(57)【要約】１またはそれ以上のｃｄｋモデュレート剤による処置に対する細胞の応答と相関関係のある発現パターンを有するバイオマーカー、およびその使用。ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤を投与することを含む癌の治療方法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを試験または予測する方法もまた提供される。
2007507204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤を投与することを含む癌の治療方法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを試験または予測する方法であって、
（ａ）配列番号：１２４６のヌクレオチド配列のレベルを哺乳動物で測定し、
（ｂ）該哺乳動物を、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に暴露し、ついで
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、配列番号：１２４６の該ヌクレオチド配列のレベルを該哺乳動物で測定する
ことを含み、その際、工程（ａ）で測定した配列番号：１２４６の該ヌクレオチド配列のレベルと比較した工程（ｃ）で測定した配列番号：１２４６の該ヌクレオチド配列のレベルの差異が、該哺乳動物が癌の該治療方法に治療的に応答するであろうことを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
該薬剤が、Ｎ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に対して哺乳動物が応答するか否かを決定する方法であって、
（ａ）哺乳動物から生物学的試料を得、
（ｂ）該生物学的試料で配列番号：１２４６のヌクレオチド配列のレベルを測定し、
（ｃ）配列番号：１２４６の該ヌクレオチド配列の該レベルをベースラインレベルと相関させ、ついで
（ｄ）該相関に基づいて該哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に応答するか否かを決定する
ことを含む方法。
【請求項４】
該薬剤が、Ｎ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤を投与することを含む癌の治療方法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを試験または予測する方法であって、
（ａ）表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを哺乳動物で測定し、
（ｂ）該哺乳動物を、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に暴露し、
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物で測定する
ことを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物が癌の該治療方法に治療的に応答するであろうことを示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
該薬剤が、Ｎ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該少なくとも１のバイオマーカーがタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該少なくとも１のバイオマーカーがｍＲＮＡ転写物である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に対して哺乳動物が応答するか否かを決定する方法であって、
（ａ）哺乳動物から生物学的試料を得、
（ｂ）該生物学的試料で表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを測定し、
（ｃ）少なくとも１のバイオマーカーの該レベルをベースラインレベルと相関させ、ついで
（ｄ）該相関に基づいて該哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に応答するか否かを決定する
ことを含む方法。
【請求項１０】
ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に対して哺乳動物が応答するか否かを決定する方法であって、
（ａ）該哺乳動物を該薬剤に暴露し、ついで
（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物で測定する
ことを含み、その際、該薬剤に暴露されていない哺乳動物における該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする該薬剤に応答することを示すことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にファーマコゲノミクスの分野に関し、さらに詳細には、その発現パターンが１またはそれ以上のｃｄｋモデュレート剤（modulating agents）で処理した細胞の応答と相関関係を有する薬力学的バイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
制御不能の増殖が癌細胞の顕著な特徴である。過去２０年間の間に、細胞周期の進行を直接制御する分子が腫瘍形成の際の欠陥を蓄積させることがますます明らかになってきた。これら欠陥は、チェックポイント制御の喪失および／または細胞周期進行の駆動体であるサイクリン依存性キナーゼ（「ｃｄｋ」または「ＣＤＫ」と称する）の不適切な活性化という結果となりうる。ｃｄｋ機能の誤制御は主要な固形腫瘍タイプ（乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、およびＮＳＣＬ癌腫を含む）では高頻度で起こる。それゆえ、ｃｄｋおよび細胞周期進行のインヒビターは、大きな治療的用途を満たす可能性を有する。
【０００３】
ｃｄｋは、細胞周期および細胞増殖の背後の駆動力であるセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ｃｄｋは、少なくとも触媒サブユニットと調節（サイクリン）サブユニットとからなるマルチサブユニット酵素である。Morgan, D. O., Nature 1995; 374:131-134。今日、９つのｃｄｋ（ｃｄｋ１〜ｃｄｋ９）と１１のサイクリンサブユニットが同定されており、これらは１３以上の活性なキナーゼ複合体を形成することができる。Gould, K. L. (1994)、Protein Kinases (Woodgett, J. R.編)中, pp. 149-166, オックスフォードユニバーシティープレス、オックスフォード。正常な細胞では、これら酵素の多くは、細胞周期進行において別個の役割を果たしているＧ１、Ｓ、またはＧ２／Ｍ相の酵素として分類することができる。van den Heuvel, S.およびHarlow, E., Science 1993; 262: 2050-2054。ｃｄｋは、腫瘍サプレッサー（たとえば、RB、p53）、転写因子（たとえば、E2F-DP1、RNA pol II）、複製因子（たとえば、DNA pol α、複製タンパク質A）、および細胞やクロマチンの構造に影響を及ぼす組織化因子（organizational factors）を含む様々な細胞タンパク質をリン酸化し、その活性をモデュレートしている。Nigg, E. A., Trends in Cell Biology 1993; 3:296-301; Rickert, P.ら、Oncogene 1996; 12:2631-2640; Dynlacht, B. D.ら、Mol. Cell. Biol. 1997; 17:3867-3875; Ookata, K.ら、Biochemistry 1997; 36:15873-15883。
【０００４】
ｃｄｋ活性は様々な整合された（co-ordinated）機構によって制御されており、かかる機構には細胞周期依存性の転写および翻訳、細胞周期依存性のタンパク質加水分解、細胞レベル下の局在、翻訳後修飾、およびｃｄｋインヒビタータンパク質（「ＣＫＩ」と称する）との相互作用が含まれる。Pines, J.およびHunter, T., Cell 1989; 58:833-846; King, R. W.ら、Science 1996; 274:1652-1659; Li, J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997; 94:502-507; Draetta, G.およびBeach, D., Cell 1988; 54:17-26; Harper, J. W., Cancer Surv. 1997; 29:91-107。細胞周期チェックポイントが構築されるのはこれら機構を通じてである。このチェックポイントの調節がｃｄｋ機能の制御により行われるとの理解は、ｃｄｋおよびその制御経路を化学療法剤の開発のためのやむにやまれぬ標的とした。p27/cdk2/サイクリンE/RBチェックポイント経路が、明らかに腫瘍形成に関与している。
【０００５】
多数の報告は、ｃｄｋ２のコアクチベーターであるサイクリンＥおよびインヒビターであるｐ２７の両者が固形腫瘍で過剰発現されるかまたは過小発現されることを示している。Porter, P. L.ら、Nat. Med. 1997; 3:222-225; Kitahara, K.ら、Int. J. Cancer 1995; 62:25-28; Wang, A.ら、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1996; 122:122-126; Keyomarsi, K.ら、Cancer Res. 1994; 54:380-385; Courjal, F.ら、Int. J. Cancer 1996; 69:247-253; Akama, Y.ら、Jpn. J. Cancer Res. 1995; 86:617-621; Tan, P.ら、Cancer Res. 1997; 57:1259-1263; Catzavelos, C.ら、Nat. Med. 1997; 3:227-230; Fredersdorf, S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997; 94:6380-6385。これらの変化した発現は、増大したｃｄｋ２活性レベルおよび悪い予後と相関関係を有することが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗癌剤の初期の臨床開発においては、臨床試験は典型的に、安全性、許容性（tolerability）、および薬物動力学を評価すべく、並びに適当な投与量やさらなる臨床評価のためのスケジュールを同定すべくデザインされている。初期の臨床試験において、とりわけ最大の許容できる投与量まで服用することが適切でない場合に、新規な薬剤の薬理効果をも評価することの必要性がますます高まっている。その結果、腫瘍標的の薬理学的モデュレーションと相関関係を有する薬力学的（ＰＤ）バイオマーカーを同定することに相当の関心が存在している。これらＰＤバイオマーカーは、腫瘍特異的であってよいが、理想的には皮膚や末梢血細胞などの利用可能な代理組織で発現されるべきである。これらＰＤバイオマーカーの同定は、目的因子によってターゲティングされる分子に関連する既知の生物学によって予想されるように、特定のポリペプチドまたはｍＲＮＡにおける変化を分析することにより行うことができる。あるいは、ＰＤバイオマーカーは、該因子の有効投与量に暴露した細胞または組織でのポリペプチドまたはｍＲＮＡにおける全体的な変化を分析することにより同定することができる。これらＰＤバイオマーカーは、同定されたら、患者の適当なレベルの因子が達成されたときの腫瘍標的の所望の薬理学的モデュレーション（たとえば、抑制）を示すのに用いることができる。
【０００７】
その発現パターンが、１またはそれ以上のｃｄｋモデュレート剤による処理に対する細胞の応答と相関関係を有するバイオマーカーを同定することに対する必要性がなお存在する。
【０００８】
ｍＲＮＡ発現パターンの大スケールの特徴付けのためのマイクロアレイ技術の開発は、その発現が医薬処理によりモデュレートされる分子バイオマーカーの体系的な探索を可能にした。そのような技術および分子ツールは、細胞集団内でのあらゆる時点の多数の転写物の発現レベルのモニターを可能にした（たとえば、Schenaら、1995, Science, 270:467-470; Lockhartら、1996, Nature Biotechnology, 14:1675-1680; Blanchardら、1996, Nature Biotechnology, 14:1649; 米国特許第5,569,588号を参照）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤に対する患者の感受性を決定するための方法および手順を提供する。本発明はまた、癌などの疾患状態または障害の治療を必要とする個体が、処置の投与に先立って該処置に応答するか否かを決定または予期する方法であって、該処置がｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤からなるものである方法をも提供する。該ｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤は、小分子または生物学的分子であってよい。一つの側面において、該薬剤は、サイクリン依存性キナーゼ２（ｃｄｋ２）／サイクリンＥを抑制する小分子である。
【００１０】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤を投与することを含む癌の治療方法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを試験または予測する方法をも提供し、該方法は、（ａ）表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを哺乳動物で測定し、（ｂ）該哺乳動物を、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物で測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物が癌の該治療方法に治療的に応答するであろうことを示す。
【００１１】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に対して哺乳動物が応答するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該薬剤に暴露し、ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物で測定することを含み、その際、該薬剤に暴露されていない哺乳動物における該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする該薬剤に応答することを示すものである方法をも提供する。
【００１２】
本明細書において応答とは、たとえば、哺乳動物における生物学的応答（たとえば、細胞の応答）または臨床的応答（たとえば、改善された症状、治療効果、または副作用）を含む。
【００１３】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に対して哺乳動物が応答するか否かを決定する方法であって、（ａ）哺乳動物から生物学的試料を得、（ｂ）該生物学的試料で表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを測定し、（ｃ）少なくとも１のバイオマーカーの該レベルをベースラインレベルと相関させ、ついで（ｄ）該相関に基づいて該哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に応答するか否かを決定することを含む方法をも提供する。
【００１４】
本明細書において、相関のために使用するベースラインレベルは、当業者により決定することができる。一つの側面において、ベースラインレベルは、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーの該薬剤に暴露されていない哺乳動物におけるレベルである。他の側面において、ベースラインレベルは、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーの、ｃｄｋモデュレート剤でこれから処置するが未だ該薬剤に暴露されていない哺乳動物におけるレベルである。さらに他の側面において、ベースラインは、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのｃｄｋモデュレート剤で処置した哺乳動物におけるレベルであり、その際、ベースラインは、ｃｄｋモデュレート剤による処置の所定の時点で選択される。この時点は、たとえば、処置の開始前に設定した基準（たとえば、生物学的応答または臨床的応答）の測定のための確立した期間であってよい。
【００１５】
哺乳動物からの少なくとも１のバイオマーカーのレベルとベースラインレベルとの統計的に有意の差異は、本発明の方法に用いることができる。哺乳動物からの少なくとも１のバイオマーカーのレベルとベースラインレベルとの統計的に有意の差異は当業者によって容易に決定することができ、たとえば、少なくとも１のバイオマーカーのレベルにおける少なくとも２倍の差異、少なくとも３倍の差異、または少なくとも４倍の差異であってよい。
【００１６】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤を投与することを含む癌の治療方法に対して治療的に応答する哺乳動物を同定する方法をも提供し、該方法は、（ａ）表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを哺乳動物で測定し、（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料を該薬剤に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該生物学的試料で測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物が癌の該治療方法に治療的に応答するであろうことを示す。
【００１７】
本明細書において治療的応答とは、癌の緩和（alleviation）または廃棄（abrogation）をいう。これは、癌を罹患した個人の平均余命が長くなること、または癌の徴候の１またはそれ以上が低減または改善することを意味する。この語は、癌様の細胞増殖または腫瘍容積の低減を包含する。哺乳動物が治療的に応答するか否かは、ＰＥＴ造影法などの当該技術分野でよく知られた多くの方法により測定することができる。
【００１８】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤を投与することを含む癌の治療方法に対して治療的に応答する哺乳動物を同定する方法をも提供し、該方法は、（ａ）該哺乳動物からの生物学的試料をｃｄｋ活性をモデュレートする該薬剤に暴露し、（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該生物学的試料で測定することを含み、その際、ｃｄｋ活性をモデュレートする該薬剤に暴露していない哺乳動物における該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物が癌の該治療方法に治療的に応答するであろうことを示す。
【００１９】
本発明はまた、ある薬剤が哺乳動物においてｃｄｋ活性をモデュレートするか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該薬剤に暴露し、ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物で測定することを含み、その際、該薬剤に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差異が、該薬剤が哺乳動物においてｃｄｋ活性をモデュレートすることを示すものである方法をも提供する。
【００２０】
本発明はまた、哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に暴露されたか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物からの生物学的試料を該薬剤に暴露し、ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１に示すバイオマーカーから選択した少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該生物学的試料で測定することを含み、その際、該薬剤に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物がｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤に暴露されたことを示すものである方法をも提供する。
【００２１】
哺乳動物は、たとえば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、霊長類、またはサルであってよい。
【００２２】
本発明の方法は、インビボまたはインビトロの方法であってよい。一つの側面において、少なくとも１のバイオマーカーのレベルを哺乳動物で測定する工程はインビトロであり、該哺乳動物から生物学的試料を採取し、ついで該生物学的試料中の該少なくとも１のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。生物学的試料としては、たとえば、新鮮な全血、末梢血単核細胞、凍結した全血、新鮮な血漿、凍結した血漿、尿、唾液、皮膚、毛包、骨髄、または腫瘍組織の少なくとも１つが挙げられる。
【００２３】
本発明の一つの側面において、本発明の方法は、バイオマーカーＷ２８７２９（配列番号１２４６）の使用を含む。
【００２４】
該少なくとも１のバイオマーカーのレベルは、たとえば、該少なくとも１のバイオマーカーのタンパク質および／またはｍＲＮＡ転写物のレベルであってよい。
【００２５】
本発明はまた、表１に示すバイオマーカーから選択される単離されたバイオマーカーをも提供する。本発明のバイオマーカーは、表１および配列表にて提供されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から選択される配列、並びにその断片および変異体を含む。
【００２６】
本発明はまた、疾患処置の治療の開発のための標的として機能しうる１またはそれ以上のバイオマーカーをも提供する。そのような標的は、癌または腫瘍の治療に特に応用できるものである。
【００２７】
本発明はまた、表１に示すバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーセットをも提供する。
【００２８】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤を含む治療に対して患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するためのキットをも提供する。一つの側面において、患者は、癌を罹患していてよい。
【００２９】
一つの側面において、本発明のキットは、本発明の１またはそれ以上の特別のマイクロアレイを入れた適当な容器、患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに用いるｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤、および使用の指示書を含む。キットはさらに、バイオマーカーセットの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでモニターするための試薬または材料を含んでいてよい。
【００３０】
本発明はまた、表１に示すバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むキットをも提供する。
【００３１】
本発明はまた、表１に示すバイオマーカーから選択される少なくとも１のバイオマーカーの存在を検出するための抗体および核酸の少なくとも一つを含むキットをも提供する。一つの側面において、該キットはさらに、ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤の投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを決定するための指示を含む。他の側面において、該指示は、（ａ）表１に示すバイオマーカーから選択される少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、（ｂ）該哺乳動物を該薬剤に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも１のバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定する工程を含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも１のバイオマーカーのレベルの差異が、該哺乳動物が癌の該治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである。
【００３２】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤による治療に対して患者が感受性または耐性であるか否かを決定するためのスクリーニングアッセイをも提供する。
【００３３】
本発明はまた、疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法であって、該疾患がｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤を投与することを含む方法により治療されるものである方法をも提供する。
【００３４】
本発明はまた、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要な個性化された遺伝子プロファイルをも提供する。
【００３５】
本発明はまた、ｃｄｋ活性をモデュレートする１またはそれ以上の薬剤に対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現プロファイルを有する１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別なマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも提供する。
【００３６】
本発明はまた、本発明の１またはそれ以上のバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも提供する。そのような抗体は、様々な仕方で用いることができ、たとえば、インビトロおよびインビボの両者の診断法、検出法、スクリーニング法、および／または治療法を含む、本発明のバイオマーカーポリペプチドを精製、検出、およびターゲティングするのに用いることができる。
【００３７】
本発明はまた、その発現がｃｄｋモデュレーションと相関関係を有するバイオマーカーを同定するための細胞培養モデルをも提供する。
【００３８】
本発明は、添付の図面と関連して考察しながら発明の詳細な説明を読むとより理解されるであろう。
【００３９】
本明細書において、「ｃｄｋ活性をモデュレートする薬剤」なる語は、本明細書において「ｃｄｋモデュレート剤」とも称するが、ｃｄｋ活性に、および／またはｃｄｋが関与する１またはそれ以上の経路に直接または間接に関与する生物学的分子または小分子である物質、およびその調合物を意味する。ｃｄｋモデュレート剤は、ｃｄｋアンタゴニストまたはインヒビターであってよい。ｃｄｋモデュレート剤はまた、ｃｄｋアゴニストまたはアクチベーターであってもよい。
【００４０】
一つの側面において、ｃｄｋモデュレート剤は、ｃｄｋ２活性に、および／またはｃｄｋ２が関与する１またはそれ以上の経路に直接または間接に関与する。他の側面において、ｃｄｋモデュレート剤は、ｃｄｋ１活性に、および／またはｃｄｋ１が関与する１またはそれ以上の経路に直接または間接に関与する。さらに他の側面において、ｃｄｋモデュレート剤は、ｃｄｋ４活性に、および／またはｃｄｋ４が関与する１またはそれ以上の経路に直接または間接に関与する。
【００４１】
生物学的分子としては、全ての脂質および単糖のポリマー、アミノ酸、および分子量が４５０を超えるヌクレオチドが挙げられる。それゆえ、生物学的分子としては、たとえば、オリゴ糖および多糖；オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質；およびオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとしては、たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。生物学的分子はさらに、上記分子のいずれかの誘導体を含む。たとえば、生物学的分子の誘導体としては、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質の脂質およびグリコシル化誘導体が挙げられる。
【００４２】
上記で検討した生物学的分子に加えて、ｃｄｋモデュレート剤はまた小分子であってもよい。生物学的分子でないあらゆる分子は、本明細書では小分子として扱われる。小分子の幾つかの例としては、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、糖、アミノ酸、およびヌクレオチドが挙げられる。小分子としては、さらに、分子量が４５０を超えないこと以外は生物学的分子と考えられる分子が挙げられる。それゆえ、小分子は、分子量が４５０またはそれ以下の脂質、オリゴ糖、オリゴペプチド、およびオリゴヌクレオチドおよびその誘導体であってよい。
【００４３】
小分子はいかなる分子量であってもよいことが強調される。小分子は、それが典型的に４５０未満の分子量を有するゆえに小分子と呼ばれるにすぎない。小分子は天然に見出される化合物並びに合成化合物を含む。一つの態様において、ｃｄｋモデュレート剤は、ｃｄｋまたはｃｄｋが関与する経路を抑制する小分子である。
【００４４】
たとえば、フラボピリドール（flavopiridol）（Aventis Pharmaceuticals Inc.、ブリッジウォーター、ニュージャージー、米国）およびＣＹＣ２０２（Cyclacel Limited、ダンディー、英国）を含む多数の小分子がｃｄｋを抑制するのに有用であると記載されている。ｃｄｋインヒビターはまた、たとえば、米国特許6,040,321号、同第6,214,852号、同第6,262,096号、同第6,515,004号、および同第6,521,759号に開示された小分子を含む。
【００４５】
一つの側面において、ｃｄｋモデュレート剤は小分子のｃｄｋインヒビターである。他の側面において、ｃｄｋモデュレート剤は小分子のｃｄｋ２インヒビターである。他の側面において、ｃｄｋモデュレート剤は小分子のｃｄｋ１インヒビターである。さらに他の側面において、ｃｄｋモデュレート剤は小分子のｃｄｋ４インヒビターである。さらなる側面において、ｃｄｋモデュレート剤は、Ｎ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩である。
【００４６】
本発明は、ｃｄｋモデュレート剤による処置に対する患者の応答をモニターする方法を提供する。これら方法は、（i）ｃｄｋモデュレート剤による処置の経過にわたって患者の応答を追跡するうえで；（ii）処置のために選択した特定のｃｄｋモデュレート剤が患者に適しているか否かを決定するうえで；（iii）投与したｃｄｋモデュレート剤の投与量が患者に適しているか否かを決定するうえで；（iv）投与したｃｄｋモデュレート剤のタイプおよび／または量を処置期間にわたって変える必要があるか否かを決定するうえで；（v）いつ処置が完了したかを決定するうえで；および（vi）終了した処置を再開する必要があるか否かを決定するうえで有用である。これら方法はまた、患者がｃｄｋモデュレート剤により処置から利益を得るか否かを同定するのにも有用である。
【００４７】
一つの側面において、本発明は、ｃｄｋモデュレート剤を含む処置を受けた患者が該患者の腫瘍においてｃｄｋを抑制するのに充分な処置を受けたか否かを決定する方法を提供する。本発明によれば、腫瘍生検または代理生検をｃｄｋモデュレート剤で処置する前および処置後に患者から得る。代理生検は、たとえば、皮膚または末梢血であってよい。ついで、細胞をアッセイしてｃｄｋモデュレート剤による処置後に本発明の１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンの変化を決定して、ｃｄｋ抑制が該処置によって達成されたか否かを決定する。処置の成功または失敗は、被験組織、たとえば、腫瘍生検または癌生検からの被験細胞の発現パターンが、１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンと相対的に同じかまたは異なるかに基づいて決定することができる。もしも被験細胞がバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットの発現プロファイルに対応する発現プロファイルを示すなら、その個人の癌または腫瘍が、一つの側面ではｃｄｋを抑制するのに充分な濃度のモデュレート剤に暴露されたことが予測される。対照的に、もしも被験細胞がバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットに対応しない遺伝子発現プロファイルを示すなら、モデュレート剤の暴露がｃｄｋを抑制するのに充分でなかったことが予測される。
【００４８】
他の側面において、本発明は、処置後の患者の組織試料、たとえば、腫瘍生検または癌生検からの細胞の発現プロファイルをバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットと比較することによる、ｃｄｋモデュレート剤で治療しうる疾患を罹患した患者の処置をモニターする方法を提供する。患者から単離した細胞は、アッセイしてその発現パターンを決定し、異なるｃｄｋモデュレート剤などの異なる処置を正当化すべく、あるいは現在の処置を中断すべく、発現プロファイルの変化が生じたか否かを決定する。ｃｄｋモデュレート剤で処置後に得られた細胞の発現プロファイルをバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットの発現プロファイルと比較する。
【００４９】
そのようなモニタリングプロセスは、患者の試料から単離した細胞の発現パターンが、バイオマーカーまたはバイオマーカーのセットの発現パターンと相対的に同じかまたは異なるかに基づいてｃｄｋモデュレート剤による患者の処置の成功または失敗を示すことができる。それゆえ、もしもｃｄｋモデュレート剤で処理した後に被験細胞がバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットからの発現プロファイルにおいて変化を示すなら、それは、現在の処置を改変、変更、あるいは中断さえもすべきとの指標として役立つ。そのようなモニタリングプロセスは、必要により、または所望により、繰り返すことができる。所定の処置に対する患者の応答のモニタリングは、ｃｄｋモデュレート剤により処置の前と処置後よりも、むしろｃｄｋモデュレート剤により処置の後にのみ上記アッセイにおける患者の細胞を試験することを包含していてよい。
【００５０】
本発明は、ｃｄｋモデュレーションの特異的な薬力学的バイオマーカーの同定に基づく。本発明に従い、ｃｄｋモデュレート剤に対する感受性を決定した処理細胞株のパネルにおいて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルを測定した。処理細胞における遺伝子発現プロファイルの決定は、その発現レベルがｃｄｋのモデュレーションまたはｃｄｋが関与する経路のモデュレーションと高度の相関関係を有するバイオマーカーの同定を可能とした。それゆえ、これらバイオマーカーは患者においてｃｄｋモデュレーションのレベルを推測するのに有用である。
【００５１】
本発明のバイオマーカーは、ポリヌクレオチドを含み、これには完全長遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および発現配列タグ（ＥＳＴ）や構造ＲＮＡなどの部分配列が含まれる。一つの側面において、本発明は、たとえば配列番号１２６４のヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチドなどの表１に示すヌクレオチド配列から選択したヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチドに関する。バイオマーカーはさらに、これらポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のバイオマーカーは、以下に表１で提供されるものを含む。一つの側面において、これらポリヌクレオチドおよびポリペプチドは単離された形態にある。
【００５２】
表１
【表１】
2007507204.tif 000003
【表２】
2007507204.tif 000004
【表３】
2007507204.tif 000005
【表４】
2007507204.tif 000006
【表５】
2007507204.tif 000007
【表６】
2007507204.tif 000008
【表７】
2007507204.tif 000009
【表８】
2007507204.tif 000010
【表９】
2007507204.tif 000011
【表１０】
2007507204.tif 000012
【表１１】
2007507204.tif 000013
【表１２】
2007507204.tif 000014
【表１３】
2007507204.tif 000015
【表１４】
2007507204.tif 000016
【表１５】
2007507204.tif 000017
【表１６】
2007507204.tif 000018
【表１７】
2007507204.tif 000019
【表１８】
2007507204.tif 000020
【表１９】
2007507204.tif 000021
【表２０】
2007507204.tif 000022
【表２１】
2007507204.tif 000023
【表２２】
2007507204.tif 000024
【表２３】
2007507204.tif 000025
【表２４】
2007507204.tif 000026
【表２５】
2007507204.tif 000027
【表２６】
2007507204.tif 000028
【表２７】
2007507204.tif 000029
【表２８】
2007507204.tif 000030
【表２９】
2007507204.tif 000031
【表３０】
2007507204.tif 000032
【表３１】
2007507204.tif 000033
【表３２】
2007507204.tif 000034
【表３３】
2007507204.tif 000035
【表３４】
2007507204.tif 000036
【表３５】
2007507204.tif 000037
【表３６】
2007507204.tif 000038
【表３７】
2007507204.tif 000039
【表３８】
2007507204.tif 000040
【表３９】
2007507204.tif 000041
【表４０】
2007507204.tif 000042
【表４１】
2007507204.tif 000043
【表４２】
2007507204.tif 000044
【表４３】
2007507204.tif 000045
【表４４】
2007507204.tif 000046
【表４５】
2007507204.tif 000047
【表４６】
2007507204.tif 000048
【表４７】
2007507204.tif 000049
【表４８】
2007507204.tif 000050
【表４９】
2007507204.tif 000051
【表５０】
2007507204.tif 000052
【表５１】
2007507204.tif 000053
【表５２】
2007507204.tif 000054
【表５３】
2007507204.tif 000055
【表５４】
2007507204.tif 000056
【表５５】
2007507204.tif 000057
【表５６】
2007507204.tif 000058
【表５７】
2007507204.tif 000059
【表５８】
2007507204.tif 000060
【表５９】
2007507204.tif 000061
【表６０】
2007507204.tif 000062
【表６１】
2007507204.tif 000063
【表６２】
2007507204.tif 000064
【表６３】
2007507204.tif 000065
【表６４】
2007507204.tif 000066
【表６５】
2007507204.tif 000067
【表６６】
2007507204.tif 000068
【表６７】
2007507204.tif 000069
【表６８】
2007507204.tif 000070
【表６９】
2007507204.tif 000071
【表７０】
2007507204.tif 000072
【表７１】
2007507204.tif 000073
【表７２】
2007507204.tif 000074
【表７３】
2007507204.tif 000075
【表７４】
2007507204.tif 000076
【表７５】
2007507204.tif 000077
【表７６】
2007507204.tif 000078
【表７７】
2007507204.tif 000079
【表７８】
2007507204.tif 000080
【表７９】
2007507204.tif 000081
【表８０】
2007507204.tif 000082
【表８１】
2007507204.tif 000083
【表８２】
2007507204.tif 000084
【表８３】
2007507204.tif 000085
【表８４】
2007507204.tif 000086
【表８５】
2007507204.tif 000087
【表８６】
2007507204.tif 000088
【表８７】
2007507204.tif 000089
【表８８】
2007507204.tif 000090
【表８９】
2007507204.tif 000091
【表９０】
2007507204.tif 000092
【表９１】
2007507204.tif 000093
【表９２】
2007507204.tif 000094
【表９３】
2007507204.tif 000095
【表９４】
2007507204.tif 000096
【表９５】
2007507204.tif 000097
【表９６】
2007507204.tif 000098
【表９７】
2007507204.tif 000099
【表９８】
2007507204.tif 000100
【表９９】
2007507204.tif 000101
【表１００】
2007507204.tif 000102
【表１０１】
2007507204.tif 000103
【表１０２】
2007507204.tif 000104
【表１０３】
2007507204.tif 000105
【表１０４】
2007507204.tif 000106
【表１０５】
2007507204.tif 000107
【表１０６】
2007507204.tif 000108
【表１０７】
2007507204.tif 000109
【表１０８】
2007507204.tif 000110
【表１０９】
2007507204.tif 000111
【表１１０】
2007507204.tif 000112
【表１１１】
2007507204.tif 000113
【００５３】
表１で提供されるバイオマーカーのアナログもまた本発明の範囲に包含される。アナログは、天然に存在するバイオマーカーとはヌクレオチド配列またはアミノ酸配列または配列が関与しない仕方において、またはその両者において異なっていてよい。非配列的な修飾は、インビボまたはインビトロでの化学的誘導体化を含む。非配列的な修飾はまた、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、またはグリコシル化における変化をも含む。
【００５４】
表１で提供するバイオマーカーの好ましいアナログ（または生物学的に活性なその断片）は、その配列が野生型の配列とは１またはそれ以上の保存的アミノ酸置換により異なる、または生物学的活性を損なわない１またはそれ以上の非保存的なアミノ酸置換、欠失、または挿入により異なるものを包含する。保存的な置換は、典型的に、１のアミノ酸を同様の特性を有する他のアミノ酸で置換すること、たとえば、以下の群内での置換を含む：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００５５】
本発明のバイオマーカーは、標準生化学的アッセイ法を用いて生物学的試料中で検出および定量できる生物学的分子であって、生物学的試料中の該バイオマーカーの存在および／または量が、（i）適当な処理を選択するのに用いることができるか、または（ii）ｃｄｋモデュレート剤による処理の有効性および進行をモニターするのに用いることができるものであればいかなる生物学的分子をも包含する。
【００５６】
一つの側面において、本発明は、配列番号１２４６で提供され、ジーンバンクアクセッション番号Ｗ２８７２９を付与されたバイオマーカーを含む。このバイオマーカーは、ｃｄｋモデュレート剤で処理したときに細胞におけるｃｄｋの抑制と相関関係を有する発現パターンを有することが見出された。配列番号１２４６のバイオマーカーは、ｃｄｋ抑制に応答して最も一貫しかつ強壮な制御を示すことが見出された。
【００５７】
本発明はまた、１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも包含する。
【００５８】
本発明はまた、以下のものを入れた適当な容器を含むキットをも包含する：１またはそれ以上のバイオマーカーを含む１またはそれ以上のマイクロアレイ；患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに使用する１またはそれ以上のｃｄｋモデュレート剤；および使用の指示書。さらに、本発明によって包含されるキットは、本明細書においてさらに記載するように、当該技術分野で実施されている他の技術および系、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（本明細書に記載する１またはそれ以上のバイオマーカーに基づいてデザインしたプライマーを使用する）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイ、イムノブロッティング、たとえば、ウエスタンブロッティング、またはインシトゥハイブリダイゼーションなどを用い、たとえば、本発明のバイオマーカーの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでモニターするための試薬または材料をさらに含んでいてよい。
【００５９】
本発明はまた、１またはそれ以上のバイオマーカーポリペプチドに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも包含する。そのような抗体は様々な仕方で用いることができ、たとえばインビトロおよびインビボ両者での診断法、検出法、スクリーニング法、および／または治療法を含めて、本発明のバイオマーカーポリペプチドを精製、検出、およびターゲティングするのに用いることができる。
【００６０】
本発明の方法のいずれかを実施するに際して、単一のバイオマーカーかまたは２またはそれ以上のバイオマーカーのセットのいずれかのレベルをアッセイすることができる。１を超えるバイオマーカーのアッセイは、ｃｄｋ抑制の程度などのｃｄｋモデュレート剤による処置に対する患者の応答をモニタリングすることの正確さを増大させることができる。複数のバイオマーカーの測定は、同じ患者から採取した同じ生物学的試料かまたは異なる生物学的試料のいずれかで異なるバイオマーカーをアッセイすることにより行うことができる。
【００６１】
一つの側面において、本発明は、ｃｄｋモデュレート剤の投与による処置に対する、疾患について処置した患者の応答をモニターする方法であって、（ａ）該剤で最初に処置する前に患者から採取した第一の生物学的試料中の少なくとも１のバイオマーカーの量を決定し、（ｂ）該剤で最初に処置した後に患者から採取した少なくとも第二の生物学的試料中の該バイオマーカーの量を決定し、ついで（ｃ）該第二の生物学的試料中に存在する該バイオマーカーの量を該第一の生物学的試料中に存在する該バイオマーカーの量と比較することを含み、その際、該第一の生物学的試料中に存在するバイオマーカーの量と比較した場合の該第二の生物学的試料および／またはその後の生物学的試料中のバイオマーカーの量の検出しうる変化が、患者が該剤により処置に対して肯定的に応答していることを示すものである方法を提供する。検出しうる変化は、第二の生物学的試料および／またはその後の生物学的試料中のバイオマーカーの量の低減または増大であってよい。
【００６２】
この方法は、患者から少なくとも２の生物学的試料を異なる時点で採取することを必要とする。第一の試料は、典型的にｃｄｋモデュレート剤で最初に処置する前に得る。ついで、ｃｄｋモデュレート剤による処置を開始した後に第二の試料を得、ついでその後の試料をも得る。この方法では、バイオマーカーは、（i）バイオマーカーの量が低減しているか否か、（ii）バイオマーカーの量の低減の割合が増大しているか否か、（iii）バイオマーカーの量が増大しているか否か、（iv）バイオマーカーの量の増大の割合が増大しているか否か、または（v）バイオマーカーの量が安定化しているか否か、を決定するためにモニターされ、これらのいずれも患者が特別の状況に応じて該処置に対して肯定的に応答していることを示すものである。
【００６３】
本明細書に記載するバイオマーカーは、１またはそれ以上のｃｄｋモデュレート剤による処理後にアップレギュレーションされるかまたはダウンレギュレーションされてよい。
【００６４】
バイオマーカーがアップレギュレーションされるバイオマーカーである場合は、バイオマーカーの量がｃｄｋモデュレート剤による処理後に増大するであろうこと、すなわち、第一の生物学的試料（ｃｄｋモデュレート剤の投与前）中のバイオマーカーの量と比較して第二の生物学的試料（ｃｄｋモデュレート剤の投与後）中のバイオマーカーの量の検出しうる増大があるであろうことが予測される。バイオマーカーがアップレギュレーションされるバイオマーカーであり、かつバイオマーカーのレベルが前もって決定したまたは検出しうる量を増大させない場合、またはバイオマーカーレベルの増大の割合が充分に高くない場合には、処置の投与量または回数を増やすことにより、または投与しているｃｄｋモデュレート剤をさらに有効なｃｄｋモデュレート剤に変えることにより、または処置に使用しているｃｄｋモデュレート剤を１またはそれ以上の他のｃｄｋモデュレート剤または療法と併用することにより、またはこれらを組み合わせることによるなどして、処置を改変することができる。
【００６５】
バイオマーカーがダウンレギュレーションされるバイオマーカーである場合は、バイオマーカーの量がｃｄｋモデュレート剤による処理後に低減するであろうこと、すなわち、第一の生物学的試料（ｃｄｋモデュレート剤の投与前）中のバイオマーカーの量と比較して第二の生物学的試料（ｃｄｋモデュレート剤の投与後）中のバイオマーカーの量の検出しうる低減があるであろうことが予測される。バイオマーカーがダウンレギュレーションされるバイオマーカーであり、かつバイオマーカーのレベルが前もって決定したまたは検出しうる量を低減させない場合、またはバイオマーカーレベルの低減の割合が充分に高くない場合には、処置の投与量または回数を増やすことにより、または投与しているｃｄｋモデュレート剤をさらに有効なｃｄｋモデュレート剤に変えることにより、または処置に使用しているｃｄｋモデュレート剤を１またはそれ以上の他のｃｄｋモデュレート剤または療法と併用することにより、またはこれらを組み合わせることによるなどして、処置を改変することができる。
【００６６】
本発明はさらに、ｃｄｋモデュレート剤の投与による疾患を罹患している患者の治療方法に対する改善を提供し、該改善は、該剤で処置する間の１またはそれ以上の時点で患者から採取した生物学的試料中の少なくとも１のバイオマーカーのレベルをモニターして、有効量の該剤が患者に投与されているか否かを決定することを含む。該剤の投与に応答して、ダウンレギュレーションされるバイオマーカーの生物学的試料中でのレベルが検出可能に低減する場合、またはバイオマーカーレベルの以前に観察した低減の割合が増大する場合は、有効量のｃｄｋモデュレート剤が患者に投与されている。さらに、該剤の投与に応答して、アップレギュレーションされるバイオマーカーの生物学的試料中でのレベルが検出可能に増大する場合、またはバイオマーカーレベルの以前に観察した増大の割合が増大する場合は、有効量のｃｄｋモデュレート剤が患者に投与されている。
【００６７】
本発明はさらに、ｃｄｋモデュレート剤の投与による疾患を罹患している患者の治療方法に対する改善を提供し、該改善は、該剤で処置する間の１またはそれ以上の時点で患者から採取した生物学的試料中の少なくとも１のバイオマーカーのレベルをモニターして、該剤による処置の充分な時間経過がいつ完了したかを決定することを含む。一つの態様において、ダウンレギュレーションされるバイオマーカーのレベルが前もって決定したレベル未満に検出可能に低減したときに、該剤による処置の充分な時間経過が完了している。他の態様において、アップレギュレーションされるバイオマーカーのレベルが前もって決定したレベルを超えて検出可能に増大したときに、該剤による処置の充分な時間経過が完了している。
【００６８】
バイオマーカーの量を決定する生物学的試料の種類は、特定のバイオマーカー、バイオマーカーがどこでおよびいつ合成されるか、バイオマーカーが組織中のどこで貯蔵されるか、およびバイオマーカーがどの生物学的組織または液に放出されるかあるいは蓄積されるかなどの種々の要因に依存するであろう。一般に、生物学的試料は、血液、血清や血漿などの血液成分、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、および尿よりなる群から選ばれるであろう。一つの側面において、生物学的試料は、血液、血清、血漿、またはＣＳＦであり、最も好ましくは血液、血清、または血漿であろう。１を超えるバイオマーカーを分析する場合は、分析は患者から得た同じかまたは異なる生物学的試料で行うことができる。
【００６９】
生物学的試料中のバイオマーカーの量は、当該技術分野で知られた標準技術を用いて決定することができる。たとえば、各バイオマーカーは、バイオマーカー特異的な抗体および当該技術分野で知られた免疫学的方法を用いてアッセイすることができる。ラジオイムノアッセイ、サンドイッチ酵素結合イムノアッセイ、競合結合アッセイ、均一アッセイ、および不均一アッセイを含むあらゆる適当なイムノアッセイ法を用いることができる。あるいは、バイオマーカーの量は、磁気共鳴分光分析、ＨＰＬＣ、または質量分光法などの他の技術を用いて決定することができる。いずれの場合も、選択したアッセイ法は、健常な患者で見出される正常値から神経学的な障害を示す上昇レベルまでの濃度範囲で特定のバイオマーカーを測定することができるに充分な感度を有していなければならない。アッセイは、当該技術分野で知られた自動イムノアッセイ分析機を用い、たとえばマイクロタイタープレート形態を含む種々の形態で行うことができる。
【００７０】
本明細書において生物学的試料中のバイオマーカーの前もって決定したレベルとは、生物学的試料中の特定のバイオマーカーの量または濃度であって、該バイオマーカーの該量が、ｃｄｋモデュレート剤で処置していない患者から得た生物学的試料中に存在すると決定される量よりも統計的に高い（アップレギュレーションされるバイオマーカー）かまたは低い（ダウンレギュレーションされるバイオマーカー）ものをいう。前もって決定したレベルは、特定のバイオマーカーに依存する。
【００７１】
バイオマーカーの発現レベルは、ｃｄｋモデュレート剤による処置に対する患者の応答しやすさについての情報を提供する。この目的のため、アッセイしたＲＮＡの量の差異と使用したＲＮＡの質の変動性との両者について補正（正規化）することがしばしば望ましい。それゆえ、アッセイは、典型的にＧＡＰＤＨやＣＹＰＬなどのよく知られたハウスキーピング遺伝子を含むある種の正規化遺伝子の発現を測定および導入する。別の態様として、またはさらに、正規化はアッセイした遺伝子のすべてまたはその大きなサブセットの平均のまたは中間値のシグナル（ＲＴ−ＰＣＲの場合のＣｔ）に基づくことができる（包括的正規化アプローチ（global normalization approach））。遺伝子−遺伝子ベースで、患者の腫瘍ｍＲＮＡの測定した正規化量を同じタイプの癌組織の参照セットで見出される量と比較する。この参照セット中の癌組織の数（Ｎ）は、異なる参照セットが（全体として）本質的に同じ仕方で挙動することを確実にすべく、充分に高いものでなければならない。この条件が適合すれば、特定のセットに存在する個々の癌組織の同一性は、アッセイした遺伝子の相対的な量に対して有意の影響を及ぼさないであろう。癌組織の参照セットは、一つの側面において、少なくとも約３０の異なる癌組織生検からなっていてよい。
【００７２】
本明細書に記載するデータは、癌療法に潜在的な有用性を有する化合物をスクリーニングおよび同定するのに日常的に用いられる細胞株で得られたものであるが、バイオマーカーは、ｃｄｋまたはｃｄｋが関与する経路が重要な他の疾患領域、たとえば、免疫学において、または細胞のシグナル伝達および／または増殖の制御が異常となった癌や腫瘍においても診断および予後の両価値を有する。
【００７３】
関連する技術分野の当業者であれば、ｃｄｋおよびｃｄｋが関与する経路が卵巣癌腫細胞および末梢血単核細胞の細胞株以外の細胞型においても使用でき機能することを評価するであろう。それゆえ、本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、疾患状態と関連する他の組織または器官からの細胞において、または他の組織型に由来する癌または腫瘍において、有用性を示す。そのような細胞、組織および器官の非制限的な例としては、乳房、結腸、肺、前立腺、精巣、卵巣、子宮頸、食道、膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、胃、リンパ球細胞および脳が挙げられ、かくして本明細書に記載するバイオマーカーの広範で有利な適用可能性が提供される。分析のための細胞は、当該技術分野で知られた通常の方法、たとえば、組織生検、吸引、脱落細胞（sloughed cells）、結腸細胞（colonocytes）、臨床的または医学的な組織もしくは細胞のサンプリング法により得ることができる。
【００７４】
実施例
以下に記載するように、転写プロファイリングを用いて上記表１に示したバイオマーカーを同定した。詳細には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するある種のｃｄｋ２インヒビターの作用の転写プロファイリングを最初に行った。つぎに、複数の投与量および時点でのｃｄｋ２インヒビター処理した腫瘍細胞株Ａ２７８０のプロファイリングを行って腫瘍部位応答と末梢血バイオマーカーとの相関関係を確立した。潜在的なバイオマーカーの分子標的−特異性を確立するため、抗ｃｄｋ２オリゴヌクレオチドで処理した腫瘍細胞株Ａ２７８０もプロファイリングした。ｃｄｋ２インヒビターで処理したヒト卵巣癌腫異種移植Ａ２７８０でさらに評価するため（実施例２）、図１に示すように重複する遺伝子発現変化を選択した。観察された変化を遺伝子チップ分析から確認するため、選択したバイオマーカーをリアルタイムＰＣＲ分析に供した。これらバイオマーカーは上記表１に示してある。
【００７５】
以下の実施例では下記条件を用いた。
ｃｄｋ２インヒビター：実施例のｃｄｋ２インヒビターは、式：
【化１】
2007507204.tif 000114
で示されるＮ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩である。このｃｄｋ２インヒビターは、１０ｍＭの濃度で１００％ＤＭＳＯに可溶化された。化合物の希釈液を各増殖培地に調製した。
【００７６】
細胞培養：細胞株をＲＰＭＩ−１６４０プラス１０％ウシ胎仔血清中で維持した。
クローン的増殖アッセイ（Clonogenic Growth Assay）：標準クローン的アッセイを用い、コロニー増殖抑制をＡ２７８０卵巣癌腫細胞について測定した。このアッセイでは２００細胞／ウエルを６−ウエル組織培養プレート（FalconTM）（Becton, Dickinson and Company、フランクリン・レークス、ニュージャージー、米国）に播種し、１８時間付着させた。アッセイ培地はＲＰＭＩ−１６４０プラス１０％ウシ胎仔血清からなっていた。ついで、細胞を６濃度用量−応答曲線で２回処理した。ＤＭＳＯの最大濃度は０.２５％を超えなかった。細胞をｃｄｋ２インヒビターに４、８または２４時間暴露した。ついで、ｃｄｋ２インヒビターを除去し、細胞を２容量のＰＢＳで洗浄した。ついで、通常の増殖培地で置換した。コロニーに３日ごとに新鮮な培地を与えた。Optimax imaging stationを用い、コロニー数を１０〜１４日目に記録した。コロニー生成の５０％または９０％を抑制するのに必要なｃｄｋ２インヒビターの濃度（それぞれ、ＩＣ５０またはＩＣ９０）を非線形回帰分析により決定した。分散（標準偏差／平均、ｎ＝３）の係数＝３０％。
【００７７】
リアルタイム定量ＰＣＲ分析：TaqmanRリアルタイムＰＣＲ蛍光アッセイ（Applied Biosystems、フォスター・シティー、カリフォルニア、米国）特定のｍＲＮＡのレベルを定量した。ｃｄｋ２インヒビター処理したＡ２７８０細胞を約７０％のコンフルエンスにて回収し、全ＲＮＡをQiagen RNeasy 96キットを用いて調製した。
【００７８】
TaqmanR反応液は以下のようにして調製した：100ngの全ＲＮＡ；25nM〜750nMのフォアウォードプライマー；25nM〜750nMのリバースプライマー；200nM〜400nMのTaqmanRプローブ（蛍光染料標識オリゴヌクレオチドプライマー）；1×緩衝液Ａ（Applied Biosystems、フォスター・シティー、カリフォルニア、米国）；5.5mMのMgCl2；300μMのdATP、dGTP、dTTP、dCTP；1UのAmplitaq Gold；20UのSuperscript 2；1UのRNaseインヒビター。
リアルタイムＰＣＲはApplied Biosystems 7700 Sequence Detection Systemを用いて行った。条件は以下の通りであった：48℃で20分（逆転写）、95℃で10分（変性およびAmplitaq Goldの活性化）、40サイクルのＰＣＲ（95℃で15秒、60℃で1分）。
【００７９】
Sequence Detection Systemは、Ct（閾値サイクル）を生成し、これを各入力メッセンジャーＲＮＡ鋳型の濃度の計算に用いた。目的とする各遺伝子またはその断片のメッセンジャーＲＮＡレベルは、GAPDHメッセージレベルに正規化して入力試料中の全ＲＮＡ量の変動について補償した。このことは、各細胞株についてGAPDH Ct値を生成することにより行った。目的とする遺伝子またはその断片のCt値およびGAPDHを、正規化相対メッセージレベルを計算するのに用いる下記δδCt式に挿入した：
核酸の鋳型の相対量＝2δδCt＝2(δCta−δCtb)
(δCta＝Ct標的−Ct GAPDH、δCtb＝Ct参照−Ct GAPDH)。
【００８０】
遺伝子チップ分析：Affymetrixヒト遺伝子チップHG-U95A, BおよびC（Affymetrix, Inc.、サンタ・クララ、カリフォルニア、米国）を用い、遺伝子チップを用いて遺伝子発現のレベルを大スケールで定量した。遺伝子チップハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブン、洗浄ステーション、スキャナー、およびコンピューターワークステーションを含むAffymetrix遺伝子チップシステムを用いて行った。製造業者の標準プロトコールに従った。生データをAffymetrix Microarray Suite 4.0ソフトウエアを用いて得た。２０単位の閾値を発現レベルが２０未満と計算された遺伝子に割り当てた、なぜならこのレベル未満の発現の識別は信頼性をもって行うことができなかったからである。
【００８１】
ＰＢＭＣのインビトロ処理：ＰＢＭＣを単離し、ｃｄｋ２インヒビターとともにインビトロでインキュベートした。詳細には、約４０ｍｌの血液を予備的研究のために回収し、ついで１０人の有志者から回収した。ついで、４０ｍｌの血液を、ヘパリンナトリウム抗凝固剤60/csを入れた５本のVacutainerTM CPTTM Mononuclear Cell Preparation Tubes（Product Number: 362753）（Becton, Dickinson and Company、フランクリン・レイクス、ニュージャージー、米国）に入れた。ついで、リンパ球を５本のVacutainerTMプールから除き、２０ｍｌの培地（ＲＰＭＩ、10%血清、およびglu/Pen/strep）に再懸濁した。細胞をこの工程でカウントし、ついで穏やかに遠心分離し、ついで４.０ｍｌの培地に懸濁した。ついで、細胞を６ウエルプレート（０.５ｍｌ／ウエル）にプレーティングした。ついで、ｃｄｋ２インヒビターまたはビヒクルを含む培地（３.５ｍｌ）を各ウエルに加えて、実験ウエルでは１００ｎＭ ｃｄｋ２インヒビターの最終濃度、１０人の被験者について実験ウエルで１０００ｎＭ ｃｄｋ２インヒビターの最終濃度とした。
【００８２】
ｃｄｋ２インヒビターの添加４時間および２４時間後にＲＮＡ試料およびタンパク質試料を回収した。RNeasy-mini RNAキットを製造業者の指示（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア、米国）に従って用いてＲＮＡを調製した。タンパク質試料については、0.5〜1.0mlの改変RIPA緩衝液［50mM Tris（pH8）、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%Na-デオキシコール酸、0.1%SDS、0.1%Na3VO4、0.1mM NaF、10mMβ-グリセロリン酸、プラスCompleteRプロテアーゼインヒビター（Boehringer Mannhiem GmbH、ドイツ）］で抽出する前に、細胞をＰＢＳで洗浄した。溶解液を−８０℃で凍結した。ｃｄｋ２インヒビター処理後の異なる時点での細胞の生存をトリパンブルー排除により決定した。
【００８３】
ウエスタンブロット分析：ｃｄｋ２インヒビター処理したＡ２７８０細胞を約７０％のコンフルエンスで回収し、細胞をＲＩＰＡ［50mM Tris（pH8）、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%Na-デオキシコール酸、0.1%SDS、0.1%Na3VO4、0.1mM NaF、10mMβ-グリセロリン酸、プラスCompleteR プロテアーゼインヒビター（Boehringer Mannhiem GmbH、ドイツ）］緩衝液中で溶解することにより全タンパク質を調製した。細胞ペレットを＜2×107細胞/mlの密度で再懸濁し、氷上で20分間インキュベートし、ついで高速の14,000rpm遠心分離を行った。ついで、タンパク質上澄み液を細胞破砕物から除去し、タンパク質含量をMicro-BCAアッセイ（Pierce Biotechnology, Inc.、ロックフォード、イリノイ、米国）を用いて定量した。ついで、処理した抽出物（25μg/レーン）を10%SDS-ポリアクリルアミドゲル（10.5×14cm）を用いて分離した。ついで、半乾燥ブロッティング装置（Hoefer Scientific Instruments、サンフランシスコ、カリフォルニア、米国）中で0.8Amp/cm2に暴露することによりゲルからPVDF-メンブレン（Millipore Corporation、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）に移した。ついで、PVDFタンパク質ブロットをTTBS（Tris-緩衝食塩水中の0.1%Tween20）中の5%脱脂粉乳でブロッキングした。ついで、ブロットをTTBS中の5%脱脂粉乳中の一次抗体（マウス抗ｃｄｋ２クローンＤ−１２、Santa Cruz Biotechnology、サンタクルス、カリフォルニア、米国）で１〜２時間プローブし、ついでTTBSで３回洗浄した。ついで、HRP-コンジュゲート二次抗体（HRPコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG、Promega Corp.、マジソン、ウイスコンシン、米国）をTTBS中で30分間ブロットとともにインキュベートした。ついで、ブロットをTTBSで３回洗浄し、ECL-プラスウエスタンブロッティング検出システム（Amersham Biosciences、ピスカタウエイ、ニュージャージー、米国）で発色させた。
【００８４】
ｃｄｋ２アンチセンス処理：以下の配列を有するｃｄｋ２ ｍＲＮＡに対してターゲティングした５つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を用いた：
ＧＣＡＧＵＡＵＡＣＣＵＣＵＣＧＣＵＣＵＵＧＵＣＡＡ（配列番号：２７７５）；
ＵＵＵＧＧＡＡＧＵＵＣＵＣＣＡＵＧＡＡＧＣＧＣＣＡ（配列番号：２７７６）；
ＧＵＣＣＡＡＡＧＵＣＵＧＣＵＡＧＣＵＵＧＡＵＧＧＣ（配列番号：２７７７）；
ＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＵＵＵＣＡＧＧＡＧＣＵＣＧＧＵ（配列番号：２７７８）；
ＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣ（配列番号：２７７９）。
すべての遺伝子モデュレーションは、アンチセンス処理細胞と逆対照オリゴヌクレオチド処理細胞とでのＲＮＡの相対レベルに基づいていた。
【００８５】
Ａ２７８０細胞を６−ウエル組織培養プレートに１〜２×１０５細胞／ウエルの密度でプレーティングした。一夜インキュベートした後、Lipofectamine 2000（Invitrogen Life Technologies、カールスバード、カリフォルニア、米国）を用いて細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチド混合物でトランスフェクションした。簡単に説明すると、１０×脂質溶液（OptiMEM中に１０μｇ／ｍｌ）および１０×オリゴヌクレオチド混合物（OptiMEM中に０.５μＭ）を調製した。ついで、等容量の１０×脂質溶液と１０×オリゴヌクレオチド混合物を混合することにより、脂質／オリゴヌクレオチド複合体の５×溶液を調製した。この脂質／オリゴヌクレオチド複合体の５×溶液を室温で１５分間インキュベートして複合体を生成させた。インキュベート後、５×脂質／オリゴヌクレオチド複合体を１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩで希釈してＩ×トランスフェクション試薬を生成した。一夜増殖培地を１×トランスフェクション試薬で置換することにより、６−ウエル培養プレート中の細胞をトランスフェクションした。ついで、TaqmanRリアルタイムＰＣＲ蛍光アッセイによる分析のためにＲＮＡを回収する前に、細胞を種々の時間（０、１２、１６、２０、および２４時間）インキュベートした。各実験において、余分のウエルをフルオレセイン処理したランダムオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、フローサイトメトリーを用いてトランスフェクションの有効性を決定した。すべての実験で８５％〜９５％のＡ２７８０細胞がトランスフェクションされた。
【００８６】
実施例１：ｃｄｋ２インヒビターで処理後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびｃｄｋ２インヒビターまたは抗ｃｄｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理後のＡ２７８０卵巣癌腫細胞の転写プロファイリング
バイオマーカーを同定するため、転写プロファイリングを、（i）ｃｄｋ２インヒビターで処理後のＰＢＭＣ、（ii）ｃｄｋ２インヒビターで処理後のＡ２７８０卵巣癌腫細胞、および（iii）抗ｃｄｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理後のＡ２７８０卵巣癌腫細胞について得た。
【００８７】
表２は、Ａ２７８０およびＰＢＭＣ細胞型の処理に用いた用量および時間経過を列挙する。
表２：実験デザイン
【表１１２】
2007507204.tif 000115
【００８８】
Ａ２７８０およびＰＢＭＣの処理は上記と同様にして行った。ｃｄｋ２インヒビターの用量は、増殖およびクローン的アッセイにより評価されるように（表３）ｃｄｋ２インヒビターによる腫瘍細胞の増殖抑制の動力学の理解から得られた。この研究は、ｃｄｋ２インヒビターによる増殖抑制が時間に依存していることを明らかに示していた。コロニー形成の有効な抑制には最小８時間の暴露が必要であった。２４時間のクローン的アッセイから得られた値は７２時間の増殖アッセイとよく一致していた。
【００８９】
表３：ｃｄｋ２インヒビターによるコロニー形成の抑制
【表１１３】
2007507204.tif 000116
【００９０】
１人の健常な有志者からのＰＢＭＣのｃｄｋ２インヒビターによるイクスビボ処理の予備的実験を最初に行った。その後、１０人の健常なヒト被験者からＰＢＭＣを回収し、ｃｄｋ２インヒビターでイクスビボ処理した。全ＲＮＡを単離し、遺伝子チップにハイブリダイズさせた。
【００９１】
ｃｄｋ２発現のアンチセンス抑制をＡ２７８０細胞について最適化し、上記と同様にして行った。これら条件下、ｃｄｋ２タンパク質レベルは２４時間の暴露後に９０％低下した。図２Ａに示すように、対照ウエル（Ｃ）と比べてアンチセンス処理した３つの全てのウエル（ＡＳ）でｃｄｋ２タンパク質の一貫した低減が観察された。これは、細胞周期の進行の阻止およびｃｄｋ２インヒビター処理Ａ２７８０細胞と同様のアポトーシスという結果となった。暴露時間との関連でのｃｄｋ２タンパク質の低減も決定した。図２Ｂに示すように、ｃｄｋ２レベルは１２時間で最大に抑制され、タンパク質レベルは２４時間後も低減したままであった。
【００９２】
実施例２：バイオマーカーの選択
ＰＢＭＣにおいて代理終点として用いることができ分子標的特異的応答を有するｃｄｋ２インヒビターについてのバイオマーカーを同定するため、実施例１の３つの実験セットの発現プロファイルを比較した。重複する遺伝子発現変化を図１に示すようにして選択した。
【００９３】
遺伝子発現レベルでのｃｄｋ２特異的な応答並びに化合物特異的な変化の同定を可能とするため、統計的な方法を用いてｃｄｋ２インヒビター処理したＡ２７８０試料セットにおける用量および処理時間と関連した遺伝子発現変化を有する遺伝子を選択した。データの分析は、各遺伝子に対する化合物の用量効果および時間効果を調べる分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを用いて行った。まず、データを再スケールしてチップ効果を線形回帰法により除いた。ついで、ＡＮＯＶＡモデルを２つの因子、用量および時間に基づいて各遺伝子に適合させた。Ｆ検定を用い、特定の遺伝子の発現レベルの変化に関して有意の用量または時間効果があるか否かを決定した。用量効果試験および時間効果試験の両者においてｐ値が０.０５未満の遺伝子を同定した。用量効果および時間効果の両者においてｐ値が０.０５未満と同定された遺伝子を表１に示してある。
【００９４】
実施例１の３つのセットからの重複する遺伝子発現変化を、ｃｄｋ２インヒビターで処理したヒト卵巣癌腫異種移植Ａ２７８０でさらに評価すべく選択した。
【００９５】
ヒト卵巣癌腫異種移植Ａ２７８０をＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスで維持した。ドナーマウスから得た腫瘍断片を用い、腫瘍を皮下（ｓｃ）移植として増殖させた。ｃｄｋ２インヒビター処理については、腫瘍を約１００〜２００ｍｇの前もって決定したサイズウインドウまで増殖させ（この範囲外の腫瘍は排除した）、動物を種々の処理群および対照群（ｎ＝６）に均等に分散させた。各動物の処理は個々の体重に基づいた。
【００９６】
ｃｄｋ２インヒビターをまずCremophorR／エタノール（５０：５０）の混合物に溶解した。投与の１時間前に、投与する溶液が特定の賦形剤組成、すなわち、CremophorR／エタノール／水（１：１：８、ｖ／ｖ）を含むようにｃｄｋ２インヒビターを水で希釈した。注射した全ての化合物の容量は０.０１ｍｌ／ｍｇマウスであった。ｃｄｋ２インヒビターの投与は、３６および１８ｍｇ／ｋｇの投与量にて腹腔内のボーラス注射として行った。処理の４、７、および２４時間後の時点で腫瘍および血漿をサンプリングした。血漿試料は薬動動態分析のために直ちに−８０℃で凍結乾燥させ、腫瘍試料は薬理ゲノミクス分析のためにＲＮＡａｓｅ不含の緩衝液中で保存した。
【００９７】
ある遺伝子が潜在的なバイオマーカーとして選択されたら、蛍光ＭＧＢ Taq-manプローブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイを上記のようにして開発した。選択した遺伝子は、遺伝子チップ分析からの観察された変化を確認するために上記のようにリアルタイムＰＣＲ分析に供した。
【００９８】
バイオマーカーＷ２８７２９（配列番号１２４６）を好ましいマーカーとして選択した。Taq-man ＭＧＢプローブを用い、正規化対照であるハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨとともにこのバイオマーカーで同一ウエル（same-well）多重リアルタイム定量ＰＣＲアッセイを開発した。Ｗ２８７２９についての遺伝子発現変化の測定は、以下の試料セットでリアルタイム定量ＰＣＲアッセイを用いて行った：２０ｎＭのｃｄｋ２インヒビターで異なる期間処理したＡ２７８０ヒト腫瘍細胞（図３Ａ）、１００ｎＭのｃｄｋ２インヒビターで４時間処理したＰＢＭＣ（図３Ｂ）、および３６および１８ｍｇ／ｋｇの用量にてｃｄｋ２インヒビターで異なる期間処理したヒト卵巣癌腫異種移植Ａ２７８０（図３Ｃ）。培養したＡ２７８０腫瘍細胞では、Ｗ２８７２９の誘発は２０ｎＭのｃｄｋ２インヒビターで処理したときに起こり、処理の１時間後に検出された。Ｗ２８７２９発現のアップレギュレーションはまた、ヒトＰＢＭＣをインビトロでｃｄｋ２インヒビターで処理したときにも観察された。Ａ２７８０異種移植を有するヌードマウスの有効投与量のｃｄｋ２インヒビターでの処理もまたＷ２８７２９の誘発という結果となり、遺伝子誘発の期間の用量依存的な長期化が認められた。
【００９９】
実施例３：Ｗ２８７２９のアップレギュレーション
以下の実験法を用いてＷ２８７２９のアップレギュレーションをさらに調べた。
患者の適用基準：患者の適用基準には以下のものが含まれていた：現在の治療では抗療性の一次固形悪性腫瘍、および適切な骨髄、肝、および腎機能。
【０１００】
処置：２つの異なる処置を行った：（i）174-001試験：BMS-387032 q 3週間（１時間注入）（ii）174-002試験：BMS-387032 q 3週間（２４時間注入）。サンプリング時間は、投与前、および投与２時間、６時間、２４時間後であった。
【０１０１】
Ｗ２８７２９の発現分析：ＲＴ−ＰＣＲ。
患者の血液試料をPAXgeneTM Blood Collection Tubes（Qiagen、カタログ#762155）で回収した。全ＲＮＡをPAXgeneTM blood RNA Kit（Qiagen、カタログ#762134）を用いて製造業者の指示に従って単離した。ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection Systemを用い、Ｗ２８７２９およびＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）ＲＮＡの存在量をTaqmanアッセイにより測定した。Ｗ２８７２９の存在量をＧＡＰＤＨに対して正規化した。プライマーおよびプローブの配列は以下のとおりである。
Ｗ２８７２９：(5+)ＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧ（配列番号：２７８０）
(3+)ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧ(配列番号：２７８１)
プローブＴＴＡＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＴＴ（配列番号：２７８２）
ＧＡＰＤＨ：  (5+)ＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴ（配列番号：２７８３）
(3+)ＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＣＣＴＴ(配列番号：２７８４)
プローブＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡ（配列番号：２７８５）
【０１０２】
結果
前臨床異種移植：BMS-387032でボーラスに腹腔内処置により与えたＡ２７８０異種移植では、腫瘍でのＷ２８７２９の誘発は一過性で用量依存的な仕方で起こった（図４Ａ）。１８ｍｇ／ｋｇ／日の最小有効投与量（ＭＥＤ）で誘発は６時間以上維持された。４０ｍｇ／ｋｇの最小有効投与量を用いた注入投与法では、遺伝子誘発は少なくとも１６時間維持された。腫瘍における遺伝子誘発は、腫瘍マウスから単離したＰＢＭＣで検出されるように、マウスのオーソログ配列（配列番号：２７８６；マウスゲノムＤＮＡ配列遺伝子座ＡＬ５９０９９４の断片）の誘発と著しく近似したパターンを伴っていた（図４Ｂ）。有効な投与法により処置は、６時間またはそれ以上にわたって該配列の＞２倍の誘発という結果となった。これらデータは、腫瘍におけるＷ２８７２９遺伝子の誘発の薬動力学的なバイオマーカーとしての使用を支持している。さらに、これら観察は、遺伝子発現の変化（ｃｄｋ２インヒビターによる処置の結果として生じる）をモニターするための代理組織としてのＰＢＭＣの使用を支持している。
【０１０３】
臨床試験：ＣＡ１７４−００１試験（１時間の注入）では、Ｗ２８７２９の一過性の誘発がＰＢＭＣにおいて２時間で検出され、６時間でベースラインレベルに戻った（図５Ａ）。ＣＡ１７４−００２試験（２４時間の注入）では、Ｗ２８７２９発現の適度の誘発が認められ、これが注入の終了後６時間持続した（図５Ｂ）。図５Ａおよび５Ｂの各線は、投与後の特定の時点での個々の患者についての遺伝子誘発の程度を示している。ＣＡ１７４−００１試験では、ベースライン発現と最大遺伝子誘発のレベルとの間に逆の相関関係が認められた（図６Ａ）。ＣＡ１７４−００２試験では、ベースライン発現と誘発の大きさとの間に明確な相関関係は認められなかった（図６Ｂ）。２４時間注入試験からのデータの解釈は困難である、なぜなら発現データは投与開始の２４時間以上後に回収されたからである。
【０１０４】
図７Ａおよび７Ｂは、ＣＡ１７４−００１からの投与量（図７Ａ）およびＡＵＣ（図７Ｂ）の関数としてのＷ２８７２９の誘発を示す。図７Ａおよび７Ｂに示すように、Ｗ２８７２９遺伝子の誘発とｃｄｋ２インヒビターの投与量または暴露との間に線形の相関関係が認められた。図８は、ＣＡ１７４−００１試験におけるＷ２８７２９のベースライン発現およびｃｄｋインヒビター暴露によるＷ２８７２９の変化の予測を提供する。Ｗ２８７２９遺伝子の発現変化は下記式により予測することができる：Δ（Ｗ２８７２９発現）＝Ａ＊ＡＵＣ＊（ベースライン発現）Ｂ（式中、Ａ＝０.０００６１９、Ｂ＝−０.５３７）。Ｗ２８７２９遺伝子の誘発は、薬剤暴露およびベースラインのＷ２８７２９発現から信頼性をもって予測することができる。
【０１０５】
前臨床データがＷ２８７２９遺伝子誘発の程度および期間が抗腫瘍剤の有効性と相関関係を有することを示唆しているので、ＣＡ１７４−００１試験において異なるＷ２８７２９誘発を示した患者の疾患結果を調べた。興味深いことに、高い誘発を示した患者は最も良好な結果が得られるように思われた（図９）。これら結果は、Ｗ２８７２９の誘発がｃｄｋをモデュレートする薬剤の臨床結果の予測の代理マーカーであることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ｃｄｋバイオマーカー同定戦略を示す。
【０１０７】
【図２Ａ】ｃｄｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃｄｋ２タンパク質レベルの低減を示す。
【０１０８】
【図２Ｂ】ｃｄｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃｄｋ２タンパク質レベルの低減を示す。
【０１０９】
【図３Ａ】ｃｄｋインヒビターで処理後のＡ２７８０、ＰＢＭＣ、および異種移植Ａ２７８０腫瘍におけるバイオマーカーＷ２８７２９（配列番号１２４６）の発現変化を示す。
【０１１０】
【図３Ｂ】ｃｄｋインヒビターで処理後のＡ２７８０、ＰＢＭＣ、および異種移植Ａ２７８０腫瘍におけるバイオマーカーＷ２８７２９（配列番号１２４６）の発現変化を示す。
【０１１１】
【図３Ｃ】ｃｄｋインヒビターで処理後のＡ２７８０、ＰＢＭＣ、および異種移植Ａ２７８０腫瘍におけるバイオマーカーＷ２８７２９（配列番号１２４６）の発現変化を示す。
【０１１２】
【図４Ａ】Ａ２７８０異種移植におけるＷ２８７２９発現の制御を示す。
【０１１３】
【図４Ｂ】マウスＰＢＭＣにおけるＷ２８７２９のマウスオーソログの制御を示す。
【０１１４】
【図５Ａ】Ｎ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩で処理した患者におけるＷ２８７２９遺伝子の発現を示す。
【０１１５】
【図５Ｂ】Ｎ−５−［［５−（１,１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル−４−ピペリジンカルボキサミド，０.５−Ｌ−酒石酸塩で処理した患者におけるＷ２８７２９遺伝子の発現を示す。
【０１１６】
【図６Ａ】Ｗ２８７２９の誘発およびベースライン発現とのその相関を示す。
【０１１７】
【図６Ｂ】Ｗ２８７２９の誘発およびベースライン発現とのその相関を示す。
【０１１８】
【図７Ａ】投与量の関数としてのＷ２８７２９の誘発を示す。
【０１１９】
【図７Ｂ】ＡＵＣの関数としてのＷ２８７２９の誘発を示す。
【０１２０】
【図８】Ｗ２８７２９のベースライン発現およびｃｄｋ２インヒビター暴露によるＷ２８７２９変化の予測を示す。
【０１２１】
【図９】疾患の結果、対腫瘍進行時間（time to tumor progression）およびＷ２８７２９変化を示す。
【図１】
2007507204.tif 000117
【図２Ａ】
2007507204.tif 000118
【図２Ｂ】
2007507204.tif 000119
【図３Ａ】
2007507204.tif 000120
【図３Ｂ】
2007507204.tif 000121
【図３Ｃ】
2007507204.tif 000122
【図４Ａ】
2007507204.tif 000123
【図４Ｂ】
2007507204.tif 000124
【図５Ａ】
2007507204.tif 000125
【図５Ｂ】
2007507204.tif 000126
【図６Ａ】
2007507204.tif 000127
【図６Ｂ】
2007507204.tif 000128
【図７Ａ】
2007507204.tif 000129
【図７Ｂ】
2007507204.tif 000130
【図８】
2007507204.tif 000131
【図９】
2007507204.tif 000132
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月4日(2006.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007507204000001.app