(57)【要約】  移植療法に有用な網膜細胞を製造する方法は，以下の工程を含む：（ｉ）１またはそれ以上の哺乳動物成人ミュラー細胞を取得し；そして（ｉｉ）細胞を細胞外マトリクス蛋白質および成長因子の存在下で培養し，このことによりミュラー細胞の先祖表現型への脱分化を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植療法において有用な網膜細胞を製造する方法であって，
（ｉ）１またはそれ以上の哺乳動物成人ミュラー細胞を取得し；そして
（ｉｉ）細胞をマトリクス蛋白質および成長因子の存在下で培養して，細胞の先祖表現型への脱分化を誘導する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
マトリクス蛋白質がフィブロネクチンであり，成長因子がＥＧＦである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞がヒトミュラー細胞である，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脱分化した細胞をマトリクス蛋白質および分化誘導剤の存在下でさらに培養して，脱分化した細胞が特定の分化した細胞表現型に適合する（ａｄｏｐｔ）よう誘導する，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
細胞外マトリクスが，マトリゲル，フィブロネクチン，コラーゲンまたはラミニンであり，および分化誘導剤がＦＧＦ−２，レチノイン酸，３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン，インスリン，インスリン様成長因子またはＴＧＦβである，請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１−５のいずれかに記載の方法により得ることができる細胞を含む組成物。
【請求項７】
治療用途用の，請求項６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１−５のいずれかにおいて定義される方法により得られる網膜細胞の，細胞喪失または細胞傷害に伴う状態を治療するための医薬品の製造における使用。
【請求項９】
細胞がヒト細胞である，請求項８記載の使用。
【請求項１０】
網膜細胞が多機能性ミュラー幹細胞である，請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
状態が，哺乳動物の目における細胞喪失または傷害に伴うものである，請求項８−１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
治療すべき状態が，加齢関連変性，増殖性糖尿病性網膜症，増殖性硝子体網膜症，網膜剥離，色素性網膜炎，緑内障および視神経傷害および変性からなる群より選択される，請求項８−１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
細胞が，治療すべき患者に由来する自己細胞，細胞バンクに保存されている異種細胞，または患者または細胞バンクに由来する細胞から遺伝的に改変された細胞である，請求項８−１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
マトリクス蛋白質および１またはそれ以上の成長因子を含む組成物の，傷害を受けた目に投与して傷害を修復するための医薬品の製造における使用。
【請求項１５】
患者に移植するための構造であって，該構造は複数の網膜ニューロンがその上に組み込まれている材料を支持する多層のマトリクスを含み，１つの層の網膜ニューロンは他の層の網膜ニューロンと同じ表現型であっても異なる表現型であってもよい，ことを特徴とする構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，細胞移植による視覚機能の回復に関する。特に，本発明は，視覚疾患，神経学的疾患の治療，末梢神経系の修復および脊髄の修復における，成人ミュラー幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚機能の回復は，視覚研究の最終的な目標の１つである。盲目につながる重症の疾病，例えば，加齢性黄斑変性（ＡＭＤ），緑内障，糖尿病性網膜症および網膜剥離の合併症についての現在の治療は，支持療法であるかまたは疾病の進行を遅らせるのみであり，視覚機能を回復することはできない。広範な種類の疾病における幹細胞移植に関する最近の研究は，医学界および科学界を熱狂させるきっかけとなり，病気にかかった網膜において神経回路を回復させるための幹細胞の研究は，先祖細胞移植を用いる他のヒト疾病，例えば，白血病，重症の熱傷および心筋不全の治療において得られた結果によって刺激されている。
【０００３】
これまでのところ，ヒト網膜機能の回復を目標とする移植研究はほとんど成功しておらず，網膜色素上皮（ＲＰＥ）および虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞の移植に限定されていた。網膜変性の動物モデルにおけるＲＰＥ細胞，シュワン細胞および脳由来前駆体細胞の実験的移植は，網膜機能の保存においてある程度の成功をもたらした。脳由来前駆体細胞をＲＣＳラット（網膜変性のモデル）に網膜移植すると，光受容細胞の生存が促進される。しかし，移植された細胞は光受容細胞層に移動するが，これらは網膜神経マーカーを発現しない。このことは，網膜の機能的および形態学的再生には特定のニューロン性前駆体が必要であることを示唆する。
【０００４】
初期の研究の間，幹細胞は胚からのみ単離することができると考えられており，これに関して，神経先祖の幹細胞は，胚性哺乳動物中枢系および末梢神経系（ＣＮＳおよびＰＮＳ）において最初に同定された。しかし，より最近の研究においてＣＮＳの神経原性領域において成人幹細胞が同定され，このことにより成人幹細胞の探索のさらなる研究が刺激された。
【０００５】
Ｌｉｍｂ（２００２；４３（３）；８６４−８６９）は，自然発生的に不死化されたミュラー細胞の同定を開示する。
【０００６】
ミュラー細胞は網膜の幅全体で縦に延びた放射状グリア細胞である。これは，網膜の複雑な構造を安定化させ，ニューロンおよび血管に構造的および代謝的支持を与え，光受容体の網膜下空間への異常な移動を防止し，硝子体腔と網膜下空間との間の液体輸送を制御する。失明の主な原因である網膜のほぼ全ての病的状態，例えば，加齢性黄斑変性，増殖性糖尿病性網膜症，増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）および色素性網膜炎（ＲＰ）は，ミュラー細胞の分布，増殖または機能の変化と関連している。
【０００７】
Ｆｉｓｃｈｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；４（３）：２４７−２５２）は，出生後のニワトリの網膜から得たミュラーグリア細胞の同定を記載する。ミュラーグリア細胞は，分化しておらず，増殖し，胚性網膜先祖により通常発現される転写因子を発現することが示されている。ミュラーグリア細胞は，網膜障害に応答して増殖する。
【０００８】
ヒトの眼においては，種々の網膜細胞を起源とするミュラー幹細胞が胎児発生の間に見いだされることが示されているが，これらの細胞が成人神経網膜に存在するかもしれないという証拠はこれまでに示されていない。したがって，ヒト網膜障害の治療のために網膜細胞移植療法において用いるのに適した細胞を開発することが必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は，成人ヒト神経網膜からミュラー細胞を得ることができ，これを適当な条件下で幹細胞のようにふるまうようにさせることを実現したことに基づく。
【００１０】
本発明の第１の観点にしたがえば，移植療法において有用な網膜細胞を製造する方法は以下の工程を含む：
（ｉ）１またはそれ以上の哺乳動物成人ミュラー細胞を取得し；そして
（ｉｉ）この細胞を細胞外マトリクス蛋白質および成長因子の存在下で培養して，ミュラー細胞の先祖表現型への脱分化を誘導する。
【００１１】
成人哺乳動物ミュラー細胞を取得し，これを処理して脱分化を誘導することができれば，大量の細胞を取得して移植療法において用いることが可能となる。本発明にしたがって用いられる細胞は，網膜の一体性を保持し，ＲＣＳラットの網膜下空間に注入したときに視覚機能の喪失を弱めることが示された。
【００１２】
本発明の第２の観点にしたがえば，上述の方法にしたがって得ることができる網膜細胞は，哺乳動物の眼における細胞喪失または細胞傷害に伴う状態を治療するための医薬品の製造において用いられる。
【００１３】
本発明の第３の観点にしたがえば，組成物は，上述した方法を用いて得られる細胞を含む。
【００１４】
本発明の第４の観点にしたがえば，組成物は，マトリクス蛋白質および１またはそれ以上の成長因子を含み，障害を受けた眼に投与して障害を修復するための医薬品の製造に用いられる。
【００１５】
本発明の第５の観点にしたがえば，患者に移植するための構造は，多層のマトリクス支持材料を含み，その上に複数の網膜ニューロンが組み込まれており，１つの層の網膜ニューロンは，他の層の網膜ニューロンと同じ表現型であっても異なる表現型であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の説明
本発明は，成人ヒトミュラー先祖細胞の同定，拡大および維持を可能とし，この細胞を種々の網膜疾患を治療するための移植療法において用いることを可能とする。成人ミュラー細胞は，哺乳動物ドナーの網膜から単離することができ，成熟細胞のマーカーを発現するが，インビトロで特定の条件で処理すると，細胞は再び細胞サイクルに入り，脱分化して，先祖細胞表現型を発現する細胞，例えば，ネスチン，ソニックヘッジホッグ蛋白質，転写因子Ｓｏｘ−２，Ｐａｘ−６およびＣｈｘ１０βＩＩＩチューブリンを発現し，ピーナッツアグルチニンに結合する細胞となる。これらはまた，分化した網膜ニューロンのマーカー，例えば，ＨｕＤ，カルレチニン，カルビンジン，Ｂｒｎ５．０，ニューロン特異的エノラーゼ，Ｔｈｙ−１，ペリフェリン，ロドプシンおよび７０ｋＤａ神経フィラメント蛋白質を発現する。
【００１７】
"脱分化"との用語は，当業者にはよく知られており，細胞表現型が分化した状態から先祖表現型に変化することを表す。
【００１８】
成人哺乳動物ミュラー細胞は，成人哺乳動物の眼の網膜から，本明細書に開示される手法を用いて取得することができる。ヒトミュラー細胞を単離することが好ましい。通常の培養条件下では，成人ミュラー細胞は，成熟ミュラー細胞のマーカー，例えば，細胞レチナアルデヒド結合蛋白質（ＣＲＡＬＢＰ），グルタミンシンセターゼ，ビメンチンおよび上皮成長因子（ＥＧＦ−Ｒ）を発現する（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，１９８８；４７：８５５−８６８）。ミュラー細胞は，位相差顕微鏡下でその特徴的な形態学により，および上述したマーカーの発現により同定される（Ｓａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９８；３９：２１２−２１６）。培養したミュラー細胞は，サブコンフルエントとなったとき，インビボで網膜について典型的に観察される形態学的特徴を示す。すなわち，これらは，延びた形状，特徴的なエンドフットプロセスおよび絨毛表面を有する非着色細胞である（図１ａ，ｂおよびｃを参照）。これらの細胞は電気生理学的応答により判定してグルタミン酸に応答し，無ストレス条件下ではＧＦＡＰを発現しない。
【００１９】
脱分化したミュラー細胞を製造するためには，単離した成人ミュラー細胞を，細胞外マトリクス蛋白質および成長因子の存在下で培養することが必要である。細胞外マトリクス蛋白質は，臓器で細胞を囲み支持する複合体化された蛋白質である。適当な細胞外マトリクス蛋白質は，当業者には知られており，例えば，マトリゲル，フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチンおよびラミニンが挙げられる。培養条件には，脱分化を助けるために成長因子が必要である。適当な成長因子は当業者には明らかであり，例えば，上皮成長因子（ＥＧＦ），線維芽細胞成長因子−２（ＥＧＦ−２），インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）が挙げられる。好ましい成長因子は上皮成長因子（ＥＧＦ）である。異なる培養条件下でのミュラー細胞の形態学は図２に示される。
【００２０】
このような条件下で成人ミュラー細胞を培養することにより，脱分化が生じ，胚性神経細胞先祖の既知のマーカーであるネスチン，βＩＩＩチューブリンを発現し，ピーナッツアグルチニンに結合するミュラー細胞が得られる。これらのマーカーは，慣用の抗体に基づく検出系，例えば免疫細胞化学および免疫ブロッティングを用いて容易に同定することができる（Ｌｉｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２００２；４３：８６４−８６９およびＬｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１９９４；１１８：３６８−３７６）。
【００２１】
脱分化した細胞は，この形で用いてもよく，特定の分化誘導剤を用いて特定の細胞表現型に分化させてもよい。例えば，よく知られる幹細胞の分化誘導剤であるレチノイン酸（ＲＡ）の存在下では，ミュラー細胞は，神経節細胞に似た細胞のモザイクを形成し，神経細胞の特徴的なマーカーである低分子神経繊維蛋白質およびニューロン特異的エノラーゼを発現する。他の適当な分化誘導剤としては，３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン，インスリンおよびＴＧＦβが挙げられる。分化誘導体の組み合わせを用いて特定の表現型を形成してもよい。例えば，ＦＧＦ２とＩＧＦ−１との組み合わせは，ヒトミュラー先祖細胞が，Ｔｈｙ−１，ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（主要な網膜ニューロン，例えば神経節細胞のマーカー）およびペリフェリン（錐状体および杆状体光受容細胞により発現される）を発現するよう誘導することができる。このようにして，特定のタイプの細胞の喪失または障害にともなう状態の治療のために，特定の表現型を生じさせることができる。したがって，本発明の方法は，多数の特定のタイプの細胞を調製し，治療に用いることを可能とする。
【００２２】
さらに，本発明の方法は，各層が異なる表現型を有する多層の網膜細胞を製造することを可能とする。ミュラー細胞は，特定の異なる網膜ニューロンに分化させてマトリクス物質中に配置することができ，これを重層して移植用の網膜構造を製造することができる。
【００２３】
ミュラー細胞の分化はまた，患者への投与の際の局所的環境によっても影響されうる。障害のある領域では，成長因子が産生され，これが移植されたミュラー細胞の最終的な表現型を決定する場合がある。したがって，脱分化したミュラー細胞を患者に投与して，障害を受けた細胞の表現型に適合させ，失われたかまたは障害を受けた細胞を置き換えることができる。
【００２４】
規定された培養条件における最初のミュラー細胞株の樹立は時間に依存する場合があり，単離されたミュラー細胞は，成長因子を加えた後に少なくとも２−３週間培養することが好ましい。培養液中で細胞のコロニーが形成され，これらを単離して新たな培養液に加えることにより，多数の細胞を生成することができる。
【００２５】
培養し脱分化したミュラー細胞は，培養中で多継代で維持および拡大することができ，分化誘導剤に応答して異なる表現型に分化する能力を維持しているという点で，不死化されているということができる。
【００２６】
細胞は，哺乳動物の眼における細胞喪失または細胞傷害に伴う状態の治療に用いることができる。本発明の細胞を移植することにより治療しうる状態としては，加齢性黄斑変性，黄斑円孔非増殖性糖尿病性網膜症，増殖性糖尿病性網膜症，増殖性硝子体網膜症，網膜剥離，色素性網膜炎，緑内障および視神経障害が挙げられる。他のタイプの遺伝性および非遺伝性網膜変性もまた治療することができる。
【００２７】
ヒトの治療において用いられる細胞は，免疫拒絶に伴う問題を減少させるために，好ましくはヒト細胞に由来するものであるべきである。細胞は，自己細胞（治療すべき哺乳動物の眼に由来する）であってもよく，細胞バンクに保存されている異種細胞でもよく，またはこれらの細胞に由来する遺伝的に改変した細胞株であってもよい。
【００２８】
患者を治療するためには，一般に，眼のどこに障害が生じたかを知ることが役立つ。一旦障害の存在，およびこれが１つの単離された領域にあるか複数の領域にあるかが確立されれば，障害を受けた領域に細胞を移植することによる治療を行うことができる。細胞は，単一の部位に移植してもよいが，好ましくは複数の部位に移植する。
【００２９】
治療後，患者の進行は，皮質性視覚機能を調べる既知の試験を用いてモニターすることができる。適当なモニタリング手法としては，以下のものが挙げられる：ｉ）精神物理学的試験，例えば視野およびコントラスト感度試験，ｉｉ）電気生理学的試験，例えば，網膜電図（ＥＲＧ），およびｉｉｉ）高解像度画像化手法，例えば，眼コヒーレンス・トモグラフィー（ＯＣＴ）。
【００３０】
好ましくは，治療は視覚障害を実質的に矯正するであろう。しかし，本発明にしたがう治療，および本発明の細胞，医薬品および医薬製剤を用いる治療は，完全な矯正がなくとも，機能の改良につながるであろう。そのような改良は価値があり貴重であろう。
【００３１】
用いるべき細胞の数は，障害の性質および程度により様々であろう。典型的には，移植において用いられる細胞の数は，約１００，０００から数百万個の範囲であろう。治療は１回の移植に限定する必要はない。追加の移植を実施して，さらに機能を改良することができる。本発明にしたがって調製した細胞は，任意の薬学的に許容しうる希釈剤または賦形剤を用いて製剤することができ，別の医薬品，例えば，免疫抑制剤または成長因子を含んでいてもよい。また，細胞は，障害を受けた部位で必要とされるであろう他の薬剤を発現するよう遺伝的に改変してもよい。
【００３２】
また，細胞は，神経系を可塑化することが知られている薬剤と組み合わせてもよい。このような薬剤は，細胞が神経系とつながり，眼の中へと成長していく能力を高めることができる。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は本発明を例示する。
実施例１
成人ミュラー先祖細胞の，網膜ニューロンのマーカーを発現する細胞への脱分化
懸濁したミュラー細胞を，マトリゲルでコーティングした培養プレートで，
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＦＧＦ−２（４０μｇ／ｍｌ）単独，またはｉ）インスリン（１００μｇ／ｍｌ），ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）（５００ｎＭ），またはｉｉｉ）トリヨードチロニン（Ｔ３，４０μｇ／ｍｌ）との組み合わせを含むＤＭＥＭ培地中で，１０００個／ｍｌの密度で培養した。４８時間ごとに新たに置き換えた培地で３−１０日間培養した後，細胞は，形態学および神経網膜マーカーの発現において種々の変化を示した。例えば，マトリゲル上でＦＧＦ２の存在下で５日間培養した後，細胞は神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成し，神経球中に含まれる細胞はＰＮＡに結合し，ネスチン，カルレチニンおよびβＩＩＩチューブリン（神経先祖のマーカー）を発現した。フィブロネクチン上でレチノイン酸の存在下で培養すると，ミュラー細胞は神経球を形成し，これも神経の形態学を示した。これらはまた，ネスチンおよび網膜ニューロンのマーカー（例えば，６８ｋＤ神経フィラメント蛋白質，ｔｈｙ−１およびカルレチニン），ならびにロドプシン（杆状体光受容細胞のマーカー）を発現していた。マトリゲル上でＦＧＦ２およびＩＧＦ−１の存在下で１０日間培養した後，これらは神経の形態学を示し，網膜神経マーカーであるｔｈｙ−１，ニューロン特異的エノラーゼおよびカルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎｇ）を発現した。さらに，これらはロドプシンおよびペリフェリン（いずれも光受容細胞のマーカー）を発現した。
【００３４】
実施例２
網膜変性の実験モデルにおける視覚機能の回復
神経節細胞喪失を伴う進行性の光受容変性を示す３週齢のジストロフィー性のＲＣＳ（Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ）ラットをシクロスポリンＡで免疫抑制し，１０5個のミュラー細胞を含む２μｌのＤＭＥＭ培地を経強膜経路で後側頭空間に注入した。移植の８，１２および１５週間後に，組織病理学的手法および免疫組織学的手法により，網膜構造および移植した細胞の位置を調べた。視覚機能は，白黒縞の線を付けた回転するドラムの中央の静止したプラットフォームに置かれたときの動物の頭の動きを設定した間隔で計時することにより測定した。この実験プロトコルを用いると，ラットが見ることができる場合には，動く線は無意識の視線運動性応答を引き起こし，例えば，ラットはその動きを追う。結果は，ＲＣＳラットの網膜下空間に移植されたヒトミュラー幹細胞が網膜を越えて移動し，光受容層および神経節細胞層に局在したことを示した。
【００３５】
移植されたラットにおける網膜形態学の試験は，光受容細胞層および一般的網膜外観がよく保存されていたことを示した（図６を参照）。この試験はまた，頭追跡応答により判定して，移植されたミュラー幹細胞がＲＣＳラットにおいて視覚機能を保っていたことを示した。
【００３６】
実施例３
ミュラー幹細胞のインビトロでの多機能性
ラット，マウスおよびトリ網膜の神経先祖について観察されるように，脱分化した細胞中に存在する細胞の大部分は，ｉ）サイクリンＤ（網膜の発達の間の増殖の制御に関与する細胞サイクル蛋白質），ｉｉ）ピーナッツアグルチニン（多機能性神経幹細胞の糖複合体に結合するレクチン）の結合；ｉｉｉ）カルレチニン（主要神経網膜マーカー）；ｉｖ）ネスチンおよびβＩＩＩチューブリン（神経分化の初期マーカー）；およびｖ）神経網膜先祖のマーカー，例えばＳｉｘ３／６およびＳｏｘ−２を発現していた。これらの細胞は，これらが発現する神経網膜マーカーの不均一性により示されるように，異なる成熟網膜ニューロンを起源とするようであった。これらには，Ｔｈｙ−１，ＮＳＥ，Ｂｒｎ５．０，ＨｕＤ，ペリフェリン，カルレチニンおよびロドプシンが含まれる。
【００３７】
５−７日後，細胞は分化した網膜ニューロンの形態学的特徴およびマーカーを示した。しかし，脱分化に用いた細胞外マトリクスおよび成長因子によって，異なるマーカーを発現する細胞の比率，ならびにこれらの分子の発現のパターンには変動があった。このことは，例えば，Ｐａｘ−６染色は，ＢＭＰのみでまたはＦＧＦ−２を用いてＦＮで培養した細胞では主として細胞質に見られたが，ＦＧＦ−２またはＲＡを用いてＢＭＰで培養した細胞では，この因子は核染色が支配的であったという観察により示される。ＦＧＦ−２の存在下でＦＮまたはＢＭＰで培養した細胞においてはＳｉｘ３／６の細胞質染色が認められたが，レチノイン酸（ＲＡ）を用いて基底マトリクス蛋白質（ＢＭＰ）で培養した細胞においてはこの因子の核染色が観察された。
【００３８】
Ｓｏｘ−２の染色は，細胞質および神経突起伸長に特徴的に関連しており，ＦＧＦ−２を用いてＦＮまたはＢＭＰで培養した細胞は，光受容細胞に似た，特徴的な二極の形態学およびペリフェリンの発現を示した。細胞をこの分子について染色したとき，２５０μｍの長さまでの神経突起伸長が認められた。ＰＫＣおよびＣｈｘ１０の発現は主として細胞質に見られたが，ソニックヘッジホッグ蛋白質（Ｓｈｈ）発現は特徴的に核の周囲で高密度であった。しかし，ＲＡを用いてＢＭＰで培養した細胞では，この因子は主として核に付随していた。
【００３９】
これらの相違に加えて，種々の培養条件に曝露すると，個々のマーカーを発現する細胞の比率が様々に変化した。ＲＡを用いてＢＭＰで培養すると１７−１９％の細胞がＰａｘ−６を発現し，一方，これはＦＧＦ−２の存在下でフィブロネクチン上で培養した細胞では８２％であった。ＦＧＦ−２を含むＦＮに播種すると，大部分の細胞（７１％）はＣＲＡＬＢＰの発現を維持し，これはＢＭＰおよびＲＡまたはＦＧＦ−２の存在下では１８％未満であったことと対称的である。Ｓｏｘ−２は，用いた基質および成長因子に関わらず，脱分化したミュラー幹細胞の５０−８８％で発現されていたが，ＦＧＦ−２の存在下でＦＮで培養したときには，大部分（８５％）の細胞がＨｕＤを発現した。ＦＧＦ−２の存在下で細胞を培養した場合にも，比較的多数の細胞がペリフェリン（２２−２９％），Ｓｈｈ（３９−４０％），Ｃｈｘ１０（１５−２１％）およびＰＫＣ（２９−３３％）を発現していることが認められた。
【００４０】
実施例４
成人ヒト網膜のミュラー細胞による先祖マーカーのインシトゥー発現
成人神経網膜から単離された多機能性幹細胞がミュラー細胞の集団を構成するという証拠は，これらの細胞がインシトゥーで同定されるか否かによってのみ確認することができる。したがって，網膜切片を網膜先祖の種々のマーカーおよび細胞マーカーＣＲＡＬＢＰまたはネスチンに対する抗体で共染色した。共焦点顕微鏡により，特徴的なミュラー細胞形態学を有し，ＣＲＡＬＢＰを発現する，神経中心網膜中に局在する細胞の集団が，先祖マーカーＳｈｈ，Ｓｏｘ−２およびＣｈｘ１０を発現することが示された。これらのマーカーを共発現するミュラー細胞の頻度は，周辺（内核層（ＩＮＬ）中の細胞総数の２−５％）において中心網膜（ＩＮＬ中の細胞の１−２％）におけるより高かったが，細胞は，毛様体から２．０−２．５ｃｍの距離で明確に観察された。網膜切片をネスチンについて共染色することによっても，この先祖マーカーおよび転写因子Ｓｈｈ，Ｓｏｘ−２およびＣｈｘ１０を共発現するミュラー細胞が同定された。調べた４つすべての標本において，ミュラー細胞は先祖マーカーについて共染色されたことが認められた。これらの知見は，成人ヒト神経網膜からのミュラー細胞の集団が多機能性の特徴を有し，これらを容易に単離することができ，インビトロで無期限に維持することができるという知見を強く裏付ける。
【００４１】
実施例５
ＲＣＳラットの網膜下空間に移植されたときのミュラー先祖細胞の運命
移植されたミュラー幹細胞をヒトミトコンドリアに対する抗体で追跡することにより，網膜下注入の７−９日後に，細胞は外核層（ＯＮＬ）の表面に沿って小さなクラスターの群を形成し，いくつかの細胞は網膜細胞層内に移動したことが観察された（図７Ａ）。光受容細胞層中に移動した細胞は，ロドプシン（杆状体細胞特異的マーカー）を発現していたが（図７Ｂ），一方，神経節細胞層（ＧＣＬ）内に移動した細胞は神経節細胞のマーカーであるカルレチニンを発現していた（図７Ｂ）。移植の５週間後には，移植された細胞の同様のパターンの移動および局在が観察された。
【００４２】
実施例６
ジストロフィー性ＲＣＳラットにおいてミュラー幹細胞の移植は網膜の一体性および視覚機能を保持する
ミュラー幹細胞移植の１５週間後に網膜形態学を分析したところ，ＯＮＬにおける光受容細胞の解剖学的構造および外側セグメントの正常な形態学により判定して，網膜の一体性がよく保存されていることが示された。１匹の動物では完全な厚さのＯＮＬが認められ，これは移植されていない反対側の網膜では光受容細胞の存在が希薄であることと対称的であった（図６）。
【００４３】
頭追跡実験により視覚機能を判定したところ，ミュラー幹細胞を移植したラットはシャム手術動物より有意によりよくすべての格子刺激を追跡することができることが示された。視覚刺激に応答するこの能力は，移植の１２および１５週間後において，８週間後におけるよりはるかに高かった（図８）。８週間後，０．１２５サイクル／度の視覚刺激を追跡したとき，移植した動物はシャム手術ラットとの相違を示さなかったが，０．２５および０．５サイクル／度の格子では，移植した動物はシャム手術ラットより有意によりよく追跡した。１５週間後，移植した動物ではすべての格子の刺激に対して視覚応答が低下したことが観察されたが，この応答はシャム手術ラットより有意に高かった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は，（Ａ）プラスチック組織培養皿中のミュラー細胞，（Ｂ）特徴的な微小絨毛を示すプラスチック組織培養皿上のミュラー細胞，および（Ｃ）エンドフットプロセスを示すミュラー細胞の写真表示である。
【図２】図２は，異なる培養条件下で成長したミュラー細胞の写真表示である。
【図３】図３は，種々の培養条件下で培養したミュラー細胞の写真表示であり，（Ａ）はサイクリンＤの発現を示し，（Ｂ）はピーナッツアグルチニンへの結合を示す。
【図４】図４は，レチノイン酸の存在下でマトリゲル上で培養したミュラー細胞による網膜神経マーカーの発現の写真表示である。
【図５】図５は，ＦＧＦ２およびＩＧＦ−１の存在下でマトリゲル上で培養したミュラー細胞による神経網膜マーカーの発現の写真表示である。
【図６】図６は，ＲＣＳラットに移植したミュラー細胞の写真表示であり，移植後４ヶ月の網膜の外観を示す。
【図７】図７は，ＲＣＳラットの網膜下空間に移植したミュラー細胞の写真表示であり，細胞は抗体マーカーにより同定される。
【図８】図８は，本発明のミュラー細胞を移植した後のＲＣＳラットの視覚刺激に対する応答のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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