(57)【要約】  本発明は、イオンチャネル、特に心筋ＩＫｒチャネル、例えばｈＥＲＧを含むＥＲＧによりコードされるものを、調節する化合物の同定、試験および／またはスクリーニングする方法において有用な標識リガンド化合物に関する。該リガンド化合物は、前臨床化合物のＥＲＧカリウムチャネルへの親和性の評価に有用である。該リガンド化合物は、式Ｉ：【化１】2007513874.tif 000011を有するかまたはその塩、水和物または溶媒和物であり、かつ少なくとも１個の放射標識を含む化合物である。
2007513874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2007513874.tif 000009
を有するかまたはその塩、水和物または溶媒和物であり、かつ少なくとも１個の放射標識を含む化合物。
【請求項２】
該化合物が少なくとも１個、２個または３個のトリチウム置換をメタ位に含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式II：
【化２】
2007513874.tif 000010
の化合物またはその塩。
【請求項４】
化合物の活性をＩＫｒチャネルブロッカーとして特徴付けるためのアッセイであって、下記工程：
ａ)ＩＫｒチャネルを含む細胞膜の、式IIの化合物の存在下、かつ試験化合物の存在下または非存在下でのインキュベーション；
ｂ)試験化合物の存在下または非存在下、特異的に結合した標識化合物の測定；
ｃ)試験化合物による標識化合物の結合の阻害の計算
を含む、方法。
【請求項５】
ａ)１個またはそれ以上の濃度の試験化合物の溶液を調製し；
ｂ)式IIの化合物とＩＫｒチャネルを含む細胞膜を混合し；
ｃ)試験化合物の溶液と、式IIの化合物およびＩＫｒチャネルを含む細胞膜の混合物をインキュベートし；
ｄ)溶液から膜を単離し、そして膜の放射活性を測定し；
ｅ)試験化合物存在下のサンプルの放射活性を、試験化合物非存在下のコントロールと比較して計算する
工程を含む、請求項４記載のアッセイ。
【請求項６】
ＩＫｒチャネルがヒトＥＲＧである、請求項４または５記載のアッセイ。
【請求項７】
細胞膜がヒトＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトした細胞系由来である、請求項６記載のアッセイ。
【請求項８】
細胞系がＨＥＫである、請求項７記載のアッセイ。
【請求項９】
１個またはそれ以上の候補化合物のＩＫｒチャネルブロッカー活性の特徴付けのためのアッセイにおける、式IIの化合物の使用。
【請求項１０】
アッセイが競合的結合アッセイである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェートの存在下、３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンをトリチウム標識することを含む、請求項３記載の式IIの化合物の製造法。
【請求項１２】
３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンおよび(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェートがジクロロメタンに溶解されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
トリチウム標識をトリチウム標識マニフォールドを使用して行う、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
実質的にここに記載の式IIの化合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、イオンチャネル、特に心筋ＩＫｒチャネル、例えばｈＥＲＧを含むＥＲＧによりコードされるものを調節する化合物の同定、試験および／またはスクリーニングの方法に有用な標識リガンド化合物に関する。該リガンド化合物は、故にＥＲＧカリウムチャネルの前臨床化合物の親和性を評価するために有用である。
【０００２】
背景技術
現在、薬剤誘発突然死の幾分かは、トルサード・ド・ポアンツ(ＴｄＰ)と呼ばれる不整脈に二次的であることが認識されている(Vandenberg JI, Walker BD, Campbell TJ. HERGK+ channels: friend and foe. Trends Pharmacol Sci 2001; 22(5): 240-6)。
【０００３】
この現象の理解における近年の進歩は、主要な事象が、このような薬剤による遅延整流カリウム電流(ＩＫｒ)の急速要素の阻害であることを示唆する。これらの化合物は、ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子(ｈＥＲＧ)によりコードされるこの電流−サブユニットを運搬するチャネルタンパク質の孔形成αサブユニットと結合する。ＩＫｒが心筋活動電位の再分極に重要な役割を有するため、その阻害が再分極を遅らせ、これがＱＴ間隔の延長として発現する。ＱＴ間隔の延長それ自体は安全性懸念事項ではないが、それは心臓血管有害事象の高リスクを伴い、少数のヒトにおいてＴｄＰおよび心室細動への退行に至り得る。
【０００４】
多くの化合物が、ｈＥＲＧによりコードされる心筋ＩＫｒチャネルの阻害のために市販し得る薬剤になれない。ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル(ｈＥＲＧ)遺伝子が変異しているＬＱＴ２症候群の患者もまたトルサード・ド・ポアンツを示す。ｈＥＲＧチャネルは、例えば、第III群抗不整脈薬メタンスルホンアニリド(ドフェチリド、Ｅ−４０３１およびＭＫ−４４９)および臨床でＱＴ延長の原因となるこのような部位を共有する多くの薬剤のための結合部位を有する。結果として、それらは警告表示(例えばピモジド)を有するかまたは市場から無くなる(例えばテルフェナジン)。ｈＥＲＧチャネルにおける活性と所望の標的の間の適切な治療域の欠如が、可能性のある薬剤のさらなる進歩を妨害するであろう。故に、新規化合物クラスでこの活性の現象を可能にするために、できるだけ早くｈＥＲＧ活性を評価する必要性がある。
【０００５】
新規化合物のＥＲＧ、および、特にｈＥＲＧ活性および結合を評価するために適切なアッセイが必要である。前臨床アッセイは開発されており、ｈＥＲＧに結合し、新規化合物クラスの親和性を決定する置換試験を可能にする放射標識化合物を使用する。しかしながら、このようなアッセイに使用するための代替的リガンドの必要性がある。
【０００６】
発明の開示
ＷＯ０２／０４４４６は、ビスピジン化合物および心不整脈の処置におけるそれらの使用を記載する。
【０００７】
従って、第一の局面において、本発明は、ＷＯ０２／０４４４６に記載のビスピジン化合物の放射標識誘導体またはその塩、水和物もしくは溶媒和物に関する。適当には該化合物は放射標識置換および、特に、トリチウム置換を含む。好ましい態様において、本化合物は少なくとも１個、２個または３個のトリチウム置換を含む。
【０００８】
好ましい態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2007513874.tif 000003
を有するかまたはその塩、水和物または溶媒和物であり、かつ少なくとも１個の放射標識を含む化合物に関する。
【０００９】
適当には該化合物は、少なくとも１個、２個または３個のトリチウム置換を、好ましくはニトロ基に対してオルト位に含む。
【００１０】
このような放射リガンドまたは放射標識化合物は、ＥＲＧ、および特にｈＥＲＧによりコードされるＩＫｒチャネルでの化合物の親和性の評価に有用である。
【００１１】
本発明の好ましい態様において：
【化２】
2007513874.tif 000004
である式IIの化合物またはその塩を提供する。
【００１２】
適当な塩は、その酸付加塩または塩基塩である。いくつかの適切な塩のレビューは、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1 19 (1977)に見ることができる。塩は、例えば、鉱酸、例えば硫酸、リン酸またはハロゲン化水素酸のような強無機酸と；酢酸のような、非置換または(例えば、ハロゲンで)置換されている１個から４個の炭素原子のアルカンカルボン酸のような強有機カルボン酸と；飽和または不飽和ジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテレフタル酸と；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸と；アミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸と；安息香酸と；またはメタン−またはｐ−トルエンスルホン酸のような、非置換または(例えば、ハロゲンで)置換されている(Ｃ１−Ｃ４)−アルキル−またはアリール−スルホン酸のような有機スルホン酸と形成される。
【００１３】
本発明はまた式ＩまたはIIの放射標識化合物の全エナンチオマーおよび互変異性体を含む。当業者は、光学特性(１個またはそれ以上のキラル炭素原子)または互変異性特性を有する化合物を認識するであろう。対応するエナンチオマーおよび／または互変異性体は、当分野で既知の方法により単離／製造し得る。
【００１４】
加えて、本発明は式ＩまたはIIの放射標識化合物のすべての立体異性体および／または幾何異性体を含む。例えば１個またはそれ以上の不斉および／または幾何中心が存在し得、故に、化合物は２個またはそれ以上の立体異性体および／または幾何的形態で存在し得る。本発明は、これらの薬剤のすべての個々の立体異性体および幾何異性体、およびこれらの混合物の使用を意図する。特許請求の範囲において使用する用語は、該形態が適切な機能的活性(必ずしも同程度ではない)を保持する限り、これらの形態を包含する。
【００１５】
本発明はまた化合物またはその塩の他の同位体異形も含む。本発明の薬剤またはその薬学的に許容される塩の同位体異形は、少なくとも１個の原子が同じ原子番号であるが、天然で最も一般的に見られるその原子質量と異なる原子質量である原子で置換されているものである。化合物に取り込めるさらなる同位体の例は、各々２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌのような水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体を含む。式IIに明示されるように、トリチウム標識形、すなわち、３Ｈが特に好ましい。炭素−１４、すなわち、１４Ｃ同位体も使用でき、その製造の容易さおよび検出性から好ましい。同位体異形は、一般に、適切な試薬の適当な同位体異形を使用した慣用法により製造できる。
【００１６】
本発明はまた本化合物の溶媒和物形の使用を含む。特許請求の範囲で使用される用語は、これらの形態を包含する。
【００１７】
結合アッセイにおける放射リガンド化合物の好結果の使用は、目的のチャネルに対する放射リガンドの親和性ならびにひとたびそれが結合したときの解離速度を含む多数のパラメーターに依存する。理想的には、適切な放射リガンドは、同じ部位に結合できる候補化合物と競合する親和性を有し、かつ、放射リガンドがその結合が検出可能になるのに十分な時間接触したままである解離速度を有する。化合物におけるこれらの特性は予測できない。従って、本発明は、１個、２個または３個トリチウム置換された式Ｉの化合物または式IIの化合物を号積でき、競合的結合アッセイにおける使用に適切であるとの発見に関する。
【００１８】
本発明の第二の局面において、本発明の化合物を使用することを含む、化合物をＩＫｒチャネルブロッカーとして特徴付けする方表を提供する。
【００１９】
適当には該方法は、下記工程：
ａ)ＩＫｒチャネルを含む細胞膜の、式IIの放射リガンド化合物の存在下、かつ試験化合物もしくは試験化合物混合物の存在下または非存在下でのインキュベーション；
ｂ)試験化合物の存在下または非存在下、特異的に結合した標識化合物の定量；
ｃ)試験化合物もしくは試験化合物混合物による標識化合物の結合の阻害の計算
を含む、アッセイである。
【００２０】
このようなアッセイは、心臓毒性副作用の可能性を有する化合物の同定および特徴付けに有用である。本アッセイは、試験化合物が、式IIの放射リガンド化合物を、好ましくはＥＲＧチャネルであるＩｋｒチャネルから離す能力を測定する。適当には本アッセイは、ハイスループット試験系で行うことができる。本アッセイは、適切な化合物(すなわちＩｋｒチャネルに親和性がないか、低いまたは低下した親和性を有する)のさらなる開発への選択を可能にする。
【００２１】
あるいは、このようなアッセイは、Ｉｋｒチャネルに結合でき、故に不整脈の患者の処置に有用な可能性のある化合物の同定に有用である。
【００２２】
好ましい態様において、該アッセイは：
ａ)１個またはそれ以上の濃度の試験化合物の溶液を調製し；
ｂ)式IIの放射リガンド化合物とＩＫｒチャネルを含む細胞膜を混合し；
ｃ)試験化合物の溶液と、式IIの放射リガンド化合物およびＩＫｒチャネルを含む細胞膜の混合物をインキュベートし；
ｄ)溶液から膜を単離し、そして膜の放射活性を測定し；
ｅ)試験化合物存在下のサンプルの放射活性を、試験化合物非存在下のコントロールと比較して計算する
工程を含む。
【００２３】
適当には、放射リガンド化合物の細胞膜への結合の５０％阻害をもたらす試験化合物の濃度(ＩＣ５０)を計算する。これらの値は、ヒトにおいて望ましくない副作用をもたらすかもしれない化合物の濃度の予測に使用できる。
【００２４】
一つの態様において、本アッセイはスポット試験である。他の態様において、本アッセイは濃度範囲、および、好ましくは、５個またはそれ以上の濃度を試験する。
【００２５】
膜の単離および放射活性の測定のための適当な方法は、本明細書に記載のアッセイのようなフィルター結合アッセイを含む。あるいは、放射活性を、シンチレーション近接アッセイ(SPA, Amersham Biosciences)のようなビーズを利用したアッセイを使用して測定し得る。
好ましくはＩＫｒチャネルはヒトＥＲＧ(ｈＥＲＧ／ＨＥＲＧ)である。
【００２６】
一つの態様において、ＩＫｒチャネル含有細胞膜は、ＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトした細胞系由来である。適当には、ＥＲＧ遺伝子はヒト(ｈＥＲＧ)、霊長類またはイヌ科由来である。
【００２７】
ＨＥＲＧは、ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)細胞において機能的チャネルとして、安定に発現されているか、または一過性に発現されている(例えば、Circulation 2001 Nov 27;104(22):2645-8 Phospholipid metabolite 1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine enhances human ether-a-go-go-related gene (HERG) K(+) channel function. Wang J, Wang H, Han H, Zhang Y, Yang B, Nattel S, Wang Z; J Biol Chem 1998 Aug 14;273(33):21061-6 HERG channel dysfunction in human long QT syndrome. Intracellular transport and functional defects. Zhou Z, Gong Q, Epstein ML, January CT参照)。
【００２８】
従って、適切な細胞系は、ＨＥＫ２９３細胞のようなＨＥＫ(ヒト胎児腎臓)細胞を含む。他の適切な細胞系は、ＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣)、ＣＨＬ(チャイニーズハムスター肺)またはＣＯＳ(サル)細胞を含む。加えて、本チャネルはＳＦ９のような細菌、酵母または昆虫細胞において発現し得る。
【００２９】
本発明の他の局面において、１個またはそれ以上の試験化合物のＩＫｒチャネルブロッカー活性の特徴付けのためのアッセイにおける本発明の化合物の使用を提供する。
【００３０】
さらなる局面において、Ｉｋｒチャネルに結合できる１個またはそれ以上の候補化合物を同定するためのアッセイにおける式IIの化合物の使用を提供する。
適当には、該アッセイは競合的結合アッセイである。
【００３１】
本発明のさらに別の局面において、(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェートの存在下、３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンをトリチウム標識することを含む、本明細書に記載の式IIの化合物の製造法を提供する。
【００３２】
適当には、３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンおよび(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェートはジクロロメタンに溶解されている。
一つの態様において、トリチウム標識はトリチウム標識マニフォールドを使用して行う。
【００３３】
特に好ましい態様において、式IIの化合物の製造法は実質的にここに記載の通りである。
下記非限定的実施例は、式IIの化合物の合成および使用を示す。
【００３４】
実施例
実施例１  −  放射活性リガンドの合成
放射標識前の３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンの合成は、ＷＯ０２／０４４４６に記載されている。
【００３５】
式IIの化合物：
【化３】
2007513874.tif 000005
｛３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(式II)｝
を得るための放射標識を下記の通り行う：
３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(１.６２mg、３.８２μmol)および(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェート(８.６mg、１０.３μmol)をジクロロメタン(１ml)に溶解し、２ml重ガラス壁丸底フラスコに移す。フラスコをRC Tritecトリチウム標識マニフォールドに接続し、凍結、＜０.０１mbarへの廃棄および融解のサイクルに付し、サンプルを脱気する。ジクロロメタン溶液を最後に液体窒素で凍結し、マニフォールド上の一次ウラン床から発生したトリチウムガス(約１３０GBq、６１μmol)を溶液上の間隙に挿入する。反応物を室温に温め、２０時間、磁気撹拌棒の手段により撹拌する。
【００３６】
溶液を液体窒素で再凍結し、残存トリチウムガスをマニフォールドの二次ウラン貯蔵床に再吸収させる。フラスコをマニフォールドから話、溶液をエタノール(２×５ml)を使用した２サイクルの凍結乾燥に付し、不安定なトリチウムを除去する。得られた残渣をエタノール(１０ml)に溶解し、３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(１９.３３GBq、放射化学純度３４％)の貯蔵溶液を得る。
【００３７】
貯蔵溶液のアリコート(２ml、３.８７GBq)を取り、窒素流下吹き落とし、残渣をアセトニトリル／０.５％ｖ／ｖ水性トリフルオロ酢酸、１：１容量(４００μｌ)に再溶解する。サンプルを下記のＨＰＬＣ条件を使用した約５回の等しい注入で精製する：Xterra MS C-8  １５０×８ｍｍ、３ml／分で３５％アセトニトリル／０.５％ｖ／ｖ水性トリフルオロ酢酸、検出２４０nm。３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(保持時間１０.７７分)のためのフラクションを各時間に集め、合わせる(放射化学純度＞９７％)。水性チオ硫酸ナトリウム(５０％ｗ／ｖ、５０μｌ)を合わせたフラクションに添加し、減圧下で溶媒を除去する前にサンプルを安定化する。得られた水性溶液を凍結乾燥し、白色残渣を残して、それをエタノール／水、２：１容量(１５ml)中で再構成して３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(８８１.７MBq；放射化学純度９７.５％)の精製貯蔵を得る。モル特異的放射活性を質量分析により測定し、２９４１.５GBq／mmolであることが判明する。
【００３８】
実施例２  −  ｈＥＲＧ結合アッセイのプロトコール
アッセイプレート
９６ウェルポリプロピレンプレート(Costar C3600)
Whatman GF/Bフィルタープレート(Packard(6005177N))
アッセイおよび洗浄緩衝液
１０mM  ＨＥＰＥＳ
１３０mM  ＮａＣｌ
５mM  ＫＣｌ
１mM  ＥＧＴＡ
０.８mM  ＭｇＣｌ２
ＮａＯＨでｐＨ７.４
ＧＦ／Ｂプレートコーティング溶液
０.３％(ｖ／ｖ)ポリエチレンイミン
０.２％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ
回収前にＧＦ／Ｂフィルタープレートをコーティング溶液に最低２０分間予め浸す。
【００３９】
膜
アッセイで使用するための膜を下記の通り調製する：
ＨＥＫ(ヒト胎児腎臓)細胞を標準法を使用して増殖させ、必要な数を得て、次いでそれらを回収し、ペレット化する。最終ペレットを、無血清培地中に調製し、充填細胞容積(ｐｃｖ)を測定する。
【００４０】
ペレットを、ｐｃｖの４倍量の低張性緩衝溶液(３部水：１部無血清培地または緩衝液)に再懸濁し、１錠／５０mlのBoehringerプロテアーゼ阻害剤(Cat No 1 697 498)を添加する。
【００４１】
細胞を数分間氷上で膨張させ、２２,０００rpmに設定したPolytron組織ホモゲナイザーを使用して溶解する。細胞懸濁液を氷上に置き、Polytronの速度を上げ、次いでスイッチを切り３０秒間冷やして、その後繰り返す。通常３バーストが、細胞の完全な溶解のために十分であろう。サンプルを顕微鏡で確認し、完全な溶解を確実にし、必要であれば工程を繰り返す。
【００４２】
緩衝液中の１０mlの冷４１％スクロース溶液を３８ml  Beckman超遠心管(Cat No 344058)に添加する。溶解した膜溶液を注意深く４１％クッション上に重層する。側面に付着し得る何らかの残骸をPolytron試験管から緩衝液で洗い出す。超遠心試験管に冷緩衝液を乗せ、試験管を完全に満たす(これは試験管が遠心中に崩壊することを抑制する)。遠心を２８,０００rpmで１時間、４℃で、SW-28スウィング−アウト・ローター(swing-out rotor)と８００rpmへのブレーキを使用して行う。
【００４３】
膜は白色の帯としてスクロース／緩衝液中間相に見られる。緩衝液の上層を廃棄し、次いですべての膜バンドをできるだけ少ないスクロース層と共に回収し、新しい遠心管に添加する。これを希釈し、少なくとも３容量のプロテアーゼ阻害剤含有氷冷緩衝液とよく混合する。遠心を２３,０００rpmで４℃で２０分間、０へのブレーキと共に行う。
【００４４】
上清を廃棄し、ペレットをアッセイ緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤に氷上で、１×１０８細胞当量／mlで再懸濁する。この調製物を次いで等分し、−８０℃またはそれ以下に凍結する。
【００４５】
アッセイで使用するために、膜溶液を６５倍に希釈し、例えばアッセイプレートあたり、０.５mL  膜を３２.５mL  アッセイ緩衝液で希釈する。３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンの全結合は、総添加量の１０％を超えない。
【００４６】
放射標識
３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンを上記プロトコールに従い製造し、３.３mg／mL  チオ硫酸ナトリウム含有６７％(ｖ／ｖ)エタノール、３３％(ｖ／ｖ)水中に供給する。これらの試験で使用する放射標識のバッチは、２９４１.５GBq／mmol(７９.５Ci／mmol)の特異的活性および２０μMの濃度を有する。貯蔵放射標識を２０００倍に１０nMまで希釈し、ウェルあたり２０μLを添加し、２００μLの最終アッセイ容量とし、１nMの最終放射リガンド濃度とする。
【００４７】
全結合
競合リガンド非存在下の全結合を媒体対象の存在下で定義する。この場合、１％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ(アッセイ緩衝液中の１０％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯの貯蔵溶液から２０μL／ウェル)であった。
【００４８】
ＮＳＢ
非特異的結合(ＮＳＢ)を、１０μM  アステミゾール(アッセイ緩衝液中の１０％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ中の１００μMの貯蔵溶液から２０μL／ウェル)の存在下、３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンの結合を測定することにより決定する。
【００４９】
試験化合物
試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、１０mMの貯蔵濃度とする。典型的に７個までの化合物を、内部標準と一緒に、１プレートあたり試験する。これらを同時に９６ウェルプレート中、８チャンネルピペットを使用して希釈する。化合物をＤＭＳＯ中で使用すべき最終アッセイ濃度の１００倍まで連続希釈し、典型的に３mMから３０μMの１００.５単位(half-log unit)である。これは、３０μLの各連続希釈を９６ウェルプレート中の６５μL  ＤＭＳＯに添加することにより達成する。さらなる希釈を下記の通りアッセイ緩衝液中で行う：化合物を、アッセイ緩衝液で１０倍に希釈し、１０％ＤＭＳＯの化合物の５濃度を得る。２０μLのこれらの各希釈を次いでアッセイプレートに添加する。他の添加をしたとき、これにより２００μLの総量および１％(ｖ／ｖ)の最終ＤＭＳＯ濃度となる。
【００５０】
アッセイ標準
ｈＥＲＧ活性化合物であるピモジドをアッセイ標準として使用する。そのｐＩＣ５０は７.７±０.１(平均±ＳＥＭ、ｎ＝７、範囲７.５−８.０)であった。該化合物をＤＭＳＯ中の１０mM貯蔵溶液として製造し、アリコートを各実験で使用するまで−２０℃で凍結する。１個の標準化合物を各アッセイプレートで試験する。
【００５１】
アッセイ法
アッセイをCostarポリプロピレン丸底９６ウェルプレートで行う。各アッセイプレートは全結合および非特異的結合のためのコントロールを含む。化合物を通常５個の１０倍希釈(log step dilution)で、デュプリケートで試験する。これにより８化合物を試験することがアッセイプレートあたり可能である。典型的に化合物を３０μMから０.３μMの範囲で試験する。
【００５２】
各アッセイプレートへの添加を表１に要約する：
【表１】
2007513874.tif 000006
【００５３】
全添加を行った後、プレートをプレート・シェーカー上に１分置いて、混合させる。プレートを次いで３時間、室温(１８−２０℃)でインキュベートする。この間、各アッセイプレートにつき１個のＧＦ／Ｂプレートをコーティング溶液に浸す。インキュベーション後、アッセイウェル内容物をTomtecハーベスターを使用して回収し、１サイクルあたり約２５０μL  洗浄緩衝液を使用して７回洗浄する(合計１７５０μL)。プレートレイアウトをハーベスターに移し、アッセイプレートのウェルＡ１がＧＦ／ＢプレートのウェルＡ１２上に回収されるようにする。
【００５４】
２０μLの１０nM  ３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンを乾燥フィルタープレートに添加し、アッセイウェルに添加した総放射活性を測定する。プレートをオーブン中、５８℃で２時間または一晩、室温のいずれかで乾燥させる。裏面のシールを各プレートの下面に貼り、５０μL／ウェル  Microscint 0を各フィルター上に添加する。TopSealを各プレートに添加し、放射活性を[３Ｈ]プロトコールのPackard TopCountで逆を向いたプレートで計数し、濾過中に行った移動させたレイアウトの補正を可能にする。
【００５５】
データ分析
全結合、非特異的結合および添加した総[３Ｈ]の平均ＣＰＭ値を計算する。平均ＣＰＭをまた試験化合物の各濃度について計算し、平均ＮＳＢを減ずる。各試験化合物の濃度−効果曲線を、試験化合物の濃度に対する平均ＣＰＭのプロットにより構築する。ｐＩＣ５０値を次いで決定する。
【００５６】
結果
３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンは、ｈＥＲＧ−トランスフェクトしたＨＥＫ細胞由来の膜と、高い親和性(Ｋｄ  ０.９１±０.０１nM；Ｂｍａｘ  ２３.１±０.４pmol／タンパク質mg；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３)で可逆的に結合した。
【００５７】
競合置換アッセイのために、１nMの放射リガンド濃度を使用し、これは非特異的結合を超える１０倍の結合窓を提供し、可逆性、一部位結合特性を証明する。
【００５８】
公表された[３Ｈ]−ドフェチリドデータとの比較
３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンは、ｈＥＲＧチャネルブロッカーについて先に記載された化合物の範囲まで、ｈＥＲＧ−トランスフェクトしたＨＥＫ膜から十分に離れる。
【００５９】
表２. ｈＥＲＧ−トランスフェクトしたＨＥＫ膜における、３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンおよび[３Ｈ]−ドフェチリド(Finlayson et al.)を使用した競合結合アッセイ由来の既知ｈＥＲＧチャネルブロッカーのｐＩＣ５０値の比較(平均±ＳＥＭ、ｎ＞４)。
【表２】
2007513874.tif 000007
【００６０】
これらの化合物のｐＩＣ５０値は、ファイザーのドフェチリドを放射リガンドとして使用して観察される公開されたデータと一致する(表２；Finlayson et al.のデータ)。この相関は、３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンが、ｈＥＲＧチャネルと相互作用することが既知の多くの薬剤により占有されるのと同様の結合部位を占有するとの観察と一致する。
【００６１】
既知ｈＥＲＧブロッカーについての電気生理学的データの比較
３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン結合ｐＩＣ５０値と、これらのｈＥＲＧチャネルブロッカーの電気生理学由来のｐＩＣ５０値は、結合アッセイが、これらの化合物が該チャネルと機能的に相互作用するであろうと予測できることを示す(表３)。
【００６２】
表３. ３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンを使用した競合結合アッセイおよび電気生理学由来の既知のｈＥＲＧチャネルブロッカーのｐＩＣ５０値の比較。
【表３】
2007513874.tif 000008
【００６３】
一定範囲の候補化合物との電気生理学データの比較
別々の範囲の構造クラスを代表する化合物の範囲を、３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン結合アッセイでスクリーニングする。これらのデータと、電気生理学試験からの機能的ｐＩＣ５０データは、大多数の化合物が電気生理学よりも結合アッセイで３〜１０倍活性が低いことを示す。しかしながら、１０マイクロモル濃度より高い機能的活性の全化合物が、結合アッセイで検出された。
【００６４】
標準化合物のデータは、結合アッセイがチャネルブロッカーのＳＡＲの調査に適しているであろうことを示す。標準と比較して、通常計画中の化合物についてよりも効果が低い化合物を扱うとき、明白なＳＡＲがアッセイ感度の範囲内ではない。
【００６５】
結合アッセイが明らか提供するものは、ｈＥＲＧチャネルと相互作用する計画中の化合物の能力の急速で早い検出の簡便な手段であることである。
【００６６】
結論
単純な、確固とした放射リガンド−結合アッセイが開発され、それはを構造クラスの様々な範囲におけるｈＥＲＧ結合活性を同定する。
【００６７】
大多数の化合物で、結合アッセイにおける活性は電気生理学で決定される活性よりも低かったが、スクリーニング間の全体的な正の相関が、機能スクリーニングにおいて著しい活性を有する化合物クラスが結合アッセイで検出されるであろうことを保証する。結合アッセイは、ＱＴ延長の原因の可能性のある化合物クラスの検出に使用できる。
【００６８】
この結合アッセイは、一次ｈＥＲＧスクリーニングとしての使用に適し、電気生理学で試験する必要のある化合物の数を最小にできる。
【００６９】
引用文献
1) Chadwick C., et al., Identification of a specific ligand for the cardiac rapidly activating delayed rectifier K+ current. Circ. Res. (1993) 72:707-714.
2) Finlayson K., et al., [3H]dofetilide binding to hERG-transfected membranes: a potential high throughput preclinical screen. Eur. J. Pharmacol. (2001) 430:147-148.
3) Kang J., et al., High affinity blockade of the hERG cardiac K+ channel by the neuroleptic pimozide. Eur. J. Pharmacol. (2000) 392:137-140.
4) Suessbrich H., et al., The inhibitory effect of the antipsychotic drug haliperidol on hERG potassium channels expressed in Xenopus oocytes. British Journal of Pharmacol. (1997) 120:968-974.
【００７０】
上記明細書中に記載のすべての刊行物および該刊行物で引用されている引用文献を、本明細書に引用して包含する。本発明の記載の方法および系における様々な修飾および変化が当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明は具体的な好ましい態様に関連して記載しているが、請求している本発明はこのような具体的な態様に過度に限定すべきでないことは理解すべきである。実際、化学および関連分野の当業者には明らかな本発明を実施するための記載の形態の様々な修飾が添付の特許請求の範囲内であると意図される。
【国際調査報告】
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