(57)【要約】  被験体における急性アルコール性肝炎の処置方法を開示する。該方法は、α-ケトアルカン酸のエステルまたはα-ケトアルカン酸のアミドの有効量を被験体に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-ケトアルカン酸のエステルまたはα-ケトアルカン酸のアミドの有効量を被験体に投与することを含む、被験体における肝炎の処置方法。
【請求項２】
肝炎が急性アルコール性肝炎である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝炎が慢性アルコール性肝炎である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
肝炎が化学薬品または薬物によって引き起こされる(case)、請求項１記載の方法。
【請求項５】
被験体が予防的に処置される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
被験体がα-ケトアルカン酸のエステルを投与され、該α-ケトアルカン酸のエステルがC3〜C8の直鎖または分枝鎖のα-ケトアルカン酸のエステルである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
α-ケトアルカン酸のエステルが、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、カルボアルコキシアルキルまたはアセトキシアルキルのエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
α-ケトアルカン酸のエステルが、ピルビン酸エチル、ピルビン酸プロピル、ピルビン酸カルボキシメチル、ピルビン酸アセトキシメチル、ピルビン酸カルボエトキシメチルメチルおよびピルビン酸エトキシメチルからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
α-ケトアルカン酸のエステルが、α-ケト-酪酸エチル、α-ケト-ペンタン酸エチル、α-ケト-3-メチル酪酸エチル、α-ケト-4-メチルペンタン酸エチルおよびα-ケト-ヘキサン酸エチルからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
α-ケトアルカン酸のエステルがエチルエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
α-ケトアルカン酸のエステルがピルビン酸のエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
α-ケトアルカン酸のエステルがピルビン酸エチルである、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
α-ケトアルカン酸のエステルが、リンゲルの等張生理食塩水中に含まれる、請求項６記載の方法。
【請求項１４】
α-ケトアルカン酸のエステルが生理学的に許容され得る担体中に含まれ、これが乳酸塩をさらに含有する、請求項６記載の方法。
【請求項１５】
生理学的に許容され得る担体が、生理学的に許容され得るエノール化剤をさらに含有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生理学的に許容され得る担体が、カリウムイオンおよび／またはナトリウムイオンを含有するリンゲル等張生理食塩水である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
α-ケトアルカン酸のエステルがグリセリルエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項１８】
α-ケトアルカン酸エステルが、
下記の式：
【化１】
2007500752.tif 000004
（式中、各Rは、独立して、Hおよびα-ケトアルカン酸塩基またはC1〜C3アシルであり、少なくとも１つのRがα-ケトアルカン酸塩基である）
で表されるリボシルエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項１９】
α-ケトアルカン酸エステルが、
式(I)または(II)：
【化２】
2007500752.tif 000005
（式中、各Rは、独立して、H、α-ケトアルカン酸塩基またはC1〜C3アシルであり、少なくとも１つのRがα-ケトアルカン酸塩基である）
で示されるグルコシルエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項２０】
α-ケトアルカン酸エステルがジヒドロキシアセトンエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項２１】
α-ケトアルカン酸エステルがチオールエステルである、請求項６記載の方法。
【請求項２２】
チオールエステルのチオール部分がシステインまたはホモシステインである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
被験体がα-ケトアルカン酸のアミドの有効量を投与される、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
α-ケトアルカン酸のアミドがピルブアミドである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記アミドがα-ケトアルカン酸のアミノ酸アミドである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
被験体に有効量のピルビン酸エチルを投与することを含む、アルコール性肝炎の処置方法。
【請求項２７】
アルコール性肝炎が急性アルコール性肝炎である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
アルコール性肝炎が慢性アルコール性肝炎である、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年６月１３日出願の米国仮出願第60/478,637号および２００３年９月２日出願の米国仮出願第60/499,552号の利益を主張する。上記出願の全教示が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、全体的にまたは部分的に、高等研究計画局からの助成金(N65236-00-1-5434)、並びにNIH助成金GM58484、GM37631およびGM68481によって支援された。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
アルコール性肝炎は、かなりの罹患率と関連する。急性アルコール性肝炎に起因する短期の死亡率は、４６％の高さであり得る（Akriviadisら、「重篤な急性アルコール性肝炎において、ペントキシフィリンは短期生存を改善する：二重盲検プラセボ対照試験」、Gastroenterology 119：1637−1648（2000）；およびAkriviadisら、「コルヒチンはアルコール性肝炎を罹患する患者における短期生存の改善に不十分である」、Gastroenterology 99：811−818（1990））。
【０００４】
アルコール性肝炎の治療のための一般的な方法としては、腹水症または肝性の脳障害が存在する場合、アルコールからの禁欲、並びに栄養補助、ビタミン不足の軽減、および食事調整等の支援的な介護が挙げられる。患者が酒を飲むことを止めればアルコール性肝炎は逆転し得るけれども、消失させるためには大抵数ヶ月かかる。従って、急性肝炎の影響を妨げる、および／または改善する新しい方法に対する緊急の必要がある。
【０００５】
発明の要旨
特定のα−ケトエステルおよびα−ケトアミドが急性アルコール性肝炎の影響を改善するために使用され得ることが見出された。例えば、リンゲルエチルピルビン酸溶液（REPS）が、大量飲酒（binge drinking）モデルに従って急性肝臓損傷を誘導した後の実験用のC57/BL6マウスに投与された場合、REPSは、乳酸リンゲル溶液(実施例２〜５)を投与された対照マウスと比較して、急性アルコール性肝炎の発生を減少させた。従って、本明細書において、肝炎、例えば、アルコールおよび他の毒素によって引き起こされる肝炎を発現させる危険性を有する、または危険にさらされている被検体を治療するための方法が、開示される。
【０００６】
当該発明は、肝炎の影響を治療する、または改善する方法である。典型的には、肝炎は、アルコール、薬物、または化学物質等の毒素によって引き起こされる。該方法は、アルファ−ケトアルカン酸のエステルまたはアルファ−ケトアルカン酸のアミドの有効量を被検体に投与する工程を含む。最も一般的には、該方法は、本明細書において以後「アルコール性肝炎」と称される、アルコールによって引き起こされる肝炎を治療するために使用される。
【０００７】
本発明の方法は、いくつかの利点を有する。本明細書中に記載される化合物を使用する急性アルコール性肝炎の治療的または予防的処置は、急性アルコール性肝炎の症状を緩和する。さらに、本明細書において記載されるように急性アルコール性肝炎を治療することにより、アルコール性肝炎を罹患する患者の回復時間が短縮され得る。
【０００８】
本発明の前述のおよび他の目的、特徴、並びに利点は、添付の図面（その中では関連するような特徴が異なる見方を通じて同一部分に言及する）に図解されるように、以下の本発明の好ましい態様のより詳細な記載から明らかとなるであろう。図面は、必ずしも共通の尺度では無く、それよりも本発明の原理を図示する上で強調がなされる。
【０００９】
発明の詳細な説明
発明の好ましい態様の記載が後に続く。本発明は、生理学的に許容され得るビヒクル中に溶解されたアルファ−ケトアルカン酸のエステルまたはアルファ−ケトアルカン酸のアミドを投与することにより、被検体における肝炎を治療する方法である。開示される方法は、アルコールによって引き起こされる肝炎、即ち、アルコール性肝炎を治療するために使用され得る。あるいはまた、開示される方法は、毒物、化学的な薬剤、および薬物によって引き起こされる肝炎を治療するために使用される。
【００１０】
「アルコール性肝炎」は、肝硬変への前兆であり、アルコールによって引き起こされる。典型的な組織学的病像としては、肝細胞性の壊死および気球状変性、並びにアルコール性マロリーヒアリン体（繊維症を暗示する細胞の中間フィラメントタンパク質の異常凝集）が挙げられる。胆汁鬱帯は、顕著である。アルコール性肝炎は、疾患の兆候のみである正常でない実験評価を伴う軽度の肝炎から、黄疸（ビリルビン停留によって引き起こされる黄色の肌）、肝性脳障害（肝機能不全によって引き起こされる神経学的機能不全）、腹水症（腹部中の体液の蓄積）、出血性食道静脈瘤（食道の静脈瘤）、正常でない血餅、および昏睡等の合併症を伴う重篤な肝機能不全までの範囲におよび得る。患者が酒を飲むことを止めればアルコール性肝炎は復帰し得るが、解決するためには大抵数ヶ月かかる。アルコール性肝炎は、肝臓瘢痕および肝硬変につながり得る。肝臓異常が約６ヶ月未満続く場合、疾患は急性肝炎と考えられよう；疾患過程が約６ヶ月よりも長くなる場合、肝炎は慢性と考えられる。
【００１１】
アメトプテリン、テトラサイクリン、アセトアミノフェン、フェノプロフェン等の多くの薬物および化学薬品が、肝臓損傷を引き起こし、肝炎を誘導する。肝臓傷害の程度および重症度は、投薬量、過程の長さ、および個体の体質に依存する。薬物および／または化学物質への長期の曝露は、慢性肝炎、さらには肝硬変を誘導し得る。開示される方法は、これらの薬剤によって引き起こされる肝炎を治療することにおいて有効である。通常、これらの薬剤への曝露（またはこれらの薬剤への最初の曝露）と肝炎に関連する症状の始まりとの間には、例えば、少なくとも１週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、または１年の時間がある。
【００１２】
開示される方法はまた、肝炎を引き起こし得るまたは悪化させ（excaberate）得る、インターフェロンアルファおよびリバビリン等の抗ウイルス薬剤の影響を改善することにおいて有効である。かかる抗ウイルス薬剤と共に本明細書中に記載される組成物を共投与することもまた、開示される発明の範囲内である。
【００１３】
開示される方法はまた、予防的に、即ち、一定のタイプの肝炎を発現する危険にさらされている被検体を治療するために使用され得る。例えば、軽度もしくは慢性のアルコール性肝炎を罹患している被検体、またはＣ型肝炎等のウイルス性肝炎に感染した被検体は、毒性薬剤に曝露されるか、または前述したような一定の薬物を用いる処置を受けている場合、更なる肝臓合併症に対してより大きな危険にさらされている。開示される方法は、かかる曝露または処置が開始される前に予防的に使用され得る。本発明の方法はまた、急性アルコール性肝炎の発症を妨げる、抑制する、または減少させるために、大量飲酒する前または後に施され得る。
【００１４】
１つの局面において、本明細書において開示される方法において使用される治療薬は、有効量のアルファ−ケトアルカン酸、例えば、Ｃ３〜Ｃ８直鎖または分岐鎖アルファ−ケトアルカン酸である。例としては、アルファ‐ケトブタン酸、アルファ‐ケトペンタン酸、アルファ‐ケト‐３-メチル‐ブタン酸、アルファ‐ケト‐４-メチル‐ペンタン酸、またはアルファ‐ケトヘキサン酸が挙げられる。ピルビン酸エステルが好ましい。アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、カルボアルコキシアルキル、またはアセトキシアルキル等の官能基の多様性は、分子のエステル部位に関して適している。特定の例としては、エチル、プロピル、ブチル、カルボメトキシメチル（-CH2COOCH3）、カルボエトキシメチル（-CH2COOCH2CH3）、アセトキシメチル（-CH2OC(O)CH3）、カルボメトキシエチル（-CH2CH2COOCH3）、カルボエトキシエチル（-CH2CH2COOCH2CH3）、メトキシメチル（-CH2OCH3）、およびエトキシメチル（-CH2OCH2CH3）が挙げられる。エチルエステルが好ましい。チオールエステル（例えば、その中でチオール部位は、システインまたはホモシステインである）およびグリセリルエステル（例えば、その中でグリセロール上の１つ以上のアルコール基が、α‐ケトアルカン酸基に置換される）もまた、含まれる。アルファ‐ケトアルカン酸のエステル化について適切な他の官能基としては、１）式：
【００１５】
【化１】
2007500752.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒ１はピルビル等のα‐ケトアルカン酸基であり、Ｒ２はＨ、ピルビル等のα‐ケトアルカン酸基、またはアセチルもしくはプロピオニル等のＣ１〜Ｃ３のアシル基である）のジヒドロキシアセトンエステル；および２）リボシルおよびグルコシルエステル：
【００１７】
【化２】
2007500752.tif 000003
【００１８】
（式中、各Ｒは独立して、Ｈ、ピルビル等のα‐ケトアルカン酸基、またはアセチルもしくはプロピオニル等のＣ１〜Ｃ３のアシル基であって、ただし、少なくとも１つのＲは、α‐ケトアルカン酸基である）等の単糖エステルが挙げられる。
【００１９】
開示した方法における使用に適したα-ケトアルカン酸エステルの具体例としては、ピルビン酸エチル、ピルビン酸プロピル、ピルビン酸カルボメトキシメチル、ピルビン酸アセトキシメチル、ピルビン酸カルボエトキシメチルメチル、ピルビン酸エトキシメチル、α-ケト-酪酸エチル、α-ケト-ペンタン酸エチル、α-ケト-3-メチル酪酸エチル、α-ケト-4-メチルペンタン酸エチルまたはα-ケト-ヘキサン酸エチルが挙げられる。ピルビン酸エチルは、好ましいα-ケト酸エステルである。
【００２０】
さらに別の局面において、本明細書に開示した方法において使用される治療剤は、α-ケトアルカン酸のアミドの有効量である。本発明の方法における使用のための好適なα-ケトアルカン酸のアミドとしては、下記構造式：RCOCONR1R2を有する化合物が挙げられる。Rはアルキル基であり、R1およびR2は、独立して、-H、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、カルボアルコキシアルキルまたは-CHR3COOH (すなわち、α-ケトアルカン酸の「アミノ酸アミド」)であり、R3は天然アミノ酸の側鎖である。好ましくは、α-ケトアルカン酸のアミドはピルブアミドである。
【００２１】
好適なアルキル基としては、C1〜C8直鎖または分鎖アルキル基、好ましくはC1〜C6直鎖アルキル基が挙げられる。
【００２２】
好適なアリール基としては、炭素環式(例えば、フェニルおよびナフチル)および複素環式(例えば、フラニルおよびチオフェニル)芳香族基が挙げられ、好ましくはフェニルである。
【００２３】
アルコキシ基は-OR4であり、式中、R4は、上記規定のアルキル基である。アルコキシアルキル基は、-OR4で置換されたアルキル基である。
【００２４】
アラルキル基は-XYであり、式中、Xはアルキル基であり、Yはアリール基である（ともに上記規定のもの）。
【００２５】
カルボキシアルキル基は、-COOHで置換されたアルキル基である。カルボアルコキシアルキル基は、-C(O)ORで置換されたアルキル基であり、式中、Rは、上記規定のアルキル基である。
【００２６】
アシル基は-C(O)-Rであり、式中、Rは上記規定のアルキル基である。
【００２７】
アセトキシアルキル基は、-O-C(O)-Rで置換されたアルキル基であり、式中、Rは上記規定のアルキル基である。
【００２８】
本明細書で使用される用語「治療用」および「処置」は、疾患症状の発症および／または重篤度の低下、疾患症状の持続期間もしくは頻度の予防、抑制または遅滞を含む、疾患または状態に関連する症状の改善をいう。
【００２９】
「被験体」は、好ましくはヒト患者であるが、愛玩動物(例えば、イヌ、ネコなど)、家畜(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジなど)または実験動物(例えば、ラット、マウス、モルモットなど)であってもよい。
【００３０】
投与され得る治療剤の製剤化は、選択した投与経路にしたがって変わる(例えば、溶液、エマルジョン、カプセル)。投与される該薬剤を含有する適切な組成物は、生理学的または薬学的に許容され得るビヒクルまたは担体において調製され得る。本発明の方法において使用される組成物用の生理学的または薬学的に許容され得る担体は、動物に治療剤を投与するのに安全であると一般的に認められている任意の担体ビヒクルであり得、例えば、輸液またはボーラス注射用バッファー溶液、経口投与用またはゲル状の錠剤、オンサイト(on-site)送達のためのミセルもしくはリポソームの形態であり得る。好ましいバッファー溶液は、水、または0.1M〜0.2Mの炭酸水素塩、リン酸塩、乳酸塩またはクエン酸塩で緩衝化した等張性または高張性生理食塩水であり得る。あるいはまた、治療剤は、血漿エキステンダー、マイクロコロイドまたは微晶質溶液にて投与される。好ましい担体の１つは、約105mM〜110mMのNaCl、約3.8mM〜約4.2mMのKClおよび約2.5〜2.9mMのCaCl2を含有するリンガー等張性生理食塩水溶液である。より好ましくは、担体は、105mM〜110mMのNaCl、約3.8mM〜約4.2mMのKClおよび約2.5〜2.9mMのCaCl2ならびに約25mM〜約30mMの乳酸塩（乳酸ナトリウムなどの塩）を含有する加乳酸リンガー溶液である。好ましくは、配合物の酸性度を、約4〜約8のpH範囲、さらにより好ましくは約5〜約7のpH値に調整する。本発明の化合物のための他の担体としては、クエン酸塩、例えば、およそ100mM〜200mMのクエン酸塩で緩衝化した等張性塩溶液が挙げられる。
【００３１】
治療剤の好ましい濃度範囲は、約0.1〜約10重量％である。特に好ましい局面において、医薬組成物は、およそ10 mg/mlのピルビン酸エチルを含有する。アルコール性肝炎の処置に使用される配合物の好ましい一例は、重量基準で2％〜3％ピルビン酸エチル、およそ100mMクエン酸塩バッファー(または約25mM〜約30mMの乳酸ナトリウム)、約4mM KCl、ならびに任意に2.7mM CaCl2を含有する。急性アルコール性肝炎の処置のために投与される配合物は、二成分型配合物（第１の成分は、例えば、ピルビン酸エチル（そのまま(neat)）を含み、第２の成分は、所望の水性配合物の残りの成分、例えば上記の試薬からなる）の成分を混合することによって形成され得る。
【００３２】
治療剤がα−ケトエステルである場合、本発明の方法中で使用される医薬組成物は、任意にエノール化剤を含み得る。エノール化剤およびα−ケトエステルを、生理学的に許容され得る担体中に含む。「エノール化剤」は化学薬剤であり、これは、生理学的ｐＨ付近（例えば、約4.0〜約8.0の間、より好ましくは約4.5〜約6.5の間）で、アルファ−ケトエステルのエノール共鳴構造を誘発し、安定化させる。エノール化剤は、カチオン性物質（好ましくは、カルシウムもしくはマグネシウムなどの２価カチオン、または、例えばオルニチンもしくはリジンなどのカチオン性アミノ酸）を含む。２価カチオンは、塩（例えば、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど）として医薬製剤中に導入する。本発明の組成物中のエノール化剤は、投与される組成物中（例えば、エステルに関して、0.0〜4.0モル当量）の活性エステル剤のアルファ−ケト官能性のエノール化を誘導する、適正な濃度である。
【００３３】
治療剤の製剤中で使用するのに正確な投薬量は、投与の経路および状態の深刻さにより、担当医の判断およびそれぞれの患者の環境により決定されるべきである。効果的な投薬量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから導かれる用量反応曲線から外挿し得る。
【００３４】
該方法に従って、アルファ−ケトアルカン酸のエステルまたはアルファ−ケトアルカン酸のアミドを、適正な経路、単独または他の薬物との組み合わせで、被検体に投与し得る。アルファ−ケトアルカン酸のエステルまたはアルファ−ケトアルカン酸のアミドの有効量を投与する。有効量とは、投与の状態のもとで、望ましい治療的または予防的効果を得るのに充分な量（アルコール性肝炎の症状の始まりを処置する（治療的にまたは予防的に）、防止する、改善する、または遅らせるのに効果的な量など）である。
【００３５】
本発明の治療用組成物は、様々な経路（経口、食事、局所、静脈、筋肉）によって、または投与の吸引（例えば、気管支内、鼻内もしくは経口吸入、点鼻剤）経路で投与し得、薬剤および疾患または処置すべき状態により、生理学的に許容され得る不活性な担体物質において、従来の方法を使用する。投与の他の好ましい方法はまた、再装薬可能または生分解性デバイスおよび徐放性高分子デバイスを含む。例えば、治療的組成物を、生分解性生体適合性ポリマーを使用する徐放性製剤中で、またはミセル、ゲル、リポソーム、もしくは緩衝溶液を使用するオンサイト送達によって投与し得る。好ましくは、医薬組成物を、本明細書に記載の緩衝溶液中、例えば、活性薬剤の10mM〜200mM、好ましくは20mM〜90mMの濃度での注入剤(infusate)として、1mg/kg体重/日〜200mg/kg体重/日の割合で、投与する。より好ましくは、医薬組成物を、緩衝溶液中、アルファ−ケトアルカン酸の100mg/kg体重/日〜150mg/kg体重/日の用量で、活性薬剤の約26mM〜30mMの濃度での注入剤として投与する。ボーラス形態では、活性化剤を、類似する投薬量（例えば、活性化剤の1mg/kg体重/日〜200mg/kg体重/日）で投与し得、ここで、それに応じて調整された活性化剤の濃度で、該投薬量を一定部分に分割し、一日当たり１〜４回（1mg/kg体重/日〜200mg/kg体重/日の総投薬量で）送達する。最適な投薬量および投与の様式を、従来のプロトコルで容易に決定し得る。
【００３６】
肝炎の処置について、本明細書で開示されるα−ケトアミドおよびα−ケトエステルは、単剤療法（すなわち、肝炎を処置するために使用されている単剤治療的薬物として単独で）として、または他の医薬的薬剤（例えば、インターフェロンアルファおよびリバビリンなど、肝炎の処置において使用される薬剤）との組み合わせで投与し得る。更に、α−ケトアミドおよびα−ケトエステルは、抗菌薬、抗炎症剤、鎮痛薬、抗ウイルス剤、抗真菌薬、抗ヒスタミン薬などとの組み合わせで投与し得る。
【００３７】
好適な抗菌薬の例は、スルファ剤、ペニシリン（例えば、ベンジルペニシリン、P-ヒドロキシベンジルペニシリン、２−ペンテニルペニシリン、N−ヘプチルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン(Flucloxacillino)、ナフシリン、アンピシリン、アモキシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アゾシリン、メクズロシリン(Meczlocillin)、メシリナン(Mecillinam)、アンジノシリン(Amdinocillin)）、セファロスポリンおよびその誘導体（例えば、セファロチン、セファピリン、セファセトリル、セファゾリン、カファレキシン(Caphalexin)、セファンジン(Cephandine)、セファドロキシル、セファマンドール、セフロキシム、セフォラニド、セフォキシチン、セフォテタン、セファクロール、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリオキソン(Ceftrioxone)、セフタジジム、モキサラクタム、セフォペラゾン、セフィキシム、セフチブテンおよびセフプロジル）、オキソリン酸、アミフロキサシン(Amifloxacin)、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサシン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン(Rosaxacin)、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β−ブロモペニシラン酸、β−クロロペニシラン酸、６-アセチルメチレンペニシラン酸、セフォキサゾール(Cephoxazole)、スルタンピシリン(Sultampicillin)、アディノシリン(Adinocillin)およびスルバクタムのホルムアミドフドレート(Hudrate)エステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン(Sulfazethin)、イソスルファゼチン(Isosulfazethin)、ノルカルディシン(Norcardicin)、m−カルボキシフェニル  フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、およびモノサイクリンを含む。
【００３８】
好適な抗炎症剤の例は、アミノアリルカルボン酸誘導体（例えば、エンフェナム酸、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナミック酸(Meclofenamic acid)、ニフルム酸、タルニフルメート(Talniflumate)、テロフェナメート(Terofenamate)およびトルフェナム酸）、アリル酢酸誘導体（例えば、アセマチシン(Acematicin)、アルクロフェナク、アンフェナク、ブフェキサマク、カプロフェン(Caprofen)、シンメタシン(Cinmetacin)、クロピラク(Clopirac)、ジクロフェナク、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロズ酸(Fenclozic Acid)、フェノプロフェン、フェンチアザク、フルビプロフェン、グルカメタシン(Glucametacin)、イブフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、イソフェナク、イソキセパク、ケトプロフェン、ロナゾラク、メチアジン酸、ナプロキセン、オキサメタシン、プログルメタシン(Proglumrtacin)、スリンダク、テニダップ、チラミド(Tiramide)、トレクチン、トルメチン、ゾマックス(Zomax)およびゾメピラック）、アリルブチル酸誘導体（例えば、ブマディゾン(Bumadizon)、ブチブフェン、フェンブフェン、およびキセンブチン）、カルボン酸アリル（例えば、クリダナク、ケトロラクおよびチノリジン）、アリルプロプリオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン(Flunoxaprofen)、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ミロプロフェン(Miroprofen)、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピロプロフェン(Piroprofen)、プラノプロフェン、プロチニジン酸(ProtinizinicAcid)、スプロフェン、およびチアプロフェン酸）、ピラゾール（例えば、ジフェナミゾールおよびエピリゾール）、ピラゾロン（例えば、アパゾン、ベンズピペリロン(Benzpiperylon)、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン(Pipebuzone)、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、およびチアゾリノブタゾン）、サリチル酸誘導体（例えば、アセトアミノサロール、5-アミノサリチル酸、アスピリン、ベノリレート(Benorylate)、ビフェニルアスピリン、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサレート、フェンドサル(Fendosal)、フルフェニサル、ゲンチシン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、１−サリチル酸ナフチル、オリサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、２−ホスホンオキシ安息香酸、サラセタミド、サリチルアミドO-酢酸、サリチル酸、サリチル酸サリチロイル、サリチル硫酸、サルサラートおよびスルファサラジン）、チアジンカルボキシアミド（例えば、ドロキシカム(Droxicam)、イソキシカム(Isoxicam)、ピロキシカムおよびテノキシカム）、ε-アセトアミドカプロン酸、S-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン(Amixetrine)、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド(Difenpiramide)、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ケトロ��ク、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール(Oxaceprol)、パラニリン(Paranyline)、ペリソキサール、ピホキシム、ピロキシカム、プロクアゾン(Proquazone )およびテニダプ(Tenidap)を含む(include)、好ましいNSAIDの例が挙げられる。
【００３９】
好適な鎮痛薬の例としては、オピオイド(例えば、モルヒネ)、COX-2インヒビター(例えば、ロフェコキシブ、バルデコキシブおよびセレコキシブ)、サリチル酸塩(例えば、アスピリン、トリサリチル酸コリンマグネシウム、サルサラート、ジフニサルおよびサリチル酸ナトリウム)、プロピオン酸誘導体(例えば、フェノプロフェンカルシウム、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセンおよびナプロキセンナトリウム、インドール酢酸誘導体(例えば、インドメタシン、スルフィンダック(sulfindac)、エトダック(etodalac)およびトルメチン)、フェナム酸塩(例えば、メフェナム酸およびメクロフェナム酸塩)、ベンゾチアジン誘導体またはオキシカム類 (例えば、モビックまたはピロキシカム)またはピロール酢酸 (例えば、ケトロラク) が挙げられる。
【００４０】
好適な抗ウイルス剤の例としては、インフェルモガンマ(inferno gamma)、リバビリン、フィアルリジン(fialuridine)、アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、PMEA、ビス-POM PMEA、ラミブジン、シタレン、オキセシン類(oxetanocins)、炭素環式オキセシン類、ホスカネット、キダチコミカンソウ(phyllanthus amarus)、N-アセチル-L-システイン、デストラキシンB、ヒペルシン、アウクビンおよびN-ブチルデオキシノジリマイシンが挙げられる。
【００４１】
好適な抗真菌剤の例としては、アンホテリシンB、ナイスタチン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルシトシンおよびダプソンが挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を、なんら限定することを意図しない以下の実施例により説明する。
【００４３】
実施例１  大量飲酒マウスモデルによる急性肝臓傷害の誘導
すべての動物に標準的な実験用食餌を与え、7日間馴化させた。馴化後、最初にCarson EJ, Pruett SB.により記載され（「エタノールの免疫学的効果の評価のためのマウスの大量飲酒モデルの開発および特徴付け」, Alcohol Clin. Exp. Res. 20: 132-138 (1996)）、後にZhou Zらによって改変された（「酸化性ストレスの抑制によるアルコール性肝臓傷害に対するメタロチオネイン防御」 Exp. Biol. Med. 227: 214-222 (2002)およびZhou Z.ら,「アルコール性肝臓傷害からのメタロチオネイン依存性亜鉛保護」, Am. J. Pathol. 160: 2267-2274 (2002)）（これらの全教示は参照により本明細書に援用される）大量飲酒モデルを用いて急性肝臓傷害を誘導した。このモデルは、ヒト大量飲酒に匹敵する血中アルコールレベル、行動効果および生理学的変化が得られるように設計した。マウスを３群(各々n=8〜10)に分けた。乳酸リンゲル溶液(RLS)群のマウスには、エタノール(5 g/kg体重)を12時間毎に合計３回分の投薬で与えた。エタノールは、25％(w/v)水溶液として強制飼養により投与した。エタノールの最終投薬の１時間後に始めて、マウスに0.4 mlのRLSを６時間毎に合計３回分の投薬で腹腔内(i.p.)注射した。リンゲルピルビン酸エチル溶液(REPS)群のマウスには、RLS群の動物と同じスケジュールにしたがってアルコールを投薬した。しかしながら、続いてRLSで処置する代わりに、これらのマウスに３回のREPS（これは、以前に記載(Yang Rら,「ピルビン酸エチルは、出血性ショックに供したマウスにおいて炎症性遺伝子発現を調節する」, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283: G212-G22 (2002)、参照によりその全体が本明細書に援用される)されたようにして製剤化した）のi.p.注射を与えた。REPSの各投薬により、130mM NaCl、4mM KClおよび2.7mM CaCl2もまた含む溶液0.4 mlに、40 mg/kgのEPを提供した。REPSを、エタノールの最終投薬の１時間後に始めて6時間毎に注射した。対照(CONT)群のマウスには、エタノールを強制飼養せずに、等容量のマルトースの等カロリー溶液を与えた。この群のマウスは、RLSまたはREPSのいずれでも処置しなかった。エタノールの最終投薬のエタノールまたはマルトースの最終投薬の19時間後、すべてのマウスをペントバルビタール(90 mg/kg i.p.)で麻酔し、以下の手順を行なった。粘膜透過性の測定のために回腸の分節を回収した；細菌転位測定するために腸管膜リンパ節(MLN)複合体を回収した；アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血漿濃度を測定するために血液を心臓から吸引した；電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用いたNF-κB活性化の測定、半定量RT-PCRを用いたTNF mRNAの発現および組織病理学的検査のために肝臓の一部を取り出した。EMSAまたはRT-PCRに使用される肝組織はただちに-80℃で凍結したが、組織病理学的検査用の組織は10％ホルマリン中に直ちに固定した。
【００４４】
実施例２  TNF-α活性化によって測定されるように、REPSはアルコール性肝炎マウスモデル(Modal)において炎症性応答を抑制する
肝臓TNF-α発現の増加は、マウスにおいて、初期アルコール誘導性肝臓傷害の病因に関与している(Yin M.ら,「マウスのアルコール誘導性肝臓傷害における腫瘍壊死因子αの本質的な役割」, Gastroenterology 117: 942-952 (1999))。
【００４５】
実施例１に記載の急性肝炎の誘導後、全RNAを、回収した肝組織試料からクロロホルムおよびTRI試薬(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)を製造業者によって指示されたとおりに用いて抽出した。全RNA を、10単位のDNアーゼI/10μg RNAを用い、DNAFree(登録商標)(Ambion, Houston, TX)で製造業者によって指示されたとおりに処理した。２μgの全RNAを、0.5μgのオリゴ(dT)15 (Promega)、1mMの各dNTP、15U AMV逆転写酵素(Promega)および1U/μの組換えRNasinリボヌクレアーゼインヒビター(Promega)5mM MgCl2、10mM Tris-HCl、50mM KCL、0.1％Triton X-100 (pH=8.0)を含有する反応液40μ1容量中で逆転写した。反応混合物を、DNA合成前に21℃で10分間プレインキュベートした。逆転写(RT)反応を50分間 42℃で行ない、95℃まで5分間加熱して反応を終了させた。PCR用反応混合物(50μL)を、5μLのcDNA鋳型、10単位AdvanTaq Plus DNA Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA)、200μMの各dNTP、1.5mM MgCl2および1.0μMの各プライマーを用い、1 x AdvanTaq PlusTM PCRバッファー中で構成した。PCR 反応を、480型サーモサイクラー(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて行なった。cDNAの増幅(amplication)を、5分間の94℃での変性で開始した。TNFおよびIL-6に関するcDNA増幅のためのPCR条件は以下の通り: 94℃での変性を45秒間、61℃でのアニーリングを45秒間、および72℃での重合を45秒間とした。iNOSに関するcDNAの増幅は、94℃で45秒間の変性、58℃で1分間のアニーリング、および72℃で45秒間の重合により行なった。増幅が線形範囲内になることを確実にするため、発明者らは、25、22、20および33が、それぞれ、RAW 264.7細胞抽出物から調製したTNFおよびIL-6 cDNA、RAW 264.7細胞抽出物から調製したiNOS cDNA、および肝組織抽出物から調製したTNF cDNAの至適サイクル数であると経験的に決定した。最後の増幅サイクル後、試料を72℃で10分間インキュベートした後、4℃で保持した。iNOS用の5'および3'プライマーは、それぞれ、CAC CACAAG GCC ACATCG GAT T (配列番号：1)およびCCGACC TGA TGT TGC CAT TGT T (配列番号：2)(Invitrogen, Carlsbad, CA)であり、予測される生成物の長さは426 bpであった。TNF用の5'および3'プライマーは、それぞれ、GGC AGG TCTACT TTG GAG TCA TTG C (配列番号：3)およびACA TTC GAG GCT CCAGTG AAT TCGG (配列番号：4)であり、予測される生成物の長さは307 bpであった。IL-6用の5'および3'プライマーは、それぞれ、TTC CAT CCA GTTGCC TTC TTGG (配列番号：5)およびTTC TCA TTT CCA CGATTT CCC AG (配列番号：6)であり、予測される生成物の長さは174 bpであった。18SリボソームRNAを増幅して等負荷量を確認した。この 反応では、5'および3'プライマーは、それぞれ、CCC GGG GAG GTAGTG ACG AAA AAT (配列番号：7)およびCGC CCG CTC CCAAGA TCC AACTAC (配列番号：8)であり、予測される生成物の長さ209 bpであった。10マイクロリットルの各PCR 反応物を2％アガロースゲル上で電気泳動し、NucleoVision画像形成ワークステーション(NucleoTech, San Mateo, CA)でスキャンし、GelExpert release 3.5を用いて定量した。
【００４６】
図1に示すように、半定量RT-PCRにより、肝臓TNF-α mRNA発現は、マウスを、12時間の間で経腸投与した３回の5 g/kg投薬量のアルコールの最終回から１時間後にRLSで処置した場合、顕著に増加したことが示された。マウスを、RLSの代わりにREPSで処理した場合は、肝臓TNF-α mRNA発現増幅のアップレギュレーションは観察されなかった。
【００４７】
実施例３  NF-κB活性化によって測定されるように、REPSはアルコール性肝炎のマウスモデルにおいて炎症性応答を抑制する
エタノールの急性または亜急性投与は、プロ炎症性転写因子NF-κBの肝活性化を促進することが知られている (Nanji A. A.ら「クルクミンは、NF-κB依存性遺伝子の発現を阻害することにより、ラットにおいてアルコール誘導性肝臓疾患を抑制する」, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2002); KonoH.ら,「NADPHオキシダーゼインヒビターであるジフェニレンヨードニウム硫酸塩は、ラットにおいて初期アルコール誘導性肝臓傷害を抑制する」, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280: G1005-G1012 (2002); Spitzer J. A.ら 「エタノールおよびLPSは、ラット肝臓細胞においてインビボでNF-κB 活性化、誘導NOシンターゼおよびCOX-2遺伝子発現を調節する」, Front. Biosci. 7: a99-alO8 (2002))。したがって、EMSAを用いて、REPSによる処置が、本発明者らの大量アルコール消費マウスモデルにおいてNF-KB活性化を調節するかどうかを調べた。
【００４８】
実施例１に記載した急性肝炎の誘導後、核抽出物を調製し、肝組織試料をT-PERTM (Pierce, Rockford, IL)により、1:20の試料調製物試薬に対する組織比を用い、製造業者による指示に従ってホモジナイズした。試料を10,000 gで5分間遠心分離し、組織残屑をペレット化した。上清みを回収し、-80℃で凍結した。核タンパク質濃度を、市販のBradfordアッセイ(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて測定した。
【００４９】
NF-κB核結合のためのEMSAを、以前に記載されたマウスiNOS プロモーターの上流のNF-κB 結合部位に基づく二重らせんオリゴヌクレオチドプローブを用いて行なった (Yang Rら,「ピルビン酸エチルは、出血性ショックに供したマウスにおいて炎症性遺伝子発現を調節する」, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283: G212-G22 (2002))。二本鎖NF-κBオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである:センス: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCCAGG C-3' (配列番号：9);アンチセンス: 3'-TCA ACT CCC CTG AAA GGGTCC G-5' (配列番号：10) (Promega; Madison, WI)。オリゴヌクレオチドは、γ-32Pアデノシン三リン酸(New England Nuclear; Boston, MA)により、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega; Madison, WI)を用いて末端標識した。6 μgの核タンパク質を、4 μlの5X結合用バッファー(65mM HEPES、325mM NaCl、5mM DTT、0.7mM EDTA、40％グリセロール、pH=8.0)中、2 μgのポリDI-DCの存在下で、γ-32P-標識NF-κBプローブにより、室温で20分間インキュベートし、全容量の結合反応混合物は20 μLとした。結合反応混合物を、4％非変性ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で電気泳動した。電気泳動後、ゲルを乾燥し、Kodak (Rochester, NY) X-Omatフィルムに-80℃で曝露した。結合反応の特異性は、予め、適切な低温競合およびスーパーシフトアッセイを行なうことにより確認した。
【００５０】
ゲル電気泳動により評価すると、RLS処置マウスにおいて、肝炎誘導後にNF-κBの活性化の顕著な増加があった。しかしながら、アルコール摂取後でのREPSによるマウスの処置は、NF-κB-DNA結合をダウンレギュレートした。
【００５１】
実施例４  レドックスストレスのマーカーであるマロンジアルデヒドの形成によってアルコール性肝炎のマウスモデルにおいて測定されるように、REPSは脂質過酸化を抑制する
急性アルコール解毒は、ヒトおよび齧歯類の両方において、脂質過酸化と関連している。さらにまた、出血性ショックおよび救急蘇生に供したラットにおいて、EPにより処置によって肝脂質過酸化が減少した。したがって、本発明者らは、EP処置の同様の有益な効果が、本発明者らの大量飲酒のマウスモデルにおいて観察されるかどうかを調べるためにさらに研究(seek)した。
【００５２】
実施例１に記載した急性肝炎の誘導後、脂質過酸化のアッセイを、Tawadrous Z. S.ら 「リンゲルピルビン酸エチル溶液による出血性ショックからの救急蘇生は、ラットにおいて、生存率を向上させ、腸粘膜超透過性を改善する」, Shock 17: 473-477 (2002)（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載のようにして行なった。簡単には、組織切片を解凍後、2 mlのリン酸塩バッファー (0.05 M, pH=7.4)を1.0 gの組織に添加した。組織をホモジナイズした。トリクロロ酢酸(20％v/v溶液; 2.5 ml)およびチオバルビツール酸(0.67％w/v溶液; 1.0 ml)を、0.5 mlの組織ホモジネートに添加した。混合物を100℃水浴中で30分間インキュベートすることにより、チオバルビツール酸顔料の色を発色させた。水道水中への浸漬によって混合物を室温まで冷却した後、4 mlのn-ブタノールを添加し、激しく攪拌した。遠心分離後、ブタノール層の吸光度を535 nmで測定した。試料は二連で実験し、結果を平均した。1,1,3,3-テトラトキシプロパンを用い、標準的な曲線を得た。結果は、組織１グラムあたりのマロンジアルデヒド(MDA)のナノモルで示した。
【００５３】
平均組織MDA濃度は、RLS群において対照群よりも有意に高かった(図2)。しかしながら、肝臓脂質過酸化のこのマーカーの平均レベルは、REPS群においてRLS群よりも有意に低かった。これは、REPS処置マウスにおける肝臓傷害の改善を示す。
【００５４】
実施例５  血漿アラニンアミノトランスフェラーゼの評価により測定される、アルコール性肝炎のマウスモデルにおける肝細胞障害の誘導の証拠
200μLの血液を心臓穿刺により得、氷上の0.5 ml容遠心チューブに入れた。試料を5,000 gで3分間遠心分離した。血清を回収し、自動アッセイシステムを用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)についてアッセイした。
【００５５】
図３に示すように、アルコールまたはマルトース溶液の最終投薬から19時間後の平均血漿ALT濃度は、RLS群において対照(CONT)群よりも有意に高かった。しかしながら、肝細胞傷害のこの生化学的マーカーの平均循環レベルは、REPS群においてRLS群よりも有意に低かった。
【００５６】
実施例６  組織学的検査により証明されるように、PERSでの処置はアルコール性肝炎のマウスモデルにおいて肝細胞障害を抑制する
ホルマリン固定肝組織を切片に細分し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡を600倍および1000倍の倍率を用いて検査した。
【００５７】
検査により、RLS群において、肝切片は、肝門領域および小葉の一部における脂肪変化のさらなる証拠を示すことが示された。高倍率では、球状の赤色硝子状物が肝細胞内において明白であり、散在する断片的な肝細胞の壊死が明白であった。対照的に、REPS群では、小葉における脂肪変化および壊死はかなり低減しており、硝子状物は明白ではなかった。
【００５８】
実施例２〜５の結果を平均±SEMで示す。群間のCFUの差を、ウィルコクソンＵ検定を用いて解析した。他の連続的データは、スチューデントｔ検定または分散の解析後、適宜フィッシャーLSD検定を用いて解析した。＜0.05のP値を有意とみなした。統計値のまとめを、iNOS、TNF-αおよびIL-6 mRNA発現を推定するためのRT-PCRを用いた試験のデンシトメトリー結果について示すが、これらの結果は、用いた方法が半定量のみであり、標本の大きさ(n=3〜4)が小さかったため、統計学的解析に供しなかった。(Ulloa Lら「ピルビン酸エチルは、マウスにおいて、確立された致死種および全身性炎症致死率を抑制する」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12351-12356 (2002) ; Sappington P. L.ら「ピルビン酸エチルは、内毒血症マウスおよび免疫刺激Caco-2腸細胞単層において腸上皮障壁機能不全を改善する」, J. Pharmacol. Exp. Ther. 304: 464-476 (2003) ; Yang R.ら「ピルビン酸エチルは、出血性ショックに供したマウスにおいて炎症性遺伝子発現を調節する」, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283: G212-G22 (2002))。
【００５９】
本発明を、その好ましい態様を参照して詳しく示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、アルコール性肝炎を罹患するマウス中における肝性ＴＮＦ−α発現に対する乳酸リンゲル溶液（RLS）またはリンゲルエチルピルビン酸溶液（REPS）の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、アルコール性肝炎を罹患するマウス中における肝性マロンジアルデヒド含有量に対する乳酸リンゲル溶液（RLS）またはリンゲルエチルピルビン酸溶液（REPS）の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、アルコール性肝炎を罹患するマウス中における血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度に対する乳酸リンゲル溶液（RLS）またはリンゲルエチルピルビン酸溶液（REPS）の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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