(57)【要約】  Gly-Pro-Glu(GPE)は、in vivoで急速に代謝される。本発明者らは、試験した全ての脳領域でGPE注入が強力且つ持続的な神経保護を誘し、ある実施形態では、GPE注入の効果はボーラス注射後の注入(「負荷用量/注入」)による効果よりも高いことを見出した。GPEは海馬内のアポトーシスを軽減し、小膠細胞増殖を阻害し、星状細胞の損傷誘導性喪失を防止し、長期身体機能を改善した。注入後のGPEは広範な有効用量範囲(0.3〜30 mg/kg/h)を示し、治療有効期間を驚く程延長し、神経損傷1時間後〜少なくとも24時間後でも使用可能である。本発明者らは、急性GPE投与の神経保護効果が延長されることにより、神経損傷後に投与した場合でさえも種々の神経変性病態の有効な治療に使用することができることを見出した。従ってGPEは有効な神経保護剤であり、単独で又は他の神経保護剤、抗炎症薬又はペプチダーゼもしくはプロテアーゼインヒビターとの同時投与で使用され得る。GPE並びにプロテアーゼ及び/又はペプチドインヒビターの組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン損傷に応答した変性からニューロン細胞を保護する方法であって、
ニューロン細胞の保護を必要とする動物に、医薬上有効量のトリペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＧＰＥ）を静脈内投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＧＰＥを、事前のボーラス注射を行わずに、注入によって投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＰＥを、ボーラスに続いて注入によって投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＰＥをニューロン損傷から約１時間〜約２４時間後に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ニューロン損傷に続く変性から動物の神経細胞を長期間保護する方法であって、
静脈内投与を介して動物にＧＰＥを投与し、前記投与がニューロン損傷から約１時間後〜約２４時間後に開始されることを含む、前記方法。
【請求項６】
選択的な手術により引き起こされる低酸素症／虚血に起因するニューロン損傷に続く神経細胞死または変性を減少させる方法であって、
約１時間〜約４時間の持続時間にわたって静脈内注入としてＧＰＥを投与し、前記注入が、前記選択的な手術から約１時間前〜約２４時間後の時間で開始されることを含む、前記方法。
【請求項７】
脳卒中により引き起こされる低酸素症／虚血に起因するニューロン損傷に続く神経細胞死または変性を減少させる方法であって、
脳卒中発症とほぼ同時〜脳卒中後約２４時間経過時に開始する静脈内注入としてＧＰＥを投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
手術が冠状動脈バイパス手術である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＧＰＥを医薬上許容される剤形で投与する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＰＥを、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量でボーラスとして投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＥを約０．０３ｍｇ／ｋｇ／時間〜約３０ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で注入する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＰＥを、損傷の後または神経変性もしくはニューロン細胞死に至ってから、約１時間〜７時間後に投与する、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＰＥを、損傷の後または神経変性もしくはニューロン細胞死に至ってから、約１時間〜約１１時間後に投与する、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ボーラスで投与されるＧＰＥの用量が約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇであり、注入でのＧＰＥを約０．０３ｍｇ／ｋｇ／時間〜約３０ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
ボーラスで投与されるＧＰＥの用量が約３ｍｇ／ｋｇであり、注入でのＧＰＥを約３ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＰＥを約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇの速度で注入する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
損傷が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、脊髄性筋萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ痴呆、進行性核上麻痺、広汎性髄鞘中心障害（消失性白質疾患）、慢性神経変性疾患、ダウン症候群、白質脳症、低酸素症、虚血、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術、シルダー病、神経芽細胞腫、頭部損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、再灌流障害、癲癇、毒素傷害、放射線傷害、仮死、炎症状態、慢性または急性の脳脊髄炎、脳炎、視神経炎、横断性脊髄炎、髄膜炎、汎脳炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、橋中心髄鞘崩壊症、鬱病、統合失調症、および視神経脊髄炎からなる群より選択される病態である、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
付加的な神経保護剤を投与することをさらに含む、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
付加的な神経保護剤が抗アポトーシス薬または抗壊死薬である、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
付加的な神経保護剤が、成長因子および関連誘導体（インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ結合タンパク質（特に、ＩＧＦＢＰ−３）、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子産物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、角化細胞成長因子、アンドロゲン誘導性成長因子、ｉｎｔ−２、線維芽細胞成長因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３、ＦＨＦ−４、角化細胞成長因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、ＴＮＦ−α、クロメチアゾール；キヌレン酸、Ｓｅｍａｘ、タクロリムス、Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、アドレノコルチコトロピン−（４〜９）アナログ（ＯＲＧ  ２７６６）、ジゾルシピン（ＭＫ−８０１）、セレギリン、グルタミン酸アンタゴニスト（ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１およびＧＶ１５０５２６からなる群より選択される）、ＡＭＰＡアンタゴニスト（２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ(ｆ)キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４からなる群より選択される）、並びに抗炎症薬（抗ＭＡｄＣＡＭ−１抗体並びにインテグリンα４β１受容体およびインテグリンα４β７受容体に対する抗体からなる群より選択される）からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
投与を約１〜約４時間連続して行う、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
血漿中のＧＰＥ分解を阻害することができる酵素インヒビターを投与することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼまたはジペプチダーゼの１以上のインヒビターを投与することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
アプロチニン、ペプスタチンＡ、ベスタチン、ロイペプチン、ＡＥＢＳＦおよびＥ−６４からなる群より選択される１以上の酵素インヒビターを投与することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＰＥと、少なくとも１のプロテアーゼインヒビターまたはペプチダーゼインヒビターとを含む、組成物。
【請求項２６】
インヒビターが、セリンプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼおよび／またはペプチジルジペプチダーゼを阻害することができる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも１のプロテアーゼインヒビターまたはペプチダーゼインヒビターが、アプロチニン、メタロプロテイナーゼインヒビター、ペプスタチンＡ、ベスタチン、ロイペプチン、ＡＥＢＳＦおよびＥ−６４からなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
医薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
急性虚血性損傷は、成年期における死亡および長期的な身体障害の主な原因の１つである。現在、脳卒中発症から３時間以内に患者が診療所に到着できる場合、脳灌流を強化するための血栓溶解（ｔｈｒｏｍｂｕｓ）によって治療することができる。急性虚血性脳損傷を治療するための神経保護は別の機構であると考えられている（Ｌｕｔｓｅｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９９９）。脳卒中または開心術に関連する神経系の合併症などの虚血性損傷に続く数時間後、場合によっては数日で大部分のニューロンは死滅することがよく実証されている（Ｃｏｉｍｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｂｅｉｌｈａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｇａｌｌｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。プログラム細胞死経路の開始のため、このような細胞消失の発展が進行し、治療介入のための治療機会(a windows of opportunity)が与えられる。
インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は、中枢神経系（ＣＮＳ）に天然に存在し（Ｂａｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）、ＣＮＳ発生で重要な役割を果たし、また、ニューロン細胞およびグリア細胞の両方のための生存因子および分化因子として作用する（Ａｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＩＧＦ−１は、成熟した脳（Ｇｌｕｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）および発達中の脳（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）の両方においていくつかの形態虚血性損傷からニューロンの死滅を防止することができることはよく実証されている。ＩＧＦ−１の抗アポトーシスの役割も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでよく実証されている（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。しかし、ＩＧＦ−１の臨床適用は、ＩＧＦ−１の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力が限られていることおよびＩＧＦ−１の有糸分裂促進作用および代謝作用の可能性のため、問題を含んでいる。
【０００２】
Ｓａｒａら（１９８９）は、酸性プロテアーゼによって媒介される過程において、ＩＧＦ−１が自然にｄｅｓ−Ｎ（１−３）−ＩＧＦ−１（ｄｅｓ−ＩＧＦ−１）とＮ末端トリペプチであるグリシン−プロリン−グルタミン酸（「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ」；「ＧＰＥ」とも呼ばれる）とに切断できることを最初に示唆した（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ，１９９４；Ｓａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ，１９９５）。ＧＰＥは、ＩＧＦ−１受容体と相互作用することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでドーパミンおよびアセチルコリンの放出を刺激することができることが証明されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｈａｋａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。本発明者らは、ＧＰＥの脳室内投与が、特に脳皮質および海馬のＣＡ１−２亜領域での低酸素性虚血性（ＨＩ）脳損傷後、ニューロンを保護できることを以前に証明している（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。静脈内（ｉ．ｖ．）投与製剤を使用して患者を治療することは脳室への投与と比較してはるかに容易であろうことから、有効なｉ．ｖ．治療の開発は非常に望ましい。ＧＰＥは、分子サイズが小さいため、虚血性損傷後に障害が起きた血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。したがって、本発明の１つの目的は、ニューロンの変性または死滅を軽減する有効なｉ．ｖ．治療を開発することである。
【発明の開示】
【０００３】
（発明の概要）
近年のＧＰＥの免疫アッセイの開発に伴い、本発明者らは、動物の循環系においてＧＰＥが急速に分解されることを発見した。しかし、その急速な分解にもかかわらず、ＧＰＥの静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、直接的な脳室内投与後に認められた神経保護効果に類似する神経保護効果を示す。本発明のある実施形態では、ＧＰＥを動物の循環系に直接注射して神経細胞死を減少または防止することができる。他の実施形態では、ＧＰＥのｉ．ｖ．ボーラスを、それに続くいかなる注入も行うことなく、投与することができる。さらなる実施形態では、ｉ．ｖ．ボーラスに続いてＧＰＥの持続的静脈内注入を行うことができる。さらに他の実施形態では、持続的静脈内注入を、事前のいかなるボーラス注射を行うことなく使用することができる。本発明者らは、事前にボーラス注射を行わずに投与した場合、ＧＰＥの持続的ｉ．ｖ．投与がより顕著な神経保護効果を示すことができることを予想外に見出した。
本発明者らはまた、ニューロンの死滅または変性に至る損傷後に投与した場合でさえ、ＧＰＥは、死滅または変性からニューロンを保護できることを予想外に見出した。いくつかの実施形態では、ＧＰＥを、損傷から２４時間後までに投与することができる。
本発明者らはまた、短期間のＧＰＥ投与で長期間の治療的利益を得ることができ、ニューロン損傷後に典型的に起こる神経変性の進行を少なくとも部分的に逆行させることができることを予想外に見出した。いくつかの実施形態では、ＧＰＥの短期間投与は、損傷および治療から３０日間持続する神経保護効果を示し得る。これらの所見は、ＧＰＥの短い半減期またはいかなる先行技術に基づいても完全に予想外である。
さらなる態様では、ペプチダーゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビターを使用して血漿中でのＧＰＥの分解を減少させ、よってＧＰＥの効果を増大または延長させることができる。
さらなる態様では、ＧＰＥおよびプロテアーゼインヒビターを含む組成物を提供する。
【０００４】
（発明の詳細な説明）
ある態様では、本発明は、動物の循環系におけるＧＰＥの量を決定する方法を含む。ＧＰＥ測定のための放射免疫アッセイ手順は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０８１９５号、２００２年３月１４日にＧｒｅｇｏｒｙ  Ｂｒｉａｎ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｂｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ，ｉｎｖｅｎｔｏｒｓによって提出された発明の名称が“Anti-GPE Antibodies, Their Uses and Analytical Methods for GPE”の米国特許出願番号１０／１００，５１５号明細書（代理人整理番号：ＮＲＮＺ  １０１６ＵＳ１  ＤＢＢ）、および発明者：Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｂｒｉａｎ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｂｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｂａｔｃｈｅｌｏｒによって同時提出された発明の名称が“Anti-GPE Antibodies, Their Uses, and Assays for Weakly Immunogenic Molecules,”の通常の特許出願明細書（代理人整理番号：ＮＲＮＺ  １０１６  ＵＳ２  ＤＢＢ）に記載されている。上記の各出願明細書は、参照により本明細書に含まれるものとする。
【０００５】
〔ＧＰＥはｉｎ  Ｖｉｖｏの血漿中で短い半減期を有する〕
上述のようなアッセイを使用して、本発明者らは、ＧＰＥが約１〜２分間の半減期で循環系から除去されることを見出した。この除去機構は明らかではないが、循環系に存在することが知られているプロテアーゼおよびペプチダーゼは、ＧＰＥの分解を担い得る。その除去機構とは無関係に、静脈内治療が有意義であることが示唆される。
第１に、循環系からの急速な除去のため、神経保護量のＧＰＥは本発明の薬剤の循環系への注入によって維持することができる。他の実施形態では、比較的少量のＧＰＥボーラス後に持続的注入を行って、ボーラス単独によって得られる神経保護効果よりも一層高い神経保護効果を得ることができる。さらに他の実施形態では、驚くべきことに、最初のボーラスなしにＧＰＥの持続的注入を行うことにより、ボーラスに続いて持続的注入を行って得られる神経保護効果よりも一層高い神経保護効果を得ることができる。
本発明者らのデータにより、ＨＩ損傷ラットにおいてのみｉ．ｖ．注入から４時間後のＣＳＦ中のＧＰＥの有意な上昇が見出されるので、ＧＰＥの中枢浸透が実証された。血液脳関門の虚血性損傷誘導性破壊は、内皮のタイトジャンクションの喪失のため、早ければ損傷から２〜４時間後であり得る。ＧＰＥがＣＳＦに侵入することができる機構は、明白には知られていない。しかし、１つの仮説によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性化も内皮基底膜を破壊し得る（Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｐｌａｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。ＧＰＥの小さな分子サイズおよび親水性により、問題の脳へアクセスすることができる。したがって、虚血性損傷後の基底膜の破壊（Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）は、脳へのＧＰＥの取り込みと関連し得る。
【０００６】
非競合的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストのＭＫ−８０１は小分子であり、動物での神経保護効果がよく実証されている。しかし、ＧＰＥの損傷関連ＣＮＳ取り込みと異なり、虚血性脳損傷は末梢投与後の組織へのＭＫ−８０１結合を減少させる（Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。ＣＮＳに非特異的にアクセスする物質と比較して、ＧＰＥの損傷媒介性中枢浸透は脳の損傷領域に本発明の薬剤をより特異的に標的化でき、非損傷領域との望ましくない相互作用を最小にすることができる。しかし、他の仮説はそのような所見を説明することができ、本発明者らは、本出願がいずれか特定の作用機構に制限されることを意図しない。
単回ボーラス注射後のＧＰＥの神経保護効果の程度は有意であるが、いくらか変動し得る。この変動性は、ＨＩ損傷ラットへの単回ボーラス投与から２分後未満と評価された血漿中でのＧＰＥの半減期の短さに起因し得る。ＧＰＥのボーラス静脈内注射後のその主な代謝産物であるグリシン、グルタミン酸およびプロリンへの急速な分解も正常なラットにおいて最近報告された（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。ＧＰＥは、内因性プロテアーゼ酵素によってＩＧＦ−１から切断され（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ  １９９４）、ＧＰＥの短い半減期は、急速なタンパク質分解に対するその感受性に関連し得る。ＧＰＥの有効な血液レベルの維持、言い換えれば安定な中枢取り込みの保持が必要と仮定すると、連続的注入はＧＰＥ治療のための有効な投与経路であるようである。
【０００７】
〔ＧＰＥの静脈内投与は有効である〕
ＧＰＥの静脈内注入によって、試験した全ての脳領域において広範な有効用量範囲で一貫して強い神経保護が得られた。歯状回および大脳皮質の組織損傷は、最も有効な用量（３ｍｇ／ｋｇ／時間で４時間）のＧＰＥでの治療後に完全に防止された。
本発明者らは、驚いたことに、いくつかの場合、持続的注入がボーラス注射後に同量の薬物注入するよりも神経保護効果が高いことを見出した。したがって、これらの場合、より低い用量のＧＰＥ後により高い神経保護効果が認められた。この結果は、先行技術に基づいた場合、完全に予想外であった。
【０００８】
急性損傷または疾患に対応した創薬および薬物の開発における別の実施上の問題は、適時での患者のリクルートメント(recruitment）及び治療への迅速なアクセスの提供である。例えば、急性虚血性脳卒中後の抗凝固薬の有効性が証明されているにもかかわらず、大部分の患者は３時間以内に入院しない（Ｆａｍｕｌａｒｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９８；Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ  ２０００）。実験モデルで神経保護性を示すことが証明された大部分の化合物は、治療機会が非常に短い（Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ  ２０００）。「治療機会」は、その間に有効な治療法を開始することができる急性事象後の期間を意味する。損傷から６時間後より後に数種の化合物を投与することができるが、これらの化合物でさえ初期治療効果と比較して有効性が減少する（Ｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。しかし、本発明者らは、３〜７時間、７〜１１時間後に開始した場合にＧＰＥ治療が有効であり得ることを予想外に見出した。実際、これらの期間中のＧＰＥの投与は、より早い投与と比較して神経保護の程度が類似していた。さらに、ＨＩ損傷から２４時間後のＧＰＥの投与も顕著な神経保護効果が得られた。これらの所見に基づいて、本発明者らは、投与が２４時間を超えて遅延した場合でさえもＧＰＥの有益な効果を得ることができると考える。広範な有効用量およびＧＰＥの治療機会の延長により、神経が損傷した動物をニューロンの死滅または変性の程度を減少させるためにＧＰＥで有効に治療することができ、典型的に慢性ニューロン損傷に関連する機能喪失を減少させることができる。部分的神経保護効果でさえ、脳卒中、冠状動脈バイパス手術、外傷性神経損傷、または他の神経損傷の副作用を減少させるのに充分であり得る。したがって、特定の状況で最も有効なタイミングおよび投薬が実施されない場合でも、神経損傷を受けた患者にはささやかな程度(modest degree)の神経保護であっても非常に有利であり得る。
【０００９】
この治療機会の延長に関与する基礎をなす機構は明確に知られていないが、１つの仮説は、最初の損傷によってニューロンの死滅が遅延し得ることである。充分に理解されている損傷の第１週後の二次的ニューロン喪失に加えて、細胞死の遅延は、何ヵ月にもわたる進行性の「第３」段階に継続し得る（Ｃｏｉｍｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｃｏｌｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｇａｌｌｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。遅延した細胞死のこの経時変化は、現在の実験ラット系で以前に証明されている（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１ｂ）。ほとんどの実証研究は、排他的に最初の損傷後２４時間と１週間との間の組織学的終点を報告している。しかし、いくつかの化合物で認められた初期保護を、長期間維持することができない（Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ  ２０００；Ｇｌａｄｓｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。したがって、短期間のニューロンの結果は、必ずしも全ての治療有効性を反映せず、急性研究のみに頼ることは、長期治療の利点の過小評価によって臨床的発展を誤った方向に導き得る。本実験は、損傷から１〜５時間後に開始したＧＰＥのｉ．ｖ．注入によってＨＩ損傷から２１日後に試験した長期ニューロンの結果が改善されたことを示した。おそらく脳の損傷および回復時に放出された内因性生成物の二相効果のために、特にこの動物モデルにおいて損傷から２１日後に試験したニューロン損傷が進行することが以前に報告されている（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００１０】
動物モデル由来の結果のヒトへの変換の失敗について充分に認識されている落とし穴の１つは、前臨床開発が典型的には組織学的結果に基づいて評価されるのに対し、臨床試験は長期挙動または臨床結果に基づいて評価されることである（Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ  ２０００；Ｇｌａｄｓｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
以前の報告では、ＨＩ損傷により、中大脳動脈の範囲内で片側性損傷を起こし（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂｕｓｔｏ  １９８９）、その灌流領域は体性知覚機能に非常に関連する（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。  大脳皮質のこの特定の分布におけるニューロン損傷によって損傷した半球に対して対側で体性知覚機能が有意に喪失し、初期の時点（３日目および５日目）で最も顕著であった。ＨＩ損傷から１０日後に自発的機能回復が認められ、これは種々の成長因子の内因性生成に関連していた（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８６；Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｋｌｅｍｐｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。ビヒクル処置群における試験期間にわたり、体性知覚機能の有意な回復は認められなかった。他方では、パッチへの接触時間が遅延したラットは試験中のパッチの見逃し(missing)もしばしば認められ、このことは、線条体(striatum)中の複数の表現型ニューロンの喪失がＨＩ損傷後に報告されていることから、運動神経の欠損を示唆し得る（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。ＩＧＦ−１での治療（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）と同様に、ＧＰＥでの処置によっても体性知覚機能の回復が改善され、比較可能な長期的なニューロン結果が得られた（図２ＡおよびＢ）。本発明者らは、ＩＧＦ−１の機能回復が梗塞サイズの減少よりもむしろニューロン損傷の進行の防止に関連することを以前に報告している（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。本研究は、組織の空洞化および萎縮が少数のラットでも認められ（６匹のビヒクル処置ラットのうちの２匹）、これはおそらく本研究におけるより小さな損傷に起因することを示した。しかし、ＧＰＥ処置群は組織学的損傷が最小であり、ＧＰＥは典型的にＨＩに関連する行動の欠陥を完全に防止した。
【００１１】
脳に対する急性低酸素性虚血性損傷は、複合的病因によりニューロンを損傷させる。いくつかの細胞は壊死（細胞膜の破裂によって開始されるより急速なニューロン死によって認識される形態）を示す一方で、他の細胞は核凝縮によって開始されるより進行した過程（例えば、アポトーシス）によって死滅させられる。ニューロン死の両形態は、損傷直後に起こらず、治療機会が得られる。ＴＵＮＥＬおよびカスパーゼ−３陽性免疫染色は、アポトーシスを受けた細胞のマーカーとして広く使用されている（Ｓｎｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｖｅｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。現在使用されている組織損傷スコアがニューロンの壊死およびアポトーシスの両方を評価することを考えると、ビヒクル処置群における海馬のＣＡ１−２、ＣＡ３、およびＣＡ４亜領域で類似の程度のニューロン損傷が見出された。興味深いことに、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の増加は主に海馬のＣＡ３亜領域で認められる一方で、大部分のカスパーゼ−３陽性細胞はビヒクル処置群のＣＡ４亜領域で異なって存在した。ＴＵＮＥＬおよびカスパーゼ−３陽性細胞は共にＣＡ１−２亜領域で低かった。実施段階のプロテアーゼであるカスパーゼ−３の活性化（Ｙａｋｏｖｌｅｖ  ａｎｄ  Ｆａｄｅｎ  ２００１）によってＤＮＡが断片化し（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、その後にＴＵＮＥＬを陽性に標識することができる。
【００１２】
ＨＩ損傷はカスパーゼ−３とＴＵＮＥＬ標識との間に空間的な相違を生じ、カスパーゼ−３経路が必ずしも陽性ＴＵＮＥＬ標識につながらないことを示す。ＴＵＮＥＬとカスパーゼ−３との間の免疫反応性のこの分離は、ＣＮＳの外側でも認められている（Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。したがって、これらの空間的相違は、カスパーゼ−３依存性経路およびカスパーゼ−３独立性経路が共にＨＩ損傷後の海馬中のニューロン損傷に関与することを示した。本発明者らのデータは、ＨＩ損傷から１〜５時間後のＧＰＥ処置が組織損傷ならびにＴＵＮＥＬおよびカスパーゼ−３陽性細胞を減少させることを明確に示し、ＧＰＥ投与がニューロンの壊死およびアポトーシスの両方の阻害に関連することが示唆される。
神経の損傷および回復におけるグリア細胞の役割は報告されているが、議論の余地がある（Ｋｒａｉｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９５）。本発明者らのデータは、ＧＰＥが小膠細胞増殖を強く抑制し、星状細胞のＨＩ誘導性喪失を完全に防止することを示す。反応性星状細胞の生理学的役割は、血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性(integrity)、細胞間伝達、細胞内の鉄ホメオスタシス、ニューロンの柔軟性、および成長因子代謝の調節によるニューロンの神経栄養作用に関与することが示唆された（Ｋｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。生理学的条件下では、星状細胞からの興奮性アミノ酸の放出が受容体媒介性であるのに対して、星状細胞からの損傷誘導性興奮性アミノ酸漏出は星状細胞の膨潤に起因し（Ｋｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）、この膨潤が、ホメオスタシスを損傷させてさらなるニューロン損傷に寄与し得る。虚血性損傷後の星状細胞の喪失が、組織梗塞発生の重要な部分であることも示唆されている（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｔａｔｅｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。したがって、星状細胞の完全性の維持は、ＧＰＥの神経保護効果の一部であり得る。
【００１３】
小膠細胞は、一般に、脳炎症、自己免疫応答、およびニューロン変性で役割を果たすと考えられている（Ｋｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ＩＧＦ−１での治療（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）と異なり、ＰＣＮＡ陽性細胞（細胞増殖のマーカー）もＧＰＥ処置によって減少するので、ＧＰＥでの処置はおそらく細胞増殖の阻害によってＨＩ損傷誘導性イソレクチンＢ４陽性小膠細胞を減少させた。ＨＩ損傷後のＧＰＥの神経保護に関与し得るＴＧＦβ−１（ＭｃＮｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）などの抗炎症特性を有するいくつかの神経保護剤が同定されている。ＧＰＥと対照的に、ＩＧＦ−１は、虚血性脳損傷後の星状細胞および小膠細胞の増殖を促進する（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。これにより、小膠細胞／ニューロン細胞相互作用におけるＧＰＥとＩＧＦ−１との間の異なる作用機構が示唆され得る。
ｉ．ｖ．ボーラス、ｉ．ｖ．注入、またはｉ．ｖ．ボーラスとｉ．ｖ．注入の両方によるＧＰＥの投与は、神経変性病態を有する患者の治療に特に適切であり得る。このような病態には、例示のみを目的として、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、脊髄性筋萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ痴呆、進行性核上麻痺、広汎性髄鞘中心障害（ｍｙｅｌｉｎｏｐａｔｈｉａ  ｃｅｎｔｒａｌｉｓ  ｄｉｆｆｕｓａ）（消失性白質疾患（ｖａｎｉｓｈｉｎｇ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ））、慢性神経変性疾患、ダウン症候群、白質脳症、低酸素症、虚血、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術およびシルダー病、神経芽細胞腫、頭部損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、再灌流障害、癲癇、毒素損傷（ｔｏｘｉｎ  ｄａｍａｇｅ）、放射線損傷、仮死、炎症状態、慢性または急性脳脊髄炎、脳炎、視神経炎、横断性脊髄炎、髄膜炎、汎脳炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、橋中心髄鞘崩壊症、および視神経脊髄炎が含まれる。
【００１４】
本明細書中に記載の投与経路はまた、他の神経保護剤の投与に適切である。このような薬剤には、例示のみを目的として、成長因子および関連誘導体（インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ結合タンパク質（特に、ＩＧＦＢＰ−３）、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子産物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、角化細胞成長因子、アンドロゲン誘導性成長因子、ｉｎｔ−２、線維芽細胞成長因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３、およびＦＨＦ−４、角化細胞成長因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０、およびＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、ＴＮＦ−α、クロメチアゾール；キヌレン酸、Ｓｅｍａｘ、タクロリムス、Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、アドレノコルチコトロピン−（４−９）アナログ（ＯＲＧ  ２７６６）、ジゾルシピン（ｄｉｚｏｌｃｉｐｉｎｅ）（ＭＫ−８０１）、セレギリン、グルタミン酸アンタゴニスト、ＡＭＰＡアンタゴニスト、および抗炎症薬からなる群より選択される抗アポトーシス薬または神経保護剤が含まれる。
【００１５】
さらなる神経保護剤には、グルタミン酸アンタゴニスト（ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１、およびＧＶ１５０５２６が含まれる）、２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０、およびＬＹ３００１６４からなる群から選択されるＡＭＰＡアンタゴニスト、ならびに抗ＭＡｄＣＡＭ−１抗体およびインテグリンα４β１受容体およびインテグリンα４β７受容体に対する抗体からなる群より選択される抗炎症薬が含まれる。
ＧＰＥは血漿中で非常に急速に分解されるので、ペプチダーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターの使用により、ＧＰＥの効果を増強してその半減期を延長することができる。したがって、さらなる実施形態では、ＧＰＥを、１つまたは複数のペプチダーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターと共に投与することができる。本発明のいくつかの実施形態では、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、および／もしくはジペプチダーゼまたはメタロプロテイナーゼのインヒビターを使用することができる。ある実施形態では、効果を増強および／または延長するために、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、ベスタチン、アプロチニン、ＡＥＢＳＦ、メタロプロテイナーゼインヒビター、およびＥ−６４からなる群から選択される１つまたは複数のインヒビターを、ＧＰＥと同時投与することができる。
【００１６】
さらに、本発明は、ＧＰＥおよび１つまたは複数のペプチダーゼインヒビターを含む新規の組成物を提供する。このようなインヒビターには、上記列挙のインヒビターおよび当該分野で公知の他のインヒビターが含まれる。さらに、必要とする被験体への投与に適切な治療用組成物を得るために、ＧＰＥおよび１つまたは複数のペプチダーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターを含む組成物中に賦形剤を含めることができる。
本発明者らは、ＧＰＥがＨＩ脳損傷後のニューロン損傷の防止で強力且つ即効性のある効果を示すことを見出した。その損傷依存性中枢浸透および急速な血漿クリアランスに加えて、広い有効用量範囲、延長された治療機会、および長期機能回復により、ＧＰＥは急性虚血性脳損傷治療のために開発されるべき潜在的候補となる。星状細胞生存の促進および小膠細胞増殖の阻害は、ニューロンのアポトーシスおよび壊死の両方の防止においてＧＰＥが重要であり得る。
【実施例】
【００１７】
（実施例１：動物および手術）
これらの研究は、Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄによって承認された。動物の苦痛を最小にし、且つ使用動物数減少させるように常に努力した。
成体雄Ｗｉｓｔａｒラット（２８０〜３１０ｇ）を、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｕｎｉｔ  ｃｏｌｏｎｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄから入手した。改変Ｌｅｖｉｎｅ調製物を使用して急性脳損傷を誘導し、これは前に記載されている（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。簡単に述べれば、右頸動脈結紮後の吸入低酸素症（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｈｙｐｏｘｉａ）によって片側脳損傷を誘導した。右頸動脈を、一般的な麻酔下で（３％ハロタン／酸素）二重結紮を行った。麻酔からの回復から１時間後、ラットを、湿度（９０±５％）および温度（３１±０．５℃）を制御したインキュベーターにさらに１時間入れた。次いで、ラットを、低酸素状態（６±０．２％酸素）に１５分間曝露した。動物を低酸素状態後にインキュベーター中にさらに３０分間維持し、その後保持室（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｒｏｏｍ）に取り出した。
【００１８】
連続的ｉ．ｖ．注入を行うために、いくつかのプロトコールにおけるラットを、以前に記載のように実験３日前に慢性的にカテーテルを挿入した（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。ラットに留置頸静脈カテーテルを外科的に挿入し、代謝ケージに個別に収容した。３％ハロタン／酸素を使用した一般的な麻酔下で、右頸動脈を露出してポリエチレンカテーテルを挿入する手術を行った。カテーテルを露出し、保護用ステンレススチールバネを介してケージから外側に出し、流体密封スイベエル・ジョイントに接続した。これにより、動物はケージ内を自由に動き回れる。３日間の術後回復期間後、カテーテルを、ＧＰＥの注入を容易にするための蠕動注入ポンプに接続した。
（実験群）
実験群を以下の表１に示す。
【００１９】
2007509169.tif 000002
【００２０】
（薬物動態学的研究）
１０匹のＨＩ損傷ラットを使用して、ＨＩ損傷から２時間後に行った単回ボーラスｉ．ｖ．注射後のＧＰＥの半減期を証明した。血液サンプルを、３ｍｇ／ｋｇのＧＰＥ（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，Ｂａｓａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のｉ．ｖ．注射の１０分前、注射時、１、２、４、８、１６、および３２分後に氷上のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含むヘパリン処理チューブに採取した。ＧＰＥ放射免疫アッセイのために、血漿を−８０℃で保存した。
２つのさらなる実験では、正常ラット（ｎ＝１５）およびＨＩ損傷ラット（ｎ＝１５）の両方についてのＧＰＥの中枢浸透を測定した。各動物群由来の９匹のラットに、３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥを４時間連続注入した。各群由来の残りの６匹のラットに、１０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ６．０）（ＧＰＥ−ビヒクル）のコントロール注入を行った。ＨＩ損傷ラットでは、損傷から１〜５時間後にＧＰＥ処置を行った。４時間の注入終了後に、動物を麻酔し、２９Ｇウルトラファインニードルおよびシリンジを使用して大槽からプロテアーゼインヒビターを含むチューブに脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収した。次いで、過剰量のペントバルビタールを使用して動物を屠殺した。ＣＳＦサンプルを、ＧＰＥアッセイのために−８０℃で保存した。
【００２１】
（実施例２：治療研究）
実験１では、１４匹のＨＩ損傷ラットの２群に、ＨＩ損傷の２時間後に１５ｍｇ／ｋｇ  ＧＰＥの単回ｉ．ｖ．注射を行うか、ＧＰＥビヒクルを注射した。４日後、ラットを屠殺し、組織学的分析のために脳を採取した。
実験２では、１６匹のラットに、ＨＩ損傷から１時間後に３ｍｇ／ｋｇ  ＧＰＥの単回ｉ．ｖ．ボーラス注射を行い、その直後に４時間のＧＰＥのｉ．ｖ．注入（３ｍｇ／ｋｇ／時間）を行った。コントロールＨＩ群（ｎ＝１６）に、ＧＰＥ−ビヒクルのみを投与した。
４日後、ラットを屠殺し、組織学的分析および免疫組織学的分析のために脳を採取した。
実験３では、ＨＩ損傷ラット群（ｎ＝７〜１６）に、ＨＩ損傷の１時間後から開始する０．０３、０．３、３、または３０ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥのいずれかの４時間の連続的ｉ．ｖ．注入を行った。コントロールＨＩ損傷ラットに、ＧＰＥ−ビヒクルのみを４時間注入した。ラットを屠殺し、ＨＩ損傷から４日後に組織学的分析のために脳を採取した。
実験４では、ＨＩ損傷ラット群（ｎ＝１２〜１６）に、ＨＩ損傷から３時間後または７時間後から開始する３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥの４時間の連続的ｉ．ｖ．注入を行った。コントロールＨＩ損傷ラットに、実験の関連する治療機会（ＨＩ損傷から３〜７時間または７〜１１時間）に対応する４時間のＧＰＥ−ビヒクルのみの注入を行った。ラットを屠殺し、ＨＩ損傷から４日後に組織学的分析のために脳を採取した。
【００２２】
実験５では、ＨＩ損傷後のニューロンの結果および機能回復の両方に対するＧＰＥの長期的効果の試験のために２４匹のラットを使用した。ラットを、正常コントロール、偽手術、ＧＰＥもしくはそのビヒクルで処置したＨＩの４つの群に無作為に分けた。全ラットを、ＨＩ損傷の３日前から両側触覚試験に慣れさせた。ＨＩ損傷から１〜５時間後に、ＧＰＥ（３ｍｇ／ｋｇ／時間）またはビヒクルを注入した（ｉ．ｖ．）。両側触覚試験の手順は、以前に記載されている（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１ｂ）。ＩＧＦ−１およびビヒクルで処置したラットを、損傷から３、５、１０、および２０日後に試験し、正常コントロールおよび偽手術ラットを並行して試験した。各試験日に各ラットを４つの試験に供した。各試験では、右および左前肢の遠位放射状部分に接着ラベル（１１ｍｍ2）を適用した。ラットを、透明な風防ガラス観察チャンバー（幅１９０ｍｍ×高さ２１０ｍｍ×長さ３３０ｍｍ）に入れた。ラットが各パッチに接触するために要した時間を測定した（分）。各試験日における各ラットの試験時間は５〜１０分間であり、パッチの配置順序は疑似ランダムであり、左および右パッチをそれぞれ４回の試験のうち最初２回に配置した。ラットがパッチに接触することができなかった場合、試験を５分間で終了した。パッチへの接触時間を、ラットにおける損傷した（右）半球およびコントロール（左）半球の体性知覚−運動機能の指標と見なした。パッチへの接触で要した時間のＬ／Ｒ比を使用して、損傷した半球に対して対側の前肢（左、潜在的欠損）と同側の前肢（右、潜在的損傷なし）との間の性能の非対称を定量した。各試験日における各ラットについての比の平均を計算した。実験者には処置群が分からなくしてあった。組織学的分析のために、ＨＩ損傷から２１日後にラットを屠殺した。
【００２３】
（実施例３：組織学）
組織学的手順は、以前に記載されている（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。簡単に述べれば、ＨＩ損傷およびＧＰＥ処置から４日後に、ラットを通常の生理食塩水およびその後に１０％ホルマリンを使用した深麻酔下で経心的に灌流した。脳を同一の固定液中に２時間保持し、その後パラフィン手順を使用して処理した。３つの冠状切片（６μｍ）を線条体、大脳皮質、および海馬から切断し、スライドガラス上に置き、チオニンおよび酸性フクシンで染色した。
死滅したニューロンを、好酸性（赤色）細胞質および収縮核を有する死滅ニューロンと同定した（Ａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｒｉｅｒｌｅｙ，１９７２）。選択的ニューロン死、細胞反応、および／または全壊死を示す脳組織を、損傷と見なした（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｍａｒｋｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。上記病変に加えて、組織損傷スコアは、ＨＩ損傷から２１日後の長期組織学的試験のために使用した群で組織萎縮および空洞化も含んでいた。外側皮質中の脳損傷の重症度を、以下の３つのレベルを使用して評価し、海馬の歯状回ならびにＣＡ１−２、３、および４亜領域を以下の２つのレベルを使用して評価し、線条体を以下の１つのレベルを使用して評価した：０＝損傷なし、１＝５％未満の組織損傷；２＝５０％未満の組織損傷；３＝５０％を超える組織損傷、および４＝９５％を超える組織損傷（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄＳｉｅｓｊ６，１９９２。データ分析のために異なる脳領域の平均組織損傷スコアを使用した（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。試験終了前に死亡した任意の動物を、組織学的分析から排除した。処置群に対する各盲検によって組織学的性質を分析した。
【００２４】
（免疫組織化学）
グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、イソレクチンＢ４、カスパーゼ−３、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を使用して、反応性膠細胞ならびにアポトーシスおよび増殖を受けた細胞をマークした。
４匹の正常なコントロールラットと共に、パラフィン組織上のコントロールおよびＧＰＥ処置ＨＩラット（実験２）における免疫組織化学染色を行った。一定レベルの海馬を含む冠状切片（６μｍ）を切断し、染色のためにクロム−ミョウバンコーティングスライド上に置いた。切片を、キシレン中で脱パラフィンし、一連のエタノールで脱水し、０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした。抗原のアンマスキングのために（カスパーゼ−３およびＰＣＮＡ染色）、切片を１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中、１分間高出力で加熱した。全切片を、１％Ｈ2Ｏ2を含む５０％メタノールで３０分間前処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させた。次いで、１．５％正常ウマ血清または２．５％正常ヒツジ血清を含むＰＢＳを室温で１時間適用して、非特異的バックグラウンド染色をブロッキングした。次いで、切片を以下の一次抗体とインキュベートした：モノクローナルマウス抗ＧＦＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、５００倍希釈）；ポリクローナルウサギ抗カスパーゼ３ｐｌ７抗体（切断カスパーゼ−３抗体、活性化カスパーゼ−３の巨大な１７〜２０ｋＤａのフラグメントを検出する、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ、１０００倍希釈）；マウス抗ＰＣＮＡ抗体（ＤＡＫＡ，Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ、１００倍希釈）。一次抗体との４℃で２日のインキュベーション後（一晩インキュベートしたＰＣＮＡ染色以外）、切片をビオチン化ウマ抗マウス二次抗体またはヤギ抗ウサギ二次抗体（２００倍、Ｓｉｇｍａ）と４℃で一晩インキュベートした。使用１時間前に調製したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ、２００倍）を、室温で３時間適用し、０．０５％３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＰＢＳ中で反応させて褐色反応生成物を得た。切片を一連のアルコールおよびキシレン中で脱水し、封入剤を使用してカバースリップで覆う。コントロール切片を、インキュベーション溶液から一次抗体を省略すること以外は同一の方法で処理した。
【００２５】
小膠細胞の特異的視覚化のために、グリフォニア・シンプリシフォリア・シーズ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｓｅｅｄｓ）由来のイソレクチンＢ４（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）をマーカーとして使用した。脱パラフィン後の内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させるために、切片を１％Ｈ2Ｏ2含む５０％メタノールで３０分間前処理した。次いで、これらの切片を、トリス緩衝化生理食塩水で希釈した（４倍）イソレクチン一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、その後ＤＡＢ中で発色させた。
ＴｄＴ媒介ｄＡＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色のために、切片をプロテイナーゼＫ（４０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１５分間前処理し、ＰＢＳで洗浄し、１％Ｈ2Ｏ2を含むメタノールと１０分間保持して非特異的ペルオキシダーゼ活性を遮断した。次いで、切片を、ＰＢＳで再度洗浄し、ＴｄＴ緩衝液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と５分間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを、ＴｄＴおよびビオチン−１４−ｄＡＴＰ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）にて３７℃で１時間標識した。その後、切片をＳＳＣ緩衝液中で洗浄し、ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と２時間インキュベートした。洗浄後、切片をＤＡＢ基質で発色させた。切片をアルコールで段階的に脱水し、ＤＰＸを使用してマウントした。ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で前処理して、ポジティブコントロールとして使用する全ＤＮＡに切れ目を入れた。インキュベーション溶液からＴｄＴを省略してネガティブコントロールスライドを得た。
海馬両側のＣＡ１−２、ＣＡ３、およびＣＡ４亜領域の錐体細胞層内のカスパーゼ−３、ＴＵＮＥＬ、ＧＦＡＰ、ＰＣＮＡ、およびイソレクチンＢ−４陽性細胞を計数した。
【００２６】
（実施例４：放射免疫アッセイ）
血漿およびＣＳＦ中のＧＰＥ濃度を、新規且つ特異的な二重抗体放射免疫アッセイによって測定した（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３；２００２年３月１４日提出の米国特許出願番号１０／１００，５１５号；およびＧｒｅｇｏｒｙ  Ｂｒｉａｎ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｂｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ，ｉｎｖｅｎｔｏｒｓによって同時提出された発明の名称が「抗ＧＰＥ抗体、その使用、およびＧＰＥの分析方法」の米国特許出願（代理人整理番号：ＮＲＮＺ  １０１６ＵＳ２  ＤＢＢ）（それぞれ本明細書中で完全に援用される）。アッセイ前に抗体結合形態を標準化し、抗体認識を最大にするために、ＧＰＥサンプル、標準、およびトレーサーを、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して誘導体化した。誘導体化ＧＰＥ放射免疫アッセイは、ラット血漿を使用した完全な並行処理およびアッセイ前に添加した非標識ＧＰＥの回収率（８３％）を示す（ｎ＝６）。ＥＤ５０は１９５ｐｇ／チューブであり、検出限界は２ｐｇ／ｍｌであった。アッセイ内ＣＶは、０．５から２５ｎｇ／ｍｌの範囲で１０％未満であった。検量線から読み取った任意のサンプルを再アッセイ前にさらに希釈した。
【００２７】
（実施例５：統計分析）
組織学的データおよび免疫組織化学的データを、従属因子（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）として処置した脳領域と共に多重比較のための二元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のボンフェローニ事後検定を使用して分析した。ＣＳＦおよび血漿中のＧＰＥレベルを、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。
【００２８】
（実施例６：ＧＰＥの薬物動態学）
ＨＩ損傷ラットにおける３ｍｇ／ｋｇのＧＰＥの単回ｉ．ｖ．注射直後にＧＰＥの血漿濃度がベースライン（８．１±４．１ｎｇ／ｍｌ）から２３６．６±５０．０ｎｇ／ｍｌまで増加した（図１Ａ）。次いで、ＧＰＥレベルは、８分以内にベースライン値（９．８±１．３３ｎｇ／ｍｌ）に急速に減少した。血漿中のＧＰＥの半減期は、２分未満であると評価された。
ビヒクル処置ＨＩコントロール群（０．７２±０．３６ｎｇ／ｍｌ、図１Ｂ）と比較して、ＨＩ損傷ラットのＧＰＥの連続的Ｉ．Ｖ．注入後（３ｍｇ／ｋｇ／時間で４時間）のＣＳＦ中のＧＰＥレベル（７．７５±１．８７ｎｇ／ｍｌ）は、有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。非ＨＩ損傷ラットにおけるＧＰＥ処理群（１．９４±０．３６ｎｇ／ｍｌ）とビヒクル処理群（１．５５±０．８８ｎｇ／ｍｌ）との間のＣＳＦ中のＧＰＥレベルの相違は認められなかった。
【００２９】
（実施例７：ＧＰＥ処置研究）
ＨＩ脳損傷により、ＨＩ損傷から４日後の結紮右半球で重篤なニューロン損傷が認められた（表２）。海馬の全亜領域で大規模な神経喪失が認められた。選択的ニューロン喪失、組織全壊死、および細胞反応が大脳皮質、海馬の全亜領域、歯状回、および線条体で混在していた。左海馬ではニューロンの喪失は認められなかった。
【００３０】
2007509169.tif 000003
【００３１】
ＨＩ損傷から２時間後に１５ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．ボーラス用量のＧＰＥを注射した動物では、ビヒクル処置群と比較して組織損傷スコアのわずかな減少が認められたが（全てＰ＝０．０４７）、各脳領域群において相違は認められなかった（表２）。対照的に、ＨＩ損傷から１〜５時間後に３ｍｇ／ｋｇボーラス注射、およびその後ＧＰＥの連続的３ｍｇ／ｋｇ／時間のｉ．ｖ．注入（全用量は１５ｍｇ／ｋｇ）を行った動物では、ビヒクル処置群と比較した場合、組織損傷スコアが非常に有意に減少した（全てＰ＜０．０００１）。事後分析は、ＧＰＥ処置が試験した全脳領域の組織損傷を有意に減少させる（Ｐ＜０．０１）ことを示した。
ＧＰＥは、最初のボーラスｉｖ注射を行うことなく損傷から１時間後に４時間のｉｖ注入を開始した場合、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間の広い有効用量範囲を示した（以下の表３）。
【００３２】
2007509169.tif 000004
【００３３】
2007509169.tif 000005
【００３４】
０．０３ｍｇ／ｋｇ／時間の用量ではＧＰＥの神経保護効果は認められなかった（上記表３）。ＧＰＥはまた、治療機会を損傷から３〜７時間後または７〜１１時間後に延長した場合に、損傷を軽減させた（上記表４）。
ビヒクル処置群では、ＨＩ損傷から２１日後の重篤な脳障害を有するラットの同側半球内に組織の空洞化および萎縮が見出された。平均組織損傷スコアは、１．２８±０．１１（ｎ＝６）であった。ＧＰＥ（０．０１±０．０１、ｎ＝６、Ｐ＜０．０００１、図２Ａ）での処置により、組織損傷スコアが有意に減少し、ＧＰＥで処置した６匹のラットのうちの１匹で軽度の線条体損傷が認められた。
正常なコントロール群と比較した場合（１．０５±０．０６）、ＨＩ損傷では、パッチ接触に要する時間のＬ／Ｒ比が有意に増加した（全て２．４５±０．５１、Ｐ＜０．０００１、図２Ｂ）。以前の報告（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１ａ）と同様に、ビヒクル処置群では、行動の欠陥を生じ、３日後に最大になり、１０日目に自発的に回復した。ＨＩ損傷から１〜５時間後の３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥでの処置により、パッチへの接触時間のＬ／Ｒ比は、ビヒクル処置群（２．４５±０．５１、Ｐ＜０．０１、図２Ｂ）と比較して、有意に減少した（１．０８±０．０７）。
【００３５】
（実施例８：免疫組織化学的分析）
海馬のコントロール側にはカスパーゼ−３陽性細胞はほとんど認められなかった（平均１８．９±３．９細胞、データは示さなかった）。ＨＩ脳損傷により、海馬のコントロール側（１８．９±３．９細胞）と比較して同側（右）海馬の全亜領域でカスパーゼ−３陽性細胞が増加した（１６０．５±８３．４細胞、図３Ａ）。カスパーゼ−３陽性細胞のこの増加は、ＣＡ４亜領域でより顕著であった（３２５．５±５５．２細胞）。ＧＰＥでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、海馬（２９．９±１０．６細胞、全てＰ＜０．０１）、特に海馬のＣＡ４亜領域（４７．７±３１．８細胞、Ｐ＜０．０１）でカスパーゼ−３陽性細胞数が有意に減少した（図３Ａ）。海馬のコントロール側にＴＵＮＥＬ陽性細胞は認められなかった。同様に、ＨＩ損傷により、海馬のコントロール側と比較して、同側海馬（１５５．５±１０５．０細胞）、特にＣＡ３亜領域（３６５．５±１３２．６細胞、図３Ｂ）で検出されたＴＵＮＥＬ陽性細胞数が増加した。ＧＰＥでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、海馬（１０．６±０．７細胞）、特に海馬のＣＡ３亜領域（１１．７±１１．７細胞）でＴＵＮＥＬ陽性細胞数が有意に減少した（Ｐ＜０．０１）（図３Ｂ）。
【００３６】
ＨＩ損傷に応答して、イソレクチンＢ−４陽性細胞が存在しないコントロール側と比較して、損傷海馬の全ての亜領域でのイソレクチンＢ−４陽性小膠細胞数が増加した（２０．９±１．１８細胞）。ＧＰＥでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、特にＣＡ３およびＣＡ４亜領域中（Ｐ＜０．０５）のイソレクチンＢ−４陽性細胞数が有意に減少した（２９±０．４細胞、全てＰ＜０．０００１）（図４Ａ）。ＰＣＮＡ陽性細胞数は、コントロール側（１．６±０．７細胞、データは示さなかった）と比較して、同側海馬で増加した（１３０．９±８．９細胞）。ＧＰＥでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、同側海馬、特にＣＡ１−２およびＣＡ４亜領域中（Ｐ＜０．０５）のＰＣＮＡ陽性細胞数（Ｐ＜０．０５）が有意に減少した（３０．９±５．１細胞、Ｐ＜０．０００１）（図４Ｂ）。ビヒクル処置動物においてＨＩ脳損傷により、非注射コントロール海馬と比較して、同側海馬、特にＣＡ４亜領域中のＧＦＡＰ陽性星状細胞数（Ｐ＜０．０５）が有意に減少した（図４Ｃおよび４Ｄ）。対照的に、ＧＰＥ処置群における同側海馬と対側海馬との間でＧＦＡＰ陽性細胞数の相違は認められなかった（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００３７】
本研究は、ＨＩ脳損傷後の成体ラットにおける４時間の連続的ｉ．ｖ．注入後にＧＰＥによって強力且つ即効性のある神経保護効果が得られることを証明した。対照的に、ＧＰＥの単回ｉ．ｖ．投与ではわずかで時折ばらつきのある効果しか得られなかった。ｉ．ｖ．注入後のＧＰＥの神経保護効果は、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間と有用用量範囲が広く、且つ治療機会はＨＩ損傷から７〜１１時間後に延長された。ＧＰＥ注入によって、長期神経保護が達成され、損傷から２０日後の体性知覚−運動機能が改善された。海馬におけるＧＰＥの神経保護効果は、カスパーゼ−３依存性および独立性ニューロンアポトーシスの阻害に関連した。ＧＰＥが虚血性損傷後の星状細胞の生存を促進し、小膠細胞の増殖を抑制するという証拠も存在した。
【００３８】
図５Ａは、２つのＧＰＥ投与プロトコール（一方は、事前のボーラス注射後のＧＰＥ注入（ｉ．ｖ．）を含み、他方は事前のボーラス注射を行わないＧＰＥ注入を含む）を比較したグラフを示す。図５Ａでは、ボーラス後のＧＰＥ投与（右のカラム）によってほぼ２０の損傷スコア（ＧＰＥ／ビヒクル比）が得られるのに対して、事前のボーラス注射を行わない注入として投与したＧＰＥ（左のカラム）によってより低いニューロン損傷スコア（ＧＰＥ／ビヒクル比）が得られた。したがって、本発明者らは、注入のみのプロトコールにおけるＧＰＥの全用量がボーラス＋注入プロトコールを使用して送達された全用量よりも低い場合でさえも、典型的な「負荷用量＋注入」プロトコールがＧＰＥ注入のみよりも神経保護効果が低いことを予想外に見出した。この所見は、ＧＰＥの用量関連効果を考慮した場合にさらにより驚くべきものであり、０．３ｍｇ／ｋｇ／時間〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲におよぶ用量の増加につれてＧＰＥ効果の増加を示す。
【００３９】
図５Ｂは、ボーラスを使用しないか（各対の左のカラム）ボーラス後（各対の右のカラム）にビヒクルまたはＧＰＥを注入した動物の脳損傷スコアのグラフを示す。
医薬産業では、一般に、虚血性脳損傷を治療するための神経保護化合物は依然として同定されていない（Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ，２０００）（Ｇｌａｄｓｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。いくつかの成長因子形態が、種々の虚血性脳損傷後に神経保護効果を示すことが報告されているにもかかわらず、その潜在的有糸分裂誘発効果およびＢＢＢ通過が困難であることは成長因子（ＩＧＦ−１が含まれる）の臨床開発を制限していることが充分に認識されている。小ペプチドがＣＮＳにより接近可能であることを考慮すると（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、薬物開発では現在小分子が注目されている。
【００４０】
（実施例９：薬物動態学研究のデザイン）
１７０ｇと２４０ｇとの間の成体雄Ｗｉｓｔａｒラットを使用した。動物を、それぞれ群あたり６匹の動物からなる３つの処置群のうちの１つに割り当てた。静脈内ボーラス注射および採血を容易にするために、全ラットに、実験３日前にハロタン麻酔下で留置頸静脈カニューレを外科的に移植した。
動物に、３０ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇのＧＰＥを含む０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ６．５）の単回静脈内ボーラス注射を行った。血液サンプル（約２２０μｌ）を、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７）で９倍希釈した哺乳動物組織用の２０μｌ  Ｓｉｇｍａプロテアーゼインヒビターカクテルを含むヘパリン処理チューブに採取した。サンプルを、注射２０、および１０分前、注射時、１、２、４、８、１６、３２、および６４分後に採取した。使用したプロテアーゼインヒビターカクテルは以下を含む：１０４ｍＭのＡＥＢＳＦ、８０μＭのアプロチニン、２．１ｍＭのロイペプチン、３．６ｍＭのベスタチン、１．５ｍＭのペプスタチンＡ、および１．４ｍＭのＥ−６４。サンプルを３０００×ｇにて４℃で１５分間遠心分離し、血漿を除去し、抽出およびアッセイまで−８０℃で保存した。
静脈内ボーラス注射から有意な時間を経て、以下の式に従った一次反応の後にＧＰＥが消失した：Ｃ＝Ｃ0e-kt（式中、Ｃは特定の測定点におけるＧＰＥ濃度を示し、Ｃ0は時間（ｔ）が０である場合の濃度であり、ｋは濃度／時間の単位で示される一次速度定数である）。ｋおよび半減期（ｔ1/2）を、以下のように時間に対する血漿濃度の半対数プロットの消失期における線形回帰線の勾配から計算した：ＬｏｇＣ＝−ｋｔ／２．３＋ｌｏｇＣ0。結果を、平均±標準誤差で示した。
【００４１】
〔結果〕
（放射免疫アッセイ）
特異的且つ感度の高いＧＰＥのＲＩＡの開発および立証後、ＧＰＥの薬物動態学的性質を、ｉ．ｖ．投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで決定した。ＧＰＥの血漿濃度は、ｉ．ｖ．ボーラス注射から１分以内に顕著に増加した（図６）。３０ｍｇ／ｋｇ（図６Ａ）および１００ｍｇ／ｋｇ（図６Ｂ）のＧＰＥの注射後、４０±１０．８および６８９±１２５μｇ／ｍｌのピーク濃度が認められた。次いで、血漿濃度は、一次反応で急速に減少した。一次速度定数は、０．１５±０．０１４（ｎｇ／ｍｌ／分、ｎ＝１２）と計算され、半減期は４．９５±０．４３（分、ｎ＝１２）と計算され、推定クリアランスは、１３７．５±１２．３（ｍｌ／時間、ｎ＝１２）である。本発明者らは、全身循環系からの非常に短い半減期を有するＧＰＥのクリアランスは非常に急速であり、循環系における安定なＧＰＥ濃度を反復注射または継続的注入によって得ることができると結論づけた。
【００４２】
（ＨＰＬＣ分析）
薬物動態学的データは、ラット循環系からの非常に急速なＧＰＥクリアランスを示した。したがって、本発明者らは、急速なクリアランスが最初の通過クリアランスであるのか、または代謝経路を介するのかどうかを調査した。ＨＰＬＣ溶離プロフィールは、ＧＰＥは約７２分の保持時間で溶離することを示した（図７）。ピークは鋭く、コントロール血漿を超えて明確に検出可能である。「スパイクされていない（ｕｎｓｐｉｋｅｄ）」天然の血漿では、ＨＰＬＣによってＧＰＥは検出されなかった。
使用したＨＰＬＣ法は、ＧＰＥの全ての潜在的な代謝産物（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）および各アミノ酸（グリシン、プロリン、およびグルタミン酸））を検出することができた。ベースラインでは、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏのレベルは、それぞれ１１、３１、および３１μｇ／ｍｌであった。ＧＰＥおよびＧｌｙ−Ｐｒｏは、このＨＰＬＣ法の限界感度（３００ｎｇ／ｍｌ）未満であった。３０ｍｇ／ｋｇのＧＰＥのｉ．ｖ．ボーラス注射の１分後、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏのレベルは、それぞれ８６、６２、および８０μｇ／ｍｌに増加した（図７）。ＧＰＥレベルは３３μｇ／ｍｌであったが、ジペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏを、４４μｇ／ｍｌの広いピークとして同定することができた。８分後、全ての代謝産物およびＧＰＥのレベルは、ベースラインレベルに戻った。Ｐｒｏ−Ｇｌｕは、いかなるサンプルにおいても同定することができなかった。
したがって、本発明者らは、ＧＰＥの代謝分解は循環系内で起こり、反復注射、継続的注入、ボーラス注射と注入との組み合わせ、または徐放法のいずれかによってＧＰＥ濃度を安定にすることができることを見出した。
【００４３】
（結論）
本発明のある実施形態は、ラットにおけるＧＰＥの薬物動態学的性質を決定するためのＧＰＥアッセイの使用に関する。本発明者らが３０および１００ｍｇ／ｋｇのＧＰＥの単回ｉ．ｖ．ボーラス後の血漿ＧＰＥ濃度を測定した実験では、ＧＰＥの投与により、血漿ＧＰＥ濃度が有意であるが一過性に増加し、崩壊期間中に４．９５分の平均半減期で消滅した。認められた血漿半減期は、ＧＰＥが多数の条件下での細胞分解または細胞死で有効であり得ることを示す先行技術の研究に基づいては全く予想外であった。本発明者らは、ＧＰＥの単回注射でさえも細胞分解および／または細胞死を減少させることができることを以前に証明していた。したがって、これらの条件下でのＧＰＥの血漿半減期が約２〜約５分という所見は、ＧＰＥの治療効果が強力であることを示す。半減期は使用容量に影響を受けなかったが動物によってそれぞれ変動することを示す。ピーク用量の変動の大きさはまた、動物およびサンプルを得るのに必要な時間によるそれぞれのばらつきを反映する。
【００４４】
ＨＰＬＣ研究は、ＧＰＥのタンパク質分解はジペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏの形成を介するが、Ｐｒｏ−Ｇｌｕはいかなるサンプル中でも検出されなかったことを示す。これにより、ＧＰＥの代謝は最初にＣ末端グルタミン酸の除去に関与し、その後に残存ジペプチドであるＧｌｙ−Ｐｒｏのその構成アミノ酸への急速なタンパク質分解に関与することが示唆される。この所見はまた、カルボキシペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼ、およびアミノペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼ、ならびに他の血漿酵素がラットの血漿中のトリペプチドを分解することができることを示す。この所見はまた、ペプチダーゼインヒビターまたはプロテイナーゼインヒビターとのＧＰＥの同時投与がＧＰＥの能力の増大および／または動物中のＧＰＥの半減期の延長の両方によってＧＰＥの治療効果を改良することができることを示す。
【００４５】
ＧＰＥの静脈内ボーラス注射後に、１２匹のラットから一次速度および血漿サンプルを得た。時間に対する血漿濃度の半対数プロットの消失期における線形回帰線の勾配から消失速度定数および半減期を決定した。しかし、本発明者らは、血漿中のペプチダーゼによるＧＰＥの急速な分解によってゼロ時間におけるＣｍａｘを正確に得ることができなかった。したがって、本発明者らが得ることができる最大濃度は、理論用量よりも低い１分の測定点でのものである。公知のように、半減期は、使用容量に影響をうけないが、各動物または他の要因の影響を受ける。速度定数に推定分布容量を掛けたものから推定クリアランスを計算した。別の所見は、腹腔内に投与した場合にＧＰＥが神経保護を示すことであり、これはＧＰＥ吸収を示し、依然として調査されていない他の機構に影響をうけ得る（５）。
興味深いことに、絶食小型ラット（本研究の範囲外のコントロール群）の基底レベルは約２．５ｎｇ／ｍｌであったが、給餌Ｗｉｓｔａｒラットの基底レベルは約１０ｎｇ／ｍｌであり、低レベルのＧＰＥが血漿中に存在することを示した。１つの潜在的な供給源は、脳および血清中のプロテアーゼによるＩＧＦ−１のｄｅｓ１−３およびＧＰＥへのタンパク質分解である。
【００４６】
本所見に基づいて、連続的静脈内注入は、治療的なＧＰＥの血液レベルを達成および保持するための有用な薬物送達様式である。反復静脈内ボーラス投与法は、濃度を過度に変動させることなく所望の平均ＧＰＥ血漿濃度を達成するためには非現実的に短い間隔がおそらく必要であろう。同様に、血漿中のタンパク質分解性代謝産物レベルにより、腹腔内注射または筋肉内注射によっても作用部位に到達し得る前にＧＰＥが有意に喪失することが示唆される。連続的静脈内注入投与計画により、遭遇する原発性および続発性虚血事象の両方を治療することもできる。
安定な物質濃度を得るための当該分野で公知の他の方法を使用することもできる。例えば、移植可能な「ミニポンプ」（例えば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、所望の位置にＧＰＥを連続的に注入することができる。別の実施形態では、徐放（ｓｈｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）組成物（カルボキシポリサッカリド／ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、およびポリリジンなど）を使用して、移植用およびマトリクス材の生分解のための組成物を製造することができ、ＧＰＥを遊離して治療効果を得ることができる。このようなデバイスおよび組成物を治療部位に局所的に配置することができ（例えば、脳、脊髄、末梢神経系）、それにより治療活性ＧＰＥを徐放することができる。
【００４７】
本発明者らは、これらの非抗原性小ペプチドまたは分子の分析のための有用で迅速且つ新規のアプローチを得るためのハプテンに対する感受性および特異性を増大させるための抗原を含むハプテンの合成で使用される誘導体化化学を活用した新規の管内サンプルの調製および分析方法を開発した。以前は、研究者は、アッセイ感度におけるヨード化の影響を最小にするためにＢｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬を使用していた。これは、本発明者らの知る限りでは、標的分子のアッセイ感度を増加させるために使用した最初である。次いで、本発明者らは、この方法を使用して最初にＧＰＥのレベルおよびクリアランスを同定した。本発明者らのデータにより、臨床試験のためのその可能な投与経路が静脈内注入であることが示唆される。
【００４８】
（実施例１０：ＧＰＥの遅延投与は有効である）
実施例１に記載のように、動物の研究および手術を行った。
（治療研究）
１４〜１６匹のＨＩ損傷ラットおよび１４〜１６匹のコントロール（ビヒクル処置）動物を個別に研究した。一方の研究では、ＨＩ損傷は比較的軽度であり、他方の研究では、ＨＩ損傷は重篤であった。各動物に、ＨＩ損傷から２４〜２８時間後にビヒクルまたは１２ｍｇ／ｋｇのＧＰＥのいずれかでの４時間の連続ｉ．ｖ．注入を行った。ＨＩ損傷から４日後にラットを屠殺し、組織学的分析のために脳を採取した。実施例３に明記するように、組織学的手順を行った。実施例５に記載のように統計的分析を行った。
（結果）
各研究では、ＨＩによって実質的に神経が損傷し、重症低酸素症の動物（図９）の損傷スコアは約１．５と約２．５との間であった。他の研究では（図８）、神経損傷スコアは約１〜約５と軽度であった。
ＧＰＥは、各群でＨＩに起因するニューロン損傷を減少させた。軽症低酸素症動物では、ＧＰＥは、損傷スコアを実質的且つ統計的に有意に減少させた（図８）。図８は、ＨＩ損傷から２４〜２８時間後に投与したＧＰＥの効果のグラフを示す。各カラム対について、左側は、ビヒクルの効果を示し、各対の右側はＧＰＥの効果を反映する。研究した各脳領域について、時間内に注入したＧＰＥにより、有意な神経保護が得られた。
【００４９】
重症低酸素症動物では、ＧＰＥは、研究した各脳領域の損傷スコアを再現可能に減少させた（図９）。しかし、本研究では、ＨＩ損傷の程度は、図８中の動物の程度より大きかった。図８と同様に、研究した各脳領域では、ＧＰＥは、ビヒクルコントロールと比較して神経保護を増加させた。したがって、図９中の神経保護の程度が図８で示された程度よりもいくらか低いにもかかわらず、これらの両研究は、損傷から２４時間後に投与した場合でさえもＧＰＥが神経保護効果を有し得ることを示した。
今までに動物モデルで試験された最も神経保護効果が高い薬剤は、３時間未満の治療機会しか持たず、最初の損傷から６時間後以内に投与した場合に依然として有効性を示し得る薬剤はほとんどなかった。ＧＰＥと対照的に、神経保護効果を有する他の薬物群は、初期投与によって悪化するので、治療機会の延長は制限される（例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））。本発明者らは、ＧＰＥの有効な治療機会は、損傷から少なくとも１〜２４時間後であることを証明し、前損傷治療が脳損傷の減少に有効であることも見出された。これらの所見に基づいて、ＧＰＥの治療機会は、神経損傷治療で公知の治療機会で現在最も広範である。
【００５０】
他方では、脳損傷の程度によって治療機会が決定されるようであった。損傷がより軽度である場合、ニューロンはより段階的に死滅し、より延長された治療機会が得られるのに対して、ニューロン損傷がより重篤である場合、治療機会は短縮され得ることが公知である。一般に、前臨床開発で使用される動物モデルは、ヒト患者よりもより一層重篤であるので、より多数のヒト患者が軽度の脳損傷に相当し得る。
提供する実施例および説明は、本発明の態様を例示することを意図し、本発明を制限することを意図しない。当業者は他の特定の実施形態を得ることができ、これらは全て本発明の一部と見なされる。本明細書中で引用した全ての刊行物は、その全体が参照としてふくまれる。
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載する。本発明の他の態様および特長を、図面の概説から理解することができる。
【００５１】
（参考文献）
2007509169.tif 000006
【００５２】
2007509169.tif 000007
【００５３】
2007509169.tif 000008
【００５４】
2007509169.tif 000009
【００５５】
2007509169.tif 000010
【００５６】
2007509169.tif 000011
【００５７】
2007509169.tif 000012
【００５８】
2007509169.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】成体ラットにおいてＨＩから２時間後に３ｍｇ／ｋｇ  ＧＰＥの単回ｉ．ｖ．ボーラス注射を行った後のＧＰＥの血漿濃度のグラフを示す。ｎ＝１０動物。
【図１Ｂ】正常なラットおよびＨＩ損傷ラットにおける３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥのｉ．ｖ．注入から４時間後のＣＳＦ中のビヒクルまたはＧＰＥレベルを示す図である。ＨＩ損傷ラットを、損傷から１〜５時間後に処置した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。ｎ＝６〜９動物／群。＊ＨＩ損傷ビヒクルコントロール群と比較してＰ＜０．０５。
【図２Ａ】ラットの異なる脳領域における長期ニューロン生存に対するビヒクルまたはＧＰＥの効果のグラフである。ＨＩ脳損傷から１〜５時間後に動物に３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥ（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝６）を動物に注入した。ＨＩ損傷から２１日後に長期の組織学的結果および挙動の結果を試験した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。＊＊＊ビヒクルコントロール群と比較してＰ＜０．００１。
【図２Ｂ】図１Ａにも示した動物中の身体機能（ｓｍａｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）の回復を示すグラフである。
【図３Ａ】カスパーゼ−３に対する抗体を使用して検出した損傷右海馬中のアポトーシス細胞に対するビヒクルまたはＧＰＥの効果を示すグラフである。データを、平均±ＳＥＭとして示す。ｎ＝１１〜１６動物／群。ＨＩ脳損傷から１〜５時間後の動物に、３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥまたはビヒクルを注入し、４日後に屠殺した。ビヒクルコントロール群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ｂ】図３Ａと同一の動物におけるＴＵＮＥＬ染色を使用して検出した損傷右海馬中のアポトーシス細胞に対するビヒクルまたはＧＰＥの効果を示すグラフである。
【図４】ビヒクルまたはＧＰＥで処置したラット海馬中の細胞数を示すグラフである。データを、平均±ＳＥＭとして示す。ｎ＝１３〜１４動物／群。ＨＩ脳損傷から１〜５時間後の動物に、３ｍｇ／ｋｇ／時間のＧＰＥまたはビヒクルを注入し、４日後に屠殺した。ビヒクルコントロール群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。＃非注射左側と比較してＰ＜０．０５。図４Ａは、イソレクチン−Ｂ４陽性小膠細胞に対するビヒクルまたはＧＰＥの効果を示すグラフである。図４Ｂは、ＰＣＮＡ陽性細胞に対するビヒクルまたはＧＰＥの効果を示すグラフである。図４Ｃおよび図４Ｄは、海馬中のＧＦＡＰ陽性星状細胞に対するビヒクルまたはＧＰＥの効果を示すグラフである。
【図５Ａ】事前のボーラス注射なし（左側のカラム）または３ｍｇ／ｋｇのボーラス注射後に投与したＧＰＥの神経保護効果を示すグラフである。
【図５Ｂ】ビヒクル（各対の左側のカラム）またはＧＰＥ（各対の右側のカラム）のいずれかのボーラス注射（カラムの左の対）またはボーラス＋注入（カラムの右の対）の効果を示すグラフである。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血漿中のＧＰＥ（３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．ボーラス）の薬物動態学を示す図である。０．０１±０．００２μｇ／ｍｌのベースラインと比較して、３０（４０±１０．８μｇ／ｍｌ）（図６Ａ）および１００（６８９±１２５μｇ／ｍｌ）（図６Ｂ）ボーラスｉ．ｖ．注射直後（１分）に血漿中のＧＰＥレベルの急激な増加が認められた。このレベルは、４．９５±０．４３分の半減期でベースラインに急速に減少した。（括弧内のデータは、６回の平均±６である）。
【図７】３０ｍｇ／ｋｇ  ＧＰＥのｉ．ｖ．投与から１、２、および８分後の血漿中のＧＰＥ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ−ＰｒｏのレベルのＨＰＬＣ分析を示す。ＧＰＥの保持時間は７２分であり、ジペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏは約８８分の保持時間で広範なピークとして検出された。グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）は、それぞれ、１７．７分、３７．５分、および７５．２分に溶離された。
【図８】軽度のＨＩ損傷から２４時間後にＧＰＥに曝露した動物における神経保護効果を示すグラフである。
【図９】重度のＨＩ損傷から２４時間後にＧＰＥに曝露した別の動物群における神経保護効果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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