(57)【要約】  本発明は、改良された比活性を有する組換えヒトインターフェロン-ベータ-1b (“IFN-ベータ-1b”)ポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体に関する。本発明は、多発性硬化症治療に有用なそのようなIFN-ベータ-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体を含む製薬組成物にも関する。本発明は、そのようなIFN-ベータ-1bポリペプチド組成物を製造するための方法にさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IFN-β-1bポリペプチド、またはその構成体、類似体もしくは変異体を含む製薬組成物であって、前記組成物がガングリオシド阻害活性を減少しそして参照IFN-β組成物に比較してより大きなIFN-β-1b比活性を有することを特徴とする製薬組成物。
【請求項２】
本質的にガングリオシドを含まない、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項３】
前記組成物の前記IFN-β-1b比活性が前記参照IFN-β組成物に比較して少なくとも2倍大きい、請求項1に記載の製薬組成物。
【請求項４】
前記IFN-β-1b比活性が前記参照IFN-β組成物に比較して少なくとも4倍大きい、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項５】
前記IFN-β-1b比活性が前記参照IFN-β組成物に比較して少なくとも6倍大きい、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項６】
前記IFN-β-1b比活性が前記参照IFN-β組成物に比較して少なくとも8倍大きい、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項７】
前記IFN-β-1b比活性が前記参照IFN-β組成物に比較して少なくとも10倍大きい、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項８】
参照IFN-β組成物に比較して大きなIFN-β-1b比活性を有する、選択的に酸化される改良されたIFN-β-1bポリペプチド、またはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項９】
前記IFN-β-1b比活性が参照IFN-β組成物に比較して少なくとも2倍大きい、請求項８に記載の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項１０】
前記IFN-β-1b比活性が参照IFN-β組成物に比較して少なくとも４倍大きい、請求項８に記載の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項１１】
前記IFN-β-1b比活性が参照IFN-β組成物に比較して少なくとも6倍大きい、請求項８に記載の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項１２】
前記IFN-β-1b比活性が参照IFN-β組成物に比較して少なくとも10倍大きい、請求項８に記載の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項１３】
請求項８〜12のいずれか１項に記載の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたはその構成体、類似体もしくは変異体を含む製薬組成物。
【請求項１４】
参照IFN-β組成物に比較してより大きなIFN-β-1b比活性を有する組成物を得るためにIFN-β-1bポリペプチドを含む組成物においてガングリオシド阻害活性を減少させることを含む方法。
【請求項１５】
前記プロセスが前記組成物からそれが本質的にガングリオシドを含まない様にガングリオシドを除去することを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガングリオシド阻害活性の減少が前記IFN-β-1bポリペプチドの選択的酸化による、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択的酸化が熱、化学、または酵素酸化による、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学酸化が過沃素酸ナトリウム、o-ヨードソ安息香酸、CuCl2、およびo-フェナンスロリンからなる群から選択される酸化剤による、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸化剤が過沃素酸ナトリウムである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
請求項14〜19のいずれか１項に記載の方法に従って製造される、IFN-β-1bポリペプチドを含む製薬組成物。
【請求項２１】
IFN-β-1bポリペプチドを選択的に酸化することを含む、参照IFN-β組成物に比較してより大きな比活性を有する改良されたIFN-β-1bポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
前記選択的酸化が熱、化学、または酵素酸化による、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学酸化が過沃素酸ナトリウム、o-ヨードソ安息香酸、CuCl2、およびo-フェナンスロリンからなる群から選択される酸化剤による、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記酸化剤が過沃素酸ナトリウムである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
請求項2１〜24のいずれか１項に記載の方法に従って製造される改良されたIFN-β-1bポリペプチド。
【請求項２６】
請求項21〜24のいずれか１項に記載の方法により製造される改良されたIFN-β-1bポリペプチドを含む製薬組成物。
【請求項２７】
前記参照IFN-β組成物が参照IFN-β-1b組成物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項２８】
前記参照IFN-β組成物が参照IFN-β-1a組成物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項２９】
前記参照IFN-β組成物が参照IFN-β-1b組成物である、請求項８〜11のいずれか１項に記載の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項３０】
前記参照IFN-β組成物が参照IFN-β-1a組成物である、請求項８〜11のいずれか１項に記載の改良IFN-β-1bポリペプチド、またはその構成体、類似体もしくは変異体。
【請求項３１】
前記参照IFN-β組成物が参照IFN-β-1b組成物である、請求項14〜19および21〜24のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記参照IFN-β組成物が参照IFN-β-1a組成物である、請求項14〜19および21〜24のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改良された比活性を有する組換えヒトインターフェロン-β-1b(“IFN-β-1b”)ポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体に関する。本発明はまた多発性硬化症治療に有効な、たとえばIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体を含む製薬組成物に関する。本発明はさらにその様なIFN-β-1b組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えヒトインターフェロン-β(“IFN-β”)は、ある種の医学的状態、殊に再発性の一時的に緩解する型の多発性硬化症(“MS”)を治療するために臨床的に使用される。ヒトIFN-βは、イントロンを欠く単一の遺伝子であり、および抗ウイルス性、抗原虫性、免疫調節剤的および細胞成長調節作用を有するサイトカインである、インターフェロン(“IFNs”)として知られる分泌蛋白質の大きな群の一員である。たとえば、Pestka, S.(1986) Meth. Enzymol. 119:3-14;およびSen, G.C. and Lengyel, P. (1992) J.Biol. Chem. 267:5017-5020 参照。
【０００３】
ヒトIFN-βのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Taniguchi, T. et al. (1980a) Gene 10:11-15および米国特許No.5,326,859に示されている如く既知である。組換えDNA技術により、ウイルス、たとえばHIV-1、およびヒト供与源からの他の汚染物を含まないIFN-βを産生することが可能である。その様な技術により、ヒトIFN-βは、IFN-βをコード化する遺伝子を含む発現ベクターで転換される宿主細胞を培養して産生できる。宿主細胞は、遺伝子を転写し、および望ましい蛋白質を産生できるものである。
【０００４】
これらの技術は細菌性宿主細胞中（Taniguchi, T. et al. (1980b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5230-5233; Derynck, R. et al. (1980) Nature 287: 193-197; およびGoeddel, D.V. et al. (198) Nucl. Acids Res. 8:4057-4074）、哺乳類宿主細胞中 (Ohno, S. and Taniguchi, T. (1982) Nucl. Acids. Res. 10:967-977; ならびにMcCormick、F. et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:166-172) ならびに昆虫宿主細胞中 (Smith, G.E. et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) でIFN-βを産生するために使用されてきた。
【０００５】
改良された性質を有するIFN-βの突然変異蛋白質を、たとえば、Mark, D.F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5666および米国特許No.4,588,585に記載の如く産生した。突然変異蛋白質は、管理された変異誘発技術により産生される、突然変異的に変更され、生物活性のある蛋白質またはポリペプチドである。IFN-β-1bは、Cys17がコドン17の最初の塩基でのTのA転移経由でSer17に転換されるIFN-βの突然変異蛋白質である。大腸菌で発現されたIFN-β-1bの産生及び精製は、たとえば、Lin,L.S. et al. (1986) Meth. Enzymol. 119:183-192および米国特許No.5,814,485に記載されている。
【０００６】
IFN-βの二つの異なる型が承認されており、再発性、緩解性MSの治療用に利用できる：それらは、(1)Avonex（商標）およびRebif（商標）を含む IFN-β-1aならびに(2)Betaseron（商標）およびBetaferon（商標）を含むIFN-β-1bである。これらの市販IFN-β製品は、再発の割合を減少し、病気の進行を遅くし、および病気活性の炎症尺度を改善する。たとえば、Vartanian, T. (2003) Clin. Ther. 25:105-118参照。
【０００７】
IFN-β-1aは、IFN-β-1bと幾つかの点で異なる：(1) IFN-β-1aはチャイニーズハムスター卵巣細胞(“CHO”)に発現されるN結合グリコシル化蛋白質であるが、一方IFN-β-1bは大腸菌に発現される非グリコシル化蛋白質である；(2) IFN-β-1aはN末端にMet1を有する長さ166のアミノ酸であるが、一方IFN-β-1bが大腸菌内で処理されおよびN末端メチオニンが除去される時に、それはN末端にSer2を有する長さ165のアミノ酸である；(3)自然系のIFN-βの様にIFN-β-1aは17位にシステイン残基を有するが、一方IFN-β-1bにおけるCys17はSer17で置換されている；および(4) IFN-β-1aは、IFN-β-1bより約10倍高い比活性を有する。たとえば、Runkel, L. et al. (1988) Pharm. Res. 15:641-649; Weber, F. et al. (1999) Neurology 52; 1069-1071;およびFrancis, G. et al., (2000) Neurology 55:322-323参照。
【０００８】
ガングリオシドは脊椎動物細胞プラズマ膜内のあちこちに発生するシアル酸含有グリコスフィンゴ脂質であり、特に神経系に豊富である。たとえば、Lloyd, K.O. and Furukawa, K. (1988) Glycocon. J. 15:627-636参照。ガングリオシドは細胞成長および分化の制御に関与し、レクチン様蛋白質または炭水化物-炭水化物相互作用経由で細胞-細胞認識または細胞-マトリックス相互作用を通して仲介される。ガングリオシドは、配糖体結合位、糖立体構造、中性糖、およびシアル酸含有量において異なる大きな群のオリゴ糖構造に結合する脂質部分からなる。ヒト血清のガングリオシドの概要は、Senn, H.J. et al., Eur. J. Biochem. 181:657-662に記載の如く、存在量の減少順にGM3、GD3、GM2、GT1b、MG-3、MG-4、およびGD1bを含む少なくとも10種の異なる化合物からなる。
【０００９】
ガングリオシドは、ある種のヒトIFNsの比活性（ここで「ガングリオシド阻害活性」とも呼ばれる）、たとえば特定の実験条件下でIFN抗ウイルス活性、を妨げる。たとえば、白血球由来自然系IFN-αではなく、線維芽細胞由来自然系IFN-βの抗ウイルス活性は、混合ガングリオシドとの事前培養により阻害される(Gupta, S.L. et al. (1984) J. Interferon Res. 4:305-314)、および自然系IFN-βの抗ウイルス活性は、シアル酸（N-アセチルノイラミン酸）単独によってではなく、ガングリオシドGM1、GM2、およびGM3により完全に破壊される (Fuse, A. et al. (1982) Antiviral Res. 2:161-166)。これらの結果は、しかしながら、部分的に精製された自然系のインターフェロンで得られたが、高度に精製された組換えIFN-β-1aまたはIFN-β-1bでは得られなかった。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明は、参照IFN-βよりも大きな比活性を有する、改良されたIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、または変異体を含む組成物、およびそのようなIFN-β-1b組成物を製造する方法を提供する。参照IFN-β組成物の例は、たとえば参照IFN-β-1b組成物または参照IFN-β-1a組成物を含む。
【００１１】
ガングリオシドは、IFN-β比活性を阻害することが知られている（ここで「ガングリオシド阻害活性」とも呼ばれる）。かくて、ある観点で、本発明のIFN-β-1b組成物は、ガングリオシド阻害活性を減少した。たとえば、ある観点で、本発明はガングリオシド阻害活性を減少し、および参照IFN-β組成物に比較してより大きなIFN-β比活性を有するIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、または変異体を含む製薬組成物を提供する。一つの観点において、本発明の製薬組成物は、ガングリオシドを本質的に含まない。さらに、ある観点において、本発明の製薬組成物のIFN-β比活性は、参照IFN-β組成物よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍大きい。
【００１２】
ある観点において、本発明は、ガングリオシド阻害活性を減少し、および参照IFN-β組成物より大きなIFN-β比活性を有する組成物を得るために、IFN-β-1b組成物を含む組成物のガングリオシド阻害活性を減少することを含むプロセスを提供する。ある観点において、プロセスは、該組成物が本質的にガングリオシドを含まない様に組成物からガングリオシドを除去する工程を含む。さらなる観点において、ガングリオシド阻害活性は組成物を選択的に、たとえば熱，化学、または酵素酸化により、酸化することにより減少される。他の観点において、酸化は酸化剤による。
【００１３】
好ましい観点において、酸化剤は、過沃素酸ナトリウム、o-ヨードソ安息香酸、CuCl2、およびo-フェナンスロリンからなる群から選択される。一つの好ましい観点において、酸化剤は過沃素酸ナトリウムである。本発明は、そのようなプロセスから得られるIFN-β-1bを含む製薬組成物をも提供する。ここにおいて製薬組成物は、減少したガングリオシド阻害活性を有し、および参照IFN-β組成物よりも大きなIFN-β比活性を有する。一つの観点において、そのようなプロセスから得られる製薬組成物は、本質的にガングリオシドを含まない。
【００１４】
本発明は、また選択的に酸化され、かつ参照IFN-β組成物に比較してより大きなIFN-β比活性を有する、改良IFN-β-1bポリペプチドもしくは構成体、類似体、誘導体、またはその変異体をも提供する。本発明は、そのように改良されたIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体を含む製薬組成物をさらに提供する。ある観点において、本発明の改良されたIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体の比活性は、参照IFN-β組成物よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍大きい。ある観点において、選択的酸化は熱，化学、または酵素酸化による。ある観点において、酸化は酸化剤による。好ましい観点において、酸化剤は、過沃素酸ナトリウム、o-ヨードソ安息香酸、CuCl2、およびo-フェナンスロリンからなる群から選択される。一つの好ましい観点において、酸化剤は過沃素酸ナトリウムである。
【００１５】
本発明はまた、改良されたIFN-β-1bポリペプチドを得るために、IFN-β-1bポリペプチドを選択的に酸化することを含むプロセスをも提供する。その時に、改良されたIFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β組成物より大きなIFN-β比活性を有する。ある観点において、選択的酸化は、熱，化学的、または酵素的酸化による。ある観点において、酸化は酸化剤による。好ましい観点において、酸化剤は、過沃素酸ナトリウム、o-ヨードソ安息香酸、CuCl2、およびo-フェナンスロリンからなる群から選択される。一つの好ましい観点において、酸化剤は過沃素酸ナトリウムである。本発明はまた、そのようなプロセスにより得られる、改良されたIFN-β-1bポリペプチドおよび改良されたIFN-β-1bポリペプチドを含む製薬組成物をも提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の改良されたIFN-β-1bポリペプチドおよび製薬組成物を特徴付けるためのインビトロおよびインビボ分析法を提供する。
本発明は、製剤的に受容できる担体および本発明の改良されたIFN-β-1bポリペプチドまたは製薬組成物を含む組成物をさらに提供する。
本発明のIFN-β-1b組成物を使用するための方法が提供される。本発明のIFN-β-1b組成物は多発性硬化症、たとえば再発性、緩解性の多発性硬化症(“MS”)、同様に、二次的進行性MS、一次的進行性MS、および進行性再発性MSを含む他の型のMSを治療するために有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の詳細な記述
本発明の製薬組成物は、IFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体を含み、かつ改良IFN-β-1b比活性を有する。本発明の改良されたIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体は、参照IFN-β組成物に比較してより大きな比活性を有するIFN-β-1bポリペプチドを含む。特定の具体例において、IFN-β-1bを含む本発明の製薬組成物は、減少したガングリオシド阻害活性、およびより大きなIFN-β比活性を有する。一つの観点において、本発明の製薬組成物は、IFN-β比活性を阻害するガングリオシドを本質的に含まず、かつ改良されたIFN-β比活性を有する。本発明の改良されたIFN-β-1組成物を得るための方法が提供される。好ましい具体例において、本発明の改良されたIFN-β-1組成物は、IFN-β-1bポリペプチドを選択的に酸化することにより得られる。
【００１８】
本発明は、改良された比活性を有するIFN-β-1組成物を得るためのプロセスを提供する。本発明のプロセスは、ガングリオシド阻害活性を減少または不活性化するためにおよび/またはIFN-β比活性を阻害できるガングリオシドを除去（またはその量を減少）するために有用であり、および従って、本発明のIFN-β-1組成物は、改良されたIFN-β比活性を有する。
特許、特許出願、雑誌文献、および本を含むここに引用された参照は、その全体において、参照によりここに組込まれている。
【００１９】
定義
本発明の記載において，下記の術語が下記に示された如く定義されている。
「組換え蛋白質またはポリペプチド」は、組換えDNA技術により産生された、すなわち望ましい蛋白質またはポリペプチドをコード化する外生組換えDNA発現構成により形質転換された細胞、微生物または哺乳動物から産生された蛋白質またはポリペプチドを指す。大抵の細菌性培養菌で発現される蛋白質またはポリペプチドは、典型的にグリカンを含まない。酵母で発現される蛋白質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されるものとは異なるグリコシレーション様式を有するであろう。
【００２０】
「生来の」または「天然の」蛋白質またはポリペプチドは、天然に存在する供与源から回収される蛋白質またはポリペプチドを指す。術語「生来のIFN-β」または「天然IFN-β」は、生来のまたは天然のIFN-βおよびその構成体を含み、そしてアセチル化、カルボキシル化、グリコシレーション、燐酸化、脂質化、アシル化、および開裂に限定されるものではないが、これらを含むIFN-βおよびその構成体の転写後修飾を含むであろう。
【００２１】
DNAまたポリヌクレオチドの「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた宿主細胞中のmRNAへの転写およびポリペプチドへの翻訳されるDNAまたはポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、5’N末端の出発コドンおよび3’C末端の翻訳停止コドンである。コーディング配列は、原核配列、真核mRNAからのcDNA、真核DNAからのゲノム性DNA配列、および合成DNA配列を含むことが出来る。転写終結配列は、通常コーディング配列に対し3’に位置する。
【００２２】
「DNAまたポリヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマー（アデニン、グアニン、チミン、シトシン塩基）である。本発明の蛋白質またはポリペプチドをコード化するDNAまたポリヌクレオチド配列は、組換えDNA発現ベクターに発現可能な合成遺伝子を提供する合成cDNA誘導DNA構成体および短いオリゴヌクレオチドリンカーから組み立てることが出来る。特定の二本鎖DNA分子の構造を議論する際に、配列はcDNAの非転写螺旋に沿って5’から3’方向への配列のみを提供する通念に従ってここに記載されるであろう。
【００２３】
「組換え発現ベクターまたはプラスミド」は、本発明の蛋白質またはポリペプチドをコード化するDNAを増幅するかまたは発現するために使用される反復可能なDNAベクターまたはプラスミド構成体である。発現ベクターまたはプラスミドは、DNA調節配列およびコーディング配列を含む。DNA調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合域、ポリアデニル化信号、転写停止配列、上流調節領域、およびエンハンサーである。ここに定義された組換え発現系は、調節要素の誘導に基づき、本発明の蛋白質またはポリペプチドを発現する。
【００２４】
「形質転換された宿主」は、外生DNAで形質転換し、および移入された細胞を指す。外生DNAは、宿主細胞のゲノムを作る染色体DNAに統合（すなわち、共有結合）したり、しなかったりであろう。原核生物および酵母においては、たとえば外生DNAは、プラスミドの様なエピゾーム要素上に維持されたりまたは染色体DNAに安定的に統合されたりするであろう。真核生物に関して、安定的に形質転換した細胞は、外生DNAが染色体に統合されたものである。この安定性は、外生DNAを含む娘細胞の個体群を複製経由で産生するための真核生物細胞系またはクローンの能力により示される。
【００２５】
「IFNまたはIFNs」は、抗ウイルス性、抗原虫性、免疫調節性、および細胞成長調節活性を有するサイトカインであるインターフェロンとして知られる一群の分泌蛋白質を指す。IFNsは、本来その供与源により分類された：白血球(IFN-α-1およびIFN-α-2)、線維芽細胞(IFN-β)および免疫細胞(IFN-γ)。たとえばPestka, S. (1986) supra; Sen, G.C. and Lengyel, P. (1992) supra; およびPestka, S. ed. Interferons Part C in Meth. Enzymol. Vol. 119. Academic Press, Inc., New York, NY. (1986)参照。
【００２６】
「IFN-β」は、ヒトにおいてイントロンに欠ける単一遺伝子である線維芽細胞IFNである。ヒトIFN-βのDNAまたはポリヌクレオチド配列は、Taniguchi, T. et al. (1980a) supraおよび米国特許No.5,326,859に記載されている。ヒトIFN-βのcDNAは、長さにおいて187のプロポリペプチドアミノ酸をコード化する。A 21アミノ酸のシグナル配列は、長さ166のアミノ酸である成熟した分泌IFN-βポリペプチドを形成するために開裂される。
【００２７】
「IFN-β-1a」は、チャイニーズハムスター卵巣(“CHO”)細胞に発現する組換えヒトIFN-βを指す。図1に示す様に、成熟した分泌IFN-β-1aは、自然系IFN-βに相当する、長さ166のアミノ酸である。IFN-β-1aは、アスパラギン残基の80位(Asp80)でN結合グリコシレーションされる。たとえば、Innis, M.A. and McCormick, F. et al., (1986) supra および米国特許No.4,966,843参照。
【００２８】
「IFN-β-1b」は、大腸菌宿主細胞で発現されおよび17位でセリンアミノ酸置換(Ser17)をするシステインを有する組換えヒトIFN-βを指す。IFN-β-1bが大腸菌中で処理され、およびN末端メチオニンが除去される時に、それはN末端にSer2を有する長さ165のアミノ酸である。IFN-β-1bは、グリコシル化されない。たとえば、Mark, D.F. et al. (1984) supraおよび米国特許No.4,588,585参照。
【００２９】
「改良されたIFN-β-1b」組成物は、参照IFN-β組成物に比較してより大きな比活性を有するIFN-β-1b組成物（たとえば、IFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体、およびIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、誘導体または変異体を含む医薬品組成物）である。好ましい具体例において、本発明の改良されたIFN-β-1b組成物は、熱，化学、または酵素酸化を用いてIFN-β-1b組成物を選択的に酸化して得られる。他の好ましい具体例において、本発明のIFN-β-1b組成物は、組成物におけるガングリオシド阻害活性の量を減少することにより得られる。他の好ましい具体例において、本発明のIFN-β-1b組成物は、該組成物が本質的にガングリオシドを含まない様に組成物からガングリオシドを除去することにより得られる。
【００３０】
「選択的に酸化されたIFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、または変異体」は、IFN-β-1bポリペプチドもしくはその構成体、類似体、または変異体が、参照IFN-β組成物に比較してより大きな比活性を有するIFN-β-1bポリペプチド（または改良されたIFN-β-1b組成物）を得るためにここに記載の如く選択的に酸化される。
【００３１】
本発明のIFN-β-1b組成物に関して「本質的にガングリオシドを含まない」は、IFN-β-1b組成物中のガングリオシドがここに記載の方法または既知の検出方法で検出されない、あるいはガングリオシドの阻害活性が、参照IFN-β組成物に比較して該組成物において減少することを意味する。好ましい具体例において本発明のIFN-β-1b組成物は、ガングリオシドを除去（または量を減少する）ために、および/またはIFN-β-1b組成物においてガングリオシドの阻害活性を減少または不活性化するために、ここに記載のプロセスを用いて得られる。それによって、IFN-β-1b組成物は、本質的にガングリオシドを含まない、および/または減少したまたは不活性化したガングリオシド阻害活性を有する。
【００３２】
術語「類似体」、「構成体」、「誘導体」、および「変異体」は、本発明の改良されたIFN-β-1bポリペプチドは、ここに記載の如く、改良されたIFN-β-1bポリペプチドと本質的に同様な機能的活性または本質的に同じ生体機能または活性を維持するその様な改良されたIFN-β-1bポリペプチドの類似体、構成体、誘導体、および変異体を意味する。
【００３３】
「類似体」は、その中に本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドのアミノ酸配列を含むプロポリペプチドを含む。改良IFN-β-1bポリペプチドは、自然のインビボプロセスまたは当業者に良く知られた方法、たとえば酵素または化学開裂により、プロ- IFN-β-1b分子を完成する付加的アミノ酸から開裂できる。たとえば、IFN-β-1b（図1参照）は、165アミノ酸である活性な成熟IFN-β-1bを解放するためにインビボで処理される166アミノ酸プロIFN-β-1bとして大腸菌中に発現する。
【００３４】
「構成体」は、下記にさらに記載の如く、ここに開示されたインビトロ分析法に示される様に、改良IFN-β-1bポリペプチドと本質的に同様な機能活性、または本質的に同じ生体機能もしくは生物活性を維持する、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの一部である。
「誘導体」は、本質的にここに開示された機能を維持し、ならびに追加的な構造および付随的機能、たとえばより大きな半減期を有する、PEG化ポリペプチドを含む本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドに対する全ての修飾を含む。
【００３５】
「変異体」は、本発明の本来の改良IFN-β-1bポリペプチドのアミノ酸配列に十分類似なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。術語「十分類似」は、第1および第2のアミノ酸配列が共通の構造分域および/または共通の機能活性を有する様に、第2のアミノ酸配列に関して、十分なまたは最小限数の同一もしくは同等のアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸を意味する。たとえば、少なくとも約45％、好ましくは、約75％から98％が同一である共通の構造分域を含むアミノ酸配列を、ここに十分類似として定義する。好ましくは変異体は、本発明の好ましい改良IFN-β-1bポリペプチドのアミノ酸配列に十分類似している。
【００３６】
変異体は、本発明のポリヌクレオチドに交雑するポリヌクレオチドによりコード化される改良IFN-β-1bポリペプチドの変異体を含む。その様な変異体は、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの機能活性を通常維持する。変異体は、変異誘発によりアミノ酸配列が異なる改良IFN-β-1bポリペプチドを含む。抗ウイルス活性を有する変異体は、突然変異体、たとえば本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの先端切断または点突然変異体、の組合せライブラリーの、「IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法」の下に記載のMxA遺伝子誘導分析法を用いたスクリーニングにより同定できる。
【００３７】
「本質的に類似の機能活性」および「本質的に同一の生体機能または生物活性」はいずれも、各ポリペプチドの生物活性を同一手段または分析法により測定した時に、生物活性の程度が、比較されるポリペプチドにより示される生物活性の約50%から100%以内またはそれ以上、好ましくは、80%から100%以内またはそれ以上、およびより好ましくは、90%から100%以内またはそれ以上である。たとえば、IFN-β-1bに対して本質的に同様な機能活性を有するポリペプチドは、例4に記載の分析法の酸化後、「IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法」の下に記載の如くMxA遺伝子を誘導するためのまたはインビトロでウイルス産生を阻害するための能力を示す。
【００３８】
2つのポリペプチドの間の「類似性」は、一つのポリペプチドのアミノ酸配列を第2のポリペプチドの配列に比較することにより決定される。一つのポリペプチドのアミノ酸配列は、もしそれが同一であるかまたは保存的なアミノ酸置換であれば、第2のポリペプチドの相当するアミノ酸配列に類似である。保存的置換は、Dayhoff, M.O.編 The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Found- ation, Washington, D.C. (1978)、およびArgos, P. (1989) EMBO J. 8:779-785に記載のものを含む。
【００３９】
たとえば、下記の群の一つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を表す：
-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；
-Cys、Ser、Tyr、Thr；
-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；
-Lys、Arg、His；
-Phe、Tyr、Trp、His；および
-Asp、Glu。
【００４０】
「哺乳動物」は、ヒトおよび家畜、たとえば、猫、犬、豚、牛、羊、山羊、馬、兎、その他同様なものを含む。
【００４１】
本発明のIFN-β-1b組成物に関してここに使用される如き「比活性」または「IFN-β比活性」は、IFN-β、たとえばIFN-β-1bまたは IFN-β-1a、の生物活性または生体機能を意味する。IFN-β-1bおよび IFN-β-1aの生物活性または生体機能は、当業者に良く知られており、および、これに限定されるものではないが、たとえば抗ウイルス活性を含む。そのような比活性は、ここに記載の方法または当業者に既知の如何なる方法を用いても検出および測定できる（たとえば、Fellous et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3082-3086; Czemiecki et al. (1984) J. Virol. 49(2):490-496; Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  81:5662-5666; Branca et al. (1981) Nature 277:221-223; Williams et al. (1979) Nature 282:582-586; Herberman et al. (1979) Nature 277:221-223; Anderson et al. (1982) J. Biol. Chem. 257(19): 11301-11304に記載の分析法参照）。
【００４２】
好ましい具体例において、本発明のIFN-β-1b組成物は、IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法の下にここに記載の如く、MxA遺伝子誘導分析法またはウイルス産生分析法を用いて検出または測定される比活性を有する。抗ウイルス活性は、参照ヒトIFN-β、たとえば参照IFN-β-1bまたは IFN-β-1aの活性に関連して測定される（たとえば、Pestka, S. (1986) Meth. Enzymol. 199:14-23参照）。1具体例において、本発明で用いたIFN-β-1bの比活性は、A549細胞およびマウス脳脊髄炎(“EMC”)ウイルスを用いた抗ウイルス細胞変性効果(“CPE”)分析法を用いて測定された如く、〜3 x 107IU/mgである。
【００４３】
「IFN-β-1b組成物」は、IFN-β-1bポリペプチド、構成体、類似体、誘導体またはその変異体、あるいはIFN-β-1bポリペプチド、構成体、類似体、誘導体またはその変異体を含む組成物（たとえば、製薬組成物）を指す。
【００４４】
ここに用いられている「改良された比活性」は、本発明のIFN-β-1b組成物の比活性が参照IFN-β-1b組成物のそれより大きいことを意味する。適切な参照IFN-β-1b組成物は、たとえば、参照IFN-β-1b組成物または参照IFN-β-1a組成物を含む。たとえば、1具体例において、本発明のIFN-β-1b組成物は、IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法の下にここに記載の如く、MxA遺伝子誘導分析法またはウイルス産生分析法で測定される様に、参照IFN-β-1b組成物の比活性より大きい比活性を有する。
【００４５】
本発明のIFN-β-1b組成物の改良された比活性は、参照IFN-β組成物（たとえば、参照IFN-β-1b組成物または参照IFN-β-1a組成物）の比活性よりも好ましくは少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍大きい。
【００４６】
ガングリオシドは、IFN-β比活性を示し得る（またここで「ガングリオシド阻害活性」とも呼ばれる）。本発明は、ガングリオシド阻害活性を減少するかまたはIFN-β-1b組成物からガングリオシドを除去し、および結果としてIFN-β比活性を増加するためのプロセスを提供する。ガングリオシドは、本発明に記載のまたは当業者に既知の方法を用いて組成物中で除去または減少される。同様に、ガングリオシド阻害活性は、ここに記載の如き、または当業者に既知の方法、たとえばガングリオシドの除去、減少または不活性化、を用いて減少または縮小される。
【００４７】
「参照IFN-β組成物」は、そのIFN-β比活性を改良するためにここに記載の如く、および/または本発明のIFN-β-1b組成物を得るためにここに記載の如く、処理または操作されていないIFN-β（たとえば、IFN-β-1bまたはIFN-β-1a）を含む組成物を指す。参照IFN-β組成物は、本発明のIFN-β-1b組成物の比活性に対して参照IFN-β組成物の相対的比活性を比較しおよび測定すべき標準として用いられるであろう。たとえば、1具体例において、参照組成物のIFN-βは、選択的に酸化されないが、一方本発明の改良されたIFN-β-1bポリペプチドは、IFN-β-1bポリペプチドの選択的酸化により得られ、およびそれにより参照IFN-β組成物に比較してより大きな比活性を有するIFN-β-1b組成物をもたらす。
【００４８】
またたとえば、他の具体例において、参照組成物のIFN-βは、ガングリオシドを除去（または量を減少）するために処理されないが、一方本発明のIFN-β-1b組成物は、ガングリオシドを除去（または量を減少）するために処理され、参照IFN-β組成物に比較して本質的にガングリオシドを含まないIFN-β-1b組成物をもたらす。またたとえば、他の具体例において、参照組成物のIFN-βは、ガングリオシドの阻害活性を減少または不活性化するために処理されないが、一方本発明のIFN-β-1b組成物は、ガングリオシド阻害活性を減少または不活性化するために処理され、参照IFN-β組成物に比較して増加した比活性を有するIFN-β-1b組成物をもたらす。
【００４９】
ガングリオシドを除去（もしくはその量を減少）する、またはガングリオシド阻害活性を減少もしくは不活性化するための本発明の方法はここに記載されており、およびそれに限定されるものではないが、たとえばIFN-β-1bポリペプチドの選択的酸化を含む。IFN-β-1bポリペプチドを選択的に酸化するための本発明の方法は、それに限定されるものではないが、熱、化学、または酵素酸化の使用を含む。
本発明のIFN-β-1b組成物の比活性は、IFN-βの比活性を検出および/または測定するための、たとえばここに記載の如きまたは当業者に既知の如き方法を用いて、参照IFN-β-1b組成物の比活性に比較して分析される。
【００５０】
「治療的に有効な量」は、それを必要とする人へ投与する時に、下記に記載の如く、再発性、緩解性多発性硬化症(“MS”)、また同様に2次進行性MS、1次進行性MS、および進行性、再発性MSを含む他の型のMSのための治療を実施するために十分な本発明の改良  IFN-β-1bポリペプチドの量を指す。「治療的に有効な量」を構成する本発明の改良  IFN-β-1bポリペプチドの量は、IFN-β-1b蛋白質、症状およびその重度、ならびに治療されるべき人の年齢により異なるが、その知識および本発明の開示にてらして、通常の当業者により日常的に決定可能である。
【００５１】
ここに使用されている如く「治療する」または「治療」は、病状がMSに関連する症状、たとえば、脱力感、痺れ感、振戦、視覚喪失、疼痛、麻痺，平衡失調、膀胱および腸機能障害、ならびに認識変化（1次症状）；再発性尿路感染症、不使用脱力感、姿勢整列不良および体幹制御不良、筋肉平衡異常、骨密度減少、浅い不十分な呼吸、および褥創（2次症状）；ならびに鬱（3次症状）により特徴付けられる哺乳動物，好ましくは人間の病状の治療を含み、および(i)容態を防止する、すなわちその進行を阻止する、または(ii) 容態を緩和する、すなわち容態の退行を引き起こすことを含む。
ここで使用される全ての他の技術的術語は、本発明が属する業界で通常用いられるものと同じ意味を有する。
【００５２】
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの特徴
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β-1b組成物のそれよりも少なくとも2倍、好ましくは少なくとも4倍、より好ましくは少なくとも6倍、さらにより好ましくは8倍、およびさらにより好ましくは少なくとも10倍大きな比活性を有する、IFN-β-1bポリペプチド、構成体、類似体、誘導体またはその変異体を含む。好ましい具体例において、参照IFN-β組成物は参照IFN-β-1b組成物である。幾つかの具体例において、参照IFN-β組成物は参照IFN-β-1a組成物である。1具体例において、本発明の改良IFN-β-1b組成物は、米国特許No.5,814,485に記載の手順に従って大腸菌で発現されおよび精製された参照IFN-β-1b組成物より少なくとも2倍大きな比活性を有する。
【００５３】
改良IFN-β-1bポリペプチドの発現と精製
細菌中、特に改良された比活性を有するIFN-β-1bポリペプチドを得るために大腸菌中、での組換えヒトIFN-β-1bを発現および精製するための方法は幾つかある。既知の方法が、細菌中でのクローン化遺伝子を発現するために使用できる。原核系におけるクローン化真核遺伝子を高度に発現させるために、mRNA転写を指示するための強いプロモーターを含むことが発現ベクターを構成するために好ましい。
【００５４】
この目的のための適切な調節域の例は、大腸菌β-グルコシダーゼ遺伝子のプロモーターおよびオペレーター域、大腸菌トリプトファン生物合成経路，またはファージλからの左方プロモーターである。大腸菌で形質転換したDNAプラスミドへの選択マーカーの封入もまた有効である。そのようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラシリン、またはクロラムフェニコールに抵抗性を有する遺伝子を含む。
【００５５】
グリコシレーションの様な翻訳後修飾は、原核細胞発現系大腸菌では起こらない。さらに、複雑なジスルフィド様式を有する蛋白質は、大腸菌で発現した時に、誤って折り畳まれ得る。原核系で発現された蛋白質は、細胞が溶解された後可溶性画分に見出された、いわゆる封入体であり、不溶形で細胞質中に存在するか、または適切な分泌シグナル塩基配列の付加によりペリプラズム中に割り当てられる。もし発現蛋白質が不溶性封入体ならば、可溶化および引き続く封入体の再折り畳みが通常必要である。
【００５６】
多くの原核発現ベクターは、当業者に既知であり、商業的に入手可能であって、たとえばpKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA)、およびpGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, USA)がある。
【００５７】
組換え微生物発現系に通常用いられるプロモーターは、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系(Chang, A.C. et al. (1978) Nature 275:617-624; およびGoeddel, D.V. et al. (1979) Nature 281:544-548)トリプトファン (trp) プロモーター系（Goeddel, D.V. et al. (1980) supra）、ならびにtacプロモーター (Sambrook, J.F. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) である。他の有用な細菌発現系は、ラムダファージpLプロモーターおよびclts857熱誘導性リプレッサーを用いる(Bernard, H.U. et al. (1979) Gene 5:59- 76; およびLove, C.A. et al. (1996) Gene 176:49-53)。
【００５８】
IFN-β-1b/Betaseron（商標）を産生するプロセスおよびその引き続く分析ならびに出荷試験はLin, L. (1988) Dev. Biol. Stand, 96:97-104に概説されている。IFN-β-1b/Betaseron（商標）は、trpプロモーターの制御下大腸菌に発現されるIFN-β-1bの形であり、およびその開示がその全体で参照により取り込まれている米国特許No.5,814,485に記載の如く産生および精製される。1具体例において、そのようなIFN-β-1b調製品の比活性は、〜3 x 107IU/mgである。
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドを発現しおよび精製するための好ましい方法は、米国特許No.5,814,485に記載のプロセスである。
【００５９】
改良IFN-β-1bポリペプチドの酸化方法
細菌に発現した組換え哺乳動物蛋白質、たとえばIFNs、の酸化は、その天然に発生する対照物と同一であるジスルフィド架橋の生成のために典型的に用いられる。還元され、システインを含有し、細菌的に発現した哺乳動物蛋白質を酸化するために有用な試薬は、米国特許No.4,530,787およびNo.4,572,798に記載の如く、o-イオドソ安息香酸、CuCl2、およびo-フェナンスロリンを含む。
【００６０】
ガングリオシドは、IFN-β-1bの比活性を阻害できる（ここに「ガングリオシド阻害活性」とも呼ばれる）。本発明の目的は、酸化は大腸菌発現哺乳動物蛋白質、たとえばIFN-β-1b、の高度に精製された調製品に存在する炭水化物の酸化的開裂のために有用なことである。本発明のそのようなプロセスは、IFN-β-1b組成物中のガングリオシドを除去（またはその量を減少）するため、および/またはガングリオシドの阻害活性を減少または不活性化しおよびその結果本発明のIFN-β-1b組成物の比活性を増加するために有用である。
【００６１】
炭水化物を酸化または開裂する方法は良く知られており、ならびにたとえば、酸加水分解、酵素加水分解、過沃素酸塩酸化、および加熱を含む。過沃素酸塩酸化は、単糖類、多糖類、およびオリゴ糖（たとえば、Pappas, R.S. et al. (1990) Carbohydr. Res. 197:1-14及びSussich, F. 及びCesaro, A. (2000) Carbohydr. Res. 329:87-95参照）, ならびに蛋白質およびペプチド (たとえば、Clamp, J.R. and Hough, L. (1965) Biochem. J. 94:17-24参照) を酸化するために使われる。
【００６２】
過沃素酸塩酸化
蛋白質およびペプチドの過沃素酸塩による迅速酸化は、ペプチドにアルデヒドを生成し、およびたとえば、ビオチン、蛍光リポーター、金属キレート化群、イメージング剤、細胞障害薬、安定剤、たとえばポリエチレングリコールを用いた位置指定標識化のための方法の第1工程として使われる(Geoghegan, K.F. and Stroh, J.G. (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146) 。過沃素酸塩酸化の標的は、N-末端セリンまたはスレオニン残基中およびヒドロキシリシン残基中の蛋白質およびペプチド中に存在する、2-アミノアルコール構造、-CH(NH2)CH(OH)-、である。
【００６３】
過沃素酸塩はまた、チロシン、メチオニン、ヒスチジン、およびトリプトファンを含む蛋白質の幾つかのアミノ酸残基をも酸化できる(Clamp, J. R. and Hough, L. (1965) supra) 。他のアミノ酸残基の酸化を最小にして、N末端セリンまたはスレオニンを選択的に酸化するための条件は、参照によりここに完全に組み込んだ開示、たとえば、Geoghegan, K.F. and Stroh, J.G. (1992) supra;およびGaertner, H.F. and Offord, R.E. (1996) Bioconjugate Res. 7:38-44に記載されている。N-末端で選択的に酸化される3例の組換え哺乳動物サイトカイン蛋白質は以下を含む：(1)インターロイキン-1α(“IL-1α“)；(2)インターロイキン-8(“IL-8”); (3)顆粒球コロニー刺激因子(“G-CSF”)。
【００６４】
(1)  IL-1α中のN末端セリン(13μM)を、pH7.0の0.2M燐酸ナトリウム中の40μM過沃素酸ナトリウム（3倍モル濃度過剰）で、0℃で30分間酸化した。過沃素酸塩を、50mM酢酸ナトリウム、pH4.5、で平衡にしたSephadex G-25を用いてゲル濾過により除去した。N末端の定量的酸化を分画電気泳動により確認した。Geoghegan, K.F. and Stroh, J. G. (1992) supra参照。 
【００６５】
(2)  IL-8中のN末端セリン(2〜5mg/mlで)を、50倍モル濃度過剰のメチオニンの存在下、pH8.3の1%NH4-HCO3緩衝液中、10倍過剰の過沃素酸ナトリウムで、室温で10分間酸化した。過沃素酸塩に対して2000倍モル濃度過剰のエチレングリコールで反応を停止し、溶液をさらに室温で15分間培養し、次に0.1M酢酸ナトリウム緩衝液に対して、pH4.6で透析した。Gaertner, H.F. and Offord, R.E. (1996)supra参照。
【００６６】
(3)  G-CSF 中N末端スレオニン(5mg/mlで)を、N末端メチオニンのアミノペプチダーゼ触媒による除去後、6Mグアニジウム塩酸を含むpH8.3の1% NH4-HCO3緩衝液中、5倍過剰の過沃素酸塩で、室温で10分間酸化した。過沃素酸塩に対して1000倍モル濃度過剰のエチレングリコールで反応を停止した。Gaertner, H.F. and Offord, R.E. (1996)supra参照。
本発明のIFN-β-1bポリペプチドを酸化するための好ましい方法は、上述の実験的プロトコール(1)、(2)、および(3)を含み、これらはIFN-β-1bのN末端セリン残基を酸化するが、以下に記載の如く、ポリペプチドの生物活性に如何なる有害な効果をも生じない。
【００６７】
改良IFN-β-1bポリペプチドの類似体、構成体、誘導体および変異体
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの類似体、構成体、誘導体および変異体は、下記の様であろう：(i)1個以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは、保存アミノ酸残基)で置換されおよびそのような置換アミノ酸残基は遺伝子コードによりコード化されるかまたはされないであろう；または(ii) 1個以上のアミノ酸残基が、置換基を含むもの；あるいは(iii) 改良IFN-β-1bポリペプチドが他の化合物、たとえば改良IFN-β-1bポリペプチドの半減期を増加するための化合物(たとえば、ポリエチレングリコール)と結合するもの；あるいは(iv)付加アミノ酸が成熟した、改良IFN-β-1bポリペプチド、たとえばリーダー配列もしくは分泌配列、または成熟した、改良IFN-β-1bポリペプチドの精製用に使用される配列、に結合するもの；あるいは(v) 改良IFN-β-1bポリペプチド配列は、効果の持続期間を延ばすため、より大きなポリペプチド，すなわち、ヒトアルブミン、抗体またはFc、と結合するもの。そのような類似体、構成体、誘導体および変異体は、ここでの教示から当業者の領域内にあると思われる。
【００６８】
好ましくは、本発明の誘導体は、1個以上の予測された、好ましくは、非必須アミノ酸残基で作られた保存的アミノ酸置換を含む。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変更せずに蛋白質の野生型配列から変更できる残基であるが、一方「必須」アミノ酸残基は生物活性のために必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基群は当業界で定義されている。
【００６９】
これらの群は、下記の側鎖を有するアミノ酸を含む：塩基側鎖(たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸側鎖(たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖(たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニラミン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ鎖側鎖(たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)。非保存的置換は、保存アミノ酸残基または保存蛋白質領域内にあるアミノ酸残基に対しては行わない。
【００７０】
構成体または生物活性部分は、医薬品、研究試薬、同様なものとしての使用に適切なポリペプチド構成体を含む。構成体は、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドのアミノ酸配列に十分類似のまたはそれから誘導されたおよびポリペプチドの少なくとも一つの活性を示すアミノ酸配列を含むペプチドを含むが、ここに開示した完全長ポリペプチドより少ないアミノ酸を含む。典型的に生物活性部分は、少なくとも一つのポリペプチド活性を有する分域またはモチーフを含む。ポリペプチドの生物活性部分は、たとえば長さ5以上のアミノ酸であるペプチドであり得る。そのような生物活性部分は、合成的にまたは組換え技術により調製でき、およびここに開示されたおよび/または当業者に良く知られた方法で本発明のポリペプチドの1以上の機能活性を評価できる。
【００７１】
本発明の好ましい誘導体は、他の化合物、たとえばポリペプチドの半減期を増加するおよび/またはポリペプチドの潜在的免疫原性を減少するため化合物(たとえば、ポリエチレングリコール、「PEG」)と融合する改良IFN-β-1bポリペプチドを含む。PEGは、水の溶解度、寸法、腎臓浄化の遅い速度および融合蛋白質への減少した免疫原性を付与するために使用できる（たとえば、米国特許No.6,214,966参照）。PEG化の場合には、PEGに対する改良IFN-β-1bポリペプチドの融合は、当業者に既知の方法により達成できる。たとえば、PEG化は、先ず改良IFN-β-1bポリペプチドにシステイン突然変異を導入し、次にPEG-マレイミドで位置特異的誘導体化により達成できる。システイン残基を、改良IFN-β-1bポリペプチドのC末端に付加できる。たとえば、Tsutsumi, Y.etal. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8548-8553参照。
【００７２】
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの変異体は、元の改良IFN-β-1bポリペプチドのアミノ酸配列に十分類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。術語「十分類似」は、第1および第2のアミノ酸配列が共通の構造分域および/または共通の機能活性を有する様に、第2のアミノ酸配列に関して十分なまたは最小数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を意味する。たとえば、少なくとも約45%、好ましくは約75%から98%同一である共通構造分域を含むアミノ酸配列は、ここに十分類似であるとして定義される。
【００７３】
好ましくは、変異体は、本発明の好ましい改良IFN-β-1bポリペプチドのアミノ酸配列に十分類似である。変異体は、厳密な条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはその補完物に交雑するポリヌクレオチドによりコード化される好ましい改良IFN-β-1bポリペプチドの変異体を含む。その様な変異体は、通常本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの機能的活性を維持する。ポリヌクレオチドの構成体のライブラリーは、スクリーニングおよび引き続く選択のための構成体の変化に富む個体群を生成するために使用出来る。
【００７４】
たとえば、構成体のライブラリーは、切断が分子当たり約1回のみ起こり、2本鎖ＤＮＡを変性させ、異なる切断産物からのセンス/アンチセンス対を含む2本鎖ＤＮＡを形成するためにＤＮＡを復元し、S1ヌクレアーゼでの処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、生成構成体ライブラリーを発現ベクターに結合する条件下で、ポリヌクレオチドの2本鎖PCRの構成体をヌクレアーゼで処理することにより生成できる。この方法により、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドのN末端および種々の寸法の内部構成体をコード化する発現ライブラリーを誘導できる。
【００７５】
変異体は、変異誘発によりアミノ酸配列の異なる改良IFN-β-1bポリペプチドを含む。抗ウイルス性活性を有する変異体は、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの突然変異体、たとえば先端切断または点突然変異体、の組合せライブラリーを、IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法の下に記載のMxA遺伝子誘導分析法を用いてスクリーニングすることにより同定できる。
【００７６】
1具体例において、変異体の変化に富むライブラリーは、核酸レベルでの組合せ変異誘発により生成され、および変化に富む遺伝子ライブラリーによりコード化される。潜在的変異体アミノ酸配列の縮退セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、そこに配列セットを含むより大きな改良IFN-β-1bポリペプチドのセットとして(たとえば、ファージ表示のため)発現できるように、変異体の変化に富むライブラリーは、たとえば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に結合させることにより産生できる。
【００７７】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的変異体のライブラリーを作るために使用できる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNA合成機で実施でき、合成遺伝子は次に適切な発現ベクターに結合される。遺伝子の縮重セットの使用により、望ましいセットの潜在的変異体配列をコード化する全ての配列は、一つの混合物で準備できる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に既知の（たとえば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura, K. et al.. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323-356; Itakura, K. et al. (1984b) Science 198:1056-1063; Ike, Y. et al. (1983) Nucl. Acid Res. 11:477-488参照)。
【００７８】
点突然変異または先端切断により作られた組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選ばれた性質を有する遺伝子産物のためのcDNAライブラリーをスクリーニングするための幾つかの技術が当業者に知られている。そのような技術は、抗ウイルス活性のための改良IFN-β-1bポリペプチドの組合せ変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに応用できる。
【００７９】
大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高処理能力分析に反応する最も広く使用されている技術は、望ましい活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコード化するベクターの単離を促進する条件下で、遺伝子ライブラリーを再生可能な発現ベクター中にクローニングし、適切な細胞を生成ベクターのライブラリーで形質転換し、および組合せ遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を促進する技術である再帰的集合変異誘発(REM)は、望ましい変異体を同定するためのスクリーニング分析法と組み合わせて使用できる。
【００８０】
IFN-β-1bポリペプチドの比活性測定用分析法
IFNsの抗ウイルス活性は、ウイルス収量またはウイルス誘導細胞変性効果(“CPE”)の減少に関連して、たとえばPestka, S. 編 Interferons Part A in Meth. Enzymol. Vol. 78, Academic Press, Inc., New York, N.Y. (1981) に記載の如く、培養ヒト細胞において、たとえば生体染料取込により、定量的に測定できる。
【００８１】
抗ウイルス細胞変性効果(CPE)分析法
IFN-β-1aおよびIFN-β-1b両者を含むIFN-β-1bポリペプチドの比活性は、ここに記載の方法または当業者に既知の方法、たとえば抗ウイルスCPE分析法、を用いて測定できる。ここに用いられた抗ウイルスCPE分析法は、マウス脳脊髄炎(“EMC”)ウイルスに感染したA549ヒト肺癌細胞におけるナフトール紺染料取込を測定する。この手順は、Pungor, E.Jr. et al. (199) J. Interferon Res. 18:1025-1030に詳細に記載されている。ここに用いられている他の抗ウイルスCPE分析法は、水泡性口内炎ウイルス(“VSV”)に感染したWISHヒト羊膜細胞におけるウイルス性プラークの減少を測定する。国際単位(“IU”)が、参照NIHヒト線維芽細胞IFN-β組成物または参照ヒト組換えIFN-β組成物に関して割り当てられている(Pestka, S. (1986) supra)。
【００８２】
MxA遺伝子誘導分析法
培養ヒト細胞のＩ型IFNsによるMxA遺伝子の特異誘導に基づき（Von Wussow, P. et al. (1990) Eur. J. Immunol. 20:2015-2019;およびSimon, A. et al. (1991) J. Interferon Res. 11:215-219）、免疫化学的照度測定 (“ICLA”) 分析法が、Files, J.G. et al. (1998) J. Interferon Res. 18:1019-1024により 開発された。ICLA分析法は、Oh, S.K. et al. (1994) J. Immunol. Meth. 176:79-91の手順に基づき、一方が照度計で検出されるアクリジニウムエステルと共役している二つの非競合抗MxAモノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物中のMxA蛋白質を検出する。ここに用いたMxA遺伝子ICLA誘導分析法は、Files, J.G. et al. (1988) supraに詳細に記載されている。
【００８３】
製薬組成物
本発明はまた、治療効果を達成するために患者に投与できる製薬組成物をも提供する。本発明の製薬組成物は、好ましい純度および製薬的有効量を有する改良IFN-β-1bポリペプチドを生理学的に受容できる担体と組み合わせることにより投与用に調製できる。
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、静脈内、皮下、筋肉内、または髄腔内投与に対する製薬組成物において使用できる。かくして、上述のポリペプチドは、好ましくは受容できる無菌製薬担体、たとえば5%デキストローズ、乳酸塩化リンゲル液、通常生理食塩水、無菌水、または他の商業的に調製された静脈内輸液用生理的緩衝液、と組合せられる。担体溶液、ならびに組成物の用量および投与は、患者および特定の臨床的設定により変化し、ならびに標準的医学手順により支配されることが理解される。
【００８４】
本発明の方法に従い、これらの製薬組成物は、MSに関連した病理学的予後または症状を阻害または改善するための有効量で投与されるであろう。
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの投与は、大量静脈内注射により、定常的静脈内輸液により、または両経路の組合せによるであろう。代替的にまたは追加的に適切な医薬品添加物と混合した改良IFN-β-1bポリペプチドおよび製薬組成物は、筋肉内部位経由で循環系に取込まれるであろう。
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドおよび製薬組成物は、非経口、局所、静脈内、経口、または局所投与用に有用である。製薬組成物は、投与方法により種々の単位剤形で投与できる。たとえば、単位剤形は、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル、粉末、溶液、およびエマルジョンを含む剤形で投与できる。
【００８５】
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドおよび製薬組成物は、静脈内投与に特に有用である。投与用組成物は、製薬的に許容できる担体、好ましくは水性担体、に溶解した改良IFN-β-1bポリペプチドの溶液を通常含む。種々の水性担体、たとえば、緩衝生理食塩水、その他同様なものが使用できる。これらの溶液は無菌であり、および通常好ましくないものを含まない。組成物は、通常の良く知られた無菌化技術により無菌化されるであろう。
静脈内投与用の典型的製薬組成物は、当業者により容易に決定できる。投与量は、明らかに蛋白質特異的であり、ならびにその力価および薬物動態の概要に依存する。非経口投与組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知または明白であり、およびRemington’s Pharmaceutical Science, 18版、Mack Publishing Company, Easton, PA, (1990)のような出版物に、より詳細に記載されている。
【００８６】
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドまたはそのカクテル(すなわち、他の蛋白質との)を含む組成物は、治療処理において投与できる。治療的使用において、組成物は、治癒にまたは少なくとも疾患を部分的に阻止するのに、十分な量で、MSを患う患者に対して投与される。これを達成するために適切な量は、「治療的有効用量」として定義される。この使用のための有効量は、病気の重度および患者の健康の一般的状態に依存する。
【００８７】
該組成物の単回または複数回投与は、患者により必要とされおよび耐えられる如き用量および頻度に従い投与されるであろう。いずれにせよ、該組成物は、患者を効果的に治療するために本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの十分量を提供する。通常、投与の意図した様式に従い、製薬的に受容できる組成物は、約1から約99重量%の本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド、および99から1重量%の適切な製薬添加物または担体を含む。好ましくは該組成物は、約5から75重量%の本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドと、残りは適切な製薬添加物または担体である。
【００８８】
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドまたはその製薬的に受容できる組成物は、用いられた特定の改良IFN-β-1bポリペプチドの比活性；改良IFN-β-1bポリペプチドの代謝安定性および作用の長さ；患者の年齢、体重、一般的健康、性、食事；投与の様式および時間；排泄速度；薬の組合せ；特定の疾病状態の重度；および宿主の受けている治療を含む種々の因子により異なる治療的有効量で投与される。通常治療に有効な日用量は、1日当たり体重１kg当たり約0.14mgから約14.3mgの本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド、好ましくは、約0.7mgから約10mg/kg/日；および最も好ましくは、約1.4mgから約7.2mg/kg/日である。たとえば、70kgの人に対する投与のための用量範囲は、1日当たり約10mgから約1gの本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド、好ましくは、約50mgから約700mg/日；および最も好ましくは、約100mgから約500mg/日である。
【００８９】
治療の適応症
IFN-βの二つの型、IFN-β-1aおよび IFN-β-1b、は、再発性、緩和性MSの治療用に承認されている（Vartanian, T. (2203) supra）。IFN-βはまた性器いぼの治療にも使用される。本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、上記病気、疾患、または状態に有効であり、および2次進行性MS、1次進行性MS、および進行性再発性MSを含む他の型のMSの治療にも有効である。有効であるにより、改良IFN-β-1bポリペプチドは、MSの様な病気の治療、たとえば病気を予防するため、またはより重度の状態への病気の進行を防止するため、あるいは病気の症状もしくは予後を改善もしくは減少するために有効である。
【００９０】
好ましい具体例
発明の要約において上述の如く、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドの内、幾つかの群の改良IFN-β-1bポリペプチドが特に好ましい。
1具体例において、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β組成物のそれよりも少なくとも2倍大きな比活性を有する。
好ましい具体例において、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β組成物のそれよりも少なくとも4倍大きな比活性を有する。
より好ましい具体例において、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β組成物のそれよりも少なくとも6倍大きな比活性を有する。
【００９１】
より好ましい具体例において、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β組成物のそれよりも少なくとも8倍大きな比活性を有する。
より好ましい具体例において、本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドは、参照IFN-β組成物のそれよりも少なくとも10倍大きな比活性を有する。
以下の特定の例は、本発明の実施を助けるためのガイドとして提供されており、および発明の範囲に制限を意図するものではない。
【実施例】
【００９２】
例１. インビトロでのIFN-β-1aおよび IFN-β-1b活性の比較
組換えヒトIFN-β-1aは、長さ166のアミノ酸で、CHO細胞に発現したN結合グリコシル化ポリペプチド(“IFN-β-1a”)である。対照的に、組換えヒトIFN-β-1bは、長さ165のアミノ酸で、大腸菌に発現した非グリコシル化ポリペプチド(“IFN-β-1b”)である。IFN-β-1a中のN末端メチオニン残基は、IFN-β-1bに検出される。それゆえ、IFN-β-1b中のN末端アミノ酸はSer2である。さらに、IFN-β-1bは、Ser17により置換されたCys17を有する。図1に(A) IFN-β-1aおよび(B) IFN-β-1bのアミノ酸配列を示す。IFN-β-1aの比活性は、2〜3 x 108IU/mgであり、一方IFN-β-1bの比活性は、2〜3 x 107IU/mgである。IFN-β-1aと IFN-β-1bの間の比活性における観測された違いに対する、N末端Met、Cys17のSer17での置換、Asn80へのN結合グリコシレーションの不在、および精製中のSDSへの暴露の相対的寄与を検討した。
【００９３】
IFN-β-1a（Dr. Rentschler Biotechnologie GmbHから入手）を、EP 0529300に記載の免疫親和性クロマトグラフィーカラムおよび手順を用いて、親和性クロマトグラフィーにより精製した。そのCys17をSer17で置換したIFN-β-1a Ser17を、標準組換えDNA技術を用いて構築し（Mark, D.F. et al. (1984) supra および米国特許No.4,588,585参照）、CHO細胞に発現し、および次にIFN-β-1aに対し記載の如く親和性クロマトグラフィーにより精製した。N末端アミノ酸配列分析を、標準推薦プロトコールに従い、HP G1005A蛋白質シークエンサーで実施した。
【００９４】
IFN-β-1aのN末端アミノ酸残基は、期待された如くMet1であった、一方IFN-β-1a Ser17分子の80%超のN末端アミノ酸残基は、IFN-β-1bに類似のSer2であった。N末端Met1の結合損失およびCys17のSer17による置換の効果を、IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法の下に記載の如く、MxA遺伝子誘導分析法で評価した。図2Aに示す如く、IFN標準として再構成したIFN-β-1b/Betaseron（商標）の製品標識比活性を用いて、IFN-β-1aの比活性は1.45〜3.22 x 108IU/mgであり、一方IFN-β-1a Ser17の比活性は1.3〜2.4 x 108IU/mgである。
【００９５】
IFN-β-1a Ser17を、非還元（1%SDS;0.5%NP-40;および100 mM Tris-HCl、pH7.6）および還元（1%SDS;0.5%NP-40;100 mM Tris-HCl、pH7.6；140 mMβ-メルカプトエタノール;および〜10分間沸騰後室温に冷却）条件下で脱グリコシル化した。非還元および還元IFN-β-1a Ser17を一晩(18時間)ペプチドNグリコシダーゼF(“PNGase F”)と培養した。還元、脱グリコシル化IFN-β-1a Ser17を空気中で18時間迄自然に再酸化した。IFN-β-1a Ser17の完全な脱グリコシレーションを、還元およびアルキル化を行っておよび行わずに、移動標準としてIFN-β-1bを用いてウエスタンブロット分析で確認した。
【００９６】
MxA遺伝子誘導分析法を用い、図2Bに示した如く、IFN-β-1a Ser17の比活性は、一晩の培養のみでは有害な影響は受けなかった。強い変性剤SDSの存在下でのIFN-β-1a Ser17の還元と自然的再酸化により、比活性は〜20%減少した。非還元または還元条件下でのIFN-β-1a Ser17のPNGase F仲介脱グリコシレーションにより、比活性は30〜35%減少した。
要約すると、N末端Met1の結合損失およびCys17のSer17での置換も強い変性剤SDSの不在下または存在下でのAsn80での脱グリコシレーションのいずれも、IFN-β-1bに比較して〜10倍大きいIFN-β-1aの比活性を説明しない。
【００９７】
例２. インビトロにおけるIFN-β-1bのガングリオシド仲介阻害
部分的に精製した線維芽細胞IFN-β調製品を用いる実験により、ガングリオシドはインビトロで天然のIFN-βの抗ウイルス活性を阻害することが示された(Gupta, S.L. et al. (1984) supra; およびFuse, A. et. al. (1982) supra) 。 インビトロでIFN-β-1bの生物活性へのガングリオシドの影響を検討した。IFN-β-1bは米国特許No.5.814,485の記載の如く調製した。
【００９８】
種々のガングリオシドが人の血清または血漿に存在する。たとえば、Kundu, S.K. et. al. (1985) Arch. Biochem. Biophys. 238:388-400;およびSenn, H.J. et. al. (1989) supra参照。図3は、GM3（N-アセチルアミノシル）ガラクトシルグルコシルセラミド）から出発するガングリオシドの生成に関与する経路を示す。
【００９９】
増量するガングリオシドGM3、GM2、GM1、GD1a、GD3、GD1b、およびGT1b、の存在下、IFN-β-1bを、IFN-β-1bポリペプチドの比活性を測定するための分析法の下に記載の如く、MxA遺伝子誘導分析法で試験した。図3に示す如く、低ミクロモル濃度（μM）領域で数種のこれらのガングリオシドは、MxA遺伝子を誘導するためにIFN-β-1bの能力を50%阻害できた。通常、より強い阻害活性を有するガングリオシドは、より複雑な複合体構造を有するものである。
【０１００】
例３. IFN-β-1b調製における炭水化物の存在
米国特許No.4,588,585に記載の如く、組換えヒトIFN-β-1b/Betaseron（商標）は、米国特許No.5.814,485に記載の手順に従って大腸菌で産生される。再調査のためには、Lin, L. (1998) supra参照。製剤に先立ちIFN-β-1b精製の最終工程は、ビーズ状、架橋デキストランゲル濾過媒体であるSephadex G-75でのカラムクロマトグラフィーである。G-75貯留物質を、米国特許No.5,814,485に記載の如く、精製IFN-β-1bの調製における炭水化物の存在を調べるためにここで用いた。2ロットのIFN-β-1bの単糖類含有量を試験した。
【０１０１】
IFN-β-1b G-75貯留物質におけるオリゴ糖の単糖類成分
IFN-β-1bを6M HClまたは2M TFAで、100℃で1時間加水分解し、speed vac下で乾燥し、および水で再調製した。単糖類成分分析を、Carbopack PA-1陰イオン交換カラムおよびCarbopackガードカラムを用いて、Dionex Glycostation (Dionex, Inc.)上でパルス電気化学検出法との組合せで高性能陰イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。Glycostationは、フコース、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、グルコース、そうしてマンノースの混合物で較正した。単糖類は、定組成的に溶離した(16 mM NaOH)、およびカラムは、オリゴ糖および他の吸着陰イオン種を溶離するために200 mM NaOHで洗浄した。
【０１０２】
6M HCl酸加水分解を用いた時、6個の全ての単糖類がIFN-β-1bのロットAに存在し、およびフコース、ガラクトース、およびマンノースがIFN-β-1bのロットBに存在した（図4A）。IFN-β-1bに対する全単糖類の分子比は、ロットAおよびBで、夫々0.58および0.05であった。酸加水分解は完全ではなく、幾つかの単糖類は酸加水分解中に劣化するので、これらの比は、IFN-β-1b中の炭水化物含有量の推定値の下限であると考えられる。Beeley, J.G. in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier, New York, N.Y. (1985)参照。
【０１０３】
2M TFA酸加水分解を用いて、フコース、N-アセチルガラクトサミン、グルコース、およびマンノースはIFN-β-1bのロットAに存在し、およびフコース、N-アセチルグルコサミン、およびガラクトースはIFN-β-1bのロットBに存在した（図4A）。IFN-β-1bに対する全単糖類の分子比は、ロットAおよびBで、夫々0.09および0.08であった。この結果は、TFAでの酸加水分解はHClでのより緩やかであるという公表データと一致する(Beeley, J.g. (1985) supra)。
二つの可能な炭水化物源の内、IFN-β-1bロット中のグルコースの存在は、精製操作で使用したSephacryl S-200およびSephadex G-75デキストランベースのカラムから溶脱したレジンで最も良く説明される。対照的に、非グルコース残渣は、多分宿主大腸菌からのものと思われる。
【０１０４】
蛋白質-オリゴ糖相互作用および分離
IFN-β-1b蛋白質-炭水化物相互作用をカラムクロマトグラフィーで調べた。IFN-β-1bのロットAを、水、アセトニトリル、およびTFA溶媒系でVydac C4カラムを用い逆相高圧液クロマトグラフィー(RP-HPLC)によりさらに精製した。クロマトグラフィー後、IFN-β-1bを6M HCl中で加水分解し、および単糖類分析を上述の如く実施した。図4Bは、RP-HPLCがIFN-β-1bロットAから炭水化物を除去しないことを示している。同定された単糖類の分布は、しかしながら、多分使用した溶媒が異なるために変化した（RP-HPLCにおけるアセトニトリル/TFAに対して、G-75貯留において0.1%SDS中50Mm酢酸ナトリウム）。
【０１０５】
あるいは、IFN-β-1bロットAを、NAP 10およびSephadex G-25サイズ排除カラム上で、移動相に5 mM HClおよび1.5 mM NaOHを夫々使って、さらに精製した。図4Bは、RP-HPLCに対しては同定された単糖類の分布は変化したが、NAP 10も G-25サイズ排除クロマトグラフィーも何れもIFN-β-1bロットAから炭水化物を除去しなかったことを示している。各クロマトグラフィー系に対して溶媒が異なり、またオリゴ糖加水分解の程度も各例で異なるので、定量的情報の取扱いには注意が必要である。
【０１０６】
IFN-β-1bロットAはまた、Pharmacia FPLC溶媒送達およびUV検出システムを用いて、Concanavalin A(“Con A”) Sepharose カラムクロマトグラフィーによりさらに精製された。Con A Sepharoseカラムは、Buffer A（20 mM Tris-HCl、pH 7.4; 500 mM NaCl、1 mM CaCl2および1 mM MnCl2）で平衡させ、5 mg IFN-β-1bロットAを装填し、次にBuffer Aで再平衡し、十分に洗浄した。溶出を、Buffer AおよびBuffer B(Buffer A  + 500 mM α-メチル-D-マンノースピラノシド)の間で連続勾配により実施した。傾斜分画物試料を、水に対して透析し、speed vacで乾燥し、0.1% SDS中の50 mM 酢酸ナトリウムで再調製または6 M HClで再調整し、上述の如く単糖類分析にかけた。
【０１０７】
図4Bは、Con A SepharoseカラムからのIFN-β-1b（分画5）ピークがカラムから溶脱するグルコースおよびマンノースを含むことを示している。Con A Sepharoseカラムは、IFN-β-1bロットA材料からアミノ糖を効率的に除去した。IFN-β-1b出発材料に存在する大部分のオリゴ糖は、Con A Sepharoseカラムクロマトグラフィーにより除去され、IFN-β-1b蛋白質-炭水化物相互作用は主として、完全ではないにしても、非共有的であることを示唆している。
【０１０８】
Con A SepharoseカラムからのIFN-β-1bピーク（分画5）を、次に抗ウイルス活性に対して試験した。VSVで感染したヒト羊膜細胞系WISH中のI型IFNsによるウイルスプラークの減少を分析するWISH CPE分析法を用いて、比活性は3.6 x 107IU/mgであった。この比活性は、少なくともIFN-β-1b出発材料のそれに類似であり、IFN-β-1b調製品からの炭水化物の除去が有益であろうことを示唆している。
【０１０９】
レクチン結合によるオリゴ糖の特性決定
最後に、IFN-β-1bロットAをVector研究所からのビオチン化レクチンに対する結合を試験した。6個の試験レクチン、Con A、Datura Stramonium レクチン  (“DSL”)、Jacalin、大豆凝集素  (“SBA”)、Maackia Amurensis レクチン II (“MAL II”)およびDolichos Bifluorus 凝集素 (“DBA”)中、DSLのみが、ニトロセルロース上にドットブロットしたIFN-β-1bと反応しなかった。この結果は、上述単糖類成分分析と一致している。IFN-β-1bロットA材料からの炭水化物の効果的除去と一致して、IFN-β-1bピーク（分画５）は最早SBAと反応しなかった。
【０１１０】
結論として、IFN-β-1b調製品は、完全ではないが、主として非共有的に精製IFN-β-1bに結合しているオリゴ糖の形の検出容易な炭水化物を含む。炭水化物の量および品質は、IFN-β-1b調製品の間で異なるようである。炭水化物源は、宿主大腸菌産生株であり、精製操作そのものではない。炭水化物はCon A Sepharoseカラムクロマトグラフィーにより大部分除去でき、およびその除去は悪影響を及ぼさず、ならびにIFN-β-1bの生物活性に多分有利であろう。
【０１１１】
例４. インビトロでの酸化IFN-β-1bの生物活性
米国特許No.5,814,485に記載の如く、発現および精製されたIFN-β-1bを、改良IFN-β-1bポリペプチドの酸化方法に記載の如く、種々の実験条件下で酸化剤過沃素酸ナトリウムで処理する。酸化IFN-β-1bの比活性をIFN-β-1bポリペプチド比活性の測定するための分析法に記載の如く、インビトロでMxA遺伝子誘導分析法を用いて測定した。その生物活性に不利益に作用することなく過沃素酸ナトリウムで酸化された3例の組換え哺乳動物サイトカインは、IL-8、G-CSF、およびIL-1αを含む(Geogehegan, K.F. and Stroh, J.G. (1992) supraおよびGaertner, H.F. and Offord, R.E. (1996) supra)。
【０１１２】
酸化後、米国特許No.5,814,485に記載の如く、IFN-β-1bを、カラムクロマトグラフィー、たとえばSephadex G-75サイズ排除カラムで再精製した。酸化IFN-β-1b調製品からの炭水化物の除去を、例3に記載の如く、6M HClで加水分解後、その単糖類の分析により評価した。次に酸化IFN-β-1b調製品比活性を、MxA遺伝子誘導分析法を用いて測定した。
このインビトロ分析において、酸化IFN-β-1bは、IFN-β-1bと同じ生体機能を定量的に示す。この様に酸化された時に、酸化IFN-β-1bの比活性は、IFN-β-1bに比較して、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも4倍、より好ましくは少なくとも6倍、およびさらにより好ましくは少なくとも10倍増加する。
【０１１３】
例５. インビボでの酸化IFN-β-1bの生物活性
げっ歯類における実験的アレルギー性脳脊髄炎(“EAE”)は、MSに対するモデルとして広く使用されている。たとえば、Swanborg, G.(1995) Clin. Immunol. Immunopathol. 77:4-13;およびMartin, R. and McFarland, H. (1996) Springer Semin. Immunopathol. 18:1-24参照。IFN-β-1bは、これら関連するMSモデルにおいてインビボ有効性を示す。これらのモデルを用いて、本発明の酸化IFN-β-1bは、米国特許No.5,814,485に記載の如く、発現および精製されるIFN-β-1bと同じ生物活性を定量的に示す。
【０１１４】
SJLマウスにおける受動伝達実験的アレルギー性脳脊髄炎
動物および材料：8週齢雌SJLマウス(Jackson Laboratories)； L-グルタミンおよび0.1ミクロンで濾過をした(Life Technologies) 25 mMのHEPES (1X)と共にRPMI 1640；定義ずみFBS（熱で不活性化したHyclone）；10 mMのMEM非必須アミノ酸溶液(100X) (Life Technologies)；D-PBS(Life Technologies)中5.5 x 10-2 Mの2-β-メルカプトエタノール(1000X)；10,000 U/μg/ml (Bio-Whittaker)のペニシリン/ストレプトマイシン(“Pen/Strep”)；0.1ミクロンで濾過をした(Life Technologies) Hank’s Balanced Salt Solution(1X)。
【０１１５】
8週齢雌SJLマウスに、200μgの結核菌H37Ra（すり潰した）と共に完全フロインドの補助物質(“CFA”)中150μgのプロテオリピド蛋白質(“PLP”)含有0.1 ml皮下注射(尾の付け根および上背部に分割して)にて免疫性を与える。11日後、身体中心部、上腕部、および鼠径部のリンパ節細胞をマウスから摘出し、下記の媒体中にて6x106 細胞/mlで培養する（(L-グルタミンとHEPESと共に)450 ml  RPMI 1640に）50 ml FBS、0.455 mlの2β-メルカプトエタノール、5.0 mlペニシリン/ストレプトマイシン、および5.0 ml非必須アミノ酸を添加)。最終濃度50μg/mlを得るために、PLPを細胞に添加する。
【０１１６】
細胞を37℃、7% CO2で72時間培養する。細胞を採取し、HBSSで2回洗浄する。リンパ節細胞の増殖力をTrypan Blue排除により評価する。リンパ節細胞の濃度を4x107 細胞/mlに調節する。2x107のリンパ節細胞を、未投薬の8週齢雌SJLマウスに、マウス当たり(用量＝0.5 ml)で腹腔内投与する。マウスの体重計測と評点付けを毎日する。IFN-β-1bおよび酸化IFN-β-1bでの処理は、必要に応じて投与される。臨床評価（EAE評点/症状）：0/正常；1/尾部リンパ；2/復元困難；3/片または両側後肢の不完全麻痺；4/片または両後肢の完全麻痺；5/不動、瀕死または死。
【０１１７】
Lewisラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎
動物および材料：8週齢で免疫化した雌Lewisラット(Charles River)；脊髄ホモジネート調製品（雄Hartleyモルモット、Simonsen Labs）：500〜700gのモルモットをCO2で安楽死させる。椎骨切断のために鋭利骨鋏を用いて、脊髄を除去し、生理食塩水でリンスし、1度ブロットし、-80℃で使用日まで保存する。次に脊髄を秤量し、1g/mlの生理食塩水で均一化する；抗原乳濁液；モルモット脊髄ホモジネートを1g/mlの結核菌（乳鉢と乳棒ですりつぶした）を有するCFA (Difco)と共に1:1で混合する。0.05 mlを各後肢足蹠に、ラット当たり全量で0.1 mlで注入する。
【０１１８】
8週齢雌SJLマウスを、第1日に単一大量注入で免疫化する。毎日ラットの体重をはかり、評点を付ける。IFN-β-1bおよびIFN-β-1bでの処理は、必要に応じて投与する。臨床評価（EAE評点/症状）：0/正常；1/尾部；2/片または両側後肢の不完全麻痺；3/片または両側後肢の完全麻痺は、動くが身体の動きを助けない；4/両後肢の完全麻痺；5/後肢の完全麻痺、片または両側前肢の脱力感、瀕死または死。
これらのインビボ分析において、酸化IFN-β-1bは定量的にIFN-β-1bと同じ生体機能を示す。この様に酸化した時に、酸化IFN-β-1bの比活性は、IFN-β-1bに比較して、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも4倍、より好ましくは少なくとも6倍、およびさらにより好ましくは少なくとも10倍増加する。
【０１１９】
例６.
本例は経口投与のための代表的製薬組成物は、本発明の改良IFN-β-1b組成物またはその製薬的に受容できる塩を含むことを示す：
A.   処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド        20.0%
ラクトース                               79.5%
ステアリン酸マグネシウム                  0.5%
上記処方成分を混合し、各100mgを含有する硬殻ゼラチンカプセルに調剤する、1カプセルは全日用量にほぼ近い。
【０１２０】
B．  処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド        20.0%
ステアリン酸マグネシウム                  0.9%
澱粉                                      8.6%
ラクトース                               69.6%
PVP（ポリビニルピロリドン）               0.9%
ステアリン酸マグネシウムを除いた上記処方成分を、顆粒液として水を用いて混合し、顆粒化する。処方を次に乾燥し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、適切な打錠機で錠剤に成型する。
【０１２１】
C．  処方成分 
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド         0.1g 
プロピレングリコール                     20.0g
ポリエチレングリコール400                20.0g
ポリソルベート 80                         1.0g
水                                  適量100 mL
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドをプロピレングリコール、ポリエチレングリコール400およびポリソルベート80に溶解する。十分量の水を撹拌しながら添加し、100mLの溶液とし、これを濾過，瓶詰めする。
【０１２２】
D．  処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド           20.0%
ピーナツ油                                  78.0%
Span 60                                      2.0%
上記処方成分を融解し、混合し、軟弾性カプセルに充填する。
【０１２３】
E．  処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド            1.0%
メチルまたはカルボキシメチルセルロース       2.0%
0.9%生理食塩水                              適量100 mL
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドをセルロース/生理食塩水に溶解し、濾過し、使用のために瓶詰めする。
【０１２４】
例７.
本例は、本発明の改良IFN-β-1bまたはその製薬的に受容できる塩を含む非経口投与のための代表的製薬処方の調製を説明する：
処方成分 
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド           0.02g
プロピレングリコール                       20.0g
ポリエチレングリコール400                  20.0g
ポリソルベート  80                          1.0g
0.9%生理食塩水                            適量100 mL
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチドをプロピレングリコール、ポリエチレングリコール400およびポリソルベート  80に溶解する。十分量の生理食塩水を撹拌しながら添加して、100mLの静脈注射液とし、0.2μm膜フィルターで濾過し，無菌条件下で包装する。
【０１２５】
例８.
本例は、本発明の改良IFN-β-1bまたはその製薬的に受容できる塩を含む座薬型での代表的製薬組成物の調製を説明する：
処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド             1.0%
ポリエチレングリコール 1000                  74.5%
ポリエチレングリコール 4000                  24.5%
処方成分を一緒に融解し、水蒸気浴上で混合し、全量2.5gを含む型に注ぐ。
【０１２６】
例９.
本例は、本発明の改良IFN-β-1bまたはその製薬的に受容できる塩を含む吸入剤の代表的製薬処方の調製を説明する：
処方成分 % wt./wt.
微粉化本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド    1.0%
微粉化ラクトース                          99.0%
処方成分を粉砕、混合し、投与ポンプを備えた吸入器に詰める。
【０１２７】
例10.
本例は、本発明の改良IFN-β-1bまたはその製薬的に受容できる塩を含む噴霧型での代表的製薬処方の調製を説明する：
処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド        0.005%
水                                      89.995%
エタノール                              10.000%
本発明の改良IFN-β-1bをエタノールに溶解し、水と調合する。処方を、次に投与ポンプを備えた噴霧器に詰める。
【０１２８】
例11.
本例は、本発明の改良IFN-β-1bまたはその製薬的に受容できる塩を含むエアロゾル型での代表的製薬処方の調製を説明する：
処方成分 % wt./wt.
本発明の改良IFN-β-1bポリペプチド            0.1%
推薬  11/12                                 98.90%
オレイン酸                                   1.0%
本発明の改良IFN-β-1bをオレイン酸と推薬中に分散する。次に生成混合物を計量バルブ付の噴霧器に注ぐ。
【０１２９】
本発明は、その特定の具体例に関して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から離れることなく、種々の変更を行えるであろうし、および等価物は置換されるであろう。さらに、本発明の目的、精神、適用範囲に特定の状態、材料、材料の組成、プロセス、プロセス工程を適応するために多くの修正を行えるであろう。全てのそのような修正はここに付加した特許請求の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、IFN-β-1a (配列番号：１)およびIFN-β-1b (配列番号：２)のアミノ酸配列を示す。IFN-β-1aのポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および構造は、たとえば、Innis, M.A. and McCormick, F. (1986) Meth. Enzymol. 119:397-403および米国特許No. 4,966,843に記載されている。IFN-β-1bのポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および構造は、たとえば、Mark, D.F. et al. (1984) supraおよび米国特許No.4,588,585に記載されている。IFN-β-1bが大腸菌で処理され、N末端メチオニンが除去される時に、それはN末端にSer2を有する長さ165のアミノ酸である。
【図２】図１は、インビトロでのIFN-β-1aの生物活性に対するN末端Met1、Ser17によるCys17置換、N結合グリコシレーション、およびSDSの影響を示す。(A) Cys17がSer17により置換されているIFN-β-1aおよびIFN-β-1aSER17は、例1に記載の如くCHO細胞に発現され、親和クロマトグラフィーにより精製され、MxA遺伝子誘導分析にて試験された。(B)還元および非還元IFN-β-1aSER17は、ペプチドN-グリコシダーゼF(“PNGaseF”)で脱グリコシレート化され、およびMxA遺伝子誘導分析で試験された。
【図３】図３は、インビトロでのIFN-β-1bの生物活性に対するガングリオシドの影響を示す。IFN-β-1bを、種々の濃度の指示されたガングリオシドに暴露し、次に例2に記載の如く、インビトロでMxA遺伝子誘導分析で試験された。GM3から出発する種々のガングリオシドの生成経路を指示する。
【図４】図４は、IFN-β-1b調製における炭水化物の存在を示す。(A)精製前および(B) さらなる精製後の2ロットのIFN-β-1bの単糖類含有量を分析した。(A) IFN-β-1bのロットAおよびBを、例3に記載の如く、6M HClまたは2M ＴFA中で酸加水分解をした後、6種類の単糖類の存在を分析した。(B) IFN-β-1bのロットAを、指示された如くRP-HPLC、NAP 10、Sephadex G-25、またはCon A Sepharoseカラムクロマトグラフィーによりさらに精製し、次に6種類の単糖類の存在を分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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