(57)【要約】レンチウイルスベクターは、癌治療について発現されるＭＳＰ３６遺伝子を送達するために、有利に使用される。本発明は、ポリペプチドを発現するための方法であって、上記方法は、ｍｓｐ３６ポリペプチドまたはその機能性改変体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を、標的哺乳動物細胞に安定して導入する工程を包含し、上記ＤＮＡ構築物は、レンチウイルス遺伝子送達媒体に含まれる方法を提供する。また、上記ＤＮＡ構築物が、上記レンチウイルス遺伝子送達媒体の、前記標的哺乳動物細胞を含む標的組織または器官への注射により、インビボにて該標的哺乳動物細胞に導入される方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを発現するための方法であって、該方法は、ｍｓｐ３６ポリペプチドまたはその機能性改変体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を、標的哺乳動物細胞に安定して導入する工程を包含し、ここで、該ＤＮＡ構築物は、レンチウイルス遺伝子送達媒体に含まれる、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＮＡ構築物は、前記レンチウイルス遺伝子送達媒体の、前記標的哺乳動物細胞を含む標的組織または器官への注射により、インビボにて該標的哺乳動物細胞に導入される、方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ構築物は、前記レンチウイルス遺伝子送達媒体の形質移入により、インビボにて前記標的哺乳動物細胞へ導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的哺乳動物細胞が、哺乳動物の上皮細胞である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的哺乳動物細胞が、前立腺上皮細胞である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的哺乳動物細胞が、卵巣上皮細胞である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記標的哺乳動物細胞が、肺上皮細胞である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項８】
請求項１、２または３に記載の方法であって、前記ＤＮＡ構築物が、ｍｓｐ３６ポリペプチドまたはその機能性改変体をコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、そしてインビボまたはインビトロにて前記標的哺乳動物細胞中で作動可能である、方法。
【請求項９】
前記プロモーターが、乳腺特異的プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、前立腺特異的プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターが、卵巣腺特異的プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターが、肺特異的プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ構築物が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物において腫瘍の増殖を阻害する方法であって、ここで、該腫瘍は、ｍｓｐ３６遺伝子またはｍｓｐ３６ポリペプチドの欠損に関連する病因を有し、該方法は、プロモーターに作動可能に連結されたｍｓｐ３６ポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを、該腫瘍を含む標的組織または標的器官の細胞に直接投与する工程を包含し、ここで、該核酸配列の発現は、腫瘍増殖の調節をもたらす、方法。
【請求項１７】
前記ベクターは、前記腫瘍にか、または該腫瘍の付近にあるように、注射により前記標的組織または標的器官に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍増殖の調節は、腫瘍のアポトーシスを増強する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍増殖の調節は、ＭＭＰ９合成の減少および／またはＭＭＰ９の腫瘍細胞からの分泌の減少である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍増殖の調節は、前記腫瘍、または該腫瘍付近の新脈管形成の減少である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍増殖の調節は、腫瘍細胞の増殖速度の減少である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍増殖の調節は、腫瘍細胞浸潤の潜在性の減少である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
外科的介入、放射線治療、ホルモン治療、免疫療法、化学療法または寒冷療法から選択されるさらなる処置をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
安定して組み込まれたレンチウイルスＤＮＡ構築物を有する標的哺乳動物細胞であって、該ＤＮＡ構築物は、ｍｓｐ３６ポリペプチドまたはその機能的改変体をコードするヌクレオチド配列を含み、該標的哺乳動物細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結される、標的哺乳動物細胞。
【請求項２５】
前記プロモーターが、乳腺特異的である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項２６】
前記プロモーターが、前立腺特異的である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項２７】
前記プロモーターが、卵巣腺特異的である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項２８】
前記プロモーターが、肺特異的である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項２９】
前記プロモーターが、構成的である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項３０】
前記プロモーターが、誘導性である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項３１】
前記細胞がマウス由来である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項３２】
前記細胞がラット由来である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項３３】
前記細胞がヒト由来である、請求項２４に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞。
【請求項３４】
上皮細胞であって、レンチウイルス形質移入により該細胞中へ導入された正常なｍｓｐ３６遺伝子を発現する、上皮細胞。
【請求項３５】
標的細胞中で、ｍｓｐ３６に対する遺伝子の欠損を処置するための組換えレンチウイルスベクターであって、該ベクターは、インビボまたはインビトロにおいて、該標的細胞中で作動可能なプロモーターへ作動可能に連結された正常なｍｓｐ３６遺伝子を含む、ベクター。
【請求項３６】
複製欠損性である、請求項３５に記載の組換えベクター。
【請求項３７】
前記標的細胞が、哺乳動物の上皮細胞である、請求項３５に記載の組換えベクター。
【請求項３８】
前記標的細胞が、前立腺上皮細胞である、請求項３５に記載の組換えベクター。
【請求項３９】
前記標的細胞が、卵巣上皮細胞である、請求項３５に記載の組換えベクター。
【請求項４０】
前記標的細胞が、肺上皮細胞である、請求項３５に記載の組換えベクター。
【請求項４１】
請求項３５に記載の前記ベクターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物の分泌タンパク質（ｍｓｐ３６）遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを患者に投与することにより、癌または悪性疾患を処置するための組成物および方法に関する。このベクターは、標的組織内で、遺伝子が発現されて分泌性の生物活性ｍｓｐ３６タンパク質を産生するような様式で投与される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
正常な細胞分裂および細胞移動は、体内で高度に調節される。この調節システム（細胞ホメオスタシスと称される）は、チェックにおいて細胞を維持するためのいくつかの機構を利用する。細胞増殖を調節するための主要な機構としては、可溶性の伝達物質（例えば、成長因子）を介した細胞外シグナル伝達、細胞接触阻害を介した細胞増殖の遅延、特定の細胞表面レセプター−リガンドの相互作用を介した細胞接着、および細胞分化が挙げられる。
【０００３】
癌の発達は、非特許文献１により最初に記載された多段階のプロセスである。正常な細胞は、そのＤＮＡ内に遺伝的変異（ヌクレオチド置換、欠失および再配列が挙げられる）を蓄積する。重要な調節遺伝子におけるいくつかのこれらの変異の蓄積は、多くの場合、接触阻害の喪失、細胞接着の喪失、および細胞分化の喪失、ならびにその意図された機能を実施できないことに起因する、細胞内ホメオスタシスの喪失をもたらす。さらに、細胞生存とプログラム細胞死（アポトーシス）との間のバランスが、変更され得る。これらの遺伝的変異の結果として、癌細胞は、制御下にある細胞分裂を維持するための調節要素を失い、そして組織および器官内での正常な細胞を超える有利な増殖性、ならびに転移のように遠位の組織および器官に移動する能力の両方を得ている。
【０００４】
成長因子およびその特異的な細胞表面結合タンパク質または細胞内結合タンパク質は、外部の環境と細胞との間の連絡のための重要な導管を形成する。増殖因子に対する結合タンパク質の例としては、上皮増殖因子（非特許文献２；非特許文献３）、神経発育因子（非特許文献４；非特許文献５）、インスリン様増殖因子（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、インスリン（非特許文献１０）、血小板由来増殖因子（非特許文献１１）、およびトランスホーミング増殖因子β（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献４）が挙げられる。ヘパリン結合増殖因子のファミリーとしては、酸性および塩基性のＦＧＦ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｉｎｔ−２、ＦＧＦ−５，ＫＧＦおよびＦＧＦ−７が挙げられる（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。これらの増殖因子は、生物学的プロセス（例えば、増殖の刺激、新脈管形成、創傷治癒および組織再生）に関係している（非特許文献１４；非特許文献１６；非特許文献１７）。
【０００５】
非特許文献１８、非特許文献１９、および非特許文献２０は、それぞれ、ヒト類表皮癌細胞由来、ウシ分娩前乳腺分泌物由来およびマウスＳＷ１３細胞由来のヘパリン結合増殖因子のための１７ｋＤ結合タンパク質を単離し、特徴付けた。このタンパク質は、塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦに非共有結合し、塩基性ＦＧＦの作用を阻害する（非特許文献１８、非特許文献１９、および非特許文献２０）。
【０００６】
Ｌｅｅ（特許文献１）は、ＴＧＦ−β配列に基づくプライマーを含むヒトｃＤＮＡ配列のディファレンシャルスクリーニングにより単離されたｍｓｐ３６を記載した。Ｌｅｅは、ｍｓｐ３６  ＲＮＡおよびタンパク質は、正常な組織と比較した場合に、乳癌細胞株および前立腺癌細胞株ならびに患者の腫瘍組織においてダウンレギュレートされることを示した。ｍｓｐ３６の腫瘍細胞内へのトランスフェクションまたはアデノウイルス感染を使用したさらなる研究は、腫瘍増殖の遅延、浸潤の潜在性および腫瘍細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）産生の減少、ならびにヌードマウスにおいてヒト腫瘍細胞を使用するマトリゲル移植アッセイにおける腫瘍の新脈管形成の阻害をもたらした。Ｌｅｅはまた、ｐ２１（細胞分化の誘発において重要な役割を果たすタンパク質）の誘導を実証した（非特許文献２１）。これらの実験は、ｍｓｐ３６が乳癌細胞の表現型の挙動を調節し得、そしてｍｓｐ３６のｍｓｐ３６欠損腫瘍細胞への置換が、ヒト患者における癌の処置に使用され得ることを示す。
【０００７】
Ｌｅｅにより記載される実験（特許文献１）は、インビトロにおいてｍｓｐ３６遺伝子を標的細胞へ送達するためにＤＮＡトランスフェクションまたはアデノウイルス感染のいずれか、ならびにインビボにおいてｍｓｐ３６遺伝子を標的細胞に送達するためにアデノウイルス感染を利用した。両方のシステムは、種々の遺伝子を送達して、細胞の遺伝的欠損を回復するために使用されている。両方のシステムはまた、患者へ直接投与するか、あるいは細胞をエキソビボで処置して、その後動物または患者へこれらの細胞を再導入するかのいずれかにより、動物およびヒトにおける遺伝的欠損を修正するために使用されている。しかし、ネイキッドＤＮＡまたは送達媒体としてのアデノウイルスのいずれかを使用して発現される遺伝子は、以下に議論されるように治療用タンパク質の一過性の発現をもたらす。したがって、ネイキッドＤＮＡまたはアデノウイルスベクターにより送達されるｍｓｐ３６遺伝子は、長期間の治療処置の間、患者への再投与を必要とする。
【０００８】
癌治療のためのｍｓｐ３６タンパク質（他のタンパク質に関する限り）の使用に伴う１つの問題は、腫瘍部位におけるｍｓｐ３６濃度の変動である。ＩＶ注射を介してボーラスとして腫瘍部位または全身に送達されるｍｓｐ３６タンパク質は、タンパク質濃度の急激な上昇、その後の除去および分解をもたらし、腫瘍部位において潜在的な治療に満たないレベルをもたらす。例として、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）（インターフェロン−α、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（インターロイキン−２、Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）は、それぞれ、約２時間および１．５時間の除去の半減期を有する（各々の製品について添付書類を参照のこと）。タンパク質のポリエチレングリコール付加は、多くの場合、治療用タンパク質の半減期を延長する（非特許文献２２）が、患者はなお、治療的レベルまでタンパク質濃度を上げるための再処置を必要とする。長期間の患者の処置の間、ｍｓｐ３６タンパク質の複数回の送達は、乳癌腫瘍増殖を阻害するために必要とされる。半減期の短い治療用タンパク質（例えば、インターロイキン−２およびインターフェロン−α）について、患者の処置は、１日１回〜３回と頻繁であり得る。腫瘍または悪性疾患を回復するために必要とされる長期間にわたって、一定の治療用量を患者へ送達することが、実質的に必要である。
【０００９】
治療レベルのｍｓｐ３６を送達するための代替のアプローチは、プロモーターに作動可能に連結されたｍｓｐ３６遺伝子を細胞内に送達し、次いで、生物活性ｍｓｐ３６タンパク質を合成して分泌する工程を包含する。トランスフェクションによるネイキッドＤＮＡおよびリポソームで被覆されたＤＮＡは、遺伝子を細胞内に送達する、２種類の確立された非ウイルス性方法である。しかし、これらの方法は、治療用タンパク質の一過性の発現をもたらし（非特許文献２３）、そして最大限の治療処置のために必要な、一定のレベルの長期間の送達には適切ではない。非ウイルス性送達システムのさらなる欠点は、細胞内の防御システムの結果として、大量のネイキッドＤＮＡが、治療効果のために必要とされることである（非特許文献２４）。
【００１０】
ウイルスの遺伝子送達システムは、非特許文献２３および非特許文献２５に記載される。共通のウイルスシステムとしては、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルスが挙げられる。これらのシステムは、種々の遺伝子を送達して細胞内の遺伝的欠損を回復するために、使用されている。これらはまた、患者へ直接投与するか、あるいは細胞をエキソビボで処置して、その後これらの細胞を動物または患者へ再導入するかのいずれかにより、動物およびヒトにおける遺伝的欠損を修正するために使用されている。しかし、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターは、宿主細胞内へ組み込まれず、一時的にタンパク質を発現し、また長期間の治療処置の間、患者への再投与を必要とする。レトロウイルス配列は、宿主細胞内へ組み込まれるが、多くの場合、宿主細胞によるそのプロモーター領域のメチル化により、数週間後不活性化される（非特許文献２６；非特許文献２７）。
【００１１】
レンチウイルスベクターは、他の遺伝子送達システムより優れたいくつかの利点を有する；外来遺伝子の哺乳動物細胞への形質移入について非常に効率が良く、非分化細胞に形質転換可能であり、そして治療用タンパク質の長期間の発現を指向可能であり、そしてインビトロおよびインビボの両方において効率的に送達され得る（非特許文献２８）。
【００１２】
レンチウイルスベクターが開発され、そして種々の遺伝的疾患および後天性疾患の処置のため使用が目的とされる（非特許文献２９；非特許文献３０）。ヒト疾患処置のためのレンチウイルスベクターの主な焦点は、ＣＮＳ疾患の処置（例えば、リソソーム蓄積症、ハンティングトン病およびパーキンソン病の処置）のためのニューロン内への遺伝子導入、リンパ血液疾患の処置のための造血前駆細胞（例えば、鎌状細胞およびβ−サラセミア）への遺伝子導入、ならびに血友病のための遺伝子導入、およびＨＩＶ感染症に対する適用のための遺伝子導入である（非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。
【００１３】
腫瘍学における潜在的な使用のための、レンチウイルスベクターの使用のいくつかの報告がある。レンチウイルスベクターは、抗癌ワクチンの産生のための不活性化された癌細胞へ免疫原性タンパク質をエキソビボ送達するため（非特許文献３５；非特許文献３６）、樹状細胞に免疫調節タンパク質をエキソビボ送達し、抗腫瘍応答を刺激するため（非特許文献３７）、そして癌細胞を直接殺傷する試みにおいて、毒素（例えば、ジフテリア毒素（非特許文献３８））、自殺遺伝子（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ（非特許文献３９；非特許文献４０））または輸送タンパク質（非特許文献４１）を送達するために使用されている。しかし、癌細胞増殖を緩和するために、細胞レセプターを介して作用する細胞外可溶性タンパク質調節因子の置換を目的とする、レンチウイルス療法を使用する報告はない。
【００１４】
癌治療に対する焦点は、医学界において優先度が高いが、この疾患の集合の進行に対処するためには、新規の処置が必要とされる。最良の癌の処置は、高毒性プロフィールであり、患者に許容されない。全身に送達することなく腫瘍部位に標的化される新規の治療分子は、副作用を最小限にしながら、改善された薬物の効力を提供することを保障する。
【００１５】
ｍｓｐ３６は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および肺癌、ならびに潜在的に他の型の癌の処置について、顕著な見込みを示す。最良の治療に関して、投薬量レベルは、このタンパク質の最大限の効力のために重要である。理想的には、長期間（すなわち、６ヶ月を超える）にわたる、一定の用量のｍｓｐ３６タンパク質の送達は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および肺癌、または悪性疾患を軽減するためのもっとも主要な処置である。
【特許文献１】国際公開第０２／３４２８２号パンフレット
【非特許文献１】Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７１年，第６８巻，ｐ８２０−３
【非特許文献２】Ｔａｙｌｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７０年，第６７巻，ｐ１６４−７１
【非特許文献３】Ｔａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７４年，第２４９巻，ｐ３１９８−２０３
【非特許文献４】Ｋａｎｚａｋｅら，Ｃｅｌｌ、１９９０年，第６１巻，ｐ１０５１−６１
【非特許文献５】Ｄｅｎｎｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９年，第２６４巻，ｐ７２１０−６
【非特許文献６】Ｚａｐｆら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７５年，第１６８巻，ｐ６３８−４５
【非特許文献７】ＣｏｈｅｎおよびＮｉｓｓｌｅｙ、Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９７６年，第８３巻，ｐ２４３−５８
【非特許文献８】Ｍｏｓｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ、１９７６年，第２６３巻，ｐ１３７−４０
【非特許文献９】ＨｉｎｔｚおよびＬｉｕ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ＆  Ｍｅｔａｂ．１９７７年，第４５巻，ｐ９８８−９５
【非特許文献１０】Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９７３年，第８０巻，ｐ２７５−８０
【非特許文献１１】Ｈｕａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８９年，第８１巻，ｐ３４２−６
【非特許文献１２】Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔおよびＷａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７年，第２６２巻，ｐ１４０９０−９
【非特許文献１３】Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８年，第２６３巻，ｐ１５３５−４１
【非特許文献１４】ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９年，第５８巻，ｐ５７５−６０６
【非特許文献１５】Ｆｉｎｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９年，第２４５巻，ｐ７５２−５
【非特許文献１６】Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９８６年，第４６巻，ｐ１８７−２０４
【非特許文献１７】Ｋａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８９年，第８６巻，ｐ７４３２−６
【非特許文献１８】Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１年，第２６６巻，ｐ１６７７８−８５
【非特許文献１９】Ｌａｍｅｔｓｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年，第２７５巻，ｐ１９４６９−７４
【非特許文献２０】Ｋｕｒｔｚら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９７年，第１４巻，ｐ２６７１−８１
【非特許文献２１】Ｌｉｕら，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔｅ、２００３年，第６巻，ｐ１８３−９５
【非特許文献２２】ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００３年，第２巻，ｐ２１４−２１
【非特許文献２３】Ｒｏｍａｎｏら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０００年，第１８巻，ｐ１９−３９
【非特許文献２４】Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９５年，第１巻，ｐ１５−７
【非特許文献２５】Ｍａｈら，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍｃｏｋｉｎ．２００２年，第４１巻，ｐ９０１−１１
【非特許文献２６】Ｄｕｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４年，第６８巻，ｐ５５９６−６０１
【非特許文献２７】ＣｈａｎｇおよびＨｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２００１年，第３巻，ｐ４６８−７５
【非特許文献２８】Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年，第８巻，ｐ４５７−６３
【非特許文献２９】ＧａｌｉｍｉおよびＶｅｒｍａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年，第２６１巻，ｐ２４５−５４
【非特許文献３０】Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９９９年，第４巻，Ｄ４８１−９６
【非特許文献３１】ＹｅｅおよびＺａｉａ，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００１年，第２６巻，ｐ１５９−７４
【非特許文献３２】ＤｅｇｌｏｎおよびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年，第２６１巻，ｐ１９１−２１０
【非特許文献３３】ＳａｌｍｏｎおよびＴｒｏｎｏ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２６１巻，ｐ２１１−２８
【非特許文献３４】ＡｍａｄｏおよびＣｈｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２６１巻，ｐ２２９−４４
【非特許文献３５】Ｎａｗｒｏｃｋｉら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００１年，第１巻，ｐ１９３−２０４
【非特許文献３６】Ｋｏｙａら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００２年，第１６巻，ｐ１６４５−５４
【非特許文献３７】Ｓｔｒｉｐｅｃｋｅら，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２００３年，第３１巻，ｐ２８−３７
【非特許文献３８】Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１年，第８巻，ｐ６２８−３５
【非特許文献３９】Ｋｏｎｇら，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ、２００３年，第１７巻，ｐ１５３−６
【非特許文献４０】Ｄｅｌ  Ｐａｌｍａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３年，第９巻，ｐ７８９−９５
【非特許文献４１】Ｄｉｎｇｌｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３年，第１０２巻，ｐ４８９−９６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍部位または悪性疾患部位において治療レベルのｍｓｐ３６を産生するための方法に関する。標的組織中で活性なプロモーターに作動可能に連結された、ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、腫瘍部位にか、または腫瘍部位の付近に送達される。このレンチウイルスベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたｍｓｐ３６遺伝子を細胞内へ送達し、そこで細胞のＤＮＡに安定して組み込む。このプロモーターは、細胞から分泌される生物活性ｍｓｐ３６タンパク質の合成を指向する。生物活性ｍｓｐ３６は、腫瘍細胞または周囲の間質細胞により合成される検出できないまでに低いレベルのｍｓｐ３６を増強し、そして腫瘍の細胞周期、転移能力、ＭＭＰ−９の合成を阻害し、そして／または腫瘍部位における新脈管形成を防ぐ。
【００１７】
ヒトｍｓｐ３６遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１４９４１２およびＭ６００４７に記載され、ウシｍｓｐ３６遺伝子配列は、ＡＦ２７１８９６に記載され、そしてマウス配列は、ＡＦ０６５４４１に記載される。酸性または塩基性ＦＧＦに結合して、腫瘍細胞増殖、ＭＭＰ−９合成またはマウスＭａｔｒｉｇｅｌ腫瘍アッセイにおける新脈管形成を阻害可能なタンパク質をコードする、遺伝子全体またはｃＤＮＡの全長、あるいはこれらのフラグメントが、本発明において使用され得る。
【００１８】
レンチウイルスベクター内のｍｓｐ３６遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、構成的であり得るか、または誘導性であり得、そして組織特異的であり得る。多くの組織特異的プロモーターが公知である。ｍｓｐ３６のリーダー配列は、同種であり得るか、または異種であり得る。ｍｓｐ３６遺伝子は、イントロン、ｃＤＮＡ、遺伝子またはｃＤＮＡのフラグメント、あるいはこれらの組み合わせを含む、全長遺伝子であり得る。レンチウイルスベクターは、ヒト由来、サル由来、ネコ由来、ウマ由来、ウシ由来または他の哺乳動物種に感染するレンチウイルス由来であり得る。レンチウイルスベクターは、誘導性プロモーターに作動可能に連結された、またはＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を介して、別の治療遺伝子、自殺遺伝子、あるいは毒性遺伝子（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ）を含み得る（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ（２００２）Ｇｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２，３５５−７８）。さらに、レンチウイルスの薬学的処方物は、癌または悪性疾患の処置のために他の治療様式と組み合わされて送達され得る。
【００１９】
低いか、または測定できないレベルのｍｓｐ３６を有する乳癌の腫瘍を、レンチウイルスベクターにより送達されるｍｓｐ３６遺伝子で処置することにより、長期間の、ｍｓｐ３６タンパク質の安定した発現をもたらす。レンチウイルスベクターにより指向される、外因性ｍｓｐ３６の発現は、乳癌のマウスモデルにおいて、腫瘍細胞増殖、浸潤の潜在性、および腫瘍の新脈管形成を阻害する。
【００２０】
本発明者らは、ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターを送達することにより、患者において乳癌、前立腺癌、卵巣癌および肺癌を処置するための方法を記載する。この遺伝子は、腫瘍部位においてｍｓｐ３６タンパク質の局所の治療レベルを発現する。この方法は、直接の注射を使用して、腫瘍部位内か、または腫瘍部位付近にレンチウイルスベクターを投与する工程を包含する。ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、他の癌処置（例えば、外科的介入（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）、放射線治療、ホルモン治療、免疫療法、化学療法または寒冷療法）と組み合わせて送達され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プロモーターに作動可能に連結されたｍｓｐ３６についての遺伝子を含むレンチウイルスベクターを投与して、腫瘍部位において治療有効量のｍｓｐ３６を送達することにより、患者において癌または悪性疾患を処置する方法に関する。このような癌または悪性疾患としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および肺癌、ならびに正常な非癌性の組織と比較してｍｓｐ３６レベルが減少されるかまたは存在しない、任意の他の癌が挙げられる。
【００２２】
「遺伝子」とは、本明細書中で使用される場合、哺乳動物のｍｓｐ３６、好ましくは、ヒトｍｓｐ３６の、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、あるいはｍｓｐ３６の全てもしくは一部をコードするこれらのフラグメントまたは部分をいう。この遺伝子は、イントロンを含み得る。ｍｓｐ３６遺伝子は、ヌクレオチド配列を変化し、そしてアミノ酸配列を変化し得る一般的な集団で説明される、天然に存在する多形を包含する。非限定的な例として、フラグメントまたは部分としては、少なくとも７０〜１００ヌクレオチドまたはそれ以上の核酸フラグメントが挙げられる。この遺伝子は、化学的方法、酵素学的方法、または組換え方法により作製され得る。
【００２３】
「改変体」とは、本明細書中で使用される場合、翻訳されるアミノ酸配列を変化しないようなヌクレオチドの変化を有するｍｓｐ３６遺伝子、あるいはｍｓｐ３６遺伝子から産生される１個以上のアミノ酸の変更を有する翻訳されたアミノ酸配列をもたらす、保存的ヌクレオチド変化または非保存的ヌクレオチド変化を有するｍｓｐ３６遺伝子をいう。用語「改変体」は、アミノ酸の欠失または挿入、あるいは両方を包含する。用語「改変体」はまた、グリコシル化もしくは他の翻訳後修飾に関与するか、またはこれらを指向するアミノ酸残基の付加あるいは除去を包含し、そしてｍｓｐ３６ポリペプチドのＮ末端における、リーダー配列またはさらなるアミノ酸の存在を包含し得る。ｍｓｐ３６の改変体はまた、融合タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））を含み得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「生物活性」であるｍｓｐ３６ポリペプチドとは、ｍｓｐ３６ポリペプチドの活性に類似するが、必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいう。生物活性なｍｓｐ３６ポリペプチドは、癌細胞の細胞周期を阻害し、インビトロアッセイにおける癌細胞の転移を阻害し（Ａｌｂｉｎｉ（１９９８）Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．４，２３０−４１）、癌細胞または周囲の間質組織におけるＭＭＰ−９の産生を減少し、アポトーシスを増強し、腫瘍細胞の増殖速度を減少し、腫瘍細胞の浸潤の潜在性を減少し、またはインビボにて癌細胞による新脈管形成の誘導を阻害する。用量依存性は、ｍｓｐ３６ポリペプチドと同一ではないかもしれない。このポリペプチドは、種々の細胞（真核細胞および原核細胞（細菌が挙げられる）、昆虫細胞、ならびに例えば、マウス、ラットおよびヒトのような哺乳動物細胞が挙げられる）において産生され得る。
【００２５】
「レンチウイルスベクター」は、本明細書中で使用される場合、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２、またはサル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ免疫不全ウイルスもしくはウシ免疫不全ウイルス、あるいは他の哺乳動物種に感染し得るレンチウイルスのベクターが挙げられる。このベクターは、一般に複製欠損性である。
【００２６】
「薬学的組成物」は、本明細書中で使用される場合、１種以上の薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と共同してｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターを含み、そして他の活性成分を含有し得る。薬学的組成物の処方物は、等張性水性滅菌溶液または非水溶性滅菌溶液、あるいは懸濁液であり得る。
【００２７】
ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、種々の経路（注射または局所適用が挙げられる）により投与され得る。このレンチウイルスベクターは、腫瘍内投与、血管内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与または吸入投与を介して患者の部位に送達され得る。
【００２８】
患者は、本明細書中で使用される場合、医師により、癌または悪性疾患であると診断されたヒトである。癌は、種々の組織または器官（胸部、前立腺、卵巣および肺が挙げられるがこれらに限定されない）に発症し得るか、または局在化され得る。この患者は、早期段階の癌を有しても、後期段階の癌を有してもよい。他の癌の処置は、ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスの薬学的処方物を用いる前か、同時にか、または用いた後に適用され得る。
【００２９】
ヒトｍｓｐ３６は、Ｗｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１６７７８−８５にＨＢｐ１７として記載され、ウシおよびマウスのｍｓｐ３６は、ＦＧＦ−ＢＰとして、それぞれ、Ｌａｍｅｔｓｃｈら，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１９４６９−７４およびＫｕｒｔｚら，（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２６７１−８１に記載される。ＨＢｐ１７は、ヘパリン結合増殖因子のファミリーのメンバーとして記載された。ｍｓｐ３６遺伝子のＤＮＡ配列は、約１７ｋＤのポリペプチドを示唆し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動は、約３６ｋＤのサイズを示唆した。明らかなサイズの違いは、ポリペプチドに結合した炭水化物の結果であり得る。
【００３０】
Ｌｅｅ（ＷＯ  ０２／３４２８２）は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現システム、ならびにインビトロにおけるｍｓｐ３６遺伝子の腫瘍細胞へのネイキッドＤＮＡおよびアデノウイルスベクター送達を使用して、組換えｍｓｐ３６の産生を記載する。Ｌｅｅは、インビトロにおける乳癌細胞に対するｍｓｐ３６の作用を特徴づけ、そして細胞周期、細胞移動ならびにＭＭＰ−９分泌の阻害を示す。Ｌｅｅはまた、これらの細胞がＭａｔｒｉｇｅｌマトリクス内に封入され、そしてヌードマウスに移植される場合、インビボで新脈管形成を阻害することを示した。
【００３１】
所望されるｍｓｐ３６をコードする、本発明の方法を使用するための遺伝物質が利用可能である。ヒトｍｓｐ３６遺伝子配列についての遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１４９４１２、およびにＭ６００４７に記載され、ウシｍｓｐ３６遺伝子配列は、ＡＦ２７１８９６に記載され、そしてマウス配列は、ＡＦ０６５４４１に記載される。
【００３２】
本発明の方法における使用のための十分に開発されたシステムは、ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターを利用する。このシステムは、ＡｉｌｌｅｓおよびＮａｌｄｉｎｉ，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６１，３１−５２に要約される。このレンチウイルスベクターは、ヒトにおける使用のために、その安全プロフィールを増加するように高度に改変されている。本来のウイルス配列の約１０％のみが、伝達ベクター内に残ったままである。レンチウイルスベクターを作製するために必要とされるパッケージング細胞は、４回までの別個のプラスミドでトランスフェクトされ、組換えを最小限にする。最良のレンチウイルスベクターの構成において、治療用遺伝子配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００３３】
ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤中に処方され得、そして他の活性成分を含み得る。薬学的組成物の処方物は、等張性水性滅菌水溶液または非水性の滅菌溶液、あるいは懸濁液であり得る。好ましい処方物は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。他のキャリア（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ヒスチジン、グリシン、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルピロリドン）が、ＰＢＳ溶液中に存在し得る。このキャリアの列挙は、網羅的ではない。薬学的調製物は、４℃、−２０℃または−８０℃で貯蔵され得、そして患者への投与前に、室温にされて粉末または乾燥処方物から再形成される。
【００３４】
レンチウイルスベクターの薬学的処方物は、シリンジを用いて組織内へ注射され得る。注射部位は、腫瘍内、血管内、皮下、筋肉内、または腹腔内であり得る。薬学的処方物は、例えば、原発性腫瘍の切除後に、外科手術部位に局所適用され得る。さらに、処方物は、吸入投与のためにエアロゾル化され得る。
【００３５】
治療用量とは、癌または悪性疾患を回復するか、減少するか、または排除するｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターの量をいう。ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターの量は、投与経路、適用される組織、および患者の状態（年齢、体重および性別、ならびに癌または悪性疾患の重篤度）に依存して変化し、これらの全ては、医師または開業医により決定される。治療効力および毒性は、治療用量および毒性用量の範囲を決定するための、細胞培養および動物モデルを使用する標準的な手順により決定され得る。レンチウイルスベクター用量の測定は、培養における細胞の感染および限界希釈により決定され得、そして測定は、ｐ２４カプシドタンパク質（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を測定するＥＬＩＳＡに基づき得る。好ましい用量は、高い効力の指数を有し、かつ低い毒性の指数を有する用量である。患者における癌の治療処置のための形質導入単位（ＴＵ）により測定されるレンチウイルスベクターの範囲は、１０５〜１０１０ＴＵ／用量である。
【００３６】
レンチウイルスベクターは、他の癌処置とともに薬学的処方物で送達され得る。例えば、トポイソメラーゼインヒビター（例えば、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ））、チューブリン結合剤（例えば、パクリタキセル）、アルキル化剤（例えば、クロラムブシル）、代謝拮抗物質（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、または免疫抑制剤（例えば、デキサメタゾン）の処方物は、レンチウイルスベクターの処方物と混合され得るか、または再処方され得、そして患者へ注射されるか、または局所適用されるかのいずれかである。
【００３７】
以下の非限定的な実施例は、乳癌の処置についての、本発明の実施に対する適応を記載する。しかし、本発明は、乳癌には限定されず、ｍｓｐ３６のレベルが腫瘍組織において減少するかまたは検出できない、任意の癌について使用され得る。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
（ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターの構築、およびこのベクターが、形質導入された哺乳動物細胞中で生物活性ｍｓｐ３６の合成を指向し得ることの証明）
ヒトｍｓｐ３６遺伝子は、乳腺のｃＤＮＡライブラリ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して単離し得る。２つのプライマー（例えば、５’−ａｃｔｇｇａｔｃｃｇｔｇｔｇｃｔｃａｇａａｃａａｇ−３’の順方向プライマー、および５’−ｔｇａｃａｔｃｔｃｔｔａａａｇｇａａｃｃｃｇｔｔｃｔｃ−３’の逆方向プライマー）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４８０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）において、製造者の指示に従い、３７℃のアニーリング、７２℃の伸張、および９４℃の変性の条件下で使用し得る。得られたＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローン化した。
【００３９】
レンチウイルスベクターは、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，９８７３−８０；Ｙａｍら，（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，４７９−８４；およびＬｏｇａｎら，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，４２９−３６に記載され、そして、例えば、ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭレンチウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＬｅｎｔｉＰａｋＴＭ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の販売元から得ることができる。これらのベクターは、ｃＤＮＡ挿入のための便利な制限部位を有し、そしてＣＭＶプロモーターを含む。ヒトｍｓｐ３６遺伝子を、その相同なシグナル配列およびポリ（Ａ）部位と組み合わせて導入する。このベクタープラスミド構築物は２つの主要なパッケージングプラスミドおよびＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈殿により同時にトランスフェクトする。２０μｇ（４５０μｌ）のプラスミド混合物を、１０％  ＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培養培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）培地で増殖させた５×１０６個の２９３細胞（ＣＲＬ−１５７３，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含む１００ｍｍのディッシュに添加する。トランスフェクションの１６時間後に新鮮な培地を追加し、そして新鮮な培地追加の２４時間後に、調製培地を収集した。この培地を、低速の遠心分離で清澄化し、０．２μｍの酢酸セルロースフィルタをとおして濾過し、そして−８０℃で貯蔵する。ウイルス調製の力価（形質移入単位、ＴＵ）を、２９３細胞に対して限定希釈物を用いた定量ＰＣＲ、ならびに、ｐ２４カプシドタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイ  （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用する全ウイルス粒子数の測定により決定した。
【００４０】
レンチウイルスベクター調製物（１０７ＴＵ／ｍｌ）を、２×１０５細胞で播種されたＨｅＬａ細胞に添加する。培地を、４８時間で収集し、ｍｓｐ３６タンパク質の量をＥＬＩＳＡにより定量する。
【００４１】
（実施例２）
（ｍｓｐ３６特異的な活性の測定）
５枚の２９３細胞の１００ｍｍプレートを、実施例１に記載するようにトランスフェクトする。調製培地を、トランスフェクト後２４時間と４８時間とで収集し、プールし、そして実施例１に記載されるように処理する。この培地を、ｐ２４カプシドタンパク質およびＴＵについて特徴付ける。調製培地を、ＨｅＬａ細胞に添加し、これらの培養からｍｓｐ３６を含む調製培地を、実施例１に記載されるように、２４時間後および４８時間後に収集する。
【００４２】
この培地を、スピンカラムを使用して、ｍｓｐ３６タンパク質を約１０μｇ／ｍｌまで濃縮する。ｍｓｐ３６タンパク質産生を、ＥＬＩＳＡにより定量し、１μｇ／ｍｌを、ＭＣＦ７乳癌細胞におけるｐ２１の発現を誘導する能力について試験する。細胞を、２４時間および７２時間にて収集し、そしてｐ２１を、ウェスタンブロットにより検出する。レンチウイルスにより指向されるｍｓｐ３６によるｐ２１の誘導のレベルを、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えｍｓｐ３６と比較する。
【００４３】
（実施例３）
（インビトロにおける乳癌細胞の形質導入効率）
３種類の乳癌細胞株（ＭＤＡＭＢ４３５、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ）を、１〜５のＭＯＩでｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターを用いて形質導入する。４８時間後、細胞の２分の１を収集し、形質導入した細胞の百分率を、レンチウイルスベクターに特異的なプライマーを使用して、定量ＰＣＲにより測定する。さらに４８時間後、この細胞の残り半分を収集し、ｐ２１誘導のウェスタンブロット検出のために処理する。培地を収集し、そしてＥＬＩＳＡにより、ｍｓｐ３６タンパク質産生について定量する。
【００４４】
（実施例４）
（ａ）細胞周期阻害、ｂ）細胞移動の阻害、およびｃ）ＭＭＰ−９の分泌阻害の終点を有する、標的乳癌細胞株に対する効力を有する遺伝子送達により産生される相関ｓｍｐ３６レベル）
（軟寒天に対する固定源非依存性増殖）
実施例３からの、ｍｓｐ３６を形質導入したＭＤＡＭＢ４３５乳癌細胞およびＴ４７Ｄ乳癌細胞は、未処理のコントロール細胞と比較して、２．５週間において軟寒天における固定源非依存性増殖の阻害を示す（ＡｌｌｅｙおよびＬｉｅｂｅｒ（１９８４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４９，２２５−３３）。
【００４５】
（細胞形態の試験）
ｍｓｐ３６を形質導入したＭＤＡＭＢ４３５乳癌細胞およびＴ４７Ｄ乳癌細胞は、形質導入しないか、または擬似的に形質導入したコントロール細胞集合と比較して形態的変化を示す。形質導入した細胞からのｍｓｐ３６産生を、ＥＬＩＳＡにより決定し得る。さらに、これらの細胞は、ウェスタンブロットにより測定されるように、ｐ２１を発現する。
【００４６】
（トランスウェル移動アッセイ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用する浸潤の潜在性の減少）
細胞浸潤の潜在性を、Ｍａｔｒｉｇｅｌで被覆した８μｍポリカーボネートフィルタとともに２４−ウェルＢｉｏＣｏａｔＴＭ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ浸潤チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定し得る。実施例３からの１０５個のｍｓｐ３６形質導入ＭＤＡＭＢ４３５細胞を４８時間上部チャンバに置いた。下部チャンバは、ＤＭＥＭ＋ｌ０％  ＦＢＳまたはＦＢＳを含まないＤＭＥＭをコントロールとして含む。インキュベーション後、細胞を、３％グルタルアルデヒドで固定し、ギムザで染色する。フィルター上部表面上の細胞をふき取ることにより取り除き、下部チャンバに移動した細胞の数を計数する。
【００４７】
（ＭＭＰ−９産生の減少）
ｍｓｐ３６を形質導入した乳癌細胞ならびに形質移入しない細胞を、１μｇ／ｍｌ  ｍｓｐ３６の調製培地の存在下で試験する。ＭＭＰ−９の産生を、酵素電気泳動法（Ｙａｍａｇａｔａら，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１，１５８−６２）により試験した。
【００４８】
（実施例５）
（腫瘍増殖および新脈管形成の軽減について、ヒト乳癌細胞で前もって接種したヌードマウスを処置することによる、遺伝子送達を介して送達されたｍｓｐ３６の効力の決定、ならびにｍｓｐ３６タンパク質蓄積物の送達に対するｍｓｐ３６遺伝子送達による効力の比較）
１コホートあたり５匹の４つのヌードマウスコホート：１）処置をしないコントロール、２）ｍｓｐ３６ベクターによる処置、３）ｍｓｐ３６タンパク質による処置、および４）コントロールベクター、を試験する。３．６×１０６個のＭＤＡＭＢ４３５腫瘍細胞を、各々のヌードマウスの２種類の乳房脂肪パッドに注射した。腫瘍注射後７〜１０日後、ｍｓｐ３６遺伝子を含むレンチウイルスベクターの濃度の３分の１（実施例３に定義される）を、シリンジを使用して１つのコホートのマウスの各々の腫瘍部位に注射する。ポジティブコントロールとして、ｍｓｐ３６タンパク質を、別個のコホートの動物の腫瘍部位に注射する。ネガティブコントロールとして、第３コホートのマウスに、生理食塩水を注射し、第４のコホートに、ｍｓｐ３６遺伝子を含まないレンチウイルスベクターを注射した。カリパス測定を、２日ごとに実施し、発達する腫瘍のサイズを測定する。腫瘍サイズが、任意の寸法で２０ｍｍに達する場合（約５〜７週間）、マウスを屠殺し、原発性腫瘍、リンパ節からの排出、および肺を、肉眼による可視化、組織病理学、および免疫組織化学により、試験する。ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲにより、ｍｓｐ３６タンパク質発現の存在、ｍｓｐ３６のＲＮＡ転写物、およびｍｓｐ３６−ＬＶ  ＤＮＡの存在を測定する。さらなる組織学的スライドガラスを調製して、免疫組織化学によりＣＤ３１（新規の血管の形成に関連するタンパク質マーカー）を測定する。
【００４９】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００５０】
上に本発明が記載されるが、種々の改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなくなされ得ることが明らかである。
【国際調査報告】
2007509611.tif 000002