(57)【要約】  本発明は、皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強するための、処方剤としての脂質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強するための、処方剤としてのジパルミトステアリン酸グリセロールの使用。
【請求項２】
ジパルミトステアリン酸グリセロールが、欧州薬局方第３版の命名法による第１種霧化型である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
タンパク質有効成分が、ソマトトロピン類似体、ソマトメジン−Ｃ、ゴナドトロピン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびその類似体（ロイプロリド、ナファレリンおよびゴセレリンなど）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、成長ホルモン放出因子、カルシトニン、コルヒチン、ゴナドトロピン（絨毛性ゴナドトロピンなど）、オキシトシン、オクトレオチド、ソマトトロピン、アミノ酸関連ソマトトロピン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、ソマトスタチン、タンパク質関連ソマトロピン、コシントロピン、リプレシン、チロトロピン放出ホルモンなどのポリペプチド、セクレチン、パンクレオザイミン、エンケファリン、グルカゴン、および内分泌されて血流により分配される内分泌物質からなる群から選択されるペプチドまたはペプチド誘導体である、請求項１および２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
タンパク質有効成分が、α１−抗トリプシン、因子VIII、因子IXおよびその他の凝固因子、インスリンおよびその他のペプチドホルモン、成長ホルモン、皮質アンドロゲン刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよびその他の下垂体ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、インターフェロンα、β、γおよびδ、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、増殖因子（顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＧＤＮＦなどの神経栄養因子、インスリン様増殖因子など）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＣＤ４、ｄＤＡＶＰ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、膵臓酵素、ラクターゼ、サイトカイン、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、腫瘍抑制タンパク質、細胞傷害性タンパク質などからなる群から選択されるタンパク質である、請求項１および２のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
タンパク質有効成分が、サイトカインの中、有利にはインターフェロンの中から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
インターフェロンが、インターフェロンα−２ｂである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
タンパク質有効成分が、大きさ０．１μｍ〜１００μｍ、好ましくは大きさ１μｍ〜２５μｍの範囲の粒子中に含まれている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
タンパク質有効成分が、脂質とともに、ナノカプセル、マイクロカプセル（脂質核、タンパク質外被構造）、ナノスフェア、マイクロスフェア、円柱状または円盤状インプラント（タンパク質有効成分分散物を含有する脂質マトリックス構造）の形態、好適にはマトリックス構造の形態に処方されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
処方系が、１μｍ〜５００μｍの範囲の大きさである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
タンパク質有効成分の粒子が、直径１０μｍ〜１００μｍの範囲の脂質粒子系に処方されている、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
タンパク質有効成分の粒子が、直径１０μｍ〜３００μｍの脂質インプラントに処方されている、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
タンパク質有効成分の粒子が、０．０１％〜１００％のタンパク質有効成分含量である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
タンパク質有効成分の粒子の処方系の含量が、０．１％〜９５％、有利には０．５％〜２５％、いっそう有利には１％〜１０％の範囲である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
処方系が、欧州薬局方第３版の命名法による第１種霧化型ジパルミトステアリン酸グリセロールから出発して製造され、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜５％のタンパク質有効成分粒子を含有するマトリックスマイクロスフェアである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
マトリックスマイクロスフェアが、流体を超臨界圧で用いることによるタンパク質有効成分のカプセル化によって得られる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
タンパク質有効成分が、インターフェロンα−２ｂである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
欧州薬局方第３版の命名法による第１種霧化型であるジパルミトステアリン酸から出発して製造され、１０％、好ましくは１％〜５％のタンパク質有効成分粒子を含み、前記タンパク質有効成分がインターフェロンα−２ｂである、マトリックスマイクロスフェア。
【請求項１８】
皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強するための、超臨界ＣＯ２に可溶な脂質の使用。
【請求項１９】
脂質が、周囲温度で固体である、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強する方法に関する。
【０００２】
バイオテクノロジー、より詳しくは遺伝子操作の分野における最近の進展により、特に重篤な病態（癌、貧血、多発性硬化症、肝炎など）の処置に用いるための、ペプチドおよびタンパク質と定義される多数のタンパク質有効成分の開発に至っている。しかしながら、これらの高分子有効成分は脆く、バイオアベイラビリティが極めて小さいため、安定で有効、かつ、患者に十分な許容性がある処方物の開発は依然として本質的な課題である。特に、タンパク質活性成分は、胃腸管において安定性が低く（低ｐＨでの分解やタンパク質分解）、また、腸障壁に対する透過性が小さいことから、経口経路によって投与することができない。この点で、上皮膜に対するペプチドおよびタンパク質の透過性を向上させることが考えられるが、経口バイオアベイラビリティはやはり数％に満たず、これら有効成分の経口形の開発を阻んでいる。よって、これに関しては、タンパク質有効成分の好ましい投与経路は依然として注射または非経口経路による投与であり続けている。従って、注射が所望の安全性と有効性をもたらす状況にあっては、治療上また商業上の成功を達成するには、新規な投与経路の使用よりも新規な注射投与形または注射機器の開発のほうが可能性が高いと思われる。バイオテクノロジーから得られた産物の新規な投与形に関する技術の現状についての総説が、最近、Orive et al. (“Drug delivery in biotechnology: present and future”; Current Opinion in Biotechnology 14, 2003, 659-664)によって発表されている。
【０００３】
静脈内、筋肉内または皮下経路により注射可能な多くのペプチドおよびタンパク質処方物がすでに市販または開発下にある。市販または開発下にあるタンパク質有効成分処方物についての総説は、最近、J. L. Cleland ら (“Emerging protein delivery methods”; Current Opinion in Biotechnology 12, 2001, 212-219)によって発表されている。これらの著者らは、こうした処方物に、依然として解決されていないいくつかの問題に関して大きな改良が必要であることを示している。１つには、反復非経口注射に対する許容度が十分でない高齢者および若年者の処置において、処置計画の適正な遵守が主要な懸念点となる。さらには、風邪様症状、食欲不振、体重減少、消化不良など、注射による、また、ピーク血漿濃度による副作用も頻繁に見られる。最後に、標的組織または器官に所望の作用をもたらすために必要なこれらタンパク質有効成分の全身濃度が高いために、患者に有害な全身毒性（血液的なものなど）の原因となる場合が極めて多く、治療の枠組みに必要なこのように高い濃度は、高用量を頻繁に注射することによって得られる。最初の２つの問題は、持続送達系の、ポリマーに基づくタンパク質有効成分（インプラント、マイクロスフェア、ゲル）によってある程度解決されたが、これらの系において活性の低下（分解）の問題、ならびに用いる方法や処方賦形剤に関連した凝集および／または沈殿の問題はまだ解決されていない（例えば、M. Van de Weert ら : “Protein instability in poly (lactic-co-glycolic acid) microparticles”; Pharm. Res. 17, 2000, 1159-1167による論文参照）。他方、患者をタンパク質有効成分に曝すことに関する第３の点は、今日ではまだ解決されておらず、患者がその処置を拒むということに至る場合が多い。この問題は、タンパク質有効成分のバイオアベイラビリティの低さ、より詳しくは、高い治療用量の使用に至らせている皮下または筋肉内経路によって投与されるタンパク質有効成分に関連したものである。皮下（SC）投与後、絶対的バイオアベイラビリティ（同じ用量の静脈投与に対するもの）は一般に、２０，０００ｇ／ｍｏｌ相当か、またはそれ以上の分子量を有するタンパク質（エリスロポエチン、インターフェロンβ、インターフェロンγなど）では１２％〜７０％の範囲である。それより小さい分子量のタンパク質では若干高くなり、約８０％となる。同様に、筋肉内（ＩＭ）投与後における、インターフェロンβなどのいくつかのサイトカインの絶対的バイオアベイラビリティは、一般に１０％以下と非常に低い（例えば、V. Bocci:”Physicochemical and biological properties of interferons and their potential uses in drug delivery systems”; Critical Reviews in Therapeutic Carrier Systems 9 (2), 1992, 91-133）による論文参照）。2003年のP. Caliceti ら (“Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly (ethylene glycol)- Protein conjuggates”; Advanced Drug Delivery Reviews 55, 2003, 1261-1277)に示されているように、このような皮下投与後のバイオアベイラビリティの問題はまた、ＰＥＧ化タンパク質（すなわち、ポリ（エチレングリコール）または（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマー基を共有結合させたもの）またはグリコシル化タンパク質（すなわち、単糖類または多糖類などの水溶性ポリマー基を共有結合させたもの）などの全身循環時間を長期化した新規な形態のバイオコンジュゲートタンパ���質に関しても主張している。
【０００４】
ＳＣまたはＩＭ注射後の絶対的バイオアベイラビリティの低さの厳密な起源はまだ説明がついていないが、文献では、注射部位における、または血漿へ向かうリンパ系輸送中のタンパク質有効成分の分解（タンパク質分解）または代謝の可能性にあるとされている。このように、ＳＣ投与後のプロテアーゼによるサイトカインの分解はそれらのバイオアベイラビリティを３０％以上低下させる（例えば、B. Rouveix: Clinical pharmacology of cytokines”; Eur. Cytokine Network 8(3), 1997, 291-293による論文参照）。ＳＣ注射による投与後のタンパク質の吸収および循環系への輸送機構に関する知見の現状についての総説は、最近、C. J. H. Porter ら (“Lymphatic transport of proteins after subcutaneous  administration”; J. Pharm. Sci. 89 (3), 2000, 297-310)によって発表されている。
【０００５】
最後に、ＳＣまたはＩＭ経路によって注射されたタンパク質のバイオアベイラビリティが低い場合（２０％未満）には、タンパク質の著しい損失が起こり、治療にはごく一部のタンパク質しか用いられず、それにより、製薬業者にとっては薬物の製造コストが著しく増大するということに留意しなければならない（J. L. Cleland ら , 既出）。
【０００６】
本明細書において、出願人は、脂質化合物を処方剤として用いてタンパク質有効成分を処方することによって、予期できないことに、皮下または筋肉注射経路による投与の後にこれらの有効成分の絶対的バイオアベイラビリティを増強することが可能となることを見出した。このバイオアベイラビリティの増強により、治療用量および不随する毒性の問題、ならびにこれらの有効成分を含有する薬物の製造が抱える経済的な問題に対応することが可能となる。
また、本発明の目的は、皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強する方法を提供することである。
【０００７】
本発明によれば、処方剤として脂質を用いることで、皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強することが可能となることが実証された。
結果として、本発明の目的は、皮下注射処方物または筋肉注射処方物中のタンパク質有効成分のバイオアベイラビリティを増強する方ための、処方剤としての脂質の使用に関する。
【０００８】
本発明によれば、これらの脂質は周囲温度で液体または固体の形で用いられる。有利な実施形態では、それらは固体の形で用いられる。
本発明のもう１つの特定の実施形態によれば、これらの脂質は、リン脂質、Ｃ８−Ｃ２２モノ、ジおよびトリグリセリド脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、グリコグリセロ脂質、スクロースエステル、およびその混合物からなる群から選択される。
【０００９】
本発明の別の特に有利な実施形態によれば、前記リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン、ジオレイルホスファチジルコリンおよびジミリストイル−ホスファチジルグリセロール、ならびにその混合物およびリゾ誘導体（lyso derivatives）からなる群から選択される。
【００１０】
本発明の別の有利な実施形態によれば、前記モノ、ジおよびトリグリセリドは、Ｃ８−Ｃ１８モノ、ジおよびトリグリセリド、特に、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸モノ、ジおよびトリグリセリドおよびその混合物からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の特に有利な実施形態によれば、前記脂肪酸エステルはＣ８−Ｃ２２脂肪酸エステルからなる群から選択される。
【００１２】
本発明の別の有利な実施形態によれば、前記脂肪酸エステルは、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸エステルおよびその混合物からなる群から、特には、パルミチン酸エチル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシルおよびその混合物の中から選択される。
【００１３】
本発明の極めて有利な実施形態によれば、固体脂質はジパルミトステアリン酸グリセロールであり、いっそうより有利には、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５（欧州薬局方第３版の命名法による第１種霧化型のジパルミトステアリン酸グリセロール）である。
【００１４】
本発明によれば、前記タンパク質有効成分は、ソマトトロピン類似体、ソマトメジン−Ｃ、ゴナドトロピン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびその類似体（ロイプロリド、ナファレリンおよびゴセレリンなど）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、成長ホルモン放出因子、カルシトニン、コルヒチン、ゴナドトロピン（絨毛性ゴナドトロピンなど）、オキシトシン、オクトレオチド、ソマトトロピン、アミノ酸関連ソマトトロピン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、ソマトスタチン、タンパク質関連ソマトロピン、コシントロピン、リプレシン、チロトロピン放出ホルモンなどのポリペプチド、セクレチン、パンクレオザイミン、エンケファリン、グルカゴン、および内分泌されて血流により分配される内分泌物質からなる群から選択されるペプチドまたはペプチド誘導体である。
【００１５】
本発明に従って送達可能な他の物質としては、特に、α１−抗トリプシン、因子VIII、因子IXおよびその他の凝固因子、インスリンおよびその他のペプチドホルモン、成長ホルモン、皮質アンドロゲン刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよびその他の下垂体ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、インターフェロンα、β、γおよびδ、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、増殖因子（顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＧＤＮＦなどの神経栄養因子、インスリン様増殖因子など）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＣＤ４、ｄＤＡＶＰ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、膵臓酵素、ラクターゼ、サイトカイン、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、腫瘍抑制タンパク質、細胞傷害性タンパク質などが挙げられる。
【００１６】
この有効成分はまた、上記で挙げたものなどのペプチドおよび／またはタンパク質の混合物でもよい。
本発明の特に有利な実施形態によれば、このタンパク質有効成分はサイトカイン、いっそうより有利にはインターフェロン、特にはα−２ｂである。
【００１７】
本発明に従って用いられるタンパク質有効成分は、好ましくは大きさ０．１μｍ〜１００μｍの範囲、いっそうより好ましくは大きさ１μｍ〜２５μｍの範囲の粒子中に含まれている。それらは、限定されるものではないが、凍結乾燥、霧化、霧化−凍結、結晶化、沈殿、摩砕、および流体を超臨界圧で用いる方法など、当業者に公知のいずれかの方法によって得られる。
【００１８】
タンパク質有効成分の粒子のタンパク質含量は０．０１％〜１００％の範囲であり、所望の治療用量を得るために当業者の知識に従って調整される。これらのタンパク質有効成分粒子はまた、例えば界面活性剤、ポリマー、糖類、多糖類、塩類、緩衝剤、およびその他のタンパク質など、通常用いられる賦形剤および添加剤も含むことができる。
【００１９】
脂質物質とともに処方されたタンパク質有効成分を含有する系を得るために実施可能な方法は多数あり、一般に、当業者に公知のものである。これらの方法は例えば乳化、分散、溶媒のエマルション抽出、ホットメルトエマルションの冷却、二重エマルション、水中油エマルション、溶媒傾斜による沈殿、コアセルベーション（相分離）、霧化とその後の冷却、小球化（prilling）、流動床でのコーティング、流体を超臨界圧で用いたカプセル化、押出し、押出し−球状化、熱成形または圧縮（インプラント用）の技術に基づくものである。溶媒または非溶媒として流体を超臨界圧で用いる、処方物の脂質または複数の脂質のカプセル化法が好適に実施される。この場合、用いる脂質物質は超臨界流体に可溶であることが好ましい。好適には、この超臨界流体は二酸化炭素（ＣＯ２）単独からなるか、または補助溶媒を伴う。
【００２０】
得られた処方系（formulated systems）は次のような構造を有する：ナノカプセル、マイクロカプセル（脂質核、タンパク質外被構造）、ナノスフェア、マイクロスフェア、円柱状または円盤状インプラント（タンパク質有効成分分散物を含有する脂質マトリックス構造）。好適には、これらの処方系はマトリックス構造を有する。
【００２１】
これらの処方系はＰＬＡ／ＰＬＧＡポリマー、アクリル系ポリマー、セルロースポリマー、またはビニルポリマーを含まない。
粒子中のタンパク質主成分含量（負荷率）は、０．１％〜９５％、有利には０．５％〜２５％、いっそうより有利には１％〜１０％の範囲である。
このようにして得られた、タンパク質有効成分を含有する処方系の平均サイズは、１μｍ〜５００μｍの範囲である。
【００２２】
これらの脂質粒子処方系では、その平均径は１０μｍ〜１００μｍの範囲が好適であり、脂質インプラントでは、その平均径は１０μｍ〜３００μｍの範囲が好適である。
これらの粒子系は、注射前に皮下注射または筋肉注射用の液体担体に再分散させる。限定されるものではないが、それらは水溶液、好適には、規定の粘度を持ち、水溶性ポリマーおよび／または界面活性ポリマーによって調整された緩衝等張水溶液であり、粒子の均質かつ安定な分散を得ることが可能な界面活性剤を含有する。これらの注射用液体担体の組成は、皮下注射分散物または筋肉注射分散物が得られるよう、当業者により調整される。
【００２３】
本発明の方法によれば、タンパク質有効成分のバイオアベイラビリティが増強し、有効成分の使用量を少なくすることができるので、前記タンパク質有効成分の高い毒性に関連する処置の中止が避けられる。
【００２４】
以下、実施例、表および図面により本発明を説明する。
【実施例】
【００２５】
実施例１：  インターフェロンα−２ｂを含有する脂質微粒子Ｍ１の製造
これらの微粒子はインターフェロンα−２ｂ（ＩＮＦ（登録商標）, Gautier Cassara, Argentina）の凍結乾燥品（lyophilizate）およびグリセリド混合物（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ  ５, Gattefosse, France）（なお、これらは周囲温度で個体である）から製造する。Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５の融点を示差走査エンタルピー分析により測定し、５６．２℃に相当することが分かっている。Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５でコーティングする前に、乳鉢を用いてインターフェロンα−２ｂを含有するＩＮＦ（登録商標）タンパク質粒子の凍結乾燥品（ＩＮＦα−２ｂ）を粉砕し、２５μｍの篩にかける。この篩にかけた２５μｍより小さい画分を微粒子の製造に用いる。粉砕して篩にかけたタンパク質凍結乾燥品粒子の平均径は、レーザー粒度計によって測定するとおよそ１５μｍである。これらの被コーティングタンパク質粒子のＩＮＦα−２ｂ含量は、ヒトＩＮＦα−２ｂに特異的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット(R & D Systems)を用いて測定する。これは被コーティング粒子１ｍｇ当たり２．８６６×１０６ｐｇのＩＮＦα−２ｂに相当することが測定により分かった。
【００２６】
コーティングされるタンパク質凍結乾燥品粒子１５７．４５ｍｇとＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５  ３ｇを内容積１Ｌのステンレス鋼製の反応器に導入する。この反応器の最大作動圧は３０ＭＰａであり、冷却剤の循環により温度制御ができる二重壁を備えている。この反応器の蓋には、磁気性の振子攪拌装置が具備されている。被コーティング粒子とＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５の導入後、反応器の蓋を閉め、圧力９．２ＭＰａとなるまで反応器に二酸化炭素を導入する。二酸化炭素を導入する操作中、温度を２３℃に維持する。次に、媒体を速度２１０ｒｐｍで攪拌する。その後、反応器の温度を徐々に４５℃まで上げると、圧力が２０ＭＰａまで高まる。このような温度および圧力条件下で、二酸化炭素は超臨界状態となり、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５が二酸化炭素中で可溶化される。このように反応器は、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５の溶液中に被コーティング粒子分散物を含む。４５℃および２０ＭＰａで１時間攪拌した後、反応器の温度を制御下で１７℃まで徐々に下げる。このような冷却の間に、圧力はおよそ６．５ＭＰａまで下がる。冷却工程の時間は３０分である。媒体の温度と圧力が低下することで、二酸化炭素中、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５の溶液が相分離を起こす。Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５が被コーティング粒子の表面に定着し、造粒現象が起こり、その結果、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５のマトリックス中に分散したタンパク質粒子を含む微粒子が得られる。次に、制御下で通風管から二酸化炭素を放出することにより、反応器の圧力を大気圧まで下げる。この減圧工程の時間は４５分である。
【００２７】
大気圧まで戻ったところで反応器を開放し、コーティングされた微粒子２．４５ｇを回収する。次に、この微粒子を１５０μｍの篩にかける。篩にかけた後の収率は９１％である。この篩にかけた微粒子（本明細書ではＭ１と呼ぶ）を、次に、窒素雰囲気下でガラス瓶に封入する。
【００２８】
この微粒子を、その微粒子を約７０℃まで加熱してＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５を融解させることができる加熱ステージを備えた光学顕微鏡を用いて観察する。このようにして観察したところ、微粒子Ｍ１は、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５中に分散されたタンパク質粒子からなっていることが実証された（図１）。
液体測定セルを備えたレーザー粒度計を用いて測定した微粒子Ｍ１の粒度分布を表１に示す。粒子の平均径は１０１．５μｍである。
【００２９】
【表１】
2007532519.tif 000002
微粒子Ｍ１を示差走査エンタルピー分析により分析する。微粒子Ｍ１は１０℃／分の速度で１０℃から８０℃まで温度上昇を受ける。この熱分析により、この微粒子の融解ピークは５７．９℃であることが示され、融解開始温度は５０．７℃であると測定された。５０．７より低い温度では吸熱現象も発熱現象も測定されなかった。微粒子Ｍ１の負荷率（ＬＦ）はヒトＩＮＦα−２ｂに特異的なキット(R&D Systems, 品番４１１００−１)を用いて免疫酵素検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定される。この微粒子Ｍ１バッチの負荷率はタンパク質凍結乾燥品の４．１％であり、力価は微粒子１ｍｇ当たりＩＮＦα−２ｂ  １４６，４８７ｐｇである。
【００３０】
実施例２：  インターフェロンα−２ｂを含有する脂質微粒子の製造
被コーティングＩＮＦα−２ｂタンパク質凍結乾燥品粒子の量が、１Ｌ反応器に導入されたＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５  ３ｇにつき７７．２４ｍｇであること以外は、実施例１に記載されているものと同じ製造プロトコールを用いる。
【００３１】
実施例１で用いたものと同じ手順に従ってタンパク質粒子をコーティングした後、コーティングされた微粒子２．４２ｇを回収する。これらの微粒子を１５０μｍの篩に通す。篩にかけた収率は９６．２％である。篩にかけた微粒子（本明細書ではＭ２と呼ぶ）を次に窒素雰囲気下でガラス瓶に封入する。
【００３２】
微粒子Ｍ２を、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５を融解させた後に光学顕微鏡を用いて観察する。この微粒子Ｍ２は、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５中に分散されたタンパク質凍結乾燥品粒子からなることが観察される。
液体測定セルを備えたレーザー粒度計を用いて測定した微粒子Ｍ２の粒度分布を表２に示す。微粒子の平均径は１１０．５μｍである。
【００３３】
【表２】
2007532519.tif 000003
【００３４】
微粒子Ｍ２を示差走査エンタルピー分析により分析する。微粒子Ｍ２を１０℃から８０℃まで１０℃／分の速度で昇温する。この熱分析により微粒子Ｍ２の融解ピークが６０℃であることが示され、融解開始温度は４８．３℃と測定され。４８．３℃より低い温度では吸熱現象も発熱現象も測定されなかった。
【００３５】
微粒子Ｍ２の負荷率を、ヒトＩＮＦα−２ｂに特異的なキット(R&D Systems)を用いて免疫酵素検定（ＥＬＩＳＡ）により測定する。この微粒子Ｍ２バッチの負荷率（ＬＦ）はタンパク質凍結乾燥品の１．６％であり、これは微粒子１ｍｇ当たりＩＮＦα−２ｂ力価４５，８９３ｐｇである。
【００３６】
実施例３：  皮下注射においてインターフェロンα−２ｂ（ＩＮＦα−２ｂ）のバイオアベイラビリティを高めるための微粒子Ｍ１の使用
３．１．  手順
３．１．１．  インターフェロンα−２ｂ微粒子分散物の作製
実施例１に記載のプロトコールに従って得られた、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５で被覆されたインターフェロンα−２ｂ（ＩＮＦα−２ｂ）を含有する脂質微粒子Ｍ１のバッチを使用する。
これらの微粒子を動物に注射する前に分散させることができる２種類の溶液を次のように作製する。
１）界面活性剤溶液：２５０ｍｌビーカー中、正確な質量として
−  Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ）５ｇ
−  Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（ＢＡＳＦ）５ｇ
−  Ｍｏｎｔａｎｏｘ（登録商標）２０ＰＨＡ（ＳＥＰＰＩＣ）０．１５ｇ
−  Ｄ−マンニトール（ＣＡＲＬＯ  ＥＲＢＡ）８．３３ｇ。
【００３７】
注射水（ＷＦＩ）１００ｍｌを、試験管を用いて加える。磁気攪拌子を用いた攪拌を、構成要素が完全に可溶化するまで続け、脂質溶液を得る。０．２μｍのＰＥＳフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅシリンジフィルター）を用い、この溶液の無菌濾過を行う。
−  カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液：  ２５０ｍｌビーカー中
−  試験管を用い、測定した１００ｍｌのＷＦＩを正確に注ぐ。
−  ＣＭＣ(Blanose 7LF, Hercules) １．２５ｇを正確に秤量する。
−  磁気攪拌子による攪拌下、このＣＭＣを全量一度にＷＦＩ  １００ｍｌに加える。
完全に溶解するまで攪拌を続ける。０．２μｍＰＥＳフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅシリンジフィルター）を用い、この溶液の無菌濾過を行う。２６３ｍｇ±１．５％を７回測定し、折り曲げ可能なブロモブチル栓付きの２０ｍｌのＩ型ガラス瓶に微粒子Ｍ１Ａ〜Ｇまで表示した。
【００３８】
各瓶について、インターフェロンα−２ｂ終濃度３，７９３，３３３ｐｇ／ｍｌとするために添加しなければならない全再構成溶液の正確な容量Ｘを算出する。秤量した微粒子の入った瓶に、予め算出した容量Ｘの６０％に相当する量の界面活性剤溶液を加える。
【００３９】
瓶にブロモブチル栓をして折り曲げずに５分間、２２ｒｐｍの速度で混合放置した。５分後、混合を止め、瓶を回収し、予め算出した容量Ｘの４０％に相当する量のＣＭＣ溶液を加える。瓶を折り曲げ、再び５分間２２ｒｐｍの速度で混合する。次に、この瓶をＶｏｒｔｅｘ  Ｔｏｐ−Ｍｉｘ  ９４３２３ミキサー(Heidolph)に載せ、２秒間最大連続混合する。
【００４０】
３．１．２．  コーティング無しのインターフェロンα−２ｂ溶液の作製
コーティング無しのＧａｕｔｉｅｒ  Ｃａｓｓａｒａインターフェロンα−２ｂを含有する溶液を、再分散溶液の場合と同様にして作製する。つまり、インターフェロン終濃度３，７９３，３３３ｐｇ／ｍｌを得るために、９１．７ｍｇ±１．５％のインターフェロンα−２ｂを１００ｍｌビーカーに加える。得られた溶液を折り曲げ可能なブロモブチル栓付きの２０ｍｌ  Ｉ型ガラス瓶７本に分注した。
【００４１】
３．１．３．  動物の処置とサンプリング
８〜１０週齢の、微粒子またはコーティング無しのインターフェロンα−２ｂの皮下注射を施した雄スイスマウスの全個体数は７０である。各マウスに１〜７０まで符番し（耳標識によるユニバーサルコーディング）、１０個体ずつ７バッチとする（バッチＡ〜Ｇ）。
【００４２】
各微粒子またはコーティング無しのインターフェロン処方物試験を１週間分析した。注射は午前中９：００以降に開始した。まず、バッチＡを構成する１０個体の注射を行った。次にバッチＢを構成する１０個体の注射を行い、その後、バッチＣなどとバッチＧまで注射を行った、各バッチについて注射を開始した正確な時間を記録し、そうしておけば、理論的な時間でなく、各バッチについてサンプリングから注射を区別した正確な時間に従って結果を補正することができる。
【００４３】
２０ゲージの針（１バッチにつき針１本）を用いて微粒子懸濁液をシリンジに吸い込み、２５ゲージ針で注射を行った（針はマウスごとに替えた）。サンプリングの度にＶｏｒｔｅｘミキサーで２秒間溶液をホモジナイズした。
【００４４】
【表３】
2007532519.tif 000004
【００４５】
同じバッチを構成する１０個体のマウスを符番し、注射と同じ順序でサンプルを採取し、注射とサンプリングの間隔が同じバッチの全マウスで同じになるようにした。各バッチのサンプリングを始めた正確な時間を記録した。以下のプロトコールに従い、同じ分析のマウスバッチではその週の中で交互にサンプリングを行い、１日１回を超えてサンプリングが行われるマウスバッチがないようにした：ＥＬＩＳＡ検定により、循環インターフェロンα−２ｂ濃度が有意でないことが明らかになったところでサンプリングを止めた（ＥＬＩＳＡ試験の定量限界値は１２．５ＩＵ／ｍｌであった）。
【００４６】
各マウスの眼窩後方からの採血量は４００μｌとした。この血液サンプルを遠心分離し、血漿を採取し、ＥＬＩＳＡ検定に必要になるまで、即冷凍した。ＥＬＩＳＡ技術（免疫酵素検定）を用い、採取した各サンプルのインターフェロンα−２ｂ血清濃度の検定を行った。ＥＬＩＳＡ検定の範囲を超える循環インターフェロンα−２ｂ濃度を示す特定のサンプルについては、ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４、０．０１％  Ｍｏｎｔａｎｏｘ  ２０  ＤＦ、０．０２％アジ化ナトリウムで希釈を行った。
【００４７】
３．２．  結果
微粒子Ｍ１を用いて得られた血清での総ての結果を下記表３にまとめる。
【００４８】
【表４】
2007532519.tif 000005
【００４９】
コーティング無しのＧａｕｔｉｅｒ  Ｃａｓｓａｒａ（ＩＮＦ（登録商標））インターフェロンα−２ｂ（ＩＮＦα−２ｂ）で得られた血清での総ての結果を下記表４にまとめる。
【００５０】
【表５】
2007532519.tif 000006
【００５１】
コーティング無しのインターフェロンα−２ｂまたは微粒子Ｍ１のいずれかを施した動物の血清において一定の時間にわたって評価したインターフェロンαの濃度を図１Ａ〜１Ｅで比較する。
タンパク質の絶対的バイオアベイラビリティを示す曲線下面積（ＡＵＣ）を各サンプリング時間と時間の間に得られた面積の三角形または矩形モデリングによって算出したものを以下の表５および表６に示す。なお、濃度はＩＵ／ｍｌで示し、ｐｇ／ｍｌではない。（１ＩＵ＝Ｇａｕｔｉｅｒ  Ｃａｓｓａｒａインターフェロンα−２ｂ  ６．８２８ｐｇ）。
【００５２】
【表６】
2007532519.tif 000007
【００５３】
【表７】
2007532519.tif 000008
タンパク質凍結乾燥品を含有する脂質微粒子Ｍ１で得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、同じ用量のタンパク質単独（コーティング無し）を投与した場合に得られたＡＵＣよりも３８．６％高い。
【００５４】
実施例４：皮下注射におけるインターフェロンα−２ｂ（ＩＦＮａ−２ｂ）のバイオアベイラビリティを増強するための微粒子Ｍ２の使用
４．１．  手順
４．１．１．  微粒子分散物の作製
実施例２に記載のプロトコールに従って得られたＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５でコーティングしたインターフェロンα−２ｂ（ＩＦＮａ−２ｂ）を含有する脂質微粒子Ｍ２のバッチを用いる。
【００５５】
動物に注射する前にこれらの微粒子を分散させることができる２種類の溶液を実施例３の場合と同様にして作製する。２０４ｍｇ±２％を７回測定し、折り曲げ可能なブロモブチル栓付きの２０ｍｌのＩ型ガラス瓶に微粒子Ｍ２Ａ〜Ｇまで表示した。各瓶について、インターフェロン終濃度９４８，３３３ｐｇ／ｍｌとするために添加しなければならない全再構成溶液の正確な容量Ｘを算出する。
秤量した微粒子の入った瓶に、予め算出した容量Ｘの６０％に相当する量の界面活性剤溶液を加える。
【００５６】
瓶にブロモブチル栓をして折り曲げずに５分間、２２ｒｐｍの速度で混合放置した。５分後、混合を止め、瓶を回収し、予め算出した容量Ｘの４０％に相当する量のＣＭＣ溶液を加える。瓶を折り曲げ、再び５分間２２ｒｐｍの速度で混合する。次に、この瓶をＶｏｒｔｅｘ  Ｔｏｐ−Ｍｉｘ  ９４３２３ミキサー(Heidolph)に載せ、２秒間最大連続混合する。
【００５７】
４．１．２．  コーティング無しのインターフェロンα−２ｂ溶液の作製
コーティング無しのＧａｕｔｉｅｒ  Ｃａｓｓａｒａインターフェロンα−２ｂを含有する溶液を同様にして作製する：インターフェロンα−２ｂ終濃度が９４８，３３３ｐｇ／ｍｌとなるように、２２．９ｍｇ±１．５％のインターフェロンα−２ｂを１００ｍｌビーカーに加える。得られた溶液を折り曲げ可能なブロモブチル栓付きの２０ｍｌのＩ型ガラス瓶７本に分注する。
【００５８】
４．１．３．  動物の処置とサンプリング
８〜１０週齢の、微粒子またはコーティング無しのインターフェロンα−２ｂの皮下注射を施した雄スイスマウスの全個体数は７０である。各マウスに１〜７０まで符番し（耳標識によるユニバーサルコーディング）、１０個体ずつ７バッチとする（バッチＡ〜Ｇ）。
各微粒子またはコーティング無しのインターフェロン処方物試験を１週間分析した。注射およびサンプリングは実施例３と同様のプロトコールに従って行った。
以下のプロトコールに従い、同じ分析のマウスバッチではその週の中で交互にサンプリングを行い、１日１回を超えてサンプリングが行われるマウスバッチがないようにした。
【００５９】
【表８】
2007532519.tif 000009
ＥＬＩＳＡ検定により、循環インターフェロンα−２ｂ濃度が有意でないことが明らかになったところでサンプリングを止めた（ＥＬＩＳＡ試験の定量限界値は１２．５ＩＵ／ｍｌであった）。各マウスの眼窩後方からの採血量は４００μｌとした。この血液サンプルを遠心分離し、血漿を採取し、ＥＬＩＳＡ検定に必要になるまで、即冷凍した。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ技術（免疫酵素検定）を用い、採取した各サンプルのヒトインターフェロンα−２ｂ血清濃度の検定を行った。ＥＬＩＳＡ検定の範囲を超える循環インターフェロンα−２ｂ濃度を示す特定のサンプルについては、ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４、０．０１％  Ｍｏｎｔａｎｏｘ  ２０  ＤＦ、０．０２％アジ化ナトリウムで希釈を行った。
【００６１】
４．２．  結果
微粒子Ｍ２を用いて得られた血清での総ての結果を下記表７にまとめる。
【００６２】
【表９】
2007532519.tif 000010
【００６３】
コーティング無しのインターフェロンα−２ｂ（ＩＮＦα−２ｂ）で得られた血清での総ての結果を下記表８にまとめる。
【００６４】
【表１０】
2007532519.tif 000011
【００６５】
インターフェロンα−２ｂまたは微粒子Ｍ２のいずれかを施した動物の血清において一定の時間にわたって評価したインターフェロンαの濃度を図２Ａおよび２Ｂで比較する。
曲線下面積は実施例３に記載の方法により算出し、下記表９および１０に示す。
【００６６】
【表１１】
2007532519.tif 000012
【００６７】
【表１２】
2007532519.tif 000013
【００６８】
タンパク質凍結乾燥品を含有する脂質微粒子Ｍ２で得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、同じ用量のタンパク質単独（コーティング無し）を投与した場合に得られたＡＵＣよりも３．９倍高い。
【００６９】
実施例５：皮下注射におけるインターフェロンα−２ｂ（ＩＦＮａ−２ｂ）のバイオアベイラビリティを増強するための、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７含有再構成溶液を伴った脂質微粒子Ｍ２の使用
５．１．  手順
５．１．１．  微粒子分散物の作製
実施例４と同じ、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５でコーティングしたインターフェロンα−２ｂ（ＩＦＮａ−２ｂ）の脂質微粒子Ｍ２バッチ（負荷率（ＬＦ）はタンパク質凍結乾燥品１．６％）を用いる。
これらの微粒子を動物に注射する前に分散させることができる溶液を次のように作製する。２５０ｍｌビーカー中、正確な質量として
−  Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ）３ｇ
−  Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（ＢＡＳＦ）３ｇ
−  Ｍｏｎｔａｎｏｘ（登録商標）２０ＰＨＡ（ＳＥＰＰＩＣ）０．０９ｇ
−  Ｄ−マンニトール（ＣＡＲＬＯ  ＥＲＢＡ）５．１ｇ。
注射水（ＷＦＩ）１００ｍｌを、試験管を用いて加え、磁気攪拌子を用いた攪拌を、構成要素が完全に可溶化するまで続け、脂質溶液を得る。このビーカーを氷水浴に入れる。Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７（ＢＡＳＦ）７．５ｇを秤量し、総て一度に前溶液に加える。完全に溶解するまで攪拌を続ける。０．２μｍのＰＥＳフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅシリンジフィルター）を用い、この溶液の無菌濾過を行う。
【００７０】
２０４ｍｇ±２％を７回測定し、折り曲げ可能なブロモブチル栓付きの２０ｍｌのＩ型ガラス瓶に微粒子Ｍ２Ａ〜Ｇまで表示する。各瓶について、インターフェロン終濃度９４８，３３３ｐｇ／ｍｌとするために添加しなければならない全再構成溶液の正確な容量Ｘを算出する。この溶液量を、秤量した微粒子Ｍ２の入った瓶に加える。
【００７１】
瓶にブロモブチル栓をし、１０分間、２２ｒｐｍの速度で混合放置する。次に、瓶をＶｏｒｔｅｘ  Ｔｏｐ−Ｍｉｘ  ９４３２３ミキサー(Heidolph)に載せ、２秒間最大連続混合する。
実施例４に記載のコーティング無しのインターフェロンα−２ｂで得られた結果を比較として用いる。
【００７２】
５．１．２．  動物の処置とサンプリング
８〜１０週齢の、微粒子またはコーティング無しのインターフェロンα−２ｂの皮下注射を施した雄スイスマウスの全個体数は７０である。各マウスに１〜７０まで符番し（耳標識によるユニバーサルコーディング）、１０個体ずつ７バッチとする（バッチＡ〜Ｇ）。
【００７３】
各微粒子またはコーティング無しのインターフェロン処方物試験を１週間分析した。注射およびサンプリングは実施例４と同様のプロトコールに従って行った。以下のプロトコールに従い、同じ分析のマウスバッチではその週の中で交互にサンプリングを行い、１日１回を超えてサンプリングが行われるマウスバッチがないようにした。
【００７４】
【表１３】
2007532519.tif 000014
【００７５】
ＥＬＩＳＡ検定により、循環インターフェロンα−２ｂ濃度が有意でないことが明らかになったところでサンプリングを止めた（ＥＬＩＳＡ試験の定量限界値は１２．５ＩＵ／ｍｌであった）。各マウスの眼窩後方からの採血量は４００μｌとした。この血液サンプルを遠心分離し、血漿を採取し、ＥＬＩＳＡ検定に必要になるまで、即冷凍した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ技術（免疫酵素検定）を用い、採取した各サンプルのヒトインターフェロンα−２ｂ血清濃度を測定した。ＥＬＩＳＡ検定の範囲を超える循環インターフェロンα−２ｂ濃度を示す特定のサンプルについては、ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４、０．０１％  Ｍｏｎｔａｎｏｘ  ２０  ＤＦ、０．０２％アジ化ナトリウムで希釈を行った。
【００７７】
５．２．  結果
Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７を含有する再構成溶液中の微粒子Ｍ２を用いて得られた血清での総ての結果を下記表１１にまとめる。
【００７８】
【表１４】
2007532519.tif 000015
【００７９】
Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７を含有する再構成溶液に溶解したインターフェロンα−２ｂまたは微粒子Ｍ２のいずれかを施した動物の血清において一定の時間にわたって評価したインターフェロンαの濃度を図３Ａおよび３Ｂで比較する。
曲線下面積を実施例３に記載の方法によって算出し、下記表１２および１３に示す。なお、濃度はＩＵ／ｍｌで示し、ｐｇ／ｍｌではない。ここでもまた、１ＩＵ＝Ｇａｕｔｉｅｒ  Ｃａｓｓａｒａインターフェロンα−２ｂ  ６．８２８ｐｇ）。
【００８０】
【表１５】
2007532519.tif 000016
【００８１】
【表１６】
2007532519.tif 000017
【００８２】
Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７の溶液中に再分散したタンパク質凍結乾燥品を含有する脂質微粒子Ｍ２で得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、同じ用量のタンパク質単独（コーティング無し）を投与した場合に得られたＡＵＣよりも２．８３倍高い。
表１４は、実施例３、４および５で見られたタンパク質の絶対的バイオアベイラビリティの指標となるパラメーターＡＵＣの値をまとめたものである。
【００８３】
【表１７】
2007532519.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】実施例１に記載したように脂質融解後の微粒子Ｍ１の光学顕微鏡写真である。
【図２】一個体当たり５００，０００ＩＵ用量のインターフェロンα−２ｂの場合の、マウスにおけるインターフェロンαの血清濃度を示す：（Ａ）コーティング無しのＩＮＦα−２ｂまたは実施例１に従って製造した微粒子Ｍ１の注射から０〜３０時間後、（Ｂ）コーティング有りのＩＮＦα−２ｂまたは実施例１に従って製造した微粒子Ｍ１の注射から２０〜５０時間後、（Ｃ）コーティング無しのＩＮＦα−２ｂまたは実施例１に従って製造した微粒子Ｍ１の注射から５０〜１５０時間後。
【図３】一個体当たり１２５，０００ＩＵ用量のインターフェロンα−２ｂの場合の、マウスにおけるインターフェロンαの血清濃度を示す：（Ａ）コーティング無しのＩＮＦα−２ｂまたは実施例２に従って製造し、実施例４から得られた媒体に懸濁させた微粒子Ｍ２の注射から０〜３０時間後、（Ｂ）コーティング無しのＩＮＦα−２ｂまたは実施例２に従って製造し、実施例４から得られた媒体に懸濁させた微粒子Ｍ２の注射から２０〜１０１時間後。
【図４】一個体当たり１２５，０００ＩＵ用量のインターフェロンα−２ｂの場合の、マウスにおけるインターフェロンαの血清濃度を示す：（Ａ）コーティング無しのＩＮＦα−２ｂまたは実施例２に従って製造し、実施例５から得られた媒体に懸濁させた微粒子Ｍ２の注射から０〜３０時間後、（Ｂ）コーティング無しのＩＮＦα−２ｂまたは実施例２に従って製造し、実施例５から得られた媒体に懸濁させた微粒子Ｍ２の注射から２０〜８０時間後。
【図１】
2007532519.tif 000019
【図２】
2007532519.tif 000020
【図３】
2007532519.tif 000021
【図４】
2007532519.tif 000022
【国際調査報告】
2007532519.tif 000023
2007532519.tif 000024
2007532519.tif 000025
2007532519.tif 000026
2007532519.tif 000027
2007532519.tif 000028
2007532519.tif 000029
2007532519.tif 000030
2007532519.tif 000031
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