(57)【要約】【課題】【解決手段】  核酸分析、特に多形及び突然変異の多重分析用の二本鎖ＤＮＡの切断方法を開示する。前記方法は、相補的ではない多数の標識センス及びアンチセンスフラグメントを生成し、従って、多形及び／又は突然変異のハイブリッド形成分析（又は捕獲介在伸長分析）に好適な条件下で、有意にリアニーリングしない。フラグメントは、所望の又は予期された長さ分布を示す。開裂サイトは、フラグメントが短いけれども分析におけるフラグメント間の識別を可能にするのに十分な長さであるように、及び統計学的可能性の問題として、フラグメントの大多数が、検出を強化する少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むよに選択することが出来る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖オリゴヌクレオチドサンプル中の特定のヌクレオチド配列を検出する方法において；    
オリゴヌクレオチド鎖間の整列されていない位置で二本鎖オリゴヌクレオチドを開裂して、これによって完全に相補的でないセンス及びアンチセンスフラグメントを生成するステップと；
アニーリング条件下で一組の一本鎖オリゴヌクレオチドを有するフラグメントを配置するステップであって、前記一組の一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記フラグメント又はフラグメントのシーケンスに対して相補的であるステップと；
一本鎖オリゴヌクレオチドとフラグメントとの間のハイブリッド形成を検出するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
二本鎖オリゴヌクレオチドサンプル中の特定のヌクレオチド配列を検出する方法において；
前記サンプルのセグメントを増幅して２本鎖アンプリコンを生成するステップと；
前記アンプリコン鎖間で整列されていない位置で２本鎖アプリコンを開裂して、これによって完全に相補的でないセンス及びアンチセンスフラグメントを生成するステップと；
アニーリング条件下で一組の一本鎖オリゴヌクレオチドを有するフラグメントを配置するステップであって、前記一組の一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記フラグメント又はフラグメントのシーケンスに対して相補的であるステップと；
一本鎖オリゴヌクレオチドとフラグメントとの間でハイブリッド形成を検出するステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法において、前記一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドサンプルがゲノムＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の方法において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドサンプルが対象とする遺伝子座を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載の方法において、前記鎖状のプリン塩基を塩酸とランダムに反応させて鎖を脱プリンし、次いで熱変性して一本鎖ＤＮＡフラグメントを生成することによって、開裂を達成することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、開裂部位の選択が、前記塩酸のｐＨを制御し、前記塩酸への暴露時間と反応時間を制御することによって制御されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２の方法において、増幅中に、標識がアンプリコン内に組み込まれることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記標識化が、ビオチンを組み込み、次いで、ビオチンが標識ストレプトアビジンと結合することによることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記ビオチンが、組み込まれたｄＮＴＰｓと結合することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２記載の方法において、蛍光標識ｄＮＴＰｓ又はｄｄＮＴＰｓがアンプリコンに組み込まれることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項８記載の方法において、標識化の頻度を予測されるフラグメント長に依存して調節して、開裂後により短いフラグメントが予測される場合に標識化の頻度が増加するようにすることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１又は２記載の方法において、前記フラグメント長が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さに近いフラグメントを生成するように調節されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１又は２記載の方法が更に、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの伸長に好適な条件を提供し、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの伸長を検出するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、特定の一本鎖オリゴヌクレオチド及びフラグメントのハイブリッド形成が、前記特定の一本鎖オリゴヌクレオチドの伸長があるかどうかに基づいて検出されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１又は２記載の方法が更に、前記一組の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブであって、そのいくらかが前記一本鎖オリゴヌクレオチドよりも短い、又は前記一本鎖オリゴヌクレオチドと相補的な一組の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを提供するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法が更に、前記一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの伸長に好適な条件を提供し、前記一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの伸長を検出するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法が更に、前記一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの伸長の結果を前記一本鎖オリゴヌクレオチドの伸長の結果と比較するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記比較がソフトウェアプログラムを使用して自動的に行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００３年１０月２９日に出願された米国暫定特許出願第６０／５１５，４１３号に対する優先権を主張する。
【０００２】
背景
サンプル中の特定対立遺伝子の存在を検出するプロセスで使用される従来の複合反転ドットブロットハイブリッド形成分析プロトコルにおいては、まず二本鎖ゲノムＤＮＡにおける選択された遺伝子座が、一組の正及び逆プライマーを使用して増幅され、例えば酵素消化法又は磁気分離法によって、各二本鎖アプリコンの一方の指定された鎖が除去される。残鎖のみ、好ましくは標識化された残鎖のみを一組のコグネイトプローブと接触させて配置し、スポットするか或いは、ニトロセルロースの一片などの基質上に配置し、又はハイブリッド形成分析の準備に符号化した微粒子上に表示する。ハイブリッド形成は、通常、一連の捕獲ターゲットと、又は対応するプローブに関連する標識の存在に基づいて検出される。復号によって、特定プローブによって捕獲された鎖のシークエンスを決定することが出来、このことは、捕獲プローブがそのようなシークエンスに対して相補的であることを示している。
【０００３】
指定された鎖の除去は、鎖−鎖リアニーリング、すなわち、コグネイト捕獲プローブへのアニーリングと競合するプロセスを除去することによって、プローブに対する残鎖の捕獲効率を向上させることを意図したものであり、ハイブリッド形成分析プロトコルでは、このプロセスは鎖の選択や除去無しに行われるであろう。
【０００４】
鎖は、消化によって除去することが出来、ここで、除去用に選択された鎖は、最初にリン酸化され、次いでリン酸化鎖用のλ−エンドヌクレアーゼなどの消化酵素を使用して酵素消化される。また、鎖は、磁気分離法によって除去することも出来る。消化法と磁気分離法の双方共、分析プロトコルに対するコスト及び労力を増大させる。好ましい代替の方法は、アンプリコンから一本鎖フラグメントを生成することであり、これによって消化法又は磁気分離法の必要性は不要になる。
【０００５】
二本鎖ＤＮＡから任意の長さの一本鎖フラグメントを生成する幾つかの方法が知られている。従来のマクサム−ギルバート配列法（Ａ．Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，ＰＮＡＳ  ７４，  ｐ．５６０，  １９７７）では、二本鎖ＤＮＡのフラグメントを、配列すべきＤＮＡ種の多複製を選択的に化学的分解することによって生成する。条件は、総ての可能な長さのフラグメントを製造するために調整されている。すなわち、フラグメントは、単一塩基のみによって、長さが互いに異なる画分に分離することが出来る。順序付ける際、各末端塩基を有する画分のシークエンスが、元のＤＮＡ種のシークエンスを表す。
【０００６】
Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ他も、二本鎖ＤＮＡから任意のサイズの一本鎖フラグメントを生成して、オリゴヌクレオチドプローブでのハイブリッド形成による更なる分析用に膜にブロットするためアガロースゲルからのＤＮＡの転写を容易にしており、これはドットブロットフォーマットを表す。条件を調整して、ゲル内部での絡み合いを最小にするのに十分短いフラグメントを生成する。
【０００７】
今日まで、反転ドットブロットハイブリッド形成分析フォーマット用の鎖消化又は分離伴わないアンプリコンフラグメントの使用を示唆した者はいない。従って、多形の多重分析（ＭＡＰ）のために、高不均質ターゲットフラグメントの複合混合物の使用は、単一又は最大でも２、３のターゲットシークエンスの使用に好適である。更に、ＭＡＰ用の切断を使用するためには、条件を正確に調整しない限り、いくつか又は総ての多形部位が除去されてしまったり、さもなければ、標識化が実用的なものでなくなり、これらの問題又はその解決策は示唆されていなかった。
【０００８】
アンプリコンを標識化する従来の方法の一つは、末端標識アンプリコンを生成するように５’−末端標識プライマーを用いて増幅を行うことである。この末端標識化法は、標識鎖がそのままの状態であることが要求される。なぜなら、切断後、５末端を含むフラグメントの小さな部分以外にどれも標識化されないからである。従って、アンプリコンが切断されるべきである別の標識化法が必要である。
【０００９】
要約
二本鎖ＤＮＡの切断方法を、核酸分析、特に多形及び突然変異の多重分析用のために開示される。この方法は、相補的でない多数の標識センスフラグメント及びアンチセンスフラグメントを生成し、従って多形及び／又は突然変異のハイブリッド形成分析（捕獲介在伸長分析）に好適な条件下での有意なリアニーリングは行わない。フラグメントは、所望の又は予期した長さ分配を表示する。開裂部位は、フラグメントが短く、更に分析中にフラグメント間で識別するのに十分長くなるように、及び、統計的な可能性の問題として、フラグメントの大部分が検出を容易にするための少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むように選択することが出来る。すなわち、標識化ヌクレオチドの含有によって、鎖標識化の選択された線密度を生成するフラグメント長分配を生成するように条件を調整する。代替の一実施例では、フラグメントの大部分は、長さにおいてコグネート捕獲プローブの長さに匹敵する。
【００１０】
二本鎖ＤＮＡ（又は増幅によって二本鎖ＤＮＡから取り出された二本鎖アンプリコン）は、完全に相補的でないフラグメントを生成するために、各鎖に沿ってランダムに分配された多数の部位において鎖開裂によって一組のセンス及びアンチセンスフラグメントに転換される。これは、各鎖上に同じ塩基で単に開裂することによって達成出来る。次いで、これらのフラグメントを、アニーリング条件下で、少なくともいくらかの予測フラグメントに対して完全に相補的であるプローブに接触させる。ハイブリッド形成イベントを検出し、その結果に基づいて、サンプル中の特定オリゴヌクレオチドセグメントの存在又は欠如を決定する。
【００１１】
この方法の利点は以下のようである；
（ｉ）後のＰＣＲ鎖選択ステップをなくすこと。；
（ｉｉ）２００４年１０月２８日に出願された「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」と題する、ここに引用されている係属中の出願に詳細が書かれているように、最小限の二次構造を有する比較的短いターゲットを生成して、高効率親和性を示すように切断部位の密度を選択することによってターゲット捕獲効率を上げること。；
（ｉｉｉ）両鎖上の多形部位尋問用のセンス及びアンチセンス捕獲プローブの双方の使用を可能にすること。；これは、複合分析の利点である設計の一態様である。なぜなら、クロスハイブリッド形成を回避するためには、センス或いはアンチセンス鎖のいずれかに選択的に結合する特定プローブを使用することが望ましいからである。例えば、引用されている２００４年５月１７日に出願された米国特許出願番号１０／８４７，０４６号「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｈＭＡＰ）」参照。更に、対応するセンスプローブを伴うアンチセンスプローブを含めることは、アンチセンスプローブが溶液からセンスターゲットの一部を除去し、これによって溶液中の鎖リアニーリングの度合いを低減するため、捕獲効率を強化する。
【００１２】
アンプリコンを生成するＰＣＲ増幅の間、ハイブリッドターゲットを最終的に同定する標識を組み込むことが出来る。ここで考慮すべきことは、ＰＣＲの間に標識を十分な頻度で組み込んで、結果として総てのフラグメントが少なくとも幾つかの標識を組み込むような確率にするようにすることである。必然的に、フラグメントが短いほど、各フラグメントにおける標識の頻度はより高くなければならない。
【００１３】
選択的なステップとして、サンプル中のハイブリッドターゲットのハイブリッド形成及び固定に続いて、捕獲介在及び伸長分析を用いてハイブリッド形成の結果の信頼性を検証するようにしてもよい。このステップにおいては、新しいセットのプローブを設計し、そのいくらかが、ハイブリッド形成分析に使用される初期プローブセットより短い又はこれに相補的であってよい。予期したターゲットにおいて、フラグメントの長さに沿って、１つ又はそれ以上の多形遺伝子座（又は、多形遺伝子座に相当するサブシークエンス）がある場合には、より短いプローブを必要とする。捕獲介在伸長分析において信頼できる結果を得るためには、末端プローブヌクレオチドが、各多形ヌクレオチド整列していなければならない（「ＳＮＰ」）。２００２年１０月１５日に出願された「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｌｏｃｉ  ｂｙ  Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１０／２７１，６０２号参照。必要ならば参照されたい。
【００１４】
加えて、このセット中のターゲット間でのクロスハイブリッド形成を回避する目的である場合には、相補的プローブを使用することが出来る。相補的プローブは、初期プローブセットとハイブリッド形成するターゲット鎖の、相補的ターゲット鎖（センス又はアンチセンス鎖どちらにも）とハイブリッド形成をするであろう。
【００１５】
捕獲介在伸長分析は、分析結果の信頼性を増加するのに望ましい。なぜなら、（初期ターゲットセットだけを使用する）ハイブリッド形成単独では、クロスハイブリッドによって偽陽性が生じるためである。捕獲介在伸長分析に続いて、その結果をハイブリッド形成介在分析と比較することが出来る。これによって、更に信頼性が向上する。この最後の比較ステップは、プログラムとソフトウェアで実施することが出来る。
【００１６】
以上の方法を、図を参照して以下に述べる。
【００１７】
詳細な説明
上記の方法を実施するために、二本鎖ＤＮＡサンプル、例えばゲノムＤＮＡを先ず単離する。対象となる遺伝子座に相当する所定の部分を、ＰＣＲを使用して増幅する。この後、相補性センス及びアンチセンス鎖を、アニーリング可能な条件下に配置するか、又は、相補性鎖を分離した状態に保つゲルに入れることが出来る。いずれの場合でも、最終的に、二本鎖ＤＮＡアンプリコンにアニーリングする。次のステップでは、２つの相補性鎖を非相補性塩基対で開裂し、部分的に相補的なセンス及びアンチセンス鎖を生成する。完全相補性鎖は、プローブ配列と接触させてアニーリング条件下に置くと、互いにアニーリングし、これによってアニーリングしているプローブと競合し、分析結果に影響を及ぼす。
【００１８】
相補的でない特定の塩基において、センス及びアンチセンスアンプリコン鎖を開裂する１つの周知の方法は、塩酸を使用して、アンプリコン上のプリン塩基にランダムに切れ目を入れることであり、これによって、これらの塩基を脱プリンする。次いで、切断した二本鎖ＤＮＡを、アルカリ溶液中で熱変性させ、これによって、一本鎖非相補性ＤＮＡフラグメントを生成する。脱プリンの程度が大きいほど、脱プリン後にもたらされる一本鎖ＤＮＡフラグメントの長さが短くなる。
【００１９】
二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅における一ステップとして、プローブセットにハイブリッド形成する特定の鎖を同定する際に最終的に使用される標識を組み込むことが有益である。これを達成する１つの方法は、反応中に両方のアンプリコン鎖を標識化するためにＰＣＲ反応混合物内に、標識デオキシヌクレオチド（又はジデオキシヌクレオチド）を加えることである。もう一つの方法は、ＰＣＲ中にビオチン化塩基を加えることであり、ビオチン化塩基は、次いで、そのような塩基で標識化する蛍光標識ストレプトアビジンと結合する。アデニン塩基ヌクレオチドよりむしろシトシンをビオチン化することが好ましい。なぜならば、アデニン塩基は、脱プリンステップ中に脱プリンされ、これによって標識化の損失を引き起こすからである。先に記載したように、標識化頻度は、検出するのが望まれる最も短いフラグメントさえも確実に標識が組み込まれるようにするため、十分に高くなければならない。ＰＣＲ中の標識化は、切断によって生成される一本鎖ＤＮＡには有効である。というのは、各鎖は、後のＰＣＲプロセシングステップで個々に標識化される必要があり、高価で時間がかかるためである。
【００２０】
追加のステップとして、ハイブリッド形成後に、捕獲介在伸長反応が上述のように開裂アンプリコンに対して実施されるならば、結果を認証して異議を唱えて、信頼性を挙げることが出来る。捕獲介在伸長反応を、上述のように、より短く、最初のセットのものと相補的なプローブを用いて実行出来る。
【００２１】
以下の実施例は、本明細書で示される方法を更に例示するものである。
【実施例】
【００２２】
実施例１：ＰＣＲ増幅
ヒト組織及び細胞から単離されたゲノムＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてテンプレートとして使用する。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ遺伝子を側面に配置するオリゴヌクレオチドを、特異遺伝子座又は特異遺伝子セグメントの増幅用正及び逆プライマーとして使用する。１組以上のプライマーを、複合遺伝子座の増幅用のＰＣＲで使用することが出来た。加えて、プライマーは、多形サイトでゲノムＤＮＡのプライミング用の縮合塩基を含んでもよい。ＰＣＲを、既知の方法に従って実施する。
【００２３】
好ましくは、少なくとも１つのタイプのリガンド標識デオキシヌクレオチドを、ＰＣＲ反応混合物中に加え、両鎖を標識化したアンプリコンを生成する。リガンドは、ビオチンなどの蛍光染料又は分子であり、反応後、標識に結合され得る。
【００２４】
プログラム可能なサーモサイクラーを使用してＰＣＲを実施する。標識としてゲル内に含まれるＤＮＡラダーを用いて、ＰＣＲ生成物のアリコートを、電気泳動法を使用してアガロース又はポリアクリルアミドゲル上に流す。ゲル内のＤＮＡを臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲアンプリコンの完全性及び収量を確認するためにＵＶトランスイルミネータ上で可視化する。例えば、Ａ及びＢ遺伝子座のエクソン２及びエクソン３を、２組のプライマーを使用して複合ＰＣＲ中で増幅した。ＤＲ遺伝子座のエクソン２を、１組のプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ生成物をアンプリコンの各２０塩基に対して、１以上のビオチン化ヌクレオチドの密度を有する両鎖上でビオチン化した。ＰＣＲ生成物のアリコートをアガロースゲル上に流し、次いで臭化エチジウムによって着色した。図１において、着色したＰＣＲ生成物を、ＵＶトランスイルミネーション下にアガロースゲル上に可視化することが出来る。
【００２５】
実施例２：ＰＣＲ後のサンプルプロセシング
標識化クラスＩ及びＩＩＰＣＲ生成物を処理して化学的開裂及び変性によって一本鎖ＤＮＡフラグメントにする。周知の通り、ＰＣＲ生成物を塩酸で処理して脱プリンする。（例、Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ＭｅｔｈｏｄｓＪ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ他  Ｅｄｓ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２））．二本鎖ＤＮＡをプリン塩基、すなわち、塩酸存在下におけるアデニン及びグアニン、でランダムに刻み目を付ける。刻み目を付けた二本鎖ＤＮＡを、９４℃でアルカリ溶液中で熱変性させ、その結果、一本鎖ＤＮＡフラグメントを生成する。脱プリンの程度は、一本鎖ＤＮＡフラグメントのサイズに直接相関する。
【００２６】
クラスＩ及びＩＩ遺伝子のＰＣＲアンプリコンの脱プリンを最適化して、可能性のある決定に基づくと、少なくとも１つのビオチン化ヌクレオチドを含む小さな一本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。ポリアクリルアミドゲルで分離した開裂生成物のサイズ分布は、一本鎖ＤＮＡフラグメントの多くが、ほぼ７５塩基長であることを示した。従って、実施例１に記載した条件によれば、各ＤＮＡフラグメントは、ほぼ２つのビオチン化ヌクレオチドを含む。
【００２７】
経時実験を行って、脱プリン条件を最適化した。Ｂ遺伝子座のエキソン２及び３のビオチン化ＰＣＲ生成物を特定量の塩酸でインキュベートし、時間を増加するために水浴槽でインキュベートした。次いで、水酸化ナトリウムを加え、熱変性させた。化学的開裂ＰＣＲ生成物を消化生成物を８％の尿素シークエンスに流して消化生成物を分離し、臭化エチジウムで染色した。開裂生成物をＵＶトランスイルミネータ（図２）で可視化した。このことは、脱プリン時間が増加するにつれて、小さい開裂生成物の量が増加することを示している（図２）。
【００２８】
実施例３：オンチップハイブリッド形成分析
実施例２に記載されたように調整されたプロセシングＰＣＲ生成物を熱変性させて、多数の一本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。変性後、サンプルを氷上でスナップ凍結して、一本鎖状態でＤＮＡフラグメントを保存する。次いで、ＤＮＡサンプルを、相補的オリゴヌクレオチドプローブにオンチップハイブリッド形成用ハイブリッド形成バッファーと混合する。ここで、異なるプローブタイプが、異なるエンコード微粒子で各々固定化され、微粒子を固体基質上の配列に配置する（ＢｅａｄＣｈｉｐ（登録商標））。例えば、引用されている２００２年８月２３日に出願された米国特許出願第１０／２０４，７９９号：「Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ」参照。
【００２９】
ハイブリッド形成条件及びハイブリッド形成緩衝液のイオン強度は、この分野では慣習的なものである。好ましくは、高速及び効率的反応ダイナミクスのために、オンチップハイブリッド形成を温度及び湿度制御インキュベーター中で実施する。２００４年６月１７日に出願された米国特許出願第１０／８７０，２１３号：「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ」参照。
【００３０】
ハイブリッド形成に続いて、未結合標識ＤＮＡを、強力な洗浄によって除去する。オリゴヌクレオチドが蛍光染料よりもビオチンなどのリガンドと結合している場合には、リガンド用に高親和性を有する蛍光標識分子を含む染色溶液でアッセイチップをインキュベートする。例えば、ビオチン化ＤＮＡフラグメントに結合するための蛍光標識ストレプトアビジンを使用することが出来る。
【００３１】
有意なクロスハイブリッド形成があるならば、標識ＤＮＡターゲットを１又はそれ以上のプローブによって捕獲することが出来、これはＢｅａｄＣｈｉｐ上の１又はそれ以上の符号化した微粒子と関連している。
【００３２】
図３に示するように、典型的なｈＭＡＰ  ＢｅａｄＣｈｉｐ分析は、以下の４ステップ：ステップ１、ビオチン化ｄＡＴＰ及びビオチン化ｄＣＴＰなどの、標識ｄＮＴＰの存在下でのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅。ＰＣＲ生成物の両鎖を標識化する。ステップ２、標識ＰＣＲ生成物を塩酸の存在下で脱プリンし、次いで、アルカリ溶液中で熱変性させた。ステップ３、切断一本鎖ＤＮＡターゲットをＢｅａｄＣｈｉｐ分析のターゲットとして使用した。ステップ４、ビード上の捕獲ターゲットを、ビオチン化ターゲットの検出用Ｃｙ３接合ストレプトアビジンなどの標識に対する高親和性を有する蛍光標識リガンドでインキュベートすることによって検出し、ＲＥＡＤを検出した（図３）。
【００３３】
実施例２に記載されている開裂ＤＮＡ生成物をＢｅａｄＣｈｉｐ  ｈＭＡＰ分析に使用した。要するに、各脱プリン処理生成物、すなわち、０、１０、１３、１５、１７、２０、２５及び２５分以上の脱プリンで出来たものを、ｈＭＡＰ  ＢｅａｄＣｈｉｐ分析でのターゲットとして使用した。シークエンス特定プローブのパネルへのターゲットのハイブリッド形成強度を分析した。図４に示されるように、プローブＡ及びプローブＣの強度は、脱プリン時間が増加するにつれて減少し、これは脱プリンからのより小さなフラグメントへの長いＤＮＡターゲットの開裂の増加を示唆する。しかし、プローブＢ、Ｄ、Ｅ及びＦに対する強度は、部分的脱プリンで先ず増加し、次いで、更なる脱プリンで減少し、これは部分的開裂がターゲットの二次構造などの他の要素に起因して長いＤＮＡに利用できなかったある種のターゲットシークエンスの解離をもたらすことを示す（図４）。
【００３４】
実施例４：カスタムビードチップの製造
ハイブリッド形成介在分析に使用されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、末端反応基、内部スペーサー分子、及び対象のターゲットＤＮＡに対して相補性がある連続ヌクレオチドを含んでいる。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖に対して相補性があり得る。どちらか一方の鎖を選択して、クロスハイブリッド形成を低減する。
【００３５】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを着色符号化微粒子へ結合した後、別のオリゴヌクレオチド官能化微粒子をシリコン水（又はＢｅａｄＣｈｉｐ）上のランダムなプラナービード配列の会合用の一のチューブ内に結合化合させた。ＨＬＡ分子タイピングでは、各ＢｅａｄＣｈｉｐは、クラスＩ及びクラスＩＩ分子の特定遺伝子座用の複合センス及びアンチセンスプローブを含んでいなければならない。別の遺伝子座用のＢｅａｄＣｈｉｐを、ハイブリッド形成反応用の共通チャンバー内に結合させてよい。
【００３６】
実施例５：捕獲介在伸長分析
上述のように、ハイブリッド形成介在分析に続いて、捕獲介在伸長反応を使用して、結果を確認又は反証することが出来る。図５で示すように、化学的開裂ＤＮＡターゲットを使用した典型的なｅＭＡＰＢｅａｄＣｈｉｐ分析は、次の４つのステップを有するべきである：ステップ１、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅。ステップ２、ＰＣＲ生成物を塩酸の存在下に脱プリンし、次いで、アルカリ溶液中で熱変性させる。ステップ３、切断された一本鎖ＤＮＡをハイブリッド形成のターゲットとして使用し、次いで、Ｃｙ３標識ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰなどの蛍光標識ｄＮＴＰの存在下に伸長反応を行う。ステップ４、ターゲットテンプレートを強力な洗浄によって除去し、次いで、伸長プローブのＲＥＡＤ検出をする（図５）。
【００３７】
実施例６：複合ＨＭＡＰ分析におけるセンス及びアンチセンスプローブ
ここに記載された化学的に開裂したＤＮＡターゲットを、多重化分析フォーマット（例えば、そのようなフォーマットにおいてＨＬＡ遺伝子を分析することが出来る）において、複合オリゴヌクレオチドプローブのパネルにハイブリッド形成することが出来る。このような複合分析において、オリゴヌクレオチドプローブは、ターゲットＨＬＡサブシーケンスのセンス或いはアンチセンス鎖に対する相補的捕獲シーケンスを含んでいてよい。このような分析を既知の遺伝子型の一組のヒトＤＮＡサンプルのスクリーニングで使用する場合、正制御シグナルに対するプローブ信号の比（「シグナル比」）を、プローブセットの各プローブ用の各サンプル中で決定することが出来る。閾値を、信号比上に任意にセットして、プローブとターゲットの間の「完全一致」を「不一致」と区別することが出来る。ターゲットＤＮＡの相補的鎖に結合することによって、パネルにおけるアンチセンスプローブの追加が、複合体ｈＭＡＰ分析におけるセンスプローブの効果的な捕獲を強化出来る。実験的に、アンチセンスプローブを追加すると、任意のセンスプローブの捕獲効率も低減させず、事実、アンチセンスプローブを加えると、捕獲効率が改善したことを示す（結果は示さず）。センスプローブのみの分析を図６に示す。
【００３８】
実施例７：ＤＮＡ切断のモデリング
この例において、ＤＮＡ切断プロセスの２つの異なる面のモデリング、すなわち、（既知の組成物の）一本鎖ＤＮＡのフラグメントサイズ分布、及び切断後の鎖における特定範囲のＤＮＡの生存確率に取り組む。この分析の値は、２つの層である。第１に、フラグメントサイズが％切断の関数として展開するかを確認する。第２に、フラグメントサイズ分布をモデリングすることにより、対象のＤＮＡ鎖における標的部位の生存確率を評価する独特の方法を提供する。対象の無傷のサブシークエンスを含むフラグメントの画分のみ、又は実質的なプローブターゲットの重複を可能にするフラグメントが捕獲プローブにうまくアニーリングすることが出来るので、このことは、捕獲プローブの設計に関する限り重要な意味を有する。
【００３９】
シミュレーションの目的のために、上記で要点をまとめた実験的切断プロトコルが、ポリヌクレオチドフラグメントのランダムな分布をつくると仮定する。ランダムな切断は、各開裂可能なヌクレオチド−ヌクレオチド結合が破壊される等確率Ｐｃｕｔを有することを示唆する。この仮定は、切断化プロトコルは、バイアスされていない態様で入手できる総てのＡ及びＧのシークエンス依存及びフラグメントであることが知られていないため、妥当である。もう一つの仮定は、結合破壊イベントが独立しており、従って、フラグメントを生成する順番が、それらの存在確率に影響を及ぼさないということである。一本鎖ＨＬＡ  Ｂエクソン２アンプリコン（２６８塩基長）を使用してシミュレーションを実施した。シークエンスを、以下に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）。
【００４０】
2007509629.tif 000003
【００４１】
手順：
１）パラメーターＰｃｕｔ（Ｐｃｕｔ＝％切断）及び鎖シークエンスを与える。
【００４２】
２）プロトコルによって破壊出来る結合及び破壊出来ない結合によって区別できる領域にシークエンスを分割する。フラグメント可能な結合の総数をＮｆとして示す。隣接非断片化結合を、断片化結合によって側面に置かれる未断片化領域として一緒に一括して扱う。
【００４３】
３）ｎＦ領域（切断可能）をそれぞれ含むＮシークエンスの集合体を作る。通常、Ｎ＝１０００。
【００４４】
４）０から１の間で、各サイズがＮｃｕｔ＝（ｎＦ＊Ｐｃｕｔ＊Ｎ）／１００である、一様乱数、Ｒ１及びＲ２の２ベクトルを生成する。ここで、Ｎｃｕｔは、破壊されるべき集団中の結合総数を示す。第１ベクトルから、切断が生じるシークエンス内でランダムな配置を決定する。従って、ベクトルＲ１のために、切断位置を、量（ｎＦ＊Ｒ１）を評価することによって計算する。第２ベクトルから、切断される集団における特定の複製を、次のように（Ｎ＊Ｒ２）決定する。従って、シークエンス上で操作される各切断、ｉのために、２つの数字の組（ｆｉ，ｎｉ）が出来る。ここで、ｎｉは、切断がなされる複製数であり、ｆｉは、切断されるべき複製における切断結合である。しかし、生成した各組（ｆｉ，ｎｉ）は、一意的でないことがある。従って、エクササイズの間、特定の複製の特定の結合が再訪してよい。所定の結合が一旦破壊されたとすると、それが接触するときに、その結合の位置を決定する繰り返し組（ｆｉ，ｎｉ）が廃棄される。従って、運動の間に破壊される結合の総数は、実際にはｎｃｕｔ＜Ｎｃｕｔである。
【００４５】
５）破壊された結合又はシークエンスの末端のいずれかによって側面に位置された（ひとまとめにした切断可能な範囲及び未切断の範囲を結合させる）塩基の数を計算して、フラグメントサイズ分布を与える。
【００４６】
図７は、５％のＰｃｕｔ値を有する選択されたＤＮＡ鎖をもたらすフラグメントの累積サイズ分布を示す。この図は、（５０％のフラグメントの最終混合物を構成する２０までの塩基よりも小さい長さのフラグメントを有する）大きいフラグメントより小さいフラグメントがより偏在することを示す。図８は、不等長の２つの異なる領域の生存確率であるが、選択されたＤＮＡ鎖におけるフラグメント可能な結合と不可能な結合の比が同じであるものを示す。
【００４７】
本明細書中で使用される用語、表現及び実施例は、典型的に単一であるが、限定ではなく、本発明の適用範囲は、後に続く特許請求の範囲にのみ規定され、特許請求の範囲の対象の総ての同等物を含むことを理解されたい。特許請求の範囲におけるプロセス及び方法のステップは、他で特許請求の範囲に定められていない限り、特許請求の範囲に記載されている順番を含む、任意の順番で実施される。検出又は伸長が行われる前に、より小さい相互の重複範囲を有するフラグメントは変性する。また、対象の切断されていない範囲を含むフラグメントサイズ分配及び鎖の百分率は、両者とも実験的に入手できる量であるので、この方法は、モデリング結果を有する実験的な照合の唯一の方法を提供し、恐らくは、モデルにおける重要なパラメーターの定量化を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、ＵＶ照射下でアガロースゲル上に可視化した、ゲノムＤＮＡからの染色したＰＣＲ生成物を示す。
【図２】図２は、化学的開裂及び変性により一本鎖ＤＮＡフラグメントに処理した標識クラスＩ及びクラスＩＩ  ＨＬＡ  ＰＣＲ生成物を示す。
【図３】図３は、本明細書で示す方法を用いたハイブリッド形成介在分析の実施に含まれるステップを示す図である。
【図４】図４は、幾つかのターゲットの結合のための、強度対脱プリン時間を示す図である。
【図５】図５は、本明細書で示す方法を使用する捕獲又は伸長介在分析の実施に含まれるステップを示す図である。
【図６】図６は、６つの異なるセンスプローブに関しての、滴定スレッシュホールド対プローブを示す図である。
【図７】図７は、５％のＰｃｕｔ値を有する選択されたＤＮＡ鎖からもたらされるフラグメントの累積寸法分布を示す図である。
【図８】図８は、不等長の２つの異なる領域の生存確率であるが、選択されたＤＮＡ鎖におけるフラグメント可能な結合と不可能な結合の比が同じであるものを示す図である。
【図１】
2007509629.tif 000004
【図２】
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【図３】
2007509629.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007509629.tif 000010
【図８】
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【配列表】
2007509629000001.xml
【国際調査報告】
2007509629.tif 000013