(57)【要約】  グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸および２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸より、モナチンまたはその塩を産生するために使用可能である方法および組成物を提供する。インドール−３−ピルビン酸および２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸中間体を産生するための方法も開示されている。提供される組成物には、核酸分子、ポリペプチド、化学構造物および細胞が含まれる。方法には、インビトロおよびインビボ工程が含まれ、インビトロ方法には、化学的反応が含まれる。
2007508840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）培養培地中で微生物を培養するステップ、ここで、前記微生物は、アルドラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む；および
（ｂ）前記培養培地または前記培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アルドラーゼポリペプチドが、ＰｒｏＡアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）およびＫＨＧアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートグリオキシレート−リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地が、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体、またはその組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤が、ツィーン、トリトンＸ−１００および酢酸ドデシルアンモニウムから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地が、５μｇ／Ｌ未満の濃度でビオチンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ペニシリン誘導体が、アンピシリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）での培養培地のｐＨが、微生物を培養する前に、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地が、モラッセ、コーンスティープリカーまたはその組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が大腸菌であり、前記培養培地が、Ｔｒｐ−１およびグルコース培地を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が増殖のためにフェニルアラニンおよびチロシンを要求し、かつ前記培養培地がフェニルアラニンおよびチロシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記コリネバクテリウム・グルタミカムが、グルタミン酸を製造しかつ分泌する、コリネバクテリウム・グルタミカム株である、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地が、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体、またはその組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モナチンまたはその塩が、コリネバクテリウム・グルタミカムから分泌される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）培養培地中で、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０５８）を培養するステップ；および
（ｂ）前記培養培地または前記培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記培養培地が、ツィーン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、またはその組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地が、トリプトファン、ピルビン酸、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記非イオン性界面活性剤が、ツィーンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地が、ピルビン酸、ツィーンおよびペニシリン誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
アミノトランスフェラーゼポリペプチドが、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２７）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．１）、芳香族アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．５）およびＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２１）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物が、モナチンまたはその塩を分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物が、発酵漕中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
アルドラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸と、アミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む微生物であって、前記核酸が、外来核酸、組換え体核酸およびその組み合わせから選択され、そしてモナチンまたはその塩を製造する、前記微生物。
【請求項２７】
前記アルドラーゼポリペプチドが、ＰｒｏＡアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）およびＫＨＧアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートグリオキシレート−リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）から選択される、請求項２６に記載の微生物。
【請求項２８】
前記アミノトランスフェラーゼポリペプチドが、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２７）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．１）、芳香族アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．５）およびＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２１）から選択される、請求項２６に記載の微生物。
【請求項２９】
前記微生物が、ピルビン酸を過剰生産する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項３０】
前記微生物が、チアミン栄養要求株である、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３１】
前記微生物が、フェニルアラニンおよびチロシン栄養要求株である、請求項２６に記載の微生物。
【請求項３２】
前記微生物が、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、トリホスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３３】
前記微生物が、リポ酸栄養要求株である、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３４】
前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含む、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３５】
前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子、および少なくとも１つのトリプトファンオペロン遺伝子を含む、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３６】
前記微生物が大腸菌である、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３７】
前記微生物が、不備Ｆ１-ＡＴＰアーゼ遺伝子を含む、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３８】
前記微生物が、内因性ｌｉｐＡ遺伝子における崩壊を含む、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３９】
前記微生物が、トリプトファンを過剰生産する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４０】
前記微生物が、１つ以上のトリプトファン生合成遺伝子の、２以上のコピーを含む、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４１】
前記微生物が、崩壊したｐｈｅＡ遺伝子を含む、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４２】
前記微生物が、崩壊内因性トリプトファナーゼ（ｔｎａ）遺伝子を含む、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４３】
前記微生物が、ｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現する、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４４】
前記微生物が、大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４５】
前記微生物が、相当する対照微生物に比べて、多量の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘパチュロソニック７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ活性を持つ、請求項４４に記載の微生物。
【請求項４６】
前記微生物が、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）シンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、前記核酸が、外来核酸、組換え体核酸およびその組み合わせから選択される、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４７】
前記微生物がｔｋｔ遺伝子をさらに含む、請求項４６に記載の微生物。
【請求項４８】
前記微生物が、トリプトファナーゼ活性を持つポリペプチドをコードする外来核酸をさらに含む、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４９】
前記微生物が、モナチンまたはその塩を分泌する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項５０】
前記微生物が、脂肪酸栄養要求株である、請求項４９に記載の微生物。
【請求項５１】
前記微生物が、アルドラーゼを発現する核酸を含む細菌の株であり、核酸より発現する前記アルドラーゼが、立体異性体的に過剰のモナチンの混合物を製造することができる、請求項２６に記載の微生物。
【請求項５２】
前記立体異性体的に過剰のモナチンの混合物は、大部分が、Ｓ，Ｓモナチンまたはその塩である、請求項５１に記載の微生物。
【請求項５３】
前記立体異性体的に過剰のモナチンの混合物は、大部分が、Ｒ，Ｒモナチンまたはその塩である、請求項５１に記載の微生物。
【請求項５４】
前記微生物が、トリプトファン取り込みポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸を過剰発現する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項５５】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）モナチンまたはその塩が製造される条件下で、培養培地中で、モナチンまたはその塩を製造する微生物を培養するステップ；および
（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を得るステップ、
を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記微生物が、モナチンまたはその塩を分泌する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記微生物が、脂肪酸栄養要求株である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
モナチンまたはその塩を合成することができる細胞を同定するための方法であって、以下：
（ａ）モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸またはその塩、モナチンの類似体またはその塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の類似体またはその塩、およびその組み合わせから選択される、炭素／エネルギー供給源の存在下で、細胞を培養するステップ；および、
（ｂ）細胞の増殖に関して試験するステップ、ここで、細胞の増殖が、細胞が、炭素／エネルギー供給源をピルビン酸に変換することを示唆し、それによって、細胞が、モナチンまたはその塩を合成することができることを示唆する、
を含む、前記方法。
【請求項５９】
前記細胞がピルビン酸栄養要求株であり、そしてピルビン酸が、炭素／エネルギー供給源の代謝によって細胞内に製造される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が、ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子中での崩壊を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
モナチンまたはその塩、または２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせを、トリプトファンから合成することができる細胞を同定するための方法であって、以下：
（ａ）トリプトファンの不在下、およびモナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせの存在下、トリプトファン栄養要求株である細胞を培養するステップ；および
（ｂ）トリプトファン栄養要求株である細胞の増殖を試験するステップ、ここで、細胞の増殖が、細胞が、モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせからトリプトファンを合成することを示唆し、それによって、細胞が、モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせを、トリプトファンから合成することができることを示唆する、
を含む、前記方法。
【請求項６２】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）培養培地中で微生物を培養するステップ、ここで、前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から選択される；および、
（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項６３】
前記微生物が遺伝的に改変されていない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記培養培地がＰＨＢ培地を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記培養培地が、トリプトファン、ピルビン酸、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、またはコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記微生物がコマモナス・テストステロニであり、そして前記培養培地がトリプトファンおよびピルビン酸をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養培地がＴＹ培地を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記培養培地が、トリプトファン、ピルビン酸またはその組み合わせをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示物は、インドール−３−ピルビン酸、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸および／またはモナチンの産生において有用である、方法および物質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
本明細書は、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、２００３年１０月２１日に出願された、米国仮出願特許明細書番号第６０／５１３，４０６号の優先権を主張する。
【０００３】
インドール−３−ピルビン酸は、高酸素濃度の組織における酸化ストレスを無効にすると信じられている強力な抗酸化剤である（Ｐｏｌｉｔｉ他「トリプトファン研究における最近の進展（Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、Ｇ．Ａ．Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉ他による編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ２９１−８）。インドールピルビン酸はまた、インドール−酢酸（ＩＡＡ）、第一植物増殖ホルモンオーキシン（拡散性増殖促進因子）を産生する経路における中間体でもある。ＩＡＡは、頂芽優勢、屈性、芽の伸長、形成層細胞分裂の誘導および発根開始を含む、広範囲の生理学的工程において、１マイクログラム未満の量で活性である。合成オーキシンン類が、発根を誘導するため、および果物の挿し木および発達を促進するために、園芸において利用される。例えば、米国特許第５，８４３，７８２号明細書および第５，９５２，２３１号明細書を参照のこと。高濃度にて、合成オーキシンン類は、広葉樹に対する効果的な除草剤である。発酵によって産生される天然のオーキシンン類は、化学的に産生された除草剤よりも、より環境に優しいと考えられ得る。増殖調節物は、１９９９年に４億ポンド（１４億米国ドル）の世界売り上げであった。植物関連利用に加えて、インドール酢酸が、薬理学的適用で有用である。例えば、米国特許第５，１７３，４９７号明細書は、アルツハイマー病および老年性認知症に関連したもののような、記憶機能障害の処置における、これらの化合物の利用を提案している。米国特許第５，１７３，４９７号明細書で提案された機構は、これらの化合物が、アセチルコリンエステラーゼを阻害し、脳中で、アセチルコリンレベルを増加させることである。
【０００４】
インドール−３−カルビノールは、ペルオキシダーゼ−触媒酸化によって、インドール−３−酢酸から産生され、簡単に、ジインドリルメタンに変換可能である。両方の化合物が、毒素を排除し、女性の健康に有益なホルモンの産生を促進することが報告されている。塩化Ｄ−トリプトファンは、非栄養性甘味料として同定されてきており、同様に、他の誘導体を追求する興味が増加している。
【０００５】
モナチン（２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸）は、天然に存在する、アミノ酸トリプトファンと組成が同一である、甘味料である。南アフリカの低木、スクレロチトン・イリシホリウス（Ｓｃｌｅｒｏｃｈｉｔｏｎ  ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）の根の樹皮から抽出可能であり、高濃度の甘味料として、食物および飲料工業にて見込みがある。モナチンの特許のいくつかの例には、米国特許第５，９９４，５５９号明細書、第４，９７５，２９８号明細書、第５，１２８，１６４号明細書および第５，１２８，４８２号明細書が含まれる。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、式：
【０００７】
【化１】
2007508840.tif 000003
【０００８】
を有する化合物である、モナチン（２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸−また４−アミノ−２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）ペンタンジオイック酸と呼ばれる、また他の番号付け系に基づいて、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）グルタミン酸とも呼ばれるものを含む。モナチンはまた、以下の化学名も持つ。３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブチ−４−イル）−インドール、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸、および３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシブタン−４−イル）−インドール。
【０００９】
モナチンは、天然に存在する、高密度甘味料である。モナチンは、４つの立体異性体形態を持つ。２Ｒ，４Ｒ（「Ｒ，Ｒ立体異性体」または「Ｒ，Ｒモナチン）、２Ｓ，４Ｓ（「Ｓ，Ｓ立体異性体」または「Ｓ，Ｓモナチン」）、２Ｒ，４Ｓ（「Ｒ，Ｓ立体異性体」または「Ｒ，Ｓモナチン」）、および２Ｓ，４Ｒ（「Ｓ，Ｒ立体異性体」または「Ｓ，Ｒモナチン」）。本明細書で使用するところの「モナチン（ｍｏｎａｔｉｎ）」は、他に言及しない限り、すべての４つのモナチンの立体異性体、ならびにモナチン立体異性体の任意の組み合わせの任意の混合物を意味する（例えば、モナチンのＲ，ＲおよびＳ，Ｓ立体異性体の混合）。
【００１０】
本発明は、部分的に、グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸から、および／またはインドール−３−ピルビン酸および２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（モナチン前駆体、ＭＰ、モナチンのα−ケト形態）のような中間体を介して、モナチンを作製する、いくつかの生合成経路の同定に基づいている。モナチン、インドール−３−ピルビン酸、およびＭＰを作製するために利用可能であるポリペプチド類および核酸配列が開示されている。モナチンの有機合成が、異性体の分離を必要とするので、安価な原材料を利用可能であり、１つの異性体のみを産生可能である生化学経路が、より経済的に利点があり得る。
【００１１】
モナチンは、インドール−３−ピルビン酸、ＭＰ、インドール−３−乳酸、トリプトファン、および／またはグルコースを介して産生可能である（図１）。図１〜３および１１〜１３で示した、モナチンまたはその中間体を産生または作製する方法には、望む最終産物が作製されるまで、基質を第一産物に変換すること、次いで、第一産物を第二産物に変換すること、などが開示されている。
【００１２】
図１〜３および１１〜１３は、ボックス中で、可能性ある中間体産物および最終産物を示している。例えば、グルコースからトリプトファン、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸、インドール−３−ピルビン酸からＭＰ、ＭＰからモナチン、またはインドール−３−乳酸（インドール−乳酸）からインドール−３−ピルビン酸のような、１つの産物から他への変換を、本明細書で提供した方法および物質を用いることによって達成可能である。これらの変換は、化学的または生物学的のいずれかで促進可能である。語句「変換（ｃｏｎｖｅｒｔ）」は、１つの産物（例えば第一中間体）を他の産物（例えば第二中間体）に変換する反応中、化学的方法またはポリペプチドのいずれかの利用を意味する。語句「化学的変換（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」は、ポリペプチドによって活発に促進されない反応を意味する。語句「生物学的変換（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」は、ポリペプチドによって活発に促進される反応を意味する。変換は、インビボまたはインビトロにて実施可能である。生物学的変換を利用する場合、ポリペプチドおよび／または細胞を、ポリマー支持体上への化学的接着によってのように、支持体に固定化可能である。変換は、例えば、バッチまたは連続反応器中で、当業者に公知の任意の反応器を用いて実施可能である。
【００１３】
第一ポリペプチドを基質に接触させること、および第一産物を産生すること、次いで、作製した第一産物を第二ポリペプチドと接触させ、第二産物を産生すること、次いで、作製した第二産物を第三ポリペプチドと接触させ、例えばモナチンのような、第三産物を作製すること、が含まれる方法も提供される。使用したポリペプチドおよび産生した産物を、図１〜３および１１〜１３で示している。
【００１４】
図１〜３および１１〜１３で示した変換を実施するために利用可能な、ポリペプチドおよびそのコード配列が開示されている。いくつかの例にて、基質特異性および／またはポリペプチドの活性を改変可能にする、１つ以上の点変異を持つポリペプチドを、モナチンを作製するために使用する。
【００１５】
モナチンを産生する単離および組換え体細胞が開示されている。これらの細胞は、植物、動物、細菌、酵母、藻類、古細菌または真菌細胞のような、任意の細胞であり得る。
【００１６】
特定の例において、開示された細胞には、１つ以上の（例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上）の以下の活性を含む。トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）、多重基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピリビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２８）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（ＥＣ番号なし、Ｈａｄａｒ他，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １２５：１０９６−１１０４，１９７６、およびＦｕｒｕｙａ他，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６４：１４８６−９３，２０００）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキシグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）または４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）のような、シンターゼ／リアーゼ（ＥＣ４．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２．−）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Ｋｏｈｉｂａ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏ，Ｐｒｏｃｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ８th  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ6  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ  １９９０）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）。
【００１７】
他の例において、細胞は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上）の以下の活性を含む。インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２３７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１１）、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．−）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）または４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）のような、シンターゼ／リアーゼ（４．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２．−）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２８）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）、多重基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．９９．１）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、および／またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）。
【００１８】
さらに、開示された細胞は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上）の以下の活性を含む。トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）、多重基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２８）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（ＥＣ番号なし）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）、インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２３７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１１）、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．−）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）または４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）のようなシンターゼ／リアーゼ（４．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２．−）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、および／またはＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ。
【００１９】
モナチンは、トリプトファンおよび／またはインドール−３−乳酸を、第一ポリペプチドと接触させることで、ここで、第一ポリペプチドが、トリプトファンおよび／またはインドール−３−乳酸を、インドール−３−ピルビン酸に変換し（トリプトファンまたはインドール−３−乳酸のＤまたはＬ形態を、インドール−３−ピルビン酸へ変換する基質として利用可能であり、当業者は、この段階で選択されたポリペプチドが、適切な特異性を理想的に示すことを理解するであろう）、得られたインドール−３−ピルビン酸を、第二ポリペプチドに接触させることであり、そこで第二ポリペプチドが、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換する、およびＭＰを第三ポリペプチドと接触させることで、そこで、第三ポリペプチドが、ＭＰをモナチンに変換する、を含む方法によって産生可能である。これらの変換に用いることが可能な、典型的なポリペプチドが図２および３に示されている。
【００２０】
本発明の他の態様は、ＭＰのような組成物、および少なくとも２つのポリペプチド、または場合によっては、少なくとも３つ、または少なくとも４つのポリペプチドを含む細胞で、少なくとも１つの外来の核酸配列（例えば少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の外来核酸配列）をコードする細胞を提供する。
【００２１】
本明細書で提供した方法および物質を、モナチン、ＭＰ、モナチン中間体、およびモナチン誘導体のような産物を作製するために利用可能である。本明細書で記述したモナチンおよびいくつかのモナチンの中間体は、甘味剤として、またはモナチン誘導体の合成における中間体として、有用であり得る。
【００２２】
他の態様において、本発明は、モナチンを産生するための方法を特徴とする。特定の実施形態において、モナチンまたはその塩を産生する方法には、（ａ）微生物を培養培地中で培養することであって、前記微生物が、アルドラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸と、アミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含むこと、および（ｂ）モナチンまたはその塩を、培養培地または培養微生物より抽出すること、が含まれる。特定の実施形態において、アルドラーゼポリペプチドは、ＰｒｏＡアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドース、ＥＣ４．１．３．１７）およびＫＨＧアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）から選択される。他の実施形態において、微生物は、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される。あるいは、微生物は、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属から選択され得る。
【００２３】
１つの実施形態において、培養培地には、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、（アンピシリンのような）ペニシリン誘導体、またはその組み合わせが含まれる。非イオン性界面活性剤には、ツィーン、トリトンＸ−１００または酢酸ドデシルアンモニウムが含まれる。１つの実施形態において、培養培地には、５μｇ／Ｌ未満の濃度で、ビオチンが含まれる。他の実施形態において、培養培地のｐＨは、微生物を培養する前に、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である。さらに、培養培地には、モラッセ、コーンスティープリカーまたはその組み合わせが含まれ得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、微生物は大腸菌であり、培養培地は、Ｔｒｐ−１およびグルコース培地を含む。他の実施形態において、微生物は、増殖のためにフェニルアラニンおよびチロシンを必要とし、培養培地には、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。微生物はまた、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含み得る。さらに、微生物は、グルタミン酸を産生し、分泌する、コリネバクテリウム・グルタミカムの株であり得る。いくつかの実施形態において、モナチンまたはその塩が、微生物（例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム）から分泌される。他の実施形態において、微生物は発酵槽中で培養される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、培養培地には、トリプトファン、ピルビン酸、（ツィーンのような）非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせが含まれる。他の実施形態において、アミノトランスフェラーゼポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２７）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．１）、芳香族アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．５）およびＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２１）から選択される。
【００２６】
さらに、本発明は、（ａ）コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０５８）を培養培地中で培養すること、および（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出すること、を含むモナチンまたはその塩を産生する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、培養培地には、ツィーン、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせが含まれる。
【００２７】
さらに、本発明は、アルドラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む微生物を特徴とし、そこで、前記核酸は、外来核酸、組換え体核酸およびその組み合わせから選択され、前記微生物がモナチンまたはその塩を産生する。いくつかの実施形態において、アルドラーゼポリペプチドは、ＰｒｏＡアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）およびＫＨＧアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸−リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）から選択される。他の実施形態において、アミノトランスフェラーゼポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２７）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．１）、芳香族アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．５）およびＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２１）から選択される。微生物には、ピルビン酸を過剰産生する、および／またはチアミン栄養要求株、フェニルアラニンおよびチロシン栄養要求株、またはリポ酸栄養要求株であるものが含まれ得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、微生物は、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、トリホスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される。他の実施形態において、前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含む。特定の実施形態において、微生物は、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子、および少なくとも１つのトリプトファンオペロン遺伝子を含む。他の実施形態において、微生物は大腸菌である。他の実施形態において、前記微生物は、不備Ｆ１-ＡＴＰアーゼ遺伝子、内因性ｌｉｐＡ遺伝子における崩壊、崩壊ｐｈｅＡ遺伝子、崩壊内因性トリプトファナーゼ（ｔｎａ）遺伝子、および／または１つ以上のトリプトファン生合成遺伝子の、２つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態において、微生物は、トリプトファンを過剰産生する。他の実施形態において、前記微生物が、ｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現し、相当する対照微生物に比べて、多量の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘパチュロソニック７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ活性を持ち、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）シンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を含み、そこで、外来核酸、組換え体核酸、およびその混合物および／またはｔｋｔ遺伝子から、核酸が選択される。他の実施形態において、微生物は大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカムである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、微生物にはさらに、トリプトファナーゼ活性を持つポリペプチドをコードする外来核酸が含まれる。他の実施形態において、微生物は、モナチンまたはその塩を分泌し、および／または脂肪酸栄養要求株である。他の実施形態において、微生物は、アルドラーゼを発現している核酸を含む細菌の株であり、そこで、核酸より発現したアルドラーゼは、立体異性体的に過剰のモナチン混合物を産生可能である。いくつかの実施形態において、立体異性体的に過剰のモナチン混合物は、主にＳ，Ｓモナチンまたはその塩である。あるいは、立体異性体的に過剰のモナチン混合物は、主にＲ，Ｒモナチンまたはその塩である。１つの実施形態において、微生物は、少なくとも１つの、トリプトファン取り込みポリペプチドをコードする核酸を過剰発現している。
【００３０】
他の態様において、本発明は、（ａ）モナチンまたはその塩が産生される条件下で、培養培地中で、モナチンまたはその塩を産生する微生物を培養すること、および（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を得ること、を含むモナチンまたはその塩を産生するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、微生物は、モナチンまたはその塩を分泌し、および／または脂肪酸栄養要求株である。
【００３１】
さらに、本発明はまた、（ａ）モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸またはその塩、モナチンの類似体またはその塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の類似体またはその塩、およびその組み合わせから選択される、炭素／エネルギー供給源の存在下で、細胞を培養すること、および、（ｂ）細胞の増殖に関して試験することで、細胞の増殖が、細胞が、炭素／エネルギー供給源をピルビン酸に変換することを示唆し、それによって、細胞が、モナチンまたはその塩を合成可能であることを示唆していること、を含む、モナチンまたはその塩を合成可能である細胞を同定するための方法を含む。１つの実施形態において、細胞はピルビン酸栄養要求株であり、ピルビン酸が、炭素／エネルギー供給源の代謝によって細胞内に産生される。他の実施形態において、前記細胞が、ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子中での崩壊を含む。
【００３２】
さらに、本発明は、（ａ）トリプトファンの不在下で、およびモナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせの存在下、トリプトファン栄養要求株である細胞を培養すること、および（ｂ）トリプトファン栄養要求株である細胞の増殖を試験することであって、細胞の増殖が、細胞が、モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせからトリプトファンを合成したことを示唆し、それによって、細胞が、モナチンまたはその塩、または２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせをトリプトファンから合成可能であることを示唆していること、を含む、モナチンまたはその塩、または２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせを、トリプトファンから合成可能である細胞を同定するための方法を特徴とする。
【００３３】
本発明はまた、（ａ）培養培地中で微生物を培養することであって、前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から選択されること、および、（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出すること、を含む、モナチンまたはその塩を産生する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、前記微生物は遺伝的に改変されていない。他の実施形態において、培養培地には、ＰＨＢ培地が含まれる。培養培地にはまた、トリプトファン、ピリビン酸、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、微生物は、シノリゾビウム・メリロッティまたはコマモナス・テストステロニである。他の実施形態において、前記微生物は、コマモナス・テストステロニであり、および／または培養培地がさらに、トリプトファンおよびピルビン酸を含む。他の実施形態において、培養培地には、ＴＹ培地が含まれる。培養培地にはまた、トリプトファン、ピルビン酸またはその組み合わせが含まれ得る。
【００３４】
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的および科学的語句は、本発明が帰属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。本明細書に記述されたものと同様の、または等価の方法および物質を、本発明を実施するために利用可能であるけれども、好適な方法および物質を以下に記述している。すべての発行物、特許明細書、特許および他の参考文献は、その全てが参照により本明細書に組み込まれている。不一致の場合、定義を含み、本明細書は制御され得る。さらに、物質、方法および実施例は、例示のみであって、制限する意図はない。
【００３５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述、および請求項より明らかであろう。
【００３６】
配列表
付随する配列表中に列記された核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準の略字、およびアミノ酸に関する三文字コードを用いて示している。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖も、表示した鎖に対する任意の参照によって含まれ得ることが理解される。
【００３７】
配列番号１および２は、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）からのアミノトランスフェラーゼの、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している（ｔａｔＡ遺伝子、文献では、チロシンまたは芳香族アミノトランスフェラーゼと呼ばれている）。
【００３８】
配列番号３および４は、（ｔａｔＡ（配列番号１および２）との相同性により）ロードバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（２．４．１）からのチロシンアミノトランスフェラーゼの、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００３９】
配列番号５および６は、ロードバクター・スファエロイデス（３５０５３）からのアミノトランスフェラーゼの、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している（新規、２．４．１配列配列番号３および４）に基づいてクローン化）。
【００４０】
配列番号７および８は、ライシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）からの、広基質アミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ）の、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００４１】
配列番号９および１０は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００４２】
配列番号１１および１２は、（芳香族アミノトランスフェラーゼとして、相同性より同定した）ラクトバシルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｙｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）からの芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の、それぞれ新規核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００４３】
配列番号１３および１４は、（受入番号第ＡＡＡＥ０１００００９３．１、ｂｐ  １４７４３−１６１５５および受入番号第ＺＰ００００５０８２．１に対する相同性によって、多重基質アミノトランスフェラーゼとして同定した）Ｒ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（３５０５３）からの多重基質アミノトランスフェラーゼ（ｍｓａ）の、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００４４】
配列番号１５および１６は、Ｂ．サブチリスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００４５】
配列番号１７および１８は、Ｓ．メリロッティｔａｔＡ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００４６】
配列番号１９および２０は、Ｂ．サブチリスａｒａＴアミノトランスフェラーゼ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００４７】
配列番号２１および２２は、ロードバクター・スファエロイデス（２．４．１および３５０５３）多重基質アミノトランスフェラーゼ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００４８】
配列番号２３および２４は、ライシュマニア・メジャーｂｓａｔ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００４９】
配列番号２５および２６は、ラクトバチルス・アミロボラスａｒａＴ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５０】
配列番号２７および２８は、Ｒ．スファエロイデスｔａｔＡ配列（２．４．１および３５０５３両方）をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５１】
配列番号２９および３０は、大腸菌ａｓｐＣ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している（遺伝子配列Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＥ０００１９５．１、タンパク質配列Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＡＣ７４０１４．１）。
【００５２】
配列番号３１および３２は、大腸菌からの芳香族アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）の、それぞれ核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００５３】
配列番号３３および３４は、大腸菌ｔｙｒＢ配列をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５４】
配列番号３５〜４０は、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＫＨＧ）（ＥＣ４．１．３．１６）活性を持つポリペプチドをクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５５】
配列番号４１および４２は、タンパク質Ｐ００９１３（ＧＩ：４０１１９５）およびＰ３１０１３（ＧＩ：４０１２０１）をそれぞれコードする、大腸菌からのトリプトファナーゼ（ｔｎａ）遺伝子、およびシトロバクター・フレウンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）からのチロシンフェノール−リアーゼ（ｔｐｌ）遺伝子の核酸配列を示している。
【００５６】
配列番号４３〜４６は、トリプトファナーゼポリペプチド類およびβ−チロシナーゼ（チロシンフェノール−リアーゼ）ポリペプチドをクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５７】
配列番号４７〜５４は、トリプトファナーゼポリペプチドおよびβ−チロシナーゼポリペプチドに変異導入するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５８】
配列番号５５〜６４は、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）活性を持つポリペプチドをクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００５９】
配列番号６５および６６は、それぞれ、Ｃ．テストステローニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）からの、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）の核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００６０】
配列番号６７〜６８は、ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣ中、大腸菌ａｓｐＣでのオペロン中、Ｃ．テストステローニ４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６１】
配列番号６９〜７２は、ｐＥＳＣ−ｈｉｓ中、大腸菌ａｓｐＣおよびＣ．テストステローニｐｒｏＡをクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６２】
配列番号７３〜７４は、本明細書で開示した遺伝子をクローン化するために使用したプライマーの５’末端に加えた、核酸配列を示している。
【００６３】
配列番号７５および７６は、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子間の介在配列を短くするために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６４】
配列番号７７および７８は、ｐＰＲＯＮｃｏ中で大腸菌ｔｎａＡをクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６５】
配列番号７９および８０は、ｐＰＲＯＮｃｏ中で、大腸菌トリプトファンオペロン（遺伝子ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ）をクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６６】
配列番号８１および８２は、それぞれ、（５−メチルトリプトファン耐性細胞から由来した）プラスミドｐＧＸ５０のｔｒｐＥ遺伝子の核酸およびアミノ酸配列を示している。
【００６７】
配列番号８３および８４は、Ｃ．テストステローニ４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）および大腸菌ａｓｐＣを含むオペロンを、コリネバクテリウム／大腸菌シャトルベクターｐＥＫＥＸ−２内にクローン化するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６８】
配列番号８５および８６は、大腸菌内に、ｐｙｋＡノックアウトを産生するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００６９】
配列番号８７および８８は、大腸菌内に、ｐｙｋＦノックアウトを産生するために使用したプライマーの核酸配列を示している。
【００７０】
配列番号８９は、ラクトバシルス・アミロボルス（配列番号１２）からの、芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の最初の１０個のアミノ酸を示している。
【００７１】
詳細な説明
語句および方法の以下の説明は、本開示をよりよく記述するため、および本開示物の実施の技術分野の当業者を導くために提供される。本明細書で使用するところの、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。さらに、単数形態「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」には、文脈が他に明確に指示する以外、複数参照を含む。例えば「タンパク質を含む」に対する参照は、１つまたは多数のそのようなタンパク質を含み、「細胞を含む」に対する参照は、当業者に公知の１つ以上の細胞およびその等価物の参照を含み、他も同様である。語句「約（ａｂｏｕｔ）」は、任意の測定で起こる、広範囲の実験的エラーを含む。他に言及しない限り、すべての測定数値は、語句「約」が表示されていない場合でも、その前に語句「約」を持つと推測される。
【００７２】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部、非コード区画（イントロン）および転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡの断片。ｃＤＮＡは、細胞から抽出したメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって、研究所内で合成可能である。
【００７３】
保存置換：同様の生化学的特性を持つアミノ酸残基に対する、１つ以上のアミノ酸置換（例えば２、５または１０残基）。典型的には、保存的置換は、得られたポリペプチドの活性において、影響が少ないか、ない。例えば、理想的に、１つ以上の保存置換を含む、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を維持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入またはＰＣＲのような標準の手順を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つ以上の保存置換を含むために産生可能である。
【００７４】
置換変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が、除去されたか、異なる残基がその位置に挿入されたものである。タンパク質中の本来のアミノ酸に対して置換可能な、そして保存置換として考えられる例には、ｓｅｒまたはｔｈｒで置換されたａｌａ、ｇｌｎ、ｈｉｓまたはｌｙｓで置換されたａｒｇ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐで置換されたａｓｎ、ａｓｎ、ｇｌｕまたはｇｌｎで置換されたａｓｐ、ｓｅｒまたはａｌａで置換されたｃｙｓ、ａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐまたはａｒｇで置換されたｇｌｎ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓまたはａｓｐで置換されたｇｌｕ、ｐｒｏで置換されたｇｌｙ、ａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、ｔｙｒで置換されたｈｉｓ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅで置換されたｉｌｅ、ｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅで置換されたｌｅｕ、ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｒｇで置換されたｌｙｓ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｈｅで置換されたｍｅｔ、ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅまたはｌｅｕで置換されたｐｈｅ、ｔｈｒ、ａｌａで置換されたｓｅｒ、ｓｅｒまたはａｌａで置換されたｔｈｒ、ｐｈｅ、ｔｙｒで置換されたｔｒｐ、ｈｉｓ、ｐｈｅまたはｔｒｐで置換されたｔｙｒ、およびｍｅｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕで置換されたｖａｌが含まれる。保存置換に関するさらなる情報に関して、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他，（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他，（Ｇｅｎｅ  ７７：２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ他，（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉ他，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１３２１−５，１９８８）、国際特許第ＷＯ００／６７７９６号（Ｃｕｒｄ他）、または遺伝学および分子生物学の標準のテキストブックを参照のこと。
【００７５】
外来：核酸およびとりわけ細胞に関して、本明細書で使用するところの語句「外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」は、天然で見られるような、特定の細胞から由来したのではない任意の核酸を意味する。したがって、天然に存在しない核酸は、一旦細胞内に導入された細胞に対して外来性であると考えられる。天然に存在する核酸はまた、特定の細胞に対して外来性である。例えば、個体Ｘの細胞から単離した全クロモソームは、一旦クロモソームがＹの細胞に導入されたならば、個体Ｙの細胞に対して、外来性の核酸である。「外来」タンパク質は、細胞内の、外来核酸の発現による。
【００７６】
機能的等価性：等価の機能を持つこと。酵素の文脈にて、機能的に等価な分子には、酵素の機能を保持する異なる分子が含まれる。例えば、機能的等価性は、酵素配列における配列の変化によって提供可能であり、そこで、１つ以上の配列の変化を持つポリペプチドが、変化しないポリペプチドの機能を維持する（例えば酵素的な活性）。特定の実施形態において、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ機能等価物は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸へ変換する能力を維持する。
【００７７】
配列変化の例には、限定はしないが、保存置換、欠損、変異、フレームシフトおよび挿入が含まれる。１つの例において、該ポリペプチドは抗体に結合し、機能的等価物は、同一の抗体に結合するポリペプチドである。したがって、機能的等価物には、ポリペプチドと同一の結合特異性を持つペプチド、およびポリペプチドの代わりに試薬として使用可能なペプチドが含まれる。１つの例において、機能的等価物には、結合配列が、不連続であり、抗体が直線エピトープに結合するポリペプチドが含まれる。したがって、ペプチド配列が、ＭＰＥＬＡＮＤＬＧＬ（配列番号１２のアミノ酸１〜１０）（配列番号８９）である場合、機能的等価物には、不連続エピトープが含まれ、以下のようであり得る（**＝任意の数の介在アミノ酸）：ＮＨ2−**−Ｍ**Ｐ**Ｅ**Ｌ**Ａ**Ｎ**Ｄ**Ｌ**Ｇ**Ｌ−ＣＯＯＨ。この例において、ポリペプチドの三次元構造が、配列番号１２のアミノ酸１〜１０に結合するモノクローナル抗体に結合可能であるようなものである場合、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１〜１０に機能的に等価である。
【００７８】
ハイブリッド形成：本明細書で使用するところの語句「ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」は、二本鎖分子を形成するための、相補的一本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの能力に基づいて、２つの核酸分子のヌクレオチド配列における相補性に関して試験する方法を意味する。核酸ハイブリッド形成技術を、本開示物の範囲内で、単離核酸を得るために使用可能である。簡単に記すと、配列番号１１にて示した配列に対する相同性を持つ任意の核酸またはその部分を、中程度から高い緊縮性の条件下でのハイブリッド形成によって、同様の核酸を同定するためのプローブとして使用可能である。一旦同定したならば、次いで核酸を精製し、配列決定し、本開示物の範囲内であるかどうかを決定するために解析可能である。
【００７９】
ハイブリッド形成は、プローブに対してハイブリッド形成する、それぞれＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同定するために、サザンまたはノザン解析によって実施可能である。プローブをビオチン、ジゴキシゲニン、ポリペプチドまたは32Ｐのような放射性同位体で標識化可能である。解析すべきＤＮＡまたはＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹの項目７．３９−７．５２で記述されたもののように、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動的に分離し、ニトロセルロース、ナイロンまたは他の好適な膜に移し、当技術分野でよく知られている標準の技術を用いてプローブでハイブリッド形成可能である。典型的には、プローブは、長さにして少なくとも約２０ヌクレオチドである。例えば、配列番号１１で示した連続２０ヌクレオチド配列に相当するプローブを、同一または類似の核酸を同定するために使用可能である。さらに、２０ヌクレオチドより長い、または短いプローブを使用可能である。
【００８０】
本開示物はまた、長さにして少なくとも１２塩基（例えば、長さにして、少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０，１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００または５０００塩基）であり、ハイブリッド条件下で、配列番号１１に示した配列を持つ核酸のセンスまたはアンチセンス鎖にハイブリッド形成する単離核酸配列を提供する。ハイブリッド形成条件は、中程度または高い緊縮性ハイブリッド形成条件であり得る。本開示物の目的のために、中程度の緊縮性ハイブリッド形成条件は、ハイブリッド形成が、２５ｍＭ  ＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５０μｇ／ｍＬ還元、超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０7ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリッド形成溶液中、約４２℃で実施され、洗浄が、２×ＳＳＣおよび０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む洗浄溶液で、約５０℃にて実施される、ことを意味する。
【００８１】
高緊縮性ハイブリッド形成条件は、ハイブリッド形成が、２５ｍＭ  ＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５０μｇ／ｍＬ還元、超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０7ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリッド形成溶液中、約４２℃で実施され、洗浄が、０．２×ＳＳＣおよび０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む洗浄溶液で、約６５℃にて実施される、ことを意味する。
【００８２】
単離された：核酸に関して、本明細書にて使用するところの語句「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、由来した有機体の天然に存在するゲノム中で、直接に連続性である（１つは５’末端上で、１つが３’末端上）配列の両方と、直接連続的ではない、天然に存在する核酸を意味する。例えば、単離した核酸は、限定せずに、通常、天然に存在するゲノム中のその組換え体ＤＮＡ分子に直接に隣接して通常発見される、核酸配列の１つが除去されるか、または存在しないという条件で、任意の長さの組換え体ＤＮＡ分子であり得る。したがって、単離核酸には、限定はせずに、他の配列に依存せずに、分離分子として存在する組換え体ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自発的複製プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）内、または真核生物または原核生物のゲノムＤＮＡ断片内に組み込まれている組換え体ＤＮＡが含まれる。さらに、単離核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部分である、組換え体ＤＮＡ分子が含まれ得る。核酸に関して、本明細書にて使用するところの語句「単離された」はまた、天然に存在しない核酸配列が天然には見られず、天然に存在するゲノム中の直接に連続する配列を持たないので、任意の天然に存在しない核酸も含む。例えば、遺伝子工学的に改変した核酸のような、天然に存在しない核酸が、単離した核酸と考えられる。遺伝子工学的に改変した核酸は、一般的な分子クローニング、または化学的核酸合成技術を用いて作成可能である。単離した天然に存在しない核酸は、他の配列に依存せず、またはベクター、自発的複製プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれ得る。さらに、天然に存在しない核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸配列の部分である、核酸分子が含まれ得る。
【００８３】
例えばｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲルスライス内で、数百から数百万の他の核酸分子の中に存在する核酸は、単離核酸とは考えない。
【００８４】
ポリペプチドに関して、本明細書で使用するところの語句「単離した」は、例えば、細胞から、任意の方法で単離した、または先の環境より分離した、ポリペプチドを意味する。単離ポリペプチドはまた、任意の方法で精製されたポリペプチドも意味し得る。
【００８５】
核酸：本明細書で使用するところの語句「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（例えば化学的に合成した）ＤＮＡを限定的ではなく含む、ＲＮＡおよびＤＮＡ両方を意味する。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。さらに、核酸は環状または直線であり得る。１つ以上の核酸は、より大きな核酸内に存在し得る。例えば、アルドラーゼポリペプチドをコードする核酸およびアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸が、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドベクターのような、より大きな単一核酸内に存在し得る。あるいは、アルドラーゼポリペプチドをコードする核酸およびアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸は、２つの異なるプラスミドベクターのような、２つの異なる核酸上に存在し得る。
【００８６】
作動可能に連結した：第一核酸配列は、この第一核酸配列が、第二核酸配列と機能的に関連して位置する場合に、第二核酸配列と「作動可能に連結する（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続しており、２つのポリペプチド−コード領域を連結する必要がある場合に、同一のリーディングフレーム中である。
【００８７】
過剰発現：細胞は、核酸または遺伝子によってコードされたポリペプチドが、細胞および／または微生物中で、相当する野生型または天然の細胞および／または微生物中で産生されるものよりも高濃度で産生される場合に、特定の核酸または遺伝子を「過剰発現する（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」。細胞は、外来、組換え体または天然に存在する（すなわち天然の）核酸または遺伝子を、細胞内で過剰発現可能である。例えば、ポリペプチドは、細胞内で、天然に存在する核酸を過剰発現することによって、高レベルで産生され得、そこで、ポリペプチドそれ自身をコードする核酸は、遺伝的に改変されていないが、核酸配列の転写に指向しているプロモーターは改変または添加されている。語句「過剰発現」はまた、過剰発現したタンパク質に関し、すなわち、相当する野生型または天然の細胞および／または微生物中に存在するものよりも、高濃度で、細胞および／または微生物中に存在するものであり得る。
【００８８】
ポリペプチド：ポリペプチドは、翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の鎖を意味する。
【００８９】
ポリペプチド改変：本開示物は、酵素、ならびにその合成実施形態を含む。さらに、望む酵素活性を持つ、類似体（非ペプチド有機分子）、誘導体（開示したポリペプチド配列で開始して得た、化学的に機能化したポリペプチド分子）、および変異体（相同物）を、本明細書で開示した方法にて利用可能である。本明細書で開示したポリペプチドには、アミノ酸の配列が含まれ、それは、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸のいずれか、天然に存在するものおよびその他であり得る。
【００９０】
ポリペプチドは、未改変ポリペプチドと同様の活性を本質的に持ち、他の望む特性を任意に持つ誘導体を産生するために、種々の化学的技術によって改変可能である。例えば、カルボキシル末端または側鎖いずれかの、ポリペプチドのカルボン酸基を、薬理学的に許容可能なカチオンの塩の形態で提供可能であり、またはＣ１〜Ｃ１６エステルを形成するためにエステル化可能であり、または式ＮＲ1Ｒ2、式中Ｒ1およびＲ2がそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１６アルキルである、のアミドに変換可能であり、または５−または６−員環のような、ヘテロ環状環を形成するために結合可能である。アミノ末端または側鎖いずれかの、ポリペプチドのアミノ基は、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、硫酸トルエン、マレイン酸、タルタル酸および他の有機塩のような、薬理学的に許容可能な酸添加塩の形態であり得、またはＣ１−Ｃ１６アルキルまたはジアルキルアミノに改変し、またはさらにアミドに変換可能である。
【００９１】
アミノ酸側鎖のヒドロキシル基を、良く認識された技術を用いて、Ｃ１〜Ｃ１６アルコキシへ、またはＣ１〜Ｃ１６エステルへ変換可能である。アミノ酸側鎖のフェニルおよびフェノール環を、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩのような１つ以上のハロゲン原子で、またはＣ１〜Ｃ１６アルキル、Ｃ１〜Ｃ１６アルコキシ、そのカルボン酸およびエステル、またはそのようなカルボン酸のアミドで置換可能である。アミノ酸側鎖のメチレン基を、相同Ｃ２〜Ｃ４アルキレンまで伸長可能である。チオールを、アセタミド基のような、多数の良く認識されている保護基の任意の１つで保護可能である。当業者はまた、結果として安定性の増加となる構造への立体配座的制限を選択し、提供するために、環状構造を、本開示物のポリペプチド内に導入するための方法も認識し得る。例えば、Ｃ−またはＮ末端システインをポリペプチドに加えることが可能であり、それによって、酸化した場合に、ポリペプチドが、ジスルフィド結合を含み得、環状ポリペプチドが産生される。他のポリペプチド環状化方法には、チオエーテル類およびカルボキシル−およびアミノ末端アミド類およびエステル類の形成が含まれる。
【００９２】
ペプチドミメティックおよびオルガノミメティック実施形態はまた、本開示物の目的の範囲内であり、それによって、そのようなペプチド−およびオルガノミメティックの化学的組成の三次元配列が、ペプチド骨格の三次元配列および構成要素アミノ酸側鎖を模倣し、結果として、検出可能な酵素活性を持つ、本開示物のポリペプチドのそのようなペプチド−およびオルガノミメティックとなる。コンピュータモデリング適用のために、ファーマフォアが、生物学的活性のための構造的な要求の、理想的な、三次元定義である。ペプチド−およびオルガノミメティックは、（コンピュータ補助薬物設計またはＣＡＤＤを用いる）現在のコンピュータモデリングソフトウェアで、それぞれのファーマコフォアを適合させるために設計可能である。例えば、ＣＡＤＤにて使用する技術の記述に関して、Ｗａｌｔｅｒｓ，「薬物のコンピュータ−補助モデリング（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ）」，Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ  ＆  Ｇｒｏｖｅｓ（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ｐｐ．１６５−７４およびｃｈ．１０２  Ｍｕｎｓｏｎ（ｅｄ．），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌを参照のこと。そのような技術を用いて調製したミメティックも本開示物の範囲内に含まれる。１つの例において、ミメティックは、酵素またはその変異体、断片または融合物によって産生された酵素活性を模倣する。
【００９３】
プローブおよびプライマー：核酸プローブおよびプライマーは、本明細書で提供したアミノ酸配列および核酸配列に基づいて簡単に調製可能である。「プローブ」には、検出可能な標識またはレポーター分子を含む、単離した核酸が含まれる。例示的な標識には、限定はしないが、放射性同位体、リガンド、化学発光試薬およびポリペプチド（例えば酵素）が含まれる。標識化のための方法、および種々の目的のために適切な標識の選択における指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ他（ｅｄ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（定期的な更新），１９８７にて議論されている。
【００９４】
「プライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）」は、典型的に、１０以上のヌクレオチドを持つ核酸分子である（例えば、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間を持つ核酸分子）である。プライマーを、核酸ハイブリッド形成によって相補的な標的核酸鎖にアニールし、プライマーと標的核酸鎖間でハイブリッドを形成させ、次いで、例えばＤＮＡ断片ポリメラーゼポリペプチドによって、標的核酸鎖にそって伸長させることが可能である。プライマー対を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で公知の他の核酸増幅方法によって、核酸配列の増幅のために使用可能である。
【００９５】
プローブおよびプライマーを調製する、および使用するための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ他（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（定期的な更新），（１９８７）、およびＩｎｎｉｓ他（ｅｄｓ．），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０のような参考文献にて記述されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．５、Ｃ１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）のような、この目的のために意図されたコンピュータプログラムを用いることによって、公知の配列より誘導可能である。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性が、長さによって増加すること、しかしプローブまたはプライマーは、全長配列から、５つの連続ヌクレオチドのように小さい配列までの範囲のサイズであり得ることを理解するであろう。したがって、例えば、２０連続ヌクレオチドのプライマーが、１５ヌクレオチドのみの相当するプライマーよりも高い特異性で標的に対してアニール可能である。したがって、より高い特異性を得るために、プローブおよびプライマーは、例えば、１０、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８５０、３９００、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、５０００、５０５０、５１００、５１５０、５２００、５２５０、５３００、５３５０、５４００、５４５０、またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含んで選別可能である。
【００９６】
プロモーター：核酸配列の転写を指向する核酸制御配列。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素のような、転写の開始部位の近くに、必須核酸を含む。プロモーターには、転写開始部位から、数千塩基対ほどに局在可能な、遠位エンハンサーまたはレプレッサー要素が含まれ得る。
【００９７】
精製した：本明細書で使用するところの語句「精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、絶対的純度を必要とせず、相対的語句として意図される。したがって、例えば、精製したポリペプチドまたは核酸調製物は、それぞれ対照ポリペプチドまたは核酸が、有機体内のその天然の環境中で存在し得るポリペプチドまたは核酸よりも、より高い濃度であるものであり得る。例えば、ポリペプチド調製物は、調製物中のポリペプチド含量が、調製物の全可溶性タンパク質含量の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％を示す場合に、精製されたと考えられる。
【００９８】
組換え体：「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」核酸は、（１）発現している有機体中に天然には存在しない配列、または（２）２つの別に分離した、より短い配列の人工的組み合わせによって作製された配列、を持つものである。この人工的組み合わせは、しばしば、化学的合成によって、より一般的には、核酸の単離区画の人工的操作によって、例えば、遺伝的工作技術によって実施される。「組換え体」はまた、人工的に操作されたが、しかし、核酸が単離された有機体中で見られる、同一の制御配列およびコード領域を含む、核酸分子を記述するためにも使用される。「組換え体」ポリペプチドは、組換え体核酸から発現されるものである。
【００９９】
配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性の語句で表現され、さもなければ、配列同一性といわれる。配列同一性はしばしば、パーセント同一性（または類似性または相同性）に関して測定し、パーセンテージが高ければ高いほど、２つの配列はより同様である。配列番号１２のような、ポリペプチドの類似物または変異体は、標準の方法を用いて並べたときに、相対的に高い程度の配列同一性を持つ。
【０１００】
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野でよく知られている。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３，１９７０、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４−８，１９８８、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４，１９８８、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９、Ｃｏｒｐｅｔ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−９０，１９８８、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９−２９，１９９４に記述されている。
【０１０１】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとの連結で使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上を含む、種々のソースより入手可能である。
【０１０２】
ポリペプチドの変異体は、典型的には、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、デフォルトパラメーターに設定したギャップｂｌａｓｔｐを用いて、アミノ酸配列との全長アライメント上で計算した、少なくとも５０％配列同一性を持つことによって特性化される。約３０アミノ酸以上のアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ２配列式を、デフォルトパラメーターに設定した、デフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて利用する（ギャップ存在コスト１１、および残基ごとギャップコスト１）。短いポリペプチド（約３０アミノ酸より小さい）をアライメントする場合、このアライメントは、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティー）に設定したＰＡＭ３０マトリックスを利用し、Ｂｌａｓｔ２配列式を使用して実施する。参照配列に対してより大きな類似性を持つポリペプチドさえ、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性のような、本方法によって査定したときに、高いパーセンテージ同一性を示し得る。全配列以下を、配列同一性に関して比較する場合、相同物および変異体は、典型的には、１０〜２０アミノ酸の短いウインドにわたり、少なくとも８０％配列同一性を持ち、参照配列に対するその類似性に依存して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９８％の配列同一性を持ち得る。そのような短いウインドにわたる配列同一性を決定するための方法は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭａｒｙｌａｎｄのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって維持されるウェブサイトにて記述されている。当業者は、これらの配列同一性範囲が、ガイダンスのためのみに提供されることを理解し得、強力に有意な類似体が、提供された範囲外で得られる可能性が完全にある。
【０１０３】
同様の方法を、核酸配列のパーセント配列同一性を決定するために利用可能である。特定の例にて、類似性配列をもとの配列と並べ、マッチの数を、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、両方の配列中に存在する位置の数を計数することによって決定する。パーセント配列同一性を、同定した配列にて表した配列（例えば配列番号１１）の長さによって、または関連した長さ（例えば、同定した配列で表した配列からの、１００連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）によってのいずれかで、マッチの数を割り、次いで得られた数値に１００をかけることによって決定する。例えば、配列番号１１で表した配列と並べたときに、８８２マッチを持つ核酸配列は、配列番号１１に表した配列に対して、７５．０パーセント同一である（すなわち、（８８２÷１１７６）*１００＝７５．０）。パーセント配列同一性値は、小数点以下二位を四捨五入して、小数点以下一位までの概数にすることが理解される。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３および７５．１４は７５．１に概数され、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８および７５．１９は７５．２に概数される。また、長さの値はつねに整数であることが理解される。
【０１０４】
特異的結合試薬：本明細書にて記述された任意のポリペプチドに特異的に結合可能な試薬。例には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、（ヒト化モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ断片のようなモノクローナル抗体の断片、ならびにそのようなポリペプチドのエピトープに特異的に結合可能である他の任意の試薬が含まれる。
【０１０５】
本明細書で提供したポリペプチドに対する抗体を、そのようなポリペプチドを精製または同定するために使用可能である。本明細書で提供したアミノ酸および核酸配列により、本明細書で記述したポリペプチドを認識する、特異的抗体に基づく結合試薬の産生が可能になる。
【０１０６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、ポリペプチド、ポリペプチドの部分、またはその変異体に対して産生可能である。好ましくは、ポリペプチド抗原上の１つ以上のエピトープに対して作製された抗体は、そのポリペプチドを特異的に検出する。したがって、１つの特定のポリペプチドに対して作製した抗体は、その特定のポリペプチドを認識および結合し、他のポリペプチドは基本的に認識または結合しない。抗体が、特定のポリペプチドに特異的に結合することは、多数の標準的な免疫アッセイ方法の任意の１つによって決定される。例えば、ウエスタンブロッティング（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと）。
【０１０７】
（配列番号１２にて表したアミノ酸配列を持つポリペプチドに対して、マウスで産生された調製物のような）該抗体調製物が、ウエスタンブロッティングによって、適切なポリペプチド（例えば、配列番号１２にて表したアミノ酸配列を持つポリペプチド）を特異的に検出することを決定するために、全細胞タンパク質を、細胞より抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離可能である。
【０１０８】
次いで、分離した全細胞タンパク質を、膜（例えばニトロセルロース）に移すことが可能であり、膜と共に抗体調製物をインキュベートする。非特異的に結合した抗体を取り除くために、膜を洗浄した後、特異的に結合した抗体の存在を、アルカリホスファターゼのようなポリペプチドに連結した、適切な第二抗体（例えば抗マウス抗体）を用いて検出可能であり、それは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムの使用が、結果として、免疫−局在化アルカリホスファターゼによる、密集した青色化合物の産生につながるからである。
【０１０９】
免疫原として利用するのに適切な、本質的に純粋なポリペプチドを、トランスフェクトした細胞、形質導入した細胞または野生型細胞より得ることが可能である。最終調製物中のポリペプチド濃度を、例えば、Ａｍｉｃｏｎフィルター器具上の濃縮によって、ミリリットルあたり数マイクログラムのレベルに適合可能である。さらに、大きさにして、全長ポリペプチドから、９アミノ酸残基を持つポリペプチドまでの範囲のポリペプチドを、免疫原として利用可能である。そのようなポリペプチドを、細胞培養中で産生可能であり、標準の方法を用いて化学的に合成可能であり、または、大きなポリペプチドを、精製可能であるより小さなポリペプチドに開裂することによって得ることが可能である。長さにして、わずか９アミノ酸残基を持つポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のような、主要組織適合性複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ））分子に関する免疫系に提示したときに、免疫原性である。したがって、本明細書で開示した任意のアミノ酸配列の、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０またはそれ以上の連続アミノ酸残基を有するポリペプチドを、抗体を産生するための免疫原として利用可能である。
【０１１０】
本明細書で開示された任意のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７，１９７５）の古典的な方法、またはその改変方法にしたがって、齧歯類ハイブリドーマより調製可能である。
【０１１１】
本明細書で開示された任意のポリペプチドの異種エピトープに対する抗体を含む、ポリクローナル抗血清を、改変されないか、または免疫原性を増強するために改変可能である、ポリペプチド（またはその断片）で、好適な動物を免疫化することによって調製可能である。ウサギに対する効果的な免疫化プロトコールが、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ他（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９１，１９７１）にて見ることができる。
【０１１２】
抗体断片を、全抗体の代わりに使用可能であり、原核生物宿主細胞に簡単に発現可能である。モノクローナル抗体の免疫学的に効果的な部分を作製および使用する方法はまた、「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」として呼ばれ、よく知られており、Ｂｅｔｔｅｒ  ＆  Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６，１９８９）、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３６２−７，１９９０）、米国特許第５，６４８，２３７号明細書（「機能的抗体断片の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」、米国特許第４，９４６，７７８号明細書（「単一ポリペプチド鎖結合分子（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、米国特許第５，４５５，０３０号明細書（「単一鎖ポリペプチド結合分子を用いる免疫治療（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」およびそれらに引用されている参考文献で記述されているものが含まれる。
【０１１３】
形質導入した：「形質導入した（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」細胞は、例えば、分子生物学的技術によって、核酸分子が導入された細胞である。形質導入は、限定はしないが、ウイルスベクターでのトランスフェクション、接合、プラスミドベクターでのトランスフォーメーション、および電気泳動による裸ＤＮＡの導入、リポフェクションおよび粒子ガン促進を含む、核酸分子を細胞内に導入可能である全ての技術を含む。
【０１１４】
変異体、断片または融合ポリペプチド：開示されたポリペプチドには、その変異体、断片および融合物が含まれる。ポリペプチド（例えば配列番号１２）、融合ポリペプチド、またはポリペプチドの断片または変異体をコードするＤＮＡ配列（例えば配列番号１１）を、遺伝子工学的に改変して、真核細胞、細菌、昆虫、および／または植物中でポリペプチドを発現可能にすることができる。発現を得るために、ＤＮＡ断片配列を変更し、他の調節配列に作動可能に連結可能である。調節配列およびポリペプチド−コード配列を含む、最終産物が、ベクターと呼ばれる。このベクターを、真核生物、細菌、昆虫および／または植物細胞内に導入可能である。一旦細胞に入ったならば、ベクターが、ポリペプチドを産生可能である。
【０１１５】
融合ポリペプチドには、ポリペプチドの望む活性（例えば、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力）を阻害しない他のアミノ酸配列に連結した、芳香族アミノトランスフェラーゼ（例えば、配列番号１２）のような、ポリペプチドが含まれ得る。１つの例にて、他のアミノ酸配列は、長さにして、約１０、１２、１５、２０、２５、３０または５０アミノ酸以上ではない。
【０１１６】
当業者は、ＤＮＡ配列が、コードされたポリペプチドの生物学的活性に影響を与えることなしに、多数の方法で変更可能であることを理解するであろう。例えば、ＰＣＲを利用して、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列中に、変異体を産生可能である。そのような変異体は、ポリペプチドを発現するために使用した宿主細胞中の、コドン参照に関して最適化された変異体、または発現を促進する他の配列変化であり得る。
【０１１７】
ベクター：細胞内に導入され、したがって形質導入細胞を産生する核酸分子。ベクターには、複製の開始点のような、細胞内で複製することを許容する核酸配列が含まれ得る。ベクターにはまた、１つ以上の選別マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝的要素が含まれ得る。
【０１１８】
生合成経路の概説
図１〜３および１１〜１３で示したように、多くの生合成経路を使用して、モナチンまたはインドール−３−ピルビン酸またはＭＰのような、その中間体を産生可能である。各基質（例えば、グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸、およびＭＰ）の、各産物（例えば、トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸、ＭＰおよびモナチン）への変換のために、いくつかの異なるポリペプチドを使用可能である。さらに、これらの反応は、非酵素化学的反応を含むインビトロ反応のような、インビボ、インビトロで、またはインビボ反応およびインビトロ反応の組み合わせを介して、実施可能である。したがって、図１〜３および１１〜１３は、例示的であり、望む産物を得るために使用可能である多数の異なる経路を示している。
【０１１９】
グルコースからトリプトファン
多くの有機体が、グルコースからトリプトファンを合成可能である。グルコースおよび／またはトリプトファンから、モナチン、ＭＰおよび／またはインドール−３−ピルビン酸を産生するために必要な遺伝子（類）を含む構造（類）を、そのような有機体内にクローン化可能である。本明細書で、トリプトファンをモナチンに変換可能であることが示される。
【０１２０】
他の例において、有機体を、トリプトファンを産生するため、またはトリプトファンを過剰産生するために、公知のポリペプチドを用いて、遺伝子工学的に改変可能である。例えば、米国特許第４，３７１，６１４号明細書は、野生型トリプトファンオペロンを含むプラスミドを形質導入した大腸菌株を記述している。トリプトファンオペロン遺伝子には、ポリペプチドアントラニリル酸シンターゼ成分Ｉ（ＥＣ４．１．３．２７）、アントラニル酸シンターゼ成分ＩＩ（ＥＣ４．１．３．２７）、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．２４）／インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼ（ＥＣ４．１．１．４８）、トリプトファンシンターゼ、αサブユニット（ＥＣ４．２．１．２０）およびトリプトファンシンターゼ、ベータサブユニット（ＥＣ４．２．１．２０）をコードするトリプトファン生合成遺伝子が含まれ、その全てが、コリスミ酸からのトリプトファンの産生に関与する。
【０１２１】
米国特許第４，３７１，６１４号明細書にて開示されたトリプトファンの最大タイターは、約２３０ｐｐｍである。同様に、国際特許第ＷＯ８７０１１３０号は、トリプトファンを産生するように遺伝的に改変した大腸菌を記述しており、Ｌ−トリプトファンの発酵産生の増加を議論している。当業者は、グルコースからトリプトファンを産生可能な有機体がまた、同様の結果で、グルコースまたはフルクトース−６−リン酸へ変換され得る他の炭素およびエネルギー供給源を利用可能であることを認識するであろう。例示的な炭素およびエネルギー供給源には、限定はしないが、スクロース、フルクトース、デンプン、セルロース、またはグリセロールが含まれる。
【０１２２】
トリプトファン産生の増加
トリプトファン産生が、ほとんどの有機体で制御される。１つの機構は、経路において、特定の酵素のフィードバック阻害を介している。例えば、トリプトファンのレベルを増加させることによって、トリプトファンの産生率が減少可能である。したがって、トリプトファン中間体を介してモナチンを産生するように、遺伝子工学的に改変した宿主細胞を用いる場合、有機体を、トリプトファン濃度に感受性でないとして使用可能である。例えば、種々のトリプトファン類似体による増殖阻害に対して耐性である、カサランサス  ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）株を、他（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ，３４：５４１−５，１９７９）で記述されたように、高濃度の５−メチルトリプトファンに繰り返しさらすことによって選別可能である。この株の得られたトリプトファンシンターゼ活性は、遺伝子中の変異のために、産物阻害による影響を受けにくい。
【０１２３】
同様の方法を、フィードバック耐性を持つ株に関して選別するために使用可能である。例えば、（大腸菌遺伝的保存センター（Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ），Ｗ３１１０ｔｎａＡ２ｔｒｐＥｆｂｒ１９（Ｙａｎｏｆｓｋｙ他，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４，１９８４およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９５：１２５３，１９６８）からの）大腸菌株＃７６９２を、フィードバック耐性ａｒｏＧ  ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソニック  ７−リン酸）シンターゼを持つ変異体に関して選別するために、フェニルアラニン類似体類、ベータ−２−チエニルアラニン、ｍ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン上で増殖させることができる。この大腸菌株＃７６９２は、測定可能な量のトリプトファンを産生可能であり、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼをコードする核酸のような、外来核酸を挿入するための、開始宿主として利用可能である。他の大腸菌株であるＥ９７１（ＡＴＣＣ１５４９１）は、高レベルのＤＡＨＰシンターゼ、ならびに、親株よりもより高いレベルのインドールおよびトリプトファンを示している原栄養菌株である（Ｌｉｍ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｌｅｓ，１９６４  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８７：１０５１−１０５５）。この株は、フィードバック耐性が、増殖培地中で５−メチルトリプトファン類似体を用いて減少した、アントラニル酸シンターゼ（ＥＣ５．３．１．２４）変異体を得るために使用可能である。この株はまた、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼをコードする外来核酸を導入した宿主として利用可能でもある。
【０１２４】
トリプトファン産生は、産物阻害に対して感受性が低いポリペプチドを発展させるための、指向進化の利用を介して最適化可能である。例えば、スクリーニングを、培地中にトリプトファンを含まないが、高レベルの代謝不可能トリプトファン類似体を含むプレート上で実施可能である。米国特許第５，７５６，３４５号明細書、第４，７４２，００７号明細書および第４，３７１，６１４号明細書は、発酵有機体中で、トリプトファン産生性を増加させるために使用する方法を記述している。トリプトファン生合成の最後の段階は、セリンのインドールへの添加である。したがって、セリンの利用可能性は、トリプトファン産生を増強するために増加され得る。
【０１２５】
トリプトファン生合成に対する制御点は、酵素ＤＡＨＰシンターゼである。このポリペプチドの３つのアイソザイムは、以下の遺伝子、ａｒｏＦ、ａｒｏＧおよびａｒｏＨによってコードされ、それぞれ、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンによってフィードバック阻害可能である。Ｌ−チロシンフィードバック阻害ＤＡＨＰシンターゼは、総酵素活性の約２０％に寄与し、Ｌ−フェニルアラニンフィードバック阻害ＤＡＨＰシンターゼは、総酵素活性の８０％に寄与し、Ｌ−トリプトファン阻害ＤＡＨＰシンターゼは、総酵素活性に対して、非常にわずかな寄与しか提供しない。酵素がフィードバック耐性である変異体を得ることによって、この制御点が解除される株を提供可能である。一般的に、主要なフィードバック耐性標的は、ａｒｏＧおよびａｒｏＦである。
【０１２６】
フィードバック耐性変異体を単離するための１つのアプローチは、化学的または紫外線変異導入を利用し、アミノ酸類似体上で増殖可能である有機体に対して選択することである。フィードバック不感受性ａｒｏＧは、類似体ベータ−２−チエニルアラニンを用いて得ることが可能である（Ｄｕｄａ  ａｎｄ  Ｓａｓｖａｒｉ−Ｓｚｅｋｅｌｙ，（１９７３）Ａｃｔａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．８（２）：８１−９０）。類似体ｍ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンはまた、フィードバック不感受性ａｒｏＧ（Ｉｔｏ他，（１９９０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（３）：７０７−７１３）、ならびにｐ−フルオロフェニルアラニン（Ｈａｇｉｎｏ  ａｎｄ  Ｎａｋａｙａｍａ，（１９７４）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８（１）：１５７−１６１）を産生するために利用可能である。
【０１２７】
フィードバック耐性ＤＡＨＰシンターゼを得るための１つのアプローチは、アミノ酸類似体を使用し、もとの遺伝子が変異された株を作製することである。他のアプローチは、フィードバック耐性酵素をコードする遺伝子をクローン化することであって、異なるプロモーターの利用で、より柔軟性を提供し、転写制御の可能性を減少可能である（Ｉｔｏ他，（１９９０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（３）：７０７−７１３）。
【０１２８】
トリプトファン生合成における他の制御点は、分岐点酵素、アントラニル酸シンターゼであり、大腸菌中のｔｒｐＥおよびｔｒｐＤによってコードされる２成分タンパク質である。トリプトファンによるフィードバック阻害から放出される変異体は、アミノ酸類似体５−フルオロトリプトファンおよび５−メチルトリプトファンを用いて入手可能である（Ｓｈｉｉｏ他，（１９７５）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９（３）：６２７−６３５）。
【０１２９】
さらに、トリプトファンによる、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼおよびトリプトファンシンターゼのフィードバック阻害が、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）内で起こり得る。しかしながら、阻害のためのこれらの酵素の脱感作が伴い得る（Ｍａｔｓｕｉ他，（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５３３０−５３３２）。そのような変異体は、トリプトファンレベルの上昇を示し得、したがって、モナチンレベルの増加があることが予想される。
【０１３０】
細胞は、転写のレベルでの調製を含む、これらが合成するトリプトファンのレベルを制御する他の方法を利用する。コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、ＤＡＨＰシンターゼが、チロシンによって転写のレベルで制御され、５’調節領域の操作によって、この制御の救済によって、トリプトファン生合成を改善可能である（Ｓｈｉｉｏ，１９８６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｉｄａ，Ｋ．，Ｃｈｉｂｉｔａ，Ｌ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．，Ｔａｋｉｎａｍｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，Ｈ．Ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。大腸菌において、トリプトファン（ｔｒｐ）オペロンが、８０倍変化に対して原因である抑圧と、６〜８倍変化に対する減衰で、抑圧および減衰両方によって、転写レベルにて調節される。抑圧タンパク質である、ＴｒｐＲポリペプチドの不活性化が、ｔｒｐオペロンｍＲＮＡのレベルを増加可能である。リーダーペプチドが、荷電ｔＲＮＡtrpのレベルに対して応答する、ｍＲＮＡ二次構造を形成する。５’−制御減衰領域の欠損が、このさらなるレベルの制御を克服することを補助可能である（Ｙａｎｏｆｓｋｙ他，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４，１９８４）。ｔｒｐ−ＲＮＡ−結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）での減衰機構がまた、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにて観察され、それをコードする遺伝子のダウン−レギュレーションまたは欠損による減衰の救済によって、宿主有機体中のトリプトファン合成を改善可能である（Ｂａｂｉｔｚｋｅ  ａｎｄ  Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：５７９５−５８０２）。あるいは、抗ＴＲＡＰポリペプチドの発現をアップレギュレート可能である。
【０１３１】
トリプトファン産生を、トリプトファン経路でポリペプチドを過剰発現することによって増加可能であり、モナチンレベルを改善可能である。例えば、ａｒｏＦfbrの、および（シキメートキナーゼをコードする）ａｒｏＬの、トランスケトラーゼをコードする核酸の過剰発現が、トリプトファン産生を改善可能である。しかしながら、これらの配列の過剰発現は、細胞上、および最小培地中で代謝負担を引きおこし得、細胞は、種々の中間体を排出する。より栄養が豊富な培地を利用して、トリプトファンのレベルを増加可能である（Ｋｉｍ他，２０００，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０（６）：７８９−７９６）。さらに、解除ＤＡＨＰシンターゼ発現、解除アントラニル酸シンターゼ発現、およびホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする多重コピープラスミドを含む、Ｃ．グルタミカム細胞が、４３ｇ／Ｌまでの増加したトリプトファン産生を示し得る（Ｋａｔｓｕｍａｔａ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ，（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：９２１−９２５０）。
【０１３２】
フィードバックおよび／または転写制御の対象である、芳香族アミノ酸経路における他の酵素には、（ａｒｏＥによってコードされる）シキメートデヒドロゲナーゼおよび（ａｒｏＫ、ａｒｏＬによってコードされる）シキメートキナーゼＩ／ＩＩが含まれる。ａｒｏＥ遺伝子の突然変異が、フィードバック耐性酵素を提供可能である。ａｒｏＫおよびａｒｏＬは、チロシンによるネガティブ転写調節対象である。プロモーター領域の遺伝的操作、または調節遺伝子（ｔｒｐＲおよびｔｙｒＲ）の欠損が、チロシンによる制御を軽減可能である。
【０１３３】
フェニルアラニンおよびチロシンは、コリスム酸が、全ての３つの芳香族アミノ酸に対する共通の前駆体であり、トリプトファン代謝と、フェニルアラニン／チロシン代謝の間の分岐点であることから、その生合成が、チロシンより炭素を転用可能である、芳香族アミノ酸である。生合成フェニルアラニンおよびチロシン経路は、コリスム酸の消費を減少させるために欠損または崩壊可能であり、これは、コリスム酸ムターゼ／プレファネートデヒドロゲナーゼをコードするｐｈｅＡまたはｔｙｒＡ遺伝子の遺伝的ノックアウトによって達成可能である。コリスム酸ムターゼ酵素は、入手可能なコリスム酸に関して、アントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＤおよびｔｒｐＥ遺伝子産物）と競合する。芳香族アミノ酸経路に競合する崩壊または欠損の例示株には、大腸菌ＮＲＲＬ  Ｂ１２２６２（実施例１５を参照のこと）、大腸菌ＮＲＲＬ  Ｂ  １２２５８、大腸菌ＳＲ２５０（Ｒｏｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００３）３２７，５９３−６０３）、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ２１８４７（実施例１７を参照のこと）、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ２１８５０、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ２１８５１が含まれる。あるいは、フェニルアラニンおよびチロシン経路の欠損、および培地へのアミノ酸添加を必要とする以外に、ｔｒｐＥ遺伝子（または全トリプトファンオペロン）を、クローン化可能であり、アントラニル酸シンターゼが、ｐｈｅＡまたはｔｙｒＡと比較して、コリスム酸に対してより高い親和性を持つので、異種プロモーターを用いて過剰発現可能である（Ｄｏｐｈｅｉｄｅ他，（１９７２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７：４４４７−４４５２）。フェニルアラニンおよびチロシンへの炭素フローを減少させる他の方法は、それらの転写制御を改変することである。さらに、トリプトファンのインドールおよびピルビン酸への変換を触媒する酵素である、トリプトファナーゼポリペプチドの発現を減少させることが、トリプトファンの欠損の防止を手助け可能である（Ａｉｂａ他，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８２，４３：２８９−２９７）。
【０１３４】
１つの実施形態において、中心代謝を、モナチン産生を増加させるために、遺伝子工学的に改変可能である。本明細書で使用するように、適切なモナチン産生を得るために、選択した、または得た有機体は、野生型有機体以上に増加した速度で、トリプトファンを産生する能力を持つべきである。トリプトファンが最終産物ではなく、モナチンへの経路における中間体であることを考えると、より高濃度のトリプトファンを蓄積するための能力を持つだけではなく、それへの流速が増加している株を開発することが重要であり得る。多数の戦略を利用して、中心炭素代謝を遺伝子工学的に改変し、炭素を、高レベルのモナチンが産生可能であるように、シキメートおよびコリスム酸経路に伝達可能である。
【０１３５】
トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンのような、芳香族化合物の生合成における第一の段階は、ＤＡＨＰを形成するための、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびエリスロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）の濃縮である。種々の方法を利用して、各前駆体の利用可能性を増加させ、この第一反応のパフォーマンスを改善可能である。以下の５つの方法が、ＰＥＰ利用可能性を増加させるために利用可能である、手順の可能性のある例である。
【０１３６】
第一に、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）による、グルコース取り込みを介したＰＥＰの消費を除外可能である。グルコース輸送系の不活性化が、結果として、グルコースネガティブ変異体となり得る。ＰＴＳ-グルコース+変異体が単離された。これらのいくつかが輸送し、ガラクトースパーミアーゼ、グルコキナーゼおよびＡＴＰを介してグルコースをリン酸化し、ＰＥＰを消費しない（Ｆｌｏｒｅｓ他，（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：６２０−６２３およびＣｈｅｎ他，（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１３：７６８−７７５）。グルコースパーミアーゼ系は、グルコースをリン酸化するために、より多量のＡＴＰを必要とする。また多量のＰＥＰとなり得る、異なるグルコース輸送およびリン酸化系を、（ｇｌｆによってコードされた）グルコース促進物、（ｇｄｈＩＶによってコードされた）グルコースデヒドロゲナーゼ、および（ｇｌｋによってコードされた）グルコン酸キナーゼをコードする遺伝子の添加によって導入可能である（国際特許第ＷＯ９９／５５８７７号）。この機構によって、グルコン酸６−リン酸を産生可能であり、これは、ペントースリン酸経路中の中間体であり、したがって、本経路における炭素流速を増加可能であり、結果として、高レベルのＥ４Ｐとなる。
【０１３７】
第二に、ＰＥＰ消費酵素、ＰＥＰカルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）およびピルビン酸キナーゼ類（例えばＰｙｋＡおよびＰｙｋＢ）を不活性化して、利用可能なＰＥＰのプールを増加可能である（Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ他，（２００１）Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．，３，２８９−３００）。
【０１３８】
第三に、ＰＴＳまたはピルビン酸キナーゼ類のいずれかで形成されたピルビン酸を、ＰＥＰシンターゼ（Ｐｐｓ）の発現を増強することによって、ＰＥＰに再び再環状化可能である（Ｐａｔｎａｉｋ他，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４６：３６１−３７０、およびＹｉ他，（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１８：１１４１−１１４８）。
【０１３９】
第四に、グルコース新生調節を、グルコース新生を増加させ、ＰＥＰ代謝に関与する種々の酵素の調節に影響を与え、解糖を減少させ、ＰＥＰレベルを増加させ得る、ｃｓｒＡ遺伝子（炭素保存調節物）を崩壊させることによって、改変可能である（Ｔａｔａｒｋｏ他，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３（１）：２６−３２）。
【０１４０】
第五に、ＰＥＰ消費を、グルコースとは違い、細胞への輸送のためのＰＴＳ系を回避する、キシロースのような糖を供給することによって減少させることができる。
【０１４１】
Ｅ４Ｐの利用可能性を増加させるために、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔＡ遺伝子、および／またはトランスアルドラーゼをコードするｔａｌＢ遺伝子を過剰発現させることが出来る。トランスケトラーゼの発現は、芳香族経路内へ、炭素流速を指向することにおいて、より効果的であり得る（Ｌｉａｏ他，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５２：１２９−１４０）。例えば、改変ペントースリン酸経路での、コリネバクテリウム・グルタミカム株を使用して、トリプトファンを産生可能である（ＫＹ９２１８含有ｐＫＷ９９０１；Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｍａｔａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，６５（６）：２４９７−５０２）。
【０１４２】
これらの方法の任意の組み合わせを使用可能である。例えば、これらの改変のいくつかの組み合わせを、大腸菌株に適用可能である。ｔｋｔＡを過剰発現した、ＰＴＳ-グルコース+、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＢ株において、芳香族経路への炭素流速における、およそ２０倍の増加が達成可能である（Ｇｏｓｓｅｔ他，（１９９６）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：４７−５２）。さらに、これらの方法は、他の改変と組み合わせて、トリプトファン生合成経路で後に発生するボトルネック（例えば、芳香族経路のトリプトファン枝における遺伝子の過剰発現、コリスム酸の消費を避けるｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子の欠損、アントラニル酸の合成を増加させるｔｒｐＥおよびｔｒｐＤの過剰発現）を減少させ、トリプトファン産生を増加させることが可能である。産生されたトリプトファンは、モナチンのような産物へさらに変換され得るので、細胞内で蓄積する必要はない。
【０１４３】
トリプトファンの産生、および続くモナチンの産生は、セリンの産生に導かれる経路での変更によって利益が生じる。セリンは、トリプトファンの産生の最後の段階で必要であり、セリンのインドール−３−グリセロリン酸の反応を含む。この反応は、トリプトファンシンターゼポリペプチドによって触媒される。トリプトファン経路を介した、炭素流速の増加が、結果として、新しい問題発生を伴い、いくつかの反応での不安定さとなり得る。セリンは、別の経路によって産生されるので、その産生速度が、トリプトファンの産生における律速因子となり得る。セリン経路を介した炭素流速は、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＧ；Ｉｋｅｄａ他，（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（４）：６７４−６７８）をコードする、この経路の第一遺伝子の過剰発現によって増加させることが出来る。
【０１４４】
ピルビン酸産生の増加
有機体によって産生されたモナチンの量は、宿主有機体によって産生されたピルビン酸の量を増加させることによって増強可能である。モナチンの産生のための１つの経路は、モナチンの４−ケト酸誘導体を形成するための、ピルビン酸とのインドール−３−ピルビン酸の反応に依存する。この反応を先に進めるために、ピルビン酸へ多量の炭素を転換可能である有機体が、モナチンの産生のための宿主として有用である。ピルビン酸過剰産生物を選別可能であり、高濃度の酸に耐性である必要はないが、より多くの炭素をピルビン酸に転換するように、その代謝経路において、解除される。トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）（Ｗａｎｇ他，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：３３８−４２，２００２）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびカンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）（以前はトルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）として知られていた）（Ｌｉ他，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：４５１−９，２００１）のような特定の酵母が、グルコースからピルビン酸を過剰産生し（５０ｇ／Ｌまで）、本明細書で記述した産物を産生するために使用可能である。
【０１４５】
これらの異なる株のチアミン栄養要求株は、ピルビン酸の酸化脱炭素化が、チアミン依存ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）の活性の減少によって弱まるので、チアミン制限下でピルビン酸を蓄積する。リポ酸がＰＤＨの共因子である。そのようにして、大腸菌株Ｗ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５；Ｋａｗａｓａｋｉ他，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８２：６０４−６、１９９６）のような、リポ酸栄養要求株は、有意な程度まで（＞２５ｇ／Ｌ）ピルビン酸を蓄積可能である（Ｙｏｋｏｔａ他，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４１：６３８−６４３，１９９４）。ピルビン酸産生の速度および量は、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ欠損遺伝子を、Ｗ１４８５ｌｉｐ２株内に導入することによって、さらに増加可能である。この変異は結果として、エネルギー産生の細胞欠損となり、解糖を介した炭素流速の増加によって埋め合わされる傾向にあり、したがって、より多量のピルビン酸が産生される（Ｙｏｋｏｔａ他，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８３：１３２−１３８，１９９７）。二重変異株を利用して、トリプトファン（Ｋａｗａｓａｋｉ他，１９９６、上記）、ロイシンおよびバリン（米国特許第５，８８８，７８３号明細書および第６，２１４，５９１号明細書）を含む、種々のアミノ酸を過剰産生する、宿主細胞を産生可能である。
【０１４６】
ピルビン酸−デヒドロゲナーゼ複合体中の変異に加えて、ピルビン酸産生におけるさらなる改善を、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸フェレドキシン−オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸−ホルミエートリアーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、および／またはピルビン酸オキシダーゼの発現を削除すること、または減少させることによって実施可能である。例えば、国際特許第ＷＯ０３／０００９１３号を参照のこと。
【０１４７】
ピルビン酸過剰産生株におけるトリプトファナーゼ遺伝子の過剰発現を、インドールからトリプトファンを産生するために使用可能である（Ｋａｗａｓａｋｉ他，１９９６、上記）。ピルビン酸の過剰産生は、トリプトファンの産生を改善可能であり、また、モナチン前駆体の形成に関して、多量の基質レベル（ピルビン酸およびインドール−３−ピルビン酸の両方）を提供する。あるいは、トリプトファナーゼ遺伝子を使用する場合、過剰なアンモニアの存在下、ピルビン酸およびインドール両方を同時に供給することが可能である。界面活性剤を、インドールの可溶性を増加させるために利用可能であり、またはインドールを、毒性および沈殿を最小化するために、連続して供給可能である。
【０１４８】
トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸
種々のポリペプチドを利用して、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換可能である。例示的なポリペプチドには、限定はしないが、酵素種類（ＥＣ）２．６．１．２７、１．４．１．１９、１．４．９９．１、２．６．１．２８、１．４．３．２、１．４．３．３、２．６．１．５、２．６．１．−、２．６．１．１および２．６．１．２１のメンバーが含まれる。これらの種類には、限定はしないが、Ｌ−トリプトファンおよび２−オキソグルタル酸を、インドール−３−ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸に変換する、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（また、Ｌ−フェニルアラニン−２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、トリプトファントランスアミナーゼ、５−ヒドロキシトリプトファン−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、ヒドロキシトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファントランスアミナーゼ、およびＬ−トリプトファン：２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）、Ｄ−トリプトファンおよび２−オキソ酸を、インドール−３−ピルビン酸およびアミノ酸に変換する、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファンおよびＮＡＤ（Ｐ）を、インドール−３−ピルビン酸およびＮＨ3およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換する、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（またＮＡＤ（Ｐ）−Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−Ｔｒｐ−デヒドロゲナーゼ、ＴＤＨおよびＬ−トリプトファン：ＮＡＤ（Ｐ）オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）とも呼ばれる）、Ｄ−アミノ酸およびＦＡＤを、インドール−３−ピルビン酸およびＮＨ3およびＦＡＤＨ2に変換する、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−トリプトファンおよびフェニルピルビン酸を、インドール−３−ピルビン酸およびＬ−フェニルアラニンに変換する、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（またＬ−トリプトファン−α−ケトイソカプロン酸アミノトランスフェラーゼおよびＬ−トリプトファン：フェニルピルビン酸アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）、Ｌ−アミノ酸およびＨ2ＯおよびＯ2を、２−オキソ酸およびＮＨ3およびＨ2Ｏ2に変換する、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（また、オフィオ−アミノ−酸オキシダーゼおよびＬ−アミノ−酸：酸素オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）とも呼ばれる）、Ｄ−アミノ酸およびＨ2ＯおよびＯ2を、２−オキソ酸およびＮＨ3およびＨ2Ｏ2に変換する、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（また、オフィオ−アミノ−酸オキシダーゼおよびＤ−アミノ−酸：酸素オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）とも呼ばれる）、Ｌ−トリプトファンおよびＨ2ＯとＯ2を、インドール−３−ピルビン酸およびＮＨ3とＨ2Ｏ2に変換する、トリプトファンオキシダーゼと呼ばれるポリペプチドが含まれる。これらの種類にはまた、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸（またはＤ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ、および多重アミノトランスフェラーゼ活性を持つ広範囲（多重基質）アミノトランスフェラーゼが含まれ、そのいくつかが、トリプトファ���および２−オキソ酸を、インドール−３−ピルビン酸およびアミノ酸に変換可能である。
【０１４９】
そのような活性を持つアミノトランスフェラーゼ種類の１１のメンバーが、以下実施例１で記述されており、配列番号１１および１２で示した新規のアミノトランスフェラーゼが含まれる。したがって、本開示物は、それぞれ配列番号１１および１２で表されている配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つ、単離した核酸配列およびアミノ酸を提供する。また、アミノトランスフェラーゼ活性を持っているか、またはアミノトランスフェラーゼ活性を維持しているポリペプチドをコードする、配列番号１１および１２で表されている配列の断片および融合物が、本開示物に含まれている。例示的な断片には、限定はしないが、配列番号１１の、少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００または１０００連続ヌクレオチド、または配列番号１２の、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００または３５０連続アミノ酸が含まれる。開示された配列（およびその変異体、断片および融合物）は、ベクターの一部であり得る。ベクターを、宿主細胞を形質導入するために使用可能であり、それによって、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を産生可能な組換え体細胞を産生し、いくつかの例にて、さらにＭＰおよび／またはモナチンを産生可能である。
【０１５０】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１．４．３．２）が公知であり、配列が、ビペラ・レベチン（Ｖｉｐｅｒａ  ｌｅｂｅｔｉｎｅ）（ｓｐＰ８１３７５）、オフィオファガス・ハンナ（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ  ｈａｎｎａｈ）（ｓｐＰ８１３８３）、アグキストロドン・ロードストーマ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）（ｓｐＰ８１３８２）、クロタラス・アトロックス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘ）（ｓｐＰ５６７４２）、ブルクホルデリア・セパチア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ）、クラミドモナス・レインハルディティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびロードコッカスｓｔｒ．（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｒ．）のような、種々の異なる供給源より単離可能である。さらに、トリプトファンオキシダーゼ類が、文献にて記述されており、例えば、コプリナスｓｐ．（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＳＦ−１、クラブ根病を持つ白菜、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）および哺乳動物肝臓より単離可能である。
【０１５１】
トリプトファンデヒドロゲナーゼが公知であり、例えば、ほうれん草、ピスム・サチバム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、プロソピス・ジュリフロラ（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｊｕｌｉｆｌｏｒａ）、エンドウ豆、メスキート、小麦、トウモロコシ、トマト、たばこ、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、およびラクトバチリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）から単離可能である。多くのＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列が公知である。
【０１５２】
図１１〜１３で示したように、トリプトファンオキシダーゼのようなアミノ酸オキシダーゼを利用して、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する場合、カタラーゼを、過酸化水素の存在を減少させる、または削除するために加えることが可能である。
【０１５３】
インドール−３−乳酸からインドール−３−ピルビン酸
インドール−３−乳酸をインドール−３−ピルビン酸に変換する反応は、ポリペプチドの１．１．１．１１０，１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３、１．１．１．２２２、１．１．１．２３７、１．１．３．−、または１．１．１．１１１クラスのメンバーのような、種々のポリペプチドによって触媒され得る。ポリペプチドの１．１．１．１１０クラスには、インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（またインドール乳酸：ＮＡＤ+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。１．１．１．２７、１．１．１．２８および１．１．２．３クラスには、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（また乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸塩：ＮＡＤ+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。１．１．１．２２２クラスには、（Ｒ）−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（またＤ−芳香族乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｒ−芳香族乳酸デヒドロゲナーゼ、およびＲ−３−（４−ヒドロキシフェニル）乳酸：ＮＡＤ（Ｐ）+２−オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれ、および１．１．１．２３７クラスには３−（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸）レダクターゼ（また、ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼおよび４−ヒドロキシフェニル乳酸：ＮＡＤ+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。１．１．３．−クラスには、乳酸オキシダーゼが含まれ、１．１．１．１１１クラスには、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（また、（Ｓ）−３−（イミダゾール−５−イル）乳酸：ＮＡＤ（Ｐ）+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。これらのクラス中のポリペプチドのいくつかによって、インドール−３−乳酸からの、インドール−３−ピルビン酸の産生が許容される可能性がある。
【０１５４】
化学反応もまた、インドール−３−乳酸を、インドール−３−ピルビン酸へ変換するために使用可能である。そのような化学反応は、例えば、Ｂ２触媒（Ｃｈｉｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，Ｖｏｌ．１３，ｎｏ．２８，ｐｇ．１８（１），２００２）、希釈過塩素酸過マンガン酸、または金属触媒存在下での過酸化水素を用いる空気酸化のような、いくつかの方法を用いて実施可能である酸化段階を含む。
【０１５５】
インドール−３−ピルビン酸から、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）
いくつかの公知のポリペプチドを、インドール−３−ピルビン酸＋ピルビン酸のような三炭素供給源をＭＰに変換するために使用可能である。例示的なポリペプチドクラスには、４．１．３．−、４．１．３．１６、４．１．３．１７および４．１．２．−が含まれる。これらのクラスには、２つのカルボン酸基質の濃縮を触媒するアルドースのような、炭素−炭素シンターゼ／リアーゼが含まれる。ポリペプチドクラスＥＣ４．１．３．−は、求核試薬として、（インドール−３−ピルビン酸のような）オキソ−酸基質を用いて、炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼであり、ＥＣ４．１．２．−は、求核試薬として、（ベンズアルデヒドのような）アルデヒド基質を用いる、炭素−炭素結合を形成する、シンターゼ／リアーゼである。
【０１５６】
例えば、欧州特許第１０４５−０２９号で記述されたポリペプチド（ＥＣ４．１．３．１６、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシレート−リアーゼ、また４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼ、またはＫＨＧアルドラーゼとも呼ばれる）は、グルコキシル酸およびピルビン酸を、４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸に変換し、ポリペプチド４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７、また４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸−リアーゼまたはＰｒｏＡアルドラーゼとも呼ばれる）は、２つのピルビン酸のような２つのケト−酸を、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸に濃縮する。これらのリアーゼを利用する反応が本明細書で記述されている。
【０１５７】
図１〜２および１１〜１３は、３−炭素（Ｃ３）分子が、インドール−３−ピルビン酸と結合する、これらの反応の略図的ダイアグラムを示している。ＥＣ４．１．２．−および４．１．３．−の多くのメンバー、とりわけＰＬＰ−利用ポリペプチドが、セリン、システインおよびアラニンのようなアミノ酸であるＣ３分子、またはその誘導体を利用可能である。ＥＣ４．１．２．−および４．１．３．−の代表によって触媒されるアルドール濃縮は、ピルビン酸またはピルビン酸の誘導体への本経路の３つの炭素分子を必要とする。しかしながら、他の化合物を、Ｃ３炭素供給源として利用可能であり、ピルビン酸に変換可能である。アラニンを、多くの上述した物を含む、多くのＰＬＰ−利用トランスアミナーゼによってトランスアミン化して、ピルビン酸を産生可能である。ピルビン酸およびアンモニアを、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、およびＯ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリンおよび３−クロロ−Ｌ−アラニンのような、十分な脱離基を持つセリンおよびシステインの誘導体の、（トリプトファナーゼまたはベータ−チロシナーゼによって触媒されるもののような）ベータ−脱離反応によって得ることが出来る。アスパラギン酸を、トリプトファナーゼ（ＥＣ４．１．９９．１）および／またはβ−チロシナーゼ（ＥＣ４．１．９９．２、また、チロシン−フェノールリアーゼとも呼ばれる）によって触媒されるもののようなＰＬＰ−仲介β−リアーゼ反応において、ピルビン酸の供給源として利用可能である。ベータ−リアーゼ反応の速度を、Ｍｏｕｒａｔｏｕ  （Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１３２０−５，１９９９）によって記述されたように、および実施例５で記述したように、（４．１．９９．１−２）ポリペプチド上で、部位特異的変異導入を実施することによって増加可能である。これらの改変によって、ポリペプチドが、ジカルボン酸アミノ酸基質類を許容する。乳酸をまた、ピルビン酸の供給源として利用可能であり、乳酸デヒドロゲナーゼ、酸化共因子または乳酸オキシダーゼおよび酸素の添加によって、ピルビン酸に酸化される。これらの反応の例が、以下に記述されている。例えば、図２および図１１〜１３で示したように、ピルビン酸をＣ３分子として利用する場合に、ＰｒｏＡアルドラーゼを、インドール−３−ピルビン酸と接触させることが出来る。
【０１５８】
ＭＰからモナチン
ＭＰのモナチンへの変換は、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ類（２．６．１．２７）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ類（１．４．１．１９）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ類（１．４．９９．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ類（１．４．１．２〜４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ類（２．６．１．２８）、または、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．５）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼまたはＤ−アラニン（２．６．１．２１）アミノトランスフェラーゼのような、アミノトランスフェラーゼファミリー（２．６．１．−）のより一般的なメンバーの、１つ以上によって触媒可能である（図２）。配列番号１１および１２で示した新規クラスメンバーを含む、アミノトランスフェラーゼクラスの１１のメンバーを以下に記述しており（実施例１）、アミノトランスフェラーゼおよびデヒドロゲナーゼ酵素の活性を示している反応を、実施例４で提供している。
【０１５９】
本反応はまた、化学的反応を用いて実施可能である。ケト酸（ＭＰ）のアミン化は、アンモニアおよびシアノボロハイドライドナトリウムを用いる、還元アミン化によって実施される。
【０１６０】
図１１〜１３は、ＭＰをモナチンに変換するために使用可能である、さらなるポリペプチド類を示しており、同時に、インドール−３−ピルビン酸またはトリプトファンからのモナチンの収率の増加を提供する。例えば、アスパラギン酸をアミノドナーとして利用する場合、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを、アスパラギン酸をオキサロ酢酸に変換するために使用可能である（図１１）。オキサロ酢酸を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのようなデカルボキシラーゼによって、ピルビン酸および二酸化炭素に変換する（図１１）。さらに、リシンをアミノドナーとして利用する場合、リシンイプシロンアミノトランスフェラーゼを、リシンをアリシンに変換するために利用可能である。（図１２）。アリシンは自発的に、１−ピペリジン６−カルボン酸に変換される（図１２）。還元アミン化反応を触媒可能なポリペプチド（例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）を、ＭＰをモナチンに変換するために使用する場合、ギ酸デヒドロゲナーゼのような、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをリサイクルし、および／または揮発性産物を産生可能なポリペプチド（図１３）を利用可能である。
【０１６１】
モナチン産生を増加させるためのさらなる方法
モナチン産生を増加させるために使用可能な遺伝的に改変した株の他の例には、以下が含まれる。
１）大腸菌ＡＧＸ１７５７を、Ｗ３１１０（プラスミドｐＳＣ１０１＋ｔｒｐｌとｔｒｐＡＥ１、ｔｒｐＲ、ｔｎａＡ）から単離可能である。ＮＴＧ変異導入を実施可能であり、６−フルオロトリプトファンまたは５−メチルトリプトファン耐性を選別する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６１の添加を使用して、産生性を増加させるために、培地中で、トリプトファンまたはモナチンを結晶化可能である。
２）Ｐｘ−１１５−９７から由来したＣ．グルタミカムＫＹ９２２５は、フェニルアラニンおよびチロシン二重栄養要求性を示し、トリプトファン阻害に対するアントラニル酸シンターゼ耐性を持つ。
３）ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）１０４１ｔｒｐＥを変異導入し、トリプトファンフィードバック阻害に対して脱感作させた。遺伝子が、アルギニンによって置換されたセリン残基を持つことがわかった。推定アテニュエーター中の末端構造でのグアニンのアデニンへの変異が、同様に転写制御を軽減することがわかった（Ｍａｔｓｕｉ他，（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６：５３３０−５３３２）。
【０１６２】
前駆体の利用可能性を最適化し、モナチン産生を最大化することにおいて、有用であり得るさらなる改変には、限定はしないが、（１）モナチン取り込みを促進可能であるポリペプチド類をコードする遺伝子を欠損させること、（２）経路を競合することに関与するポリペプチド類をコードする遺伝子を欠損させること、またはダウンレギュレートすること、（３）アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼポリペプチド発現をアップレギュレートすること、（４）正しくない形態のモナチンを産生する、アミノトランスフェラーゼポリペプチド類をコードする遺伝子を欠損させること、および（５）ＰＬＰ利用可能性を増加させること、が含まれる。モナチン取り込みを促進可能であるポリペプチド類をコードする遺伝子には、バシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アスパラギン酸取り込みトランスポーター（ＹｖｅＡ；Ｌａｒｃａ他，２００３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８５（１０）：３２１８−２２）、Ｇｌｔ−１  Ｌ−グルタミン酸／Ｌ−アスパラギン酸／Ｄ−アスパラギン酸取り込みポリペプチド（シンポーター類）、およびＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｇｌｕＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄグルタミン酸取り込み遺伝子が含まれ得る。競合経路に関与するポリペプチドをコードする遺伝子は、インドールが、トリプトファン産生のための基質として利用出来る場合を除いて、（トリプトファナーゼポリペプチドをコードする）ｔｎａＡ遺伝子であり得る。
【０１６３】
生合成経路の設計におけるさらなる考慮
インドール−３−ピルビン酸、ＭＰ、および／またはモナチンを産生するためにどのポリペプチドを使用するか、に依存して、共因子、基質および／またはさらなるポリペプチドを、産物形成を増強するために、産生細胞に提供可能である。さらに、遺伝的改変を、インドール−３−ピルビン酸、ＭＰ、および／またはモナチンのような産物の産生を増強するために設計可能である。同様に、モナチン産生のために利用した宿主細胞を最適化可能である。
【０１６４】
本明細書で記述するように、大腸菌または（クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）およびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）株のような）腸内細菌科、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム株、バシルス株およびサッカロマイセス株のような任意の有機体を、インドール−３−ピルビン酸、ＭＰ、および／またはモナチンのような産物を産生するために使用可能である。例えば、（多くの問題のある副産物となる）アントラニル酸からトリプトファンを過剰産生するために遺伝子工学的に改変した、バシルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、効果的に産物を産生するために改変可能である。さらに、グルタミン酸を産生する、そしてリシンのような他のアミノ酸を効果的に産生するように改変した、野生型ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株が存在する。Ｔ．Ｏｋａ，「アミノ酸、産生工程（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍ．Ｃ．Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｗ．Ｄｒｅｗ，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．８９−１００。さらに、本明細書で記述した有機体を、（１）低費用の基質上で増殖可能であるように、好ましい増殖動力学を持つ、（２）モナチンのような産物を分泌する、および／または（３）トリプトファンおよびピルビン酸のような、モナチンに対する高レベルの前駆体を産生する、ために選別または設計可能である。そのような有機体は、簡単に入手可能な遺伝的ツールで、および／または食物成分を産生することにおいて安全な利用の歴史を持つ、よく特性化された種からのものであり得る。
【０１６５】
１．過酸化水素の除去
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は、産生されたならば、産生細胞に対して毒性であり得、産生されたポリペプチドまたは産物（例えば中間体）に障害を与え得る産物である。以上で記述したＬ−アミノ酸オキシダーゼは、産物としてＨ2Ｏ2を産生する。したがって、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを利用する場合、細胞または産物に対する可能性のある障害を減少するために、得られたＨ2Ｏ2を除去するか、またはそのレベルを減少させ得る。
【０１６６】
カタラーゼを、細胞内のＨ2Ｏ2のレベルを減少するために利用可能である（図１１〜１３）。産生細胞は、カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）をコードする遺伝子またはｃＤＮＡ配列を発現可能であり、水および酸素気体への過酸化水素の分解を触媒する。例えば、カタラーゼを、産生細胞内にトランスフェクトしたベクターから発現させることが出来る。利用可能なカタラーゼの例には、制限はしないが、ｔｒ｜Ｑ９ＥＶ５０（スタフィロコッカス・キシロサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ））、ｔｒ｜Ｑ９ＫＢＥ８（バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、ｔｒ｜Ｑ９ＵＲＪ７（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、ｔｒ｜Ｐ７７９４８（ストレプトマイセス・コエリカラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ））、ｔｒ｜Ｑ９ＲＢＪ５（キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））（ＳｗｉｓｓＰｏｒｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．）が含まれる。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはトリプトファンオキシダーゼを利用する生体触媒反応物もまた、カタラーゼポリペプチドを含み得る。
【０１６７】
２．ピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）利用可能性の調節
図１で示すように、ＰＬＰを、１つ以上の、本明細書で記述した生合成段階にて利用可能である。ＰＬＰが反応の総効率における制限にならないように、ＰＬＰの濃度を加えることが可能である。
【０１６８】
ビタミンＢ6（ＰＬＰの前駆体）のための生合成経路が、大腸菌において、完全に研究されてきており、タンパク質のいくつかが結晶化されてきた（Ｌａｂｅｒ他，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４９：４５−８，１９９９）。２つの遺伝子（ｅｐｄまたはｇａｐＢおよびｓｅｒＣ）が、他の代謝経路で必要であり、３つの遺伝子（ｐｄｘＡ、ｐｄｘＢおよびｐｄｘＪ）が、ピリドキサールリン酸生合成に対して固有である。大腸菌経路における開始物質の１つが、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）である。この前駆体の、共通２および３炭素中心代謝からの合成は、ポリペプチド１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）によって触媒される。他の前駆体は、４−炭素糖、Ｄ−エリスロース４−リン酸から形成されるチロシン誘導体である。ホスホ−４−ヒドロキシル−Ｌスレオニン（ＨＴＰ）を変換するために必要な遺伝子は、ｅｐｄ、ｐｄｘＢおよびｓｅｒＣである。ＰＬＰの形成のための最後の反応は、複合分子内濃縮およびＤＸＰおよびＨＴＰ間の閉環反応であり、ｐｄｘＡおよびｐｄｘＪの遺伝子産生によって触媒される。
【０１６９】
ＰＬＰが、モナチンを産生するための、発酵の間の制限栄養になる場合、産生宿主細胞における、経路遺伝子の１つ以上の発現の増加が、モナチンの収率を増加させるために利用可能である。宿主有機体は、その本来の経路遺伝子の多数のコピー、または有機体ゲノム内に組み入れられ得る非天然の経路遺伝子のコピーを含み得る。さらに、復旧経路遺伝子の多数のコピーを、宿主有機体内にクローン化可能である。
【０１７０】
全ての有機体で保存される、１つの復旧経路は、活性ＰＬＰ形態に対して、ビタミンＢ6の種々の誘導体をリサイクルする。この経路に関連するポリペプチドは、ｐｄｘＫキナーゼ、ｐｄｘＨオキシダーゼおよびｐｄｘＹキナーゼである。１つ以上のこれらの遺伝子の過剰発現が、ＰＬＰ利用可能性を増加可能である。
【０１７１】
ビタミンＢ6のレベルは、宿主有機体中の、天然の生合成経路遺伝子の代謝調節の削除または抑制によって増加させることができる。ＰＬＰは、バクテリウム・フラボバクテリウムｓｐ．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）株２３８−７中の、前駆体スレオニン誘導体の生合成に関与するポリペプチドを抑制する。この細菌株、代謝対照の解放は、ピリドキサール誘導体を過剰産生し、２０ｍｇ／ＬのＰＬＰまで分泌する。同様の様式でモナチンを産生する宿主有機体の遺伝的操作によって、生合成経路遺伝子の過剰発現なしで、産生ＰＬＰを増加させる可能性がある。
【０１７２】
３．アンモニア利用
トリプトファナーゼ反応を、アンモニアをより利用可能にすることによって、または水を除去することによって、合成の方向（インドールからのトリプトファンの産生）に誘導可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒されるもののような、還元アミン化反応もまた、過剰のアンモニアによって進めることが可能である。
【０１７３】
アンモニアを、炭酸またはリン酸緩衝系中で、炭酸アンモニアまたはリン酸アンモニウム塩として利用可能にできる。アンモニアをまた、ピルビン酸アンモニアまたはギ酸アンモニアとして提供可能である。あるいは、アンモニアを、グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはトリプトファンデヒドロゲナーゼのような、アンモニアを産生する反応と連結する場合に供給可能である。アンモニアを、ＥＣ４．１．９９．−の天然の基質（チロシンまたはトリプトファン）の添加によって産生可能であり、フェノールまたはインドール、ピルビン酸およびＮＨ3に加水分解され得る。これによってまた、酵素にその好ましい基質を加水分解させることにより、正常の等価量において、合成産物の収率を増加させる。
【０１７４】
４．産物および副産物の除去
反応が、グルタミン酸を産生し、共基質２−オキソグルタル酸（α−ケトグルタル酸）を必要とするので、トリプトファンアミノトランスフェラーゼを介した、トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換が、インドール−３−ピルビン酸の産生速度に悪影響を与え得る。グルタミン酸が、アミノトランスフェラーゼの阻害を引き起こし得、この反応は多量の共基質を消費し得る。さらに、高濃度のグルタミン酸が、下流分離工程に対して不利益であり得る。
【０１７５】
ポリペプチドグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）は、グルタミン酸を２−オキソグルタル酸に変換し、それによって、トリプトファンアミノトランスフェラーゼによって触媒された反応中で、共基質をリサイクルする。ＧＬＤＨはまた、好気性条件下、細胞（ＡＴＰ）のためのエネルギーを産生するために利用可能である還元等価物（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）も産生する。ＧＬＤＨによるグルタミン酸の利用がまた、副産物形成を減少させる。さらに、この反応はアンモニアを産生し、細胞に対する窒素供給源として、または図１で示した最終段階のための、還元アミン化での基質として利用可能である。したがって、ＧＬＤＨポリペプチドを過剰発現する産生細胞を利用して、収率を増加させ、培地の費用および／または分離工程を減少させることが出来る。
【０１７６】
トリプトファンのモナチンへの経路において、段階３のアミノドナー（例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸）が、適切な酵素クラスからのアミノトランスフェラーゼを利用する場合に、段階１のために必要なアミノアクセプター（例えば２−オキソ−グルタル酸またはオキサロ酢酸）に変換され戻され得る。１つのトランスアミナーゼの基質が、他のトランスアミナーゼの活性を競合的に阻害しない、本経路のための２つの別のトランスアミナーゼの利用が、本経路の効果を増加可能である。
【０１７７】
記述した経路における多くの反応が、可逆性であり、したがって、基質と産物間の平衡に達する。経路の収率を、ポリペプチドからの産物の連続的な除去によって増加可能である。例えば、ペルメアーゼまたは他の輸送タンパク質両方を用いる発酵ブロス内へのモナチンの分泌、または基質の付随するリサイクルで、生物触媒反応物ストリームからのモナチンの選択的結晶化が、反応収率を増加させ得る。
【０１７８】
さらなる酵素的反応を介して、またはアミノドナー基の置換を介しての副産物の除去が、反応収率を増加させる他の方法である。例えば、副産物は、相変化（例えば最終産物の沈殿）によって、または二酸化炭素のような、揮発性最終産物への自発的な変換によってのいずれかで、逆方向で反応するために利用できないように産生可能である。
【０１７９】
５．基質プールの調節
インドールプールを、トリプトファン前駆体の産生を増加させること、および／またはインドール−３−ピルビン酸および／またはトリプトファンを含む異化経路を変更すること、によって調節可能である。例えば、インドール−３−ピルビン酸からの、インドール−３−酢酸の産生を、宿主細胞中、ＥＣ４．１．１．７４をコードする遺伝子を機能的に欠損させることによって、減少または削除可能である。トリプトファンからのインドールの産生は、宿主細胞中のＥＣ４．１．９９．１をコードする遺伝子を機能的に欠損させることによって、減少または削除可能である。あるいは、過剰なインドールを、ＥＣ４．１．９９．１をコードする多量の遺伝子との組み合わせで、インビトロまたはインビボ工程で、基質として利用可能である（Ｋａｗａｓａｋｉ他，Ｊ．Ｆｅｒｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．，８２：６０４−６、１９９６）。
【０１８０】
さらに、Ｄ−エリスロース−４−リン酸およびコリスム酸のような、中間体のレベルを増加させるために、遺伝的改変を実施可能である。
【０１８１】
６．キラリティーの制御
モナチンの風味プロファイルを、その立体化学（キラリティー）を制御することによって変化可能である。例えば、異なるモナチンの異性体は、異なる食物系については異なる濃度のブレンドで望ましいことがある。キラリティーは、ｐＨおよびポリペプチドの組み合わせを介して制御可能である。
【０１８２】
【化２】
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【０１８３】
モナチン（以上の番号付けした分子を参照のこと）のＣ−４位でのラセミ化が、α炭素の脱プロトン化および再プロトン化によって起こり得、それは、ｐＨのシフトによって、または溶液中で、ラセマーゼのような酵素と結合した、または遊離の共因子ＰＬＰとの反応によって、起こり得る。微生物中で、ｐＨは、ラセミ化が起こるのに十分なほどシフトする見込みがないが、ＰＬＰは豊富である。ポリペプチドでのキラリティーを制御するための方法は、モナチン産生のために利用した生合成経路に依存する。
【０１８４】
モナチンが、図２で示した経路を用いて形成される場合、以下が考慮可能である。生物触媒反応において、炭素−２のキラリティーは、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換する酵素によって決定され得る。多数の酵素（例えばＥＣ４．１．２．−、４．１．３．−から）は、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換可能であり、したがって、望む異性体を形成する酵素が選択可能である。あるいは、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換する酵素のエナンチオ特異性を、指向進化の利用を介して改変可能であり、または望む反応を触媒するように、触媒抗体を遺伝子工学的に改変可能である。一旦（酵素的、または化学的濃縮によって）ＭＰが産生されたならば、アミノ基を、本明細書で記述したもののような、トランスアミナーゼを用いて、立体特異的に加えることが可能である。炭素−４のＲまたはＳ配座のいずれかは、どのＤ−またはＬ−芳香族酸アミノトランスフェラーゼを利用するかに依存して産生可能である。ほとんどのアミノトランスフェラーゼは、好ましくは、基質のＬ−異性体と反応するが、しかし、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼが、特定の植物に存在する（Ｋｏｈｉｂａ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ6  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ，１９９０）。さらに、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２１）、Ｄ−メチオニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．４１）、および（Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．６１）と（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２２）両方が同定された。特定のアミノトランスフェラーゼが、好ましく、Ｃ２炭素にて、特定の配座を持つ基質と反応する。したがって、ＭＰへの変換が、立体特異的でない場合でも、最終産物の立体化学を、トランスアミナーゼの適切な選別を介して制御可能である。反応が可逆的であるので、未処理ＭＰ（望まない異性体）を、その構成物質にリサイクルして戻すことが可能であり、ＭＰのラセミ混合物を再形成可能である。
【０１８５】
発酵または全細胞生物触媒産生経路（インビボ）において、Ｓ，ＳまたはＲ，Ｓモナチンの産生が、Ｄ−アミノトランスフェラーゼと比較して、多量の天然のＬ−アミノトランスフェラーゼによって、有利に働き得る。Ｒ，Ｒおよび／またはＳ，Ｒモナチンが望む立体異性体である場合、ＡｓｐＣおよびＴｙｒＢのような、広い特異性および芳香族Ｌ−アミノトランスフェラーゼ類が、株ＳＲ２５０（Ｒｏｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００３）３２７，５９３−６０３）にてのように、ノックアウトされるべきであり得る。そうすることにおいて、フェニルアラニンおよびチロシンが、増殖培地中で必要とされ得る。好ましく、トリプトファンのＬ−異性体と反応する、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼを、モナチンを産生する経路において、インドール−３−ピルビン酸産生に対して置換可能であり、一方で、好ましく（Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼのような）Ｄ−アミノ酸と反応する、Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、Ｒ，ＲまたはＳ，Ｒモナチンの産生を促進するために、野生型有機体中よりも、より多量で存在する必要があることがもっとも適当である。
【０１８６】
１つの実施形態において、立体異性体的に過剰のモナチンの混合物が、生合成経路中、および／または細胞中で産生される。「立体異性体的に過剰のモナチン混合物」は、混合物が一つ以上のモナチン立体異性体を含み、混合液中の少なくとも６０％のモナチン立体異性体が、Ｒ，Ｒ、Ｓ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓのような、特定の立体異性体であることを意味する。他の実施形態において、混合物には、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上の特定のモナチン立体異性体が含まれる。「立体異性体的に過剰の」Ｒ，Ｒモナチンは、モナチンが、少なくとも６０％のＲ，Ｒモナチンを含むことを意味する。「立体異性体的に過剰の」Ｓ，Ｓモナチンは、モナチンが、少なくとも６０％のＳ，Ｓモナチンを含むことを意味する。他の実施形態において、「立体異性体的に過剰の」モナチンは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上のＲ，ＲまたはＳ，Ｓモナチンを含む。
【０１８７】
他の実施形態において、主にＳ，ＳまたはＲ，Ｒモナチンは、生合成経路にて、および／または細胞内で産生される。「主に（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ）」は、生合成経路および／または細胞内で産生されたモナチン立体異性体のうち、モナチンが、９０％以上の特定の立体異性体を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、産生されたモナチンは、本質的にＲ，ＳまたはＳ，Ｒモナチンを含まない。「本質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ）」は、生合成経路および／または細胞内で産生されたモナチン立体異性体のうち、モナチン立体異性体が、２％未満の特定の立体異性体を含むことを意味する。さらに、またはあるいは、生合成経路および／または細胞内で産生されたモナチンを記述する際に用いる場合、「本質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ）」は、異なる立体異性体（例えば、Ｒ，Ｒモナチン）を産生するために、キラル−特異的酵素（例えばＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）および／またはキラル−特異的基質（例えば、Ｒ−立体配座での炭素を持つもの）を含む、生合成経路において、副産物として産生される立体異性体（例えばＲ，Ｓモナチン）の量をも意味する。
【０１８８】
７．基質活性化
ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のような、リン酸化基質を、本明細書で開示した反応で利用可能である。リン酸化基質は、よりエネルギー的に好ましく、したがって、反応速度および／または収率を増加させるために利用可能である。アルドール濃縮において、リン酸基の添加が、求核基質のエノール互変異性体を安定化し、より反応性にする。他の反応において、リン酸化基質が、よりよい脱離基を提供可能である。同様に、基質を、ＣｏＡ誘導体またはピロリン酸誘導体への変換によって活性化可能である。
【０１８９】
８．産物分泌
微生物は、アミノ酸を産生可能である。例えば、コリネバクテリアおよびブレビバクテリアは、グルタミン酸、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、スレオニン、リシン、メチオニン、バリン、イソロイシンおよびロイシンのような、種々のアミノ酸を産生可能であり、一方、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、およびセラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）は、グルタミン酸を産生可能である。さらに、微生物は、有機酸およびアミノ酸を分泌可能である。例えば、バシルスおよびラクトバシルス有機体は、乳酸および酢酸のような有機酸を分泌可能であり、コリネバクテリアおよびブレビバクテリア有機体は、全てではないが、産生する多くのアミノ酸を分泌可能である。
【０１９０】
アミノ酸を分泌可能な有機体は通常、２つの理由の内１つのために実施する。（１）ポリペプチド類を炭素およびエネルギー供給源として利用するが、特定のアミノ酸を異化することが出来ない、または（２）荷電アミノ酸が、ｐＨまたは浸透圧を制御するために、ストレス応答として分泌され得る。例えば、グルタミン酸は、野生型コリネバクテリアによって構成的に排泄されない。オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性のレベル、特定のエクスポーターの存在、細胞エンベロープの状態、化学的ポテンシャルまたは調節における変化による、取り込み工程の反転、およびストレスのようないくつかの条件が、グルタミン酸の輸出を誘発することに関与する可能性がある。
【０１９１】
細胞エンベロープ状態は、培地の組成物および増殖条件によって影響を受け得る。一般的に、ペプチドグリカン（細胞壁およびムレイン）は、輸送のバリアではないが、コリネバクテリアおよびグルタミン酸の場合は例外である。ペニシリン、またはアンピシリンまたはカルバニシリンのような、ペニシリン誘導体の添加が、とりわけコリネバクテリアにて、グルタミン酸流出を助けることがわかっている。ペニシリン、およびアンピシリンおよびカルバニシリンのようなペニシリン誘導体は、トランスペプチダーゼによって触媒される、細胞壁架橋の合成の最終段階を阻害する、ベータ−ラクタム抗生物質である。これらはまた、大腸菌の棒様構造にとって、および分裂の間の壁隔形成のために必要である、ペニシリン結合タンパク質と呼ばれる酵素を阻害する。
【０１９２】
細胞膜の流動性が同様に関与し得る。例えば、より飽和された脂肪酸の存在が、流動性および流出を減少させ得る。流動性は、ビオチンを制限すること、および界面活性剤を加えることによって影響を受け得る。温度の上昇、酢酸ドデシルアンモニアの添加、オレイン酸栄養要求性、グリセロール栄養要求株におけるグリセロール欠損、ツィーン６０のような界面活性剤の添加、局所麻酔の添加、脂肪酸変異体、リソザイム−感受性変異体の利用、および電気的電位の適用が、細胞膜／壁の浸透性に影響を与え得る。例えば、プロトン原動力が、荷電分子の分泌のために重要であり得、細胞内ｐＨと比較して、培地のｐＨによって大きく影響を受け得る。
【０１９３】
任意の方法を利用して、膜流動性および産物分泌を増加可能である。例えば、イソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ）を、ミコール酸合成活性を阻害するために、培養液に加えて良く、結果として、膜流動性の増加と、産物分泌の増加となる。さらに、ｃｓｐ１（ＰＳ１−ミコリルトランスフェラーゼ）の不活性化が、細胞壁結合ミコール酸含量を５０％まで減少させ、細胞エンベロープを介して、親水性基質の輸送を増加させ得る。（ミコール酸合成に関与する）ａｃｐ遺伝子の過剰発現が、ツィーン６０を培地に加える利点を無効にするため、この遺伝子をダウンレギュレートする方法を利用して、コリネバクテリア株からのモナチン分泌を増加させることが出来る。
【０１９４】
Ｃ．グルタミカムの細胞膜の主要な脂肪酸はオレイン酸（１８：１）およびパルミチン酸（１６：０）であり、不飽和がわずか、またはない脂肪酸である。ブレビバクテリアおよびコリネバクテリアからの異なる脂肪酸シンターゼが、飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する比、および脂肪酸の長さに関して、異なる特徴を持つ。コリネバクテリアは、脂肪酸合成のために、ＦＡＳ  Ｉ（酵母および哺乳動物系）およびＦＡＳ  ＩＩ（大腸菌および植物系）酵素の両方を持つ。事実、コリネバクテリア・グルタミカムは、２つの脂肪酸シンターゼＩ酵素を持つ。これらの遺伝子、またはこれらの遺伝子の発現の操作によって、膜の流動性を変更可能である。
【０１９５】
ビオチンが、脂肪酸合成および細胞増殖で必要とされ得る。ビオチンレベルを制限することによって、非常に不飽和な脂肪酸に影響を与える以上に、オレイン酸（または、不飽和がわずか、またはない他の脂肪酸）レベルを低下させ、細胞膜をより流動化する。分泌を改善するために、ビオチンを含み、リン脂質の合成のために必要である、アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼポリペプチド類を、ダウンレギュレートまたは阻害可能である。さらに、ビオチンの制限よりも、ビオチンアンタゴニストを利用可能である。例えば、温度感受性ビオチン阻害ポリペプチド（ｄｔｓＲ遺伝子産物）は、界面活性剤抵抗性を与え、分泌を改善する。さらに、温度感受性ビオチン阻害ポリペプチドをコードする核酸を、コリネバクテリアに形質導入可能であり、グルタミン酸およびリシンを産生するために使用可能である（例えば、米国特許第２００３００７７７６５号明細書を参照のこと）。
【０１９６】
デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を、有機体に加えて、膜流動性を増加可能である。Ｃ．グルタミカムにおいて、ｐｌｓＣ、ｃｍａおよびｃｌｓのような、リン脂質生合成ポリペプチドをコードする遺伝子の過剰発現を、グルタミン酸分泌を改善するために使用可能である。
【０１９７】
エイコサペンタノイル酸（ＥＰＡ）は、膜流動性において有意な役割を果たすことが知られており（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ他，１９９９，Ｌｉｐｉｄｓ，３４：１２９７−１３０４）、このポリ不飽和脂肪酸の過剰産生が、宿主有機体の総流動性／輸送特性において補助可能である。３８ｋｂｐゲノムＤＮＡ断片が、海洋バクテリア（シェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ））から首尾良くクローン化されており、大腸菌中で発現され、結果としてＥＰＡの産生となる（Ｙａｚａｗａ，１９９６，Ｌｉｐｉｄｓ，３１：Ｓ２９７−Ｓ３００）。ＥＰＡ合成のためのシェワネラｓｐ．遺伝子が市販されている。ポリケチドシンターゼ酵素がまた、ポリ不飽和脂肪酸を産生すると知られており、これらの酵素の酵素ドメインが、ＥＰＡ産生のために利用された、上述ＦＡＳ−関連遺伝子と同様のオープンリーディングフレーム内に存在する。宿主有機体内のこれらの遺伝子クラスターのクローニングが、膜流動性および続く産物放出において、有意な効果を持ち得る。
【０１９８】
培地は、副産物の量および輸送の速度に影響を持ち得る。Ｃ．グルタミカムにおいて、多量のミネラルが、ＮＡＤＰＨ、Ｈ+産生速度における増加と関連した様式で、酢酸および乳酸副産物に対して、グルタミン酸産生を好み得る。炭素供給源の選択はまた、ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ+に対する比に影響を与え得、結果として、副産物形成および輸送速度の変化となる。高Ｈ+の存在、またはナトリウムおよびカリウムのような培地中の他の陽極に荷電したイオンの存在が、アンチポート（流出）またはシンポート（取り込み）の速度に影響を与え得る。
【０１９９】
グルタミン酸／グルタミン比はしばしば、細胞内の窒素（アンモニア）の利用可能性の示唆である。グルタミンは、いくつかの有機体内で、アスパラギン酸からのアスパラギン産生のためのアンモニアドナーとして利用される。高レベルのグルタミン酸が集積し、これが、細胞にシグナルを与え、グルタミン酸を分泌させ得る。また、グルタミン酸および他のアニオン性分子を、異なるストレスの条件下で、細胞内外に輸送可能である。
【０２００】
芳香族アミノ酸は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）中で、共通の輸送システムを共有可能である。これらのアミノ酸の取り込みに欠損を持つ株を見つけることが、アミノ酸の産生が増加した株を産生するために利用可能である（Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｍａｔａ，（１９９５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：１６００−１６０２）。
【０２０１】
１つの実施形態において、以下の段階を、グルタミン酸流出を示している有機体を同定するために実施可能である。コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）として再分類された、ＡＴＣＣ１３６５５および１３０５８のような株を得ることができる。例えば、米国特許第３，１２８，２３７号明細書および第３，００２，８８９号明細書を参照のこと。有機体を、産生されたグルタミン酸のレベルを決定するために査定可能である。次いで、ツィーン、アンピシリン（またはペニシリンまたはカルベニシリン）の利用、およびビオチンの減少のような、種々の条件の効果を、グルタミン酸放出のためのもっとも効果的な処置を決定するために測定可能である。グルタミン酸放出が検出された場合、有機体を、輸送活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子を得るために利用可能である。
【０２０２】
細菌内のアミノ酸放出ポリペプチドは主に、プロトン−原動力駆動である。一般的に、これらはプロトンアンチポーターであるが、他の陽極に荷電した分子も、アミノ酸が分泌されるときに、輸入され得る。荷電勾配の方向ですでに動いているので、陰極に荷電した分子の輸出は、輸入されるべきプロトンを必要とすべきでない。したがって、グルタミン酸トランスポーターは、アンチポーターではなく、ユニポーターであり得る。
【０２０３】
任意の有機体を、モナチンまたはグルタミン酸を輸送するポリペプチドに対してスクリーニングし得る。例えば、以下の有機体を、モナチンまたはグルタミン酸トランスポーターに関して試験可能である。（１）大腸菌、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリックセッチア（Ｒｉｃｋｓｅｔｔｉａ）のような、多数の予想された第二トランスポーターを持つ有機体、（２）コリネバクテリアおよびブレビバクテリアのような、グルタミン酸を分泌する有機体、（３）ダイズ、エンドウ、ピーナッツおよび豆のような、植物を含む、植物および豆科植物、（４）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、および（５）乳酸バクテリア、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）株、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のような、酸に対して高い耐性を持つ有機体。有機体はまた、単独の窒素供給源として、グルタミン酸濃縮合成または天然ポリペプチド類（例えば、ＧＬＵＲＰ、プラズモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からのグルタミン酸濃縮ポリペプチドまたはポリグルタミン酸）を利用する能力に関してスクリーニング可能である。そのような有機体は、グルタミン酸を分泌する能力を持ち、これらが、毒性であり得、または細胞浸透圧ポテンシャルによくない影響を与え得る、高レベルの細胞内グルタミン酸の存在下で生存することを可能にする。
【０２０４】
モナチンを認識しないトランスポーターポリペプチド類を、モナチンを認識するトランスポーターポリペプチド類を産生するために操作可能である。とりわけ、選別工程のような技術を使用して、モナチンを基質として認識するトランスポーターポリペプチドを得ることができる。例えば、古典的な変異導入を介したフェニルアラニンおよびチロシン調節遺伝子の変異導入と、大腸菌でのスクリーニングが、結果として、フェニルアラニンの産生および分泌の増加となることが示されてきた。
【０２０５】
トリプトファン分泌を促進するポリペプチドが検出された場合、これらのポリペプチドをコードする遺伝子を、モナチンの産生のために、トリプトファンが細胞内で簡単に利用可能であるように、そして収率を増加させるために、ノックアウト可能である。さらに、トリプトファン取り込みポリペプチドをコードする遺伝子を、トリプトファンを、分泌するのではなく、モナチン産生のために利用可能であるように、トリプトファンを過剰産生している宿主細胞中で発現させることが出来る。そのような遺伝子には、ＭＴＲペルメアーゼ（トリプトファン特異的輸送タンパク質）、ＴｙｒＰ（チロシン特異的輸送タンパク質）、ＴｎａＢ（トリプトファン特異的輸送タンパク質）、（大腸菌指定）およびＡｒｏＰ（芳香族アミノ酸取り込みタンパク質）が含まれる。
【０２０６】
９．遺伝的ツール
過去２０年間に、クローニングベクターおよびＤＮＡ輸送方法のような、一般的な分子生物学的ツールが、アミノ酸産生コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウム株に関して発展してきた。これらのツールのいくつかを利用して、モナチンのような産物を産生するように、コリネバクテリウム・グルタミカムの、グルタミン酸および／またはトリプトファン産生株を操作可能である。例えば、ｐｒｏＡおよびａｓｐＣ遺伝子が、Ｃ．グルタミカム株中で過剰発現する場合に、モナチンが、高レベルで産生または分泌され得る。
【０２０７】
協和発酵工業株式会社内の研究所は、Ｃ．グルタミカム株を遺伝的に操作して、芳香族アミノ酸生合成に関与するいくつかの遺伝子を過剰発現させることによって、トリプトファンの産生を増加させた。協和発酵によって開発されたシャトルベクターの１つ、ｐＣＥ５４が、ＡＴＣＣより入手可能である（カタログ番号３９０１９）。これは、多重クローニング部位、３つの抗生物質マーカー、およびコリンベバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｂｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）／ブレビバクテリウムに対する、ｐＣＧ２レプリコン、および大腸菌に対するｐＭＢ１レプリコンをもつ。ｐＣＢ１０１、ｐＥｔｈｒ１、ｐＣＧ１１およびｐＣＥ５３を含む、異なる選別可能マーカーを持ついくつかの他のシャトルベクターが、協和発酵によって開発された（米国特許第４，７１０，４７１号明細書、およびＩｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｍａｔａ，（１９９９）Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５：２４９７−２５０２）。
【０２０８】
ＥｉｋｍａｎｎｓおよびＳａｈｍのグループが、Ｃ．グルタミカム／大腸菌のための、シャトルおよび発現ベクターのファミリーを構築した（Ｅｉｋｍａｎｎｓ他，（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０２：９３−９８）。これらは、コリンバクテリアｐＢＬ１および大腸菌ＣｏｌＥ１の複製起源に基づき、多重制限部位を持ち、カナマイシン−またはクロラムフェニコール−耐性遺伝子を含む。これらの内の２つ、８．２ｋｂ  ｐＥＫＥ×１またはｐＥＫＥ×２ベクターが、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導可能である。プロモータープローブベクターがまた、プロモーター強度をアッセイするために存在する。
【０２０９】
Ｓｉｎｓｋｅｙと共同研究者らは、コリネバクテリウムにおける代謝的遺伝子工学のための、ベクターを開発した。彼らのシャトルベクターは、本来、Ｃ．グルタミカムおよびＣ．ラクトフェルメンタムから単離された、ｐＳＲ１（広宿主範囲）、ｐＢＬ１およびｐＮＧ２プラスミドに基づく。これらには、共役ベクター、転写解析のためのベクター、大腸菌ｔａｃプロモーター、またはｔａｃプロモーターとｆｄａ−遺伝子から得たコリネバクテリウムプロモーター両方を含む２つの発現ベクター、およびプロモータープローブベクターが含まれる（Ｊｅｔｔｅｎ他，（１９９４）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７２１：１２−２９、およびＪｅｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｎｓｋｅｙ，（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：７３−１０３）。
【０２１０】
遺伝的ツールは、真菌種に対しても利用可能である。例えば、Ｚｈｏｕ他，（１９９４）Ｇｅｎｅ，１４２：１３５−４０、Ｗｉｌｌｉｎｓ他，（２００２）Ｇｅｎｅ，２９２：１４１−９、Ｈａｎｉｃ−Ｊｏｙｃｅ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，（１９９８）Ｇｅｎｅ，２１１：３９５−４００、およびＢａｒｋａｎｉ他，（２０００）Ｇｅｎｅ，２４６：１５１−５を参照のこと。簡単に記すと、ほとんどのトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種が、Ｔ．グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）を含む、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）と名前を変更された。カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）は、無性半数体子嚢真菌である。サッカロマイセス・セルビシエと同様のオーダーであるが、クローニングツールの全ては適合ではない。例えば、共通のｍｕ自主複製配列（ＡＲＳ）は、Ｃ．グラブラータでは複製しない。それにもかかわらず、ｐＲＳ３１６、セントロメア（ＣＥＮ）−に基づくＳ．セルビシエプラスミドが、Ｃ．グラブラータ中で使用可能である。さらに、ＵＲＡ３は、栄養要求性選別マーカーとして、Ｃ．グラブラータ中で使用可能であり、統合プラスミドが、相同組換えを介して、ＵＲＡ３座での、挿入配列に関して存在する。
【０２１１】
Ｃ．グラブラータ中で機能する発現ベクターが、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．で、研究者によって設計され（Ｗｉｌｌｉｎｓ他，（２００２）Ｇｅｎｅ  ２９２：１４１−１４９）、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２およびＬＥＵ２栄養要求性を含む。このベクターはまた、Ｓ．セルビシエＣＥＮおよびＡＲＳ領域も持つ。Ｃ．グラブラータの銅−誘導可能メタロチオネインＩ（ＭＴ−１）プロモーター、および標準のネオマイシンおよびカナマイシン耐性遺伝子を、Ｃ．グラブラータ中で使用可能である。同様に、ＡＤＥ２遺伝子を持つ高コピー−数ベクターが、Ｃ．グラブラータ中で機能的であり、ＡＲＳとして利用されるＳ．セルビシエミトコンドリア（ｍｔ）ＤＮＡの断片を含む（Ｈａｎｉｃ−Ｊｏｙｃｅ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，（１９９８）Ｇｅｎｅ  １１：３９５−４００）。
【０２１２】
Ｃ．グラブラータのための大腸菌シャトルベクターが構築され、Ｃ．グラブラータＣＥＮ−ＡＲＳカセットおよび大腸菌のｌａｃＺコード配列両方を含む（Ｅｌ  Ｂａｒｋａｎｉ他，（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４６：１５１−１５５）。ＨＩＳ３遺伝子プロモーターおよびリボソーム結合部位を、ｌａｃＺを発現するために使用した。ＭＴＩＩ遺伝子：ｌａｃＺレポーター融合もまた、銅でのディファレンシャル誘導のために作製した。
【０２１３】
Ｓ．セルビシエのＦＬＰリコンビナーゼのような、他のカンジダ株のために開発された方法、プロモーターおよび選別マーカーの単離、ＵＶ変異導入技術および細胞透過化方法を、Ｃ．グラブラータに適用可能である。さらに、酢酸リチウムまたはエレクトロポレーション技術を、カンジダ種を形質導入するために利用可能である。
【０２１４】
非組換え体有機体中のモナチン産生、およびモナチン産生可能な有機体の単離のためのスクリーニング方法
シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、およびシュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）は、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ、ならびに芳香族アミノトランスフェラーゼ活性を持つ原核生物である。これらの有機体が、トリプトファンからモナチンを産生するために必要な酵素を含むので、その生合成のために遺伝的改変は必要ない。アルドラーゼおよび芳香族アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、誘導可能であり、適切な増殖条件（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸の存在下の増殖）が、これらが誘導されることを確かにするために必要である。４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼは、シュードモナスおよび関連種における、プロトカテキュエート分解経路の部分である。コリネバクテリウム・グルタミカムはまた、モナチンを産生可能である。４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼが、本有機体にて未だ同定されていないが、プロトカテキュエート分解に関与する他の酵素が含まれる。
【０２１５】
これらの遺伝子を持つか、または他の経路によってモナチンを合成可能な他の有機体を、単独の炭素供給源として、モナチンまたはモナチン前駆体（ＭＰ）上での増殖に関してスクリーニングすることによって検出可能である。トリプトファンおよびピルビン酸から、モナチンまたはモナチン前駆体（ＭＰ）を産生する反応は、すべて可逆的である。したがって、モナチンまたはモナチン前駆体（ＭＰ）を、トリプトファンまたはピルビン酸へ変換可能である細胞のスクリーニングは、モナチン産生のために有用な酵素を含む細胞に関して試験するために使用可能であるツールである。試験は、トリプトファン栄養要求株（トリプトファンを産生不可能で、増殖のための培地にその添加が必要である細胞）を用いること、およびモナチンまたはＭＰ上で増殖可能な細胞かどうか決定することによって達成可能であり、モナチンまたはＭＰをトリプトファンに変換した細胞を示唆し得る。あるいは、細胞を、（以下で記述したように）モナチン、ＭＰ、モナチン類似体、および／またはＭＰ類似体が、第一炭素／エネルギー供給源である、最小培地上にプレート可能である。生存（および可視コロニーに増殖）するために、これらの細胞は、モナチン、ＭＰ、モナチン類似体および／またはＭＰ類似体を、ピルビン酸または中枢代謝の他の成分に変換しなければならない。細胞の増殖を、例えば、アガープレート上のコロニー形成を探すことによって、または陰性対照と比較して、液体培養液中での増殖の証拠を探すことによって（例えば、液体の光学密度での変化を探すことによって）試験可能である。試験細胞は、ピルビン酸栄養要求株（ピルビン酸を産生不可能であり、増殖のための培地中にピルビン酸供給源を必要とする細胞）であり得、細胞が、モナチン、ＭＰ、モナチン類似体および／またはＭＰ類似体上で増殖可能であるかどうかを決定する。試験細胞は、天然に、モナチン産生のために有用である酵素を含む、野生型有機体であり得る。そのプレート上での増殖能力によって陽性試験細胞として同定された場合、例えば、アルドラーゼおよび／またはアミノトランスフェラーゼが、陽性試験細胞より精製可能である。
【０２１６】
試験細胞はまた、モナチンまたはＭＰをトリプトファンおよび／またはピルビン酸に変換する、遺伝子産物の能力に関して試験するために発現され得る遺伝子を含む、組換え体細胞でもあり得る。増殖可能な細胞が、外来遺伝子が、モナチンまたはＭＰをトリプトファンおよび／またはピルビン酸に変換可能な酵素をコードすることを示している。本方法によるスクリーニングは、（１）合成経路が可逆的であることで、産物、モナチンが、本経路で代謝可能であること、および（２）有機体が、モナチンまたはＭＰ（または類似体）を輸入可能である輸送系を持つこと、を必要とする。これらの有機体におけるタイター改良は、古典的な変異原生技術を用いて実施可能である。
【０２１７】
本発明は、以下の実施例にてさらに記述され、これは、請求項で記述された本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【０２１８】
実施例１
トリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニングおよび発現
本実施例は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換するために使用可能である、トリプトファンアミノトランスフェラーゼをクローン化するために使用した方法を記述している。開裂可能Ｎ末端ＨＩＳ6−Ｔａｇ／Ｔ７−Ｔａｇｓとの融合タンパク質を産生するために、遺伝子を、ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣベクター内にクローン化した。得られたタンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２１９】
実験概略
アミノトランスフェラーゼをコードする１１遺伝子を、大腸菌内にクローン化した。これらの遺伝子は、バシルス・サブチリスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ１４０８２．１  ｂｐ２８６２２−２９４７０、およびＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿３８８８４８．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（またリゾビウム・メリロッティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）とも呼ばれる）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔａｔＡ、配列番号１および２、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、ロードバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）株２．４．１チロシンアミノトランスフェラーゼ（相同性によって主張された、ｔａｔＡ、配列番号３および４、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、Ｒ．スファエロイデス３５０５３チロシンアミノトランスフェラーゼ（相同性によって主張された、配列番号５および６、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、レイスマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）広基質アミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ、Ｌ．メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）からのペプチド断片に対する相同性によって主張された、配列番号７および８、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、バシルス・サブチリス芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ、相同性によって主張された、配列番号９および１０、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、ラクトバシルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）芳香族アミノトランスフェラーゼ（相同性によって主張されたａｒａＴ、配列番号１１および１２、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、Ｒ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）３５０５３多重基質アミノトランスフェラーゼ（相同性によって主張された、配列番号１３および１４、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、ロードバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）株２．４．１多重基質アミノトランスフェラーゼ（相同性によって主張されたｍｓａ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＺ＿ＡＡＡＥ０１００００９３．１、ｂｐ１４７４３−１６１５５およびＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００００５０８２．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＥ０００１９５．１  ｂｐ２７５５−１５６５およびＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ７４０１４．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）、および大腸菌チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ、配列番号３１および３２、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）であった。
【０２２０】
市販されている酵素と共に、遺伝子をクローン化し、発現させ、トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換における活性に関して試験した。すべての１１のクローンが活性をもった。
【０２２１】
望む活性を持つポリペプチドを含み得る、細菌株の同定
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベース中の遺伝子は、どれもトリプトファンアミノトランスフェラーゼとしては指定されていなかった。しかしながら、この酵素的活性を持つ有機体が同定されてきた。Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）活性を、細胞抽出物中で、または以下の供給源からの精製タンパク質から測定した。フェスツカ・オクトフローラ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｃｔｏｆｌｏｒａ）からのリゾバクテリア単離物、エンドウ豆ミトコンドリアおよび細胞質、ヒマワリ・クラウンゴール細胞、リゾビウム・レグミノサラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種トリホリ（ｔｒｉｆｏｌｉ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ｐｖギプソフィラエ、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．サバスタノイ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アゾスピリラム・リフェラム＆ブラシレンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｆｅｒｕｍ  ＆  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）、エンテロバクター・クロアサエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ブラジルヒゾビウム・エルカニイ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｌｋａｎｉｉ）、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、ラット脳、ラット肝臓、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＣＨＡ０、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシルス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、小麦苗木、オオムギ、ファセオラス・アウレウス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（マングビーンズ）、サッカロマイセイス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）（カールスベルゲンシス）、レイシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ｓｐ．、トウモロコシ、トマト根、エンドウ豆植物、たばこ、ブタ、クロストリジウム・スポロジーンズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）。
【０２２２】
クローニングのためのゲノムＤＮＡの単離
Ｓ．メリロッティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ＡＴＣＣ番号９９３０）を、２５℃、ｐＨ７．２にて、ＴＹ培地中で増殖させた。細胞を、１．８５の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）まで増殖させ、２％接種材料を、ゲノムＤＮＡ調節物のために利用した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲノムチップ２０／Ｇキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を、ゲノムＤＮＡ単離のために使用した。
【０２２３】
バシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）６０５１（ＡＴＣＣ）を、Ｂｅｒｅｔｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中、３０℃にて増殖させた。キアゲンゲノムチップ２０／Ｇプロトコールを使用して、以下の変更で、ゲノムＤＮＡを単離した。プロテイナーゼＫおよびリソザイムの濃度を二倍し、培養時間を２〜３倍にした。
【０２２４】
レイシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＡＴＣＣ５０１２２ゲノムＤＮＡは、ＴＥ緩衝液ｐＨ８．０、１７ｎｇ／μＬ中、ＩＤＩ，Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）によって供給された。
【０２２５】
（Ｓａｍ  Ｋａｐｌａｎ博士、テキサス大学、Ｈｏｕｓｔｏｎにより供給された）ロードバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）２．４．１、Ｒ．スファエロイデス３５０５３（ＡＴＣＣ番号）、およびＬ．アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）ゲノムＤＮＡを、標準のフェノール抽出によって調製した。細胞を後期ログ相にて回収し、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で再懸濁させ、細胞懸濁液ｍＬあたり、０．０２４ｍＬのラウリルサルコシンナトリウムの添加によって溶解した。少なくとも３回、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で飽和した、等容量のフェノールで抽出した後、ＤＮＡ溶液を９：１クロロホルム：オクタノールで一回、クロロホルムで三回抽出した。ＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８および２容量のエタノールの添加によって沈殿させた。沈殿物を、遠心によって回収し、７０％エタノールで一度洗浄した。最後に、ＤＮＡを０．１０ｍＬ蒸留水中に溶解した。
【０２２６】
大腸菌ゲノムＤＮＡを、株ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））より単離し、キアゲンＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商標）（５００／Ｇ）キットを用いて調製した。ＬＢ中にて、１．８７のＯＤ650まで増殖させた本株、３０ｍＬから、０．３ｍｇの精製ＤＮＡが得られた。精製したＤＮＡを、キアゲン溶出緩衝液（ＥＢ）中で、０．３７μｇ／μＬの濃度にて溶解した。
【０２２７】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
プライマーを、ｐＥＴ  ３０Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に対する適合可能なオーバーハングを含めて設計した。ｐＥＴベクターは、Ｘａ／ＬＩＣ部位の５’部上で、１２塩基単一鎖オーバーハング、Ｘａ／ＬＩＣ部位の３’部上で、１５−塩基単独鎖オーバーハングを持つ。プラスミドは、ライゲーション独立クローニングのために設計され、Ｎ末端ＨｉｓとＳ−タグ、および任意にＣ末端Ｈｉｓ−タグを含む。Ｘａプロテアーゼ認識部位（ＩＥＧＲ）は、直接、対象の遺伝子の開始コドンの前に存在し、融合タンパク質タグを除去可能である。
【０２２８】
以下の配列を、プライマーを設計するときに、有機体特異的配列の５’末端に加えた。フォワードプライマー、５’ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣ（配列番号７３）、リバースプライマー：５’ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣ（配列番号７４）。
【０２２９】
バシルス・サブチリスｄａｔプライマー：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＧＧ−３’およびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴ−３’（配列番号１５および１６）。
【０２３０】
シノリゾビウム・メリロッティｔａｔＡプライマー：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＧおよびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ（配列番号１７および１８）。
【０２３１】
バシルス・サブチリスａｒａＴプライマー：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣおよびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧ（配列番号１９および２０）。
【０２３２】
ロードバクター・スファエロイデスｍｓａ（２．４．１および３５０５３両方）：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴおよびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧ（配列番号２１および２２）。
【０２３３】
レイシュマニア・メジャーｂｓａｔ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＡＴおよびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号２３および２４）。
【０２３４】
ラクトバシルス・アミロボラスａｒａＴ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡおよびＣ末端：；５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡ（配列番号２５および２６）。
【０２３５】
ロードバクター・スファエロイデスｔａｔＡ（２．４．１および３５０５３株両方）：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣおよびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号２７および２８）。
【０２３６】
大腸菌ａｓｐＣ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣ−３’、およびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’（配列番号２９および３０）。
【０２３７】
大腸菌ｔｙｒＢ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＣおよびＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧ−３’（配列番号３３および３４）。
【０２３８】
Ｓ．メリロッティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ｔａｔＡ）から由来した遺伝子を、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅させた。５０μＬの反応中、０．１〜０．５μｇの鋳型、１．５μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕエクスパンドハイフィデリティポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、およびＭｇを含む１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を使用した。使用したサーモサイクラープログラムには、９６℃で５分間の熱開始と、続く以下の段階の２９回の繰り返し、すなわち、９４℃３０秒間、５５℃２分間、および７２℃２．５分間が含まれた。２９回の繰り返しの後、試料を、７２℃にて１０分間維持し、次いで、４℃にて保存した。このＰＣＲプロトコールによって、１１９９ｂｐの産物が産生された。
【０２３９】
Ｒ．スファエロイデスより由来した遺伝子（ｍｓａおよびｔａｔＡ）、Ｌ．アミロボラス  ａｒａＴおよびバシルスａｒａＴの配列を、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬ反応中、０．１〜０．５μｇの鋳型、１．５μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕエクスパンドハイフィデリティ（商標）ポリメラーゼ、およびＭｇを含む１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を加えた。使用したサーモサイクラープログラムには、９６℃で５分間の熱開始と、続く以下の段階の２９回の繰り返し、すなわち、９４℃３０秒間、４０〜６０℃１分４５秒間（勾配サーモサイクラー）、および７２℃２分１５秒間が含まれた。２９回の繰り返しの後、試料を、７２℃にて１０分間維持し、次いで、４℃にて保存した。
【０２４０】
各Ｒ．スファエロイデスｍｓａ遺伝子に関して、４２℃と４８℃のアニーリング温度によって、多数の産物が産生されたが、およそ１４６４ｂｐにて、明確なバンドが産生された。Ｌ．アミロボラスａｒａＴに関して、４２℃、４８℃および５６℃のアニーリング温度にて、１１７３ｂｐにて、強力なバンドの単一産物が産生された。Ｂ．サブチリス  ａｒａＴに関して、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃アニーリング温度によって、ゲノムＤＮＡおよびコロニー両方から、単一の強力な産物（１１７３ｂｐ）が産生された。Ｌ．メジャーｂｓａｔに関して、５５℃のアニーリング温度が、もっとも明確な産物（１２３９ｂｐ）を与えた。ロードバクターｔａｔＡ遺伝子に関して、５０〜５５℃のアニーリング温度により、明確な産物が、正しいサイズ（１２６０ｂｐ）で得られた。大腸菌遺伝子およびＢ．サブチリスｄａｔ遺伝子両方に関して、５５〜６０℃のアニーリング温度を利用し、アニーリング時間を４５秒まで短くした。正しい大きさの明確な産物が得られた（大腸菌遺伝子に関して、およそ１．３ｋｂ、ｄａｔ遺伝子に関して８５０ｂｐ）。
【０２４１】
クローニング
ＰＣＲ産物を、キアゲンゲル抽出キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、０．８％または１％ＴＡＥ−アガロースゲルよりゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上の標準物と比較することによって定量し、次いで、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のための、製造業者の推奨プロトコールにしたがって、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。
【０２４２】
簡単に記すと、およそ０．２ｐｍｏｌの精製ＰＣＲ産物を、ｄＧＴＰの存在下、２２℃にて３０分間、１Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ポリメラーゼが、ＰＣＲ産物の３’から連続する塩基を除去する。ポリメラーゼが、グアニン残基に至ると、酵素の５’〜３’ポリメラーゼ活性が、エクソヌクレアーゼ活性と対抗し、さらなる切断が効果的に防止される。これによって、ｐＥＴ  Ｘａ／ＬＩＣベクターと適合可能な、一本鎖オーバーハングが作製される。ポリメラーゼを、７５℃にて２０分間のインキュベートによって不活性化する。
【０２４３】
ベクターおよび処理挿入物を、ノヴァジェンによって推奨されたようにアニールした。およそ０．０２ｐｍｏｌの処理挿入物と、０．０１ｐｍｏｌのベクターを、２２℃にて５分間インキュベートし、６．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を加え、２２℃でのインキュベーションを繰り返した。アニーリング反応（１μＬ）をＮｏｖａＢｌｕｅ（商標）単一コンピテント細胞（ノヴァジェン、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に加え、氷上で５分間インキュベートした。混合後、細胞を、熱ショックによって、４２℃にて３０秒間、形質導入した。細胞を２分間氷上に置き、２５０μＬの室温ＳＯＣ中、２２５ｒｐｍで振とうしながら、３７℃にて３０分間、回収させた。細胞を、カナマイシン（２５〜５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上にプレートした。
【０２４４】
プラスミドＤＮＡを、キアゲンスピンミニプレップキットを用いて精製し、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって、正確な挿入物に関してスクリーンした。正確な挿入物を持つことが明らかになったプラスミドの配列を、ジデオキシ鎖終結ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０２４５】
配列番号１〜１４および３１〜３２は、組換え体アミノトランスフェラーゼのヌクレオチドおよび相当するアミノ酸配列を示しており、Ｇｅｎｂａｎｋ配列からの任意の変化は、サイレントであるか、またはタンパク質配列の保存置換を産生するか、のいずれかであった。配列番号１１および１２は新規の配列である。
【０２４６】
遺伝子発現およびアッセイ
配列解析によって確認した、プラスミドＤＮＡを、大腸菌発現宿主ＢＬR（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）（ノヴァジェン、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にサブクローン化した。この培養液を増殖させ、プラスミドを、キアゲンミニプレップキットを用いて単離し、制限消化によって解析して、同一性を確認した。
【０２４７】
誘導を、ＢＬＲ（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）細胞両方での、Ｌ．アミロボラス  ａｒａＴ、Ｂ．サブチリスａｒａＴ、およびＳ．メリロッティｔａｔＡでまず実施した。時間経過研究を、カナマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ中の、０．５〜０．８のＯＤ600までの培養液増殖で実施し、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）で誘導し、誘導後、０、１、２および４時間でサンプリングした。２．０ｍＬからの細胞を、１０％硫酸ドデシルナトリウム、１０％２−メルカプトエタノールおよび２０％グリセロールを含む、０．１０ｍＬ  １２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８中で再懸濁させ、９５℃にて１０分間熱し、冷却し、０．１０ｍＬ  Ｈ2Ｏで希釈した。これらの総細胞タンパク質試料の一部を、４〜１５％勾配ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。２時間から４時間の誘導の間に発現されたタンパク質の量に、有意な違いはなく、ＢＬR（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）細胞間でもなかった。
【０２４８】
細胞抽出液をまた、０．２５μＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含む０．２５ｍＬノヴァジェンＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中の２ｍＬの培養液から細胞ペレットを懸濁し、室温にて２０分間、穏やかに撹拌してインキュベートし、細胞残骸を除去するために、１６，０００×ｇで遠心することによって、４時間試料から調製した。上清（細胞抽出液）を、細胞可溶性タンパク質の解析のために、４〜１５％勾配ゲル上にのせた。
【０２４９】
３つのクローン（Ｌ．アミロボラスａｒａＴ（配列番号１１および１２）、Ｂ．サブチリスａｒａＴ（配列番号９および１０）およびＳ．メリロッティｔａｔＡ（配列番号１および２）は、正確な大きさ（およそ４５ｋＤａ）に相当する可溶性タンパク質を示した。Ｂ．サブチリスａｒａＴ遺伝子産物は、最も高いレベルで過剰発現し、および／または他の２つの遺伝子産物よりも、より可溶性であった。
【０２５０】
続く発現方法において、陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを、この宿主のよりよい増殖特性のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）にサブクローン化した。誘導を、カナマイシンを５０ｍｇ／Ｌで含むＬＢ中の培養液増殖で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて繰り返し、ＯＤ600がおよそ０．８に達したときに誘導した。細胞を、３７℃での増殖の４時間後に回収し、３０００ｒｐｍにて１０分間（４℃）にて遠心し、ＴＥＧＧＰ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／Ｌグルタチオン、５％グリセロール、ロッシュ完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）で洗浄し、−８０℃エタノール中で、瞬間凍結した。
【０２５１】
試料を、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼ阻害剤カクテルセット＃３（カルビオケム−ノヴァバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含む、５ｍＬ／ｇウェット細胞重量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（ノヴァジェン）試薬中で再懸濁させた。試料を、環状シェーカー上で、室温にて２０分間インキュベートした。不溶性細胞残骸を、４℃、１６，０００×ｇでの２０分間の遠心によって除去した。
【０２５２】
細胞抽出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、以下のプロトコールを用いる、インドール−ピルビン酸の産生に続くことで、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性に関してアッセイした。１ｍＬ反応を、５０ｍＭテトラボレートナトリウム（ｐＨ８．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭヒ酸ナトリウム、５０μＭリン酸ピリドキサール、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、および５ｍＭ  Ｌ−トリプトファン中で実施した。この反応は、細胞を含まない抽出物、または精製した酵素の添加によって開始し、３０℃にて３０分間インキュベートした。２０％ＴＣＡ（２００μＬ）を、反応を終了させるために加え、沈殿したタンパク質を遠心によって除去した。３２７ｎｍでの吸収を測定し、アッセイ緩衝液中で、新鮮に調製したインドール−３−ピルビン酸の標準曲線と比較した。基質トリプトファンを含まない、またはｐＥＴ３０ａのみを形質導入したクローンからの細胞を含まない抽出液を用いる、対照反応も実施した。
【０２５３】
細胞抽出液中の、天然の大腸菌アミノトランスフェラーゼからのバックグラウンドのために、ｐＥＴ３０アミノ末端ＨＩＳ6−Ｔａｇ／Ｓ−Ｔａｇに融合した、アミノトランスフェラーゼタンパク質をそれぞれ含む、組換え体融合タンパク質を、製造業者のプロトコール（ノヴァジェン、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にしたがって、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジでの、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質のＨＩＳ6−Ｔａｇ配列は、ＩＤＡ−基礎Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂上に固定化した二価Ｎｉ2+カチオンに結合する。溶出画分を、ＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンセス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム上で脱塩し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０中に溶出した。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、アミノトランスフェラーゼ活性に関してアッセイした。
【０２５４】
１ｍＭ  ＩＰＴＧでの３７℃イ誘導（４時間）からの結果は、Ｌ．メジャーｂｓａｔ、Ｓ．メリロッティｔａｔＡ、大腸菌ａｓｐＣ、および両方のＲ．スファエロイデスｔａｔＡクローンが、有意なレベルのトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を持つことを示している。Ｂ．サブチリスからのａｒａＴタンパク質が過剰発現し、可溶性であったが、ほとんど酵素活性を示さなかった。Ｌ．アミロボラスａｒａＴ遺伝子産物は、細胞抽出液中で可溶性であることがわかったが、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを用いる精製では、正確な分子量を持つタンパク質の量はわずかであった。ｍｓａ遺伝子産物は不溶性であり、さらなる発現実験を、２４℃にて実施して、封入体形成を最小とした。１０μＭ〜１ｍＭ間のいくつかの濃度のＩＰＴＧを使用して、可溶性タンパク質の量を最大化した。
【０２５５】
表１は、ミリグラムタンパク質あたり、分あたりに形成された、インドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）のマイクログラムにて測定した、特定の活性を列記している。いくつかの場合、非常の少量の組換え体タンパク質が、アッセイの効果的な直線範囲上で、高レベルの活性を示した。これらの場合、「＞」は、特異的活性数を越えている。
【０２５６】
【表１】
2007508840.tif 000005
【０２５７】
【表２】
2007508840.tif 000006
【０２５８】
クローン化された全ての組換え体タンパク質のアライメント比較によって、ａｒａＴ、ｔａｔＡ、ｂｓａｔおよびｍｓａ配列間で、多くの高い保存領域は存在しないことが示された。最も高い活性組換え体タンパク質のアライメント、すなわちロードバクターｔａｔＡ遺伝子産物相同物、Ｌ．メジャー広基質アミノトランスフェラーゼ、およびシノリゾビウム・メリロッティチロシンアミノトランスフェラーゼが、いくつかの保存領域を示したが、これらは、タンパク質レベルで、およそ３０〜４３％同一であるのみである。広範囲、Ｄ−特異的（Ｄ−アラニン）アミノトランスフェラーゼの利用が、モナチンの他の立体異性体の産生において有用であり得る（実施例３および４を参照のこと）。
【０２５９】
実施例２
アルドラーゼでの、インドール−３−ピルビン酸の２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸への変換
本実施例は、アルドラーゼ（リアーゼ）を用いて、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換するために使用可能である方法を開示している（図２）。アルドール濃縮は、アルデヒドまたはケトンのβ−炭素と、他のアルデヒドまたはケトンのカルボニル炭素間の、炭素−炭素結合を形成する反応である。カルバニオンが、１つの基質のカルボニル基に隣接した炭素上で形成され、第二の基質のカルボニル炭素（求電子性炭素）を攻撃する求核試薬として働く。もっとも一般的に、求電子性基質はアルデヒドであり、したがってほとんどのアルドラーゼが、ＥＣ４．１．２．−カテゴリーに入る。非常にしばしば、求核基質はピルビン酸である。アルドラーゼが、２つのケト酸または２つのアルデヒド間の濃縮を触媒することは、あまり一般的ではない。
【０２６０】
しかしながら、２つのカルボン酸の濃縮を触媒するアルドラーゼが同定されてきた。例えば、欧州特許第ＥＰ１０４５−０２９号は、シュードモナス培養液（ＥＣ４．１．３．１６）を用いる、グリオキシル酸とピルビン酸からの、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の産生を記述している。さらに、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）は、２つのケト酸の濃縮を触媒可能である。したがって、同様のアルドラーゼポリペプチドを、インドール−３−ピルビン酸のピルビン酸との濃縮を触媒するために使用した。これらの酵素の活性またはエナンチオ選択性は、モナチンの特定の立体異性体の産生のために改変可能であり、以下実施例９で記述した方法を利用して選別可能である。
【０２６１】
クローニング
４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ（ＰｒｏＡアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）および４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸−リアーゼ（ＫＨＧアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）は、図２のアルドラーゼ反応と非常に類似した反応を触媒する。プライマーは、ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノヴァジェン、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に対して適合可能なオーバーハングを持って設計された。これらのプライマーの設計は、実施例１にて以上で記述している。
【０２６２】
以下のプライマーを、ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣクローニングのために設計した。
【０２６３】
１．シュードモナス・ストラミネアｐｒｏＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：１２９６４６６３、Ｖｅｒｓｉｏｎ：１２９６４６６３、あるいは、ＡＢ０５０９３５．２  ＧＩ：１２９６４６６３と呼ばれる）およびコマモナス・テストステロニｐｒｏＡ遺伝子（配列番号６５−６６、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ−３’（配列番号５５および５６）。
【０２６４】
２．シノリゾビウム・メリロッティ１０２１ＳＭｃ００５０２遺伝子（ｐｒｏＡに対して相同、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：１５０７４５７９またはＡＬ５９１７８８．１  ＧＩ：１５０７４５７９およびＣＡＣ４６３４４．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＣＧＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号６１および６２）。
【０２６５】
３．スフィンゴモナスｓｐ．ＬＢ１２６ｆｌｄＺ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：７５７３２４７  Ｖｅｒｓｉｏｎ：７５７３２４７またはＡＪ２７７２９５．１  ＧＩ：７５７３２４７、推定アシルトランスフェラーゼをコードする  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＣＡＢ８７５６６．１  ＧＩ：７５７３２５４）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＴＣＣＡ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＡ−３’（配列番号５７および５８）。
【０２６６】
４．アルスロバクター・キーセリ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｅｙｓｅｒｉ）ｐｃｍＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＦ３３１０４３  Ｖｅｒｓｉｏｎ：ＡＦ３３１０４３．１、オキサロサイトラマレートアルドラーゼをコードする  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＫ１６５２５．１  ＧＩ：１３２４２０４５）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＡＴＴＣＣＡ−３’（配列番号５９および６０）。
【０２６７】
５．イエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）株ＣＯ９２  ＹＰＯ００８２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：１５９７８１１５  Ｖｅｒｓｉｏｎ：１５９７８１１５またはＡＪ４１４１４１．１  ＧＩ：１５９７８１１５、可能性のあるトランスフェラーゼをコードする  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＣＡＣ８８９４８．１  ＧＩ：１５９７８１９５）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＧＡＡ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡ−３’（配列番号６３および６４）。
【０２６８】
６．バシルス・サブチリスｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：Ｚ９９１１５．１  ＧＩ：２６３４４７８、１２６７１１−１２７３０１またはＺ９９１１５．１  ＧＩ：２６３４４７８、１２６７１１−１２７３０１およびＣＡＢ１４１２７．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＴＧＡ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴ−３’（配列番号３５および３６）。
【０２６９】
７．大腸菌ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＥ０００２７９．１  １３３１−１９７２およびＡＡＣ７４９２０．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡ−３’（配列番号３７および３８）。
【０２７０】
８．Ｓ．メリロッティｋｈｇまたはＳＭｃ０３１５３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＬ５９１７９２．１  ＧＩ：１５０７５８５０またはＡＬ５９１７９２．１  ＧＩ：１５０７５８５０、６４６７３．．６５３１１およびＣＡＣ４７４６３．１、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列）フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＧＧＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＧＣＧＡＡＧ−３’（配列番号３９および４０）。
【０２７１】
以上１〜２および６〜８で記述した有機体からのゲノムＤＮＡを、キアゲンＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）プロトコールを用いて精製した。３〜５にて記述した有機体からのゲノムＤＮＡを、同様の技術を用いて精製可能である。
【０２７２】
シュードモナス・ストラミネア（ＡＴＣＣ３３６３６）を、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈおよびヒドロキシ安息香酸培地中で、３０℃にて増殖させた。コマモナス・テストステロニ（ＡＴＣＣ４９２４９）を、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈおよびヒドロキシ安息香酸培地中、２６℃にて増殖させた。スフィンゴモナスｓｐ．ＬＢ１２６（Ｆｌｅｒｎｉｓｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＩＴＯ，Ｂ−２４００Ｍｏｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、Ｗａｔｔｉａｕ他（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：８６１−７２，２００１）によって記述された方法にしたがって増殖させた。アルスロバクター・キーセリ（Ｇｕｌｆ  Ｅｃｏｌｏｌｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，Ｇｕｌｆ  Ｂｒｅｅｚｅ，ＦＬ３２５６１，ＵＳＡ）を、Ｅａｔｏｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：３６８９−３７０３，２００１）によって記述されたプロトコールにしたがって増殖させた。シノリゾビウム・メリロッティ１０２１（ＡＴＣＣ５１１２４）を、ＡＴＣＣＴＹ培地およびヒドロキシ安息香酸培地中、２６℃にて増殖させた。イールシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）株ＣＯ９２（ＡＴＣＣ）を、ＡＴＣＣ培地７３９ウマ血液アガー中、２６℃にて増殖させた。バシルス・サブチリス６０５１（ＡＴＣＣ）を、Ｂｅｒｅｔｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）；Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中、３０℃にて増殖させた。大腸菌ゲノムＤＮＡを、実施例１で記述したように、株ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン）より単離した。
【０２７３】
実施例１で記述したＰＣＲ、クローニングおよびスクリーニングプロトコールを使用して、Ｃ．テストステロニおよびＳ．メリロッティｐｒｏＡ配列、ならびに大腸菌、Ｂ．サブチリス、およびＳ．メリロッティｋｈｇ配列をクローン化した。同様の方法を用いて、以上に記述した他の配列をクローン化可能である。Ｃ．テストステロニｐｒｏＡ遺伝子に関して、ＰＣＲに関するアニーリングおよび伸長条件は、４０〜６０℃１分４５秒間（勾配サーモサイクル）および７２℃２分１５秒間、であった。
【０２７４】
陽性クローンを、Ｓ−ｔａｇおよびＴ７終結プライマー（ノヴァジェン）でのジデオキシ鎖終結シークエンシング（セクウェライト（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ）、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、およびインテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）からの内部プライマーを用いて配列決定した。
【０２７５】
発現および活性アッセイ
（配列解析によって確認した）プラスミドＤＮＡを、発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノヴァジェン）内にサブクローン化した。培養液を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で増殖させ、プラスミドを、キアゲンスピンプラスミドミニプレップキットを用いて単離し、続いて、制限消化によって解析して、同一性を確認した。誘導実験を、３７℃にて、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で増殖させた、ＢＬ２１（ＤＥ３）構造物で実施した。タンパク質発現を、ＯＤ600が、およそ０．６に達した後、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。細胞を、３０℃にて４時間増殖させ、遠心によって回収した。次いで細胞を、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）試薬（ノヴァジェン）を用いて溶解し、Ｈｉｓ−タグ組換え体タンパク質を、以上（実施例１）で記述したように、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを用いて精製した。精製したタンパク質を、ＰＤ−１０使い捨てカラム上で脱塩し、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３中に溶出した。
【０２７６】
タンパク質を、４〜１５％勾配ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、組換え体融合タンパク質の予想ＭＷでの、可溶性タンパク質のレベルを検出した。
【０２７７】
タンパク質を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ナトリウムを基質として用いて活性に関してアッセイした。アッセイ混合液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７−ｐＨ８．９）、０〜８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）、および６ｍＭの各基質が１ｍＬ中に含まれた。反応を、種々の量のポリペプチド（例えば、１０〜１００μｇ）を加えることによって開始し、２５℃〜３７℃にて３０分間インキュベートし、濾過し、次いで−８０℃にて凍結した。
【０２７８】
ｐｒｏＡ遺伝子産物での活性結果
Ｃ．テストステロニｐｒｏＡおよびＳ．メリロッティＳＭｃ００５０２遺伝子構造物は、ＩＰＴＧで誘導したときに、高レベルの発現を持った。組換え体タンパク質は、総タンパク質および細胞抽出試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決定されたように、非常に可溶性であった。Ｃ．テストステロニ遺伝子産物を、＞９５％純度まで精製した。Ｓ．メリロッティ遺伝子産物の収率は、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを用いたアフィニティー精製の後、非常に低かったので、細胞抽出液を、酵素アッセイのために使用した。
【０２７９】
両方の組換え体アルドラーゼが、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からのＭＰの形成を触媒した。二価リン酸マグネシウムおよびカリウム両方の存在が、酵素活性のために必要である。インドール−３−ピルビン酸、ピルビン酸またはリン酸カリウムが存在しない場合、産物は現れなかった。少量の産物がまた、酵素が存在しない場合に形成された（典型的には、酵素が存在した場合よりも、１オーダー小さな規模である）。
【０２８０】
実施例６で記述したＬＣ／ＭＳ法を用いて、産物ピークが、インドール−３−ピルビン酸標準よりもわずかに遅く、逆相Ｃ１８カラムより溶出され、このピークの質量スペクトルが、２９２．１の衝突誘導親イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）を示し、親イオンが、産物ＭＰを予測した。質量スペクトル中に存在する主要な娘断片には、ｍ／ｚ＝１５８（１Ｈ−インドール−３−カルボアルデヒドカルボニウムイオン）、１６８（３−ブタ−１，３−ジエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、２７４（２９２−Ｈ2Ｏ）、２５６（２９２−２Ｈ2Ｏ）、２３８（２９２−３Ｈ2Ｏ）、２２８（２９２−ＣＨ4Ｏ3）および２０４（ピルビン酸の欠損）のものが含まれた。産物はまた、２７９〜２８０のλmax、およびおよそ２９０ｎｍにて、小さな肩で、トリプトファンのような、他のインドールを含む化合物のＵＶスペクトル特性を示した。
【０２８１】
Ｃ．テストステロニアルドラーゼによって産生されたＭＰの量は、室温から３７℃までの反応温度、基質の量およびマグネシウムの量の増加によって増加した。酵素の合成活性は、ｐＨの増加によって減少し、観察された最大産物はｐＨ７の時であった。トリプトファン標準に基づいて、２０μｇの精製タンパク質を用いる標準アッセイ下で産生されたＭＰの量は、およそ、１ｍＬ反応あたり、１０〜４０μｇであった。
【０２８２】
Ｓ．メリロッティとＣ．テストステロニＰｒｏＡアルドラーゼコード配列の、以上で記述した他の遺伝子との高程度の相同性によって、全ての組換え体遺伝子産物が、この反応を触媒可能であることが予想される。さらに、（Ｃ．テストステロニの番号付けシステムに基づいて）位置５９および８７にてスレオニン（Ｔ）、１１９にてアルギニン（Ｒ）、１２０にてアスパラギン酸（Ｄ）、３１および７１にてヒスチジン（Ｈ）を持つアルドラーゼが、同様の活性を持ち得ることが予想される。
【０２８３】
ｋｈｇ遺伝子産物での活性結果
Ｂ．サブチリスおよび大腸菌ｋｈｇ遺伝子構築物両方が、ＩＰＴＧで誘導したときに、高レベルのタンパク質を発現したが、Ｓ．メリロッティｋｈｇは、より低いレベルの発現であった。組換え体タンパク質は、総タンパク質および細胞抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって判断したように、非常に可溶性であった。Ｂ．サブチリスおよび大腸菌ｋｈｇ遺伝子産物を、＞９５％純度まで精製し、Ｓ．メリロッティ遺伝子産物の収率は、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを用いたアフィニティー精製の後、高くはなかった。
【０２８４】
マグネシウムおよびリン酸が、本酵素の活性に必要であるという証拠はない。しかしながら、文献によって、リン酸ナトリウム緩衝液中でのアッセイの実施が報告されており、酵素が二機能性であり、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸（ＫＤＰＧ）のような、リン酸化基質上で活性を持つことが報告されている。酵素アッセイを以上で記述したように実施し、いくつかの例では、リン酸を省略した。結果は、組換え体ＫＨＧアルドラーゼ類がＭＰを産生するが、ＰｒｏＡアルドラーゼのような活性ではなかったことを示唆している。いくつかの場合、ＫＨＧによって産生されたＭＰのレベルは、マグネシウムおよびリン酸のみによって産生された量とほとんど同一であった。リン酸は、ＫＨＧ活性を増加させるようには見えなかった。バシルス酵素がもっとも高い活性を持ち、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって決定したように、マグネシウムおよびリン酸のみよりも、およそ２０〜２５％高い活性を持った（実施例６を参照のこと）。シノリゾビウム酵素は、最小の活性量を持ち、これは、発現において考えられた、ホールディングおよび可溶性の問題に関連し得る。すべての３つの酵素は、活性部位グルタミン酸（Ｂ．サブチリス番号付けシステムで位置４３）、ならびにピルビン酸とのＳｈｉｆｆ塩基形成に必要なリシン（位置１３０）を持つが、Ｂ．サブチリス酵素は、位置４７にて、アルギニンではなく、スレオニン、活性部位残基を含む。Ｂ．サブチリスＫＨＧはより小さく、活性部位スレオニンを持つ他の酵素と一緒に、Ｓ．メリロッティおよび大腸菌酵素から遠いクラスター内でみられる。活性部位の差が、Ｂ．サブチリス酵素の活性の増加の理由であり得る。
【０２８５】
アルドラーゼ活性の改善
触媒抗体は、天然のアルドラーゼと同様に効果的であり得、広範囲の基質を許容し、図２で示した反応を触媒するために利用可能である。
【０２８６】
アルドラーゼはまた、リン酸に対する要求性を取り除くため、およびエナンチオ選択性を反転させるために、例えば、ＤＮＡシャフリングおよびエラー傾向ＰＣＲによって発展させた、ＫＤＰＧアルドラーゼ（以上で記述したＫＨＧに対して高い相同性）に関して先に記述されたように、指向発達によって改善可能である。ＫＤＰＧアルドラーゼポリペプチドは、ドナー基質（ここでは、ピルビン酸）に対して非常に特異的であるが、アクセプター基質（すなわちインドール−３−ピルビン酸）に関して比較的柔軟性があるため、生化学反応において有用である（Ｋｏｅｌｌｅｒ  ＆  Ｗｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：２３２−９，２００１）。ＫＨＧアルドラーゼは、多数のカルボン酸およびアルデヒドとのピルビン酸の濃縮に対して活性を持つ。ＫＨＧアルドラーゼの哺乳動物バージョンは、４−ヒドロキシ４−メチル２−オキソグルタル酸の高い活性を含む、多くの細菌のバージョンよりも広いエナンチオ特異性を持ち、４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の両方の立体異性体の許容性を持つと考えられる。細菌供給源は、Ｒ異性体に関して、１０倍の優先傾向を持つことが明らかである。ゲノムデータベースで、ほぼ１００ＫＨＧの相同物が利用可能であり、活性が、シュードモナス、パラコッカス、プロビデンシア、シノリゾビウム、モルガネラ、大腸菌および哺乳動物組織で示されてきた。これらの酵素を、モナチン産生のために望まれるエナンチオ特異性を調製するための開始点として利用可能である。
【０２８７】
ピルビン酸および、ケト酸であるか、および／またはインドールのような、大きな疎水性基を持つかいずれかである他の基質を利用するアルドラーゼが、ポリペプチドの特異性、スピードおよび選択性を調製するために「発展（ｅｖｏｌｖｅｄ）」することが可能である。本明細書で示したＫＨＧおよびＰｒｏＡアルドラーゼに加えて、これらの酵素の例には、限定はしないが、ＫＤＰＧアルドラーゼおよび関連ポリペプチド類（ＫＤＰＨ）、ノカルジオイデスｓｔ．（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｔ．）からのトランスカルボキシベンザールピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ、ピルビン酸と２−カルボキシベンズアルデヒド（芳香族環含有基質）を濃縮する、４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブト−３−エノエートアルドラーゼ（２’−カルボキシベンザールピルビン酸アルドラーゼ）、また基質としてピルビン酸および芳香族含有アルデヒドを利用する、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）およびスフィンゴモナス・アロマチシボランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からの、トランス−Ｏ−ヒドロキシベンジリデンピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ、基質として２−オキソ酸を利用し、有機体ミクロコッカス・デニトリカンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中に存在すると考えられる、３−ヒドロキシアスパラギン酸アルドラーゼ（エリスロ−３−ヒドロキシ−Ｌ−アスパラギン酸グリオキシレートリアーゼ）、ベンジル基を含む基質を利用する、ベンゾインアルドラーゼ（ベンズアルデヒドリアーゼ）、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ、グリシンをベンズアルデヒドと濃縮する、Ｌ−スレオ−３−フェニルセリンベンズアルデヒド−リアーゼ（フェニルセリンアルドラーゼ）、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ、１，２−ジヒドロキシベンジルピルビン酸アルドラーゼ、および２−ヒドロキシベンザールピルビン酸アルドラーゼが含まれる。
【０２８８】
以上で記述したのと同様のアッセイ、および実施例６で記述した検出方法を利用して、イソシトレートリアーゼ、Ｎ−アセチルノウラミン酸シンターゼ、クエン酸リアーゼ、トリプトファナーゼおよび特定の変異体、ベータ−チロシナーゼおよび特定の変異体、ＰＬＰ、触媒的アルドラーゼ抗体、トリプトファンシンターゼ（類）が、試験した条件下で、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに検出可能なほど変換することは見られなかった。
【０２８９】
望む活性を持つポリペプチドを、以下の方法を用いて、対象のクローンをスクリーニングすることによって選別可能である。トリプトファン栄養要求株に、発現カセット上に対象のクローンを含むベクターを形質導入し、少量のモナチンまたはＭＰを含む培地上で増殖させる。アミノトランスフェラーゼおよびアルドラーゼ反応が可逆的であるので、細胞が、モナチンのラセミ混合物よりトリプトファンを産生可能である。同様に、（組換え体および野生型両方の）有機体を、炭素およびエネルギー供給源として、ＭＰまたはモナチンの利用可能性によって選別可能である。標的アルドラーゼの１つの供給源が、種々のシュードモナスおよびリゾバクテリア株の発現ライブラリーである。シュードモナスは、芳香族分子の分解のために、多くの異常な代謝経路を持ち、また、多くのアルドラーゼを含み、一方で、リゾバクテリアは、アルドラーゼ類を含み、植物根圏中で増殖すると知られており、モナチンのための生合成経路の構築のために記述された多くの遺伝子を持つ。
【０２９０】
実施例３
トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸のモナチンへの変換
２つの酵素、アミノトランスフェラーゼおよびアルドラーゼを利用するインビトロ工程が、トリプトファンおよびピルビン酸よりモナチンを産生した。第一段階において、α−ケトグルタル酸が、インドール−３−ピルビン酸およびグルタミン酸を産生する、トランスアミノ化反応において、トリプトファンからのアミノ基のアクセプターであった。アルドラーゼは、Ｍｇ2+およびリン酸の存在下で、ピルビン酸がインドール−３−ピルビン酸と反応し、モナチン（ＭＰ）のα−ケト誘導体、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸を産生する第二反応を触媒した。アミノ基の、第一反応にて形成されたグルタミン酸からの伝達によって、望む産物であるモナチンが産生された。産物の精製および特性化によって、形成された異性体が、Ｓ，Ｓ−モナチンであったことが確立された。他の基質、酵素および条件、および本工程に関して実施された改善を記述する。
【０２９１】
酵素
アルドラーゼ、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）からの４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ（ＰｒｏＡアルドラーゼ、ｐｒｏＡ遺伝子）（ＥＣ４．１．３．１７）を、実施例２で記述したように、クローン化し、発現させ、精製した。Ｂ．サブチリス、大腸菌およびＳ．メリロッティからの４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシレートリアーゼ類（ＫＨＧアルドラーゼ類）（ＥＣ４．１．３．１６）を、実施例２で記述したようにクローン化し、発現させ、精製した。
【０２９２】
モナチンを産生するために利用したアルドラーゼとの組み合わせで使用したアミノトランスフェラーゼは、大腸菌ａｓｐＣ遺伝子によってコードされたＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、大腸菌ｔｙｒＢ遺伝子によってコードされたチロシンアミノトランスフェラーゼ、Ｓ．メリロッティＴａｔＡ酵素、Ｌ．メジャーｂｓａｔ遺伝子によってコードされた広基質アミノトランスフェラーゼ、またはブタ心臓からの、グルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｔｙｐｅ  ＩＩａ）であった。非哺乳動物タンパク質のクローニング、発現および精製は、実施例１で記述している。ブタ心臓からのグルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（＃Ｇ７００５）より得た。
【０２９３】
ＰｒｏＡアルドラーゼおよびＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いる方法
反応混合液には、１リットル中、５０ｍＭ酢酸アンモニア、ｐＨ８．０、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３ｍＭリン酸カリウム、０．０５ｍＭリン酸ピリドキサール、１００ｍＭピルビン酸アンモニア、５０ｍＭトリプトファン、１０ｍＭ  α−ケトグルタル酸、１６０ｍｇの組換え体Ｃ．テストステロニＰｒｏＡアルドラーゼ（未精製細胞抽出液、〜３０％アルドラーゼ）、２３３ｍｇの組換え体大腸菌Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（未精製細胞抽出液、〜４０％アミノトランスフェラーゼ）が含まれた。酵素を除くすべての成分を一緒に混合し、トリプトファンが溶解するまで、３０℃にてインキュベートした。次いで、酵素を加え、反応溶液を、３．５時間、ゆっくりと撹拌しながら（１００ｒｐｍ）、３０℃にてインキュベートした。酵素の添加０．５および１時間後、固体トリプトファンの一部（各５０ｍｍｏｌ）をこの反応液に加えた。加えたトリプトファンは全ては溶解しなかったが、濃度は、５０ｍＭ以上に維持された。３．５時間後、固体トリプトファンを濾過して取り除いた。標準として定義された量のトリプトファンを用いる、ＬＣ／ＭＳによる反応混合液の解析が、溶液中のトリプトファンの濃度が、６０．５ｍＭであり、モナチンの濃度が、５．８１ｍＭ（１．０５ｇ）であったことを示した。
【０２９４】
以下の方法を使用して、最終産物を精製した。９０パーセントの透明な溶液を、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（２２５ｍＬ、１．７ｍｅｑ／ｍＬの結合能力）のカラムに適用した。カラムを水で洗浄し、２８０ｎｍでの吸収が、画分をとおした最初のフローの＜５％であるまで、３００ｍＬ画分を回収した。次いでカラムを、１Ｍ酢酸アンモニア、ｐＨ８．４で溶出し、４  ３００−ｍＬ画分を回収した。すべての４つの画分が、モナチンを含み、ぬるい水浴での、回転エバポレーターを用いて、１０５ｍＬまで蒸発させた。沈殿物が、容量が減少したように形成され、蒸発工程の経路にわたって濾過して除去した。
【０２９５】
ＬＣ／ＭＳによるカラム画分の解析によって、９９％のトリプトファンおよびモナチンがカラムに結合したことが示された。蒸発工程の間に形成された沈殿物は、＞９７％トリプトファンおよび＜２％モナチンが含まれた。上清中のトリプトファンの産物に対する比は、およそ２：１であった。
【０２９６】
上清（７ｍｌ）を、０．５Ｌ  １Ｍ  ＮａＯＨ、０．２Ｌ水、１．０Ｌの１．０Ｍ酢酸アンモニア、ｐＨ８．４、および０．５Ｌ水で洗浄することによって、先に、酢酸形態に変換した、１００ｍＬ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム  バイオサイエンシス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。上清を、＜２ｍＬ／分でのせ、カラムを、２８０ｎｍでの吸収が〜０になるまで、３−４ｍＬ／分で、水によって洗浄した。モナチンを、１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．４にて溶出し、４  １００−ｍＬ画分を回収した。
【０２９７】
画分の解析によって、画分を介したフロー中の、トリプトファンのモナチンに対する比が、８５：１５であり、溶出画分中の比が７：９３であったことが示された。モナチンの２８０ｎｍでの消滅係数が、トリプトファンと同様であるとすると、溶出画分は、０．１４６ｍｍｏｌの産物を含んだ。合計１Ｌの反応液に外挿すると、モナチンは〜２．４ｍｍｏｌ（〜７１０ｍｇ）産生され、６８％の回収率であった。
【０２９８】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出画分を、＜２０ｍＬまで蒸発させた。産物の一部をさらに、解析スケールのモナチン特性化のために、実施例６で記述したものと同様のクロマトグラフィー条件を用いて、Ｃ8プレパラティブ逆相カラムに適用することによって、さらに精製した。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｆｒａｃｔｉｏｎｌｙｎｘ（商標）ソフトウェアを利用して、ｍ／ｚ＝２９３イオンの検出に基づいて、モナチンの自動化画分回収を誘発した。モナチンに関する、相当するプロトン化された分子でのＣ8カラムからの画分を回収し、乾燥するまで蒸発させ、次いで、少量の水中に溶解した。この画分を、産物の特性化のために使用した。
【０２９９】
得られた産物を、以下の方法を用いて特性化した。
【０３００】
ＵＶ／可視スペクトロスコピー
酵素的に産生されたモナチンのＵＶ／可視スペクトロスコピー測定を、Ｃａｒｙ  １００  Ｂｉｏ  ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を用いて実施した。水中に溶解させた精製した産物は、２８８ｎｍの肩を持つ、２８０ｎｍの吸収最大を持ち、これは、インドールを含む化合物の典型的な特徴である。
【０３０１】
ＬＣ／ＭＳ解析
インビトロ生化学反応より由来したモナチンに関する、混合液の解析を、実施例６で記述したように実施した。インビトロ酵素合成混合液中のモナチンの、典型的なＬＣ／ＭＳ解析を図５に例示している。図６に下パネルは、ｍ／ｚ＝２９３でのモナチンのプロトン化分子イオンに関する、選択したイオンクロマトグラムを例示している。混合液中でのこのモナチンの同定は、図６で示した質量スペクトルによって確証となった。ＬＣ／ＭＳによる精製した産物の解析は、２９３の分子イオンでのシングルピークと、２８０ｎｍでの吸収を示した。質量スペクトルは、図６で示したものと同一であった。
【０３０２】
ＭＳ／ＭＳ解析
実施例６で示したような、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験をまた、モナチンにおいて実施した。モナチンの娘イオン質量スペクトルを図７に示している。図７で標識された全ての断片イオンの仮の構造アサイメントを実施した。これらには、ｍ／ｚ＝２７５（２９３−Ｈ2Ｏ）、２５７（２９３−（２×Ｈ2Ｏ））、２３０（２７５−ＣＯＯＨ）、２１２（２５７−ＣＯＯＨ）、１６８（３−ブタ−１，３−ジエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１５８（１Ｈ−インドール−３−カルボアルデヒドカルボニウムイオン）、１４４（３−エチル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１３０（３−メチレン−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）および１１８（インドールカルボニウムイオン）の断片イオンが含まれる。これらの多くは、分子のインドール部分から由来すると予測されたように、ＭＰに関して得たもの（実施例２）と同様である。いくつかは、ケトンの代わりにアミノ基の存在によって、ＭＰに関して見られたものよりも１質量ユニット大きい。
【０３０３】
モナチンの正確な質量測定
図８は、アプライド・バイオシステムズ−パーキン・エルマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）Ｑ−Ｓｔａｒハイブリッドクワドロポール／飛行時間質量スペクトロメーターを用いて、精製したモナチンに関して得られた質量スペクトルを示している。内部質量較正標準としてトリプトファンを用いた、プロトン化されたモナチンに関する測定された質量は、２９３．１１４４であった。プロトン化モナチンの計算された質量は、要素組成Ｃ14Ｈ17Ｎ2Ｏ5に基づいて、２９３．１１３７である。これは、２部分／１００万（ｐｐｍ）以下の質量測定エラーであり、酵素的に産生されたモナチンの要素組成の決定的な証拠を提供している。
【０３０４】
ＮＭＲ分光法
ＮＭＲ実験を、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００ＭＨｚ器具上で実施した。モナチンの試料（〜３ｍｇ）を０．５ｍｌのＤ2Ｏ中に溶解した。最初に、溶媒（Ｄ2Ｏ）を、４．７８ｐｐｍでの内部参照として利用した。水に対するピークが大きかったので、1Ｈ−ＮＭＲを、水に対するピークの抑制のために実施した。つづいて、水ピークの広がりのために、モナチンのＣ−２部分を、参照ピークとして利用し、７．１９２ｐｐｍの公表値として設定した。
【０３０５】
13Ｃ−ＮＭＲに関して、数百のスキャンの初期実施によって、試料が希釈されすぎており、割り当てられた時間で、正確な13Ｃスペクトルを得ることができないことが示唆された。したがって、ヘテロ核多重量子結合力（ＨＭＱＣ）実験を実施し、水素および結合した炭素の相関を可能にし、また、炭素の化学シフトにおける情報を提供する。
【０３０６】
1ＨおよびＨＭＱＣデータの要約を、表２および３で示している。公表値との比較によって、ＮＭＲデータが、酵素的に産生されたモナチンが、（Ｓ，Ｓ）または（Ｒ，Ｒ）いずれか、または両方の混合物であることを示唆した。
【０３０７】
キラルＬＣ／ＭＳ解析
インビトロで産生されたモナチンが、１つの異性体であり、（Ｒ，Ｒ）および（Ｓ，Ｓ）エナンチオマーの混合物ではないことを確立するために、キラルＬＣ／ＭＳ解析を、実施例６で記述した器具を用いて実施した。
【０３０８】
キラルＬＣ分離を、Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔ（アドバンスド・セパレーションズ・テクノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キラルクロマトグラフィーカラムを用いて、室温にて実施した。ベンダーからの公表されたプロトコールに基づいて、分離および検出を、トリプトファンのＲ−（Ｄ）およびＳ−（Ｌ）異性体に最適化した。ＬＣ移動相は、Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む水、Ｂ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むメタノールからなった。溶出は、７０％Ａおよび３０％Ｂで定組成であった。流速は、１．０ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸収を２００ｎｍ〜４００ｎｍでモニタした。トリプトファンおよびモナチンのキラルＬＣ／ＭＳ解析に関して使用した器具パラメータは、ＬＣ／ＭＳ解析に関して、実施例６で記述したものと同一である。ｍ／ｚ１５０〜４００領域に関する質量スペクトルの回収を利用した。プロトン化分子イオンに関する選択したイオンクロマトグラム（Ｒ−およびＳ−トリプトファンに関して、［Ｍ＋Ｈ］+＝２０５、モナチンに関して［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３）によって、混合液中でのこれらの解析物の直接の同定が可能であった。
【０３０９】
キラルクロマトグラフィーによって分離し、ＭＳによってモニタした、Ｒ−およびＳ−トリプトファンおよびモナチンのクロマトグラムを図９で示している。モナチンのクロマトグラム中での単一のピークが、化合物が１つの異性体であることを示唆し、Ｓ−トリプトファンに対してほとんど同一である保持時間を持つ。
【０３１０】
【表３】
2007508840.tif 000007
【０３１１】
【表４】
2007508840.tif 000008
【０３１２】
偏光分析法
旋光度を、Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ａｕｔｏｐｏｌ  ＩＩＩ旋光度計上で測定した。モナチンを、水中１４．６ｍｇ／ｍＬ溶液として調製した。Ｓ，Ｓモナチン（塩形態）に関して予想された特定の旋光（［α］D20）は、水中１ｇ／ｍＬ溶液に関して、−４９．６である（Ｖｌｅｇｇａａｒ  ｅｔ  ａｌ）。観察された［α］D20は、精製した、酵素的に産生されたモナチンに関して、−２８．１であり、これがＳ，Ｓ異性体であることを示唆している。
【０３１３】
改善
試薬および酵素濃度を含む、反応条件を最適化し、５〜１０ｍｇ／ｍＬの収率を、以下の試薬混合液、５０ｍＭ酢酸アンモニア  ｐＨ８．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００ｍＭピルビン酸（ナトリウムまたはアンモニウム塩）、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸（ナトリウム塩）、０．０５ｍＭ酢酸ピリドキサール、酵素の添加後、１ｍＬの最終容量を達成するための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、５０μｇ／ｍＬの組換え体ＰｒｏＡアルドラーゼ（細胞抽出液、総タンパク質濃度１６７μｇ／ｍＬ）、１０００μｇ／ｍＬの、大腸菌ａｓｐＣ遺伝子によってコードされた、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（細胞抽出液、総タンパク質濃度、２５００μｇ／ｍＬ）、および＞６０ｍＭの濃度を達成するための固体トリプトファン（飽和、反応を通して未溶解）を用いて産生した。混合液を、３０℃にて４時間、ゆっくりと撹拌するか、混合しながらインキュベートした。
【０３１４】
代用
α−ケトグルタル酸の濃度は、１ｍＭまで減少可能であり、等収率のモナチンで、９ｍＭアスパラギン酸を含めることができる。オキサロ酢酸のような、他のアミノ酸アクセプターを、第一段階で使用可能である。
【０３１５】
組換え体Ｌ．メジャー広基質アミノトランスフェラーゼを、大腸菌Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの代わりに使用した場合、モナチンの同様の収率を達成した。しかしながら、２９２の分子量を持つ、第二の未同定産物（主要産物の３〜１０％）もまた、ＬＣ−ＭＳ解析によって検出された。０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬのモナチン濃度が、大腸菌ｔｙｒＢコード酵素、Ｓ．メリロッティｔａｔＡコード酵素、またはブタ心臓からのグルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）をアミノトランスフェラーゼとして加えた場合に産生された。インドール−３−ピルビン酸から反応を開始した場合、還元アミン化は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨで、最終段階にて実施可能である（実施例４で示したように）。
【０３１６】
Ｂ．サブチリス、大腸菌およびＳ．メリロッティからのＫＨＧアルドラーゼをまた、モナチンを酵素的に産生するために、大腸菌Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと一緒に使用した。以下の反応条件を使用した。５０ｍＭ  ＮＨ4−ＯＡｃ  ｐＨ８．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００ｍＭ  ピルビン酸、５ｍＭ  グルタミン酸、０．０５ｍＭ  リン酸ピリドキサール、酵素の添加後、０．５ｍＬの最終容量を達成するための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、２０μｇ／ｍＬの組換え体Ｂ．サブチリスＫＨＧアルドラーゼ（精製）、約４００μｇ／ｍＬの細胞抽出液より未精製な、大腸菌Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、および１２ｍＭインドール−３−ピルビン酸。反応液を、振とうしながら、３０℃にて３０分間インキュベートした。Ｂ．サブチリス酵素を用いて産生されたモナチンの量は、８０ｎｇ／ｍＬであり、アルドラーゼの増量に伴って増加した。インドール−３−ピルビン酸およびグルタミン酸を、飽和量のトリプトファンおよび５ｍＭα−ケトグルタル酸で置換した場合、モナチンの産生が、３６０ｎｇ／ｍＬまで増えた。反応を、飽和量のトリプトファンで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３中、３０μｇ／ｍＬの各３つのＫＨＧ酵素で繰り返し、検出を増加させるために、１時間処理した。バシルス酵素は、実施例２でのように、最も高い活性を持ち、およそ４０００ｎｇ／ｍＬモナチンを産生する。大腸菌ＫＨＧは３０００ｎｇ／ｍＬモナチンを産生し、Ｓ．メリロッティ酵素は、２３００ｎｇ／ｍＬを産生した。
【０３１７】
実施例４
ＭＰおよびモナチン間の相互変換
モナチンを形成するためのＭＰのアミン化は、実施例１および３で同定したもののようなアミノトランスフェラーゼ類によって、またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのような還元共因子を必要とするデヒドロゲナーゼ類によって触媒可能である。これらの反応は可逆的であり、いずれかの方向で測定可能である。デヒドロゲナーゼ酵素を利用する場合、方向性は、アンモニウム塩の濃度によって、大きく制御され得る。
【０３１８】
デヒドロゲナーゼ活性
モナチンの酸化的脱アミノ化を、ＮＡＤ（Ｐ）＋が、より発色体のＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されたので、３４０ｎｍでの吸収の増加を追うことでモニタした。モナチンを、実施例３で記述したように、酵素的に産生し、精製した。
【０３１９】
典型的なアッセイ混合液には、０．２ｍＬ中、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〜８．９、０．３３ｍＭ  ＮＤＡ+またはＮＡＤＰ+、２〜２２ユニットのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ）、および１０〜１５ｍＭの基質が含まれた。アッセイは、モレキュラー・デバイセス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｖｉｃｅｓ）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー上、ＵＶ−透明マクロタイタープレート中で、二重に実施した。酵素、緩衝液、およびＮＡＤ（Ｐ）+の混合液を、基質を含むウェル内にピペットし、３４０ｎｍでの吸収の増加を、簡単に混合した後、１０秒の間隔でモニタした。反応液を、２５℃にて１０分間インキュベートした。陰性対照を、基質の添加無しで実施し、グルタミン酸を、陽性対照として利用した。ウシ肝臓からのＩＩＩ型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ＃Ｇ−７８８２）は、グルタミン酸のα−ケトグルタル酸への変換率の、およそ１００分の１の変換率で、モナチンのモナチン前駆体への変換を触媒する。
【０３２０】
アミノ基転移活性
モナチンアミノトランスフェラーゼアッセイを、大腸菌からのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、大腸菌からのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）、Ｌ．メジャーからの広基質アミノトランスフェラーゼ（ＢＳＡＴ）、および実施例１で記述した、２つの市販されているブタグルタミン酸−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼにて実施した。オキサロ酢酸およびα−ケトグルタル酸両方を、アミノアクセプターとして試験した。アッセイ混合液には、（０．５ｍＬ中）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、５ｍＭ  アミノアクセプター、５ｍＭ  モナチン、および２５μｇのアミノトランスフェラーゼが含まれた。アッセイを、３０℃にて３０分間インキュベートし、反応を、０．５ｍＬのイソプロピルアルコールの添加によって停止させた。モナチンの欠損を、ＬＣ／ＭＳによってモニタした（実施例６）。最も高い量の活性が、アミノアクセプターとしてオキサロ酢酸での、Ｌ．メジャーＢＳＡＴにて記録され、続いて、アミノアクセプターとしてα−ケトグルタル酸での同様の酵素であった。オキサロ酢酸での相対活性は、ＢＳＡＴ＞ＡｓｐＣ＞ブタＩＩａ型＞ブタＩ型＝ＴｙｒＢであった。α−ケトグルタル酸での相対活性は、ＢＳＡＴ＞ＡｓｐＣ＞ブタＩ型＞ブタＩＩａ型＞ＴｒｙＢであった。
【０３２１】
以上で記述したのと同様のアッセイ、および実施例６で記述した検出方法を利用して、２つの酵素、Ｓ．メリロッティｔａｔＡおよびＲ．スファエロイデスｔａｔＡは、試験した条件下で、モナチンをＭＰへ、検出可能に変換するようには見られなかった。この検出可能な活性の欠損は、しかしながら、水溶液中で不安定であるので、ＭＰが時折検出することが難しいという事実による可能性がある。
【０３２２】
実施例５
トリプトファンおよびトリプトファン以外のＣ３供給源からのモナチンの産生
実施例３で記述したように、インドール−３−ピルビン酸またはトリプトファンを、Ｃ３分子としてピルビン酸を用いてモナチンに変換可能である。しかしながら、いくつかの環境で、ピルビン酸は、望ましい原材料ではない。例えば、ピルビン酸は、他のＣ３炭素供給源より高額であり得、または培地に加えた場合に、発酵において、逆効果を持ち得る。アラニンを、多くのＰＬＰ−酵素によってアミン変換して、ピルビン酸を産生可能である。
【０３２３】
トリプトファナーゼ−様酵素は、アミノトランスフェラーゼのような、他のＰＬＰ酵素よりもより速い速度で、ベータ−脱離反応をおこす。このクラス（４．１．９９．−）からの酵素は、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、およびＯ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリン、３−クロロ−Ｌ−アラニンのような、良い脱離基を持つセリンおよびシステインの誘導体から、アンモニアおよびピルビン酸を産生可能である。
【０３２４】
ＥＣ４．１．９９．−ポリペプチドを用いてモナチンを産生するための工程を、Ｍｏｕｒａｔｏｕ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１３２０−５，１９９９）の方法にしたがって、β−チロシナーゼ（ＴＰＬ）またはトリプトファナーゼに変異導入することによって改良可能である。Ｍｏｕｒａｔｏｕ他は、β−チロシナーゼの、天然に存在するとは報告されていない、ジカルボン酸アミノ酸β−リアーゼへの変換の能力を記述している。特異性の変化は、バリン（Ｖ）２８３を、アルギニン（Ｒ）に、そしてアルギニン（Ｒ）１００をスレオニン（Ｔ）に変換することによって達成した。これらのアミノ酸の変化が、リアーゼに関して、（アスパラギン酸のような）加水分解脱アミノ化反応に関して、ジカルボン酸アミノ酸を許容させる。したがって、アスパラギン酸がまた、続くアルドール濃縮反応のための、ピルビン酸の供給源として利用可能である。
【０３２５】
さらに、細胞または酵素反応器に、乳酸および乳酸をピルビン酸に変換する酵素を供給可能である。この反応を触媒可能な酵素の例には、乳酸デヒドロゲナーゼおよび乳酸オキシダーゼが含まれる。
【０３２６】
ゲノムＤＮＡの単離
トリプトファナーゼポリペプチドは、例えばＭｏｕｒａｔｏｕ他（ＪＢＣ  ２７４：１３２０−５，１９９９）にて先に報告されてきている。トリプトファナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を単離するために、大腸菌ＤＨ１０ＢからのゲノムＤＮＡを、実施例１で記述したようなＰＣＲのための鋳型として利用した。
【０３２７】
チロシン−フェノールリアーゼに関する遺伝子を、Ｃ．フレウンディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（ＡＴＣＣカタログ番号８０９０、Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  １３３１６、ＮＣＴＣ  ９７５０）より単離し、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天（Ｄｉｆｃｏ  ０００１）および栄養培地（Ｄｉｆｃｏ  ０００３）上で、ＯＤ２．０まで、３７℃にて増殖させた。ゲノムＤＮＡを、キアゲンＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商標）１００／Ｇキットを用いて精製した。
【０３２８】
コード配列のＰＣＲ増幅
プライマーを、実施例１で記述したように、ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノヴァジェン、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に関して適合可能なオーバーハングを含めて設計した。
【０３２９】
大腸菌ｔｎａ（配列番号４１）。ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＮ−末端プライマー：５’−ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＣＴ−３’（配列番号４３）。ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＣ−末端プライマー：５’−ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  Ｇ−３’（配列番号４４）。
【０３３０】
Ｃ．フレウンディ  ｔｐｌ（配列番号４２）。ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＮ−末端プライマー：５’−ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号４５）。ｐＥＴ３０Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＣ−末端プライマー：５’−ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号４６）。
【０３３１】
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｌｅｒ（商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ５３３１  Ｔｈｅｒｆｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを全てのＰＣＲ反応のために使用した。５０μＬ中、０．５μｇ  鋳型（ゲノムＤＮＡ）、１．０μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ）、１×Ｅｘｐａｎｄ緩衝液Ｍｇ入り、および５％ＤＭＳＯ（最終濃度）を加えた。使用したサーマルサイクラーＰＣＲプログラムは、以下のようであった。９６℃加熱開始（５分間）、９４℃−３０秒間、４０〜６０℃−１分４５秒間、７２℃−２分１５秒間、３０回繰り返し。最終重合段階は７分間であり、次いで試料を４℃にて保存した。
【０３３２】
クローニング
実施例１で詳述した、クローニングおよび陽性クローン同定手順を使用して、適切なクローンを同定した。
【０３３３】
遺伝子発現および活性アッセイ
（配列解析によって確認した）プラスミドＤＮＡを、発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノヴァジェン）内にサブクローン化した。培養液を、３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で増殖させ、プラスミドをキアゲン・ミニプレップ・キットを用いて単離し、制限消化によって解析して、同一性を確認した。
【０３３４】
誘導実験を、ＢＬ２１（ＤＥ３）発現宿主で実施し、構造物を、３７℃にて、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で増殖させた。タンパク質発現を、培養液のＯＤ600がおよそ０．６に達した後、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導した。細胞を、３０℃にて４時間増殖させ、遠心によって回収した。次いで、細胞を、５μＬ／ｍＬプロテアーゼ阻害剤カクテルセット＃ＩＩＩ（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ（ノヴァジェン）を含む、５ｍＬ／ｇウェット細胞重量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（ノヴァジェン）試薬中で溶解し、Ｈｉｓ−タグ化組換え体タンパク質を、実施例１で記述したような、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを使用して精製した。精製タンパク質を、ＰＤ−１０（Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、アマシャム  バイオサイエンセス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））カラム上で脱塩し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０中に溶出した。タンパク質を、４〜１５％勾配ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、組換え体融合タンパク質の予想ＭＷでの、可溶性タンパク質レベルを確認した。
【０３３５】
変異導入
ペプチドクラス４．１．９９．−のいくつかのメンバー（トリプトファナーゼおよびβ−チロシナーゼ）が、任意の改変なしで、アスパラギン酸または同様のアミノ酸と、ベータ−リアーゼ反応を起こし得る。しかしながら、このクラスのいくつかのメンバーは、基質の利用および／または産物の作製を可能にするために、変異導入される必要があり得る。さらに、いくつかの場合、変換を実施可能なポリペプチドをさらに、変異導入によって最適化可能である。
【０３３６】
部位特異的変異導入を、ＰＬＰ−結合ポリペプチドの３Ｄ構造解析に基づいて実施した。ポリペプチドの基質特異性を変化させた２つの例を以下に示す。
【０３３７】
トリプトファナーゼの変異導入  実施例Ａ
以下の提供した変異導入プロトコールによって、アミノ酸配列に２つの点変異が導入された。第一点変異導入は、位置１０３でのアルギニン（Ｒ）をスレオニン（Ｔ）に変え、第二点変異導入は、位置２９９でのバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）に変えた（大腸菌成熟タンパク質のためのナンバリングシステム）。変異導入実験は、ＡＴＧラボラトリーズ（ＡＴＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）によって実施した。変異を、遺伝子断片のＰＣＲによって連続的に導入し、断片の再アセンブルを、同様にＰＣＲによって実施した。
【０３３８】
アルギニン（Ｒ）１０３をチロシン（Ｔ）に変換するためのプライマー
５’−ＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＴ−３’（配列番号４７）、および
５’−ＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号４８）。
【０３３９】
バリン（Ｖ）２９９をアルギニン（Ｒ）に変換するためのプライマー
５’−ＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＣＧＧＴ−３’（配列番号４９）、および
５’−ＣＴＴＴＧＣＣＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡ−３’（配列番号５０）。
【０３４０】
変異体を、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩでの制限消化によって選別し、シークエンシングによって確認した。
【０３４１】
チロシンフェノールリアーゼ（β−チロシナーゼ）の変異導入  実施例Ｂ
２つの点変異導入を、チロシンフェノールリアーゼアミノ酸配列に実施した。これらの変異導入によって、位置１００でのアルギニン（Ｒ）がチロシン（Ｔ）に変換され、位置２８３のバリン（Ｖ）が、アルギニンに変換された（Ｃ．フレウンディ成熟タンパク質配列中）。
【０３４２】
Ｒ１００Ｔ変換のためのプライマーは、
５’−ＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＡＴＣＧ−３’（配列番号５１）、および
５’−ＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＡＡＣＡＡＴ−３’（配列番号５２）であった。
【０３４３】
Ｖ２８３Ｒ変換のためのプライマーは、
５’−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＣＧＴＣＴＡＣＧＡＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴ−３’（配列番号５３）、および
５’−ＧＴＡＧＡＣＧＣＧＧＡＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５４）であった。
【０３４４】
以上で記述した方法を用い、クローンを、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ消化、およびＢｓｔＸＩ消化によって選別した。配列を、ジデオキシ鎖終結シークエンシングによって確認した。組換え体タンパク質を、野生型酵素に関して以上で記述したように産生した。
【０３４５】
反応混合液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００ｍＭ  Ｃ３炭素供給源、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、ナトリウム塩、０．０５ｍＭ  リン酸ピリドキサール、酵素の添加後、０．５ｍＬの最終容量を達成するための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５、２５μｇの、実施例２で調製したような、未精製組換え体Ｃ．テストステロニＰｒｏＡアルドラーゼ、５００μｇの、実施例１で調製したような、未精製Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、および＞６０ｍＭの濃度を達成するための固体トリプトファン（飽和、反応を通して未溶解）からなった。この反応混合液を、混合しながら、３０℃にて３０分間インキュベートした。セリン、アラニンおよびアスパラギン酸を、３−炭素供給源として供給した。アッセイを、ベータ−脱離およびベータ−リアーゼ反応を実施可能な第二ＰＬＰ酵素（精製）（トルプトファナーゼ（ＴＮＡ）、二重変異導入トリプトファナーゼ、β−チロシナーゼ（ＴＰＬ））あり、およびなしで実施した。反応混合液のＬＣ／ＭＳ解析の結果を表４に示している。
【０３４６】
【表５】
2007508840.tif 000009
【０３４７】
３−炭素供給源として、アラニンおよびセリンから産生されたモナチンを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘スキャン解析によって確認し、実施例３で産生された、特性化されたモナチンと同一であった。アラニンは、試験した中で最もよいものであり、ＡｓｐＣ酵素によってアミノ変換された。産生されたモナチンの量は、トリプトファナーゼの添加によって増加し、この酵素は、アミノ変換第二活性を持つ。炭素供給源としてセリンによって産生されたモナチンの量は、アミノトランスフェラーゼと比較して、５分の１だけの量のトリプトファナーゼを加える場合でも、トリプトファナーゼ酵素の添加によって、ほぼ二倍になった。ＡｓｐＣは、いくらかの量のベータ−脱離活性のみで可能である。アスパラギン酸の結果は、アスパラギン酸におけるトリプトファナーゼ活性が、β−チロシナーゼに関して先に提案されたのと同様の部位特異的変異導入では増加しなかったことを示唆している。変異体β−チロシナーゼが、モナチン産生に関して、より高い活性を持ち得ることが予想される。
【０３４８】
実施例６
モナチン、ＭＰ、トリプトファンおよびグルタミン酸の検出
本実施例は、モナチンの存在、およびその前駆体２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸、ならびにトリプトファンおよびグルタミン酸の存在を検出するために使用する方法を記述している。また、モナチンの４つの立体異性体の分離および検出に関する方法も記述している。
【０３４９】
モナチン、ＭＰおよびトリプトファンのＬＣ／ＭＳ解析
インビトロまたはインビボ生化学反応より由来した、モナチン、ＭＰおよび／またはトリプトファンの解析を、クロマトグラフと、ミクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ三重四重極子質量分析器の間に連続してウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）９９６  Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）吸収モニターが配置された、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２７９５液体クロマトグラフィーを含む、ウォーターズ／ミクロマス（Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）器具を用いて実施した。ＬＣ分離は、Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ8逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、またはＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ18逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×１５０ｍｍを用いて、室温にて、または４０℃にて実施した。ＬＣ移動相は、Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む水、およびＢ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むメタノールからなった。
【０３５０】
勾配溶出は、５％Ｂ〜３５％Ｂの直線、０〜４分間、３５％Ｂ〜６０％Ｂの直線、４〜６．５分間、６０％Ｂ〜９０％Ｂの直線、６．５〜７分間、９０％Ｂでの定組成、７〜１１分間、９０％Ｂ〜９５％Ｂの直線、１１〜１２分間、９５％Ｂ〜５％Ｂの直線、１２〜１３分間、および実施の間の５分間の再平衡であった。流速は、０．２５ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸収を、２００ｎｍ〜４００ｎｍでモニタした。ＥＳＩ−ＭＳの全てのパラメータを、対象の解析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）の発生、および特徴的な断片イオンの産生に基づいて、最適化し、選択した。
【０３５１】
以下の器具パラメータを、モナチンのＬＣ／ＭＳ解析のために利用した。キャピラリー（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）：３．５ｋＶ、コーン（Ｃｏｎｅ）：４０Ｖ、ヘックス１（Ｈｅｘ１）：２０Ｖ、開口（Ａｐｅｒｔｕｒｅ）：０Ｖ、ヘックス２（Ｈｅｘ２）：０Ｖ、供給源温度（Ｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：１００℃、脱溶媒和温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：３５０℃、脱溶媒和ガス（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｇａｓ）：５００Ｌ／時間、コーンガス（Ｃｏｎｅ  ｇａｓ）：５０Ｌ／時間、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ１）：１５．０、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ１）：１５．０、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）：０．２、入口（Ｅｎｔｒａｎｃｅ）：５０Ｖ、衝突エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）：２、出口（Ｅｘｉｔ）：５０Ｖ、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ２）：１５、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ２）：１５、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）（Ｑ２）：３．５、乗数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）：６５０。報告された質量／電荷比（ｍ／ｚ）および分子量の不確かさは、±０．０１％である。モナチン（ＭＰ）のα−ケト酸形態および混合液中のモナチンの初期検出は、ｍ／ｚ１５０〜４００の範囲の質量スペクトルの回収で、ＬＣ／ＭＳモニタリングによって実施した。プロトン化分子イオン（ＭＰに関して、［Ｍ＋Ｈ］+＝２９２、モナチンに関して、［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３、トリプトファンに関して、［Ｍ＋Ｈ］+＝２０５）に関する選択されたイオンクロマトグラフィーは、混合液中でのこれらの解析物の直接の同定を可能にする。モナチンおよびＭＰ検出に関する続く方法は、（ＭＲＭ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法をモニタリングする多重反応を利用した（以下を参照のこと）。
【０３５２】
モナチンのためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験を、以下のようにモナチンにおいて実施した。娘イオン解析には、第一質量解析器（Ｑ１）から、質量分析器の衝突細胞内への、対象の親イオン（例えば、モナチンに関してｍ／ｚ＝２９３）の遷移を伴い、そこで、アルゴンが導入され、親を断片（娘）イオンへ化学的に分離する。これらの断片イオンを次いで、第二質量解析器（Ｑ２）で検出し、親の構造アサイメントを確認するために利用可能である。トリプトファンを、ｍ／ｚ＝２０５の遷移および断片化を介して、同様の方法で、特性化し、定量した。
【０３５３】
以下の器具パラメータを、モナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析のために利用した。キャピラリー（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）：３．５ｋＶ、コーン（Ｃｏｎｅ）：４０Ｖ、ヘックス１（Ｈｅｘ１）：２０Ｖ、開口（Ａｐｅｒｔｕｒｅ）：０Ｖ、ヘックス２（Ｈｅｘ２）：０Ｖ、供給源温度（Ｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：１００℃、脱溶媒和温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：３５０℃、脱溶媒和ガス（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｇａｓ）：５００Ｌ／時間、コーンガス（Ｃｏｎｅ  ｇａｓ）：５０Ｌ／時間、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ１）：１３．０、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ１）：１３．０、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）：０．２、入口（Ｅｎｔｒａｎｃｅ）：−５Ｖ、衝突エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）：１４、出口（Ｅｘｉｔ）：１Ｖ、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ２）：１５、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ２）：１５、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）（Ｑ２）：３．５、乗数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）：６５０。
【０３５４】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング
モナチン検出の感度および選択性を増加させるために、ＭＲＭ測定を利用するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法が開発された。ＬＣ分離を、先の項目で記述したように実施した。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに関する器具パラメータを、Ｑ１およびＱ２に関して設定した、低および高質量分解を、感度を最大化するために、１２．０に設定した以外、先の項目で記述したように設定した。５つのモナチン特異的親−娘遷移を利用して、インビトロおよびインビボ反応にて、モナチンを特異的に検出した。遷移は、２９３．１から１５８．３、２９３．１から１６８．２、２９３．１から２１１．２、２９３．１から２３０．２および２９３．１から２５７．２である。
【０３５５】
モナチン、トリプトファンおよびグルタミン酸（グルタミン酸塩）のハイ−スループット決定
インビトロまたはインビボ反応から由来したモナチン、トリプトファン、および／またはグルタミン酸に関する混合液の、ハイ−スループット解析（＜５分／試料）を、以上で記述した器具、およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリングに関して記述したのと同様のＭＳパラメータを用いて実施した。ＬＣ分離を、４．６ｍｍ×５０ｍｍ  アドバンスド  セパレーション・テクノロジーズ・カイロバイオティックＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔ）カラムを用いて、室温にて実施した。ＬＣ移動相は、Ａ）０．２５％酢酸を含む水、Ｂ）０．２５％酢酸を含むメタノール、からなった。アイソクラチック溶出は、５０％Ｂ、０〜５分であった。流速は、０．６ｍＬ／分であった。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムの全てのパラメータを、トリプトファンおよびモナチンのプロトン化分子イオンの最適なインソース発生、および内部標準2Ｈ5−トリプトファンまたは2Ｈ3−グルタミン酸、ならびに多重反応モニタリング（ＭＲＭ）実験のための解析物−特異的断片イオンの、衝突誘導産生（トリプトファンに関して、２０４．７〜１４６．４、2Ｈ5−トリプトファンに関して２０９．７〜１５１．４、グルタミン酸に関して、１４７．６〜１０２．４、2Ｈ3−グルタミン酸に関して１５０．６〜１０５．４、モナチン−特異的遷移は先の項目で列記している）に基づいて、最適化し、選択した。
【０３５６】
モナチンの正確な質量測定
高分解ＭＳ解析を、アプライド  バイオシステムズ−パーキンエルマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）Ｑ−Ｓｔａｒハイブリッド四重極子／飛行時間質量分析器を用いて実施した。プロトン化モナチンに関して測定した質量は、トリプトファンを内部質量較正標準として使用した。要素組成Ｃ14Ｈ17Ｎ2Ｏ5に基づいて、プロトン化モナチンの計算した質量は、２９３．１１３７である。実施例３で記述した生物触媒工程を用いて産生したモナチンは、２９３．１１４４の測定質量を示した。これは、２部分／１００万（ｐｐｍ）以下の質量測定エラーであり、酵素的に産生されたモナチンの要素組成の確実な証拠を提供している。
【０３５７】
モナチンのキラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）測定
インビトロおよびインビボ反応中の、モナチンの立体異性体分布の決定を、１−フルオロ−２−４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミド（ＦＤＡＡ）での誘導体化、続いて逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭ測定によって実施した。
【０３５８】
ＦＤＡＡでのモナチンの誘導体化
５０μＬの試料または標準に、２００μＬの、酢酸中１％ＦＤＡＡ溶液を加えた。４０μＬの１．０Ｍ重炭酸ナトリウムを加え、この混合液を、時折混合して、４０℃にて１時間インキュベートした。試料を除去し、冷却し、２０μＬの２．０Ｍ  ＨＣｌで中和した（より多くのＨＣｌが、緩衝化生物学的混合物の中和を達成するために必要であり得る）。脱気を完了した後に、試料が、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる解析のために準備出来た。
【０３５９】
インビトロおよびインビボ反応における、モナチンの立体異性体分布の決定のための、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング
解析を、先の項目で記述した、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ器具を用いて実施した。モナチン（とりわけＦＤＡＡ−モナチン）のすべての４つの立体異性体を分離可能であるＬＣ分離を、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｌｕｎａ（５μｍ）Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム上で、４０℃にて実施した。ＬＣ移動相は、Ａ）０．０５％（質量／容量）酢酸アンモニアを含む水、Ｂ）アセトニトリル、からなった。勾配溶出は、２％Ｂ〜３４％Ｂの直線、０〜３３分、３４％Ｂ〜９０％Ｂの直線、３３〜３４分、９０％Ｂの定組成、３４〜４４分、および９０％Ｂ〜２％Ｂの直線、４４〜４６分であり、実施の間に１６分の再平衡化期間を含んだ。流速は、０．２５ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸収を、２００ｎｍ〜４００ｎｍでモニタした。ＥＳＩ−ＭＳの全てのパラメータは、ＦＤＡＡ−モナチンのプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）の発生、および特徴的な断片イオンの産生に基づいて、最適化し、選択した。
【０３６０】
以下の器具パラメータを、陰性イオンＥＳＩ／ＭＳモードにおける、モナチンのＬＣ／ＭＳ解析のために使用した。キャピラリー（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）：２．０ｋＶ、コーン（Ｃｏｎｅ）：２５Ｖ、ヘックス１（Ｈｅｘ１）：１０Ｖ、開口（Ａｐｅｒｔｕｒｅ）：０Ｖ、ヘックス２（Ｈｅｘ２）：０Ｖ、供給源温度（Ｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：１００℃、脱溶媒和温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：３５０℃、脱溶媒和ガス（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｇａｓ）：５００Ｌ／時間、コーンガス（Ｃｏｎｅ  ｇａｓ）：５０Ｌ／時間、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ１）：１２．０、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ１）：１２．０、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）：０．２、入口（Ｅｎｔｒａｎｃｅ）：−５Ｖ、衝突エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）：２０、出口（Ｅｘｉｔ）：１Ｖ、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ２）：１２、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑ２）：１２、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）（Ｑ２）：３．０、乗数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）：６５０。３つのＦＤＡＡ−モナチン−特異的親〜娘遷移を使用して、インビトロおよびインビボ反応における、ＦＤＡＡ−モナチンを特異的に検出した。遷移は、５４３．６から２６８．２、５４３．６から４９９．２および５４３．６から５２５．２である。ＦＤＡＡ−モナチン立体異性体の同定は、精製したモナチン立体異性体と比較した、クロマトグラフィー保持時間、および質量スペクトルデータに基づいた。
【０３６１】
グルタミン酸を含むアミノ酸の、液体クロマトグラフィー−後カラム蛍光検出
インビトロおよびインビボ反応での、グルタミン酸の決定のための、カラム後蛍光検出を含む液体クロマトグラフィーを、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２６９０ＬＣシステム、またはウォーターズ４７４スキャニング蛍光検出器と組み合わせた等価のもの、およびウォーターズカラム後反応モジュール上で実施した。ＬＣ分離を、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−Ｓｏｄｉｕｍロードイオン交換カラム上で、６０℃にて実施した。移動相Ａは、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｎａ  ３２８緩衝液（ピッカーリング  ラボラトリーズ社（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）であった。移動相Ｂは、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｎａ  ７４０緩衝液であった。勾配溶出は、０％Ｂ〜１００％Ｂ、０〜２０分、１００％Ｂ定組成、２０〜３０分、および１００％Ｂ〜０％Ｂ、３０〜３１分であり、実施の間に、２０分間の再平衡化期間を含んだ。移動相の流速は、０．５ｍＬ／分であった。ＯＰＡカラム後誘導体化溶液の流速は、０．５ｍＬ／分であった。蛍光検出器設定は、ＥＸ３３８ｎｍおよびＥｍ４２５ｎｍであった。ノルロイシンを、解析のための内部標準として利用した。アミノ酸の同定は、精製した標準物に対する、クロマトグラフィー保持時間データに基づいた。
【０３６２】
実施例７
細菌におけるモナチンの産生
本実施例は、大腸菌細胞内でモナチンを産生するために使用した方法を記述している。当業者は、同様の方法を、他の細菌細胞においてモナチンを産生するために使用可能であることを理解するであろう。さらに、モナチン合成経路（図２）での他の遺伝子を含むベクターを利用可能である。
【０３６３】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）：：ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ細胞内でのモナチンの産生
（実施例２で記述したような）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ＃）：：Ｃ．テストステロニｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ細胞のフレッシュプレートを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地上で調製した。一晩培養液（５ｍＬ）を、単一コロニーから接種し、カナマイシンを含むＬＢ培地中で、３０℃にて増殖させた。典型的には、１〜５０接種を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むｔｒｐ−１＋グルコース培地中での誘導のために利用した。
【０３６４】
大腸菌細胞中でのトリプトファンの産生を増加させるために使用されてきた最小培地（Ｚｅｍａｎ他，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：２００−４）である、Ｔｒｐ−１＋グルコース培地を以下のように調製した。７００ｍＬナノピュア水に、以下の試薬、２ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１３．６ｇＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇ  ＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇ  ＣａＣｌ2＊２Ｈ2Ｏおよび０．５ｍｇ  ＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏを加えた。ｐＨを７．０に調整し、容量を、８５０ｍＬまで増加させ、培地をオートクレーブした。５０％グルコース溶液を別に調製し、濾過滅菌した。４０ｍＬを、１Ｌ最終容量のために、ベースの培地に加えた（８５０ｍＬ）。
【０３６５】
１０ｇ／ＬのＬ−トリプトファン溶液を、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７中で調製し、濾過滅菌した。１０分の１の容量を、一般的に、以下に特記したように、培地に加えた。１０％ピルビン酸ナトリウム溶液をまた調製して、濾過滅菌した。１０ｍＬの分液を一般的に、培養液１リットルあたりで使用した。アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）およびＩＰＴＧ（８４０ｍＭ）のストックを調製し、濾過滅菌し、使用の前に−２０℃にて保存した。ツィーン２０（ポリオキシエチレンン  ２０−Ｓｏｒｂｉｔａｎモノラウレート）を、０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）最終濃度にて使用した。アンピシリンを、非致死濃度、典型的には、１〜１０μｇ／ｍＬ最終濃度で使用した。
【０３６６】
細胞を３７℃にて増殖させ、０．３５〜０．８のＯＤ600が得られるまで、各時間ごとにサンプリングした。次いで細胞を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧにて誘導し、インキュベーション温度を３４℃まで下げた。試料（１ｍｌ）を誘導の前に回収し（ゼロ時間点）、５０００×ｇで遠心した。上清を、ＬＣ−ＭＳ解析のために、−２０℃にて冷凍した。誘導の４時間後、さらに１ｍＬの試料を回収し、遠心して、細胞ペレットからブロスを分離した。トリプトファン、ピルビン酸ナトリウム、アンピシリンおよびツィーンを以上で記述したように加えた。
【０３６７】
細胞を、誘導後４８時間増殖させ、他の１ｍＬの試料をとり、以上のように調製した。４８時間の時点で、他のトリプトファンおよびピルビン酸の分液を加えた。全培養液容量を、増殖（誘導後）のおよそ７０時間後、４℃、３５００ｒｐｍにて２０分間遠心した。上清をデカントし、ブロスおよび細胞両方を−８０℃にて凍結した。ブロス画分を濾過し、ＬＣ／ＭＳによって解析した。［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３ピークの高さおよび面積を、実施例６で記述したようにモニタした。培地のバックグラウンドレベルを差し引いた。データをまた、６００ｎｍでの培養液の光学密度で割った、［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３ピークの高さをプロットすることによって、細胞増殖に関して正規化した。
【０３６８】
ピルビン酸、アンピシリンおよびツィーンを、誘導時ではなく、誘導後４時間で加えた場合に、より高いレベルのモナチンが産生された。ＰＬＰ、さらなるリン酸、またはさらなるＭｇＣｌ2のような他の添加物は、モナチンの産生を増加させなかった。トリプトファンを、インドール−３−ピルビン酸の代わりに利用した場合、およびトリプトファンを、接種時、または誘導時ではなく、誘導後に加えた場合に、より高いタイターのモナチンが得られた。誘導前、および誘導後４時間（基質添加時点）にて、典型的には、発酵ブロスまたは細胞抽出物中に、検出可能なレベルのモナチンはなかった。陰性対象を、ｐＥＴ３０ａベクターのみでの細胞を用いて、ならびにトリプトファンおよびピルビン酸を加えない培養で実施した。親ＭＳスキャンによって、（ｍ＋１）／ｚ＝２９３を持つ化合物が、より大きな分子より誘導されず、（実施例６でのように実施した）娘スキャンが、インビトロ作製されたモナチンと同様であったことを示唆した。
【０３６９】
（ツィーン、Ｔｒｉｘｏｎ  Ｘ−１００および酢酸ドデシルアンモニウムのような）非イオン性界面活性剤の、モナチン細胞分泌における効果を研究した。とりわけ、モナチンの分泌における、ツィーンの効果を、０、０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、および０．６％最終濃度のツィーン−２０を用いることによって研究した。シェイクフラスコによて産生されたモナチンのもっとも大きな量は、０．２％ツィーンでのものであった。ツィーンまたは他の界面活性剤によって、細胞の増殖は典型的には阻害されるけれども、この宿主内で、多くの界面活性剤が、非特異的に細胞の漏水を増加させることが予想されたので、他のツィーンの型（例えば、ツィーン−４０、ツィーン−６０およびツィーン−８０）もまた、この濃度で大腸菌内で試験した。ツィーン  ４０は、最も少ない増殖の阻害を引き起こし、続いて、ツィーン６０、ツィーン８０そしてツィーン２０であった。Ｔｗｅｎ２０での細胞増殖の最終ＯＤ600は、ツィーン４０の存在下で増殖させた培養液のほんの半分であった。
【０３７０】
アンピシリン濃度を、０〜１０μｇ／ｍＬで変化させた。細胞ブロス内のモナチンの量は、０〜１μｇ／ｍＬの間で急速に（２．５×）増加し、アンピシリン濃度が、１〜１０μｇ／ｍＬに増加したときに、１．３×増加した。
【０３７１】
典型的な結果を示している、時間経過実験を図１０で示している。細胞ブロス内に分泌されたモナチンの量は、値を、細胞増殖に関して標準化した場合でさえも、増加した。トリプトファンのモル減衰係数を利用することによって、ブロス中のモナチンの量が、１０μｇ／ｍＬ以下であることが推測された。同様の実験を、ｐｒｏＡ挿入物を含まないベクターを含む細胞で繰り返した。多数が陰性であり、これは、（ｍ＋１）／ｚ＝２９３でのピークの高さが、培地のみの場合よりも、これらの培養液中で少なかったことを示唆している（図１０）。数字は、トリプトファンおよびピルビン酸が存在しない場合に一貫して低く、これは、モナチン産生が、アルドラーゼ酵素によって触媒された酵素的な反応の結果であることを示唆している。
【０３７２】
細菌内でのモナチンのインビボ産生を、８００ｍＬシェイクフラスコ実験、および発酵器内で繰り返した。２５０ｍＬのモナチンの試料（細胞を含まないブロス）を、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびプレパラティブ逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。この試料を蒸発させ、（実施例３で記述した）高分解能質量解析に対して提示した。高分解ＭＳによって、産生されている代謝物がモナチンであることが示唆された。
【０３７３】
インビトロ工程に関する最適化実験が、アミノトランスフェラーゼの濃度が、アルドラーゼの濃度よりも数倍高い場合に、より高濃度のモナチンが産生され得ること（実施例３を参照のこと）を示唆しているので、ａｓｐＣ遺伝子が、ｐｒｏＡ遺伝子よりも高いレベルで発現した、インビボ研究のために、オペロンを構築した。
【０３７４】
プライマーを、Ｃ．テストステロニｐｒｏＡを、ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣで、オペロン内に導入するために設計した。５’プライマー：ＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴ（配列番号６７）および３’プライマー：ＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ（配列番号６８）。クローニングのために、５’プライマーは、ＢａｍＨＩ部位を含み、３’プライマーは、ＳａｌＩ部位を含む。ＰＣＲを、実施例２で記述したように実施し、産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲル精製した。ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ構造物およびＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。消化物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、ＥＢ緩衝液にて、スピンカラムから溶出した。ｐｒｏＡ  ＰＣＲ産物を、製造業者の取扱説明書にしたがって、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、ベクターとライゲートした。化学的形質導入を、実施例１にて記述したように、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（ノヴァジェン）を用いて実施した。単一コロニーを利用して、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（５ｍＬ）を含むＢＬ培地中に接種し、プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて精製した。プラスミドＤＮＡを、制限消化解析によって選別し、配列を、セクウェイライト（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ）（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって確認した。
【０３７５】
２つの遺伝子間の介在配列を、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、２３塩基対によって短化した。以下のプライマーを設計し、手順のために合成した。フォワード５’−ＧＡＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＡＡＧＧＣＴＣＴＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣ（配列番号７５）、リバース５’−ＧＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣ（配列番号７６）。温度サイクル、消化およびＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテント細胞への形質導入に関して、製造業者のプロトコールにしたがった。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢプレート上で増殖可能なクローンを、制限消化解析によって選別し、配列を、ジデオキシ鎖終結ＤＮＡシークエンシング（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって確認した。１つの変異が、位置２１４にて、アルドラーゼアミノ酸配列を、メチオニンからイソロイシンに変化させた、ｐｒｏＡ遺伝子（Ｇ６４２Ａ）中での、全ての配列決定されたクローンで発生した。この構造物を、さらに改変せずに使用した。構造物を、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノヴァジェン）内にサブクローン化した。ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ構造物をまた、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質導入した。
【０３７６】
実施例６で記述したようにＬＣ／ＭＳによって解析した、以上で記述した標準の条件下での、ＢＬＲ（ＤＥ３）シェイクフラスコ試料の初期比較によって、第二遺伝子（ａｓｐＣ）の添加が、７倍まで、産生されたモナチンの量を改善したことが示された。増殖率がより高いので、ＢＬ２１（ＤＥ３）−由来宿主株を続く実験のために使用した。ｐｒｏＡクローンおよび２つの遺伝子オペロンクローンを、以上のように、Ｔｒｐ−１培地中で誘導した。クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）を、ｐＬｙｓＳベクターを持つ細胞を含む培養液の培地に加えた。シェイクフラスコ実験を、０．２％  ツィーン−２０および１ｍｇ／Ｌアンピシリンの添加あり、およびなしで実施した。ブロス中のモナチンの量を、標準として、インビトロで産生された、精製されたモナチンを用いて計算した。Ｌｃ／ＭＳ／ＭＳ解析を、実施例６で記述したように実施した。細胞を、増殖のゼロ、４時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の時点でサンプリングした。
【０３７７】
培養ブロス中に産生された最大量に関して、結果を表５に示している。ほとんどの例において、２つの遺伝子構造物が、相当するｐｒｏＡ構造物よりも高い値を与えた。リーカー細胞エンベロープを持つはずである、ｐＬｙｓＳベクターを持つ宿主株が、これらの株が典型的にはより遅い速度で増殖するにもかかわらず、より高いレベルのモナチン分泌を示した。ツィーンおよびアンピシリンの添加が、モナチン分泌に対して利点がある。ペニシリンまたは（カルベニシリンのような）他のペニシリン誘導体の、アンピシリンの代用により、同様の利点が提供され得る。
【０３７８】
【表６】
2007508840.tif 000010
【０３７９】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の増殖速度における、いくつかの界面活性剤ツィーンの効果を、シェイクフラスコ実験で試験した。ツィーン−２０、−４０、６０または−８０を、１０μｇ／ｍＬアンピシリンの存在下で、０．２％にて加え、増殖を４８時間にわたって追った。ツィーン−４０が、もっとも少なく、増殖速度に影響をした。ツィーン−２０の存在下での増殖速度は、有機体が、ツィーン−４０の存在下で増殖した場合に観察されたものの約半分であった。ツィーン−６０および−８０は、効果においては中間であった。大腸菌宿主有機体の増殖速度に異なって影響を与えることに加えて、異なるツィーン処方が、モナチンの分泌において、異なる影響を持ち得ることが予想される。
【０３８０】
ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０ｂの構築
短化介在配列（〜７μｇ）およびｐＥＴ３２ｂ（〜６．６μｇ）を持つａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣプラスミドを、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化した。ＸｂａＩおよびＳａｌＩでのｐＥＴ３２ｂベクターの消化によって、アミノ−末端チオレドキシン−、Ｈｉｓ−およびＳ−タグが除去され、一方で、この消化によって、ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣプラスミド中のａｓｐＣ配列の上流である、Ｈｉｓ−Ｔａｇは保持される。２．１ｋＢ  ａｓｐＣｐｒｏＡバンドおよび５．４ｋＢ  ｐＥＴ３２ｂバンドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、１％−ＴＡＥアガロースゲルから精製した。消化したＤＮＡを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを用いて、消化したベクターとライゲーションさせ、上述したように、ライゲーション混合液を、ＮｏｖａＢｌｕｅ（商標）Ｓｉｎｇｌｅｓ（ノヴァジェン）内に形質導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたはカルベニシリンを含むＬＢプレート上で増殖可能なクローンを、制限消化解析によってスクリーンし、配列を、ジデオキシ鎖終結ＤＮＡシークエンシング（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＣ）によって確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に、ノヴァジェンのプロトコールにしたがって、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２を形質導入した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地上で増殖可能であるＢＬ２１（ＤＥ３）形質導入組からの２つのクローン、および１００μｇ／ｍＬアンピシリン＋３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で増殖可能であるＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質導入組からの２つのクローンを、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ遺伝子を発現するその能力に関して試験した。適切な抗生物質を含むＬＢ中の構築物の５０ｍＬ培養液を、０．５〜０．７５のＯＤ600まで、振とうして、３７℃にて増殖させた。遺伝子発現を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることによって誘導し、培養液を、さらに３時間、振とうしながら３０℃にてインキュベートした。細胞を、４０００×ｇにて１０分間の遠心によって回収し、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７で洗浄し、再び遠心した。細胞抽出物を、ノヴァジェンのプロトコールにしたがって、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩを含む、ノヴァジェン  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬を用いて調製した。細胞抽出物中のタンパク質発現のレベルを、４〜１５％勾配ゲル（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。両方のポリペプチドが良く発現し、アルドラーゼポリペプチドは、可溶性タンパク質画分の１５〜２０％であることが明らかであり、一方、アミノトランスフェラーゼポリペプチドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主培養液中の可溶性タンパク質画分の２０〜３０％であることが明らかである。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ培養液中の発現のレベルはより低かった。
【０３８１】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２ｂの新鮮なプレートを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地上で調製した。一晩培養液（５ｍＬ）を、単一コロニーから接種し、アンピシリンを含むＬＢ培地中で、３０℃にて増殖させた。典型的に、１〜１００接種を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンまたはカルベニシリンを含むｔｒｐ−１＋グルコース培地中での誘導のために使用した。接種した培養液（１００ｍＬ）を、ＯＤ600が０．５に達するまで、振とうしながら３７℃にてインキュベートした。遺伝子発現を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によって誘導し、培養液を、さらに４時間、振とうしながら３０℃にてインキュベートした。遺伝子発現が誘導されたときに、ピリドキシンをまた、０．５ｍＭの最終濃度まで加えた。誘導の４時間後、ｔｒｐ−１培地の２５−ｍＬ分液、および０．０５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬカルベニシリン（５ｍｇ）を培養液に加え、インキュベーションを、振とうしながら、３０℃にて続けた。インキュベーションの１８時間後、リン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中の０．０４ｍＭピリドキサールリン酸（最終濃度）を加えた。培養液を、無菌培養フラスコ中で、２つの等しい分液にわけた。最終濃度５０ｍＭまでの固体トリプトファン、最終濃度０．２％までのツィーン−２０（ストック溶液２０％）、および最終濃度０．１％までのピルビン酸ナトリウム（ストック溶液１０％）を、最初の分液に加えた。最終濃度５０ｍＭまでの固体トリプトファン、最終濃度０．２％までのツィーン−２０を、第二の分液に加えた。両方の培養液のｐＨを、８．２〜８．４に調整し、３０℃でインキュベーションを続けた。モナチン（０．５ｍＬ）およびタンパク質産生（５〜１０ｍＬ）の解析のための試料を、ＩＰＴＧでの誘導後、４、１８（添加前）、１９、２４および４８時間で抜いた。これらの試料を細胞をペレット化するまで遠心した。上清を、モナチンに関して、ＬＣ−ＭＳ解析の前に、Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）１３ｍｍシリンジフィルター（０．４５μｍ；ゲルマンラボラトリー（Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））を用いて濾過した。細胞ペレットを、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７にて洗浄し、細胞抽出物が、タンパク質産生の解析のために調製されるまで、−８０℃にて冷凍した。
【０３８２】
発酵ブロス試料中のモナチンの濃度を、（実施例６で記述した）ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。モナチンを、トリプトファンおよびツィーンを培養液に加えた時に、３４ｍｇ／Ｌの濃度で、２４時間発酵ブロス試料中で検出した。濃度が、誘導の４８時間後に、４．４ｍｇ／Ｌまで落ちた。トリプトファン、ピルビン酸およびツィーンを培養液に加えたときに、モナチンが、誘導の１９〜４８時間後に、１３０〜１５０ｍｇ／Ｌの濃度で、発酵ブロス試料中で検出された。
【０３８３】
細胞抽出物を、ノヴァジェンのプロトコールにしたがって、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩを含む、Ｎｏｖａｇｅｎ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬を用いて調製した。細胞抽出物中のタンパク質発現のレベルを、４〜１５％勾配ゲル（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。発現されたタンパク質の濃度は、誘導１８〜２４時間後に、細胞抽出試料中で、もっとも高かった。アルドラーゼポリペプチドは、可溶性タンパク質の＞１０％をしめ、アミノトランスフェラーゼは、可溶性タンパク質の＞２５％であることが明らかになった。
【０３８４】
実施例８
酵母でのモナチンの産生
本実施例は、真核生物において、モナチンを産生するために使用した方法を記述している。当業者は、同様の方法を、任意の対象の細胞内で、モナチンを産生するために使用可能であることを理解するであろう。さらに、他の遺伝子を、本実施例で記述したものに加えて、または変えて、利用可能である（例えば図２で列記したもの）。
【０３８５】
ｐＥＳＣ酵母エピトープ標的化ベクターシステム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で、大腸菌ａｓｐＣおよびＣ．テストステロニｐｒｏＡ遺伝子をクローン化および発現させた。ｐＥＳＣベクターは、２つの異なる多重クローニング部位を含み、ＧＡＬ１および反対の鎖にＧＡＬ１０プロモーター両方を含み、これによって同時に、２つの遺伝子を発現可能である。ｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクターはまた、宿主（ＹＰＨ５００）内で、ヒスチジン栄養要求性の相補性のために、Ｈｉｓ３遺伝子も含む。ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターが、グルコースによって抑制され、ガラクトースによって誘導され、Ｋｏｚａｋ配列が、酵母における最適な発現のために必要である。ｐＥＳＣプラスミドはシャトルベクターであり、大腸菌内で、初期構造物を作製可能にするが（選別のために、ｂｌａ遺伝子を含む）、細菌リボソーム結合部位は、多重クローニング部位では存在しない。
【０３８６】
以下のプライマーを、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ内へのクローニングのために設計した（制限部位に下線を引き、Ｋｏｚａｋ配列は太字である）。ａｓｐＣ（ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ）、ＧＡＬ１：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧ−３’（配列番号６９）および５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’（配列番号７０）。ｐｒｏＡ（ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ）、ＧＡＬ１０：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号７１）および５’−ＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣＣ−３’（配列番号７２）。
【０３８７】
両方の成熟タンパク質に関する第二コドンを、Ｋｏｚａｋ配列の導入のために、芳香族アミノ酸から、バリンに変えた。対象の遺伝子を、鋳型として、実施例１および２で記述したクローンのキアゲンＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製したｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ  ＤＮＡ）を用いて増幅した。ＰＣＲを、５０μＬの反応に関して、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒサイクル勾配サーマルサイクラーおよび以下のプロトコールを用いて実施した。１．０μＬ鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．４ｍＭ  各ｄＮＴＰ、３．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびＭｇ入り１×  Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液。使用したサーモサイクラープログラムは、９４℃にて５分間の熱開始、続く以下の段階の２９回繰り返し、９４℃３０秒間、５０℃１分４５秒間、および７２℃２分１５秒間からなっていた。２９回の繰り返しの後、試料を７２℃にて１０分間維持し、次いで４℃にて保存した。ＰＣＲ産物を、１％  ＴＡＥ−アガロースゲル上での分離、つづいて、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いた回収によって精製した。
【０３８８】
ｐＥＳＣ−ＨｉｓベクターＤＮＡ（２．７μｇ）を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩにて消化し、以上で記述したようにゲル精製した。ａｓｐＣ  ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩにて消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）で精製した。ライゲーションを、製造業者のプロトコールにしたがって、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで実施した。脱塩ライゲーション混合液を、製造業者の説明書にしたがって、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩシステムで、０．２ｃｍバイオ−ラッド使い捨てキュベットを用いて、４０μｌのＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にエレクトロポレーションした。１ｍＬのＳＯＣ培地中の回復１時間後、形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地上にプレートした。単一コロニーを利用して、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地を接種し、これらを、３７℃にて一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔｓを用いて、一晩培養液から精製した。このＤＮＡを、制限消化によって選別し、ベクターに関して設計したプライマーを用いて、確認のために配列決定した（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ）。
【０３８９】
ａｓｐＣ／ｐＥＳＣ−ＨｉｓクローンおよびｐｒｏＡ  ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した。ＤＮＡを精製し、ライゲーションを、以上で記述したように実施した。２つの遺伝子構造物を、Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（インビトロジェン）内に形質変換し、制限消化によって選別し、確認のために配列決定した（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ）。
【０３９０】
２つの遺伝子構造物を、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて、Ｓ．セルビシエ株ＹＰＨ５００内に形質変換した。形質変換反応液を、２％グルコースを含む、ＳＣ−Ｈｉｓ最小培地（インビトロジェンｐＹＥＳ２マニュアル）上にプレートした。個々の酵母コロニーを、以上で列記したＰＣＲプライマーを用いて、コロニーＰＣＲによって、ｐｒｏＡおよびａｓｐＣ遺伝子の存在に関してスクリーニングした。ペレット化した細胞（２μｌ）を、１μｌのザイモラーゼを含む、２０μＬのＹ−Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）中に懸濁させ、３７℃にて１０分間熱した。次いで、４μＬのこの懸濁液を、以上で記述したＰＣＲプロトコールを用いて、５０μＬ  ＰＣＲ反応液中で使用した。
【０３９１】
５ｍＬの培養液を、３０℃、２２５ｒｐｍにて、ＳＣ−Ｈｉｓ＋２％グルコース上で一晩増殖させた。ガラクトースでの誘導の前のラグ期間を最小化するために、細胞を、徐々に、ラフィノース上での増殖に適合させた。増殖のおよそ１２時間後、６００ｎｍでの吸収測定を実施し、適切な容量の細胞を、スピンダウンさせ、新鮮なＳＣ−Ｈｉｓ培地中で、０．４のＯＤ600を与えるように再懸濁した。以下の炭素供給源を連続して使用した。誘導のために、１％ラフィノース＋１％グルコース、０．５％グルコース＋１．５％ラフィノース、２％ラフィノースおよび最後に１％ラフィノース＋２％ガラクトース。
【０３９２】
誘導培地中の増殖のおよそ１６時間後、５０ｍＬの培養液を、二重の２５ｍＬ培養液に分け、以下を培養液の１つに加えた。（最終濃度）１ｇ／Ｌ  Ｌ−トリプトファン、５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．１、１ｇ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2。非誘導培地からの、そして（モナチン経路に関する基質の添加前）１６時間培養液からのブロスおよび細胞ペレットの試料を、陰性対照として利用した。加えて、機能的ａｓｐＣ遺伝子（および短化非機能的ｐｒｏＡ遺伝子）のみを含有する構造物を別の陰性対照として使用した。細胞を、誘導後合計６９時間増殖させた。いくつかの実験で、酵母細胞が、より低いＯＤ600にて誘導され、トリプトファンおよびピルビン酸の添加前４時間のみ増殖した。しかしながら、モナチン経路基質が、増殖を阻害することが明らかであり、より高いＯＤ600での添加がより効果的であった。
【０３９３】
培養液からの細胞ペレットを、製造業者のプロトコールにしたがって、細胞のグラム（ウェット質量）あたり、５ｍＬのＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ（商標）＋５０μｌ  ＴＨＰ（ノバジェン）で溶解した。さらに、カルビオケムプロテアーゼ阻害剤組ＩＩＩおよびベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、細菌細胞抽出物の調製のために、先の実施例で記述したように、試薬に加えた。培養ブロスおよび細胞抽出物を濾過し、実施例６で記述したように、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって解析した。この方法を用いて、モナチンはブロス試料中で検出されず、これは、細胞が、これらの条件下でモナチンを分泌出来なかった（プロトン誘因力が、これらの条件下で不十分であり得る、または一般的なアミノ酸トランスポーターが、トリプトファンで飽和された）ことを示唆している。組換え体タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた変化の検出が可能なレベルではなかった。
【０３９４】
トリプトファンおよびピルビン酸を培地に加えた時に、２つの機能的な遺伝子を発現している細胞から産生された細胞抽出物中で、モナチンは一過性に検出可能であった（約６０ｎｇ／ｍＬ）。モナチンは、任意の陰性対照細胞抽出物では検出されなかった。モナチンに関するインビトロアッセイを、実施例３で記述した最適化アッセイを用いて、４．４ｍｇ／ｍＬの総タンパク質（大腸菌細胞抽出物に関して典型的に使用するものの約二倍）を含む細胞中抽出物で二重に実施した。他のアッセイを、どの酵素が、酵母細胞抽出物中で制限であったかを決定するために、３２μｇ／ｍＬ  Ｃ．テストステロニＰｒｏＡアルドラーゼ、または４００μｇ／ｍＬ  ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼいずれかの添加で実施した。陰性対照を、酵素を添加しないか、またはＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼのみを添加して実施した（アルドール濃縮が、非酵素的に、低レベルで起こり得る）。陽性対照を、１６μｇ／ｍＬアルドラーゼおよび４００μｇ／ｍＬアミノトランスフェラーゼを用いて、部分的に精製した酵素（３０〜４０％）で実施した。
【０３９５】
インビトロアッセイをＳＲＭによって解析した。細胞抽出物の解析によって、誘導後、培地に加えた場合に、トリプトファンが、効果的に細胞内に輸送され、結果として、追加のトリプトファンを加えない場合と比較して、２倍高い程度のトリプトファンレベルとなることが示された。インビトロモナチン解析に関する結果を、表６で示している（数字は、ｎｇ／ｍＬを示している）。
【０３９６】
【表７】
2007508840.tif 000011
【０３９７】
陽性の結果が、増殖の間に基質を添加した、およびしない培養液からの、完全な２遺伝子構造物細胞抽出物で得られた。陽性対照と比較した場合、これらの結果は、酵素が、酵母中の総タンパク質の１％に近いレベルで発現したことを示唆している。（短化ｐｒｏＡを含む）ａｓｐＣ構築物からの細胞抽出物を、アルドラーゼによって解析した場合に、産生されたモナチンの量は、細胞抽出物をそれのみでアッセイした場合よりも、有意に多かった。これは、組換え体ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼが、およそ１〜２％の酵母総タンパク質を含むことを示唆している。未誘導培養液の細胞抽出物は、細胞内での天然のアミノトランスフェラーゼの存在によって、添加したＰｒｏＡアルドラーゼでアッセイした場合に、少量の活性も持った。加えたＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼでアッセイした場合に、未誘導細胞からの抽出物の活性は、ＡｓｐＣでの陰性対照（約２００ｎｇ／ｍｌ）によって産生されたモナチンの量まで増加した。反対に、２つの遺伝子構築物細胞抽出物をアッセイした場合に観察された活性は、アルドラーゼを加えた場合よりも、アミノトランスフェラーゼを加えた場合で、より増加した。両方の遺伝子が、同一のレベルで発現すべきであるので、このことは、産生されたモナチンの量が、アミノトランスフェラーゼのレベルが、アルドラーゼのレベルよりも高い場合に、最大化されることを示唆している。
【０３９８】
ピルビン酸およびトリプトファンの添加は、細胞増殖を阻害するだけでなく、あきらかに、タンパク質発現も阻害する。ｐＥＳＣ−Ｔｒｐプラスミドの添加を、ＹＰＨ５００宿主細胞のトリプトファン栄養要求性に関して補正するため、増殖、発現および分泌においてより小さな効果で、トリプトファンを提供する方法を提供するために使用可能である。Ｓ．セルビシエ株ＹＰＨ５００に、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ構造物およびｐＥＳＣ−ｔｒｐを共形質変換した。培養液を、以上で記述したように、省略し、誘導した、ヒスチジンおよびトリプトファン両方を含む培地中で増殖させた。モナチンが、基質（トリプトファンまたはピルビン酸）を、誘導の後、増殖培地に加えなかったＹＰＨ５００：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ培養液からの細胞抽出物試料で、低レベル（８．７ｎｇ／ｍＬ未満）で検出された。一方で、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ構築物のみで形質変換したＹＰＨ５００を含む培養液からの細胞抽出物にて、モナチンは検出されなかった。
【０３９９】
実施例９
野生型有機体における、モナチンのインビボ産生
いくつかの市場で、モナチンのための産生宿主として、遺伝的に改変されていない有機体を持つことが望ましい。ゲノムデータベースを、モナチン産生のために利用可能な酵素、４−ヒドロキシ４−メチル２−オキソグルタル酸アルドラーゼを持つと知られている有機体に関して検索した。シノリゾビウム・メリロッティ、コマモナス・テストステロニ、およびシュードモナス・ストラミネアが、このアルドラーゼならびに芳香族アミノトランスフェラーゼを持つと知られている。これらの有機体を、種々の条件下で増殖させて、モナチン産生を誘導した。古典的な変異導入技術を、これらの有機体によって産生されるモナチンのタイターを改善するために利用可能であった。
【０４００】
材料
他に特に言及しない限り、すべての試薬は、培地グレード純度以上のものであった。ＴＹ培地は、（Ｌあたり）６ｇトリプトン、３ｇ酵母抽出物、９ｍＭ  ＣａＣｌ2を含んだ。トリプトンおよび酵母抽出物を、ナノピュア水中に溶解し、ｐＨを７．２に調整した。容量を９９１ｍｌに調整し、混合液をオートクレーブによって滅菌した。１モルの塩化カルシウムを別に調製し、滅菌濾過し、新鮮なオートクレーブ済み培地に加えた。
【０４０１】
パラ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）培地を、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ１７０２）によって指示されたように調製した。溶液Ａ（９９０ｍｌ）には、３ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．６ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4、２．５ｇ  ＮａＣｌ、０．５ｇ酵母抽出物、および３ｇ  ４−ヒドロキシ安息香酸が含まれた。溶液Ｂ（１０ｍ）には、０．２７ｇ  ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏが含まれた。溶液ＡおよびＢを別々にオートクレーブし、冷却後併せて溶液Ｃを調製した。この新鮮に調製した溶液Ｃに、０．０５ｇ  Ｆｅ（ＮＨ4）2（ＳＯ4）2６Ｈ2Ｏ（使用の前に濾過滅菌）を含む１ｍｌの溶液を加えた。最終培地のｐＨを、６Ｎ  ＮａＯＨによって７．０に調整した。
【０４０２】
１０ｇ／ＬのＬ−トリプトファン溶液を、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７中で調製し、滅菌濾過した。１０分の１の容量を、一般的に、以下で特記したように、培養液に加えた。１０％ピルビン酸ナトリウム溶液をまた調製し、滅菌濾過した。１０ｍｌの分液を一般的に、培養リットルあたりで使用した。
【０４０３】
Ｍ９最小培地プレートを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９で記述されたように調製し、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）最小培地プレートを、以下のように調製した。各１リットルの培地に、１５ｇ寒天、０．１ｇ酵母抽出物、１ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、７ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4、２ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、０．１ｇ  ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ  ＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、０．００２５ｇ  ＮｉＣｌ2−６Ｈ2Ｏ、および４ｍＬ  １Ｍ  ＣａＣｌ2（濾過滅菌、オートクレーブの後に加える）を含めた。炭素供給源およびカサミノ酸を、以下の文脈で記述した種々の濃度で加えた。
【０４０４】
方法
シノリゾビウム・メリロッティ１０２１（ＡＴＣＣ５１１２４）を、ＴＹ培地中で接種させ、一方、コマモナス・テストステロニ（ＡＴＣＣ４９２４９）およびシュードモナス・ストラミネア（ＡＴＣＣ３３６３６）を、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））中で増殖させた。全ての株を、２６℃にて培養した。２日間増殖の後、２ｍＬの培養液を使用して、１００ｍＬの新鮮に調製したＰＨＢ培地に接種した。Ｃ．テストステロニ中のアルドラーゼ−含有経路を誘導可能である、単独の炭素およびエネルギー供給源として、ＰＨＢと一緒に１時間増殖させた後、１０ｍＬのトリプトファンおよび１ｍＬのピルビン酸を加えた。細胞を６０時間増殖させ、全ての培養液は、８〜９の最終ｐＨを持った。
【０４０５】
６００ｎｍでの吸収を、以下のように６０時間後に記録した。Ｓ．メリロッティ、３．３５、Ｐ．ストラミネア、１．２８、およびＣ．テストステロニ、１．９３。
【０４０６】
細胞を、３５００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心した。ペレットを、処理するまで、−８０℃にて冷凍した。上清（発酵ブロス）を、ＬＣ／ＭＳ解析のために濾過した。結果を、バイオマスの量における差を説明するために標準化した。細胞ペレットを、実施例１で記述したように、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（ノヴァジェン）にて処理し、得られた細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、ＬＣ／ＭＳのために濾過した。溶解の効率に差があるので、結果を、２８０ｎｍでの吸収で標準化し、細胞タンパク質の相対量の指標とした。同様の細胞抽出物を、トリプトファンおよびピルビン酸の添加無しでの、ＰＨＢ上での細胞増殖のために調製し、１つの場合（Ｓ．メリロッティ）、細胞を、ＰＨＢではなく、ＴＹ培地上で増殖させた。
【０４０７】
増殖の数日後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、アルドラーゼに関して予想された大きさでは、バンドは存在しなかった。これらの細胞抽出物を、ＰＤ１０カラム上で脱塩し、インドール−３−ピルビン酸、ピルビン酸およびグルタミン酸からの、モナチンまたはモナチン前駆体のインビトロ産生に関してアッセイした。アッセイ混合液には、１ｍＬ中、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭリン酸化カリウム（ｐＨ８）、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、酵素（細胞抽出物）、および６ｍＭの各インドール−３−ピルビン酸（エタノール中で調製）、グルタミン酸およびピルビン酸ナトリウムが含まれた。反応を、０．５ｍＬの脱塩細胞抽出物を加えることによって開始し、３７℃にて３０分間インキュベートし、濾過し、ＬＣ／ＭＳ解析の前に−８０℃で凍結した。
【０４０８】
ＬＣ／ＭＳ上での検出を、実施例６で記述したように実施した。インビトロアッセイのために、陰性対照を、モナチンの基準量を決定するために提供した、細胞抽出物なしで、またはマグネシウムとリン酸との基質の反応から産生されたＭＰで、実施した。結果を、表７〜９で示している。数字は、いくつかの場合に、面積を積分するのが難しいので、ＬＣ／ＭＳ解析からの電子スプレーピークの高さを反映している。これらの数字は、モナチン濃度とおおよそ比例し、定性的な傾向を探るために利用した。
【０４０９】
【表８】
2007508840.tif 000012
【０４１０】
ＬＣ／ＭＳクロマトグラムの解析によって、検出されたモナチンのレベルを増加するようには見えなかったけれども、Ｃ．テストステロニ株が、他の２つの有機体よりも、より大きなパーセンテージのトリプトファンを代謝した可能性があることが示唆された。これらの結果は、細胞が、モナチンを分泌することにおいて、効果的ではなかったことを示唆し得る。したがって、細胞抽出物をまた、ＬＣ／ＭＳによって解析した（表８）。
【０４１１】
【表９】
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【０４１２】
ブロスおよび細胞抽出物量の中に、検出可能なレベルのＭＰが存在しないことは、ＭＰが、特定のマトリックス内で安定ではなかったことを示唆した。さらなるトリプトファンおよびピルビン酸の効果は検出不可能であり、ただしコマモナスでは検出可能であり、利点が記録された。後者の実験によって、トリプトファンおよびピルビン酸の添加のタイミングが、非常に重要であり、適切でない時間での添加は、培養液の増殖に悪影響をおよぼし得ることが示唆された。トリプトファンおよびピルビン酸が、これらの野生型有機体中で効果的に取り上げられるかどうか、または遺伝子発現において、どんな変化が、高濃度のこれら基質を培地に加えたことの結果として発生するか、は分かっていない。パラヒドロキシ安息香酸基質が、唯一、コマモナスにおいて、アルドラーゼを誘導することが知られている一方で、Ｓ．メリロッティで産生されたモナチンの量も改善したことが示されている。
【０４１３】
Ｓ．メリロッティおよびＣ．テストステロニの細胞抽出物中で、インドール−３−ピルビン酸からモナチンを産生可能である酵素の存在を確認するために、インビトロアッセイを以上で記述したように実施した。細胞抽出物を脱塩して、培養液から残っていた任意の残余モナチンを除去した。細胞に関する培養条件を、表９の左に示し、モナチンに関するＭＳピーク高さを右カラムに示している。
【０４１４】
【表１０】
2007508840.tif 000014
【０４１５】
表９で示した結果は、陰性対照と比較して、モナチンが、これらの濾過細胞抽出物によって形成されたことを定性的に示している。表の最後の行の陰性対照は、化学的に誘導されたアルドール濃縮の示唆である。過剰なトリプトファンなしでの、ＰＨＢ上での細胞増殖が、モナチンに関して、非常に低いシグナル対ノイズ比を持ち、このことが、トリプトファンの添加が天然の芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を誘導し得ることを示唆している。質量スペクトルおよびＵＶスペクトルが、陽性対照および他の試料と異なる差を示しているので、ＴＹ上で増殖した細胞からの、Ｓ．メリロッティ細胞抽出物が、定量を干渉している少なくとも１つの他の夾雑物を持つと示されている。より大きな分子質量種の存在が示唆された一方で、Ｓ．メリロッティ２９３モナチンピークの娘断片およびＵＶスペクトルが、精製されたアルドラーゼ／トランスアミナーゼ混合物から産生されたモナチンと一致する。しかしながら、親スキャンは、より大きな分子が、２９３ピークに関連したことを示唆しなかった。
【０４１６】
さらなる増殖実験を、Ｓ．メリロッティおよびＣ．テストステロニで実施した。Ｓ．メリロッティを、トリプトファンおよびピルビン酸あり、およびなしで、ＴＹおよびＰＨＢ培地中で増殖させた。さらに、ツィーンおよびアンピシリンを、ＰＨＢ＋トリプトファン＋ピルビン酸フラスコの１つに加えて、細胞を透過性とした。Ｃ．テストステロニを、添加トリプトファンあり、およびなしで、ＮＢまたはＰＨＢ培地中で増殖させた。ＴＹ培地を、ＬＣ／ＭＳ解析物中、陰性対照として利用した。試験した両方の有機体において、モナチン分子量に相当するピークの高さは、リッチなＴＹ培地に対して、ＰＨＢ培地中で増殖した細胞に関してより高く、トリプトファンおよびピルビン酸の添加に際して、両方の細胞型に関して増加した。ツィーンおよびアンピシリンの添加は、シノリゾビウム細胞の増殖速度を大きく減少させたが、ＯＤ600によって標準化した際に、ブロス中のモナチンのレベルを改善したようには見えなかった。ＰＨＢ培地中、モナチンに相当するＬＣ／ＭＳシグナルレベルは、陰性対照よりも、両方の試料中で、２〜３倍高かった。
【０４１７】
Ｓ．メリロッティＰＨＢ実験からの試料を蒸発させ、陽イオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製した。溶出プロファイルは、他の酵素的に産生したモナチンの試料と同様に見えた。
【０４１８】
主要な炭素およびエネルギー供給源としてモナチンを用いるプレートアッセイ
モナチンを合成可能な有機体を、モナチン（またはモナチン前駆体（ＭＰ））が主要な炭素およびエネルギー供給源である、プレート上での増殖に関してスクリーニングすることによって検出可能である。この方法によるスクリーニングは、（１）合成経路が可逆的であり、産物のモナチンを、本経路によって代謝可能にすること、および（２）有機体が、モナチンまたはＭＰを輸入可能である輸送経路を持つこと、を必要とする。Ｓ．メリロッティ、Ｐ．ストラミネア、およびＣ．テストステロニを、主要な炭素およびエネルギー供給源として、モナチンを含む、最小培地プレート上で増殖させるその能力に関して試験した。
【０４１９】
実験方法および結果
Ｍ９最小培地またはリゾビウム最小培地を含むプレートを、０．０１％カサミノ酸および０．１〜０．２％炭素供給源（グルコースまたは精製モナチン）で調製した。陰性対照プレートには、カサミノ酸が含まれるが、追加の炭素供給源は含まなかった。Ｓ．メリロッティ、Ｐ．ストラミネアおよびＣ．テストステロニを、リッチ培地中で、ＯＤ２．１〜２．７まで増殖させ、無菌１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０００倍希釈した。１〜１０μＬの容量をプレーティングのために使用した。プレートを、数日間、２６℃にてインキュベートした。Ｍ９培地＋モナチン上で増殖したＳ．メリロッティは、試験した他の株よりもより増殖を示し、一方で、Ｍ９培地のみ上では増殖しなかった。実験を繰り返し、Ｃ．テストステロニが、誘導の前に、ＮＢならびにＰＨＢ培地両方で増殖した。プレーティングのためにＭ９培地を再び用いて、Ｓ．メリロッティが、他の有機体よりも、炭素供給源としてモナチンで、よりよく増殖したことがわかった。Ｃ．テストステロニはまた、わずかな増殖を示した。リゾビウム最小培地を用いて、Ｃ．テストステロニが、グルコースでのときよりも、炭素および供給源としてモナチンの場合に、よりよく増殖した。さらに、より高い希釈（１０-6）で、ＰＨＢ−増殖接種の利用が、ＮＢ−増殖接種と比較して、得られたコロニーの数および大きさを増加させた。
【０４２０】
夾雑が起こらないことを保証するために、種々のＣ．テストステロニプレートからの４つのコロニーを、ＨＭＧアルドラーゼ遺伝子に対するプライマーを用いて、コロニー−ＰＣＲによって解析した。すべての４つのコロニーが、約７５０ｂｐ（正確な大きさ）でＰＣＲ産物を与え、一方で陰性対照は産物を含まなかった。コロニーをまた、ＰＨＢプレート上で再画線させ、再び増殖可能であることがわかった。ＰＨＢ−増殖液体培養液およびＭ９プレートを用いた、Ｃ．テストステロニに関するプレーティング実験を繰り返し、細胞をスピンダウンさせ、１×ＰＢＳで洗浄し、プレーティングの前に、１×ＰＢＳ中で再懸濁させた。得られたコロニーの数は、グルコースプレートと同等であるが、一方で、陰性対照はコロニーを含まなかった。
【０４２１】
これらの結果は、シノリゾビウムおよび種々のシュードモナス属が、モナチンのインビトロ産生のために、アルドラーゼ遺伝子を含むという事実にそって、これらの有機体が、異種遺伝子の誘導なしに、モナチンを産生可能であることを示唆している。増殖培地、トリプトファンおよびピルビン酸のような基質の添加、および細胞壁に影響を与える成分の添加が、これらの野生型有機体によって産生されたモナチンのレベルを増加させるための、重要な因子であることが明らかである。有機体内での、アルドラーゼおよび芳香族アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現法の理解、およびその発現への影響が、モナチンの産生の改善を導き得る。産生性を改善するために、古典的な変異導入技術を利用可能であることが予想される。
【０４２２】
異なる供給方策を用いる他の実験
Ｐ．ストラミネア、Ｃ．テストステロニおよびＳ．メリロッティ培養液のシェイクフラスコ実験を、基質および共因子に関して、異なる供給方策略を用いて、実験的改善をして、繰り返し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭを用いて解析した。
【０４２３】
方法
シュードモナス・ストラミネアおよびコマモナス・テストステロニを、ＰＨＢ培地中で増殖させた。シノリゾビウム・メリロッティを、以上で記述したように、そして、３．７５ｍｌの２０％酵母抽出物および２ｍｌの５０％グルコースを加えた、ＰＨＢ培地中で増殖させた。開始培養液を増殖させ、１Ｌシェイクフラスコ内の２５０ｍｌ培地中に接種させた。すべての培養液を、２９℃にて一晩、２５０ｒｐｍにて振とうさせて、〜０．５〜１．１のＯＤ600までインキュベートした。
【０４２４】
モナチン排出を手助けするために、基質、共因子および試薬（表１０および１１での組成リスト）の添加のための供給方策を、２５０ｍｌの培養液あたり、以下のように実施した。
【０４２５】
【表１１】
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【０４２６】
添加２日後、培養液を、９０〜１００ｒｐｍにて、振とうしながら、２５℃にてインキュベートした。
【０４２７】
【表１２】
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【０４２８】
添加３日後、培養液を、〜８時間増殖させ、その後、この培養液を遠心して細胞を分離した。上清を濾過し、モナチンに関して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によって解析した（実施例６を参照のこと）。細胞抽出物を、以下のように細胞ペレットより調製した。ペレットを、１×リン酸緩衝食塩水中に再懸濁させ、懸濁液を、Ｆｒｅｎｃｈプレス（〜２０，０００ｐｓｉ）を２回通し、次いで遠心して細胞残留物を除去した。
【０４２９】
【表１３】
2007508840.tif 000017
【０４３０】
濾過発酵ブロス試料の、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭ法を用いる解析によって、断定的に、モナチンが、Ｃ．テストステロニおよびＰ．ストラミネアより産生されたことが示された（表１２を参照のこと）。実施例６で記述したＦＤＡＡ誘導体化方法を用いて、Ｓ，Ｓモナチン形成を、Ｃ．テストステロニ試料中で確認した。
【０４３１】
実験２条件からの濾過細胞抽出物の解析によって、モナチンが、Ｓ．メリロッティによっても細胞内で産生されたことが示された。Ｓ．メリロッティの発酵ブロス中ではモナチンが検出されず、これは、この有機体が、モナチンを分泌しないことを示唆している。しかしながら、実験２条件からのこの培養液の細胞抽出物を試験した時に、多数のモナチン異性体が、逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて同定された。異性体は、Ｓ，ＳまたはＲ，ＲおよびＳ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンとして同定された。これらの解析によって、少なくとも２つのモナチンの異性体が、Ｓ．メリロッティによって産生されたことが示唆される。多数のモナチンの異性体を産生する有機体を、インビトロでのモナチンの特異的な立体異性体の産生のための酵素の供給源として使用可能である。
【０４３２】
一緒に考えると、以上の結果は、あきらかに、シュードモナス・ストラミネア、コマモナス・テストステロニおよびシノリゾビウム・メリロッティの、モナチンを産生し、異種宿主内で発現可能な、モナチンオペロン中の遺伝子の供給源として利用可能である、その可能性が示された。
【０４３３】
組換え体大腸菌中の、ピルビン酸アルドラーゼのスクリーニングのための選別方法
炭素供給源としてリボースを含むＭ９最小培地上で増殖した場合に、ピルビン酸の添加を必要とする大腸菌の株が、すでに記述されている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５．１７７：５７１９−５７２２）。株の遺伝子型は、△ｐｙｋＡ△ｐｙｋＦである。二重ノックアウトを、Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ．２０００．９７：６６４０−６６４５）の方法によって産生可能である。これらの株は、ピリビン酸産生アルドラーゼスクリーンのための基礎を形成し、モナチンの特定の立体異性体、モナチン前駆体の特定の立体異性体、またはモナチンまたはモナチン前駆体の類似体において、より活性である、アルドラーゼに関するスクリーニングのための基礎を形成可能である。モナチン前駆体の類似体には、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸、４−カルボキシル−４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソアジピン酸のような、ＰｒｏＡアルドラーゼまたはＫＨＧアルドラーゼに対する基質、またはアルドール反応中に、ピルビン酸に変換される他のカルボキシルリッチな化合物として同定されてきた化合物が含まれる。使用可能なモナチンの類似体の例は、４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸であり、これは、天然のアミノトランスフェラーゼによって、試験細胞中で、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸（ＰｒｏＡの基質）に容易にアミノ変換され得る。
【０４３４】
クローニング
以下のプライマーを、ｐｙｋＡノックアウトを産生するために使用した。
５’−ＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＴＴＡＣＣＡＣＧＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号８５）および
５’−ＣＴＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’（配列番号８６）。
【０４３５】
以下のプライマーを、ｐｙｋＦノックアウトを産生するために使用した。
５’−ＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＣＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’（配列番号８７）および
５’−ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号８８）。
【０４３６】
ＰＣＲ反応を、標準のプロトコールを用いて、鋳型として、ｐＫＤ３またはｐＫＤ４いずれかで実施した。ＰＣＲ産物を、ラムダレッド相同組換えシステムを発現する大腸菌の株内にエレクトロポレーションした。ＰＣＲ産物は、ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦに相同性を持ち、これらのサイトで、クロモソーム内に組み換えられた。二重クロスオーバーが発生した際、結果としての子孫が欠損ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦ遺伝子および抗生物質耐性マーカーを持っていた。抗生物質耐性マーカーを持つ欠損遺伝子を、標準のＰ１形質導入技術を用いて、大腸菌株（ＭＧ１６５５）に導入した。
【０４３７】
株解析
二重ノックアウトを、（Ｂａｌｃｈのビタミン溶液、Ｂａｌｃｈの改変トレース要素溶液（Ｂａｌｃｈ，Ｗ．Ｅ．，Ｇ．Ｅ．Ｆｏｘ，Ｌ．Ｊ．Ｍａｇｒｕｍ，Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ、ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．Ｗｏｌｆｅ．１９７９．「メタン生成微生物：ユニークな生物学的群の再評価（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ：ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒｏｕｐ．）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０−２９６）、０．４％  Ｄ−リボースを含む、Ｍ９塩（ディフコ））最小培地上での増殖に関して試験した。５ｍＭピルビン酸をまた培地に加えないかぎり、二重変異体に関して、増殖は見られなかった。野生型ＭＧ１６５５を、ピルビン酸の存在する場合、またはしない場合両方で、上記培地上で増殖した。二重ノックアウトを、リボースではなく、０．４％グルコースを含む、上述した最小培地上での増殖に関して試験した。この培地上での増殖は、野生型株で見られたものと同様であった。この培地と共に、ピルビン酸が、ｐｔｓＩ遺伝子産物（ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸を産生し、リン酸をグルコースに移動させる、ホスホトランスフェラーゼシステムの酵素）を介して、グルコースから産生され得る。二重ノックアウト株をまた、リボースではなく、０．４％  Ｌ−アラビノースまたは０．４％Ｄ−キシロースを加えた、上述したような培地を用いて、増殖に関して試験した。ピルビン酸は、（非ＰＴＳ）基質を含むこれらの５−炭素上での増殖からは産生されていない。二重ノックアウトは、５ｍＭピルビン酸を含まないかぎり、これらの条件下で増殖しなかったが、野生型株は、ピルビン酸の存在する場合、およびしない場合両方で、正常に増殖した。
【０４３８】
（ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ中にクローン化した、実施例２で記述した）コモモナス・テストステロニからのｐｒｏＡアルドラーゼ遺伝子、および（ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣおよびｐＥＴ３２中でクローン化した）実施例３で記述したａｓｐＣ／ｐｒｏＡ遺伝子を、ｐＢＡＤ  ＴＯＰＯ  ＴＡ発現キット（インビトロジェン）を用いて、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ内にサブクローン化した。これらの構造物中の、遺伝子（類）の発現は、誘導可能ａｒａＢＡＤプロモーターによって制御される。アラビノース（例えば０．４％）およびＩＰＴＧの存在下で、遺伝子（類）が発現する。ピルビン酸またはピルビン酸の供給源を含めない限り、株は、最小培地上で増殖しないであろう。培地に、モナチン、モナチン前駆体、モナチンおよびモナチンの前駆体の類似体を加えることができる。文献中で使用された基質の典型的な範囲は、０．５〜５ｍＭである。ＰｒｏＡアルドラーゼは例えば、モナチン前駆体をピルビン酸およびインドール−３−ピルビン酸に変換し、ピルビン酸の供給源を株に供給し、０．４％アラビノースを含む最小培地上での増殖を許容する。ｐｒｏＡ遺伝子およびａｓｐＣ遺伝子の両方を発現する構造物は、モナチンをモナチン前駆体に、およびモナチン前駆体をピルビン酸およびインドール−３−ピルビン酸に変換できる。このシステムを、アルドラーゼに関して選別するため、およびモナチンの特定の立体異性体、モナチン前駆体の特定の立体異性体、またはモナチンまたはモナチン前駆体の類似体上で、より活性である、アルドラーゼに関して選別するために利用可能である。例えば、望む進化が、実施例２で言及した任意のアルドラーゼにて起こった場合、プレートアッセイは、得られた変異体酵素のエナンチオ特異性を測定するために、ＲまたはＳモナチン前駆体いずれかを含む培地を利用可能である。Ｒ−モナチン前駆体を含むプレート上で増殖が起こり、Ｓ−モナチン前駆体を含むプレート上で、増殖がほとんど、または全く起こらなかった場合、アルドラーゼは、反応部位において、Ｒ−キラリティーを含む基質に対して特異性を持つ。
【０４３９】
Ｍ９最小培地プレートを、１×Ｂａｌｃｈビタミン溶液およびＢａｌｃｈ改変トレース要素溶液（Ｂａｌｃｈ，Ｗ．Ｅ．，Ｇ．Ｅ．Ｆｏｘ，Ｌ．Ｊ．Ｍａｇｒｕｍ，Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ、ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．Ｗｏｌｆｅ．１９７９．「メタン生成微生物：ユニークな生物学的群の再評価（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ：ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒｏｕｐ．）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０−２９６）を含んで作製した。グルコースまたはアラビノースを、炭素供給源（０．４％  ｗ／ｖ）として含め、プレートに、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解した５ｍＭ  モナチン（Ｒ，Ｒ；Ｓ，Ｓラセミ体混合物）、またはモナチンを含まない、等量のリン酸カリウム緩衝液いずれかを含めた。増殖を、以下表１３で要約している。
【０４４０】
【表１４】
2007508840.tif 000018
【０４４１】
スクリーンを、ＰｒｏＡおよびＡｓｐＣのレベルを制御すること、モナチンの取り込みを増加させること、モナチンの代わりにモナチン前駆体を利用すること（この場合、アミノトランスフェラーゼは存在する必要がない）、または以上で記述したもののような、少ないモナチンの疎水性類似体を利用すること、によって最適化可能であることが予測される。モナチンの取り込みを増加させるための方法には、アミノ酸混合物の添加、特定のアミノ酸の添加、および細胞壁を浸透性にすることを助ける、界面活性剤、抗生物質、抗生物質類似体または酵素の利用が含まれる。ポリミキシンＢナノペプチド（Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｒａ．１９８６．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．２９：７８１−７８８）およびミクロシスチンＲＲ（Ｄｉｘｏｎ，Ａｌ−Ｎａｚａｗｉ，ａｎｄ  Ａｌｄｅｒｓｏｎ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００４．２００３：１６７−１７０）が、大腸菌の外側膜を浸透性にする試薬として記述されてきている。
【０４４２】
他のプロモーターシステム／プラスミドを、等しい結果を持って、このスクリーニングシステムで使用可能であることが予想される。例には、Ｔ７プロモーターシステムおよびｔａｑおよびｌａｃのようなＩＰＴＧ誘導可能プロモーターが含まれる。
【０４４３】
モナチンおよびモナチン前駆体（ＭＰ）類似体の合成
モナチン前駆体（ＭＰ）類似体４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸を、Ｓｈａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｕｓ（１９６２）またはＰｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ（１９５５）またはＷａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（１９５４）の方法を用いて合成する。モナチン前駆体（ＭＰ）類似体４−カルボキシ−４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸を、Ｔａｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）の方法、またはＭａｒｔｉｕｓ（１９４３）の方法によって合成する。
【０４４４】
モナチン類似体４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸を、実施例４のアミノ変換活性項目にて記述したように、アミノドナーグルタミン酸の存在下で、ａｓｐＣアミノトランスフェラーゼとの反応によって、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸から生合成した。
【０４４５】
実施例１０
リポ酸生合成遺伝子のノックアウトによる、大腸菌内でのピルビン酸の産生の増加
リポ酸生合成経路の妨害によって、大腸菌におけるピルビン酸生産性が増加可能であり、これは、インビボモナチン産生のために利点であり得る。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに関する共因子として利用するために可能である、リポ酸がほとんどないか、または全くない場合、ピルビン酸からのアセチル−ＣｏＡの形成が制限される。ＤＥ３株を、ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ中のＴ７プロモーターからのモナチンオペロンの発現に関して使用可能である。ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ：：ｃａｍ株を、トリプトファン過剰産生株である、大腸菌７６９２内への、ｌｉｐＡノックアウト（クロラムフェニコール挿入あり）のＰ１形質導入のための、ドナー株として利用した。大腸菌７６９２△ｌｉｐＡおよびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ変異体両方を、Ｔ７発現のために、溶原化した。
【０４４６】
株
大腸菌株ＢＥ２５１１３および大腸菌ＣＧＳＣ７６９２を、ジェネティック  ストック  センター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））より得た。大腸菌ＣＧＳＣ７６９２は、以下の遺伝子型を持つ。Ｗ３１１０ｔｎａＡ２ｔｒｐＥＦＢＲ１９（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９６８）９５：１２８３−１２９４、およびＹａｎｏｆｓｋｙ他，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８４）１５８：１０１８−１０２４）。この株は、フォードバック耐性アントラニル酸シンターゼ遺伝子（ｔｒｐＥ）を持ち、これは、トリプトファンの生合成に関する、鍵となる分岐点であり、調節点である。
【０４４７】
ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ：：ｃａｍ構造物は、Ｄｒ．Ｈａｎｓ  Ｌｉａｏより提供された（第ＷＯ０２０８５２９３Ａ号）。
【０４４８】
材料と方法
Ｐ１ファージを、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）カタログ＃２５４０４−Ｂ１から購入した。ラムダ（ＤＥ３）溶原化キットを、ノヴァジェン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。他に言及しない限り、全ての試薬は、培地グレードまたはそれ以上であった。
【０４４９】
ピルビン酸過剰発現培地を、以下を含めて利用した。５０ｇ／Ｌグルコース（オートクレーブ後に加える）、１０ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４ｇ／Ｌペプトン（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））、１ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、２ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2−２Ｈ2Ｏ（オートクレーブ後に加える）、および１μｇ／リットルのリポ酸（オートクレーブ後に加える）。ピルビン酸過剰産生培地を、ＮａＯＨでｐＨ８に調節した。
【０４５０】
大腸菌株の遺伝的操作
Ｐ１形質導入を、Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，「細菌遺伝学のショートコース（Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９２）の方法を用いて実施した。Ｐ１溶解物を、大腸菌ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ：：ｃａｍ細胞を用いて作製した。次いで、単離したＰ１ファージを、大腸菌ＣＧＳＣ７６９２を形質導入するために使用した。対象のクローンを、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１０ｎＭリポ酸を含むＢＬプレート上での増殖によって選別した。リポ酸シンターゼ欠損を、リポ酸を含む、そして含まないプレート上での増殖の比較によって、およびＰＣＲスクリーニングならびに正確な大きさおよび制限パターンに関するＰＣＲ産物の解析によって確認した。
【０４５１】
大腸菌株ＣＧＳＣ７６９２のλＤＥ３溶原化、７６９２△ｌｉｐＡ、およびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡを、製造業者のプロトコールにしたがって、ノヴァジェンλＤＥ３溶原化キットを用いて実施した。ＤＥ３ファージの存在を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのない状態では、プラークを形成することができない、Ｔ７  Ｔｅｓｔｅｒファージ（４１０７）の利用によって確認した。溶原化を、さらに、ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ構造物を用いる発現実験によって確認した。
【０４５２】
ピルビン酸の検出
ピルビン酸に関して解析すべき、インビトロまたはインビボ生化学反応実験の試料を、ｐＨを３未満に減少させるために、ギ酸で処理し、次いで、ＬＣ／ＭＳ解析にかける前に、０．４５μｍのナイロンシリンジフィルターを介して濾過した。ピルビン酸の同定は、保持時間および質量選択的検出に基づいた。ＬＣ分離を、Ｗａｔｅｒｓ２６９０液体クロマトグラフィーシステム、および４０℃での定組成溶出での、２．１ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｐｅｈｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｑｕａ  Ｃ18逆相クロマトグラフィーカラムを用いて実施した。ＬＣ移動相は、０．１８ｍＬ／分の流速での、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む水中１％メタノールであった。
【０４５３】
ピルビン酸の解析のための検出系には、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）検出器およびＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ四極子質量分析器が含まれる。クロマトグラフィープロファイルをモニタリングするために、１９５〜２２５ｎｍにて操作する、ＰＤＡを、クロマトグラフィーシステムと質量分析器の間に連続して配置した。ピルビン酸の［Ｍ＋Ｈ］-イオンの安定性を増強するために、イソ−プロパノールおよび水中の１％（ｖ／ｖ）ＮＨ4ＯＨのインラインカラム後添加を、質量分析器の前に、０．０２５ｍＬ／分の速度で加えた。
【０４５４】
陰性電子噴霧イオン化モード（−ＥＳＩ）にて操作するＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ四極子質量分析器パラメータを、以下のように設定した。キャピラリー（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）：２．０ｋＶ、コーン（Ｃｏｎｅ）：３０Ｖ、エクストラクター（Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）：４Ｖ、ＲＦレンズ：１Ｖ、供給源温度（Ｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：１２０℃、脱溶媒和温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：３８０℃、脱溶媒和ガス（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｇａｓ）：６００Ｌ／時間、コーンガス（Ｃｏｎｅ  ｇａｓ）：オフ、低質量分解（Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：１５．０、高質量分解（Ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：１５．０、イオンエネルギー（Ｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）：０．２、倍増管（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）：６５０。単一イオンモニタリングＭＳ試験を、ピルビン酸の脱プロトン化分子［Ｍ−Ｈ］-イオンである、ｍ／ｚ  ８７を選択的に検出可能にするために、設定した。
【０４５５】
増殖実験
ＢＷ２５１１３、ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ、ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）、ＣＧＳＣ７６９２、７６９２△ｌｉｐＡ、７６９２（ＤＥ３）、および７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）の２０ｍＬ培養液を、１０ｎＭリポ酸を含む、２ＹＴ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他）を含む１２５ｍＬシェイクフラスコ中で増殖させた。２４時間後、発酵ブロスの試料を、解析のためにのぞき、２０ｇ／Ｌのグルコースを加えた。培養液を、さらに２４時間増殖させ、その時点で、細胞を回収して、発酵ブロスを濾過し、以上で記述したように、ＬＣ／ＭＳによって解析した。７６９２△ｌｉｐＡおよびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ細胞両方が明らかに、ｌｉｐＡ遺伝子を含むＣＧＳＣ７６９２およびＢＷ２５１１３細胞よりも、多くのピルビン酸を産生可能であるので、図１４でリポ酸生合成の遺伝的ノックアウトの利点を示している。実験を、５０ｇ／Ｌグルコースを含む、ピルビン酸過剰産生培地で繰り返した（Ｙｏｋｏｔａ他，（１９９７）．Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８３：１３２−１３８）。ブロスの試料を、増殖の２４、４８および７２時間後に取り除き、ピルビン酸に関して、ＬＣ／ＭＳによって解析した。結果を図１５に示しており、異なる培地を用いて図１４の結果を確認している。７６９２構築物は、２ＹＴ培地中で、より高い生産性を持つことが明らかである。他の細菌における同様の遺伝的変異が、同様の効果を持つことが予想される。
【０４５６】
実施例１１
リポ酸シンターゼ遺伝子を欠く、大腸菌構造物におけるモナチンの産生
図１０にて、ピルビン酸産生が、ｌｉｐＡ遺伝子を欠損した場合に、大腸菌構造物中で増加した。ｌｉｐＡノックアウトのＤＥ３株に、モナチンオペロン（実施例７で記述したａｓｐＣ  ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２ｂ構造物）を形質導入し、誘導されたタンパク質を発現する、およびモナチンを産生するそれらの能力に関して評価した。モナチンオペロンを形質導入した、大腸菌ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）構造物は、トリプトファンを、誘導の数時間後に培養液に加えた場合に、８〜９ｎｇ／ｍｌバイオモナチンを産生した。モナチンオペロンを形質導入した、トリプトファン過剰発現株大腸菌７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）は、トリプトファンを与えないで、約２ｎｇ／ｍＬモナチンを産生した。モナチンオペロンで基質導入したが、ｌｉｐＡ遺伝子を含む、大腸菌７６９２（ＤＥ３）構造物は、検出可能なモナチンを産生しなかった。
【０４５７】
大腸菌７６９２（ＤＥ３）、７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）およびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）のエレクトロコンピテント細胞の調製
（１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび、もし△ｌｉｐＡなら、１０ｎＭ  α−リポ酸を含む）ＬＢ培地中の大腸菌７６９２（ＤＥ３）、７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）およびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）の２００ミリリットル培養液を、０．４５〜０．５のＯＤ650まで、振とうしながら３７℃にて増殖させた。氷浴中で冷却した後、培養液を、４，０００×ｇにて１０分間４℃にて遠心した。上清をデカントし、細胞ペレットを、それぞれ、２００ｍＬの無菌氷冷水中に懸濁させた。遠心を繰り返して、細胞ペレットをそれぞれ、２０ｍＬの無菌氷冷水中に検索させた。三回目の遠心の後、細胞ペレットを、２ｍＬ氷冷１０％グリセロール中にそれぞれ懸濁した。四回目の遠心によって得られた細胞ペレットを、０．１５ｍＬ氷冷１０％グリセロール中に懸濁させ、この懸濁液を、４０μＬ分液にわけて、−８０℃にて冷凍した。
【０４５８】
大腸菌７６９２（ＤＥ３）、７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）、およびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）エレクトロコンピテント細胞に、バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ  ＩＩ器具を用いて、バイオ−ラッド・エレクトロポレーションマニュアルにて記述された標準の条件下での、エレクトロポレーションによって、モナチンオペロン構築物（ａｓｐＣ  ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２）を形質導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（および△ｌｉｐＡの場合、２０ｎＭ  αリポ酸）を含むＬＢ培地上で増殖可能なクローンを、その、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ遺伝子を発現する能力に関して解析した。
【０４５９】
１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ中の、２つの７６９２（ＤＥ３）クローンの５０ｍＬ培養液を、０．５〜０．９の間のＯＤ650まで、振とうしながら、３７℃にて増殖させた。さらに、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０ｎＭ  αリポ酸を含むＬＢ中の、１つの７８９２ＤｌｉｐＡ（ＤＥ３）クローンと１つのＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）クローンの５０ｍＬ培養液を、０．５〜０．９の間のＯＤ650まで、振とうしながら、３７℃にて増殖させた。遺伝子発現を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導し、培養液を、さらに撹拌しながら、３０℃にて４時間インキュベートした。細胞を、４，０００ｒｐｍにて１０分間の遠心によって回収し、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７緩衝液で洗浄し、再び遠心した。細胞抽出物を、製造業者のプロトコールにしたがって、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩを含む、ノヴァジェンＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬を用いて調製した。細胞抽出物中のタンパク質発現のレベルを、４〜１５％勾配ゲル（バイオ−ラッド、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。全ての宿主において、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ両方がよく発現され、レベルは、ＬＢ培養液上で増殖させた場合に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主で見られたものと同様であった。
【０４６０】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＴ３２を形質導入した、大腸菌７６９２（ＤＥ３）、７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）およびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）細胞における、モナチンの産生
これらの実験において、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２を形質導入した大腸菌株を、以上で記述したように、増殖させ、誘導した。これらの培養液に、トリプトファンおよびピルビン酸両方を加え、細胞内および細胞外試料を、モナチンの産生に関して解析した。
【０４６１】
ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２を形質導入した、大腸菌７６９２（ＤＥ３）、７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）およびＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）細胞のフレッシュなプレートを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地上で調製した。△ｌｉｐＡ株に関して使用したプレートはまた、１０ｎＭαリポ酸を含んだ。一晩培養液（５ｍＬ）を、単一コロニーから接種し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０ｎＭαリポ酸を含むＬＢ培地中、３７℃にて増殖させた。一晩培養液の１ｍＬを、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび１０ｎＭαリポ酸を含むｔｒｐ−１培地、１００ｍＬ中で、接種として利用した。培養液を、ＯＤ650が約０．５に達するまで、振とうしながら、３７℃にてインキュベートした。遺伝子発現を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導し、培養液を、振とうしながら、３０℃にてさらに４時間インキュベートした。遺伝子発現が誘導された時に、ピリドキシンを、最終濃度０．５ｍＭまで加え、同時に１ｎｍｏｌのαリポ酸も加えた。誘導の４時間後、ｔｒｐ−１培地の２５ｍＬの分液、および０．０５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬカルベニシリン（５ｍｇ）を培養液に加え、インキュベーションを、振とうしながら、３０℃にて続けた。誘導の１８時間後、リン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中の０．０４ｍＭリン酸ピリドキサールを全ての培養液に加えた。ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２を形質導入した大腸菌７６９２（ＤＥ３）および７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）培養液に、グルコース（０．２ｇ）および０．２％の最終濃度までのツィーン−２０を与えた。大腸菌ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）構造物培養液に、最終濃度５０ｍＭまでの固体トリプトファンと、最終濃度０．２％までのツィーン−２０を与えた。すべての３つの培養液のｐＨを、８．２〜８．４に調節し、３０℃でのインキュベーションを続けた。モナチン（０．５ｍＬ）およびタンパク質産生（５〜１０ｍＬ）の解析のための試料を、ＩＰＴＧでの誘導の０、４、１８（添加前）、１９、２４、４８および７２時間後に抜いた。
【０４６２】
発酵ブロス試料中のモナチンの濃度を、実施例６で記述したように、ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。
【０４６３】
モナチンは、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入大腸菌７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）培養液からの１８時間試料中で、〜２ｎｇ／ｍＬの濃度で、発酵ブロス中で検出された。２４〜７２時間の間で抜いた試料では、モナチンは観察されなかった。ａｓｐＣ  ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入大腸菌７６９２（ＤＥ３）培養液からの任意の試料にて、モナチンは観察されなかった。しかしながら、モナチンが、濃度８〜９ｎｇ／ｍＬにて、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入大腸菌ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）培養液の、４８および７２時間発酵ブロス試料中で検出された。
【０４６４】
細胞抽出物を、ノヴァジェンのプロトコールにしたがって、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩを含む、ノヴァジェンＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬を用いて調製した。細胞抽出物中のタンパク質発現のレベルを、４〜１５％勾配ゲル（バイオ−ラッド、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。発現したタンパク質の濃度は、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入大腸菌７６９２（ＤＥ３）試料に関する、２４時間細胞抽出物試料にて、もっとも高いレベルであった。発現したタンパク質の濃度は、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入大腸菌７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）細胞抽出物試料に関して、４および１８時間試料でその最大値であった。アルドラーゼポリペプチドが、可溶性タンパク質の約１５％を占め、一方で、アミノトランスフェラーゼポリペプチドは、これらの試料中、可溶性タンパク質の＞３０％であることが明らかであった。２つのポリペプチドは、ｔｒｐ−１培地中で増殖した、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入大腸菌ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）培養液中でも、発現しなかった。しかしながら、１８および２４時間細胞抽出物試料中で見られたもっとも高いレベルは、いずれのポリペプチドでも、総可溶性タンパク質の１０〜１５％超ではなかった。
【０４６５】
これらの結果は、タンパク質が、ＩＰＴＧでの誘導の後、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２を形質導入した株全てで産生されたことを示している。ｌｉｐＡ遺伝子を欠損し、ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２を形質導入した、２つの株（大腸菌ＢＷ２５１１３△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）および７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３））が、ピルビン酸を与えることなしに、モナチンを産生した。これは、ｌｉｐＡ遺伝子ノックアウトが、モナチンのインビボ産生に関して有利であることを示している。トリプトファン過剰発現株大腸菌７６９２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）は、トリプトファンまたはピルビン酸の添加なしで、モナチンを産生した。しかしながら、モナチン産生のレベルは、トリプトファンおよびピルビン酸両方を与えた大腸菌構築物中で産生され、および分泌された量よりも、非常に少量であった（例えば、実施例７の表５を参照のこと）。
【０４６６】
実施例１２
トリプトファンおよびピルビン酸を過剰産生する、大腸菌構築物におけるモナチンの産生
ｌｉｐＡ遺伝子を欠く、大腸菌トリプトファン過剰産生株、ＮＲＲＬ１２２６４を、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含むプラスミド、ならびにトリプトファンオペロンを含む第二オペロンを形質導入した時に、モナチンを産生する能力に関して評価した。モナチンおよびトリプトファン両方を、遺伝子発現の誘導の後に測定した。
【０４６７】
株
実施例１５において、トリプトファン過剰発現物として米国特許第４，３７１，６１４号明細書にて引用された３つの株を、２つの培地組成にて、それらのトリプトファンを産生するための能力に関して実験した。１つの株である、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２（また、引用された遺伝子型ｓｅｒＢ-、ｔｒｐ△ＥＤ、ｔｎａＡ２-、ｔｅｔＳ、ｔｙｒＡ-、ｐｈｅＡ-を持つ、ＡＧＸ１５とも呼ばれる）は、ｐＢＲ３２２から由来するｐＧＸ４４と呼ばれるプラスミドも含み（Ｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１７６：３６１−３６８）、ｓｅｒＢ遺伝子およびトリプトファンオペロンを含む。他の株、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４（また、引用された遺伝子型ｓｅｒＢ-、ｔｒｐ△ＥＤ、ｔｎａＡ２-、ａｒｏＰ-を持つＡＧＸ６とも呼ばれる）は、ｐＢＲ３２２から由来した、ｐＧＸ５０と呼ばれるプラスミドを含み、ｓｅｒＢ遺伝子、５−メチルトリプトファンに耐性である細胞から由来するトリプトファンオペロン、およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。これらの２つの株を、以下の遺伝的操作にかけ、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４から由来した株を、モナチン産生のために解析した。
【０４６８】
遺伝的操作
ｌｉｐＡ遺伝子を欠損させるためのＰ１形質導入、および大腸菌ＮＲＲＬ株１２２６２および１２２６４のλＤＥ３溶原化を、実施例１０で記述したように実施した。リポ酸シンターゼ欠損を、リポ酸の存在下、または存在しない状態で、プレート上での増殖比較によって、およびＰＣＲスクリーニングおよび正確な大きさおよび制限パターンに関する、ＰＣＲ産物の解析によって、確認した。ＤＥ３ファージの存在を、Ｔ７  Ｔｅｓｔｅｒファージの利用、およびａｓｐＣｐＥＴ３０（Ｘａ／ＬＩＣ）を形質導入したときに、ａｓｐＣ遺伝子を発現する能力によって確認した。セリンおよびトリプトファンを含み、アンピシリンを含まない、リッチ培地上で、繰り返し継代することによって、プラスミドｐＧＸ４４を、株１２２６２より保存し、プラスミドｐＧＸ５０を、株１２２６４より保存した。保存を、アンピシリンの存在下での、増殖の能力の欠損によって、株１２２６４中で確認した。
【０４６９】
大腸菌１２２６２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）および１２２６４△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）のエレクトロコンピテント細胞の調製
大腸菌１２２６２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）および１２２６２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）のエレクトロコンピテント細胞を、実施例１０にて記述したように調製した。最終洗浄と、氷冷１０％グリセロール中での再懸濁の後、細胞を、４０μＬ分液にわけ、−８０℃にて冷凍した。
【０４７０】
トリプトファンオペロンを含むプラスミドの構築
キアゲンＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＧＸ４４を、株１２２６２から精製し、プラスミドｐＧＸ５０を、株１２２６４から精製した。大腸菌ゲノムＤＮＡを、実施例１で記述したように、株大腸菌ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から単離した。
【０４７１】
プラスミドｐＧＸ４４、ｐＧＸ５０のトリプトファンオペロン、および大腸菌株ＤＨ１０ＢからのゲノムＤＮＡを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ｐＰＲＯＮｃｏプラスミド内にクローン化するために、プライマーを設計した。このプラスミドは、１つのＮｃｏＩ部位が、変異Ｔ１５３８Ｃによって取り除かれた、ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ１１２ベクター（ＢＤバイオサイエンセス  クロンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の誘導体である。トリプトファンオペロン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＮＣ＿０００９１３．２  ＧＩ：４９１７５９９０  １３２０９７０−１３１４４４０）は、以下の遺伝子、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡのオープンリーディングフレームを含む。遺伝子産物のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、以下のようである。ｔｒｐＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４１５７８０．１  ＧＩ：１６１２９２２５、ｔｒｐＤ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４１５７７９．１  ＧＩ：１６１２９２２４、ｔｒｐＣ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４１５７７８．１  ＧＩ：１６１２９２２３、ｔｒｐＢ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４１５７７７．１  ＧＩ：１６１２９２２２、ｔｒｐＡ  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＯ＿４１５７７６．１  ＧＩ：１６１２９２２１。
【０４７２】
Ｎ末端：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧ−３’（配列番号７９）
【０４７３】
Ｃ末端：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＴＴＴＣＡＴ−３’（配列番号８０）。以下のＰＣＲプロトコールを遺伝子増幅のために利用した。５０μＬの反応液中に、１００〜３００ｎｇ  ＤＮＡ鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．７５Ｕ  ｐｆｕＵｌｔｒａ  ＨＦ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、２．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ），Ｍｇ入り１ＸＥｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を加えた。サーモサイクラープログラムは、９４℃５分間の熱開始、続く、３０サイクルの９４℃（３０秒間）の変性段階、６１．５℃（１分間）のアニーリング段階、および７２℃（８分間）の伸長段階、および最終的に、７２℃（７分間）の最終段階、を利用した。増幅されたＤＮＡを、キアゲン  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、１％アガロースゲルより精製した。
【０４７４】
ＰＣＲ産物およびｐＰＲＯＮｃｏベクターを、製造業者のプロトコールにしたがって、連続して、ＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より購入したＢａｍＨＩ、次いでＫｐｎＩで消化した。両方の消化の後、キアゲンＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔを用いて、ＤＮＡをタンパク質および緩衝液塩より精製した。ベクターもまた、第二の洗浄段階の前に、製造業者の推奨にしたがって、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理した。精製したＤＮＡを、２６０ｎｍでの吸収を測定することによって定量し、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、＞８：１の挿入物対ベクターの比でライゲートした。ライゲーション混合液の、エレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞への形質導入を、バイオ−ラッド  エレクトロポレーション  マニュアルに記述されているように、０．１ｃｍキュベットおよびバイオ−ラッドＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩシステムを用いて、標準条件下で実施した。トリプトファンオペロンを含むクローンを、制限解析によって同定し、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。大腸菌ＤＨ１０ＢおよびｐＧＸ４４（大腸菌株１２２６２）からのトリプトファンオペロン遺伝子の核酸配列は同一であり、ＮＣＢＩデータベース（上記リストの受入番号）と一致する一方で、ｐＧＸ５０（大腸菌株１２２６４）からのトリプトファンオペロンは、ｔｒｐＥ遺伝子中１５の変異を示したが、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子中のＤＨ１０ＢおよびｐＧＸ４４配列は同一であった。ｐＧＸ４４のｔｒｐＥ遺伝子での変異は以下のようであった。Ｇ３０Ａ（サイレント）、Ｔ６１Ｃ（サイレント）、Ｃ６３Ｇ（サイレント）、Ｇ１６０Ａ（サイレント）、Ｔ１８９Ａ（サイレント）、Ｃ２１０Ｔ（サイレント）、Ｃ２１１Ａ（Ｇｌｎ７２Ｌｙｓ）、Ａ２１７Ｇ（サイレント）、Ｃ２１８Ｔ（サイレント）、Ｔ２２０Ａ（サイレント）、Ｃ２２９Ｔ（サイレント）、Ｃ２３２Ｔ（サイレント）、Ｃ２４１Ｇ（サイレント）、Ｇ２８１Ａ（Ｓｅｒ９４Ａｓｎ）、Ｃ３４９Ｔ（サイレント）。配列番号８１および８２は、それぞれ、ｐＧＸ５０からのｔｒｐＥ遺伝子の、核酸配列およびアミノ酸配列を示している。
【０４７５】
大腸菌株１２２６２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）および１２２６４△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）の形質導入
大腸菌１２２６４△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）および１２２６２△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）エレクトロコンピテント細胞を、バイオ−ラッド・エレクトロポレーション・マニュアルにて記述された標準条件下で、バイオ−ラッド  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ器具を用いて、（実施例１０で記述した）ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＴ３２で形質導入するか、またはａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＴ３２および以上で記述したトリプトファンオペロン構造物の１つでエレクトロポレーションによって共形質導入した。１００ｍｇ／Ｌでのアンピシリンおよび２０ｎＭ  αリポ酸（ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２形質導入株）、または１００ｍｇ／Ｌでのアンピシリン、５０ｍｇ／Ｌでのカナマイシンおよび２０ｍＭαリポ酸（ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２およびトリプトファンオペロン形質導入株）のいずれかを含むＬＢ培地上で増殖可能なクローンを、さらなる解析のために選んだ。
【０４７６】
ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子およびトリプトファンオペロンを含むプラスミドを形質導入した、大腸菌株１２２６４△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）におけるモナチンの産生
ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２、またはａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２およびＤＨ１０トリポペロン／ｐＰＲＯＮｃｏで、またはａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２およびｐＧＸ４４トリポペロン／ｐＰＲＯＮｃｏで、またはａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２およびｐＧＸ５０トリポペロン／ｐＰＲＯＮｃｏで形質導入した大腸菌１２２６４△ｌｉｐＡ（ＤＥ３）のフレッシュなプレートを、適切な抗生物質および２０ｎＭのαリポ酸を含むＬＢ培地上で調製した。一晩培養液（５ｍＬ）を、単一のコロニーより接種し、適切な抗生物質および２０ｎＭαリポ酸を含む、（実施例１および７で記述した）ＬＢ培地またはｔｒｐ−１培地中、３７℃にて増殖させた。ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２およびｐＧＸ５０トリポペロン／ｐＰＲＯＮｃｏを持つ株は、ｔｒｐ−１またはＬＢ中の液体培養液中では、どちらでも増殖せず、さらには使用しなかった。１〜２ｍＬの各一晩培養液を、適切な抗生物質、０．４％カサミノ酸、０．１％Ｂａｌｃｈのビタミン溶液、および２０ｎＭαリポ酸を含む、１００ｍＬのｔｒｐ−１培地に関して接種として利用した。Ｂａｌｃｈのビタミン溶液は、以下を含んだ。１Ｌ中、ｐ−アミノ安息香酸（５．０ｍｇ）、ギ酸（２．０ｍｇ）、ビオチン（２．０ｍｇ）、ニコチン酸（５．０ｍｇ）、ペントテン酸カルシウム（５．０ｍｇ）、リボフラビン（５．０ｍｇ）、チアミン−ＨＣｌ（５．０ｍｇ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（１０．０ｍｇ）、シアノコバラミン（０．１ｍｇ）、およびαリポ酸（０．１ｍｇ）。ｐＨをＮａＯＨで７．０に調節し、この溶液を使用の前に濾過滅菌した。
【０４７７】
株を、振とうしながら、３７℃にてインキュベートした。ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２ベクターのみを持つ株は、８時間にわたり、６００ｎｍでのＯＤの増加を示さず、さらにインキュベートはしなかった。他の培養液は、ＯＤ６００が約０．５に達するまで（およそ８時間）インキュベートした。遺伝子発現を、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．５％アラビノースの添加によって誘導した。５０ｍＭ  でのピリドキシンおよび１ｍｇ／ｍＬでのビオチンも、各培養フラスコに加えた。誘導の５時間後、０．０４ｍＭ  リン酸ピリドキサール、０．５％ピルビン酸ナトリウム、０．２％  ツィーン−２０および１０μｇ／ｍＬアンピシリンを、各培養フラスコに加え、インキュベーションを３０℃にて続けた。モナチン（０．５ｍＬ）およびタンパク質産物（５〜１０ｍＬ）の解析のための試料を、ＩＰＴＧでの誘導後、０、４、１６、２４、４０、４９および６７時間後に抜いた。発酵ブロス試料中のモナチンおよびトリプトファンの濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭによって測定した。結果を、以下の表に示している。トリプトファンおよびモナチンの濃度は、表１４および１５で示したように、誘導１６〜２４時間後に抜いた発酵ブロス試料中でもっとも高かった。
【０４７８】
【表１５】
2007508840.tif 000019
【０４７９】
【表１６】
2007508840.tif 000020
【０４８０】
細胞抽出物を、ノヴァジェンのプロトコールにしたがって、ベンゾナーゼヌクレアーゼ、ｒ−リソザイムおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩで、ノヴァジェンＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬を用いて調製した。細胞抽出物中のタンパク質発現のレベルを、４〜１５％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。細胞抽出物中に効果的に発現したタンパク質を、誘導後４〜２４時間で回収したタンパク質より調製した。５５〜５９ｋＤ（ｔｒｐＳおよびｔｒｐＥ遺伝子産物）および４８〜５０ｋＤ（ｔｒｐＣおよびＨＩＳ6ａｓｐＣ遺伝子産物）の分子量のタンパク質が、高いレベルの発現を示した。細胞抽出物試料を、５倍に希釈し、濾過し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭによって解析した。モナチンではなくトリプトファンが、細胞抽出物試料中で検出された。最も高いレベルのトリプトファンが、誘導後１６〜２４時間で抜いた試料にて測定され、それより後の時間点では減少した。より濃縮した細胞抽出物試料が、検出可能なレベルでのモナチン濃度を示すことが予想される。
【０４８１】
実施例１３
組換え体グラム陽性細菌でのモナチン産生
本実施例は、コリネバクテリウム細胞のようなグラム陽性細菌中で、モナチンを産生するために使用可能である方法を記述している。当業者は、同様の方法を、他の細菌細胞中でモナチンを産生するために利用可能であることを理解するであろう。さらに、ベクターが、モナチンの産生を増加させるための他の遺伝子を含み得る。
【０４８２】
方法と材料
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１８４７を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより得た。この株は、種々の芳香族アミノ酸類似体に対して耐性であることが知られており、増殖のためにフェニルアラニンおよびチロシンを必要とする。
【０４８３】
全ての制限酵素を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｒｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より購入した。プライマーを、他に言及しない限り、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成した。コリネバクテリウム／大腸菌シャトルベクター、ｐＥＫＥＸ−を、Ｄｒ．Ｌｏｔｈａｒ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ  Ｊｕｌｉｃｈ  ＧｍｂＨ，５２４２５  Ｊｕｌｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｅｉｋｍａｎｎｓ他，（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０２（１）：９２−８））より得た。
【０４８４】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２の構築
ＰＣＲのための組換え体ＤＮＡ技術、ＤＮＡの精製、ライゲーションおよび形質導入を、確立された手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ他，１９８９）にしたがって実施した。ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含むモナチンオペロンを、鋳型としてａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＴ３２を用いて、ｐＥＫＥＸ−２ベクター内にクローン化した。ａｓｐＣ  ＡＴＧ開始コドンの５’およびｐｒｏＡ終止コドンの３’  ＫｐｎＩ制限を持つオペロンの合成のためのプライマーを、ＰＣＲ増幅のために設計した。フォワードプライマーを、ａｓｐＣ配列のリボソーム結合部位５’を含み、ｐＥＴ３２構築物中に存在するＨｉｓ−タグ配列を除くように設計した。フォワードプライマー：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＡＴ−ＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＴ−３’；リバースプライマー：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴ−ＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ−３’（配列番号８３および８４）。
【０４８５】
以下のＰＣＲプロトコールを用いてモナチンオペロンを増幅させた。５０μＬの反応液中、５０ｎｇ鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．２ｎＭの各ｄＮＴＰ、０．５Ｕ  Ｐｆｕｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、２．８Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、およびＭｇを含む１×ＥｘｐａｎｄＴＭ緩衝液を加えた（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。使用したサーモサイクラープログラムは、９６℃にて５分間の熱開始、以下の段階９４℃３０秒間、５９〜５９℃１分間４５秒（勾配サーモサイクラー）、および７２℃１分３０秒間の１０回の繰り返し、以下の段階９４℃３０秒間、５９〜５９℃１分間４５秒、および７２℃１分３０秒間、各サイクルで５秒間増加させる、の１５回繰り返し、および以下の段階９４℃３０秒間、５９〜５９℃１分４５秒間、および７２℃２分４５秒間の１０回繰り返しを含んだ。３５サイクル後、試料を、７２℃にて７分間インキュベートし、次いで４℃にて保存した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製し、２６０ｎｍでの吸収を測定することによって定量した。
【０４８６】
ｐＥＫＥＸ−２プラスミドを、ＫｐｎＩにて２時間、３７℃にて消化し、次いで、１５分間、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理した。ＰＣＲ産物を、３７℃での一晩反応中で、ＫｐｎＩで消化し、両方の消化物を、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを用いて精製した。ライゲーション反応を、８４ｎｇのプラスミドおよび１３０ｎｇのＰＣＲ産物で、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて実施し、得られたライゲーション混合液を、０．２ｃｍ  ミクロ−エレクトロポレーションキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で、大腸菌細胞を形質導入するための、製造業者の推奨手順を用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂ  ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に形質導入した。ＳＯＣ培地中での回復後、形質導入混合液を、５０μｇ／ｍＬでカナマイシンを含むＬＢプレート上でプレートした。プラスミドＤＮＡを、ＬＢ＋カナマイシンプレートからピックアップしたコロニーの液体培養液（３７℃にて一晩増殖した、５ｍＬ  ２×ＹＴ培地＋カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ））から単離し、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン）を用いて精製した。次いでプラスミドを、正確な方向および大きさを持つ挿入物に関して、制限消化によって選別し、配列を、ジデオキシヌクレオチド鎖−終結ＤＮＡシークエンシング（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって確認した。
【０４８７】
正確な配列および方向を持つ２つのクローンを、それらの、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ遺伝子を発現する能力に関して試験した。５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ中の構築物の５０ｍＬ培養液を、約０．３のＯＤ600まで撹拌して３７℃にて増殖させた。遺伝子発現を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって誘導し、培養液を、さらに１５時間、３０℃で振とうしながらインキュベートした。試料（１０ｍＬ）を、誘導後０、２および１５時間の時点で抜いた。細胞を４０００×ｇにて１０分間の遠心によって回収し、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７にて洗浄し、再び遠心した。細胞抽出物を、ノヴァジェンのプロトコールにしたがって、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩで、ノヴァジェンＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）を用いて調製した。細胞抽出物中でのタンパク質発現のレベルを、４〜１５％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。両方のポリペプチドが発現された。ｐｒｏＡアルドラーゼポリペプチドは、誘導１５時間後、可溶性タンパク質画分の５〜１０％であり、ａｓｐＣアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、１５時間試料中の可溶性タンパク質画分の２０〜３０％であることが明らかになった。
【０４８８】
エレクトロポレーションのための、コリネバクテリウム・グルタミカム・コンピテント細胞の調製
エレクトロコンピテントＣ．グルタミカム細胞を、Ｔａｕｃｈ他（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）４５：３６２−３６７）およびＫｏｆｆａｓ他（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、（２００３）５：３２−４１）のプロトコールを組み合わせた方法を用いて調製した。Ｃ．グルタミカム細胞を、一晩増殖させ、翌日、２００ｍＬのＭＢ培地（６００ｎｍでの初期吸収０．１）内に接種させた。ＭＢ培地は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１５ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌソイトン、および５ｇ／Ｌ塩化ナトリウムを含んだ。次いで、細胞を、２００ｒｐｍにて振とうして、０．７の６００ｎｍでの最終吸収まで増殖させた。細胞を遠心（４０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、細胞ペレットを、４０ｍＬの氷冷緩衝液（５％グリセロールを含む、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）にて３回洗浄した。スライス洗浄ペレットを、２０ｍＬ氷冷１０％ｖ／ｖグリセロールでさらに２回洗浄した。４℃、４０００×ｇでの１０分間の遠心の後、細胞ペレットを、１．０ｍＬ  １０％ｖ／ｖグリセロール中に懸濁させ、０．１５ｍＬ分液にわけ、−８０℃にて保存した。
【０４８９】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２での、コリネバクテリウム・グルタミカムの形質導入
Ｃ．グルタミカム細胞（株２１８４７）中の形質導入を、Ｔａｕｃｈ他（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）４５：３６２−３６７）およびＫｏｆｆａｓ他（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、（２００３）５：３２−４１）の手順を組み合わせた方法を用いて実施した。エレクトロコンピテントＣ．グルタミカム細胞を、氷上で融解した。ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２  ＤＮＡを加え（１μｇ）、混合液を、冷却０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移す前に、５分間氷上でインキュベートした。電気パルスの前に、０．８ｍＬの氷冷１０％  ｖ／ｖグリセロールを、２つの液体層が混合するのを避けるために、穏やかに細胞懸濁液上にのせた。エレクトロポレーション条件は、２００ｏｈｍｓ、２５μＦｄ、および１２．５ｋＶ／ｃｍであった。単一電気パルスへの暴露に続き、細胞懸濁液をすぐに、４ｍＬの先に暖めた（４６℃）ＭＢ培地中に移し、振とうしながら、４６℃にて６分間インキュベートした。続いて、細胞を、２００ｒｐｍにて振とうしながら、３０℃にて５０分間インキュベートした。細胞の部分を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む選択的ＭＢプレート上に蒔き、形質導入細胞を回復させた。２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む選択的ＭＢプレート上で増殖可能なクローンを、ＰＣＲによって選別して、形質導入を確認した。
【０４９０】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２で形質導入した、コリネバクテリウム細胞中のモナチンの産生
Ｃ．グルタミカム：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＫＥＸ−２（株２１８４７）のフレッシュなプレートを、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＭＢ培地上で調製した。一晩培養液（５ｍＬ）を、単一コロニーから接種し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＭＢ中で、３０℃にて増殖させた。培養液を遠心し、細胞を１ｍＬの産生培地中で懸濁させた。懸濁液の分液（０．５ｍＬ）を、１００ｍＬの産生培地を接種するために使用した。産生培地は、以下の変更をして、リシンの産生のためのＫｏｆｆａｓ他（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ，（２００３）５：３２−４１）によって使用されたものと同様であった。アミノ酸添加が、２００μｇ／ｍＬの最終濃度にて、チロシンおよびフェニルアラニンであった。カナマイシンを、２５μｇ／ｍＬで加えた。トレオニン、メチオニンおよびロイシンは加えなかった。接種した培養液（１００ｍＬ）を、ＯＤ600が０．２〜０．４に達するまで、振とうしながら、３０℃にてインキュベートした。遺伝子発現を、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によって誘導し、培養液を、振とうしながら、３０℃にてインキュベートした。遺伝子発現を誘導した時に、ピリドキシンを、最終濃度０．５ｍＭまで加えた。インキュベーションを、振とうしながら、一晩３０℃にて続けた。
【０４９１】
誘導の１６時間後、リン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中の０．０４ｍＭリン酸ピリドキサール（最終濃度）、ピルビン酸ナトリウム（０．１％）およびツィーン−２０（０．２％）を加えた。３０℃にてインキュベーションを続けた。モナチンおよびタンパク質産生の解析のための試料（５ｍＬ）を、ＩＰＴＧでの誘導の後０〜１１２時間、いくつかの時間点で抜いた。試料を遠心し、分離した上清とペレット画分を、解析まで、−８０℃にて冷凍した。
【０４９２】
発酵ブロス試料中のモナチンの濃度を、（実施例６で記述した）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。モナチン（３〜１２ｎｇ／ｍＬ）が、誘導６６〜１１２時間後に抜いたブロス試料中で検出された。よりトリプトファンを産生する培養液がまた、よりモナチンを産生した。例えば、誘導４０時間後に抜いたブロス試料中のトリプトファンの濃度が、７０μｇ／ｍＬであった場合、モナチンの濃度は、誘導後６６〜１１２時間で抜いた試料中で、１１〜１２ｎｇ／ｍＬであった。一方、少ないトリプトファン（４０時間の時点で５１μｇ／ｍＬ）を産生した培養液は、３ｎｇ／ｍＬのモナチンのみを分泌した。
【０４９３】
グルタミン酸過剰産生物、Ｃ．グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０５８）でのモナチンの産生
方法と材料
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０５８を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより得た。この株は、グルタミン酸を産生および分泌することが知られている。
【０４９４】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２でのエレクトポレーションおよび形質導入のための、コリネバクテリウム  グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０５８）コンピテント細胞の調製
エレクトロコンピテントＣ．グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０５８）細胞を、ＡＴＣＣ株２１８４７に関して記述したように調製した。最終洗浄および１０％グリセロール中での再懸濁の後、０．１５ｍＬの分液を−８０℃で保存した。細胞を、ＡＴＣＣ株２１８４７に関して記述したように、ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２およびｐＥＫＥＸ−２で形質導入した。
【０４９５】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２で形質導入したコリネバクテリウム（ＡＴＣＣ１３０５８）細胞におけるモナチンの産生
Ｃ．グルタミカム：：ａｓｐＣ  ｐｒｏＡ／ｐＥＫＥＸ−２（ＳＴＣＣ１３０５８）の２つの単離物、および  Ｃ．グルタミカム：：ｐＥＫＥＸ−２（ＳＴＣＣ１３０５８）の１つの単離物のフレッシュプレートを、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＭＢ培地上で調製した。一晩培養液（５ｍＬ）を、単一コロニーから接種し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＭＢ中で、３０℃にて増殖させた。この培養液を遠心し、細胞を１ｍＬのＣ．グルタミカム発酵培地中に懸濁させた。この培地には、１Ｌ中、以下の、グルコース（１００ｇ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（２ｇ）、Ｋ2ＨＰＯ4（１ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（１ｇ）、ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ（０．２５ｇ）、ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ（０．０１ｇ）、ＭｎＳＯ4−４Ｈ2Ｏ（０．０１ｇ）、ビオチン（２．５μｇ）が含まれた。（長期発酵に関して、ｐＨを維持するために、４〜６時間の間隔で、少量の１０％尿素を培養液に加えた。）各懸濁液（０．５ｍＬ）の分液を、２×１００−ｍＬの培地を接種するために利用した。接種した培地（１００ｍＬ）を、ＯＤ600が〜０．４に達するまで、振とうしながら、３０℃にてインキュベートした。遺伝子発現を、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によって誘導し、培養液を振とうしながら、３０℃にてインキュベートした。遺伝子発現が誘導された時に、ピリドキシンを、０．５ｍＭの最終濃度まで加えた。インキュベーションを、振とうしながら、一晩、３０℃にて続けた。
【０４９６】
誘導の９時間後、リン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、０．０４ｍＭリン酸ピリドキサール（最終濃度）、ピルビン酸ナトリウム（０．１％）およびツィーン−２０（０．２％）を、各構築物に関して、１つの培養液フラスコに加えた。ツィーン−２０を、各培養液の第二フラスコから除いた。３０℃でのインキュベーションを続けた。モナチンおよびタンパク質産生の解析のための試料（５ｍＬ）を、ＩＰＴＧでの誘導後、０〜６８時間で、いくつかの時間点で抜いた。試料を遠心し、分離した上清およびペレット画分を、解析まで−８０℃にて冷凍した。
【０４９７】
結果
発酵ブロス試料中のモナチンの濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。モナチンが、誘導後３０〜６８時間で抜いたブロス試料中で検出された。誘導後４５時間で、モナチンの濃度が、ツィーン−２０を、２４０〜３３０ｎｇ／ｍＬの間で加えた、ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２を形質導入した培養液中で最大であった。ツィーン−２０なしの培養液中でのモナチンのレベルは、５０〜６６ｎｇ／ｍＬの範囲であった。驚くべきことに、モナチンは、対照培養液中で、検出可能なレベルで発見されたが、定量可能なレベルでは観察されなかった。
【０４９８】
ａｓｐＣｐｒｏＡｐＥＫＥＸ−２で形質導入したコリネバクテリウム（ＡＴＣＣ１３０５８）細胞におけるモナチンの産生（続き）
シェイクフラスコ実験を、異なるフィードレジメを用いて、Ｃ．グルタミカム１３０５８：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＫＥＸ−２およびＣ．グルタミカム１３０５８：：ｐＥＫＥＸ−２で繰り返し、実施例６で記述したように、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭによって解析した。
【０４９９】
以下の開始培養液を、２５０ｒｐｍにて振とうしながら、３０℃にて一晩、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ中で増殖させた。
【０５００】
Ｃ．グルタミカム１３０５８：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ｐＥＫＥＸ−２−１（モナチンオペロン）
【０５０１】
Ｃ．グルタミカム１３０５８：：ｐＥＫＥＸ−２−１（ベクター対照）
【０５０２】
５ｍｌの開始培養液を、５０ｍｇ／Ｌにてカナマイシンを含む、１００ｍｌのＣ．グルタミカム発酵培地に移した。培養液を、〜０．５のＯＤ600まで、２５０ｒｐｍにて振とうしながら、３０℃にてインキュベートした。この時点で、以下の添加物を、遺伝子発現を誘導するために、各フラスコに加えた。１μｌ  ＩＰＴＧ（８４０ｍＭストック）、１０ｍｌピリドキシンＨＣｌ（５０ｍＭストック）、および２００μｌ  ＰＬＰ（２０ｍＭストック）。培養液を、ＩＰＴＧの誘導の後、２５０ｒｐｍにて振とうしながら、３０℃にて３時間（ＯＤ６００  〜０．５）インキュベートした。培養液を５５ｍｌ（半分）容量を新しいフラスコに移すことによって、２つのフラスコにわけた。各フラスコを、以下に記述する２つの測定のうちの一つにかけた。添加物を、表１６で記述したように加えた。
【０５０３】
【表１７】
2007508840.tif 000021
【０５０４】
添加の後、培養液を、２５０ｒｐｍにて４８時間、振とうしながら３０℃にてインキュベートした。各フラスコからの１０ｍｌの培養液ブロスを、乾燥細胞質量決定のために除いた。残った培養液容量を遠心し、上清を濾過し、グルタミン酸およびモナチン解析のために使用した。
【０５０５】
培養液ブロスに関する結果を、表１７にて以下のように表にした。
【０５０６】
【表１８】
2007508840.tif 000022
【０５０７】
以上で観察されたように、ベクターｐＥＫＥＸ−２を形質導入した細胞と比較したときに、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を発現しているＣ．グルタミカム１３０５８細胞において、モナチン産生が明らかに増加した。しかしながら、モナチンが、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含むベクターで形質導入しなかった細胞で、あきらかに形成されており、このことは、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム株が、モナチンを産生可能であることを示唆している。モナチン流出におけるさらなる増加が、ツィーン−４０、ツィーン−６０およびアンピシリンを培養液に加えた際にも観察された。さらに、ベクターのみで形質導入したＣ．グルタミカム１３０５８上清試料の、実施例６のＦＤＡＡ誘導体化方法を用いたキラル解析が、Ｓ，Ｓモナチンと、微量のＲ，Ｒモナチン両方の存在を示唆した（一過性にみられた）。別の実験で、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭ解析によって、多重のモナチンピークの存在が見られ、このことはＳ，ＲまたはＲ，ＳおよびＲＲまたはＳＳモナチンいずれかの存在を示唆している。
【０５０８】
Ｃ．グルタミカム１３０３２：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ＰＥＫＥＸ−２をまた、Ｃ．グルタミカム１３０５８：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ＰＥＫＥＸ−２で使用したのと同様のプロトコールを用いて、シェイクフラスコ実験で増殖させた。誘導後２１時間の時点で、Ｃ．グルタミカム１３０３２：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ＰＥＫＥＸ−２が、表１６で示した基質に加えて、ツィーンおよびアンピシリンで培養液を処理したときに、１０５９ｐｐｂのモナチンを産生した。Ｃ．グルタミカム１３０３２：：ａｓｐＣｐｒｏＡ／ＰＥＫＥＸ−２は、ＩＰＴＧでの誘導の２１時間後に相当する時間点で、ツィーンおよびアンピシリンが存在しない状態で、４２８ｐｐｂのモナチンを産生した。Ｃ．グルタミカム１３０３２：：ＰＥＫＥＸ−２での対照実験が、ＩＰＴＧでの誘導の２１時間後に、ツィーンおよびアンピシリンが存在する場合、またはしない場合で、４５〜５８ｐｐｂのモナチンを産生した。Ｃ．グルタミカム１３０３２は、モナチン産生のためのさらなる産生宿主を表している。
【０５０９】
一緒に考えると、以上の結果は、明らかに、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび他のコリネバクテリウム属のメンバーの、モナチンを産生する、そして異種宿主にて発現可能な、モナチンオペロン中の遺伝子の供給源として役に立つ可能性を表していた。
【０５１０】
実施例１４
大腸菌における制御を軽減する変異を利用する、インビボでのトリプトファンの産生の増加
トリプトファン生合成経路は、大腸菌にて非常に制御されている。制御点の軽減によって、トリプトファン生合成に対する流れが増加可能である。制御は、酵素のフィードバック阻害、ならびに本経路における酵素の合成の抑制によってのいずれかで起こり得る。トリプトファンはモナチン産生の中間体であるので、トリプトファンのレベルを改善することによって、産生されるモナチンのレベルが改善可能である。以下で記述した制御遺伝子は、トリプトファン経路における制御点のほんのいくつかであり、当業者は、他のトリプトファン過剰産生戦略もまた、大腸菌におけるモナチンの収量を増加できることを理解する。
【０５１１】
当業者は、トリプトファンを過剰発現可能な、耐性変異体に関して選別するために、類似体を利用可能である。トリプトファン経路における制御点の軽減によって、大腸菌のような細菌によって産生されたモナチンのレベルの増加となり得る。フィードバック阻害の制御点を変更するための１つのアプローチは、類似体化合物に対して耐性である、変異体を選別することである。そのような化合物の例には、限定はしないけれども、５−フルオロトリプトファン、３−フルオロフェニルアラニン、ベータ−２−チエニルアラニン、６−フルオロトリプトファン、トリプトファンヒドロキサメート、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートおよびフェニルアラニンヒドロキサートが含まれる（Ａｚｕｍａ他，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３，３９：４７１−４７６およびＤｕｄａ  ａｎｄ  Ｓａｓｖａｒｉ−Ｓｚｅｋｅｌｙ，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．，１９７３，８：８１−９０）。
【０５１２】
７６９２のような大腸菌株と、（実施例１０で記述した）大腸菌７６９２△ｌｉｐＡ  ＤＥ３は、新鮮なＬＢプレート上で増殖可能である。個々のコロニーを利用して、Ｍ９培地＋グルコースおよび他の必要なビタミン類または共因子類で、シェイクフラスコに接種可能である。２５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃でのインキュベーションの２４時間後、少量の大腸菌培養液をのぞき、種々の濃度の類似体（例えば１ｍｇ／ｍＬ  ｐ−フルオロフェニルアラニン）を含むＭ９最小培地上にプレートすることができる。耐性コロニーをピックアップし、５ｍＬのＬＢの培養液中で、振とうしながら、３７℃にて増殖させ、トリプトファン産生の増加に関して選別することができる。プレート上での類似体に対する耐性の増加が、類似体濃度を徐々に増加させることによって影響をうける。これはまた、連続培養液中でも実施し得る。
【０５１３】
例えば、これらの類似体は、芳香族アミノ酸合成の開始点での鍵となる分岐点、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチュロソネート７−リン酸シンターゼに影響を与える。大腸菌において、これは、３つのアイソザイムａｒｏＦ、ａｒｏＧおよびａｒｏＨによってコードされており、それぞれが、本経路のアミノ酸、それぞれ、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンによってフィードバック阻害される。以上で記述した類似体に対する変異体耐性が、本フィードバック阻害の軽減を示し得る。
【０５１４】
他の鍵となる分岐点は、アントラニル酸シンターゼであり、この遺伝子におけるフィードバック耐性変異体がまた、トリプトファン産生を改善可能である。また、１つの制御変異（例えばフィードバック耐性アントラニル酸シンターゼ）の効果を、本経路中の中間体のバックアップによってマスク可能である。したがって、当業者は、モナチン産生を改善するために、トリプトファン経路変異を組みあわせ得る。モナチン産生を改善するために利用可能である、トリプトファン経路および芳香族生合成経路における変異の例には、トリプトファンによるフィードバック阻害に耐性をつくり得る、トリプトファン生合成に特異的な任意の酵素、およびｔｒｐＲまたはその結合部位を変化させる抑制の救済、ならびに、オペロン発現の減衰制御の軽減が含まれるが、それらに限定されない（Ｋｉｍ他，Ｊ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｂｉｐｏｃｈｎｏｌ．，２０００，１０：７８９−７９６、Ｊｏｓｓｅｋ他，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００１，２０２：１４５−１４８；Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ他，Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．，２００１，３：２８９−３００，Ａｚｕｍａ他，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３，３９：４７１−４７６；Ｆｌｏｒｅｓ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，１４：６２０−６２３；Ｔｒｉｂｅ  ａｎｄ  Ｐｉｔｔａｒｄ，Ａｐｐｌｅ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９７９，３８：１８１−１９０；Ｙａｎｏｆｓｋｙ他，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８４，１５８：１０１８−１０２４；Ｇｏｓｓｅｔ他．Ｊ．Ｉｎｄｕｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，１７：４７−５２）。
【０５１５】
トリプトファンおよびモナチン産生を増強するための、株の遺伝的改変に加えて、培地成分、ならびにｐＨ、温度および混合のような工程条件の変更のような、増殖条件が、宿主微生物によるトリプトファンおよびモナチンの生合成を改善可能である。したがって、増殖因子を含むもののような、好適な培地を、大腸菌からのトリプトファン産生を増加させるために利用可能である。例えば、ピリミジン類のような増殖因子、トレース要素、およびビオチンの濃度が、中間体の産生および放出に影響を与え得る（Ｊｅｎｓｅｎ，（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：３４０１−３４０７）。
【０５１６】
実施例１５
過剰発現戦略を用いる、大腸菌におけるトリプトファンの産生の増加
大腸菌においてトリプトファンのレベルを増加させるための他の戦略は、細胞内での、トリプトファン生合成遺伝子のコピー数を増加させることである。このことは、ベクター内へ遺伝子をクローニングし、細胞内にこのベクターを形質導入することによって実施可能である。当業者は、遺伝子のコピー数の増加をまた、クロモソームＤＮＡ内へ遺伝子をクローニングすること、または天然のプロモーター領域を変更することによっても達成可能であることを認識するであろう。
【０５１７】
米国特許第４，３７１，６１４号明細書で引用された３つの株を、Ｕ．Ｓ．Ｄ．Ａ．Ｐｅｏｒｉａ培養コレクションから得た。第一の宿主株、ＮＲＲＬ  Ｂ−４５７４はまた、ＫＢ３１００と呼ばれ、△ａｒｏＰである。第二の株ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２はまた、ＡＧＸ１５と呼ばれ、遺伝子型ｓｅｒＢ-、ｔｒｐ△ＥＤ、ｔｎａＡ２-、ｔｅｔＳ、ｔｙｒＡ-、ｐｈｅＡ-を持つ。これは、ｐＧＸ４４と呼ばれるプラスミドを含む。ｐＧＸ４４は、ｐＢＲ３２２（Ｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｅｖｉｌｌｅ，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１７６：３６１−３６８）から由来し、ｓｅｒＢ遺伝子とトリプトファンオペロンを含む。第三の株、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４はまた、ＡＧＸ６と呼ばれ、遺伝子型ｓｅｒＢ-、ｔｒｐ△ＥＤ、ｔｎａＡ２-、ａｒｏＰ-を持つ。これは、ｐＧＸ５０と呼ばれるプラスミドを含む。ｐＧＸ５０は、ｐＢＲ３２２から由来し、ｓｅｒＢ遺伝子と、５−メチルトリプトファンに対して耐性である細胞から由来した、トリプトファンオペロンを含む。
【０５１８】
株ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２およびＢ−１２２６４は、ｓｅｒＢ遺伝子が欠損し、結果として宿主株増殖のためにセリンが必要となる。プラスミドｐＧＸ４４（Ｂ１２２６２中）およびｐＧＸ５０（Ｂ−１２２６４中）はそれぞれ、ｓｅｒＢ遺伝子を含み、したがって、セリン栄養要求性が、プラスミドを維持していることに関する選別圧力である。セリンを欠く培地を利用して、これらの有機体によって産生された高濃度のトリプトファンの存在下においても、プラスミドを維持可能である。セリンなしの培地中で培養した場合、プラスミドを含む株、１２２６２および１２２６４が、生存し、増殖するために、多数のプラスミドのコピーを維持しなければならず、したがって多数のトリプトファンオペロンのコピーを含む。ＮＲＲＬ  Ｂ−４５７４株は、これらのプラスミドのいずれをも持たず、したがって、（ゲノム上に）トリプトファンオペロンの１つのコピーのみを持つ。ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４に関して使用した、すべての増殖培地および発酵培地は、ｐＧＸ５０ベクターが、アンピシリン耐性遺伝子を含むので、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含んだ。
【０５１９】
株を、ＬＢブロスおよびＴｒｐ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ培地中で増殖させた。ｔｒｐ産生培地には、リットルあたり、３０ｇのグルコース、１０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．０ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇのＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＭｎＣｌ2−４Ｈ2Ｏ、４ｇのカサミノ酸および４０ｇのＣａＣＯ3が含まれた。シェイクフラスコに対する接種を、ＬＢブロス中で増殖させた。３ミリリットルの接種培養液を利用して、２５０ｍＬバッフルドシェイクフラスコ中の５０ｍＬの培地を接種した。シェイクフラスコを、穏やかに振とうしながら（２００ｒｐｍ）、３０℃にてインキュベートした。トリプトファンを実施例６で記述したように測定した。シェイクフラスコを、グルコースおよびＯＤ550に関して定期的にサンプリングした。結果を、表１８で示している。
【０５２０】
【表１９】
2007508840.tif 000023
【０５２１】
トリプトファンオペロンの多数のコピーが、大腸菌によるトリプトファンの産生を増加させることが明らかである。同様の遺伝的改変のいくつかを含むが、余分なトリプトファンのコピーは含まない株は、同様な実験条件下で、より少ないトリプトファンを産生した。例えば、大腸菌ＳＲ２５０（Ｒｏｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈ，２０３３）は、ｔｙｒＡ−およびｐｈｅＡ−株であるが、同様の条件下で試験した場合、およそ０．１μｇ／ｍＬしか産生しなかった。これらのデータにより、多数のトリプトファン生合成遺伝子のコピー、とりわけｐｈｅＡが崩壊したものを、モナチン産生を増加させるために利用可能であることが示唆されている。
【０５２２】
実施例１６
発酵におけるトリプトファンの産生
発酵を、経済的に効果的なモナチン産生を達成するために利用可能である。発酵器具の利用に際し、ｐＨ、酸素および混合のようなパラメータを、発酵反応が最適化され得るように、簡単に制御する。
【０５２３】
３つの大腸菌株、ＮＲＲＬ  Ｂ−４５７５、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２およびＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４を、Ｐｅｏｒｉａ，ＩｌｌｉｎｏｉｓのＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ．研究所から得た。後者２つの株は両方とも、トリプトファンオペロンをプラスミド上に含む。これらの株は、実施例１５にてより詳細に記述している。３００ｍｌの培地でのＩｎｆｏｒｓ発酵槽を、発酵研究のために利用した。トリプトファン産生培地は、実施例１５で記述した。
【０５２４】
微生物接種を、新鮮にストリーキングしたＬＢプレートよりとった。１つの狭間を、２５０ｍＬシェイクフラスコ中、５０ｍＬのＴｒｐ産生培地内に接種させ、培養液を３７℃にて一晩増殖させた。シードフラスコからの１５ｍＬを、各二重に、２５０ｍＬのＴｒｐ産生培地を含むＩｎｆｏｒ３００ｍＬ発酵瓶内に接種させた。撹拌を５００ｒｐｍにて開始し、１０００ｒｐｍまで増加させた。空気を、１ｖｖｍにて噴霧し、４時間で、５ｖｖｍまで増加させた。ｐＨを、１Ｎ水酸化ナトリウムで、７．０に維持した。
【０５２５】
試料を定期的にとり、グルコースおよびＯＤ550に関して解析した。３日後、発酵ブロスを１５，０００ｒｐｍにて２分間スピンダウンさせ、濾過し、トリプトファン解析まで冷凍した。
【０５２６】
実施例１５で示したように、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２は、Ｔｒｐ産生培地を用いたシェイクフラスコで、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４よりも、約４倍のトリプトファンを産生する。表１９で見られるように、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２は、シェイクフラスコ中よりも、発酵槽中で、かなり少ないトリプトファンを産生し、これは、細菌における、最適化されていないスケール−アップによる。株ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４の同様のストレスが、発酵槽における検出可能なトリプトファンの産生の欠如を説明し得る。当業者が、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６２およびＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４株両方による、発酵槽におけるトリプトファン産生を改善可能であり得ることが予想される。
【０５２７】
【表２０】
2007508840.tif 000024
【０５２８】
実施例１７
コリネバクテリアの変異株によるトリプトファンの産生増加
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ２１８４７をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。該菌株は種々の類似体に耐性であり、フェニルアラニンおよびチロシン要求性を生じる遺伝子突然変異を有する。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）２１８０および２１８５１は、異なる菌株であるが、６フルオロ‐トリプトファン、４アミノフェニルアラニン、トリプトファンヒドロキサマート、および４メチルトリプトファンなどの類似体を用いて同様に作製される。
【０５２９】
普通寒天平板から採取したＡＴＣＣ２１８４７の新鮮なコロニーを、グルコース２％、ペプトン１％、酵母抽出物１％、およびＮａＣｌ０．３％を含む５ｍＬの種管に接種した。３０℃にて一晩振とう培養した後、管から２ｍＬを振とうフラスコ中の５０ｍＬの培地に接種した。２種の培地を用いた。第１の培地（培地１）は、グルコース１０％、ＫＨ2ＰＯ4０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4０．０５％、ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ０．０２５％、（ＮＨ4）2ＳＯ4２％、ＮＺ‐アミン０．５％、ビオチン３０μｇ／ｍＬ、およびＣａＣＯ3２％を含む。ｐＨは７．２に調整した。第２の培地（培地２）は、１Ｌ当たり、廃糖蜜１００ｇ（グルコースベース）、ＫＨ2ＰＯ4０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＭｇＳＯ4０．２５ｇ、ＮＨ4ＳＯ4０．２５ｇ、コーンスティープリカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）１０ｇ、ＣａＣＯ3２０ｇ、チロシン４ｍｇ／ｍＬの原液３８ｍＬ、およびフェニルアラニン２５ｍｇ／ｍＬの原液１２ｍＬを含む（米国特許第３８４９２５１号明細書）。ｐＨは７．２に調整した。
【０５３０】
このフラスコをイノバ（Ｉｎｎｏｖａ）社の振とう機を用いて、３０℃、２５０ｒｐｍにて４日間インキュベートし、トリプトファンの量を実施例６に記載したように測定した。
【０５３１】
結果を表２０に示す。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の類似体耐性変異株は他のＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株よりも多くのトリプトファンを産生した（表２０）。培地２で産生値が高いのは、コーンスティープリカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）や廃糖蜜などの、栄養分のある培地組成物の影響だと思われる。同様に、ＡＴＣＣ２１８５１は培地２では３００〜３７０μｇ／ｍＬのトリプトファンを産生したが、培地１では１〜２μｇ／ｍＬしか産生しなかった。ＡＴＣＣ２１８５０は最適培地（培地２）では試験しなかったが、２１８５１と同様の結果になると思われる。これらの結果は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主株が経済的なモナチン生産株となり得ることを実証している。さらに、本明細書に記載の大腸菌によるトリプトファン産生を増加させるための方策（例えば、実施例１４〜１７を参照されたい）と同様のものをコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に使用して、モナチンの生産宿主菌株としての性質を改善することができる（Ｓｈｉｉｏ他，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７５，３９：６２７−６３５；Ｈａｇｉｎｏ  ａｎｄ  Ｎａｋａｙａｍａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７５，３９：３４３−３４９；Ｓｈｉｉｏ他，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，４８：２０７３−２０８０；Ｈｅｅｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９４，２０１：１２５５−１２６２；Ｈｅｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｕｎｉｃａｎ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，５９：７９１−７９９；およびＫａｔｓｕｍａｔａ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３，１１：９２１−９２５）。
【０５３２】
【表２１】
2007508840.tif 000025
【０５３３】
実施例１８
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）によるグルタミン酸の産生
【０５３４】
パートＡ：培養物中でのグルタミン酸の収率を向上させるための物理的方法
経済的なアミノ酸産生に対する重要な制約のひとつは、細胞からのアミノ酸の排出である。細菌細胞は一般にアミノ酸を細胞中へ輸送する機構を有するが、多くの場合、多量のアミノ酸を運び出す機構は知られていない。グルタミン酸流出に影響を与えるために、洗浄液の使用や培地の変更などの物理的な方法を用いることができる。グルタミン酸およびモナチンはどちらもジカルボン酸であるので、当業者は下記のグルタミン酸に対する技術を、モナチンの培地への放出を改善するために利用できる。
【０５３５】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０５８、１３６５５、および１３６８９をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。これらの菌株はグルタミン酸の産生株として挙げられている（米国特許第３，００２，８８９号明細書、および同第３，１２８，２３７号明細書）。
【０５３６】
これらの菌株を、振とうフラスコ内で、１Ｌ当たり以下を含む培地で培養した。ＫＨ2ＰＯ4１．０ｇ、大豆ペプトン２．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ、ＦｅＳＯ4０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4０．０１ｇ、グルコース１００ｇ、尿素５ｇ、ビオチン４μｇ、チアミン２００μｇ。培地のｐＨは６．０に調整し、尿素、グルコース、ビオチン、およびチアミンはすべて別々に滅菌した。この培養物を３０℃にて７２時間、振とうしながらインキュベートした。１８時間目に、１．８％の尿素をフラスコに加えた。
【０５３７】
表２１に示したように、３種の菌株全てがグルタミン酸を産生し、その一部を培地内に分泌した。細胞を遠心分離によりフラスコから回収し、分離して、Ｌｙｓｏｎａｓｅ（商標）でＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた洗浄酵素法または浸透圧衝撃のどちらかの処理をした。浸透圧衝撃は、細胞を低温度の脱イオン水で１：２０に希釈することにより行った。これらの処理により、グラム陽性菌（コリネバクテリウム・グルタミカムなど）の細胞外被を完全にではなく部分的に破壊し、それによって細胞内の代謝産物の放出を促進することが望まれる。グルタミン酸は、実施例６に記載のハイスループット法により分析した。
【０５３８】
データから、分泌されたのと同量のグルタミン酸が細胞内に留まっており、その放出を種々の物理的処理により実行できることが示された。これらの処理法に加えて、他の物理的処理法も同様に細胞からグルタミン酸を放出させることが期待でき、またこれらの技術はモナチンの遊離促進にも使用できることが期待される。
【０５３９】
【表２２】
2007508840.tif 000026
【０５４０】
パートＢ：グルタミン酸の産生向上に対する付加的な因子
グルタミン酸の排出は、抗生物質、界面活性剤、温度、浸透ストレス、ｐＨおよびビオチン濃度などの種々の因子により影響され得る。本実施例ではグルタミン酸の産生および／または分泌に関連する因子を明らかにする。
【０５４１】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０５８およびＡＴＣＣ１３６５５をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。これらの菌株は既知のグルタミン酸産生株である。
【０５４２】
一連の統計、要因計画を行い、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ株１３０５８およびＡＴＣＣ１３６５５によるグルタミン酸の産生に関する種々の因子を調査した。それぞれの菌株のコロニーを５ｍＬの改良ＭＣＧＣ培地に接種し、３０℃にて一晩培養した。振とうフラスコに入れた改良ＭＣＧＣ培地に０．５〜１．０ｍＬの種培養物を接種した。改良ＭＣＧＣ培地は１Ｌ当たり以下を含む。Ｎａ2ＨＰＯ4３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4６ｇ、ＮａＣｌ２ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4８ｇ、ソイトン０．５ｇ、グルコース６０ｇ、ＦｅＣｌ3３．９ｍｇ、ＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ０．９ｍｇ、ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ０．５６ｍｇ、ＭｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ３．９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ4‐４Ｈ2Ｏ０．１ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7−１０Ｈ2Ｏ０．３ｍｇ、ＣａＣｌ2−２Ｈ2Ｏ８４ｍｇ、ベタイン２ｇ。処理物は、１Ｌ当たり、１００ｍｍｏｌのＭＯＰＳまたはＭＥＳ、ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ５０ｍｇまたは４００ｍｇ、チアミン４ｍｇまたは２０ｍｇ、およびビオチン４ｕｇまたは２０ｕｇを含んだ。１６時間目に、ツィーン４０または６０を１Ｌ当たり３ｍｇ、アンピシリンを０ｕｇまたは１０ｕｇ／ｍＬ加え、高温処理を必要とするフラスコの温度を４０℃まで上昇させた。フラスコを３０℃、２５０ｒｐｍにて、他に注記がなければ２〜３日間インキュベートした。
【０５４３】
試料を定期的に採取し、グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、細胞密度（ＯＤ600）、およびｐＨを分析した。２〜３日後、試料を遠心分離して上清を濾過し、実施例６に記載のような、蛍光検出法によるＨＰＬＣを用いたグルタミン酸の分析を行うまで凍結させた。
【０５４４】
グルタミン酸の産生／排出に関して検討した因子としては、アンピシリン、ツィーン、温度、初期ｐＨ、ビオチン、マグネシウム、およびチアミンが挙げられる。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０５８に関しては、グルタミン酸の産生において統計的に有意な因子としては、ビオチン、初期ｐＨ、およびビオチンとｐＨとの相互作用が挙げられる。結果の分析には、２種以上の異なる方法間の相違に関する仮説を検定するための統計的手法である、分散分析（ＡＮＯＶＡ）用いた。予測モデルは、０．９６に調整したＲ2でαレベル＜０．０００１において有意であった。初期ｐＨ７．６または６．５よりもｐＨ８．０の方がグルタミン酸の産生により適していた。ビオチン濃度は最低濃度の４ｕｇ／Ｌでグルタミン酸がより多く産生された。この結果は、２〜５ｕｇ／Ｌ（マイクログラム／Ｌ）に制限されたビオチン濃度が細胞膜の流動性に影響してグルタミン酸の流出を増加させるという別の研究（Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ  ａｎｄ  Ｓａｈｍ  Ｈ（１９９９）「アミノ酸産生：代謝工学の原理（Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」  ｉｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｅｄ：Ｌｅｅ  ＳＹ，Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ  ＥＴ）；  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ＮＹ，ＮＹ．）とも一致する。したがって、ある実施形態では、微生物を培養する培地は５ｕｇ／Ｌ以下のビオチンを含む。
【０５４５】
ビオチン濃度が低濃度と高濃度（４ｕｇ／Ｌおよび２０ｕｇ／Ｌ）のどちらの場合でも、ｐＨ７．６よりもｐＨ８．０の方が、グルタミン酸の産生が多かった。ツィーン４０とツィーン６０はどちらも同等に有効に働いたが、マグネシウム濃度とツィーンの種類との間に、グルタミン酸の産生に影響を与える相互作用の可能性が見られた。ツィーン存在下では、アンピシリンの添加によりグルタミン酸の産生が減少した。上清グルタミン酸濃度は、ＡＴＣＣ１３０５８およびＡＴＣＣ１３６５５に関してそれぞれ０〜１３．３ｍＭおよび０〜１１．３ｍＭであった。
【０５４６】
これらの結果は、グルタミン酸の産生／排出は上記の有意な因子を用いて操作可能であることを示している。モナチンの産生／排出に対しても、モナチンがグルタミン酸と同様にジカルボン酸構造を有することから、同じ因子が有効であると予測される（Ｄｅｌａｕｎａｙ  Ｓ．他，１９９９，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５，７６２−７６８）。
【０５４７】
パートＣ：Ｋｒａｍｅｒ’ｓ培地の使用および温度上昇によるグルタミン酸の産生向上
本実施例は、異なる菌株、温度、および培地を用いたグルタミン酸の産生向上を実証する。
【０５４８】
コリネバクテリウム・グルタミカム株ＡＴＣＣ１３０３２およびＡＴＣＣ１３０５８をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
【０５４９】
どちらの菌株についても、３０℃および３７℃にて、Ｋｒａｍｅｒ’ｓＡ培地を用いて研究を行った。それぞれの菌株のコロニーを５ｍＬのＫｒａｍｅｒ’ｓＡ培地に接種し、３０℃にて一晩培養した。振とうフラスコに入れたＫｒａｍｅｒ’ｓＡ培地に０．５〜１．０ｍＬの種培養物を接種した。Ｋｒａｍｅｒ’ｓＡ培地は、１Ｌ当たり以下を含む。（ＮＨ4）2ＳＯ4５ｇ、尿素５．０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4２．０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4１．５３ｇ、ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ１モル、グルコース５０ｇ、ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、ＣａＣｌ2−２Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、ＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ０．０３ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ4−４Ｈ2Ｏ由来のＭｏ０．１ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3０．１０ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ2Ｏ０．０７ｍｇ、ＮｉＣｌ2−２Ｈ2Ｏ０．０１ｍｇ、ＣｕＣｌ2−２Ｈ2Ｏ０．０３ｍｇおよびビオチン１ｕｇ。ｐＨは５ＭのＮａＯＨで７．０に調整した。ツィーンおよびアンピシリンはこの実験では添加しなかった。フラスコを２５０ｒｐｍ、３０℃または３７℃にて２４時間インキュベートした。グルタミン酸を実施例６に記載のハイスループット法により分析した。
【０５５０】
ＡＴＣＣ１３０３２およびＡＴＣＣ１３０５８を用いた、３０℃および３７℃における実験結果は表２２に記載する。
【０５５１】
【表２３】
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【０５５２】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０５８は、３７℃でより多くのグルタミン酸を産生したが（５４ｍＭ）、一方Ｃ．グルタミカム１３０３２についてはどちらの温度でもグルタミン産生量は同様であった（〜４０ｍＭ）。これらの結果は、温度および培地組成を変えることにより、グルタミン酸の産生／排出が操作可能であることを再度示すものである。モナチンの産生／排出に対しても、モナチンがグルタミン酸と同様にジカルボン酸構造を有することから、同じ因子が有効であると予測される（Ｈｏｉｓｃｈｅｎ  Ｃ．ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  Ｒ．，１９８９，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：３４２−３４７）。
【０５５３】
実施例１９
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのトリプトファナーゼ遺伝子（ｔｎａ）のクローニング
トリプトファナーゼポリペプチド（ＥＣ  ４．１．９９．１）は以下の可逆反応を触媒する。
【０５５４】
【化３】
2007508840.tif 000028
【０５５５】
場合によっては、トリプトファナーゼをコードする遺伝子は、トリプトファンの加水分解による崩壊を防ぐために宿主株から取り除かれる。しかし、過剰なインドール、ピルビン酸、およびアンモニウムを細胞に供給すると、この酵素が過剰発現してトリプトファンの合成を助ける。この手法は、トリプトファンの宿主生合成経路の自由化が行われない場合に特に有効である。大腸菌ＤＨ１０Ｂ由来のトリプトファナーゼ遺伝子を、モナチン生合成経路遺伝子および補足遺伝子を含むｐＥＴベクターに適合性である、ｐＰＲＯＬＡＲ由来のベクター中にクローン化した。
【０５５６】
クローニングのためのゲノムＤＮＡの単離
大腸菌のゲノムＤＮＡをＤＨ１０Ｂ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から単離し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商標）（５００／Ｇ）ｋｉｔを用いて調製した。ＬＢ中でＯＤ650１．８７まで培養した該菌株の３０ｍＬから、０．３ｍｇの精製ＤＮＡを得た。この精製ＤＮＡを濃度０．３７μｇ／μＬでＱｉａｇｅｎ溶出緩衝液（ＥＢ）中に溶解させた。
【０５５７】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
カナマイシン遺伝子中のＮｃｏＩ認識部位が突然変異したｐＰＲＯＬａｒ．Ａ１２２（クロンテック  ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．））への分子クローニングのために、プライマーを設計した（本明細書中、ｐＰＲＯＮｃｏとする）。ｐＰＲＯＮｃｏプライマーの配列は下記である。
ｆｏｒｗａｒｄ：５’‐ＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡ‐ＡＡＣＡＴＣＴ‐３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：３’‐ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧ‐３’（配列番号７７および７８）
【０５５８】
下記のＰＣＲプロトコールでＰＣＲを行なった。５０μＬの反応物中、鋳型０．１〜０．５μｇ、プライマーそれぞれ１．５μＭ、ｄＮＴＰそれぞれ０．４ｍＭ、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）３．５Ｕ、およびＭｇを含むＥｘｐａｎｄ（商標）緩衝液１Ｘを用いた。用いたサーモサイクラープログラムは下記であった。最初９６℃にて熱開始５分間、次いで以下のステップを２９回繰り返した。９４℃にて３０秒間、５０℃にて１．７５分間、７２℃にて２．２５分間。この２９回の反復の後、試料を７２℃にて１０分間維持し、次いで４℃にて保存した。このＰＣＲプロトコールにより約１５００ｂｐの産物が産生された。
【０５５９】
クローニング
ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて０．８％または１％のＴＡＥアガロースゲルからゲル精製した。ｔｎａ遺伝子を、マルチクローニングサイトの制限酵素認識部位ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間に挿入することにより、ＰＲＯＮｃｏに挿入した。ｐＰＲＯＮｄｅへのクローニングはＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入することで行なった。
【０５６０】
ライゲーション混合物を、電気穿孔法を用いてＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換した。選抜のために、細胞を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地上で培養した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いて精製し、制限酵素認識部位の切断により正しく挿入されたかをスクリーニングした。正しく挿入されたと思われるプラスミドの配列を、ジデオキシ鎖終止ＤＮＡスクリーニングにより確認した。化学的コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、製造者（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の手順に従い、ａｓｐＣ  ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２とｔｎａ／ｐＰＲＯＮｃｏで同時形質転換するか、ｔｎａ／ｐＰＲＯＮｃｏ単独で形質転換した。
【０５６１】
ａｓｐＣ  ｐｒｏＡｐＥＴ３２とｔｎａ／ｐＰＲＯＮｃｏで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）によるモナチンおよびトリプトファンの産生
ｔｎａ／ｐＰＲＯＮｃｏで形質転換するか、またはａｓｐＣ  ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３２とｔｎａ／ｐＰＲＯＮｃｏの両方で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、グルコース０．４％およびＢａｌｃｈ’ｓビタミン溶液を含むｔｒｐ‐１培地で、３７℃にて振とう培養した（それぞれの構成について２連）。ｔｎａ／ｐＰＲＯＮｃｏの培養物はさらに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだが、両方のプラスミドで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）を含む培養物は、さらに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだ（処方は実施例１、７および１１を参照されたい）。ＯＤ600が０．５〜０．７に達した時に、１．０ＭのＩＰＴＧおよび０．５％のＬ‐アラビノースで誘導し、３０℃にてインキュベーションを続けた。さらに、誘導の際０．５ｍＭのピリドキシンを加えた。誘導の５時間後、０．０４ｍＭのピリドキサールリン酸、０．５％のピルビン酸ナトリウム、および０．６％の塩化アンモニウムをそれぞれの培養フラスコに添加し、それぞれのｐＨを７．５〜７．６に調整し、次にそれぞれのフラスコに５ｍＭのインドール（２％のトリトンＸ−１００の水溶液中５０ｍＭのインドール原液より）を加えた。インキュベーションを３０℃にて続けた。トリプトファンおよびモナチン（０．５ｍＬ）およびタンパク質誘導（１ｍＬ）の分析用の試料を、ＩＰＴＧによる誘導の０、５、７．５、２０、３０、４８および７４時間後に回収した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）分析用の試料を誘導後７．５、２０、３０、および４８時間後に回収した。発酵培養液中のモナチンおよびトリプトファンの濃度を、実施例６に記載のようにＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭにより測定した。
【０５６２】
結果下記の表２３および２４に示す。発酵培養液中のトリプトファン濃度は、ｔｎａ遺伝子を単独で発現している培養物において誘導後２０時間で約１．１ｇ／Ｌに達し、７４時間までに約１．３ｇ／Ｌまで増加した。モナチンはｔｎａ遺伝子のみを発現している培養物から回収したどの試料からも検出できなかった。ｔｎａ遺伝子とａｓｐＣｐｒｏＡ遺伝子の両方を発現している培養物中のトリプトファン濃度は、ｔｎａ遺伝子のみを発現している培養物の約１０％であった。しかし、これらの培養物ではモナチンが産生された。モナチンの最高濃度は誘導の４８時間後に測定された（２６３ｎｇ／ｍＬ）。
【０５６３】
【表２４】
2007508840.tif 000029
【０５６４】
【表２５】
2007508840.tif 000030
【０５６５】
実施例２０
ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＥＣ２．７．９．２）および関連する遺伝子の過剰発現による芳香族代謝経路への流量増加
グルコースまたはピルビン酸由来の炭素の、芳香族代謝経路への流量を増加させるように中央代謝を設計することにより、発酵の間に産生されるトリプトファンの量を増加させることができ、その結果モナチンの量も増加させることができる。種々の取り組みが行なわれているが、そのひとつは、ＰＥＰシンターゼ（Ｐｐｓ）の発現を増やすことにより、ＰＴＳまたはピルビン酸キナーゼのどちらかによって形成されるピルビン酸を再利用して、またＰＥＰにするというものである（Ｐａｔｎａｉｋ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，（１９９４），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：３９０３−３９０８；  Ｐａｔｎａｉｋ他，（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４６，３６１−３７０；  Ｙｉ他，（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１８，１１４１−１１４８；米国特許第６，４８９，１００号明細書；同第５，９８５，６１７号明細書；および同第５，９０６，９２５号明細書）。ＰＥＰシンターゼは、水の存在下でＡＴＰおよびピルビン酸をＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸、およびリン酸に転換する。ＰＥＰ濃度が上昇することにより、シキミ酸、コリスミ酸、ならびに芳香族アミノ酸産生の重要な前駆物質である、ＤＡＨＰ産生が増加する。ｐｐｓＡ遺伝子は高度に遍在しており、単離および大腸菌などの産生宿主内での過剰発現が容易に可能である。組換えＰｐｓＡは宿主生物の染色体中に、またはプラスミド上に誘導することができる。ｐｐｓＡ遺伝子を含むプラスミドは、実施例７に記載のモナチンオペロンと共発現し得るか、またはモナチンオペロンに追加され得る。トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）遺伝子を共発現させて、芳香族アミノ酸の前駆体分子をさらに増加させることができる。そのような遺伝的構造により、モナチン産生の改良が期待できる。
【０５６６】
実施例２１
発酵槽中での生合成遺伝子産生
実施例３に、アミノトランスフェラーゼとアルドラーゼの２つの酵素を利用して、トリプトファンおよびピルビン酸からモナチンを産生させる方法を記載している。コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のアルドラーゼ（ＰｒｏＡアルドラーゼ、ｐｒｏＡ遺伝子）および大腸菌ａｓｐＣ遺伝子によりコードされているＬ‐アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをクローン化し、発現させ、前述の実施例のように精製した。発酵方法を開発して酵素の産生を増加させ、それらをモナチンの産生のためのインビトロ工程で使用できるようにした。
【０５６７】
Ｌ‐アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの産生のためのバッチ発酵
大腸菌ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０／ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｌ‐アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ産生株）を３Ｌの発酵槽内のバッチ中で培養した。使用した培地は１Ｌ当たり、（ＮＨ4）2ＳＯ4２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１．６ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4＊７Ｈ2Ｏ９．９ｇ、クエン酸ナトリウム０．６５ｇ、ＭｇＳＯ4０．２４ｇ、ＮＺ  Ａｍｉｎｅ  Ａ２０ｇ、グルコース２０ｇ、およびカナマイシン２５ｍｇを含んだ。ｐＨはＮａＯＨで７．０に調整し、温度は、インキュベーション前は３７℃に維持し、インキュベーション時に３４℃に下げた。培養物は、攪拌速度を上昇させることにより、発酵の間中好気性を維持した。酵素の発現を０．１〜０．４ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。細胞をＯＤ600３（接種後３〜４時間）またはＯＤ600１０（接種後５〜６時間の）で誘導した。最良の結果は、ＯＤ600３時に０．１ｍＭのＩＰＴＧで細胞を誘導した時に得られた。これらの条件下で、細胞のバイオマス濃度は７．２ｇ／Ｌ、アミノトランスフェラーゼである可溶性タンパク質の総量の２０〜４０％に達した。酵素の総量（培養物１Ｌ当たりアミノトランスフェラーゼペプチド０．８ｇ）は、実施例３に記載のように行なった、振とうフラスコで実験した培養物から得られたものより６倍多かった。
【０５６８】
ＰｒｏＡアルドラーゼの産生のためのフェッドバッチ発酵
大腸菌ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０／ＢＬ２１（ＤＥ３）（アルドラーゼ産生株）を３Ｌの発酵槽内で、フェッドバッチモードで培養した。１Ｌ当たり以下を含む所定の培地を用いた。（ＮＨ4）2ＳＯ4２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4８ｇ、ＮａＣｌ２ｇ、クエン酸ナトリウム１ｇ、ＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、ＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ２ｇ、ＣａＳＯ4＊２Ｈ2Ｏ０．０５ｇ、ＥＤＴＡ７．５ｍｇ、ＭｎＳＯ4＊Ｈ2Ｏ２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2＊６Ｈ2Ｏ０．５ｍｇ、ＺｎＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ０．５ｍｇ，ＣｕＳＯ4＊５Ｈ2Ｏ０．０５ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3０．０５ｍｇ、ｐ‐アミノ安息香酸５０ｍｇ、葉酸２０ｍｇ、ビオチン２０ｍｇ、ニコチン酸２０ｍｇ、パントテン酸カルシウム５０ｍｇ、リボフラビン５０ｍｇ、塩酸チアミン５０ｍｇ、および塩酸ピリドキシン１００ｍｇ。初めのグルコース濃度は２ｇ／Ｌで、グルコースを指数関数的に供給して増殖速度を０．１５〜０．２５時間-1に保った。ＮＨ4ＯＨでのｐＨ調整の際要求に応じて窒素を供給した。培養物を、ＯＤ600が２５（接種後１７時間）または３５（接種度２１時間）に達した時に、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。よりよいタンパク質発現は、細胞密度の低い方で細胞を誘導した場合に得られた。酵素発現は、全可溶性タンパク質の２０〜３０％と非常に高く、特異的な酵素活性はフラスコで培養した細胞に比べ減少したにもかかわらず、培地１Ｌ当たりの総酵素活性は、実施例３に記載のように行なった振とうフラスコでの実験での測定値の９倍であった。培養物１Ｌ当たり総量１．８ｇのアルドラーゼポリペプチドが測定された。増殖率に応じて異なる細胞濃度が得られ、最大値は乾燥細胞重量の２６．３ｇ／Ｌであった。
【０５６９】
どちらの発酵方法も、任意のこれらの酵素の産生に適用できる。グルコースを指数関数的に供給して増殖率０．１５〜０．２５時間-1に保つようなフェッドバッチ手順が、高い酵素濃度で高い細胞密度を得るのにより良い方法であり、いずれの場合にも特異的な酵素活性を増加させるようさらに最適化できる。フェッドバッチ発酵において、一定の供給速度または断続的な供給などの代替の供給手順も利用できる。
【０５７０】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明に関連して記載しているが、前述の説明は例示目的であって、添付の請求項の範囲で規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および変更は下記の請求項の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０５７１】
【図１】図１は、モナチンおよび／またはインドール−３−ピルビン酸を産生するために使用した、生合成経路を示している。１つの経路は、トリプトファンを介してインドール−３−ピルビン酸を産生し、一方で、他は、インドール−３−乳酸を介してインドール−３−ピルビン酸を産生する。モナチンが続いて、ＭＰ中間体を介して産生される。  ボックス内で示した化合物は、生合成経路で産生された基質および産物である。  矢印に隣接した組成物は、共因子、または基質の産物への変換の間に使用可能である反応物である。使用した共因子または反応物は、生合成経路の特定の段階に関して使用されたポリペプチドに依存し得る。共因子ＰＬＰ（ピロドキサール５’−リン酸）は、ポリペプチドに依存せずに反応を触媒可能であり、したがって、単にＰＬＰを提供することによって、基質から産物へ進行を可能にする。
【図２】図２は、ＭＰ中間体を利用する生合成経路のより詳細なダイアグラムである。本経路の各段階のための基質を箱内に示している。基質間の変換を許容するポリペプチドを、基質間の矢印に隣接して列記している。各ポリペプチドを、その共通名および酵素クラス（ＥＣ）番号で示している。
【図３】図３は、インドール−３−乳酸の、インドール−３−ピルビン酸への変換の生合成経路のより詳細なダイアグラムを示している。基質を箱内で示し、基質間の変換を可能にするポリペプチドを、基質間の矢印に隣接して列記している。各ポリペプチドを、その共通名および酵素クラス（ＥＣ）番号で示している。
【図４】図４は、化学的な方法を介して、ＭＰを産生するための１つの可能性のある反応を示している。
【図５Ａ】図５Ａ、酵素的に産生されたモナチンのＬＣ／ＭＳ同定を示しているクロマトグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、酵素的に産生されたモナチンのＬＣ／ＭＳ同定を示しているクロマトグラムである。
【図６】図６は、酵素的に合成したモナチンの電子噴霧質量スペクトルである。
【図７Ａ】図７Ａは、酵素的混合物中で産生されたモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン解析のクロマトグラムである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、酵素的混合物中で産生されたモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン解析のクロマトグラムである。
【図８】図８は、酵素的に産生されたモナチンの、高分解能質量測定を示しているクロマトグラムである。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、（Ａ）Ｒ−トリプトファン、（Ｂ）Ｓ−トリプトファン、および（Ｃ）酵素的に産生したモナチンの、キラル分離を示しているクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、ＩＰＴＧ誘導に続く、細菌細胞中で産生されたモナチンの相対量を示している棒グラフである。（−）は、基質添加を欠くことを示している（トリプトファンまたはピルビン酸を加えなかった）。
【図１１】図１１は、トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から産生されたモナチンの収率を増加させるために使用した経路を示している略図的ダイアグラムである。
【図１２】図１２は、トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から産生されたモナチンの収率を増加させるために使用した経路を示している略図的ダイアグラムである。
【図１３】図１３は、トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から産生したモナチンの収率を増加させるために利用可能である経路を示している、略図的ダイアグラムである。
【図１４】図１４は、遺伝子的に改変した大腸菌７６９２およびＢＷ２５１１３細胞中での、ピルビン酸産生の増加を描写しているグラフである。
【図１５】図１５は、ピルビン酸過剰産生培地中で、遺伝子的に改変した大腸菌７６９２およびＢＷ２５１１３細胞中での、ピルビン酸産生の増加を描写しているグラフである。
【図１６】図１６は、コマモナス・テストステロニ（ＡＴＣＣ４９２４９）からクローン化されたｐｒｏＡ遺伝子の、核酸配列リストである。
【図１７】図１７は、コマモナス・テストステロニ（ＡＴＣＣ４９２４９）からのｐｒｏＡ遺伝子によってコードされたＰｒｏＡアルドラーゼポリペプチドの、アミノ酸配列リストである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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