(57)【要約】  本発明は、未分化哺乳動物細胞を骨芽細胞へと誘導するための方法、作用物質、及び化合物のスクリーニングアッセイに関連する。それゆえ、本発明は、化合物を配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び、前記細胞の分化に関連した化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む方法を提供する。本発明はさらに、骨形成を増幅させる医薬組成物、及び対象での平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う疾患の治療及び／又は予防におけるそれらの使用に関連する。その上、本発明は、骨組織のインビトロ産生に対する方法に関連する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する化合物を同定するための方法であって：
（ａ）化合物を、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び
（ｂ）前記細胞の分化に関連した化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、インビトロで細胞を使用せずに調製されたポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが哺乳動物細胞中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特性が、前記ポリペプチドへの前記化合物の結合親和性である、請求項１、２、又は３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、前記細胞の分化の生化学的指標マーカーを産生する生物学的経路の活性化である、請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的マーカーが骨アルカリフォスファターゼである、請求項７記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号：１９９、２３０、２３７、２６２、及び２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、及び配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドへの結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、ファージディスプレーライブラリー又は抗体フラグメントライブラリー中のペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するための作用物質が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択され、このとき前記作用物質が、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はその配列から設計された核酸配列を含む、前記作用物質。
【請求項１１】
アミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１９９、２３０、２３７、２６２、及び２８１からなる群から選択される、請求項１０記載の作用物質。
【請求項１２】
哺乳動物細胞中のベクターが前記作用物質を発現させる、請求項１１記載の作用物質。
【請求項１３】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペス単純ウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクターである、請求項１２記載の作用物質。
【請求項１４】
前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に相補的な１７〜２５塩基のアンチセンス鎖を含み、このとき前記センス鎖が配列番号：７８〜１９３からなる群から選択される核酸配列の連続した１７〜２５ヌクレオチドから選択される、請求項１０〜１３いずれか１項記載の作用物質。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡが、さらに前記センス鎖を含む、請求項１０〜１４いずれか１項記載の作用物質。
【請求項１６】
前記センス鎖が、配列番号：８３、１１４、１２１、１４６、及び１６５からなる群から選択される核酸配列の連続した１７〜２５ヌクレオチドから選択される、請求項１５記載の作用物質。
【請求項１７】
前記ｓｉＲＮＡが、さらに前記センスと前記アンチセンス鎖を連結するループ領域を含む、請求項１０〜１６いずれか１項記載の作用物質。
【請求項１８】
前記ループ領域が、配列番号：３１０で定義される核酸配列を含む、請求項１７記載の作用物質。
【請求項１９】
前記作用物質が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、又は配列番号：１〜７７からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡである、請求項１０〜１８いずれか１項記載の作用物質。
【請求項２０】
前記作用物質が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、又は配列番号：６９〜７７からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡである、請求項１０〜１９いずれか１項記載の作用物質。  
【請求項２１】
医薬として許容し得るキャリアーとの混合物において、治療的に有効な量の請求項１０〜２０いずれか１項記載の作用物質を含む、骨形成を増進する医薬組成物。
【請求項２２】
疾患に苦しむ又は疾患の影響を受けやすい対象における、全身性又は局所性の平均骨密度の減少を伴う前記疾患を治療及び／又は予防する方法であって、前記対象に請求項２１記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記疾患が、骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、多発性骨髄腫症、副甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患が骨粗鬆症である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
平均骨密度の減少を伴う疾患を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における、請求項１０〜２０いずれか１項記載の作用物質の使用。
【請求項２６】
前記疾患が、骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、多発性骨髄腫症、副甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
前記疾患が骨粗鬆症である、請求項２５又は２６記載の使用。
【請求項２８】
前記未分化細胞が骨芽細胞へと分化するために十分な時間で、未分化の哺乳動物細胞を、配列番号：１〜７７からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列に接触させる工程を含み、それによって継続的に骨マトリクスを産生する、骨組織のインビトロ産生のための方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法であって、前記ステップが：
（ａ）未分化哺乳動物細胞を基質上に適用して細胞基質を形成すること、
（ｂ）前記細胞を、配列番号：１〜７７からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列に接触させ、それによって継続的に骨マトリクスを産生することを含む、前記方法。
【請求項３０】
平均骨密度の全身的又は局所的減少、若しくは対象の病気への脆弱性を含む病態を診断するための方法であって、生物学的サンプルにおいて配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を決定すること、及び該量と健康な対象における該ポリペプチドの量とを比較することを含み、このとき健康な対象と比較したポリペプチドの量の増加が該病態の存在を示す、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う哺乳動物の疾患の分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
骨は２つの異なる細胞系統、すなわち、造骨細胞（例えば骨芽細胞）及び骨吸収細胞（例えば破骨細胞）を含む。骨は、これらの骨芽細胞と破骨細胞との間の複雑な相互作用によって、継続的に破壊（再吸収）及び再構築される動的組織である。破骨細胞において、前駆細胞から機能的な破骨細胞への発達に関与する転写因子及び成長因子のカスケードはかなり確立されている。対照的に、骨芽細胞系統に関してはほとんど知られていない。
【０００３】
骨芽細胞は、分化した間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）から生じる。骨芽細胞への分化の間、骨アルカリフォスファターゼ活性（ＢＡＰ）は上昇する。インビボの骨形成は胚発生の間、２つの異なる経路：軟骨内骨化、又は膜内骨化（図１）を介して起こる。この図において示されるように、間葉前駆体、又は幹細胞は、骨形成の両方の形態における開始点に相当する。膜内骨化の間、頭蓋骨又は鎖骨などの扁平骨は、間葉細胞の凝集から直接的に形成される。四肢骨などの長骨の形成の間、間葉凝集は、骨芽細胞及び骨細胞へと分化する内皮細胞、破骨細胞、及び間葉細胞によって、さらなる発達の間に侵入される軟骨性中間体を最初にもたらす（Nakashima及びde Crombrugghe, 2003）。
【０００４】
多くの疾患が、骨再吸収と骨構築との間の微調整されたバランスの乱れによって引き起こされることが知られており、それらの骨疾患は、多くの患者：悪性の高カルシウム血症、パジェット病、関節リウマチ及び歯周病のような炎症性骨疾患、骨格転移の間に起こる局所的骨形成、クルーゾン症候群、くる病、成熟遅延骨異形成症、濃化異骨症／トゥールーズ−ロートレック（Toulouse-Lautrec）病、骨形成不全症、及び単独の最も重要な骨疾患である骨粗鬆症に相当する。
【０００５】
現在は、骨粗鬆症は、５０歳以上の女性５人に１人、及び５０歳以上の男性２０人に１人を冒す。これらの患者のために多くの治療が使用可能であり、その大部分は骨再吸収の純増加に取り組み、すなわち：
−ホルモン入れ替え療法（ＨＲＴ）
−選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭｓ）
−ビスフォスフォネート
−カルシトニン。
【０００６】
これらの治療は骨再吸収を減速させるが、失われた骨が十分に補充されないために、骨折をなくさない。骨折は、骨形成が十分に促進される場合に止められるであろう。それゆえ、骨形成経路自体に、効果として骨同化を含む治療的介入を与える骨形成経路を同定することは、大きな関心を呼んでいる。現在は、１つの骨同化治療のみが、骨粗鬆症市場：副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１〜３４に達している。ＰＴＨは、断続的に投与された場合に骨同化作用を示す。しかしながら、ＰＴＨを用いた治療は、この生物医薬品が、該患者によって毎日注射される必要があるためにとても面倒である。さらに、高用量で動物に処理した場合、腫瘍形成が観察された。また、非常に高価な治療である。
【０００７】
骨同化の別のクラスは骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）であり、骨折治癒機転を促進するための治療的作用物質としてのそれらの使用に不都合があるので、隙間市場でしか承認されてこなかった。骨形成タンパク質に対する受容体は、多くの組織において同定されており、またＢＭＰｓそれ自体が、特有の一時的かつ空間的なパターンで様々な組織において発現している。これは、ＢＭＰｓが骨以外の多くの他の組織に効果がある可能性を示唆し、全身的に投与された場合に治療薬剤としてのそれらの有用性を潜在的に限定している。
したがって、現在使用できる治療戦略の１以上の欠点を未然に防ぐ新たな治療戦略、及び化合物（特定の同化において）への継続的な必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するための方法、作用物質、及び化合物スクリーニングアッセイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明のある態様は、未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する化合物を同定するための方法に関連し、化合物を、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させることを含み；かつ前記細胞の分化に関連した化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。
本発明の別の態様は、未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するための作用物質に関連し、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択され、このとき前記作用物質は、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、自然発生的なポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から作り出された核酸配列を含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、医薬として許容し得るキャリアーと混合した、治療的に有効な量の該作用物質を含む医薬組成物を促進する骨形成に関連する。
本発明の別の態様は、対象の平均骨密度における、全身的又は局所的減少を伴う疾患を治療及び／又は予防するための方法に関連し、前記対象に前記骨形成促進医薬組成物を投与することを含む。
本発明のさらなる態様は、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う疾患の治療及び／又は予防のための薬剤の製造における、先に記載した作用物質の使用に関連する。
【００１１】
本発明の別の態様は、骨組織のインビトロ産生に対する方法に関連し、未分化細胞を骨芽細胞へと分化させるために十分な時間の間、未分化哺乳動物細胞を、配列番号：１〜７７からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列に接触させ、それによって継続的に骨マトリクスを産生する段階を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
用語「キャリアー」は、医薬組成物に媒体、体積、及び／又は有効な形体を提供する医薬組成物の製剤において使用される非毒性物質を意味する。キャリアーは、賦形剤、安定剤、又は水性ｐＨ緩衝化溶液などの、１以上のそのような物質を含むこともある。生理学的に許容し得るキャリアーの例は、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はトゥイーン（TWEEN）（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びプルロニクス（PLURONICS）（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む、水性又は固体緩衝成分を含む。
【００１３】
用語「化合物」は、本明細書において、本発明のアッセイに関連して記載された「テスト化合物」又は「薬剤候補化合物」との関連で使用される。そういうものとして、これらの化合物は、合成的に又は天然資源から生じた有機又は無機化合物を含む。該化合物は、ポリヌクレオチド、脂質、又は比較的低分子量によって特徴付けられるホルモン類似体のような無機又は有機化合物を含む。他の生物高分子有機テスト化合物は、約２〜約４０アミノ酸を含むペプチド及び抗体、又は抗体複合体などの、約４０〜約５００アミノ酸を含むより大きなポリペプチドを含む。
用語「接触」又は「接触すること」は、インビトロシステムであれインビボシステムであれ、少なくとも２つの部分を一緒にすることを意味する。
【００１４】
用語「病気（condition）」又は「疾患（disease）」は、症状の明らかな存在（すなわち疾病（illness））、又は異常な臨床指標（例えば、生化学的指標）の明示を意味する。あるいは、用語「疾患」は、そのような症状、又は異常な臨床指標を発現することの遺伝的又は環境的リスク若しくは傾向をさす。
用語「内因性の」は、哺乳動物が天然に産生する物質を意味することとする。対照的に、この文脈における用語「非内因性の」は、哺乳動物（例えば、限定されないが、ヒト）又はウイルスによって天然に産生されないものを意味することとする。
用語「発現」は、形質導入による内因性発現、及び過剰発現の両方を含む。
用語「発現し得る核酸」は、タンパク性分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ分子をコードする核酸を意味する。
【００１５】
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する、任意のプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間での水素結合の形成の効力によって２つの核酸配列間で形成される複合体をさす。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液内（例えば、C.sub.0t又はR.sub.0t解析）、又は溶液内に存在するある核酸配列と固体支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、又はガラススライド、若しくは細胞、又はそれらの核酸が固定される任意の他の適切な基材）上に固定された別の核酸配列間に形成されてもよい。用語「厳しい条件」は、ポリヌクレオチドと請求項に記載のポリヌクレオチドとの間でのハイブリダイゼーションを可能にする条件をさす。厳しい条件は、塩濃度、例えば、ホルムアミドのような有機溶媒の濃度、温度、及び当業者によく知られた他の条件によって定義され得る。特に、塩濃度を減少させること、ホルムアミドの濃度を増加させること、又はハイブリダイゼーション温度を上げることは、厳しさを増大し得る。
用語「阻害」又は「阻害すること」は、用語「反応」との関連において、反応が、該化合物の不在下とは反対に、化合物の存在下で減少又は妨げられることを意味する。
【００１６】
用語「医薬として許容し得るプロドラッグ」は、本明細書に使用されるとおり、しっかりとした医学的判断の範囲内において、適度な利益/リスク割合に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応を有する患者の組織との接触しての使用に適した、かつ本発明の化合物のそれらの目的とする使用に効果的な、本発明において有用な化合物のプロドラッグを意味する。用語「プロドラッグ」は、本発明における有用な効果的な化合物又は医薬として許容し得る塩、水和物、又はその溶媒和物を生じさせるために、インビボで形質転換された化合物を意味する。形質転換は、血中における加水分解を介してなどの、様々な機構によって起こることもある。代謝的に開裂可能な基を有する化合物は、代謝的に開裂可能な基の存在によって、親化合物上に与えられた強化された溶解度及び／又は吸収速度の結果として向上した生態利用効率を示すこともある点で有利であり、それゆえそのような化合物はプロドラッグとして作用する。徹底した議論が、『プロドラッグのデザイン』、H. Bundgaard, 編, Elsevier (1985); 『酵素学における方法』; K. Widderら, 編, Academic Press, 42, 309-396 (1985); 『ドラッグデザイン及び開発のテキスト』, Krogsgaard-Larsen and H. Bandaged, 編, ５章; 『プロドラッグのデザイン及び応用』113-191 (1991); 『上級薬物送達概論』, H. Bundgard, 8 , 1-38, (1992); J.  Pharm. Sci., 77,285 (1988); Chem. Pharm. Bull., N. Nakeyaらの論文, 32, 692 (1984); 『新規の送達システムとしてのプロドラッグ』, T. Higuchi及びV. Stella, 14 A.C.S. 『シンポジウムシリーズ及びドラッグデザインにおける生物可逆的キャリアー』, E.B. Roche, 編, American Pharmaceutical  Association and Pergamon Press, 1987の中に提供されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。プロドラッグの例は、エステルプロドラッグである。「エステルプロドラッグ」は、インビボにおける代謝的手段（例えば、加水分解によって）によって、本発明に従った阻害化合物へと変換可能である化合物を意味する。例えば、カルボキシ基を含む化合物のエステルプロドラッグは、インビボにおける加水分解によって対応するカルボキシ基へと変換可能なこともある。
【００１７】
用語「医薬として許容し得る塩」は、本発明の化合物の、非毒性の、無機及び有機酸付加塩並びに塩基付加塩をさす。それらの塩は、本発明における有用な化合物の最終的な単離及び精製の間に、インサイチュウで調製され得る。
用語「ポリヌクレオチド」は、一本又は二本鎖構造のポリヌクレオチド、及びセンス若しくはアンチセンス方向において厳しい条件下で特定のポリ核酸とハイブリダイズする相補的ポリ核酸、並びにその塩基対の少なくとも約６０パーセント、及びより好ましくは共通のその塩基対の７０パーセント、最も好ましくは９０パーセント、及び特別な態様ではその塩基対の１００パーセントにおいて相同であるポリヌクレオチドを意味する。ポリデオキシリボ核酸  及びその合成類似体を含む。該ポリヌクレオチドは、約１０〜約５０００塩基、好ましくは約１００〜約４０００塩基、より好ましくは約２５０〜約２５００塩基の範囲の長さで変化する配列によって記載される。好ましいポリヌクレオチド態様は、約１０〜約３０塩基の長さから成る。ポリヌクレオチドの特別な態様は、約１０〜約２２ヌクレオチドのポリリボヌクレオチド、より一般的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として記載されるものである。別の特別な態様は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修飾された骨格を有する核酸、ポリシロキサン、及び２'-Ｏ-（２-メトキシ）エチルフォスフォロチオエート、又は非天然に生じる核酸残基を含む、若しくはメチル-、チオ−、硫酸−、ベンゾイル−、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの１以上の核酸置換基、又はその検出を促進するためのレポーター分子である。
【００１８】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク様分子、タンパク質ペプチドの画分、及びオリゴペプチドに関連する。
用語「溶媒和物」は、１以上の溶媒分子を有する、本発明において有用な化合物の物理的結合を意味する。この物理的結合は水素結合を含む。場合によって溶媒和物は、例えば１以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子中に組み込まれる場合に単離することができるであろう。「溶媒和物」は、溶液相、及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物は、水和物、エタノレート及びメタノレートを含む。
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
【００１９】
用語「有効量」又は「治療的に有効な量」は、医師若しくは他の臨床医によって診られる対象の生物学的又は医学的反応を引き出すであろう化合物若しくは作用物質の量を意味する。特に、骨関連疾患を治療することに関連して、用語「有効量」は、医師又は他の臨床医によって診られる対象の生物学的若しくは医学的反応を引き出す化合物又は作用物質の量を意味することが意図されている。特に、平均骨密度の全身的又は局所的減少を含む病気を治療することに関連して、用語「有効量」は、生物学的に有意な平均骨密度の減少を引き起こす化合物又は作用物質の効果的な量を意味することが意図されている。
【００２０】
用語「治療すること（treating）」は、進展を防ぐ、又は病状を除去する意思を持って行われる診療、並びにそれによって、障害、又は病気の１以上の症状を含む障害、疾患、又は病気を緩和することを意味する。したがって、「治療」は、治療上の処置、及び予防上（prophylactic）又は予防上（preventative）の措置の両方をさす。治療の必要があるそれらの人々は、該障害が予防されるそれらの人々と同様、すでに該障害を有するそれらの人々も含む。本明細書で使用されるように、関連した用語「治療（treatment）」は、用語「治療すること」が先に定義されているように、障害、症状、疾患、又は病気を治療する行為をさす。
【００２１】
「未分化哺乳動物細胞」は、特殊化の初期段階にある、すなわち細胞がそれらの最終的な機能を未だ有しておらず、かつほとんどの任意の与えられた細胞型を形成するために誘導され得る、多機能性細胞である。特に、これらは特定の骨細胞、骨芽細胞、又は破骨細胞へ未だ分化していない細胞である。そのような多機能性細胞は、脂肪組織から生じた細胞同様、特に血球細胞及び骨髄に存在する細胞である。さらに、間葉前駆細胞へと分化し得る細胞は、例えば全能性幹細胞などの胚幹細胞といった、本発明において検討されている細胞である。
【００２２】
本発明のある態様は、未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する化合物を同定するための方法に関連し、化合物を、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び前記細胞の分化に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。「化合物−ポリペプチド特性」は、当業者によって選択される測定可能な現象である。測定可能な特性は、例えばポリペプチドのペプチドドメインに対する結合親和性、又は骨芽細胞分化の多くの生化学的マーカーレベルの任意の１つのレベルであってもよい。骨芽細胞分化は、例えばアルカリフォスファターゼ、タイプ−1コラーゲン、オステオカルシン、及びオステオポンチンなどの、分化プロセスの間に誘導される酵素のレベルを測定することによって測定され得る。アルカリフォスファターゼ活性は、メチルウンベリフェリルヘプタフォスフェート（ＭＵＰ）溶液（Ｓｉｇｍａ）を細胞へと添加することによって測定され得る。ＡＰ活性によるＭＵＰ基質の切断によって生じる蛍光は、蛍光プレートリーダー（Fluostar, BMG）で測定される。
【００２３】
本発明の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：１９９、２３０、２３７、２６２、及び２８１（表２Ｂ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
当業者の選択次第で、本アッセイ法は一連の測定として機能するためにデザインされてもよく、それらのそれぞれは、薬剤候補化合物が該ポリペプチド上で確かに作用して、それによって未分化細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するするかどうかを決定するためにデザインされる。例えば、化合物のポリペプチド又はそれらの断片への結合親和性を測定するためにデザインされたアッセイは、テスト化合物が対象に投与された場合、平均骨密度を増加させるために有用であり得るかどうかを確かめるために必要であるかもしれないが、十分ではない。それにもかかわらず、そのような結合情報は、溶着したカルシウムの量を測定することによってアッセイされる骨石灰化などの生化学的経路の更なる先で、異なる特性を測定できるアッセイでの使用のためのテスト化合物のセットを同定することにおいて有用である。そのような第２アッセイは、該ポリペプチドに対して結合親和性を有するテスト化合物が、実際に未分化細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するかを確認するためにデザインされてもよい。適切なコントロールは、常に擬陽性の読み込みを防ぐために設けられるべきである。
【００２４】
これらの測定を行う順番は、本発明の実行に対して重要であるとは考えられてはおらず、任意の順番で実行されてよい。例えば、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性に関する情報が知られていない一連の化合物のスクリーニングアッセイが最初に実行されるかもしれない。あるいは、ポリペプチドドメイン又はポリペプチドの阻害剤として同定された一連の化合物に対する結合親和性を有するものとして同定された一連の化合物が選別されるかもしれない。しかしながら、本アッセイが薬剤候補化合物の最終的な使用に有意となるためには、骨アルカリフォスファターゼレベル又は骨石灰化の測定が必要である。コントロールを含む有効性確認研究、及び本発明のポリペプチドへの結合親和性の測定は、それでも任意の治療的又は診断的用途において有用な化合物を同定するのに有用である。
【００２５】
本アッセイ法は、１以上の該ポリペプチド又はそれらの断片を用いて、インビトロの細胞フリーシステムで実行されてもよい。該ポリペプチドを有する該化合物の結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）の使用、ラベルされた化合物（例えば、Scatchard、及びLindmo解析）を用いた飽和結合分析、微分ＵＶ分光光度計、蛍光偏光法、フルオロメトリックイメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー転移、及び生体蛍光共鳴エネルギー転移などの、当業者に既知の方法によって測定され得る。化合物の結合親和性はまた、解離定数（Ｋｄ）で、又はＩＣ５０若しくはＥＣ５０として表現され得る。ＩＣ５０は、別のリガンドがポリペプチドへ結合するのを５０％阻害するのに必要とされる化合物の濃度を表す。ＥＣ５０は、受容体機能を測定する任意のアッセイにおける最大効果の５０％を獲得するために必要とされる濃度を表す。解離定数Ｋｄは、リガンドがポリペプチドへどの程度よく結合するかの測定であり、ポリペプチド上の結合部位の正確に半分を飽和させるのに必要とされるリガンド濃度に等しい。高い結合親和性を有する化合物は、低いＫｄ、低いＩＣ５０値、及び低いＥＣ５０値、すなわち１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲を有し；中程度〜低結合親和性は、高いＫｄ、高いＩＣ５０値、及び高いＥＣ５０値、すなわちマイクロモラー値域に関連する。
【００２６】
本アッセイ法はまた、細胞アッセイにおいて実行してもよい。該ポリペプチドを発現している宿主細胞は、内因性の発現を有する細胞、又は形質導入によって該ポリペプチドを過剰発現している細胞であり得る。該ポリペプチドの内因性発現が、容易に測定され得る基準を決定するのに十分でない場合、当業者は該ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞を使用するかもしれない。そのような細胞アッセイにおいて、該ポリペプチドの生物学的活性は、骨アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）の産生、又は骨石灰化に従って測定されてもよい。
【００２７】
本発明はさらに、未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する化合物を同定するための方法に関連し、以下を含む：
（ａ）化合物を、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；
（ｂ）該ポリペプチドへの該化合物の結合親和性を決定すること；
（ｃ）前記ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の集団を、少なくとも１０マイクロモラーの結合親和性を示す該化合物に接触させること；及び
（ｄ）前記未分化細胞の分化を誘導する該化合物を同定すること。
【００２８】
ハイスループットの目的に対して、化合物のライブラリーは、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレーライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、脂質ライブラリー（BioMol）、合成化合物ライブラリー（例えばＬＯＰＡＣ（商標）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、又は天然化合物ライブラリー（Specs、TimTec）などを使用してもよい。
【００２９】
好ましい薬剤候補化合物は、低分子量化合物である。低分子量化合物、すなわち５００ダルトン又はそれより小さい分子量を有する化合物は、生物学的システムにおいて良好な吸収性及び浸透性を有する可能性が高く、その結果、５００ダルトンより大きい分子量を有する化合物よりも成功する薬剤候補である可能性がより高い。ペプチドは、薬剤候補化合物の別の好ましいクラスを含む。ペプチドはおそらく優れた薬剤候補であり、また稔性ホルモン、及び血小板凝集阻害剤などの、商業的に価値のあるペプチドの多数の例がある。天然化合物は、薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。そのような化合物は、天然資源中に見出されて抽出され、その後合成されることがある。脂質は、薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。
【００３０】
薬剤候補化合物の別の好ましいクラスは抗体である。本発明はまた、本発明の該ポリペプチドの細胞外ドメインに対して指図された抗体を提供する。これらの抗体は、該ポリペプチドの１以上の細胞外ドメインに特異的に結合すべきであり、又はさらに以下で記載されるように、内生的に産生されて、細胞内ポリペプチドドメインに結合するように設計される。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でもよい。本発明は、ＦＡｂ断片及びＦＡｂ発現ライブラリーの産物、並びにＦｖ断片及びＦｖ発現ライブラリーの産物に加えて、キメラの、一本鎖、及びヒト化抗体を含む。
【００３１】
特定の実施態様において、ポリクローナル抗体を、本発明の実施において使用してもよい。当業者は、ポリクローナル抗体の調製法を知っている。ポリクローナル抗体は哺乳動物内において、例えば１以上の免疫剤、及び所望ならばアジュバントの注入によって、抗体価を上げることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを、複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注入するであろう。また、抗体を、無傷のタンパク質若しくはポリペプチド又はその細胞外ドメインペプチドなどの断片、複合体を含む誘導体、又は細胞膜内に埋め込まれたポリペプチドなどのタンパク質若しくはポリペプチドの他のエピトープ、又はファージディスプレーライブラリーなどの抗体可変領域のライブラリーに対して生産してもよい。
【００３２】
免疫剤と、免疫された該哺乳動物における免疫原性であることが知られたタンパク質とを結合することは有用であるかもしれない。そのような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシン阻害剤を含むが、それらに限定されない。使用してもよいアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント、及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノフォスフォリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。不適切な実験を行わない当業者は、おそらく免疫プロトコルを選択するであろう。
【００３３】
いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体を、当業者に既知の方法を使用して調製してもよい。本発明のモノクローナル抗体は、抗体への免疫反応が高まることから宿主を防ぐために「ヒト化された」ものであってよい。「ヒト化抗体」は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び／又は軽可変ドメイン骨格及び／又は重可変ドメイン骨格は非ヒト免疫グロブリンに由来するが、分子の残りの部分は１以上のヒト免疫グロブリンに由来する抗体である。ヒト化抗体はまた、ドナー又はアクセプター非修飾軽鎖若しくはキメラの軽鎖に関連する、ヒト化重鎖によって特徴付けられる抗体を含み、逆に後者が前者を含む。抗体のヒト化は、当業者に既知の方法によって達成されてよい（例えば、Mark及びPadlan, (1994)「４章．モノクローナル抗体のヒト化」、『実験薬理学のハンドブック』  １１３巻、Springer-Verlag、New Yorkを参照されたい）。トランスジェニック動物を使用して、ヒト化抗体を発現させてもよい。
【００３４】
また、ヒト抗体を当業者に周知の様々な技術を用いて産生することができ、ファージディスプレーライブラリー（Hoogenboom及びWinterの論文(1991) J. Mol.  Biol. 227:381-8; Marksらの論文(1991). J. Mol. Biol.  222:581-97）を含む。Coleら、及びBoernerらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Coleらの論文(1985) モノクローナル抗体、及びガン治療、Alan R.  Liss, p.  77; Boernerらの論文(1991).  J.  Immunol., 147(1):86-95）。
【００３５】
一本鎖抗体の産生のための当業者に既知の技術を適合させて、本発明のポリペプチド及びタンパク質への一本鎖抗体を産生させることができる。該抗体は一価抗体であってよい。一価抗体の調製法は、当業者に周知である。例えば、ある方法は、免疫グロブリン軽鎖、及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖の架橋結合を防ぐために、一般的にＦｃ領域の任意の点で先端を切断する。あるいは；関連するシステイン残基を、別のアミノ酸残基を用いて置換し、又は架橋結合を防ぐために削除する。
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なった抗原、及び好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体若しくは受容体サブユニットに対する結合特異性を有する、好ましくはヒトの又はヒト化モノクローナル抗体である。
【００３６】
二重特異性抗体を作成する方法は、当業者に既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産物は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいている（Milstein及びCuelloの論文(1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖がランダムに組み合わせられるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なった抗体分子の潜在的混合物を産生し、それらのうちの１つだけが、正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィー段階は、正しい分子の精製を通常達成する。同様の手順は、Trauneekerらの論文(1991) EMBO J. 10:3655-9において開示されている。
【００３７】
別の好ましい実施態様に従って、アッセイ法は、１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有するものとして同定された薬剤候補化合物を使用することを含む。
本発明はさらに、アンチセンスポリヌクレオチドからなる群から選択される、未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する作用物質、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関連し、前記作用物質は、配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。好ましい実施態様において、該作用物質は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択され、前記作用物質は、配列番号：１９９、２３０、２３７、２６２、及び１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。
【００３８】
前記作用物質のある実施態様は、配列番号：８３〜１９３を含む核酸に対してアンチセンスである核酸である。好ましくは、該作用物質は配列番号：８３、１１４、１２１、１４６、及び１６５を含む核酸に対してアンチセンスである核酸である。例えば、アンチセンス核酸（例えば、ＤＮＡ）を、インビトロで細胞へと導入し、又は配列番号：７８〜１９３、好ましくは配列番号：１９９、２３０、２３７、２６２、及び２８１を含む核酸の細胞発現を阻害するための遺伝子治療として、インビボで対象へ投与してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは約１７〜約１００ヌクレオチド、及びより好ましくは約１８〜約３０ヌクレオチドから構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む配列を含む。アンチセンス核酸は、逆向きに発現する、配列番号：７８〜１９３の配列から選択される約１０〜約３０の連続的なヌクレオチドから調製してもよい。
【００３９】
前記アンチセンス核酸は、好ましくはオリゴヌクレオチドであり、デオキシリボ核酸、修飾されたデオキシリボヌクレオチド、又は両方のいくつかの組み合わせにみから構成されてもよい。該アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドであり得る。該オリゴヌクレオチドを化学的に修飾し、所望であれば安定性及び／又は選択性を向上させてもよい。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによる分解の影響を受けやすいので、該修飾は、例えば、硫黄基を使用して、リン酸ジエステル結合の遊離酸素原子を置換することを含み得る。この修飾は、フォスフォロチオエート結合と呼ばれる。フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性、ポリアニオン性及び内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性である。さらに、フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがその標的部位にハイブリダイズした場合、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖は、該ハイブリッド分子のｍＲＮＡ成分を切断する、内因性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを活性化する。
【００４０】
さらに、フォスフォアミダイト（phosphoramidite）及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に対して高度に抵抗性であるべきである。その上、化学基を、該糖部分の２´炭素、及びピリミジンの５炭素（Ｃ−５）に付加して安定性を増加して、及びその標的部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進し得る。修飾は、当業者に既知の他の修飾同様、２´−デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシフォスフォロチオエート、修飾塩基を含んでもよい。
【００４１】
本発明のポリペプチドのレベルを減らす発現阻害作用物質の別の型は、リボザイムである。リボザイムは、別々の触媒及び基質結合ドメインを有する触媒ＲＮＡ分子（ＲＮＡ酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性、及び場合によりその標的配列と相互作用する非水素結合によって結合する。触媒部分は、特異的部位で標的ＲＮＡを切断する。リボザイムの基質ドメインは、それが特定のｍＲＮＡ配列に向くように設計することができる。リボザイムは認識し、それから相補的塩基対を介して標的ｍＲＮＡに結合する。いったん正しい標的部位に結合すると、リボザイムは酵素的に作用して、標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイムによるｍＲＮＡの切断は、対応するペプチドの合成を指示するためのｍＲＮＡの能力を破壊する。いったんリボザイムがその標的配列を切断すると、ｍＲＮＡは放出され、繰り返し他のｍＲＮＡに結合し、切断することができる。
【００４２】
リボザイムの形態は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ肝炎ウイルスモチーフ、グループＩイントロンモチーフ、又はＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連して）モチーフ、若しくはアカパンカビ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフを含む。ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有するリボザイムは、これらの触媒ＲＮＡ分子が真核生物プロモータから細胞内で発現され得るために、容易に調製される（Chenらの論文(1992) Nucleic Acids Res.  20:4581-9）。本発明のリボザイムは、適切なＤＮＡベクターから真核生物細胞内で発現され得る。所望ならば、該リボザイムの活性を、２番目のリボザイムによる一次転写産物からのリボザイムの放出によって増強してもよい（Venturaらの論文  (1993) Nucleic Acids Res.  21:3249-55）。
【００４３】
リボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドを転写後の標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列の側面のリボザイム触媒ドメイン（２０ヌクレオチド）と結合させることによって、化学的に合成してもよい。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結合配列をプライマーとして使用することによって増幅される。該増幅産物は、真核性の発現ベクター内にクローン化する。
【００４４】
リボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はウイルスベクターに挿入された転写単位から発現される。該リボザイム配列の転写は、真核性ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ（Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ））に対するプロモータから駆動される。ｐｏｌＩＩプロモータ又はｐｏｌＩＩＩプロモータからの転写は、全ての細胞内において高レベルで発現されるであろう；所与の細胞型における、所与のｐｏｌＩＩプロモータのレベルは、近傍の遺伝子制御配列次第であるだろう。適切な細胞内で原核的ＲＮＡポリメラーゼ酵素が発現されるのであれば、原核的ＲＮＡポリメラーゼプロモータもまた使用される（Gao及びHuangの論文、(1993) Nucleic Acids Res.  21:2867-72）。これらのプロモータから発現したリボザイムは、哺乳動物細胞内で機能し得ることが示されている（Kashani-Sabetらの論文(1992) Antisense Res.  Dev.  2:3-15）。
【００４５】
特に好ましい阻害作用物質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、抑制されたＲＮＡに対する配列に相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子抑制の転写後過程を仲介する。本発明に従ったｓｉＲＮＡは、配列番号：７８〜１９３、好ましくは配列番号：８３、１１４、１２１、１４６、及び１６５に記載される配列の群から選択される、連続した１７〜２５ヌクレオチド配列に相補的な又は相同なセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な１７〜２３のアンチセンス鎖を含む。最も好ましいｓｉＲＮＡは、互いにかつ標的ヌクレオチド配列に１００パーセント相補的である、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡはさらに、センス鎖及びアンチセンス鎖を連結するループ領域を含む。
【００４６】
本発明に従った自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ループ領域リンカーによって結合されるセンス部分及びアンチセンス部分を含む。好ましくは、ループ領域配列は、４〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは５〜１５ヌクレオチド長、及び最も好ましくは８ヌクレオチド長である。最も好ましい実施態様において、リンカー配列は、配列番号３１０によって特定されるように、GTTTGCTATAACである。自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡはヘアピンを形成し、普通のｄｓＲＮＡよりもより安定である。さらにそれらは、より容易にベクターから産生される。
【００４７】
ｓｉＲＮＡはアンチセンスＲＮＡに類似であるため、ｓｉＲＮＡを修飾して、核酸分解への抵抗性を確認、又は活性を増大、若しくは細胞内分布を促進させることができ、そのような修飾は、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖、及び／又はｓｉＲＮＡを１以上の部分又は複合体に連結する化学的結合を含んでもよい。該ヌクレオチド配列は、これらのｓｉＲＮＡをデザインする基準に適合しないヌクレオチド配列に比較して標的配列の改善された減少を与える、ｓｉＲＮＡデザイン基準に従って選択される（これらの基準の議論及びｓｉＲＮＡの調製の例は、２００４年１１月４日に公開されたＷＯ２００４０９４６３６、及びＵＡ２００３０１９８６２７であり、これらは引用により本明細書に組み込まれる。）。
【００４８】
本発明はまた、組成物、及び該組成物を使用した方法に関連し、該組成物は未分化細胞の分化を骨芽細胞へと誘導することができるポリヌクレオチドを発現することができるＤＮＡ発現ベクター及び発現阻害作用物質として先に記載されたものを含む。
発現阻害作用物質を発現するポリヌクレオチドは、好ましくはベクター内に含まれる。ポリ核酸は、核酸配列の発現を可能にするシグナルに操作可能であるように結合され、またいったんベクターが細胞に導入されると、好ましくはアンチセンス核酸を発現する組換えベクター構築を利用する細胞へと導入される。アデノウイルスベクターシステム、レトロウイルスベクターシステム、アデノ随伴ウイルスベクターシステム、レンチウイルスベクターシステム、ヘルペス単純ウイルスベクターシステム、又はセンダイウイルスベクターシステムを含むウイルスに基礎を置いた様々なシステムが利用でき、かつその全てのシステムを使用して、標的細胞内で発現阻害作用物質に対するポリヌクレオチド配列を導入及び発現させてもよい。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法において用いられるウイルスベクターは、複製欠損型である。そのような複製欠損型ウイルスは通常、感染細胞においてウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を有する。これらの領域は（全体的に又は部分的に）削除するか、又は当業者に既知の任意の技術で非機能的にすることができる。これらの技術は、完全削除、置換、一部の削除、又は（複製に）必須な領域への１以上の塩基の付加を含む。そのような技術は、インビトロ（単離されたＤＮＡ上）又はインサイチュウで、遺伝子操作の技術を使用して、若しくは突然変異誘発物質を用いた処理によって実行してもよい。好ましくは、複製欠損型ウイルスは、ウイルス粒子をカプシドで包むために必要なそのゲノム配列を保持する。
【００５０】
好ましい実施態様において、ウイルス性成分はアデノウイルスに由来する。好ましくは、媒体はアデノウイルスカプシド中に包まれたアデノウイルスベクター又は機能的部分、誘導体、及び／又はそれらの類似体を含む。アデノウイルスの生物学はまた、分子レベルで比較的よく知られている。アデノウイルスベクター用の多くの道具が発達し続けてきており、それゆえ本発明のライブラリーに組み込むのに好ましい媒体であるアデノウイルスカプシドを形成する。アデノウイルスは、幅広い種類の細胞に感染することができる。しかしながら、異なったアデノウイルス血清型は、細胞に対して異なった選好を有する。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスカプシドが入ることができる標的細胞集団を集約しかつ拡大させるには、媒体は少なくとも２つのアデノウイルスからのアデノウイルス線維タンパク質を含む。
【００５１】
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスの後期タンパク質又は機能的部分、誘導体、及び／又はそれらの類似体をコードする核酸を含む。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス線維タンパク質を有利に利用して、特定の細胞へ媒体を標的化する、又は細胞への該媒体の輸送の向上を誘起してもよい。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスカプシド全体又は機能的部分、類似体、及び／又はそれらの誘導体の形成を可能にして、本来の全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードする。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスＥ２Ａ又は機能的部分、誘導体、及び／又はそれらの類似体をコードする核酸を含む。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、細胞内の核酸に由来するアデノウイルスの複製を少なくとも部分的に促進する、少なくとも１つのＥ４領域タンパク質又は機能的部分、誘導体、及び／又はそれらの類似体をコードする核酸を含む。本明細書の実施例に使用されるアデノウイルスベクターは、治療発明の現行方法において有用なベクターの典型である。
【００５２】
本発明の特定の実施態様は、レトロウイルスベクターシステムを使用する。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組み込みウイルスであり、それらの構築は当業者に既知である。レトロウイルスベクターは、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、及びフレンドウイルスなどの、異なった型のレトロウイルスから構築され得る。また、レンチウイルスベクターシステムは、本発明の実行において使用されてもよい。レトロウイルスシステム及びヘルペスウイルスシステムは、神経細胞のトランスフェクションに好ましい媒体であろう。
【００５３】
本発明の他の実施態様において、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）を利用する。ＡＡＶウイルスは、安定的かつ部位特異的様式で感染細胞のゲノム中へと組み込まれる、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。ＡＡＶウイルスは細胞の成長、形態、又は分化においてどのような影響をも誘導せずに幅広い範囲の細胞に感染することができ、かつ人体病理学に関与していないようである。
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド作用物質を１以上の制御領域に結合させてもよい。適切な制御領域の選択は、一般的な当業者のレベル内で決まりきった問題である。制御領域はプロモータを含み、エンハンサー、サプレッサーなどを含んでもよい。
【００５４】
本発明の発現ベクターに使用してもよいプロモータは、構成的プロモータ及び制御（誘導性）プロモータの両方を含む。該プロモータは、宿主次第で原核的又は真核的であってよい。原核的（バクテリオファージを含む）プロモータの中で、本発明の実行において有用なのは、ｌａｃプロモータ、ｌａｃＺプロモータ、Ｔ３プロモータ、Ｔ７プロモータ、ラムダ（lambda）P.sub.rプロモータ、P.sub.1プロモータ、及びｔｒｐプロモータである。真核的（ウイルス性を含む）プロモータの中で、本発明の実行において有用なのは、普遍的プロモータ（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモータ（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモータ（例えば、ＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子）、組織特異的プロモータ（例えば、平滑筋細胞におけるアクチンプロモータ、又は内皮細胞において活性なＦｌｋプロモータ及びＦｌｋプロモータ）であり、組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において使用されている動物の転写制御領域を含み：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftらの論文(1984) Cell 38:639-46；Ornitzらの論文(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonaldの論文(1987) Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahanの論文(1985) Nature 315:115-22）、リンパ球様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlらの論文(1984) Cell 38:647-58；Adamesらの論文(1985) Nature 318:533-8；Alexanderらの論文(1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44）、睾丸、乳房、リンパ球及びマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Lederらの論文(1986) Cell 45:485-95）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertらの論文(1987) Genes and Devel. 1:268-76）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufらの論文(1985) Mol. Cell. Biol., 5:1639-48；Hammerらの論文(1987) Science 235:53-8）、該肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyらの論文(1987) Genes and Devel., 1: 161-71）、骨髄性細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域（Mogramらの論文(1985) Nature 315:338-40；Kolliasらの論文(1986) Cell 46:89-94）、脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadらの論文(1987) Cell 48:703-12）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Saniの論文(1985) Nature 314.283-6）、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonらの論文 (1986) Science 234:1372-8）。
【００５５】
本発明の実行において使用してもよい他のプロモータは、分裂細胞において選択的に活性化されるプロモータ、刺激に応答するプロモータ（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御性転写モジュレータ、サイトメガロウイルス前初期プロモータ、レトロウイルスＬＴＲプロモータ、メタロチオネインプロモータ、ＳＶ−４０プロモータ、Ｅ１ａプロモータ、及びＭＬＰプロモータを含む。
【００５６】
さらなるベクターシステムは、患者へのポリヌクレオチド作用物質の導入を促進する非ウイルス性システムを含む。例えば、所望の配列をコードするＤＮＡベクターは、リポフェクションによってインビボで導入され得る。リポソーム仲介トランスフェクションで直面する困難を制限するためにデザインされた合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる（Felgnerらの論文(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7）；Mackeyらの論文(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31；Ulmerらの論文(1993) Science 259:1745−8を参照されたい）。カチオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸の封入を促進し、また負に荷電した細胞膜との融合を促進することもある（Felgner及びRingoldの論文(1989) Nature 337:387-8）。核酸の運搬において特に有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許公報ＷＯ９５／１８８６３及びＷＯ９６／１７８２３、並びに米国特許第5,459,127号に記載されている。インビボで特定の組織に外来遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用はある程度の実用的利点を有し、特定の細胞型へトランスフェクションを方向づけることは、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳などの細胞の不均質性を有する組織中で特に有利になるであろう。脂質は、標的化の目的で他の分子と化学的に連結されてもよい。例えば、ホルモン又は神経伝達物質などの標的化ペプチド及び、例えば抗体などのタンパク質、又は非ペプチド分子は、おそらく化学的にリポソームと連結され得る。他の分子もまたインビボでの核酸のトランスフェクションを促進するために有用であり、例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公報ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公報ＷＯ９６／２５５０８）、又はカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公報ＷＯ９５／２１９３１）である。
【００５７】
インビボで、裸のＤＮＡプラスミドとしてＤＮＡベクターを導入することもまた可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号、及び第５，５８０，８５９号を参照されたい）。治療目的の裸のＤＮＡベクターは、当業者に既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞内へと導入され得る（例えば、Wilsonらの論文(1992) J. Biol. Chem. 267:963-7；Wu及びWuの論文(1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4；Hartmutらの１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Williamsらの論文(1991).  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照されたい）。受容体仲介ＤＮＡ輸送アプローチもまた使用することができる（Curielらの論文(1992) Hum. Gene Ther.  3:147-54、Wu及びWuの論文(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32）。
【００５８】
さらに本発明が提供するのは、医薬として許容し得るキャリアーとの混合剤中で、先に記載されているような治療的に有効量の薬剤を含む、骨形成を向上させる医薬組成物である。別の好ましい実施態様は、平均骨密度の全身的又は局所的減少、若しくその病気に対する脆弱性を伴う病気の治療用又は予防用の医薬組成物であって、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物において、骨形成能向上に有効量の本発明のポリペプチドの拮抗剤又は逆作動薬、及び／又はそれらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物又はプロドラッグを含む。
【００５９】
医薬組成物は、固体、液体、ゲル、又は他の形態の組成物であってもよく、本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び抗体は、例えば、生物学的活性を生じさせることができる形態の活性型形態として維持される。例えば本発明の化合物は、ポリペプチド上で逆作動薬又は拮抗薬活性を有するであろう；核酸は、複製、伝達内容を翻訳、又はポリペプチドの相補的ｍＲＮＡに対してハイブリダイズすることができるであろう；ベクターは、先に記載されたように、標的細胞にトランスフェクトされ、そしてアンチセンス、抗体、リボザイム、又はｓｉＲＮＡを発現することができるであろう；抗体は、ポリペプチドドメインに結合するであろう。
【００６０】
そのような組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、皮下及び眼球内経路による投与のために処方され得る。非経口投与は、静脈注射、筋肉内注射、動脈内注射、又は注入技術を含むことを意味する。組成物は、標準の、よく知られた非毒性の生理的に許容し得るキャリアー、アジュバント、及び所望の賦形剤を含む用量単位剤形で、非経口的に投与されてもよい。
【００６１】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当業者によく知られた医薬として許容し得るキャリアーを用いることで処方され得る。そのようなキャリアーは、患者による摂取のために、該医薬組成物が、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。経口使用用途の医薬組成物を、所望であれば適切な補助剤を付加した後に、活性化合物を固体賦形剤と混ぜ合わせること、生じた混合物を任意で粉にすること、そして顆粒の混合物を加工することによって調製し、錠剤又は糖衣錠の核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールなどの糖；トウモロコシ、小麦、米、ポテト、又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビア及びトラガカントを含むゴム；及び、ゼラチン並びにコラーゲンのようなタンパク質などの炭水化物又はタンパク質充填剤である。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤又は可溶化剤を添加してもよい。糖衣錠の核は、濃縮糖溶液などの適切な被覆剤と併用で使用してもよく、また被覆剤はアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含んでもよい。染料又は色素を製品識別のために錠剤又は糖衣錠の被覆に添加し、あるいは活性化合物の量すなわち用量を特徴付けてもよい。
【００６２】
経口的に使用され得る医薬製剤は、ゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの被覆剤でできた軟らかい密封型のカプセルのみならず、ゼラチンから作られた押し込み型のカプセルを含む。押し込み型のカプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤若しくは結合剤と混ぜ合わされた活性成分、滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意に安定剤を含み得る。軟らかいカプセルにおいて、活性化合物を、脂肪油、液体、又は安定剤を含む又は含まない液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁してもよい。
【００６３】
好ましい無菌の注入可能な製剤は、非毒性の経口的に許容し得る溶媒又は希釈剤中で、溶液若しくは懸濁液であることができる。医薬として許容し得るキャリアーの例は、生理食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム又は塩化マグネシウム、若しくはそれらの塩の混合物）、リンガー溶液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせであり、１，３−ブタンジオール及び滅菌された不揮発性油は、溶媒又は懸濁溶剤として都合よく使用される。任意の無刺激性の不揮発性油は、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含んで使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注入物質の調製に使用する。
【００６４】
組成物溶剤もまたヒドロゲルであり得、ヒドロゲルは薬剤吸収スポンジとして作用することができる親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの任意の生体適合性又は非細胞毒性のホモポリマー若しくはヘテロポリマーから調製される。特に、エチレン及び／又はプロピレン酸化物から得られるヒドロゲルなどの特定のヒドロゲルは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科的介入時に治療すべき組織の表面上に溶着することができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド阻害作用物質をコードする複製欠損型組換えウイルスベクター及びポロクサマーなどのトランスフェクションエンハンサーを含む。ポロクサマーの例はポロクサマー４０７であり、これは市販されており（BASF, Parsippany, N.J.）、また非毒性かつ生体適合性を有するポリオールである。組換えウイルスに含浸されたポロクサマーを、例えば外科的介入時において治療すべき組織の表面上に直接的に溶着させてもよい。ポロクサマーは、低い粘度を有してはいるが、ヒドロゲルと同じ利点を本質的に有する。
【００６６】
また活性発現阻害作用物質を、コロイド薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロエマルジョン内で、例えば界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリル樹脂）マイクロカプセル中にそれぞれ封入してもよい。そのような技術は、『レミングストンの薬学』 (1980)第１６版、Osol, A.  Edにおいて開示されている。
【００６７】
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の適切な例は抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは例えばフィルム、又はマイクロカプセルの造形品の形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル樹脂）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（酪酸−グリコール酸コポリマー、及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）などの分解性酪酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。酢酸エチレン−ビニル、及び酪酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間以上にわたって分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。封入された抗体が長時間にわたって体内で保持される場合、それらは３７℃で水分に曝された結果として変性又は凝集することがあり、結果として生物学的活性の損失及び免疫原性の変化が起こる可能性がある。関係する機構次第で、安定化を図るための合理的な方法を考案することができる。例えば、該凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子内Ｓ−Ｓ結合形成ものであることが発見されたならば、スルフヒドリル基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の調節、適切な添加剤の使用、及び特異的なポリマーマトリクス組成物の開発によって安定化を図ってもよい。
【００６８】
先に記載されたように、治療的に有効な用量と、症状又は病気を改善させるタンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド又はその抗体、作動薬若しくは拮抗薬の量を意味する。そのような化合物の治療的効果及び毒性は、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）などの、培養細胞又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表現することができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。培養細胞アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトが使用する用量の範囲を策定することに使用される。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどない又は毒性が全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用された剤形、患者の脆弱性、及び投与経路次第でこの範囲内において変化する。
【００６９】
どんな化合物であっても、治療的に有効な投与量を、培養細胞アッセイ、又は通常マウス、ウサギ、イヌ、又はブタである動物モデルのどちらかで始めに概算することができる。また、動物モデルは、投与の好ましい濃度範囲及び経路を達成するために使用される。そのような情報をそれから、ヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定するために使用することができる。正確な投与量は、治療される患者を考慮してそれぞれの医師によって決定される。用量及び投与は、活性部分の十分なレベルを提供するため又は目的の効果を維持するために調整される。考慮されてもよい付加的な因子は、疾患状態の重症度、年齢、体重、及び患者の性別；食事、治療の好ましい継続期間、投与方法、投与回数、及び頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応性を含む。長時間作用型の医薬組成物を、半減期、及び特定の製剤の除去率次第で、３〜４日毎、毎週、又は２週に１回投与してもよい。
【００７０】
本発明に従った医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与してもよい。医薬組成物は、直接標的組織に加えても、カチオン性脂質と複合体を形成させても、リポソーム内に封入しても、あるいは当業者に既知の他の方法によって標的細胞へと輸送してもよい。所望の組織への局所的投与は、カテーテル、輸液ポンプ、又はステントによって行ってもよい。ＤＮＡ、ＤＮＡ／賦形剤複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位へ局所的に投与される。代替輸送経路は、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤又は丸薬形態）、局所的、全身的、眼球、腹腔内及び／又は髄腔内輸送を含むが、これらに限定されない。リボザイムの輸送及び投与の例は、SullivanらのＷＯ９４／０２５９５において提供されている。
【００７１】
本発明に従った抗体は、ボーラスのみとして輸送、経時的注入、あるいはボーラスとして投与と経時的注入の両方を行ってもよい。当業者はおそらく、タンパク質に使用するのとは異なる処方をポリヌクレオチドに使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド、又はポリペプチドの輸送は、特定の細胞、病気、場所などに特異的であろう。
先に議論されたように、組換えウイルスを用いて、本発明において有用なポリヌクレオチド作用物質をコードするＤＮＡを導入してもよい。本発明に従った組換えウイルスは、通常約１０．ｓｕｐ．４〜約１０．ｓｕｐ．１４  ｐｆｕの間の用量の形態で処方及び投与する。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、約１０．ｓｕｐ．６〜約１０．ｓｕｐ．１１  ｐｆｕの用量が好ましく用いられる。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）は、ウイルス粒子の懸濁液の感染力に対応し、適切な培養細胞に感染させ、そして形成されたプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は、先行技術おいてかなり報告されている。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う疾患を治療又は予防する方法に関連し、本明細書に記載されているように、骨形成を増進する医薬組成物を前記対象へ投与することを含む。
本発明はまた、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う疾患の治療又は予防用薬物の調製のための、先に記載したような薬剤の使用に関連する。
本発明の好ましい実施態様において、疾患は、骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、多発性骨髄腫症、副甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される。本発明の特別な実施態様は、該疾患が骨粗鬆症である場合の方法である。
【００７３】
さらに本発明の別の態様は、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う病気又は患者の病気に対する脆弱性を診断するための方法に関連し、生物学的サンプルにおいて配列番号：１９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を決定すること、及び該量と健康な対象におけるポリペプチドの量を比較することを含み、健康な対象と比較したポリペプチドの量の増加は病気の存在の指標となる。
好ましくは、該病気は、骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、多発性骨髄腫症、副甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される。より好ましくは、該病気は、骨粗鬆症である。
【００７４】
本明細書に記載される方法において使用される本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを、溶液中で遊離、固体支持体に付加、細胞表面上に輸送、又は細胞内に配置してもよい。諸方法を実行するのに、アッセイの自動化を行うことに加えて、本発明のポリペプチド又は化合物の一方を固定して、ポリペプチドの複合体でない形態から複合体の分離を促進することは、実現可能である。本発明のポリペプチドと化合物との相互作用（例えば、結合すること）は、反応物質を収容するのに適切な任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、テストチューブ、及び微小遠心管を含む。ある実施態様において、ポリペプチドがマトリクスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、本発明のポリペプチドを「Ｈｉｓ」と標識し、その後Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレート上に吸着させることができる。あるいは本発明のポリペプチドを有するＰｒｏｔＡ融合体をＩｇＧへ吸着させることができ、次に該ＰｒｏｔＡ融合体を細胞溶解物（例えば、（３５）Ｓでラベルされた）及び候補化合物、並びに複雑な構造に有益な状況下（塩及びｐＨに対する生理的条件）でインキュベートされた混合物と混合する。インキュベートに続いて、該プレートを洗浄して任意の結合していないラベルを除去し、マトリクスを固定する。放射能の量は直接、又は該複合体の解離後の上清において決定することができる。あるいは、該複合体を該マトリクスから解離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、本発明のタンパク質に結合しているタンパク質のレベルを、標準的な電気泳動技術を用いたゲルから定量することができる。
【００７５】
マトリクス上にタンパク質を固定化するための他の技術もまた、化合物を同定するための方法において使用することができる。例えば、本発明のポリペプチド又は化合物のどちらかは、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定することができる。本発明のビオチン化されたタンパク質分子は、当業者によく知られた技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製することができ、かつストレプトアビジンで被覆された９６ウエルプレート（Pierce Chemical）のウエル中に固定することができる。あるいは、本発明のポリペプチドに反応性であるが、該化合物への該ポリペプチドの結合を妨げない抗体は、該プレートのウエルに誘導体化することができ、本発明のポリペプチドは、抗体結合によってウエル中に捕捉することができる。先に記載したように、ラベルされた候補化合物の調製は、本発明のポリペプチドを提示しているプレートのウエル中でインキュベートされ、該ウエル中に捕捉された複合体の量は測定することができる。
【００７６】
本発明の配列番号：１〜７７のポリヌクレオチドは、骨芽細胞分化を増進させることが明らかにされてきた。
したがって、本発明の別の実施態様は骨組織のインビトロ産生に対する方法に関連し、哺乳動物の未分化細胞を骨芽細胞へと分化させるために十分な時間で、配列番号：１〜７７からなる群から選択され、好ましくは配列番号：６９〜７７からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列に接触する工程と、それによって継続的に骨マトリクスを産生する工程を含む。
好ましい実施態様において、方法は以下の工程を含む：
（ａ）未分化哺乳動物細胞を基質上に加えて細胞基質を形成すること、
（ｂ）未分化哺乳動物細胞を骨芽細胞へと分化させるために十分な時間で、配列番号：１〜７７からなる群から選択され、好ましくは配列番号：６９〜７７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列、又はベクターを導入し、それによって継続的に骨マトリクスを産生すること。
【００７７】
本発明はそれゆえ、基質上で成長するマトリクスを有する基質の産生方法を提供し、基質は人工股関節、膝関節、及び指関節などの人工関節、及び人工歯根などの顎顔面移植物を含む耐力移植物の提供に用いることができる。また基質は、スペーサー、又は骨充填剤などの特定の外科装置に使用することができ、かつ骨欠損、並びに損傷を受けた又は失われた骨の増強、除去、再構成に使用することができる。骨形成は、誘導的及び導電的プロセスの両方による石灰化の変化によって最適化することができる。
【００７８】
記載されたようなマトリクスを含む骨充填剤を有する耐力移植物（好ましくは先に記載されたようなマトリクスで被覆された）の提供の組み合わせは、本発明に従った有利な方法を構成する。
本発明の方法はまた、改正手術、すなわち、以前の外科装置を交換しなければならない場合に関連して非常に適している。
適切な未分化細胞は骨髄細胞であり、造血細胞、及び具体的には間質細胞を含む。骨髄細胞、特に間質細胞は、それらの本来の環境から採られた場合、骨産生過程において非常に効果的であることがわかっている。
【００７９】
未分化細胞を基質上に直接的に加えることができ、又はそれらを基質上に付加する前に、基質の不在下で有利に増殖させることができる。後者の様式において、該細胞は増殖後、依然として大部分が未分化であり、かつ本発明の目的で、それらはやはり未分化として参照される。続いて、該細胞は分化可能となる。分化は、グルココルチコイド及びデキサメタゾンなどの適切な誘導剤の存在によって誘導又は増進することができる。分化に特に適した誘導剤は、本発明の発現阻害剤である。
【００８０】
未分化細胞の使用は、いくつかの利点を提供する。第一に、それらの分化が少なめであることは増殖速度がより速いことを示唆し、最終的な機能性がより方向付けられかつ制御されることを可能にする。その上、これらの培養細胞は、有機及び無機成分を含む所要の骨マトリクスを産生するのみならず、培地及びマトリクス中で、組織の成長、及び現存する生組織への適応に必須ないくつかの因子の存在を結果的に生じる。また、該培地は、成長因子などの活性因子の供給源であり得、移植過程に関連して使用される。さらに、そのような未分化細胞はしばしば大量に利用可能であり、例えば、成熟骨細胞よりもより便利であり、回復中により低い死亡率を示す。その上、未分化細胞は、移植が意図されている患者から獲得することができる。これらの未分化細胞から生じた骨は該患者に対して自系であり、それゆえ免疫反応を誘導しない。１００μｍより厚いマトリクスは、未分化細胞の使用の結果として産生され得る。
【００８１】
未分化細胞がその上に加えられ培養された基質は、チタン、コバルト／クロム合金、又はステンレス鋼などの金属、リン酸カルシウムなどの生物活性表面、ポリエチレンなどのポリマー表面、及びそれらのようなものであり得る。それほど好ましくはないが、ガラスセラミックなどのケイ酸含有材料もまた、基質として用いることができる。最も好ましいのは、チタン、及びリン酸カルシウムのような金属であるが、リン酸カルシウムは該基質に必須な構成要素ではない。基質は、多孔性又は非多孔性であってもよい。未分化細胞は、例えば、ｃｍ２当たり１０３〜１０６、特にｃｍ２当たり１０４〜２×１０５細胞の割合で適用され得る。
【００８２】
本発明に従った方法において使用すべき培地は、ＭＥＭ（最小必須培地）などの一般的に知られた培地であり得る。都合よく、該培地は馴化培地であり得る。このような状況において、馴化培地は、その中に類似した細胞を予めインキュベートして、培地に細胞成長及び細胞分化のために重要な該細胞によって分泌されたポリペプチドなどの因子を含ませた培地であると理解される。
【００８３】
前記細胞は十分な時間培養され、例えば少なくとも０．５μｍ、具体的には１〜１００μｍ、より具体的には１０〜５０μｍの厚さを有するマトリクス層を産生する。該細胞を、例えば２〜１５週間、より具体的には４〜１０週間、培地に接触させてもよい。
前記マトリクスの産生は、マトリクスを基質上に付加した場合、基質の表面積の少なくとも５０％、特に少なくとも８０％を覆う連続的又は準連続的被覆を生じる。
本発明はさらに上記方法によって得ることができる骨芽細胞に関連する。
本発明はさらに下記の図、及び実施例で説明される。
【実施例】
【００８４】
（実施例）
（実施例１．内因性アルカリフォスファターゼの検出のためのハイスループットスクリーニング法の開発）
（アッセイの原理）
適切な因子（例えばＢＭＰ２）の存在下で、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）を決定し、骨芽細胞へと分化させる。そのような因子をスクリーニングするためのアッセイは、骨芽細胞分化プログラムにおける初期マーカーであるアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）酵素の活性をモニタリングすることによって発達した。諸ＭＰＣを３８４ウエルプレート中にまき、ヒトコクサッキー受容体及びアデノウイルス受容体（ｈＣＡＲ；Ａｄ−ｈＣＡＲ）並びにＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔ（商標）コレクションからの個々のｓｉＲＮＡアデノウイルス（Ａｄ−ｓｉＲＮＡ）をコードするアデノウイルスを用いて、１日後に同時に共感染させた。ＡｄＣ１５−ｈＣＡＲ／ＡｄＣ２０−ｈＣＡＲ共感染は、ＡｄＣ０１−ｓｉＲＮＡ感染効率を増加させる。細胞性ＡＰ活性は、感染の開始後１３日目（１３ｄｐｉ）に決定した。図２は、本アッセイの原理を描いている。
【００８５】
（アッセイの開発）
ＭＰＣを、インフォームドコンセント（Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Belgium）後に得られた健康なボランティアの骨髄から単離した。
一連の３８４ウエルプレートにおいて実行した実験において、いくつかのパラメータ：細胞播種密度、コントロールウイルス（Ａｄ−ＢＭＰ２又はＡｄ−ｅＧＦＰ）の感染の多重度（ＭＯＩ）、Ａｄ−ｈＣＡＲのＭＯＩ、感染の継続期間、毒性、感染効率（Ａｄ−ｅＧＦＰを用いて）及び読み出しの日を最適化した
【００８６】
アッセイの開発へのポジティブコントロールとしてＡｄ−ＢＭＰ２（ＢＭＰ２過剰発現）を使用することによって、以下のプロトコルは、バックグラウンドシグナル上の最も低い標準偏差を有するアッセイで、最も高いダイナミックレンジを生じた：ＭＰＣを、３８４ウエルプレートのウエル毎に５００個の細胞を０日目にまき、その翌日にＡｄ−ｈＣＡＲ（Ａｄ−ｈＣＡＲ溶液の５μｌ：混合物合計ＭＯＩ＝１５５．７）、及び１μｌのＡｄ−コントロール−ウイルス（Ａｄ−ＢＭＰ２、又はＡｄ−ｅＧＦＰ；理論上５０００のＭＯＩに対応する）の混合物を使用して、共感染させた。５日目に、ウイルスを含む培地を除去し、ウイルスを含まない未使用の培地に交換した。アルカリフォスファターゼの上方調節を１３ｄｐｉで読んだ：１５μｌの４−メチルウンベリフェリルリン酸（MUP, Sigma）をそれぞれのウエルに添加し、該プレートを３７℃で１５分間インキュベートし、蛍光プレートリーダー（Fluostar, BMG）を使用してＡＰ活性をモニタリングした。
【００８７】
アッセイの最適化の後、小規模の試験的選抜を、ロボット（ＴｅＭＯ９６、ＴｅＭＯ３８４及びＲｏＭａを装備した９６／３８４チャンネルディスペンサーＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ２００、Ｔｅｃａｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用（１０３の異なるＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルス）して実行した。この選抜でヒットしたものを集め、同じアッセイで再テストした。最も高い成績（Ｈ９＝Ｈ２４−０１０；Ｈ１０＝Ｈ２４−０１１）だった２つのＡｄ−ｓｉＲＮＡを使用して、Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含むコントロールプレート（ノックダウン（ＫＤ）コントロールプレート）を作成した。コントロールプレート、３つのネガティブコントロールウイルス（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３）及び３つのポジティブコントロールウイルス（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を含む９６ウエルプレートを図３に示した。この「ノックダウン」コントロールプレートは、ポジティブコントロールとしてＡｄ−Ｈ９（Ｈ２４−０１０）及びＡｄ−Ｈ１０（Ｈ２４−０１１）；感染コントロールとしてＡｄ−ｅＧＦＰ（ノックインウイルス）；及びネガティブコントロールとしてＡｄ−ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、Ａｄ−Ｍ６ＰＲ−ｓｉＲＮＡ及びＡｄ−Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ（３つ全てがノックダウンウイルス）を含む。
【００８８】
コントロールウイルスを、ロボットを用いて９６ウエルＫＤコントロールプレートから３８４ウエルプレートへピペットで入れた。該３８４ウエルプレートの最終的な配置を図４に示した。
図５は、ＫＤコントロールプレートを用いた、自動化されたスクリーニング手順の結果を示している。ＫＤネガティブコントロール（Ｎ１〜Ｎ３）の平均及び標準偏差を使用してヒット解析のカットオフを計算し、ヒット解析は、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３の平均（「全ての陰性」）に加えて、「全ての陰性」の標準偏差の３倍に設定した。ポジティブコントロール（Ｐ１及びＰ２）は、感染ウエルの９５％より上の成績であった。ネガティブコントロールウイルスは、該ウエルの５％未満の成績であった。
【００８９】
（実施例２．骨形成アッセイにおける２７６０Ａｄ−ｓｉＲＮＡアデノウイルスのスクリーニング）
ＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔライブラリーのスクリーニング用に最適化されたプロトコルは次の通りである：０日目に、ＭＰＣ細胞をウエル毎に、６０μｌの培地中に５００個の細胞密度で、透明な底面（Costar又はNunc）を有する黒い３８４ウエルプレート中にまく。１日後、３８４ウエルプレート中に保存されたＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔ（商標）コレクションからの１μｌのＡｄ−ｓｉＲＮＡ（概算された力価は、１ｍｌ毎に２．５×１０９ウイルス粒子）及び９６ウエルＶ−ボトムプレート中に分配した５μｌのＡｄ−ｈＣＡＲ溶液（合計ＭＯＩ＝１５５）を、Ａｄ−ｈＣＡＲ溶液を含む９６ウエルプレートのウエルからＭＰＣを含む３８４ウエルプレートのそれぞれのウエルへと９６／３８４チャンネルディスペンサー（ＴｅＭＯ９６、ＴｅＭＯ３８４及びＲｏＭａを装備したＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ２００、Ｔｅｃａｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の補助で移動させた。ＫＤコントロールプレートは、ＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔコレクションからの一定分量のプレートとして同じ条件下で実行した。全てのＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルスを、異なったＭＰＣプレート上でそれぞれ１種を二重に選別した。プレートはそれから３７℃でインキュベートした。アデノウイルスを含む培地を、感染後４日目にウイルスを含まない未使用培地と交換した。感染後１３日目に、ＡＰ活性の読み出しを実行した。３８４ウエルスクリーニングプレートの典型的な結果を図６に示し、ここでＹ軸上の該３８４ウエルプレートのそれぞれのデータポイントを相対的蛍光単位（ＲＦＵ）でプロットした；一方、Ｘ軸上の数値は、３８４ウエルプレートの位置に一致する。
この複製選別は２回行い、かつ４つ全てのデータポイントをヒットの判定に使用した（図３を参照されたい）。
【００９０】
（実施例３．ＡＰアッセイを用いた標的の同定）
これらの２回の選抜を行った後、該ＡＰ活性を測定することから得られたデータを次のとおりに解析した：バックグラウンドを、コントロールプレートを除いた全てのプレートからのデータポイントの平均をとることによって計算した。ヒットの判定に対するカットオフ値を、コントロールプレートを除いた全てのデータポイントの標準偏差の３倍を足すことによって計算した。それぞれのデータポイントを、カットオフの上、又は下を採点することによって解析した。内因性ＡＰ活性レベルをカットオフ上に引き上げるＡｄ−ｓｉＲＮＡｓのみがさらに興味深かった。ヒットは、１つ又は両方の選別において、単一若しくは二重のそれらの採点に従って優先順位をつけた。２６５７個の独立なＫＤ構成を示している２６８８個のＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルス構成に関するデータを集め、表２に記載する。以前から同定されたヒットの１つは骨同化因子であることが示されており、それゆえ本アッセイの正当性を立証する：
（Ｈ２４−２４１：ＢＭＰ３）
ＢＭＰ３は、分泌されたタンパク質の骨形成タンパク質ファミリーのメンバーである。ＢＭＰ３は、骨形成ＢＭＰ２への拮抗薬として機能する。ＢＭＰ３欠損マウスは、野生型動物に対して２倍の骨梁を有し、ＢＭＰ３はインビボにおいて骨恒常性の陰性制御因子であることを示した（Daluiskiらの論文、Nature Genetics (2001) 27:84-88）。
【００９１】
（実施例４．標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡの品質管理）
Ａｄ−ｓｉＲＮＡヒットは、ｓｉＲＮＡ挿入時に品質管理を受ける。
標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡを、９６ウエルプレートレベルでＰｅｒＣ６細胞（Crucell, Leiden, The Netherlands）を用いて増殖させ、続いて一次アッセイ（実施例１を参照されたい）においていくつかのＭＯＩでこれらのウイルスを再スクリーニングし、標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡによってコードされるｓｉＲＮＡの配列決定を行った。
【００９２】
ＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ細胞を、１８０μｌのＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ培地中に、１ウエル当たり４００００個の細胞密度で、９６ウエルプレート中にまいた。細胞をそれから、１０％ＣＯ２を含む、加湿されたインキュベータ内において、３９℃で一晩インキュベートした。１日後、標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含むＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔストックからの精製していない細胞溶解物の１μｌを用いて細胞に感染させた。細胞を、細胞変性効果（細胞が膨らむこと及び集まることによって示され、典型的には感染後７日）の出現から、さらに３４℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。上清を集め、ウイルスを含む精製していない溶解物をプロテイナーゼＫで処理した：１２μｌの精製していない溶解物を、無菌のＰＣＲチューブ中で、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Roche Molecular Biochemicals, Cat No 745 723）及び０．４５％のＴｗｅｅｎ−２０（Roche Molecular Biochemicals, Cat No 1335465）を補助した４μｌの溶解バッファー（ＭｇＣｌ２を含む１×拡張高忠実性バッファー（Roche Molecular Biochemicals, Cat.  No 1332465））に加えた。これらは、５５℃で２時間のインキュベートの後に、９５℃で１５分の不活化を行った。ＰＣＲ反応のために、１μｌの溶解物を、ＭｇＣｌ２を含む５μｌの１０×拡張高忠実性バッファー、０．５μｌのｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰに対して１０ｍＭ）、１μｌの「フォワードプライマー」（１０ｍＭストック、配列：５′ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＧＣＣ、配列番号：３１１）、１μｌの「リバースプライマー」（１０ｍＭストック、配列：５′ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  Ｃ、配列番号：３１２）、０．２μｌの拡張高忠実性ＤＮＡポリメラーゼ（3.5 U/l, Roche Molecular Biochemicals）及び４１．３μｌのＨ２ＯからなるＰＣＲマスターミックスに加えた。ＰＣＲは、以下のようにPE Biosystems GeneAmp PCR system 9700内で行った：該ＰＣＲ混合物（合計５０μｌ）を９５℃で５分間インキュベートし；続く３５サイクルのそれぞれを、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で４分間で行った。最後の６８℃でのインキュベーションは７分間行った。該ＰＣＲ混合物の５μｌを、２μｌの６×ゲルローディングバッファーと混合し、０．５μｇ／μｌのエチジウムブロマイドを含む０．８％アガロースゲル上にロードして増幅産物を分離した。増幅断片のサイズは、同一ゲル上にロードした標準ＤＮＡラダーから概算した。推定されたサイズは〜５００ｂｐであった。
【００９３】
配列決定解析のため、標的アデノウイルスによって発現されたｓｉＲＮＡ構築物を、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−Ｕ６プラスミドのＳａｐＩ部位の側面のベクター配列に相補的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。該ＰＣＲ断片の配列を決定し、予期された配列と比較した。
【００９４】
（実施例５：内因性骨ＡＰ  ｍＲＮＡの上方調節対胎盤の、又は腸のＡＰ  ｍＲＮＡの上方調節の解析）
ＢＡＰは、骨形成に関与する生理学的に関連性のあるＡＰである。測定したＡＰ活性がＢＡＰ発現の上方調節、又は別のＡＰ遺伝子産物の上方調節に起因していたかどうかを決定するために、全てのＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを感染ＭＰＣについて解析した。ｍＲＮＡレベルを、前のセクションで記載されたように決定した。違いは、使用したプライマーセットである（表１を参照されたい）：あるセットは、ＢＡＰ  ＡＬＰＬ（肝臓／骨／腎臓ヒトアルカリフォスファターゼ）ｍＲＮＡ発現を検出する。別のセットは、他の３つのＡＰ遺伝子（ＡＬＰＩ（腸のヒトアルカリフォスファターゼ）、ＡＬＰＰ（胎盤のヒトアルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ））及びＡＬＰＰＬ２（胎盤様ヒトアルカリフォスファターゼ））の発現を検出する。ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰ及びＡＬＰＰＬ２は、ヌクレオチドレベルで高度に類似しており、それゆえあるプライマー対を用いて増幅させ得る。
【００９５】
プライマー対は、Ａｄ−ｅＧＦＰ及びＡｄ−ＢＭＰ２を用いて感染されたＭＰＣから単離されたＲＮＡ上で最初に確認された。図７は、Ａｄ−ＢＭＰ２によるＢＡＰ  ｍＲＮＡの強い上方調節、及び任意の他のＡＰ遺伝子の発現の上方調節がないことを示している。ＭＰＣを、Ａｄ−ｅＧＦＰ（ネガティブコントロール）又は骨形成Ａｄ−ＢＭＰ２を用いた２４ウエルプレートフォーマットで感染させた。細胞を採取し、そしてＲＮＡを調製し、ＢＡＰ  ｍＲＮＡ、又は該他の３つのＡＰ遺伝子（ＰＬＡＰ／ＩＡＰ）からのｍＲＮＡを増幅するプライマーセットを使用したｒｔＲＴ−ＰＣＲに用いた。Ａｄ−ＢＭＰ２はＢＡＰ  ｍＲＮＡレベルを強く上方調節したが、他の３つのＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルは上方調節しなかった。
【００９６】
それから両方のプライマーセットを使用して、Ａｄ−ｓｉＲＮＡを感染させたＭＰＣから単離したＲＮＡにおける、全てのＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する。
【表１】
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【００９７】
（実施例６．石灰化）
骨形成の過程は、いくつかの連続的な事象からなる。骨形成の初期段階の間、骨アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）は上方調節されるようになる。しかしながら、石灰化などの、骨形成の後期において起こる特定の事象を考慮することも同様に重要である。
【００９８】
（アッセイの準備）
骨形成の過程は、いくつかの連続的な事象からなる。骨形成の初期段階の間、骨アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）は上方調節されるようになる。その後、分化の間、細胞は、ほとんどがコラーゲンタイプＩからなる細胞外マトリクス上に（ヒドロキシ）アパタイト（Ｃａ２＋−リン酸沈殿物）を堆積し、石灰化した骨を形成する。
骨細胞石灰化アッセイ（ＢＭアッセイ）において、第一のヒトＭＳＣを、骨形成剤としてＢＭＰ２（組換え、又はアデノウイルスによる形質導入によって輸送される）を用いて、石灰化骨芽細胞へとインビトロで分化させる。石灰化をそれから、カルシウムに高親和性を有する着色料であるアリザリンレッドを用いてＭＳＣを染色することによって可視化する（図８を参照されたい）。
【００９９】
（スクリーニング、及びヒットの判定）
下記の最適化されたプロトコルは、前記一次アッセイにおいて同定されたＡｄ−ｓｉＲＮＡ標的及びＡｄ−ｃＤＮＡ標的のスクリーニングに使用した：
１００，０００個のＭＣＰを、６ウエルプレートのそれぞれのウエルに、１０％ＦＣＳを含む２ｍｌのＭＳＣ培地と共にまいた。その次の日、加湿したインキュベータ内の３７℃、１０％ＣＯ２のインキュベーションの後、細胞をＡｄＣ１５−ｈＣＡＲ（７５０の最終ＭＯＩ）と、１２５０、２５００及び５０００の最終ＭＯＩのＡｄ−ｓｉＲＮＡ、Ａｄ−ｃＤＮＡ、又はコントロールウイルスとを共に共感染させた。細胞をさらに６日間、加湿したインキュベータ内において、３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。ウイルスを取り除き、２ｍｌの未使用ＭＳＣ培地、１０％ＦＣＳで交換した。次の２２日にわたり、培地は２週に３回交換した。１回おきに、培地は半分又は完全に交換した。本実験の開始から２８日目に馴化培地を取り除き、細胞を１０％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、単層はＭｉｌｌｉＱ水（ｐＨを４．２に調整した）中で〜１％のアリザリンレッド（Sigma, # A5533）１ｍｌを用いて染色した。感染効率を評価するためのＡｄ−ｅＧＦＰ、強力な骨形成誘導剤としてのＡｄ−ＢＭＰ２、及び弱い骨形成因子としてのＡｄ−Ｈ４−２は、それぞれ、個々の実験においてネガティブ及びポジティブコントロールとして加えた。Ａｄ−Ｈ４−２が石灰化を誘導しない実験はどれも繰り返した。
石灰化を誘導したＡｄ−ｓｈＲＮＡは表２に示した。
【０１００】
（実施例７．同定された標的に対する創薬）
化合物を、本発明のポリペプチドへの結合によってスクリーニングする。該化合物の該ポリペプチドへの親和性は、置換実験で決定する。そのような置換実験は当業者に周知であり、他のものからポリペプチドに結合する化合物を同定するための一般的な技術として考えることができる。
手短に、本発明のポリペプチドを、該ポリペプチドに結合することが知られているラベルされた（放射性ラベル、蛍光又は抗体ラベル、若しくは任意の他の検出可能なラベル）リガンドを用いてインキュベートし、さらにラベルしていない化合物と共にインキュベートする。
該ポリペプチドからの該ラベルされたリガンドの置換は、まだ該ポリペプチドと結合している、ラベルされたリガンドの量を測定することによって決定する。該ポリペプチドと結合したラベルされたリガンドの量は、ラベルされていない化合物への親和性の表れである。
【０１０１】
該ポリペプチドと結合したラベルされたリガンドの量をラベルされていない化合物の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０値を計算する。この値は、その標的への、すなわち、本発明のポリペプチドへの、ラベルされていない化合物の結合親和性を反映する。
化合物は、ナノモラー範囲及びさらにピコモラー範囲にＩＣ５０を有する場合、強力な結合剤と考えられる。ｎｍｏｌ〜ｐｍｏｌ範囲に、少なくとも１０マイクロモル、又はそれよりもよいＩＣ５０を有する化合物を、骨アルカリフォスファターゼアッセイ（ＢＡＰ）、及び／又は骨芽細胞マーカーの誘導並びに骨芽細胞機能におけるそれらの効果を決定するためのアッセイのどちらかに適用する。より低いＩＣ５０を有する化合物は、一般的にあまり重要ではないものと考えられる。本発明のポリペプチドは、本アッセイを、細胞、細胞画分、又は精製されたタンパク質で生化学的に行うかどうかということによって、いくつもの方法で調製できる。そのような調製は、異なったアッセイであるものとして当業者に周知である。
【０１０２】
（実施例８．破骨細胞アッセイ：同定された標的の抗吸収活性の確認）
一生を通じて、骨格は絶え間なく再形成を行う。骨の焦点領域は破骨細胞によって再吸収され、それから骨芽細胞によって新規に形成される骨マトリクスによって置換される。骨粗鬆症の進展は、破骨細胞活性と骨芽細胞活性との間のバランスの脱制御による深刻な骨量の減少によって特徴付けられ、破骨細胞介在性骨吸収の増大を引き起こす。
破骨細胞は、単球／マクロファージ系統の細胞から生じる。インビボにおいて、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化は、間質細胞（ＭＰＣ）によって発現された２つの中心的因子：ＮＦκＢリガンド受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）及びオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）によって制御される。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞分化を駆動するＭＰＣの表面上に発現する膜結合リガンドである。ＯＰＧは、活性ＲＡＮＫＬを取り除くことによって破骨細胞の分化を阻害する、ＲＡＮＫＬに対する可溶性のおとり受容体である。ＭＰＣによるＲＡＮＫＬとＯＰＧの発現との間のバランスが、破骨細胞分化のレベルを決定する。
【０１０３】
ＭＰＣは破骨細胞の分化を制御するので、破骨細胞分化、又は活性における、同定された標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡの効果を知ることは重要である。これらは２つの機構：骨芽細胞の分化／活性の増加、及び破骨細胞活性の減少、によって骨の付加を増加させることが予期されるので、破骨細胞分化／活性を減少させる標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡは非常に価値がある。様々な前例に示されているように（Thirunavukkarasuらの論文、(2000) J Biol Chem 275 : 25163-72；Yamadaらの論文、(2003) Blood 101 : 2227-34）、そのような骨形成因子の多面発現効果を予期することができる。
【０１０４】
（破骨細胞分化アッセイ）
破骨細胞形成における骨形成因子の効果は、２つのタイプのアッセイを介して評価する。
最初のアッセイ準備において、初代ヒト単核球とＭＰＣとの共培養を行う。破骨細胞を支持するその能力における、ノックダウンウイルスを用いたＭＰＣ単層の感染の効果を評価する。所望の効果は以下の通りである：ＭＰＣにおけるＡｄ−ｓｉＲＮＡ標的遺伝子発現のノックダウンは、例えば、１０ｎＭの１，２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３、及び５０ｎＭのＭ−ＣＳＦの混合物のような生理的なトリガーによって駆動される破骨細胞分化を阻害するはずである。使用する単球は、骨髄、又は末梢血から生じ得る。本例では、末梢血由来単核球（ＰＢＭＣ）に基づいた分化実験を記述する。ＭＰＣ（Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Belgiumから得た）を、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地（GIBCO-Life Technologies）中で９６ウエルプレート内にまき（ウエル当たり１０００個の細胞）、１日後、これらを標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡを用いて感染させる。少なくとも３日後、Ｍ−ＣＳＦ（R&D systems, 終濃度50ng/ml）に加えて、１ウエル当たり１０００００個のＰＢＭＣを添加する。培地の半分容量を、培地＋５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、及び１０ｎＭの１，２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３で、週に２回交換する。読み出しは、該ＰＢＭＣを共培養に添加した後１４日目に行う。生理的に適切なトリガーの混合物によって駆動される自発的な破骨細胞分化は、複合的な読み出しで調査できる。「ＴＲＡＰ陽性」の数の顕微鏡を用いた調査において、１ウエル当たりの多核細胞は、破骨細胞分化のレベルの指標であると一般的に考えられている。「ＴＲＡＰ陽性」は、細胞が酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を有することを意味する。これを調査するために、共培養は、酸性フォスファターゼ検出キット（SIGMA, 386-A）に従って実行されたインサイチュウＴＲＡＰ染色の対象とする。陽性細胞は、処理によって紫色になる。選択的な読み出しとして、成熟破骨細胞に特異的なマーカー、例えばＴＲＡＣＰ５ｂ（酒石酸耐性酸性フォスファターゼタイプ５ｂ）、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）、又はカテプシンＫ（ＣＴＳＫ）を測定する。共培養上清中の破骨細胞由来酒石酸耐性酸性フォスファターゼタンパク質（ＴＲＡＣＰ５ｂ）の量の測定は、市販のＥＬＩＳＡ（BoneTRAP assay, Sba sciences, Turku, Finland）で実行する。ＣＴＲ又はＣＴＳＫは、以下の一般的なプロトコルの適用によって、免疫細胞化学で検出する。培地を取り除き、該共培養を固定し（４％パラホルムアルデヒド、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４℃、３０分）、洗浄し、そしてブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、少なくとも４時間インキュベートする。該ブロッキングバッファーを取り除き、適切なバッファー（例えば、０．０５ＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ）中に所望の濃度で溶解された、カテプシンＫ（例えば、Oncogene, IM55L）、又はカルシトニン受容体（例えば、Serotec, AHP635）に対して指図された一次抗体を、該ウエルに添加する。インキュベーションは４℃、一晩で行う。該混合物を取り除き、該細胞を洗浄（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）し、そして該一次抗体と同じバッファー中に希釈した、適切なＨＲＰ共役二次抗体を添加する。少なくとも４時間のインキュベーション後、洗浄段階を行い（ＰＢＳ��０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ルミノール（蛍光シグナルを生じるＨＲＰに対する基質：ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質[POD] (luminol), Roche Diagnostics,  Cat No 1582950）を加える。５分のインキュベーションの後、読み出しをルミノメーター（Luminoskan Ascent, Labsystem）で行う。記載された２つのアッセイ（多核細胞の数の調査、及び破骨細胞特異的マーカーの検出のための免疫化学）は、単核球から破骨細胞への分化を調査することは可能にするが、形成された破骨細胞の骨吸収活性については情報を与えない。
【０１０５】
破骨細胞の活性は、ピット形成アッセイで測定する。この目的のために、細胞の共培養及び感染は先にアッセイの説明で記載したように実行するが、骨様基質が共培養が行われるウエルの底に存在するという違いがある。この骨様基質は、象牙質スライス（例えば、Kamiya Biomedical Company, Seattle (Cat No KT018)）、又は市販の同等物（炭酸カルシウムコーティング、ＯＡＡＳ（商標）、Gentaur；Ｂｉｏｃｏａｔ（商標）Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ（商標）、BD Biosciences）であり得る。共培養は、該骨様基質上で、少なくとも１４日間実行する。細胞はそれから次亜塩素酸ナトリウムを用いた処理によって取り除き、そして破骨細胞によって吸収された領域（吸収ピット）は顕微鏡を用いて観察できる。これは、トルイジンブルーを用いた象牙質スライスの表面処理によって促進し得る。
【０１０６】
２番目のアッセイの準備において、破骨細胞へと分化する能力を持つヒットウイルスを有する破骨細胞前駆体細胞（ＰＢＭＣ又はＢＭＭＣ）の感染の効果は、単培養アッセイで測定する。この目的のために、単球（ＰＢＭＣ又はＢＭＭＣ）を、１０％血清、及び２５ｎｇ／ｍｌの組換えＭ−ＣＳＦ（R&D systems）を追加したαＭＥＭ培地中で、３８４ウエルプレート内にまいた。まいた１日後、該細胞を標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡで感染させる。感染後４日目に、組換えＲＡＮＫＬをウエルに添加する（２５ｎｇ／ｍｌ、R&D systems）。培地は週に２回交換する。ＲＡＮＫＬの添加後１４日目に、単球から破骨細胞への分化を、先のアッセイ準備において記載した読み出しの１つを用いて測定する。このアッセイは、Ｍ−ＣＳＦ、又はＲＡＮＫＬに対する破骨細胞前駆体細胞の反応に不可欠である因子の同定を可能にする。
【０１０７】
（ＰＢＭＣ単離）
ＰＢＭＣは、以下のプロトコルを対象とした末梢血から得られる（インフォームドコンセント後、患者から得られる）。血液を５０ｍｌファルコンチューブ内に無菌的に注ぎ、２５℃で１０分間、３０００ｇで遠心する。軟膜をそれから回収し、ＰＢＳを用いて１：１に希釈する。希釈された軟膜を、２０ｍｌのリンフォプレップ（Lymphoprep）（Sigma）を含む５０ｍｌファルコンチューブ内の上部に注ぐ。遠心分離（２５℃、４００ｇで３５分）した後、リンフォプレップ上部の単核球の白い層を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し（２００ｇ、１０分、２５℃で遠心分離）、そして７ｍｌのＰＢＳ中に再溶解させた。この溶液を、７ｍｌの高浸透圧性パーコール勾配を含む１５ｍｌファルコンチューブ内の層上にピペットで加え、３５分、４００ｇ、２５℃で遠心分離する。高浸透圧性パーコール勾配は、以下のように調製する：１容量の１．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び９容量のパーコール（Pharmacia, d=1,130 g/ml）を混合する。この混合物を、１：１の割合でＰＢＳ／クエン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ １．４９ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ９．１５ｍＭ、ＮａＣｌ １３９．９７ｍＭ、Ｎａ−クエン酸 (二水和物) １３ｍＭ、ｐＨ  ７．２）に加える。遠心分離の後、単球は該勾配の上に分離した環を形成する。単球を回収し、培地中で洗浄する。細胞はそれからアッセイに使用できる。
【０１０８】
（実施例９．「オフ−ターゲット（off-target）」ノックダウン効果の解析）
ｓｉＲＮＡは、最近発見され、かつ部分的に理解されている機構を介して遺伝子発現のノックダウンを行使する。ｓｉＲＮＡ配列がｍＲＮＡに特異的にアニーリングすることは、遺伝子特異的「オン−ターゲット（on-target）」ノックダウンに関与することは、一般的に受け入れられている。しかしながら、ｓｉＲＮＡと別のｍＲＮＡとの間の限定された不一致が遺伝子発現の「オフ−ターゲット」下方調節を誘導できることは、未だ排除することはできない。「オフ−ターゲット」ｍＲＮＡのノックダウンが、観察された骨形成効果の原因であることを排除するために、さらなるｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを、厳しいデザイン基準を用いた石灰化を誘導する５つのターゲット（表２Ｂ）に対してデザインした。付加的なＡｄ−ｓｈＲＮＡはそれからＢＡＰアッセイでテストした。
【０１０９】
ガラパゴスは、刊行された及び独自に開発したデザイン基準（ガラパゴスアルゴリズムは、ツシュル法則（Tuschl rules）、又はReynoldsらの論文Nat. Biotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30からの法則のような、ｓｉＲＮＡデザインに対する刊行された基準に立脚している）の両方を組み込んだ独自開発のアルゴリズムを発展させてきた。後者は、ＲＮＡｉ配列の５´アンチセンス末端における低い熱力学的内部安定性、及び「ＧＣ含量」などの基準を含む。可能な「オフ−ターゲット」効果の問題に取り組むために、さらなるｓｉＲＮＡ配列を下記のようにデザインした：
−本来のｓｉＲＮＡによって標的化されたｍＲＮＡを完全に並べる
−下記のような「オフ−ターゲット」ｍＲＮＡの最小数を有して不完全に並べてもよい（１９塩基長の各位置についてチェックされた、最大２塩基対の非同一性）
○推定上の「オフ−ターゲット」ｍＲＮＡは、本来のｓｉＲＮＡに対して同定された推定上の「オフ−ターゲット」ｍＲＮＡとは異なっていた
○推定上の「オフ−ターゲット」ｍＲＮＡは、ＰＰＩＡに対してデザインされた付加的なｓｉＲＮＡを除いた、全ての本来の標的ｓｉＲＮＡについて同定された推定上の「オフ−ターゲット」ｍＲＮＡとは異なっていた
【０１１０】
５つの選択された標的遺伝子のそれぞれに対してデザインされた７つのさらなるｓｉＲＮＡを加工して、組換えアデノウイルスを得た。全てのｓｉＲＮＡは、それらの独自性を検証し、オリゴヌクレオチド合成に起因するエラーを排除するために、クローニング時に配列を決定した。
３４のＡｄ−ｓｈＲＮＡをうまく生成させ、同時に５つの独自のＡｄ−ｓｈＲＮＡを用いて、２つの独立な実験を３ＭＯＩでのＢＡＰアッセイでテストした。デザインしたｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ｓｈＲＮＡ）をコードする組換えアデノウイルスを生産し、力価を測定し、９６ウエルプレート中に等分し、−８０℃で保存した。これらのプレートは、下記の通り一次ＢＡＰアッセイで処理した：
【０１１１】
ＭＰＣ細胞を、ウエル当たり５００個の細胞密度で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＭＳＣ培地（Ｐｒｏｇｅｎｔｉｘからの特許培地、The Netherlands）６０μｌで、透明な底を有する黒い３８４ウエルプレート（Costar又はNunc）内にMultidrop 384（Labsystems）を用いてまいた。１日後、等分されたＡｄ−ｓｈＲＮＡを含む９６ウエルプレート、及びネガティブ並びにポジティブコントロールウイルス（ノックダウンコントロールプレート、図３）を含む別のものを解凍し、等分されたウイルスを、９６チャンネルディスペンサー（ＴｅＭＯ９６及びＲｏＭａプレートハンドラーを装備したＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ２００、Tecan AG, Switzerland）を用いてＭＰＣプレートへと移した（図９）。コントロールプレートに対して、１μｌのウイルスストック（ｍｌ当たり２×１０９ウイルス粒子の平均力価）を、３８４ウエルスクリーニングプレートに移した。Ａｄ−ｓｈＲＮＡを３つの感染の多重度（ＭＯＩ）：１２，０００、４，０００及び１，３３３でスクリーニングした。ウイルスを、９６ウエルストックプレートから、３つの３８４ウエルスクリーニングプレートへと移した（図９）。次に、ヒトコクサッキー及びアデノウイルス受容体（ｈＣＡＲ）（ＡｄＣ１５−ｈＣＡＲ／ＡｄＣ２０−ｈＣＡＲ）を発現しているアデノウイルスの５μｌを、９６チャンネルディスペンサーの補助で９６ウエルＶ−ボトムプレートからこれらのウエル（１５５の最終ＭＯＩ）へと移した。
【０１１２】
プレートはそれから４日間、加湿したインキュベータ中において３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。感染後４日目に、アデノウイルスを含んだ培地を、ウイルスを含まない、１０％ＦＣＳを含有した未使用ＭＳＣ培地６０μｌで交換した。インキュベーションのさらに９日後、培地を取り除き、１５μｌの４−メチルウンベリフェリルフォスフェート溶液（Sigma, # M3168）を各ウエルに加え、そしてアルカリフォスファターゼ活性によって放出された４−メチル−ウンベリフェロンの蛍光は、蛍光光度計（励起：３６０ｎｍ；発光：４４０ｎｍ；FluoStar, BMG）を用いて、３７℃、１５分のインキュベーションの後に測定した。
全てのＡｄ−ｓｈＲＮＡウイルスは、３ＭＯＩの、２つの同一な、しかし独立な選別で二重にスクリーニングした。閾値は、あるスクリーニング期間（「グローバル」解析）において存在する全てのネガティブコントロール、又は１つのスクリーニングプレート（「ローカル」解析）上に存在するネガティブコントロールの使用のどちらかを使用して、ヒットの判定のために計算した。ヒットは以下の選択基準に従って判定した：
１）ネガティブコントロールの平均値＋標準偏差×３（＋3）を超えたＢＡＰシグナル。１回分のそれぞれのウイルスに関する２つの個々のデータポイントは、独立に解析した。
２）２つの選抜の少なくとも１つにおいて、少なくとも重複したうちの１つのＭＯＩでのあるＡｄ−ｓｈＲＮＡの基準１によって定義されるような陽性ＢＡＰシグナル。
【０１１３】
データの「グローバル」解析は、５遺伝子座を標的とする８種類のｓｉＲＮＡを同定し、かつ「ローカル」解析は、５遺伝子座を標的とする９種類のｓｉＲＮＡを同定した。５種類の選択された遺伝子の同一性は、該ＢＡＰアッセイで得点化された最終的なｓｉＲＮＡの数と共に表３に示している。全ての独自の５種類のＡｄ−ｓｈＲＮＡは、「グローバル」及び「ローカル」解析の両方に基づいてＢＡＰアッセイで得点化した。
【表３】
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【０１１４】
表３において、数字は、独自の５種類のｓｉＲＮＡを含む、ＢＡＰアッセイで得点化された全てのｓｉＲＮＡを示している。
結論として、５種類の選択されたターゲットを標的とするさらなるＡｄ−ｓｈＲＮＡをデザインし構築した。コントロールプレートに存在するネガティブコントロールを、プレート毎に（「ローカル」解析）、又はプレート１回分毎に（「グローバル」解析）に使用して、ヒットの判定（ + 3）に対するカットオフを決定した。
−該「グローバル」解析は、該ＢＡＰアッセイにおいて陽性として得点化された８種類のウイルスを生じ、５種類の有効な標的の５つを確認する
−該「ローカル」解析は、ＢＡＰアッセイにおいて陽性として得点化された９種類のウイルスを生じ、有効な標的の５つを確認する。
−全ての独自の５つのＡｄ−ｓｈＲＮＡウイルスは全て「グローバル」又は「ローカル」解析のどちらかを用いた場合に、ＢＡＰアッセイで得点化する。
【０１１５】
表２Ａは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びノックダウン構築物をリスト化している：
【表２Ａ】
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【０１１６】
【表２Ｂ】
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【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】膜内の、及び軟骨内の骨化
【図２】骨芽細胞分化アッセイの原理
【図３】９６ウエルノックダウンコントロールプレートのレイアウト（Lay-out）
【図４】３８４ウエルコントロールプレートのレイアウト
【図５】ＡＰアッセイにおけるノックダウンコントロールプレートの評価
【図６】あるＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔスクリーニングプレートに対する生データのドットプロット表示
【図７】ＢＡＰ−ｍＲＮＡ対ＰＬＡＰ−ｍＲＮＡ、又はＢＡＰ−ｍＲＮＡ対ＩＡＰ−ｍＲＮＡの上方調節の解析
【図８】石灰化アッセイの結果
【図９】３ＭＯＩでＡｄ−ｓｈＲＮＡをスクリーニングするためのピペッティングスキーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月19日(2006.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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