(57)【要約】【課題】表面、腔、及び食品原料のための抗菌ラクトフェリン組成物【解決手段】本発明は、特に口腔表面又は負傷した皮膚、外科的機器のような不活性表面、あるいは肉のような食品原料の、表面の汚染除去のための方法及び組成物に関し、該方法は、酸性ｐＨのラクトフェリン溶液；ラクトフェリン及びＥＤＴＡの溶液；ラクトフェリン及びＥＤＴＡの酸性ｐＨ溶液、又はそれらの組み合わせによって表面を処理することからなる。該溶液は任意に、ポリサッカリド、好ましくは略中性のｐＨで負に帯電したポリサッカリド、例えばペクチンをさらに含む。【選択図】      なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面及び食品原料の微生物汚染を減少するための方法であって、以下の一以上で表面を処理することを含む方法：
ａ）酸性ｐＨのラクトフェリン溶液；
ｂ）ラクトフェリン及び金属キレート剤、特にＥＤＴＡの溶液；
ｃ）ラクトフェリン及び金属キレート剤、特にＥＤＴＡの、酸性ｐＨの溶液。
【請求項２】
前記溶液のｐＨが、前記表面の処理の前に、前記請求項１ａ）、１ｂ）又は１ｃ）で定義されたような溶液の初期のｐＨ以上の値、特に、ｐＨ 2〜8.5、好ましくはｐＨ 5〜8、より好ましくはｐＨ 6〜7まで上昇されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液がさらに、一以上のポリサッカリド、好ましくは略中性のｐＨで負に帯電したポリサッカリドを含む、請求項１及び２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリサッカリドは、ペクチン、カラゲナン、ヘパリン、寒天からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酸性ｐＨは、５未満のｐＨ、好ましくは４未満、より好ましくは３未満、さらにより好ましくは2.5未満、最も好ましくは約２のｐＨである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液中のＥＤＴＡの濃度が、0.1 mMより高く、好ましくは0.2 mMより高く、好ましくは少なくとも0.4 mMであり、より好ましくは少なくとも0.6 mMであり、さらにより好ましくは少なくとも0.8 mMであり、及び最も好ましくは少なくとも1 mMである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液中のラクトフェリンの量が、0.2〜20％(W/V)であり、好ましくは0.5〜12％(W/V)であり、より好ましくは1〜8％(W/V)であり、さらにより好ましくは2〜6％(W/V)であり、最も好ましくは約2％(W/V)である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ラクトフェリンが、ウシラクトフェリン、又は天然のウシのものと95〜100％アミノ酸相同性を示す（組換え）ヒトラクトフェリン又は（組換え）ヒトラクトフェリンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリサッカリドの量が、0.001〜0.2％(W/V)であり、好ましくは0.01〜0.1％(W/V)であり、最も好ましくは約0.02％(W/V)である、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理されるべき表面が、口腔内における表面、負傷した皮膚、又は外科的機器（外科的刃身、鉗子、ハサミ、チューブなど）におけるような不活性表面である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記処理されるべき食品表面が肉である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
表面又は食品原料の微生物汚染を減少させるための組成物であって、ラクトフェリン及び任意に金属キレート剤、特にＥＤＴＡを含み、酸性ｐＨを有する組成物。
【請求項１３】
さらに、一以上のポリサッカリド、好ましくは略中性のｐＨで負に帯電したポリサッカリドを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリサッカリドが、ペクチン、カラゲナン、ヘパリン、寒天からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、ＥＤＴＡを含まず、３未満、好ましくは2.5未満、より好ましくは2.3未満、さらにより好ましくは2.1未満のｐＨを有し、最も好ましくは約２のｐＨである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、ＥＤＴＡを含み、５未満、好ましくは４未満、より好ましくは３未満、さらにより好ましくは2.5未満のｐＨを有し、最も好ましくは約２のｐＨである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記溶液中のＥＤＴＡの濃度が、0.1〜10 mMであり、好ましくは0.5〜5 mMであり、最も好ましくは約1 mMである、請求項１２〜１４及び１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
その使用が食品原料中又は食品原料上である場合に、0.1 mMより高く、好ましくは0.2 mMより高く、好ましくは少なくとも0.4 mMであり、より好ましくは少なくとも0.6 mMであり、さらにより好ましくは少なくとも0.8 mMであり、及び最も好ましくは少なくとも1 mMである、前記溶液中のＥＤＴＡ濃度を有する、請求項１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物中のラクトフェリンの量が、0.2〜20％(W/V)であり、好ましくは0.5〜12％(W/V)であり、より好ましくは1〜8％(W/V)であり、さらにより好ましくは2〜6％(W/V)であり、最も好ましくは約2％(W/V)である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ラクトフェリンが、ウシラクトフェリン、又は天然のウシのものと95〜100％アミノ酸相同性を示す（組換え）ヒトラクトフェリン又は（組換え）ヒトラクトフェリンである、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリサッカリドの量が、0.001〜0.2％(W/V)であり、好ましくは0.01〜0.1％(W/V)であり、最も好ましくは約0.02％(W/V)である、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載組成物。
【請求項２２】
前記組成物が液体の形態、又は粉末のような乾燥産物である、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記乾燥産物が、乾燥配合物又は乾燥された溶液である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
創傷治療における使用のための、請求項１２〜１８及び２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
口部治療における使用のための、請求項１２〜１８及び２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
外科的機器（外科的刃身、鉗子、ハサミ、チューブなど）のような、不活性の表面の汚染除去における使用のための、請求項１２〜１８及び２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
食品産物、特に肉の汚染除去における使用のための、請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、表面及び腔／周囲、特に口腔表面又は負傷した皮膚又は汚染除去が必要な不活性表面の微生物汚染、あるいは肉及びそれらの表面のような食品原料の微生物汚染を減少させるための方法に関し、並びに、該方法において使用するための組成物に関する。
【０００２】
それらの表面のすべては、細菌、真菌、原生動物及びウイルスによる微生物汚染を起こしやすい。
【０００３】
細菌は、口腔がその最初の部分である消化管の通常の居住者である。常在性又は内在性の菌叢（flora）として通常知られる菌叢から、微生物条件における変化のために特異的な細菌が発達し、日和見感染を起こし得る。口の健康は、内在性の細菌と口の防御システムの間の平行状態である。
【０００４】
口の防御力は、主に、物理的なバリヤー（角質化した上皮、粘膜産生、唾液を流すこと）、化学的成分の産生（唾液の酵素及び抗菌性の歯肉の液体分泌など）、及び炎症反応に基づいている。すべての口の表面から毎日１００ビリオンの細菌が唾液中に流されていることが推定されている。全プラーク菌叢は、唾液の菌叢の約５％を構成している。約３００の異なる種を、歯のプラーク単独から単離することができる。１ｍｇの歯のプラークは、約１０ミリオンの細菌を含む。臨床的に健康な歯肉の菌叢は、主に好気性菌及び通性嫌気性菌で構成される。歯肉病に付随する歯肉下の菌叢は、主に嫌気性である。他の口の感染病は、カリエス、歯根尖端周囲の感染、歯原性の感染、骨髄炎及び口内炎を含む。
【０００５】
口の感染病の発展のリスクを避けるために、望ましくない細菌及び他の部生物による口腔の汚染は避けられるべきである。これは、定期的なブラッシング及び歯をフロスできれいにすることなどのような通常の口の衛生により達成することができるが、しかし、これは十分でないことがある。それゆえ、口腔の微生物汚染をさらに減少させることができる補助産物の必要性が存在する。これが、本発明の第一の目的である。
【０００６】
外傷傷害がない場合、健康な皮膚は、細菌−非病原体及び同様に病原体−と調和した関係で生きている。組織生検の定量的アッセイは、１グラムあたり103生物の範囲の細菌密度を示す。ほとんどの皮膚性の細菌は、上皮の割れ目の凹んだところ−汗腺、毛嚢、及び他の肌の付属器に生息する。にもかかわらず、皮膚は感染に対する重要なバリヤーとして役立っている。
【０００７】
組織ｐＨ、外皮層の乾燥、及び局所的分泌のような多くの変数が、皮膚内の細菌の増殖に影響を与え得る。皮脂腺で生産された脂肪酸は、連鎖球菌の増殖に特に有効な阻害剤である。しかしながら、傷害は、平衡状態を劇的に変化させる。髭剃りのような極小の外傷でさえ、細菌レベルを増加させる。火傷は、細菌の侵入に対するケラチンバリアを破壊する。裂傷は、深部組織層を露出する。
【０００８】
創傷の感染を避けるためには周辺細菌によるそれらの汚染を避けねばならない。創傷及び周辺組織の微生物汚染を減少するための手段を提供することが、本発明の第二の目的である。
【０００９】
食品原料及び特に食品表面において、細菌、真菌、原生動物及びウイルスによる微生物汚染が起こりやすい。
【００１０】
新鮮な肉又は精肉産物上の細菌の総生存数は、その有効期間を制限する。総生存数が高すぎるようになると、肉は「傷む(spoil)」。健康な食用動物の可食部組織は屠殺の前には本質的に無菌であるにもかかわらず、というのも外部の及び内部の組織表面における種々の生来の宿主の防御メカニズムが有効なバリヤーを作成し、微生物が生きた動物に侵入することを予防するためであるが、該動物が屠殺されるとすぐに、侵入する微生物に対する天然の防御が実質的に消滅し、露出された組織は微生物のコロニー形成と増殖にきわめて影響されやすくなる。屠殺及び加工の間の汚染、及びさらに貯蔵の間の汚染は、温度、ｐＨ及び相対湿度が肉の品質低下を誘導し、さらに悪いことには、消費者に食中毒をもたらす。
【００１１】
それゆえ、肉及び他の食品産物の微生物汚染を減少させるための手段を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１２】
ラクトフェリンは、免疫システム応答において重要な役割を果たす、多方面にわたる生理活性乳たんぱく質であり、感染に対する身体の保護を助ける。免疫システムの刺激の他に、ラクトフェリンは、病原体の増殖を防ぎ、抗菌性及び抗ウイルス性の性質を発揮し、酸化による細胞及び組織の損傷を制御し、及び鉄輸送を促進する。
【００１３】
汚染除去の処理において使用するため、ラクトフェリンの抗菌活性を改良することは、本発明の目的である。
【００１４】
この目的は、表面及び周辺上の微生物汚染を減少させる方法によって達成することができ、以下の一以上で表面を処理することを含む：
ａ）酸性ｐＨのラクトフェリン溶液；
ｂ）ラクトフェリン及び金属キレート剤、特にＥＤＴＡの溶液；
ｃ）ラクトフェリン及び金属キレート剤、特にＥＤＴＡの、酸性ｐＨの溶液。
【００１５】
酸性ｐＨは、５未満のｐＨであり、好ましくは４未満、より好ましくは３未満、さらにより好ましくは2.5未満、最も好ましくは約２のｐＨである。ｐＨ１までのより低いｐＨは、本発明にしたがって可能であるが、しかし通常は必須ではない。
【００１６】
ポリサッカリド、好ましくは略中性ｐＨで負に帯電したポリサッカリド（例えば、ペクチン、カラゲナン、ヘパリン、寒天）の使用が、本発明の組成物の抗菌活性をさらに増強するということが、さらに発見された。ポリサッカリドの量は、0.001〜0.2％(W/V)であり、好ましくは0.01〜0.1％(W/V)であり、最も好ましくは約0.02％(W/V)である。
【００１７】
本発明で使用するための金属キレート剤の適切な例は、ＥＤＴＡ及びホスホン酸である。後者は特に、口部治療への適用に使用するのに適切である。
【００１８】
ＥＤＴＡがラクトフェリン溶液に加えられる場合、そのｐＨは中性に近づき、ＥＤＴＡなしで低ｐＨで見出された同様の汚染除去が達成される。さらにその上、ＥＤＴＡ単独で、すなわち、ｐＨを５未満まで低下することなしで、ラクトフェリン溶液の抗菌活性を増強することも証明されている。
【００１９】
2% (W/V) ラクトフェリン及び１ mM ＥＤＴＡの溶液は、約５のｐＨを有する。そのような溶液は、ｐＨのさらなる調整なしで本発明のために役立つ。ｐＨをより酸性領域に調整したとき、これは「ラクトフェリン及びＥＤＴＡの酸性ｐＨの溶液」と呼ばれる。
【００２０】
いずれのケースにおいても、即ち、より酸性値へのｐＨ調整をしたかしないかのいずれのケースにおいても、溶液中のＥＤＴＡの濃度は、0.1〜10 mMであり、好ましくは0.5〜5 mMであり、最も好ましくは約1 mMである。
【００２１】
ラクトフェリンの必要量は、当該分野の技術者によって測定されることができるが、溶液中のその濃度は、適切には0.2〜20％(W/V)であり、好ましくは0.5〜12％(W/V)であり、より好ましくは1〜8％(W/V)であり、さらにより好ましくは2〜6％(W/V)であり、最も好ましくは約2％(W/V)である。
【００２２】
本発明の方法によって処理される表面のひとつのタイプは、適切には、口腔又は負傷した皮膚である。他の表面は、例えば、外科的機器（外科的刃身、鉗子、ハサミ、チューブなど）におけるような不活性の表面が想定できる。
【００２３】
本発明のラクトフェリン溶液は、細菌、真菌、原生動物及びウイルスを含む広範な微生物に対して有効である。
【００２４】
本発明の方法によって制御されうる口腔の微生物は、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、サングイス連鎖球菌（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、アクチノマイセス・ビスコーサス（Actinomyces viscosus）、アクチノマイセス・イスラエリー（Actinomyces israelii）、アクチノマイセス・ゲレンセリエ（Actinomyces gerencseriae）、ポルフィロモナス・ジンジヴァリス（Porphyromonas gingivalis）、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobavterium nucleatum）、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、アクチノマイセス・ネスランディー（Actinomyces naeslundii）、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）である。
【００２５】
創傷治療適用において、例えば以下の微生物が制御されることが可能である：大腸菌（Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、エンテロバクター・アエロジェネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ属（Klebsiella spp）、例えば、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、霊菌（Serratia marcessens）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ファカリス（Streptococcus faecalis）、プロビデンシア属（Providencia spp.）、エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus spp.）、バクテロイデス属（Bacteroides spp.）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）及びヒト真菌種様毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィリン・トンスランス（Trichophyton tonsurans）、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、エピダーモフィトン・フロコッサム（Epidermophyton floccosum）、石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum）。
【００２６】
また、本発明のラクトフェリン溶液は、細菌、真菌、原生動物及びウイルス、特に、食品性（food-borne）病原体、食品性（food-borne）放射性抵抗性細菌、及び食品の品質低下微生物を含む、食品原料に対する脅威を構成する広範な微生物に対して有効である。本発明の方法によって制御することができる代表的な細菌には、腸内毒素原性の大腸菌、腸管病原性の大腸菌、赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・アボニー（Salmonella abony）、サルモネラ・ダブリン（Salmonella dublin）、サルモネラ・ハートフォード（Salmonella hartford）、サルモネラ・ケンタッキー（Salmonella kentucky）、サルモネラ・パナマ（Salmonella panama）、雛白痢菌（Salmonella pullorum）、サルモネラ・ロストック（Salmonella rostock）、サルモネラ・トンプソン（Salmonella thompson）、サルモネラ・ビスコー（Salmonella virschow）、カンピロバクター・ジェジュニー（Campylobacter jejuni）、アエロモナス・ハイドロフィリア（Aeromonas hydrophila）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ヒークス（Staphylococcus hyicus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphyulococcus hominis）、スタフィロコッカス・ワリネリ（Staphylococcus warineri）、スタフィロコッカス・キシロサス（Staphylococcus xylosus）、スタフィロコッカス・クロモゲネス（Staphylococcus chromogenes）、リステリア（Listeria）、カンピロバクター（Campylobacter）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）、及び放射性耐性菌、例えば、ブロクオスリクス・セルモスパクタ（Brochothrix thermospacta）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）、デイルノコッカス・ラジオプグナンス（Deilnococcus radiopugnans）、デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）、デイノバクター・グランディス（Deinobacter grandis）、アシネトバクター・ラジオレジスタンス（Acinetobacter radioresistens）、メチロバクテリウム・ラジオトーレランス（Methylobacterium radiotolerans）が含まれる。本発明の方法によって処理される他の表面は、適切には肉である。本発明の方法は、血清型Ｏ157：Ｈ7を含むベロ毒素性大腸菌による肉の汚染を減少させるのにきわめて効果的であることが発見された。
【００２７】
前記溶液のｐＨは、表面に適用した後上昇し、肉表面上でその緩衝能力のために上昇するが、しかし該溶液の抗菌性能力は、それにもかかわらず維持される。
【００２８】
ラクトフェリンは、そのより高い活性を得るために、酸でわずかな時間処理されることだけを必要とすることが発見された。酸処理の適切な持続時間は、30秒から７日間まで変動し、好ましくは10分から３日間まで、より好ましくは１〜２４時間まで、さらにより好ましくは２〜１２時間まで変動し、最も好ましくは約４時間である。それゆえ、ラクトフェリンを酸での前処理に供し、その後にＮａＯＨ、重炭酸ナトリウムなどを用いてｐＨをより中性値に調整することも可能である。創傷治療及び口の治療への適用のために、より中性のｐＨが望ましい。
【００２９】
ラクトフェリン溶液のｐＨは、有機酸及び無機酸の両方で低下することができる。創傷治療及び口の治療のために、以下の酸が特に有用である：リン酸、硫酸、塩酸、乳酸、クエン酸、ソルビン酸、安息香酸、酢酸、ペルオキシ酢酸、過酸化水素と組み合わせたペルオキシ酢酸、又はそれらの酸の一以上の組み合わせ。肉への適用には、リン酸、硫酸、塩酸、乳酸、クエン酸、アスコルビン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酢酸、ペルオキシ酢酸、過酸化水素と組み合わされたペルオキシ酢酸、又はそれらの酸の一以上の組み合わせ、のような酸を用いることができる。ラクトフェリンの増強された抗菌性効果を達成するのに十分に低いｐＨ値を達成するために、強酸が好ましい。
【００３０】
本発明はさらに、表面の微生物汚染を減少させるための組成物に関し、該組成物は、ラクトフェリン及び任意にＥＤＴＡを含み、酸性ｐＨを有する。肉への適用の場合には、ポリサッカリド、好ましくは略中性のｐＨで負に帯電したポリサッカリドが、単独で又はＥＤＴＡとともに用いられうる。
【００３１】
該組成物がＥＤＴＡを含まない場合、ｐＨを、ｐＨ５以下の酸性値に調整することが必要である。（脱塩）水中にＥＤＴＡが存在する場合、ｐＨはすでに約５である。ＥＤＴＡが存在する場合、ｐＨは任意にさらに低下されてもよい。
【００３２】
ラクトフェリン、ポリサッカリド及びＥＤＴＡの量、及び好ましいｐＨは、上記のように定義される。
【００３３】
本発明の組成物は、溶液であってよいが、種々の成分の乾燥配合物（dry blend）または全体としての溶液を乾燥させて得られた組成物であってもよい。乾燥配合物は、水、好ましくは脱塩された水を加えて元に戻すことができる。そのような乾燥配合物は、ラクトフェリン及び任意にＥＤＴＡ及び／又はポリサッカリド、好ましくは略中性のｐＨで負に帯電したポリサッカリドを固体形態で含み、任意に、固体形態で入手可能である場合には酸性組成物とともに含む。また、乾燥配合物は、ラクトフェリン及び任意にＥＤＴＡ及び／又はポリサッカリド、好ましくは略中性のｐＨで負に帯電したポリサッカリドを含んでもよく、そのｐＨは配合物の溶解後に調整されてよい。さらなる態様において、ＥＤＴＡは、まだＥＤＴＡを含んでいない乾燥配合物の溶解後に添加されてよい。口への適用のために、ＥＤＴＡの代わりにリン酸のような他の金属キレート剤を用いることができる。すでに酸性化された溶液を乾燥して乾燥配合物を得る場合、その溶液のｐＨは、スプレードライ、凍結乾燥、回転乾燥（tumble drying）のような乾燥の前に、中性か又は中性近くに調整されることができる。
【００３４】
「溶液」は、活性成分ラクトフェリン及び任意に金属キレート剤、特にＥＤＴＡ、及び／又はポリサッカリド、好ましくはペクチンのような略中性ｐＨで負に帯電したポリサッカリドを含む、溶解された形態、即ち、液体からゲルまで変動する形態である、いずれのものをも意味するように理解される。創傷及び口の治療のための任意の他の成分は、塩、緩衝成分、保存剤である。口の治療への適用において、着色料(colouring)、香料(flavouring)、甘味料(sweetener)（非カリエス性の）を添加することもできる。肉への適用のための任意の他の成分は、シュウ酸又はそれらの塩：クエン酸又はそれらの塩；重炭酸ナトリウム；塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、乳酸塩、二酢酸ナトリウムのような塩；ナイシン（nisin）；香料剤；着色剤；保存剤などを含む。
【００３５】
好ましくは該組成物は、口の治療及び創傷治療の適用において施用される場合は、おおよそ中性のｐＨ（６〜７）に中和される。該組成物は、中和した後でなお高い抗菌活性を示すことが発見された。
【００３６】
創傷治療の適用のために、本発明の組成物は、溶液、スプレー、ゲル、創傷包帯剤、クリーム、軟膏、衛生上のふき取り、絆創膏の形態であってもよい。
【００３７】
本発明の組成物は、ヒト又は動物の身体のすべての部分上での創傷の治療のために用いることができる。
【００３８】
本発明の組成物は、口の治療に用いられる場合、洗口（mouth wash）、練り歯磨き、ゲル、うがい溶液、義歯クレンザー、チューイングガム、歯磨剤、スプレー、カプセル、錠剤の形態で適用されることができる。
【００３９】
食品への適用において、特に肉の汚染除去において、本発明の組成物は、スプレー、浸漬、コーティングなどによって適用されることができる。
【００４０】
本発明の組成物は、微生物の汚染又は増殖を起こしやすい全ての食品産物の汚染除去のために有用である。そのような産物は、ヒト又は動物の消費のための、加工された食品表面及び未加工の食品表面、減圧／微量-好気性（micro-aerophilic）の、パックされたか又は不活性ガス下でパックされたか又は非減圧パックされたものを含む。該組成物は特に、牛肉製品、豚肉製品及び鶏肉製品、例えばソーセージ、サラミ、ホットドック、ハンバーグ、ヒレ肉などのようなものを含む、全ての筋肉及び挽き肉製品の処理に有用である。加えて、該組成物は、スライスチキン、ハム、ポーク、ターキー、フィレアメリカイン（Filet Americain）などのような、加工されたデリカテッセン肉の処理において有用である。
【００４１】
本発明の組成物は、処理されるべき食品産物の調製の間のいつでも適用されることができる。例えば、該産物が肉である場合、該組成物は、屠殺の間又は胴体洗浄の間、あるいは、肉産物が挽き肉製品である場合には、肉の粉砕又は粉砕肉の調製の間、又は製造の間に適用されてよい。適用後、食品表面のＬＦの濃度は、典型的には、食品表面１ cm2あたり1 ng〜50 mgラクトフェリンの範囲であり、好ましくは１ cm2あたり10 ng〜５ mg、より好ましくは0.1 mg〜0.5 mgである。
【００４２】
いくつかの態様において、該組成物は、例えば微細なスプレーとして適用することによって、ソーセージ、サラミ、ホットドックなどを作るためのバッターを包装に詰める前に、包装の内部表面上にフィルムを形成するために用いられる。適切なコーティング製剤は、本発明の組成物とカラゲナン、ゼラチン又はコラーゲン（Ｉ型及びＩＩ型）のようなフィルム形成剤とを組み合わせることによって製造される。抗菌性活性は保持され、包まれた食品産物の微生物汚染を防止し、又は有害な微生物の増殖又は剥離を防ぐ。本発明の組成物は、精肉業において包装材料として用いられる、蝋コーティングされた包装材料、セルロース系材料又はポリエチレンライナーのような精肉包装材料のためのコーティング中でも有用である。コーティングは、その抗菌活性の全期間中安定である。
【００４３】
本発明にしたがって有用であるラクトフェリンは、哺乳類源（ヒト、雌牛、雌豚、雌馬、遺伝子組換え動物など）、初乳、移行乳、成熟した乳、授乳期間の後期の乳などのような生物学的な分泌物、あるいはスキムミルク及び乳清のようなそれらの加工製品から単離されたラクトフェリンを含む。組換えヒトラクトフェリンを含む、組換えラクトフェリンも有用であり、それは、原核生物細胞及び真核生物細胞のいずれかでクローン化され発現される。これは、天然のウシ又はヒトラクトフェリンに少なくとも９５％アミノ酸相同性を示す、ウシ及び（組換え）ヒトラクトフェリンを含む。
【００４４】
ラクトフェリンは、クロマトグラフィー（イオン交換、陽イオン及び陰イオンの両方；分子篩又は親和性）によるような、従来の任意の方法によって単離することができる。適切なラクトフェリンは、例えばＤＭＶインターナショナルニュートリショナルス（オランダ）から商業的に入手することもできる。
【００４５】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。実施例において、ラクトフェリン単独と比較した場合の、本発明の組成物の改良された抗菌活性は、インビトロ系（水蒸気滅菌トリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）における大腸菌ATCC 43895の増殖阻害、或いは、ろ過滅菌ルリア・ブロス・ベース（Luria Broth Base）（ＬＢ）におけるPs.アエルギノーサ（Pak株）の増殖阻害）において及び口及び創傷治療試験モデルにおいて、証明されている。実施例において、以下の図面を参照する：
図１：ＰＢＳ中の２％(W/V)ＬＦサンプルの抗菌活性におけるｐＨの影響、ＬＦなしでの増殖コントロールを含む。図１Ａは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に関する。大腸菌／ラクトフェリン比は、530 CFU’s：１ mgラクトフェリンであった。図１Ｂは、シュードモナス・アエルギノーサ（Ps. aeruginosa／ＬＦ比が200 CFU’s:1 mg LF）に関する。
【００４６】
図２：２％（W/V）ＬＦを有するか有さない脱塩水を用いる、異なるＥＤＴＡ濃度、0 mM EDTA、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM EDTA、及び1 mM EDTAの、大腸菌の増殖に及ぼす影響。大腸菌／ＬＦ比は270 CFU’s:1 mg LFであった。
【００４７】
図３Ａ：大腸菌／ＬＦ比  460 CFU’s:1 mg LFを用いた、ＰＢＳ中、２％(W/V)ＬＦ／0.2 mM EDTAの抗菌活性におけるｐＨの影響。図３Ｂは、ＰＢＳ中、２％(W/V)ＬＦ／0.2 mM EDTAの、Ps.アエルギノーサに対する抗菌活性におけるｐＨの影響を示す（Ps. aeruginosa/LF比265 CFU’s:1 mg LFであった）。
【実施例】
【００４８】
実施例１
トリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）阻害アッセイにおける細菌増殖の阻害
本発明の組成物を、以下のように行ったインビトロでのトリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）増殖阻害アッセイにおいて試験した。
【００４９】
18 mlのTSB中で、２ mlの定常状態の大腸菌培養物を３７℃で2.5時間培養して、対数期の大腸菌ATCC 43895培養物を調製した。続いて、30 mlのＰＢＳを加え、3600 rpmで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを20 mlのＰＢＳに再懸濁した。大腸菌の濃度を、ＰＢＳでもって約2-5E8/mlから1E4/mlまで希釈した。
【００５０】
10 mlのＬＢ中の定常期のPs.アエルギノーサ培養物に、40 mlのPBSを加え、続いて3600 rpmで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを10 mlのＰＢＳに再懸濁した。Ps.アエルギノーサの濃度を、ＰＢＳで約1E9/mlから2E3/mlまで希釈した。
【００５１】
0及び2％(W/V)のラクトフェリン（ＬＦ）を含む試験溶液を、適切な量のＥＤＴＡを含むか含まない脱塩水又はＰＢＳ中に作った。ｐＨを塩酸で調整した。
【００５２】
阻害アッセイを、特異な平底１００ウェルプレートを用いて、バイオスクリーンＣアナライザーシステム（登録商標）（Thermo Labsystems Oy, Finland）によって行った。ウェルは、下記表１にしたがって充填した（ｎ＝４〜８）。
【表１】
2007523204.tif 000002
【００５３】
次いで、プレートを３７℃でインキュベーションした。バイオスクリーンＣアナライザーシステムを用いて、ＯＤ420-580 nmを連続的に測定した。プレートは、各測定の前に振盪した（１０秒間）。
【００５４】
実施例２
ラクトフェリンの抗菌活性におけるｐＨの影響
ＰＢＳ中の２％（W/V）のラクトフェリンサンプルの範囲が、1.18、1.55、1.7、2.2、2.58、3.2、3.8、5及び7のｐＨを有するように作られた。これらのサンプルを、表１におけるスキームにしたがって、バイオスクリーンＣアナライザーシステム用の平底１００ウェルプレートのウェルに加えた。対数期の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を用いた。ＴＳＢ中における増殖コントロール大腸菌としては、ＬＦを用いなかった。実験は、４倍又は６倍で行った。
【００５５】
図１Ａは、結果を示す。ｐＨ 2.5未満のラクトフェリン試験サンプルを用いることにより少なくとも６０時間の間、大腸菌増殖が阻害されたことを明らかにしている。
【００５６】
同様の実験を、200 CFU’s/wellのシュードモナス・アエルギノーサを用いて行った。ＰＢＳ中の２％(W/V)のラクトフェリンサンプルが、1.55、1.7、2.1、2.2、2.58、3.2、4、5及び7のｐＨを有するように作られた。図１Ｂは、ｐＨ 1.7又はより低いｐＨでの、シュードモナス・アエルギノーサの増殖が、少なくとも４５時間阻害されることを示す。
【００５７】
実施例３
ラクトフェリンの抗菌活性におけるＥＤＴＡの影響
この実施例においては、異なるＥＤＴＡ濃度（大腸菌に対し、0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及び1 mM）が脱塩水中２％(W/V)のＬＦの抗菌活性に及ぼす影響を、実施例２において記載した同じ方法で実証する。試験溶液のｐＨは調整せず、ＥＤＴＡの溶解後に約５であった。
【００５８】
図２は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７におけるＬＦの抗菌活性が、ＥＤＴＡ濃度（0〜1 mM）の上昇とともに上昇することを示す。
【００５９】
これらの結果から、ＥＤＴＡは、ラクトフェリンの抗菌活性を増強すると結論づけることができる。
【００６０】
実施例４
ラクトフェリンの抗菌活性におけるＥＤＴＡとｐＨの影響
0.2 mMのＥＤＴＡを含む、ＰＢＳ中の２％(W/V)ＬＦの抗菌活性におけるｐＨの影響を調査した。実施例１に記載したように、インビトロ増殖阻害アッセイを使用した。ＬＦサンプルは、1.2、1.3、1.4、1.5、1.7、2、2.2、2.5、3.1、3.9、5及び7のｐＨを有した。
【００６１】
図３Ａは、2.5未満のｐＨを有するサンプルの、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する抗菌活性が、より高いｐＨを有するサンプルと比較して高かったことを示す。図３Ｂから、ｐＨ1.4で最適な増殖阻害が得られた。
【００６２】
実施例５
口の治療への適用における本発明の組成物の使用
Ｍ．ウィルソンによって「Methods in Enymology: Biofilms. San Diego, Academic Press, 1999; 310, 264-279」に記載されているように、フィルム発酵槽の一定の深さを用いて、抗菌剤／抗プラーク剤の評価のために、インビトロモデルで記載されたように、口への適用における試験を行った。多種類の口部バイオフィルム中の細菌の総数は、Ｓ．ミュータンス（S.mutans）、アクチノマイセス・ナエスルンディー（Actinomyces naeslundii）、ベイロネッラ・パルブラ（Veillonella parvula）及びフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）から成り、象牙質プレート上で、コントロール（ラクトフェリン単独）と比較して本発明の組成物で処理した後に減少した。
【００６３】
実施例６
創傷治療への適用における本発明の組成物の使用
本発明を試験する方法は、「Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair: Normal and Chronic Wounds」（A. Barbul, M. Caldwell and W. Eaglstein et al. (eds.), 1991, Wiley-Liss, New York;301-312）中の「Hayward and Robson: Animal Models of Wound Contraction」によって記載されている。「急性の創傷」モデルを用いた。この試験において、本発明の組成物は非常に良好に働くことがわかった。
【００６４】
実施例７
精肉における大腸菌増殖に及ぼす本発明のラクトフェリン溶液の影響
この実施例は、肉片上でのナリジキシン酸耐性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株の増殖に及ぼす、異なるラクトフェリンサンプル（ｐＨ調整の有無、ＥＤＴＡの有無、ペクチンの有無）の影響を示す。第一のラクトフェリンサンプルを精肉の表面につけ、続いてその表面に定常状態の大腸菌を接種した。
【００６５】
大腸菌懸濁液は、ナリジキシン酸ストックの10？lを含む10 mlのＴＳＢ（１×）中のナリジキシン酸耐性大腸菌培養物を、回転なしで、３７℃で一晩から開始して調製した。続いて、40 mlのＰＢＳを加え、懸濁液を3600 rpmで１０分間遠心分離した。その上清を捨て、10 mlのＰＢＳを加えた。大腸菌濃度は、約10E9/mlであった。大腸菌の懸濁液をさらにＰＢＳで希釈し、所望の濃度にした。
【００６６】
精肉アッセイを以下のように行った。精肉の四角片（牛肉、2-3 mm厚さ）を、切断機を用いて調製した。肉片をプラスチック皿においた。無菌のバクテイナー（bactainer）（4 cm2）を肉表面に押しつけ、100？l又は300？lのＬＦ溶液を、ピペットを用いて4 cm2上に滴下した。続いて、その肉四角片にＰＢＳ中の大腸菌懸濁液100 μlを接種した。室温（21〜23℃）で３時間インキュベーションした。
【００６７】
インキュベーション後、肉の接種された領域を切り取った。肉四角片をフィルターつきのストマッカーバッグ（stomacher bag）中におき、10 mlのＰＢＳを加えた。バッグをストマッカー中に２分間置いた。ストマッカーを高速で稼動した。
【００６８】
ブレンダー方法を用いた場合、肉四角片を、10 mlＰＢＳを含むプラスチックチューブ内に置き、肉片をウルトラトラックス（ultra turrax）で３０秒、スピード６（24000 rpm）を用いて混合した。
【００６９】
ストマッカー流体又はブレンダー流体で、ＰＢＳ中の連続的な10倍希釈を作った（100？ｌ流体＋900？ｌ  ＰＢＳ）。流体の３〜４の適切な連続的希釈の50？ｌを、ナリジキシン酸を含むＳＭＡＣ（Sorbitol MacConkey agar）プレート(SMAC/NA)上に置いた。該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。計数はCFU’s/4 cm2として算出した。
【００７０】
表２は結果を示す。  
表２は、100？ｌ又は300？ｌの異なるＬＦサンプルがバクテイナー（bactainer）中にピペットで加えられた、精肉アッセイの結果に関する。その後に、ＰＢＳ中の100 μlの大腸菌懸濁液を加えた。コントロールとして、大腸菌のみを接種した肉を用いた（無処理肉）。
【表２】
2007523204.tif 000003
【００７１】
上記の結果から、肉表面上での大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の増殖は、ペクチンを含むか又は含まない、ＥＤＴＡを含むラクトフェリンサンプルのｐＨを低下させることによって減少することができることがわかった。中性ｐＨを有する参照ラクトフェリンサンプル（ＥＢ中２％ＬＦ）と比較して、ＬＦの量、ｐＨを低下させることによって、また、異なる量のＥＤＴＡの使用によって、大腸菌増殖を減少させることができる。さらにその上、より低いｐＨで、ＬＦの量を増加させることは、肉表面における大腸菌の増殖をさらに減少させることができた。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】ＰＢＳ中の２％(W/V)ＬＦサンプルの抗菌活性におけるｐＨの影響。
【図１Ｂ】ＰＢＳ中の２％(W/V)ＬＦサンプルの抗菌活性におけるｐＨの影響。
【図２】異なるＥＤＴＡ濃度の大腸菌の増殖に及ぼす影響。
【図３Ａ】ＰＢＳ中の２％(W/V)ＬＦ／0.2 mM EDTAの抗菌活性におけるｐＨの影響。
【図３Ｂ】ＰＢＳ中の２％(W/V)ＬＦ／0.2 mM EDTAの抗菌活性におけるｐＨの影響。
【図１Ａ】
2007523204.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月14日(2006.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面又は食品原料の微生物汚染を減少するための方法であって、以下の一以上で表面又は食品原料を処理することを含む方法：
ａ）酸性ｐＨのラクトフェリン溶液；
ｂ）ラクトフェリン及び金属キレート剤の溶液。
【請求項２】
前記溶液のｐＨが、前記表面の処理の前に、前記溶液ａ）又はｂ）の初期のｐＨ以上の値、特に、ｐＨ 2〜8.5、好ましくはｐＨ 5〜8、より好ましくはｐＨ 6〜7まで上昇されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液がさらに、一以上のポリサッカリドを含む、請求項１及び２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリサッカリドが、ペクチン、カラゲナン、ヘパリン及び寒天からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリサッカリドの量が、0.001〜0.2％(W/V)である、請求項３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液ａ）が３未満のｐＨを有し、あるいは前記溶液ｂ）が５未満のｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液ｂ）中のＥＤＴＡの濃度が、0.2 mMより高い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液中のラクトフェリンの量が、0.2〜20％(W/V)である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記処理される表面が、口腔における表面、負傷した皮膚、又は外科的機器におけるような不活性表面である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理されるべき食品原料が肉である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
表面又は食品原料の微生物汚染を減少するための溶液であって、ラクトフェリンを含み、
ａ）３未満のｐＨを有する；又は
ｂ）金属キレート剤を含み、５未満のｐＨを有する;
ことを特徴とする溶液。
【請求項１２】
前記溶液ａ）が2.5未満のｐＨを有し、好ましくは2.3未満、より好ましくは2.1未満のｐＨを有し、及び最も好ましくは約２のｐＨである、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
さらに、0.001〜0.2％(W/V)の一以上のポリサッカリドを含む、請求項１１及び１２のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項１４】
前記ポリサッカリドが、ペクチン、カラゲナン、ヘパリン及び寒天からなる群から選択される、請求項１３に記載の溶液。
【請求項１５】
食品原料中又は食品原料上で使用するための、0.1〜10 mMのＥＤＴＡを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項１６】
0.2 mMより高く、好ましくは少なくとも0.4 mM、より好ましくは少なくとも0.6 mM、さらにより好ましくは少なくとも0.8 mM、及び最も好ましくは少なくとも1 mMを含む、食品原料中又は食品原料上で使用するための、請求項１５に記載の溶液。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の溶液を乾燥させることによって得られる乾燥組成物。
【請求項１８】
創傷治療において使用するための、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
口の治療において使用するための、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
外科的機器のような不活性表面の汚染除去における、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
食品産物の汚染除去における、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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