(57)【要約】  本発明は、対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止する方法、対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防する方法、及び対象者の運動誘発性突然心臓死を予防する方法を提供する。また、これらの方法におけるJTV-519の使用も提供する。更に、本発明は、運動誘発性突然心臓死の予防において使用する薬剤の同定方法、並びにそのような方法により同定した薬剤も提供する。また、これらの薬剤を投与することによる運動誘発性突然心臓死の予防方法も提供する。更に、本発明は、JTV-519、放射能標識JTV-519、並びに1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体の合成方法も提供する。
2007507536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動誘発性心不整脈の候補である対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止する方法であって、該対象者に、該対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止するのに有効な量のJTV-519を投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
RyR2結合FKBP12.6レベルの低下を、前記対象者において、前記対象者のリン酸化RyR2レベルを低下させることによって抑制又は防止する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対象者が、ヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記対象者が、カテコールアミン作用性多源性心室頻拍(CPVT)を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止するのに有効なJTV-519の量が、前記対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防するのに有効なJTV-519の量である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
JTV-519により、前記対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止するのに有効なJTV-519の量が、前記対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効なJTV-519の量である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
JTV-519により、前記対象者の運動誘発性突然心臓死を予防する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止するのに有効なJTV-519の量が、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
運動誘発性心不整脈の候補である対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止する方法におけるJTV-519の使用。
【請求項１１】
JTV-519を、対象者に、該対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防するのに有効な量で投与することを特徴とする、対象者の運動誘発性心不整脈の治療又は予防方法。
【請求項１２】
前記心不整脈が、カテコールアミン作用性多源性心室頻拍(CPVT)に関連する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記対象者が、運動誘発性突然心臓死の候補である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は防止するのに有効なJTV-519の量が、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
対象者の運動誘発性心不整脈の治療又は予防方法におけるJTV-519の使用。
【請求項１６】
JTV-519を、対象者に、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することを特徴とする、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防方法。
【請求項１７】
前記運動誘発性突然心臓死が、カテコールアミン作用性多源性心室頻拍(CPVT)に関連する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効なJTV-519の量が、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
運動誘発性突然心臓死を予防するのに使用する薬剤の同定方法であって、
下記の工程、
(a) RyR2を含有する細胞の培養物を取得する又は生成させる工程、
(b) 前記細胞を候補薬剤と接触させる工程、
(c) 前記細胞を細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている１以上の条件に暴露させる工程、及び、
(d) 前記薬剤が前記細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止しているかどうかを判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
(e) 前記薬剤が前記細胞内のRyR2関連生物学的事象に対する作用を有するかどうかを判定する工程を更に含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９記載の方法によって同定した薬剤。
【請求項２２】
請求項２１記載の薬剤を、対象者に、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することを特徴とする、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防方法。
【請求項２３】
運動誘発性突然心臓死を予防するのに使用する薬剤の同定方法であって、
下記の工程、
(a) RyR2を含有する動物を取得する又は産生させる工程、
(b) 候補薬剤を前期動物に投与する工程、
(c) 前記動物を細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている１以上の条件に暴露させる工程、及び、
(d) 前記薬剤が前記動物内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止しているかどうかを判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
(e) 前記薬剤が前記動物内のRyR2関連生物学的事象に対する作用を有するかどうかを判定する工程を更に含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法によって同定した薬剤。
【請求項２６】
下記の式、
【化１】
2007507536.tif 000034
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり、Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)
を有する化合物の合成方法であって、下記の工程、
(a) 下記の式、
【化２】
2007507536.tif 000035
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、下記の式、
【化３】
2007507536.tif 000036
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(b) 工程(a)で調製した化合物をクロライド及びクロロエチルアミンで処理して、下記の式、
【化４】
2007507536.tif 000037
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(c) 工程(b)で調製した化合物を、テトラヒドロレートの存在下に、還元剤及び塩基で処理して、下記の式、
【化５】
2007507536.tif 000038
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(d) 工程(c)で調製した化合物を還元剤で処理して、下記の式、
【化６】
2007507536.tif 000039
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
工程(a)におけるジアゾ化剤がNaNO2である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
工程(a)におけるジスルフィドがNa2S2である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
工程(b)におけるクロライドがSOCl2である、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
工程(c)における還元剤が、トリメチルホスフィン(PMe3)である、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
工程(c)における塩基が、トリエチルアミンである、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
工程(d)における還元剤が、LiAlH4である、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
下記の式、
【化７】
2007507536.tif 000040
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり、Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)
を有する工程(a)における化合物を、下記の工程、
(e) 下記の式、
【化８】
2007507536.tif 000041
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を、任意成分としての触媒の存在下に、還元剤で処理して、下記の式、
【化９】
2007507536.tif 000042
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
を含む方法によって合成する、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
工程(e)における還元剤がH2である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
下記の式、
【化１０】
2007507536.tif 000043
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり、R' = アルキル、アリール又はHであり、Rは、位置2、3、4又は5に有り得る)
を有する化合物の合成方法であって、下記の工程、
(a) 下記の式、
【化１１】
2007507536.tif 000044
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、下記の式、
【化１２】
2007507536.tif 000045
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(b) 工程(a)で調製した化合物をクロライド及びクロロエチルアミンで処理して、下記の式、
【化１３】
2007507536.tif 000046
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(c) 工程(b)で調製した化合物を、テトラヒドロレートの存在下に、還元剤及び塩基で処理して、下記の式、
【化１４】
2007507536.tif 000047
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(d) 工程(c)で調製した化合物を還元剤で処理して、下記の式、
【化１５】
2007507536.tif 000048
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
(e) 工程(d)で調製した化合物を、3-ブロモプロピオン酸クロライド及び下記の式、
【化１６】
2007507536.tif 000049
を有する化合物で処理して、下記の式、
【化１７】
2007507536.tif 000050
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
下記の式、
【化１８】
2007507536.tif 000051
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり、Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)
を有する工程(a)における化合物を、下記の工程、
(f) 下記の式、
【化１９】
2007507536.tif 000052
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を、任意成分としての触媒の存在下に、還元剤で処理して、下記の式、
【化２０】
2007507536.tif 000053
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程、
を含む方法によって合成する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
下記の式、
【化２１】
2007507536.tif 000054
を有する化合物の合成方法であって、下記の工程、
(a) 下記の式、
【化２２】
2007507536.tif 000055
を有する化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、下記の式、
【化２３】
2007507536.tif 000056
を有する化合物を調製する工程、
(b) 工程(a)で調製した化合物をクロライド及びクロロエチルアミンで処理して、下記の式、
【化２４】
2007507536.tif 000057
を有する化合物を調製する工程、
(c) 工程(b)で調製した化合物を、テトラヒドロレートの存在下に、還元剤及び塩基で処理して、下記の式、
【化２５】
2007507536.tif 000058
を有する化合物を調製する工程、
(d) 工程(c)で調製した化合物を還元剤で処理して、下記の式、
【化２６】
2007507536.tif 000059
を有する化合物を調製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
下記の式、
【化２７】
2007507536.tif 000060
を有する工程(a)における化合物を、下記の工程、
(e) 下記の式、
【化２８】
2007507536.tif 000061
を有する化合物を、任意成分としての触媒の存在下に、還元剤で処理して、下記の式、
【化２９】
2007507536.tif 000062
を有する化合物を調製する工程、
を含む方法によって合成する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
下記の式：
【化３０】
2007507536.tif 000063
を有する化合物の合成方法であって、下記の工程、
(a) 下記の式、
【化３１】
2007507536.tif 000064
を有する化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、下記の式、
【化３２】
2007507536.tif 000065
を有する化合物を調製する工程、
(b) 工程(a)で調製した化合物をクロライド及びクロロエチルアミンで処理して、下記の式、
【化３３】
2007507536.tif 000066
を有する化合物を調製する工程、
(c) 工程(b)で調製した化合物を、テトラヒドロレートの存在下に、還元剤及び塩基で処理して、下記の式、
【化３４】
2007507536.tif 000067
を有する化合物を調製する工程、
(d) 工程(c)で調製した化合物を還元剤で処理して、下記の式、
【化３５】
2007507536.tif 000068
を有する化合物を調製する工程、
(e) 工程(d)で調製した化合物を、3-ブロモプロピオン酸クロライド及び下記の式、
【化３６】
2007507536.tif 000069
を有する化合物で処理して、下記の式、
【化３７】
2007507536.tif 000070
を有する化合物を調製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
下記の式、
【化３８】
2007507536.tif 000071
を有する工程(a)における化合物を、下記の工程、
(f) 下記の式、
【化３９】
2007507536.tif 000072
を有する化合物を、任意成分としての触媒の存在下に、還元剤で処理して、下記の式、
【化４０】
2007507536.tif 000073
を有する化合物を調製する工程、
を含む方法によって合成する、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、2002年12月3日に発行された現在の米国特許第6,489,125 B1号である2000年5月10日に出願された米国特許出願第09/568,474号の継続出願である2002年11月5日に出願された米国特許出願第10/288,606号の１部継続出願である2003年6月26日に出願された米国特許第10/608,723号の１部継続出願である。これら出願の内容は、参考として本明細書に合体させる。
（政府権利についての声明）
本発明は、NIH Grant No. PO1 HL 67849-01の下に、政府助成によりなされた。従って、米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
（背景技術）
心不全は、世界的に死亡及び疾病の主要原因である。心不全のより重篤な症例(New York Heart Association クラスIV)においては、2年間死亡率は、50%を上回っている(Braunwald, E.B., Heart Disease, 4th ed. (Philadelphia:W.B. Saunders Co., 1992))。心不全の一般的特徴である心不整脈は、該疾患に関連した多くの死亡をもたらしている。詳細には、心疾患を有する全患者数のおよそ50%が致死性心不整脈により死亡している。心臓内のある種の心室性不整脈は、速やかに死に至る(“突然心臓死”(SCD)と称される現象)。しかしながら、致死性心室性不整脈は、構造的心疾患を有することに気付いていない若年の本来であれば健常な個々人においても生じ得る。事実、心室性不整脈は、本来であれば健常な個々人における突然死の最も一般的な原因である。
カテコールアミン作用性多源性心室頻拍(CPVT)は、構造的に正常な心臓を有する個々人における遺伝性疾患である。CPVTは、ストレス誘発性心室頻拍(突然心臓死を起し得る致死性不整脈)に特徴を有する。CPVTを有する対象者においては、身体運動及び/又はストレスにより、検出し得る構造的心疾患の不存在においてSCDに至る双方向性及び/又は多形性心室頻拍が誘発される(Laitinen et al., Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:485-90, 2001；Leenhardt et al., Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children: a 7-year follow-up of 21 patients. Circulation, 91:1512-19, 1995；Priori et al., Clinical and molecular characterization of patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 106:69-74,2002；Priori et al.,Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:196-200, 2001；Swan et al., Arrhythmic disorder mapped to chromosome 1q42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts. J. Am. Coll. Cardiol., 34:2035-42, 1999)。CPVTは、常染色体優性型の優性遺伝である。CPVTを有する個々人は、運動をしなければならないときに心室性不整脈を有するが、安静時には不整脈を発症しない。関連研究及び直接のシークエンシングにより、CPVTを有する個々人の染色体1q42 q43においてヒトRyR2遺伝子の突然変異が同定されている(Laitinen et al., Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:485-90, 2001；Priori et al.,Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:196-200, 2001；Swan et al., Arrhythmic disorder mapped to chromosome 1q42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts. J. Am. Coll. Cardiol., 34:2035-42, 1999)。
【０００３】
心不全は、危険臓器の潅流低下に至る心筋の収縮機能の進行性疾患に特徴を有する。心筋及び他の横紋筋の収縮は、カルシウム(Ca2+)が筋小胞体(SR)から周辺細胞質に放出されたときに開始される。リアノジンレセプター(RyR)類のような、SR上のカルシウム放出チャンネルは、興奮収縮(EC)連関(即ち、活動電位と筋細胞収縮との連関)において必要とする。３つのタイプのリアノジンレセプターが存在し、これらの全てが高関連性のCa2+チャンネルである：RyR1、RyR2、及びRyR3。RyR1は骨格筋において見出され、RyR2は心臓において見出され、RyR3は脳内に位置する。タイプ2のリアノジンレセプター(RyR2)は、EC連関及び心臓横紋筋の筋収縮において必要とする主要Ca2+放出チャンネルである。
RyR2チャンネルは、Ca2+の細胞内貯蔵を放出するSRの特定領域内の濃密アレー中に包み込まれており、それによって筋収縮を誘発させる(Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281:818-21, 1998)。EC連関中、心筋細胞膜の脱分極が、活動電位のゼロ段階において、電位依存性Ca2+チャンネルを活性化する。引続き、これらのチャンネルを通るCa2+流入は、Ca2+誘発性Ca2+放出として知られる過程において、SRからRyR2を介してCa2+放出を開始させる(Fabiato, A., Calcium-induced release of calcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum. Am. J. Physiol., 245:C1-C14, 1983；Nabauer et al., Regulation of calcium release is gated by calcium current, not gating charge, in cardiac myocytes. Science, 244:800-03, 1989)。その後、RyR2介在、Ca2+誘発性Ca2+放出は、心筋収縮に関与する収縮タンパク質を活性化する。
【０００４】
RyR2は、４個の565,000ダルトンRyR2ポリペプチドを４個の12,000ダルトンFK506結合性タンパク質(FKBP)、とりわけFKBP12.6タンパク質と一緒に含むタンパク質複合体である。FKBP類は、広範囲に発現して種々の細胞機能を奏するシス-トランスペプチジル-プロリルイソメラーゼ類である(Marks, A.R., Cellular functions of immunophilins. Physiol. Rev., 76:631-49, 1996)。FKBP12タンパク質類は、骨格リアノジンレセプター、RyR1 (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994；Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992)；心臓リアノジンレセプター、RyR2 (Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle. Cric. Res., 78:990-97, 1996)；タイプ1イノシトール1,4,5-トリホスフェートレセプター(IP3R1)として知られる関連細胞内Ca2+-放出チャンネル(Cameron et al., FKBP12 binds the inositol 1,4,5-triphosphate receptor at leucine-proline (1400-1401) and anchors calcineurin to this FK506-like domain. J. Biol. Chem., 272:27582-88, 1997)；及びタイプI形質転換成長因子β(TGFβ)レセプター(TβRI) (Chen et al., Mechanism of TGFbeta receptor inhibition by FKBP12. EMBO J, 16:3866-76, 1997)の機能に密接に関連して、該機能を調節する。FKBP12.6は、RyR2チャンネルに結合し(RyR2サブユニット当り1分子)、RyR2チャンネル機能を安定化させ(Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994)、近隣RyR2チャンネル間の連関門通を容易にし(Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281:818-21, 1998)、それによって心臓サイクルの静止期におけるチャンネルの異常活性化を阻止する。
【０００５】
心不全(例えば、心不全を有する患者及び心不全の動物モデルにおける)は、慢性アドレナリン亢進刺激を含む不適応応答に特徴を有する(Bristow et al., Decreased catecholamine sensitivity and beta-adrenergic-receptor density in failing human hearts. N.Eng.J Med, 307: 205-11, 1982)。心不全におけるこの刺激の病原的意義は、β-アドレナリン刺激及び左心室心筋壁ストレスを低下させて心室リモデリングを強力に逆転させる治療方法によって裏付けされている(Barbone et al., Comparison of right and left ventricular responses to left ventricular assist device support in patients with severe heart failure: a primary role of mechanical unloading underlying reverse remodeling. Circulation, 104: 670-75, 2001；Eichhorn and Bristow, Medical therapy can improve the biological properties of the chronically failing heart. A new era in the treatment of heart failure. Circulation, 94: 2285-96, 1996)。心不全においては、慢性β-アドレナリン刺激は心臓内のβ-アドレナリンレセプターの活性化に関連し、該レセプターは、G-タンパク質との連関により、アデニリルシクラーゼを活性化し、それによって細胞内cAMP濃度を増大させる。cAMPは、RyR2の過剰リン酸化を誘発させることが証明されているcAMP依存性タンパク質キナーゼ(PKA)を活性化させる。
RyR2の過剰リン酸化は、心不全における収縮機能低下及び不整脈原性に寄与する要因として提案されている(Marks et al., Progression of heart failure: is protein kinase a hyperphosphorylation of the ryanodine receptor a contributing factor? Circulation, 105: 272-75, 2002；Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000)。この仮説と一致して、心不全におけるRyR2のPKA過剰リン酸化は、動物モデル及び心臓移植を受けた心不全患者の双方において、生体内で実証されている(Antos et al., Dilated cardiomyopathy and sudden death resulting from constitutive activation of protein kinase A. Circ.Res., 89: 997-1004, 2001；Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000；Ono et al., Altered interaction of FKBP12.6 with ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca (2+) release in heart failure. Cardiovasc. Res., 48: 323-31,2000；Reiken et al., Beta-adrenergic receptor blockers restore cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) structure and function in heart failure. Circulation, 104: 2843-48, 2001；Semsarian et al., The L-type calcium channel inhibitor diltiazem prevents cardiomyopathy in a mouse model. J. Clin. Invest., 109:1013-20, 2002；Yano et al., Altered stoichiometry of FKBP12.6 versus ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca (2+) leak through ryanodine receptor in heart failure. Circulation, 102: 2131-36, 2000))。
【０００６】
心不全においては、PKAによるRyR2の過剰リン酸化は、RyR2チャンネルからの調節FKBP12.6サブユニットの解離を誘発させる(Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76,2000)。このことは、RyR2チャンネルの生理学的特性に顕著な変化をもたらす。そのような変化は、Ca2+依存性活性化に対する感受性増大に基づく開確率(Po)の増大 (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23,1994；Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78: 990-97, 1996)；伝導性低下(subconductance)状態をもたらす上記チャンネルの不安定化；及びEC連関欠陥及び心機能異常をもたらす上記チャンネルの連関門通欠損(Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281: 818-21, 1998)によって証明されている。即ち、PKA過剰リン酸化RyR2は低レベルのCa2+刺激に対して極めて感受性であり、このこと自体が過剰リン酸化チャンネルによるSRCa2+漏出を明示している。
構造的に正常な心臓においては、同様な現象が活動中に生じ得る。とりわけ、運動及びストレスが、心臓内でβ-アドレナリンレセプターを活性化させるカテコールアミンの放出を誘発させることは知られている。β-アドレナリンレセプターの活性化は、RyR2チャンネルの過剰リン酸化をもたらす。更にまた、証拠により、β-アドレナリンレセプター活性化に由来するRyR2の過剰リン酸化は変異RyR2チャンネルを心臓サイクルの弛緩期において更に一層開放せしめ、不整脈の可能性を増大させることが示唆されている。
【０００７】
心不整脈は、構造的に正常な心臓におけるSRCa2+漏出と関連することが知られている。これらの場合、心室性頻拍の誘発及び持続の最も一般的なメカニズムは、異常自動性である。誘発性不整脈として知られる１つの形の異常自動性は、遅延後脱分極(DAD)を開始させるSRCa2+の異常放出と関連している(Fozzard, H.A., Afterdepolarizations and triggered activity. Basic Res. Cardiol., 87: 105-13,1992；Wit and Rosen, Pathophysiologic mechanisms of cardiac arrhythmias. Am. Heart J., 106: 798-811, 1983)。DADは、致死性心室性不整脈を誘発し得、心臓活動電位の再分極後に生じる心筋細胞内の異常脱分極である。DADをもたらす異常SR Ca2+放出についての分子的根拠は、完全には解明されていない。しかしながら、DADは、リアノジンにより阻止されることが知られており、RyR2がこの異常Ca2+放出の病因において主要な役割を果たし得る証拠を示している(Marban et al., Mechanisms of arrhythmogenic delayed and early afterdepolarizations in ferret ventricular muscle. J. Clin. Invest., 78: 1185-92,1986；Song and Belardinelli, ATP promotes development of afterdepolarizations and triggered activity in cardiac myocytes.Am. J. Pllysiol., 267: H2005-11, 1994)。
上記に照らして、RyR2チャンネルにおける漏出が多くの病理状態(疾患性心臓及び構造的に正常な心臓の双方における)に関連していることは明白である。従って、RyR2における漏出を修復させる方法は、何百万もの患者における致死性不整脈を予防し得る。
1,4-ベンゾチアゼピンの誘導体であるJTV-519 (4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンモノヒドロクロライド；k201としても知られている)は、カルシウムイオンチャンネルの新たなモジュレーターである。心筋細胞中のCa2+レベルの調節以外に、JTV-519は、モルモット心室細胞内のNa+電流及び内向き整流K+電流も調節し、モルモット心房細胞内の整流K+電流遅延を抑制する。研究により、JTV-519がカテコールアミン誘発性心筋損傷、心筋損傷誘発性筋細線維過収縮、及び虚血/再灌流損傷に対する強力な心臓保護作用を有することが証明されている。実験筋細線維過収縮モデルにおいては、JTV-519は、プロプラノロール、ベラパミル及びジルチアゼムよりも大きい心臓保護作用を示していた。また、実験データは、JTV-519が、動物モデルにおいて細胞内Ca2+過負荷レベルを低下させることによって心室虚血/再灌流を有効に予防することを示唆している。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、RyR2が運動誘発性突然心臓死(SCD)を引起す心不整脈を予防するためのターゲットであるという驚くべき発見に基づく。本明細書において説明するように、本発明者等は、７種のCPVT変異による変異体RyR2チャンネルを調製し、それらの機能を試験した。７種の変異体全てが、運動中に刺激したとき、漏出性(SRカルシウム漏出)となるチャンネル内に生じた機能欠陥を有していた。本発明者等の研究は、先ず第１に、SRカルシウム漏出がDADを引起すメカニズムを特定することである。注目すべきことに、変異体CPVTチャンネルにおける欠陥は、該チャンネルを末期心不全(致死性心不整脈の高発生率に特徴を有する障害)を有する患者の心臓内の漏出性チャンネルであるかのようにしていた。従って、本発明者等は、本明細書において、CPVTにおけるVTについてのメカニズムが心不全におけるVTについてのメカニズムと同じであることを実証する。
また、本発明者等は、本明細書において、1,4-ベンゾチアゼピン化合物群の１員である薬物JTV-519 (k201)がRyR2チャンネル内の漏出を修復することを開示する。本発明者等が本明細書において証明するように、JTV-519は、FKBP12.6のPKAリン酸化RyR2に対する結合性及び他方でFKBP12.6に対して低減した親和性を有するか又は結合しない変異体RyR2に対する結合性を増強する。JTV-519のこの作用は、致死性心不整脈(心臓死)を誘発し且つ心不全における心筋機能障害に寄与するRyR2内の漏出を固定する。更に、本発明者等は、JTV-519の新規な合成法、並びに該薬物の放射能標識形も開発している。
従って、１つの局面においては、本発明は、運動誘発性心不整脈の候補である対象者に該対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を防止するのに有効な量のJTV-519を投与することによる、上記対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止する方法を提供する。また、運動誘発性心不整脈の候補である対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は防止する方法におけるJTV-519の使用も提供する。
【０００９】
もう１つの局面においては、本発明は、対象者にJTV-519を対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防するのに有効な量で投与することによる、対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防する方法を提供する。また、対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防する方法におけるJTV-519の使用も提供する。
更にもう１つの局面においては、本発明は、対象者にJTV-519を対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することによる、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防する方法を提供する。また、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防する方法におけるJTV-519の使用も提供する。
更にもう1つの局面においては、本発明は、(a) RyR2を含有する細胞の培養物を取得し又は生成させ；(b) 上記細胞を候補薬剤と接触させ；(c) 上記細胞を細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている１以上の条件に暴露させ；そして、(d) 上記薬剤が前記細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を阻止しているかどうかを判定することによる、運動誘発性突然心臓死を予防するのに使用する薬剤の同定方法を提供する。該方法は、(e) 前記薬剤が前記細胞内のRyR2関連生物学的事象に対する作用を有するかどうかを判定する工程を更に含み得る。また、上記方法によって同定した薬剤、並びに該薬剤を対象者に対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することによる、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防する方法も提供する。
さらなる局面においては、本発明は、(a) RyR2を含有する動物を取得し又は産生させ；(b) 候補薬剤を上記動物に投与し；(c) 上記動物を細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている１以上の条件に暴露させ；そして、(d) 上記薬剤が前記動物内のRyR2とFKBP12.6間の結合を増大させているかどうかを判定することによる、運動誘発性突然心臓死を予防するのに使用する薬剤の同定方法を提供する。該方法は、(e) 前記薬剤が前記動物内のRyR2関連生物学的事象に対する作用を有するかどうかを判定する工程を更に含み得る。また、上記方法によって同定した薬剤、並びに該薬剤を対象者に対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することによる、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防する方法も提供する。
【００１０】
更にもう１つの局面においては、本発明は、下記のようなJTV-519並びの1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体の合成方法を提供する：
【化１】
2007507536.tif 000003
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり；Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)；
【化２】
2007507536.tif 000004
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり；Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)；
【化３】
2007507536.tif 000005
(式中、R1 = n-MeO、n-MeS又はn-アルキルであり、n = 6、7、8又は9であり；R2 = アルキルであり；R3 = アルキルである)。
さらなる局面においては、本発明は、放射能標識JTV-519の合成方法も提供する。
本発明のさらなる局面は、以下の説明に照らして明らかとなるであろう。
【００１１】
（発明を実施するための最良の形態）
上述したように、カテコールアミン作用性多源性心室頻拍(CPVT)は、構造的に正常な心臓を有する個々人における遺伝子性疾患である。CPVTは、ストレス誘発性心室頻拍、即ち、突然心臓死(SCD)を起し得る致死性不整脈に特徴を有する。筋小胞体上に位置するRyR2チャンネルの変異は、CPVTに関連している。CPVTにおける致死性心不整脈の基礎をなす分子的メカニズムを判定するために、本発明者等は、CPVT関連変異体RyR2チャンネル(例えば、S2246L、R2474S、N4104K、R4497C)を試験した。
CPVTを有する個々人は、全て運動誘発性心不整脈を有する。本発明者等は、以前に、運動誘発性不整脈及び突然死(CPVTを有する患者における)がRyR2に対するFKBP12.6の親和性低下に由来することを証明した。本明細書において、本発明者等は、運動が、アデノシン3',5'-モノホスフェート(cAMP)依存性タンパク質キナーゼ(PKA)によるリン酸化の結果としてRyR2を活性化することを実証している。変異体RyR2チャンネルは、基本条件下において平面脂質二分子層においては正常機能を有し、PKAリン酸化による活性化に対してより感受性であった(野生タイプチャンネルと比較したとき、増大した活性(開確率)及び長期の開放状態を示した)。更に、PKAリン酸化変異体RyR2チャンネルは、Mg2+、即ち、該チャンネルの生理学的インヒビターに対しては抵抗性であり、FKBP12.6(閉鎖状態において該チャンネルを安定化させる)に対して低下した結合性を示していた。これらの知見は、運動中、RyR2がPKAリン酸化されたとき、変異体CPVTチャンネルが心臓サイクルの弛緩期(拡張期)において更に開放するようであり、SR Ca2+漏出により誘発される不整脈の可能性を増大させることを示唆している。心不全は世界的に主要な死亡原因であるので、RyR2中の漏出を修復する方法は、世界的に何百万もの患者における致死性不整脈を予防し得る。
更に、本発明者等は、本明細書において、ベンゾチアゼピン誘導体であるJTV-519が、FKBP12.6遺伝子に対して異型接合性のマウスにおいて、致死性心室性不整脈を予防することを実証している。JTV-519は、PKAリン酸化RyR2に対するFKBP12.6の親和性を増大させることにより、運動後に死亡させたFKBP12.6+/-マウスから分離したRyR2の開確率を低下させていた。更にまた、JTV-519は、FKBP12.6結合親和性を増大させることにより、CPVT関連変異体RyR2チャンネルの門通を正常化させていた。これらのデータは、JTV-519が、FKBP12.6-RyR2結合親和性を増大させることにより、致死性心室不整脈を予防し得ることを示唆している。
【００１２】
新規な治療及び予防方法
上記に従い、本発明は、対象者の細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止する方法を提供する。本明細書において使用するとき、“FKBP12.6”は、“FKBP12.6タンパク質”及び“FKBP12.6アナログ”の双方を包含する。本明細書において特に断らない限り、“タンパク質”は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド又はペプチド、及びこれらの任意のフラグメントを包含する。“FKBP12.6アナログ”は、FKBP12.6タンパク質と60%以上(好ましくは、70%以上)のアミノ酸配列相同性を有する、FKBP12.6生物学的活性を有するFKBP12.6タンパク質の機能性変異体である。更に本明細書において使用するとき、用語“FKBP12.6生物学的活性”とは、本明細書において説明するアッセイ条件下に、未リン酸化又は非リン酸化RyR2と物理的に会合する又は結合する能力(即ち、陰性対照の背景結合性よりもおよそ２倍、より好ましくはおよそ５倍高い結合性)を示すタンパク質又はペプチドの活性を称するが、親和性はFKBP12.6の親和性とは異なり得る。
更に、本明細書において使用するとき、“RyR2”は、“RyR2タンパク質”及び“RyR2アナログ”の双方を包含する。“RyR2アナログ”は、RyR2タンパク質と60%以上(好ましくは、70%以上)のアミノ酸配列相同性を有する、RyR2生物学的活性を有するRyR2タンパク質の機能性変異体である。本発明のRyR2は、未リン酸化、リン酸化又は過剰リン酸化し得る。更に本明細書において使用するとき、用語“RyR2生物学的活性”とは、本明細書において説明するアッセイ条件下に、FKBP12.6と物理的に会合する又は結合する能力(即ち、陰性対照の背景結合性よりもおよそ２倍、より好ましくはおよそ５倍高い結合性)を示すタンパク質又はペプチドの活性を称するが、親和性はRyR2の親和性とは異なり得る。
【００１３】
前述したように、心臓リアノジンレセプター、RyR2は、４個の565,000ダルトンRyR2タンパク質を４個の12,000ダルトンFKBP12.6タンパク質と一緒に含むタンパク質複合体である。FK506結合性タンパク質(FKBP)類は、広範囲に発現して種々の細胞機能を奏するシス-トランスペプチジル-プロリルイソメラーゼ類である。FKBP12.6タンパク質は、RyR2の機能に密接に関連して、該機能を調節する。FKBP12.6は、RyR2チャンネルに結合し(RyR2サブユニット当り1分子)、RyR2チャンネル機能を安定化させ、近隣RyR2チャンネル間の連関門通を容易にし、それによって心臓サイクルの静止期におけるチャンネルの異常活性化を阻止する。従って、本明細書において使用するとき、“RyR2結合FKBP12.6”は、RyR2タンパク質サブユニットに結合させた１分子のFKBP12.6タンパク質又はRyR2のテトラマーと結合しているFKBP12.6のテトラマーを含む。
本発明の方法によれば、対象者の細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの“低下”とは、対象者の細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの検出可能な低下、消失又は減少を称する。そのような低下は、その低下がJTV-519の投与により何らかの形で阻止され、隠蔽され、抑制され、妨害され又は緩和されて(以下で説明するように)、対象者の細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルがそうでないJTV-519が存在しないであろう場合よりも高いような場合に、対象者の細胞内で抑制又は阻止される。
対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルは、公知の技術から容易に決定する方法のような標準のアッセイ及び方法(例えば、免疫学的方法、ハイブリッド化分析、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析、蛍光画像法、及び/又は放射線検出法等)、並びに本明細書において開示する任意のアッセイ法及び検出法によって検出し得る。例えば、タンパク質は、対象者の細胞から、限定するものではないが、必要に応じての細胞からの抽出(例えば、そのタンパク質を可溶化する清浄剤による)、その後のカラム上でのアフィニティー精製、クロマトグラフィー(例えば、FTLC及びHPLC)、免疫沈降(抗体による)、及び沈降(例えば、イソプロパノール及びTrizolのような試薬による)のような当該技術において公知の標準方法を使用して分離し精製し得る。タンパク質の分離及び精製の後、電気泳動(例えば、SDS-ポリアクリルアミドゲル上で)を行い得る。対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下、又はその抑制又は阻止は、JTV-519の投与前に検出したRyR2結合FKBP12.6の量(以下で説明する方法に従っての)をJTV-519投与後の適切な時間で検出した量と比較することによって判定し得る。
【００１４】
本発明の方法においては、対象者の細胞内でのRyR2結合FKBP12.6レベルの低下は、例えば、対象者の細胞内のFKBP12.6とRyR2の解離を抑制することにより、対象者の細胞内のFKBP12.6とRyR2間の結合性を増大させることにより、又は対象者の細胞内のRyR2-FKBP12.6複合体を安定化させることにより抑制又は阻止し得る。本明細書において使用するとき、用語“解離を抑制する”は、対象者の細胞内でのRyR2分子からFKBP12.6サブユニットの物理的解離又は分離を阻害し、減少させ、抑制し、制限し又は阻止すること、或いは対象者の細胞内でのFKBP12.6サブユニットからRyR2分子の物理的解離又は分離を阻害し、減少させ、抑制し、制限し又は阻止することを含む。更に本明細書において使用するとき、用語“結合性を増大させる”は、対象者の細胞内でリン酸化RyR2がFKBP12.6と物理的に結合する能力(例えば、陰性対照の背景結合性よりもおよそ２倍、より好ましくはおよそ５倍高い結合性)を増強し、増大させ又は改善すること、並びに対象者の細胞内でFKBP12.6がリン酸化RyR2と物理的に結合する能力(例えば、陰性対照の背景結合性よりもおよそ２倍、より好ましくはおよそ５倍高い結合性)を増強し、増大させ又は改善することを含む。更に、本発明の方法においては、対象者の細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下は、対象者の細胞内のリン酸化RyR2レベルを直接低下させることにより、又は上記細胞内のリン酸化RyR2レベルを間接的に低下させることにより(例えば、上記細胞内のリン酸化RyR2の機能又はレベルを規制又は調節する酵素(PKAのような)又は他の内生分子をターゲッティングすることにより)、抑制又は阻止し得る。好ましくは、細胞内のリン酸化RyR2レベルは、本発明の方法においては、少なくとも10%低下させる。より好ましくは、リン酸化RyR2レベルは、少なくとも20%低下させる。
【００１５】
本発明の方法によれば、RyR2結合FKBP12.6レベルの低下は、対象者、とりわけ対象者の細胞において抑制又は阻止される。本発明の対象者は、両性類、鳥類、魚類、哺乳類及び有袋類のような任意の動物であり得るが、好ましくは哺乳類(例えば、ヒト；ネコ、イヌ、サル、マウス又はラットのような家畜；又は、ウシ又はブタのような経済動物)である。更に、本発明の対象者は、運動誘発性心不整脈の候補である。運動誘発性心不整脈は、対象者が身体運動を経験する間/後に発症する心臓症状(例えば、突然心臓死に至るどれかのような心室細動又は心室頻拍)である。運動誘発性心不整脈の“候補”は、身体運動中/後に心不整脈を発症するリスクにあることが知られている、又はリスクにあると信じられる、又はリスクにある疑いのある対象者である。運動誘発性心不整脈の候補の例としては、限定するものではないが、カテコールアミン作用性多源性心室頻拍(CPVT)を有することが分っている動物/ヒト；CPVTを有する疑いのある動物/ヒト；及び、身体運動中/後に心不整脈を発症するリスクにあることが知られている、又はリスクにあると信じられる、又はリスクにある疑いがあり、且つ運動をしようとしている、今運動している又は丁度運動を終えた動物/ヒトがある。前述したように、CPVTは、構造的に正常な心臓を有する個々人における遺伝性疾患である。CPVTは、ストレス誘発性心室頻拍(突然心臓死を起し得る致死性不整脈)に特徴を有する。CPVTを有する対象者においては、身体活動/ストレスが、検出し得る構造的心臓疾患なしで突然心臓死(SCD)に至る双方向性及び/又は多形性心室頻拍を誘発する。CPVTを有する個々人は、運動を経験するときに心室不整脈を有するが、安静時には不整脈を発症しない。
【００１６】
本発明の方法においては、対象者の細胞は、好ましくは、横紋筋細胞である。横紋筋は、収縮性筋原繊維の繰返し単位(サルコメア)が細胞全体に亘って登記的に配列され、光学顕微鏡レベルで観察し得る横又は斜めの筋条痕を生じている筋肉である。横紋筋細胞の例としては、限定するものではないが、随意(骨格)筋細胞及び心筋細胞がある。好ましい実施態様においては、本発明の方法において使用する細胞は、ヒト心筋細胞である。本明細書において使用するとき、用語“心筋細胞”は、心臓の心筋において見出されるもののような心筋繊維を含む。心筋繊維は、介在板において末端-末端接合した連続の心筋細胞、即ち、カージオミオサイトの連鎖からなる。これらの介在板は、２種類の細胞接合部を有する：その横部分に沿って延びている膨張デスモソーム、及び間隙接合部(その最大物は介在板の縱部分に沿って存在する)。
本発明の方法においては、RyR2結合FKBP12.6レベルの低下を、対象者にJTV-519を投与することにより、対象者の細胞内で抑制又は阻止する；このことは、対象者の細胞とJTV-519間の接触を可能にもする。JTV-519 (4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンモノヒドロクロライド)は、k201としても知られており、1,4-ベンゾチアゼピンの誘導体であり、カルシウムイオンチャンネルのモジュレーターである、心筋細胞中のCa2+レベルの調節以外に、JTV-519は、モルモット心室細胞内のNa+電流及び内向き整流K+電流も調節し、モルモット心房細胞内の整流K+電流遅延を抑制する。FK506及びラパマイシンは、運動誘発性心不整脈の候補である対象者の細胞内でRyR2-FKBP12.6結合性を安定化させる他の化合物を設計するのに使用し得る薬物である。FK506及びラパマイシンは、双方ともFKBP12.6をRyR2から解離させる。これらの薬物と構造的には関連するが反対の作用を有する化合物を設計しスクリーニングすることは可能である。
【００１７】
本発明の方法においては、JTV-519は、対象者に、JTV-519と製薬上許容し得る担体を含む治療用組成物の形で投与し得る。製薬上許容し得る担体は、組成物の他の成分と適合性である意味において“許容し得”なければならず、その受容者に対し有害であってはならない。本発明において使用する製薬上許容し得る担体は、調合製剤用の物質として使用し、且つ鎮痛剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、乳化剤、賦形剤、増量剤、流動促進剤、可溶化剤、安定剤、懸濁剤、等張化剤、ビヒクル及び増粘剤として混入させ得る種々の有機又は無機物質から選択する。必要ならば、酸化防止剤、芳香剤、着色剤、風味改良剤、防腐剤及び甘味化剤のような製薬添加剤も添加し得る。許容し得る製薬担体の例としては、なかんずく、カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアゴム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、粉末類、生理食塩水、アルギン酸ナトリウム、スクロース、澱粉、タルク及び水がある。
本発明の調合製剤は、製薬技術において周知の方法によって調製し得る。例えば、JTV-519は、懸濁液又は溶液として、担体又は希釈剤と一緒にし得る。必要に応じて、１種以上の補助成分(例えば、緩衝剤、風味料、界面活性剤等)も添加し得る。担体の選択は、投与経路による。
JTV-519は、対象者の生体内ターゲット細胞(例えば、心筋細胞)をJTV-519と接触させることにより、対象者に投与し得る。JTV-519は、タンパク質、核酸及び他の薬物の導入及び投与において使用する公知の方法を使用して、対象者の細胞と接触(例えば、細胞に導入)し得る。細胞をJTV-519と接触させる(即ち、細胞をJTV-519により治療する)方法の例としては、限定するものではないが、吸収、エレクトロポレーション、浸漬、注入、導入、リポソーム伝達、移入、輸血、ベクター、並びに他の薬物伝達ビヒクル及び方法がある。ターゲット細胞が対象者の特定部分に局在化されている場合、JTV-519を、注入により又は幾つかの他の方法により(例えば、JTV-519を血液又は他の体液に導入することにより)、直接細胞に導入するのが望ましくあり得る。ターゲット細胞は、対象者の心臓組織中に含有され得、対象者の心臓組織内で、公知の技術から容易に特定される標準検出方法によって検出し得、それら検出方法の例としては、限定するものではないが、免疫学的方法(例えば、免疫組織化学染色法)、蛍光画像法及び顕微鏡法がある。
【００１８】
更に、本発明のJTV-519は、ヒト又は動物対象者に、限定するものではないが、経口投与、非経口投与及び経皮投与のような公知の手法によって投与し得る。好ましくは、JTV-519は、筋膜上、嚢内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、柔組織内、皮下又は舌下注入により、或いはカテーテルにより、非経口投与する。１つの実施態様においては、該薬剤は、対象者に、対象者の心臓に装入したカテーテルによる心筋細胞へのターゲッティング伝達により投与する。
経口投与においては、JTV-519製剤は、カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤として、又は懸濁液として提供し得る。製剤は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はポテトスターチのような通常の添加剤を含み得る。また、製剤は、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤によっても提供し得る。更に、製剤は、コーンスターチ、ポテトスターチ又はナトリウムカルボキシメチルセルロースのような崩壊剤によっても提供し得る。また、製剤は、二塩基性リン酸カルシウム無水物又は澱粉グリコール酸ナトリウムによっても提供し得る。最後に、製剤は、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤によって提供し得る。
非経口投与(即ち、消化管以外の経路を介しての注入による投与)においては、JTV-519は、対象者の血液と好ましくは等張性である滅菌水溶液と混合し得る。そのような製剤は、固形活性成分を、塩化ナトリウム、グリシン等のような生理学的に適合し得る物質を含有し且つ生理条件と適合し得る緩衝pHを有する水中に溶解させて水溶液を調製し、その後、該溶液を滅菌性とすることによって調製し得る。製剤は、密封したアンプル又はバイアルのような単位又は多数回投与量容器内で提供し得る。製剤は、限定するものではないが、筋膜上、嚢内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、柔組織内、皮下又は舌下のような任意の注入方式により、或いは対象者の心臓へのカテーテルにより、伝達し得る。
【００１９】
経皮投与においては、JTV-519は、JTV-519に対する皮膚の浸透性を増大させ且つJTV-519が皮膚を介して血流中に浸透するのを可能にするプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、N-メチルピロリドン等のような皮膚浸透エンハンサーと混合し得る。また、JTV-519/エンハンサー組成物は、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン/酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン等のような高分子物質と更に混合してゲル状の組成物を調製し得、この組成物は、塩化メチレンのような溶媒に溶解し、所望粘度まで蒸発させ、その後、裏当て材に塗布してパッチを調製することもできる。
本発明の方法によれば、JTV-519は、対象者中の、とりわけ対象者の細胞中のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止するのに有効な量で、対象者に投与し得る(そして、JTV-519を対象者の細胞と接触させ得る)。この量は、当業者であれば、生体内で確立した滴定曲線の分析のような既知の手順、及び本明細書において説明する方法及びアッセイ法に基づき容易に決定し得ることである。対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止するのに有効なJTV-519の適切な量は、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日の範囲であり得、及び/又は、約300 ng/ml〜約1000 ng/mlの範囲の血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。好ましくは、JTV-519の量は、約10 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日の範囲である。
本発明の１つの実施態様においては、対象者は、まだ運動誘発性心不整脈を発症していない。この場合、対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止するのに有効なJTV-519の量は、対象者の運動誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の量である。心不整脈は、心拍又は心臓鼓動の異常として現れる心臓の電気的活動の障害である。本明細書において使用するとき、“運動誘発性心不整脈を予防するのに有効な”JTV-519の量は、臨床的な障害又は運動誘発性心不整脈の症状(例えば、動悸、失神、心室細動、心室頻拍及び突然心臓死)の発症を予防するのに有効なJTV-519の量を含む。対象者の運動誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の量は、運動誘発性心不整脈のタイプ、対象者の体重、対象者症状の重篤度及びJTV-519の投与方式のような各々の症例の特定の要因によって変動する。この量は、当業者であれば、臨床試験のような既知の手順及び本明細書において説明する方法に基づき容易に決定し得ることである。好ましい実施態様においては、運動誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の量は、対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効なJTV-519の量である。もう１つの好ましい実施態様においては、JTV-519は、対象者の運動誘発性心不整脈及び運動誘発性突然心臓死を予防する。
【００２０】
RyR2結合FKBP12.6を安定化し、且つRyR2の動的PKAリン酸化及び脱リン酸化に関しての均衡を維持し再生させるその能力故に、JTV-519は、運動誘発性心不整脈の臨床症状を既に示し始めた対象者の治療においても有効である。不整脈の徴候を対象者において十分に早期に観察した場合、JTV-519は、対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルのさらなる低下を抑制又は阻止するのに有効であり得る。
従って、本発明の更にもう１つの実施態様においては、対象者は、運動していた、今運動中である、そして、運動誘発性心不整脈を発症した。この場合、対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止するのに有効なJTV-519の量は、対象者の運動誘発性心不整脈を治療するのに有効なJTV-519の量である。本明細書において使用するとき、“運動誘発性心不整脈を治療するのに有効な”JTV-519の量は、臨床的な障害又は運動誘発性心不整脈の症状(例えば、動悸、失神、心室細動、心室頻拍及び突然心臓死)を軽減又は改善するのに有効なJTV-519の量を含む。対象者の運動誘発性心不整脈を治療するのに有効なJTV-519の量は、運動誘発性心不整脈のタイプ、対象者の体重、対象者症状の重篤度及びJTV-519の投与方式のような各々の症例の特定の要因によって変動する。この量は、当業者であれば、臨床試験のような既知の手順及び本明細書において説明する方法に基づき容易に決定し得ることである。好ましい実施態様においては、JTV-519により、対象者の運動誘発性心不整脈を治療する。
【００２１】
更に、本発明は、対象者の運動誘発性心不整脈の治療方法を提供する。該方法は、対象者に、JTV-519を対象者の運動誘発性心不整脈を治療するのに有効なJ量で投与することを含む。対象者の運動誘発性心不整脈を治療するのに有効なJTV-519の適切な量は、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日の範囲であり得、及び/又は、約300 ng/ml〜約1000 ng/mlの範囲の血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。また、本発明は、対象者の運動誘発性心不整脈の予防方法も提供する。該方法は、対象者に、JTV-519を対象者の運動誘発性心不整脈を予防するのに有効な量で投与することを含む。対象者の運動誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の適切な量は、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日の範囲であり得、及び/又は、約300 ng/ml〜約1000 ng/mlの範囲の血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。更に、本発明は、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防方法を提供する。該方法は、対象者に、JTV-519を対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することを含む。対象者の運動誘発性心突然心臓死を予防するのに有効なJTV-519の適切な量は、約5 mg/kg/日〜約20 mg/kg/日の範囲であり得、及び/又は、約300 ng/ml〜約1000 ng/mlの範囲の血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
上述した方法の各実施態様においては、対象者の運動誘発性心不整脈は、VTに関連する。好ましい実施態様においては、VTは、CPVTである。これらの方法の他の実施態様においては、対象者は、運動誘発性突然心臓死の候補を含む運動誘発性心不整脈の候補である。
上述の各方法に照らして、本発明は、運動誘発性心不整脈の候補である対象者のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止する方法におけるJTV-519の使用も提供する。また、本発明は、対象者の運動誘発性心不整脈を治療又は予防する方法におけるJTV-519の使用も提供する。更にまた、本発明は、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防方法におけるJTV-519の使用も提供する。
【００２２】
上述し、本明細書において提示するように、本発明者等のデータは、心臓リアノジンレセプター、RyR2のセリン2809上でのタンパク質キナーゼA (PKA)リン酸化が、FK506結合性タンパク質、FKBP12.6を放出することにより、チャンネルを活性化させることを示している。心不全(心不全のヒト心臓及び動物モデルを含む)においては、RyR2は、PKA過剰リン酸化されて、減少量の結合FKBP12.6を含み且つカルシウム誘発性活性化に対して増大した感受性を有する欠陥チャンネルを生じる。これらの変化の正味の結果は、RyR2チャンネルが“漏出性”であることである。これらのチャンネル漏出は、筋収縮のための強い刺激を与えるには筋小胞体(SR)中のカルシウムがもはや十分でないような程度にまでのカルシウムの細胞内貯蔵不足を生じる。このことは、心筋の弱い収縮をもたらす。上記チャンネル漏出の２番目の結果として、RyR2チャンネルは、“拡張期”として知られる心臓サイクルの静止期中にカルシウムを放出する。拡張期中のこのカルシウム放出は、突然心臓死(SCD)を起す心臓の致死性不整脈(例えば、心室頻拍及び心室細動)を誘発し得る。
また、本発明者等は、心臓を休止状態に置き、正常化機能を再生させる左心補助循環装置(LVAD)と称される機械的ポンピング装置による心不全の治療がRyR2のPKA過剰リン酸化の低下及びチャンネル機能の正常化に関連していることを証明している。更にまた、本発明者等は、イヌ(ペーシング誘発性心不全を有する)のベータ-アドレナリン遮断薬(ベータ遮断薬)による治療がRyR2のPKA過剰リン酸化を逆転させることも証明している。ベータ遮断薬は、PKAを活性化させる経路を抑制する。本発明者等の研究結果から導き出し得る結論は、RyR2のPKAリン酸化がチャンネルの活性を増大させ、チャネルの所定の誘発剤(活性化剤)のための細胞中へのさらなるカルシウムの放出をもたらすと言うことである。
本明細書において更に開示するように、本発明者等は、運動誘発性突然心臓死がRyR2タンパク質(とりわけ、CPVT関連RyR2変異体タンパク質)のリン酸化の増大及びRyR2結合FKBP12.6レベルの低下に関連していることを確立している。このメカニズムを使用して運動誘発性突然心臓死の予防のために有効な薬物を設計することが可能である。RyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止する能力を有する候補薬剤は、この抑制又は予防活性の結果として、RyR2関連生物学的事象に対する作用を有し、それによって運動誘発性突然心臓死を予防し得る。
【００２３】
従って、本発明は、更に、運動誘発性突然心臓死の予防に使用する薬剤の同定方法を提供する。該方法は、以下の工程を含む：(a) RyR2を含有する細胞の培養物を取得し又は生成させる工程；(b) 上記細胞を候補薬剤と接触させる工程；(c) 上記細胞を細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている１以上の条件に暴露させる工程；及び、(d) 上記薬剤が上記細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止しているかどうかを判定する工程。本明細書において使用するとき、“薬剤”としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸(DNA又はRNA)、抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、分子、化合物、抗生物質、薬物、及びこれらの任意の組合せがあるであろう。RyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止する薬剤は、天然又は合成物のいずれかであり、RyR2及び/又はFKBP12.6と反応性の薬剤(即ち、RyR2及び/又はFKBP12.6に対する親和性を有し、RyR2及び/又はFKBP12.6に結合し、或いはRyR2及び/又はFKBP12.6に対し特異性である薬剤)であり得る。更に本明細書において使用するとき、“RyR2を含有する”細胞は、RyR2又はその誘導体もしくは相同物が自然に発現し又は自然に産生している細胞(好ましくは、心筋細胞)である。細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている条件は、限定するものではないが、PKAを含む。
本発明の方法においては、細胞は、本明細書において説明する任意の導入及び投与方法のような薬物/薬物と細胞間の接触を実施する任意の標準方法により、候補薬剤と接触させ得る。細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルは、当業者にとって公知の又は本明細書において説明する方法、分子手法及びアッセイ法のいずれかのような公知の手法により測定又は検出し得る。本発明の１つの実施態様においては、上記薬剤は、細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止する。
【００２４】
本発明において開示するように、RyR2は、横紋筋細胞内の多くの生物学的事象に関与している。例えば、RyR2チャンネルは、心筋細胞内のEC連関及び収縮に重要な役割を果たすことが証明されている。従って、細胞、とりわけ心筋細胞内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止するように設計した予防薬が、EC連関及び収縮のような多くのRyR2関連生物学的事象の調節において有用であることは明白である。即ち、本発明の候補薬剤をスクリーニングし、RyR2結合FKBP12.6レベルの低下に対する適切な抑制又は予防効果を有することを判定した時点で、該候補薬剤は、細胞、とりわけ心筋細胞内のEC連関及び収縮に対するその効果について評価し得る。本発明の予防剤は、運動誘発性突然心臓死を予防するのに有用であることが期待される。
従って、本発明の方法は、以下の工程を更に含む：(e) 候補薬剤をRyR2を含有する細胞の培養物と接触させる工程；及び、(f) 上記薬剤が上記細胞内のRyR2関連生物学的事象に対する作用を有するかどうかを判定する工程。本明細書において使用するとき、“RyR2関連生物学的事象”は、RyR2レベル又は活性が関与する生化学又は生理学的過程を含む。本明細書において開示するように、RyR2関連生物学的事象の例としては、限定するものではないが、心筋細胞のEC連関及び収縮がある。本発明のこの方法によれば、候補薬剤は、１種以上の細胞(好ましくは、心筋細胞)と生体外で接触させ得る。例えば、細胞培養物を、候補薬剤を含有する製剤と一緒にインキュベートし得る。その後、RyR2関連生物学的事象に対する候補薬剤の作用を、イムノブロッティング法、単チャンネル記録法のような当該技術において公知の任意の生物学的アッセイ法又は方法及び本明細書において開示する任意の他の方法により評価し得る。
更に、本発明は、上述の同定方法により同定した薬剤、並びに該薬剤と製薬上許容し得る担体を含む製薬組成物に関する。該薬剤は、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防において、更に他のRyR2関連症状の治療又は予防において有用であり得る。本明細書において使用するとき、“RyR2関連症状”は、RyR2レベル又は活性が関与する症状、疾患又は障害であり、RyR2関連生物学的事象を含む。RyR2関連症状は、対象者に対象者のRyR2関連症状を治療又は予防するのに有効な量の上記薬剤を投与することにより、対象者において治療又は予防し得る。この量は、当業者であれば、容易に決定し得ることである。１つの実施態様においては、本発明は、上記薬剤を対象者に対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することによる、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、運動誘発性突然心臓死を予防するのに使用する薬剤の生体内同定方法も提供する。該方法は、以下の工程を含む：(a) RyR2を含有する動物を取得し又は産生させる工程；(b) 候補薬剤を上記動物に投与する工程；(c) 上記動物を細胞内のRyR2リン酸化を増大させることが知られている１以上の条件に暴露させる工程；及び、(d) 上記薬剤が上記動物内のRyR2結合FKBP12.6レベルの低下を抑制又は阻止しているかどうかを判定する工程。該方法は、以下の工程を更に含む：(e) RyR2を含有する動物に上記薬剤を投与する工程；及び、(f) 上記薬剤が上記動物内のRyR2関連生物学的事象に対する作用を有するかどうかを判定する工程。また、この方法によって同定した薬剤；この薬剤を含む製薬組成物；及び、この薬剤を対象者に対象者の運動誘発性突然心臓死を予防するのに有効な量で投与することによる、対象者の運動誘発性突然心臓死の予防方法も提供する。
本発明者等の研究は、PKA活性を遮断する化合物がRyR2チャンネルの活性を低下させて細胞中への少なめのカルシウム放出をもたらすことが期待されるであろうことを実証している。RyR2チャンネルにFKBP12.6結合部位で結合するが、該チャンネルがPKAによってリン酸化されるときには該チャンネルから離脱しない化合物も、PKA活性化又はRyR2チャンネルを活性化する他の誘発剤に応答してチャンネル活性を低下させることが期待される。そのような化合物も、細胞中への少なめのカルシウム放出をもたらすであろう。これらの知見に鑑み、本発明は、更に、運動誘発性突然心臓死を予防するのに有用であり得る薬剤(これらの薬剤がRyR2活性を遮断又は抑制する点で)を同定するさらなるアッセイ法も提供する。
【００２６】
例えば、本発明の診断アッセイ法は、カルシウム感受性蛍光染料(例えば、Fluo-3、Fura-2等)を使用して、RyR2チャンネルを介しての細胞中へのカルシウム放出についてスクリーニングし得る。細胞に選択した蛍光染料を負荷させ、その後、RyR2活性化剤により刺激して、細胞に加えた化合物がカルシウム依存性蛍光シグナルを低下させたか又はさせなかったかどうかを判定する(Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994；Gillo et al., Calcium entry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Blood, 81: 783-92, 1993；Jayaraman et al., Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation. Science, 272: 1492-94, 1996)。カルシウム依存性蛍光シグナルは、光電子倍増管によりモニターして、以前に開示されたような適切なソフトウェアにより分析し得る(Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994；Gillo et al., Calcium entry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Blood, 81: 783-92, 1993；Jayaraman et al., Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation. Science, 272: 1492-94, 1996)。このアッセイは、マルチウェル板を使用して、容易に自動化して多数量の化合物をスクリーニングし得る。
RyR2介在細胞内カルシウム放出のPKA依存活性化を抑制する化合物を同定するには、アッセイ法は、Sf9、HEK293又はCHO細胞のような異種発現系中での組換えRyR2チャンネルの発現を含み得る(Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994)。また、RyR2は、ベータアドレナリンレセプターと共発現させることも可能である。この共発現は、ベータアドレナリンレセプター作用薬の添加に応答してのRyR2活性化に対する化合物の作用の評価を可能にするであろう。
【００２７】
また、心不全の程度に相関するRyR2のPKAリン酸化レベルも、アッセイし、その後、RyR2チャンネルのPKAリン酸化を遮断するように設計した化合物の有効性を判定するのに使用し得る。そのようなアッセイは、RyR2タンパク質に対して特異性である抗体の使用に基づく。例えば、RyR2チャンネルタンパク質を免疫沈降させ、その後、PKA及び[γ32P]-ATPにより逆リン酸化させ得る。その後、RyR2タンパク質に移行した放射性[32P]標識量を、ホスホルイメーギャー(phosphorimager)を使用して測定する(Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76,2000)。
本発明のもう１つのアッセイ法は、Ser 2809上でPKAリン酸化されるRyR2を検出するリンエピトープ特異性抗体の使用を含む。そのような抗体によるイムノブロッティングは、心不全及び心不整脈の治療有効性を評価するのに使用し得る。更に、RyR2 S2809A及びRyR2S 2809D組込み(knock-in)マウスを使用しても心不全及び心不整脈の治療有効性を評価し得る。そのようなマウスは、RyR2のPKA過剰リン酸化が心不全及び心不整脈の寄与因子である証拠を、RyR2 S2809A変異が心不全及び不整脈を抑制すること及びRyR2 S2809D変異が心不全及び不整脈を悪化させることを示すことによって更に提供する。
【００２８】
新規な化学合成経路
1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、JTV-519のような生物学的活性分子の調製における重要な構築用基材である。本発明者等は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンのような1,4-ベンゾチアゼピン中間化合物の新規な調製方法を開発した。本発明者等の方法は、容易に入手でき且つ安価な出発物質を使用して、高収率の主要1,4-ベンゾチアゼピン中間体を調製する。
1990年代の早期に、Kaneko等(米国特許第5,416,066号；WO 92/12148号；JP第4230681号)は、JTV-519を、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン中間体)を塩化アクリロイルと反応させ、その後、得られた生成物を4-ベンジルピペリジンと反応させることによって調製し得ることを開示した。
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び同様な化合物の２つの調製方法が以前に文献において報告されている。Kaneko等(米国特許第5,416,066号)が開示した第１の方法は、2,5-ジヒドロキシ安息香酸により出発した６工程の合成経路を含んでいた。この方法においては、2,5-ジヒドロキシ安息香酸を硫酸ジメチルにより選択的にメチル化する。その後、得られた化合物をジメチルチオカルバモイルクロライドと20時間反応させ、次いで、高温(270℃)に9時間供する。この工程の生成物をメタノール中のナトリウムメトキシドと一緒に20時間還流させる。その後、該還流工程の生成物を塩基性条件下に高温で2-クロロエチルアミンと反応させて環状化アミドを調製する。この環状化アミドをLiAlH4によって還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン中間体)を得ている。
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンの第２の調製方法は、Hitoshiによって日本特許(JP第10045706号)において開示された。この方法は、2-ブロモ-5-メトキシベンズアルデヒドにより出発する。臭化物をNaSMeで置換し、得られた生成物を塩素で酸化し、その後、水中で還流させて、ジスルフィドジアルデヒドを得る。該ジアルデヒドを2-クロロエチルアミンで処理し、得られた生成物をNaBH4のような還元剤と反応させる。得られた化合物を環状化して7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを得ている。
【００２９】
最初、本発明者等は、上述の方法を使用して、1,4-ベンゾチアゼピン中間体、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを調製することを試みた。しかしながら、本発明者等は、Kaneko等(米国特許第5,416,066号)が開示した第１の方法は、高温及び長反応時間の合成工程を含むことを見出した。更に、本発明者等は、３番目のチオ化中間体のチオ基は空気によってジスルフィド化合物に容易に酸化され、その後の環状化生成物の合成を不可能にすることも見出した。また、本発明者等は、Hitoshi (JP第10045706号)が開示した方法は、Cl2を含むこと及び１番目の中間体の調製のためには、NaSMeによる臭化物の置換は別にしても、他の特許方法を使用しなければならないと判断した。
上記の問題を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき且つ安価な出発物質から7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造する新規な方法を開発した。本発明者等の方法は、単離及び精製工程を簡素化し、下記の式で示される一般的構造を有する7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び他の化合物のような各種1,4-ベンゾチアゼピン中間体を調製するのに使用し得る：
【化４】
2007507536.tif 000006
この方法は、JTV-519を調製するのにも使用し得る。
【００３０】
従って、上記に鑑み、本発明は、下記の式：
【化５】
2007507536.tif 000007
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり；Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)
を有する化合物の合成方法を提供し、該方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：
(a) 下記の式：
【化６】
2007507536.tif 000008
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を、任意成分としての触媒の存在下に、還元剤で処理して、下記の式：
【化７】
2007507536.tif 000009
(Rは、上記で定義したとおりである)
を調製する工程；
(b) 工程(a)で調製した化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、下記の式：
【化８】
2007507536.tif 000010
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程；
(c) 工程(b)で調製した化合物をクロライド及びクロロエチルアミンで処理して、下記の式：
【化９】
2007507536.tif 000011
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程；
(d) 工程(c)で調製した化合物を、テトラヒドロレートの存在下に、還元剤及び塩基で処理して、下記の式：
【化１０】
2007507536.tif 000012
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程；及び、
(e) 工程(d)で調製した化合物を還元剤で処理して、下記の式：
【化１１】
2007507536.tif 000013
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程。
本発明の上記方法によれば、工程(a)における還元剤は、H2であり得る。更に、工程(b)におけるジアゾ化剤はNaNO2であり得、工程(b)におけるジスルフィドはNa2S2であり得る。更にまた、工程(c)におけるクロライドは、SOCl2であり得る。工程(d)における還元剤はトリメチルホスフィン(PMe3)であり得、また、工程(d)における塩基はトリエチルアミンであり得る。もう１つの実施態様においては、工程(e)における還元剤は、LiAlH4であり得る。
【００３１】
本発明は、更に、下記の式：
【化１２】
2007507536.tif 000014
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり；Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)
を有する化合物の合成方法を提供し、該方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：
(a) 下記の式：
【化１３】
2007507536.tif 000015
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を、3-ブロモプロピオン酸クロライド及び下記の式：
【化１４】
2007507536.tif 000016
を有する化合物で処理して、下記の式：
【化１５】
2007507536.tif 000017
(Rは、上記で定義したとおりである)
を有する化合物を調製する工程。
例えば、下記の式：
【化１６】
2007507536.tif 000018
(式中、R = OR'、SR'、NR'、アルキル又はハライドであり；R' = アルキル、アリール又はHであり；Rは、位置2、3、4又は5にあり得る)
を有する化合物は、下記のとおりに合成し得る：
【化１７】
2007507536.tif 000019
【００３２】
本発明の方法は、更に、下記の式：
【化１８】
2007507536.tif 000020
を有する化合物の合成方法を提供し、該方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：
(a) 下記の式：
【化１９】
2007507536.tif 000021
を有する化合物を、任意成分としての触媒の存在下に、還元剤で処理して、下記の式：
【化２０】
2007507536.tif 000022
を有する化合物を調製する工程；
(b) 工程(a)で調製した化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、下記の式：
【化２１】
2007507536.tif 000023
を有する化合物を調製する工程；
(c) 工程(b)で調製した化合物をクロライド及びクロロエチルアミンで処理して、下記の式：
【化２２】
2007507536.tif 000024
を有する化合物を調製する工程；
(d) 工程(c)で調製した化合物を、テトラヒドロレートの存在下に、還元剤及び塩基で処理して、下記の式：
【化２３】
2007507536.tif 000025
を有する化合物を調製する工程；
(e) 工程(d)で調製した化合物を還元剤で処理して、下記の式：
【化２４】
2007507536.tif 000026
を有する化合物を調製する工程。
【００３３】
また、本発明は、下記の式：
【化２５】
2007507536.tif 000027
を有する化合物の合成方法を提供し、該方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：
(a) 下記の式：
【化２６】
2007507536.tif 000028
を有する化合物を、3-ブロモプロピオン酸クロライド及び下記の式：
【化２７】
2007507536.tif 000029
を有する化合物で処理して、下記の式：
【化２８】
2007507536.tif 000030
を有する化合物を調製する工程。
【００３４】
例えば、下記の実施例７及び反応式１に示すように、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンは、2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸から次のようにして調製し得る。2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸のニトロ基を、触媒としてのPd/Cと一緒にH2を使用して還元して2-アミノ-5-メトキシ安息香酸を得る。2-アミノ-5-メトキシ安息香酸をNaNO2によりジアゾ化し、次いでNa2S2で処理して、安定なジスルフィド化合物を調製し得る。更に精製することなく、安定なジスルフィド化合物をSOCl2で処理し、次いで、Et3Nの存在下に、2-クロロエチルアミンと反応させて、アミドを得ることができる。その後、アミド化合物を、ワンポット手順により、次のようにして環状化化合物に転化できる。還元剤(トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィンのような)及び塩基(トリエチルアミンのような)をTHF (テトラヒドロ葉酸塩)中のアミド化合物溶液に添加し得る。得られた反応混合物は、その後、3時間還流させ得る。還元剤(トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)はジスルフィド(S-S)をそのモノスルフィド(-S)に開裂させ、このモノスルフィドがその場でクロライドによる分子内環状化を受けて環状化アミドを生成する。その後、環状化アミドをLiAlH4で還元して、1,4-ベンゾチアゼピン中間体、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを得ることができる。JTV-519は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンから、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを3-ブロモプロピオン酸クロライドと反応させ、次いで、得られた化合物を4-ベンジルピペリジンと反応させることによって調製し得る。
例えば、下記の実施例８及び反応式２に示すように、放射能標識JTV-519は、以下のようにして調製し得る。JTV-519を、BBr3を使用して、フェニル環において脱メチル化し得る。その後、得られたフェノール化合物を、塩基(NaHのような)の存在下に、放射能標識メチル化剤(3H-ジメチルスルフェートのような)により再メチル化して、3H-標識JTV-519を調製し得る。
更に、本発明は、放射能標識JTV-519を含む組成物も提供する。JTV-519の標識化は、当該技術において公知の種々の異なる放射性標識の１つを使用して達成し得る。本発明の放射性標識は、例えば、放射性同位元素であり得る。放射性同位元素は、検出し得る放射線を発出し得る任意の同位元素であり得、限定するものではないが、35S、32P、125I、3H又は14Cがある。放射性同位元素から発出された放射活性は、当該技術において周知の方法により検出し得る。例えば、放射性同位元素からのガンマ放射は、ガンマ画像法、とりわけシンチグラフ画像法を使用して検出し得る。
【００３５】
（実施例）
本発明を以下の実施例において説明するが、これらの実施例は、本発明の理解を助けるために提示するものであり、特許請求の範囲において定義するような本発明の範囲を如何なる形においても限定するものと解釈すべきではない。
実施例１
FKBP12.6欠損マウス
FKBP12.6欠損マウスを、以前に開示されているようにして産生させた(Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003)。要するに、ヒトFK506結合性タンパク質12.6 (FKBP12.6)のマウス相同分子種に対するマウスゲノムλファージクローンを、全長マウスcDNAプローブを使用して、DBA/llacJライブラリーから分離した。ターゲッティングベクターを、3.5 kbのマウスゲノムDNAをPGK-neo選択性マーカーで置換することによって、マウスFKBP12.6に対するコード配列全体を含有するエクソン3及び4 (Bennett et al., Identification and characterization of the murine FK506 binding protein (FKBP) 12.6 gene. Mamm. Genome, 9: 1069-71, 1998)を欠落するように設計した。5.0-kb 5'フラグメント及び1.9-kb 3'フラグメントを、pJNS2、即ち、PGK-neo及びPGK-TKカセットを有する主鎖ベクター中にクローニングした。DBA/lacJ胚幹(ES)細胞を、確立されたプロトコールを使用して、増殖させ、移入させた。ターゲット化ES細胞を先ずサザン分析によりスクリーニングし、５つの陽性ES細胞系をPCRにより分析して相同組換えを確認した。雄キメラ体をDBA/llacJ雌と交配させ、生殖細胞系列子孫をブラウンコート色により同定した。生殖細胞系列子孫は、5'サザン分析を使用して遺伝子型を特定した。陽性FKBP12.6+/-雄と雌を交配させたところ、子孫はおよそ25%の頻度でFKBP12.6-/-マウスを生じていた。FKBP12.6-/-マウスは、繁殖性であった。
FKBP12.6-/-マウスで実施した試験は、全て、対照として、年齢及び性別を整合させたFKBP12.6+/+マウスを使用した。以下の背景において産生させたFKBP12.6-/-マウス間において差異は観察されなかった：DBA/C57BL6混成、純DBA及び純C57BL6.
【００３６】
実施例２
マウスにおける遠隔測定記録及び運動試験
FKBP12.6+/+マウス及びFKBP12.6-/-マウスを、コロンビア大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコールに従い、保育し試験した。マウスを、2.5%イソフルラン吸入麻酔を使用して麻酔させた。歩行動物のECG無線遠隔測定記録を腹腔内埋込み後の>7日において取得した(Data Sciences International社、ミシガン州セントポール) (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003)。ストレス試験においては、マウスを傾斜トレッドミル上で疲労するまで運動させ、その後、エピネフリン(0.5〜2.0 mg/kg)を腹腔内注入した(Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003)。歩行動物の安静時心拍数を4時間に亘って平均化した。
【００３７】
実施例３
野生タイプ及びRyR2-S2809D変異体の発現
RyR2上のPKAターゲット部位の変異誘発(RyR2-S2809D)を、以前に開示されているようにして実施した(Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003)。HEK293細胞に、Ca2+ホスフェート沈降法を使用して、20μgのRyR2野生タイプ(WT)又は変異体cDNA及び5μgのFKBP12.6cDNAを共移入した。RyR2チャンネルを含有する小胞を、以前に開示されているようにして調製した(Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003)。
【００３８】
実施例４
RyR2 PKAリン酸化及びFKBP12.6結合性
心臓SR膜を、以前に開示されているようにして調製した(Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000；Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle. Circ Res., 78:990-97 ,1996)。35S標識FKBP12.6を、Promega社(ウィスコンシン州マジソン)からのTNTTM Quick Coupled Transcription/Translationシステムを使用して、産生させた。[3H]リアノジン結合性を使用してRyR2レベルを定量した。100μgのミクロソームを100μlの10-mM イミダゾール緩衝液(pH 6.8)中で希釈し、250-nM (最終濃度)の[35S]-FKBP12.6と一緒に37℃で60分間インキュベートし、その後、500μlの氷冷イミダゾール緩衝液により失活させた。サンプルを100,000gで10分間遠心分離し、イミダゾール緩衝液中で３回洗浄した。結合[35S]-FKBP12.6の量を、ペレットの液体シンチレーション計数により測定した。
【００３９】
実施例５
イムノブロット
ミクロソーム(50μg)のイムノブロッティングを、抗-FKBP12/12.6 (1：1,000)、抗-RyR (5029；1：3,000) (Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992)、又は抗-ホスホRyR2 (P2809；1：5,000)により、開示されているようにして、室温で1時間実施した(Reiken et al., Beta-blockers restore calcium release channel function and improve cardiac muscle performance in human heart failure. Circulation, 107:2459-66, 2003)。P2809-ホスホエピトープ特異性抗-RyR2抗体は、Ser2809でPKA-リン酸化したRyR2に相応するペプチドのCRTRRI-(pS)-QTSQを使用して、Zymed Laboratories社(カリフォルニア州サンフランシスコ)により特注製造されたアフィニティー精製ポリクローナルウサギ抗体である。HRP-標識抗-ウサギIgG (1：5,000希釈；Transduction Laboratories社、ケンタッキー州レキシントン)と一緒のインキュベーション後、ブロットを、ECL (Amersham Pharmacia社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用して展開した。
【００４０】
実施例６
単チャンネル記録
マウス心臓由来の天然RyR2又は組換えRyR2の単チャンネル記録を、0 mVの電圧固定条件下に、以前に開示されているようにして獲得した(Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000)。チャンネル記録用に使用した対称溶液は、次のとおりであった。トランスコンパートメント：HEPES、250 mmol/L；Ba(OH)2、53 mmol/L (幾つかの試験においては、Ba(OH)2をCa(OH)2で置換えた)；pH 7.35、及びシスコンパートメント：HEPES、250 mmol/L；Tris-塩基、125 mmol/L；EGTA、1.0 mmol/L；CaCl2、0.5 mmol/L；pH 7.35。特に断らない限り、単チャンネル記録は、シスコンパートメント中で、150-nM [Ca2+]及び1.0-mM [Mg2+]の存在下に行なった。リアノジン(5 mM)をシスコンパートメントに加えて全チャンネルの同一性を確認した。データは、Fetchanソフトウェア(Axon Instruments社、カリフォルニア州ユニオンシティー)を使用して、デジタル化電流記録から分析した。全てのデータを平均±SEとして表している。不対スチューデントt-検定を、試験間の平均値の統計比較において使用した。P<0.05の値を統計的に有意とみなした。
RyR2チャンネルに対するJTV-519の効果を図１〜３及び表１(下記)に示す。図３において実証されるように、単チャンネル試験は、特異性PKAインヒビター、PKA5-24の存在下でのPKAリン酸化(C)と比較して、PKAリン酸化後のRyR2(D)の増大した開確率を示していた。単チャンネル機能は、JTV-519の存在下にFKBP12.6と一緒にインキュベートしたPKAリン酸化RyR2 (E)において正常化されていた。各増幅ヒストグラム(右側)は、JTV-519及びFKBP12.6による処理後ではないが、PKAリン酸化RyR2における活性増大と伝導度低下開放を明らかにしている。図３Fは、JTV-519の存在下でのFKBP12.6と一緒のPKAリン酸化RyR2のインキュベーションが、RyR2活性化のCa2+依存性を右方向にシフトさせ、この依存性を未リン酸化チャンネルのCa2+依存性と同様にしていたことを示している。
【００４１】
表１：運動前、運動中及び運動後、並びにエピネフリン注入後の歩行ECGデータ
2007507536.tif 000031
JTV-519 (n =8)又は対照(n =6)で治療したFKBP12.6+/-マウス、及びJTV-519で治療したFKBP12.6-/-マウス(n = 5)における歩行ECGデータの要約。SCL = 洞周期長；HR = 心拍；ms = ミリ秒；bpm = 分当りの拍動数；FKBP12.6+/- = FKBP12.6異型接合マウス；FKBP12.6-/- = FKBP12.6欠損マウス
【００４２】
実施例７
1,4-ベンズチアゼピン中間体及びJTV-519の合成
生体内試験において、本発明者等は、グラム量のJTV-519を必要とした。しかしながら、この化合物を報告された1,4-ベンゾチアゼピン中間体、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(下記の反応式１における化合物6)から調製する当初の試みは、不成功であった。この中間体のチオ基は、空気によりジスルフィド化合物に容易に酸化され、この化合物は環状化生成物(５)の合成を不可能にする。この問題を克服するため、本発明者等は、容易に入手でき且つ安価な2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸(１)により出発する新規な方法を開発した。この方法は、下記の反応式１に示している。
触媒としてのPd/Cと一緒にH2を使用しての化合物(１)のニトロ基の還元により、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸(２)を定量的収率で得た。化合物(２)をNaNO2によりジアゾ化し、次いでNa2S2で処理して、安定なジスルフィド化合物(３)を80%の収率でもって調製した。更に精製することなく、安定なジスルフィド(３)をSOCl2で処理し、次いで、Et3Nの存在下に、2-クロロエチルアミンと反応させて、アミド(４)を90%の収率で得た。化合物(４)を、ワンポット手順により、THF中でのトリメチルホスフィン及びEt3Nによる還流によって環状化化合物(５)に転化させた。その後、環状化アミド(５)をLiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(６)を得た。
反応式１：
【化２９】
2007507536.tif 000032
JTV-519は、化合物(６)を3-ブロモプロピオン酸クロライドと反応させ、次いで、得られた生成物を4-ベンジルピペリジンと反応させることによって調製した。JTV-519の構造は、1H NMRにより確立した。
【００４３】
実施例８
放射能標識JTV-519の合成
本発明者等の放射能標識JTV-519の新規な合成方法を下記の反応式２に示す。放射能標識JTV-519を調製するために、JTV-519をフェニル環においてBBr3を使用して脱メチル化させて、フェノール化合物(２１)を得た。フェノール化合物(２１)を、塩基(NaH)の存在下に、放射能標識メチル化剤(3H-ジメチルスルフェート)により再メチル化して、3H-標識JTV-519を調製した(反応式２)。
反応式２：
【化３０】
2007507536.tif 000033
【００４４】
上記発明を明確化及び理解を目的としてかなり詳細に説明してきたが、当業者であれば、上記の開示から、態様及び詳細における種々の変更を特許請求の範囲における本発明の真の範囲から逸脱することなくなし得ることを認識されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】JTV-519がFKBP12.6+/-マウスの運動誘発性心室性不整脈を予防することを実証する。(A) 未治療FKBP12.6+/-マウス、JTV-519で治療したFKBP12.6+/-マウス、及びJTV-519で治療したFKBP12.6-/-マウスの代表的な24時間心電図。心拍において或いは測定したECGパラメーターのいずれにおいても有意差はなかった。(B) 上方透写図：運動試験及び1.0mg/kgエピネフリン注射を受けた未治療FKBP12.6+/-マウスにおいて記録した持続性多源性心室頻拍の例。中央透写図：同じプロトコール後のJTV-519治療FKBP12.6+/-マウスの心電図；不整脈は、検出されなかった。下方透写図：JTV-519で治療したFKBP12.6-/-マウスにおける運動誘発性心室頻拍(VT)。点線は、図中に示していない16.31秒のVTを示す。‘P’はP波を示し、心室頻拍後の洞律動を指標する。(C) JTV-519により治療した又は治療しなかったそれぞれのFKBP12.6+/-マウス及びFKBP12.6-/-マウスにおける突然心臓死(左側)、持続性心室頻拍(>10拍動数、中央)及び非持続性心室頻拍(3〜10回の異常拍動数、右側)の数量化を示す棒グラフ。JTV-519による治療は、未治療FKBP12.6+/-マウス(n = 10)又はJTV-519で治療したFKBP12.6-/-マウス(n = 5)と比較したとき、JTV-519で治療したFKBP12.6+/-マウス(n = 9)において運動-及びエピネフリン-誘発性不整脈を完全に予防しており、JTV-519が、FKBP12.6をRyR2に再結合させることにより、FKBP12.6+/-マウスにおける不整脈及び突然死を予防することを示唆していたことに注目すべきである。
【００４６】
【図２】JTV-519が、FKBP12.6+/-マウス中のRyR2に対するFKBP12.6の親和性を増大させることにより、運動誘発性突然心臓死(SCD)を予防することを示す。(A〜B) 心臓リアノジンレセプター(RyR2)を、RyR2-5029抗体を使用して免疫沈降させた。それぞれ、JTV-519の不存在又は存在下での安静条件下及び運動後の、野生タイプ(FKBP12.6+/+)マウス、FKBP12.6+/-マウス及びFKBP12.6-/-マウスにおけるRyR2、PKAリン酸化RyR2(RyR2-pSer2809抗体)及びFKBP12.6の定量化量を示すイムノブロット(A)及び棒グラフ(B)を示している。休息条件下においては、〜70%のFKBP12.6がFKBP12.6+/-マウス内のRyR2と結合している。運動試験後は、RyR2複合体と結合したFKBP12.6の量は、FKBP12.6+/-マウスにおいて劇的に低下していたが、この低下はJTV-519による治療により救済し得ていた。(C) RyR2単チャンネルを、運動試験及びエピネフリン注入後に得た心臓から分離した。JTV-519による事前治療有り及び無しのFKBP12.6+/-マウス由来のチャンネル、及びJTV-519事前治療後のFKBP12.6-/-マウス由来のチャンネルを示している。RyR2チャンネル機能は、JTV-519により治療した運動FKBP12.6+/-マウスにおいて正常化されていることに注目すべきである。JTV-519治療後の運動FKBP12.6-/-マウス由来の代表的な単チャンネルは、心臓内のFKBP12.6をJTV-519の作用において必要とすることを示している。点線は、不完全チャンネル開放又は‘伝導性低下’開放を示しており、FKBP12.6欠乏RyR2チャンネルを指標している。左の透写図は5.0秒を示しており、一方、右の透写図は500ミリ秒を示している。図中、Po = 開確率であり；To = 平均開放時間であり；Tc = 平均閉鎖時間であり；c = チャンネルの閉鎖状態である。(D) 単RyR2チャンネルの平均開確率(上記参照)を示す要約棒グラフ。JTV-519は、拡張期カルシウム濃度(150 nM)での運動試験後、FKBP12.6+/-マウス由来のRyR2の開確率を劇的に低下させている。
【００４７】
【図３】PKAリン酸化RyR2チャンネルに対する増大したFKBP12.6結合親和性によるJTV-519正常化RyR2チャンネル門通を示す。(A、B) イヌ心臓SR膜(A)及び組換え発現RyR2チャンネルを以前に開示されているようにして調製した(Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78: 990-97, 1996)。(A) リアノジンレセプター(RyR2)を、PKA触媒サブユニット(40 U；Sigma Chemical社、ミズーリ州セントルイス)により、PKAインヒビター、PKI5-24の存在又は不存在下にリン酸化緩衝液(8 mM MgCl2、10 mM EGTA、及び50 mM Tris/PIPES；pH 6.8)中でリン酸化した。各サンプルを100,000×gで10分間遠心分離し、イミダゾール緩衝液(10mM イミダゾール；pH 7)中で３回洗浄した。組換え発現FKBP12.6(最終濃度 = 250nM)を、各サンプルに、種々の濃度のJTV-519の不存在又は存在下に添加した。60分のインキュベーション後、各サンプル各サンプルを100,000×gで10分間遠心分離し、イミダゾール緩衝液中で２回洗浄した。各サンプルを95℃に加熱し、SDS-PAGEを使用してサイズ分割した。SRミクロソームのイムノブロッティングは、以前に開示されているようにして(Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. CHem., 267: 9474-77, 1992)、抗-FKBP12.6抗体(1：1000)及び抗-RyR2-5029抗体(1：3,000)により実施した。図は、JTV-519により、FKBP12.6が(A) PKAリン酸化RyR2(100nMで部分的に結合；1000nMで完全結合)又は(B) 構成的にPKAリン酸化させたRyR2チャンネルであるRyR2-S2809D変異体チャンネルに結合可能であることを実証している。(C〜E) 特定のPKAインヒビター、PKI5-24の存在下でのPKAリン酸化(C)と比較したときの、PKAリン酸化後のRyR2 (D)の増大した開確率を示す単チャンネル試験。単チャンネル機能は、JTV-519の存在下にFKBP12.6と一緒にインキュベートしたPKAリン酸化RyR2 (E)において正常化されていた。チャンネル開放は上向きであり、ダッシュは完全開放のレベル(4 pA)を示し、文字‘c’は閉鎖状態を示す。チャンネルは、圧縮(5秒、上方透写図)及び拡大(500ミリ秒、下方透写図)時間尺度で示しており、記録は0mVにおいてである。各増幅ヒストグラム(右側)は、JTV-519及びFKBP12.6による処理後ではないが、PKAリン酸化RyR2における活性増大と伝導度低下開放を明らかにしている。(F) 細胞質[Ca2+]の関数としての開確率の標準化プロット。JTV-519の存在下でのFKBP12.6と一緒のPKAリン酸化RyR2のインキュベーションは、RyR2活性化のCa2+依存性を右方向にシフトさせ、この依存性を未リン酸化チャンネルのCa2+依存性と同様にした。
【図１】
2007507536.tif 000074
【図２】
2007507536.tif 000075
【図３】
2007507536.tif 000076
【国際調査報告】
2007507536.tif 000077
2007507536.tif 000078
2007507536.tif 000079