘導性神経突起退縮は、基層への接着の消失よりもむしろ、アクチン-細胞骨格の収縮によって起こる（Jalink et al., 1993b; Jalink et al., 1994b）。
【００１３】
LPAは、他の生理的化学誘引物質（例えば、インターロイキン-8）と同様、ヒト単球において走触性メカニズムによる細胞遊走を引き起こす（Zhou et al., 1995）。細胞遊走の誘導に加えて、LPAは肝細胞癌および癌腫細胞の中皮細胞単層への侵襲を促進する（Imamura et al., 1993）。この侵襲の根底にあるメカニズムはまだ不明であるが、細胞運動性の亢進および細胞接着増加による可能性がある。最後に、LPAは新生児心筋細胞アポトーシスを阻止することも知られている（Umansky et al., 1997）。
【００１４】
独特の天然リン脂質、すなわち環状-PAは、細胞型に応じて他のGPMと類似または反対の細胞作用を担っていることが示された。アフリカツメガエル卵母細胞で試験したところ、他のGPMとまったく同様の塩化物電流を誘発したが、その反応はLPAによって脱感作されなかった（Fischer et al., 1998）。Murakami-Murofushi et al. (1993)は、環状-PAが、増殖を誘導するLPAとは異なり、抗増殖作用を示すことを明らかにした。
【００１５】
PLGF受容体（PLGFR）は7回膜貫通型（7TM）グアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（Gタンパク質）結合受容体（GPCR）スーパーファミリーに属する。7TM GPCRはヘテロ三量体Gタンパク質との相互作用を介してそれらの細胞性反応を仲介する細胞表面受容体のファミリーである。特にEDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24を含むいくつかのLPA受容体が同定されている。これらのLPA受容体と他の受容体との近縁度を例示する系統樹を図1に示している。
【００１６】
1996年に、Hechtらはディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いて、マウス新皮質細胞株から推定セルペンタイン（serpentine）受容体をコードするcDNAをクローニングした（Hecht et al., 1996）。この遺伝子は脳室ゾーン遺伝子-1（Vzg-1）と命名された。この遺伝子は皮質神経形成領域で発現され、分子量41kDa（364アミノ酸）のタンパク質をコードしていた。Vzg-1は内皮分化遺伝子-2（EDG-2）と呼ばれる未発表のヒツジ配列に非常に類似していた。同じcDNAがマウスおよびウシのライブラリからもオーファン受容体として単離され、recl.3として知られていた（Macrae et al., 1996）。これはマウス組織中に広く分布し、脳および心臓で最も高度に発現された。
【００１７】
1996年に、GuoらはPCRによるプロトコルを用いてアフリカツメガエル卵母細胞から別の推定LPA受容体PSP-24（372アミノ酸）を単離した（Guo et al., 1996）。この受容体はVzg-1/EDG-2/recl.3とほとんど類似性を示さなかった（Guo et al. 1996）。EDG-2ヒトLPA受容体のcDNA配列を用いた、スフィンゴ脂質受容体の配列による検索から、二つの密接に関連するGPCR、すなわちラットH218（EDG-5、354アミノ酸）およびEDG-3（378アミノ酸）が得られた（An et al., 1997a）。ノーザン分析により、心臓組織においてEDG-3およびEGD-5をコードするmRNAの高い発現が示された。
【００１８】
LPAの機能性受容体としてEDG-2が最近同定されたことは、AnらをLPA受容体新規サブタイプの配列による検索を行うよう促した（An et al., 1998a）。GPCRをコードするヒトcDNAが見いだされ、EDG-4と命名された（An et al., 1998a）。ノーザンブロット分析により、EDG-2とEDG-4はいずれもGPM受容体としてはたらくが、それらの組織分布は非常に異なることが判明した。EDG-2とは異なり、EDG-4は主に末梢血白血球および精巣において発現される（An et al., 1998a）。
【００１９】
ヒトジャーカットT細胞からのcDNAのPCR増幅により、EDGファミリーに属するこれまでに知られていないGPCRが同定された。同定されたGPCRはEDG-7と命名された。これは40kDaの分子質量（353アミノ酸）を有する。ヒト組織におけるEDG-7発現のノーザンブロット分析により、EDG-7が心臓、膵臓、前立腺、および精巣で発現されることが判明した（Bandoh et al., 1999）。したがって、PLGF受容体にはPSP24およびEDGの二つの異なるファミリーがあり、合計10の個々のPLGFRがある（図1）。リストは増え続けている。
【００２０】
これらの様々な受容体は、下記の表1に示すとおり、GPMおよびSPMに対するそれらのリガンド特異性に基づいて分類することができる。
【００２１】
（表１）リン脂質成長因子受容体、長さ、および原理リガンド
2007508324.tif 000002
【００２２】
アフリカツメガエルPSP24およびマウス発現PSP24は特異的にGPM（LPA、Fischer et al., 1998）誘発振動性塩化物電流を伝達する。これらはEDGファミリーと構造的に同種ではない（Tigyi and Miledi, 1992; Fernhout et al., 1992）。EDGファミリーは二つの異なるサブグループに分類することができる。第一のグループには、EDG-2、EDG-4、およびEDG-7が含まれ、これらはGPMだけの受容体としてはたらき（Hecht et al., 1996; An et al., 1998a; Bandoh et al., 1999; An et al., 1998b）、リガンド結合に反応して多くのシグナルを送る。第二のグループはEDG-1、EDG-3、EDG-5、EDG-6、およびEDG-8を含み、SPMに特異的である（An et al., 1997a; Im et al., 2000; van Brocklyn et al., 1998; van Brocklyn et al., 2000; Spiegel and Milstein, 2000）。様々なPLGFRの原理組織発現を下記の表2に示す。
【００２３】
（表２）リン脂質成長因子受容体のヒト組織発現
2007508324.tif 000003
【００２４】
PLGFは複数のGタンパク質仲介性シグナル伝達事象を活性化する。これらのプロセスはヘテロ三量体Gタンパク質ファミリーGq/11、Gi/0、およびG12/13を通して仲介される（Moolenaar, 1997; Spiegel and Milstein, 1995; Gohla, et al., 1998）。
【００２５】
Gq/11経路はホスホリパーゼC（PLC）の活性化を担っており、これが次いでイノシトール三リン酸（IP3）産生と、続いてCa2+の広範な細胞への移動を誘導する（Tokumura, 1995）。いくつかの細胞では、この反応はPTX感受性で、複数のPTX感受性および非感受性経路の関与が示唆される（Tigyi et al., 1996）。この経路はジアセチルグリセロール（DAG）仲介性のプロテインキナーゼC（PKC）の活性化も担っている。PKCは、ホスファチジルコリンの遊離コリンおよびPAへの加水分解を担う細胞性ホスホリパーゼD（PLD）を活性化する（van der Bend et al., 1992a）。また、PLCはいくつかの細胞型においてMAPキナーゼを直接、またはPKCのDAG活性化を介して活性化することもできる（Ghosh et al., 1997）。
【００２６】
分裂促進シグナリング経路はGタンパク質ヘテロ三量体Gi/0サブユニットを通して仲介される。形質移入試験により、αiサブユニットよりもむしろGiβγ二量体がRas-MAPキナーゼ活性化を担っていることが明らかである。Rasの活性化よりも先にEGF（Cunnick et al., 1998）またはPDGF受容体（Herrlich et al., 1998）などの受容体チロシンキナーゼ（RTK）のトランス活性化が起こる。トランス活性化されたRTKSはRasを活性化し、これはRafを介してMAPキナーゼ（ERK 1,2）の活性化を引き起こす。PTX感受性であるGiαサブユニットは、アデニリルシクラーゼ（AC）を阻害し、その結果βγ二量体が、受容体をリン酸化して脱感作するGタンパク質結合受容体キナーゼ（GRK）にドッキングする。リン酸化された受容体はβアレスチンによって動員され、したがってsrcキナーゼを動員し、これがEGF受容体をリン酸化して、その活性な立体配座を生成する（Lin et al., 1997; Ahn et al., 1999; Luttrell et al., 1999）。トランス活性化されたRTKは次いで、Rasを活性化し、これはRafを介してMAPキナーゼ（ERK 1,2）の活性化を引き起こす。PTX感受性であるGiαサブユニットはACを阻害し、その結果環状AMP（cAMP）のレベル低下を引き起こす。LPAによる反対の細胞性作用、すなわち、有糸分裂促進と分裂阻害は、cAMPセカンドメッセンジャー系への対抗作用を伴う。分裂促進はGiα経路を通して仲介され、その結果cAMPのレベル低下を引き起こす（van Corven et al., 1989; van Corven et al., 1992）が、分裂阻害はPTX非感受性Ca2+依存性のcAMP上昇を伴う（Tigyi et al., 1994; Fischer et al., 1998）。
【００２７】
これとは対照的に、アクチン-細胞骨格の再編成を引き起こすPTX非感受性G12/13シグナリング経路についてはほとんど知られていない。この経路はRTKのトランス活性化にも関与すると考えられ（Lin et al., 1997; Ahn et al., 1999; Luttrell et al., 1999; Gohla et al., 1998）、小さいGTPアーゼ、Rhoに収束する（Moolenaar, 1997）。Rhoの下流シグナリングについては、様々なタンパク質パートナーが単離および同定されているため、はるかに詳しく知られている。RhoはSer/Tyrキナーゼを活性化し、これらはミオシンL鎖ホスファターゼ（MLC-ホスファターゼ）をリン酸化し、その結果阻害する（Kimura et al., 1996）。この経路はMLCのリン酸化型の蓄積を引き起こし、神経突起の退縮（Tigyi and Miledi, 1992; Tigyi et al., 1996; Dyer et al.,1992; Postma et al., 1996; Sato et al., 1997）、ストレスファイバーの誘導（Ridley and Hall, 1992; Gonda et al., 1999）、走化性の刺激（Jalink et al., 1993a）、細胞遊走（Zhou et al., 1995; Kimura et al., 1992）、および腫瘍細胞侵襲性（Imamura et al., 1993; Imamura et al., 1996）のような細胞性作用につながる細胞骨格反応を起こす。PLGF誘導性、Rho仲介性の腫瘍細胞侵襲性は、ADP依存性メカニズムでRhoを特異的にリボシル化するボツリヌス菌（C. Botulinum）C3毒素により阻止される（Imamura et al., 1996）。
【００２８】
Rhoは静止線維芽細胞においてDNA合成を刺激する能力も有する（Machesky and Hall, 1996; Ridley, 1996）。RhoファミリーGTPアーゼの発現は、早期遺伝子転写を仲介する血清反応因子（SRF）を活性化する（Hill et al., 1995）。さらに、PLGF（LPA）は腫瘍細胞侵襲を誘導する（Imamura et al., 1996）が、これが細胞骨格の変化もしくは遺伝子転写、または両方に関連するかどうかはまだ不明である。
【００２９】
いくつかの細胞系路ならびに増殖および/または遊走などの細胞活性におけるLPA/LPA受容体の関与、ならびに創傷治癒および癌におけるそれらの掛かり合いによって、上で同定されたLPA受容体でアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかとして、好ましくは選択的に作用することができる新規化合物を同定することが望ましいと考えられる。
【００３０】
現在のところ、合成または内因性LPA受容体阻害剤はほとんど知られていない。これまでに報告されたアンタゴニストのうち、最大の研究はSPH、SPP、N-パルミトイル-1-セリン（Bittman et al., 1996）、およびN-パルミトイル-1-チロシン（Bittman et al., 1996）に対して行われた。前述の化合物がアフリカツメガエル卵母細胞においてLPA誘導性塩化物電流を阻害することは公知である（Bittman et al., 1996; Zsiros et al.,1998）。しかし、これらの化合物はすべての細胞系で研究されてはいない。SPPが腫瘍細胞侵襲性を阻害することも公知であるが、SPPがLPAの阻害剤であることによりそのような作用を示すのか、またはそれ自体の受容体の作用を介しているのかについては不明である。N-パルミトイル-1-セリンおよびN-パルミトイル-1-チロシンもLPA誘導性血小板凝集を阻害した（Sugiura et al., 1994）が、これらの化合物がLPA受容体で作用するかどうかはまだ調べる必要がある。リゾホスファチジルグリセロール（LPG）は、LPA作用のある程度の阻害を示す最初の脂質であった（van der Bend et al., 1992b）が、いくつかのLPA反応性細胞型で検出されなかった（Liliom et al., 1996）。これらの阻害剤で、特定のLPA受容体において選択的に作用することが示されたものはなかった。
【００３１】
ポリスルホン化化合物、スラミンは、LPA誘導性のDNA合成を可逆的かつ用量依存的に阻害することが明らかにされた。しかし、スラミンはLPA受容体に対していかなる特異性も持たず、非常に高いミリモル（mM）濃度でのみLPAの作用を阻止することが判明した（van Corven et al., 1992）。 
【００３２】
本発明は、現行のLPAアゴニストおよびLPAアンタゴニストに関連する欠点を克服することを目的とする。
【発明の開示】
【００３３】
発明の概要
本発明は、下記の式（I）の化合物に関する：
2007508324.tif 000004
式中、
X1、X2、およびX3の少なくとも一つは(HO)2PS-Z1-、もしくは(HO)2PO-Z2-P(OH)S-Z1-であるか、X1およびX2は一緒に結合して-O-PS(OH)-O-であるか、またはX1およびX3は一緒に結合して-O-PS(OH)-NH-であり；
X1、X2、およびX3の少なくとも一つはR1-Y1-A-で、ただしX1、X2、およびX3の二つがR1-Y1-A-である場合にそれぞれは同じもしくは異なっているか、またはX2およびX3は一緒に結合して-N(H)-C(O)-N(R1)-であり；
任意に、X1、X2、およびX3の一つはHであり；
Aは直接結合、(CH2)k（kは0から30の整数である）、またはOのいずれかであり；
Y1は-(CH2)l-（lは1から30の整数である）、-O-、
2007508324.tif 000005
であり；
Z1は-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-、もしくは-O(CH2)m-（mは1から50の整数である）、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2は-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-（nは1から50の整数である）、または-O-であり；
Q1およびQ2は独立にH2、=NR4、=O、またはHと-NR5R6との組み合わせであり；
R1は、X1、X2、またはX3のそれぞれについて、独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2007508324.tif 000006
であり；かつ
R2、R3、R4、R5、R6、R7、およびR8は独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、あるいは直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００３４】
薬学的に許容される担体と本発明の化合物とを含む薬学的組成物も同様に開示される。
【００３５】
本発明のさらなる局面は、LPA受容体に対するLPA活性を阻害する方法であって、LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、LPA受容体のLPA誘導性活性を阻害するのに有効な条件下で、LPA受容体と化合物を接触させる段階とを含む方法に関する。
【００３６】
本発明のもう一つの局面は、LPA受容体活性を調節する方法であって、LPA受容体アゴニストまたはLPA受容体アンタゴニストいずれかとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、LPA受容体の活性を調節するのに有効な条件下で、LPA受容体と化合物を接触させる段階とを含む方法に関する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの局面は、癌の治療法であって、本発明の化合物を提供する段階と、癌を治療するのに有効な様式で、患者に有効量の化合物を投与する段階とを含む方法に関する。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの局面は、細胞増殖を促進する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、細胞のLPA受容体誘導性増殖を促進するのに有効な様式で、細胞上のLPA受容体と化合物を接触させる段階とを含む方法に関する。
【００３９】
本発明のさらなる局面は、創傷の治療法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、創傷部位に有効量の化合物を送達し、そこで化合物は創傷の治癒を促進する細胞上のLPA受容体と結合し、それによりLPA受容体アゴニスト誘導性細胞増殖を刺激して創傷治癒を促進する段階とを含む方法に関する。
【００４０】
本発明のさらに他の局面は、本発明の化合物を製造する方法に関する。本発明の化合物を製造するための一つのアプローチは：
硫黄存在下で、
(Y2O)2PO-Z11-Z13または(Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z13
（式中、
Z11は-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-、もしくは-O(CH2)m-（mは1から50の整数である）、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z12は-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-（nは1から50の整数である）、または-O-であり；
Z13はHもしくは第一脱離基であるか、または-Z11-Z13は一緒になって第一脱離基を形成し；かつ
Y2はHまたは保護基である）と、
式（IX）の中間化合物
2007508324.tif 000007
（式中、
X11、X12、およびX13の少なくとも一つはR11-Y11-A-で、ただしX11、X12、およびX13の二つがR11-Y11-A-である場合にそれぞれは同じもしくは異なっているか、またはX12およびX13は一緒に結合して-N(H)-C(O)-N(R11)-であり；
X11、X12、およびX13の少なくとも一つはOH、NH2、SH、または第二脱離基であり；
任意に、X11、X12、およびX13の一つはHであり；
Aは直接結合、(CH2)k（kは0から30の整数である）、またはOのいずれかであり；
Y11は-(CH2)l-（lは1から30の整数である）、-O-、
2007508324.tif 000008
であり；
Q1およびQ2は独立にH2、=NR13、=O、Hと-NR14R15との組み合わせであり；
R11は、X11、X12、またはX13のそれぞれについて、独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2007508324.tif 000009
であり；かつ
R12、R13、R14、R15、R16、およびR17は独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキルである）
を反応させる段階、続いて必要があれば脱保護する段階、ただしこの反応段階および脱保護段階はいずれも式（I）の化合物（X1、X2、およびX3の一つまたは二つは(HO)2PS-Z1-または(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-である）を得るのに有効な条件下で実施する段階を含む。
【００４１】
本発明のさらにもう一つの局面は、細胞、組織、または臓器においてアポトーシスを処置する、または機能を保存もしくは回復する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、細胞、組織または臓器と、細胞、組織または臓器においてアポトーシスを処置する、または機能を保存もしくは回復するのに有効な量の化合物を接触させる段階とを含む方法に関する。
【００４２】
本発明のさらなる局面は、細胞を培養する方法であって、細胞を、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有し、アポトーシスを防止する、または培養中の細胞を保存するのに有効な量で存在する、本発明の化合物を含む培地中で培養する段階を含む方法に関する。
【００４３】
本発明のもう一つの局面は、臓器または組織を保存する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、臓器または組織を、臓器または組織機能を保存するのに有効な量の化合物を含む溶液で処理する段階とを含む方法に関する。
【００４４】
本発明の関連する局面は、臓器または組織を保存する別の方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、移植臓器または組織の受容者に臓器または組織機能を保存するのに有効な量の化合物を投与する段階とを含む方法に関する。
【００４５】
本発明のさらに他の局面は、皮膚病状態を処置する方法であって、LPA受容体アゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、患者に化合物を含む組成物（ただし化合物は皮膚病状態を処置するのに有効な量で存在する）を局所投与する段階とを含む方法に関する。
【００４６】
本明細書において一つまたは複数のLPA受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであると同定された本発明の化合物は、それぞれLPA受容体シグナリングによって仲介される生化学経路を阻害または促進するために用いられる。LPA受容体シグナリングを調節することにより、アンタゴニストおよびアゴニストは本明細書に記載の特異的で実質的な用途がある。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明の一つの局面は、式（I）の化合物に関する：
2007508324.tif 000010
式中、
X1、X2、およびX3の少なくとも一つは(HO)2PS-Z1-、もしくは(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-であるか、X1およびX2は一緒に結合して-O-PS(OH)-O-であるか、またはX1およびX3は一緒に結合して-O-PS(OH)-NH-であり；
X1、X2、およびX3の少なくとも一つはR1-Y1-A-で、ただしX1、X2、およびX3の二つがR1-Y1-A-である場合にそれぞれは同じもしくは異なっているか、またはX2およびX3は一緒に結合して-N(H)-C(O)-N(R1)-であり；
任意に、X1、X2、およびX3の一つはHであり；
Aは直接結合、(CH2)k（kは0から30の整数である）、またはOのいずれかであり；
Y1は-(CH2)l-（lは1から30の整数である）、-O-、
2007508324.tif 000011
であり；
Z1は-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-、もしくは-O(CH2)m-（mは1から50の整数である）、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2は-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-（nは1から50の整数である）、または-O-であり；
Q1およびQ2は独立にH2、=NR4、=O、Hと-NR5R6との組み合わせであり；
R1は、X1、X2、またはX3のそれぞれについて、独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2007508324.tif 000012
であり；かつ
R2、R3、R4、R5、R6、R7、およびR8は独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、あるいは直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００４８】
上で同定されたR基（例えば、R1〜R8）のそれぞれについて、直鎖アルキルは式-(CH2)xCH3（xは0から29である）を有し；分枝鎖アルキルは一つまたは複数のCH2基がCHW基（Wはアルキル側鎖である）で置換されている以外は、直鎖アルキルについて上で定義された式を有し；直鎖アルケニルは式-(CH2)xaCH=CH(CH2)xbCH3（xaおよびxbはそれぞれ0から27であり、かつ(xa+xb)は27未満である）を有し；かつ分枝鎖アルケニルは一つまたは複数のCH2基がCHW基で、またはCH基がCW基で（Wはアルキル側鎖である）置換されている以外は、直鎖アルケニルについて上で定義された式を有することが意図される。好ましい炭化水素基は、好ましくは約8から約18炭素原子の長さ、より好ましくは約約10から約16炭素原子の長さで、一つまたは複数の二重結合を含んでいてもよい。
【００４９】
芳香環または芳香族複素環には、フェニル、インデン、ピロール、イミダゾール、オキサゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、ピペリジン、チオフェン、フラン、ナフタル、ビフェニル、およびインドールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。芳香環または芳香族複素環は、R1-Y1-A鎖のY1基に環が結合している位置に対する環上のオルト、メタ、またはパラ位にある1、2、または3置換を含むことができる。環上の置換には、アルキル、アルコキシ、アミン（2級または3級アミンを含む）、アルキルアミン、アミド、アルキルアミド、酸、アルコールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５０】
アシル基は、前述のアルキル、アルケニル、または芳香環もしくは芳香族複素環を含むことができる。
【００５１】
アリールアルキルおよびアリールオキシアルキル基は、前述の直鎖または分枝鎖C1からC30アルキル基で、R1-Y1-A鎖のY1基に結合しているアルキル基を含むことができるが、それらに限定されるわけではない。
【００５２】
式（I）の例示的化合物は下記の式（II）〜（VII）のサブクラス化合物である。
【００５３】
式（II）Aおよび（II）Bの構造において、Q1およびQ2はいずれもH2であり；X1、X2、およびX3の一つは(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-（Z1およびZ2はOである）であり；かつX1、X2、およびX3の二つはR1-Y1-A-（それぞれについてAは直接結合であり、Y1はOである）である。各R1は独立に式（I）について上で定義されたとおりである。
2007508324.tif 000013
【００５４】
式（III）の構造において、Q1はH2であり；Q2は=Oであり；X1は(HO)2PO-Z1-（Z1はOである）であり；かつX2およびX3はR1-Y1-A-（それぞれについてAは直接結合であり、Y1は-NH-である）である。式IIIの範囲内の好ましい種は、X3が-NH2であり、かつX2が-NHR1（R1はC10からC18アルキル、より好ましくはC14アルキルまたはC18アルキルのいずれかである）であるもの；またはX3が-NHR1（R1はアセチル基である）であり、かつX2が-NHR1（R1はC14アルキルである）であるものである。
2007508324.tif 000014
【００５５】
式（IV）の構造において、Q1は=NR4であり；Q2はH2であり；X1およびX2は一緒に結合して-O-PO(OH)-O-であり；かつX3はR1-Y1-A-（Aは直接結合であり、かつY1は-NH-である）である。R1およびR4は式（I）について上で定義されたとおりである。
2007508324.tif 000015
【００５６】
式(V）Aおよび（V）Bの構造において、Q1およびQ2はいずれもH2であり；X1、X2、およびX3の二つは(HO)2PO-Z1-（Z1はそれぞれについてOである）であり；かつX1、X2、およびX3の一つはR1-Y1-A-（Aは直接結合であり、かつY1は-O-である）である。R1は式（I）について上で定義されたとおりである。式（V）Aおよび（V）Bの範囲内の好ましい種には、R1がC21アルキルを含むアシルであるか、またはR1がC18アルキルである化合物が含まれる。
2007508324.tif 000016
【００５７】
式（I）の化合物、ならびに式（II）A、（II）B、（III）、（IV）、（V）A、および（V）Bの亜属化合物は、ホスホラミデートまたはピロホスフェートを硫黄存在下（還流）で反応させてチオ置換誘導体を得ることができる他は、2001年3月19日提出のPCT/US01/08729に記載の合成スキームを用いて調製することができ、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５８】
式（VI）の化合物において、Q1およびQ2はいずれもH2であり；X1およびX2の一つは(HO)2PS-Z1-（Z1はOである）であり；かつX1、X2、およびX3の一つはR1-Y1-A-（Aは直接結合であり、かつY1は-CH2-である）である。R1は式（I）について上で定義されたとおりである。
2007508324.tif 000017
好ましいR1基は、直鎖および分枝鎖両方の飽和および不飽和C2からC24炭化水素、ならびにC2からC24炭化水素を含むアリールアルキル基であり；最も好ましいR1基は、飽和および不飽和C4からC18炭化水素である。式VIの好ましい化合物はチオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステル（8g；FAP 18:1 d9とも呼ばれる）である。
【００５９】
式（VI）のチオホスホネート合成の概略を図1のスキーム2に示す。保護チオホスホン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-アルキル/アルケニルエステルは、Haines et al. (1996)の改変法を用いて合成することができる。市販の脂肪族アルコール（6a〜g）を、無水塩化メチレン中の1H-テトラゾールおよびビス(2-シアノエチル)-N,Nジイソプロピルホスホラミダイトの混合物で処理し、続いて元素硫黄存在下で還流することにより、ビスシクロエチル保護脂肪族アルコールチオホスフェート（7a〜g）を得ることができる。これらの保護チオホスフェートをメタノールKOHで処理し、続いて酸性化することにより、所望のチオホスフェート（8a〜g）を得ることができる。
【００６０】
式（VII）Aおよび（VII）Bの構造において、Q1およびQ2はいずれもH2であり；X1お、X2およびX3の一つは(HO)2PS-Z1-（Z1はOである）であり；かつX1、X2、およびX3の二つはR1-Y1-A-（それぞれについてAは直接結合であり、かつY1はOである）である。各R1は独立に式（I）について前述のとおりに定義される。
2007508324.tif 000018
【００６１】
好ましいR1基は、直鎖および分枝鎖両方の飽和および不飽和C6からC24炭化水素であり；最も好ましいR1基は、飽和および不飽和C8からC18炭化水素である。グループ（VII）Aの二つの好ましい化合物は、両方のR1基が飽和オクチル基であるものの（R）および（S）鏡像異性体である。（R）鏡像異性体は部分LPA1アゴニスト（EC50：695nM）、一過性部分LPA2アゴニスト（EC50：1.02uM）、および完全LPA3アゴニスト（EC50：3nM）である。（S）鏡像異性体はLPA1およびLPA3受容体のアゴニストである（LPA1に対してIC50 328nMおよびLPA1に対してIC50 184nM（いずれも200nM LPA）。
【００６２】
式（VII）Aおよび（VII）Bの化合物は、ホスホラミデートを硫黄存在下（還流）で反応させてチオ置換誘導体を得ることができる他は、2001年3月19日提出のPCT/US01/08729に記載の合成スキームを用いて調製することができ、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６３】
式（VIII）の化合物において、Q1およびQ2はいずれもH2であり；X1およびX2の一つは(HO)2PS-Z1-（Z1はCF2である）であり；かつX1、X2、およびX3の一つはR1-Y1-A-（Aは直接結合であり、かつY1は-CH2-である）である。R1は式（I）について上で定義されたとおりである。
2007508324.tif 000019
好ましいR1基は、直鎖および分枝鎖両方の飽和および不飽和C2からC20炭化水素であり；最も好ましいR1基は、飽和および不飽和C4からC12炭化水素である。
【００６４】
式（VIII）のジフルオロチオホスホネート合成の概略を図1のスキーム3に示す。テトラデシルジフルオロホスホネート類縁体を、ジエチルジフルオロメタンホスホネートを出発原料として用いて、二段階で合成した（スキーム3）（Halazy et al., 1991）。ジエチルジフルオロメタンホスホネートをLDAにより-78℃で処理し、続いて陰イオンを臭化テトラデシルと反応させて、保護ホスホネート10を得た。化合物10をブロモトリメチルシランを用いて脱保護し、所望のジフルオロホスホネート化合物（11）を得た。
【００６５】
したがって、本発明の非環状化合物は、(Y2O)2PO-Z11-Z13、(Y2O)2PO-Z12-P(OH)S-Z11-Z13（Z11は-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-、もしくは-O(CH2)m（mは1から50の整数である）、-C(R3)H-、または-O-であり、Z12は-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-（nは1から50の整数である）、または-O-であり、Z13はHまたは第一脱離基であるか、あるいは-Z11-Z13は一緒になって第一脱離基を形成し、かつY2はHまたは保護基である）を、式（IX）の中間化合物と硫黄存在下で反応させ、続いて必要があれば脱保護段階を行い、ただしいずれも式（I）の化合物（X1、X2、およびX3の一つまたは二つは(HO)2PS-Z1-または(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-（Z1およびZ2は上で定義したとおりである）である）を得るのに有効な条件下で実施することにより調製することができる。
【００６６】
式（IX）の中間化合物は下記の構造を有する：
2007508324.tif 000020
（式中、
X11、X12、およびX13の少なくとも一つはR11-Y11-A-で、ただしX11、X12、およびX13の二つがR11-Y11-A-である場合にそれぞれは同じもしくは異なっているか、またはX12およびX13は一緒に結合して-N(H)-C(O)-N(R11)-であり；
X11、X12、およびX13の少なくとも一つはOH、NH2、SH、または第二脱離基であり；
任意に、X11、X12、およびX13の一つはHであり；
Aは直接結合、(CH2)k（kは0から30の整数である）、またはOのいずれかであり；
Y11は-(CH2)l-（lは1から30の整数である）、-O-、
2007508324.tif 000021
であり；
Q1およびQ2は独立にH2、=NR13、=O、Hと-NR14R15との組み合わせであり；
R11は、X11、X12、またはX13のそれぞれについて、独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2007508324.tif 000022
であり；かつ
R12、R13、R14、R15、R16、およびR17は独立に水素、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキル、直鎖もしくは分枝鎖C2からC30アルケニル、環の1、2もしくは3置換を有するもしくは有していない芳香環もしくは芳香族複素環、C1からC30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分枝鎖C1からC30アルキルを含むアリールオキシアルキルである）。
【００６７】
本発明のLPA受容体アゴニストおよびアンタゴニストを調製した後、そのような化合物を用いて以下に記載する患者の処置に適した薬学的組成物を調製することができる。したがって、本発明のさらなる局面は、薬学的に許容される担体と本発明の化合物とを含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は適当な賦形剤、または安定化剤も含むことができ、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤などの固体または液体剤形でありうる。典型的に、組成物は約0.01％〜約99％、好ましくは約20％〜約75％の活性化合物を、担体、賦形剤、安定化剤などと共に含むことになる。
【００６８】
固体単位用量剤形は通常のタイプでありうる。固体剤形は、本発明の化合物、ならびに担体、例えば、滑沢剤および乳糖、ショ糖、またはトウモロコシデンプンなどの不活性充填剤を含む通常のゼラチンタイプなどのカプセル剤であってもよい。もう一つの態様において、これらの化合物を、乳糖、ショ糖、またはトウモロコシデンプンなどの通常の錠剤基剤と、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、またはアルギン酸などの崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤との組み合わせにより錠剤化する。
【００６９】
本発明の化合物を、生理的に許容される希釈剤および薬学的担体中のこれらの材料の溶液または懸濁液による注射用または局所適用剤形で投与してもよい。そのような担体には、界面活性剤ならびに補助剤、賦形剤または安定化剤を含む他の薬学的および生理的に許容される担体を加えた、または加えない、水および油など無菌の液体が含まれる。例示的な油は石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、落花生油。ダイズ油、または鉱油である。一般に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射用液剤のために好ましい液体担体である。
【００７０】
エアロゾルとして用いるために、溶液または懸濁液中の本発明の化合物を加圧エアロゾル容器に、適当な噴射剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素噴射剤および通常の補助剤と共に包装してもよい。本発明の材料をネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧型で投与してもよい。
【００７１】
行う治療に応じて、本発明の化合物は経口、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、点鼻により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内、動脈内、病巣内、または鼻、喉、および気管支などの粘膜への適用により投与することができる。
【００７２】
本発明の範囲内の組成物には、本発明の化合物がその所期の目的を達成するのに有効な量で含まれるすべての組成物が含まれる。個々の必要性は様々であるが、各成分の有効量の最適範囲を決定することは当業者の技術範囲内である。典型的用量は、体重1kgあたり約0.01mg〜約100mgを含む。好ましい用量は体重1kgあたり約0.1mg〜約100mgを含む。最も好ましい用量は体重1kgあたり約1mg〜約100mgを含む。本発明の化合物投与のための治療法も、当業者であれば容易に決定することができる。
【００７３】
本発明の特定の化合物はLPA受容体のアゴニストとして有用であることが判明している一方で、本発明の他の化合物はLPA受容体のアンタゴニストとして有用であることが判明している。これらは活性が異なるため、様々な化合物に異なる用途がある。本発明の好ましい動物被検者は哺乳動物、すなわち哺乳綱に属する個体である。本発明はヒト被検者の治療において特に有用である。
【００７４】
本発明のもう一つの局面は、LPA受容体活性を調節する方法であって、LPA受容体アゴニストまたはLPA受容体アンタゴニストいずれかとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、LPA受容体の活性を調節するのに有効な条件下で、LPA受容体と化合物を接触させる段階とを含む方法に関する。
【００７５】
LPA受容体は、LPA受容体を普通に発現するか、またはそうではなく特定のLPAを発現するよう形質転換されている細胞上にある。適用なLPA受容体には、EDG-2（LPA1）、EDG-4（LPA2）、EDG-7（LPA3）、GPR23（LPA4）（Noguchi et al. 2003）、およびPSP-24受容体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。これらの受容体を普通に発現する細胞を含む組織を前掲の表1に示している。細胞を本発明のLPA受容体アゴニストまたはLPA受容体アンタゴニストと接触させる際、接触は細胞がインビトロまたはインビボにある時に行うことができる。
【００７６】
通常はこれらの受容体を発現しない宿主細胞においてこれらを異種性に発現するために、そのような受容体の一つまたは複数をコードする核酸分子を、適当な転写および翻訳調節領域（すなわち、プロモーターおよび転写終結シグナル）を含む発現ベクター中にセンス方向に挿入し、次いで宿主細胞を発現ベクターで形質転換することができる。発現ベクターは細胞ゲノムに組み込んでもよく、または染色体外核内物質として単純に存在してもよい。発現は構成性または誘導性のいずれでもありうるが、構成性発現がほとんどの目的に適している。
【００７７】
EDG-2のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が公知で、An et al. (1997b)およびGenbankアクセッション番号U80811に報告されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。EDG-2（LPA1）をコードする核酸分子は下記の配列番号:1のヌクレオチド配列を有する：
2007508324.tif 000023
コードされるEDG-2（LPA1）受容体は下記の配列番号:2のアミノ酸配列を有する：
2007508324.tif 000024
【００７８】
EDG-4（LPA2）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が公知で、An et al. (1998b)およびGenbankアクセッション番号NM_004720に報告されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。EDG-4をコードする核酸分子は下記の配列番号:3のヌクレオチド配列を有する：
2007508324.tif 000025
コードされるEDG-4（LPA2）受容体は下記の配列番号:4のアミノ酸配列を有する：
2007508324.tif 000026
【００７９】
EDG-7（LPA3）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が公知で、Bandoh et al. (1999)およびGenbankアクセッション番号NM_012152に報告されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。EDG-7をコードする核酸分子は下記の配列番号:5のヌクレオチド配列を有する：
2007508324.tif 000027
コードされるEDG-7（LPA3）受容体は下記の配列番号:6のアミノ酸配列を有する：
2007508324.tif 000028
【００８０】
PSP-24のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が公知で、Kawasawa et al. (2000)およびGenbankアクセッション番号AB030566に報告されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。PSP-24をコードする核酸分子は下記の配列番号:7のヌクレオチド配列を有する：
2007508324.tif 000029
コードされるPSP-24受容体は下記の配列番号:8のアミノ酸配列を有する：
2007508324.tif 000030
【００８１】
LPA受容体アゴニストは、LPA受容体からのLPA様活性を特徴的に誘導し、この活性は化学的に、例えば、卵母細胞中のCa2+もしくはCl-電流により、または細胞の形態、運動性、増殖などの変化を調べることにより測定することができる。これとは対照的に、LPA受容体アンタゴニストは、LPA受容体からのLPA様活性を特徴的に阻止する。これも化学的に、例えば、卵母細胞中のCa2+もしくはCl-電流により、または細胞の形態、運動性、増殖などの変化を調べることにより測定することができる。
【００８２】
LPA受容体アンタゴニストとして作用する本発明の化合物によって、本発明は、LPA受容体に対するLPA誘導性活性を阻害する方法にも関する。この方法は、LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、LPA受容体のLPA誘導性活性を阻害するのに有効な条件下で、LPA受容体と化合物を接触させる段階とを含む。LPA受容体は前述の定義のとおりでありうる。LPA受容体は、受容体を普通に発現するか、または受容体を異種性に発現する細胞上にある。LPA受容体の本発明の化合物との接触はインビトロまたはインビボで行うことができる。
【００８３】
前述のとおり、LPAは前述のLPA受容体を含むLPA受容体を通してのシグナリングを含むいくつかの異なる細胞経路に関連するシグナリング分子である。したがって、本発明の化合物は、LPA受容体アンタゴニストまたはLPA受容体アゴニストいずれかとして作用することにより、細胞挙動に対するLPAの効果を調節することになる。
【００８４】
本発明の一つの局面は、癌の治療法であって、本発明の化合物を提供する段階と、有効量の化合物を患者に癌を治療するのに有効な様式で投与する段階とを含む方法に関する。本発明の化合物で治療することができる癌のタイプには、挙動が少なくとも部分的にLPA仲介性活性に起因しうる癌細胞によって特徴付けられる癌が含まれる。典型的には、これらの癌のタイプは、一つまたは複数のタイプのLPA受容体を発現する癌細胞によって特徴付けられる。癌の例示的な型には、前立腺癌、卵巣癌、および膀胱癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８５】
癌治療のために特に有用な本発明の化合物は、LPA受容体アンタゴニストである。
【００８６】
本発明の化合物を投与する際、全身投与することもでき、または代わりに癌細胞がある特定の部位に直接投与することもできる。したがって、投与は化合物を癌細胞に送達するのに有効ないかなる様式でも達成することができる。理論に縛られることなく、LPA受容体アンタゴニストはLPA受容体に結合した後、癌細胞の増殖もしくは転移を阻害するか、またはそうではなく癌細胞を破壊することになると考えられる。下記の実施例12に示すとおり、本発明のいくつかのLPAアンタゴニスト化合物は、前述のタイプの一つまたは複数のLPA受容体を発現する前立腺癌細胞株に対して細胞毒性であった。
【００８７】
本発明のLPAアンタゴニスト化合物または薬学的組成物を癌治療のために投与する場合、薬学的組成物は様々なタイプの癌を治療するために現在公知であるか、または今後開発される他の治療薬または治療法も含む、または一緒に投与することができる。
【００８８】
癌の侵襲は、個々の細胞または細胞群が原発腫瘍から離れ、全身循環またはリンパ系に達して異なる臓器に広がる、複雑な多段階過程である（Liotta et al., 1987）。この過程において、腫瘍細胞は毛細管内で停止し、遊出し、組織の支質中に移動して、二次病巣を形成しなければならない。第一に、腫瘍細胞は循環からそれらを停止させる内皮細胞上のシグナルを認識しなければならない。第二に、腫瘍細胞は細胞表面ラミニン受容体を介して基底膜糖タンパク質ラミニンに結合しなければならない。基底膜への結合後、腫瘍細胞はプロテアーゼを分泌して基底膜を分解する。結合および局所的タンパク質分解の後、侵襲の第三段階は腫瘍細胞の移動である。細胞の運動性が腫瘍細胞侵襲および転移において中心的役割を果たす。インビトロでの腫瘍細胞の運動性と動物における転移挙動との関係を調べる実験から、強い直接相関が示されている（Hoffman-Wellenhof et al., 1995）。インビトロでPLGFが増殖を促進し、癌細胞の侵襲性を高めることは詳細に報告された事実である。Imamuraらは、癌細胞がその侵襲のために血清因子を必要とすることを確立し（Imamura et al., 1991）、後にLPAを、無血清系で腫瘍細胞侵襲を完全に回復することができる最も重要な血清成分であると同定した（Xu et al., 1995a; Imamura et al., 1993; Mukai et al., 1993）。
【００８９】
PLGFRは卵巣癌細胞株、すなわち、OCC1およびHEY細胞において発現されることが明らかにされている。特に、RT-PCR分析により、これらの細胞株におけるEDG-2およびEDG-7受容体の存在が示されている。最近、Im et al., (2000)は、EDG-7が前立腺癌細胞株、すなわち、PC-3およびLNCaP細胞において発現されることを示した。前立腺癌細胞株DU-145、PC-3、およびLNCaP株でのRT-PCR分析により、EDG-2、4、5、およびEDG-7は3つの前立腺癌細胞株すべてに存在するが、EDG-3はLNCaPおよびDU-145前立腺癌細胞株に存在することが判明した。
【００９０】
本発明のもう一つの局面は、細胞増殖を促進する方法に関する。この細胞増殖を促進する方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階と、細胞のLPA受容体誘導性増殖を促進するのに有効な様式で、細胞上のLPA受容体と化合物を接触させる段階とを含む。
【００９１】
LPAが癌細胞活性の調節において果たす役割に加え、LPAは自然な創傷治癒における生理的役割も有することを示唆する強力な証拠がある。創傷部位で、活性化血小板由来のLPAは、少なくとも部分的には、おそらく他の血小板由来因子と同期して、損傷および炎症の部位での細胞増殖の刺激を担っていると考えられる（Balazs et al., 2000）。さらに、LPAはそれ自体で血小板凝集を刺激し、これは次に初期凝集反応への正のフィードバックの要素を起動する因子であると考えられる（Schumacher et al., 1979; Tokumura et al., 1981; Gerrard et al., 1979; Simon et al.、1982）。
【００９２】
細胞増殖におけるLPAの役割のため、LPA受容体アゴニスト活性を有する化合物を、創傷治癒を促進するのに有効な様式で用いることができる。したがって、本発明のもう一つの局面は、創傷の治療法に関する。この方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供し、創傷部位に有効量の化合物を送達し、そこで化合物は創傷の治癒を促進する細胞上のLPA受容体と結合し、それによりLPA受容体アゴニスト誘導性細胞増殖を刺激して創傷治癒を促進することにより実施する。
【００９３】
創傷の治療における第一のゴールは、創傷閉鎖を達成することである。開放皮膚創は創傷の一つの主要な範疇を表し、熱傷、神経障害性潰瘍、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、および糖尿病性潰瘍が含まれる。開放皮膚創は通常、次の6つの主な成分を含む過程によって治癒する：i）炎症、ii）線維芽細胞増殖、iii）血管増殖、iv）結合組織合成、v）上皮化、およびvi）創傷収縮。創傷治癒は、これらの成分が個別または全体のいずれかで適切に機能しない場合に損なわれる。栄養不良、感染症、薬物（例えば、アクチノマイシンおよびステロイド）、糖尿病、および高齢を含む、多くの因子が創傷治癒に影響しうる（Hunt and Goodson, 1988参照）。
【００９４】
リン脂質は、有糸分裂誘発（Xu et al., 1995b)、アポトーシス、細胞接着、および遺伝子発現の調節を含む、細胞活性の重要な調節因子であることが明らかにされた。特に、例えば、LPAは細胞増殖（Moolenaar, 1996）および細胞移動（Imamura et al., 1993）に対する成長因子様効果を誘発する。LPAが創傷治癒および再生において役割を果たすことも示唆されている（Tigyi and Miledi, 1992）。
【００９５】
一般に、線維芽細胞、内皮および上皮細胞の創傷内へのより迅速な流入を促進する物質は、創傷が治癒する速度を高めるはずである。創傷治癒の治療において有用な本発明の化合物は、いくつかのインビトロおよびインビボモデルで同定および試験することができる。
【００９６】
インビトロ系は創傷治癒過程の異なる成分、例えば、細胞の、線維芽細胞（Verrier et al., 1986）、内皮細胞（Miyata et al., 1990）、または上皮細胞（Kartha et al., 1992）などの組織培養細胞の「傷ついた」コンフルエント単層への逆行を模擬する。他の系は内皮細胞移動および/または増殖の測定を可能にする（Muller et al., 1987; Sato et al., 1988）。
【００９７】
傷ついたブタ表皮（Ohkawara et al., 1977）またはハムスター頬袋内の薬物誘導性口腔粘膜病変（Cherrick et al., 1974）を含む、創傷治癒のインビボモデルも当技術分野において公知である。
【００９８】
創傷治癒において有効な本発明の化合物は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、駆虫剤、抗炎症剤、鎮痛剤、鎮痒剤、またはその組み合わせからなる群より選択される医薬品との組み合わせで、すなわち本発明の薬学的組成物で投与することもでき、または異なる経路から同時投与することもできる。
【００９９】
創傷治癒のために、好ましい投与様式は局所経路による。しかし、別様式で、または同時に、薬剤を非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または経皮経路で投与してもよい。別様式で、または同時に、投与は経口経路であってもよい。投与する用量は受容者の年齢、健康、および体重、併用治療があればその種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存することになる。
【０１００】
好ましい局所適用のために、特に創傷を有するヒトおよび動物の治療のために、本発明の有効量の化合物を創傷領域、例えば、皮膚表面に投与することが好ましい。この量は一般に、治療する領域、症状の重症度、および用いる局所媒体の性質に応じて、適用毎に約0.001mg〜約1gの範囲となる。好ましい局所製剤は軟膏で、PEG-1000などの軟膏基剤1mlあたり約0.01mg〜約50mgの活性成分を用いる。
【０１０１】
本発明はさらにアポトーシスを阻害する、または細胞、組織もしくは臓器機能を保存もしくは回復する方法も提供する。この方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供し、細胞、組織または臓器と、細胞、組織または臓器においてアポトーシスを治療する、または機能を保存もしくは回復するのに有効な量の化合物を接触させることによって実施する。接触はインビトロ（すなわち、細胞培養または臓器もしくは組織転移中）またはインビボ（すなわち、下記のとおり有効量の化合物を患者に投与することにより）で実施することができる。
【０１０２】
治療しうる様々な適応症には、アポトーシスに関連するもの、虚血、外傷、および再灌流傷害が含まれるが、それらに限定されるわけではない。アポトーシスに関連する状態には、加齢の皮膚への影響、虚血事象後の再灌流の影響、免疫抑制、胃腸の混乱、心血管障害、組織移植の拒絶、創傷治癒、およびアルツハイマー病が含まれるが、それらに限定されるわけではない。治療は、免疫抑制ウイルス、化学療法剤、放射線、および免疫抑制剤に伴うアポトーシス関連の問題を減弱することもできる。これらの刺激は、消化管組織のもの、および胃腸の混乱に伴うものを含むが、それらに限定されるわけではない、様々な障害においてアポトーシスを引き起こす。
【０１０３】
本発明のこの局面を実施するために好ましい化合物、特に本明細書の実施例に記載のとおり、化学療法または放射線誘導性のアポトーシスに対する胃内皮細胞の保護に関して、好ましい化合物は化合物8gである。
【０１０４】
治療は臓器移植のすべての段階においても適当である。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を用いて、臓器を安定化または保存するのに有効な量の化合物を供与者に投与することにより臓器を準備することができる。臓器を化合物を含むOPS中で灌流および/または保存することができる。次いで、臓器の安定性および機能を増強するのに有効な量の化合物を臓器受容者に投与することができる。組成物は、移植または他の外科的介入に関連しているかどうかにかかわらず、心臓麻痺を治療する際の使用にも適している。
【０１０５】
胃腸の混乱には、腸管の内層への損傷、重度の慢性潰瘍、結腸炎、放射線誘導性損傷、化学療法誘導性損傷、および寄生虫が原因の胃腸管の混乱、ならびに任意の他の原因による下痢が含まれるが、それらに限定されるわけではない。様々なウイルスおよび細菌感染症が胃腸管の混乱を引き起こすことが知られている。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、これらの感染症に伴う副作用の治療における使用にも適している。そのような化合物は、化学療法に伴う胃腸障害を軽減する際の使用に特に適している。したがって、そのような化合物は化学療法に伴う下痢の予防のみならず、悪心の予防における使用にも適している。
【０１０６】
これらの化合物は、家畜およびペット動物を含むが、それらに限定されるわけではない、動物の様々な胃腸状態の治療に特に適している。そのような状態、特に下痢は、脱水および栄養不良により多くのウシやイヌを失う原因となる。胃腸状態の治療は好ましくは胃腸投与による。ウシおよびペット動物の場合、これらの有効量の化合物を試料中に都合よく混合することができる。ヒトでは、投与は胃腸投与の技術分野において公知のいかなる方法によるものであってもよい。好ましくは、投与は経口である。
【０１０７】
加えて、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、免疫不全患者、特にHIV陽性患者に、AIDS患者で見られるような免疫不全の悪化を来す状態に伴うT細胞のアポトーシスによる死滅を予防、または少なくとも軽減するために投与することができる。好ましくは、そのような患者への投与は非経口であるが、経皮または胃腸内に投与することもできる。
【０１０８】
LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、冠動脈閉塞；脳梗塞；脊髄/頭部外傷および随伴する重度の麻痺を含むが、それらに限定されるわけではない、様々な状態に関連する再灌流傷害、凍傷、冠動脈形成術、血管結合、四肢結合、臓器結合、および腎再灌流などの他の傷害による再灌流傷害に伴うアポトーシスを治療するために投与することもできる。
【０１０９】
心筋および脳梗塞（卒中）は一般に、塞栓、血栓、または肉眼的壊死領域を生じる圧による動脈もしくは静脈血液供給の突然の不足によって引き起こされ、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肺および精巣が冒されやすい。その領域への血液の再灌流後に、梗塞周囲の組織で細胞死が起こり、したがって組成物を梗塞開始時、再灌流中、またはその直後に投与すると有効である。本発明は、再灌流傷害の治療法であって、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物の治療上有効な量を、そのような治療を必要としている患者に投与することによる方法を含む。
【０１１０】
本発明はさらに、心臓発作および卒中のリスクが高い患者の心筋および脳梗塞に伴う損傷を軽減する方法であって、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物の治療上有効な量を、そのような治療を必要としている患者に投与することによる方法を含む。好ましくは、そのような損傷の治療はそのような化合物の非経口投与による。しかし、任意の他の方法、例えば、心筋梗塞の場合の直接心臓注入も用いることができる。そのような注入用の器具、例えば、アボジェクト（Aboject）心臓用シリンジは当技術分野において公知である。
【０１１１】
本発明はさらに、哺乳動物臓器、組織、および細胞の培養または維持中に、細胞におけるアポトーシスを制限および防止する、またはそうではなく細胞を保存する方法であって、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する有効量の化合物を、哺乳動物臓器、組織、および細胞の培養または維持の技術分野において用いられる任意の培地または溶液中に加えることによる方法を提供する。
【０１１２】
本発明はさらに、哺乳動物臓器、組織、および細胞の培養および維持の技術分野において公知の培地および溶液であって、細胞、組織もしくは臓器機能を保存もしくは回復する、または培養中の細胞のアポトーシスを制限もしくは防止するのに有効な量の、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を含む培地および溶液を含む。本発明のこれらの局面は、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する少なくとも一つの有効量の化合物を含む哺乳動物細胞培養の培地、および細胞、組織もしくは臓器機能を保存もしくは回復する、または哺乳動物細胞培養中のアポトーシスを制限もしくは防止するためのそのような培地の使用を含む。有効量とは、アポトーシスの速度を低下させる、および/または細胞、組織もしくは臓器を保存する量である。そのような化合物は、細胞が通常はアポトーシスを刺激すると思われる軽度の外傷を被る状況下で、アポトーシスを制限または防止することができる。例示的外傷には、低レベルの放射線照射、凍結細胞保存物の解凍、培地の温度、pH、モル浸透圧濃度、または鉄濃度の急速な変化、細胞毒への曝露、初代細胞培養調製における無傷の組織からの細胞の解離、および血清欠乏（または無血清培地中での増殖）が含まれうるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１３】
したがって、本発明は、組織培養培地、およびLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する有効量の化合物を含む組成物を含む。抗アポトーシス培地補充物として組成物を加えることができる無血清培地には、AIM V(P Media、Neuman and Tytell's Serumless Media、Trowell's TS Media、Waymouth's MB 752/1および705/1 Media、ならびにWilliams' Media Eが含まれるが、それらに限定されるわけではない。無血清培地に加えて、抗アポトーシス培地補充物としてLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を加えることができる適当な哺乳動物細胞培養の培地には、イーグル基本培地（Basal Media Eagle's）、フィッシャー培地（Fischer's Media）、McCoy培地（McCoy's Media）、199培地、RPMI 1630培地および1640培地、F-10&F-12栄養混合物に基づく培地（Media based on F-10 & F-12 Nutrient Mixtures）、リーボビッツL15培地（Leibovitz's L-15 Media）、グラスゴー最小必須培地（Glasgow Minimum Essential Media）、ならびにダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Media）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を加えることができる哺乳動物細胞培養の培地には、当技術分野において公知のいかなる培地補充物もさらに含まれる。例示的補充物には、糖類、ビタミン、ホルモン、金属タンパク質、抗生物質、抗真菌剤、成長因子、リポタンパク質、および血清が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１４】
本発明はさらに、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する有効量の化合物を含む、哺乳動物臓器を移植前に維持するための溶液、ならびに臓器機能を保存もしくは回復する、または治療した哺乳動物臓器の外科的摘出および移植前の取り扱い中に、これら臓器におけるアポトーシスを制限もしくは防止するための、そのような溶液の使用を含む。溶液は臓器をラッシュ、灌流および/または保存するために用いることができる。すべての場合に、臓器への損傷を制限または防止するために必要とされる化合物（LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する）の濃度は、当技術分野において公知の方法により、当業者が経験的に決定することができる。
【０１１５】
前述に加えて、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、様々な皮膚病状態を治療するために皮膚に局所適用することができる。これらの状態には、加齢および/または光損傷による脱毛およびしわが含まれるが、それらに限定されるわけではない。したがって本発明は、皮膚病状態の治療法も含む。特に、脱毛は毛包の細胞のアポトーシスによって引き起こされることがある（Stenn et al., 1994）。したがって、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、持続的脱毛を予防するための皮膚の局所治療における使用に適している。
【０１１６】
様々な皮膚病状態は、好ましくはLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する有効量の化合物（またはそれらを含む組成物）の局所適用によって治療する。そのような化合物の有効量とは、皮膚病状態の症状を改善または減弱する量である。好ましくは、治療は皮膚病状態の消散または正常な皮膚機能の回復を来すが、症状のいかなる改善または低減も本発明に含まれる。
【０１１７】
実施例
下記の実施例は添付の特許請求の範囲に示す本発明の範囲を例示することを意図しているが、決して制限することを意図するものではない。
【０１１８】
一般法
すべての試薬は、Sigma-Aldrich Chemical Co.、Fisher Scientific（Pittsburgh、PA）、Bedukian Research（Danbury、CT）およびToronto Research Chemicals（North York、ON、Canada）から購入し、それ以上精製せずに用いた。ホスホネート類縁体は、Lancaster（Pelham、NH；n-デシル-ホスホネート（9a））、PolyCarbon（Devens、MA；n-ドデシル-ホスホネート（9b））、Alfa Aesar（Ward Hill、MA；n-テトラデシル-ホスホネート（9c）およびn-オクタデシル-ホスホネート（9d））から購入した。LPA 18:1、DGPP、Ser-PA、およびTyr-PAは、Avanti Polar Lipids（Alabaster、AL）から入手した。融点はThomas-Hoover毛管融点測定器で測定し、未補正とした。ルーチンの薄層クロマトグラフィ（TLC）は250μmの背面ガラスUNIPLATES（Analtech、Newark、DE）で実施した。フラッシュクロマトグラフィはあらかじめ充填されたシリカゲルカラムでHorizon HPFCシステム（Biotage、Charlottesville、VA）を用いて行った。1Hおよび31P NMRスペクトルはBruker AX 300（Billerica、MA）分光計で得た。1H NMRの化学シフトはTMSに対する100万分率（ppm）で報告する。31p NMRの化学シフトはCDCl3中0.0485Mリン酸トリフェニルに対する100万分率（ppm）で報告する。質量分析データはBruker ESQUIREエレクトロスプレー/イオントラップ装置で陽および陰イオンモードで収集した。元素分析はAtlantic Microlab Inc.、Norcross、GAが実施した。
【０１１９】
実施例1：リン酸ジ-tert-ブチルエステルアルケニルエステル（4a〜f）の合成
市販の不飽和脂肪族アルコール（3a〜f）を出発原料として用いた。塩化メチレン（60mL）中のアルコール（2.5mmol）およびジ-tert-ブチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト（1.51g、4mmol）の溶液を撹拌しながら、これに1H-テトラゾール（578mg、8.25mmol）を加えた。撹拌30分後、混合物を0℃に冷却し、50％過酸化水素（0.3mL）を加えた。混合物を1時間撹拌し、塩化メチレン（100mL）で希釈し、10％メタ重亜硫酸ナトリウム（2×50ml）、飽和炭酸水素ナトリウム（2×50ml）、水（50ml）、および食塩水（50ml）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィにより、ヘキサン/酢酸エチル（7：3）を用いて所望の生成物、ジ-t-Boc保護脂肪族アルコールホスフェート（4a〜f）を溶出して精製した。
【０１２０】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルデカ-9-エニルエステル（4a）：澄明油状物として単離（収率75％）。
2007508324.tif 000031
【０１２１】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルデカ-4-エニルエステル（4b）：澄明油状物として単離（収率68％）。
2007508324.tif 000032
【０１２２】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルドデカ-9-エニルエステル（4c）：澄明油状物として単離（収率70％）。
2007508324.tif 000033
【０１２３】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルテトラデカ-9-エニルエステル（4d）：澄明油状物として単離（収率68％）。
2007508324.tif 000034
【０１２４】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルテトラデカ-11-エニルエステル（4e）：澄明油状物として単離（収率82％）。
2007508324.tif 000035
【０１２５】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルオクタデカ-9-エニルエステル（4f）：澄明油状物として単離（収率72％）。
2007508324.tif 000036
【０１２６】
実施例2：リン酸モノアルケニルエステル（5a〜f）の合成
Boc保護FAP（4a〜f）をTFAで脱保護して対応する不飽和FAP（5a〜f）を得た。塩化メチレン（20mL）中の1a〜6a（100mg）の溶液にトリフルオロ酢酸（0.3mL）を加えた。混合物を4時間撹拌し、TLCにより反応の完了が示された。溶媒を蒸発させ、残渣を塩化メチレン（2×20mL）で洗浄し、減圧濃縮して、所望のリン酸モノアルケニルエステルを無色油状物で得た。
【０１２７】
リン酸モノデカ-9-エニルエステル（5a）：油状物として単離（85％）。
2007508324.tif 000037
【０１２８】
リン酸モノデカ-4-エニルエステル（5b）：油状物として単離（78％）。
2007508324.tif 000038
【０１２９】
リン酸モノドデカ-9-エニルエステル（5c）：油状物として単離（82％）。
2007508324.tif 000039
【０１３０】
リン酸モノテトラデカ-9-エニルエステル（5d）：油状物として単離（84％）。
2007508324.tif 000040
【０１３１】
リン酸モノテトラデカ-11-エニルエステル（5e）：油状物として単離（78％）。
2007508324.tif 000041
【０１３２】
リン酸モノオクタデカ-9-エニルエステル（5f）：油状物として単離（86％）。
2007508324.tif 000042
【０１３３】
実施例3：チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-アルキル/アルケニルエステル（7a〜g）の合成
市販の飽和または不飽和脂肪族アルコール（6a〜g）を出発原料として用いた。アルコール（2.0mmol）、ビス-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト（1.085g、4mmol）および1H-テトラゾール（420mg、6mmol）の溶液を室温で30分間撹拌し、続いて元素硫黄（200mg）を加え、混合物を2時間還流した。反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させた。酢酸エチル（30mL）を加えて過剰の硫黄を沈殿させ、これをろ去し、溶媒を蒸発させて、未精製混合物を得た。混合物をフラッシュクロマトグラフィで精製し、所望の生成物を無色油状物で得た。
【０１３４】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-デシルエステル（7a）：無色油状物として単離（収率72％）。
2007508324.tif 000043
【０１３５】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-ドデシルエステル（7b）：無色油状物として単離（収率84％）。
2007508324.tif 000044
【０１３６】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-テトラデシルエステル（7c）：澄明油状物として単離（収率82％）。
2007508324.tif 000045
【０１３７】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-デカ-9-エニルエステル（7d）：澄明油状物として単離（収率76％）。
2007508324.tif 000046
【０１３８】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-ドデカ-9-エニルエステル（7e）：澄明油状物として単離（収率80％）。
2007508324.tif 000047
【０１３９】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-テトラデカ-9-エニルエステル（7f）：澄明油状物として単離（収率75％）。
2007508324.tif 000048
【０１４０】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-オクタデカ-9-エニルエステル（7g）：澄明油状物として単離（収率72％）。
2007508324.tif 000049
【０１４１】
実施例4：チオリン酸O-アルキル/アルケニルエステル（8a〜g）の合成
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-アルキル/アルケニルエステル（7a〜7g）を出発原料として用いた。メタノールKOH（10mL）中の7a〜7g（100mg）の溶液を2時間撹拌し、TLCにより反応の完了が示された。溶媒を蒸発させて粗生成物を得、これを水（20mL）に溶解し、HClで酸性化した。水性混合物を酢酸エチル（2×50mL）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して、所望の化合物を淡黄色油状物で得た。
【０１４２】
チオリン酸O-デシルエステル（8a）：淡黄色油状物として単離（収率80％）。
2007508324.tif 000050
【０１４３】
チオリン酸O-ドデシルエステル（8b）：淡黄色油状物として単離（収率73％）。
2007508324.tif 000051
【０１４４】
チオリン酸O-テトラデシルエステル（8c）：淡黄色油状物として単離（収率70％）。
2007508324.tif 000052
【０１４５】
チオリン酸O-デカ-9-エニルエステル（8d）：淡黄色油状物として単離（収率76％）。
2007508324.tif 000053
【０１４６】
チオリン酸O-ドデカ-9-エニルエステル（8e）：淡黄色油状物として単離（収率80％）。
2007508324.tif 000054
【０１４７】
チオリン酸O-テトラデカ-9-エニルエステル（8f）：淡黄色油状物として単離（収率72％）。
2007508324.tif 000055
【０１４８】
チオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステル（8g）：淡黄色油状物として単離（収率82％）。
2007508324.tif 000056
【０１４９】
実施例5：(1,1-ジフルオロ-ペンタデシル)ホスホン酸ジエチルエステル（10）の合成
THF（50mL）中のジエチルジフルオロメタンホスホネート（1.0g、5.316mmol）の溶液に2M LDA（626mg、5.847mmol）を-78℃で加え、30分間撹拌した。THF（10mL）中の臭化テトラデシル（1.474g、5.316mmol）を混合物に-78℃で加え、反応混合物を終夜撹拌した。THFを蒸発させ、残留油状物をフラッシュクロマトグラフィによりヘキサン中30％酢酸エチルを溶離剤として用いて精製し、化合物10を無色油状物で得た（817mg、40％）。
2007508324.tif 000057
【０１５０】
実施例6：(1,1-ジフルオロ-ペンタデシル)ホスホン酸（11）の合成
塩化メチレン（5mL）中、減圧乾燥した10（225mg、0.585mmol）の溶液に、ブロモトリメチルシラン（895mg、5.85mmol）を加え、混合物を室温で撹拌した。TLCにより6時間後に反応の完了が示された。溶媒を減圧下で除去し、残渣を95％メタノール（3mL）中1時間で撹拌した。混合物を減圧濃縮し、減圧下で乾燥して11を淡黄色固体で得た（150mg、78％）。融点66〜69℃；
2007508324.tif 000058
【０１５１】
実施例7：LPA受容体アゴニストまたはアンタゴニスト活性についての化合物の分析
LPA1、LPA2、およびLPA3受容体を安定に発現しているRH7777ラット肝細胞腫細胞およびLPA1〜3を内因的に発現するPC-3において、化合物がLPA誘導性のカルシウム一過性変化を誘導または阻害する能力について、FlexStation II自動蛍光光度計（Molecular Devices、Sunnyvale、CA）を用いて試験した（Fischer et al., 2001; Virag et al., 2003）。
【０１５２】
LPA1、LPA2またはLPA3のいずれかを安定に発現しているRH7777細胞（Fischer et 2001; Virag et al., 2003）またはPC-3細胞を、ポリ-Dリシンでコーティングされた壁が黒く底が澄明の96穴プレート（Becton Dickinson、San Jose、CA）に50000細胞/ウェルの密度で播種し、終夜培養した。次いで、培地（10％FBSを含むDMEM）を改変クレブス液（120mM NaCl、5mM KCl、0.62mM MgS04、1.8mM CaCl2、10mM HEPES、6mMグルコース、pH7.4）に置き換え、細胞を6〜8時間無血清処理した（PC-3細胞では12時間）。改変クレブス培地中で細胞にFura-2 AMを35分間負荷した。プレートをFlexStation機器に載せる前に、培地を改変クレブス培地100μl/ウェルで再度置き換えることにより、Fura-2を除去した。プレートを機器中で4分間インキュベートして、37℃まで加温した。細胞内Ca2+濃度の変化を、それぞれ波長340nmおよび380nmの光による励起に反応しての520nmでの発光強度の比を測定することによりモニターした。各ウェルを80〜120秒間モニターした。測定開始後15秒の時点で、試験化合物50μl（改変クレブス中3×保存溶液）が各ウェルに自動的に添加された。時間経過をSoftMax Proソフトウェア（Molecular Devices、Sunnyvale、CA）を用いて記録した。各ウェルの最大および基準の比の値の差を計算することにより、Ca2+一過性変化が自動的に定量された。
【０１５３】
選択した化合物を、以前に報告されたとおり（Zhang et al., 2004）アシル補酵素Aオキシダーゼ-ルシフェラーゼ（PPRE-Acox-Rluc）レポーター遺伝子作成物を形質移入したCV1細胞でPPARγ活性化について試験した。CV1細胞におけるPPARγ活性化のアッセイはZhang et alに報告されたとおりに行った。簡単に言うと、CV-1細胞を10％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で96穴プレートに播種した（5×103細胞/ウェル）。翌日、細胞に125ngのpGL3-PPRE-Acox-Rluc、62.5ngのpcDNAI-PPARγ、および12.5ngのpSV-β-ガラクトシダーゼ（Promega、Madison、Wisconsin）をLipofectAMINE 2000（Invitrogen）を用いて一過性に形質移入した。24時間後、それぞれSystem（Promega）および登録商標Galacto-Light Plus System（Applied Biosystems、Foster City、California）。試料を四つ組で実行し、平均±標準誤差を計算した。データは少なくとも二つの独立の形質移入の代表である。スチューデンツt検定を用いてヌル仮説検定を行い、P<0.05を形質移入と考え、細胞をDMSOまたはDMSOに溶解した10μM試験化合物を含む、1％FBS補充OptiMEMI（Invitrogen）で20時間処理した。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を登録商標Steady-Glo（登録商標） Luciferase Assayで測定し、有意（図中、P<0.05は*で示し、P<0.01は**で示す）。
【０１５４】
本発明者らの独自の二点接触モデル（Wang et al., 2001; Sardar et al., 2002）によれば、頭部極性リン酸基および尾部疎水性基は両方、LPA GPCRとの特異的相互作用に必要である（Fischer et al., 2001）。リン酸基は、LPA受容体の第三および第七膜貫通ヘリックスにおいて二つの正に荷電した保存アミノ酸残基と相互作用する必須の成分であると同定された（Wang et al., 2001）。疎水性尾部は受容体の膜貫通領域における疎水性残基のポケットと相互作用し、リガンド-受容体結合に著しく貢献している（Wang et al., 2001; Sardar et al., 2002）。
【０１５５】
このモデルに基づき、本発明者らはDGPPおよびジオクチルホスファチジン酸を選択的LPA1およびLPA3アンタゴニストとして、またFAPをLPA1〜3受容体のサブタイプ選択的アゴニスト/アンタゴニストとして同定した（Fischer et al., 2001; Virag et al., 2003）。Bandoh et al. (2000)は、LPA3が飽和LPAよりも不飽和脂肪族アシルLPA種を優先することを明らかにした。ホスフェートをホスホネートで置換すると、化合物をリン脂質脱リン酸化酵素による分解に対して代謝的に安定化する。ホスホネート修飾は、極性頭部基の電荷密度を下げることにより、リガンド-受容体相互作用にも影響をおよぼす。LPAのホスホネート類縁体が最近研究され、LPAよりも効力が低い（Hooks et al., 2001; Xu et al., 2002）。または、ホスフェートの代わりのチオホスフェートは、選択的LPA3アゴニストであるOMPTなどの、頭部極性基に高い電荷を有する、代謝的に安定な化合物を生じる（Hasegawa et al., 2003; Qian et al., 2003）。
【０１５６】
FAP構造の側鎖における多様性と共に、これらの修飾の効果を調べるために、本発明者らは側鎖の異なる位置の不飽和（5a〜f）、チオホスフェート（8a〜g）、およびホスホネート（9ad、11）を有する一連のFAP類縁体を合成した。これらの新しい類縁体を、LPA1〜3に関してアゴニストおよびアンタゴニストとして評価した。10、12または14炭素を含む飽和FAP類縁体（2a〜c）は、本発明者らの初期の試験においてLPA1〜3の最も有効なアゴニストおよび/または阻害剤であることが示された（Virag et al., 2003）。このことから、本発明者らはこれらの最適鎖長を有する修飾FAP類縁体を合成し、特徴付けた。
【０１５７】
各FAP類縁体を、LPA1〜3受容体を形質移入したRH7777細胞においてCa2+一過性変化を誘導する能力（アゴニズム）、ならびに同じ細胞においてLPA誘導性Ca2+一過性変化を阻害する能力（アンタゴニズム）について試験した（表3）。この試験で評価した化合物のうち、非形質移入RH7777細胞において30μMまでの濃度で適用した場合に、細胞内Ca2+一過性変化を誘導するものはなかった。異なる位置の不飽和、不飽和に加えて/不飽和なしのホスホネート、ジフルオロホスホネート、およびチオホスフェートによる頭部基修飾の、LPA1〜3受容体におけるC-14類縁体の活性におよぼす影響を図2に示す。これらの修飾はLPA1〜3受容体に対するFAPの薬理特性を劇的に変化させた。モノ不飽和FAP類縁体（5a〜e）は、LPA2およびLPA3受容体におけるアゴニストまたはアンタゴニストとしてのリガンド特性を変えることなく、C-10類縁体を除いて、飽和類縁体に比べると効力および/または有効性を高める傾向を示した（表3）。二重結合の位置も活性に影響を有していた。デセニル位置異性体5aと5bとの間の活性の比較により、LPA 18:1において見られるC9=C10二重結合はC4=C5よりもLPA2受容体の活性化において好ましいことが示唆された（5aのEC50＝3800nMに対して5bの>10000nM）。LPA3受容体の阻害について、5b（Ki＝370nM）は5a（Ki＝504nM）よりも中等度に活性が高かったが、二重結合の位置に対する嗜好性は明白ではなかった。同様に、LPA2受容体はテトラデセニル異性体5d（EC50＝397nM）と5e（EC50＝4100nM）との間でC9=C10不飽和に嗜好性を示し、LPA3は二重結合の位置に有意な嗜好性を示さなかった。これとは対照的に、LPA1は5d（Ki＝1146nM）と5e（Ki＝457nM）との間でC9=C10よりもC11=C12を嗜好し、3つのLPA受容体それぞれで側鎖における区別的立体配座条件の可能性を示している（図2）。一連の不飽和化合物において、テトラデセニル化合物（5d、5e）だけがLPA1受容体におけるLPA反応にアンタゴニスト作用を示した。このことは、LPA受容体との相互作用にとって側鎖の鎖長が非常に重要であるという本発明者らの考えをさらに裏付けるものである。
【０１５８】
10-、12-、および14-炭素飽和FAP類縁体（8a〜c）の頭部基としてのホスフェートをチオホスフェートで置換することは、3つのLPA受容体サブタイプすべてにおいてそのアゴニスト/アンタゴニスト特性に大きな影響を有していた。LPA1では、チオホスフェート修飾は元のFAP類縁体の阻害効果を完全に消失させた。一方LPA2では、チオホスフェートは元のFAPの有効性を100％まで一貫して上昇させた。LPA3受容体では、飽和チオホスフェートFAP類縁体は元のFAPに比べてLPA反応の阻害改善を一貫して示した。ドデシル-チオホスフェート（8b）は、LPA2（EC50＝1000nM）およびLPA3（Ki＝14nM）でそれぞれ、飽和チオホスフェート類縁体において最も強力なアゴニストおよびアンタゴニストである。疎水性尾部の特性によって影響を受けた電荷密度の増加がFAPのアゴニストまたはアンタゴニスト特性を増大させたこれらの結果は、本発明者らの二点接触モデルと一致している。
【０１５９】
次に、本発明者らは頭部のチオリン酸基を側鎖のモノ不飽和（C9=C10）と組み合わせる効果を調べた。頭部のチオリン酸基とC9=C10不飽和との組み合わせにより、飽和チオホスフェートと不飽和FAPとを組み合わせた特性であるアゴニスト/アンタゴニスト特性を有する類縁体（8d〜8f）を生じ、EC50およびIC50値を実質的に低下させた。飽和チオ類縁体と同様に、化合物8d〜8fはLPA1受容体では不活性であった。飽和および不飽和C12、C14チオホスフェートのLPA2およびLPA3での効果を比較すると、LPA2では不飽和類縁体で効力が高まり、LPA3受容体では効力にわずかな変化しか見られない。テトラデカ-9-エニルチオホスフェート（8f）化合物は別に論ずる必要がある。この化合物はLPA誘導性のCa2+動員にまったく影響しなかったため、LPA1では飽和チオ類縁体の特徴を保持していた。一方、8fはすべてのC-10、-12、および-14チオホスフェート類縁体のうち、LPA2では最良のアゴニストであり（EC50＝480nM）、LPA3では最も強力なアンタゴニストである（Ki＝14nM）ことが判明した（図2Bおよび2D）。ドデカ-9-エニル類縁体（8e）はLPA3受容体で8fと効力の等しいアンタゴニストであった。短鎖チオホスフェートはLPA2およびLPA3受容体と選択的に相互作用するという、このようなLPA受容体サブタイプにおけるチオホスフェート類縁体の効果の違いにより、将来サブタイプ選択的アゴニストおよびアンタゴニストを開発する際に実用的な利点が得られる。
【０１６０】
オレオイル-LPAの不飽和FAP類縁体であるオレオイルホスフェート（5f）は、LPA1〜3を発現している細胞中でCa2+動員を阻害も活性化もしなかった。しかし、二つの化合物を同時適用すると、3つのLPA受容体すべてにおいてLPA反応を強化した。この知見より、ホスフェートをチオホスフェートで置き換えて5f頭部基の電荷密度を増大させることにより、この類縁体をアゴニストに変えるために必須の、化合物の受容体への結合を高めうるという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、本発明者らはオレオイルチオホスフェート（8g）を合成し、LPA1〜3受容体で評価した。本発明者らの予測と一致して、化合物8gはLPA1（EC50（Emax）＝193nM（80％））およびLPA3（EC50（Emax）＝546nM（78％））における部分アゴニストで、LPA2では、オレオイル-LPAの値（EC50＝300nM）よりも低いEC50＝244nM（Emax＝LPA反応の175％）の強力な完全アゴニストであった。8gのLPA1〜3受容体における用量反応を、LPA 18:1と比較して、図3に示している。
【０１６１】
ホスホネート類縁体（9a〜d）はLPA受容体において、それらの対応するホスフェートよりも弱い阻害剤およびアゴニストで、以前に報告されたデータと一致していた（Hooks et al., "Lysophosphatidic Acid-Induced Mitogenesis Is Regulated by Lipid Phosphate Phosphatases and Is Edg-Receptor Independent," J. Biol. Chem. 276:4611-4621 (2001)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。しかし、テトラデシル-ホスホン酸（9c）は3つの受容体サブタイプすべてでLPA誘導性Ca2+動員を阻害し（IC50値はマイクロモル濃度の範囲）、したがってEDGファミリーLPA受容体の最初のパンアンタゴニストとなる（図2）。この知見の重要性は二倍である。化合物9cは、控えめで部分阻害しか示さないKi16425（Ohta et al., 2003）を除き、LPA2受容体サブタイプの唯一知られている阻害剤である。単純な構造と頭部ホスホン酸基を有する化合物9cは、おそらくリン脂質脱リン酸化酵素による分解に抵抗性である。これらの特徴により、この分子はLPA1〜3受容体のパンアンタゴニストをさらに開発するための良好な先導構造となる。本発明者らは、化合物9cのジフルオロホスホネート類縁体で、ホスホネートをジフルオロホスホネートで等配電子置換した化合物11を合成し、LPA1〜3受容体で試験した。この化合物はホスファターゼに対する代謝的安定性を保持し、同時にホスホン酸基の酸性度を高め、これはおそらく受容体への結合を高める。化合物11の二つのフッ素原子によるホスホン酸基の酸性度上昇は、この化合物をLPA2受容体のアンタゴニストから弱い部分アゴニスト（EC50＝10μM（Emax＝40％））に逆転させた。化合物11はLPA3で9c（Ki＝1120nM）に比べて改善されたアンタゴニスト活性（Ki＝575nM）を示したが、LPA1では部分アンタゴニズムを示した（およそKi＝788nM；LPA反応の40％阻害）。
【０１６２】
LPAはPC-3細胞において有糸分裂促進および細胞遊走促進シグナリングを活性化することが示された（Kue et al., 2002）。アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞株であるPC-3細胞のRT-PCR分析により、3つのLPA受容体すべてをコードする転写物の発現が示された（Daaka et al., 2002）。本発明者らは、形質移入されたRH7777細胞とは異なり、LPA1〜3受容体を内因的に発現するPC-3細胞においてFAP類縁体を試験した。PC-3細胞はLPA1〜3受容体を発現するため、FAP化合物によって示される効果（表3）は3つのLPA受容体におけるこれら化合物の効果の組み合わせを表している。これらの実験により、各LPA受容体を個別に発現するRH7777細胞から得られたFAP類縁体の薬理特性が確認された。チオホスフェート類縁体（8eおよび8f）は、LPA1〜3受容体それぞれで異なる効果を有するため、PC-3細胞においてLPA誘導性Ca2+一過性変化の独立の活性化および阻害両方を示した。オレオイルチオホスフェート（8g）は、最大LPA反応の30％の最大反応を示し、LPA反応の阻害は示さず、これは形質移入されたRH7777細胞からのデータと一致する。同様に、他の化合物が示した阻害活性（表3）は、個々のLPA1〜3受容体におけるこれら化合物の効果の組み合わせである。LPA受容体を内因的に発現するPC-3細胞から得られた結果の、形質移入されたRH7777細胞を用いて得られた結果との一貫性は、本発明者らのアッセイ系の妥当性を確認するものである。
【０１６３】
LPA受容体におけるこれらFAP類縁体の効果を他の入手可能なアゴニストおよびアンタゴニストと比較するために、本発明者らはDGPP 8:0、Ki16425、N-アシルセリンリン酸（Ser-PA）、N-アシルチロシンリン酸（Tyr-PA）、およびVPC12249を本発明者らのRH7777細胞系で試験した。すべての化合物に一つの試験系を用いるこの比較には、個々の試験系が有しうる固有の欠点にもかかわらず、これらの化合物の相対的有効性について信頼できる情報を提供するという利点がある。本発明者らの結果は、DGPP 8:0、Ser-PAおよびKi16425について以前に報告されたデータと一致していたが、Tyr-PAおよびVPC12249については相違を認めた（表3）。DGPP 8:0は本発明者らの研究室でLPA3およびLPA1のサブタイプ選択的阻害剤（Ki値はそれぞれ106nMおよび6.6μM）と同定された（Fischer et al., 2001）。本発明者らの高処理量の試験系を試験するために、同じ安定に形質移入されたRH7777細胞株でDGPP 8:0の効果を評価した。Ki値はLPA3では202nM、LPA1では4.3μMであった（表3）。これらの結果は、元のアッセイ法を改変した後でも、DGPPの結果の再現性を納得のいくように示した。Ki16425が合成され、LPA受容体を形質移入したHEK293T細胞におけるGTPγS負荷アッセイを用い、LPA1およびLPA3のサブタイプ選択的アンタゴニストで、LPA2に対しては非常に弱い阻害作用を示すと同定された（Ki値はそれぞれ250nM、360nM、および5.6μM）（Ohta et al., 2003）。この化合物を本発明者らの高処理量細胞内Ca2+モニタリング系で試験した場合、LPA1およびLPA3については同様のKi値が得られた（それぞれ425nMおよび148nM）が、Ki16425はLPA1に比べてLPA3をわずかによく阻害するようであった（表3）。N-アシルセリンリン酸およびN-アシルチロシンリン酸は当初、LPA誘導性血小板凝集の阻害剤（Sugiura et al., 1994）およびアフリカツメガエル卵母細胞におけるLPA誘導性Cl-電流の阻害剤（Liliom et al., 1996）として同定された。しかし、哺乳動物細胞株において、Ser-PAはLPA様アゴニストであることが判明した（Hooks et al., 1998）。LPA1およびLPA2がTAg-ジャーカットT細胞において異種性に発現された場合、Ser-PAはこれらの受容体サブタイプのアゴニストであることも示された（An et al., 1998b）。本発明者らの実験で、Ser-PAはLPA1では完全アゴニストであった（EC50＝1.85μM)が、LPA2では弱いアゴニストでしかなかった。LPA3では、Ser-PAは同じく弱いが、完全アゴニストであった（EC50値1.6μM）（表3）。
【０１６４】
An et al. (1998b)は、Tyr-PAは1μMの濃度で適用した場合に、LPA1およびLPA2受容体でLPAシグナリングに影響しないことを示した。本発明者らの実験では、表3に示すとおり、Tyr-PAはLPA1にはまったく影響をおよぼさなかったが、LPA2の弱いアゴニスト（EC50＝11μM）で、LPA3の阻害剤（Ki＝2.3μM）であることが判明した。VPC12249は、LPA1、LPA2、またはLPA3を発現しているHEK293T細胞から単離した細胞膜によるGTPγS負荷アッセイを用いて、LPA1およびLPA3受容体のサブタイプ選択的阻害剤であると同定された、N-アシルエタノールアミドホスフェートの2-置換類縁体である。VPC12249はLPA3（Ki＝428nM）よりもLPA1（Ki＝137nM）で良好なアンタゴニストであった（Heise et al. 2001）。しかし、本発明者らの実験では、VPC12249はLPA1では弱い阻害剤にすぎず、LPA3ではより良い阻害剤であった（Ki値588nM）（表3）。VPC12249はLPA2を通じてLPAシグナリングに影響することはなかったという知見に加え、この値は既発表のデータと妥当に近似している。FAPと同様、これらの化合物はPC-3細胞上の3つのLPA受容体に対する効果の組み合わせである効果も示し、本発明者らのアッセイ系をさらに確認している。
【０１６５】
その原形質膜受容体に加え、LPAは核内転写因子PPARγのアゴニストであることが示された（McIntyre et al., 2003）。ロシグリタゾンに代表されるチアゾリジンジオンファミリー、酸化リン脂質、脂肪酸、エイコサノイド、および酸化LDLを含む多くの物質が、PPARγを活性化すると報告されている。ZhangらはLPAの不飽和およびアルキルエーテル類縁体である、1,1-ジフルオロデオキシ-(2R)-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、そのモノ-フルオロ類縁体1-パルミトイル-(2R)-フルオロデオキシ-sn-グリセロ-3-ホスフェート、および酸化ホスファチジルコリン1-O-ヘキサデシル-2-アゼレオイル-ホスファチジルコリンが、PPARγ活性化を通して、アテローム斑の発生につながる初期段階の新生内膜形成を誘導することを示した（Zhang et al., 2004）。
【０１６６】
インビボでのLPA類縁体による新生内膜形成のSARは、インビトロでのPPARγ活性化に等しく、LPA Gタンパク質結合受容体とは異なっていた（Zhang et al., 2004）。本発明者らはPPRE-Acox-Rlucレポーター遺伝子アッセイを用い、FAP-12（2b）、不飽和チオホスフェート類縁体（8d-g）、テトラデシルホスホン酸9c、以前に報告されたLPA1/LPA3アンタゴニストDGPP、Ki16425、VPC12249、および選択的LPA3アゴニストであるチオホスフェート類縁体OMPTを含む、選択された化合物を、CV1細胞におけるインビトロでのPPARγ活性化について試験した。興味深いことに、このアッセイからの結果（図4）は、以前に報告されたアゴニスト（OMPT）およびアンタゴニスト（DGPP、Ki16425、VPC12249）に加え、LPA1〜3アゴニスト/アンタゴニスト活性を有するFAP類縁体はPPRE-Acox-Rlucレポーターを活性化しうることを示している。これらの結果は、LPA GPCRリガンドがPPARγを活性化しうるという以前に報告された結果と一致している（Zhang et al., 2004）。しかし、結果はPPARγ活性化のSARがGPCRと異なることも強調している。
【０１６７】
本試験は本発明者らが以前に記載した二点接触モデルの妥当性をLPA GPCRとの特異的相互作用を引き出すための最小条件として拡大し、パンアゴニストおよびパンアンタゴニストならびにいくつかのサブタイプ選択的リガンドの合成を可能にする修飾を同定することにより、最小ファルマコフォアFAPのさらなる改良を提供する。ホスホネート、チオホスフェートおよび側鎖の不飽和導入によるFAPファルマコフォアの系統的SAR試験は、サブタイプ選択的LPA受容体アゴニストおよびアンタゴニスト設計のための重要な方針の概要を示した。それぞれのLPA受容体を発現している形質移入されたRH7777細胞から得られた、FAP類縁体、ならびに他のグループにより以前に報告されたLPAアゴニストおよびアンタゴニストの結果は、LPA1〜3受容体を内因的に発現するPC-3細胞から得られた結果と一致していた。LPA GPCRにおけるそれらのリガンド特性に加え、本発明者らはFAPがLPA GPCRとは異なるSARで核内転写因子PPARγを活性化することも明らかにした。FAP-12のSARから出てきた方針に基づき、オレオイルチオホスフェート（8g）を合成して、3つのLPA受容体すべてにおける新規パンアゴニストであると同定し、LPA1〜3アゴニストが適当な電荷と側鎖（長さおよび不飽和）の両方を有するための以前に予測した必要性を確認した。テトラデシル-ホスホン酸（9c）を、リン脂質脱リン酸化酵素による分解に非感受性のLPA1〜3受容体アンタゴニストをさらに開発するための先導構造として役立ちうる、代謝的に安定な初めてのパンアンタゴニストとして同定した。本発明者らの結果は、PPARγアゴニストとしてのLPA-GPCRリガンドの初めての包括的評価を提供する。VPC12249を除くすべての他の類縁体が、LPA GPCRにおけるそれらのアゴニストまたはアンタゴニスト活性にかかわらず、PPARγのアゴニストであるということは予想外の驚きであった。
【０１６８】
（表３）FAP類縁体5a〜f、8a〜g、9a〜d、および11のLPA1〜3形質移入RH7777細胞に対する効果、ならびに以前に報告された化合物との活性比較
2007508324.tif 000059
2007508324.tif 000060
a  Emax＝薬物の最大効果/LPA 18:1の最大効果、パーセンテージで表す。
b  以前にVirag et al. (2003）において報告。
c  NE＝試験した最高濃度（30μM）で効果が示されなかった。
d  ND＝決定せず。
e  NA＝適用外。
f  LPA反応の40％阻害を示す部分アンタゴニスト。
g  報告されたDGPPのKi値は、LPA3およびLPA1でそれぞれ106nMおよび6.6μMである（Hasegawa et al., 2003）。
h  報告されたKi16425のKi値は、LPA1、LPA3およびLPA2でそれぞれ250nM、360nMおよび5.6μMである（Virag et al., 2003）。
i  WA＝弱いアンタゴニスト。
j  報告されたVPC12249のKi値は、LPA1およびLPA3でそれぞれ137nMおよび428nMである（Ohta et al., 2003）。
【０１６９】
実施例8：放射線または化学療法誘導性アポトーシスに対する腸上皮細胞保護についての化合物8gのインビトロ評価
用いた実験法はDeng et al.(2002)およびDeng et al.(2003)において報告されたものと実質的に同じであった。
【０１７０】
基本的に、IEC-6細胞を5％ウシ胎仔血清、インスリン（10μg/ml）、硫酸ゲンタマイシン（50μg/ml）を補充したDMEM培地中、加湿90％空気-10％CO2雰囲気、37℃でインキュベートして培養した。培地を1日おきに交換した。実験の前夜、サブコンフルエント細胞を二回洗浄し、無血清DMEMで置き換えた。
【０１７１】
γ線照射または化学療法のいずれかにより損傷およびIEC-6細胞アポトーシスを誘導した。すべての実験で一回線量20Gyの[137Cs]線源ガンマ線照射を用いた。血清不足IEC-6細胞をLPA、FAP12、または化合物8g（FAP 18:1 d9）で15分間前処理し、次いでMark I Model 25 Gamma Irradiator（J. L. Shepherd & Associate, San Fernando, CA）により416R/分の速度で4.81分間、回転プラットフォーム上で照射した。いくつかの実験では、LPAを放射線照射前または後の異なる時点で加えた。IEC-6細胞の20μMカンプトテシン処理は、処理後16時間の時点でELISAアッセイにより測定してDNA断片化を引き起こす。DNA断片化はBoehringer（Indianapolis, NJ）からのCell Death Detection ELISAキットを製造者の指示により用いて定量した。試料を三つ組で実行した。Pierce（Rockford, IL）からのBCAキットを用い、二つ組の試料でタンパク質濃度を定量した。DNA断片化を1分間のタンパク質1μgあたりの吸光度単位で表した。
【０１７２】
LPAおよびFAP12（両方10μM）はIEC-6細胞においてカンプトテシン誘導性（20μM）DNA断片化を阻害した。FAPの効果は図5でFAP 18:1 d9チオホスフェート（8g）について示すとおり用量依存的で、LPAの効果と同等であるが、3μMよりも高濃度ではLPAに取って代わる。
【０１７３】
実施例9：放射線または化学療法誘導性アポトーシスに対する腸上皮細胞保護についての化合物8gのインビボ評価
用いた実験法はDeng et al. (2002)において報告されたものと実質的に同じであった。
【０１７４】
全身放射線照射（WBI）プロトコルが再検討され、ACUC Committee of University of Tennessee Health Sciences Centerによって承認された。12時間明暗周期と、それ以外は標準の実験用固形飼料を自由に摂取させて維持したICR系統雄マウス（Harlan Laboratories、体重30〜33g）を、処置前16時間絶食させた。WBIをCs137線源を毎分1.9Gyの線量率で用い、12Gyおよび15Gy線量で行った。4匹ずつのマウス群にハンクス基本塩溶液に溶解した1mM LPAと100μM BSA複合物またはBSA媒体単独のいずれか250μlを放射線照射の2時間前に投与した。
【０１７５】
アポトーシス小体を検出するために、放射線照射後4時間の時点でマウスを二酸化炭素吸入により安楽死させ、小腸を摘出し、中性リン酸緩衝化等張10％ホルマリン中に固定した。小腸からの約3から4mmの長さの区分4つをパラフィン包埋し、厚さ5μmの切片を切断し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。生存クリプトの数を放射線照射後3.5日の時点で計数した。
【０１７６】
FAP 18:1 d9（200μMを放射線照射の2時間前に胃内に投与）は放射線照射した動物においてクリプト生存を有意に（P>0.01）促進した（図6）。FAPの効果は用量依存的であった（図7）。FAP 18:1 d9の効果は回腸および空腸で認められ、LPAの効果を越えていた（図8）。
【０１７７】
参考文献一覧
以下に挙げた各参考文献はその全体が参照により本出願の明細書に組み入れられる。
2007508324.tif 000061
2007508324.tif 000062
2007508324.tif 000063
2007508324.tif 000064
2007508324.tif 000065
2007508324.tif 000066
2007508324.tif 000067
2007508324.tif 000068
2007508324.tif 000069
2007508324.tif 000070
【０１７８】
本明細書において好ましい態様を示し、詳細に説明してきたが、関連する分野の技術者には、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変、追加、置換などを行いうることは明らかであると思われ、したがってこれらは添付の特許請求の範囲において規定される、本発明の範囲内であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】脂肪酸ホスフェート（スキーム1）、脂肪酸チオホスホネート（スキーム2）、およびジフルオロホスホネート（スキーム3）を調製するために用いた三つの反応スキームを示す図である。
【図２】LPA1-3受容体を安定に形質移入されたRH7777細胞に対する修飾したC-14類縁体の効果を示すグラフである。200nMのLPA 18:1をC14類縁体の漸増濃度と共に、LPA1およびLPA3を安定に発現しているRH7777細胞に適用した。異なるC-14類縁体の漸増濃度を適用して、LPA2でのそれらのアゴニスト特性を測定した。データの点は4測定の平均を示す。図2AはLPA1でのC-14類縁体によるLPA反応の阻害を示しており；図2BはC-14 FAP類縁体によるLPA2の活性化を示しており；図2CはLPA2でのC-14ホスホネート9cによるLPA反応の阻害を示しており；図2DはLPA3でのC-14類縁体によるLPA反応の阻害を示している。
【図３】オレオイル-チオホスフェート（8g）がRH7777細胞において発現されたLPA1、LPA2およびLPA3受容体におけるアゴニストであることを示すグラフである。8gの漸増濃度の適用に反応しての細胞内Ca2+の一過性変化を測定し、対応する量のLPA 18:1によって誘発された一過性変化と比較した。データの点は4測定の平均を示す。LPA1（図3A）、LPA2（図3B）、およびLPA3（図3C）を発現しているRH7777細胞におけるLPA 18:1および8gについての用量-反応関係。
【図４】PPARγおよびPPRE-Acox-Rlucレポーター遺伝子を形質移入されたCV1細胞における選択した化合物によるインビトロPPARγ活性化の結果を示す棒グラフである。公知のPPARγアゴニストであるロシグリタゾンによる効果と比較して、CV1細胞を1％DMSOまたはDMSO中に溶解した10μMの試験化合物で20時間処理した。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性（平均±SEM）を細胞溶解産物（n＝4）で測定した。*P<0.05および**P<0.01、媒体対照との有意差。
【図５】LPAおよびFAP18:1d9チオホスフェート（8g）がカンプトテシン（20μM）により誘導されたDNA断片化を用量依存的に阻害することを示すグラフである。
【図６】FAP18:ld9チオホスフェート（8g）がクリプト生存を促進することを示すグラフである。
【図７】FAP 18:1 d9処置マウスにおけるクリプト生存の用量依存的促進を示すグラフである。
【図８】FAP 18:1d9がγ照射マウスの回腸および空腸における用量依存的クリプト生存を誘発することを示すグラフである。
【図９】Y1もアルキルである場合にアリールアルキルR1基を含むチオリン酸エステルを調製するための合成スキームを示す図である。
【図１】
2007508324.tif 000077
【図２】
2007508324.tif 000078
【図３】
2007508324.tif 000079
【図４】
2007508324.tif 000080
【図５】
2007508324.tif 000081
【図６】
2007508324.tif 000082
【図７】
2007508324.tif 000083
【図８】
2007508324.tif 000084
【図９】
2007508324.tif 000085
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月13日(2006.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007508324000001.app
【国際調査報告】
2007508324.tif 000086
2007508324.tif 000087
2007508324.tif 000088