(57)【要約】  本発明は、配列番号１のうち少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列を含む、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得られる単離されたポリヌクレオチド分子を開示する。さらに本発明は、高収率でのＬ−アスコルビン酸の製造方法、特に所定の炭素源をビタミンＣに転換できる微生物の休止細胞を使用する方法に関する。このようにして得られたビタミンＣは、精製工程および／または分離工程によってさらに加工処理されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のうち少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列を含むＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから誘導可能な単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列番号１の部分ヌクレオチド配列が、少なくとも５０個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
配列番号１の部分ヌクレオチド配列が、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
部分ヌクレオチド配列が、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを比較して、配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
部分ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項１〜４のいずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
部分ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項１〜５のいずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号１、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２６からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
部分ヌクレオチド配列が、配列番号５、６、７、８、９、１０、２３、および２４からなる群より選択される、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２、１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２７からなる群より選択される少なくとも２５個の連続するアミノ酸の部分アミノ酸配列を含む、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
部分アミノ酸配列が、少なくとも３５個の連続するアミノ酸を有する、請求項９または１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの発現のための組換えＤＮＡ分子であって、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２記載の組換えＤＮＡおよび／または請求項１３記載の発現ベクターで形質転換された組換え生物。
【請求項１５】
組換えＤＮＡが染色体に少なくとも部分的に組込まれている、請求項１４記載の組換え生物。
【請求項１６】
真菌細胞、植物細胞、動物細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項１４または１５記載の組換え生物。
【請求項１７】
生物がグルコノバクター（Gluconobacter）、アセトバクター（Acetobacter）、シュードモナス（Pseudomonas）およびエシェリキア（Escherichia）からなる群より選択される属の細菌である、請求項１６記載の組換え生物。
【請求項１８】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質からのＬ−アスコルビン酸の製造方法であって、
（ａ）適切な培地中で請求項１４〜１７のいずれか１項記載の組換え生物を増殖させ；そして
（ｂ）該培地からＬ−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。
【請求項１９】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質からのＬ−アスコルビン酸の製造方法であって、
（ａ）適切な培地中で請求項９記載のポリペプチドをコードする非組換え微生物を増殖させ；そして
（ｂ）該培地からＬ−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。
【請求項２０】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質を請求項９記載の単離されたポリペプチドと接触させることを含む、Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。
【請求項２１】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質からのＬ−アスコルビン酸の製造方法であって、
（ａ）適切な培地中で請求項１４〜１７のいずれか１項記載の生物の組換え体または請求項９記載のポリペプチドをコードする非組換え微生物を増殖させ；
（ｂ）Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離および精製し；
（ｃ）（ｂ）のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの存在下で該基質をインキュベートし；そして
（ｄ）反応混合物からＬ−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。
【請求項２２】
適切な培地中で請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む組換え生物を増殖し、細胞を破壊し、かつＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離する、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項２３】
適切な培地中で請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む非組換え微生物を増殖し、細胞を破壊し、かつＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離する、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項２４】
微生物の休止細胞を含む培地中で基質をビタミンＣに転換することを含む、ビタミンＣの製造方法。
【請求項２５】
（ａ）成長を可能にする条件下で微生物を培養し；
（ｂ）該微生物の成長速度を低減して休止細胞をもたらすような条件に変更し；そして
（ｃ）（ｂ）の休止細胞を使用して基質からビタミンＣを産生する
工程を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）および（ｃ）が、二つ以上の別個の容器において行われる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）および（ｃ）がいかなる洗浄工程および／または単離工程によっても隔てられない、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
微生物を、回分法、流加法、連続法、または半連続法で成長させる、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）を、回分法、流加法、連続法、または半連続法で行う、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
６００nmでのＯＤとして測定される、培地中の休止細胞の密度が少なくとも１０である、請求項２４〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
産生するビタミンＣの収量が、少なくとも１．８g/lである、請求項２４〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
微生物が、酵母、藻類、および細菌からなる群より選択される、請求項２４〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
微生物が、カンジダ（Candida）、サッカロミセス（Saccharomyces）、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、スキゾサッカロミセス（Scyzosaccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、クロレラ（Chlorella）、グルコノバクター、アセトバクターアセチ（Acetobacter aceti）、パントエア（Pantoea）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、シュードモナスおよびエシェリキアからなる群より選択される、請求項２４〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
基質が、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、２−ケト−Ｌ−グロナート、Ｄ−グルコナート、２−ケト−Ｄ−グルコナートおよび２，５−ジケト−グルコナートからなる群より選択される、請求項２４〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
基質からビタミンＣおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の両方を産生できる微生物を使用し、ビタミンＣおよび２−ＫＧＡの濃度の比が０．１を超える、請求項２４〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
培地からのビタミンＣの単離、および場合により一つまたは複数の精製工程をさらに含む、請求項１８〜２１または請求項２４〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
すべての精製工程が水性環境で行われる、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−ソルボソンをＬ−アスコルビン酸に直接転換する酵素をコードするポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチドに関する。その酵素であるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ（以下ＳＮＤＨａｉ）は、Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）を直接産生する。Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ（ＳＮＤＨａｉ）は、グルコノバクター（Gluconobacter）属およびアセトバクター（Acetobacter）属に属する細菌から得られた。本発明は、さらに高い収率でのＬ−アスコルビン酸の製造方法に関する。Ｌ−アスコルビン酸は、製薬業、食品工業および化粧品工業に広く使用されている。
【０００２】
過去７０年間、Ｌ−アスコルビン酸 (ビタミンＣ)は、周知のライヒシュタイン法によってＤ−グルコースから工業的に製造されている。この方法における全段階は、微生物変換によって実施される一工程（Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの転換）を除いて化学的である。Ｌ−アスコルビン酸の工業製造のための最初の実施以来、ライヒシュタイン法の効率性を改善するためにいくつかの化学的および技術的修正が用いられた。ビタミンＣの製造の最近の発展が、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Vol. A27 (1996), pp. 547ffに要約されている。近年、微生物またはそれから単離された酵素の助けを借りて、ビタミンＣ製造の種々の工程が行われている。
【０００３】
Ｌ−アスコルビン酸のための現行の製造方法は、高いエネルギー消費ならびに大量の有機溶媒および無機溶媒の使用などのいくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、過去１０年間にわたり、より経済的および生態学的であろう微生物転換を使用してＬ−アスコルビン酸を製造するための他のアプローチが研究された。いくつかの微生物ではＬ−アスコルビン酸の直接産生が報告された。
【０００４】
驚くことに、Ｇ．オキシダンス（G. oxydans）Ｎ４４−１から単離されたＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ（以下ＳＮＤＨａｉと呼ぶ）、またはグルコノバクター属およびアセトバクター属に属する酢酸菌に由来するそのオーソログである酵素を使用してＬ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸への直接転換を行えることが今や見いだされた。この反応を担う遺伝子が単離され、その配列が決定された。この遺伝子がコードするソルボソンデヒドロゲナーゼ酵素は、Ｌ−ソルボソンをＬ−アスコルビン酸に転換する。この酵素は、公知のＳＮＤＨ酵素とは異なる。
【０００５】
本明細書において相互交換可能に使用されるＬ−アスコルビン酸またはビタミンＣは、例えば未解離の遊離酸型または陰イオンとして解離した型のように、水溶液中でみられるＬ−アスコルビン酸の任意の化学形態でありうる。可溶化塩型のＬ−アスコルビン酸は、例えばカリウム、ナトリウム、アンモニウム、またはカルシウムのような発酵上清に通常みられるあらゆる種類の陽イオンの存在下での陰イオンとして特徴づけられうる。遊離酸型のＬ−アスコルビン酸の単離された結晶も含まれうる。一方、塩型のＬ−アスコルビン酸の単離された結晶は、対応する塩の名前で、すなわちアスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウムなどと呼ばれる。
【０００６】
Ｌ−ソルボソンからビタミンＣへの転換は、結果としてビタミンＣをもたらす基質の転換がＳＮＤＨａｉによって行われること、すなわちその基質がビタミンＣに直接転換されうることを意味する。
【０００７】
クローニングベクターは、例えば宿主細胞中で自律的に複製でき、かつ一つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位に特徴づけられるあらゆるプラスミドＤＮＡもしくはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列でありうる。その認識部位でベクターの本質的な生物学的機能を喪失せずに決定可能な方法でそのようなＤＮＡ配列を切断でき、ＤＮＡフラグメントを複製させるためにその認識部位にそのＤＮＡフラグメントをスプライスできる。クローニングベクターは、例えばそのクローニングベクターで形質転換された細胞の同定に使用するために適したマーカーをさらに含みうる。そのようなマーカーは、例えばテトラサイクリンまたはアンピシリンのような例えば抗生物質耐性を提供しうる。
【０００８】
発現ベクターは、例えば形質転換により宿主に導入された後に、その発現ベクターにクローニングされた遺伝子の発現を増強できるあらゆるベクターでありうる。クローニングされた遺伝子は通常、例えばプロモーター配列のようなある制御配列の制御下に置かれる（すなわち作動可能に連結する）。プロモーター配列は、構成性または誘導性のいずれかでありうる。
【０００９】
核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。例えば二本鎖核酸、一本鎖核酸、およびそのヌクレオシドのようなあらゆる形態が核酸分子として有用でありうる。例えばＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質ハイブリッド、ＲＮＡ−タンパク質ハイブリッド、およびＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドのようなハイブリッドも含まれる。ポリヌクレオチドは、いくつかの塩基、通常少なくとも２０個のヌクレオチド塩基からなる場合がある。
【００１０】
「相同性」という用語は、二つのポリヌクレオチド配列の類似性のことを意味する。相同性を決定するために、類似した領域を比較できるようにポリヌクレオチド配列を配置する。必要ならば、類似性を向上させるためにある位置のヌクレオチドをブランク位置に交換してもよい。例えば手作業で、または商業的に入手できるコンピュータプログラムを使用することによって、相同性の比較を行える。最大の相同性を得るために、好ましくはプログラムを標準条件で実行する。二つのヌクレオチド配列間の相同性または類似性の程度を、「％相同性」で示す。
【００１１】
変異は、例えば目的のヌクレオチド配列における単一塩基対の変更、挿入もしくは欠失、または例えばトランスポゾンのような遺伝子エレメントの挿入のような遺伝学的事象でありうる。
【００１２】
例えば微生物の染色体中または内在性プラスミド上の任意の位置に生じて変異の正確な部位が予想できないランダムに、すなわちランダム変異誘発のような種々の方法で、ＤＮＡへの変異の発生、すなわち変異誘発を行うことができる。例えば放射線照射、化学処理、または遺伝子エレメントの挿入のような作用因子によって引き起こされる、例えば物理的損傷の結果として、変異を発生させることもできる。
【００１３】
それぞれの遺伝子の開始コドンに隣接して位置し、一つまたは複数の近隣遺伝子の転写を開始するあらゆるＤＮＡ配列をプロモーターとして使用できる。一般にプロモーターは、それぞれの遺伝子の５′領域に位置しうる。プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターでありうる。誘導性プロモーターの場合、誘導剤に応答して転写率は増加する。構成性プロモーターの場合、転写率は例えば誘導剤によって調節されない。
【００１４】
「同一性」および「％同一性」という用語は、例えば以下に例示するような配列解析プログラムを使用した二つのアミノ酸配列の比較を意味する。「％同一である」は、比較されるアミノ酸配列の中で一致して同一のアミノ酸となっている対象のアミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。比較される両アミノ酸配列が、それらのアミノ酸のいずれとも相異しないならば、それらの配列は同一であるか、あるいは１００％の同一性を有する。
【００１５】
一態様において本発明は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの、配列番号１の部分ヌクレオチド配列を含む、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子から誘導可能な単離されたポリヌクレオチドに関する。このように本発明は、配列番号１の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列を含む、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得られる単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１のうち好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列を含む。配列番号１のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが最も好ましい。さらに最も好ましい態様は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１および２６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。その単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから誘導できる。配列番号１は、微生物であるグルコノバクターオキシダンスＮ４４−１から単離されたＳＮＤＨａｉの完全ヌクレオチド配列に相当する。そのような配列の部分を種々の目的に使用できる。例えば他の生物から単離された適切なポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーとして、例えば短鎖ポリヌクレオチドを使用できる。短鎖ポリヌクレオチドは、約１０〜約１００塩基対（ｂｐ）、通常約１４〜約５０ｂｐ、好ましくは約１７〜約３０ｂｐの範囲に入りうる。そのような短鎖ポリヌクレオチド配列の例は、配列番号５、６、７、８、９、１０、２３または２４によって表される。それよりも長鎖のポリヌクレオチドは、酵素活性を有するポリペプチドをコードしうる。例えばＳＮＤＨａｉは、酵素活性に使用できない膜貫通ドメインを有する。膜貫通ドメインを有さない酵素的に活性なタンパク質の領域をコードするポリヌクレオチド部分が発現するならば、そのようなポリペプチドは十分な酵素活性を有しうる。
【００１６】
単離されたポリヌクレオチド分子は、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドもコードする、より長鎖のポリヌクレオチド配列から通常は誘導される。そのようなポリヌクレオチドは、例えば細菌から単離されうる。好ましくはそれらのポリヌクレオチドは、Ｇ．オキシダンス、Ｇ．フラトゥリ（G. frateurii）、Ｇ．セリナス（G. cerinus）およびＡ．アセチ（A. aceti）を含むグルコノバクター属およびアセトバクター属に属する細菌から単離されるが、それらに限定されない。そのようなポリヌクレオチドが、より長鎖のポリヌクレオチド配列から誘導される場合、そのようなポリヌクレオチド配列と配列番号１との間の相同性を決定することが可能である。そのような場合に少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを有する領域が好ましくは選択され、他のポリヌクレオチドからの対応するストレッチをそれと比較できる。そのポリヌクレオチド配列および配列番号１から誘導可能な対応するストレッチが、１００個の連続するヌクレオチドを比較することによって例えば同一である６０個のヌクレオチドを有するならば、相同性は６０％である。このように、一態様において本発明は、本発明による単離されたポリヌクレオチドに関し、部分ヌクレオチド配列は、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドが比較されたとき配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導される。好ましくは、本発明の部分ポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。相同性の決定のために例えば少なくとも１００個のストレッチ、好ましくは３００個のストレッチ、さらに好ましくは少なくとも５００個の連続するヌクレオチドのストレッチを使用できる。
【００１７】
本発明は、Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生するための、グルコノバクター属およびアセトバクター属を含めた酢酸菌に属する微生物のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする新規なポリヌクレオチド配列を提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは例えば配列番号２のアミノ酸配列における一つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって前記ポリペプチドから誘導され、また誘導することができるポリペプチドを好ましくはコードし、そのポリペプチドは、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を保持し、Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生する。例えば配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２７によって表されるポリペプチドのようにＬ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生するＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を保持するポリペプチドの部分ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列もさらに含まれる。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、本出願に開示されるポリペプチドのアミノ酸配列より選択される少なくとも２５個の連続するアミノ酸の部分アミノ酸配列を好ましくは含む。当業者は、ポリペプチドにおいてあるストレッチが生物学的活性に必須であるという事実を認識している。しかし、アミノ酸が、交換されるアミノ酸に好ましくは類似するアミノ酸のような他のアミノ酸によって挿入、欠失または置換されうる他の領域がある。
【００１９】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、特に適切な宿主細胞において機能するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子および／または発現ベクターにさらに関するものである。
【００２０】
例えば複製可能な発現ベクターもしくはクローニングベクターを有する細胞、または自己の染色体もしくはゲノム上に所望の遺伝子を含むように周知の手法によって遺伝子操作された細胞のような、外来ヌクレオチド酸分子（類）のレシピエントとして働く任意の細胞を宿主細胞として使用できる。宿主細胞は、例えば細菌細胞、ヒト細胞を含む動物細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、および植物細胞のような原核生物または真核生物起源でありうる。好ましくは宿主細胞は、インビボ活性型としてＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを発現できる細菌に属し、さらに好ましくはグルコノバクター属、アセトバクター属、Ｐ．プチダ（P. putida）のようなシュードモナス属（Pseudomonas）または大腸菌（Escherichia coli）のようなエシェリキア属の細菌に属する。
【００２１】
したがって、そのような発現ベクターを含むか、またはその染色体ＤＮＡに組込まれたポリヌクレオチドを有するそのようなヌクレオチドを含む上記のような宿主細胞を提供することは、本発明の一局面である。このとき、そのような宿主細胞は、組換え宿主細胞または組換え生物と呼ばれる。
【００２２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼポリペプチドの製造方法にさらに関するものである。そのような方法には、例えば上に具体的に記載したように本発明の任意の組換え生物の培養がある。したがって、本発明の一部は、この方法によって産生される組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼポリペプチドである。このような組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを、例えば酵素反応のために使用され当業者に公知である任意の標準的な手法において可溶性酵素として使用でき、膜モジュールもしくは膜リアクターのような装置の使用によってリサイクルでき、または固相酵素反応のために固体担体上に固定化できる。
【００２３】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼポリペプチドを活用して基質をＬ−アスコルビン酸に転換することを含む、Ｌ−アスコルビン酸の製造方法である。そのような酵素を自然に、すなわち非組換え的に産生する微生物から単離されたＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ（ＳＮＤＨａｉ）の使用も本発明に含まれ、ここで単離されたＳＮＤＨａｉは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＳＮＤＨａｉによってＬ−アスコルビン酸に転換できる炭素源を基質として使用できる。好ましい基質は、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ソルビトール、およびＬ−ソルボソンから選択される。
【００２５】
本発明の一態様において、Ｌ−アスコルビン酸の製造方法は、Ｌ−ソルボースをＬ−ソルボソンに転換する能力またはＤ−ソルビトールをＬ−ソルボソンに転換する能力を有する宿主細胞において、Ｌ−ソルボースまたはＤ−ソルビトールをＬ−アスコルビン酸に転換することを含む。
【００２６】
別の態様において、Ｌ−アスコルビン酸の製造方法は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる組換えＳＮＤＨａｉを活用してＬ−ソルボソンをＬ−アスコルビン酸に転換することを含む。そのような酵素を自然に、すなわち非組換え的に産生する微生物から単離されるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ（ＳＮＤＨａｉ）もそのような方法に使用でき、単離されたＳＮＤＨａｉは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２７】
本発明は、その酵素（Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼＳＮＤＨａｉまたはその部分）をコードする単離された核酸分子を提供する。単離された核酸分子の操作のために設計された方法および手法は、当技術分野において周知である。核酸分子の単離、精製、およびクローニングのための方法、ならびに真核生物および原核生物宿主の使用とその宿主における核酸およびタンパク質の発現とを解説している方法と手法とは、当業者に公知である。
【００２８】
本発明のポリペプチドの機能的誘導体も本発明の一部でありうるが、その機能的誘導体は、本発明のアミノ酸配列を基にそのような配列への一つまたは複数のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失および／または置換によって規定され、そのような誘導体は、本技術分野において公知であるアッセイか、または本明細書において具体的に記載されるアッセイによって測定されるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性もなお有することが好ましい。そのような機能的誘導体は、当技術分野の現状において公知である化学ペプチド合成、または当技術分野の現状に公知である方法による、本明細書に開示されるようなＤＮＡ配列に基づいた組換え手法のいずれかによって作成されうる。タンパク質およびペプチドの活性を一般に変更しない、そのような分子におけるアミノ酸の交換は公知である。
【００２９】
本発明の特定の態様において、目的の保存的置換は、以下のように生じる：例示的な置換として、ＡｌａからＶａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、ＡｒｇからＬｙｓ／Ｇｌｎ／Ａｓｎ、ＡｓｎからＧｌｎ／Ｈｉｓ／Ｌｙｓ／Ａｒｇ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＰｒｏ／Ａｌａ、ＨｉｓからＡｓｎ／Ｇｌｎ／Ｌｙｓ／Ａｒｇ、ＩｌｅからＬｅｕ／Ｖａｌ／Ｍｅｔ／Ａｌａ／Ｐｈｅ／ノルＬｅｕ、ＬｙｓからＡｒｇ／Ｇｌｎ／Ａｓｎ、ＭｅｔからＬｅｕ／Ｐｈｅ／Ｉｌｅ、ＰｈｅからＬｅｕ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ａｌａ／Ｔｙｒ、ＰｒｏからＡｌａ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ／Ｐｈｅ、ＴｙｒからＴｒｐ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、およびＶａｌからＩｌｅ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｐｈｅ／Ａｌａ／ノルＬｅｕが妥当である。好ましい例として、ＡｌａからＶａｌ、ＡｒｇからＬｙｓ、ＡｓｎからＧｌｕ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＡｌａ、ＨｉｓからＡｒｇ、ＩｌｅからＬｅｕ、ＬｅｕからＩｌｅ、ＬｙｓからＡｒｇ、ＭｅｔからＬｅｕ、ＰｈｅからＬｅｕ、ＰｒｏからＡｌａ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ、ＴｙｒからＰｈｅ、およびＶａｌからＬｅｕが妥当である。そのような置換が生物学的活性に変化をもたらすならば、上記の例示的置換と称されるさらに実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【００３０】
特に示さない限り、本明細書におけるＤＮＡ分子を配列分析することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、（モデルApplied Biosystems PRISM 310遺伝子分析装置のような）ＤＮＡ自動シーケンサを用いて決定された。したがって、この自動化アプローチによって決定されるあらゆるＤＮＡ配列について当技術分野において公知であるように、本明細書において決定されるあらゆるヌクレオチド配列は、いくつかの誤りを含みうる。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列分析されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％相同である。当技術分野において周知である手作業によるＤＮＡ配列分析法を含む他のアプローチによって、実際の配列をさらに精密に決定できる。当技術分野においてこれも公知であるように、実際の配列に比べ、決定されたヌクレオチド配列に単一の挿入または欠失が生じると、そのヌクレオチド配列の翻訳にフレームシフトを引き起こす結果、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列は、その配列分析されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは、そのような挿入または欠失の位置を起点として全く異なるようになるであろう。
【００３１】
好ましい態様において、本発明は、配列番号２として挙げられている配列に開示されるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、その相補鎖、またはこれらの配列を含むポリヌクレオチド；そのＤＮＡ配列またはそのフラグメント；およびそのような配列と標準条件でハイブリダイズするが正確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関するものである。
【００３２】
ポリヌクレオチド配列の類似性を記載する別の様式は、そのような配列が実際にハイブリダイズするか、またはハイブリダイズしないかを決定することである。これは、ハイブリダイゼーションのために選択した条件に依存する。
【００３３】
これに関連してハイブリダイゼーションのために標準的な条件は、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者によって一般に使用される条件、または好ましくは当業者によって使用されるいわゆる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を意味する。このように、本明細書に使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、配列との間に約９５％、好ましくは約９７％の相同性が存在するならばハイブリダイゼーションが起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば１００μg/mlサケ精子ＤＮＡの存在下もしくは非存在下のDigEasyHyb溶液（Roche Diagnostics GmbH）、または５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、および２％ブロッキング試薬（Roche Diagnostics GmbH）のような溶液に溶かした（ＤＩＧ標識システム（Roche Diagnostics GmbH、68298マンハイム、ドイツ）を使用して調製された）ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブを用いて４２℃で２時間〜４日間インキュベートし、その後室温で２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中でそのフィルターを５〜１５分間で２回洗浄してから６５〜６８℃で０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５〜３０分間で２回洗うことである。
【００３４】
一局面において、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を含む核酸分子、発現ベクターおよび本発明に使用される組換え生物を以下の工程によって得ることができる：
（１）使用するトランスポゾンによってコードされる抗生物質耐性を発現するコロニーを得るためにＬ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生するグルコノバクター属株またはアセトバクター属株に属する株への、下記のようなトランスポゾン変異；
（２）基質としてＬ−ソルボソンを用いたスクリーニングにおけるＬ−アスコルビン酸非産生変異体の選択；
（３）その変異体からの染色体ＤＮＡの単離；
（４）コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、またはサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニングなどによる染色体ＤＮＡからのトランスポゾン含有ＤＮＡフラグメントのクローニング；
（５）トランスポゾンの挿入を含むＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列の決定；
（６）Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生する親株からのＤＮＡフラグメントのクローニング；
（７）Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が効率的に発現できる発現ベクターの構築；
（８）宿主細胞にＤＮＡを導入するための適切な方法、例えば形質転換、形質導入、接合伝達および／またはエレクトロポレーションによるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する組換え生物の構築。この宿主細胞は、それによって本発明の組換え生物となる。
【００３５】
トランスポゾン変異誘発は、遺伝子解析のための強力なツールとして公知である（P. Gerhardt et al., "Methods for General and Molecular Bacteriology" Chapter 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology）。
【００３６】
Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、ファージＭｕなどのような多様なトランスポゾンが当技術分野で公知である。それらの間で、Ｔｎ５は挿入特異性をほとんど有さず、そのサイズは相対的に小さい。本発明の実施においてランダム変異誘発に使用する目的のためには、Ｔｎ５が好ましい。抗生物質耐性または他の選択マーカー遺伝子に連結した転位に必要な１９bpのＴｎ５逆位反復からなるＭｉｎｉ−Ｔｎ５と称される多様なＴｎ５誘導体も本発明に有用である。そのようなＭｉｎｉ−Ｔｎ５は、Ｔｎ５トランスポザーゼ（ｔｎｐ）に追加して自殺ベクターに挿入され、効率的なＴｎ５自殺変異誘発系が構築される。
【００３７】
トランスポゾンによるランダム変異誘発は、自殺プラスミドまたはファージベクターを使用することによって、例えば形質転換、形質導入、接合交配またはエレクトロポレーションを介して標的細菌細胞にトランスポゾンを導入することを伴う。得られた変異体を、トランスポゾンが有するマーカーを活用してスクリーニングできる。使用するベクターが分離により喪失した後で、レシピエント細菌のゲノムへのトランスポゾンの転位を検出できる。
【００３８】
グルコノバクター属またはアセトバクター属の微生物にトランスポゾンを導入するために、例えばファージＰ１の誘導体およびＣｏｌＥ１複製起点を有するｐＢＲ３２５の誘導体のような宿主の範囲の狭いプラスミドを含む、いわゆる自殺ベクターが通常使用される。ファージＰ１ベクターおよびプラスミドベクターを、それぞれ感染によって、および形質転換、接合交配またはエレクトロポレーションによって、レシピエント細胞に移送でき、これらのベクターは、好ましくは適切なレシピエントの起源を欠く。使用する自殺ベクターおよびトランスポゾンの選択は、例えばファージの感受性、レシピエント細胞の固有の抗生物質耐性、形質転換、接合伝達、エレクトロポレーションを含めた遺伝子導入系の利用性、または大腸菌にトランスポゾン保有ベクターを導入するための感染を含む基準に依存する。
【００３９】
本発明に使用するための好ましいベクターの一つは、例えばグルコノバクター属またはアセトバクター属に属する微生物に自己のＤＮＡを注入するファージＰ１（ＡＴＣＣ２５４０４）であるが、このＤＮＡは複製できず分離によって失われる。そのようなＴｎ５（Ｐ１：：Ｔｎ５）を有するＰ１ファージを、公知の手法によりＰ１：：Ｔｎ５を有する大腸菌を溶解させることによって調製できるファージ溶解物の形で使用できる（例えば"Methods for General and Molecular Bacteriology" Chapter 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiologyまたは米国特許第５０８２７８５号、１９９２を参照のこと）。
【００４０】
その欠損変異体が本当にトランスポゾンを有することを確認するために、例えば標準法によりプローブとして使用されるトランスポゾンを含む標識ＤＮＡフラグメントを用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはサザンハイブリダイゼーションのような方法を実施できる（Molecular cloning, a laboratory manual second edition, Maniatis T., et al., 1989）。
【００４１】
そのような変異体を、本発明の実施例５に記載されているように単離する。トランスポゾン変異体は、さらにＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする標的遺伝子を同定するために、およびそのトランスポゾンでタグ付けされた領域のヌクレオチド配列を決定するために有用でありうる。
【００４２】
ベクターおよびトランスポゾンの選択マーカーの両表現型を示す形質転換体を選択することによって、トランスポゾンの挿入を含むＤＮＡフラグメントを、任意の大腸菌クローニングベクター、好ましくはpUC18、pUC19、pBluescript II KS+（Stratagene Europe）およびそれらの類縁物にクローニングできる。トランスポゾン近隣のヌクレオチド配列を当技術分野で公知の配列分析法によって決定できる。
【００４３】
あるいはまた、前記Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼポリペプチドがＬ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生する株から精製される場合、以下の例示的な方法によって総染色体ＤＮＡからプラスミドベクターまたはファージベクターのいずれかに所望の遺伝子をクローニングできる：
（ｉ）例えばマトリックス介助レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）のような方法によって、精製されたタンパク質またはそのペプチドフラグメントから部分アミノ酸配列を決定できる。そのようなタンパク質全体の単離によって、またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のゲルからのペプチダーゼ処理によって、そのようなタンパク質全体またはペプチドフラグメントを調製できる。このように得られたタンパク質またはそのフラグメントは、Applied Biosystems気相自動シーケンサ470Aのようなタンパク質シーケンサにも適用できる。例えばApplied Biosystems自動ＤＮＡシーケンサ381AのようなＤＮＡ合成装置を用いてオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを設計および調製するために、そのアミノ酸配列を利用できる。例えばサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーションにより、標的遺伝子を有する株の遺伝子ライブラリーから標的遺伝子を有するクローンを単離するためにこれらのプローブを使用できる。
（ｉｉ）あるいはまたさらに、遺伝子ライブラリーから標的タンパク質を発現するクローンを選択する目的で、例えば標的タンパク質に対して調製される抗体を用いた免疫学的方法を適用できる。
（ｉｉｉ）一組のプライマー、すなわち上記のように決定されたアミノ酸配列により合成された二つのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって、総染色体ＤＮＡから標的遺伝子のＤＮＡフラグメントを増幅できる。次に、例えばプローブとして前記で得られたＰＣＲ産物を用いたサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションによって、例えば大腸菌に構築された遺伝子ライブラリーから、遺伝子全体を有するクローンを単離できる。
【００４４】
当技術分野で公知の方法によってそこに開示されているＤＮＡ配列に基づいて設計されたプライマーを用いたＰＣＲによって作成できるＤＮＡ配列も、本発明の目的である。
【００４５】
例えば精製されたＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼタンパク質、例えば大腸菌に発現したＨｉｓタグ付きＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼのような精製された組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼタンパク質、またはそのペプチドフラグメントを抗原として用いて、上に言及した抗体を調製できる。Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列から推定されるポリペプチド配列を、抗体を調製するための抗原として使用できる。
【００４６】
いったん所望の遺伝子を有するクローンが得られたならば、標的遺伝子のヌクレオチド配列を周知の方法によって決定できる。
【００４７】
所望の遺伝子／ヌクレオチド配列を効率的に発現させるために、多様なプロモーター、例えばその遺伝子の本来のプロモーター、例えばカナマイシン耐性遺伝子Ｔｎ５、アンピシリン耐性遺伝子ｐＢＲ３２２、および大腸菌のベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ）のような抗生物質耐性遺伝子のプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ラムダファージのプロモーター、および宿主細胞において機能的でありうるあらゆるプロモーターを使用できる。この目的のために、細菌細胞、ヒト細胞を含む動物細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、および植物細胞からなる群より宿主細胞を選択できる。好ましくは、宿主細胞は、インビボ活性型としてＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを発現できる細菌、特にグルコノバクター属、アセトバクター属、シュードモナス属およびエシェリキア属の細菌に属する。
【００４８】
発現のために、例えばシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列（例えば宿主細胞において作動可能な天然および合成配列を含むＡＧＧＡＧＧなど）および（コード配列が導入され本発明の組換え細胞を提供する）宿主細胞において作動可能な転写ターミネーター（任意の天然および合成配列を含む逆位反復構造）のような他の調節エレメントを、上記のプロモーターと共に使用できる。
【００４９】
広範囲の宿主／クローニングベクターの組み合わせを二本鎖ＤＮＡのクローニングに採用できる。大腸菌に本発明の遺伝子、すなわちＳＮＤＨａｉ遺伝子を発現させるための好ましいベクターを、例えばＨｉｓタグ付き組換えタンパク質を発現できる例えばｐＱＥベクター（QIAGEN AG、スイス）、ｐＢＲ３２２または例えばｐＵＣ１８およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州、米国）を含むその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４およびそれらの誘導体、ならびにＲＫ２およびＲＳＦ１０１０のような広範囲の宿主を有するプラスミドから誘導されるベクターのような、大腸菌において通常使用されるあらゆるベクターから選択できる。グルコノバクター、アセトバクター、およびシュードモナスを含む細菌に本発明のヌクレオチド配列を発現させるための好ましいベクターは、グルコノバクター、アセトバクター、またはシュードモナス、ならびに大腸菌のような好ましいクローニング生物において複製できる任意のベクターより選択される。好ましいベクターは、例えばｐＶＫ１００およびその誘導体ならびにＲＳＦ１０１０のようなコスミドベクターのような宿主範囲の広いベクターである。クローニングされた遺伝子を安定に効率的に発現させるために、またクローニングされた遺伝子を有する宿主細胞を効率的に培養するためにも、ベクターのコピー数および安定性を注意深く考慮すべきである。例えばＴｎ５のような転移性エレメントを含む核酸分子も、好ましい宿主に、特に染色体に所望の遺伝子を導入するためのベクターとして使用できる。本発明のＳＮＤＨａｉ遺伝子と共に好ましい宿主から単離された任意のＤＮＡを含む核酸分子も、好ましい宿主、特に染色体にこの遺伝子を導入するのに有用でありうる。宿主細胞および核酸分子の性質を考慮して当技術分野で周知である常法、例えば形質転換、形質導入、接合交配またはエレクトロポレーションのいずれかを適用することによって、そのような核酸分子を好ましい宿主に移送できる。
【００５０】
発現ベクターを産生するために、当技術分野において周知の方法で、本発明において提供されるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ遺伝子／ヌクレオチド配列を、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、および上記の宿主細胞において作動可能な転写ターミネーターのような調節領域を含む適切なベクターに連結できる。
【００５１】
発現ベクターを有する組換え微生物を構築するために、例えば形質転換、形質導入、接合交配、およびエレクトロポレーションを含めた多様な遺伝子導入法を使用できる。組換え細胞を構築するための方法を、分子生物学の分野で周知の方法より選択できる。例えば、通常の形質転換系をグルコノバクター、アセトバクター、シュードモナス、またはエシェリキアに使用できる。大腸菌に形質導入系も使用できる。接合交配系は、例えば大腸菌、Ｐ．プチダおよびグルコノバクターを含むグラム陽性およびグラム陰性菌に広く使用できる。接合交配の例は、ＷＯ８９／０６６８８に開示されている。接合は、例えば液体培地または固体表面で起こり得る。ＳＮＤＨａｉ産生のためのレシピエントの例には、例えばグルコノバクター、アセトバクター、シュードモナス、またはエシェリキア属の微生物がある。接合交配のためのレシピエントに選択マーカーを追加でき、例えばナリジクス酸またはリファンピシンに対する耐性が普通選択される。自然耐性も使用され、例えばポリミキシンＢに対する耐性は多くのグルコノバクターに有用である。
【００５２】
本発明は、組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ（ＳＮＤＨａｉ）を提供する。上記の宿主細胞に、本発明によって提供されるＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することによって、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ酵素の産生収率を増加させることができる。一局面において、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼタンパク質は、本発明のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ遺伝子を使用することによってグルコノバクター、アセトバクター、シュードモナス、またはエシェリキアからなる群より選択される宿主細胞から産生する。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるようにＳＮＤＨａｉを発現できる微生物を、好気条件で適切な栄養素を補充した水性培地中で培養できる。回分法、流加法（fed-batch）、半連続培養法または連続培養法で培養を実施できる。例えば標的ポリペプチドの発現に使用する宿主、ｐＨ、温度および使用する栄養培地に応じて培養時間は変動しうるが、運転が回分法または流加培養法の場合、好ましくは約１〜約１０日間である。例えばｐＨ約４．０〜約９．０、好ましくは約５．０〜約８．０で培養を実施できる。培養を行うのに好ましい温度範囲は、約１３℃〜約３６℃、好ましくは約１８℃〜約３３℃である。通常、培地は同化可能な炭素源、例えばグリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、エリトリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、およびスクロース、好ましくはＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、およびグルセロール；ならびに有機物のような可消化窒素源、例えばペプトン、酵母エキス、パン酵母、尿素、アミノ酸、およびコーンスチープリカーのような栄養素を含みうる。多様な無機物、例えば硝酸塩およびアンモニウム塩も窒素源として使用できる。さらに培地は通常、無機塩類、例えば硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウムおよび炭酸カルシウムを含みうる。
【００５４】
本発明のようなポリヌクレオチドによってコードされるＳＮＤＨａｉを含む宿主を用いた基質からのビタミンＣの製造方法は、成長中の細胞、すなわち例えば少なくとも比成長速度０．０２h-1である細胞で行われることが理解される。
【００５５】
本発明の一態様は、ビタミンＣの産生のために本明細書に開示されているヌクレオチド配列によってコードされる単離されたＳＮＤＨａｉを使用することである。培養後の微生物からＳＮＤＨａｉを単離および／または精製するために、例えば遠心分離または濾過によって液体培養ブロスから微生物の細胞を採取できる。採取された細胞を、例えば水、生理食塩水または適切なｐＨを有する緩衝溶液で洗浄できる。洗浄された細胞を、適切な緩衝溶液に懸濁でき、例えばホモジナイザー、ソニケーター、フレンチプレス、またはリゾチームなどによる処理によって破壊でき、破壊された細胞の溶液を与えることができる。例えば超遠心、適切な界面活性剤を使用した較差溶解度、塩類または他の適切な薬剤による沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、または結晶化のような標準的な方法によって、無細胞抽出物または破壊された細胞から、好ましくは膜画分からＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離および精製できる。組換えＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを、例えばＨｉｓ−タグを付けたポリペプチドのようなタグ付きポリペプチドとして産生するとき、例えばニッケルアフィニティ樹脂のようなアフィニティ樹脂を用いてそれを精製できる。Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの精製は、ニトロブルー塩化テトラゾリウム（ＮＢＴ）およびファナジンメトスルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、フェリシアニドまたはシトクロムｃのような例えば人工の電子受容体を使用することによって測光的に監視できる。
【００５６】
本明細書に記載するようにＳＮＤＨａｉの助けを借りたＬ−アスコルビン酸の産生が、本明細書によって提供される。ＳＮＤＨａｉの供給源は重要ではない。例えば活性ＳＮＤＨａｉ酵素を自然に発現できる微生物、前記微生物から単離された本発明のヌクレオチド配列によってコードされるＳＮＤＨａｉ、本発明のＳＮＤＨａｉ遺伝子を有する上記のような組換え生物を使用することによって、または下記のようなＬ−ソルボソンをＬ−アスコルビン酸に転換する生物学的触媒として働く膜画分、可溶性酵素または固定化酵素の形態の天然および／または組換えＳＮＤＨａｉを使用することによって、本法を行うことができる。ＳＮＤＨａｉの単離および精製のための上記の方法を、天然および組換えＳＮＤＨａｉの両方に対して使用できる。
【００５７】
Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生するために使用される組換え生物を、上記のように培養できる。好ましくは、組換え生物は、本発明のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するグルコノバクター、アセトバクター、シュードモナス、およびエシェリキアからなる群より選択される。この組換え微生物を上記と同条件で培養できる。Ｌ−アスコルビン酸の産生のために使用される組換え生物が、上記のいずれの炭素源もＬ−ソルボソンに転換できないのであれば、Ｌ−アスコルビン酸の産生のための前駆体としてＬ−ソルボソンを培地に加えなければならない。反応時間はｐＨ、温度および使用する反応混合物によって変動しうるが、回分法または流加法で運転する場合は好ましくは約１〜約１０日間である。
【００５８】
一態様において、組換え型酵素または天然型酵素、すなわち単離された非組換え酵素のいずれかとしての本発明のＳＮＤＨａｉは、上記のような培地から精製され、回分法、流加法、半連続法または連続法として当業者に公知の任意の加工処理法でＬ−ソルボソンをＬ−アスコルビン酸に転換するための生物学的触媒として可溶性酵素または固定化酵素の形態で使用される。精製されたＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを、可溶型、膜装置によって反応容器に保持された形態、または例えば多孔質マトリックスまたはポリマーマトリックスのような任意の固相に固定化された酵素として使用できる。例えばその酵素は、一つまたは複数の官能基を有する樹脂製の膜、顆粒などに直接結合しうるし、あるいは一つまたは複数の官能基を有する架橋化合物、例えばグルタルアルデヒドを介してその樹脂に結合しうる。可溶型、保持型または固定化型の精製された酵素を使用する反応は、例えば好気条件でＬ−ソルボソンおよび他の適切な栄養素を含む水性培地中で行われうる。反応培地は、例えば無機塩、例えば硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、および炭酸カルシウムを含みうる。反応は、約４．０〜約９．０、好ましくは約５．０〜約８．０のｐＨで実施されうる。反応を行うための好ましい温度範囲は、約１３℃〜約３６℃、好ましくは約１８℃〜約３３℃である。
【００５９】
本発明に使用できる微生物は、種々の供給源、例えばドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）（ＤＳＭＺ）、Mascheroder Weg 1B, D-38124ブラウンシュバイク、ドイツ；２００３年５月１２日のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、P.O. Box 1549、マナッサス、バージニア州20108米国；またはＮＩＴＥ生物遺伝資源部門遺伝資源保存課、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、日本（以前：発酵研究所、大阪（ＩＦＯ）、〒532-8686大阪市淀川区十三本町2-17-85、日本）から公的に入手できる。ＩＦＯに寄託されている好ましい細菌の例は、例えばグルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．メラノゲナス（G. melanogenus）として公知であった）ＩＦＯ３２９３、グルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．メラノゲナスとして公知であった）ＩＦＯ３２９２、グルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．ルビギノサス（G. rubiginosus）として公知であった）ＩＦＯ３２４４、グルコノバクターフラトゥリ（以前はＧ．インダストリウス（G. industrius）として公知であった）ＩＦＯ３２６０、グルコノバクターセリナスＩＦＯ３２６６、グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ３２８７、およびアセトバクターアセチ亜種オルレアナス（Acetobacter aceti subsp. orleanus）ＩＦＯ３２５９（それらはすべて１９５４年４月５日に寄託された）；１９７５年１０月２２日に寄託されたアセトバクターアセチ亜種キシリナム（Acetobacter aceti subsp. xylinum）ＩＦＯ１３６９３；および１９７７年１２月８日に寄託されたアセトバクターアセチ亜種キシリナムＩＦＯ１３７７３である。好ましい細菌の例でもあるアセトバクター種ＡＴＣＣ１５１６４株はＡＴＣＣに寄託された。好ましい細菌の別の例としてのグルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．メラノゲナスとして公知であった）Ｎ４４−１株は、ＩＦＯ３２９３株の派生株であり、Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990に記載されている。
【００６０】
上記の微生物に、国際原核生物命名規約（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）によって規定されるものと同じ生理学的性質を有するそのような種の異名またはバシオニムも含めることが理解される。
【００６１】
さらなる局面において、本発明は所定の炭素源をビタミンＣに転換できる微生物の休止細胞を使用することによる、高収率でのＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の新規な製造方法に関するものである。
【００６２】
Ｌ−アスコルビン酸の直接産生が、種々の培養法を用いたいくつかの微生物で報告されている。しかし、そのような方法の欠点は、産物の不安定性が原因となって産生されるビタミンＣが低収率であることである。例えば、２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＧＡ）およびビタミンＣの両方を産生できることが公知である微生物を使用するとき、微生物により産生されるビタミンＣの収率は、前記微生物によってさらに容易に合成される２−ＫＧＡの産生が相対的に高いことによってさらに制限され、例えば０．１未満であるビタミンＣと２−ＫＧＡとの濃度比をもたらす。このように、従来技術で記載されている方法よりも高い収率を得るために、微生物によるビタミンＣの産生を改善することが、本発明の目的である。
【００６３】
驚くことに、基質からビタミンＣへの直接転換を行える微生物の休止細胞を使用した方法は、さらに高いビタミンＣの収率をもたらすことが、今や見出された。
【００６４】
特に、本発明は、微生物の休止細胞を含む培地中で基質をビタミンＣに転換することを含む、ビタミンＣの製造方法を提供する。
【００６５】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法のための基質として、Ｌ−アスコルビン酸に転換できる炭素源を使用できる。その炭素源は、例えばＤ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、２−ケト−Ｌ−グロン酸塩、Ｄ−グルコン酸塩、２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩または２，５−ジケト−グルコン酸塩のようにＤ−グルコース代謝経路またはＤ−ソルビトール代謝経路から容易に得られる。さらに可能性のある基質は、ガラクトースでありうる。好ましくは、基質は、例えばＤ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースまたはＬ−ソルボソンより、さらに好ましくはＤ−グルコース、Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルボースより、最も好ましくはＤ−ソルビトールまたはＬ−ソルボースより選択される。微生物の休止細胞を使用する上記の方法に関して「基質」および「生産基質」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００６６】
微生物の休止細胞を使用する上記の方法に関連して基質からビタミンＣへの転換は、ビタミンＣを結果としてもたらす基質の転換が微生物によって実施される、すなわち基質がビタミンＣに直接変換されうることを意味する。前記の微生物は、上に定義されるような基質からのそのような転換を可能にする条件で培養される。
【００６７】
微生物の休止細胞を使用する上記の方法のために本明細書に使用する培地は、ビタミンＣの産生に適した任意の培地でありうる。概してその培地は、例えば塩類、基質（類）、およびあるｐＨを含む水性培地である。その基質がビタミンＣに転換される培地も生産培地と称される。
【００６８】
微生物の休止細胞を使用する上記の方法に関連して、例えば野生型株として、古典的変異誘発および選択法によって誘導される変異株として、または組換え株としてのいずれかでの酵母、藻類または細菌のように、基質からビタミンＣへの転換を行えるあらゆる微生物を使用できる。そのような酵母の例は、例えばカンジダ（Candida）、サッカロミセス（Saccharomyces）、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、スキゾサッカロミセス（Scyzosaccharomyces）、またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）でありうる。そのような藻類の例は、例えばクロレラ（Chlorella）でありうる。そのような細菌の例は、例えばグルコノバクター、アセトバクター、ケトグロニシゲニウム（Ketogulonicigenium）、パントエア（Pantoea）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、例えばシュードモナスプチダのようなシュードモナス、例えば大腸菌のようなエシェリキアがありうる。例えばＧ．オキシダンス、Ｇ．セリナス、Ｇ．フラトゥリ、Ａ．アセチ亜種キシリナム、またはＡ．アセチ亜種オルレアナスのようなグルコノバクターまたはアセトバクターアセチが好ましい。
【００６９】
微生物の休止細胞を使用する上記の方法に関連して、本発明に使用できる微生物は、種々の供給源、例えばドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）、Mascheroder Weg 1B, D-38124ブラウンシュバイク、ドイツ；２００３年５月１２日のアメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、P.O. Box 1549、マナッサス、バージニア州20108米国；またはＮＩＴＥ生物遺伝資源部門遺伝資源保存課、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、日本（以前：発酵研究所、大阪（ＩＦＯ）、〒532-8686大阪市淀川区十三本町2-17-85、日本）から公的に入手できる。ＩＦＯに寄託されている好ましい細菌の例は、例えばグルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．メラノゲナスとして公知であった）ＩＦＯ３２９３、グルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．メラノゲナスとして公知であった）ＩＦＯ３２９２、グルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．ルビギノサスとして公知であった）ＩＦＯ３２４４、グルコノバクターフラトゥリ（以前はＧ．インダストリウスとして公知であった）ＩＦＯ３２６０、グルコノバクターセリナスＩＦＯ３２６６、グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ３２８７、およびアセトバクターアセチ亜種オルレアナスＩＦＯ３２５９（それらはすべて１９５４年４月５日に寄託された）；１９７５年１０月２２日に寄託されたアセトバクターアセチ亜種キシリナムＩＦＯ１３６９３；および１９７７年１２月８日に寄託されたアセトバクターアセチ亜種キシリナムＩＦＯ１３７７３である。好ましい細菌の例でもあるアセトバクター種ＡＴＣＣ１５１６４株は、ＡＴＣＣに寄託された。好ましい細菌の別の例としてのグルコノバクターオキシダンス（以前はＧ．メラノゲナスとして公知であった）Ｎ４４−１株は、ＩＦＯ３２９３株の派生株であり、Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990に記載されている。
【００７０】
微生物の休止細胞を使用する上記の方法に関連して、上記の微生物に、国際原核生物命名規約によって規定されるものと同じ生理学的性質を有するそのような種の異名またはバシオニムも含めるものとする。本明細書において使用する微生物の命名は、国際原核生物分類命名委員会（International Committee on Systematics of Prokaryotes）および国際微生物学会連合の細菌学および応用微生物学部門によって（優先権主張出願の提出日に）公的に承認され、公的出版媒体であるInternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology（ＩＪＳＥＭ）によって公表されたものである。Urbance et al., IJSEM (2001) vol 51:1059-1070に特定の参照がなされ、Ｇ．オキシダンスＤＳＭ４０２５をケトグロニシゲニウムブルガレ（Ketogulonicigenium vulgare）として分類学的に再分類することを記載してIJSEM (2001) vol 51:  1231-1233に修正通知がなされている。
【００７１】
本明細書に使用するように、休止細胞は、例えば生存可能であるが活発に成長していないか、または低い比成長速度（μ）、例えば０．０２h-1未満、好ましくは０．０１h-1未満の成長速度で成長している微生物の細胞を意味する。上記の増殖速度を示す細胞は、「休止細胞モード」にあると言われる。
【００７２】
微生物の休止細胞を使用した上記のような本発明の方法を、種々の工程および時期で行うことができ、好ましくはその微生物は、成長が可能な条件で（工程（ａ）または成長期とも呼ぶ）第一工程で培養される。この時期は、工程（ｂ）とも呼ぶ微生物の成長速度が低減して休止細胞をもたらすように条件を変更することによって終了し、（ｂ）の休止細胞を使用して基質からビタミンＣを産生させることに続き、これを産生期とも呼ぶ。
【００７３】
微生物の休止細胞を使用して上記の方法において行われる成長期および産生期を、二つの時期の間で場合による細胞分離工程を伴って同一の容器、すなわちわずか一つの容器で、または二つ以上の異なる容器で行うことができる。細胞から産生したビタミンＣをあらゆる適切な手段によって回収できる。回収は、例えば産生したビタミンＣが生産培地から分離されうることを意味する。場合により、このように産生したビタミンＣをさらに処理する。
【００７４】
微生物の休止細胞を使用する上記の方法に関する本発明のために、「成長期」、「成長する工程」、「成長工程」および「成長時間」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。「産生期」、「産生工程」、「産生時間」という用語にも同じことがあてはまる。
【００７５】
本発明のように微生物の休止細胞を使用して上記の方法を行う一つのやり方は、休止細胞の供給源として第一の容器、いわゆる成長容器でその微生物を成長させ、その細胞の少なくとも一部を第二の容器、いわゆる産生容器に移送する方法でありうる。産生容器における条件は、成長容器から移された細胞が上に定義されるような休止細胞になるような条件でありうる。ビタミンＣは、第二の容器で産生し、そこから回収される。
【００７６】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、一局面において成長工程を、好気条件での成長に適した栄養素を補充した水性培地、すなわち成長培地で実施できる。例えば培養を回分法、流加法、半連続法または連続法で実施できる。培養時間は、細胞の種類、ｐＨ、温度および使用する栄養培地により変動しうるし、回分法または流加法で運転する場合に微生物に応じて例えば約１０時間〜約１０日間、好ましくは約１〜約１０日間、さらに好ましくは約１〜約５日間でありうる。細胞を連続法で成長させるならば、滞留時間は、微生物に応じて例えば約２〜約１００時間、好ましくは約２〜約５０時間でありうる。微生物が細菌から選択されるならば、培養は、例えば約３．０〜約９．０、好ましくは約４．０〜約９．０、さらに好ましくは約４．０〜約８．０、なおさらに好ましくは約５．０〜約８．０のｐＨで実施されうる。藻類または酵母を使用するならば、培養は、例えば約７．０未満、好ましくは約６．０未満、さらに好ましくは約５．５未満、最も好ましくは約５．０未満のｐＨで実施されうる。細菌を使用した培養を実行するために適切な温度範囲は、例えば約１３〜約４０℃、好ましくは約１８℃〜約３７℃、さらに好ましくは約１３℃〜約３６℃、最も好ましくは約１８℃〜約３３℃でありうる。藻類または酵母を使用するならば、培養を実行するために適切な温度範囲は、例えば約１５℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約４５℃、さらに好ましくは約２５℃〜約４０℃、なおさらに好ましくは約２５℃〜約３８℃、最も好ましくは約３０℃〜約３８℃でありうる。成長用培地は、普通は同化可能な炭素源、例えばグリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、エリトリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、およびスクロース、好ましくはＤ−ソルボース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールおよびグルセロール；ならびに有機物のような可消化窒素源、例えばペプトン、酵母エキスおよびアミノ酸のような栄養素を含みうる。その培地は、尿素および／またはコーンスチープリカーおよび／またはパン酵母を有しても有さなくてもよい。多様な無機物、例えば硝酸塩およびアンモニウム塩も窒素源として使用できる。さらに成長培地は、普通は無機塩類、例えば硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウムおよび炭酸カルシウムを含みうる。
【００７７】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、成長期における比成長速度は、例えば少なくとも０．０２h-1である。回分法、流加法または半連続法で成長している細胞について、成長速度は例えば成長培地の組成、ｐＨ、温度などに依存する。一般に成長速度は、例えば約０．０５〜約０．２h-1、好ましくは約０．０６〜約０．１５h-1、最も好ましくは約０．０７〜約０．１３h-1の範囲にありうる。
【００７８】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法の別の局面において、休止細胞は、本質的に同条件、例えば培養時間、ｐＨ、温度、寒天を添加した上記のような栄養培地を使用して、成長容器としての役目を果たす寒天平板上でそれぞれの微生物を培養することによって提供されうる。
【００７９】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、成長期および産生期が二つの別々の容器で行われるならば、成長期からの細胞を採取または濃縮し、第二の容器、いわゆる産生容器に移送する。この容器は、その細胞によってＬ−アスコルビン酸に転換されうるあらゆる適用可能な生産基質を補充した水性培地を含みうる。成長容器からの細胞を、例えば遠心分離、膜十字流限外濾過または精密濾過、濾過、デカンテーション、凝集のようなあらゆる適切な作業によって採取または濃縮できる。このように得られた細胞を、採取、濃縮または洗浄せずに成長容器からの本来のブロスの形で、すなわち細胞懸濁液の形で産生容器に移送することもできる。好ましい態様において、細胞を、中間に洗浄または単離工程を全く行わずに細胞懸濁液の形で成長容器から産生容器に移送する。
【００８０】
このように、微生物の休止細胞を使用した上記の方法の好ましい態様において、上に記載するような本発明の方法の工程（ａ）および（ｃ）は、いかなる洗浄および／または分離工程によっても隔てられない。
【００８１】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、成長期および産生期が同一の容器で行われるならば、所望の細胞密度まで適切な条件で細胞を成長させてから、成長培地を生産基質を含有する産生培地に交換できる。そのような交換は、例えばその容器からの上清の抜き取りおよび採取と同時および同速度でその容器に生産培地を供給することでありうる。容器内に休止細胞を保つために、例えば細胞リサイクリング工程のような細胞のリサイクリングまたは保持のための作業を使用できる。そのようなリサイクリング工程は、例えば遠心器、フィルター、限外濾過段階の膜十字流精密濾過、膜リアクター、凝集、または適切な多孔質、非多孔質もしくはポリマーマトリックスへの細胞の固定化を使用する方法があるが、それに限定されるわけではない。移行期の後で、その容器は、上に定義されるような休止細胞モードに細胞がなる加工処理条件にされて、生産基質は効率的にビタミンＣに転換される。
【００８２】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して産生工程に使用される産生容器内の水性培地は、以下生産培地と呼ばれるが、Ｌ−アスコルビン酸に転換される生産基質のみを含みうるか、または例えば追加の無機塩類、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、および炭酸カルシウムを含みうる。生産培地は、例えば有機物、例えばペプトン、酵母エキス、尿素、アミノ酸、およびコーンスチープリカー、ならびに無機物、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、および硝酸ナトリウムのような可消化窒素源も、その細胞が上に定義されるような休止細胞モードにあり続ける濃度で含みうる。培地は、尿素および／またはコーンスチープリカーおよび／またはパン酵母を有するか、または有さない場合がある。産生段階は、例えば回分法、流加法、半連続法または連続法で実施されうる。流加法、半連続法または連続法の場合、成長容器および生産培地の両方からの細胞を適切な供給速度で産生容器に連続的または間欠的に供給できる。または、生産培地のみを産生容器に連続的または間欠的に供給でき、一方で成長容器からの細胞を産生容器に一度に移送する。成長容器からの細胞を産生容器内の細胞懸濁液として使用でき、また例えば多孔質マトリックスまたはポリマーマトリックスのような任意の固相に凝集または固定化された細胞として使用できる。産生容器への基質の投入からビタミンＣを含む上清の採取、いわゆる採取流の間に経過した時間として定義される産生時間は、例えば細胞の種類および濃度、ｐＨ、温度、ならびに使用する栄養培地に応じて変動しうるが、好ましくは約２〜約１００時間である。ｐＨおよび温度は、成長工程のｐＨおよび温度と異なる場合があるが、本質的に成長工程の場合と同様である。
【００８３】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法の好ましい態様において、産生工程は、連続法で実施される。連続法は、成長容器からの細胞を含む第一供給流、および基質を含む第二供給流を産生容器に連続的または間欠的に供給することを意味する。第一流は、成長培地から単離／分離された細胞のみ、または成長工程から直接もたらされた細胞懸濁液、すなわち細胞の分離、洗浄および／もしくは単離の中間工程を全く行わずに成長培地に懸濁した細胞のいずれかを含みうる。本明細書において定義される第二供給流は、一つまたは数個の異なる流液、希釈用の水、およびｐＨ調整のための塩基の形で、産生工程の作業、例えば基質を含む生産培地に必要な他のすべての供給流を含みうる。
【００８４】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、両方の流液を連続的に供給する場合、第二流の供給速度に対する第一流の供給速度の比は、約０．０１から約１０の間、好ましくは約０．０１から約５の間、最も好ましくは約０．０２と約２の間を変動しうる。その比は、第一流および第二流の細胞および基質の濃度にそれぞれ依存する。
【００８５】
本発明の微生物の休止細胞を使用した上記の方法を行う別の方法は、産生容器中のある細胞密度の休止細胞を使用した方法でありうる。その細胞密度は、当業者に公知の方法により６００nmでの吸光度ユニット（光学密度）として測定される。好ましい態様において、産生工程における細胞密度は、少なくとも約１０、さらに好ましくは約１０から約２００の間、なおさらに好ましくは約１５から約２００の間、なおさらに好ましくは約１５から約１２０の間、最も好ましくは約２０から約１２０の間である。
【００８６】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、例えば連続法または半連続法で行われる産生期の間に産生容器中の細胞を所望の細胞密度に保つために、例えば遠心分離、濾過、精密濾過の膜十字流限外濾過、デカンテーション、凝集による細胞リサイクリング；膜装置または細胞固定化による容器内での細胞保持のような当技術分野において公知であるあらゆる手段を使用できる。さらに、産生工程を連続法または半連続法で行い、細胞を成長容器から連続的または間欠的に供給する場合、例えば成長容器から供給される細胞の量に対応した細胞の量を産生容器から採取することによって、産生容器内の細胞密度を一定のレベルに保つことができる。
【００８７】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、いわゆる採取流に含まれる産生ビタミンＣは、産生容器から回収／採取される。採取流には、例えば産生容器中の休止細胞による生産基質の転換の結果としてのビタミンＣを含む、産生容器からの無細胞水溶液または細胞含有水溶液がありうる。例えば濾過、遠心分離、デカンテーション、膜十字流限外濾過もしくは精密濾過、タンジェント流限外濾過もしくは精密濾過、またはデッドエンド濾過のような当技術分野で公知のあらゆる作業によって、採取流に依然として存在する細胞をビタミンＣと分離できる。この細胞分離の作業後に、採取流は本質的に細胞を含まない。
【００８８】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、一局面において本発明の方法は、少なくとも約１．８g/l、好ましくは少なくとも約２．５g/l、さらに好ましくは少なくとも約４．０g/l、最も好ましくは少なくとも約５．７g/lであるビタミンＣの収量をもたらす。一態様において、本発明の方法によって産生するビタミンＣの収量は、約１．８〜約６００g/lの範囲である。ビタミンＣの収量は、産生容器から直接流出する採取流、すなわちビタミンＣを含む無細胞上清中のビタミンＣ濃度を示す。
【００８９】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、本発明の一態様においてビタミンＣは、例えば組換え細菌のような組換え微生物の休止細胞を用いて上記のような方法によって産生する。好ましくは組換え細菌は、インビボ活性型としてＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを発現できる細菌、特にグルコノバクター属、アセトバクター属、シュードモナス属およびエシェリキア属の細菌、最も好ましくはグルコノバクター、アセトバクターまたは大腸菌より選択される。例えばＧ．オキシダンスおよび大腸菌がなおさらに好ましく、Ｇ．オキシダンスＮ４４−１、Ｇ．オキシダンスＩＦＯ３２９３およびＧ．オキシダンスＩＦＯ３２４４からなる群より選択されるのが最も好ましい。組換え微生物は、その染色体または前記微生物に導入されたプラスミド上に一つまたは複数の所望の遺伝子を含むように周知の手法によって遺伝子操作され、例えば前記遺伝子（群）の過剰発現をもたらすあらゆる微生物でありうる。前記微生物に導入された所望の遺伝子（群）は、例えば基質からビタミンＣへの転換に関与する酵素をコードしうる。好ましい態様において、所望の遺伝子は、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣへの転換を触媒するＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする。本発明において使用される好ましいＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼは、例えば配列番号２で表されるＧ．オキシダンスＮ４４−１（Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990）のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ (ＳＮＤＨａｉ)であり、前記ＳＮＤＨａｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で表される。前記ＳＮＤＨａｉの機能的誘導体も本発明のために使用できる。配列番号１に比べて少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣへの転換を触媒できる酵素をコードするヌクレオチド配列も本発明の一部であるものとする。
【００９０】
例えばＧ．オキシダンスＮ４４−１のような組換え微生物は、適切なプラスミドにクローニングされたか、またはその染色体に組込まれた数コピーのＳＮＤＨａｉを含みうる。本発明に適しうるプラスミドコピーは、形質転換された微生物あたり例えば約２〜約１５の範囲、好ましくは約５〜約１０の範囲にある。プラスミドコピー数は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で可視であるそれぞれのバンドの強度の比較によって決定されうる。
【００９１】
微生物の休止細胞を使用した上記の方法に関連して、本発明の方法のために組換え微生物を使用する場合、成長および産生工程は本質的に上記と同様でありうる。例えば増加したＳＮＤＨａｉ量を有する組換えＧ．オキシダンスＮ４４−１のようなＳＮＤＨａｉを含む組換え微生物を使用する場合、成長培地は、例えばＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、グリセロールまたはＤ−グルコースの単独またはそれらの混合のいずれか、一つまたは複数の適切な窒素源および塩類を含みうる。生産培地は、例えばＤ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルボースならびに塩類を含みうる。ビタミンＣの採取は、本明細書に本質的に記載するように行える。
【００９２】
さらなる局面において、本発明の方法を、採取流に含まれる他の成分と産生ビタミンＣを分離および／または精製するさらなる工程、すなわちいわゆる下流の加工処理工程と組合わせてもよい。これらの工程には、例えば濃縮、結晶化、沈殿、吸着、イオン交換、電気透析、バイポーラ膜電気透析および／または逆浸透のような当業者に公知のあらゆる手段がありうる。ビタミンＣは、例えば活性炭を用いた処理、イオン交換、吸着および溶出、濃縮、結晶化、濾過ならびに乾燥のような作業によって、遊離酸型またはあらゆる公知の塩型としてさらに精製されうる。具体的には、ビタミンＣと採取流中の他の成分との最初の分離を、例えば以下の方法のあらゆる適切な組合わせまたは反復によって行うことができる：二区画または三区画電気透析、バイポーラ膜電気透析、逆浸透または例えばイオン交換樹脂もしくは非イオン樹脂への吸着。得られたビタミンＣの形態がＬ−アスコルビン酸の塩であるならば、例えばバイポーラ膜電気透析、イオン交換、模擬移動層クロマトグラフィー法などによって、塩型から遊離酸型への転換を実施できる。言及した工程、例えば電気透析およびバイポーラ膜電気透析を組合わせて一工程にすることも、言及した工程、例えば模擬移動層クロマトグラフィー法を使用することによるイオン交換のいくつかの工程を組合わせることと同様に使用できる。これらのいかなる手法も、単独または組み合わせで産物すなわちビタミンＣを単離および精製する便利な手段を構成する。このように得られた産物を、例えば濃縮、結晶化、沈殿、結晶の洗浄および乾燥のような方法によってさらに単離でき、かつ／または例えば活性炭を用いた処理、イオン交換および／または再結晶化によってさらに精製できる。
【００９３】
好ましい態様において、ビタミンＣは、この加工処理のあらゆる時点で非水溶液に移送することなしに上記のような一連の下流の加工処理工程によって、すなわちすべての工程段階が水性環境中で行われて採取流から精製される。そのような好ましい下流の加工処理工程には、例えば二区画または三区画電気透析による産生容器からの採取流の濃縮、バイポーラ膜電気透析および／またはイオン交換による濃縮溶液中に存在する塩型から酸型のビタミンＣへの転換、例えば活性炭、イオン交換樹脂または非イオン樹脂を用いた処理後にさらなる濃縮工程および結晶化を行うような方法による精製がありうる。これらの結晶を分離し、洗浄し、かつ乾燥できる。必要ならば、結晶をもう一度水に再溶解し、活性炭および／またはイオン交換樹脂で処理し、再結晶できる。次に、これらの結晶を分離し、洗浄し、かつ乾燥できる。
【００９４】
以下の実施例は本発明をさらに例示するものであり、本発明を何ら限定することを意図しない。
【００９５】
実施例１
精製ＳＮＤＨａｉによるＬ−アスコルビン酸の産生
１．ＳＮＤＨａｉの精製
流加発酵（培養については実施例３参照）によって培養された、ＳＮＤＨａｉを産生可能な微生物の細胞を、２mM ＭｇＣｌ２、１mM ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、およびＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤錠（Roche Diagnostics GmbH）２〜３個を含むリン酸緩衝液（２０mM、ｐＨ７．０）２５mlに懸濁した。この細胞懸濁液をフレンチプレスセルで３回処理した。その後、２mM ＭｇＣｌ２および１M ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（２０mM、ｐＨ７．０）２５mlを加え、得られた懸濁液を超遠心分離した（３００００rpm、６０分、４℃）。膜画分を含むペレットを２mM ＭｇＣｌ２および５００mM ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（２０mM、ｐＨ７．０）で洗浄し、その後、２mM ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝液（２０mM、ｐＨ７．０）適量に懸濁した。次に、最終濃度２w/v％となるようにＮ−オクチルグルコシド（Fluka）を加え、その懸濁液を氷冷下で静かに撹拌しながら９０分間インキュベートした。遠心分離（２００００rpm、６０分、４℃）後に、透明な赤色上清を採集し、最終濃度が１５w/v％となるようにポリエチレングリコール６０００（Fluka）を加えた。静かに振盪しながら４℃で６０分間インキュベートした後、遠心分離（１００００rpm、３０分、４℃）を行い、２mM ＭｇＣｌ２および０．５w/v％ラウリルスルホベタイン（Fluka）を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（２０mM、ｐＨ７．６）にペレットを溶解させた。４℃で一晩静かに振盪した後、溶液を遠心分離（２００００rpm、３０分、４℃）した。上清を採集し、下記のようにさらに精製した。
【００９６】
ソフトウェアUNICORN3.1を備えるAKTA Explorer 10Sシステム（Amersham Biosciences）で４℃で下記の精製工程を行った。イオン交換クロマトグラフィーのための典型的な流速は１〜２ml/分の範囲であった。タンパク質の溶出を２８０nmで監視し、精製の全段階（下記参照）での標準的な測光アッセイまたは精製された画分を用いた産物アッセイを使用してＳＮＤＨａｉ活性画分を決定した。
【００９７】
Sephadex G25ゲル濾過カラム（ボイド容量：２．５ml）で、２mM ＭｇＣｌ２および０．５w/v％ラウリルスルホベタインを含む２０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を使用して、透明な上清ＩＶを脱塩して２．５mlの部分にした。
【００９８】
ＳＮＤＨａｉ陽性画分をプールし、使用前に緩衝液Ａ１（１０mMトリス、１０mMビス−トリス、１０mM ＭＥＳ、２mM ＭｇＣｌ２、０．５％ラウリルスルホベタイン、ｐＨ７．６）で平衡化した強陰イオン交換カラム（例えばMono-Q HR、Amersham Biosciences、カラム容積８ml）にそのアリコート（約１０ml）を入れた。非結合性のタンパク質を１００％緩衝液Ａ１で溶出させ、４カラム容後に、１００％緩衝液Ｂ１（１０mMトリス、１０mMビス−トリス、１０mM ＭＥＳ、２mM ＭｇＣｌ２、０．５％ラウリルスルホベタイン、ｐＨ４．７）への６カラム容の直線ｐＨ勾配を適用してから、８カラム容の１００％緩衝液Ｂ１で溶出させた。ＳＮＤＨａｉは、ｐＨ値約６．５で溶出した。そのｐＨは、アミノ酸配列から計算されたｐＩ値６．５２に非常に近接している。活性画分をプールし、２mM ＭｇＣｌ２、および０．５％ラウリルスルホベタインを含む同量のＨＥＰＥＳ緩衝液（５０mM、ｐＨ８．０）で希釈し（最終容積１５〜２０ml）、緩衝液Ａ２（１５mM ＨＥＰＥＳ、２mM ＭｇＣｌ２、０．５％ラウリルスルホベタイン、ｐＨ７．６）で平衡化した別の強陰イオン交換カラム（例えばMono-Q HR、Amersham Biosciences、カラム容積１ml）に適用した。非結合性のタンパク質を１００％緩衝液Ａ２で溶出させ、４カラム容後に、４０％緩衝液Ｂ２（１５mM ＨＥＰＥＳ、２mM ＭｇＣｌ２、１M ＬｉＣｌ、および０．５％ラウリルスルホベタイン、ｐＨ７．６）への２０カラム容の直線塩勾配を適用し、その後１００％緩衝液Ｂ２への段階勾配をかけた。ＳＮＤＨａｉは１５０mMのＬｉＣｌ付近で溶出した。活性画分は、ＳＤＳゲル電気泳動で約８５kDaに単一バンドを示した。
【００９９】
２．  ＳＮＤＨａｉの測光アッセイ
ＳＮＤＨａｉ活性の測光測定用の反応混合物は、最終体積１．０mlの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した０．１９６mMニトロブルー塩化テトラゾリウム（ＮＢＴ）、０．１３７mMフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、２０．４mM Ｌ−ソルボソン、および酵素溶液からなった。酵素を加えて反応を開始し、ＮＢＴの初期減少率として光路長１cmのキュベットで酵素活性を５７０nmで測定した（Ｔ＝２５℃）。酵素活性１単位を１分間あたり１μMのＮＢＴの減少を触媒する酵素の量と定義した。ｐＨ７．５でのＮＢＴの吸光係数を１００mM-1cm-1とした。活性の決定にＬ−ソルボソン以外の上記の成分を含む一つおよび酵素溶液以外のすべての成分を含むもう一つの２種類の参照キュベットを使用した。
【０１００】
３．  ＳＮＤＨａｉの産物アッセイ
以下の組成を有するアッセイでＬ−ソルボソンからのＬ−アスコルビン酸の産生について、純粋なＳＮＤＨａｉを含有する画分（上記参照）を直接分析した（総容積０．５ml）：０．１４mg/ml精製脱塩ＳＮＤＨａｉ、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、８mg/mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００mM Ｌ−ソルボソン、１mM ＰＭＳ、５mM ＣａＣｌ２、５０μM ＰＱＱ−Ｋ２。遮光下で十分に振盪しながら（ベンチトップ振盪器で９００rpm）、２５℃で適切な反応管に入れてアッセイを実施した。
【０１０１】
Aminex-HPX-78H（３００×７．８mm）カラム（Biorad、ライナッハ、スイス）を取り付けたLiChrospher-100-RP18（１２５×４．６mm）カラム（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）を備えるAgilent 1100ＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies、ウィルミントン、米国）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で試料を分析した。移動相は、０．００４M硫酸であり、流速は０．６ml/分であった。ＵＶ検出器（波長２５４nm）と屈折率検出器とを組合わせて使用して二つのシグナルを記録した。さらに、アミノカラム（YMC-PackポリアミンＩＩ、ＹＭＣ社、京都、日本）を使用して２５４nmでＵＶを検出してＬ−アスコルビン酸の確認を行った。移動相は５０mM ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４およびアセトニトリル（４０：６０）であった。これらの条件でのＬ−アスコルビン酸の典型的な初期容積生産性は０．５〜１．０g/l/時であった。このように、１時間の反応時間後に上清中のＬ−アスコルビン酸濃度は３００〜９３０mg/lであった。
【０１０２】
実施例２
試験管発酵およびフラスコ発酵におけるＬ−ソルボースおよびＤ−ソルビトールからのＬ−アスコルビン酸の産生
３ＢＤ番の液体培地４mlに植菌するためにＧ．オキシダンスＮ４４−１の細胞を使用し、２２０rpmで振盪しながら３０℃で３日間試験管（直径１８mm）内で培養した。インキュベーション時間の終了時にＬ−アスコルビン酸２０mg/lが蓄積していた。
【０１０３】
５００ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れた１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス（Difco）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１５g/l ＣａＣＯ３を含む５番培地５０ml中でＮ４４−１株の細胞を（３回の繰り返しで）２００rpmで浸透しながら３０℃で培養した。７２時間培養した後に、フラスコ３本からＨＰＬＣによって測定したＬ−アスコルビン酸の量は、４００、５００および６８０mg/lであった。
【０１０４】
実施例３
流加発酵におけるＤ−ソルビトールからのＬ−アスコルビン酸の産生
２l容バッフル付き振盪フラスコに入れた１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス（Fluka BioChemika、ブックス、スイス）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１５g/l ＣａＣＯ３を含む５番の培地２００ml中で１８０rpmで浸透しながら３０℃でＧ．オキシダンスＮ４４−１の細胞を成長させた。４８時間後に、２０g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス（Fluka BioChemika、ブックス、スイス）および２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む培地５．３lを予め準備し、温度センサー、ｐＨセンサーおよび溶存酸素センサーならびに制御ループを備える１０l容のバイオリアクター（B. Braun ED10、メルスンゲン、ドイツ）に植菌するために、この培養液１５０mlを使用した。温度を３０℃に制御し、２８％アンモニア液を加えることによってｐＨを６．０に制御し、通気流は４．５l/分であり、溶存酸素を撹拌速度による多段階で３０％に制御した（最小３００rpm）。工程時間の６時間後に、５００g/lソルビトール溶液を４４時間の間、２５g/時の速度で供給した。工程時間の９６時間後に約１％の基質が上清に残留し、９５０mg/lのＬ−アスコルビン酸が産生していた。
【０１０５】
実施例４
細胞膜画分を用いたＬ−ソルボソンまたはＬ−ソルボースからのＬ−アスコルビン酸の産生
５００ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れた３ＢＤ番の液体培地１００ml中で３０℃で２２０rpmで振盪しながら３日間Ｇ．オキシダンスＮ４４−１の細胞を培養した。得られた培養液を５００rpmで遠心分離してＣａＣＯ３を除去した。この工程からの上清を次に５０００rpmで遠心分離して細胞をペレットにした。採集した細胞を５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３ml中に懸濁し、９００psiでフレンチプレスセル（SIM-AMINCO Spetronic Instruments、米国）を２回通過させることで細胞を破壊した。得られたホモジネートをまず５０００rpmで遠心分離して細胞破壊片を除去した。次に、タンパク質３mg/mlのタンパク質最終濃度まで上清を希釈した。この希釈された試料を無細胞抽出物（ＣＦＥ）と名付けた。ＣＦＥを１０００００×ｇで６０分間遠心分離した。得られた上清を捨て、膜画分としてペレットを採集した。
【０１０６】
５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０℃で２２０rpmで１５時間振盪しながら膜画分（１００μl）との反応（２００μl）を実行した。被験基質は、Ｌ−ソルボソン（最終濃度１％）およびＬ−ソルボース（最終濃度２％）であった。反応に使用したタンパク質の最終濃度は１．５mg/mlであった。インキュベーション時間の終了時に６８０mg/lおよび１０mg/lのＬ−アスコルビン酸がそれぞれ１％Ｌ−ソルボソンおよび２％Ｌ−ソルボースから産生していた。
【０１０７】
実施例５
グルコノバクターオキシダンスＮ４４−１からのＳＮＤＨａｉ遺伝子の単離
１．  Ｔｎ５の変異誘発
Ｔｎ５を含む「自殺」ベクターであるプラスミドｐＳＵＰ２０２１（Simon R. et al. 1983. BIO/TECHNOLOGY 1: 784-791）を下記のような接合交配法によって大腸菌ＨＢ１０１からＧ．オキシダンスＮ４４−１に転移させた。ＭＢ液体培地５mlの入った試験管でＧ．オキシダンスＮ４４−１を３０℃で一晩培養した。ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（D. H. Figurski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,1648-1652, 1979）を有する大腸菌ＨＢ１０１およびプラスミドｐＳＵＰ２０２１を有する大腸菌ＨＢ１０１を、カナマイシン５０μg/mlを有するＬＢ培地５mlの入った試験管で３７℃で一晩培養した。一晩培養後の培養液から、Ｇ．オキシダンスＮ４４−１、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）、および大腸菌ＨＢ１０１（ｐＳＵＰ２０２１）の細胞を遠心分離により別々に採集し、本来の容積になるようにＭＢ培地に懸濁した。次に、これらの細胞懸濁液を等量ずつ混合し、得られた混合物をＭＢ寒天平板上に置いた０．４５μmニトロセルロース膜に塗布した。２７℃で１日培養後、細胞を膜からかき取り、ＭＢブロスで希釈液を調製した。次に、希釈された細胞を、ポリミキシンＢ１０μg/mlおよびカナマイシン５０μg/mlを含むＭＢ寒天培地（ＭＰＫ培地）に塗布した。ポリミキシンＢは大腸菌ドナー株およびヘルパー株に対して選択し、カナマイシンはプラスミドｐＳＵＰ２０２１で形質転換されたＧ．オキシダンス細胞（すなわち接合完了体）を選択する。約３００００個の接合完了体が得られた。
【０１０８】
２．  Ｌ−アスコルビン酸非産生体のスクリーニング
全部で３７６０個の接合完了体を滅菌つまようじでＭＰＫグリッド平板に移植し、２７℃で３日間成長させた。Ｌ−ソルボソンからのＬ−アスコルビンの産生を試験するために、各接合完了体の細胞を滅菌つまようじでグリッド平板から釣り上げ、９６穴マイクロタイタープレートに０．５％Ｌ−ソルボソン、０．３％ＮａＣｌ、および１％ＣａＣＯ３を含む休止細胞反応混合液５０μlに懸濁した。マイクロタイタープレートを３０℃で１日間振盪せずにインキュベートした。アスコルビン酸検査ストリップおよびRQFlex2装置（Merck KGaA, 64271ダルムシュタット、ドイツ）を使用してＬ−アスコルビン酸の形成について、得られた反応混合物それぞれ１μlを分析した。陽性対照株は、同条件で成長したＧ．オキシダンスＮ４４−１であった。この方法によって、Ｌ−アスコルビン酸非産生変異体Ｎ４４−１−６Ａ９が同定された。次に、変異体Ｎ４４−１−６Ａ９の染色体ＤＮＡにＴｎ５が存在することを確認するためにサザンブロットハイブリダイゼーション分析を行った。変異体から単離された染色体ＤＮＡ２μgをＡｐａＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳｔｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩのいずれかで分解し、アガロースゲル電気泳動に供した（０．８％アガロース）。次にゲルを０．２５N ＨＣｌで１５分間処理し、その後０．５N ＮａＯＨで３０分間処理した。急速下方転移システムTurboBlotter（Schleicher & Schuell GmbH、ドイツ）でＤＮＡをナイロン膜に転移させた。プライマーＴｎ２４１９（配列番号３）およびプライマーＴｎ３１２５Ｒ（配列番号４）を使用してプラスミドｐＳＵＰ２０２１を鋳型として用いてPCR-DIG標識キット（Roche Diagnostics GmbH、68298マンハイム、ドイツ）でプローブを調製した。７０７bpのＰＣＲ産物を得た。
【０１０９】
使用したハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、例えば１００μg/mlサケ精子ＤＮＡを有するDigEasyHyb溶液（Roche Diagnostics）に入れた（ＤＩＧ標識システム（Roche Diagnostics GmbH, 68298マンハイム、ドイツ）を使用して調製した）ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブを使用して４２℃で２時間〜４日間インキュベーション後に、室温で２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中でフィルターを１５分間（２回）洗浄してから０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６５℃で１５分間（２回）洗浄することでハイブリダイゼーションを行った。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション工程の後で、STORM装置（Amersham Biosciences）を使用して抗ＤＩＧ−ＡＰコンジュゲート（Roche Diagnostics GmbH, 68298マンハイム、ドイツ）およびＥＣＦ基質（Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン）を用いてハイブリダイゼーションの検出を行った。供給業者の指示書にしたがってすべての作業を行った。
【０１１１】
上記の方法を使用して、変異体Ｎ４４−１−６Ａ９の染色体にＴｎ５が存在することを確認した。
【０１１２】
３．Ｔｎ５が割り込んだＤＮＡフラグメントのクローニングおよび近隣領域の配列分析
上記第２節に記載した制限酵素による分解の結果に基づいて、ＡｐａＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶが、Ｔｎ５挿入部の両側に１kbを超える隣接染色体ＤＮＡを有するＤＮＡフラグメントを発生する酵素として選択された。（Ｔｎ５のほぼ中央を切断する）ＳａｌＩおよびＡｐａＩによる変異体Ｎ４４−１−６Ａ９のＤＮＡの二重分解は、上記の７０７bpプローブにハイブリダイズする２本のフラグメント（６．２kbおよび３．８kb）を与えた。
【０１１３】
Ｔｎ５変異体であるＧ．オキシダンスＮ４４−１−６Ａ９の染色体ＤＮＡを調製し、ApaIで分解した。９〜１２kbのサイズを有するＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、予めApaIで分解したクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（Stratagene、スイス）に連結した。次に、この連結混合物を使用してコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、５０μg/mlカナマイシンおよび１００μg/mlアンピシリンを含むＬ寒天平板で選択した。一つの形質転換体からプラスミドを抽出し、Ｔｎ５挿入部に隣接したクローニングされた領域の配列分析を行った。Ｔｎ５転位の事象の間に起こることが公知である９bpの重複を除去した後で、（Ｔｎ５挿入部が割り込んだ）単一のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を組み立てた。以後グルコノバクターオキシダンスＮ４４−１のＳＮＤＨａｉ遺伝子と呼ぶ完全長オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、２３６７bpからなり、それを配列番号１として示す。配列番号１のヌクレオチド配列から推定される対応するアミノ酸配列を配列番号２として本明細書に示す。
【０１１４】
ＳＮＤＨａｉ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を、データベースPRO SW-SwissProt（完全公開および増加分の更新）に関するBlast 2検索（BLASTバージョン２、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）が記載）に供した。使用した条件は、ギャップ付きアラインメントおよび低複雑度領域に対するクエリ配列のフィルタリングであった。
【０１１５】
プログラムMOTIFSを使用して、細菌キノンタンパク質デヒドロゲナーゼ類の署名配列が容易に同定され、ＳＮＤＨａｉがＰＱＱ依存性酵素の性質を有することが示された。
【０１１６】
実施例６
Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生する細菌のサザンブロット分析
グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ３２９３、ＩＦＯ３２９２、ＩＦＯ３２４４、ＩＦＯ３２８７、グルコノバクターフラトゥリＩＦＯ３２６０およびＩＦＯ３２６５、グルコノバクターセリナスＩＦＯ３２６６およびＩＦＯ３２６９、アセトバクターアセチ亜種オルレアナスＩＦＯ３２５９、アセトバクターアセチ亜種キシリナムＩＦＯ１３６９３およびＩＦＯ１３７７３、アセトバクター種ＡＴＣＣ１５１６４、ならびに大腸菌Ｋ−１２の細胞から染色体ＤＮＡを調製した。ＩＦＯ１３６９３株およびＩＦＯ１３７７３株を、５g/lバクトペプトン（Difco）、５g/L酵母エキス（Difco）、５g/Lグルコース、５g/Lマンニトール、１g/L ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ml/Lエタノール、および１５g/L寒天を含む３５０番の培地で２７℃で３日間成長させた。他のすべてのアセトバクター株およびすべてのグルコノバクター株を、 ２５g/lマンニトール、５g/l酵母エキス（Difco Laboratories、デトロイト、ミシガン州、米国）、３g/lバクトペプトン（Difco）、および１８g/l寒天（Difco）を含むマンニトールブロス（ＭＢ）寒天培地で２７℃で３日間成長させた。大腸菌Ｋ−１２をルリアブロス（Luria Broth）寒天培地で成長させた。実施例５に記載したようなストリンジェントな条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションに、染色体ＤＮＡ調製物を使用した。染色体ＤＮＡ調製物をClaI（Ｎドメイン領域を分析する場合）またはEcoRI（Ｃドメイン領域を分析する場合）で分解し、ＤＮＡフラグメント１μgをアガロースゲル電気泳動（１％アガロース）で分離した。ゲルを０.２５N ＨＣｌで１５分間処理してから、０．５N ＮａＯＨで３０分間処理し、次に供給業者の指示書にしたがってVacuum Blotterモデル７８５（BIO-RAD Laboratories AG、スイス）を用いてナイロン膜に転写した。表２に記載するようなプライマーセットを使用することによって、PCR-DIG標識キット（Roche Diagnostics）でプローブを調製した。ＰＣＲ産物Ｐ１は、Ｎドメイン（可能な膜貫通領域）と称されるＳＮＤＨａｉの領域に対応し、ＰＣＲ産物Ｐ２は、Ｃドメイン（可能な一次デヒドロゲナーゼ領域）と称されるＳＮＤＨａｉの領域に対応する。
【０１１７】
【表１】
2007502102.tif 000002
【０１１８】
表２にサザンブロットハイブリダイゼーション実験の結果を示す。Ｐ１（Ｎドメイン）プローブを用いたハイブリダイゼーションにおいて、Ｇ．オキシダンスＩＦＯ３２９３、ＩＦＯ３２９２、ＩＦＯ３２４４、ＩＦＯ３２８７およびＡ．種ＡＴＣＣ１５１６４株に対して鮮明な陽性バンドが観察された。Ｐ２（Ｃドメイン）プローブを用いたハイブリダイゼーションにおいて、ＩＦＯ３２９３、ＩＦＯ３２９２、ＩＦＯ３２４４、ＩＦＯ３２８７およびＡ．種ＡＴＣＣ１５１６４株に対して鮮明な陽性バンドが観察され、一方でＩＦＯ３２６０、ＩＦＯ３２６５、ＩＦＯ３２６６、ＩＦＯ３２６９およびＩＦＯ１３７７３株について弱いバンドが観察された。対照株である大腸菌Ｋ−１２はいずれのドメインに対しても検出可能なシグナルを示さなかった。
【０１１９】
【表２】
2007502102.tif 000003
【０１２０】
ｔｒ：痕跡、ｎｄ：検出せず。プローブＰ１およびＰ２は、表２に具体的に述べるプライマーセットを用いて（ＤＩＧ標識ＰＣＲ産物として）合成された。
【０１２１】
実施例７
グルコノバクターオキシダンスＮ４４−１のＳＮＤＨａｉ遺伝子のオーソログのＰＣＲ増幅および配列分析
（実施例６に記載したように調製した）染色体ＤＮＡ調製物を、表２に示す４つのプライマーセットを用いたＰＣＲのための鋳型として使用した。染色体ＤＮＡ５〜１００ngを一反応あたりに使用した（総容積５０μl）。特に指定しない限り、Expand High Fidelity PCRシステム（Roche Diagnostics）を使用した。PCR条件は以下のとおりであった。
【０１２２】
９４℃で２分間インキュベーション、（ｉ）９４℃で１５秒間の変性工程、（ｉｉ）６０℃で３０秒間のアニーリング工程、（ｉｉｉ）７２℃で４５〜１２０秒間の合成工程（プライマーセットＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４に対する合成段階は、それぞれ４５秒、１２０秒、９０秒、および９０秒であった）、７２℃で７分間の伸長。
【０１２３】
ＰＣＲ反応の試料をアガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色後に透視装置でバンドを可視化した。ＰＣＲ反応の結果を表４にまとめる。
【０１２４】
【表３】
2007502102.tif 000004
【０１２５】
＋：検出、ｎｄ：検出せず、ｎｔ：試験せず。＊Expand High Fidelity PCRシステムのために使用したものと同じ反応サイクルでＧＣリッチＰＣＲシステム（Roche Diagnostics）を用いて、このＰＣＲを行った。
【０１２６】
アガロースゲルに鮮明なＰＣＲバンドが観察された場合（表４）、標準法を使用したヌクレオチド配列分析のためにそのＰＣＲ産物を直接使用した。種々のＰＣＲ産物について得られたヌクレオチド配列、およびコードされるペプチドの対応するアミノ酸配列を、ＳＮＤＨａｉ遺伝子の完全長配列およびＧ．オキシダンスＮ４４−１由来タンパク質と比較した。
【０１２７】
グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ３２９２のＳＮＤＨａｉオーソログ
プライマーＳＮＤＨ１３９１Ｆ（配列番号１０）およびＳＮＤＨ２３６４Ｒ（配列番号８）ならびに鋳型としてＧ．オキシダンスＩＦＯ３２９２由来染色体ＤＮＡを用いた増幅により得られたＰＣＲ産物（約１kb）を、プライマーＳＮＤＨ１３９１Ｆ（配列番号１０）を用いた配列分析に使用した。決定された７７１bpのヌクレオチド配列（配列番号１１）は、Ｇ．オキシダンスＮ４４−１由来ＳＮＤＨａｉ配列（配列番号１）のヌクレオチド１４３１〜２２０１と９８．７％（７６１／７７１）の相同性を示した。アミノ酸２５６個の推定されるアミノ酸配列（配列番号１２）は、Ｇ．オキシダンスＮ４４−１由来SNDHのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸４７８〜７３３と１００％の同一性を示した。
【０１２８】
グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ３２８７のＳＮＤＨａｉオーソログ
プライマーＳＮＤＨ１Ｆ（配列番号５）およびＳＮＤＨ４２０Ｒ（配列番号６）ならびに鋳型としてＧ．オキシダンスＩＦＯ３２８７由来染色体ＤＮＡを用いた増幅により得られたＰＣＲ産物（約０．４kb）を、プライマーＳＮＤＨ４２０Ｒ（配列番号６）を用いた配列決定に使用した。決定された３５０bpのヌクレオチド配列（配列番号１３）は、配列番号１のヌクレオチド３１〜３８０と９７．４％（３４１／３５０）の相同性を示した。推定される１１６残基のアミノ酸配列（配列番号１４）は、配列番号２のアミノ酸１１〜１２６と１００％の同一性を示した。
【０１２９】
プライマーＳＮＤＨ５０１Ｆ（配列番号７）およびＳＮＤＨ２３６４Ｒ（配列番号８）を用いた増幅により得られたＰＣＲ産物（約１．９kb）を、プライマーＳＮＤＨ５０１Ｆ（配列番号７）を用いた配列分析に使用した。決定された８０８bpのヌクレオチド配列（配列番号１５）は、配列番号１のヌクレオチド５７８〜１３８５と９８．０％（７４５／８０８）の相同性を示した。推定される２６８残基のアミノ酸配列（配列番号１６）は、配列番号２のアミノ酸１９４〜４６１と１００％の同一性を示した。
【０１３０】
プライマーＳＮＤＨ１３９１Ｆ（配列番号１０）およびＳＮＤＨ２３６４Ｒ（配列番号８）を用いた増幅により得られたＰＣＲ産物（約１kb）を、プライマーＳＮＤＨ１３９１Ｆ（配列番号１０）を用いた配列分析に使用した。決定された８００bpのヌクレオチド配列（配列番号１７）は、配列番号１のヌクレオチド１４６９〜２２６８と９８．８％（７９０／８００）の相同性を示した。推定される２６６残基のアミノ酸配列（配列番号１８）は、配列番号２のアミノ酸４９１〜７５６と１００％の同一性を示した。
【０１３１】
アセトバクター種ＡＴＣＣ１５１６４のＳＮＤＨａｉオーソログ
プライマーＳＮＤＨ１Ｆ（配列番号５）およびＳＮＤＨ４２０Ｒ（配列番号６）ならびに鋳型としてＡ．種ＡＴＣＣ１５１６４由来染色体ＤＮＡを用いた増幅により得られたＰＣＲ産物（約０．４kb）を、プライマーＳＮＤＨ４２０Ｒ（配列番号６）を用いた配列分析に使用した。決定された３６０bpのヌクレオチド配列（配列番号１９）は、配列番号１のヌクレオチド３１〜３９０と９７．８％（３５２／３６０）の相同性を示した。推定される１２０残基のアミノ酸配列（配列番号２０）は、配列番号２のアミノ酸１１〜１３０と１００％の同一性を示した。
【０１３２】
プライマーＳＮＤＨ５０１Ｆ（配列番号７）およびＳＮＤＨ２３６４Ｒ（配列番号８）を用いた増幅により得られたＰＣＲ産物（約１．９kb）を、プライマーＳＮＤＨ５０１Ｒ（配列番号７）を用いた配列決定に使用した。決定された７６０bpのヌクレオチド配列（配列番号２１）は、配列番号１のヌクレオチド５６３〜１３２２と９８．０％（７４５／７６０）の相同性を示した。推定される２５２残基のアミノ酸配列（配列番号２２）は、配列番号２のアミノ酸１８９〜４４０と１００％の同一性を示した。
【０１３３】
グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ３２４４のＳＮＤＨａｉオーソログ
Ｇ．オキシダンスＩＦＯ３２４４のＳＮＤＨａｉオーソログ遺伝子の完全ヌクレオチド配列を、鋳型としてＧ．オキシダンスＩＦＯ３２４４の染色体ＤＮＡおよび以下のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物を使用することによって決定した：ＳＮＤＨ１Ｆ（配列番号５）およびＳＮＤＨ４２０Ｒ（配列番号６）、ＳＮＤＨ５０１Ｆ（配列番号７）およびＳＮＤＨ１５３０Ｒ（配列番号９）、ＳＮＤＨ１３９１Ｆ（配列番号１０）およびＳＮＤＨ２３６４Ｒ（配列番号８）、ＳＮＤＨ３８２（配列番号２３）およびＳＮＤＨ１５３０Ｒ（配列番号９）、ＳＮＤＨ１Ｆ（配列番号５）およびＳＮＤＨ６８９Ｒ（配列番号２４）。ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで分解し、連結した染色体ＤＮＡを、以下のプライマーセットを用いたさらに２回のＰＣＲに使用した：ＳＮＤＨ４２０Ｒ（配列番号６）およびＳＮＤＨ５０１Ｆ（配列番号７）およびＳＮＤＨ１５３０Ｒ（配列番号９）およびＩＳ−５０．３（配列番号２５）。完全ヌクレオチド配列（配列番号２６）は、Ｇ．オキシダンスＮ４４−１（配列番号１）由来ＳＮＤＨａｉのヌクレオチド配列と９８．４％の相同性を示した。推定されるアミノ酸配列（配列番号２７）は、配列番号２のアミノ酸配列と１００％の同一性を示した。
【０１３４】
実施例８
ＳＮＤＨａｉの遺伝子の量を増加させることによるＬ−ソルボソンからのＬ−アスコルビン酸産生の増加
上流および下流に隣接領域を有するＳＮＤＨａｉ遺伝子を、鋳型としてＮ４４−１株の染色体ＤＮＡおよびプライマーセットＮ１（配列番号２８）およびＮ２（配列番号２９）を用いたＰＣＲによって増幅させた。
【０１３５】
供給業者の指示書にしたがって、ＧＣリッチＰＣＲシステム（Roche Diagnostics）を用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡフラグメントをベクターpCR2.1-TOPO（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入した。次に、得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで分解した。ＳＮＤＨａｉ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理したベクターｐＶＫ１００（アメリカンタイプカルチャーコレクション、カタログ番号ＡＴＣＣ３７１５６から入手可能）に連結した。この連結混合物を大腸菌ＴＧ１を形質転換するために使用した。ｐＶＫ−Ｐ−ＳＮＤＨａｉ−Ｔと称する所望のプラスミドを大腸菌から単離し、標準法を使用したエレクトロポレーション（Electrocell manipulator ECM600、BTX Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）によってＧ．オキシダンスＮ４４−１株に導入した。
【０１３６】
Ｇ．オキシダンスＮ４４−１株およびプラスミドｐＶＫ−Ｐ−ＳＮＤＨａｉ−Ｔを有するＮ４４−１株の細胞を、５００ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れた１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス（Difco）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．５g/lおよびＣａＣＯ３  １５g/Lを含む５番の培地５０ml中で３０℃、２００rpmで振盪しながら培養した。４８時間の培養後、HPLCで測定された、２本のフラスコの上清中のＬ−アスコルビン酸の量は、それぞれ１１０mg/lおよび２００mg/lであった。
【０１３７】
実施例９
マンニトールブロス寒天培地上で成長した休止細胞を使用したＬ−ソルボソンからのＬ−アスコルビン酸の産生
ＩＦＯ株３２９３、３２９２、３２４４、３２６０、３２６６、３２８７、３２５９、１３６９３、および１３７７３ならびにアセトバクター種ＡＴＣＣ１５１６４およびＩＦＯ３２９３株の派生株であるグルコノバクターオキシダンスＮ４４−１を 、Ｌ−ソルボソンからのＬ−アスコルビン酸の産生に使用した。
【０１３８】
ＩＦＯ１３６９３およびＩＦＯ１３７７３株を、５g/lバクトペプトン（Difco）、5g/l酵母エキス（Difco）、５g/lグルコース、５g/lマンニトール、１g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ml/lエタノール、および１５g/l寒天を含む３５０番の培地上で２７℃で３日間成長させた。他のすべてのアセトバクター株およびすべてのグルコノバクター株を、２５g/lマンニトール、５g/l酵母エキス（Difco Laboratories、デトロイト、ミシガン州、米国）、３g/lバクトペプトン（Difco）、および１８g/l寒天（Difco）を含むマンニトールブロス（ＭＢ）寒天培地上で２７℃で３日間成長させた。
【０１３９】
寒天平板から細胞をかき取り、蒸留水に懸濁し、２３０rpmで振盪しながら５ml容試験管中で３０℃で２０時間実施した休止細胞反応のために使用した。反応混合物（０．５ml）は、１％Ｌ−ソルボソン、０．３％ＮａＣｌ、１％ＣａＣＯ３および６００ナノメータで１０吸光単位（ＯＤ６００）の最終濃度の細胞を含んでいた。インキュベーション時間の最後に、Aminex-HPX-78H（３００×７．８mm）カラム（Biorad、ライナッハ、スイス）を取り付けたLiChrospher-100-RP18（１２５×４．６mm）カラム（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）を具備したAgilent 1100ＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies、ウィルミントン、米国）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってその反応混合物を分析した。移動相は、０．００４M硫酸であり、流速は０．６ml/分であった。ＵＶ検出器（波長２５４nm）と屈折率検出器とを組み合わせて使用して二つのシグナルを記録した。さらに、アミノカラム（YMC-PackポリアミンＩＩ、ＹＭＣ社、京都、日本）を使用して２５４nmでＵＶを検出してＬ−アスコルビン酸の確認を行った。移動相は５０mM ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４およびアセトニトリル（４０：６０）であった。
【０１４０】
Ｌ−アスコルビン酸を同定するためにAgilent Series 1100ＨＰＬＣ−マススペクトロメトリー（ＭＳ）システムを使用した。エレクトロスプレイインターフェースを使用した正イオンモードでＭＳを運転した。LUNA-C8(2)カラム（１００×４．６mm）（Phenomenex、トランス、米国）を使用して分離を行った。移動相は、０．１％ギ酸およびメタノール（９６：４）の混合物であった。Ｌ−アスコルビン酸は、３．１分の保持時間で溶出した。Ｌ−アスコルビン酸の同一性を保持時間およびその化合物の分子量から確認した。
【０１４１】
Ｄ−イソアスコルビン酸が存在していることを除外するために、アミノカラム（YMC-PackポリアミンＩＩ、ＹＭＣ社、京都、日本）を使用して２５４nmでＵＶを検出したときの保持時間によってＬ−アスコルビン酸の同定を追加的に行った。移動相は５０mM ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４およびアセトニトリル（４０：６０）であった。
【０１４２】
グルコノバクター株およびアセトバクター株は、表５に示すようにＬ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸を産生した。
【０１４３】
【表４】
2007502102.tif 000005
【０１４４】
ブランク：細胞を含まない反応混合物で反応を行った。
【０１４５】
実施例１０
３ＢＤ寒天培地上で成長した休止細胞を使用したＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースまたはＬ−ソルボソンからのＬ−アスコルビン酸の産生
Ｇ．オキシダンスＮ４４−１の細胞を、７０g/l Ｌ−ソルボース、０．５g/lグリセロール、７．５g/l酵母エキス（Difco）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０g/l ＣａＣＯ３および１８g/l寒天（Difco）を含む３ＢＤ番の寒天培地上で２７℃で３日間成長させた。休止細胞の反応（１０ml容試験管に入れた反応混合物１ml）を、実施例９に記載したように２％Ｄ−ソルビトール、２％Ｌ−ソルボース、または１％Ｌ−ソルボソンを用いて３０℃で２４時間行った。Ｎ４４−１株は、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、およびＬ−ソルボソンからそれぞれ２８０、４００および１７８０mg/lのＬ−アスコルビン酸を産生した。
【０１４６】
３ＢＤ番の寒天培地上で成長したＮ４４−１細胞を、実施例９に記載するように２％Ｄ−ソルビトール、２％Ｌ−ソルボースまたは２％Ｌ−ソルボソンを含む反応混合物に入れて、他の反応（１０ml容試験管に入れた反応混合物０．５ml）を２日間行った。Ｎ４４−１株は、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、およびＬ−ソルボソンからそれぞれ１．８、２．０および５．１g/lのＬ−アスコルビン酸を産生した。
【０１４７】
Ｇ．オキシダンスＩＦＯ３２９３の細胞を使用した反応を、上記のように２％Ｌ−ソルボソンを用いて実行した。ＩＦＯ３２９３株は、２日間でＬ−アスコルビン酸５．７g/lを産生した。
【０１４８】
実施例１１
液体培地中で成長した休止細胞を使用したＤ−ソルビトールからのＬ−アスコルビン酸の産生
Ｇ．オキシダンスＮ４４−１の細胞を、２l容のバッフル付き振盪フラスコに入れた１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス（Fluka BioChemika、ブックス、スイス）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１５g/l ＣａＣＯ３を含む５番の培地２００ml中で３０℃、１８０rpmで振盪しながら成長させた。２４時間後に培養液を３２２０gで遠心分離し（Eppendorf 5810R、ハンブルグ、ドイツ）、細胞を０．９％ＮａＣｌ溶液に再懸濁し、再び３２２０gで遠心分離し、得られた細胞ペレットを、完全成長培地（１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１５g/l ＣａＣＯ３）５０mlを含む５００ml容バッフル付き振盪フラスコ１本および生産培地（１００g/l Ｄ−ソルビトール、３g/l ＮａＣｌ、１０g/l ＣａＣＯ３）５０mlを含む別の５００ml容バッフル付き振盪フラスコに植菌するために使用した。６００nmでの光学密度（ＯＤ６００）として測定された両フラスコでの初期細胞密度は１０であった。両フラスコを、３０℃、１８０rpmで振盪しながらインキュベートした。４８時間後に成長培地および生産培地中の細胞懸濁液は、それぞれ１．０６および１．１８g/lのＬ−アスコルビン酸を蓄積していた。インキュベーション時間の間に完全培地ではさらなる成長は観察されなかった。
【０１４９】
実施例１２
増加したＳＮＤＨａｉ遺伝子量を有する組換え微生物の休止細胞によるＬ−ソルボソンまたはＤ−ソルビトールからのＬ−アスコルビン酸の産生
上流および下流に隣接領域を有するＧ．オキシダンスＮ４４−１（配列番号１）のＳＮＤＨａｉ遺伝子を、鋳型としてＮ４４−１株の染色体ＤＮＡならびにプライマーセットＮ１（配列番号２８）およびＮ２（配列番号２９）を用いたＰＣＲによって増幅させた。
【０１５０】
供給業者の指示書に従って、ＧＣリッチＰＣＲシステム（Roche Diagnostics GmbH）でＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡフラグメントをベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入した。次に、得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで分解した。ＳＮＤＨａｉ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理したベクターｐＶＫ１００（アメリカンタイプカルチャーコレクション、カタログ番号ＡＴＣＣ３７１５６として入手可能）に連結した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１を形質転換した。ｐＶＫ−Ｐ−ＳＮＤＨａｉ−Ｔと称する所望のプラスミドを大腸菌から単離し、標準法を使用したエレクトロポレーション（Electrocell manipulator ECM600、BTX Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）によってＧ．オキシダンスＮ４４−１株に導入した。
【０１５１】
Ｎ４４−１（ｐＶＫ−Ｐ−ＳＮＤＨａｉ−Ｔ）クローン番号１、２、および３と称する３つの独立した形質転換体を、その親株Ｇ．オキシダンスＮ４４−１と共に３ＢＤ番の寒天培地およびＭＢ番の寒天培地でそれぞれ成長させた。細胞を平板からかき取り、実施例９に記載されているように休止細胞の反応（基質として１％Ｌ−ソルボソン）のために使用した。３ＢＤ番の寒天上で成長後の休止細胞アッセイにおいて、Ｎ４４−１株は、２．５g/lのＬ−アスコルビン酸を産生したが、一方でＮ４４−１（ｐＶＫ−Ｐ−ＳＮＤＨａｉ−Ｔ）クローン１、２および３株はそれぞれ４．２、４．１および４．２g/lのＬ−アスコルビン酸を産生した。ＭＢ寒天で成長後の休止細胞アッセイで、Ｎ４４−１株は０．１２g/lのＬ−アスコルビン酸を産生したが、一方でＮ４４−１（ｐＶＫ−Ｐ−ＳＮＤＨａｉ−Ｔ）クローン１、２および３株は、それぞれ１．８、２．５および０．９４g/lのＬ−アスコルビン酸を産生した。
【０１５２】
５００ml容のバッフル付き振盪フラスコ２本に入れた５番の培地（１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１５g/l ＣａＣＯ３）５０ml中で３０℃、２２０rpmで振盪しながら３日間培養したＧ．オキシダンスＮ４４−１およびクローン２（上記参照）の細胞を使用して別の反応を行った。各株について１本のフラスコから、得られたブロスを５００rpmで遠心分離してＣａＣＯ３を除去した。この工程の上清を次に５０００rpmで遠心分離して細胞をペレットにした。採集した細胞を０．９％ＮａＣｌ溶液１０mlに再懸濁し、再び５０００rpmで遠心分離して細胞をペレットにした。採取した細胞を水に再懸濁し、１０ml容の反応管に入れた生産培地（２０g/l Ｄ−ソルビトール、３g/l ＮａＣｌ、１０g/l ＣａＣＯ３）１mlに６００nmで５ＯＤ単位に対応する最終休止細胞密度で植菌するために使用した。３０℃、２２０rpmで反応時間２０時間後に、産生フラスコから採取された上清は、Ｎ４４−１株およびＳＮＤＨａｉ過剰発現Ｎ４４−１株についてそれぞれ３６０および７６０mg/lのＬ−アスコルビン酸を含んでいた。それに対して、７２時間後に残りの成長培地から採取された上清は、それぞれ０および４４０mg/lのＬ−アスコルビン酸を含んでいた。
【０１５３】
実施例１３
大腸菌の休止細胞におけるＬ−ソルボソンからのＬ−アスコルビン酸の産生
配列番号１のヌクレオチド１〜２３６４に対応する、ＳＮＤＨａｉ−１と名付けた、停止コドンを有さないＳＮＤＨａｉ遺伝子を、プライマー対ＳＮＤＨａｉ−Ｎｄｅ（配列番号３０）およびＳＮＤＨａｉＨｉｓ−Ｘ（配列番号３１）を使用したＰＣＲ（Roche High Fidelity Kit）によってＮ４４−１株の染色体ＤＮＡから増幅させた。
【０１５４】
増幅したＤＮＡをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）にクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＳＮＤＨａｉ−１を得て、そのＳＮＤＨａｉ配列が正しいことをヌクレオチド配列分析によって確認した。次に、そのＳＮＤＨａｉ−１遺伝子をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Novagen、マディソン、ウィスコンシン州、米国）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位の間に連結し、ｐＥＴ２ｌｂ−ＳＮＤＨａｉＨｉｓを産生させた。ＳＮＤＨａｉのＣ末端に６個のＨｉｓを付加した。このｐＥＴ２１ｂ−ＳＮＤＨａｉＨｉｓを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。
【０１５５】
カルベニシリン５０μg/mlを有するＬＢ中で一晩培養した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｂ−ＳＮＤＨａｉＨｉｓの培養液５mlを同培地２００mlに植菌した。細胞を２３０rpm、３７℃で２時間培養してから、１mM ＩＰＴＧで誘導し、２３０rpm、２５℃で３時間培養を続けた。得られた培養物を遠心分離し、食塩水で２回洗浄し、細胞ペレットを水２mlに再懸濁した。ＯＤ６００＝１０の細胞、１％ソルボソン一水和物、５μM ＰＱＱ、５mM ＭｇＣｌ２、０．３％ＮａＣｌ、および１％ＣａＣＯ３を含む反応混合物（５ml容試験管中に５００μl）を用いて３０℃で１５時間行った休止細胞反応にその細胞を使用した。１５時間のインキュベーション後にＬ−アスコルビン酸０．１４g/Lが産生した。休止細胞反応を１μM ＰＱＱ（その他の条件は上記と同様）と共に行った場合、３時間のインキュベーション後にＬ−アスコルビン酸０．０５g/Lが産生した。
【０１５６】
実施例１４
増加したＳＮＤＨａｉ遺伝子量を有する組換え微生物の休止細胞によるＤ−ソルビトールからのＬ−アスコルビン酸の産生
ＳＮＤＨａｉを過剰発現するＧ．オキシダンスＮ４４−１の細胞を、５００ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れた１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．５g/lグリセロール、１５g/l酵母エキス（Fluka BioChemika、ブックス、スイス）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１５g/l ＣａＣＯ３を含む５番の培地５０ml中で３０℃、１８０rpmで振盪しながら４８時間成長させた。得られた細胞懸濁液を、１００g/l Ｄ−ソルビトール、１５g/l酵母エキス（Fluka BioChemika、ブックス、スイス）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３g/l ＫＨ２ＰＯ４および０．１２g/l ＣａＳＯ４からなる培地１．２５lを含む成長容器（Biostat-MD、B. Braun Melsungen、メルスンゲン、ドイツ）と呼ばれる２L容のバイオリアクターに植菌するために使用した。細胞を３０℃、通気速度１l/分で培養し、２５％Ｎａ２ＣＯ３溶液でｐＨを５．７に制御し、撹拌速度を変動させることによって溶存酸素を１０％飽和に制御した。２４時間後、６００nmでの吸光単位として測定された細胞密度は２０であった。この時点で、１００g/l Ｄ−ソルビトール、１５g/l酵母エキス（Fluka BioChemika、ブックス、スイス）、２．５g/l ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３g/l ＫＨ２ＰＯ４および０．１２g/l ＣａＳＯ４を含む供給溶液を１２５ml/時の供給速度で成長容器に供給し、採取速度１２５ml/時でブロスを連続的に採取した。これによって、成長容器中の体積を１．２５lの一定に保持した。他の工程パラメータを、上に言及したように制御し続けた。
【０１５７】
このブロスを、１００g/l Ｄ−ソルビトール、０．３g/l ＮａＣｌおよび０．１２g/l ＣａＳＯ４を含む生産培地５lを満たした産生容器と呼ぶ第二リアクターに１２５ml/時の速度で連続的に供給し、温度を３０℃に、２０％ＮａＯＨ溶液を用いた制御によりｐＨを７．０に保持した。通気速度を１０l/分の一定に保ち、撹拌速度を変動させることによって溶存酸素を２０％に制御した。同じ組成を有する生産培地も供給速度３７５ml/間で産生容器に連続的に供給した。５００ml/時の速度で連続的に上清を採取することによって、容器の容積を５lの一定に保ち、その採取は孔サイズ５００kDaを有する十字流限外濾過モジュール（UFP-500-E-9A、Amersham Biosciences）からの濾液流としてもたらされ、そのモジュールを通過して産生容器から採取された細胞懸濁液は、Masterflexポンプを使用して５０l/時で汲み出された。リテンテート流をポンプで容器に汲み戻した。産生容器中の細胞密度が、いったん６００nmで１００吸光単位に達したならば、産生容器中の細胞密度を一定に保つために２５ml/時の速度で産生容器に還流する濃縮細胞流からの細胞の採取を開始した。
【０１５８】
無細胞上清の採取流は、４g/lのＬ−アスコルビン酸を含み、３０℃で二重ジャケットを有する採集容器（Ecoline Re 112、Lauda、ラウダ−ケーニックスホーフェン、ドイツ）に５００ml/時の速度で連続的に供給された。この容器は、二区画電気透析ユニット（Eurodia Industries、Wissous、フランス製、陽イオン交換膜ＣＭＸ−Ｓおよび陰イオン交換膜ＡＳＡを有し、膜総面積０．２m2を有するセル対１０個を含むスタック）の希釈液区画に連続的に上清を１８０l/時の速度で供給し、一定の流液がその容器から汲み出され容積を２lの一定に保った。最初３０℃の脱イオン水を入れた二重ジャケットを有する別の容器に、６２．５ml/時の速度で新鮮脱イオン水を連続的に供給し、２００l/時の速度で電気透析ユニットの濃縮区画に水溶液を一定に汲み入れ、一定の採取流をその容器から汲み出した。ぜん動ポンプ（7518-00、Masterflex、米国）を使用して電気透析スタックに供給溶液をポンプで入れ、各電気透析区画を通過した溶液の再循環をロータリーポンプ（MD-20、IWAK、東京、日本）の助けを借りて行った。工程全般で、電気透析スタックに１４Vを印加した（電源FuMATech TS001/5、ザンクトイングベルト、ドイツ）。採取流中のＬ−アスコルビン酸濃度は１６g/lであった。
【０１５９】
実施例１５
下流の加工処理工程による休止細胞反応から産生したＬ−アスコルビン酸の精製
１６g/1のＬ−アスコルビン酸を含む実施例１４の採取流をキレート樹脂（Amberlite IRC 748、Rohm and Haas、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、米国）に供給して、流液から二価陽イオンを除去した。次に、それを冷却容器（供給容器）に採集し、１０lを採集したときにバイポーラ膜電気透析ユニット（Eurodia Industries、Wissous、フランス製、7 Neosepta BP1/CMB膜を含むスタック、総膜面積０．１４m2）を通過する回分法でそれらを加工処理した。この溶液を電気透析ユニットの供給区画を介して２００l/時の速度で汲み出し、供給容器に再循環させた。最初に２g/l ＮａＯＨ溶液５lを含む別の冷却容器（濃縮容器）から、バイポーラ膜電気透析ユニットの濃縮区画を介して１００l/時でポンプで液を流動させた。最大電圧２５Vおよび最大電流２０Aを適用することによって、供給区画からのナトリウム陽イオンを濃縮区画に移動させ、よって供給流に存在するナトリウム型のＬ−アスコルビン酸を対応する遊離酸型に転換した。９０％の転換効率に達した後、工程を停止した。濃縮容器において、７．５g/l ＮａＯＨを含む溶液６lを希釈容器から採集し、ナトリウム塩型から遊離酸型への転換効率を約９９％まで増加させるために約１６g/l Ｌ−アスコルビン酸を遊離酸型で、および１．６g/l Ｌ−アスコルビン酸をナトリウム塩型で含む溶液９lを陽イオン交換樹脂（Amberlite FPC 21 H、Rohm and Haas、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、米国）でさらに加工処理した。あるいはまた、電気透析工程からのナトリウム塩型の１６g/l Ｌ−アスコルビン酸を含む溶液１０lを陽イオン交換樹脂で直接処理し、９９％の収率で遊離酸型に転換させた。上記の方法のいずれかによって得られた遊離酸型のＬ−アスコルビン酸の流液を、次に一連の以下の工程によってさらに加工処理した：陰イオン交換、活性炭処理、濃縮、結晶化、結晶の濾過、および乾燥。得られた結晶の最終純度は、９８％であり、下流の加工処理工程の組み合わせで得られた収率は８０％であった。
【配列表】
2007502102000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月17日(2006.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のうち少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列を含むＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから誘導可能な単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列番号１の部分ヌクレオチド配列が、少なくとも５０個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
配列番号１の部分ヌクレオチド配列が、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
部分ヌクレオチド配列が、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを比較して、配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
部分ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項１〜４のいずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
部分ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項１〜５のいずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号１、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２６からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
部分ヌクレオチド配列が、配列番号５、６、７、８、９、１０、２３、および２４からなる群より選択される、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２、１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２７からなる群より選択される少なくとも２５個の連続するアミノ酸の部分アミノ酸配列を含む、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
部分アミノ酸配列が、少なくとも３５個の連続するアミノ酸を有する、請求項９または１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの発現のための組換えＤＮＡ分子であって、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２記載の組換えＤＮＡおよび／または請求項１３記載の発現ベクターで形質転換された組換え生物。
【請求項１５】
組換えＤＮＡが染色体に少なくとも部分的に組込まれている、請求項１４記載の組換え生物。
【請求項１６】
真菌細胞、植物細胞、動物細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項１４または１５記載の組換え生物。
【請求項１７】
生物がグルコノバクター（Gluconobacter）、アセトバクター（Acetobacter）、シュードモナス（Pseudomonas）およびエシェリキア（Escherichia）からなる群より選択される属の細菌である、請求項１６記載の組換え生物。
【請求項１８】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質からのＬ−アスコルビン酸の製造方法であって、
（ａ）適切な培地中で請求項１４〜１７のいずれか１項記載の組換え生物を増殖させ；そして
（ｂ）該培地からＬ−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。
【請求項１９】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質からのＬ−アスコルビン酸の製造方法であって、
（ａ）適切な培地中で請求項９記載のポリペプチドをコードする非組換え微生物を増殖させ；そして
（ｂ）該培地からＬ−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。
【請求項２０】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質を請求項９記載の単離されたポリペプチドと接触させることを含む、Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。
【請求項２１】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ソルボソンより選択される基質からのＬ−アスコルビン酸の製造方法であって、
（ａ）適切な培地中で請求項１４〜１７のいずれか１項記載の生物の組換え体または請求項９記載のポリペプチドをコードする非組換え微生物を増殖させ；
（ｂ）Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離および精製し；
（ｃ）（ｂ）のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの存在下で該基質をインキュベートし；そして
（ｄ）反応混合物からＬ−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。
【請求項２２】
適切な培地中で請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む組換え生物を増殖し、細胞を破壊し、かつＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離する、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項２３】
適切な培地中で請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む非組換え微生物を増殖し、細胞を破壊し、かつＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離する、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項２４】
微生物の休止細胞を含む培地中で基質をビタミンＣに転換することを含む、ビタミンＣの製造方法。
【請求項２５】
（ａ）成長を可能にする条件下で微生物を培養し；
（ｂ）該微生物の成長速度を低減して休止細胞をもたらすような条件に変更し；そして
（ｃ）（ｂ）の休止細胞を使用して基質からビタミンＣを産生する
工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）および（ｃ）が、二つ以上の別個の容器において行われる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）および（ｃ）がいかなる洗浄工程および／または単離工程によっても隔てられない、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
微生物を、回分法、流加法、連続法、または半連続法で成長させる、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）を、回分法、流加法、連続法、または半連続法で行う、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
６００nmでのＯＤとして測定される、培地中の休止細胞の密度が少なくとも１０である、請求項２４〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
産生するビタミンＣの収量が、少なくとも１．８g/lである、請求項２４〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
微生物が、酵母、藻類、および細菌からなる群より選択される、請求項２４〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
微生物が、カンジダ（Candida）、サッカロミセス（Saccharomyces）、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、スキゾサッカロミセス（Scyzosaccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、クロレラ（Chlorella）、グルコノバクター、アセトバクターアセチ（Acetobacter aceti）、パントエア（Pantoea）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、シュードモナスおよびエシェリキアからなる群より選択される、請求項２４〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
基質が、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、２−ケト−Ｌ−グロナート、Ｄ−グルコナート、２−ケト−Ｄ−グルコナートおよび２，５−ジケト−グルコナートからなる群より選択される、請求項２４〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
基質からビタミンＣおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の両方を産生できる微生物を使用し、ビタミンＣおよび２−ＫＧＡの濃度の比が０．１を超える、請求項２４〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
培地からのビタミンＣの単離、および場合により一つまたは複数の精製工程をさらに含む、請求項１８〜２１または請求項２４〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
すべての精製工程が水性環境で行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
更に、電気透析を用いて培地中の成分からビタミンＣを分離することを含む、請求項１８〜２１及び２４〜３７のいずれか１項記載の方法。
【国際調査報告】
2007502102.tif 000006
2007502102.tif 000007
2007502102.tif 000008
2007502102.tif 000009
2007502102.tif 000010
2007502102.tif 000011