(57)【要約】【課題】本発明は、憂鬱症治療用蓮肉抽出物、これを含む薬学的組成物及び健康食品を提供する。【解決手段】本発明の蓮肉抽出物は、蓮肉を熱水で抽出して製造する。前記蓮肉抽出物は、動物行動学的、生化学的方法によって強力な抗憂鬱活性を示すうえ、既存の抗憂鬱剤の副作用を減少させる安全性が確保されているので、憂鬱症治療用組成物及び健康食品として有用に使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蓮肉を熱水で抽出して製造される、抗憂鬱活性を有する蓮肉抽出物。
【請求項２】
前記熱水抽出が８０〜１００℃で１〜３時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の抗憂鬱活性を有する蓮肉抽出物。
【請求項３】
前記熱水抽出の後、
抽出濾液を濾過して濃縮する段階と、
凍結乾燥させる段階とをさらに含む方法によって製造されたことを特徴とする、請求項１に記載の抗憂鬱活性を有する蓮肉抽出物。
【請求項４】
前記熱水抽出が還流抽出であることを特徴とする、請求項１に記載の抗憂鬱活性を有する蓮肉抽出物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蓮肉抽出物を有効成分として含有する、憂鬱症治療用薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蓮肉抽出物を有効成分として含有する、憂鬱症治療用健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、憂鬱症治療効果を有する蓮肉(Nelumbinis Semen, Nelumbo nucifera)抽出物、これを含む薬学的組成物及び健康食品に係り、より詳しくは、蓮肉を熱水で抽出して製造した蓮肉抽出物、この蓮肉抽出物を有効成分として含む憂鬱症治療用薬学的組成物及び健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の複雑な社会内で発生する精神的損傷の多くは、過去とは異なり、大きな心理的衝撃または刺激よりは、日常生活からの微弱であるが持続的且つ反復的なストレスによって発生する。このようなストレスは、患者自らも認識できず、病院ですらこれを看過し易いものであって、弱い刺激が累積して個人を憂鬱症に苦しまれるようにする。
【０００３】
憂鬱症は、客観的な状況とは関係なく起こる情緒的病理現象であって、患者のすべての生活が憂鬱な気分に取り囲まれており、興味が減少し、無快感症(anhedonia)になり、精神運動が低下し、厭世感及び絶望感に捕われるうえ、自殺意欲を感じて自殺まで企てる病気であるが、食欲低下、不眠、便秘、性欲感退、免疫機能低下による疾病に対する感受性が高くなるなど様々な身体的症状を示す。
【０００４】
憂鬱症の発生メカニズムと、憂鬱症の治療剤である抗憂鬱剤の作用メカニズムを完璧に説明する理論は未だ出てない。ところが、一般には、中枢神経系のシナプス(synapse)内にモノアミン(monoamine)系神経伝達物質(neurotransmitter)、例えばセロトニン(serotonin)、ノルエピネフリン(norepinephrin)、ドパミン(dopamine)などが足りなければ憂鬱症が誘発されるという仮説が最も有力なものである。したがって、抗憂鬱剤はいずれも、中枢セロトニンまたはノルアドレナリンシナプスで神経伝達物質の濃度を高める薬理作用をもっている。
【０００５】
抗憂鬱剤は、神経伝達物質の濃度を高めるメカニズムによって、三環系抗鬱薬（ＴＣＡ；tricyclic antidepressants)、モノアミン酸化酵素阻害薬(ＭＡＯＩ；monoamine oxidase inhibitors)、または選択的セロトニン再取り込み阻害薬(ＳＳＲＩ；selective serotonin reuptake inhibitors)に大別されて用いられている。
【０００６】
比較的久しい前に開発されたフェネルジン(phenelzine)などのモノアミン酸化酵素阻害薬は、心臓病の誘発という深刻な副作用があるため、最近ではあまり使われておらず、イミプラミンなどの三環系抗鬱薬も、抗コリン作用性副作用、及び鎮静作用、心血管系に対する副作用が相当な問題点として残っている。したがって、最近では、このような副作用の少ない憂鬱症治療剤として、選択的セロトニン(５−ＨＴ)再取り込み阻害薬(selective serotonin reuptake inhibitor、以下「ＳＳＲＩ」という)を用いた憂鬱症治療剤の開発に焦点が合わせられている。その代表的な薬剤としては、臨床的にその効能を広く認められている、フルオキセチン(fluoxetine、製品名：Ｐｒｏｚａｃ)、パロキセチン(paroxetine、製品名：Ｓｅｒｏｘａｔｅ)、セルトラリン(sertraline、製品名：Ｚｏｌｏｆｔ)などがある。
【０００７】
ところが、これらの薬剤も、全身疲労感、性機能障害、不眠症などの副作用を示す。一般的な抗憂鬱剤の投与は、セロトニンの量を増加させてセロトニン受容体を活性化させ、そのダウンストリーム(down-stream)であるＰＫＡの活性を強化させ、ひいてはＣＲＥＢ、脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor；ＢＤＮＦ)とその受容体であるｔｒｋＢのタンパク質量を増加させると報告されている。これらは、抗憂鬱剤の分子的な水準で効果的な作用標識として見られ、このようなＢＤＮＦの増加或いはセロトニン受容体の活性により、特に海馬(hippocampus)で損傷した脳細胞が再び回復される神経細胞再生成という現象が起こって、憂鬱症患者の損傷した記憶力を回復させるものと知られている(J. of Psychosomatic Research 53, 687-697 (2002))。また、抗憂鬱剤の投与は、憂鬱症にかかっている人々に一般に現れる免疫低下の代表的な反応、例えばコルチゾール(cortisol)濃度,の減少、ＩＬ−２濃度の減少、ＷＢＣ数の減少、リンパ球(lymphocyte)数の減少を正常数値に上げて再び正常的な免疫体系を成すことを可能にするものと知られている(Ann N Y Acad Sci.917, 478-487 (2000))。このような作用効果も、抗憂鬱剤の憂鬱症治療効果の別の徴表として見られる。
【０００８】
最近は、西洋でも天然薬材抽出物の薬効を認めて研究する趨勢にある。憂鬱症と関連しては、主にセイントジョーンズウォート(St. John's wort)といわれるセイヨウオトギリソウ(Hypericum perforatum)の抽出物を用いた研究が行われている(Neuropharmacology, 1999, 21(2), 247-257; Cochrane Database Syst Rev, 2000, (2), CD000448; Drugs Aging, 2000, 16(3), 189-197)。
【０００９】
セイヨウオトギリソウの抽出物とイミプラミン(imipramine)の薬効を比較した研究から、セイヨウオトギリソウの抽出物が憂鬱症の治療にイミプラミンと同等の効果を示しながらも副作用は一層少ないと報告されている(BMJ, 2000, 321, 536-539)。また、セイヨウオトギリソウの抽出物がヒトシトクロムＰ４５０酵素活性(human cytochrom P450 enzyme activity)を抑制する可能性を持つと報告されている(J Pharmacol Exp Ther, 2000, 294(1), 88-95)。
【００１０】
セイヨウオトギリソウの抽出物には、中枢神経系(ＣＮＳ)に直接または間接に作用する、構造的に差異のある多数の化合物が含まれている。すなわち、セイヨウオトギリソウの抽出物は、実際、ハイペリシン(hypericin)やハイパーフォリン(hyperforin)などの活性化合物及び二量体フラボン類(dimeric flavones)が含まれている。これらは、動物及びヒトにおいて抗憂鬱作用及び不安解消作用を有するものと知られている。
【００１１】
その作用メカニズムは次のとおりである。ハイペリシンは、セイヨウオトギリソウの抽出物に含有された二量体のプロシアニジン(dimeric procyanidines)の存在下で抗憂鬱作用が立証された(Regensburg, Germany, V. Butterwecke et.al., 45th Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, 1997, Abstract No. 011)。ハイパーフォリン(hyperforin)は、マウスの視床下部(hypothalamus)と海馬(hippocampus)における５−ＨＴ(serotonine)の濃度を上昇させると報告されており、その抗憂鬱効果はセロトニンシステムと関係があるものと推定される(J Pharm Pharmacol, 2001, 53(5), 583-600; Pharmacopsychiatry, 2000, 33(2), 60-65)。ところが、憂鬱症患者の中には既存の抗憂鬱剤では治療できない患者が約２０％も存在し、ＳＳＲＩなど最近開発された抗憂鬱剤の副作用も、既存の抗憂鬱剤に比べて相対的に少ないが、依然として無視できない水準である。
【００１２】
一方、憂鬱症の治療のための抗憂鬱剤の開発過程において様々な憂鬱症動物モデルが試みられてきた。初期には強いフットショック(intense foot-shock)、冷水浸漬(cold water immersion)、４８時間の摂餌／摂水制限(48h food/water deprivation)などの高強度の刺激を与える方法が好まれたが、最近は、弱いながらも持続的且つ慢性的なストレスを受ける現代人の日常をさらによく模倣することが可能な、軽微な強度の反復的ストレスを利用する方法が好まれている(Psychopharmacology, 1984, 83, 1-16)。その中でも、Ｗｉｌｌｎｅｒ等提案の慢性的且つ弱い刺激(Chronic Mild Stress、以下「ＣＭＳ」という)モデルが、信頼度と妥当度を備えた優れた憂鬱症動物モデルとして認められている(Neuroscience and Biobehavial Review, 1981, 5, 231-246; TIPS, 1991, 12, 131-136)。
【００１３】
慢性的且つ温和なストレスを受けたラット(Chronic mild stressed rat)は、慢性的且つ弱い刺激(ＣＭＳ)によって誘発された行為的変化が数週間の持続的投薬期間中に観察され、これが習慣的に起こらない場合、またはその習慣化が一定の限度的範囲内で起こりうる場合をいう(Psychopharmacology, 1997, 134, 319-320)。一般的実験では、２４時間光周期(overnight illumination)、一定期間の摂餌及び／または摂水制限(periods of food and/or water deprivation)、ケージ傾斜(cage tilt)、ケージメートの変化(change of cage mate)などの様々な慢性的かつ弱い刺激源が利用される(Psychopharmacology, 1997, 134, 319-320)。このようなストレス手続きを繰り返すと、白ネズミは、憂鬱症の代表的症状と見られる無快感症(anhedonia)に相応する症状として、蔗糖溶液(sucrose solution)摂取量の相当な減少を示す。このような摂取量の減少は、何らの処置もしない場合には、ＣＭＳ手続きを撤回した後にも数週間持続すると知られている。多数の抗憂鬱剤は、ＣＭＳ処置による蔗糖摂取量の減少を元々の水準に回復させるのに効果があると明らかになっている(Psychopharmacology, 1992, 109, 433-438)。
【００１４】
一方、蓮肉は、ハスの成熟な実の殻を除去した種子であって、その内部に緑色蓮心がある。また、蓮肉は、匂いがなく、甘くてみずみずしいうえ、やや渋い。
【００１５】
蓮肉は、多量の澱粉とラフィノース(raffinose)という糖を含有しており、薬理作用としては、脾臓と胃腸の機能強化、不眠症の緩和、皮膚美白、炎症緩和作用、皮膚傷治癒などの効果が知られている。ところが、今まで、蓮肉熱水抽出物を用いた憂鬱症の症状緩和に関連した何の報告もない実情である。
【００１６】
【非特許文献１】J. of Psychosomatic Research 53, 687-697 (2002)
【非特許文献２】Ann N Y Acad Sci.917, 478-487 (2000)
【非特許文献３】Neuropharmacology, 1999, 21(2), 247-257
【非特許文献４】Cochrane Database Syst Rev, 2000, (2), CD000448
【非特許文献５】Drugs Aging, 2000, 16(3), 189-197
【非特許文献６】BMJ, 2000, 321, 536-539
【非特許文献７】J Pharmacol Exp Ther, 2000, 294(1), 88-95
【非特許文献８】Regensburg, Germany, V. Butterwecke et.al., 45th Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, 1997, Abstract No. 011
【非特許文献９】J Pharm Pharmacol, 2001, 53(5), 583-600;
【非特許文献１０】Pharmacopsychiatry, 2000, 33(2), 60-65
【非特許文献１１】Psychopharmacology, 1984, 83, 1-16
【非特許文献１２】Neuroscience and Biobehavial Review, 1981, 5, 231-246;
【非特許文献１３】TIPS, 1991, 12, 131-136
【非特許文献１４】Psychopharmacology, 1997, 134, 319-320
【非特許文献１５】Psychopharmacology, 1997, 134, 319-320
【非特許文献１６】Psychopharmacology, 1992, 109, 433-438
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、熱水抽出による抗憂鬱活性を有する蓮肉抽出物、これを有効成分として含有する薬学的組成物及び健康食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、本発明では、蓮肉を熱水で抽出したエキスを濃縮乾燥させて得た蓮肉抽出物、この蓮肉抽出物を有効成分として含む憂鬱症治療用薬学的組成物及び健康食品を提供する。
【００１９】
本発明者らは、昔から蓮肉が民間薬として用いられてきたことに着目して、蓮肉抽出物の薬理活性を調査することにより、蓮肉抽出物が既存の抗憂鬱剤として用いられるセイヨウオトギリソウの抽出物と近年最も多く用いられる抗憂鬱剤、すなわちＳＳＲＩの一つであるフルオキセチン(fluoxetine、製品名：Ｐｒｏｚａｃ)よりも一層優れた抗憂鬱効果を示すことを動物行動学的方法によって究明し、これらの有する副作用を最小化する本発明の蓮肉抽出物からなる憂鬱症治療用薬学的組成物を提供するに至った。
【００２０】
また、本発明の蓮肉抽出物に対して抗憂鬱メカニズムと抗憂鬱剤の別の効果、すなわち免疫機能の正常化を分子生物学的、生化学的方法によって究明し、本発明の蓮肉抽出物からなる憂鬱症治療用薬学的組成物を提供するに至った。
【００２１】
しかも、本発明の蓮肉抽出物は、既存の抗憂鬱剤のような副作用がないことを動物行動学的方法によって究明した。
【００２２】
したがって、本発明は、抗憂鬱活性を有する蓮肉熱水抽出物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、前記蓮肉抽出物を有効成分として含有する憂鬱症治療用薬学的組成物を提供する。
【００２４】
また、本発明は、前記蓮肉抽出物を有効成分として含有する憂鬱症治療用健康食品を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
上述したように、本発明の熱水抽出による蓮肉抽出物は、非常に高い抗憂鬱活性を示し、蓮肉抽出物の原料である蓮肉は、憂鬱症治療用薬学的組成物として使用するとき、人体に無害で吸収率に優れる天然薬材なので、憂鬱症に関連した各種疾患の治療及び予防に有用に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明は、蓮肉を熱水で抽出して製造される抗憂鬱活性を有する蓮肉抽出物からなる。熱水抽出は、経済性と工程上の便宜性を有するとともに、蓮肉抽出物を用いた液状製剤の生産の際に液状製剤の主成分が水なのでさらによく溶解できるという利点がある。前記水としては、不純物が含まれていない蒸留水(disitlled water)、特に３次蒸留水を使用することが好ましい。
【００２８】
また、前記熱水抽出は、８０〜１００℃で１〜３時間行われることが好ましい。熱水抽出の温度が８０℃より低いか或いは時間が１時間より短い場合には、蓮肉抽出物の有効成分がよく溶出せず、温度が１００℃より高いか或いは時間が３時間を超過する場合には、蓮肉抽出物の有効成分が分解されることもあるので、前記温度と時間の範囲において熱水抽出を行うのが好ましい。
【００２９】
また、本発明は、前記熱水抽出の後、蓮肉抽出濾液を濾過して濃縮する段階と凍結乾燥させる段階とをさらに含む。
【００３０】
また、前記熱水抽出は、還流条件の下で行われることが好ましい。熱水抽出には還流抽出や加圧蒸留法などが使用可能であるが、特に還流抽出が好ましい。
【００３１】
本発明者らは、本発明の蓮肉抽出物が抗憂鬱活性を有するかを確認するために、下記の実験を行った。このために、本発明の蓮肉抽出物を白ネズミに1日(急性効果)或いは６日(慢性効果)投与した後、それぞれその翌日に強制水泳検査(Forced swim test)を行った。強制水泳させる間、もがくのを止めて四肢を全く動かない不動時間(immobility time)を測定した。その強制水泳は直ちにそれ自体が憂鬱症を誘発させる実験であって、通常、水槽内に入ったラットは暫く四肢をもがいてから全く四肢を動かないまま水に浮かんでいる状態となるが、この際、動物は絶望に陥って殆ど命を放棄する状態となる。このときを憂鬱症が誘発された状態であると見なすが、通常、このような状態を持続する時間を、大部分の抗憂鬱剤は有意に減少させると知られている。
【００３２】
したがって、このような原理を利用して薬物の抗憂鬱効果を測定するのである。薬物を投与する前、予め実験動物を水槽内に入れて１５分間強制水泳を行わせ、実験動物があまりにも急変な環境を恐れずに適応し得るように訓練させる。薬物を投与してから強制水泳を行わせた結果、図１に示すように、本発明の蓮肉抽出物は、抗憂鬱活性を持つと共に、比較群として使用したセイヨウオトギリソウ抽出物、フルオキセチンより、１日処理した場合、各薬物の有効用量範囲内で比較したとき、蓮肉抽出物でのみ有意にラットの非活動性時間が減少する強力な抗憂鬱効果を示した。また、図２に示すように、各薬物を６日処理した場合、各薬物の有効用量範囲内において蓮肉抽出物が最も強力な抗憂鬱効果を示した。
【００３３】
また、本発明の蓮肉抽出物が抗憂鬱活性を有するかと既存の抗憂鬱剤の代表的な副作用である性機能障害を克服するかを下記のとおりに試験した。つまり、現実的状況に適用できる上述した憂鬱症モデルであるＣＭＳを用いてラットに８週間憂鬱症を誘発させた後、蔗糖摂取量が減少する快感を感じられない無快感症状態である憂鬱症状態にあることを確認した。その後、ＣＭＳが与えられる最後の４週間、抗憂鬱剤として用いられるＰｒｏｚａｃ、セイヨウオトギリソウの抽出物及び本発明の蓮肉抽出物を投与して、抗憂鬱効果とそれによる副作用を、行動検査によって体重変化、蔗糖摂取量及びオープンフィールドにおける活動の変化を薬物処置後の集団間の比較から観察することにより客観的に比較し、また代表的なＳＳＲＩ系抗憂鬱剤投与の際に現れる副作用である性行動(sexual behavior)減少が前記薬物の投与によってどのように現れるかを調べるために交尾行動を比較した。その結果、本発明の蓮肉抽出物は、比較群として使用したセイヨウオトリギリソウ抽出物とＰｒｏｚａｃより優れた抗憂鬱活性を示しながらも、前記従来の薬物の副作用である性行動減少を全く示さないため、従来の抗憂鬱症薬物の副作用がないものと判断された。
【００３４】
しかも、本発明に係る蓮肉抽出物の抗憂鬱メカニズムを次のとおりに生化学的な方法によって確認した。
【００３５】
第一に、慢性ＣＭＳモデルで微細透析とＨＰＬＣ−ＥＣＤ方法を用いて、５−ＨＴとＮＥの変動に及ぼす候補薬物の効能を検証した。カテコールアミン(catecholamine)の含量は、電気化学的検出器(electrochemical detector)付きＨＰＬＣを用いて分析する。移動相の構成成分は、０．０５Ｍリン酸一ナトリウム(monobasic sodium phosphate)、０．１Ｎソジウムアセチックアセテート(sodium acetic acetate)、１％メタノールであり、ＨＰＬＣ用リン酸によってｐＨを４．４に調節する。ＤＡはＬＣ−１８ガードカラム(guard column)で保護されたＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ ３−μｍカラム(１５０×４．６ｍｍ、Ｓｕｐｅｃｏｌ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ)によってなされる。この試験結果、本発明の蓮肉抽出物は、比較群として使用したＰｒｏｚａｃのように、神経伝達物質である５−ＨＴの量を有意に増加させた。
【００３６】
第二に、憂鬱症に主要に関与するところと知られているラットの脳部分前前頭葉、海馬、視床下部でセロトニン受容体１Ａアゴニスト(serotonin receptor 1A agonist)としての［３Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰを用いた受容体の結合を分析し、結合の増減による抗憂鬱作用を標識によって次のように確認した。８週間ＣＭＳを与えて最後の４週間薬物投与したラットの全体脳を分離してドライアイスに入れて急速冷凍させる。このように急速冷凍した脳は、切片にする前まで−７０℃に保管する。冷凍切片機(Ｌｅｉｋａ)を用いて−２０℃で脳の切片を２０μｍの大きさに切断した後、ゼラチンでコートされたスライド(Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ガラスに付着させる。このように作られたスライドは、５−ＨＴ１Ａ受容体の変化を観察するために使用される前まで−７０℃に保管する。５−ＨＴ１Ａ受容体の変化は、放射線同位元素である［３Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴを用いて観察する。予め作られたスライドは、−７０℃で取り出して室温でＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ(Ｔｒｉｓ １７０ｍＭ、ＣａＣｌ２４ｍＭ、ｐＨ７．６)に３０分間浸漬して前培養(pre-incubation)させる。前培養が終わった後、１時間Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファに２ｎＭの［３Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴ(Ａｍｅｒｓｈａｍ)を混ぜた溶液に浸漬して培養させる。これは５−ＨＴ１Ａ受容体全体の変化観察のためのトータルバインディング(total binding)であり、非特異的結合は１μＭの５−ＨＴ(Ｓｉｇｍａ)を前記培養の際に使用された溶液に添加して観察する。全体的な受容体の変化と非特異的結合のためのそれぞれの培養が終わると、４℃のＴｒｉｃ−ＨＣｌバッファで６回洗浄した後、冷たい風を用いて乾燥させる。乾燥後２４時間、デシケーターに入れて完全に乾燥させる。完全に乾燥したスライドと密度を調べるための標準スケールバーを用いてハイパーフィルムに５週間露出させる。現像液と固定液を用いて５週間露出させたフィルムを現像する。定量的な密度の分析は、イメージ分析プログラムであるＩｍａｇｅＱｕａｎｔ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ)を用いてスキャンした後分析する。それぞれの対照群と比較して結合の増減による抗憂鬱作用標識を観察した結果、本発明の蓮肉抽出物は、比較群として使用したセイヨウオトギリソウ抽出物と同様に、セロトニン受容体１Ａアゴニストとしての［３Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴの結合を、前述した脳の三つの部分で全て増加させた。
【００３７】
第三に、憂鬱症に主要に関与するラットの海馬部位で抗憂鬱作用の標識であるいろんな蛋白質の増加を２−ＤＥを介してタンパク質水準で次のとおりに確認した。８週間ＣＭＳを与えて最後の４週間薬物を投与したラットの海馬を分離して超音波処理機(ソニケータ)で懸濁した後、遠心分離し、上清液のみを回収した。それぞれのサンプルをＩＥＦサンプル緩衝液に入れる。ＩＥＦゲルを用いて各サンプルを等電点(isoelectric point)に応じて分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにランニングされたＩＥＦゲルを滴下した後、１００〜２００Ｖで１〜２時間程度ランニングして分子量に応じてサンプルを分離する。ゲルコードブルーステイニング(Gel-Code Blue staining)方法を用いてゲルをステイニングすることにより、抗憂鬱物質によって増加するか新たに現れるタンパク質を確認する。質量分析法(mass-spectrometry)で、抗憂鬱物質によって増加するか新たに現れるタンパク質を同定する。
【００３８】
その結果、本発明の蓮肉抽出物は、Ｐｒｏｚａｃとは異なり、アデニルスクシニルシンテターゼ(adenylsuccinyl synthetase)、シトクロムＣオキシダーゼ(cytochrome C oxidase)、ＭＡＰキナーゼ２(MAP kinase 2)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１(Aldehyde dehydrogenase 1)の４つのタンパク質量を全て増加させた。
【００３９】
また、本発明は、前記蓮肉抽出物を有効成分として含有する憂鬱症治療用薬学的組成物を提供する。
【００４０】
本発明の憂鬱症治療用薬学的組成物は、前記蓮肉抽出物を有効成分として含有する。前記蓮肉抽出物は、臨床投与の際に経口または非経口で投与可能であり、一般的な医薬品製剤の形で使用できる。
【００４１】
すなわち、本発明の蓮肉抽出物は、実際臨床投与の際に経口及び非経口の様々な剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤及び界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。
【００４２】
経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤及びカプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、蓮肉抽出物に少なくとも一つの賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も使用される。
【００４３】
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤及びシロップ剤などが挙げられるが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に各種賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤及び保存剤などが含まれてもよい。
【００４４】
非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び座剤が含まれる。非水性溶剤と懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol)、オリブ油(olive oil)などの植物性油、オレイン酸エチル(ethyl oleate)などの注射可能なエステルなどが使用できる。座剤の基剤としては、ｗｉｔｅｐｓｏｌ、マクロゴール(macrogol)、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール及びゼラチンなどが使用できる。
【００４５】
投薬単位は、例えば個別投薬量の１、２、３または４倍を含有し、あるいは１／２、１／３または１／４倍を含有することができる。個別投薬量は、好ましくは有効薬物が１回に投与される量を含有する。これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３または１／４倍に相当する。
【００４６】
憂鬱症治療用薬学的組成物において、蓮肉抽出物の有効用量は、３０〜７００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｋｇであり、１日１〜６回投与できる。但し、特定の患者に対する投与用量の水準は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度などに応じて変化できる。
【００４７】
本発明の蓮肉抽出物に対して白ネズミへの経口投与、腹腔内投与及び皮下注射時の毒性実験を行った結果、本発明の蓮肉抽出物は、腹腔内投与毒性試験による５０％致死量(ＬＤ５０)が少なくとも蓮肉抽出物２０ｇ／ｋｇ以上である安全な物質と判明された。
【００４８】
また、本発明は、前記のような蓮肉抽出物を有効成分として含有する憂鬱症治療用健康食品を提供する。
【００４９】
本発明の抽出物を食品として使用する場合、前記抽出物をそのまま添加し、あるいは他の食品または食品成分と共に使用し、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、その使用目的(予防、健康または治療的処置)に応じて適切に決定できる。一般に、本発明の抽出物は、食品または飲料への製造の際に、原料に対して０．０１〜１重量％、好ましくは０．１〜１重量％の量で添加することができる。本発明の抽出物の有効用量は、前記薬学的組成物の有効用量に準じて定めることができるが、健康及び衛生を目的とし、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には前記範囲以下であってもよく、有効成分が安全性の面で何の問題もないため、前記範囲以上の量でも使用できるのは確実である。
【００５０】
前記食品の種類には特別な制限はない。前記物質を添加することが可能な食品の例には、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、補血剤、保養剤、皮膚美白剤などを目的とする民間療法剤などを挙げることができる。また、例えば熱多寒少湯、清心山薬湯、太陰調胃湯などの種々の漢医学処方にも使用することができる。
【００５１】
以下に添付図面を参照しながら、本発明を実施例及び実験例によって詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００５２】
<実施例１>蓮肉抽出物の製造
蓮肉乾燥物粉末５００ｇを３次蒸留水１Ｌ入りのフラスコに仕込んで１００℃で１時間還流抽出による熱水抽出を行い、ガーゼで濾過した濾液を減圧濾過機(Ｅｙｅｌａ．Ｊａｐａｎ)で濃縮した後、凍結乾燥させて本発明の蓮肉抽出物を製造した。その結果、１０６ｇの乾燥抽出物を得た。
【００５３】
<実験例１>蓮肉抽出物を用いた抗憂鬱動物行動実験
生後８５〜９５日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ種の雄ラットに本発明の蓮肉抽出物を経口投与した。比較群としては、抗憂鬱剤として用いられるセイヨウオトギリソウ抽出物を経口投与し、フルオキセチンは腹腔投与した。これらを実験に応じて１日或いは６日投与した。
【００５４】
薬物投与の前、円筒状の水槽(直径２０ｃｍ、水の深さ４０ｃｍ)に白ネズミを入れて１５分間強制水泳させ、薬物投与１日或いは６日後、その翌日に５分間強制水泳させる間に四肢を全く動かない不動時間を測定した。
【００５５】
その結果、図１に示すように、各薬物を１日投与した後、強制水泳させる間に四肢を全く動かない不動時間は、対照群と比較すれば、比較群であるセイヨウオトギリソウ抽出物とフルオキセチンはそれぞれ有意性のない１．５％、９．３％の減少を示したが、蓮肉抽出物は３０．６％の有意性のある減少を示した。
【００５６】
また、図２に示すように、各薬物を６日投与した後、強制水泳させる間に四肢を全く動かない不動時間は、対照群と比較すれば、比較群であるセイヨウオトギリソウ抽出物とフルオキセチンは２９．６％、２２．１％の有意性のある減少を示したが、蓮肉抽出物はより有意性のある３４．３％の減少を示した。
【００５７】
前述したように、本発明の蓮肉抽出物は、抗憂鬱活性を示すと共に、比較群として使用したセイヨウオトギリソウ抽出物またはフルオキセチンよりそれぞれ薬物の有効用量範囲内において抗憂鬱効果が優れることを確認した。
【００５８】
<実験例２>蓮肉抽出物を用いたＣＭＳ下における抗憂鬱動物行動実験
生後６週のＷｉｓｔａｒ種の１８０〜２００ｇの白ネズミ雄を購入し、実験集団と統制集団のラットをまず４８時間１％の蔗糖溶液に露出させ、甘い味に対して適応させた後、３日後から実験集団に総８週間ＣＭＳ処置を加えた。実験集団の動物に加えたＣＭＳ手続きは、Ｗｉｌｌｎｅｒなど(１９８７)の手続きを採用した。ラットにいろいろの軽微なストレスを連続的に加えるが、一連のストレスを１週間適切に配分して時間表に従って処置し、その手続きを８週間繰り返し行った。
【００５９】
ストレス手続きは、表１に例示されたＣＭＳ週間スケジュールの通りである(摂餌／摂水制限２０時間、摂餌／摂水制限後の給食制限(４５ｇの粉を撒く)、摂水制限後の空いた水瓶の露出、一日中照明、飼育箱の３０°傾斜、水４００ｍＬによる飼育環境の汚染、間欠的な８５ｄＢ白色雑音の提示、きらめいたストロボスコープ(stroboscope)照明の提示、３倍数集団の飼育)。統制集団のラットに対しては、毎週、蔗糖摂取量測定前２０時間の摂餌／摂水のみを制限し、残りの期間には個別飼育箱で正常的に飼育し、水と餌を十分供給する。蔗糖溶液摂取量の測定のために、１週１回の摂餌／摂水制限と、実験動物のＣＭＳ手続き上の制限スケジュールを除く場合には、水と餌を自由に摂取し得るように供給した。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
ＣＭＳを与えた後の蔗糖摂取が、ＣＭＳを与えていないものと比較して蔗糖摂取が有意に減少(憂鬱症の代表的な症状)すると、本発明の蓮肉抽出物を経口投与した。比較群は、抗憂鬱剤として使用されるセイヨウオトギリソウ抽出物を経口投与し、フルオキセチンは腹腔投与した。
【００６２】
<行動検査>
（１）蔗糖摂取量及び体重の測定
前述した４集団の全てに対して毎週１回ずつ１％蔗糖溶液摂取量を測定した。２０時間摂餌／摂水を制限した状態で、１％の蔗糖溶液と水入りの瓶をそれぞれ同時に1時間露出させ、露出の前と後の容器の重さを記録することにより、蔗糖溶液及び水の摂取量を測定した。その後、水と蔗糖溶液の摂取総量に対する蔗糖溶液摂取量の割合によって蔗糖溶液の選好性を産出した。また、蔗糖溶液の摂取量をＣＭＳ群と比較することにより、ＣＭＳ群で憂鬱症が起こったかを測定した。各集団の蔗糖溶液摂取量は、開始から総８週間測定された。体重は、毎週蔗糖摂取量を測定するために行う摂餌摂水制限２０時間のスケジュールが始まる前に測定した。
【００６３】
蔗糖溶液の摂取結果、図３の（Ａ）に示すように、最初始めるときは蔗糖摂取量に何の有意的な変化も感知されなかったが、図３の（Ｂ）に示すように、５週後から有意に、ＣＭＳを受けたグループの蔗糖溶液選好性が、ＣＭＳを受けていないグループより１６％減少した。これは憂鬱症が誘発されたことを意味する。このときからそれぞれの薬物を４週間投与した結果、図３の（Ｃ）に示すように、正常群を対照群(ＣＭＳを処理した群)と比較したとき、対照群は、蔗糖摂取量が５６％も有意的に減少し、蔗糖を摂取することにより快感を感じる正常的な状態ではなく、蔗糖を摂取しても快感を感じない無快感症状の憂鬱症が誘発されたことを示唆し、ＣＭＳの下で蓮肉抽出物、セイヨウオトギリソウ抽出物、フルオキセチンを４週間投与したとき、蔗糖摂取量が正常群とほぼ同様に回復されることからみて、これらはいずれも抗憂鬱効果を持っていることが確認された。また、蓮肉は正常群の蔗糖摂取量の７９％まで回復されることが分かった。これは、蓮肉抽出物もヒトの憂鬱症をよく描写することが可能なＣＭＳモデルの下で相異なる２つの代表的な抗憂鬱製剤とほぼ同様の抗憂鬱効果があることを示す。
【００６４】
体重の測定結果、図４の（Ａ）に示すように、最初ＣＭＳを与え始めるときは図４に示すように全くグループ間に差異がなかったが、８週間ＣＭＳを与えて最後の４週間薬物を投与した結果、対照群(ＣＭＳを与えたもの)は、正常群と比較して相当な差異をもって体重が減少した。これは、通常ＣＭＳの下で起こった憂鬱症からよく見られる現象である。蓮肉抽出物投与群のみが対照群の体重とほぼ同様に回復されたが、正常群と同じ程度には回復されていない。ところが、図４の（Ｂ）に示すように、セイヨウオトギリソウ抽出物、フルオキセチン投与群では却って有意に対照群と比較して体重が減少したが、これはこれらの薬物に対する深刻な副作用を引き起こす。
【００６５】
これらの結果は、蓮肉抽出物が、既存の抗憂鬱剤から現われる深刻な副作用、或いは毒性である体重の減少を回復させ、既存の抗憂鬱剤の毒性を示さないより安全な薬であるのを立証する契機になった。
【００６６】
（２）オープンフィールド活動(open field activity)
ＣＭＳ処置とそれぞれの薬物処置による活動量の差異を調べるために、９週間の蔗糖溶液摂取量測定続きが全て終わった後、オープンフィールドでの様々な行動を観察した。オープンフィールドは７５×７５×３０ｃｍ規格の木材箱であり、その床には１５ｃｍ間隔の横線、縦線で碁盤形状の区画が分けられている。オープンフィールドの一方側には１５×１５×１５ｃｍの小さい箱が連結されていて、実験動物がオープンフィールドに出る前に待機する出発箱として用いられる。出発箱とオープンフィールドとの間はハッチドアを設置し、出発箱内に白ネズミを入れてから３０秒後にドアが開き、ドアの開放後からオープンフィールドに出るまでにかかった時間を出発潜在期として測定する。ドアが開いたときから尻まで完全に出発箱を抜け出してくるまでの時間で定義する。出発潜在期の終了と同時にオープンフィールドでの活動が観察され始めるが、オープンフィールドでの活動は総１０分間観察され、その間に現われる歩行活動(locomotion)、立ち上がり行動(rearing)、身づくろい行動(grooming)、排便行動(defaecation)などを記録する。身づくろい行動はその回数に関係なく１０分間身づくろいにかかった総時間で測定し、残りの行動指標はいずれも発生頻度を記録した。歩行活動は白ネズミが床に描かれた１５×１５ｃｍの２５個の区画を過ぎる度にコンピュータトラッキングシステム(computer tracking system)を用いて記録した。立ち上がりは、総１０分間のオープンフィールド活動中に後肢立ちで探索行動を見せた全体回数で記録され、身づくろい行動は、前足で頭を撫でたり口と手で毛を繕う行動を全体１０分間どのくらい見せたかに対する時間で記録する。１０分間の観察を済ませると、白ネズミをオープンフィールドから取り出した後、オープンフィールドの床に残っている大小便の個数を数えて排便回数で記録した。
【００６７】
全体訪問した部屋の個数(Visit counts)を測定した結果、８週のＣＭＳ処理の際に最後の４週間それぞれ薬物処理した後、オープンフィールドテストによって、全体訪問した部屋の個数を測定すると、図５に示すように、対照群(control group、ＣＭＳを処理する群、１０分間平均３０箇所を訪問)と比較して蓮肉処理グループの訪問部屋の個数が最も有意的に増加(１０分間平均７５箇所を訪問、Ｐ＜０．０５)した。代表的な抗憂鬱剤であるＰｒｏｚａｃ(１０分間平均６０箇所を訪問、Ｐ＜０．０５)または天然物であるセイントジョーンズウォート(１０分間平均５０箇所を訪問、Ｐ＜０．０５)より優れた抗憂鬱効果が確認された。これは蓮肉の投与によって活動性が活発になったためである。すなわち、ＣＭＳによる憂鬱症の誘発に起因した活動性の低下を克服したものと見られる。
【００６８】
出発潜在期(Start latency)の測定結果、８週ＣＭＳ処理の際に最後の４週間それぞれ薬物処理した後、オープンフィールドテストによって、オープンフィールドのドアを開いて最初にオープンフィールドを出た時間を測定すると、図６に示すように、対照群と比較して蓮肉処理グループのみが、出発潜在期が有意的に減少(Ｐ＜０．０５)した。代表的な抗憂鬱剤であるＰｒｏｚａｃまたは天然物であるセイントジョーンズウォートより優れた抗憂鬱効果が確認された。これは蓮肉の投与によって出発時間が速くなったことを意味する。すなわち、ＣＭＳによる好奇心と生に対する意欲低下を克服したものと見られる。
【００６９】
立ち上がり(Rearing)の測定結果、８週ＣＭＳ処理の際に最後の４週間それぞれ薬物処理した後、オープンフィールドテストによって、前足上げて歩く回数を測定すると、図７に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループのみが立ち上がり回数が有意的に減少(Ｐ＜０．０５)した。代表的な抗憂鬱剤であるＰｒｏｚａｃより優れた抗憂鬱効果が確認された。これは、蓮肉の投与によって新しい周囲環境に対する探検心が回復されたことを意味する。すなわち、ＣＭＳによる周囲環境に対する好奇心及び探検心の低下を克服したものと見られる。
【００７０】
身づくろい行動(Grooming)の測定結果、８週ＣＭＳ処理の際に最後の４週間それぞれ薬物処理した後、オープンフィールドテストによって、自分の身づくろいにかかる時間を測定すると、図８に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループのみが身づくろい時間が有意的に増加した(Ｐ＜０．０５)。代表的な抗憂鬱剤であるセイントジョーンズウォートとほぼ同様の抗憂鬱効果が確認された。これは、蓮肉の投与によって自分に対する関心が回復されたことを意味する。すなわち、ＣＭＳによる自分に対する関心の低下を克服したものと見られる。
【００７１】
（３）性行動
ＣＭＳを８週間与えて蔗糖減少(憂鬱症の代表的な症状)を確認し、抗憂鬱剤を４週間投与した後、ラットの交尾活動を観察する。検査場所は、暗くて静かな部屋であった。１６×１６インチの透明なアクリル箱を使用する。
【００７２】
検査を行う４８時間の前に、卵素が切除された成熟な雌ラットに安息香酸エストランジオール(estradiol benzoate)２０μｇを投与し、検査５時間の前には、プロゲステロン(progesterone)１ｍｇを投与することにより、その雌ラットが性的受容性を持つようにする。雄ラット１匹を環境に馴染ませるために毎３０分間箱内に置いておく。その後、雌ラットを入れて３０分間交尾行動を観察する。雌ラットの性的受容性が備えられた場合、すなわち発情した場合、雄ラットが乗り上がるように許容し、脊椎前湾を示す。雄ラットの性行動を乗り上がり(mounting)、挿入(intromission)、射精(ejaculation)に区分してそれぞれの頻度を測定した。雄ラットが３０分間見せた射精の回数(ejaculation number、この回数が多ければ多いほど性的能力がより優れるものと思われる)を記録し、１回射精してから再び射精するまでの時間を射精後挿入間隔(post-ejaculation interval、ＰＥＩ)という。この時間が短ければ短いほど、性的能力がより優れるものと思われる。
【００７３】
卵素切除の後、エストラジオール(Estradiol)とプロゲステロン(progesterone)を投与した雌と実験動物を同一ケージに入れて３０分間射精の頻度を測定した。その結果、図９に示すように、ビヒクル(vehicle)、フルオキセチン(fluoxetine)、セイントジョーンズウォート(St.John's wort)投与動物の性動物は正常動物に比べて著しく減少したが、蓮肉投与動物の性行動は統制動物と統計的に差異がなかった。これは、ＣＭＳによって抑制された性行動が蓮肉の投与によって回復されたことを示す結果である。
【００７４】
卵素切除の後、エストラジオール(Estradiol)とプロゲステロン(progesterone)を投与した雌と実験動物を同一ケージに入れ、３０分間最初に射精してから次の射精までにかかる時間を測定した。その結果、図１０に示すように、フルオキセチン、セイントジョーンズウォート投与動物の性行動は、ＣＭＳ処理動物（Ｃ）と有意的差異がなかったが、蓮肉投与動物の性行動は統制動物と統計的に差異があった。すなわち、ＰＥＩが有意に減少したことを示し、これはＣＭＳによって抑制された性行動が蓮肉の投与によって回復されたことを示す結果である。
【００７５】
<実験例３>蓮肉抽出物を用いた慢性ＣＭＳの下における抗憂鬱メカニズムの究明
正常的な状態と慢性ＣＭＳモデルで微細透析とＨＰＬＣ−ＥＣＤ方法を用いて５−ＨＴとＮＥの変動に及ぼす蓮肉抽出物の抗憂鬱効能を検証した。これにより、抗憂鬱剤作用の核心である直接的な神経伝達物質の増加有無を確認することができる。蓮肉処理による直接的な神経伝達物質の増加有無を確認すると、図１１に示すように、正常動物に蓮肉抽出物(１００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．)、セイントジョーンズウォート抽出物(５００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．)、及びフルオキセチン(１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．)を投与したとき、蓮肉抽出物５００及び１０００ｍｇ投与群で５−ＨＴの濃度を有意に増加させ、フルオキセチン(１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．)も５−ＨＴの濃度を有意に増加させ、セイントジョーンズウォート抽出物(５００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．)は５−ＨＴを増加させる傾向性は示したが、統計的有意性はなかった。正常的な状態でもフルオキセチンとほぼ同様にセロトニン濃度を増加させるのは、抗憂鬱製剤としての効能があることを意味する。
【００７６】
蓮肉のＣＭＳ憂鬱症モデルで抗憂鬱効果を検証するために、ＣＭＳを８週間連続的に繰り返し加えた後、海馬で５−ＨＴの変動を回復させるかを微細透析とＨＰＬＣ−ＥＣＤ方法を用いて検証した結果、図１２に示すように、８週間ストレスを加えたとき、海馬の５−ＨＴ濃度がＣＭＳ群で正常群に比べて有意に減少し、蓮肉抽出物を投与した集団のうち１０００ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．を投与した集団ではＣＭＳ群に比べて５−ＨＴを有意に増加させ(ｐ＜０．０５)、フルオキセチン(１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．)投与群はＣＭＳ群に比べて５−ＨＴの濃度を有意に増加させた(ｐ＜０．０５)。セイントジョーンズウォート抽出物(５００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．)投与群では、ＣＭＳ統制群と有意な差異を発見することができなかった。このような結果は、ＣＭＳによる動物憂鬱症モデルにおいて蓮肉抽出物が抗憂鬱効果を示すのを強力に示唆する。
【００７７】
５−ＨＴ１Ａ受容体の変化は、放射線同位元素である［３Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴを用いて観察する。５−ＨＴ１Ａ受容体の減少或いは非活性は、憂鬱症患者の前前頭葉、海馬、視床下部などに現われているが、抗憂鬱剤の投与によって、これらの受容体はその数が正常になるか、再び正常的な活性化がなされるものと知られており、これによる向神経性の行動(neurotrophic action)、神経細胞の生存(neuronal survival)などが増加する。憂鬱症による神経変性(neuro-degeneration)の治療及び憂鬱症の治療に効果がある。したがって、このように５−ＨＴ１Ａ受容体の拮抗剤(antagonist)を用いたバインディング(binding)実験によって５−ＨＴ１Ａ受容体の増加有無が分かる。蓮肉の投与によってＣＭＳ対照群と比較して５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が行われると、これを抗憂鬱効果の生体内分子的水準の標識と見られる。ＣＭＳと共に８週薬物処理の後、５−ＨＴ１Ａ受容体の増加による蓮肉の生体内抗憂鬱標識が確認される。
【００７８】
図１３に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループは脳の海馬、視床下部で５−ＨＴ１Ａ受容体拮抗剤を用いたバインディング実験によって５−ＨＴ１Ａ受容体の増加がＰｒｏｚａｃ群と類似であると確認される(binding intensity：Red>Yellow>Green)。したがって、蓮肉の投与による代表的な抗憂鬱標識である５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が確認される。
【００７９】
慢性ＣＭＳ８週処理の後、最後の４週間それぞれ薬物処理し、その後５−ＨＴ１Ａ受容体の増加による蓮肉の生体内抗憂鬱標識を確認した結果、図１４に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループは脳の海馬ＣＡ２部分で５−ＨＴ１Ａ受容体拮抗剤を用いたバインディング実験によって５−ＨＴ１Ａ受容体の増加がセイントジョーンズウォート処理群と類似であると確認される(それぞれ１４％、１５％増加)。ところが、これとは逆に、Ｐｒｏｚａｃ処理群は却って１２％減少した。これは蓮肉の他の抗憂鬱メカニズムを意味する。よって、蓮肉の投与による代表的な抗憂鬱標識である５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が確認される。蓮肉の投与は、記憶格納と長期記憶(long term memory)形成のために必ず経なければならない海馬ＣＡ２部分の５−ＨＴ１Ａ受容体を増加させる。これは、ＣＭＳによって損傷したこの部分に対する回復を意味する。ところが、Ｐｒｏｚａｃの場合、却って反対効果を示すので、毒性及び副作用を注意する必要がある。
【００８０】
図１５に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループは、脳の海馬ＣＡ３部分で５−ＨＴ１Ａ受容体拮抗剤を用いたバインディング実験によって他の薬物より優れた５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が確認される(１４％増加)。ところが、これとは逆に、Ｐｒｏｚａｃ処理群は却って２％減少した。これは蓮肉の他の抗憂鬱メカニズムを意味し、蓮肉の投与による代表的な抗憂鬱標識である５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が確認される。蓮肉の投与は、記憶格納と長期記憶形成のために必ず経なければならない海馬ＣＡ３部分の５−ＨＴ１Ａ受容体の増加を示す。これはＣＭＳによって損傷されたこの部分に対する回復を意味し、ひいては記憶力及び学習能力の低下を治療するものと予想される。しかし、Ｐｒｏｚａｃの場合、却って反対効果を示すので、毒性及び副作用に対する注意をする必要がある。
【００８１】
図１６に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループは、脳の前面大脳皮質(frontal cortex)、I−II部分で５−ＨＴ１Ａ受容体拮抗剤を用いた結合実験によって５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が確認される(１１％増加)。ところが、これとは逆に、Ｐｒｏｚａｃ処理群は蓮肉群と比較したとき、却って４６％有意に減少した(Ｐ＜０．０５)。これは蓮肉の他の抗憂鬱メカニズムを意味する。すなわち、蓮肉の投与による代表的な抗憂鬱標識である５−ＨＴ１Ａ受容体の増加が確認され、蓮肉の投与は認知能力に関与する脳の前面大脳皮質I−II部分で５−ＨＴ１Ａ受容体を増加させる。これは、ＣＭＳによって損傷したこの部分に対する回復を意味し、ひいては憂鬱症による認知能力低下を治療するものと予想される。ところが、Ｐｒｏｚａｃの場合、却って反対効果を示すので、毒性及び副作用を注意する必要がある。
【００８２】
図１７に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループは脳の視床下部部分で５−ＨＴ１Ａ受容体拮抗剤を用いたバインディング実験によって５−ＨＴ１Ａ受容体増加をセイントジョーンズウォート処理群と同様に確認した(それぞれ４２％、４４％増加)。Ｐｒｏｚａｃ処理群も７１％増加した。したがって、蓮肉の投与による代表的な抗憂鬱標識である５−ＨＴ１Ａ受容体の増加を確認した。蓮肉の投与は、憂鬱症を誘発するおそれのある慢性的なストレスに最も敏感に反応し、最も損傷を被った視床下部部分の５−ＨＴ１Ａ受容体を増加させる。これはＣＭＳによって損傷したこの部分に対する回復を意味する。
【００８３】
一般的な抗憂鬱製剤の投与は、セロトニンの量を増加させてセロトニン受容体を増加或いは活性化させ、それのダウンストリームであるアデニルシクラーゼ(adenyl cyclase)を活性化させてｃＡＭＰを増加させる。これはＰＫＡを活性化させ、ひいてはＣＲＥＢ、ＢＤＮＦとその受容体であるｔｒｋＢ、及びＥＲＫ(ＭＡＰキナーゼ)のタンパク質の量を増加させるものと報告された。これらによって細胞成長(cell growth)或いは細胞生存(cell survival)に関連した遺伝因子の発現を増幅させ、これらによって憂鬱症による神経細胞損傷(neuronal cell damage)を防ぎ、神経細胞(nerve cell)間の疎通(communication)と適応性(plasticity)を増加させるものと報告されている。蓮肉を投与した後、このような抗憂鬱標識或いはこれらと直接、間接に関連した因子の発現増加或いは発現減少を２−ＤＥシステムによって確認し、蓮肉の抗憂鬱の分子的メカニズムを究明することができる。ＩＥＦ(Isoelectric focusing)ゲルを用いて各脳海馬サンプル(brain hippocampus sample)を等電点(isoelectric point)によって分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてこれらをさらに分子量によって分離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて、蓮肉の投与によって増加または減少するタンパク質を確認する。
【００８４】
図１８及び図１９に示すように、対照群と比較して、蓮肉処理グループは４つのスポット(spot)が増加する。これは、対照群だけでなく正常群と比較しても、相当量の強さ(intensity)が増加することが分かる。この中でも、スポット１とスポット２は蓮肉とは逆に強さが減少することが分かる。蓮肉処理群による特別な生体内標識が発見される。４つのスポットのいずれも、セロトニン増加によるその受容体の活性化ダウンストリーム部門に関与する生体内抗憂鬱標識と関連があることが分かる。
【００８５】
スポット１．アデニロコハク酸シンテターゼ(Adenylosuccinate synthetase)
アデニロコハク酸シンテターゼ(Adenylosuccinate synthetase)は、ＡＭＰ生合成過程に関与する。海馬または前頭葉におけるｃＡＭＰ−減少信号変換体系は、憂鬱症の病理学的状態と連関がある。成長因子(Growth factor)によるこの酵素の活性化が報告されたことがあって、セロトニンの増加による５−ＨＴ受容体の活性化とそれによる成長因子の発現増加に起因したこの酵素の発現増加及び活性化を推測すれば、この場合、非常にゆっくりｃＡＭＰの増加を誘導するものと予想される。蓮肉による長時間にわたってのｃＡＭＰ増加は、薬物嗜癖(drug addiction)、薬剤使用中止による禁断症状(withdrawal symptom)の副作用及び性機能障害(sexual dysfunction)の解消可能性を示し、これとは逆に、Ｐｒｏｚａｃは、却ってこの酵素の活性を阻害するものと確認され、この酵素の活性化による間接的なｃＡＭＰ増加ではなく別のことによるｃＡＭＰ増加を誘発させるものと確認される。これは、ｃＡＭＰの直接且つ速い増加を意味するので、あまり速く生理システムを変化させて薬物嗜癖、薬剤使用の中止による禁断症状の副作用及び性機能障害を引き起こすものと推定される。
【００８６】
スポット２．シトクロムＣオキシダーゼポリペプチドVIａ−リバー、ミトコンドリア前駆体(Cytochrome C oxidase polypeptide VIa-liver, mitochondrial precursor)
シトクロムＣオキシダーゼは、ＡＴＰ生成の主要酵素として作用し、ミトコンドリア細胞内壁の陽性子の運搬に関与する。神経活動またはＡＴＰレベルと比例して変化する。神経活動またはＡＴＰの低下はシナプスの神経伝達機能の低下と密接な連関があり、憂鬱症は神経伝達機能の低下が特徴なので、シトクロムＣオキシダーゼポリペプチドVIａ−リバー(Cytocharome C oxidase polypeptide VIa-liver)の増加は憂鬱症の改善を示唆することができる。
【００８７】
スポット３．ミトゲン−活性化プロテインキナーゼ１(Mitogen-activated protein kinase 1)(Extracelluar signal-regulated kinase 2, ERK-2)
ＥＲＫ−２は、神経成長因子(Nerve Growth Factor)を活性化するものと知られている。抗憂鬱剤の投与による５−ヒドロキシトリプタミン(５-hydroxytryptamine、５ＨＴセロトニン)の増加は、海馬のセロトニン受容体の活性化を誘導し、新しいシナプス連結の成長を引き起こして、セロトニン受容体のダウンストリームであるＭＡＰＫの活動を増加させる。ＭＡＰＫは、遺伝子発現とシナプスの適応力、受容体の機能及び神経活動において重要な役割をする。この酵素は、また、例えばＣＲＥＢなどの転写調節因子(transcription factor)を活性化させて神経細胞の生存に必要な成長因子を作り出すものと報告されている。いろんな憂鬱症患者は、５−ＨＴレベルの減少によるシナプス連結の刺激伝達低下を示す。したがって、憂鬱症の改善はＭＡＰＫの増加と関連付けることができる。
【００８８】
スポット４．アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Aldehyde dehydrogenase)
このＡＬＤＨは、フルクトース、アセトアルデヒド、オキサレートメタボリズム(oxalate metabolism)の重要酵素(key enzyme)として反応性カルボニルとアルデヒドに対する毒素除去システムを代表する酵素である。ダウン症候群患者の脳からＡＬＤＨレベルを調査した結果、対照群に比べて半分以下に減少していることが確認された。これにより、神経伝達物質の不完全な分解によってプラーク(plaque)とタングル(tangle)を形成することにより、脳内神経信号伝達体系の撹乱が起こっていることが発表された。また、ＡＬＤＨの不足は、機能性の足りない５−ＨＴ受容体の突然変異と密接な関連がある。したがって、蓮肉によるＡＬＤＨ酵素の活性化は、５−ＨＴ受容体の保護と連関付けることができ、結局５−ＨＴ受容体のより優れた活性化を意味し、この活性化による一層優れた抗憂鬱効果を考えることができる。これとは逆に、ＰｒｏｚａｃによるＡＬＤＨ酵素の減少は、別の抗憂鬱作用の神経伝達物質であるＮＥの減少を加速化し、また機能性の足りない５−ＨＴ受容体の突然変異をたくさん引き起す可能性があって、これも毒性及び副作用を引き起こすおそれがある。
【００８９】
<実験例４>ラットに対する経口投与急性毒性実験
６週齢の特定病原体未感染(specific pathogen-free、ＳＰＦ)のＳＤ系ラットを用いて急性毒性実験を行った。群当り５匹ずつの動物に、本発明の蓮肉抽出物をそれぞれ０．５％メチルセルロース溶液に懸濁してそれぞれ５ｇ／ｋｇ、１０ｇ／ｋｇ及び２０ｇ／ｋｇの用量で単回経口投与した。試験物質投与の後、動物の斃死有無、臨床症状、体重変化を観察し、血液学的検査と血液生化学的検査を行い、剖検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常有無を観察した。
【００９０】
その結果、試験物質を投与した全ての動物からは、特記すべき臨床症状または斃死現象は現われず、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などにおいても毒性変化は観察されなかった。以上の結果より、本発明の蓮肉抽出物は、全てのラットで２０ｇ／ｋｇまで毒性変化を示さず、よって、経口投与中間致死量(ＬＤ５０)が蓮肉抽出物２０ｇ／ｋｇ以上である安全な物質と判断された。
【００９１】
<製剤例１>軟質カプセル剤の製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物１００．０ｍｇ、大豆油１７５．０ｍｇ、黄蝋４５．０ｍｇ、椰子硬化油１２７．５ｍｇ、大豆リン脂質２１．０ｍｇ、ゼラチン２１２．０ｍｇ、グリセリン(比重１．２４)５０．０ｍｇ、ジソルビトール７６．０ｍｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．５４ｍｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０．９０ｍｇ、メチルバニリン０．５６ｍｇ、黄色２０３号適量の成分が１カプセル中に含有されるように、大韓薬典(韓国薬局方)製剤総則中の軟質カプセルの製法によって製造した。
【００９２】
<製剤例２>錠剤の製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物１００．０ｍｇ、コーンスターチ９０．０ｍｇ、乳糖１７５．０ｍｇ、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース１５．０ｍｇ、ポリビニルピロリドン９０５．０ｍｇ及びエタノール適量の原料を均質に混合して湿式顆粒法で顆粒化し、ステアリン酸マグネシウム１．８ｍｇを加えて混合した後、１錠が４００ｍｇとなるように打錠した。
【００９３】
<製剤例３>カプセル剤の製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物１００．０ｍｇ、コーンスターチ８３．２ｍｇ、乳糖１７５．０ｍｇ、及びステアリン酸マグネシウム１．８ｍｇの原料を均質に混合し、１カプセルに３６０ｍｇが含有されるように充填した。
【００９４】
<製剤例４>食品及び飲料の製造方法
本発明者らは、蓮肉抽出物を有効成分として含有する食品または飲料組成物を下記の如く製造した。
【００９５】
<４−１>チューインガムの製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物０．２４〜０．６４％、ガム基礎剤２０％、砂糖７６．３６〜７６．７６％、フルーツ香１％、及び水２％の組成及び含量にして通常の方法を用いてチューインガムを製造した。
【００９６】
<４−２>アイスクリームの製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物０．２４〜０．６４％、乳脂肪１０．０％、無脂固形分１０．８％、砂糖１２．０％、水あめ３．０％、乳化安定剤(スパン)０．５％、香料(イチゴ)０．１５％、及び水６３．３１〜６２．９１％の組成及び含量にして通常の方法を用いてアイスクリームを製造した。
【００９７】
<４−３>飲料の製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物０．４８〜１．２８ｍｇ、蜜５２２ｍｇ、チオクト酸アミド５ｍｇ、ニコチン酸アミド１０ｍｇ、塩酸リボフラビンナトリウム３ｍｇ、塩酸ピリドキシン２ｍｇ、イノシトール３０ｍｇ、オロチン酸５０ｍｇ、及び水２００ｍＬの組成及び含量にして通常の方法を用いて飲料を製造した。
【００９８】
<４−４>ソーセージの製造
実施例１によって製造された蓮肉抽出物０．２４〜０．６４％、豚肉６３．６％、鶏肉２７．５％、澱粉３．５％、大豆タンパク１．７％、食塩１．６２％、ブドウ糖０．５％、及びその他の添加物(グリセリン)０．９４〜１．３４％の組成及び含量にして通常の方法を用いてソーセージを製造した。
【００９９】
以上説明した本発明は、その技術的思想または主要な特徴から逸脱することなく、他の様々な形態で実施することができる。したがって、前述した実施例は、全ての点で単純な例示に過ぎず、限定的に解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明の蓮肉抽出物を一日投与した白ネズミと対照群、フルオキセチン投与群及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの強制水泳検査における四肢不動時間を比較したグラフ
【図２】本発明の蓮肉抽出物を６日間投与した白ネズミと対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの強制水泳検査における四肢不動時間を比較したグラフ
【図３】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのＣＭＳ下における蔗糖溶液摂取量を比較したグラフ
【図４】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのＣＭＳ下における体重を比較したグラフ
【図５】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのオープンフィールドにおける訪問した部屋の数を比較したグラフ
【図６】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのオープンフィールドにおける出発潜在期を比較したグラフ
【図７】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのオープンフィールドにおける立ち上がり回数を比較したグラフ
【図８】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのオープンフィールドにおける身づくろい時間を比較したグラフ
【図９】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの射精回数を比較したグラフ
【図１０】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの射精後挿入間隔(post-ejaculation interval)を比較したグラフ
【図１１】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの神経伝達物質の増加有無を比較したグラフ
【図１２】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとのＣＭＳ下における神経伝達物質の増加有無を比較したグラフ
【図１３】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの受容体バイディングを比較したオートラジオグラフィー
【図１４】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの海馬のＣＡ２部分の受容体増加を比較したグラフ
【図１５】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの海馬のＣＡ３部分の受容体増加を比較したグラフ
【図１６】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの脳の前面大脳皮質I−II部分の受容体増加を比較したグラフ
【図１７】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、フルオキセチン投与群、及びセイヨウオトギリソウ抽出物投与群の白ネズミとの脳の視床下部部分の受容体増加を比較したグラフ
【図１８】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、及びフルオキセチン投与群の白ネズミとの関連タンパク質の増減を比較した写真
【図１９】本発明の蓮肉抽出物を投与した白ネズミと正常群、対照群、及びフルオキセチン投与群の白ネズミとの関連タンパク質スポットの強さを比較した表
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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