(57)【要約】  腫瘍溶解ウイルス複製の外部調節のための組成物、方法、およびシステムを提供する。前記腫瘍溶解ウイルスは、細胞型特異的転写調節エレメント（CT-TRE）、および誘導性トランス活性化因子調節性転写調節エレメントを含む。前記ウイルスは、CT-TREが機能することが許容される細胞において選択的に複製する。さらに、誘導物質の濃度または条件が、トランス活性化因子調節性転写調節エレメントを調節するために使用され、それによって、腫瘍溶解ウイルス複製の少なくとも2つの制御レベルを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
細胞型特異的転写応答エレメント（CT-TRE）の転写制御下にある誘導性転写トランス活性化因子コーディング配列；および
上記転写トランス活性化因子によって調節される転写応答エレメントの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子；
を含む複製能力があるアデノウイルス・ベクターであって、ここで、上記転写トランス活性化因子が外因性誘導物質に対して機能的に応答性である、前記アデノウイルス・ベクター。
【請求項２】
前記アデノウイルス遺伝子がアデノウイルスの複製に不可欠な遺伝子である、請求項1に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項３】
前記複製に不可欠な遺伝子がアデノウイルスの初期遺伝子である、請求項2に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項４】
前記アデノウイルスの初期遺伝子がE1Aである、請求項3に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項５】
前記アデノウイルスの初期遺伝子がE1Bである、請求項3に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項６】
前記アデノウイルスの複製に不可欠な遺伝子がアデノウイルスのE4遺伝子である、請求項に2記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項７】
前記アデノウイルスの複製に不可欠な遺伝子がアデノウイルスの後期遺伝子である、請求項2に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項８】
前記転写トランス活性化因子が前記誘導物質によって抑制される、請求項1に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項９】
前記転写トランス活性化因子が前記誘導物質によって活性化される、請求項1に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
前記誘導物質が、テトラサイクリン、ドキシサイクリンおよびその類似体、FKBPホモダイマーおよびヘテロダイマー、エクジソン、ラパマイシンおよびその類似体から成る群から選ばれる、請求項1に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
以下の：
細胞型特異的転写応答エレメント（CT-TRE）の転写制御下にある誘導性転写トランス活性化因子コーディング配列；および
上記転写トランス活性化因子によって調節される転写応答エレメントの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子、および第2転写応答エレメントの転写制御下にある第2遺伝子；
を含む複製能力があるアデノウイルス・ベクターであって、ここで、上記転写トランス活性化因子が外因性誘導物質によって活性化される前記アデノウイルス・ベクター。
【請求項１２】
前記第2遺伝子がアデノウイルス遺伝子である、請求項11に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１３】
前記アデノウイルス遺伝子がアデノウイルスの複製に不可欠な遺伝子である、請求項12に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１４】
前記アデノウイルスの複製に不可欠な遺伝子がアデノウイルスの初期遺伝子である、請求項13に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１５】
前記アデノウイルスの初期遺伝子がE1Aである、請求項14に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１６】
前記アデノウイルスの初期遺伝子がE1Bである、請求項14に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１７】
前記第1および第2遺伝子がアデノウイルスの複製に不可欠である、請求項12に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１８】
前記第1および第2遺伝子がアデノウイルスの初期遺伝子である、請求項17に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１９】
前記第1遺伝子がE1Aであり、かつ、第2遺伝子がE1Bである、請求項18に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項２０】
前記第1または第2遺伝子の発現がIRESによって調節される、請求項17に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項２１】
前記第2遺伝子が導入遺伝子である、請求項11に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項２２】
前記導入遺伝子が細胞毒性遺伝子である、請求項21に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項２３】
請求項1に記載のアデノウイルス・ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項1に記載のアデノウイルス・ベクター、および医薬として許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項２５】
以下の：
細胞型特異的転写応答エレメント（CT-TRE）の転写制御下にある誘導性転写トランス活性化因子コード配列；および
上記転写トランス活性化因子によって調節される転写応答エレメントの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子；
を含むアデノウイルス・ベクターの伝播方法であって、ここで、上記転写トランス活性化因子が外因性誘導物質によって活性化される、複製能力があり、以下のステップ：
上記アデノウイルス・ベクターを、細胞特異的TREが機能することを許容する細胞内に導入し；そして
上記誘導物質を投与し、ここで、上記アデノウイルス・ベクターが伝播される；
を含む前記アデノウイルス・ベクターの伝播方法。
【請求項２６】
以下の：
細胞型特異的転写応答エレメント（CT-TRE）の転写制御下にある誘導性転写トランス活性化因子コード配列；および
上記転写トランス活性化因子によって調節される転写応答エレメントの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子；
を含むアデノウイルス・ベクターの調節方法であって、ここで、上記転写トランス活性化因子が外因性誘導物質によって阻害される、複製能力があり、以下のステップ：
上記アデノウイルス・ベクターを、細胞特異的TREが機能することを許容する細胞内に導入し、ここで、上記アデノウイルス・ベクターが伝播され；そして
上記誘導物質を投与し、ここで、上記アデノウイルスの伝播が阻害される；
を含む前記方法。
【請求項２７】
以下の：
細胞型特異的転写応答エレメント（CT-TRE）の転写制御下にある誘導性転写トランス活性化因子コード配列；および
上記転写トランス活性化因子によって調節された転写応答エレメントの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子；
を含む標的腫瘍細胞の選択的細胞溶解方法であって、ここで、上記転写トランス活性化因子が外因性誘導物質によって活性化され、以下のステップ：
上記アデノウイルス・ベクターを、細胞特異的TREが機能することを許容する細胞内に導入し；そして
上記誘導物質を投与し、ここで上記アデノウイルス・ベクターが伝播され、そして上記標的前立腺細胞の溶解を引き起こす；
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
外因性ヌクレオチドが細胞に提供される遺伝子治療は、革新的で、もしかすると強力な病気と戦う道具の原理を形成する。このアプローチは、癌だけでなく、嚢胞性線維症、貧血、血友病、糖尿病、ハンチントン病、エイズ、異常に高い血清コレステロール・レベル、特定の免疫不全症、および癌の多くの形態を含めた多くの他の病気の治療にも大きな可能性を同様に有する。遺伝子治療は、例えば、ウイルス・ベクターまたは非ウイルス・ベクターのような外因性の配列のデリバリー担体を一般に必要とする。種々のウイルス・ベクターが、これらの病気に対して治療上の効能を示した。概説のために、例えば、Sandrin V et al., Curr Top Microbiol Immunol. 2003; 281:137-78; Buning H., Gene Then 2003 Jul;10(14):1142-51、およびSt George JA, Gene Ther. 2003 Jul; 10(14): 1135-41を参照のこと。
【０００２】
癌治療に適用できる代わりのアプローチにおいて、癌細胞中の選択的な複製がそれらの細胞を選択的に破壊する特定の弱毒化された複製能力があるウイルス・ベクターが開発された。例えば、特定の細胞型を選択的に複製し、（そしてそれにより破壊する）様々な細胞に特有な複製能力があるアデノウイルス構築物が、例えば、WO95/19434、WO98/39465、WO98/39467、WO98/39466、WO99/06576、WO98/39464、WO00/15820に記載されている。
【０００３】
アデノウイルスを安全な治療剤にする要因は、以下の事実：（a）アデノウイルス感染症には軽微な臨床的な病気の徴候がある；（b）アデノウイルスが安定で、十分に説明され、そして特徴づけられたゲノムを持っている；（c）アデノウイルスは一般にそのウイルスDNAを宿主DNA内に組み込まない；（d）アデノウイルス感染は一時的な遺伝子発現をもたらす；（e）アデノウイルスは分裂細胞にも無分裂細胞にも感染することができる；（f）アデノウイルスは種々のヒト細胞型に感染することができる；（g）アデノウイルスは物理的に安定している；そして（h）アデノウイルスは高感染価生産に耐えられる、を含む。
【０００４】
患者の遺伝子治療に関する引き続く関心事は、潜在的な中毒性である。したがって、インビボにおけるウイルス感染および/または遺伝子発現を調節する能力が有効であることになる。遺伝子治療の目的のための調節された遺伝子発現は、例えば、Zoltick and Wilson (2001) Ann NY Acad Sci. 953:53-63; Harrington et al. (2000) Adv Drug Deliv Rev. 44(2-3): 167-84; およびClackson (2000) Gene Ther. 7(2): 120-5によって検討されている。遺伝子治療のために一般に使われる、複製と異なり欠陥があるベクター、例えば本明細書中で例証したような腫瘍溶解ベクターは、追加の標的細胞に感染する子孫を生み出すインビボにおける複製をする。したがって、インビボにおいて腫瘍溶解ベクターの複製を調節することができることに対する大きな着目が存在することになる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の概要
複製能力があるウイルス・ベクターと、それらの使用方法が提供される。本発明は、複製能力があるアデノウイルスによって本明細書中に例証される、調節された遺伝子発現システムの転写制御下にある少なくとも1つのウイルス遺伝子を持っている複製能力があるウイルスを含む組成物を提供する。調節された遺伝子発現システムは、少なくとも2つのレベルの転写調節を含む。調節の1つ目のレベルにおいて、転写トランス転写活性化因子（transcriptional transactivator）コード配列は、細胞型特異的転写応答エレメント（CT-TRE）の転写調節下にある。調節の2つ目のレベルにおいて、ウイルス遺伝子は、転写応答エレメント（本明細書中で転写トランス活性化因子に調節された応答エレメントと呼ばれる）と転写トランス活性化因子の相互作用によって調節される転写調節下にある。本発明を実施するのに着目の転写活性化因子は、着目の宿主細胞に外部から提供される誘導物質、通常非天然の誘発物質、例えば化学的な物質、例えばテトラサイクリン、エクジソン、ラパマイシン、合成プロゲステロン、グルココルチコイド、またはその類似体と一緒に機能的に相互作用する。同様に、誘導物質は、非化学系誘導因子、すなわち、超音波、熱、外照射、低酸素など、であるかもしれない。
【０００６】
転写トランス活性化因子は、細胞型特異的TREが活性である細胞でのみ産生される。転写トランス活性化因子の活性は、特別な誘導物質の存在/濃度または条件に依存している。そのため、誘導物質または状態は、転写トランス活性化因子の機能を調節する手段を提供する。適切な濃度の誘発物質および/または条件の存在下において、転写トランス活性化因子の活性化が、転写を活性化し、そして阻害型転写トランス活性化因子が転写を抑える。ウイルスの複製に不可欠な遺伝子の発現はこのように調節され、それによってウイルスの複製および伝染を調節する。ゆえに、腫瘍溶解ウイルスの複製および伝染は、本明細書中に記載される組成物および方法を使って誘導物質を提供する、および/または誘導物質の濃度を調整することによってインビトロまたはインビボで調節される。
【０００７】
態様の詳細な説明
細胞型特異的制御的転写調節エレメント（CT-TRE）、および誘導性であるトランス活性化因子調節性転写調節エレメント（transactivator regulated transcriptional regulatory element）を含む、調節された複製能力があるウイルス・ベクターが提供される。ウイルスは、CT-TREの機能を許容する細胞内で、そしてトランス活性化因子調節性転写調節エレメントを調節する誘導因子の存在または不存在に基づいて選択的に複製される。
【０００８】
CT-TREは、誘導性転写トランス活性化因子（TA）コード配列の転写を制御する。転写トランス活性化因子は、（a）機能する誘導物質を必要とし、そして（b）ウイルス遺伝子の転写を制御する。誘導因子は、その類似体を含む着目の宿主細胞に通常存在しない外因性化合物、例えばテトラサイクリン、エクジソン、ラパマイシン、合成プロゲステロン、グルココルチコイドなどであるか、または誘導因子は、超音波、熱、外照射、低酸素、または他の何らかの処理であるかもしれない。
【０００９】
阻害型転写トランス活性化因子は、誘導物質の存在下で転写を抑えて、活性化型転写トランス活性化因子は、誘導物質の存在下で転写を活性化する。このようにして、複製に不可欠なウイルス遺伝子の発現は、CT-TREおよびトランス活性化因子調節性転写調節エレメント、そして間接的に誘導物質の濃度または条件の両方に調節される。したがって、腫瘍溶解ウイルス療法による患者の治療の間、そのウイルスの複製および伝染は誘導物質濃度を調整することによって調節されることになる。
【００１０】
ウイルス・ベクターの特定の使用に依存して、誘導物質は転写を抑えるか、または転写を高めるために作用するかもしれない。転写抑制因子は、誘導物質を宿主細胞にデリバリーすることによってウイルス複製を「止める」方法を提供する。転写活性化因子は、誘導物質の追加によりウイルスの複製を誘発する方法を提供する。
【００１１】
好ましくは、複製に不可欠なウイルス遺伝子は、初期遺伝子である。いくつかの態様で、本願発明のウイルス・ベクターはトランス活性化因子調節性転写調節エレメントの転写制御下のウイルス遺伝子、および、同じトランス活性化因子調節性転写調節エレメントまたは第1トランス活性化因子調節性転写調節エレメントと実質的に同一である第2トランス活性化因子調節性転写調節エレメントのいずれかの制御下にある、例えば追加のウイルス遺伝子または導入遺伝子のような、少なくとも1つの他の遺伝子を含む。好ましくは、トランス活性化因子調節性転写調節エレメントの転写調節下の第1および第2遺伝子は、どちらも複製に必要なウイルス遺伝子である。1以上のトランス活性化因子調節性転写調節エレメントの使用による細胞に特異的な転写によって、本発明は、標的細胞の選択的な細胞溶解をもたらす、細胞に特異的な複製に使われることができるウイルス・ベクターを提供する、ここで、ウイルスの複製を外因性誘導物質または条件に標的細胞をさらすことによって調節する。
【００１２】
本発明のウイルス・ベクターは、本明細書中で標的細胞と呼ばれる、CT-TRE機能細胞内で選択的に複製する。この複製の優先傾向は、CT-TREが活性な細胞での複製レベル（すなわち、力価）をCT-TREが活性でない細胞の複製レベル（すなわち、非標的細胞）と比較することによって示される。標的細胞の感染に続くウイルス力価と、非標的細胞（CT-TRE不活性）の感染に続く力価との比較は、全体的な複製の優先傾向が標的細胞における複製により高められ、そしてと非標的細胞における複製で低下するという重要な指標を提供する。これは、手に負えない感染を予防するように、標的細胞を殺傷する手段を提供する。さらなるレベルの複製制御は、誘導物質または条件の存在もしくは不存在、あるいはその濃度の変化によって提供される。本発明のウイルス・ベクターは、標的細胞特異的な複製を示し、その制御が誘導物質によってさらに調節される、複製能力があるアデノウイルスによって本明細書中で例証される。
【００１３】
一般的な技術
本発明の実施は、別段の示唆がなければ、当該技術分野の技能の範囲内にある（組み換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の伝統的な技術を利用する。そのような技術は、文献中、例えば"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); および "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., eds., 1991)に完全に説明されている。
【００１４】
規定
（互換的に本明細書中に使われている）本発明の「複製能力があること」または「腫瘍溶解」ベクターは、これだけに制限されることなく、裸のDNA；ウイルスコート中に封入されたウイルス・ベクター；他のウイルスまたはウイルス様形態に詰め込まれたウイルス・ベクター（例えば、単純ヘルペスウイルスとAAV）；リポソーム中に封入されたウイルス・ベクター；ポリリジンまたは他の生体適合性ポリマーと複合体を形成したウイルス・ベクター；合成ポリカチオン性分子と複合体を形成したウイルス・ベクター；トランスフェリンによって抱合されたウイルス・ベクター；例えばPEGのような化合物と複合体を形成して、その分子を免疫学的に「マスクした」および/または半減期を延ばしたウイルス・ベクター；または、非ウイルス・タンパク質、もしくは当業者に知られるいずれかのデリバリー担体に抱合されたウイルス・ベクター、を含むいくつかの形態のいずれかであるかもしれない。そのようなベクターが本発明の1つの態様を表す。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。
【００１５】
本明細書中において、「DNA」は、塩基A、T、C、およびGだけを含むのではなく、同様にそれらの類似体、または、例えばメチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間の修飾、例えば非荷電性結合およびチオアート、糖類似体の使用、ならびに修飾および/または代替骨格構造体、例えばポリアミドのような、これらの塩基のあらゆる修飾形態を含む。本願発明の目的のために、ウイルス・ベクターは、標的細胞内において複製能力がある。本発明の範囲内に含まれる複製能力がある典型的なウイルスは、これだけに制限されることなく、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス；HSV）、レオウイルス、パラミクソウイルス、ライノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、西ナイルウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、およびワクチニアウイルスなどを含む。複製能力があるウイルスの全ての血清型が、本明細書中に記載の技術を使って標的化された発現および調節された発現のために作り出されることができる。
【００１６】
（本明細書中において、互換的に使われる）「アデノウイルス・ベクター」または「アデノウイルスのベクター」は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、アデノウイルス・ゲノムの全部または一部を含む（本明細書中に規定される）ポリヌクレオチドを一般に含む。本明細書中において、「アデノウイルス」は、ウイルス自体、またはその誘導体を表す。前記用語は、別段の示唆がある場合を除いて、全ての血清型およびサブタイプ、そして天然および組み換えの形態におよぶ。本発明の目的のために、調節可能なアデノウイルス・ベクターが提供される。誘導性トランス活性化因子遺伝子に動作できるように連結された細胞型特異的な転写制御エレメント（CT-TRE）、および誘導性トランス活性化因子によって調節される転写トランス活性化因子調節性調節エレメントに動作できるように連結されたアデノウイルス遺伝子を含む。アデノウイルス・ベクターは、場合により、トランス活性化因子調節性調節エレメント、または細胞型特異的ではない、他のタイプの転写調節エレメントに動作できるように連結された2番目のアデノウイルスの遺伝子または導入遺伝子を含むかもしれない。
【００１７】
アデノウイルスに特に関連した技術に関して、とりわけ、Feigner and Ringold (1989) Nature 337:387-388; Berkner and Sharp (1983) Nucl. Acids Res. 11:6003-6020; Graham (1984) EMBO J. 3:2917-2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67:5911-5921; Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806を参照のこと。アデノウイルスに関連するアデノウイルス生物学および/または技術の様々な側面について説明している刊行物は以下のものを含む。Graham and Van de Eb (1973) Virology 52:456-467; Takiff et al. (1981) Lancet ii:832-834; Berkner and Sharp (1983) Nucleic Acid Research 6003-6020; Graham (1984) EMBO J 3:2917-2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67:5911-5921; およびBett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806は、遺伝子導入担体として働くように遺伝子的に修飾された複製欠損アデノウイルスを説明する（すなわち、遺伝子治療）。そのようなベクターにおいて、初期のアデノウイルス遺伝子産物、E1AおよびE1Bが一般に欠失されて、そしてフランク・グラハムによって開発されたパッケージング細胞株293によってイントランスに提供される（Graham et al. (1987) J. Gen. Birol. 36:59-72 and Graham (1977) J. Genetic Virology 68:937-940）。
【００１８】
遺伝子導入される遺伝子は、一般にアデノウイルスのウイルスゲノムの欠失されたE1AおよびE1B領域中に挿入される、Bettほか（1990）上記。遺伝子治療のためのアデノウイルス・ベクターは、Stratford-Perricaudet (1990) Human Gene Therapy 1:2-256; Rosenfeld (1991) Science 252:431-434; Wang et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol. 309:61-66; Jaffe et al. (1992) Nat Gent. 1:372-378; Quantin et al. (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155; Stratford-Perricaudet et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:626-630; Le Gal La Salle et al. (1993) Science 259:988-990; Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:225-234; Ragot et al. (1993) Nature 361:647-650; Hayaski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23872-23875によって記載された。
【００１９】
「トランス活性化因子」、「トランス活性化する因子」または「転写活性化因子」は、プロモーターからの転写を容易にするポリペプチドを意味する。誘導性トランス活性化因子は、特定の誘導物質または条件の存在（または不在）、あるいはその濃度の変化により転写を容易にする。例えば、tet調節性の誘導性トランス活性化因子は、トランス活性化因子が適当な誘導因子、例えばテトラサイクリンもしくはその類似体、に結合していない時、誘導性tetOプロモーターからの転写を容易にするかもしれない。テトラサイクリンの存在下、そのようなトランス活性化因子はその標的への結合を妨げられ、それにより転写が妨げられる。逆tetトランス活性化因子は、野生型tetリプレッサーのDNA結合特異性を維持しているが、しかし逆の様式で調節される、すなわち、それは誘導因子の欠如よりむしろ適当な誘導因子、例えばテトラサイクリンもしくはその類似体、の存在下でのみtetオペレーター配列に結合する。一般に、転写活性化因子は直接的に転写応答エレメントに結合するが、しかしある場合には、それらは、転写応答エレメントに次に結合するか、または結合した他のタンパク質に間接的に結合する。
【００２０】
本明細書中において、「転写調節エレメント」は、「転写応答エレメント」または「TRE」とも表され、RNAを形成するRNAポリメラーゼによる動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を調節（すなわち、管理）する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。本明細書中において、TREは、TREが機能することを可能にする宿主細胞における動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加させる。TREは、同じ遺伝子に由来するかまたは由来しないエンハンサー因子および/またはプロモーター因子を含む。所望の転写活性が得られる限り、TREのプロモーターおよびエンハンサー成分は、着目のコード配列からあらゆる方向および/または距離であることができ、また、前述の多量体を含むかもしれない。本明細書中において、TREはサイレンサー・エレメントを欠くかもしれない。TREは、細胞型特異的であるか、例えば、種々の組織のいずれかに由来する癌細胞（前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、結腸癌細胞、肝臓癌細胞、腎臓癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞など）に特異的（細胞ステータス特異的）であるか、またはたくさんの細胞型で活性であるかもしれない。本明細書中において、用語、細胞型特異的転写調節エレメント（CT-TRE）は、細胞型特異的、および細胞ステータス特異的調節エレメントの両者を表す。
【００２１】
トランス活性化因子が作用する転写調節エレメントは、「転写トランス活性化因子調節性調節エレメント」と呼ばれる。転写トランス活性化因子調節性調節エレメントは動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を調節して、そして誘導性トランス活性化因子によって、例えばプロモーター内またはその付近の特定のDNA結合部位への誘導性トランス活性化因子タンパク質の結合によって調節される。本明細書中において、転写トランス活性化因子調節性調節エレメントまたはTA-TREは、転写を下方調節するかまたは上方調節することによって、誘導物質の存在下で転写レベルを変更する。
【００２２】
「エンハンサー」は当該技術分野のよく理解されている用語であり、遺伝子に動作できるように連結された場合にエンハンサーの不存在下でプロモーターによってもたらされた転写活性化よりも強い程度まで、プロモーターに動作できるように連結された遺伝子の転写を増強する、すなわちそれがプロモーターからの転写を増やす、遺伝子由来のヌクレオチド配列である。「エンハンサー活性」を持つは、当該技術分野でよく理解されている用語であり、「エンハンサー活性」があるヌクレオチド配列が存在する時、動作できるようにプロモーターに連結された遺伝子の転写を、「エンハンサー活性」をもつヌクレオチド配列の不存在下、遺伝子に動作できるように連結される時にプロモーター自体によってもたらされた転写レベルより高いレベルまで増やす、すなわち、プロモーターからの転写を増やす、ことを意味する。
【００２３】
「転写調整下」は、当該技術分野でよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常DNA配列、の転写が、それが動作できるように（動作可能なように）連結された、転写の促進または抑制のいずれかの調整に寄与するエレメントに依存することを示す。
【００２４】
用語「動作できるように連結された」は、機能上の関係においてポリヌクレオチド・エレメントの配向性に関する。TREがコード配列の転写を促進すれば、TREは動作できるようにコード区域に連結している。動作できるように連結されたは、連結されたDNA配列が一般に隣接して、そして2つのタンパク質コード領域をつなぐのに必要な所で、隣接し、そして同じ読み取り枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、数キロベースまでプロモーターから離れた場合に一般に機能して、そしてイントロン配列が可変長であるので、いくつかのポリヌクレオチド・エレメントが動作できるように連結されているが、隣接していないかもしれない。
【００２５】
用語「誘導物質」および「誘導条件」は互換的に使われて、そしてプロモーター内またはその付近の特定のDNA結合部位への誘導性トランス活性化因子転写応答エレメントの結合を容易にする化学物質または条件を表す。本明細書中において、誘導物質/条件がトランス活性化因子転写応答エレメントに作用する時、転写を下方調節するかまたは上方調節することによって、転写レベルが変更されるかまたは調整される。典型的な「誘導物質」および「誘導条件」は、化学物質または非化学物質に制限されることなく（例えば、超音波、熱、外照射、低酸素など）を含む。本発明の腫瘍溶解ベクターのそのような「誘導物質」または「誘導条件」への暴露は、それぞれ、ウイルスの複製の増加または減少をもたらす、転写の活性化（誘導）または抑制（抑制）をもたらすことが理解される。
【００２６】
「宿主細胞」は、本発明のいずれかのウイルスおよび/またはベクターの受け手であることができるまたはそうだった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単独の宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、自然の、偶然の、または意識的な突然変異および/または変化により、（形態学、または全DNA相補体の点で）元の親細胞と必ずしも完全に同一ではないかもしれない。宿主細胞は、本発明のウイルスおよび/またはベクターをインビボでトランスフェクトされたか、またはそれに感染した細胞を含む。宿主細胞は、インビトロにおける培養のために組織または動物宿主から単離される。
【００２７】
本明細書中において、（互換的に本明細書中に使われる）用語「新生物細胞」、「新形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」、および「癌細胞」は、それらが細胞増殖の制御の顕著な損失を特徴とする異常な成長発現型を示すように、比較的に自立的な増殖を示す細胞を表す。新生物細胞は、悪性であるか、または良性であるかもしれない。
【００２８】
ウイルス・ベクター、例えば本発明のウイルス・ベクター、に関して、「異種の」プロモーターまたはエンハンサーは、野生型ウイルスに存在しないものである。異種のプロモーターまたはエンハンサーの例は、アルブミン・プロモーターまたはエンハンサー、および他のウイルス・プロモーターおよびエンハンサー、例えばSV40、である。
【００２９】
ウイルス（ウイルス・ベクター）に関して、「内在性の」プロモーター、エンハンサー、またはTREは、そのウイルスに固有であるか、またはそのウイルス由来である。
【００３０】
用語「遺伝子」は、当該技術分野で十分に理解されていて、そしてポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。ポリペプチド・コード領域に加えて、遺伝子は、これだけに制限されることなく、イントロン、転写されるが翻訳されていない区域、およびコード区域の上流および下流の調節エレメントを含む非コード領域を含む。
【００３１】
ウイルス（ウイルス・ベクター）に関して、「異種のポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」は、野生型ウイルスに存在しないあらゆる遺伝子である。好ましくは、導入遺伝子は、ウイルス（ウイルス・ベクター）による導入前に標的細胞において発現または存在してもいないであろう。好ましい導入遺伝子の例を以下に提供する。
【００３２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに係わらず、配列番号「で表された」配列は、その配列が配列番号の配列で同じく隣接している配列として存在することを意味する。
【００３３】
互換的に本明細書中に使われる、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体の形態を表す。これらの用語は、1本鎖、2本鎖、もしくは3本鎖DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。以下のものはポリヌクレオチドの制限されることのない例である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたDNA、いずれかの配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、ウラシル、例えばフルオロリボースおよびチオアートのような他の糖および連鎖基、ならびにヌクレオチド分岐のような、修飾されたヌクレオチドを含むかもしれない。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって遮られるかもしれない。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との抱合によって、重合後にさらに修飾されうる。この規定に含まれる他のタイプの修飾は、キャップ（caps）、類似体による天然のヌクレオチドの1以上の置換、ならびにポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に取り付けるための手段の導入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書中において、「DNA」は、塩基A、T、C、およびGだけを含むわけでなく、同様にそれらの類似体またはこれらの塩基の修飾された形態、例えばメチル化されたヌクレオチド、ヌクレオチド間の修飾、例えば非荷電結合とチオアート、糖類似体、ならびに修飾および/または代替骨格構造体、例えばポリアミドの使用のどれをも含む。
【００３４】
他の配列に対してある割合（例えば80％、85％、90％、または95％）の「配列同一性」をもつポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域は、アラインされる時に、2つの配列の比較において、その割合の塩基が同じことを意味する。このアラインメントと相同率または配列同一性は、当該技術分野で知られているソフトウェア・プログラム、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1.で記載のものを使って決定することができる。好ましいアラインメント・プログラムは、好ましくはデフォルトのパラメーターを使った、ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania)である。
【００３５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸の重合体を表すために互換的に使用される。これらの用語は、グリコシド化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通して翻訳後に修飾されたタンパク質を同様に含む。
【００３６】
「複製」と「増殖」は、互換的に使用されて、そして再生または増殖する本発明のウイルス・ベクターの能力を表す。この用語は当該技術分野で十分に理解されている。本願発明の目的のために、複製は、ウイルス・タンパク質の産生を伴って、一般に、ウイルスの複製に向かう。複製は、当該技術分野で標準的な、そして本明細書中に記載されているアッセイ、例えばバースト・アッセイまたはプラーク・アッセイ、を使って計測されることができる。「複製」と「増殖」は、これだけに制限されることなく、ウイルスの遺伝子発現、ウイルス・タンパク質、核酸、または他の成分の産生、完全なウイルスへのウイルス成分のパッケージング、ならびに細胞溶解を含むウイルス製作工程に直接的にまたは間接的に関係しているあらゆる活性を含む。
【００３７】
「複製に不可欠な遺伝子」は、その転写が細胞において複製すべきウイルス・ベクターのために必要とされる遺伝子である。
【００３８】
本明細書中において、「標的細胞」は、細胞型特異的転写調節エレメント（TRE）が機能することを許容する（すなわち、可能にするまたは誘導する）細胞である。一般に、標的細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、である。
【００３９】
本明細書中において、「細胞毒性」は、当該技術分野でよく理解されている用語であり、細胞の1つ以上の通常の生化学的または生物学的な機能を混乱させる（すなわち、抑制されるか、または高められる）状態を表す。これらの活性は、これだけに制限されることなく、代謝、細胞の複製、DNA複製、転写、翻訳、および分子の取り込みを含む。「細胞毒性」は、細胞死および/または細胞溶解を含む。細胞毒性を示すアッセイ、例えば色素排除、3Hチミジン取り込み、およびプラーク・アッセイは、当該技術分野で知られている。本明細書中において、用語「選択的な細胞毒性」は、同じTREが機能することを許容しないか、またはそれをわずかしか許容しない細胞に本発明ウイルス・ベクターによって与えられた細胞毒性と比較した場合の、細胞型特異的TREが機能することを許容する細胞に本発明のウイルス・ベクターによって与えられた細胞毒性を表す。そのような細胞毒性は、例えばプラーク・アッセイ、標的細胞を含む腫瘍のサイズの減少または安定化、あるいは腫瘍細胞を特徴なマーカーまたは組織特有のマーカー、例えば、癌マーカー、例えば前立腺特異的抗原、の血清レベルの低下または安定化によって計測されうる。
【００４０】
本明細書中において、「細胞毒性」遺伝子は、単独でまたはウイルス複製に関連した細胞でのその発現が細胞における細胞毒性および/または細胞溶解活性の程度および/または割合を高める遺伝子である。
【００４１】
「治療のための」遺伝子は、細胞におけるその発現が望ましい結果に関係する遺伝子である。癌との関係において、この望ましい結果は、例えば細胞毒性、細胞増殖の抑制または減速、および/または細胞死であるかもしれない。
【００４２】
「生物学的なサンプル」は、個体から得られた種々のサンプル・タイプを含み、診断またはモニタリング・アッセイで使用されることができる。前記規定は、血液および生物学的な起源の他の液体サンプル、固体組織サンプル、例えばバイオプシー検体または組織培養物またはそこから得られた細胞、ならびにその子孫を含む。前記規定は、例えば試薬での処理、特定の成分、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドの可溶化または濃縮によって、入手後にあらゆる方法で操作されたサンプルを同様に含む。用語「生物学的なサンプル」は、医療用サンプルを含み、そして同様に培養細胞、細胞上清、細胞ライセート、血清、血漿、体液、および組織サンプルを含む。
【００４３】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは人間である。哺乳動物は、これだけに制限されることなく、齧歯動物、霊長類、家畜、競技用動物、およびペットを含む。
【００４４】
「効果的な量」は、有益であるか、または所望の臨床的結果を達成するのに十分な量である。効果的な量は、1回以上の投与によって投与されることができる。本願発明の目的のために、ウイルス・ベクターの効果的な量は、病状の進行を緩和するか、改善するか、安定させるか、逆転させるか、遅くするか、または遅らせるのに十分な量である。
【００４５】
本明細書中において、「治療」は、有益であるか、または所望の臨床的結果を得るためのアプローチである。本願発明の目的のために、有益であるか、または所望の臨床的結果は、これだけに制限されることなく、検出可能であろうとなかろうと、症状の軽減、病気の範囲の縮小、病状の安定化（すなわち、悪化しない）、病気の伝染（すなわち、転移性）の予防、病気の進行の遅延または減速、病状の改善または苦痛緩和、ならびに（部分的かまたは全体的な）寛解を含む。「治療」は、治療を受けていない時に期待される生存と比べた場合に生存を延長することを同様に意味することができる。
【００４６】
病気を「緩和する」ことは、本発明のウイルス・ベクターを投与しないのと比べて、病状の程度および/またはその好ましくない臨床的徴候を少なくされること、および/または進行の経時変化を遅くするか、または延長することを意味する。
【００４７】
調節可能な転写トランス活性化因子とリプレッサー
本発明は、ウイルス感染のための宿主細胞としての目的を果たすことができる哺乳動物細胞内で機能するトランス活性化タンパク質を利用する。そのようなトランス活性化タンパク質は、脊髄動物細胞を含めた真核細胞からの合成、キメラ、および天然の転写トランス活性化タンパク質またはタンパク質ドメイン、脊髄動物プロモーターからの転写を刺激することができるウイルスのトランス活性化タンパク質またはいずれかの合成アミノ酸配列を含む。そのようなトランス活性化タンパク質は、（1）天然（野生型）のものであるか、（2）キメラ（天然のタンパク質のDNA結合ドメインおよび天然のタンパク質の調節（アクチベーターもしくはリプレッサー）ドメインのキメラ）のものであるか、（3）構造モデリング、ファージ・ディスプレイ・スクリーニング、または他の方法によって設計された新規DNA結合ドメインをもつ合成のものであるか、ならびに（4）融合タンパク質の形態をとるかもしれないものであるかもしれない。
【００４８】
転写活性化ドメインの種類は、酸性転写活性化ドメイン、高プロリン転写活性化ドメイン、高セリン/トレオニン転写活性化ドメイン、および高グルタミン転写活性化ドメインを含む。酸性転写活性化ドメインの例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Gal4のVP16領域およびアミノ酸残基753〜881を含む（Braselmann et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90 (5): 1657-1661）。高プロリン活性化ドメインの例は、CTF/NF1のアミノ酸残基399〜499、およびAP2のアミノ酸残基31〜76を含む。高セリン/トレオニン転写活性化ドメインの例は、ITFのアミノ酸残基11〜427とITF2のアミノ酸残基2〜451を含む。高グルタミン活性化ドメインの例は、Oct1のアミノ酸残基175〜269とSp1のアミノ酸残基132〜243を含む。先に記載の領域の各々、および他の有用な転写活性化ドメインのアミノ酸配列は、Seipel, K.ら(EMBO J. (1992) 13:4961-4968)によって開示される。
【００４９】
トランス活性化タンパク質の例は、Muller らによって同定されたリンパ特異的転写因子（1988, Nature 336:544-551）、fosタンパク質（Lucibello et al., 1988, Oncogene 3:43-52）；v-junタンパク質（Bos et al., 1988, Cell 52:705-712）；ファクターEF-C（Ostapchuk et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2787-2797）；HIV-1tatタンパク質（Arya et al., 1985, Science 229:69-73）、パピローマウイルスE2タンパク質（Lambert et al., 1989, J. Virol. 63:3151-3154）、およびアデノウイルスE1Aタンパク質（Flint and Shenk, 1989, Ann.Rev.Genet.で検討される）を同様に含む。本発明の好ましい態様において、トランス活性化タンパク質は、単純ヘルペスウイルスVP16である（Sadowski et al., 1988, Nature 335:563-564; Triezenberg et al., 1988, Genes and Dev. 2:718-729）。ヒトNF-kappaB活性化ドメイン（p65）が多数の系で同様に使用された（Vermeulen L et. al., Biochem Pharmacol 64(5-6):963-70, 2002）。
【００５０】
誘導性トランス活性化因子は、（i）DNA結合タンパク質の機能的部分と、（ii）先に記載の転写活性化タンパク質の機能的部分を含むキメラ融合タンパク質を含む。DNA結合タンパク質とトランス活性化タンパク質をコードしているDNA配列は、各々の個別の結合およびトランス活性化特性を保存するように組み合わされる。DNA結合タンパク質または転写トランス活性化タンパク質の機能を要求されない領域は、マッピング突然変異のアッセイ、ならびに分子の他の、より機能的に関連している部分より突然変異敏感ではないであろう、マッピング突然変異を欠く領域の同定を含む当該技術分野で知られているいずれかの方法によって同定されうる。適当な組み換え構築物は、Maniatis（1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory)）に記載のものを含めて、分子生物学の標準的な技術を使って準備される。
【００５１】
DNA結合タンパク質部分は、あらゆる脊椎動物、無脊椎動物（nonvertebrate）、真菌、植物、または細菌起源由来でありえ、そして天然、加工、または合成であるかもしれない。例は、Gal4（Keegan et al., 1986, Science 231:699-704）、ADR1（Hartshorne et al., 1986, Nature 320:283-287）、Swl（Stillman et al., 1988, EMBO J. 7:485-495）を含み、そして一般にジョンソンら（1989, Annual Rev. Biochem., 58:799-839）によって検討されるとおりである。トランス活性化因子は、リプレッサータンパク質、例えばlexAリプレッサー、であるかもしれない。いくつかの態様において、キメラ・トランス活性化因子タンパク質は、その結果、転写トランス活性化因子調節性調節エレメントに加工された部位への結合によってトランス活性化因子タンパク質に対する特異性を与える細菌のDNA結合タンパク質由来である。細菌のDNA結合部位に対するDNA配列の相同は、哺乳動物ゲノムにおいて頻繁に起こる可能性が低く、そのため着目の遺伝子の発現を選択的に制御する。
【００５２】
典型的なアクチベーター・ドメインは、これだけに制限されることなく、VP16、NF-kappaB、TFE3、ITF1、Oct-1、Spl、Oct-2、NFY-A、ITF2、c-myc、およびCTFを含む（Seipel, et al., 1992, EMBO J 13: 4961-4968）。典型的なリプレッサー・ドメインは、これだけに制限されることなく、Kruppel（KRAB; Margolin et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91 (10): 4509-13）、kox-1（Deuschle et al., 1995）、even-skipped（Licht et al., 1994）、LacR、engrailed（Li et al, 1997, J Biol Chem., 274 (12): 7803-15）、hairy（HES; Fisher et al., 1996, EMBO J 12 (13): 5075-82）、Groucho（TLE; Fisher etal., 1996）、RING1（Satjin etal., 1997, Mol. Cell. Biol. 17 (7): 4105-4113）、SSB16とSSB24（Sana et al., 1993）、TUPI（Tzamarlas, Struhl, 1994）、Nabl（Swirnoff et al., 1998）、AREB（Ikeda et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18 (1): 10-18）、E4BP4（Cowell & Hurst, 1996）、HoxA7（Schnabell et al, 1996）、EBNA3（Bourillot et al., 1998, J Gen Virol. 79 (Pt 2): 363-70.）、およびv-erbA（Busch et al., 1997, Mol Endocrinol. 11 (3): 379-89.）を含む。特定の例として、tTs（TETサイレンサー）がKRABタンパク質の抑制ドメインを使う。アクチベーター・ドメイン、リプレッサー・ドメイン、およびキメラ転写トランス活性化因子のさらなる例に関してPCT公開WO0052179を同様に参照のこと。
【００５３】
キメラ・トランス活性化因子タンパク質が細胞核内に選択的に濃縮されるように、キメラ・トランス活性化因子タンパク質はさらに核局在配列を含むかもしれない。例えば、SV40ラージT抗原の核局在シグナル、Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val（Kalderon et al., 1984, Cell 39:499-509）をコードする核酸配列は、トランス活性化因子タンパク質コード配列と同格で配置される。
【００５４】
誘導物質または条件による遺伝子発現の制御のたくさんの方法、例えばテトラサイクリン、抗プロゲスチン、およびエクジソンによって誘導されたものが記載された。
【００５５】
本発明に適用できる誘導性システムは、その各々が明確に本明細書中に援用される米国特許第5,464,758号、同第5,589,362号、PCT公表WO94/29442、同WO96/01313、および同WO96/40892に記載されるtet（Tet(商標)）およびリバース（RevTet(商標)）システムを含む。例えば、当業者は標的の転写を調節する（オンまたはオフにする）ために小分子、例えばテトラサイクリン（Tc）または類似体、例えばドキシサイクリン、を利用するTet(商標)およびRevTet(商標)システム（BDBiosciences Clontech）を使うかもしれない（Knott A et al., Biotechniques 32(4):796, 798, 800 (2002)）。Tet(商標)およびRevTet(商標)システムの両方が、インビボでの遺伝子発現を調整することが証明された。パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、および単純ヘルペスウイルスに基づいた修飾されたベクターが、インビトロでTET技術を導入するために使用された。例えば、Ho, D.Y. et al. (1996) Mol. Brain Res. 41:200-209; Hwang, J-J. et al. (1996) J. Virol. 70:8138-814; Hu, S-X. et al. (1997) Cancer Res. 57:3339-3343; and Maxwell, I.H. et al. (1996) Gene Ther.3:28-36を参照のこと。Gossen et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89(12):5547- 51は、テトラサイクリン感受性プロモーターによって哺乳動物細胞における遺伝子発現の制御を説明する。Gossen et al. (1995) Science 268(5218): 1766-9は、哺乳動物細胞におけるテトラサイクリンによる転写活性化を説明する。Urlinger ef al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(14):7963-8は、テトラサイクリン依存性転写アクチベーターの突然変異について議論する。Freundlieb et al. (1999) J Gene Med. 1(1):4-12は、哺乳動物細胞内への遺伝子導入の高い能力を持つテトラサイクリン制御性活性化/抑制システムを議論する。
【００５６】
他の典型的なシステムにおいて、転写は、その各々がトランス活性化因子またはDNA結合タンパク質と連結する2個の細胞内分子を接合するラパマイシン（またはその類似体）によって活性化される。これらの成分が一緒になる時、着目の遺伝子の転写が活性化される。ラパマイシンは、イムノフィリンFK506結合タンパク質（FKBP）と脂質キナーゼ同族体FRAPの間のヘテロダイマーの形成を介在する（Standaert, R. F. et al., Nature 346, 671-674 (1990); Brown, E. J. et al., Nature 369, 756-758 (1994); Rivera, V. M. ef al. Nat. Med. 2, 1028-1032 (1996); and Ho, S. N. et al., Nature 382, 822-826(1996)）。ラパマイシン・ベースのシステム（Ariad）は、細胞培養および動物モデルの両方で標的遺伝子の転写を調節することがしめされ、高い用量依存性の誘導性がラパマイシンの添加の後に証明された。
【００５７】
例えば、Ye et al. Science 283 (5398):88-91, 1999; Magari et a/. J Clin Invest. 100(11):2865-72,1997; Rivera et al. Nat Med. 2(9): 1028-32,1996を参照のこと。Ariadは、2つの主要なシステム：ホモダイマー形成に基づいたシステムとヘテロダイマー形成に基づいたシステム、を持っている（Rivera et al.,1996, Nature Med, 2(9): 1028-1032; Ye et al., 2000, Science 283: 88-91; Sawyer TK et al., 2002, Mini Rev Med Chem. 2(5):475-88）。ヘテロダイマー形成システムは、ヒトFKBP12（FK506結合タンパク質）とラージヒトPI3K同族体、FRAP（RAFT、mTOR）の93aa断片に基づく。ZFHD1（2つのヒトDNA結合ドメインの融合タンパク質）と呼ばれるDNA結合タンパク質がFKBPに結合され、そしてヒトのNF-kappa b p65活性化ドメインがFRAP（ラパマイシン類似体が誘導物質として使用される場合には、代わりにFRAPの変異バージョン）に融合される。FKBP12およびFRAPの両方に結合する誘導因子分子の追加によって、FKBP12およびFRAPはDNA結合タンパク質と活性化ドメインと一緒になる。遺伝子転写がそれによって開始される。
【００５８】
調節性遺伝子発現システムまたはプロモーターの他の例は、メタロチオネイン・プロモーター・システム（Mulherkar et al. Biochem Biophys Res Commun. 177(1):90-6, 1991）；グルココルチコイド・プロモーター・システム（Ko ef al. (1989) Gene 84(2):383-9）、エクジソン調節性遺伝子スイッチ（Saez ef al. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26): 14512-7）、およびマクロライド・ベースの導入遺伝子制御システム（Weber ef al. (2002) Nat Biotechnol. 20(9):901-7）を含む。
【００５９】
エクジソン・システムのうちで、ショウジョウバエ（Drosophila）エクジソン・システム（Yao and Evans, 1996, Proc. Nat. Acad. Sci., 93:3346）、カイコガ属（Bombyx）エクジソン・システム（Suhr et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci., 95:7999）である。ステロイド・ベースのシステムは、誘導因子としてRU-486を利用する合成プロゲステロン・レセプター・システムを含む（Wang et al., Biochim Biophys Acta, 1994, 1218 (3): 308-314; Delort and Capecchi, 1996, Hum Gene Ther 7 (7): 809-820; およびOsterwalder et al., 2001, Proc Natl Acad Sci 98(22): 12596-601）。
【００６０】
転写トランス活性化因子、リプレッサー、またはそのための応答エレメントの「機能的に保存された」変異体は、参照する転写トランス活性化因子、リプレッサー、またはそのための応答エレメントと異なる転写トランス活性化因子、リプレッサー、またはそのための応答エレメントであるが、動作できるように連結されたポリヌクレオチド転写を増やす能力、特に細胞型特異的転写活性を維持する。相違は、例えば、単独のまたは複数の塩基の突然変異、付加、欠失、および/または塩基の修飾のために生じる、変更された直鎖配列または立体配座に起因するかもしれない。相違は、糖の変化、および/または塩基間の連結から同様に生じるかもしれない。
【００６１】
本発明の腫瘍溶解ウイルスは、幅広い種類の目的のために使用されることができる。目的は標的細胞によって変わる。好適な標的細胞は、ウイルス・ベクター内の細胞特異的転写応答エレメントの転写活性化によって特徴づけられる。転写活性化の調整は、cis-調節要素に結合する転写アクチベーター、基礎転写要素に結合する因子と、転写メディエーターの活性、コアクチベーター、および誘導物質または条件の存在の間の相互作用の結果である。トランス活性化因子調節性転写調節エレメントは、複製有能が標的細胞でおよび/または導入遺伝子に対して達成できるように、増殖に不可欠なウイルス遺伝子と動作できるように連結される。導入遺伝子によって、野生型ウイルスにないあらゆる遺伝子が意図され、しばしば、導入遺伝子は、同様にウイルスによる導入より前に標的細胞で発現されない。
【００６２】
当業者は、転写因子結合部位内およびその周囲の塩基のいくつかの変更が、遺伝子活性化と細胞特異性により否定的に影響することが見込まれるが、一方で、転写因子結合に関係していない塩基の変更がそのような影響を与えることがそれほど見込まれないことを認識する。特定の突然変異が、同様に転写トランス活性化因子またはリプレッサー活性を増やすことができる。塩基を変える効果の試験が、当該技術分野で知られているいずれかの方法、例えば移動度シフト・アッセイ、または標的、非標的細胞におけるこれらの変更を含むベクターのトランスフェクトによって、インビトロまたはインビボで実施されうる。その上、当業者は、点突然変異および欠失が転写を調節する配列の能力を変えることなく転写トランス活性化因子またはリプレッサー配列、あるいはそのための応答エレメントに対して行われることができることを認識する。
【００６３】
非常に低い基礎転写レベルが非標的細胞型で存在するかもしれないことは、当業者によって知られる。転写活性化によって、転写が、少なくとも約2倍；好ましくは少なくとも約5倍；好ましくは少なくとも約10倍；より好ましくは少なくとも約20倍、30倍、または40倍；より好ましくは少なくとも約50倍、60倍、70倍、80倍、または90倍；より好ましくは少なくとも約100倍；より更に好ましくは少なくとも約200倍、より更に好ましくは少なくとも約400〜約500倍、より更に好ましくは少なくとも約1000倍まで標的細胞の基礎レベルを上回り増加することが意図される。
【００６４】
遺伝子発現の制御のための先に記載のシステムの全てが、本発明を実施するうえでの有用性を発見する。誘導物質の有効な用量または効果的な誘導条件は公開された結果の外挿から、実証的検定から、および当業者によって知られそして日常的に使用されている他の方法から容易に決定される。例えば、誘導物質は、本発明のウイルス・ベクターをもつ動物に投与され、そして効果的なウイルス力価が誘導物質の投与後に測定される。
【００６５】
転写調節エレメント（TREs）
本発明の実施において、トランス活性化因子タンパク質をコードする遺伝子配列は好適な細胞型特異的TREの転写調整下に望ましくは配置される。「細胞型特異的TRE」は、異なる機能をもつ他の型の細胞に対して特定の細胞型において選択的に機能する。「細胞型」は、正常な生理学的な条件下、不可逆的で、末期状態である、細胞状態の差別化の反映である。例えば、前立腺特異的抗原TREは、前立腺細胞で機能するが、他の細胞型、例えば肝細胞、神経膠星状細胞、心臓細胞、リンパ球などで実質的に機能しない。一般的に、細胞型特異的TREは、1つの細胞型でしか活性ではない。細胞型特異的TREが1つ以上の細胞型で活性である場合、その活性は限定された数の細胞型に制限される、すなわち、全ての細胞型で活性であるわけではない。細胞型特異的TREは腫瘍細胞特異的であるかもしれない。そのような細胞型特異性は、TREが活性でない細胞と比較してTREが活性である標的宿主細胞における転写の相対的な増加を表す。
【００６６】
本明細書中において、特定の遺伝子由来のTREはそれが派生した遺伝子によって表され、そしてその遺伝子を発現する宿主細胞内の動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列である。標的細胞型に依存して、様々なエンハンサーが特異的な転写を提供するために使用されうる。リンパ球で、B細胞のために、当業者はIgエンハンサーを使用し、そしてT細胞のために、当業者はT細胞抗原レセプター・プロモーターを使用するかもしれない。異なる筋肉細胞のために、当業者は異なるミオシンのためにプロモーターを使うかもしれない。内皮細胞のために、当業者は異なるセレクチンのために異なるプロモーターを使うかもしれない。各々の細胞型のために、標的細胞特異的転写を可能にする細胞に関連する特定のタンパク質が存在する。
【００６７】
本明細書中において、「細胞状態特異的転写調節エレメント」または細胞状態特異的TREは、その転写調整下でポリヌクレオチドの発現を許容する、または誘導する特別な生理学的な条件下で誘導されるか、または活性になるTREである。
【００６８】
細胞状態の例は細胞周期である。その発現が細胞周期に関係する典型的な遺伝子は、S期に転写活性のピークを示す、普遍的に発現される、成長調節性遺伝子、E2F-1である。Johnson et al. (1994) Genes Dev. 8:1514-1525。RBタンパク質、ならびにRBファミリーの他のメンバーは、E2F-1と特異的な複合体を形成し、それによって、転写を活性化するその能力を阻害する。このように、E2F-1-応答性プロモーターがRBによって下方調節されている。多くの腫瘍細胞が、E2F-1感受性プロモーターを抑制解除させ、次々に脱調節された細胞分裂を引き起こしうるRB機能を有する。
【００６９】
S期に転写活性のピークを示す細胞状態-特異的TRE、例えば普遍的に発現される、成長調節性遺伝子の「E2F-1-TRE」、を含む複製能力があるベクターが、本発明内に含まれる。「E2F-1-TRE」は、例えばE2F-1を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞）のように、E2F-1-TREが機能することを許容された宿主細胞における（動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の）転写を選択的に増加させる、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。E2F-1-TREは、転写因子および/またはE2F−1産生細胞に関係する補因子に感受性であり、そしてE2F-1プロモーターおよび/またはエンハンサーの少なくとも1部を含む。Hernandez-Alcoceba R et al. (Hum Gene Ther 2002 Sep 20; 13(14): 1737-50); Tsukuda et al. (Cancer Res. 62:3238-3447, 2002); Johnson et al., Cancer Cell. 2002 May; 1(4):325-37. (Onyx); Jakubczak JL et al., Cancer Res. 2003 Apr 1; 63(7): 1490-9; 20010053352として公開された米国特許第09/392,822号、および20030104625として公開された米国特許第10/081969号を参照のこと。E2Fプロモーターの配列は当該技術分野で知られていて、例えばFueyo J et al., Nat Med. 1998 Jun;4(6):685-90に説明されている。
【００７０】
細胞状態のさらなる例は、（例えば、低酸素応答エレメントまたはHREのような）低酸素条件への応答である。低酸素応答の重要なメディエーターは、血管内皮増殖因子およびエノラーゼ-1を含めて糖分解酵素をコードするいくつかのの遺伝子を含む、いくつかの遺伝子の調節領域内の低酸素感受性エレメント（HRE）と相互作用する転写複合体HIF-1、または低酸素誘導性因子-1である。マウスHRE配列が確認されて、特徴づけられた。Firth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6496-6500。低酸素は、それらの起源、配置、または遺伝子の変更にかかわらずほとんどの固体腫瘍で発現して、その血管供給と関係する腫瘍の急速な増殖を生じる腫瘍微小環境の必須の構成要素である。低酸素は放射線療法および化学療法に対する癌細胞の抵抗を与える主要な要因であるので、高度に悪性の腫瘍クローンを選んで、腫瘍を転移性の傾向を与え、腫瘍の低酸素領域を狙う新規治療のための戦略の開発は重要である。
【００７１】
低酸素誘導性因子（HIF）は、標的遺伝子に存在する低酸素応答エレメント（HRE）に結合することによって低酸素への応答を調停するヘテロダイマー転写因子であり、それによりHIF/HREシステムが腫瘍に対する治療用遺伝子発現を特異的に標的にするために利用される。同様に、低酸素応答性エレメントまたは「HRE」を含む複製能力があるベクターが、本発明内に含まれる。低酸素応答性エレメントは、例えば低酸素感受性エレメント（HRE）と相互作用する低酸素誘導性因-子1を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）のようにHREが機能することを許容する条件下の宿主細胞における（動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の）転写を選択的に増やす、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。低酸素応答性エレメントの配列は当該技術分野で知られており、例えば、マウスエノラーゼ-1プロモーターからのHREは、Jiang et al. (1997) Cancer Res. 57:5328-533に説明される。
【００７２】
その発現が細胞周期に関係する他の典型的な遺伝子は、テロメラーゼである。例えば、ヒト・テロメラーゼ・プロモーターを使ったアデノウイルスの調節された発現を説明する20030104625として公開された米国特許出願第10/081969号；PCT公開WO00/46355；20030095989としての公開された米国特許出願第10/023,969号、US20030099616（Geron）として公開された米国特許出願第10/206447号；20020028785（セントルイス大学）として公開された米国特許出願第09/956,335号を参照のこと。本発明は、例えばテロメラーゼ・プロモーターといったテロメラーゼ調節エレメントを含む、複製能力があるベクターを提供する。多数のテロメラーゼ・プロモーター配列が当該技術分野で知られており、その例がGenBank登録番号AF128893.1およびAF121948に見られる。
【００７３】
他の細胞状態特異的転写応答エレメントは、熱誘導性（すなわち、ヒートショック）プロモーター、ならびに電離放射線およびUV放射を含めた放射線被曝応答性プロモーターを含む。例えば、初期成長応答-1（Egr-1）遺伝子のプロモーター領域は電離放射線によって誘導されるエレメントを含む。Hallahan et  al. (1995) Nat. Med. 1:786-791; and Tsai-Morris et al. (1988) Nucl. Acids. Res. 16:8835-8846。熱誘導性エレメントを含む熱誘導性プロモーターが説明された。例えば、Welsh (1990) in "Stress Proteins in Biology and Medicine", Morimoto, Tisseres, and Georgopoulos, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Perisic et al. (1989) Cell 59:797-806を参照のこと。
【００７４】
その結果、いくつかの態様において、細胞状態特異的転写応答エレメントは、電離放射線感受性エレメント、例えばEgr−1遺伝子の5'フランキング配列、ヒートショック応答性エレメント、または熱誘導性エレメントの1以上を含む。
【００７５】
本明細書中において、用語「細胞型特異的」は、遺伝子、すなわちウイルスの複製に不可欠な遺伝子が動作できるように連結されるか、または導入遺伝子が動作できるように連結されるTRE配列、あるいは転写（そして、動作できるように連結された遺伝子がウイルスの複製に不可欠なものであれば、複製）が標的細胞で選択的に進むか、または導入遺伝子が標的細胞で発現されるような標的細胞において特異的な機能を意味するように意図される。これは、動作できるように連結された転写調整配列によって駆動する転写を活性化する転写因子の、標的細胞内の存在の効果によって生じ、そして非標的細胞で生じることはない。それは、同様に通常非標的細胞で生じる転写阻害因子の効果によって生じて、そして動作できるように連結された転写制御配列によって駆動される転写を妨げることができる。本明細書中において、用語「細胞型特異的」は、細胞型特異性や組織特異性、ならびに与えられた標的細胞の癌症状に関する特異性を含むように意図される。後者の場合において、正常細胞の癌症状に関して特異性は、正常、非癌の対応物との比較による。
【００７６】
1つの態様において、本発明は、CT-TREが前立腺細胞特異的である腫瘍溶解性ウイルス・ベクターを含む。例えば、前立腺細胞において選択的に機能して、本発明で前立腺新生物に対する標的ウイルス複製に使用されることができるTREsは、これだけに制限されることなく、ヒト遺伝子hKLK2-TREからの）腺性カリクレイン-1遺伝子由来のTREs、前立腺特異的抗原遺伝子（PSA-TRE）、およびプロバシン遺伝子（PB-TRE）を含む。これらの遺伝子の3つ全てが、前立腺細胞で選択的に発現され、そして発現はアンドロゲンにより誘導可能である。一般的に、アンドロゲン誘導に感受性の遺伝子の発現は、アンドロゲンレセプター（AR）の存在を必要とする。
【００７７】
ヒト腺性カリクレイン（hK2タンパク質をコードするhKLK2）は、前立腺でもっぱら発現されて、その発現は主に転写活性化によりアンドロゲンによって調節されている。様々な腫瘍と前立腺癌の患者の血清中で見つかったhK2のレベルは、PSAのそれらと実質的に異なって、hK2抗原が前立腺癌のための重要なマーカーであるかもしれないことを示す。
【００７８】
「ヒト腺性カリクレイン転写調節エレメント」または「hKLK2-TRE」は、本発明の複製能力のあるベクターに含まれる。「hKLK2-TRE」は、例えばアンドロゲン・レセプターを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）、hKLK2-TREが機能することを許容する宿主細胞内の動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA塩基配列である。したがって、hKLK2-TREは、アンドロゲン・レセプターの結合に感受性であり、hKLK2プロモーターおよび/またはhKLK2エンハンサー（すなわち、AREまたはアンドロゲン・レセプター結合部位）の少なくとも1つの部分を含む。hKLK2-TREsはさらに米国特許出願第09/875,228号に記載される。
【００７９】
hKLK2の5'プロモーターの活性が先に記載されていて、そして転写開始領域と関係がある-2256までの領域が先に開示された（配列番号3）。Schedlich et al. （1987）DNA 6: 429-437。hKLK2プロモーターは、アンドロゲン応答性であり、そしてプロモーターが単独でリポーター遺伝子の発現を制御するプラスミド構築物において、上記リポーター遺伝子の発現は、アンドロゲンの存在により約10倍に増やされる。hKLK2エンハンサー活性は、（配列番号3に示される）転写開始点に対して約nt-12,014〜nt-2257のポリヌクレオチド配列の範囲内で見られ、そしてこの配列が動作できるようにhKLK2プロモーターおよびリポーター遺伝子と連結される時、前立腺細胞における動作できるように連結された配列の転写がアンドロゲンの存在により約30倍〜約100倍のアンドロゲンの不存在の転写レベルを超えるレベルまで増強される。この誘導は、一般に、配向非依存性、かつ、位置非依存性である。エンハンサー活性は、同様に（すべて転写開始部位に対する）以下の領域：約nt-3993〜nt-3643（配列番号3のnt8021〜8371）、約nt-4814〜nt-3643（配列番号3のnt7200〜8371）、約nt-5155〜nt-3387（配列番号3のnt6859〜nt8627）、約nt-6038〜nt-2394（配列番号3のnt5976〜9620）で説明された。
【００８０】
このように、hKLK2エンハンサーは、hKLK2プロモーターまたは異種プロモーターに動作できるように連結され、hKLK2転写調節エレメント（hKLK2-TRE）を形成する。そして、hKLK2-TREは、異種ポリヌクレオチドに動作できるように連結されて、連結された遺伝子にKLK2-TRE特異的転写制御を与え、そしてその発現を増やすことができる。
【００８１】
他の例において、「プロバシン（PB）転写調節エレメント」または「PB-TRE」は、本発明の複製能力があるベクターに含まれる。「PB-TRE」は、PB-TREが機能することを許容する宿主細胞、例えばアンドロゲン・レセプターを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）、において、動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。したがって、APB-TREは、アンドロゲン・レセプターの結合にに対して感受性であり、PBプロモーターおよび/またはPBエンハンサーの少なくとも一部（すなわち、AREまたはアンドロゲン・レセプター結合部位）を含む。PB-TREsは、さらに米国特許第6,436,394号で記載される。
【００８２】
例えば、アンドロゲン・レセプター（AR）を発現する前立腺細胞に対するPB-TRE活性の特異性は、以下のとおり証明された。配列内プロモーター配列を含むPB 5'フランキングDNAの領域（nt-426〜nt+28）（配列番号9）を、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入して、キメラPB-TRE-lucプラスミドを作製する。LNCaP細胞（PSA産生、およびAR産生前立腺癌細胞）およびPC-3細胞（PSA欠損、およびAR欠損前立腺癌細胞）のカチオン介在、一過性トランスフェクションが実施された。結果は、PB-TRElucをトランスフェクトしたLNCaP細胞は、非トランスフェクト細胞より約400倍のさらに活性を有し、PR-TREがもとのままだったことを示すことを示した。さらに、トランスフェクトLNCaP細胞の細胞抽出物中に回収された全体的なルシフェラーゼ活性は、トランスフェクトPC-3細胞の細胞抽出物中で計測したものより約30〜40倍高かった。このように、前記結果は、PB-TRE発現がPSA欠損、AR欠損前立腺癌細胞と比べて、PSA産生、AR産生前立腺癌細胞において選択的に機能していること、そしてPB-TREがアンドロゲン・レセプターを産生する細胞に特異的な発現を仲介することができることを示す。ラット・プロバシン（PB）遺伝子は、核、および分泌タンパク質、プロバシンをコードする。それは前立腺背側のみで発現される。（配列番号4）で示されるように、PB-TREは、転写開始部位に対して約nt-426〜nt+28の、プロバシン・コード配列の上流の約0.5 kb断片の配列で示された。PB遺伝子からのこの最小のプロモーター配列が、トランスジェニックマウスの前立腺に特異的な、動作できるように連結された異種遺伝子の直接的な開発とホルモン調節性発現に対する十分な情報を提供するように思われる。
【００８３】
他の例において、「前立腺特異的抗原（PSA）転写調節エレメント」または「PSA-TRE」もしくは「PSE-TRE」は、本発明の複製能力があるベクターに含まれる。「PSA-TRE」または「PSE-TRE」は、PSA-TREが機能することを許容する宿主細胞、例えばアンドロゲン・レセプターを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）において、動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。したがって、PSE-TREは、アンドロゲン・レセプターの結合に対して応答性であり、PSAプロモーターおよび/またはPSAエンハンサー（すなわち、AREまたはアンドロゲン・レセプター結合部位）の少なくとも一部を含む。PSE-TREsは、米国特許第5,648,478号、同第6,057,299号,および同第6,136,792号でさらに記載される。
【００８４】
特に前立腺細胞において、アンドロゲン依存性細胞特異性を提供するのに使用されるPSA遺伝子の領域は、約6.0 kbにおよぶ。Schuur et al. (1996) J. Biol.Chem. 271:7043-7051。ヒトにおける約1.5 kbのエンハンサー領域は、PSA遺伝子の転写開始部位に対してnt-5322〜nt-3739の間に位置する。PSAプロモーターは、転写開始部に対して約nt-540〜nt+8の配列から成る。これらの近位にある2つの遺伝子エレメントは、完全に機能的で、最小の前立腺特異的エンハンサー/プロモーター（PSE）TREをもたらす。PSA遺伝子の約6.0 kbの領域から成る他の部分は、必要な機能についての記載が維持される限り、本発明で使用されることができる。
【００８５】
（配列番号1）で示されるPSE-TREは、GenBank登録番号U37672によって与えられるものと同じである。変異体PSA-TREヌクレオチド配列が（配列番号2）に示される。これは、CN706クローン35.190.13内に含まれているPSA-TREである。CN706は、Ad5内のE1A遺伝子がPSA-TREの転写制御下にあるアデノウイルス用ベクターである。CN706は、インビトロおよびインビボにおいてPSA発現細胞に対する選択的な細胞毒性を証明している。Rodriauez et al. (1997)。
【００８６】
特に前立腺細胞におけるアンドロゲンに依存した細胞特異性を提供するために利用される領域は、約1.5 kbのエンハンサー領域と0.5 kbのプロモーター領域におよぶ。ヒトにおけるエンハンサー領域は、前立腺特異的抗原（PSA）遺伝子の転写開始部位に対してnt-5322〜nt-3739にある。前記プロモーターは、nt-540〜nt+8から成る。近位の前記2つの遺伝子エレメントは、完全に機能的な、最小の前立腺特異的エンハンサー・プロモーター（PSE）を生じる。前記エンハンサーは、前立腺特異的DNA結合タンパク質に結合する3つの領域を含み、その1つが想定されるアンドロゲン応答エレメントを含む。プロモーター領域は、典型的なTATAおよびCAATボックス、ならびに想定される第2のアンドロゲン応答エレメントを含む。
【００８７】
CEAは、胃腸管の新生物、例えば結腸癌、胃部（胃）癌および膵臓癌、内胚葉由来新形成、ならびに他の腺癌、例えば乳がんおよび肺癌に存在する180,000ダルトンの糖タンパク質腫瘍関連抗原である。さらに他の例において、「癌胎児抗原（CEA）転写調節エレメント」または「CEA-TRE」は、本発明の複製能力があるベクターに含まれる。CEA-TREは、CEA-TREが機能することを許容する宿主細胞、例えばCEAを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）において、動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。CEA-TREは、CEA産生細胞に関係する転写因子および/または補因子に応答性であり、CEAプロモーターおよび/またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。CEA遺伝子の5'上流フランキング配列は、細胞特異的活性を与えることが示された。遺伝子の5'フランキング領域内の翻訳開始部位の上流の最初の約424ヌクレオチドのCEAプロモーター領域は、CEA産生細胞において、非産生HeLa細胞より高いプロモーター活性が提供された時に細胞特異的活性を与えることが示された。
【００８８】
さらに、細胞特異的エンハンサー領域が見つかった。（プロモーター、想定されるサイレンサー、およびエンハンサー因子を含む）5'CEAフランキング領域の全体が、転写開始領域から約14.5 kb上流以内に含まれるように思われる。多量体化プロモーターに連結される時、2つの上流領域、-13.6〜-10.7 kb、または-6.1〜-4.0 kb、はCEA-産生細胞において、レポーター構築物の高レベルで、選択的な発現をもたらす。プロモーター領域は、発現に不可欠なnt-41〜nt-18の領域を伴う、転写開始部位に対してnt-90〜nt+69に位置が特定される。WO95/14100は、細胞特異的活性を与える一連の5'フランキングCEAフラグメント、例えば約nt-299〜約nt+69；約nt-90〜nt+69；nt-14,500〜nt-10,600；nt-13,600〜nt-10,600、nt-6100〜nt-3800について説明する。さらに、細胞特異的転写活性は、（配列番号7）で示されるnt-402〜nt+69のCEAフラグメントによって、動作できるように連結された遺伝子に与えられる。本発明で使用するCEA-TREsは、これだけに制限されることなく、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞由来である。このように、必要な所望の機能についての記載が示される限り、あらゆるCEA-TREsが本発明で使用されることができる。CEA配列のクローン化および特徴づけは文献（例えば、200030026792として公開されている米国特許出願第10/045,116号）に記載されている。
【００８９】
さらなる例において、「アルファ・フェトプロテイン（AFP）転写調節エレメント」または「AFP-TRE」が、本発明の複製能力があるベクターに含まれる。AFPは癌胎児性タンパク質である。AFPの血清濃度は、進行した病気の患者に見られる高レベルのAFPを伴う肝癌の患者で高められる。患者の血清AFPレベルは、周囲の正常な肝臓ではなく肝細胞癌におけるAFP発現によって調節されるように思われる。このように、AFP遺伝子は、肝癌細胞特異的発現に関係するように思われる。AFP遺伝子からの細胞特異的TREsが同定された。「AFP-TRE」は、AFP-TREが機能することを許容する宿主細胞、例えばAFPを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）において、（動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の）転写を選択的に増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。AFP-TREは、AFP産生細胞に関係する転写因子および/または補因子に応答性であり、AFPプロモーターおよび/またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。AFP-TREsは、米国特許出願番号第09/898,883号でさらに記載され、上記文献を明示的に本明細書中に援用する。（プロモーター、想定されるサイレンサー、およびエンハンサー分子を含む）5'AFPフランキング領域全体が、転写開始領域から約5 kb上流以内に含まれる（配列番号5）。
【００９０】
ヒトのAFPエンハンサー領域は、AFP遺伝子の転写開始部位に対して約nt-3954〜nt-3335に位置する。ヒトAFPプロモーターは、nt-174〜nt+29の領域を含む。近位のこれらの2つの遺伝子エレメントは、完全な機能性AFP-TREをもたらす。Idoら（1995）は、HCCに特異的な259 bpのプロモーター・フラグメント（nt-230〜nt+29）を記載する。Cancer Res. 55:3105-3109。AFPエンハンサーは、転写開始部位に対してnt-3954〜nt-3335に位置する、AとBと規定される2つの領域を含む。プロモーター領域は、典型的なTATAとCAATボックスを含む。好ましくは、AFP-TREは、少なくとも1つのエンハンサー領域を含む。より好ましくは、AFP-TREは、両方のエンハンサー領域を含む。
【００９１】
AFP-TREsを含む腫瘍溶解ウイルス・ベクターのための好適な標的細胞は、AFP-TREが機能することを許容する全ての細胞型である。これだけに制限されることなく、AFPを発現する腫瘍細胞を含む、AFPを発現または産生する細胞が好ましい。そのような細胞の例は、肝細胞癌細胞、生殖腺および他の胚細胞腫瘍（特に、内胚葉洞腫瘍）、脳腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の腺房細胞癌、第一胆嚢腫瘍、子宮内膜腺癌細胞、および（肺、副腎、骨髄、および/または脾臓で生じうる）先のいずれかの転移性のものである。ある場合には、特定のすい臓癌および胃癌から肝臓への転移性の病気がAFPを産生する。肝細胞癌細胞およびそれらの転移性のいずれかが特に好ましい。AFP産生は、当該技術分野の標準的なアッセイ、例えばAFPタンパク質産生を測定するためのRIA、ELISAもしくはウエスタンブロット（免疫学的測定法）、またはAFP mRNA産生レベルを測定するためのノーザンブロット、を使って計測されることができる。あるいは、そのような細胞は、同定されて、かつ/またはAFP-TREを転写的に活性化する（すなわち、AFP-TREが機能することを許容する）それらの能力によって特徴づけられることができる。
【００９２】
よりさらなる例において、尿路上皮細胞特異的転写調節エレメントは、本発明の複製能力があるベクターに含まれる。尿路上皮細胞特異的転写調節エレメントは、尿路上皮宿主細胞において、（動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の）転写を選択的に増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。例えば、尿路上皮細胞特異的TREは、UP-TREが機能することを許容する細胞、例えばウロプラキンを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）において、（動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列の）転写をTRE選択的に増やすようなウロプラキン遺伝子の5’フランキング領域由来であるかもしれない（すなわち、UP-TRE）。これらの態様のいくつかで、尿路上皮細胞特異的TREは、UPIa遺伝子の5’フランキング領域由来である。他の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、UPIb遺伝子の5’フランキング領域由来である。さらに他の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、UPII遺伝子の5’フランキング領域由来である。UP-TREは、尿路上皮細胞特異的プロモーターおよび異種エンハンサーを含むかもしれない。他の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、尿路上皮細胞特異的プロモーターを含む。他の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、尿路上皮細胞特異的エンハンサーと異種プロモーターを含む。他の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、尿路上皮細胞特異的プロモーターと尿路上皮細胞特異的エンハンサーを含む。UP-TREsはPCT公開WO01/72994でさらに記載される。
【００９３】
MUC1遺伝子のタンパク質産物（ムチンまたはMUC1タンパク質；エピシアリン；多形性上皮ムチンまたはPEM；EMA；DF3抗原；NPGP；PAS-O；あるいはCA15.3抗原として知られる）は、胃、膵臓、肺、気管、腎臓、子宮、唾液腺、および乳腺の腺および管を内張りする上皮細胞の先端面で通常主に発現される。しかし、ムチンは、ヒト乳癌の75〜90％で過剰発現される。ムチン・タンパク質発現は、乳癌分化の程度と関連する。この過剰発現は転写レベルで制御されるように思われる。ヒト乳癌細胞MCF-7とZR-75-1のMUC1遺伝子の過剰発現は、転写レベルで調節されるように思われる。「MUC1-TRE」は、MUC1-TREが機能することを許容する宿主細胞、例えばMUC1を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）において、（動作できるように連結されたポリヌクレオチド配列）の転写を選択的に増やすポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。MUC1-TREは、MUC1産生細胞に関係する転写因子および/または補因子に応答性であり、MUC1プロモーターおよび/またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。MUC1-TREsは米国特許第6,432,700号でさらに記載される。さらなる例において、「ムチン遺伝子（MUC）転写調節エレメント」または「MUC1-TRE」が、本発明の複製能力があるベクターに含まれている。配列番号8に記載の細胞特異的転写に係わるように思われるTREを含む転写開始部位の上流約0.9 kbを含む、MUC1遺伝子の調節配列がクローン化された。
【００９４】
本発明で使用されるMUC1-TREsは、これだけに制限されることなく、ヒト細胞を含む、哺乳動物細胞由来である。好ましくは、MUC7-TREはヒト由来である。1つの態様において、MUC1-TREは、MUC1遺伝子の0.9 kbの5'フランキング配列の全体を含むかもしれない。他の態様において、MUC1-TREsは（MUC1遺伝子の転写開始部位と関係がある）以下の配列を含む：（プロモーターに動作できるように連結された）約nt-725〜約nt+31、nt-743〜約nt+33、nt-750〜約nt+33、そしてnt-598〜約nt+485。
【００９５】
c-erbB2/neu遺伝子（HER-2/neuまたはHER）は、185 kDの上皮成長因子レセプター関連膜貫通糖タンパク質をコードする形質転換遺伝子である。ヒトにおいて、c-erbB2/neuタンパク質は胎児の発達の間発現されているが、成人では、そのタンパク質は多くの正常組織の上皮で（免疫組織化学で）わずかに探知することができる。c-erbB2/neu遺伝子の増幅および/または過剰発現が、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌および肺癌を含む多くのヒトの癌に関係した。
【００９６】
よりさらなる例において、「HER-2/neu転写調節エレメント」または「HER-2/neu-TRE」が、本発明の複製能力があるベクターに含まれている。
【００９７】
さらなる腫瘍および/または細胞型特異的TREsが、当該技術分野で知られており、本発明の腫瘍溶解ベクターに含まれるそれは以下の：アロマターゼ、乳腺特異的プロモーター、マンマグロビン、プラスミノーゲン活性化因子ウロキナーゼ（uPA）、およびそのレセプター遺伝子（乳癌、結腸癌、および肝臓癌に関係する；uPAとuPARの転写を調節するTREsが配列番号6で提供される：そしてRiccio et al. Nucleic Acids Res. 13:2759-2771, 1985; Cannio et al., Nucleic Acids Res. 19:2303-2308, 1991でさらに記載される；ヒトα-ラクトアルブミン（胸部組織に関係している）；BCSG1、BRCA1、およびBRCA2（乳癌に関係している）；ヒト・パピローマ・ウイルス（HPV）細胞型依存性調節エレメント（子宮頸癌に関係している）；BLCA4（膀胱癌に関係している）；ウロプラキン（膀胱に関係している）；NCA（胃癌に関係している）；ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT；グリオーマに関係している）；AVP、ヒト肺胞サーファクタント・タンパク質B遺伝子、およびプロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（肺癌に関係している）；
【００９８】
チロシナーゼ、gplOO；メラノーマ特異的TREs、例えばヒトMARTプロモーター（hMART）、マウス・チロシナーゼ遺伝子エンハンサーおよびプロモーター（mEP）、TREを含むマウス・チロシナーゼ遺伝子エンハンサーおよびプロモーター（mEEP）、TREを含むヒト・チロシナーゼ・プロモーター（hTYR）およびメラニン形成細胞特異的因子（MSF）；HER2/neu、ウロキナーゼ、およびCA125（卵巣癌に関係している）；SL3-3およびT細胞抗原レセプター（T細胞型リンパ腫に関係している）；前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺癌に関係している）；EBV特異的TRE（EBV発現腫瘍に関係している）、例えばLMP1プロモーター；LMP2Aプロモーター、LMP2Bプロモーター；またはCpプロモーター（例えば、Sjoblom, A et al, J.Virol. (1998) 72, (2), 1365-1376;Franken et al, J. Virol (1995) 69 (12) 8011-8019.;Laux et al, J. Gen. Virol, 1989, 70, 3079-3084；そしてand Fuentes-Panana et al, J. Virol., (1999) 73, 826-833 and V01555に記載のとおり）；肝臓特異的TRE（肝臓癌に関係している）、例えばCRGL2プロモーター；ならびに白血病特異的遺伝子発現に関係するWT1プロモーターおよびエンハンサー（Hosen N. Leukemia. 2004 Jan 22）を含む。
【００９９】
さらに、腫瘍特異的プロモーターは、（例えば、Wang J et al. FEES Lett. Jul 10;546 (2-3):315-20, 2003に記載の）人工的なhTERT-cHSF1/HSEプロモーター、または完全に合成の構築物によって（Li X et al Nat Biotechnol. 1999 Mar;17(3):241-5）によって例証されるように異なるプロモーター・エレメントを使ったキメラ構築物によって得られるかもしれない。これらの細胞特異的TREsに関する記述は様々な科学的な刊行物で見つけることができて、そしておびただしい数のこれらのTREsに関係するプロモーター、エンハンサー、および調節配列がhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/にてインターネットで入手可能なGenBankデータベースで見つかる。したがって、多くの関連配列が本願発明の実施のために入手可能であり、そして本明細書中で詳細に記載されなくてもよい。
【０１００】
先に列挙されたTREsは、当該発明で機能するTREsの制限されることのない例として提供される。さらなる細胞特異的TREsが、候補TREs細胞特異性の同定および試験する方法のように当該技術分野で知られている。TREはサイレンサーを欠くかもしれない。サイレンサー（すなわち、負の調節エレメント）の存在は、非許容細胞（すなわち、正常な細胞状態の細胞）において、転写（および、それによる複製）を止めることを補助するかもしれない。このように、サイレンサーの存在は、非標的細胞の腫瘍溶解ウイルス・ベクター複製をより効果的に防ぐことによって高い誘導可能性または細胞特異的複製を与えるかもしれない。あるいは、サイレンサーの欠損は標的細胞における複製を達成するのを補助し、それにより標的細胞におけるより効果的な複製による高い細胞型特異的複製を与えるかもしれない。TREは同様に多量体を含むことができる。例えば、TREは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つのTREsのタンデム・シリーズを含むことができる。これらの多量体は、同様に異種プロモーターおよび/またはエンハンサー配列を含むかもしれない。
【０１０１】
1つの典型的な態様において、実質的に同じ2つのTREsがウイルス遺伝子、例えばアデノウイルスE1AとE1B遺伝子、の転写を制御する。しかし、遺伝子の多数の組み合わせのいずれかが、これらの少なくとも2つのTREsと一緒に使用されることが知られている。アデノウイルスの例において、他の好ましい態様がE1A、E1B、およびE4の発現を行う実質的に同じTREsを含むものを含む。そのような構築物は、実質的に同じTREの制御下にあるかもしれない導入遺伝子をさらに含むかもしれない。これらおよび他の態様の準備は、以下におよび実施例において提供される。
【０１０２】
転写の活性化は、当該技術分野で知られる（そして以下でもっと詳しく記載されている）多数の方法で計測されることができるが、TREの制御下にある（すなわち、動作可能なようにTREに連結した）コード配列のmRNAまたはタンパク質産物の検出および/または定量によって一般に計測される。TRE活性は以下のとおり測定されることができる。TREポリヌクレオチド配列またはそのような配列のセットは、当該技術分野で知られている方法、例えば化学合成、部位特異的突然変異誘導、PCR、および/または組み換え法、を使って作製されることができる。試験される配列は、（プロモーター・エレメントがTREになければ）プロモーター、ならびにこれだけに制限されることなく、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（CAT）、（lacZ遺伝子によってコードされる）β-ガラクトシダーゼ、（luc遺伝子によってコードされる）ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光性タンパク質、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼを含めた、レポーター・タンパク質をコードする適当なレポーター遺伝子を含むベクター内に挿入されることができる。そのようなベクターおよびアッセイは、とりわけ、商業的な供給源から容易に入手可能である。このように構築されたプラスミドは、例えばリン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、リポソーム（リポフェクション）、およびDEAEデキストランのような、当該技術分野で知られているトランスフェクション法を使って、想定されるTREによって制御されるレポーター遺伝子の発現の検査をするために好適な宿主細胞内にトランスフェクトされる。
【０１０３】
適当な条件下での宿主細胞内へのTRE-レポーター遺伝子構築物の導入後に、TRE活性が、好適な誘導物質または条件の存在または不存在を含めて、レポーター遺伝子由来mRNAまたはタンパク質産物の検出および/または定量によって計測されうる。レポーター遺伝子タンパク質は、（例えば、免疫化学的に）直接的に、またはもしあれば、適当な基質を用いてその酵素活性を通して検出されることができる。一般的にTREの細胞特異的活性を測定するために、TREレポーター遺伝子構築物が種々の細胞型に導入される。TRE活性の量は、各々の細胞型で測定されて、TREのないレポーター遺伝子構築物のそれと比較される。異なる型の細胞を上回って特定の型の細胞において選択的に機能する時、TREは細胞特異的である。
【０１０４】
本明細書中において、「TREが機能することを許容する細胞」またはTREの機能が「十分に保存された」かまたは「機能的に保存された」細胞、あるいは「TREが機能する細胞」は、（TREに含まれていなければ）動作できるようにプロモーターに連結される時、TREが、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも約5倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、さらにより好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400〜500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍まで標的細胞の基礎レベルを上回って転写を増強するであろう。基礎レベルは、一般に、もしあれば非標的細胞における活性レベルであり、または標的細胞型で試験される場合に着目のTREを欠くレポーター構築物の（もしあれば）活性レベル）である。（相対的であるかまたは絶対的であるかにかかわらず）発現レベルを計測する方法が当該技術分野で知られていて、本明細書中に記載される。同じように、本発明の調節可能な腫瘍溶解ウイルスシステムを利用する時、効果的な量の誘導物質の存在下、または遺伝子発現を誘導するのに十分な誘導条件下の誘導性トランス活性化因子は、誘導物質の不存在下の同じプロモーターおよび遺伝子の発現と比べた場合に、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも約5倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、さらにより好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400〜500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍まで遺伝子の発現を増強する。
【０１０５】
TREの「機能的に保存された」変異体は、他のTREと異なるが、特に細胞型特異的転写活性で、動作できるように連結されたポリヌクレオチドの転写を増やす能力をまだ保存しているTREである。TREの相違は、直鎖配列または立体配座の相違、例えば単独または複数の塩基の突然変異、付加、欠失、および/または修飾、のために生じるのかもしれない。相違は、同様に糖、および/またはTRE塩基間の連結の変化から生じる。
【０１０６】
TREs配列内の特定の点突然変異は、転写因子結合と遺伝子活性化を減少させることが示された。当業者は、転写因子結合領域内およびその付近の塩基のいくつかの変更が、遺伝子活性化および細胞特異性により否定的に影響する可能性が高い一方で、転写因子結合に関係していない塩基の変更がそのような影響を与える可能性が低いことを認識している。特定の突然変異は同様にTRE活性を増やすことができる。塩基の変更の効果の試験は、当該技術分野で知られているいずれかの方法、例えば移動度シフト・アッセイか、TRE機能性およびTRE非機能性細胞におけるこれらの変更を含むベクターのトランスフェクト、によって、インビトロまたはインビボで実施される。さらに、当業者は、点突然変異および欠失が転写を調節する上記配列の能力を変えないでTRE配列に施されることを認識している。
【０１０７】
腫瘍溶解ウイルス複製の外部制御のためシステム
複製能力がある（腫瘍溶解）ウイルス・ベクターが提供される。ベクターは、細胞型特異的転写調節エレメント（CT-TRE）、および誘導性トランス活性化因子調節性転写調節エレメントを含む。CT-TREは、誘導性トランス活性化因子（TA）コード配列の転写を制御する。誘導性トランス活性化因子は、（a）機能するために誘導因子または条件を必要とし、そして（b）複製に不可欠なウイルス遺伝子の転写を制御する。複製に不可欠なウイルス遺伝子の発現は、CT-TRE、およびトランス活性化因子調節性転写調節エレメントによって、そして間接的に誘導物質の濃度または条件によって調節される。
【０１０８】
ウイルス・ベクターの特定の使用に依存して、誘導物質または条件は、転写を抑えるか、または転写を高めるために作用する。転写抑制因子は、誘導物質を宿主細胞にデリバリーすることによって「止められた」ウイルス複製の手段を提供する。転写アクチベーターは、ウイルスがそれ以外に不活性な場合に、誘導物質の追加によってウイルス複製を誘導する手段を提供する。
【０１０９】
複製に不可欠なウイルス遺伝子の制御が本発明の方法を使って達成される全ての腫瘍溶解ウイルスが本発明の範囲内に含まれている。典型的な複製の能力がある（腫瘍溶解）ウイルスは、これだけに制限されることなく、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス；HSV）、レオウイルス、パラミクソウイルス、ライノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、西ナイルウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、およびワクチニアウイルスなどを含む。
【０１１０】
実質的に同じ2つのTREsが使用される態様において、本発明は、TREsが同じ遺伝子に由来することを必要としない。TRE配列が実質的に同じで、必要な機能について示されている限り、TREsは異なる遺伝子由来でありうる。
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明の腫瘍溶解ベクターは、トランス活性化因子調節性転写調整下の第1のウイルス遺伝子と、第1のTREと異なる他の異種TREの制御下の少なくとも1つの他の遺伝子、例えばウイルス遺伝子または導入遺伝子を含み、ここで、異種TREsが同じ細胞で機能するがポリヌクレオチド配列に同じものを持っていない（すなわち、異なるポリヌクレオチド配列を持っている）。好ましくは、腫瘍溶解ベクター内の異種TREsの少なくとも2つが、細胞特異的であるか、同じ細胞、誘導物質、もしくは条件に対して誘導可能である。1つのアプローチにおいて、ウイルス遺伝子は、細胞死を促進するもの、より好ましくはウイルスの複製に不可欠なものである。好ましくは、細胞複製に必要なウイルス遺伝子の少なくとも1つが、初期遺伝子であり、異種TRE転写調整下の遺伝子が複製に必要である。複数の異種TREsの使用を通して細胞特異的転写を提供することによって、本発明は、選択的な複製による細胞特異的細胞障害効果を達成することができる腫瘍溶解ベクターを提供する。
【０１１２】
腫瘍溶解ウイルスの調節された発現のための本発明の新規システムは、調節可能なアデノウイルス・ベクターによって本明細書中で例証される。この典型的な態様において、トランス活性化因子調節性転写調節エレメントに調節される遺伝子は、初期または後期アデノウイルス遺伝子および/または導入遺伝子であるかもしれない。調節された転写を提供することによって、当業者は、他の非標的細胞型と異なる、宿主標的細胞内への遺伝子の能力の導入のための媒体として使用することができるアデノウイルスを提供することができる。アデノウイルスの存在に起因する遺伝子型または発現型のいずれかの修飾に加えて、導入遺伝子は標的細胞の遺伝子型または発現型を修飾する働きをもつ。複製能力があるアデノウイルスによる本発明の腫瘍溶解ベクターの典型として、アデノウイルスの増殖はその細胞障害効果のために使用されうる。
【０１１３】
少なくとも2つの異なる異種TREsを含むアデノウイルス・ベクターが、先に記載のアデノウイルス・ベクターより安定していて、複製に関して高い細胞特異性を提供することが説明された。例えば、米国特許第6,432,700号を参照のこと。それ故に、E1AおよびE1B遺伝子の各々が異なる2つの異種TREsの転写調整下にあるアデノウイルス・ベクターが構築された。しかし、遺伝子の多数の組み合わせのいずれかが、少なくとも2つのTREsのいずれかの組み合わせとともに使用されることができることが理解される。
【０１１４】
わずかなまたは顕著な程度に異なる、アデノウイルスの多数の異なる血清型、例えばAd2、Ad5、Ad3、Ad35、およびAd40がある。特に、アデノウイルスの血清型は宿主細胞指向性に関して異なる。当該本発明の目的のために、Ad5が例証されるが、しかし、アデノウイルスの血清型のいずれかまたは全てが本発明の範囲内に含まれている。
【０１１５】
当該発明には興味深いアデノウイルス遺伝子は、初期遺伝子と後期遺伝子の2つのグループに分けられ、後者の発現は、主要な後期プロモーターによって制御される。初期遺伝子について、E1A、E1B、E2、E3、およびE4が存在する。E1A遺伝子は、ウイルス感染（0〜2h）直後、そして全ての他のウイルス遺伝子の前に発現される。E1Aタンパク質は、トランス作用性、正作用性の転写調節因子として作用し、そして他の初期ウイルス遺伝子およびプロモーター隣接主要後期遺伝子の発現のために必要とされる。名称に関係なく、主な後期プロモーターによって行われたプロモーター隣接遺伝子がAd5感染後の初期の時間の間に発現された。機能的E1A遺伝子の不存在下、ウイルスDNA複製に必要な遺伝子産物が産生されないので、ウイルス感染は進まない。
【０１１６】
E1Bタンパク質はトランスにおいて機能して、原子核から細胞質まで後期mRNAの輸送に必要である。E1B発現の欠陥は、後期ウイルス・タンパク質の乏しい発現と、宿主細胞タンパク質合成の遮断の不可能をもたらす。
【０１１７】
E4遺伝子には多数の転写産物がある。E4転写ユニットのオープン・リーディング・フレーム（ORF）3およびORF6は、E1Bからの55 kDaのタンパク質と、E2F-1とDP-1のヘテロダイマーの結合によって、主な後期転写ユニットmRNAの蓄積を増やす。ORF3およびORF6からの機能的タンパク質の不存在下、プラークが、106の野生型ウイルスのそれより低い効率で産生される。
【０１１８】
当該発明と関連した主な後期遺伝子は、AD5ウイルスのウイルス粒子のタンパク質をコードする、例えばL1、L2、およびL3遺伝子である。
【０１１９】
欠失されるアデノウイルスの領域、通常少なくとも500 nt、より通常少なくとも約1000 ntは、AD5ゲノムヌクレオチドに、300〜3600をE1に、特に342〜3523；27000〜31000、特に28133〜30818、または27865〜30995をE3に含む。欠失は、所望の構築物の挿入に少なくとも十分であり、パッケージングを可能にする。いくつかの態様において、E3配列は、本発明の調節可能な複製能力があるアデノウイルスに含まれていて、米国特許出願第6,495,130号でさらに記載される。他の態様において、配列内リボソーム進入領域（IRES）は、としての調節可能な本発明の複製能力があるアデノウイルスに含まれており、20030148520として公開された米国特許出願第09/814,351号でさらに記載される。
【０１２０】
前立腺細胞に特異的であるプロモーターおよびエンハンサー構築物を含む細胞特異的応答エレメントをもつアデノウイルス・ベクターを利用することによって例証されるように、様々な遺伝子の能力が、前立腺細胞内に導入され、前立腺特異的抗原を発現する。前立腺細胞において特に活性な転写開始領域によって制御される細胞障害効果を導入する機会は、特別な関心がある。モジュレーションが望ましい条件に関係している特定の活性な転写因子がある他の細胞型は、白血球、特にリンパ球、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、すい臓細胞、神経細胞、およびケラチン生成細胞を含む。アデノウイルスは一般に一時的な発現（約6〜8週間）に終わるので、例えば所望の結果がただ限定された反応期間を必要とする状況において、当業者は細胞に一時的な能力を提供することができる。他の場合において、異なる腫瘍溶解ベクターが、所望の発現の時間およびレベルにより好まれる。
【０１２１】
誘導物質によって仲介された制御の特異性をさらに高めるために、2つのウイルス遺伝子の発現、すなわちE1AとE1Bアデノウイルス遺伝子の発現、を制御することが同様に望ましい。この様式で、特異性が高められる、すなわち、CT-TREが活性でない非標的細胞の腫瘍溶解ウイルスの複製がさらに減らされうる。E1AとE1Bの両者は、テトラサイクリン調節性複製制御を有する前立腺特異的腫瘍溶解ウイルス・ベクターを説明する、図1で例証された誘導因子応答性プロモーター・エレメントによって制御され、ここで、テトラサイクリン応答性エレメントプロモーター（TRE）は、E1A遺伝子発現を行い、そして前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターがリバースtet応答性トランス活性化因子（rtTA）の発現を行う。
【０１２２】
このアプローチにおいて、E1AおよびE1B遺伝子の発現は、E1AおよびE1B遺伝子の間のIRESによって連結されている。このウイルスの構築物において、配列内E1Bプロモーター・エレメントは取り除かれて、そしてIRESエレメントに置き換えられる。したがって、E1AおよびE1B発現の両者は、誘導因子応答性プロモーター・エレメントの制御下にある。IRES変異体としての、口蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2Aペプチド配列は、E1Aと導入遺伝子の両者の効率的な2シストロン性発現を提供するために、（Purler S et al., Gene Ther. 2001 Jun;8(11):864-73に記載されるように）IRES配列の代わりに使用されることができた。
【０１２３】
好ましいアデノウイルスの態様は、E1A、E1B、およびE4の発現を行う少なくとも2つの異なる異種TREsを含むものを含む。そのような構築物は、TREの制御下にあるかもしれない導入遺伝子をさらに含むかもしれない、ここでTREはCT-TREであるかもしれない。例えば米国特許第6,436,394号および同第6,432,700号を参照のこと。
【０１２４】
それ故に、本発明は、トランス活性化因子調節性転写調整エレメントの転写制御下のウイルス遺伝子、およびTRE、好ましくはCT-TRE、の転写制御下の誘導性トランス活性化因子を含む腫瘍溶解ウイルス・ベクターを提供する。いくつかの態様において、第1トランス活性化因子調節性転写調節エレメントが、第1ウイルス遺伝子の発現を制御して、第2トランス活性化因子調節性転写調節エレメントが、第2ウイルス遺伝子の発現を調節した。これらのTREs下で制御される遺伝子は、好ましくは増殖に不可欠なウイルス遺伝子である。または、これらのTREs下で制御される遺伝子は、増殖に不可欠な第1ウイルス遺伝子であるかもしれず、ここで、第2遺伝子は導入遺伝子である。ウイルス・ベクター内の追加のTREsが存在するかもしれず、それらの追加のTREsが第1および/または第2TREsと実質的に同一であるかもしれないことが理解される。本発明は、3つ以上、4つ以上のTREsの使用を含む。
【０１２５】
導入遺伝子
特定の標的細胞において能力を有するウイルス・ベクターの使用は、その宿主細胞の死をもたらす標的細胞におけるウイルスの増殖、および他の宿主細胞に対するウイルスの増殖を可能にする。さらに治療の効能を高めるために、本発明の腫瘍溶解ベクターは治療効果を与える1以上の導入遺伝子を含むかもしれない。
【０１２６】
それ故に、本願発明のウイルス・ベクターは、トランス活性化因子調節性転写調節エレメントの制御下にある治療用遺伝子産物をコードする異種ポリヌクレオチド（導入遺伝子）をさらに含むことができる。あるいは、ウイルス・ベクターは、恒常性または誘導性プロモーターの制御下にある治療用遺伝子産物をコードする異種導入遺伝子を含むかもしれない。恒常性または誘導性プロモーターの多数の例が当該技術分野で知られており、ウイルス・ベクターとの関係で導入遺伝子発現に日常的に利用されている。このようにして、様々な遺伝子の能力が標的細胞に導入されうる。例えば、ある例において、細胞障害活性度を高めることによって治療の効能の程度を高めることが望ましいかもしれない。これは、細胞特異的複製細胞障害活性を、細胞が5-フルオロシトシン（5-FC）を化学療法薬5-フルオロウラシル（5-FU）およびカルボキシペプチダーゼG2（CPG2）に代謝させることができるようにする1以上の代謝酵素、例えばHSV-tk、ニトロ還元酵素、シトクロムP450またはシトシンデアミナーゼ（cd）の発現と組み合わせることによって達成されることができた。このタイプの導入遺伝子は、同様にバイスタンダー効果を与えるために使用されるかもしれない。
【０１２７】
本発明のウイルス・ベクターに導入されるかもしれない追加の導入遺伝子は、他にも能力はあるが、増殖に不可欠なタンパク質、例えば構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼなど、その病原体が細胞内に増殖するウイルスまたは他の病原性タンパク質、細胞毒性タンパク質、例えばジフテリアのチェーン、リシン、アブリンなど、ヌクレアーゼ（例えば、RNaseA）またはプロテアーゼ（例えば、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼなど）の人工的細胞質性変異体をコードする遺伝子、ケモカイン、例えばMCP3アルファまたはMIP-1、ウイルス、細菌、または哺乳動物細胞由来の孔形成タンパク質、ファスゲニック遺伝子（fusgenic genes）、化学療法増感遺伝子および放射線増感遺伝子、をコードするmRNAに向けられるアポトーシスを開始することができる因子、アンチセンス、またはリボザイムを含む。着目の他の遺伝子は、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質など、例えばIL-1、-2、-6、-12、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IFN-α、-β、-γ、TNF-α、-β、TGF-α、-β、NGF、MDA-7（メラノーマ分化関連遺伝子-7、mda-7/インターロイキン-24）などを含む。さらなる例は、プロアポトーシス遺伝子、例えばFas、Bax、カスパーゼ、TRAIL、Fasリガンドなど；細胞融合をもたらすかまたは細胞融合を容易にすることができる融合遺伝子、例えばV22、VSVなど；腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、RB、p16、p17、W9など；細胞周期に関係している遺伝子、および抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子、例えばエンドスタチン、アンギオスタチンなどを含む。
【０１２８】
特定の遺伝子の修飾の他の機会は、T細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球（TILs）を含み、TILsは、増殖を促進する、細胞毒性を高める、増殖抑制因子への応答を軽減する、リンホカインの発現を高めるなどのために修飾されうる。当業者は同様に特定の表面膜タンパク質、例えばB7、SV40T抗原変種など、の発現に備えることによって標的細胞受攻性を高めることを望むかもしれない。
【０１２９】
いくつかの態様において、E3領域内にコードされているアデノウイルス・デス・タンパク質（ADP）は、アデノウイルス・ベクター内で維持される（すなわち、含まれる）。主な後期プロモーター（MLP）の制御下にあるADP遺伝子は、宿主細胞溶解を早急に処理するのに重要なタンパク質（ADP）をコードすると思われる。Tollefson et al., （1996）J. Virol．70（4）、2296；Tollefson et al., （1992）J. Virol. 66（6）: 3633。このように、、ADP遺伝子を含むアデノウイルス・ベクターは、アデノウイルス・ベクターをより強力にし、多くの効果的な治療および/またはより低い投与量要求を可能にした。
【０１３０】
その結果、1つの態様において、本発明は、アデノウイルス遺伝子が第1トランス活性化因子調節性転写調節エレメントの転写調整下にあるアデノウイルス・ベクター、および第2トランス活性化因子調節性転写調節エレメントの制御下にあるADPをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、そして好ましくは、アデノウイルス遺伝子が複製に不可欠である。ADPをコードするDNA配列とADPのアミノ酸配列が、配列番号10と配列番号11にそれぞれ示される。要するに、ADPコード配列は、好ましくは、PCRのような当該技術分野で知られている技術を使って、（これが、ADPがより完全に特徴づけられていた菌株であるので）Ad2から得られる。好ましくは、（後期遺伝子の正しい発現のための重要な配列である）Yリーダーが同様に得られて、ADPコード配列に連結される。そして、（Yリーダーを伴うかもしれない）ADPコード配列は、アデノウイルス・ゲノム、例えば（ADPコード配列がMLPによって駆動される）E3領域に導入されることができる。ADPコード配列は、同様にアデノウイルス・ゲノムの他の位置、例えばE4領域、に挿入されることができた。または、ADPコード配列は、これだけに制限されることなく、他のウイルスTREを含む異なるタイプのTREに動作できるように連結されることができた。
【０１３１】
本発明が、トランス活性化因子調節性転写調節エレメントの制御下にある追加の遺伝子を含む腫瘍溶解ベクターを除外しないことは理解される。それ故に、本発明は、第3のTREの転写制御下にある第3遺伝子を含むウイルス・ベクターを提供する。第3のTREは、第1および/または第2TA-TREsと実質的に同一であるかもしれず、同じ細胞内で機能的な全3つのTREsを伴う。好ましくは、第3の遺伝子は、（直接的および/または間接的にかかわらず）細胞毒性に関与するものであり、より好ましくは細胞死に関与する、および/またはそれを高めるものである。
【０１３２】
細胞への腫瘍溶解ベクターのデリバリー
腫瘍溶解ベクターは、これだけに制限されることなく、裸のポリヌクレオチド（通常DNA）構築物；細胞内への侵入を容易にする作用物質と複合したポリヌクレオチド構築物、例えばカチオン性リポソームまたは他の化合物、例えばポリリジン；（アデノウイルス・ベクターより高い免疫原性にするかもしれない）感染性アデノウイルス粒子内にパッケージされたもの；他の粒子型ウイルス、例えばHSVかAAV、の形態にパッケージされたもの；免疫応答を高めるかまたは弱めるための作用物質と複合体を形成したもの；インビボのトランスフェクションを容易にする作用物質、例えばDOTMA(商標)、DOTAP(商標)、およびポリアミン、と複合体を形成したもの、を含む種々の形態で使用されることができる。
【０１３３】
腫瘍溶解ベクターがウイルス内にパッケージされる場合、ウイルス自体はさらに標的化を促進するように選ばれうる。例えば、アデノウイルス・ベクターについて、アデノウイルス線維が、指向性を手助けにした細胞レセプターとの最初の接触を仲介する。例えば、Arnberg et al. (1997) Virol. 227:239-244を参照のこと。アデノウイルス血清型の特定の亜属が標的細胞型に指向性および/または標的細胞型に低い親和性を示した場合、そのような亜属（または複数の亜属）は、細胞毒性および/または細胞溶解の細胞特異性をさらに増やすために使用されることができた。アデノウイルス線維、ヘキソン、または他の表面タンパク質が、標的細胞による取り込みの特異性を高めるために修飾されうる。
【０１３４】
修飾された腫瘍溶解ベクターは、細胞が培養、エクスビボまたはインビボであるかどうかに依存して、種々の方法によって標的細胞にデリバリーされうる。インビボのデリバリーが望まれる状況で、デリバリーは、リポソーム、直接的な注射、皮下注射、筋注、カテーテル、静脈内吸入、局所適用、静脈内注入などを利用して、種々の方法で成し遂げられることができる。様々な腫瘍溶解ベクターのトランスフェクションの高い効率のために、当業者はたくさんの修飾された細胞を達成することができる。毒性が生じる新生物の場合に、毒性がトランスフェクトされなかったかもしれない細胞に影響するために局所的に放出されうる。この様式で、当業者は、正常細胞への重大な影響なしに、新生物細胞を特異的に除くことができる。さらに、ウイルス・タンパク質の発現は、標的細胞に対する免疫系を活性にする役割を持つ。最後に、宿主細胞における複製能力があるウイルス・ベクターの増殖が細胞死をもたらす。デリバリーの手段は、（形態を含む）特定のベクター、ならびに（すなわち、細胞がインビトロまたはインビボであるかどうかにかかわらず）標的細胞のタイプと位置に主に依存するであろう。
【０１３５】
パッケージされたウイルス、例えばアデノウイルス、の例で、そのアデノウイルスは、約104〜1011の用量で、適当な生理学的に許容される担体中で投与されうる。感染の多重度は、一般に約0.001〜100の範囲内にある。宿主の免疫応答能力に依存して、ウイルスは1回以上投与されうる。必要ならば、強い免疫応答のない反復投与を可能にするために、循環抗体のレベルを減少させるために種々の免疫抑制剤または処置を利用することによって免疫応答は減らされうる。
【０１３６】
ポリヌクレオチド構築物として（すなわち、ウイルスとしてパッケージされないで）投与されれば、約0.01マイクログラム〜1000マイクログラムのウイルス・ベクターが投与されることができる。腫瘍溶解ベクターは1回以上投与されるか、または複数の同時注射として投与されうる。利用される複製能力があるウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（HSV）、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、ニューカッスル病ウイルス、ワクチニアウイルス、西ナイルウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、および麻疹ウイルス、のタイプに依存して、投与されるウイルスの量は、（例えば、刊行された文献から容易に入手可能である）その特定のウイルスについての標準的な知識に基づき、そして経験的に決定することができる。
【０１３７】
いくつかの態様において、パッケージされたウイルス・ベクターが、親水性ポリマーと複合体を形成して、マスクされたウイルスを生じる。親水性ポリマーは（共有結合的にまたは非共有結合的に）ウイルスのキャプシド・タンパク質に、アデノウイルスの場合には、特にヘキソンおよび線維タンパク質に結合する。好ましい態様において、当該発明のウイルス・ベクターは、マスキング剤と複合体を形成することによって、マスクされたウイルス・ベクターを生じる。（例えば、20030152553として公開された、米国特許出願第10/139,089号を参照のこと）。本発明のアデノウイルス・ベクターの態様において、マスクされたウイルスは、（a）循環中のアデノウイルス中和抗体またはオプソニンに対するアデノウイルス表面のマスキング、および（b）身体（すなわち、マクロファージなど）による非特異的クリアランス機構の削減によるアデノウイルス粒子の体循環時間の増加により、有利である。インビボとの関係で、マスクされたウイルスの全身的なデリバリーは、免疫原性が低く、そして肝臓および脾臓によるクリアランスの減少による増加した生体内分布のウイルス粒子のより長い循環をもたらす。
【０１３８】
宿主細胞と標的細胞
本発明は、本明細書中に記載のウイルス・ベクターを同様に含む（すなわち、それにより形質転換された）宿主細胞と標的細胞を提供する。宿主細胞は、その宿主の維持に必要な配列、例えば適当な複製起点が存在する限り、原核および真核宿主細胞の両方を含む。便宜のために、選択マーカーが同様に提供される。原核宿主は、細菌細胞、例えばE.コリ（E.coli）およびマイコバクテリウム（mycobacteria）を含む。真核宿主細胞は、酵母、昆虫、鳥類、両生類、植物および哺乳動物の宿主細胞である。多数の宿主細胞が当該技術分野で知られていて、本明細書中で詳細に説明する必要はない。
【０１３９】
本発明のウイルス・ベクターのための好適な標的細胞は、TREsおよびトランス活性化因子調節性転写調節エレメントの機能を許容する全ての真核細胞型、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、さらに好ましくは新生物の細胞を含む。好適な標的細胞は、TREsの制御下にある遺伝子の発現に必要なタンパク質と他の因子を産生する全ての細胞を同様に含み、上記発現に必要なそのような因子は天然または組み換えによって産生される。例えば、使用されたTRE（s）が前立腺細胞特異的ならば、その細胞は好ましくは前立腺細胞である。使用されたプロモーターがアンドロゲン誘導性であるかどうかに依存して、細胞が使った前立腺がアンドロゲン・レセプターを産生しているかもしれない。アンドロゲンで誘導性プロモーターが使用される場合、アデノウイルスと一緒にアンドロゲン・レセプターをコードする発現ベクターが細胞内に導入されれば、非アンドロゲン・レセプター産生細胞、例えばHLF、HLE、および3T3、ならびに非AR産生前立腺癌細胞、PC3およびDU145を使用することができる。腫瘍溶解ベクターがAFP遺伝子由来のTREを含む場合、好適な宿主細胞は、AFPを産生する全ての細胞型、例えばこれだけに制限されることなく、Hep3B、HepG2、HuH7、HuH1/C12を含む。所定の細胞の所定のTRE活性は、標準的なアッセイを使って動作できるように連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを計測することによって評価されることができる。TREが機能すると疑われる細胞と、対照細胞の間の発現の比較は、転写増大の存在または不存在を示す。
【０１４０】
様々なTREs間またはその中での比較は、単一の標的細胞株内の発現レベルを計測し、そして比較することによって評価することができる。TREの絶対的な転写活性は、いくつかの因子、例えば標的細胞の性質、デリバリー様式、およびTREの形態、そして選択的に転写が活性化されるコード配列、に依存することが知られている。使用した様々なプラスミドのサイズを補正するために、活性はトランスフェクト・プラスミドの1モルあたりの相対的な活性として表されることができる。あるいは、転写レベル（すなわち、mRNA）は、標準的なノザンアッセイおよびハイブリダイゼーション技術計によって計測されることができる。トランスフェクションのレベル（すなわち、トランスフェクション効率）は、CMV最初期プロモーターのように、異なるTREの制御下にある異なるレポーター遺伝子をコードするプラスミドを同時トランスフェクトすることによって計測される。このアッセイは、負の調節領域、すなわちサイレンサー、を同様に示すことができる。
【０１４１】
組成物
本発明は、本明細書中に記載のウイルス・ベクターを含む医薬組成物を含めた組成物を同様に含む。例えば個体内の形質導入および/または細胞殺傷の有効性の程度を測る時、そのような組成物はインビボでの投与に役立つ。好ましくは、これらの組成物はさらに医薬として許容される賦形剤を含む。医薬として許容される賦形剤中に効果的な量の本発明のウイルス・ベクターを含む、これらの組成物は単位剤形の、無菌の注射液もしくは懸濁液、無菌の非注射液または経口溶液もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水乳濁液などの個体への全身的な投与に好適である。腸管外および非腸管外ドラッグデリバリーのための製剤が、当該技術分野で知られていて、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing (1990)で記載されている。組成物は、本発明の（アデノウイルスのようなウイルスとしてパッケージされたものを含む）ウイルス・ベクターの凍結乾燥、および/または還元形態を同様に含む。
【０１４２】
他の組成物が使用されて、本明細書中に記載の検出方法に役立つ。これらの組成物について、ウイルス・ベクターは適当な溶剤またはバッファー系のような溶液に通常懸濁される。そのような溶剤系は、当該技術分野で周知である。
【０１４３】
キット
本発明は、本発明の腫瘍溶解ベクターを含むキットを同様に含む。これらのキットは診断上および/またはモニタリングの目的のために、好ましくはモニタリングで、使用されることができる。これらのキットを使った手順は、医療機関の実験室、実験室、開業医、または私的な個人によって実施されることができる。本願発明に含まれるキットは、バイオプシー検体のような、好適な生物学的なサンプル中の標的細胞の存在を検出することを可能にする。
【０１４４】
本発明のキットは、好適な包装内に本明細書中に記載の腫瘍溶解ベクターを含む。キットは、これだけに制限されることなく、バッファー、現像試薬、標識、反応表面（reacting surfaces）、検出手段、対照サンプル、取扱説明書、および解説情報を含む、手順に有用な追加の成分を場合により提供するかもしれない。
【０１４５】
本発明のウイルス・ベクターの準備
本願発明のウイルス・ベクターは、当該技術分野で標準的である組み換え技術を使って準備することができる。一般的に、TREsは、着目のアデノウイルスおよびトランス活性化因子遺伝子、好ましくは1以上の初期遺伝子（あるいは、後期遺伝子が使用されうる）に挿入される。TREsは、（配列が知られていれば）オリゴヌクレオチド合成か組み換え法（例えば、PCRおよび/または制限酵素）を使って準備できるかもしれない。天然のDNA配列内の、または、例えばPCRまたは部位特異的突然変異のような方法によって誘導によって好都合な制限領域は、TREsの挿入領域を同様に提供する。それ故にTREsをアニーリング（すなわち、挿入）するための好都合な制限領域は、標準的な組み換え法、例えばPCR、を使ってTREの5'および3'末端に加工されることができる。
【０１４６】
本発明の腫瘍溶解ウイルス・ベクターを作製するために使用されたポリヌクレオチドは、当該技術分野の標準方法、例えば化学合成組み換え法、を使って得られるか、および/または生物学的な起源から得られる。
【０１４７】
アデノウイルスの場合に、ベクターは、一方のプラスミドがアデノウイルスのライト・ハンド領域を提供し、そして他方のプラスミドがレフト・ハンド領域を提供すし、2つのプラスミドが少なくとも約500ntの相同組換えのための中間領域を共有する2つのプラスミドを利用することによって一般的に準備できる。このようにして、各々のプラスミドが、必要に応じて遺伝子の補完を提供するコンピテント宿主における同時トランスフェクションか、アデノウイルスの増殖のためのPSEからの転写開始のための適当な転写因子が続く、所望のとおり独自に操作されうる。
【０１４８】
便宜のために、プラスミドは、アデノウイルスの必要な部分を提供する市販のものである。プラスミドpXC.1（McKinnon (1982) Gene 19:33-42）は、Ad5の野生型レフト・ハンド末端を含む。pBHG10は、E3の欠失を有し、Ad5のライト・ハンド末端を提供する。E3の欠失は、野生型エンハンサー・プロモーターの欠失なしに2 kbの最小PSEを挿入するためのウイルスの余地を提供する。E3のための遺伝子は、E4（r鎖）から反対側の鎖に位置している。
【０１４９】
初期遺伝子の操作について、Ad5E1Aの転写開始部位がnt560であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位がウイルスゲノムのnt610である。この領域が細胞特異的エレメント、例えばPSE、の挿入のために使用されることができる。好都合なことに、制限部位がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使うことによって導入され、利用されるプライマーが、Ad5ゲノムに限られるか、またはAd5ゲノムDNAを担持するプラスミドの一部を含む。例えば、pBR322が骨格である場合、プライマーは、pBR322骨格のEcoRI部位と、Ad5のnt1339のXpal部位を使うかもしれない。領域の中心の重複プライマーが独特の制限部位をもたらす配列変更を導入する、2ステップのPCRを実施することによって、当業者はその部位に細胞特異的応答エレメントの挿入を提供することができる。
【０１５０】
似通った戦略が、E1Bを調節する細胞特異的応答エレメントの挿入のために同様に使用される。Ad5のE1Bプロモーターは、SplとTATAボックスに対する単独の高親和性認識領域から成る。この領域は、1636〜1701 ntに及ぶ。この領域への細胞特異的応答エレメントの挿入によって、当業者はE1B遺伝子の細胞特異的転写を提供することができる。E1Bを調節するための細胞特異的応答エレメントを導入するための鋳型としてE1Aを調節する細胞特異的応答エレメントによって修飾されたレフト・ハンド領域を利用することによって、得られたアデノウイルスがE1AおよびE1Bの両者を発現するために細胞特異的転写因子に依存するであろう。
【０１５１】
例えば、我々は、オリゴ定方向突然変異誘導および連結されたPCRによって5'のAgeI部位12bpをE1A開始コドンに挿入した（Ad5ヌクレオチド547）。さらに、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘導によって、G残基をAd5の1682ntに挿入することによりEagI領域をE1B開始領域の上流に作り出した。EagI領域へのTREの挿入を簡単にするために、CN95の配列内EagI領域をEagIによる切断により取り除き、ムング豆ヌクレアーゼで処理し、そしてCN114構築物に再ライゲートした。このようにして、我々は、近位上流の領域内の独特のAgeIとEagI領域を、それぞれE1AとE1Bに含むアデノウイルス・ベクターを作製した。これらの独特な領域を使って、当業者はAgeIまたはEagI領域を加工したTREを挿入することができ、それにより組み換えアデノウイルス・ベクター構築物を簡単にすることができる。したがって、本発明は、E1Aイニシエーション・コドンの5’の独特なAgeI部位、とE1Bの5'の独特なEagI部位を含むアデノウイルスのベクターを含む。
【０１５２】
同じように、TREが、E2遺伝子の上流に挿入されうる。27050〜27150からのAd5内にマッピングされたE2初期プロモーターは、広範囲および狭い転写イニシエーション部位から成り、後者は、E2転写産物、2つの非標準TATAボックス、2つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位（E2プロモーター・アーキテクチャの詳細な調査については、Swaminathan et al., Curr. Topics in Microbiol. and Immunol. (1995) 199 part 3:177-194を参照のこと）の約5％の割合を占める。
【０１５３】
E2後期プロモーターは、カウンター鎖によってコードされた遺伝子のコード配列と重なって、そのため遺伝子操作の影響を受けにくい。しかし、E2初期プロモーターは、いくつかの塩基対でしかカウンター鎖の33 kDのタンパク質をコードする配列に重ならない。特に、SpeI制限領域（Ad5の27082位）は、上記の33 kDタンパク質の停止コドンの一部であり、そして広範囲のE2初期転写イニシエーション領域およびTATA結合タンパク質領域を、上流の転写因子結合部位、E2FおよびATFから都合よく分離する。したがって、プラス鎖内のSpeI部位へのSpeI末端を有するTREの挿入は、Ad5の配列内E2初期プロモーターを分裂させて、E2転写産物のTRE調節性発現を可能にするはずである。
【０１５４】
E4について、当業者は、アデノウイルス・ゲノムのライト・ハンド部分を使用しなければならない。E4転写開始領域は主にnt35609であり、TATAボックスはnt35638であり、そしてORF1の第1のAUG/CUGはnt35532である。irtanen et al. (1984) J. Virol. 51: 822-831。他の遺伝子について上述の戦略のいずれかを使って、異種TREが、転写開始部位の上流に導入されるかもしれない。E4領域の変異構築物について、E4タンパク質を提供してこれらのタンパク質の合成における欠損を補完する同時トランスフェクションおよび相同組換えが、W162細胞で実施される（Weinberg et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5383-5386）。
【０１５５】
アデノウイルス粒子内へのアデノウイルス・ポリヌクレオチドをパッケージングする方法は、当該技術分野で知られていて、実施例で説明される。
【０１５６】
本発明の腫瘍溶解ベクターの使用方法
当該腫瘍溶解ベクターは、所望のまたは意図されている結果により変化する幅広い種類の目的のために使用されることができる。したがって、本発明は、先に記載の腫瘍溶解ウイルス・ベクターを使った方法を含む。1つの態様において、腫瘍溶解ベクターを使用する方法は、インビトロまたはインビボにおいて、ベクターを細胞に、好ましくは真核細胞に、より好ましくは哺乳動物細胞に導入することを含む。1つの好ましい態様において、本発明の腫瘍溶解ベクターが癌の治療のためにインビボで投与される。
【０１５７】
一過性の発現を導入する目的は、例えば乾癬性病変、再狭窄症、創傷治癒、組織再生、高い免疫応答、感染への抵抗、因子の産生、高い増殖といった腫瘍とは別の望ましくない増殖を伴う治療される兆候、代謝経路または他の生理学的経路の調査、ウイルスなどによる修飾の前、最中、そして後の細胞活性を比較することにより、導入遺伝子を導入したウイルスの存在と不存在における細胞活性の比較を含む。当該ベクターは、特定の細胞群の細胞混合物を取り除くために使用されることができ、その細胞群は標的細胞である。標的細胞において選択的に増殖能力がある腫瘍溶解ウイルスを有することによって、それらの細胞だけが上記腫瘍溶解ウイルスの増殖によって殺傷される。前記ウイルスを細胞混合物と組み合わせることによって、例えば培養またはインビボにおいて、腫瘍溶解ウイルスは、標的細胞においてのみ増殖ができて、誘導物質の存在によって調節される。このように、標的細胞以外の細胞は、腫瘍溶解ウイルスに影響されない一方で、標的細胞が殺傷される。標的細胞における伝播による腫瘍溶解ウイルスの増殖は、混合物が標的細胞を実質的に取り除かれることを保証する。いったん標的細胞が破壊されれば、腫瘍溶解ウイルスはもはや増殖ができなくなるが、しかし培養において、標的細胞、例えば変異細胞または新生物細胞、の再発に関して混合物を絶えず監視するために維持される。誘導物質および/または条件の存在または濃度は、ウイルス複製に対するさらなる制御を提供する。
【０１５８】
標的宿主細胞によって特異的に発現される遺伝子を同定することによって、細胞の性質、それらの成熟レベル、またはそれらの条件に基づいて、標的細胞特異的応答エレメントが、そのような細胞に対する遺伝子の能力を提供するために使用されることができ、その遺伝子の能力は、たとえ腫瘍溶解ウイルスをトランスフェクトされたとしても、他の細胞には存在しない。
【０１５９】
1つの態様において、腫瘍溶解ウイルス・ベクターの使用方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを標的細胞、好ましくは新生物細胞に導入することを含む。他の態様において、腫瘍溶解ウイルス・ベクターの使用方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを前立腺細胞に導入することを含む。他の態様において、腫瘍溶解ウイルス・ベクターの使用方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを肝臓細胞に導入することを含む。他の態様において、腫瘍溶解ウイルス・ベクターの使用方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを乳癌細胞に導入することを含む。他の態様において、腫瘍溶解ウイルス・ベクターの使用方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを結腸癌細胞に導入することを含む。
【０１６０】
1つの態様において、方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターが侵入する、すなわち、細胞を変換するように、細胞を本明細書中に記載の腫瘍溶解ウイルス・ベクターと接触させることを含み、TREの機能を許容する細胞において細胞選択的な細胞毒性を与えることを提供する。細胞毒性は、当該技術分野の標準的なアッセイ、例えば色素排除、3Hチミジン取り込み、および/または溶解、を使って計測されることができる。
【０１６１】
他の態様において、方法は、細胞型特異的、かつ、トランス活性化因子調節性転写調節エレメントの機能を許容する細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、に特異的な腫瘍溶解ウイルスの増殖を提供する。これらの方法は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを、TREsの機能を許容する哺乳動物細胞と組み合わることを伴い、それにより上記腫瘍溶解ウイルスが増殖する。
【０１６２】
他の態様は、細胞混合物を、本発明の腫瘍溶解ウイルス・ベクターと組み合わせることを含む、TREが機能することを許容する細胞（すなわち、標的細胞）を殺傷する方法を提供する。細胞混合物は、一般にTREsが機能的である癌細胞と、正常な細胞の混合物であり、インビボの混合物かインビトロの混合物であるかもしれない。
【０１６３】
本発明は、生物学的なサンプル中の、CT-TREおよび/またはトランス活性化因子調節性転写調節エレメントが機能する細胞を検出する方法を同様に含む。これらの方法は、実験的環境、または臨床的環境にかかわらず、個体（すなわち、哺乳動物）の臨床的および/または生理学的な症状を監視するのに特に有用である。これらの方法について、生物学的サンプルの細胞を腫瘍溶解ウイルス・ベクターと接触させて、腫瘍溶解ウイルス・ベクターの複製を検出する。好適な生物学的サンプルは、標的細胞が存在すると疑われるかもしれないか、またはそう疑われるものである。一般的に、哺乳動物において、好適な医療用サンプルは、標的癌細胞が存在することが疑われているものである。そのような細胞は、例えば、針生検または他の外科的処置によって得ることができる。接触させる細胞は、アッセイ条件を作るために、例えば選択的な濃縮および/または可溶化といった、処理がされる。これらの方法において、標的細胞は、当該技術分野で標準的である、増殖を検出するインビトロのアッセイを使って検出される。そのような標準的なアッセイの例は、これだけに制限されることなく、（ウイルスの収率を計測する）バースト・アッセイおよび（細胞あたりの感染粒子を計測する）プラーク・アッセイを含む。また、増殖は、標準的アッセイでもある、特定の腫瘍溶解ウイルスDNA複製を計測することによって検出することができる。
【０１６４】
本発明は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターがその細胞に侵入する、標的細胞を、本明細書中に記載の腫瘍溶解ウイルス・ベクターと接触させることを含む、標的細胞の遺伝子型を修飾する方法を同様に提供する。
【０１６５】
本発明は、腫瘍溶解ウイルス・ベクターがその腫瘍細胞に侵入し、そしてその腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性を示すように、腫瘍細胞と本発明の腫瘍溶解ウイルス・ベクターを接触させることを含む、腫瘍細胞の成長を抑制する方法をさらに提供する。腫瘍細胞の成長は、これだけに制限されることなく、腫瘍サイズを計測すること、3Hチミジン取り込みアッセイを使って腫瘍細胞が増殖しているかどうかを測定すること、または腫瘍細胞をカウントすることを含めて、当該技術分野で知られているいずれかの手段によって評価することができる。腫瘍細胞の成長を「抑制する」ことは、以下の条件：腫瘍の成長を遅くする、遅らせる、および止める、ならびに腫瘍縮小、の一部または全部を意味する。腫瘍の成長を「抑制する」ことは、本明細書中に記載の腫瘍溶解ウイルス・ベクターとも接触、すなわち、それによるトランスフェクション、を伴わない成長と比べた場合に、抑えられた成長状態を示す。
【０１６６】
本発明は、本発明の腫瘍溶解ウイルス・ベクターを個体に与えることを含む、個体の腫瘍細胞マーカーのレベルを下げる方法を同様に提供して、ここで、上記腫瘍溶解ウイルス・ベクターは、腫瘍細胞マーカーを産生している細胞において選択的に細胞毒性をもつ。腫瘍細胞マーカーは、これだけに制限されることなく、PSA、CEA、およびhK2を含む。腫瘍細胞マーカーのレベルを計測する方法は、当業者に知られており、そしてこれだけに制限されることなく、免疫学的アッセイ、例えば腫瘍細胞マーカーに特異的な抗体を使った酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、を含む。一般に、生物学的サンプルは、試験する個体から得られて、例えばELISAのような好適なアッセイが生物学的サンプルで実施される。
【０１６７】
本発明は、効果的な量の本明細書中に記載の腫瘍溶解ウイルス・ベクターを個体に投与する治療方法を同様に提供する。例えば、少なくとも1つの細胞型特異的TREが前立腺細胞（例えば、PSE-TRE、PB-TRE、および/またはhKLK2-JRE）に特異的である腫瘍溶解ウイルス・ベクターを使った治療は、先に記載されるような前立腺に関連する疾患、例えば過形成および癌、の個体に適応とされる。この例において、前立腺関連疾患にかかる危険性が高いとみなされる個体、例えば摘出された疾患を持っていた人、および前立腺関連疾患の家族歴を持っていた人に同様に適応とされる。本発明の腫瘍溶解ウイルス・ベクターの投与の妥当性のアッセイは、とりわけ、評価可能な臨床的パラメーター、例えば血清学的指標、および組織バイオプシーの組織学的調査に依存する。一般的に、腫瘍溶解ウイルス・ベクターを含む医薬組成物が投与される。医薬組成物は先に記載されている。
以下の実施例は、説明の手段として提供され、制限の手段として提供されるものではない。
【実施例】
【０１６８】
実施例1
前立腺組織に特異的なテトラサイクリン調節性腫瘍溶解ウイルス複製
少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子の発現を制御するTet-Onシステムを使って複製が調節される前立腺特異的腫瘍溶解アデノウイルスが提供される。腫瘍溶解のウイルス複製を制御するTet-On調節性遺伝子発現システムの場合に、最初期アデノウイルスE1A遺伝子領域の発現は、配列内のアデノウイルス・プロモーター・エレメントの削除とテトラサイクリン応答性エレメントの挿入によって、キメラ・プロモーター・エレメント、テトラサイクリン応答性エレメント（図1）の制御下に置かれる。テトラサイクリンおよびその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）の存在下、テトラサイクリン応答性エレメントに結合して発現を誘導する、修飾されたリバース・テトラサイクリン・トランス活性化因子（rtTA（2）s-M2）の産生のための発現カセットは、ヒト前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターによって本明細書中に例証された組織/腫瘍特異的プロモーター（CT-TRE）の制御下のウイルスのE3領域に配置される。
【０１６９】
この様式で、rtTAトランス活性化因子（TA-TRE）の発現が、PSAプロモーターが活性である組織または腫瘍組織、例えば前立腺由来組織に制限される。テトラサイクリン（またはその誘導体）の追加によって、rtTAトランス活性化因子がテトラサイクリン応答性エレメントに結合して、E1A転写、そしてそれによる発現のスイッチをいれる。E1Aタンパク質の発現から、アデノウイルス複製プロセスは続き、宿主細胞の最終的な死、そしてさらなるアデノウイルスの子孫の放出をもたらす。それに比べ、誘導因子の不存在、または非標的細胞に侵入したウイルスにおいて、rtTAは、テトラサイクリン応答性エレメントに結合することができず、E1Aタンパク質が発現されず、そしてウイルス複製が続かない。E1A遺伝子領域はこの実施例で記載されているが、しかしアデノウイルスのあらゆる必須ORFがこの様式で調節されることができる、すなわち、テトラサイクリン応答性エレメントは、E1a、E1b、E2、またはE4領域を制御することができる。さらに、複数のORFsが、システムの制御を増やすためにテトラサイクリン調節性制御下、すなわちE1とE4、E1とE2、に置かれるかもしれない。
【０１７０】
1A．Ad5によるE1AのPSE駆動性発現
最小前立腺特異的エンハンサー（PSE）のクローン化および特徴づけは、Schuur et al., 1996で記載されている。プラスミドCN71は、最小PSE（PSA遺伝子の転写開始部位と関係がある-5322 bp〜3875 bp）およびPSAプロモーターの-532〜+11を含んでいる。CN71を、XhoI/PSAプロモーターを取り除くHindIIIで切断した。-230〜+7の短いプロモーターをPCRによって増幅した。PCR産物をXhoI/HindIIIで切断して、XhoI/HindIII切断CN71を戻ってライゲートしてCN105を作製した。そして、プラスミドpUHrt62-1（2）（W.Hillenからの惜しみない贈与）をEcoRIで切断し、クレノーフラグメントで部位平滑化し、そしてXhoIで切断して、上記構築物からCMVプロモーターを取り除いた。そして、前記のものからのPSAプロモーター・フラグメントを、CMVの代わりに（pUHrt62-1（2）内の）rtTA2（s）-M2導入遺伝子の5'に配置して、pUH-PSA-rt62-1（2）を作製した。そして、（SV40後期polyAを組み込んだ）PSA-rtTA2（s）-M2フラグメントを、XhoI/HindIII消化を使ってpUH-PSA-rt62-1（2）から遊離させ、そしてXbaI制限部位によってpABS4（Microbix, Toronto）内にライゲート/挿入して、カナマイシン耐性遺伝子を含むシャトルプラスミド、pABS4-PSA-rtTAを作製した。pABS4-PSA-rtTAをPacIで消化することによって、KanR遺伝子を含むフラグメントとPSA-rtTA2（s）-M2発現カセットを単離し、そして同じように切断した、Ad5のE3領域で加工された独特なPacI領域を含むBHG11（Microbix）内にライゲートして、BHG11-PSA-rtTA-KanRを作製した。BHG11-PSA-rtTA-KanRをSwaIで消化し、そしてベクターをライゲートすることによってKanR遺伝子を取り除いた（BHG11-PSA-rtTA）。
【０１７１】
1B．E1Aを駆動し、そして配列内Ad5 E1Aプロモーターおよびエンハンサーを保有するテトラサイクリン応答性プロモーターを有する弱毒化Ad5
機能的E1A遺伝子の不存在下、ウイルスDNA複製に必要な遺伝子産物が産生されないのでウイルス感染は進まない（Nevins (1989) Adv. Virus Res. 31:35-81）。Ad5E1Aの転写開始部位は、nt560であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位は、ウイルスゲノムのnt610である。
【０１７２】
pXC.1をMicrobix Biosystems社（Tronto）から購入した。pXC.1は、bp22〜5790のアデノウイルスの5つの配列を含む。AgeI領域を、オリゴ部位特異的突然変異誘導および連結PCRによって、5'の12bpでE1A開始コドン（Ad5の547ヌクレオチド）に導入された。プラスミドpXC.1を、エクストラAを含むプライマーを使ってPCR増幅して、AgeI領域を導入した。これが、pBR322骨格のEcoRI領域からAd5のnt560までのセグメントを作製した。Adヌクレオチド541からAdヌクレオチド1339のXbaI部位までのpXC.1の第2セグメントを、エクストラTを含むプライマーを用いて増幅して、AgeI部位を導入した。これらの2つのPCR増幅DNAセグメントの混合物を、混ぜて、プライマー3および4で増幅して、pXC.1のEcoRI部位からXbaI部位までのDNAセグメントを作製した。このDNAセグメントは、アデノウイルス配列の一番左の1317塩基を包含し、Adヌクレオチド547のAgeI部位を含んでいる。このDNAセグメントをpXC.1の対応するセグメントを置き換えるために使用して、CN95を作製した。同じように、AgeI末端を有するテトラサイクリン応答性エレメントを、プラスミドpTRE2（BD Biosciences Clontechから購入）からPCR増幅して、pXC-TRE-E1aを作製した。
【０１７３】
1C．相同組換えによって作製されたウイルス-CG1974
E3領域のrtTA（2）s-M2遺伝子を駆動するPSAプロモーター、およびE1領域のE1aを駆動するテトラサイクリン応答性エレメントを含むAd5組み換えウイルスを、先に述べたように構築した。Ad E1AおよびE1Bタンパク質を発現するヒト腎臓細胞系の少ない継代の293の細胞による相同組換えによって、ウイルスを製造した。これは、pXC-TRE-E1aとBHG11-PSA-rtTAの同時トランスフェクションによって達成された。得られた組み換えウイルス構築物のゲノム完全性を、HindIII消化を使って確認し、そしてCG1974を指定した（図1）。
【０１７４】
実施例2
さらなる実施例において、腫瘍溶解ベクターを、効能を高めるための治療用導入遺伝子、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）またはチミジンキナーゼ（TK）、によって「武装させる」。これらの治療用導入遺伝子の発現を、調節性遺伝子発現システムの制御下に置く。この様式において、調節性遺伝子発現システム内に使用された誘導因子は、ウイルス複製も、治療用遺伝子の発現も同時にスイッチをいれる。そのようなベクターの例は、テトラサイクリン調節性複製および発現制御を有するGMCSFで武装した前立腺特異的腫瘍溶解ウイルス・ベクターを説明する図2で挙げられる。この例において、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）がE1およびGMCSF発現を駆動する。IRESは、1つのプロモーターから発現されるべき2つのコード配列を可能にし、そして前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターは、リバースtet応答性トランス活性化因子（rtTA）の発現を駆動する。ここで、システムへのTetの添加によってスイッチがはいるE1およびGMCSFの両者の発現により、先に記載されるように、ベクターが機能する。この例において、配列内リボソーム進入部位（IRES）または2A配列は、1つのプロモーターを使って2つのコード領域を発現することができる。
【０１７５】
実施例3
先に記載の様式における使用のための多数の異なったテトラサイクリン調節性遺伝子制御系。例えば、先に記載のTet-Onシステムと併用するテトラサイクリン制御性転写サイレンサー（tTS）システム（Freundlieb et al 1999）は、より厳密に遺伝子発現を制御するために使用される（膀胱癌の使用のための二重のテトラサイクリン調節性複製制御を有する腫瘍溶解ウイルス・ベクターを説明する図3を参照のこと）。この例において、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）はE1遺伝子発現を駆動し、そしてヒト・ウロプラキンII（hUPII）プロモーターはリバースtet応答性トランス活性化因子（rtTA）およびtet制御性転写サイレンサー（tTS）の発現を駆動する。rtTAトランス活性化因子に加えて、tTSリプレッサー分子の使用は、「オフ」状態の基礎または「漏出性の」遺伝子発現を減少させ、遺伝子調節の程度を高める。例えば、図3のシステムは、配列内リボソーム進入部位（IRES）を使ったヒト・ウロプラキンIIプロモーターからTet-Onトランス活性化因子とtTsリプレッサーの両方を発現する。この様式での、rtTAおよびtTSの発現は、膀胱組織細胞型に特有である。必要不可欠なE1遺伝子の発現は、この場合にもTRE制御下にある。Tetの不存在下において、tTS分子はTREエレメントに結合して、E1遺伝子発現を能動的に抑制する。アデノウイルスはそのゲノム内に存在する多数の転写エンハンサー・エレメントを持っているので、tTS分子によるこの能動的な抑制が必要とされる。その配列内プロモーターの不存在にもかかわらず、誘導因子の不存在の制限された量のウイルス形成を導くE1プロモーターの「漏出性の」発現を引き起こす可能性がある。テトラサイクリンの添加によって、tTS分子の構造変化が、TREへの結合、およびTREからの発現の能動的な抑制を妨げる。そして、rtTA、Tet-Onトランス活性化因子が、複製が進むように得られたTREへの結合能力によってE1の発現を誘導することができる。
【０１７６】
代わりのシステムが、汎癌適用における使用のためのラパマイシン（ARIADシステム）調節性複製制御を有する腫瘍溶解ウイルス・ベクターの例を表す図4で示される。このシステムは、E1遺伝子発現を駆動する最小IL-2プロモーターのZFHD1上流の8コピーの認識部位を包含するキメラ・プロモーター、および「活性化ドメイン」（NF-KBのp65サブユニットの活性化領域に融合したFRAPのラパマイシン結合ドメイン（FRB））の発現を駆動するヒト・E2Fプロモーター（E2F）、そして（3コピーのFKBPに融合したZFHD1を伴うキメラDNA結合分子をコードする）「DNA結合ドメイン」に依存する。
【０１７７】
調節可能な複製能力のあるウイルスが特定の宿主細胞に特異的な担体として提供されることができて、上記ウイルスが特定の標的細胞において選択的に複製し、そしてウイルスの複製が調節されうることは、先の記載から明白である。
【０１７８】
この明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願を、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願を明確にそして個別に援用したかのように本明細書中に援用する。
【０１７９】
本発明はここに完全に記載され、添付した請求項の本質または範囲から逸脱することなく多くの変更および修飾がそれに対してなされることができることは当業者にとって明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】テトラサイクリン調節性複製制御を有する前立腺特異的アデノウイルス・ベクターのゲノムを略図で説明する。
【図２】テトラサイクリン調節性複製および導入遺伝子制御を有する、GM-CSFで武装した前立腺特異的アデノウイルス・ベクターのゲノムを略図で説明する。
【図３】二重のテトラサイクリン調節性複製制御を有するアデノウイルス・ベクターのゲノムを略図で説明する。
【図４】汎癌適用における使用のためのラパマイシン（ARIAD system）調節性制御を有するアデノウイルス・ベクターのゲノムを略図で説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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