(57)【要約】  本発明は、複数のインターフェロン（ＩＦＮ）αサブタイプの生物活性を阻害し、ＩＦＮα２１の生物活性又はＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害せず、抗インターフェロンαモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。また、免疫複合体、二重特異性分子及び本発明の抗体を含む医薬組成物を提供される。本発明の抗体を用いたＩＦＮαの生物活性を阻害する方法、及び本発明の抗体を投与することによって、自己免疫疾病、移植片拒絶及び移植片対宿主病などのＩＦＮαが仲介する疾病又は疾患の治療する方法を提供する。【選択図】なし
2007513633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体は、
（ａ）複数のインターフェロン（ＩＦＮ）αサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害せず、
（ｂ）ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害しない、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮによって誘導される表面発現を阻害する請求項１記載の抗体。
【請求項３】
末梢血単核細胞のＩＰ−１０のＩＦＮによって誘導される発現を阻害する請求項１記載の抗体。
【請求項４】
全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する請求項１記載の抗体。
【請求項５】
複数のヒトＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ヒトＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害しない請求項１記載の抗体。
【請求項６】
（ｉ）インターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）を発現する細胞とＩＦＮαとの結合を阻害せず、
（ｉｉ）ＩＦＮα存在下でＩＦＮＡＲを発現する細胞に結合する請求項１記載の抗体。
【請求項７】
ヒト抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項８】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプの全長抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項９】
抗体断片又は単鎖抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項１０】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体は、
（ａ）ヒトＶＨ  １−１８遺伝子の重鎖可変領域又は４−６１遺伝子の重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒトＶｋ  Ａ２７遺伝子の軽鎖可変領域と、を含み、
（ｃ）少なくとも１個のインターフェロンαサブタイプの生物活性を阻害する、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
前記ヒトＶＨ  １−１８遺伝子の重鎖可変領域を含む請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
前記ヒトＶＨ  ４−６１遺伝子の重鎖可変領域を含む請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ３の配列は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含み、
（ｂ）前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ３の配列は、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含み、
（ｃ）前記抗体は、複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害せず、
（ｄ）前記抗体は、ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害しない、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮによって誘導される表面発現を阻害する請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
末梢血単核細胞のＩＰ−１０のＩＦＮによって誘導される発現を阻害する請求項１３記載の抗体。
【請求項１６】
全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する請求項１３記載の抗体。
【請求項１７】
前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ２配列は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含み、
前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ２配列は、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含む請求項１３記載の抗体。
【請求項１８】
前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ１の配列は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含み、
前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ１の配列は、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含む請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
ヒト抗体である請求項１３記載の抗体。
【請求項２０】
ヒト化抗体又はキメラ抗体である請求項１３記載の抗体。
【請求項２１】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）前記重鎖可変領域は、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記抗体は、複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害せず、
（ｄ）前記抗体は、ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害しない、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２２】
末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮによって誘導される表面発現を阻害する請求項２１記載の抗体。
【請求項２３】
末梢血単核細胞のＩＰ−１０のＩＦＮによって誘導される発現を阻害する請求項２１記載の抗体。
【請求項２４】
全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する請求項２１記載の抗体。
【請求項２５】
ヒト抗体である請求項２１の抗体。
【請求項２６】
ヒト化抗体又はキメラ抗体である請求項２１記載の抗体。
【請求項２７】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含み、
少なくとも１個のインターフェロンαサブタイプの生物活性を阻害する、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２８】
（ａ）前記配列番号１を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）前記配列番号４を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）前記配列番号７を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）前記配列番号１０を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）前記配列番号１３を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）前記配列番号１６を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含む請求項２７記載の抗体。
【請求項２９】
（ａ）前記配列番号２を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）前記配列番号５を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）前記配列番号８を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）前記配列番号１１を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）前記配列番号１４を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）前記配列番号１７を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含む請求項２７記載の抗体。
【請求項３０】
（ａ）前記配列番号３を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）前記配列番号６を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）前記配列番号９を含む前記重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）前記配列番号１２を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）前記配列番号１５を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）前記配列番号１８を含む前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含む請求項２７記載の抗体。
【請求項３１】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
（ａ）配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み、
少なくとも１個のインターフェロンαサブタイプの生物活性を阻害する、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３２】
（ａ）前記配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）前記配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む請求項３１記載の抗体。
【請求項３３】
（ａ）前記配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）前記配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む請求項３１の抗体。
【請求項３４】
（ａ）前記配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）前記配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む請求項３１の抗体。
【請求項３５】
単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
（ａ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み、
少なくとも１個のインターフェロンαサブタイプの生物活性を阻害する、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３６】
インターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）を発現する細胞とＩＦＮαとの結合を阻害せず、ＩＦＮＡＲを発現する細胞にＩＦＮαの存在下では結合するがＩＦＮα非存在下では結合せず、複数のインターフェロン（ＩＦＮ）αサブタイプの生物活性を阻害する、単離された抗インターフェロンαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれかに記載の抗体とＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂとの結合が競合する、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３８】
請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合部分、及び薬理学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３９】
治療薬に結合する請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合部分を含む免疫複合体。
【請求項４０】
前記治療薬は細胞毒素である請求項３９記載の免疫複合体。
【請求項４１】
前記治療薬は放射性同位体である請求項３９記載の免疫複合体。
【請求項４２】
請求項３９記載の免疫複合体、及び薬理学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項４３】
抗体又はその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に結合され、請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合部分を含む二重特異性分子。
【請求項４４】
請求項４３記載の二重特異性分子、及び薬理学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項４５】
請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項４６】
請求項４５記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４７】
請求項４６記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４８】
ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の導入遺伝子を含む形質転換マウスであって、前記マウスは、請求項１から３６のいずれかに記載の抗体を発現する形質転換マウス。
【請求項４９】
請求項４８記載のマウスから調製されるハイブリドーマであって、前記抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５０】
請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合部分と、インターフェロンαと、を接触させることを含む、インターフェロンαの生物活性を阻害する方法。
【請求項５１】
請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合部分を被験者に投与することを含む、治療の必要がある被験者においてインターフェロンαが仲介する疾病又は疾患を治療する方法。
【請求項５２】
前記疾病又は疾患は、全身エリテマトーデスである請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾病又は疾患は、多発性硬化症、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、リウマチ様関節炎及び糸球体腎炎からなる群より選択される請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
前記疾病又は疾患は、移植片拒絶又は移植片対宿主病である請求項５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年１２月１０日に出願した米国特許仮出願第６０／５２８，７５７号明細書の利益を享受し、その内容は、その全体を参照することによって本願明細書に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−τ）は、抗ウィルス、抗ガン、及び免疫抑制性効果を有する、構造的に関連したサイトカインのファミリーである（Ｈａｒｄｙ他、（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：４７３；Ｃｕｔｒｏｎｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７１４０）。ヒトのＩＦＮαは２個のサブファミリーを含む。第１のサブファミリーは、少なくとも７５％のホモロジーを有する少なくとも１４の非対立遺伝子及び４つの偽遺伝子からなる。第２のサブファミリーは、αＩＩ又はωであり、ＩＦＮα遺伝子と７０％の類似を示す５個の偽遺伝子及び１個の機能的遺伝子を含む。ＩＦＮαのサブタイプは、異なる特異活性を有するが、同じ生物学的スペクトルを持ち（Ｓｔｒｅｕｌｉ他、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２８４８）、同じ細胞受容体を有する（Ａｇｎｅｔ  Ｍ．他、（１９８３）ｉｎ“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ５”Ｅｄ．Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ  ｐ．１−２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０００３】
全てのヒトのＩ型インターフェロンは、２個の膜貫通型タンパク質、ＩＦＮＡＲ−１及びＩＦＮＡＲ−２からなる細胞表面受容体（ＩＦＮα受容体、ＩＦＮＡＲ）と結合する（Ｕｚｅ他、（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：２２５；Ｎｏｖｉｃｋ他、（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７：３９１；Ｐｅｓｔｋａ他、（１９８７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７２７；Ｍｏｇｅｎｓｅｎ他、（１９９９）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏ１ｃｉｎｅ  Ｒｅｓ．１９：１０６９）。ＩＦＮＡＲ−１は、高親和性の結合及びＩＦＮＡＲ複合体の異なる特異性に必要とされる（Ｃｕｔｒｏｎｅ（２００１）前述）。Ｉ型ＩＦＮサブタイプの機能的な違いは同定されていないが、潜在的に多様なシグナルを伝達するＩＦＮＡＲ受容体構成要素と、異なる相互作用を示すと考えられる（Ｃｏｏｋ他、（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１３４４８）。特に、変異型のＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２を用いた研究は、インターフェロンα及びインターフェロンβが鎖を用いて別々に相互作用し、受容体を介して別々に信号を送ることが示唆される（Ｌｅｗｅｒｅｎｚ他、（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：５８５）。
【０００４】
Ｉ型ＩＦＮの初期の機能研究は、ウィルス感染に対する生得的な防御に焦点が当てられた（Ｈａｌｌｅｒ他、（１９８１）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１９９；Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ他、（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７８：１８１）。しかしながら、最近の研究では、Ｉ型ＩＦＮは、適応性のある免疫応答における免疫調節性サイトカインであることを示唆している。具体的に、Ｉ型ＩＦＮは、Ｔｈｌ経路に沿った未処理のＴ細胞の分化を促進し（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ他、（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１６５５）、抗体産生を促進し（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１１７９）、記憶Ｔ細胞の機能活性と生存を支持すること（Ｓａｎｔｉｎｉ他、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１７７７；Ｔｏｕｇｈ他、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９４７）が示されてきた。
【０００５】
多くのグループによる最近の研究は、樹状細胞（ＤＣ）の成熟又は活性化を高めることを示唆している（Ｓａｎｔｉｎｉ他、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１７７７；Ｌｕｆｔ他、（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１９４７；Ｌｕｆｔ他、（２００２）Ｓｌｉｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３６７；Ｒａｄｖａｎｙｉ他、（１９９９）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５０：４９９；Ｐａｑｕｅｔｔｅ他、（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６４：３５８）。さらに、Ｉ型インターフェロンの発現の増加が、数多くの自己免疫疾患において記載される（Ｆｏｕｌｉｓ他、（１９８７）Ｌａｎｃｅｔ  ２：１４２３；Ｈｏｏｋｓ他、（１９８２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｒｎ  ２５：３９６；Ｈｅｒｔｚｏｇ（１９８８）Ｃｌｉｎ．４８：１９２；Ｈｏｐｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅａｇｅｒ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７３：８８；Ａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ２７：５８２）。例えば、多くの研究は、高レベルのＩＦＮαに関連するインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）（Ｆｏｕｌｉｓ（１９８７）前述）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（Ｈｏｏｋｓ（１９８２）、前述；Ｂｌａｎｃｏ他、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１５４０；Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ（１９８２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２５：４０１；Ｂａｔｔｅｕｘ他、（１９９９）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ  ＿：５０９）、及び自己免疫性甲状腺炎（Ｐｒｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｌａｕｒｂｅｒｇ（２００３）Ｔｈｙｒｏｉｄ  １３：５４７；Ｍａｚｚｉｏｔｔｉ他、（２００２）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２５：６２４；Ｙｏｕ他、（１９９９）Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．１１２：６１；Ｋｏｈ他、（１９９７）Ｔｈｙｒｏｉｄ  ７：８９１）、及びＩＦＮ−βがより重要な役割を果たすリウマチ様関節炎（ＲＡ）（Ｈｅｒｔｚｏｇ（１９８８），Ｈｏｐｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅａｇｅｒ（１９８８），Ａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８４）、前述）に関連する。
【０００６】
さらに、インターフェロンの投与は、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、及び多発性硬化症を持つ患者に内在する病気を悪化させ、自己免疫疾患の既往歴のない患者においてＳＬＥ症候群を引き起こすことが報告される。また、インターフェロンαは正常なマウスに糸球体腎炎を引き起こし、ＮＺＢ／Ｗマウスの自発的な自己免疫疾患の攻撃の始まりを早めることも示される。さらに、ＩＦＮ−α療法は、ある場合において、発熱や神経疾患などの望ましくない副作用を引き起こすことを示されている。従って、ＩＦＮ−α活性の阻害は患者に対して有益となり、ＩＦＮ−α活性を阻害するのに効果的な薬剤の必要がある病的状況が存在している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＩＦＮαに結合し、複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮαサブタイプ２１、又はＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害しない単離したモノクローナル抗体を提供する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩＦＮαによって誘導される細胞マーカーの表面発現を阻害し、ＩＦＮαによって誘導されるＩＰ−１０発現を阻害し、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を持つ患者の血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する能力がある。これらの抗体は、例えば、インターフェロンαの産生又は発現が病的症状に関連する場合における予防目的を含んだ治療に用いられる。また、そのような抗体は、様々な病気の診断又は病気の研究を進展させるためにも使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、ＩＦＮα、好ましくはヒトＩＦＮα（例えば、ヒトＩＦＮα２ａ、ヒトＩＦＮα２ｂ）に結合し、そして複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮαサブタイプ２１、又はＩＦＮβ又はＩＦＮガンマの生物活性を実質的に阻害しない抗体又は抗体断片を含む。さらに、様々な実施形態において、本発明の抗体は、ＩＦＮαによって誘導される細胞マーカーの表面発現を阻害し、ＩＦＮαによって誘導されるＩＰ−１０発現を阻害し、及び／又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する能力を持つ。好ましくは、抗体又は抗体断片はヒトの抗体又は抗体断片であり、ネズミ、キメラ、又はヒト化された抗体であってよい。ある実施形態では、本発明の抗体は、非競合的な作用のメカニズムによって機能する。例えば、好ましい実施形態において、抗体は（ｉ）ＩＦＮα２ａなどのＩＦＮαがインターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）を発現する細胞との結合を阻害せず、（ｉｉ）ＩＦＮα２ａなどのＩＦＮαの存在下でＩＦＮＡＲを発現する細胞に結合する。
【０００９】
１実施態様において、本発明は、
（ａ）ヒトＶＨ  １−１８又は４−６１遺伝子の重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒトＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域と、を含み、
（ｃ）インターフェロンα（少なくとも１個のＩＦＮαサブタイプ）の生物学活性を阻害する単離した抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３の配列は、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３の配列は、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾を含み、
（ｃ）複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害せず、
（ｄ）
（ｉ）ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害せず、
（ｉｉ）末梢血単核細胞においてＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮに誘導される表面発現を阻害する、
（ｉｉｉ）末梢血単核細胞による、ＩＦＮに誘導される発現を阻害する、
（ｉｖ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する、（ｉ）〜（ｉｖ）の特性の少なくとも１つを示す、
単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１１】
そのような抗体において、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含む。さらに、そのような抗体においては、重鎖可変領域のＣＤＲ１の配列は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含み、そして軽鎖可変領域のＣＤＲ１の配列は、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾と、を含む。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１と少なくとも８０％相同するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４と少なくとも８０％相同するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体が、ＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害せず、
（ｄ）
（ｉ）ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害せず、
（ｉｉ）末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮによって誘導される表面発現を阻害する、
（ｉｉｉ）末梢血単核細胞のＩＦＮに誘導される発現を阻害する、
（ｉｖ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する、（ｉ）〜（ｉｖ）の特性のうち少なくとも１つを示す、
単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、インターフェロンα（少なくとも１個のＩＦＮαサブタイプ）の生物活性を阻害する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１４】
さらに別の実施態様において、本発明は、高い安定性のある配列番号１９の変異体に関する。好ましい実施形態は、
（ａ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み、
少なくとも１個のインターフェロンαサブタイプの生物活性を阻害する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む。
【００１５】
さらに別の実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含み、
抗体がインターフェロンα（少なくとも１個のＩＦＮαサブタイプ）の生物活性を阻害する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１６】
さらに別の実施態様において、本発明は、ＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂと上記のいずれかの抗体との結合が競合する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１７】
さらに別の実施態様において、本発明は、複数のインターフェロン（ＩＦＮ）αサブタイプの生物活性を阻害し、ＩＦＮαとインターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）を発現する細胞との結合を阻害せず、ＩＦＮαの存在下でＩＦＮＡＲを発現する細胞と結合する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００１８】
また、本発明は、上記のいずれかの抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子も含む。
【００１９】
本発明の抗体は、いかなるアイソタイプの抗体であってよい。好ましい抗体は、ＩｇＧｌ又はＩｇＧ４アイソタイプの抗体である。本発明の抗体は、可変領域及び定常領域を含む全長の抗体又は単鎖抗体又はＦａｂ断片などのその抗原結合断片であってよい。
【００２０】
本発明は、細胞毒素又は放射性同位体などの治療薬に結合する抗体の免疫複合体も含む。さらに、本発明は、異なる結合特異性を有する第２の機能部分に結合される本発明の抗体を含む二重特異性分子も含む。
【００２１】
また、抗体又はその抗原結合部分、免疫複合体、又は二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、活性薬及び薬理学的に許容可能な担体を含む。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、インターフェロンαの生物活性を阻害するように、本発明の抗ＩＦＮα抗体とインターフェロンαとを接触させることを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるインターフェロンαの生物活性を阻害する方法を含む。
【００２３】
別の実施態様において、本発明の抗ＩＦＮα抗体を被験者に投与することを含み、被験者におけるインターフェロンαが仲介する病気又は疾患を治療する方法を含む。治療する病気は、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、リウマチ様関節炎、及び糸球体腎炎）、移植拒絶反応、及び移植片対宿主病などである。
【００２４】
本発明の他の特徴及び長所は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかであり、限定的に解釈されるべきでない。本願明細書の全体にわたって記載される全ての参考文献、特許、及び特許公報の内容は、明白に本願明細書に引用されて援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＦＮαに結合し、複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮαサブタイプ２１、又はＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を阻害しない単離したモノクローナル抗体に関係する。本発明の抗体は、ＩＦＮαによって誘導される細胞マーカーの表面発現を阻害し、ＩＦＮαによって誘導されるＩＰ−１０発現を阻害し、及び全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）を持つ患者の血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する能力を持つ。本発明は、単離した抗体、その調製方法、及びそれらの抗体を含む免疫複合体及び二重特異性分子を作る方法、及び本発明の抗体、免疫複合体、又は二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、例えば、自己免疫疾患の治療又は移植拒絶反応の阻害又は予防、又は移植片対宿主病の治療において、ＩＦＮα活性を阻害する抗体の使用の方法にも関連する。
【００２６】
最初に、本発明がより容易に理解されるようにいくつかの用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって述べられる。
【００２７】
本願明細書で使われる“インターフェロンα”及び“ＩＦＮα”という用語は、同義的に使用され、ＩＦＮα１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿０７６９１８又はＧｅｎｂａｎｋ番号ＮＭ＿０２４０１３によってコードされるタンパク質）と７５％以上の配列相同性を持つ、インターフェロンα遺伝子座位の機能的な遺伝子によってコードされたＩＦＮαタンパク質について言及することを目的とする。ＩＦＮαサブタイプの例は、ＩＦＮα１、α２ａ、α２ｂ、α４、α５、α６、α７，α８、α１０、α１、α１４、α１６、α１７、及びα２１を含む。“インターフェロンα”という用語は、様々なＩＦＮαサブタイプの組み換え体と同様に、白血球及びリンパ芽球腫のＩＦＮなどのＩＦＮαタンパク質を含む、自然発生的な標品を含むことを目的とする。ＩＦＮαという用語は、ＩＦＮωのみを含むことを目的としないが、ＩＦＮα及びＩＦＮωの両方からなる組成物は、ＩＦＮαという用語によって包含される。
【００２８】
本願明細書で使われる“ＩＦＮα受容体”という用語は、リガンドであるＩＦＮαの受容体分子のＩＦＮα受容体ファミリーのメンバーについて言及することを目的とする。ＩＦＮα受容体の例は、ＩＦＮα受容体１及びＩＦＮα受容体２である。
【００２９】
本願明細書で使われる“免疫応答”という用語は、例えば、リンパ球、抗原が存在する細胞、食細胞、顆粒球、及び上述の細胞又は肝臓によって産生される可溶性の巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補足物を含む）、それらが侵入した病原体、病原体に感染された細胞又は組織、ガン細胞、又は、自己免疫又は病理学的な炎症の場合には、正常なヒト細胞又は組織の選択的な損傷、破壊、又は人体からの除去などの活動について言及する。
【００３０】
本願明細書で使われる“シグナル伝達経路”という用語は、細胞のある部分から別の部分へのシグナルの送信において役割を果たす、様々なシグナル伝達分子の間の生化学的な関係について言及する。本願明細書で使われるフレーズ“細胞表面受容体”とは、例えば、シグナルを受信し、及び細胞の形質膜を介してシグナル伝達する能力を持つ分子及び分子の複合体を含む。本発明の“細胞表面受容体”は、例えば、ＩＦＮα受容体１又はＩＦＮα受容体２である。
【００３１】
本願明細書で使われる“抗体”という用語は、抗体全体、及びいずれの抗原結合断片（すなわち“抗原結合部分”）又はその単鎖を含む。“抗体”とは、ジスルフィド結合によって相互に繋がった、少なくとも２個の重鎖（Ｈ）及び２個の軽鎖（Ｌ）、又はその抗原結合部分を含む糖タンパク質について言及する。各重鎖は、重鎖可変領域（本願明細書においてＶＨと略記される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本願明細書においてＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣＬからなる。さらに、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へと細かく分けられ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域によって分散する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序に並べられる３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、様々な細胞の免疫系（例えば、効果細胞）及び、古典的な相補系の第１構成要素（Ｃ１ｑ）を含む因子、又は宿主組織に対する免疫グロブリンとの結合を仲介する。
【００３２】
本願明細書で使われる、抗体の“抗原結合部分”という用語（又は単に“抗体部分”）は、抗原（例えばＩＦＮα）に対して特異結合する能力を持つ抗体の１個以上の断片について言及する。抗体の抗原結合機能は、抗体全長の断片によって行われることが示される。抗体の“抗原結合部分”という用語内に含まれる結合断片の例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片と、（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって結合した２個のＦａｂ断片からなる二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片と、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の一本の腕のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ他、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）と、（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え手法を用いて一価の分子を形成するＶＬ領域及びＶＨ領域のペアを単一のタンパク質鎖として生成することができる合成リンカーによって結合される（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ他、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；ａｎｄ  Ｈｕｓｔｏｎ他、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。そのような単鎖抗体も、抗体の“抗原結合部分”という用語内に含まれることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に従来公知の技術を用いて得られ、その断片は選別され、完全な抗体と同様に使用される。
【００３３】
本願明細書で使われる“単離した抗体”という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体から十分に離れた状態である抗体（例えば、特異的にＩＦＮαに結合する単離した抗体は、ＩＦＮα以外の抗原に特異結合する抗体から十分に離れている）について言及することが意図される。しかしながら、ＩＦＮαに特異結合する単離した抗体は、他の種に由来するＩＦＮα分子などの他の抗原に対して交差反応を有する。さらに、単離した抗体には、他の細胞素材及び／又は化学物質からほとんど存在しない。
【００３４】
本願明細書で使われる“モノクローナル抗体”又は“モノクローナル抗体組成物”という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製品について言及する。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性、及び特定のエピトープに対する親和性を表す。
【００３５】
本願明細書で使われる“ヒト抗体”という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまたヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダム又は部位特異変異によって、又はｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含む。しかしながら、本願明細書で使われる“ヒト抗体”という用語は、マウスなど別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列上に移植される抗体を含むことを意図しない。
【００３６】
“ヒトモノクローナル抗体”という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を表す抗体について言及する。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する非ヒト形質転換動物、例えば形質転換マウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００３７】
本願明細書で使われる“組み換えヒト抗体”という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子又は後述する調製されたハイブリドーマのために、形質転換又は染色体導入された動物（例えば、マウス）から単離した抗体と、（ｂ）ヒト抗体を発現するために形質転換した宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから、単離した抗体、（ｃ）組み換えのコンビナトリアルなヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列に対するスプライシングと、を含む、いずれかの他の方法によって、調製、発現、生成、又は単離などの組み換え手法によって調製、発現、生成、又は単離した全てのヒト抗体を含む。そのような組み換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある実施形態において、そのような組み換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列を形質転換動物が使われた場合はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を受けやすく、組み換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来するため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリーにおいて天然に存在しない配列である。
【００３８】
本願明細書で使われる“アイソタイプ”という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる、抗体のクラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）について言及する。
【００３９】
本願明細書で使われる、ＩＦＮαサブタイプの“生物活性を阻害する”抗体とは、例えば、実施例に記載されるＤａｕｄｉ細胞増殖検定などの機能検定を用いて、抗体の非存在下の活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、より好ましくは２０〜８０％のサブタイプの活性レベルで阻害する抗体について言及する。ＩＦＮαサブタイプの“生物活性を阻害する”抗体とは、２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、さらに好ましくは５０ｎＭ以下、持に好ましくは１０ｎＭ以下のＥＣ５０を持つサブタイプの活性を阻害する抗体について言及することができる。
【００４０】
本願明細書で使われる、ＩＦＮαサブタイプ、又はＩＦＮβ又はＩＦＮωの“生物活性を十分に阻害しない”抗体とは、そのサブタイプの活性を１０％以下にまで、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは原則的に検出できない量において阻害する抗体について言及することが意図される。また、ＩＦＮαサブタイプの“生物活性を阻害しない”抗体とは、そのサブタイプの活性を、３００ｎＭ以上のＥＣ５０で阻害する抗体について言及することができる。
【００４１】
本願明細書で使われる、“特異結合”とは、所定の抗原に結合する抗体について言及する。一般的に、抗体は、１０−８Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原または非常に密接な抗原以外の非特異的な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合のＫＤより少なくとも１／２のＫＤで所定の抗原に結合する。“抗原認識抗体”及び“抗原に特異抗体”というフレーズは、本願明細書の“抗原特異結合抗体”という用語と同義である。
【００４２】
本願明細書で使われる“Ｋａｓｓｏｃ”又は“Ｋａ”という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度について言及することが意図され、本願明細書で使われる“Ｋｄｉｓ”または“Ｋｄ”という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度について言及することが意図される。本願明細書で使われる“ＫＤ”という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られるモル濃度（Ｍ）で表される解離定数について言及することが意図される。抗体のＫＤ値は、従来的に十分に確立された方法を用いて決定する。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用し、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する。
【００４３】
本願明細書で使われる、ＩｇＧ抗体の“高親和性”という用語は、１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、そしてさらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下、ＫＤを有する抗体について言及する。しかしながら、“高親和性”結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化する。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する“高親和性”結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８以下のＫＤを有する抗体について言及する。
【００４４】
本願明細書で使われる、“被験者”という用語は、ヒト又は非ヒト動物も含む。“非ヒト動物”という用語は、例えば、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、馬、牛、ニワトリ、両生類、は虫類など、哺乳類及び非哺乳類の全ての脊椎動物を含む。
【００４５】
本発明の様々な実施態様が、詳細に以下の区分に記載される。
【００４６】
［抗ＩＦＮα抗体］
本発明の抗体は、抗体の特定の機能特徴又は機能特性を有する。例えば、特定の実施形態において、抗体はＩＦＮα２ａ及びＩＦＮα２ｂなどの、複数のＩＮＦαのサブタイプに特異結合する。本発明の抗体は、高親和性、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらに好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤでＩＦＮα２ａ及び／又はα２ｂに結合する。好ましい実施形態において、抗体は、ヒトＩＦＮα２ａ及びヒトＩＦＮα２ｂに結合する。本発明の抗体の結合親和性及び反応速度は、例えば、実施例に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ分析によって調べることができる。
【００４７】
さらに、他の実施形態において、本発明の抗体は様々な機能特性を表す。例えば、抗体は、複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害しない。また、その抗体は、ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害しない。また、本発明の抗体は、正常なヒト末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩなどの細胞マーカーのＩＦＮによって誘導される表面発現を阻害する能力を持つ。ＩＦＮαサブタイプ、ＩＦＮβ及び／又はＩＦＮωの生物活性の阻害は、Ｄａｕｄｉ細胞増殖検定などの実施例に記載される機能検定を用いて評価する。
【００４８】
またさらに、抗体は、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）を持つ患者の血漿が仲介する、樹状細胞の成長を阻害する能力を持つ。樹状細胞の成長は、実施例に記載されるように、ＣＤ３８、ＭＨＣクラスＩ、及び／又はＣＤ１２３などの細胞表面マーカーの発現を調べることによって評価される。
【００４９】
ある好ましい実施形態では、本発明の抗体が、非競合的な作用のメカニズム、すなわち抗体がＩＦＮαのＩＦＮＡＲとの結合に競合しないメカニズムによって、ＩＦＮαの生物活性を阻害する。つまり、そのような抗体は、ＩＦＮαの存在下で細胞表面のＩＦＮＡＲに結合した状態になり、ＩＦＮＡＲを介した細胞シグナリングを阻害する。他の好ましい実施形態において、これらの結合特性を有する抗体は有意なＡＤＣＣ活性を阻害しない。抗体のこれらの機能特性を調べるための検定は従来公知であり、実施例８及び実施例９に記載される。例えば、放射性同位元素で識別したＩＦＮαのＩＦＮＡＲを発現する細胞との結合を阻害する抗体の能力を調べる。放射性同位元素で識別したＩＦＮαのＩＦＮＡＲとの結合は非競合的なメカニズのム作用であることが示唆される。この非競合的なメカニズムの作用をさらに調べるため、放射性同位元素で識別した抗体のＩＦＮＡＲを発現する細胞との結合は、ＩＦＮαの存在下又は非存在下において検定される。放射性同位元素で識別した抗体は、ＩＦＮＡＲを発現する細胞にＩＦＮαの存在下では結合し、ＩＦＮα非存在下では結合しないというメカニズムの作用が示唆される。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＩＦＮα単独（１個以上のサブタイプ）及び／又はＩＦＮＡＲ単独に対してより高い親和性（例えばＫＤ）で、ＩＦＮα−ＩＦＮＡＲ複合体に結合する。例えば、ある実施形態において、本発明の抗体は、１０−８Ｍ以上の親和性のＫＤ１０−９Ｍ以上の親和性のＫＤ、又は１０−１０Ｍ以上の親和性のＫＤで、ＩＦＮα−ＩＦＮＡＲ複合体に結合する。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＩＦＮα（１個以上のサブタイプ）及びＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１及び／又はＩＦＮＡＲ２）に対して二重特異性である。つまり、抗体が、ＩＦＮαとＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１及び／又はＩＦＮＡＲ２）の両方に結合することを意味する。従って、本発明は、例えば、ＩＦＮＡＲ１の第２の結合特異性は、少なくとも１個のＩＦＮαに対する第１の結合特異性及びＩＦＮＡＲ１に対する第２の結合特異性からなる二重特異的分子を含み、ＩＦＮαと抗体との結合によって形成される。また、本発明は、例えば、ＩＦＮＡＲ２に対する第２の結合特異性は、少なくとも１個のＩＦＮαに対する結合特異性及びＩＦＮＡＲ２に対する第２の結合特異性を含む二重特異的分子も含み、ＩＦＮαと抗体との結合によって形成される。
【００５２】
［モノクローナル抗体１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９］
本発明の好ましい抗体は、実施例に記載されるように単離し、構造的であることを特徴とするヒトモノクローナル抗体１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９である。１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９のＶＨのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に示される。これらの抗体のそれぞれがＩＦＮαに結合する場合、ＶＨ配列とＶＬ配列を“混ぜて合わせる”ことによって、本発明の他の抗ＩＦＮα結合分子を生成する。又はそのような“混ぜて合わせられる”抗体のＩＦＮαの結合活性又は中性化活性は、上記の及び実施例中に記載される結合検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、Ｄａｕｄｉ細胞増殖検定）を用いて検査される。好ましくは、これらの抗体は、１３Ｈ５と７Ｈ９のＶＨ配列を混ぜて合わせられる。なぜなら、同じ生殖系列配列（ＶＨ  １−１８）に由来するＶＨ配列を使うため、構造上の類似性を表すからである。また、これらの抗体は１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＬ配列は混ぜて合わせられる。同じ生殖系列の配列（ＶｋＡ２７）を使うことによって構造上の類似性を表すからである。
【００５３】
従って、１個の実施態様において、本発明の抗体は、
（ａ）配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を含み、インターフェロンαの生物活性を阻害する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００５４】
好ましい重鎖と軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のうちいずれかを含む。
【００５５】
別の実施態様において、本発明は、１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又はその組み合わせからなる抗体を提供する。１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＨのＣＤＲ３ｓのアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、及び１５に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９のＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に示される。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ．Ｅ．Ａ．他、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｌｉｂｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて図示される。
【００５６】
これらの各抗体はＩＦＮ結合活性に基づいて選択され、抗原結合特異性がＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域によって最初に与えられる場合、ＶＨのＣＤＲ１、２、及び３配列、及びＶＬのＣＤＲ１、２、及び３配列を“混ぜて合わせる”ことによって、本発明の他の抗ＩＦＮα分子を生成する（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを混ぜて合わせるが各抗体はＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、及びＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む必要がある）。そのような“混ぜて合わせられる”抗体のＩＦＮα結合は、実施例に記載される結合検定（例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＢｉａｃｏｒｅ）を用いて検査される。好ましくは、ＶＨのＣＤＲ配列を混ぜて合わせると、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３の配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列に置き換えられる。同様に、ＶＬのＣＤＲ配列を混ぜて合わせると、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３の配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列に置き換えられる。例えば、１３Ｈ５及び７Ｈ９のＶＨのＣＤＲ１は、いくつかの構造の類似性を共有する。当業者にとって、新規的なＶＨ配列及びＶＬ配列は、モノクローナル抗体１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９として本願明細書に開示されたＣＤＲ配列に由来する構造的に類似した配列と、１個以上のＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域配列とを置換して生成されることは明らかである。
【００５７】
従って、別の実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含み、
インターフェロンαの生物活性を阻害する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００５８】
好ましい実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号１からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号４からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１０からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１３からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１６からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含む。
【００５９】
別の好ましい実施形態においては、抗体は、
（ａ）配列番号２からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号５からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号８からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１１からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１４からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１７からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含む。
【００６０】
別の好ましい実施形態においては、抗体は、
（ａ）配列番号３からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号６からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号９からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１２からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１５からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１８からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と、を含む
【００６１】
［特定の生殖系列配列を有する抗体］
ある実施形態において、本発明の抗体は、特定の生殖系列の重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域、及び／又は特定の生殖系列の軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域からなる。
【００６２】
例えば、好ましい実施形態においては、本発明は、
（ａ）ヒトＶＨ  １−１８又は４−６１遺伝子の重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒトＶｋ  Ａ２７遺伝子の軽鎖可変領域と、を含み、
（ｃ）インターフェロンαの生物活性を阻害する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００６３】
一実施形態において、抗体は、ヒトＶＨ  １−１８遺伝子の重鎖可変領域を含む。ＶＨ  １−１８のＶＨ遺伝子配列及びＶｋ  Ａ２７のＶｋ遺伝子配列を有する抗体は、１３Ｈ５及び７Ｈ９を含む。別の実施形態において、抗体は、ヒトＶＨ  ４−６１遺伝子の重鎖可変領域を含む。ＶＨ  ４−６１ＶＨ遺伝子配列及びＶｋ  Ａ２７のＶｋ遺伝子配列を有する抗体は、例えば、１３Ｈ７である。
【００６４】
抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いた系から得られる場合、本願明細書で使われるヒト抗体は、特定の生殖系列の配列“の”（産生物）、又は特定の生殖系列の配列“に由来する”（産生物）の重鎖又は軽鎖可変領域からなる。そのような系は、注目される抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を有する形質転換マウスに免疫性を持たせること、又は注目する抗原とともにファージ上に表わされるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを選別することを含む。ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列“の”（産生物）、又はヒト生殖系列の免疫グロブリン配列“に由来する”（産生物）のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を比較して、及びヒト抗体の配列と配列上最も近い（すなわち、相同性が最も大きい）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択してヒト抗体を同定する。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列“の”（産生物）、又は特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列“に由来する”ヒト抗体は、例えば、自然発生的に起こる体細胞突然変異又は部位特異変異の計画的に導入するために、生殖系列の配列と比較した場合にアミノ酸の違いを含む。しかしながら、一般的に、選択されるヒト抗体は、アミノ酸配列において、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードしたアミノ酸配列と、少なくとも９０％相同し、他の種の生殖系列の免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較してヒト抗体であると同定するアミノ酸残基を含む。ヒト抗体は、アミノ酸配列において、生殖系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードしたアミノ酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９６〜９９％相同する。一般的に、特定のヒト生殖系列の配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列によってコードしたアミノ酸配列と１０アミノ酸程の違いしか示さない。ある状況において、ヒト抗体は、生殖系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードしたアミノ酸配列と５個、好ましくは４〜１個のアミノ酸の違いしか示さない。
【００６５】
［同種抗体］
さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、本願明細書に記載される好ましい抗体のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からなり、本発明の抗ＩＦＮα抗体の望ましい機能特性を保持する。
【００６６】
例えば、本発明は、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなるグループから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％相同するアミノ酸配列と、を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなるグループから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％相同するアミノ酸配列と、を含み、
（ｃ）ＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害せず、
（ｄ）
（ｉ）ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害せず、
（ｉｉ）末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮによって誘導される表面発現を阻害する、
（ｉｉｉ）末梢血単核細胞によるＩＰ−１０のＩＦＮによって誘導される発現を阻害する、
（ｉｖ）全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する、（ｉ）〜（ｉｖ）の特性のうち少なくとも１つを示す、
単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００６７】
他の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、上記に記載される配列と８５〜９９％相同する。配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１と配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４のそれぞれにおいて高い相同性（すなわち８０％以上の相同性）を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１、及び／又は配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４をコードする核酸分子の変異（例えば、部位特異変異、又はＰＣＲ変異）によって得られ、本願明細書に記載される機能検定を用いて、保持機能（すなわち、上記の（ｃ）及び（ｄ））について、コードした変異抗体の検査を行う。
【００６８】
本願明細書で使われる２個のアミノ酸配列の間のパーセント類似性は、２個の配列の間の相同性に相当する。２個の配列の間の相同性は、２個の配列の最適なアラインメントを導くために必要なギャップの数及びギャップの長さを考慮に入れ、配列が共有する相同的な部位の数（すなわち、相同性％＝相同的な部位の数／部位の数の全体×１００）の関数である。配列の比較、及び相同性の決定は、以下の非限定的な実施例に記載される数学的なアルゴリズムを用いて行われる。
【００６９】
２個の配列間の相同性は、ＰＡＭ１２０残基重みテーブル、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を用いて決定する。さらに、２個のアミノ酸配列間の相同性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクス、及び１６、１４、１２、１０、８，６、又は４のギャップ重み、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを用いたＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））を用いて決定する。
【００７０】
または、本発明のタンパク質配列は、例えば、関連した配列を同定するための公共のデータベースに対して検索を行う“問合せ配列”としてさらに使用する。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４１３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に対するアミノ酸配列類似性を得るために、スコア＝５０、語の長さ＝３の条件でＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて行われる。比較の目的でギャップの入ったアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを「Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２」に記載されるようにして用いる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期のパラメーターが使われる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
【００７１】
［抗体内の保存的修飾］
ある実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３からなる重鎖可変領域、及びＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３からなる軽鎖可変領域からなり、１個以上のＣＤＲ配列は、本願明細書に記載される好ましい抗体（例えば、１３Ｈ５、１３Ｈ７、又は７Ｈ９）に基づく特異的なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾からなる。抗体は、本発明の抗ＩＦＮα抗体の望ましい機能特性を保持する。例えば、本発明の好ましい抗体は、重鎖可変領域のＣＤＲ３配列が配列番号３のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列が配列番号６のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の保存的修飾を含む。従って、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３からなる重鎖可変領域、及びＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３からなる軽鎖可変領域を含み、
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列内の保存的修飾からなるグループから選択され、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列内の保存的修飾からなるグループから選択され、
（ｃ）複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を阻害せず、
（ｄ）
（ｉ）ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害せず、
（ｉｉ）末梢血単核細胞のＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮが誘導する表面発現を阻害し、
（ｉｉｉ）末梢血単核細胞のＩＰ−１０のＩＦＮが誘導する発現を阻害する、
（ｉｖ）全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する樹状細胞の成長を阻害する、（ｉ）〜（ｉｖ）の特性のうち少なくとも１つを示す、
単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００７２】
さらなる実施形態において、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列内の保存的修飾からなるグループから選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５、及び該アミノ酸配列内の保存的修飾からなるグループから選択される。さらなる実施形態において、重鎖可変領域のＣＤＲ１の配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列内の保存的修飾からなるグループから選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１の配列は、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列内の保存的修飾からなるグループから選択される。
【００７３】
本願明細書で使われる、“配列内の保存的修飾”という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に実質的に影響しない又はそれを変えない、アミノ酸変異について言及することが意図される。そのような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。部位特異変異及びＰＣＲに仲介された変異などの従来公知の標準技術によって、本発明の抗体は変異する。アミノ酸内の保存的修飾とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、技術的に定義される。ファミリーは、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷のない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。従って、本発明の抗体のＣＤＲ領域内で１個以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置換することができ、変異した抗体については、本願明細書に記載される機能検定を用いて保持機能（すなわち、上記の（ｃ）及び（ｄ））を検査することができる。
【００７４】
［本発明の抗ＩＦＮα抗体と同じエピトープに結合する抗体］
別の実施形態において、本発明は、本願明細書に記載される１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９抗体と同じエピトープに結合する他のヒト抗体などの本願明細書に記載される本発明の様々なヒトＩＦＮα抗体が結合する抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。そのような抗体は、標準的なＩＦＮα結合検定において、１３Ｈ５、１３Ｈ７又は７Ｈ９などの本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に重要な様式で結合を競合的に阻害する）能力に基づいて同定される。例えば、実施形態において示すように、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて１３Ｈ５はＩＦＮα２ａ及びＩＦＮα２ｂと高い親和性で結合する。従って、一実施形態において、本発明は、本発明の別の抗体（例えば、１３Ｈ５、１３Ｈ７又は７Ｈ９）と、ＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂとの結合について競合する抗体、好ましくはヒト抗体を提供する。例えば、１３Ｈ５、１３Ｈ７又は７Ｈ９のＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂとの結合を阻害する検査抗体の能力は、検査抗体がＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂと結合する抗体と競合することを示す。このような抗体は、非限定的な理論によれば、競合する抗体とは、ＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂ上の同じ、又は関連した（例えば、構造的に類似した又は空間的に近接した）エピトープに結合する。好ましい実施形態において、例えば、１３Ｈ５、１３Ｈ７又は７Ｈ９が、ＩＦＮα２ａ又はＩＦＮα２ｂ上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、実施例において記載されるように調製され、単離される。
【００７５】
［改変抗体及び変異抗体］
さらに、本発明の抗体は、最初の抗体の特性が変化した変異抗体へと改変する出発材料として、本願明細書に開示する１個以上のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を有する抗体を用いて調製する。例えば、１個以上のＣＤＲ領域内、及び／又は１個以上のフレームワーク領域内の１個又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）の１個以上の残基を変異して、抗体を改変する。また、例えばその抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を変異して抗体を改変する。
【００７６】
形変が行われる可変領域の１つのタイプはＣＤＲ移植である。抗体は、６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置づけられたアミノ酸残基を通して、標的抗原と優勢に相互作用する。従って、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体の間で多様となる。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用を担うため、異なる特性を持つ抗体に由来するフレームワーク配列上に移植した天然の特異抗体に擬似のＣＤＲ配列を含む、発現ベクターを構築することによって、天然の抗体の特性を真似る組み換え抗体の発現が可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．他、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．他、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．他、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，２２５，５３９号明細書；及びＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２、及び米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【００７７】
従って、本発明の別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３と、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６と、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるグループからそれぞれ選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２と、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５と、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８のアミノ酸配列からなるグループからそれぞれ選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。従って、そのような抗体は、モノクローナル抗体１３Ｈ５、１３Ｈ７、又は７Ｈ９のＶＨ及びＶＬのＣＤＲの配列を含み、さらにこれらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含む。
【００７８】
そのようなフレームワーク配列は、公共のＤＮＡデータベース、又は生殖系列の抗体遺伝子配列を含む公開された参考文献から得られる。例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列のＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）と、「Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，他、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，他、（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．他、（１９９４）“Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６」の内容は明示的に本願明細書に引用されて援用する。
【００７９】
本発明の抗体の使用のための好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択される抗体によって使われるフレームワーク配列に構造的に類似したものであり、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体によって使われるＶＨ  １−１８又は４−６１及びＶＫ  Ａ２７フレームワーク配列に類似する。ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、及びＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、フレームワーク配列に由来する生殖系列の免疫グロブリン遺伝子に見られるのと同じ配列を有するフレームワーク領域上に移植されるか、又はそのＣＤＲ配列は、生殖系列の配列と比較し、１個以上の変異を含むフレームワーク領域上に移植される。例えば、抗体の抗原結合能力を調節又は向上させるフレームワーク領域内の残基を変異させることは有益であるということが見出される（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１；米国特許第５，５８５，０８９；米国特許第５，６９３，７６２及び米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【００８０】
可変領域の変異の別のタイプは、注目する抗体の１個以上の結合特性（親和性）を改善することによって、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３領域内でアミノ酸残基を変異させる。部位特異変異又はＰＣＲ変異は、変異の導入のために行われ、抗体の結合又は他の注目される機能特性上の効果は、本願明細書及び実施例に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの検定において評価する。上記に記載される好ましい保存的修飾が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加、又は欠失であるが、好ましくは置換である。さらに、一般的に、ＣＤＲ領域内の変化される１〜５個の残基が変化する。
【００８１】
従って、別の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２、及び配列番号３と比較して１〜５個のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列からなるグループから選択されるＶＨのＣＤＲ１領域と、（ｂ）配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号４、配列番号５、及び配列番号６と比較して１〜５個のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列からなるグループから選択されるＶＨのＣＤＲ２領域と、（ｃ）配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号７、８、及び９と比較して１〜５個のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列からなるグループから選択されるＶＨのＣＤＲ３領域と、（ｄ）配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のアミノ酸配列又は配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２と比較して１〜５個のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列、からなるグループから選択されるＶＬのＣＤＲ１領域と、（ｅ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５のアミノ酸配列、又は配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５と比較して１〜５個のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列からなるグループから選択されるＶＬのＣＤＲ２領域と、（ｆ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８のアミノ酸配列、又は配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８と比較して１〜５個のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列からなるグループから選択されるＶＬのＣＤＲ３領域とを含む重鎖可変領域を含む、単離した抗ＩＦＮαモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００８２】
本発明の改変された抗体は、例えば、特性を改善するようにＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基の変異も含む。一般的に、フレームワークの変異は、抗体の免疫原性を減少させる。例えば、１つの手段は、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列の配列に“逆突然変異”させることである。具体的に、体細胞変異を受けた抗体は、抗体の由来する生殖系列の配列から異なるフレームワーク残基を含む。そのような残基は、抗体の由来する生殖系列の配列と、抗体のフレームワーク配列を比較することによって同定される。例えば、１３Ｈ５について、ＶＨのアミノ酸残基番号８１（ＦＲ３内）は、ロイシンであり、ＶＨ  １−１８生殖系列の配列に相当する残基はメチオニンである（図４参照）。フレームワーク領域の配列を生殖系列の構成に戻すため、体細胞変異は、例えば、部位特異変異又はＰＣＲ変異によって生殖系列の配列に“逆突然変異”する（例えば、１３Ｈ５のＶＨの残基８１は、ロイシンからメチオニンに“逆突然変異”する）。そのような“逆突然変異”された抗体も本発明に含まれるということが意図される。
【００８３】
フレームワーク変異の別のタイプは、抗体の有力な免疫原性を減少させることによって、Ｔ細胞のエピトープを除去するフレームワーク領域内、又は１個以上のＣＤＲ領域の１個以上の残基を変異させることを含む。この手段はまた、“脱免疫化”と呼ばれ、Ｃａｒｒ他の米国特許公開第２００３０１５３０４３号明細書に詳細に記載される。
【００８４】
さらにまた、フレームワーク又はＣＤＲ領域内の変異のため、本発明の抗体は、血清の半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的な細胞毒性など抗体の１個以上の機能特性を一般的に変化させるＦｃ領域内の変異を含むように改変する。さらに、本発明の抗体は、化学的に変異（例えば、１個以上の化学的部分が抗体に結合する）、又は糖鎖形成と抗体の１個以上の機能特性を変化させるように変異する。これらの実施例は、以下に詳細に記載される。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵ指標のものである。
【００８５】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変わる、例えば、増加する又は減少するように変異される。この手段は、Ｂｏｄｍｅｒの米国特許第５，６７７，４２５号明細書に記載される。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖の結合を容易にする、又は抗体の安定性を増加又は減少させるために変化する。
【００８６】
別の実施形態においては、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的な半減期を減少させるために変異させる。具体的には、１個以上のアミノ酸の変異は、抗体が天然のＦｃ−ヒンジドメインのスタフィロコッカス属タンパク質Ａ（ＳｐＡ）の結合と比較して、ＳｐＡの結合が損なわるＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの接点領域に導入される。この手段は、Ｗａｒｄ他の米国特許第６，１６５，７４５号明細書に詳細に記載される。
【００８７】
別の実施形態において、抗体は、その生物学的な半減期を増加させるために変異される。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５に記載されるように、１個以上の変異（Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ）が導入される。また、Ｐｒｅｓｔａ他の米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載されるように、抗体は、生物学的な半減期を増加させるため、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから受け継がれる再利用受容体結合エピトープを含むＣＨ１又はＣＬ領域内で変化する。
【００８８】
さらに他の実施形態において、Ｆｃ領域は、少なくとも１個のアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を変化させる異なるアミノ酸残基で置換することによって変化する。例えば、２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２のアミノ酸残基から選択される１個以上のアミノ酸は、抗体とエフェクターリガンドとの親和性を変化させるが、元の抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換する。親和性が変化したエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分である。この手段は、Ｗｉｎｔｅｒ他の米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び米国特許５，６４８，２６０号明細書に詳細に記載される。
【００８９】
別の実施形態において、アミノ酸残基３２９、３３１及び３３２から選択される１個以上のアミノ酸は、抗体がＣ１ｑ結合を変化させ、及び／又は補体依存的な細胞毒性（ＣＤＣ）を減少又は消滅させる異なるアミノ酸残基で置換される。この手段は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ他の米国特許第６，１９４，５５１号明細書に詳細に記載される。
【００９０】
別の実施形態においては、アミノ酸位置２３１及び２３９内の１個以上のアミノ酸残基は、補体を固定する抗体の能力を変化させる。この手段は、Ｂｏｄｍｅｒ他の国際公開第９４／２９３５１号明細書に記載される。
【００９１】
さらに別の実施形態においては、Ｆｃ領域が、抗体依存的な細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介する抗体の能力を向上させる、及び／又は以下の位置において１個以上のアミノ酸の変異によってＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を向上させるように変異される：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９。この手段は、Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号明細書に記載される。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対する結合部位が位置づけられ改善した結合を持つ変異体について記載される（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．他、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４及び３３９での特異変異は、ＦｃγＲＩＩＩとの結合を改善させることを示す。さらに、これらの組み合わせ（Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ，Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ，Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ）の変異がＦｃγＲＩＩＩ結合を改善させることが示す。
【００９２】
さらに別の実施形態において、抗体の糖鎖形成が変異（欠如）する。例えば、糖鎖形成のない抗体が生成される。糖鎖形成は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を向上させるために変化する。糖質の変異は、例えば、抗体配列内の１個以上の糖鎖形成の部位を変えることによって達成する。例えば、１個以上のアミノ酸は、部位における成を除去することによって、１個以上の可変領域フレームワークの糖鎖形成部位の除去をもたらすように置換される。このような脱糖鎖形成は、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。そのような手段は、Ｃｏ他の米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び米国特許第６，３５０，８６１号明細書に記載される。
【００９３】
また、抗体は、フコシル残基の量が減少したハイポフコシル化抗体又は交差したＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの糖鎖形成の変化したタイプを有するように生成される。このように変化した糖鎖形成パターンには、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが示される。そのような糖質の変異は、例えば、糖鎖形成の機構を変化させた宿主細胞中で抗体を発現させることによって行われる。糖鎖形成の機構が改変した細胞は、従来的に記載されており、糖鎖形成が改変した抗体を産生することによって、本発明の組み換え抗体を発現する宿主細胞として使われる。例えば、Ｈａｎａｉ他の欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、ハイポフコシル化を示す細胞株中に発現したフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞株について記載する。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号明細書は、Ａｓｎ（２９７）に結合した糖質にフコースが結合する能力を減少させた変異体ＣＨＯ細胞株であるが、Ｌｅｅ１３細胞もまた、宿主細胞中で発現された抗体のハイポフコシル化をもたらすことが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照）。Ｕｍａｎａ他の国際公開第９９／５４３４２号明細書には、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすＧｌｃＮａｃ構造の二分の増加を示す改変した細胞株において抗体を発現させるように、糖タンパク質−変異グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するために改変された細胞株が記載されている（Ｕｍａｎａ他（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照）。
【００９４】
本発明によって検討される抗体の別の変異は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的な（例えば、血清）半減期を増加させるためにペグ化する。一般的に、抗体をペグ化するため、抗体又はその断片は、１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体又は抗体断片に結合する条件下で、ＰＥＧの反応性のあるエステル又はアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性のＰＥＧ分子（又は類似の反応性な水可溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われる。本願明細書で使われる、“ポリエチレングリコール”という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミド、又はアリロキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導化するために使われるＰＥＧのいずれの形も含むことが意図される。ある実施形態において、ペグ化される抗体は、糖鎖形成のない抗体である。タンパク質をペグ化する方法は従来公知であり、本発明の抗体にも適用される（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ他の欧州特許第０，１５４，３１６号明細書、及びＩｓｈｉｋａｗａ他の欧州特許第０，４０１，３８４号明細書を参照）。
【００９５】
［安定性が向上した変異抗体］
別の実施態様において、本発明は、野生型の１３Ｈ５と比べて向上した安定性を示す、１３Ｈ５抗体の変異型を供給する。実施例１０において詳細に記載されるように、１３Ｈ５抗体は、ＶＨ鎖のＣＤＲ２内のＡｓｎ−５５に脱アミド部位を含む。この部位、位置５５〜５８のアミノ酸配列は、ＮＧＮＴである（配列番号１９のアミノ酸残基５５〜５８）。従って、ある実施形態において、１３Ｈ５のＶＨ鎖のアミノ酸配列は、位置５５においてアスパラギンから異なるアミノ酸に変異される。位置５５での好ましいアミノ酸置換は、アスパラギン酸及びグルタミンを含み、グルタミンがより好ましい。Ｎ５５Ｄ置換を持つ１３Ｈ５のアミノ酸配列は、配列番号３４に示される。Ｎ５５Ｑ置換を持つ１３Ｈ５のアミノ酸配列は、配列番号３５に示される。別の実施形態において、Ａｓｎ−５５の変異と共に１３Ｈ５のＶＨ鎖のＡｓｎ−５７も変異する。位置５７での好ましいアミノ酸置換はグルタミンである。Ｎ５５Ｑ及びＮ５７Ｑ置換を持つ１３Ｈ５のアミノ酸配列は、配列番号３６に示される。これら３つの変異した抗体は、実施例１１において記載されるように、野生型の１３Ｈ５と比較して、強制的な脱アミド化条件下において、安定性の向上が示される。
【００９６】
別の実施形態において、アミノ酸位置５６のグリシンは、アラニンに変異され（Ｇ５６Ａ）、脱アミド化の速度が、アラニンに隣接したグリシンよりアラニンが約２０倍遅いということがモデルペプチドから測定される（Ａｈｅｒｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．，ｅｄｓ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，１章，１−３０ページを参照）。従って、Ｇ５６Ａ変異は、反応性の減少と野生型配列からの構造変化との間のバランスを示すので、活性を調節する間に安定性を向上させる。Ｇ５６Ａ置換を持つ１３Ｈ５のアミノ酸配列は、配列番号３７に示される。
【００９７】
従って、様々な実施形態において、本発明は、配列番号１９に示された野生型の配列の１３Ｈ５ＶＨ鎖のＣＤＲ２におけるＡｓｎ−５５、Ｇｌｙ−５６及び／又はＡｓｎ−５７におけるアミノ酸置換を有するＩＦＮα抗体を提供する。好ましい変異抗体は、配列番号３４、３５、３６及び３７からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。好ましくは、抗体のＶＨ鎖は、配列番号２２に示される１３Ｈ５のＶＫ鎖とペアさせる。
【００９８】
［抗体を改変する方法］
上記に記載されるように、本願明細書に公開されたＶＨ配列及びＶＬ配列を有する抗ＩＦＮα抗体は、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、又はそれに結合した定常領域を変異させることによって、新しい抗ＩＦＮα抗体を生成するために使われる。従って、本発明の別の実施態様において、本発明の抗ＩＦＮα抗体、例えば、１３Ｈ５、１３Ｈ７、又は７Ｈ９の構造上の特徴は、ＩＦＮαに結合する本発明の抗体の少なくとも１個の機能特性を保持する構造上関連した抗ＩＦＮα抗体を生成するために使われる。例えば、１３Ｈ５、１３Ｈ７又は７Ｈ９の１個以上のＣＤＲ領域、又はその変異体は、上記に記載されるように、付加的又は組み換え的に改変した本発明の抗ＩＦＮα抗体を生成するために、既知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み換え的に結合する。他のタイプの変異は上記に記載される変異を含む。改変方法に必要な出発材料は、本願明細書で提供されたＶＨ配列及び／又はＶＬ配列の１個以上、又はその１個以上のＣＤＲ領域である。改変された抗体を生成するために、本願明細書で提供されたＶＨ配列及び／又はＶＬ配列の１個以上、又はその１個以上のＣＤＲ領域を有する抗体を調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報は、元の配列に由来する“第２世代の”配列を生成するために出発材料として使われ、“第２世代の”配列が調製され、タンパク質として発現させる。
【００９９】
従って、別に実施形態において、本発明は、
（ａ）
（ｉ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなるグループから選択されるＣＤＲ１のアミノ酸配列、及び／又は配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなるグループから選択されるＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び／又は配列番号７、８、及び９からなるグループから選択されるＣＤＲ３のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなるグループから選択されるＣＤＲ１のアミノ酸配列、及び／又は配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなるグループから選択されるＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び／又は配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなるグループから選択されるＣＤＲ３のアミノ酸配列と、を含む重鎖可変領域の抗体配列を提供し、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列及び／又は軽鎖可変領域抗体配列の少なくとも１個のアミノ酸残基を少なくとも１個の変化した抗体配列を生成するために変えることと、
（ｃ）変化した抗体配列をタンパク質として発現させること、とを含む抗ＩＦＮα抗体の調製方法を提供する。
【０１００】
標準的な分子生物学的な技術は、変化した抗体配列を調製し、及び発現させるために使われる。
【０１０１】
好ましくは、変化した抗体配列によってコードした抗体は、
（ｉ）インターフェロンαの生物活性を阻害することと、
（ｉｉ）複数のＩＦＮαサブタイプの生物活性を阻害するが、ＩＦＮα２１の生物活性を実質的に阻害しないことと、
（ｉｉｉ）ＩＦＮβ又はＩＦＮωの生物活性を実質的に阻害しないことと、
（ｉｖ）末梢血単核細胞におけるＣＤ３８又はＭＨＣクラスＩのＩＦＮによって誘導される発現を阻害することと、
（ｖ）末梢血単核細胞による、ＩＰ−１０のＩＦＮによって誘導される発現を阻害することと、
（ｖｉ）全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）血漿が仲介する、樹状細胞の成長を阻害することと、
（ｖｉｉ）ヒトインターフェロンα２ａと高い親和性で結合することと、
（ｖｉｉｉ）ヒトインターフェロンα２ｂと高い親和性で結合することと、を含むが、これらに限定されず、本願明細書に記載される、抗ＩＦＮα抗体の１個、いくつか、又は全ての機能特性を保持する。
【０１０２】
変化した抗体の機能特性は、従来利用される検定、及び／又は本願明細書に記載される標準的な検定を用いて評価する。例えば、ＩＦＮαに結合するための抗体の能力は、実施例に記載されるような標準的な結合検定（例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＢｉａｃｏｒｅ）を用いて決定する。インターフェロンαの様々な機能活性を阻害する抗体の能力は、実施例に記載される検定（例えば、Ｄａｕｄｉ細胞増殖、ＩＦＮよって誘導される細胞マーカーの発現、ＩＦＮによって誘導されるＩＰ−１０の発現など）によって決定される。
【０１０３】
本発明の改変した抗体の方法のある実施例において、変異は、抗ＩＦＮα抗体（例えば、１３Ｈ５）をコードする配列の全体又は部分の間に、ランダムに又は選択的に導入して得られた抗ＩＦＮαの変異抗体は、本願明細書に記載される結合活性及び／又は他の機能特性によって選別される。変異の方法は従来的に記載される。例えば、Ｓｈｏｒｔによる国際公開第０２／０９２７８０号明細書は、サチュレーション突然変異誘発、合成的なライゲーション結合、又はその組み合わせを用いて、変異抗体を生成及び選別する方法を記載する。また、Ｌａｚｅｒ他の国際公開第０３／０７４６７９号明細書は、抗体の生理化学的な特性を最適化するコンピュータースクリーニング法の使用の方法を記載する。
【０１０４】
［本発明の抗体をコードする核酸分子］
本発明の別の実施態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞全体又は細胞溶解物中に部分的に精製した形又は実質的に純粋な形で存在する。核酸が、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ帯分画、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び他の従来公知の方法によって、核酸が、他の細胞成分、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から精製される場合、“単離される”又は“実質的に純粋にされる”。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ及びイントロン配列を含む又は含まない。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１０５】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の手法を用いて得られる。ハイブリドーマ（例えば、以下に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有する形質転換マウスから調製したハイブリドーマ）によって発現された抗体について、ハイブリドーマによって生成した抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅手法又はｃＤＮＡクローニング手法によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体（例えば、ファージディスプレイ手法を用いて）について、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収される。
【０１０６】
本発明の好ましい核酸分子は、１３Ｈ５、１３Ｈ７、又は７Ｈ９モノクローナル抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするものである。１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９のＶＨ配列をコードしたＤＮＡ配列は、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に示される。１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９のＶＬ配列をコードしたＤＮＡ配列は、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０に示される。
【０１０７】
ＶＨ部分及びＶＬ部分をコードするＤＮＡ断片を得ると、ＤＮＡ断片は、例えば、可変領域の遺伝子を抗体鎖全長の遺伝子、Ｆａｂ断片の遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子と変換するように標準的な組み換えＤＮＡ手法によって改変する。これらの改変において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片へと改変可能となるように結合される。本願明細書で使われる“改変可能となるように結合される”という用語は、２個のＤＮＡによってコードしたアミノ酸配列をつなげた２個のＤＮＡ断片が、フレームに分けたままで保持されることを意味することが意図される。
【０１０８】
ＶＨ領域をコードする単離したＤＮＡは、ＶＨ領域をコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと改変可能となるように結合することによって、重鎖遺伝子全長へと変換する。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は従来公知であり、（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｌ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３。ＩｇＧ４、ＩｇＧＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域である。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子について、ＶＨ領域をコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に改変可能となるように結合する。
【０１０９】
ＶＬ領域をコードする単離したＤＮＡは、ＶＬ領域をコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＫをコードする別のＤＮＡ分子に改変可能な結合を行うことによって、軽鎖遺伝子全長（と同様にＦａｂ軽鎖遺伝子）へと変換する。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は従来公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照。）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。軽鎖定常領域はκ又はラムダ定常領域であり、好ましくはκ定常領域である。
【０１１０】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、ＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子断片は、例えば、柔軟なリンカーによってつながれたＶＨ領域及びＶＬ領域を持つ、隣接する単一鎖のタンパク質として発現するＶＨ配列及びＶＬ配列などのアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする柔軟なリンカーをコードする別の断片に改変可能な結合を行う（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照）。
【０１１１】
［本発明のモノクローナル抗体の産生］
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション手法などの、従来型のモノクローナル抗体方法論を含む、様々な方法によって産生される。体細胞ハイブリダイゼーション手法が好ましく、原則として、モノクローナル抗体を産生する他の手法、例えば、ウィルス又はＢリンパ球のガン化などが行われる。
【０１１２】
ハイブリドーマを調製する好ましい動物系は、ネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常に良く確立された手法である。融合のために免疫化された脾細胞の単離する免疫化手順及び手法は従来公知である。融合のパートナー（例えば、ネズミの骨髄腫細胞）及び融合の手法も公知である。
【０１１３】
本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上記に記載されるように調製したネズミのモノクローナル抗体の配列に基づいて調製される。重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンをコードする遺伝子は、ネズミハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学の手法を用いて非ネズミ（例えば、ヒト）の免疫グロブリン配列を含むように改変する。例えば、キメラ抗体を生成するために、ネズミの可変領域が、従来公知の方法を用いてヒトの定常領域に結合する（例えば、Ｃａｂｉｌｌｖ他の米国特許第４，８１６，５６７を参照）。ヒト化した抗体を生成するために、ネズミのＣＤＲ領域が、従来公知の方法を用いてヒトのフレームワークへと挿入される（Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９、及びＱｕｅｅｎ他の米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書及び米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１１４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなＩＦＮαに向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウスの系よりもむしろヒトの免疫系を持つ形質転換マウス又は染色体導入マウスを用いて生成する。これらの形質転換及び染色体導入マウスは、それぞれ本願明細書においてＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと言及されたマウスを含み、本願明細書において集合的に“ヒトＩｇマウス”と言及される。
【０１１５】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標、Ｍｅｄａｒｅｘ社）は、位置が改変していないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン小遺伝子座と共に、内因性のμ及びκ鎖部位を不活性化する標的変異を含む（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ他（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照）。従って、マウスは、ＩｇＭ又はκの発現の減少を示し、免疫化に対する応答においては、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子が、クラススイッチ、及び高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成させる体細胞変異を受ける（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．他（１９９４）、上述；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、及びＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６に概説される）。ＨｕＭＡｂマウスの調製と使用、及びそのようなマウスによって運ばれたゲノムの変異は、さらに、「Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．他、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．他、（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ他、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ他、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．他、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ他、（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．他、（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；及びＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．他、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１」に記載され、内容の全ては、具体的にその全体を参照して本願明細書に添付する。さらに、ＬｏｎｇｂｅｒｇとＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；及び米国特許第５，７７０，４２９号明細書、Ｓｕｒａｎｉの米国特許第５，５４５，８０７号明細書、ＬｏｎｂｅｒｇとＫａｙの国際公開第９２／０３９１８号明細書，国際公開第９３／１２２２７号明細書号明細書，国際公開第９４／２５５８５号明細書，国際公開第９７／１３８５２号明細書，国際公開第９８／２４８８４号明細書及び国際公開第９９／４５９６２号明細書、及びＫｏｒｍａｎ他の国際公開第０１／１４４２４号明細書も参照される。
【０１１６】
別の実施形態において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を持つマウスなどの導入遺伝子及び導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を持つマウスを用いて生成される。そのようなマウスは、本願明細書において“ＫＭマウス”と言及され、Ｉｓｈｉｄａ他の国際公開第０２／４３４７８号明細書に詳細に記載される。
【０１１７】
またさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の形質転換動物の系を従来的に利用することができ、本発明の抗ＩＦＮα抗体を生成するために使われる。例えば、ゼノマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ社）と言及される別の形質転換の系が使われる。そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉの米国特許第５，９３９，５９８号明細書、米国特許第６，０７５，１８１号明細書、米国特許第６，１１４，５９８号明細書、米国特許第６，１５０，５８４号明細書及び米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載される。
【０１１８】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の染色体導入動物系を利用することができ、本発明の抗ＩＦＮα抗体を生成するために使用する。例えば、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体の両方を持つ、“ＴＣマウス”と称するマウスが使われる。そのようなマウスは、「Ｔｏｍｉｚｕｋａ他、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７」に記載される。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖導入染色体を持つウシが、技術的に記載され（Ｋｕｒｏｉｗａ他、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本発明の抗ＩＦＮα抗体をもたらすために使われる。
【０１１９】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のスクリーニングライブラリーのファージディスプレイ法を用いて調製する。そのようなヒト抗体を単離するファージディスプレイ法は従来的に確立される。（Ｌａｄｎｅｒ他の米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；及び米国特許第５，５７１，６９８号明細書、Ｄｏｗｅｒ他の米国特許第５，４２７，９０８号明細書及び米国特許第５，５８０，７１７号明細書、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他の米国特許第５，９６９，１０８号明細書及び米国特許第６，１７２，１９７号明細書、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他の米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書及び６，５９３，０８１号明細書を参照。）
【０１２０】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体の応答が免疫化において生成し、ヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを用いて調製される。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ他の米国特許第５，４７６，９９６号明細書及び米国特許５，６９８，７６７号明細書に記載される。
【０１２１】
［ヒトＩｇマウスの免疫化］
ヒトＩｇマウスが本発明のヒト抗体を産生するために使われる場合、「Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．他、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．他、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；及び国際公開第９８／２４８８４号明細書及び国際公開第０１／１４４２４号明細書」に記載されるように、ＩＦＮα抗原の精製された又は組み換えの調製においてそのようなマウスを免疫化する。好ましくは、マウスは最初の注入は６〜１６週齢に行われる。例えば、複数のＩＦＮαサブタイプを含む（しかしＩＦＮωは含まない）ＩＦＮα調製物を産生するリンパ芽球状細胞株をウィルスで処理して調製されるリンパ芽球状のＩＦＮが精製される調製物（２５〜１００μｇ）は、ヒトＩｇマウスを腹腔内に免疫化するために使われる。また、ＩＦＮαサブタイプの組み換え体の混合物が、免疫原として使われる。
【０１２２】
ＩＦＮαに対するヒトモノクローナル抗体の完全に生成する詳細な方法は、以下の実施例１に記載される。様々な抗原による累積経験において、まず完全なフロイントの補助剤中の抗原によって腹腔内で（ＩＰ）免疫化され、不完全な免疫増強剤中の抗原で隔週にＩＰ免疫化した（全部で６回以下）場合、形質転換マウスが応答するということを示した。しかしながら、フロイントのもの以外の補助剤もまた効果的であることが分かった。さらに、補助剤のない細胞全体は、大いに免疫原性であることが分かった。免疫応答は、眼球後出血によって得られる血漿サンプルを用いて免疫化手順の経過の間モニターされる。血漿は、以下に記載のＥＬＩＳＡによって選別され、抗ＩＦＮαヒト免疫グロブリンの十分な滴定濃度を有するマウスが融合のために使われる。マウスは、犠牲となって脾臓が除去される３日前に抗原で静脈中に追加免疫される。免疫化するために２から３回の融合に必要であると予想される。６匹と２４匹の間のマウスが、一般的に抗原に対して免疫化される。ＨｕＭＡｂマウスのために、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２種の両方が使われる。さらに、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２導入遺伝子の両方が、２個の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一のマウス中で繁殖される（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）。または、ＫＭマウス種が、実施例２に記載されるように使われる。
【０１２３】
［本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成］
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫化したマウスに由来する脾細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株と融合する。結果として生じたハイブリドーマは、抗原特異抗体の産生について選別する。例えば、免疫化したマウスに由来する脾リンパ球の単一細胞懸濁液を５０％ＰＥＧ中で６分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）と融合する。平底のマイクロタイタープレートに約２×１０５で細胞を配置し、続いて２０％のＦｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ血清、１８％の“６５３”調製した培地、５％のオリゲン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び１Ｘ  ＨＡＴ（シグマ、ＨＡＴは融合の２４時間後に加えられる）を含む選択培地中で２週間インキュベーションする。約２週間の後、細胞は、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地中で培養する。個々のウェルは、ヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。培地において、大量のハイブリドーマの成長が通常１０〜１４日後に観察される。ハイブリドーマが分泌する抗体は、再びプレート及びスクリーニングされる。ヒトＩｇＧについて陽性である場合、モノクローナル抗体は、限界希釈法によって２回以上サブクローニングする。安定なサブクローンはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、特徴付けのために組織培養培地中で少量の抗体を生成する。
【０１２４】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、モノクローナル抗体を生成する２リットルのスピナー培養瓶中で選択したハイブリドーマを生育する。プロテインＡ−セファロース（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いたアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し濃縮する。純度を確認するために、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによって、溶出したＩｇＧを検査する。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、１．４３の減衰係数を用いてＯＤ２８０によって濃度を測定する。そのモノクローナル抗体を分注し、−８０℃で保存する。
【０１２５】
［本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成］
また、本発明の抗体は、例えば、従来公知の組み換えＤＮＡ手法及び遺伝子形質移入法の組み合わせを用いて、宿主細胞のトランスフェクトーマ中に産生される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。
【０１２６】
例えば、抗体又はその抗体断片を発現させるように、軽鎖及び重鎖の部分又は全長をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学の手法（例えば、当該の抗体を発現するハイブリドーマを用いたＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）によって得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写の及び翻訳の調節配列に改変可能となる結合によって発現ベクターに挿入される。本願明細書において“改変可能となる結合”という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写の及び翻訳の調節配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御する機能を与えるベクターに連結されることが意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使われる発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入され、一般的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法によって発現ベクターに挿入される（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的な制限酵素認識部位における連結、制限酵素認識部位が存在しない場合は平滑末端連結する）。本願明細書に記載される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域は、ＶＨ部分がベクター内でＣＨ部分に改変可能となるように結合され、及びＶＬ部分がベクター内でＣＬ部分に改変可能となるように結合される望ましいアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターへと、軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子を挿入することによって、いずれの抗体のアイソタイプの全長抗体遺伝子を生成するために使われる。また、組み換え発現ベクターは、宿主細胞に由来する抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチドである（すなわち、免疫グロブリンタンパク質でないものに由来するシグナルペプチド）。
【０１２７】
抗体鎖遺伝子にさらに、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を持つ。“調節配列”という用語は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌの（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））」に記載される。調節配列の選択を含めた発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの要素に依存することは、当業者にとって良く理解されよう。哺乳類宿主細胞発現のために好ましい調節配列は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Ｓｉｍｉａｎウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス（例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどの哺乳類の細胞内で高いレベルのタンパク質発現を導くウィルスの成分を含む。また、ユビキチンプロモーター又はβ−グロブリンプロモーターなどの非ウィルスの調節配列が使われる。さらに、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウィルスタイプ１の長い末端繰り返しに由来する配列を含むＳＲαプロモーター系などの異なるソースに由来する配列からなる（Ｔａｋａｂｅ，Ｙ。他、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【０１２８】
抗体鎖遺伝子及び調節配列にさらに、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製の起点）及び選択可能なマーカー遺伝子などの付加的な配列を有する。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ他の米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書及び米国特許第５，１７９，０１７号明細書、を参照）。例えば、一般的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセートを使ってｄｈｆｒ−宿主細胞中における選択／増幅させるために使用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のするために使用）を含む。
【０１２９】
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターが標準技術によって宿主細胞へと形質移入される。“形質移入”という用語の様々な形は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入など、原核又は真核の宿主細胞へ外来のＤＮＡの導入するために一般に使われる幅広く多様な手法を含むことが意図される。本発明の抗体を原核または真核の宿主細胞のどちらかで発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における抗体は、原核細胞より発現され、適切に混合した免疫学的に活性な抗体を結合し及び分泌する。抗体遺伝子における原核細胞での発現は、活性な抗体の高収量な産生のためには効果的でないことが報告される（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．とＷｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０１３０】
本発明の組み換え抗体を発現する好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎとＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるＤＨＦＲ選択可能なマーカーとともに使われ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載され、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用する別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号明細書，国際公開第８９／０１０３６号明細書及び欧州特許第３３８，８４１号明細書に公開されたＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞へと導入される場合、抗体は、宿主細胞中で抗体の発現をさせるのに十分な、好ましくは、宿主細胞が生育される培地に抗体を分泌させるのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収される。
【０１３１】
［抗原に結合する抗体の特徴付け］
本発明の抗体は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅ分析によって、ＩＦＮαとの結合を検査する。ＥＬＩＳＡについて簡潔に説明すれば、マイクロタイタープレートは、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌのＩＦＮα（例えば、異なるＩＦＮαサブタイプの組み換え体、又は白血球又はリンパ芽球状のＩＦＮ）で被覆し、その後ＰＢＳ中５％のウシ血清アルブミンでブロックする。抗体（例えば、ＩＦＮαで免疫化したマウスに由来する血漿）の希釈液を各のウェルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートする。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄され、その後アルカリホスファターゼと結合された二次的な試薬（例えば、ヒト抗体については、ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃ特異的ポリクローナル試薬）とともにプレートを３７℃で１時間インキュベートする。洗浄の後、プレートはｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で現像し、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最も高い滴定濃度を呈するマウスが融合のために使われる。
【０１３２】
上記に記載したようなＥＬＩＳＡ検定はまた、ＩＦＮα免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマを選別するために使われる。ＩＦＮαと高い親和力で結合するハイブリドーマは、サブクローニングされ、特徴付けされる。元の細胞の反応性（ＥＬＩＳＡによる）を保持するそれぞれのハイブリドーマに由来するクローンは、−１４０℃で５−１０のバイアル細胞バンクを保存され、抗体精製用に選択される。
【０１３３】
抗ＩＦＮα抗体を精製するために、選択されるハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製するのに２リットルのスピナー培養瓶中で生育する。プロテインＡ−セファロース（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）でのアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過及び濃縮する。溶出したＩｇＧは、純度を確認するためにゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによって検査する。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、１．４３の減衰係数でＯＤ２８０によって濃度を決定する。モノクローナル抗体を分注し、−８０℃で保存する。
【０１３４】
選択される抗ＩＦＮα抗体はユニークなエピトープに結合するかを決定するため、抗体は、市販の試薬（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）を用いてビオチン化される。ラベルされていないモノクローナル抗体とビオチン化したモノクローナル抗体を用いた競合実験が、上記に記載されるようなＩＦＮαで被覆したＥＬＩＳＡプレートを用いて行われる。ビオチン化したｍＡｂの結合が、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼのプローブで検出される。
【０１３５】
精製した抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプのＥＬＩＳＡが、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて行われる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、４℃で１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで一晩被覆する。１％のＢＳＡでブロックした後、そのプレートと、１μｇ／ｍｌ以下の検査モノクローナル抗体又は精製したアイソタイプコントロールを室温で１〜２時間反応させる。ヒトＩｇＧ１、又はヒトＩｇＭに特異的なアルカリホスファターゼを結合させたプローブのどちらかとウェルを反応させる。プレートは、上記に記載されるように現像され、分析される。
【０１３６】
さらに、抗ＩＦＮαヒトＩｇＧは、ウェスタンブロッティングによってＩＦＮα抗原との反応性を検査する。簡潔に説明すれば、ＩＦＮαを発現する細胞に由来する細胞抽出物が調製され、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動が行われる。電気泳動の後、分離された抗原はニトロセルロース膜に移され、１０％ウシ胎仔血清でブロックされ、検査するモノクローナル抗体で精査される。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出され、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（シグマケム社、セントルイス、ミズーリ州）で現像する。
【０１３７】
［免疫複合体］
別の実施態様において、本発明は、細胞毒素、薬剤（例えば、免疫抑制剤）又は放射性毒物などの治療上の部分と結合した抗ＩＦＮα抗体又はその断片を特徴とする。そのような結合は本願明細書において“免疫複合体”として言及される。１個以上の細胞毒素を含む免疫複合体は“抗毒素”として言及される。細胞毒素又は細胞毒性因子は、細胞にとって有害な（例えば、殺す）因子を含み、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビジン、ダウノルビジン、ジヒドロキシアントラシン−ジオン、マイトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロ検査ステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、及びそのアナログ又は同族体を含む。また、治療薬は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化薬剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビジン（以前は、ダウノマイシン）及びドクソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂性薬剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含む。
【０１３８】
本発明の抗体と結合する、治療上の細胞毒素の他の好ましい例は、デュオカルマイシン、カリチェアミシン、マイタンシン及びオーリスタチン、及びその類縁体を含む。カリチェアミシン抗体の結合の例は、市販される（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ウイエス−アイエルスト）。
【０１３９】
細胞毒素は、技術的に利用可能なリンカー手法を用いて、本発明の抗体と結合される。抗体と細胞毒素との結合に使われるリンカーのタイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びペプチドを含むリンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソーム区画内で低いｐＨによって切断されやすい、又はカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などのガン組織中に優先的に発現するプロテアーゼによって切断されやすいものを選択する。
【０１４０】
細胞毒素、リンカー、及び抗体と治療薬を結合させるための方法のタイプのさらなる検討は、「Ｓａｉｔｏ，Ｇ．他、（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５；Ｔｒａｉｌ，Ｐ．Ａ．他、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．とＫｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｔ  Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．とＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４」が参照される。
【０１４１】
また、本発明の抗体は、放射性免疫複合体として言及される、細胞毒性な放射性医薬を産み出すために、放射性同位体と結合する。診断上の又は治療上の使用のために、抗体と結合する放射性同位体の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０及びルテニウム１７７を含むが、これらに限定されない。放射性免疫複合体を調製するための方法は従来的に確立されている。放射性免疫複合体の例は市販されており、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標、ＩＤＥＣファーマシューティカルズ）及びＢｅｘｘａｒ（登録商標、コリクサ  ファーマシューティカルズ）を含む。類似の方法が、本発明の抗体を用いた放射性免疫複合体を調製するために使われる。
【０１４２】
本発明の抗体複合体は、与えられた生物学的応答を変異するために使用され、薬剤部分は古典的な化学的治療薬に限定して解釈されない。例えば、薬剤部分は、望ましい生物活性を持つタンパク質又はポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の外毒素、ジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素、又は酵素的に活性な断片、腫瘍壊死因子腫瘍又はインターフェロン−γなどのタンパク質、又はリンフォカイン、インターロイキン−１（“ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（“ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（“ＩＬ−６”）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（“ＧＭ−ＣＳＦ”）、顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）、又は他の成長因子などの生物学的応答変異体などを含んでもよい。
【０１４３】
抗体に、そのような治療的な部分を結合させるための手法は、よく知られており、例えば、「Ａｒｎｏｎ他、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他、編，ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ他、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、編，ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社，１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ他、編，ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ他、編，ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），及びＴｈｏｒｐｅ他、“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）」が参照される。
【０１４４】
［二重特異性分子］
別の実施態様において、本発明は、本発明の抗ＩＦＮα抗体又はその断片からなる二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、別の機能分子、例えば、少なくとも２個の異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成させる別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に誘導化又は結合される。本発明の抗体は、実際に、２個以上の異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異性分子もまた、本願明細書で使われる“二重特異性分子”という用語に同義であることが意図され、この分子を生成させる１個以上の他の機能分子に誘導化又は結合される。本発明の二重特異性分子を生成するために、本発明の抗体は、（例えば、化学的な結合、遺伝子の融合、非共有的な結合又はその他の方法よって）別の抗体、別の断片、ペプチド、又は二重特異性分子をもたらす結合模倣体などの１個以上の他の結合分子に機能結合する。
【０１４５】
従って、本発明は、少なくとも１個のＩＦＮαに対する第１の結合特異性及び第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本発明の特定の実施形態において、第２の標的エピトープは、例えば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）などのＦｃ受容体である。それゆえ、本発明は、エフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、又は多核白血球（ＰＭＮｓ））が発現するＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲ、及びＩＦＮαを発現する標的細胞の両方に対して結合する能力を持つ二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、ＩＦＮαを発現する細胞からエフェクター細胞までを標的とし、ＩＦＮαを発現する細胞の食細胞活動、抗体依存的な細胞を仲介した細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカインの放出、又はスーパーオキシド・アニオンの生成などの、Ｆｃ受容体が仲介するエフェクター細胞の活動を引き起こす。
【０１４６】
二重特異性分子が多重特異性である、本発明の実施形態において、その分子は抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＩＦＮα結合特異性にさらに、第三の結合特異性をさらに含む。一実施形態において、第三の結合特異性は、例えば、細胞毒性活性に関係する表面タンパク質に結合することによって標的細胞に対する免疫応答が増加する分子である強化因子（ＥＦ）部分に対抗するものである。“抗強化因子部分”は抗体、機能的な抗体断片、又は例えば抗原又は受容体などの与えられた分子に結合するリガンドであり、これによって、Ｆｃ受容体又は標的細胞抗原に対する結合決定基の効果の強化をもたらす。“抗強化因子部分”は、Ｆｃ受容体又は標的細胞抗原に結合する。また、抗強化因子部分は、第１及び第２の結合特異性をもつものが結合する存在物とは異なる存在物に結合する。例えば、抗強化因子部分は、（例えば、標的細胞に対して増加した免疫応答をもたらす、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１又は他の免疫細胞などを介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合する。
【０１４７】
一実施形態において、本発明の二重特異性分子は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖなどを含む、少なくとも１個の抗体又はその抗体断片を、結合特異性を持つものとして含む。また、抗体は、軽鎖又は重鎖の二量体、又は、その内容が参考のために明白に示されるＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されるＦｖ又は単鎖構成物などの最小の断片である。
【０１４８】
一実施形態において、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によって結合がブロックされないモノクローナル抗体によって与えられる。本願明細書で使われる“ＩｇＧ受容体”とは、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかについて言及する。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）へとグループ分けされる、全部で１２の膜貫通又は可溶性受容体アイソフォームをコードする。１個の好ましい実施形態において、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは、単量体のＩｇＧに対して高い親和性（１０８−１０９Ｍ−１）を示す、７２ｋＤａの分子である。
【０１４９】
ある好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の産生及び特徴付けは、その教示は本願明細書に完全に参考のために示され、Ｆａｎｇｅｒ他の国際公開第８８／０００５２号明細書及び米国特許第４，９５４，６１７号明細書に記載される。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位とは別の部位で、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合し、生理学的なレベルのＩｇＧによって実質的にブロックされない。本発明において有用で特異的な抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２及びｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、米国培養細胞系統保存機関、ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の実施形態において、抗Ｆｃγ受容体抗体は、モノクローナル抗体２２のヒト化型（Ｈ２２）である。Ｈ２２抗体の産生及び特徴付けは、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｎａｍｕｆｚｏｌ  １５５（１０）：４９９６−５００２及び国際公開第９４／１０３３２に記載される。Ｈ２２抗体を産生する細胞株は、ＨＡ０２２ＣＬ１と命名され、米国培養細胞系統保存機関に保管され、受入番号はＣＲＬ１１１７７である。
【０１５０】
さらに他の好ましい実施形態において、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、例えば、ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によって好ましくはブロックされない、Ｆｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））などのヒトＩｇＡ受容体に結合する抗体によって与えられる。“ＩｇＡ受容体”という用語は、染色体１９に位置するα−遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むことが意図される。この遺伝子は、５５から１１０ｋＤａの択一的にスプライシングされる膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、エオシン好性及び好中球の顆粒球において恒常的に発現され、非エフェクター細胞集団においては発現されない。ＦｃαＲＩは、Ｇ−ＳＣＦ又はＧＭ−ＳＣＦなどのサイトカインに曝された状況下で増加するＩｇＡ１及びＩｇＡ２両方に対して、中程度の親和性（≒５×１０７Ｍ−１）を有する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．他、（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓｉｒａ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０）。ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側のＦｃαＲＩに結合するＡ３、Ａ５９、Ａ６２及びＡ７７として同定される４つのＦｃαＲＩ特異的なモノクローナル抗体は（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．他、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４）。に記載される
【０１５１】
ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲＩは、（１）例えば、単球、ＰＭＮ、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫のエフェクター細胞において主に発現し、（２）高レベルに発現し（例えば、細胞あたり５，０００−１００，０００）、（３）細胞毒性活性の仲介者であり（例えば、ＡＤＣＣ、食細胞活動）、（４）標的とされる抗原、抗原自身も含む、増加した抗原の提示を仲介するなどの理由から、本発明の二重特異性分子において使用する好ましいトリガー受容体である。
【０１５２】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異性分子に用いられる他の抗体は、ネズミモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及びヒト化モノクローナル抗体である。
【０１５３】
本発明の二重特異性分子は、従来公知の方法を用いて、例えば、抗ＦｃＲ及び抗ＩＦＮ結合特異体などの恒常的な結合特異体と結合させることによって調製される。例えば、二重特異性分子の各結合特異体は、別々に生成され、互いに結合される。結合特異体がタンパク質又はペプチドである場合、様々な結合又は架橋剤が共有結合のために使われる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオ酢酸（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、及びスルフォスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ他、（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ他、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照）。他の方法は、「Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ他、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３，及びＧｌｅｎｎｉｅ他、（１９８７）Ｊ．ｌｉｎｍｕｎｏｌ  １３９：２３６７−２３７５」に記載のものを含む。好ましい結合試薬はＳＡＴＡ及びｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣであり、ピアースケミカル社（ロックフォード、イリノイ州）より入手可能である。
【０１５４】
結合特異体が抗体である場合、それらは、２個の重鎖のＣ−末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合される。特に好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、結合の前に奇数個、好ましくは１個のスルフヒドリル基を含むように変異される。
【０１５５】
また、両方の結合特異体が、同じ宿主細胞内で同じベクター内にコードされ、発現され、そして結合する。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ  ｘ  ｍＡｂ、ｍＡｂ  ｘ  Ｆａｂ、Ｆａｂ  ｘ  Ｆ（ａｂ’）２、又はリガンドｘＦａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１個の単鎖抗体と結合決定基、又は２個の結合決定基からなる単鎖二重特異性分子からなる単鎖の分子である。二重特異性分子は、少なくとも２個の単鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子の調製方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書、米国特許第５，４５５，０３０号明細書、米国特許第４，８８１，１７５号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，４７６，７８６号明細書、米国特許第５，０１３，６５３号明細書、米国特許第５，２５８，４９８号明細書及び米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載される。
【０１５６】
二重特異性分子の特異標的に対する結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定（例えば、生育阻害）、又はウェスタンブロット検定によって確認される。一般に、当該複合体に特異ラベル化された試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特定のタンパク質−抗体複合体の存在が検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は抗体−ＦｃＲ複合体を認識し、特異結合又は酵素結合した抗体又は抗体断片を用いて検出される。また、複合体は、様々な他の免疫検定を用いて検出する。例えば、抗体は、放射性ラベルされ、放射免疫測定（ＲＩＡ）に使われる（例えば、本願明細書に参考のために示す、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照）。放射性同位体は、γカウンター又はシンチレーションカウンターの使用などの方法によって、又はオートラジオグラフィーによって検出される。
【０１５７】
［医薬組成物］
別の実施態様において、本発明は、例えば、薬理学的に許容可能な担体とともに処方される本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分の１個又は組み合わせを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。そのような組成物は、（例えば、２個又はそれ以上の異なる）抗体又は免疫複合体又は本発明の二重特異性分子の１個又は組み合わせを含む。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する、又は相補的な活性を有する抗体（又は免疫複合体又は二重特異性体）の組み合わせを含む。
【０１５８】
また、本発明の医薬組成物は、併用療法において、すなわち他の薬剤を組み合わせて投与される。例えば、併用療法は、少なくとも１個の他の抗ＩＦＮα薬剤（例えば、免疫抑制剤）と組み合わせ、本発明の抗ＩＦＮα抗体を含む。
【０１５９】
本願明細書で使われる、“薬理学的に許容可能な担体”とは、いずれかの溶媒、分散媒体、被膜、抗細菌薬剤及び抗真菌薬剤、等張性及び吸収を遅らせる薬剤などの生理適合的なものを含む。好ましくは、担体は、（例えば、注射又は輸液による）静脈注射、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮からの投与に適切なものである。投与の経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体、又は二重特異性分子は、酸の作用及び化合物が不活性である他の自然条件から化合物を守る素材を被覆してもよい。
【０１６０】
また、本発明の医薬的化合物は、１個以上の薬理学的に許容可能な塩を含んでもよい。“薬理学的に許容可能な塩”とは、元の化合物の望ましい生物学活性を保持し、望ましくない毒物学的な効果を与えない塩について言及する（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．他、（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性な無機酸、脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族硫酸及び芳香族硫酸などの非毒性な有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性な有機アミンに由来するものを含む。
【０１６１】
また、本発明の医薬組成物は、薬理学的に許容可能な抗酸化剤を含んでもよい。薬理学的に許容可能な抗酸化剤の例は、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水可溶性な抗酸化剤と、（２）アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどのオイルに可溶な抗酸化剤と、（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート薬剤と、を含む。
【０１６２】
本発明の医薬組成物に用いてもよい。適切な水性担体及び非水性担体は、水、エタノール、多価アルコール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、オリーヴオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。適当な流動性は、例えば、レクチンなどの被膜素材の使用、分散の場合には必要な粒子の大きさの調節、及び界面活性剤の使用によって調節される。
【０１６３】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含んでもよい。微生物の予防は、上述の滅菌手法、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗細菌薬剤及び抗真菌薬剤を含むことによって保証されてもよい。また、砂糖、塩化ナトリウムなど組成物中へ等張剤を含むことも望ましい。さらに、吸収を遅らす注射可能な医薬剤形は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤の含んでもよい。
【０１６４】
薬理学的に許容可能な担体は、無菌の水性溶液又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液又は分散液の素早く調製する無菌粉末を含む。医薬活性物質用の培地及び薬剤の使用は従来公知である。いずれの従来型の培地又は薬剤も活性化合物と相性が悪い範囲を除外して、本発明の医薬組成物におけるその使用が検討される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込まれる。
【０１６５】
治療上の組成物は、一般的に、製造及び保存の条件下では無菌かつ安定である必要がある。組成物は、溶液、微小乳濁液、リポソーム、又は高い医薬濃度に適切した構造として処方される。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びその適切な混合物を含む、溶液又は分散培地である。適切な流動性は、例えば、レクチンなどの被膜の使用、分散の場合には必要な粒子サイズの調節、及び界面活性剤の使用によって調節される。多くの場合において、例えば、組成物中に砂糖、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。吸収を遅らす注射可能な組成物は、例えば、組成物中に、モノステアリン酸塩及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含んでもよい。
【０１６６】
無菌の注射可能な溶液は、上記の含有物の１個又は組み合わせを含む適切な溶媒の必要な量に活性化合物を組み込ませることによって調製され、必要があれば、その後に精密濾過滅菌を行う。一般に、分散液は、基本的な分散培地及び上記の含有物中で必要なものを含む無菌の媒体に活性化合物を取り込んで調製される。無菌での注射を可能にする溶液の調製用の無菌粉末の好ましい調製方法は、活性含有物の粉末、前もって濾過滅菌した溶液からの添加物を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１６７】
単一の投与形態を生成する担体素材と組み合わせられる活性含有物の量は、治療される被験者、及び投与の特定の形態に依存して変化する。単一の投与形態を産み出す担体素材と組み合わせられる活性含有物の量は、一般的に、治療効果を産み出す組成物の量であり、薬理学的に許容可能な担体との組み合わせにおいて、活性含有物の約０．０１〜約９９％、好ましくは約０．１〜約７０％、より好ましくは約１〜約３０％含まれる。
【０１６８】
投与計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療上の応答）を与えるように調節される。例えば、医者は、投与量を分けて時間の経過とともに投与し、投与量は治療の状況の緊急性応じて投薬量を減少又は増加してもよい。投与及び投与量の均一性を簡略化するために、投与量単位で非経口の組成物を処方することは特に有利である。本願明細書で使われる投与量単位とは、治療される被験者への単一の投与量に適切な、物理的に不連続な単位について言及し、単位は、必要な医薬担体に関連する望ましい治療効果を得るように計算された活性化合物の規定量を含む。本発明の投与量単位の仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特性及び達成される特定の治療効果、及び（ｂ）個々の過敏症治療用の活性化合物などの化合物から複合の制限によって決定され、及び直接的に依存する。
【０１６９】
抗体の投与に関して、その投与量は、宿主体重の約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、一般的に、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。治療例として、週、隔週、３週間、４週間、月、３ヶ月又は３〜６ヶ月に一度投与される。
【０１７０】
本発明の抗ＩＦＮα抗体のための投与計画は、（ｉ）４週間ごとに６回その後３ヶ月ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重（ｉｉ）３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重、（ｉｉｉ）１回目は３ｍｇ／ｋｇ体重、３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈注射によって投与される。
【０１７１】
ある方法において、各投与量が上記範囲内である場合、異なる結合特異性を持つ２個又はそれ以上のモノクローナル抗体の同時に投与される。抗体は、たいてい複数回に投与される。１回の投与の間隔は、例えば、週、月、３ヶ月ごと、年であるが、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定に示されるように変則的である。ある方法における投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度となるように調節され、ある異なる方法においては約２５〜３００μｇ／ｍｌで調節される。
【０１７２】
また、抗体は、高い頻度の投与が必要ではない場合に、徐放剤として投与される。投与量及び頻度は患者中の抗体の半減期に依存する。一般に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体の順である。投与の量及び頻度は予防か治療かに依存する。予防への応用において、相対的に少ない投与量が、長期にわたって相対的に低頻度の間隔で投与される。ある患者は、余命において治療を受け続ける。治療上の応用において、相対的に短い間隔で相対的に多い投与量が、病気の進行が減少又は終了し、及び好ましくは患者が病気の症状の部分的な又は完全な改善を示すまで必要とされる。その後は予防計画において患者に投与する。
【０１７３】
本発明の医薬組成物における活性剤の実際の投与量レベルは、特別の患者、組成物、及び患者に対して毒性を示さない投与への望ましい治療上の応答を得るのに効果的な活性含有物の量を知るために変化してもよい。選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩、又はアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられた特定の化合物の排出の速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使われる他の医薬、化合物、素材、一般的な健康及び治療された患者の年齢、性別、体重、状態、既往歴など医療技術において公知の要因を含む様々な薬物動態学的な要因に依存する。
【０１７４】
本発明の抗ＩＦＮα抗体の“治療上効果的な投与量”は、好ましくは、病状の軽減、病状のない期間の頻度及び持続時間の増加、又は苦痛による機能障害又は能力障害を予防する。例えば、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）において、治療上効果的な投与量は、好ましくは、例えば痛み又は疲労などのＳＬＥに関連する肉体的な症状のさらなる悪化を予防する。また、治療上効果的な投与は、好ましくは、病気の初期又は発端の兆候が現われる時に望まれ、ＳＬＥの始まりを予防又は遅らせる。同様に、それはＳＬＥに関わる慢性的な進行を遅らせることを含む。ＳＬＥの診断において用いられる臨床検査は、化学（ＩＦＮαのレベルの測定を含む）、血液学、血清学及び放射線医学を含む。従って、モニターする臨床検査又は生化学検査は、ＳＬＥを治療するのに治療上効果的な投与量かどうかを決定するために使われる。ある従来公知の技術は、被験者の大きさ、被験者の症状の重症度、及び特定の組成物又は選択される投与の経路などの要因に基づいて、投与量が決定される。
【０１７５】
本発明の組成物は、ある従来公知の様々な方法を用いて、１つ以上の投与の経路で投与される。熟練した技術者によって正しく評価されるように、投与の経路及び／又は方式は、望まれる結果に依存して変化する。本発明の抗体の好ましい投与の経路は、静脈、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口の、例えば、注射又は輸液などを含む。本願明細書で使われる“非経口投与”というフレーズは、腸の及び局所的な投与以外の投与の方式、通常は注射を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄こう内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管内、皮下、角皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、及び茎内の注射及び輸液を含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
また、本発明の抗体は、局所的な表皮性、又は、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸、舌下又は粘膜への投与の経路など、非経口ではない経路を介して投与される。
【０１７７】
活性化合物は、埋め込み、経皮貼布、及びマイクロカプセルに入れた送達システムを含む、遊離制御した製剤などの素早い放出に対して化合物を守る担体とともに調製される。生物分解性のポリマー、生物適合性のポリマー、エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などが使われる。このような多くの調製方法は、特許権利化され、当業者に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８」から参照することができる。
【０１７８】
治療上の組成物は、従来公知の医療器具を用いて投与される。例えば、好ましい実施形態において、本発明の治療上の組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号明細書、米国特許第５，３８３，８５１、米国特許第５，３１２，３３５号明細書、米国特許第５，０６４，４１３号明細書、米国特許第４，９４１，８８０号明細書、米国特許第４，７９０，８２４号明細書、又は米国特許第４，５９６，５５６号明細書で開示され、無針皮下注射器を用いて投与される。本発明において有用な公知の埋め込みモジュールの例は、制御速度で薬剤を調剤する埋め込み可能なマイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）、皮膚を通して医薬体を投与する治療器具（米国特許第４，４８６，１９４号明細書にて開示）、正確な注入速度で薬剤を送達する薬剤注入ポンプ（米国特許第４，４４７，２３３号明細書にて開示）、継続的な医薬送達する可変流かつ埋め込み可能な注入装置（米国特許第４，４４７，２２４号明細書にて開示）複数の試験槽区画を有する浸透圧の医薬運搬システム（米国特許第４，４３９，１９６号明細書にて開示）、及び浸透圧の医薬運搬システム（米国特許第４，４７５，１９６号明細書にて開示）を含む。これらの特許明細書は本願明細書に引用されて援用する。多くの他のそのような埋め込み型の運搬システム及びモジュールが当業者にとって公知である。
【０１７９】
ある実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適切な分布を確認するために調製される。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療上の化合物がＢＢＢを通過することを確認するために（もし望むのであれば）、例えば、リポソームが調製される。リポソームを生成する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書、米国特許第５，３７４，５４８号明細書、及び米国特許第５，３９９，３３１号明細書から参照することができる。リポソームは、特定の細胞又は臓器へ選択的に送達される１つ以上の部分からなってもよく、医薬送達性の向上を目的とする（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ  Ｃｌｉｖａ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。模範的な標的部分は、葉酸又はビオチン（例えば、Ｌｏｗ他の米国特許第５，４１６，０１６を参照）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ他、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ他、（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ他、（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）、界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ他、（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ他、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）を含む。また、「Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３」も参照することができる。
【０１８０】
［本発明の使用及び方法］
本発明のモノクローナル抗ＩＦＮα抗体及びそれに関連した誘導体／複合体及び組成物は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの診断上の及び治療上の有用性を有する。例えば、抗体は、標準的な抗体／抗原結合検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ＩＦＮαタンパク質を検出するために使われる。さらに、これらの分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＩＦＮαが役割を果たす様々な疾患を治療、予防、又は診断するため、被験者に投与される。本願明細書で使われる、“被験者”という用語は、ヒト及びヒトでない動物の両方を含むことが意図される。好ましい被験者は、自己免疫疾患を示すヒトの患者を含む。本発明の“ヒトでない動物”という用語は、例えば、哺乳類、及びヒトでない霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、は虫類などの非哺乳類などの全ての脊椎動物を含む。
【０１８１】
本発明の抗体組成物は、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ；クローン病、潰瘍性大腸炎及びセリアック病を含む）、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び糸球体腎炎などの自己免疫疾病の治療において使われる。さらに、本発明の抗体組成物は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療における移植の拒絶を阻害又は予防するために使われる。
【０１８２】
本発明の抗体は、始めに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける治療上の使用に関連する結合活性について検査される。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例に記載されるＢｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー検定を用いて検査する。さらに、これらの分子の活性は、例えば、以下の実施例に記載されるような、細胞増殖検定、その後のＩＦＮαへの暴露によって検定される。本発明の抗体及び組成物を投与する適切な方法は、従来公知であり開示されている。また、当分野の技術の範囲内で適切な投与量を決定することができ、被験者の年齢及び体重及び使われる特定の医薬に依存する。模範的な投与量は上記に記載される。
【０１８３】
また、本発明の抗ＩＦＮα抗体は上記に記載されるような他の治療上の薬剤とともに投与する。
【０１８４】
上記に記載されるように、治療目的のために、治療上効果的な量のヒト抗体組成物及び薬理学的に許容可能な担体が患者に投与される。投与される量が生理学的に重要である場合、抗体組成物及び薬理学的に許容可能な担体の組み合わせで“治療上効果的な量”において投与されると言われる。薬剤は、過敏症の患者の生理において検出可能な変化をもたらす場合、“生理的に重要”である。標的でない薬剤を全身に投与して標的となる場合より標的となる治療薬が指定した標的へ高い割合の投与量を送達される場合、“治療上効果的”である。
【０１８５】
また本発明の範囲内には、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、免疫複合体及び二重特異性分子）及び使用のための説明書からなるキットも含まれる。さらに、このキットは、本発明の１個以上の付加的なヒト抗体（例えば、ＩＦＮα活性を阻害するが、第１のヒト抗体とは別のものである相補的な活性を有するヒト抗体）などの少なくとも１個の付加的な試薬を含む。
【０１８６】
本発明は、以下の実施例によって詳細に説明されるが、本発明の内容を限定するものと解釈されるべきではない。本願明細書の全体にわたって、全ての図及び全ての参考文献、特許及び公報は明白に引用されて援用する。
【実施例１】
【０１８７】
＜ＩＦＮαに対するヒトモノクローナル抗体の生成＞
抗原：
結果として複数のＩＦＮαサブタイプを産生するが、ＩＦＮωは産生しない、ウィルスで刺激されたヒトリンパ芽球状細胞株から精製した、複数のサブタイプを含む天然のヒトＩＦＮαを抗原として用いた。
【０１８８】
形質転換及び染色体導入ＫＭ  Ｍｉｃｅ（登録商標）：
ＩＦＮαに対する完全なヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子を発現する形質転換、染色体導入マウスのＫＭ種を用いて調製した。このマウス種において、内因性のマウスκ軽鎖遺伝子を、「Ｃｈｅｎ他、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０」に記載されるようにホモ接合的に破壊し、内因性のマウス重鎖遺伝子をＨｕＭａｂマウスにおいて、「国際公開第０１／０９１８７号明細書」の実施例１に記載されるようにホモ接合的に破壊した。このマウスは、「Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１」に記載されるように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子を持つ。また、このマウスは、「国際公開第０２／４３４７８号明細書」に記載されるようにヒト重鎖導入染色体ＳＣ２０を持つ。
【０１８９】
ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）の免疫化：
ＩＦＮαに対する完全なヒトモノクローナル抗体を生成するために、ウィルスで刺激したヒトリンパ芽球状細胞株から精製した複数のサブタイプを含む天然のヒトＩＦＮαを用いて、ＫＭマウスを免疫化した。一般的な免疫化の概要は、「Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．他、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．他、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１」及び「国際公開第９８／２４８８４号明細書」に記載される。最初に、６−１６週齢において、マウスに抗原を注入した。ＩＦＮα抗原を精製した（すなわち、ウィルスで刺激したヒトリンパ芽球状細胞株から精製した）天然の調製物（２５〜１００μｇ）は、腹腔内に（ＩＰ）又は皮下（Ｓｃ）に注入し、ＫＭマウスを免疫化した。
【０１９０】
形質転換及び染色体導入マウスは、腹腔内に（ＩＰ）又は皮下（Ｓｃ）に完全な免疫増強剤中の抗原を２回注入して、２−４週間（全部で８回）にかけてＩＰに不完全な免疫増強剤中の抗原を注入して免疫化した。免疫応答を、眼球後出血によって監視した。（以下に記載されるように）ＥＬＩＳＡで血漿を選別し、十分な滴定濃度の抗ＩＦＮαヒト免疫グロブリンを有するマウスを使用して融合した。マウスの静脈内に抗原を追加して免疫化した２日又は３日後にマウスを犠牲にした。
【０１９１】
抗ＩＦＮα抗体を産生するＫＭマウスの選択：
ＩＦＮαに結合する抗体を産生するＫＭマウスを選択するために、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他（１９９６）が記載するように、ＥＬＩＳＡによって免疫化したマウスの血清を検査した。要約すると、マイクロタイタープレートにＰＢＳ中１−２μｇ／ｍｌのリンパ芽球細胞から精製した天然のＩＦＮαを５０μｌ／ウェル加え、４℃で一晩インキュベートして被覆し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中の５％のニワトリ血清でブロックした。ＩＦＮαで免疫化したマウスの血漿の希釈液を各ウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、そのプレートをＡＢＴＳ基質（シグマ、Ａ−１８８８，０．２２ｍｇ／ｍｌ）で現像し、４９５ｎｍのバックグラウンド補正で波長を４１５ｎｍに設定した分光光度計を用いて各ウェルの光学濃度を測定した。抗ＩＦＮα抗体の最も高い滴定濃度を呈したマウスを使って以下に記載されるように融合し、抗ＩＦＮα活性についてハイブリドーマの上清をＥＬＩＳＡで検査した。
【０１９２】
ＩＦＮαに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成：
脾細胞をＫＭマウスから単離し、ＰＥＧを用いて標準的な手順に基づいてマウス骨髄腫細胞株に融合した。抗原特異抗体の産生において、得られたハイブリドーマを選別した。
【０１９３】
免疫化したマウスに由来する脾臓のリンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ（シグマ）を用いて、４分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５８０）又はＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５８１）に融合された。細胞を約１×１０５／ウェルの密度で平底のマイクロタイタープレートに配置し、１０％のウシ胎仔血清、１０％のＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ，ＣＢＬ  ＴＩＢ−６３）調製した培地、３〜５％のＤＭＥＭ（メディアテック、ＣＲＬ  １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミン及びピルビン酸ナトリウム含有）中のオリジン（ＩＧＥＮ）、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１ｘＨＡＴ（シグマ、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）を含む選択培地において約２週間インキュベートした。ヒト抗ＩＦＮαＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによって各ウェルを選別した。
【０１９４】
ＩＦＮαの抗増殖効果をブロックする能力について、ＥＬＩＳＡによって同定した抗体を分泌するハイブリドーマから調製した培地をＤａｕｄｉ増殖検定（以下に記載する）において検査した。Ｄａｕｄｉ検定の選別において最も高い中和活性をもつハイブリドーマを、限界希釈法によって少なくとも２回サブクローニングした。得られた安定なサブクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、組織培養培地中で少量のモノクローナル抗体を生成した。Ｄａｕｄｉ増殖検定を繰り返し、サブクローンの活性を確認した。モノクローナル抗ＩＦＮαを精製して特徴付けするため、Ｄａｕｄｉ検定において最も高い活性を持つサブクローンを増量し、十分な量（一般的に１Ｌ）の調製した培地を生成した。
【０１９５】
抗ＩＦＮα抗体を中和するハイブリドーマの選別：Ｄａｕｄｉ増殖検定：
インターフェロンαは、分量依存的な様式でＤａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２１３）の増殖を阻害する。インターフェロンのその受容体に対する結合をブロックする中和抗体は、増殖を回復させる。Ｄａｕｄｉにおける天然のリンパ芽球状のＩＦＮαの抗増殖効果についての用量応答曲線を測定し、Ｄａｕｄｉの生育を５０％にまで阻害する（ＥＣ５０）のに十分な濃度を求めた。
【０１９６】
ＩＦＮαの添加又は非添加の条件下、９６ウェルの平底細胞培養プレートにおいて、ハイブリドーマを調製した培地を培養培地（１０％のＦＣＳ、１ｘ２−ＭＥ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン、ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０）のＤａｕｄｉ細胞と混合した。最終的な試薬の混合物は、１×１０４Ｄａｕｄｉ細胞＋１０％のハイブリドーマ上清＋／−ＥＣ５０における１００μｌ／ウェルのＩＦＮαであった。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。２０μｌ／ウェルのＭＴＳ（プロメガ）を添加して増殖を検定し、４９０ｎｍにおいてＯ．Ｄ．を読み、さらに３時間インキュベートした。生存可能な細胞の数は、Ｏ．Ｄ．の読み取り値に比例していた。ハイブリドーマ上清のみに対するＤａｕｄｉ阻害のパーセンテージをハイブリドーマ上清＋ＩＦＮαについて計算し、ＩＦＮα添加及び非添加の培地コントロールと比較した。ハイブリドーマをＩＦＮαの効力に従って順序づけし、最も活性を中性化したハイブリドーマを選択してサブクローニングした。
【０１９７】
ハイブリドーマクローン１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９を選択して、さらに分析した。
【実施例２】
【０１９８】
＜ヒトモノクローナル抗体１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９の構造上の特徴付け＞
標準的なＰＣＲ手法を用いて、１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、１３Ｈ５、１３Ｈ７、及び７Ｈ９ハイブリドーマからそれぞれ得た。そして、標準的なシークエンス手法を用いて配列決定した。
【０１９９】
図１Ａに、１３Ｈ５の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列、及び配列番号２配列番号５及び配列番号１９をそれぞれ示す。
【０２００】
図１Ｂに、１３Ｈ５の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列、及び配列番号２配列番号８及び配列番号２２をそれぞれ示す。
【０２０１】
１３Ｈ５の重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖の配列との比較によって、１３Ｈ５の重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ  １−１８に由来するＶＨ部分、未決定Ｄ部分、及びヒト生殖系列ＪＨ  ４ｂに由来するＪＨ部分を利用することを明らかにした。図４に１３Ｈ５のＶＨ配列のヒト生殖系列ＶＨ  １−１８配列に対するアラインメントを示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて、１３Ｈ５のＶＨ配列をさらに分析し、図１Ａ及び図４の配列番号１、配列番号４及び配列番号７に重鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域をそれぞれ図示した。
【０２０２】
１３Ｈ５の軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖の配列との比較によって、１３Ｈ５の軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７に由来するＶＬ部分及びヒト生殖系列ＪＫ  １に由来するＪＫ部分を利用することを明らかにした。図６に１３Ｈ５のＶＬ配列の生殖系列ＶＫ  Ａ２７配列に対するアラインメントを示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて１３Ｈ５のＶＬ配列のさらに分析し、図１Ｂ及び図６、の配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６に軽鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域をそれぞれ図示した。
【０２０３】
図２Ａの配列番号２６及び配列番号２０に１３Ｈ７の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【０２０４】
図２Ｂの配列番号２９及び配列番号２３に１３Ｈ７の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【０２０５】
１３Ｈ７の重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖の配列を比較して、１３Ｈ７の重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ  ４−６１に由来するＶＨ部分、ヒト生殖系列３−１０に由来するＤ部分、及びヒト生殖系列ＪＨ  ４ｂに由来するＪＨ部分を利用することを明らかにした。図５に１３Ｈ５のＶＨ配列のヒト生殖系列ＶＨ  ４−６１配列に対するアラインメントを示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて１３Ｈ７のＶＨ配列をさらに分析し、図２Ａ及び図５の配列番号２、配列番号５及び配列番号８に重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域をそれぞれ図示した。
【０２０６】
１３Ｈ７の軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖の配列を比較して、１３Ｈ５の軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７に由来するＶＬ部分及びヒト生殖系列ＪＫ  ２に由来するＪＫ部分を利用することを明らかにした。図６に１３Ｈ７のＶＬ配列の生殖系列ＶＫ  Ａ２７配列に対するアラインメントを示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて１３Ｈ７のＶＬ配列のさらに分析し、図２Ｂ及び図６の配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１７に軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域をそれぞれ図示した。
【０２０７】
図３Ａの配列番号２７及び配列番号２１に７Ｈ９の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【０２０８】
図３Ｂの配列番号３０及び配列番号２４に７Ｈ９の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【０２０９】
７Ｈ９の重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖の配列を比較し、７Ｈ９の重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ  １−１８に由来するＶＨ部分、ヒト生殖系列６−６に由来するＤ部分、及びヒト生殖系列ＪＨ  ４ｂに由来するＪＨ部分を利用することを明らかにした。図４に７Ｈ９のＶＨ配列のヒト生殖系列ＶＨ  １−１８配列に対するアラインメントを示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて７Ｈ９のＶＨ配列をさらに分析し、図３Ａ及び図４の配列番号３、配列番号６及び配列番号９に重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域をそれぞれ図示した。
【０２１０】
７Ｈ９の軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖の配列を比較し、７Ｈ９の軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７に由来するＶＬ部分及びヒト生殖系列ＪＫ  １に由来するＪＫ部分を利用することを明らかにした。図６に７Ｈ９のＶＬ配列の生殖系列ＶＫ  Ａ２７配列に対するアラインメントを示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて７Ｈ９のＶＬ配列をさらに分析し、図３Ｂ及び図６の配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８に軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を図示した。
【実施例３】
【０２１１】
＜抗ＩＦＮαヒトモノクローナル抗体は複数のインターフェロンαサブタイプの生物活性阻害＞
実施例１に記載されるように、インターフェロンαは、用量依存的な様式でＤａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２１３）の増殖を阻害する。インターフェロンの受容体との結合をブロックする中和抗体は増殖を回復させる。細胞増殖検定を用いて、天然のリンパ芽球状ＩＦＮα、天然の白血球インターフェロン、１３の組み換えＩＦＮαサブタイプ、ＩＦＮβ及びＩＦＮωの阻害について、精製したヒト抗ＩＦＮα抗体の特異性を検査して調べた。
【０２１２】
平底細胞培養プレート中で、ＩＦＮαの添加又は非添加の条件下、９６ウェルのＤａｕｄｉ細胞を培養培地（１０％ＦＣＳ、１ｘ２−ＭＥ、Ｌ−グルタミン、及びペニシリン、ストレプトマイシンで補ったＲＰＭＩ  １６４０）中で生育させた。各タイプＩインターフェロンを、ＥＣ５０で検定し、各抗体の２倍ずつ増加させた滴定濃度、一般的に５０μｇ／ｍｌ（３１２ｎＭ）〜３８１ｐｇ／ｍｌ（２．４ｐＭ）で混合した。抗体／ＩＦＮ混合物は、１×１０４Ｄａｕｄｉ細胞／１００μｌ／ウェルが最終濃度となるように底に積層し、９６ウェルのＤａｕｄｉ細胞に加えられ、３７℃で、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。２０μｌ／ウェルのＭＴＳ（プロメガ）を添加して増殖を検定し、４９０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定し、さらに３時間インキュベートした。生育可能な細胞の数は、Ｏ．Ｄ．の読み取りに比例した。インターフェロンの阻害パーセンテージを、ＩＦＮがない（＝１００％阻害）及びＩＦＮだけが存在するＤａｕｄｉの増殖に対して計算した。抗体は、阻害の度合いに従ってスコア付けを行い、検査した各抗体についてのＩＦＮＡＲサブタイプ特異性のプロファイルを得た。非線形回帰；Ｓ字状用量曲線；可変傾斜曲線適合を用いたＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてＥＣ５０値を得た。結果として、ヒト抗ＩＦＮα抗体１３Ｈ５は、複数のインターフェロンαサブタイプ、特にＩＦＮα  ６、２ｂ、２ａ、１、１６、１０、８、５及び１４の作用を阻害するが、ＩＦＮα  ２１、ＩＦＮβ又はＩＦＮωを阻害しないことが明らかであった。１３Ｈ５は、ＩＦＮαサブタイプ１７、７及び４の阻害度の低い阻害剤である。インターフェロンのＥＣ５０値及び阻害度は、下の表１に示される。
【０２１３】
【表１】
2007513633.tif 000003
【実施例４】
【０２１４】
＜抗ＩＦＮα抗体による細胞表面マーカーのＩＦＮαが誘導する発現の阻害＞
ＩＦＮα２ｂを細胞培養培地へ添加することによって、正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）の細胞表面マーカーＣＤ３８及びＭＨＣクラスＩの発現を誘導することが知られている。ヒト抗ＩＦＮα抗体１３Ｈ５の活性による一次ヒト細胞の培養における細胞表面マーカーの発現を誘導するインターフェロンの阻害について検査し、ＦＡＣＳ分析によって検定した。
【０２１５】
抗ＩＦＮαモノクローナル抗体１３Ｈ５及び同位体コントロールを、各ＰＢＭＮＣ培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ＋１％のヒト血清）中で２０μｇ／ｍｌに希釈した。１．５ｍｌ／ウェルの抗体は、Ｔ２５通気キャップ培養フラスコへ分配し、培養培地中に希釈した４００ｉｕ／ｍｌの白血球ＩＦＮ、ＩＦＮα２ｂ又はＩＦＮωのいずれか、又は等量の培地とともに混合した。ＰＢＭＮＣを製造者（ベクトン  ディッキンソン社）の指示に従って用い、ヘパリンで被覆したＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（登録商標）チューブを正常なヒトの血液から単離した。細胞を培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％のＦＢＳ＋１％のヒト血清）中で２×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、最終の検定条件として、６ｍｌの培地あたり６×１０６のＰＢＭＮＣ＋５μｇ／ｍｌのＡｂ＋／−１００ｉｕ／ｍｌのＩＦＮのＡｂ／ＩＦＮ混合物を等量加えた。フラスコは３７℃、５％のＣＯ２において２４時間又は４８時間インキュベートした。
【０２１６】
調製した培地を各フラスコから収集し、懸濁細胞をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴＨ−７５０ローターにおける１０００ｒｐｍの遠心によって回収した。固まった細胞を氷上に保持し、上清はＥＬＩＳＡのために−８０℃で凍結した。付着した細胞をＰＢＳ洗浄（２ｍｌ）でフラスコから回収し、ヴェルセン中で１５分間インキュベートした。ヴェルセンインキュベーション後にフラスコを掻き取り、ＰＢＳ（２ｍｌ）で洗浄した。各ＰＢＳ洗浄液の及びヴェルセンは、調製した培地の収穫から回収した細胞と混合した。溜めた細胞懸濁液を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴＨ−７５０ローターにおいて１０００ｒｐｍで遠心し、得られたペレットを染色バッファー（ＰＢＳ＋０．１Ｍ  ＥＤＴＡ＋２％ＰＢＳ＋１％ＨＳ）中で３００μｌに再懸濁し、Ｖ型底の９６ウェルプレートへ１００μｌ／ウェルずつ分配した。
【０２１７】
そのプレートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴＨ−７５０ローターにおいて２８００ｒｐｍでパルス遠心し、以下のようにして、蛍光色素ラベルした抗体中で２５μｌ／ウェルに固まった細胞を再懸濁した。
（１）マウス抗ＭＨＣ  Ｉ−ＦＩＴＣ＋マウス抗ＣＤ３８−ＰＥ
（２）同位体コントロール、マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ＋マウスＩｇＧ−ＰＥ
光を遮って、そのプレートを氷上で４５分間インキュベートした。細胞を２００μｌの染色バッファーを添加して３回洗浄し、パルス遠心し、最終的に２００μｌのＰＢＳ中の２％のパラホルムアルデヒド中で懸濁した。ベクトン  ディックソンＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）を用いたフローサイトメトリーによって単球細胞の染色を分析し、側方散乱光対前方散乱光のグラフで描き、ゲートは分析から汚染した細胞を除去した。結果として、ヒトモノクローナル抗体１３Ｈ５が、正常なＰＢＭＮＣにおけるＣＤ３８及びＭＨＣクラスＩの発現の変化を誘導する白血球ＩＦＮ及び組み換えＩＦＮα  ２ｂを阻害することを明らかにした。ヒトモノクローナル抗体１３Ｈ５は、ＣＤ３８及びＭＨＣクラスＩの細胞表面マーカーの発現における変化を仲介するＩＦＮωを阻害しない。これらの結果は、以下の表２及び表３に示す。
【０２１８】
【表２】
2007513633.tif 000004
【０２１９】
【表３】
2007513633.tif 000005
【実施例５】
【０２２０】
＜抗ＩＦＮα抗体によるＩＰ−１０のＩＦＮが誘導する発現の阻害＞
ＩＦＮα２ｂを細胞培養培地に添加することによって、正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）におけるＩＰ−１０発現を誘導することが知られている。ＥＬＩＳＡ結合検定によって、ヒト抗ＩＦＮα抗体１３Ｈ５の活性による正常なＰＢＭＮＣ中のＩＰ−１０発現を誘導するインターフェロンの発現の阻害について検査した。
【０２２１】
実施例４に記載されるようにＰＢＭＮＣ培養を調製し、白血球ＩＦＮ、ＩＦＮα２ｂ又はＩＦＮωとともに調製した。調製した培地は、製造者の指示に従って定量的なサンドウィッチＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄシステムズ）を用い、１：３０希釈でＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０の発現について分析した。その結果、ヒトモノクローナル抗体１３Ｈ５が、正常なＰＢＭＮＣ培養中のＩＰ−１０の発現を誘導し、白血球ＩＦＮ及び組み換えＩＦＮα２ｂを阻害するが、ＩＰ−１０発現を誘導するＩＦＮωを阻害しないことを明らかにした。これらの結果を表４に示す。
【０２２２】
【表４】
2007513633.tif 000006
【実施例６】
【０２２３】
＜抗ＩＦＮαヒトモノクローナル抗体の親和性の特徴付け＞
本実施例において、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用い、モノクローナル抗体１３Ｈ５を組み換えＩＦＮα２ａ及びＩＦＮα２ｂとの結合親和性について調べた。
【０２２４】
１０μｇ／ｍｌの精製した抗体を、Ｐｒｏｔ−Ｇで被覆したＣＭ５チップ上に捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰ流動バッファー中の８０〜１０ｎｍの濃度の抗原の液体を２５μｌ／ｍｉｎの速度でチップ上を通過させた。放置した結合時間は５分であり、解離期間を１０分設定した。バックグラウンドとチップ及び抗体への非特異結合を、捕捉したアイソタイプコントロールであるヒトＩｇＧ（シグマ）とバッファーを用いて表面との結合を検出して除外した。２０ｍＭのＮａＯＨ＋４００ｍＭのＮａＣｌを用い、１００μｌ／ｍｉｎの流速で０．４分間、チップの再生を行なった。結合曲線及び解離曲線は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いたラングミュア結合モデルへ適用した。これらの結果を以下の表５に示す。
【０２２５】
【表５】
2007513633.tif 000007
【実施例７】
【０２２６】
＜ＳＬＥ血漿に仲介された樹状細胞成長の抗体阻害＞
ＳＬＥ血漿は、正常なヒト単球に由来する樹状細胞の成長を誘導する。本実施例において、精製したモノクローナルヒト抗ＩＦＮα抗体によるＳＬＥ血漿の細胞表面マーカーＣＤ３８、ＭＨＣクラスＩ及びＣＤ１２３の誘導を阻害する抗体の能力によって評価し、樹状細胞の成長の阻害について検査した。
【０２２７】
２５ｍｌの軟膜をＰＢＳで４倍に希釈した。そのサンプルを４×５０ｍｌの円錐管に分け、１５ｍｌの白血球分離培地（ＩＣＮバイオメディカルズ）を底部に積層した。５００ｘｇにおいて３０分間回転させ、ＰＢＭＣを含む軟膜を除去し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を４×１０６細胞／ｍｌで培養培地中に再懸濁した。単球を培養培地中で３７℃にて１．５時間、ＰＢＭＣ（２．０×１０７細胞／５ｍｌ／２５ｃｍ２フラスコ）をインキュベートし、非接着細胞を２回洗い流すことによって単離した。二度目の洗浄に続いて、その細胞を１％の熱不活性化ヒト血清を含む培地中で培養した。２５％のＳＬＥ患者の血漿、プラス／マイナス中和抗体及びアイソタイプコントロール（３０μｇ／ｍｌ）を培養培地に加え、ＩＦＮα２ｂ（１００＆１０ｉｕ／ｍｌ）プラス２５％の正常なヒトの血漿をマーカー誘導の陽性対照として使用した。フラスコを３７℃で５％のＣＯ２において３〜７日間インキュベートした。樹状細胞を調製した培地から回収し、（実施例４に記載されるように）ＰＢＭＮＣ培養中のマーカー誘導の阻害について染色する前に、ＰＢＳ及びヴェルセン処理してもよい。樹状細胞の染色をベクトン  ディックソンのＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。側方散乱光対前方散乱光のグラフにおいて描き、ゲートは分析から汚染した細胞を除去した。抗ＩＦＮαヒトモノクローナル抗体１３Ｈ５は、１３Ｈ５の存在下で細胞表面マーカーＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３８、及びＣＤ１２３の正常化した発現によって明らかとなり、樹状細胞の成長におけるＩＦＮαに依存する過程を阻害する。以下表６の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の４人のＳＬＥ提供者のサンプルについての結果を示す。
【０２２８】
【表６】
2007513633.tif 000008
【実施例８】
【０２２９】
＜モノクローナル抗体１３Ｈ５の作用のメカニズム＞
本実施例において、放射性ラベルされたサイトカイン及び抗体を用い、１３Ｈ５の作用のメカニズムを決定するため、ＩＦＮＡＲを発現する細胞とのいくつかの結合実験を行った。
【０２３０】
実験の第１のセットにおいて、組み換えＩＦＮα２ａは、２９．３Ｃｉ／ｍ  ｍｏｌｅ比放射能（ピアースＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）試験管）で放射性ヨウ素化され、約１ｎＭのＫＤでＤａｕｄｉ細胞に特異結合することが決定された。細胞に対するこのリガンドとの結合の競合について調べるために、ガラス繊維プレートを、２００μｌ／ウェルのミルクバッファーとともに４℃にて一晩ブロックした。Ｄａｕｄｉ細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地において２×１０６細胞／ウェルで分配し、１２５Ｉ−ＩＦＮαに加えて、１３Ｈ５、アイソタイプコントロール又は非ラベルのＩＦＮαのいずれかの競合相手の３倍ずつ希釈（３０ｎＭ〜１４ｐＭ）して混合した。そのプレートをＲＰＭＩで洗浄し、振とう器上で４℃にて２時間インキュベートして空気乾燥した。そのフィルターをガラス試験管に移し、放射活性を分析した。
【０２３１】
いくつかの実験結果を図７に示す。非ラベルのリガンドを陽性対照として使用し、約０．５ｎＭのＩＣ５０で１２５Ｉ−ＩＦＮαとの結合を特異的に阻害することが観測された。しかしながら、１３Ｈ５抗体はヨウ素化リガンドとの結合を阻害しなかったが、細胞に対する１２５Ｉ−ＩＦＮαとの結合に効果を持たないアイソタイプコントロール抗体の作用に対照し、処理した細胞に関連した放射性シグナルが高められることが観測された。この結果は、１３Ｈ５が非競合的な作用のメカニズムを有し、リガンドとの結合の阻害ではなく、シグナリングを阻害することによって生物学活性を中和することを示す。
【０２３２】
また、上記の結果は、１３Ｈ５がＩＦＮαの存在下で細胞の表面に結合することを示唆する。各１３Ｈ５分子は２個のＩＦＮα分子を結合させる能力を有するので、細胞膜に結合した第２のリガンドを生成する可能性がある。この仮説は、細胞に結合した放射活性が、ＩＦＮαの１３Ｈ５結合部位に対して１：１の比率と一致し、抗体及びリガンドの各濃度で約２倍向上したという観測に基づいて支持される。
【０２３３】
１３Ｈ５の作用のメカニズムをさらに調べるために、抗体のＤａｕｄｉ細胞に対する結合について、ＩＦＮα２ａの存在下又は非存在下において放射性ラベル化した抗体を用いて検定した。結合実験に基づき、サイトカインをＩＦＮＡＲとの結合を飽和させるように計算された濃度（１０ｎＭ）で使用した。１３Ｈ５抗体を、４１４Ｃｉ／ｍ  ｍｏｌｅの比放射能（ピアースＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）試験管）で放射性ヨウ素化した。細胞に結合する抗体を調べるために、ガラス繊維プレートを、２００μｌ／ウェルのミルクバッファーとともに４℃で一晩ブロックした。Ｄａｕｄｉ細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地中２×１０６細胞／ウェルで分配し、１２５Ｉ−１３Ｈ５の２倍ずつ希釈し、プラス／マイナスＩＦＮα（１０ｎＭ）と混合した。そのプレートをＲＰＭＩで洗浄し、振とう器上で４℃にて２時間インキュベートし、空気乾燥した。ＩＦＮα２ａに依存した結合を決定するために、単独で結合する１２５Ｉ−１３Ｈ５についてのＣＰＭ値をＩＦＮα２ａの存在下で測定された値から差し引いた。いくつかの実験結果を図８に示す。結果として、ＩＦＮα２ａの存在下でＤａｕｄｉ細胞に対して１２５Ｉ−１３Ｈ５の用量依存的かつ飽和可能な結合を示すが、１２５Ｉ−１３Ｈ５のみとの結合はごく僅かであることを示した。１３Ｈ５とのＩＦＮα依存的な特異結合は、図８に●で示され、ＩＦＮα存在下おける１３Ｈ５との結合について、の全体のＣＰＭから抗体のみについてのＣＰＭ（非特異結合を意味する）を差し引いて計算した。
【０２３４】
従って、１３Ｈ５の作用のメカニズムとは、１３Ｈ５に結合したＩＦＮαの複合体が細胞表面のＩＦＮＡＲに結合できる非競合的なものであり、ＩＦＮαの生物活性はＩＦＮＡＲを通したシグナリングの阻害によって中和される。
【実施例９】
【０２３５】
＜１３Ｈ５を用いた抗体依存的な細胞を介した細胞毒性検定＞
１３Ｈ５はＩＦＮα存在下で細胞表面に結合するため、抗体依存的な細胞を介した細胞毒性（ＡＤＣＣ）が５１Ｃｒ放出検定を用いて調べた。Ｒａｊｉ細胞を新鮮なヒト単核細胞による溶解の標的として使用した。単核細胞をＦｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によってヘパリン添加の全血液から精製した。標的細胞を１０６細胞あたり１００μＣｉの５１Ｃｒで１時間ラベル化し、Ｕ型底のマイクロタイタープレートにウェルあたり１０４細胞で分配し、エフェクター細胞に加えて、滴定濃度の抗体とともに混合した（エフェクター：標的＝５０：１）。３７℃で４時間のインキュベートに続いて、上清を調製した培地を回収し、放射活性について分析した。抗体の非存在下で放射活性を放出してバックグラウンドコントロールとして使い、標的細胞を界面活性剤処理して１００％溶解を測定した。細胞毒性を次の式によって計算した。
％溶解＝（実験のｃｐｍ−標的細胞の漏れによるｃｐｍ）／（界面活性剤による溶解のｃｐｍ−標的細胞の漏れによるｃｐｍ）×１００％
特異的溶解＝１３Ｈ５存在下での％溶解−１３Ｈ５非存在下での％溶解
検定は、３回行われた。
【０２３６】
図９に示すＡＤＣＣ検定の結果は、１３Ｈ５が、単独又はＩＦＮα２ｂの存在下のいずれおいても、Ｒａｊｉ細胞において有意なＡＤＣＣ活性を有しないことを示す。同様に、陽性対照（リツキシマブ）が強い用量依存的な細胞毒性を示したのに対して、ＩｇＧと一致したアイソタイプは活性を示さなかった。これらの結果は、ＩＦＮＡＲを発現する細胞の細胞表面にある１３Ｈ５との結合に仲介されるＩＦＮαがＡＤを仲介するのに十分ではないことを示す。
【実施例１０】
【０２３７】
＜１３Ｈ５の安定性の試験＞
１３Ｈ５抗体は、重鎖のＣＤＲ２領域内のＡｓｎ−５５において強力な脱アミド部位を含む。アスパラギン残基の脱アミド化は、組み換えＤＮＡ手法を用いて得られるポリペプチド及びタンパク質の一般的な修飾であり、脱アミド化が常に生物活性の喪失と関連するとは限らないが、生物活性及び／又は安定性を減少させる可能性がある。アスパラギン酸（及びイソアスパラギン酸）を形成するアスパラギンの脱アミド化は、荷電に基づいた分析方法によって検出する実効荷電を変化させる。促進された条件下（塩基性のｐＨ）における１３Ｈ５の脱アミド化を調べるために、ＩＥＸ−ＨＰＬＣ及びキャピラリー等電点電気泳動法（ｃＥＩＦ）によるＦａｂ断片の脱アミド化変異体の検出方法が用いられた。
【０２３８】
１３Ｈ５の脱アミド化を促進させるために、抗体はアルカリ性のｐＨでバッファーに曝した。出発材料として、１０２μｌの一定分量の１３Ｈ５（５．９ｍｇ／ｍｌで全体の６００μｇに対して）を、４９８μｌのＰＢＳ及び６μｌの１００Ｘアジ化ナトリウム（２％溶液）へ加えた。ＰＢＳ時間ゼロサンプルのために、１３０μｌの出発材料を３０μｌのＰＢＳに混合し、そのサンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。脱アミドバッファーにおける時間ゼロのサンプルのために、１３０μｌの出発材料を１５μｌの１０Ｘ脱アミド化バッファー（ｐＨ８．５の１０％炭酸水素アンモニウム）及び１５μｌのｐＨ調節バッファー（ｐＨ６．０の１Ｍ  ＭＥＳ）と混合し、さらなる分析まで−２０℃で保存した。ＰＢＳの２日のサンプルのために、１３０μｌの出発材料を３０μｌのＰＢＳと混合し、４０℃で４８時間インキュベートし、そのサンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。脱アミド化条件下の２日サンプルのために、１３０μｌの出発材料を１５μｌの１０Ｘ脱アミド化バッファーと混合し、４０℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、１５μｌのｐＨ調節バッファーを加え、そのサンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存された。
【０２３９】
分析用の上記のサンプルを調製するために、パパイン消化が行った。使用した反応条件は、１６０μｌのサンプル（１３０μｇ  １３Ｈ５）、３．２μｌの５０ｍＭのシステイン及び６．５μｌの１．０ｍｇ／ｍｌ溶液中でのパパイン酵素であった。そのサンプルを４０℃で４時間置き、４．８μｌの１Ｍヨードアセトアミドを添加して反応を止めた。パパイン消化後、Ｆａｂ及びＦｃ断片の存在を確認するために非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
【０２４０】
そのサンプルにおいてＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を行うために、全てのサンプルをまず水に対して透析した。その後、５０μｌの各サンプルを以下のクロマトグラフィー条件でＨＰＬＣ分析を行なった。
カラム＝Ｄｉｏｎｅｘ  ＷＣＸ−１０弱陽イオン交換カラム
“Ａ”バッファー＝ｐＨ５．５の１０ｍＭ  ＭＥＳ
“Ｂ”バッファー＝ｐＨ５．５の１０ｍＭ  ＭＥＳ；１．０Ｍ  ＮａＣｌ
溶出＝４−２５％“Ｂ”を３０分の間０．８ｍｌ／ｍｉｎで溶出
検出＝２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果は、脱アミド化条件下の時間ゼロ及び２日サンプルにおいて、脱アミド化したＦａｂのピーク面積を図７に示す。
【０２４１】
【表７】
2007513633.tif 000009
【０２４２】
ｃＩＥＦ分析を行うために、サンプルをまず水に対して３時間透析し、分析の標準的な方法を用いてｃＩＥＦ分析を行なった。ｃＩＥＦ分析の結果として、脱アミド化条件下での時間ゼロ及び２日サンプルにおいての脱アミド化したＦａｂのピーク面積を下記の表８に示す。
【０２４３】
【表８】
2007513633.tif 000010
【０２４４】
強制的な脱アミド化のｐＨ依存性について調べるために、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の２日サンプルにおいてのＩＥＸ−ＨＰＬＣデータを、脱アミド化条件下の２日サンプルと比較した。その結果として、脱アミド化条件下のＰＢＳ２日サンプル及び２脱アミド化条件下の２日サンプルのＦａｂのピーク面積を下記の表９に示す。
【０２４５】
【表９】
2007513633.tif 000011
このデータは、中性のｐＨと比較し、塩基性のｐＨの下で速度が増加すると、β−アスパルチルシフトメカニズムによるポリペプチドの脱アミド化が発生すると予想されるタンパク質分解の既存の理論を支持する。
【実施例１１】
【０２４６】
＜安定性が向上した１３Ｈ５変異体の調製及び特徴付け＞
本実施例において、１３Ｈ５変異体をＡｓｎ−５５でアミノ酸置換を有するように調製し、実施例１０に記載されるようにｃＩＥＦ分析によって、変異体の安定性を脱アミド化条件下に２日置いて調べた。変異体を標準的な組み換えＤＮＡ変異手法によって調製し、野生型１３Ｈ５とＶＨのアミノ酸位置５５−５８での変異の配列は、以下の通りであった。
１３Ｈ５野生型：  Ｎ  Ｇ  Ｎ  Ｔ
変異体番号１：    Ｄ  Ｇ  Ｎ  Ｔ
変異体番号２：    Ｑ  Ｇ  Ｎ  Ｔ
変異体番号３：    Ｑ  Ｇ  Ｑ  Ｔ
変異体番号１、変異体番号２及び変異体番号３の全長のＶＨアミノ酸配列は、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６に示される。
【０２４７】
野生型及び２日脱アミド化条件の変異体のｃＩＥＦ分析した結果について、脱アミド化したＦａｂのピーク面積を下記の表１０に示す。
【０２４８】
【表１０】
2007513633.tif 000012
結果から、３つのＡｓｎ−５５変異体は、野生型の１３Ｈ５抗体より強制的な脱アミド化条件下で良い安定性を示すことが明らかである。
【０２４９】
配列リストの要約
【表１１】
2007513633.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１Ａ】１３Ｈ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２５）及びアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号４）及びＣＤＲ３（配列番号７）領域を線引きし、そしてＶ、Ｄ、及びＪ生殖系列の派生を表す。
【図１Ｂ】１３Ｈ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２８）及びアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１３）及びＣＤＲ３（配列番号１６）領域を線引きし、そしてＶ、Ｄ、及びＪ生殖系列の派生を表す。
【図２Ａ】１３Ｈ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２６）及びアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２）、ＣＤＲ２（配列番号５）及びＣＤＲ３（配列番号８）領域を線引きし、そしてＶ、Ｄ、及びＪ生殖系列の派生を表す。
【図２Ｂ】１３Ｈ７ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２９）及びアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１１）、ＣＤＲ２（配列番号１４）及びＣＤＲ３（配列番号１７）領域を線引きし、そしてＶ、Ｄ、及びＪ生殖系列の派生を表す。
【図３Ａ】７Ｈ９ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２７）及びアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３）ＣＤＲ２（配列番号６）及びＣＤＲ３（配列番号９）領域を線引きし、そしてＶ、Ｄ、及びＪ生殖系列の派生を表す。
【図３Ｂ】７Ｈ９ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３０）及びアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１２）、ＣＤＲ２（配列番号１５）及びＣＤＲ３（配列番号１８）領域を線引きし、そしてＶ、Ｄ、及びＪ生殖系列の派生を表す。
【図４】１３Ｈ５及び７Ｈ９の重鎖可変領域及びヒト生殖系列ＶＨ  １−１８（配列番号３１）とのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図５】１３Ｈ７の重鎖可変領域及びヒト生殖系列ＶＨ  ４−６１（配列番号３２）とのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６】１３Ｈ５、１３Ｈ７及び７Ｈ９の軽鎖可変領域及びヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７（配列番号３３）とのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図７】ｍＡｂ  １３Ｈ５による１２５Ｉ−ＩＦＮα  ２ａ結合の増加（▼）と対比した、非ラベルＩＦＮα  ２ａによるＩＦＮＡＲを発現するＤａｕｄｉ細胞との結合（●）の競合物質の濃度を示したグラフである。アイソタイプコントロール抗体は、結合において効果がなかった（◆）。
【図８】ＩＦＮα  ２ａの存在下での１２５Ｉ−１３Ｈ５のＤａｕｄｉ細胞に結合（■）するが、ＩＦＮα  ２ａ非存在下では結合しない（▲）ことを示すグラフである。１３Ｈ５の特異的なＩＦＮα依存的な結合は丸（●）によって表される。
【図９】１３Ｈ５存在下（■）、１３Ｈ５＋ＩＦＮα存在下（▲）、アイソタイプコントロール抗体＋ＩＦＮα（▼）、又は陽性対照抗体（●）の新鮮なヒト単核細胞による、Ｒａｊｉ細胞溶解のＡＤＣＣ検定の結果を示すグラフである。溶解は、陽性対照を用いた場合のみ見られた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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