(57)【要約】  本発明は、多座金属キレートアフィニティリガンドの合成方法であって、カルボニルとそれに隣接したイオウと求核基とを含む環状骨格を与える段階、求核基の誘導体化によって各骨格に多座金属キレートアフィニティリガンドのアームを与える段階、骨格にさらに金属キレートアフィニティリガンドのアームを追加する試薬の添加によって骨格を開環させる段階、及び必要に応じて、得られたリガンドアームの官能基を脱保護する段階を含む方法に関する。この方法の最も好ましい実施形態では、開環及び脱保護の段階を単一の段階で実施する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の多座金属キレートアフィニティリガンドの合成方法であって、
（ａ）一般式（Ｉ）で定義される１以上の骨格を与える段階
【化１】
2007528835.tif 000004
（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに独立にｓｐ２又はｓｐ３混成炭素原子又はヘテロ原子であり、Ｘ４は求核基であり、ｍは０〜２の整数である。）、
（ｂ）上記骨格の環構造を維持しながら、骨格の求核基Ｘ４の誘導体化によって各骨格に１以上の多座金属キレートアフィニティリガンドのアームを適宜金属キレート官能基を保護した形態で与える段階、
（ｃ）骨格に１以上の金属キレートアフィニティリガンドのアームを追加する試薬の添加によって誘導体化骨格のカルボニルとイオウとの間の結合を開環させる段階、及び必要に応じて
（ｄ）段階（ｂ）で準備したリガンドのアームの官能基を脱保護する段階
を含む方法。
【請求項２】
式（Ｉ）のＸ１、Ｘ２及びＸ３が炭素原子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）のＸ４が−ＮＨ２である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）のｍが１であって、前記骨格がホモシステインチオラクトンである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）における前記誘導体化を、求電子性で式（Ｉ）のＸ４と反応し得る部分と金属キレートアフィニティリガンドである部分からなる１種以上の誘導体化剤の添加によって行う、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記誘導体化を、２種類の異なる又は同一の金属キレート官能基を含む２種類の誘導体化剤の添加によって行う、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種類の誘導体化剤がハロゲン化保護エステルである、請求項５又は請求項６記載の方法。
【請求項８】
１種類の誘導体化剤がブロモ酢酸エチルエステルである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
段階（ｃ）における前記開環が塩基の添加による加水分解である、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
金属キレート官能基が段階（ｂ）で保護されており、次いで段階（ｃ）及び段階（ｄ）を実質的に同時に実施する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
誘導体化骨格を与えるため段階（ａ）及び（ｂ）を前もって実施しておく、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｄ）で得た生成物をそのチオール基を介してベースマトリックスに結合させて分離媒体を形成する、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
チオール基をベースマトリックスのアリル基に結合させる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ベースマトリックスをアリル化して反応性基を得る段階をさらに含む、請求項１２又は請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記リガンドのチオール基を、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）のアリル基を介してベースマトリックスに結合させる、請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ベースマトリックスの反応性基を活性化させる段階をさらに含む、請求項１２乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化を臭素化によって実施する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
多座金属キレートアフィニティリガンド又はベースマトリックスに複数の多座金属キレートアフィニティリガンドが結合した分離媒体であって、当該リガンド又は媒体が請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法で合成したものである、リガンド又は媒体。
【請求項１９】
前記リガンドが三座リガンドである、請求項１８記載のリガンド又は分離媒体。
【請求項２０】
一般式（Ｉ）で定義される請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の骨格を含むキットであって、ベースマトリックスに複数の多座金属キレートアフィニティリガンドが結合した分離媒体の製造に前記骨格を使用するための使用説明書と共に固体状態の前記骨格を含むキット。
【請求項２１】
前記骨格がホモシステインチオラクトンである、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
次の一般式で定義される、ベースマトリックスに結合した多座金属キレートアフィニティリガンドを含む分離媒体。
ベースマトリックス−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯ−）２Ｎｉ２＋
式中、ｎは２〜４の整数である。
【請求項２３】
ｎ＝２である、請求項２２記載の媒体。
【請求項２４】
固定化金属イオン吸着クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）用のクロマトグラフィーカラムであって、請求項１８、請求項１９、請求項２２又は請求項２３のいずれか１項記載の分離媒体を充填したカラム。
【請求項２５】
液体から目標物質を分離する方法であって、請求項１８、請求項１９、請求項２２又は請求項２３のいずれか１項記載の分離媒体を準備し、媒体に適当な金属イオンをチャージしてキレートを形成し、媒体を液体と接触させてその表面に目標物質を吸着させることを含む方法。
【請求項２６】
分離媒体から目標化合物を脱着させる液体の添加によって、分離媒体から目標物質を溶出する段階をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記溶出が、減少ｐＨ勾配を含む液体の使用又は増加イミダゾール濃度勾配の使用によって得られる、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多座金属キレートアフィニティリガンドの合成方法に関する。本発明は、かかるリガンドを含む分離媒体の製造方法、並びにかかるリガンド及び媒体も包含する。
【背景技術】
【０００２】
いかなる化学産業又はバイオプロセス産業でも、複雑な混合物から生成物を分離精製する必要があることは、生産ラインにおける必要かつ重要な段階である。今日、かかる目標を工業的に達成し得る各種方法には広範な市場が存在し、その一つはクロマトグラフィーである。クロマトグラフィーは、複雑な混合物を非常に高い精度で分離できるので、バイオテクノロジー分野での様々な用途に適しており、また実施条件が概して過酷でないので、タンパク質のような比較的変性しやすい生成物にも適している。
【０００３】
特に感度の高い分離法でしかも大半のタンパク質に利用できるクロマトグラフィー法の一つが、固定化金属イオン吸着クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）としても知られる金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（ＭＣＡＣ）である。この方法は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のような他のクロマトグラフィー段階と共に精製スキームで常用されている。
【０００４】
さらに具体的には、ＩＭＡＣで利用するマトリックスは遷移金属イオンとキレート形成し得る基を有しており、こうしたキレートを、液体から化合物を吸着するクロマトグラフィーにおけるリガンドとして使用する。ＩＭＡＣの結合強度は、主に、金属イオンの種類、緩衝液のｐＨ及び使用するリガンドの性状によって影響される。金属イオンはマトリックスに強く結合しているので、ｐＨを下げるか或いは競合溶出によって吸着タンパク質を溶出することができる。
【０００５】
一般に、ＩＭＡＣは、タンパク質その他マトリックスの遷移金属に親和性を示す分子の分離に有用である。例えば、タンパク質は接近可能なヒスチジン、システイン及びトリプトファン残基（これらはいずれもキレート金属に親和性を示す）が存在していればマトリックスに結合する。
【０００６】
分子生物学的方法の出現により、タンパク質の金属キレートリガンドに対する親和性を高めるためのタンパク質の改変又は１以上のヒスチジン残基でのタグ付けが容易に行えるようになり、タンパク質の精製における金属キレートクロマトグラフィーの役割は一段と重要性を増すと考えられている。
【０００７】
ＩＭＡＣ用のリガンドとしては、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）のような簡単なキレート剤が提案されている。ＩＤＡをアガロース担体に結合した後、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋及びＮｉ２＋など様々な金属をチャージしたものがタンパク質及びペプチドの捕捉に用いられており、市販樹脂としても入手できる。具体的には、米国特許第４５５１２７１号（Ｈｏｃｈｕｌｉ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社に譲渡）には、インターフェロンの精製に用いられるＩＤＡリガンドを含む金属キレート樹脂が開示されている。この樹脂は次式で定義することができる。
［アガロース］−Ｏ−（ＣＨ２）−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯ−）２Ｍｅ２＋
式中、ＭｅはＮｉ又はＣｕである。
【０００８】
この樹脂での最良の結果は、インターフェロンが既に部分精製されているときに得られる。上記米国特許明細書によれば、この樹脂はアガロースをエピクロロヒドリン又はエピブロモヒドリンで処理し、得られたエポキシドをイミノ酢酸二ナトリウム塩と反応させ、その生成物を銅（II）又は亜鉛溶液で洗浄して銅塩又は亜鉛塩に転化させることによって公知の手法で製造することができる。
【０００９】
欧州特許出願第８７１０９８９２．７号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社）及びその対応米国特許第４８７７８３０号（Ｄｏｂｅｌｉ他、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社に譲渡）には、６配位部位を有する金属と使用するための、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）として知られる四座配位キレート剤が開示されている。具体的には、マトリックスは、一般式［担体マトリックス］−スペーサー−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯ−）２Ｎｉ２＋で表すことができる（式中、ｘ＝２〜４である。）。開示されたマトリックスは、式Ｒ−ＨＮ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨ（式中、Ｒはアミノ保護基であり、ｘは２、３又は４である。）のアミノ酸化合物を、アルカリ性媒質中のブロモ酢酸と反応させ、次いで、中間精製段階後に保護基を脱離し、この基を活性化マトリックスと反応させることによって製造される。従ってこの製造方法では、アミノ酸のアルキル化及び脱保護に別々の段階を要するため、時間がかかり、コストもかかるものとなる。さらに、アルキル化はさほど効率的でなく、脱保護後の生成物は、中和及び解離で得られる他の生成物に関してはっきりとしない。この後、材料を、カルボキシル官能基を有する固体担体にアミド結合の形成によって結合させる。しかし、この手順では、得られる媒体が所望の固定化キレートリガンドだけでなく、若干の未反応カルボキシル基を呈し、不均一な媒体を与えるという短所を伴うおそれがある。さらに、モノ−Ｎ−保護アミノ酸化合物は高価な出発物質であり、この方法全体が一段とコストのかかるものになる。
【００１０】
最後に、国際公開第０１／８１３６５号（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）には金属キレート組成物が開示されており、その明細書によれば、該金属キレート組成物は、金属イオンと比較的安定なキレートを形成することができ、ポリヒスチジンタグタンパク質に対して向上した選択性を示す。国際公開第０１／８１３６５号によれば、キレート剤と樹脂との連結部は選択性に関する重要なパラメータであり、連結部は、中性エーテル、チオエーテル、セレノエーテル又はアミドである。開示された組成物は、その実施例によればＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のような不溶性担体に結合させる。クロマトグラフィー媒体は、予め活性化しておいた固体担体で直接固相反応を行ってクロマトグラフィー媒体に使用するか、或いは中間生成物Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（カルボニル）−Ｌ−シスチンを溶液中で別途合成してから最終的に固体担体に結合するかの２通りの異なる方法で製造される。
【００１１】
上記固相合成は、予めエピクロルヒドリンで活性化しておいたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ゲルにＬ−システインを添加してアルカリ条件下で長時間（１８時間）反応させた後洗浄することによって実施される。しかる後、ブロモ酢酸を添加して同じくアルカリ条件下で長時間（７２時間）反応させた後、再度洗浄し、最終的にゲルに残存する遊離アミノ基を酢酸無水物で封鎖する。
【００１２】
こうした固相合成では、反応制御が十分に行えず、副反応を起こす可能性があり、均質性に劣る生成物が得られる。
【００１３】
中間生成物の液相合成による代替法は、大量（４０倍）のグリオキシル酸をアルカリ性ホウ酸緩衝液中でＬ−シスチンに添加することから始まる。次いで、反応混合物のｐＨ調整及び導電率の調節の後、中間生成物をイオン交換クロマトグラフィーで精製してＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（カルボキシメチル）−Ｌ−シスチンを得る。
【００１４】
固体担体に結合する前に、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（カルボキシメチル）−Ｌ−シスチンをアルカリ条件下でトリス（カルボキシエチル）ホスフィンを用いてＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−システインに還元しなければならない。最終的にはこの物質を用いて予備活性化固体担体に結合させ、クロマトグラフィー媒体を形成することができる。この合成法は複雑で所望生成物の形成に大量の試薬を用いる必要があり、その所望生成物を特定のクロマトグラフィー条件下で精製した後で追加の合成段階として還元を行うので、大規模生産での使用にはさほど適していない。
【００１５】
従って、ＩＭＡＣリガンドの改良合成法並びにＩＭＡＣリガンドをベースマトリックスに固定化する方法に対するニーズが依然として存在する。
【特許文献１】米国特許第４５５１２７１号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０２５３３０３号明細書
【特許文献３】米国特許第４８７７８３０号明細書
【特許文献４】国際公開第０１／８１３６５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明の一つの目的は、後でベースマトリックスに結合させるための多座金属キレートアフィニティリガンドの改良合成法であって、安価で容易に入手できる出発物質及び試薬を利用して高い収率を与える方法にある。これは、請求項１に記載の通り達成できる。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＩＭＡＣ用のベースマトリックスに固定化されるリガンドを厳選できるようにすることである。これは、ベースマトリックスに結合した多座金属キレートアフィニティリガンドを含む分離媒体の合成法であって、その結合反応の化学が明確で容易に制御できる方法によって達成できる。
【００１８】
本発明の別の目的は、かかる方法であって、均質な生成物が得られる方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、かかる方法であって、２以上の同一又は異なる官能基を導入することもできる方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー用のリガンドであって、ベースマトリックス結合用の改良されたハンドルを有し、従来技術のリガンドよりも結合効率の向上したリガンドを提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に使用する際の金属イオンの漏れが低減したクロマトグラフィー媒体を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、同一骨格に基づく多種多様な金属キレートアフィニティリガンドのライブラリーの合成法であって、特定の用途に向けたリガンドの至適化に使用できる方法を提供することである。
【００２３】
本発明の以上の目的は、上記請求項のいずれか１以上によって達成できる。本発明のその他の目的、利点及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
従って第一の態様では、本発明は、
１以上の多座金属キレートアフィニティリガンドの合成方法であって、
（ａ）一般式（Ｉ）で定義される１以上の骨格を与える段階
【００２５】
【化１】
2007528835.tif 000002
【００２６】
（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに独立にｓｐ２又はｓｐ３混成炭素原子又はヘテロ原子であり、Ｘ４は求核基であり、ｍは０〜２の整数である。）、
（ｂ）上記骨格の環構造を維持しながら、骨格の求核基Ｘ４の誘導体化によって各骨格に１以上の多座金属キレートアフィニティリガンドのアームを適宜金属キレート官能基を保護した形態で与える段階、
（ｃ）骨格に１以上の金属キレートアフィニティリガンドのアームを追加する試薬の添加によって誘導体化骨格のカルボニルとイオウとの間の結合を開環させる段階、及び必要に応じて
（ｄ）段階（ｂ）で準備したリガンドのアームの官能基を脱保護する段階
を含む方法を提供する。
【００２７】
定義
「分離媒体」という用語は、本明細書では、例えばクロマトグラフィーカラムの充填材として有用な材料、具体的には、ベースマトリックスに１以上のリガンドが結合したものからなる材料に用いる。ベースマトリックスは担体として作用し、リガンドはクロマトグラフィーで目標物質と相互作用する官能基を与える。
【００２８】
「スペーサー」という用語は、ベースマトリックスからリガンドを離隔するための化学物質に用いる。
【００２９】
「リガンド」という用語は、本明細書では、目標物質に結合し得る化学物質をいう。かかる目標物質は、クロマトグラフィーでの単離又は除去が望まれる化合物でもよいし、或いは分析の目標物質でもよい。
【００３０】
「多座金属キレート」リガンドという用語は、金属に同時に配位（即ちキレート）し得る２以上の供与体原子をもつリガンドをいう。従って、多座リガンドは２以上の供与体原子を有し、配位圏の２以上の部位を占有する。
【００３１】
従って「金属キレート官能基」という用語は、供与体原子を与える基をいう。通常、官能基は互いに離隔しており、各々の官能基に対して「リガンドアーム」という用語を用いる。
【００３２】
「ゲル」という用語は、ゲルの形態の分離媒体に用いる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
段階（ａ）の骨格は固体として準備してもよいが、好ましくは溶媒中で準備する。最も好適な実施形態では、式（Ｉ）におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３は炭素原子である。別の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のうちの１以上はヘテロ原子、つまり酸素、イオウ、窒素及び／又はシリカからなる群から選択されるヘテロ原子であるが、該ヘテロ原子が後段でのリガンドの使用に支障をきたさないことを条件とする。
【００３４】
式（Ｉ）のＸ４は、誘導体化が可能な求核基である。例示的な実施形態では、Ｘ４は−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＨ２のような基から選択される。好適な実施形態では、Ｘ４は−ＮＨ２である。
【００３５】
上述の通り、ｍは０〜２の任意の整数であり、換言すれば０、１又は２のいずれでもよい。上記方法の段階から明らかな通り、ｍの値は、ベースマトリックスを分離媒体に展開する際のベースマトリックスの結合点とリガンドアームとの間の原子数を決定する。
【００３６】
好適な実施形態では、式（Ｉ）のｍは１であり、骨格はホモシステインチオラクトンである。当業者には自明であろうが、ホモシステインチオラクトンは純粋な形態でもラセミ化合物の形態でも使用できる。ホモシステインチオラクトンは市販されており（例えばＡｌｄｒｉｃｈ社のカタログ番号Ｈ１，５８０−２）、ＣＡＳ番号は６０３８−１９−３である。
【００３７】
段階（ｂ）の誘導体化は、求電子性で式（Ｉ）のＸ４と反応し得る第一の部分と金属キレート官能基を含む第二の部分からなる適当な誘導体化剤の添加によって実施される。
【００３８】
誘導体化剤の第一の部分（即ち求電子部分）の代表例としては、Ｃ＝Ｃ、Ｃ−Ｙ（式中、Ｙは例えばＢｒ、Ｉ、Ｃｌなどのハロゲン、メシレート基又はトシレート基である。）、又はＷＣ＝Ｏ（式中、Ｗは例えばＮ−ヒドロスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール、パラニトロフェノール又はクロロギ酸イソプロピルからなる。）のような酸又は活性酸が挙げられる。
【００３９】
好適な実施形態では、誘導体化は、各々２種類の異なる又は同一の金属キレート官能基（本明細書ではＬ１及びＬ２で示す。）を含む２種類の誘導体化剤の添加によって行われる。この実施形態では、誘導体化剤の求電子部分は、誘導体化を促進するため好ましくは同じ種類のものである。別の実施形態では、当業者には自明であろうが、好ましくは２以上の異なる段階を用いたＸ４の誘導体化によって、３種類以上の異なる又は同一の金属キレート官能基を導入する。こうして、同じ多座金属キレートアフィニティリガンドに複数の官能基を容易に与えることができる。
【００４０】
本発明の方法で用いる誘導体化剤は、金属キレート官能基を保護した形態（この場合、骨格の誘導体化に際して供与体原子は反応に利用されない）で含んでいてもよいし、保護されていない形態で含んでいてもよい。官能基が保護されている実施形態では、保護基は後段での除去が容易なものとすべきである。保護基は、アルキル基のような酸不安定なもの、又はｔ−ブチル基のような塩基不安定なもののいずれでもよい。一実施形態では、保護基はＣＨ２ＣＨ３基である。様々な金属キレート官能基が当技術分野で公知であり、原則的には電子供与基であればどんなものでもよい。具体的には、本発明の方法で用いる金属キレート官能基は、芳香族、ピリジン、チオフェン、フラン、イミダゾールのような複素環式誘導体、酸、エステル、ケトン、アミド、スルホン、スルホンアミド、ニトリル、炭素−炭素二重及び三重結合からなる群から選択される。
【００４１】
例示的な実施形態では、誘導体化剤は、ハロゲン化カルボン酸アルキルエステルのようなハロゲン化カルボン酸エステルである。上述の通り、特定の実施形態では、Ｘ４はＮＨ２である。ＮＨ２基をハロゲンその他の脱離基を有する基と反応させる方法は当技術分野で周知であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような溶媒中室温で簡便に実施できる。一実施形態では、誘導体化によって各骨格に２個の金属キレートアフィニティリガンドアームを与えるため、誘導体化剤は骨格に対して２：１のモル比で使用される。ＬＣ−ＭＳのような慣用法によって反応をモニターし、誘導体化の結果を確認することは当業者が容易になし得る。本発明は、国際公開第０１／８１３６５号よりも簡単な多座金属キレートアフィニティリガンドの合成経路を提供する。また、好適な化学反応を用いるので、本発明の方法は均質性に優れた生成物を与える。本発明の方法で得られる収率は９０％もの高さにすることができ、出発物質は現在妥当な価格で容易に入手できる。
【００４２】
段階（ｃ）では、骨格に１以上の金属キレートアフィニティリガンドのアームを追加する試薬の添加によって誘導体化骨格のカルボニルとイオウとの間の結合を開環させる。即ち、１以上の追加の金属キレートリガンドアームを与えるため環構造を開環する。
【００４３】
開環によって、後段でのベースマトリックスとの結合に利用できるハンドルもチオフィリック基の形態で生じ、その求核性のため好適な結合反応化学がもたらされる。好適な実施形態では、開環は、ＮａＯＨのようなアルカリ水酸化物の添加による加水分解であり、この場合、骨格のカルボニルはカルボキシル基に転化される。ただし、当業者には自明であろうが、開環を別の試薬で実施すれば、１以上の異なる金属キレート官能基を導入することができる。別の実施形態では、開環はアミノ分解であり、この場合、窒素は１個以上の金属キレート官能基を有する。この実施形態では、試薬は次の一般式IIで定義される。
【００４４】
【化２】
2007528835.tif 000003
【００４５】
式中、Ｌ３及びＬ４は金属キレート官能基を含むもので、同一でも異なるものでもよい。さらに、一実施形態では、上記リガンドアームＬ３及びＬ４は、段階（ｂ）の誘導体化で与えるものと同一である。
【００４６】
上述の通り、誘導体化段階で金属キレート官能基Ｌ１及びＬ２を保護する実施形態では、脱保護段階を実施するのが好ましい。一実施形態では、脱保護は段階（ｃ）の後で別個の段階として実施され、上述の通り塩基又は酸の添加によって達成できる。官能基の保護／脱保護に有用な化学は当技術分野で周知であり、かかる段階の実施は当業者が容易になし得る。
【００４７】
本発明の方法の特に好適な実施形態では、脱保護は開環と同じ段階、つまり実質的に同時に実施される。この実施形態の大きな利点は、多座金属キレートアフィニティリガンドを、２段階しか含まない簡単な方法を用いて合成できることである。従って、この実施形態は、従来技術の方法よりも簡単な多座金属キレートアフィニティリガンドの合成法を提供する。誘導体化剤が塩基不安定基を含む実施形態では、この段階は水酸化ナトリウムの添加によって行われる。加水分解は好適には室温で例えば１〜２時間実施される。実際、本発明は、すべての出発物質を９０分以内に転化させることができ、さらに４８時間経過しても副産物を全く生じないことが判明した。このように、本発明による加水分解では安定かつ均質で明確に規定される生成物が得られる。段階（ｃ）の誘導体化剤が酸不安定基を含む別の実施形態では、この段階はＨＣｌのような酸の添加によって行われる。
【００４８】
本発明の方法の特定の実施形態では、誘導体化骨格を与えるため段階（ａ）及び（ｂ）を前もって実施しておく。従って、本発明は骨格のカルボキシメチル化を前もって実施しておく方法も包含する。
【００４９】
好適な実施形態では、こうして得られた生成物をそのチオール基を介してベースマトリックスに結合させて分離媒体を形成する。（固定化法の概説、特にイオウを介したカップリングに関しては、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ他のＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２，  Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍａｌｌｉａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）の第３章、特に３．４．１．２章を参照されたい。）。かかる分離媒体は、例えば分析などを目的とした目標物質の単離に有用である。本発明の方法で用いるベースマトリックスは、目的とする用途に適した材料であればどんな材料からなるものでもよい。
【００５０】
例えば、分離媒体を固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィーに用いる場合、ベースマトリックスは一般にビーズ又はモノリシックの形態で、アガロースやデキストランのような天然高分子、又はジビニルベンゼンやスチレンのような合成ポリマーから作られる。ベースマトリックスは例えばゲルの形態であってもよい。天然高分子に関して、適当なその多孔質ポリマービーズは、逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３〜３９８（１９６４））又は回転ディスク法（例えば国際公開第８８／０７４１４号（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）参照）などの常法で当業者が容易に得ることができる。或いは、天然高分子ビーズは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ）などの供給元から入手できる。かかる有用な天然高分子ビーズの商品名としては、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）やＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）として知られるものがある。
【００５１】
合成ポリマーに関して、ベースマトリックスは、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの架橋合成ポリマーからなる。かかるポリマーは常法で容易に製造される。例えば“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），  ７０−７５（１９８８））参照。或いは、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））などの市販品を本発明に従って表面改質することもできる。
【００５２】
別の実施形態では、ベースマトリックスは例えばメンブラン、フィルター、１以上のチップ、表面、キャピラリーなどであってもよい。
【００５３】
一実施形態では、ベースマトリックスの反応性基はアリル基、即ち炭素−炭素二重結合である。一実施形態では、既にアリル基を有する市販のベースマトリックスを使用する。別の実施形態では、周知の方法でアリル基を与える。例えば、例示的な実施形態では、アリル官能基を有するエポキシドで適当な温度及び反応時間処理することによって本発明のベースマトリックスをアリル化しておく。かかるアリル官能性エポキシドとして常用されるものの一例はアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）である。従って、特定の実施形態では、段階（ｄ）で、リガンドのイオウ基をアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）の活性化アリル基を介してベースマトリックスに結合させる。この実施形態では、最終生成物においてイオウ基はエーテル基とヒドロキシ基を含むスペーサーを介してベースマトリックスに結合することになり、分離媒体はベースマトリックス−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−Ｓ−リガンドと定義することができる。
【００５４】
別の実施形態では、エポキシドの開環や二重結合へのラジカル付加など、他の周知のチオール含有リガンドの結合法を用いる。
【００５５】
特定の実施形態では、アリル基を臭素化で活性化するか、或いはカップリングをラジカル反応で行う。使用するラジカルは、適当な市販の開始剤でも、ＵＶなどでもよい。
【００５６】
本発明の第二の態様は、多座金属キレートアフィニティリガンド又はベースマトリックスに１以上、好ましくは複数の多座金属キレートアフィニティリガンドが結合した分離媒体であり、当該媒体は上述の方法で合成したものである。特定の実施形態では、金属キレートアフィニティリガンドは三座リガンドである。かかる分離媒体には、Ｃｕ（II）、Ｚｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｃａ（II）、Ｃｏ（II）、Ｍｇ（II）、Ｆｅ（III）、Ａｌ（III）、Ｇａ（III）、Ｓｃ（III）のような適当な金属イオンをチャージすることができ、例えば上記「背景技術」の欄で概略を述べたような周知のＩＭＡＣの原理に従って使用することができる。最も好ましい実施形態では、Ｎｉ２＋を使用する。
【００５７】
好適な実施形態では、本発明の多座金属キレートアフィニティリガンドは三座リガンドであり、次式で定義される。
−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯ−）２。
【００５８】
特定の実施形態では、ベースマトリックスに結合した多座金属キレートアフィニティリガンドを含む本発明の分離媒体は、次の一般式で定義される。
ベースマトリックス−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯ−）２Ｎｉ２＋
式中、ｎは２〜４の整数である。一実施形態では、ｎ＝２である。これに関して、ベースマトリックスが例えば粒子の形態の場合、上述の通り各粒子には複数のリガンドが結合する。
【００５９】
本発明の第三の態様は、好ましくは上述の方法による多座金属キレートリガンドの製造の出発物質としてホモシステインチオラクトンを使用する方法である。本発明は、多座金属キレートリガンドの製造におけるホモシステインチオラクトンのようなカルボキシメチル化骨格の使用方法も包含する。最も好適な実施形態では、これらの使用方法は上記で説明した通りである。上述の通り、ホモシステインチオラクトンは市販されている。
【００６０】
本発明のさらに別の態様は、上記の一般式（Ｉ）で定義される骨格を含むキットであり、このキットは、固体状態の骨格と共に、金属キレートアフィニティリガンドの製造又はベースマトリックスに複数の多座金属キレートアフィニティリガンドが結合した分離媒体の製造に骨格を使用するための使用説明（好ましくは文書）を含む。別の実施形態では、本発明に係るキットは、その他の形態の骨格（例えば部分的又は完全に誘導体化されたもの）を、本発明の方法の実施に適した液体及び／又は試薬と共に含む。特定の実施形態では、キットは、脱保護以外は本発明の方法で反応させた骨格からなるが、その場合、キットは、使用説明書と共に塩基や酸などの脱保護に適した試薬も含んでいる。
【００６１】
本発明は、本発明の媒体を充填したクロマトグラフィーカラムも包含する。カラムはどんなサイズのものでもよく、大量生産用又は実験室用でも、分析用に適したものでもよい。カラムは分離媒体及び適宜液体と組合せて第二の種類のキットにすることもでき、これも本発明に包含される。一実施形態では、本発明に係るキットはＮｉ２＋イオンのような金属イオンを含む。
【００６２】
さらに本発明は、液体から目標物質を分離する方法であって、上記で定義した分離媒体を準備し、媒体に適当な金属イオンをチャージしてキレートを形成し、媒体を液体と接触させてその表面に目標物質を吸着させることを含む方法にも関する。好適な実施形態では、この方法は、分離媒体から標的化合物を脱着させる液体の添加によって、分離媒体から標的物質を溶出する段階をさらに含む。一実施形態では、溶出は、減少ｐＨ勾配を含む液体の使用又は増加イミダゾール濃度勾配の使用によって行う。上述のように目標物質を分離するためのクロマトグラフィーの一般原理は、当技術分野で周知であり（例えば  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｊ−Ｃ  Ｊａｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｒｙｄｅｎ１９８９  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照）、本発明の方法に用いる所要パラメータを採用することは当業者が容易になし得ることである。
【００６３】
最後に、本発明は、スクリーニング及び至適化のため、１以上の多様な金属キレートアフィニティリガンドのライブラリーを生成する方法に関する。例えば、この方法では、１個の配位座をもつアームを一定に保ちながら、最適な性能に関して他のアームを選択すればよい。当業者には自明であろうが、例えば上記のＬ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４のうちの１以上を変更して最適な形態を特定し、最適な形態が特定されたら、それを一定に保って、他のものを変化させる。従って、上記の最適化法は、選り抜きの最適なリガンドを含む分離媒体を製造するためのツールを与える。
【００６４】
図面の詳細な説明
図１は、本発明に係る多座金属キレートアフィニティクロマトグラフィーリガンドを含む分離媒体の全体的合成経路を示す概略図である。最初の段階は本発明の方法の段階（ｂ）つまり誘導体化に相当し、第二段階は誘導体化した骨格を開環する加水分解であり、最後の段階は固定化つまり合成したリガンドのベースマトリックスへのカップリングである。以上の説明から明らかな通り、第二段階は好適には開環と脱保護の組合せである。図１で、Ｒは水素又は酸もしくは塩基不安定保護基を表す。
【００６５】
図２（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係るＩＭＡＣ分離媒体を用いた（Ｈｉｓ）６テールを有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｈｉｓ）の精製例を示す。具体的には、図２（ａ）はクロマトグラムであり、図２（ｂ）はクロマトグラムの勾配部分の拡大図である。図２では、Ａ２８０ｎｍの曲線をＡで示し、溶出緩衝液のパーセンテージ（％）をＢで示し、導電率をＣで示す。
【００６６】
図３は、ＭＢＰ−ＨｉｓのＩＭＡＣ精製で得た画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分の番号は図２のクロマトグラムと同様である。
【００６７】
図４は、試験クロマトグラムを示し、ＵＶ３７２ｎｍ＝Ａ、導電率＝Ｂ、注入＝Ｃである。以下の実施例５で述べるように、この試作品のニッケル結合容量は１６μｍｏｌ  Ｎｉ／ｍｌであり、金属の漏れは４％であった。
【００６８】
図５は、実施例５に記載の本発明に係る分離媒体で実施したニッケル容量試験の結果を示す。具体的には、Ｘ軸はリガンド密度を示し、Ｙ軸はニッケル結合量を示す。ニッケル結合容量はリガンド密度に伴って線形に増加し、勾配は１に近いことが分かる。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、例示を目的としたものにすぎず、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいずれかの箇所で引用した文献の記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００７０】
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＣＨ−相関、ＡＰＴ及びＣＯＳＹスペクトルは、参照としてＴＭＳを用いて、Ｂｒｕｋｅｒ  ３００ＭＨｚでδスケール（ｐｐｍ）で記録した。特記しない限り、スペクトルはすべてＣＤＣｌ３中で記録した。ＴＬＣは、ＭｅｒｃｋプレコートシリカゲルＦ２５４プレートを用いて実施した。ＴＬＣプレート上のスポット検出には、ニンヒドリン又はＭｏ／Ｃｅ混合物を使用した。ＬＣ−ＭＳデータは、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００  ＭＳＤエレクトロスプレーを用いて記録した。フラッシュカラムクロマトグラフィー精製はＭｅｒｃｋ  Ｇ−６０シリカゲルを用いて実施した。
【００７１】
実施例１：骨格のカルボキシメチル化によるＮ，Ｎ−ビス（エチル−カルボキシメチルエステル）＋／−ホモシステインチオラクトンの合成
乾燥２５０ｍｌ丸底フラスコ中で、Ｄ／Ｌホモシステインチオラクトン（４．５ｇ、２９．２２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのＤＭＦに溶解した。これにブロモ酢酸エチルエステル（９．７６ｇ、５８．４４ｍｍｏｌ、６．４８ｍｌ）、ＫＩ（４．８５０ｇ、２９．２２ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（１４．７２７ｇ、１７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。反応は、ＴＬＣ（３：１トルエン：酢酸エチル）及びＬＣ−ＭＳデータで追跡した。３．５時間後に反応を完了した。
【００７２】
所望の生成物はＲｆ＝０．３５（３：１トルエン：酢酸エチル）を有する。溶媒を蒸発させ、得られた固体をＣＨＣｌ３に再び溶解し、Ｈ２Ｏで２回抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させた。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３：１トルエン：酢酸エチル）で精製した。収量：７．６３６ｇ（２６．４２２ｍｍｏｌ）、９０％。
【００７３】
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．５２（ｔ，６Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０５−２．５６（ｍ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）、δ３．２５（ｍ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）、δ３．５２（ｓ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）、δ４．２４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−）；１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１４．７１（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２７．４２（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）、δ２９．６８（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）、δ５４．０１（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−）、δ６０．９９（−Ｎ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）、δ６７．１５（−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）、δ１７０．９４（Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ）、δ２０７．２０（−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）．ＬＣ−ＭＳ：Ｍ＋  ２９０。
【００７４】
実施例２：加水分解によるＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）＋／−ホモシステインの合成及び安定性試験
上記の実施例１に記載の通り製造したＮ，Ｎ−ビス（エチルカルボニルエステル）＋／−ホモシステインチオラクトン（５０ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）を１００ｍｌ丸底フラスコ中で１ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を室温で１００分間撹拌した。反応は、ＬＣ−ＭＳで出発物質が検出されなくなるまで追跡した。
【００７５】
安定性試験：加水分解終了後、上記反応混合物を、Ｈ２Ｏで５ｍｌに希釈した。ｐＨを１２．５に調整し、反応混合物を撹拌しながら５０℃に加熱した。４時間にわたって１時間毎に５０μＬの試料を混合物から採取した。５０μＬの各試料を次いで１ｍｌのＭｅＯＨと混合し、ＬＣ−ＭＳ分析に用いた。この段階の後、反応混合物を一晩放置し、最後に５０μＬの試料を上述の通りＬＣ−ＭＳ分析用に採取した。この実験期間中分解は観察されなかった。
【００７６】
粗生成物を凍結乾燥した。
【００７７】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ１．５２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ），δ２．２４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ），δ３．２０（ｍ，５Ｈ，Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ−）；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ２２．３４（−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ），δ３５．３９（−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ），δ５７．３３（Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２−），δ６７．３０（−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ），δ１８０．５５（Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），δ１８１．８４（−Ｎ−ＣＨ−Ｃ＝Ｏ）；ＬＣ−ＭＳ：Ｍ＋  ２５２。
【００７８】
実施例３：実施例２で得た生成物とアリル化アガロースとのＡＧＥを用いたカップリング
１０ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ−アリル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））（４４μｍｏｌ／ｍｌゲル）を、１ｇのＮａＯＡｃと共に２０ｍｌの蒸留水中で撹拌した。Ｂｒ２飽和水溶液を、持続的な黄色が生成するまで添加した。次いでギ酸ナトリウムを黄色が消えるまで添加した。次いでゲルを蒸留水で洗浄した。Ｎ，Ｎ−ビス（エチルカルボキシメチルエステル）＋／−ホモシステインチオラクトン（１０２ｍｇ）を、２ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨ中で室温で２時間撹拌した。５ｍｌの蒸留水と３ｍｌの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加し、２Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを１１．０に調整した。
【００７９】
次いでリガンド溶液を、バイアルに排出したゲルに添加して、蓋をした。
【００８０】
バイアルを５０℃で１６時間振盪し、次いでゲルをガラス濾過漏斗上で蒸留水で洗浄した。
【００８１】
実施例４：本発明で合成したＩＭＡＣ分離媒体を用いた（Ｈｉｓ）６テールを有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｈｉｓ）の精製及び金属漏れ試験
材料及び方法：
ＭＢＰ−Ｈｉｓを含む抽出液
Ｃ末端ヘキサＨｉｓテールマルトース結合タンパク質、ＭＢＰ−Ｈｉｓ、理論Ｍｒ及びｐＩは４３７８１及び５．４であった。
【００８２】
ＭＢＰ−Ｈｉｓを発現する大腸菌クローンの発酵及び細胞の均質化は常法によって実施した。この抽出液中のＭＢＰ−Ｈｉｓ濃度は約１．９ｍｇ／ｍｌと推定された。
【００８３】
ＩＭＡＣ  Ａ−緩衝液：
１リットルについて：（水１０００ｍｌにＰＢＳ錠剤１個添加すると、１０ｍＭリン酸Ｎａ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ及び３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４が得られる。）。ＰＢＳ錠剤２個を水に溶解し、ＮａＣｌを５Ｍ保存溶液から７２０ｍＭ分余計に添加し（最終的に１４０＋１４０＋７２０ｍＭ＝１Ｍ）、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節し、最終体積を１０００ｍｌとした（緩衝液は６ｍＭ  ＫＣｌも含有する）。
【００８４】
溶出緩衝液（ＩＭＡＣ  Ｂ−緩衝液）：
ＩＭＡＣ  Ａ緩衝液と同じ方法で製造したが、イミダゾールも５００ｍＭ添加し（イミダゾール−ＨＣｌの２．０Ｍ保存溶液、ｐＨ７．４から）、ｐＨ及び体積を最終的に調節した。
【００８５】
硫酸Ｎｉ２＋溶液：１００ｍＭ水溶液。フィルター０．２μｍ。ｐＨ約４．６。
【００８６】
ＥｘｃｅｌＧｅｌ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））の使用説明書に準拠した試料緩衝液及び実験操作条件
ゲル：ＥｘｃｅｌＧｅｌ（商標）ＳＤＳ、勾配８〜１８％。
【００８７】
試料調製：試料を２×試料緩衝液と１＋１で混合（大量の目標タンパク質の精製用）又は１倍量の試料を１／３倍量の４×試料緩衝液と混合（少量のタンパク質の精製用）した。（４×試料緩衝液＝１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＡｃ  ｐＨ７．５、２％ＳＤＳ）。９５℃で３〜５分間加熱した。
【００８８】
試料添加：ＩＥＦ用試料添加片（５×１０ｍｍ濾紙片、＃８０−１１２９−４６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ）））を使用した。最大３０〜３２枚の紙片を、その短辺を泳動方向に配置した。２０μｌの試料混合物を各紙片に添加した。これらの紙片は全電気泳動期間中ゲル上に放置した。
【００８９】
電気泳動：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ（商標）ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））装置で１５℃（循環冷却浴）。電源ＥＰＳ  ３５００。限界設定：６００Ｖ、５０ｍＡ、３０Ｗ。
【００９０】
染色：３０％ＭｅＯＨ、１０％ＨＡｃに溶解した０．１％クーマシーＲ３５０中。脱色は２５％ＥｔＯＨ、８％ＨＡｃ中で実施。
【００９１】
クロマトグラフィー：  媒体をＨＲ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））にベッド高さ５ｃｍ＝１．０ｍｌベッドに充填した。使用に先だって、カラムに硫酸ニッケル溶液（５カラム体積）を流して媒体にＮｉ２＋をチャージした後、水を流し、結合緩衝液（＝ＩＭＡＣ  Ａ緩衝液）で平衡化し、５ｍＭのイミダゾールを添加した。溶出緩衝液を流した後再度結合緩衝液で平衡化することによって短いブランクランを実施した。
【００９２】
ＭＢＰ−Ｈｉｓ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ（新たに添加）による大腸菌抽出液を、遠心分離及び０．４５μｍ濾過によって清澄化した。次いで所要体積を０．２μｍフィルターを通してＳｕｐｅｒｌｏｏｐ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））に導入してからＩＭＡＣを開始した。次いで３ｍｌをカラムに加えた。結合緩衝液で十分に洗浄した後、ＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を使用して、２０ｍｌの直線勾配をかけた（４０％溶出緩衝液＝２００ｍＭイミダゾールまで）。最後に、１００％溶出緩衝液（５００ｍＭイミダゾール）で５ｍｌ溶出させた。以上の段階はすべて１．０ｍｌ／分で実施した。
【００９３】
実施例５：ｐＨ４．０でのニッケル結合容量及び金属漏れの決定
ニッケル結合容量
本発明の分離媒体のニッケル（Ｎｉ２＋）結合容量は、ＵＶ／Ｖｉｓ  ＤＡＤ検出器を備えたＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を用いたクロマトグラフィーで決定した。試験は、１ｍｌのＨＲ５／５カラムに充填し、上述の通りＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）＋／−ホモシステインをカップリングしたゲルで実施した（図４）。その結果を、元素分析（窒素分析、各リガンドは１個の窒素原子を含有する）で求めたゲルに存在するリガンド密度と比較した。
【００９４】
ニッケル結合容量とリガンド密度との相関関係は非常に良好であり、１個のリガンドが１個の金属イオンをもつと考えられた。典型的な結果を図５に示す。
【００９５】
方法の説明
ＮｉＳＯ４溶液を注入してゲルにＮ２＋イオンを添加した。過剰の金属は、水及びリン酸緩衝液（２０ｍＭ  ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄することによって除去した。ゲルに結合したニッケルイオンを、非常に強力なキレート剤でゲルから金属イオンを効率的に取り去るＥＤＴＡで溶出した。溶出した緑色のＮｉ−ＥＤＴＡ錯体のピーク面積を３７２ｎｍで測定した。濃度の種々異なるＮｉ−ＥＤＴＡ溶液から線形較正曲線を作成し、これを用いて定量を行った。ニッケル結合容量（図４、ピーク１）はμｍｏｌ  Ｎｉ／ｍｌ充填ゲルとして示した。
【００９６】
金属漏れ
リガンド−ニッケル錯体の安定性を試験するため金属漏れ試験を行った。ニッケル添加ゲルをアセトン緩衝液、ｐＨ４．０で洗浄してから、ゲル上のＮｉ含量を求めた（図４）。
【００９７】
本発明で製造したすべての試験ゲルで金属の漏れは極めて低いと考えられ、典型的には漏れは４％であった。
【００９８】
方法の説明
ニッケルイオンの漏れは、ニッケル結合容量と同じように試験した。ただし、ＥＤＴＡでニッケルイオンを溶出する前に、ゲルを１０カラム体積の酢酸緩衝液、１００ｍＭ、ｐＨ４．０で洗浄した。漏れは結合容量に対する％として示し、式：（面積ピーク２−面積ピーク１）／面積ピーク１に従ってニッケル結合容量とｐＨ４での洗浄後の溶出量（図４、ピーク２）との差として求めた。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明に係る多座金属キレートアフィニティクロマトグラフィーリガンドを含む分離媒体の全体的合成経路を示す概略図である。
【図２】本発明に従って製造したＩＭＡＣ分離媒体を用いた（Ｈｉｓ）６テールを有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｈｉｓ）の精製例を示す。具体的には、図２（ａ）はクロマトグラムであり、図２（ｂ）はクロマトグラムの勾配部分の拡大図である。図２では、Ａ２８０ｎｍでの曲線をＡで示し、溶出緩衝液のパーセンテージ（％）をＢで示し、導電率をＣで示す。
【図３】ＭＢＰ−ＨｉｓのＩＭＡＣ精製で得た画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分の番号は図２のクロマトグラムと同様である。
【図４】試験クロマトグラムを示し、ＵＶ３７２ｎｍ＝Ａ、導電率＝Ｂ、注入＝Ｃである。この試作品のニッケル結合容量は１６μｍｏｌ  Ｎｉ／ｍｌであり、金属漏れは４％であった。
【図５】実施例５に記載の本発明に係る分離媒体で実施したニッケル容量試験の結果を示す。
【図１】
2007528835.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
2007528835.tif 000010
2007528835.tif 000011
2007528835.tif 000012
2007528835.tif 000013