(57)【要約】ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの高度に精製された調製物は、一般に以下の工程を含む方法を用いて調製され得る：（１）Ｅ．ｃｏｌｉ内でのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの発現、（２）屈折体の単離、（３）屈折体の溶解、および発現したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのリフォールディング、（４）ＳＰ−セファロース高流速（ＦＦ）クロマトグラフィー、（５）一次濃縮工程およびダイアフィルトレーション工程、（６）Ｑ−セファロース高速（ＨＰ）クロマトグラフィー、（７）ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、（８）ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー、ならびに（９）二次濃縮工程／ダイアフィルトレーション工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を含む、精製された調製物であって、ここで、該ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満が改変された化学種であり、ここで該改変された化学種が以下：
逆相クロマトグラフィーで検出されるような、酸化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
陽イオン交換クロマトグラフィーで検出されるような、カルバミル化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出されるような、脱アミド化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
アミノ酸解析で決定されるような、システイン付加物を含むＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
サイズ排除クロマトグラフィーで検出されるような、凝集したＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；および
非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されるような、誤ってフォールディングされたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子
のうちの１種以上を含む、精製された調製物。
【請求項２】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約９％未満が酸化されている、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項３】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満がカルバミル化されている、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項４】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約９％未満が脱アミド化されている、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項５】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約２％未満がシステイン付加物を含む、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項６】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満が凝集している、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項７】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満が誤ってフォールディングされている、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項８】
前記多数のＴＦＰＩ分子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項９】
前記ＴＦＰＩアナログ分子が、ａｌａ−ＴＦＰＩ分子である、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項１０】
多量のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を含む薬学的処方物であって、ここで、該ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満が改変された化学種であり、ここで、該改変された化学種が以下：
逆相クロマトグラフィーで検出されるような、酸化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
陽イオン交換クロマトグラフィーで検出されるような、カルバミル化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出されるような、脱アミド化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
アミノ酸解析で決定されるような、システイン付加物を含むＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；
サイズ排除クロマトグラフィーで検出されるような、凝集したＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；および
非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されるような、誤ってフォールディングされたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子
のうちの１種以上を含む、薬学的処方物。
【請求項１１】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満が酸化されている、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１２】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満がカルバミル化されている、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１３】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約９％未満が脱アミド化されている、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１４】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満がシステイン付加物を含む、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１５】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満が凝集している、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１６】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満が誤ってフォールディングされている、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１７】
前記多数のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子のメンバーが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＴＦＰＩ分子である、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１８】
前記多数のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子のメンバーが、ａｌａ−ＴＦＰＩ分子である、請求項１０に記載の薬学的処方物。
【請求項１９】
以下を含む薬学的処方物であって：
多数のａｌａ−ＴＦＰＩ分子であって、ここで、該ａｌａ−ＴＦＰＩ分子の約１２％未満が改変された化学種であり、ここで、該改変された化学種が以下：
逆相クロマトグラフィーで検出されるような、酸化されたａｌａ−ＴＦＰＩ分子；
陽イオン交換クロマトグラフィーで検出されるような、カルバミル化されたａｌａ−ＴＦＰＩ分子；
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出されるような、脱アミド化されたａｌａ−ＴＦＰＩ分子；
アミノ酸解析で決定されるような、システイン付加物を含むａｌａ−ＴＦＰＩ分子；
サイズ排除クロマトグラフィーで検出されるような、凝集したａｌａ−ＴＦＰＩ分子；および
非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されるような、誤ってフォールディングされたａｌａ−ＴＦＰＩ分子
の１種以上を含み、
ここで、該薬学的処方物は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのＬ−アルギニン、および５ｍＭのメチオニンを含み、ｐＨ５．５である、薬学的処方物。
【請求項２０】
精製されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を生成する方法であって、以下の工程：
（１）リファンピシン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内でＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを発現する工程であって、ここで、該ＴＦＰＩまたは該ＴＦＰＩアナログは以下の要素：
（ａ）転写プロモーター；
（ｂ）該リクラック転写プロモーターに隣接した、リボソーム結合部位；
（ｃ）該リボソーム結合部位に隣接した、該ＴＦＰＩまたは該ＴＦＰＩアナログをコードするヌクレオチドコード配列；
（ｄ）該ヌクレオチドコード配列に隣接した、転写ターミネーター；
（ｅ）レプリコン；
（ｆ）抗生物質耐性遺伝子；および
（ｇ）Ｎ末端メチオニン除去酵素をコードする遺伝子
を含むプラスミドにコードされる工程；
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞から、該ＴＦＰＩまたは該ＴＦＰＩアナログを含む封入体を単離する工程；
（３）該封入体から該ＴＦＰＩまたは該ＴＦＰＩアナログを単離して、単離されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを得る工程；
（４）該単離されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをリフォールディングして、リフォールディングしたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを生成する工程；
（５）Ｍｇ＋＋の存在下で、ＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィーにて、該リフォールディングしたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を生成する工程；
（６）該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を生成する工程；
（７）Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィーにて、該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を生成する工程；
（８）ブチルＨＩＣクロマトグラフィーにて、該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を生成する工程；
（９）ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーにて、該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を生成する工程；
（１０）該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の二次濃縮調製物を生成する工程であって、ここで、該ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満が、改変されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子である、工程
を含む、方法。
【請求項２１】
前記転写プロモーターがリクラックプロモーターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リボソーム結合部位が、バクテリオファージＴ７の第１０遺伝子に由来するリボソーム結合部位である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオチドコード配列がａｌａ−ＴＦＰＩをコードする、請求個２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヌクレオチドコード配列が配列番号４４である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記転写ターミネーターが、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記レプリコンが、ｐＢＲ３２２の複製起点を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記レプリコンが、ｐＢＲ３２２由来のｒｏｐコピー数制御遺伝子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗生物質耐性遺伝子がストレプトマイシンアデニルトランスフェラーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｎ末端メチオニン除去酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉのメチオニンアミノペプチダーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がＭＯＮ２１０（ＡＴＣＣ登録番号  ＰＴＡ−５５６４）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を精製する方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィーにて、組換え的に生成したＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を生成する工程；
（２）該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を生成する工程；
（３）Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィーにて、該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を生成する工程；
（４）ブチルＨＩＣクロマトグラフィーにて、該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を生成する工程；
（５）ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーにて、該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を生成する工程；
（６）該精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の二次濃縮調製物を生成する工程であって、ここで、該ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満が、改変されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子である、工程
を含む方法。
【請求項３２】
前記ＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィーがＭｇ＋＋の存在下で行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子が酵母細胞内で生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子が哺乳動物細胞内で生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物細胞がＨｅｐＧ２細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞がＣｈａｎｇ肝細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞がＳＫ肝癌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを発現させる方法であって、以下：
（１）発酵培地内にてリファンピシン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養する工程であって、ここで、該Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、以下の要素：
（ａ）転写プロモーター；
（ｂ）該リクラック転写プロモーターに隣接したリボソーム結合部位；
（ｃ）該リボソーム結合部位に隣接した、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードするヌクレオチドコード配列；
（ｄ）該ヌクレオチドコード配列に隣接した、転写ターミネーター；
（ｅ）レプリコン；
（ｆ）抗生物質耐性遺伝子；および
（ｇ）Ｎ末端メチオニン除去酵素をコードする遺伝子；
を有するプラスミドを含む工程
を含み、ここで、１リットルの該発酵培地は、４１ｇのブドウ糖、２．５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇのポリリン酸ナトリウム、７．０ｇのＫ２ＳＯ４、１．６３ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．０ｇのメチオニン、２．０ｇのグリセロール、０．５ｍｇのＨ３ＢＯ４、０．５ｇの塩化コバルト、０．１３ｇのＣｕＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、５４．０ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１１．０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａＳｅＯ３、２２．０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４、および０．５５ｍｌのＵＣＯＮ消泡剤を含む、方法。
【請求項４０】
前記転写プロモーターがリクラックプロモーターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リボソーム結合部位が、バクテリオファージＴ７の第１０遺伝子に由来するリボソーム結合部位である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレオチドコード配列がａｌａ−ＴＦＰＩをコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヌクレオチドコード配列が配列番号４４である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記転写ターミネーターが、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記レプリコンが、ｐＢＲ３２２の複製起点を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記レプリコンが、ｐＢＲ３２２由来のｒｏｐコピー数制御遺伝子を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗生物質耐性遺伝子がストレプトマイシンアデニルトランスフェラーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｎ末端メチオニン除去酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉのメチオニンアミノペプチターゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がＭＯＮ２１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−５５６４）である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、同時係属中の仮出願第６０／４９４，５４６号（２００３年８月１３日出願）、同第６０／５０９，２７７号（２００３年１０月８日出願）、同第６０／５１２，１９９号（２００３年１０月２０日出願）による利益を主張するものであり、およびこれらの仮出願を参考として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、精製されたＴＦＰＩの生成に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は長さにおいて２７６アミノ酸であり、そして組織因子が媒介する血液凝固のインヒビターとして機能する。特許文献１を参照のこと。ＴＦＰＩのアミノ末端は負の電荷を持ち、そしてカルボキシ末端は正の電荷を持つ。このＴＦＰＩタンパク質は、３つのクニッツ型酵素インヒビタードメインを含む。ＴＦＰＩは、正しくフォールディングした場合、１８個のシステイン残基を含み、そして９つのジスルフィド架橋を形成する。その一次配列は、Ｎ結合型のコンセンサスグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を３つ含む。このグリコシル化部位のアスパラギン残基は、１４５位、１９５位、および２５６位に位置する。ＴＦＰＩはまた、リポプロテイン関連性血液凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、および外因性経路インヒビター（ＥＰＩ）としても公知である。
【０００４】
ＴＦＰＩの使用は、様々な徴候の治療に提唱されており、それは、敗血症（特許文献２および特許文献３）、深部静脈血栓（特許文献４、特許文献５、および特許文献６）、虚血（特許文献７、特許文献８、および特許文献９）、再狭窄（特許文献１０および特許文献１１）、および癌（特許文献１２および特許文献１３）を含む。ＴＦＰＩ改変体は、アミノ末端にアラニン残基を付加した点でＴＦＰＩと異なるが（「ａｌａ−ＴＦＰＩ」）、敗血症の処置について、動物モデルにおいて有効であることが示されている（非特許文献１）。
【０００５】
生物学的に活性な、精製されたＴＦＰＩ、およびそれを取得するための方法について、当該分野において、継続的な必要性がある。
【特許文献１】米国特許第４９６６８５２号明細書
【特許文献２】米国特許第６０６３７６４号明細書
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９３／２４１４３号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５５６３１２３号明細書
【特許文献５】米国特許第５５８９３５９号明細書
【特許文献６】国際公開第ＷＯ９６／０４３７８号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５８８５７８１号明細書
【特許文献８】米国特許第６２４２４１４号明細書
【特許文献９】国際公開第ＷＯ９６／４０２２４号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第５８２４６４４号明細書
【特許文献１１】国際公開第ＷＯ９６／０１６４９号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第５９０２５８２号明細書
【特許文献１３】国際公開第ＷＯ９７／０９０６３号パンフレット
【非特許文献１】Ｃａｒｒら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ  ４４（３）、１２６−３７、１９９４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも以下の実施形態を提供する。
【０００７】
本発明の１つの実施形態は、多数のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を含む、精製された調製物を提供する。このＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満は、改変された化学種である。この改変された化学種は、以下のうちの１種以上を含む：逆相クロマトグラフィーで検出されるような、酸化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；陽イオン交換クロマトグラフィーで検出されるような、カルバミル化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出されるような、脱アミド化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；アミノ酸解析で決定されるような、システイン付加物を含むＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；サイズ排除クロマトグラフィーで検出されるような、凝集したＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；および、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されるような、誤ってフォールディングされたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子。
【０００８】
本発明のもう１つの実施形態は、多数のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を含む、薬学的処方物である。このＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満は、改変された化学種である。この改変された化学種は、以下のうちの１種以上を含む：逆相クロマトグラフィーで検出されるような、酸化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；陽イオン交換クロマトグラフィーで検出されるような、カルバミル化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出されるような、脱アミド化されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；アミノ酸解析で決定されるような、システイン付加物を含むＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；サイズ排除クロマトグラフィーで検出されるような、凝集したＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子；および、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されるような、誤ってフォールディングされたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態は、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを生成する方法を提供する。この方法は、以下の工程：（１）リファンピシン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内での、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを発現する工程、（２）上記のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞から、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む封入体を単離する工程、（３）上記の封入体からＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの単離して、単離されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを得る工程、（４）上記の単離されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをリフォールディングして、リフォールディングしたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを生成する工程、（５）Ｍｇ＋＋存在下でのＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィーによって、上記のリフォールディングしたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を生成する工程、（６）上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を生成する工程、（７）Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィーによって、上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を生成する工程、（８）ブチルＨＩＣクロマトグラフィーによって、上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を生成する工程、（９）ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーによって、上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を生成する工程、および（１０）上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の二次濃縮調製物を生成する工程を含み、ここで、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満は、改変された化学種である。このＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、以下の要素を含むプラスミドにコードされる：（ａ）転写プロモーター；（ｂ）上記の転写プロモーターに隣接するリボソーム結合部位；（ｃ）上記のリボソーム結合部位に隣接する、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードするヌクレオチドコード配列；（ｄ）上記のヌクレオチドコード配列に隣接する転写ターミネーター；（ｅ）レプリコン；（ｆ）抗生物質耐性遺伝子；および（ｇ）Ｎ末端メチオニン除去酵素をコードする遺伝子。
【００１０】
本発明のもう１つの実施形態は、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを生成するための方法である。この方法は、以下の工程：（１）ＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィーによって、上記のリフォールディングしたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を生成する工程、（２）上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を生成する工程、（３）Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィーによって、上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの一次濃縮調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を生成する工程、（４）ブチルＨＩＣクロマトグラフィーによって、上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの二次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を生成する工程、（５）ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーによって、上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの三次調製物を精製して、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を生成する工程、および（６）上記の精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの四次調製物を濃縮して、精製されたＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の二次濃縮調製物を生成する工程を含み、ここで、ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約１２％未満は、改変された化学種である。
【００１１】
本発明の、さらにもう１つの実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの発現の方法であって、それは、リファンピシン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を発酵培地内にて培養する工程を含む。上記のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、以下の要素を有するプラスミドを含む：（ａ）転写プロモーター；（ｂ）上記のリクラック（ｒｅｃｌａｃ）転写プロモーターに隣接したリボソーム結合部位；（ｃ）上記のリボソーム結合部位に隣接した、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードするヌクレオチドコード配列；（ｄ）上記のヌクレオチドコード配列に隣接した、転写ターミネーター；（ｅ）レプリコン；（ｆ）抗生物質耐性遺伝子；および（ｇ）Ｎ末端メチオニン除去酵素をコードする遺伝子。上記の発酵培地１ｌは、４１ｇのブドウ糖、２．５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇのポリリン酸ナトリウム、７．０ｇのＫ２ＳＯ４、１．６３ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．０ｇのメチオニン、２．０ｇのグリセロール、０．５ｍｇのＨ３ＢＯ４、０．５ｇの塩化コバルト、０．１３ｇのＣｕＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、５４．０ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１１．０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａＳｅＯ３、２２．０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４、および０．５５ｍｌのＵＣＯＮ消泡剤を含む。
【００１２】
本発明の、さらにもう１つの実施形態は、多量のａｌａ−ＴＦＰＩ分子、ならびに２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのＬ−アルギニン、および５ｍＭのメチオニンを含み、ｐＨ５．５である、薬学的組成物である。上記のａｌａ−ＴＦＰＩの約１２％未満は、改変された化学種である。上記の改変された化学種は、以下のうちの１種以上を含む：逆相クロマトグラフィーにて検出されるような、酸化されたａｌａ−ＴＦＰＩ分子；陽イオン交換クロマトグラフィーにて検出されるような、カルバミル化されたａｌａ−ＴＦＰＩ分子；Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットにて検出されるような、脱アミド化されたａｌａ−ＴＦＰＩ分子；アミノ酸解析から決定されるような、システイン付加物を含むａｌａ−ＴＦＰＩ分子；サイズ排除クロマトグラフィーにて検出されるような、凝集したａｌａ−ＴＦＰＩ分子；および、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて検出されるような、誤ってフォールディングされたａｌａ−ＴＦＰＩ分子。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ（下記に定義）を精製するための改良された方法を提供する。上記の精製方法は、ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の調製物であって、その調製物の約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満が「改変された化学種」からなる調製物を生成し得る。
「改変された化学種」は、酸化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、カルバミル化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、脱アミド化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、アセチル化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、誤ってフォールディングしたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログである。
【００１４】
上記の方法は、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの大規模な調製物（例えば、下記に定義するような、精製された２００〜３００ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された５００ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された４００〜６００ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された７５０ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された６００〜９００ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された８００ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された８００〜１，２００ｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、精製された１．２ｋｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、あるいは精製された２．４ｋｇのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ）の調製に、特に適している。
【００１５】
（ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ）
「ＴＦＰＩ」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、グリコシル化されていないＴＦＰＩである。「ＴＦＰＩアナログ」は、配列番号１に示されるようなＴＦＰＩとは異なる一次アミノ酸構造を有し（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、および／またはアミノ酸付加）、一方で下記に論じられるような、ＴＦＰＩの１つ以上の生物学的活性を保持する。ＴＦＰＩアナログはＴＦＰＩのアミノ酸配列（配列番号１）と、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のアミノ酸同一性を有する。ＴＦＰＩアナログは、ムテイン、キメラ分子、およびＴＦＰＩの断片を含む。任意のこれらの分子は、メチオニンからノルロイシンの置換、またはロイシンからノルバリンの置換を１つ以上含み得る。
【００１６】
ＴＦＰＩアナログと、ＴＦＰＩのアミノ酸配列（配列番号１）との間の同一性の百分率は、Ｂｌａｓｔ２整列化プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ  ６２、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、標準遺伝暗号、ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  １、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ  ５０、および低複雑性フィルター  オフ）を用いて決定する。アミノ酸が、類似した性質を有するもう１つのアミノ酸に交換される、保存的な置換が好ましい。保存的な置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限らない。保存的なアミノ酸置換は代表的には、約１〜５アミノ酸（すなわち、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、または５アミノ酸）の範囲内で起きる。付加的なアミノ酸は、分子内の任意の場所、特にアミノ末端またはカルボキシ末端において付加され得る。アミノ酸付加は、１個、２個、５個、１０個、２５個、１００個、またはそれ以上の付加的なアミノ酸であり得る。融合タンパク質は、アナログの定義内に含まれる。明らかに、ＴＦＰＩアナログをコードするＤＮＡ内に起きた変化は、その配列をリーディングフレーム外に位置させてはならず、そして好ましくは、二次的なｍＲＮＡの構造を生成させ得る相補領域を作成しない。生物学的活性も免疫学的活性も消失させずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させ得るかということを決定するための手引きは、当該分野にて周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア、またはＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照）を用いて見出し得る。
【００１７】
好ましいＴＦＰＩアナログはＮ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（「ａｌａ−ＴＦＰＩ」）であって、ａｌａ−ＴＦＰＩは、配列番号１のアミノ末端に付加的なアラニン残基を有する。
【００１８】
アナログは、配列番号１に関連する、１〜５個の保存的なアミノ酸置換を有する「ＴＦＰＩムテイン」を含む。好ましいムテインは、分子の立体配座を実質的に変化させない置換を有する。いくつかの事例において、ＴＦＰＩムテインは、（１）Ｎ結合グリコシル化のための３つの部位のうちの１つ以上を除去するアミノ酸置換を有するか、（２）ＴＦＰＩ（配列番号１）の残基をＴＦＰＩ−２の対応する残基に変化させる１〜５個のアミノ酸置換を有するか、（３）１つ以上のクニッツ型ドメイン内のＰ１反応部位内のアミノ酸置換を有するか、または（４）１つ以上のクニッツ型ドメイン内のＰ１反応部位の５個のアミノ酸中の部位にアミノ酸置換を有する。１つのＴＦＰＩムテインにおいて、ＴＦＰＩ（配列番号１）の第１のクニッツ型ドメインのＰ１反応部位内のリジン残基はアルギニンに置換される。
【００１９】
ＴＦＰＩ（配列番号１）の様々な部分を含む、「キメラのＴＦＰＩ」分子は、米国特許第５，５８９，３５９号にて記述される。
【００２０】
断片は、ＴＦＰＩ（配列番号１）の諸部分からなるＴＦＰＩアナログである。例えば、断片は、長さが２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または２７５の連続したアミノ酸であり得る。断片の例としては、クニッツドメイン１、２、または３；クニッツドメイン１および２、または２および３；および、Ｎ末端の欠失、Ｃ末端の欠失、または両方の欠失が挙げられる。このようなアナログを作成するための実質的な手引きは、米国特許第５，１０６，８３３号に見出される。
【００２１】
（ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩアナログ、あるいは改変されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの生物学的活性）
ＴＦＰＩまたは改変されたＴＦＰＩ（下記に定義）の生物学的活性は、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体および第Ｘａ因子の双方のアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性、ならびに、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイにて測定できるような、抗血液凝固活性との結合および阻害を含む。下記に定義するような改変されたＴＦＰＩアナログを含むＴＦＰＩアナログは、好ましくは、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体および第Ｘａ因子のどちらか、または双方と結合し得る。改変されたＴＦＰＩアナログを含むＴＦＰＩアナログは、好ましくは、実質的な量の抗血液凝固活性（例えば、下記に記述するＰＴアッセイにて測定される、ＴＦＰＩ（配列番号１）の、１０％、３０％、５０％、６０％、８０％、９０％、またはそれ以上の抗血液凝固活性）を有する。
【００２２】
（精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの調製物）
本発明の、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの調製物は、その約１２％未満が、下記に記述されるアッセイのうちの１つ以上によって検出される、改変された化学種である、ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を含む。「改変されたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種」は、以下の翻訳後修飾のうちの１つ以上を含む分子である：酸化（酸化されたメチオニン残基）、システイン付加物、アミノ酸改変（残余のＮ末端メチオニン、脱アミド化、アセチル化、およびカルバミル化）、凝集（ＴＦＰＩオリゴマーまたはＴＦＰＩアナログオリゴマーの生成）、および誤ったフォールディング。
【００２３】
好ましくは、本発明の精製された調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満は、逆相クロマトグラフィー（下記に記述のＣＮ  ＨＰＬＣ）にて検出されるように、酸化されている。好ましくは、本発明の精製された調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は、陽イオン交換クロマトグラフィー（下記に記述のＣＥＸ  ＨＰＬＣ）にて検出されるように、カルバミル化されている。さらに他の精製された調製物内において、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物中の上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットを用いて測定できるように、脱アミド化されている。好ましくは、本発明の精製された調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は、アミノ酸解析にて決定されるように、システイン付加物を有する。他の好ましいＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物において、上記のＴＦＰＩ分子およびＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は、サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）にて検出されるように凝集されているか、あるいは、非変性条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（下記に記述）にて検出されるように、誤ってフォールディングされている。
【００２４】
好ましくは、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物は、質量分析（下記に記述）にて検出可能なレベルのアセチル化したＴＦＰＩ化学種もＴＦＰＩアナログ化学種も含まない。本発明の精製された調製物はまた、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質を実質的に除かれている（すなわち、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物中の、銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて検出可能なタンパク質の２ｎｇ／ｍｇ未満が、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質である）。
【００２５】
その他の好ましい、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物は、約４％未満の酸化されたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種、約１％未満のカルバミル化されたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種、約５％未満の脱アミド化されたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種、ならびに、約３％未満の凝集した、および／または、誤ってフォールディングしたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種を含む。
【００２６】
本発明の、任意の精製されたＴＦＰＩ調製物は、メチオニンからノルロイシンへの１つ以上の置換、またはロイシンからノルバリンへの１つ以上の置換を含み得る。
【００２７】
（アッセイ）
下記に記すアッセイは、ＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物の純度、安定性、または生物学的活性を決定するために用いられる。
【００２８】
（逆相クロマトグラフィー（ＣＮ  ＨＰＬＣ）による純度）
逆相高速液体クロマトグラフィー法（ＣＮ  ＨＰＬＣ）は、改変されたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種（すなわち、改変（例えば、酸化されたメチオニン残基）、およびアミノ酸改変（例えば、残余のＮ末端メチオニン、カルバミル化、脱アミド化、およびアセチル化）を含むＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子）を検出するために用いられる。ＣＮ  ＨＰＬＣはまた、メチオニンからノルロイシンへの置換を有するＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種を検出し得る；しかし、上記に記述したように、こうした化学種は「改変されたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種」ではなく、そして本発明の精製された調製物内に存在し得る。
【００２９】
上記のＣＮ  ＨＰＬＣ法は、安定に結合したシアノ−逆相カラム、ならびに、アセトニトリルおよび０．２％のトリフルオロ酢酸を含む移動層を用いる。溶離液を、２１４ｎｍにおける吸光度を検出することで、タンパク質についてモニターする。結果のサンプルを、参照標準物質と比較する。純度は、主要なピークの面積百分率によって評価される。
【００３０】
ＣＮ  ＨＰＬＣにて測定されるように、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満は、酸化されたメチオニン残基を有する。
【００３１】
（アミノ酸解析による、遊離のシステインの定量）
遊離のシステインの定量を可能にする任意のアミノ酸解析方法が、システイン付加物を有するＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の定量に用いられ得る。例えば、Ｂａｒｋｈｏｌｔ＆Ｊｅｎｓｅｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９年３月；１７７（２）：３１８−２２；Ｈｏｏｇｅｒｈｅｉｄｅ＆Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年２月１４日；２０１（１）：１４６−５１；Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３年７月；２１２（１）：９８−１０５；Ｈａｌｅら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４年１月；２１６（１）：６１−６；Ｍａｎｎｅｂｅｒｇら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５年１１月１日；２３１（２）：３４９−５３；Ｔｈａｎｎｈａｕｓｅｒら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９８年１月；１７（１）：３７−４３；Ｙａｎら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．１９９８年７月１０日；８１３（１）：１８７−２００；米国特許第４，６７０，４０３号；および米国特許第４，７８４，９６２号に開示された方法を参照のこと。代表的には、ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子を還元した後に放出される遊離のシステインを定量する。
【００３２】
アミノ酸解析によって決定されるように、本発明の精製された調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は、システイン付加物を有する；より好ましくは、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物は、検出され得るレベルのシステイン付加物を全く含まない。
【００３３】
（脱アミド化アッセイ）
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．ＴＢＩ００１（ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、改訂  ８／９９））またはそれに相当するものが、イソアスパラギン酸の間接的な測定を通して、ＴＦＰＩの脱アミド化またはＴＦＰＩアナログの脱アミド化を決定するために用いられる。手短に言えば、上記のキットは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）のメチル基の、イソアスパラギン酸への転移を触媒する、タンパク質イソアスパルチルメチル転移酵素（ＰＩＭＴ）を利用する。この反応は副産物であるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）を生成し、ＳＡＨは続いて、タンパク質の脱アミド化のレベルを定量するために、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃａｒｌｓｏｎ＆Ｒｉｇｇｉｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｓｉｔｒｙ  ２７８，１５０−５５，２０００）にて解析される。
【００３４】
このアッセイにて測定されるように、精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満は脱アミド化されている。
【００３５】
（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ））
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）は、ＴＦＰＩオリゴマーまたはＴＦＰＩアナログオリゴマー（すなわち、凝集した形態）から、ＴＦＰＩ単量体またはＴＦＰＩアナログ単量体を検出するために用いられる。この方法は、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０−５ならびに、４０％のアセトニトリルおよび０．７５％のトリフルオロ酢酸を含む移動層を用いる。溶出液を、２１４ｎｍにおける吸光度にて、タンパク質についてモニターする。単量体およびオリゴマーは、水力学的半径に基づいて分離される。純度は、面積百分率によって評価される。
【００３６】
サイズ排除クロマトグラフィーの２つの方法が、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの凝集した形態の検出に用いられ得る。１つの方法は、４０％のＡＣＮ、０．７５％のＴＦＡ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２バッファーを溶出液として用い、そして２２０ｎｍに設定したＵＶ検出器を用いる。もう一方の方法は、溶出液として処方バッファー（３００ｍＭのＬ−アルギニン、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．５）、ならびに、２８０ｎｍでの励起および３２０ｎｍでの発光に設定した蛍光検出器を用いる；このシステムを有する上記のＳＥＣカラム全長にわたる重量バランスは８５％である。
【００３７】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣにて測定されるように、精製されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は凝集されている。
【００３８】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシーブルー染色、非還元的状態））
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を非還元的条件下にて行い、そして、クーマシーブルー染色を用いて、誤ってフォールディングしたＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種の検出に用いる。この方法は、１４％のアクリルアミドゲルおよびコロイド性のクーマシー染色を用いる。還元されたサンプルおよび還元されていないサンプルを、参照標準物質と比較する。非還元的条件下にて、誤ってフォールディングされた形態のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログよりも、わずかに大きな電気泳動的な移動度を有し、他方で、還元的状態下では、電気泳動的な移動度に違いはない。精製された調製物中の、凝集した、および／または誤ってフォールディングした化学種の割合を決定するために、その結果を、参照標準物質と比較する。
【００３９】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥにて測定されるように、本発明の精製された調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は、誤ってフォールディングされている。
【００４０】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色））
ＳＤＳ  ＰＡＧＥを非変性条件下にて行い、そして、銀染色を用いて、精製プロセスの間には除かれないＥ．ｃｏｌｉタンパク質の同定に用いる。上記のサンプルは、１４％アクリルアミドゲルに注ぐ前に還元する。サンプルの結果は、参照標準物質と比較する。
【００４１】
精製されたＴＦＰＩ調製物またはＴＦＰＩアナログ調製物は、実質的に、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質が除かれている（すなわち、銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて検出可能な、本発明の精製された調製物中のタンパク質の２ｎｇ／ｍｇ未満が、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質である）。
【００４２】
（ＣＥＸ  ＨＰＬＣ）
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ  ＨＰＬＣ）は、カルバミル化したＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種、あるいは電荷の関係したＴＦＰＩ化学種またはＴＦＰＩアナログ化学種の存在の検出に用いられる。上記のＣＥＸ−ＨＰＬＣ法は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ−Ｓ  ＨＲ  ５／５−ガラスカラムを用いる。上記のカラムは、８０％のバッファーＡ（ｐＨ  ５．４にて、２０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物：アセトニトリル溶液（７０：３０  ｖ／ｖ））および２０％のバッファーＢ（ｐＨ  ５．４にて、２０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物−１．０Ｍの塩化アンモニウム−アセトニトリル溶液（７０：３０  ｖ／ｖ））にて平衡化される。サンプルを注入した後、ＴＦＰＩを溶出するために、０．７ｍｌ／分の流速にて、２１分間内に２０％のバッファーＢ〜８５％のバッファーＢの勾配が適用される。タンパク質のピークは、２８０ｎｍにおける吸光度、または、励起に２８０ｎｍおよび発光に３２０ｎｍを用いた蛍光によって検出される。
【００４３】
ＣＥＸ  ＨＰＬＣにて測定されるように、本発明の精製された調製物中の、上記のＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、または約０．１３％未満は、カルバミル化されている。
【００４４】
（質量分析）
質量分析法は、下記の、特定の実施例にて記述される。本発明の精製されたＴＦＰＩ調製物は、好ましくは、質量分析によるアッセイによって検出し得るレベルのアセチル化されたＴＦＰＩ化学種を含まない。
【００４５】
（プロトロンビン時間アッセイ）
ＰＴアッセイは、Ｃｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ  ＭＴＸ  ＩＩ器械（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）上にて行われる。ＴＦＰＩサンプルまたはＴＦＰＩアナログサンプルは、まずバッファー（２Ｍの尿素、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２）にて１５０μｇ／ｍｌに希釈され、続いてＴＢＳＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、ｐＨ  ７．５）にて３０μｇ／ｍｌに希釈され、そして最後に、ＴＢＳＡバッファーにて１２〜１５μｇ／ｍｌに希釈される。アッセイのために、１０μｌの希釈したサンプルを、まず９０μｌのプールしたＶｅｒｉｆｙ  Ｉ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、カタログ番号５９５６６）に混ぜ、試験トレー（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、カタログ番号３５０１４）に充填し、そして上記のＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ内に配置する。次いで、２００μｌのＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｅｘｃｅｌ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、カタログ番号５２００１）を、凝固プロセスを開始するために加える。この凝固時間は、標準物質中のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの濃度の対数に対する、凝固時間（秒）の対数の標準プロットと比較することで、投入したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの濃度に変換される。相対的な効力は、試験サンプル中のＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの阻害活性を、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログのコントロールの阻害活性と比較することで、計算される。
【００４６】
（精製手順の概要）
本発明の精製方法（「方法Ｃ」）は一般に以下の工程を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉ内にてＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを発現する工程、（２）屈折体を単離する工程、（３）上記屈折体を溶解し、そして発現したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをリフォールディングする工程、（４）ＳＰ−セファロース高流速（ＦＦ）クロマトグラフィー工程、（５）一次濃縮およびダイアフィルトレーション工程、（６）Ｑ−セファロース高速（ＨＰ）クロマトグラフィー工程、（７）ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程、（８）ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程、および（９）二次濃縮／ダイアフィルトレーション工程。随意的に、濃縮／ダイアフィルトレーション工程は、ブチルＨＩＣ工程とＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程との間に含まれ得る。
【００４７】
本発明の上記の精製方法は、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ５、２３３−４１、１９９４；ＷＯ  ９６／４０７８４；米国特許第６，３１９，８９６号；および米国特許第６，３２３，３２６号に記述された従来の精製方法（「方法Ｂ」）よりも少ない改変されたＴＦＰＩ化学種およびＴＦＰＩアナログ化学種を含む、ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の調製物を生成する。
【００４８】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの精製は、一連のクロマトグラフィー操作によるフォールディング工程の後に、大部分は達成される。１工程の溶出を用いる、上記のＳＰセファロース捕獲カラムを除いて、残りのクロマトグラフィー工程は全て、画分収集、およびどの画分をプールすべきかということを決定するための分析を用いる。実際的な生産見込みから、画分は、プールするためのある最小の要求に応じる。しかし、必要ならば、ピークの画分のみを収集し、そして引き続くクロマトグラフィー操作を通して実行されるならば、さらに高いレベルの純度を得ることができる。これらの改変された形態のＴＦＰＩを除くことで、この精製方法は、上記の調製物の約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満が、改変された化学種からなる、ＴＦＰＩ分子またはＴＦＰＩアナログ分子の調製物を生成し得る。
【００４９】
表１は、方法Ｂを用いて生成された組換え型ａｌａ−ＴＦＰＩの純度、および本発明の方法を用いて生成された組換え型ａｌａ−ＴＦＰＩの純度を比較する。さらに、下記に記述した、発現系、発酵制御戦略、および屈折体の単離手順は、結果として、従来の生成方法と比較して、生産されるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの量において５倍を超える増加をもたらす。
【００５０】
【表１】
2007528211.tif 000002
１単量体（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）または主要なピーク（ＨＰＬＣ）に対する％として表した値。
２メチオニン１モル当たりのノルロイシンの置換の％で表した。
３ロイシン１モル当たりのノルバリンの置換の％で表した。
【００５１】
この手順のある局面（例えば、上記ブチルＨＩＣ工程、細胞の収集の間のＤＴＰＡキレート剤の使用、（特にＭｇ＋＋存在下での）ＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィー、および改良された発酵方法）は一般に、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ以外のタンパク質に適している。
【００５２】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの工業規模での生成に適した、この精製方法の好ましい実施形態を、下記に記述する。
【００５３】
（ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの発現）
（ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードする配列）
ＴＦＰＩの野生型のアミノ酸配列を、配列番号１に示す。上記に定義したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードする任意のヌクレオチド配列が、発現されるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードするために用いられ得る。ａｌａ−ＴＦＰＩにとって好ましいコード配列は、図１５に示す。
【００５４】
（ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの生成）
組換え型のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、当該分野で周知の、任意の適した宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞または哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃｈａｎｇ肝細胞、またはＳＫ肝癌細胞））内で生成され得る。例えば、米国特許第５，２１２，０９１号、同第６，１０３，５００号、および同第６，３２３，３２６号を参照のこと。このように組換え的に生成されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、下記に記述したような、本発明の方法を用いて精製され得る。
【００５５】
（Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内にて生成される。ＴＦＰＩの生成に用いられる好ましいＥ．ｃｏｌｉ株は「ＭＯＮ２１０」とよばれ、この「ＭＯＮ２１０」は、ブダペスト条約の規定の下で、２００３年１０月８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡに寄託された（登録番号ＰＴＡ−５５６４）。ＭＯＮ２１０は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（Ｂａｃｋｍａｎ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３６、５２５−５７、１９９６）から、Ｗ３１１０→ＭＯＮ１０５→ＬＢＢ３５８→ＭＯＮ２１０の順序を含む多段階のプロセスを通して、産生された。
【００５６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＯＮ２１０株は、ＬＢＢ３５８株からいくつかの工程を経て産生された。産生プラスミドのコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を減少させるために、Ｐ１形質転換（ＣｓｏｎｋａおよびＣｌａｒｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３、５２９−５３０、１９８０）によって、ＬＢＢ３５８株にｒｅｃＡ５６変異を導入し、その結果、ＬＢＢ３５８ｒｅｃＡ−株を得た。次いでＬＢＢ３５８ｒｅｃＡ−から、Ｔｎ１０に存在するテトラサイクリン耐性遺伝子を、フザリン酸選抜によって除き、ＬＢＢ３５８ｒｅｃＡ−  Ｔ１０株を産生した。自発的に起こる、リファンピシン耐性に関連する、度合いの変化する転写物伸長を選抜するために、ＬＢＢ３５８ｒｅｃＡ−  Ｔ１０株にプラスミドｐＭＯＮ２６３３５ｒｏｐ＋を導入し、ＬＢＢ３５８ｒｅｃＡ−  Ｔ１０／ｐＭＯＮ２６３３５ｒｏｐ＋株を産生した。ＴＦＰＩ生成のレベルの増加を示した、リファンピシン耐性株の１つを選抜し、次いでプラスミドｐＭＯＮ２６３３５ｒｏｐ＋を除いた。結果として産生された培養物をＭＯＮ２１０とよんだ。
【００５７】
（プラスミド）
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内にてＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを発現させるために用いるプラスミドは、以下の遺伝子要素を有する：転写プロモーター、リボソーム結合部位、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログをコードする配列、転写ターミネーター、レプリコン、抗生物質耐性遺伝子、およびＮ末端メチオニンを除去する酵素。特に好ましい要素を、表２に示す。
【００５８】
【表２】
2007528211.tif 000003
プラスミド「ｐＭＯＮ３７６２１」は、上記の好ましい要素のそれぞれを含む。ｐＭＯＮ３７６２１のプラスミド地図を、図１に示す。このプラスミドは、ａｌａ−ＴＦＰＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ内にてタンパク質を高レベルで生産するに有用な制御要素をコードする最適化された構造遺伝子を含む。このｐＭＯＮ３７６２１プラスミドは、上記のａｌａ−ＴＦＰＩコード領域の改変を除いて、ｐＭＯＮ９１９７から産生された。
【００５９】
（ｐＭＯＮ３７６２１の構築）
プラスミドｐＭＯＮ３７６２１は、プラスミドｐＭＯＮ９１９７から始まって構築された。ｐＭＯＮ９１９７は、ａｌａ−ＴＦＰＩをコードする最適化された遺伝子、第１０遺伝子リボソーム結合部位（Ｏｌｉｎｓら、Ｇｅｎｅ  ７３、２２７−３５、１９８８）、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｆｌｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３、７０９５、１９８５）、ＭＡＰ遺伝子（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９、７５１−５７、１９８７）、およびｐＢＲ３２７の複製起点（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｇｅｎｅ  ２、９５−１１３、１９７７）を含む。上記のリクラックプロモーター（米国特許第５，２１２，０９１号を参照のこと）をｐＭＯＮ９１９７に挿入し、本来のｔａｃプロモーターと交換して、プラスミドｐＭＯＮ２６３３５を産生した。
【００６０】
上記のリクラックプロモーター（米国特許第５，２１２，０９１号）は、ａｌａ−ＴＦＰＩ遺伝子の転写を指向するために用いられる。上記のリボソーム結合部位は、バクテリオファージＴ７の第１０遺伝子から得られる。上記の転写ターミネーターは標準のターミネーター配列に基づき、そして２２５４とよばれる。上記の複製起点はｐＢＲ３２２に由来する。産生プラスミドのコピー数のより良い制御のために、ｐＢＲ３２２由来のｒｏｐ遺伝子（Ｐｏｌｉｓｋｙ、Ｃｅｌｌ  ５５、９２９−３２，１９８８）をｐＭＯＮ２６３３５に挿入し、結果としてプラスミドｐＭＯＮ２６３３５ｒｏｐ＋を得た。ｐＭＯＮ３７６２１の構築の最終工程は、バクテリオファージＰ２２ターミネーターを、２２５４とよばれる転写ターミネーター（配列番号４２；米国出願番号第０９／０４４，３６９号の配列番号３を参照のこと）と置換することであった。プラスミドｐＭＯＮ３７６２１はまた、宿主にストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンへの耐性を与えるアミノグリコシドヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子、ならびにＮ末端メチオニンの除去を亢進させるためのＥ．ｃｏｌｉメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）遺伝子を保有する。
【００６１】
（製造株ＭＯＮ２１０／ｐＭＯＮ３７６２１の調製）
製造株ＭＯＮ２１０／ｐＭＯＮ３７６２１は、ＭＯＮ２１０にｐＭＯＮ３７６２１を形質転換することで産生される。形質転換は、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得る。形質転換されたＭＯＮ２１０／ｐＭＯＮ３７６２１のグリセロールストックが調製され得、そして保存用細胞バンクおよび作業用細胞バンクの樹立に用いられ得る。
【００６２】
（保存用細胞バンクおよび作業用細胞バンクの調製）
保存用細胞バンクおよび作業用細胞バンクは、以下のように、製造株から調整される。保存用細胞バンクの調製のためには、親ＭＯＮ２１０／ｐＭＯＮ３７６２１の凍結バイアルを解凍し、そして、スペクチノマイシンを含む、規定された産生播種培地内で、約９世代、振盪フラスコ内で増殖させる。次いで、１０％のグリセロールを含む細胞のバイアルを凍結してよく、そして−７０℃にて維持してよい。作業用細胞バンクは、保存用ストックバイアルを解凍し、そして保存用細胞バンクについて記述したように細胞を増殖させることで調製し得る。
【００６３】
（発酵条件）
製造発酵プロセスは、３つの工程を含む：（１）種１振盪フラスコ、（２）種２発酵槽、および（３）１０，０００Ｌ生産発酵槽。この発酵プロセスの間に用いられる培養液の組成を、表３に収載する。ＫＯＨおよびＨ２ＳＯ４が、種１培養液および種２培養液の培養液ｐＨを合わせるために用いられる。ＮＨ４ＯＨおよびＨ２ＳＯ４が、発酵槽の培養液のｐＨを合わせるために用いられる。ＮＨ４ＯＨはまた、発酵の間にｐＨを制御するためにも用いられる。
【００６４】
ＵＳＰ精製水を、発酵プロセスを通して用いる。選択的抗生物質であるスペクチノマイシンを、作業用細胞バンクの調製中に用い、そして種菌の調製または発酵プロセスの間には用いない。
【００６５】
【表３】
2007528211.tif 000004
１上記の発酵槽の最初の体積は６４００Ｌである。
２最初の実際のグルコース濃度は、セレローズの含水量（９％未満）に起因して３４〜４２ｇ／Ｌである。
３最初に加えられた３．５ＬのＵｃｏｎ消泡剤。さらなる消泡剤（１２．５Ｌまで）が、発酵の間に加えられ得る。
【００６６】
（種１−振盪フラスコ）
上記の発酵プロセスは、作業用細胞バンクの凍結バイアルの解凍から始まる。このバイアル（１ｍＬ）の中身を、種１振盪フラスコ内の０．５Ｌの種１培養液の接種に用いる。このフラスコを、３７±２℃でインキュベートし、そして２００ＲＰＭで混ぜる。この培養物は、細胞濃度が０．９〜１．７ＯＤに達するまで、約９世代間増殖させられる。次いで上記の種１培養物を、種２発酵槽に移す。
【００６７】
（種２−３０Ｌ発酵槽）
３０Ｌの種２培養液に、種１培養物の０．５Ｌ容量を接種する。上記の種２培養液は、基本的に種１培養液と同一であるが、０．１ｍＬ／ＬのＵｃｏｎ消泡剤を添加している点で異なる。上記の種２発酵は、好ましくは、３７±２℃の温度で、６±２ＬＰＭの空気散布と共に行われる。上記の培養液の最初のｐＨは、好ましくは７．２±０．２である。
【００６８】
細胞が、０．９〜１．７ＯＤの濃度まで、約６世代、増殖させられた場合、上記の種２培養物を１０，０００Ｌ発酵槽に移す。
【００６９】
（１０，０００Ｌ産生発酵槽）
上記の種２発酵槽の全ての中身を、約６，４００Ｌの産生培養液を入れた１０，０００Ｌ発酵槽に移す。上記の産生培養液の組成を表３に示す。上記の産生発酵槽は、以下のパラメーターについて制御される。増殖段階の温度は、好ましくは３７±２℃である。温度設定値を、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの発現の誘導の約０．５時間前に、３７℃から３０℃に変更し、そして発現段階の温度は、好ましくは３０±２℃である。ｐＨを、濃ＮＨ４ＯＨの添加によって制御し、好ましくは６．９±０．２である。グルコースの最初の供給が枯渇した場合、および栄養分の供給の開始の直前において、約ｐＨ７．４±０．２までの一時的なｐＨの棘波が起きる。最後に、溶存酸素（好ましくは０．１〜０．５ａｔｍ）は、攪拌速度、散布速度、および散布ガス中の酸素の割合の調整によって制御される。
【００７０】
１０，０００Ｌの産生発酵における細胞の増殖は、開始培養液のグルコースを用いた、単純なバッチ培養として始まる。ｐＨの７．４±０．２への増加によって示されるように、細胞密度が約４０ＯＤに達する場合、グルコースは枯渇する。このとき、グルコース／栄養素の供給を開始する。この栄養素の供給は、５５０ｇ／Ｌのグルコース、１８ｇ／Ｌのポリリン酸ナトリウム、６．６５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、および４ｇ／Ｌのメチオニンを含む。栄養素の供給速度は、指数関数的に増加させる。
【００７１】
細胞密度が約１００ＯＤに達する場合、上記の培養物を、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを産生するように、ＩＰＴＧの添加（例えば、１発酵ごとに１８７±３ｇのＩＰＴＧ、通常の体積＝９５００Ｌ）によって誘導し、そして、この発現段階の間のグルコースレベルを制限するために、上記のグルコース／栄養素供給速度を減少させる。温度設定値を、上記の培養物が誘導後１時間以内に３０±２℃に達するように変更する。上記の培養物を誘導後約１２時間に収集する。収集時のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決定されるように、約５ｇ／ＬのＴＦＰＩである。
【００７２】
（細胞の収集、屈折体の溶解、および発現したＴＦＰＩのリフォールディング）
（細胞の収集）
細胞の収集のために、発酵ブロスをｐＨ５．５〜６に調整し、そして酸素およびグルコースの送達を中断する。攪拌を減少し、そしてブロス温度を５〜１０℃に低下させる。キレート剤であるＤＴＰＡを、最終濃度１ｍＭとなるように加える。上記のＤＴＰＡの添加は、クエン酸でｐＨを５．５〜６．０に調整したストック溶液を用いてなされる。収集培養物を、上清中の固形物の損失が最小限になるような流速で作動させたＢＴＵＸ−５１０遠心機に送る。収集した細胞を含む固形物を、発酵槽が空になるまで、引き続いてタンクにポンプで汲み出す。精製水を、収集した細胞に、体積が約１０，０００リットルになるまで加え、ＤＴＰＡを最終濃度が１ｍＭとなるように加え、そして、前記に記述したように、ＢＴＵＸ−５１０遠心機を通して処理する。この洗浄工程を、全てで２回繰り返す。
【００７３】
（屈折体（ＲＢ）の単離）
上記の細胞洗浄工程の後、屈折体（ＲＢ、封入体としても公知）の回収を始める。回収は、上記の固形物が宿主細胞の細片を含まない基本的にきれいな屈折体になるまで、繰り返されるホモジェナイズ、遠心分離、および上記の固形物への体積追加の工程を含む。ホモジェナイザーは、約９０００ｐｓｉｇの一定の圧力で操作し、そしてＢＴＵＸ−５１０遠心機またはそれに相当するものは、上清中の固形物の損失が最小限になるような流速で作動させる。
【００７４】
（体積の縮小）
連続的な遠心分離および体積追加プロセスの第１段階（ダイア遠心分離（ｄｉａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ））の間、その体積は約５０００Ｌから約２５００Ｌへ減少する。遠心分離による上清は捨てられ、そして固形物を収集する。この工程および引き続く工程のためのＤＴＰＡ濃度は、１０ｍＭである。
【００７５】
（バッチダイア遠心分離１）
ＲＢ単離プロセスの次の工程は、バッチダイア遠心分離である。この工程の間、前工程にて調製された粗製ＲＢスラリーを、最終的なＲＢスラリーが、混入する細胞性物質をほとんど含まなくなるまで、繰り返しホモジェナイズし（連続的な方法で）、そして遠心分離する（バッチ方法で）。代表的には、望ましいＲＢ純度を達成するためには、ＢＴＵＸ−５１０遠心機またはそれに相当するものを用いた、３回のバッチ工程が用いられる。バッチダイア遠心分離のための遠心分離パラメーターは、体積の減少のために示されたパラメーターと同一である。
【００７６】
（バッチダイア遠心分離２）
第２のバッチダイア遠心分離工程の最後において、望ましくない発酵不純物（例えば、核酸および金属）を除くために、クエン酸ナトリウムバッファーによる洗浄を用いる。この工程の最後において、クエン酸ナトリウムを、最終濃度１５０ｍＭ、ｐＨ約５．５〜６．０となるように加える。
【００７７】
（バッチダイア遠心分離３）
第３のバッチダイア遠心分離工程のために、ＳＣ−３５遠心機またはそれに相当するものが用いられる。バッチダイア遠心分離３は、約２５００ＬのＲＢスラリー体積から始まる。上清を捨て、そして固形物を別々に収集する。この工程の間、収集される固形物の体積は、宿主細胞の不活性化前に最終体積が５００Ｌを超えないように、最小化される。
【００７８】
（宿主細胞不活性化）
前工程において収集されたＲＢスラリーは、残余の組換え細菌細胞（約１０３〜１０５細胞／ｍｌ）を含む。これらの生存可能な細胞を、上記のＲＢスラリーが容器に分配され得る前に、不活性化する。残余のＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１−オクタノール（約５０％の固形物を含むスラリーに対して、０．２％ｖ／ｗ）に５〜１０℃にて３０分間接触させることで、不活性化する。
【００７９】
（ＲＢスラリーの分配および貯蔵）
不活性化の後、上記のＲＢスラリー（「ＲＢ中間体」）を、同等の部分に分配し、凍結する。例えば、上記の不活性化したＲＢスラリーを、７．５Ｌずつのアリコートにて、−２０℃未満で、都合良く凍結する。
【００８０】
（溶解およびリフォールディング）
下記に記述するリフォールディング反応は、１０，０００Ｌの工業規模においても、１日で完了し得る。リフォールディング工程におけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの量は、２０，０００ｇである。上記のリフォールディング反応の間、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの濃度は、２ｇ／Ｌである。上記のリフォールディング化学作用は、正しいジスルフィド結合を形成するための、システインの結合および銅触媒性の酸化を含む。
【００８１】
解凍したＲＢ中間体を、６Ｍの尿素、２ｇ／Ｌのポリリン酸、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが１０のタンクに移し、剪断ミキサーを用いてホモジェナイズし、ストックＤＴＴ溶液を添加して還元する。還元され、ホモジェナイズされたＲＢ溶液をフォールディングタンクに移し、このフォールディングタンクは、移送後、約３．５Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのグリシン、２ｇ／Ｌのポリリン酸、および１ｍＭのＤＴＴを含み、ｐＨが１０．２である。フォールディングは、０．２μＭの塩化第二銅および０．６ｍＭのシステインの添加によって開始される。約２４時間後、１０μＭの塩化第二銅を加える。約１時間後、塩化マグネシウムを最終濃度が５０ｍＭとなるように加え、そして４７．５％の酢酸溶液を用いて、フォールディングされたプールのｐＨを５．５に調整する。必要に応じて、調整したフォールディングされたプールは約２日間保持し得、このことは、上記のプールの一部を取り出し、そして次の精製工程を通してサブロット（ｓｕｂｌｏｔ）として処理することを可能にする。
【００８２】
（ＳＰ−セファロース高流速クロマトグラフィー）
ＳＰ−セファロースＦＦ樹脂をもちいた陽イオン交換クロマトグラフィーを、最初の捕捉工程に用いる。上記のカラムの装填容量は、総タンパク質４０ｇ／Ｌである。上記のカラムを、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３Ｍの尿素、ｐＨ６にて平衡化する。上記の調整したフォールディングされたプールを、デプスフィルターおよび０．４５μＭフィルターを通して濾過し、そして上記のカラムに注ぐ。装填後、上記のカラムを平衡化バッファーにて洗浄し、次いで中間塩洗浄（約１５０ｍＭのクエン酸ナトリウム）にて洗浄する。タンパク質は、約１９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いて溶出される。この溶出工程の間のＡ２８０のトレースが増加したら、プール工程を開始する。このプール工程は、約３カラム容量、またはＡ２８０のトレースが基線に戻るまで続ける。溶出後、上記のカラムを０．５ＮのＮａＯＨ溶液にて再生し、そしてさらなるサブロットの処理のために再平衡化するか、または保存のために０．１ＮのＮａＯＨにて洗浄する。タンパク質の濃度およびカラムの回復を決定するために、上記のプールの吸光度を２７８ｎｍにて測定する。
【００８３】
（第１の濃縮／ダイアフィルトレーション）
上記のＳＰのプールを、６Ｎの酢酸を用いてｐＨを４．５〜５．０に調整し、１２〜１４ｇ／Ｌに濃縮し、そして、１０ｋＤａ膜を用い、２０ｍＭの酢酸、１５ｍＭのＮａＣｌ、３Ｍの尿素を含み、ｐＨが４．２５の、８容積のダイアフィルトレーションバッファーにて、ダイアフィルター処理（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）する。ダイアフィルター処理された溶液を上記の系から排出し、そして工程の回収率を決定するために、濃度を２７８ｎｍにて決定する（代表的には、１０〜１２ｇ／Ｌの範囲）。次いで、上記のダイアフィルター処理されたプールを０．２μｍのフィルターを通して、滅菌した袋の中へ濾過し、そして、Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程を行うまで、少なくとも３ヶ月間、２〜８℃にて維持し得る。
【００８４】
（Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィー）
濃縮し、ダイアフィルター処理したＳＰのプールを、最終濃度で約４Ｍの尿素、２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスとなり、ｐＨが７．６〜８．５となるように調整し、そして、Ｑ−セファロースＨＰカラムに充填する。カラムを、４Ｍの尿素、２０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのトリスを含み、ｐＨが８であるバッファーにて平衡化する。装填後、上記のカラムを平衡化バッファーにて洗浄し、次いで、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む平衡化バッファーにて洗浄する。ＴＦＰＩを、バッファー内での５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムの勾配１０ＣＶを用いて溶出する。ＴＦＰＩを含む画分は、適切な画分に含まれていることを確認するための、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる画分解析およびＨＰＬＣ解析に基づいてプールし得る。
【００８５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの溶出の後、上記のカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムバッファーにて洗浄し、次いで、０．５ＮのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＣｌを含む溶液にて再生する。サブロットは、上記に記述したようにカラムを平衡化した後に、処理し得る。カラムは、０．１ＮのＮａＯＨ内で保存し得る。上記のプールの２７８ｎｍでの吸光度を、タンパク質の濃度およびカラムの回復を決定するために用いる。
【００８６】
（ブチルＨＩＣクロマトグラフィー）
上記のＱ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程からのプールを、２．５ＭのＮａＣｌ、２Ｍの尿素、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６にて調整し、そしてブチル６５０Ｍカラムに装填する。装填後、上記のカラムを、３ＣＶの１．７ＭのＮａＣｌ、２Ｍの尿素、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６にて洗浄する。生成物を、２Ｍの尿素および１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨが６であるバッファー中で、１．７ＭのＮａＣｌ〜０ＭのＮａＣｌの勾配１０ＣＶにて溶出する。上記のカラムは、「結合および溶出」方式で操作する。画分を収集し、プール中の適切な画分の封入を確認するために、ＨＰＬＣ解析にて解析する。溶出後、上記のカラムを、塩を含まないバッファーにて洗浄する。カラムの再生は、０．５ＮのＮａＯＨを用いて行う。さらなるサブロットを処理する場合には、上記のカラムを再平衡化してもよく、または保存のために０．１ＮのＮａＯＨにて洗浄してもよい。タンパク質の濃度およびカラムの回復を決定するために、上記のプールの吸光度を２７８ｎｍにて測定する。
【００８７】
（ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー）
カルバミル化したＴＦＰＩ化学種または誤ってフォールディングしたＴＦＰＩ化学種を除くために、高速陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、洗練させる工程として用いる。上記のブチルプールを、３．９Ｍの尿素を含みｐＨ５．５のバッファーにて約５倍に希釈し、導電率を２〜８℃にて約１５．６にする。調整したブチルプールを、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３Ｍの尿素、ｐＨ５．５にて平衡化したＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填する。装填後、上記のカラムを、４００ｍＭのＮａＣｌ、３Ｍの尿素、２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ５．５であるバッファー１．５ＣＶにて洗浄する。タンパク質を、３Ｍの尿素、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５内にて４００〜６５０ｍＭのＮａＣｌの勾配１７ＣＶを用いて溶出する。
【００８８】
上記のＵＶ吸光度の上昇が起きた場合、画分を収集する。カルバミル化した物質、および誤ってフォールディングした物質は、溶出ピークの上昇する部分にて溶出する。タンパク質の溶出後、上記のカラムを、３Ｍの尿素、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５中の１Ｍの塩化ナトリウムにて、次いで０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液にて再生する。次いで、上記のカラムを洗浄し、そして０．１ＮのＮａＯＨ内で保存する。上記の画分は、純度を決定するために、ＣＥＸ  ＨＰＬＣおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥにて解析する。
【００８９】
主要なＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含むピークとして、含まれる物質の９５％を超える部分を含む画分を、ＳＰ−セファロースＨＰのプールを生成するために合わせ得る。好ましくは、この画分は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む。この精製工程の収量を決定するために、さらなる製造過程のアッセイ（２７８ｎｍにおける吸光度によるタンパク質濃度）が行われ得る。
【００９０】
（第２の濃縮／ダイアフィルトレーション）
第２の（最後の）濃縮／ダイアフィルトレーション工程にはまた、１０ｋＤａ膜も用いる。上記のＳＰ−セファロースＨＰプールを約１２ｇ／Ｌタンパク質まで濃縮し、そして、３００ｍＭのＬ−アルギニン、および２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ５．５であるバッファー８容量にてダイアフィルター処理する。ダイアフィルター処理した溶液を回収し、この工程の収量を決定するために、２７８ｎｍにてタンパク質濃度を測定する。代表的には、最終のタンパク質濃度は、上記のユニットを流した後、約１０ｍｇ／ｍＬである。
【００９１】
薬物原料は０．２μｍの滅菌したフィルターを通して濾過してよく、そして、好ましくは６０℃未満で、最低２４ヶ月間保存され得る。
【００９２】
（薬物の処方）
上記に記述された方法に従って生産されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、治療的な投与に適している。好ましい実施形態において、薬学的処方物は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのＬ−アルギニン、および５ｍＭのＬ−メチオニン、ｐＨ５．５中に、０．１５ｍｇのａｌａ−ＴＦＰＩ／ｍＬを含む。第６０／４３８，５１９号、第６０／４９４，５７７号、第６０／５０９，２６０号、第６０／５１２，０９０号、第６０／４３８，５２４号、第６０／４９４，５４７号、第６０／５０９，２７６号、および第６０／５１２，０９２号に開示された処方物も参照のこと。
【００９３】
本開示に引用される全ての特許、特許出願、および参考文献は、本明細書において明白に、その全体が参考として援用される。上記の開示は一般に、本発明を記述する。本開示における特定の実施例は、例証のみの目的で提供され、そして本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
（アミノ酸解析およびアミノ酸組成の決定）
それぞれのロットの組換えａｌａ−ＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）薬物原料の３つの複製アリコートであって、それぞれが約６００ピコモル（約２０μｇ）のタンパク質を含むアリコートを、１％のフェノールを含む、不断に沸騰したＨＣｌ１００μＬ内にて、減圧中で１１０℃にて２２時間、加水分解した。還元、およびシステイン残基のカルボキシメチル化の後に得られた調製物のサンプルを、同様に処理した。遊離のアミノ酸をＢｅｃｋｍａｎ  Ｍｏｄｅｌ  ６３００アミノ酸解析装置を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって分離した。この装置は、タンパク質の加水分解産物をナトリウムバッファーと共に解析するための、製品のプログラムによって操作した。カラムのニンヒドリンによる誘導体化の後、上記のアミノ酸を、５７０ｎｍにて一級アミンを、または４４０ｎｍにてプロリンを定量化した。このシステムの較正は、Ｂｅｃｋｍａｎアミノ酸標準混合物の使用を通して達成された。全てのサンプルは、内部標準としてノルロイシン（Ｎｌｅ）を用いて、「棘波を描いた」。
【００９５】
（イオン交換法によるノルバリンおよびホモシトルリンの定量）
Ｂｅｃｋｍａｎ  ６３００アミノ酸解析装置を用いて、ノルバリンおよびホモシトルリンを定量化した。このとき、バリンからの、ノルバリンおよびホモシトルリンの分離を容易にするような、ナトリウムバッファー溶出プロトコール改変を使用した。この分離プロトコールにおいて、２つのバッファーを用いた：６ＮのＨＣｌにてｐＨ３．７５に滴定したＢｅｃｋｍａｎバッファーＮａ−Ｆ、および、ｐＨも濃度も変えないＢｅｃｋｍａｎバッファーＮａ−Ｄ。上記のプログラムは、Ｎａ−Ｆを最初の溶出液として使用し、カラム温度は２５℃であった。流量を４０分間維持し、その間にカラムの温度を、３０分間のイソクラティクな溶出の後に７５℃まで上昇させた。注入後４０分において、もう１５分間のイソクラティクな溶出のためにＮａ−Ｄを用いた。このプログラムは、ノルバリン、バリンおよびホモシトルリンの基線分離を生じ、そして塩基性アミノ酸の分離を維持した。
【００９６】
タンパク質の加水分解を、上記に記述したように行った。このシステムの較正は、Ｂｅｃｋｍａｎアミノ酸標準混合物の使用を通して達成された。ノルバリンは、Ｓｉｇｍａから入手した重量測定標準に対して定量した。ホモシトルリンは、オハイオ州のＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから購入し、そして重量測定標準をシステムの較正（下記を参照のこと）のために調製した。サンプルを上記のカラムに「過度に装填し」、そしてｒＴＦＰＩ内にて出現率の低いアミノ酸（タンパク質１モル当たり３モル）であるヒスチジンを、タンパク質中のロイシン（ノルバリン）およびリジン（ホモシトルリン）の含有量に基づいた取り込みレベルを算出するためのサンプル内に存在するｒＴＦＰＩのモル数を定義するために、定量した。
【００９７】
（ＲＰ−ＨＰＬＣ法によるホモシトルリンの定量）
ホモシトルリンは、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ・Ｔａｇアミノ酸解析法を用いて定量した。タンパク質を、１％のフェノールを含む６ＮのＨＣｌ内にて、１１０℃で２２〜２４時間加水分解し；遊離のアミノ酸を、ホウ酸塩バッファーの存在下で、高いｐＨにて、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）にて誘導体化した。このように、一級アミンおよび二級アミンの双方を、安定な蛍光性の誘導体に変換した。ここで、これらの蛍光性の誘導体は、逆相（ＲＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した。コントロール実験から、アミノ酸アナログの２５％が、酸加水分解の間にリジンに変換されることが示される。この反応を説明するために、このデータに補正因子を適用した。ノルバリンの定量の場合のように、ヒスチジンを定量してサンプル内に存在するｒＴＦＰＩのモル数を定義し、このタンパク質のリジン含有量に基づいて改変のレベルを算出した。
【００９８】
（エドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列解析）
たくさんのバルクのｒＴＦＰＩ生成物のＮ末端配列解析を、エドマン分解によって行った。この配列解析のそれぞれのサイクルの間に、タンパク質サンプルを、揮発性の塩基、カップリング試薬（フェニルイソチオシアネート）、および無水酸に曝露して、Ｎ末端アミノ酸残基のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体を放出し、このことにより、Ｎ末端において１つ残基が少ないタンパク質を産生している。遊離のＰＴＨ−アミノ酸誘導体を、逆相ＨＰＬＣによって確認した。
【００９９】
配列解析は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＥＢ）  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４タンパク質配列決定装置によって達成した。１：１０に希釈し、約５０ピコモルのタンパク質を含む、それぞれのロットのｒＴＦＰＩの１．５−μＬアリコートを水に希釈し、そしてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上に直接装填した。賦形剤を除くために、ＰｒｏＳｏｒｂシステム（ＰＥＢ）を用いた。プログラム、プロトコール、および試薬は、器具製造業者によって供給された。
【０１００】
（スルフヒドリル基の還元およびカルボキシメチル化（ＲＣＭ））
サンプルを、ｏ−リングキャップを有する１．５ｍＬの微量遠心チューブに移し、そしてＳａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ濃縮装置での減圧遠心分離によって乾燥した。それぞれのサンプルを、０．２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、６．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．００３Ｍのエチレンジアミン四酢酸を含み、ｐＨが８．５である、還元およびカルボキシメチル化（ＲＣＭ）バッファー２５０μＬに溶解し、そして、ジスルフィド結合を還元するために、１．０ＭのＤＴＴを１５μＬ加えた。このチューブにアルゴンガスを流し、そして酸素を排除するためにきつく蓋をした。このサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ内にて６０℃で１時間インキュベートした。新鮮なヨウ化酢酸ナトリウム（ＩＡＡ）溶液を、上記のＲＣＭバッファーの４倍希釈のアリコート内にて調製し（０．２５ｇ／ｍＬ、１．２Ｍ）、そしてＩＡＡ溶液２６μＬを、それぞれのｒＴＦＰＩサンプルに加えた。このチューブにアルゴンガスを流し、そして酸素を排除するためにきつく蓋をした。カルボキシメチル化反応を、室温にて、遮光して、３０分間行った。反応混合液をＮＡＰ−５カラムにて脱塩した。それぞれの反応の最終生成物のアリコートを、アミノ酸解析によって、タンパク質濃度を定量した。
【０１０１】
（タンパク質の脱塩）
いくつかの場合において、タンパク質を、解析または酵素的消化に先立って脱塩する。Ｖｙｄａｃ  Ｃ４ガードカートリッジ（４．６×２０ｍｍ；粒子サイズは５ミクロン）を、賦形剤（例えば、尿素、アルギニン、またはグアニジン塩酸塩）からタンパク質を分離するために用い、この賦形剤は多くの種類の解析を妨害し得る。１〜２ミリグラムのタンパク質のサンプルを、水中に０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（バッファーＡ）内で平衡化した上記のカラムに注入した。タンパク質を、上記のカートリッジから、流速毎分１．０ｍＬにて、バッファーＢ（水中に８０％のアセトニトリル：０．１％のＴＦＡ）の以下の勾配（終末点）にて溶出した：０分＝０％Ｂ；５分＝０％Ｂ；１５分＝９０％Ｂ；１８分＝９０％Ｂ；２０分＝０％Ｂ。上記の溶離液を、波長２２０ｎｍで、２．０吸光度単位フルスケール（ＡＵＦＳ）の範囲にて、モニターした。全ての賦形剤は、溶出の最初の５分間に溶出した。ｒＴＦＰＩのピークを手動で収集し、そして揮発性溶媒を減圧遠心分離にて除いた。
【０１０２】
（エンドプロテイナーゼ消化；非還元化ペプチド断片の生成）
１０μＬの、ロットＭＡＥＣＭ０１４由来のｒＴＦＰＩを、０．８μＧのＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により、１５０μＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８中で消化した。１０μＬのｒＴＦＰＩを、１．８ｍＭの酢酸亜鉛により、１５０μＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８中で消化した。上記のＡｓｐ−Ｎ消化は、３７℃にて１８時間行った。１５０μＬの８Ｍのグアニジン塩酸塩溶液の添加によって消化を終結させ、そしてサンプルを、解析前に、−８０℃にて保存した。
【０１０３】
（トリプシン消化；ＲＣＭペプチド断片の生成）
ＲＣＭ後の８０μＬずつのｒＴＦＰＩのアリコートを、トリプシン消化のために、１．５ｍＬ微小遠心チューブに移した。Ｐｒｏｍｅｇａブタトリプシン（２０μｇ）を０．０５Ｍ酢酸（４０μＬ）に溶解し、そしてこのトリプシン溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）１．６μＬを、それぞれのｒＴＦＰＩサンプルに加えた。最終のｒＴＦＰＩ濃度は、３５ｍＭトリス（ｐＨ８）内にて０．４ｍｇ／ｍＬであり、ここでトリプシン／ＴＦＰＩの割合は１／５０（ｗ／ｗ）であった。上記のトリプシン消化を、３７℃にて１８時間行った。サンプルの凍結により消化を停止させ、解析前に、−８０℃にて保存した。
【０１０４】
（非還元的Ａｓｐ−Ｎ  ＋４２／４３ＤａペプチドのＧｌｕ−Ｃエンドプロテイナーゼによる予備消化）
ＨＰＬＣにより単離したペプチドを、減圧遠心分離にて乾燥した。それぞれのサンプルを、ｐＨ４の３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液５０μＬに再溶解した。それぞれのペプチドサンプルに、約０．５μｇのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを加えた。この消化は、室温で一晩にて進めた。ｐＨ８の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーの添加にて、ｐＨを８に調整し；次いで、ＬＣ−ＭＳによる解析に先立って、１ＭのＤＴＴ０．５μＬを６０℃にて３０分間用いることで、還元した。
【０１０５】
（還元条件下でのＧｌｕ−ＣペプチドのＡｒｇ−Ｃエンドプロテイナーゼによる予備消化）
ＨＰＬＣにより単離したペプチドを、減圧遠心分離にて乾燥した。消化バッファーは、１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５ｍＭの塩化カルシウムで、ｐＨは７．５であった。酵素活性化バッファーは、消化の直前に、キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にて供給される凍結乾燥された材料に３００μＬの水を加えて作った。エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ酵素溶液は、５μｇの凍結乾燥された酵素を２５０μＬの水の中で再構成することで調製した。それぞれのサンプルを、３μＬの活性化バッファーおよび１μＬのＡｒｇ−Ｃ酵素溶液に加えて、７μＬの消化バッファーに、再溶解した。この消化は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析に先立って、３７℃にて２時間で進めた。
【０１０６】
（高速勾配ＬＣ−ＭＳ；インタクトなｒＴＦＰＩの分子量の測定）
インタクトなｒＴＦＰＩの分子量の測定を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １００質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）とインターフェースで接続されたＭｉｃｈｒｏｍ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＵＭＡ）  ＨＰＬＣシステムを用いて行った。サンプル（それぞれ約２μｇ）を、逆相（ＲＰ）カラム（Ｚｏｒｂａｘ  Ｃｙａｎｏ、１ｍｍ×１５０ｍｍ）に注入した。溶媒Ａは、水および０．１％のＴＦＡ内に５％のアセトニトリルであり、溶媒Ｂは、０．０９％のＴＦＡを含むアセトニトリルであった。勾配溶出は、流速５０μＬ／分にて、１０分間に５％Ｂ〜９５％Ｂにて行った。流出液を、フローセルの後で１０：１の割合にて分配し、約５μＬ／分でＡＰＩ  １００質量分析計のエレクトロスプレーイオン源に指向させた。上記のイオンスプレーの電圧を４．５ｋＶに設定し、そして開口部の電圧を５０ボルトに設定した。この装置は、製造業者によって供給されるポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）混合物から発生するイオンによって、較正した。
【０１０７】
エレクトロスプレーイオン化の間、ペプチドまたはタンパク質を、低いｐＨにて質量分析計のイオン源に導入する。タンパク質およびペプチド中の塩基性部分（アルギニン残基、リジン残基およびヒスチジン残基の側鎖中の窒素原子、およびＮ末端残基のα−アミノ基）を、種々の程度にプロトン化し、このことは結果として複数の荷電状態の分子イオン（例えば、［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋２Ｈ］２＋）を生じ、この荷電状態は、プロトン化のために接触しやすい部位の数に依存する。この検出器は、ソフトウェアのアルゴリズムによって分子量を計算し得る、分子イオンの電荷に対する質量の比（ｍ／ｚ）を記録する。この方法における上記の測定の質量の精度は、ｒＴＦＰＩの分子量の０．０１％（±３Ｄａ）であった。
【０１０８】
（低速勾配ＬＣ−ＭＳ；個々のｒＴＦＰＩ成分のインタクトな分子量の測定）
５μｇのサンプルを、逆相（ＲＰ）カラム（Ｚｏｒｂａｘ  Ｃｙａｎｏ、１ｍｍ×１５０ｍｍ）にて解析した。溶媒Ａは水および０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の５％のアセトニトリルであって、溶媒Ｂは０．０９％のＴＦＡを含むアセトニトリルであった。勾配溶出は、流速５０μＬ／分にて、３０分間に２７％Ｂ〜３２％Ｂにて行った。エレクトロスプレーイオン化質量分析計の操作は、上記に記したとおりに行った。
【０１０９】
（非還元的ペプチド消化物のＬＣ−ＭＳ；ペプチドの質量測定）
上記のＡｓｐ−Ｎ消化物の１０μＬのアリコートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １００質量分析計とインターフェースで接続されたＭｉｃｈｒｏｍ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＵＭＡ）  ＨＰＬＣシステムを用いたＬＣ−ＭＳ解析に供した。サンプルを、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、Ｒｅｌｉａｓｉｓｌ  Ｃ１８、またはＺｏｒｂａｘ  Ｃｙａｎｏカラム（１ｍｍ×１５０ｍｍ、粒子サイズ５μｍ、および細孔サイズ３００オングストローム）を用いたＬＣ−ＭＳのための逆相（ＲＰ）カラムに注入した。溶媒Ａは水および０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）内に５％のアセトニトリルで、そして溶媒Ｂは０．０９％のＴＦＡを含むアセトニトリルであった。勾配溶出は、流速５０μＬ／分にて、２５分間に５〜２５％の溶媒Ｂ、および３０分間に２５％〜３６％のＢにて行った。トリプシン消化物のためには、勾配溶出は、８０分間に５％〜４５％のＢにて行った。流出液を、フローセルの後で１０：１の割合で分配し、約５μＬ／分でＡＰＩ  １００質量分析計のエレクトロスプレーイオン源に指向させた。イオンスプレー電圧を４．５ｋＶに設定し、そして開口部の電圧を５０ボルトに設定した。この装置は、製造業者によって供給されるポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）混合物から発生するイオンによって、較正した。ＬＣ−ＭＳによる分子量測定の質量の精度は、ｒＴＦＰＩペプチドの質量の範囲内で、±１Ｄａであった。
【０１１０】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ；ペプチドの正確な質量計測）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、窒素レーザー（３３７ナノメートル、４ナノ秒のパルス）および、遅延引き出し（ｄｅｌａｙｅｄ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）イオン源を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ装置上にて得られた。解析のためのサンプルは、１μＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の飽和溶液に１μＬを加えることで調製した。混合物をボルテックスし、そして１μＬをサンプル標的に装填した。風乾したサンプル／マトリックス混合物を、真空ロックを用いて、質量分析計に導入した。加速電圧に２０ｋＶ、リフレクトロン（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）電圧に２１．５ｋＶを用いて、スペクトルを記録した。遅延性イオンの引き出しのために、サンプルプローブと抽出レンズとの間に、６ｋＶの電位差を適用した。外部較正標準として公知のペプチドの混合物を用いて、スペクトルを較正した。遅延引き出しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量測定の質量の精度は、外部較正を用いて±０．５Ｄａであった。いくつかの場合において、サンプル中の公知のペプチドを用いて、スペクトルを較正した。この場合、質量の精度は、ペプチドの質量が２，０００Ｄａ以下（約１０ｐｐｍ）の場合に、±０．０２Ｄａであった。
【０１１１】
（ナノＥＳ  ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ；ペプチド改変の同定）
特注のイオン源（Ｗｉｌｍ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ、ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および、最新の高圧衝突セルを備えた、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−ＩＩＩ三連四重極装置上にて、実験を行った。それぞれのサンプルの約１μＬを、金で覆ったガラス毛細管針に装填し、そして立体顕微鏡を用いて、質量分析計源内に位置させた。質量スペクトルを、解析するペプチドに適したｍ／ｚの範囲にわたって、８秒／走査にて、０．１Ｄａのステップサイズ（ｓｔｅｐ  ｓｉｚｅ）を用いて記録した。この装置は、ＰＰＧ混合物から発生するイオンを用いて較正し、このＰＰＧ混合物は製造者から供給された。
【０１１２】
低エネルギー衝突誘起解離直列質量スペクトル（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）を、陽イオン型にて取得した。サンプルを、上記のように、ＭＳイオン源に導入した。二次四重極を、５０〜親イオンのｍ／ｚの範囲のｍ／ｚにわたって、５〜１０秒／走査にて、１Ｄａのステップサイズを用いて走査した。開口部の電位を４０ボルトに設定し、そして衝突エネルギーを約６０電子ボルトとした。直列質量分析において、目的の分子イオンは、ペプチドの混合物の中で、選択的に衝突セルに導入され得る。衝突セル内での不活性ガスによる衝撃は、結果として、そのペプチドのアミド結合における断片化をもたらす。衝突セル内で生成された上記の断片を、二次質量分析計にて解析する。直列の質量スペクトルは、任意の共有結合性の改変の位置を含むアミノ酸配列情報を提供する。
【０１１３】
（質量の割り当て；モノアイソトピック（Ｍｏｎｏｓｉｏｔｏｐｉｃ）質量）
遅延イオン引き出しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるペプチドの解析において、純粋なペプチドの質量スペクトルは、高い分解能にて多くのピークを有し、それぞれのピークは、特定の同位元素存在量を有するペプチドに対応する。化合物のモノアイソトピック質量は、その化合物内の元素の最も軽い安定同位体の質量（例えば、炭素は１２．００００Ｄａ；９８．９０％の存在量）の和である。天然の存在量が１．１０％である、質量が１３．００３４Ｄａの炭素の安定同位体が存在するため、１００以上の炭素原子を有する任意の有機化合物は、１つ以上の炭素−１３異性体を有する。ペプチドの質量スペクトルの主要なイオンは、１つの水素イオンの単純な捕捉に起因する；較正ソフトウェアの使用により、炭素−１２異性体への割り当てを利用することで、上記のスペクトルの構成成分のモノアイソトピック質量が得られる。同位体ピークがその異性体のレベルで分離し得た場合（例えば、より低い質量値でか、または高分解能の装置を用いることを通して）、モノアイソトピック分子質量がＭＳ解析によって得られる。
【０１１４】
（質量の割り当て；平均値）
ペプチドまたはタンパク質の平均分子量は、その分子のそれぞれの元素の化学的平均質量の和である。元素の平均化学的質量は、すべての安定同位体の質量の和（例えば、炭素は１２．０１１１Ｄａ）であり、相対的存在量として重さを計られる。モノアイソトピックピークが分離し得なかった場合（例えば、高い質量値で）、平均分子量がＭＳ解析によって得られる。
【０１１５】
（実施例２）
（標準物質の薬物物質放出試験）
ＣＥＸ  ＨＰＬＣおよびＳＥＣ  ＨＰＬＣにて評価した、方法Ｂに従って調製したｒＴＦＰＩの純度および、方法Ｃに従って調製したｒＴＦＰＩの純度の比較を、それぞれ図２および図３に示す。クーマシー染色または銀染色を用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を、それぞれ図４および図５に示す。これらのデータは、これらの放出アッセイによる、方法Ｂの薬物物質と方法Ｃの薬物物質との間の比較性を示す。ＣＮ  ＨＰＬＣによる同じ物質の比較を、図１１に示す。
【０１１６】
（主要な成分の物理的な性質決定）
（アミノ酸組成）
方法Ｃに従って調製したｒＴＦＰＩについて決定されたアミノ酸組成を表４に示す。アミノ酸の回収は、１分子ごとの残基に標準化した。理論的な値は、ｒＴＦＰＩ遺伝子のヌクレオチド配列から予測した。アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基はアスパラギン酸（Ａｓｘ）として回収した；グルタミン酸残基およびグルタミン残基はグルタミン酸（Ｇｌｘ−全てのアミド連結は酸処理により加水分解される）として回収した。システインの値は、ＲＣＭタンパク質調製物の中のカルボキシメチル−システインの定量化によって決定した。トリプトファンは、標準の加水分解条件下では破壊されるため、決定しなかった（ＮＤ）。イソロイシンの回収は、この残基により形成される結合が、２２〜２４時間では部分的にしか加水分解されないため、低かった。システインの値は、上記の方法の誤差範囲内で、ヨード酢酸試薬との完全な反応性を示す。上記の２つの参照ロットのタンパク質のアミノ酸組成は、このタンパク質の予測された配列と一致する。
【０１１７】
【表４】
2007528211.tif 000005
サンプルは還元し、およびカルボキシメチル化した。
結果は、タンパク質１モル当たりのアミノ酸残基のモル数として表す。
Ｔｒｐは全く定量しない。
Ａｓｘ＝Ａｓｐ＋Ａｓｎ；Ｇｌｘ＝Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ
（Ｎ末端）
エドマン分解によるＮ末端配列解析の結果を表５に示す。示された収量は、それぞれの分解サイクルにおける、対応するＰＴＨ−アミノ酸誘導体の回収の総量である。同一性は、それぞれのサイクルにおける相対的な回収から推論した：繰り返さない残基の場合における、最大の増加；繰り返す残基の場合における、持続して高い収量（他の誘導体の大きな増加は無しで）。サイクル回収における相違は、サンプルの沈着の間の、ＰＶＤＦ膜上の上記の２つのロットに由来するタンパク質の回収の相違を反映する。それぞれのロットから同じ結果を得た：ｒＴＦＰＩ遺伝子のヌクレオチド配列から予測されたものと正確に一致した、主要素をなす１５残基の配列。
【０１１８】
【表５】
2007528211.tif 000006
＊ピコモル単位のＰＴＨ−アミノ酸としてのサイクル収量。
【０１１９】
（分子量）
ＬＣ−ＭＳによるインタクトなｒＴＦＰＩの解析から、それぞれのロットの主要な成分が、上記遺伝子の配列から予測される分子量（９つのジスルフィド結合を有し、理論的分子量が３４，００４Ｄａ）を有することが示された。このことは、上記の組換え細胞株によってタンパク質の全体が発現されることを示す。図６は、方法Ｂに従って調製したｒＴＦＰＩロット（ＭＡＥＣＭ０１４）の逆重畳積分エレクトロスプレー質量スペクトル、および方法Ｃに従って調製したｒＴＦＰＩロット（ＰＢ５８０６）の逆重畳積分エレクトロスプレー質量スペクトルを示す。少数のＲＴＦＰＩの成分もまた観察され、そしてこれらの構造の更なる詳細は他で示す。表６には、ＬＣ−ＭＳ解析の間に観察された主要なｒＴＦＰＩ分子イオンの質量を収載する。
【０１２０】
【表６】
2007528211.tif 000007
１質量の精度は、約±３Ｄａ。
【０１２１】
（一次構造）
ｒＴＦＰＩの全体の配列を、ロットＭＡＥＣＭ０１４およびロットＰＢ５８０６についての、非還元的（天然の）タンパク質のＡｓｐ−Ｎエンドプロテイナーゼペプチド地図の解析、ならびにＬＣ−ＭＳによるＲＣＭタンパク質のトリプシンによって生じたペプチド地図の解析の併用によって、確かめた。ＬＣ−ＭＳを用いると、従来のペプチド地図および、クロマトグラムにおけるペプチドの分子量がともに、単一の実験で得られる。Ａｓｐ−Ｎペプチド地図およびトリプシンによって生じたペプチド地図は、一次構造を確かめるためのタンパク質配列の重複した領域に関する情報を提供した。図７は、ＬＣ−ＭＳ解析の間に記録した、ロットＭＡＥＣＭ０１４およびロットＰＢ５８０６の非還元的ｒＴＦＰＩについてのＡｓｐ−ＮペプチドのＵＶクロマトグラムを示す。表７には、測定された分子イオンのｍ／ｚと、Ａｓｐ−Ｎペプチドについて理論的に予測されたｍ／ｚ値との比較から、Ａｓｐ−Ｎペプチド地図内で同定されたペプチドを収載する。図８は、ＬＣ−ＭＳ解析の間に記録した、ロットＭＡＥＣＭ０１４およびロットＰＢ５８０６のＲＣＭ  ｒＴＦＰＩについてのトリプシンによって生じたペプチドのＵＶクロマトグラムを示す。表８には、測定された分子イオンのｍ／ｚと、ｒＴＦＰＩのトリプシンによって生じたペプチドについて理論的に予測されたｍ／ｚ値との比較から、トリプシンによって生じたペプチド地図内で同定されたペプチドを収載する。Ａｓｐ−Ｎペプチド地図およびトリプシンによって生じたペプチド地図からのＬＣ−ＭＳ結果を合わせると、そのタンパク質配列の１００％（２７７残基中２７７）の説明となり、そして双方のロットにおけるタンパク質の一次構造が確認される。
【０１２２】
上記のペプチド地図作製の結果は、方法Ｃに従って生成したｒＴＦＰＩの一次構造だけでなく、カルバミル化されたｒＴＦＰＩ不純物の除去も確認する。方法Ｂの方法が用いられた場合に起きる、ｒＴＦＰＩへの＋４２Ｄａの改変が、第３のクニッツドメイン（２０６〜２５８残基）に結合したタンパク質の領域に存在すると同定した。方法Ｃに従って調製したｒＴＦＰＩのＡｓｐ  Ｎ消化物およびトリプシンにより生ずる消化物の解析から、このドメインに対応するペプチドが、改変されていないｒＴＦＰＩの理論的な質量に一致した質量を有することが示される。このことは、上記の修正された方法によって生成されたｒＴＦＰＩから、カルバミル化された化学種が精製されたことを示す。さらに、この解析の間に、検出可能なレベルのホモシトルリンは見つからず、このことは、上記のｒＴＦＰＩサンプル内からカルバミル化されたリジン残基がないことと矛盾しない。
【０１２３】
【表７】
2007528211.tif 000008
＊１５００Ｄａより少ないモノアイソトピック質量、１５００Ｄａを超える平均分子量。
ＨＰＬＣのピーク４およびピーク７はそれぞれ、クニッツ領域内のジスルフィド結合で一緒にされた２つのペプチドを含んだ。
【０１２４】
【表８】
2007528211.tif 000009
＊１５００Ｄａより少ないモノアイソトピック質量；１５００Ｄａを超える平均分子量。
【０１２５】
（二次／三次構造）
ｒＴＦＰＩの二次／三次構造を、ロットＭＡＥＣＭ０１４およびロットＰＢ５８０６のＡｓｐ−Ｎエンドプロテイナーゼペプチド地図の解析から確認した。ここで、インタクトなクニッツドメインが認められた（図１１および表８）。図９はｒＴＦＰＩ構造を図示し、これは３つのクニッツドメインおよびＡｓｐ−Ｎ切断部位を示す。非変性条件下にて、上記のクニッツドメイン間のＡｓｐ−Ｎ切断に起因して、７つのペプチドが認められる。これらのペプチドのうちの２つはまた、内部的にも切断されるが、結果として生じるペプチドは、ジスルフィド結合によって一緒にされる（図９）。上記のデータは、天然のタンパク質の二次／三次構造について予測されたとおり、クニッツドメイン内のジスルフィド結合の存在および、クニッツドメイン間のジスルフィド結合の非存在と矛盾しない。
【０１２６】
（実施例３）
（微量な成分の同定および性質決定）
（ＣＮ  ＨＰＬＣによる純度の評価）
方法Ｂに従って調製したｒＴＦＰＩのＣＮ  ＨＰＬＣクロマトグラム（Ａ）と、方法Ｃに従って調製したｒＴＦＰＩのＣＮ  ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｂ）の比較を図１０に示す。このアッセイによって分離された全てのピークがｒＴＦＰＩを含む。ＥＳ−ＭＳを用いたピークの解析から、方法Ｂの物質は、理論的な質量を有するｒＴＦＰＩを約７５％、１６原子質量単位だけ増加した質量を有しかつ酸化したメチオニン残基を含むと考えられるｒＴＦＰＩ（ピーク１）を５〜１０％、および、４２原子質量単位または４３原子質量単位だけ増加した質量を有しかつアセチル化したリジン残基を含むと考えられるｒＴＦＰＩ（ピーク３）を約１５％含む。方法Ｃに従って調製された物質は、約９０％のｒＴＦＰＩの主要なピーク、および酸化したメチオニン残基を含む５〜１０％のｒＴＦＰＩ（ピーク１）を含む。前の方法とは異なり、本発明の方法では、感知できるほどのレベルのアセチル化したｒＴＦＰＩを生成しないようである。本発明の方法に対する参照標準（ピーク２、図１０）は小さな肩を示す。この肩は、ｒＴＦＰＩの主要なピークのすぐ前に溶出し、そして、以下の節にて記述する、ロイシンに対するノルバリンでの置換を含むｒＴＦＰＩとして同定された。
【０１２７】
（ノルバリンの誤取り込みの同定）
ロイシンに対するノルバリンでの置換は、Ｅ．ｃｏｌｉにて発現された異種タンパク質中で同定され、そしてｔＲＮＡレベルでの誤取り込みを通して生じると考えられる（Ａｐｏｓｔｏｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２８９８０−８８、１９９７）。ｒＴＦＰＩは１５残基のロイシン残基を含み、そしてロイシンの代わりのノルバリンの取り込みは、９０位、１００位、１８１位および１９１位に位置する４残基に同定された。方法Ｂに従って調製されたｒＴＦＰＩロット（ＭＡＥＣＭ０１４）および方法Ｃに従って調製されたｒＴＦＰＩロット（ＰＢ５８０６）の特定の部位における誤取り込みのレベルは、ＬＣ−ＭＳの間に記録される、通常のＲＣＭ  ｒＴＦＰＩのトリプシンにより生じるペプチドのＵＶピーク面積と、相当するノルバリンを含むトリプシンにより生じるペプチドのＵＶピーク面積との比較により推定した。ノルバリンの総量は、アミノ酸解析により定量した。
【０１２８】
（収集したＣＮ  ＨＰＬＣの肩中のノルバリンの同定）
ＣＮ  ＨＰＬＣアッセイでの上記の肩中のｒＴＦＰＩの平均分子量は、ＬＣ−ＭＳによって３１，９８９Ｄａと同定された。この値は、ｒＴＦＰＩについて予測された分子量（３２，００４Ｄａ）よりも、１５Ｄａ±３Ｄａだけ低い。この改変の性質を同定するために、ピーク２（図１０）のタンパク質を還元およびカルボキシメチル化し、そして次いで、トリプシンで消化した。このトリプシンにより生じたペプチドをＬＣ−ＭＳにて解析し、そして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる正確な質量の測定のために収集した。収集した６つの画分の内４つは、予測された分子量よりも１４Ｄａ低い、モノアイソトピック分子量を示した（表９）。このペプチドを、ナノＥＳ  ＭＳ／ＭＳおよびエドマン分解にて配列決定した。上記の改変は、９０位、１００位、１８１位および１９１位における予測されるロイシン残基でのノルバリンの取り込みと同定され、そして、エドマン配列解析の間のＰＴＨ−アミノ酸の保持時間によって確認された。
【０１２９】
【表９】
2007528211.tif 000010
ロットＰＢ６０９６のＣＮ  ＨＰＬＣピーク２由来の、トリプシンにより生じたペプチドを、ＬＣ−ＭＳにより単離した。
ノルバリンはｎＶと略し、そして上記のペプチド配列中にて太字体で示す。
ｎＶ１００、ｎＶ９０、ｎＶ１８１およびｎＶ１９１はそれぞれ、１００位、９０位、１８１位および１９１位における誤取り込みを示す。
【０１３０】
（ＬＣ−ＭＳによる、特定部位におけるノルバリン誤取り込みの定量）
上記のＲＰ  ＨＰＬＣの肩が、ノルバリンを誤取り込みしたｒＴＦＰＩの画分を含むに過ぎない可能性があったことから、方法Ｃに従って調製した分画していない参照物質を、ノルバリン含有ペプチドの定量について解析した。ロットＰＢ５８０６を還元し、アルキル化し、そして次いでトリプシンで消化した。ノルバリン含有ペプチドの定量のために、４反復のＬＣ−ＭＳ解析を行った。分子量の同定のために完全走査方式を用いて、そしてノルバリン含有ペプチドの検出感度の上昇のために選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を用いて、データを取得した。
【０１３１】
図１２Ａでは、ＬＣ−ＭＳの間の３０〜６０分間に記録したＵＶクロマトグラムを示す。約５１分に溶出するピークは、平均分子量２５８５．２Ｄａの、トリプシンにより生じたペプチドＴ（８８〜１０８）として同定された。ペプチドＴ（８８〜１０８）のＳＩＭクロマトグラムを図１２Ｂに示す。ＵＶ検出器によるペプチドの検出と、ＬＣ−ＭＳの間の質量分析計での検出との間にはわずかな遅れがあり、それは、これらの２つの検出器の間を溶出液が移動するためにかかる時間に起因することに注意されたい。約４８分および４９分に溶出する小さなピークは、それぞれ、１００位の残基にてノルバリンの誤取り込みが起きたペプチドＴ（８８〜１０８）（ペプチドｎＶ１００）、および９０位の残基にてノルバリンの誤取り込みが起きたペプチドＴ（８８〜１０８）（ペプチドｎＶ９０）として同定された（平均分子量２５７１．２Ｄａ；理論的質量２５７１．２Ｄａ）。上記のノルバリンの取り込み部位は、エドマン分解、およびナノＥＳ  ＭＳ／ＭＳ解析によって上記で同定されたｒＴＦＰＩロットＰＢ６０９６中のＲＰ  ＨＰＬＣの肩に由来するペプチドとの比較に基づいた。
【０１３２】
図１２ＣではペプチドｎＶ１００およびペプチドｎＶ９０のＳＩＭクロマトグラムを示し、ここではこれらの２つのペプチドが明らかに観察される。ペプチドＴ（８８〜１０８）、ペプチドｎＶ１００およびペプチドｎＶ９０の割合は、上記のＵＶクロマトグラム（図１２Ａ）でのピーク面積、および４つの別々の解析から得られる値から算出した。１７８残基〜１９６残基を含むトリプシンにより生じたペプチド内でのノルバリン置換の度合いを定量するためにも、同様の研究方法を用いた。
【０１３３】
表１０では、４反復のＬＣ−ＭＳ解析における、９０位、１００位、１８１位および１９１位の残基におけるノルバリンの誤取り込みの定量を示す。配列番号３４〜３９に示されるペプチドについて、２１５ｎｍにおけるピーク面積を積分した。ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３についてピーク面積を総計し、そしてその総計に対するそれぞれのピークの割合を計算して、そしてこの表に示す。同様のことをペプチド４、ペプチド５およびペプチド６について行った。ノルバリンはｎＶと略し、そしてペプチド配列中にて太字体で示す。誤取り込みの相対量を、ノルバリン含有ペプチドのＵＶピーク面積と、相当する非置換ペプチドとの比較から算出した。
【０１３４】
こうしたいろいろな要素を含む結果は、ノルバリン置換が、参照ロットＰＢ５８０６（方法Ｃに従って調製された）において、９０位、１００位、１８１位および１９１位の残基において起きたことを示す。これらの部位における取り込みのレベルは、それぞれ３．３％、４．３％、２．８％および１．４％である。このことは、ＰＢ５８０６における誤取り込みのモルのレベルが、少なくとも１１．８％であることと一致する。対照的に、方法Ｂに従って調製した参照ロット（ＭＡＥＣＭ０１４）におけるノルバリンの誤取り込みは、おそらく１００位の残基において、極小のレベルでしか検出されず、そして０．２％未満であると推定された。
【０１３５】
【表１０】
2007528211.tif 000011
（アミノ酸解析による総ノルバリン誤取り込みの定量）
表１１では、イオン交換アミノ酸解析による、ｒＴＦＰＩ調製物中のノルバリン定量の結果の概略を示す。この結果は、ノルバリンとして誤取り込みされたロイシンのモルベースでの百分率として表される。この解析方法では、ロットＭＡＥＣＭ０１４（方法Ｂの参照）のｒＴＦＰＩ内には、検出可能な量のノルバリンはない。しかし、方法Ｃの参照（ＰＢ５８０６）および、上記の新しい方法によって調製した他のロットは、ロイシン１モル当たり、平均で２．６４％のノルバリンを含む。ロイシンに代わるノルバリンの誤取り込みがランダムに起き、そしてｒＴＦＰＩ分子１つごとに平均で１つのノルバリンがある場合、このことは、４０％以下のｒＴＦＰＩ分子が１つのノルバリン置換を有することを示す。これらの結果は、上記のＬＣ−ＭＳのデータから生成された相対量の予測を確かなものとする。
【０１３６】
【表１１】
2007528211.tif 000012
（インビトロでの活性に対するノルバリン置換の影響）
表１２では、方法Ｂに従って調製した物質に対するインビトロでのＰＴ生物活性、および方法Ｃに従って調製した物質に対するインビトロでのＰＴ生物活性の概略を示す。ノルバリンの存在は、ｒＴＦＰＩのインビトロでの生物学的活性に不利に影響しない。たとえ、ＣＮ  ＨＰＬＣの純度が実質的に上昇したとしても、ＰＴ活性は定常のままである。このことは、この異質性が、活性に極小の影響しか有しないことを示す。
【０１３７】
【表１２】
2007528211.tif 000013
ＮＤ、決定せず。ＰＴ活性は、コントロールに対する％として表す；放出規格は５０〜１５０％。
【０１３８】
（実施例４）
（陽イオン交換ＨＰＬＣによる純度評価における微量な構成要素）
図１３では、ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーを行う前および後のｒＴＦＰＩの比較を示す。このＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程の後で、主要なピークの純度は８９％（装填）から１００％（プール）に増加する。
【０１３９】
（実施例５）
（インタクトな分画していないｒＴＦＰＩ薬物物質の解析）
ＬＣ−ＭＳによるインタクトなｒＴＦＰＩの解析を、方法Ｃに従って調製した物質の同一性を実証するために行った。主要な構成成分の観察された質量は３２，００７Ｄａである。このことは、ｒＴＦＰＩの理論的な質量が３２，００４Ｄａであることと一致する。これらの結果は、組換え細胞株によって完全なタンパク質が発現されていることを示す。
【０１４０】
（低速勾配ＬＣ−ＭＳ）
分画していない、ｒＴＦＰＩロットＭＡＥＣＭ０１４（方法Ｂに従って調製）、ならびにｒＴＦＰＩロットＰＢ５８０６、ＰＢ６０９６、およびＰＢ６７７０（方法Ｃに従って調製）を、早期に溶出するピークおよび後期に溶出するピークの割り当てを確かめるために、低速勾配ＬＣ−ＭＳにて解析した。
【０１４１】
図１４ではＬＣ−ＭＳの間に記録したＵＶクロマトグラムを示し、ここで、早期に溶出するピークは全てのｒＴＦＰＩロットにおいて観察されるが、後期に溶出するピークはＭＡＥＣＭ０１４参照ロットでのみ観察される。このクロマトグラムは純度評価アッセイにより観察されたクロマトグラムと類似しているが、ＬＣ−ＭＳによってピークがより少なくしか分解されない点で異なり、このことは、この解析において内径の小さな（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）カラムの方法を用いることに起因する。全てのサンプルにおける早期に溶出するピークの逆重畳積分質量スペクトルから、全てのスペクトルにおいて観察される主要な分子イオンは、メチオニンスルホキシドを含むｒＴＦＰＩと一致することが決定された。
【０１４２】
方法Ｃに従って調製した物質はまた、通常のＴＦＰＩよりも２８Ｄａ低い分子量を有する分子イオンも含む。このことは、ＴＦＰＩ分子が、予測されるロイシン残基において、一分子あたり２つの部位のノルバリンの取り込みを含むことと一致する。ロットＭＡＥＣＭ０１４において後期に溶出するピークの逆重畳積分質量スペクトルから、１つの構成成分が＋４２／４３Ｄａの化学種であることを含むことが決定された。新たなロットのＵＶクロマトグラムの同一の領域に由来する逆重畳積分質量スペクトルは、＋４２／４３Ｄａの構成成分の量が顕著に少ないことを示す。この知見は、アセチル化したｒＴＦＰＩが、方法Ｂに従って調製した参照物質には同定されるが、方法Ｃに従って調製した物質には同定されないことと一致する。
【０１４３】
（高速勾配ＬＣ−ＭＳ）
方法Ｂの参照の質量スペクトルは、通常のｒＴＦＰＩよりも＋４２／４３Ｄａ高い分子量を有する微量の成分を示す（約１５％の相対存在量）。Ａｓｐ−ＮおよびＡｒｇ−Ｃによる連続的な消化によってｒＴＦＰＩロットＭＡＥＣＭ０１４から単離された２つの微量なペプチドを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる正確な質量測定および、ナノＥＳ  ＭＳ／ＭＳによる配列解析に基づき、アセチル化したペプチドとして同定した（
【０１４４】
【化１】
2007528211.tif 000014
、配列番号４０、および
【０１４５】
【化２】
2007528211.tif 000015
、配列番号４１）。この単離したペプチドでは、＋４２Ｄａの（アセチル化した）改変を有するインタクトなｒＴＦＰＩロットＭＡＥＣＭ０１４における、＋４２／４３Ｄａの化学種の割合が同定されていない。しかし、ＣＥＸ−ＨＰＬＣおよび、上記の低速勾配ＬＣ−ＭＳからのデータと総合すると、ＣＮ  ＨＰＬＣによって方法Ｂ参照ロットにおいて検出される＋４２／４３Ｄａの微小な成分は、主にアセチル化したｒＴＦＰＩであるようである。
【０１４６】
（実施例６）
（Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の除去）
方法Ｂに従って生産したｒＴＦＰＩ調製物中のＥ．ｃｏｌｉタンパク質の相対量と、方法Ｃに従って生産したｒＴＦＰＩ調製物中のＥ．ｃｏｌｉタンパク質の相対量とを比較するために、後者の方法によるサンプルを、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質に対して産生した抗体を用いた抗体ＥＬＩＳＡアッセイを用いて解析した。
【０１４７】
表１３の結果は、この精製方法が、推定のＥ．ｃｏｌｉ不純物をこのアッセイにおける検出レベル未満にまで除去するのに効果的であることを示す。
【０１４８】
【表１３】
2007528211.tif 000016
（実施例７）
（ノルロイシン置換）
細菌性タンパク質において、メチオニンのアナログであるノルロイシンが、メチオニンの代わりになり得ることはよく立証されている。組換えタンパク質を過剰生産するようにストレスをかけられているＥ．ｃｏｌｉ細胞において、この置換は特に優勢であり得る。組換えａｌａ−ＴＦＰＩは５つのメチオニン残基を有し、カルボキシ末端に１つを含む。本明細書にて記述される方法では、アミノ酸置換の量を増やさずに発現レベルを向上させる。
【０１４９】
３ロットのｒＴＦＰＩを方法Ｃに従って調製し、そしてノルロイシン置換について試験した。結果を表１４に示す。ここで、ノルロイシンは総メチオニンの百分率として表す。
【０１５０】
【表１４】
2007528211.tif 000017
これらの物質中のノルロイシンのレベルは、方法Ｂに従って調製した物質中の存在レベルよりも僅かに低かった。定量の限界は１％であり；このように、双方のレベルとも、このアッセイによる正確な定量のレベルを下回っている。
【０１５１】
（実施例８）
（脱アミド化の測定）
（較正用標準調製物）Ｓ−アデノシル−ホモシステイン（ＳＡＨ）標準物質を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＳＡＨ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（１５．１μＭ）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５０μＭ、および３．７５μＭの濃度まで希釈することで、ＨＰＬＣ解析のために調製した。サンプルは、ＨＰＬＣによる解析以前は、２〜８℃にて保った。
【０１５２】
（ｒＴＦＰＩサンプルの調製）サンプルの調製に先立って、ｒＴＦＰＩのバルクの薬物物質サンプル（１０．０ｍｇ／ｍｌ）を、ｒＴＦＰＩ処方バッファーを用いて０．１５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。次いで、それぞれのｒＴＦＰＩサンプルを、３０μｌの５×Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、３μｌのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、および３０μｌのＰＩＭＴを含む反応混合物に、８７μｌのＴＦＰＩを加えることで、インキュベートのために調製した。短時間のボルテックスの後、サンプルを、３０℃に維持したウォーターバスにて３０分間インキュベートした。インキュベート後、それぞれのサンプルに３０μｌのＰｒｏｍｅｇａ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＮＲを加え、続いて短時間ボルテックスした。サンプルは、ＨＰＬＣによる解析以前は、２〜８℃に保った。
【０１５３】
（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ＳＡＨの測定は、ＣａｒｌｓｏｎおよびＲｉｇｇｉｎ２によって開発された、改変されたＲＰ−ＨＰＬＣ方法を用いて行った。サンプルの解析は、ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ  ５μｍ、１２０Ａ、４．６×２５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｐ／Ｎ  ＡＱ１２Ｓ０５２５４６ＷＴ）を装着したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを用いて行った。溶離液Ａは、２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭの１−オクタンスルホン酸、および１０％のメタノールからなり、一方、溶離液Ｂは１００％メタノールとした。上記のシステムを１０％の溶離液Ｂにて、流速１．０ｍｌ／分で平衡化した。上記のカラムを周囲温度に維持し、２６０ｎｍでモニターして検出した。サンプルの注入後（ＳＡＨ標準物質について４０μｌ、およびＴＦＰＩサンプルについて１００μｌ）、１５分間にわたる溶離液Ｂの１０〜６０％の勾配、続いて９０％の溶離液Ｂによる３分間のカラム洗浄によって、分離を達成した。次いで上記のカラムを、次の注入に先立って、９分間の最初の条件（１０％の溶離液Ｂ）にて再平衡化した。
【０１５４】
（データ解析）ＳＡＨ標準物質セットについて較正曲線を生成した後、それぞれのＴＦＰＩサンプルについて、ｐｍｏｌ単位でＳＡＨのレベルを決定した。次いで、それぞれのＴＦＰＩサンプルについての脱アミド化のレベルを、以下の式を用いて決定した：
脱アミド化（％）＝ＳＡＨ（ｐｍｏｌ）／（注入したＴＦＰＩ（ｐｍｏｌ））×１００
（ｒＴＦＰＩ薬物生成物の安定性）表１５に示すように、相対的なアミド化レベルは、保存時間および温度の関数として増加する。ロットＱＡ０４７７についてのサンプルセットの安定性は、以下の終点脱アミド化レベルを示した：５．２％（−６０℃、２２ヶ月）、２６％（＋８℃、２４ヶ月）、および５７％（＋２５℃、６ヶ月）。
【０１５５】
（ｒＴＦＰＩのバルクの薬物物質の安定性）−６０℃にて約２４ヶ月保存した、４つのバルクの薬物のロットの解析から、脱アミド化のレベルは４．６％〜７．６％の間で変化し、平均値が５．８％であることが明らかとなった（表１５）。この脱アミド化レベルは、相当する条件において保存したＴＦＰＩ薬物生産物（５．２％）と極めて類似した。
【０１５６】
（臨床の返品のサンプル）表１５に示すように、＋５℃にて約２年間保存した３つの臨床の返品ロットの解析から、脱アミド化のレベルは平均１５．９％であることが示された。これらの結果は、同一の条件にて保存したＡｎＯｐｓ保持サンプル（１５．４％の脱アミド化）と極めて類似した。
【０１５７】
【表１５】
2007528211.tif 000018
このように、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）による方法は単純であり、そして、ｒＴＦＰＩサンプル中の相対的な脱アミド化のレベルを測定する、比較的速い手段である。上記の結果から、ｒＴＦＰＩ中の相対的な脱アミド化は保存時間および温度の関数として増加することが示され；ｒＴＦＰＩの臨床の返品およびＡｎＯｐｓの保持サンプルが、類似した脱アミド化レベルを示し；そしてｒＴＦＰＩバルク薬物物質および薬物生成物は双方とも、類似したレベルの脱アミド化を示した。
【０１５８】
（実施例９）
（ＴＦＰＩによるプロトロンビン時間の延長の説明）―プロトロンビン時間アッセイは血漿に基づいた凝固アッセイであって、ここで凝固は、ＴＦおよびカルシウム（インノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ））を血漿に添加することで開始される。ＴＦＰＩは、用量に依存した様式でプロトロンビン時間を延長する。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの試験サンプルは、このアッセイにおけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの標準物質と比較し得る。
【０１５９】
（プロトコール：）全プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）プログラムを、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ９０００血液凝固測定装置（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）上で実行した。反応を、血漿サンプルへμｌ単位のインノビンを添加した器具によって開始した。凝血塊を形成する時間を記録した。１００μｌの血漿に加えられた、１０μｌのアルギニン／リン酸バッファーは、何も加えない血漿と類似した凝固時間（それぞれ１０．９秒および１１．０秒）を与えた。０〜４．５μｇ／ｍｌのｒＴＦＰＩによる検量線を用いて、試験サンプルの活性を、ｒＴＦＰＩ標準物質と比較した。三連の解析による平均値を、表１６に示す。
【０１６０】
【表１６】
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（実施例１０）
（生存調査）
新しく調製した、臨床的なグレードのｒＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ  ９２）と、部分的に脱アミド化および酸化した、臨床的なグレードの物質（ＴＦＰＩ  ７８）とを比較するために、マウスの盲腸結紮および盲腸穿刺の調査を行った。このモデルは、直接的な糞便の汚染および盲腸の壊死による、複数菌の腹腔における感染および複数菌の全身性感染を引き起こし、ヒトの腹腔内敗血症をそっくりに模倣する。Ｏｐａｌら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２９、１３−１８、２００１。
【０１６１】
ＴＦＰＩの双方の調製物は、方法Ｃに従って調製した。ｒＴＦＰＩ  ７８、ｒＴＦＰＩ  ９２、または希釈したコントロールのいずれも、４８時間にわたって、盲検様式で与えた（皮下（ＳＱ）、１２時間毎×４用量）。外科的手順に先立ち、およびその４８時間後に、菌血症の定量的なレベル、内毒素の定量的なレベル、およびサイトカイン（腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン６）の定量的なレベルを決定するために、血液を得た。上記の動物を毎日観察し、そして死亡が起きたときにその死亡を記録した。実験期間の最後において、器官障害の組織学的な証拠についての検死評価、および定量的細菌学的な検死評価を、全ての動物が受けた。
【０１６２】
カプラン―マイヤー生存曲線を図１６に示す。部分的に酸化し、脱アミド化した形のｒＴＦＰＩを与えられたマウスに比べて、新たに調製したｒＴＦＰＩを与えられたマウスについて、有意な生存上の利点があった。双方のｒＴＦＰＩグループは、コントロールグループにおいて希釈液を与えられたマウスよりもうまくやった。予想通りに、偽手術されたマウス（盲腸の確認を含むが、結紮および穿刺は含まない外科的処置）は、７日間の調査期間の間、生存した。上記の２つのｒＴＦＰＩ処置したグループの間では、菌血症、内毒血症、およびサイトカイン生産の二次終点に有意差は無かった。
【０１６３】
この調査は、ＴＦＰＩが、血液の細菌レベル、内毒素レベル、またはサイトカインレベルでは説明できない機構を通して、生存上の優位性を提供するようであることを立証する。脱アミド化、酸化したＴＦＰＩは、新たに調製したＴＦＰＩよりも低い保護しか提供しなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】プラスミドｐＭＯＮ３７６２１の地図。
【図２】２ロットの組換えａｌａ−ＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）調製物の、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ  ＨＰＬＣ）による比較。１０μｇのサンプルをＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ  Ｓ  ５／５陽イオン交換カラムに注ぎ、そして、３０％のアセトニトリルおよび０．０２Ｍの酢酸ナトリウム中の、０．２〜０．８５Ｍの塩化アンモニウムの直線勾配にて分離した。カラム溶離液を２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度にてモニターした。上部のクロマトグラムはロットＰＢ５８０６（方法Ｃ（下記に定義）に従って調製）に由来する；下部のクロマトグラムはロットＭＡＥＣＭ０１４（方法Ｂ（下記に定義）に記述した方法に従って調製）に由来する。
【図３】２ロットのｒＴＦＰＩ調製物の、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）による比較。１０μｇのサンプルをＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０−５カラムに注ぎ、そして、４０％のアセトニトリルおよび０．７５％のトリフルオロ酢酸を含むイソクラティク溶離液を用いて分離した。カラム溶離液を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度にてモニターした。上部のクロマトグラムはロットＰＢ５８０６（方法Ｃに従って調製）に由来する；下部のクロマトグラムはロットＮＡ０１８２（方法Ｂに従って調製）に由来する。
【図４】還元型のｒＴＦＰＩサンプルおよび非還元型のｒＴＦＰＩサンプルのＳＤＳ  ＰＡＧＥ。サンプルを、１４％トリス−グリシンゲルを用いて解析し、クーマシー染色を用いて可視化した。約３μｇのサンプルを、それぞれのレーンに注いだ。レーン１〜６のサンプルの電気泳動は還元的な条件下にて行った；レーン８〜１２のサンプルの電気泳動は非還元的な条件下にて行った。サンプルは以下のようにロードした：レーン１、分子量標準物質；レーン２および８、ロットＮＡ０１８２（方法Ｂ（下記に定義）に従って調製）のサンプル；レーン３および９、ロットＭＡＥＣＭ０１４（方法Ｂに従って調製）のサンプル；そして、レーン４および１０、５および１１、ならびに６および１２、それぞれ、ロットＰＢ５６６６のサンプル、ロットＰＢ５８０６のサンプル、ならびにロットＰＢ６０９６のサンプル（方法Ｃに従って調製）。
【図５】銀染色解析を用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥ。サンプルをＤＴＴで還元し、そして１４％トリス−グリシンゲルを用いて解析した。約０．５ｍｇのｒＴＦＰＩサンプル（方法Ｃに従って調製）をそれぞれのレーンに注いだ。このサンプルは、分子量標準物質（レーン１）、参照ロットＰＢ５８０６（方法Ｃに従って調製）由来のサンプル（レーン２および３）、２ｎｇのウシ血清アルブミン（６６ＫＤａ）および０．２５ｎｇの炭酸脱水酵素（３１ＫＤａ）（レーン４）、５ｎｇのウシ血清アルブミン（６６ＫＤａ）および０．２５ｎｇの炭酸脱水酵素（３１ＫＤａ）（レーン５）、ならびにロットＰＢ６６３６由来の３つ組のサンプル（レーン６〜８）およびロットＰＢ６７７０由来の３つ組のサンプル（レーン９〜１１）（方法Ｃに従って調製）を含んだ。レーン１２はブランクである。
【図６】インタクトなタンパク質の分子量を示す、逆重畳積分エレクトロスプレー質量スペクトル。図６Ａ、ｒＴＦＰＩロットＭＡＥＣＭ０１４（方法Ｂに従って調製）。図６Ｂ、ｒＴＦＰＩロットＰＢ５８０６（方法Ｃに従って調製）。観察される、主要成分の質量は、理論的な分子量３２，００４Ｄａに一致する。
【図７】非還元型のＡｓｐ−ＮペプチドのＬＣ−ＭＳ解析の間に記録されたＵＶクロマトグラム。ロットＭＡＥＣＭ０１４由来の非還元型のサンプル（図７Ａ）およびロットＰＢ５８０６由来の非還元型のサンプル（図７Ｂ）を、Ａｓｐ−Ｎ消化およびＬＣ−ＭＳ解析に供した。同定されたピークの分子量を、表８に示す。
【図８】非還元型のＡｓｐ−ＮペプチドのＬＣ−ＭＳ解析の間に記録されたＵＶクロマトグラム。ロットＰＣ１０５８由来の非還元型のサンプルを、Ａｓｐ−Ｎ消化およびＬＣ−ＭＳ解析に供した。
【図９】ＲＣＭトリプシンペプチドのＬＣ−ＭＳ解析の間に記録されたＵＶクロマトグラム。図９Ａ、ｒＴＦＰＩロットＭＡＥＣＭ０１４。図９Ｂ、ｒＴＦＰＩロットＰＢ５８０６。
【図１０】３つのクニッツ領域および予測されるジスルフィド結合を描いた、ｒＴＦＰＩのアミノ酸配列。矢印は、方法Ｃに従って調製したｒＴＦＰＩを、非還元的な条件下でＡｓｐ−Ｎにて消化した結果として生じる、切断部位を示す。切断は、クニッツ領域間の、実線の矢印で示されたＡｓｐ−Ｎ部位に観察され、結果として７つの主要なペプチドを生じた。破線の矢印で示される、クニッツ領域内の切断は、結果として、互いにジスルフィド結合によって保たれるペプチドを生じた。内部的に切断されたペプチド内の切断部位における水分子の付加は、結果として分子量を、予想される非切断ペプチドよりも１８Ｄａ高くした。破線の矢印で示される内部切断の特異的部位は、過去の研究に基づく。この観察されるＡｓｐ−Ｎペプチドは、ｒＴＦＰＩの予想される二次構造／三次構造に一致する。
【図１１】ｒＴＦＰＩ薬物物質のＣＮ  ＨＰＬＣ。図１１Ａ、方法Ｂに従って調製された物質。図１１Ｂ、方法Ｃに従って調製された物質。１０μｇのサンプルを、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−ＣＮカラムに注ぎ、アセトニトリルおよび０．２％のトリフルオロ酢酸を含む勾配を用いて分離した。カラム溶離液は、２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度を用いてモニターした。小さなピークは、酸化されたメチオニン残基を含むｒＴＦＰＩ（１）、ロイシンから置換されたノルバリンを含むｒＴＦＰＩ（２）、および、アセチル化された残基またはカルバミル化された残基を含むｒＴＦＰＩ（３）である。
【図１２】ロットＰＢ５８０６に由来するＲＣＭトリプシンペプチドの、部分的なＵＶクロマトグラム。図１２Ａ、実線の矢印はノルバリン含有ペプチドを示し、破線の矢印は対応する正常なペプチドＴ（８８−１０８）を示す。図１２Ｂ、ペプチドＴ（８８−１０８）のＳＩＭクロマトグラムで、ｍ／ｚは１２９３．６。図１２Ｃ、ノルバリンの誤取り込みをしたペプチドＴ（８８−１０８）のＳＩＭクロマトグラムで、ｍ／ｚは１２８６．６であって、ここで、ｎＶ９０およびｎＶ１００は、それぞれ、９０位の残基のノルバリンおよび１００位の残基のノルバリンに対応する。
【図１３】ＳＰ−セファロースＨＰのサンプルの、ＣＥＸ−ＨＰＬＣを用いた、製造過程のアッセイ。上部のサンプルは、カラムへ装填したものを表し、そして下部のサンプルは、ＳＰ−セファロースＦＦを用いたクロマトグラフィーを行った後の、カラムのプールを表す。
【図１４】緩慢な勾配の逆相ＬＣ−ＭＳ解析の間に記録されたＵＶクロマトグラム。図１４Ａ、ロットＭＡＥＣＭ０１４。図１４Ｂ、ロットＰＢ５８０６。図１４Ｃ、ロットＰＢ６０９６。図１４Ｄ、ロットＰＢ６７７０。影付きの線は、逆重畳積分質量スペクトルによって特徴付けられたＵＶクロマトグラムの領域を示す。初期の溶出領域は、方法Ｂに従って調製された物質および、方法Ｃに従って調製された物質中とほぼ同じ割合でメチオニンスルホキシドを含むｒＴＦＰＩとして同定された。後期の溶出領域は、方法Ｂに従って調製された物質中でアセチル化残基を含むｒＴＦＰＩとして同定された。
【図１５−１】ｐＭＯＮ９１９７中の発現カセットのヌクレオチド配列（上部のヌクレオチド配列は、配列番号４３に示される）。この配列は、転写プロモーター、リボソーム結合部位、Ｍｅｔ３９およびＭｅｔ７５の双方に翻訳開始を減少させたａｌａ−ＴＦＰＩ、および転写ターミネーターを含む。列の上のヌクレオチドは、ｐＭＯＮ６８７５またはｐＭＯＮ６６５５内にて、そのヌクレオチドの部位に存在するヌクレオチドである。上記の置換は内部の翻訳開始を減少させるためになされ、そしてこの置換はコードされるａｌａ−ＴＦＰＩタンパク質の配列に影響を及ぼさない。翻訳終止コドンの付近の、列の上のヌクレオチドは、ｐＭＯＮ６６５５中のその領域に存在する。ｐＭＯＮ６６５５内で用いられる終止コドンはＴＡＧである。ＴＡＧに続く記号＾＾＾は６４ヌクレオチドの欠失を表し、この欠失はＣｌａＩの認識部位およびＥｃｏＲＩの認識部位を含む。ｐＭＯＮ６６５５中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に続く配列は、ｐＭＯＮ９１９７における配列と同一（ＭＡＰ遺伝子がｐＭＯＮ９１９７に挿入されることを除いて）である。
【図１５−２】ｐＭＯＮ９１９７中の発現カセットのヌクレオチド配列（上部のヌクレオチド配列は、配列番号４３に示される）。この配列は、転写プロモーター、リボソーム結合部位、Ｍｅｔ３９およびＭｅｔ７５の双方に翻訳開始を減少させたａｌａ−ＴＦＰＩ、および転写ターミネーターを含む。列の上のヌクレオチドは、ｐＭＯＮ６８７５またはｐＭＯＮ６６５５内にて、そのヌクレオチドの部位に存在するヌクレオチドである。上記の置換は内部の翻訳開始を減少させるためになされ、そしてこの置換はコードされるａｌａ−ＴＦＰＩタンパク質の配列に影響を及ぼさない。翻訳終止コドンの付近の、列の上のヌクレオチドは、ｐＭＯＮ６６５５中のその領域に存在する。ｐＭＯＮ６６５５内で用いられる終止コドンはＴＡＧである。ＴＡＧに続く記号＾＾＾は６４ヌクレオチドの欠失を表し、この欠失はＣｌａＩの認識部位およびＥｃｏＲＩの認識部位を含む。ｐＭＯＮ６６５５中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に続く配列は、ｐＭＯＮ９１９７における配列と同一（ＭＡＰ遺伝子がｐＭＯＮ９１９７に挿入されることを除いて）である。
【図１５−３】ｐＭＯＮ９１９７中の発現カセットのヌクレオチド配列（上部のヌクレオチド配列は、配列番号４３に示される）。この配列は、転写プロモーター、リボソーム結合部位、Ｍｅｔ３９およびＭｅｔ７５の双方に翻訳開始を減少させたａｌａ−ＴＦＰＩ、および転写ターミネーターを含む。列の上のヌクレオチドは、ｐＭＯＮ６８７５またはｐＭＯＮ６６５５内にて、そのヌクレオチドの部位に存在するヌクレオチドである。上記の置換は内部の翻訳開始を減少させるためになされ、そしてこの置換はコードされるａｌａ−ＴＦＰＩタンパク質の配列に影響を及ぼさない。翻訳終止コドンの付近の、列の上のヌクレオチドは、ｐＭＯＮ６６５５中のその領域に存在する。ｐＭＯＮ６６５５内で用いられる終止コドンはＴＡＧである。ＴＡＧに続く記号＾＾＾は６４ヌクレオチドの欠失を表し、この欠失はＣｌａＩの認識部位およびＥｃｏＲＩの認識部位を含む。ｐＭＯＮ６６５５中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に続く配列は、ｐＭＯＮ９１９７における配列と同一（ＭＡＰ遺伝子がｐＭＯＮ９１９７に挿入されることを除いて）である。
【図１６】カプラン−マイヤー生存曲線。Ｘ軸、生存；Ｙ軸、時間（時間）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月22日(2006.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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