(57)【要約】本発明は、ＫＣＮＣ１遺伝子によってコードされる新規タンパク質を提供し、アルツハイマー病患者の特定の脳領域におけるＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子ＫＣＮＣ１の発現の差を開示する。この知見に基づき、本発明は被験者においてアルツハイマー病を診断または予測診断するための、または被験者がアルツハイマー病を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法を提供する。さらに、本発明は、ＫＣＮＣ１遺伝子およびそれに対応する遺伝子産物を用いた、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患を治療または予防するための治療的および予防的方法を提供する。神経変性疾患の調節物質についてのスクリーニング方法もまた開示される。
2007532610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者においてアルツハイマー病を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体、
のレベルおよび／または活性を測定し、および前記転写産物または前記翻訳産物の前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患状態を表す参照値と、および／または既知の健康状態を表す参照値と比較し、および前記レベルおよび／または前記活性が既知の健康状態を表す参照値と比較して変動し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と同様または等しく、それによって前記被験者においてアルツハイマー病を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記遺伝子が配列番号１を持つＫＣＮＣ１をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子が配列番号４を持つＫＣＮＣ１をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験者においてアルツハイマー病を診断または予測診断する、または被験者のそのような疾患を発症する傾向または素因を判定するためのキットであって、
前記キットは、（ｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬および（ｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも一つの試薬
を含み、かつそれにより、アルツハイマー病を発症する傾向または素因の診断または予測診断を下記の段階によって行う、前記キット。
（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出すること、および（ｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の前記レベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値とおよび／または既知の疾患状態を表す参照値と比較すること、および配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物の前記レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、既知の健康状態を表す参照値と比較して変化し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と同様または等しい。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
からなる群から選択された少なくとも一つの物質の活性および／またはレベルの調整因子。
【請求項６】
配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする非天然遺伝子配列を含む、遺伝子組み換え非ヒト動物であって、前記動物は
（ｉ）前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構造を提供する；および
（ｉｉ）前記ターゲッティング構造を非ヒト動物の幹細胞に導入する；および
（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入する；および
（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植する；および
（ｖ）前記胚を満期まで発生させる；および
（ｖｉ）ゲノムが前記遺伝子配列の修飾を両方の対立遺伝子に含む、遺伝子操作非ヒト動物を特定すること；および
（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子操作非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を得ることを含み、前記破壊は神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因を示す非ヒト動物を結果として生じる
ことによって得ることが可能である。
【請求項７】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物、物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するための、請求項６に記載の組み換え非ヒト動物の使用。
【請求項８】
アルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）細胞を被験化合物と接触させること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；および、
段階（ｂ）および（ｃ）の細胞中の物質のレベルおよび／または活性を比較するが、接触された細胞中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示すこと
を含む前記方法。
【請求項９】
アルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質に関して、神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している非ヒト被験動物に、被験化合物を投与すること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質に関して、およびそのような被験化合物が投与されていない、神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している対応する対照動物において、（ｉ）または（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物における物質の活性および／またはレベルを比較するが、被験動物における物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示すこと
を含む前記方法。
【請求項１０】
前記非ヒト被験動物および／または前記非ヒト対照動物が、天然のＫＣＮＣ１遺伝子転写調節要素ではない転写調節要素の調節下にある、配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体を発現する組み換え動物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物の試験のための、好ましくは複数の化合物のスクリーニングのための、配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質へのまたはその断片、または誘導体、または変異体への前記化合物の結合の程度を決定するための分析法であって、
（ｉ）配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える；
（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングされる、検出可能な、特に蛍光標識される化合物、または検出可能な、特に蛍光標識される複数の化合物を前記複数の容器に加える；
（ｉｉｉ）前記配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記検出可能な、特に蛍光標識される化合物または検出可能な、特に蛍光標識される複数の化合物をインキュベートする；
（ｉｖ）前記配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と相関する好ましくは蛍光量を測定する；および
（ｖ）一種類以上の前記化合物による前記配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の程度を判定する
段階を含む分析法。
【請求項１２】
配列番号１および／または配列番号４を持つタンパク質分子をコードする核酸分子で形質転換された細胞であって、細菌細胞、酵母細胞、哺乳細胞または昆虫細胞である細胞。
【請求項１３】
配列番号１を持つ単離されたタンパク質分子。
【請求項１４】
アルツハイマー病を検出するための診断標的としての、前記配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１をコードする遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体であるタンパク質分子の使用。
【請求項１５】
アルツハイマー病を予防する、または治療する、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての使用のための、配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１をコードする遺伝子のタンパク質分子の使用。
【請求項１６】
被験者由来の試料中の細胞の病理状態を検出するための、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体の使用であって、前記免疫原が前記配列番号１および／または配列番号４を持つＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体であり、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化がアルツハイマー病と関係する前記細胞の病理状態を示す前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における神経変性疾患の進行を診断、予測、および監視する方法に関する。さらに、神経変性疾患の調節物質の治療コントロールおよびスクリーニングの方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物、キット、および組み換え動物モデルも開示する。
【０００２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の生活を強く衰弱させる影響を与える。さらに、これらの疾患は、甚大な健康上の、社会的な、および経済的な負担を構成する。ＡＤは最も一般的な神経変性疾患であり、痴呆の症例全体の約７０％を占め、６５歳超の人口の約１０％および８５歳超の最大４５％が罹患する、おそらく最も破壊的な加齢関連神経変性症状である（最近の総説はヴィッカーズ（Ｖｉｃｋｅｒｓ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００，６０；１３９−１６５を参照）。現在、これは米国、欧州、および日本において推定約１２００万例に達する。この状況は、発展途上国における高齢者数の人口統計上の増加（「ベビーブーマーの高齢化」）に伴い不可避的に悪化する。ＡＤを有する人の脳に生じる神経病理学的な顕著な特徴は、アミロイド−βタンパク質で構成される老人斑、および異常な線維状構造の出現および神経原線維変化の形成と一致して現れる著しい細胞骨格変化である。 
【０００３】
アミロイド−βタンパク質は、さまざまな種類のプロテアーゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の開裂から生じる。β／γ−セクレターゼによる開裂はさまざまな長さのＡβペプチドの形成に繋がり、典型的には、４０アミノ酸から構成される短くより可溶性が高く凝集が遅いペプチド、および細胞外で迅速に凝集し特徴的なアミロイド斑を形成する、より長い４２アミノ酸ペプチドである（セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ）， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ２００１， ８１； ７４１−６６；グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，５； Ｄ７２−８３）。２種類の斑、すなわちびまん性斑および老人斑をＡＤ患者の脳中で検出することが可能であり、後者は伝統的で最も蔓延した種類である。それらは主に大脳皮質および海馬に見出される。脳における毒性のＡβ沈着物の生成は、ＡＤの経過のごく早期に開始し、およびＡＤの病理に繋がるその後の破壊過程の中心的存在であると論じられている。ＡＤの他の病理学的な顕著な特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴ）および、ニューロピル・スレッドと表現される異常な神経突起である（ブラーク（Ｂｒａａｋ）およびブラーク（Ｂｒａａｋ）， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １９９１， ８２； ２３９−２５９）。ＮＦＴは神経細胞の内部に出現し、および互いに絡まり合う対のらせん状線維を形成する、化学的に変化したタウタンパク質から成る。ＮＦＴの形成とともに、神経細胞の喪失も見出すことができる（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９６， １： ３８−５８； ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびハーティガン（Ｈａｒｔｉｇａｎ）， Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９９， １： ３２９−３５１）。神経原線維変化の出現およびその数の増加は、ＡＤの臨床的重症度とよく相関する（シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００， ５５； ３７０−３７６）。
【０００４】
ＡＤは進行性疾患であり、初期の記憶形成の障害を伴い、および最終的にはより高次の認知機能の完全な衰退に繋がる。認知障害には、とりわけ、記憶障害、失語症、失認症、および実行機能の喪失がある。ＡＤの病因の特徴的性質は、脳の特定の領域および神経細胞の部分集団の、変性過程に対する選択的な不安定性である。具体的には、側頭葉領域および海馬は、疾患の経過中に早期におよびより重度に冒される。一方、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は大体は損なわれないままであり、神経変性から守られている（テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１， １０； １８４−９２）。ＡＤの発症年齢は５０年の範囲内でさまざまであり、６５歳未満の人で起こる早発型ＡＤ、６５歳超の人で起こる遅発型ＡＤがある。ＡＤの全症例のうち約１０％が早発型 ＡＤに罹患し、１〜２％だけが家族性の遺伝例である。
【０００５】
現在、ＡＤに治療法は無く、ＡＤの進行を止めるか、または高確率で死亡前にＡＤを診断するためさえ、有効な方法は無い。個人がＡＤを発症する素因となるいくつかのリスク因子が特定されており、中でも非常に重要なのは、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の既存の３つの異なる対立遺伝子（イプシロン２、３、および４）のイプシロン４対立遺伝子である（シュトリトマター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）ら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３， ９０； １９７７−８１；ローゼス（Ｒｏｓｅｓ）， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９８， ８５５； ７３８−４３）。第２１染色体上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、第１４染色体上のプレセニリン−１、および第１染色体上のプレセニリン−２の遺伝子の遺伝的欠陥によるとされる早発型ＡＤの稀な例が存在するが、遅発型散発性ＡＤの一般的な型は、これまでのところ病因的起源は不明である。神経変性疾患の遅い発症および複雑な病因は、治療用および診断用薬の開発に困難な問題をもたらす。医薬標的および診断マーカーの候補のプールを拡大することが極めて重大である。したがって、神経疾患の病因に関する洞察を与えること、およびこれらの疾患の治療の診断および開発に特に適した方法、材料、物質、組成物、および動物モデルを提供することは、本発明の目的である。この目的は、独立請求項の条項によって解決される。下位請求項は、本発明の好ましい実施形態を定義する。
【０００６】
本発明は、電位依存性カリウムイオンチャネルサブファミリーＣメンバーであるＫＣＮＣ１、またはＳｈａｗ関連サブファミリーメンバー１、別名Ｋｖ３．１をコードする遺伝子、およびヒトアルツハイマー病脳試料中のＫＣＮＣ１のタンパク質産物の検出および無調節な発現差に基づく。
【０００７】
電位依存性カリウムイオン（Ｋ＋）チャネルは、他のＫｖアルファサブユニットとのホモまたはヘテロメリック四量体のいずれかを形成可能な膜貫通タンパク質である。各アルファサブユニットは６つの膜貫通ヘリックス（Ｓ１−Ｓ６）から成る。電位依存性カリウムチャネルの主要な役割の一つは、細胞の静止膜の調節であり、それによってたとえば神経細胞の興奮性および心筋活動電位を調節することである。このようなアルファサブユニットの活性は、たとえばチャネル表面発現、ゲート動力学または伝導特性の変化に繋がる単一の膜貫通領域から構成される細胞内水溶性タンパク質または膜貫通タンパク質によって調節されてもよい。一般に、電位依存性カリウムチャネルは神経系において重要なおよび異なる役割を果たし、これによって神経機能は、イオンチャネル特性自体、特定の神経区画における位置および密度、および神経集団全体にわたる発現勾配の影響を受ける。ヘテロメリックなチャネルの形成によって、莫大な多様性、およびこれによって生理学的特性の広範なスペクトルを生じる。
【０００８】
脱分極および不活性特性に対する感受性に基づき、Ｋｖ３．１電位依存性カリウムイオンチャネルは、高電圧電流を媒介するイオンチャネルに属する。高電圧活性カリウムチャネルは、シナプス前活性電位再分極に関与する（イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）ら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３， ２３： １０４４５−１０４５３）。これらは高速の再分極において重要な役割を果たし、体細胞部位で高周波で反復的に神経を発火させることができる（デュ（Ｄｕ）ら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９６， １６： ５０６−５１８； エリシール（Ｅｒｉｓｉｒ）ら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９９９， ８２： ２４７６−２４８９）。Ｋｖ３．１カリウムチャネルは海馬のＧＡＢＡ性シナプスの介在神経細胞中における高周波活動電位生成に必要である（リーン（Ｌｉｅｎ）およびジョナス（Ｊｏｎａｓ）， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３， ２３： ２０５８−２０６８）。今日までのところ、２９個のメンバーの関連する電位依存性カリウムチャネルファミリーを生じる８個の遺伝子ファミリーが説明されてきた。これまで全部あわせて７０を超える異なるカリウムチャネルサブユニットが哺乳動物中に特定されてきた。哺乳動物のカリウムチャネルの大部分は、当初Ｓｈａｋｅｒ，Ｓｈａｂ，ＳｈａｗおよびＳｈａｌとしてショウジョウバエ中に記載されてきた４つのサブファミリーのうち一つに属し、および類似性の高い細孔領域を共有する （ルーディ（Ｒｕｄｙ）ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９１， ２： ８９−１０２）。Ｓｈａｗに関連するカリウムチャネルの遺伝子ファミリーの一つは、ヒトおよびげっ歯類において４つの電位依存性カリウムチャネルは、Ｋｖ３．１，Ｋｖ３．２，Ｋｖ３．３およびＫｖ３．４から構成されるＫＣＮＣファミリーである。Ｋｖ３．１およびＫｖ３．２はイオンチャネルの遅延整流ファミリーに属する。Ｋｖ３遺伝子はそれぞれアイソフォームに特異的な調節およびターゲッティング特性を提供する ３’末端での選択的スプライシングによって複数のアイソフォームをコード化する（ルーディ（Ｒｕｄｙ）およびマクベイン（ＭｃＢａｉｎ）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００１， ２４： ５１７−５２６）。オザイタ（Ｏｚａｉｔａ）（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００２， ８８： ３９４−４０８）らによると、前記スプライシングはチャネルの電気生理学的特性に影響しない。前シナプス端における電位依存性カリウムチャネルおよび電位依存性カリウムチャネルがどのようにシナプス伝達に影響するかについてはほとんど知られていない。デボー（Ｄｅｖａｕｘ）ら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３， ２３： ４５０９−４５１８）は、高電圧活性チャネルＫｖ３．１ｂがラットおよびマウスのＣＮＳ（中枢神経系）におけるランビエのノードの構成要素であることを初めて実証した。Ｋｖ３．１ｂは脊髄の灰白質中で大量に発現している。Ｋｖ３．１サブユニットは、シナプス末端および海馬介在神経の末端で検出されてきた（セカーンジャック（Ｓｅｋｉｒｎｊａｋ）ら， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９９７， ７６６： １７３−１８７； ドッドソン（Ｄｏｄｓｏｎ）ら， Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００３， ５５０： ２７−３３）。オザイタ（Ｏｚａｉｔａ）（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００２， ８８： ３９４−４０８）らは、Ｋｖ３．１遺伝子の２つの代替スプライス産物であるＫｖ３．１ａおよびＫｖ３．１ｂの脳内分布および細胞内局在性を検討した。彼らは、Ｋｖ３．１ｂタンパク質がマウスの脳における特異的神経細胞集団の細胞体および近接樹状突起細胞膜に発現したが、一方Ｋｖ３．１ａは細胞体樹状突起膜にはほとんど発現しなかったことを報告した。１９９２年にはすでに異なるサブファミリーに由来するカリウムチャネルの発現パターンが文献に記載されていた（ドレブ（Ｄｒｅｗｅ）ら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９２， １２： ５３８−５４８； パーニー（Ｐｅｒｎｅｙ）ら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９９２， ６８： ７５６−７６６； ワン（Ｗａｎｇ）ら， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ １９９８， ９５： １８８２−１８８７）。Ｋｖ３．１は、成人脳、小脳、プルキンエおよび顆粒細胞、いくつかの皮質において、およびより少ない程度で灰白質にのみ発現することが報告された。Ｋｖ３．１は、蝸牛神経核中の有毛細胞のシナプス後膜に隣接した脊椎様突起に局在している。ウィーザー（Ｗｅｉｓｅｒ）ら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９５， １５： ４２９８−４３１４）はＫｖ３．１ｂの分布を検討し、および 細胞体膜および軸索膜中へのＫｖ３．１ｂの局在を報告した。
【０００９】
ヒトＫＣＮＣ１遺伝子（Ｋｖ３．１）（ｍＲＮＡ，１６０４ｂｐ，Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ５６７７０）は染色体１１ｐ１５．１（グリスマー（Ｇｒｉｓｓｍｅｒ）ら， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２， ２６７： ２０９７１−２０７９； リード（Ｒｉｅｄ）ら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９３， １５： ４０５−４１１）上に局在し、および分子量が約５８ｋＤａのアミノ酸５１１のタンパク質をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  Ｐ４８５４７）。ルノー（Ｌｕｎｅａｕ）ら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ １９９１， ８８： ３９３２−３９３６）はげっ歯類（ラット脳）中のＳｈａｗ関連Ｋｖ３．１遺伝子が択一的にスプライシングされ、ＮｇＫ２とも、Ｋｖ３．１ａおよびＫｖ４とも呼ばれる転写物を生じることを示した。この２つの転写物はアミノ酸５０１までは同一であり、Ｃ末端において異なる。Ｋｖ３．１の最後の１０個のアミノ酸は、タンパク質Ｋｖ３．１ｂ中の８４個のアミノ酸に置換される。ラットＫｖ３．１ｂ転写物のオープン・リーディング・フレームは、予測される大きさが約６５ｋＤａである５８５個のアミノ酸のタンパク質をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ２５１２２）。ラットのＫｖ３．１ｂは長さがそれぞれ１１６１塩基対（ｂｐ）および１０６１ｂｐである５’および３’の非翻訳領域を有する。ラットＫｖ３．１ｂの配列は、ショウジョウバエＳｈａｗカリウムチャネルと４８％同一であり、コード配列の１５０４塩基対のうち５０においてＫｖ３．１ａの公開された配列とは異なる。今日までラットスプライス変異体Ｋｖ３．１ｂに対するホモログが説明されてきた。
【００１０】
ＫＣＮＣ１遺伝子（Ｋｖ３．１）の発現は、非神経細胞中のＫｖ３．１発現を表す５’ＵＴＲに配置されたサイレンシング因子に起因するＴリンパ球の亜集団を除いて、ＣＮＳに限定される（ハーン（Ｈａｈｎ）ら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｍｉｓｔｒｙ １９９９， ７３： １３５０−１３７９）。２つのアイソフォームの発現パターンは時間的に異なるが、空間的には異ならない（リュー（Ｌｉｕ）およびカズマレック（Ｋａｃｚｍａｒｅｋ）， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９８， １８： ２８８１−２８９０）。げっ歯類のスプライス変異体 Ｋｖ３．１ｂの分布および発現を後半に検討した。Ｋｖ３．１ｂ変異体の発現はシナプス形成の時に顕著に増加する（パーニー（Ｐｅｒｎｅｙ）ら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９９２， ６８： ７５６−７６６）。高いレベルの発現が、維持された一連のシナプス入力の間に適応がほとんどまたは全くなく高い周波数で発火活動電位が可能な神経細胞中にみとめられた。ＫＣＮＣ１（Ｋｖ３．１）遺伝子のプロモータは、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質のための結合部位を含み、ｃＡＭＰおよびカルシウムによって活性化されてもよい（ガン（Ｇａｎ）ら， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６， ２７１： ５８５９−５８６５）。一般にＫｖ３．１チャネルは、ヒト神経芽腫細胞中のカリウム電流の減少に繋がるＤｅｌｔａＥ９−突然変異体プレセニリン−１と共発現する場合、原形質膜中で減少する（Ｐｌａｎｔら， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００２， １３： １５５３−１５５６）。マリン（Ｍａｌｉｎ）ら（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ １９９８， ４： ３９８−４０９）は、プレセニリン類が相互作用はしないが、機能的カリウムチャネル発現に直接的または間接的に介在しうることを示唆した。 エスピノーサ（Ｅｓｐｉｎｏｓａ）およびその同僚らは、アルコール高感受性に罹患する二重ホモ接合Ｋｖ３．１／Ｋｖ３．３欠損マウスが移動運動および自発的ミクロオーヌスを増加したことを記載した（エスピノーサ（Ｅｓｐｉｎｏｓａ）ら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００１， ２１： ６６５７−６６６５）。Ｋｖ３．１の一重変異体およびＫｖ３．１欠損マウスの両方とも、可視的な神経変性の徴候はなく、比較的穏やかな表現型を示した。これまでのところアルツハイマー病のＫＣＮＣ１（Ｋｖ３．１）とわれわれの今日の知識との関連はまだ開示されていない。
【００１１】
ここでおよび請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈でそうでないと示されない限り、複数への言及を含む。たとえば、「ａ細胞（一つの細胞）」は複数の細胞をも意味する、など。本明細書および請求項で用いられる「および／または」の語句は、この語句の前および後の語句が選択肢としてまたは組み合わせて考えられるべきであることを示す。たとえば、「レベルおよび／または活性の測定」という言い回しは、レベルだけ、または活性だけ、またはレベルおよび活性の両方が測定されることを意味する。ここで用いられる「レベル」の語は、転写産物、たとえばｍＲＮＡ、または翻訳産物、たとえばタンパク質またはポリペプチドの、量または濃度の尺度または指標を含むことを意図する。ここで用いられる「活性」の語は、転写産物または翻訳産物が生物学的効果を生じる能力についての指標、または、生物学的に活性な分子のレベルの指標と理解すべきである。「活性」の語はまた、カリウムチャネルまたはカリウムチャネルサブユニットの結合、拮抗、抑制、阻害、中和または金属イオン封鎖を言い、および配列番号１の新規のカリウムチャネルポリペプチドおよび配列番号４のカリウムチャネルポリペプチドを含むがこれに限定されないカリウムチャネルまたはカリウムチャネルポリペプチドの活性化、拮抗、情報調節をいう。「生物学的活性」はカリウムイオンの膜透過輸送および／または膜貫通型イオン流動および／またはそのアップレギュレーションを含むが、これらに限定されない。「薬理活性」は、リガンド、化合物、物質、調節物質および／または別のカリウムチャネルサブユニットと結合するカリウムチャネルまたはカリウムチャネルサブユニットの能力を含むがこれらに限定されない。
【００１２】
ここで用いられる「レベル」および／または「活性」の語はさらに、遺伝子発現レベルまたは遺伝子活性をいう。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生に繋がる、転写および翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用と定義される。「調節障害」は遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味することとする。遺伝子産物はＲＮＡまたはタンパク質のどちらかを含み、および遺伝子の発現の結果である。遺伝子産物の量は、遺伝子がどの程度活性であるかを測定するのに用いることができる。本明細書および請求項で用いられる「遺伝子」の語は、コード領域（エクソン）および非コード領域（たとえばプロモーターまたはエンハンサー、イントロン、リーダーおよびトレーラー配列といった非コード調節配列）の両方を含む。「ＯＲＦ」の語は「オープン・リーディング・フレーム」の頭文字であり、および、少なくとも１つの読み枠に終止コドンを持たずおよびしたがって潜在的にアミノ酸の配列に翻訳されうる核酸配列をいう。「調節配列」は、遺伝子発現を推進し調節する、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびその他の配列を含む。ここで用いられる「断片」の語は、たとえば択一的にスプライシングされ、または短縮され、またはさもなければ切断された転写産物または翻訳産物を含むことを意図する。ここで用いられる「誘導体」の語は、突然変異の、またはＲＮＡ改変された、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた転写産物、または、突然変異の、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた翻訳産物をいう。明確には、誘導体転写産物は、たとえば、一塩基または複数塩基の欠失、挿入、または交換といった変化を核酸配列に有する転写産物をいう。例えば、転写産物は、変化したリン酸化、またはグリコシル化、またはアセチル化、または脂質化といった過程によって、または変化したシグナルペプチド開裂またはその他の型の成熟開裂によって生じうる。これらの過程は翻訳後に起こりうる。本発明および請求項で用いられる「調節因子」の語は、遺伝子、または遺伝子の転写産物、または遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性を変化または改変することができる分子をいう。「調節因子」は、ポタシアムチャンネルサブユニットまたはポタシアムチャンネルの機能的性質を促進または阻害、したがって「調節する」、ポタシアムチャンネルまたはポタシアムチャンネルサブユニットの結合、拮抗、抑制、阻害、中和または封鎖を「調節する」、および活性化、作用、アップレギュレーションを「調節する」ことができる能力を有する分子をいう。「調節」はまた、細胞の生物活性に影響を与える能力をいうのにも用いられる。
【００１３】
好ましくは、「調整因子」は、遺伝子の転写産物または翻訳物の生物活性を変化または改変することができる。例えば、前記調整因子は、生物活性において、および／または、薬理活性においての結合性質の変化、または前記遺伝子の翻訳産物の生物学的、機能的、または免疫学的形態においての増加、減少、変化または改変が可能である。「物質」、「試薬」、または「化合物」の語は、細胞、組織、体液に対して、または任意の生物学的系または被験分析系の背景内で、正または負の生物学的効果を有する任意の物質、化学物質、組成物または抽出物をいう。それらは標的の作用因子、拮抗因子、部分的作用因子または逆作用因子でありうる。このような物質、試薬または化合物は、核酸、ネイティブまたは合成ペプチドまたはタンパク質複合体または融合タンパク質であってもよい。これらはまた、抗体、有機または無機の分子または組成物、小分子、薬剤および上述した任意の物質の任意の組み合わせであってもよい。これらは、試験、診断または治療目的のために用いてもよい。「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」の語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって、与えられた標的ポリヌクレオチドとアニーリングすることができ、およびポリメラーゼによって伸長することができる、短い核酸配列をいう。それらは特定の配列に対して特異的であるように選択することができ、または任意に選択することができ、たとえばそれらはある混合物中のすべての可能な配列のプライマーとなることができる。ここで用いられるプライマーの長さは１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変動しうる。「プローブ」はここで記載および開示される核酸配列の短い核酸配列またはそれと相補的である配列である。それらは完全長配列、または任意の配列の断片、誘導体、アイソフォーム、または変異体を含むことができる。「プローブ」と分析試料との間のハイブリダイゼーション複合体の同定は、その試料内の他の類似配列の存在の検出を可能にする。ここで用いられる「ホモログまたはホモロジー」は、ヌクレオチドまたはペプチド配列の、別のもう一つのヌクレオチドまたはペプチド配列との関連性を表す本分野の語であり、比較される前記配列間の同一性および／または類似性の程度によって測定される。本分野では、「同一性」および「類似性」の語は、問い合わせ配列と、好ましくは同一の種類の別の配列（核酸またはタンパク質配列）とを、互いにマッチングさせることによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」を計算および決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧ ＢＬＡＳＴ（基礎局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５： ４０３−４１０；アルチュールら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５： ３３８９−３４０２；デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４，１２： ３８７）、 ＢＬＡＳＴＮ ２．０ （ギッシュ（Ｇｉｓｈ）Ｗ．，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ，１９９６−２００２）、ＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，８５： ２４４４−２４４８）、および最長の重複を有する一対のコンティグを決定および整列するＧＣＧ ＧｅｌＭｅｒｇｅ（ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８４，４４： ５５７−５６７；ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびビュンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８： ４４３−４５３）を含むがそれらに限定されない。ここで用いられる「変異体」の語は、本発明で開示されたポリペプチドおよびタンパク質に関して、本発明の天然のポリペプチドまたはタンパク質の天然のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端におよび／または中に、１個以上のアミノ酸が付加されたおよび／または置換されたおよび／または欠失したおよび／または挿入された、任意のポリペプチドまたはタンパク質であるが、その必要本質的形態を留める。さらに、「変異体」の語は、ポリペプチドまたはタンパク質の任意のより短いかまたはより長い形を含む。「変異体」はまた、配列番号１（Ｋｖ３．１ｂ），配列番号４（Ｋｖ３．１ａ）のＫＣＮＣ１タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、および非常に好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する配列も含む。タンパク質分子の「変異体」は、たとえば、高度に保存された領域に保存されたアミノ酸置換を有するタンパク質を含む。本発明の「タンパク質およびポリペプチド」は、配列番号１（Ｋｖ３．１ｂ），配列番号４（Ｋｖ３．１ａ）のＫＣＮＣ１タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質の、変異体、断片、および化学的誘導体を含む。コドンが代替的な塩基配列によって別のコドンに置き換えられ、しかしそのＤＮＡ配列によって翻訳されるアミノ酸配列が変化しないままである配列変異を含めるべきである。この本分野で知られる現象は、特定のアミノ酸を翻訳するコドンの組の冗長性と呼ばれる。アルギニンをリジンに、バリンをロイシンに、アスパラギンをグルタミンにといった、機能性にまったく影響しないアミノ酸の交換もまた含めるべきである。天然から単離することができるかまたは、組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができるタンパク質およびポリペプチドを含めることができる。ネイティブタンパク質またはポリペプチドは、天然に存在する短縮型または分泌型、天然に存在する変異型（たとえばスプライス変異体）および天然に存在する対立遺伝子変異体をいう。ここで用いられる「単離された」の語は、天然の環境から変化および／または取り出された、すなわち通常存在する細胞からまたは生体から単離され、および天然で付随して見出される共存成分から分離されたかまたは本質的に精製された分子または物質をいうと考えられ、またそれらは「非ネイティブ」であるともいう。この概念はさらに、そのような分子をコードする配列を人間の手で、自然状態では結合していないポリヌクレオチドと結合させることができること、およびそのような分子を組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができることを意味する（非ネイティブ）。前記の目的のためにそれらの配列が、当業者に既知である方法によって生体または死んだ生物に導入されても、およびそれらの配列が前記生物中にまだ存在していても、それらはなお単離されており、非ネイティブであると考えられる。本発明では、「リスク」、「感受性」、および「素因」の語は同等であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して用いられる。
【００１４】
「ＡＤ」はアルツハイマー病を意味する。ここで用いられる「ＡＤ型神経病理」は、本発明に記載されている通りの、および最先端の文献から一般に既知である通りの、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的、および臨床的な顕著な特徴をいう（イクバル（Ｉｑｂａｌ），スワーブ（Ｓｗａａｂ），ウィンブラッド（Ｗｉｎｂｌａｄ）およびウィスニュースキ（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ），『アルツハイマー病と関連疾患（疫学、病因論および治療薬）』（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ （Ｅｔｉｏｌｏｇｙ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）），ワイリー・アンド・サンズ社（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ），トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ），１９９９；シント（Ｓｃｉｎｔｏ）およびダフナー（Ｄａｆｆｎｅｒ），『アルツハイマー病の早期診断』（Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），ヒューマナ・プレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ），ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）２０００；マイユ（Ｍａｙｅｕｘ）およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ）『アルツハイマー病の疫学：遺伝子から予防まで』（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ； Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ），シュプリンガー・プレス社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ），ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ），ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９９；ヨーンキン（Ｙｏｕｎｋｉｎ），タンジ（Ｔａｎｚｉ）およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ），『プレセニリンとアルツハイマー病』（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），シュプリンガー・プレス社，ベルリン，ハイデルベルク，ニューヨーク，１９９８を参照）。「ブラーク病期」または「ブラーク病期分類」の語は、ブラークおよびブラークによって提案された判定基準に従った脳の分類をいう（ブラーク（Ｂｒａａｋ）およびブラーク（Ｂｒａａｋ），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１，８２： ２３９−２５９）。神経原線維変化およびニューロピル・スレッドの分布に基づいて、ＡＤの神経病理学的進行は６つの病期に分けられる（病期０から６）。本発明では、ブラーク病期０から２は対照健常者（「対照」）を表し、およびブラーク病期４から６はアルツハイマー病の患者（「ＡＤ患者」）を表す。前記「対照」から得られた値が、「既知の健康状態」を表す「参照値」であり、および前記「ＡＤ患者」から得られた値が、「既知の疾患状態」を表す「参照値」である。ブラーク病期３は、対照健常者またはＡＤ患者のどちらかを表しうる。ブラーク病期が高いほど、ＡＤの症状を示す可能性が高い。神経病理学的評価、すなわちＡＤの病理学的変化が痴呆の根本にある原因である確率の推定については、ブラーク（Ｂｒａａｋ）Ｈによる提言が与えられている（ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ）。
【００１５】
本発明に記載の神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭性痴呆症、進行性核麻痺、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆症、多系統変性症、嗜銀性顆粒痴呆症およびその他のタウオパシー、および軽度の認知障害を含む。さらに、神経変性過程を含むその他の症状は、たとえば、加齢黄斑変性、ナルコレプシー、運動神経細胞疾患、プリオン病および外傷性神経損傷および修復、および多発性硬化症である。
【００１６】
本発明は、特定の試料において、ＡＤ患者の特定の脳領域において、および／または対応する年齢の対照健常者と比較して、電位依存性カリウムイオンチャネルサブファミリーＣメンバー１をコードする遺伝子ＫＣＮＣ１（別名Ｋｖ３．１）およびＫＣＮＣ１のタンパク生成物（別名Ｋｖ３．１ａ, Ｋｖ３．１ｂ）の特定、発現差、異常調節を開示する。本発明は、ＫＣＮＣ１の遺伝子発現が変化し、ＡＤ患者脳において、前頭皮質と比較して側頭皮質においてＫＣＮＣ１ｍのＲＮＡレベルが減少し、およびダウンレギュレートされ、または側頭皮質と比較して前頭皮質において上昇しおよびアップレギュレートする点で、異常調節をきたすことを開示する。さらに本発明は、ＡＤ患者の前頭皮質および側頭皮質と比較して、対応する年齢の対照健常者の前頭皮質と側頭皮質との間でＫＣＮＣ１発現が異なることを開示する。対応する年齢の対照健常者から得た試料中にはこのような調節異常はみとめられない。この調節異常はおそらくＡＤ罹患脳におけるＫＣＮＣ１の病理学的改変と関連すると思われる。今日まで、とりわけＡＤにおけるＫＣＮＣ１遺伝子発現の調節異常と神経変性疾患の病理との間の関係を示す実験が記載されたことはなかった。同様に、前記疾患と関連するＫＣＮＣ１遺伝子の突然変異もこれまで記載されてこなかった。ＫＣＮＣ１遺伝子をこのような疾患に関連付けることによって、とりわけ前記疾患の診断および治療に新しい方法を提供する。
【００１７】
本発明は、ＡＤ患者の特定脳領域においてＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の調節異常を開示する。後側頭葉、内嗅皮質、海馬、および扁桃体内のニューロンは、ＡＤにおける変性過程の影響を受ける（テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１， １０： １８４−１９２）。これら脳領域は、学習および記憶機能の処理において主に関与し、およびＡＤにおける神経細胞脱落および変性に対する選択的な脆弱性を示す。対照的に、前頭皮質、後頭部皮質、および小脳神経細胞は、ほとんど無傷のままであり、および神経変性から保護されている。ＡＤ患者および年齢対応する対照健常者の前頭皮質（Ｆ）、側頭皮質（Ｔ）および海馬（Ｈ）に由来する脳組織は、本明細書中で開示される実施例に使用されている。その結果、ＫＣＮＣ１遺伝子およびその対応する転写および／または翻訳産物は、ＡＤに典型的にみとめられる局在的な選択的神経細胞の変性において原因となる。あるいはＫＣＮＣ１は、残存する神経細胞に対して神経保護的機能を有しうる。これら開示に基づいて、本発明は、神経変性疾患、とりわけＡＤに対する素因の診断評価および予後予測、ならびに、特定に対して有用性を持つ。さらに本発明は、これら疾患に対する治療を受ける患者の診断監視のための方法を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法を扱う。その方法は：前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定すること、および、前記転写産物および／または、前記翻訳産物の前記レベル、および／または前記活性を、既知の疾患または健康状態（健康対照）を表す参照値と比較し、および前記レベルおよび／または前記活性が異なり、既知の健康状態を表す参照値と比較して改変され、および／または、既知の健康状態を表す参照値と等しく、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定することを含む。「被験者において」という言い回しは、被験者が罹患する疾患に結果が関係する限りの、すなわち、前記疾患が被験者「において」存在する、開示された方法の結果をいう。
【００１９】
本発明はまた、本発明に開示される通りの核酸配列、またはその断片、または変異体に独自のプライマーおよびプローブの構築および用途に関する。そのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、蛍光、生物発光、磁性、または放射性物質で特異的に標識することができる。本発明はさらに、適当な組み合わせの前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、前記核酸配列、またはその断片および／または変異体の検出および製造に関する。ＰＣＲ分析は、当業者によく知られた方法であるが、核酸を含む試料から前記遺伝子特異的核酸配列を増幅するために、前記プライマーの組み合わせを用いて実施することができる。そのような試料は、健常者または患者のどちらかから得ることができる。増幅の結果として特定の核酸産物を生じるかどうか、および異なる長さの断片を得ることができるかどうかは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示しうる。このように、本発明は、調べる核酸配列を含む任意の試料中の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連している可能性がある、遺伝子突然変異および一塩基多型の検出に有用な、少なくとも長さ１０塩基、最大でコード配列および遺伝子配列全体の、核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する。この機能は、好ましくはまたキットの形式である、ＤＮＡに基づく迅速診断検査を開発するために有用である。ＫＣＮＣ１のプライマー例は例（ｉｖ）に説明されている。
【００２０】
別の一態様では、本発明は被験者における神経変性疾患の進行を監視する方法を扱う。前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定する。前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較する。それによって前記被験者において前記神経変性疾患の、アルツハイマー病の、進行を監視する。
【００２１】
さらに別の一態様では、本発明は、前記疾患について治療されている被験者由来の試料中の（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定することを含む、神経変性疾患の治療を評価する方法を扱う。前記レベル、または前記活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記神経変性疾患の治療を評価する。
【００２２】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および用途の好ましい一実施形態では、前記電位依存性カリウムイオンチャネルサブファミリーＣメンバー１、ＫＣＮＣ１とも呼ばれるＫＣＮＣ１遺伝子およびタンパク質、またはＫｖ３．１、ＮＧＫ２、Ｋｖ４またはＲａｗ２とも呼ばれるＳｈａｗ関連サブファミリーメンバー１は、配列番号１（Ｋｖ３．１ｂ）を有するタンパク質、および配列番号４を有するＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ４８５４７（Ｋｖ３．１ａ）をコードする遺伝子によって表される。前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２（Ｋｖ３．１ｂ ｃＤＮＡ）に対応し、および配列番号５を有するＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ５６７７０（Ｋｖ３．１ａ）のｃＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列から導かれる。本発明においてＫＣＮＣ１は、配列番号２および配列番号５を有し、配列番号１および配列番号４を有するタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 Ｐ４８５４７）をコードする核酸配列、および配列番号７および配列番号８を有するプライマーの増幅産物に対応する配列番号６のこともいう。本発明において前記配列は、ここで用いられるように「単離されている」。また本発明では、前記ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子は、一般にＫＣＮＣ１遺伝子またはＫｖ３．１遺伝子、または単にＫＣＮＣ１またはＫｖ３．１ともいわれる。さらに、ＫＣＮＣ１またはＫｖ３．１のタンパク質は、一般にＫＣＮＣ１タンパク質またはＫｖ３．１タンパク質ともいわれる。好ましくは、前記ＫＣＮＣ１タンパク質またはＫｖ３．１タンパク質は、ＫＣＮＣ１またはＫｖ３．１のスプライス変異体Ｋｖ３．１ｂおよびＫｖ３．１ａである。
【００２３】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および用途の別の好ましい一実施形態では、前記神経変性疾患または障害はアルツハイマー病であり、および前記被験者または患者はアルツハイマー病患者である。
【００２４】
分析および測定する前記試料は、脳組織，脳細胞または他の組織または他の体細胞から成る群から選択されるのが好ましい。試料はまた、脳脊髄液または、唾液、尿、血液、血清、血漿、または粘液を含むその他の体液を含むことができる。好ましくは、本発明に記載の神経変性疾患の診断、予測診断、進行の監視、または治療の評価の方法は、体外で実施することができ、およびそのような方法は好ましくは、たとえば、被験者または患者または対照健常者から摘出、採取、または単離された体液または細胞といった試料に関する。
【００２５】
さらに好ましい実施形態では、前記参照値は、前記神経変性疾患に罹患していない被験者由来の試料中の（対照健常者、対照試料、対照）、または、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を罹患している被験者由来の試料中の（患者試料、患者）、（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の値である。
【００２６】
好ましい実施形態では、既知の健康状態を表す参照値（対照試料）に対する、被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液中の、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／またはＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、レベルおよび／または活性における変化、変化したレベルおよび／または活性が、神経変性疾患、特にＡＤに罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の既知の疾患状態を表す参照値（ＡＤ患者試料）に対する、被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液中の、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／またはＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、等しいかまたは類似のレベルおよび／または活性は、前記神経変性疾患に罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物のレベルの測定が、被験者から得られた試料において、被験者の試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡに由来する前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせを用いた定量的ＰＣＲ分析を使用して実施される。プライマーの組み合わせ（配列番号９、配列番号１０）は本発明の実施例（ｉｖ）に示されるが、本発明で開示される通りの配列から生成される他のプライマーもまた用いることができる。前記遺伝子に特異的なプローブを用いたノーザンブロットもまた適用することができる。チップを基礎とするマイクロアレイ技術によって転写産物を測定することがさらに好ましい。これらの手法は当業者に公知である（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，２００１；シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）Ｍ．，『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），２０００を参照）。免疫測定法の一例は、特許出願国際公開第０２／１４５４３号パンフレットに開示され記載される通り、酵素活性の検出および測定である。
【００２９】
さらに、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物のおよび／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性、および／または、前記翻訳産物および／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の活性のレベルは、免疫測定法、活性測定法、および／または結合測定法によって検出することができる。これらの測定法は、前記タンパク質分子と抗タンパク質抗体との間の結合の量を、抗タンパク質抗体かまたはその抗タンパク質抗体と結合する二次抗体のどちらかに結合した、酵素、色力学、放射性、磁性、または発光標識を用いることによって測定することができる。加えて、他の高親和性リガンドを用いることができる。使用することができる免疫測定法は、たとえばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および当業者に公知のその他の技術を含む（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体を用いて：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９９およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｒ，『免疫診断：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），英国オックスフォード，１９９９を参照）。これらの検出方法すべてはまた、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップ、またはタンパク質チップを基礎とする技術の形式で使用することができる（シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）Ｍ．，『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），２０００を参照）。
【００３０】
好ましい一実施形態では、前記疾患の進行を監視するため、ある期間にわたって前記被験者から採取された一連の試料中の（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が比較される。さらに好ましい実施形態では、前記被験者は前記試料収集の１回以上の前に治療を受ける。さらに別の好ましい一実施形態では、前記レベルおよび／または活性は、前記被験者の前記治療の前および後に測定される。
【００３１】
別の一態様では、本発明は被験者において神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、または被験者の神経変性疾患、特にＡＤを発症する傾向または素因を判定するためのキットを扱い、前記キットは下記を含む：
（ａ）（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも１つの試薬；および（ｂ）−前記被験者に由来する試料中の、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出する；および−神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、および／またはそのような疾患を発症する前記被験者の傾向または素因を判定する段階を記載することによる、神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する被験者の傾向または素因を判定するための指示であって、既知の健康状態を表す参照値（対照）と比較した前記転写産物および／または前記翻訳産物の、変化したレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方、および／または、既知の疾患状態、好ましくはＡＤの疾患状態を表す参照値と同様であるかまたは等しい、前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、神経変性疾患、特にＡＤの診断または予測診断、またはそのような疾患を発症する高い傾向または素因を示す。本発明に記載のキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクがある人の特定に特に有用である可能性がある。
【００３２】
したがって、別の一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断または予測診断する方法における、およびそのような疾患を発症する被験者の高い傾向または素因を判定する方法における、（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出、および（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、前記レベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値および／または既知の疾患状態を表す参照値と比較し、および前記転写産物および／または前記翻訳産物の前記レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、既知の健康状態を表す参照値と比較して変動し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と類似または等しい段階を含むキットの使用を扱う。
【００３３】
したがって、本発明の記載のキットは、疾患経過において不可逆的損傷が与えられる前に、特定された人を疾患の発症前の早期予防処置または治療的介入の対象とする方法となりうる。さらに、好ましい実施形態では、本発明で扱うキットは、被験者において神経変性疾患、特にＡＤの進行を監視、および前記被験者のそのような疾患について治療的処置の成功または失敗を監視および評価するのに有用である。
【００３４】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方に直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質の前記被験者への投与を含む、被験者において神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防する方法を扱う。前記物質は低分子を含むことができ、またはペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドを含むこともできる。前記ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドは、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列、またはその断片、または誘導体、または変異体を含むことができる。本発明に記載の、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための物質はまた、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから成ることができる。前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、センス方向かまたはアンチセンス方向のどちらかで含むことができる。
【００３５】
好ましい実施形態では、本方法は前記の一または複数の物質を投与するための遺伝子治療および／またはアンチセンス核酸技術の本質的に既知である方法の応用を含む。一般的に、遺伝子治療はいくつかの手法を含む： 変異遺伝子の分子的置換、治療用タンパク質の合成を結果として生じる新しい遺伝子の付加、および組み換え発現方法によるかまたは薬剤による内因性細胞遺伝子発現の調節。遺伝子導入法は詳細に記載されており（たとえばベール（Ｂｅｈｒ），Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９３，２６： ２７４− ２７８ およびムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０： ９２６−９３１を参照）、および細胞へのＤＮＡの機械的マイクロインジェクションといった直接的遺伝子導入法、および生物ベクター（組み換えウイルス、特にレトロウイルスのような）またはモデルリポソームを用いる間接的方法、またはＤＮＡのポリカチオンとの共沈を用いた遺伝子導入に基づく方法、化学的（溶媒、界面活性剤、ポリマー、酵素）または物理的手段（機械的、浸透圧、熱、電気ショック）による細胞膜の不安定化を含む。出生後の中枢神経系への遺伝子導入は詳細に記載されている（たとえばウォルフ（Ｗｏｌｆｆ），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９３，３： ７４３−７４８を参照）。
【００３６】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療、すなわちある種の重要な細胞へのアンチセンス核酸またはその誘導体の導入による、不適切に発現されたかまたは欠陥のある遺伝子のダウンレギュレーションを用いた、神経変性疾患を治療するかまたは予防する方法を扱う（たとえばギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ），ＤＮ＆Ｐ １９９２，５： ３８９−３９５；アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）およびアクター（Ａｋｈｔａｒ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５，１３： １９７−１９９；クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０： ８８２−６を参照）。ハイブリダイゼーション戦略以外に、リボザイム、すなわち酵素として作用するＲＮＡ分子の、疾患のメッセージを運ぶＲＮＡを破壊する適用もまた記載されている（たとえばバリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６２： １５１２−１５１４を参照）。好ましい実施形態では、治療される被験者はヒトであり、および治療的アンチセンス核酸またはその誘導体はＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物に対して向けられる。被験者の中枢神経系、好ましくは脳の細胞は、そのような方法で治療されるのが好ましい。細胞透過は、アンチセンス核酸およびその誘導体のキャリヤー粒子へのカップリング、または上記の方法といった既知の戦略によって実施することができる。標的化した治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与するための戦略は当業者に公知である（たとえばウィックシュトロム（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９２，１０： ２８１− ２８７を参照）。一部の場合では、デリバリーは単なる局所投与によって実施することができる。別の手法はアンチセンスＲＮＡの細胞内発現に向けられる。この戦略では、細胞は標的核酸の領域と相補的であるＲＮＡの合成を指示する組み換え遺伝子を用いてｅｘ ｖｉｖｏで形質転換される。細胞内で発現されたアンチセンスＲＮＡの治療的用途は、手続的に遺伝子治療と同様である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としてさまざまに知られる、二本鎖ＲＮＡを用いて遺伝子の細胞内発現を調節する近年開発された方法は、核酸治療のもう一つの有効な手法である可能性がある（ハノン（Ｈａｎｎｏｎ），Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１８： ２４４−２５１）。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、ＫＣＮＱ１、または適切な細胞、たとえばＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞中の他のカリウムチャネルｌ、または他の神経細胞株と共発現したＫＣＮＣ１に対する化合物および／または物質の影響を検討する方法が提供される。これによって、ＫＣＮＱ１または他のカリウムチャネルと共発現したＫＣＮＣ１に媒介されたカリウム電流に対する化合物および／または物質の電気生理学的な影響が検討される。前記検討を実施するために、ヒト遺伝子産物ＫＣＮＣ１をコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクターへとクローニングする。ＫＣＮＱ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４０９９０）、または他の電位依存性カリウムチャネルをコードするｃＤＮＡＫを別の適切な発現ベクターへとクローニングする。上述のような適切な細胞核は、好ましくはＤＭＲＩＥ−Ｃ（陽イオン性脂質１，２−ジミリスチルオキシプロピルｌ−３−ジメチル−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムのリポソーム製剤）のような試薬を用いて前記プラスミドで形質変換される。パッチクランプ実験は電圧固定モードで実施することができ（ハミル（Ｈａｍｉｌｌ）ら， Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． １９８１， ３９１８５−１００）、および細胞全膜電流が記録され、および得られた信号が増幅され、デジタル化され、保存され、および適切なソフトウェアたとえばパルス／パルスフィット（Ｐｕｌｓｅ／Ｐｕｌｓｅｆｉｔ）（ヘカ（ＨＥＫＡ）社、ドイツ、ランブレヒト）を用いて分析される。化合物および／または物質の効果の評価に対して電流の「ランダウン」または「ランアップ」（バナム（Ｖａｒｎｕｍ）ら， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９３，  ９０１１５２８−１１５３２）が依然として強すぎる場合、前記電位依存性 カリウムチャネルの媒介電流に関する調査は、非特異的な電流増幅変化を防止するために穿孔パッチクランプ法で行いうる（ダート（Ｄａｒｔ）ら， Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９５， ４８３： ２９−３９； ディネス（Ｄｉｎｅｓｈ）およびハブリッツ（Ｈａｂｌｉｔｚ）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９９０， ５３５： ３１８−３２２）。被験化合物のＫＣＮＱ１または他のカリウムチャネルと共発現したＫＣＮＣ１に対する影響および可逆性の調査のための刺激プロトコールの例を以下に示す。ＫＣＮＣ１をＫＣＮＱ１または他のカリウムチャネルと共発現させる細胞は、たとえば−８０ｍＶの保持電位で固定される。パルスサイクル速度は１０秒であってもよい。化合物および／または物質の試験には、安定的に形質変換された細胞が、たとえば−８０ｍＶの保持電圧から、たとえば１００ｍｓ、たとえば−９０ｍＶまで過分極化し、引き続きたとえば１ｓの＋４０ｍＶまでの脱分極を行ってもよい。試験パルスの最後での＋４０ｍＶまでの電流増幅が、分析に用いられる。この方法はまた、ＫＣＮＱ１または他のカリウムチャネルと共発現したＫＣＮＣ１の生物物理学的特性を開放、閉鎖、活性化、不活性化または修飾することができる被験化合物および／または物質を特定するためにも適している。このように特定および試験されたカリウムチャネルの調節物質は、学習および記憶機能に影響を与える可能性があり、およびたとえば神経変性疾患とりわけア��ツハイマー病の治療のアプローチへと使用しうる。 
【００３８】
さらに好ましい実施形態では、本方法は前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳に、ドナー細胞、または好ましくは移植片拒絶を最小化または低減するように処理されたドナー細胞を移植することを含み、前記ドナー細胞は前記一または複数の物質をコードする少なくとも一つの導入遺伝子の挿入によって遺伝子組み換えされている。前記導入遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって運ばれうる。導入遺伝子は、導入遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス物理的遺伝子導入によって、特にマイクロインジェクションによってドナー細胞へ挿入することができる。導入遺伝子の挿入はまた、エレクトロポレーション、化学的媒介遺伝子導入、特にリン酸カルシウム遺伝子導入またはリポソーム媒介遺伝子導入によっても実施することができる（マクセランド（Ｍｃ Ｃｅｌｌａｎｄ）およびパーディー（Ｐａｒｄｅｅ），『発現遺伝学：迅速および高処理量法』（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ； Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），１９９９を参照）。
【００３９】
好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にＡＤを治療および予防するための前記物質は、対象細胞を前記被験者に導入し、ここで前記対象細胞は前記治療用タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されており、前記対象細胞がｉｎ ｖｉｖｏで前記被験者において治療的に有効な量の前記治療用タンパク質を発現することを含む過程によって、前記被験者、好ましくはヒトに投与することができる治療用タンパク質である。前記ＤＮＡ断片は、前記細胞へｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって挿入することができる。
【００４０】
本発明に記載の、治療の方法は、前記の細胞治療的および遺伝子治療的方法の任意のものと組み合わせた、治療的クローニング、移植、および胚性幹細胞または胚性生殖細胞および神経細胞性成体幹細胞を用いた幹細胞治療の適用を含む。幹細胞は全能性または多能性でありうる。それらはまた器官特異性でもありうる。罹患および／または損傷した脳細胞または組織を修復する戦略は、（ｉ）ドナー細胞を成体組織から採取することを含む。これらの細胞の核は、遺伝物質が除去されている未受精卵細胞に移植される。胚性幹細胞は、体細胞核移植を受けた細胞の胚盤胞期から単離される。その時、分化因子の使用は、特化した細胞型、好ましくは神経細胞への幹細胞の分化誘導に繋がる（ランザ（Ｌａｎｚａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９，９： ９７５−９７７）、または（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大およびその後の移植のために、中枢神経系から、または骨髄（間葉性幹細胞）から単離された成体幹細胞を精製する、または（ｉｉｉ）内因性神経幹細胞を直接、増殖、移動、および機能する神経細胞へ分化するように誘導する（ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ＤＡ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，２： ３４−４２）。成体脳の胚中心は神経細胞損傷または機能障害が存在しないため、成体神経幹細胞は、損傷したかまたは罹患した脳組織を修復する大きな可能性がある（コルマン（Ｃｏｌｍａｎ）Ａ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ２００１，７： ６６−７１）。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明に記載の治療または予防の被験者は、ヒト、実験動物、たとえばマウスまたはラット、家畜、または非ヒト霊長類であることができる。実験動物は、神経変性疾患の動物モデル、遺伝子改変動物、たとえばＡＤ型神経病理を示す、遺伝子導入マウスまたはハエおよび／またはノックアウトマウスであることができる。
【００４２】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子を扱う。
【００４３】
別の一態様では、本発明は、前記調節因子および好ましくは医薬キャリヤーを含む医薬組成物を扱う。前記キャリヤーは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または調節因子と共に投与する媒体をいう。
【００４４】
別の一態様では、本発明は、医薬組成物における用途のための（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子を扱う。
【００４５】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための（ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子の用途を提供する。
【００４６】
一態様では、本発明はまた、治療的にまたは予防的に有効な量の前記医薬組成物を詰めた一個以上の容器を含むキットを提供する。
【００４７】
別の一態様では、本発明は非天然ＫＣＮＣ１遺伝子配列、またはその断片または誘導体、または変異体を含む組み換え、非ヒト動物を扱う。前記組み換え、遺伝子操作非ヒト動物の作製は、
（ｉ）前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構造を提供、および（ｉｉ）前記ターゲティング構造を非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入、および（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入、および（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植、および（ｖ）前記胚を満期まで発生させること、および（ｖｉ）ゲノムが一方または両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を特定すること、および（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子操作非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を得ることを含む。前記遺伝子は、異所性発現、または低発現、または過剰発現であり、および、前記破壊または改変は神経変性疾患の神経病理に類似した症状、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症する素因を示す前記非ヒト動物を結果として生じる。そのような動物の作製および構築のための戦略および技術は当業者に公知であり（たとえばカペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４４： １２８８−１２９２ およびホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら，『マウス胚操作：実験の手引き』（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９４ およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）およびアボット（Ａｂｂｏｔｔ），『マウス遺伝学および遺伝子組み換え：実践的手法』（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会，英国オックスフォード，１９９９を参照）。神経変性疾患、特にアルツハイマー病を調べるための動物モデルとして、そのような組み換え非ヒト動物を利用するのが好ましい。そのような動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物、物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するのに有用な被験動物または実験動物でありうる。
【００４８】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または （ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体。本スクリーニング方法は（ａ）細胞の被験化合物との接触、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｃ）前記被験化合物に接触のない対照細胞における前記物質の活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞中の物質のレベルを比較し、ここで、接触させた細胞中の前記物質の活性および／またはレベルの変化は、被験化合物が前記疾患および障害の調節因子であることを示す。
【００４９】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または （ｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常の、調節因子についてのスクリーニングのための測定法を扱い、その方法は下記を含む（ａ）神経変性疾患または関連する疾患または障害を発症する素因を有するかまたはすでに発症している、被験動物または実験動物または動物モデルへ被験化合物を投与、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｃ）等しく前記疾患を発症する素因を有するかまたはすでに発症している、およびそのような被験化合物が投与されていない、対応する対照動物中の前記物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物中の物質の活性および／またはレベルを比較し、ここで被験動物、または実験動物、または動物モデル中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患および障害の調節因子であることを示す。
【００５０】
好ましい一実施形態では、前記被験動物、および／または前記対照動物は、天然ＫＣＮＣ１タンパク質遺伝子転写調節配列でない転写調節配列の調節下にある、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子、またはその断片、または誘導体を発現する、組み換え、非ヒト動物である。
【００５１】
別の一実施形態では、本発明は（ｉ）後述するスクリーニング測定法の方法によって神経変性疾患の調節物質を特定する、および（ｉｉ）調節物質を医薬キャリヤーと混合する段階を含む薬剤を生成する方法を提供する。しかし、前記調節物質は他の種類のスクリーニング測定法によって特定してもよい。
【００５２】
別の一態様では、別の一態様では、本発明は、リガンドと、ＫＣＮＣ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を提供する。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングする一または複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える、および（ｉｖ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする、および（ｖ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に結合した蛍光の量を測定する、および（ｖｉ）前記リガンドの、前記ＫＣＮＣ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する段階を含む。リガンドと前記ＫＣＮＣ１翻訳産物との間の結合の阻害を測定するためには、前記ＫＣＮＣ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体を、人工リポソーム中に再構成し、対応するプロテオリポソームを作製するのが好ましい可能性がある。界面活性剤からリポソームへのＫＣＮＣ１翻訳産物の再構成の方法は詳しく説明されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８： ９４５６−９４６４；クリヴォシェフ（Ｋｒｉｖｏｓｈｅｅｖ）およびウサノフ（Ｕｓａｎｏｖ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｍｏｓｃｏｗ １９９７，６２： １０６４−１０７３）。蛍光標識リガンドを利用する代わりに、一部の態様では、当業者に公知である任意のその他の検出可能な標識、たとえば放射性標識を用い、およびそれをしかるべく検出するのが好ましい可能性がある。前記方法は、新規化合物の同定に、および、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子産物、またはその断片、または誘導体、または変異体へのリガンドの結合を阻害する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。キャリヤー粒子の使用を基礎としたこの場合の蛍光結合測定法の一例は、特許出願国際公開第００／５２４５１号パンフレットに開示され記載されている。別の一例は、特許国際公開第０２／０１２２６号パンフレットに記載された競合測定法である。本発明のスクリーニング測定法のために好ましいシグナル検出方法は、下記の特許出願に記載されている：国際公開第９６／１３７４４号、第９８／１６８１４号、第９８／２３９４２号、第９９／１７０８６号、第９９／３４１９５号、第００／６６９８５号、第０１／５９４３６号および第０１／５９４１６号パンフレット。
【００５３】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の阻害結合測定法によって、化合物を、リガンドとＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の遺伝子産物との間の結合の阻害因子として特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００５４】
別の一態様では、本発明は、ＫＣＮＣ１タンパク質との、またはその断片、または誘導体、または変異体との前記化合物の結合の程度を測定する、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を扱う。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングする検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と、前記検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物をインキュベートする、および（ｉｖ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と結合した好ましくは蛍光の量を測定する、および（ｖ）前記ＫＣＮＣ１タンパク質への、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への、一種類以上の前記化合物による結合の程度を測定する段階を含む。この型の測定では、蛍光標識を用いるのが好ましい。しかし、任意の他の種類の検出可能な標識もまた使用することができる。またこの型の測定では、ＫＣＮＣ１翻訳産物またはその断片、または誘導体、または変異体を、本発明に記載の通り、人工リポソーム中に再構成するのが好ましい可能性がある。前記測定法は、新規化合物の同定に、およびＫＣＮＣ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体へ結合する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。
【００５５】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の結合測定法によって、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子産物への結合因子として化合物を特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００５６】
別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得ることができる薬剤を提供する。別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得られた薬剤を提供する。
【００５７】
本発明はまた、配列番号１のタンパク質分子であるＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂ、機能的変異体、または断片、または誘導体をエンコードするアミノ酸分子を扱う。アミノ酸分子は、遺伝子ＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子のようなＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子である可能性がある。特に前記アミノ酸分子は配列番号２、または配列番号３、または配列番号６のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子である可能性がある。
【００５８】
本発明はまた、厳密条件のもと配列番号２または配列番号３または配列番号６に記述されるｃＤＮＡの相補体でハイブリダイゼーションできる単離されたＤＮＡ分子も扱う。厳密条件とは、完全に相補的な核酸がちょうどハイブリダイゼーションする温度より５℃から１０℃低い温度でハイブリダイゼーションが行われることを意味する。各配列に対する最適化された厳密条件は、温度、核酸分子の一貫性、塩の条件およびその他当業者に公知のものといったパラメーターによって設定される（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）， 『分子クローニング−実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，２００１を参照）。厳密条件の例は、（ｉ）０．２ｘＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）および０．１％ＳＤＳ、６０℃にて、（ｉｉ）５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｘデンハード液、１００μｇ／ｍｌの４２℃にて熱変性したサケ精子ＤＮＡを含む。これは上述したようなより高度な厳密条件を除外するものでもなく、また上述したようなより低い厳密条件を除外するものでもない。
【００５９】
別の態様では、本発明は配列番号１のタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂをコードする核酸、またはその変異体、または誘導体、または断片を含むベクターを扱う。好ましい一実施形態では、ウイルス、バクテリオファージ、またはプラスミドは所望の核酸を含む。特に、細菌細胞における発現に適応したプラスミドは、配列番号１の前記核酸分子Ｋｖ３．１ｂをコードする前記核酸、またはその断片、または変異体、または誘導体、および細菌細胞中における前記分子の発現に必要な調節要素を含む。
【００６０】
別の態様では、本発明は、ＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の翻訳産物である配列番号１のタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂをコードするタンパク質分子、またはその変異体、または断片、または誘導体、および酵母細胞中における前記分子の発現に必要な調節因子を含む酵母細胞における発現に適合したプラスミドを扱う。別の態様では、本発明は、配列番号１のタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂをコードする核酸分子、またはその断片、または変異体、または誘導体、およびに必要な調節因子を含む哺乳細胞における発現に適合したプラスミドを扱う。
【００６１】
別の態様では、本発明は、配列番号１を有するＫＣＮＣ１のタンパク質分子をコードする核酸分子、またはその断片、または誘導体、または変異体を含む細胞を扱う。本発明は、厳密条件下で配列番号２または配列番号３に記述されるｃＤＮＡの相補体によってハイブリダイゼーションできるＤＮＡ分子を扱う。好ましい実施形態では、前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳細胞、または昆虫の細胞である。特に本発明は、細菌細胞中での発現に適合したプラスミドを含む細菌細胞であって、前記プラスミドが配列番号１、またはその断片、または誘導体、または変異体を有し、および／または配列番号４を有するタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂをコードする核酸分子、および細菌細胞における前記分子の発現に必要な調節因子を含むプラスミドを含む細菌細胞を扱う。本発明は、酵母細胞における発現に適合したプラスミドを含む酵母細胞を扱う。前記プラスミドは、配列番号１、またはその断片、または誘導体、または変異体を有し、および／または配列番号４を有するタンパク質分子Ｋｂ３．１ｂをコードする核酸分子、および酵母細胞中における前記分子の発現に必要な調節因子を含む有するタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂをコードする核酸分子を含む。本発明はさらに、哺乳細胞における発現に適合したプラスミドを含む哺乳細胞であって、前記プラスミドが、配列番号１、またはその変異体、または誘導体、または断片を有する、および／または配列番号４を有するタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂをコードする核酸分子、および哺乳細胞における前記分子の発現に必要な調節因子を含む哺乳細胞を扱う。
【００６２】
別の一態様では、本発明は配列番号１を持つタンパク質分子Ｋｖ３．１ｂを示す。
【００６３】
さらに本発明の別の一態様では、配列番号１および配列番号４に示される、ＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体、および、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を検出する診断標的としてのその用途を扱う。
【００６４】
本発明は、配列番号１および配列番号４に示される、ＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体、および、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防、または治療、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての用途のためのその用途を扱う。
【００６５】
本発明は、配列番号１および／または配列番号４を持つＫｖ３．１ｂおよび／またはＫｖ３．１ａタンパク質をコードするＫＣＮＣ１遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体である免疫原と、特異的に免疫反応する抗体を扱う。その免疫原は、前記遺伝子の翻訳産物の免疫原性または抗原性のエピトープまたは部分を含むことができ、ここで翻訳産物の前記免疫原性または抗原性部分はポリペプチドであり、および前記ポリペプチドは抗体反応を動物において導き、前記ポリペプチドは前記抗体によって免疫特異的に結合している。抗体を作製する方法は本分野でよく知られている（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら，『抗体−実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９８８を参照）。本発明で使用される「抗体」の語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、組み換え、抗イディオタイプ、ヒト化、または一本鎖抗体、およびその断片といった、当前記分野で既知のすべての型の抗体を包含する（デュベル（Ｄｕｂｅｌ）およびブライトリンク（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ），『組み換え抗体』（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），ワイリー・リース社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ），ニューヨーク州ニューヨーク，１９９９）。本発明の抗体は、たとえば（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体を用いて：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９９およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｒ，『免疫診断：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），英国オックスフォード，１９９９を参照）、酵素免疫測定法（たとえば酵素結合免疫吸収測定法、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、化学発光免疫測定法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および抗体マイクロアレイといった、最先端の方法を基礎とするさまざまな診断および治療方法で有用である。これらの方法は、ＫＣＮＣ１遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の検出を含む。
【００６６】
本発明の好ましい一実施形態では、前記抗体は被験者に由来する試料中の細胞の病理状態を検出するのに用いることができ、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化は、前記細胞の病理状態を示す。好ましくは、病理状態は神経変性疾患、特にＡＤに関係する。細胞の免疫細胞化学染色は、本分野でよく知られたいくつかの異なる実験法によって実施することができる。しかし、抗体結合の検出には自動化法を適用するのが好ましく、ここで、細胞の染色の程度の判定、または細胞の細胞染色または細胞成分染色のパターンの判定、または細胞表面上または細胞内のオルガネラおよびその他の細胞下構造の間の抗原のトポロジカルな分布は、米国特許第６１５０１７３号明細書に記載の方法に従って実施される。
【００６７】
本発明のその他の特性および利点は、単なる説明であり、および開示の残りを限定することを決して意図しない下記の図および実施例の説明から明らかになる。
【００６８】
実施例１
（ｉ）ＡＤ患者由来の脳組織解剖：
ＡＤ患者および対応する年齢の対照被験者由来の脳組織を死後６時間以内に採取し、直ちにドライアイス上で凍結した。診断の組織病理的確認のため、各組織からの試料切片はパラホルムアルデヒドで固定した。発現差の分析のための脳の部分を特定し、ＲＮＡ抽出を実施するまで-８０℃にて保存した。
【００６９】
（ｉｉ）総ｍＲＮＡの単離：
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を取扱説明書に従って使用することによって、死後脳組織から抽出した。正確なＲＮＡ濃度およびＲＮＡ品質は、ＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）系を用いてアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して測定した。調製したＲＮＡの追加の品質試験、すなわち部分分解の排除およびＤＮＡ混入に関する試験は、特に設計したイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドおよび参照対照としてゲノムＤＮＡを使用して、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術を取扱説明書（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って用いて融解曲線を作成した。
【００７０】
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ合成および発現差のある遺伝子の蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ（ＦＤＤ）による特定：
異なる組織における遺伝子発現の変化を特定するために、我々は改変および改良したディファレンシャル・ディスプレイ（ＤＤ）スクリーニング法を使用した。元のＤＤスクリーニング法は当業者に公知である（リャン（Ｌｉａｎｇ）およびパーディー（Ｐａｒｄｅｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，２６７：１１８６−７）。この方法は、ＲＮＡの２つの集団を比較し、および一方の集団で発現されているが他方の集団では発現されていない遺伝子のクローンを提供する。いくつかの試料を同時に分析することができ、および同一の実験でアップおよびダウンレギュレートされる遺伝子の両方を特定できる。ＤＤ法でのいくつかの段階を調整および改良し、および技術的パラメーターを修正、たとえば冗長性を増大、総ＲＮＡの逆転写のための最適化された試薬および条件を評価、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその産物の分離を最適化することによって、高再現性および高感度の結果を可能にする方法が開発された。その応用および改良されたＤＤ法はフォン・デル・カマー（ｖｏｎ ｄｅｒ Ｋａｍｍｅｒ）ら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９９９，２７： ２２１１−２２１８）によって詳細に記載された。可能なすべてのＲＮＡ種の統計的に包括的な分析を達成するために、６４種類の特に設計されたランダムプライマーの組が開発された（標準セット。さらに、蛍光標識化されたプライマーの使用に基づいて、本方法は修正されて調製用ＤＤスラブゲル法を生じた。本発明では、アルツハイマー病患者および対応する年齢の対照被験者の注意深く選択された死後脳組織（前頭および側頭皮質）に由来するＲＮＡ集団を比較した。
【００７１】
ＤＤ分析の開始材料として、我々は、上記（ｉｉ）の通り抽出された総ＲＮＡを用いた。各０．０５μｇの等量のＲＮＡを、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのセンシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素および１ｘＲＴ緩衝液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、１０ＵＲＮアーゼ阻害因子（キアゲン）および１μＭのいずれかの一塩基アンカーオリゴヌクレオチドＨＴ１１Ａ、ＨＴ１１ＧまたはＨＴ１１Ｃを含む２０μｌの反応物中でｃＤＮＡに転写した（リャン（Ｌｉａｎｇ）ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４，２２： ５７６３−５７６４；チャオ（Ｚｈａｏ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９５、１８：８４２−８５０）。逆転写は６０分間３７℃にて実施し、９３℃にて５分間の最終変性段階を伴った。得られたｃＤＮＡの各２μｌは、対応する一塩基アンカーオリゴヌクレオチド（１μＭ）を、Ｃｙ３標識化ランダムＤＤプライマー（１μＭ）のいずれか１つ、１ｘジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲ緩衝液（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２（アプライド・バイオシステムズ）、 ２μＭ ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰアマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））、５％ＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ）と共に用いて、終容量２０μｌ中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。ＰＣＲ条件は下記の通り設定した：９４℃にて３０秒間１回で変性、１℃／秒で４０℃まで冷却、４０℃にて４分間でプライマーの低厳密性アニーリング、１℃／秒で７２℃まで加熱、７２℃にて１分間で伸長。この回に続いて、高厳密性サイクル３９回を実施した：９４℃にて３０秒、１℃／秒で６０℃まで冷却、６０℃にて２分間、１℃／秒で７２℃まで加熱、７２℃にて１分間。最後のサイクルに、７２℃にて５分間の最終段階１回を加えた（ＰＣＲサイクラー：マルチサイクラーＰＴＣ２００、ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））。８μｌのＤＮＡ負荷緩衝液を２０μｌのＰＣＲ産物調製物に加え、５分間変性し、およびゲルへの負荷まで氷上に保持した。各３．５μｌを厚さ０．４ｍｍの６％ポリアクリルアミド（ロングレンジャー（Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ））／７Ｍ尿素シーケンスゲルで、スラブゲルシステム（日立ジェネティック・システムズ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ））で２０００Ｖ、６０Ｗ、３０ｍＡにて、１時間４０分で分離した。電気泳動の完了後、ゲルをＦＭＢＩＯ ＩＩ 蛍光スキャナー（日立ジェネティック・システムズ）で、適当な ＦＭＢＩＯ ＩＩ Ａｎａｌｙｓｉｓ ８．０ソフトウェアを用いてスキャンした。原寸画像を印刷し、発現差のあるバンドに印を付け、ゲルから切り出し、１．５ｍｌ容器へ移し、２００μｌの滅菌水を加え、および抽出まで−２０℃にて保存した。
【００７２】
ＤＤ産物の溶出および再増幅：２００μｌのＨ２Ｏ中で１０分間煮沸し、氷上で冷却し、および上清液からエタノール（メルク（Ｍｅｒｃｋ））およびグリコーゲン／酢酸ナトリウム（メルク）を用いて−２０℃にて一夜沈澱、および続いて１３．０００ｒｐｍで２５分間４℃にて遠心分離によって、差のあるバンドをゲルから抽出した。沈澱を氷冷エタノール（８０％）で２回洗浄し、１０ｍＭトリスｐＨ８．３（メルク）に再懸濁し、および１０％グリセロール（メルク）に対して１時間室温にて０．０２５μｍＶＳＷＰ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上で透析した。得られた調製物は、ＤＤＰＣＲ（上記参照）に用いられた通りの対応するプライマーを含む２５μｌのＰＣＲ混合物中での、初回９４℃５分間、次いで９４℃にて４５秒、６０℃にて４５秒、傾斜１℃／秒で７０℃４５秒、および７２℃にて５分間の最終段階１回以外は同一条件下での、１５ 回の高厳密性サイクルによる再増幅のためのテンプレートとして使用した。 
【００７３】
ＤＤ産物のクローニングおよび配列決定：
再増幅されたｃＤＮＡをＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）システム（アジレント２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で分析し、および取扱説明書に従ってＰＣＲ−ブラント（Ｂｌｕｎｔ）ＩＩ−ＴＯＰＯベクターへライゲーションし、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆ'細胞へ形質転換した（ゼロブラント（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ）ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。クローニングされたｃＤＮＡ断片は市販の配列決定設備によって配列決定した。ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子についてのそのようなＦＤＤ実験の一つの結果を図１に示す。
【００７４】
（ｉｖ）発現の差の定量ＲＴ−ＰＣＲによる確認：
側頭皮質対前頭皮質における、および海馬対前頭皮質におけるＫＣＮＣ１遺伝子発現の差の裏付けを、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術（ロシュ（（Ｒｏｃｈｅ））を用いて実施した。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応についての迅速熱サイクリング、および増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を扱い、およびしたがって、終点計測値でなく動力学を用いたＲＴ−ＰＣＲ産物の高精度な定量を可能にする。ＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の側頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の前頭皮質由来、ＡＤ患者および対応する年齢の健常対照者の海馬由来の、ＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡの比、およびＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の側頭皮質および前頭皮質由来のＫＣＮＣ１ｃＤＮＡの比、およびＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の海馬および前頭皮質由来のＫＣＮＣ１ｃＤＮＡの比をそれぞれ測定した（相対的定量）。
【００７５】
ＫＣＮＣ１の、前頭皮質組織（Ｆ）と下側頭皮質組織（Ｔ）との間のｍＲＮＡ発現プロファイリングを、各ブラーク病期につき４〜最大９の組織で分析した。ブラーク３病理を有するドナー１名からの高品質組織が無かったため、ブラーク３病理を有する追加の１名のドナーの組織を含め、およびブラーク６病理を有するドナー１名からの高品質組織が無かったため、ブラーク５病理を有する追加の１名のドナーの組織試料を含めた。
【００７６】
プロファイリングの分析のため、２つの一般的手法を用いている。ＫＣＮＣ１の、ＡＤ生理における関連の複合像に寄与する、下側頭皮質に対する前頭皮質、およびＡＤ患者に対する対照の両方の比較プロファイリング試験を下記に詳細に示す。
【００７７】
１）対照の、および ＡＤ患者の、前頭皮質 組織と下側頭皮質組織との間のｍＲＮＡ発現の相対比較。この手法は、同定された遺伝子ＫＣＮＣ１が、変性に対する脆弱性のより低い組織（前頭皮質）の保護に関与しているか，または、脆弱性のより高い組織（下側頭 皮質）の変性過程に関与するかまたはそれを促進するかを検証することを可能にした。
【００７８】
最初に、ＰＣＲの効率を測定するため、ＫＣＮＣ１をコードする遺伝子についてのプライマー：
５'−ＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＧＴＴＴ−３'（配列番号９；配列番号２のヌクレオチド２８５２−２８７２）を用いて、および、５'−ＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＡＡＴＣ−３'（配列番号１０；配列番号２のヌクレオチド２９７５−２９５２）を用いて、標準曲線を作成した。
【００７９】
ＰＣＲ増幅（９５℃で１秒間，５６℃で５秒間、および７２℃で５秒間）を、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）混合物（ファストスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ混合物、ＳＹＢＲグリーンＩ色素、および１ｍＭ ＭｇＣｌ２；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＭプライマー、２μｌのｃＤＮＡ希釈系列（終濃度４０、２０、１０、５、１および０．５ｎｇヒト脳総ｃＤＮＡ；クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および、使用プライマーに応じて追加の３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む２０μｌ容量中で実施した。融解曲線分析は、約８２℃にて単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物の品質および大きさはＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）システムを用いて測定した（アジレント２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。
ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子について、試料の電気泳動図で１２４ｂｐに、単一ピークが観察された。
【００８０】
同様の方法で、ＰＣＲ手順を適用して、定量用の参照標準として選択された参照遺伝子の組のＰＣＲ効率を測定した。本発明では、５種類のそのような参照遺伝子の平均値を測定した；（１）シクロフィリンＢ、特異的プライマー５'−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’（配列番号１１）および５'−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３'（配列番号１２）を用いＭｇＣｌ２を省いて（別に１ｍＭを３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ ｂｐ）の単一バンド一本を示した。（２）リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、特異的プライマー５’−ＧＧＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡ−３'（配列番号１３）および５'−ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１４）を用いて（例外；別に１ｍＭ ＭｇＣｌ２を３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８５℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（３）ベータアクチン、特異的プライマー５'ＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ−３’（配列番号１５）および５'−ＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３'（配列番号１６）を用いて。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（１４２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（４）ＧＡＰＤＨ、特異的プライマー５１ＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧ−３'（配列番号１７）および５'−ＧＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３'（配列番号１８）を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８１ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（５）トランスフェリン受容体ＴＲＲ、特異的プライマー５'−ＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＴＴ−３'（配列番号１９）および５'ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣ−３'（配列番号２０）を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８０ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。
【００８１】
値の計算のために、まずｃＤＮＡ濃度の対数を、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子ついて、および５種類の参照標準遺伝子についてのサイクル数閾値Ｃｔに対してプロットした。標準曲線の傾きおよび切片（すなわち直線回帰）をすべての遺伝子について計算した。次の段階で、ＡＤ患者のおよび対照健常者の前頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対照健常者の側頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対照健常者の海馬由来のｃＤＮＡ、および、ＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質および側頭皮質由来、およびＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質および海馬由来のｃＤＮＡを、それぞれ平行して分析しシクロフィリンＢに対して正規化した。Ｃｔ値を測定し、対応する標準曲線を用いてｎｇ総脳ｃＤＮＡに変換した：
１０^（（Ｃｔ値−切片）／傾き）       [ｎｇ総脳ＤＮＡ]
【００８２】
側頭および前頭皮質ＫＣＮＣ１ｃＤＮＡ、および前頭皮質ＫＣＮＣ１ｃＤＮＡについての値、および、ＡＤ患者（Ｐ）および対照者（Ｃ）の前頭ＫＣＮＣ１ｃＤＮＡからの値、およびＡＤ患者（Ｐ）および対照者（Ｃ）の側頭皮質ＫＣＮＣ１ｃＤＮＡについての値は、おのおのシクロフィリンＢに対して正規化し、および比を下記の式に従って計算した：
ＫＣＮＣ１側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ側頭[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＫＣＮＣ１前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ前頭[ｎｇ]
ＫＣＮＣ１側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｐ）側頭[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＫＣＮＣ１（Ｃ）側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｃ）側頭[ｎｇ]
ＫＣＮＣ１（Ｐ）前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｐ）前頭[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＫＣＮＣ１（Ｃ）前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｃ）前頭[ｎｇ]
【００８３】
三番目の段階で、参照標準遺伝子の組を平行して分析し、個別の脳試料それぞれについて参照標準遺伝子の発現レベルの、対照者対ＡＤ患者側頭皮質比の、対照者対ＡＤ患者前頭皮質比、およびＡＤ患者および対照者の前頭対側頭比の、およびＡＤ患者および対照者の前頭対海馬比の平均値をそれぞれ決定したシクロフィリンＢを段階２および段階３で分析し、また、一つの遺伝子から別の遺伝子への比は別々の分析で一定のままであったため、ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする値を、単一の遺伝子だけに対して正規化するのでなく、参照標準遺伝子の組の平均値に対して正規化することが可能であった。計算は、上記に示すそれぞれの比を、すべてのハウスキーピング遺伝子の平均値からのシクロフィリンＢの偏差で割ることによって行った。ＫＣＮＣ１タンパク質をコードする遺伝子についてのそのような定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果およびそれぞれの計算値を図２から図４に示す。
【００８４】
２）対照とＡＤ患者との間のｍＲＮＡ発現の比較。
この分析に関して、別の時点での別の実験間のリアルタイム定量ＰＣＲ（ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）法）の絶対値は、キャリブレーターを使用しない定量比較に用いるのに十分に一貫性があることが証明された。シクロフィリンを、１００を超える組織について、ｑＰＣＲ実験のどれでも正規化のための標準物質として用いた。我々の正規化実験において、中でもシクロフィリンは最も一貫して発現されたハウスキーピング遺伝子であることが見出された。したがって、シクロフィリンに関して生じた値を用いることによって概念実証が行われた。
【００８５】
第一の分析は、３名の異なるドナー由来の前頭皮質および下側頭皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いた。分析したすべての実験で、各組織から同一のｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析の中では、データ数の小ささのため、値の正規分布は達成されなかった。したがって、中央値およびその９８％信頼レベルの方法を用いた。この分析は、絶対値の比較について中央値から８．７％の中間偏差、および相対値の比較について中央値から６．６％の中間偏差を明らかにした。
【００８６】
第二の分析は、それぞれ２名の異なるドナー由来の前頭皮質および下側頭皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いたが、異なる時点からの異なるｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析、絶対値の比較について中央値から２９．２％の中間偏差、および相対値の比較について中央値から１７．６％の中間偏差を明らかにした。この分析から、ｑＰＣＲ実験からの絶対値を使用できるが、しかし中央値からの中間偏差はさらに考慮されるべきであると結論されたＫＣＮＣ１について絶対値の詳細な分析を実施した。したがって、シクロフィリンを用いた相対的正規化後にＫＣＮＣ１の絶対レベルを用いた。中央値および９８％信頼レベルを対照群（ブラーク０〜ブラーク３）および患者群（ブラーク４〜ブラーク６）についてそれぞれ計算した。同じ分析を、対照群（ブラーク０〜ブラーク２）および患者群（ブラーク３〜ブラーク６）を再定義して実施し、および対照群（ブラーク０〜ブラーク１）および患者群（ブラーク２〜ブラーク６）を再定義して実施した。後者の分析は、対照とＡＤ患者との間のｍＲＮＡ発現差の初期出現を見出すことを目的とした。この分析の別の視点では、遺伝子発現調節および初期出現差の傾向を見出すため、それぞれブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３、およびブラーク病期４〜６を含む３群を互いに比較した。上記の通りの前記分析を図３に示す。
【００８７】
（ｖ）免疫ブロッティング：
総タンパク質抽出物を、１ｍｌＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、１ｍＭエチレンジアミン−四酢酸、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、５μ／ｍｌのロイペプチン）中での氷上でのホモジナイゼーションによって、Ｋｖ３．１ｂ−ｍｙｃを発現しているＨ４ＡＰＰから取得した。４℃、３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を２回行った後、上清をＳＤＳ−添加緩衝液中で５倍に希釈した。希釈試料のアリコート１２μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）で溶解し、およびＰＶＤＦウェスタンブロッティング膜（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））に移した。ブロットは、ウサギポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（ＭＢＬ、１：５０００）、続いて、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（サンタクルーズｓｃ−２０３０、１：５０００に希釈）でプローブし、およびＥＣＬ化学発光検出キット（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で展開した（図１６）。
【００８８】
（ｖｉ）免疫蛍光分析：
細胞中のｋｖ３．１タンパク質の免疫蛍光染色のために、スウェーデン変異を有するヒトＡＰＰ６９５アイソフォームを安定に発現する（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）ヒト神経膠腫細胞株（Ｈ４細胞）を使用した（Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞）。Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞を、強いＣＭＶプロモーターの調節下で、Ｋｖ３．１（Ｋｖ３．１ ｃｄｓ、１７５８ｂｐ、配列番号２の６９から１８２６ヌクレオチド）のコード配列を含むｐＦＢ−Ｎｅｏベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン）、＃２１７５６１）、およびｍｙｃ−タグ（ｐＦＢ−Ｎｅｏ−Ｋｖ３．１ｃｄｓ−ｍｙｃ、Ｋｖ．３．１−ｍｙｃベクター、９０３６ｂｐ）で遺伝子導入した。Ｋｖ３．１−ｍｙｃベクターの産生のために、Ｋｖ３．１−ｍｙｃ配列を、ｐＦＢ−Ｎｅｏベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）へと導入した。Ｋｖ３．１−ｍｙｃベクターによるＨ４ＡＰＰｓｗ細胞の遺伝子導入のために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン）のレトロウイルス発現システムウィラポート（ＶｉｒａＰｏｒｔ）を用いた。
【００８９】
ｍｙｃ標識Ｋｖ．３．１ｂを過剰発現する細胞（Ｈ４ＡＰＰｓｗ−Ｋｖ．３．１ｂ−ｍｙｃ）を、２４ウェルプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、デンマークロスキレ；＃１４３９８２）中のガラス製カバースリップ上に５ｘ１０４の細胞密度で播種し、および３７℃、５％のＣＯ２にて一夜インキュベートした。細胞をカバースリップ上に固定するために、培地を取り除き、および冷却したメタノール（−２０℃）を添加した。−２０℃、１５分間のインキュベーション時間の後、メタノールを除去し、および固定された細胞を室温で１時間ブロッキング溶液（２００μｌＰＢＳ／５％ＢＳＡ／３％ヤギ血清）中でブロッキングした。第１の抗体 （ポリクローナル抗ｍｙｃ抗体、ウサギ、１：５０００、ＭＢＬ）およびＰＢＳ／１％ヤギ血清中のＤＡＰＩ（ＤＮＡ−染色、０．０５μｇ／ｍｌ、１：１０００）を添加し、および室温で１時間インキュベートした。第１の抗体を取り除いた後、固定された細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した。第２の抗体（Ｃｙ３複合抗ウサギ抗体、１：１０００、アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ドイツ）をブロッキング溶液に添加し、および室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した。カバースリップをパーマフルーア（Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）（ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて顕微鏡用スライドに載せ、および４℃にて一夜保存し、封入培地を硬化した。顕微鏡暗視野エピ蛍光法および明視野位相差照明条件（ＩＸ８１、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて細胞を可視化した。顕微鏡画像（図１５）をＰＣＯセンシカムでデジタル撮像し、および適切なソフトウェア（アナリシス、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて分析した。
【００９０】
（ｖｉｉ）免疫組織化学：
ＫＣＮＣ１の免疫蛍光染色のために、ヒト脳内のＫｖ３．１ｂを、およびＡＤ罹患組織と対照組織との比較のために、様々なブラーク病期（ブラーク４および５）でアルツハイマー病と臨床的に診断されおよび神経病理学的に確認された患者、ならびにアルツハイマーでない対応する年齢の対照者（ブラークおよび１）を含むドナーに由来する、死後の新鮮凍結前頭および側頭の前脳試料をクリオスタット（レイカ（Ｌｅｉｃａ）ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて厚さ１４μｍにそれぞれ切断した。組織切片を空気乾燥し、および２０分間氷で冷却したアセトン中でまたは室温にて１０分間４％ＰＦＡ中で固定した。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片をブロッキング緩衝液（１０％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中の０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で３０分間プレインキュベートし、および次にアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗Ｋｖ３．１ｂ抗血清（ブロッキング緩衝液中で１：３０に希釈；アロモネラボ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）；アミノ酸５６７−５８５）で４℃にて一夜インキュベートした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ中で３回すすいだ後、切片をＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）／ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）、Ｎｏ．１１１−０９６−０４５、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：１５０に希釈）で室温にて２時間インキュベートし、および次に再びＰＢＳ中で洗浄した。核の染色は、切片をＰＢＳ中の５μＭのＤＡＰＩで３分間インキュベーションすることによって実施した（青色のシグナル）。神経細胞の染色を、神経細胞系特異的マーカーＮｅｕＮに対するマウスモノクローナル抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＭＡＢ３７７、１：４００に希釈）および二次Ｃｙ３−複合ヤギ抗マウス抗体（ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）、１１５−１６６−０６２、１：６００に希釈）を用いて実施した。一般にＫｖ３．１ｂの免疫活性は、大脳皮質中に、神経体細胞中に、ならびに細点線の分布をした神経網中に主としてみとめられた。Ｋｖ３．１ｂ免疫活性は、星状細胞、ＣＤ−６８陽性ミクログリア、ＣＮＰａｓｅ陽性乏突起膠細胞には実質的に検出されず、およびミエリンとの関連性はない。さらなる結果を図１７および１８において示す。アミロイド斑の染色（Ａｂｅｔａ沈着、神経斑、びまん性斑）を抗マウス抗体６Ｅ１０（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）， ４４−３５２， １０％ ＮＧＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ中で１：２００）を用いて実施した（図２０）。異常なリン酸化タウに特異的な抗マウス抗体（ＡＴ１００， イムノジェネティクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ＢＲ−０１２， １０％ＮＧＳ／０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ中で１：３００）を用いてタウの染色（神経絨毛糸、神経原線維変化）を実施した（図１９）。星状細胞の染色は、星状細胞特異的マーカーＧＦＡＰに対する抗体を用いて実施し（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ＡＢ７８０ｂ、１：３００に希釈）、ミクログリアの染色はミクログリア特異的マーカーＣＤ６８に対する抗体を用いて実施し（ダコ（ＤＡＫＯ）、Ｍｏ７１８、１：２００に希釈）、および乏突起膠細胞に対する染色は、乏突起膠細胞特異的マーカーＣＮＰａｓｅに対する抗体を用いて実施した（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｃ５Ｐ２２、１：４００に希釈）。ヒト脳内のリポフスチンの自己蛍光を遮断するために、切片を７０％エタノール中の１％スーダンブラックＢで室温にて２〜１０分間処理し、および次に順次７０％エタノール、蒸留水およびＰＢＳ中に浸漬した。切片を「ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）」封入培地（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム）でカバースリップした。顕微鏡画像を、暗視野エピ蛍光法および明視野 位相差照明条件（ＩＸ８１、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて取得した。顕微鏡画像をＰＣＯセンシカムでデジタル撮像し、および適切なソフトウェア（アナリシス、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて分析した（図１７〜２０を参照）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ画面におけるＫｖ３．１タンパク質をコードするＫＣＮＣ１遺伝子の発現差の最初の特定を開示する。図は、大調製用蛍光ディファレンシャル・ディスプレイゲルの切り抜きを示す。対照健常者２名およびＡＤ患者６名の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）に由来するＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲルに２連で負荷した（左から右へ）。ＰＣＲ産物は、対応する一塩基アンカーオリゴヌクレオチドおよび特異的Ｃｙ３標識化ランダムプライマーを用いた、個々のｃＤＮＡの増幅によって得られた。矢印は、前頭皮質に由来するＫＣＮＣ１遺伝子の転写産物についてのシグナルの強度に、ＡＤ患者の前頭皮質および側頭皮質に由来するシグナルと比較して、および対照健常者と比較して、有意差が存在する移動位置を示す。その発現差は、ダウンレギュレーション、ＡＤ患者の前頭皮質と比較した側頭皮質におけるヒトＫＣＮＣ１遺伝子転写の発現の減少を反映する。非ＡＤ対照健常者の側頭皮質および前頭皮質に由来するシグナルを互いに比較して、シグナル強度に差、すなわち発現レベルの変化は検出できない。
【図２】図２は、ヒトＫＣＮＣ１遺伝子の発現差をＡＤ脳組織において、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって図示する。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質から採取したＲＮＡ試料（図２ａ）、および対応する年齢の対照健常者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）に由来する試料からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクリング法によって実施した。データは、遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子の組の平均値の組み合わせについて正規化した。前記標準遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から成った。図は、蛍光によって測定された増幅された物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の動力学を示す。反応の指数期の間、対照健常者の前頭皮質および側頭皮質に由来するＫＣＮＣ１ｃＤＮＡの増幅動力学は並列しており（図２ｂ、矢印）、一方、アルツハイマー病では（図２ａ、矢印）対応する曲線の有意な分離があり、分析した脳領域のそれぞれでＫＣＮＣ１をコードする遺伝子の発現の差を示し、ヒトＫＣＮＣ１遺伝子の転写産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の、前頭皮質と相対的な側頭皮質において、調節障害、好ましくはダウンレギュレーションを、または、側頭皮質と相対的な前頭皮質において、ヒトＫＣＮＣ１遺伝子の転写産物のアップレギュレーションを示すことに注意する。
【図３】図３は、９８％信頼レベルでの中央値の統計手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＫＣＮＣ１の（図７）絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０から１、ブラーク病期０から２、またはブラーク病期０から３のいずれかの被験者を含む対照群を定義することによって計算し、ブラーク病期２から６、ブラーク病期３から６およびブラーク病期４から６をそれぞれ含む定義されたＡＤ患者群について計算されたデータと比較する。加えて、ブラーク病期０から１、ブラーク病期２から３およびブラーク病期４から６のどれかの被験者をそれぞれ含む３群を互いに比較した。ＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質（Ｆ）と下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して有意差が検出された。前記の差は、対照者の側頭皮質と比較したＡＤ患者の側頭皮質における、ＫＣＮＣ１のダウンレギュレーションを反映する。およびＡＤ患者の側頭皮質における、前頭皮質と比較したＫＣＮＣ１のダウンレギュレーションを反映する。
【図４】図４は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９（Ｆ１．２３倍〜Ｆ５．００倍）および内部参照番号Ｃ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７（Ｆ０．８２〜Ｆ３．２３倍）で特定される対応する年齢の対照者２６名での、側頭皮質における前頭皮質と相対的なＫＣＮＣ１遺伝子発現レベルを列記する。それぞれ、側頭皮質におけるアップレギュレーションについては、表示の数値は本明細書に記載の式（下記参照）に従って計算し、および前頭皮質におけるアップレギュレーションの場合は、逆数値を計算した。側頭皮質におけるダウンレギュレーションまたは前頭皮質におけるアップレギュレーションの反映の明確な差が示された。棒グラフは、異なるブラーク病期（０から６）における側頭皮質の前頭皮質に対する自然対数値ｌｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質調節因子に対する前頭皮質の自然体数値ｌｎ（ＩＦ／ＩＴ）を視覚化する。
【図５】図５は、配列番号１、すなわち、ヒトＫＣＮＣ１タンパク質Ｋｖ３．１ｂのアミノ酸配列を表す。完全長ヒトＫｖ３．１ｂタンパク質は５８５のアミノ酸を含む。
【図６】図６は、配列番号２、すなわち、３１４６ヌクレオチドを含むＫｖ３．１ｂタンパク質をエンコードするヒトＫＣＮＣ１ ｃＤＮＡをヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は配列番号３、すなわち、蛍光ディファレンシャル・ディスプレイおよび続いてのクローニングによって特定され、および得られた、２０１ｂｐのＫＣＮＣ１ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す（５’から３'方向の配列）。
【図８】図８は、配列番号４、すなわち、ヒトＫＣＮＣ１タンパク質 Ｋｖ３．１ａのアミノ酸配列を開示する。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ４８５４７に定義される完全長ヒトＫｖ３．１ａタンパク質は５１１アミノ酸を含む。
【図９】図９は、配列番号５、すなわち、１６０４ヌクレオチドを含む、Ｋｖ３．１ａタンパク質をエンコードするヒトＫＣＮＣ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、ＫＣＮＣ１ ｃＤＮＡ、すなわち配列番号２のヌクレオチド配列に対する、配列番号３の配列整列の概要を示す。
【図１１】図１１は、配列番号６、すなわち、Ｋｖ３．１ｂ特異的プライマー、配列番号７：５'−ＣＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＡＧＧＡＣＧＡＣＧＴＡＧＣ−３'および配列番号８：５'−ＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧ−３'と、ＰＣＲ増幅による９０４ｂｐ ＰＣＲ１破片のヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２は、ＫＣＮＣ１コンセンサスｃＤＮＡ配列をコードするＫｖ３．１ｂを構成する、ゲノムデータベースの配列断片からの配列番号２の構造の概略図であり、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号に基づきおよび派生する延長したおよび修正されたコンセンサス配列、ＥＳＴ配列断片、およびＫＣＮＣ１をコードする遺伝子に対する特異的プライマー配列番号７および配列番号８によるＰＣＲ増幅由来の配列（ＰＣＲ−１、配列番号６）が左側に示されている。
【図１３】図１３は、ヒトＫｖ３．１ｂタンパク質配列、すなわち、配列番号１と、９９．８％配列同一性を示すラットＫｖ３．１ｂアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ２５１２２）との配列整列を示す。
【図１４】図１４は、ヒトＫｖ３．１ｂタンパク質配列、すなわち、配列番号１と、９８．８％配列同一性を示すヒトＫｖ３．１ｂアミノ酸配列、すなわち配列番号４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ４８５４７）との配列整列を示す。
【図１５】図１５は、Ｈ４ＡＰＰｓｗ対照細胞およびｍｙｃ−タグ化Ｋｖ３．１ｂタンパク質を安定に過剰発現するＨ４ＡＰＰｓｗ細胞（Ｈ４ＡＰＰｓｗ−Ｋｖ３．１ｂ ｃｄｓ−ｍｙｃ）の免疫蛍光分析を示す。Ｋｖ３．１ｂ−ｍｙｃタンパク質は、ウサギ抗ｍｙｃ抗体（モビテック（Ｍｏｂｉｔｅｃ））およびＣｙ３結合抗ウサギ抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いて検出した（図１８ＡおよびＢ）。細胞核はＤＡＰＩで染色した（図１５ＣおよびＤ）。オーバーレイ分析は、Ｋｖ３．１ｂ ｃｄｓ−ｍｙｃタンパク質は主に細胞質に局在し（図１５Ｅ）、およびＨ４ＡＰＰｓｗ対照細胞と比較してＨ４ＡＰＰｓｗ−Ｋｖ３．１ｂ形質導入細胞の９０％より多く過剰発現することを示す（図１５Ｆ）。
【図１６】図１６は、ポリクローナル抗ｍｙｃ抗体で標識した全細胞タンパク質抽出物（ＭＢＬ、１：５０００）のウェスタンブロット像を表す。  レーンＡおよびＢ：ｍｙｃ−タグで標識したＨＩＦ３ａ ｓｖ３ａ（Ｋｖ３．１ｂ、Ａ）を安定的に発現するＨ４ＡＰＰｓｗ細胞および対照Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞の（Ｂ）総タンパク質抽出物。矢印は約６５ｋＤａ（レーンＢ）の大きなバンドを示唆し、これはＫｖ３．１ｂタンパク質の予測した分子量に相当する。
【図１７】図１７は、年齢対応する健康な対照者（対照Ｆ、ブラーク０、上図）およびアルツハイマー患者（患者Ｆ、ブラーク４、下図）に由来する、Ｋｖ３．１ｂの５６７〜５８５アミノ酸に対応するペプチド（アロモネラボ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）， ＡＰＣ−０１４， １：３０）に対して惹起したアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗Ｋｖ３．１ｂ抗血清（Ｋｖ３．１ｂ）で標識し、引き続きＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清で標識した、ヒト前頭皮質の切片を表す（緑色のシグナル、図１７の図ＢおよびＣ、矢印で表示）。神経細胞を、神経細胞特異的マーカーＮｅｕＮ、引き続きＣｙ３−複合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清（赤色のシグナル、図１７図ＡおよびＣ）で標識する。青色のシグナルは、ＤＡＰＩで染色した核を示唆する。健常者の前頭皮質における神経細胞（マーカーＮｅｕＮ）は強い細胞核のＫｖ３．１ｂ免疫活性を示し、黄色の矢印はＫｖ３．１ｂを発現している神経細胞を説明的に示唆する（上図、Ｃ図）。一方ＡＤ患者において、Ｋｖ３．１ｂ神経免疫活性は前頭皮質中で減少する（下図、Ｃ図）。ここで例示的に示されるデータは、Ｋｖ３．１ｂの免疫活性の強度および量のレベルが、対照者（ブラーク０）に由来する前頭皮質と比較して、患者（ブラーク病期４）由来の前頭皮質においてわずかに減少する。前頭皮質（Ｆ）；年齢対応する健常対照者（対照）；アルツハイマー患者（患者）。
【図１８】図１８は、健康な対照者（対照Ｔ、ブラーク１、上図）およびアルツハイマー患者（患者Ｔ、ブラーク４、下図）に由来する、Ｋｖ３．１ｂの５６７〜５８５のアミノ酸（アロモネラボ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ），ＡＰＣ−０１４， １：３０）に対応するペプチドに対して惹起したアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗Ｋｖ３．１ｂ抗血清（Ｋｖ３．１ｂ）、引き続きＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清で標識した、ヒト後側頭皮質（下側頭回）の切片を表す（緑色のシグナル、図１８の図ＢおよびＣ、矢印で表示）。神経細胞を神経細胞特異的マーカーＮｅｕＮ、引き続きＣｙ３−複合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清（赤色のシグナル、図１８図ＡおよびＣ、矢印で表示）で標識する。青色のシグナルは、ＤＡＰＩで染色した核を示唆する。上図の図Ｃは、健常者の後側頭皮質における神経細胞（マーカーＮｅｕＮ）が強い細胞核のＫｖ３．１ｂ免疫活性を示すことを示し、黄色の矢印はＫｖ３．１ｂを発現している神経細胞を説明的に示唆する（上図、Ｃ図）。一方、ＡＤ患者においてＫｖ３．１ｂ神経免疫活性は後側頭皮質中で顕著に減少し（下図、Ｃ図）、とりわけ神経網中の繊維に沿った細い点線のシグナルはＡＤ患者において大きく減少する。ここで例示的に示されるデータは、Ｋｖ３．１ｂの免疫活性の強度および量のレベルが、対照者（ブラーク１）に由来する後側頭皮質と比較して、患者（ブラーク病期４）由来の後側頭皮質において大きく減少することを明らかに示す。知見は、ＫＣＮＣ１翻訳産物、すなわちＫｖ３．１ｂタンパク質のレベルを表す神経Ｋｖ３．１ｂ神経活性が、健常対照者の側頭皮質と比較してＡＤ患者の側頭皮質において顕著に減少することを示す。このＡＤに起因するＫＶ３．１ｂ免疫活性の減少は、ブラーク病期の進行とともに顕著となり、これはＡＤの過程、すなわちＡＤ病理の進行が強いＫｖ３．ＡＤの神経変性による変更と併発して、またはその後に、またはその前に起こりうるＫｖ３．１ｂの発現に反映されることを示唆する。側頭皮質（Ｔ）；健常対照者（対照）；アルツハイマー患者（患者）。
【図１９】図１９は、対照ドナー（対照ブラーク１、ブラーク０）に由来する、およびアルツハイマー患者（患者ブラーク４、ブラーク５）に由来する、後側頭回（ＩＴ、下図）および前頭皮質（Ｆ）の切片からデジタル撮影した顕微鏡写真を例示的に表す。組織切片を、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗Ｋｖ３．１ｂ抗体（アロモネラボ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）， ＡＰＣ−０１４， １：３０，緑色のシグナル）で免疫標識する（倍率４０ｘ）。タウを異常なリン酸化タウに特異的な抗マウス抗体（ＡＴ１００， イムノジェネティクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ＢＲ−０１２，１：３００、赤色のシグナル）で染色する。核をＤＡＰＩで染色する（青色のシグナル）。ＡＴ１００免疫活性は対照には観察されないが、一方ＡＤ患者においては多数の神経絨毛糸、神経原線維変化がある。神経絨毛糸、神経原線維変化において、Ｋｖ３．１ｂと異常なリン酸化タウの間の系統的な共局在化は観察されなかった。
【図２０】図２０は、健康な対照者（対照、ブラーク０）およびアルツハイマー患者（ＡＤ患者、ブラーク４）に由来する、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗Ｋｖ３．１ｂ抗血清（Ｋｖ３．１ｂ）（アロモネラボ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）， ＡＰＣ−０１４， １：３０）、およびＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清で標識したヒト後側頭皮質（下側頭回）の切片を例示的に表す（緑色のシグナル、黄色の矢印で表示）。老人性およびびまん性斑を、Ａｂｅｔａに特異的な抗マウス抗体６Ｅ１０（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）， ４４−３５２， １：２００， 赤色のシグナル、Ａｂｅｔａ陽性沈着は赤色の矢印で表示）で標識した。青色のシグナルは、ＤＡＰＩで染色した核を示唆する。二重免疫染色法は、対照試料において多数のＫｖ３．１の陽性シグナルが存在しおよびＡｂｅｔａ沈着は存在しないが、一方ＡＤ患者においてＫｖ３．１ｂの陽性シグナルはほとんどなくおよび強いアミロイド斑が存在することを明らかに示す。Ｋｖ３．１ｂと６Ｅ−１０陽性Ａｂｅｔａ沈着との間の共局在は観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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