(57)【要約】本発明は抗アポトーシス活性アプタマーに関する。対応する配列を示す。本発明は、とりわけ動脈硬化の治療、創傷の治癒促進、エイズ、癌、アルツハイマー病、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチおよびその他の慢性炎症性疾患の治療のための可能な治療用途および診断用途について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アポトーシス活性のある配列番号１から配列番号９及びこの核酸の機能的変種、からなる群から選択される核酸配列を含む核酸。
【請求項２】
配列番号１から配列番号９からなる群から選択される配列に５’方向および／または３’方向に、１００個以下、好ましくは７０個以下、特に好ましくは３０個以下、極めて特に好ましくは２０個以下、および最も好ましくは１０個以下のヌクレオチドが付加されることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列番号１から配列番号９からなる群から選択される核酸。
【請求項４】
請求項１から３に記載の核酸を含む医薬製剤。
【請求項５】
動脈硬化、創傷、創傷治癒の促進、特に治癒の遅い創傷における創傷治癒の促進、エイズ、アルツハイマー病、癌、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、およびその他の慢性炎症性疾患からなる群から選択される疾患を治療する医薬品を製造するための請求項１から３に記載の核酸の使用。
【請求項６】
診断ツールとしての請求項１から３に記載の核酸の使用。
【請求項７】
化学合成による請求項１から３に記載の核酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗アポトーシス活性アプタマーに関する。対応する配列を示す。本発明は、可能な治療用途および診断用途について述べる。
【背景技術】
【０００２】
特定の標的分子（抗原）に特異的に結合する核酸分子（いわゆるアプタマー）については、そのアプタマーの製造および単離方法と共に、既に最新技術で十分に述べられている。
【０００３】
一本鎖ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡからなるこのアプタマーは、対応する抗原に非常に高い親和性および特異性を有する。今までに、金属イオン、有機化合物、ペプチド、タンパク質、またはウイルスおよび細胞などの複合構造に対しても核酸リガンドが単離された（要旨記事：Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（１９９５年）、７６３〜７９７頁；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＣｏｎｒａｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１（１９９５年）、１８５〜２１４頁；Ｆａｍｕｌｏｋ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（１９９９年）、３２４〜３２９頁）。
【０００４】
したがって、アプタマーは、その空間的構造により特定の標的に特異的かつ高い親和性で結合することができるＤＮＡまたはＲＮＡからなる核酸である（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｓ．Ｅ．およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．、（１９９７年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．」、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９７（２）、３４９〜３７０頁）。これまで数年にわたって、医学関連の標的タンパク質に対するいくつかのアプタマーが同定された。さらに今や、初めて治療目的および診断目的での核酸の利用が実際に開始されることに期待が寄せられている（Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．（１９９９年）、「Ａｐｔａｍｅｒｓ：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｉｖａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４５（９）、１６２８〜１６５０頁、Ｃｅｒｃｈｉａ，Ｌ．、Ｈａｍｍ，Ｊ．ら、（２００２年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２８（１〜３）、１２〜１６頁）。この新しい発展の理由には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同定および適用が、今日でも多くの分野でまだ治療および診断を独占する抗体と比較して有する利点が含まれる。
【０００５】
モノクローナル抗体を得る方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、（１９７５年）、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（５５１７）、４９５〜４９７頁）は、近代生物学および医学の多くの分野に大きな突破口を示した。医学研究において、これは診断分野で最も突出した役割を果たすが、その一方で個々の抗体も薬物として認可された。あるタンパク質が、例えば細胞表面上で、診断目的または治療目的に関して標的として同定され、ａ）その存在が診断目的で同定されるものか、もしくはｂ）その機能が治療目的で阻害されるものである場合、今日まで両方の場合で、モノクローナル抗体の開発が最も重要かつ／または最速の方法であった。低分子治療剤の開発は、まだ非常に長く面倒なプロセスである。抗体の同定および製造の不利点および制限がよく知られており（Ｊａｙａｓｅｎａ  １９９９年）、例えば動物試験による一次免疫化の実行の必要性、数年にわたるハイブリドーマ細胞の有用性および再現性の問題、または抗体製造の高い作業負荷および莫大なコストなどである。
【０００６】
特別に設計された実験条件下、例えば診断法に最適な条件下で、アプタマーを選択することができる（Ｊａｙａｓｅｎａ  １９９９年）。タンパク質と異なり、不可逆的変性を受けず、いつでも温度により復元することができるため、アプタマーを長期にわたり貯蔵することができる。選択手順では、通常アプタマーを酵素的に合成する。しかし、より大規模な製造では化学的にも合成でき、したがってモノクロ−ナル抗体の製造と比較して、かなり改良された再現性で製造することができる（Ｊａｙａｓｅｎａ  １９９９年）。
【０００７】
ＤＮＡの安定化をもたらす修飾（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．（１９９６年）、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（１０）、３７６〜３８７頁）またはＲＮＡの安定化をもたらす修飾（Ｐｉｅｋｅｎ，Ｗ．Ａ．、Ｏｌｓｅｎ，Ｄ．Ｂ．ら（１９９１年）、「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ２’−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３（５０１７）、３１４〜３１７頁；Ｒｕｃｋｍａｎ，Ｊ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．ら（１９９８年）、「２’−Ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  １６５−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ１６５）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ  ７−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｄｏｍａｉｎ．」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（３２）、２０５５６〜２０５６７頁）が核酸またはヌクレオチド前駆体の合成においてルーチン法として確立され、今日、臨床試験で最初のアプタマーを試験することが可能である（Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（２００２年）、「Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｓｅ  １Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ａｐｔａｍｅｒ（ＥＹＥ００１）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．」、Ｒｅｔｉｎａ  ２２（２）、１４３〜１５２頁）。
【０００８】
アポトーシスは、一般に特定の生理学的状態または病態下において真核細胞で誘導される、遺伝的にコードされた「自殺プログラム」である。活動亢進が変性疾患をもたらし得るため、アポトーシスの誘導は極めて精密に調節されなければならない。一方、アポトーシス誘導の低下は、例えば腫瘍進行の原因となる可能性がある。
【０００９】
様々な低分子アポトーシス誘導物質については既に述べられている。重要な物質類は腫瘍細胞増殖抑制剤である。しかし、これらの細胞増殖抑制剤または他の物質がアポトーシスを誘導する方法は、ほとんどの症例において知られていない。
【００１０】
アポトーシスの誘導は、例えば一連のいわゆるデス（ｄｅａｔｈ）レセプター、すなわちそのリガンドに結合後にアポトーシスシグナル経路を誘導するＣＤ９５、ＴＮＦ−ＲＩ、ＤＲ３、ＤＲ４またはＤＲ５などの「デスドメイン」（ＤＤ）を含むレセプターを介して起こることが可能である。例えば、ＣＤ９５リガンドに結合後、ＣＤ９５レセプターはアダプタータンパク質ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１と相互に作用し、それによりＤＩＳＣ「細胞死誘導シグナル複合体」でのプロテアーゼＦＬＩＣＥ／カスパーゼ８の「採用」および活性化を誘導する。ＦＡＤＤおよびＦＬＩＣＥはそれぞれ「デスエフェクタードメイン」（ＤＥＤ）を含む。例えば、細胞毒性物質の投与、放射線、ウイルス、成長因子の離脱または力学的細胞損傷により、外部からこれらのアポトーシスシグナル経路を介してアポトーシスを誘導することも可能である。しかし、これらのアポトーシス誘導の可能性に伴い、特定の不利点が生じる。例えば、細胞増殖抑制剤などの毒素投与または癌細胞の放射線処理などは、耐性発現をもたらし、アポトーシス誘導を全く望まない正常な健康細胞を損傷させることが可能である。
【００１１】
一般にアポトーシス誘導は、例えば癌の治療または血管新生プロセスの阻止など治療用に提案される。これに関して、誘導物質について既に述べられているが、多くの不利点もまだ示される。例えば、細胞増殖抑制剤には重度の副作用が伴う。
【００１２】
アポトーシスが悪影響を与え、かつ適切な治療法がアポトーシスの阻害を含む病態も懸案事項である。
【００１３】
このような病態の例は動脈硬化である。とりわけ発明者は、アポトーシス細胞が動脈硬化プラークを有する部位（特に内皮細胞、平滑筋細胞）で特に発生し、この発生が障害のあるフロー条件でさらに強まる、すなわち流量依存的であることを以前から示してきた（Ｆｒｅｙｂｅｒｇら、ＢＢＲＣ、２８６、１４１〜１４９頁、２００１年）。
【００１４】
また、創傷治癒にプラスの効果を得るのにアポトーシスを調節する物質を利用することができる。高レベルのアポトーシスに関連する懸案中のさらなる病態は、エイズ、癌およびアルツハイマー病、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチおよびその他の慢性炎症性疾患である。
【００１５】
したがって、アポトーシスにプラスまたはマイナスの影響を与えることができる物質に対する多大な要望がある。本発明の意義では、アポトーシスを阻害するこのような物質が特に好ましい実施形態である。動脈硬化および創傷治癒で問題の要因因子としても考えられる流量依存または力依存アポトーシスを阻害するのが特に好ましいであろう。したがって、このような物質を含み、かつアポトーシスの誘導または阻害を示す病態の治療、特に、動脈硬化の治療および創傷治癒の改善はもちろん、エイズ、アルツハイマー病および癌治療で投与可能な薬剤処方に対する多大な要望が依然として存在する。
【００１６】
以前の独国特許出願ＤＥ１０１６３１３０において、本発明の発明者はアポトーシスを阻害または誘導するペプチドを開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって本発明の目的は、さらに改良されたアポトーシス活性物質を提供することである。とりわけ、本発明のさらなる目的は、真核細胞、特に内皮細胞および線維芽細胞のＴＳＰ−１誘導アポトーシスを阻害することができる物質を提供することである。本発明のさらなる目的は、アポトーシスの誘導または阻害を示す、動脈硬化、創傷、エイズ、アルツハイマー病、癌、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、およびその他の慢性炎症性疾患などの疾患を治療することができる医薬製剤を提供することである。
【００１８】
これらの目的および特に明確化されないさらなる目的は、先に述べた最新技術の評価により明白となるが、特許請求の範囲に定義する本発明の実施形態により解決される。
【００１９】
驚くべきことに、配列番号１から９に示す配列からなる群から選択される核酸配列を含む核酸を提供することで簡単にこの目的を解決することができる。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、これらの核酸の機能的変種に関する。本発明の目的に関して、これらは、少なくとも６個、好ましくは少なくとも１０個、非常に好ましくは少なくとも１５個、および最も好ましくは少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドの範囲を示し、配列番号１から配列番号９からなる群から選択された配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示し、以下で述べる試験手順で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、非常に好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の阻害指数の抗アポトーシス活性を示す核酸である。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、ヌクレオチドが、配列番号１から配列番号９からなる群から選択される核酸配列に、５’方向および／または３’方向に付加している核酸に関する。とりわけ、いずれの場合にも、この延長は１００個以下、好ましくは７０個以下、特に好ましくは３０個以下、非常により好ましくは２０個以下、最も好ましくは１０個以下のヌクレオチドを含む。
【００２２】
ここでも、上記の定義の意味のこれらの延長された核酸の機能的変種が含まれることは言うまでもない。
【００２３】
本発明のアプタマーは、好ましくはヌクレアーゼの分解に対して本発明の核酸の安定性を高める修飾を含む。好ましくは、修飾されていないヌクレオチドのウリジンおよびシチジンの代わりに、２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジンおよび／または２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジンを使用する。
【００２４】
本発明の目的に関して、核酸は、ＲＮＡの場合、ヌクレオチドのアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、グアノシン（Ｇ）からなるポリマー分子、ＤＮＡの場合、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシシチジン（Ｃ）、デオキシグアノシン（Ｇ）およびチミジン（Ｔ）からなるポリマー分子として理解される。これらのヌクレオチドは、次の修飾、つまり２’−デオキシ、２’−フッ素化、２’−塩素化、２’−臭素化、２’−ヨウ素化、２’−アミノ（好ましくは非置換またはモノ置換またはジ置換）、２’−モノ−、ジもしくはトリ−ハロメチル、２’−ｏ−アルキル、２’−ｏ−ハロ置換アルキル、２’−アルキル、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル、メチルホスホン酸塩、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン、ポリエチレングリコール修飾、ならびにピリミジン塩基に関して６−位置の硫黄および５−位置のハロゲン、３’−末端のＣ1-5アルキル基、脱塩基リンカー、３’−デオキシアデノシンもしくは他の連鎖停止剤または伸長できないヌクレオチドアナログあるいは５’−および／または３’−末端の他の修飾の少なくとも１つを示すことができる。もちろん、例えばＷＯ０２／２６９３２などの最新技術で既に開示されているさらなる修飾を本発明に同様に含む。
【００２５】
一般に、アプタマーは１０から１００個のヌクレオチド、好ましくは１５から５０個のヌクレオチド、特に好ましくは２０から４０個のヌクレオチドを含む。必要であれば、アプタマーは、その結合を保証するのに必要である、少なくとも６個、好ましくは少なくとも１０個、特に好ましくは少なくとも１４から１５個のヌクレオチドの最小配列を示す。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、本発明の核酸を少なくとも１つ含む医薬製剤である。
【００２７】
本発明の特に好ましい実施形態は、動脈硬化、創傷、エイズ、アルツハイマー病、癌、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、およびその他の慢性炎症性疾患の治療のための薬物を産業上よく知られる方法で製造するために、本発明の核酸を使用することである。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、本発明はまた、診断ツールとしての本発明の核酸の使用に関する。本発明では、マーキングした核酸を使用する。例えば、蛍光色素、酵素、抗体または放射性核種を用いてマーキングを行うことができる。対応する検出法は当業者によく知られる。
【００２９】
好ましくは、本発明のアプタマーは、例えば陰性および陽性対照と共にキットの構成品になる。専門家には、原理上、対応するアプタマーを、例えばＥＬＩＳＡ用途、クロマトグラフ法、および診断／スクリーニング手順における抗体のように利用できることがよく知られている。
【００３０】
本発明では、抗アポトーシス活性とは、実施例６による阻害試験において対応する物質が、ＴＳＰ−１誘導アポトーシスを有する対照に関して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の阻害指数を起こすことを指す。
【００３１】
医薬製剤の活性成分であるアプタマーは、通常、薬剤として許容される適切な賦形剤に溶解する。この薬剤として許容される賦形剤の例として、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液などの緩衝液であることが可能である。各患者に特定される投薬法および薬量は、使用する特定の化合物の活性、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、栄養状態、投与時間、投与方法、排せつ率、他の薬物処理との相互作用、および治療を行う疾患の重症度などいくつかの因子によって決まる。これらの因子によって医師がこれを決定するものである。
【００３２】
例えば吸入スプレー、経直腸的、経皮下、静脈内、筋肉内、関節内および髄膜注射ならびに輸液法により非経口的に、あるいは薬剤として許容される媒質、アジュバントおよび賦形剤を通常含む医薬製剤の外用により、たいていアプタマー薬物を投与する。特定された物質の性質に依存して、他の投与方法、例えば経口投与も可能である。さらに、軟膏、ジェル、湿布などとしてこの薬物を施用することができる。
【００３３】
本発明はまた、従来の賦形薬と組み合わせて効果的な抗アポトーシスアプタマーの有効量を含む医薬化合物を提供する。賦形薬は、例えば固体もしくは液体増量剤、被包物質または溶剤である。賦形薬の役割を果たすことができる物質の例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類、トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉などの澱粉、セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースの誘導体、トラガント末、麦芽、ゼラチン、獣脂、カカオバターおよび坐剤ワックスなどの薬物賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油類、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝液、アルギン酸、ピロゲンフリー水、等張食塩水、リンガー液、エタノールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で使用されるその他の無毒であり混合可能な物質である。製薬上の必要に応じて、湿潤剤、乳化剤およびラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、ならびに色素、コーティング剤、香料および保存剤も本製剤に含有させることが可能である。個々の投薬量となるように賦形剤と組み合わせた活性物質の量は、治療を受ける患者や特別な投与方法に依存して変化する。
【００３４】
例えば、本発明の化合物を対応する緩衝水溶液または水に溶解し、凍結乾燥するなどのよく知られる方法により、本発明のアプタマーの薬剤として適切な塩を製造することができる。本発明の化合物を対応するイオンを含む溶液に溶解し、ＨＰＬＣまたはゲル透過法により本化合物を単離して、金属塩を得ることができる。
【００３５】
アプタマー薬物の製造ならびにその投与に関するさらなる手順および方法は、例えばＷＯ０２／２６９３２で開示されており、もちろん本発明において同様に利用することができる。
【００３６】
本発明の核酸は、当業者に全く問題を生じることなく簡単な方法、例えばＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザを用いて従来の化学的合成により製造することができる。対応する手順書および装置は当業者によく知られており、定型的な作業である。
【００３７】
図１は配列番号２の仮想二次構造を示す。アプタマー配列番号２は、ＲＮＡ配列５’−ＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＵＧＣＣＧＣＵＧＵＣＣＧ−３’と共に構造Ｈ１を形成する。らせん（ヘアピン）構造（Ｈ１）を有するこの領域は、「ヘリックスＦ」と呼ばれるらせん構造も形成することができる２つのＲＮＡセクションに隣接される。アプタマー８９（配列番号２）から開始する変更／変異ＲＮＡの合成により、ヘリックスＦを形成する隣接配列がこのアプタマーの機能に重要であるか否か、およびアプタマー８９がこの機能を維持したまま短縮できるか否かが示される（配列番号４、実施例７）。
【００３８】
図２は配列番号７で予測される二次構造を示す。本構造は、配列（配列番号９）の中央部分に、隣接配列からのさらなるらせんで補われるヘアピンループ（Ｈ２）を有する。
【００３９】
以下の実施例は、全く限定されることはなく、本発明を例示するものである。
【００４０】
実施例
以下の概説により使用される物質および供給元について示す。特に記載のない場合、供給元はドイツに所在する。
【００４１】
【表１】
2007513618.tif 000002
溶液調製用の再蒸留水をピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）０．０１％で２０℃から２５℃で２４時間処理し、その後、１２１℃で６０分間オートクレーブ処理した。
【００４２】
溶液：
ＣＩ  クロロホルム／イソアミルアルコール２４：１（容量／容量）混合液
１ｘＴＢＥ  ９０ｍＭ  トリス、９０ｍＭ  ホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ
【００４３】
実施例１：本発明によるアプタマーの合成
アプタマーは、ピリミジンヌクレオチド（ＵおよびＣ）が２’位置にＯＨ基の代わりにＮＨ2（アミノ）基を有する修飾ＲＮＡを表わす。本発明ではＲＮＡポリメラーゼを使用して修飾されていないプリンおよび修飾されているピリミジンヌクレオチドを挿入することで酵素的にこの修飾ＲＮＡの合成を行う。
【００４４】
バクテリオファージＴ７のＴ７プロモーター配列および最初の転写ヌクレオチド由来の所望のアプタマーＲＮＡのＤＮＡコピー（例えば、５’−ＧＧＧＡＧＡＣ．．．−３’で始まるアプタマーＮｏ．８９：ＤＮＡ配列「配列番号１」、実施例２参照）を含む二本鎖ＤＮＡ（６０〜７０ｐｍｏｌのＤＮＡ）から開始して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりアプタマーＲＮＡを合成する。製造会社（製造会社：ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔｈ）が推薦する緩衝液および塩条件下において、１６℃＋／−３℃で２０から４４時間、４０μｌ容量で市販のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼとインキュベートすることにより、修飾ヌクレオチド２’−ＮＨ2−ＵＴＰ（２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン）および２’−ＮＨ2−ＣＴＰ（２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）ならびにＡＴＰとＧＴＰの存在下で転写が起こる。その後、まだ存在するＤＮＡを、ＭｇＣｌ2（２．７４ｍＭ差まで濃度を上昇させる）およびＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（最終濃度０．０６ユニット／μｌ）を添加し、３７℃で１３５分間インキュベートすることによって消化する。それにより１ユニットのＤＮａｓｅＩは、４０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2の５０μｌ緩衝液（２５℃でｐＨ７．９）において３７℃、１０分で１μｇのＤＮＡを完全に消化する酵素量であると定義される。
【００４５】
４５μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）を添加した後、最初に溶液をフェノールで抽出し、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出する。その後、エタノールでアプタマーＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄後、３０μｌのＤＥＰＣ処理再蒸留水（ｄｄ−Ｈ2Ｏ）に溶解させ、−２０℃で貯蔵する。８Ｍ  尿素と９．４７％（ｗ／ｖ）アクリルアミドおよび０．５３％ビス−アクリルアミドを有するトリスホウ酸緩衝液との存在下でのポリアクリルアミドゲル、８Ｍ  尿素及びＴＢＥ緩衝液（標準１ｘＴＢＥ緩衝液系：９０ｍＭ  トリス、９０ｍＭ  ホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で分離後、アプタマーＲＮＡの産生量を、既知の濃度の核酸と共に２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を分析することにより決定する。３５から４５分間の１２から１６Ｖ／ｃｍで核酸が分離する。その後、ゲルを蛍光色素ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（分子プローブ；製造会社の説明書に準じる濃度）で２０分間染色し、ＵＶ光で励起して可視光における蛍光発光を分析する。
【００４６】
実施例２：本発明によるアプタマーの配列
１）ＤＮＡ  Ｎｏ．８９の配列（配列番号１）
５’−ＧＧＧＡＧ  ＡＣＧＡＴ  ＡＴＴＣＧ  ＴＣＣＡＴ  ＣＡＣＣＧ  ＧＡＣＧＧ  ＧＡＣＣＡ  ＧＡＧＧＴ  ＧＣＣＧＣ  ＴＧＴＣＣ  ＧＡＣＴＧ  ＡＡＴＴＣ  ＴＣＧＡＣ  Ｃ−３’
２）ピリミジン修飾アプタマーＮｏ．８９のＲＮＡ配列（配列番号２）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＧＧＧＡＧ  ＡＣＧＡＵ  ＡＵＵＣＧ  ＵＣＣＡＵ  ＣＡＣＣＧ  ＧＡＣＧＧ  ＧＡＣＣＡ  ＧＡＧＧＵ  ＧＣＣＧＣ  ＵＧＵＣＣ  ＧＡＣＵＧ  ＡＡＵＵＣ  ＵＣＧＡＣ  Ｃ−３’
３）隣接配列を含まないピリミジン修飾アプタマーＮｏ．８９のコア領域のＲＮＡ配列（配列番号３）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＡＣＣＧＧ  ＡＣＧＧＧ  ＡＣＣＡＧ  ＡＧＧＵＧ  Ｃ−３’
４）アプタマー変異「８９−２」（５８ｎｔ）のＲＮＡ配列（配列番号４）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＧＧＧＡＧ  ＡＣＧＡＵ  ＡＵＵＣＧ  ＵＣＣＡＵ  ＣＡＣＣＧ  ＧＡＣＧＧ  ＧＡＣＣＡ  ＧＡＧＧＵ  ＧＣＣＧＣ  ＵＧＵＣＣ  ＧＡＣＡＵ  ＧＧＡ−３’
５）アプタマー変異Ｎｏ．８９−Ｚ（３０ｎｔ）のＲＮＡ配列（配列番号５）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＡＣＣＧＧ  ＡＣＧＧＧ  ＡＣＣＡＧ  ＡＧＧＵＧ  ＣＣＧＣＵ  ＧＵＣＣＧ−３’
６）ＤＮＡ  Ｎｏ．８２の配列（配列番号６）
５’−ＧＧＧＡＧ  ＡＣＧＡＴ  ＡＴＴＣＧ  ＴＣＣＡＴ  ＣＧＧＧＡ  ＧＣＡＧＧ  ＧＡＡＧＧ  ＧＧＧＣＣ  ＧＣＴＧＴ  ＣＣＧＡＣ  ＴＧＡＡＴ  ＴＣＴＣＧ  ＡＣＣ−３’
７）ピリミジン修飾アプタマーＮｏ．８２のＲＮＡ配列（配列番号７）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＧＧＧＡＧ  ＡＣＧＡＵ  ＡＵＵＣＧ  ＵＣＣＡＵ  ＣＧＧＧＡ  ＧＣＡＧＧ  ＧＡＡＧＧ  ＧＧＧＣＣ  ＧＣＵＧＵ  ＣＣＧＡＣ  ＵＧＡＡＵ  ＵＣＵＣＧ  ＡＣＣ−３’
８）隣接配列を含まないピリミジン修飾アプタマーＮｏ．８２のコア領域のＲＮＡ配列（配列番号８）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＧＧＧＡＧ  ＣＡＧＧＧ  ＡＡＧＧＧ  ＧＧＣ−３’
９）アプタマー変異「８２−Ｚ」（３０ｎｔ）のＲＮＡ配列（配列番号９）
（Ｕ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシウリジン；Ｃ＝２’−ＮＨ2−２’−デオキシシチジン）
５’−ＵＣＧＧＧ  ＡＧＣＡＧ  ＧＧＡＡＧ  ＧＧＧＧＣ  ＣＧＣＵＧ  ＵＣＣＧＡ−３’
【００４７】
実施例３：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養
溶液（無菌）：
培養培地：ＩＦ基本培地＋１５％（ｖ／ｖ）ＮＣＳ、５μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５μｇ／ｍｌ  ヘパリン、０，７μｇ／ｍｌ  ＦＧＦ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン［ＩＦ基本培地：Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）とＨａｍ  Ｆ１２の１：１混合液（共にＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国ペーズリーより入手）］
ＮＣＳ：新生子ウシ血清（Ｓｅｂａｋ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ）
ＦＧＦ：線維芽細胞成長因子（ブタ脳より部分精製し、自ら作製）
器具：
ゼラチンコート細胞培養容器
実験手順：
３７℃の５％ＣＯ2および蒸気飽和空気中において、ゼラチンコート培養容器で、ＨＵＶＥＣの培養を行う。培養培地は２〜３日ごとに取り替える。集密期に細胞を１：３から１：５の分離比で継代培養する。ＨＵＶＥＣは、厳密に接触阻害を受けて増殖し、典型的な敷石状形態を有する単層の細胞叢を形成する。集密期に培養液は４〜９ｘ１０4細胞／ｃｍ2の細胞密度になる。アポトーシス試験では、もっぱら１〜４回継代したＨＵＶＥＣ培養液を使用する。
培養容器のコーティング：
溶液（無菌）：
ゼラチン１％（ｗ／ｖ）ミリＱ水溶液
１ｇのゼラチン（細胞培養試験用）を１００ｍｌのミリＱ水に懸濁し、１２１℃、２ｂａｒで２０分間オートクレーブにかけて溶解させ、室温で貯蔵する。
ＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4）
８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ
０．２ｇ／ｌ  ＫＣｌ
１．４４ｇ／ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ
０．２ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4
対応量のミリＱ水でこれらの塩を溶解し、１２１℃、２ｂａｒで２０分間オートクレーブにかけ、室温で貯蔵する。ｐＨ値を測定し、７．２と７．４の間の状態にする。
【００４８】
器具：
細胞培養容器
実験手順：
接着して増殖する細胞の培養のためにゼラチンで培養容器をコートする。細胞培養容器の底を滅菌ゼラチン溶液で被覆し、その容器を室温で１５分間放置する。ゼラチン溶液を吸い取る。細胞培養容器をＰＢＳで１回洗浄した後、使用することができる。
【００４９】
付着細胞の継代培養
溶液（無菌）：
ＰＢＳ
トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％（ｗ／ｖ）／０．０２％（ｗ／ｖ））
０．１ｍｌ  トリプシンストック液
０．０５ｍｌ  ＥＤＴＡストック液
滅菌ＰＢＳを充填して５０ｍｌにし、−２０℃において１０ｍｌ量で貯蔵する。
器具：
ゼラチン処理細胞用容器
実験手順：
トリプシン／ＤＥＴＡ溶液を用いて培養液表面から全細胞を脱離する。吸引により培養培地を取り除く。培養容器の底をＰＢＳで簡単に洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（２５ｃｍ2培養フラスコに対し約１ｍｌ）で被覆する。直ちに再度この酵素溶液を吸い取り、細胞上に液体薄膜を残す。この細胞を室温で１〜１０分静置し、細胞の脱離を顕微鏡で観察する。培養容器の端をそっとたたくこことで細胞の脱離を促進させることができる。計数が必要であれば細胞を新鮮な培養培地に移した後、新たな培養容器に接種する。
【００５０】
実施例４：ＤＡＰＩを用いたアポトーシス細胞の染色によるアポトーシスの比率の測定
ＤＡＰＩはインドール染料に属し、選択的ＤＮＳ染色液をもたらす。この染色液は３４０〜３６０ｎｍで励起され、４８０ｎｍで発光極大を有する。この物質はアポトーシス試験で使用される［参照：Ｃｏｈｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１４、Ｎｏ．３、１２６〜１３０頁（１９９３年）］。
【００５１】
形態評価：
溶液：
ＰＢＳ
ホルムアルデヒド溶液
ホルムアルデヒド  ４％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ溶液
ＤＡＰＩ溶液（モレキュラープローブス、ライデン、オランダ）
ＤＡＰＩ  ２μｇ／ｍｌメタノール溶液
器具：
培養中のＨＵＶＥＣ細胞の付いたペトリ皿（３５ｍｍ）または２４ウェルプレート
実験手順：
ペトリ皿または２４ウェルプレートの培養上清液を吸い取る。細胞叢を氷上冷却したホルムアルデヒド溶液１ｍｌで１５分間固定し、ＰＢＳ２ｍｌで２回洗浄する。ＤＡＰＩ溶液０．５ｍｌを１５分間添加し、再度ＰＢＳで洗浄した後、蛍光顕微鏡で評価する。ＵＶフィルタセットおよび２０ｘもしくは４０ｘの対物レンズを用いてこの作業を行う。５００〜１０００個の細胞を無作為に選び、アポトーシス核の数をカウントする。
アポトーシス指数を次式により算出する：
アポトーシス指数［％］＝アポトーシス細胞数／総カウント細胞数ｘ１００
【００５２】
実施例５：抗アポソーシス活性アプタマーの試験系
実施例３で述べた方法で細胞を培養する。適切な培養容器（例えば２４ウェルプレート／ウェルあたり０．５ｍｌ）に細胞を接種し、完全に集密化した後、実際の試験に使用することができる。
【００５３】
内皮細胞が自ら産生および分泌し、培養培地で強化されている（培養培地の自己順化）ＴＳＰ１により、アポトーシスの誘導を起こす。
【００５４】
内皮細胞のアポトーシス比率における様々なアプタマーの影響を証明するために実験を行う。このために、ＤＥＰＣ処理再蒸留水（実施例１）に溶解させたアプタマーを、ＨＵＶＥＣ用培養培地（実施例３）に希釈し、既定の濃度で使用する。いかなるアプタマーもしくは阻害物質も全く含まない培養培地を正対照として使用する。
【００５５】
アプタマーを有する培地を細胞に添加し、培養条件下（実施例３）で３日間インキュベートする。３６時間後、培養培地／アプタマー含有培養培地を一度取り替える。
【００５６】
その後、実施例４に述べるように細胞をＤＡＰＩで染色し、アポトーシス比率を測定し、アポトーシス指数を既定の式で算出する。
【００５７】
正対照における自己順化培地の明らかなアポトーシス誘導活性、および阻害対照におけるアポトーシスの減少により、内部対照としての試験の成功が示される。
【００５８】
実施例６：本発明による方法を用いた抗アポソーシス活性アプタマーの同定
実施例３に述べた方法で細胞を培養する。適切な培養容器（例えば２４ウェルプレート／ウェルあたり０．５ｍｌ）に細胞を接種し、完全に集密化した後、実施例４の試験に使用することができる。次の試料を調製する。
（Ｋ）培養培地（順化培地、基本比率のアポトーシス、対照）
（１）培養培地＋アプタマー８９、配列番号２、濃度：１５０ｎＭ
（２）培養培地＋アプタマー８９、配列番号２、濃度：３００ｎＭ
（３）培養培地＋アプタマー８２、配列番号７、濃度：１５０ｎＭ
（４）培養培地＋アプタマー８２、配列番号７、濃度：３００ｎＭ
培養条件下におけるインキュベーションの７２時間後、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で形態を調べる。アポトーシス細胞の計数および総細胞の計数を行い、アポトーシス指数を算出する（アポトーシス細胞のパーセンテージ）（実施例３、実施例４、実施例５）。
【００５９】
【表２】
2007513618.tif 000003
【００６０】
実施例７：短縮による抗アポトーシス活性アプタマーの最小配列の同定
実施例６で述べるように試験を行った。短縮化した全長を有するアプタマー（配列番号４、ここでは「８９−２」と呼ぶ）をアプタマー８９（完全長配列番号２、「８９」と呼ぶ）と比較した。熱力学的に好ましいヘアピン構造ＨＩも、図１に示すように配列番号４を形成する。その一方、配列番号２の３’末端の既存配列５’−ＵＧＡＡＵＵＣＵＣＧＡＣＣ−３’が、配列番号４ではＲＮＡ配列５’−ＡＵＧＧＡ−３’（修飾ＲＮＡ、実施例２参照）に取って代わられる。これは「ヘリックスＦ」構造を壊し、新たな短いらせんが（５’−ＡＵＧＧＡ／５’−ＵＣＣＡＵ）を形成することができる。
【００６１】
実施例３で述べた方法で細胞を培養する。適切な培養容器（例えば２４ウェルプレート／ウェルあたり０．５ｍｌ）に細胞を接種し、完全に集密化した後、試験に使用することができる。（実施例４、実施例５）。次の試料を調製する。
（Ｋ）培養培地（順化培地、基本比率のアポトーシス、対照）
（５）培養培地＋アプタマー８９、配列番号２、濃度：５０ｎＭ
（６）培養培地＋アプタマー８９、配列番号４、濃度：５０ｎＭ
次の表２に結果をまとめる。Ｎｏ．８９−２（配列番号４）の短縮配列領域が元の配列Ｎｏ．８９（配列番号２）の活性と比べて遜色ない活性を有することがはっきりとわかる。
【００６２】
【表３】
2007513618.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】配列番号２の仮想二次構造を示す図である。
【図２】配列番号７で予測される二次構造を示す図である。
【図１】
2007513618.tif 000005
【図２】
2007513618.tif 000006
【配列表】
2007513618000001.app
【国際調査報告】
2007513618.tif 000007
2007513618.tif 000008
2007513618.tif 000009
2007513618.tif 000010
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