(57)【要約】  本発明は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  ７２ｋＤａ外膜タンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）及びそのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ感染症（腸内スピロヘーター感染症）を予防（ワクチン接種）または治療処置するためのこれらの配列の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列２−配列２２から成るグループから選択されたアミノ酸配列、
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列に少なくとも６０％相同のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列に少なくとも８０％一致のアミノ酸配列、または、
（ｉｖ）配列２によってコードされているポリペプチドの生物活性をもつ（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのフラグメント、
からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列１に示すヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に定義した配列の縮重形に対応するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）−（ｉｉｉ）の配列に選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列、
（ｖ）配列（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
（ｖｉ）プライマーまたはプローブとして使用するための適当な（ｖ）の配列のフラグメント、
からなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された請求項２（ｉ）−（ｉｖ）に記載のポリヌクレオチドを含む細胞をポリペプチド発現条件下で培養する段階と、
（ｉｉ）発現したポリペプチドを回収する段階と、
を含む請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項４】
クロマトグラフィーを使用してポリペプチドを回収する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィーがＮｉ−キレート化カラム及び／またはゲル濾過の使用を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項２に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のアミノ酸配列に特異的な抗体。
【請求項９】
更に、検出可能なラベルを含む請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチドをキャリアータンパク質にコンジュゲートする段階と、
（ｉｉ）（ｉ）のコンジュゲートとアジユバントとを動物に投与する段階と、
（ｉｉｉ）生じた抗体を動物から単離する段階と、
を含む抗体の製造方法。
【請求項１１】
（ｉ）適当なハイブリダイズ条件下でサンプルを請求項２（ｖｉ）に記載のポリヌクレオチドに接触させる段階と、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドとサンプル中のヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖を検出する段階と、
を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種を選択するためのサンプルのスクリーニング方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが配列２４及び配列２７−３７から成るグループから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）反応複合体が形成され得る条件下でサンプルを請求項８に記載の抗体に接触させる段階と、
（ｉｉ）反応複合体を検出する段階と、
を含む、請求項１に記載のポリペプチドを選択するためのサンプルのスクリーニング方法。
【請求項１４】
（ｉ）反応複合体が形成され得る条件下でサンプルを請求項１に記載のポリペプチドに接触させる段階と、
（ｉｉ）反応複合体を検出する段階と、
を含む、請求項８に記載の抗体を選択するためのサンプルのスクリーニング方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項２（ｖｉ）に記載のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドとサンプル中のヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖を検出する手段と、
を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種を選択するためのサンプルのスクリーニングキット。
【請求項１６】
（ｉ）請求項８に記載の抗体と、
（ｉｉ）抗体を含む反応複合体を検出する手段と、
を含む、請求項１に記載のポリペプチドを選択するためのサンプルのスクリーニングキット。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチドと、
（ｉｉ）前記ポリペプチドを含む反応複合体の検出手段と、
を含む、請求項８に記載の抗体を選択するためのサンプルのスクリーニングキット。
【請求項１８】
（ｉ）請求項２（ｉ）−（ｉｖ）に記載のポリヌクレオチド配列を該ポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドを発現させる編成形態で含む組成物、
（ｉｉ）請求項１に記載のポリペプチド、または、
（ｉｉｉ）アジュバントを伴う（ｉ）または（ｉｉ）、
から成るグループから選択された組成物を有効量で動物に投与する段階を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する動物の疾患の治療方法。
【請求項１９】
請求項２（ｖ）に記載のポリヌクレオチドを含む組成物を有効量で動物に投与する段階を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する動物の疾患の治療方法。
【請求項２０】
疾患が腸スピロヘーター感染症である請求項１８または１９に記載の疾患治療方法。
【請求項２１】
（ｉ）請求項２（ｉ）−（ｉｖ）に記載のポリヌクレオチド配列を該ポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドを発現させる編成形態で含む組成物、
（ｉｉ）請求項１に記載のポリペプチド、または、
（ｉｉｉ）アジュバントを伴う（ｉ）または（ｉｉ）、
から成るグループから選択された組成物を免疫原性有効量で投与する段階を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する疾患に対する動物の免疫方法。
【請求項２２】
疾患が腸スピロヘーター感染症である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
動物が、ブタ、ニワトリ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、魚及びヒトから成るグループから選択される請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
担体と、（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド、（ｉｉ）請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは（ｉｉｉ）請求項８に記載の抗体とを含む組成物。
【請求項２５】
Ｂｐｍｐ−７２をコードしているポリヌクレオチド配列の一部分に相補的な少なくとも１つのポリヌクレオチドと、適当な容器と、その使用説明書とを含むスクリーニングキット。
【請求項２６】
Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する疾患を治療または予防する医薬を製造するための請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には腸スピロヘーター感染症の分野に関する。特定的には本発明は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのＢｐｍｐ−７２と命名された７２ｋＤａの外膜タンパク質の新規なアミノ酸配列及び該タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列に関する。より特定的には本発明は、トリのような動物種及びヒトのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ感染症（“腸スピロヘーター感染症”）の予防（“ワクチン接種”）及び治療処置におけるこれらの配列の使用に関する。本発明はまた、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉがコロニー化した動物及びヒトの血清学及び分子生物学に基づく診断に関する。本発明は更に、Ｂ．  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ治療薬のスクリーニングに関する。最後に、本発明は本出願に記載したヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に由来の予防、治療及び診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸スピロヘーター感染症またはスピロヘーター性下痢としても知られる腸スピロヘーター感染症（ＩＳ）は、ブタや採卵用メンドリ及びブロイラー産生用メンドリの生産量を抑制する重大な疾患である。ＩＳの原因は、大腸の腸スピロヘーターＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ（正式にはＳｅｒｐｕｌｉｎａ）  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ感染である。このスピロヘーターはまた、イヌのような他の多くの動物種及びヒトにも感染する。ブタの関連疾患が最も理解され研究されている。
【０００３】
オーストラリアの養豚産業では感染率が確認されていないが、ヨーロッパ及びスカンジナビアの調査では飼育されているブタの３０％以上が感染していると示唆されている。関連疾患は、間欠的な下痢及び成長の遅れを伴う大腸炎／盲腸炎である。ブタの罹患による経済的重要度は明らかではないが、ブタ赤痢よりも症状が軽いにしても全般的に感染率がはるかに高いので、軽視できるものではない。
【０００４】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉはまた成鶏にも広く感染している。オーストラリアの最近の調査では、ブロイラー産生用メンドリの４３％及び採卵用メンドリの６８％から腸スピロヘーターが回収され、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉはこれらのメンドリのサブセットの４４％に含まれているスピロヘーターであった。感染群は非感染群よりも平均で１４％水分の多い糞便を排泄していた。この試験で単離したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉをブロイラー産生用メンドリに感染させた実験では、産卵の開始が有意に遅延し、産卵の持続的な減少となった。採卵用メンドリ群だけでなく、ブロイラー産生群でも産卵量が減少し、これは全ブロイラー産業にかなりの打撃となる。これらの問題のコストを査定することは難しいが、オーストラリアではこの産業は重要である。鶏肉産業は２５億ドルの小売価格に相当する鶏肉を生産しており、鶏卵産業は３億４千万ドルの価格の鶏卵を生産している。
【０００５】
イヌ及びその他の動物種に対するＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの病原体機能はまだしっかりと確認されていないが、いくつかの他の要因次第では健康に多少の影響を与えるであろうと考えられる。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉはまた、開発途上国の多くの人々に感染する。先進国の感染は主として免疫低下個体及び同性愛男性に限定される。この感染が高齢者及び／または免疫低下個体のスピロヘーター血症の原因として記録されている。これらのヒト集団グループのＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの病原的影響の完全範囲はいまだ調査中である。
【０００６】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ感染を抑制する手段を開発するための研究は少ない。豚舎でＩＳが問題であることが確認されると、常套的には動物を抗生物質で治療するが、治療をやめると病気が再発し易い。しかしながら、ニワトリの病気は十分に解明されていないので、養鶏産業が感染の抑制を特に試みることはなかった。
【０００７】
ブタのＩＳを抑制するワクチンの使用に関する研究の記録が一つだけ存在する。この自原的バクテリンは感染防御に成功しなかった（Ｈａｍｐｓｏｎ  ＤＪ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＩＤ，Ｌａ  Ｔ，Ｏｘｂｅｒｒｙ  ＳＬ  ＆  Ｐｅｔｈｉｃｋ  ＤＷ（２０００）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ）ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：７５−８４）。しかしながら、大腸粘膜に対するスピロヘーターの特異的エンドオン付着が存在するので、適当なワクチン誘導免疫の使用によってコロニー化を抑制または防止できる可能性は高いと考えられる。
【０００８】
本発明は、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのこれまでに同定されたことのない新規なアミノ酸配列及び該配列をコードしているポリヌクレオチド配列を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
我々は、本文中でＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ膜タンパク質７２（Ｂｐｍｐ−７２）と呼ぶ新規なアミノ酸配列、並びに、腸スピロヘーター感染症に関連する診断、予防及び治療の目的に特に適したそのアミノ酸フラグメントを同定した。我々はまた、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を同定した。
【００１０】
従って本発明は、配列２に示した配列を含むＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列または該配列に実質的に相同のアミノ酸配列または配列２のアミノ酸配列のフラグメントを提供する。本発明の１つの好ましい実施態様では、配列３−配列２２から選択されるＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列のフラグメントが提供される。
【００１１】
本発明はまた、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列（配列１）またはその相同配列を提供する。好ましくは、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列１に示すヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列１に示すポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントに選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列、（ｃ）遺伝コードの結果として（ａ）または（ｂ）に定義の配列に縮重であるポリヌクレオチド配列、または、（ｄ）上記の項（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列に相補的なポリヌクレオチド配列、から選択される。
【００１２】
また、本発明のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできる検出可能に標識されたヌクレオチド配列も提供される。このような配列は例えば、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列のコーディング領域または非コーディング領域にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、配列２４及び配列２７−配列３７に示すようなＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列をコードしているＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉゲノムＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【００１３】
本発明によって提供されるベクターは、本発明のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を含有するであろう。好ましくはベクターがクローニングベクターまたは発現ベクターである。ベクターが発現ベクターである場合、ベクターは主として、発現コントロール配列に作動可能に結合したＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
また、本発明のポリヌクレオチド配列によって、または、上記に記載のベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた細胞が提供される。好ましい細胞は、細菌、酵母、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞またはブタ細胞の組織培養物などである。
【００１５】
本発明は更に、（ａ）上記に記載の細胞をＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列が発現し得る条件下で培養する段階と、（ｂ）発現したＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を回収する段階とを含むＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の製造方法を提供する。この手順に、（ｃ）Ｎｉ−キレート化カラムでアミノ酸配列をクロマトグラフィー分離する段階、及び、（ｄ）ゲル濾過によってアミノ酸配列を精製する段階を付加してもよい。
【００１６】
本発明はまた、本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特異的な標識及び非標識のモノクローナル及びポリクローナル抗体を提供し、また、本発明のモノクローナル抗体を産生する不死細胞系を提供する。本発明の抗体製造は、（ａ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列をキャリアータンパク質にコンジュゲートする段階と、（ｂ）アジュバントに混合した段階（ａ）のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列フラグメント−キャリアータンパク質コンジュゲートで宿主細胞を免疫する段階と、（ｃ）免疫した宿主動物からＢｐｍｐ−７２特異的抗体を採取する段階とを含む。
【００１７】
本発明は更に、生物サンプル中のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の有無を検出する方法を提供する。方法は、（ａ）安定なハイブリダイズ条件下で本発明のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブまたはプライマーに生物サンプルを接触させる段階と、（ｂ）プローブまたはプライマーとサンプル中のヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖を検出する段階とを含む。
【００１８】
本発明は、サンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の存在を測定する方法を提供する。方法は、（ａ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を含有する疑いのあるサンプルとＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特異的に結合する抗体とを反応複合体の形成が可能な条件下で接触させる段階と、（ｂ）反応複合体の形成を検出する段階とを含み、反応複合体の形成の検出がサンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の存在を示す指標となる。
【００１９】
本発明はまた、生物サンプル中の腸スピロヘーター感染症抗体の検出方法を提供する。方法は、（ａ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントを準備する段階と、（ｂ）該アミノ酸配列を生物サンプルと共に抗体抗原複合体の形成が可能な条件下でインキュベートする段階と、（ｃ）抗体抗原複合体を検出する段階と、を含む。
【００２０】
これに対応して、生物サンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列のレベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定方法が提供される。方法は、（ａ）上述の方法に従って生物サンプル中の反応複合体の形成を検出する段階と、（ｂ）形成された反応複合体の量を測定する段階とを含み、この量が生物サンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列のレベルに対応する。
【００２１】
更に、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する動物宿主の疾患の治療処置をｉｎ  ｖｉｔｒｏモニターする方法が提供される。方法は、このような治療処置を受けている動物宿主からいくつかの異なる時点に採取した一連の生物サンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列のレベルを上述の手順で測定する段階を含む。
【００２２】
本発明の目的はまた、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する疾患の変調医薬を製造するために、本発明のポリヌクレオチド配列、及び、本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズできるアンチセンス核酸配列を使用することである。
【００２３】
更に、本発明は、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する腸スピロヘーター感染症を予防、軽減または治療するための、ワクチンを非限定例とする医薬または治療用の組成物または薬剤を提供する。これらは、（ａ）少なくとも１つの本文中に記載のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列または少なくとも１つの本文中に記載のＢｐｍｐ−７２ヌクレオチド配列または上記配列の１つに特異的に結合する抗体と、（ｂ）１種類または複数の医薬に許容される担体及び／または希釈剤とを含む。
【００２４】
本発明は更に、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチド、アミノ酸配列及び／または抗体を提供する。また、腸スピロヘーター感染症を特徴とする状態の治療方法が提供される。方法は、治療が必要な動物に有効量の本発明のポリヌクレオチド、アミノ酸配列または抗体を投与する段階を含む。更に、本発明は、腸スピロヘーター感染症を予防するかまたは少なくとも最小限に抑えるために動物を予防的に処置する方法を提供する。方法は、有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはこれらの生物分子を１種類以上含む医薬組成物を動物に投与する段階を含む。
【００２５】
更に本発明は、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の生物活性をＢｐｍｐ−７２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列との直接的または間接的相互作用を介して変調し得る薬物のスクリーニング方法を提供する。これらの方法によって同定された物質は腸スピロヘーター感染症の治療方法に使用し得る。
【００２６】
本発明はまた、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に感染した疑いのある動物をスクリーニングするため、または、動物がＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に感染していることを確認するためのキットを提供する。このキットは、適当な容器に包装されたＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的な少なくとも１つのポリヌクレオチドをその使用説明書と共に含む。代替形態として、本発明は、（ａ）Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に感染している疑いのある宿主動物をスクリーニングするため、または、（ｂ）宿主動物がＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に感染していることを確認するためのキットを提供する。キットは、適当な容器に包装されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントまたは上記配列に結合する抗体をその使用説明書と共に含む。
【００２７】
本発明の別の特徴及び利点は、添付図面を参照しながら進める以下の記載の閲覧から当業者に明らかであろう。
【００２８】
概論
本文中に記載の発明が明確に記載した変更及び修正以外の変更及び修正の対象となり得ることは当業者に理解されよう。本発明はこのような変更及び修正のすべてを包含すると理解されたい。本発明はまた、明細書で個別的にまたは集合的に言及または指示した段階、特徴、組成物及び化合物のすべてを包含し、また、任意の２つ以上の段階または特徴のいずれかの組合せをすべて包含する。
【００２９】
本発明の範囲は本文中に記載した特定実施態様によって限定されない。これらの実施態様は例示目的で示しただけである。機能的に等価の生成物、組成物及び方法は明らかに本文中に記載の本発明の範囲内である。
【００３０】
本明細書に含まれているヌクレオチド及びアミノ酸配列情報を内包する配列認識番号（配列Ｎｏ．）は、明細書の末尾にまとめて示すが、これはプログラムＰａｔｅｎｔ  Ｉｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２を使用して作成したものである。配列表のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の各々は配列識別子の付いた数値指標＜２０１＞によって識別される（例えば、＜２０１＞１、＜２０１＞２、など）。各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の長さ、配列型及び起原生物はそれぞれ数値指標欄＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞に与えられた情報によって示されている。明細書中で言及したヌクレオチド及びアミノ酸配列は、配列識別子の付いた数値指標欄＜４００＞に与えられた情報（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２、など）によって定義されている。
【００３１】
本文中に引用したすべての刊行物（特許、特許出願、雑誌記事、実験便覧、書物またはその他の文献）の開示はその全体が参照によって本発明に含まれるものとする。いずれの参考文献についても、それらが先行技術を構成するとも、または、本発明の関連分野の当業者の一般常識の一部であるとも認めていない。
【００３２】
本文中に使用した“由来の”及び“に由来の”という用語は、特定の完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）が特定のソースから得られることを意味しているが、該ソースから必ずしも直接的に得られなくてもよい。
【００３３】
本明細書を通じて、文脈から別の解釈が必要な場合を除いて、“含む”という用語または“含む（主語が単数）”もしくは“含んでいる”のようなその変形は、所定の完全体または完全体グループが含まれることを意味するが、その他の完全体または完全体グループを排除しないことは理解されよう。
【００３４】
本文中に使用したその他の選択用語の定義は発明の詳細な説明の項に示したが、これらの定義は明細書全体に通用する。本文中に使用した他の科学的及び技術的用語は異なる定義がない限り本発明の所属分野の当業者が共通に理解する意味と同義である。
本発明は、その変形及びフラグメントも含めたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列及び該配列をコードしているポリヌクレオチド配列の同定に関する。
【００３５】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列は、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉラムダバクテリオファージゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉから単離された。このスクリーニングプロセスによって６つのクローンが見出され、ＡＨＰ１−６と命名された。これらのクローンはいずれも、見掛け分子量３４ｋＤａの共通タンパク質を産生し、これらのタンパク質はいずれも吸収された超免疫ブタ血清と強力に反応した。１つのクローンの配列決定によれば、２９．４ｋＤａのコーディング容量をもつ７８３塩基対の部分的読取り枠（ＯＲＦ）が同定された。この部分的ＯＲＦは、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの７２ｋＤａ外膜タンパク質のカルボキシ末端部分をコードしているであろう。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースでＢｐｍｐ−７２の相同性サーチを行うと、このタンパク質とＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍのＴｒｅｐｏｎｅｍａｌ膜タンパク質Ｂ（ＴｍｐＢ）とが約５％相同であることが確認された。これらのタンパク質は、外膜と結合し、ポーリンとしてまたは巨大分子の輸送タンパク質として機能し得る。Ｂｐｍｐ−７２ヌクレオチドをＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドデータベースに比較しても他の細菌遺伝子との強力な相同性は判明しなかった。
【００３６】
【表１】
2007534311.tif 000002
【００３７】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の解析から、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉゲノムＤＮＡの１００９塩基対のインサートが判明した（図３）。インサートＤＮＡの配列解析から、推定ＡＴＧ開始コドンとＴＡＡ終結コドンとをもつ塩基１−７８３の７８３塩基対の潜在的な部分的ＯＲＦが判明した。残りの遺伝子を更にクローニングして配列決定すると、Ｂｐｍｐ−７２のコーディング配列が１，６９２ヌクレオチドのサイズであることが判明した。潜在的シャイン・ダルガーノリボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧ）及び推定−１０（ＴＡＡＴＡＴ）及び−３５（ＴＴＧＡＡＡ）プロモーター領域がＡＴＧ開始コドンの上流で同定された。７２ｋＤａの外膜タンパク質をコードしている遺伝子配列を分子量７２ｋＤａの外膜タンパク質と命名した（Ｂｐｍｐ−７２）。
【００３８】
翻訳されたポリペプチドは５６４アミノ酸（ａａ）残基から構成され、予測分子量６２．１ｋＤａを有していた（図４）。推定されたサイズは、天然型Ｂｐｍｐ−７２タンパク質のウェスタンブロットで観察されたサイズと有意な違いを有していた。Ｂｐｍｐ−７２の推定コーディング容量と天然型Ｂｐｍｐ−７２外膜タンパク質との分子量の違いの原因は、アシル化、メチル化、アセチル化、リン酸化及び硫酸化のような翻訳後修飾にあると考えられる。
【００３９】
アミノ酸配列の解析から、翻訳されたポリペプチドのＣ−末端に１１８残基の領域が存在することが判明し、これは保存されたリシンモチーフ（ＬｙｓＭ）ドメインに相同であった。このドメインは、細菌細胞壁を分解する酵素で初めて同定されたがその後多くの他の細菌タンパク質にも存在することが証明された遍在タンパク質モジュールである。ＬｙｓＭドメインは細菌細胞表面タンパク質の最も普遍的なモジュールの１つである。ＬｙｓＭドメインを有している他の細菌タンパク質、例えば、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｉ）のＩｇＧ結合タンパク質及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のインチミンは細菌性病因に関与する。
【００４０】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列
本発明によって提供される全長Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列は約５６４個のアミノ酸（ａａ）残基を有しており、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ外膜タンパク質をコードしているであろう。タンパク質の推定分子量は６２，０８１Ｄａである。
【００４１】
本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列は、本文中に示したアミノ酸配列、例えば配列２−配列２２を有している。また、保存性アミノ酸置換で修飾されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列、並びに、それらのアナローグ、フラグメント及び誘導体を包含する。
【００４２】
本発明の好ましい形態では、本文中に記載したような単離Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列が提供される。より望ましくは、実質的に純粋な形態のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列が提供される。
【００４３】
“単離された”という用語は、自然状態で付随している成分から分離されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を表すために使用されている。更に、少なくとも約６０−７５％のサンプルが１つのＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を示すときにはＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列が“実質的に精製”されている。実質的に精製されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列は、典型的には約６０−９０％Ｗ／Ｗ、より一般的には約９５％のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列サンプルを含み、好ましくは約９９％以上純粋であろう。タンパク質の純度または均質性は当技術分野で公知のいくつかの手段によって表すことができ、例えば、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いでゲル染色によってＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の単一バンドを可視化するとよい。ある種の目的には、ＨＰＬＣまたは本願でも使用した当技術分野で公知の他の手段を使用することによってより高い分解能が得られる。
【００４４】
本発明の好ましいＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列は、天然型全長Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列の１つまたは複数の生物学的特性（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは免疫学的特性）を有しているであろう。非機能性のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列も、例えばＢｐｍｐ−７２のアンタゴニストとして有用であり得るので本発明の範囲に包含される。野生型に比べたアナローグ、フラグメントまたは誘導体の生物学的特性は例えば生物学的アッセイを用いて決定され得る。
【００４５】
アナローグ、フラグメント及び誘導体を含めたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列は、合成的に（例えば、公知の固相または溶液相ペプチド合成法を使用して）作製できる。好ましくは固相合成法を使用する。あるいは、本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列は後述するような公知の遺伝子操作技術を使用して作製できる。また別の実施態様では、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列がブタ、ニワトリ、ヒト及びイヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ及び魚などの動物の血漿、糞便、血清または尿を非限定例とする生物流体から精製できる（例えば、イムノアフィニティ精製によって）。
【００４６】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列のアナローグ
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列のアナローグは、１つまたは複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されているがこの置換によって分子の生物学的活性が実質的に変質されないアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明の文脈で、アナローグ配列は、少なくとも２０、５０、１００または２００個のアミノ酸に関するアミノ酸レベルで配列２に示したアミノ酸配列に少なくとも６０、７０、８０または９０％相同、好ましくは少なくとも９５または９８％相同のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を含意する。特に、相同性は典型的にはタンパク質の機能に必須であることが判っている配列の領域について考察されるべきであり、隣接の必須でない配列は考慮するに及ばない。特に好ましい本発明のアミノ酸配列は、配列３−配列２２に示したアミノ酸配列の１つまたは複数に６０または７０％以上、より好ましくは８０−９０％以上の相同性を有している連続的配列を含む。
【００４８】
相同性を類似性（即ち、類似の化学的特性／機能を有しているアミノ酸残基）として考えることもできるが、本発明の文脈では相同を配列一致として表すほうが好ましい。Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に関して“実質的な相同”または“実質的な一致”という用語が使用されたとき、これらの用語は、問題のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列が天然産生のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の全長またはその一部分に少なくとも約７０％の一致、通常は少なくとも約８０％の一致、好ましくは少なくとも約９０％または９５％の一致を示すことを表す。
【００４９】
本発明の極めて好ましい形態では、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列アナローグが配列２で示したＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列または配列３−配列２２で示した配列に８０％以上のアミノ酸配列一致を示すであろう。本発明の範囲内のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列アナローグの例は、（ａ）１つまたは複数のアスパラギン酸残基がグルタミン酸で置換された配列２のアミノ酸配列、（ｂ）１つまたは複数のイソロイシン残基がロイシンで置換された配列２のアミノ酸配列、（ｃ）１つまたは複数のグリシンまたはバリン残基がアラニンで置換された配列２のアミノ酸配列、（ｄ）１つまたは複数のアルギニン残基がヒスチジンで置換された配列２のアミノ酸配列、あるいは、（ｅ）１つまたは複数のチロシンまたはフェニルアラニン残基がトリプトファンで置換された配列２のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
Ｂｐｍｐ−７２アナローグのスクリーニング
ポリペプチドのアナローグをスクリーニングするために様々なスクリーニング技術が当技術分野で公知である。多様な化学物質ライブラリーが利用可能である。従って本発明は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列のアナローグを得るために、より詳細に後述するように、多年の研究で作製された合成化合物のライブラリー、天然化合物のライブラリー及び組合せライブラリーなどのようなライブラリーのスクリーニングを考察する。１つの実施態様では、本発明はＢｐｍｐ−７２特異的抗体に結合するアナローグを選択するためのかかるライブラリーのスクリーニングを考察する。
【００５１】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列のフラグメント
アナローグに加えて、本発明はＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列のフラグメントを考察する。Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列フラグメントは、少なくとも約５−７個の連続アミノ酸、しばしば少なくとも約７−９個の連続アミノ酸、典型的には少なくとも約９−１３個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０−３０個またはそれ以上の連続アミノ酸から成るアミノ酸残基連鎖である。好ましいＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列フラグメントは配列３−配列２２に示すような配列を包含する。
【００５２】
本発明の極めて好ましい形態では、フラグメントがＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特徴的なリガンド結合免疫活性及び／またはその他の生物学的活性を示す。より好ましくはフラグメントが天然型のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列に存在する免疫エピトープに一致する免疫エピトープを有している。
【００５３】
本文中で使用した“エピトープ”という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を表す。エピトープは３つのアミノ酸を該エピトープに特有の空間的コンホメーションで含み得る。一般に、エピトープは少なくとも５個のアミノ酸、もっと普通には少なくとも８−１０個のアミノ酸から構成されている。このようなアミノ酸の空間的コンホメーションの決定方法は当技術分野で公知である。
【００５４】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列誘導体
本発明によって“Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列誘導体”が提供される。これらは、一次構造が実質的に相同であるが化学的及び／または生化学的修飾または普通は存在しないアミノ酸を含んでいるＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列、そのアナローグまたはフラグメントを包含する。このような修飾は、当業者に容易に理解されるように、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性ヌクレオチドによる標識）及び種々の酵素的修飾、などを包含する。
【００５５】
本発明の１つの形態では、誘導体化に適した化学的部分が水溶性ポリマーから選択される。選択されたポリマーは、ポリマーに結合したタンパク質が生理的環境のような水性環境で沈殿しないように水溶性でなければならない。最終製品を製造して治療に使用するため、医薬に許容されるポリマーが好ましい。当業者は、ポリマー／タンパク質コンジュゲートが治療に使用されるかについて考察し、使用される場合には所望の用量、循環時間、タンパク質分解耐性やその他の要因について考察し、これらの考察に基づいて所望のポリマーを選択できるであろう。本発明のタンパク質及びペプチドについては本文中に示したアッセイを使用して確認できる。
【００５６】
水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、及び、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールから成るグループから選択するとよい。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水安定性なので製造には有利であろう。
【００５７】
本発明の別の形態では、例えばＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に１つまたは複数の抗体フラグメント（例えばＦｃフラグメント）を融合させることによって動物宿主体内の半減期を延長するようにアミノ酸配列を修飾し得る。
【００５８】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を標識形態で提供する必要がある場合、アミノ酸配列を標識する種々の方法が当技術分野で公知であり、例えば、３２Ｐのような放射性同位体、標識アンチリガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、フルオロホア、化学発光剤、酵素、標識リガンドへの特異的結合相手として作用できるアンチリガンドが包含される。ラベルの選択は、必要な感度、安定性要件及び入手可能な計器類に左右される。アミノ酸配列の標識方法は当技術分野で公知である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；及び、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）参照］。
【００５９】
本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列が可溶性である場合には、固相支持体、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材料（例えば、セファロースビーズ）、磁気ビーズ、グラスウール、プラスチック、金属、ポリマーゲル、セルまたはその他の支持体に配列を結合させるとよい。このような支持体は例えばビーズ、ウェル、浸漬棒または膜の形態を有し得る。
【００６０】
本発明はまた、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列及びフラグメントを含む融合ポリペプチドを提供する。即ち、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列が２つ以上のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の融合物、または、１つのＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列と類縁タンパク質との融合物であってもよい。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組合せを示す異種融合物を構築することもできる。例えば、リガンド結合性ドメインまたは他のドメインが異なる融合ポリペプチドまたはフラグメント間で“交換”されてもよい。このような同種または異種融合ポリペプチドは例えば、強度または結合特異性の変質を示すであろう。融合相手は、免疫グロブリン、細菌性ベータ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、ベータ−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母のアルファ接合因子などである。
【００６１】
修飾されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列は、慣用の技術を使用して合成し得る。すなわち、修飾ポリヌクレオチド配列によってコードし組換え核酸方法を使用することにより産生し得る。修飾ポリヌクレオチド配列も慣用の技術によって作製し得る。融合タンパク質は典型的には、組換え核酸方法によって作製するかまたは化学合成し得る。
【００６２】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド
本発明によれば、単離されたまたは実質的に純粋なＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列が提供される。該配列は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのアナローグ、フラグメントもしくは誘導体をコードしている。本発明による好ましいＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は、配列１で示す配列またはそのフラグメントを含む。
【００６３】
“Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列”は、一本鎖形態または二重鎖ヘリックスのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；“ＲＮＡ分子”）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；“ＤＮＡ分子”）のリン酸エステル高分子形態を表す。二重鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を検討するとき、本文中では、ＤＮＡの非転写ストランド（即ち、ｍＲＮＡに相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’の方向だけで配列を示す標準協約に従って配列を記述する。
【００６４】
“単離された”または“実質的に純粋な” Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチドは、天然型Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉゲノム配列に天然に付随する他の細胞成分から実質的に分離された配列を意味する。この用語は、その天然産生環境から取出されたＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を含意し、また、組換えられたもしくはクローニングされたＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列単離物及び化学的に合成された変異体もしくは異種系によって生合成された変異体を包含する。
【００６５】
１つの実施態様で本発明は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を発現するＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を提供する。より詳細には、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列１に示すポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、（ｂ）（ａ）に定義したポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列またはハイブリダイズ可能なそのフラグメント、及び、（ｃ）上記ポリヌクレオチド配列のいずれかによってコードされているアミノ酸配列の発現をコードしているポリヌクレオチド配列、から成るグループから選択される。
【００６６】
相同的Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列
本発明のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は、天然のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列に由来するか実質的に類似である配列、または、天然のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列またはその一部分と実質的相同性を有している配列を包含する。Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は、別のポリヌクレオチド配列（またはその相補ストランド）と（適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って）最適に位置合せされたときに、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、一般的には少なくとも約７０％、より一般的には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５−９８％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列一致が存在するならば、別のポリヌクレオチド配列に“実質的に相同”（または“実質的に類似”）である。
【００６７】
あるいは、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で別のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド（またはその相補ストランド）、ストランドまたはその相補鎖にハイブリダイズするときに実質的な相同または一致が存在する。選択的ハイブリダイゼーションは、低、中または高緊縮性条件下で行うことができるが、好ましくは高緊縮性条件下で行う。典型的には、少なくとも約１４ヌクレオチドの連鎖にわたって少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、極めて好ましくは少なくとも約９０％の一致が存在するときに選択的ハイブリダイゼーションが生じるであろう。記載したような相同性比較は、もっと長い連鎖で行ってもよく、いくつかの実施態様では、しばしば少なくとも約９ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドを含む連鎖で行う。
【００６８】
このように、本発明のポリヌクレオチド配列は、本文中の配列表に示した配列に対して好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、もっと好ましくは少なくとも９０％の相同性を有している。さらに好ましくは、少なくとも９５％、いっそう好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。ヌクレオチドの相同性比較は後述のポリペプチドと同様にして行うとよい。好ましい配列比較プログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。
【００６９】
本発明の文脈では、相同配列は少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００または８１９ヌクレオチドの範囲の核酸レベルで配列１に示したヌクレオチド配列に少なくとも６０、７０、８０または９０％一致、好ましくは少なくとも９５または９８％一致するヌクレオチド配列を含むと理解される。特に、相同性は一般にタンパク質の機能に必須であることが判っている連続アミノ酸配列をコードしている配列の領域に関して考察されるべきであり、必須でない隣接の配列を考慮する必要はない。
【００７０】
本発明の別の好ましいＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は、配列３−配列２２の１つまたは複数のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に５０、６０または７０％を上回る相同性、より好ましくは８０、９０、９５または９７％を上回る相同性を有している連続配列を包含する。
【００７１】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列フラグメント
本発明のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列フラグメントは、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、１００または２００ヌクレオチドの長さであろう。一般的に、ポリヌクレオチド配列の長さが短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るために高い相同性が必要である。従って、本発明のポリヌクレオチド配列が約３０未満のヌクレオチドから構成されている場合には、本文中の配列表に示したポリヌクレオチド配列に対する一致パーセンテージが７５％以上、好ましくは９０％または９５％以上であるのが好ましい。逆に、本発明のポリヌクレオチド配列が例えば５０または１００以上のヌクレオチドから構成される場合には、本文中の配列表に示したポリヌクレオチド配列に対する一致パーセンテージがもっと低い値でもよく、例えば５０％以上、好ましくは６０または７５％以上でよい。
【００７２】
Ｂｐｍｐ−７２プローブ配列
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列に由来のプローブ配列が本発明の範囲内で考察される。これは本文中に開示した特定配列から簡便に作製できる。プローブは、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチドの全部または一部分にわたって該配列に特異的にハイブリダイゼーションできる任意の適当な長さでよい。
【００７３】
相同度が高いほど、使用できるハイブリダイゼーションの緊縮性が高い。従って、１つの実施態様では、相同Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を同定するために低緊縮性ハイブリダイゼーション条件を使用するようにプローブを設計するのが好ましい。代替的な実施態様では、中度のハイブリダイゼーション条件を使用するようにプローブを設計する。より好ましくは高緊縮性条件を使用する。本文中の実験で示したように、Ｂｐｍｐ−７２プローブ配列は配列１に示すようなポリヌクレオチド配列に中度の緊縮性条件下でハイブリダイズするであろう。より好ましくは高緊縮性条件下でハイブリダイズするであろう。
ハイブリダイゼーションの緊縮性が、当業者に容易に理解されるような塩基組成、相補ストランドの長さ及びハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度または有機溶媒のような条件によって左右されることを当業者は認識している。緊縮性温度条件は一般的に３０℃以上、典型的には３７℃以上、好ましくは４５℃以上の温度を含むであろう。緊縮性塩条件は、通常は１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満であろう。しかしながら、パラメーターの組合せはいずれかの単一パラメーターの測定値よりもはるかに重要である。緊縮性ハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）である。
【００７４】
好ましくはプローブ配列が、配列１に由来の少なくとも約８個の連続ヌクレオチド、または好ましくは約１５個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２５個のヌクレオチドを有しており、少なくとも約４０ヌクレオチドの最小サイズを有し得る。Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を検出するための特に好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、配列３−配列１８及び実施例に示すオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
本発明のプローブは、ラベルまたはリポーター分子に付着した単離ポリヌクレオチドを含んでいてもよく、配列類似性を有している他のポリヌクレオチドを単離するために標準方法によって使用し得る。プローブを作製し標識する技術に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）前出、または、Ａｕｓｕｂｅｌら，（２００１）前出を参照するとよい。
【００７６】
合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチド配列を含む本発明のプローブはまた、天然産生または組換え操作した一本鎖または二重鎖のポリヌクレオチドから得てもよく、あるいは、化学的に合成されてもよい。プローブはニックトランスレーション、クレノウ埋戻し反応または当技術分野で公知の他の方法によって標識し得る。
【００７７】
Ｂｐｍｐ−７２プライマー配列
本発明はまたＢｐｍｐ−７２プライマー配列を提供する。増幅反応に使用されるプライマーは最大増幅効率を得るためには一本鎖であるのが好ましいが、二重鎖でもよい。二重鎖の場合、プライマーを先ずストランド分離処理して、その後に伸長産物の作製に使用する。プライマーは、重合誘導剤の存在下でＢｐｍｐ−７２伸長産物の合成をプライムすべく十分な長さを有していなければならない。プライマーの正確な長さは温度、バッファ及びヌクレオチド組成のような多くの要因に従属するであろう。
【００７８】
オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１２−２０個またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、より少数のヌクレオチドを含有してもよい。好ましくはプライマーが、配列３−配列１８に示した配列から選択される。
【００７９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、慣用のホスホトリエステル法及びホスホジエステル法またはその全自動化実施態様のような何らかの適当な方法によって作製できる。このような全自動化実施態様の１つでは、ジエチルホスホラミダイトを出発材料として使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅら，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２に記載されたようにして合成し得る。修飾された固体支持体の上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法が米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【００８０】
アンチセンス核酸及びリボザイム
本発明はまた、翻訳レベルでＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の発現を妨害するために使用できるアンチセンスヌクレオチド及びリボザイムの作製に及ぶ。この方法では、特異的ｍＲＮＡの翻訳をブロックするためにアンチセンス核酸及びリボザイムを使用し、該ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスキングするかまたはリボザイムで開裂する。
【００８１】
アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ．（１９９０）Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６２：４０−４６；Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：２８９−２９５参照］。これらは細胞内部でｍＲＮＡにハイブリダイズし、二重鎖分子を形成する。細胞は、この二重鎖形態に複合化したｍＲＮＡを翻訳しない。従って、アンチセンス核酸はｍＲＮＡがタンパク質として発現することを妨害する。約１５ヌクレオチドのオリゴマー及びＡＵＧ開始コドンにハイブリダイズする分子が特に効率的であろう。その理由は、それらが合成し易くまたそれらを感染細胞に導入するときにもっと大きい分子よりも問題が生じ難いからである。アンチセンス方法は多くの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を阻止するために使用されてきた［Ｈａｍｂｏｒら，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８：１２３７−１２４５］。
【００８２】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに多少似通った方法で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に開裂する能力を有しているＲＮＡ分子である。リボザイムは、ある種のｍＲＮＡがそれ自体のイントロンを切除する能力を有しているという観察から発見された。研究者らは、これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することによって、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識しそれを開裂する分子を作製することに成功した［Ｃｅｃｈ，（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２６０：３０３０−３０３４］。それらは配列特異的なので特定配列をもつｍＲＮＡだけを失活させる。
【００８３】
研究者らは２つのタイプのリボザイム、テトラヒメナ型及び“ハンマーヘッド”型を同定した。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型は１１−１８塩基の配列を認識する。認識配列が長いほど、リボザイムの発生がターゲットｍＲＮＡ種内に限定され易い。従って、特異的ｍＲＮＡ種を失活させるためにはハンマーヘッド型リボザイムのほうがテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましい。また、１８塩基認識配列はもっと短い認識配列よりも好ましい。
【００８４】
従って、本文中に記載のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列のｍＲＮＡに対するアンチセンス分子及びそのｍＲＮＡを開裂するリボザイムを作製しこれによってＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の発現を阻害するために使用し得る。
【００８５】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の単離
精製形態または非精製形態のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの標本をＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を単離する出発点として利用できる。このような標本は主として血液、組織材料、糞便などのような動物サンプルから、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐ２８０−２８１（１９８２）に記載された技術のような様々な技術によって選択的に抽出される。
【００８６】
抽出したサンプルが精製されていないときは、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を単離する前にサンプルの細胞または細菌細胞膜を開くために有効な量の試薬でサンプルを処理し、（１つまたは複数の）核酸の（１つまたは複数の）ストランドを露出及び／または分離させるとよい。
【００８７】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉゲノム材料を遊離した後、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を増幅及び／または単離するためにいくつかの方法が存在する。このような方法の詳細はＳａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）前出またはＡｕｓｕｂｅｌら，（２００１）前出、から得られる。
【００８８】
ＰＣＲは恐らく、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を最初に増幅するために使用できるよく知られた方法の１つであり、本発明でも好ましく使用される。増幅される特異的Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は長い分子の一部分でもよく、または、最初から特異的配列が完全核酸を構成するような独立分子として存在してもよい。増幅される配列が最初から純粋形態で存在する必要はない。配列は、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの全ＤＮＡに含まれているような複合混合物の小部分であってもよい。
【００８９】
ＰＣＲプロセスでは、適量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを個別にまたはプライマーと一緒に合成混合物に添加し、得られた溶液を約９０−１００℃で約１−１０分間、好ましくは１−４分間加熱する。この加熱期間の後、溶液は冷やされる。プライマーハイブリダイゼーションにはこの溶液が好ましい。冷却した混合物に、プライマー伸長反応を惹起するために適当な補佐物質（本文中では“重合剤”と呼ぶ）を添加し、当技術分野で公知の条件下で反応を生じさせる。重合剤が熱安定性ならば重合剤を他の試薬と一緒に添加してもよい。この合成（または、増幅）反応は、室温から重合剤が機能しない高温までの温度範囲で生じ得る。従って、例えば重合剤としてＤＮＡポリメラーゼを使用するときは、温度は一般に約４０℃以下である。反応を室温で行うのが最も簡便である。
【００９０】
新しく合成したＢｐｍｐ−７２ストランド及びその相補核酸ストランドは上述のハイブリダイズ条件下で二重鎖分子を形成するであろう。このハイブリッドを次の段階のプロセスで使用する。
【００９１】
変性、アニーリング及び伸長産物合成の段階をターゲットＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオド配列が検出に必要な程度に増幅するまで必要回数繰り返す。産生された特異的Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の量は指数関数的に累積するであろう。このような増幅反応はＰＣＲ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＬＲ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄｓ．Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅ  ＆  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ，１９９２、により詳細に記載されている。
【００９２】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド増幅産物は放射性プローブを使用しないでサザンブロット分析によって検出し得る。このようなプロセスでは、例えば、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の核酸配列を極めて低いレベルで含有しているＤＮＡの少量サンプルを増幅し、サザンブロット法または同様のドットブロット分析を使用して分析する。高レベルの増幅シグナルによって非放射性プローブまたはラベルの使用が容易になる。あるいは、増幅産物を検出するために使用するプローブを本文中に記載するように直接的または間接的に検出可能に標識することもできる。
【００９３】
本発明の方法によって増幅した配列を更に、溶液中でまたは固体支持体に結合させた後で、ＰＣＲ、オリゴマー制限［Ｓａｉｋｉら，（１９８５），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：１００８−１０１２］、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析［Ｃｏｎｎｅｒら，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２７８］、オリゴヌクレオチド結合アッセイ［Ｌａｎｄｇｒｅｎら，（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１００７］、などのような特異的ＤＮＡ配列の検出に常用の方法のいずれかによって評価、検出、クローニング、配列決定などができる。
複数の代替的増幅方法が文献に記載されておりこれらも本発明に使用できる。これらの代替的増幅系の非限定例は、自立性配列複製、核酸配列に基づく増幅（これは逆転写及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用し、そのサイクリングスキームをターゲットするために２つのプライマーを組込む）である。あるいは、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を結合活性化転写またはリガーゼ連鎖反応または修復鎖反応核酸増幅技術によって増幅することもできる。
【００９４】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド構築物及びベクター
別の実施態様によれば、本発明はＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の作製方法を提供する。該方法は、（ａ）本文中に記載のような細胞をＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列が発現する条件下で培養する段階と、（ｂ）発現したＢｐｍｐ−７２配列を回収する段階とを含む。この手順にまた、（ｃ）当技術分野で公知の適当な手段のいずれかを使用してアミノ酸配列をクロマトグラフィー処理する段階、及び／または、アミノ酸配列にタンパク質精製処理を行う段階を付け加えてもよい。
【００９５】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を発現できる細胞を産生するために、好ましくは本発明のポリヌクレオチド配列を組換えベクターに取込ませ、次いでこのベクターを原核性または真核性の宿主細胞に導入する。
【００９６】
本発明によって提供されるベクターは典型的には、所望のアミノ酸配列をコードしているＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列と、好ましくはアミノ酸コーディング配列に作動可能に連結された転写及び翻訳開始の調節配列とを含むであろう。このような発現ベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）前出またはＡｕｓｕｂｅｌら，（２００１）前出に記載されている。多くの有用なベクターが当技術分野で公知であり、このようなベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈなどから得ることができる。
【００９７】
発現ベクターはまた、例えば、複製起点または自律複製配列及び発現調節配列、プロモーター、エンハンサー、及び、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終了配列、及び、ｍＲＮＡ安定化配列のような必要なプロセシング情報部位を含み得る。また、同一の種または類縁の種の分泌ポリペプチドからの分泌シグナルを適宜含ませてもよく、これらは、タンパク質が細胞膜を透過及び／または細胞膜に滞留できるようにしてその機能的トポロジーに到達させるかまたは細胞から分泌させる。このようなベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）前出またはＡｕｓｕｂｅｌら，（２００１）前出に記載されている当技術分野で公知の標準組換え技術を用いて作製できる。
適当なプロモーター及び他の必要なベクター配列は宿主体内で機能できるように選択されるであろう。これらの配列は、適当な場合には外膜リポタンパク質遺伝子と天然に結合している配列を含み得る。
【００９８】
ｔｒｐ、ｌａｃ及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、解糖酵素プロモーターのようなプロモーターは原核細胞宿主中で使用し得る。有用な酵母プロモーターは、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリーレートキナーゼ、または、エノラーゼもしくはグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのような他の解糖酵素、マルトース及びガラクトースの利用を担当する酵素などに対するプロモーター領域を含む。酵母発現に使用するための適当なベクター及びプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎら，欧州特許公開ＥＰ７３，６７５Ａに詳細に記載されている。適当な非天然型哺乳類プロモーターは、ＳＶ４０由来の初期及び後期プロモーターまたはマウスのモロニー白血病ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスまたはポリオーマに由来のプロモーターなどであろう。更に、遺伝子の多数コピーが作製されるように構築物を適当なエンハンサー及び他の発現コントロール配列用の増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に接合してもよい。
【００９９】
このような発現ベクターは自律複製するであろうが、当技術分野で公知の方法によって宿主細胞のゲノムに挿入することによって複製させてもよい。
【０１００】
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカー、すなわちベクターによって形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子を含有している可能性が大きい。この遺伝子の存在はインサートを発現する宿主細胞だけを確実に増殖させる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒物、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに耐性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するタンパク質、または、（ｃ）複合培地から利用できない臨界栄養素を供給するタンパク質、をコードしている遺伝子であり、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子がある。適切な選択可能マーカーの選択は宿主細胞に従属し、種々の宿主細胞に適したマーカーは当技術分野で公知である。
【０１０１】
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を含有しているベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写し、得られたＲＮＡを当技術分野で公知の方法例えば注入によって宿主細胞に導入できる。または、ベクターを当技術分野で公知の方法で宿主細胞に直接的に導入することもできる。方法は細胞宿主の種類次第で違っており、例えば、電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたはその他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ベクターがレトロウイルスゲノムのような感染物質であるとき）；及びその他の方法がある。Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の宿主細胞内導入には、特に上記のような方法を含む当技術分野で公知の方法のいずれかを使用するとよい。
【０１０２】
本発明はまた、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。好ましい宿主細胞は、酵母、繊維性真菌類、植物細胞、昆虫、両生類、鳥類、細菌、哺乳類細胞及び組織培養したヒト細胞、などである。このような宿主細胞の代表例は、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母、ＣＨＯ、Ｒ．１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０及びＳｆ９細胞から成るグループから選択される。
【０１０３】
本発明のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列は、ベクターまたは他の発現ベクターに入れたＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列またはその部分を適合性の原核性または真核性の宿主細胞中で発現させることによって量産できる。最も常用の原核細胞宿主は、大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の菌株であるが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのような他の原核細胞も使用し得る。常用の哺乳類宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び、Ｗ１３８、ＢＨＫ及びＣＯＳ細胞系であるが、その他にも適当な細胞系が存在することが当業者には理解されよう。
【０１０４】
また、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列のコーディング配列の機能的近傍に発現調節配列を挿入する相同的組換えイベントによってＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列をより高度に発現するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾したＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を含有する哺乳類細胞が提供される。
【０１０５】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に対する抗体
本発明によれば、組換えまたは化学合成によって産生されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列及びそのフラグメントまたは他の誘導体またはアナローグ（融合タンパク質を含む）は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を認識する抗体を発生させる免疫原として使用し得る。このような抗体の非限定例は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリーである。
【０１０６】
分子は、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できるとき“抗原性”である。抗原性アミノ酸配列は、少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸を含有している。分子の抗原性部分は、抗体またはＴ細胞受容体を認識する免疫優性部分であってもよく、または、免疫感作用キャリアー分子に抗原性部分をコンジュゲートすることによって分子に抗体を発生させるために使用される部分であってもよい。抗原性である分子はそれ自体が免疫原性である必要はない。即ち、キャリアーなしで免疫応答を誘発できる必要はない。
【０１０７】
“抗体”は特異的エピトープに結合する抗体及びそのフラグメントのような免疫グロブリンのいずれかである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びキメラ抗体を包含する。キメラ抗体については米国特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号により詳細に記載されている。抗体という用語はまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）のような抗体（一本鎖抗体を含む）の抗原結合部分を包含する。従って、本文中で使用した様々な文法的形態の“抗体分子”という用語は、完全形（ｉｎｔａｃｔ）の免疫グロブリン分子及び抗体結合部位を含有している免疫グロブリン分子の免疫活性部分の双方を考察している。“抗体結合部位”は、抗原と特異的に結合するＨ鎖及びＬ鎖の可変領域及び超可変領域から成る抗体分子の構造部分である。
【０１０８】
代表的な抗体分子は、完全形の免疫グロブリン分子、実質的に完全形の免疫グロブリン分子、及び、免疫グロブリン分子のパラトープ含有部分、例えば当技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として公知の部分である。このような部分は本文中に記載の治療方法に好ましく使用される。
【０１０９】
抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２部分はそれぞれ、当技術分野で公知の方法によって実質的に完全形の抗体分子をパパイン及びペプシンでタンパク質分解反応させることによって作製できる。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらの米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体分子部分も当技術分野で公知であり、２つのＨ鎖部分を連結しているジスルフィド結合をメルカプトエタノールで還元し、次いで得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化することによってＦ（ａｂ’）２部分から作製される。本発明では完全形抗体分子を含有している抗体が好ましい。
【０１１０】
多様な文法的形態の“モノクローナル抗体”という表現は、特定抗原と免疫反応できる抗体結合部位を一種類しか有していない抗体を意味する。従ってモノクローナル抗体は典型的には、該抗体が免疫反応するいかなる抗原に対しても単一の結合親和性を示す。従ってモノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に免疫特異的な複数の抗体結合部位を有している抗体分子、例えば、バイスペシフィック（キメラ）モノクローナル抗体を含有し得る。
【０１１１】
“アジュバント”という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を意味する。アジュバントは、抗原を緩やかに放出する組織デポーとして機能でき、また、免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性化物質として機能できる［Ｈｏｏｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐ．３８４，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９８４）］。アジュバントの非存在下の抗原単独による一次抗原投与は体液性または細胞性の免疫応答の誘発に成功しないことがしばしば生じるであろう。アジュバントの非限定例は、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント例えばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍである。医薬的に許容されるアジュバントが好ましい。
【０１１２】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナローグに対するポリクローナル抗体を産生するために当技術分野で公知の様々な手順を使用し得る。抗体産生のためには、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはその誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）を注射することによって、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを非限定例とする種々の宿主動物を免疫する。１つの実施態様では、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントを免疫原性キャリアー、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせる。宿主の種次第では、免疫応答を増強するために、フロインドアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールを非限定例とする種々のアジュバント及びＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを使用し得る。
【０１１３】
Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列、または、そのフラグメント、アナローグもしくは誘導体に対するモノクローナル抗体を作製するためには、連続培養細胞系によって抗体分子を産生させる技術のいずれかを使用し得る。これらの非限定例は、Ｋｏｈｌｅｒら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、トライオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Ｋｏｚｂｏｒら，（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２］、及び、ヒトモノクローナル抗体を産生させるＥＢＶハイブリドーマ技術［Ｃｏｌｅら，（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．］などである。不死の抗体産生細胞系は、腫瘍原性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バールウイルスによるトランスフェクションのような融合以外の技術によって創製できる。例えば、米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４５１，５７０号、第４，４６６，９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９１，６３２号及び第４，４９３，８９０号を参照するとよい。
【０１１４】
本発明の追加の実施態様では、最新技術を使用してモノクローナル抗体を無菌動物で産生できる。本発明によれば、ニワトリまたはブタの抗体を使用でき、これらの抗体は、ニワトリもしくはブタのハイブリドーマを使用することによってまたはＢ細胞をＥＢＶウイルスでｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質転換することによって得ることができる。実際、本発明によれば、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特異的なマウス抗体分子に由来の遺伝子を適当な生物活性の抗体分子に由来の遺伝子とスプライシングすることによって“キメラ抗体”を産生するために開発された技術［Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，（１９６４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９−８７０；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４２−４５４］を使用できる。このような抗体は本発明の範囲内である。腸の疾患または障害（前出）の治療にはこのようなキメラ抗体の使用が好ましい。何故ならばこのような抗体はそれ自体の免疫応答、特にアレルギー性応答を誘発することが異種間抗体よりもはるかに少ないからである。
【０１１５】
本発明によれば、一本鎖抗体産生用に記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）をＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列特異的一本鎖抗体の産生に応用できる。本発明の追加の実施態様は、Ｆａｂ発現ライブラリー構築用に記載された技術［Ｈｕｓｅら，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１］を利用して、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはその誘導体もしくはアナローグに対して所望の特異性を有しているモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定できる。
【０１１６】
抗体分子のイディオタイプを含有している抗体フラグメントは公知の技術によって作製できる。このようなフラグメントの非限定例は例えば、抗体分子のペプシン消化によって生じるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦａｂ’ フラグメント、及び、抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生じるＦａｂフラグメントである。
【０１１７】
抗体産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、“サンドイッチ”イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体ラベルの使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどによって行うことができる。１つの実施態様では、第一抗体のラベルを検出することによって抗体結合を検出する。別の実施態様では、第一抗体への第二抗体または試薬の結合を検出することによって第一抗体を検出する。また別の実施態様では、第二抗体を標識する。イムノアッセイ中の結合を検出するために多くの手段が当技術分野で公知であり、これらは本発明の範囲内である。例えば、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列の特異的エピトープを認識する抗体を選択するためには、形成されたハイブリドーマを試験して、該エピトープを含有しているＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列フラグメントに結合する産物の有無を検査すればよい。特定の動物種からＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特異的な抗体を選択するためには、該動物種の細胞によって発現されているかまたは細胞から単離されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列への陽性結合に基づいて選択できる。
【０１１８】
診断
別の実施態様によれば、本発明は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列及び／または該配列に由来の抗体及び／またはＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を使用する、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の存在を検出する診断及び予後観察方法を提供する。
【０１１９】
診断及び予後観察方法は一般に、ニワトリまたはブタのような動物から得られた生物サンプルを使用して行う。“サンプル”は、動物から採取したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種を含有する疑いのある組織または流体のサンプルを意味しており、その非限定例は、血漿、血清、糞便サンプル、組織及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分のサンプルである。
【０１２０】
ポリペプチド／抗体に基づく診断
本発明はサンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の存在を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を含有する疑いのあるサンプルを、抗体とＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列とを含む反応複合体が形成できる条件下でＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特異的に結合する抗体（好ましくは固体支持体に結合されている）に接触させる段階と、（ｂ）サンプル中の抗体とＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列とを含む反応複合体の形成を検出する段階とを含み、反応複合体の検出がサンプル中のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の存在を示す指標となる。
【０１２１】
好ましくは、この方法に使用される抗体が、アフィニティ精製ポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂに由来する。更に、本発明に使用される抗体分子はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦ（ｖ）部分または完全抗体分子の形態であるのが好ましい。
【０１２２】
上記方法に基づくＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の特に好ましい検出方法は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ並びにモノクローナル及び／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイのような免疫酵素アッセイである。
【０１２３】
このような手順のうちでも特に有用な３つの手順では、検出可能ラベルで標識されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列（またはそのフラグメント）、検出可能ラベルで標識された抗体Ａｂ１、または、検出可能ラベルで標識された抗体Ａｂ２を利用する。この手順を以下の等式によって要約する。式中の星印は、粒子が標識されていることを表し、“ＡＡ”はＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を表す。
Ａ．ＡＡ＊＋Ａｂ１＝ＡＡ＊Ａｂ１
Ｂ．ＡＡ＋Ａｂ１＊＝ＡＡＡｂ１＊
Ｃ．ＡＡ＋Ａｂ１＋Ａｂ２＊＝Ａｂ１ＡＡＡｂ２＊
当業者はこのような手順及びそれらの使用に精通しており、従って、本発明の範囲内で使用し得る。“競合”手順である手順Ａは米国特許第３，６５４，０９０号及び第３，８５０，７５２号に記載されている。手順Ｂは公知の競合アッセイ技術の代表である。手順Ｃは“サンドイッチ”手順であり、米国特許ＲＥ３１．００６及び第４，０１６，０４３号に記載されている。“二重抗体”または“ＤＡＳＰ”手順のようなまた別の手順も知られている。
【０１２４】
どの場合にも、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列が１つまたは複数の抗体または結合相手と共に複合体を形成し、複合体の一方の構成要素は検出可能ラベルで標識されている。複合体が形成されたという事実及び所望の場合にはその量は、ラベル検出に応用できる公知の方法によって判定できる。
【０１２５】
上記の記載より、Ａｂ２の特性がＡｂ１と反応することであるというのは理解されよう。その理由は、１つの哺乳動物種で感作されたＡｂ１が別の種で抗体Ａｂ２を感作する抗原として使用されるからである。例えば、抗原としてウサギ抗体を使用し、ヤギの体内でＡｂ２を感作する。従ってＡｂ２はヤギで感作された抗ウサギ抗体であろう。本明細書及び特許請求の範囲では、Ａｂ１を第一抗体と呼び、Ａｂ２を第二抗体または抗Ａｂ１抗体と呼ぶ。
これらの研究で最も多く使用されたラベルは放射性元素、酵素、紫外光線に照射されると蛍光を発する化学物質、などである。
【０１２６】
複数の蛍光材料が公知であり、ラベルとして使用できる。これらの例は、フルオレセイン、ローダミン及びオーラミンを含む。特定の検出材料はヤギに産生させイソチオシアナートによってフルオレセインにコンジュゲートした抗ウサギ抗体である。
【０１２７】
また、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそれらの結合相手を放射性元素または酵素で標識してもよい。放射性ラベルは現在入手可能な計測手段のいずれかによって検出できる。好ましい同位体は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ及び１８８Ｒｅから選択するとよい。
【０１２８】
酵素ラベルも有用であり、現在利用されている比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法またはガス測定法のいずれかによって検出できる。酵素を、カルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子と反応させることによって選択された粒子にコンジュゲートする。これらの手順で使用できる多くの酵素が公知であり、利用できる。好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼである。代替的標識材料及び方法の開示例として米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号及び第４，０１６，０４３号を挙げることができる。
【０１２９】
本発明はまた、生物サンプル中の腸スピロヘーター感染症の抗体を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントを用意する段階と、（ｂ）生物サンプルを該アミノ酸配列と共に抗体抗原複合体が形成できる条件下でインキュベートする段階と、（ｃ）該アミノ酸配列を含む抗体抗原複合体が形成された否かを判断する段階とを含む。
【０１３０】
本発明の別の実施態様では、生物サンプル中のＢｐｍｐ−７２抗体のレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価する方法が提供される。該方法は、（ａ）上述の方法に従って生物サンプル中の反応複合体の形成を検出する段階と、（ｂ）形成された反応複合体の量を評価する段階とを含み、この反応複合体の量が生物サンプル中のＢｐｍｐ−７２抗体のレベルに対応する。
【０１３１】
更に、動物宿主体内のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する疾患の治療処置をｉｎ  ｖｉｔｒｏモニターする方法が提供される。該方法は、このような治療処置を受けている動物宿主から種々の時点に採取した一連の生物サンプル中のＢｐｍｐ−７２抗体のレベルを評価する段階を含む。
【０１３２】
核酸に基づく診断
本発明は更に、生物サンプル中のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の有無を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）適正なハイブリダイズ条件下で生物サンプルを本発明のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブまたはプライマーに接触させる段階と、（ｂ）プローブまたはプライマーとサンプル中の核酸との間に形成された二重鎖を検出する段階とを含む。
【０１３３】
本発明の１つの実施態様によれば、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の検出は、公知の技術を使用して生物サンプルからＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を直接的に増幅し、次いでＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の存在を検出することによって行う。
【０１３４】
本発明の１つの形態では、ターゲット核酸配列をＰＣＲによって増幅し、次いで上述の特異的方法のいずれかを使用して検出する。Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の存在を検出する他の有用な診断技術の非限定例は、（１）対立遺伝子特異的ＰＣＲ、（２）一本鎖コンホメーション解析、（３）変性用勾配ゲル電気泳動、（４）ＲＮアーゼ保護アッセイ、（５）大腸菌ｍｕｔＳタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用、（６）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、及び、（７）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどである。
【０１３５】
上記方法に加えて、慣用のプローブテクノロジーによってＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を検出してもよい。Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の存在を検出するためにプローブを使用するとき、所望の場合には血液または血清のような分析すべき生物サンプルに核酸抽出処理を施す。サンプルのポリヌクレオチド配列を様々なやり方、例えば、変性、制限消化、電気泳動またはドットブロット法で処理してターゲット配列の検出が容易になるように準備する。サンプルのポリヌクレオチド配列のターゲット領域は通常は、プローブのターゲティング配列とハイブリッドを形成するために少なくとも部分的に一本鎖でなければならない。配列が天然に一本鎖であるときは変性が不要であろう。しかしながら、配列が二重鎖であるならば、配列を変性することが必要であろう。変性は当技術分野で公知の種々の技術によって行うことができる。
【０１３６】
サンプルポリヌクレオチド配列及びプローブをプローブ中のターゲット配列とサンプル中の推定Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列との安定なハイブリッド形成が促進される条件下でインキュベートする。擬陽性を防止するために好ましくは高緊縮性条件を使用する。ハイブリッドが得られたならば、得られたハイブリッドの検出を一般には標識プローブを使用して行う。あるいは、プローブを標識せず、標識されているリガンドとの特異的結合によって直接的または間接的に検出することも可能である。適当なラベル並びにプローブ及びリガンドの標識方法は当技術分野で公知であり、例えば、公知の方法（例えば、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理）によって取込ませる放射性ラベル、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に励起されたジオキセタン）、酵素、抗体などがある。この基礎的スキームの変更は当業者に公知であり、検出すべきハイブリッドを外来材料から分離し易くするような変更及び／または標識部分からのシグナルを増幅するような変更がある。
【０１３７】
また、本発明の核酸プローブアッセイにＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を検出できる核酸プローブカクテルを使用することも本発明の範囲内で考察できる。従って、１つの例では、細胞サンプル中のＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列の存在を検出するために、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列に相補的な２つ以上のプローブを使用する。具体的には、異なるプローブの数は２、３または５種類の異なる核酸プローブ配列である。
【０１３８】
核酸アレイ−“ＤＮＡチップ”テクノロジー
Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列（好ましくはプローブの形態）はまた、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種を検出するために固相支持体に固定してもよい。あるいは、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列が、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種から複数の異なる遺伝子を同時に検出するために使用できるＤＮＡ分子ライブラリーの一部を形成してもよい。本発明の別の代替形態では、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列を他のポリヌクレオチド配列（例えば、他の細菌またはウイルスに由来）と共に固体支持体に固定し、固体支持体に結合したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種及び／または他のポリヌクレオチド配列の存在を同定できるようにしてもよい。
【０１３９】
ＤＮＡ分子の固定ライブラリーを作製する技術は当技術分野の文献に記載されている。一般に、従来技術の大抵の方法は、例えば固体基板の種々の不連続位置に種々の配列の順列を形成するマスキング技術を使用した一本鎖核酸分子ライブラリーの合成を記載している。米国特許第５，８３７，８３２号は、超大規模集積テクノロジーに基づいてシリコン基板に固定したＤＮＡアレイを製造する改良方法を記載している。具体的には米国特許第５，８３７，８３２号は、基板の空間的に規定された位置に特定のプローブセットを合成するための“タイリング”と呼ばれる戦略を記載しており、これは本発明の固定ＤＮＡライブラリーを作製するために使用できる技術である。米国特許第５，８３７，８３２号はまた、同じく使用可能なもっと初期の技術の参考文献を提供している。このように、ポリヌクレオチド配列プローブは基板の表面でｉｎ  ｓｉｔｕに合成し得る。
【０１４０】
あるいは、固体基板から離れて一本鎖分子を合成し、予め合成した配列の各々を固体基板の不連続位置に付着させてもよい。例えば、ピンまたは圧電デバイスを備えたロボットデバイスを使用してポリヌクレオチド配列を基板に直接的にプリントしてもよい。
【０１４１】
ライブラリー配列は典型的には、固体基板上のまたは固体基板中の不連続領域に固定される。基板は、基板の内部に固定することが可能な多孔質基板でもよく、または、実質的に非多孔質でもよく、その場合には、ライブラリー配列が典型的には基板の表面に固定される。固体基板はポリペプチドが直接的または間接的に結合できるいかなる材料から製造されてもよい。適当な固体基板の例は、平坦ガラス、シリコンウェーハ、マイカ、セラミックス、及び、例えばポリスチレン、ポリメタクリレートなどのプラスチックのような有機ポリマーである。また、ニトロセルロース膜またはナイロン膜のような半透膜を使用することも可能であり、これらは広く出回っている。半透膜をガラスのようなもっと強固な固体表面に取り付けてもよい。場合によっては金、白金または他の遷移金属のような金属層で表面をコートしてもよい。適当な固体基板の特定例は、市販のＢｉｏＣｏｒｅＴＭチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）である。
【０１４２】
好ましくは固体基板が一般には剛性または半剛性の表面をもつ材料である。好ましい実施態様では、基板の少なくとも１つの表面が実質的に平坦であろうが、いくつかの実施態様では、異なるポリマー用の合成領域を例えば隆起領域または腐食溝などによって物理的に分離するのが望ましいこともあろう。また、固体基板が５０−１００μｍの不連続区域で高密度のＤＮＡ配列付着に適しているのが好ましい。この場合、１００００〜４００００ドット／ｃｍ−２の密度を与える。
【０１４３】
固体基板をセクションに分割するのが便利である。これは、ホトエッチングのような技術によって、または、疎水性インキ例えばテフロン基剤のインキ（Ｃｅｌ−ｌｉｎｅ，ＵＳＡ）を塗布することによって行うとよい。
【０１４４】
ライブラリーの異なる構成員の各々を配置する不連続位置は例えば円形、長方形、楕円形、楔形などの適当な形状を有し得る。
ポリヌクレオチド配列を基板に付着させるには共有結合または非共有結合を利用し得る。ポリヌクレオチド配列は、ライブラリー配列が結合している分子の層を介して基板に付着し得る。例えば、ポリヌクレオチド配列をビオチンで標識し、基板をアビジン及び／またはストレプトアビジンでコートする。ビオチン化ポリヌクレオチド配列の使用によって得られる利点は、固体基板への結合効率を容易に測定できることである。ポリヌクレオチド配列はある種の固体基板には結合し難いので、固体基板（例えばガラスの場合）と核酸配列との間に化学的インターフェースを設けることがしばしば必要である。適当な化学的インターフェースの例はヘキサエチレングリコールである。別の例はポリリシンでコートしたガラスの使用である。この場合ポリリシンはアフィニティリガンドを導入するために標準手順によって化学的に修飾される。カップリング剤を使用して固体基板の表面に分子を付着させる別の方法が当技術分野で公知である。例えば、国際特許ＷＯ９８／４９５５７参照。
【０１４５】
相補的ポリヌクレオチド配列が固定核酸ライブラリーに結合したことは、固定したポリヌクレオチド配列の光学特性値の変化（即ち、臭化エチジウムの使用）またはフルオロホアで標識したポリペプチドのような標識核酸の使用などの種々の手段によって判断できる。ラベルの使用が不要な他の検出技術は、音響光学法、反射測定法、偏光解析法、表面プラスモン共鳴法（国際特許ＷＯ９７／４９９８９参照）のような光学技術である。
【０１４６】
従って本発明は、少なくとも１種類の本発明のポリヌクレオチド、好ましくは異なる２種類以上の本発明のポリヌクレオチド配列が固定された固体基板を提供する。好ましい実施態様では固体基板が更に、Ｂｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列以外の遺伝子に由来のポリヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
治療的使用
本発明はまた予防薬または治療薬として使用できる。これらはニワトリ及びブタのような動物の体内の体液性及び細胞性応答を刺激し、これによってＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種のコロニー化を防御する目的で使用し得る。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の自然感染は、Ｂｐｍｐ−７２に対する循環抗体価を誘発する。従って、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはその部分は、腸スピロヘーター感染症を防御するために全身的または経口的に投与される予防薬または治療薬の基剤を形成する可能性を有している。
【０１４８】
従って１つの実施態様で本発明は、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合された治療有効量でＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または、該アミノ酸配列に結合する抗体もしくは本文中に記載のポリヌクレオチド配列を提供する。
本文中に使用した“治療有効量”という表現は、動物宿主の活性、機能及び応答の臨床的に有意な不全を少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％軽減し、最も好ましくはこのような不全を防止するために十分な量を意味する。あるいは、治療有効量は、動物宿主の状態の臨床的に有意な改善を生じさせるために十分な量を意味する。
【０１４９】
“医薬的に許容される”という表現は、生理的に寛容であり、典型的には、動物に投与されたときにアレルギー反応または同様の不都合な反応、例えば胃の不調などを生じさせない分子完全体及び組成物を表す。“担体”という用語は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒介物を表す。このような医薬担体は、滅菌液体、例えば水、及び、石油、動物もしくは植物に由来するかまたは合成した油であり、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などがある。水または生理的塩類溶液、デキストロース及びグリセロールの水溶液が、特に注射液用担体として好ましく使用される。適当な医薬担体は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９９０）に記載されている。
【０１５０】
本発明のより特定的な形態では、治療有効量のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのアナローグ、フラグメントもしくは誘導産物、または、これらに対する抗体を、医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／または担体と共に含む医薬組成物が提供される。また、ヒアルロン酸を用いてもよい。このような組成物は、種々のバッファ含量（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤と、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、トゥイーン８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ亜硫酸水素ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）のような添加剤及び増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。材料はポリ乳酸、ポリグリコール酸などのような高分子化合物の微粒状調製物に組み込んでもよく、または、リポソームに組み込んでもよい。また、ヒアルロン酸を用いてもよい。このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与える。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １８０４２）１４３５−１７１２頁参照。該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。組成物は液体形態に調製してもよく、または、凍結乾燥形態のような乾燥粉末として調製してもよい。
【０１５１】
投与
本発明に従って提供される医薬組成物が当技術分野で公知のいずれかの手段によって投与できることは理解されよう。好ましくは、投与すべき医薬組成物を、注射、経口、または、肺、鼻腔経路で投与する。Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列または該配列に由来の抗体はより好ましくは静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内または皮下への投与経路によって運搬される。あるいは、適正に配合されたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列または該配列に由来の抗体は鼻腔または経口投与によって投与できる。
【０１５２】
ポリヌクレオチド主体の治療方法
本発明はまた、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉに関連する疾患を変調する医薬を製造するために本発明のポリヌクレオチド配列、並びに、本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なアンチセンス及びリボザイムポリヌクレオチド配列を使用することについて述べている。
【０１５３】
治療方法に使用するアンチセンス構築物またはリボザイムをコードしているポリヌクレオチド配列は望ましくは無被覆の核酸構築物として直接的に投与される。細菌細胞による無被覆核酸構築物の取込みはいくつかの公知のトランスフェクション技術、例えば、トランスフェクション補佐物質の使用を含む技術によって増進される。これらの補佐物質の例は、カチオン性物質（例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン）及びリポフェクタント（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍＴＭ及びｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭ）である。典型的には、核酸構築物をトランスフェクション補佐物質と混合して組成物を製造する。
【０１５４】
あるいは、アンチセンス構築物またはリボザイムを医薬的に許容される担体または希釈剤と合せて医薬組成物を製造してもよい。適当な担体及び希釈剤は、例えば、リン酸塩緩衝生理的塩類溶液のような等張性塩類溶液である。非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮的に投与するように組成物を配合し得る。
【０１５５】
記載の投与経路は単なる指針であり、当業者は特定の動物及び状態に最適の投与経路及び薬用量を容易に決定できるであろう。
【０１５６】
薬物スクリーニングアッセイ
本発明はまた、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に結合する物質を同定するための適当なアッセイを提供する。更に、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を妨害する物質を同定するための適当なアッセイが提供される。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備アッセイで同定された候補物質の完全形細胞に対する効果を全細胞アッセイで試験するアッセイも提供される。
【０１５７】
１つのタイプのアッセイでは、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に結合する物質を同定するために、固体支持体に固定させたＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を非固定の候補物質に接触させ、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列と候補物質との互いの結合の有無及び／または結合の程度を定量する段階を含む。あるいは、候補物質を固定し、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を非固定にしてもよい。
【０１５８】
好ましい１つのアッセイ方法では、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列をアガロースビーズのようなビーズに固定する。この方法は典型的には、細菌、酵母またはより高等な真核細胞系中で成分をＧＳＴ−融合タンパク質として発現させ、グルタチオン−アガロースビーズを使用して粗細胞抽出物からＧＳＴ−融合タンパク質を精製する。次に、固定Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に対する候補物質の結合を定量する。このタイプのアッセイはＧＳＴプルダウンアッセイとして当技術分野で知られている。この場合にも、候補物質を固定し、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を非固定にしてもよい。
【０１５９】
また、このタイプのアッセイは、例えばＮｉ−ＮＴＡアガロース及びヘキサヒスチジン標識成分といった、成分の一つを固定するための異なるアフィニティ精製系を使用して行うことも可能である。
【０１６０】
候補物質へのＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列の結合は、当技術分野に公知の多様な方法によって定量し得る。例えば、非固定成分を標識する（例えば、放射性ラベル、エピトープタグ、または、酵素−抗体複合体）。あるいは、免疫検出技術によって結合を定量してもよい。例えば、反応混合物をウェスタンブロット処理し、非固定成分を検出する抗体でブロットをプローブする。ＥＬＩＳＡ法を使用してもよい。
【０１６１】
候補物質は典型的には、１−１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましく１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで添加する。抗体の場合、使用される最終濃度は典型的には１００−５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００−３００μｇ／ｍｌである。
【０１６２】
従って本発明は、薬物をＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントに接触させ、（ｉ）該薬物とＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントとの間の複合体の存在、または、（ｉｉ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントとリガンドとの間の複合体の存在、を当技術分野で公知の方法によって検定する段階を含む薬物のスクリーニング方法を提供する。このような競合結合アッセイでは典型的にはＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントを標識する。タンパク質：タンパク質複合体中に存在するＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントから遊離Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントを分離すると、遊離（即ち、複合体を形成していない）ラベルの量が、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に対する被験薬物の結合またはＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列：リガンド結合に対する被験薬物による妨害をそれぞれ表す尺度となる。
【０１６３】
別の薬物スクリーニング技術は、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に適当な結合アフィニティを有している化合物の高スループットスクリーニングを提供する。これは１９８４年９月１３日公開のＧｅｙｓｅｎのＰＣＴ出願公開ＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に説明すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物をプラスチックピンまたは他の何らかの表面のような固体基板上に合成する。ペプチド試験化合物をＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列と反応させて洗浄する。次いで、結合したＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列を当技術分野で公知の方法で検出する。
【０１６４】
本発明はまた、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはそのフラグメントに対する結合に関して、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列に特異的に結合し得る抗体と試験化合物とを競合させる競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を考察する。この方法では、抗体を使用して、Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列の１つまたは複数の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。
【０１６５】
キット
本発明はまた、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に感染した疑いのある動物をスクリーニングするため、または、動物がＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に感染していることを確認するためのキットを提供する。該キットは、適当な容器に包装されたＢｐｍｐ−７２ポリヌクレオチド配列に相補的な少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をその使用説明書と共に含んでいる。
【０１６６】
本発明の別の実施態様では、感染疑惑のある動物体内のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の有無を判定するため、または、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の感染を定量的に測定するために専門家の使用に好適なキットが作製される。上述の試験技術と同様に、このようなキットの１つのクラスは、標識Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはその結合相手、例えば該配列に特異的な抗体を少なくとも含み、また、例えば、“競合”、“サンドイッチ”、“ＤＡＳＰ”などの選択された方法による指示を含むであろう。キットはまた、バッファ、安定剤などのような周辺試薬を含有し得る。
【０１６７】
従って、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の存在を証明するための検査キットを作製し得る。キットは、
（ａ）本発明のＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列またはその特異的結合相手を検出可能ラベルに直接的または間接的に付着させることによって得られた少なくとも１つの標識された免疫化学的に反応性の所定量の成分と、
（ｂ）他の試薬類と、
（ｃ）該キットの使用指示と、
を含む。
【０１６８】
より詳細には、診断用検査キットが、
（ａ）イムノソルベントを形成するために一般に固相に結合されるかあるいは適当なタグに結合された既知量の上述のようなＢｐｍｐ−７２アミノ酸配列（またはその結合相手）、または、複数のこのような目的物質と、
（ｂ）必要ならば他の試薬類と、
（ｃ）該検査キットの使用指示と、
を含む。
【０１６９】
変形実施態様では、所定のプロトコル（例えば、“競合”、“サンドイッチ”、“二重抗体”、など）に従って操作する検査キットを作製し上述の目的に使用する。該検査キットは、
（ａ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列を検出可能ラベルに結合させることによって得られた標識成分と、
（ｂ）１種または複数の追加の免疫化学試薬と、
（ｃ）Ｂｐｍｐ−７２アミノ酸配列とその特異的結合相手との間の免疫化学反応の１つまたは複数の成分を検出及び／または定量するプロトコルの実行指示と、
を含み、
前記（ｂ）の免疫化学試薬の少なくとも１つが、
（ｉ）標識成分（ａ）に結合し得るリガンド、
（ｉｉ）標識成分（ａ）の結合相手に結合し得るリガンド、
（ｉｉｉ）定量すべき成分の少なくとも１つに結合し得るリガンド、または、
（ｉｖ）定量すべき成分の少なくとも１つの少なくとも１つの結合相手に結合し得るリガンド
から成るグループから選択されたリガンドまたは固定リガンドである。
【０１７０】
本発明の最良実施方法
本発明のその他の特徴を以下の非限定実施例でより十分に説明する。しかしながら、この詳細な記載は本発明を例示する目的のみで含まれることを理解されたい。上記の広範囲な発明の開示を制限すると理解してはならない。
【０１７１】
以下の実施例で明白に記載していない分子クローニング、免疫学及びタンパク質化学の方法は文献に報告されており、当技術分野に公知である。当技術分野に周知の慣用の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術を記載した概説書は、例えば、  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ＆  １１，ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．（１９８５）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，  Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）、などである。
【実施例１】
【０１７２】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの７２ｋＤａ外膜タンパク質をコードしている遺伝子の同定及びキャラクタリゼーション
方法
スクリーニング用ポリクローナル抗体（ＡＨＰＳ）の産生
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｂ７８Ｔ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＰＷＳ／ＡＴ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｉｎｎｏｃｅｎｓ  Ｂ２５６Ｔ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ  ５６−１５０Ｔ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ａａｌｂｏｒｇｉ  ５１３Ｔ及び大腸菌ＪＭ１０９の１０１２細胞を含有している細胞懸濁液（９．０ｍｌ）に、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株１６４８で超免疫したブタの血清（１．０ｍｌ）を添加した。連続完全撹拌（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ  ｍｉｘｉｎｇ）を伴ってスラリーを４℃で一夜インキュベートした。細胞に吸収された抗体を、４℃、５，０００×ｇで２０分間遠心することによって除去した。上清を取り出して、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｂ７８Ｔ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＰＷＳ／ＡＴ、Ｂ．ｉｎｎｏｃｅｎｓ  Ｂ２５６Ｔ、Ｂ．ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ  ５６−１５０Ｔ、Ｂｒ．ａａｌｂｏｒｇｉ  ５１３Ｔ及び大腸菌ＪＭ１０９の１０１２細胞を含有している混合細胞ペレットをこの上清に再懸濁させた。連続完全撹拌を伴ってスラリーを４℃で一夜インキュベートした。細胞に吸収された抗体を、４℃、５，０００×ｇで２０分間遠心することによって再度除去した。吸収プロセスを更に２回繰り返した。最終吸収プロセス後、吸収された超免疫ブタ血清（ＡＨＰＳ）をアリコート（５０μｌ）に分け、−８０℃で保存した。
【０１７３】
ゲノムライブラリーのスクリーニング
ＡＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  Ｐ４３／６／７８ゲノムライブラリーは、部分的に制限した高分子量ＤＮＡ（２−３ｋｂ）をラムダバクテリオファージのアームに結合し、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してファージ粒子をパッケージすることによって作製した。得られたファージライブラリーを大腸菌中で増幅し、標準プラーク−リフト法を使用して希釈ＡＨＰＳでイムノスクリーニングした。３回のイムノ−スクリーニングサイクル後に４つのクローン（ＡＨＰ１−４と命名）をプラスミドとして切り出した。
【０１７４】
大腸菌中の７２ｋＤａ外膜タンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）をコードしている遺伝子の発現
組換えプラスミドを内包した大腸菌クローンを、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬＢ寒天プレートに画線培養し、３７℃で一夜インキュベートした。単一コロニーを使用して、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）及びＩＰＴＧ（１ｍＭ）を補充したＬＢブロス（１０ｍｌ）に接種した。ブロス培養物を振盪しながら３７℃で１２時間インキュベートした。各培養物のアリコート（１．０ｍｌ）を２，５００×ｇで１５分間遠心し、３回洗浄した。洗浄プロセスでは、細胞ペレットをリン酸塩緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）（１ｍｌ）に再懸濁させ、２，５００×ｇで１５分間遠心した。洗浄した細胞ペレットをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロット法に備えてＰＢＳ（１００μｌ）に再懸濁させた。
【０１７５】
Ｂｐｍｐ−７２タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析には不連続トリス−グリシンバッファ系を使用する電気泳動分離を用いた。タンパク質サンプルのアリコート（３０μｌ）を１０μｌの４×サンプル処理バッファ（２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、８％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２００ｍＭのＤＴＴ、４０％（ｖ／ｖ）のグリセロール及び０．０４％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー）と混合した。サンプル（１０μｌ）をゲルのウェルに充填する直前にサンプルを５分間煮沸した。ゲルは積層ゲル（１２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、４％ｗ／ｖのアクリルアミド、０．１５％ｗ／ｖのビス−アクリルアミド及び０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ）と分離ゲル（３７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、４％ｗ／ｖのアクリルアミド、０．３１％ｗ／ｖのビス−アクリルアミド及び０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ）から構成した。０．１％（ｖ／ｖ）のＴＥＭＥＤ及び０．０５％（ｗ／ｖ）の新しく調製した硫酸アンモニウム溶液を添加することによってこれらのゲルを重合させ、ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ二層スラブセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に流し込んだ。サンプルを室温（ＲＴ）、１５０Ｖでブロモフェノールブルーの色素の最前部がゲルの底部に到達するまで処理した。分子量の推定値を得るために予め染色した分子量標準をサンプルと並列に電気泳動にかけた。電気泳動後直ちにゲルをウェスタンブロット用のニトロセルロース膜に電気転移させた。
【０１７６】
ウェスタンブロット分析
Ｔｏｗｂｉｎ転移バッファ系を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから分離したタンパク質をニトロセルロース膜に電気泳動転移させた。電気泳動後、転移バッファ（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、２０％ｖ／ｖのメタノール，ｐＨ８．３）中でゲルを１５分間平衡させた。ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎトランスブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｐｒｏｍｅｇａ）に移した。ゲルホルダーを製造業者の指示通りに組立てた後、３０Ｖ、４℃で電気泳動転移を一夜行った。分離されたタンパク質を含んでいる新しく転移されたニトロセルロース膜を、５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有している１０ｍｌのトリス緩衝生理的塩類溶液（ＴＢＳ）によって室温で１時間ブロックした。膜をＴＢＳ（０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０（ＴＢＳＴ））で洗浄し、次いで１０ｍＬのＡＨＰＳ（ＴＢＳＴで５，０００倍に希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄した後、膜をＴＢＳＴで５，０００倍に希釈した１０ｍＬのヤギ抗ブタＩｇＧ（完全分子）−ＨＲＰと共に室温で１時間インキュベートした。１０ｍＬのＤＡＢ基質溶液（０．５ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジン、０．００３％ｗ／ｖの過酸化水素、ＴＢＳ）で膜を発色させた。膜を蒸留水で洗浄することによって発色反応を停止させた。次に膜を乾燥し、プレゼンテーション用に調べた。
【０１７７】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉインサートの配列決定
ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して直接的にＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのゲノムインサートを配列決定するためにプラスミドＡＨＰ１を選択した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示通りに使用して大腸菌細胞からファージミドを精製した。初期インサート配列は、市販のＴ３及びＴ７オリゴヌクレオチドを使用しこれらをインサートの両端に隣接するベクター領域にアニーリングすることによって得られた。残りのオリゴヌクレオチドは、上流インサート配列の３’−ＯＨ端に基づいて設計した（表２）。“ＴＡ”は、オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲの最適なアニーリング温度を表す。
【０１７８】
【表２】
2007534311.tif 000003
【０１７９】
各配列決定反応は、ファージミド（３００ｎｇ）、プライマー（４ｐｍｏｌ）、及び、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（４μｌ）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のアリコート（１０μｌ）中で行った。サイクリング条件は、まずは変性段階を９６℃で２分間行った。次いで、９６℃で１０秒の変性、プライマーの溶融温度（表２）で５秒のアニーリング、及び、６０℃で４分間のプライマー伸長を２５サイクルとした。１２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）を含有する９５％（ｖ／ｖ）エタノール溶液で沈殿させることによって配列決定産物から残留ダイターミネーターを除去し、真空乾燥した。配列決定産物をＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーを使用して解析した。
【０１８０】
Ｂｐｍｐ−７２配列の完成
配列決定ベクターへのゲノムＤＮＡフラグメントのクローニング
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  Ｐ４３／６／７８から精製した染色体ＤＮＡをＨｉｎＤＩＩＩで完全消化した。簡単に説明すると、染色体ＤＮＡ（２μｇ）とｐＴｒｃＨｉｓプラスミド（１μｇ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを別々に、２０ＵのＨｉｎＤＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有している１×ＨｉｎＤＩＩＩバッファ中で３７℃で一夜インキュベートした。ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造業者の指示通りに使用して制限産物を精製した。制限したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を、直鎖化したｐＴｒｃＨｉｓベクターのアリコート（１００ｎｇ）と共に１ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有している３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ  ７．８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＡＴＰに入れて１４℃で１６時間インキュベートした。このライゲーション反応の生成物をｐＴｒｃ−ＰＩＬと命名した。ベクター再環化陰性対照としてゲノムＤＮＡ非含有の等しいライゲーション反応も行った。すべてのライゲーション反応はすべて全容量２０μｌで行った。
【０１８１】
ライゲーションＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
使用したプライマーは、ｐＴｒｃＨｉｓのＨｉｎＤＩＩＩクローニング部位に隣接する相補配列にアニールするｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆ（５’−ＣＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＧ−３’）（配列２６）、及び、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの部分的ＯＲＦの５’末端の相補配列にアニールするＡＨＰ−Ｒｅｖ（５’−ＴＣＧＣＴＴＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧ−３’）（配列２７）であった。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、５０μｌの全容量中のＰＣＲによってライゲーションＤＮＡを増幅した。増幅混合物は、１×ＰＣＲバッファ（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）、０．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．５μＭのプライマー対（ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆ，ＡＨＰ−Ｒｅｖ）及びｐＴｒｃ−ＰＩＬ（２μｌ）から構成した。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期鋳型変性段階、次いで、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、及び、６８℃で４分間のプライマー伸長を３０サイクルとした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファ（４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ）中の１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ光を使用して観察した。
【０１８２】
Ｂｐｍｐ−７２のＯＲＦ伸長部の配列決定
ｐＴｒｃ−ＰＩＬのＰＣＲで得られた増幅産物をＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔを製造業者の指示通りに使用して精製した。ＰＣＲ産物の配列決定は、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆ及びＡＨＰ−Ｒｅｖプライマーを使用して重複で行った。各配列決定反応は、ＰＣＲ産物（５０ｎｇ）、プライマー（２ｐｍｏｌ）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（４μｌ）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から成る容量１０μｌで行った。サイクリング条件は、９６℃で２分間の変性段階、次いで９６℃で１０秒間の変性、１２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）による５５℃で５秒間のプライマーアニーリングを２５サイクルとし、真空乾燥した。配列決定産物をＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーを使用して解析した。  ＳｅｑＥｄ  ｖ１．０．３及びＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ６を使用して配列結果を編集し、コンパイルして、比較した。
【０１８３】
Ｂｐｍｐ−７２の残りのＯＲＦの配列決定
ｐＴｒｃ−ＰＩＬのＰＣＲ増幅を上記のように繰り返した。使用したプライマーは、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆ及びＡＨＰ−Ｒｅｖ２（５’−ＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＴＧＣＴＣ−３’）（配列２８）であった。配列２８は、伸長したＢ．  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの部分的ＯＲＦの５’−末端で相補配列にアニールする。  Ｂｐｍｐ−７２  ＯＲＦの残りの未知領域の配列決定は、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆ及びＡＨＰ−Ｒｅｖ２プライマーを使用して上記同様に行った。配列決定産物をＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーを使用して解析した。ＳｅｑＥｄ  ｖ１．０．３及びＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ６を使用して配列結果を編集し、コンパイルして、比較した。
【０１８４】
仮定Ｂｐｍｐ−７２  ＯＲＦ配列の解析
配列結果をＳｅｑＥｄ  ｖ１．０．３（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して編集しコンパイルした。ヌクレオチド配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６（ＩｎｆｏｒＭａｘ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して解析した。
【０１８５】
演繹された仮定読取り枠（ＯＲＦ）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＮＣＢＩ）から入手可能な全配列データベースに対する相同性探索に使用した。
【０１８６】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種のＢｐｍｐ−７２のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析
８２のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａのゲノムＤＮＡ：４８株のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、１８株のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ、１２株のＢ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、８株のＢ．ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ、４株のＢ．ｉｎｎｏｃｅｎｓ、２株の“Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｓ”、１株のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ及び１株のＢ．ａａｌｂｏｒｇｉに由来の７２ｋＤａの外膜タンパク質をコードしている遺伝子のＰＣＲ検出のためにＢｐｍｐ−７２  ＯＲＦの９１３及び１６９２ｂｐの領域にアニールした２つのプライマーを設計し最適化した。使用したプライマーは、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  ＯＲＦに隣接する相補配列にアニールするＡＨＰ−Ｆ４（５’−ＣＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧ−３’）（配列２９）及びＡＨＰ−Ｒ７８３（５’−ＴＴＡＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＡＧＴＧ−３’）（配列３０）であった。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し全容量５０μｌで遺伝子をＰＣＲ増幅した。増幅混合物は、１×ＰＣＲバッファ（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）、０．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．５μＭのプライマー対（ＡＨＰ−Ｆ４、ＡＨＰ−Ｒ７８３）、及び、２．５μ１の精製染色体鋳型ＤＮＡから構成した。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期鋳型変性段階、次いで９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、及び、６８℃で２分間のプライマー伸長を２５サイクルとした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファ（４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ）中の１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ光を使用して観察した。
【０１８７】
他のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株中に存在するＢｐｍｐ−７２の配列決定
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株のＢｐｍｐ−７２のＰＣＲ
鋳型配列決定用Ｂｐｍｐ−７２のＰＣＲ増幅のために２つのプライマー、即ち、Ｂｐｍｐ−７２  ＯＲＦの９８塩基対上流にアニールしたＡＨＰ−９８Ｆ（５’−ＣＧＴＴＴＡＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧ−３’）（配列３１）及びＯＲＦから１７８塩基対下流にアニールしたＡＨＰ＋１８９０Ｒ（５’−ＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＣＴＴＡＡＴＣＡＴ−３’）（配列３２）を設計し、最適化した。ＰＣＲは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し全容量５０μｌで行った。増幅混合物は、１×ＰＣＲバッファ（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）、０．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．５μＭのプライマー対（ＡＨＰ−Ｌ１，ＡＨＰ−Ｒ１）及び２．５μ１の精製染色体鋳型ＤＮＡから構成した。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期鋳型変性段階、次いで９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリン、及び、６８℃で４分間のプライマー伸長を３０サイクルとした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファ（４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ）中の１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ光を使用して観察した。
【０１８８】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株由来のＢｐｍｐ−７２の配列決定
６つのＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株由来のＰＣＲ産物をＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔを製造業者の指示通りに使用して精製した。ＰＣＲ産物の配列決定は、ＡＨＰ−９８Ｆ、ＡＨＰ＋１８９０Ｒ及びＡＨＰ＋１０１２Ｒ（５’−ＴＡＴＣＧＣＴＴＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧ−３’）（配列３３）プライマーを使用して重複で行った。各配列決定反応は、ＰＣＲ産物（５０ｎｇ）、プライマー（２ｐｍｏｌ）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（４μｌ）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から成る容量１０μｌで行った。サイクリング条件は、９６℃で２分間の変性段階、次いで９６℃で１０秒間の変性、５５℃で５秒間のプライマーアニーリング、及び６０℃で４分間のプライマー伸長を２５サイクルとした。１２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）を含有する９５％（ｖ／ｖ）エタノールで沈殿させることによって配列決定産物から残留ダイターミネーターを除去し、真空乾燥した。配列決定産物をＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーを使用して解析した。  ＳｅｑＥｄ  ｖ１．０．３及びＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ６及びＣｌｕｓｔａｌＸを使用して配列結果を編集し、コンパイルして、比較した。
【０１８９】
結果
大腸菌中の７２ｋＤａ外膜タンパク質をコードしている組換えファージミドの単離及びキャラクタリゼーション
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉバクテリンで超免疫したブタの血清を上述のようにして（Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ以外の）Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種の全細胞及び大腸菌全細胞に吸収させた。吸収された血清（ＡＨＰＳ）をＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの外膜抽出物に対してウェスタンブロット分析すると、ＡＨＰは７２ｋＤａの見掛け分子量をもつタンパク質と優先的に反応することが判明した（図１）。  Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉラムダＺＡＰゲノムライブラリーのスクリーニングから６つのクローンが得られたので、ＡＨＰ１−６と命名した。これらのクローン全部が見掛け分子量３４ｋＤａの共通タンパク質を産生した。これらのタンパク質のすべてがＡＨＰＳと強力に反応した（図２）。１つのクローンの配列決定で２９．４ｋＤａのコーディング容量をもつ７８３塩基対の部分的ＯＲＦが同定された。この部分的ＯＲＦはＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの７２ｋＤａの外膜タンパク質のカルボキシ末端部分をコードしていると考えられる。
【０１９０】
読取り枠の配列解析
モチーフ及び保存ドメイン
表２に示したプライマーを使用してＡＨＰ１プラスミドを配列決定すると  Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉゲノムＤＮＡの１００９塩基対のインサートが判明した。インサートＤＮＡを配列解析すると、推定ＡＴＧ開始コドンとＴＡＡ終結コドンとをもつ塩基１−７８３までの７８３塩基対の潜在的な部分的ＯＦＲが判明した（図３）。残りの遺伝子を更にクローニングして配列決定すると、Ｂｐｍｐ−７２のコーディング配列が１，６９２ヌクレオチドのサイズであることが判明した。潜在的なシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧ）と−１０（ＴＡＡＴＡＴ）及び−３５（ＴＴＧＡＡＡ）の推定プロモーター領域がＡＴＧ開始コドンの上流で同定された。７２ｋＤａの外膜タンパク質をコードしている遺伝子配列を分子量７２ｋＤａの外膜タンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）と命名した。
【０１９１】
翻訳されたポリペプチドは、予想分子量６２．１ｋＤａの５６４アミノ酸（ａａ）残基から構成されていた。推定されたサイズは、天然型Ｂｐｍｐ−７２タンパク質のウェスタンブロットで観察されたサイズとは有意に違っていた。  Ｂｐｍｐ−７２の仮定コーディング容量と天然型Ｂｐｍｐ−７２外膜タンパク質との分子量の違いは恐らく、アシル化、メチル化、アセチル化、リン酸化及び硫酸化のような翻訳後修飾が原因であろう。アミノ酸配列の解析によって、翻訳されたポリペプチドのＣ末端の１１８残基領域の存在が判明した。これは保存されたリシンモチーフ（ＬｙｓＭ）ドメインに相同であった。このドメインは、細菌細胞壁を分解する酵素で初めて同定され、それ以来多くの他の細菌性タンパク質に存在することが判明した遍在タンパク質モジュールである。ＬｙｓＭドメインは細菌細胞の表面タンパク質に最も多いモジュールの１つである。ＬｙｓＭドメインを有している他の細菌性タンパク質、例えば、ブドウ球菌ＩｇＧの結合タンパク質及び大腸菌のインチミンは細菌病因論に関与する。
【０１９２】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に存在するＢｐｍｐ−７２遺伝子の配列決定
４８株のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、１８株のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ、１２株のＢ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、８株のＢ．ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ、４株のＢ．ｉｎｎｏｃｅｎｓ、２株の“Ｂ．ｃａｎｉｓ”、２株のＢ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ及び１株のＢ．ａａｌｂｏｒｇｉに由来のゲノムＤＮＡをＢｐｍｐ−７２−特異的ＰＣＲを使用して増幅した。Ｂｐｍｐ−７２遺伝子はＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの全部の菌株に存在していたが、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ、Ｂ．ｉｎｎｏｃｅｎｓ、“Ｂ．ｃａｎｉｓ”、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉまたはＢ．ａａｌｂｏｒｇｉのどの菌株にも存在していなかった。存在するＢｐｍｐ−７２遺伝子の配列決定のためにＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの６つの菌株を選択した。表３及び４は、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株のＢｐｍｐ−７２遺伝子間の相同レベルのまとめである。
【０１９３】
６つのＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｔｉ菌株のＢｐｍｐ−７２遺伝子はヌクレオチドレベルで９９．８−１００％の相同性を示した（表３）。全部の菌株が１，６９２ｂｐの遺伝子を有しており、これは５６４アミノ酸のタンパク質に翻訳される。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの異なる菌株間の高い相同レベルは、Ｂｐｍｐ−７２が種の内部で高度に保存された遺伝子座であることを示唆する。
【０１９４】
【表３】
2007534311.tif 000004
【０１９５】
６つのＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株のＢｐｍｐ−７２遺伝子はアミノ酸レベルで９９．３−１００％の相同性を示した（表４）。全部の菌株が１，６９２ｂｐの遺伝子を有しており、これは５６４アミノ酸のタンパク質に翻訳される。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの異なる菌株間の高い相同レベルは、Ｂｐｍｐ−７２が種の内部で高度に保存された遺伝子座であることを示唆する。
【０１９６】
【表４】
2007534311.tif 000005
【実施例２】
【０１９７】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの組換え７２ｋＤａ外膜タンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）のクローニング、発現及び精製
方法
プラスミド抽出
ｐＴｒｃＨｉｓプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含ませた大腸菌ＪＭ１０９クローンを、グリセロール予製保存液（ｓｔｏｃｋ  ｓｔｏｒａｇｅ）からアンピシリン（１００ｍｇ／１）補充ルリア−ベルタニ（ＬＢ）寒天プレートに画線培養し、３７℃で１６時間インキュベートした。単一コロニーをアンピシリン（１００ｍｇ／１）補充ＬＢブロス（１０ｍｌ）に接種し、ブロス培養物を振盪しながら３７℃で１２時間インキュベートした。完全一夜培養物を５，０００×ｇで１０分間遠心し、細胞に含まれていたプラスミドを製造業者の指示通りに使用したＱｌＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。精製したプラスミドをＤｙｎａｑｕａｎｔ  ＤＮＡフルオロメーター（Ｈｏｅｆｅｒ）を使用して定量し、ＴＥバッファで希釈することによってＤＮＡ濃度を１００μｇ／ｍｌに調整した。精製したｐＴｒｃＨｉｓプラスミドを−２０℃で保存した。
【０１９８】
ベクター調製
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中に５ＵのＥｃｏＲ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び５ＵのＸｈｏ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有している全容量１００μｌ中の精製ｐＴｒｃＨｉｓプラスミド（１μｇ）を３７℃で一夜消化した。消化反応物（２μｌ）を１×ＴＡＥバッファ中、１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルに９０Ｖで１時間電気泳動させることによって制限されたベクターを検証した。電気泳動したＤＮＡを臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、紫外（ＵＶ）光を使用して観察した。
【０１９９】
直鎖化したｐＴｒｃＨｉｓベクターを、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造業者の指示通りに使用して精製した。精製した直鎖状ベクターを蛍光計で定量し、ＴＥバッファで希釈することによってＤＮＡ濃度を５０μｇ／ｍｌに調整した。精製した制限ベクターを−２０℃で保存した。
【０２００】
インサート調製
プライマー設計
Ｂｐｍｐ−７２遺伝子の種々の位置を増幅するために３対のプライマーを設計した。プライマー配列及び得られた遺伝子のクローン化部分を表５に示す。全部のプライマー配列が、得られたアンプリコンの付着末端を直鎖化ｐＴｒｃＨｉｓベクターに結合させ得る末端制限酵素部位を含んでいた。順方向プライマーは、末端Ｘｈｏ１制限酵素部位がｐＴｒｃＨｉｓの発現カセットとインフレームになるように設計した。逆方向プライマーは、ｐＴｒｃＨｉｓベクターのＥｃｏＲ１クローニング部位に結合後に未熟翻訳終結コドンが形成されないように設計した。Ａｍｐｌｉｆｙ  １．２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用してプライマーを試験し、理論的アンプリコン配列をｐＴｒｃＨｉｓベクター配列の適正位置に挿入した。ベクターＮＴＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６（ＩｎｆｏｒＭａｘ）を使用してキメラｐＴｒｃＨｉｓ発現カセットの推定された翻訳を実行させ、Ｂｐｍｐ−７２インサートが正しい読取り枠に存在することを確認した。
【０２０１】
【表５】
2007534311.tif 000006
2007534311.tif 000007
【０２０２】
Ｂｐｍｐ−７２インサートの増幅
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、１００μｌの全容量中でＢｐｍｐ−７２インサートをＰＣＲ増幅した。簡単に説明すると、増幅混合物は、１×ＰＣＲバッファ（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．１ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．５μＭの適正プライマー対（ＡＨＰ−Ｆ１−Ｘｈｏ１／ＡＨＰ−Ｒ７８３−ＥｃｏＲ１、ＡＨＰ−Ｆ１−Ｘｈｏ１／ＡＨＰ−Ｒ２２３−ＥｃｏＲ１またはＡＨＰ−Ｆ４−Ｘｈｏ１／ＡＨＰ−Ｒ７８３−ＥｃｏＲ１）、及び、２．５μｌの染色体鋳型ＤＮＡとから構成した。染色体ＤＮＡは、２００μｌのＴＥ中に１０μｌの凍結Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ９５／１０００菌株（ブタから単離したＷｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎ）を再懸濁させ、１分間煮沸することによって調製した。煮沸した細胞を２０，０００×ｇで５分間遠心し、上清を集めてＰＣＲ鋳型として使用した。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期鋳型変性段階、次いで９４℃で３０秒間の変性、５０℃で１５秒間のアニーリング、及び、６８℃で２分間のプライマー伸長を３０サイクルとした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファ中の１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ光を使用して観察した。
【０２０３】
正しいサイズのＰＣＲ産物の存在を確認した後、上述のようにＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔを使用してＲＣＲ反応物を精製した。
【０２０４】
Ｂｐｍｐ−７２インサートの制限酵素消化
精製したＰＣＲ産物（５０μｌ）を、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中の１ＵのＥｃｏＲ１及び１ＵのＸｈｏ１によって全容量１００μｌで３７℃で一夜消化した。消化したインサートＤＮＡをＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔを使用して精製した。精製した消化インサートＤＮＡをＴＥバッファ（５０μｌ）を使用するクリーンアップカラムから溶出させ、蛍光計で定量し、ＴＥバッファで希釈してＤＮＡ濃度を２０μｇ／ｍｌに調整した。精製した制限インサートＤＮＡを直ちにベクター結合に使用した。
【０２０５】
ｐＴｒｃＨｉｓベクターへのＢｐｍｐ−７２インサートのライゲーション
ライゲーション反応はいずれも全容量２０μｌで行った。Ｘｈｏ１／ＥｃｏＲ１−直鎖化ｐＴｒｃＨｉｓ（１００ｎｇ）を、Ｘｈｏ１／ＥｃｏＲ１制限したＢｐｍｐ−７２インサート（２０ｎｇ）と共に、１ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有している３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＡＴＰ中、１４℃で１６時間インキュベートした。ベクター再環化の陰性対照とするためにＢｐｍｐ−７２インサートＤＮＡを含まないライゲーションの結合反応も使用した。
【０２０６】
ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２結合物による大腸菌細胞の形質転換
コンピテント大腸菌ＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）  ｐＬｙｓ  Ｏｎｅ  ＳｈｏｔＲＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞を−８０℃の保存から氷上で解凍し、５μｌの一夜ライゲーション反応物（２５ｎｇのｐＴｒｃＨｉｓベクターに等価）を収容している氷冷した１．５ｍｌのマイクロ遠心管に移した。ベンチ上で各管の底部を穏やかに叩いて管を混合し、３０分間氷上に維持した。次に管を４２℃の水浴に４５秒間入れることによって細胞に熱ショックを与え、その後に管を氷上に戻して２分間維持した。形質転換した細胞をＬＢブロス（１ｍｌ）に回収し、穏やかに撹拌しながら３７℃で１時間維持した。回収した細胞を２，５００×ｇで５分間処理して採取し、細胞を新しいＬＢブロス（５０μｌ）に再懸濁させた。再懸濁させた細胞の全量（５０μｌ）をアンピシリン含有（１００ｍｇ／ｌ）のＬＢ寒天プレートに滅菌ガラス棒を使用して均等に拡げた。プレートを３７℃で１６時間インキュベートした。
【０２０７】
大腸菌中のｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２インサートのＰＣＲによる検出
１２の単一形質転換体コロニーを各構築物ごとに新しいアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）含有ＬＢ寒天プレートに画線培養し、３７℃で１６時間インキュベートした。各形質転換イベントから得られた単一コロニーをＴＥバッファ（５０μｌ）に再懸濁させ、１分間煮沸した。煮沸した細胞のアリコート（２μｌ）をＰＣＲ鋳型として使用した。増幅混合物は、１×ＰＣＲバッファ（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭのｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆプライマー（配列６）及び０．５μＭのｐＴｒｃＨｉｓ−Ｒプライマー（５’−ＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＡＣＴＣＴＣＧ−３’）（配列３８）から構成した。サイクリング条件は、９４℃で４分間の初期鋳型変性段階、次いで、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１５秒間のアニーリング、及び、７２℃で３０分間のプライマー伸長を３０サイクルとした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファ中の１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ光を使用して観察した。
【０２０８】
直接配列解析によるｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２読取り枠の検証
正しいサイズのＰＣＲ産物を産生した各構築物あたり２つの形質転換体クローンをアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）含有ＬＢブロス（１０ｍｌ）に接種し、振盪しながら３７℃で１２時間インキュベートした。完全一夜培養物を５，０００×ｇで１０分間遠心し、細胞が含有していたプラスミドを前述のようにＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して抽出した。精製したプラスミドを蛍光計で定量した。
【０２０９】
双方の精製プラスミドを、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｆ及びｐＴｒｃＨｉｓ−Ｒプライマーを使用するｐＴｒｃＨｉｓ発現カセットの全自動化直接配列決定で処理した。配列決定反応の各々は、プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）、プライマー（２ｐｍｏｌ）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（４μｌ）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から成る容量１０μｌで行った。サイクリング条件は、９６℃で２分間の変性段階、次いで９６℃で１０秒間の変性、６０℃で４分間のプライマーのアニーリング及び伸長を組合せた段階を２５サイクルとした。残留ダイターミネーターは、１２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）を含有する９５％（ｖ／ｖ）エタノールで沈殿させることによって配列決定産物から除去し、真空乾燥した。各プライマーを使用してプラスミドの配列決定を重複で行った。配列決定産物をＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。ライゲーションに成功したプラスミドを、ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２（完全タンパク質）、ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｎ（Ｎ−末端部分）及びｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ（Ｃ−末端部分）と命名した。
【０２１０】
組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの大規模発現
Ｂｐｍｐ−７２の３４ｋＤａの組換えＣ末端部分を大規模産生に選択しその後にワクチンとして使用した。大腸菌ＢＬ２１中のｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの単一コロニーを２５０ｍｌ容の円錐フラスコに入れたアンピシリン（１００ｍｇ／１）含有ＬＢブロス（５０ｍｌ）に接種し、振盪しながら３７℃で１６時間インキュベートした。アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢブロス（１Ｌ）を収容している２Ｌ容の円錐フラスコに、一夜培養物（１０ｍｌ）を接種し、３７℃で、細胞の光学密度が６００ｎｍで０．５になるまで（約３−４時間）インキュベートした。次にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加えて培養物を誘発し、細胞を振盪しながら３７℃に戻した。５時間の誘発後、培養物を２５０ｍｌ容の遠心ボトルに移し、ボトルを４℃、５，０００×ｇで２０分間遠心した。上清を廃棄し、各ペレットを１０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ変性用溶菌バッファ（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、８Ｍの尿素、ｐＨ８．０）に再懸濁させた。再懸濁した細胞を−２０℃で一夜保存した。
【０２１１】
組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの大規模精製
−２０℃保管庫から細胞懸濁液を取り出し、氷上で解凍した。次に細胞溶解液を氷上で３０秒間ずつ３回超音波処理した。毎回の超音波処理の間に１分間の氷上インキュベーションを挿入した。溶解した細胞を４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心することによって清澄化し、上清を１ｍｌのベッドボリュームのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を収容している１５ｍｌ容のカラムに移した。Ｈｉｓ６で標識された組換えタンパク質を完全撹拌を伴って４℃に１時間維持して樹脂に結合させた。次に樹脂を５０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ変性用洗浄バッファ（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、８Ｍの尿素、ｐＨ６．３）で洗浄した後、３０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ変性用溶出バッファ（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍの尿素、ｐＨ４．５）で溶出させた。溶出液の３つの１０ｍｌ画分を集めて４℃で保存した。各溶出液のアリコート（３０μｌ）を４×サンプル処理バッファ（１０μｌ）で処理し、５分間煮沸した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、クーマシーブリリアントブルーＧ２５０（Ｓｉｇｍａ）で染色した。染色したゲルを蒸留水で１時間平衡させ、２枚のセルロースシートに挟んで室温で一夜乾燥した。
【０２１２】
精製した組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの透析及び凍結乾燥
溶出したタンパク質をプールし、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）３，５００Ｄａの水和透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）に移した。プールした溶出液のアリコート（２００μｌ）を採取し、Ｂｉｏｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｒａｄ）を製造業者の指示通りに使用して定量した。タンパク質を２ｌの蒸留水に４℃で撹拌しながら透析した。透析バッファを１２時間毎に８回交換した。透析したタンパク質を透析管から５０ｍｌ遠心管（最大容量４０ｍｌ）に移し、管を−８０℃で一夜維持した。管をＭＡＸＩ凍結乾燥機（Ｈｅｔｏ）に入れ、凍結乾燥して乾固した。次に、凍結乾燥したタンパク質をＰＢＳで濃度２ｍｇ／ｍｌに再水和し−２０℃で保存した。
【０２１３】
結果
組換えｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２ベクターの構築
表６は、大腸菌中でＢｐｍｐ−７２タンパク質の種々の部分を発現させる構築物を示す。クローン化インサートの作製に使用したプライマー対は表５に示した。これらのプライマーはＢｐｍｐ−７２の所定部分を増幅し、Ｂｐｍｐ−７２タンパク質全体またはそのＮ−末端部分またはＣ−末端部分を発現させる。種々のインサートをｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクターにクローニングすると、それぞれ６，０８１、５，５１８及び５，１７１ｂｐのサイズの組換えベクターｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２，ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｎ及びｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｃが得られた。  ｐＴｒｃＨｉｓ構築物のヌクレオチド配列決定は、全部の構築物で発現カセットが正しいフレームに存在することを検証した。ｐＴｒｃＨｉｓ発現カセットの予測された翻訳は、組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２タンパク質（６６．３ｋＤａ）、Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｎ（４６．９ｋＤａ）、Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２（３４．６ｋＤａ）と天然型Ｂｐｍｐ−７２リポタンパク質（６２．１ｋＤａ）の推定アミノ酸配列が等しいことを示した。ｐＴｒｃＨｉｓ構築物の完全プラスミドマップを図４に示す。
【０２１４】
【表６】
2007534311.tif 000008
2007534311.tif 000009
【０２１５】
組換えＢｐｍｐ−７２Ｃの発現及び精製
十分な量のワクチン接種用組換えタンパク質を作製するために、ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｃを含有する選択された組換えクローンの大規模発現を行った。ヘキサ−ヒスチジン（４ｋＤａ）と融合した組換えＢｐｍｐ−７２Ｃタンパク質は、見掛け分子量３４ｋＤａの主要タンパク質を産生した（図５）。ラムダバクテリオファージゲノムライブラリーの初期スクリーニングに使用したＡＨＰＳは天然型Ｂｐｍｐ−７２及び組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの双方に反応した（図５）。
【０２１６】
変性条件下でアフィニティクロマトグラフィーによって行ったＨｉＳ６−Ｂｐｍｐ−７２組変え抗原の精製は成功であった。大規模精製したＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの６つの複製バッチのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、組換え抗原が９０％以上純粋であり、タンパク質の発現が恒常的であることを示した（図６）。この発現プロトコルを使用して２ｍｇ／Ｌという組換えタンパク質の収率が恒常的に得られた。透析及び凍結乾燥後、安定な組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ抗原の産生に成功した。
【実施例３】
【０２１７】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの組換え７２ｋＤａ外膜タンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）のカルボキシ末端部分を使用するニワトリのワクチン接種
方法
１グループ１５羽の２つのニワトリグループをＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの７２ｋＤａタンパク質の３４ｋＤａの組換えＣ−末端部分（Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ）で全身的及び経口的に免疫感作し、次いでＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉで抗原投与して、ワクチン接種がＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのコロニー化を防御したか否かを判定した。第三グループの１５羽のメンドリにはワクチンを接種しないで対照とした。４５羽のトリ全部を一室で個別のケージに収容した。３つのグループをそれぞれ、
ｉ）グループＡ：ワクチン非接種；
ｉｉ）グループＢ：組換えタンパク質（１００μｇ）をアジュバントと共に筋肉内投与し、次いで３週後に１ｍｇの溶解タンパク質を?嚢チューブで注入；
ｉｉｉ）グループＣ：組換えタンパク質（１ｍｇ）をアジュバントと共に筋肉内投与し、次いで３週後に１ｍｇの溶解タンパク質を?嚢チューブで注入、
と命名した。二回目のワクチン接種の２週後に全部のトリにＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉのニワトリ菌株（Ｃｓｐ１）を経口で抗原投与した。
【０２１８】
ニワトリ及び免疫感作プロトコル
３４ｋＤａの組換えＢｐｍｐ−７２のＣ−末端部分（Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ）を等量のフロインド不完全アジュバントで乳化し、グループＢ及びＣの各１５羽のメンドリの胸筋に筋肉内注射した。（ＩＳＡ  Ｂｒｏｗｎ産卵メンドリ：各トリはほぼ１８週齢及び体重１．５ｋｇ）。グループＢのトリの各々には、１００μｇのタンパク質を全容量１ｍｌで与えた。グループＣのトリの各々には、１ｍｇのタンパク質を全容量１ｍｌで与えた。グループＡのトリにはワクチン接種しなかった。一回目のワクチン接種の３週後、グループＢ及びＣの全部のトリに２ｍｌのリン酸塩緩衝生理的塩類溶液に入れた１ｍｇのタンパク質を?嚢に直接投与した。グループＡのトリにはワクチン接種しなかった。経口ワクチン接種の２週後に、２ｍｌの指数関数的対数増殖期（〜１０９細胞／ｍｌ）のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを全部のトリの?嚢に直接与えた。抗原投与を連続３日間繰り返した。トリを個別にケージに入れた。
【０２１９】
一回目のワクチン接種の前、二回目のワクチン接種の直前、初日の抗原投与の前、及び、５週後に、翼静脈から採血することによって血清を採取した。血清をＥＬＳＡで試験しワクチン抗原に対する抗体の存在を調べた。また、Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの細胞抽出物に対してウェスタンブロット分析した。全部のトリの糞便スワブを週に三回採取し、培養した。実験的感染の５週後に頚椎脱臼によってトリを死亡させた。死後、小腸及び結腸の掻取り組織を集めて、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析によって特異的免疫グロブリン含量を検査した。
【０２２０】
スピロヘーター培養物
糞便から採取したスワブを５％（ｖ／ｖ）繊維素除去ヒツジ血液、スペクチノマイシン（４００μｇ／ｍｌ）、コリスチン（２５μｇ／ｍｌ）及びバンコマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有しているＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ寒天プレートで画線培養した。これらのプレートを好気性環境中、３７℃で７日間インキュベートした。弱いベータ−溶血及び顕微鏡観察形態に基づいてスピロヘーターがＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉであることを同定した。単離物のサブセットを継代培養し、種特異的ＰＣＲを使用してＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉであることを確認した。
【０２２１】
ＥＬＩＳＡ（血清）
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ，Ｄｙｎｅｘ）のウェルに、炭酸塩バッファ（ｐＨ９．６）中の１００μｌの精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ（１μｇ／ｍｌ）をコートし、４℃で一夜インキュベートした。１５０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）によって室温で撹拌しながらプレートを１時間ブロックし、次いで１５０μｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｖ／ｖ）で３回洗浄した。
【０２２２】
ニワトリ血清を１００μｌのＰＢＳＴ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）で２００倍に希釈し、撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを（上述のように）洗浄した後、ＰＢＳＴで８０，０００倍に希釈した１００μｌのヤギ抗ニワトリＩｇＧ（完全分子）−ＨＲＰを加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質を加えた。室温で１０分間発色させた後、５０μｌの１Ｍの硫酸を加えて停止させた。各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡ（粘膜）
小腸及び結腸の１５ｃｍ２の切片から掻取り標本を採取した。１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、２ｍＭのＰＭＳＦ，１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジドを含有している１ｍｌのＰＢＳに掻取り標本を再懸濁させた。懸濁液を十分に混合し、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を除去し、ＰＢＳＴで２倍に希釈し、１００μｌをＥＬＩＳＡに使用した。ＥＬＩＳＡは上述の血清ＥＬＳＡと同様にして行った。
【０２２４】
ウェスタンブロット分析
超音波処理し清澄化したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ細胞懸濁液のアリコート（５０ｍｇ）を７ｃｍの分取ウェルに充填し、１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動させ、ニトロセルロース膜に電気転移させた。膜をＴＢＳ−脱脂乳（５％ｗ／ｖ）でブロックし、マルチプローブ装置（Ｂｉｏｒａｄ）に取り付けた。ウェルを１００μｌの希釈したニワトリ血清プール（２００倍）または粘膜上清（２倍）と共に室温で２時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖ）で３回洗浄した後、１００μｌのヤギ抗−ニワトリＩｇＧ（完全分子）−ＨＲＰ（１０，０００倍）と共に室温で１時間インキュベートした。装置から膜を取り外し、ＴＢＳＴで３回洗浄した。１０ｍｌのＤＡＢ溶液（５ｍｇ／ｍｌ、０．０００３％ｖ／ｖ過酸化水素、ＴＢＳ）中で発色させ、十分な発色が生じた後で膜を水道の流水で洗浄した。膜を乾燥し、プレゼンテーション用に調べた。
【０２２５】
結果
ワクチン接種に対する血清学的応答
ニワトリの全身性血清学的（ＥＬＩＳＡ）応答を図７−９に示す。対照トリ（グループＡ）には循環抗体が存在せず、実験感染後に発色したものはなかった（図７）。ワクチン接種したトリの全部ではないが大抵には実験感染後の循環抗体が増加しないことが観察された（図８及び図９）。１００μｇのタンパク質でワクチン接種したトリ（グループＢ）の６羽が控え目な一次応答を示し、残りのトリはワクチンに十分な応答を示さなかった（図８）。対照的に、１ｍｇのタンパク質でワクチン接種したトリ（グループＣ）の１１羽が良好な一次全身性応答を示し、このグループの残りの４羽はワクチン接種に対して控え目な応答しか示さなかった。これらのトリのうち、３羽を除く全部が経口ブースト後に応答増加を示した（図９）。
【０２２６】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ抽出物に対するワクチン接種ニワトリのウェスタンブロット分析を図１０及び１１に示す。グループ毎に各プール３羽から成る５つの血清プールを示す。ウェスタンブロットは、（３４ｋＤａサブユニットでワクチン接種したにもかかわらず）これらの応答が天然型７２ｋＤａタンパク質特異的であることを示す。また、グループＣ（１ｍｇ）がグループＢ（１００μｇ）よりも強力に応答する傾向があることを示す。
ワクチン接種及び抗原投与に対するニワトリの粘膜性ＥＬＩＳＡ応答（死後にサンプル収集）を図１２に示す。対照トリは感染しているにもかかわらず局部的応答を全く示さなかった。１００μｇのワクチン接種グループ（グループＢ）では１羽（２７）だけが小腸及び結腸の双方で良好な局部的抗体応答を示した。このグループの別の４羽のトリ（２３、２４、３４及び３５）は結腸で控え目な局部的応答を示した。１ｍｇのワクチンを接種したグループ（グループＣ）では２羽のトリ（４０及び４８）が小腸に良好な局部的応答を示し、６羽のトリ（３６、３８、４０、４１、４３及び５０）は結腸に良好な局部的応答を示した。
【０２２７】
高い粘膜抗体価を有しているトリから得られた粘膜抽出物のウェスタンブロット分析を図１３に示す。全部のトリの局部的抗体応答は天然型７２ｋＤａに対する応答であった。これらの結果は、?嚢への経口ワクチン接種（加えてその後の実験的抗原投与）が胃腸管の深部に局部的応答を誘発できることを示す。しかしながら、経口ワクチン接種は結腸（及び小腸）で検出可能な局部的応答の誘発に恒常的に成功することはできない。
【０２２８】
Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌコロニー化の防御
３つのグループのトリの糞便培養物のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌに関する結果をまとめて表７に示す。３つのグループの個々のトリの結果をそれぞれ表８−１０に示す。継代培養した単離物の全部が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとする種特異的ＰＣＲによってＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌであると確認された。
【０２２９】
【表７】
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【０２３０】
感染後（ｐｉ）９日目までに、対照グループではコロニー化率８０％に発達し、これに比べて２つのワクチン接種グループでは７％及び０％であった（表６）。その後、対照グループのコロニー化率は低下に転じたが、３０日の期間で平均４５％を維持した。対照的に、双方のワクチン接種グループのコロニー化率は経時的に増加する傾向を示し、最大コロニー化率はグループＢで感染３０日後の６０％、グループＣで感染２５日後の４０％であった。感染３０日後の３つのグループのコロニー化率は同等であった。しかしながら、全期間を通じて、対照グループのコロニー化率は双方のワクチン接種グループを著しく有意に上回っていた。
【０２３１】
表８は、ワクチン接種しなかったニワトリの個々のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌの経口抗原投与後のコロニー化結果を示す。糞便スワブの培養によってコロニー化を定量した（−）記号は培養陰性を表し、（＋）は培養陽性を表す。表９は、ワクチン接種した（１００μｇ筋肉内に加えて１ｍｇ経口）ニワトリの個々のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌの経口抗原投与後のコロニー化結果を示す。糞便スワブの培養によってコロニー化を定量した。（−）記号は培養陰性を表し、（＋）は培養陽性を表す。表１０は、ワクチン接種した（１ｍｇ筋肉内に加えて１ｍｇ経口）ニワトリの個々のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌの経口抗原投与後のコロニー化結果を示す。糞便スワブの培養によってコロニー化を定量した。（−）記号は培養陰性を表し、（＋）は培養陽性を表す。
１５羽全部の対照ニワトリがコロニー化を生じ、陽性スワブが実験期間中に３〜６回、サンプリングされた。（実行できる１１のうち、平均で４．５３回のサンプリング）。
グループＢの結果は、１４羽のトリがある時点までコロニー化を示し、１〜３回のサンプリング（平均で１．８７回のサンプリング）で陽性を示した。グループＣでは、１４羽のトリがある時点までコロニー化を示し、１〜５回の間のサンプリング（平均で１．６回のサンプリング）で陽性を示した。これらの結果は、ワクチン接種したトリの全感染度が対照トリよりも小さいこと、及び、コロニー化防御に関しては双方のワクチン接種計画が同様の結果を生じたことを強調する。
【０２３２】
コロニー化に関する全身または結腸の抗体応答を個々のトリで比較するとき、恒常的な図は浮かんでこない。対照グループは、感染に対する局部的または全身的な抗体をほとんど生じなかった。２日目以後にコロニー化を生じたグループＢの４羽のトリ（２１、２４、２９及び３０）を考察すると、それらのトリの抗体価はもっと短期間にコロニー化を生じた同グループの他のトリよりも低い値ではなかった。コロニー化を生じなかったトリ（２６）は、同グループの他のトリと同様の抗体価を有していた。対照的にグループＣでは、２日目以後にコロニー化した３羽のトリ（３７、４６及び４９）は結腸抗体応答が少なく、これらのうちで、トリ３７は良好な全身性抗体応答を有していたが、トリ４６及び４９は有していなかった。コロニー化を生じなかったトリ（４０）は、全身性抗体応答は控え目であったが結腸抗体応答は良好であった。このワクチン接種グループでは、コロニー化の少ないトリほど結腸抗体価が高い傾向が見られた。
【０２３３】
総合的に、この実験は、ワクチン接種プロトコルが循環中及び結腸内でＢｐｍｐ−７２特異的抗体の抗体価を誘発することを証明する。この場合、１ｍｇのタンパク質による筋肉内ワクチン接種は、１００μｇを使用するよりも良好な応答を生じる。双方のワクチン接種プロトコルはＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌのコロニー化を明らかに遅延させ、（特に感染９日後の対照トリの感染ピークに比べて）コロニー化の持続期間を短縮し、また、コロニー化を生じたトリの個体数も減少させた。対照トリで高いコロニー化率が維持されていれば、この違いはいっそう顕著であったかもしれない。これらの結果は、Ｂｐｍｐ−７２が、ニワトリ並びにブタ、イヌのような他の動物種及びヒトのＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｉｌのコロニー化を防御する有効な手段として開発できることを示唆する強力な根拠を提供する。
【０２３４】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】吸収された超免疫ブタ血清（ＡＨＰＳ）のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ外膜タンパク質によるウェスタンブロット分析。レーン１，分子量マーカー；レーン２，Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  ９５／１０００。７２ｋＤａタンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）を矢印で示す。
【図２】吸収された超免疫ブタ血清（ＡＨＰＳ）のＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの先端欠失７２ｋＤａ外膜タンパク質を発現している大腸菌細胞によるウェスタンブロット分析。レーン１−分子量マーカー；レーン２−ＡＨＰ１；レーン３−ＡＨＰ２；レーン４−ＡＨＰ３；レーン５−ＡＨＰ４；レーン６−ＡＨＰ５；レーン７−ＡＨＰ６；レーン８−Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  ９５／１０００外膜タンパク質。３４ｋＤａ先端欠失タンパク質を矢印で示す。
【図３】Ｂｐｍｐ−７２のヌクレオチド配列。
【図４】ｐＴｒｃＨｉｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングされたＢｐｍｐ−７２遺伝子（図中Ｏｍｐ−７２として示す）の種々の領域のベクター図。ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２（Ａ；６，０８１ｂｐ）、ｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｎ（Ｂ；５，５１８ｂｐ）及びｐＴｒｃ−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ（Ｃ；５，１７１ｂｐ）構築物が完全Ｂｐｍｐ−７２、Ｂｐｍｐ−７２のＮ−末端部分及びＢｐｍｐ−７２のＣ−末端部分をそれぞれ発現する。全部のベクターを同じベクター主鎖から構築し、違いは発現カセットにクローニングされたＢｐｍｐ−７２領域だけである。
【図５】天然型Ｂｐｍｐ−７２（図中Ｏｍｐ−７２として示す）及びＢｐｍｐ−７２の組換えＣ−末端部分（Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ）のウェスタンブロット分析。レーン１−分子量マーカー；レーン２−精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃ；レーン３−Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ９５／１０００由来の天然型Ｂｐｍｐ−７２Ｃ；レーン４−Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  Ｃｓｐ１由来の天然型Ｂｐｍｐ−７２Ｃ。矢印は天然型及び組換えＢｐｍｐ−７２タンパク質の位置を示す。
【図６】Ｎ−ＮＴＡクロマトグラフィーを使用して精製した組換えＨｉｓ６Ｂｐｍｐ−７２の種々のバッチのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。組換えタンパク質の全部のバッチを同じ方法で発現させ精製した。レーン１−分子量マーカー；レーン２−９−精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃバッチ１−６。組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃタンパク質を矢印で示す。
【図７】組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃでワクチン接種しなかったニワトリのＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ抗原投与の前及び後の全身性抗体価（ＥＬＩＳＡ）。循環抗体は精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃをコーティング抗原として使用してＥＬＩＳＡによって検出した。
【図８】組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃでワクチン接種しＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ抗原投与した後のニワトリの全身性抗体価（ＥＬＩＳＡ）。全部のトリに１００μｇのタンパク質を筋肉内投与し、次いで１ｍｇを経口ブーストした。循環抗体は精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃをコーティング抗原として使用しＥＬＩＳＡによって検出した。
【図９】組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃでワクチン接種しＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ抗原投与した後のニワトリの全身性抗体価（ＥＬＩＳＡ）。全部のトリに１ｍｇのタンパク質を筋肉内投与し、次いで１ｍｇを経口ブーストした。循環抗体は精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃをコーティング抗原として使用しＥＬＩＳＡによって検出した。
【図１０】１００μｇの組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの筋肉内投与及び  １ｍｇのタンパク質の経口投与を順次行ってワクチン接種したニワトリからプールした血清のウェスタンブロット分析。各サンプリング時点で３羽のニワトリから血清をプールした。使用した抗原は、抗原投与に使用したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株の全細胞抽出物であった。レーン１−実験Ａ１のワクチン接種ニワトリ（陽性対照）；レーン２−４−ニワトリ２１−２３；レーン５−７−ニワトリ２４−２６；レーン８−１０−ニワトリ２７−２９；レーン１１−１３−ニワトリ３０−３２；レーン１４−１６−ニワトリ３３−３５。３つのサンプルの各々はワクチン接種前、抗原投与前、抗原投与後に順次採取した血清である。分子量マーカーをｋＤａで示す。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの天然型７２ｋＤａタンパク質を矢印で示す。
【図１１】１ｍｇの組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃの筋肉内投与及び１ｍｇのタンパク質の経口投与を順次行ってワクチン接種したニワトリからプールした血清のウェスタンブロット分析。各サンプリング時点で３羽のニワトリから採取した血清をプールした。使用した抗原は、抗原投与に使用したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株の全細胞抽出物であった。レーン１−実験Ａ１のワクチン接種ニワトリ（陽性対照）；レーン２−４−ニワトリ３６−３８；レーン５−７−ニワトリ３９−４１；レーン８−１０−ニワトリ４２−４４；レーン１１−１３−ニワトリ４５−４７；レーン１４−１６−ニワトリ４８−５０。３つのサンプルの各々はワクチン接種前、抗原投与前、抗原投与後に順次採取した血清である。分子量マーカーをｋＤａで示す。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの天然型７２ｋＤａタンパク質を矢印で示す。
【図１２】組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃをワクチン接種し次いでＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉで抗原投与したニワトリの小腸及び結腸の粘膜性抗体価（ＥＬＩＳＡ）。トリ１−１９はワクチン非接種、トリ２１−３５は１００μｇのタンパク質を筋肉内投与し次いで１ｍｇのタンパク質を経口投与、トリ３６−５０は１ｍｇのタンパク質を筋肉内投与し次いで１ｍｇのタンパク質を経口投与した。  循環抗体は精製Ｈｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃをコーティング抗原として使用しＥＬＩＳＡによって検出した。
【図１３】組換えＨｉｓ６−Ｂｐｍｐ−７２Ｃをワクチン接種し次いでＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを抗原投与したニワトリの粘膜抗体のウェスタンブロット分析。抗原投与に使用したＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ菌株の全細胞抽出物を抗原として使用した。レーン１−３，小腸抗体；レーン４−１７，結腸抗体：レーン１，ニワトリ２７；レーン２，ニワトリ４０；レーン３，ニワトリ４８；レーン４−５，ニワトリ２３−２４；レーン６，ニワトリ２７；レーン７−９，ニワトリ３４−３６；レーン１０−１３，ニワトリ３８−４１；レーン１４−１５，ニワトリ４３−４４；レーン１６，ニワトリ４８；レーン１７，ニワトリ５０；レーン１８，実験Ａ１のワクチン接種ニワトリ（陽性対照）。ニワトリ２１−３５には１００μｇのタンパク質を筋肉内投与し次いで１ｍｇのタンパク質を経口投与した。ニワトリ３６−５０には１ｍｇのタンパク質を筋肉内投与し次いで１ｍｇのタンパク質を経口投与した。分子量マーカーはｋＤａで示す。Ｂ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉの天然型７２ｋＤａタンパク質（Ｂｐｍｐ−７２）を矢印で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月18日(2005.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列２、配列４−配列６、配列８−配列２２から成るグループから選択されたアミノ酸配列、
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列に少なくとも６０％相同のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列に少なくとも８０％一致のアミノ酸配列、または、
（ｉｖ）配列２によってコードされているポリペプチドの生物活性をもつ（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのフラグメント、
からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列１に示すヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に定義した配列の縮重形に対応するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）−（ｉｉｉ）の配列に選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列、
（ｖ）配列（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
（ｖｉ）プライマーまたはプローブとして使用するための適当な（ｖ）の配列のフラグメント、
からなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された請求項２（ｉ）−（ｉｖ）に記載のポリヌクレオチドを含む細胞をポリペプチド発現条件下で培養する段階と、
（ｉｉ）発現したポリペプチドを回収する段階と、
を含む請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項４】
クロマトグラフィーを使用してポリペプチドを回収する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィーがＮｉ−キレート化カラム及び／またはゲル濾過の使用を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項２に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のアミノ酸配列に特異的な抗体。
【請求項９】
更に、検出可能なラベルを含む請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチドをキャリアータンパク質にコンジュゲートする段階と、
（ｉｉ）（ｉ）のコンジュゲートとアジユバントとを動物に投与する段階と、
（ｉｉｉ）生じた抗体を動物から単離する段階と、
を含む抗体の製造方法。
【請求項１１】
（ｉ）適当なハイブリダイズ条件下でサンプルを請求項２（ｖｉ）に記載のポリヌクレオチドに接触させる段階と、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドとサンプル中のヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖を検出する段階と、
を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種を選択するためのサンプルのスクリーニング方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが配列２４及び配列２７−３７から成るグループから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）反応複合体が形成され得る条件下でサンプルを請求項８に記載の抗体に接触させる段階と、
（ｉｉ）反応複合体を検出する段階と、
を含む、請求項１に記載のポリペプチドを選択するためのサンプルのスクリーニング方法。
【請求項１４】
（ｉ）反応複合体が形成され得る条件下でサンプルを請求項１に記載のポリペプチドに接触させる段階と、
（ｉｉ）反応複合体を検出する段階と、
を含む、請求項８に記載の抗体を選択するためのサンプルのスクリーニング方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項２（ｖｉ）に記載のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドとサンプル中のヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖を検出する手段と、
を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種を選択するためのサンプルのスクリーニングキット。
【請求項１６】
（ｉ）請求項８に記載の抗体と、
（ｉｉ）抗体を含む反応複合体を検出する手段と、
を含む、請求項１に記載のポリペプチドを選択するためのサンプルのスクリーニングキット。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチドと、
（ｉｉ）前記ポリペプチドを含む反応複合体の検出手段と、
を含む、請求項８に記載の抗体を選択するためのサンプルのスクリーニングキット。
【請求項１８】
（ｉ）請求項２（ｉ）−（ｉｖ）に記載のポリヌクレオチド配列を該ポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドを発現させる編成形態で含む組成物、
（ｉｉ）請求項１に記載のポリペプチド、または、
（ｉｉｉ）アジュバントを伴う（ｉ）または（ｉｉ）、
から成るグループから選択された組成物を有効量で動物に投与する段階を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する動物の疾患の治療方法。
【請求項１９】
請求項２（ｖ）に記載のポリヌクレオチドを含む組成物を有効量で動物に投与する段階を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する動物の疾患の治療方法。
【請求項２０】
疾患が腸スピロヘーター感染症である請求項１８または１９に記載の疾患治療方法。
【請求項２１】
（ｉ）請求項２（ｉ）−（ｉｖ）に記載のポリヌクレオチド配列を該ポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドを発現させる編成形態で含む組成物、
（ｉｉ）請求項１に記載のポリペプチド、または、
（ｉｉｉ）アジュバントを伴う（ｉ）または（ｉｉ）、
から成るグループから選択された組成物を免疫原性有効量で投与する段階を含む、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する疾患に対する動物の免疫方法。
【請求項２２】
疾患が腸スピロヘーター感染症である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
動物が、ブタ、ニワトリ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、魚及びヒトから成るグループから選択される請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
担体と、（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド、（ｉｉ）請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは（ｉｉｉ）請求項８に記載の抗体とを含む組成物。
【請求項２５】
Ｂｐｍｐ−７２をコードしているポリヌクレオチド配列の一部分に相補的な少なくとも１つのポリヌクレオチドと、適当な容器と、その使用説明書とを含むスクリーニングキット。
【請求項２６】
Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂ．ａｌｖｉｎｉｐｕｌｌｉ、Ｂ．ａａｌｂｏｒｇｉ及びＢ．ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉを非限定例とするＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ種に関連する疾患を治療または予防する医薬を製造するための請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載のポリペプチドの使用。
【国際調査報告】
2007534311.tif 000038