(57)【要約】  組成物ならびに酸化還元機能性アミノ酸をタンパク質に組み入れる直交性ｔＲＮＡ、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびｔＲＮＡ／シンテターゼの直交性の対を含むタンパク質生合成機構の成分を産生させる方法を提供する。これらの直交性の対を使用して酸化還元機能性アミノ酸を伴うタンパク質を産生させる方法と共に、これらの直交性の対を同定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでなる組成物であって、Ｏ−ＲＳは酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、組成物。
【請求項２】
Ｏ−ＲＳは配列番号１、またはその保存的変形を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｏ−ＲＳはメタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈｏｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
細胞を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
翻訳系を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
翻訳系を含んでなる細胞であって、翻訳系は、
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；
直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）；および、
酸化還元機能性アミノ酸；
を含んでなり、
Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳは、第１の酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、細胞。
【請求項９】
Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ポリヌクレオチド配列もしくは相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされ、かつＯ−ＲＳは配列番号１、またはその保存的変形を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞はさらなる異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および非天然アミノ酸をさらに含んでなり、Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳは第２の非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１２】
細胞は非真核細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１３】
非真核細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸をさらに含んでなり、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる、請求項８に記載の細胞。
【請求項１５】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；
直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）であって、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）；
酸化還元機能性アミノ酸；および、
目的のポリペプチドをコードする核酸であって、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる核酸、
を含んでなる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞。
【請求項１６】
Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、請求項１５に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞。
【請求項１７】
配列番号１を含んでなる人工ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリペプチドをコードする人工ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含んでなるかまたはコードするベクター。
【請求項２０】
ベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、またはウイルスを含んでなる、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
ベクターは発現ベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１９に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項２３】
酸化還元アミノ酸を利用する、Ｏ−ｔＲＮＡと共に使用するための直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを同定するための方法であって、該方法は、
第１の種の細胞の集団を選択に供すること；ならびに
酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを選択し、それによって、Ｏ−ｔＲＮＡと共に使用するための直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを提供すること、
を含んでなり、
ここで、細胞はそれぞれ、
１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー；
２）１つもしくはそれ以上の種から誘導される直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；および
３）選択マーカーをコードし、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチド；
を含んでなり、
ここで、複数のＲＳのメンバーを欠くかまたは減少した量の該メンバーを含んでなる細胞と比較して、抑制効率が増強される細胞は、Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含んでなる、方法。
【請求項２４】
選択はポジティブ選択を含んでなり、選択マーカーはポジティブ選択マーカーを含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
複数のＲＳは、変異ＲＳ、第１の種以外の１つもしくはそれ以上の種から誘導されるＲＳまたは変異ＲＳおよび第１の種以外の種から誘導されるＲＳの両方を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法によって同定される直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項２７】
細胞において、指定された位置に酸化還元機能性アミノ酸を伴うタンパク質を産生させる方法であって、該方法は、
適切な培地において細胞を増殖させることであって、ここで、細胞は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、タンパク質をコードする核酸を含んでなること；
酸化還元機能性アミノ酸を提供すること；ならびに
少なくとも１つのセレクターコドンを伴う核酸の翻訳中にタンパク質の指定された位置に酸化還元機能性アミノ酸を組み入れ、それによって、タンパク質を産生させること、
を含んでなり、
ここで、細胞は：
細胞において機能し、セレクターコドンを認識する直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；および
酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
をさらに含んでなる、方法。
【請求項２８】
Ｏ−ＲＳは、配列番号１を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞は非真核細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
非真核細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質を含んでなる組成物であって、タンパク質は酸化還元機能性アミノ酸を含んでなる、組成物。
【請求項３２】
酸化還元機能性アミノ酸は、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）（ＤＨＰ）、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−チロシン、４−ニトロ−フェニルアラニン、および３−チオール−チロシンからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
タンパク質は、野生型の治療用タンパク質、診断用タンパク質、産業用酵素、またはその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
組成物は薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる、請求項３１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年１０月１４日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５１１，５３２号（その開示内容は、すべての目的のために、その全体が本明細書において参考として援用される）の優先権および利益を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発による発明に対する権利に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から交付された政府助成金番号ＧＭ６６４９４およびエネルギー省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）から交付された助成金ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４５８１２によって行われた。政府は、本発明に対し一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は翻訳生化学の分野に属する。本発明は、酸化還元機能性アミノ酸をタンパク質に組み入れる直交性ｔＲＮＡ、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびそれらの対を作製および使用するための組成物ならびに方法に関する。本発明はまた、そのような対および関連する組成物を使用して、細胞においてタンパク質を産生させる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２０種の一般に遺伝子からコードされるアミノ酸のうち、システインのみが容易な酸化還元化学を経験し、その結果、広範な酵素触媒による酸化および還元反応に参加することができる（サードハー（Ｓｕｒｄｈａｒ）およびアームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）（１９８７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９１：６５３２−６５３７；リヒト（Ｌｉｃｈｔ）ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：４７７−４８１）。従って、ほとんどの生物学的酸化還元プロセスは、フラビン、ニコチンアミドおよび金属イオンなどの補因子を必要とする。まれに、チロシンの翻訳後修飾から誘導されるキノンおよびトリプトファン側鎖は、酸化還元補因子として使用される（スタッブ（Ｓｔｕｂｂｅ）およびファン・デル・ドンク（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ）（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９８：７０５−７６２）。例えば、ウシ血漿中銅アミンオキシダーゼは、第一級アミンおよび分子状酸素のそれぞれアルデヒドおよび過酸化水素への変換において、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＴＯＰＡ）を使用する（ジェーンズ（Ｊａｎｅｓ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：９８１−９８７）。
【０００５】
これらのアミノ酸誘導性酸化還元触媒は、ラジカル仲介性および酵素的反応の両方によって作製される（ロジャーズ（Ｒｏｄｇｅｒｓ）およびディーン（Ｄｅａｎ）（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３２：９４５−９５５）。
【０００６】
明らかに、さらなる酸化還元機能性アミノ酸を、複雑な翻訳後機構よって作製するのではなく、遺伝子からコードする能力は、タンパク質における電子移動プロセスを研究しかつ操作する能力を顕著に増強する。本発明は、これらおよび他の必要性を満たし、ならびに以下の開示内容の再検討において明らかとなろう。
【非特許文献１】サードハー（Ｓｕｒｄｈａｒ）およびアームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）（１９８７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９１：６５３２−６５３７
【非特許文献２】リヒト（Ｌｉｃｈｔ）ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：４７７−４８１
【非特許文献３】スタッブ（Ｓｔｕｂｂｅ）およびファン・デル・ドンク（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ）（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９８：７０５−７６２
【非特許文献４】ジェーンズ（Ｊａｎｅｓ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：９８１−９８７
【非特許文献５】ロジャーズ（Ｒｏｄｇｅｒｓ）およびディーン（Ｄｅａｎ）（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３２：９４５−９５５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、セレクターコドン、例えば、終止コドン、ナンセンスコドン、４もしくはそれ以上の塩基のコドンなどに例えば、インビボで応答して、酸化還元機能性アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組み入れるための直交性成分を産生させる組成物および方法を提供する。例えば、本発明は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）およびその対を提供する。これらの対は、酸化還元機能性アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組み入れるために使用することができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、ここで、Ｏ−ＲＳは酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは配列番号１、またはその保存的変形を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる。本発明の所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０００９】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は、場合により、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をさらに含むことができ、ここで、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。典型的に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、同種のシンテターゼの存在下、セレクターコドンに対応し、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該配列によってコードされるＯ−ｔＲＮＡと比較して、少なくとも約、例えば、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％もしくはそれ以上の抑制効率を含む。１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡの合同の抑制効率は、Ｏ−ＲＳを欠くＯ−ｔＲＮＡの抑制効率より例えば、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍もしくはそれ以上高い。１つの態様では、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡの合同の抑制効率は、メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から誘導される直交性チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑制効率の少なくとも４５％である。
【００１０】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は、場合により細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのような非真核細胞、もしくは真核細胞）、および／または翻訳系を含むことができる。
【００１１】
翻訳系を含んでなる細胞（例えば、非真核細胞、または真核細胞）もまた本発明によって提供され、ここで、翻訳系は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）；および酸化還元機能性アミノ酸を含む。典型的に、Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳは、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。１つの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡは、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ポリヌクレオチド配列もしくは相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳは配列番号１、またはその保存的変形のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含んでなる。
【００１２】
本発明の細胞は、場合により、さらなる異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および第２の非天然アミノ酸をさらに含んでなることができ、例えば、ここで、このＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは第２の非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。場合により、本発明の細胞は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、酸化還元機能性アミノ酸、および目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。本発明の所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【００１４】
本発明の所定の実施形態では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ポリヌクレオチド配列もしくは相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは配列番号１に記載のアミノ酸配列、またはその保存的変形を含んでなる。１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳまたはその一部は、配列番号１に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１５】
本発明のＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは、様々な生物体（例えば、真核および／または非真核生物体）のいずれかから誘導することができる。
【００１６】
ポリヌクレオチドもまた、本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含んでなる人工（例えば、人為的、および天然に存在しない）ポリヌクレオチドを含み、および／または上記のポリヌクレオチド配列に相補的であるかもしくは該配列をコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、高度にストリンジェントな条件下で、核酸の実質的に全体の長さにわたって、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドに、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくはそれ以上同一であるポリヌクレオチドを含む（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ以外である）。上記のいずれかに、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくはそれ以上同一である人工ポリヌクレオチドおよび／または上記のいずれかの保存的変形を含んでなるポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターもまた、本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター、および／または類似物を含むことができる。本発明のベクターを含んでなる細胞もまた、本発明の特徴である。
【００１８】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分を産生する方法もまた、本発明の特徴である。これらの方法によって産生される成分もまた、本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１つのｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を産生させる方法は、変異ｔＲＮＡのライブラリーを作製すること；変異ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを変異して、セレクターコドンの認識を可能にし、それによって、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供し、第１の種の細胞の第１の集団をネガティブ選択に供することを含み、ここで、細胞は、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる。ネガティブ選択は、細胞に対して内因性であるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる細胞を排除する。これは、第１の種の細胞に直交性であるｔＲＮＡのプールを提供し、それによって、少なくとも１つのＯ−ｔＲＮＡを提供する。本発明の方法によって産生されるＯ−ｔＲＮＡもまた提供される。
【００１９】
所定の実施形態では、方法は、第１の種の細胞の第２の集団をポジティブ選択に供することをさらに含んでなり、ここで、細胞は、第１の種の細胞、同種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびポジティブ選択マーカーに直交性であるｔＲＮＡのプールのメンバーを含んである。ポジティブ選択を使用して、同種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによってアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望される応答を示し、それによって、Ｏ−ｔＲＮＡを提供するｔＲＮＡのプールのメンバーを含んでなる細胞について、細胞が選択またはスクリーニングされる。所定の実施形態では、細胞の第２の集団は、ネガティブ選択によって排除されなかった細胞を含んでなる。
【００２０】
Ｏ−ｔＲＮＡと共に使用するための酸化還元機能性アミノ酸に対する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを同定するための方法もまた提供される。例えば、方法は、第１の種の細胞の集団を選択に供することであって、ここで、細胞はそれぞれ：１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー、（例えば、複数のＲＳは、変異ＲＳ、第１の種以外の種から誘導されるＲＳまたは変異ＲＳおよび第１の種以外の種から誘導されるＲＳの両方を含むことができる）；２）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（例えば、１つもしくはそれ以上の種由来）；ならびに３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【００２１】
細胞（例えば、宿主細胞）は、複数のＲＳのメンバーを欠くかまたは減少した量の該メンバーを有する細胞と比較して、抑制効率の増強を示す細胞について選択またはスクリーニングされる。これらの選択された／スクリーニングされた細胞は、Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性なＲＳを含んでなる。方法によって同定される直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼもまた本発明の特徴である。
【００２２】
細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのような非真核細胞、または真核細胞）において、指定された位置に酸化還元機能性アミノ酸を伴うタンパク質を産生させる方法もまた、本発明の特徴である。例えば、方法は、適切な培地において、細胞を増殖させることを含み、ここで、細胞は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、タンパク質をコードする核酸を含んでなり、酸化還元機能性アミノ酸を提供し、少なくとも１つのセレクターコドンにより核酸の翻訳中にタンパク質の指定された位置に酸化還元機能性アミノ酸を組み入れ、それによって、タンパク質を産生させる。細胞は：細胞において機能し、セレクターコドンを認識する直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；および酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含んでなる。本方法によって産生されるタンパク質もまた本発明の特徴である。
【００２３】
本発明はまた、タンパク質を含む組成物を提供し、ここで、タンパク質は、酸化還元機能性アミノ酸（例えば、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）（ＤＨＰ）、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−チロシン、４−ニトロ−フェニルアラニン、３−チオール−チロシン、および／または類似物）を含んでなる。所定の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、産業用酵素、またはその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。場合により、組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる。
【００２４】
定義
本発明について詳細に説明する前に、本発明は特定の生物学的システムに限定されず、もちろん変動することができることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、所定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を指令しない限り、複数形にも言及する。従って、例えば、「細胞」に対する言及は、２つもしくはそれ以上の細胞の組み合わせを含み；「細菌」に対する言及は、細菌の混合物を含む、などである。
【００２５】
本明細書の本箇所および以降において規定されない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、本明細書に関する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２６】
直交性：本明細書において使用する用語「直交性」は、細胞もしくは翻訳系に内因性であるかまたは細胞の内因性成分と共に機能し得ない対応する成分と比較して減少した効率で細胞の内因性成分と共に機能する分子（例えば、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および／または直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））に関する。ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して、直交性は、内因性ｔＲＮＡシンテターゼと共に機能する内因性ｔＲＮＡと比較した内因性ｔＲＮＡシンテターゼと共に機能する直交性ｔＲＮＡ、または内因性ｔＲＮＡと共に機能する内因性ｔＲＮＡシンテターゼと比較した内因性ｔＲＮＡと共に機能する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの不可能性あるいは減少した効率、例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、もしくは１％未満の効率を指す。直交性分子は、細胞における機能的に正常な内因性の相補的分子を欠く。例えば、細胞における直交性ｔＲＮＡは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較する場合、減少したまたは正にゼロの効率で、細胞の任意の内因性ＲＳによってアミノアシル化される。別の例では、直交性ＲＳは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、減少したまたは正にゼロの効率で目的の細胞において任意の内因性のｔＲＮＡをアミノアシル化する。第２の直交性分子は、第１の直交性分子と共に機能する細胞に導入することができる。例えば、直交性ｔＲＮＡ／ＲＳの対は、コントロール、例えば、対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内因性対、または活性な直交性の対（例えば、チロシル直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対）の効率と比較して、所定の効率（例えば、４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、または９９％もしくはそれ以上の効率）で細胞において共に機能する導入された相補的成分を含む。
【００２７】
直交性チロシルｔＲＮＡ：本明細書において使用されるように、直交性チロシルｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）は、目的の翻訳系に対して直交性であるｔＲＮＡであって、ここで、ｔＲＮＡは：（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡに同一または実質的に同一であるか、（２）天然もしくは人工的変異によって天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）または（２）の野生型もしくは変異型チロシルｔＲＮＡ配列を考慮する任意のプロセスによって誘導されるか、（４）野生型もしくは変異型チロシルｔＲＮＡに相同であるか；（５）表１におけるチロシルｔＲＮＡシンテターゼの置換物として称される任意の例示的ｔＲＮＡに相同であるか、あるいは、（６）表１におけるチロシルｔＲＮＡシンテターゼの置換物として称される任意の例示的ｔＲＮＡの保存的変異体である。チロシル−ｔＲＮＡは、アミノ酸でチャージされているか、またはチャージされていない状態で存在することができる。「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は、場合により、リジン以外のアミノ酸、例えば、アミノ酸ホモグルタミンで同種のシンテターゼによってチャージ（アミノアシル化）されることもまた、理解されるべきである。実際、本発明のチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンに応答して、翻訳中に、任意のアミノ酸（天然であるかまたは人工的であるかにかかわらず）を成長中のポリペプチドに本質的に挿入するために有利に使用されることが理解されよう。
【００２８】
直交性チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書において使用されるように、直交性チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）は、目的の翻訳系においてアミノ酸でチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ上に充填するアミノ酸は、天然化または人工的であるかにかかわらず任意のアミノ酸であることができ、本明細書において限定されない。シンテターゼは、場合により、天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同じもしくは相同であるか、または表１のチロシル−Ｏ−ＲＳと称されるシンテターゼと同じもしくは相同である。例えば、チロシル−Ｏ−ＲＳは、表１のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存的変異体であり得、および／または表１のチロシル−Ｏ−ＲＳに対する配列において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一であり得る。
【００２９】
同種の：用語「同種の」は、共に機能する成分、例えば、直交性ｔＲＮＡおよび直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを指す。成分はまた、相補的であることが言及され得る。
【００３０】
優先的にアミノアシル化する：用語「優先的にアミノアシル化する」は、Ｏ−ＲＳが、天然に存在するｔＲＮＡまたはＯ−ｔＲＮＡを作製するために使用される出発物質をアミノアシル化するＯ−ＲＳと比較して、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率、例えば、７０％の効率、７５％の効率、８５％の効率、９０％の効率、９５％の効率、または９９％もしくはそれ以上の効率を指す。
【００３１】
セレクターコドン：用語「セレクターコドン」は、翻訳プロセスにおいてＯ−ｔＲＮＡによって認識され、内因性ｔＲＮＡによって認識されないコドンを指す。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸のような非天然アミノ酸を、ポリペプチドにおけるこの部位で組み入れる。セレクターコドンは、例えば、終止コドン、例えば、アンバー、オーカー、およびオパールコドンのようなナンセンスコドン；４もしくはそれ以上の塩基のコドン；レアコドン；天然もしくは非天然の塩基対および／または類似物から誘導されるコドンを含むことができる。
【００３２】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、セレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組み入れる機構を提供することによって、所定の翻訳系におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、終止コドン、４塩基コドン、レアコドンなどを介して読み取ることができる。
【００３３】
抑制活性：本明細書において使用する用語「抑制活性」は、一般に、リードスルーがなければ翻訳の終結または翻訳ミス（例えば、フレームシフト）を生じるであろうコドン（例えば、アンバーコドンまたは４もしくはそれ以上の塩基コドンであるセレクターコドン）の翻訳のリードスルーを可能にするｔＲＮＡ（例えば、サプレッサーｔＲＮＡ）の能力を指す。サプレッサーｔＲＮＡの抑制活性は、第２のサプレッサーｔＲＮＡと比較するか、またはコントロールシステム、例えば、Ｏ−ＲＳを欠くコントロールシステムと比較して観察される翻訳リードスルー活性の百分率として表現することができる。
【００３４】
本発明は、抑制活性を定量することができる多様な手段を提供する。目的のセレクターコドン（例えば、アンバーコドン）に対する特定のＯ−ｔＲＮＡおよびＯＲＳの抑制パーセントは、目的の翻訳系で発現された試験マーカーをコードする核酸においてセレクターコドンを含む所定の発現される試験マーカー（例えば、ＬａｃＺ）の活性の百分率を指し、ここで、目的の翻訳系はポジティブコントロールの構築物と比較して、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ含み、ここで、ポジティブコントロールはＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳおよびセレクターコドンを欠く。従って、例えば、セレクターコドンを欠く活性なポジティブコントロールマーカー構築物が、所定の翻訳系において、問題のマーカーアッセイに関連する単位でＸの観察された活性を有する場合、セレクターコドンを含んでなる試験構築物の抑制パーセントは、試験マーカー構築物がＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳをも含む翻訳系において発現される場合以外で、試験マーカー構築物が、ポジティブコントロールマーカーが発現された条件と本質的に同じ環境条件下で示すＸの百分率である。典型的に、試験マーカーを発現する翻訳系はまた、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡによって認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑制パーセントの測定は、試験マーカーと、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳならびに／あるいはＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳによって認識される関連のアミノ酸を含まないシステムにおいて、試験マーカーと同じセレクターコドンを含む「バックグランド」または「ネガティブ」コントロールマーカー構築物との比較によって、精錬され得る。このネガティブコントロールは、目的の翻訳系におけるマーカー由来のバックグランドのシグナル効果を説明するために抑制パーセントの測定を正規化するのに有用である。
【００３５】
抑制効率は、当該分野において公知の任意の多くのアッセイによって決定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば、誘導体化ｌａｃＺプラスミド（ここで、構築物はｌａｃＺ核酸配列においてセレクターコドンｎを有する）は、本発明のＯ−ｔＲＮＡを含んでなるプラスミドと共に、適切な生物体由来の細胞（例えば、直交性成分を使用することができる生物体）に導入される。同種のシンテターゼを（発現される場合に同種のシンテターゼをコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかとして）導入することができる。細胞を、培地において、所望される密度、例えば、約０．５のＯＤ６００まで増殖させ、例えば、ＢｅｔａＦｌｕｏｒＴＭβ−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、β−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。抑制パーセントは、比較可能なコントロール、例えば、誘導体化ｌａｃＺ構築物から観察される値に関連するサンプルに対する活性の百分率として算出することができ、ここで、構築物は、セレクターコドン以外の所望される位置で対応するセンスコドンを有する。
【００３６】
翻訳系：用語「翻訳系」は、アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）に組み入れる成分を指す。翻訳系の成分は、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡなどを含むことができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは、例えば、非真核細胞、例えば、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような）細菌、あるいは真核細胞、例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および／または類似物におけるインビトロもしくはインビボでの翻訳系に添加するかあるいは部分であることができる。
【００３７】
非天然アミノ酸：本発明において使用する用語「非天然アミノ酸」は、任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、および／あるいは２０種の一般的な天然に存在するアミノ酸の１つではないか、またはセレノシステインもしくはピロリシンである酸化還元機能性アミノ酸のようなアミノ酸アナログを指す。
【００３８】
から誘導される：本明細書において使用する用語「から誘導される」は、指定された分子もしくは生物体、または指定された分子もしくは生物体由来の情報を使用して単離あるいは作製される成分を指す。
【００３９】
ポジティブ選択またはスクリーニングマーカー：本明細書において使用する用語「ポジティブ選択またはスクリーニングマーカー」は、存在する、例えば、発現される、活性化されるなどの場合、形質を伴わない細胞から、形質を含んでなる細胞、例えば、ポジティブ選択マーカーを伴う細胞の同定をもたらすマーカーを指す。
【００４０】
ネガティブ選択またはスクリーニングマーカー：本明細書において使用する用語「ネガティブ選択またはスクリーニングマーカー」は、存在する、例えば、発現される、活性化されるなどの場合、（例えば、特性または形質を有する細胞と比較して）選択された特性または形質を含まない細胞の同定を可能にするマーカーを指す。
【００４１】
レポーター：本明細書において使用する用語「レポーター」は、目的のシステムの標的成分を同定および／または選択するために使用することができる成分を指す。例えば、レポーターは、タンパク質、例えば、抗生物質耐性または感受性を付与する酵素（例えば、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（例えば、（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰなど）、発光マーカー（例えば、ホタルルシフェラーゼタンパク質）、親和性に基づくスクリーニングマーカー、またはｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２などのようなポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子を含むことができる。
【００４２】
真核生物：本明細書において使用する「真核生物」は、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類など）、繊毛虫、植物（例えば、単子葉植物、双子葉植物、藻類など）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などのような系統発生学的ドメインの真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物体である。
【００４３】
非真核生物：本明細書において使用する用語「非真核生物」は、非真核生物体を指す。例えば、非真核生物体は、真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）など）の系統発生学的ドメイン、または古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）（例えば、メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍｊ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）（Ｍｍ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔ）、メタノコッカス・マルパリディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、  ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１のようなハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａｆ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐｈ）、パイロバクラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓ）、スルフォロバス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、アエウロピラム・ペルニックス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）（Ａｐ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）など）の系統発生学的ドメインに属することができる。
【００４４】
保存的変異体：翻訳成分に関して本明細書において使用する用語「保存的変異体」は、翻訳成分、例えば、保存的変異体が例えば、対照Ｏ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳと比較して配列において変異を有するＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳに類似である塩基成分と同様に機能的に実行する保存的変異体Ｏ−ｔＲＮＡまたは保存的変異体Ｏ−ＲＳを指す。例えば、Ｏ−ＲＳは、非天然アミノ酸、例えば、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）のような酸化還元機能性アミノ酸で相補的Ｏ−ｔＲＮＡまたは保存的変異体Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡおよび保存的変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同じ配列を有さない。保存的変異体は、保存的変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳに相補的であるかぎり、例えば、配列中に、１つの変形、２つの変形、３つの変形、４つの変形、または５つもしくはそれ以上の変形を有することができる。
【００４５】
選択またはスクリーニング因子：本明細書において使用する用語「選択またはスクリーニング因子」は、存在する場合、集団からの所定の成分の選択／スクリーニングを可能にする因子を指す。例えば、選択またはスクリーニング因子は、例えば、栄養物、抗生物質、光の波長、抗体、発現されたポリヌクレオチドなどであることができるが、これらに限定されない。選択因子は、例えば、濃度、強度などによって変動することができる。
【００４６】
に応答して：本明細書において使用する用語「に応答して」は、本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡに結合する酸化還元機能性アミノ酸の成長中のポリペプチド鎖への組み入れを仲介するプロセスを指す。
【００４７】
コードする：本明細書において使用する用語「コードする」は、ポリマー性巨大分子または配列ストリングにおける情報を使用して、第１の分子または配列ストリングとは異なる第２の分子または配列ストリングの産生を指令する任意のプロセスを指す。本明細書において使用する用語は広範に使用され、様々なアプリケーションを有することができる。１つの態様では、用語「コードする」は、半保存的ＤＮＡ複製のプロセスを説明し、ここで、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって新たに合成される相補的姉妹分体（ｓｉｓｔｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）をコードするテンプレートとして使用される。
【００４８】
別の態様では、用語「コードする」は、１つの分子における情報を使用して、第１の分子とは異なる化学的性質を有する第２の分子の産生を指令する任意のプロセスを指す。例えば、ＤＮＡ分子は、（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を組み入れる転写のプロセスによって）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は、翻訳のプロセスにおけるように、ポリペプチドをコードすることができる。翻訳のプロセスを説明するために使用される場合、用語「コードする」はまた、アミノ酸をコードする３連コドンにまで及ぶ。いくつかの態様において、ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを組み入れる逆転写のプロセスによって、ＤＮＡ分子をコードすることができる。別の態様では、ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードすることができ、ここで、その場合において使用されるように「コードする」は、転写および翻訳のプロセスの両方を組み入れることが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
インビボで遺伝子暗号に酸化還元機能性アミノ酸のようなさらなる合成アミノ酸を追加するためには、翻訳機構において効率的に機能することができるが、問題の翻訳系に対して「直交性」であるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡの新たな直交性の対が必要であり、これは、それが、翻訳系に対して内因性のシンテターゼおよびｔＲＮＡとは独立して機能することを意味する。オーソロガスな対の所望される特徴は、特定の新たなコドン、例えば、任意の内因性ｔＲＮＡによってデコードされないセレクターコドンのみをデコードまたは認識するｔＲＮＡ、および特定の酸化還元機能性アミノ酸のみでその同種のｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化（またはチャージ）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。Ｏ−ｔＲＮＡはまた、典型的に、内因性シンテターゼによってアミノアシル化されない。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、直交性の対は、内因性ｔＲＮＡ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では４０種が存在する）のいずれかと交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、および内因性シンテターゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では２１種が存在する）のいずれかによってアミノアシル化されない直交性ｔＲＮＡを含む。
【００５０】
本発明は、さらなる直交性ｔＲＮＡ−アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの対、例えば、酸化還元機能性アミノ酸を組み入れるために使用することができるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を同定および産生させるための組成物ならびに方法を提供する。本発明のＯ−ｔＲＮＡは、例えば、インビボで、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質への酸化還元機能性アミノ酸の組み入れを仲介することが可能である。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、ポリペプチドにおけるこの部位でそのアミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸を組み入れる。本発明の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、特定の酸化還元機能性アミノ酸のみでそのＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化（またはチャージ）する。
【００５１】
例えば、キノンに対して二電子酸化を経験することができる酸化還元機能性アミノ酸３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）は、セレクターコドン、例えば、ＴＡＧコドンに応答して、生物体、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））のタンパク質に選択的かつ効率的に組み入れられている。図１を参照のこと。ＤＨＰは、タンパク質内において電子化学的に酸化され得る。酸化還元機能性アミノ酸を部位特異的にタンパク質に組み入れる能力は、タンパク質における電子移動の研究を容易にすることができ、ならびに新規の特性を伴う酸化還元タンパク質の操作を可能にする。図４を参照のこと。例えば、酸化還元機能性タンパク質の発現は、研究ならびにタンパク質における電子移動経路を変更する能力を容易にし、酵素の触媒機能を変更し、小さな分子および生体分子などでタンパク質を架橋することができる。
【００５２】
直交性ｔＲＮＡ／直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびそれらの対
１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸を含むタンパク質を作製するのに適切である翻訳系については、国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＡＮＯＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ」および国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ」に記載されている。さらに、２００４年４月１６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号明細書を参照のこと。これらの出願のうちそれぞれが、本明細書においてその全体が参考として援用される。そのような翻訳系は、一般に、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、および酸化還元機能性アミノ酸を含む細胞（例えば、非真核細胞、または真核細胞）を含んでなり、ここで、Ｏ−ＲＳは、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する。本発明の直交性の対は、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡなど、およびＯ−ＲＳの対を含む。個々の成分もまた、本発明において提供される。
【００５３】
Ｏ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、同種のシンテターゼの存在下、セレクターコドンに対応し、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該配列によってコードされるＯ−ｔＲＮＡと比較して、少なくとも約、例えば、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％もしくはそれ以上の抑制効率を含む。Ｏ−ＲＳは、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する。細胞は、成分を使用し、例えば、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を介して、酸化還元機能性アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組み入れ、ここで、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。本発明の所定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような細胞は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、酸化還元機能性アミノ酸；および目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。翻訳系はまた、インビトロ系であり得る。
【００５４】
１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡの合同の抑制効率は、Ｏ−ＲＳを欠くＯ−ｔＲＮＡの抑制効率より、約、例えば、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍もしくはそれ以上高い。１つの態様では、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡの合同の抑制効率は、メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から誘導される直交性チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑制効率の少なくとも約、例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％もしくはそれ以上である。
【００５５】
本発明は、場合により、細胞において、１を超える非天然アミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸および別の非天然アミノ酸の組み入れを可能にする複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、細胞は、さらなる異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および第２の非天然アミノ酸をさらに含むことができ、ここで、このさらなるＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このさらなるＯ−ＲＳは第２の非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対（ここで、Ｏ−ｔＲＮＡは、例えば、アンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は、第２の直交性の対、例えば、ロイシル、リジル、グルタミルなど（ここで、第２のＯ−ｔＲＮＡは、異なるセレクターコドン、例えば、オパール、４塩基などを認識する）をさらに含んでなることができる。
【００５６】
Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは、天然に存在することができるかもしくは例えば、様々な生物体からｔＲＮＡのライブラリーおよび／またはＲＳのライブラリーを作製する天然に存在するｔＲＮＡおよび／またはＲＳの変異によって誘導することができる。例えば、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対を生成するための１つのストラテジーは、例えば、宿主細胞以外の供給源、または複数の供給源由来の（宿主細胞に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼの対を宿主細胞に輸送することに関与する。異種のシンテターゼ候補の特性には、例えば、それが任意の宿主細胞ｔＲＮＡをチャージしないことが含まれ、異種のｔＲＮＡ候補の特性には、例えば、それが任意の宿主細胞シンテターゼによってアミノアシル化されないことが含まれる。さらに、異種のｔＲＮＡは、すべての宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
【００５７】
直交性の対を作製するための第２のストラテジーは、Ｏ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳをスクリーニングおよび／または選択する変異ライブラリーを作製することに関与する。これらのストラテジーもまた組み合わせることができる。
【００５８】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は、例えば、インビボまたはインビトロで、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質への酸化還元機能性アミノ酸の組み入れを仲介する。所定の実施形態では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、同種のシンテターゼの存在下、セレクターコドンに対応し、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該配列によってコードされるＯ−ｔＲＮＡと比較して、少なくとも約、例えば、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％もしくはそれ以上の抑制効率を含む。
【００５９】
抑制効率は、当該分野において公知の任意の多くのアッセイによって決定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば、誘導体化ｌａｃＺプラスミド（ここで、構築物はｌａｃＺ核酸配列においてセレクターコドンｎを有する）は、本発明のＯ−ｔＲＮＡを含んでなるプラスミドと共に、適切な生物体由来の細胞（例えば、直交性成分を使用することができる生物体）に導入される。同種のシンテターゼを（発現される場合に同種のシンテターゼをコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかとして）導入することができる。細胞を、培地において、所望される密度、例えば、約０．５のＯＤ６００まで増殖させ、例えば、ＢｅｔａＦｌｕｏｒＴＭβ−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、β−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。抑制パーセントは、比較可能なコントロール、例えば、誘導体化ｌａｃＺ構築物から観察される値に関連するサンプルに対する活性の百分率として算出することができ、ここで、構築物は、セレクターコドン以外の所望される位置で対応するセンスコドンを有する。
【００６０】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例には配列番号２がある。本明細書では、例示的なＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳ分子の配列については表１ならびに実施例２を参照のこと。また、本明細書における表題「核酸およびポリペプチド配列ならびに変異体（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖａｒｉａｎｔｓ）」のセクションも参照のこと。ｔＲＮＡ分子では、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）に置き換えられる。塩基に対するさらなる修飾も存在することができる。本発明はまた、Ｏ−ｔＲＮＡの保存的変形も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存的変形は、配列番号２のＯ−ｔＲＮＡと同様に機能し、ｔＲＮＡのＬ型構造を維持するが、同じ配列を有さない（そして野生型ｔＲＮＡ分子以外である）該分子を含む。また、本明細書における表題「核酸およびポリペプチド配列ならびに変異体」のセクションも参照のこと。
【００６１】
Ｏ−ｔＲＮＡを含んでなる組成物は、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含むことができ、ここで、Ｏ−ＲＳは、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。所定の実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は、翻訳系（例えば、インビトロまたはインビボ）をさらに含むことができる。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸であって、ここで、ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドン、またはこれらの１つもしくはそれ以上の組み合わせを含んでなる上記核酸もまた、細胞に存在することができる。また、本明細書における表題「直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ）」のセクションも参照のこと。
【００６２】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を産生させる方法もまた、本発明の特徴である。方法によって産生されるＯ−ｔＲＮＡもまた本発明の特徴である。本発明の所定の実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡは変異のライブラリーを作製することによって産生させることができる。変異ｔＲＮＡのライブラリーは、当該分野において公知の多様な変異技術を使用して作製することができる。例えば、変異ｔＲＮＡは、部位特異的変異、ランダム点変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的変異方法（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、キメラの構築またはそれらの任意の組み合わせによって作製することができる。
【００６３】
さらなる変異を、特定の位置、例えば、非保存的位置、または保存的位置、無作為化された位置、あるいはｔＲＮＡの所望されるループもしくは領域、例えば、アンチコドンループ、アクセプターステム、Ｄアームもしくはループ、可変ループ、ＴψＣアームもしくはループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域、またはその組み合わせにおける両方の組み合わせにおいて、導入することができる。典型的に、ｔＲＮＡにおける変異は、セレクターコドンの認識を可能にするために、変異ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを変異することを含む。方法は、Ｏ−ｔＲＮＡの末端にさらなる配列（ＣＣＡ）を付加することをさらに含むことができる。典型的に、Ｏ−ｔＲＮＡは、出発物質、例えば、複数のｔＲＮＡ配列と比較して、所望される生物体に対する直交性の改善を有する一方、所望されるＲＳに対するその親和性を保存する。
【００６４】
方法は、場合により、ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の相同性を解析して、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳおよび／または特定の生物体に対して直交性であるようであるその対の潜在的候補を決定することを含む。当該分野において公知であり、本明細書において説明するコンピュータプログラムは、解析、例えば、ＢＬＡＳＴのために使用することができ、パイルアップ（ｐｉｌｅｕｐ）プログラムを使用することができる。１つの例では、原核生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において使用するための潜在的な直交性翻訳コンポーネントを選択するために、原核生物体に対して異例の相同性を示さないシンテターゼおよび／またはｔＲＮＡが選択される。
【００６５】
典型的にＯ−ｔＲＮＡは、例えば、ネガティブ選択、第１の種の細胞の集団に供することによって得られ、ここで、細胞は、複数の潜在的なＯ−ｔＲＮＡのメンバーを含んでなる。ネガティブ選択は、細胞に対して内因性であるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる細胞を排除する。これは、第１の種の細胞に対して直交性であるｔＲＮＡのプールを提供する。
【００６６】
所定の実施形態では、ネガティブ選択において、セレクターコドンは、ネガティブ選択マーカー、例えば、抗生物質耐性を付与する酵素、例えば、β−ラクタマーゼ、検出可能な産物を付与する酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、例えば、（例えば、機能的バルナーゼをなお産生する）バルナーゼのような毒性産物などをコードするポリヌクレオチドに対し、非必須位置において導入される。スクリーニング／選択は、場合により、選択因子（例えば、アンピシリンのような抗生物質）の存在下で細胞の集団を増殖させることによって行われる。１つの実施形態では、選択因子の濃度は変動される。
【００６７】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するために、ネガティブ選択マーカー、例えば、β−ラクタマーゼの遺伝子（ｂｌａ）をコードするポリヌクレオチドに導入されたセレクターコドン、例えば、ナンセンスまたはフレームシフト変異のインビボ抑制に基づく選択システムが使用される。例えば、所定の位置でセレクターコドンを伴うポリヌクレオチド変異体、例えば、ｂｌａ変異体が構築される。細胞、例えば、細菌をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シンテターゼによって効率的にチャージされ得ない直交性ｔＲＮＡの場合、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン耐性は、プラスミドを伴わずに形質転換された細菌の耐性にほぼ同じかまたはそれ未満であるべきである。ｔＲＮＡが直交性でない場合、またはｔＲＮＡをチャージすることが可能な異種シンテターゼがシステムにおいて同時発現される場合、より高いレベルの抗生物質（例えば、アンピシリン）耐性が観察される。プラスミドを伴わずに形質転換された細胞に対してほぼ等価な抗生物質濃度を伴うＬＢ寒天プレート上で増殖し得ない細胞、例えば、細菌を選択する。
【００６８】
毒性産物（例えば、リボヌクレアーゼまたはバルナーゼ）の場合、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内因性宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のシンテターゼによってアミノアシル化される（即ち、それが宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のシンテターゼに対して直交性でない）場合、セレクターコドンが抑制され、産生される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死をもたらす。直交性ｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡを所有する細胞は生き残る。
【００６９】
１つの実施形態では、所望される生物体に対して直交性であるｔＲＮＡのプールは、次いで、セレクターコドンが例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子のような薬物耐性遺伝子によってコードされるポジティブ選択マーカーにおいて置き換えられるポジティブ選択に供される。ポジティブ選択は、細胞に対して直交性であるｔＲＮＡのプールのメンバーをコードするかまたは該メンバーを含んでなるポリヌクレオチド、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、および同種のＲＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなる細胞に対して行われる。所定の実施形態では、細胞の第２の集団は、ネガティブ選択によって排除されなかった細胞を含んでなる。ポリヌクレオチドは細胞において発現され、細胞は、選択因子、例えば、アンピシリンの存在下で増殖される。次いで、ｔＲＮＡを、同時発現される同種のシンテターゼによってアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入するそれらの能力について選択する。典型的に、これらの細胞は、非機能的ｔＲＮＡ、または目的のシンテターゼによって効率的には認識され得ないｔＲＮＡを所有する細胞と比較して、抑制効率の増強を示す。非機能的ｔＲＮＡまたは目的のシンテターゼによって効率的には認識されないｔＲＮＡを所有する細胞は、抗生物質に対して感受性である。従って、（ｉ）内因性宿主（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））のシンテターゼの基質ではない；（ｉｉ）目的のシンテターゼによってアミノアシル化することができる；および（ｉｉｉ）翻訳において機能的であるｔＲＮＡは、両方の選択に生存する。
【００７０】
上記の方法における選択、例えば、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはポジティブおよびネガティブ選択の両方のストリンジェンシーは、場合により、選択ストリンジェンシーを変動することを含む。例えば、バルナーゼは極端に毒性なタンパク質であるため、ネガティブ選択のストリンジェンシーは、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入することによって、および／または誘導性プロモーターを使用することによって、制御することができる。別の例では、選択またはスクリーニング因子の濃度は変動する（例えば、アンピシリン濃度）。本発明の１つの態様では、所望される活性は早期のラウンド中に低くあり得るため、ストリンジェンシーは変動される。従って、早期のラウンドではより低いストリンジェント選択基準が適用され、選択のより以降のラウンドでは、より高いストリンジェント基準が適用される。所定の実施形態では、ネガティブ選択、ポジティブ選択またはネガティブおよびポジティブ選択の両方は、複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカーまたはネガティブおよびポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定の実施形態では、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーは同じであり得る。
【００７１】
選択／スクリーニングの他のタイプは、直交性翻訳コンポーネント、例えば、酸化還元機能性アミノ酸を利用したＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、およびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を産生させるために、本発明において使用することができる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカーまたはポジティブおよびネガティブ選択マーカーの両方は、蛍光を発するか、もしくは適切な反応物の存在下で発光反応を触媒するマーカーを含むことができる。別の実施形態では、マーカーの産生は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または発光によって検出される。場合により、マーカーは、親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。フランシスコ，Ｊ．Ａ．（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．）ら、（１９９３年）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：１０４４４−８を参照のこと。
【００７２】
組換え直交性ｔＲＮＡを産生させるためのさらなる方法については、例えば、国際特許出願国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ」；ならびに米国特許出願第６０／４７９，９３１号明細書、および同第６０／４９６，５４８号明細書、表題「ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ」において見出すことができる。また、フォスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）ら、（２００３年）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ、ＰＮＡＳ１００（１１）：６３５３−６３５７；およびフェング（Ｆｅｎｇ）ら、（２００３年）、Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ、ＰＮＡＳ１００（１０）：５６７６−５６８１も参照のこと。
【００７３】
直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明のＯ−ＲＳは、インビトロまたはインビボにおいて、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳは、Ｏ−ＲＳを含むポリペプチドによって、および／またはＯ−ＲＳもしくはその一部をコードするポリヌクレオチドによって、翻訳系、例えば、細胞に提供され得る。例えば、Ｏ−ＲＳは配列番号１に記載のアミノ酸配列、またはその保存的変形を含んでなる。別の実施形態では、Ｏ−ＲＳ、またはその一部は、配列番号１を含んでなるアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書では、例えば、例示的なＯ−ＲＳ分子の配列については表１ならびに実施例２を参照のこと。また、本明細書における表題「核酸およびポリペプチド配列ならびに変異体」のセクションも参照のこと。
【００７４】
Ｏ−ｔＲＮＡと共に使用するための直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、例えば、Ｏ−ＲＳを同定するための方法もまた、本発明の特徴である。例えば、方法は、第１の種の細胞の集団を選択、例えば、ポジティブ選択に供することであって、ここで、細胞は個々に：１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー、（例えば、複数のＲＳは、変異ＲＳ、第１の種以外の種から誘導されるＲＳまたは変異ＲＳおよび第１の種以外の種から誘導されるＲＳの両方を含むことができる）；２）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（例えば、１つもしくはそれ以上の種由来）；ならびに３）（例えば、ポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。細胞は、複数のＲＳのメンバーを欠くかまたは減少した量の該メンバーを伴う細胞と比較して、抑制効率の増強を示す細胞について選択またはスクリーニングされる。抑制効率は、当該分野において公知の技術によって、および本明細書に記載のように測定することができる。抑制効率の増強を有する細胞は、Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性なＲＳを含んでなる。第１の種由来のｔＲＮＡの第１の組の活性なＲＳによるアミノアシル化（インビトロまたはインビボ）のレベルを、第２の種由来のｔＲＮＡの第２の組の活性なＲＳによるアミノアシル化（インビトロまたはインビボ）のレベルと比較する。アミノアシル化のレベルは、検出可能な物質（例えば、標識されたアミノ酸または非天然アミノ酸、例えば、ＤＨＰのような酸化還元機能性アミノ酸）によって測定することができる。第１の組のｔＲＮＡと比較して、第２の組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性なＲＳを典型的に選択し、それによって、Ｏ−ｔＲＮＡと共に使用するための効率的な（最適化された）直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを提供する。方法によって同定されるＯ−ＲＳもまた本発明の特徴である。
【００７５】
多くのアッセイのいずれも、アミノアシル化を決定するために使用することができる。これらのアッセイは、インビトロまたはインビボで達成することができる。例えば、インビトロアミノアシル化アッセイについては、例えば、ホベン（Ｈｏｂｅｎ）およびソル（Ｓｏｌｌ）（１９８５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化はまた、直交性翻訳成分と共にレポーターを使用し、タンパク質をコードする少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチドを発現する細胞においてレポーターを検出することによって、測定することができる。また、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ」；および２００４年４月１６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号明細書も参照のこと。
【００７６】
Ｏ−ＲＳは、所望される非天然アミノ酸、例えば、ＤＨＰのような酸化還元機能性アミノ酸だけではなく、一般的な２０種のアミノ酸のいずれもがＯ−ｔＲＮＡにチャージされるように、シンテターゼの基質特異性を変更するために操作することができる。非天然アミノ酸に対する基質特異性を伴う直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを作製するための方法は、シンテターゼの異なるドメインなどを組み合わせ、選択プロセスを適用することによって、例えば、シンテターゼにおける活性部位、シンテターゼにおける編集機構部位、異なる部位でシンテターゼを変異することを含む。ポジティブ選択の組み合わせ、それに続くネガティブ選択に基づくストラテジーが使用される。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入されるセレクターコドンの抑制は、細胞が、ポジティブ選択による抑圧下で生存することを可能にする。従って、天然および非天然の両方のアミノ酸の存在下では、生存体は、天然または非天然アミノ酸のいずれかで直交性サプレッサーｔＲＮＡをチャージする活性なシンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入されるセレクターコドンの抑制により、天然アミノ酸特異性を伴うシンテターゼが取り出される。ネガティブおよびポジティブ選択の生存体は、非天然アミノ酸のみで直交性サプレッサーｔＲＮＡをアミノアシル化（チャージ）するシンテターゼをコードする。次いで、これらのシンテターゼを、さらなる変異、例えば、ＤＮＡシャフリングまたは他の再帰的変異（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法に供することができる。
【００７７】
変異Ｏ−ＲＳのライブラリーは、当該分野において公知の多様な変異技術を使用して作製することができる。例えば、変異ＲＳは、部位特異的変異、ランダム点変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的変異（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法、キメラの構築またはそれらの任意の組み合わせによって作製することができる。例えば、変異ＲＳのライブラリーは、２もしくはそれ以上の他の、例えば、より小さな、多様性がより低い「サブ−ライブラリー」から生成することができる。ＲＳのキメラライブラリーもまた、本発明に含まれる。場合により、天然の多様性を含んでなるライブラリー（例えば、米国特許第６，２３８，８８４号明細書、ショート（Ｓｈｏｒｔ）ら；米国特許第５，７５６，３１６号明細書、シャレンベルガー（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）ら；米国特許第５，７８３，４３１号明細書、ペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）ら；米国特許第５，８２４，４８５号明細書、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら；米国特許第５，９５８，６７２号明細書、ショート（Ｓｈｏｒｔ）らを参照のこと）のような多様な生物体（例えば、真正細菌または古細菌のような微生物）由来のｔＲＮＡシンテターゼのライブラリーを構築し、直交性の対についてスクリーニングすることについて留意すべきである。
【００７８】
一旦、シンテターゼをポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニングストラテジーに供すると、次いで、これらのシンテターゼをさらなる変異に供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えば、ランダム変異、部位特異的変異、組換えまたはそれらの任意の組み合わせによって）変異したＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドの組を核酸から作製することができ；そして、非天然アミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する変異Ｏ−ＲＳが得られるまで、これらの個々の工程またはこれらの工程の組み合わせを反復することができる。本発明の１つの態様では、複数回、例えば、少なくとも２回、工程が反復される。
【００７９】
選択／スクリーニングストリンジェンシーのさらなるレベルもまた、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、またはそれらの対を産生させるための本発明の方法において使用することができる。選択またはスクリーニングストリンジェンシーは、Ｏ−ＲＳを産生させるための方法の１つまたは両方の工程に対し変動させることができる。これは、例えば、使用される選択／スクリーニング因子の量を変動することなどを含み得る。ポジティブおよび／またはネガティブ選択のさらなるラウンドもまた、実施することができる。選択またはスクリーニングすることはまた、１つもしくはそれ以上のアミノ酸の透過性の変化、翻訳効率の変化、翻訳精度の変化などを含んでなることができる。典型的に、１つもしくはそれ以上の変化は、タンパク質を産生するために直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を使用する生物体における１つもしくはそれ以上の遺伝子の変異に基づく。
【００８０】
Ｏ−ＲＳ産生させること、およびシンテターゼの基質特異性を変更することについてのさらなる一般的な詳細事項については、国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ」；および２００４年４月１６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号明細書において見出すことができる。
【００８１】
供給源および宿主生物体
本発明の翻訳コンポーネントは、非真核生物体から誘導することができる。例えば、直交性Ｏ−ｔＲＮＡは、非真核生物体（もしくは生物体の組み合わせ）、例えば、メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１のようなハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエウロピラム・ペルニックス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、メタノコッカス・マルパリディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）（Ｍｍ）、パイロバクラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓ）、スルフォロバス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）などのような古細菌、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ）などのような真正細菌から誘導することができる一方、直交性Ｏ−ＲＳは、非真核生物体（もしくは生物体の組み合わせ）、例えば、メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１のようなハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエウロピラム・ペルニックス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、メタノコッカス・マルパリディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃ���ｎａ  ｍａｚｅｉ）、パイロバクラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロバス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）などのような古細菌、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ）などのような真正細菌から誘導することができる。１つの実施形態では、真核生物供給源、例えば、植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物など）などをＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳの供給源として使用することができる。
【００８２】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対の個々の成分は、同じ生物体または異なる生物体から誘導することができる。１つの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、同じ生物体由来である。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対のＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳは、異なる生物体由来である。
【００８３】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳまたはＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、インビボもしくはインビトロで選択またはスクリーニングし、および／あるいは細胞、例えば、非真核細胞、もしくは真核細胞において使用して、酸化還元機能性アミノ酸を伴うポリペプチドを産生させることができる。非真核細胞は、様々な供給源、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ）などの真正細菌、またはメタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１のようなハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエウロピラム・ペルニックス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、メタノコッカス・マルパリディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）（Ｍｍ）、パイロバクラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓ）、スルフォロバス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）などのような古細菌由来であり得る。真核細胞は、様々な供給源、例えば、植物（例えば、単子葉植物、または双子葉植物のような複合植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物など）など由来であり得る。本発明の翻訳コンポーネントを伴う細胞の組成物もまた、本発明の特徴である。
【００８４】
また、別の種において使用するために、１つの種においてＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳをスクリーニングすることについては、２００４年４月１６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号明細書を参照のこと。
【００８５】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークにまで及ぶ。例えば、セレクターコドンは、例えば、独特な３塩基コドン、終止コドンのようなナンセンスコドン、例えば、アンバーコドン（ＵＡＧ）、またはオパールコドン（ＵＧＡ）、非天然のコドン、少なくとも４塩基コドン、レアコドンなどを含む。多くのセレクターコドン（例えば、１もしくはそれ以上、２もしくはそれ以上、３を超えるなど）を、所望される遺伝子に導入することができる。異なるセレクターコドンを使用することによって、これらの異なるセレクターコドンを使用する複数の酸化還元機能性アミノ酸、例えば、非天然アミノ酸の同時部位特異的組み入れを可能にする複数の直交性ｔＲＮＡ／シンテターゼの対を使用することができる。
【００８６】
１つの実施形態では、方法は、細胞におけるインビボでの酸化還元機能性アミノ酸の組み入れのための終止コドンであるセレクターコドンの使用に関与する。例えば、終止コドンを認識して、酸化還元機能性アミノ酸を伴いＯ−ＲＳによってアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡが産生される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼには認識されない。従来の部位特異的変異を使用して、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの目的の部位に終止コドンを導入することができる。例えば、セイヤーズＪ．Ｒ．（Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．）ら（１９８８年）、５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、７９１−８０２を参照のこと。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび目的のポリペプチドをコードする核酸を、例えば、インビボで組み合わせる場合、終止コドンに応答して酸化還元機能性アミノ酸が組み入れられ、指定された位置に酸化還元機能性アミノ酸を含有するポリペプチドが与えられる。本発明の１つの実施形態では、セレクターコドンとして使用される終止コドンは、アンバーコドン、ＵＡＧ、および／またはオパールコドン、ＵＧＡである。１つの例では、ＵＡＧおよびＵＧＡの両方がセレクターコドンとして使用される遺伝子暗号は、２２種のアミノ酸をコードすることができる一方、最も豊富にある終結シグナルであるオーカーナンセンスコドン、ＵＡＡを保存する。
【００８７】
酸化還元機能性アミノ酸のインビボでの組み入れは、宿主細胞の有意な擾乱を伴わずに行うことができる。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような非真核細胞では、ＵＡＧコドンに関する抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、アンバーサプレッサーｔＲＮＡと、放出因子１（ＲＦ１）（ＵＡＧコドンに結合し、リボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）との間の競合に依存するため、抑制効率は、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを増加するかまたはＲＦ１欠損株を使用するかのいずれかによって、調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンに関する抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、アンバーサプレッサーｔＲＮＡと、真核生物の放出因子（例えば、ｅＲＦ）（終止コドンに結合し、リボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）との間の競合に依存するため、抑制効率は、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを増加することによって、調節することができる。さらに、さらなる化合物、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤も存在することができる。
【００８８】
酸化還元機能性アミノ酸は、レアコドンによってもコードされ得る。例えば、インビトロタンパク質合成反応におけるアルギニン濃度が減少する場合、稀なアルギニンコドン、ＡＧＧは、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に効率的であることが立証されている。例えば、マ（Ｍａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：７９３９（１９９３年）を参照のこと。この場合、合成ｔＲＮＡは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においてより少数の主として存在する天然に存在するｔＲＮＡＡｒｇと競合する。さらに、いくつかの生物体は、すべての３連コドンを使用するわけではない。マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）の割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロ転写／翻訳抽出物におけるアミノ酸の挿入に利用されている。例えば、コワル（Ｋｏｗａｌ）およびオリバー（Ｏｌｉｖｅｒ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２５：４６８５（１９９７年）を参照のこと。本発明の成分を作製して、インビボでこれらのレアコドンを使用することができる。
【００８９】
セレクターコドンはまた、伸長されたコドン、例えば、４、５、６塩基もしくはそれ以上のコドンのような４塩基もしくはそれ以上のコドンを含んでなることができる。４塩基コドンの例として、例えば、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５塩基コドンの例として、例えば、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の方法は、フレームシフト抑制に基づく伸長されたコドンを使用することを含む。４塩基もしくはそれ以上のコドンは、例えば、酸化還元機能性アミノ酸のような１個もしくは複数個の非天然アミノ酸を同じタンパク質に挿入することができる。他の実施形態では、例えば、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドンもしくはそれ以上でアンチコドンループをデコードすることができる。２５６通りの可能な４塩基コドンが存在するため、４塩基もしくはそれ以上のコドンを使用して、複数の非天然アミノ酸を、同じ細胞においてコードすることができる。また、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、（２００２年）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９：２３７−２４４；およびマキエリー（Ｍａｇｌｉｅｒｙ）、（２００１年）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照のこと。
【００９０】
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を使用して、非天然アミノ酸がタンパク質に組み入れられている。例えば、マ（Ｍａ）ら、（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：７９３９；およびホーサカ（Ｈｏｈｓａｋａ）ら、（１９９９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１：３４を参照のこと。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、２種の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡによって、インビトロでストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンおよびリジンのＮＢＤ誘導体を同時に組み入れるために使用した。例えば、ホーサカ（Ｈｏｈｓａｋａ）ら、（１９９９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１：１２１９４を参照のこと。インビボでの研究において、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）らは、ＮＣＵＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ、またはＣであり得る）を抑制する能力について調べ、４連のＵＡＧＡを、ＵＣＵＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡＬｅｕによって、１３〜２６％の効率で、０または−１フレームでのデコーディングをほとんど伴うことなく、デコードすることができることを見出した。ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９８：１９５を参照のこと。１つの実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づいて伸長されたコドンを本発明において使用することができ、ミスセンスのリードスルーおよび他の所望されていない部位でのフレームシフト抑制を減少することができる。
【００９１】
所定のシステムについて、セレクターコドンはまた、天然の３塩基コドンの１つを含むことができ、ここで、内因性システムは、天然の塩基コドンを使用しない（または稀に使用する）。例えば、これは、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いているシステム、および／または３塩基コドンがレアコドンであるシステムを含む。
【００９２】
セレクターコドンは、場合により、非天然の塩基対を含む。これらの非天然の塩基対は、現存の遺伝子暗号文字にまでさらに及ぶ。塩基対が新たに１つ加わると、３連コドンの数は６４から１２５に増加する。第３の塩基対の特性には、安定かつ選択的塩基対形成、ポリメラーゼによる高い精度を伴うＤＮＡへの効率的な酵素的組込み、および初期の非天然塩基対の合成語の効率的な継続されたプライマー伸長が含まれる。方法および組成物に適応することができる非天然塩基対に関する記載として、例えば、ヒラオ（Ｈｉｒａｏ）ら、（２００２年）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：１７７−１８２が挙げられる。また、フー，Ｙ．（Ｗｕ，Ｙ．）ら、（２００２年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０を参照のこと。他の関連の刊行物については下記に列挙する。
【００９３】
インビボでの取り扱いについて、非天然のヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて、対応する三リン酸を形成する。さらに、増加した遺伝子情報は安定であり、細胞の酵素によって破壊されない。ベンナー（Ｂｅｎｎｅｒ）らによる先の取り組みでは、標準的ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）対とは異なる水素結合パターンが利用されたが、その最も顕著な例はイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対である。例えば、スウィトサー（Ｓｗｉｔｚｅｒ）ら、（１９８９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１：８３２２；およびピッチリリ（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ）ら、（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、３４３：３３；クール（Ｋｏｏｌ）、（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：６０２を参照のこと。これらの塩基は、一般に、天然の塩基とある程度のミスペアを形成し、酵素による複製ができない。クール（Ｋｏｏｌ）らは、塩基間の疎水性パッキングの相互作用は水素結合を置き換えて、塩基対の形成を駆動することができることを実証した。クール（Ｋｏｏｌ）、（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：６０２；ならびにガキアン（Ｇｕｃｋｉａｎ）およびクール（Ｋｏｏｌ）、（１９９８年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３６、２８２５を参照のこと。上記のすべての要件を満たす非天然の塩基対を開発するための努力において、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、ロメスベルグ（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ）らは、一連の非天然疎水性塩基を系統的に合成し、研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然の塩基対よりも安定であることが見出されており、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（ＫＦ）によって効率的にＤＮＡに組み入れることができる。例えば、マックミン（ＭｃＭｉｎｎ）ら、（１９９９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１：１１５８６；およびオガワ（Ｏｇａｗａ）ら、（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：３２７４を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、ＫＦによって、生物学的機能に対して十分な効率かつ選択性で合成することができる。例えば、オガワ（Ｏｇａｗａ）ら、（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：８８０３を参照のこと。しかし、両方の塩基とも、さらなる複製に対してチェーンターミネーターとして作用する。最近、ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用することができる変異ＤＮＡポリメラーゼが展開してきている。さらに、７ＡＩ自己対を複製することができる。例えば、タエ（Ｔａｅ）ら、（２００１年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：７４３９を参照のこと。Ｃｕ（ＩＩ）への結合時に安定な対を形成する新規のメタロ塩基対（ｍｅｔａｌｌｏｂａｓｅ  ｐａｉｒ）、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発されている。例えば、メガーズ（Ｍｅｇｇｅｒｓ）ら、（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：１０７１４を参照のこと。伸長されたコドンおよび非天然コドンは、天然コドンに対して本質的に直交性であるため、本発明の方法は、この特性を利用して、それらに対する直交性ｔＲＮＡを作製することができる。
【００９４】
翻訳バイパスシステムを使用して、所望されるポリペプチドに酸化還元機能性アミノ酸を組み入れることもできる。翻訳バイパスシステムでは、大きな配列が遺伝子に挿入されるが、タンパク質には翻訳されない。配列は、リボソームが配列を飛び越して、挿入物より下流から翻訳を再開するように誘導するための指示としての役割を果たす構造を含有する。
【００９５】
非天然アミノ酸
本明細書において使用する非天然アミノ酸とは、任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、あるいはセレノシステインおよび／またはピロリジン以外のアミノ酸アナログならびに以下の２０種の遺伝子コードされるα−アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンを指す。α−アミノ酸の一般構造を式Ｉに例示する。
【化１】
2007508034.tif 000002
【００９６】
非天然アミノ酸は、典型的に、式Ｉ［式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸において使用される基以外の任意の置換基である］を有する任意の構造である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｌ．ストライヤー（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）、第３版、１９８８年、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨークを参照のこと。本発明の非天然アミノ酸は、上記の２０種のα−アミノ酸以外の天然に存在する化合物であり得ることに留意すること。
【００９７】
本発明の非天然アミノ酸は、典型的に、天然アミノ酸とは側鎖が異なるため、非天然アミノ酸は、それらが天然に存在するタンパク質において形成されるのと同じ様式で、他のアミノ酸（例えば、天然または非天然）とアミド結合を形成する。しかし、非天然アミノ酸は、それらを天然アミノ酸と区別する側鎖の基を有する。
【００９８】
分子の内外の電子および／またはプロトン伝達を可能にする部分を含んでなる酸化還元機能性アミノ酸、例えば、非天然アミノ酸をタンパク質に組み入れる能力を有することは、非天然アミノ酸をタンパク質に組み入れる点において特に興味深い。例えば、酸化還元機能性アミノ酸では、式ＩのＲは、例えば、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ハロ−（例えば、ヨード−）、ニトロ−、チオール−、セレノ−、スルホニル−、ヘテロ環、アルデヒド（ａｌｄｅｌｈｙｄｅ）、チオ酸（ｔｈｉｏａｃｉｄ）などまたはそれらの任意の組み合わせを含むが、それらに限定されない。本発明の酸化還元機能性アミノ酸の例として、例えば、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−チロシン、４−ニトロ−フェニルアラニン、３−チオール−チロシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、図１も参照のこと。
【００９９】
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩのＲは、場合により、アルキル−、アリール−、アシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミンなど、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなる。目的の他の非天然アミノ酸として、光活性化型架橋を含んでなるアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規の官能基を伴うアミノ酸、他の分子と共有または非共有的に相互作用するアミノ酸、光ケージされた（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）および／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチンアナログ含有アミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖に付着した多糖部分、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換されたアミノ酸、化学的に切断可能または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長された側鎖を伴うアミノ酸（例えば、ポリエーテルまたは長鎖炭化水素、例えば、約５を超える、約１０を超える炭素など）、炭素結合型糖を含有するアミノ酸、アミノチオ酸（ａｍｉｎｏ  ｔｈｉｏａｃｉｄ）を含有するアミノ酸、および１つもしくはそれ以上毒性部分を含有するアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
新規の側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸はまた、場合により、例えば、式ＩＩおよびＩＩＩの構造によって例示されるように、修飾された骨格構造を含んでなる。
【化２】
2007508034.tif 000003
式中、Ｚは、典型的に、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’を含んでなり；ＸおよびＹは同じもしくは異なり得、典型的に、ＳまたはＯを含んでなり、ＲおよびＲ’は場合により同じもしくは異なり、典型的に、式Ｉを有する非天然アミノ酸について上記のＲ基の構成要素の同じリストならびに水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、場合により、式ＩＩおよびＩＩＩによって例示されるアミノまたはカルボキシル基における置換基を含んでなる。このタイプの非天然アミノ酸として、例えば、一般的な２０種の天然アミノ酸に対応する側鎖または非天然の側鎖を伴うα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸（α−ｔｈｉｏａｃｉｄｓ）、α−アミノチオカルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、α−炭素での置換基は、場合により、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などのようなＬ、Ｄ、またはα−α−２置換アミノ酸を含む。他の構造代替物は、環状アミノ酸、例えば、プロリンアナログならびに３、４、６、７、８、および９員環プロリンアナログ、βおよびγアミノ酸例えば、置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸を含む。
【０１０１】
例えば、多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどのような天然アミノ酸に基づく。チロシンアナログとして、パラ−置換チロシン、オルト−置換チロシン、およびメタ置換チロシンが挙げられ、ここで、置換チロシンは、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖または分岐炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などを含んでなる。さらに、多置換アリール環もまた考慮される。本発明のグルタミンアナログとして、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環式誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フェニルアラニンアナログの例として、パラ−置換フェニルアラニン、オルト−置換フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅｓ）、およびメタ−置換フェニルアラニンが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基、またはケト基などを含んでなる。非天然アミノ酸の特定の例として、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードーフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。様々な非天然アミノ酸の構造は、例えば、本明細書の図１および国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」の図１６、１７、１８、１９、２６、および２９に提供される。
【０１０２】
非天然アミノ酸の化学合成
上記の多くの非天然アミノ酸は、例えば、Ｓｉｇｍａ（米国）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州、米国）から市販されている。市販されていないアミノ酸は、場合により、多様な刊行物において提供されているように、または当業者に公知の標準的な方法を使用して、合成される。有機合成技術については、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、フェッセンドン（Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ）およびフェッセンドン（Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ）、（１９８２年、第２版、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎマサチューセッツ州）；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、マーチ（Ｍａｒｃｈ）（第３版、１９８５年、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）；ならびにＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ケアリー（Ｃａｒｅｙ）およびサンドベルク（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）（第３版、ＡおよびＢ部、１９９０年、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について説明するさらなる刊行物として、例えば、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」；マトウカス（Ｍａｔｓｏｕｋａｓ）ら、（１９９５年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３８、４６６０−４６６９；キング，Ｆ．Ｅ．（Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．）およびキッド，Ｄ．Ａ．Ａ．（Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．）（１９４９年）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３３１５−３３１９；フリードマン，Ｏ．Ｍ．（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．）およびチャタージ，Ｒ．（Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．）（１９５９年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１、３７５０−３７５２；クレイグ，Ｊ．Ｃ．（Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．）ら（１９８８年）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４  ［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  （Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；アゾウレイ，Ｍ．（Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．）、ヴィルモント，Ｍ．（Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．）およびフラッピア，Ｆ．（Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．）（１９９１年）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６、２０１−５；コシネン，Ａ．Ｍ．Ｐ．（Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．）およびラポポート，Ｈ．（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．）（１９８９年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、１８５９−１８６６；クリスティ，Ｂ．Ｄ．（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．）およびラポポート，Ｈ．（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．）（１９８５年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；バートン（Ｂａｒｔｏｎ）ら、（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；ならびにサバシング（Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ）ら、（１９９２年）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。また、２００３年１２月２２日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号明細書、表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ」も参照のこと。
【０１０３】
非天然アミノ酸の細胞取り込み
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、例えば、タンパク質への組み入れのために非天然アミノ酸を設計し、選択する場合に典型的に考えられる１つの問題点である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性ではない可能性があることを示唆する。天然アミノ酸は、しばしば、様々な程度のアミノ酸特異性を示すタンパク質に基づく輸送システムのコレクションを介して、細胞に取り込まれる。存在するならば、どの非天然アミノ酸が細胞に取り込まれるかを評価する迅速なスクリーニングを行うことができる。例えば、２００３年１２月２２日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号明細書、表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ」；ならびにリュウ（Ｌｉｕ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）（１９９９年）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ、ＰＮＡＳ９６：４７８０−４７８５の毒性アッセイを参照のこと。多様なアッセイで容易に取り込みが分析されるが、細胞取り込み経路に従う非天然アミノ酸を設計することの別法は、インビボでアミノ酸を作製するための生合成経路を提供することである。
【０１０４】
非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸および他の化合物の産生のために、細胞には既に多くの生合成経路が存在する。特定の非天然アミノ酸ための生合成方法は天然には存在し得ない一方、例えば、細胞において、本発明はそのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸のための生合成経路は、場合により、新しい酵素を添加するかまたは存在している宿主細胞経路を修飾することによって、宿主細胞において作製される。さらなる新しい酵素は、場合により、天然に存在する酵素であるか、または人工的に展開された酵素である。例えば、（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、上掲の実施例において提示されている）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は、他の生物体由来の既知の酵素の組み合わせの添加に依存する。これらの酵素の遺伝子は、遺伝子を含んでなるプラスミドで細胞を形質転換することによって、細胞に導入することができる。遺伝子は、細胞において発現される場合、所望される化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により添加される酵素のタイプの例を、下記の実施例に提供する。さらなる酵素配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて見出される。人工的に展開された酵素もまた、場合により、同じ様式で細胞に添加される。この様式では、細胞の機構および細胞の資源を操作して、非天然アミノ酸を産生させる。
【０１０５】
実際、インビトロまたはインビボでの非天然アミノ酸の産生のための生合成経路における使用、または存在する経路の展開のために新規の酵素を産生させるため、様々な方法のいずれかを使用することができる。酵素および他の生合成経路成分を展開する多くの利用可能な方法を本発明に適用して、非天然アミノ酸を産生させる（または、実際には、新たな基質特異性もしくは目的の他の活性を有するためにシンテターゼを展開する）ことができる。例えば、インビトロもしくはインビボでの非天然アミノ酸の産生（あるいは新たなシンテターゼの産生）のための新規の酵素および／またはそのような酵素の経路を開発するために、場合により、ＤＮＡシャフリングが使用される。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）（１９９４年）、Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ３７０（４）：３８９−３９１；およびステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、（１９９４年）、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９１：１０７４７−１０７５１を参照のこと。関連するアプローチは、関連（例えば、相同）遺伝子のファミリーをシャッフルして、所望される特徴を伴う酵素を迅速に展開する。そのような「ファミリー遺伝子シャフリング」方法の例は、クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）ら（１９９８）「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ、３９１（６６６４）：２８８−２９１において見出される。新たな酵素（生合成経路の成分またはシンテターゼのいずれでも）は、例えば、オスターメイヤー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）ら（１９９９年）「Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ１７：１２０５に記載のように、「ハイブリッド酵素の創製のためのインクリメンタルな短縮（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ）」（「ＩＴＣＨＹ」）として公知のＤＮＡ組換え手順を使用して、作製することもできる。このアプローチを使用して、酵素のライブラリーまたは１つもしくはそれ以上のインビトロもしくはインビボ組換え方法のための基質として役割を果たすことができる他の経路の変異体を作製することができる。また、オスターメイヤー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）ら（１９９９年）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３５６２−６７、およびオスターメイヤー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）ら（１９９９年）、「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒ���ｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７：２１３９−４４も参照のこと。別のアプローチでは、指数アンサンブル変異（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、例えば、非天然アミノ酸（または新たなシンテターゼ）を産生させることに関する生合成反応を触媒する能力について選択される酵素のライブラリーまたは他の経路の変異体を生成する。このアプローチでは、各変更された位置で、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定すると同時に、目的の配列における小グループの残基を無作為化する。非天然アミノ酸（または新たなシンテターゼ）の産生のための新たな酵素を産生させるために、本発明に適用することができるそのような手順の例は、デレグレイブ（Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ）およびユーバン（Ｙｏｕｖａｎ）（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１：１５４８−１５５２において見出される。さらに別のアプローチでは、酵素および／または経路成分操作のための混成（ｄｏｐｅｄ）もしくは縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダムまたはセミランダム変異を、例えば、アーキン（Ａｒｋｉｎ）およびユーバン（Ｙｏｕｖａｎ）（１９９２年）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：２９７−３００；またはライドハール−オルソン（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ）ら（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般的な変異方法を例えば使用することによって、使用することができる。ポリヌクレオチドを使用して再集成する、しばしば、「非確率的（ｎｏｎ−ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）」変異と呼ばれるなお別のアプローチおよび部位集中変異（ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、酵素および／または経路成分を産生させることができ、次いで、１つもしくはそれ以上のシンテターゼもしくは（例えば、インビボでの非天然アミノ酸の産生のための）生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、ショート（Ｓｈｏｒｔ）「Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」国際公開第００／４６３４４号パンフレットを参照のこと。
【０１０６】
そのような変異方法の別法は、生物体のゲノム全体を組換え、得られる子孫を特定の経路の機能について選択すること（しばしば、「全ゲノムシャフリング」と称される）に関与する。このアプローチは、例えば、ゲノム組換えおよび非天然アミノ酸（もしくはその中間体）を産生する能力に対する生物体（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の細胞）の選択によって、本発明に適用することができる。例えば、以下の刊行物において教示される方法は、細胞において現存するおよび／または新しい経路の展開のための経路の設計に適用し、非天然アミノ酸をインビボで産生させることができる：パトナイック（Ｐａｔｎａｉｋ）ら（２００２年）「Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０（７）：７０７−７１２；ならびにチャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）「Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｎａｔｕｒｅ、２月７日４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１０７】
生物体および代謝経路の操作、例えば、所望される化合物の産生に関する他の技術もまた利用可能であり、非天然アミノ酸の産生にも適用することができる。有用な経路操作アプローチについて教示している刊行物の例として：ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ）（２００３年）「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら（２００２年）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ」Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：１２７−１３３；バンタ（Ｂａｎｔａ）ら（２００２年）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１（２０）、６２２６−３６；セリボノバ（Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａ）ら（２００１年）「Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、ならびにその他が挙げられる。
【０１０８】
使用する方法にかかわらず、典型的に、本発明の操作された生合成経路によって産生される非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質生合成に十分な濃度、例えば、天然の細胞量であるが、他の細胞中アミノ酸の濃度に有意な影響を及ぼさず、または細胞の資源を消耗しない程度の量で産生される。この様式でインビボで産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。一旦、細胞が特定の経路に所望される酵素を産生するように操作され、非天然アミノ酸が作製されると、場合により、インビボでの選択を使用して、リボソームタンパク質合成および細胞増殖に対して非天然アミノ酸の産生をさらに最適化する。
【０１０９】
３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）を組み入れるための直交性成分
本発明は、セレクターコドン、例えば、終止コドン、ナンセンスコドン、４もしくはそれ以上の塩基のコドンなどに例えば、インビボで応答して、酸化還元機能性アミノ酸、例えば、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）を成長中のポリペプチド鎖に組み入れるための直交性成分を産生させる組成物および方法を提供する。例えば、本発明は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）およびその対を提供する。これらの対を使用して、ＤＨＰを成長中のポリペプチド鎖に組み入れることができる。
【０１１０】
本発明の組成物は直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、ここで、Ｏ−ＲＳはＤＨＰでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは配列番号：１、またはその保存的変形を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる。本発明の所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは、酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、ここで、Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率を有する。
【０１１１】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は、場合により、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をさらに含むことができ、ここで、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。典型的に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、同種のシンテターゼの存在下、セレクターコドンに対応し、本明細書の配列表および実施例に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該配列によってコードされるＯ−ｔＲＮＡと比較して、少なくとも約、例えば、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％もしくはそれ以上の抑制効率を含む。１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡの合同の抑制効率は、Ｏ−ＲＳを欠くＯ−ｔＲＮＡの抑制効率より例えば、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍もしくはそれ以上高い。１つの態様では、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡの合同の抑制効率は、メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から誘導される直交性チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑制効率の少なくとも４５％である。
【０１１２】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は、場合により細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのような非真核細胞、もしくは真核細胞）、および／または翻訳系を含むことができる。
【０１１３】
翻訳系を含んでなる細胞（例えば、非真核細胞、または真核細胞）もまた本発明によって提供され、ここで、翻訳系は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）；および酸化還元機能性アミノ酸、例えば、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）を含む。典型的に、Ｏ−ＲＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳは、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。１つの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡは、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ポリヌクレオチド配列もしくは相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳは配列番号１、またはその保存的変形のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含んでなる。
【０１１４】
本発明の細胞は、さらなる異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および第２の非天然アミノ酸をさらに含んでなり、例えば、ここで、このＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは第２の非天然アミノ酸によってＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。場合により、本発明の細胞は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。
【０１１５】
所定の実施形態では、本発明の細胞は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、酸化還元機能性アミノ酸、および目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。本発明の所定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは、本明細書において列挙した任意のＯ−ＲＳ配列のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの効率のうち少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０１１６】
本発明の所定の実施形態では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、本明細書の配列表または実施例に記載のポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ポリヌクレオチド配列もしくは相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の特定の実施形態では、Ｏ−ＲＳは配列表に記載のアミノ酸配列、またはその保存的変形を含んでなる。１つの実施形態では、Ｏ−ＲＳまたはその一部は、本明細書の配列表または実施例に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１７】
本発明のＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは、様々な生物体（例えば、真核および／または非真核生物体）のいずれかから誘導することができる。
【０１１８】
ポリヌクレオチドもまた、本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書の配列表に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる人工（例えば、人為的、および天然に存在しない）ポリヌクレオチドを含み、および／または該ポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明のポリヌクレオチドはまた、高度にストリンジェントな条件下で、核酸の実質的に全体の長さにわたって、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、天然に存在するｔＲＮＡまたは対応するコーディング核酸に、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくはそれ以上同一であるポリヌクレオチドを含み（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡまたは対応するコーディング核酸以外である）、ここで、ｔＲＮＡは、セレクターコドン、例えば、４塩基コドンを認識する。上記のいずれかに、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくはそれ以上同一である人工ポリヌクレオチドおよび／または上記のいずれかの保存的変形を含んでなるポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１１９】
本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターもまた、本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター、および／または類似物を含むことができる。本発明のベクターを含んでなる細胞もまた、本発明の特徴である。
【０１２０】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分を産生する方法もまた、本発明の特徴である。これらの方法によって産生される成分もまた、本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１つのｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を産生させる方法は、変異ｔＲＮＡのライブラリーを作製すること；変異ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを変異して、セレクターコドンの認識を可能にし、それによって、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供し、第１の種の細胞の第１の集団をネガティブ選択に供することを含み、ここで、細胞は、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる。ネガティブ選択は、細胞に対して内因性であるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる細胞を排除する。これは、第１の種の細胞に直交性であるｔＲＮＡのプールを提供し、それによって、少なくとも１つのＯ−ｔＲＮＡを提供する。本発明の方法によって産生されるＯ−ｔＲＮＡもまた提供される。
【０１２１】
所定の実施形態では、方法は、第１の種の細胞の第２の集団をポジティブ選択に供与することをさらに含んでなり、ここで、細胞は、第１の種の細胞、同種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびポジティブ選択マーカーに直交性であるｔＲＮＡのプールのメンバーを含んである。ポジティブ選択を使用して、同種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによってアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望される応答を示し、それによって、Ｏ−ｔＲＮＡを提供するｔＲＮＡのプールのメンバーを含んでなる細胞について、細胞が選択またはスクリーニングされる。所定の実施形態では、細胞の第２の集団は、ネガティブ選択によって排除されなかった細胞を含んでなる。
【０１２２】
酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをチャージする直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを同定するための方法もまた提供される。例えば、方法は、第１の種の細胞の集団を選択に供することであって、ここで、細胞はそれぞれ：１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー、（例えば、複数のＲＳは、変異ＲＳ、第１の種以外の種から誘導されるＲＳ、または変異ＲＳおよび第１の種以外の種から誘導されるＲＳの両方を含むことができる）；２）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（例えば、１つもしくはそれ以上の種由来）；ならびに３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０１２３】
細胞（例えば、宿主細胞）は、複数のＲＳのメンバーを欠くかまたは減少した量の該メンバーを有する細胞と比較して、抑制効率の増強を示す細胞について選択またはスクリーニングされる。これらの選択された／スクリーニングされた細胞は、Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性なＲＳを含んでなる。方法によって同定される直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼもまた本発明の特徴である。
【０１２４】
細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのような非真核細胞、または真核細胞）において、指定された位置に３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）を伴うタンパク質を産生させる方法もまた、本発明の特徴である。例えば、方法は、適切な培地において、細胞を増殖させることを含み、ここで、細胞は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、タンパク質をコードする核酸を含んでなり、ＤＨＰを提供し、少なくとも１つのセレクターコドンにより核酸の翻訳中にタンパク質の指定された位置にＤＨＰを組み入れ、それによって、タンパク質を産生させる。細胞は：細胞において機能し、セレクターコドンを認識する直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；およびＤＨＰでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含んでなる。本方法によって産生されるタンパク質もまた本発明の特徴である。
【０１２５】
本発明はまた、タンパク質を含む組成物を提供し、ここで、タンパク質は、例えば、ＤＨＰを含んでなる。所定の実施形態では、タンパク質は、既知のタンパク質、例えば、治療用タンパク質、診断用タンパク質、産業用酵素、またはその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。場合により、組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる。
【０１２６】
核酸およびポリペプチド配列ならびに変異体
上記および下記において説明するように、本発明は、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳをコードする核酸ポリヌクレオチド配列、ならびにポリペプチドアミノ酸配列、例えば、Ｏ−ＲＳ、ならびに例えば、前記配列を含んでなる組成物、システムおよび方法を提供する。前記配列、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳアミノ酸ならびにヌクレオチド配列の例は、本明細書において開示されている（表１、例えば、配列番号１〜３を参照のこと）。しかし、当業者であれば、本発明が、例えば、実施例および配列表におけるような本明細書において開示された該配列に限定されないことを理解するであろう。当業者であれば、本発明はまた、例えば、本明細書に記載の機能を伴う、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳをコードする多くのおよび関連のない配列を提供することを理解するであろう。
【０１２７】
本発明は、ポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）およびポリヌクレオチド、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドまたはその部分、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチドなどを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、１つもしくはそれ以上のセレクターコドンを伴う本発明の目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるかまたはコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号１を含んでなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下で上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズする（かつ天然のポリヌクレオチド以外である）人工核酸は、本発明のポリヌクレオチドである。１つの実施形態では、組成物は、本発明のポリペプチドおよび賦形剤（例えば、緩衝液、水、薬学的に許容可能な賦形剤など）を含む。本発明はまた、本発明のポリペプチドと特異的に免疫反応する抗体または抗血清を提供する。人工ポリヌクレオチドは、人為的であり、天然に存在しないポリヌクレオチドである。
【０１２８】
本発明のポリヌクレオチドはまた、天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドに、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくはそれ以上同一である（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外である）人工ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドはまた、天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドに、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくはそれ以上同一である人工ポリヌクレオチドを含む。
【０１２９】
所定の実施形態では、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなど）は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。１つの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。別の実施形態では、発現ベクターは、本発明の１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態では、細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含んでなる。
【０１３０】
当業者であれば、開示された配列の多くの変異体が本発明に含まれることを理解するであろう。例えば、機能的に同一な配列を生じる開示された配列の保存的変形は、本発明に含まれる。核酸ポリヌクレオチド配列の変異体であって、少なくとも１つの開示された配列にハイブリダイズする上記変異体は、本発明に含まれると考えられる。例えば、標準的な配列比較技術によって決定されるような本明細書において開示される配列の独特なサブ配列もまた、本発明に含まれる。
【０１３１】
保存的変形
遺伝子暗号の縮重のため、「サイレント置換」（即ち、コードされるポリペプチドの変更を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするすべての核酸配列に包含される特徴である。同様に、アミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸が高度に類似の特性を伴う異なるアミノ酸で置換される「保存的アミノ酸置換」もまた、開示された構築物に高度に類似であるとして容易に同定される。開示された各配列のそのような保存的変形は、本発明の特徴である。
【０１３２】
特定の核酸配列の「保存的変形」は、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする該核酸を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一な配列を指す。当業者であれば、コードされた配列における単一のアミノ酸またはアミノ酸の小さな百分率（典型的に、５％未満、より典型的には、４％、２％もしくは１％未満）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に修飾された変形」であって、ここで、変異はアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じることを認識するであろう。従って、本発明の列挙されたポリペプチド配列の「保存的変形」は、同じ保存的置換グループの保存的酸化還元機能性アミノ酸によるポリペプチド配列のアミノ酸の小さな百分率、典型的に、５％未満、より典型的には２％もしくは１％未満の置換を含む。最終的に、非機能的配列の付加のような核酸分子のコードされる活性を変更しない配列の付加は、基本的な核酸の保存的変形である。
【０１３３】
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野において周知であり、ここで、１つのアミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、芳香族側鎖もしくは正に荷電した側鎖）を有する別のアミノ酸残基に代わって置換され、従って、ポリペプチド分子の機能的特性を実質的に変更しない。以下は、類似の化学的特性の天然アミノ酸を含有する例示的群について説明しており、ここで、群内の置換基が「保存的置換」である。
【０１３４】
【表１】
2007508034.tif 000004
【０１３５】
核酸ハイブリダイゼーション
比較ハイブリダイゼーションを使用して、本発明の核酸の保存的変形を含む配列番号２のような本発明の核酸を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション方法は本発明の核酸を区別する好適な方法である。さらに、高（ｈｉｇｈ）、超高（ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ）および超超高（ｕｌｔｒａ−ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ）ストリンジェンシー条件下で、配列番号２で表される核酸にハイブリダイズする標的核酸は本発明の特徴である。そのような核酸の例は、所定の核酸配列と比較して、１個もしくは数個のサイレントまたは保存的核酸置換基を伴う核酸を含む。
【０１３６】
試験核酸が、完全一致の相補的標的に対する場合の少なくとも１／２倍良好に、即ち、完全一致のプローブが、不一致の標的核酸のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５×〜１０×の高さであるシグナル対ノイズ比で完全一致の相補的標的に結合する条件下における標的へのプローブのハイブリダイゼーションの少なくとも１／２の高さでのシグナル対ノイズ比でハイブリダイズする場合、該試験核酸は、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言われる。
【０１３７】
核酸が典型的に溶液中で会合する場合、核酸は「ハイブリダイズ」する。核酸は、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなどのような様々な良好に特徴付けられた物理化学的力により、ハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針については、ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２章、パートＩ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」（エルゼビア、Ｎ．Ｙ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））、ならびに、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、上掲において見出される。ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）（１９９５年）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国、（ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）１）ならびにヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）（１９９５年）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国（ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）２）は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識化、検出および定量化に関する詳細について提供する。
【０１３８】
サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上の１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で、１ｍｇのヘパリンを伴う５０％ホルマリンであり、ハイブリダイゼーションは１晩行われる。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液に関する説明については、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、上掲を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄は、バックグランドプローブのシグナルを取り除くために、低ストリンジェンシー洗浄によって置き換えられる。例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４０℃で１５分間の２×ＳＳＣである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連のないプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の５×（もしくはそれ以上）高いシグナル対ノイズ比であれば、特異的ハイブリダイゼーションの検出であることが示される。
【０１３９】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験に関する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３年）、上掲ならびにヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）１および２において見出される。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、任意の試験核酸について、経験的に容易に決定することができる。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を決定することにおいては、基準の選択された組が一致するまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、（例えば、ハイブリダイゼーションあるいは洗浄において、温度を上昇すること、塩濃度を減少すること、界面活性剤の濃度を増加することおよび／またはホルマリンのような有機溶媒の濃度を増加することによって）緩徐に増加される。例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件では、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが、不一致の標的に対するプローブのハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも５×であるシグナル対ノイズ比で、完全一致の相補的標的に結合するまで、緩徐に増加される。
【０１４０】
「極めてストリンジェントな」条件は、特定のプローブの融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）試験配列の５０％が完全一致のプローブにハイブリダイズする温度である。本発明の目的のために、一般に、「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特異的配列に対するＴｍより約５℃低くあるように選択される。
【０１４１】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、完全一致の相補的標的核酸に対するプローブの結合に対するシグナル対ノイズ比が不一致の標的核酸のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０×の高さであるまで、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄条件が増加される条件である。完全一致の相補的標的核酸の少なくとも１／２のシグナル対ノイズ比で、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超高ストリンジェンシー条件下でプローブに結合すると言われる。
【０１４２】
同様に、さらにより高いレベルのストリンジェンシーは、関連ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を緩徐に増加することによって、決定することができる。例えば、完全一致の相補的標的核酸に対するプローブの結合に対するシグナル対ノイズ比が不一致の標的核酸のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０×、２０×、５０×、１００×、または５００×もしくはそれ以上高くなるまで、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄条件が増加されるストリンジェンシー。完全一致の相補的標的核酸の少なくとも１／２のシグナル対ノイズ比で、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超超高ストリンジェンシー条件下でプローブに結合すると言われる。
【０１４３】
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子暗号によって可能になる最大コドン縮重を使用して作製される場合に生じる。
【０１４４】
独特なサブ配列
１つの態様では、本発明は、本明細書において開示されるＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳ配列から選択される核酸において独特なサブ配列を含んでなる核酸を提供する。独特なサブ配列は、任意の既知のＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸と比較して独特である。アラインメントは、例えば、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴを使用して、実施することができる。任意の独特なサブ配列は、例えば、本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１４５】
同様に、本発明は、本明細書において開示されるＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチドにおいて独特なサブ配列を含んでなるポリペプチドを含む。ここで、独特なサブ配列は、任意の既知のポリペプチド配列に対応するポリペプチドと比較して独特である。
【０１４６】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、Ｏ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチドにおいて独特なサブ配列をコードする独特なコーディングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする標的核酸を提供し、ここで、独特なサブ配列は、コントロールポリペプチド（例えば、変異によって、本発明のシンテターゼが誘導される親配列）のいずれかに対応するポリペプチドと比較して独特である。独特な配列は、上記のようにして決定される。
【０１４７】
配列の比較、同定、および相同性
２つもしくはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する用語「同一」または「同一性」パーセントは、同じであるか、あるいは下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つ（もしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用するかまたは目視検査によって測定されるように、最大の対応について比較され、整列される場合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定された百分率を有する２つもしくはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。
【０１４８】
２つの核酸またはポリペプチド（例えば、Ｏ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ、またはＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関する語句「実質的に同一な」は、配列比較アルゴリズムを使用するかまたは目視検査によって測定されるように、最大の対応について比較され、整列される場合、少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つもしくはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような「実質的に同一な」配列は、典型的に、実際の先祖を参照せずに「相同」であるとみなされる。好ましくは、「実質的同一性」は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって、または比較しようとする２つの配列の全長にわたって実質的に同一である。
【０１４９】
タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらが共通の先祖タンパク質あるいはタンパク質配列から（天然もしくは人工的に）誘導される場合、「相同」である。同様に、核酸および／または核酸配列は、共通の先祖の核酸あるいは核酸配列から（天然もしくは人工的に）誘導される場合、相同である。例えば、任意の天然に存在する核酸を、任意の利用可能な変異方法によって修飾し、１つもしくはそれ以上のセレクターコドンを含むようにすることができる。発現される場合、この変異された核酸は、１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸、例えば、非天然アミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする。変異プロセスは、もちろん、１つもしくはそれ以上の標準的なコドンをさらに変更することができ、それによって、得られる変異タンパク質においても１つもしくはそれ以上の標準的なアミノ酸が変化する。相同性は、２つもしくはそれ以上の核酸またはタンパク質（あるいはその配列）間の配列類似性から一般的に推論される。相同性を確立するのに有用である配列間の類似性の正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質によって変動するが、相同性を確立ためには、２５％もの低い配列類似性が日常的に使用される。より高いレベルの配列類似性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％もしくはそれ以上を使用しても、相同性を確立することができる。配列類似性を百分率を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）については、本明細書において記載されており、一般に利用可能である。
【０１５０】
配列比較および相同性決定については、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列は、コンピュータに入力され、必要であればサブ配列候補が設計され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが標示される。次いで、配列比較アルゴリズムは、標示されたプログラムパラメータに基づく参照配列に対し、試験配列について、配列同一性パーセントを算出する。
【０１５１】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）の局所相同アルゴリズムによって、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリプマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、マディソン、ウィスコンシン州）のコンピュータ化された実行によって、または目視検査（一般に、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、下記を参照のこと）によって行うことができる。
【０１５２】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適切であるアルゴリズムの１つの例は、アウスベル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さの単語で整列する場合、いくつかのポジティブに評価された閾値スコアＴに一致するかまたは満足する問い合わせ配列において長さＷの短い単語を同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することに関与する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、上掲）。これらの初期隣接ワードのヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードのヒットは、累積アラインメントスコアを増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列のために、パラメータＭ（一致する残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（一致する残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して、算出する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。各方向におけるワードのヒットの延長は、次の場合停止される：累積アラインメントスコアが、その最大限に達成された値から量Ｘだけ低下する場合；１つもしくはそれ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積のため累積スコアが０もしくはそれ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照のこと）。
【０１５３】
配列同一性パーセントを算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７（１９９３年）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の表示を提供する最も小さな確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小の全確率が約０．１未満、好ましくは、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満である場合、参照配列により類似であるとみなされる。
【０１５４】
変異および他の分子生物学技術
本発明のならびに本発明において使用されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、分子生物学的技術を使用して、操作することができる。分子生物学的技術について説明している一般的なテキストとして、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ））；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、２００１年（「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．の合弁会社、（２００３年中に補充された）（「アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）」）が挙げられる。これらのテキストは、変異、ベクター、プロモーターならびに例えば、酸化還元機能性アミノ酸（例えば、ＤＨＰ）、直交性ｔＲＮＡ、直交性シンテターゼ、およびそれらの対を含むタンパク質の産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連トピックの使用について記載している。
【０１５５】
例えば、ｔＲＮＡ分子を変異するため、ｔＲＮＡのライブラリーを生成するため、シンテターゼのライブラリーを生成するため、酸化還元機能性アミノ酸をコードするセレクターコドンを目的のタンパク質またはポリペプチドに挿入するために、多様な対応の変異が本発明において使用される。それらは、部位特異的、ランダム点変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングまたは他の再帰的変異（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを使用する変異、オリゴヌクレオチド特異的変異、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使用する変異など、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。さらなる適切な方法として、ポイントミスマッチ修飾、修飾欠損宿主株を使用する変異、制限−選択および制限−精製、欠失変異、総遺伝子合成による変異、二本鎖切断修復などが挙げられる。例えば、キメラ構築物に関与する変異もまた、本発明に含まれる。１つの実施形態では、変異は、天然に存在する分子または変更もしくは変異された天然に存在する分子の既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造などによって誘導することができる。
【０１５６】
宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、あるいは本発明のポリヌクレオチド、例えば、クローニングベクターもしくは発現ベクターあり得る本発明のベクターを含む構築物で遺伝子操作（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）される。例えば、直交性ｔＲＮＡ、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ、および誘導体化しようとするタンパク質のコーディング領域を、所望される宿主細胞において機能的である遺伝子発現コントロールエレメントに操作可能に連結する。典型的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、場合により、少なくとも１つの非依存的ターミネーター配列、真核生物、もしくは原核生物、または両方（例えば、シャトルベクター）においてカセットの複製を可能にする配列ならびに原核生物および真核生物系の両方に対する選択マーカーを含有する遺伝子発現カセットを含んでなる。ベクターは、原核生物、真核生物、あるいは好ましくは両方における複製および／または組込みに適切である。ギルマン（Ｇｉｌｉｍａｎ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｇｅｎｅ８：８１（１９７９年）；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７年）；シュナイダー，Ｂ．（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、ベーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）（すべて上掲）を参照のこと。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、またはコンジュゲートされたポリヌクレオチドの形態であることができる。ベクターは、エレクトロポレーション（フロム（Ｆｒｏｍ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、５８２４（１９８５年）、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子のマトリックス内、または表面上のいずれかに核酸を伴う小粒子による高速衝撃貫通（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７、７０−７３（１９８７））などを含む標準的な方法によって、細胞および／または微生物に導入される。
【０１５７】
クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣ、例えば、ＡＴＣＣによって出版されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６年）ゲルナ（Ｇｈｅｒｎａ）ら（編）によって、提供される。配列決定、クローニングならびに分子生物学および基礎をなす理論的考察のためのさらなる基本的な手順についてもまた、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（上掲）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（上掲）、およびワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら（１９９２年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク州において見出される。さらに、本質的に任意の核酸（および事実上任意の標識核酸、標準的または非標準的にかかわらず）は、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ、カリフォルニア州、ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州、ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、カリフォルニア州）およびその他多くのような任意の様々な商業的供給源から特別にまたは標準的に注文することができる。
【０１５８】
操作された宿主細胞は、例えば、スクリーニング工程、プロモーターを活性化することまたは形質転換体を選択することのような活動に適切なように修飾された従来の栄養培地において培養することができる。これらの細胞は、場合により、トランスジェニック生物体へ培養することができる。例えば、細胞単離および培養（例えば、以後の核酸単離のため）のための他の有用な参考文献として、フレッシュネイ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９９４年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク州および該文献に引用された参考文献；ペイネ（Ｐａｙｎｅ）ら（１９９２年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク州；ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）およびフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）（編）（１９９５年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ニューヨーク州）ならびにアトラス（Ａｔｌａｓ）およびパークス（Ｐａｒｋｓ）（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３年）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、フロリダ州が挙げられる。
【０１５９】
目的のタンパク質およびポリペプチド
酸化還元機能性アミノ酸の１つの利点は、それらを使用して、タンパク質における電子移動プロセスを操作することができることである。他の利点として、酸化還元機能性タンパク質の発現は、研究ならびにタンパク質における電子移動経路を変更する能力を容易にし、酵素の触媒機能を変更し、小さな分子および生体分子などでタンパク質を架橋することができることが挙げられるが、これに限定されない。少なくとも１つの酸化還元機能性アミノ酸を伴う目的のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物および方法を使用して産生される少なくとも酸化還元機能性アミノ酸を伴うポリペプチドまたはタンパク質を含む。賦形剤（例えば、薬学的に許容可能な賦形剤）もまた、タンパク質と共に存在することができる。場合により、本発明のタンパク質は、翻訳後修飾を含む。
【０１６０】
細胞において、指定された位置で酸化還元機能性アミノ酸を伴うタンパク質を産生させる方法もまた、本発明の特徴である。例えば、方法は、適切な培地において、細胞を増殖させることであって、ここで、細胞は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、タンパク質をコードする核酸を含んでなる；および酸化還元機能性アミノ酸を提供することを含み；ここで、細胞は：細胞において機能し、セレクターコドンを認識する直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）；および酸化還元機能性アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含んでなる。所定の実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡは、同種のシンテターゼの存在下、セレクターコドンに対応し、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該配列によってコードされるＯ−ｔＲＮＡと比較して、少なくとも約、例えば、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％もしくはそれ以上の抑制効率を含んでなる。本方法によって産生されるタンパク質もまた本発明の特徴である。
【０１６１】
本発明はまた、タンパク質を含む組成物を提供し、ここで、タンパク質は、酸化還元機能性アミノ酸を含んでなる。所定の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、産業用酵素、またはその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。
【０１６２】
本発明の組成物および本発明の方法によって作製される組成物は、場合により、細胞に存在する。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対または本発明の個々の成分を、タンパク質に組み入れられる酸化還元機能性アミノ酸を生じる宿主系の翻訳機構において、使用することができる。２００４年４月１６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号明細書、表題「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」；および国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ」は、このプロセスについて説明しており、本明細書において参考として援用される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対が宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に導入される場合、対は、セレクターコドンに応答して、外部から増殖培地に添加することができるＤＨＰのような酸化還元機能性アミノ酸、例えば、チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸の誘導体のような合成アミノ酸のタンパク質へのインビボ組み入れをもたらす。場合により、本発明の組成物は、インビトロ翻訳系、またはインビボ系において存在することができる。
【０１６３】
本発明の細胞は、多量な有用な量で非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を合成する能力を提供する。１つの態様では、組成物は、場合により、酸化還元機能性アミノ酸を含んでなる例えば、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラムもしくはそれ以上、またはインビボタンパク質産生方法（組換えタンパク質産生および精製に関する詳細は、本明細書において提供される）に達成させることができる量のタンパク質を含む。別の態様では、タンパク質は、場合により、（例えば、約１ｎＬ〜約１００Ｌのいずれかの容積で）例えば、細胞溶解物中、緩衝液、薬学的緩衝液、あるいは他の液体懸濁物において、例えば、１リットルあたり少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも１ミリグラムのタンパク質、または少なくとも１リットルあたり１０ミリグラムもしくはそれ以上のタンパク質の濃度で、組成物中に存在する。少なくとも１つの酸化還元機能性アミノ酸を含む細胞におけるタンパク質の大量産生（例えば、他の方法、例えば、インビトロ翻訳で典型的に可能な量を超える）は、本発明の特徴である。
【０１６４】
酸化還元機能性アミノ酸の組み入れは、例えば、タンパク質構造および／または機能の変化を調整する、例えば、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位のアクセス可能性（例えば、タンパク質アレイのための）部分への標的化を変更するなどのために行うことができる。酸化還元機能性アミノ酸を含むタンパク質は、増強されたまたはさらにまったく新たな触媒もしくは物理特性を有することができる。例えば、以下の特性が、場合により、酸化還元機能性アミノ酸のタンパク質の封入によって修飾される：毒性、生体分布、構造特性、分光特性、化学および／または物理特性、触媒能、半減期（例えば、血清中半減期）、（例えば、共有もしくは非共有的に）他の分子と反応する能力など。少なくとも１つの酸化還元機能性アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、例えば、新規の治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合性タンパク質（例えば、抗体）、ならびに例えば、タンパク質構造および機能の研究に有用である。例えば、ドアティー（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ）、（２０００年）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：６４５−６５２を参照のこと。
【０１６５】
本発明の１つの態様では、組成物は、少なくとも１、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０もしくはそれ以上の非天然アミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸および／または他の非天然アミノ酸を伴う少なくとも１つタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じであるかまたは異なることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上の部位が存在し得る。別の態様では、組成物は、少なくとも１つを伴うタンパク質を含むが、タンパク質に存在する特定のアミノ酸のうち全体未満が酸化還元機能性アミノ酸で置換される。１を超える非天然アミノ酸を伴う所定のタンパク質では、非天然アミノ酸は、同一であるかまたは異なることができる（例えば、タンパク質は、２もしくはそれ以上の異なるタイプの非天然アミノ酸を含みことができるか、または２つの同じ非天然アミノ酸を含むことができる）。２を超える非天然アミノ酸を伴う所定のタンパク質では、非天然アミノ酸は、同じであるか、異なるか、または少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸を伴う同じ種類の複数の非天然アミノ酸の組み合わせであることができる。
【０１６６】
酸化還元機能性アミノ酸（および例えば、１つもしくはそれ以上のセレクターコドンを含む任意の対応するコーディング核酸）を含む本質的に任意のタンパク質（またはその部分）は、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、産生させることができる。数十万の既知のタンパク質（このうちのいくつかは、例えば、関連の翻訳系において１つもしくはそれ以上の適切なセレクターコドンを含むように任意の利用可能な変異方法を調整することによって、１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾させることができる）を同定することは試みられていない。既知のタンパク質の共通配列のレパートリーとして、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＮＣＢＩが挙げられる。他のレパートリーもまた、インターネットを検索することによって容易に同定することができる。
【０１６７】
典型的に、タンパク質は、任意の利用可能なタンパク質（例えば、治療用タンパク質、診断用タンパク質、産業用酵素、またはその部分など）に、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％もしくはそれ以上同一であり、それらは、１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含んでなる。１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸を含んでなるように修飾することができる治療用、診断用、および他のタンパク質の例は、２００４年４月１６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号明細書、表題「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」；および国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ」において見出すことができるが、これらに限定されない。１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸を含んでなるように修飾することができる治療用、診断用、および他のタンパク質の例として、例えば、α−１アンチトリプシン、アンギオスタチン、抗溶血因子、抗体（抗体に関するさらなる詳細については、下記に見出される）、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えば、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば、単球遊走因子−１、単球遊走因子−２、単球遊走因子−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体インヒビター、補体受容体１、サイトカイン（例えば、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、剥脱性毒素ＡおよびＢ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ドナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグタンパク質（例えば、ソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２など）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱性毒素Ａ、Ｂ、およびＣ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、即ち、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、サイモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼならびにその他多数が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
本明細書において記載の酸化還元機能性アミノ酸のインビボ組み入れのための組成物および方法を使用して作製することができるタンパク質の１つのクラスは、転写調節因子またはその一部を含む。転写調節因子の例として細胞の増殖、分化、調節などを調節する遺伝子および転写調節タンパク質が挙げられる。転写調節因子は、原核生物、ウイルス、ならびに真菌、植物、酵母、昆虫、および哺乳動物を含む動物を含む真核生物において見出され、広範な治療標的を提供する。発現および転写活性化因子は、多くの機構、例えば、受容体に結合し、シグナル伝達カスケードを刺激し、転写因子の発現を調節し、プロモーターおよびエンハンサーに結合し、プロモーターおよびエンハンサーに結合するタンパク質に結合し、ＤＮＡを巻き戻し、プレ−ｍＲＮＡをスプライスし、ＲＮＡをポリアデニル化し、ＲＮＡを分解することによって、転写を調節することが理解される。
【０１６９】
本発明のタンパク質の１つのクラス（例えば、１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸を伴うタンパク質）として、発現活性化因子、例えば、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、それらの受容体、および癌遺伝子産物、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８など）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ならびにヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子および対応する癌遺伝子産物、例えば、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ならびにＭｅｔ；ならびに転写活性化因子および抑制因子、例えば、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、およびステロイドホルモン受容体、例えば、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンドおよびコルチコステロンに対する受容体が挙げられる。
【０１７０】
少なくとも１つの酸化還元機能性アミノ酸を伴う酵素（例えば、産業用酵素）またはその部分もまた、本発明によって提供される。酵素の例として、例えば、アミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、デオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えば、ｐ４５０）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
これらのタンパク質の多くは、市販されており（例えば、Ｓｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００２年カタログおよび価格表を参照のこと）、対応するタンパク質配列および遺伝子ならびに典型的にその多くの変異体は、周知であり得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋを参照のこと）。それらのいずれも、本発明に従う１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸の挿入によって修飾し、例えば、１つもしくはそれ以上の目的の治療、診断または酵素特性についてタンパク質を変更することができる。治療関連特性の例として、血清中半減期、保存半減期、安定性、免疫原性、治療活性、検出可能性（例えば、非天然アミノ酸、例えば、酸化還元機能性アミノ酸におけるレポーター基（例えば、標識もしくは標識結合部位）の封入による）、ＬＤ５０の減少または他の副作用、胃管系を介して身体に進入する能力（例えば、経口アベイラビリティ）などが挙げられる。診断特性の例として、保存半減期、安定性、診断活性、検出可能性などが挙げられる。関連酵素特性の例として、保存半減期、安定性、酵素活性、産生能などが挙げられる。
【０１７２】
他の様々なタンパク質もまた、本発明の１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸を含むために、修飾することができる。例えば、本発明は、１つもしくはそれ以上のワクチンタンパク質における１つもしくはそれ以上の天然アミノ酸を、例えば、感染性真菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種；細菌、特に、病原性細菌のモデルとして役割を果たす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ならびにブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（例えば、アウレウス（ａｕｒｅｕｓ））、または連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）（例えば、ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））のような医学的に重要な細菌；胞子虫（ｓｐｏｒｏｚｏａ）（例えば、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ））、根足虫（ｒｈｉｚｏｐｏｄｓ）（例えば、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ））および鞭毛虫（トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リ−シュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）など）のような原生動物；（＋）ＲＮＡウイルス（例として、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）；ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）；トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、風疹（ｒｕｂｅｌｌａ）；フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ＨＣＶ；およびコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が挙げられる）、（−）ＲＮＡウイルス（例えば、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ＶＳＶ；パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｍｓｅｓ）、例えば、ＲＳＶ；オルトミクスウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｍｓｅｓ）、例えば、インフルエンザ；ブニアウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅｓ）；およびアレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ））、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ））、ＲＮＡからＤＮＡへのウイルス、即ち、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶ、ならびにＢ型肝炎のような所定のＤＮＡからＲＮＡへのウイルスのようなウイルス由来のタンパク質における酸化還元機能性アミノ酸で置換することを含むことができる。
【０１７３】
昆虫耐性タンパク質（例えば、Ｃｒｙタンパク質）、デンプンおよび脂質産生酵素、植物および昆虫毒素、毒素耐性タンパク質、マイコトキシン（Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ）解毒タンパク質、植物成長酵素（例えば、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ルビスコ（ＲＵＢＩＳＣＯ）」）、リポオキシゲナーゼ（ＬＯＸ）、およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼのような農業関連タンパク質もまた、酸化還元機能性アミノ酸修飾に適切な標的である。
【０１７４】
所定の実施形態では、本発明の方法および／または組成物における目的のタンパク質もしくはポリペプチド（またはその部分）は、核酸によってコードされる。典型的に、核酸は、少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個もしくはそれ以上のセレクターコドンを含んでなる。
【０１７５】
目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を、当業者に周知であり、本明細書の「変異および他の分子生物学技術」に記載の方法を使用して変異し、酸化還元機能性アミノ酸の組み入れのために、例えば、１つもしくはそれ以上のセレクターコドンを含めるようにすることができる。例えば、目的のタンパク質のための核酸を変異して、１つもしくはそれ以上のセレクターコドンを含み、１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸の挿入を提供するようにする。本発明は、そのような任意の変異体、例えば、変異、例えば、少なくとも１つの酸化還元機能性アミノ酸を含む任意のタンパク質のバージョンを含む。同様に、本発明はまた、対応する核酸、即ち、１つもしくはそれ以上の酸化還元機能性アミノ酸をコードする１つもしくはそれ以上のセレクターコドンを伴う任意の核酸を含む。
【０１７６】
酸化還元機能性アミノ酸を含むタンパク質を作製するために、宿主細胞および直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介して酸化還元機能性アミノ酸のインビボ組み入れに適応される生物体を使用することができる。宿主細胞は、直交性ｔＲＮＡを発現する１つもしくはそれ以上のベクター、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ、および誘導体化しようとするタンパク質をコードするベクターで遺伝子操作（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）される。これらの成分のそれぞれは、同じベクター上にあることができるか、またはそれぞれが個別のベクター上にあることができるか、または２つの成分が１つのベクター上にあり、第３の成分が第２のベクター上にあることができる。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、またはコンジュゲートされたポリヌクレオチドの形態であることができる。
【０１７７】
免疫活性によるポリペプチドの規定
本発明のポリペプチドは、様々な新たなポリペプチド配列（例えば、ここで、翻訳系において合成されるタンパク質の場合、または例えば、新規のシンテターゼ、標準的なアミノ酸の新規な配列の場合に、酸化還元機能性アミノ酸を含んでなる）を提供するため、ポリペプチドはまた、例えば、免疫学的アッセイにおいて認識することができる新たな構造的特徴を提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清ならびにそのような抗血清により結合されるポリペプチドの作製は、本発明の特徴である。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、または  分析物（抗原）に特異的に結合し、認識するそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。例として、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および一本鎖抗体などが挙げられる。Ｆａｂフラグメントおよびファージディスプレイを含む発現ライブラリーによって産生されるフラグメントを含む免疫グロブリンのフラグメントもまた、本明細書において使用する用語「抗体」に含まれる。抗体の構造および用語については、例えば、ポール（Ｐａｕｌ）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、１９９９年、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州を参照のこと。
【０１７８】
イムノアッセイにおいて使用するための抗血清を産生させるために、本明細書に記載のように、１つもしくはそれ以上の免疫原性ポリペプチドを産生させ、精製した。例えば、組換えタンパク質は、組換え細胞において産生させることができる。（マウスの事実上の遺伝子同一性により、結果はより良好に再現可能であるため、本アッセイにおいて使用される）近交系マウスを、フロイントのアジュバントのような標準的なアジュバントと組み合わせた免疫原性タンパク質、および標準的なマウス免疫プロトコルにより免疫する（抗体作製、イムノアッセイ形式および特異的免疫活性を決定するために使用することができる条件に関する標準的な説明については、例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨーク州を参照のこと）。タンパク質、抗体、抗血清などに関するさらなる詳細については、米国特許出願第６０／４７９，９３１号明細書、同第６０／４６３，８６９号明細書、および同第６０／４９６，５４８号明細書、表題「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」；国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、表題「ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ」；２００３年１月１６日に出願された特許出願、表題「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、米国特許出願第６０／４４１，４５０号明細書；ならびに２００２年１２月２２に出願された特許出願、表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ」、代理人整理番号Ｐ１００１ＵＳ００において見出すことができる。
【０１７９】
Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳならびにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対の使用
本発明の組成物および本発明の方法によって作製される組成物は、場合により、細胞に存在する。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対または本発明の個々の成分を、タンパク質に組み入れられる酸化還元機能性アミノ酸を生じる宿主系の翻訳機構において、使用することができる。対応する特許出願「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）らは、このプロセスについて説明しており、本明細書において参考として援用される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対が宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に導入される場合、対は、セレクターコドン、例えば、アンバーナンセンスコドンに応答して、外部から増殖培地に添加することができる酸化還元機能性アミノ酸のタンパク質、例えば、ミオグロビンまたは治療用タンパク質へのインビボ組み入れをもたらす。場合により、本発明の組成物は、インビトロ翻訳系、またはインビボ系において存在することができる。酸化還元機能性アミノ酸を伴うタンパク質は、治療用タンパク質として使用することができ、酵素の触媒機能および／またはタンパク質の電子移動経路を変更する、小さな分子および／または生体分子でタンパク質を架橋する、タンパク質の構造、他のタンパク質との相互作用、タンパク質における電子移動プロセスなどに関する研究を容易にするために使用することができる。
【０１８０】
キット
キットもまた、本発明の特徴である。例えば、細胞において、少なくとも１つの酸化還元機能性アミノ酸を含んでなるタンパク質を産生させるためのキットが提供され、ここで、キットは、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、および／またはＯ−ｔＲＮＡ、ならびに／あるいはＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、および／またはＯ−ＲＳを含有する容器を含む。１つの実施形態では、キットは、酸化還元機能性アミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、キットは、タンパク質を産生させるための指示物質をさらに含んでなる。
【実施例１】
【０１８１】
以下の実施例は、例示のために付与されるものであって、特許請求の範囲を制限するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲から逸脱することなく、あまり重要ではないパラメータを変更することができることを理解するであろう。
【０１８２】
実施例１：酸化還元機能性アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み入れ
最近、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母において、直交性ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対を使用して、多くの非天然アミノ酸をタンパク質に選択的に組み入れることができることが報告されている（ワング（Ｗａｎｇ）ら（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：４９８−５００；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２：６７３５−６７４６；チン（Ｃｈｉｎ）ら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４−９６７）。これらの直交性の対は、宿主細胞の翻訳機構の内因性成分とは交差反応しないが、所望される非天然アミノ酸を認識し、アンバーナンセンスコドン、ＴＡＧに応答して、タンパク質に組み入れる（ワング（Ｗａｎｇ）ら（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：５０１０−５０１１；ワング（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）（２００１年）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、８：８８３−８９０）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ；図１における化合物１を参照のこと）を遺伝的にコードさせるために、直交性メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ｔＲＮＡ−シンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ；図５および表１において提供される、およびまた、配列番号４においてアミノ酸配列が提供され、配列番号５においてヌクレオチド配列が提供される）の特異性を、シンテターゼがＤＨＰで変異チロシンｔＲＮＡアンバーサプレッサー（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ）をアミノアシル化し、一般の２０種のアミノ酸のいずれでもアミノアシル化しないように変更した。これらの変異シンテターゼを、２種の変異ＭｊＴｙｒＲＳライブラリーから選択した（ワング（Ｗａｎｇ）ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：４９８−５００；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４１：２８４０−２８４２）。バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の相同性ＴｙｒＲＳの結晶構造の解析に基づく第１のライブラリー（ブリック（Ｂｒｉｃｋ）ら（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０８：８３−９８）では、チロシンのアリール環のパラ位の６．５Å内に存在するＭｊＴｙｒＲＳの活性部位の５残基（Ｔｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９、およびＬｅｕ１６２）を無作為に変異した（プラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ上でコードされる）。第２のライブラリーでは、チロシンアリール環のメタ位の６．９Å内の６塩基（Ｔｙｒ３２、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、Ａｌａ１６７）を無作為に変異した（プラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ−ｍ上でコードされる）。
【０１８３】
ＴｙｒＲＳが特異的にＤＨＰを組み入れ、他のいずれの天然アミノ酸も組み入れないようにＴｙｒＲＳの特異性を変更するために、いくらかのラウンドのポジティブおよびネガティブ選択からなる遺伝子選択を適用した。ポジティブ選択では、変異ＴｙｒＲＳの両方のライブラリーを、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（ｐＲｅｐ（２）／ＹＣ）における非必須位置（Ａｓｐ１１２）に導入されたアンバーコドンの抑制に基づく選択スキームに供した。変異ＴｙｒＲＳライブラリー、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ遺伝子、アンバー変異ＣＡＴ遺伝子で形質転換した細胞を、ＤＨＰの酸化を回避するための嫌気条件下、１ｍＭ  ＤＨＰおよび７０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する最小培地において増殖させた。生存細胞は、ＤＨＰまたは内因性アミノ酸のいずれかでｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒをアミノアシル化する変異ＴｙｒＲＳを含有する。次に、ネガティブ選択を適用して、毒性のバルナーゼ遺伝子（ｐＬＷＪ１７Ｂ３）の非必須位置（Ｇｌｎ２、Ａｓｐ４４、Ｇｌｙ５５）に導入した３個のアンバーコドンの抑制に基づく天然アミノ酸をチャージする変異ＴｙｒＲＳを取り出した。先のポジティブ選択由来の変異ＴｙｒＲＳ、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ、およびアンバー変異バルナーゼ遺伝子を所有する細胞を、ＤＨＰの非存在下、ルーリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地において増殖させた。これらの条件下、内因性アミノ酸に対する特異性を伴う変異ＴｙｒＲＳをコードする細胞は、全長バルナーゼを産生し、死滅する。ＤＨＰに対する特異性を伴う変異ＴｙｒＲＳを含有するそれらの細胞のみが生存することができる。２ラウンドのネガティブ選択と交代して行われた３ラウンドのポジティブ選択後、高濃度のクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）（９０ｍｇ／Ｌ）での生存が、ＤＨＰ、選択された変異ＴｙｒＲＳ遺伝子（ＤＨＰＲＳ）、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ、およびＡｓｐ１１２ＴＡＧ  ＣＡＴ遺伝子の存在に依存するクローンを展開した。しかし、ＤＨＰの非存在下では、同じ細胞が、２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）においてしか生存しなかった。この結果は、選択されたＤＨＰＲＳ酵素が、天然アミノ酸よりもＤＨＰにより高い特異性を有することを示唆する。配列決定により、選択されたＤＨＰＲＳにおいて以下の変異が示された：Ｔｙｒ３２→Ｌｅｕ、Ａｌａ６７→Ｓｅｒ、Ｈｉｓ７０→Ａｓｎ、Ａｌａ１６７→Ｇｌｎ。図６および表１にＤＨＰＲＳシンテターゼを示す。また、アミノ酸配列を配列番号１に提供し、ヌクレオチド配列を配列番号３に提供する。
【０１８４】
選択されたクローンｐＤＨＰＲＳを使用して、ＤＨＰ組み入れの精度および効率を測定するために、本発明者らは、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ変異マッコウクジラミオグロビン（Ｍｂ；チン（Ｃｈｉｎ）ら（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：１１０２０−１１０２４を参照のこと）の表面暴露された第４の残基におけるアンバーコドンに応答するＤＨＰを組み入れた。増殖培地としてＧＭＭＬ（ロイシンを伴うグリセロール最小培地）を使用し、タンパク質への組み入れ前のＤＨＰの酸化を防止するための還元条件（１００μＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））下で、ＤＨＰ（ＤＨＰＭｂ）を含有する全長ミオグロビンを発現させた。変異タンパク質の収量は約１ｍｇ／リットルであった（同じ条件下での野生型Ｍｂ（ｗｔＭｂ）の収量は検出不能である）。ＤＨＰの非存在下では、全長Ｍｂはまったく発現されず；ＤＴＴの非存在下では、ほとんどの細胞が酸化型キノンの毒性のために死滅した（図１の化合物３を参照のこと）。全長ＤＨＰＭｂを、コバルトＩＭＡＣ樹脂（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）を使用して精製した。ＤＨＰの存在および非存在下において発現された変異タンパク質の精製されたサンプルを、銀染色、およびゲルのウエスタンブロッティングのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填した。抗Ｈｉｓ６タグ抗体を使用すると、ＤＨＰＲＳまたはｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒのいずれかの非存在下では全長Ｍｂは発現されなかった（図２Ａに示す）。四重極−四重極飛行時間型（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＱｑＴＯＦ）質量分析器を具備したエレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｒａｙ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＥＳＩ）を使用して、タンパク質の分子量を測定した。図２Ｂは、１８，４４８．５ダルトンの質量を伴うＤＨＰＭｂのＥＳＩ−ＱｑＴＯＦ質量スペクトルを示す。これは、Ｍｂを含有するＤＨＰに対して算出された１８４４７．２ダルトンの質量から７０ｐ．ｐ．ｍ．内である（隣接するピークは、測定技術により、コントロール実験に従って、生じた酸素、または酸素およびプロトンの消失による１８，４３２．３ダルトンの質量を示す）。
【０１８５】
ＤＨＰＭｂを含有する溶液に裸金電極を浸漬した場合、酸化型ハイドロキノンの酸化還元波を観察することができるかどうかを、サイクリックボルタンメトリーを使用して決定した。図３Ａは、ｗｔＭＢを含有する溶液および嫌気条件下のＤＨＰＭｂの不可逆的なボルタンメトリック応答を示す（バート（Ｂａｒｄ）およびホークナー（Ｆａｕｌｋｎｅｒ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｊｏｈｎ  Ｗ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ニューヨーク州、１９８０年；２１３−２４８頁、４２９−４８７頁および６７５−６９８頁）。ｗｔＭｂＦｅ（ＩＩＩ）を起源とする還元ピーク電位をＥ＝−３２０ｍＶで観察すると、変異タンパク質の還元ピーク電位は、より負電位側のＥ＝−４００ｍＶにシフトする。このシフトは、ＤＨＰの非存在下におけるよりも相当低い電位でのＦｅ（ＩＩＩ）の還元を容易にし得るＤＨＰの存在によるものである。不可逆的な観察されたボルタモグラムは、遅い電子移動速度によるものであり、これは、電子の電極への制限されたアクセス可能性から誘導されるようである。図３Ｂは、１００μＭのＤＨＰ、ｗｔＭｂおよびＤＨＰＭｂを含有する溶液のボルタンメトリック応答を示す。ＤＨＰの酸化を起源とする電流は、変異型Ｍｂの存在下または遊離ＤＨＰの溶液においてのみ、それぞれＥ＝５８０ｍＶおよびＥ＝３８５ｍＶで出現する。これらの結果は、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ヘム基の還元電位に対するＭｂ中ＤＨＰの存在の有意な影響が存在し、その逆もまた同様であることを明らかに示す。
【０１８６】
本明細書において提供される説明は、生物体、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、酸化還元機能性アミノ酸、例えば、ＤＨＰを、効率的かつ選択的にタンパク質に組み入れることができることを実証する。これらのアミノ酸は、タンパク質内において電子化学的に酸化され得る。酸化還元機能性アミノ酸を部位特異的にタンパク質に組み入れる能力は、タンパク質における電子移動の研究を容易にすることができ、ならびに新規の特性を伴う酸化還元タンパク質の操作を可能にする。モデルタンパク質、例えば、Ｍｂおよび他のタンパク質における多様な部位への酸化還元機能性アミノ酸、例えば、ＤＨＰの部位特異的組み入れを使用して、このタンパク質およびその他における電子移動経路を研究することができる（マヨ（Ｍａｙｏ）ら（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：９４８−９５２；グレイ（Ｇｒａｙ）およびマルストーム（Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ）（１９８９年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：７４９９−７５０５）。
【０１８７】
実施例２：酸化還元機能性アミノ酸の組み入れのための例示的Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ
例示的Ｏ−ｔＲＮＡは、配列番号２を含んでなる（表１を参照のこと）。Ｏ−ＲＳの例には、配列番号１（表１を参照のこと）および図６において提供されるアミノ酸配列が含まれる。Ｏ−ＲＳまたはその部分をコードするポリヌクレオチドの例には、配列番号１を含んでなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが含まれる。例えば、図６および配列番号３において提供されるポリヌクレオチドは、例示的Ｏ−ＲＳをコードする。
【０１８８】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示目的のみであり、それに照らして行われる多様な修飾や変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。
【０１８９】
上記において本発明について、明確および理解を目的として若干詳細に説明してきたが、本開示を読んだ当業者にとっては、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における多様な変更を行うことができることが明らかであろう。例えば、上記のすべての技術および装置は、多様な組み合わせで使用することができる。本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の書面は、各個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の書面が、あたかもすべての目的について参考として援用されることが個々示唆されているが如く、同じ程度に、すべての目的について、それらの全体が参考として援用される。
【０１９０】
【表２−１】
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【表２−２】
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【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】容易にＤＨＰ−キノン３に酸化されるＤＨＰ−セミキノンラジカル２への３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ；構造１）の酸化的生成の略図を提供する。
【図２】Ｍｂ遺伝子における４位のアンバーコドンに対する応答としてのマッコウクジラミオグロビンのＤＨＰ依存的発現の例示を提供する。図２Ａは、銀染色したゲルおよびウエスタンブロットを提供する。図２ＢはＤＨＰＭｂのＥＳＩ−ＱｑＴＯＦ質量スペクトル分析を提供する。
【図３】サイクリックボルタモグラムを提供する。図３Ａは、ｗｔＭｂおよびＤＨＰＭｂにおけるヘム基のサイクリックボルタモグラムを提供する。図３Ｂは、１００μＭ  ＤＨＰ、ｗｔＭｂまたはＤＨＰＭｂを含有する異なる溶液に対するＤＨＰのサイクリックボルタモグラムを提供する。すべてのボルタモグラムは、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中、アルゴン下；スキャン速度：１Ｖｓ−１対ＳＣＥで記録した。
【図４】タンパク質内における電気化学的なＤＨＰの酸化の例示を提供する。
【図５】メタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【図６】次のアミノ酸変化：Ｔｙｒ３２→Ｌｅｕ、Ａｌａ６７→Ｓｅｒ、Ｈｉｓ７０→Ａｓｎ、Ａｌａ１６７→Ｇｌｎを有するメタノコッカス・ヤナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）に基づく、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＨＰＲＳ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。変化したアミノ酸および対応する３連コドン（野生型配列に関連する）を囲み内に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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