(57)【要約】  本発明は、急性冠症候群を処置および予防するための方法および製剤を提供する。本発明の方法は、動脈硬化性プラークを減少および安定化するための、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の安全かつ有効な用量を提供する。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤もまた提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性冠症候群の処置を必要とする患者に、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン複合体（アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体）を約１ｍｇのタンパク質／ｋｇ〜約１００ｍｇのタンパク質／ｋｇの用量で投与することを含む、急性冠症候群を処置する方法。
【請求項２】
アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体が、約１５ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体が、約４５ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体が、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏが、組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体が、約１：１のタンパク質重量／脂質重量の比のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏおよび１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体が、滅菌液体医薬製剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
医薬製剤が、約１５ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
医薬製剤が、約４５ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
医薬製剤が、約６ヶ月間、約５ヶ月間、約４ヶ月間、約３ヶ月間、約２ヶ月間または約１ヶ月間、週に１回患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
医薬製剤が、約１ヶ月間ほぼ毎日患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
医薬製剤が、約１ヶ月〜約６ヶ月間、ほぼ３日ごとに患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
医薬製剤が、約１ヶ月〜約６ヶ月間、ほぼ１０日ごとに投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
医薬製剤が、約１ヶ月〜約６ヶ月間、ほぼ１４日ごとに投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
外科的介入をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
外科的介入が、経皮経管冠動脈形成術または冠動脈バイパス移植を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
急性冠症候群に関連する疾患、障害、症状または疼痛を処置、予防または改善するための別の薬物の投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
患者の罹患した血管における粉瘤体積パーセントが、約−０.７３％〜約−１.２９％減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
患者の標的血管における粉瘤体積の合計が、約−１５.１ｍｍ3〜約−１２.６ｍｍ3減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
患者の標的冠動脈部分における平均最大粉瘤厚さが、約−０.０３９ｍｍ〜−０.０４４ｍｍだけ減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
医薬製剤が静脈内に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
医薬製剤が、約１時間にわたって投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
医薬製剤が、約３時間にわたって投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
医薬製剤が、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、ＰＯＰＣ、ショ糖−マンニトール担体およびリン酸緩衝液を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２５】
ショ糖−マンニトール担体が、約６.０％〜約６.４％のショ糖および約０.８％〜約１％のマンニトールからなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ショ糖−マンニトール担体が、約６.２％のショ糖および約０.９％のマンニトールからなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
医薬製剤が、約７.０〜約７.８のｐＨを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項２８】
ｐＨが約７.５である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
医薬製剤が、約１２ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項３０】
医薬製剤が、約１１ｍｇ／ｍｌ〜約１７ｍｇ／ｍｌのＰＯＰＣを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項３１】
医薬製剤が、１０μｍより大きいサイズの粒子を５０ｍＬあたり６,０００個未満含む、請求項７に記載の方法。
【請求項３２】
医薬製剤が、２５μｍより大きいサイズの粒子を５０ｍＬあたり６００個未満含む、請求項７に記載の方法。
【請求項３３】
医薬製剤が、約２８０〜約３２０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項３４】
医薬製剤が、約２９０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
動脈硬化性プラークの減少を必要とする患者に、４５ｍｇ／ｋｇの組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体を該患者に少なくとも１回投与することを含む、動脈硬化性プラークを減少させる方法。
【請求項３６】
組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体が、週に一度、月に一度、または年に一度投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体が、約３〜５週間、週に一度投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
１５ｍｇ／ｋｇの組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体の用量を少なくとも１回患者に投与することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
複合体が、週に一度、月に一度、または年に一度投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
患者が、急性冠症候群に関連する疾患、障害、症状または疼痛を処置、予防または改善するための別の薬物でも処置される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
薬物が、スタチン、β遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、抗血栓剤、血管拡張剤またはそれらの組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
緩衝液中の組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏまたはその変異体／１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン複合体を含む液体医薬製剤であって、該緩衝液が、約６.０％〜約６.４％のショ糖を含み、さらに約０.８〜約１％のマンニトールを含み、該緩衝液が約７.０〜約７.８のｐＨを有する、液体医薬製剤。
【請求項４３】
約６.２％のショ糖を含む、請求項４２に記載の医薬製剤。
【請求項４４】
約０.９％のマンニトールを含む、請求項４２に記載の医薬製剤。
【請求項４５】
ｐＨが約７.５である、請求項４２に記載の医薬製剤。
【請求項４６】
ｒアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの濃度が、緩衝液１ｍＬあたり約１２ｍｇ〜約１８ｍｇである、請求項４２に記載の医薬製剤。
【請求項４７】
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンと複合体化した組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏまたはその変異体、および約７.０〜約７.８のｐＨを有するリン酸緩衝液を含む医薬製剤であって、該緩衝液が２％のグルコースおよび４ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、医薬製剤。
【請求項４８】
約７.５のｐＨにするためにリン酸緩衝液を含む、請求項４７に記載の医薬製剤。
【請求項４９】
組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏが、保存的に置換されたアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏである、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５０】
組換えアポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏおよびＰＯＰＣが、１：０.９５の組換えアポＡ−Ｉ
Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ比（タンパク質重量／脂質重量）で複合体化している、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５１】
１０μｍより大きいサイズの粒子を５０ｍＬあたり６,０００個未満含む、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５２】
２５μｍより大きいサイズの粒子を５０ｍＬあたり６００個未満含む、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５３】
重量オスモル濃度が約２８０〜約３２０ｍＯｓｍである、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５４】
重量オスモル濃度が約２９０ｍＯｓｍである、請求項５３に記載の医薬製剤。
【請求項５５】
滅菌されている、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５６】
凍結されている、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５７】
滅菌バイアル、滅菌プレフィルドバッグ、またはプレフィルドシリンジである、請求項４２または４７に記載の医薬製剤。
【請求項５８】
ａ）  １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンと複合体化した、組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏまたはその変異体；
ｂ）  約６.０％〜約６.４％のショ糖；および
ｃ）  約０.８〜約１％のマンニトール
を含む、凍結乾燥医薬製剤。
【請求項５９】
約６.２％のショ糖を含む、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６０】
約０.９％のマンニトールを含む、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６１】
約７.５のｐＨを有する緩衝液をさらに含む、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６２】
組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏが、保存的に置換されたアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏである、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６３】
ＰＯＰＣの濃度が、約１１ｍｇ／ｍｌ〜約１７ｍｇ／ｍｌである、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６４】
組換えアポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏおよびＰＯＰＣが、１：０.９５の組換えアポＡ−Ｉ
Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ比（タンパク質重量／脂質重量）で複合体化している、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６５】
１０μｍより大きいサイズの粒子を５０ｍＬあたり６,０００個未満含む、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６６】
２５μｍより大きいサイズの粒子を５０ｍＬあたり６００個未満含む、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６７】
重量オスモル濃度が約２８０〜約３２０ｍＯｓｍである、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項６８】
重量オスモル濃度が約２９０ｍＯｓｍである、請求項６７に記載の医薬製剤。
【請求項６９】
滅菌されている、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項７０】
滅菌バイアル、滅菌プレフィルドバッグまたはプレフィルドシリンジである、請求項５８に記載の医薬製剤。
【請求項７１】
虚血性再潅流の処置を必要とする患者に、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン複合体（アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体）を約１５ｍｇのタンパク質／ｋｇの用量で投与することからなる、虚血性再潅流を処置する方法。
【請求項７２】
虚血性再潅流の処置を必要とする患者に、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン複合体（アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ複合体）を約４５ｍｇのタンパク質／ｋｇの用量で投与することからなる、虚血性再潅流を処置する方法。
【請求項７３】
４５ｍｇのタンパク質／ｋｇを投与することをさらに含む、請求項２、８または７１に記載の方法。
【請求項７４】
１５ｍｇのタンパク質／ｋｇを投与することをさらに含む、請求項３、９または７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性冠症候群を処置または予防するための新規な製剤および方法を提供する。好ましい実施形態において、製剤は、特定のｐＨ、重量オスモル濃度および純度を有する単一の単位投薬形態である。好ましい方法において、製剤は、投与あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、週に一度、月に一度または年に一度投与される。さらに、用量および投与計画、さらにその用量または投与計画が使用されることを意図される特定の疾患が開示される。製剤および方法は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を使用する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞の管理および処置は、２０世紀の前半から劇的に変化しており、安静と観察の時代から、血行動態モニタリングおよびバルーンカテーテルを含む技術に重点を置き、血栓溶解療法に対して関心が高まるまでに進歩している。（ＡｎｔｍａｎおよびＢｒａｕｎｗａｌｄ，「Ａｃｕｔｅ  Ｍｉｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第６版、第２巻、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら編、２００１，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。心循環器疾患の処置に対する治療アプローチは、根底にある病理のより深い理解と共にこの１００年で大いに発展してきた。
【０００３】
ほとんど全ての心筋梗塞は、一般的に冠状動脈血栓症を併発した冠状動脈硬化症の結果として生じる。ゆっくりと蓄積するプラークは、側副血管の発達に起因して無症候性であり得る。しかし、動脈硬化性プラーク、特に脂質が多い動脈硬化性プラークは、突然のプラーク破綻を起こす傾向がある。プラーク破綻および付随する内皮損傷は、トロンボキサンＡ2、セロトニン、アデノシン二リン酸、トロンビン、血小板活性化因子、組織因子および酸素由来フリーラジカルのようなメディエーターの放出を引き起こす。これらのメディエーターは、血小板凝集を促進し、そして機械的閉塞がしばしば血栓形成をもたらし、これが血流および酸素供給を妨害する。心筋の酸素供給の持続する重篤な妨害は、急性心筋梗塞をもたらし得る（Ｒｉｏｕｆｏｌら，２００２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：８０４，Ｔｉｍｍｉｓ，２００３，Ｈｅａｒｔ  ８９：１２６８−７２を参照のこと）。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症の薬物療法の主力は、治療の終点としてＬＤＬまたは「悪玉コレステロール」を低下させることに主に集中することにより動脈硬化性プラークの発達を防止するかまたは遅らせるための長期治療であった。例えばスタチン療法は、心臓血管の健康状態の改善に大いに寄与してきた；しかし、横紋筋融解のような副作用が依然として障害となっている。さらに、スタチンは、急性の状況では、例えば虚血性発作の間に脆弱で不安定な動脈硬化性プラークを減少させることにほとんど機能しない。急性処置は、（ｔＰＡのような）血栓溶解薬ならびに経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）および冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）のような外科的介入に大部分依存していた。血栓溶解薬は、閉塞している血栓を減少させるかまたは排除することによる緩和をもたらすが、それらは根底にある病理を変更することはない。ＰＴＣＡのような介入は、それ自体危険性を有しており、そしてしばしば急性状態にある患者には不適切である。それゆえ現在の薬理療法は、一旦不安定なプラークが危険性として現れた場合には患者にほとんど役立たない（ＮｅｗｔｏｎおよびＫｒａｕｓｅ  ２００２，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓ３：３１−３８を参照のこと）。
【０００５】
ＨＤＬ療法は、異常脂質血症およびアテローム性動脈硬化症のための新しい処置パラダイムとして浮上している。すなわち、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）は、このアポリポタンパク質の変異形のキャリアが低いＨＤＬ（「善玉コレステロール」）レベルおよび心循環器疾患の減少した危険性を有するという矛盾した発見に起因して興味を持たれてきた。（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら，１９８０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：８９２−９００，Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２５０８−２５１３，Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら，１９８５，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ５８：１５９−１７４，Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら，１９８７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ７：４２６−４３５）。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏホモダイマーは、コレステロールを与えられたウサギにおける内膜肥厚を低減することが見いだされた（Ａｍｅｌｉら，１９９４，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：１９３５−４１およびＳｏｍａら，１９９５，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７６：４０５−１１）。アポＥ欠損マウスにおいて、アテローム性動脈硬化部は、複数回の低用量と単回の高用量のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の両方により減少した（Ｓｈａｈら，１９９８，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：７８０−８５およびＳｈａｈら，２００１，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：３０４７−５０）。ウサギにおけるプラーク退縮は、ウサギ１匹あたり５００ｍｇのタンパク質の用量と１０００ｍｇのタンパク質の用量でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を単回局所注入することでも実証された。（Ｃｈｉｅｓａら，２００２，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．９０：９７４−８０）。ウサギモデルにおいて誘発された病巣は、大部分がマクロファージからなり、そしてヒトにおけるより複雑な病巣の典型ではない。従って、類似の処置がヒトのアテローム性動脈硬化症において見られる複雑なプラークに対して有効であるかどうかは不確定である。（Ｌｉら，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  １９：３７８−３８３およびＳｈａｈら，２００１，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：３０４７−５０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
心筋梗塞の病態生理学の改善された理解およびＨＤＬ療法における進歩にもかかわらず、ヒトにおけるアポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の予防的使用および治療的使用のための安全かつ有効な用量、投与計画および医薬製剤が未だ望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、虚血、虚血性再潅流傷害、狭心症および心筋梗塞を含む心循環器疾患または関連する障害の処置および予防、ならびに動脈硬化性プラークの低減または安定化、閉塞した血管におけるプラークの低減およびコレステロール流出の促進のための、方法および医薬製剤を提供する。それ故本発明は、アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、虚血性再潅流傷害、狭心症および心筋梗塞を含む心循環器疾患または関連する障害の処置または予防、ならびに動脈硬化性プラークの低減または安定化、閉塞した血管におけるプラークの低減およびコレステロール流出の促進のための、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体およびアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤の使用のための用量および投与計画を包含する。本明細書中に記載される方法および製剤は、未処置のままにされるかまたは従来の方法により処置された場合には破綻し、そして急性冠症候群を含む虚血性事象をもたらし得る不安定な動脈硬化性プラークの迅速な減少または安定化をもたらす。
【０００８】
出願人らは、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、好ましくはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体のような外因的に産生されたＨＤＬミメティックが、心循環器疾患もしくは関連する障害（このような障害としては、アテローム性動脈硬化症，急性冠症候群、虚血、虚血性再潅流傷害、狭心症および心筋梗塞が挙げられるがこれらに限定されない）の処置および予防、または狭窄もしくは閉塞した血管における動脈硬化性プラークの低減もしくは安定化のための独特のアプローチを提供することを解明した。本発明の用量および投与計画を含む方法ならびに医薬製剤は、コレステロール流出および動脈硬化性プラークからの移動を迅速に促進する安全で有効な非外科的処置を提供する。迅速なコレステロール流出の促進は、１つまたはそれ以上の罹患した血管における粉瘤体積を減少させる。粉瘤（動脈硬化性血管に生じる変性し肥厚した動脈内膜のプラークの塊）の減少は、より多い血流を可能にし、そして不安定狭心症、心筋梗塞および急性冠症候群を含む虚血の危険性を低減する。
【０００９】
急性冠症候群、アテローム性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、および虚血性再潅流傷害を含む心循環器疾患の処置および予防のためのアポＡ−Ｉ  Ｍの医薬製剤および特定の用量を提供する本発明の以前には、従来のアテローム性動脈硬化症の治療は、治療の終点としてＬＤＬまたは「悪玉コレステロール」を低下させることに集中していた。これらの従来のＬＤＬ療法、例えばスタチンを用いる処置は、ＬＤＬ血清レベルが被験体において減少するまで何ヶ月もの処置を要することがある。急性または新たに生じる心臓血管障害において、従来の治療は、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）および冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）のような外科的介入に大部分依存していた。しかし、外科的介入は、緊急事態にある一部の患者、特に全身の健康状態が不良の患者にはしばしば禁忌である。さらに、これらの従来の方法は、急性状態において有効な非外科的薬物治療を提供しない。その上、従来の治療は、特に循環系における心循環器疾患および急性冠症候群の症状を処置することに集中していた。上に記載されそして以下に詳述される従来の治療は、ＬＤＬコレステロールを低減すること、血栓形成を低減すること、および血圧を低下させることに集中しており、これらは心循環器疾患および急性冠症候群の根底にある原因、血管壁内のプラークの安定化、減少および改善を処置も予防もしない。
【００１０】
本明細書中に提供される用量および投与スケジュールを含む医薬製剤および方法は、安全かつ有効であり、そして動脈硬化性プラークを低減または安定化するように迅速に作用する。本明細書中に記載される用量は、迅速に作用し、コレステロール移動を促進することにより、早ければ数週間で動脈硬化性プラークの減少をもたらす。特定の実施態様において、本明細書中に記載される用量を、急性冠症候群または虚血もしくは血管閉塞に関連した障害に罹患した被験体を処置するために使用することができる。特定の実施態様において、本明細書中に記載される用量を、ひとたび動脈硬化性プラークが被験体に危険をもたらした場合に疾患の進行を防止するために使用することができる。防止される疾患の進行は、血管のさらなる閉塞であり得、または急性冠症候群および虚血性再潅流傷害を含む虚血性状態をもたらし得る不安定な動脈硬化性プラークの破綻を防止することであり得る。
【００１１】
本明細書中に提供される方法および医薬製剤は、とても効果的であるので、４５ｍｇ／ｋｇの単一用量が、動脈硬化性プラークからのコレステロール移動を刺激することができる。特定の実施態様において、単一高用量、例えば、約４５ｍｇ／ｋｇのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤を、被験体に投与することができる。特定の実施態様において、１つまたはそれ以上の高用量のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤を、被験体に投与し、続いて１つまたはそれ以上の同じ用量（４５ｍｇ／ｋｇ）またはより低い用量、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１５ｍｇ／ｋｇを投与することができる。例えば、被験体は、４５ｍｇ／ｋｇの２用量を投与され、次いで１０ｍｇ／ｋｇのさらなる用量を投与されてもよい。さらに、低用量に続いて高用量という反対の投与計画を使用してもよい。当然のことながら、急性疾患状態については、より高い用量が最初に好ましく使用される。特定の実施態様において、被験体は、数週間、週に一度アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤で処置され得、次いで断続的に、例えば年に２回、年に１回または２年ごとに、開通した非閉塞血管を維持し、そしてプラーク破綻および不利な血管事象の危険性を低減する必要に応じて処置され得る。
【００１２】
特定の実施態様において、急性冠症候群の処置または予防のための方法は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤をほぼ毎日、ほぼ１日ごと、ほぼ３日ごと、ほぼ４日ごと、ほぼ５日ごと、ほぼ６日ごと、ほぼ７日ごと、ほぼ８〜１０日ごと、またはほぼ１１〜１４日ごとに、その処置または予防を必要とする被験体に投与することからなる。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤を、ほぼ７日ごとに投与することができる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与は、１回の投与であり得る。特定の実施態様において、投与は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７〜１２週間、約１３〜２４週間または約２５〜５２週間、続けることができる。特定の好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与は、約５週間ほぼ７日ごとである。特定の実施態様において、投与は、例えば約５週間後に断続的であり得る。例えば、被験体は、約５週間週に１回処置され得、次いで翌年の間に約３〜約４回処置され得る。特定の実施態様において、本明細書中に記載される医薬製剤は、血管の開通性を維持するために断続的に被験体に投与され得る。例えば、約１５ｍｇ／ｋｇの用量が、約７週間ほぼ１０日ごとに医薬製剤投与に投与され得、次いで、例えば約２６週後または約５２週後に処置され得る。従来の薬物療法および外科的介入と組み合わせた投与スケジュールおよび方法の使用を含む他の実施態様は、本明細書で以下に記載される。
【００１３】
本発明は、急性冠症候群および虚血性再潅流傷害の処置または予防のためのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）の投与のための医薬製剤を提供する。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、本明細書中に記載される方法のために脂質と複合体化される。例えば、脂質は、リン脂質、好ましくは１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンまたはＰＯＰＣとも呼ばれる）であり得る。最も好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体は、医薬製剤であり得る。別の好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、約１ｍｇのタンパク質／ｋｇ〜約１００ｍｇのタンパク質／ｋｇの用量でそれを必要とする被験体に投与され得る。
【００１４】
特定の実施態様において、方法は、急性冠症候群の処置のためにアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその注射可能もしくは液体の医薬製剤の用量を投与することを含み得る。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、約１ｍｇ（タンパク質）／ｋｇ〜約１００ｍｇ（タンパク質）／ｋｇの用量でそれを必要とする被験体に投与され得る。特定の実施態様において、方法は、静脈内注入としてのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与による急性冠症候群の処置または予防を含み得る。特定の実施態様において、方法は、管注（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｐｕｓｈ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）としての投与を含み得る。管注により、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質またはその医薬製剤が、５分まで、例えば２〜５分のような短時間にわたって静脈内に投与されることを意味する。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与は、持続性静脈内注入を含み得る。持続性静脈内注入により、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤が、２〜５分より長い時間、例えば約３０分〜約３時間にわたって連続的に投与されることを意味する。持続性静脈内注入は、輸液ポンプまたは輸液用器具を用いて投与することができる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質またはその医薬製剤の投与は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の持続性静脈内注入と管注（「ボーラス投与」）との併用であり得る。ボーラス投与は、持続性注入の前、後、または間に投与され得る。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏもしくは脂質複合体またはその医薬製剤の投与は、心循環器疾患、付随するかもしくは合併している疾患を処置もしくは予防するか、症状軽減をもたらす他の薬物と併用することができる。他の薬物の投与は、同時または逐次的であり得る。
【００１５】
方法は、本明細書に記載される医薬製剤の静脈内注射を提供する。任意の適切な血管を注射に使用することができ、腕の肘窩における血管のような末梢血管または胸部への中心静脈ラインが挙げられる。好ましい実施態様において、医薬製剤は、被験体の腕の肘窩における橈側皮または肘正中皮血管に注入される。
【００１６】
特定の実施態様において、方法は、高用量もしくは低用量またはそれらの組み合わせでのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤の投与を含み得る。本明細書中以下に記載されるように、短い投与間隔での高用量の医薬製剤は、部分的または完全に閉塞した血管を有する被験体において粉瘤体積を安全かつ効果的に低減することができる。特定の実施態様において、医薬製剤は、閉塞した血管の閉塞物を取り除くためのＰＴＣＡのような外科的介入の前、間、または後に投与され得る。特定の実施態様において、１つまたはそれ以上の断続的用量は、以前に閉塞した血管の開通性を維持するために被験体に投与され得る（「維持用量」）。
【００１７】
本発明は、虚血性再潅流傷害の処置または予防に対する新規なアプローチ、すなわち、虚血性再潅流の処置について本明細書に記載されるアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ複合体の医薬製剤の使用または用量を提供する。この処置に有用な用量は、それを必要とする被験体へ投与される１００ｍｇ／ｋｇまでのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の用量を含む。特定の実施態様において、方法は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重）の用量でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬組成物を投与することを含み得る。特定の実施態様において、方法は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量でのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬組成物の投与を含み得る。好ましい実施態様において、方法は、約１５ｍｇ／ｋｇの特定の用量でのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬組成物の投与を含み得る。別の好ましい実施態様において、方法は、約４５ｍｇ／ｋｇの特定の用量でのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬組成物の投与を含み得る。本発明はまた、好ましくは、単独または４５ｍｇ／ｋｇの用量と組み合わせた１５ｍｇ／ｋｇの使用を含む。同様に、４５ｍｇ／ｋｇの用量は、単独または１５ｍｇ／ｋｇの用量と組み合わせて虚血性再潅流傷害の処置または予防のために使用することができる。
【００１８】
本明細書中で提供される医薬製剤は、被験体への安全な投与を可能にするために適切なｐＨ、重量オスモル濃度、張度、純度および滅菌性のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む。医薬製剤は、単一の１回限りの使用のために製剤され得、または医薬製剤を複数回用量に適するようにする、以下に記載されるような抗菌性補形薬を含有するように製剤され得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、凍結または冷蔵することができる滅菌プレフィルドシリンジまたは滅菌プレフィルドバッグであり得る。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体である。より好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣである。
【００１９】
特定の実施態様において、医薬製剤は、単位用量または使用単位包装であり得る。当業者に公知であるように、単位用量包装は、単一用量の薬物の被験体への送達を提供する。本発明の方法は、例えば、一包装あたり１０５０ｍｇのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏタンパク質を含む医薬製剤の単位用量包装を提供する。例えば、１０５０ｍｇのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏタンパク質は、７０ｋｇの被験体に１５ｍｇ／ｋｇのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを投与する量である。この単位は、例えば滅菌単回使用バイアル、滅菌プレフィルドシリンジ、滅菌プレフィルドバッグ（すなわち、ピギーバック）などであり得る。
【００２０】
特定の実施態様において、医薬製剤は、使用単位包装であり得る。当業者に公知であるように、使用単位包装は、医療関連業者による直接販売用にラベルを付けられた便利な規定サイズの患者用に準備された（ｐａｔｉｅｎｔ−ｒｅａｄｙ）単位であり得る。使用単位包装は、所定の適応のための典型的な処置間隔および継続期間に必要な量で医薬製剤を含有する。本発明の方法は、例えば、平均的なサイズの成人男性または女性を１５ｍｇ／ｋｇのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏタンパク質で５週間週に一度静脈内で処置するのに十分な量でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む医薬製剤の使用単位包装を提供する。それ故、上記のような使用単位包装は、５用量のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体（バイアルまたはプレフィルドシリンジで入手可能）を有するだろう。一実施態様において、使用単位包装は、平均的なサイズの成人男性または女性を６週間週に一度１５ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇの用量で処理するのに十分な量でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む医薬製剤を含み得る。本明細書中に記載される用量が、被験体の体重に基づくことは当業者に明らかだろう。
【００２１】
医薬製剤は、ラベルを付けることができ、そしてその中に含まれる製剤を同定するための添付標示、ならびに医療関連業者および急性冠症候群の処置中の被験体に有用な他の情報を有し得、この情報としては、使用上の注意、用量、投与間隔、継続期間、適応、禁忌、警告、事前注意、取り扱いおよび保管の指示などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
５．１．定義
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有するべきである：
用語「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、疾患、障害および／またはその症状を軽減するかまたは終わらせる方法をいう。
【００２３】
用語「治療有効量」とは、処置される状態または障害の症状の１つまたはそれ以上をある程度軽減するのに十分な、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏもしくは脂質複合体またはその医薬製剤の量をいう。
【００２４】
用語「予防する」、「予防すること」、または「予防」とは、被験体が疾患、障害および／またはその症状を患うことを防ぐ方法をいう。特定の実施態様において、用語「予防する」、「予防すること」、または「予防」とは、疾患、障害および／またはその症状を患う危険性を低減する方法をいう。
【００２５】
用語「予防有効量」とは、処置される状態または障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、開始または再発を生じるのに十分な、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏもしくは脂質複合体またはその医薬製剤の量をいう。
【００２６】
用語「急性冠症候群」とは、不安定狭心症、Ｑ波および非Ｑ波心筋梗塞のような虚血性障害または国際疾病分類第９版（ＩＣＤ−９）（第１０版（ＩＣＤ−１０）に代わる予定）に提供されるような虚血性障害をいう。心筋梗塞は、心電計においてＳＴ上昇を伴うかまたは伴わずに現れ得る。
【００２７】
用語「虚血」とは、機械的または生物学的に誘導される、例えば、けいれん、血栓症、血液供給の狭窄閉塞（主に動脈の狭窄または途絶）に起因する局所貧血をいう。用語「心筋虚血」とは、通常は冠動脈疾患の結果としての、心筋への血液の不適切な循環をいう。
【００２８】
用語「虚血性再潅流」とは、組織への酸素を豊富に含んだ血液の増加した量が回復することをいう。
【００２９】
用語「心循環器疾患」とは、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム性動脈硬化症、狭心症、虚血性再潅流傷害および関連する障害のような、心臓、血管および血液循環の疾患をいう。
【００３０】
用語「外科的介入」とは、本明細書中で使用される場合、手を使う非薬理学的な方法または手術的な方法をいう。外科的介入は、診断、放射線学的、予防的または処置の目的のためであり得る。
【００３１】
用語「不安定狭心症」とは、あごおよび腕に放散し得る胸部の痛みまたは上腹部痛のような、慢性の安定狭心症の症状の頻度、重篤度または持続期間の変化をいう。慢性安定狭心症は、胸部に痛みがあり、この痛みが被験体のあごおよび腕に放散し、これは、運動、食事および／またはストレスにより誘導され、そして症状を生じるのに必要な活動の頻度または重篤度に最近の変化がなくても安静により緩和される。
【００３２】
用語「医薬製剤」とは、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体および適切な希釈剤、担体、賦形剤、または被験体への投与に適切な補形薬を含む組成物をいう。この用語は、以下に記載されるような経口、非経口および局所組成物を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
用語「約」とは、それが指す名目上の値のプラスマイナス２０％の近似を示す相対的な用語をいう。本開示の分野については、このレベルの近似は、その値がより厳密な範囲を要することが特に述べられていなければ適切である。
【００３４】
用語「ラベル」とは、物品の直接容器上の文書、印刷物または図形の表示をいい、例えば、薬学的に活性な薬剤を含有するバイアル上に表示された文書である。
【００３５】
用語「標示」とは、任意の物品上の全てのラベルおよび他の書面、印刷物もしくは図形、またはその容器もしくは包装のいずれか、またはそのような物品に添付すること、例えば、薬学的に活性な薬剤の容器に添付または付随させた包装挿入物、説明用ビデオテープもしくは説明用ＤＶＤをいう。
【００３６】
５．２．処置の方法
本発明は、不安定狭心症、ＳＴ上昇心筋梗塞および非Ｑ波心筋梗塞を含む急性冠症候群の処置または予防のための方法および製剤を提供する。本明細書に記載される医薬製剤のための安全かつ有効な用量は、急性冠症候群の処置および予防のために出願人らにより決定された。
【００３７】
現在の理解に基づいて、臨床所見を再編成した枠組みが浮かび上がってきて、今や急性冠症候群（「ＡＣＳ」）と呼ばれている。すなわち、急性冠症候群は、不安定狭心症、Ｑ波および非ＳＴ上昇心筋梗塞を含み、そして罹患率および特に示された後最初の２４時間以内の死亡率の主要な原因である（Ｓｃｈｏｅｎｈａｇｅｎら，２０００，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：５９８−６０３）。ＡＣＳは、心電計でＳＴ上昇を示さない虚血性不快症状である。虚血は、しばしば不安定狭心症、Ｑ波および非Ｑ波心筋梗塞に発展する。（ＡｎｔｍａｎおよびＢｒａｕｎｗａｌｄ，「Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第６版，第２巻，Ｂｒａｕｎｗａｌｄら編，２００１，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。
【００３８】
本発明の方法および製剤は、アテローム性動脈硬化症および急性冠症候群の処置に対する独特で有効なアプローチを提供する。本発明の方法において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、症状の緩和を提供するのではなく、疾患の病態生理学的基盤を逆転させる非外科的療法を提供する。本発明の方法は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与を提供し、これはコレステロールの流出を促進し、コレステロール輸送を逆転させ、そして動脈硬化性プラークを減少させるＨＤＬ療法を提供する。いかなる理論にも拘束されることなく、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、コレステロール流出を促進し、そしてコレステロール輸送を逆転させ、粉瘤体積を減少させ、そして動脈硬化性プラークを安定化することができる機能的ＨＤＬを模倣すると考えられる。
【００３９】
本発明は、急性冠症候群の処置のための方法を提供する。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、以下に記載されるように、約１ｍｇ（タンパク質）／ｋｇ〜約１００ｍｇ（タンパク質）／ｋｇの用量、好ましくは１ｍｇ（タンパク質）／ｋｇ〜５０ｍｇ（タンパク質）／ｋｇの用量；最も好ましくは１５ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。本明細書中で詳細に記載されるように、出願人らは、これらの用量が、安全で有効で、そして急性冠症候群に罹患しているかまたは急性冠症候群の危険性を有する被験体に十分耐えられることを示した。
【００４０】
本発明は、急性冠症候群の徴候または症状の緩和または改善を含む急性冠症候群の処置または予防のための方法を提供する。特定の実施態様において、方法は、冠状動脈硬化症の処置または低減を提供する。特定の実施態様において、方法は、罹患した血管からのコレステロールの流出の促進を提供する。特定の実施態様において、方法は、逆コレステロール輸送の促進を提供する。一実施態様において、方法は、罹患した血管における減少した粉瘤体積を提供する。特定の実施態様において、罹患した血管は、冠状動脈である。粉瘤体積は、本明細書に記載されるように、血管内超音波法（ＩＶＵＳ）により決定することができる。特定の実施態様において、方法は、罹患した血管の全プラーク体積の減少を提供する。特定の実施態様において、方法は、罹患した血管における平均最大プラーク厚さの減少を提供する。特定の実施態様において、方法は、平均最大粉瘤厚さの減少を提供する。特定の実施態様において、方法は、最小パーセントプラーク領域におけるプラーク体積の減少を提供する。特定の実施態様において、方法は、最大パーセントプラーク領域における減少を提供する。特定の実施態様において、方法は、罹患した血管における増加した平均冠動脈管腔直径を提供する。特定の実施態様において、本発明の方法および製剤を与えられる被験体は、本発明の方法および製剤を与えられていない被験体と比較して減少した血管造影病変を有し得る。特定の実施態様において、方法は、既存の病変における後退を提供する。特定の実施態様において、方法および医薬製剤は、閉塞した血管の開通の達成または閉塞した血管の開通性の維持を提供する。
【００４１】
特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の約１５ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇの用量は、約２％、約１％または約０.０５％の平均パーセント粉瘤体積減少を提供する。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の約１５ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇの用量は、約２０ｍｍ3、約１５ｍｍ3、約１０ｍｍ3または約５ｍｍ3の粉瘤体積の減少を提供する。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の約１５ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇの用量は、平均最大粉瘤厚さの約−０.０３９ｍｍ〜−０.０４４ｍｍの減少を提供する。
【００４２】
一実施形態において、方法は、急性冠症候群の徴候または症状を有する被験体における急性冠症候群の処置を提供する。一実施形態において、被験体は、心筋虚血の徴候および／または症状、例えば、胸部、あご、腕または上胃部における痛み、動悸、息切れ、発汗、吐き気および／または嘔吐、を有し得る。別の実施態様において、方法は、ＳＴ上昇、反転のようなＴ波変化のような心電図（「ＥＣＧ」または「ＥＫＧ」）における変化、クレアチンキナーゼの割合、トロポニンＩまたはＣ反応性タンパク質の増加と共に、急性冠症候群の徴候および症状を示す被験体において急性冠症候群の処置を提供する。
【００４３】
一実施形態において、方法は、急性冠症候群を発症する危険性がある被験体における急性冠症候群の予防を提供する。危険性がある被験体としては、様々な年齢（例えば、１８〜２４歳、約２５歳、約３０歳、約４０歳、約５０歳、約６０歳、約７０歳、約８０歳または約９０歳）の被験体、心循環器疾患の家族歴があるかもしくは心循環器疾患に対する遺伝性素因を有する被験体、糖尿病、高血圧、多血管疾患もしくは左主幹疾患を有する被験体、または以前に心筋梗塞を有していた被験体を挙げることができる。
【００４４】
本発明の製剤の実際の用量が、被験体の身長、体重、年齢、疾病の重篤度、合併症の存在などによって変動し得ることは、当業者に理解される。例えば、腎機能障害または肝機能障害を有する高齢の被験体を、約１ｍｇ／ｋｇの用量より低い範囲（例えば、０.８ｍｇ／ｋｇまたは０.９ｍｇ／ｋｇ）にある用量のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体で処置することができる。良好な腎機能および肝機能を有し肥満体である重篤な急性冠症候群を有する被験体を、例えば、約１００ｍｇ／ｋｇより高い範囲の用量（例えば、１２０ｍｇ／ｋｇ、１１９ｍｇ／ｋｇ、１１８ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇなど）である用量のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体で処置することができる。本明細書に記載される製剤の投与量は、意図された目的を達成するのに有効であることが示された。これらの用量は、有益なプロファイルに対して許容しうる危険性の有効用量を含む範囲の循環濃度を達成する。
【００４５】
本発明は、そのような処置を必要とする被験体において急性冠症候群の処置をするために十分な投薬スケジュールを用いて急性冠症候群を処置または予防する方法を提供する。特定の実施態様において、以下に記載されるように、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤を、ほぼ毎日、ほぼ１日おき、ほぼ３日ごと、ほぼ４日ごと、ほぼ５日ごと、ほぼ６日ごと、ほぼ７日ごと、ほぼ８〜１０日ごと、またはほぼ１１〜１４日ごとに投与することができる。この期間は、投与間隔または間隔とも呼ばれる。特定の実施態様において、投与間隔は、１ヶ月に１回、６ヶ月に１回、１２ヶ月に１回、１８ヶ月に１回、または２４ヶ月に１回であり得る。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、脂質複合体またはその医薬製剤を、ほぼ７日ごとに投与することができる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与は、１回の投与であり得る。特定の実施態様において、投与は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７〜１２週間、約１３〜２４週間、約５２週間継続し得るか、または被験体の寿命の間継続し得る。この期間は、投薬継続期間、処置継続期間または継続期間とも呼ばれる。それ故、投薬スケジュールは、例えば、約６週間ほぼ７日に１回投与されるアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤であり得る。特定の実施態様において、投与間隔は、約５２週後断続的に継続することができる。例えば、被験体を、約５２週間週に１回処置し、次いで翌年の間に約３〜約４回処置し得る。特定の好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む医薬製剤の投与は、約５週間の間ほぼ７日ごとである。様々な投与間隔および継続期間を使用する他の投薬スケジュールは、本明細書に記載される本発明の範囲内である。
【００４６】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の用量は、処置の継続期間にわたって変動し得る。例えば、被験体を、３週間週に１回、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤４５ｍｇ／ｋｇで処置し、次いで、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤１５ｍｇ／ｋｇで被験体の寿命の間４ヶ月ごとに１回または１年に１回処置し得る。このような断続的用量は、血管の開通性を維持するために投与され得る。減少した粉瘤体積および増加した血管管腔を維持するための、被験体の寿命の間の断続的用量は、本発明の範囲内である。
【００４７】
本発明の方法および製剤は、外科的介入と共に、すなわち、手術の前、間、または後に使用され得る。外科的介入としては、血管形成、血管内超音波法、冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）、冠動脈造影、血管ステントの移植、経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）および／またはプラークの安定化を挙げることができる。特定の実施態様において、方法は、閉塞した血管を広げるため、または血管における動脈硬化性プラークを減少させるために、外科的介入の前または後のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤の投与を提供する。外科的介入とは、障害または状態を予防し、または処置するための診断、画像化（放射線学）のために使用される、手を使う非薬理学的または手術的な方法をいう。例えば、血管内超音波法（ＩＶＵＳ）および冠動脈造影は、プラーク量の定量的評価を提供できる手段であり（診断目的）、血管造影は、血管の画像を提供でき（放射学的目的）、そして血管形成は、閉塞した血管を広げることができる（処置目的）。本明細書で使用される場合、全て外科的介入に包含される。
【００４８】
５．３．アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ
一局面において、本発明は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含む製剤を投与することによる、急性冠症候群からの傷害の処置、低減または予防のための方法および製剤を提供する。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）を、脂質と複合体化することができる。
【００４９】
ヒトアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、アポＡ−Ｉの天然の変異体である（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら  １９８０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：９０１  ９０７）。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏにおいて、アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ１７３）は、アミノ酸システイン（Ｃｙｓ１７３）と置き換えられている。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、ポリペプチド鎖あたり１つのシステイン残基を含有するので、モノマー形態、ホモダイマー形態、またはヘテロダイマー形態で存在し得る。（米国特許第５,８７６,９６８号、全て参照により本明細書に加入される）。これらの形態は、化学的に交換可能であり、そして用語アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、これらの形態間を区別しない。ＤＮＡレベルでは、変異体形態は、遺伝子配列におけるＣ−Ｔ置換の結果として生じ、すなわち、コドンＣＧＣがＴＧＣに変化し、アミノ酸１７３位においてアルギニン（Ａｒｇ）の代わりにシステイン（Ｃｙｓ）の翻訳を可能にする。
【００５０】
特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、変異体または保存的に置換されたアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏであり得る。保存的置換により、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの特定のアミノ酸残基が、タンパク質の活性に有意に有害な影響を及ぼすことなく他のアミノ酸残基と置き換えられ得ることを意味する。それ故、その構造中の少なくとも１つの規定されたアミノ酸残基が別のアミノ酸残基と置換されているアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの変更または置換された形態もまた、本発明に包含される。保存的アミノ酸置換を決定する目的のために、アミノ酸側鎖の物理−化学的特徴に主に依存して、２つの主なカテゴリー−親水性および疎水性−にアミノ酸を簡単に分類することができる。これらの２つの主なカテゴリーをさらに、アミノ酸側鎖の特徴をより明確に規定するサブカテゴリーに分類することができる。例えば、親水性アミノ酸のクラスは、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸および極性アミノ酸にさらに細分することができる。疎水性アミノ酸のクラスは、非極性アミノ酸および芳香族アミノ酸にさらに細分することができる。構造（Ｉ）を規定するアミノ酸の種々のカテゴリーの定義は、以下のとおりである：
「親水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性基準に従って、０より低い疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）を含む。
【００５１】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、水素イオンの損失に起因して生理学的ｐＨでは負に荷電した側鎖を典型的に有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）を含む。
【００５２】
「塩基性アミノ酸」とは、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの結合に起因して生理学的ｐＨでは正に荷電した側鎖を典型的に有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸はＨｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）およびＬｙｓ（Ｋ）を含む。
【００５３】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨでは荷電していないが、２個の原子により共有されている電子対が、その原子のうちの一方により近く保持されている少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる極性アミノ酸は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）を含む。
【００５４】
「疎水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性基準に従って、０より大きい疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＴｙｒ（Ｙ）を含む。
【００５５】
「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香環または複素芳香環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。芳香環または複素芳香環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ2、−ＮＯ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどのような１つまたはそれ以上の置換基を含み得、ここで各Ｒは独立して、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、置換（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ1−Ｃ6）アルケニル、置換（Ｃ1−Ｃ6）アルケニル，（Ｃ1−Ｃ6）アルキニル、置換（Ｃ1−Ｃ6）アルキニル，（Ｃ5−Ｃ20）アリール、置換（Ｃ5−Ｃ20）アリール、（Ｃ6−Ｃ26）アルカリール、置換（Ｃ6−Ｃ26）アルカリール、５〜２０員ヘテロアリール、置換５〜２０員ヘテロアリール、６〜２６員アルカヘテロアリールまたは置換６〜２６員アルカヘテロアリールである。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＴｒｐ（Ｗ）を含む。
【００５６】
「非極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで非荷電であり、そして２個の原子により共有されている電子対が、その２つの原子の各々によりおおむね等しく保持されている結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は極性ではない）を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＡｌａ（Ａ）を含む。
【００５７】
「脂肪族アミノ酸」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【００５８】
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスルファニル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点において特異である。還元された遊離−ＳＨ形態または酸化されたジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基がペプチドに対して正味の疎水性特性または親水性特性のどちらに寄与するかに影響を及ぼす。Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，前出）の正規化コンセンサス基準に従って０.２９の疎水性を示すが、本発明の目的のためには、Ｃｙｓ（Ｃ）は、上で規定した一般的な分類にかかわらず、極性親水性アミノ酸として分類されることが理解されるべきである。
【００５９】
当業者に理解されるように、上で規定した分類は、相互排他的ではない。それ故、２つまたはそれ以上の物理−化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含まれ得る。例えばＴｙｒ（Ｙ）のようなさらに極性置換基で置換される芳香族部分構造を有するアミノ酸側鎖は、芳香族疎水性特性および極性または親水性特性の両方を示し得、従って、芳香族カテゴリーと極性カテゴリーの両方に含めることができる。任意のアミノ酸の適切なカテゴリー化は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らせば当業者に明らかである。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの置換されたかまたは変更された形態は、アポＡ−Ｉではない。
【００６０】
本発明において利用されるアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、利用可能な任意の供給元から入手できる。例えば、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、組換え、合成、半合成または精製されたアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏであり得る。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、米国特許第５,７２１,１１４号ならびに欧州特許ＥＰ  ０  ４６９  ０１７およびＥＰ  ０  ２６７  ７０３（全て参照により本明細書に加入される）に記載されるような、酵母またはＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えタンパク質（ｒアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）であり得る。本発明により利用されるアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを入手する方法は、当該分野で周知である。例えば、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、例えば、密度勾配遠心分離法、続いてリポタンパク質の脱脂、還元、変性（ｄｅｎａｔｕｒｅｚａｔｉｏｎ）およびゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（例えば、フェニルセファロース）相互作用クロマトグラフィーもしくは免疫親和性クロマトグラフィーにより血漿から分離することができるか、または合成、半合成により、もしくは当業者に公知の組換えＤＮＡ技術、続いて当業者によく知られる精製を使用して製造され得る（例えば、米国特許第６,１０７,４６７号；同第６,５５９,２８４号；同第６,４２３,８３０号；同第６,０９０,９２１号；同第５,８３４,５９６号；同第５,９９０,０８１号；同第６,５０６,８７９号、Ｍｕｌｕｇｅｔａら，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７９８（１−２）：８３−９０；Ｃｈｕｎｇら，１９８０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１；Ｃｈｅｕｎｇら，１９８７，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９；Ｐｅｒｓｓｏｎ，ら，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７１１：９７−１０９；米国特許第５,０５９,５２８号、同第５,８３４,５９６号、同第５,８７６,９６８号および同第５,７２１,１１４号；ならびにＰＣＴ公報ＷＯ８６／０４９２０およびＷＯ８７／０２０６２を参照のこと）。
【００６１】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏが天然源から得られる場合、任意の種の任意の動物源から入手できる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、哺乳動物源から入手できる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、ヒト源から入手できる。本発明の好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏが投与される被験体と同じ種に由来する。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏタンパク質（ｒアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）である。
【００６２】
５．４．投与方法
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、循環におけるバイオアベイラビリティーを確実にする、当業者に公知の任意の適切な経路により投与され得る。治療有効量の本発明の製剤を提供する任意の投与経路が使用され得る。投与経路は、医薬製剤の様式により示され得る。例えば、注射剤は、静脈内（ＩＶ）注射、筋内（ＩＭ）注射、皮内注射、皮下（ＳＣ）注射、冠動脈内注射、動脈内注射、心膜内注射、関節内注射および腹腔内（ＩＰ）注射が挙げられるがこれらに限定されず、非経口的に投与され得る（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，１９８９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．２，ｐｐ．１５−３４（全て参照により本明細書に加入される）を参照のこと）。
【００６３】
好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体またはその医薬製剤は、非経口投与され得る。より好ましい実施態様において、非経口投与は静脈内である。静脈内投与は、ボーラス、例えば、約２〜３分間かけて投与されるかまたは持続注入により、例えば、ポンプにより約１時間かけて投与されるか、もしくは約２４時間かけて持続注入され得る。好ましい実施態様において、注入は約１〜約３時間かけられ得る。
【００６４】
方法は、本明細書に記載される医薬製剤の静脈内注射を提供する。任意の適切な血管は、注入部位として使用され得、これらとしては、腕の肘窩における血管のような末梢血管または胸部への中心静脈ラインが挙げられる。好ましい実施態様において、医薬製剤は、被験体の腕の肘窩における橈側皮または肘正中皮血管に注入される。
【００６５】
特定の実施態様において、投与は、機械ポンプもしくは送達デバイス（例えば、心膜送達デバイス（ＰｅｒＤＵＣＥＲ(登録商標)）または心肺バイパス機械により行われ得る。
【００６６】
５．５  脂質複合体
特定の実施態様において、本発明の方法は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの脂質複合体の投与を含む。特定の実施態様において、本発明は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の医薬製剤を提供する。脂質をアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏに複合体化することにより有効性が増強され得る。典型的には、脂質を投与の前にアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏと混合する。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏと脂質とを、適切な比率で水溶液中にて混合し得、そしてフリーズドライ、界面活性剤可溶化とそれに続く透析、微少流体化、超音波処理、および均質化を含む当該分野で公知の方法により複合体化し得る。複合体の有効性を、例えば、圧力、超音波振動数、または界面活性剤濃度を変化させることにより最適化することができる。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を製造するために一般的に使用される界面活性剤の例は、コール酸ナトリウムである。
【００６７】
いくつかの場合には、急性冠症候群を処置または予防するために、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを単独で、本質的に脂質無しで投与することが好ましい。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体を、それを必要とする被験体に投与する。
【００６８】
一実施形態において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体は、適切な製薬希釈剤と共に溶液状態であり得る。別の実施態様において、フリーズドライまたは凍結乾燥されたアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の製剤を、投与前に水和するかまたは適切な製薬希釈剤を用いて再形成することができる。別の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体は、それを必要とする被験体への投与の前に、均一な溶液が得られるまで解凍される凍結製剤であり得る。
【００６９】
脂質は、当業者に公知の任意の適切な脂質であり得る。リン非含有脂質を使用することができ、ステアリルアミン、ドデシルアミン、アセチルパルミテート、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’（グリコシルチオ）ヘキシルエーテル糖脂質、Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロパ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドおよび脂肪酸アミドが挙げられる。好ましい実施態様において、脂質はリン脂質である。
【００７０】
リン脂質は、当業者に公知の任意の供給元から入手できる。例えば、リン脂質を、市販、天然源または当業者に公知の合成もしくは半合成手段により入手できる（Ｍｅｌ’ｎｉｃｈｕｋら，１９８７，Ｕｋｒ．Ｂｉｏｋｈｉｍ．Ｚｈ．５９（６）：７５−７；Ｍｅｌ’ｎｉｃｈｕｋら，１９８７，Ｕｋｒ．Ｂｉｏｋｈｉｍ．Ｚｈ．５９（５）：６６−７０；Ｒａｍｅｓｈら，１９７９，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５６（５）：５８５−７；ＰａｔｅｌおよびＳｐａｒｒｏｗ，１９７８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１５０（２）：５４２−７；Ｋａｄｕｃｅら，１９８３，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２４（１０）：１３９８−４０３；Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒら，２００３，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５（３）：２５５−７；Ｔｓｕｊｉら，２００２，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｙａｋｕｒｉｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ  １２０（１）：６７Ｐ−６９Ｐ）。
【００７１】
好ましい実施態様において、脂質はリン脂質であり得る。リン脂質は、当業者に公知の任意のリン脂質であり得る。例えば、リン脂質は、低級アルキル鎖リン脂質、ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルグリセロール、卵ホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン、１−オレイル−２−パルミチルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール，ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ケファリン、カルジオリピン、ジセチルホスフェート、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールならびにその誘導体であり得る。
【００７２】
リン脂質はまた、上記のリン脂質のいずれかの誘導体または類縁体であり得る。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体は、２種またはそれ以上のリン脂質の組み合わせを含み得る。
【００７３】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の投与を提供する。より好ましい実施態様において、脂質は、リン脂質、好ましくは、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）または（「１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン」）である。さらにより好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体は、約１対１の重量比のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣを含む。最も好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体は、医薬製剤である。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体はＥＴＣ−２１６と呼ばれる。
【００７４】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏおよび脂質を含む複合体は、急性冠症候群を処置または予防するために有効な、任意の量の脂質、好ましくはリン脂質、および任意の量のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含み得る。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、重量で約１対約１の比で、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏおよびリン脂質の複合体を含み得る。しかしアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、約１００：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：１０および約１：１００（タンパク質重量／脂質重量）のような、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏに対して他の比のリン脂質を含む複合体を含み得る。約１：０.５〜約１：３（タンパク質重量／脂質重量）の間の重量比、より好ましくは約１：０.８〜約１：１.２（タンパク質重量／脂質重量）の比が、最も均一な集団を生成するため、および安定で再現可能なバッチを製造する目的のために好ましい。なお一層より好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ対リン脂質の比は、１：０.９５（タンパク質重量／脂質重量）である。
【００７５】
本発明の方法における使用に適したさらなる脂質は、当業者に周知であり、そして種々の周知の資料、例えばＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓおよび  ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．（これらの両方が、参照により本明細書に加入される）に列挙される。一般的に、脂質が３７℃、３５℃、または３２℃で液晶であることが望ましい。液晶状態の脂質は、典型的にはゲル状態の脂質よりも有効にコレステロールを受容する。被験体は典型的に約３７℃の中核体温を有するので、３７℃で液晶である脂質は、処置の間概して液晶状態である。
【００７６】
５．６．脂質複合体の製造
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体は、当業者に公知の任意の方法により作製することができる。いくつかの場合には、投与の前に脂質とアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏとを混合することが望ましい。脂質は、溶液状態または均質化、超音波処理もしくは押出のような標準的な技術を使用して形成されたリポソームもしくはエマルジョンの形態であり得る。超音波処理は、一般的には氷浴中でＢｒａｎｓｏｎチップソニファイアーのようなチップソニファイアーを用いて行われる。典型的には、懸濁液を数回の超音波処理サイクルにかける。押出は、Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  ＥｘｔｒｕｄｅｒTM（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）のような生体膜エクストルーダーにより行うことができる。押出フィルターにおける規定された孔径が、特定のサイズの単薄膜リポソーム小胞を生成し得る。リポソームはまた、Ｃｅｒａｆｌｏｗ  ＭｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒTM（Ｎｏｒｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｍａｓｓから市販されている）のような非対称セラミックフィルター、またはポリカーボネートフィルターもしくは当業者に公知の他の種類のポリマー材料（すなわち、プラスチック）を通す押出によっても形成することができる。
【００７７】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体を、小胞、リポソーム、またはプロテオリポソームを含むがこれらに限定されない種々の形態で製造することができる。当業者に周知の種々の方法を使用して、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体を製造することができる。リポソームまたはプロテオリポソームを製造するための利用可能な多数の技術が使用され得る。例えば、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを、適切な脂質と共に（バス式またはプローブ超音波発生機を使用して）同時超音波処理して（ｃｏ−ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）脂質複合体を形成することができる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、予め形成された脂質小胞と混合され得、結果としてアポリポタンパク質：脂質複合体を自発的に形成する。別の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏはまた、界面活性剤透析法により作製され得；例えば、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、脂質およびコール酸塩のような界面活性剤の混合物を、界面活性剤を除去するために透析し得、そして脂質複合体を作製するために再形成し得る。（例えば、Ｊｏｎａｓら，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８，５５３−８２を参照のこと）。
【００７８】
別の実施態様において、脂質複合体は、米国特許第６,２８７,５９０号および同第６,４５５,０８８号（その内容は、全て参照により本明細書に加入される）に記載されるように、同時凍結乾燥（ｃｏ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することにより作製することができる。他の方法は、例えば、米国特許第６,００４,９２５号、同第６,０３７,３２３号および同第６,０４６,１６６号（全て参照により本明細書に加入される）に開示される。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体を製造する他の方法は、当業者に明らかである。
【００７９】
好ましい実施態様において、脂質複合体は均質化により作製することができる。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の作製は、組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを注射のために溶液中１５ｍｇ／ｍｌの濃度まで水で希釈するときに開始する。リン酸ナトリウムを、９〜１５ｍＭのリン酸塩の最終濃度まで加え、そしてｐＨを約７.０と約７.８との間に調整する。マンニトールを、約０.８％〜約１％のマンニトールの濃度（ｗ／ｖ）を達成するように添加する。次いでＰＯＰＣを、約１：０.９５（タンパク質重量／脂質重量）のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏダイマー対ＰＯＰＣの混合物を達成するように加える。この混合物を、温度を３７℃〜４３℃の間に維持しながら、５０００ｒｐｍで約２０分間オーバーヘッドプロペラおよびＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘを使用して撹拌した。インライン熱交換機（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）を用いて温度を３２℃〜４３℃の間に維持しながら、供給容器を連続的に３００ｒｐｍで撹拌する。最初の３０分間の均質化は、５０ＭＰａ（７２５０ｐｓｉ）で行い、その後、ゲル浸透クロマトグラフィーによる製造過程検査がタンパク質標準間で＞７０％の％ＡＵＣを実証するまで、圧力を８０〜１２０ＭＰａ（１１６００〜１７４００ｐｓｉ）に維持する。複合体はまた、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌおよび１４ｍｇ／ｍｌの製剤として（ここで重量はタンパク質の重量である）作製され得る。
【００８０】
５．７．併用療法
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏもしくは脂質複合体またはその医薬製剤は、本発明の方法において単独で、または他の介入との併用療法で使用することができる。このような療法としては、他の薬物の同時または逐次投与が挙げられるがこれに限定されない。
【００８１】
特定の実施態様において、本発明の方法および製剤は、本明細書中に提供される方法を達成するための他の薬物と組み合わせて使用することができる。別の薬物との共投与は、付随する疾患、状態、障害または症状を処置、予防または改善するためであり得、例えば、抗不整脈薬が既存の不整脈を処置するために投与される。特定の実施態様において、方法は、急性冠症候群に付随する疼痛を処置または予防するための薬物の共投与を提供する。
【００８２】
上記のように、心筋梗塞、狭心症および急性冠症候群を含む虚血性事象のための従来の治療は、破綻したかまたは不安定な動脈硬化性プラークの根底にある病理を対象としていなかった。例えば、心臓胸部の不快感または他の虚血性症状を示す被験体は、アスピリン、クロピドグレル、ヘパリン、エプチフィバチドまたはアブシキシマブのような抗凝固薬または抗血栓剤を用いて、緊急の経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）の用意ができる。βアドレナリン遮断薬（β遮断薬）を、心拍数を減少させるために投与することができる。アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）の投与は、付随する鬱血性心不全（ＣＨＦ）または左心室（ＬＶ）機能障害に罹患している被験体に対して推奨される。突然心臓死から蘇生した被験体については、アミオダロンの投与が推奨される。酸素は、一般的にマスクまたは鼻カニューレによりしばしば被験体に供給され、そしてパルス酸素測定により酸素飽和度を含むバイタルサインが綿密にモニタリングされる。長期の処置については、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害薬のスタチンは、ＬＤＣレベルを減少させるためにしばしば被験体に投与される。
【００８３】
例えば、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏもしくは脂質複合体またはその医薬製剤は、他の薬学的に活性な薬物と共に投与され得、この薬物としては、α／βアドレナリン拮抗薬、抗アドレナリン作動薬、α−１アドレナリン拮抗薬、βアドレナリン拮抗薬、ＡＭＰキナーゼ活性化剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗不整脈薬、血管拡張薬、硝酸薬、昇圧剤、強心薬、利尿薬、抗凝固薬、抗血小板凝集薬、血栓溶解剤、抗糖尿病薬、酸化防止剤、抗炎症薬、胆汁酸金属イオン封鎖剤、スタチン、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、コレステロール低下剤／脂質調節剤、アラキドン酸変換を遮断する薬物、エストロゲン補充療法、脂肪酸類縁体、脂肪酸合成阻害薬、フィブラート、ヒスチジン、ニコチン酸誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体作動薬または拮抗薬、脂肪酸酸化阻害薬、サリドマイドまたはチアゾリジンジオンが挙げられるがこれらに限定されない（Ｄｒｕｇ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  ｍｏｎｔｈｌｙ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３，Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６th  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２）Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ）。
【００８４】
単一で、または組み合わせて、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、脂質複合体もしくはその医薬製剤の有利な特性を補足し得るかまたは相乗作用し得る他の薬物としては：カルベジロール（ｃａｒｖｅｄｉｏｌ）（Ｃｏｒｅｇ（登録商標））；ラベタロールＨＣｌ、（Ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ（登録商標））のようなα／βアドレナリン拮抗薬（「β遮断薬」）；グアナドレル、（Ｈｙｌｏｒｅｌ（登録商標））；グアネチジン、（Ｉｓｍｅｌｉｎ（登録商標））；レセルピン、クロニジン、（Ｃａｔａｐｒｅｓ（登録商標）およびＣａｔａｐｒｅｓ−ＴＴＳ（登録商標））；グアンファシン、（Ｔｅｎｅｘ（登録商標））；グアナベンズ、（Ｗｙｔｅｎｓｉｎ（登録商標））；メチルドーパおよびメチルドペート、（Ａｌｄｏｍｅｔ（登録商標））のような抗アドレナリン作動薬；ドキサゾシン（Ｃａｒｄｕｒａ（登録商標））；プラゾシン、（Ｍｉｎｉｐｒｅｓｓ（登録商標））；テラゾシン、（Ｈｙｔｒｉｎ（登録商標））；およびフェントラミン、（Ｒｅｇｉｔｉｎｅ（登録商標））のようなα−１アドレナリン拮抗薬；ソタロール、（Ｂｅｔａｐａｃｅ  ＡＦ（登録商標）およびＢｅｔａｐａｃｅ（登録商標））；チモロール、（Ｂｌｏｃａｄｒｅｎ（登録商標））；プロプラノロール、（ＩｎｄｅｒａｌＬＡ（登録商標）およびＩｎｄｅｒａｌ（登録商標））；ベタキソロール、（Ｋｅｒｌｏｎｅ（登録商標））；アセブトロール、（Ｓｅｃｔｒａｌ（登録商標））；アテノロール、（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ（登録商標））；メトプロロール、（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ（登録商標）およびＴｏｐｒｏｌ−ＸＬ（登録商標））；ビソプロロール、（Ｚｅｂａｔａ（登録商標））；カルテオロール、（Ｃａｒｔｒｏｌ（登録商標））；エスモロール、（Ｂｒｅｖｉｂｌｏｃ（登録商標））；ナドロール（ｎａｌｄｏｌｏｌ）、（Ｃｏｒｇａｒｄ（登録商標））；ペンブトロール、（Ｌｅｖａｔｏｌ（登録商標））；およびピンドロール、（Ｖｉｓｋｅｎ（登録商標））のようなβアドレナリン（Ａｎｄｒｅｎｅｒｇｉｃ）拮抗薬；ＥＳＰ  ３１０１５、（ＥＴＣ−１００１）；ＥＳＰ  ３１０８４、ＥＳＰ  ３１０８５、ＥＳＰ  １５２２８、ＥＳＰ  ５５０１６およびＥＳＰ  ２４２３２；ゲムカベン（ｇｅｍｃａｂｅｎｅ）（ＰＤ  ７２９５３およびＣＩ−１０２７）；およびＭＥＤＩＣＡ  １６のようなＡＭＰキナーゼ活性化剤；キナプリル（Ａｃｃｕｐｒｉｌ（登録商標））；ベナゼプリル、（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ（登録商標））；カプトプリル、（Ｃａｐｏｔｅｎ（登録商標））；エナラプリル、（Ｖａｓｏｔｅｃ（登録商標））；ラミプリル（Ａｌｔａｃｅ（登録商標））；フォシノプリル（Ｍｏｎｏｐｒｉｌ（登録商標））；モエキシプリル、（Ｕｎｉｖａｓｃ（登録商標））；リシノプリル、（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ（登録商標）およびＺｅｓｔｒｉｌ（登録商標））；トランドラプリル、（Ｍａｖｉｋ（登録商標））、ペリンドプリル、（Ａｃｅｏｎ（登録商標））のようなアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；およびカンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ（登録商標））；イルベサルタン、（Ａｖａｐｒｏ（登録商標））；ロサルタン、（Ｃｏｚａａｒ（登録商標））；バルサルタン、（Ｄｉｏｖａｎ（登録商標））；テルミサルタン、（Ｍｉｃａｒｄｉｓ（登録商標））；エプロサルタン、（Ｔｅｖｅｔａｎ（登録商標））；およびオルメサルタン、（Ｂｅｎｉｃａｒ（登録商標））のようなアンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬；ニフェジピン、（Ａｄａｌａｔ（登録商標）、Ａｄａｌａｔ  ＣＣ（登録商標）、Ｐｒｏｃａｒｄｉａ（登録商標）およびＰｒｏｃａｒｄｉａ  ＸＬ（登録商標））；ベラパミル、（Ｃａｌａｎ（登録商標）、ＣａｌａｎＳＲ（登録商標）、Ｃｏｖｅｒａ−ＨＳ（登録商標）、ＩｓｏｐｔｉｎＳＲ（登録商標）、Ｖｅｒｅｌａｎ（登録商標）およびＶｅｒｅｌａｎＰＭ（登録商標））；ジルチアゼム、（Ｃａｒｄｉｚｅｍ（登録商標）、ＣａｒｄｉｚｅｍＣＤ（登録商標）およびＴｉａｚａｃ（登録商標））；ニモジピン、（Ｎｉｍｏｔｏｐ（登録商標））；アムロジピン、（Ｎｏｒｖａｓｃ（登録商標））；フェロジピン、（Ｐｌｅｎｄｉｌ（登録商標））；ニソルジピン、（Ｓｕｌａｒ（登録商標））；ベプリジル、（Ｖａｓｃｏｒ（登録商標））；イスラジピン、（ＤｙｎａＣｉｒｃ（登録商標））；およびニカルジピン、（Ｃａｒｄｅｎｅ（登録商標））のようなカルシウムチャネル遮断薬；種々のキニジン；プロカインアミド、（Ｐｒｏｎｅｓｔｙｌ（登録商標）およびＰｒｏｃａｎ（登録商標））；リドカイン、（Ｘｙｌｏｃａｉｎｅ（登録商標））；メキシレチン（ｍｅｘｉｌｉｔｉｎｅ）、（Ｍｅｘｉｔｉｌ（登録商標））；トカイニド、（Ｔｏｎｏｃａｒｄ（登録商標））；フレカイニド、（Ｔａｍｂｏｃｏｒ（登録商標））；プロパフェノン（Ｒｙｔｈｍｏｌ（登録商標））、モリシジン、（Ｅｔｈｍｏｚｉｎｅ（登録商標））；イブチリド、（Ｃｏｖｅｒｔ（登録商標））；ジソピラミド、（Ｎｏｒｐａｃｅ（登録商標））；ブレチリウム、（Ｂｒｅｔｙｌｏｌ（登録商標））；アミオダロン、（Ｃｏｒｄａｒｏｎｅ（登録商標））；アデノシン、（Ａｄｅｎｏｃａｒｄ（登録商標））；ドフェチリド（Ｔｉｋｏｓｙｎ（登録商標））；およびジゴキシン、（Ｌａｎｏｘｉｎ（登録商標））のような抗不整脈薬；ジアゾキシド、（Ｈｙｐｅｒｓｔａｔ  ＩＶ（登録商標））；ヒドララジン、（Ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ（登録商標））；フェノルドパム、（Ｃｏｒｏｌｐａｍ（登録商標））；ミノキシジル、（Ｌｏｎｉｔｅｎ（登録商標））；およびニトロプルシド、（Ｎｉｐｒｉｄｅ（登録商標））のような血管拡張薬；イソソルビドジニトレート；（Ｉｓｏｒｄｉｌ（登録商標）およびＳｏｒｂｉｔｒａｔｅ（登録商標））；イソソルビドモノニトレート、（Ｉｍｄｕｒ（登録商標）、Ｉｓｍｏ（登録商標）およびＭｏｎｏｋｅｔ（登録商標））；ニトログリセリンペースト、（Ｎｉｔｒｏｌ（登録商標））；種々のニトログリセリンパッチ；ニトログリセリンＳＬ、（Ｎｉｔｒｏｓｔａｔ（登録商標））、Ｎｉｔｒｏｌｉｎｇｕａｌスプレー；およびニトログリセリンＩＶ、（Ｔｒｉｄｉｌ（登録商標））のような硝酸薬；ノルエピネフリン、（Ｌｅｖｏｐｈｅｄ（登録商標））；およびフェニレフリン、（Ｎｅｏ−Ｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ（登録商標））のような昇圧薬（Ｖａｓｓｏｐｒｅｓｓｏｒｓ）；アムリノン；（Ｉｎｏｃｏｒ（登録商標））；ドーパミン、（Ｉｎｔｒｏｐｉｎｅ（登録商標））；ドブタミン、（Ｄｏｂｕｔｒｅｘ（登録商標））；エピネフリン、（Ａｄｒｅｎａｌｉｎ（登録商標））；イソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｎｏｌ）、（Ｉｓｕｐｒｅｌ（登録商標））、ミルリノン、（Ｐｒｉｍａｃｏｒ（登録商標））のような強心薬（Ｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）；スピロノラクトン、（Ａｌｄａｃｔｏｎｅ（登録商標））；トルセミド、（Ｄｅｍａｄｅｘ（登録商標））；ヒドロフルメチアジド、（Ｄｉｕｃａｒｄｉｎ（登録商標））；クロロチアジド、（Ｄｉｕｒｉｌ（登録商標））；エタクリン酸、（Ｅｄｅｃｒｉｎ（登録商標））；ヒドロクロロチアジド、（ｈｙｄｒｏＤＩＵＲＩＬ（登録商標）およびＭｉｃｒｏｚｉｄｅ（登録商標））；アミロリド、（Ｍｉｄａｍｏｒ（登録商標））；クロルタリドン、（Ｔｈａｌｉｔｏｎｅ（登録商標）およびＨｙｇｒｏｔｏｎ（登録商標））；ブメタニド、（Ｂｕｍｅｘ（登録商標））；フロセミド、（Ｌａｓｉｘ（登録商標））；インダパミド、（Ｌｏｚｏｌ（登録商標））；メトラゾン、（Ｚａｒｏｘｏｌｙｎ（登録商標））；トリアムテレン、（Ｄｙｒｅｎｉｕｍ（登録商標））；およびトリアムテレンとヒドロクロロチアジドの組み合わせ（Ｄｙａｚｉｄｅ（登録商標）およびＭａｘｚｉｄｅ（登録商標））のような利尿薬；ビバリルジン、（Ａｎｇｉｏｍａｘ（登録商標））；レピルジン、（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標））；種々のヘパリン；ダナパロイド、（Ｏｒｇａｒａｎ（登録商標））；種々の低分子量ヘパリン；ダルテパリン、（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））；エノキサパリン、（Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標））；チンザパリン、（Ｉｎｎｏｈｅｐ（登録商標））；ワルファリン、（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））；ジクマロール、（Ｄｉｃｏｕｍａｒｏｌ（登録商標））；アニシンジオン、（Ｍｉｒａｄｏｎｅ（登録商標））；アスピリン；アルガトロバン、（Ａｒｇａｔｒｏｂａｎ（登録商標））；アブシキシマブ、（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））；エプチフィバチド、（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ（登録商標））；チロフィバン、（Ａｇｇｒａｓｔａｔ（登録商標））；クロピドグレル、（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））；チクロピジン、（Ｔｉｃｌｉｄ（登録商標））；およびジピリダモール、（Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ（登録商標））のような抗血栓剤／抗凝血剤／抗血小板薬；アルテプラーゼ、（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））；組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）、（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））；アニストレプラーゼ、ＡＰＳＡＣ、（Ｅｍｉｎａｓｅ（登録商標））；レテプラーゼ、ｒＰＡ（Ｒｅｔａｖａｓａｅ（登録商標））；ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）ＳＫ，（Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ（登録商標））；ウロキナーゼ、（Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ（登録商標））  のような血栓溶解薬；メトホルミン、（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標））；グリピジド、（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ（登録商標））；クロルプロパミド、（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ（登録商標））；アセトヘキサミド、（Ｄｙｍｅｌｏｒ（登録商標））；トラザミド、（Ｔｏｌｉｎａｓｅ（登録商標））；グリメピリド、（Ａｍａｒｙｌ（登録商標））；グリブリド、（ＤｉａＢｅｔａ（登録商標）およびＭｉｃｒｏｎ��ｓｅ（登録商標））；アカルボース、（Ｐｒｅｃｏｓｅ（登録商標））；ミグリトール、（Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標））；レパグリニド（ｒｅｐａｆｌｉｎｉｄｅ）、（Ｐｒａｎｄｉｎ（登録商標））；ナテグリニド、（Ｓｔａｒｌｉｘ（登録商標））；ロシグリタゾン、（Ａｖａｎｄｉａ（登録商標））；およびピオグリタゾン、（Ａｃｔｏｓ（登録商標））  のような抗糖尿病薬；抗酸化剤および抗炎症薬；コレスチラミン、（ＬｏＣｈｏｌｅｓｔ（登録商標）、Ｐｒｅｖａｌｉｔｅ（登録商標）およびＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標））；コレスチポール、（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標））；およびコレセベラム、（Ｗｅｌｃｈｏｌ（登録商標））のような胆汁酸金属イオン封鎖剤；ロバスタチン、（Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標））；フルバスタチン、（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））；アトルバスタチン、（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標））；ロバスタチン、（Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標））；プラバスタチン、（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標））；およびシムバスタチン、（Ｚｏｃｏｒ（登録商標））のようなスタチン（ＨＭＧＣｏＡ還元酵素を阻害する薬物）；ＣＥＴＰ阻害剤；アラキドン酸変換を遮断する薬物：エストロゲン補充療法；ＰＤ−７２９５３、ＭＥＤＩＣＡ  １６、ＥＳＰ  ２４２３２、およびＥＳＰ  ３１０１５のような脂肪酸類縁体；脂肪酸合成阻害剤；脂肪酸合成阻害剤；脂肪酸酸化阻害剤、ラノラジン、（Ｒａｎｅｘａ（登録商標））；クロフィブレート、（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標））；ゲムフィブロジル、（Ｌｏｐｉｄ（登録商標））；微粉末化フェノフィブラートカプセル、（Ｔｒｉｃｏｒ（登録商標））；ベザフィブラートおよびシプロフィブレートのようなフィブラート；ヒスチジン；ナイアシン延長放出錠、（Ｎｉａｓｐａｎ（登録商標））のようなニコチン酸誘導体；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体作動薬および拮抗薬；サリドマイド、（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））ならびに米国特許第６,４５９,００３号、同第６,５０６,７９９号、および米国特許出願公報２００３００２２８６５、２００３００１８０１３、２００２００７７３１６および２００３００７８２３９（これらの内容は、全て参照により本明細書に加入される）に記載される化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８５】
単一で、または組み合わせて、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏもしくは脂質複合体またはその医薬製剤の有利な特性を補足し得るかもしくは相乗作用し得る他の薬物としては、例えば、パクリタキセルおよびトポテカンのような抗増殖薬、（Ｂｒｅｈｍら  ２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６１（１）：１１９−１２７）およびステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤（シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を含む）のような抗炎症薬が挙げられる。
【００８６】
５．８．医薬製剤
一局面において、本発明は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含む医薬製剤を投与することにより急性冠症候群に由来する傷害を処置、低減または予防するための製剤を提供する。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）は、脂質と複合体化され得る。より好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、ＰＯＰＣと複合体化される。
【００８７】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏまたはその脂質複合体は、医薬製剤の形態で投与され得る。本明細書中に記載される医薬製剤は、例えば、許容しうる希釈剤、補形薬、賦形剤または担体の添加を含む。当該分野で公知のように、１種またはそれ以上の希釈剤、補形薬、賦形剤または担体の添加は、製剤を被験体への投与に適切にし、そして延長された保管寿命のような他の都合のよい特性を与えることができる。
【００８８】
医薬製剤は、典型的には薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む。多くの薬学的に許容しうる担体または賦形剤を使用することができる。本明細書に記載される実施例は、ショ糖−マンニトールを利用する。標準的な生理食塩水が製薬担体または賦形剤としてしばしば使用される。他の適切な担体または賦形剤としては、グルコース、トレハロース、ショ糖、滅菌水、緩衝用水、０.４５％食塩水（半生理食塩水）、および０.３％グリシンが挙げられ、増強された安定性のためにアルブミンのような糖タンパク質をさらに含み得る。これらの製剤は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することができる。得られた水溶液は、使用のために包装されるか無菌状態で濾過され、そして凍結乾燥（フリーズドライ）され得る。凍結乾燥された製剤は、次いで投与前に滅菌水溶液と混合され得る。
【００８９】
医薬製剤はまた、生理条件に近づけるために必要な場合、ｐＨ調整剤および緩衝剤、ならびに張度調整剤（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウム）のような薬学的に許容しうる補形薬を含み得る。抗菌剤、例えば、フェノール、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを、製品、特に複数回用量の非経口用途用に意図された医薬製剤の滅菌性を維持するために添加することができる。懸濁化剤、安定剤および／または分散剤もまた、本発明の製剤において使用することができる。
【００９０】
医薬製剤は、塩形態のアポリポタンパク質（アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ）を含み得る。例えば、タンパク質は酸性および／または塩基性の末端および／または側鎖を含み得るので、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、遊離酸もしくは遊離塩基として、または薬学的に許容しうる塩として医薬製剤中に存在し得る。薬学的に許容しうる塩は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏと塩を形成し得る適切な酸を含み得、この酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などのような無機酸；およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などのような有機酸が挙げられる。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏと塩を形成し得る適切な塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどのような無機塩基；およびモノ−、ジ−およびトリ−アルキルアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）ならびに場合により置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンなど）のような有機塩基を挙げることができる。
【００９１】
医薬製剤は、非経口、経腸、局所または吸入を含むがこれらに限定されない任意の投与経路に適切な種々の形態であり得る。非経口投与とは、消化管を通らない任意の投与経路を指し、注射投与（すなわち、本明細書に記載されるような静脈内、筋内など）を含むがこれに限定されない。経腸投与とは、消化管を使用する、経口または直腸の任意の投与経路を指し、本明細書に記載されるような、錠剤、カプセル、経口液剤、懸濁剤、スプレーなどが挙げられるがこれらに限定されない。この用途の目的のためには、経腸投与は、膣投与経路のことも指す。局所投与とは、皮膚を介した任意の投与経路を指し、本明細書に記載されるような、クリーム、軟膏、ゲルおよび経皮パッチが挙げられるがこれらに限定されない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８th  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０も参照のこと）。
【００９２】
本発明の非経口医薬製剤は、注射により、例えば、静脈に（静脈内）、動脈に（動脈内）、筋肉に（筋内）、皮膚の下に（皮下またはデポー製剤）、心膜に、冠動脈に、投与することができる。注射可能な医薬製剤は、心臓、心膜または冠動脈への直接的な投与について薬学的に適切な製剤であり得る。好ましい実施態様において、医薬製剤は、被験体の末梢血管、例えば、腕または肘窩に注入される。
【００９３】
注射可能医薬製剤は、水性賦形剤または油性賦形剤中の滅菌の懸濁剤、液剤または乳剤であり得る。注射用の製剤は、単位投薬形態、例えば、アンプル中または複数回用量容器中で提供され得、そして添加された保存料を含み得る。非経口医薬製剤用の好ましい緩衝剤は、リン酸塩、クエン酸塩および酢酸塩である。
【００９４】
別の実施態様において、医薬製剤は、適切な賦形剤（滅菌パイロジェンフリー水、食塩水またはデキストロースが挙げられるがこれらに限定されない）で使用前に再形成するための散剤形態で提供され得る。この目的のために、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏは、凍結乾燥されるか、または適切な場合には上記のような脂質と同時凍結乾燥され得る。別の実施態様において、医薬製剤は、単位投薬形態で供給され、そして使用前に再形成され得る。
【００９５】
長期送達のために、医薬製剤は、移植による投与（例えば、皮下、皮内または筋内注射）のために、デポー製剤として提供され得る。それ故、例えば、医薬製剤は、適切なポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば、許容しうるオイル中の乳剤として）もしくはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体として；例えば、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏもしくはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の難溶性塩形態として、製剤化され得る。
【００９６】
別の実施態様において、医薬製剤は、経皮吸収のための活性成分をゆっくりと放出する吸盤またはパッチとして製造される経皮送達系である。この実施態様において、浸透増強剤を、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの経皮浸透を促進するために使用することができる。別の実施態様において、経皮医薬製剤は、狭心症を有する患者における使用のためにニトログリセリンをさらに含有することができる。
【００９７】
吸入による投与のために、医薬製剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して、加圧パックからまたは噴霧器を介してエアゾールスプレーにより送達され得る。加圧エアゾール剤の場合には、投薬単位は、計量された量を送達するバルブ、例えば定量投与量吸入器を提供することにより決定することができる。吸入器または注入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏおよび乳糖またはデンプンのような適切な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤化され得る。
【００９８】
製剤は、所望の場合、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ医薬製剤を含む１つまたはそれ以上の単位投薬形態を含むことができるパックまたはディスペンサーデバイスに入れて提供され得る。パックは、例えば、ブリスター包装のような金属またはプラスチックの箔を含む。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示書または標示を添付され得る。
【００９９】
特定の実施態様において、アポＡＩ−ＭまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、処置を必要とする被験体を処置するために十分な濃度のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含み得る。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含み得る。好ましい実施態様において、製剤は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含み得る。より好ましい実施態様において、製剤は、約１３ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌの濃度でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含み得る。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの濃度は、当業者に公知の任意の適切な技術により決定することができる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの濃度は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定される。
【０１００】
特定の実施態様において、アポＡＩ−ＭまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏと複合体を形成するために十分な濃度の脂質を含み得る。特定の実施態様において、脂質は、リン脂質である。好ましい実施態様において、脂質はＰＯＰＣである。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＯＰＣを含み得る。好ましい実施態様において、製剤は、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＯＰＣを含み得る。より好ましい実施態様において、製剤は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＯＰＣを含み得る。さらにより好ましい実施態様において、製剤は、約１１ｍｇ／ｍｌ〜約１７ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＯＰＣを含み得る。ＰＯＰＣの濃度は、当業者に公知の任意の適切な技術により決定することができる。特定の実施態様において、ＰＯＰＣの濃度は、高速液体クロマトグラフィーにより決定される。
【０１０１】
好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の薬学的に適切な製剤を作製するために十分な量のショ糖を含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約０.５％〜約２０％のショ糖を含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約３％〜約１２％のショ糖を含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約５％〜約７％のショ糖を含み得る。好ましい実施態様において、医薬製剤は、約６.０％〜約６.４％のショ糖を含み得る。最も好ましい実施態様において、医薬製剤は、６.２％のショ糖を含み得る。
【０１０２】
好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の薬学的に適切な製剤を作製するために十分な量のマンニトールを含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約０.０１％〜約５％のマンニトールを含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約０.１％〜約３％のマンニトールを含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約０.５％〜約２％のショ糖を含み得る。好ましい実施態様において、医薬製剤は、約０.８％〜約１％のマンニトールを含み得る。最も好ましい実施態様において、医薬製剤は、０.９％のマンニトールを含み得る。
【０１０３】
特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏまたはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の薬学的に適切な製剤を作製するために十分な量の緩衝剤を含み得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、リン酸緩衝剤を含み得る。特定の実施態様において、緩衝剤濃度は、約３ｍＭ〜約２５ｍＭであり得る。特定の実施態様において、緩衝剤濃度は、約５ｍＭ〜約２０ｍＭであり得る。好ましい実施態様において、緩衝剤濃度は、約８ｍＭ〜約１５ｍＭであり得る。特定の実施態様において、適切な緩衝剤は、被験体への投与に適切な範囲に医薬製剤のｐＨを調整するために添加される。特定の実施態様において、医薬製剤は、約６.８〜約７.８のｐＨを有し得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約７.０〜約７.８のｐＨを有し得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約７.２〜約７.５のｐＨを有し得る。好ましい実施態様において、医薬製剤は、約７.５のｐＨを有し得る。
【０１０４】
特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、被験体への投与に適切な重量オスモル濃度を有する。特定の実施態様において、製剤の重量オスモル濃度は、約２００〜約４００ｍＯｓｍであり得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約２２０〜約３８０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有し得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、約２６０ｍＯｓｍ〜約３４０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有し得る。好ましい実施態様において、医薬製剤は、約２８０ｍＯｓｍ〜約３２０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有し得る。最も好ましい実施態様において、医薬製剤は、約２９０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有し得る。
【０１０５】
本発明の製剤は、被験体への投与を許容するために十分な純度のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体を提供する。特定の実施態様において、医薬製剤は、約９８％もしくはそれ以上、約９６％もしくはそれ以上、約９５％もしくはそれ以上、約９３％もしくはそれ以上、約９１％もしくはそれ以上、または約９０％もしくはそれ以上の純度のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを含み得る。好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの純度は、約９０％またはそれ以上である。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの純度は、当業者に公知の任意の適切な技術により決定することができる。特定の実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの純度は、サイズ排除ＨＰＬＣにより決定することができる。
【０１０６】
本発明の製剤は、被験体への投与を許容するために十分な純度のＰＯＰＣのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体を提供する。特定の実施態様において、医薬製剤は、約９８％もしくはそれ以上、約９６％もしくはそれ以上、約９５％もしくはそれ以上、約９３％もしくはそれ以上、約９１％もしくはそれ以上、または約９０％もしくはそれ以上の純度のＰＯＰＣを含み得る。好ましい実施態様において、ＰＯＰＣの純度は、約９０％より高い。ＰＯＰＣの純度は、当業者に公知の任意の適切な技術により決定することができる。特定の実施態様において、ＰＯＰＣの純度は、ＨＰＬＣにより決定することができる。
【０１０７】
特定の好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体は、約１０％，もしくはそれ以下、約８％もしくはそれ以下、約６％もしくはそれ以下、約４％もしくはそれ以下、約２％もしくはそれ以下、約１％または鉄酸化／キシレノールオレンジアッセイ（Ｊｉａｎｇ，ら  １９９２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０２：３８４−３８９）により測定される場合の検出限界よりも低い脂質ヒドロペルオキシド量を有する。特定の実施態様において、アポＡ−ＩＭ：ＰＯＰＣ−複合体は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより決定された場合に８５％より高い（全ピーク面積の％として測定される）純度を有する。特定の実施態様において、製剤は、内毒素をほとんどまたは全く有さない。好ましい実施態様において、製剤は、＜０.０４ＥＵ／ｍｇアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの内毒素を有する。
【０１０８】
特定の実施態様において、製剤は、光遮蔽法により決定された場合に１０μｍより大きいサイズの粒子の量が５０ｍＬバイアルあたり＜約６,０００になり得る。特定の実施態様において、光遮蔽法により決定された場合に２５μｍより大きいサイズの粒子の量が５０ｍＬバイアルあたり＜約６００になり得る。
【０１０９】
好ましい実施態様において、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体の医薬製剤は、ｒアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを注射用水で１５ｍｇ／ｍｌの溶液の濃度まで希釈することにより作製される。リン酸ナトリウムを添加してリン酸塩の最終濃度を９〜１５ｍＭにし、そしてｐＨを約７.０と約７.８との間に調整する。マンニトールを、約０.８％〜約１％のマンニトールの濃度（ｗ／ｖ）を達成するように添加する。次いでＰＯＰＣを、１：０.９５（タンパク質重量／脂質重量）のアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏダイマー対ＰＯＰＣの比を達成するように添加される。混合物を、３７℃と４３℃との間の温度を維持しながら、５０００ｒｐｍにて約２０分間オーバーヘッドプロペラおよびＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘを使用して撹拌する。供給容器を、インライン熱交換機（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）を使用して３２℃〜４３℃の温度を維持しながら連続して３００ｒｐｍで連続して撹拌する。最初の３０分間の均質化を、５０ＭＰａ（７２５０ｐｓｉ）で行い、その後、ゲル浸透クロマトグラフィーによる製造過程検査がタンパク質標準間で約７０％より高い％ＡＵＣを実証するまで、圧力を８０〜１２０ＭＰａ（１１６００〜１７４００ｐｓｉ）に維持する。次いで複合体の重量オスモル濃度を、６.０％〜６.４％のショ糖を加えることによりだいたい調節する。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：ＰＯＰＣ複合体の医薬製剤を、次いで０.２２μＭフィルターを通す濾過により滅菌する。
【０１１０】
別の好ましい実施態様において、医薬製剤は、約１２〜約１８ｍｇ／ｍｌの組換えアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、約１１〜約１７ｍｇ／ｍｌの１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンをｐＨ７.４で、６.２％ショ糖および０.９％マンニトールと共に含み、約２８０ｍＯｓｍ〜約３２０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有する。医薬製剤は、約９０％の純度のｒアポＡ−Ｉ−Ｍ、約９７％の純度のＰＯＰＣを有し得る。特定の実施態様において、単一の不純物が約２％を超えることはない。
【０１１１】
医薬製剤を、凍結（約−１５℃〜約−２５℃）保存することができる。特定の実施態様において、製剤は、低温液剤、凍結液剤、または凍結乾燥液剤であり得る。このような製剤が、被験体への投与前に解凍されそして室温まで加温されることが好ましい。穏やかな解凍および加温が、タンパク質の変性を避けるために推奨される。
【０１１２】
別の好ましい実施態様において、製剤は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む医薬製剤を含有する、約２ｍＬ〜約２５０ｍＬ、好ましくは約１０ｍＬ〜約１００ｍＬ、最も好ましくは約５０ｍＬの滅菌ガラスバイアルであり得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、バイアルあたり約３９〜４１ｍｌの最終充填容量で約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬのアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含み得る。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体の量は、５０ｍＬバイアルあたり約５００ｍｇ〜７５０ｍｇであり得る。
【０１１３】
医薬製剤は、単一の一回限りの使用用であり得、または複数回使用（例えば、複数回使用バイアル）に適切である医薬製剤を提供する、上記のような抗菌補形薬を含有し得る。特定の実施態様において、医薬製剤は、使用単位包装であり得る。当業者に公知であるように、使用単位包装は、医療関連業者による直接販売用にラベルを付けられた、便利な規定サイズの患者用に準備された単位である。使用単位包装は、所定の適応について典型的な処置間隔および継続期間のために必要な量で医薬製剤を含有する。本発明の方法および製剤は、例えば、平均的なサイズの成人男性または女性を１５ｍｇ／ｋｇで週に１回５週間処置するために十分な量でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む医薬製剤の使用単位包装を提供する。一実施形態において、使用単位包装は、平均的なサイズの成人被験体を４５ｍｇ／ｋｇで週に１回６週間処置するために十分な量でアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：リン脂質複合体を含む医薬製剤を含み得る。本明細書中に記載される用量は、被験体の体重に基づくことは、当業者に明らかである。
【０１１４】
医薬製剤は、ラベルを付けられ得、そして心臓血管および血管障害、急性冠症候群、虚血性障害の処置および予防において、そしてプラークの安定化のために、その中に含有される製剤を同定するための添付の標示、ならびに医療関連業者および被験体に有用な他の情報を有し得、これらとしては、使用上の注意、用量、投与間隔、継続期間、適応、禁忌、警告、安全上の注意、取り扱いおよび保管の指示などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
さらなる実施態様において、本発明は、心臓血管および血管障害、急性冠症候群、虚血性障害を処置または予防するため、ならびにプラークの安定化のためのキットを提供する。キットは、１つまたはそれ以上の有効用量のアポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏもしくはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体またはその医薬製剤を、本発明の方法に従って急性冠症候群を処置または予防するためのアポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏもしくはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体またはその医薬製剤の使用に関する指示を含むラベルまたは標示と共に含む。特定の実施態様において、キットは、アポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏもしくはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体またはその医薬製剤を送達するためのデバイスおよびこれらのデバイスの安全な廃棄のための構成要素（例えば、シャープスコンテナー）のような、方法を実行するために有用な構成要素を含み得る。特定の実施態様において、キットは、プレフィルドシリンジ、単位用量または使用単位の包装入りのアポＡ−Ｉ  ＭｉｌａｎｏもしくはアポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ：脂質複合体またはその医薬製剤を含み得る。
【実施例】
【０１１６】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解されるであろう。
【０１１７】
実施例１：ＥＴＣ−２１６の忍容性
この実施例は、健常なボランティアにおいてＥＴＣ−２１６の安全性および忍容性を実証する。
二重盲検プラセボ対照試験を、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏおよびリン脂質の安全性および忍容性を決定するために行った。アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏを、１：１の重量比のリン脂質（ＰＯＰＣ）と複合体化した（ＥＴＣ−２１６と呼ぶ）。この試験は、健常男性ボランティアにおける段階的に増加する５用量の単一静脈内注入、および健常女性ボランティアにおける２つの異なる用量での安全性および忍容性を評価した。試験の前に全てのボランティアからインフォームドコンセントを得た。
【０１１８】
１８歳〜５０歳の間の年齢の３２人の健常ボランティア（「被験体」）に、ＥＴＣ−２１６の静脈内用量を投与した。男性被験体において、１００ｍｇ／ｋｇまでおよび１００ｍｇ／ｋｇを含む用量を投与した。女性被験体において、５０ｍｇ／ｋｇまでおよび５０ｍｇ／ｋｇを含む用量を投与した。被験体の性別、用量および速度を以下の表１に示す。
【表１】
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有害事象モニタリングには、臨床検査評価、身体診察およびバイタルサインが含まれた。被験体を２７日間以下の投与量でモニターした。
【０１１９】
この試験における３２人の被験体のうち２０人は、有害事象が報告され、これらの全てが、軽度から中等度であった。二人またはそれ以上の被験体において発生した有害事象を、試験薬物処置におそらく関連するとみなした。これらの有害事象およびこれらの有害事象を経験した被験体の数は、リンパ球減少（１１被験体）、白血球増加（１０被験体）、吐き気（６被験体）、頭痛および下痢（４被験体）、嘔吐（３被験体）ならびに腹痛およびトリグリセリド過剰血（２被験体）であった。おそらく関連する有害事象の大部分（胃腸障害および白血球障害）は、男性被験体における５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの注入後に報告された。プラセボ処置被験体において発生した２つの有害事象（低タンパク血および異常肝機能）は、試験処置におそらく関連するとみなした。死亡者も、重篤な有害事象も、有害事象による辞退も全くなかった。
【０１２０】
図１に示されるように、ＥＴＣ−２１６の単一用量の３０分後の男性被験体におけるＨＤＬ非エステル化コレステロールの血清レベルは、１５ｍｇ／ｋｇおよびより高い用量で増加した。
【０１２１】
アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏに対する抗体力価を、注入前および注入後２７日まで血清で試験した。単一用量投与後のいずれの被験体においても有意な抗体応答はなかった。
【０１２２】
約１００時間の終末半減期は、７日ごとの投与計画を用いるヒトにおける初期複数用量試験を行うための論理的根拠を支持する。
【０１２３】
これらの結果は、ＥＴＣ−２１６が、全ての用量において安全かつ十分に忍容性であり、そして重篤な有害事象が全く発生しなかったことを示す。
【０１２４】
実施例２：アテローム性動脈硬化症の後退におけるＥＴＣ−１６の種々の用量の有効性
この実施例は、急性冠症候群を伴う被験体における冠状動脈硬化症の後退における１５ｍｇ／ｋｇおよび４５ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６の用量の有効性を実証する。
この試験は、血管内超音波法により評価した場合に、急性冠症候群を伴う被験体においてＥＴＣ−２１６の有効性および安全性を評価するための、無作為二重盲検プラセボ対照複数用量試験であった。いずれの試験の特定の手順を開始する前に、全ての患者から、それぞれの参加施設のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により承認されたインフォームドコンセントを得た。
【０１２５】
適格被験体は、スクリーニングの１４日前以内に急性冠症候群（不安定狭心症、非Ｑ波心筋梗塞またはＳＴ上昇心筋梗塞）と診断された被験体、ならびに冠動脈造影および／または経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）を受けることを予定されており、そして術後２４時間の滞在が見込める被験体であった。この基準に合う被験体は、それらの処置が緊急であると考えられるか、かつ／または急性合併症の高い危険性を負っていると考えられると処置する医師により決定された場合には除外した。
【０１２６】
第一の有効性の終点は、血管内超音波法（ＩＶＵＳ）により評価された１つの対象の（画像化された）冠状動脈の３０〜８０ｍｍの部分における粉瘤体積パーセントの変化（処置の終了−処置前）であった。肯定的な結果は、０を含まない信頼区間（ＣＩ）を有する粉瘤体積パーセントの負の変化と規定した。
【０１２７】
第２の有効性の終点は、全粉瘤体積の平均変化および平均最大粉瘤厚さであった。第二の有効性終点をＩＶＵＳおよび血管造影について確立した。ＩＶＵＳについては、第二の有効性終点は：
１）対象の冠動脈の解剖学的に比較可能な部分の全スライスについてのプラーク面積の平均を測定した場合の全プラーク「体積」における名目上の変化（処置の終了−処置前）；
２）対象の冠動脈の解剖学的に比較可能な部分の全スライスについての平均最大プラーク厚さにおける名目上の変化（処置の終了−処置前）；
３）最も軽度の患部および最も重度の患部の「体積」：
ａ）最小パーセントプラーク領域（最も軽度の患部として規定される）を含むベースラインにおける１０ｍｍの連続したスライスについての部分プラーク「体積」における名目上の変化（処置の終了−処置前）；
ｂ）最大パーセントプラーク領域（最も重度の患部として規定される）を含むベースラインにおける１０ｍｍの連続したスライスについての部分プラーク「体積」における名目上の変化（処置の終了−処置前）
であった。
【０１２８】
血管造影についての第２の有効性終点は：
１）全ての測定された冠動脈部分内の平均冠動脈管腔直径；
２）各処置サブグループにおける新しい血管造影病巣の数；
３）処置の終了において１つまたはそれ以上の新しい血管造影冠動脈病巣を有する被験体の比率；
４）後退を示す既存の病巣を含む部位の数；
５）進行を示す既存の病巣を含む部位の数；
６）任意の既存の病巣における「後退」を示す被験体の割合；
７）全ての既存の病巣において「進行または変化無し」を示す被験体の割合；
８）全ての既存の病巣において「後退または変化無し」を示す被験体の割合
であった。
【０１２９】
ＩＶＵＳに関する方法は、Ｎｉｓｓｅｎ  ２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８７：１５Ａ−２０Ａ（全て参照により本明細書に加入される）により記載されるように解析した。簡単に述べると、オペレーターは、ＩＶＵＳビデオテープをデジタル化し、引き戻しを見直し、そして図２（Ａ）に示されるように、解析のための始点として最も遠位の側枝の基点を選択した。続いて、正確に０.５ｍｍ間隔を空けられた一連の断面を表す３０枚ずつの画像を解析のために選択した。最後に解析される断面は、図２（Ｂ）〜２（Ｄ）に示すように、左主冠動脈または右冠動脈入り口部（近位基準部位）の出現前の一続きの画像における最も近位の画像であった。同一の部分を両方の時点で解析したことを確実にするために、同一の目印を使用して、検証試験のために手順を繰り返した。
【０１３０】
指向性ＩＶＵＳ測定および派生的ＩＶＵＳ測定の両方を行った。直接ＩＶＵＳ測定を、米国心臓病学会および欧州心臓病学会の基準に従って行った（Ｍｉｎｔｚら  ２００１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３７：１４７８−９２，全て参照により本明細書に加入される）。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｍａｇｅ  １．６２（ＮＩＨパブリックドメインソフトウェア）を使用して、オペレーターは、スキャナーによりＩＶＵＳ画像に符号化された１ｍｍのグリッドマークを測定することにより較正手順を実行した。各断面について、管腔および外部弾性膜の境界の先端をなぞるために、オペレーターは手作業による面積測定を実行した（図３（Ａ）〜３（Ｄ））。最大粉瘤厚さもまた直接測定した。これらの方法の精度および再現性は、以前に報告されており、較正後、平均ＩＶＵＳ断面積測定値は、３.２４ｍｍ2〜２７.９９ｍｍ2の面積の範囲に及ぶ精密な穴をあけたルーサイト模型についての実際の寸法の０.５％以内であった（Ｓｃｈｏｅｎｈａｇｅｎら  ２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒ．１６：２７７−８４、全て参照により本明細書に加入される）。複数の観察者による測定の変動は、２.９％の標準偏差であることが実証された。
【０１３１】
派生的ＩＶＵＳ測定は、外部弾性膜（ＥＥＭ）面積−管腔面積としての粉瘤面積の計算を含んでいた。画像断面は、０.５ｍｍ間隔で得られたので、合計の粉瘤体積は、平均粉瘤面積に引き戻し長さ（ミリメートル）を掛けることによりＳｉｍｐｓｏｎ規則を使用して計算することができた。粉瘤体積パーセントを：（Σ 粉瘤面積／Σ ＥＥＭ面積）×１００（例えば、Ｎｉｓｓｅｎら，２００３，ＪＡＭＡ  ２９０：２２９２−２３００を参照のこと）として算出した。冠動脈造影の解析を、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの中心の研究室において測定変動を減少するように設計された標準化方法を使用して行った。既知の寸法を有する血管造影用カテーテルチップの直径の比較を、システムを較正するために使用した。血管造影終点は、ベースラインから追跡までの平均冠動脈管腔直径の変化であった。
【０１３２】
５７人の被験体を無作為に分けて、１５ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６、４５ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６または体積を一致させたプラセボを、７日ごとに（±１日）最大５回の静脈内用量で投与した。被験体を、１５ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６、４５ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６またはプラセボに２：２：１の比で無作為に分けた。４７人の被験体が試験を完了した。
【０１３３】
１５ｍｇ／ｋｇの用量を約５０分かけて静脈内に注入し、そして４５ｍｇ／ｋｇの用量を約１５０分かけて静脈内に注入した。吐き気の発生のために何人かの被験体については注入速度を増加させた。全ての静脈内注入は、末梢部に行われた。
【０１３４】
被験体を、ＥＴＣ−２１６についての抗体レベル、身体診察、バイタルサイン、心電図（ＥＫＧ）ならびに臨床的有害事象の頻度および強度を含む臨床検査パラメーターによりモニタリングした。血管造影およびＩＶＵＳを、各患者に対して２回行った。１回目は最初のスクリーニング訪問の完了後であり、そして二回目は、試験薬の最後の用量のおよそ２週間後（±７日）であった。
【０１３５】
以下の表２にまとめたように、肯定的な結果を第一の終点に関して得た。併用処置のグループ（１５ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量のＥＴＣ−２１６を投与された患者）において、平均（標準偏差またはＳＤ）粉瘤体積パーセントの変化は、−１.０６％（３.１７％）であった。中央値は−０.８１％であった（９５％ＣＩ、−１.５３％〜−０.３４％；ｐ＝０.０２、ベースラインと比較）。プラセボグループについては、平均（ＳＤ）変化は、０.１４％（３.０９％）であった。中央値は、０.０３％であった（９５％ＣＩ、−１.１１％〜１.４３％；ｐ−０.９７、ベースラインと比較）。
【０１３６】
【表２】
2007509157.tif 000004
【０１３７】
以下の表３に示すように、第２の終点に関しても肯定的な結果が得られた。ベースラインと比較して、併用処置グループにおける全粉瘤体積における平均（ＳＤ）変化は、−１４.１ｍｍ3であった（３９.５ｍｍ3；中央値  −１３.３ｍｍ3；９５％ＣＩ、−２０.７〜−７.２；ｐ＜０.００１）。プラセボグループについては、対応する変化は、−２.９ｍｍ3であった（２３.３ｍｍ3）。中央値は−０.２ｍｍ3（２３.３ｍｍ3）であった。中央値は、−０.２ｍｍ3；９５％ＣＩ、−８.６〜８.２；ｐ＝０.９７）であった。併用処置グループについての最大粉瘤厚さにおけるベースラインからの平均（ＳＤ）変化は、−０.０４２ｍｍ（０.０８０ｍｍ）であった。中央値は、−０.０３５ｍｍ（９５％ＣＩ、−０.０５８〜−０.０２０；ｐ＜０.００２）であった。プラセボグループについては、対応する変化は、−０.００８ｍｍ（０.０６１ｍｍ；中央値−０.００９（９５％ＣＩ、−０.０３５〜０.０２６；ｐ＝０.８３）であった。以下の表４を参照のこと。
【０１３８】
【表３】
2007509157.tif 000005
【０１３９】
【表４】
2007509157.tif 000006
【０１４０】
結果は、ＥＴＣ−２１６がプラークサイズの減少において有効であることを示した。アテローム性動脈硬化症の統計的に有意な後退が、両方の処置グループにおいて実証された。
【０１４１】
実施例３：エクスビボＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ
この実施例は、再潅流された分離した虚血性ウサギ心臓における予防的ＥＴＣ−２１６の心保護作用を実証する。体重約２〜３ｋｇの雄性ニュージーランド白色ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手）を試験で使用した。雄性ニュージーランド白色ウサギを、この試験の目的に適切な試験システムのとおりに選択した。分離した虚血性再潅流ウサギ心臓は、ヒト心筋梗塞のモデルである。到着した際に、動物に独特の同定番号を割り当てた。
【０１４２】
動物の使用および世話に関するミシガン大学委員会のガイドラインに従って、ステンレス鋼のケージで動物を飼育した。獣医による世話が、実験動物医療に関するミシガン大学の部署により提供された。ミシガン大学は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅによる適格審査に合格しており、動物の世話使用プログラムは、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，ＤＨＥＷ（ＮＩＨ）Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．８６−２３の基準に準拠している。
【０１４３】
ＥＴＣ−２１６は、１：１の重量比の組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ／１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン複合体である。ＥＴＣ−２１６のストック溶液は、１４ｍｇのタンパク質／ｍｌをショ糖−マンニトール緩衝液中に含んでいた。ショ糖−マンニトール緩衝液は、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液と非相容性であり、そしてマンニトール単独の任意の独立した効果を制御するために、ＥＴＣ−２１６を透析して４ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.４）中２％のグルコースからなるバックグラウンド緩衝液を得た。ＥＴＣ−２１６をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で希釈して、０.４５ｍｇ／ｍｌの薬物濃度を得た。賦形剤を同様に希釈した。
【０１４４】
用量選択は、ＥｓｐｅｒｉｏｎのヒトフェーズＩ単一用量安全性臨床試験において使用された用量についての歴史的なデータに基づいており、この場合、１００ｍｇ／ｋｇまでのＥＴＣ−２１６の用量がヒトに投与された。このプロトコルでまとめられた試験については、０.５ｍｇ／ｍｌの濃度が、ヒトに投与された２５ｍｇ／ｋｇの静脈内用量にほぼ相当する。
【０１４５】
ウサギ心臓を潅流するためにＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置を使用して実験を行った。ウサギを頸椎脱臼により意識消失にし、そして心臓を迅速に取り出し、そして大動脈を通した潅流のためのカニューレに取り付けた。潅流媒体は、循環Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（ｐＨ７.４，３７℃；「ＫＨ」）からなり、これを連続的に９５％  Ｏ2／５％  ＣＯ2の混合物にさらし、そして２０〜２５ｍｌ／分の一定速度で送達した。心臓を、右心房に取り付けられた電極によりプロトコルの間中ペースを整えた。ペースを整える刺激を、研究用方形波発生器（生理学的なペースよりも１０％速い、１ｍｓｅｃの持続期間、Ｇｒａｓｓ  ５８８，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）から送った。冠状静脈洞への冠静脈還流示す肺動脈流出物の収集を容易にするために、肺動脈にＳｉｌａｓｔｉｃＴＭ管状部材を用いてカニューレ挿入した。上下の大静脈および肺静脈を、他の切断された血管からの灌水の損失を防ぐために結紮した。左心室排液管、サーミスタプローブ、およびラテックスバルーンを、左心房を介して挿入し、そして左心室に位置づけした。流体充填ラテックスバルーンを、左心室が生じる圧力の測定を可能にするためにＭｉｌｌｅｒカテーテル圧力変換器に硬性管状部材を用いて接続した。心室内バルーンを蒸留水を用いて膨張させて、約１０ｍｍＨｇの初期ベースライン左心室拡張終期圧を達成させた。冠動脈潅流圧を、大動脈カニューレの側方アームに接続された圧力変換器を用いて測定した。冠動脈潅流の速度は一定に維持されたので、冠動脈潅流圧における変化は、冠動脈の抵抗性における変化の指標として役立った。全ての血流力学的変数を、Ｐｏｌｙｖｉｅｗ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍとインターフェースで接続したＧｒａｓｓ  Ｐｏｌｙｇｒａｐｈ  ７９Ｄ（Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）のようなマルチチャンネルレコーダーを連続的に使用してモニタリングした。心臓を温度調節した二重管腔ガラスチャンバで囲み、そして潅流媒体を熱源および送達系に通すことにより、実験期間の間中、心臓を３７℃に維持した。
【０１４６】
２つの処置グループを、以下に示されるような実験手順のために使用した。
グループ       処置        試験物質  濃度（ｍｇ／ｍｌ）
１      虚血および再潅流      賦形剤                  ０
２      虚血および再潅流      ＥＴＣ−２１６          ０.４５
【０１４７】
虚血および再潅流
心臓を、図５に示されるように実験的に処置した。分離した心臓を、全体虚血の誘導の前２０分間、正常酸素圧（酸素の正常レベル）条件下で安定化した。この期間の最初の１０分間の間、心臓をＫＨ緩衝液のみにさらし、次いでさらに１０分間、賦形剤（グループ１）またはＥＴＣ−２１６（グループ２）のいずれかを含有するＫＨ緩衝液にさらした。次いで心臓を、３０分間の虚血、続いて賦形剤（グループ１）またはＥＴＣ−２１６（グループ２）を含有するＫＨ緩衝液を用いた６０分間の再潅流を受けさせた。心臓への灌水の流れを停止することにより全ての全体虚血の誘導を達成し、そしてポンプを作動して元の流量を回復させることにより心臓の再潅流を達成した。
【０１４８】
肺動脈流出物のアリコートを、全てのグループにおいてベースライン（虚血前）、そして初期の５分まで毎分、およびその後再潅流期間の間５分ごとに心臓から収集した。流出物を、クレアチンキナーゼ濃度（組織損傷の指標）について分析した（図６）。クレアチンキナーゼは、不可逆的に傷ついた細胞から放出される細胞質内酵素である。心機能を連続的にモニタリングした（図７）。心臓終点決定を以下に関して行った：
１−心電図−心拍（ペース調整）  不整脈の有無を検出するため；
２−左心室が生じる圧力（図８）（各グループにおける示された心臓の数についての平均±平均の標準誤差としてデータを示す）；
３−左心室のｄＰ／ｄｔ
４−左心室拡張終期圧（図９）（各グループにおける示された心臓の数についての平均±平均の標準誤差としてデータを示す）；
５−冠動脈潅流圧（図１０）（各グループにおける示された心臓の数についての平均±平均の標準誤差としてデータを示す）；
６−再潅流の前後における組織クレアチンキナーゼの放出を決定するためのリンパ排液の収集（図６）
【０１４９】
実験プロトコルの終わりに、各処置グループから５つまでの心臓生検材料を、即座に液体窒素に浸漬し、そして−８０℃で続く脂質ヒドロペルオキシド分析のために保存した。ホモジェネートサンプルを、脂質過酸化物に関するアッセイを行う前にタンパク質含量に対して正規化した（図１１）。ＥＴＣ−２１６は、この実施例において心臓脂質ヒドロペルオキシドを４６％減少させた。
【０１５０】
指定されたプロトコルの終わりに、各グループからの２つの心臓を、３分間０.１Ｍカコジル酸（ｃａｌｃｏｄｙｌａｔｅ）ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.４）中の２.５％グルタルアルデヒドおよび１％ＬａＣｌ3で潅流した。通常条件下で好濃ＬａＣｌ3は、血管壁に結合した血管区画に保持され、そして血管完全性の指標として役立つ。脈管外隙へのＬａＣｌ3の管外遊出を、血管傷害の存在の指標として使用した。左心室心筋からの組織サンプルを取り出し、一辺が約１ｍｍある断片に切り取った。サンプルをさらに２時間４℃にて上述の緩衝液中で固定した。その後、サンプルをエタノール系で脱水し、そしてＥＭ  ｂｅｄ−８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）中に包埋した。組織ブロックをＲｅｉｃｈｅｒｔ超ミクロトームで切断し、そしてホルムバールをコーティングした銅グリッド上に配置し、続いて４％酢酸ウラニルで染色した。切片をＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ−１０電子顕微鏡で観察した。
【０１５１】
透過電子顕微鏡法を使用して、試験グループのそれぞれからの心筋標本を調べた。画像は、賦形剤で処置した心臓の筋節の構造的特徴が消え、そして収縮帯が存在することを示す。ミトコンドリアは、崩壊した結晶様および好濃の封入体で顕著に膨張している。ＥＴＣ−２１６で処置した心臓において、筋節構造は、比較的正常であり、そしてミトコンドリアは、最小限の膨張があるだけで変化していないように見える。収縮帯が実質的に存在しないことは、コントロール心臓において観察される収縮帯と著しく対照的である。収縮帯壊死を防ぐＥＴＣ−２１６の能力は、ＥＴＣ−２１６で前処置された心臓が再潅流の際にＬＶＥＤＰの増加を示さなかったという所見と一致している。収縮帯壊死およびＬＶＥＤＰの持続した増加の両方が、細胞内カルシウム過負荷の増加および不可逆性細胞損傷と関連している。Ｚ帯の筋原線維のかすみの存在、および筋原線維構造の崩壊は、多大な損害の指標である。他に予測される形態的損傷には、ミトコンドリアの崩壊したクリステおよびマトリックス、さらにミトコンドリア中の大きな電子密度の高い構造体が含まれた。倍率係数は、両方の顕微鏡写真（図１２）において７９００×であった。
【０１５２】
クレアチンキナーゼ濃度の分析（図６）は、静脈流出物への酵素放出の急速期が、再潅流の時点で起こることを示していた。コントロール心臓（賦形剤で処置された）は、ＥＴＣ−２１６で処置した心臓と比較してクレアチンキナーゼの顕著な放出を示した。さらに、ＥＴＣ−２１６で処置した心臓は、左心室の減少した拡張終期圧（図７および９）、上昇した左心室発生圧（図８）、減少した冠動脈潅流圧（図１０）およびコントロール心臓（図１１）と比較して減少した脂質ヒドロペルオキシド（ＬＨＰ）を示した。さらに、ＥＴＣ−２１６は、心筋における形態変化に対して保護した（図１２）。これらの結果は、虚血性事象の前に投与された場合のＥＴＣ−２１６の心保護作用を実証する。
【０１５３】
実施例４：ＬＡＤ閉塞再潅流ウサギ心臓における１００ｍｇ／ｋｇでの急性および慢性投与
この実施例は、局所心筋虚血および再潅流のインビボモデルにおけるＥＴＣ−２１６の心保護作用を実証する。雄性ニュージーランド白色ウサギを、この試験の目的に適切な試験システムのとおりに選択した。心臓への側副血液供給がないので、心筋血流測定を使用する必要がない。この試験において、種々の用量の投与計画を、別々のウサギグループに使用し、これらは、冠動脈結紮による３０分の局所心筋虚血および再潅流を受けた。２つの投与計画を使用した。第一のプロトコルにおいて、局所虚血の開始直前に心臓を１００ｍｇ／ｋｇの薬剤にさらす単一の前処置としてＥＴＣ−２１６を試験し、一方第２のプロトコルにおいて、局所虚血の開始前に２回の１００ｍｇ／ｋｇの前処置（１日前および直前）を施した。これらのプロトコルを（図１３）に示す。この試験は、ウサギ心臓を３０分の期間の間、局所心筋虚血の状態にし、続いて最小４時間再潅流するインビボ試験における心保護剤としてのＥＴＣ−２１６の効果に注目した。この実施例は、ＥＴＣ−２１６が、虚血性事象の後に与えられた場合心保護剤であることを実証する。
【０１５４】
この試験において使用された手順は、動物の使用および世話に関するミシガン大学委員会のガイドラインに従っている。獣医による世話が、実験動物医療に関するミシガン大学の部署により提供された。ミシガン大学は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅによる適格審査に合格しており、動物の世話使用プログラムは、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，ＤＨＥＷ（ＮＩＨ）Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．８６−２３の基準に準拠している。
【０１５５】
体重約２〜３ｋｇの雄性ニュージーランド白色ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手）を試験で使用した。到着した際に、動物に独特の同定番号を割り当てた。ウサギを、キシラジン（３.０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を筋肉注射し、続いてペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を用いて麻酔した。ペントバルビタール（３０ｍｇ／ｍｌ）の静脈注射を用いて麻酔を維持した。カフ付きの気管内チューブを挿入し、そして動物を大気での陽圧換気下に置いた。右頸静脈を分離し、そしてＥＴＣ−２１６または一致した体積の賦形剤の投与のためにカニューレ挿入した。右頸動脈を分離し、そして大動脈血圧をモニタリングするため、および圧力パルスの導き出された一次導関数（ｄＰ／ｄｔ）を得るために、大動脈弁の直ぐ上に位置づけてＭｉｌｌａｒＴＭカテーテルマイクロチップ圧力変換器を取り付けた。誘導ＩＩ心電図を実験の間中モニタリングした。左の開胸術および心膜切開術を行い、続いて左前下行枝（ＬＡＤ）冠動脈の同定を行った。絹縫合糸（３.０；Ｄｅｋｎａｔｅｌ，Ｆａｌｌ  Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）を動脈の後ろに通し、そして縫合糸の両端を短い長さのポリエチレン管状部材に挿入した。縫合糸の自由端に対して上向きの張力をかける間のポリエチレンチューブ上の下方の圧力は、下にある冠動脈を圧縮し、結果として血管の閉塞および局所心筋虚血を生じる。閉塞を３０分間維持し、その後縫合糸に対する張力を緩めてポリエチレン管状部材を引き抜き、再潅流を起こさせた。局所心筋虚血を、閉塞した血管の分布領域にある部分の存在、および貫壁性局所心筋虚血の存在と一致する心電図における変化（ＳＴ上昇）により検証した。
【０１５６】
主要な終点決定は、左心室のパーセントとしておよび危険性領域のパーセントとしての梗塞サイズの測定から成っていた（図１４および図１５）。試験の終わりに、麻酔をしながらウサギにヘパリンを投与し（１,０００Ｕ  静脈内）、その後それらを安楽死させた。心臓を切除し、次いでＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置でＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液を用いて２２〜２４ｍｌ／分の一定流量で大動脈を介して潅流する準備をした。組織が清浄であることを保証するために心臓を緩衝液で１０分間洗浄した。リン酸塩緩衝液（ｐＨ７.４）中のトリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）の１％溶液４５ミリリットルを、心臓を通して潅流した。ＴＴＣは、赤レンガ色を有する危険性領域内の非梗塞心筋を区別し、生存心筋組織に存在している補酵素によるＴＴＣの還元から生じるホルマザン沈殿物の存在を示す。細胞質デヒドロゲナーゼを欠いている、不可逆的に損傷した組織は、ホルマザン沈殿物を形成し得ず、そして淡黄色に見える。左前下行枝（ＬＡＤ）動脈を、局所心筋虚血の誘導の間に結紮した領域と同一の位置で結紮した。潅流ポンプを停止し、そしてＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅの０.２５％溶液２ｍｌをゆっくりと大動脈カニューレに接続された側枝ポートを通して注入した。色素が心臓を１０秒間で通過し、色素の同等な分布を確認した。Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅの存在を使用して、危険性領域とは対照的に、局所虚血を受けていない左心室組織を区別した。心臓を潅流装置から取り外し、そして縦軸に対して直角な横断面に切断した。右心室、心尖、および心房組織を廃棄した。各横断面の両面を、透明のアセテートシートに透写した。画像を複写して拡大した。コピーをスキャンしてＡｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）にダウンロードした。正常左心室（ＮＬＶ）非危険性領域、危険性領域、および梗塞の面積を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏ  Ｓｈｏｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して各領域が占める画素の数を計算することにより決定した。危険性領域の合計を、左心室のパーセントとして表す。梗塞サイズを危険性領域（ＡＲＲ）のパーセントとして表す（図１４および図１５）。
【０１５７】
ＥＴＣ−２１６（１００ｍｇ／ｋｇ）または等体積の賦形剤で、１回処置された（すなわち、急性処置）ウサギまたは２回処置された（すなわち、慢性処置）ウサギにおける危険性領域の梗塞パーセント、左心室の梗塞パーセント、および左心室の危険性領域パーセント。データは、グループあたりｎ＝６の動物についての平均±平均の標準誤差である。図１４におけるアスタリスクは、それぞれのコントロールとの有意な差を示す。
【０１５８】
他の終点決定を行った。最終的な梗塞サイズは、心筋酸素利用の増加または減少により影響され得る。心筋酸素補償の２つの重要な決定要因は、心拍および圧力負荷である。速度圧力積（心拍×平均動脈圧）は、心臓による心筋酸素必要量の変化の近似を提供する。従って、梗塞サイズの観察された減少が、速度圧力積の変化と相関していたかどうかを決定するために、速度圧力積を計算した。心拍および平均大動脈圧を、実験プロトコルの間連続的にモニタリングし、そしてデータを、各実験グループについての試験の特定の時点での速度圧力積を計算するために使用した。
【０１５９】
左心室の危険性領域パーセントは、急性および慢性投与の両方について、コントロールと比較してＥＴＣ−２１６で処置した心臓において減少したが、結果は、統計学的に有意ではなかった。危険性領域の梗塞パーセントおよび左心室の梗塞パーセントは、急性および慢性投与の両方について、コントロールと比較してＥＴＣ−２１６で処置した心臓において有意に減少した。これらの結果は、急性投与および慢性投与の両方の場合にＥＴＣ−２１６が心保護性であることを示す。
【０１６０】
危険性領域および非危険性領域の心筋組織のクレアチンキナーゼ活性を比較することができる。アッセイの原理は、ＮＡＤＨへのＮＡＤの等モル還元の結果として３４０ｎｍにおける反応混合物の吸光度の増加を基にした。吸光度の変化率は、クレアチンキナーゼ活性に直接比例する。１単位は、アッセイ手順の条件下で１分あたり１マイクロモルのＮＡＤＰＨを生成する酵素の量として定義される。
【０１６１】
再潅流無しに長期の血流妨害（虚血）を受けた心筋組織は、炎症性細胞の存在に沿った壊死に特徴的な形態変化を受ける。虚血誘導細胞死の形態学的外観は、再潅流の結果として発生する外観とは異なる。後者は、収縮帯を特徴とし、そして収縮帯壊死と呼ばれる。各グループからの心臓組織を保存し、そして電子顕微鏡による検査のために準備をした。
【０１６２】
虚血性再潅流傷害は、危険性領域における炎症性細胞（大部分は好中球）の蓄積と関係がある。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、ほとんど好中球にのみ存在する酵素である（Ｌｉｕら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８７：５２７−５３７，１９９８）。従って、心臓のそれぞれの領域からの組織を、傷害の指標としてＭＰＯ活性についてアッセイすることができると予測される。炎症性応答を低減し得る介入が、処置されていない動物の危険性領域からの心臓組織と比較した場合に、再潅流した危険性領域におけるＭＰＯ活性の減少と関連することもまた予測される。それ故、ＭＰＯ活性の変化パーセント（危険性領域／非危険性領域）は、コントロールの賦形剤で処置した心臓と比較して、薬物で処置された心臓において減少するであろう。
【０１６３】
実験の終わりに、組織ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を、予備的な無制御の未検証のアッセイで決定した。心臓組織サンプルを、危険性領域および非危険性領域から得て、０.５％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド中で均質化し、そして５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）に溶解した（Ｌｉｕら，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８７：５２７−５３７も参照のこと）。ホモジェネートを１２,５００ｇで４℃にて３０分間遠心分離した。上清を収集し、そして０.１６７ｍｇ／ｍｌのｏ−ジアニシジン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）および５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）中の０.０００５パーセントＨ2Ｏ2と反応させた。吸光度の変化を分光光度法で４６０ｎｍにて測定した。１単位のＭＰＯを、２５℃で１ｍｍｏｌのＨ2Ｏ2／分を加水分解する酵素の量として定義した。この予備的実験からの結果（本明細書には示していない）は、ＥＴＣ−２１６で処置された心臓と賦形剤で処置された心臓との間で虚血性再潅流傷害に関しては全く差がないことを示しているように思えるが、これらの結果はまだ、例えば、虚血性再潅流傷害前のＭＰＯレベルの比較により検証されていない。
【０１６４】
危険性領域の梗塞パーセントおよび左心室の梗塞パーセントの減少により実証されるように、ＥＴＣ−２１６で処置された心臓は、虚血性再潅流傷害から保護された。心保護は、両方の投与プロトコル、すなわち、虚血の開始前に単一の１００ｍｇ／ｋｇの用量として投与されるＥＴＣ−２１６または２回の１００ｍｇ／ｋｇの用量（１回の用量は虚血の１日前に与えられ、そして２回目の用量は虚血の直前に与えられる）で投与されるＥＴＣ−２１６、により与えられる。
【０１６５】
実施例５：ＬＡＤ閉塞再潅流ウサギ心臓における急性投与についての最小有効用量の決定
この実施例は、局所虚血の開始直前の単一前処置として投与された場合の種々の用量のＥＴＣ−２１６の予防的有効性を実証する。実施例２における試験は、インビボ試験における心保護剤としてのＥＴＣ−２１６の効果に注目し、この試験ではウサギ心臓を３０分の間局所心筋虚血状態にし、続いて最小４時間の再潅流をした。２つの投与計画を使用した。第一のプロトコルでは、ＥＴＣ−２１６を単一の前処置として試験し、ここでは全身循環を局所虚血の直前に１００ｍｇ／ｋｇの薬剤にさらしたが、一方第二のプロトコルでは、２回の１００ｍｇ／ｋｇの前処置を局所虚血の開始前（一日前および直前）に投与した。両方のレジメンは、１００ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６を用いる１回または２回の処置のいずれもが心保護性であることを示した。
【０１６６】
従って、ＥＴＣ−２１６を、心保護に対する効果を決定するために単一の前処置として試験し、ここでは心臓を単一用量の薬剤または等体積の賦形剤に局所虚血の直前にさらした。心臓を実施例２で使用した方法と同じ方法により解析した。さらに、このプロトコルを、虚血からの保護のためにウサギ心臓を処置するためのＥＴＣ−２１６の最小有効用量を見つけるためにデザインした。
【０１６７】
ＥＴＣ−２１６の最小有効用量を見つけるために、急性処置についての同じプロトコル（図１３を参照のこと）を使用した。ここでは、図１６に示されるように、動物に１０、３もしくは１ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６または等体積の賦形剤のいずれかの単一処置を施した。１０ｍｇ／ｋｇの処置のグループについての全左心室のパーセントとして表される危険性領域（ＡＡＲ）または虚血性領域は、コントロールグループおよび処置グループで同様であった（図１７）。１０ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６で処置されたウサギは、賦形剤で処置されたウサギと比較して、ＡＡＲのパーセントとして表されるより小さい梗塞（ｐ＜０.０００５）を発生した（図１８）。心筋梗塞サイズの減少（ｐ＜０.０００１）もまた、データを全左心室のパーセントとして表した場合に見られた（図１７）。
【０１６８】
３ｍｇ／ｋｇの用量を用いて同様の結果が得られた。全左心室のパーセントとして表されたＡＡＲは、ＥＴＣ−２１６で処置されたグループおよび賦形剤で処置されたグループにおいて同様であった（図１７）。３ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６で処置されたウサギは、賦形剤で処置されたウサギと比較して、危険性領域のパーセントとして表されたより小さな梗塞を発生した（ｐ＜０.０５）（図１７）。心筋梗塞サイズの減少（ｐ＜０.０５）は、データを全左心室のパーセントとして表した場合に観察された（図１７）。
【０１６９】
１ｍｇ／ｋｇの用量を用いると、左心室のパーセントとして表された場合のＡＡＲのサイズにおいてＥＴＣ−２１６と賦形剤との間には有意な差は示されなかった（図１７）。１ｍｇ／ｋｇでは、ＡＡＲのパーセントとしてのグループ間（図１７）、および全左心室のパーセントとして表された心筋梗塞サイズ（図１７）におけるグループ間で有意な差は示されなかった。
【０１７０】
４つの急性処置グループ（すなわち、１００、１０、３および１ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれおよびそれらのそれぞれのコントロールからのデータのまとめを図１７に示す。梗塞のＡＡＲは、４つのグループのそれぞれにおいて同様であった。４つの投与計画のうち、危険性領域のパーセントまたは左心室のパーセントのいずれで表されても、それぞれのコントロールと比較すると、梗塞サイズは、１００、１０および３ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６の用量で減少した。対照的に、１ｍｇ／ｋｇを与えられた動物のグループにおける梗塞サイズは、それぞれの賦形剤で処置されたグループにおいて観察された梗塞サイズと差がなかった。
【０１７１】
図１８は、リポタンパク質非エステル化コレステロールにおける一時的変化の例を示す。血液サンプルを、１、３、１０もしくは１００ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６または賦形剤の投与の直前および投与後定期的にウサギから得た。それぞれの一時的な血清サンプルにおいて得られた非エステル化コレステロールプロファイルを示し、ここで血清リポタンパク質を、オンライン非エステル化コレステロール分析を伴うゲル濾過クロマトグラフィーによりサイズに基づいて分離した。静脈内に投与されたＥＴＣ−２１６試験薬剤中に非エステル化コレステロールが実質的に存在しないのにもかかわらず、特に１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより低い程度で１０ｍｇ／ｋｇにおいて、ＥＴＣ−２１６の投与後４５分で高密度コレステロール非エステル化コレステロールが上昇したことに注目のこと。１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのいずれかのＥＴＣ−２１６の投与後２１０分および２７０分における超低密度リポタンパク質非エステル化コレステロールの遅れた顕著な上昇にも注目のこと。リポタンパク質非エステル化コレステロールの変化は、評価した時点において３ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６処置用量では明らかではなかったことにも留意のこと。しかし、この用量は、図１７に示されるように心保護性であった。
【０１７２】
結果は、１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの用量が、ＥＴＣ−２１６の有効な予防的用量であることを実証する。
【０１７３】
実施例６：ＥＴＣ−２１６は、閉塞した再潅流ウサギ心臓におけるＬＡＤ閉塞の開始後に投与された場合、虚血−再潅流傷害を防止する
この実施例は、虚血性事象または閉塞事象後に投与された場合に、虚血性再潅流傷害を予防または低減する際のＥＴＣ−２１６の有効性を実証する。実施例２および３における試験は、虚血の開始前に心筋を処置する予防的利点を明らかにする。従って、ＥＴＣ−２１６が虚血の開始後に心筋を保護し得るかどうかを決定するために、ＬＡＤを試験薬剤または賦形剤の投与の前に閉塞させた。このプロトコルにおいて、ＥＴＣ−２１６を、単一の処置として試験し、ここでは、局所虚血の最後５分間の間に投与され、そして再潅流の最初の５５分をとおして続けられる、１０ｍｇ／ｋｇの薬剤または等体積の賦形剤に心臓をさらした（図１９）。１０ｍｇ／ｋｇの処置グループについての全左心室のパーセントとして表されるＡＡＲまたは虚血性領域は、コントロールグループと同様であった（図２０）。ＥＴＣ−２１６で処置されたウサギは、賦形剤で処置されたウサギと比較して、ＡＡＲのパーセントとして表されるより小さな梗塞（ｐ＜０.００１）を発生した（図２０）。心筋梗塞サイズの減少（ｐ＜０.０００５）もまた、データが全左心室のパーセントとして表される場合に観察された（図２０）。
【０１７４】
この実施例は、虚血性事象の後に施された単一処置が、虚血性再潅流傷害を緩和または減少させたことを実証する。
【０１７５】
本発明の種々の実施態様が記載されている。説明および実施例は、本発明の例示であり限定ではないことが意図される。実際に、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、変更が本発明の種々の実施態様に対してなされ得ることは、当業者にあきらかである。
【０１７６】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、全て参照により本明細書に加入される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】正常雄性被験体における血清ＨＤＬに対するＥＴＣ−２１６の単一用量の急性効果を示す。
【図２】２Ａは、遠位基準枝（部位Ｃ）で始まって近位枝（部位Ａ）で終わる、ＩＶＵＳ画像化カテーテルの電動式引き戻しを示す。カテーテルの経路を、血管造影図に図示する；２Ｂは、近位枝に達するまで０.５ｍｍごとに得られた血管の代表的な断面を示す；２Ｃは、血管の中間断面を示す；２Ｄは、ＩＶＵＳ画像における遠位枝を示す。
【図３】３Ａは、解析のための断面を示す；３Ｂは、外部弾性膜（ＥＥＭ）を示す；３Ｃは、管腔領域を示す；３Ｄは、ＥＥＭの面積から管腔の断面積を引くことにより測定された最大粉瘤厚さの計算を示す。
【図４】４Ａは、ＥＴＣ−２１６を与える前の患者における血管のベースライン画像を示す；そして４Ｂは、ＥＴＣ−２１６を与えられた後の患者における血管の追跡画像を示す。管腔面積は実質的に変化することなく、粉瘤面積が８.１から５.３５ｍｍ3に減少した。
【図５】プロトコルの例であり、ここでは分離したウサギ心臓を、虚血の開始前に賦形剤または本発明のタンパク質／脂質複合体（ＥＴＣ−２１６）で処置した。
【図６】冠状静脈流出物におけるクレアチンキナーゼ活性を示す。
【図７】Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置における賦形剤で処置された分離ウサギ心臓およびＥＴＣ−２１６で処置された分離ウサギ心臓から収集した心機能の実時間モニタリングを示す。
【図８】３０分の全体虚血性停止および６０分の再潅流の前、間、および後の分離ウサギ心臓における左心室発生圧力（ＬＶＤＰ）の一時的な変化を示す。
【図９】３０分の全体虚血性停止および６０分の再潅流の前、間、および後の分離ウサギ心臓における左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）の一時的な変化を示す。
【図１０】３０分の全体虚血性停止および６０分の再潅流の前、間、および後の分離ウサギ心臓における冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）の一時的な変化を示す。
【図１１】３０分間の全体虚血性停止、続いて６０分再潅流させた、賦形剤で処置したウサギ心臓およびＥＴＣ−２１６で処置したウサギ心臓からの組織ホモジェネートにおける脂質ヒドロペルオキシド含量を示す。
【図１２】賦形剤で処置されたウサギ心臓およびＥＴＣ−２１６で処置されたウサギ心臓からの心筋サンプルの電子顕微鏡画像を示す。
【図１３】本発明のさらなるプロトコルを示し、ここでは急性投与グループにおいて虚血の開始前に１回の前処置を施し、そして慢性投与グループにおいて虚血の開始前に２回の前処置を施した。
【図１４】梗塞のサイズを決定するためのプロトコルを示す。
【図１５】ＥＴＣ−２１６（１００ｍｇ／ｋｇ）で１回処置（すなわち、急性処置）もしくは２回処置された（すなわち、慢性処置）か、または等容量の賦形剤で処置されたウサギにおける危険性領域の梗塞パーセント、左心室の梗塞パーセント、および左心室の危険性領域のパーセントを示す。
【図１６】本発明のさらなるプロトコルを示し、ここではウサギを虚血の開始前に賦形剤（グループ１）または１０、３もしくは１ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６（グループ２）のいずれかで前処置した。
【図１７】各グループについて１０、３もしくは１ｍｇ／ｋｇのＥＴＣ−２１６で１回処置された（すなわち、急性処置）か、または等容量のショ糖−マンニトール賦形剤で処置されたウサギにおいて決定された危険性領域の梗塞パーセント、左心室の梗塞パーセント、および左心室の危険性領域パーセントを示す。
【図１８】リポタンパク質非エステル化コレステロールの一時的な変化を示す。
【図１９】本発明のさらなるプロトコルを示し、ここでは３０分の虚血性期間の最後の５分間に賦形剤、ＥＴＣ−２１６の単一処置を施した。
【図２０】ウサギにおいて決定された危険性領域の梗塞パーセント、左心室の梗塞パーセント、および左心室の危険性領域パーセントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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