(57)【要約】  本発明は、アンネリダ（Ａｎｎｅｌｉｄｓ）、例えば、アレニコラ  マリナ（Ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ｍａｒｉｎａ）の細胞外ヘモグロビン分子を形成するタンパク質鎖を得るために使用することができる、アンネリダ、例えば、アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン分子を解離させる方法に関する。本発明の方法は、アンネリダ、特にアレニコラ  マリナからの細胞外ヘモグロビンサンプルを、少なくとも１つの解離剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）塩酸塩又はβ−メルカプトエタノール及び解離緩衝剤を含有する混合物と、タンパク質鎖が互いに分離するのに十分な長さの時間、接触させることからなる工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンネリダ（Ａｎｎｅｌｉｄａ）、特にアレニコラ  マリナ（Ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ｍａｒｉｎａ）の細胞外ヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖を得るための方法であって、
アンネリダ、特にアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのサンプルと少なくとも１つの解離剤、及び適当ならば還元剤、特にジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）又はβ−メルカプトエタノール及び解離緩衝剤からなる混合物とを、タンパク質鎖が互いに分離するのに十分な時間一緒にする工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
解離緩衝剤が、ｐＨを約５〜約１２、好ましくは約７．５〜１２に調整した約０．０５M〜約０．１Mの濃度の緩衝剤、特にＴｒｉｓｍａ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）及びＥＤＴＡ０〜１０mMを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該分子を構成するタンパク質鎖が、例えばＤＴＴの存在下で、還元剤による４つのサブユニットの還元により得られ、該サブユニット自体はアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのサンプルと種々の解離剤、特に解離緩衝剤とを一緒にすることにより得られることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法に従って得られるタンパク質鎖からプライマー対を調製する方法であって、該方法が、以下の工程：
−  請求項１〜３のいずれか１項記載の方法に従って得られるヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の各々を単離する工程、
−  質量分析法及びエドマン配列決定により前記単離されたタンパク質鎖の各々をミクロ配列決定し、５〜２０個のアミノ酸からなる配列の各々に対応するミクロ配列を得る工程、及び
−  前記ミクロ配列から縮重したプライマー対を決定する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法に従って得られるプライマー対であって、該対が、特に以下のもの：
【表１】
2007508024.tif 000021
（式中、
ＲはＡ又はＧを表し、
ＹはＣ又はＴを表し、
ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、
Ｉはイノシンを表し、
ＨはＡ、Ｃ又はＴを表す）
であるプライマー対。
【請求項６】
請求項４記載の方法に従って得られたプライマーから、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列を調製する方法であって、該方法が、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードする一本鎖ｃＤＮＡを加熱により変性し、いかなる二次構造物及びＲＮＡ残留物をも変性する工程であって、該ｃＤＮＡはｍＲＮＡから得られたものであり、この工程は変性された一本鎖ｃＤＮＡの鎖を得ることを可能とし、及び
＊  前記変性した一本鎖ｃＤＮＡの鎖に前記方法により得られるプライマー対を適当な温度でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、及び
＊  先の工程で得られたハイブリダイズしたプライマーから、適当な温度でポリメラーゼによりｃＤＮＡの相補鎖を合成する工程
により構成されたサイクルを少なくとも３０回繰り返すことを含む、ポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）に相当することを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項６記載の調製方法であって、
−  該方法の第１工程が、約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程であること、
−  約３０〜４０回繰り返すサイクルが、以下の工程：
＊  約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程、
＊  約５０℃〜約６０℃、好ましくは約５０℃〜約５６℃の温度で、約２０秒〜約２分間ハイブリダイズさせる工程、
＊  約７０℃〜約７５℃の温度で、約２０秒〜約１分３０秒間伸長させる工程、
を含むこと、そして、
−  該方法の最終工程が、約７０℃〜約７５℃の温度で、約５分〜約１５分間伸長させる工程であること
を特徴とする、調製方法。
【請求項８】
使用するプライマー対が請求項５記載と同義であることを特徴とする、請求項６又は７記載の調製方法。
【請求項９】
請求項８記載の調製方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＧＡＲ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＣＣＮ  ＴＴＲ  ＣＡＲ  ＣＧ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｙ及びＮが請求項５記載と同義であることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  ５６℃に等しい温度で、３０秒間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、４０秒間伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、配列番号１３のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号１のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項１０】
請求項８記載の調製方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＡＴＨ  ＣＴＮ  ＣＡＲ  ＣＧ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｎ、Ｙ及びＲが請求項５記載と同義であることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  ５３℃に等しい温度で、３０秒間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、４０秒間伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、配列番号１５のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号３のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項１１】
請求項８記載の調製方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＡＡＲ  ＧＴＩ  ＡＡＲ  ＣＡＮ  ＡＡＣ  ＴＧＧ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｉ及びＮが請求項５記載と同義であることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、１分間変性する工程、
＊  ５０℃に等しい温度で、１分間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、１分３０秒間伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、配列番号１７のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号５のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項１２】
請求項８記載の調製方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＴＧＹ  ＴＧＹ  ＡＧＹ  ＡＴＨ  ＧＡＲ  ＧＡＹ  ＣＧ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｙ、Ｈ及びＲが請求項５記載と同義であることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  ５２℃に等しい温度で、４０秒間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、３０秒間伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、配列番号１９のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号７のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項１３】
請求項８記載の調製方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＡＡＲ  ＧＴＮ  ＡＴＨ  ＴＴＹ  ＧＧＮ  ＡＧＲ  ＧＡ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｈ、Ｎ及びＹは請求項５記載と同義であることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  ５２℃に等しい温度で、４０秒間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、３０秒間伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、部分的参照ヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、配列番号９のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項１４】
請求項８記載の調製方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＧＡＲ  ＣＡＹ  ＣＡＲ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＧＡ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｎ及びＹは請求項５記載と同義であることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、４０秒間変性する工程、
＊  ５８℃に等しい温度で、１分間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、１分１０秒間伸長させる工程、
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、部分的参照ヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、配列番号１１のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれか１項記載の方法に従って得られた配列の１つによりコードされるタンパク質。
【請求項１６】
請求項１５記載のタンパク質であって、
該タンパク質が、
−  配列番号２の配列、
−  又は配列番号２の配列又は下記フラグメントから、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は配列番号２の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、好ましくは配列番号２の配列と少なくとも約７５％の相同性を有し、但し、該相同配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号２の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１７】
請求項１５記載のタンパク質であって、
該タンパク質が、
−  配列番号４の配列、
−  又は配列番号４の配列又は下記フラグメントから、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は配列番号４の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、好ましくは配列番号４の配列と少なくとも約７５％の相同性を有し、但し、該相同配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号４の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１５記載のタンパク質であって、
該タンパク質が、
−  配列番号６の配列、
−  又は配列番号６の配列又は下記フラグメントから、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は配列番号６の配列又は下記フラグメントに対して任意の相同の配列であって、好ましくは配列番号６の配列と少なくとも約７５％の相同性を有し、但し、該相同配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号６の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１９】
請求項１５記載のタンパク質であって、
該タンパク質が、
−  配列番号８の配列、
−  又は配列番号８の配列又は下記フラグメントから、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は配列番号８の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、好ましくは配列番号８の配列と少なくとも約７５％の相同性を有し、但し、該相同配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号８の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項２０】
請求項１５記載のタンパク質であって、
該タンパク質が、
−  配列番号１０の配列、
−  又は配列番号１０の配列又は下記フラグメントから、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は配列番号１０の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、好ましくは配列番号１０の配列と少なくとも約７５％の相同性を有し、但し、該相同配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号１０の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項２１】
請求項１５記載のタンパク質であって、
該タンパク質が、
−  配列番号１２の配列、
−  又は配列番号１２の配列又は下記フラグメントから、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列はグロブリン鎖の互いの組み合わせを可能とするもの、
−  又は配列番号１２の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、好ましくは配列番号１２の配列と少なくとも約７５％の相同性を有し、但し、該誘導された配列はグロブリン鎖の互いの組み合わせを可能とするもの、
−  又は前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントはグロブリン鎖の互いの組み合わせを可能とし、特に配列番号１２の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約２８０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項２２】
請求項６〜１４のいずれか１項記載の方法に従って得られたヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項１５〜２１のいずれか１項記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２４】
請求項２３記載のヌクレオチド配列であって、
該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号１の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号２により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号２から誘導されたタンパク質をコードする配列番号１の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により、誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号１に対して相同の任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは配列番号１の配列と少なくとも約６０％の相同性を有するもの、
−  又は配列番号１のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】
請求項２３記載のヌクレオチド配列であって、
該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号３の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号４により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号４から誘導されたタンパク質をコードする配列番号３の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により、誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号３に対して相同の任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは配列番号３の配列と少なくとも約６０％の相同性を有するもの、
−  又は配列番号３のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２６】
請求項２３記載のヌクレオチド配列であって、
該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号５の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号６により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号６から誘導されたタンパク質をコードする配列番号５の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により、誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号５に対して相同の任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは配列番号５の配列と少なくとも約６０％の相同性を有するもの、
−  又は配列番号５のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
請求項２３記載のヌクレオチド配列であって、
該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号７の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号８により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号８から誘導されたタンパク質をコードする配列番号７の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により、誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号７に対して相同の任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは配列番号７の配列と少なくとも約６０％の相同性を有するもの、
−  又は配列番号７のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２８】
請求項２３記載のヌクレオチド配列であって、
該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号９の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号１０により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号１０から誘導されたタンパク質をコードする配列番号９の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により、誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号９に対して相同の任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは配列番号９の配列と少なくとも約６０％の相同性を有するもの、
−  又は配列番号９のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２９】
請求項２３記載のヌクレオチド配列であって、
該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号１１の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号１２により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号１２から誘導されたタンパク質をコードする配列番号１１の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により、誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は配列番号１１に対して相同の任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは配列番号１１の配列と少なくとも約６０％の相同性を有するもの、
−  又は配列番号１１のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約８００個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項３０】
アンネリダ、特にアレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列のための請求項６記載の調製方法であって、該方法が、以下の工程：
−  前記ヘモグロビン分子を、少なくとも１つの解離剤及び還元剤、特にジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）又はβ−メルカプトエタノール及び解離緩衝剤からなる混合物と、タンパク質鎖が互いに分離するのに十分な時間一緒にし、
該ヘモグロビン分子の解離、次いで還元を可能として、該分子を構成するタンパク質鎖を得る工程、
−  前記タンパク質鎖の各々を単離する工程、
−  質量分析法及びエドマン配列決定により前記単離されたタンパク質鎖の各々をミクロ配列決定し、５〜２０個のアミノ酸からなる配列の各々に対応するミクロ配列を得る工程、
−  前記ミクロ配列から縮重したプライマー対を決定する工程、
−  先に得られたプライマーから、ポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）により前記タンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列を調製する工程を含み、
ここで、このポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）は、以下の工程：
−  該方法の第１工程は、約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程であること、
−  約３０〜４０回繰り返されるサイクルが、以下の工程：
＊  約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程、
＊  約５０℃〜約５６℃の温度で、約２０秒〜約２分間ハイブリダイズさせる工程、
＊  約７０℃〜約７５℃の温度で、約２０秒〜約１分３０秒間伸長させる工程、
を含むこと、そして
−  該方法の最終工程が、約７０℃〜約７５℃の温度で、約５分〜約１５分間伸長させる工程であること
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、アンネリダ（Ａｎｎｅｌｉｄａ）、特にアレニコラ  マリナ（Ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ｍａｒｉｎａ）の細胞外ヘモグロビン分子を解離させるための方法、及び該分子を構成するタンパク質鎖の特徴付けである。
【０００２】
本発明の主題は、前記タンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列の特徴付け及びこれらのヌクレオチド配列を調製する方法でもある。
【０００３】
血液は、呼吸プロセスを確実にするために、その主な機能が酸素及び二酸化炭素を輸送することである複雑な液体である。この機能を確実にするのは、赤血球中に見出されるヘモグロビン分子である。
【０００４】
哺乳動物のヘモグロビン分子は、対をなす４つの同様な機能的ポリペプチド鎖（α型グロビンの２つの鎖及びβ型グロビンの２つの鎖）のアセンブリーにより形成される。これらのポリペプチド鎖の各々は、ミオグロビン分子の同じ三次構造を有する（Dickerson and Geis, 1983）。
【０００５】
ヘム、即ち、ヘモグロビンの活性部位は、その中心に一個の鉄原子を含有するテトラピロールプロトポルフィリン環である。酸素を固定する鉄原子は、６つの配位結合、即ち、４つはポルフィリンの窒素原子との配位結合、１つは近接ヒスチジンＦ８との配位結合及び１つはグロビンの酸素化期間中の酸素分子との配位結合を確立する。
【０００６】
我々は、最近、汚染の恐れがあるため血液供与の減少による血液供給問題に直面している。かくして、血液代替物の研究が最近の数年間にわたり促進されてきた。我々は、感染性疾患の伝達の危険を排除することができ、しかも血液群適合性（blood group compatibility）に関して問題のない人工的血液代替物をデザインすることを探求している。
【０００７】
現在まで、主要な研究経路は、一方で化学製品の合成（Clark and Gollan, 1966）及び他方では生物学的製品の合成（Chang, 1957; Chang, 1964）に関する。
【０００８】
第一の研究経路に関しては、パーフルオロカーボン（ＰＦＣｓ）が使用されてきた。ＰＦＣｓは、酸素を運搬することができる化学製品であり、そしてそれらは大量のガス、例えば、酸素及び二酸化炭素を溶解することができる。
【０００９】
現在では、血中により有効に分散させることができるこれらの製品のエマルションを製造する試みがなされている（Reiss, 1991; Reiss, 1994; Goodin et al, 1994）。
【００１０】
ＰＦＣｓの利点は、肺中に見出されるべき酸素の量に直接比例するそれらの酸素運搬能力（oxyphoric capacity）にある。更に、通過するべき膜が存在しないため、ＰＦＣｓは、組織に向けて酸素をより速く運搬することができる。しかしながら、器官中にこれらの製品を保持することの長期効果は知られていない。これらの製品が１９６０年代にマウスにおける血液代替物として初めて使用された際は（Clark and Gollan, 1966; Geyer et al.,1966; Sloviter and Kamimoto, 1967）、副作用が非常に重大であった。ＰＦＣｓは満足できる方法で循環から排除されず、そして器官の組織中に蓄積し、そのため浮腫を引起した。
【００１１】
１９８０年代には、新しいバージョンのＰＦＣが臨床期で試験された。しかし、貯蔵、財政的コスト、無視できない副作用及びこの化合物の低い有効性の問題が、その市場拡大を妨げた（Naito, 1978; Mitsuno and Naito, 1979; Mitsuno and Ohyanagi, 1985）。
【００１２】
最近、新世代のＰＦＣ（ＰＦＢＯ  パーフルオロオクチルブロミド）が開発された。新規な製品（Reiss,1991）は、合衆国において臨床試験を受けているが、血液中の酸素量の増加が組織における酸素蓄積を生じさせることがあり、これは生物にとって危険である（スーパーオキシド型酸素ラジカルの形成）ことが既に認められている。
【００１３】
かくして、徐徐に進歩したにもかかわらず、これらの化合物の副作用は、それらを大規模で市販するのには依然としてあまりにも重大である。
【００１４】
第２の研究経路に関しては、研究者は、天然のヘモグロビンの構造を修飾することによる血液代替物の開発に従事してきた（Chang, 1957; Chang, 1997）。修飾したヘモグロビン型の血液代替物を得るためには、遺伝子的に修飾した微生物により合成されたヘモグロビン又はヒトもしくは動物起源のヘモグロビンを使用し、特に、ウシヘモグロビンの分子を使用する。実際に、ウシヘモグロビンはヒトヘモグロビンとは僅かに免疫学的に異なっているが、それは組織に向けて酸素をより容易に輸送する。それにもかかわらず、ウイルス汚染又は海綿状脳症型の汚染の危険が依然として重大である。
【００１５】
機能的であるためには、ヘモグロビンは、赤血球の内側にのみ存在するアロステリックエフェクター、２，３−ジホスホグリセリン酸塩（２，３−ＤＰＧ）と接触しなければならない（Dickerson and Geis, 1983）。更に、２，３−ＤＰＧ及び赤血球中に存在する他のエレメント、例えば、メトヘモグロビンレダクターゼなしでは、ヘモグロビンは、自動酸化を受け、そして酸素又は二酸化炭素を運搬するその能力を失う。
【００１６】
これらのプロセスは、ヘモグロビンの構造を修飾することにより、更に正確には、２つのα及びβ二量体間の四量体分子の弱い結合を安定化させることにより排除しうる（Chang, 1971）。多数の修飾、即ち、２つのα鎖間の共有結合、２つのβ鎖間の共有結合又はαとβとの間の共有結合も試験された（Payne, 1973; Bunn and Jandl, 1968）。
【００１７】
四量体分子を重合する試み又はそれらをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と呼ばれるポリマーとコンジュゲートさせる試みもなされた（Nho et al., 1992）。これらの修飾は分子を安定化させ、そしてそのサイズを増加させて、腎臓によるその除去を妨害するという結果をもたらす。
【００１８】
アンネリダは、それらの細胞外ヘモグロビンについて多くの研究がなされた（Terwilliger, 1992; Lamy et al., 1996）。これらの細胞外ヘモグロビン分子は、アンネリダの３つのクラス：Ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅｓ、Ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔｅｓ及びＡｃｈａｅｔｅｓに存在し、そしてＶｅｓｔｉｍｅｎｔｉｆｅｒａにも存在する。これらは、一般に２つの種類に分類される６又は８つの異なる型に属する約２００のポリペプチド鎖からなる巨大バイオポリマーである。１４４〜１９２エレメントを含む第１の種類は、活性部位を有し、そして可逆的に酸素を結合することができるいわゆる「機能的」ポリペプチド鎖を含み；これらは、その質量が１５〜１８kDaであり、そして脊椎動物のα及びβ型鎖に非常に類似するグロビン型鎖である。３６〜４２エレメントを含む第２の種類は、少数の活性部位を有するか又は活性部位を有しない「１２分の１体（twelfths）」のアセンブリーを可能とするいわゆる「構造的」ポリペプチド鎖を含む。
【００１９】
得られたアレニコラの細胞外ヘモグロビンの最初の像（Roche et al., 1960）は、六角形構造を示した。各ヘモグロビン分子は、「六角形二層」として記載された２つの重なり合った六角形からなり（Levin, 1963; Roche, 1965）、そして各六角形は「中空球状構造」（De Haas et al., 1996）又は「１２分の１体（twelfth）」として記載された水滴の形態にある６つのエレメントのアセンブリーによりそれ自体形成される（Van Bruggen and Weber, 1974; Kapp and Crewe, 1984）。ネイティブ分子は、約２５０kDaの分子量を有する１２のこれらのサブユニットから形成される。
【００２０】
かくして、フランス国特許第２  ８０９  ６２４号は、アレニコラ  マリナ、潮間帯生態系のＰｏｌｙｃｈａｅｔｅ  Ａｎｎｅｌｉｄａの細胞外ヘモグロビンの血液代替物としての使用であって、該血液代替物が、供与不足の問題をなくすることを可能とする使用に関する。
【００２１】
アレニコラ  マリナのヘモグロビンの全体構造は、特に質量分析法によるその精密な四次元研究により知られているけれども（Zal et al., 1997）、それを構成する種々のタンパク質鎖の一次配列は知られていない。
【００２２】
かくして、本発明の目的は、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質配列を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、生化学及び分子生物学的方法によって血液代替物を開発するために、アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の第一段階を提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、特に血液代替物として使用するという枠内でのこの分子のストックを増加させるために、場合により、遺伝子工学によって単純化したヘモグロビン分子を調製する方法を提供することである。
【００２５】
本発明は、アンネリダ、特にアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン分子を解離させて、該分子を構成するタンパク質鎖を得ることを可能とする方法であって、
アンネリダ、特にアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのサンプル及び少なくとも１つの解離剤、特にジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）又はβ−メルカプトエタノール及び解離緩衝剤（dissociation buffer）からなる混合物を、タンパク質鎖が互いに分離するのに十分な時間一緒にする工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２６】
本発明は、アンネリダ、特にアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖を得る方法であって、
アンネリダ、特にアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのサンプル及び少なくとも１つの解離剤、及び適当ならば還元剤、特にジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）又はβ−メルカプトエタノール及び解離緩衝剤からなる混合物を、タンパク質鎖が互いに分離するのに十分な時間一緒にする工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２７】
「細胞外ヘモグロビン」という用語は、細胞内に含有されておらず、血液中に溶解したヘモグロビンを表す。
【００２８】
「解離」という表現は、弱い相互作用（疎水性、静電気的、水素等）を破壊する（break）ことができる化学的処理を表す。
【００２９】
「解離緩衝剤」という用語は、ｐＨ調整を可能とする緩衝剤を含有し、そして解離剤を含有する液体を表す。
【００３０】
「解離剤」という表現は、弱い相互作用（疎水性、静電気的、水素等）を破壊することができる化合物を表す。該解離剤は、特に、水酸化物イオン、尿素又はヘテロポリタングステン酸イオン又はグアニジニウム塩又はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）から選ばれる。
【００３１】
「還元」という表現は、強い相互作用、例えばジスルフィド橋を破壊することができる化学的処理を表す。
【００３２】
「還元剤」という表現は、強い相互作用、例えばジスルフィド橋を破壊することができる化合物を表す。
【００３３】
アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン分子を構成する１０のタンパク質鎖は、８つのグロビン型鎖と２つの構造型鎖を含む。
【００３４】
３６４８±２４kDaの質量を有するアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンは、２つの種類、即ち、
第１（１５６鎖）は、酸素に可逆的に結合することができる活性部位を有するいわゆる「機能的」ポリペプチド鎖を含み、これらはその質量が１５〜１８kDaであるグロビン型鎖であり、これらの鎖は脊椎動物のα及びβ型鎖に非常に類似しており、そして
第２（４２鎖）は、少数の活性部位を有するか又は活性部位を有しないが、１２量体のアセンブリーを可能とするいわゆる「構造的（又は「リンカー」）ポリペプチド鎖を含み、これらの鎖は２２〜２７kDaの分子量を有する、
に分類される、１０の異なる型に属する１９８のポリペプチド鎖からなることが思い起こされる。
【００３５】
本発明は、アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン分子を解離させて、該分子を構成するタンパク質鎖を得ることを可能とする方法であって、
アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのサンプルと、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び解離緩衝剤からなる混合物とを、約１時間〜３週間一緒にする工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３６】
本発明の有利な解離方法は、解離緩衝剤が、約５〜約１２、好ましくは約７．５〜１２にｐＨを調整した、約０．０５M〜約０．１M濃度の緩衝剤、特にＴｒｉｓｍａ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）、ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム及びＥＤＴＡ０〜１０mMを含み、その際全体は、特に約２〜１２、好ましくは約５〜１２にｐＨを調整することを特徴とする。
【００３７】
好ましくは、該解離緩衝剤は、特にソーダの２N溶液により約１０のｐＨに調整した約１mM濃度のＥＤＴＡを含む。
【００３８】
有利な実施態様に従えば、本発明の方法は、前記分子を構成するタンパク質鎖が、還元剤により、例えば、ＤＴＴの存在下で４つのサブユニットを還元することにより得られ、該サブユニット自体は、アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンのサンプルと種々の解離剤、特に解離緩衝剤とを一緒にすることにより得られることを特徴とする。
【００３９】
ネイティブ分子は、非還元性解離剤の作用下でサブユニットに解離される。故に、共有結合の破壊はない。しかしながら、還元剤の作用（共有結合の開裂）の後、サブユニットはポリペプチド鎖（アミノ酸のアセンブリーからなるタンパク質鎖）に還元される。
【００４０】
故に、上記した４つのサブユニットは、一量体、二量体、三量体及び十二量体である。
【００４１】
一量体は、グロビン鎖である。
【００４２】
ホモ形態の二量体及びヘテロ二量体は、構造的鎖である。
【００４３】
三量体は、３つのグロビン鎖の共有結合アセンブリー（covalent assembly）である。
【００４４】
十二量体は、１２のタンパク質鎖：例えば、３つの三量体＋３つの一量体、２つの三量体＋６つの一量体、１つの三量体＋９つの一量体、からなる。
【００４５】
故に、アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンの直接還元による一工程で、又は一つの工程がアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンの４つのサブユニットへの解離からなり、そして他の工程が該４つのサブユニットのタンパク質鎖への還元である２つの工程で、タンパク質鎖を得ることが可能である。
【００４６】
本発明は、前記４つのサブユニットを得るために使用される解離剤が、以下のもの、即ち、
−  約５〜約１２、好ましくは約７．５〜１２にｐＨを調整した、Ｔｒｉｓｍａ塩基（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）０．１M及びＥＤＴＡ０〜１０mMを含む解離緩衝溶液、及び
−  その濃度が約０．１M〜約８Mであり、特に３Mに等しい尿素溶液
であることを特徴とする、前記解離方法にも関する。
【００４７】
本発明は、４つのサブユニットを得るための解離剤が、以下のもの、即ち、
−  ｐＨ１０に調整した、Ｔｒｉｓｍａ塩基０．１M及びＥＤＴＡ１mMを含む解離緩衝溶液、及び
−  尿素３M、
であることを特徴とする、前記解離方法にも関する。
【００４８】
本発明は、タンパク質鎖を得るために使用される解離剤及び還元剤が、以下のもの、即ち、
−  約８〜約９のｐＨのＴｒｉｓｍａ塩基（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）０．１Mを含む解離緩衝溶液、及び
−  その濃度が約４M〜約８Mであり、特に８Mに等しい尿素溶液、及び
−  ＤＴＴ１〜１０％
であるか、又は、
−  約８〜約９のｐＨの重炭酸アンモニウム０．１Mを含む解離緩衝溶液、及び
−  ＤＴＴ１〜１０％、
であることを特徴とする、前記解離及び還元方法にも関する。
【００４９】
本発明の解離及び還元方法は、アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の混合物を含有する組成物を得ることを可能とする。
【００５０】
本発明は、以下の工程、
−  前記方法に従って得られたヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の各々を単離する工程、
−  質量分析法及びエドマン配列決定により前記単離されたタンパク質鎖の各々をミクロ配列決定し、５〜２０個のアミノ酸からなる配列の各々に対応するミクロ配列を得る工程、及び
−  前記ミクロ配列から縮重したプライマー（degenerated primers）を決定する工程
を含むことを特徴とする、前記方法に従って得られたタンパク質鎖からプライマー対を調製する方法にも関する。
【００５１】
タンパク質鎖の単離の第１工程は、特に本発明の解離及び還元方法に従って得られたヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖を含む前記混合物から逆相液体クロマトグラフィー及び二次元ゲルにより行われる。
【００５２】
「ミクロ配列」という表現は、タンパク質配列のフラグメントを表す。
【００５３】
前記ミクロ配列は、Ｃ−及びＮ−両末端に由来するのみならず、内部配列にも由来することができる。
【００５４】
タンパク質鎖は、アレニコラ  マリナの精製されたヘモグロビンから逆相液体クロマトグラフィーにより又は２次元ゲルから得ることができる。各ピーク又はスポットを切り出し、そしてプロテアーゼにより消化した。かくして得られたペプチドをゲルから抽出し、そしてｃａｐＬＣ（毛細管液体クロマトグラフィー）により分離させた。次いで、フラグメントを質量分析法により分析する。他方、逆相により単離した各ピークをエドマン配列決定により分析した。
【００５５】
「縮重したプライマー（degenerated primer）」という表現は、タンパク質配列のフラグメントから得られたヌクレオチド配列を表す。それらは、遺伝暗号の縮重（１個のアミノ酸につきいくつかのコドン）の故に縮重したプライマーと呼ばれる。
【００５６】
縮重したプライマー対の決定の最終工程は、それらの合成に対応する。
【００５７】
この工程は、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの両方を得ることを可能とする。
【００５８】
本発明は、前記方法に従って得られるプライマー対であって、該対が、特に以下のもの：
【表２】
2007508024.tif 000002
（式中、
ＲはＡ又はＧを表し、
ＹはＣ又はＴを表し、
ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、
Ｉはイノシンを表し、
ＨはＡ、Ｃ又はＴを表す）
であるプライマー対にも関する。
【００５９】
本発明は、前記方法に従って得られるプライマー対であって、該対が、特に以下のもの：
【表３】
2007508024.tif 000003
（式中、
ＲはＡ又はＧを表し、
ＹはＣ又はＴを表し、
ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、
Ｉはイノシンを表し、
ＤはＡ、Ｇ又はＴを表し、
ＨはＡ、Ｃ又はＴを表す）
であるプライマー対にも関する。
【００６０】
本発明は、前記方法に従って得られるプライマーから、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列を調製する方法であって、該方法が、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードする一本鎖ｃＤＮＡを加熱により変性し、いかなる二次構造物及びＲＮＡ残留物をも変性する工程であって、該ｃＤＮＡはｍＲＮＡから得られたものであり、この工程は変性された一本鎖ｃＤＮＡの鎖を得ることを可能とし、及び
＊  前記変性した一本鎖ｃＤＮＡの鎖に、前記方法により得られるプライマー対を適当な温度でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、及び
＊  先の工程で得られたハイブリダイズしたプライマーから、適当な温度でポリメラーゼにより前記ｃＤＮＡの相補鎖を合成する工程
により構成されたサイクルを少なくとも３０回繰り返すことを含む、ポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）に相当することを特徴とする方法にも関する。
【００６１】
前記タンパク質鎖をコードするｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから得られ、該ｍＲＮＡは成長している若いアレニコラから抽出された全ＲＮＡｓからの精製により得られたものであり、該若いアレニコラは種々のメッセンジャーＲＮＡｓの転写の高いレベルを有する。
【００６２】
前記サイクルが３０回未満繰り返されるならば、ＤＮＡの増幅は減少する。
【００６３】
「随意の二次構造（optional secondary structures）」という表現は、ｃＤＮＡの２つの配列間の無秩序な対形成を表す。
【００６４】
「ｃＤＮＡの加熱による変性」という表現は、ｃＤＮＡの２つの配列間の無秩序な対形成の破壊を表す。
【００６５】
「適当な温度でのハイブリダイゼーション」という表現は、プライマーによるＤＮＡマトリックス上のそれらの相補性配列の認識を表す。
【００６６】
有利な実施態様に従えば、本発明に従うヌクレオチド配列を調製する方法は、
−  該方法の第１工程が、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードするｃＤＮＡを約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程であること、
−  約３０〜４０回繰り返すサイクルが、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードするｃＤＮＡを約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程、
＊ 一本鎖ｃＤＮＡの前記鎖に本発明のプライマー対を約５０℃〜約６０℃、好ましくは約５０℃〜約５６℃の温度で、約２０秒〜約２分間ハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、
＊  先に得られたハイブリダイズしたプライマーを約７０℃〜約７５℃の温度で、約２０秒〜約１分３０秒間ポリメラーゼにより伸長させる工程、
を含むこと、そして、
−  該方法の最終工程が、先に得られたハイブリダイズしたプライマーを約７０℃〜約７５℃の温度で、約５分〜約１５分間ポリメラーゼにより伸長させる工程であること
を特徴とする。
【００６７】
本発明の方法のＰＣＲ反応は、特にｃＤＮＡ（５〜２０ng）、センスプライマー（１００ng）及びアンチセンスプライマー（１００ng）、ｄＮＴＰ（２００μM、最終）、ＭｇＣｌ２（２mM  最終）、ＰＣＲ緩衝剤（ポリメラーゼを供給した）（１Ｘ  最終）、Ｔａｑポリメラーゼ（１ユニット）及び水（２５μl  ｑｓｆ）の存在下で行う。
【００６８】
前記ヌクレオチド配列を調製する方法は、部分的コード配列を得ることを可能とする。
【００６９】
部分的コード配列を先の実験によって得ると、グロビン及びリンカーのｃＤＮＡのコード配列の全体の増幅及び配列決定は、５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification cDNA Ends）ＰＣＲにより、そして供給者（５’／３’ＲＡＣＥ  ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ）により提供されるデータシートのプロトコール推奨に従って行う。
【００７０】
本発明は、使用されるプライマー対が前記したとおりであることを特徴とする、前記調製方法にも関する。
【００７１】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が、（ＧＡＲ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＣＣＮ  ＴＴＲ  ＣＡＲ  ＣＧ；ＣＣＡ  ＮＧＣ  ＮＴＣ  ＹＴＴ  ＲＴＣ  ＲＡＡ  ＧＣＡ）又は（ＧＡＲ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＣＣＮ  ＴＴＲ  ＣＡＲ  ＣＧ；ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｙ及びＮが前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
―  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  一本鎖ｃＤＮＡの前記鎖に本発明のプライマー対を５６℃に等しい温度で、３０秒間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、
＊  先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、４０秒間ポリメラーゼにより伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、１０分間ポリメラーゼにより伸長させ、配列番号１３のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号１のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、
前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００７２】
次いで配列番号１３の部分配列を、前記５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ実験により完了した。配列番号１３のヌクレオチド配列は、Ａ２ａと名付けたグロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号１３は３７６個のヌクレオチドを含む。
【００７３】
配列番号１のヌクレオチド配列（開始コドンから停止コドンまで、即ち、機能的グロビン一量体に相当する転写され、そして翻訳される配列）は、Ａ２ａと名付けられた前記グロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号１は、４７４個のヌクレオチドを含む。
【００７４】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの（ＡＮ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＣＣＮ  ＣＴＮ  ＣＡＲ  ＣＧ；  ＣＣＡ  ＮＧＣ  ＮＴＣ  ＹＴＴ  ＲＴＣ  ＲＡＡ  ＧＣＡ）であり、Ｎ、Ｙ及びＲが前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  一本鎖ｃＤＮＡの前記鎖に本発明のプライマー対を５２℃に等しい温度で、３０秒間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、
＊  先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、４０秒間ポリメラーゼにより伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、１０分間ポリメラーゼにより伸長させ、配列番号１５のヌクレオチド配列を得る工程であることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００７５】
配列番号１５のヌクレオチド配列は、Ａ２ｂと名付けられた、グロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号１５は２８８個のヌクレオチドを含む。
【００７６】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＡＴＨ  ＣＴＮ  ＣＡＲ  ＣＧ；  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｎ、Ｙ及びＲが前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、約４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  ５３℃に等しい温度で、３０秒間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、４０秒間伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させ、配列番号１５のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号３のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００７７】
次いで配列番号１５の部分配列を、前記５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ実験により完成した。
【００７８】
配列番号３のヌクレオチド配列（開始コドンから停止コドンまで、即ち、機能的グロビン一量体に相当する転写され、そして翻訳される配列）はＡ２ｂと名付けられた前記グロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号３は、４７７個のヌクレオチドを含む。
【００７９】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が、（ＡＡＲ  ＧＴＩ  ＡＡＲ  ＣＡＮ  ＡＡＣ  ＴＧＧ；  ＣＣＡ  ＮＧＣ  ＮＣＣ  ＤＡＴ  ＲＴＣ  ＲＡＡ）又は（ＡＡＲ  ＧＴＩ  ＡＡＲ  ＣＡＮ  ＡＡＣ  ＴＧＧ；  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｉ、Ｎ及びＤが前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の各々をコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、１分間変性する工程、
＊  一本鎖ｃＤＮＡの前記鎖に本発明のプライマー対を５０℃に等しい温度で、１分間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、
＊  先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、１分３０秒間ポリメラーゼにより伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、１０分間ポリメラーゼにより伸長させ、配列番号１７のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号５のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００８０】
次いで配列番号１７の部分配列を、前記５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ実験により完成した。配列番号１７のヌクレオチド配列は、Ａ１と名付けられたグロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号１７は３６０個のヌクレオチドを含む。
【００８１】
配列番号５のヌクレオチド配列（開始コドンから停止コドンまで、即ち、機能的グロビン一量体に相当する転写され、そして翻訳される配列）は、Ａ１と名付けられた前記グロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号５は４７４個のヌクレオチドを含む。
【００８２】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの：（ＴＧＹ  ＴＧＹ  ＡＧＹ  ＡＴＨ  ＧＡＲ  ＧＡＹ  ＣＧ；  ＣＡ  ＮＧＣ  ＮＹＣ  ＲＣＴ  ＲＴＴ  ＲＡＡ  ＲＣＡ）又は（ＴＧＹ  ＴＧＹ  ＡＧＹ  ＡＴＨ  ＧＡＲ  ＧＡＹ  ＣＧ；  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｙ、Ｈ、Ｒ及びＮが前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の各々をコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖の１つをコードするｃＤＮＡを９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  一本鎖ｃＤＮＡの前記鎖に本発明のプライマー対を５２℃に等しい温度で、４０秒間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、
＊  先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、３０秒間ポリメラーゼにより伸長させる工程
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、先に得られたハイブリダイズしたプライマーを７２℃に等しい温度で、１０分間ポリメラーゼにより伸長させ、配列番号１９のヌクレオチド配列を得る工程であり、
該方法は、場合により、配列番号７のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含む
ことを特徴とする、前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００８３】
配列番号１９の部分配列を、次いで前記５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ実験により完成した。配列番号１９のヌクレオチド配列は、Ｂ２と名付けられたグロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号１９は３９０個のヌクレオチドを含む。
【００８４】
配列番号７のヌクレオチド配列（開始コドンから停止コドンまで、即ち、機能的グロビン一量体に相当する転写され、そして翻訳される配列）は、Ｂ２と名付けられた前記グロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号７は、４９８個のヌクレオチドを含む。
【００８５】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの（ＡＡＲ  ＧＴＮ  ＡＴＨ  ＴＴＹ  ＧＧＮ  ＡＧＲ  ＧＡ；  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｈ、Ｎ及びＹが前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、３０秒間変性する工程、
＊  ５２℃に等しい温度で、４０秒間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、３０秒間伸長させる工程、
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させて、
参照部分ヌクレオチド配列を得て、このコード配列の完全な決定を続ける工程であり、
該方法は、配列番号９のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００８６】
配列番号９のヌクレオチド配列（開始コドンから停止コドンまで、即ち、機能的グロビン一量体に対応する転写され、そして翻訳される配列）は、Ｂ１と名付けられたグロビン鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号９は、４９８個のヌクレオチドを含む。
【００８７】
本発明に従う特に有利な調製方法は、前記ヌクレオチド配列を調製する方法であって、
使用するプライマー対が以下のもの（ＧＡＲ  ＣＡＹ  ＣＡＲ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＧＡ；  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ）であり、Ｒ、Ｎ及びＹは前記したとおりであることを特徴とし、
該方法が、
−  該方法の第１工程は、９５℃に等しい温度で、４分間変性する工程であり、
−  ３５回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  ９５℃に等しい温度で、４０秒間変性する工程、
＊  ５８℃に等しい温度で、１分間ハイブリダイズさせる工程、
＊  ７２℃に等しい温度で、１分１０秒間伸長させる工程、
を含み、そして、
−  該方法の最終工程は、７２℃に等しい温度で、１０分間伸長させて、
参照部分ヌクレオチド配列を得て、このコード配列の完全な決定を続ける工程であり、
該方法は、配列番号１１のヌクレオチド配列を得るための５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの追加の工程を含むことを特徴とする、前記ヌクレオチド配列を調製する方法である。
【００８８】
配列番号１１のヌクレオチド配列（開始コドンから停止コドンまで、即ち、機能的グロビン一量体に対応する転写され、そして翻訳される配列）は、Ｌ１と名付けられたリンカー鎖に対応するタンパク質鎖をコードする新規なヌクレオチド配列である。配列番号１１は、７７１個のヌクレオチドを含む。
【００８９】
本発明は、前記方法に従って得られたヌクレオチド配列の１つによりコードされたタンパク質配列にも関する。
【００９０】
本発明に従う好ましいタンパク質は、前記タンパク質であって、
−  配列番号２若しくは配列番号１４の配列、
−  又は、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、配列番号２若しくは配列番号１４の配列又は下記フラグメントから誘導された任意の配列、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、好ましくは配列番号２若しくは配列番号１４の配列と少なくとも約７５％、特に少なくとも約８５％の相同性を有する、配列番号２若しくは配列番号１４の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、但し、該相同配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とするものとし、特に配列番号２の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記タンパク質である。
【００９１】
配列番号２の配列は、Ａ２ａと名付けられた全グロビン鎖に対応する新規なタンパク質配列である。
【００９２】
配列番号１４の配列は、配列番号２の配列により表されるＡ２ａと名付けられたグロビン鎖に由来する配列のフラグメントに対応する新規なタンパク質配列である。
【００９３】
本発明のタンパク質配列の酸素運搬性は、特に、典型的なオキシヘモグロビン分光法によるそれらの吸収スペクトルを測定することにより証明できる。
【００９４】
本発明に従う好ましいタンパク質は、前記タンパク質であって、
−  配列番号４若しくは配列番号１６の配列、
−  又は、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、配列番号４若しくは配列番号１６の配列又は下記フラグメントから誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、好ましくは配列番号４若しくは配列番号１６の配列と少なくとも約７５％、特に少なくとも約８５％の相同性を有する、配列番号４若しくは配列番号１６の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、但し、該相同性配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号４の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記タンパク質である。
【００９５】
配列番号４の配列は、Ａ２ｂと名付けられた全グロビン鎖に対応する新規なタンパク質配列である。
【００９６】
配列番号１６の配列は、配列番号４の配列により表されるＡ２ｂと名付けられたグロビン鎖に由来する配列のフラグメントに対応する新規なタンパク質配列である。
【００９７】
本発明に従う好ましいタンパク質は、前記タンパク質であって、
−  配列番号６若しくは配列番号１８の配列、
−  又は、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、配列番号６若しくは配列番号１８の配列又は下記フラグメントから誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、好ましくは配列番号６若しくは配列番号１８の配列との少なくとも約７５％、特に少なくとも約８５％の相同性を有する、配列番号６若しくは配列番号１８の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、但し、該相同性配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号６の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記タンパク質である。
【００９８】
配列番号６の配列は、Ａ１と名付けられた全グロビン鎖に対応する新規なタンパク質配列である。
【００９９】
配列番号１８の配列は、配列番号６の配列により表されるＡ１と名付けられたグロビン鎖に由来する配列のフラグメントに対応する新規なタンパク質配列である。
【０１００】
本発明に従う好ましいタンパク質は、前記タンパク質であって、
−  配列番号８若しくは配列番号２０の配列、
−  又は、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、配列番号８若しくは配列番号２０の配列又は下記フラグメントから誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、好ましくは配列番号８若しくは配列番号２０の配列との少なくとも約７５％、特に少なくとも約８５％の相同性を有する、配列番号８若しくは配列番号２０の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、但し、該相同性配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号８の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記タンパク質である。
【０１０１】
配列番号８の配列は、Ｂ２と名付けられた全グロビン鎖（whole globin chain）に対応する新規なタンパク質配列である。
【０１０２】
配列番号２０の配列は、配列番号８の配列により表されるＢ２と名付けられたグロビン鎖に由来する配列のフラグメントに対応する新規なタンパク質配列である。
【０１０３】
本発明に従う好ましいタンパク質は、前記タンパク質であって
−  配列番号１０の配列、
−  又は、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、配列番号１０の配列又は下記フラグメントから誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、好ましくは配列番号１０の配列との少なくとも約７５％の相同性を有する、配列番号１０の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列、但し、該相同性配列は酸素の運搬を可能とするもの、
−  又は、前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントは酸素の運搬を可能とし、特に配列番号１０の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記タンパク質である。
【０１０４】
配列番号１０の配列は、Ｂ１と名付けられたグロビン鎖に対応する新規なタンパク質配列である。
【０１０５】
本発明に従う好ましいタンパク質は、前記タンパク質であって、
−  配列番号１２の配列、
−  又は、特に１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、配列番号１２の配列又は下記フラグメントから誘導された任意の配列であって、但し、該誘導された配列はグロビン鎖の互いの組み合わせを可能とするもの、
−  又は、好ましくは配列番号１２の配列との少なくとも約７５％の相同性を有する、配列番号１２の配列又は下記フラグメントに対して相同の任意の配列であって、但し、該相同性配列はグロビン鎖の互いの組み合わせを可能とするもの、
−  又は、前記配列のうちの１つの任意のフラグメントであって、但し、該フラグメントはグロビン鎖の互いの組み合わせを可能とし、特に配列番号１２の配列における少なくとも約６０個のアミノ酸、特には少なくとも約２８０個の連続したアミノ酸からなる任意のフラグメント
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記タンパク質である。
【０１０６】
配列番号１２の配列は、Ｌ１と名付けられたリンカー鎖に対応する新規なタンパク質配列である。
【０１０７】
本発明は、前記方法に従って得られるヌクレオチド配列にも関する。
【０１０８】
本発明は、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列にも関する。
【０１０９】
本発明は、前記ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
−  それぞれ、配列番号２又は配列番号１４をコードする配列番号１又は配列番号１３のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１又は配列番号１３の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そしてそれぞれ、配列番号２又は配列番号１４により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は、それぞれ配列番号２又は配列番号１４から誘導されたタンパク質をコードする、配列番号１又は配列番号１３の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１の配列との好ましくは少なくとも約６０％の相同性を有する、配列番号１又は配列番号１３に対して相同の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドにより構成されるもの、
−  又は、前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列又はフラグメントのうちの１つに相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列にも関する。
【０１１０】
ストリンジェンシー条件は、４８〜６０℃の温度範囲及び１〜３mMのＭｇＣｌ２濃度に相当する。
【０１１１】
本発明は、前記ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
−  それぞれ、配列番号４又は配列番号１６をコードする配列番号３又は配列番号１５のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号３又は配列番号１５の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そしてそれぞれ、配列番号４又は配列番号１６により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は、それぞれ配列番号４又は配列番号１６から誘導されたタンパク質をコードする、配列番号３又は配列番号１５の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号３又は配列番号１５の配列との好ましくは少なくとも約６０％の相同性を有する、配列番号３又は配列番号１５に対して相同の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号３又は配列番号１５のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドから構成されるもの、
−  又は、前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列又はフラグメントのうちの１つに対して相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列にも関する。
【０１１２】
本発明は、前記ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
−  それぞれ、配列番号６又は配列番号１８をコードする配列番号５又は配列番号１７のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号５又は配列番号１７の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そしてそれぞれ、配列番号６又は配列番号１８により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は、それぞれ配列番号６又は配列番号１８から誘導されたタンパク質をコードする、配列番号５又は配列番号１７の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは配列番号５又は配列番号１７の配列との少なくとも約６０％の相同性を有する、配列番号５又は配列番号１７に対して相同の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号５又は配列番号１７のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドから構成されるもの、
−  又は、前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列又はフラグメントのうちの１つに相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列にも関する。
【０１１３】
本発明は、前記ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
−  それぞれ、配列番号８又は配列番号２０をコードする配列番号７又は配列番号１９のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号７又は配列番号１９の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そしてそれぞれ、配列番号８又は配列番号２０により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は、それぞれ配列番号８又は配列番号２０から誘導されたタンパク質をコードする、配列番号７又は配列番号１９の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは配列番号７の配列との少なくとも約６０％の相同性を有する、配列番号７又は配列番号１９に対して相同の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号７又は配列番号１９のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドから構成されるもの、
−  又は、前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列又はフラグメントのうちの１つに相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列にも関する。
【０１１４】
本発明は、前記ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号９の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号１０により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１０から誘導されたタンパク質をコードする、配列番号９の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは配列番号９の配列との少なくとも約６０％の相同性を有する、配列番号９に対して相同の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号９のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約４８０個の連続したヌクレオチドから構成されるもの、
−  又は、前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列又はフラグメントのうちの１つに相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列にも関する。
【０１１５】
本発明は、前記ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
−  配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１１の配列から、遺伝暗号の縮重により誘導され、そして配列番号１２により表されるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１２から誘導されたタンパク質をコードする、配列番号１１の配列から、特に１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加により誘導された任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１１の配列との好ましくは少なくとも約６０％の相同性を有する、配列番号１１に対して相同の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、配列番号１１のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであって、該フラグメントは、好ましくは該配列中の少なくとも約１８０個のヌクレオチド、特には少なくとも約８００個の連続したヌクレオチドから構成されるもの、
−  又は、前記配列又はフラグメントに対して相補性の任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列又はフラグメントのうちの１つに相補性の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むこと、あるいはそれより構成されることを特徴とする、前記ヌクレオチド配列にも関する。
【０１１６】
本発明は、アンネリダ、特にアレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列のための前記調製方法であって、該方法が、以下の工程：
−  前記ヘモグロビン分子を、少なくとも１つの解離剤及び還元剤、特にジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）又はβ−メルカプトエタノール及び解離緩衝剤からなる混合物と、タンパク質鎖が互いに分離するのに十分な時間一緒にし、
該ヘモグロビン分子の解離、次いで還元を可能として、該分子を構成するタンパク質鎖を得る工程、
−  前記タンパク質鎖を単離する工程、
−  前記単離されたタンパク質鎖の各々を質量分析法及びエドマン配列決定によりミクロ配列決定し、５〜２０個のアミノ酸からなる配列の各々に対応するミクロ配列を得る工程、
−  前記ミクロ配列から縮重したプライマー対（センス及びアンチセンス）を決定する工程、
−  先に得られたプライマーからポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）により前記タンパク質鎖をコードするヌクレオチド配列を調製する工程を含み、ここで、このポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）は、以下の工程：
−  該方法の第１工程は、アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするｃＤＮＡを約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程であること、
−  約３０〜４０回繰り返すサイクルは、以下の工程：
＊  アレニコラ  マリナのヘモグロビン分子を構成するタンパク質鎖をコードするｃＤＮＡを約９０℃〜約１１０℃の温度で、約１０秒〜約５分間変性する工程、
＊  本発明のプライマー対を一本鎖ｃＤＮＡの前記鎖に約５０℃〜約５６℃の温度で、約２０秒〜約２分間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプライマーを得る工程、
＊  先に得られたハイブリダイズしたプライマーを約７０℃〜約７５℃の温度で、約２０秒〜約１分３０秒間ポリメラーゼにより伸長させる工程
を含むこと、そして
−  該方法の最終工程が、先に得られたハイブリダイズしたプライマーを、約７０℃〜約７５℃の温度で、約５分〜約１５分間ポリメラーゼにより伸長させる工程であること
を含むことを特徴とする、方法に関する。
【０１１７】
実施例部分
本発明の目的は、脊椎動物における血液代替物として海産多毛類（marine polychaete）アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン（ＨｂＡｍ）の使用である。しかしながら、この虫は重要なバイオマスを表すとしても、遺伝子工学による合成が必須であり、そして必要な経路であることが証明された。ゆえに、この分子のセルフアセンブリー性（self-assembly property）から人工的、機能的かつ安定なヘモグロビンを発生させるためにＨｂＡｍを構成するタンパク質鎖の一次配列を得ることが一番に重要である。各サブユニットの解離プロトコール及びポリペプチド鎖への還元並びにこれらの鎖の精製、単離、ミクロ配列決定及び配列決定技術を以下に詳細に検討する。
【０１１８】
ヘモグロビンの抽出及び精製
１）研究した種：  アレニコラ  マリナ；潮間生態系のアンネリダ
Ａｎｎｅｌｉｄａ  Ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ  アレニコラ  マリナは、４０度線より上に位置した北大西洋、黒海及びアドリア海のすべての海岸全体にわたり広がっている定在の種である。ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）地域において、「釣り人の虫」（"ｖｅｒ  ｄｕ  ｐeｃｈｅｕｒ"）としてフランスで周知であるアレニコラは密な集団を形成する。これらの集団が生息している堆砂（sediment）は、糞により発生する粒子（coprogeneous particles）の盛り上がり（mounds）及び円錐形窪みによりそれぞれ形成された交互する突起（bumps）及び凹み（hollows）の不規則な表面を有する。アレニコラは砂中に作られた地下巣穴（galleries）に生息している。地下巣穴の構造は、外側に開口した分岐を有し、他方は閉じているＵ字形態にある。アレニコラは水平部分に入っており、その頭部端は出口のない部分（blind part）に向いている。アレニコラは砂を摂取し、同化可能な有機物質を抽出し、次いでその尻の端部を通して排便し、かくして砂のミミズの糞状の山を形成する。潮間帯の内側では、集団の分布及び密度は、グラニュロメトリー（granulometry）、有機物質及び塩分の濃度により本質的に制御される。
【０１１９】
なかでも潮間帯に生息しているアレニコラは、酸素圧の変動を受けざるを得ない。地下巣穴は、アレニコラが低潮時に海水（酸素に富んだ）と恒久的に接触していることを可能とする。
【０１２０】
２）研究方法
２．１  生物学的材料のサンプリング
前記動物をロスコフ（フランス）付近のペンプール湾（Ｂａｉｅ  ｄｅ  Ｐｅｎｐｏｕｌｌ）において低潮時に採集し、そして海水中に一夜保って、それらの消化管を空にする。血液サンプルを注射器を使用して背管脈から採取する。サンプルを氷上に採集し、そしてガラスウールを通してろ過する。分子の解離を回避し、そして組織デブリスを除去するために、低温遠心（４℃で１５分間、１５，０００g）の後、上清をＡｍｉｃｏｎセル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び５００kDaの「カットオフ」膜（５００kDaより大きい質量のみが保持される）によって濃縮する。
【０１２１】
２．２  ヘモグロビンの精製
血液が濃縮されると、排除（分子のサイズの関数としての分離、即ち、分子のサイズがより有意であればある程、それはより速く溶離される）による低圧ろ過（ＦＰＬＣ）は、低温室（４℃）中で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０×１０３〜８０００×１０３の分離範囲）のカラム（１００×３cm）で行う。各精製はサンプル５mLで行い、アレニコラ  マリナ生理食塩化緩衝剤（Arenicola marina salinated buffer）（２ＮソーダによりｐＨ７．０に調整した、１０mM  Ｈｅｐｅｓ；４mM  ＫＣｌ；１４５mM  ＮａＣｌ；０．２mM  ＭｇＣｌ２）により溶離する。この第１の精製のために使用した流速は４０ｒ．ｐ．ｍであり、そして第１の最も赤い画分（ヘムを含有する）のみを回収する。次いでこの画分を、１０，０００Da以上の重量を有する分子を保持するＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０kDa管を使用して濃縮する。
【０１２２】
次いで、第２の精製を、周囲温度で、１×３０cmＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２−Ｃカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、５×１０３〜３×１０５Daの分離範囲）でアリコート２００μLの低圧ろ過（ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ）により行う。使用する流速は、０．５ml／分である。サンプルを４℃に保ち、そして氷中に収集する。溶離物の吸光度を２つの波長：２８０nm（タンパク質の吸光度ピーク特性）及び４１４nm（ヘムの吸光度ピーク特性）で監視する。ヘムを含有する画分を、収集器（ヘモグロビンの保持時間に対応する時間ウインドーでプログラムした）（図１）を使用して単離する。サンプルを濃縮し、アッセイし、次いで使用の前に−４０℃で保存する。
【０１２３】
２．３  ヘモグロビンのアッセイ
アッセイのために使用するＤｒａｂｋｉｎの試薬（Ｓｉｇｍａ）は、溶液中のヘムの量を決定することを可能とする。ヘモグロビンは、フェリシアン化カリウム、シアン化カリウム及び重炭酸ナトリウムを含有するＤｒａｂｋｉｎの試薬と反応する。ヘモグロビンはフェリシアン化物の作用により、メトヘモグロビンに転換される。次いでメトヘモグロビンをシアン化物と反応させて、シアンメトヘモグロビンを形成する。５４０nmにおけるこの誘導体の吸光度は、溶液中のヘムの量に比例している。アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン（ＨＢＬ）は平均してタンパク質２３，０００g当たりヘム１モルを含有し、これは簡単な計算により、各サンプルのＨＢＬ濃度を得ることを可能とする。
【０１２４】
３）結果
かくして、数ミリグラムのアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンを精製した。各バッチ（１mLアリコート）をＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２−Ｃカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのＦＰＬＣにより分析して、サンプルの純度を確実にする（単一ピーク）。同様に、４００nm〜７００nmの範囲にわたるＵＶスペクトルを作成して、各バッチのヘモグロビンの機能性を証明する（図２）。三つの吸光度極大値を４１４、５４１及び５７７nmにおいて観察する。比較により、メトヘモグロビンは５００及び６３５nmにおいて、２つの極大値を示すことが想起されるべきである。
【０１２５】
最後に、これらのバッチは、マウス及びラットで行われる前臨床試験のためにＢｉｏｔｒｉａｌ  Ｓ．Ａ．（フランス国レンヌ）により使用され、可能な病理学的及び免疫原性反応を試験する。
【０１２６】
これらの異なる基本的サブユニット（三量体、リンカー二量体及び一量体）におけるアレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビンの解離
アレニコラ  マリナの細胞外ヘモグロビン（ＨｂＡｍ）の解離は全体的（total）でなければならず、そして機能的サブユニットを保持しなければならない。次いで、異なるサブユニットを単離し、この目的に開発された液体クロマトグラフィー技術（排除及びイオン交換）により分析する。
【０１２７】
１）ＨＢＬの解離
１．１  解離プロトコール
解離の予備的研究は、先行技術の刊行物（Vinogradov et al., 1979; Sharma et al., 1996; Mainwaring et al.,1986; Polidori et al.,1984; Kapp et al., 1984; Chiancone et al., 1972; Vinogradov  et al., 1991; Krebs et al., 1996）から、即ち、単一の解離試薬：尿素、ヘテロポリタングステン酸イオン、グアニジニウム塩、ＳＤＳ又は水酸化物イオンの存在下に開発された。使用した試薬は分子に対して異なって作用する：即ち、
−  水酸化物イオン（ＯＨ−）、ＳＤＳ、グアニジニウム塩及びヘテロポリタングステン酸イオンは塩橋を脱安定化し、
−  尿素は疎水性相互作用を脱安定化する。
【０１２８】
この目的は、できる限り速く且つ有効に４つの基本的サブユニットを得ること、従って、種々の解離剤、特にアルカリ性ｐＨ及び尿素を組み合わせるという考えである。種々の試験の後、急速且つ有効な解離は２NソーダでｐＨ１０に調整した解離緩衝剤（Ｔｒｉｓｍａ塩基０．１M及びＥＤＴＡ１mM）において希釈した３M尿素で得られることが明らかになる。ＨｂＡｍを約４mg/mLの濃度に調節する（ストック溶液）。すべての分析は＋４℃で行い、そしてサンプルを研究全体にわたり暗所に保つ（Ｔｒｉｓｍａ＝トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）。
【０１２９】
１．２  排除クロマトグラフィー分析
分析条件を、以下の表１に詳細に示す。
【表４】
2007508024.tif 000004
【０１３０】
１．３イオン交換分析
ＨＢＬの等電点（ｐＨｉ）が４．６９であるので（Vinogradov, 1985）、ＣＩＭ  ＤＥＡＥディスクアニオンカラム（Interchim）でイオン交換分析を行う。実際に、ＨＢＬは、ｐＨｉより大きいｐＨでは負に帯電しており、故に正に帯電した樹脂（ＤＥＡＥ樹脂）上に固定される。溶離は０〜１Mの非線状ＮａＣｌ勾配（ｐＨ７．０の解離緩衝剤中に希釈し、そして０．４５μmを通してろ過した１M  ＮａＣｌ溶液）によりイオン力によって行う。ｐＨ７の解離緩衝剤を溶離緩衝剤として使用する。流速は４mL／分である。
【０１３１】
１．４．逆相クロマトグラフィー分析
Ｗａｔｅｒｓ３００Ｃ１８５μm（４．６×２５０mm）Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムで逆相クロマトグラフィーを行う。アセトニトリル及びＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の存在下で、ＨｂＡｍをその基本的サブユニット（三量体、一量体及びリンカー）に解離させ、そしてヘムをグロビンから解離させる。かくして、前処理することなく、ＨｂＡｍをカラムヘッドにおいて解離させる。開発した方法を、下表に述べる。
【０１３２】
【表５】
2007508024.tif 000005
【０１３３】
２）結果
２．１  排除クロマトグラフィー
部分的に解離したＨｂＡｍのクロマトグラムを、図３に示す。５つのピークが観察され、そして同定されなければならない。分子はそれらの減少する質量に従って溶離し、そして溶離したネイティブＨｂＡｍはホールドアップ容量（１６分）にある。各ピークに対応する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（図４）。結果を、以下の表２に示す。
【０１３４】
【表６】
2007508024.tif 000006
【０１３５】
２．２  イオンクロマトグラフィー
この方法が解発されると（表３）、画分を集め、濃縮し、そしてＳＤＳゲルにより分析して、各ピークを同定する（図６及び表４）。
【０１３６】
次いで、各サブユニットを再精製するための方法を開発する。
【表７】
2007508024.tif 000007
表３：ＣＩＭ−ＤＥＡＥでの解離したＨＢＬの分析のために開発された方法
【０１３７】
【表８】
2007508024.tif 000008
表４：ゲル（図６）の分析後に行われた保持時間とサブユニットの間の関連付け
【０１３８】
２．３  逆相クロマトグラフィー
この方法が開発されると、画分を集め、凍結乾燥し、そして質量分析法により分析して各ピークを同定する。
【０１３９】
【表９】
2007508024.tif 000009
【０１４０】
三量体の化学的性質は、逆相によりそれらを分離することが可能であるためには余りにも類似しすぎているにちがいない。かくして、２つのリンカー並びに一量体ａ１及びａ２のみ単離することが可能であった。
【０１４１】
２．４．ＨｂＡｍの解離
解離速度論を排除クロマトグラフィーにより監視する。Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）によるクロマトグラムの積分は、曲線下の面積から種々の化合物の百分率を計算することを可能とする。解離速度論の展開を、図７、８及び９に示す。
【０１４２】
図７、８及び９における三つのグラフは、２４時間に三つの基本的サブユニットを有効に得るために、２つの解離剤（３M尿素及びＯＨ−）を組み合わせることの利益を示す。
【０１４３】
ヘモグロビンの再会合
１）材料及び方法
前記プロトコール（ｐＨ９、ｐＨ１０、３M尿素、４M尿素、ｐＨ１０における３M尿素）に従って解離されたＨｂＡｍに対して再会合実験を行う。種々の再会合緩衝剤を試験して、最適再会合を得る。緩衝剤の変更（解離緩衝剤→再会合緩衝剤）を２つの異なる方法で行う：即ち、
−  解離したＨｂＡｍを、＋４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で再会合緩衝剤４mLに対して４回洗浄する；
−  解離したＨｂＡｍをＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（２×２L）に対して２４時間、次いで＋４℃で再会合緩衝剤（３×２L）に対して４８時間透析する。
【０１４４】
２）結果
アンネリダの細胞外ヘモグロビンに関するその後の結果に従えば（Mainwaring et al., 1986; Polidori et al.,1984）、二価イオン、例えば、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋の存在がヘモグロビンの四次構造の維持のためには必要である。実際に、二価イオンはヘモグロビンの四次構造を安定化し、そして解離現象を遅くする（Sharma et al., 1996）。これらのイオンは、側鎖のカルボキシレート基及び主鎖のカルボニルとの複合体を形成する。二価イオンの存在は、カルボキシル基がイオン化されるとき、故に中でも解離がアルカリｐＨにおいて起こったとき、再会合に対する効果を有することができる。故に、再会合緩衝剤がカルシウム及び／又はマグネシウムを含有することは有意義である。これは、解離緩衝剤におけるＥＤＴＡの存在；これらの二価イオンをキレート化するＥＤＴＡの存在も説明する。今開発された緩衝剤は、濃ＨＣｌによりｐＨ７に調節されたＴｒｉｓｍａ塩基０．１M、ＮａＣｌ４００mM、２．９５mMＫＣｌ、３２mMＭｇＳＯ４、１１mMＣａＣｌ２から構成される。解離と同じ原理に従って再会合を監視する（図１０及び１１）。
【０１４５】
解離が１分のオーダーの短い期間であるならば、再会合が観察される。この再会合は、トランケーションされたヘモグロビン（１つ以上の１２分の１体（ｔｗｅｌｆｔｈｓ）から解離したＨＢＬ）である解離中間体の再配列に対応する。
【０１４６】
種々のポリペプチド鎖の研究のためのＨｂＡｍの還元
１）逆相液体クロマトグラフィーによる分離の前のヘモグロビンの還元
ＨｂＡｍ（４mg／mL）をｐＨ８〜９の解離緩衝剤（０．１Mｔｒｉｓｍａ又は１０mM重炭酸アンモニウム）中に溶解した１０％ＤＴＴ（ジチオスレイトール）中で周囲の温度で３０分間還元する。還元すると、得られたタンパク質鎖をｐＨ８〜９の解離緩衝剤中に溶解した１００mMヨードアセトアミドの存在下で、周囲温度で３０分間アルキル化する。
【０１４７】
以下のプロトコールを場合によりもくろむこともできる：即ち、ＨｂＡｍ（４mg／mL）をｐＨ８〜９の解離緩衝剤に溶解したＤＴＴ（ジチオスレイトール）１００mM中で４０℃で１時間還元する。これらの激しい条件下に、グロビンのみを分析することができる。実際に、リンカー（非グロビンタンパク質）はシステインに富んでおり、それ故損傷される。還元されると、ＨｂＡｍをＡｍｉｃｏｎ３０，０００Da（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で４回洗浄し、そのろ液のみを回収する。（３０，０００Da未満の重量を有するすべて）。次いでろ液をＡｍｉｃｏｎ１０，０００Daで洗浄して、１０，０００Da未満のすべてを除去する。かくして、３０，０００Da〜１０，０００Da一量体のみがサンプル中に含まれる（ＨｂＡｍを構成するグロビン鎖の重量範囲）。
【０１４８】
２）逆相クロマトグラフィーによるタンパク質鎖の分離
２．１  材料及び方法
Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００Ｃ１８５μm（４．６×２５０mm）カラムで逆相クロマトグラフィーを行う。開発された方法を以下の表に記載し，そして得られたクロマトグラムを図１２に示す。
【表１０】
2007508024.tif 000010
【０１４９】
以下のプロトコールを場合によりもくろむこともできる。
【表１１】
2007508024.tif 000011
【０１５０】
各タンパク質鎖（２８０nmにおける単一ピークにより示される）を集め、次いで凍結乾燥し、そして次の分析まで−４０℃で保存する。かくして、下記の５種類の一量体：即ち、ａ１（〜１５９５２kDa）、ａ２（〜１５９７５kDa）、ｄ２（〜１７０３３kDa）、ｂ２（〜１６０２０kDa）、及びｃ（〜１６６６４kDa）を分離することが可能であった。
３）二次元ゲルによるタンパク質鎖の分離
一次元における等電点電気泳動技術及び二次元におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術の組み合わせである二次元ゲルは、複雑なタンパク質混合物を分離することを可能とする。
【０１５１】
等電点電気泳動
ＦＰＬＣによる精製の後に、アレニコラのヘモグロビンを透析し、そして凍結乾燥する。５００μgを再水和緩衝剤中に取り込む。この緩衝剤は、４％Ｃｈａｐｓ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート；Ｓｉｇｍａ）、１％の調製されたばかりのＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Bohringher）、ＴＬＣＫ５０μg／ml（トリプシン阻害剤）及び１％ブロモフェノールブルー１μlを含有する。
【０１５２】
混合物を超音波処理し、そして遠心して、非溶解物質を排除する。次いで等電点電気泳動バンドの支持体の２つの端部に石油を適用し、次いでサンプルを媒体に適用する。次いで１７cmのバンドをサンプルに適用し、いかなる気泡も除去する。次いでバンドを石油で覆って、サンプルの蒸発を回避する。
【０１５３】
次いで活性な再水和を５０Ｖ（１２時間にわたり２０℃）で行う。次いで２日間にわたりフォーカリゼーション（ｆｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行う。
【０１５４】
次いでバンドを回収し、そして６〜１８％アクリルアミドゲル、特に１０％、１８cm幅、２０cm長さ及び１mm厚さ上に置く。冷凍したエンクロージャー中で４００Ｖ、２５mA及び１００Ｗで１４時間にわたり１０℃で移動を行う。
【０１５５】
次いで、１％アガロース溶液を使用してゲルの頂部にバンドをシールした後に、タンパク質鎖のサイズの関数として、タンパク質鎖の分離を行う。分離すると、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー（Coomassie（登録商標）G250）で染色することによりゲル上にタンパク質バンドが現れる。
【０１５６】
勾配ゲルの構成
１８％ポリアクリルアミドの高密度（dense）溶液（２．５Mアクリルアミド；０．４Mトリス；３０％グリセロールｖ／ｖ）；３．５mMドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；０．０５％ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン；Ｓｉｇｍａ）（ｖ／ｖ）；１．６mM過硫酸ナトリウム）２５mlを一定の攪拌下に混合室に入れると共に、同容量の６％ポリアクリルアミドの低密度（light）溶液（アクリルアミド０．８M；Ｔｒｉｓ０．４M；ＳＤＳ３．５mM；ＴＥＭＥＤ０．０６％（ｖ／ｖ）；過硫酸ナトリウム２．４mM）を他方の室に入れる。ゲルの頂部を二回蒸留水（bidistilled water）中の飽和イソブタノール溶液で覆う。次いでゲルを１時間放置して周囲温度で重合させ、次いでゲルの頂部を二回蒸留水で数回すすぎ、次いで全体を１０℃で一夜置く。吸収紙を使用して残留水の除去の後に、濃厚ゲル溶液（０．５６Mアクリルアミド；６．９mMメチレンビス−アクリルアミド；１２４mMＴｒｉｓ；３．５mMＳＤＳ；０．０５％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）；２．２mM過硫酸ナトリウム）を分離ゲル上に注ぎ、そしてバンドのブロットを形成することを可能とするくさび（shim）を、濃厚ゲル溶液に導入する。重合は周囲温度で１時間後に完了する。
【０１５７】
４）逆相及び二次元ゲルにより単離されたタンパク質鎖のミクロ配列決定による分析
次いで、逆相クロマトグラフィー及び二次元ゲルにより単離されたタンパク質鎖を消化し、そしてＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型装置でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析法により分析する。
【０１５８】
逆相クロマトグラフィーにより分離されたタンパク質の消化
各単離されたタンパク質鎖を、ミクロ配列決定によるそれらの分析前の必須の工程である、酵素による消化に付す。凍結乾燥したタンパク質鎖をｍｉｌｌｉＱ水溶液、エンドプロテアーゼ；リシン及びアルギニンのＣ末端レベルで加水分解して、一般に５００〜２５００Daの質量を有するペプチドを産生するトリプシン、を含有するアセトニトリル中に周囲温度で最小３時間にわたり溶解させる。
【０１５９】
二次元ゲル上で分離されたタンパク質の消化
ゲルの各スポットを切り取って酵素消化に付す。この酵素消化工程は必須である。それは、酵素を使用して特定の方式でタンパク質をいくつかのペプチドに加水分解することからなる。
【０１６０】
消化を始める前に、脱色、還元及びアルキル化工程が必須である：即ち、
●炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）及びアセトニトリル（ＡＣＮ）による引き続く洗浄は、ゲルのピース中に存在する染色剤を除去することを可能とし、
●ジチオスレイトール（ＤＴＴ）との還元反応及びヨードアセトアミドとのアルキル化反応は、タンパク質配列中に存在する２つのシステイン間に形成されたジスルフィド橋及びシステイン−アクリルアミド結合の開放、次いでブロッキングを可能とする。
【０１６１】
この方法の最終工程は、少しの酸を加えられた、アセトニトリル及び水からなる抽出溶液を使用して、ゲルからトリプシンにより生成されたペプチド（trypsic peptides）を抽出することからなる。
【０１６２】
ナノＬＣ−ＭＳ−ＭＳによる分析
次いで抽出されたペプチドをＰＣＲプレートに移行させる。この移行は、２回の１５μLで行って、容量のすべてを回収する。予備カラムでのペプチドの保持を妨害することがあるアセトニトリルを除去するために、ナノＬＣ−ＭＳ−ＭＳによる分析の前に、２時間の蒸発（休止）の時間を適用する。
【０１６３】
結果
これは、二次元ゲルにより各別々の鎖タンパク質に対応する数百ミクロ配列を得ることを可能とした。
【０１６４】
５）逆相クロマトグラフィーによる単離されたタンパク質鎖のＥｄｍａｎ配列決定による分析
原理
Ｎ−メチルピペリジン緩衝剤の存在下で、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｉｓｏ−Ｔｈｉｏ−Ｃｙａｎａｔｅ（ＰＩＴＣ）をタンパク質の第一級及び第二級アミン官能基にカップリングさせる（ＰＴＣ−タンパク質）。４５℃での反応時間は１８分である。下記のペプチド結合が弱められ、これは純粋なトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により３分間に切断されることを可能とし、かくして第一アミノ酸（ＡＡ）のアニリノ−チアゾリノン（ＡＴＺ）及び第一アミノ酸（ＡＡ）を失ったタンパク質を発生させることを可能とする。
【０１６５】
ＡＴＺ−ＡＡを反応媒体から抽出し、そして酸媒体（水中の２５％ＴＦＡ）中でより安定なフェニルチオ−ヒダントイン（ＰＴＨ−ＡＡ）に転換する。ゆえに、ＰＴＨ−ＡＡをＨＰＬＣにより分析することができ、そしてその性質はＰＴＨ−ＡＡ標準によって決定することができる。反応サイクルを繰り返すことができ、かくしてタンパク質配列をもたらす。Ｅｄｍａｎは、１９６７年に最初のタンパク質配列決定装置を創り出すことにより彼の名前を有する反応を自動化した。この装置をＨＰＬＣにカップリングさせて、それに該装置はＰＴＨ−ＡＡを射出する。次いで標準スペクトルとの比較により、元のアミノ酸を同定し、そしてその定量を得ることが可能である。全体のプロセスは、種々のエレメントを制御しそしてデータの取得及びそれらの処理を確実にするコンピュータにより制御される。
【０１６６】
結果
かくして、逆相により単離された５つの一量体及びリンカーのＮ末端から約３０個のアミノ酸を得ることが可能であった。
【０１６７】
ｍａｒｉｎｅ  ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ  アレニコラ  マリナのサブファミリーＡ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ２及びＢ１並びにリンカーＬ１のグロビンのヌクレオチド配列及びポリペプチド配列のＰＣＲ増幅プロトコール及び提示の詳細
そのヌクレオチド配列が以下に示されている５つのグロビンＡ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１及びＢ２並びにリンカーＬ１のＰＣＲ増幅を、サブファミリーＡ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２の特定の縮重したプライマー（センス及びアンチセンス）のデザインで開始した。前記した５つのグロビン（Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１及びＢ２）の増幅、次いで対応するＰＣＲ産物のクローニング及び配列決定を可能とするこれらのプライマーは、データバンクから入手可能なアンネリダグロビンのタンパク質配列のアラインメントからデザインされた。
【０１６８】
ＰＣＲ反応のために使用された相補性ＤＮＡマトリックスは、アレニコラの小さなサイズ並びにヘモグロビンの合成に関与する遺伝子を含む遺伝子の有意なレベルの発現を反映するそれらの強い成長速度（intense growth rate）により、アレニコラから抽出された全ＲＮＡｓから精製したメッセンジャーＲＮＡから合成された。かくして相補性ＤＮＡｓを合成した。これらの工程は、Ａｍｂｉｏｎ（ＲＮＡｓの精製）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ｍＲＮＡｓの精製）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＲＴ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（クローニング）、Ａｂｇｅｎｅ（配列決定）により作成された市販の分子生物学キットを使用した。
【０１６９】
第２段階では、我々は、特に、変性時間、ハイブリダイゼーション時間及び温度並びに伸長時間パラメーターの決定に関して、ＰＣＲ反応を開発した。ＭｇＣｌ２濃度も最適化した。
【０１７０】
最後に、最終工程で、５’及び３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ実験を行って、完全なコード配列を得た。これらの工程では、Ｒｏｃｈｅ分子生物学キットを使用した。
【０１７１】
グロビン、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ａ１、Ｂ１及びＢ２の各々並びにリンカーＬ１について、縮重したセンス及びアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列、ＰＣＲパラメーター並びに部分的又は完全なコード配列を以下に示す。
【０１７２】
これらの配列の全ブラストデータバンク分析（total blast databank analysis）が２．１０−３＜Ｅｖａｌｕａｔｅ＜５ｅ−３１の値を生じることが特定される。
【０１７３】
グロビンＡ２ａ
グロビンＡ２ａ（配列番号２）をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を得るために、プライマー対（配列番号１９；配列番号２０）を使用する。
【０１７４】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
【表１２】
2007508024.tif 000012
【０１７５】
ＰＣＲ反応：
反応当たり    ５〜２０ng  ｃＤＮＡ
１００ngセンスプライマー
１００ngアンチセンスプライマー
ｄＮＴＰ２００μM最終
ＭｇＣｌ２２mM最終
緩衝剤ＰＣＲ１Ｘ最終
１ユニットＴａｑポリメラーゼ
２５μLとするのに十分な量の（ｑｓｆ）Ｈ２Ｏ
グロビンＡ２ｂ
グロビンＡ２ｂ（配列番号４）をコードする配列番号３のヌクレオチド配列を得るために、プライマー対（配列番号２１；配列番号２０）を使用する。
【０１７６】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
【表１３】
2007508024.tif 000013
【０１７７】
グロビンＡ１
グロビンＡ１（配列番号６）をコードする配列番号５のヌクレオチド配列を得るために、プライマー対（配列番号２２；配列番号２０）を使用する。
【０１７８】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
【表１４】
2007508024.tif 000014
【０１７９】
グロビンＢ２
グロビンＢ２（配列番号８）をコードする配列番号７のヌクレオチド配列を得るために、プライマー対（配列番号２３；配列番号２０）を使用する。
【０１８０】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
【表１５】
2007508024.tif 000015
【０１８１】
グロビンＢ１
グロビンＢ１（配列番号１０）をコードする配列番号９のヌクレオチド配列を得るために、プライマー対（配列番号２４；配列番号２０）を使用する。
【０１８２】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
【表１６】
2007508024.tif 000016
【０１８３】
リンカーＬ１
リンカーＬ１（配列番号１２）をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を得るために、プライマー対（配列番号２５；配列番号２０）を使用する。
【０１８４】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
【表１７】
2007508024.tif 000017
【０１８５】
【表１８】
2007508024.tif 000018
2007508024.tif 000019
2007508024.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２−Ｃカラムでのアレニコラ  マリナのヘモグロビンのクロマトグラムを表す。上部曲線は４１４nmの吸光度に対応し、そして下部曲線は２８０nmの吸光度に対応する（収集器（collector）は１６〜１８分を集めるようにプログラムされる）。
【図２】図２は、アレニコラ  マリナの機能的ヘモグロビン（そのオキシヘモグロビン形態にある）のＵＶスペクトルを表す。
【図３】図３は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２−Ｃで得られた（部分的に）解離したＨｂＡｍのクロマトグラム（４１４nmにおける）を表し、そしてクロマトグラムの鉛直線は収集ウインドーに相当する（サブユニットの回収に相当する）。
【図４】図４は、集められた種々の画分について得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表す。
【図５】図５は、ＣＩＭ  ＤＩＳＫ  ＤＥＡＥ（アニオン交換システム）で得られた（部分的に）解離したＨｂＡｍのクロマトグラム（４１４nmにおける）を表し、そしてクロマトグラムの鉛直線は収集ウインドーに対応する。点線曲線は、勾配を表す。
【図６】図６は、集められた種々の画分について得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表す。
【図７】図７は、３Ｍ尿素の存在下でのＨｂＡｍの解離速度論を表す。ｘ軸は日数に対応し、そしてｙ軸はネイティブ分子の解離の百分率に相当する。点線曲線は１２量体に対応し、黒の四角を有する曲線は三量体及び「リンカー」（構造鎖）に対応し、そして黒の円を有する曲線は一量体に対応する。
【図８】図８は、ｐＨ１０におけるＨｂＡｍの解離速度論を表す。ｘ軸は日数に対応し、そしてｙ軸はネイティブ分子の解離の百分率に相当する。点線曲線は１２量体に対応し、黒の四角を有する曲線は三量体及び「リンカー」に対応し、そして黒の円を有する曲線は一量体に対応する。
【図９】図９は、ｐＨ１０における３M尿素の存在下でのＨｂＡｍの解離速度論を表す。ｘ軸は日数に対応し、そしてｙ軸はネイティブ分子の解離の百分率に相当する。点線曲線は１２量体に対応し、黒の四角を有する曲線は三量体及び「リンカー」に対応し、そして黒の円を有する曲線は一量体に対応する。
【図１０】図１０は、ＨｂＡｍ（ＨＢＬ）及び十二量体（Ｄ）の百分率からのそして緩衝剤変更技術（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ又は透析）に従う再会合速度論の監視を表す。ｘ軸は日数に対応し、そしてｙ軸はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ技術によるネイティブ分子の解離の百分率に相当する。点線曲線は透析技術によるＨＢＬに対応し、黒の三角形を有する曲線はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ技術による１２量体に対応し、実線は透析技術による十二量体に対応する。
【図１１】図１１は、種々の再会合時間に対応する再会合期間中の排除クロマトグラフィークロマトグラムの重なりを表す。
【図１２】図１２は、ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）での逆相によるポリペプチド鎖の分離後に得られたＨＰＬＣクロマトグラムを表す。コード（ｄ２、ａ１、ａ２、ｂ２、ｃ）は、Zal et al.(1997)による論文に記載されたグロビンの名称に対応する。
【図１】
2007508024.tif 000022
【図２】
2007508024.tif 000023
【図３】
2007508024.tif 000024
【図４】
2007508024.tif 000025
【図５】
2007508024.tif 000026
【図６】
2007508024.tif 000027
【図７】
2007508024.tif 000028
【図８】
2007508024.tif 000029
【図９】
2007508024.tif 000030
【図１０】
2007508024.tif 000031
【図１１】
2007508024.tif 000032
【図１２】
2007508024.tif 000033
【配列表】
2007508024000001.app
【国際調査報告】
2007508024.tif 000034
2007508024.tif 000035
2007508024.tif 000036
2007508024.tif 000037
2007508024.tif 000038
2007508024.tif 000039