(57)【要約】  本発明は、第１の生物種由来の抗体を再設計または改造する方法を提供し、再設計または改造された抗体は第２の生物種において望ましくない免疫応答を引き起こすことがなく、しかも、再設計または改造された抗体は第１の生物種由来の抗体と実質的に同じ抗原結合能を保持するものである。本発明によれば、第２の生物種由来のフレームワーク領域とインフレームで融合された第１の生物種由来の抗体のCDRを含むコンビナトリアルライブラリーを構築して、所望の改変抗体をスクリーニングすることができる。特に、本発明は、抗体またはそのフラグメントを効率よくヒト化するために、相同性の低いアクセプター抗体のフレームワークを利用する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって作製された抗体を提供する。
2007528723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではない、前記ライブラリー。
【請求項２】
ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものである、前記ライブラリー。
【請求項３】
ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではない、前記ライブラリー。
【請求項４】
ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、前記ライブラリー。
【請求項５】
(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものである、前記ライブラリー。
【請求項６】
(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものである、前記ライブラリー。
【請求項７】
(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものである、前記ライブラリー。
【請求項８】
(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、前記ライブラリー。
【請求項９】
(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して全体で65％以上同一ではないものである、前記ライブラリー。
【請求項１０】
前記アクセプターがヒトである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１１】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して全体で65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49にドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項１２】
前記細胞がさらに、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項１１に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項１４】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれ、FR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域と65％以上同一ではないフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項１５】
前記細胞がさらに、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項１４に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項１７】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項１８】
前記細胞がさらに、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項１７に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項２０】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とを含むものであり、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項２１】
前記細胞がさらに、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項２０に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項２３】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  (i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および(ii) アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成すること、ただし前記第１のヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とを含み、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項２４】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項２３に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項２５】
複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞の集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞の集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項２６】
複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞の集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項２７】
、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞を用意し、前記ヌクレオチド配列を発現させることを含む、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、前記ヌクレオチ配列を含有する細胞は、以下により作製されたものである：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対して、ドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入すること。
【請求項２８】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞を用意し、前記ヌクレオチド配列を発現させることを含む前記方法、ただし前記ヌクレオチ配列を含有する細胞は以下により作製されたものである：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対してドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定された残基に導入された１以上の変異を有するものであること；
(d)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項２９】
キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基、の１つまたはそれ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２７または２８の方法により製造されたヒト化抗体。
【請求項３２】
請求項３１に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【請求項３３】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の同定方法であって、請求項１１、１４、１７または２０に記載の細胞において核酸配列を発現させ、前記抗原に対して1×106 Ｍ-1以上の親和性を有するヒト化抗体についてスクリーニングすることを含む前記方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法により同定されたヒト化抗体。
【請求項３５】
請求項３４に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  発明の分野
本発明は、抗体の抗原に対する免疫特異性を保持したまま、抗体の免疫原性を弱めるための、抗体の再設計または改造方法に関する。特に、本発明は、抗体またはそのフラグメントを効率よくヒト化するために、相同性の低いアクセプター抗体のフレームワーク領域を利用する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって作製された抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
抗体は我々の免疫反応において極めて重要な役割を担っている。それらはウイルスや細菌毒素を不活化することができ、また、補体系と様々なタイプの白血球を動員して、侵入してくる微生物や大型の寄生生物を死滅させるのに不可欠である。抗体はもっぱらＢリンパ球によって数限りない形態で作られており、それぞれの形態が異なるアミノ酸配列を有し、異なる抗原結合部位をもっている。抗体は、まとめて免疫グロブリン（Ig）と呼ばれているが、血液中で最も豊富に存在するタンパク質成分の一つである。Albertsら, Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989, Garland Publishing, Inc.。
【０００３】
典型的な抗体は、２本の同一の重（Ｈ）鎖（それぞれが約440アミノ酸を含む）と２本の同一の軽（Ｌ）鎖（それぞれが約220アミノ酸を含む）をもつＹ型分子である。４本の鎖は非共有結合と共有（ジスルフィド）結合との組み合わせにより一緒に保持されている。パパインやペプシンのようなタンパク質分解酵素は、抗体分子を、異なる特性を示すフラグメントに分割することができる。パパインは分離した同一のFabフラグメント２本（それぞれが１つの抗原結合部位を保持する）とFcフラグメント１本をもたらす。ペプシンはF(ab’)2フラグメントを１本生成する。Albertsら, Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989, Garland Publishing, Inc.。
【０００４】
Ｌ鎖とＨ鎖は双方ともそのアミノ末端に可変配列を有し、そのカルボキシル末端には定常配列を有する。Ｌ鎖は約110アミノ酸長の定常領域と同じサイズの可変領域を保持する。Ｈ鎖も約110アミノ酸長の可変領域を有するが、Ｈ鎖の定常領域はＨ鎖のクラスに応じて約330または440アミノ酸長である。Albertsら, Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989, Garland Publishing, Inc. pp 1019。
【０００５】
可変領域の部分だけが抗原の結合に直接関与している。研究によって、Ｌ鎖とＨ鎖の両方の可変領域の多様性はほとんど、各鎖に含まれる３つの小さな超可変領域（相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる）に限られることが示されている。可変領域の残りの部分は、フレームワーク領域（FR）として知られるもので、比較的変化しない。Albertsら, Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989, Garland Publishing, Inc. pp 1019-1020。
【０００６】
天然の免疫グロブリンはアッセイや診断に使用されており、また、使用頻度は限られるものの治療にも用いられている。しかし、そのような用途、特に治療においては、天然の免疫グロブリンの多クローン性によって使用が妨げられている。特定の特異性を有するモノクローナル抗体の出現は治療用途の機会を増大させた。ところが、ほとんどのモノクローナル抗体は、宿主げっ歯動物を標的タンパク質で免疫し、続いて対象の抗体を産生するげっ歯動物の脾細胞をげっ歯動物のミエローマ細胞と融合することにより産生される。したがって、それらは本質的にげっ歯動物のタンパク質であり、そのままではヒトにおいて免疫原性があり、しばしばHAMA（Human Anti-Mouse Antibody：ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれる望ましくない免疫応答を誘起させる。
【０００７】
多くのグループが治療用抗体の免疫原性を弱めるための技術を開発してきた。慣習的には、ドナー抗体に対する相同性の程度によってヒトテンプレートを選択する。すなわち、可変領域が非ヒト抗体に最も相同なヒト抗体をヒト化のためのテンプレートとして使用する。その理論は、フレームワーク配列が抗原との相互作用のためにCDRをその正しい空間的方向付けで保持するように作用し、また、フレームワーク残基が時には抗原結合に関与することさえある、ということにある。こうして、選択したヒトフレームワーク配列がドナーのフレームワーク配列に最も類似している場合には、ヒト化抗体において親和性が保持される可能性が最大となろう。例えば、Winter (ヨーロッパ特許第0239400号)は、重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれに由来する３つの相補性決定領域（CDR1、CDR2およびCDR3）をグラフトするために、長いオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発によりヒト化抗体を作製することを提案した。この方法はうまくいくことが示されたが、ドナーCDRを支持する最良のヒトテンプレートを選択するという可能性に限界がある。
【０００８】
ヒト化抗体はその天然のまたはキメラな対応物よりもヒトにおいて免疫原性が少ないが、多くのグループは、CDRをグラフトさせたヒト化抗体は著しく低下した結合親和性を示しうることに気づいている（例えば、Riechmannら, 1988, Nature 3 32:323-327）。例えば、Riechmannとその仲間は、CDR領域のみの転移はCDRグラフト産物において満足のいく抗原結合活性を得るのに十分ではなく、ヒト配列の27位のセリン残基を対応するラットフェニルアラニン残基に変換することも必要である、ことを見いだした。これらの結果は、効果的な抗原結合活性を得るためにはCDR領域の外側にあるヒト配列の残基の変更が必要でありうることを示した。それにしても、結合親和性はもとのモノクローナル抗体の親和性よりもまだかなり低いものであった。
【０００９】
例えば、Queenら（米国特許第5,530,101号）は、マウスモノクローナル抗体（抗Tac MAb）のCDRを、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域および定常領域と結合させることによって、インターロイキン-2受容体に結合するヒト化抗体を作製することを記載した。ヒトフレームワーク領域は、抗Tac MAb配列との相同性が最大となるように選択された。さらに、コンピュータモデリングを用いることにより、CDRまたは抗原と相互作用しそうなフレームワークアミノ酸残基が同定され、これらの位置ではヒト化抗体においてマウスアミノ酸が使用された。得られたヒト化抗Tac抗体は、インターロイキン-2受容体(p55)に対する親和性が3 X 109 M-1であると報告され、この数値は依然としてマウスMAbの親和性の３分の１ほどにすぎなかった。
【００１０】
他のグループは、可変領域のフレームワーク領域内の更なる位置（すなわち、可変領域のCDRおよび構造ループの外側の位置）を同定したが、それらの位置では、アミノ酸残基の正体が満足のいく結合親和性を有するCDRグラフト産物の取得に寄与している可能性がある。例えば、米国特許第6,054,297号および第5,929,212号を参照されたい。しかしまだ、特定のCDRグラフト配置が対象となる所与の抗体にどのように有効であるのかを前もって知ることは不可能である。
【００１１】
Leung (米国特許出願公開第US 2003/0040606号) は、フレームワークパッチング（framework patching）アプローチを記載しており、このアプローチでは、免疫グロブリンの可変領域をFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4に画定して、非ヒト抗体とヒト抗体テンプレートとの相同性が最大となるように個々のFR配列を選択している。しかし、このアプローチは手間がかかり、最適なフレームワーク領域を簡単に同定することができない。
【００１２】
治療上より効果的な抗体が開発されつつあり、また、それらはより有望な成果を収めつつあるので、投与された抗体が誘発する生体の免疫反応を抑制または排除することができることが重要である。したがって、抗体をヒト様にするための効率的かつ迅速な遺伝子工学的操作を可能にし、かつ/また、抗体をヒト化する際の労力の軽減を可能にする新しいアプローチは、多大な利益と医療的価値をもたらすだろう。
【００１３】
本明細書中での文献の引用または考察は、それが本発明の先行技術であることを容認するものと解釈されるべきでない。
【発明の開示】
【００１４】
3.  発明の概要
本発明は、一部には、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む抗体のコンビナトリアルライブラリーの作製に基づいており、前記可変鎖領域は、ドナー抗体由来の相補性決定領域（CDR）と、アクセプター抗体の低相同性フレームワーク領域由来のフレームワーク領域とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、ここで、前記ドナー抗体とアクセプター抗体は異なる生物種に由来するものである（例えば、ドナー抗体がマウス由来で、アクセプター抗体がヒト由来である）。アクセプターフレームワークは生殖系列配列、成熟抗体遺伝子配列、または他の既知の機能性抗体の配列から得ることができる。コンビナトリアルライブラリーは、いくつかのキー（key）位置のドナー残基またはアクセプター残基（すなわち、キー残基）をコードする「ゆらぎコドン」（wobble codon）を使用して、有限の多様性を軽鎖と重鎖の両方の可変領域に導入することによって作製される。作製されたライブラリーは抗体の抗原結合活性および/または機能についてスクリーニングされる。低相同性アクセプターフレームワークを用いた抗体（定常領域を含むまたは含まない）のコンビナトリアルライブラリーの作製は、抗体（定常領域を含むまたは含まない）の迅速で手間のかからない製造を可能にし、これらの抗体は、対象の抗原に対するそれらの免疫特異性だけでなく、対象の生物におけるそれらの免疫原性について容易にスクリーニングすることができる。本発明の方法は、人間に使用するためのヒト化抗体の作製に関して本明細書で例証される。しかしながら、本発明の方法は、任意の対象生物に使用するための抗体の作製に容易に応用することが可能である。
【００１５】
本発明は、各ヌクレオチド配列が、アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖フレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター重鎖フレームワーク領域（例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域１、ヒト重鎖フレームワーク領域２、ヒト重鎖フレームワーク領域３、またはヒト重鎖フレームワーク領域４）をコードしている、複数のヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーを提供する。いくつかの実施形態において、アクセプター重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムに従う）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する。特定の実施形態では、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に１つ以上の突然変異が導入されており、前記キー残基にアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93（Kabatナンバリングシステムに従う）は含まれない。特定の実施形態において、キーと指定された残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基（canonical residue）、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン（vernier zone）内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、キーと指定されたアミノ酸残基は、Kabatナンバリングシステムに従うグループとしての重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基６、23、24および/または49ではない。
【００１６】
本発明は、各ヌクレオチド配列が、アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖フレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖フレームワーク領域（例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域１、ヒト軽鎖フレームワーク領域２、ヒト軽鎖フレームワーク領域３、またはヒト軽鎖フレームワーク領域４）をコードしている、複数のヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーを提供する。いくつかの実施形態において、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に１つ以上の突然変異が導入されており、前記キー残基にアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98（Kabatナンバリングシステムによる）は含まれない。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、置換により、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基が、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基で置き換えられる。いくつかの実施形態において、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、および/またはバーニヤゾーン内の残基。
【００１７】
本発明は、各ヌクレオチド配列が、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列および本明細書に記載したとおりに選択されたアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列をインフレームで一緒に融合することにより作製されたヒト化重鎖可変領域をコードしている、複数のヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーを提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化重鎖可変領域は該可変領域に加えて１つ以上の定常領域をさらに含む。ヒト化重鎖可変領域をコードする複数のヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーは宿主細胞（該宿主細胞には軽鎖または軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が含まれていても、含まれていなくてもよい）において発現させることができ、これは対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体のスクリーニング、同定および/または選別に使用することができる。
【００１８】
本発明は、各ヌクレオチド配列が、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列および本明細書に記載したとおりに選択されたアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列をインフレームで一緒に融合することにより作製されたヒト化軽鎖可変領域をコードしている、複数のヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーを提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化軽鎖可変領域は該可変領域に加えて１つ以上の定常領域をさらに含む。ヒト化軽鎖可変領域をコードする複数のヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーは宿主細胞（該宿主細胞には重鎖または重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が含まれていても、含まれていなくてもよい）において発現させることができ、これは対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体のスクリーニング、同定および/または選別に使用することができる。
【００１９】
本発明は、(i)第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーを提供し、ここで、第１セット中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体由来のCDRをコードする核酸配列および本明細書に記載したとおりに選択されたアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列をインフレームで一緒に融合することにより作製されたヒト化重鎖可変領域をコードしており、また第２セット中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体由来のCDRをコードする核酸配列および本明細書に記載したとおりに選択されたアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列をインフレームで一緒に融合することにより作製されたヒト化軽鎖可変領域をコードしている。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は可変領域に加えて１つ以上の定常領域を含む。ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列およびヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーは宿主細胞において発現させることができ、これは対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体のスクリーニング、同定および/または選別に使用される。
【００２０】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列はドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。特定の実施形態において、ヒト化重鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体アミノ酸残基は、CDRの６Å、6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態において、前記細胞は軽鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はさらに、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞内に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はまた、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２１】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。特定の実施形態において、キーと指定された残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、キーと指定されたアミノ酸残基は、Kabatナンバリングシステムに従うグループとしての重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基６、23、24および/または49ではない。いくつかの実施形態において、ヒト化重鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体アミノ酸残基は、CDRの６Å、6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明によれば、前記ドナー抗体とアクセプター抗体は異なる生物種に由来するものである（例えば、ドナー抗体がマウス由来で、アクセプター抗体がヒト由来である）。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態において、前記細胞は軽鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はさらに、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞内に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２２】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、また、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有すること、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。
【００２３】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター軽鎖フレームワーク領域１、アクセプター軽鎖フレームワーク領域２、アクセプター軽鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター軽鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態において、前記細胞は重鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２４】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター軽鎖フレームワーク領域１、アクセプター軽鎖フレームワーク領域２、アクセプター軽鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター軽鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態において、ヒト化軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体アミノ酸残基は、CDRの６Å以内、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。いくつかの実施形態において、キー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、および/またはバーニヤゾーン内の残基。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態において、前記細胞は重鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２５】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)(i)軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態においては、軽鎖がヒト化される。特定の実施形態では、ヒト化重鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２６】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)(i)軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態においては、軽鎖がヒト化される。特定の実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択するステップ、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態において、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/またはヒト化軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列��含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２８】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択するステップ、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態において、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、またはバーニヤゾーン内の残基。特定の実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/またはヒト化軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異���に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００２９】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アクセプター重鎖フレームワーク領域１、アクセプター重鎖フレームワーク領域２、アクセプター重鎖フレームワーク領域３、およびアクセプター重鎖フレームワーク領域４を選択するステップ、その際、前記フレームワーク領域の少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）が、アミノ酸レベルでドナー抗体の対応するフレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないこと、また、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有すること、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択するステップ、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではない、少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全て）のフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。
【００３０】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ。ある実施形態において、ヒト化重鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å、6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態では、前記細胞が軽鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はさらに、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３１】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態において、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、キーと指定されたアミノ酸残基は、Kabatナンバリングシステムに従うグループとしての重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基６、23、24および/または49ではない。さらなる実施形態では、キーと指定されたアミノ酸残基は、Kabatナンバリングシステムに従うグループとしての重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基６、24、48、49、71、73、および78ではない。さらなる実施形態では、キーと指定されたアミノ酸残基は、Kabatナンバリングシステムに従うグループとしての重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基23、24、26〜30、および49ではない。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明によれば、ドナー抗体とアクセプター抗体は異なる生物種に由来するものである（例えば、ドナー抗体がマウス由来で、アクセプター抗体がヒト由来である）。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態では、前記細胞が軽鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３２】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)ドナー抗体の軽鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態では、前記細胞が重鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はさらに、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３３】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、および/またはバーニヤゾーン内の残基。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載したヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態では、前記細胞が重鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。本発明はさらに、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３４】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)(i)軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。いくつかの実施形態では、軽鎖がヒト化される。ある実施形態では、ヒト化重鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３５】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)(i)軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態では、軽鎖がヒト化される。ある実施形態において、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配���を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択すること、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基��、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供し、前記核酸配列は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択すること、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域���のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のドナー抗体のアミノ酸残基は、CDRの６Å以内ではなく、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Å以内ではない。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含む細胞を提供し、前記細胞は、ここに記載した第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを含む核酸配列を細胞に導入することにより作製されたものである。本発明はまた、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ここに記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【００３８】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(c)前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態において、前記細胞は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。特定の実施形態では、軽鎖がヒト化される。ある実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００３９】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること、(c)前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態において、前記細胞は軽鎖可変領域（好ましくは、ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する。ある実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４０】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)ドナー抗体の軽鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(c)前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４１】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(c)前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態において、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４２】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)(i)軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第２セットのヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること、(c)前記第１セットのヌクレオチド配列と第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。好ましくは、軽鎖がヒト化される。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４３】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)(i)軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第２セットのヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること、(c)前記第１セットのヌクレオチド配列と第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態においては、軽鎖がヒト化される。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４４】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１セットのヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２セットのヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること、(d)前記第１セットのヌクレオチド配列と第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４５】
本発明は、複数のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された細胞の集団を提供し、前記細胞は、以下のステップを含む方法により作製されたものである：(a)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(c)(i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と依然として65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないフレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップ、ただし、前記第１セットのヌクレオチド配列は、ドナー抗体の軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記第２セットのヌクレオチド配列は、ドナー抗体の重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基（キー残基には、Kabatナンバリングシステムによるアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93は含まれない）に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること、(d)前記第１セットのヌクレオチド配列と第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形��において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖および/または軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。前記細胞の集団は、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニング、同定および/または選択する際に使用することができる。
【００４６】
本発明によれば、本明細書に記載した細胞は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域と定常領域、軽鎖可変領域と定常領域、またはこれらの組合せ（例えば、定常領域を有する重鎖および軽鎖、重鎖可変領域と軽鎖可変領域）を含むことができる。
【００４７】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞を用意すること、前記核酸配列を発現させることを含んでなる。ここで、前記核酸配列を含有する細胞は、以下のステップにより作製されたものである：(a)ドナー抗体の重鎖可変領域の核酸配列を、アクセプター重鎖可変領域の配列コレクションと対比させるステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(c)ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードするヌクレオチド配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、ヒト化重鎖可変領域をコードする核酸配列を合成するステップ、(d)前記ヒト化重鎖可変領域をコードする核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。
【００４８】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞を用意すること、前記核酸配列を発現させることを含んでなる。ここで、前記核酸配列を含有する細胞は、以下のステップにより作製されたものである：(a)ドナー抗体の重鎖可変領域の核酸配列を、アクセプター重鎖可変領域の配列コレクションと対比させるステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(c)ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(d)前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、および/またはChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。ある実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、重鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。
【００４９】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞を用意すること、前記核酸配列を発現させることを含んでなる。ここで、前記核酸配列を含有する細胞は、以下のステップにより作製されたものである：(a)ドナー抗体の軽鎖可変領域の核酸配列を、アクセプター軽鎖可変領域の配列コレクションと対比させるステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(c)ドナー抗体の軽鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(d)前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。いくつかの実施形態では、キーと指定される残基は以下の残基の１つまたはそれ以上である：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基、および/またはバーニヤゾーン内の残基。いくつかの実施形態において、キーと指定されたアミノ酸残基に導入される突然変異は置換である。特定の実施形態では、前記置換は、軽鎖可変フレームワーク領域中のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域中の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである。
【００５０】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞を用意すること、前記核酸配列を発現させることを含んでなる。ここで、前記核酸配列を含有する細胞は、以下のステップにより作製されたものである：(a)ドナー抗体の重鎖可変領域の核酸配列を、アクセプター重鎖可変領域の配列コレクションと対比させるステップ、(b)アミノ酸レベルでドナー抗体の重鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではなく、かつアミノ酸残基６、23、24および/または49（Kabatナンバリングシステムによる）に、ドナー抗体の対応するアミノ酸残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、または少なくとも３個）含有する、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(c)ドナー抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の突然変異が導入されているアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(d)ドナー抗体の軽鎖可変領域の核酸配列を、アクセプター軽鎖可変領域の配列コレクションと対比させるステップ、(e)アミノ酸レベルでドナー抗体の軽鎖可変フレームワーク領域と全体的に65％以上（好ましくは、60％以上、55％以上、50％以上、45％以上、または40％以上）同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域（好ましくは、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、およびフレームワーク領域４を含む）を選択するステップ、(f)ドナー抗体の軽鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列、およびキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の突然変異が導入されているアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップ、(g)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップ。
【００５１】
本発明は、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、対象の抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を同定する方法を提供し、前記方法は、上記細胞中の核酸配列を発現させ、前記抗原に対して少なくとも1x106 M-1、好ましくは少なくとも1x107 M-1、少なくとも1x108 M-1、または少なくとも1x109 M-1の親和性を有するヒト化抗体をスクリーニングすることを含んでなる。
【００５２】
本発明によれば、本明細書に記載したとおりに作製した抗体（例えば、ヒト化抗体）は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載したとおりに作製した抗体は定常領域をさらに含む。
【００５３】
本発明は、ある成分（例えば、治療剤または薬物）に結合または融合された、本発明に従って作製した抗体（好ましくは、ヒト化抗体）を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ある成分に結合または融合された、本発明に従って作製したヒト化抗インターロイキン-9（抗IL-9）抗体および/またはヒト化抗EphA2抗体を提供する。本発明はまた、本発明に従って作製および/または同定した抗体、ならびに担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物（好ましくは、医薬組成物）を提供する。特定の実施形態では、本発明は、本発明に従って作製および/または同定したヒト化抗IL-9抗体および/またはヒト化抗EphA2抗体、ならびに担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物（好ましくは、医薬組成物）を提供する。ある好適な実施形態では、本発明は、本明細書に記載したヒト化抗体および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物（好ましくは、医薬組成物）を提供する。本発明はまた、ある成分（例えば、治療剤または薬物）に結合または融合された、本発明に従って作製および/または同定した抗体、ならびに担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物（好ましくは、医薬組成物）を提供する。ある好適な実施形態では、本発明は、ある成分（例えば、治療剤または薬物）に結合または融合されたヒト化抗体（またはそのフラグメント）および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物を提供する。本発明はさらに、本発明に従って作製および/または同定した抗体（例えば、ヒト化抗体）を単独でまたは他の治療薬と組み合わせて、疾患またはその症状を予防、治療、管理または軽減するために使用することを提供する。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、疾患またはその１つ以上の症状を予防、治療、管理または軽減するために使用することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は無菌であり、患者への特定の投与方法に適した形態をしている。特定の実施形態では、ヒト化抗IL-9抗体を含有する本発明の組成物は、呼吸器疾患またはその症状を予防、治療、管理または軽減するために使用される。別の実施形態では、ヒト化抗EphA2抗体を含有する本発明の組成物は、過増殖性細胞疾患を予防、治療、管理または軽減するために使用される。
【００５５】
本発明はさらに、本発明の方法に従って作製および/または同定した１種以上の抗体（好ましくは、１種以上のヒト化抗体）を利用して、疾患を検出する、診断する、および/または疾患の進行をモニターする方法を提供する。
【００５６】
本発明は、本発明のヒト化抗体を含む１つ以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。医薬パックまたはキットは、特定の疾患の治療に有用な１種以上の他の予防薬もしくは治療薬をさらに含んでいてもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種以上の成分を含む１つ以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。場合により、そのような容器は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を取り締まる政府機関によって定められた形式の通知書を伴っていてもよく、その通知書はヒトへの投与のために製造、使用または販売することの政府機関による承認を反映するものである。
【００５７】
本発明はまた、製造物品を提供する。
【００５８】
3.1.  技術用語
本明細書中で用いる「アクセプター」および「アクセプター抗体」とは、１以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは100％を提供する抗体、またはそれをコードする核酸配列をさす。いくつかの実施形態では、「アクセプター」という用語は定常領域を提供する抗体、またはそれをコードする核酸配列をさす。さらに別の実施形態では、「アクセプター」は、１以上のフレームワーク領域と定常領域を提供する抗体、またはそれをコードする核酸配列をさす。特定の実施形態では、「アクセプター」は、１以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは100％を提供するヒト抗体、またはそれをコードする核酸配列をさす。本発明によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１以上の特定位置に存在しないアミノ酸残基を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも10個含んでいてもよい。アクセプターフレームワーク領域および/またはアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能性抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体、または市販されている抗体）から得ることができる。
【００５９】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Fabフラグメント、F(ab)フラグメント、ジスルフィド結合Fv（dsFv）、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを表す。詳細には、抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を包含する。免疫グロブリン分子は、いかなるタイプ（たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）、もしくはサブクラスのものであってもよい。
【００６０】
典型的な抗体は、2つの軽鎖と組み合わされた2つの重鎖を含有する。全長の重鎖は約50kDの大きさ（約446アミノ酸の長さ）であって、重鎖可変領域遺伝子（約116アミノ酸）および定常領域遺伝子によってコードされる。α、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、ε、およびμ配列といった異なるアイソタイプの重鎖定常領域をコードする、異なる定常領域遺伝子が存在する。全長の軽鎖は約25kDの大きさ（約214アミノ酸の長さ）であって、軽鎖可変領域遺伝子（約110アミノ酸）およびκもしくはλ定常領域遺伝子によってコードされる。軽鎖および／または重鎖の可変領域は抗原との結合を担っており、定常領域は抗体に特有のエフェクター機能を担う。
【００６１】
本明細書中でタンパク質性物質（例えば、抗体などのタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド）に関して用いる「類似体」とは、第２のタンパク質性物質と類似したまたは同一の機能を保持するが、必ずしも第２のタンパク質性物質の類似したまたは同一のアミノ酸配列を有しないか、または第２のタンパク質性物質の類似したまたは同一の構造を保有しないタンパク質性物質をさす。類似したアミノ酸配列を有するタンパク質性物質は、以下のうちの少なくとも１つを満たす第２のタンパク質性物質をさす：(a)第２のタンパク質性物質のアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質性物質、(b)少なくとも５個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ酸残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、または少なくとも150個連続したアミノ酸残基の第２のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性物質、および(c)第２のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性物質。第２のタンパク質性物質に類似した構造を有するタンパク質性物質とは、第２のタンパク質性物質に類似した二次、三次または四次構造を有するタンパク質性物質をさす。タンパク質性物質の構造は、当業者に公知の方法（ペプチド配列解析、X線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、結晶電子顕微鏡法を含むがこれらに限らない）で測定することができる。
【００６２】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較のために配列同士をアライメントさせる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有される場合には、それらの分子はその位置で同一となる。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有された同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複する位置の数／位置の総数×100）。ある実施形態では、２つの配列が同じ長さである。
【００６３】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを用いて行うこともできる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい例は、限定するものではないが、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268に記載のアルゴリズムを、KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877に記載のように改変したものである。そのようなアルゴリズムは、Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403に記載のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターを例えばscore＝100、wordlength＝12に設定して、BLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためには、XBLASTプログラムパラメーターを例えばscore＝50、wordlength＝3に設定して、BLASTタンパク質検索を行うことができる。比較のためにギャップ入りアライメントを得るためには、Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようなGapped BLASTを利用することができる。あるいはまた、PSI-BLASTを用いて、分子間の遠縁の関係を検出する反復検索を行うことができる（同上）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる（例えば、NCBIウェブサイトを参照のこと）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい例は、MyersおよびMiller, 1988, CABIOS 4:11-17に記載のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用する場合には、PAM120 weight residue table、ギャップ長ペナルティー12、およびギャップペナルティー４を用いることができる。
【００６４】
２つの配列間の同一性パーセントは、上記と同様の技法を用いて、ギャップを入れてまたはギャップ無しで、決定することができる。同一性パーセントを算出する際には、典型的には正確に一致したものだけを数える。
【００６５】
本明細書で使用する「CDR」という用語は、抗体の可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに3つのCDRがあり、可変領域のそれぞれについてCDR1、CDR2およびCDR3と称される。これらのCDRの正確な境界は、異なるシステムに従ってそれぞれに定められている。Kabatにより記載された（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest (米国国立衛生研究所、ベセスダ、MD(1987)および(1991)）システムは、抗体のいずれの可変領域に対しても適用できる明白な残基ナンバリングシステムを与えるだけでなく、3つのCDRを定義する正確な残基の境界も提供する。これらのCDRはKabat CDRと称することができる。Chothiaおよび共同研究者ら（Chothia およびLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)、ならびにChothiaら、Nature 342:877-883 (1989)）は、Kabat CDR内の一定の小部分がアミノ酸配列レベルでは多大な多様性を有するにもかかわらず、ほとんど同一のペプチド主鎖立体構造をとることを見出した。こうした小部分はL1、L2およびL3、またはH1、H2およびH3と呼ばれ、ここで「L」および「H」は軽鎖および重鎖領域をそれぞれ示す。これらの領域はChothia CDRと呼ばれ、これらはKabat CDRと部分的に重なる境界を有する。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界がPadlan（FASEB J. 9:133-139(1995)）およびMacCallum（J. Mol. Biol. 262(5): 732-45 (1996)）によって報告されている。さらに他のCDRの境界の定義が、厳密には上記システムの一つに従わないが、それでも、Kabat CDRと部分的に一致することが考えられる。ただしそうした境界の定義は、特定の残基もしくは残基群が、またはCDR全体であっても、抗原結合に有意な影響を与えないという予測もしくは実験結果を踏まえて、短縮、または延長される可能性がある。本明細書で使用する方法は、上記システムのいずれかにしたがって定義されたCDRを用いることができるが、ただし、好ましい実施形態はKabatまたはChothiaの定義によるCDRを使用する。
【００６６】
本明細書中で用いる「カノニカル」残基とは、Chothiaら（J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothiaら, J. Mol. Biol. 227:799 (1992)；両参考文献の内容を参照することにより本明細書に組み入れるものとする）によって定義されるような特定のカノニカルCDR構造を規定しているCDRまたはフレームワーク中の残基をさす。Chothiaらによれば、多くの抗体のCDRの決定的な部分は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様性であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド主鎖コンフォメーションを有する。それぞれのカノニカル構造は、主に、ループを形成しているアミノ酸残基の連続セグメントのペプチド主鎖捻り角を特定している。
【００６７】
本明細書で使用する場合、タンパク質性物質（たとえば、抗体のような、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド）との関連での「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加によって変化したアミノ酸配列を含んでなるタンパク質性物質を表す。本明細書で使用する「誘導体」という用語はまた、タンパク質性物質に何らかの分子を共有結合することによって、修飾されたタンパク質性物質を指す。限定する意図はないが例を挙げると、抗体は、たとえばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質との結合などによって修飾することができる。タンパク質性物質の誘導体は、当業者に知られている技法を用いた化学修飾によって作製することができ、これには特異的な化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めるがそれに限定されない。さらに、タンパク質性物質の誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。タンパク質性物質の誘導体は、それが誘導される起源となったタンパク質性物質と同様もしくは同一の機能を有する。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「障害」および「疾患」という用語は、被験者の状態に対して相互交換可能に使用される。
【００６９】
本明細書で使用する「ドナー」および「ドナー抗体」という用語は、１つもしくは複数のCDRを与える抗体を指す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるまたは誘導される抗体とは異なる生物種に由来する抗体である。ヒト化抗体との関連において、「ドナー抗体」という用語は、１つもしくは複数のCDRを与える非ヒト抗体を指す。
【００７０】
本明細書で使用する「有効な量」という用語は、疾患、または疾患の１つもしくは複数の症状の、重症度および／または持続時間を軽減もしくは改善し、疾患の進行を妨げ、疾患の寛解をもたらし、疾患に伴う1つもしくは複数の症状の再発、発生、発現もしくは進行を防ぎ、疾患を発見し、または別の治療（たとえば、予防薬もしくは治療薬）の予防もしくは治療効果を増強もしくは改善するのに十分な、治療のための量を指す。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は、動物において、好ましくは哺乳動物において、さらにもっとも好ましくはヒトにおいて、抗原性もしくは免疫原性を有する、ポリペプチドまたはタンパク質の断片を指す。免疫原性を有するエピトープは、動物において抗体応答を引き起こすポリペプチドもしくはタンパク質の断片である。抗原性を有するエピトープは、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドもしくはタンパク質の断片であって、当業者に周知の任意の方法によって、たとえばイムノアッセイによって、測定される。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【００７２】
本明細書で使用する「融合タンパク質」という用語は、第1のタンパク質もしくはポリペプチドもしくは機能性断片、その類似体もしくは誘導体のアミノ酸配列と、異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド（すなわち、第1のタンパク質もしくは断片、その類似体もしくは誘導体とは異なる、第2のタンパク質もしくはポリペプチドもしくは断片、その類似体もしくは誘導体）のアミノ酸配列と、を含んでなるポリペプチドまたはタンパク質（抗体を含めるがそれに限定されない）を指す。ある実施形態において、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドと融合した予防薬または治療薬を含んでなる。この実施形態によれば、異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドは別のタイプの予防薬もしくは治療薬であってもよく、またはそうでなくてもよい。たとえば、免疫調節性を有する2つの異なるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを融合させて1つの融合タンパク質を生成することができる。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドと融合する前の元のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの活性に比べて向上した活性を保持する。
【００７３】
本明細書で使用する「断片」という用語は、あるポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも5個連続するアミノ酸残基、少なくとも10個連続するアミノ酸残基、少なくとも15個連続するアミノ酸残基、少なくとも20個連続するアミノ酸残基、少なくとも25個連続するアミノ酸残基、少なくとも40個連続するアミノ酸残基、少なくとも50個連続するアミノ酸残基、少なくとも60個連続するアミノ酸残基、少なくとも70個連続するアミノ酸残基、少なくとも80個連続するアミノ酸残基、少なくとも90個連続するアミノ酸残基、少なくとも100個連続するアミノ酸残基、少なくとも125個連続するアミノ酸残基、少なくとも150個連続するアミノ酸残基、少なくとも175個連続するアミノ酸残基、少なくとも200個連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含んでなる、もう一つのペプチドもしくはポリペプチド（抗体を含めるがそれに限定されない）を指す。具体的な実施形態において、タンパク質もしくはポリペプチドの断片は、そのタンパク質もしくはポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持している。
【００７４】
本明細書で使用する「機能性断片」という用語は、第2の、別のポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも5個連続するアミノ酸残基、少なくとも10個連続するアミノ酸残基、少なくとも15個連続するアミノ酸残基、少なくとも20個連続するアミノ酸残基、少なくとも25個連続するアミノ酸残基、少なくとも40個連続するアミノ酸残基、少なくとも50個連続するアミノ酸残基、少なくとも60個連続するアミノ酸残基、少なくとも70個連続するアミノ酸残基、少なくとも80個連続するアミノ酸残基、少なくとも90個連続するアミノ酸残基、少なくとも100個連続するアミノ酸残基、少なくとも125個連続するアミノ酸残基、少なくとも150個連続するアミノ酸残基、少なくとも175個連続するアミノ酸残基、少なくとも200個連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含んでなる、ペプチドもしくはポリペプチド（抗体を含めるがそれに限定されない）を指すが、この場合、前記のポリペプチドもしくはタンパク質は、第2の、別のポリペプチドもしくはタンパク質の少なくとも1つの機能を保持する。具体的な実施形態において、ポリペプチドもしくはタンパク質の断片は、そのタンパク質もしくはポリペプチドの機能を少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つ保持する。特定の抗原と免疫特異的に結合する抗体の断片は、その抗原と免疫特異的に結合する能力を保持していることが好ましい。
【００７５】
本明細書で使用する「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、CDRを除いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の正確な定義が、異なるシステムによって決定されうるため、フレームワーク配列の意味するところもそれに相応して異なる解釈に従う。6個のCDR（軽鎖のCDR1、2および3、ならびに重鎖のCDR1、2および3）も、軽鎖および重鎖のフレームワーク領域をそれぞれ4つのサブ領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）に分割するが、軽鎖と重鎖のそれぞれにおいてCDR1はFR1とFR2の間に位置し、CDR2はFR2とFR3の間、さらにCDR3はFR3およびFR4の間に位置する。FR1、FR2、FR3またはFR4のような特定のサブ領域を指定しないならば、フレームワーク領域は、一般に言及されるように、天然に存在する免疫グロブリン一本鎖の可変領域内のFRの組合せを表す。本明細書で使用する場合、FRは4つのサブ領域のうちの1つを表し、FRsはフレームワーク領域を構成する4つのサブ領域のうちの2つ以上を表す。
【００７６】
本明細書で使用する「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝子再構成および突然変異を招く成熟化プロセスを経ることのない、非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を表す。（たとえば、Shapiroら、Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonisら、Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30(2001)を参照されたい）。本発明のさまざまな実施形態によって与えられる利点の一つは、生殖系列抗体遺伝子が成熟抗体遺伝子よりも、その生物種において個体に特徴的な基本的アミノ酸配列構造を保存している可能性が高く、したがってその生物種において治療に使用する場合、外来起源由来として認識される可能性が低いという認識に由来する。
【００７７】
本明細書中で用いる「キー」残基とは、抗体（特にヒト化抗体）の結合特異性および/または親和性により大きな影響を及ぼす可変領域内のいくつかの残基をさす。キー残基には、限定するものではないが、以下の残基の１つまたはそれ以上が含まれる：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（N-またはO-グリコシル化部位でありうる）、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域内の残基。特定の実施形態において、キー残基はKabatナンバリングシステムに従うグループとしての重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基６、23、24および49ではない。特定の実施形態において、キー残基はKabatナンバリングシステムに従う重鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基２、４、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93ではない。特定の実施形態において、キー残基はKabatナンバリングシステムに従う軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸残基４、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85、および98ではない。
【００７８】
本明細書中で用いる「過増殖性細胞疾患」とは、細胞の過増殖がその疾患の病的状態または症状の原因または一因となる疾患をさす。ある実施形態では、過増殖性細胞疾患は癌である。ある実施形態では、過増殖性細胞疾患は、細胞の過増殖がその疾患の病的状態または症状の原因または一因となる非腫瘍性疾患である。ある実施形態では、過増殖性細胞疾患は過増殖する上皮細胞によって特徴づけられる。過増殖性上皮細胞疾患には、限定するものではないが、喘息、COPD、肺線維症、気管支の過反応、乾癬、脂漏性皮膚炎、および嚢胞性線維症が含まれる。他の実施形態では、過増殖性細胞疾患は過増殖する内皮細胞によって特徴づけられる。過増殖性内皮細胞疾患には、限定するものではないが、再狭窄、過増殖性血管障害、ベーチェット症候群、アテローム性動脈硬化症、および黄斑変性が含まれる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、対象となる抗原と免疫特異的に結合し、かつ実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（FR）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（CDR）とを含んでなる、抗体またはその変異体、誘導体、類似体もしくはフラグメントである。本明細書で使用する場合、CDRとの関連で「実質的に」という用語は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するCDRを表す。ヒト化抗体は、少なくとも1つの、そして典型的には2つの可変ドメイン（Fab、Fab’、F(ab’)2、HabC、Fv）の実質的にすべてを含んでなるが、その場合、CDR領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリン（すなわちドナー抗体）のCDR領域に相当し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の一部も含んでなる。ある実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖だけでなく、重鎖の少なくとも可変ドメインを含有する。ヒト化抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を包含してもよい。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン、および／またはヒト化重鎖のみを含有する。
【００８０】
ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含むいかなる免疫グロブリンクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むがこれに限定されない、いかなるアイソタイプからも、選択することができる。ヒト化抗体は、2つ以上のクラスもしくはアイソタイプからの配列を含んでいてもよく、特定の定常ドメインは、当業界でよく知られている技術を用いて、目的とするエフェクター機能を最適化するように選択することができる。
【００８１】
ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は、正確に親配列に一致する必要はなく、たとえば、ドナー抗体CDRまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失によって突然変異されていてもよく、その結果その部位のCDRまたはフレームワーク残基はドナー抗体にもコンセンサスフレームワークにも一致しなくなる。しかしながら、好ましい実施形態では、このような突然変異は広範囲にわたることはない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにもっとも好ましくは少なくとも95％は、親のFRおよびCDR配列に一致する。本明細書中で用いる「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域をさす。本明細書中で用いる「コンセンサス免疫グロブリン配列」とは、関係のある免疫グロブリン配列のファミリー中に最も高頻度で存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から生成された配列をさす（例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987を参照のこと)。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列の各位置はそのファミリーの当該位置に最も高頻度で存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しく高頻度で存在する場合は、どちらをコンセンサス配列に含めてもよい。
【００８２】
本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされ、または形質転換された特定の対象細胞、およびそうした細胞の子孫もしくは潜在的な子孫を包含する。こうした細胞の子孫は、その後の世代において発生しうる、または核酸の宿主細胞ゲノムへの組み込みにおいて発生しうる突然変異または環境の影響のために、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一ではない可能性がある。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「抗原と免疫特異的に結合する」という表現および類似の表現は、ある抗原または断片には特異的に結合するが他の抗原には特異的に結合しない、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（融合タンパク質および抗体を含めるが、それに限定されない）またはそれらのフラグメントを表す。抗原と免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それより低い親和性で他の抗原と結合する可能性があり、例えばイムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で知られている他のアッセイ法によって測定される。抗原と免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントは、関連抗原と交差反応性である可能性がある。ある抗原と免疫特異的に結合する抗体もしくはフラグメントは、他の抗原と交差反応しないことが好ましい。
【００８４】
本明細書で使用する場合、タンパク質性物質（例えば、ペプチド、ポリペプチドまたは（融合タンパク質もしくは抗体といった）タンパク質）との関連において「単離された」という用語は、その物質の由来する細胞もしくは組織起源からの細胞性物質、もしくは混入タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体を実質的に含まない、または化学合成の場合には化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない、タンパク質性物質を表す。「細胞性物質を実質的に含まない」という言い方は、タンパク質性物質が細胞（該細胞からタンパク質性物質が単離されるか、または組換えによって製造される）の細胞成分から分離されている、タンパク質性物質の調製物を包含する。したがって、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質性物質は、（乾重量で）約30％、20％、10％、または5％未満の異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド（「混入タンパク質」とも称される）を有する、タンパク質性物質の調製物を包含する。タンパク質性物質が組換え技術によって製造される場合には、タンパク質性物質が培地も実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地は、タンパク質性物質の調製物の容量の約20％、10％、または5％未満を占める。タンパク質性物質が化学合成によって製造される場合には、それが化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、そのタンパク質性物質の合成に関わる化学的前駆体もしくは他の化学物質から分離される。したがって、タンパク質性物質の調製物は、（乾重量で）約30％、20％、10％、5％未満の化学的前駆物質もしくはタンパク質性物質以外の化合物を有する。具体的な実施形態において、本明細書に記載のタンパク質性物質は単離されている。好ましい実施形態において、本発明の抗体は単離されている。
【００８５】
本明細書で使用する場合、核酸分子との関連において「単離された」という用語は、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を表す。さらに、「単離された」核酸分子、例えばcDNA分子は、好ましくは、組換え技術による生成の場合には他の細胞性物質もしくは培地を実質的に含まず、化学合成の場合には化学的前駆物質もしくは化学物質を実質的に含まない。具体的な実施形態において、核酸分子は単離されている。好ましい実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸分子は単離されている。本明細書で使用する場合、「実質的に含まない」という用語は、異なる核酸、ならびに、好ましくは、他の細胞性物質、培地、化学的前駆物質もしくは他の化学物質が（乾重量で）約30％、20％、10％、もしくは5％未満である、「単離された」核酸の調製物を指す。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「併用して」および「組み合わせて」という用語は、2つ以上の治療法（例えば2つ以上の予防薬および／または治療薬）を使用することを表す。「併用して」という用語の使用は、治療（例えば、予防および／または治療薬）が被験者に施される順序を限定するものではない。第１の治療（例えば、第１の予防もしくは治療薬）を、被験者に第２の治療（例えば、第２の予防もしくは治療薬）を施す前に（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間前に）、同時に、または後に（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間後に）、施すことができる。
【００８７】
本明細書で使用する「管理する」、「管理すること」、および「管理」は、被験者が治療（例えば、予防もしくは治療薬）から引き出す有益な効果を指すが、それは病気の治癒をもたらすものではない。ある特定の実施形態において、被験者は１以上の治療（例えば、１以上の予防もしくは治療薬）を受けて、病気が進行または悪化しないように、病気を「管理する」。
【００８８】
本明細書で使用する「成熟抗体遺伝子」という用語は、例えば、B細胞のようなリンパ球において、ハイブリドーマにおいて、または特定の免疫グロブリンを発現するよう成熟化プロセスを経た、なんらかの抗体産生細胞において発現される、免疫グロブリンをコードする遺伝子配列を指す。この用語は、こうした成熟遺伝子をコードする、成熟ゲノムDNA、cDNAおよび他の核酸配列を包含するが、これらの核酸配列は単離されており、かつ／または他の細胞型で発現するように組換え操作されている。成熟抗体遺伝子は、さまざまな変異および再構成を受けており、それによって成熟抗体遺伝子はリンパ球以外のあらゆる細胞においてコードされる抗体遺伝子と構造的に区別される。ヒト、齧歯類および他の多くの哺乳類における成熟抗体遺伝子は、抗体軽鎖の場合、VおよびJ遺伝子セグメントの融合によって、抗体重鎖の場合は、V、DおよびJ遺伝子セグメントの融合によって形成される。多くの成熟抗体遺伝子は、融合後に点変異を獲得し、その変異のあるものは抗体タンパク質の特異的抗原に対する親和性を増大させる。
【００８９】
本明細書で使用する「製薬上許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁に承認され、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般に認められた、動物に使用する、より詳細にはヒトに使用する薬局方に記載されていることを表す。
【００９０】
本明細書で使用する「予防する」、「予防すること」および「予防」は、治療（例えば、予防もしくは治療薬）、または併用治療（例えば、予防薬または治療薬の併用）を施した結果生じる、被験者における、疾患の発生もしくは発症の阻止、または疾患の１以上の症状の再発、発現、もしくは進行の防止を指す。
【００９１】
本明細書で使用する「予防薬」という用語は、疾患、またはその１以上の症状を、予防するために使用することができる、何らかの作用物質を表す。ある実施形態において、「予防薬」という用語は、本発明の抗体を指す。別のある実施形態において、「予防薬」という用語は、本発明の抗体以外の作用物質を表す。好ましくは、予防薬は、疾患、またはその１以上の症状が発現、発生、進行および／または重症化しないようにする、またはそれを遅らせるために、有用であるとわかっている、またはすでに使用され、もしくは現在使用されている作用物質である。
【００９２】
本明細書で使用する「予防上有効な量」は、疾患、または疾患の１以上の症状の発生、再発、もしくは発症の予防をもたらすのに十分な、または別の治療（例えば、予防薬）の予防効果を強め、もしくは改善するのに十分な、治療に関わる（例えば予防薬の）量を表す。
【００９３】
本明細書に使用される「プロトコル」という語句は、治療効果のある１以上の治療（例えば治療薬）を与え、投与の時期を決めるための投薬計画を指す。
【００９４】
本明細書で使用する「副作用」という語句は、予防薬もしくは治療薬の望ましくない有害作用を包含する。副作用は常に望まれないが、望まれない作用が必ずしも有害であるとは限らない。治療（例えば、予防薬もしくは治療薬）に起因する有害作用は、有毒、不快または危険となることもある。
【００９５】
本明細書で使用する「小分子」という用語および類似の用語は、ペプチド、ペプチドミメティク、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、ならびに塩、エステルおよび他の製薬上許容される形の前記物質を包含するがそれらに限定されない。
【００９６】
本明細書で使用する「被験者」および「患者」という用語は、相互交換可能なものとして使用される。本明細書で使用する「被験者」という用語は、動物、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーといったサルおよびヒト）を含めた哺乳動物、ならびにもっとも好ましくはヒトを指す。ある実施形態において、被験者は、鳥類（例えば、ウズラ、ニワトリまたはシチメンチョウ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、もしくはヒツジ）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌもしくはモルモット）、または実験動物（例えば、疾患のための動物モデル）といった、ヒト以外の動物である。好ましい実施形態において、被験者はヒト（例えば、乳児、小児、成人、もしくは高齢者）である。
【００９７】
本明細書で使用する「相乗的な」という用語は、なんらかの2つ以上の単独治療（例えば１以上の予防薬または治療薬）の効果を足し合わせるよりいっそう効果的な、治療法（例えば、予防薬もしくは治療薬）の組み合わせを指す。治療法の組み合わせ（例えば、予防薬もしくは治療薬の組み合わせ）による相乗効果は、疾患を有する被験者に対して、より少ない投与量、および／またはより少ない投与回数で１以上の治療法（例えば、１以上の予防薬または治療薬）を用いることを可能にする。少ない投与量の治療法（複数）（例えば、予防もしくは治療薬（複数））を利用できること、および／または、前記治療法をより少ない回数で投与できることは、被験者に前記治療を施すことに伴う毒性を、疾患の予防もしくは治療における前記治療法の有効性を減らすことなく、低下させる。加えて、相乗効果は、結果として、疾患の予防または治療において、治療法（例えば、予防薬もしくは治療薬）の有効性の向上をもたらすことができる。最終的に、治療法（例えば、予防薬もしくは治療薬）を組み合わせることによる相乗効果は、何らかの単独の治療法を使用することに付随する、有害なもしくは望まれない副作用を回避または低減することができる。
【００９８】
本明細書で用いる「治療薬」という用語は、疾患、または疾患の１以上の症状の、予防、治療、管理、または改善に用いることができる何らかの作用物質を表す。ある実施形態において、「治療薬」という用語は、本発明の抗体を指す。別の実施形態において、「治療薬」という用語は、本発明の抗体以外の作用物質を指す。好ましくは、治療薬は、疾患または疾患の１以上の症状の予防、治療、管理または改善のために有用であることがわかっている、または、これまで使用されてきた、もしくは現在使用されている作用物質である。
【００９９】
本明細書で使用する「治療に有効な量」という用語は、疾患の重篤度を下げ、疾患の持続期間を短くし、疾患の１以上の症状を改善し、疾患の進行を妨げ、疾患の寛解を引き起こし、または別の治療の治療効果を強め、もしくは改善するのに十分な、治療に関わる量を表す。
【０１００】
本明細書で使用する「治療（法）」という用語は、疾患または疾患の１以上の症状の、予防、治療、管理、および／または改善に使用することができる、何らかのプロトコル、方法、および／または作用物質を表す。ある実施形態において、「治療（法）」という用語は、抗ウイルス治療、抗菌治療、抗真菌治療、抗癌剤、生物学的治療、支持療法、および／または他の、当業者、例えば医師のような医学の専門家に知られている、疾患または疾患の１以上の症状の、治療、管理、予防、または改善に有用な治療を指す。
【０１０１】
本明細書で使用する「治療する」、「治療」および「治療すること」という用語は、１以上の治療法を施すこと（１以上の予防薬または治療薬の投与を含めるが、それに限定されない）に起因する、疾患の進行、重症度、および／または持続期間の減少もしくは改善、または疾患の１以上の症状の改善を指す。
【０１０２】
本明細書中で用いる「バーニヤ」ゾーンとは、FooteおよびWinter（1992, J. Mol. Biol. 224:487-499；前記文献の開示内容を参照することにより本明細書に含めるものとする）に記載されるような、CDR構造を調整しかつ抗原適合性を微調整しうるフレームワーク残基のサブセットをさす。バーニアゾーンの残基はCDRの下にある層を形成し、CDRの構造と抗体の親和性に影響を及ぼしうる。バーニアゾーン内にある残基の非限定的な例を表１に示す（FooteおよびWinter, 1992, J. Mol. Biol. 224:487-499参照）：
【表１】
2007528723.tif 000003
【０１０３】
4.  図面の説明
図１は、抗IL-9モノクローナル抗体L1の重鎖と軽鎖の核酸配列およびタンパク質配列を示す。
【０１０４】
図２は、抗IL-9モノクローナル抗体L1の重鎖および軽鎖と、対応する所定のアクセプター生殖系列配列（それぞれVH3-23/JH4およびL23/Jκ4）との配列アライメントを示す。
【０１０５】
図３は、抗IL-9モノクローナル抗体L1の重鎖および軽鎖のコンビナトリアルヒト化ライブラリーのタンパク質配列を示す。軽鎖の４つの位置および重鎖の４〜６つの位置が多様性を導入するための標的とされた。
【０１０６】
図４は、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングおよびFabフラグメントの発現のために使用されたファージベクターを示す。
【０１０７】
図５は、ライブラリー２の捕捉-リフトスクリーニングを示す。ヒトIL-9との結合が陽性の６つのクローンを円で囲ってある。
【０１０８】
図６は、コンビナトリアルライブラリー１および２の二次スクリーニング後の抗IL-9モノクローナル抗体L1のヒト化クローンの代表的な配列を示す。
【０１０９】
図７(A)および(B)は、固定化抗原（IL-9）上での上清発現Fabを用いたELISAタイトレーションを示す。抗RSVモノクローナル抗体の上清発現Fabを陰性対照とした。
【０１１０】
図８は、抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101の重鎖と軽鎖の核酸配列およびタンパク質配列を示す。
【０１１１】
図９は、抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101の重鎖および軽鎖と、対応する所定のアクセプター生殖系列配列（それぞれVH1-58/JH5およびO18/Jκ4）との配列アライメントを示す。
【０１１２】
図10は、抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101の重鎖および軽鎖のコンビナトリアルヒト化ライブラリーのタンパク質配列を示す。軽鎖の４つの位置および重鎖の４つの位置が多様性を導入するための標的とされた。
【０１１３】
図11は、コンビナトリアルライブラリー１および２の二次スクリーニング後の抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101のヒト化クローンの代表的な配列を示す。
【０１１４】
図12は、固定化抗原（ヒトEphA2）上でのペリプラズム（周辺細胞質）発現Fabを用いたELISAタイトレーションを示す。
【０１１５】
5.  発明の詳細な説明
本発明は、第１の生物種由来の抗体を再設計または改造する方法を提供し、再設計または改造された抗体は第２の生物種において望ましくない免疫応答を引き起こすことがなく、しかも、再設計または改造された抗体は第１の生物種由来の抗体と実質的に同じ抗原結合能を保持するものである。本発明によれば、第２の生物種由来のフレームワーク領域とインフレームで融合された第１の生物種由来の抗体のCDRを含むコンビナトリアルライブラリーを構築して、所望の改変抗体をスクリーニングすることができる。
【０１１６】
本発明は、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を提供する。本発明はまた、本明細書に記載した核酸配列を含有する細胞または該核酸配列を発現するように遺伝子操作された細胞を提供する。本発明は、本明細書に記載した細胞において重鎖可変領域（好ましくは、ヒト化重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を発現させることを含んでなる、重鎖可変領域（好ましくは、ヒト化重鎖可変領域）の作製方法を提供する。本発明は、本明細書に記載した細胞において軽鎖可変領域（好ましくは、ヒト化軽鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を発現させることを含んでなる、軽鎖可変領域（好ましくは、ヒト化軽鎖可変領域）の作製方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載した細胞中に含まれるヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含んでなる、抗原と免疫特異的に結合する抗体（好ましくは、ヒト化抗体）の作製方法を提供する。本発明はさらに、目的のヒト化抗体を同定および/または選択するための任意のスクリーニング方法を提供する。
【０１１７】
本発明は、本明細書に記載した方法によって作製された抗体を提供する。好ましい実施形態では、本発明は本明細書に記載した方法によって作製されたヒト化抗体を提供する。本発明はまた、本明細書に記載した方法によって作製された抗体および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は本明細書に記載した方法によって作製されたヒト化抗体および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物はその意図した用途に適する形態の医薬組成物である。
【０１１８】
開示を明確にするために（限定するためではない）、発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分割する：
(i)    アクセプター抗体テンプレートの選択
(ii)   コンビナトリアルライブラリーの構築
(iii)  コンビナトリアルライブラリーの発現
(iv)   ヒト化抗体の選択
(v)    ヒト化抗体の作製および特徴付け
(vi)   抗体コンジュゲート
(vii)  本発明の組成物の用途
(viii) 投与および製剤
(ix)   投与量および投与回数
(x)    生物学的アッセイ
(xi)   キット
(xii)  製造物品
【０１１９】
5.1.  アクセプター抗体テンプレートの選択
1つのアクセプター重鎖フレームワーク(好ましくはヒト重鎖フレームワーク)と1つのアクセプター軽鎖フレームワーク(好ましくはヒト軽鎖フレームワーク)は以下の「設計の規則」に従い選択する:
(1)  (a)または(b)を用いて重鎖および／または軽鎖のアクセプターフレームワーク領域を選択する:
(a)重鎖および／または軽鎖の第１、第２、第３および第４フレームワーク領域については対応するアクセプター領域を選択するが、その例としてはヒト生殖系列配列、ヒト機能性抗体配列、データバンクもしくは文献から得られたヒト抗体配列または公に利用可能なヒト抗体の配列などが挙げられ、これらはアミノ酸レベルで、ドナー抗体配列と、65％以上、好ましくは60％以上、55％以上、50％以上、45％以上または40％以上のフレームワーク相同性を有しないものである。この場合、アクセプターFR1、FR2、FR3またはFR4は個別に、アミノ酸レベルで、ドナー抗体の対応するフレームワーク領域に対して65％、60％、55％、50％または45％以上の相同性を有しない。好ましくは、フレームワーク領域を決定するために、CDRのChothiaおよびKabatの定義を両方適用する。そのような配列が存在しない場合には、可能な限り低い相同性の配列を選択する。特に、そして任意選択的に考慮することとして、より精緻な基準に従って重鎖と軽鎖の両方についてアクセプター第４フレームワークを選択することができ、例えば、CDR3の近位末端ではドナー抗体配列に対して高い相同性を示し、CDR3の遠位末端では低い相同性を示すヒト生殖系列第４フレームワークまたは機能性抗体第４フレームワークを優先的に選択してもよい。本明細書において用いる「CDR3の近位末端」は第４フレームワークのN末端をさし、「CDR3の遠位末端」は第４フレームワークのC末端をさす。
【０１２０】
(b)これとは別に、重鎖のフレームワーク領域および／または軽鎖のフレームワーク領域については、対応するアクセプター領域を選択するが、その例としてはヒト生殖系列配列、ヒト機能性抗体配列、データバンクもしくは文献から得られたヒト抗体配列または公に利用可能なヒト抗体の配列などが挙げられ、これらはアミノ酸レベルで、ドナー抗体配列と、全体で65％以上、好ましくは60％以上、55％以上、50％以上、45％以上または40％以上のフレームワーク相同性を有しないものである。この場合、アクセプターFR1、FR2、FR3およびFR4は合わせて、アミノ酸レベルで、ドナー抗体FR1、FR2、FR3およびFR4全部を合わせたものと、全体で65％、60％、55％、50％、45％または40％以上の相同性を有しない。従って、4つのアクセプターフレームワーク領域のうちの1以上の領域は、個別にはドナー抗体フレームワーク領域のうちの1つ以上に対して、アミノ酸レベルで65％、60％、55％、50％、または45％を超える相同性を有してもよい。一例として、ある実施形態においては、アクセプター抗体のドナー抗体配列に対する、全体的なフレームワーク相同性は、アミノ酸レベルで65％を超えないが、アクセプター抗体のフレームワーク領域1はドナー抗体配列に対してアミノ酸レベルで65％を超える相同性を有する。好ましくは、CDRのChothiaおよびKabatの定義の両方を、フレームワークを決定するために適用する。そのような配列が存在しない場合には、可能な限り低い相同性を有する配列が選択される。
【０１２１】
(2)  次のアミノ酸残基:6、23、24および49(Kabatのナンバリング)の1つ、2つ、3つ、または全てにおいて、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を有する、重鎖フレームワークを同定し選択する。これらの4つの残基のうち少なくとも1つさえも、ドナー配列と異なってはいないアクセプター配列を排除する。
【０１２２】
(3)  次のアミノ酸残基を同定すること:軽鎖における4L, 38L, 43L, 44L, 46L, 58L, 62L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 73L, 85Lおよび98Lならびに重鎖における2H, 4H, 24H, 36H, 39H, 43H, 45H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 76H, 78H, 92Hおよび93H。これらの位置の残基は、コンビナトリアルライブラリーに突然変異が導入されないようにアクセプターとして固定される。適用可能ならば、ドナー抗体配列と比較した場合にこれらの部位の２つ以上が変化しているアクセプター配列は排除する。これらの位置でドナー抗体配列に対比して保存されているアクセプターフレームワーク配列は好ましい。より精緻な基準もまた利用可能であり、カノニカル、バーニヤまたは境界面パッキングとしてさらに定義される(下記規則(6)を参照)上述の位置において高度に保存されているヒト生殖系列遺伝子または機能性抗体配列の選択につながる。
【０１２３】
(4)  軽鎖および重鎖配列の両方について、CDRループのカノニカルクラスを決定する。適用可能であれば、ドナー抗体配列と同じカノニカルクラス(例えばChothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196, 901-917,または次のウェブサイト: www.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinf.org/abs/chothia.html,および www.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinf.org/abs/chothia.dat.autoに記載されている)を有しないアクセプター配列を排除する。場合により、ドナー抗体と同じカノニカルクラスのH1、H2、L1、L2およびL3ループをもつアクセプター配列を選択する。場合により、軽鎖および重鎖のCDR1およびCDR2の両方において、ドナー抗体配列と最も低い相同性を示したアクセプター配列を排除することにより、残ったアクセプター配列の中からさらなる選択を行ってもよい。
【０１２４】
(5)  種々のFabフラグメントの既知の三次元構造(www.rcsb.org/pdb/で入手可能)をモデルとして使用し、(a) CDR残基と相互作用していない、(b) CDRに隣接していない、(c)希少アクセプターフレームワーク残基に代わるものではない、および／または(d) CDRから６Åより遠い、好ましくは6.5Å、７Å、7.5Å、または８Åより遠い、選択されたアクセプター重鎖および軽鎖中の特定位置を同定する。ドナー抗体およびアクセプター抗体は異なる種に由来し、例えばドナー抗体は非ヒト抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。好ましくは、埋もれて隠れた残基に対応する位置を検討する。これらの必要条件を満たす位置のうちで、軽鎖と重鎖について、ドナーとアクセプターの間で対応する残基が異なる少なくとも1つの位置(少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つの位置)を特定する。それらの位置には置換を導入しない(すなわちコンビナトリアルライブラリーにおいて、多様性を導入しない)。
【０１２５】
(6)  残りのアクセプター抗体配列をドナー抗体配列と個別にアライメントさせる。キー残基と指定された次の位置の一部または全部に、先のステップで固定されたものではないという条件で、好ましくは１以上の突然変異を導入する:(a)ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワークとで異なる希少フレームワーク残基( 例えばKabatら, 1991, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.およびpeople.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/のウェブサイトに定義された通り);(b) ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワークとで異なる場合のバーニヤゾーン残基(Kabatのナンバリングに従った: 2H, 27-30H, 47-49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 78H, 93H, 94H, 103H, 2L, 4L, 35L, 36L, 46-49L, 64L, 66L, 68L, 69L, 71Lおよび98Lが挙げられるが、これらに限定されない);(c) ドナー抗体とアクセプター抗体フレームワークとで異なる、VL/VHドメイン境界面における鎖間パッキング残基(Kabatのナンバリングに従った: L36, L38, L44, L46, L87, L98, H37, H39, H45, H47, H91, H93およびH103が挙げられるが、これらに限定されない)；(d)ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワーク配列とで異なるカノニカル残基、特にドナーCDRループのカノニカルクラスの定義にきわめて重要なフレームワーク位置(例えばChothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196, 901-917, ウェブサイトのwww.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinf.org/abs/chothia.html, およびwww.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinf.org/abs/chothia.dat.autoに記載されたもの);(e) ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワークとで異なる、重鎖の、Chothiaに定義されたCDR1領域とKabatに定義された第1フレームワーク領域の両方を包含する残基(Kabatのナンバリングで位置26〜30)；(f) CDRに隣接した残基;(g) 潜在的グリコシル化部位である残基;(h) 抗原と相互作用可能な残基;(i) CDRと相互作用可能な残基;ならびに(j) 可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの間の接触残基。いくつかの実施形態においては、キー残基においてアクセプター抗体フレームワークに導入された突然変異は、そのような位置に、ドナー抗体フレームワーク中の対応するアミノ酸残基と同一とされるアミノ酸残基をもたらす。
【０１２６】
規則(6)の(a)〜(j)においては、ドナー抗体フレームワーク残基とアクセプター抗体フレームワーク残基との間の化学構造の類似性を考慮し、それ故所定の位置における類似した残基の存在が対応するアクセプター残基の保存に役立つようにする。特定のアミノ酸残基が保存されるべきかを決定する際に考慮すべき特徴としては、限定するものではないが、疎水性および電荷特性が挙げられる。
【０１２７】
アクセプターフレームワークは、当業者に知られているあらゆる供給源から取得または誘導されうる。ある実施形態において、本発明に従い用いるアクセプター抗体フレームワークは、ヒト生殖系列配列(Ｖκ、Ｖλ、およびＶＨ)から取得または誘導される。特定の実施形態では、第１、第２および第３フレームワークについて、46のヒト生殖系列κ鎖フレームワーク配列を検討する(Kawasaki ら, 2001, Eur. J. Immunol., 31:1017-1028, Schable and Zachau, 1993, Biol. Chem. Hoppe Seyler 374:1001-1022およびBrensing-Kuppers ら, 1997, Gene 191:173-181に記載され、またウェブサイト: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=VK&seqType=nucleotideに掲載される、A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, Ｏ1, Ｏ11, Ｏ12, Ｏ14, Ｏ18, Ｏ2, Ｏ4 およびＯ8)。表２を参照されたい。
【表２】
2007528723.tif 000004
2007528723.tif 000005
2007528723.tif 000006
【０１２８】
特定の実施形態においては、第４フレームワークについて５つのヒト生殖系列κ鎖配列が検討される(Hieter ら, 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-1522に記載され、またウェブサイト: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=JK&seqType=nucleotideに掲載されるJκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4およびJκ5)。表３を参照されたい。
【表３】
2007528723.tif 000007
【０１２９】
他の特定の実施形態においては、ヒト生殖系列λ鎖配列を、第１、第２、第３、または第４フレームワークについて検討する。
【０１３０】
特定の実施形態においては、第１、第２および第３フレームワークについて、44のヒト生殖系列重鎖配列を検討する(Matsuda ら, 1998, J. Exp. Med., 188:1973-1975に記載され、またウェブサイト: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=VH&seqType=nucleotideに掲載される、VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1およびVH7-81)。表４(Kabatの定義に従った)および表５(Chothiaの定義に従った)を参照されたい。
【表４】
2007528723.tif 000008
2007528723.tif 000009
2007528723.tif 000010
【表５】
2007528723.tif 000011
2007528723.tif 000012
2007528723.tif 000013
【０１３１】
特定の実施形態においては、第４フレームワークについて、６つのヒト生殖系列重鎖配列を検討する(Ravetch ら, 1981, Cell 27(3 Pt 2):583-591に記載され、またウェブサイト: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=JH&seqType=nucleotideに掲載されるJH1, JH2, JH3, JH4, JH5およびJH6)。表６を参照のこと。
【表６】
2007528723.tif 000014
【０１３２】
別の実施形態において、本発明に従って用いるヒトフレームワークは、当技術分野で知られた任意の抗体(好ましくは成熟抗体遺伝子)から取得または誘導されるが、こうした抗体は例えば、ヒトにおいて著しい免疫応答を引き出さない、市場で認可されたもしくは後期臨床試験にある抗体である。このような抗体の非限定的例としては、HuMax CD4、MT201、LL2 IgG (狼瘡用)、Xolair、Synagis、Herseptin(抗HER-2)、およびZenapax(抗IL2受容体)が挙げられるがこれらに制限されない。別の実施形態においては、本発明に従って用いるアクセプター抗体フレームワークは、当技術分野で知られたヒト化抗体から取得または誘導される。当技術分野で知られた抗体のフレームワークのアミノ酸配列は、文献、データベースまたは他のあらゆる供給源から得ることができる。抗体の非限定的な例としては、0.5B (Maeda ら (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2:124 - 134); 1B4 (Singer ら (1993) J. Immunol. 150:2844 - 2857); 3a4D10 (Tempest ら (1994) Prot. Engng. 7:1501 - 1507; 425, Kettleborough ら (1991) Prot. Engng. 4:773 - 783; 60.3, Hsiao ら (1994) Prot. Engng. 7:815 - 822); A4.6.1 (Baca ら (1997) J. Biol. Chem. 272:10678 - 10684); AN100226m (Leger ら (1997) Hum. Antibod. 8:3 - 16); AT13/5 (Ellis ら (1995) J. Immunol. 155:925 - 937); AUK12 20 (Sato ら (1994) Mol. Immunol. 31:371 - 381); B1 8 (Jones ら (1986) Nature 321:522 - 525); B3{Fv} PE38 (Benhar ら (1994) P. N. A. S. 91:12051 - 12055); B72.3 {M4} (Sha and Xiang (1994) Canc. Biother. 9:341 - 349); BMA 031 (Shearman ら (1991) J. Immunol. 147:4366 - 4373); BR96 (Rosok ら (1996) J. Biol. Chem. 271:22611 - 22618); BW431/26 (Gussow & Seemann (1991) Meth. Enzymol. 203:99 - 121); BrE 3 (Couto ら (1994) Antigen and Antibody Molecular Engineering, pp:55 - 59); CC49 (Kashmiri ら (1995) Hybridoma 14:461 - 473); CTM01 (Baker ら (1994) Antigen and Antibody Molecular Engineering, pp:61 - 82); Campath 1{YTH34.5HL} (Riechmann ら (1988) Nature 332:323 - 327); Campath 9 {YNB46.1.8SG2B1.19} (Gorman ら (1991) P.N.A.S. 88:4181 - 4185); D1.3 (Verhoeyen ら (1988) Science 239:1534 - 1536); D1.3 {improved} (Foote & Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487 - 499); DX48 (Lewis & Crowe (1991) Gene 101:297 - 302); Fd138 80 (Co ら (1991) P.N.A.S. 88:2869 - 2873); Fd79 (Co ら (1991) P.N.A.S. 88:2869 - 2873); H17E2 (Verhoeyen ら (1991) Monoclonal Antibodies, pp:37 - 43); H52 (Eigenbrot ら (1994) Proteins 18: 49 - 62); HCMV16 (Hamilton ら (1997) J. Infect. Diseases 176:59 - 68); HCMV37 (Tempest ら (1995) Int. J. Biol. Macromol. 17:37 - 42); HMFG1 (Verhoeyen ら (1993) Immunol. 78:364 - 370); JES1 39D10 (Cook ら, (1996) Prot.Engng. 9:623 - 628); K20 (Poul ら, (1995) Mol. Immunol. 32:101 - 116); M195 (Co ら (1992) J. Immunol. 148:1149 - 1154); M22 (Graziano ら (1995) J. Immunol.155:4996 - 5002); MaE11 (Presta ら (1993) J. Immunol. 151:2623 - 2632); MikB1 (Hakimi ら (1993) J. Immunol. 151:1075 - 1085); N901 (Roguska ら (1996) Prot. Engng. 9:895 - 904); OKT3 (Adair ら (1994) Hum. Antibod. Hybridomas 5:41 - 47); PM 1 (Sato ら (1993) Canc. Res. 53:851 - 856); RSV19 (Tempest ら (1991) Biotech. 9:266 - 271); SK2 (Sato ら (1996) Hum. Antibod. Hybridomas 7:175 - 183); TES C21 (Kolbinger ら (1993) Prot. Engng. 6:971 - 980); UCHT1 (Zhu and Carter (1995) J. Immunol. 155:1903 - 1910); YFC51.1 (Sims ら (1993) J. Immunol. 151:2296 - 2308); YTH12.5 (Routledge ら (1991) Eur. J. Immunol. 21:2717 - 2725); anti B4 (Roguska ら (1996) Prot. Engng. 9:895 - 904); anti Tac {MAT} (Queen ら (1989) P.N.A.S. 86:10029 - 10033);およびmumAb4D5 (Carter ら (1992) P.N.A.S. 89:4285 - 4289)が挙げられるがこれらに限定されない。これらはそれぞれ、参照により本明細書にその全内容を組み入れる。
【０１３３】
ある実施形態において、本発明に従って用いる重鎖および軽鎖フレームワーク領域は同じ供給源から取得または誘導される。別の実施形態において、軽鎖フレームワークは、重鎖フレームワークとは異なる供給源から取得または誘導される。別の実施形態において、重鎖および／または軽鎖クレームワークと、定常領域の１以上とは、同じ供給源から取得または誘導される。別の実施形態において、重鎖および／または軽鎖クレームワークと、定常領域の１以上とは、異なる供給源から取得または誘導される。
【０１３４】
5.2  コンビナトリアルライブラリーの構築
ヌクレオチド配列を含む核酸分子の集団を含有するコンビナトリアルライブラリーが構築されるが、ここで各ヌクレオチド配列はセクション５．１に記載された「設計の規則」に従って選択されたアクセプター重鎖および／または軽鎖可変領域のテーラードのフレームワークとインフレームで融合されたドナー抗体配列の重鎖または軽鎖CDRループを含む。本発明に従って、前記ヌクレオチド配列は、さらに１以上の定常領域を含んでもよい。
【０１３５】
好ましくは３つのライブラリーが構築されるが、ここで１つめのライブラリーはKabatナンバリングシステムに従って定義されたCDRを有する重鎖コンビナトリアルライブラリーからなり、２つめのライブラリーはKabatおよびChothiaナンバリングシステムの両方に従って定義されたCDRを有する軽鎖コンビナトリアルライブラリーからなり、３つめのライブラリーはChothiaナンバリングシステムに従って定義されたCDRを有する重鎖コンビナトリアルライブラリーからなる。
【０１３６】
ライブラリーは、当技術分野で知られているあらゆる方法を用いて構築することができる。好ましい実施形態において、コンビナトリアルライブラリーの構築は、適当なオリゴヌクレオチドを使用したオーバーラップ伸長によるポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を用いて行われる。あるいはまた、CDRとフレームワークは、リガーゼを用いて一緒にライゲートされる。
【０１３７】
重鎖および軽鎖ライブラリーは、当技術分野で知られている方法によって、またはWu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212(参照により本明細書に組み入れる)に記載されている通りにアセンブルすることができる。VHおよびVL遺伝子は、その後Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りに増幅してもよい。キメラFab(対応するアクセプター定常領域に融合されたマウスVHおよびVL領域)もまた、L1-VLおよびL1-VHをコードする遺伝子の増幅後に構築しうる。
【０１３８】
PCR産物またはライゲーション産物は、当技術分野で知られているどのような方法で精製してもよい。好適な実施形態では、二本鎖PCR産物またはライゲーション産物を水酸化ナトリウムにより解離させ、ストレプトアビジンをコーティングした磁性ビーズを用いてビオチン化された鎖を除去した後エタノール沈殿によりマイナス一本鎖DNAを精製したが、これはWu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233 および Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りであり、この両方を参照により本明細書に組み入れる。
【０１３９】
本発明に従って構築されたコンビナトリアルライブラリーは、その後の使用のために貯蔵することができる。核酸は溶液中で、乾燥させた無菌化凍結乾燥粉末として、または密閉容器中の水不含濃縮物として貯蔵しうる。核酸を溶液中で貯蔵しない場合には、核酸をその後の使用のために(例えば水または生理食塩水で)適当な濃度へと再調製することができる。本発明のコンビナトリアルライブラリーは、好ましくは核酸の量および濃度が表示されている容器中で、2℃〜8℃で貯蔵される。
【０１４０】
5.3.  コンビナトリアルライブラリーの発現
本発明に従って構築されるコンビナトリアルライブラリーは、当業界で公知のいずれの方法によっても発現させることができ、そのような方法としては、限定するものではないが、細菌発現系、哺乳動物発現系およびin vitroリボソームディスプレイ系が挙げられる。
【０１４１】
好ましい実施形態において、本発明は、コンビナトリアルライブラリーを発現させるためのファージベクターの使用を包含する。ファージベクターには、発現され提示されたタンパク質の非常に大きな集団をスクリーニングして、所望の結合活性をコードする１以上の特定のクローンを探し出す手段を提供する、という特別な利点がある。
【０１４２】
抗体分子の大集団を発現させるためにファージディスプレイベクターを使用することは当業界では周知のことであり、本明細書で詳しく述べることはない。一般に、この方法には、ライブラリーの抗体種をクローニングし発現させるための繊維状ファージ（ファージミド）表面発現ベクター系の使用が含まれる。例えば、Kangら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:4363-4366 (1991)；Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:7978-7982 (1991)；Zebedeeら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3175-3179 (1992)；Kangら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:11120-11123 (1991)；Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4457-4461 (1992)；Gramら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580 (1992)；Brinkmanら, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995)；Amesら, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995)；Kettleboroughら, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994)；Persicら, Gene 187 9-18 (1997)；Burtonら, Advances in Immunology 57:191-280 (1994)；PCT出願PCT/GB91/01134号；PCT出願WO 90/02809号；WO 91/10737号；WO 92/01047号；WO 92/18619号；WO 93/11236号；WO 95/15982号；WO 95/20401号；ならびに米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号および第5
,969,108号を参照されたい（それらは全て、参照することによりその全体を本明細書に含めるものとする）。
【０１４３】
本発明の１つの好ましいファージミドベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、(1)原核生物分泌シグナルドメイン、(2)免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖可変領域を規定する異種ポリペプチド、および(3)繊維状ファージ膜固定ドメインを含む融合ポリペプチドをコードして発現することができるヌクレオチド配列を含む組換えDNA分子である。このベクターは、この融合ポリペプチドを発現させるためのDNA発現制御配列、好ましくは原核生物制御配列を含む。
【０１４４】
繊維状ファージ膜固定ドメインは、好ましくは、繊維状ファージ粒子のマトリックスに結合して融合ポリペプチドをファージ表面に組み込むことができるcpIIIまたはcpVIIIコートタンパク質のドメインである。
【０１４５】
このベクターの好ましい膜固定ドメインは、繊維状ファージM13、f1、fdおよび同等の繊維状ファージから得られる。好ましい膜固定ドメインは、遺伝子IIIおよび遺伝子VIIIによりコードされるコートタンパク質中に見られる（Ohkawaら, J. Biol. Chem., 256:9951-9958, 1981を参照）。繊維状ファージコートタンパク質の膜固定ドメインは、そのコートタンパク質のカルボキシ末端領域の一部であり、脂質二重層膜にわたる疎水性アミノ酸残基の領域と、通常は膜の細胞質面に見られ、膜から延びている荷電アミノ酸残基の領域とを含んでいる。繊維状ファージ粒子の構造、それらのコートタンパク質および粒子アセンブリの詳細な説明については、Rachedら, Microbiol. Rev., 50:401-427 (1986)；およびModelら, "The Bacteriophages: Vol. 2", R. Calendar編. Plenum Publishing Co., p.p.375-456 (1988) による概説を参照されたい。
【０１４６】
分泌シグナルはタンパク質のリーダーペプチドドメインであり、これは該タンパク質をグラム陰性細菌のペリプラズム膜にターゲティングする。１つの好ましい分泌シグナルはpelB分泌シグナルである。（Betterら, Science, 240:1041-1043 (1988)；Sastryら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5728-5732 (1989)；およびMullinaxら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:8095-8099 (1990)）。エルビニア・カロトバ（Erwinia carotova）由来の２つのpelB遺伝子産物変異体から得られる分泌シグナルドメインの推定アミノ酸残基配列は、Leiら, Nature, 331:543-546 (1988)に記載されている。本発明において有用な大腸菌由来の他の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列は、Oliver, Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Neidhard, F. C. (編), American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69 (1987)に記載されるようなものである。
【０１４７】
DNA発現制御配列は、構造遺伝子産物を発現させるための１セットのDNA発現シグナルを含み、その遺伝子に機能しうる形で連結された、周知のような5'エレメントおよび3'エレメントを共に含む。5'制御配列は、転写開始のためのプロモーターと、上流の翻訳可能なDNA配列の5’末端に機能しうる形で連結されたリボソーム結合部位とを規定する。3'制御配列は、異種融合ポリペプチドとインフレームにかつ機能しうる形で連結された少なくとも１つの終結（停止）コドンを規定する。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明で用いられるベクターは、原核生物由来の複製起点またはレプリコン、すなわち、それで形質転換された原核宿主細胞（細菌宿主細胞など）内での自律複製および組換えDNA分子の染色体外での維持を指令することができるDNA配列を含む。そのような複製起点は当業界では周知である。好ましい複製起点は、宿主生物内で効率的なものである。１つの好ましい宿主細胞は大腸菌である。Sambrookら, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)を参照されたい。
【０１４９】
さらに、原核生物由来のレプリコンを含む実施形態は、次のような核酸も含むことができる。つまり、その核酸の発現が、形質転換された細菌宿主に、薬剤耐性のような選択上の利点を付与するものである。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与するものである。また、ベクターは、典型的には、翻訳可能なDNA配列を挿入するための好都合な制限部位も含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、可変重鎖領域をコードするヌクレオチド配列と可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列のような、内部に含まれる２つのシストロンを共発現することができる。共発現は、さまざまな系において達成されており、したがって、２つの遺伝子産物の十分な相対量が産生されて機能性ヘテロダイマーのアセンブリおよび発現が可能であれば、どのような特定の設計にも限定される必要はない。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、DNA発現ベクターは、ゲノムを被包している繊維状ファージ粒子の形態で、好都合に操作されるように設計される。この実施形態において、DNA発現ベクターはさらに、繊維状ファージの複製起点を規定するヌクレオチド配列を含み、その結果、該ベクターは、適切な遺伝的相補性が提示されると、一本鎖複製形態の繊維状ファージとして複製することができ、繊維状ファージ粒子内にパッケージングされるようになる。この特徴は、DNA発現ベクターがファージ粒子内にパッケージングされる能力を付与し、該粒子およびそこに含まれるベクターを、ファージ粒子の集団を構成する他の粒子からその後分離するのに役立つ。
【０１５２】
繊維状ファージ複製起点は、周知のように、複製開始部位、複製終結部位および複製により産生された複製形態のパッケージングのための部位を規定する、ファージゲノムの領域である（例えば、Raschedら, Microbiol. Rev., 50:401-427, 1986；およびHoriuchi, J. Mol. Biol., 188:215-223, 1986を参照されたい）。本発明で使用するための好ましい繊維状ファージ複製起点は、M13、f1またはfdファージの複製起点である（Shortら, Nucl. Acids Res., 16:7583-7600, 1988）。
【０１５３】
ヘテロダイマー免疫グロブリン分子の作製方法は、一般に、(1)提示ベクターの大集団（それぞれがファージミド表面提示タンパク質上に提示された異なる推定上の結合部位を発現できる）を繊維状ファージ粒子に導入し、(2)繊維状ファージ粒子の表面にその提示タンパク質および結合部位を発現させ、(3)予め選択した抗原に対するファージ粒子のパンニングのようなアフィニティ技法を用いて、表面に発現されたファージ粒子を単離（スクリーニング）し、それにより予め選択した抗原と結合する結合部位を含む提示タンパク質を含む１種以上のファージミドを単離する、ことを含んでなる。
【０１５４】
対象の抗体結合部位を発現することができる特定のベクターの単離には、ファージミド提示タンパク質を発現できるジシストロン性発現ベクターを、繊維状ファージ遺伝子の発現およびファージ粒子のアセンブリを許容する宿主細胞に導入することが含まれる。典型的には、この宿主は大腸菌である。次いで、ヘルパーファージゲノムを、ファージミド発現ベクターを含む宿主細胞に導入して、ファージ粒子のアセンブリを可能にするのに必要な遺伝的相補性を与える。
【０１５５】
こうして得られた宿主細胞を培養して、導入されたファージ遺伝子と提示タンパク質遺伝子を発現させ、ファージ粒子をアセンブルさせて宿主細胞から脱離させる。次に、脱離したファージ粒子を宿主細胞培地から収集（回収）し、望ましい抗体結合特性についてスクリーニングする。典型的には、収集した粒子は、予め選択した抗原との結合について「パンニング」する。次に、強く結合する粒子を回収し、個々の種の粒子をクローン的に単離し、その抗原への結合についてさらにスクリーニングする。所望の抗原結合特異性の結合部位を産生するファージが選択される。
【０１５６】
ファージの選択後、そのファージからの抗体コード領域を単離して、抗体全体もしくは他の所望の抗原結合性フラグメントの作製のために使用し、そして所望の宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌において発現させることができる。これについては後記で詳細に述べる。例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換えにより作製するための技法を、国際公開WO 92/22324号；Mullinaxら, BioTechniques 12(6):864-869 (1992)；およびSawaiら, AJRI 34:26-34 (1995)；およびBetterら, Science 240:1041-1043 (1988)（これらの文献は参照することによりその全体を本明細書に含めるものとする）に開示されるような当業界で公知の方法と共に、用いることができる。一本鎖Fvおよび抗体の作製に使用される技法の例としては、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号；Hustonら, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991)；Shuら, PNAS 90:7995-7999 (1993)；ならびにSkerraら, Science 240:1038-1040 (1988)に記載されるものが挙げられる。
【０１５７】
本発明はまた、本発明のベクターまたはヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。特定の実施形態において、その宿主細胞は大腸菌である。
【０１５８】
好ましい実施形態において、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、M13系のファージベクターにクローニングされる。このベクターは、lacZプロモーターの制御下で、ヒトγ1重鎖の第１定常ドメインとヒトκ軽鎖の定常ドメインとを含むFabフラグメントの発現を可能にする。これは、Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233；Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212； およびKunkelら, 1987, Methods Enzymol. 154, 367-382（それらは全て、参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されるようなハイブリダイゼーション変異誘発により行うことができる。簡単に述べると、クローニングしようとする重鎖および軽鎖に対応する精製されたマイナス鎖を、それぞれ１つのパリンドロームループを含む２つの領域にアニーリングさせる。それらのループは、ユニークなXbaI部位を含んでおり、この部位は、ヒトκ定常領域および第１のヒトγ1定常領域とそれぞれインフレームに融合された、VL鎖およびVH鎖の両者を含むベクターの選択を可能にする（Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233、Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212）。次に、合成されたDNAを、Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212び記載されるように、XL1-blue細菌叢上でのプラーク形成またはFabフラグメントの産生のために、XL1-blueにエレクトロポレーションする。
【０１５９】
本発明では、本発明のコンビナトリアルライブラリーを発現させるために、細菌／ファージ発現系に加えて、他の宿主−ベクター系も使用可能である。これらとしては、限定するものではないが、ベクターで形質転換した、あるいはウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス）を感染させた哺乳動物細胞系；ベクターで形質転換した、あるいはウイルス（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物；またはDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNAで形質転換した細菌が挙げられる。例えば、Vermaら, J Immunol Methods. 216(1-2):165-81 (1998)（これは参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【０１６０】
ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性においてさまざまである。使用する宿主−ベクター系に応じて、多くの適切な転写および翻訳エレメントのいずれか１つを使用すればよい。好ましい態様において、本発明のコンビナトリアルライブラリーの各核酸は、適当な宿主内で、ヒト化重鎖および／または軽鎖あるいはヒト化重鎖および／または軽鎖の可変領域を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、抗体のコード領域に機能しうる形で連結されたプロモーター（好ましくは異種プロモーター）を有しており、そのプロモーターは誘導性または構成性であり、場合によっては組織特異的である。（さらなる詳細については、セクション5.7を参照されたい。）別の特定の実施形態では、抗体コード配列および任意の他の所望配列が、ゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域によって挟まれており、かくして抗体コード核酸の染色体内発現をもたらす核酸分子を使用する（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０１６１】
また、上記コンビナトリアルライブラリーは、リボソーム提示系などのin vitro系を用いて発現させることも可能である（詳細については、セクション5.6を参照）。
【０１６２】
5.4  ヒト化抗体の選択
発現されたコンビナトリアルライブラリーは、当業界で公知のいずれかの方法を用いて、ドナー抗体によって認識される抗原への結合についてスクリーニングすることができる。好ましい実施形態において、それぞれセクション5.2および5.3に記載されるように構築され発現されたファージディスプレイライブラリーは、ドナー抗体によって認識される抗原への結合についてスクリーニングし、その抗原に対して有意な結合を示すVHおよび／またはVLドメインを発現するファージを、慣用のスクリーニング技法（例えば、Harlow, E., およびLane, D., 1988, 前掲、Gherardi, Eら 1990. J. Immunol. meth. 126 p61-68に記載されるもの）を用いてライブラリーから単離することができる。宿主細胞から脱離したファージ粒子を宿主細胞培地から収集（回収）し、望ましい抗体結合特性についてスクリーニングする。典型的には、収集した粒子を、予め選択した抗原との結合について「パンニング」する。次に、強く結合する粒子を回収し、個々の種の粒子をクローニングにより単離し、その抗原に対する結合についてさらにスクリーニングする。望ましい抗原結合特異性の結合部位を生じるファージを選択する。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、対象の抗原に対して少なくとも1×106 M-1、好ましくは少なくとも1×107 M-1、少なくとも1×108 M-1または少なくとも1×109 M-1の親和性を有する。
【０１６３】
好ましい実施形態において、ファージライブラリーは、まず、捕捉リフト（capture lift）と呼ばれる改良型プラークリフティングアッセイを用いてスクリーニングする。Watkinsら, 1997, Anal. Biochem., 253:37-45を参照されたい。簡単に述べると、ファージ感染細菌を固形寒天叢上にプレートし、続いてFab特異的試薬（例えば抗Fab抗体）をコーティングしたニトロセルロースフィルターで覆う。ほぼ均一量のファージ発現Fabの捕捉を行った後、そのフィルターを、そのFabのKd値よりも実質的に低い濃度の所望の抗原-Ig融合タンパク質でプローブする。
【０１６４】
別の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーを発現させ、リボソームディスプレイ系などのin vitro系を用いてスクリーニングする（例えば、Graddisら, Curr Pharm Biotechnol. 3(4):285-97 (2002)；Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997)；He, 1999, J. Immunol. Methods, 231:105；Jermutusら (1998) Current Opinion in Biotechnology, 9:534-548（それらはそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。リボソームディスプレイ系は、翻訳中のリボソームから抗体（もしくはそのフラグメント）またはmRNAのいずれも放出させることなく、抗体またはそのフラグメントのライブラリーをin vitroで翻訳することによって作動する。これはおそらく、終結コドンを欠失させ、かつリボソーム安定化バッファー系を用いることにより行われる。翻訳された抗体（もしくはそのフラグメント）はまた、新たに合成された抗体もしくはそのフラグメントがリボソームトンネルから容易に現れて独立して折りたたまれるように、C末端テザー（tether）ポリペプチド伸長を含む。折りたたまれた抗体もしくはそのフラグメントは、コグネイト抗原を用いてスクリーニングまたは捕捉できる。これによりmRNAの捕捉が可能になり、続いてin vitroで富化する。大腸菌およびウサギ網状赤血球系がリボソームディスプレイに一般的に使用される。
【０１６５】
当業界で公知の他の方法、例えばPROfusion（商標）（米国特許第6,281,344号, Phylos Inc., Lexington, MA）、共有結合ディスプレイ（国際公開WO 9837186号, Actinova Ltd., Cambridge, U.K.）も、本発明に従って使用可能である。
【０１６６】
別の実施形態では、抗原を固相支持体に結合させることができ、その支持体はペトリ皿、クロマトグラフィービーズ、磁性ビーズなどによって提供できる。本明細書中で用いられる「固相支持体」という用語は、特定のタイプの固相支持体に限定されるものではない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、当業者には公知である。固相支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、コットン、プラスチクビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、および多糖類が挙げられる。好適な固相支持体は、目的とする最終用途および種々の合成プロトコルに対する適性に基づいて選択すればよい。例えば、ペプチド合成の場合、固相支持体は、p-メチルベンズヒドリルアミン（pMBHA）樹脂（Peptides International, Louisville, KY）、クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンなどのポリスチレン類（例えば、Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.から入手されるPAM樹脂）、ポリ(ジメチルアクリルアミド)グラフト化スチレンコジビニルベンゼン（例えば、POLYHIPE樹脂、Aminotech, Canadaから入手)、ポリアミド樹脂（Peninsula Laboratoriesから入手）、ポリエチレングリコールでグラフト化したポリスチレン樹脂（例えば、TENTAGELまたはARGOGEL、Bayer, Tubingen, Germany）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Milligen/Biosearch, Californiaから入手)、またはセファロース（Pharmacia, Sweden)などの樹脂とすることができる。
【０１６７】
次に、コンビナトリアルライブラリーを抗原上に通過させ、洗浄後、結合している個々の抗体を保持し、場合によっては検出系により検出する。結合した集団のサンプルを徐々に高めたストリンジェント条件下で除去する場合には、各サンプルにおいて表される結合親和性が増大する。ストリンジェンシーを高めた条件は、例えば、浸漬時間を長くすること、または浸漬溶液のpHを変えること等によって達成できる。
【０１６８】
別の実施形態では、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）を用いて、所望の結合活性を有する抗体についてスクリーニングする。ELISAには、抗原の調製、抗原によるマイクロタイタープレートのウェルのコーティング、ウェルに結合していない抗原の洗い流し、酵素基質などの検出可能な化合物（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）にコンジュゲートさせた対象の抗体のウェルへの添加および一定期間にわたるインキュベーション、未結合抗体もしくは非特異的に結合した抗体の洗い流し、ならびに、抗原をコーティングしたウェルに特異的に結合している抗体の存在の検出が含まれる。ELISAにおいて、対象の抗体は、必ずしも検出可能な化合物にコンジュゲートさせる必要はない。その代わり、検出可能な化合物にコンジュゲートさせた二次抗体（対象の抗体を認識するもの）をウェルに添加すればよい。さらに、ウェルに抗原をコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素基質などの検出可能な化合物（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）にコンジュゲートさせた抗原ととすることができる。当業者であれば、検出されるシグナルが増大するように改変できるパラメーター、ならびに当業界で公知のELISAの他の可変要因について理解できるであろう。ELISAに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1を参照されたい。
【０１６９】
別の実施形態では、BIAcore反応速度解析を用いて、特定の抗原への本発明の抗体の結合onおよびoff速度（Kd）を求めることができる。BIAcore反応速度解析には、本発明の抗体が表面に固定されているチップへの抗原の結合および該チップからの解離を解析することが含まれる。Wuら, 1999, J. Mol. Biol., 294:151-162（これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。簡単に述べると、抗原-Ig融合タンパク質を、酢酸ナトリウム中の抗原-Igを注入かることにより、(1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]-カルボジイミド塩酸塩)およびN-ヒドロキシ-スクシンイミド活性化センサーチップCM5に固定する。抗原-Igは低密度で固定して、解離期中のFabの再結合を防止する。結合速度定数（Kon）を得るために、６つの異なるFab濃度での結合速度を一定流速にて測定する。解離速度定数（Koff）は、解離期を解析することにより得られる６つの測定値の平均である。センサーグラムは、BIAevaluation 3.0プログラムを用いて解析する。Kdは、Kd＝Koff/Konから算出する。残存するFabは、長期の解離により各測定後に除去する。さらに好ましい実施形態では、陽性プラークを拾い、低密度で再プレートし、再度スクリーニングする。
【０１７０】
別の実施形態では、抗体（scFvまたは、抗体フラグメントもしくはその変異体を含むまたはそれからなる他の分子を含む）の抗原への結合親和性、ならびに抗体−抗原相互作用のoff速度は、競合結合アッセイにより求めることができる。競合結合アッセイの一例は、徐々に増大させた量の未標識抗原の存在下で、標識抗原（例えば3Hまたは121I）を対象の抗体と共にインキュベートすること、ならびに、標識抗原に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。本発明の抗体の親和性および結合off速度は、得られたデータからScatchardプロット解析により求めることができる。また、二次抗体との競合もラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合には、徐々に増大させた量の未標識二次抗体の存在下で、抗原を、標識化合物（例えば、3Hまたは121I）にコンジュゲートさせた本発明の抗体と共にインキュベートする。
【０１７１】
他のアッセイ、例えば、限定するものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（固相酵素免疫アッセイ）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技法を用いた競合的および非競合的アッセイ系を含むイムノアッセイを用いて、ヒト化抗体をスクリーニングしたり、その結合特異性をさらに特徴付けることも可能である。そのようなアッセイはルーチンであり、当業界で周知である（例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York（これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照）。代表的なイムノアッセイを以下で簡単に述べる（これは限定しようとするものではない）。
【０１７２】
好ましい実施形態において、ELISAは、捕捉リフトアッセイにより同定されたクローンを確認するために、Fabフラグメントを発現する細菌培養物から調製した上清の二次スクリーニングとして用いられる。２つのELISAを行うことができる：(1)定量的ELISA：これは、本質的にWu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212（これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されるように行うことができる。簡単に述べると、抗ヒトFab ELISAにより濃度を測定できる： 96ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルに50ngのヤギ抗ヒトFab抗体をコーティングし、次にサンプル（上清に発現させたFab）または標準物質（ヒトIgG Fab）と共にインキュベートする。続いて、ヤギ抗ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートと共にインキュベートを行う。HRP活性をTMB基質で検出し、反応を0.2MのH2SO4により停止させる。プレートを450nmで読み取る。次に、二次スクリーニングの次の段階のために、検出可能な量のFabを発現するクローンを選択する。(2)機能的ELISA：簡単に述べると、特定の抗原結合活性を抗原に基づくELISAにより測定する：96ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルに50ngの対象の抗原をコーティングし、1% BSA/0.1% Tween 20でブロックし、次にサンプル（上清発現Fab）と共にインキュベートする。続いて、ヤギ抗ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートと共にインキュベートする。HRP活性をTMB基質で検出し、反応を0.2MのH2SO4により停止させる。プレートを450nmにて読み取る。
【０１７３】
免疫沈降プロトコルは、一般に、プロテインホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、EDTA、PMSF、159アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したRIPAバッファー（１％のNP-40またはTriton X-100、１％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH 7.2、１％Trasylol）などの溶解バッファー中で細胞集団を溶解させ、その細胞溶解物に対象の抗体を添加し、40℃にて一定期間(例えば４時間)にわたってインキュベートし、プロテインAおよび／またはプロテインGセファロースビーズを細胞溶解物に添加し、約１時間以上にわたり40℃にてインキュベートし、ビーズを溶解バッファー中で洗浄し、ビーズをSDS／サンプルバッファーに再懸濁することを含む。対象の抗体の、特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により評価することができる。当業者であれば、抗体と抗原の結合を増大させ、かつバックグラウンドを低減させるように変更可能なパラメーター（例えば、細胞溶解物をセファロースビーズで前もってクリアランスすること）について理解できるであろう。免疫沈降プロトコルについてのさらなる解説については、例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, at 10. 16. 1を参照されたい。
【０１７４】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製すること、そのタンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜20％のSDS-PAGE）で電気泳動すること、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルから膜（例えば、ニトロセルロース、PVDFまたはナイロン）に移行させること、膜をブロッキング溶液（例えば、３％BSAまたは脱脂乳を含むPBS）中でブロックすること、膜を洗浄バッファー（例えば、PBS Tween 20）中で洗浄すること、膜をブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（対象の抗体）でブロックすること、膜を洗浄バッファー中で洗浄すること、膜を、ブロッキングバッファーで希釈した酵素基質(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ)または放射性分子（例えば、12Pまたは121I）にコンジュゲートさせた二次抗体（一次抗体を認識するもの、例えば抗ヒト抗体）でブロックすること、膜を洗浄バッファーで洗浄すること、抗原の存在を検出することを含む。当業者であれば、シグナルを増大させ、かつバックグラウンドノイズを低減させるように変更可能なパラメーターについて理解できるであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる解説としては、例えば、Ausubelら編, 1994, GinTent Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1を参照されたい。
【０１７５】
所望の抗原結合活性を有する改変型（例えばヒト化）抗体またはそのフラグメントをコードする核酸は、ABI300ゲノムアナライザを用いるジデオキシ塩基配列決定などの配列決定法により特性決定できる。上記で述べた、２部からなる二次ELISAスクリーニングなどの他のイムノアッセイを用いて、改変型（例えばヒト化）抗体を、特定の抗原への結合について、互いと、およびドナー抗体と比較することができる。
【０１７６】
5.5  ヒト化抗体の作製および特徴付け
所望の結合活性を有するヒト化抗体およびそのフラグメントをコードする１つ以上の核酸を選択したら、当業界で公知の標準的な技法によりその核酸を回収することができる。好ましい実施形態において、選択したファージ粒子を回収し、それを新たな細菌に感染させてから目的の核酸を回収する。
【０１７７】
所望の特異性または親和性を有するヒト化可変領域を含むタンパク質を提示するファージは、当業界で公知のいずれの方法によってもアフィニティマトリックスから溶出させることができる。１つの実施形態では、マトリックスに対してより良好な親和性を有するリガンドが用いられる。特定の実施形態では、対応する非ヒト化抗体が用いられる。別の実施形態では、抗原−抗体複合体に対して特異的ではない溶出方法が用いられる。
【０１７８】
温和な溶出方法は、ファージ抗体集団とビオチン化抗原との結合およびストレプトアビジン磁性ビーズとの結合を利用するものである。洗浄して未結合ファージを除去した後、ファージ抗体を溶出させ、これを用いて細胞に感染させ、選択したファージ抗体集団を得る。ビオチンと抗原分子との間のジスルフィド結合が、ジチオトレイトールによる温和な溶出を可能にする。１つの実施形態では、ビオチン化抗原は過剰に用いることができるが、抗原−抗体結合についての所望の解離定数と同じ濃度またはそれより低い濃度で用いてもよい。この方法は、高親和性抗体の選択に有利である（R. E. Hawkins, S. J. RussellおよびG. Winter J. Mol. Biol. 226 889-896, 1992）。また、抗体は、Hawkinsら, 1992, （前掲）に記載されるように、抗原選択のために、より遅いoff速度を選択してもよい。ビオチン化抗原の濃度を徐々に低下させて、より高い親和性のファージ抗体を選択することができる。別法として、J. K. Scott & G. P. Smith (Science 249 386-390, 1990)によって記載されるビオチン化抗体に対するペプチドファージの競合と同様の方法で、ファージ抗体を結合について競合させるために、ファージ抗体をビオチン化抗原よりも過剰にすることができる。
【０１７９】
別の実施形態では、高特異性プロテアーゼによる切断の認識部位を構成するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、挿入した外来タンパク質（例えば抗体フラグメントをコードする核酸）と遺伝子IIIの残部の配列との間に導入することができる。そのような高特異性プロテアーゼの非限定的な例は、X因子およびトロンビンである。ファージをアフィニティマトリックスに結合させ、非特異的に結合しているファージおよび弱く結合しているファージを溶出して除去した後、前記切断部位での消化に適する条件下でカラムをプロテーゼで洗浄することにより、強く結合しているファージを分離する。これにより、抗体フラグメントがファージ粒子から切断されて、ファージが溶出される。これらのファージは感染性であると予想される。何故ならば、プロテアーゼ部位だけが特異的に導入されたものであるはずだからである。次いで、強く結合するファージを、例えば大腸菌TG1細胞に感染させることによって回収できる。
【０１８０】
上記の方法の別法は、強く結合したpAbを保持しているアフィニティマトリックスを取り、例えばSDS溶液中で煮沸することによって、DNAを抽出することである。次に、抽出されたDNAを用いて、大腸菌宿主細胞を直接形質転換させるか、あるいは抗体コード配列を、例えば適切なプライマーを用いたPCRを用いて増幅し、次いでさらなる研究を行うための可溶性抗体として発現させるため、またはさらなる選択ラウンドを行うためのｐAbとして、ベクターに挿入することができる。
【０１８１】
別の実施形態では、ファージの集団を、少量の抗原を含むアフィニティマトリックスに結合させる。高親和性タンパク質を提示するファージと低親和性タンパク質を提示するファージとの間で、マトリックス上の抗原への結合に関して競合が起こる。高親和性タンパク質を提示するファージが主に結合し、低親和性タンパク質は洗い流される。次に、その高親和性タンパク質を、リガンドによる溶出またはファージをアフィニティマトリックスから溶出させる他の手順（国際公開WO92/01047号に、この手順が示されている）により回収する。
【０１８２】
ドナーCDRおよびヒト化フレームワークをコードする、回収された核酸は、それ自体として使用することも可能であるし、あるいは、それらを各アクセプターテンプレートの定常領域に結合させることによって完全な抗体分子の核酸を構築するのに使用することも可能である。抗体をコードする核酸が適切な宿主細胞系に導入されると、トランスフェクトされた細胞は、モノクローナル抗体の望ましい特性を全て有する抗体を分泌することができる。
【０１８３】
本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらのフラグメント（好ましくは、重鎖もしくは軽鎖可変領域を含むもの）をコードする核酸が得られたら、この抗体分子を作製するためのベクターは、組換えDNA法により、当業界で周知の技法を用いて作製することができる。したがって、抗体をコードする核酸を発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA法、合成法、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに機能しうる形で連結された、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、またはそのフラグメント、または重鎖もしくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、そのフラグメント、または重鎖もしくは軽鎖CDRの発現は、構成性プロモーターにより調節される。別の実施形態では、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、そのフラグメント、または重鎖もしくは軽鎖CDRの発現は、誘導性プロモーターにより調節される。別の実施形態では、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、そのフラグメント、または重鎖もしくは軽鎖CDRの発現は、組織特異的プロモーターにより調節される。そのようなベクターはまた、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく（例えば、国際公開WO 86/05807号；国際公開WO 89/01036号；および米国特許第5,122,464号を参照）、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体または重鎖と軽鎖の両方を発現させるために、そのようなベクターにクローニングできる。
【０１８４】
この発現ベクターは、慣用の技法により宿主細胞に導入し、次にトランスフェクトされた細胞を慣用の技法により培養して、本発明の抗体を産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能しうる形で連結された、本発明の抗体もしくはそのフラグメント、またはその重鎖もしくは軽鎖、それらの部分、または本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体を発現させるための好ましい実施形態において、後記で詳細に述べるように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖の双方をコードするベクターを宿主細胞内で共発現させることができる。
【０１８５】
好ましくは、改変抗体を産生させるために形質転換される細胞系は、リンパ系起源の不死化哺乳動物細胞系であり、例えば、限定するものではないが、ミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ（quadroma）細胞系が挙げられる。また、この細胞系は、エプスタイン・バーウイルスなどのウイルスで形質転換することにより不死化されている正常なリンパ細胞(例えばＢ細胞)を含むことも可能である。最も好ましくは、この不死化細胞系は、ミエローマ細胞系またはその誘導物である。
【０１８６】
ミエローマ細胞系などの不死化リンパ細胞系の中には、正常な状態で、単離型の免疫グロブリン軽鎖または重鎖を分泌するものがあることが知られている。そうした細胞系がファージライブラリーから回収された核酸で形質転換される場合、その回収されたフラグメントを定常領域に再構成させることは必要でない。但し、これは、正常に分泌される鎖がファージライブラリーから回収された核酸によりコードされる免疫グロブリン鎖の可変ドメインに相補的である場合である。
【０１８７】
本発明の抗体の産生に用いられる細胞系は、好ましくは哺乳動物細胞系であるが、いずれの他の適切な細胞系も代わりに使用することが可能である。これらとしては、限定するものではないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（例えば、サッカロミセス・ピチア（Saccharomyces Pichia）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）に感染させた、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスのゲノム由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0および3T3細胞）などの微生物が挙げられる。好ましくは大腸菌などの細菌細胞、さらに好ましくは真核細胞（特に、組換え抗体分子全体を発現させるためのもの）が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物細胞を、ヒト・サイトメガロウイルス由来の主な前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせたものが、有効な抗体の発現系である（Foeckingら, 1986, Gene 45:101；およびCockettら, 1990, Bio/Technology 8:2）。
【０１８８】
細菌系では、発現させようとする抗体分子の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体分子の医薬組成物の調製のために、そのようなタンパク質を大量に産生させようとする場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルな発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EMBO 12:1791）（抗体コード配列が個々に、lacZコード領域とインフレームでベクターにライゲートされて、融合タンパク質が産生できるようになっているもの）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられる。また、pGEXベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させるのに使用できる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、続いて行う遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテーゼ切断部位を含むことにより、クローニングした標的がGST成分から放出されるように設計されている。
【０１８９】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体ウイルス（AcNPV）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスは、ヨトウガ（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））細胞内で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングでき、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におかれる。
【０１９０】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系の発現系が使用できる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、対象の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターと３部構成（tripartite）リーダー配列）にライゲートすることができる。次に、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入すればよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ElまたはE3）への挿入により、生存可能で、しかも感染した宿主内で抗体分子を発現できる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359を参照）。また、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルが必要な場合もある。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、対象のコード配列のリーディングフレームと読み枠が合っていなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、さまざまな起源のものとすることができ、天然のものであっても合成されたものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強できる（例えば、Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。
【０１９１】
さらに、宿主細胞株としては、挿入配列の発現を調節するもの、または所望の特定の様式で核酸を修飾しプロセシングするものを選択することができる。そのようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、そのタンパク質の機能にとって重要でありうる。さまざまな宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的で特異的な機構を有している。発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングが確実になるように、適切な細胞系または宿主系を選択する。この目的のためには、適切な一次転写産物のプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用可能である。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0（免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス・ミエローマ細胞系）、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が挙げられる。
【０１９２】
組換えタンパク質を長期にわたって高収率で産生させるためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系を遺伝子工学的に作製することができる。ウイルス性の複製起点を含む発現ベクターを用いずに、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されたDNAおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来DNAを導入した後、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体内に安定に組み込み、増殖してフォーカス（これは次にクローニングされて細胞系へと拡大できる）を形成できるようにする。この方法は、抗体分子を発現する細胞系の操作に有利に用いることができる。そのような操作した細胞系は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用となり得る。
【０１９３】
いくつかの選択系が使用でき、例えば、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:8-17）遺伝子が、それぞれtk-細胞、hgprt-細胞またはaprt-細胞において使用できる。また、代謝拮抗物質耐性を次の遺伝子の選択基準として用いることが可能である：dhfr（メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O’Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；gpt（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；neo（アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する）（WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15）；およびhygro（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Santerreら, 1984, Gene 30:147）。組換えDNA法の技術分野において一般に知られている方法を、目的とする組換えクローンの選択にルーチンに適用することができ、そのような方法は、例えば、Ausubelら（編）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；およびChapters 12 and 13, Dracopoliら（編）, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1（これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
【０１９４】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大させることができる（概説としては、BebbingtonおよびHentschel, The use of vector based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい）。抗体を発現するベクター内のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養物中に存在するインヒビターのレベルの増加により、そのマーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅した領域は抗体遺伝子と結合しているので、その抗体の産生もまた増加する（Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０１９５】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（第１のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードする）で共トランスフェクトすることができる。これら２つのベクターは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとを等しく発現させることができる同一の選択マーカーを含むことができる。あるいはまた、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの双方をコードし、それらを発現することができる単一のベクターを使用することも可能である。そのような場合、有害な遊離重鎖が過剰になることを防止するために、軽鎖を重鎖の前に配置しなければならない（Proudfoot, 1986, Nature 322:52；およびKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197）。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAでもゲノムDNAでもよい。
【０１９６】
また、本発明の抗体は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）に導入することもできる。例えば、Bruggemann, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 49(3):203-8 (2001)；Bruggemann and Neuberger, Immunol. Today 8:391-7 (1996)（それらは各々、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。トランスジーン構築物または転座は、例えばプラスミドの組み立て、酵母人工染色体内でのクローニング、および染色体断片の使用によって得ることができる。トランスジェニック動物系統内での転座の組込みおよび維持は、卵母細胞への前核DNAの注入および胚性幹細胞を使用する種々のトランスフェクション法により達成できる。
【０１９７】
例えば、ヒト化重鎖および／または軽鎖あるいはヒト化重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸は、マウス胚性幹細胞へ無作為に導入してもよいし、相同組換えによって導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによりヒト化抗体をコードする核酸を導入することによって、別々にまたは同時に、非機能性にすることができる。特に、JH領域がホモ接合的に欠失すると、内因的な抗体産生が妨害される。改変した胚性幹細胞を増やして、胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを作製する。次に、このキメラマウスを交配させて、ヒト化抗体を発現するホモ接合型の子孫を作製する。
【０１９８】
本発明の抗体分子を組換え発現により産生させたら、それを、免疫グロブリン分子を精製するための当業界で公知のいずれかの方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（特にプロテインAの後での特異的抗原に対する親和性により）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差異的溶解度により、あるいはタンパク質を精製するための他の標準的な方法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製しやすくするために、本明細書中で記載される、または当業界で公知の異種ポリペプチド配列に融合させることができる。
【０１９９】
5.6  抗体コンジュゲート
本発明は、１つ以上の成分（限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、ミメティック物質、合成薬物、無機分子および有機分子を含む）にコンジュゲートまたは融合させた抗体またはそのフラグメントを包含する。
【０２００】
本発明は、融合タンパク質を生成するように、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個または少なくとも100個のアミノ酸からなるポリペプチド）に組換えによって融合された、または化学的にコンジュゲートされた（共有結合および非共有結合によるコンジュゲーションを含む）抗体またはそのフラグメントを包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起こるものであってもよい。例えば、抗体は、その抗体を、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲートさせることにより、in vitroまたはin vivoで、異種ポリペプチドを特定の細胞型にターゲティングさせるのに使用することができる。異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートさせた抗体はまた、in vitroでのイムノアッセイおよび当業界で公知の方法を用いる精製方法において使用することもできる。例えば、国際公開WO 93/21232号；欧州特許EP439,095号；Naramuraら, 1994,  Immunol. Lett. 39:91-99；米国特許第5,474,981号；Gilliesら, 1992, PNAS 89:1428-1432；およびFellら,1991, J. Immunol. 146:2446-2452（それらは参照によりそれらの全体が組み入れられるものとする）を参照されたい。
【０２０１】
本発明はさらに、抗体フラグメントに融合またはコンジュゲートさせた異種タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、異種ポリペプチドは、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、VHドメイン、VLドメイン、VH CDR、VL CDR、またはそれらのフラグメントに融合またはコンジュゲートさせることができる。ポリペプチドを抗体部分へ融合またはコンジュゲートさせるための方法は、当業界では周知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号；欧州特許EP 307,434号およびEP 367,166号；国際公開WO 96/04388号およびWO 91/06570号；Ashkenaziら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zhengら, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; and Vilら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341（それらの参照文献は参照によりそれらの全体が組み込まれるものとする）を参照されたい。
【０２０２】
遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリングの技法（まとめて「DNAシャフリング」と呼ばれる）により、さらなる融合タンパク質を作製することが可能である。DNAシャッフリングを用いて、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を変化させることができる（例えば、より高い親和性とより低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント）。概略的には、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号、ならびにPattenら, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hanssonら, 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；およびLorenzoおよびBlasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313（これらの特許および刊行物は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組換えを行う前に、誤りがちの（error-prone）PCR、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することにより変化させることができる。抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの１以上の部分を、１種以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、区域、部分、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
【０２０３】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、精製しやすくするために、例えばペプチドなどのマーカー配列と融合させることも可能である。好ましい実施形態では、そのマーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えばpQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）内に与えられるタグであり、ほかにもあるが、それらの多くは市販されている。Gentzら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されるように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を可能にする。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、ヘマグルチニン「HA」タグ（インフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するもの）（Wilsonら, 1984, Cell, 37:767）および「flag」タグが挙げられる。
【０２０４】
他の実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメント、類似体もしくは誘導体は、診断剤または検出可能な物質とコンジュゲートさせることができる。そのような抗体は、特定の治療薬の有効性の判定などの臨床試験法の一部として、疾患の発生または進行をモニタリングまたは予測するのに有用であり得る。そのような診断および検出は、抗体を検出可能な物質とカップリングさせることにより達成できる。検出可能な物質としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼなどの種々の酵素；ストレプトアビジンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子団；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドもしくはフィコエリトリンなどの蛍光物質；ルミノールなどの発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンなどの生物発光物質；ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、三重水素（3H）、インジウム（115In, 113In、112In、111In）およびテクネチウム（99Tc）、タリウム（201Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセノン（133Xe）、フッ素（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142 Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Snおよび117Tinなどの放射性物質；さまざまな陽電子放射断層法を用いる陽電子放射金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびに放射性標識されたもしくは特定の放射性同位元素にコンジュゲートされた分子。
【０２０５】
本発明はさらに、治療成分にコンジュゲートさせた抗体またはそのフラグメントを包含する。抗体またはそのフラグメントは、細胞毒素（例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオン（例えばα線放射体）などの治療成分にコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤としては、細胞にとって有害であるあらゆる物質が含まれる。治療成分としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルムスチン（BCNU）およびルムスチン（CCNU）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、ならびにシスジクロロジアミン白金(II)（DDP）シスプラチン)、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（従来名はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（従来名はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（AMC））、オーリスタチン分子（例えば、オーリスタチンPHE、ブリオスタチン１、およびソラスタチン（solastatin）10；Woykeら, Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)、Woykeら, Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)、Mohammadら, Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)、Wallら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)、Mohammadら, Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)（それらは全て、参照により本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）、ホルモン（例えば、グルココルチコイド、プロゲステロン、アンドロゲンおよびエストロゲン）、DNA修復酵素阻害剤（例えば、エトポシドまたはトポテカン）、キナーゼ阻害剤（例えば、化合物ST1571、メシル酸イマチニブ（Kantarjianら, Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)）、細胞傷害剤（例えば、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydroxy anthracin dione）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体）、ならびに、米国特許第6,245,759号、第6,399,633号、第6,383,790号、第6,335,156号、第6,271,242号、第6,242,196号、第6,218,410号、第6,218,372号、第6,057,300号、第6,034,053号、第5,985,877号、第5,958,769号、第5,925,376号、第5,922,844号、第5,911,995号、第5,872,223号、第5,863,904号、第5,840,745号、第5,728,868号、第5,648,239号、第5,587,459号に開示される化合物；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、R115777、BMS-214662、および、例えば米国特許第6,458,935号、第6,451,812号、第6,440,974号、第6,436,960号、第6,432,959号、第6,420,387号、第6,414,145号、第6,410,541号、第6,410,539号、第6,403,581号、第6,399,615号、第6,387,905号、第6,372,747号、第6,369,034号、第6,362,188号、第6,342,765号、第6,342,487号、第6,300,501号、第6,268,363号、第6,265,422号、第6,248,756号、第6,239,140号、第6,232,338号、第6,228,865号、第6,228,856号、第6,225,322号、第6,218,406号、第6,211,193号、第6,187,786号、第6,169,096号、第6,159,984号、第6,143,766号、第6,133,303号、第6,127,366号、第6,124,465号、第6,124,295号、第6,103,723号、第6,093,737号、第6,090,948号、第6,080,870号、第6,077,853号、第6,071,935号、第6,066,738号、第6,063,930号、第6,054,466号、第6,051,582号、第6,051,574号および第6,040,305号に開示されるもの）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン；イリノテカン；SN-38；トポテカン；9-アミノカンプトテシン；GG-211（GI 147211）；DX-8951f；IST-622；ルビテカン；ピラゾロアクリジン；XR-5000；サイントピン（saintopin）；UCE6；UCE1022；TAN-1518A；TAN-1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506；ED-110；NB-506；およびレベッカマイシン）；ブルガレイン（bulgarein）；Hoescht色素33342およびHoechst色素33258などのDNA副溝結合物質；ニチジン（nitidine）；ファガロニン（fagaronine）；エピベルベリン；コラリン（coralyne）；β-ラパコン；BC-4-1；ビホスホネート（例えば、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート（olpandronate）、リセドロネート、ピリドロネート（piridronate）、パミドロネート、ゾレンドロネート）、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、セリバスタチン、レスコール、リピトール（lupitor）、ロスバスタチンおよびアトロバスタチン）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体およびプロドラッグ（例えば、Rothenberg, M.L., Annals of Oncology 8:837-855(1997)；およびMoreau, P.,ら, J. Med. Chem. 41:1631-1640(1998)を参照されたい）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号および第5,618,709号に開示されるもの）、免疫調整物質（例えば、抗体およびサイトカイン）、抗体、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、リン酸フルダラビンおよび2-クロロデオキシアデノシン）。
【０２０６】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、所与の生物学的応答を改変させる治療成分または薬物成分とコンジュゲートさせることができる。治療成分および薬物成分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドとすることができる。そのようなタンパク質としては、例えば、次のものが挙げられる：アブリン、リシンA、シュードモナス（pseudomonas）外毒素、コレラ毒素もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質；アポトーシス誘発剤（apoptotic agent）、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I（国際公開WO 97/33899号を参照）、AIM II（国際公開WO 97/34911号を参照）、Fasリガンド（Takahashiら, 1994, J. Immunol., 6:1567-1574）およびVEGI（国際公開WO 99/23105号を参照）；血栓症剤（thrombotic agent）もしくは抗血管新生剤（antiangiogenic agent）、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンもしくは凝集経路の成分（例えば、組織因子）；または生物学的応答調節物質、例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）および顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、成長因子（例えば、成長ホルモン（「GH」）；または凝集剤、例えば、カルシウム、ビタミンK、組織因子（例えば、ハーゲマン（Hageman）因子（XII因子）、高分子キニノゲン（HMWK）、プレカリクレイン（PK）、凝集タンパク質-II因子（プロトロンビン）、V因子、XIIa因子、VIII因子、XIIIa因子、XI因子、XIa因子、IX因子、IXa因子、X因子、リン脂質、フィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖由来のフィブリノペプチドAおよびB、フィブリンモノマー）。
【０２０７】
さらに、抗体は、α線放射体(例えば213Bi)などの放射性金属イオンのような治療成分に、または放射性金属イオン（限定するものではないが、131In、131LU、131Y、131Ho、131Smなど）をポリペプチドとコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、その大環状キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸（DOTA）であり、これはリンカー分子を介して抗体に結合させることができる。そのようなリンカー分子は当業界で一般に知られており、Denardoら, 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Petersonら, 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；およびZimmermanら, 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50（それぞれ、参照によりそれらの全体が組み込まれるものとする）に記載されている。
【０２０８】
治療成分を抗体にコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら（編）, p.p.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)のArnonら, “Monoclonal Antibodies or Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”； Controlled Drug Delivery (第２版), Robinsonら（編）, p.p.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)のHellstromら, “Antibodies For Drug Delivery”； Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら (編), p.p.475-506 (1985)のThorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”； Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら (編), p.p.303-16 (Academic Press 1985)の“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”；およびThorpeら, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58に記載されている。
【０２０９】
あるいはまた、Segalにより米国特許第4,676,980号（これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されるように、抗体を二次抗体にコンジュゲートさせて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成させてもよい。
【０２１０】
抗体またはそのフラグメントにコンジュゲートされる治療成分または薬物は、被験者の特定の疾患に対して所望の予防効果または治療効果を達成するように選択すべきである。医師または他の医療従事者は、抗体またはそのフラグメントにコンジュゲートさせようとする治療成分または薬物を決定する際に、次のことを考慮すべきである：疾患の性質、疾患の重症度、および被験者の状態。
【０２１１】
また、抗体は、固相支持体に結合させることも可能であり、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。そのような固相支持体としては、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられる。
【０２１２】
5.7  本発明の組成物の用途
本発明は、対象の抗体を効率的にヒト化するための方法を提供する。本発明のヒト化抗体は、疾患またはその１つ以上の症状を治療、管理、予防または改善するために、単独で、または他の予防剤もしくは治療剤と組み合わせて使用することができる。
【０２１３】
本発明は、疾患の予防、管理、治療または改善方法であって、それを必要とする被験者に、１種以上の本発明の抗体を単独で、または本発明の抗体以外の１種以上の他の治療薬（例えば１種以上の予防剤もしくは治療剤）と組み合わせて投与することを含む上記方法を提供する。また、本発明は、１種以上の本発明の抗体と、本発明の抗体以外の１種以上の予防剤もしくは治療剤とを含む組成物、ならびに前記組成物を用いて疾患またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療または改善する方法も提供する。治療剤または予防剤としては、限定するものではないが、小分子、合成薬物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えばDNAおよびRNAヌクレオチド、限定するものではないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三本鎖らせん構造体、RNAi、および生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）、抗体、合成もしくは天然の無機分子、ミメティック剤、および合成もしくは天然の有機分子が挙げられる。
【０２１４】
疾患またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療または改善に有用であることが知られている、またはこれまで使用されてきたか現在使用されている治療剤であれば、いずれも、本発明にしたがって、本発明の抗体と組み合わせて使用することができる。疾患またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療または改善にこれまで使用されてきたか現在使用されている治療薬（または予防剤または治療剤）に関する情報については、例えば、Gilmanら, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第10版, McGraw-Hill, New York, 2001；The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D.ら (編), 第17版, Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999；Cecil Textbook of Medicine, 第20版, Bennett and Plum (編), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996を参照されたい。そのような薬剤の例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：免疫調整剤、抗炎症剤（例えば、アドレノコルチコイド、コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニソン、ヒドロコルチゾン）、グルココルチコイド、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、およびCOX-2阻害剤）、抗癌剤、疼痛緩和剤、ロイコトリエンアンタゴニスト（例えば、モンテルカスト、メチルキサンチン、ザフィルルカストおよびジロイトン）、β2-アゴニスト（例えば、アルブテロール、ビテロール、フェノテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリンホルメテロール、サルメテロール、およびサルブタモールテルブタリン）、抗コリン作動薬（例えば、臭化イプラトリピウムおよび臭化オキシトロピウム）、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン剤、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、抗ウイルス剤、ならびに抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（従来名はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））。
【０２１５】
特定の実施形態において、本発明は、呼吸状態または１以上のその症状を予防、治療、管理または軽減するために被験者（好ましくは、ヒト被験者）に１種以上のヒト化抗IL-9抗体を投与することを提供する。ある実施形態では、本発明は、呼吸障害または１以上のその症状（例えば、アレルギー、喘鳴、喘息）を予防、治療、管理または軽減する方法を包含し、前記方法は、それを必要とする被験者に予防または治療に有効な量の１種以上のヒト化抗IL-9抗体を投与することを含んでなる。別の実施形態では、本発明は、呼吸感染症または１以上のその症状を予防、治療、管理または軽減する方法を提供し、前記方法は、予防または治療に有効な量の１種以上のヒト化抗IL-9抗体を投与することを含んでなる。
【０２１６】
特定の実施形態において、本発明は、過増殖性細胞疾患または１以上のその症状を予防、治療、管理または軽減するために被験者（好ましくは、ヒト被験者）に１種以上のヒト化抗EphA2抗体を投与することを提供する。ある実施形態では、１種以上のヒト化抗EphA2抗体を単独でまたは他の薬剤との併用で被験者に投与して、癌または１以上のその症状を予防、治療、管理または軽減する（例えば、米国特許出願第10/436,782号参照；その開示内容を参照することによりそのまま本明細書に含めるものとする）。別の実施形態では、１種以上のヒト化抗EphA2抗体を単独でまたは他の薬剤との併用で被験者に投与して、非腫瘍性の過増殖性細胞（特に、過増殖性上皮および内皮細胞）または１以上のその症状を予防、治療、管理または軽減する（例えば、米国特許出願第60/462,024号参照；その開示内容を参照することによりそのまま本明細書に含めるものとする）。さらに別の実施形態では、１種以上のヒト化抗EphA2抗体を診断またはスクリーニングのために使用する。
【０２１７】
本発明のヒト化抗体は、特定の抗原に対して直接使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、その抗体が結合する細胞の溶解を媒介することができるサブクラスまたはアイソタイプに属する。特定の実施形態において、本発明の抗体は、細胞表面タンパク質と複合化すると、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージなどのエフェクター細胞を活性化することにより、血清補体を活性化しかつ／または抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を媒介するサブクラスまたはアイソタイプに属する。
【０２１８】
抗体の生物学的活性は、その抗体分子の定常ドメインまたはFc領域によってかなり決定されることが知られている（UananueおよびBenacerraf, Textbook of Immunology, 第２版, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)）。これには、白血球によりもたらされる補体活性化能力および抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を媒介する能力が含まれる。異なるクラスおよびサブクラスの抗体はこの点に関して異なり、同じサブクラス由来であるが異なる生物種由来の抗体もそうである。本発明によれば、所望の生物学的活性を有するクラスの抗体が調製される。これらの抗体の調製には、公知の技法による抗体定常ドメインの選択およびそれらのヒト化抗体での取込みが含まれる。例えば、IgG3クラスおよびlgG2aクラスのマウス免疫グロブリンは、コグネイト抗原を発現する標的細胞に結合すると、血清補体を活性化することができ、したがって、IgG3およびlgG2aエフェクター機能を取り込んだヒト化抗体は、特定の治療用途に望ましい。
【０２１９】
一般に、IgG2aおよびIgG3サブクラス、ならびに場合によってはIgG1サブクラスのマウス抗体はADCCを媒介することができ、またIgG3、IgG2a、およびIgMサブクラスの抗体は血清補体に結合してそれを活性化する。通常、補体の活性化には、少なくとも２つのIgG分子が標的細胞上で近接して結合する必要がある。しかし、IgM分子はたった１つの分子の結合で血清補体を活性化する。
【０２２０】
補体活性化および／またはADCCにより標的細胞の溶解を媒介する特性の抗体の能力は、アッセイすることができる。対象となる細胞を増殖させ、in vitroで標識する。抗体を、抗原−抗体複合体により活性化し得る血清補体または免疫細胞のいずれかと組み合わせて、細胞培養物に添加する。標的細胞の細胞溶解は、溶解した細胞からの標識の放出により検出される。実際、抗体は、補体および／または免疫細胞の供給源として患者自身の血清を使用してスクリーニングすることができる。その後、in vitro試験において補体を活性化するかまたはADCCを媒介することができる抗体を、その特定の患者において治療に使用する。
【０２２１】
特定の用途ではIgM抗体を使用することが好ましい場合があるが、IgG分子は、それよりも小さいので、ある種のタイプの感染細胞にIgM分子よりも局在化させやすいかもしれない。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、患者を受動免疫するのに有用である。
【０２２３】
また、本発明の抗体は、被験者内または生物学的サンプル（例えば、細胞または組織）中での抗原の発現を検出／同定するためのin vivoまたはin vitro診断アッセイにおいて使用することも可能である。抗体、そのフラグメント、または抗体もしくはそのフラグメントを含む組成物の、診断アッセイにおける非限定的な使用例は、米国特許第6,392,020号；第6,156,498号；第6,136,526号；第6,048,528号；第6,015,555号；第5,833,988号；第5,811,310号；第8 5,652,114号；第5,604,126号；第5,484,704号；第5,346,687号；第5,318,892号；第5,273,743号；第5,182,107号；第5,122,447号；第5,080,883号；第5,057,313号；第4,910,133号；第4,816,402号；第4,742,000号；第4,724,213号；第4,724,212号；第4,624,846号；第4,623,627号；第4,618,486号；第4,176,174号（それらは全て、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。抗原およびその抗体についての好適な診断アッセイは、使用する特定の抗体に依存する。非限定的な例は、ELISA、サンドイッチアッセイ、および立体構造阻害（steric inhibition）アッセイである。本発明の抗体を用いるin vivo診断アッセイでは、その抗体を、Ｘ線、コンピューター連動断層撮影（CT）、超音波、または磁気共鳴イメージング（MRI）などのイメージング法により検出することができる標識にコンジュゲートさせる。また、本発明の抗体は、抗原を組換え細胞培養物または天然の供給源からアフィニティ精製するのに使用することも可能である。
【０２２４】
5.8  投与および製剤
本発明は、疾患の診断、検出、またはモニタリングにおいて、疾患もしくはその１つ以上の症状の予防、治療、管理、または改善において、および／または研究において使用するための本発明の抗体を含む組成物を提供する。具体的な実施形態では、組成物は本発明の抗体を１種以上含んでなる。別の実施形態では、組成物は１種以上の本発明の抗体および本発明の抗体以外の１種以上の予防薬または治療薬を含んでなる。好ましくは、予防薬または治療薬は、疾患もしくはその１つ以上の症状の予防、治療、管理または改善において有用であることが知られているか、それらに用いられてきたかあるいは現在用いられているものである。これらの実施形態によれば、該組成物は担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでもよい。
【０２２５】
本発明の組成物としては、限定するものではないが、医薬組成物の製造に有用なバルク薬物組成物（例えば不純なまたは未滅菌の組成物）、および単位剤形の調製に用いることができる医薬組成物（すなわち、被験者または患者への投与に好適な組成物）が挙げられる。このような組成物は、予防もしくは治療に有効な量の、本明細書中に開示した予防薬および／または治療薬あるいはそれらの薬剤の組合せ、ならびに製薬上許容される担体を含んでなる。好ましくは、本発明の組成物は医薬組成物であり、有効量の１種以上の本発明の抗体、製薬上許容される担体、および場合によっては、有効量の別の予防薬もしくは治療薬を含んでなる。
【０２２６】
医薬組成物は経口投与剤形または非経口投与剤形として、即時放出または持続放出のために製剤化することができる。該組成物は医薬製剤に通常用いられる不活性な成分、例えば希釈剤、充填剤、崩壊剤、甘味料、滑沢剤および香料などを含むことができる。医薬組成物は好ましくは静脈内投与（ボーラス注射もしくは持続滴下のいずれかによる）のために、または移植したカプセルからの放出のために製剤化される。静脈内投与用の典型的な製剤には希釈剤として生理食塩水を用いる。
【０２２７】
本発明の抗体のFabまたはFab’部分もまた、治療用有効成分として用いることができる。これら抗体フラグメントの調製は当技術分野で周知である。
【０２２８】
本発明の組成物はまた、抗体を治療薬として投与しうるための臨床上の指示、投与量および投与スケジュール、ならびに／または患者への本発明の抗体の投与に対する禁忌を記載した印刷物を含むことができる。
【０２２９】
本発明の組成物としては、限定するものではないが、医薬組成物の製造に有用なバルク薬物組成物（例えば不純なまたは未滅菌の組成物）、および単位剤形の調製に用いることができる医薬組成物（すなわち、被験者または患者への投与に好適な組成物）が挙げられる。このような組成物は、予防もしくは治療に有効な量の、本明細書中に開示した予防薬および／または治療薬あるいはそれらの薬剤の組合せ、ならびに製薬上許容される担体を含んでなる。好ましくは、本発明の組成物は医薬組成物であり、有効量の１種以上の本発明の抗体、製薬上許容される担体、および場合によっては、有効量の別の予防薬もしくは治療薬を含んでなる。
【０２３０】
具体的な実施形態では、「製薬上許容される」との用語は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁に承認された、または米国薬局方もしくは動物（特にヒト）での使用のための他の広く認識された薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」との用語は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイント・アジュバント（完全または不完全））、賦形剤またはビヒクル（それと共に治療薬を含有するかまたは投与する）を指す。そのような医薬用担体は、無菌液体（例えば水または油（例えば石油、動物、植物もしくは合成由来の、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など））であってよい。医薬組成物を静脈内に投与するならば、水が好ましい担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液のために、液体担体として用いることができる。好適な製薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。該組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤などの剤形を採ることができる。
【０２３１】
一般的には、本発明の組成物の成分は、別々かまたは単位剤形に一緒に混合して、例えば凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として密閉容器（例えば活性薬剤の量を表示したアンプルもしくは小袋）中に供給する。組成物が点滴による投与のためのものである場合には、無菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する点滴瓶を用いて提示することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提示することができ、それにより投与前に成分を混合してもよい。
【０２３２】
本発明の組成物は、非荷電の、または塩の形態で製剤化することができる。製薬上許容される塩としては、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののようなアニオンを用いて形成したもの、および例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのカチオンを用いて形成したものが挙げられる。
【０２３３】
種々の送達システムが公知であり、本発明の１以上の抗体、または本発明の１以上の抗体と、疾患もしくはその１以上の症状を予防、管理、治療または改善するのに有用な予防薬もしくは治療薬との組合せを投与するために用いることができる（例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、抗体もしくは抗体フラグメントを発現可能な組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えばWu および Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照）、レトロウイルスその他のベクターの一部としての核酸の構築など）。本発明の予防薬または治療薬を投与する方法としては、限定するものではないが、非経口投与（例えば皮内、筋内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、および粘膜投与（例えば鼻腔内および口腔内経路）が挙げられる。さらに、例えば吸入器もしくは噴霧器を用い、エアロゾル化剤と共に製剤化することにより、肺内投与を用いることができる。例えば、米国特許第6,019,968号、同第5,985,320号、同第5,985,309号、同第5,934,272号、同第5,874,064号、同第5,855,913号、同第5,290,540号、および同第4,880,078号；ならびに、PCT 公開公報WO 92/19244号、同WO 97/32572号、同WO 97/44013号、同WO 98/31346号、および同WO 99/66903号を参照のこと（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。一実施形態では、本発明の抗体、組合せ治療剤、または本発明の組成物を、Alkermes AIRTM 肺内薬剤送達技術（Alkermes, Inc., Cambridge, MA）を用いて投与する。具体的な実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、筋内に、静脈内に、腫瘍内に、経口的に、鼻腔内に、肺内に、または皮下に投与する。予防薬または治療薬は、いずれの都合のよい経路によって投与してもよく、例えば点滴もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収により投与してもよく、また他の生物学的活性薬剤と共に投与してもよい。投与は全身的でも局所的でもよい。
【０２３４】
具体的な実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましく、これは例えば、限定するものではないが、局所注入（注射によって、またはインプラントによって（該インプラントは、メンブレンおよびマトリックス（例えばシラスティックメンブレン、ポリマー、繊維性マトリックス（例えばTissuel（登録商標））またはコラーゲンマトリックス）をはじめとする多孔性もしくは非多孔性材料によりなる））によって達成することができる。一実施形態では、本発明アンタゴニストの１以上の抗体の有効量を、疾患もしくはその症状を予防、治療、管理および／または改善するために被験者に対して罹患部位に局所的に投与する。別の実施形態では、本発明の１以上の抗体の有効量を、疾患またはその１以上の症状を予防、治療、管理、および／または改善するために、被験者に対して、本発明の抗体とは別の１以上の治療剤（例えば１以上の予防薬または治療薬）の有効量と組み合わせて罹患部位に局所的に投与する。
【０２３５】
別の実施形態では、予防薬または治療薬を、制御放出もしくは持続放出システムで送達することができる。一実施形態では、制御放出または持続放出を実現するためにポンプを用いてもよい（Langer, 上掲；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald ら, 1980, Surgery 88:507；Saudek ら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 参照）。別の実施形態では、本発明の治療剤の制御放出または持続放出を実現するためにポリマー材料を用いることができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (編), Wiley, New York (1984)；Ranger および Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；Levyら, 1985, Science 228:190；Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howardら, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105；米国特許第5,679,377号；同第5,916,597号；同第5,912,015号；同第5,989,463号；同第5,128,326号；PCT 公開公報WO 99/15154号；および同WO 99/20253号を参照されたい）。持続放出製剤に用いるポリマーの例としては、限定するものではないが、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレンコビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（PLG）、ポリ酸無水物、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（PLA）、ポリ（ラクチドコグリコリド）（PLGA）、およびポリオルトエステルが挙げられる。好ましい実施形態では、持続放出製剤に用いるポリマーは、不活性で、濾過の必要な不純物を含まず、保存において安定であり、無菌で、かつ生分解性である。また別の実施形態では、制御放出または持続放出システムを予防または治療の標的の近傍に配置し、したがって全身容量の一部しか必要としないようにすることができる（例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 上掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 参照）。
【０２３６】
制御放出システムはLanger（1990, Science 249:1527-1533)による総説中で考察されている。当業者に公知のいずれの技術をも、本発明の１以上の治療薬を含んでなる持続放出製剤の製造に用いることができる。例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開公報WO 91/05548号、同WO 96/20698号、Ning ら, 1996, “Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179 189、Song ら, 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 397、Cleek ら, 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853 854、および Lam ら, 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759 760 を参照されたい（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。
【０２３７】
具体的な実施形態では、本発明の組成物が予防薬または治療薬をコードする核酸である場合、該核酸は、それを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それが細胞内に入るように投与することにより（例えばレトロウイルスベクターを用いることにより（米国特許第4,980,286号参照）、または直接注入により、または微小粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont）もしくは脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション試薬によるコーティングを用いることにより、または核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチドと連結して投与することにより（例えばJoliot ら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868参照））、それがコードする予防薬または治療薬の発現を促進するためにin vivo投与することができる。あるいはまた、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって発現のために宿主細胞DNA内に組み込むことができる。
【０２３８】
本発明の医薬組成物は、所望の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定するものではないが、非経口（例えば静脈内）、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。具体的な実施形態では、該組成物をヒトに対する静脈内、皮下、筋内、経口、鼻腔内、または局所投与に適合する医薬組成物として通常の方法に従って製剤化する。典型的には、静脈内投与のための組成物は無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、該組成物は可溶化剤および局所麻酔薬（例えば注射の部位での痛みを和らげるためのリグノカイン）を含有してもよい。
【０２３９】
本発明の組成物が局所的に投与するためのものであるならば、該組成物は軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ジェル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、懸濁液の剤形、または当業者に周知の他の剤形で製剤化することができる。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 第19版, Mack Pub. Co., Easton, PA (1995) を参照のこと。非スプレー式局所用投与剤形のためには、局所適用に適合する担体もしくは１以上の賦形剤を含んでなり、好ましくは水より高い動的粘度を有する、粘性から半固体または固体形状を典型的に用いる。好適な製剤としては、限定するものではないが、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム剤、軟膏剤（ointment）、粉末剤、リニメント剤、軟膏（salve）などが挙げられ、それらは所望であれば、滅菌するかまたは、例えば浸透圧のような種々の性質に影響する補助剤（例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤もしくは塩）と混合する。他の好適な局所用投与剤形としては、スプレー用エアロゾル製剤が挙げられ、ここで有効成分（好ましくは固体または液体不活性担体と組み合わされている）は、加圧揮発性物質（例えばフレオンのような気体状噴射剤）と混合してつめるか、または搾り出し用容器中につめる。保湿剤または湿潤剤もまた、所望であれば医薬組成物および投与剤形に含めることができる。そのような付加的な成分の例は、当技術分野で周知である。
【０２４０】
本発明の方法が組成物の鼻腔内投与を含むものならば、組成物はエアロゾル剤形、スプレー、ミストまたは液滴の剤形で製剤化することができる。特に、本発明の使用のための予防薬または治療薬は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス）を使用して、加圧容器または噴霧器からのエアロゾルスプレーの剤形で、都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、単位投与量は計量送達用のバルブを与えることにより測定することができる。吸入器または散布器での使用のためのカプセルまたはカートリッジ（例えばゼラチンによりなる）は、化合物と、好適な粉末状基材（例えばラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含有して製剤化することができる。
【０２４１】
本発明の方法が経口投与を含むものならば、組成物を錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルカップ剤、溶液剤、懸濁液剤などの剤形で、経口用に製剤化することができる。錠剤またはカプセル剤は、以下のもののような製薬上許容される賦形剤と共に通常の方法により調製することができる：結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は、当技術分野で周知の方法でコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、限定するものではないが、溶液、シロップもしくは懸濁液の剤形をとることができ、またはそれらは使用前に水もしくは他の好適なヒビクルで調製するための粉末製品として提示してもよい。そのような液体製剤は、以下のもののような製薬上許容される添加剤と共に、通常の方法を用いて調製することができる：懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；および保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）。製剤はまた、緩衝塩、香料、着色料、および甘味料を適宜含有することができる。経口投与用の製剤は、好適には予防薬または治療薬の遅延放出、制御放出、または持続放出用に製剤化することができる。
【０２４２】
本発明の方法は、エアロゾル化剤と共に製剤化した組成物の、例えば吸入器または噴霧器を用いた肺内投与を含むことができる。例えば、米国特許第6,019,968号、同第5,985, 320号、同第5,985,309号、同第5,934,272号、同第5,874,064号、同第5,855,913号、同第5,290,540号、および同第4,880,078号；並びにPCT公開公報WO 92/19244号、同WO 97/32572号、同WO 97/44013号、同WO 98/31346号、および同WO 99/66903号を参照のこと（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。具体的な実施形態では、本発明の抗体、組合せ治療剤、および／または本発明の組成物を、Alkermes AIRTM 肺内薬剤送達技術（Alkermes, Inc., Cambridge, MA）を用いて投与する。
【０２４３】
本発明の方法は、注入による（例えばボーラス注射または連続注入による）非経口投与のために製剤化した組成物の投与を含んでもよい。注入のための製剤は、添加された保存料を含む単位剤形で（例えばアンプル中に、または複数用量容器中に）提示することができる。組成物は油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような剤形を採ることができ、また懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような医薬用試薬を含有してもよい。あるいはまた、有効成分は使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌で、発熱物質フリーの水）を用いて調製するための粉末形態であってもよい。
【０２４４】
本発明の方法はさらに、デポー製剤として製剤化した組成物の投与を含んでもよい。そのような長期作用製剤は、インプランテーション（例えば皮下、または筋内への）により、または筋内注射により投与してもよい。したがって、例えば、組成物を好適なポリマー性もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）製剤化してもよい。
【０２４５】
本発明の方法は、中性または塩の形態で製剤化した組成物の投与を包含する。製薬上許容される塩としては、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののようなアニオンを用いて形成したもの、および例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのカチオンを用いて形成したものが挙げられる。
【０２４６】
一般的には、組成物の成分は、別々かまたは単位剤形に一緒に混合して、例えば凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、密閉容器（例えば活性薬剤の量を表示したアンプルもしくは小袋）中に供給する。投与の形式が点滴である場合には、無菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する点滴瓶を用いて組成物を提供することができる。投与の形式が注射である場合には、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができ、それにより投与前に成分を混合してもよい。
【０２４７】
特に、本発明はまた、本発明の予防薬もしくは治療薬、または医薬組成物が、薬剤の量を表示したアンプルまたは小袋のような密閉容器中に封入されていることを規定する。一実施形態では、本発明の１以上の予防薬もしくは治療薬、または医薬組成物を、密閉容器中の無菌凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として供給し、そして被験者への投与に適当な濃度にまで（例えば水または生理食塩水を用いて）再調製することができる。好ましくは、本発明の１以上の予防薬もしくは治療薬、または医薬組成物は、密閉容器中の無菌凍結乾燥粉末として、すくなくとも5mg、より好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも75mg、または少なくとも100mgの単位投与量で供給される。凍結乾燥した本発明の予防薬もしくは治療薬または医薬組成物は、そのもともとの容器中で、２℃〜８℃の間で保存しなければならず、また本発明の予防薬もしくは治療薬または医薬組成物は、再調製後１週間以内、好ましくは５日以内、72時間以内、48時間以内、24時間以内、12時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与しなければならない。別の実施形態では、本発明の１以上の予防薬もしくは治療薬または医薬組成物は、薬剤の量および濃度を表示した密閉容器中に液状で供給される。好ましくは、投与される液状の組成物は、密閉容器中に、少なくとも0.25mg/ml、より好ましくは少なくとも0.5mg/ml、少なくとも１mg/ml、少なくとも2.5mg/ml、少なくとも５mg/ml、少なくとも８mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも75mg/ml、または少なくとも100mg/mlで供給される。液状組成物はそのもともとの容器中で、２℃〜８℃の間で保存しなければならない。
【０２４８】
一般的には、本発明の組成物の成分は、その組成物のレシピエントと同じ種に由来するか同じ種反応性である被験者から誘導したものである。したがって、好ましい実施形態では、治療または予防のためには、ヒト患者に対してはヒト抗体またはヒト化抗体を投与する。
【０２４９】
5.8.1  遺伝子治療
具体的な実施形態では、本発明の抗体または本発明の別の予防薬もしくは治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を、遺伝子治療によって疾患もしくはその１以上の症状を治療、予防、管理、または改善するために投与する。遺伝子治療とは、発現されるかまたは発現されうる核酸の、被験者への投与により行われる治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、それがコードする本発明の抗体または予防薬もしくは治療薬（予防効果もしくは治療効果を媒介する）をもたらす。
【０２５０】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれをも、本発明に従って用いることができる。遺伝子治療の方法の一般的な総説としては、Goldspiel ら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu および Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；ならびに Morgan および Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215 を参照されたい。用いることのできる組換えDNA技術の分野で公知の方法は、Ausubel ら (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；および Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) に記載されている。
【０２５１】
一実施形態では、本発明の方法は本発明の抗体または別の予防薬もしくは治療薬をコードする核酸配列を含んでなる組成物の投与を含み、該核酸は本発明の抗体、別の予防薬もしくは治療薬、またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質または重鎖もしくは軽鎖を、好適な宿主内で発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、抗体コード領域と機能的に連結されたプロモーター（好ましくは異種起源プロモーター）を有し、該プロモーターは誘導的または構成的であり、また場合によっては組織特異的である。別の実施形態では、本発明の抗体または別の予防薬もしくは治療薬のコード配列および他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域に連結されており、それにより抗体をコードする核酸の染色体内発現が可能になる状態で、核酸分子を用いる（Koller および Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstra ら, 1989, Nature 342:435-438）。具体的な実施形態では、発現される抗体または他の予防薬もしくは治療薬は一本鎖抗体であり；あるいはまた、核酸配列は本発明の抗体または別の予防薬もしくは治療薬の重鎖および軽鎖の両方、またはそれらのフラグメントをコードする配列を含む。
【０２５２】
被験者への核酸の送達は、直接的（この場合、被験者を核酸または核酸輸送ベクターに直接的に曝露させる）、または間接的（この場合、まずin vitroで核酸を用いて細胞を形質転換し、その後被験者に移植する）のいずれでもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれin vivoまたはex vivo遺伝子治療として公知である。
【０２５３】
具体的な実施形態では、核酸配列をin vivoで直接的に投与し、この場合にはそれが発現して、コードされた産物を産生する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれによっても実現することができ、例えばそれらを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを投与してそれらが細胞内に入るようにすることによって（例えば欠損または弱毒レトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを用いた感染により（米国特許第4,980,286号参照）、または裸のDNAの直接注入により、または微小粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont）もしくは脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション試薬によるコーティング、リポソーム、微小粒子もしくはマイクロカプセルへのカプセル化を用いることにより、または核に侵入することが知られているペプチドと連結して投与することにより、受容体介在エンドサイトーシスに供されるリガンドと連結して投与することにより（例えば、Wu および Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 参照）（この方法は受容体を特異的に発現する標的細胞型に対して用いることができる））行うことができる。別の実施形態では、核酸−リガンド複合体を形成させ、ここで該リガンドはエンドソームを阻害する融合性（fusogenic）ウイルスペプチドを含むものであり、それにより核酸がリソソーム性分解を回避できるようにすることができる。また別の実施形態では、特異的な受容体を標的化することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現のために核酸をin vivoで標的化することができる（例えば、国際公開公報WO 92/06180号；同WO 92/22635号；同W092/20316号；同W093/14188号；および同WO 93/20221号を参照）。あるいはまた、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞DNAに組み込むことができる（Koller および Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；および Zijlstra ら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０２５４】
具体的な実施形態では、本発明の抗体、別の予防薬もしくは治療薬、またはそれらのフラグメントをコードする核酸配列を含んでなるウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Miller ら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599 参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの適正なパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みのために必要なエレメントを含んでなる。遺伝子治療に用いるための本発明の抗体または別の予防薬もしくは治療薬をコードする核酸配列は、被験者への遺伝子の送達を容易にする１以上のベクター内にクローニングされる。レトロウイルスベクターについての詳細は、Boesen ら, 1994, Biotherapy 6:291-302 中に見出すことができ、これは、化学療法に対してより耐性な幹細胞を作製する目的で、造血幹細胞にmdr 1遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している他の引用文献は、以下のものである：Clowes ら, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Klein ら, 1994, Blood 83:1467-1473；Salmons および Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；ならびに Grossman および Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114。
【０２５５】
アデノウイルスは、遺伝子治療に用いることができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸器系上皮に対して遺伝子を送達するために特に関心が持たれる運搬体である。アデノウイルスは、自然界で呼吸器上皮に感染し、そこで軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Kozarsky および Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 には、アデノウイルスに基づく遺伝子治療についての総説が示されている。Bout ら, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 では、アカゲザルの呼吸器上皮に対して遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、以下の文献中に見出すことができる：Rosenfeld ら, 1991, Science 252:431-434；Rosenfeld ら, 1992, Cell 68:143-155；Mastrangeli ら, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT 公開公報 W094/12649号；およびWang ら, 1995, Gene Therapy 2:775-783。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターを用いる。
【０２５６】
アデノ随伴ウイルス（AAV）もまた、遺伝子治療での使用が提案されている（Walsh ら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；および米国特許第5,436,146号）。
【０２５７】
遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染のような方法による組織培養物中の細胞への遺伝子の導入を含む。通常、導入の方法は、細胞への選択マーカーの導入を含む。細胞をその後、導入した遺伝子を取り込み、それを発現している細胞を単離するために選別にかける。そしてそれらの細胞を被験者に送達する。
【０２５８】
この実施形態では、核酸を細胞に導入し、その後結果として得られる組換え細胞のin vivoでの投与を行う。前記導入は、当技術分野で公知のいかなる方法を用いても行うことができ、そのような方法としては、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含んでなるウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体仲介遺伝子導入、マイクロセル仲介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などが挙げられる。細胞に外来性遺伝子を導入するための多数の技術が当技術分野で公知であり（例えば、Loeffler および Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohen ら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；Clin. Pharma. Ther. 29:69-92 (1985) 参照）、レシピエント細胞の不可欠な発達および生理的機能を阻害しないで、本発明に従って用いることができる。該技術は、細胞への核酸の安定な導入を可能にし、それにより核酸が細胞により発現可能となり、かつ好ましくは遺伝してその細胞の子孫によっても発現可能とならなければならない。
【０２５９】
結果として得られる組換え細胞を、当技術分野で公知の種々の方法によって被験者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは静脈内に投与する。使用を予定する細胞の量は、限定するものではないが、所望の効果および患者の病状をはじめとするいくつかの要因に依存し、当業者が決定することができる。
【０２６０】
遺伝子治療の目的で核酸を導入しうる細胞は、いずれの利用可能な細胞をも包含し、そのような細胞としては、限定するものではないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮ケラチン細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞（例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、巨核球、顆粒球）；種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞（例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られる）が挙げられる。好ましい実施形態では、遺伝子治療に用いる細胞は被験者の自己由来のものである。
【０２６１】
遺伝子治療に組換え細胞を用いる実施形態では、抗体またはそのフラグメントをコードする核酸配列を細胞内に導入し、それによりそれらを細胞もしくはその子孫により発現可能とし、そして組換え細胞を治療効果を求めてin vivo投与する。具体的な実施形態では、幹細胞または前駆細胞を用いる。単離およびin vitroでの維持が可能ないかなる幹細胞および／または前駆細胞も、潜在的には本発明のこの実施形態に従って用いうる（例えば、PCT 公開公報 WO 94/08598号；Stemple および Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229；ならびに Pittelkow および Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771 参照）。
【０２６２】
具体的な実施形態では、遺伝子治療の目的で導入するための核酸は、適当な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより核酸の発現を制御可能とする、コード領域に機能的に連結された誘導可能プロモーターを含んでなる。
【０２６３】
5.9  投与量および投与回数
疾患もしくはその１以上の症状の治療、管理、予防または改善に有効であろう本発明の予防薬もしくは治療薬または組成物の量は、標準的な臨床実務により決定することができる。投与回数および投与量は、投与する具体的な治療剤または治療剤群（例えば具体的な治療薬または予防薬）、障害、疾患もしくは病状の重症度、投与経路、同様に年齢、体重、応答、患者の免疫状態、および患者の過去の医療履歴に依存する、各患者に特異的な因子に応じて変わるであろう。例えば、疾患もしくはその１以上の症状の治療、予防、管理、または改善に有効であろう本発明の予防薬もしくは治療薬または組成物の投与量は、動物モデル（例えば本明細書中に開示されているかまたは当業者に公知の動物モデル）に対して組成物を投与することにより決定することができる。さらに、場合によっては適正な投与量の範囲の特定を助けるためにin vitroアッセイを用いてもよい。好適な処方は、そのような因子を考慮することにより、また例えば文献に報告され、Physician’s Desk Reference (第57版, 2003) において推奨されている投与量に従って、当業者が選択することができる。
【０２６４】
本発明の予防および／または治療プロトコルの毒性および／または有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な製薬上の手法によって測定することができ、例えばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％で治療上有効な用量）を決定することにより、測定することができる。毒性作用と治療的作用との用量比が治療指数であり、これはLD50／ED50の比で表される。大きな治療指数を示す治療薬が好ましい。毒性副作用を示す治療薬を用いてもよいが、非感染細胞への起こりうるダメージを最小限にするために、そしてそれにより副作用を軽減するために、罹患組織の部位に対してそのような薬剤をターゲットする送達システムを設計することに留意すべきである。
【０２６５】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトでの使用のための予防薬および／または治療薬の投与量の範囲を計画するのに用いることができる。そのような薬剤の投与量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く有しないED50を含む循環濃度の一定範囲内にある。投与量は、用いる投与剤形および用いる投与経路に依存して、この範囲内で変化しうる。本発明の方法で用いるいかなる治療に対しても、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから、まず見積もることができる。細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大半値阻害を実現する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するために、動物モデルにおいて用量を設定してもよい。そのような情報は、ヒトで有効な用量をより精密に決定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０２６６】
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、および抗体に関しては、患者に投与する投与量は、典型的には0.01mg/kg〜100mg/kg 患者体重である。好ましくは、患者に投与する投与量は、0.1mg/kg〜20mg/kg 患者体重、より好ましくは１mg/kg〜10mg/kg 患者体重である。一般的に、ヒト抗体およびヒト化抗体は、外来性ポリペプチドに対する免疫応答による他の生物種由来の抗体よりも、ヒト体内で長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体は多くの場合、より少ない投与量およびより少ない投与回数が可能である。
【０２６７】
小分子の代表的な用量としては、被験者体重のキログラム当たりミリグラムまたはマイクログラム量の小分子（例えば、約１マイクログラム／キログラム〜約500ミリグラム／キログラム、約100マイクログラム／キログラム〜約５ミリグラム／キログラム、または約１マイクログラム／キログラム〜約50マイクログラム／キログラム）が挙げられる。
【０２６８】
予防薬または治療薬の投与量については、Physicians’ Desk Reference（第56版, 2002）中に記載されている。
【０２６９】
5.10  生物学的アッセイ
本発明の抗体またはそのフラグメントは、当業者に周知の種々の方法で特性決定することができる。特に、本発明の抗体またはそのフラグメントは、抗原と免疫特異的に結合する能力についてアッセイする。そのようなアッセイは、溶液中で（例えば、Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421）、ビーズ上で（Lam, 1991, Nature 354:82 84）、チップ上で（Fodor, 1993, Nature 364:555 556）、細菌上で（米国特許第5,223,409号）、胞子上で（米国特許第5,571,698号；同第5,403,484号；および同第5,223,409号）、プラスミド上で（Cull ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869）、またはファージ上で（Scott および Smith, 1990, Science 249:386 390；Cwirla ら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382；および Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310）行うことができる（これらの引用文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。特定された抗体またはそのフラグメントは、その後特異性および親和性についてアッセイすることができる。
【０２７０】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、特異的抗原への免疫特異的結合および他の抗原との交差反応性について、当技術分野で公知のいずれの方法を用いてアッセイしてもよい。免疫特異的結合および交差反応性を解析するために用いることができるイムノアッセイとしては、限定するものではないが、いくつか挙げると、例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた、競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは、当技術分野で通常行われ、かつ周知のものである（例えば、Ausubel ら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York を参照、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。代表的なイムノアッセイはセクション5.6に簡単に記載してある。
【０２７１】
本発明の抗体またはそのフラグメントはまた、宿主細胞の受容体に対する抗原の結合を阻害するその能力について、当業者に公知の技術を用いてアッセイすることもできる。例えば、ある受容体を発現している細胞を、リガンドのアンタゴニストである抗体もしくはそのフラグメントの存在下または不在下でその受容体に対するリガンドと接触させることができ、そして該抗体もしくはそのフラグメントがリガンドの結合を阻害する能力を、例えばフローサイトメトリーまたはシンチレーションアッセイによって測定することができる。リガンドまたは抗体もしくは抗体フラグメントは、リガンドとその受容体との相互作用の検出を可能とする、放射性標識（例えば32P、35S、および125I）または蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒドおよびフルオレサミン）のような検出可能な化合物を用いて標識することができる。あるいはまた、抗体またはそのフラグメントがリガンドのその受容体への結合を阻害する能力は、無細胞アッセイにおいて測定することができる。例えば、リガンドを、該リガンドのアンタゴニストである抗体またはそのフラグメントと接触させることができ、そして抗体または抗体フラグメントがリガンドのその受容体への結合を阻害する能力を測定する。好ましくは、リガンドのアンタゴニストである抗体または抗体フラグメントを固相支持体上に固定し、そしてリガンドを検出可能な化合物で標識する。あるいはまた、リガンドを固相支持体上に固定し、抗体またはそのフラグメントを検出可能な化合物で標識する。リガンドは部分的に、もしくは完全に精製したもの（例えば、他のポリペプチドを部分的に、もしくは完全に含まない）であるか、または細胞溶解物の一部であってよい。あるいはまた、リガンドを当業者に周知の技術（例えば、ビオチン化キット, Pierce Chemicals; Rockford, IL）を用いてビオチン化することができる。
【０２７２】
本発明に従って構築され、および／または同定された抗体もしくはそのフラグメントを、細胞の生物学的活性を改変するその能力についてin vitroおよび／またはin vivoで試験することができる。そのような能力は、例えば抗原および遺伝子の発現を検出すること；細胞の増殖を検出すること；シグナル伝達分子（例えば、シグナル伝達因子およびキナーゼ）の活性化を検出すること；細胞のエフェクター機能を検出すること；または細胞の分化を検出することによって評価することができる。当業者に公知の技術を、これらの活性を測定するために用いることができる。例えば、細胞増殖は、3H-チミジン取り込みアッセイおよびトリパンブルー細胞計数によりアッセイすることができる。抗原発現は、例えば、限定するものではないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよびFACS解析のような技術を用いた、競合的および非競合的アッセイ系をはじめとするイムノアッセイによってアッセイすることができる。シグナル伝達分子の活性化は、例えばキナーゼアッセイおよび電気泳動シフトアッセイ（EMSA）によってアッセイすることができる。
【０２７３】
本発明の抗体、そのフラグメント、または組成物は、ヒトでの使用に先立って、所望の治療的または予防的活性について、好ましくはin vitroで、その後in vivoで試験する。例えば、特定の医薬組成物の投与を指示するかどうか決定するのに用いることができるアッセイとしては細胞培養アッセイが挙げられ、そこでは患者組織サンプルを培養し、医薬組成物に曝露するかその他の方法によりそれと接触させ、そして組織サンプルへの当該組成物の作用を観察する。組織サンプルは、患者から生検により取得することができる。この試験により、それぞれの患者に対して治療上最も有効な治療剤（例えば予防薬または治療薬）の特定が可能になる。種々の具体的な実施形態において、特定の疾患に関与する細胞タイプの代表的な細胞を用いてin vitroアッセイを行って、本発明の医薬組成物がその細胞タイプに対して所望の作用を有するかを決定することが可能である。例えば、in vitroアッセイは、細胞株を用いて行うことができる。
【０２７４】
本発明の抗体、そのフラグメント、または組成物の末梢血リンパ球数への影響は、当業者に公知の標準的な技術を用いてモニタリング／評価することができる。被験者体内の末梢血リンパ球数は、例えば、当該被験者から末梢血サンプルを取得し、例えばFicoll-Hypaque（Pharmacia）勾配遠心を用いて血漿などの末梢血の他の成分からリンパ球を分離し、そしてトリパンブルーを用いてリンパ球を計数することにより測定することができる。被験者体内の末梢血T細胞数は、例えば、Ficoll-Hypaque（Pharmacia）勾配遠心を用いて血漿などの末梢血の他の成分からリンパ球を分離し、T細胞抗原に対する抗体（FITCまたはフィコエリトリンにコンジュゲートされている）を用いてT細胞を標識し、そしてFACSによってT細胞の数を計測することにより測定することができる。
【０２７５】
ウイルス感染もしくはその１以上の症状を治療、管理、予防、または改善するのに用いる本発明の抗体、フラグメント、もしくは組成物は、ウイルス複製を阻害するかまたはウイルス量を軽減するその能力について、in vitroアッセイで試験することができる。例えば、ウイルス複製は、例えばJohnson ら（1997, Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224 176:1215-1224）により記載されているようなプラークアッセイによりアッセイすることができる。本発明の方法に従って投与する抗体またはそのフラグメントはまた、ウイルスポリペプチドの発現を阻害するかまたはダウンレギュレートするその能力についてもアッセイすることができる。限定するものではないが、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、およびRT-PCRをはじめとする当業者に公知の技術を、ウイルスポリペプチドの発現を測定するのに用いることができる。
【０２７６】
細菌感染もしくはその１以上の症状を治療、管理、予防、または改善するのに用いる本発明の抗体、フラグメント、もしくは組成物は、当技術分野で周知のin vitroアッセイにおいて試験することができる。当技術分野で公知のin vitroアッセイはまた、治療剤に対する細菌の耐性の存在または発達を試験するのにも用いることができる。そのようなin vitroアッセイは、Gales ら, 2002, Diag. Nicrobiol. Infect. Dis. 44(3):301-311；Hicks ら, 2002, Clin. Microbiol. Infect. 8(11): 753-757；および Nicholson ら, 2002, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 44(1): 101-107 に記載されている。
【０２７７】
真菌感染もしくはその１以上の症状を治療、管理、予防、または改善するのに用いる本発明の抗体、フラグメント、もしくは組成物は、種々の真菌種に対する抗真菌活性について試験することができる。当技術分野で周知のいずれの標準的な抗真菌アッセイも、治療剤の抗真菌活性を評価するのに用いることができる。種々の真菌種に対する抗真菌作用を試験することができる。米国臨床検査標準化委員会（NCCLS）により推奨されている試験（National Committee for Clinical Laboratories Standards. 1995, Proposed Standard M27T. Villanova, Pa. 参照、その全ては参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）および当業者に公知の他の方法（Pfaller ら, 1993, Infectious Dis. Clin. N. Am. 7: 435-444）を、治療剤の抗真菌作用を評価するために用いることができる。治療剤の抗真菌特性はまた、真菌溶解アッセイから、ならびに、とりわけ増殖阻害アッセイ、蛍光に基づく真菌生存率アッセイ、フローサイトメトリー解析、および当業者に公知の他の標準的なアッセイをはじめとする他の方法により、測定してもよい。
【０２７８】
例えば、治療剤の抗真菌活性は、当業者に周知のプロトコルを用いてマクロ希釈法および／またはミクロ希釈法により試験することができる（例えば、Clancy ら, 1997 Journal of Clinical Microbiology, 35(11): 2878-82；Ryder ら, 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42(5): 1057-61；U.S. 5,521,153；U.S. 5,883,120、U.S. 5,521,169 参照、これらの全ては参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。簡単に述べると、真菌株を適当な液体培地中で培養し、用いる特定の真菌株に応じた適当な温度で、これもまた用いる特定の真菌株に応じた一定の時間、増殖させる。接種菌を光学測定により調製し、懸濁液の濁度を標準品（例えばMcFarland 標準）のものと比較する。接種菌の濁度への治療剤の作用を、目視により、または分光光度計により測定する。治療剤の最小阻害濃度（「MIC」）を決定する。ここで、MICとは、培養物の濁度を測定することにより計測される接種菌の可視的増殖を妨げるリード化合物の最低濃度と定義される。
【０２７９】
治療剤の抗真菌活性はまた、当業者に周知の比色アッセイを用いても測定することができる。治療剤の抗真菌活性を評価するのに用いることができる１つの代表的な比色アッセイは、Pfallerらにより記載されている（1994, Journal of Clinical Microbiology, 32(8): 1993-6、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる；Tiballi ら, 1995, Journal of Clinical Microbiology, 33(4): 915-7 も参照）。このアッセイでは、酸化−還元指示薬（Alamar Biosciences, Inc., Sacramento CA）を用いた比色終点を利用する。
【０２８０】
治療剤の抗真菌活性はまた、当業者に周知の光学測定アッセイを用いても測定することができる（例えば、Clancy ら, 1997 Journal of Clinical Microbiology, 35(11): 2878-82；Jahn ら, 1995, Journal of Clinical Microbiology, 33(3): 661-667 参照、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。この光学測定アッセイは、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5,-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド（MTT）のホルマザンへの還元を介して生存真菌によるミトコンドリア呼吸を定量することに基づいている。このアッセイにより測定されるMICとは、光学密度の最初の急激な低下と関連した被験治療剤の最高濃度と定義される。一部の実施形態では、治療剤はマクロ希釈、ミクロ希釈およびMTTアッセイを並行して用いて抗真菌活性についてアッセイする。
【０２８１】
さらに、当業者に公知のいかなるin vitroアッセイも、特定の疾患もしくはその１以上の症状に対する、本明細書中で開示される抗体治療剤の予防上および／または治療上の有用性を評価するのに用いることができる。
【０２８２】
本発明の抗体、組成物、または組合せ治療剤は、ヒトでの使用に先立って、好適な動物モデルシステムで試験することができる。そのような動物モデルシステムとしては、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知のいずれの動物系を用いてもよい。手順のいくつかの面は変更することができ、こうした面としては、限定するものではないが、治療剤を別々に投与するか混合して投与するかといった、治療剤（例えば予防薬および／または治療薬）の投与の時間的計画、および治療剤の投与回数が挙げられる。
【０２８３】
特定の疾患もしくはその１以上の症状を治療、管理、予防、または改善するための本発明の抗体、そのフラグメント、もしくは組成物の有効性を評価するのに、動物モデルを用いることができる。
【０２８４】
本発明の方法に従った抗体、組成物、または組合せ治療剤の投与を、特定の疾患の時間経過を、少なくとも25％、好ましくは少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも95％、または少なくとも99％減少させるその能力について試験することができる。本発明の抗体、組成物、または組合せ治療剤はまた、特定の疾患に罹患したヒトの生存期間を、少なくとも25％、好ましくは少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも95％、または少なくとも99％増加させるその能力についても試験することができる。さらに、本発明の抗体、組成物、または組合せ治療剤は、ウイルス性呼吸器感染症に罹患したヒトの入院期間を、少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも95％、または少なくとも99％短縮させるその能力について試験することができる。当業者に公知の技術を、in vivoで本発明の抗体、組成物、または組合せ治療剤の機能を解析するのに用いることができる。
【０２８５】
さらに、特定の疾患もしくはその１以上の症状に対する、本明細書中で開示されている抗体、そのフラグメント、組成物、組合せ治療剤の予防上および／または治療上の有用性を評価するのに、当業者に公知のいかなるin vivoアッセイも用いることができる。
【０２８６】
本発明の予防および／または治療プロトコルの毒性および／または有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な製薬上の手法によって測定することができ、例えばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％で治療上有効な用量）を決定することにより、測定することができる。毒性作用と治療的効果との用量比が治療指数であり、これはLD50／ED50の比で表される。大きな治療指数を示す治療剤が好ましい。毒性副作用を示す治療剤を用いうるが、非感染細胞への起こりうるダメージを最小限にするために、そしてそれにより副作用を軽減するために、罹患組織の部位にそのような薬剤をターゲットする送達システムを設計することに留意すべきである。
【０２８７】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトでの使用のための予防薬および／または治療薬の投与量の範囲を計画するのに用いることができる。そのような薬剤の投与量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く有しないED50を含む循環濃度の一定範囲内にある。投与量は、用いる投与剤形および用いる投与経路に依存して、この範囲内で変化しうる。本発明の方法で用いるいかなる治療剤に対しても、治療上有効用量は細胞培養アッセイから、まず見積もることができる。用量は、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大半値阻害を実現する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するために、動物モデルにおいて設定してもよい。そのような情報は、ヒトで有効な用量をより精密に決定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０２８８】
5.11.  キット
本発明は、インフレームで融合されたフレームワーク領域およびCDR（例えば、FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3+CDR3+FR4）をコードするヌクレオチド配列を含む、複数の核酸配列を含むコンビナトリアルライブラリーを含有するキットを提供する。
【０２８９】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体を入れた１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。医薬パックまたはキットは、特定の疾患の治療に有用な１以上の他の予防薬または治療薬をさらに含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を入れた１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。場合によっては、そのような容器には、医薬もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた書式の注意書きであって、ヒトへの投与についての製造、使用または販売に関する該機関による認可を反映するものを添えることができる。
【０２９０】
5.12  製造物品
本発明はまた、梱包済みの、ラベルされた医薬品を包含する。本製品は、ガラスバイアルもしくは他の密閉容器のような所定の容器中の所定の単位剤形を含む。非経口投与に好適な投与剤形の場合、有効成分は無菌状態で、微粒子を含まない溶液としての投与に好適なものである。言い換えれば、本発明は、非経口投与用溶液および凍結乾燥粉末剤（いずれも無菌）の両者を包含し、後者は注入前の再調製に好適なものである。あるいはまた、単位剤形は、経口、経皮、局所または粘膜送達に好適な固体であってもよい。
【０２９１】
好ましい実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋内または皮下送達に好適なものである。したがって、本発明は、各送達経路に好適な溶液（好ましくは無菌）を包含する。
【０２９２】
いかなる医薬品とも同様に、包装材料および容器は保存および輸送の間の製品の安定性を保護するために設計される。さらに、本発明の製品は、使用についての説明書、または問題となっている疾患もしくは障害を適切に予防または治療する方法について、医師、技術者または患者に説明する他の資料を含む。言い換えれば、製品は、限定するものではないが、実際の用量、モニタリング方法（例えば平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、および腫瘍サイズをモニタリングする方法）および他のモニタリング情報をはじめとする投薬方式を指示または提案する説明書を含む。
【０２９３】
より具体的には、本発明は、包装材料（例えば箱、瓶、管、バイアル、容器、スプレー容器、吸入器、静脈内（i.v.）バッグ、袋など）；および前記包装材料中に含まれる医薬の少なくとも１つの単位剤形、を含んでなる製品を提供する。本発明はさらに、包装材料（例えば箱、瓶、管、バイアル、容器、スプレー容器、吸入器、静脈内（i.v.）バッグ、袋など）；および前記包装材料中に含まれる各医薬の少なくとも１つの単位剤形を含んでなる製品を提供する。
【０２９４】
具体的な実施形態では、製品は包装材料ならびに前記包装材料中に含まれる医薬および説明書を含んでなり、ここで前記医薬はヒト化抗体および製薬上許容される担体であり、前記説明書は特定の疾患を有する被験者を予防、治療または管理するための投薬方式を指示するものである。別の実施形態では、製品は包装材料ならびに前記包装材料中に含まれる医薬および説明書を含んでなり、ここで前記医薬はヒト化抗体、該ヒト化抗体とは異なる予防薬または治療薬および製薬上許容される担体であり、前記説明書は特定の疾患を有する被験者を予防、治療または管理するための投薬方式を指示するものである。別の実施形態では、製品は包装材料ならびに前記包装材料中に含まれる２種類の医薬および説明書を含んでなり、ここで前記１種類目の医薬はヒト化抗体および製薬上許容される担体であり、前記２種類目の医薬は該ヒト化抗体とは異なる予防薬または治療薬であり、前記説明書は特定の疾患を有する被験者を予防、治療または管理するための投薬方式を指示するものである。
【０２９５】
本発明は、本発明の方法により軽減または回避されうる副作用を、疾患に伴う１以上の症状の予防、治療または改善における使用のために製品に同梱される資料中に示すことを提案する。本発明の方法により軽減または回避されうる副作用としては、限定するものではないが、バイタルサインの異常（例えば発熱、頻脈、徐脈、高血圧、低血圧）、血液学的症状（例えば貧血、リンパ球減少、白血球減少、血小板減少）、頭痛、悪寒、めまい、吐き気、虚弱、背部痛、胸痛（例えば胸部圧迫感）、下痢、筋肉痛、痛み、かゆみ、乾癬、鼻炎、発汗、注射部位反応、および血管拡張が挙げられる。一部の治療剤は免疫抑制性でありうるので、長引く免疫抑制が、日和見感染をはじめとする感染症のリスクを増大させることはありうる。長引く持続性の免疫抑制はまた、あるタイプの癌の進行の増大したリスクももたらしうる。
【０２９６】
さらに、製品中に同梱される資料は、外来性タンパク質はアナフィラキシーまたはサイトカイン放出症候群をはじめとするアレルギー反応も引き起こす可能性があることを知らせることができる。該資料は、アレルギー反応は軽い掻痒性発疹として現れるだけかもしれないし、または紅皮症、スティーブン・ジョンソン症候群、脈管炎、もしくはアナフィラキシーのように重症でありうることを知らせるべきである。該資料はまた、アナフィラキシー反応（アナフィラキシー）は重篤な、ときには致死性の過敏性反応であることも知らせるべきである。アナフィラキシーをはじめとするアレルギー反応は、どんな外来性タンパク質を体内に注入したときにでも起こりうる。それらは蕁麻疹または発疹のような軽い徴候から、致死的な全身性反応にまで及んでいる。アナフィラキシー反応は、曝露のすぐ後に、多くの場合10分以内に起きる。患者は、知覚異常、低血圧、喉頭水腫、精神状態の変化、顔部もしくは咽頭の血管性浮腫、気道閉塞、気管支痙攣、蕁麻疹および掻痒、血清病、関節炎、アレルギー性腎炎、糸球体腎炎、一過性関節炎、または好酸球増多症に見舞われうる。
【０２９７】
該資料はまた、サイトカイン放出症候群が急性の臨床症候群であり、ある種の活性化する抗T細胞抗体の投与と時間的に関連する、ことを示すことができる。サイトカイン放出症候群は、活性化リンパ球または単球によるサイトカインの放出に起因するとされている。サイトカイン放出症候群の臨床症状は、より頻繁に報告される、軽い自然治癒性の「風邪様」疾患から、報告される頻度の低い、重症の、生死に関わるショック様反応（重篤な心血管系、肺および中枢神経系症状を含みうる）にまでわたる。該症候群は、典型的には投与から約30〜60分後に始まり（但しもっと後に起こることもある）、数時間続く。この症状の発生頻度および重症度は多くの場合、初回投与の場合に最も大きい。連続的な投与に従って、この症候群の発生頻度および重症度は減少する傾向にある。用量の増加または中断後の治療の再開は該症候群の再発をもたらすことがある。上述のように、本発明は本明細書中に記載した１以上の副作用を回避するかまたはそれを軽減させる治療法および予防法を包含する。
【０２９８】
5.13  代表的な実施形態
1．ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではない、前記ライブラリー。
【０２９９】
2．ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものである、前記ライブラリー。
【０３００】
3．ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではない、前記ライブラリー。
【０３０１】
4．ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、各ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものであり、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、前記ライブラリー。
【０３０２】
5．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものである、前記ライブラリー。
【０３０３】
6．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製されたものである、前記ライブラリー。
【０３０４】
7．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものである、前記ライブラリー。
【０３０５】
8．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、前記ライブラリー。
【０３０６】
9．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して全体で65％以上同一ではないものである、前記ライブラリー。
【０３０７】
10．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものである、前記ライブラリー。
【０３０８】
11．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、前記ライブラリー。
【０３０９】
12．(i)ヒト化重鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列のライブラリーであって、第１セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではないものであり、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであり、第２セットのヌクレオチド配列中の各ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とをインフレームで一緒に融合することにより作製され、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域全部を合わせたものに対して全体で65％以上同一ではなく、かつキー残基と指定されたアミノ酸残基に１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、前記ライブラリー。
【０３１０】
13．前記アクセプターがヒトである、実施形態1〜12のいずれか１形態に記載のライブラリー。
【０３１１】
14．前記アクセプターが、ヒト抗体の特定の位置に現れないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む、実施形態1〜12のいずれか1形態に記載のライブラリー。
【０３１２】
15．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、Kabatのナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49において、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む、実施形態1、2、5、6、9、10、11または12に記載のライブラリー。
【０３１３】
16．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態2、4、6、8、10、11または12に記載のライブラリー。
【０３１４】
17．実施形態1〜12のいずれか１形態に記載の核酸配列を含む、細胞集団。
【０３１５】
18．実施形態15に記載の核酸配列を含む、細胞集団。
【０３１６】
19．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の同定方法であって、実施形態17に記載の細胞中の核酸配列を発現させ、前記抗原に対して1×106 Ｍ-1以上の親和性を有するヒト化抗体についてスクリーニングすることを含む前記方法。
【０３１７】
20．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の同定方法であって、実施形態18に記載の細胞中の核酸配列を発現させ、前記抗原に対して1×106 Ｍ-1以上の親和性を有するヒト化抗体について同定することを含む前記方法。
【０３１８】
21．実施形態19の方法により同定されたヒト化抗体。
【０３１９】
22．実施形態20の方法により同定されたヒト化抗体。
【０３２０】
23．実施形態21に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【０３２１】
24．実施形態22に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【０３２２】
25．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して全体で65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49にドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２３】
26．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49にドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として65％以上相同ではないフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２４】
27．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２５】
28．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とを含むものであり、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２６】
29．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(ｂ)  (i)軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヒト化重鎖可変領域は、アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有し、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２７】
30．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(ｂ) (i)軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヒト化重鎖可変領域はアミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有し、かつ前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、ここで前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(c)  前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２８】
31．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  (i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および(ii) アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成すること、ただし前記第１のヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とを含み、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３２９】
32．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  (i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および(ii) アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成すること、ただし前記第１のヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とを含み、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであり、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであり、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(d)  前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３３０】
33．前記細胞が、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する、実施形態25に記載の細胞。
【０３３１】
34．前記細胞が、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をさらに含有する、実施形態26に記載の細胞。
【０３３２】
35．軽鎖がヒト化されている、実施形態33または34の細胞。
【０３３３】
36．軽鎖がヒト化されている、実施形態29または30の細胞。
【０３３４】
37．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態26に記載の細胞。
【０３３５】
38．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態28に記載の細胞。
【０３３６】
39．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態30に記載の細胞。
【０３３７】
40．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態31に記載の細胞。
【０３３８】
41．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態32に記載の細胞。
【０３３９】
42．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基の１つまたはそれ以上である、実施形態33に記載の細胞。
【０３４０】
43．変異が置換である、実施形態26に記載の細胞。
【０３４１】
44．変異が置換である、実施形態28に記載の細胞。
【０３４２】
45．変異が置換である、実施形態30に記載の細胞。
【０３４３】
46．変異が置換である、実施形態31に記載の細胞。
【０３４４】
47．変異が置換である、実施形態32に記載の細胞。
【０３４５】
48．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態43に記載の細胞。
【０３４６】
49．置換が、軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態44に記載の細胞。
【０３４７】
50．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態45に記載の細胞。
【０３４８】
51．置換が、軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態46に記載の細胞。
【０３４９】
52．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態47に記載の細胞。
【０３５０】
53．置換が、軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態48に記載の細胞。
【０３５１】
54．置換が、重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態47に記載の細胞。
【０３５２】
55．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基6および23においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態26、30または31に記載の細胞。
【０３５３】
56．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基6および24においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態26、30または31に記載の細胞。
【０３５４】
57．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基6および49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態26、30または31に記載の細胞。
【０３５５】
58．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基23および49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態26、30または31に記載の細胞。
【０３５６】
59．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基24および49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態26、30または31に記載の細胞。
【０３５７】
60．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基23および24においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態26、30または31に記載の細胞。
【０３５８】
61．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態55に記載の細胞。
【０３５９】
62．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態56に記載の細胞。
【０３６０】
63．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態60に記載の細胞。
【０３６１】
64．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基24においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態55に記載の細胞。
【０３６２】
65．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態64に記載の細胞。
【０３６３】
66．キーと指定されたアミノ酸残基が、Kabatナンバリングシステムに従った重鎖可変フレームワーク領域アミノ酸残基6、23、24および49ではない、実施形態26、30、または32に記載の細胞。
【０３６４】
67．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域と60％以上相同ではない、実施形態25、26、29、30、31または32に記載の細胞。
【０３６５】
68．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域と55％以上相同ではない、実施形態67に記載の細胞。
【０３６６】
69．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域と50％以上相同ではない、実施形態68に記載の細胞。
【０３６７】
70．アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域と65％以上相同ではない、実施形態27、28、31または32に記載の細胞。
【０３６８】
71．アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域と60％以上相同ではない、実施形態70に記載の細胞。
【０３６９】
72．アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域と55％以上相同ではない、実施形態71に記載の細胞。
【０３７０】
73．ヒト化重鎖可変フレームワーク領域のドナー抗体アミノ酸残基が、CDRの６Å以内にはない、実施形態25、26、29、30、31または32に記載の細胞。
【０３７１】
74．ヒト化軽鎖可変フレームワーク領域のドナー抗体アミノ酸残基が、CDRの６Å以内にはない、実施形態26、30、または32に記載の細胞。
【０３７２】
75．前記アクセプターがヒトである、実施形態25〜32のいずれか1形態に記載の細胞。
【０３７３】
76．前駆アクセプターがヒト抗体の特定の位置に現れないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む、実施形態25〜32のいずれか1形態に記載の細胞。
【０３７４】
77．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３７５】
78．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヒト化重鎖可変領域はアミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上相同ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するものであり、ここで前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、ここで前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(c)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３７６】
79．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３７７】
80．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、ここで前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであること；
(c)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３７８】
81．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  (i)軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列および(ii)ヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヒト化重鎖可変領域はアミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上相同ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するものであり、前記第２セットのヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(c)  前記第１セットのヌクレオチド配列および前記第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３７９】
82．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  (i)軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヒト化重鎖可変領域はアミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上相同ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するものであり、かつ前記第２セットのヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、キー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(c)  前記第１セットのヌクレオチド配列と前記第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３８０】
83．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、およびヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし(i)前記第１セットのヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであり；(ii)前記第２セットのヌクレオチド配列は、アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上相同ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するものであり、かつ前記第２セットのヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記第１セットのヌクレオチド配列と前記第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３８１】
84．複数のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作された細胞集団であって、以下を含む方法により作製される前記細胞集団：
(a)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体のフレームワーク領域とアクセプター重鎖可変フレームワーク領域との間で保存されていないアミノ酸残基を含有し、ここで前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  (i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１セットのヌクレオチド配列、および(ii)ヒト化重鎖可変領域をコードする第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記第１セットのヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、前記アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものであり、前記第２セットのヌクレオチド配列によりコードされる前記ヒト化重鎖可変領域は、アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するものであり、かつ前記第２セットのヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸を含み、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定されたアミノ酸残基に導入された１以上の変異を含有し、ここで前記キー残基はKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであること；
(d)  前記第１セットのヌクレオチド配列と前記第２セットのヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０３８２】
85．細胞がさらに、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、実施形態77に記載の細胞。
【０３８３】
86．細胞がさらに、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態78に記載の細胞。
【０３８４】
87．軽鎖がヒト化されたものである、実施形態81または82に記載の細胞。
【０３８５】
88．軽鎖がヒト化されたものである、実施形態85または87に記載の細胞。
【０３８６】
89．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態78に記載の細胞。
【０３８７】
90．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態80に記載の細胞。
【０３８８】
91．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態82に記載の細胞。
【０３８９】
92．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態83に記載の細胞。
【０３９０】
93．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態84に記載の細胞。
【０３９１】
94．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態85に記載の細胞。
【０３９２】
95．変異が置換である、実施形態78に記載の細胞。
【０３９３】
96．変異が置換である、実施形態80に記載の細胞。
【０３９４】
97．変異が置換である、実施形態82に記載の細胞。
【０３９５】
98．変異が置換である、実施形態83に記載の細胞。
【０３９６】
99．変異が置換である、実施形態84に記載の細胞。
【０３９７】
100．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態95に記載の細胞。
【０３９８】
101．置換が、軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態96に記載の細胞。
【０３９９】
102．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態97に記載の細胞。
【０４００】
103．置換が、軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態98に記載の細胞。
【０４０１】
104．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態99に記載の細胞。
【０４０２】
105．置換が、軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態99に記載の細胞。
【０４０３】
106．置換が、重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態99に記載の細胞。
【０４０４】
107．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基6および23においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態78、82または83に記載の細胞。
【０４０５】
108．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基6および24においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態78、82または83に記載の細胞。
【０４０６】
109．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基6および49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態78、82または83に記載の細胞。
【０４０７】
110．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基23および49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態78、82または83に記載の細胞。
【０４０８】
111．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基24および49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態78、82または83に記載の細胞。
【０４０９】
112．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸残基23および24においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態78、82または83に記載の細胞。
【０４１０】
113．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態107に記載の細胞。
【０４１１】
114．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態108に記載の細胞。
【０４１２】
115．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態112に記載の細胞。
【０４１３】
116．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基24においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態107に記載の細胞。
【０４１４】
117．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、さらにアミノ酸残基49においてドナー抗体アミノ酸残基を含む、実施形態116に記載の細胞。
【０４１５】
118．キーと指定されたアミノ酸残基が、Kabatナンバリングシステムに従った重鎖可変フレームワーク領域アミノ酸残基6、23、24および49ではない、実施形態78、82、または83に記載の細胞。
【０４１６】
119．アクセプター重鎖可変フレームワーク領域が、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域と60％以上同一ではない、実施形態77、78、79、80、81、82、83または84に記載の細胞。
【０４１７】
120．前記アクセプターがヒトである、実施形態77〜84のいずれか1つに記載の細胞。
【０４１８】
121．前記アクセプターが、ヒト抗体の特定の位置に現れないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む、実施形態77〜84のいずれか1つに記載の細胞。
【０４１９】
122．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態25に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２０】
123．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態26に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２１】
124．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態27に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２２】
125．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態29に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２３】
126．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態30に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２４】
127．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態31に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２５】
128．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、実施形態32に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【０４２６】
129．ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞を用意し、前記ヌクレオチド配列を発現させることを含む、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、前記ヌクレオチ配列を含有する細胞は、以下により作製されたものである：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対して、ドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入すること。
【０４２７】
130．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞を用意し、前記ヌクレオチド配列を発現させることを含む前記方法、ただし前記ヌクレオチ配列を含有する細胞は以下により作製されたものである：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対してドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含み、前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域はキー残基と指定された残基に導入された１以上の変異を有するものであること；
(d)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【０４２８】
131．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、およびバーニヤゾーン内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態129に記載の方法。
【０４２９】
132．キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、実施形態130に記載の方法。
【０４３０】
133．変異が置換である、実施形態131に記載の方法。
【０４３１】
134．変異が置換である、実施形態132に記載の方法。
【０４３２】
135．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態133に記載の方法。
【０４３３】
136．置換が、重鎖可変フレームワーク領域のアクセプターアミノ酸残基を、ドナー重鎖可変フレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と置き換えるものである、実施形態134に記載の方法。
【０４３４】
137．キーと指定されたアミノ酸残基が、アミノ酸残基6、23、24および49ではない、実施形態129に記載の方法。
【０４３５】
138．キーと指定されたアミノ酸残基が、アミノ酸残基6、23、24および49ではない、実施形態130に記載の方法。
【０４３６】
139．前記アクセプターがヒトである、実施形態129または130に記載の方法。
【０４３７】
140．前記アクセプターが、ヒト抗体の特定の位置に現れないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む、実施形態129または130に記載の方法。
【０４３８】
141．実施形態122、123、124、125、126、127または128の方法により製造されたヒト化抗体。
【０４３９】
142．実施形態129または130に記載の方法により製造されたヒト化抗体。
【０４４０】
143．実施形態138に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【０４４１】
144．実施形態142に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【０４４２】
145．抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の同定方法であって、実施形態53、54、55、56、57、58または59に記載の細胞中の核酸配列を発現させ、前記抗原に対して1×106 Ｍ-1以上の親和性を有するヒト化抗体についてスクリーニングすることを含む前記方法。
【０４４３】
146．実施形態145に記載の方法により同定されたヒト化抗体。
【０４４４】
147．実施形態146に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【実施例】
【０４４５】
6.  実施例：抗インターロイキン-9抗体のヒト化
インターロイキン-９(「IL-9」)は4-ヘリックス束サイトカインファミリーのメンバーであり、このファミリーにはIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-15およびIL-23が含まれる。IL-9は、マウスにおけるいくつかの抗原誘導性応答において重要な役割を果たすが、こうした応答としては、例えば気管支過敏性、上皮性ムチン産生、好酸球増加、T細胞、B細胞、肥満細胞、好中球および気管支洗浄における他の炎症性細胞のカウント数の増加、炎症と関連した肺の組織学的変化、ならびに上昇した血清総IgEが挙げられる。米国出願第60/477797号および第60/477801号(いずれも2003年6月10日にMedImmune, Inc.により出願されたものであり、参照により本明細書にその内容を組み入れる)を参照されたい。IL-9は活性化T細胞および肥満細胞により発現され、T細胞増殖因子として機能する。さらに、IL-9は、赤血球前駆細胞、B細胞、肥満細胞、好酸球、および胎児胸腺細胞の増殖を仲介し、インターロイキン-3(「IL-3」)と相乗作用的に作用して肥満細胞の活性化および増殖を誘導し、肺上皮によるムチン産生を促進する。
【０４４６】
ヒトIL-9とマウスIL-9の遺伝子については構造上の類似性が観察されており、このことはヒトIL-9が、ヒトにおけるぜん息性免疫応答の兆候において類似の役割を果たすと期待される。低い免疫原性と、ヒトIL-9に対する高い結合親和性とを有する抗体を、ヒトの治療に用いるために設計することができれば、ぜん息のような、IL-9発現と関連する疾患または症状のヒト患者にとって有益である。本実施例は、本発明に従ってこのような抗体をいかに構築することができるかを実証する。
【０４４７】
6.1  ヒトフレームワークの選択
設計の規則(セクション5.1を参照)に従い、ドナー重鎖CDRループをグラフトするためにヒト生殖系列JH4と組み合わせたVH3-23を使用し、ドナー軽鎖CDRループをグラフトするためにヒト生殖系列Jκ4と組み合わせたL23を使用した(図２参照)。これらの組み合わせを用いたとき、ドナー抗体およびアクセプター抗体のフレームワーク間の相同性はKabatの定義に従い、軽鎖および重鎖についてそれぞれ60％および56.3％であった。ヒト化軽鎖については、4つの位置に多様性を導入した(Kabatナバリングに従った41、47、49および71)。ヒト化重鎖については、重鎖CDR1および2のどの定義(すなわち、それぞれChothiaまたはKabat)を用いるかによって、4つ(Kabatのナンバリングに従った49、67、71および94)または6つ(Kabatのナンバリングに従った27、30、49、67、71および94)の位置を多様化させた(図３参照)。簡潔に述べると、ヒト化L1-軽鎖およびL1-重鎖を合成するために、オーバーラップ伸長によるポリメラーゼ連鎖反応を用いて突然変異誘発を行ったが、ここで全てのマウス残基は、多様性が導入された領域(図３およびセクション5.1の規則(6)(a)〜(f)を参照)またはドナー残基が固定された領域(図３および規則(5)を参照)を除いて、そのヒト対応残基で置換された。これはヒト残基とマウス残基の両方のコドン(ゆらぎ)をコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて行った。
【０４４８】
6.2  コンビナトリアルライブラリーの構築
2つのライブラリーを構築した。ライブラリー1は、長さが47mer〜80merのオリゴヌクレオチドを使用した軽鎖コンビナトリアルライブラリーおよび重鎖コンビナトリアルライブラリー(Kabatの定義に従うCDRを含む)を含むものであった(表７および８を参照されたい)。ライブラリー2は、長さが39mer〜60merのオリゴヌクレオチドを使用した軽鎖コンビナトリアルライブラリーおよび重鎖コンビナトリアルライブラリー(Chothiaの定義に従うCDRを含む)を含むものであった(表９および１０参照。表７〜１０において、全てのオリゴヌクレオチドは5'から3’の方向で示されており、名称の後に配列が続き、ここでK=GまたはT、M=AまたはC、R=AまたはG、S=CまたはG、W=AまたはTおよびY=CまたはTである)。
【表７】
2007528723.tif 000015
【表８】
2007528723.tif 000016
【表９】
2007528723.tif 000017
【表１０】
2007528723.tif 000018
【０４４９】
重鎖および軽鎖ライブラリーは、Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りに、以下のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてアセンブルした。ライブラリー1重鎖：1K〜11K；ライブラリー1軽鎖：1'K〜10'K；ライブラリー2重鎖：1C〜15C；およびライブラリー2軽鎖：1'C〜14'C。
【０４５０】
次にVHおよびVL遺伝子を、Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りに、以下のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて増幅した。ライブラリー1重鎖：1K/11K；ライブラリー1軽鎖：1'K/10'K；ライブラリー2重鎖：1C/15C；およびライブラリー2軽鎖：1'C/14'C。
【０４５１】
キメラFab(マウスVHおよびVL領域が対応するヒト定常領域に融合されたもの)もまた構築したが、これはそれぞれCmH/CmH'およびCmL/CmL'オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、L1-VLおよびL1-VHをコードする遺伝子(図１参照)を増幅した後に行った(下記とセクション6.3を参照されたい)。
【０４５２】
CmH  ビオチン-GATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAG (配列番号 497)
CmH’  GGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGAGTAGAGTCCC (配列番号 498)
CmL  ビオチン-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGACATCTTGCTGACTCAGTCTCC (配列番号 499)
CmL’ GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTTCCAGC (配列番号 500)
【０４５３】
その後、マイナス一本鎖DNAをエタノール沈殿により精製した。それに先立って、水酸化ナトリウムを用いて二本鎖PCR産物を解離させ、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズを用いてビオチン化鎖を除去した。これはWu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233 および Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りであった。
【０４５４】
6.3  発現系へのコンビナトリアルライブラリーのクローニング
ライブラリー1および2、ならびにキメラ構築物を、M13に基づくファージベクター内にクローニングした。このベクターは、ヒトγ1重鎖の第１定常ドメインおよびヒトカッパ(κ)軽鎖の定常ドメインを含有するFabフラグメントの発現を、lacZプロモーターの制御下で可能にする(図４を参照されたい)。これは実質的にWu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233, Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212およびKunkelら, 1987, Methods Enzymol. 154, 367-382に記載された通りに、ハイブリダイゼーション突然変異誘発により行った。簡潔に述べると、クローニングすべき重鎖および軽鎖に対応する精製済みのマイナス鎖を、それぞれ１つのパリンドロームループを含む2つの領域にアニーリングさせた。これらのループはユニークXbaI部位を含み、これはヒトカッパ(κ)定常領域および第１ヒトγ1定常領域とインフレームで融合されたVL鎖とVH鎖の両方を含有するベクターの選択を可能にする(Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233 および Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212)。次に合成されたDNAを、Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載の通りにXL1-blue細菌叢上でのプラーク形成またはFabフラグメントの産生のために、XL1-blue内にエレクトロポレーションした。
【０４５５】
6.4  ライブラリーのスクリーニング
ライブラリーをスクリーニングするために、捕捉リフトアッセイ(capture lift assay)を用いた一次スクリーニングを行い、続いてシングルポイントELISA(SPE)二次スクリーニングを行った。しかし、SPEをライブラリーの最初のスクリーニングに使用することも可能である。
【０４５６】
ライブラリー１および２の一次スクリーニング
ライブラリー１および２は、実質的にWu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りに捕捉リフトアッセイでスクリーニングした。フィルターをビオチン化ヒトIL-9とともにインキュベート後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートで発色させて、IL-9結合抗体(binder)を同定した。二次スクリーニングのために、ライブラリー１および２からそれぞれ、6個および40個の陽性クローンを選択した(図５を参照されたい)。
【０４５７】
ライブラリー１および２の二次スクリーニング
二次スクリーニングは、捕捉リフトアッセイで同定されたクローンを確認するために、上清発現Fabフラグメントに対するELISAで行った。96深底ウェルプレートで増殖させた1ml細菌培養物から調製した上清を用いて、２種類のELISA、すなわち定量的ELISAおよび機能的ELISAを行った。
【０４５８】
定量的ELISA:  これは実質的にWu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りに実施した。簡潔に述べると、濃度を抗ヒトFab ELISAにより測定したが、ここでは96ウェルImmulon Immunoplateの個々のウェルを50ngのヤギ抗ヒトFab抗体でコーティングし、次にサンプル(上清発現Fab)または標準物質(ヒトIgG Fab)とインキュベートした。次にヤギ抗ヒトκ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートとインキュベートした。HRP活性をテトラメチルベンジジン(TMB)基質で検出し、反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。ライブラリー１および２からの、それぞれ4個および32個のクローンが検出可能な量のFabを発現した。次に、これらのクローンを二次スクリーニングの次の段階のために選択した(下記を参照されたい)。
【０４５９】
機能的ELISA:  簡潔に述べると、IL-9結合活性はIL-9に基づくELISAで測定したが、ここでは96ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルを50ngのヒトIL-9でコーティングし、1％BSA/0.1％Tween 20でブロックし、次にサンプル(上清発現Fab)とインキュベートした。次にヤギ抗ヒトκ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートとインキュベートした。HRP活性をTMB基質で検出し、反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
【０４６０】
6.5  選択されたヒト化クローンの特徴付けと解析
二次スクリーニング後に陽性と検証されたクローンを、ABI300ゲノムアナライザを用いてジデオキシ塩基配列決定により特徴付けした。ライブラリー１および２について、それぞれ4個および21個のユニーク配列が見出された(図６を参照されたい)。これらの抗IL-9モノクローナルL1の異なるヒト化型は、軽鎖および重鎖に、それぞれ2〜5個および3〜7個のマウス残基を含有する。全体としてはマウス残基の数は5〜10個であった。これらの数には軽鎖および重鎖それぞれで固定された2個の非ヒト残基が含まれる(セクション5.1の規則(5)を参照のこと)。興味深いことに、軽鎖の位置49ならびに重鎖の位置49および71は、ほぼ例外なく、対応する非ヒト残基を保持する。このことは、それらのフレームワーク残基がIL-9への結合を維持するうえで重要な役割を果たすことを示唆する。
【０４６１】
二部構成の二次ELISAスクリーニングは、ヒトIL-9への結合に関して、本発明者らに、クローン同士を比較し、さらにクローンをL1のキメラFabと比較することを可能にした(図７を参照されたい)。図７に示すように、L1のキメラFabと比較して、殆どのヒト化分子はIL-9への良好な結合を保持した。特に、いくつかのヒト化クローンは、キメラ分子よりも良好なIL-9への結合を示した(クローン2'、3'、3、4、6、8、9、17、20、21、23、29、30および42、図７Ａを参照されたい)。他のヒト化クローンは、キメラ分子と同程度のIL-9への結合を示した(クローン8'、1、11、16、22、25、26、28および34、図７Ｂを参照)が、2個の偽陽性クローン(7'と38)は有意な結合活性を示さなかった(図７Ｂを参照のこと)。
【０４６２】
このようにして、本発明の戦略は、そのコグネイト抗原への良好な結合を保持する非ヒト化抗体の種々のヒト化型の製造を可能にした。
【０４６３】
7  実施例：抗EphA2抗体のヒト化
EphA2は、成体上皮で発現される130kDaの受容体チロシンキナーゼであり、上皮には低レベルで見出され、細胞-細胞接着の箇所において富化される(Zantekら, Cell Growth & Differentiation 10:629, 1999; R.A. Lindberg ら, Molecular & Cellular Biology 10: 6316, 1990)。EphA2が細胞膜に固着されているリガンド(Ephrin A1〜A5と呼ばれる)に結合することから、EphA2の細胞下局在は重要である(Eph Nomenclature Committee, Cell 90:403. 1997; Galeら, Cell & Tissue Research 290: 227, 1997)。リガンド結合の主な結果は、EphA2自己リン酸化である(Lindberg ら, Molecular & Cellular Biology 10: 6316, 1990)。しかしながら、他の受容体チロシンキナーゼとは異なり、EphA2はリガンド結合の不在またはホスホチロシン含量の不在下でも酵素活性を保持する(Zantekら, Cell Growth & Differentiation 10:629, 1999)。
【０４６４】
EphA2に対する抗体が作製され、それらは以下において有用であることが示されている：(1)癌の予防、治療、管理および／または改善(例えば米国出願第10/436,782号を参照されたい、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる);(2)非腫瘍性の過増殖性細胞、特に過増殖性上皮細胞および内皮細胞に関連する疾患の予防、治療、管理および／または改善(例えば米国仮出願第60/462,024号を参照されたい、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる);(3)診断またはスクリーニングのツール(例えば米国出願第10/436,782号および仮出願第60/462,024号を参照されたい、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。
【０４６５】
7.1  ヒトフレームワークの選択
設計の規則(セクション5.1を参照)に従い、ドナー重鎖CDRループをグラフトするためにはヒト生殖系列JH5と組み合わせたVH-158を使用し、ドナー軽鎖CDRループをグラフトするためにはヒト増殖細胞系列Jκ4と組み合わせたＯ18を使用した(図９を参照のこと)。
【０４６６】
ヒト化軽鎖については4つの位置(Kabatのナンバリングに従った3、20、22および49)に多様性を導入した(図１０を参照されたい)。より詳細には、位置22に多様性を創出したのは、潜在的なグリコシル化部位の重要性を検討したことに起因し、この多様性の創出はヒト生殖系列L22に見られるヒト残基と対応するマウス残基との間のゆらぎ(wobble)からなる。ヒト化重鎖については4つの位置(Kabatのナンバリングに従った48、67、80および94)を多様化させた(図１０を参照されたい)。いずれの場合にも、ヒト化抗EphA2抗体軽鎖および抗EphA2抗体重鎖を合成するために、オーバーラップ伸長によるポリメラーゼ連鎖反応を用いて変異誘発を行ったが、ここで全てのマウス残基は、多様性が導入された領域(図１０およびセクション5.1を参照)またはドナー残基が固定された領域(図１０およびセクション5.1を参照)を除いて、そのヒト対応残基で置換された。ポリメラーゼ連鎖反応は、ヒト残基とマウス残基の両方のコドン(ゆらぎ)をコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて行った。
【０４６７】
7.2  コンビナトリアルライブラリーの構築
1つの主要なヒト化ライブラリー(ライブラリー「Ａ」)を構築し、これは2つのサブライブラリーを含んでいた：(1)サブライブラリー1は、Kabatに従って定義されたCDRを含む重鎖コンビナトリアルライブラリーであり;(2)サブライブラリー2は、Kabatに従って定義されたCDRを含む軽鎖コンビナトリアルライブラリーであった。
【０４６８】
下記の表１１および表１２のオリゴヌクレオチドを、サブライブラリーを構築するために使用した(全てのオリゴヌクレオチドは5'から3’の方向で示されており、名称の後に配列が続き、ここでK=GまたはT、M=AまたはC、R=AまたはG、S=CまたはG、W=AまたはTおよびY=CまたはTである)。
【表１１】
2007528723.tif 000019
【表１２】
2007528723.tif 000020
【０４６９】
重鎖および軽鎖ライブラリーは、実質的にWu, Methods Mol. Biol., 207, 197-212, 2003に記載された通りに融合することによりアセンブルし、これには以下のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。サブライブラリー1(重鎖)：1K〜17K；サブライブラリー2(軽鎖)：1'K〜16'K。
【０４７０】
次にVHおよびVL遺伝子を、Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りに増幅したが、これには以下のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。サブライブラリー1(重鎖)：1K/17K；サブライブラリー2(軽鎖)：1'K/16'K。
【０４７１】
X-VLおよびX-VHをコードする遺伝子の増幅(図８を参照)後、キメラFab(マウスVHおよびVL領域が対応するヒト定常領域に融合されたもの)もまた構築したが、これにはそれぞれChimH/ChimH'およびChimL/ChimL'オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた(下記とセクション7.3を参照されたい)。
【０４７２】
ChimH  ビオチン-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAG (配列番号501)
ChimH’  GGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTG (配列番号502)
ChimL  ビオチン-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTG (配列番号503)
ChimL’ GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGAACG (配列番号 504)
【０４７３】
いずれの場合についても、マイナス一本鎖DNAをエタノール沈殿により精製したが、これに先立って、水酸化ナトリウムを用いて二本鎖PCR産物を解離させ、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズを用いてビオチン化鎖を除去した。これはWu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233 および Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212に記載された通りであった。
【０４７４】
7.3  発現系へのコンビナトリアルライブラリーのクローニング
ライブラリーＡ(上記を参照)およびキメラ構築物(上記を参照)を、M13に基づくファージベクター内にクローニングした。このベクターは、ヒトγ1重鎖の第１定常ドメインおよびヒトカッパ(κ)軽鎖の定常ドメインを含有するFabフラグメントの発現を、lacZプロモーターの制御下で可能にする(図４を参照されたい)。これは実質的にWu & An, Methods Mol. Biol., 207, 213-233, 2003; Wu, Methods Mol. Biol., 207, 197-212, 2003およびKunkelら, Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987に記載された通りに、ハイブリダイゼーション突然変異誘発により行った。簡潔に述べると、クローニングすべき重鎖および軽鎖(セクション7.2を参照)に対応する精製済みのマイナス鎖を、それぞれ１つのパリンドロームループを含む2つの領域にアニーリングさせた。これらのループは、ユニークXbaI部位を含み、これはヒトカッパ(κ)定常領域および第１ヒトγ1定常領域とインフレームで融合されたVL鎖とVH鎖の両方を含有するベクターの選択を可能にする(Wu & An, Methods Mol. Biol., 207, 213-233, 2003 および Wu, Methods Mol. Biol., 207, 197-212, 2003)。次に合成されたDNAを、Wu, Methods Mol. Biol., 207, 197-212, 2003に記載の通りにXL1-blue細菌叢上でのプラーク形成またはFabフラグメントの産生のために、XL1-blue内にエレクトロポレーションした。
【０４７５】
7.4  ライブラリーのスクリーニング
ライブラリーをスクリーニングするために、シングルポイントELISA(SPE)を用いた一次スクリーニングを行い、続いて機能的ELISAおよび定量的ELISA二次スクリーニングを行った。
【０４７６】
一次スクリーニング
一次スクリーニングは、シングルポイントELISA(SPE)からなり、これは実質的にWu, Methods Mol. Biol., 207, 197-212, 2003に記載された通りに行った。簡潔に述べると、96ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルを100ngのヤギ抗ヒトFab抗体でコーティングし、サンプル(ペリプラズム発現Fab)とともに室温で1時間インキュベートした。3％BSA/PBSを用いて37℃で2時間ブロックした後、ビオチン化ヒトEphA2-Fcを100ng/ウェルで添加し、室温で1時間インキュベートした。この操作の次に、ニュートラアビジン(Neutravidin)-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートと共に40分間、室温でインキュベーションを行った。HRP活性をTMB基質で検出し、反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。スクリーニングしたライブラリーA由来の約180個のクローンの内、12個のクローンが顕著なシグナル(0.1〜0.3の範囲のOD450)を示した。次にこれらのクローンを二次スクリーニングによる確認のために選択した(下記を参照のこと)。
【０４７７】
二次スクリーニング
二次スクリーニングは、SPEアッセイによって同定されたクローン(上記を参照)を確認するために、ペリプラズム発現Fabフラグメントに対するELISAにより行った。より詳細には、96深底ウェルプレートで増殖させた1ml細菌培養物から調製したペリプラズム抽出物を用いて、２種類のELISA、すなわち機能的ELISAおよび定量的ELISAを行った。
【０４７８】
機能的ELISA:  簡潔に述べると、96ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルを500ngのヒトEphA2-Fcでコーティングし、3％BSA/PBSにより37℃で２時間ブロックした。サンプル(ペリプラズム発現Fab)を加えて室温で1時間インキュベートした。次にヤギ抗ヒトκ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートとインキュベートした。HRP活性をTMB基質で検出し、反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
【０４７９】
定量的ELISA:  これは実質的にWu, Methods Mol. Biol., 207, 197-212, 2003に記載された通りに実施した。簡潔に述べると、濃度を抗ヒトFab ELISAにより測定したが、ここでは96ウェルImmulon Immunoplateの個々のウェルを50ngのヤギ抗ヒトFab抗体でコーティングし、次にサンプル(ペリプラズム発現Fab)または標準物質(ヒトIgG Fab)とインキュベートした。次にヤギ抗ヒトκ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートとインキュベートした。HRP活性をTMB基質で検出し、反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
【０４８０】
7.5  選択されたヒト化クローンの特徴付けと解析
二次スクリーニング後に陽性と検証されたクローンを、ABI300ゲノムアナライザを用いてジデオキシ塩基配列決定により特徴付けした。3つの異なる抗体配列(その後I、II、およびIIIと命名した)を同定したが、これらは抗体あたり4〜6個のマウス残基を含有し、この数には軽鎖および重鎖のそれぞれで固定された2個の非ヒト残基も含まれる(セクション5.1を参照されたい)。この3つの抗体中に、重鎖については2つのユニーク配列が見出され、また軽鎖については2つのユニーク配列が見出された(図１０を参照のこと)。興味深いことに、軽鎖の位置49ならびに重鎖の位置94は、例外なく、対応する非ヒト残基を保持する。このことは、それらのフレームワーク残基が抗EphA2抗体EP101のヒトEphA2への結合を維持するうえで重要な役割を果たすことを示唆する。
【０４８１】
二部構成の二次ELISAスクリーニング(セクション7.4を参照)は、ヒトEphA2への結合に関して、本発明者らに、FabクローンI、II、およびIII同士を比較し、さらにそれらのクローンを抗EphA2抗体のキメラFabと比較することを可能にした(図１２を参照されたい)。図１２に示すように、抗EphA2抗体のキメラFabと比較して、FabクローンI、II、およびIIIはヒトEphA2への良好な結合を保持する。抗EphA2抗体の種々のヒト化型をさらに特徴付けするために、FabクローンI、II、およびIIIならびにキメラFabを次にクローニングし、完全長ヒトIgG1として発現させた。BIAcore解析によって本発明者らは種々の分子同士を比較することができた。
【０４８２】
2007528723.tif 000021
【０４８３】
上記の通り、異なる3種のヒト化抗体は、ヒトEphA2への親和性を示し、この親和性は抗EphA2抗体のキメラ型および親マウス抗体と類似していた。
【０４８４】
このようにして、本発明者らの戦略は、そのコグネイト抗原への良好な結合を保持する非ヒト抗体の種々のヒト化型の製造を可能にした。全体として、これらのデータから、「設計の規則」の選択が妥当であると認められ、より一般的には、本発明に従った抗体のヒト化法が妥当であると立証される。
【０４８５】
引用文献および均等物
本明細書中に引用された全ての文献は、個々の刊行物、特許または特許出願があらゆる目的のために参照することにより本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体を参照することにより本明細書に含めるものとする。
【０４８６】
2003年8月22日に出願された米国仮出願番号第60/497213号および2003年10月13日に出願された第60/510741号は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【０４８７】
本発明の多くの修飾および変更が、その精神および範囲を逸脱することなく可能であるが、このことは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４８８】
【図１】抗IL-9モノクローナル抗体L1の重鎖と軽鎖の核酸配列およびタンパク質配列を示す。
【図２】抗IL-9モノクローナル抗体L1の重鎖および軽鎖と、対応する所定のアクセプター生殖系列配列（それぞれVH3-23/JH4およびL23/Jκ4）との配列アライメントを示す。
【図３】抗IL-9モノクローナル抗体L1の重鎖および軽鎖のコンビナトリアルヒト化ライブラリーのタンパク質配列を示す。軽鎖の４つの位置および重鎖の４〜６つの位置が多様性を導入するための標的とされた。
【図４】コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングおよびFabフラグメントの発現のために使用されたファージベクターを示す。
【図５】ライブラリー２の捕捉-リフトスクリーニングを示す。ヒトIL-9との結合が陽性を示す６個のクローンを円で囲ってある。
【図６】コンビナトリアルライブラリー１および２の二次スクリーニング後の抗IL-9モノクローナル抗体L1のヒト化クローンの代表的な配列を示す。
【図７】AおよびBは、固定化抗原（IL-9）上での上清発現Fabを用いたELISAタイトレーションを示す。抗RSVモノクローナル抗体の上清発現Fabを陰性対照とした。
【図８】抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101の重鎖と軽鎖の核酸配列およびタンパク質配列を示す。
【図９】抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101の重鎖および軽鎖と、対応する所定のアクセプター生殖系列配列（それぞれVH1-58/JH5およびO18/Jκ4）との配列アライメントを示す。
【図１０】抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101の重鎖および軽鎖のコンビナトリアルヒト化ライブラリーのタンパク質配列を示す。軽鎖の４つの位置および重鎖の４つの位置が多様性を導入するための標的とされた。
【図１１】コンビナトリアルライブラリー１および２の二次スクリーニング後の抗ヒトEphA2モノクローナル抗体EP101のヒト化クローンの代表的な配列を示す。
【図１２】固定化抗原（ヒトEphA2）上でのペリプラズム（周辺細胞質）発現Fabを用いたELISAタイトレーションを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月17日(2007.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対してドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して全体で65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49にドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項２】
前記細胞がさらに、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項２に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項４】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アクセプター軽鎖可変領域の配列のコレクションに対してドナー抗体軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列、およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d)  前記ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項５】
前記細胞がさらに、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項5に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項７】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列を含有する細胞であって、以下を含む方法により作製される前記細胞：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対してドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  アクセプター軽鎖可変領域の配列のコレクションに対してドナー抗体軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(d)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(e)  (i)ヒト化軽鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および(ii)アミノ酸レベルでドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して依然として全体で65％以上同一ではないFR1、FR2、FR3およびFR4を含有するフレームワーク領域を有するヒト化重鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成すること、ただし前記第１のヌクレオチド配列はドナー抗体軽鎖可変領域由来のCDRをコードする核酸配列と、アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列とを含み、前記第２のヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；ならびに
(f)  前記第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入すること。
【請求項８】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、請求項７に記載の細胞に含有される、ヒト化抗体をコードする核酸配列を発現させることを含む前記方法。
【請求項９】
ヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞を用意し、前記ヌクレオチド配列を発現させることを含む、抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の製造方法であって、前記ヌクレオチ配列を含有する細胞は、以下により作製されたものである前記方法：
(a)  アクセプター重鎖可変領域の配列のコレクションに対して、ドナー抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(b)  アミノ酸レベルで、ドナー抗体重鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター重鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター重鎖可変フレームワーク領域は、Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基6、23、24または49に、ドナー抗体の対応する残基と同一ではないアミノ酸残基を少なくとも１つ含有し、前記アクセプター重鎖フレームワーク領域およびドナー抗体重鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること;
(c)  ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体重鎖可変領域由来の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸配列およびアクセプター重鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；
(d) アクセプター軽鎖可変領域の配列のコレクションに対して、ドナー抗体軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を比較すること；
(e) アミノ酸レベルで、ドナー抗体軽鎖可変フレームワーク領域に対して65％以上同一ではないアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域を選択すること、ただし前記アクセプター軽鎖フレームワーク領域およびドナー抗体軽鎖フレームワーク領域はそれぞれFR1、FR2、FR3およびFR4を含むものであること；
(f) ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を合成すること、ただし前記ヌクレオチド配列は、ドナー抗体軽鎖可変領域由来の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸配列およびアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域をコードする核酸配列を含むものであること；ならびに
(g)  前記ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入すること。
【請求項１０】
アクセプター重鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体の同定方法であって、請求項2、5または7に記載の細胞において核酸配列を発現させ、前記抗原に対して1×106 Ｍ-1以上の親和性を有するヒト化抗体についてスクリーニングすることを含む前記方法。
【請求項１２】
請求項11に記載の方法により同定されたヒト化抗体。
【請求項１３】
請求項12に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【請求項１４】
アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
アクセプター重鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであり、かつアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
アクセプター重鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものである、請求項1または7に記載の細胞。
【請求項１７】
アクセプター軽鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、請求項4または7に記載の細胞。
【請求項１８】
アクセプター重鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基2、4、24、35、36、39、43、45、64、69、70、73、74、75、76、78、92および93を含まないものであり、かつアクセプター軽鎖可変フレームワーク領域においてキー残基と指定された残基に1以上の変異が導入されており、該キー残基がKabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸残基4、38、43、44、46、58、62、65、66、67、68、69、73、85および98を含まないものである、請求項７に記載の細胞。
【請求項１９】
キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、請求項16、17または18に記載の細胞。
【請求項２０】
キーと指定された残基が以下の残基：CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位、希少残基、抗原と相互作用できる残基、CDRと相互作用できる残基、カノニカル残基、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基、およびChothia定義の重鎖可変領域CDR1とKabat定義の第１重鎖フレームワークとの間でオーバーラップする領域内の残基、の１つまたはそれ以上である、請求項10または14に記載の方法。
【請求項２１】
請求項3、6、8、9、10、14または15に記載の方法により製造されたヒト化抗体。
【請求項２２】
請求項21に記載のヒト化抗体、および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【国際調査報告】
2007528723.tif 000130
2007528723.tif 000131
2007528723.tif 000132
2007528723.tif 000133