(57)【要約】  非癌性血管新生関連疾患の治療のための治療方法は個体におけるクラステリンの有効量を減少させるのに有効な組成物の治療有効量を投与することを含む。好ましい治療用組成物はクラステリンの有効量を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非癌性血管新生関連疾患の治療に使用するための医薬組成物を製剤する際の、インビボにおいてクラステリンのレベルを減少させるのに有効な組成物の使用。
【請求項２】
前記組成物が、ヒトクラステリンの配列（配列番号１）に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その配列が本質的に配列番号２〜１５に示す配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物がＲＮＡｉ物質を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ＲＮＡｉ物質が、その配列が本質的に配列番号１６〜２３に示す配列又はそれらに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
非癌性血管新生関連疾患における血管新生を減少させるための医薬品を製造する際の、細胞内のクラステリンの有効量を減少させるのに有効な組成物の使用。
【請求項７】
前記治療用組成物が、ヒトクラステリンの配列（配列番号１）に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その配列が本質的に配列番号２〜１５に示す配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記治療用組成物がＲＮＡｉ物質を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＲＮＡｉ物質が、その配列が本質的に配列番号１６〜２３に示す配列又はそれらに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願番号６０／４６４，１６０、２００３年４月１８日出願の利益並びに優先権を主張し、法的に許される範囲内において参照により本明細書に取り込む。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、血管新生性障害、特に非癌性血管新生性障害の治療法に関する。
【０００３】
表４に非癌性血管新生に関連する疾患及びその特徴を列記する。但し、これらに限定されるものではない。これらの疾患は本質的に異なるものであるが、原因がよく分かっていない一部のケースでは、血管の不適切な増殖という共通の特徴を有しており、多くの場合に、この不適切な血管新生は著しく有害な病気の症状と関連している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、非癌性血管新生関連疾患に罹患している個体において血管新生を減少させるか或いは除去する治療薬及び治療方法は望まれるであろう。本発明の目的は、そのような治療薬及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、クラステリンのレベルの減少が血管新生の減少を生じさせるという驚くべき知見に基づいている。この糖タンパク質クラステリンは、最初は雄羊の睾丸網の液及びセルトリ細胞から精製され、この部位において細胞凝集性（クラステリング）があると報告された（Ｂｌａｓｃｈｕｋ，Ｂｕｒｄｚｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８３；Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）。このタンパク質は後に、血漿中でアポリポタンパク質Ａ１と会合していることが発見され、別途アポリポタンパク質Ｊと命名された。このタンパク質のそのほかの名称として、硫酸化糖タンパク質−２（ＳＧＰ−２）、補体細胞溶解阻害物質（ＣＣＩ）及びテストステロン抑制前立腺メッセンジャー−２（ＴＲＰＭ−２）がある。名称が広範囲にわたることは、このタンパク質の組織分布及び提案された機能の多様性を反映している。事実、このタンパク質は、前立腺、睾丸、表皮、腎臓、子宮、肝臓、脾臓及び脳を含む殆どのヒト組織に存在し、存在しないことが示されているのはＴ−リンパ球だけである（Ｇｒｉｍａ，Ｚｗａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。従って、クラステリンは、脂質輸送（Ｂｕｒｋｅｙ，Ｓｔｕａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）、膜のターンオーバー（Ｌｅｇｅｒ，Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）、補体誘発細胞溶解の阻害及び精子成熟（Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）を含む身体の中の多くの正常な生理機能に関係すると提案されてきた。しかし、このタンパク質が正常な生理において機能する特異的機序は明らかにされていない。
【０００６】
クラステリンの発現増加はまた、癌、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、腎臓疾患、及び多くの神経学的障害を含む多数の病態と関連付けられている（Ｓｅｎｓｉｂａｒ，Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。しかし、このような罹患組織におけるクラステリンの発現増加が疾患の病態の一部なのか、又は単なる疾患過程に対する応答なのかは知られていない。確かに、アポトーシス細胞死とクラステリン発現の間には明らかな相関があり、それによってクラステリンの量又はクラステリン発現（ｍＲＮＡ）の増加は該当細胞における生存促進性シグナルと関連付けられている。最初は、クラステリンの発現増加は、アポトーシスの結果として退行する組織内の細胞生存と関係すると報告された。しかし、ごく最近アポトーシス調節におけるクラステリンの主な役割が多くの細胞で記述されている。例えば、前立腺癌細胞において、クラステリン発現の増加は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａ）又はホルモン除去のいずれかにより誘発されるアポトーシス細胞死に対して耐性を与えることが示されている（Ｓｅｎｓｉｂａｒ，Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。表皮癌細胞において、クラステリン遺伝子発現の増加は、熱ショック及び酸化的ストレスにより生じるアポトーシス細胞死に対する耐性を付与することが示された。同様に、クラステリンは卵胞濾胞閉鎖の際のアポトーシス細胞死から顆粒膜細胞を防護すると報告されている。
【０００７】
このタンパク質が血管内皮細胞、動脈の平滑筋及び心臓の心房筋細胞に存在することから、循環系におけるクラステリンの役割について厳密な調査が行われている。心臓における病巣に隣接した心筋細胞のように損傷に続いてリモデリングを受ける組織においてクラステリンの発現が上昇していることが認められた。組織修復におけるクラステリンの正確な役割は分かっていないが、このタンパク質は組織リモデリングに関係する細胞において一般的な細胞増殖よりもむしろ表現形の変化を誘発又は促進すると思われる。
【０００８】
その他の心臓血管系疾患において、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるクラステリン発現の増加は、アテローム性動脈硬化の病因における炎症促進性シグナルと思われ、これら細胞の補体誘発活性化に対する耐性を付与すると考えられる。また、未成熟血管及び血栓性疾患（アテローム性血栓性疾患）の進展は高ホモシステイン血症により特徴付けられる。ホモシステインレベルの上昇による影響の一つは、血管内皮細胞における保護タンパク質であるクラステリンのレベルを減少することであると考えられる。血管内皮細胞は移植片及び損傷部位の上に遊走し、血管平滑筋細胞の増殖因子を分泌して、この疾患部位において炎症促進性応答に寄与するので、吻合部動脈内膜過形成による動脈移植不全において血管内皮細胞は積極的に関与する。これらの疾患部位においてクラステリン発現は上昇することが示されており、クラステリンは内皮細胞の遊走及び接着を阻害することを示したが、細胞増殖に対しては増強したり阻害したりしなかった。
【０００９】
発明の要約
本発明は、個体においてクラステリンの有効量を減少させるために有効な組成物の形態の治療薬、並びに非癌性血管新生に関係する疾患に罹患した個体にその個体においてクラステリンの有効量を減少させるのに有効な組成物の治療有効量を投与するステップを含む治療方法を提供する。好ましい治療用組成物は、クラステリンの有効量を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本出願の明細書及び請求項で使用する際、用語「クラステリン」とは、最初ラット精巣に由来した糖タンパク質であり、そしてヒトを含めてその他の哺乳動物に由来するクラステリン又はその他の名称が付けられた相同のタンパク質のことである。多数のクラステリン種の配列は既知である。例えば、ヒトのクラステリンの配列はＷｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１（３），９１７−９２５（１９９４）により、又ＮＣＢＩ配列登録番号ＮＭ＿００１８３１の中に報告されており、そして塩基４８から１３９７にわたるコード配列を持つ配列番号１として記述されている。
【００１１】
本発明の明細書及び請求項に使用する際、本質的に配列番号により示されている特定の配列からなるオリゴヌクレオチドは、列記された配列と正確に同一の配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又は例えば１個又は２個の塩基の付加又は置換の結果として正しい配列と異なっているが、クラステリンの有効量を減少させるアンチセンス又はＲＮＡｉ物質として作用する能力を保有しているオリゴヌクレオチドである。ＲＮＡｉ物質の場合に、所与の配列は３’−ｄＴｄＴ配列の無いセンスｓｉ  ＲＮＡ鎖を表し、この用語は本質的にこのデオキシヌクレオチドテイルを含む配列を包含することより成る。
【００１２】
本発明は、非癌性血管新生関連疾患に伴う血管新生の予防のための治療用組成物及び該組成物を使用する方法を提供する。本出願で使用する際用語「非癌性血管新生関連疾患」とは、その疾患の症状として不適切な血管新生が観察される非癌性の疾患又は状態のことである。このような疾患の具体的で非限定的な例は表４に記述されている。
【００１３】
本発明の治療方法は、治療されている個体に存在するクラステリンの有効量の減少を達成する。本出願で使用する際「クラステリンの有効量」とは、血管新生を増強又は促進する機能を有する形態で存在するクラステリンの量である。クラステリンの発現速度を低減させる、クラステリンの分解速度を増加させる、或いはクラステリンを不活化するように修飾する（例えば抗体と結合させる）ことにより、クラステリンの有効量を減少させることができる。
【００１４】
クラステリンの有効量の減少は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、特に翻訳開始部位又は終結部位に及ぶクラステリンｍＲＮＡの領域に相補的なアンチセンスＯＤＮを投与することにより達成される。使用されるＯＤＮはインビボにおけるＯＤＮの安定性を増加させるために修飾することができる。例えば、ＯＤＮをヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を増加したホスフォロチオエート誘導体（リン酸の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換）として使用することができる。ＭＯＥ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾（ＩＳＩＳ骨格）もやはり有効である。このような修飾ＯＤＮの構築は、米国特許出願１０／０８０，７９４（ＵＳ−００３０１６６５９１として公開）の中に詳細に記述されており、これは、法的に許容される範囲内で参照により明細書に取り込む。本発明の方法に使用することができる特定のアンチセンス種は、限定せずに、配列番号２〜１５に列記された配列を含む。クラステリンの発現を標的にしたそのほかのアンチセンス種は、米国特許番号６，３８３，８０８に記述されており、法的に許容される範囲内で参照により明細書に取り込む。
【００１５】
アンチセンスＯＤＮの投与は、そのままの投与及び医薬として受容し得る脂質担体に入れての投与を含めて、当業者に既知の種々の方法を使用して行うことができる。例えば、アンチセンス送達のための脂質担体は、米国特許番号５，８５５，９１１及び５，４１７，９７８に開示されており、これらは法的に許容される範囲内で参照により明細書に取り込む。一般的に、アンチセンスは静脈内、腹腔内、皮下又は経口的経路により、或いは直接腫瘍局所注射により投与される。
【００１６】
クラステリンの減少はＲＮＡｉの方法を使用して達成することもできる。ＲＮＡ干渉即ち「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が虫の中に導入された場合に遺伝子発現を阻止することができるという観察を記述するために最初Ｆｉｒｅ及び共同研究者により造り出された用語である（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６〜８１１、法的に許容される範囲内で参照により明細書に取り込む）。ｄｓＲＮＡは脊椎動物を含めて多数の生物体において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを指令し、遺伝子機能の研究のための新しい道具を提供した。ＲＮＡｉはｍＲＮＡの分解に関係するが、この干渉の基となる生化学的機構の多くは不明である。ＲＮＡｉの使用はさらに、Ｃａｒｔｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，２４４〜２４８、及びＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４〜４９８の中に記述されており、いずれも法的に許容される範囲内で参照により明細書に取り込む。クラステリンの発現は、その配列が対応するクラステリン特異的ｍＲＮＡの分解を指令する約２１から約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子の導入により減少させることができる。その配列に完全に一致する必要はなく、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断を当該ＲＮＡが充分に指令できる程度の一致であればよい。この目的のために特異的に有用なＲＮＡ配列は配列番号１６〜２３に記述された配列及びその相補的配列である。
【００１７】
本発明のＲＮＡ分子は、ヒト患者を含めて非癌性血管新生関連疾患を持つ患者の治療に有用である。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、１日に１回以上の注射（静脈内、皮下又は髄腔内）により又は１回以上の治療サイクルでの継続的な静脈内又は髄腔内投与により標的ｍＲＮＡ及びタンパク質の調節に適した血漿中又は組織濃度に達するまで患者に投与する。ＲＮＡｉ物質は個別のｓｉＲＮＡ分子として導入して、ｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡｉ物質を産生するｓｉＲＮＡ発現プラスミドの部分として導入してもよい。後者の場合に、ヘアピン構造が作られ次いでＲＮＡｉ物質を形成するために切断されるようにループ領域（例えば９塩基）によって分離されている、記述した配列及び相補配列を含む配列を使用することができる。
【００１８】
本発明に従って、クラステリンの有効量を減少させる治療薬は、非癌性血管新生疾患に対する治療を必要とする被検者、望ましくはヒト被検者に投与される。この治療薬は、血管新生を減少させるのに有効な量を投与される。この量は、もしあれば、具体的な治療薬、投与経路及び使用される担体のタイプによって変動することは当業者に理解されるであろう。しかし、適量の決定は日常的な実験による問題であり、一般的に毒性に基づいて決定される上限又は毒性と有効性のバランスによって規定される。
【００１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、等張注射液の溶液として血流中に注射するなど、当業者に既知の通常の方法により投与することができる。注射方法は、疾患を抑制するのに必要なオリゴヌクレオチドの治療濃度を維持するのに充分な薬物の投与量を毎日注射することによるものであろう。その他の非経口経路は、例えば、筋肉内、腹腔内及び皮下である。しかし、これらの薬物は、分解からオリゴヌクレオチドを保護し、腸から血流へのオリゴヌクレオチドの通過を促進する、当業者に既知の新しい方法を使用して経口的に投与することもできる。
【００２０】
これらの薬物は、疾患を有効に治療し易いほかの方法によっても投与することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液を直接疾患部位に注射すること、例えばオリゴヌクレオチドの溶液を関節内に注射することがより良好な場合があるであろう。タンパク質及びオリゴヌクレオチドのような大きな（分子量の）分子は、滑液関節からややゆっくりと除去されるので、関節内に長く留まり標的疾患細胞にオリゴヌクレオチドを多く侵入させ得ることは良く知られている。また、全身投与経路に比較してオリゴヌクレオチドのもっと高い局所濃度を標的部位において達成すれば、疾患のより有効な治療を行うことができる。ケロイド周囲、眼に直接、血管移植周囲、手術外傷部位周囲又は乾癬炎症部位への注射といった局所的注射方法は、他の多くの血管新生性疾患に適するであろう。
【００２１】
薬物放出制御送達システムは、種々の血管新生関連疾患の有効な治療に特に適用することができ、以下の例はこのシステムの適用可能性を示している。眼の血管新生性疾患に対しては、薬物を制御して放出するゲルのような生体適合ポリマーマトリックス中に懸濁してオリゴヌクレオチドを直接眼の上へ投与することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、乳酸とグリコール酸のコポリマーで作られたマイクロスフェア中に封入することができ、標的部位に注射すると、オリゴヌクレオチドは拡散により或いは生分解性マトリックスの分解によりマイクロスフェアから放出される。このようなマイクロスフェアを関節炎の関節内に直接注射して、治療上の必要に応じて数時間から数日更に数ヶ月の間放出するように関節内にオリゴヌクレオチドを留めておくこともできる。ヒアルロン酸で作られたような粘稠ゲルは、ムコ接着性があるので、この目的に使用することができ、例えば、血管移植片を入れた部位の周囲又は手術外傷部位の周囲（手術による癒着を防ぐために）のような適切な組織にオリゴヌクレオチドを局在させることができる。陽性に荷電した生体適合及び生分解性多糖キトサンは、インビボにおいてオリゴヌクレオチドを結合しそして投与するのに有用であることが示されており、この物質は疾患の部位において調節放出をすることができる注射可能製剤に含めることができる。
【００２２】
クラステリンの有効量を減少させる治療薬は、単独で投与してもよく、或いは血管新生（毛細血管増殖）を阻害する他の組成物と組み合わせて順に又は同時に投与してもよい。このような組成物としては、限定することなく、タキサン類（例えば、パクリタキセル）、カンプトテシン及びその抗−血管新生性誘導体、並びにアポトーシスの誘発により低いナノモル範囲でＨｕｖｅｃｓを阻害するドキソルビシンのような抗増殖薬がある。下記結果に示すように、これらの抗増殖薬により誘発される細胞増殖の阻害はアンチセンスの投与により増強され、クラステリンの下方調節を生じる。
【００２３】
以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに詳細に記述する。
実施例
【００２４】
ＨＵＶＥＣＳをウエル当たり１２００接種した後ウエル中で２日間増殖させた。配列番号５（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）と伴に４・ｇ／ｍｌ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドを無血清培地中に加えて細胞と４時間インキュベートした。次いで１００・ｌの血清を加え、終夜インキュベーションを続けた。翌日、血清培地中の薬物溶液１５０・ｌを加えた。２日後、２０・ｌのｍｔｓ溶液を加えて約３時間放置した。細胞生存率を、４９０ｎｍ及び５９５ｎｍにおける吸光度の差として測定した。
【００２５】
表１は、試験した薬物がパクリタキセルであった最初の一連の実験において測定された吸光度を示す。結果の上段は４９０ｎｍの吸光度である。結果の下段は５９５ｎｍの吸光度である。
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【００２６】
図１は、このセットにおける各試験検体の細胞生存率をグラフで示す。中央のバーは２００ｎＭで使用したミスマッチ（ＭＭ）対照を表す。示すように、アンチセンス濃度に対する用量依存的応答が観察され、１００ｎＭパクリタキセルの存在する場合に応答はより大きい。
【００２７】
表２は、試験した薬物がカンプトテシンであった最初の一連の実験において測定された吸光度を示す。結果の上段は４９０ｎｍの吸光度である。結果の下段は５９５ｎｍの吸光度である。
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【００２８】
図２は、このセットにおける各試験検体の細胞生存率をグラフで示す。中央のバーは２００ｎＭで使用したミスマッチ（ＭＭ）対照を表す。示すように、アンチセンス濃度に対する用量依存的応答が観察され、１００ｎＭカンプトテシンの存在する場合に応答はより大きい。
【００２９】
表３は、試験した薬物がドキソルビシンであった最初の一連の実験において測定された吸光度を示す。結果の上段は４９０ｎｍの吸光度である。結果の下段は５９５ｎｍの吸光度である。
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【００３０】
図３は、このセットにおける各試験検体の細胞生存率をグラフで示す。中央のバーは２００ｎＭで使用したミスマッチ（ＭＭ）対照を表す。示すように、アンチセンス濃度に対する用量依存的応答が観察され、２００ｎＭドキソルビシンの存在する場合に応答はより大きい。
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【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、パクリタキセルの存在下又は非存在下にアンチセンスに暴露した後のＨＵＶＥＣの細胞生存率を示す。
【図２】図２は、カンプトテシンの存在下又は非存在下にアンチセンスに暴露した後のＨＵＶＥＣの細胞生存率を示す。
【図３】図３は、ドキソルビシンの存在下又は非存在下にアンチセンスに暴露した後のＨＵＶＥＣの細胞生存率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月26日(2007.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非癌性血管新生関連疾患の治療に使用するための医薬組成物を製剤する際の、インビボにおいてクラステリンのレベルを減少させるのに有効な組成物の使用。
【請求項２】
非癌性血管新生関連疾患における血管新生を減少させるための医薬品を製造する際の、細胞内のクラステリンの有効量を減少させるのに有効な組成物の使用。
【請求項３】
前記組成物が、ヒトクラステリンの配列（配列番号１）に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その配列が本質的に配列番号２〜１５に示す配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記組成物が、ＲＮＡｉ物質を含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
前記ＲＮＡｉ物質が、その配列が本質的に配列番号１６〜２３に示す配列又はそれらに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【国際調査報告】
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