(57)【要約】本発明は、中心的野生型グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドと比較して、増強されたＧＤＨ活性および／または熱安定性を有する、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関する。さらに、本発明は、本発明のＧＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含有する核酸配列、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを包含する発現ベクター、ＧＤＨポリペプチドを発現するように形質転換された宿主細胞および本発明のＧＤＨポリペプチドを産生する方法。
2007502114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の野生型ＧＤＨの少なくとも１．５倍のＧＤＨ活性を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のアミノ酸配列と少なくとも９１％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）
（ｉ）配列番号５３、７３、８３、１５９、１６３または１６７のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のいずれかと中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド；
（ｃ）１個〜６個のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のポリペプチドの改変体；
（ｄ）配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント；および
（ｅ）５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高い活性を保持する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチド
からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された、核酸配列。
【請求項４】
作動可能にプロモータに連結される請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のＧＤＨポリペプチドを作製する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含有する宿主細胞を、該ポリペプチドの産生に適切な条件下で培養する工程；ならびに該ポリペプチドを回収する工程を包含する、ＧＤＨポリペプチドを作製する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の単離および精製された、ＧＤＨポリペプチド。
【請求項８】
凍結乾燥された形態の請求項１に記載のＧＤＨポリペプチド。
【請求項９】
配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のアミノ酸配列と少なくとも９１％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
（ｉ）配列番号５３、７３、８３、１５９、１６３または１６７のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖
のいずれかと中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
１個〜６個のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のポリペプチドの改変体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメントである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ａ）のフラグメントである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ｂ）のフラグメントである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ｃ）のフラグメントである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高く保持する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高く保持する（ａ）のポリペプチドである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高く保持する（ｂ）のポリペプチドである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高く保持する（ｃ）のポリペプチドである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
緩衝媒体中に請求項１に記載のポリペプチドを含有する、組成物。
【請求項２１】
グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドであって、配列番号５２と少なくとも８４％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチド、配列番号７２と少なくとも９８％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチドおよび配列番号５８と少なくとも９８％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチドからなる群より選択される、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵素学の分野、特にグルコースデヒドロゲナーゼ酵素学に関する。より詳細には、本発明は、改良酵素活性（即ち、高い基質ターンオーバー）、安定性を有するグルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドおよび改良グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドが、酸化酵素または還元酵素と共役して、高収率で合成有機化学品または前駆体を産生し得るので有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
グルコースデヒドロゲナーゼ［ＥＣ．１．１．１．４７］または「ＧＤＨ」は、β−グルコースおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のグルコノラクトンンおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドへの反応を触媒する。ＮＡＤは、この反応において補因子としての役目を果たし、そしてＮＡＤＰの形態でリン酸化され得る。ＧＤＨは、臨床検査および食品産業において使用される重要な酵素である。ＧＤＨはまた、化学的変換のための触媒として使用され、アルデヒドおよびケトンなどの酵素的カルボニル還元においてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの再生において役目を果たす。
【０００３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、ＧＤＨの優れた供給源である。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｍ１２８６は、均質なまでに精製され、そして緩衝条件に依存し８．０〜９．０の最適ｐＨを有する３０，０００ＤＡのサブユニットのホモテトラマーであることがわかった。その酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のいずれかを補因子として使用する（Ｐａｕｌｙ  Ｈ．Ｅ．およびＰｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  Ｇ．、Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５  ３５６：１６１３〜２３）。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ  Ｙ  ００３３由来の酵素は、６．０〜８．０の最適ｐＨ、５５℃の最適温度および１１０ｋＤａの分子量を有する（米国特許第４，８７７，７３３号）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＦＨ１２２７由来の酵素は、８．５〜９．５の最適ｐＨ、５５℃の最適温度および１０１ｋＤａの分子量を有する（米国特許第５，２９８，４１１号）。
【０００４】
市販のＧＤＨは、主に微生物由来である。最初は、ＧＤＨは、天然宿主の生物体（例えば、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＡＴＣＣ３９１１８（米国特許第４，５４２，０９８号）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １６４４（ＵＳ４３９７９５２）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ  Ｙ  ００３３（米国特許第４．８７７，７３３号）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＦＨ１２２７（米国特許第５，２９８，４１１号）の発酵により産生された。それ以降は、ＧＤＨをコードする遺伝子が同定され、クローンニングされ、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような異種宿主において発現された。
【０００５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７  ＧＤＨ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、そしてその天然宿主で産生される酵素と同じ物理化学的性質を示した（Ｖａｓａｎｔｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８３  ８０：７８５）。Ｂ．ＳｕｂｔｉｌｉｓＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列が、Ｌａｍｐｅｌ、Ｋ．Ａ．、Ｕｒａｔａｎｉ、Ｂ．、Ｃｈａｕｄｈｒｙ、Ｒ．、Ｒａｍａｌｅｙ、Ｒ．Ｆ、およびＲｕｄｉｋｏｆｆ  Ｓ．、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６、２３８〜２４３（１９８６）およびＹａｍａｎｅ、Ｋ．、Ｋｕｍａｎｏ、Ｍ．およびＫｕｒｉｔａ、Ｋ．、「  Ｔｈｅ  ２５  ｄｅｇｒｅｅｓ−３６  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  １４６ｋｂ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １１３  ｇｅｎｅｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２（Ｐｔ  １１）、３０４７〜３０５６（１９９６）により報告され、そして登録番号Ｍ１２２７６およびＤ５０４５３で、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて見出される。
【０００６】
同様に、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１４５７９（Ｎａｔｕｒｅ  ２００３  ４２３：８７〜９１；Ｇｅｎｂａｎｋ  登録番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８  １７４：４８５〜４９０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｌｅｎｇ．１９９０  ７０：３６３〜３６９、Ｇｅｎｂａｎｋ  登録番号Ｄ９００４４）由来のＧＤＨの遺伝子配列が、測定された。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＧＤＨ酵素とＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＧＤＨ酵素とは、ほぼ８５％の相同性である（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１９８６、１２０：４８９〜４９７）。
【０００７】
ＧＤＨ酵素が、限られた安定性に問題があることは十分立証されてきた。ＲａｍａｌｅｙおよびＶａｓａｎｔｈａは、抽出緩衝液および精製緩衝液中のグリセロールの存在が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＧＤＨの安定性維持には絶対に必要であることを報告した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３  ２５８：１２５５８〜１２５６５）。上記酵素の安定性は、テトラマーのそのモノマーへの解離に大きく起因し得る。その解離は、ｐＨおよびイオン強度のような環境因子により制御される平衡プロセスである（ＭａｕｒｅｒおよびＰｆｌｅｉｄｅｒｅｒ、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｈ．１９８７  ４２：９０７〜９１５）。これでＢ．ｍａｇａｔｅｒｉｕｍのような他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ由来のＧＤＨの単離および研究につながった。例えば、米国特許第５，１１４，８５３号および同第５，１２６，２５６号およびＢａｉｋら  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  ６１：３２９〜３３５は、高い熱安定性を示し、かつ組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主で産生され得るＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびその変異体由来のＧＤＨをコードする遺伝子を記載している。しかしながら熱安定性が高いだけでなく酵素活性も高いＧＤＨ酵素の工業的必要性は依然として存在する。上で参考としている刊行物および特許、および本明細書で参考としている全ての他の刊行物および特許は、これによって全体として本明細書に参考として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、複数の局面を有する。１つの局面では、本発明は、配列番号２の野生型ＧＤＨの少なくとも１．５倍、典型的には１．５〜約２５倍、より典型的には１．５〜約１１培のＧＤＨ活性（実施例４の方法により決定される）を有するポリペプチドに関し、そして、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のアミノ酸配列と少なくとも９１％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、そしてより好ましくは少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（以降「相同性ポリペプチド」という）；
（ｂ）（ｉ）配列番号５３、７３、８３、１５９、１６３または１６７のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のいずれかと中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；
（ｃ）１〜６のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のポリペプチドの改変体；
（ｄ）配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント；および
（ｅ）５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高い活性を保持する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチド。
【０００９】
一つの実施形態では、本発明はまた、本明細書で記載されているように単離されそして精製された形態の改変体ＧＤＨポリペプチドに関する。別の実施形態では、本発明は本明細書に記載されているように凍結乾燥された形態の改変体ＧＤＨポリペプチドに関する。さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているような改変体ＧＤＨポリペプチドおよび適切なキャリア、典型的には緩衝液、より典型的にはｐＨ６．０〜８．０を有する緩衝溶液を含有する組成物に関する。
【００１０】
本発明の新規なＧＤＨポリペプチドは、配列番号２のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の中心的ＧＤＨポリペプチドに比較して高いＧＤＨ活性を有し、そして典型的には配列番号２と１個〜７個のアミノ酸残基、より典型的には１個〜６個のアミノ酸残基、さらにより典型的には１個〜５個のアミノ酸残基、そして最も典型的には１個〜４個のアミノ酸残基が異なる。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の相同性の程度は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム、即ち、導入ギャップ（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｇａｐ）＝−２２．１８３および伸長ギャップ（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｇａｐ）＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＧｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ：ＰＡＭ  １２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して決定された。第１の配列と第２配列との同一性％＝同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）における第１配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【００１１】
置換されてＧＤＨ活性および熱安定性が増強するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨポリペプチドの種々の残基位置が、本明細書の表１にまとめられている。ＧＤＨ活性および５０℃での熱安定性が増強することが例証されている本発明のＧＤＨポリペプチドは本明細書に以下に記載されている。
【００１２】
【化１】
2007502114.tif 000003
本発明の別のＧＤＨポリペプチド（配列番号５２）は、配列番号５１のポリヌクレオチドによりコードされているが、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来ＧＤＨ（配列番号４）のアミノ酸に基づいており、６つのアミノ酸残基が異なる。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２の野生型グルコースデヒドロゲナーゼと比較して増強されたグルコースデヒドロゲナーゼ活性および／または増強された熱安定性を有する、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４および１６８の新規なグルコースデヒドロゲナーゼに関する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ配列番号５２と少なくとも８４％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチド；配列番号７２と少なくとも９８％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチドおよび配列番号５８と少なくとも９８％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドに関する。
【００１５】
第２の局面では、本発明は、対応する参考ＧＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重が与えられる場合、本発明はまた、本発明の上記参考ＧＤＨポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドに関する。別の好ましい実施形態では、本発明は配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４および１６８の新規なグルコースデヒドロゲナーゼを、それぞれコードする配列番号５３、７３、８３、１５９、１６３および１６７のある特定のポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
第３の局面では、本発明は、プロモータと作動可能に連結した本発明のＧＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を包含する、核酸構築物、ベクターまたは宿主に関する。
【００１７】
第４の局面では、本発明は、本発明のＧＤＨポリペプチドを作製する方法であって、（ａ）上記ポリペプチドを産生するのに適切な条件下で本発明のＧＤＨポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸構築物を包含する宿主細胞を培養する工程；および上記ポリペプチドを回収する工程からなる、ＧＤＨポリペプチドを作製する方法に関する。
【００１８】
前述の概要および以下の本発明の特定の実施形態の詳細な説明は、添付図と共に読まれる場合、より理解される。本発明の例示を目的として、図、特定の実施形態が示される。しかしながら本発明は添付の図に示されるような配列および手段に限定されないと解釈されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、複数の局面を有する。１つの局面では、本発明は、配列番号２の野生型ＧＤＨの少なくとも１．５倍、典型的には１．５〜約２５倍、より典型的には１．５〜約１１培のＧＤＨ活性（例えば、実施例４の方法により決定される）を有するポリペプチドに関し、そして、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のアミノ酸配列と少なくとも９１％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（以降「相同性ポリペプチド」という）；
（ｂ）（ｉ）配列番号５３、７３または８３のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のいずれかと中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；
（ｃ）１個〜６個のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４または１６８のポリペプチドの改変体；
（ｄ）配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント；および
（ｅ）５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期のＧＤＨ活性の８０％より高い活性を保持する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチド。
【００２０】
他に注釈しない限り、本明細書の全体で使用される場合、用語「同一性パーセント」「同一性％」「同一のパーセント」および「同一の％」は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して即ち、導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＧｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ：ＰＡＭ  １２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して）決定される、アミノ酸配列同一性パーセントを本明細書でいうのに、互換的に使用される。同一性％＝第１の配列と第２配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）における第１配列の長さで割ったもの。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、グルコースとニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）が、グルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）へ変換するのを触媒する能力を有するポリペプチドを本明細書でいう時に互換的に使用される。代替的に、リン酸化された補因子ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨは、上記の反応においてＮＡＤとＮＡＤＨとに置き換わり得る。本質的には、ＧＤＨは、ホモテトラマーとなって、緩く一緒に保持される４個のサブユニットからなる。野生型Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＧＤＨポリペプチド（配列番号４）の結晶構造（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１  １２９：３０３〜３１２）に基づいて、上記ポリペプチドの１８８〜２１７の残基が、ＮＡＤ＋およびグルコース結合に関与しているタンパク質ループ領域を規定する。
【００２２】
使用される場合、本発明の増強されたＧＤＨポリペプチドは、還元型補因子の連続的な供給源を提供する補因子再生系として、好ましくは合成反応と共役される（図１を参照のこと）。本明細書に使用される場合、用語「補因子」とは、目的とする反応を触媒する酵素との組合せにより作動する非蛋白性化合物をいう。本発明のＧＤＨポリペプチドと一緒に用いられる適切な補因子としては、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）およびＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が挙げられる。
【００２３】
用語「補因子再生系」とは、本明細書では、使用された補因子を反応前の状態に再生し戻す反応に関与する一連の反応体をいう。例としては、例えばＮＡＤＰからＮＡＤＰＨへ、酸化型補因子再生の還元型補因子への再生をいう。その還元された（再生された）補因子は、次いで基質と還元酵素のような酵素との反応に関与し、還元型基質および酸化型（使用済みの）補因子を産生することができ、それは再び、補因子再生系によって再生され得る。上記のグルコース／グルコースデヒロゲナーゼ補因子再生系の上述の作動は、図１に例示される。
【００２４】
図１において、還元酵素により触媒される反応はグルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系と共役されるように示される。用語「共役される」は、基質の還元における補因子の還元型形態の使用および、同じ補因子の還元型形態を生成する補因子再生系の成分（例えば、グルコース）の酸化において、上述の反応で生成される同じ補因子の酸化型形態の同時使用をいう。共役系における全体的な反応速度において１つの考えられる制限因子は、補因子再生におけるＧＤＨポリペプチドの速度（活性）である。
【００２５】
本発明のＧＤＨポリペプチドは、配列番号２のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の中心的なＧＤＨポリペプチドの１．５倍〜約１１倍を超える増強されたＧＤＨ活性（実施例４の方法により測定される）を有し、典型的には配列番号２と、１個〜７個のアミノ酸残基、より典型的には１個〜６個のアミノ酸残基、さらにより典型的には１個〜５個アミノ酸残基、そして最も典型的には１個〜４個のアミノ酸残基が異なる。好ましくは、本発明のＧＤＨポリペプチドは、配列番号２のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の中心的なＧＤＨポリペプチドの２．５〜約１１倍を超える増強したＧＤＨ活性を有した。より好ましくは、本発明のＧＤＨポリペプチドは、５０℃で２０分間の加熱処理後に、配列番号２のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の中心的なＧＤＨポリペプチドの１．５倍〜約１５倍を超えるＧＤＨ活性である増強された熱安定性を有した。熱安定性は、ＧＤＨポリペプチドの５０℃で２０分間の加熱処理後保持される残存するＧＤＨ活性（例えば、実施例４の方法によって）を測定して決定される。
【００２６】
増強したＧＤＨ活性および／または５０℃での熱安定性を示した本発明の多くのＧＤＨポリペプチドのアミノ酸配列を以下に開示する。
【００２７】
【化２】
2007502114.tif 000004
さらに別の局面では、本発明は、共役反応において増強された活性を有するＧＤＨポリペプチドに関する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は（ｉ）配列番号５３、７３、８３、１５９、１６３または１６７のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のいずれかと中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるＧＤＨポリペプチド（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）に関する。長さが少なくとも１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドに関して、低いストリンジェントな条件から非常に高いストリンジェントな条件が、５ｘＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｍμｇ／ｍｌの剪断され、かつ変性したサケ精子ＤＮＡ中で、低いストリンジェンシーに対しては２５％ホルムアミド、中程度および中程度から高いストリンジェンシーに対しては、３５％のホルムアミド、または高いおよび非常に高いストリンジェンシーに対しては５０％ホルムアミドのいずれかで、４２℃での予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、引き続く標準的なサザンブロッティング手順として規定される。
【００２９】
長さが少なくとも１００のヌクレオチドのポリヌクレオチドに関して、上記キャリア物質は最終的に、２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）で、少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）で、少なくとも６０℃（中高ストリンジェンシー）で、少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）そして少なくとも７０℃（極高ストリンジェンシー）で、１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２の野生型ＧＤＨから１個〜６個のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有し、野生型ＧＤＨの１．５〜約１１倍のＧＤＨ活性（例えば、実施例４の方法で決定される）を有する、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４および１６８のポリペペプチドの改変体に関する。好ましくは、アミノ酸変化は、以下のような小さな性質のものである：そのタンパク質のフォールディングおよび／もしくは活性にそれ程影響しない保存的なアミノ酸置換；典型的には１個〜６個のアミノ酸の小さな欠失；アミノ末端もしくはカルボキシ末端の小さな伸長；小さなリンカーペプチド；または総電荷もしくはポリヒスチジン領域、抗原エピトープもしくは結合ドメインのような他の機能を変化させることにより精製を容易にする小さな伸長である。
【００３１】
保存的置換の例としては、塩基性アミノ酸群（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸群（グルタミン酸、アスパラギン酸）、極性アミノ酸群（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸群（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）ならびに小アミノ酸群（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン、システインおよびメチオニン）の範囲内である。特定の活性をあまり変化させないアミノ酸置換は、当該分野では公知であり、例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、１９７９、Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。通常最もよくある交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙならびにこれらの逆である。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、例えば、実施例４に記載の方法により測定される、配列番号２の野生型ＧＤＨの１．５倍〜約１１倍のＧＤＨ活性を有する、上述の発明の詳細な説明の第１パラグラフに記載のフラグメント（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメントに関する。用語「フラグメント」とは、そのポリペプチドがカルボキシ末端、アミノ末端またはその両方から１個〜１０個のアミノ酸残基の欠失を有することを意味する。好ましくは、欠失がカルボキシ末端から１個〜１０個の欠失、さらに好ましくは、欠失がカルボキシ末端から１個〜５個の欠失である。
【００３３】
さらに別の実施形態では、本発明は、上述の発明の詳細な説明の第１パラグラフに記載の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＧＤＨポリペプチドであって、５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期の（インキュベーション前の）ＧＤＨ活性の８０％より高い活性を保持するＧＤＨポリペプチドに関する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、５０℃およびｐＨ７での２０分間のインキュベーション後、初期活性の少なくとも８５％の残留活性、より好ましくは少なくとも９０％の残留活性を保持する。上記初期ＧＤＨ活性は、例えば、本明細書の実施例４に記載されるようにＧＤＨ活性のアッセイにより容易に測定される。
【００３４】
本発明の別のＧＤＨポリペプチド（配列番号５２）は、Ｂ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＧＤＨポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）に基づき、６個のアミノ酸残基によりそれらと異なる。本ＧＤＨポリペプチドは、配列番号５１のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３５】
さらに別の実施形態では、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有し、配列番号５２と少なくとも８４％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチド、配列番号７２と少なくとも９８％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチド、および配列番号５８と少なくとも９８％の配列同一性を有するＧＤＨポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドに関する。これらの同一パーセントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫから入手可能なバージョンＷ８．１）（アラインメントの中で同一一致の数を数え、同一一致のその数を参照配列の長さで割って、そして以下のデフォルトのＣｌｕｓｔａｌＷパラメータを使用する：緩徐／正確なペア最適アラインメント−ギャップオープンペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．１０；タンパク質重量マトリックス：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ；ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ；Ｔｏｇｇｌｅ  Ｓｌｏｗ／Ｆａｓｔペアアラインメント＝ＳＬＯＷまたはＦＵＬＬアラインメント）により得られた。
【００３６】
（ポリヌクレオチド）
第２の局面では、本発明は、本発明のＧＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。遺伝子コードの縮重が与えられる場合、本発明はまた、本発明の上記参照ＧＤＨポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号５４、７４、８４、１６０、１６４および１６８の新規なグルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドを、それぞれコードする配列番号５３、７３、８３、１５９、１６３および１６７のある特定のポリヌクレオチドに関する。
【００３７】
本発明の改良されたＧＤＨポリペプチドを作製するために、ＧＤＨポリペプチドをコードする１以上の野生型ポリヌクレオチドから始める。用語「野生型」ポリヌクレオチドは、上記核酸フラグメントが天然から単離された形態からいかなる変異も含まないことを意味する。用語「野生型」タンパク質とは、そのタンパク質が、天然に見出された活性レベルで活性であり、典型的には天然に見出されたアミノ酸配列を含むことを意味する。このように、用語「野生型」または「親配列」とは、本発明の操作を行う前の出発配列または参照配列を指す。
【００３８】
改良されるべき出発物質としての野生型ＧＤＨの適切な供給源は、本明細書に記載されているＧＤＨ活性についてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより容易に同定される。例えば、実施例４を参照のこと。ＧＤＨの特に適切な供給源としては、天然に見出されるＢａｃｉｌｌｕｓ種の細菌である。実施例１を参照のこと。公開されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（例えば、ＥＰ９５５３７５）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（例えば、米国特許第５，１１４，８５３号）のグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子配列を使用して、それぞれの遺伝子ライブラリーから遺伝子を増幅するためのプライマーが、従来技術を使用して作製され、上記プライマーは、以下の配列を有する。
【００３９】
【化３】
2007502114.tif 000005
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の遺伝子の適切な部分を増幅する従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてフォーワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を使用して、いくつかのＰＣＲ産物が得られた。それぞれのＰＣＲ産物を発現ベクターにクローニングし、ｌａｃプロモータの後ろに作動可能に連結した。ＧＤＨ活性について、クローンをスクリーニング（例えば、実施例４のアッセイによる）する際に、いくつかのクローンが活性型ＧＤＨを発現することが分かり、これらの遺伝子が配列分析された。Ｓ０６−３として設計され、公開されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ（配列番号２）と同一のＧＤＨポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列（配列番号１）が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られた。Ｍ０２−６として設計され、公開されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＧＤＨ（配列番号４）と９８．５％同一であるＧＤＨポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列（配列番号３）が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから得られた。これらのＤＮＡ配列は、本発明の改良されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを開発するための出発物質として利用された。
【００４０】
上述のＰＣＲプライマーに加えて、異なる長さの他のＰＣＲプライマーは、同様に使用され得る。例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０、ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の従来の核酸増幅手順が使用され得る。
【００４１】
一度、適切な出発物質が同定されると、未知のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する非天然および変異された酵素ならびに／または進化酵素は、周知の変異誘発または指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）のいずれか１つを使用して容易に生成される。
【００４２】
【化４】
2007502114.tif 000006
これらの方法のいずれも、ＧＤＨポリヌクレオチドを生成するために使用され得る。いかなる多様性をも最大化するために、上述の技術のいくつかは、連続的に使用され得る。典型的には、種々のポリヌクレオチドのライブラリーは、変異誘発、進化技術により作製されそしてそれらの発現産物は、細孔のＧＤＨ活性を有するポリペプチドを見出すためにスクリーニングされる。次いで、第２変異誘発または進化技術が、第２ライブラリーを作製するためにもっとも活性の高いポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに適用され、そして同じ方法により、順次スクリーニングされる。変異およびスクリーニングのプロセスは、点変異の挿入を含め、所望の活性、熱安定性および補因子選択性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドリンヌクレオチドに到達するために、必要なだけ何度も繰り返され得る。
【００４３】
代替的に、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、公知の合成法に従って標準的な固相法により調整され得る。典型的には、約１００塩基までのフラグメントは個別に合成され、次いで任意の所望の連続配列を本質的に形成するために、結合される（例えば、酵素的結合法、化学合成法またはポリメラーゼ介在法により）。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜６９に記載されている古典的なホスホルアミド法、またはＭａｔｔｈｅｓら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜０５に記載されている方法（例えば典型的には自動合成法で実施される）を使用して化学合成で調製され得る。ホスホルアミド方に従って、オリゴヌクレオチドは合成され得る。例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、精製され、アニールされ、結合されそして適切なベクターにクローニングされる。
【００４４】
さらに、本質的にいかなる核酸もＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）などのような種々の任意の業者からカスタム注文され得る。同様にペプチドおよび抗体は、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｉｎｃ．などの種々の任意の業者からカスタム注文され得る。
【００４５】
ポリヌクレオチドはまた、技術文献に記載の周知の技術により合成され得る。Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１〜４１８（１９８２）、およびＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８３）を参照のこと。次いで２重鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖を合成して適切な条件下で一緒に鎖をアニーリングするか、または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリペプチドリマラーゼを使用して相補鎖を添加するかのいずれかにより、得られ得る。
【００４６】
【化５】
2007502114.tif 000007
遺伝子コードの縮重により、本発明のＧＤＨポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が産生され得、そのいくつかは、本明細書で明確に開示される核酸配列と実質的同一性を有することが当業者に理解される。
【００４７】
本ケースでは、いくつかのラウンド１番ライブラリーが、種々の変異誘発技術を、ＰＣＲにより得られたように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｄｈ遺伝子（配列番号１）のコード領域またはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ｇｄｈ遺伝子（配列番号３）のコード領域に適用することにより作製された。
【００４８】
ＧＤＨをコードする改変体遺伝子の発現を得るために、その改変体遺伝子は、例えば、発現ベクターまたは発現カセットのような核酸構築物を作製する遺伝子発現を制御する１以上の異種制御配列に最初に作動可能に連結された。その後、発現ベクターまたは発現カセットのような、得られた核酸構築物は、配列を入れ換えられた遺伝子によりコードされるＧＤＨポリペプチドの究極の発現のための適切な宿主細胞に挿入された。「核酸構築物」とは、本明細書において、天然に存在する遺伝子から単離されるか、または天然には存在しない様式で組み合わされそして並べられた核酸の断片を含むように改変された、１重鎖または２重鎖のいずれかの核酸分子として定義される。このように、１つの局面では、本発明は、本発明のＧＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸構築物に関する。
【００４９】
用語「核酸構築物」は、核酸構築物が、本発明のコード配列の発現に必要な全ての制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。用語「コード配列」とは、本明細書において、そのタンパク質産生物のアミノ酸配列を直接的に特定する、核酸配列として定義される。ゲノムコード配列の境界は一般的に、ｍＲＮＡの５’末端におけるオープンリーディングフレームの丁度上流に位置するリボソ−ム結合部位（原核細胞）またはＡＴＧ開始コドン（真核細胞）およびｍＲＮＡの３’末端におけるオープンリーディングフレームの丁度下流に位置する転写終結配列により決定される。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換え核酸配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明のＧＤＨポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドの発現を提供する種々の方法で操作され得る。ベクターに挿入する前の、上記の単離されたポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して望ましいか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を使用して、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当業者には周知である。
【００５１】
用語「制御配列」は、本明細書では、本発明のポリペプチドの発現に必要なまたは有利な全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列と同じ起源でも、外来性でも良い。そのような制御配列としては、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列および転写停止配列が挙げられるが、限定されない。最低限で、制御配列としては、プロモーターシグナル、転写シグナルおよび転写終結シグナルが挙げられる。上記制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と結合するのを容易にする特定の制限部位を導入するためのリンカーと共に提供され得る。
【００５２】
用語「作動可能に連結」とは、制御配列が、制御配列がポリペプチドの発現に向くように、上記ＤＮＡ配列をコードする配列に関連する位置に適切に配列される配置として、本明細書で定義される。
【００５３】
上記制御配列は、適切なプロモーター配列であり得る。上記「プロモーター配列」は、後に続くより長いコード領域の発現のための宿主細胞により認識される、相対的に短い核酸配列である。上記プロモーター配列は、上記ポリペプチドの発現を媒介する、転写制御配列を含有する。上記プロモーターは、変異体プロモーター、短縮されたプロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、選択された宿主細胞において、転写活性を示す任意の核酸配列であり得、そしてその宿主細胞に相同性か、もしくは非相同性のいずれかである細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲られ得る。
【００５４】
細菌宿主細胞にとって、本発明の核酸構築物の転写を導くのに適切なプロモーターとしては、以下から得られるプロモーターが挙げられる：
【００５５】
【化６】
2007502114.tif 000008
糸状菌宿主細胞にとって本発明の核酸構築物の転写を導くのに適切なプロモーターとしては、以下の遺伝子から得られるプロモーターが挙げられる：
【００５６】
【化７】
2007502114.tif 000009
酵母宿主において、有用なプロモーターは以下の遺伝子から得られる：
【００５７】
【化８】
2007502114.tif 000010
上記制御配列はまた、適切な転写終結配列で、転写を終結する宿主細胞により認識される配列であり得る。上記終結配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主で機能的である、任意のターミネーターは、本発明に使用され得る。
【００５８】
糸状菌宿主細胞にとって、好ましいターミネーターは、以下の遺伝子から得られる：
【００５９】
【化９】
2007502114.tif 000011
上記制御配列はまた、適切なリーダー配列、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であり得る。上記リーダー配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能がある、任意のリーダー配列は、本発明で使用され得る。糸状菌宿主細胞の好ましいリーダー配列は、以下の遺伝子から得られる：
【００６０】
【化１０】
2007502114.tif 000012
上記制御配列はまた、ポリアデニル化配列（上記核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、それが転写される場合、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を加えるシグナルとして宿主細胞に認識される、配列）であり得る。選択された宿主細胞において機能性である、任意のポリアデニル化配列は本発明で使用され得る。糸状菌宿主細胞において、好ましいポリアデニル化配列は、以下の遺伝子から得られ得る
【００６１】
【化１１】
2007502114.tif 000013
上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてコードされたそのポリペプチドを細胞分泌経路に向けるシグナルペプチドコード領域であり得る。上記核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域の断片を有する翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されているシグナルペプチドコード領域を、固有に含み得る。あるいは、上記コード配列の５’末端は、上記コード配列とは、異なる外来性のシグナルペプチドコード領域を含み得る。上記外来性のシグナルペプチドコード領域は、上記コード配列が、天然にシグナルペプチドコード領域を含まない場合、要求され得る。
【００６２】
あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、上記ポリペプチドの分泌を高めるために天然のシグナルペプチドコード領域に単に代わり得る。しかしながら、選択された宿主細胞の分泌経路に発現ポリペプチドを向ける、任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【００６３】
細菌宿主細胞にとって効果的なシグナルペプチドコード領域は、以下の遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である：
【００６４】
【化１２】
2007502114.tif 000014
糸状菌宿主細胞にとって効果的なシグナルペプチド領域は、以下の遺伝子から得られたシグナルペプチド領域である：
【００６５】
【化１３】
2007502114.tif 000015
上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするポリペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはある場合には、チモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般的には不活性で、プロポリペプチドから触媒的または自動触媒的なプロペプチドへの切断により成熟した活性ポリペプチドへ変換され得る。上記プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ  α因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロティナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  Ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉａラクターゼ（ＷＯ  ９５／３３８３６）からの遺伝子から獲られ得る。
【００６６】
シグナルペプチド領域とプロペプチド領域との両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、上記プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、そして上記シグナルペプチド領域は、上記ポリペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【００６７】
宿主細胞の増殖に関連するポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を加えることもまた、望ましいことであり得る。調節系の例としては、調節性化合物の存在を含む、化学的または物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現を作動させるかまたは停止させる原因となるものである。原核宿主細胞において、適切な調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適切な調節系としては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において適切な調節配列としては、ＴＡＫＡαアミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【００６８】
調節配列の他の例としては、遺伝子増幅を可能にする配列である。真核生物系において、調節配列とは、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、本発明のＧＤＨポリペプチドをコードする核酸配列は、作動可能に調節配列に連結され得る。
【００６９】
（発現ベクター）
別の局面では、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（本発明のＧＤＨポリペプチドをコードする）、そして例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点等のような１以上の発現調節領域を、それらが導入される宿主のタイプに依存して、含有する、組換え発現ベクターに関する。上述の種々の核酸配列および制御配列は、そのような部位において上記ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする、１以上の都合の良い制限部位を含み得る組換え発現ベクターを産生するために一緒に結合され得る。代替的に、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその核酸配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。その発現ベクターを作製する際に、上記コード配列は、そのコード配列が発現のための適切な制御配列に作動可能に連結されるようにベクターの中で位置付けられる。
【００７０】
その組換え発現ベクターは、都合良く組換えＤＮＡ手順を受け得、そして上記ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、そのベクターとそのベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。上記ベクターは線形プラスミドであり得、または閉環プラスミドであり得る。
【００７１】
上記発現ベクターは、自律的に複製するベクター（即ち染色体外のものとして存在するベクター）であり得、その複製は、染色体複製とは無関係である、即ち、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工的染色体である。上記ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含み得る。あるいは上記ベクターは、上記宿主細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれて、組込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または上記宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを合わせて含有する２以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンが使用され得る。
【００７２】
本発明の発現ベクターは、好ましくは１以上の選択マーカーを含有し、形質転換細胞の容易な選択を可能にする。選択マーカーは、その産物が殺菌耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養体への栄養要求性などを提供する遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性（実施例１）またはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を与えるマーカーである。酵母宿主細胞にとって適切なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
【００７３】
糸状菌宿主細胞に使用される選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、およびｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにそれらの等価物が挙げられるが、それらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用される好ましいものは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子である。
【００７４】
本発明のベクターは、好ましくは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組込みまたはゲノムとは無関係に細胞におけるベクターの自律的な複製を可能にする要素を含む。宿主細胞ゲノムへの組込みにとって、上記ベクターは、上記ポリペプチドをコードする核酸配列または同種または非同種組換えによるゲノムへのベクターの組込みのためのベクターの他の要素に依存し得る。
【００７５】
代替的に、ベクターは、上記宿主細胞のゲノムへの同種の組換えによる組込みを導くためのさらなる核酸配列を含有し得る。上記さらなる核酸配列は、そのベクターが染色体の正確な位置で宿主細胞ゲノムへ組込まれることを可能にする。正確な位置における組み込みの可能性を増加させるために、組込み要素は、好ましくは、例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対そして最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対のような十分な量の核酸を含み、それは同種組換えの可能性を高める対応する標的配列と非常に相同性が高い。組込み要素は、上記宿主細胞のゲノムにおける上記標的配列と相同性がある任意の配列であり得る。さらに上記組込み要素は、核酸配列をコード−し得ないか、またはコードし得る。一方、上記ベクターは非同種組込みによる宿主細胞のゲノムへ組込まれ得る。
【００７６】
自律的複製のために、上記ベクターは、問題の宿主細胞におけるそのベクターが自律的に複製できるのを可能にする複製起点を、さらに含み得る。細菌の複製起点の例としては、Ｐ１５Ａであり、Ｐ１５Ａ（複製起点）を有するｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７というプラスミドの複製起点、またはＥ．ｃｏｌｉにおいて複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４；ならびにＢａｃｉｌｌｕｓで複製できるｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭβ１である。酵母宿主細胞において使用される複製起点の例としては、２ｍｉｃｒｏｎの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せがある。複製起点は、宿主細胞において温度感受性の機能をなすような変異を有し得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１４３３を参照のこと）。
【００７７】
本発明の核酸配列の１以上のコピーは、遺伝子産物の産生を増加させるために宿主細胞への挿入され得る。核酸配列のコピー数の増加は、少なくとも１の付加的な上記配列のコピーを宿主細胞ゲノムへ組込むことにより、または選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それにより上記核酸配列の付加的なコピーを含有する細胞が、適切な選択可能な薬剤の存在下に上記細胞を培養することにより選択され得る、核酸配列を有する増幅し得る選択マーカー遺伝子を包含することにより、得られ得る。
【００７８】
本発明の組換え核酸構築物および発現ベクターを構築する上述の要素を結合するために使用される手順は、当業者には周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）
本発明で使用される発現ベクターの多くは、市販のものである。適切な市販の発現ベクターとしては、ＳｉｇｍａーＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．、からのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクター（哺乳動物細胞宿主において発現するためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位およびｐＢＲ３２２複製起点ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを包含する）が挙げられる。他の適切な発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶであり、それらは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ  ＣＡから市販されており、ｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５７、１９３〜２０１）由来のプラスミドである。
【００７９】
（宿主細胞）
本発明の発現ベクターを発現させるのに使用される宿主細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞のような細菌細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３およびＢｏｗｅｓメラーノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上述の宿主細胞にとっての適切な培養培地および条件は、当業者に周知である。
【００８０】
例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０は、本発明の配列入れ換え遺伝子を発現するための発現ベクターにより形質転換された。上記発現ベクターは、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子の制御下で上記ｌａｃプロモーターに本発明の改変体遺伝子を作動可能に連結することにより作製された。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を包含した。上記形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０は、上記発現ベクターを発現した、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞のみが生存するようにクロラムフェニコールを含有する適切な培養培地で培養された。実施例１を参照のこと。
【００８１】
（精製）
一度、上記ＧＤＨポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて上記改変体遺伝子により発現されると、上記ポリペプチドは、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心、アフィニティクロマトグラフィーなどを含む、タンパク質精製の周知の１以上の技術のいずれかを使用して、細胞およびまたは培養培地から精製される。例えばＥ．ｃｏｌｉのような細菌由来のタンパク質の高効率的な抽出のための適切な溶液は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．のＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭという商品名で市販されている。化学的プロセスにおいて適用されるために細胞ライゼートから十分にＧＤＨポリペプチドを精製するのに適切なプロセスは、本明細書の実施例３に開示されている。
【００８２】
（スクリーニング）
増強されたＧＤＨ活性の発現ライブラリーからＧＤＨポリペプチドのクローンをスクリーニングすることは、典型的にはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成速度を、吸収もしくは蛍光の増加を通じてモニタリングする標準的な生化学的技術を使用して実施される。そのような手順は、本明細書の実施例４に記載されている。
【００８３】
第１ラウンド目の変異の後の上記ライブラリーのスクリーニング後に、改良されたＧＤＨポリペプチドは、配列番号２のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨに比較して変異Ｉ１６５Ｔを有し、野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ（配列番号２）に比較して初期ＧＤＨ活性において２．６倍の増加を提供した。その後、指向的進化の付加的ラウンド数が実施され、得られた本発明の例示的なＧＤＨポリペプチドが、それらの変異および配列番号２の野生型（ｗ−ｔ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中心的ＧＤＨと比較した活性が、下の表１に列挙されている：
【００８４】
【表１】
2007502114.tif 000016
上の表１における配列番号６４および８４のＧＤＨポリペプチドを比較すると、Ｑ２５２Ｌ変異は、ＧＤＨポリペプチドに熱安定性を与えたが、一方初期のＧＤＨ活性をいくらかを減少させたことがわかる。
【００８５】
配列番号７４の上記ＧＤＨポリペプチドは、配列番号２の野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中心的ＧＤＨと比較して単一変化Ｉ１６５Ｌを有し、野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ（配列番号２）と比較して初期ＧＤＨ活性の５倍増加および共役化学プロセスにおいて活性の１３倍増加を提供する。
【００８６】
本発明のより好ましいＧＤＨポリペプチドは、配列番号１６０、１６４および１６８のポリペプチドと、９５％の相同性、より好ましくは９７％の相同性およびさらにより好ましくは１００％の相同性を有するそれらのポリペプチドである。上に示されるように、これらのポリペプチドの各々は、５個〜８個の変異、しかし以下の５つの変異を共通に有する：Ｉ１６５Ｍ、Ｐ１９４Ｔ、Ａ１９７Ｋ、Ｋ２０４Ｅ、およびＫ２０６Ｒ。このように、以前述べられたように、本発明の１つの実施形態では、５個〜８個の残基置換を有し、そのうちの残基置換の５個が、Ｉ１６５Ｍ、Ｐ１９４Ｔ、Ａ１９７Ｋ、Ｋ２０４Ｅ、およびＫ２０６Ｒである、配列番号２のＧＤＨポリペプチドに関する。
【００８７】
野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中心的ＧＤＨ（配列番号２）に対してほんの僅かの（＜０．５％）変異は、有益であることが分かった。詳細には、スクリーニングされる各１０００クロ−ンごとに、３〜５個の有益であった単一点変異または２点変異しか起こらなかった。事実、変異の多くが有害であることが見出された。例えば、Ｙ２５３Ｃは、上記ＧＤＨポリペプチドを不活化し、Ｑ２５２Ｌは僅かに野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ（配列番号２）の初期ＧＤＨ活性を減少させた。興味深いことに、１個の変異の有益な効果は、別の変異の有益な効果に加算的であることはなかった。このように、例えば、野生型活性と比較して２倍ＧＤＨ活性を増加した第１変異と、野生型活性と比較して３倍ＧＤＨ活性を増加した第２の残基位置における第２変異との組合せは、ＧＤＨ活性の５〜６倍の増加を有するＧＤＨポリペプチドを得る結果には、殆どならなかった。
【００８８】
本発明のＧＤＨポリペプチドは、本明細書で記載した活性および他の望ましい特性、例えば、改変された温度最適性および／またはｐＨ最適性、溶媒耐性（例えば、酢酸ブチル）などを有する。さらに、上記ＧＤＨポリヌクレオチドは、例えば，ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰ＋とも呼ばれる）のような補因子として他の化合物を優先的に受容する能力を有する改変されたＧＤＨポリペプチドを、同定するためにスクリーニングされ得るライブラリーを作成するよう変異または進化され得る。
【００８９】
本発明のＧＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物体からの最適産生のために最適化されたコドンであり得る。当業者は、広い範囲の生物体のコドン選択性情報を提供する表および他の参考文献は容易に入手できることを認識する。例えば、ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ」、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ｐ２０４７〜２０６６（１９９６）を参照のこと。
【００９０】
ＧＤＨを発現する形質転換細胞をスクリーニングすることは、一般的には２工程のプロセスである。第１に、細胞を物理的に分離し、そして次いでどの細胞が望ましい性質を有するか、有しないかを決定する。選択とは、同定および物理的分離が選択マーカーの発現により同時に達成され、それはある遺伝学的環境において、他の細胞は死んでいく中で上記マーカーを発現する細胞が生存可能である（または、その逆）スクリーニング形式である。例示的なスクリーニングマーカーとしては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選択マーカーとしては、クロラムフェニコール耐性、アンピシリン耐性などのような薬物および毒素耐性遺伝子が挙げられる。自然の進化の過程において同時選択は起こり得るし、起こるが、本方法においては、選択は人為的に実施される。
【００９１】
変異誘発または指向進化法により生成される上記ＧＤＨポリヌクレオチドは、実施例４に記載されているプロトコールに従って、本発明の改良されたＧＤＨポリペプチドとして包含されるのに適切な増強された活性を有するものを同定するためにスクリーニングされる。
【００９２】
以下の配列は、配列番号２の野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＧＤＨポリペプチドに比較して本発明のＧＤＨポリペプチドの多様性を要約する。また、ＥＰ９５５３７５にもまた開示されるように、そこでは、残基数が後に記載されている「Ｘ」と指定された１以上のアミノ酸残基が、本発明の上記ＧＤＨポリペプチドに置換わり得る。
【００９３】
【化１４】
2007502114.tif 000017
本発明のＧＤＨポリペプチドの種々の残基位置での変化の多様性は、下の表２において矢印の右側に示され、そして対応する配列番号２（ＥＰ０５５３７５）の野生型ＧＤＨのアミノ酸残基が、矢印の左側に示される：
【００９４】
【表２】
2007502114.tif 000018
【実施例】
【００９５】
（実施例１：グルコースデヒドロゲナーゼの発現のための発現構築物の構築）
上記グルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのゲノムＤＮＡ調製物からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅した。増幅反応のプライマーは、公開されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子配列を使用して以下の通り、設計した：
【００９６】
【化１５】
2007502114.tif 000019
プラスミドｐＧＤＨＳ０６またはｐＧＤＨＭ０２を作製する、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下で、上記ＰＣＲ産物を、図３の発現ベクターのｌａｃプロモーターの後ろにクローン化した。上記発現ベクターは、Ｐ１５Ａ複製起点（Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含んだ。いくつかのクローンが、活性ＧＤＨを発現することが分かり、そしてそれらの配列を確認するために、これらの遺伝子を配列決定した（配列番号１（グルコースデヒドロゲナーゼＳ０６−３）および配列番号３（グルコースデヒドロゲナーゼＭ０２−６）を参照のこと。
【００９７】
（実施例２：ＧＤＨの産生）
通気攪拌発酵槽において、０．５２８ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム、７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０５ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）、および、２ｇ／Ｌ塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸第１銅七水和物、０．１ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム十水和物ならびに０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含む、３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液を含む，１０．０Ｌの増殖培地を３０℃の温度にした。
【００９８】
発酵槽に、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する振盪フラスコで増殖したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｐＧＤＨＳ０６またはｐＧＤＨＭ０２）の後期指数的増殖培養物を、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での開始光学密度０．５〜２．０まで播種した。上記発酵槽を５００〜１５００ｒｐｍで攪拌し、空気を発酵槽に１．０〜１５．０Ｌ／分で供給し、培養液のｐＨを２０％容積／容積水酸化アンモニウムの添加により７．０に調整した。培養液のＯＤ６００が４０に到達した後、上記温度を２５℃に下げ、グルコースデヒドロゲナーゼの発現をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を最終濃度１ｍＭまで添加することにより誘導した。上記培養物をさらに１５時間増殖させた。誘導後に、細胞を遠心分離により収穫し１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した。上記細胞ペーストを下流回収プロセスに直接使用するか、使用されるまで−８０℃で貯蔵した。
【００９９】
（実施例３：ＧＤＨ酵素調製）
上記細胞ペーストを、１容量の細胞湿重量の細胞ペーストを、３容量の１００ｍＭトリス／硫酸（ｐＨ７．２）に懸濁して洗浄し、その後Ｓｏｒｖａｌ  １２ＢＰにおいて５０００ｇで４０分間遠心分離する。上記洗浄した細胞ペーストを、２容量の１００ｍＭトリス／硫酸（ｐＨ７．２）に懸濁した。上記細胞内ＧＤＨについて、上記懸濁液を、第１回の通過は１４，０００ｐｓｉｇの圧力そして第２回の通過については８，０００ｐｓｉｇを使用して、ホモジナイザーを通して、計２回の通過をさせて、細胞から放出した。そのホモジネートをＢｅｃｋｍａｎ  ｌａｂ遠心分離器で、１０，０００ｒｐｍで６０分遠心分離した。上記上清を、デカントして浅い容器に分配し−２０℃で凍結し、凍結乾燥した。
【０１００】
（実施例４：ＧＤＨ酵素活性アッセイ）
細胞を０．５％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有する２ｘＹＴの中で３０℃で一晩増殖した。この培養液を、次いで３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する新鮮なＬＢに、２０倍に希釈し、３７℃で２時間増殖後、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を添加した。その培養液（０．３ｍｌ）を、さらに４〜５時間、３７℃で増殖した。
【０１０１】
溶解緩衝液は、１００ｍＭトリエタノ−ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＢＳ（ポリミキシンＢ硫酸塩）、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する。
【０１０２】
細胞を、遠心によりペレット化し０．２ｍｌの溶解緩衝液で室温で１．５時間浸透しながら溶解した。
【０１０３】
１００ｍＭトリエタノ−ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１〜０．２ｍＭのＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨおよび１００ｍＭグルコースからなる水溶液アッセイミックスを調製した。１部の４−クロロアセト酢酸エチル（ＥＣＡＡ）および２部の酢酸ブチルからなる溶媒混合物を、アッセイミックスに添加し反応混合物を作製した。溶媒混合物とアッセイミックスとの比は、それぞれ１：２である。熱安定性を試験するために、希釈しないライゼートを、５０℃に加熱し、次いで反応混合物に添加した。反応は、１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に予め溶解した溶液として希釈されたグルコースデヒドロゲナーゼを添加することにより開始した。反応の過程を３４０ｎｍにおける吸光度の増加の測定、または４４０ｎｍの光の蛍光発光より、経時的に追跡した。その結果を、時間に対して、吸光単位としてまたは相対的蛍光単位（ＲＦＵ）（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）としてプロットし、プロットの傾きを決定した（吸光単位／分、またはＲＦＵ／分）。
【０１０４】
（実施例５：ＫＲＥＤ／ＧＤＨ共役化学アッセイ）
ｐＨ電極制御自動滴定器を装備した１００ｍＬの反応槽に、１００ｍＭのトリエタノールアミンｐＨ７緩衝液（２５ｍＬ）中におけるグルコース（７．５ｇ）溶液を入れた。この溶液に、上記２種の酵素（１００ｍｇ  ＫＲＥＤ；５０ｍｇ  ＧＤＨ）およびＮＡＤＰ（６．２５ｍｇ）を入れた。（「ＫＲＥＤ」はケトレダクターゼまたはカルボニルレダクターゼ分類（ＥＣ１．１．１．１８４）で、対応するプロキラルのケトン基質から光学的に活性のアルコールの合成に有用である）。酢酸ブチル（１０ｍｌ）を、次いでいれた。最終的には、酢酸ブチル（１０ｍＬ）中に、４−クロロアセト酢酸エチル（６ｇ）をその反応槽に入れた。４ＭＮａＯＨを自動滴定器（ｐＨ６．８５を最下限としてセットした）により、必要に応じて滴下して常にｐＨを７．０に調節した。上記反応を、苛性ソーダを必要としなくなった場合に完結した。上記反応速度は、時間当たりに添加した塩基の量を測定することにより、または上記反応混合物のサンプルを取って、そのサンプルを３回等容量の酢酸エチルで抽出して、合わせた有機層をガスクロマトグラフィーで単位時間当たり産生されるエチル−Ｓ−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸の量を決定して分析することにより、決定した。
【０１０５】
本発明は、特定の実施形態に関連して記載されているが、種々の変更がなされ得、等価物は本発明の範囲から離れずに置換され得ることは、当業者に理解される。さらに、多くの改変が、その範囲から離れずに本発明の教示にしたがって特定の状況または物質に適用され得る。従って、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る全ての実施形態を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、ＮＡＤ＋（またはＮＡＤＰ＋）存在下でグルコースがＧＤＨによりグルコン酸に酸化され、対応する還元型ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）を、それぞれ産生する酸化−還元サイクルを例示する。それは、順に還元型基質への基質の還元を引き起こす一方、レダクターゼによりＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）に酸化され戻る。この反応で生成されるグルコン酸は、水酸化ナトリウムでグルコン酸ナトリウムに中和される。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂを組み合わせて、本発明のＧＤＨポリペプチドと上に示された先行技術文献のＧＤＨポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。図２の４列目においてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｓ０６−３）のＧＤＨポリペプチドは、ＥＰ９５５３７５（８列目）に開示されているのと同じアミノ酸配列を有している。図２Ａ−２Ｂを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アラインメントを行った。同一性％は、第１配列と第２配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアラインメント（ギャップを有する）（ｐ）において第１の配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂを組み合わせて、本発明のＧＤＨポリペプチドと上に示された先行技術文献のＧＤＨポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。図２の４列目においてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｓ０６−３）のＧＤＨポリペプチドは、ＥＰ９５５３７５（８列目）に開示されているのと同じアミノ酸配列を有している。図２Ａ−２Ｂを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アラインメントを行った。同一性％は、第１配列と第２配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアラインメント（ギャップを有する）（ｐ）において第１の配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図３】Ｐ１５Ａ複製起点（Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）、ｌａｃＩリプレッサー、ＣＡＰ結合部位、ｌａｃプロモーター（ｌａｃ）、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０ＲＢＳ）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含有する本発明の４０３６ｂｐの発現ベクター（ｐＣＫ１１０９００）である。
【図１】
2007502114.tif 000020
【図２Ａ】
2007502114.tif 000021
【図２Ｂ】
2007502114.tif 000022
【図３】
2007502114.tif 000023
【配列表】
2007502114000001.app
【国際調査報告】
2007502114.tif 000024
2007502114.tif 000025
2007502114.tif 000026
2007502114.tif 000027
2007502114.tif 000028
2007502114.tif 000029