(57)【要約】【課題】ヒト個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法の提供。【解決手段】本方法は、生体試料から取得した淋菌ｐｏｒＡ核酸断片を検出する。本方法は、生体試料を、配列番号１及び配列番号２に従う各ヌクレオチド配列を有するプライマーを用いる核酸配列増幅に供して、それによりｐｏｒＡ淋菌増幅産物を生成することを含む。増幅産物は、ドナーフルオロフォアを有する配列番号３及びアクセプターフルオロフォアを有する配列番号４に従う各ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、蛍光共鳴エネルギー転移によって検出される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法であって、該方法は、該個体から取得した生体試料中に存在する場合に、淋菌の単離ｐｏｒＡ核酸を検出する工程を含み、該ｐｏｒＡ核酸の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示す、方法。
【請求項２】
該方法が、淋菌の該単離ｐｏｒＡ核酸を、該生体試料中に存在する別のナイセリア種のｐｏｒＡ核と識別する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該別のナイセリア種が髄膜炎菌である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
淋菌の該単離ｐｏｒＡ核酸の増幅を促進する条件下において、生体試料を核酸配列増幅に供して、増幅産物を生成する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
増幅産物が淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子の断片に対応する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
核酸配列増幅が、配列番号１及び配列番号２からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する１個以上のＰＣＲプライマーを用いて行われる、請求項４記載の方法。
【請求項７】
該増幅産物をプローブハイブリダイゼーションによって検出する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
プローブが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
プローブが、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該増幅産物の検出が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて行われる、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ヒト個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定する方法であって、次の工程を含む該方法：
（ｉ）該ヒト個体から取得した生体試料中に存在する場合に、配列番号１及び配列番号２記載の各ヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、該生体試料を核酸配列増幅に供して、淋菌ｐｏｒＡ核酸からのｐｏｒＡ淋菌増幅産物を生成すること；及び
（ｉｉ）存在する場合に、ドナーフルオロフォアを有する配列番号３及びアクセプターフルオロフォアを有する配列番号４記載の各ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、プローブハイブリダイゼーション及び蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって該増幅産物を検出し、それにより該ｐｏｒＡ増幅産物の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示すこと。
【請求項１２】
淋菌のｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように、該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得るが、別のナイセリア種のｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得ない、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
該別のナイセリア種が髄膜炎菌である、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
淋菌のｐｏｒＡ核酸を検出するためのキットであって、該キットは、請求項１２記載の１個以上のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は１個以上の検出試薬と共に含む、キット。
【請求項１７】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
淋菌ｐｏｒＡ核酸の増幅を促進する１個以上のプライマーをさらに含む、請求項１６記載のキット。
【請求項２０】
１個以上のプライマーが、配列番号１及び配列番号２からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
基板に固定化されているか、カップリングしているか、結合しているか、含浸されているか、又はそれら以外で連結している、請求項１２記載の１個以上のオリゴヌクレオチドを含む、核酸アレイ。
【請求項２２】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項２１記載の核酸アレイ。
【請求項２３】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項２２記載の核酸アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細菌の淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の検出、より詳細には細菌の核酸の検出に関する。詳細には、本発明は、典型的には臨床診断を目的として、細菌が個体から取得した生体試料中に存在しているかを決定するための、淋菌のｐｏｒＡ遺伝子の増幅断片の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
淋菌は、グラム陰性の双球菌属の細菌性病原体であり、淋病として知られている性感染症（ＳＴＤ）の原因生物である。淋病は西暦１５０年にＧａｌｅｎによって最初に記述された古代の疾患であるが、それは現在もヒトの主なＳＴＤである。淋菌の感染を検出及び治療することに失敗すると、疾患が、心臓、関節、髄膜、眼及び咽頭に影響を及ぼす重篤な全身感染に進展することを許容し得る。従って、初期の確定診断は、疾患の治療を補助し、この細菌性感染の結果として生じ得る重篤な合併症を予防することができる。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、淋菌の慣用的な検出のえり抜きの方法ではあるが、ＰＣＲには制約があり、依然として細菌単離が確定診断についての中心的な標準である。これは大きくは、淋菌が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含む他のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種と高い配列相同性を共有し、その上多くの非保存配列を含むからである（非特許文献１）。従って、ＰＣＲを淋菌の慣用的な検出に用いる場合には、偽陽性及び偽陰性の結果の両方を生じる可能性がある。両方の状況において、その結果は、重大になり得る。公衆衛生の観点から、偽陰性の結果は、疾患の無制限な拡大を許容し得る一方で、偽陽性の結果は、患者にかなりの社会的な波及を有し得る。
【０００４】
Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ系（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア）は、淋菌の検出のために広く用いられているＰＣＲアッセイである。その魅力は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可もまた保有しつつ、淋菌、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）及び阻害物質の存在を同時に検出するその能力に依拠する。しかしながら、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ系にも制約がある。最も顕著には、その淋菌アッセイは、ナイセリア・サブフラヴァ（Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラヴェセンス（Ｎ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）及びナイセリア・シッカ（Ｎ．ｓｉｃｃａ）を含む、片利共生ナイセリア種の幾つかの株と交叉反応することが知られている（非特許文献１、２）。結果的に、第二のＰＣＲアッセイを用いて、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒの陽性結果を確認する必要がある。それに応じて、臨床実験室は組織内の確認用アッセイを採用していた。
【０００５】
現在までに、組織内の確認用試験について最も一般的な標的は、淋菌の潜在性プラスミド（ｃｐｐＢ）遺伝子であり、幾つかのそのようなプロトコルが記述されている（非特許文献２−５）。特に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒベースのｃｐｐＢ  ＰＣＲ（ｃｐｐＢ−ＬＣ）アッセイはＣｏｂａｓ淋菌陽性検体の確認のために開発されていた（非特許文献４）。しかしながら、ｃｐｐＢ遺伝子を標的とする淋菌アッセイの感度および特異性について、深刻な懸念が現在持ち上がっている。英国及びオーストラリアの両方において実施された研究は、ｃｐｐＢ遺伝子を欠く淋菌単離物を同定した（非特許文献１、６）。従って、この遺伝子を標的とする実験室では、偽陰性の結果のリスクを抱える。その上、ｃｐｐＢ遺伝子は、ナイセリア・シネレアを含む、片利共生ナイセリア株中に存在し得、そのためまた偽陽性の結果を生じ得る（非特許文献１）。
【０００６】
交叉反応は、淋菌性核酸ベースの診断テストについての重大な問題であり、ナイセリア属における遺伝子水平交換がこれらの交叉反応の主な原因である（非特許文献７）。さらに、淋菌性試験は、非無菌部位上で用いられ、他のナイセリア株がそのような部位において頻繁に見出され得る。
【０００７】
ｐｏｒＡ遺伝子のＰＣＲ検出は、この遺伝子が片利共生ナイセリアにおいて欠損しているという推定（非特許文献８）に部分的に起因して、髄膜炎菌の検出のために用いられていた（非特許文献９）。さらに、そのようなアッセイでは、交叉反応（又は交叉反応の可能性）は重大な脅威とはならない。なぜなら、これらの試験は血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む無菌部位上で用いられるためである。
【０００８】
ｐｏｒＡ配列が同定されている唯一の他のナイセリア種は淋菌であり、それは、髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子とかなりの配列類似性のｐｏｒＡ偽遺伝子を有する（非特許文献８）。しかしながら、この偽遺伝子が淋菌の全株中に存在しているかは明確ではなく、また片利共生株におけるその欠損も立証されていない。
【非特許文献１】Ｐａｌｍｅｒら，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１  ８３５−７
【非特許文献２】Ｆａｒｒｅｌｌ，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７  ３８６−９０
【非特許文献３】Ｈｏら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．４５  ４３９−４４２
【非特許文献４】Ｗｈｉｌｅｙら，２００２，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４２  ８５−９
【非特許文献５】Ｔａｂｒｉｚｉら，２００４，Ｓｅｘ．Ｔｒａｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．８０  ６８−７１
【非特許文献６】オタワ：培養物陽性であるが、ＰＣＲ偽陰性の淋菌感染のクラスター，Ｔａｐｓａｌｌら．，要約  ０１２９．性感染症に関する国際学会（ＩＳＳＴＤＲ）の第１５回の隔年会議
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎら，２００２，ＭＭＷＲ Ｒｅｃｏｍｍ．Ｒｅｐ  １８  １−３８
【非特許文献８】Ｆｅａｖｅｒｓ  ＆  Ｍａｉｄｅｎ，１９９８，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０  ６４７−６５６
【非特許文献９】Ｇｌｕｓｔｅｉｎら．，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ４  ２３３−９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子が、淋菌の核酸ベースの検出のための、より詳細には、淋菌と髄膜炎菌との間の識別のための標的としての見込みは少なく、淋菌単離物及び株の間において遍在的に存在し得ないか、又は片利共生株では欠損し得るという事実にもかかわらず、本発明者らは、淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子を標的として用いる、驚くべき感度及び再現性の核酸ベースの検出方法を開発した。
【００１０】
従って、本発明は、個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法を広く対象にし、その方法はｐｏｒＡ偽遺伝子又はそれに由来するｐｏｒＡ核酸を感染の指標として利用する。
【００１１】
本発明はまた、淋菌ｐｏｒＡ遺伝子又はｐｏｒＡ核酸の検出を促進（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ）する１個以上のオリゴヌクレオチドを広く対象にする。
【００１２】
第一の局面では、本発明は、個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法を提供する。該方法は、該個体から取得した生体試料中に存在する場合に、淋菌の単離ｐｏｒＡ核酸を検出する工程を含み、該ｐｏｒＡ核酸の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示す。
【００１３】
好ましくは、本方法は、検出可能なレベルまで該単離ｐｏｒＡ核酸の増幅を促進する条件下において、核酸試料を核酸配列増幅に供する工程を含む。
【００１４】
第二の局面では、本発明は、個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法を提供する。該方法は、該個体から取得した該生体試料中に存在する場合に、淋菌の単離ｐｏｒＡ核酸を、別のナイセリア種のｐｏｒＡ核から選択的に検出または識別する工程を含み、該単離ｐｏｒＡ核酸の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示す。
【００１５】
好ましくは、本方法は、検出可能なレベルまで該単離ｐｏｒＡ核酸の増幅を促進するが、検出可能なレベルまで該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核の増幅を促進しない条件下において、核酸試料を核酸配列増幅に供する工程を含む。
【００１６】
好ましくは、該別のナイセリア種は髄膜炎菌である。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明は、ヒト個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法を提供する。該方法は次の工程を含む：
（ｉ）該ヒト個体から取得した生体試料中に存在する場合に、該生体試料を核酸配列増幅に供して、淋菌ｐｏｒＡ核酸からの増幅産物を選択的に生成すること；及び
（ｉｉ）存在する場合に、プローブハイブリダイゼーションによって該増幅産物を検出し、それにより該ｐｏｒＡ増幅産物の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示すこと。
【００１８】
第三の局面では、本発明は、淋菌のｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように、該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得るが、別のナイセリア種のｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１９】
好ましくは、該別のナイセリア種は髄膜炎菌である。
【００２０】
好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、表１及び図１（配列番号３−９）に示されるようなヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
第四の局面では、本発明は、第三の局面に記載された１個以上のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は１個以上の検出試薬と共に含むキットを提供する。
【００２２】
第五の局面では、本発明は、基板に固定化されているか、カップリングしているか、含浸されているか、又はそれら以外で連結している、第二の局面に記載されたオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを提供する。
【００２３】
当然のことながら、本発明は、淋菌のｐｏｒＡ核酸の検出を促進する方法及びオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２４】
好ましくは、ｐｏｒＡ核酸は淋菌のｐｏｒＡ偽遺伝子の断片に対応する。
【００２５】
より好ましくは、本実施形態によれば、ｐｏｒＡ核酸は、淋菌のｐｏｒＡ偽遺伝子の断片に対応し、この断片が別のナイセリア種のｐｏｒＡ遺伝子又は偽遺伝子の断片と異なるヌクレオチド配列を有する。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、淋菌のｐｏｒＡ核酸は、オリゴヌクレオチドが該ｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるようにアニーリングし得るヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
適切には、該オリゴヌクレオチドは別のナイセリア種のｐｏｒＡ核酸のヌクレオチド配列中に存在しないか、又はそれと異なる１個以上のヌクレオチドを有し、それにより該オリゴヌクレオチドは、該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核酸の検出を促進するのに十分であるように該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得ない。
【００２８】
好ましくは、該別のナイセリア種は髄膜炎菌である。
【００２９】
特に利点がある実施形態では、本発明の方法及びオリゴヌクレオチドは、淋菌の複数の単離物、株、対立遺伝子バリアント又は亜種のそれぞれに存在し得るｐｏｒＡ核酸の検出を促進する。
【００３０】
本明細書を通じて、他に示されていない場合には、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は排他的ではなく包括的に用いられ、それにより述べられた整数又は整数の群は、１個以上の他の述べられていない整数又は整数の群を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、淋菌の核酸ベースの検出を改善することを対象とする。この目的のために、本発明者らは、淋菌ゲノム上の代替ＰＣＲ標的配列、すなわちｐｏｒＡ偽遺伝子を同定した。これは、これまでに淋菌検出の標的として用いられたことがなく、そして現在までに記述されてきた他のＰＣＲアッセイと比較した場合に、淋菌の検出について劇的に改善された臨床感度及び特異性を予想外に提供する。
【００３２】
より詳細には、本発明者らは、淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子を標的とする、新しい淋菌ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）アッセイを開発した。重要なことには、ナイセリアｐｏｒＡ遺伝子は、試験された全ての淋菌試料及び単離物中に存在するが、片利共生ナイセリア種中には欠損していることが示されている。従って、この遺伝子標的の選択は、片利共生ナイセリア種との交叉反応の可能性を除外又は少なくとも減少させる。
【００３３】
淋菌と髄膜炎菌間との間におけるｐｏｒＡ配列中に存在する差異が、淋菌由来ｐｏｒＡ核酸のみの特異的ＰＣＲ増幅及び検出を可能とするオリゴヌクレオチドを開発するために活用されていた。
【００３４】
本発明によって克服された特定の困難性は、ｐｏｒＡ配列のうち少数の小さな区分のみが、特異的な淋菌性アッセイを開発するのに、淋菌と髄膜炎菌間との間で十分な差異を有するということである。増幅プライマーと混入ＤＮＡ、すなわち髄膜炎菌性ｐｏｒＡ  ＤＮＡとの間でミスマッチが少な過ぎると、アッセイが交叉反応を引き起こす。プライマーとそれらの各標的との間でミスマッチが多過ぎると、淋菌性標的ｐｏｒＡ配列のＰＣＲ増幅の増幅効率が減少し得る。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、比較的高濃度（反応あたり約０．５ｇ）の髄膜炎菌性ＤＮＡが混入している場合でさえも、淋菌性ｐｏｒＡ  ＤＮＡに特異的なアッセイになるように十分なミスマッチを有する。
【００３６】
従って、本発明は、生体試料中の淋菌の単離ｐｏｒＡ核酸を検出するための方法、並びに該ｐｏｒＡ核酸の増幅及び／又は検出を促進する１個以上のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３７】
本発明の目的については、「単離」とは、材料がその天然状態から取り出されたか、又はそれ以外であれば、ヒトの操作に供されたことを意味する。単離材料は、その天然状態でそれに通常伴う成分を実質的又は本質的に含まないか、あるいは天然状態でそれに通常伴う成分と一緒の人工状態で操作され得る。単離材料は、ネイティブ、化学的合成又は組換えの形態であり得る。
【００３８】
本明細書中で用いられる場合、「核酸」としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが挙げられ、かつ包含する。ＤＮＡとしては、当技術分野で十分に理解されているように、一本鎖及び二本鎖ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡとしては、一本鎖及び二本鎖の未処理ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡが挙げられる。
【００３９】
当然のことながら、「ｐｏｒＡ核酸」とは、ｐｏｒＡ遺伝子又は偽遺伝子の少なくとも断片又は領域に対応する核酸を意味する。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、「遺伝子」とは、ゲノムの不連続構造単位であり、１個以上のシストロンに典型的に存在するアミノ酸コーディング領域、オペレーター、プロモーター、ターミネーター及び／又は任意の他の調節ヌクレオチド配列などの１個以上のエレメントを含むものである。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、「偽遺伝子」は、既知の機能性遺伝子と類似の配列を有する、ゲノムの不活性な単位、領域又は配列である。典型的には、この配列類似性のために、偽遺伝子は、正常に機能する遺伝子に対して相対的に進化的であると通常考えられている。
【００４２】
淋菌では、ｐｏｒＡは偽遺伝子であるが、髄膜炎菌ｐｏｒＡでは遺伝子である。
【００４３】
本文脈における「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」とは、ｐｏｒＡ核酸が、ｐｏｒＡ偽遺伝子中に存在するヌクレオチド配列を含むか、又はｐｏｒＡ偽遺伝子中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるか、あるいはこれらのいずれかに、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はさらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であることを意味する。
【００４４】
特に好ましい実施形態では、ｐｏｒＡ核酸は、ｐｏｒＡ偽遺伝子の１３２ｂｐ断片に対応する。
【００４５】
特定の局面では、本発明は、１個以上のオリゴヌクレオチド及び／又はｐｏｒＡ核酸の核酸配列増幅及び／又は検出を促進するためにこれを用いる方法を提供する。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」とは、百（１００）以下のヌクレオチド（塩基）又はヌクレオチド対（塩基対）を有する一本又は二本鎖核酸である。「ポリヌクレオチド」は、百（１００）を超えるヌクレオチド又はヌクレオチド対を有する。
【００４７】
核酸配列増幅の特定の文脈では、本発明のオリゴヌクレオチドはプライマーの形態であり得る。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、「プライマー」とは、核酸「鋳型」にハイブリダイズし得、そしてＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又はＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）等の適切なＤＮＡポリメラーゼの作用によって、鋳型依存的な様式で伸長され得る一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００４９】
典型的には、プライマーは、少なくとも１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個又は４０個の連続するヌクレオチド残基を有するが、５０個以下の連続するヌクレオチド残基を有し得る。
【００５０】
当然のことながら、本明細書中で記述されたプライマーは、検出感度及び特異性を最大にするように、選ばれた基準に従って設計されている。
【００５１】
適切には、本発明のプライマーは、別のナイセリア種のｐｏｒＡ核酸のヌクレオチド配列中に存在しないか、又はそれと異なる１個以上のヌクレオチドを有する淋菌のｐｏｒＡ核酸のヌクレオチド配列にアニールし得るように設計され、それにより、該オリゴヌクレオチドは、該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核酸の検出を促進するのに十分であるように該別のナイセリア種の該ｐｏｒＡ核酸にアニールし得ない。
【００５２】
好ましくは、該別のナイセリア種は髄膜炎菌である。
【００５３】
また当然のことながら、本発明は、ナイセリア・サブフラヴァ、ナイセリア・シネレア、ナイセリア・フラヴェセンス、ナイセリア・ラクタミカ及びナイセリア・シッカ等の他の片利共生ナイセリア種がｐｏｒＡ偽遺伝子を有さないという知見に部分的には準拠する。
【００５４】
一つの特に利点がある実施形態では、本発明のプライマーは、淋菌の単離物、株、対立遺伝子バリアント又は亜種の複数のｐｏｒＡ核酸の検出を促進するように設計される。
【００５５】
従って、本発明者らは、淋菌のｐｏｒＡ遺伝子におけるヌクレオチド配列を同定した。これは、この病原性生物の複数の単離物内で保存されており、その配列は、髄膜炎菌のｐｏｒＡ偽遺伝子における各ヌクレオチド配列には存在しないか、又はそれらと十分に異なっている。
【００５６】
これにより、本発明者らは、該別のナイセリア種のｐｏｒＡ核酸の増幅を回避しつつ、又は検出不能なレベルまでその増幅を少なくとも最小にしつつ、淋菌ｐｏｒＡ核酸の特異的、高感度及び広域性の増幅を促進するプライマーを設計することが可能となった。
【００５７】
本発明に従うプライマーの特定の例は、図１及び表１に提供される（配列番号１及び２）。
【００５８】
当然のことながら、図１のプライマー配列（配列番号１及び２）、図１に示される淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号１０）及び対応する公開された髄膜炎菌ｐｏｒＡヌクレオチド配列の比較から、淋菌ｐｏｒＡ配列を選択的に増幅するために必要な特異性を維持しつつ、プライマー配列におけるバリエーションが、容易に達成され得る。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明は、核酸配列増幅によるｐｏｒＡ核酸又はその断片の検出、及びｐｏｒＡ増幅産物の引き続く検出を意図する。
【００６０】
核酸増幅技術は、当業者に周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌら  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＮＹ，１９９５−１９９９）の第１５章に記述されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記述されるような鎖置換増幅（ＳＤＡ）；例えばＬｉｕら，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８  １５８７及び国際出願ＷＯ９２／０１８１３に記述されるような、並びに国際出願ＷＯ９７／１９１９３におけるＬｉｚａｒｄｉらによるローリングサークル複製（ＲＣＲ）：例えばＳｏｏｋｎａｎａｎら，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７  １０７７により記述されるような核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）；例えばＴｙａｇｉら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３  ５３９５により記述されるようなＱ−βレプリカーゼ増幅、並びに国際公開ＷＯ２００４／０２０２５に記述されるようなヘリカーゼ依存性増幅が挙げられる。
【００６１】
上記は核酸配列増幅技術の例であるが、技術の網羅的なリストとして提示してはいない。当業者は、種々の他の適用可能な技術並びに本明細書中に記述された技術に対するバリエーション及び改変を十分に承知している。
【００６２】
例えば、本発明は、「競合的ＰＣＲ」、又はＷｈｉｌｅｙら，２００２（同上）に記載されるような「リアルタイム」ＰＣＲ増幅等の技術などによる核酸配列増幅産物の定量を促進する特定の技術の使用を意図する。
【００６３】
好ましくは、核酸配列増幅技術はＰＣＲである。
【００６４】
本明細書中で用いられる場合、「増幅産物」とは、本明細書中で先に記載されるような核酸配列増幅技術によって作出された核酸である。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、本方法は単一の１３２ｂｐ  ｐｏｒＡ増幅産物を生成する。
【００６６】
本明細書中で用いられる場合、「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」及び「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」とは、当技術分野において周知のように、規定された条件下において相補的又は少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の間の塩基対合を通してハイブリッド核酸を形成することをいう。正常な塩基対合は、相補的な塩基ＡとＴ又はＵとの間、及び塩基ＧとＣとの間の水素結合の形成を通して起こる。また当然のことながら、塩基対合は、プリン（Ｇ及びＡ）並びにピリミジン（Ｃ、Ｔ及びＵ）の種々の誘導体の間でも起こり得る。プリン誘導体としては、イノシン、メチルイノシン及びメチルアデノシンが挙げられる。ピリミジン誘導体としては、チオウリジン等の硫黄含有ピリミジン及びメチルチオシン等のメチル化ピリミジンが挙げられる。核酸ハイブリダイゼーションに一般的に影響する因子の詳細な議論については、当業者は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（同上）の第２章を対象にする。
【００６７】
より具体的には、用語「アニール」及び「アニーリング」は、例えば核酸配列増幅又はジデオキシヌクレオチド配列決定の最中に起こるような、引き続くプライマー伸長反応のための核酸鋳型へのプライマーハイブリダイゼーションの文脈中で用いられる。
【００６８】
ＰＣＲプライマーのアニーリングに影響する因子の議論については、当業者は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＮＹ  １９９５−１９９９）の第１５章を対象にする。
【００６９】
本発明は、生体試料が由来したか、又はそれから取得された個体における淋菌の指標又は存在として、あるいは該個体の過去の淋菌感染の指標として、生体試料中の淋菌のｐｏｒＡ核酸を検出することを提供する。
【００７０】
好ましくは、ｐｏｒＡ核酸増幅産物であり、この増幅産物は当技術分野において十分に理解されているような１個以上の方法により検出される。
【００７１】
増幅産物の検出は、増幅産物にハイブリダイズしたプローブの検出によって、増幅産物のアガロースゲル泳動、ヌクレオチドシーケンシングを介した増幅産物の直接的な可視化によって、又は蛍光標識した増幅産物の検出によって達成され得る。
【００７２】
本明細書中で用いられる場合、「プローブ」は、一本又は二本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであって、それらの一方及び／又は他方の鎖が別の核酸とハイブリダイズし得、それにより「ハイブリッド」核酸を形成するものである。
【００７３】
本発明のプローブ及び／又はプライマーは、当該分野で周知の技術により増幅産物の検出を補助するために、例えばビオチン又はジゴキシゲニンを用いて、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＦＡＭ６、ＨＥＸ、ＲＯＸ又はオレゴングリーン等の蛍光色素又はドナーフルオロフォア、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０等のアクセプターフルオロフォア、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）等の酵素を用いて、あるいは１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ又は３５Ｓ等の放射性核種を用いて標識され得る。
【００７４】
本発明に従うプローブの好ましい実施形態は、図１及び表２（配列番号３−９）に示される各ヌクレオチド配列を有する。
【００７５】
本発明に従うプローブの特に好ましい実施例は、配列番号３及び４に示される各ヌクレオチド配列を有する。
【００７６】
蛍光標識された増幅産物の検出に関しては、これは、本明細書中の先に記載されるような蛍光標識を取り込む１個以上のプライマーを用いて達成され得る。
【００７７】
別の実施形態では、検出は、配列増幅反応において増幅産物にハイブリダイズする、蛍光標識を取り込んでいるプローブを用いた融解曲線解析によって行われ得る。特定の例は、増幅産物が増幅の各サイクルで生成されるのと「リアルタイム」で増幅産物とハイブリダイズさせるための、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブの使用である。
【００７８】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ対は、標的ＤＮＡ上の隣接領域にハイブリダイズするように設計される。各プローブは、異なるマーカー色素で標識される。２つの色素の相互作用は、両方がそれらの標的に結合している場合にしか起こり得ない。典型的には、ドナープローブは、３’末端にてフルオロフォア（例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＦＡＭ６、ＨＥＸ、ＲＯＸ又はオレゴングリーン）で標識され、アクセプタープローブは、その５’末端にてアクセプターフルオロフォア（例えばＬＣ−Ｒｅｄ６４０，ＴＡＭＲＡ又はＱＳＹ色素）で標識される。ＰＣＲの最中に、２個の異なるオリゴヌクレオチドプローブは、標的ＤＮＡの隣接領域にハイブリダイズし、それによりオリゴヌクレオチドにカップリングしたフルオロフォアはハイブリッド構造において密接に近接する。ドナーフルオロフォアは、外部光源によって励起され、次いでその励起エネルギーの一部を隣接するアクセプターフルオロフォアに受け渡す。励起されたアクセプターフルオロフォアは、異なる波長で光を放射し、次いでこの波長が検出及び測定され得る。
【００７９】
なお別の実施形態では、本発明は、融解曲線解析の使用を意図し、それによりエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）又はサイバーグリーンＩ等の核酸インターカレート色素が増幅産物を結合し、そのインターカレートされた複合体による蛍光放射が検出される。
【００８０】
融解曲線解析は、例えばＷｈｉｌｅｙら，２００２（同上）に記載されているように、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）等の装置を用いて有利に行われ得る。
【００８１】
前述を踏まえると、本発明の淋菌検出方法は、淋菌感染を有していたか、又は現在有し得る個体の診断を補助するのに理想的に適している。
【００８２】
淋菌は、主に、ヒトの病原性生物であり、それ故に本発明はヒト個体における淋菌感染の検出を特に対象にする。
【００８３】
適切には、該生体試料は、頸部、尿道、陰茎、肛門、直腸、咽喉、唾液、糞便又は尿の試料であるが、それらに限定されない。
【００８４】
適切には、該生体試料は、細菌あるいはＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得る該細菌由来の核酸を１個以上含む。
【００８５】
好ましくは、該生体試料の取扱いを最小限にするため、ゲノムＤＮＡが、本発明の方法に従って該生体試料から単離される。しかしながら、原則として、ｃＤＮＡは、例えばＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（同上）の第１５章に記載されているように、当該分野で周知のように、単離ＲＮＡを逆転写することによって作出され得る。
【００８６】
特に臨床診断の目的のため、それに限定されないが、本発明は、本発明の第三の局面に従うプライマー対等の１個以上のオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。該キットは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｏｒＡ核酸プローブ、陽性及び／又は陰性核酸対照試料、分子量マーカー、増幅産物の比色検出又は蛍光検出等のための検出試薬などの他の試薬並びに／あるいはマイクロタイタープレート等の反応容器をさらに含み得る。
【００８７】
また当然のことながら、本発明の方法は、単独で、あるいは診断の精度を改善するために、細菌培養試験又は臨床症状に基づいた伝統的診断等の診断の他の形態と組み合わせて用いられ得る。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明は、ヒト個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定する方法を提供する。該方法は次の工程を含む：
（ｉ）該ヒト個体から取得した生体試料中に存在する場合、該生体試料を核酸配列増幅に供して、淋菌ｐｏｒＡ核酸からｐｏｒＡ淋菌増幅産物を選択的に生成すること；及び
（ｉｉ）存在する場合、該増幅産物をプローブハイブリダイゼーションによって検出し、それにより該ｐｏｒＡ増幅産物の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示すこと。
【００８９】
本実施形態の特に好ましい形態によれば、リアルタイムＰＣＲ検出は、隣接ハイブリダイゼーションプローブ形式を用いる蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって、工程（ｉｉ）にて利用される。好ましい上流オリゴヌクレオチドプローブ（ＮＧｐａｐＰ１；表１；配列番号３）は、ドナーフルオロフォア、フルオレセインで３’末端にて標識され、好ましい下流オリゴヌクレオチドプローブ（ＮＧｐａｐＰ２；表１；配列番号４）は、アクセプターフルオロフォア、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０で５’末端にて標識される。プローブＮＧｐａｐＰ２（配列番号４）もまた３’末端にてリン酸化される。  
【００９０】
さらに当然のことながら、本発明は、他の病原性生物の核酸ベースの検出と共同して行われ得る。
【００９１】
この点において、本発明は、他の病原性生物の１個以上の他の核酸が検出され得る、淋菌のｐｏｒＡ核酸の核酸アレイ検出を意図する。
【００９２】
多病原体検出に対するマイクロアレイアプローチのこのタイプの一般的な議論は、Ｂｒｙａｎｔら，２００４，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４  １００に提供されている。
【００９３】
当然のことながら、核酸アレイは、基板に固定化されているか、カップリングしているか、含浸されているか、又はそれら以外で連結している、第二の局面に従うオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００９４】
より一般的には、核酸アレイ技術は、当技術分野で周知となっており、アレイ技術に適用可能な方法の例は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＮＹ  ＵＳＡ  １９９５−２００１）の第２２章に提供されている。
【００９５】
所定の実施形態では、複数の対象物のうちの少なくとも１個の対象物としては、核酸ライブラリのメンバー（例、センス又はアンチセンス鎖）に特異的にハイブリダイズする核酸捕捉プローブが挙げられる。１つの好ましい実施形態では、複数の対象物のうちの対象物サブセットは、核酸ライブラリメンバーに対する核酸捕獲プローブを有する。サブセットの各対象物としては、ライブラリメンバーの異なる領域にハイブリダイズする捕捉プローブを挙げることができる。
【００９６】
本発明に関して、好ましいアレイ形式は、複数のｃＤＮＡ断片が固定化された、規則正しい格子を有するガラススライドを含む。
【００９７】
アレイは、１平方センチメートルあたり少なくとも１０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、又は１０，０００以上の対象物及びそれらの間の範囲の密度を有し得る。基板は、二次元の基板、例えば、ガラススライド、ウエハー（例、シリカ又はプラスチック）、質量分析プレート、あるいは三次元の基板、例えば、ゲルパッドであり得る。
【００９８】
アレイは、例えば、フォトリソグラフィー法（例、米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，５１０，２７０号；及び同第５，５２７，６８１号参照）、機械的方法（例、米国特許第５，３８４，２６１号に記述されるようなダイレクトフロー（ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｆｌｏｗ）法、ピン（ｐｉｎ）ベースの方法（例、米国特許第５，２８８，５１４に記述されるような）、並びにビーズベースの技術（例、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５に記述されるような）の種々の方法で作出され得る。
【００９９】
本発明が容易に理解され、かつ実用化されるために、参照が以下の非限定的な実施例に対してなされる。
【実施例】
【０１００】
（材料及び方法）
患者の検体
性健康診断に参加した患者から合計２８２個の臨床試料（４６個の頸部スワブ（ｓｗａｂ）、１２個の尿道スワブ、２２４個の尿検体）を本研究に用いた。我々の局地集団における淋菌感染の低い発生率を考慮し、試料を、高い割合のＣｏｂａｓ陽性検体を提供するように選択した。
患者は、１７８人の女性及び１０４人の男性を含み、年齢は１３歳から７０歳にわたり、平均年齢２６歳及び年齢中央値２３歳であった。合計２８２個の試料を、ＮＧｐａｐＬＣアッセイによって並びにＲｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイ及びｃｐｐＢ−ＬＣアッセイを組み合わせた試験アルゴリズムによって試験した。このアルゴリズムを用いて、検体を、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ法によって最初に試験した。次いで、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイによって陽性の淋菌結果を提供した任意の試料を、確認のためにｃｐｐＢ−ＬＣアッセイによって試験した。
【０１０１】
Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイ
尿及びスワブ検体を処理し、製造業者の使用説明書に従ってＲｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ系上で試験した。各検体を、淋菌、トラコーマクラミジア及び阻害物質の存在について同時に試験した。結果の解釈を、製造業者によって供給された基準を用いて行った。簡潔には、０．２未満の吸光度を提供する検体を、淋菌について陰性とみなしたのに対し、０．２以上の吸光度の値を提供する検体を、陽性とみなした。
【０１０２】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒアッセイ（ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣ）
カラム抽出を、ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒアッセイの両方について用いた。核酸を、製造業者の使用説明書に従って、各検体０．２ｍｌからＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア）を用いて抽出した。精製検体ＤＮＡを、５０μｌの溶出緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア）中で、カラムから溶出した。ＤＮＡ抽出物を、解析まで−２０℃で保存した。
ＮＧｐａｐＬＣアッセイは、１個のプライマー対、ハイブリダイゼーションプローブ一対を含み、淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子を標的としていた。増幅を、プライマーｐａｐＦ及びｐａｐＲ（表１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，オーストラリア）を用いて行い、それにより反応の最中に１３２ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。リアルタイムＰＣＲ検出を、隣接ハイブリダイゼーションプローブ形式を用いて、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって達成した。上流オリゴヌクレオチドプローブ（ｐａｐＰ１；表１）を、ドナーフルオロフォア、フルオレセインで３’末端にて標識し、下流オリゴヌクレオチドプローブ（ｐａｐＰ２；表１）を、アクセプターフルオロフォア、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０で５’末端にて標識した（ＴＩＢＭＯＬＢＩＯＬ，ドイツ）。プローブｐａｐＰ２もまた、３’末端にてリン酸化した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア）を、反応混合物についての基礎として用いた。これは、各反応キャピラリーにおいて２０μｌの容量を占めていた。簡潔には、キャピラリーに、２μ１のキットＭａｓｔｅｒ試薬（１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア，試薬１）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア，試薬２）、０．４μＭのプライマーｐａｐＦ、０．６μＭのプライマーｐａｐＲ、０．２μＭの各ハイブリダイゼーションプローブ及び５μｌのＤＮＡ抽出物をロードした。各混物を、無菌ＰＣＲグレード水（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア，試薬３）を用いて２０μｌに調整した。各試験のランは、陽性対照物及び５μｌの抽出溶出緩衝液を有する１５μｌの反応混合物からなる３個の無標的対照物を含んでいた。増幅及び検出を、以下のパラメータを用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ソフトウェアバージョン５．３２）上で行った：９５℃にて１０分間の最初の変性工程、続いて９５℃にて１０秒間の変性、５５℃にて１０秒間のプライマー及びプローブアニーリング並びに７２℃にて２０秒間の伸長を５５サイクル。蛍光応答データをアニーリング期の最中に取得し、チャンネル設定Ｆ２／Ｆ１で解析した。融解曲線解析を以下のＰＣＲ増幅を用いて行った。簡潔には、解析を４０℃にて開始し、温度を０．２℃／Ｓの速度にて９５℃まで上昇させた。
ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイを、以前の記述(Ｗｈｉｌｅｙら，２００２，同上)のように行い、ＮＧｐａｐＬＣアッセイのものと類似の条件を利用した。簡潔には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ   Ｐｒｏｂｅｓキット(Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア)を、反応混物の基礎として用いた。各反応キャピラリーは、２０μｌの合計反応容量を含み、淋菌ｃｐｐＢ遺伝子（Ｗｈｉｌｅｙら，２００２，同上）を標的とする２つのプライマー（ＨＯ１＠０．２μＭ及びＨＯ２＠０．４μＭ）並びに２つのハイブリダイゼーションプローブ（各０．２μＭ）を含んでいた。
【０１０３】
検出限界
ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣアッセイの検出限界を、淋菌培養物（ＡＴＣＣ４９２２６）の懸濁液の希釈液を５ｘ１０Ｅ４コロニー形成単位／ｍｌ（ｃｆｕ／ｍｌ）にて試験することによって、決定及び比較した。この懸濁液の１０倍系列の希釈液を抽出し、上記の条件を用いて両方のアッセイによって試験した。各アッセイの検出限界を、陽性反応に帰する最低濃度として決定した。
【０１０４】
ナイセリアパネル
ナイセリア種のパネルを、ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣアッセイの両方によって試験した。このパネルは、６３の非淋菌性ナイセリア単離物を含み、それらを疑陽性の交叉反応を決定するために試験した。種は、ナイセリア属と密接に関連する、髄膜炎菌（３８）、ナイセリア・サブフラヴァ（１２）、ナイセリア・シッカ（６）、ナイセリア・エロンガタ（Ｎ．ｅｌｏｎｇａｔａ）（３）、ナイセリア・ムコサ（Ｎ．ｍｕｃｏｓａ）（１）、ナイセリア・ラクタミカ（３）及びブランハメラ・カタラリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（６）を含んでいた。さらに、各アッセイのプライマー及びプローブ配列の標的が保存されているかを決定するために、８４個の淋菌単離物を試験した。ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイによって陰性であると以前に試験された６個の淋菌単離物が含まれていた。これらの６個の単離物はＲｏｙａｌ  Ｄａｒｗｉｎ病院（ノーザンテリトリー）によって提供された。残りの淋菌単離物を、広く横断的な地区の単離物を保証するため、クイーンズランド州の異なる地理的場所から選択した。核酸を、製造者の使用説明書に従って、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，オーストラリア）を用いて各単離物の培養物から抽出した。各反応には、およそ０．５μｇの細菌性ＤＮＡを加えた。
【０１０５】
非ナイセリアパネル−一般的なヒト病原体及び正常な微生物叢
ＮＧｐａｐＬＣアッセイの特異性をさらに決定するために、一般的なヒト病原体及び標準な微生物叢のさらなるパネルもまた用いた；アシネトバクター・アラニトラトゥス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｒａｎｉｔｒａｔｕｓ）ＡＴＣＣ  １９６０６、アシネトバクター・ボーマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂｅａｕｍａｎｎｉ）ＡＣＭ  ６８６、アシネトバクター・ヘモリティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＣＭ  ６２０、アシネトバクター・ジョンソニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＡＣＭ  ６２１、アシネトバクター・ジュニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｕｎｉｉ）ＡＣＭ  ６１７、アシネトバクター・ルウォルフィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｌｆｉｉ）ＡＣＭ  ６６４、 エロモナス・ハイドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）ＡＴＣＣ  ３５６５４、アルカリゲネス・フェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ３５６５５、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ  ３６４２、短バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ  ３７、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １１７７８、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ  ６１、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ  ２６４、バチルス・ファームス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）ＡＴＣＣ  ３１、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ  ２９５、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  １２７５５９、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）ＡＴＣＣ  ４０１、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ  ２６４０、バチルス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ  ２８、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＡＴＣＣ  ３５、バチルス・プムリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｕｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４３３、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ４５２５、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）ＡＴＣＣ  １１７７４、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ  ４５３、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）ＡＴＣＣ  ８５０３、 バクテロイデス・ジンジヴァリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ３３２７７、バクテロイデス・ヴァルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ）ＡＴＣＣ  ８４８２、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  １０５８０、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＡＴＣＣ  １５２３７、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｕｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＡＴＣＣ  １７７６５、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅ��ｕｎｉ）ＡＴＣＣ  ３３２９１、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ  １４０５３、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）(実験室単離物)、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）(実験室単離物)、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ  ８０９０、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）ＡＴＣＣ  １３８１２、エンテロバクター・アエロゲンス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ  １３０４８、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）(実験室単離物)、エンテロコッカス・デューランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）ＡＴＣＣ  ６５０６、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ２９２１２、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＡＴＣＣ  ３５６６７、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）ＡＴＣＣ  １９４１４、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ  ３５２１８、フラボバクテリウム・インドロゲネス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）(実験室単離物), フラボバクテリウム・マルチボラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｍ）ＡＴＣＣ  ３５６５６、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＡＴＣＣ  １０２１１、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ  １３８８３、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ  ７６４６、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ４９８８、プロテウス・ミラビルス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ  ７００２、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ  ６３８０、プロビデンシア・スチュアーティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）ＡＴＣＣ  ３５０３１、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ  ２７８５３、シュードモナス・ベシキュラリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）(実験室単離物)、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ  ２３６６、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ  １４０２８、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）(実験室単離物)、セラチア・オデイリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｅｒｉｆｅｒａ）ＡＴＣＣ  ３３０７７、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）(実験室単離物)、ソネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）ＡＴＣＣ  ２５９３１、スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ  ２７８５１、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）(実験室単離物)、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ３３５９１、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ��ｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＮＣＴＣ  ６７５１、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）ＡＴＣＣ  ２７８４０、スタフィロコッカス・コーニー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ）ＡＴＣＣ  ２９９７４、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）(実験室単離物)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２９９７０、スタフィロコッカス・ホミヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ  ２７８４４、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ  ２９６６３、スタフィロコッカス・ラグデネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｅｎｅｎｓｉｓ）(実験室単離物)、スタフィロコッカス・スクイリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｕｉｒｉ）(実験室単離物)、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ２７８３６、スタフィロコッカス・ザイロサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ  ２９９７１、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）(実験室単離物)、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＡＴＣＣ  １２３８６、ストレプトコッカス・ボヴィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＡＴＣＣ  ９８０９、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ  ９５２８、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ３５６６６、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）(Ｂ群)ＡＴＣＣ  １２３８６、連鎖球菌(Ｆ群)ＡＴＣＣ  １２３９２、連鎖球菌(Ｇ群)ＡＴＣＣ  １２３９４、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  ３５６６８、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ  ２７３３６、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ１９６１５、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ１３４１９、ビブリオ・アルギノリティクス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１７７４９、ビブリオ・パラヘモリティクス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１７８０２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ９７７３及びエルジニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ２３７１５。これらの生物の培養物からゲノムＤＮＡを精製し、上記の条件を用いて、ＮＧｐａｐＬＣアッセイにおいて試験した。
【０１０６】
（結果）
合計２８２個の臨床試料を、ＮＧｐａｐＬＣアッセイによって及びＲｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ＡｍｐｌｉｃｏｒアッセイをｃｐｐＢ−ＬＣアッセイと共に組み合わせた試験アルゴリズムによって試験した。これらの結果の要旨を表２に提供する。
【０１０７】
概して、淋菌ＤＮＡについて、３つの全てのＰＣＲ法によっては、７９（２８．０％）検体は陽性であり、１２０（４２．６％）検体は陰性であった。さらなる８１（２８．７％）検体はＣｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイにより陽性であったが、ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣアッセイの両方によっては陰性であった。これらを、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒによって取得された偽陽性の結果とみなした。さらなる２（０．７％）検体はＣｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイによると陽性であったが、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒアッセイ上では矛盾した結果を生じた；１検体は、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイにより陽性であり、サイクル閾値（Ｃｔ値）は４７であったが、ＮＧｐａｐＬＣによっては陰性であったのに対し、残りの検体はＮＧｐａｐＬＣによってのみ陽性であり、Ｃｔ値は４１を提供した。これらのＣｔ値は各試験について最高の記録されたＣｔ値であり、各検体中の低淋菌ＤＮＡ濃度を示している。繰り返し試験の際、いずれの検体も一貫して陽性ではなかった。これは、両方の検体におけるＤＮＡの濃度が、各試験の感度の閾値上にあったことを示唆する。
【０１０８】
５ｘ１０Ｅ＋４から５ｘ１０Ｅ−２ｃｆｕ／ｍｌの範囲の淋菌培養物の希釈液を試験することにより、ＮＧｐａｐＬＣの感度の限界を、検体中における５ｃｆｕ／ｍｌの淋菌であると決定した。ｃｐｐＢ−ＬＣの検出限界は、５ｘ１０Ｅ−１ｃｆｕ／ｍｌと決定した。これは、ｃｐｐＢ−ＬＣがＮＧｐａｐＬＣアッセイよりも１０倍良い検出限界を有することを示唆する。
【０１０９】
さらにＮＧｐａｐＬＣアッセイの特異性を決定するため、生物の広範なパネルの培養物からゲノムＤＮＡを精製し、試験した。これらは、ナイセリア種並びに他の一般的なヒト病原体及び正常な微生物叢を含んでいた。全ての非淋菌性種は、ＮＧｐａｐＬＣアッセイによって試験した場合に、陰性であった。一方、試験した３個の髄膜炎菌単離物は、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイによると陽性であった。これらの３個の髄膜炎菌単離物は、陽性の淋菌単離物に提供され、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイにおけるサイクル閾値（Ｃｔ）よりも有意に大きい値を提供した；淋菌単離物のＣｔ値は、一貫して１６未満であったのに対し、これらの３個の髄膜炎菌単離物は３３以上のＣｔ値を提供した。これは、ｃｐｐＢ遺伝子が、これらの髄膜炎菌単離物において、より低いコピー数で存在し得ることを示唆する。
【０１１０】
試験した８４の淋菌単離物のうち、７個はｃｐｐＢ−ＬＣアッセイによって陰性であった。これらの７個の陰性単離物のうち、６個の陰性単離物は、ノーザンテリトリーから取得された淋菌単離物であり、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイにより陰性であると、以前に試験された。従って、クイーンズランド単離物では、１個の、さらなるｃｐｐＢ陰性単離物のみが同定された。一方、全８４の淋菌単離物は、ＮＧｐａｐＬＣアッセイによって試験した場合に、陽性の結果を提供した。これは、ＮＧｐａｐＬＣオリゴヌクレオチド標的が全単離物に存在していたことを示す。その上、ＮＧｐａｐＬＣアッセイによる蛍光融解曲線解析は、淋菌単離物又はいずれの陽性臨床検体の間で、如何なるバリエーションも示さなかった；全ＮＧｐａｐＬＣ陽性反応は６５℃の融解温度を提供した。
【０１１１】
細菌性培養物と比較したＮＧｐａｐＬＣ
クイーンズランドの局地集団に対して、細菌性培養物との比較を行い、性健康診察に参加している患者から採取した５５７検体を含んでいた。この集団における淋菌の低発生率から判断して、この集団を、ＮＧｐａｐＬＣアッセイの特異性を試験するために理想的であるとみなした。
細菌性培養物と比較して、アッセイは１００％感度及び８８．２％特異的であった（表３）。
しかしながら、この特異性の算定は、２個のさらなるＰＣＲ陽性が偽陽性の結果であるという推定に基づいている。一方、我々はこれらのさらなる陽性結果が真に陽性な結果であると考えている。これは、ＮＧｐａｐＬＣの結果が、別個の淋菌遺伝子を標的とする第二のＰＣＲアッセイによって支持されているからである。その上、以前の研究から、ＰＣＲは、細菌性培養物よりも優れた臨床感度を有することが示されている。従って、さらなるＰＣＲ陽性は予想外ではない。概して、上の結果は、新ＮＧｐａｐＬＣアッセイが、臨床試料における淋菌の慣用的な検出に高度に適切であることを示唆する。
表４−７は、表３データの検体タイプへの分類を提供する。
尿道および頸部検体の両方については、ＮＧｐａｐＬＣアッセイは１００％特異的であった。
咽喉スワブの結果は、ＮＧｐａｐＬＣもまた、肛門スワブに対するより限られたデータでそうであるように、これらの検体タイプに対する使用に適していることを示唆する。
【０１１２】
（考察）
Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ淋菌アッセイの特異性に伴う問題及び確証的アッセイについての要件は、十分に記述されている。不幸にも、確認用試験に用いられる慣習的遺伝子標的はまた、限界を有することが証明されている。本研究の結果は、ＮＧｐａｐＬＣアッセイが、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ淋菌陽性結果の確認についての、ｃｐｐＢ−ＬＣに対する適切な代替物であることを示唆する。淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子を標的とすることにより、ＮＧｐａｐＬＣはｃｐｐＢ遺伝子に伴う限界を克服し、改善された臨床感度及び特異性についての可能性を提供する。
【０１１３】
淋菌のＡＴＣＣ株の希釈液を試験することにより、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイは、我々の新ＮＧｐａｐＬＣアッセイと比較して、１０倍良い検出限界を有した。これはおそらく、潜在性のプラスミドが、淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子よりも高いコピー数であるためである。それにもかかわらず、検出限界における差異は、アッセイの臨床感度に影響しなかった。臨床検体については、ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣアッセイは、淋菌の検出について良く一致していた。２８２検体のうち２検体のみは、各ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒアッセイが他方に対してさらなる陽性を検出するという矛盾した結果を提供した。当初は、さらなるｃｐｐＢ−ＬＣ陽性の結果は、淋菌ＤＮＡロードがＮＧｐａｐＬＣアッセイの検出限界よりも低いことに起因し得たと考えられた。しかしながら、より高感度な入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲアッセイを用いることによって、我々は依然として、この検体中の淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子の存在を検出することができなかった（データは示さず）。これは、この検体が、我々のＲｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ及びｃｐｐＢ−ＬＣ試験アルゴリズムを用いて偽陽性であったこと、又はｐｏｒＡ偽遺伝子を欠損する淋菌株を示すことのいずれかを示唆する。しかし、現在までにｐｏｒＡ偽遺伝子を欠損する淋菌株の報告はない。さらに興味深いことに、入れ子増幅を用いることにより、我々は、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイにより陰性であったがＮＧｐａｐＬＣ試験により陽性であった検体中にｃｐｐＢ遺伝子の存在を検出することができたことに注目すべきである。これは、このｃｐｐＢ−ＬＣ陰性の結果が、この推定淋菌株におけるｃｐｐＢ遺伝子の欠損のために起こったのではないことを実証する（データは示さず）。
【０１１４】
概して、臨床検体についての結果は、ＮＧｐａｐＬＣ及びｃｐｐＢ−ＬＣアッセイが類似した臨床感度及び特異性を有し、実際にｃｐｐＢ−ＬＣアッセイが、我々の集団における尿及び生殖器のスワブ検体に対する使用に適し得ることを示唆する。しかしながら、これらの結果は細菌性パネルのそれと対照的であり、それはｃｐｐＢ−ＬＣアッセイの制限を強調した。最も顕著には、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイは７個の淋菌単離物を検出することに失敗した。これは、我々の集団において、ｃｐｐＢ遺伝子を欠損する淋菌株が存在することを示す。より重要なことには、我々の試験アルゴリズムは偽陰性の結果を生じるようである；Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒによって陽性であると試験された検体は、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイによって、偽陽性として不正確に同定され得る。本研究において、淋菌単離物は無作為に選択されたのではなく、従って全体のｃｐｐＢ−ＬＣ偽陰性率を決定するためには、さらなる試験が必要である。他の研究によって、ｃｐｐＢ遺伝子を欠損するこのような単離物の発生率は、オーストラリアでは低いことが示唆されている（Ｌｅｓｌｉｅら,２００３,Ｃｏｍｍｕｎ  Ｄｉｓ  Ｉｎｔｅｌｌ．２７  ３７３−９）。
【０１１５】
しかしながら、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイを用いた場合には、偽陰性の結果の可能性が存在する。一方で、ＮＧｐａｐＬＣ法は、本研究において試験した全ての淋菌単離物を正確に同定した。これは、ＮＧｐａｐＬＣアッセイが、我々の局地淋菌株におけるｐｏｒＡ偽遺伝子の欠損から生じる偽陰性の結果を感知し得ないことを示唆する。従って、それは、ｃｐｐＢ−ＬＣアッセイと比較して、改善された臨床感度を提供するはずである。
【０１１６】
ＮＧｐａｐＬＣアッセイはまた、淋菌ＤＮＡに高度に特異的であることが証明された；全ての非淋菌性種は、ＮＧｐａｐＬＣ法によって試験した場合に、陰性の結果を提供した。注目すべきは、我々は、ナイセリア種を取得するのに困難を経験し、従って我々の細菌性パネルは全ての既知のナイセリア種を含まず、大部分の種について、限られた数の単離物のみを含んでいた。従って、他のナイセリア種との交叉反応は、これらの結果だけを根拠に、はずすことはできない。しかしながら、ナイセリアｐｏｒＡ遺伝子は、淋菌及び髄膜炎菌に存在するとのみ報告されており（Ｆｅａｖｅｒｓ  ＆  Ｍａｉｄｅｎ  １９９８，同上）、従って髄膜炎菌との交叉反応が、より意味があると考えられた。本研究においては、我々は、３８個の髄膜炎菌単離物を試験し、交叉反応を全く見出さなかった。その結果、我々は、我々の局地試料集団に対して用いた場合に、本試験の特異性について自信がある。
【０１１７】
３個の髄膜炎菌培養物から陽性の結果が取得されたことにより、細菌性パネルについてのｃｐｐＢ−ＬＣの結果は、ｃｐｐＢ標的を用いることに関連する特異性の問題の良い例を提供した。それにもかかわらず、局地の髄膜炎菌単離物におけるｃｐｐＢ遺伝子の存在は、試験が尿及び生殖器のスワブ検体に限定された場合には大きな特異性の問題を引き起こし得ない。現在までに、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイにおいて、髄膜炎菌が、偽陽性の結果を生じたという報告はなく、そのような単離物は、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒによって最初にスクリーニングされたときに陰性である。その一方で、ｃｐｐＢ遺伝子は、ナイセリア・シネレアを含む、他のナイセリア種の単離物中に発見されており、それらはまたＣｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイと交叉反応する（Ｐａｌｍｅｒら，２００３，同上；Ｆａｒｒｅｌｌ，１９９９，同上）。さらに、我々の研究は、限られた数のみのナイセリア種及び株を調査しており、従って、我々の集団における他のナイセリア種との交叉反応の可能性は、排除できない。
【０１１８】
淋菌についての確証的アッセイを取り囲む重要性はまた、検体部位に依存する。Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒの鍵となる限界の一つは、生殖器外の部位上で用いられた場合に、その特異性が有意に低減することである。特に、咽喉スワブは、主要な問題である。なぜなら、それらは種々のナイセリア種を保有し得、従って偽陽性の交叉反応についてより大きな可能性を呈し得るためである。最近の研究（Ｌｅｓｌｉｅら，２００３，同上）は、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ淋菌陽性結果の確証率が、陰茎及び尿道スワブについての８６．２％から、口腔咽頭スワブについての５．６％まで落ちることを見出した。ｃｐｐＢ−ＬＣ確証的アッセイを用いた場合でさえも、咽喉スワブから取得される真の陽性の数は、生殖器検体から取得されるそれよりもはるかに低いようであることは注目すべきである。これは、咽喉スワブ中の多数のナイセリア種の存在が、両方のアッセイが偽陽性の結果を提供する機会を増加させるからである；１個の種がスクリーニングアッセイと交叉反応し得、一方、別の種が確証的アッセイと交叉反応し得、それによりアルゴリズムから偽陽性の結果を生じる。我々は、我々の新ＮＧｐａｐＬＣ確証的アッセイにより提供される特異性が、生殖器外の部位における淋菌の改善された検出を提供し得ると考える。我々のねらいは、咽喉スワブを含む多数の検体タイプに対するＮＧｐａｐＬＣアッセイの使用を、広く評価することである。
【０１１９】
本研究の結果は、ｐｏｒＡ偽遺伝子が、淋菌のＰＣＲ検出のための適切な標的であることを示す。ｐｏｒＡ遺伝子が、以前はＰＣＲによる髄膜炎菌の検出についての人気の標的であったことは強調するに値する。しかしながら、挿入配列が幾つかの髄膜炎菌単離物のｐｏｒＡ遺伝子中に組み込まれ、偽陰性の結果を与え得ることが発見されたため、それはその後支持を失った（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｎｄｅら，１９９９，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６７  ２９２８−３４；Ｎｅｗｃｏｍｂｅら，１９９８，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０  ４５３−４；Ｊｅｌｆｓら  ２０００，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７  ３９０−５）。
【０１２０】
そのような変異は、ＰＣＲ増幅又はプローブハイブリダイゼーションを潜在的に遮断し、それ故に幾つかの髄膜炎菌単離物の検出を妨げ得る。全ての淋菌単離物が本研究において検出されたという事実は、挿入配列が淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子中に見出され得ないことを示唆する。しかしながら、我々の淋菌単離物の選択が無作為ではなかったことから判断すると、挿入配列を含む淋菌単離物は、本研究によって単に見逃された可能性がある。あるいは、挿入配列は存在し得たが、その小さなＰＣＲ産物のサイズ（１３２ｂｐ）のため、ＮＧｐａｐＬＣアッセイに影響しなかった；そのような小さなＰＣＲ産物のサイズは、ＰＣＲプライマー標的の間に配列が挿入する可能性を低減し得る。我々は淋菌単離物の拡大したパネルに対して、ＮＧｐａｐＬＣアッセイをさらに評価することをねらいとする。 
【０１２１】
本明細書を通して、ねらいは、本発明をいずれか一つの実施形態又は特徴の特定の集合に制限することなく、本発明の好ましい実施形態を記述することである。従って、本発明の開示を考慮して、種々の改変及び変更が、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態において行われ得ることが、当業者より理解され得る。
【０１２２】
本明細書中において言及されている全ての特許及び科学文献、アルゴリズム及びコンピュータプログラムは、それらの全体において参考になるように、本明細書中に援用される。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
【表２】
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【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】淋菌のｐｏｒＡ偽遺伝子の好ましいオリゴヌクレオチドプライマー配列（ＡＳ＝アンチセンス）及びヌクレオチド配列のリスト。太字の残基は、ＮＧ−ｐａｐ−Ｆ（フォワード）プライマーアニーリング部位；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ１プローブハイブリダイゼーション部位；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ２プローブハイブリダイゼーション部位；及びＮＧ−ｐａｐ−Ｒ（リバース）プライマーアニーリング部位を示す（５’から３’）。予想される増幅産物のサイズは１３２ｂｐである。影付きの残基は、対応する髄膜炎菌ｐｏｒＡ配列と非同一のものである。配列の識別名は以下の通りである：ＮＧ−ｐａｐ−Ｆ（フォワード）プライマー配列：（配列番号１）；ＮＧ−ｐａｐ−Ｒ（リバース）プライマー配列（配列番号２）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ１プローブ（配列番号３）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ２プローブ配列（配列番号４）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ３プローブ配列（配列番号５）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ４プローブ配列（配列番号６）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ５プローブ配列（配列番号７）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ６プローブ配列（配列番号８）；ＮＧ−ｐａｐ−ｐ７プローブ配列（配列番号９）；淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子配列（配列番号１０）；
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月24日(2005.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定するための方法であって、該方法は、該個体から取得した生体試料中に存在する場合に、１個以上のオリゴヌクレオチドを用いて淋菌の該単離ｐｏｒＡ核酸を検出する工程を含み、該ｐｏｒＡ核酸の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示し、該１個以上のオリゴヌクレオチドは、該生体試料に存在する場合に、髄膜炎菌の該ｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように髄膜炎菌の該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得ない、方法。
【請求項２】
該方法が、淋菌の該単離ｐｏｒＡ核酸を、該生体試料中に存在する髄膜炎菌のｐｏｒＡ核から識別する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
淋菌の該ｐｏｒＡ核酸が、髄膜炎菌以外の別のナイセリア種から識別される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
淋菌の該単離ｐｏｒＡ核酸の増幅を促進する条件下において、生体試料を核酸配列増幅に供して、増幅産物を生成する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
増幅産物が淋菌ｐｏｒＡ偽遺伝子の断片に対応する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
核酸配列増幅が、淋菌の該単離ｐｏｒＡ核酸の増幅を検出可能なレベルまで促進するが、髄膜炎菌の該ｐｏｒＡ核の増幅を検出可能なレベルまで促進しない条件下で行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
核酸配列増幅が、配列番号１及び配列番号２からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する１個以上のＰＣＲプライマーを用いて行われる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該１個以上のオリゴヌクレオチドが、該増幅産物をプローブハイブリダイゼーションによって検出するためのプローブを含む、請求項４記載の方法。
【請求項９】
プローブが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
プローブが、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該増幅産物の検出が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ヒト個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあるかを決定する方法であって、次の工程を含む該方法：
（ｉ）該ヒト個体から取得した生体試料中に存在する場合に、配列番号１及び配列番号２記載の各ヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、該生体試料を核酸配列増幅に供して、淋菌ｐｏｒＡ核酸からのｐｏｒＡ淋菌増幅産物を生成すること；並びに
（ｉｉ）存在する場合に、ドナーフルオロフォアを有する配列番号３及びアクセプターフルオロフォアを有する配列番号４記載の各ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、プローブハイブリダイゼーション及び蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって該増幅産物を検出し、それにより該ｐｏｒＡ増幅産物の存在は、該個体が淋菌に感染しているか、又は感染していたことがあることを示すこと。
【請求項１３】
淋菌のｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得るが、髄膜炎菌のｐｏｒＡ核酸の検出を可能とするのに十分であるように髄膜炎菌の該ｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得ない、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
該オリゴヌクレオチドが、髄膜炎菌以外の別のナイセリア種のｐｏｒＡ核酸にハイブリダイズし得ない、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
淋菌のｐｏｒＡ核酸を検出するためのキットであって、該キットは、請求項１３記載の１個以上のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は１個以上の検出試薬と共に含む、キット。
【請求項１８】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
淋菌ｐｏｒＡ核酸の増幅を促進する１個以上のプライマーをさらに含む、請求項１７記載のキット。
【請求項２１】
１個以上のプライマーが、配列番号１及び配列番号２からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
基板に固定化されているか、カップリングしているか、結合しているか、含浸されているか、又はそれら以外で連結している、請求項１３記載の１個以上のオリゴヌクレオチドを含む、核酸アレイ。
【請求項２３】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項２２記載の核酸アレイ。
【請求項２４】
１個以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項２３記載の核酸アレイ。
【国際調査報告】
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