(57)【要約】【課題】  磁性粒子を磁性流体から分離するための改良された方法を提供し、磁性流体の安価な大量生産を達成する。【解決手段】  本発明は、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタと、それを含む水性磁性流体と、分離手順におけるそれらの使用方法を提供する。多層ポリマー被覆ナノクラスタには、超常磁性コアと、超常磁性コアに付着され、超常磁性コア粒子に付着することにより形成される超常磁性コア粒子との複合体をコロイド状に安定にしない第１のポリマーと、前記第１のポリマーが付着している複合体に付着され、前記複合体にに付着することにより、多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子の複合体を安定化するような第２のポリマーとが含まれる。使用方法には、発現タンパク質のそれを発現する細胞及びウイルスからの分離を含む分離方法が含まれる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタであって、
（ａ）超常磁性コア粒子と、
（ｂ）キレート基を含み、前記超常磁性コア粒子に付着され、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、コロイド状に安定ではない第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体を形成し、前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような第１のポリマーと、
（ｃ）前記第１のポリマーが付着している複合体に付着され、前記複合体にに付着することにより、当該多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化するような第２のポリマーとを含むことを特徴とする多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２】
前記超常磁性コア粒子が、マグネタイトを含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３】
前記キレート基が、鉄キレート基であることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４】
前記鉄キレート基が、遊離カルボン酸であることを特徴とする請求項３に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項５】
前記ナノクラスタが３５〜２００ｎｍのサイズであることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項６】
前記ナノクラスタサイズが、前記第１のポリマー中の前記キレート基と前記マグネタイト・コア粒子中の鉄原子の比の関数であることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項７】
前記比が０．１〜０．６であることを特徴とする請求項６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項８】
前記ナノクラスタサイズが、第１のポリマーの量を制限することにより制御されることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項９】
前記第１のポリマーが、アクリル酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１０】
前記第１のポリマーが、アクリル酸、スチレンスルホン酸、及びビニルスルホン酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１１】
前記ビニルスルホン酸の濃度が２５〜５０％であることを特徴とする請求項１０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１２】
前記スチレンスルホン酸の濃度が２５〜７５％であることを特徴とする請求項１０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１３】
前記アクリル酸の濃度が約２５％であることを特徴とする請求項１０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１４】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．１〜０．６であることを特徴とする請求項１０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１５】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．２であることを特徴とする請求項１０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１６】
前記第１のポリマーが、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１７】
前記ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの濃度が２５〜９０％であることを特徴とする請求項１６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１８】
前記ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの濃度が７０〜８０％であることを特徴とする請求項１６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項１９】
前記アクリル酸の濃度が約７５％であることを特徴とする請求項１６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２０】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．１〜０．６であることを特徴とする請求項１６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２１】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．２であることを特徴とする請求項１６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２２】
前記第１のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドを含むコポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２３】
前記ポリエチレンオキサイドが８〜１６％の濃度でグラフトされることを特徴とする請求項２２に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２４】
前記ポリエチレンオキサイドが０〜８％の濃度でグラフトされることを特徴とする請求項２２に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２５】
前記ポリアクリル酸が５０００の分子量を有することを特徴とする請求項２２に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２６】
前記ポリマーの濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５〜１．２５グラムであることを特徴とする請求項２２に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２７】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５グラムの濃度にあることを特徴とする請求項２２に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２８】
前記第２のポリマーが、アクリル酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項２９】
前記第２のポリマーが１５キロダルトン以上のサイズであることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３０】
タンパク質
前記第２のポリマーがポリアクリル酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３１】
前記ポリアクリル酸が２，０００〜２５０，０００の分子量を有することを特徴とする請求項３０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３２】
前記ポリアクリル酸が５，０００の分子量を有することを特徴とする請求項３０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３３】
前記ポリマーの濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムであることを特徴とする請求項３０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３４】
前記前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．３グラムの濃度にあることを特徴とする請求項３０に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３５】
前記第２のポリマーが、アクリル酸とビニルスルホン酸のコポリマーを含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３６】
前記アクリル酸及びビニルスルホン酸の濃度が２５〜５０％であることを特徴とする請求項３５に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３７】
前記アクリル酸及びビニルスルホン酸の濃度が約２５％であることを特徴とする請求項３５に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３８】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムの濃度にあることを特徴とする請求項３５に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項３９】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．４グラムの濃度にあることを特徴とする請求項３５に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４０】
前記第２のポリマーが、前記コア粒子の周囲に立体的なシェルを作ることによって前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化することを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４１】
前記第２のポリマーが、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに電荷を供給することによって前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化することを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４２】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが、高イオン強度の溶液中で安定していることを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４３】
前記第１のポリマーが、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸及びアクリル酸を含み、前記第２のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びプロピレンオキサイド、またはポリアクリル酸、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４４】
前記第１のポリマーが、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸を含み、前記第２のポリマーが、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４５】
前記第１のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドを含み、前記第２のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイド、またはポリアクリル酸、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４６】
標的部分を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４７】
前記標的部分が、抗体、抗体フラグメント、レセプタ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオンキレート、酵素補助因子、核酸またはリガンドであることを特徴とする請求項４６に記載の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ。
【請求項４８】
請求項１の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを含む溶液。
【請求項４９】
前記溶液が水溶液であることを特徴とする請求項４８に記載の溶液。
【請求項５０】
前記溶液が高イオン強度溶液であることを特徴とする請求項４８に記載の溶液。
【請求項５１】
多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを生成するための方法であって、
（ｉ）水溶液中でキレータを含む第１のポリマーに超常磁性コア粒子を接触させ、前記超常磁性コア粒子への第１のポリマー付着により、第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体における不安定性及び前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらす過程と、
（ｉｉ）（ｉ）に於ける溶液を第２のポリマーに接触させ、前記第２のポリマーが、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを形成するポリマー−マグネタイト粒子複合体を安定化するようにする過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
前記超常磁性コア粒子がマグネタイトを含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの溶液が更に濃縮されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記溶液を濃縮する過程が、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの沈降を含むことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記キレート基が鉄キレート基であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記鉄キレート基が遊離カルボン酸であることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ナノクラスタが２５〜２００ｎｍのサイズであることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ナノクラスタのサイズが、前記第１のポリマー中の前記キレート基と前記マグネタイト・コア粒子中の鉄原子の比を制御することによって制御されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ナノクラスタのサイズが、第１のポリマーの量を制限することによって制御されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のポリマーが、アクリル酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１のポリマーが、アクリル酸、スチレンスルホン酸及びビニルスルホン酸を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記ビニルスルホン酸の濃度が２５〜５０％であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記スチレンスルホン酸の濃度が２５〜７５％であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記アクリル酸の濃度が約２５％であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．１〜０．６であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．２であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１のポリマーが、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項６８】
前記ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの濃度が２５〜９０％であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの濃度が７０〜８０％であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記アクリル酸の濃度が約７５％であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．１〜０．６であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比が０．２であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドを含むコポリマーであることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ポリエチレンオキサイドが８〜１６％の濃度でグラフトされることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリエチレンオキサイドが０〜８％の濃度でグラフトされることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリアクリル酸が５０００の分子量を有することを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリマーの濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５〜１．２５グラムであることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５グラムの濃度にあることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２のポリマーが、アクリル酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２のポリマーがポリアクリル酸を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項８１】
前記ポリアクリル酸が２，０００〜２５０，０００の分子量を有することを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポリアクリル酸が５，０００の分子量を有することを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記ポリマーの濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムであることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．３グラムの濃度にあることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２のポリマーが、アクリル酸とビニルスルホン酸のコポリマーを含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項８６】
前記アクリル酸及びビニルスルホン酸の濃度が２５〜５０％であることを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記アクリル酸及びビニルスルホン酸の濃度が約２５％であることを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムの濃度にあることを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記ポリマー濃度が、マグネタイト１グラム当たりポリマー０．４グラムの濃度にあることを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記第２のポリマーが、前記コア粒子の周囲に立体的なシェルを作ることによって前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化することを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９１】
前記第２のポリマーが、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに電荷を供給することによって前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化することを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９２】
前記溶液が、高イオン強度溶液であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９３】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが、高イオン強度の溶液中で安定していることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１のポリマーが、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸及びアクリル酸を含み、前記第２のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイド、またはポリアクリル酸、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１のポリマーが、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸を含み、前記第２のポリマーが、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドを含み、前記第２のポリマーが、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイド、またはポリアクリル酸、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９７】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに標的部分を共役させる過程を更に含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項９８】
前記標的部分が、抗体、抗体フラグメント、レセプタ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオンキレート、酵素補助因子、核酸またはリガンドであることを特徴とする請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
分離の方法であって、
（ｉ）（ａ）超常磁性コア粒子と、
（ｂ）キレート基を含み、前記超常磁性コア粒子に付着され、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、コロイド状に安定ではない第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体を形成し、前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような第１のポリマーと、
（ｃ）前記第１のポリマーが付着している複合体に付着される第２のポリマーとを含み、前記第２のポリマーを前記複合体に付着させることにより安定化されるような多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに、所定の物質を含む溶液を接触させる過程と、
（ｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記所定の物質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、
（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を前記溶液の他の成分から磁気的に分離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１００】
前記方法が、溶液中のサンプルから所定の生物学的物質を分離するために利用されることを特徴とする請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記サンプルが生物学的サンプルであることを特徴とする請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記生物学的サンプルが、組織ホモジネート、細胞溶解物、ブロスまたは細胞または組織培養であることを特徴とする請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記生物学的物質が、真核細胞、原核細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、核酸、炭水化物、リガンド、脂質、またはこれらの任意の組合せであることを特徴とする請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複合体の磁気分離が、高勾配磁気分離により行われることを特徴とする請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
前記方法が、細胞によって発現されるタンパク質を前記細胞から分離するために利用されることを特徴とする請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
前記タンパク質が強カチオン性であることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記タンパク質がリゾチームであることを特徴とする請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞がウイルスに感染することを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記タンパク質が前記ウイルスから分離されることを特徴とする請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記方法が、溶液またはブロス中で行われることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞が細菌または酵母であることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１２】
前記酵母がピキア属酵母であることを特徴とする請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
分離の方法であって、
（ｉ）（ａ）超常磁性コア粒子と、
（ｂ）キレート基を含み、前記超常磁性コア粒子に付着され、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、コロイド状に安定ではない第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体を形成し、前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような第１のポリマーと、
（ｃ）前記第１のポリマーが付着している複合体に付着される第２のポリマーと、
（ｄ）前記第２のポリマーが付着している複合体に付着される標的部分とを含み、前記第２のポリマーを前記複合体に付着させることにより安定化されるような多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに、所定の物質を含む溶液を接触させる過程と、
（ｉｉ）前記標的部分が前記所定の物質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、
（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を前記溶液の他の成分から磁気的に分離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１４】
前記方法が、溶液中のサンプルから所定の生物学的物質を分離するために利用されることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１５】
前記サンプルが生物学的サンプルであることを特徴とする請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１６】
前記生物学的サンプルが、組織ホモジネート、細胞溶解物、ブロスまたは細胞または組織培養であることを特徴とする請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１７】
前記生物学的物質が、真核細胞、原核細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、核酸、炭水化物、リガンド、脂質、またはこれらの任意の組合せであることを特徴とする請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１８】
前記標的部分が、抗体、抗体フラグメント、レセプタ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオンキレート、酵素補助因子、核酸、リガンドまたはレクチンであることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記複合体の磁気分離が、高勾配磁気分離により行われることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１２０】
発現タンパク質を、前記タンパク質を発現するウイルスから分離する方法であって、
（ｉ）所定のタンパク質を発現するウイルスを含む細胞を溶解する過程と、
（ｉｉ）（ａ）超常磁性コア粒子と、
（ｂ）キレート基を含み、前記超常磁性コア粒子に付着され、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、コロイド状に安定ではない第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体を形成し、前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような第１のポリマーと、
（ｃ）前記第１のポリマーが付着している複合体に付着される第２のポリマーとを含み、前記第２のポリマーを前記複合体に付着させることにより安定化されるような多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに、（ｉ）において得られた溶解物を接触させる過程と、
（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記発現タンパク質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐発現タンパク質複合体を形成するようにする状態を与える過程であって、前記状態が多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐ウイルス複合体の形成をもたらすこともあるような該過程と、
（ｉｖ）他の成分から磁性ナノクラスタを含む複合体を磁気的に分離する過程であって、前記複合体が、発現タンパク質、ウイルス、またはこれらの混合物を前記複合体中に含むことがある該過程と、
（ｖ）前記複合体を高イオン強度の溶液に接触させる過程と、
（ｖｉ）前記発現タンパク質を捕集する過程とを含み、
それによって、前記高イオン強度の溶液が、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する前記ウイルスの結合親和性を高めるか、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する前記発現タンパク質の結合親和性を低下させるか、またはその組合せであり、
結合親和性に対する前記効果により、前記発現タンパク質の優先的な捕集が、前記タンパク質を発現するウイルスから組換え技術により発現されたタンパク質を分離する方法となることができるようにすることを特徴とする方法。
【請求項１２１】
前記複合体の磁気分離が、高勾配磁気分離により行われることを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記細胞が酵母または哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが２０〜１０００ｎｍのサイズであることを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
前記高イオン強度溶液が０．１〜０．４Ｍの濃度であることを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが０．０５〜０．３％の濃度にあることを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２６】
前記複合体を高ｐＨ溶液に接触させる過程を更に含むことを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
前記溶液が低イオン強度溶液であることを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ウイルスを捕集する過程を更に含むことを特徴とする請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが、ビニルスルホン酸とアクリル酸のコポリマーを含むことを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【請求項１３０】
前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタがＰＥＯを含むことを特徴とする請求項１２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製において使用する化合物及び使用方法を提供する。本発明は、多層ポリマー被覆（multi-polymer-coated）水性磁性流体を提供する。これは、水性媒体からの疎水性材料の分離に有用な実施形態の１つを用いて、発酵物からのタンパク質のイオン交換精製または任意の電荷またはアフィニティ（親和性）に基づく分離に有用である。製造方法は、上記流体の製造に有用であり、様々な分離のための高イオン強度環境における安定性を有する制御されたサイズ磁性ナノ粒子の合成に有用である。
【背景技術】
【０００２】
複合体溶液からの所定の物質の分離は、種々の方法によって達成されてきた。いくつかの用途には、サンプルからの所定の生物学的物質の分離、例えば発酵ブロスなどの複合培地からのタンパク質の精製が含まれる。そのような分離は、とりわけ、細胞の不純物除去（clarification）とそれに続くカラムクロマトグラフィ、クロマトグラフィ媒体の流動層の使用により達成されてきた。しかしながら、これらの技術には、前者においては、粒子状物質を取り扱うことができない、質量移動が不良であるなどの制限があり、後者においては、接触時間が短い、樹脂の充填容量が少ないなどの制限がある。
【０００３】
磁気分離は、複合体分離を達成し得る別の手段である。これに関連して、水溶液中の生物学的に活性な磁性粒子（磁性流体と呼ばれる）は特定の用途を見出していた。高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）は、磁場を用いて懸濁液から磁性粒子を分離するが、磁性粒子が所定の生物学的物質（例えば、細胞、薬物）に付着されているときに、磁性粒子に結合されていない他の物質から所定の物質または標的材料が分離され得るようにＨＧＭＳが活用されてきた。
【０００４】
幅広い種類の磁性流体が当該分野で知られているが、目下のところそのような各磁性流体の使用は適用の際に制限を受ける。例えば、２分子層において界面活性剤を用いて水性磁性流体を形成することができるが、この流体は外側の界面活性剤層の脱着に因り希釈化で不安定化する傾向があり、これを回避する方法はそれほどうまくいっているとは言えず、さらに、容易には量産化することができない。磁性流体の別の種類は、単層ポリマー被覆磁性流体の種類である。しかしながら、これらの粒子は、小さすぎて容易に捕捉できないか、高イオン強度環境中で安定していないかいずれかである。ポリマーマトリックス中に埋め込まれた磁性ナノ粒子も同様に用いられてきたが、これらの粒子は典型的な例ではずっと大きく、コロイド状に安定ではなくて懸濁状態を維持するために撹拌が必要であり、占有する表面積が比較的少ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの制限のない改良技術及び磁性流体の安価な大量生産の提供は広範な用途が見込まれるが、目下のところ当該分野にはそのような技術などがない。
【発明を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一実施形態において、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタであって、（ａ）超常磁性コア粒子と、（ｂ）キレート基を含み、前記超常磁性コア粒子に付着され、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、コロイド状に安定ではない第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体を形成し、前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような第１のポリマーと、（ｃ）前記第１のポリマーが付着している複合体に付着され、前記複合体にに付着することにより、当該多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化するような第２のポリマーとを含む多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを提供する。
【０００７】
一実施形態においては、超常磁性コア粒子にはマグネタイトが含まれる。別の実施例においては、キレート基は鉄キレート基であり、これは別の実施例においては遊離カルボン酸である。
【０００８】
別の実施例においては、ナノクラスタは２５〜２００ｎｍのサイズである。別の実施例においては、ナノクラスタサイズは、第１のポリマー中のキレート基とマグネタイト・コア粒子中の鉄原子の比の関数である。一実施形態において、この比は０．１〜０．６である。別の実施例において、ナノクラスタサイズは、ポリマー１（第１のポリマー）の量を制限することにより制御される。
【０００９】
別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ＰＥＯ、ＰＰＯ、ＰＡＡ、またはこれらの任意の組合せが含まれる。別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸、スチレンスルホン酸、及びビニルスルホン酸が含まれる。この態様によれば、一実施形態においてビニルスルホン酸濃度は２５〜５０％であり、または別の実施例においてスチレンスルホン酸濃度は２５〜７５％であり、または別の実施例においてアクリル酸濃度は約２５％である。別の実施例においてはアクリル酸濃度対鉄原子濃度の比は０．１〜０．６であり、または別の実施例において０．２である。
【００１０】
別の実施例においては、第１のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれる。
【００１１】
別の実施例においては、第１のポリマーは、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドを含むコポリマーである。この態様によれば、一実施形態においてポリエチレンオキサイドは８〜１６％の濃度でグラフトされる。別の実施例においては、ポリプロピレンオキサイドは０〜８％の濃度でグラフトされる。別の実施例においては、ポリアクリル酸は５０００の分子量を有する。別の実施例においてポリマー濃度はマグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５〜１．２５グラムであり、または別の実施例においてマグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５グラムである。
【００１２】
別の実施例においては、第２のポリマーには、アクリル酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、またはこれらの任意の組合せが含まれる。別の実施例においては、第２のポリマーにはポリアクリル酸が含まれ、これは別の実施例において２，０００〜２５０，０００の分子量を有するかまたは別の実施例において５０００の分子量を有する。一実施形態においてポリマー濃度はマグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムであり、または別の実施例においてマグネタイト１グラム当たりポリマー０．３グラムである。
【００１３】
別の実施例においては、第２のポリマーには、アクリル酸とビニルスルホン酸のコポリマーが含まれる。一実施形態においては、この態様によれば、アクリル酸及びビニルスルホン酸の濃度は２５〜５０％であり、または別の実施例において約２５％である。別の実施例においては、ポリマー濃度はマグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムであり、または別の実施例においてマグネタイト１グラム当たりポリマー０．４グラムである。
【００１４】
別の実施例においては、第２のポリマーは、コア粒子の周囲に立体的なシェル（steric shell）を作ることによって、または別の実施例においては多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに電荷を供給することによって、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化する。別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、高イオン強度の溶液中で安定している。
【００１５】
別の実施例においては、第１のポリマーには、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸及びアクリル酸が含まれ、第２のポリマーには、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイド、またはポリアクリル酸、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸が含まれる。別の実施例においては、第１のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれ、第２のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれる。別の実施例においては、第１のポリマーには、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドが含まれ、第２のポリマーには、ポリアクリル酸にグラフトされたポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイド、またはポリアクリル酸、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸が含まれる。
【００１６】
別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタには標的部分が更に含まれ、標的部分は、別の実施例においては、抗体、抗体フラグメント、レセプタ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオンキレート、酵素補助因子、核酸またはリガンドである。
【００１７】
別の実施例においては、本発明は多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを含む溶液を提供するが、これは別の実施例においては水溶液であり、または別の実施形態においては高イオン強度溶液である。
【００１８】
別の実施例においては、本発明は、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを生成するための方法であって、
（ａ）水溶液中でキレータを含む第１のポリマーに超常磁性コア粒子を接触させ、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、第１のポリマー付着が、第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体における不安定性及び超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすようにする過程と、（ｂ）（ａ）における溶液を第２のポリマーに接触させ、第２のポリマーが、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを形成するポリマー−マグネタイト粒子複合体を安定化するようにする過程とを含む方法を提供する。
【００１９】
一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの溶液を更に濃縮させるが、これには、別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを沈降させる過程が含まれる。別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを生成するための方法には、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに標的部分を共役させる過程が更に含まれる。
【００２０】
別の実施例においては、本発明は、分離の方法であって、（ｉ）所定の物質を含む溶液を本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに接触させ、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記所定の物質との強化された相互作用を有するようにする過程と、（ｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記所定の物質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を前記溶液の他の成分から磁気的に分離する過程とを含む方法を提供する。
【００２１】
一実施形態においては、上記方法は、溶液中のサンプルから所定の生物学的物質を分離するために利用される。一実施形態においては、サンプルは生物学的サンプルであり、これは一実施形態においては組織ホモジネート、細胞溶解物、ブロス、または細胞または組織培養である。
【００２２】
一実施形態においては、生物学的物質は、真核細胞、原核細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、核酸、炭水化物、リガンド、脂質またはこれらの任意の組合せである。
【００２３】
別の実施例においては、複合体の磁気分離は、高勾配磁気分離により行われる。一実施形態においては、上記方法は、細胞によって発現されるタンパク質を前記細胞から分離するために利用される。この態様によれば、一実施形態においてタンパク質は強カチオン性である。
【００２４】
別の実施例においては、本発明の方法は、溶液またはブロス中で行われる。別の実施例において細胞は細菌または酵母であり、別の実施例において酵母はピキア属酵母（Pichia species）である。
【００２５】
別の実施例においては、本発明は、分離の方法であって、（ａ）標的部分を更に含む本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに、所定の物質を含む溶液を接触させる過程と、（ｂ）前記標的部分が前記所定の物質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、（ｃ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を前記生物学的サンプルの他の成分から磁気的に分離する過程とを含む方法を提供する。
【００２６】
一実施形態においては、この態様によれば、標的部分は、抗体、抗体フラグメント、レセプタ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオンキレート、酵素補助因子、核酸、リガンドまたはレクチンである。別の実施例においては、上記方法は、サンプルから所定の生物学的物質を分離するために利用されるが、このサンプルは一実施形態においては生物学的サンプルであり、これは別の実施例においては組織ホモジネート、細胞溶解物、または細胞または組織培養である。
【００２７】
別の実施例においては、この態様に基づく生物学的物質は、真核細胞、原核細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、核酸、炭水化物、リガンド、脂質またはこれらの任意の組合せである。
【００２８】
別の実施例においては、複合体の磁気分離は、ＨＧＭＳにより行われる。
【００２９】
別の実施例においては、本発明は、発現タンパク質を、前記タンパク質を発現するウイルスから分離する方法であって、（ｉ）所定のタンパク質を発現するウイルスを含む細胞を溶解する過程と、（ｉｉ）（ａ）において得られた溶解物を本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに接触させる過程と、（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記発現タンパク質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐発現タンパク質複合体を形成するようにする状態を与える過程であって、前記状態が多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐ウイルス複合体の形成をもたらすこともあるような該過程と、（ｉｖ）他の成分から多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを含む複合体を磁気的に分離する過程であって、前記複合体が、発現タンパク質、ウイルス、またはこれらの混合物を前記複合体中に含むことがある該過程と、（ｖ）前記複合体を高イオン強度の溶液に接触させる過程と、（ｖｉ）前記発現タンパク質を捕集する過程とを含み、それによって、前記高イオン強度の溶液が、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する前記ウイルスの結合親和性を高めるか、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する前記発現タンパク質の結合親和性を低下させるか、またはその組合せであり、結合親和性に対する前記効果により、前記発現タンパク質の優先的な捕集が、前記タンパク質を発現するウイルスから組換え技術により発現されたタンパク質を分離する方法となることができるようにする方法を提供する。
【００３０】
本発明のこの態様によれば、一実施形態において複合体の磁気分離は高勾配磁気分離により行われる。一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは２０〜１０００ｎｍのサイズである。別の実施例においては、高イオン強度の溶液は０．１〜０．４Ｍの濃度である。別の実施例においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ濃度は０．０５〜０．３％である。
【００３１】
別の実施例においては、上記方法には、複合体を高ｐＨ溶液に接触させる過程が更に含まれる。一実施形態においては、溶液は低イオン強度溶液である。
【００３２】
別の実施例においては、上記方法には、ウイルスを捕集する過程が更に含まれる。
【００３３】
別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタには、ビニルスルホン酸とアクリル酸のコポリマーが含まれ、または別の実施例において多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタにはＰＥＯが含まれ、または別の実施例において多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタにはこれらの混合物が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、一実施形態において、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタであって、超常磁性コア粒子と、キレート基を含み、前記超常磁性コア粒子に付着され、前記超常磁性コア粒子に付着することにより、第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体（コロイド状に安定ではない）を形成し、前記超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような第１のポリマーと、前記第１のポリマーが付着している複合体に付着され、前記複合体にに付着することにより、当該多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化するような第２のポリマーとを含む多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを提供する。
【００３５】
マグネタイト・コアを含む多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを以下に例示するように生成した。本発明のこの態様によれば、一実施形態において、幾つかの異なるポリマーで被覆された８ｎｍマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）コアの２５〜２００ｎｍクラスタで構成される磁性流体を生成した。使用するポリマー被覆の特性に基づき、磁性ナノ粒子のサイズを所望の値に調整することができることが分かった。クラスタは、２次ポリマー被覆の適用によりコロイド状に安定化されるが、単一のポリマー層で被覆してもこの効果は生じない。粒子サイズの調整は、一実施形態において多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子の回収のために有用である。というのも、サイズが５０ｎｍ以下のときには回収は非常に困難であるからである。別の実施例においては、粒子サイズが低下するにつれてコロイド状の安定性のみならず分離のための粒子の受容能（capacity）が劇的に向上するので、粒子サイズ調整は有用である。
【００３６】
一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、長期間溶液中に留まらせるサイズのものである。別の実施例においては、ナノクラスタは２０〜１０００ｎｍのサイズである。一実施形態においては、ナノクラスタは２５〜２００ｎｍのサイズである。一実施形態においては、ナノクラスタは３０〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは３５〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは４０〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは４５〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは５０〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは７５〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは１００〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは１２５〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは１５０〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは１７５〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは３５〜７５ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは５０〜１００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは７５〜２００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは７５〜１５０ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは５０〜１２５ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは２０〜１００ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは２０〜１２５ｎｍのサイズである。一実施形態においては、ナノクラスタは２０ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは４０ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは５０ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは６０ｎｍのサイズであり、または別の実施例においてナノクラスタは８０ｎｍのサイズであり、または別の実施例において１００ｎｍのサイズである。
【００３７】
別の実施例においては、ナノクラスタサイズは、第１のポリマー中のキレート基とマグネタイト・コア粒子中の鉄原子の比の関数である。一実施形態において、この比は０．１〜０．６である。別の実施例において、この比は０．１〜０．６であり、または別の実施例においてこの比は０．１〜０．３であり、または別の実施例においてこの比は０．３〜０．６であり、または別の実施例においてこの比は０．１であり、または別の実施例においてこの比は０．２であり、または別の実施例においてこの比は０．３であり、または別の実施例においてこの比は０．４であり、または別の実施例においてこの比は０．５であり、または別の実施例においてこの比は０．６である。別の実施例において、ナノクラスタサイズは、ポリマー１の量を制限することにより制御される。別の実施例において、ナノクラスタサイズは、ポリマー２の分子サイズにより制御される。
【００３８】
本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタには少なくとも２つのポリマーが含まれ、これらは超常磁性コア粒子に付着されるが、形成時にはコロイド状に安定である。一実施形態においては、上記付着は超常磁性コア粒子とポリマー間の強いまたは弱い相互作用である。
【００３９】
一実施形態においては、超常磁性コア粒子にはマグネタイトが含まれる。マグネタイトは、一実施形態において磁石に強力に引き付けられる鉄鉱石を指す。一実施形態においては、それは一般式Ｆｅ３Ｏ４を有し、これは別の実施例においては、約１：１．５ないし約１：２．５のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比を有し、または別の実施例において約１：２の比を有する。別の実施例においては、超常磁性粒子には（Ｆｅ，Ｍ）ＯＦｅ２Ｏ３などの化学的等価物が含まれることがあり、ここでＭは一実施形態において、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、またはＣｒであることがある。別の実施例においては、Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋比には、本発明の方法に基づき超磁性ナノ粒子の形成を可能にする任意の比が含まれる。
【００４０】
別の実施例においては、超常磁性コア粒子にはキレート基が含まれる。一実施形態においては、キレート基は鉄キレート基であり、これは別の実施例においては遊離カルボン酸である。別の実施例においては、超常磁性コア粒子には、γまたはα酸化鉄、二酸化クロム、フェライト、または金属合金の種々の元素が含まれる。
【００４１】
一実施形態においては、ポリマー被覆磁性ナノクラスタには常磁性体が含まれる。常磁性体は、一実施形態において磁場中に置かれたときに磁場中の力線に平行にかつ磁場の強度に比例して磁化される物質を指す。一実施形態においては、ポリマー被覆磁性ナノクラスタには、本発明のポリマーが付着する超常磁性コアが含まれる。一実施形態においては、「超常磁性」なる語は、外部磁場において強磁性材料として同様の磁性を有するが、外部磁化場（external magnetization field）を取り除いた後には残留磁気を有していない物質の種類を指す。
【００４２】
超常磁性コア粒子の多層ポリマー被覆（multiple polymer coating）は、本発明の一要素である。一実施形態においては、本発明のポリマーにはコポリマーが含まれることがある。別の実施例においては、本発明のポリマーはホモポリマーであることがあり、別の実施例においてヘテロポリマーであることがある。別の実施例においては、本発明のポリマーは合成ポリマーであり、または別の実施例においては天然ポリマーである。別の実施例においては、本発明のポリマーはフリーラジカル・ランダムコポリマーであり、または別の実施例においてはグラフトコポリマーである。一実施形態においては、ポリマーには、タンパク質、ペプチドまたは核酸が含まれることがある。超常磁性コア粒子に対する親和性を有する任意のポリマーを加えると本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを連続的に生成するが、このようなポリマーは本発明の一部であると考えられるべきである。
【００４３】
一実施形態においては、利用されるポリマーの選択は、用いられる磁性粒子の電荷の関数であることがある。一実施形態においては、第１のポリマーには、負電荷の粒子に対するアクリル酸、スチレンスルホン酸及びビニルスルホン酸のランダムコポリマーと、正電荷の粒子に対するアクリル酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドのランダムコポリマーと、アクリル酸の主鎖とポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドの側鎖を有するグラフトコポリマーとが含まれることがある。一実施形態においては、ポリマーの選択が、疎水性安定化のための疎水性領域及び親水性の安定化シェルを与えるために行われる。
【００４４】
別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、ポリプロピレンオキサイド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、またはその組合せが含まれる。別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸、スチレンスルホン酸及びビニルスルホン酸が含まれる。この態様によれば、一実施形態においてビニルスルホン酸の濃度は２５〜５０％であり、または別の実施例においてスチレンスルホン酸の濃度は２５〜７５％であり、または別の実施例においてアクリル酸の濃度は約２５％である。別の実施例においてはアクリル酸濃度対鉄原子濃度の比は０．１〜０．６であり、または別の実施例において０．２である。
【００４５】
別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸２５％、ビニルスルホン酸５０％、スチレンスルホン酸２５％が含まれる。本発明のこの態様によれば、別の実施例においては結果として生じるポリマー１の分子量は、３、５、９、１２、１７、３２または７０ｋＤａであるかまたはその範囲であることがある。別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸２５％、ビニルスルホン酸２５％、スチレンスルホン酸５０％が含まれる。本発明のこの態様によれば、別の実施例においては結果として生じるポリマー１の分子量は、２、４、５、７、１０、１９または３８ｋＤａであるかまたはその範囲であることがある。別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸２５％、スチレンスルホン酸７５％が含まれる。本発明のこの態様によれば、別の実施例においては結果として生じるポリマー１の分子量は、３、５、１２、１６、２３、４４、１０２、２１０または３００ｋＤａであるかまたはその範囲であることがある。別の実施例においては、第１のポリマーの構成は、アクリル酸２０％、ビニルスルホン酸８０％、または別の実施例においてはアクリル酸３０％、ビニルスルホン酸７０％、または別の実施例においてはアクリル酸４０％、または別の実施例においてはビニルスルホン酸６０％である。本発明のこの態様によれば、別の実施例においては結果として生じるポリマー１の分子量は、１、２、３、４、５、６、７または１１ｋＤａであることがある。別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸２５％、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド７５％が含まれる。本発明のこの態様によれば、別の実施例においては結果として生じるポリマー１の分子量は、２、３、５、１０、１９、３５または２６０ｋＤａであることがある。別の実施例においては、第１のポリマーには、アクリル酸２５％、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド７５％が含まれる。本発明のこの態様によれば、別の実施例においては結果として生じるポリマー１の分子量は、１１、１６、３６または１７０ｋＤａであることがある。
【００４６】
別の実施例においては、第１のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれる。この態様によれば、一実施形態においては、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの濃度は、２５〜９０％であり、または別の実施例において７０〜８０％であり、または別の実施例において約７５％である。一実施形態においては、アクリル酸濃度対鉄原子濃度の比は０．１〜０．６であり、または別の実施例において０．２である。
【００４７】
別の実施例においては、第１のポリマーは、ＰＡＡにグラフトされたＰＥＯ及びＰＰＯを含むコポリマーである。この態様によれば、一実施形態においてＰＥＯは８〜１６％の濃度でグラフトされる。別の実施例においては、ＰＰＯは０〜８％の濃度でグラフトされる。別の実施例においては、ＰＡＡは５，０００の分子量を有する。別の実施例においては、ポリマー濃度はマグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５〜１．２５グラムであり、または別の実施例においてはマグネタイト１グラム当たりポリマー０．２５グラムである。
【００４８】
別の実施例においては、ポリマー１のポリマー分子量はいろいろに変えられることがあり、一実施形態においては、第１のポリマーの分子量は、１〜３００、１〜５、１〜１０、１０〜２０、２０〜２５、１〜２５、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、２５〜５０、５０〜７０、７０〜１００、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜１７０、１７０〜２００、１５０〜２００、１００〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、１００〜３００、または２００〜３００ｋＤａの範囲であることがある。
【００４９】
別の実施例においては、ポリマー１による超常磁性粒子の被覆は、反応溶液を加熱することによって向上することがある。ここでは、約４５〜５０℃から９０℃もの高温までの温度が超常磁性コア粒子のポリマー被覆を促進することが実証された。本発明の方法による超常磁性コア粒子のポリマー被覆のために、一実施形態においては８０℃の温度、または別の実施例においては８５℃の温度、または別の実施例においては７５℃の温度、または別の実施例においては７０℃の温度、または別の実施例においては６５℃の温度、または別の実施例においては６０℃の温度が維持される。
【００５０】
第２のポリマーの付着は、形成された本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタのコロイド状安定化（colloidal stabilization）をもたらす。一実施形態においては、「安定化された」または「安定化」なる語は、ナノクラスタ生成後、溶液中における結果的にもたらされたナノクラスタの安定性を指す。一実施形態においては、「安定化された」、「安定化」または「コロイド状に安定である」または「コロイド状安定化」なる語は、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが溶液中に凝集または「沈殿」しないという事実を指す。別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、特定の期間にわたり化学組成が変化しない。
【００５１】
一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタはコロイドを形成する。コロイドは、一実施形態において溶液中に分散したナノクラスタの均質の透明ではない（non-crystalline）性質を指すが、このときナノクラスタは、一実施形態においては沈降せず、別の実施例においては通常の濾過または遠心分離によって分離することができない。
【００５２】
一実施形態においては、第２のポリマーには、アクリル酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、またはこれらの任意の組合せが含まれる。
【００５３】
別の実施例においては、第２のポリマーにはポリアクリル酸が含まれ、これは別の実施例においては２〜２５０ｋＤａの分子量を有する。別の実施例においては、第２のポリマーとして用いられるポリアクリル酸の分子量は、２、５、８、１５、３０、５０、７０、１００または２５０ｋＤａである。一実施形態においては、ポリマー濃度はマグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムであり、または別の実施例においてマグネタイト１グラム当たりポリマー０．３グラムである。
【００５４】
別の実施例においては、第２のポリマーにはアクリル酸とビニルスルホン酸のコポリマーが含まれる。一実施形態においては、この態様によれば、アクリル酸及びビニルスルホン酸の濃度は２５〜５０％であり、別の実施例においては約２５％である。別の実施例においては、第２のポリマーの分子量はこの態様によれば１０ｋＤａであることがある。
【００５５】
別の実施例においては、第２のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれる。別の実施例においては、第２のポリマーには、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれる。この態様によれば、一実施形態においてアクリル酸は２５％の濃度、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドは７５％の濃度で、ポリマー分子量が約１０ｋＤａであることがある。
【００５６】
別の実施例においては、第２のポリマーは、ＰＡＡにグラフトされたＰＥＯ及び／またはＰＰＯを含む。一実施形態においては、本発明のこの態様によれば、第２のポリマーには、サイズが５ｋＤａのポリ（アクリル酸）主鎖に、サイズが３ｋＤａ、グラフト化率（grafting）１６％のポリ（エチレンオキサイド）を加えたものが含まれる。別の実施例においては、第２のポリマーには、サイズが５ｋＤａのポリ（アクリル酸）主鎖に、サイズが３ｋＤａ、グラフト化率８％のポリ（エチレンオキサイド）と、サイズが２ｋＤａ、グラフト化率８％のポリ（プロピレンオキサイド）を加えたものが含まれる。
【００５７】
別の実施例においては、ポリマー濃度はマグネタイト１グラム当たりポリマー０．１〜０．５グラムであり、または別の実施例においてマグネタイト１グラム当たりポリマー０．４グラムである。
【００５８】
別の実施例においては、第２のポリマーは、コア粒子の周囲に立体的なシェルを作ることによって、または別の実施例においては多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに電荷を供給することによって、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを安定化する。別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、高イオン強度の溶液中で安定している。
【００５９】
別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタには、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸及びアクリル酸を含む第１のポリマーと、ＰＡＡにグラフトされたＰＥＯ及びＰＰＯ、またはＰＡＡ、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸を含む第２のポリマーとが含まれる。別の実施例においては、第１のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれ、第２のポリマーには、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸またはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリル酸が含まれる。
【００６０】
別の実施例においては、第１のポリマーには、ＰＡＡにグラフトされたＰＥＯ及びＰＰＯが含まれ、第２のポリマーには、ＰＡＡにグラフトされたＰＥＯ及びＰＰＯ、またはＰＡＡ、またはアクリル酸及びビニルスルホン酸が含まれる。
【００６１】
本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを形成するために非常に多くのポリマーの組合せが用いられることがあり、上記したものは可能な組合せの極一部を示しているにすぎないことを理解されたい。しかしながら、可能な組合せの各々は本発明の一実施形態と考えられる。
【００６２】
別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタには更に標的部分が含まれる。「標的部分（targeting moiety）」なる語は、一実施形態においては、標的部分を同族のパートナー（cognate partner）に付着させることになるような、標的部分に与えられた特異性、または別の実施例においては標的部分を所望の同族のパートナー分子に特異的に「標的にする」能力を指す。標的部分は、一実施形態において、標的部分を介して、一実施形態においては所定のタンパク質または糖タンパク質へ、または別の実施例においては所定の核酸へ、または別の実施例においては所定の細胞性画分への多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの付着を促進することがある。
【００６３】
一実施形態においては、標的部分は少ない存在量で分子への付着を増強するが、このことは興味深い。別の実施例においては、標的部分は、ＵＶ光源などのエネルギー源の供給を受けて付着を増強する。一実施形態においては、化学的な架橋基を介してポリマーに標的部分を化学的に付着させ、または別の実施例において多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタのポリマーとの安定した会合を形成し、または別の実施例において多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタのポリマーとの会合を形成するが、これにより、次に続く例えば塩濃度やｐＨなどの溶液状態の変化との関係が容易に絶たれる。
【００６４】
一実施形態においては、標的部分は抗体であることがあり、これはタンパク質や核酸などの所定の分子を特異的に認識する。別の実施例においては、抗体は、所定の分子に付着されるレポーター分子を特異的に認識することがある。別の実施例においては、標的部分は、抗体フラグメント、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオンキレート、酵素補助因子、または核酸であることがある。別の実施例においては、標的部分は、所定の同族リガンドに結合するかまたは所定の分子または細胞と会合するレセプタであることがあり、または別の実施例において、標的部分は、その同族のパートナーとの相互作用によって細胞を「探し出す」ために用いられるリガンドであることがある。
【００６５】
細胞などの任意の所定の構成要素またはその成分であって、他の材料からを分離されることが望ましく、本技術に従うものは、本発明の一部と考えられるべきである。
【００６６】
例えば、一実施形態において多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、他の物質から所望の物質を分離または除去するために用いられることがあり、例えば癌性のまたは他の細胞または物質を標識しかつ生物環境から除去するために、それがin vitroであろうとin vivoであろうと、用いられることがある。
【００６７】
一実施形態においては、細胞分離のための多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの使用は、次のように達成されることがある。即ち、骨髄、血液、尿、痰または分泌物などの種々の体液から得られる細胞の混合群（mixed population）は、標準的な手順を用いて得られる。多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、所定の細胞の細胞表面上で発現されるレセプタに対する特異抗体により直接標識されることがある。所定の標的細胞への標識された多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの結合が生じることができるようになった後、懸濁液からの磁性粒子の磁気分離を行う。所定のタンパク質、または所定の核酸に対して、生物学的サンプル、培地、細菌または酵母培養からの分離に対して、及び当業者に明らかであろう多くの他のシナリオに対して、同様の手順が用いられることがある。
【００６８】
一実施形態においては、混合群に存在する、サイズ、膜電荷などの点で異なる特定の細胞群の富化のために、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが用いられる。一実施形態においては、所定の群は他の細胞群と比べて本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する高い結合親和性を示し、その所定の群はナノクラスタから分離・除去される。別の実施例においては、所定の群は、望ましくない群と比べて多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する低い親和性を示す。この除去は、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタとの接触により達成される。細胞群の濃縮または分離目的で本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを用いることは、本発明の一部であると考えられるべきである。
【００６９】
一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、生体適合性の組成物に存在することがあり、別の実施例においては、適切な薬学的に許容される担体または賦形剤であって Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA, 1985 に開示されているようなものと混合されることがある。ナノ粒子は、癌細胞の標識付け、検出、及び／または例えばサンプルまたは組織からの除去など、一定の症状の治療または診断において用いられることがある。別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは、家庭廃棄物及び産業廃棄物からの所望の物質の価値ある回収及び／または解毒に利用されることもある。
【００７０】
別の実施例においては、本発明は多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタを含む溶液を提供するが、これは別の実施例においては水溶液であり、または別の実施例においては高イオン強度溶液である。
【００７１】
一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの磁気特性は、磁場勾配にあるときにのみ磁気的挙動を示すようなものであり、永久に磁気を帯びることはない。
【００７２】
別の実施例においては、本発明は、ポリマー被覆磁性ナノクラスタを生成する方法であって、水溶液中でキレータを含む第１のポリマーに超常磁性コア粒子を接触させる過程であって、それによって前記超常磁性コア粒子への前記第１のポリマーの付着が、コロイド状に安定ではない第１のポリマー−超常磁性コア粒子複合体及び超常磁性コア粒子のクラスタ形成をもたらすような該過程と、第１のポリマー‐超常磁性コア粒子複合体を含む溶液を第２のポリマーに接触させる過程であって、それによって第２のポリマーがポリマー‐マグネタイト粒子複合体を安定化し、ポリマー被覆磁性ナノクラスタを形成する該過程とを提供する。
【００７３】
一実施形態においては、ポリマー被覆磁性ナノクラスタの溶液は更に濃縮されるが、これには、別の実施例においては、ポリマー被覆磁性ナノクラスタを沈降させる過程が含まれる。一実施形態においては、沈降は、アセトン、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、アセトニトリル、または任意の水溶性有機溶媒など、任意の数の適切な溶媒により達成されることがある。別の実施例においては、沈降に続くポリマー被覆磁性ナノクラスタの回収は溶液の磁気傾瀉（magnetic decanting）によって達成されることがある。別の実施例においては、ポリマー被覆磁性ナノクラスタは水溶液に懸濁されることがあり、再懸濁後に超音波処理されることがある。
【００７４】
さらに上記したように、ポリマー被覆磁性ナノクラスタを生成するための方法は、用いられるポリマーの種類、その分子サイズや、加えられるポリマー１の量、ポリマー２のサイズ、またはその方法が行われる温度の制限や、またはこれらの組合せにより更に処理されることがあり、前記それぞれは本発明の一実施形態を代表する。
【００７５】
別の実施例においては、ポリマー被覆磁性ナノクラスタを生成するための方法には、上文で更に説明しているように、ポリマー被覆磁性ナノクラスタに標的部分を共役させる過程が更に含まれる。
【００７６】
別の実施例においては、本発明は、分離の方法であって、所定の物質を含む溶液を本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに接触させる過程であって、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが所定の物質との強化された相互作用を有するような過程と、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが所定の物質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を前記生物学的サンプルの他の成分から磁気的に分離する過程とを含む方法を提供する。
【００７７】
一実施形態においては、上記方法は、溶液中のサンプルから所定の生物学的物質を分離するために利用される。一実施形態においては、サンプルは生物学的サンプルであり、これは一実施形態においては組織ホモジネート、細胞溶解物、ブロス、細胞または組織培養である。
【００７８】
一実施形態においては、生物学的物質は、真核細胞、原核細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、核酸、炭水化物、リガンド、脂質またはこれらの任意の組合せである。
【００７９】
別の実施例においては、複合体の磁気分離は高勾配磁気分離により行われる。一実施形態においては、上記方法は、細胞によって発現されたタンパク質を前記細胞から分離するために利用される。この態様によれば、一実施形態においてタンパク質は強カチオン性である。
【００８０】
別の実施例においては、本発明の方法は溶液またはブロス中で行われる。別の実施例において細胞は細菌または酵母であり、別の実施例において酵母はピキア属酵母である。
【００８１】
本発明のこの態様によれば、一実施形態において複合体の磁気分離は高勾配磁気分離により行われる。一実施形態においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは２０〜１０００ｎｍのサイズである。別の実施例においては、高イオン強度の溶液は濃度が０．１〜０．４Ｍである。別の実施例においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの濃度は０．０５〜０．３％である。
【００８２】
別の実施例においては、本発明は、分離の方法であって、（ｉ）所定の物質を含む溶液を本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに接触させる過程であって、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記所定の物質との強化された相互作用を有するような該過程と、（ｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記所定の物質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を前記溶液の他の成分から磁気的に分離する過程とを含む方法を提供する。
【００８３】
一実施形態においては、上記方法は、溶液中のサンプルから所定の物質を分離するために利用される。一実施形態においては、所定の物質は生物学的物質であり、サンプルが生物学的サンプルであり、生物学的サンプルは一実施形態において組織ホモジネート、細胞溶解物、細胞または組織培養である。
【００８４】
一実施形態においては、所定の生物学的物質は、真核細胞、原核細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、核酸、炭水化物、リガンド、脂質 またはこれらの任意の組合せである。
【００８５】
別の実施例においては、複合体の磁気分離は高勾配磁気分離により行われる。一実施形態においては、上記方法は、細胞によって発現されるタンパク質を前記細胞から分離するために利用される。この態様によれば、一実施形態においてタンパク質は強カチオン性である。
【００８６】
一実施形態においては、細胞は細菌または酵母である。一実施形態においては、培養系またはブロスにおいて原核細胞または真核細胞を分離するのが望ましく、または別の実施例においては原核細胞または真核細胞を含む培養物において発現されたタンパク質を単離するのが望ましい。別の実施例においては、原核細胞または真核細胞は異種性のタンパク質を発現するように操作されることがあるが、このことは、別の実施例において、タンパク質を発現する細菌または真核細胞から分離するために望ましい。
【００８７】
別の実施例においては、本発明の方法は、溶液またはブロス中で行われる。この溶液またはブロスは、別の実施例においては、当業者であれば理解するであろうように、単離される特定の物質及び物質が単離される環境に適した任意のそのような溶液またはブロスであることがある。
【００８８】
例えば、一実施形態において、培養物またはブロスにおいて細菌により発現されたタンパク質を単離するための適切な条件は、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Volumes 1-3) Cold Spring Harbor Press, N. Y.、及び Ausubel et al., 1989 またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. に見つけられることがある。
【００８９】
別の実施例においては、所定のタンパク質は、哺乳類細胞において発現されることがあるが、これは様々な培地において培養されることがある。シグマ（Sigma）社のＨａｍＦ１０、同ＭＥＭ培地（Minimal Essential Medium）、同ＲＰＭＩ １６４０、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。その他に、Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 [1979]、Bames et al., Anal. Biochem., 102: 255 [1980]、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、または第５，１２２，４６９、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号に記載のいずれかの培地が哺乳類細胞のための培地として用いられることがある。
【００９０】
培地またはブロスのいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン、チミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（登録商標）医薬物質など）、微量元素（マイクロモルの範囲に最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充されることがある。その他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれることがある。温度、ｐＨなどの培養条件は、当業者には明らかであろう（例えば Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRLPress, 1991) を参照）。
【００９１】
一実施形態においては、分離されるタンパク質は、当該タンパク質を発現する細胞から分泌される。別の実施例においては、タンパク質は細胞内で発現される。
【００９２】
一実施形態においてはタンパク質を発現する細胞、または別の実施例においてはタンパク質を産出するために遺伝子を組み換えられたウイルスを含む細胞は、当業者に知られているような方法で、例えば洗浄剤または浸透圧ショックを用いて、溶解される。
【００９３】
一実施形態においては、タンパク質は、説明されているような本発明の方法によって分離される。別の実施例においては培地、または別の実施例においては細胞溶解物、または別の実施例においては組織／器官ホモジネートを遠心分離して特定の細胞片を除去し、溶液、溶解物、ホモジネートなどを、イオン交換カラム及び／または別の実施例においてＤＥＡＥなどのシリカまたはカチオン交換樹脂クロマトグラフィ及び／または別の実施例においてゲル濾過で分別し、その後、本発明の方法に基づき磁気分離を行う。一実施形態においては、タンパク質は特にカチオン性ではなく、用いられる方法はタンパク質調製物に存在する汚染ウイルスを減らすためのものである。
【００９４】
別の実施例においては、精製中のタンパク質分解による崩壊を阻害するために、本発明の方法においてフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤が用いられることがある。
【００９５】
別の実施形態においては、本発明の方法は、以下に例示するようにピキア酵母において発現したタンパク質を単離するために利用される。
【００９６】
別の実施例においては、本発明は、発現タンパク質を、前記タンパク質を発現するウイルスから分離する方法であって、（ｉ）所定のタンパク質を発現するウイルスを含む細胞を溶解する過程と、（ｉｉ）（ｉ）において得られた溶解物を本発明の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに接触させる過程と、（ｉｉｉ）前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタが前記発現タンパク質と相互に作用して多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐発現タンパク質複合体を形成するようにする状態を与える過程であって、前記状態が多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐ウイルス複合体の形成をもたらすこともあるような該過程と、（ｉｖ）他の成分から磁性ナノクラスタを含む複合体を磁気的に分離する過程であって、前記複合体が、発現タンパク質、ウイルス、またはこれらの混合物を前記複合体中に含むことがある該過程と、（ｖ）前記複合体を高イオン強度の溶液に接触させる過程と、（ｖｉ）前記発現タンパク質を捕集する過程とを含み、それによって、前記高イオン強度の溶液が、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する前記ウイルスの結合親和性を高めるか、前記多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタに対する前記発現タンパク質の結合親和性を低下させるか、またはその組合せであり、結合親和性に対する前記効果により、前記発現タンパク質の優先的な捕集が、前記タンパク質を発現するウイルスから組換え技術により発現されたタンパク質を分離する方法となることができるようにする方法を提供する。
【００９７】
本発明のこの態様によれば、一実施形態において溶液、培地またはブロス中のウイルス及び遊離のタンパク質は本発明の方法によって互いから分離されることがある。本発明は、１つのそのような実施形態（例８）を例示する。この実施形態においては、記載のように０．３Ｍのイオン強度の溶液中では１００ｎｍのウイルスの９９．９％以上が５０ｎｍのナノクラスタに結合されるが、ナノクラスタとの複数の相互作用のために遊離のタンパク質の３０％以下が結合される。０．３Ｍのイオン強度で行われる結合はウイルスを３対数減少させるが、タンパク質の７０％は非結合である。０．３ＭのＮａＣｌによりナノクラスタを繰り返し溶離すると、ウイルスの０．１％のみが失われることになるがタンパク質の７０％は回収されることになり、そのような溶離が数回行われた後では、ほぼ全てのウイルスは捕捉されることになるがほぼ全てのタンパク質は溶離されることになる（図１４）。
【００９８】
本発明のこの態様によれば、一実施形態において、分離のための方法には、タンパク質とウイルスの混合物に磁性ナノクラスタを加える過程と、溶液にＨＧＭＳを通過させる過程と、タンパク質が溶離しなくなるまで高イオン強度（約０．３Ｍ ＮａＣｌ）の溶液によってカラムを洗浄する過程と、高ｐＨ、低イオン強度の溶液によってナノクラスタを溶離し、ウイルスを除去する過程とが含まれることがある。
【００９９】
多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタは上記したサイズの範囲で用いられることがあり、本明細書中に開示される任意の実施形態を表すと考えられるべきである。
【０１００】
一実施形態においては、細胞はウイルスのゲノム内でコードされないタンパク質を発現し、上記方法は、細胞からタンパク質を分離するために利用されるが、ここで、培養細胞にはウイルスが含まれる。別の実施例においては、タンパク質はウイルスゲノム内でコードされるが、これはタンパク質発現のために細胞機構を利用する。
【０１０１】
一実施形態においては、本発明の方法に用いられる高イオン強度の溶液は、１ｍＭ〜２Ｍの濃度であることがある。一実施形態においては、本発明の方法に用いられる高イオン強度の溶液は０．０５〜０．６Ｍの濃度であることがある。一実施形態においては、用いられるイオン強度は０．１Ｍ〜０．３Ｍであることがあり、または別の実施例において０．１Ｍ〜０．４Ｍ、または別の実施例において０．１Ｍ〜０．５Ｍ、または別の実施例において０．１Ｍ〜０．２５Ｍの濃度であることがある。
【０１０２】
別の実施例においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの濃度は０．０００１〜１５％である。別の実施例においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの濃度は０．０５〜０．３％である。一実施形態においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの濃度は０．０２５〜０．６％であり、または別の実施例においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの濃度は０．０５〜０．５％であり、または別の実施例においては、溶液中の多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタの濃度は０．０５〜１％である。
【０１０３】
別の実施例においては、本発明のこの態様によれば、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタにはビニルスルホン酸とアクリル酸のコポリマーが含まれ、または別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタにはＰＥＯが含まれ、または別の実施例においては、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタにはこれらの混合物が含まれる。
【０１０４】
一実施形態においては、本発明の方法は、伝統的な濾過または遠心分離によって除去するには小さすぎるウイルスを培養物から除去するのに有用であり、多額の出費となる限外濾過の必要性またはタンパク質活性に影響することがある酸または洗浄剤によるウイルス不活化の必要性を不要にする。
【０１０５】
別の実施例においては、本発明は、分離の方法であって、標的部分を更に含む本発明のポリマー被覆磁性ナノクラスタに、所定の物質を含む溶液を接触させる過程と、標的部分が所定の物質と相互に作用してポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を形成するようにする状態を与える過程と、前記生物学的サンプルの他の成分からポリマー被覆磁性ナノクラスタ‐所定物質複合体を磁気的に分離する過程を含む方法を提供する。
【０１０６】
一実施形態においては、標的部分は、抗体、レセプタ、リガンドまたはレクチンである。
【０１０７】
別の実施例においては、本発明の分離方法は、上記したように、サンプルから所定の生物学的物質を分離するために利用される。
【０１０８】
別の実施例においては、本発明のポリマー被覆磁性ナノクラスタを含む溶液は再使用可能であり、これは、一実施形態において完全なＨＧＭＳ捕捉及び再懸濁安定性が達成され得ることを意味している。例えば図５ｅは、タンパク質の吸着／脱着サイクル１サイクル後に再使用のために利用可能であったポリマー被覆磁性ナノクラスタの割合を示す。別の実施例においては、本発明のポリマー被覆磁性ナノクラスタの再使用の効率をよくするために追加の第２のポリマーを加える。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態をさらに十分に説明するために、以下に例を示す。しかしながら、これらの例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１１０】
例
【０１１１】
例１：
【０１１２】
ポリマー被覆磁性ナノクラスタの準備
【０１１３】
化学共沈によって磁性ナノ粒子を生成した。２．３５ｇの塩化鉄（ＩＩ）六水和物及び０．８６ｇの塩化鉄（ＩＩ）四水和物を４０ｍＬの脱酸素水に加えた。激しく撹拌した１００ｍＬの三つ口フラスコ中で窒素を発泡（バブリング）させることによって脱酸素化を達成した。得られたＦｅ３＋及びＦｅ２＋濃度はそれぞれ０．２２及び０．１１Ｍであり、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）生成のための必要な２：１の比になった。
【０１１４】
窒素バブリングを止め、その後、混合物を５０〜９０℃の範囲で加熱した。８０℃が望ましい使用温度であることがわかった。２８％の水酸化アンモニウムを５ｍＬと種々の量のポリマーの混合物を水に溶かして加えた総体積を１０ｍＬ（モノマー単位は通常７ｍｍｏｌ）にしたものを加えた。１５分後、追加被覆のために追加のポリマー（通常は４ｍｍｏｌモノマーベース）を加えた。室温まで冷却する前に更に１５分間（合計で３０分間）反応を進行させた。その後、磁性流体を５０〜１００ｍＬのアセトンで沈殿させ、磁気的に傾瀉し、３０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に再懸濁し、ブランソン音波発生器４５０（Branson sonifier 450）により４０％の出力で３０秒間超音波処理した。
【０１１５】
化学共沈による磁性ナノ粒子生成の全体手順を図１に示す。上記に例示したように、ポリマーの存在下で塩基によって鉄イオンを沈降させ、ナノクラスタを形成する。クラスタを安定化するために第２のポリマーを加える。
【０１１６】
被覆磁性ナノ粒子の準備において多くの異なるポリマーを利用した。本明細書中で例証した２つの種類のポリマー即ちフリーラジカル・ランダムコポリマー及びグラフトコポリマーについて、更に詳しく説明する。第１の被覆は、負電荷の粒子に対するアクリル酸、スチレンスルホン酸及びビニルスルホン酸のランダムコポリマーと、正電荷の粒子に対するアクリル酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド及びアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドのランダムコポリマーと、アクリル酸の主鎖とポリエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドの側鎖を有するグラフトコポリマーとにより行われた。これは、疎水性領域及び親水性の安定化シェルを与えるために用いられた。
【０１１７】
負電荷の粒子の第１の被覆はポリマー１により達成した。ポリマー１は、全増分濃度範囲（full incremental range of concentration）が２５％ないし７５％のスチレンスルホン酸と、全漸増濃度範囲が２５％ないし５０％のビニルスルホン酸と、２，０００〜３００，０００（好適には５，０００〜１０，０００で行った）の分子量を有する好適には２５％の平衡アクリル酸（balance acrylic acid）から構成されていた。アクリル酸濃度／鉄原子濃度の比が０．１〜０．６となるようにポリマー被覆を行った。ポリマー１の概略図を図２ａに示す。形成されたアニオン性ポリマーは、そのカルボン酸官能基を介してマグネタイトに付着する。
【０１１８】
正電荷の粒子の第１の被覆もポリマー２により達成した。ポリマー２は、２５％ないし９０％の濃度であって７０〜８０％、特に７５％でより大きな増分のアセスメントが行われるビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリドまたはアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドと、平衡アクリル酸から構成されていた。アクリル酸濃度／鉄原子濃度の比が０．１〜０．６となるようにポリマー被覆を行った。ポリマー２の概略図を図２ｂに示す。ここでは、この合成手順によりアニオン性ポリマーを生成したが、アニオン性ポリマーはそのカルボン酸官能基を介してマグネタイトに付着する。
【０１１９】
ポリマー３による粒子の第１の被覆も達成した。ポリマー３は、マグネタイト１グラム当たり０．２５〜１．２５グラムの範囲で分子量５０００のＰＡＡにグラフトされた、分子量３，０００のＰＥＯ（グラフト化率すなわちＰＥＯと反応したアクリル酸反復単位のパーセントが８〜１６％）または分子量２，０００のＰＰＯ（グラフト化率０〜８％の）のブラシコポリマー（brush copolymer）で構成されていた。ポリマー３の概略図を図２ｃに示す。図２ｃは、アミド化反応によりアミノ端ＰＥＯ及びＰＰＯ側鎖をＰＡＡ主鎖に付着させることによるグラフトコポリマー合成を示している。ＣＯＯＨ基の大部分は、次に行われるマグネタイト・ナノ粒子への付着のために未反応のまま残された。
【０１２０】
上記の例に加えて、磁性ナノ粒子の被覆のために用いられる追加の第１のポリマーを表１に示す。
【表１】
2007528784.tif 000003
2007528784.tif 000004
2007528784.tif 000005
【０１２１】
表１から分かるように、第１のポリマーが多様な濃度の組成から構成され、分子量が一定に保たれているか、またはその逆であるような多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子を作成した。更に、種々の異なる温度で同じように多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子が生成されることがある（表２）。
【表２】
2007528784.tif 000006
【０１２２】
ポリアクリル酸から構成されるポリマー４の第２の被覆を、マグネタイト１グラム当たり０．１〜０．５グラム、好適には０．３グラムの濃度で分子量を２ｋＤａから２５０ｋＤａまで利用範囲内で僅かづつ例えば５ｋＤａづつ増量させたポリアクリル酸により達成した。代わりの第２の被覆を利用したが、それはポリマー５の第２の被覆であって、１０，０００の分子量を有する、ＡＡとＶＳＡ（２５〜５０％）のコポリマー、特にマグネタイト１グラム当たり０．１〜０．５グラム、例えば０．４グラムの濃度で５０％及び２５％のコポリマーから構成されるものを作成した。
【０１２３】
上記の例に加えて、磁性ナノ粒子の被覆のために用いられる追加の第２のポリマーを表３に示す。
【表３】
2007528784.tif 000007
2007528784.tif 000008
【０１２４】
表３から明らかなように、第２のポリマーが様々な組成から構成され、加えるポリマーの量を変えても分子量は一定に保たれているか、またはその逆であるような多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子を作成した。
【０１２５】
これらの方法によって複数の粒子が合成されたが、これには、ポリマー１による第１の被覆及びポリマー３、４または５による第２の被覆がなされたもの、またはポリマー２により粒子に第１及び第２の被覆がなされたもの、またはポリマー３による第１の被覆、ポリマー３、４または５による第２の被覆がなされたものが含まれる。
【０１２６】
例２：
【０１２７】
第１のポリマー付着材料の関数としての磁性ナノクラスタサイズ制御及び実験方法：
【０１２８】
磁性ナノ粒子は以下のように準備した。２．３５ｇの塩化鉄（ＩＩ）を４０ｍＬの脱酸素水に加えた。得られたＦｅ３＋及びＦｅ２＋濃度はそれぞれ０．２２及び０．１１Ｍであった。その後、混合物を８０℃まで加熱した。
【０１２９】
種々の多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子の形成のために用いた第１のポリマーを表４に示す。
【表４】
2007528784.tif 000009
【０１３０】
５ｍＬの２８％水酸化アンモニウムと種々の量のポリマーの混合物であって、Ｆｅイオン１ｍｏｌ当たりＣＯＯ−０．０６ｍｏｌないし０．５５ｍｏｌ。
【０１３１】
１５分後、追加被覆のために第２のポリマー即ち０．３グラムの５０００ＰＡＡを加えた。室温まで冷却する前に更に１５分間（合計で３０分間）反応を進行させた。その後、磁性流体を５０〜１００ｍＬのアセトンで沈殿させ、磁気的に傾瀉し、３０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に再懸濁し、ブランソン音波発生器４５０により４０％の出力で３０秒間超音波処理した。測定角９０°でブルックヘイブン（Brookhaven）ＢＩ−２００ＳＭ光散乱系により動的光散乱（ＤＬＳ）実験を行った。
【０１３２】
結果
【０１３３】
ＨＧＭＳ捕捉結果は、クラスタサイズが５０〜７０ｎｍであるときに最適である。クラスタサイズに対する第１のポリマーの効果を判定するために、先ず表３に示すような種々の量のポリマーを塩基に加えた。ポリマー１の量を制限すると、上記の最適クラスタサイズが得られた（図３）。具体的に言うと、ポリマー１中の鉄キレート基（カルボン酸）の濃度と溶液中の鉄原子の量のモル比が約０．１４〜０．２になるようにポリマー１の量を制限すると、所望のクラスタサイズが得られた（図３）。磁性クラスタサイズ制御は、この場合は第１の被覆を含む溶液中のポリマーの比を制御することによって影響されるが、数分後に１５ｋＤａ以下の２次ポリマーを加えても粒子サイズに影響しなかった。疎水性スチレンスルホン酸基を含有するポリマーから作られたクラスタに対するクラスタサイズは１つの曲線に沿って減少し、疎水基を含まないクラスタでは異なる曲線に沿って減少した。
【０１３４】
例３：
【０１３５】
第２のポリマー付着材料の関数としての磁性ナノクラスタサイズ制御及び実験方法：
【０１３６】
磁性ナノ粒子を例２のように準備し、アクリル酸２５％と、ビニルスルホン酸５０％と、スチレンスルホン酸２５％から構成される１０ｋＤａのサイズの第１のポリマー０．８グラムで上記の方法により被覆した。各ケースにおいて、第２のポリマー被覆なしのサンプルと同様に表５に示すように分子量（ＭＷ）を変えた０．３グラムのポリマーを用いて同様に第２のポリマー被覆を達成した。例２においてそうであったように動的光散乱が達成された。
【表５】
2007528784.tif 000010
【０１３７】
結果
【０１３８】
２次被覆の分子サイズが比較的小さかったときには（＜１５ｋＤａ）、２次ＰＡＡ被覆されたクラスタのサイズは２次被覆なしのものと有意には異ならなかった（図４）。しかし、２次被覆の分子サイズがより大きかったときには、クラスタはひとまとまりになり、より大きな凝集体を形成した。
【０１３９】
例４：
【０１４０】
ポリマー被覆磁性ナノクラスタ材料を用いたタンパク質精製及び実験方法：
【０１４１】
アクリル酸２５％と、ビニルスルホン酸５０％と、スチレンスルホン酸２５％から構成される０．８グラムまたはサイズが１０ｋＤａのポリマーから構成される第１の被覆により本明細書中で述べているようにナノクラスタを構築した。第２の被覆は、ポリ（アクリル酸）から構成される０．３グラム、サイズ５ｋＤａのポリマー２から構成されていた。
【０１４２】
０．２〜１．４ ｍｇ／ｍｌの濃度のチトクロームＣ（ｐＩ＝１０．３）を洗浄した（過剰のポリマー及び塩を除去した）磁性ナノクラスタと混合し、最終濃度１．０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７〜８の５ｍＭのＴＥＳ緩衝液を準備した。サンプルを１０分間平衡化し、ＨＧＭＳカラムを通過させ、ここで非結合タンパク質を捕集した。その後、磁性流体を０．５ＭのＮａＣｌで再懸濁し、再びカラムを通過させ、溶離したタンパク質を捕集した。その後、磁性流体を純粋中に再懸濁した。４１２ｎｍの吸光度で結合及び溶離したタンパク質濃度をモニタした。
【０１４３】
ＳＧフランツ社（S. G. Frantz Co., Inc. (Trenton, NJ)）製のＬ−１ＣＮ型フランツ・カニスタ・セパレータ（Frantz Canister Separator）を用いて高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）実験を行った。ＨＧＭＳシステムは、同じくＳＧフランツ社製の４３０型の細粒ステンレススチールウール（直径４０〜６６ｍｍ）が詰まった内半径０．３３２ｃｍ、長さ５．８ｃｍ（体積２ｃｍ３）の円柱形ガラスカラムから構成されていた。詰め物は０．２５ｃｍ３を占めていたので、詰め物の割合は１２．５％であった。取り付けられた電磁石により、カラムを通過する流れの方向を横断する磁場の方向を有する磁場を発生させた。２枚のプレート間に発生した磁束密度は、手持ち式の磁力計で測定したところ１．３Ｔであった。
【０１４４】
電磁石をオンにして２０ｍＬの希薄磁性流体をカラムに通過させることによって粒子の磁気濾過を行った。この体積は１２カラム体積に等しいので、捕捉された粒子は永久に捕捉されると想定された。蠕動ポンプで液体を１．４ｍＬ／分でポンピングした。その後、磁石をオフにし、２０ｍＬの水をカラムに通過させて、洗浄した粒子を捕集及び再懸濁した。磁気洗浄中に出て行く粒子の割合は、濾過液中のＦｅ３Ｏ４濃度を測定した化学的な鉄滴定［Yoe, J. H.; Jones, L. Colorimetric Determination of Iron with Disodium-1,2-dihydroxybenzene-3, 5-disulfonate. Ind. Eng. Chem. 1944,16, 111-115］により判定した。
【０１４５】
結果
【０１４６】
上述の多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子のためにＨＧＭＳを効率的に用いることができるかを判定するために、結合等温式（binding isotherm）のアセスメントを行った。非結合濃度の関数としての結合タンパク質の割合を図５ａに示すが、最大受容能は磁性流体１ｇ当たり１６４０ｍｇであった。粒子密度１．３ｇ／ｍｌでは、これは支持体の８４０ｍｇ／ｍｌに等しいが、この値は多孔性支持体の最大結合受容能（約１５０ｍｇ／ｍＬ）よりもかなり高い。受容能は、図５ｂに示されるように、静電相互作用に対して期待されるように、Ｉ０．５で線形に減少する。０．５ＮａＣｌでのタンパク質の溶離は、図５ｃに示すようにほぼ定量的である。
【０１４７】
多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子が効率的なＨＧＭＳ捕捉をもたらすことを判定するために、生成した磁性流体の多くにＨＧＭＳ濾過を行った。ポリマー架橋によって付着される粒子とコアからコアへの接触（core-to-core contact）によって形成されるクラスタ両方に対して粒子の捕捉を粒子サイズの関数として図５ｄに示す。コアからコアへの接触によって形成されるときには約６０ｎｍ以上のクラスタに対して捕捉はほぼ完全であることが図５ｄから分かる。
【０１４８】
流体が再使用可能であり得るかどうか、即ち完全なＨＧＭＳ捕捉及び再懸濁安定性が達成され得ることを判定することも興味深い。タンパク質は多価イオンのように作用し、従って高塩濃度のようにコロイドを凝集する傾向があるので、粒子が再使用のために十分に安定したものであるように高臨界凝固濃度が必要とされる。図５ｅは、より多くの２次ポリマーが加えられるとき、タンパク質の吸着／脱着サイクル１サイクル後に再使用のために利用可能である粒子の割合を示す。現行システムにおいて検査した全ての組合せの中では１８％の再使用が最大であった。その一方で、十分な第２のポリマーが加えられたときには全部の再使用が可能であった。
【０１４９】
例５：
【０１５０】
発現タンパク質の精製
【０１５１】
清澄化されていない（unclarified）発酵ブロスからのタンパク質の回収は、図６に概略を示したような手順によって達成されることができる。上記した実施形態のいずれかに従って多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子を生成することができ、磁性ナノクラスタを発酵ブロスに直接加えることができる。この発酵ブロスでは所望のタンパク質が吸着される。その後、溶液を高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）装置に通過させ、所望のタンパク質と共に磁性クラスタを捕捉する。
【０１５２】
例６：
【０１５３】
全細胞ブロスからのタンパク質精製
【０１５４】
全細胞ブロス（whole cell broth）からのタンパク質回収が磁性ナノクラスタにより達成され得るかを判定するために、ドロソマイシン（drosomycin）を発現するピキア・パストリス（Pichia Pastoris）細胞を３０℃でＢＭＧＹ培地（酵母抽出物１％、ペプトン２％、酵母窒素ベース１．３４％、ビオチン４×１０−５％、グリセロール１％、リン酸カルシウム１００ｍＭ、ｐＨ５．０）を入れた振盪フラスコ内で１６時間インキュベートした。２０％以上の溶存酸素含量を維持するために純酸素を補充した空気流量１ｖｖｍの１５５を用いて３０℃で発酵を行った。水酸化アンモニウム（３０％ｗ／ｖ）によりｐＨを５に維持した。撹拌は、過剰な発泡が観察されない最大速度、典型的には５００ｒｐｍで行った。
【０１５５】
発酵ブロスをエッペンドルフ（Eppendorf）５８１０Ｒ遠心分離機において４０００ｒｐｍで３０分間遠心し、細胞を除去した。清澄化されたブロスを再希釈し、細胞体積に因る体積損失を補った。その後、１０ＭＨＣｌによりブロスのｐＨを典型的には３の値に調整した。４ｍＬの発酵ブロスを、多様なマグネタイト含量を持つ１ｍＬの磁性流体と混合した。その後、混合物にＨＧＭＳカラムを通過させ、そこで非結合割合を捕集した。磁石をオンにしたまま、１カラム体積の５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝３）によりカラムを洗浄した。その後、磁石をオフにし、所望の溶出緩衝液によりナノクラスタを溶離させた。このナノクラスタを再びＨＧＭＳにより捕捉し、溶離したタンパク質を捕集した。
【０１５６】
ナノクラスタは、発現タンパク質即ちドロソマイシンに結合するよりも強く細胞に結合したが（図７ａ）、このことは細胞分離のために様々な用途を提供する。これに関連して、全細胞表面電荷が結合において役割を果たしたかどうかを判定するためにアニオン性及びカチオン性ナノクラスタの両方を検査した。アニオン性ナノクラスタを使用すると、結合はより強くなった。従って、異種細胞表面電荷は、両電荷のナノクラスタが結合することを可能にする。
【０１５７】
結合機構を描写するために、細胞及びナノクラスタのゼータ電位を測定した。図７ｂは、細胞及びナノクラスタは共に、全ての観察された適切なｐＨ値で全負電荷であったことを示す。このことは、結合が全細胞電荷ではなく局部的な正電荷に起因するものであったことを示している。酵母細胞表面は、多糖、タンパク質及びリン脂質の複合体混合物であり、十中八九はタンパク質である正電荷基を細胞表面上に有する。タンパク質の電荷はｐＨへの依存度が高いので、細胞へのナノクラスタの結合はｐＨの強関数であると期待される。「平均的タンパク質」の電荷対ｐＨを図８ａに示すが、これは、ドロソマイシンと同じサイズのタンパク質であるが大腸菌中のアミノ酸の全存在量に等しいアミノ酸成分を有すると仮定している（Lehninger, A. L., Biochemstry. 2nd edition ed. 1975, New York: Worth Publishers）。曲線は、理論上のものであり、アミノ酸残基は単離されたアミノ酸と同じｐＫａ値を有すると仮定して得られた。ドロソマイシンは、平均的なタンパク質の電荷と著しく異なる電荷を有するわけではないので、細胞表面タンパク質を含む他のタンパク質を結合することなく結合するのが難しい標的であることに留意されたい。リゾチームなどの強カチオン性タンパク質は、著しく異なる電荷対ｐＨの挙動を示す。
【０１５８】
細胞へのナノクラスタの結合は、強いｐＨ依存性を示した。このことは、ナノクラスタに結合した荷電基が十中八九タンパク質であったことを示している。結合のｐＨ依存性は、図８ｂに示すように、ドロソマイシン及び「平均的タンパク質」の電荷を反映する。
【０１５９】
細胞を全ての細胞外タンパク質から遠心分離によって単離し、タンパク質不含緩衝液中での再懸濁の前にｐＨ１０のカーボネート緩衝液で数回洗浄することにより、クラスタ形成の原因が架橋剤として働くような結合したドロソマイシンである可能性をなくした。これらの条件下では、ナノクラスタは尚も低ｐＨでは強く、高ｐＨでは弱く細胞に結合する。このことは、結合タンパク質が細胞表面の一部であったことを示している。
【０１６０】
ナノクラスタ架橋が細胞−ナノクラスタ結合の支配的機構でないことを更に検証するために、発酵ブロスにリゾチーム及びチトクロームＣを加えた。これらのタンパク質のいずれか、特にリゾチームが存在していたとき、高ｐＨ値でのタンパク質媒介架橋（protein mediated crosslinking）に因り、ナノクラスタは尚も可逆的に凝塊形成した。しかしながら、吸着タンパク質が存在するようなより高ｐＨでは、ナノクラスタは図８ｃに示すように細胞に結合せず、それどころか吸着タンパク質が存在するときにはナノクラスタに結合する細胞の割合が僅かに減少する。細胞へのナノクラスタの結合の支配的機構は、ドロソマイシンと同じ条件下で結合するピキア・パストリスの表面タンパク質によるものであるようである。
【０１６１】
ナノクラスタ−細胞結合はタンパク質結合の結果であったので、ドロソマイシンに対する結合の特異性を向上させるために幾つかの試みを行った。最初の試みは、疎水性相互作用を低下させるために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トウィーン２０、プルロニックＦ‐６８などの界面活性剤を用いることであった。結果は表６にまとめたが、界面活性剤を加えることは細胞−ナノ粒子結合を減らす効果的な方法ではないことが分かった。極性有機化合物を用い、他の磁性流体合成経路によりタンパク質吸着を立体的に邪魔する（立体障害）などの幾つかの他の試みを試みたが、細胞表面タンパク質は、アセスメントを行った条件下ではドロソマイシンよりも強く結合することが分かった。
【表６】
2007528784.tif 000011
【０１６２】
例７
【０１６３】
ナノクラスタ−細胞結合のためのモデル
【０１６４】
例６は細胞表面タンパク質がナノ粒子−細胞結合に関与することを示したが、全細胞電荷が負であるときには小さな局部的な正電荷のパッチが結合のために十分である可能性があることはさらに驚くべきことである。酵母細胞は通常はカチオン交換樹脂に結合しないが、哺乳類細胞が低ｐＨで負電荷のクロマトグラフィ支持体に結合することが報告されている。ナノクラスタの結合増加の最も可能性の高い理由は、クロマトグラフィ支持体よりナノクラスタの曲率がずっと大きいことであった。以下に概説しかつ図９に概略的に示すように、異なる直径の荷電球体間の静電相互作用に基づき、この相互作用のための単純なモデルを考案した。
【０１６５】
異なる直径の荷電球体間の相互作用は、クラスタ群と単一のナノクラスタ間の相互作用に対してホッグら（Hogg et al.）によって与えられた式（Trans. Faraday Soc. 1966,62: 1638）により表すことができる。
2007528784.tif 000012
ここで、sは粒子間の表面分離距離、Ψ∞は単離した粒子の表面電位であって近似的には粒子のゼータ電位、κはデバイ長の逆数、εは誘電率、ε０は自由空間の誘電率、Ｒ１及びＲ２は相互作用する粒子の直径である。式７−１をよく見ると、静電位はより小さな粒子に支配されている。
【０１６６】
例えばＲ１＞＞Ｒ２であれば、括弧内の項については
2007528784.tif 000013
である。
【０１６７】
タンパク質が直径４ｎｍの球体であり、ナノクラスタが半径５０ｎｍの球体であり、細胞が５μｍの直径を有し、タンパク質の表面が細胞表面から２ｎｍ突出すると仮定すれば、相互作用エネルギーを計算することができる。細胞及びナノ粒子の電荷（Ψ∞）を−３０ｍＶと仮定する。一方で、タンパク質は３０ｍＶの電荷を有する。イオン強度を０．４と仮定し、全電位（total potential）を、簡単に、ナノクラスタと単離タンパク質の電位に加えられたナノクラスタと単離細胞の相互作用であると仮定する。
【０１６８】
この単純なモデルの結果を図１０に示す。細胞及びタンパク質のナノクラスタとの相互作用エネルギーは引力的であり、結合が期待される。ナノ粒子の直径が典型的なクロマトグラフィ支持体の直径１００μｍに置き換えられると、相互作用は強い斥力相互作用になる。ナノクラスタもクロマトグラフィ・ビーズもタンパク質より大きく、引力はタンパク質の半径に対応するので、タンパク質とナノクラスタ間、タンパク質とクロマトグラフィ・ビーズ間の引力相互作用は本質的に同じである。しかし、細胞とナノクラスタ間の斥力はナノクラスタ半径に対応し、細胞とクロマトグラフィ支持体間の反発力（細胞直径に対応する）よりもずっと小さい。
【０１６９】
この単純なモデルの結果は、ナノクラスタのサイズが小さく発酵ブロスのイオン強度が高いために、ナノクラスタは遊離のタンパク質に引きつけられるのと同じくらい強力に細胞表面タンパク質に引きつけられることになることを示している。調べた条件下では、細胞表面タンパク質を引きつけない状態で、標的にされたタンパク質を捕捉することができる場合にかぎり、全細胞ブロスにおいて分離を行うことができる。
【０１７０】
ドロソマイシンなど強カチオン性ではないタンパク質を他の細胞外タンパク質から精製すること（多くのタンパク質を結合し、ドロソマイシンを選択的に溶離すること）は、細胞表面タンパク質も結合されるのであるから、調べた条件下では全細胞ブロスにおいて効果的であることはないであろう。この発見は、分離をデザインするための根拠を与え、一段階精製の場合に粒子と所望のタンパク質間の非常に特異的な相互作用が存在するに違いないことを示す。疎水性が低く、ドロソマイシンの電荷対ｐＨがほぼ平均的であるので、ドロソマイシンと、ドロソマイシンのみが他の表面修飾なしに疎水性荷電表面に結合される何らかの状態が存在するとは考えにくい。しかし、ある種のタンパク質は、平均的挙動からかなり大きく外れ、これらの未修飾のナノクラスタにより一段階で全細胞ブロスから分離されることができる。
【０１７１】
２００μｇ／ｍＬのリゾチームを含むｐＨ７に調整されたピキア・パストリス・ブロスについても同様にアセスメントを行った。磁性ナノクラスタ（０．４ｗｔ％）をブロスに加え、標準的な分離処理を実行した。供給原料中のリゾチーム活性及び非結合割合を測定したところ、リゾチームの結合率が２５％であることを示した。リゾチームを０．２ＭのＭｇＣｌ２で溶離したところ、元のリゾチーム活性の１９％が回復された。１カラム体積の洗浄緩衝液を加えたときにＨＧＭＳカラムに細胞の約４％しか保持されなかったが、このことは、実際に、一段階で全細胞ブロスから比較的純粋な成分としてタンパク質を回収できることを示している。
【０１７２】
例８
【０１７３】
磁性ナノクラスタによるウイルスクリアランス
【０１７４】
例７において、全細胞電荷がナノクラスタをはねつける状態でもナノクラスタが細胞に結合することが分かった。細胞表面上の突出したタンパク質とナノクラスタ間の相互作用エネルギーに基づく単純なモデルを創り出した。そして、より大きなミクロンサイズのクロマトグラフィ・ビーズが結合しない状態でもナノクラスタは細胞に結合することが示された。これは全細胞ブロスにおけるタンパク質分離にとっては芳しくない結果であるが、ナノクラスタをはねつける全電荷と実体（entity）を結合する場合には有用であることが示されるかもしれない。ここでは、ナノクラスタと、伝統的なクロマトグラフィ・ビーズの両方に対して、ウイルス表面上でのタンパク質結合によるウイルス除去の例を調べる。
【０１７５】
例７のモデルとは違って、ここでの目標はナノクラスタに結合したウイルス粒子の割合を定量的に予想することであった。例７のように総エネルギーを計算するよりもむしろ、既知の遊離タンパク質平衡結合を、ナノクラスタが同じ電荷のウイルス表面に及ぼす静電反発力に変更する。
【０１７６】
反発エネルギーは
【数１】
2007528784.tif 000014
である。ここで、sは粒子間の表面分離距離、Ψ∞は単離した粒子の表面電位であって近似的には粒子のゼータ電位、κはデバイ長の逆数、εは誘電率、ε０は自由空間の誘電率、Ｒｖはウイルスの直径、Ｒｃはクラスタの直径である。この反発エネルギーを用いて、sをタンパク質の半径に等しい値に設定することによって遊離のタンパク質及び表面上のタンパク質に対する粒子の相対親和性を求めることができる。
【０１７７】
タンパク質結合に対する全体的な反応は、
【数２】
2007528784.tif 000015
である。ここで、Ｐはタンパク質、Ｉは交換されたイオン、ｚは交換されたイオンの数であり、添字ｓは溶液中のタンパク質またはイオンを表し、添字ｂは結合種を表す。遊離のタンパク質（ウイルス表面上にない）に対する平衡定数は、従って
【数３】
2007528784.tif 000016
であり、結合タンパク質と遊離タンパク質の比は、
【数４】
2007528784.tif 000017
である。
【０１７８】
残りの分析のために、結合がイオン濃度を有意に変えることがないように結合タンパク質によって覆われるナノクラスタ表面の割合は十分に小さく、イオン強度は高いと仮定する。ゆえに、結合タンパク質と遊離のタンパク質の比は平衡定数に比例する。
【０１７９】
ウイルスタンパク質とナノクラスタのための結合の自由エネルギーが単に、遊離のタンパク質とナノクラスタ＋静電相互作用の結合の自由エネルギーであると仮定すると、同じ条件下で結合した遊離のタンパク質の割合から結合したウイルスタンパク質の割合を推定することが可能である。
【数５】
2007528784.tif 000018
【０１８０】
ウイルス表面上のタンパク質に対する平衡定数は、
【数６】
2007528784.tif 000019
である。ここで、ｕｅは式１から得られる。平衡定数の比、ひいては遊離のタンパク質と比べたウイルス上の結合／遊離タンパク質の比は、
【数７】
2007528784.tif 000020
である。
【０１８１】
低ナノクラスタ被覆率での遊離のタンパク質（ｍｇ／ｍＬ）対結合タンパク質（ｍｇ／ｇ粒子）の比は、ドロソマイシンとチトクロームＣの結合等温式からそれぞれ０．２及び０．４のイオン強度で０．８３及び０．１５であることが知られている。環境のイオン強度は０．３Ｍであると仮定する。平衡定数がＩ０．５の一次関数であると仮定すると、溶液中の結合タンパク質対非結合タンパク質の比は０．４５である。
【０１８２】
ウイルスは表面上に多くのタンパク質を有するがウイルスに結合する必要があるナノクラスタは１つしかないので、ナノクラスタが結合されていないウイルスの割合は
【数８】
2007528784.tif 000021
である。
【０１８３】
従って、ウイルスクリアランスを対数減少で表すと、
【数９】
2007528784.tif 000022
となる。
【０１８４】
これらのモデルを用いて、自由溶液からのタンパク質の吸着に対する既知の平衡及び単純な静電モデルから対数減少を計算することができる。
【０１８５】
ウイルスとナノクラスタ間の結合をモデリングする第一歩は、幾つかの重要なパラメータを推定することである。基本ケースとして、ウイルスの直径を１００ｎｍに設定し、タンパク質の直径を４ｎｍに、タンパク質である表面の割合を２％に、磁性ナノクラスタ濃度を０．１ｗｔ％に、ナノクラスタサイズ２０、５０、及び１００ｎｍでのイオン強度を０．３Ｍに、クロマトグラフィ・ビーズのサイズを１００μｍに設定した。その後、これらのパラメータを全てこの基本ケースのものと違うものにした。全てのケースにおいて、ウイルス、ナノクラスタ及びクロマトグラフィ・ビーズは−３０ｍＶのゼータ電位を有する。
【０１８６】
この分析は主にナノクラスタ結合が伝統的なクロマトグラフィより好ましいかどうかを調べるためのものであるので、調査した第１の変数は、図１１に示されるように粒子直径であった。タンパク質結合は粒子サイズに影響されないが、静電反発力は粒子サイズの増大につれて大きくなるので、ナノ粒子が小さければ対数減少はかなり大きい。調査したサイズでより小さなものは２０ｎｍであったが、これは単一のナノ粒子を表す。２０ｎｍのマグネタイト粒子はＨＧＭＳにより捕捉されることができないが、本発明の他の実施形態において、単一のナノ粒子として捕捉されることができるようなコバルト−フェライトまたは鉄で構成されるナノ粒子を用いることが可能である。
【０１８７】
ウイルスのサイズはかなり変わる可能性があるので、ウイルスサイズの効果も図１２に示すように形に表した。ウイルスサイズが増大するにつれて表面上のタンパク質の合計数が増加し、これが式８中のｎと、ウイルスクリアランスを増加させた。しかし、クロマトグラフィ・ビーズを用いたときには静電反発力はウイルスのサイズにおおよそ比例し、ウイルスサイズが増大するにつれて平衡定数は低下した。クロマトグラフィ・ビーズを用いたところ、ウイルスサイズにトレードオフがあり、最大ウイルスクリアランスが約７０ｎｍで検出された。ナノクラスタはウイルスとほぼ同じサイズであった。ウイルスサイズを増大させても静電反発力を大幅には増加させず、ウイルスが大きければより容易に排除することができる。
【０１８８】
磁性ナノクラスタ濃度が増加するにつれて結合タンパク質の割合が増加し、そのことがウイルス結合を増加させる。ウイルスクリアランスが増加と、結合した遊離のタンパク質の量も増加するので、トレードオフが期待される。全ての計算は、ナノクラスタ上の結合部位が総結合タンパク質よりずっと高いと仮定して行った。高い遊離タンパク質濃度が存在するときには、この概算は破綻を来すことになり、高被覆率での結合を計算することが必要になる。しかしながら、磁性ナノ粒子濃度が大きくなるにつれてより多くのタンパク質とウイルスが結合するという基本原則は概ねあてはまる（図１３）。
【０１８９】
前述の計算は、カラムクロマトグラフィがうまくいかない状況で磁性ナノクラスタによって実際にウイルスが結合されることができることを示した。
【０１９０】
しかしながら、ナノクラスタ結合ウイルスは、他のタンパク質とともにある。必要なものは、遊離タンパク質を結合することなくウイルスを結合する手段、または両者を結合するが遊離タンパク質を優先的に溶離する手段である。
【０１９１】
しかしながら、ウイルス結合のイオン強度依存性を計算するときには、純粋イオン結合が想定される（即ち疎水性相互作用がない）ときでさえも、ウイルスの結合はイオン強度の増加につれて増加するが、結合した遊離タンパク質の割合は劇的に低下する。これは、イオン強度の増加によって低下する静電反発力に起因する。
【０１９２】
よって、０．３Ｍのイオン強度では１００ｎｍのウイルスの９９．９％以上が５０ｎｍのナノクラスタに結合されるが、ナノクラスタとの複数の相互作用のために遊離のタンパク質の３０％以下が結合される。従って、０．３Ｍで結合が行われれば、タンパク質の７０％は非結合であるがウイルスを３対数減少させることができる。０．３ＭのＮａＣｌによりナノクラスタを繰り返し溶離すると、ウイルスの０．１％のみが失われることになるがタンパク質の７０％は回収されることになり、そのような溶離が数回行われた後では、ほぼ全てのウイルスは捕捉されることになるがほぼ全てのタンパク質は溶離されることになる（図１４）。
【０１９３】
図１５及び１６に示すように、他の推定されたパラメータの効果が果たされた。タンパク質である表面の割合が増加するにつれて、ウイルスクリアランスが増加する。表面上のタンパク質が一定の表面被覆率（fractional surface coverage）で大きくなるにつれて、タンパク質は表面から更に突出し、従って静電反発力は低下するが、合計数は減少し、クリアランスは低下する。
【０１９４】
モデルの結果に基づけば、分離方法の一実施形態は以下のとおりであることがある。
１．タンパク質とウイルスの混合物に磁性ナノクラスタを加える
２．溶液にＨＧＭＳを通過させる
３．タンパク質が溶離しなくなるまで高イオン強度（約０．３Ｍ ＮａＣｌ）の溶液によってカラムを洗浄する
４．高ｐＨ、低イオン強度の溶液によってナノクラスタを溶離し、ウイルスを除去する
【０１９５】
この分離方法の一実施形態においては、タンパク質とナノクラスタ間に疎水性相互作用がないので、高イオン強度緩衝液がタンパク質を溶離する。ナノ粒子は、この態様によれば、疎水性領域を有しないポリマーから作られる。このようにして、例えば、ビニルスルホン酸／アクリル酸のコポリマーが用いられることがあり、ＰＥＯ殻はＰＰＯを有しないことになる。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、多層ポリマー被覆磁性ナノクラスタ合成の方法を概略的に示す。ポリマーの存在下で塩基によって鉄イオンを沈降させ、ナノクラスタを形成する。クラスタを安定化するために第２のポリマーを加える。
【図２ａ】ポリマー１の一実施形態の合成を示す。モノマーは、超常磁性粒子（この場合はマグネタイト）をそのカルボン酸官能基に付着するアニオン性ポリマーを形成するために重合されるフリーラジカルである。
【図２ｂ】ポリマー２の一実施形態の合成を示す。モノマーは、超常磁性粒子（この場合はマグネタイト）をそのカルボン酸官能基に付着するアニオン性ポリマーを形成するために重合されるフリーラジカルである。
【図２ｃ】ポリマー３の合成の一実施形態を示す。ここでは、アミド化反応によりアミノ端ＰＥＯ及びＰＰＯ側鎖をＰＡＡ主鎖に付着させることによってグラフトコポリマーが合成される。ＣＯＯＨ基の大部分は、次に行われるマグネタイト・ナノ粒子への付着のために未反応のまま残される。
【図３】図３は、ポリマー１の量を制限することによって達成される粒子サイズ制御を示す。ポリマー１の量が十分に少ないとき、ポリマー１中のカルボキシル基対溶液中のマグネタイト粒子中の鉄イオンのモル比の関数として粒子直径をプロットすることによって証明されるように、効率的なＨＧＭＳ捕捉のために十分大きな（＞５０ｎｍ）クラスタが形成される。
【図４】図４は、粒子サイズ制御がポリマー２の分子サイズの関数であり得ることを示している。ポリアクリル酸２次ポリマーの分子サイズ対粒子サイズをプロットすると、種々のサイズの凝集体の形成が実証される。その上に架橋が生じるような粒子サイズの最小の変化が１５ｋＤａ以下のポリマー２分子量で見られた。
【図５ａ】図５は、多層ポリマー被覆磁性ナノ粒子に吸着されるタンパク質のためにＨＧＭＳを用いるタンパク質精製を示す。図５ａは、磁性ナノクラスタ上のチトクロームＣに対する結合等温式（２５℃ ｐＨ＝７）である。ＮａＣｌを加えて幾つかのイオン強度で結合を行った。
【図５ｂ】磁性ナノクラスタに対する最大結合受容能をイオン強度の関数として示す。
【図５ｃ】０．５ＭのＮａＣｌによる結合タンパク質の溶離を示す。タンパク質のほぼ定量的な回収は、０．５ＭのＮａＣｌにより得られる。
【図５ｄ】ＨＧＭＳによるナノクラスタの捕捉率を粒子サイズの関数として示す。十分な捕捉のために約４０ｎｍ以上のクラスタが必要である。
【図５ｅ】結合／捕捉／脱着サイクル１サイクル後に安定しているままである磁性ナノクラスタのパーセンテージを示す。再使用のために十分な安定性を与えるために、２次ポリマーを加えることが必要である。
【図６】図６は、清澄化されていない発酵ブロスからのタンパク質の回収のための方法を概略的に示す。磁性ナノクラスタは発酵ブロスに直接加えられるが、この発酵ブロスでは所望のタンパク質が吸着される。その後、溶液を高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）装置に通過させ、所望のタンパク質と共に磁性クラスタを捕捉する。
【図７ａ】図７は、発酵ブロス中のナノクラスタに結合する細胞を示す。図７ａは、発酵ブロス中の磁性ナノクラスタへの細胞及びドロソマイシンの結合を示すグラフである。ｐＨ＝３では、ナノクラスタはドロソマイシンに結合するよりもずっと強力に細胞に結合し、清澄化されていないブロス中で使用できないようにされる。正電荷のナノクラスタは、負電荷のナノクラスタよりも一層強く細胞に結合する。
【図７ｂ】発酵ブロス中のナノクラスタ及び細胞のゼータ電位をグラフで示す。ナノクラスタ及び細胞は共に、結合のために検査した全てのｐＨ値で全負電荷である。このことは、結合が表面上の正電荷のパッチに起因することを示している。
【図８ａ】図８は、磁性ナノクラスタに結合する細胞のｐＨ効果を示す。図８ａは、タンパク質の電荷対ｐＨを示すグラフである。アミノ酸配列に基づき、ドロソマイシン及び平均的タンパク質（大腸菌中の全アミノ酸存在量に等しい全てのアミノ酸成分を有する [Lehninger, A. L., Biochemistry. 2nd edition ed. 1975, New York: Worth Publishers]）に対する電荷は似ており、細胞結合とよく合う。
【図８ｂ】発酵ブロス中の磁性ナノクラスタ（０．１２ｗｔ％）への細胞の結合をｐＨの関数として示す。ナノクラスタは、低ｐＨでは細胞に強く結合し、高ｐＨでは辛うじて弱く結合するが、これは表面上のタンパク質が結合に関与することを示している。表面から全てのタンパク質を脱着するために細胞をｐＨ＝１０で３回洗浄した後、結合は尚も発生する。このことは、タンパク質が細胞壁の一部であり、表面上で吸着されるドロソマイシンではないことを示している。
【図８ｃ】磁性ナノクラスタに結合した細胞であって他の高ｐＩタンパク質を加えたものをｐＨの関数として示す。リゾチームまたはチトクロームＣを加えるとき、細胞結合は本質的に不変であり、たとえｐＨ＞６であっても磁性ナノクラスタはリゾチームを加えると可逆的に凝結するがリゾチームなしではそうはならない。このことは、結合がフロック（floc）中の物理的捕獲ではないことと、吸着されたタンパク質が細胞結合に関与しないことを示している。
【図９】図９は、表面上にタンパク質を有する酵母細胞とナノクラスタ間の相互作用エネルギーのモデルを概略的に示す。これらは全て球体であり、タンパク質の半分が酵母表面から出ているので酵母細胞よりも粒子に近いと仮定する。高いイオン強度及びナノクラスタの曲率に因り、全体的な相互作用は、たとえ酵母表面と粒子が同じ電荷であっても引力相互作用である可能性がある。
【図１０】図１０は、式６‐１及び図９のモデルの結果を示すグラフである。タンパク質が４ｎｍ、クラスタが５０ｎｍ、細胞が５ｍｍで、イオン強度が０．４のとき、細胞ナノクラスタの相互作用は引力相互作用である。電荷が同じ１００ｍｍのクロマトグラフィ・ビーズをナノクラスタの代わりに置くと、ビーズの曲率が小さくなり、細胞表面との相互作用が強くなるので、相互作用は斥力相互作用である。
【図１１】図１１は、１００ｎｍ及び５０ｎｍのウイルスに対してウイルスの対数減少の計算値をクラスタサイズの関数として示すグラフである。クラスタが小さければ小さいほど、ウイルス表面との静電反発力が小さいので、ウイルスに対する親和性が高くなる。
【図１２】図１２は、対数減少に対するウイルスサイズの影響を示すグラフである。ウイルスが大きければ大きいほど、結合されるタンパク質部位は大きく、従ってナノクラスタ結合を有する可能性が高くなる。一方で、クロマトグラフィ・ビーズが大きければ大きいほど、より大きなウイルス粒子との静電反発力が強くなり、約７０ｎｍで最大クリアランスに到達する。
【図１３】図１３は、結合が線形応答を示す領域（linear regime）にあるという仮定の下で、ウイルスクリアランスに対する磁性ナノクラスタ濃度の影響を示すグラフである。ナノクラスタ濃度が低下するにつれて、結合したウイルスの割合が増大する。
【図１４】図１４は、ウイルス結合に対するイオン強度の影響を示すグラフである。イオン強度が増すにつれて、タンパク質結合親和性が低下するが、静電反発力もまた低下する。よって、より高いイオン強度では、ほとんどのタンパク質は結合しないことになるが、ほとんどのウイルスは多点相互作用のために結合することになる。結合したナノ粒子を高イオン強度緩衝液により洗浄すると、ウイルスを保持しつつ結合タンパク質を溶離することになる。
【図１５】図１５は、ウイルスクリアランスをタンパク質表面密度の関数として示している。表面に存在するタンパク質が多ければ、結合したウイルス粒子の割合が増大する。
【図１６】図１６は、ウイルスクリアランスに対するタンパク質サイズの効果を示すグラフである。表面上のタンパク質が大きくなるにつれて、特に大きな粒子に対して、静電反発力が低下する。表面上のタンパク質の総数も減少して、全体的な結合を減少させる。
【図１】
2007528784.tif 000023
【図２ａ】
2007528784.tif 000024
【図２ｂ】
2007528784.tif 000025
【図２ｃ】
2007528784.tif 000026
【図３】
2007528784.tif 000027
【図４】
2007528784.tif 000028
【図５ａ】
2007528784.tif 000029
【図５ｂ】
2007528784.tif 000030
【図５ｃ】
2007528784.tif 000031
【図５ｄ】
2007528784.tif 000032
【図５ｅ】
2007528784.tif 000033
【図６】
2007528784.tif 000034
【図７ａ】
2007528784.tif 000035
【図７ｂ】
2007528784.tif 000036
【図８ａ】
2007528784.tif 000037
【図８ｂ】
2007528784.tif 000038
【図８ｃ】
2007528784.tif 000039
【図９】
2007528784.tif 000040
【図１０】
2007528784.tif 000041
【図１１】
2007528784.tif 000042
【図１２】
2007528784.tif 000043
【図１３】
2007528784.tif 000044
【図１４】
2007528784.tif 000045
【図１５】
2007528784.tif 000046
【図１６】
2007528784.tif 000047
【国際調査報告】
2007528784.tif 000048