(57)【要約】  核酸またはポリペプチドのサンプル中の少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドを検出および／または定量化するための方法であって、ａ）核酸またはポリペプチドを含むサンプルを供するステップ；ｂ）該核酸またはポリペプチドをリガンド複合体で標識するステップであって、該リガンド複合体は、該核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むステップ；ｃ）該核酸−リガンド複合体またはポリペプチド−リガンド複合体を、少なくとも１つの捕獲プローブと接触させるステップであって、該捕獲プローブは、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズするかまたは結合するステップ；ｄ）ｉ）該捕獲リガンドにより認識される酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、該捕獲レセプターが、該捕獲リガンドに結合できる複合体を、加えるステップ；ｅ）酸化還元ポリマーを加えるステップであって、該酸化還元ポリマーが、該酸化還元酵素に結合し、それによって、電子が、酵素から該酸化還元ポリマーを経て電極表面に移動するステップ；およびｆ）該標的核酸または標的ポリペプチドの存在を検出および／または定量化するステップ；を含む方法。
2007534961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸またはポリペプチドのサンプル中の、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドを検出および／または定量化する方法であって、
ａ）核酸またはポリペプチドを含むサンプルを供するステップと；
ｂ）前記核酸またはポリペプチドをリガンド複合体で標識するステップであって、前記リガンド複合体が、前記核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むステップと；
ｃ）前記核酸−リガンド複合体またはポリペプチド−リガンド複合体を、少なくとも１つの捕獲プローブと接触させるステップであって、前記捕獲プローブが、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合するステップと；
ｄ）ｉ）前記捕獲リガンドにより認識される酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、前記捕獲レセプターが前記捕獲リガンドに結合できる複合体を加えるステップと；
ｅ）酸化還元ポリマーを加えるステップであって、前記酸化還元ポリマーが前記酸化還元酵素に結合し、それによって、電子が、前記酵素から前記酸化還元ポリマーを経て電極表面に移動するステップと；
ｆ）前記標的核酸または標的ポリペプチドの存在を検出および／または定量化するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記捕獲プローブが、電極表面上に固定されているか、または電極表面上に固定することを可能にする手段を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕獲プローブが、前記標的核酸の少なくとも１部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸のサンプルが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのサンプルである、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸のサンプルが全ｍＲＮＡのサンプルであり、前記捕獲プローブが少なくとも１つの標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸のサンプルが、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのサンプルであり、前記捕獲プローブが、少なくとも１つの標的ｃＤＮＡまたは少なくとも１つの標的ゲノムＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項７】
前記捕獲プローブが、標的ポリペプチドに結合する抗体またはリガンドである、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドのサンプルがタンパク質のサンプルであり、前記捕獲プローブが少なくとも１つの標的タンパク質に結合する、請求項１〜２、７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸または前記ポリペプチドに結合する前記第１の成分が、シスプラチン、白金結合シアニン３、白金結合シアニン５であり、前記捕獲リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、捕獲レセプターに結合する抗体または抗原、前記酸化還元酵素に結合する抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕獲レセプターが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、前記捕獲リガンドに結合している抗原または抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化還元酵素が前記捕獲リガンドに結合し、前記捕獲リガンドが抗体である、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼまたはヒドロゲナーゼである、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼまたはそれらの混合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸化還元ポリマーが、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーである、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面電極が、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）または電流測定用カーボン−エポキシ複合材で作られている、請求項２〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、全ｍＲＮＡサンプル中の特異的遺伝子を直接検出および／または定量化するための方法である、請求項１〜６、９〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが哺乳動物サンプルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルがヒトサンプルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍＲＮＡサンプルが、組織から抽出される、請求項１６〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンド複合体がシスプラチン−ビオチンであり、前記捕獲レセプターがアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項１６〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、１つ以上の標的遺伝子を検出および／または定量化するための診断方法である、請求項１６〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的遺伝子が、腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）、およびヒストンＨ４（Ｈｉｓ４）の少なくとも１つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸の検出限界が、０．２０〜１．０ｆｇである、請求項１〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出された標的核酸がｍＲＮＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ｍＲＮＡが、前記乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）に対応する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、センサーアレイで実行される、請求項１〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記センサーアレイが、支持材；前記支持材上に適用された第１の電極材；前記電極材上に適用されたスペーサー／絶縁層、および第２の電極材を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記電極材が、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）または電流測定用カーボン−エポキシ複合材で作られている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記スペーサー／絶縁層が、底部から上部にかけて、粘着性のスペーシング／絶縁層、スクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌ層および疎水性層を含む、請求項２７〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記支持材がガラス支持材である、請求項２６〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
微小電気医学システム（ＭＥＭＳ）および／または完全自動化マイクロ・トータル・アナリシス・システム(Micro Total Analysis System)（μ−ＴＡＳ）に組み込まれている、請求項１〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ａ）ｉ）電極表面上に固定されているか、またはｉｉ）電極表面上に固定するための手段を含む、少なくとも１つの捕獲プローブと；Ｂ）サンプルの核酸またはポリペプチドを標識するためのリガンド複合体であって、前記核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むリガンド複合体と；Ｃ）ｉ）前記捕獲リガンドによって結合され得る酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合された酸化還元酵素を含む複合体であって、前記捕獲レセプターが、前記捕獲リガンドに結合することができる複合体と；Ｄ）酸化還元ポリマーとを含む、診断用キット。
【請求項３３】
前記捕獲プローブが、標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記捕獲プローブが、標的ポリペプチドに結合することができる抗体またはリガンドである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記核酸または前記ポリペプチドに結合する前記第１の成分が、シスプラチン、白金結合シアニン３、白金結合シアニン５であり、前記捕獲リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、捕獲レセプターに結合する抗体または抗原、または前記酸化還元酵素に結合する抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項３２〜３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記捕獲レセプターが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、前記捕獲リガンドに結合する抗原または抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項３２〜３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼまたはヒドロゲナーゼである、請求項３２〜３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼまたはそれらの混合物である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記酸化還元ポリマーが、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーである、請求項３２〜３８に記載のキット。
【請求項４０】
サンプル分析物中の標的核酸および／またはポリペプチドを検出するためのセンサーアレイ装置であって、スペーサー／絶縁層で隔てられた第１および第２の電極を含み、前記電極が、前記分析物を前記第２の電極に作用させたとき、接続される、装置。
【請求項４１】
前記２つの電極を通過する電流が、作用させた分析物の量を反映する、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記第１の電極が、支持材上に適用される、請求項４０〜４１に記載の装置。
【請求項４３】
捕獲プローブが、前記第１の電極の表面上に適用され、前記捕獲プローブが、前記分析物の少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合することができる、請求項４０〜４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記電極が、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）および／または電流測定用カーボン−エポキシ複合材で作られている、請求項４０〜４３に記載の装置。
【請求項４５】
前記スペーサー／絶縁層が、底部から上部にかけて、粘着性のスペーシング／絶縁層、スクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌ層および疎水性層を含む、請求項４０〜４４に記載の装置。
【請求項４６】
前記支持材がガラスである、請求項４０〜４５に記載の装置。
【請求項４７】
前記分析物が、全ｍＲＮＡのサンプルである、請求項４０〜４６に記載の装置。
【請求項４８】
前記分析物が、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのサンプルである、請求項４０〜４６に記載の装置。
【請求項４９】
前記装置が、微小電気医学システム（ＭＥＭＳ）および／または完全自動化マイクロ・トータル・アナリシス・システム(Micro Total Analysis System)（μ−ＴＡＳ）に組み込まれている、請求項４０〜４８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関心のある少なくとも１つの標的遺伝子の発現を検出および／または定量化するための方法に関する。具体的には、本発明は、複数の標的遺伝子、特に、選択された発現遺伝子の同時検出および／または定量化において有用である。本発明はまた、該検出および／または定量化を実行するための装置も提供する。
【背景技術】
【０００２】
最も一般的に使用される遺伝子発現の定量化方法としては、ノーザンブロッティング(Watson,J.ら、Recombinant DNA,第2版。W.H.Freeman and Company,New York,1992)、リボヌクレアーゼプロテクション法(Chan,S.D.H.ら、Anal.Biochem.,242,214,1996)および逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）(Cottrez,F.ら、Nucleic Acids Res.,22,2712,1994;Totze,G.ら、Mol.Cell.Probes,10,427,1996)などがある。最初の２法は、１０〜１００μｇのｍＲＮＡを必要とし、１０6〜１０7コピーレベルで１つのｍＲＮＡ分子を検出することができる。このような量は、バルク組織から容易に単離することができるが、限られた量のサンプルで多数の遺伝子を定量化しなければならなかったり、分析のためにある特定のタイプの細胞のみを分離する必要があったりする場合、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼプロテクション法技術は適さない。ＲＴ−ＰＣＲは理論的には、１つの核酸分子を１００万倍に増幅することができ、したがって、非常に小さいサンプルサイズに非常に有用な可能性がある。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、汚染を招く傾向がある。ＲＴ−ＰＣＲ増幅はまた、プライマー・セットのかなりの最適化およびサンプルの前処理をも必要とし、したがって、アッセイ時間が長引く。さらに頻繁に、出発ｍＲＮＡ混合物中の様々な量のｍＲＮＡ配列は、選択的で非直線的な標的増幅のため、最終ＲＴ−ＰＣＲ産物中に同一レベルで提示されないことがある。ｃＤＮＡ合成工程中のＲＮＡ二次構造の不完全変性もまた、ポリメラーゼを休止させ、その結果、標的ｍＲＮＡの、より短いｃＤＮＡコピーをもたらすことがある。こうした制限は、結果として得られるデータの正確さおよび質に影響を及ぼし、しばしば、遺伝子発現の歪曲した情報を与える。多重複製は、このような実験の結果に信頼を得るのに役立つが、少量サンプルまたは希少サンプルに適当ではない。
【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲと関連した上述の問題を回避するために、シスプラチン−ジゴキシゲニン誘導体複合物を使用して、標識核酸分子を直接標識する技術が最近、開発された(Hoevel T.ら、Biotechniques,27(5):1064-7,1999)。直接核酸標識方法論の主要な利点は、簡単で速くかつ核酸分子の撹乱が少ないことである。結果として得られる標識された核酸により、発現が異なる遺伝子をより正確に同定することが可能になる。しかし、既存の核酸検出技術の感度が低いため、遺伝子発現の定量化は困難である。
【０００４】
通常は、定量目的には数マイクログラムのｍＲＮＡが必要である(Hoevel T.ら、Biotechniques,27(5):1064,1999;Boon,E.M.ら、Nat.Biotechnol.,18,1096,2000)。高感度遺伝子検出は、現在および未来の分子診断学における課題の１つである。
【０００５】
生体電子ＤＮＡ分析システムの開発における最近の進歩は、分子診断学の新しい機会を開き、また多大な研究努力を集めた(Boon,E.M.ら、Nat.Biotechnol.,18,1096,2000;Rodriguez,M.およびBard,A.J.Anal.Chem.,62,1658,1990)。光学的(Jordan,C.E.ら、Anal.Chem.,69,4939,1997;Fotin,A.V.ら、Nucleic Acids Res.,26,1515,1998)、電気化学的(Kelley,S.O.ら、Bioconjug.Chem.,8,31,1997;Kelly,S.O.ら、Nucleic Acids Res.,27,4830,1999)、ならびに微小重力測定的および水晶振動子マイクロバランス(Bardea,A.ら、Chem.Commun.,839,1998;Wang,J.、Nucleic Acids Res.,28,3011,2000)、形質導入法がＤＮＡハイブリダイゼーション・イベントの検出用に報告されている。近年、核酸認識事象の増幅された電気的形質導入(Caruana,D.J.およびHeller,A.、J.Am.Chem.Soc.,121,769,1999;Patolsky,F.ら、Chem.Int.,40,2261,Ed.2001;Patolsky,F.ら、J.Am.Chem.Soc.,122,418,2000;Zhang,Y.ら、Anal.Chem.,75,3267,2003)にも、取り組まれてきた。電気化学的バイオセンサーの本質的小型化、および進歩した半導体技術とのそれらの適合性は、遺伝病の早期診断のための簡単で正確かつ安価な基盤を提供することが期待される。過去５年間に電気化学的核酸バイオセンサーにおいて大きな進歩を遂げたにもかかわらず、市場に一歩近づくためには、幾つかの重大なハードルを克服することが必要である。第１は、現実世界のサンプルからのゲノム核酸で、バイオセンサーをテストすることである(Lay,P.A.ら、Inorg.Synth.,24,291,1986)。今までのところ、電気化学的バイオセンサーの多くは、比較的短い合成オリゴヌクレオチドかまたは一連のＰＣＲ増幅から始める。もう１つの課題は、電気化学的バイオセンサーを多重化することおよびそれらの有用なセンサーアレイへの組み立てである。一般的に、診断目的には、３０〜１００のアレイが必要とされる。たとえば、乳癌スクリーニングは、陽性対照および陰性対照に加えて、２０〜３０の癌マーカー遺伝子のテストが必要である。(Drummond,T.G.ら、Nat.Biotechnol.,21,1192,2003)。
【０００６】
したがって、少量の核酸を同定および／または分析するための、改良された能率的な方法の開発が当該技術分野で必要である。特に、サンプル中に存在する全ｍＲＮＡ中の標的遺伝子を直接同定および／または分析するための改良された能率的な方法が必要である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、先行技術の必要性に対処し、標的核酸を検出および／または定量化するための簡単で迅速かつ超高感度の方法および装置を提供する。本発明による方法および装置はまた、標的タンパク質の検出および／または定量化にも適用することができる。
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、核酸またはポリペプチドのサンプル中の、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドを検出および／または定量化する方法であって、
ａ）核酸またはポリペプチドを含むサンプルを供するステップと；
ｂ）該核酸またはポリペプチドをリガンド複合体で標識するステップであって、該リガンド複合体が、該核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むステップと；
ｃ）該核酸−リガンド複合体またはポリペプチド−リガンド複合体を、少なくとも１つの捕獲プローブと接触させるステップであって、該捕獲プローブが、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合するステップと；
ｄ）ｉ）該捕獲リガンドにより認識される酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、該捕獲レセプターが、該捕獲リガンドに結合できる複合体を加えるステップと；
ｅ）酸化還元ポリマーを加えるステップであって、該酸化還元ポリマーが、該酸化還元酵素に結合し、それによって、電子が、酵素から該酸化還元ポリマーを経て電極表面に移動するステップと；
ｆ）該標的核酸または標的ポリペプチドの存在を検出および／または定量化するステップと；
を含む方法を提供する。
【０００９】
該捕獲プローブは、電極表面上に固定されていてもよい。あるいは、該捕獲プローブは、溶液中で自由であってもよく、また電極表面に固定することを可能にする手段を含んでもよい。
【００１０】
核酸のサンプルは、哺乳動物サンプル、たとえばヒトサンプルまたはマウスサンプルであってもよい。該サンプル、たとえば全ｍＲＮＡのサンプルは、組織から抽出してもよい。
【００１１】
該サンプルが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのような核酸のサンプルであるとき、該捕獲プローブは、該標的核酸の少なくとも一部分に相補的であり、該標的核酸の少なくとも一部分とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
ある特定の実施形態によれば、該サンプルは、全ｍＲＮＡのサンプルであり、該電極表面上に固定される該捕獲プローブは、該標的ｍＲＮＡの一部に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００１３】
この方法は、直接検出および／または定量化ｍＲＮＡ法に属するものである。
【００１４】
該サンプルがポリペプチド、たとえばタンパク質のサンプルであるとき、該捕獲プローブは、該標的ポリペプチドを認識して結合することができる任意のリガンド、たとえば該標的ポリペプチドに特異的な抗体であってもよい。
【００１５】
該核酸または該ポリペプチドに結合する第１の成分は、一般的に、標識剤、たとえば、シスプラチン、白金結合シアニン３、白金結合シアニン５であってもよい。該捕獲リガンドは、ビオチン、ジゴキシゲニン、該捕獲レセプターに結合する抗体または抗原、該酸化還元酵素に結合する抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターのような、該捕獲レセプターに結合することができる任意の責任ある(liable)（置換可能な）リガンドであってもよい。
【００１６】
該捕獲レセプターは、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、該捕獲リガンドに結合する抗原または抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターであってもよい。
【００１７】
ある特定の実施形態によれば、該リガンド複合体は、シスプラチン−ビオチンであり、該捕獲レセプターは、アビジンまたはストレプトアビジンである。具体的には、該複合体は、ＧＯＸ−ストレプ（アビジン）である。
【００１８】
別の実施形態によれば、該酸化還元酵素は、該捕獲リガンドに結合し、該捕獲リガンドは、抗体である。
【００１９】
該酸化還元酵素は、本発明の目的に適する任意の酵素、たとえばオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロゲナーゼ等々であってもよい。該オキシダーゼは、本発明の目的に適する任意のオキシダーゼ、たとえば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼまたはそれらの混合物であってもよい。
【００２０】
該酸化還元ポリマーは、当該技術分野で公知でかつ本発明の目的に適する任意の酸化還元ポリマーであってもよい。たとえば、該酸化還元ポリマーは、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーであってもよい。
【００２１】
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法は、１つ以上の標的遺伝子を検出および／または定量化するための診断方法である。該標的遺伝子は、下記の少なくとも１つである：腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）、および／またはヒストンＨ４（Ｈｉｓ４）。本発明による診断方法はまた、異なる標的遺伝子を同時に検出および／または定量化することも可能である。
【００２２】
本発明による方法は、非常に少量の核酸またはポリペプチドの検出を可能にする。たとえば、該サンプルが全ｍＲＮＡのサンプルであるとき、本発明の方法は、０．１０〜０．９５ｆｇの範囲内で、標的ｍＲＮＡの検出を可能にする。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、本発明の方法を実行するための装置を提供する。
【００２４】
該装置は、センサーアレイで構成される。詳細には、サンプル分析物中の標的核酸および／またはポリペプチドを検出するためのセンサーアレイ装置は、スペーサー／絶縁層で隔てられた第１および第２の電極を含み、該電極は、該分析物を第２の電極に作用させたとき、接続される。２つの電極を通過する電流は、作用させた分析物の量を反映する。電極材は、本発明の目的に適する任意の材料で作られる。たとえば、該電極材は、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）、電流測定用カーボン−エポキシ複合材、ドープダイアモンドフィルム、カーボンナノチューブ、インジウム−酸化スズ、および／または任意の導電体、たとえば導電性ポリマー、ドープ半導体等で作られていてもよい。特に、該スペーサー／絶縁層は、底部から上部にかけて、粘着性のスペーシング／絶縁層、スクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌ層および疎水性層を含む。さらに、支持材は、ガラス支持材であってもよい。該分析物は、全ｍＲＮＡのサンプル、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのサンプルであってもよい。
【００２５】
ある特定の態様によれば、本発明による装置は、微小電気医学システム（ＭＥＭＳ）および／または完全自動化Micro Total Analysis System（μ−ＴＡＳ）に組み込まれる。
【００２６】
別の態様によれば、本発明は、下記の成分：Ａ）ｉ）電極表面上に固定される、またはｉｉ）電極表面に固定することが可能である手段を含む、少なくとも１つの捕獲プローブと；Ｂ）サンプルの核酸またはポリペプチドを標識するためのリガンド複合体であって、該核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分、および捕獲リガンドである第２の成分を含むリガンド複合体と；Ｃ）ｉ）捕獲リガンドにより結合され得る酸化還元酵素またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、該捕獲レセプターが、該捕獲リガンドに結合することができる、複合体と；Ｄ）酸化還元ポリマーと；を含む診断用キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、標的核酸を検出および／または定量化するための簡単で迅速、かつ能率的で超高感度な方法および装置を提供する。本発明による方法および装置は、標的タンパク質の検出および／または定量化にも応用することができる。
【００２８】
詳細には、本発明の方法は、複合標的核酸またはポリペプチド／酵素／ポリマーアクティベーター二重層を形成することによる、好ましくはセンサーアレイで実行される、標的核酸またはポリペプチドのアンペロメトリー検出に基づく。
【００２９】
第１の態様によれば、本発明は、核酸またはポリペプチドのサンプル中の、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドを検出および／または定量化する方法であって、
ａ）核酸またはポリペプチドを含むサンプルを供するステップと；
ｂ）該核酸またはポリペプチドをリガンド複合体で標識するステップであって、該リガンド複合体は、該核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むステップと；
ｃ）該核酸−リガンド複合体またはポリペプチド−リガンド複合体を、少なくとも１つの捕獲プローブと接触させるステップであって、該捕獲プローブは、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合するステップと；
ｄ）ｉ）該捕獲リガンドにより認識される酸化還元酵素か、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、該捕獲レセプターは、該捕獲リガンドに結合できる複合体を加えるステップと；
ｅ）酸化還元ポリマーを加えるステップであって、該酸化還元ポリマーは、該酸化還元酵素に結合し、それによって、電子が、酵素から該酸化還元ポリマーを経て電極表面に移動するステップと；
ｆ）該標的核酸または標的ポリペプチドの存在を検出および／または定量化するステップと；
を含む方法を提供する。
【００３０】
該捕獲プローブは、電極表面上に固定されていてもよい。あるいは、該捕獲プローブは、溶液中で自由であってもよく、また電極表面に固定することを可能にする手段を含んでもよい。電極表面上に固定するための手段は、標的核酸またはポリペプチドに結合した捕獲プローブの選択および回収を可能にし、かつ該捕獲プローブを該電極基材上に固定することができる、任意の手段であってもよい。たとえば、抗体を使用してもよい。あるいは、該手段は、磁気ビーズの使用からなることもあり、これは、該標的核酸またはポリペプチドに結合した捕獲プローブの選択および回収を可能にし、また該捕獲プローブを、該磁気ビーズを引きつけることができる電極表面に結合させるかまたは電極表面上に固定させることができる。こうした代替法によれば、該捕獲プローブに結合した核酸またはポリペプチド（該標的）のみが選択され、該電極表面上に固定される。
【００３１】
核酸のサンプルは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのサンプルであってもよい。ｃＤＮＡのサンプルは、たとえば、所望の標的ｃＤＮＡが選択されるｃＤＮＡライブラリーであってもよい。サンプルが、ゲノムＤＮＡまたは全ｍＲＮＡのサンプルであるとき、該サンプルは、たとえば組織から得られる、任意の生体サンプルであってもよい。該サンプルまたは組織は哺乳動物から得られることもある。したがって、該サンプルまたは組織は、たとえば、ヒトまたはマウスのサンプルまたは組織である可能性もある。
【００３２】
該サンプルが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのような、核酸のサンプルであるとき、該捕獲プローブは、該標的核酸の少なくとも一部分に相補的であり、該標的核酸の少なくとも一部分とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである。
【００３３】
ある特定の実施形態によれば、該サンプルは、全ｍＲＮＡのサンプルであり、該電極表面上に固定される該捕獲プローブは、該標的ｍＲＮＡの一部に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
したがって、この方法は、直接検出および／または定量化ｍＲＮＡ法に属するものである。
【００３５】
本発明の目的上、核酸分子、たとえばオリゴヌクレオチドは、該核酸分子の１本鎖形が、適当な温度条件および溶液イオン強度条件で他の核酸分子にアニーリングできるとき、別の核酸分子、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis、T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)、特にその中の11章および表12.1に例示されている（参照により本明細書に全面的に組み込む）。温度条件およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が、相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間の不一致が可能である。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知変数である、核酸の長さおよび相補性の程度によって異なる。２つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が大きいほど、こうした配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、下記の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さ１００ヌクレオチドより大きいハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための式が導かれている(Sambrookら、上掲、9.50-9.51参照)。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、不一致の位置はより重要になり、また、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrookら、上掲、11.7-11.8参照)。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の因子により、必要に応じて調節できることが分かるであろう。用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を表現するために使用される。たとえば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、またシトシンはグアニンに相補的である。
【００３６】
該サンプルが、ポリペプチド、たとえばタンパク質のサンプルであるとき、該捕獲プローブは、該標的ポリペプチドを認識して結合することができる任意のリガンド、たとえば標的ポリペプチドに特異的な抗体であってもよい。
【００３７】
リガンド複合体に関して、該核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分は、シスプラチン(Hoevel T.ら、Biotechniques,27(5):1064-7,1999)、白金結合シアニン３および／または白金結合シアニン５(Guptaら、Nucleic Acids research,Vol.31,No.4,2003)であってもよい。該核酸に結合する他の成分としては、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、ｒｅｃＡまたはその相同体のような、ＤＮＡに対して親和性を有するまたはＤＮＡに結合する適当なタンパク質、細菌起源、ウイルス起源または哺乳動物起源の不一致検出タンパク質(mismatch detecting proteins)、またはＤＮＡ関連の他のタンパク質などがある。
【００３８】
該捕獲リガンドは、ビオチン、ジゴキシゲニン、該捕獲レセプターに結合する抗体または抗原、該酸化還元酵素に結合する抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターのような、該捕獲レセプターに結合することができる任意の責任ある(liable)（置換可能な）リガンドであってもよい。
【００３９】
該捕獲レセプターは、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、該捕獲リガンドに結合する抗原または抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターであってもよい。
【００４０】
ある特定の実施形態によれば、該リガンド複合体は、ジゴキシゲニン誘導体に結合したシスプラチン(Hoevel T.ら、Biotechniques,27(5):1064-7,1999)、またはシスプラチン−ビオチンであり、該捕獲レセプターは、アビジンまたはストレプトアビジン（両者を、「ストレプト（アビジン）」とも表す）である。
【００４１】
別の実施形態によれば、ストレプト（アビジン）に結合した酸化還元酵素を含む複合体が提供される。たとえば、ＧＯＸ−ストレプト（アビジン）。
【００４２】
別の実施形態によれば、酸化還元酵素は、単独で（したがって、該捕獲レセプターとの複合体の形態で）加えられ、該酸化還元酵素は、該捕獲リガンドに結合することができる。この場合、該捕獲リガンドは、酸化還元酵素を認識して結合する抗体であってもよい。
【００４３】
該酸化還元酵素は、本発明の目的に適する任意の酵素、たとえばオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロゲナーゼ等々であってもよい。該オキシダーゼは、本発明の目的に適する任意のオキシダーゼ、たとえば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸまたはＧＯｘ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アスコルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ、ベリルビンオキシダーゼ、またはそれらの混合物であってもよい。
【００４４】
酸化還元ポリマーは、当該技術分野で公知でかつ本発明の目的に適する任意の酸化還元ポリマーであってもよい。たとえば、該酸化還元ポリマーは、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーであってもよい。
【００４５】
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法は、１つ以上の標的遺伝子を検出および／または定量化するための診断方法である。該標的遺伝子は、下記の少なくとも１つを含んでもよい：腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）、および／またはヒストンＨ４（Ｈｉｓ４）。本発明による診断方法はまた、異なる標的遺伝子を同時に検出および／または定量化することも可能である。さらに、適当なマーカーを使用することが可能である。
【００４６】
本発明による方法は、非常に少量の核酸またはポリペプチドの検出を可能にする。たとえば、該サンプルが全ｍＲＮＡのサンプルであるとき、本発明の方法は、０．２０〜１．０ｆｇ（フェムトグラム）、特に、０．１０〜０．９５ｆｇの範囲内で、標的ｍＲＮＡの検出を可能にする。
【００４７】
ある特定の実施形態によれば、本発明は、図２に例示されている方法を提供する。本方法は、ヒト乳房組織から抽出された全ｍＲＮＡ中の特定の遺伝子の直接検出を可能にする新規な手法を示す。該ｍＲＮＡは、シスプラチン−ビオチン複合体を使用して一段階非酵素反応で標識される。金電極表面上に固定された相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後、核酸／ポリマーアクティベーター二重層の形成は、鋭敏なアンペロメトリー検出を可能にする。標的ｍＲＮＡ用システムの検出限界は、フェムトモル濃度レベルである。これは、０．２０〜１．０ｆｇのｍＲＮＡに換算される。実際問題として、このレベルのバイオセンサー感度は、ＰＣＲ工程を必要とせずに、現実世界サンプル中のｍＲＮＡを直接検出するための必要条件を満たしている。センサーアレイ、たとえば８×８センサーアレイで、多数のアッセイが首尾よく試みられた。
【００４８】
該ｍＲＮＡ分子に複数の酵素標識を組み入れることによって、本発明の方法の感度は、当該技術分野で公知の方法に比べて大幅に、４０倍も向上した。ＴＰ５３遺伝子発現の０．８０倍という僅かな差も、全ｍＲＮＡで首尾よく検出された。感度が大幅に改善されて、蛍光に基づく技術より少なくとも１０００倍鋭敏になり、アッセイに必要な全ｍＲＮＡの量は、マイクログラムからナノグラムに切り下げられた。このシステムは、乳癌遺伝子を直接マッピングするための超高感度な方法を提供し、また分子診断のための完全なシステムを構成する。
【００４９】
別の態様によれば、本発明は、本発明の方法を実行するための装置を提供する。本発明による装置の一例を図１（Ａ、Ｂ）に示す。図１（Ａ、Ｂ）に示す例は、本発明による装置の限定的な例ではない。
【００５０】
本装置は、センサーアレイで構成される。詳細には、サンプル分析物中の標的核酸および／またはポリペプチドを検出するためのセンサーアレイ装置は、スペーサー／絶縁層で隔てられた第１および第２の電極を含み、該電極は、該分析物を第２の電極に作用させたとき、接続される。２つの電極を通過する電流は、作用させた分析物の量を反映する。電極材は、本発明の目的に適する任意の材料で作られる。たとえば、該電極材は、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）、電流測定用カーボン−エポキシ複合材、ドープダイアモンドフィルム、カーボンナノチューブ、インジウム−酸化スズ、および／または任意の導電体、たとえば導電性ポリマー、ドープ半導体等で作られていてもよい。特に、該スペーサー／絶縁層は、底部から上部にかけて、粘着性のスペーシング／絶縁層、場合によりスクリーン印刷層および疎水性層を含む。該スクリーン印刷層は、スクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌであってもよい。さらに、第１の電極を、支持材上に適用してもよい。本発明の目的上、該支持材は任意の適する支持材、たとえば、ガラス支持材であってもよい。該捕獲プローブを、該第１の電極の表面上に適用してもよい。該捕獲プローブは、該分析物の少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合することができる。該分析物は、全ｍＲＮＡのサンプル、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのサンプルであってもよい。
【００５１】
該センサーアレイは、下記の通りに作動する。絶縁層で隔てられた２層の電極がある。溶液を作用させる前は、電極は切断されていて、１滴の溶液が加えられたとき接続され、該２電極を通過する電流は、その滴中の分析物の量を示す。全ｍＲＮＡ（または任意の他の核酸またはポリペプチド）中の個々の遺伝子の検出は、該センサーアレイで実施される。たとえば４０ｍＭグルコース試験液のアリコート１０μｌが加えられるまで、個々のセンサーは開回路のままである。試験液を取り去ることにより、センサーを事実上作動しないようにする。アンペロメトリー測定が、適当な電圧で実行される。たとえば、実験パートに示す通り、アンペロメトリー測定は、０．３６Ｖで実行された。この研究で報告された全ての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を基準にしたが、該参照電極は、この化学組成に限定されない。
【００５２】
μ−流体工学および微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）、マイクロ・トータル・アナリティカル・システムズ(Micro Total Analytical Systems)（μＴＡＳ）およびバイオチップテクノロジーの近年の進歩は、多くの微量分析機器の小型化をもたらした。流体処理における小型化の利点としては、サンプルサイズ、応答時間、経費、分析性能、プロセス制御、集積化、スループットおよび自動化に関する効率性の改善などがある(de Mello,Anal.Bioanal.Chem.372:12-13,2002)。ある特定の態様によれば、本発明による装置は、微小電気医学システム（ＭＥＭＳ）および／または完全自動化マイクロ・トータル・アナリティカル・システムズ(Micro Total Analysis System（μ−ＴＡＳ））に組み込まれる。
【００５３】
別の態様によれば、本発明は、下記の成分：Ａ）ｉ）電極表面に固定される、またはｉｉ）電極表面上に捕獲プローブを固定することを可能にする手段を含む、少なくとも１つの捕獲プローブと；Ｂ）サンプルの核酸またはポリペプチドを標識するためのリガンド複合体であって、該核酸またはポリペプチドに結合するための第１の成分および捕獲リガンドである第２に成分を含むリガンド複合体と；Ｃ）ｉ）該捕獲リガンドにより結合され得る酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、該捕獲レセプターが、該捕獲リガンドに結合することができる、複合体と；Ｄ）酸化還元ポリマーと；を含む診断用キットを提供する。
【００５４】
さて、本発明を全般的に説明してきたが、実例として提供されるのであって、本発明を限定するためではない、下記の実施例を参考にすることにより、もっと容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００５５】
［材料］
他に記載がない限り、試薬は、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)（米国ミズーリ州セントルイス(St Louis,MO,USA)）から入手し、さらに精製せずに使用した。グルコースオキシダーゼ−アビジン複合体（ＧＯｘ−Ａ）は、ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)（米国カリフォルニア州サンディエゴ(SanDiego,CA,USA)）から購入した。シスプラチン結合ビオチン複合体（ビオチン−ケム−リンク(Biotin-Chem-Link)）は、ロシュ・ダイアグノスチックス(Roche Diagnostics)（ドイツ、マンハイム(Mannheim,Germany)）から入手した。［オスミウム（２，２´−ビピリジン）2Ｃ１2］Ｃｌ（［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］）、［オスミウム（４，４´−ジメチル−２，２´−ビピリジン）2Ｃ１2］Ｃｌ、（［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］）および［オスミウム（４，４´−ジアミノ−２，２´−ビピリジン）2Ｃ１2］Ｃｌ（［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］）は、Layらにより提案された方法(Lay,P.A.ら、Inorg.Synth.24,291,1986、参照により本明細書に組み込む)に従って、Ｋ2ＯｓＣ１6から合成した。［オスミウム（２，２´−ビピリジン）2（１−メチルイミダゾール）Ｃｌ］Ｃ１2（［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］）および［オスミウム（２，２´−ビピリジン）2（イミダゾール）Ｃｌ］Ｃ１2（［（Ｏｓ（ｂｐｙ）2（ｉｍ）］）複合体は、文献の手順（Sullivan,B.P.,Salmon D.& Meyer,T.J.Inorg.Chem.,1978,17,3334、参照により本明細書に組み込む）に従って、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃ１2］複合体から調製した。本研究で使用した酸化還元ポリマーは、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］（Ｉ）、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］（ＩＩ）、［（Ｏｓ（ｂｐｙ）2（ｉｍ）］（ＩＩＩ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］（ＩＶ）および［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］（Ｖ）と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）であった。こうした酸化還元ポリマーの合成は、他所（Gao,Z.,Binyamin,G.,Kim,H.H.,Barton,S.C.,Zhang,Y.& Heller,A.Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,810、参照により本明細書に組み込む）に記述されている。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を、洗浄および電気化学的測定に使用した。全てのオリゴヌクレオチドは、アルファ・ＤＮＡ（Ａｌｐｈａ−ＤＮＡ）（カナダのモントリオール(Montreal,Canada)）による特注品であった。
【００５６】
［全ｍＲＮＡ抽出および標識］
ヒト乳房組織の全ｍＲＮＡは、製造業者の推奨するプロトコールに従って、ダイナビーズ(Dynabeads)（商標）ｍＲＮＡダイレクト(DIRECT)（商標）キット（ノルウェーのオスロにあるダイナルＡＳＡ(Dynal ASA,Oslo,Norway)）で抽出した。ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)により推奨された方法に従い、シスプラチン結合ビオチン複合体を使用して、全ｍＲＮＡを直接標識した。スキーム１に示す通り、この複合体は、脂肪族リンカーによってシスプラチン複合体に結合されている、ビオチン部分からなる。一方の結合部位は、リンカー／ビオチン分子に共有結合しており、他方の部位は、切断可能な硝酸リガンドである。核酸鋳型（ＤＮＡまたはＲＮＡ）と共に水溶液中でインキュベートすることにより、硝酸塩が切断され、シスプラチンとＧ塩基およびＡ塩基のＮ７位との間に新しい複合体が形成される。配位化合物は、安定でかつ核酸変性に抵抗する。一般的に、全ｍＲＮＡ１．０μｇを各標識反応で使用した。我々の実験では、シスプラチン−ビオチン複合体１．０μｌを、全ｍＲＮＡ１．０μｇと共に、最終体積２０μｌで、８５℃で３０分間インキュベートし、停止液５μｌを加えることによって反応を終わらせた。最終生成物を−２０℃で保存した。
【００５７】
【化１】
2007534961.tif 000003
スキーム１：シスプラチン−ビオチン複合体（ビオチン−ケム−リンク(Biotin-Chem-Link)）の構造。
【００５８】
［核酸センサーアレイ製作］
２５〜５０Åのチタン接着層に続いて２５００〜３０００Åの金を、スライドガラス上に電子ビーム蒸着させた。スクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌ層および疎水性層が付いた厚さ１ｍｍの模様付き粘着性スペーシング／絶縁層からなる、模様付きスペーサー／絶縁層を、図１（Ａ、Ｂ）に示す通りに、組み立てた。個々のセンサー（上面図の点により図１（Ａ、Ｂ）に描かれている）の直径は２．０ｍｍであり、疎水性パターンの直径は４ｍｍであった。５０μＭ捕獲プローブ溶液のアリコート２．５μｌを、センサー表面上に該溶液を注意深くのせることによって、プラズマ洗浄した個々のセンサーに作用させ、制御された環境で少なくとも１２時間インキュベートした。未結合のプローブを洗い流した後、遮蔽のない金をブロックするために、エタノール中５０μＭの１−メルカプトドデカン（ＭＤ）のアリコート２．５μｌを４〜６時間作用させた。水で完全にすすいだ後、該センサーアレイは準備が整っていた。該センサーアレイは、下記の通りに作動する。絶縁層で隔てられた２層の電極がある。溶液を作用させる前は、電極は切断されていて、１滴の溶液が加えられたとき接続され、該２電極を通過する電流は、その滴中の分析物の量を示す。全ｍＲＮＡ中の個々の遺伝子の検出は、該センサーアレイで実施した。４０ｍＭグルコース試験液のアリコート１０μｌが加えられるまで、個々のセンサーは開回路のままである。試験液を取り去ることにより、センサーを事実上作動しないようにする。アンペロメトリー測定は、０．３６Ｖで実行された。この研究で報告された全ての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を基準にした。
【００５９】
［ハイブリダイゼーションおよび酵素標識］
全ｍＲＮＡ抽出物中の乳癌感受性遺伝子、すなわち、腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３，１１８２ｂｐ）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０，１６３２ｂｐ）、乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１，５５９２ｂｐ）、およびヒストンＨ４（Ｈｉｓ４，３１２ｂｐ）を選択し、後述の通りに使用した。該システムをさらに検証するために、ハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ，１００８ｂｐ）もテストした。ヒト乳房組織から抽出された対応遺伝子のｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを、分析された核酸として較正試験で使用した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．１０Ｍ  ＮａＣｌ緩衝溶液（ＴＥ）を、ハイブリダイゼーション緩衝溶液として使用した。ハイブリダイゼーションは、５５℃の水浴中で３０分間実施した。核酸サンプルを、９５℃（ｃＤＮＡ）および７０℃（ｍＲＮＡ）で１０分間変性させ、氷浴中で冷却してからセンサーアレイに加えた。ハイブリダイゼーション後、該センサーアレイを５．０ｍｇ／ｍｌＧＯｘ−Ａのアリコート２．５μｌに室温で３０分間暴露し、攪拌したＰＢＳ溶液中に５分間浸漬したが、これは、非ＤＮＡ関連のＧＯｘ−Ａ取り込みの排除を目的とする手法である。該酸化還元ポリマーの最大負荷を確実にするために、次いで、該電極を少なくとも１０分間、５．０ｍｇ／ｍｌ酸化還元ポリマー溶液のアリコート２．５μｌに暴露し、その後、ＰＢＳで完全にすすいだ。
【００６０】
［電気化学的測定］
電気化学的測定は、ペンティアム(Pentium)（登録商標）コンピューターと連結した、低電流モジュールを備えた低ノイズＣＨインスツルメント・モデル６６０Ａ(low-noise CH Instruments Model 660A)電気化学ワークステーションを用いて、ファラデー箱内で実施した。ＰＢＳ緩衝溶液中および４０ｍＭグルコースを含むＰＢＳ緩衝溶液中で、サイクリック・ボルタンメトリーを実施した。電気化学的特性決定は、金電極で実施した。Ａｇ／ＡｇＣ１電極を参照電極として使用し、白金ワイヤーを対極として使用した。全ｍＲＮＡ中の個々の遺伝子の検出は、該センサーアレイで実施した。４０ｍＭグルコース試験液のアリコート１０μｌが加えられるまで、個々のセンサーは開回路のままである。試験液を取り去ることにより、センサーを事実上作動しないようにする。アンペロメトリー測定は、０．３６Ｖで実行された。この研究で報告された全ての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を基準にした。
【００６１】
［検出スキーム］
直接ハイブリダイゼーションおよびｍＲＮＡ＋ＧＯｘＡ／酸化還元ポリマー二重層の形成によりｍＲＮＡを検出するためのスキームを図２に示す。テストの前に、チオール化オリゴヌクレオチド捕獲プローブとチオール分子との混合物を、自己集合によってセンサーアレイ表面上に固定した。次いで、該センサーアレイを該標的遺伝子溶液に暴露した。相補的ビオチニル化標的ｍＲＮＡにハイブリダイズした後、アビジン−ビオチン相互作用を介して、ＧＯｘ−Ａ標識をシステムに導入した。次いで、多層静電自己集合により、酸化還元ポリマー被覆をセンサーアレイに導いた。該酸化還元ポリマー層は、酵素反応のための仲介層の役割を果たす。該酸化還元ポリマー層は、標的遺伝子に付着した酵素標識を電気化学的に活性化する。基質分子の存在下で、該基質の酵素的酸化により生じた電流はアンペロメトリーで検出され、これは、サンプル溶液中の標的ｍＲＮＡ濃度に直接相関している。
【００６２】
［シスプラチン−ビオチン複合体標識ｍＲＮＡの合成］
ＲＴ−ＰＣＲ工程中にビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して核酸を標識する代わりに、シスプラチン−ビオチン複合体とともに核酸鋳型をインキュベートしても、申し分のない標識をもたらす（図３）。図４に示す通り、ＴＰ５３を例にとると、シスプラチン−ビオチン複合体との反応後、全長ＴＰ５３ｍＲＮＡはその完全性を保持した。非標識ＴＰ５３（レーン２）と比べて、反応生成物（レーン３）の移動度シフト低いことから、シスプラチン−ビオチン複合体が該ｍＲＮＡ鎖に首尾よく組み込まれたことが示唆される。定量分析は、ＴＰ５３ｍＲＮＡの塩基の８〜１０％が標識されたことを示した(Hoevel,T.,Holz,H.& Kubbies,M.Biotechniques 1999,27,1064)。この標識の効率は、次のＧＯｘ−Ａ負荷に十分であった。実験は、ＧＯｘ−Ａを、ｍＲＮＡ分子上のあらゆるシスプラチン−ビオチン部分に付着させることは不可能なことを示した。平均で、４０〜４５塩基当たり１つのＧＯｘ−Ａ複合体が、該ｍＲＮＡ分子に付着した、またはビオチン部分の〜３０％に付着した。最高の感度および最良の再現性を達成するために、シスプラチン−ビオチン標識工程およびＧＯｘ−Ａ標識工程の両者を最適化して、ビオチン標識およびＧＯｘ−Ａ標識の最大負荷を確実にした。同様に、シスプラチン−ビオチン複合体とともに全ｍＲＮＡを８５℃で３０分間、インキュベートする際に、多数のビオチン部分を、全ての他のｍＲＮＡ分子に組み入れた。
【００６３】
［ハイブリダイゼーションおよび標的遺伝子検出の実現可能性試験］
該センサーアレイ上の混合形自己集合単層の形成を、表面被覆率および電気化学的測定により、定期的にモニターした。得られた全てのデータは、センサー表面上に、オリゴヌクレオチド捕獲プローブおよび空間充填１−メルカプトドデカン分子を含む、１層のコンパクトな混合分子層を示した。この研究で使用した酸化還元ポリマーはプラスに帯電しており、またセンサー表面はマイナスに帯電していたため、該センサーを５．０ｍｇ／ｍｌ  酸化還元ポリマー溶液中に短時間浸漬することによって、多層静電自己集合により、該電極上に核酸／酸化還元ポリマー二重層が形成された(Decker,G.Science 1997,277,1231)。図５曲線「ａ］に示す通り、該二重層被覆センサーは、極めて可逆的な表面固定酸化還元対に期待される通りに作用し、徹底的な洗浄後および−０．３０〜＋０．６０Ｖの多数の繰り返し電位サイクル後に、ほとんど変化がなく、極めて安定した表面限定静電二重層であることを示した(Bard,A.J.& Faulkner,L.R.Electrochemical Methods.John Wiley & Sons:New York,2001,p590)。このような結果から、オスミウム酸化還元中心の全てが、電極表面に到達して、可逆的不均一電子移動に進めることが究明された。陰イオン種（捕獲プローブ）の量にもよるが、結合したオスミウム酸化還元中心の総量、１．５〜２．５×１０-10モル／ｃｍ2は、バックグラウンド電流から補正された酸化または還元ピーク電流下面積から推定した。次の、フェリシアン化物溶液中でのボルタンメトリーテストは、裸の金電極で得られたものと全く同じボルタモグラムを示した。これらの変化は、オスミウム酸化還元中心を電極表面に最も接近させる、二重層の形成に起因する電子トンネル経路の減少に原因があるとされ、またより重要なことは、二重層中のオスミウム酸化還元中心の速い電子移動速度であり、下にある絶縁単層を横切る電子トンネルの効果を最小限に抑え、また溶液種から該電極表面への電子移動を仲介した(Xie,H.;Yu,Y.H.;Mao,P:L.;Gao,Z.Nucleic Acids Res.2004)。後で示す通り、核酸およびＧＯｘ−Ａがフィルム中に存在することによって、該酸化還元ポリマーの電気化学は感知できるほど変化しなかった。
【００６４】
最初のハイブリダイゼーションテストで、全ｍＲＮＡ中の全長ＴＰ５３  ｍＲＮＡを標的遺伝子として選択した。ハイブリダイゼーションの前に、該ｍＲＮＡ混合物を７０℃で１０分間、変性させた。ＲＴ−ＰＣＲに使用した全てのプライマーは、１ｓｔ  ＢＡＳＥ（シンガポール）による特注品であった。プライマー配列は、下記の通りであった：ＧＡＰＤＨセンス、５´−ATGGTGAAGGTCGGTGTCAA−３´（配列番号１）；ＧＡＰＤＨアンチセンス、５´−TTACTCCTTGGAGGCCATGT−３´（配列番号２）；ＴＰ５３センス、５´−ATGGAGGATTCACAGTCGGA−３´（配列番号３）；およびＴＰ５３アンチセンス、５´−TCAGTCTGAGTCAGGCCC−３´（配列番号４）。
【００６５】
【表１】
2007534961.tif 000004
【００６６】
ＴＰ５３遺伝子に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、センサー表面上に固定され、捕獲プローブの役割を果たした。５５℃で３０分間ハイブリダイズしたとき、該混合物からのＴＰ５３  ｍＲＮＡは、その相補的捕獲プローブに選択的に結合され、センサー表面上に固定された。ハイブリダイゼーション緩衝溶液で完全にすすぎ、ハイブリダイゼーション非関連のｍＲＮＡの全てを洗い流した。次の、Ｇｏｘ−Ａ複合体とのインキュベーション中に、ＧＯｘ−Ａ標識は、ビオチン−アビジン相互作用によってセンサー表面に導かれた。酸化還元ポリマー被覆適用後の、該センサーの典型的なサイクリックボルタモグラムを、図５、曲線「ｂ」に示す。曲線「ｂ」に見られる通り、酸化工程でも還元工程でも、ＴＰ５３  ｍＲＮＡ処理センサーでかなり高いピーク電流が確認され、ほぼ確実に、捕獲されたｍＲＮＡ分子のため、増量した酸化還元ポリマーがセンサー表面に導かれたことを示すが、これによって、より多くの負電荷がセンサー表面に導かれ、該センサー上に微小三次元構造が作り出された。酸化還元ポリマー溶液中でセンサーを処理した結果、混合微小三次元ｍＲＮＡ＋ＧＯｘ−Ａ／酸化還元ポリマー二重層が形成された。酸化還元ポリマーの総量、５．９〜８．６×１０-10モル／ｃｍ2は、酸化還元ポリマー単層の総量、〜１０-11モル／ｃｍ2よりかなり多く、該酸化還元ポリマー鎖が、三次元ネットワーク構造で電極上に密に「グラフト結合」されたことが分かる。この二重層はまた、非常に迅速な電子交換プロセスも有する：５００ｍＶ／秒までの走査速度で、ボルタンメトリーによる電気的還元波および電気的酸化波のピーク電流の分離は、ＧＯｘ−Ａ標識を含む二重層では、一般に２５ｍＶ未満である。徹底的な洗浄および電位サイクリングは、目だった変化をもたらさず、該酸化還元ポリマーは、静電二重層の形成により、またある程度まで、第１の核酸層との相互作用を介して、該センサー表面にてしっかりと結合されることが分かった。図５、曲線「ｃ」は、ハイブリダイゼーション後の、４０ｍＭグルコースを含むＰＢＳ中でのボルタモグラムであった。二重層にグルコースオキシダーゼが存在するため、明白な接触電流が確認された。対照実験では、非相補的捕獲プローブは、ＴＰ５３を捕獲することができず、その結果、酵素標識はセンサー表面に結合することができなかった。ボルタンメトリーで顕著な接触電流は得られなかった。
【００６７】
図６および表２から分かる通り、酸化還元ポリマー被覆の構造差が、その仲介能力に大きく影響を与えた。
【００６８】
【表２】
2007534961.tif 000005
【００６９】
ポリマー（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）は、セクション「材料」に記載のものを指す。
【００７０】
ＧＯｘの等電点は約４．０であるため、２つの正電荷を持つオスミウム酸化還元中心が、正電荷１つのものより高かった酸化還元ポリマーの接触電流は、ＧＯｘ−Ａとオスミウム酸化還元中心の静電気相互作用が、仲介成功における重要な因子の１つであることを意味した(Trudeau,F.,Daigle,F.& Leech,D.Anal.Chem.1997,69,882)。酸化還元ポリマーのアクリルアミド部分はまた、二重層の安定化をも助け、またオスミウム酸化還元中心をＧＯｘに近接近させるのにも役立った。１−置換イミダゾールリガンドを含む酸化還元ポリマーで発生した接触電流は、非置換イミダゾールを含むものより小さいことが確認され、ＧＯｘのＦＡＤ酸化還元中心に近い、ＧＯｘ上のイミノ基とカルボキシル基との間の水素結合は、電子交換をさらに容易にしたことが示唆される。ＩＩＩ被覆（該酸化還元ポリマーＩＩＩ）を使用したセンサーで発生した同一実験条件で、ボルタンメトリー接触電流は最高であり、ＩＶ被覆（該酸化還元ポリマーＩＶ）を用いたセンサーで確認されたものより３倍高いと測定された。したがって、最高の電流感度を得るために、その後の実験ではＩＩＩを使用した。
【００７１】
別のテストでは、全ｍＲＮＡ  ２０ｎｇ中のＴＰ５３とのハイブリダイゼーション後、完成したセンサーを、ＰＢＳ緩衝溶液に浸漬した。４０ｍＭグルコースをＰＢＳ溶液に添加したとき、アンペロメトリーで酸化電流は、０．３６Ｖで２．７ｎＡ増加した（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）（図５、曲線ａ）。非相補的捕獲プローブをセンサー表面上に固定した対照実験では、僅か０．１８ｎＡの増分が確認された（図７、曲線「ｂ」）。アンペロメトリーの結果は、先に得られたサイクリック・ボルタモグラムとよく一致し、全ｍＲＮＡ中に何万もの遺伝子があることを考慮すると、ＴＰ５３は全ｍＲＮＡ混合物から高い特異性で首尾よく検出されることが再確認された。同様の方法で、センサー表面上に固定される捕獲プローブを変えることによって、全ての他の遺伝子も全ｍＲＮＡから首尾よく検出された。
【００７２】
［一塩基不一致の標的遺伝子の検出］
完全に相補的な捕獲プローブを、塩基の１つが不一致のプローブと取り替えることによって、標的遺伝子を検出するためのアッセイの特異性を、全ｍＲＮＡ  ４０ｎｇでさらに評価した。図８に示す通り、完全に一致した配列の場合、電流増分は０．８０〜９．２ｎＡの範囲であったが、１塩基不一致の場合、増分は、非相補的配列（対照センサー）で確認された０．１９ｎＡより僅かに高い０．２３ｎＡまで、８０％も減少した。
【００７３】
［標的遺伝子用較正曲線］
乳癌の大部分は、４群に分類される乳癌感受性遺伝子と、何らかの形で関係があり、こうした遺伝子の鋭敏な検出および正確な定量化を提供できるであろう技術は、早期診断および予後診断を容易にするのに役立つ(Martin,K.J.ら、Cancer Res.2000,60,2232)。この研究で、シスプラチン標識ｃＤＮＡを標準として使用し、ＴＥ緩衝溶液で様々な濃度に希釈した後、使用した。０．１０ｆＭ〜２．０ｐＭの範囲の、異なる濃度のｃＤＮＡを含む分析物溶液をテストした。対照実験用に、非相補的捕獲プローブを、センサー作製で使用した。図９に示す通り、この範囲内で、電流は、ｃＤＮＡの濃度とともに直線的に増加した。ＴＰ５３、ＨＳＰ９０、ＢＲＣＡ１、Ｈｉｓ４およびＧＡＰＤＨのダイナミックレンジは、それぞれ２．０〜４００ｆＭ、２．０〜４００ｆＭ、１．０〜３００ｆＭ、２．０〜６００ｆＭおよび１．５〜４００ｆＭで、検出限界は、０．２０、０．４５、０．９５、０．１０および０．２７ｆｇに対応する、１．０、１．０、０．５０、２．０および１．０ｆＭであった。サンプル量を考慮に入れると、提案された方法を使用して、８００コピーという少量の核酸分子が首尾よく検出された。これは、電気化学的に検出されたゲノム核酸の報告された最低量であると思われる。サンドイッチ型アッセイに基づいた先の結果(Patolsky,F.,Lichtenstein,A.,Kotler,M.& Willner,I.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2261;Drummond,T.G.,Hill,M.G.,& Barton,J.K.Nat.Biotechnol.2003,21,1192)と比較して、ゲノム核酸分析の感度は、多数の酵素標識スキームを採用することによって大幅に改善され、その結果は、長さ２０〜５０塩基の短い合成オリゴヌクレオチドで得られるものに匹敵した。先に報告されたサンドイッチ型アッセイでは(Patolsky,F.,Lichtenstein,A.,Kotler,M.& Willner,I.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2261;Drummond,T.G.,Hill,M.G.,& Barton,J.K.Nat.Biotechnol.2003,21,1192)、酵素標識と標的核酸分子の比率は、一定であった。該センサー表面上に固定された捕獲プローブの量およびハイブリダイゼーション効率が、遺伝子のサイズにもかかわらず、該表面に結合される標的核酸の量を決定し、それによって酵素標識の量が決定される。事実、より長い核酸分子では、はるかに低い電流感度が確認された。しかし、この提案されたモデルでは、１つの核酸鎖上の多数のシスプラチン−ビオチン標識が、酵素標識負荷を大きく増加し、したがって酵素反応からの対応する応答が増大し、したがって、現実世界サンプルを扱うとき、該核酸バイオセンサーの感度および検出限界が実質的に改善された。たとえば、１０００塩基長の核酸では、５０塩基当たり１つの酵素標識があれば、全シグナルは、２０倍増加する可能性がある。シスプラチン−ビオチン複合体によって、核酸分子を多数の酵素分子で標識することにより、感度は、遺伝子の長さによって、サンドイッチ型アッセイと比較して１５〜４０倍上昇した。この研究で得られた感度は、該サンドイッチ型手法の短い合成オリゴヌクレオチド（５０量体）で確認されたものに匹敵し(Patolsky,F.,Lichtenstein,A.,Kotler,M.& Willner,I.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2261;Drummond,T.G.,Hill,M.G.,& Barton,J.K.Nat.Biotechnol.2003,21,1192)、短い合成オリゴヌクレオチドサンプルおよびゲノム核酸サンプルの両者とも、酵素／塩基比は、非常に小さい差異を有し、言い換えれば、類似した感度の分析シグナルを発生させることが分かった該酵素標識／塩基比は、核酸分子の長さにより、１／４０〜１００の範囲であると推定された。理論的には、この比率が全ての遺伝子で不変のままであれば、全ての遺伝子で、塩基当たり同じ電流感度が得られるはずである。しかし、塩基当たりの感度は、核酸長依存的であることは、特筆すべきであった。たとえば、ＢＲＣＡ１の感度は、遺伝子中に塩基（５５９２ｂｐ）が有意に多いため、他の遺伝子と比較して２倍を超えていた。しかし、塩基当たりの電流感度という意味では、ＢＲＣＡ１は最低であった。原則として、同一モル濃度で、感度は遺伝子中の塩基数におおよそ比例するはずであるが、この傾向は、本実験で確認されなかった。試験した遺伝子の中で一番短い、Ｈｉｓ４（３１２ｂｐ）は、塩基当たり、最高の電流感度を有していた。これは、たぶん、センサー表面上の核酸分子の立体障害および三次元パッキングが原因で、全てのビオチン部分がＧＯｘ−Ａ複合体に平等に接近できるとは限らないためであろう。ビオチン部分の一部は、より長いＤＮＡ分子の内部に深く「埋没」している可能性もあるため、ＧＯｘ−Ａ複合体にとって、より短い核酸鎖（短遺伝子）に付着したビオチン部分と相互に作用する方がはるかに容易であろう。
【００７４】
［ヒト乳房組織における乳癌感受性遺伝子の検出］
全ｍＲＮＡをヒト乳房組織から抽出した後、４つの代表的な乳癌感受性遺伝子、すなわち、ＴＰ５３、ＨＳＰ９０、ＢＲＣＡ１、Ｈｉｓ４、に加えてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを、該センサーアレイでテストした。外科手術の直後に、乳房組織サンプルをｍＲＮＡ抽出まで液体窒素で保存した。組織を機械的にホモジナイズし、磁気層抽出（ダイナビーズ（商標）ｍＲＮＡダイレクト（商標）キット（Dynabeads（商標）mRNA DIRECT（商標）Ｋｉｔ；ノルウェーのオスロにあるダイナルＡＳＡ(Dynal ASA,Oslo,Norway)）を用いて全ｍＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを、内部標準として使用した。ｍＲＮＡレベルを該センサーアレイで定量化し（各遺伝子につき１０重複および合計１４対照）、正常組織におけるハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対する比率として計算した。表３から分かる通り、ＢＲＣＡ１およびＨｉｓ４の過少発現およびＨＳＰ９０の過剰発現が乳癌組織で認められたが、たぶん、癌組織における発現変化ではなく、ＴＰ５３突然変異の高い確率のため、ＴＰ５３は、癌と正常組織との間でほとんど差を示さず、また変異したＴＰ５３遺伝子もまた、該センサーにより捕獲された。
【００７５】
【表３】
2007534961.tif 000006
【００７６】
これらの結果は、幾つかの以前の報告とよく一致している(30 Rosen,B.M.;fan,S.;Pestell,R.G.;Goldberg,L.D.J.Cell.Physiol.2003,19-41;Pavelic,K.;Gall-Troselj,K,;J.Mol.Med.2001,79,56'6-573;Saad,Z.;Bramwell,V.H.;Wilson,S.M.,O'Malley,F.P.,Jeacock,J.;Chambers,A.F.Lancet,1998,351,1170-1173.33 Gullans,S.R.Nature Genet.2000,26,4-5)。しかし、有用な臨床情報は、患者の病歴と関連した統計学的に有効な数のサンプルから得られるに過ぎない。それにもかかわらず、これらのデータから、現実世界サンプルの直接分析における、該センサーアレイの適用性が裏付けられる。ｍＲＮＡ検出の成功に必要な全ｍＲＮＡの最低量は、約１．５ｎｇであった。この全ｍＲＮＡプールに約３００００遺伝子があると考えると、各特異的ｍＲＮＡの実際の検出可能限界は、平均でフェムトグラム未満であり、較正試験とよく一致している（上記参照）。個々の遺伝子のｍＲＮＡアッセイ関連の相対的誤差は、一般に、２．０〜３００ｆＭの濃度範囲で２５％未満である。したがって、２つの条件の間で発現の差が１倍未満の遺伝子の同定が可能であった。最新のテクノロジーを使用しても、２倍異なる遺伝子発現を検出することは非常に困難である。３倍を超える遺伝子発現差は、確実に識別できるに過ぎない(Saad,Z.;Bramwell,V.H.;Wilson,S.M.,O'Malley,F.P.,Jeacock,J.;Chambers,A.F.Lancet,1998,351,1170-1173.33 Gullans,S.R.Nature Genet.2000,26,4-5)。しかし、多くの場合、最も興味深い遺伝子の多く発現は、様々な条件で少し異なるに過ぎない。遺伝子発現の微小変化を検出できる能力を判定するために、全ｍＲＮＡ  ５０ｎｇ中のＴＰ５３  ｍＲＮＡで多重アッセイを実施した。様々な量の全ｍＲＮＡをテスト溶液に添加することによって、ＴＰ５３の発現レベルを模倣した。図１０から、提案のアッセイが、１倍未満の遺伝子発現の差を明確に検出できることが明らかに分かる。図１０から分かる通り、０．８０倍の全ｍＲＮＡを添加した後、ＴＰ５３のアンペロメトリー応答は、テスト溶液のそれから完全に区別された。これによって、発現量の異なる遺伝子を、より正確に同定することが可能になり、余計な反復を実行する必要性が減少する。加えて、感度が非常に向上して、蛍光に基づくアッセイのものより少なくとも１０００倍鋭敏になったため、該提案の方法はまた、全ｍＲＮＡの量もマイクログラムからナノグラムに低減する。
【００７７】
［結論］
本明細書に記載の電気化学的センサーアレイは、迅速で超高感度かつ非放射性のゲノムｍＲＮＡに基づいており、またＰＣＲ増幅せずに、全ｍＲＮＡから乳癌感受性遺伝子およびハウスキーピング遺伝子を直接検出することができる。シスプラチン−ビオチン複合体を使用することにより、ｍＲＮＡは、一段階非酵素反応で、ビオチン部分で直接標識された。ハイブリダイゼーション工程およびｍＲＮＡ＋ＧＯｘ−Ａ／ポリマーアクティベーター二重層の形成を用いて、特異的遺伝子がアンペロメトリーにより、高感度および特異性で検出された。ｍＲＮＡサンプルを多数の酵素分子で標識することにより、感度は、サンドイッチ型アッセイと比較して大幅に、１５〜４０倍も上昇した。ヒト乳房組織癌からの感受性遺伝子全長ｍＲＮＡは、８×８センサーアレイを使用して、フェムトモル濃度レベルで選択的に検出された。１倍未満の遺伝子発現差は、首尾よく検出された。ｍＲＮＡの検出可能な最低量は、全ｍＲＮＡ  １．５ｎｇ中に約８００コピーであった。該センサーアレイを、組織消化およびサンプル調製から核酸単離および定量化まで、完全自動化微小電気機械システムに組み込むことにより、分子診断、特に早期癌診断、ポイント・オブ・ケアおよび現場使用のための、より速くかつ安価で簡単な解決法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明によるセンサーアレイ装置の上面図（Ａ）および分解組立図（Ｂ）を示す図である。
【図２】ＲＮＡ／酸化還元ポリマー二重層モデルを使用するＲＮＡアッセイの略図である。
【図３】シスプラチン標識メカニズムを示す図である。
【図４】シスプラチン−ビオチン複合体標識ＴＰ５３のアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。サンプルは、２．５％アガロースゲルを用いて、０．０９０Ｍ  Ｔｒｉｓ−０．０９０Ｍ  ホウ酸−０．００２０Ｍ  ＥＤＴＡ緩衝溶液中、１０Ｖ／ｃｍで実行した。
【図５】（ａ）ハイブリダイゼーション前および（ｂ）全ｍＲＮＡ  ５００ｎｇ中のＴＰ５３とのハイブリダイゼーション、ＧＯＸ−Ａとのインキュベーション後；および（ｃ）４０ｍＭグルコースを該ＰＢＳに添加後の、ＰＢＳ中２５ｍＶ／秒におけるセンサーのサイクリック・ボルタモグラム。ＶＩ被覆を全てのセンサーに適用した。条件は、実験のセクションに詳述する。
【図６】全ｍＲＮＡ  ５００ｎｇ中のＴＰ５３とのハイブリダイゼーション、ＧＯＸ−Ａとのインキュベーションおよび酸化還元ポリマー被覆の適用（ａおよびｃ）後；および４０ｍＭグルコースをＰＢＳに添加後（ｂおよびｄ）の、ＰＢＳ中２５ｍＶ／ｓの、センサーのサイクリックボルタモグラム。ＩＶ被覆を（ａ）および（ｂ）に適用し；およびＩＩＩ被覆を、（ｃ）および（ｄ）に適用した。条件は、実験のセクションに詳述する。
【図７】（ａ）相補的捕獲プローブおよび（ｂ）非相補的捕獲プローブを用いた、全ｍＲＮＡ  ２０ｎｇ中のＴＰ５３とのハイブリダイゼーション、ＧＯＸ−ＡとのインキュベーションおよびＩＩＩ被覆の適用後の、アンペロメトリー応答。平衡電位：０．３６Ｖ、４０ｍＭグルコース。条件は、実験のセクションに詳述する。
【図８】全ｍＲＮＡ  ４０ｎｇ中の遺伝子に相補的な、一塩基不一致の、および該遺伝子に非相補的な、捕獲プローブを用いた、ｍＲＮＡ混合物中でのハイブリダイゼーション後の、センサーのアンペロメトリー応答を示す図である。条件は、図７の場合と同じである。
【図９】異なる濃度における乳癌感受性遺伝子のアンペロメトリー応答を示す図である。条件は、図７の場合と同じである。
【図１０】アンペロメトリー応答（６反復）の、ＴＰ５３ｍＲＮＡ発現レベル依存性。様々な量の全ｍＲＮＡを、全ｍＲＮＡ  ５０ｎｇを含むテスト溶液に添加することにより、発現レベルを模倣した。条件は図７の通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2007534961000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月16日(2007.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸またはポリペプチドのサンプル中の、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドを検出および／または定量化する方法であって、
ａ）核酸またはポリペプチドを含むサンプルを供するステップと；
ｂ）前記核酸またはポリペプチドをリガンド複合体で標識するステップであって、前記リガンド複合体が、前記核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むステップと；
ｃ）前記核酸−リガンド複合体またはポリペプチド−リガンド複合体を、少なくとも１つの捕獲プローブと接触させるステップであって、前記捕獲プローブが、少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合するステップと；
ｄ）ｉ）前記捕獲リガンドにより認識される酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合した酸化還元酵素を含む複合体であって、前記捕獲レセプターが前記捕獲リガンドに結合できる複合体を加えるステップと；
ｅ）酸化還元ポリマーを加えるステップであって、前記酸化還元ポリマーが前記酸化還元酵素に結合し、それによって、電子が、前記酵素から前記酸化還元ポリマーを経て電極表面に移動するステップと；
ｆ）前記標的核酸または標的ポリペプチドの存在を検出および／または定量化するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記捕獲プローブが、電極表面上に固定されているか、または電極表面上に固定することを可能にする手段を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕獲プローブが、前記標的核酸の少なくとも１部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸のサンプルが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのサンプルである、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸のサンプルが全ｍＲＮＡのサンプルであり、前記捕獲プローブが少なくとも１つの標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸のサンプルが、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのサンプルであり、前記捕獲プローブが、少なくとも１つの標的ｃＤＮＡまたは少なくとも１つの標的ゲノムＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項７】
前記捕獲プローブが、標的ポリペプチドに結合する抗体またはリガンドである、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドのサンプルがタンパク質のサンプルであり、前記捕獲プローブが少なくとも１つの標的タンパク質に結合する、請求項１〜２、７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸または前記ポリペプチドに結合する前記第１の成分が、シスプラチン、白金結合シアニン３、白金結合シアニン５であり、前記捕獲リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、捕獲レセプターに結合する抗体または抗原、前記酸化還元酵素に結合する抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕獲レセプターが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、前記捕獲リガンドに結合している抗原または抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化還元酵素が前記捕獲リガンドに結合し、前記捕獲リガンドが抗体である、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼまたはヒドロゲナーゼである、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはそれらの混合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸化還元ポリマーが、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーである、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面電極が、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）または電流測定用カーボン−エポキシ複合材で作られている、請求項２〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、全ｍＲＮＡサンプル中の特異的遺伝子を直接検出および／または定量化するための方法である、請求項１〜６、９〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが哺乳動物サンプルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルがヒトサンプルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍＲＮＡサンプルが、組織から抽出される、請求項１６〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンド複合体がシスプラチン−ビオチンであり、前記捕獲レセプターがアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項１６〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、１つ以上の標的遺伝子を検出および／または定量化するための診断方法である、請求項１６〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的遺伝子が、腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）、およびヒストンＨ４（Ｈｉｓ４）の少なくとも１つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸の検出限界が、０．２０〜１．０ｆｇである、請求項１〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出された標的核酸がｍＲＮＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ｍＲＮＡが、前記乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）に対応する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、センサーアレイで実行される、請求項１〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記センサーアレイが、支持材；前記支持材上に適用された第１の電極材；前記電極材上に適用されたスペーサー／絶縁層、および第２の電極材を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記電極材が、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）または電流測定用カーボン−エポキシ複合材で作られている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記スペーサー／絶縁層が、底部から上部にかけて、粘着性のスペーシング／絶縁層、スクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌ層および疎水性層を含む、請求項２７〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記支持材がガラス支持材である、請求項２６〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
微小電気医学システム（ＭＥＭＳ）および／または完全自動化マイクロ・トータル・アナリシス・システム(Micro Total Analysis System)（μ−ＴＡＳ）に組み込まれている、請求項１〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ａ）ｉ）電極表面上に固定されているか、またはｉｉ）電極表面上に固定するための手段を含む、少なくとも１つの捕獲プローブと；Ｂ）サンプルの核酸またはポリペプチドを標識するためのリガンド複合体であって、前記核酸またはポリペプチドに結合する第１の成分および捕獲リガンドである第２の成分を含むリガンド複合体と；Ｃ）ｉ）前記捕獲リガンドによって結合され得る酸化還元酵素、またはｉｉ）捕獲レセプターに結合された酸化還元酵素を含む複合体であって、前記捕獲レセプターが、前記捕獲リガンドに結合することができる複合体と；Ｄ）酸化還元ポリマーとを含む、診断用キット。
【請求項３３】
前記捕獲プローブが、標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記捕獲プローブが、標的ポリペプチドに結合することができる抗体またはリガンドである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記核酸または前記ポリペプチドに結合する前記第１の成分が、シスプラチン、白金結合シアニン３、白金結合シアニン５であり、前記捕獲リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、捕獲レセプターに結合する抗体または抗原、または前記酸化還元酵素に結合する抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項３２〜３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記捕獲レセプターが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、前記捕獲リガンドに結合する抗原または抗体、アプタマー、タンパク質および／またはタンパク質レセプターである、請求項３２〜３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼまたはヒドロゲナーゼである、請求項３２〜３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはそれらの混合物である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記酸化還元ポリマーが、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーである、請求項３２〜３８に記載のキット。
【請求項４０】
サンプル分析物中の標的核酸および／またはポリペプチドを検出するためのセンサーアレイ装置であって、第１の電極層と、前記第１の電極層の上に適用されたスペーサー／絶縁層と、前記スペーサー／絶縁層の上に適用された第２の電極層とを含み、前記第２の電極層が参照電極である、装置。
【請求項４１】
支持材と、
前記支持材の上に適用された第１の電極層と、
前記第１の電極層の上に適用されたスペーサー／絶縁層と、
前記スペーサー／絶縁層の上に適用された第２の電極層であって、参照電極である第２の電極層と、
前記第２の電極層の上に適用された疎水性層と
を含む、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記２つの電極を通過する電流が、作用させた分析物の量を反映する、請求項４０または４１に記載の装置。
【請求項４３】
前記分析物を前記第２の電極に作用させたとき、前記電極が接続される、請求項４０〜４２に記載の装置。
【請求項４４】
対極をさらに含む、請求項４０〜４３に記載の装置。
【請求項４５】
捕獲プローブが、前記第１の電極の表面上に適用され、前記捕獲プローブが、前記分析物の少なくとも１つの標的核酸または標的ポリペプチドとハイブリダイズまたは結合することができる、請求項４０〜４４に記載の装置。
【請求項４６】
前記電極が、金、白金、グラッシーカーボン、グラファイト、カーボンペースト（ＣＰＥ）および／または電流測定用カーボン−エポキシ複合材で作られている、請求項４０〜４５に記載の装置。
【請求項４７】
前記第２の電極層がＡｇ／ＡｇＣｌ層である、請求項４０〜４６に記載の装置。
【請求項４８】
前記支持材がガラスである、請求項４０〜４７に記載の装置。
【請求項４９】
前記分析物が、全ｍＲＮＡのサンプルである、請求項４０〜４８に記載の装置。
【請求項５０】
前記分析物が、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのサンプルである、請求項４０〜４８に記載の装置。
【請求項５１】
前記装置が、微小電気医学システム（ＭＥＭＳ）および／または完全自動化マイクロ・トータル・アナリシス・システム(Micro Total Analysis System)（μ−ＴＡＳ）に組み込まれている、請求項４０〜５０に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
該酸化還元酵素は、本発明の目的に適する任意の酵素、たとえばオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロゲナーゼ等々であってもよい。該オキシダーゼは、本発明の目的に適する任意のオキシダーゼ、たとえば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、ラクターゼオキシダーゼ（ＬＡＸ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＸ）、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはそれらの混合物であってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
該酸化還元ポリマーは、当該技術分野で公知でかつ本発明の目的に適する任意の酸化還元ポリマーであってもよい。たとえば、該酸化還元ポリマーは、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーであってもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
酸化還元ポリマーは、当該技術分野で公知でかつ本発明の目的に適する任意の酸化還元ポリマーであってもよい。たとえば、該酸化還元ポリマーは、酸化還元活性なポリマー材料、ポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、［Ｏｓ（ｂｐｙ）2］、［Ｏｓ（ｄｍｂｐｙ）2］、［（Ｏｓｂｐｙ）2（ｉｍ）、［Ｏｓ（ｄａｂｐｙ）2］および／または［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（Ｍｉｍ）］と部分的にイミダゾール複合化したポリ（ビニルイミダゾール−コ−アクリルアミド）、ポリ［ビニルピリジンＯｓ（ビス−ビピリジン）2Ｃｌ−コ−アリルアミン］（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＡＡ）、フェロセンをベースとするポリマー、および／またはルテニウムをベースとするポリマーであってもよい。
【国際調査報告】
2007534961.tif 000020
2007534961.tif 000021
2007534961.tif 000022