(57)【要約】  実施の形態は、好ましくはＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を誘発し、増強し、持続するための方法及び組成物に関する。この方法及び組成物は、予防又は治療目的のために用いられ得る。
2007523863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫感作方法であって、
第一の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする免疫原を含む第一の組成物を哺乳類に送達する工程、及び
増幅ペプチドを含む第二の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与する工程を包含し、前記ペプチドは前記第一の抗原のエピトープに対応し、前記第一の組成物及び前記第二の組成物は同一でない、免疫感作方法。
【請求項２】
前記第一の組成物は抗原又はその免疫原性断片をコードする核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第一の組成物はｐＡＰＣ中のエピトープを発現し得る核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記核酸は原生動物、細菌、ウイルス又はウイルスベクターの一構成成分として送達される、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記第一の組成物は免疫原性ポリペプチド及び免疫増強剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記免疫増強剤はサイトカインである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記免疫増強剤はトール様受容体リガンドである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記アジュバントは免疫刺激配列を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記アジュバントはＲＮＡを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫原性ポリペプチドは前記増幅ペプチドである、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫原性ポリペプチドは前記第一の抗原である、請求項５記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫原性ポリペプチドは原生動物、細菌、ウイルス、ウイルスベクター又はウイルス様粒子の一構成成分として送達される、請求項５記載の方法。
【請求項１３】
前記アジュバントは原生動物、細菌、ウイルス、ウイルスベクター又はウイルス様粒子の一構成成分として送達される、請求項５記載の方法。
【請求項１４】
前記第二の組成物はアジュバント及び免疫増強剤を含まない、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記送達する工程は哺乳類のリンパ系への直接投与を包含する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類のリンパ系への直接投与はリンパ節又はリンパ管への直接投与を包含する、請求項１又は請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記直接投与は２又はそれ以上のリンパ節又はリンパ管に対してである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
リンパ節は鼠径部、腋窩、頚部及び扁桃リンパ節から成る群から選択される、請求項１
６記載の方法。
【請求項１９】
前記第一の抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得ることをさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記エフェクターＴ細胞応答は前炎症性サイトカインの産生を包含する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記サイトカインはγ−ＩＦＮ又はＴＮＦαである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記エフェクターＴ細胞応答はＴ細胞ケモカインの産生を包含する、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記ケモカインはＲＡＮＴＥＳ又はＭＩＰ−１αである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記エピトープはハウスキーピングエピトープである、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記エピトープは免疫エピトープである、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記送達する工程又は前記投与する工程は１回のボーラス注射を包含する、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記送達する工程又は前記投与する工程は反復のボーラス注射を包含する、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
前記送達する工程又は前記投与する工程は連続注入を包含する、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記注入は約８〜約７日間の持続期間を有する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記送達する工程の終了と前記投与する工程の開始の間に間隔を有し、該間隔は少なくとも約７日間である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記間隔は約７〜約１４日間である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記間隔は約７５日を上回る、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記第一の抗原は疾患関連抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患関連抗原は腫瘍関連抗原である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患関連抗原は病原体関連抗原である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法を包含する、疾患の治療方法。
【請求項３７】
前記第一の抗原は標的関連抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
前記標的は新生細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記標的は病原体感染細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記病原体感染細胞は原生動物、細菌、真菌、ウイルス又はプリオンにより感染されている、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記エフェクターＴ細胞応答はサイトカイン検定、エリスポット検定、細胞傷害性検定、四量体検定、ＤＴＨ応答、臨床応答、腫瘍縮小、腫瘍クリアランス、腫瘍進行の抑制、病原体力価減少、病原体クリアランス及び疾患症候の寛解から成る群から選択される少なくとも１つの指標により検出される、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
前記エフェクターＴ細胞応答は細胞傷害性Ｔ細胞応答である、請求項１９記載の方法。
【請求項４３】
免疫感作方法であって、
第一の抗原又はその免疫原性断片をコードする核酸を含む第一の組成物を哺乳類に送達する工程、及び
ペプチドを含む第二の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することを包含し、前記ペプチドは前記第一の抗原のエピトープに対応する、免疫感作方法。
【請求項４４】
前記抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得ることをさらに包含する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
存在する抗原特異的免疫応答の増大方法であって、
ペプチドを含む組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与する工程であって、前記ペプチドは前記抗原のエピトープに対応し、前記組成物は前記免疫応答を誘導するために用いられていない工程、及び
抗原特異的免疫応答の増大を得る工程
を包含する、存在する抗原特異的免疫応答の増大方法。
【請求項４６】
前記増大は前記応答を長時間持続させることを包含する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記増大は静止Ｔ細胞を再活性化することを包含する、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記増大は抗原特異的Ｔ細胞の集団を拡大することを包含する、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物は免疫増強剤を含まない、請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
免疫感作方法であって、
第一の抗原の少なくとも一部分及び第二の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする免疫原を含む第一の組成物を哺乳類に送達する工程、及び
第一のペプチドを含む第二の組成物、及び第二のペプチドを含む第三の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与する工程を包含し、前記第一のペプチドは前記第一の抗原のエピトープに対応し、前記第二のペプチドは前記第二の抗原のエピトープに対応し、前記第一の組成物は前記第二又は第三の組成物と同一でない、免疫感作方法。
【請求項５１】
前記抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得ることをさらに包含する、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記第二及び第三の組成物はそれぞれ前記第一の及び第二のペプチドを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
抗原特異的寛容原性又は調節性免疫応答を発生させる方法であって、
アジュバントを含まないペプチドを含む組成物を哺乳類のリンパ系に直接、定期的に投与する工程であって、前記ペプチドは前記抗原のエピトープに対応し、前記哺乳類はエピトープにナイーブである工程、
を包含する、抗原特異的寛容原性又は調節性免疫応答を発生させる方法。
【請求項５４】
寛容原性又は調節性Ｔ細胞免疫応答を得ることをさらに包含する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫応答は炎症性障害の治療を補助する、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記炎症性障害はクラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性免疫応答から生じる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫応答は免疫抑制性サイトカインの産生を包含する、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
前記サイトカインはＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＴＧＢ−βである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
免疫感作方法であって、
免疫原性用量系列を哺乳類のリンパ系に直接投与する工程を包含し、前記系列は少なくとも１惹起（entraining）用量及び少なくとも１増幅用量を含み、前記惹起用量は免疫原をコードする核酸を含み、前記増幅用量は任意のウイルス、ウイルスベクター又は複製−コンピテントベクターを含有しない、免疫感作方法。
【請求項６０】
１〜６惹起用量を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
複数惹起用量を投与することを包含し、前記用量は１〜約７日間の期間に亘って投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
惹起用量、増幅用量、又は惹起及び増幅用量が多数対の注射で投与され、対の第一成員は、対の第二成員の約4日以内に投与され、異なる対の第一成員間の間隔は少なくとも約１４日である、請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
最終惹起用量投与及び第一の増幅用量投与間の間隔は約７〜約１００日である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
抗原特異的免疫応答を得ることをさらに包含する、請求項５９記載の方法。
【請求項６５】
１〜６惹起用量及び少なくとも１増幅用量を含む、哺乳類における免疫応答を誘導するための免疫原性組成物セットであって、前記惹起用量は免疫原をコードする核酸を含み、前記増幅用量はペプチドエピトープを含み、前記エピトープは核酸を発現するｐＡＰＣにより提示される、免疫原性組成物のセット。
【請求項６６】
１用量はアジュバントをさらに含む、請求項６５記載のセット。
【請求項６７】
前記アジュバントはＲＮＡである、請求項６６記載のセット。
【請求項６８】
前記惹起及び増幅用量がリンパ系への直接投与に適した担体中に存在する、請求項６５記載のセット。
【請求項６９】
前記惹起及び増幅用量はリンパ節への直接投与に適した担体中に存在する、請求項６８記載のセット。
【請求項７０】
前記核酸はプラスミドである、請求項６５記載のセット。
【請求項７１】
前記エピトープはクラスＩ  ＨＬＡエピトープである、請求項６５記載のセット。
【請求項７２】
前記クラスＩ  ＨＬＡは表１−４から選択される、請求項７１記載のセット。
【請求項７３】
前記ＨＬＡはＨＬＡ−Ａ２である、請求項７２記載のセット。
【請求項７４】
前記免疫原はエピトープアレイを含む、請求項６５記載のセット。
【請求項７５】
前記エピトープアレイは遊離配列を含む、請求項７４記載のセット。
【請求項７６】
前記免疫原は本質的に標的関連抗原から成る、請求項６５記載のセット。
【請求項７７】
前記標的関連抗原は腫瘍関連抗原である、請求項７６記載のセット。
【請求項７８】
標的関連抗原は微生物抗原である、請求項７６記載のセット。
【請求項７９】
前記免疫原はエピトープクラスターを含む標的関連抗原の断片を含む、請求項６５記載のセット。
【請求項８０】
１〜６惹起用量及び少なくとも１増幅用量を含む、哺乳類におけるクラスＩ  ＭＨＣ拘束性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物セットであって、前記惹起用量は免疫原又は免疫原をコードする核酸及び免疫増強剤を含み、前記増幅用量はペプチドエピトープを含み、前記エピトープはｐＡＰＣにより提示される、免疫原性組成物セット。
【請求項８１】
前記免疫原をコードする核酸は免疫増強剤として機能する免疫刺激配列をさらに含む、請求項８０記載のセット。
【請求項８２】
前記免疫原はウイルス、又は免疫増強剤を含むか又は誘導する複製コンピテントベクターである、請求項８０記載のセット。
【請求項８３】
前記免疫原は細菌、細菌溶解物又は精製細胞壁構成成分であり、該細菌細胞壁構成成分は免疫増強剤として機能する、請求項８０記載のセット。
【請求項８４】
前記免疫増強剤はＴＬＲリガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、飲食作用パターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤサポニン、ツカレソール及び前炎症性サイトカインから成る群から選択される、請求項８０記載のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に開示される本発明は、ＭＨＣクラスＩ拘束性免疫応答を誘導して、応答の性質及び大きさを制御し、病原性過程における有効な免疫学的介入を促進するための方法及び組成物に関する。特に本発明は、免疫原性組成物、それらの性質、並びにそれらが有効に用いられる投与の順序、時機及び経路に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連技術分野の説明］
主要組織適合性複合体及びＴ細胞標的認識
リンパ球（Ｔ細胞）は、特定の抗原シグナルに対する応答において機能する抗原特異的免疫細胞である。Ｂリンパ球及びそれらが産生する抗体も、抗原特異的存在物である。しかしながらＢリンパ球とは違って、Ｔ細胞は、遊離又は可溶性形態で抗原に応答しない。Ｔ細胞が抗原に応答するには、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）として既知の提示複合体に結合される抗原を必要とする。
【０００３】
ＭＨＣタンパク質は、Ｔ細胞がネイティブ又は「自己」細胞を外来細胞から区別する手段を提供する。ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞によりその後監視される潜在的ペプチドエピトープを提示する免疫受容体の一部類である。２種類のＭＨＣ、即ちクラスＩ  ＭＨＣ及びクラスＩＩ  ＭＨＣが存在する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質と相互作用し、主にヘルパー表現型を有し、一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質と相互作用し、主に細胞溶解性表現型を有するが、それらは各々、調節機能、特に抑制機能も示し得る。両ＭＨＣは、細胞の外表面にそれらの構造の大部分を有する膜貫通型タンパク質である。さらに両クラスのＭＨＣは、それらの外側部分にペプチド結合溝を有する。ネイティブ又は外来のタンパク質の小断片、が結合され、細胞外環境に提示されるのは、この溝においてである。
【０００４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる細胞は、ＭＨＣを用いてＴ細胞に抗原を表示する。Ｔ細胞は、それがＭＨＣ上に提示される場合、抗原を認識する。この要件は、ＭＨＣ拘束と呼ばれる。抗原が認識可能ＭＨＣにより表示されない場合、Ｔ細胞は認識せず、抗原シグナルに作用しない。認識可能ＭＨＣに結合されたペプチドに特異的な細胞は、これらのＭＨＣ−ペプチド複合体と結合して、免疫応答の次の段階に進行する。
【０００５】
公称ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ拘束性エピトープに対応するペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導し、増幅し、あるいは操作する目的のために送達され得る最も簡単な形態の抗原のうちの1つである。ペプチドエピトープはｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激Ｔ細胞株、クローン又はＴ細胞ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激するに際して有効であることが示されている、という事実にもかかわらず、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ効力は非常に制限されている。これは、以下の２つの主要要因のためである：
（１）急速な腎クリアランス及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ分解により引き起こされて、ＡＰＣへの接近制限を生じるペプチドの不十分な薬物動態（ＰＫ）プロフィール；
（２）強力且つ持続的免疫応答、特にＴｃ１又はＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−アルファを産生）から成る応答を誘導するか又は増幅するための抗原誘導性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）依存性シグナル伝達単独（シグナル１）の不足。さらに、ペプチドに関連した限定ＰＫを回避するための、大用量のペプチド又はデポー助剤の使用は、ある種の免疫増強又は変調アジュバントが一緒に用いられない限り、種々の程度の非応答性又は「免疫偏向」を誘発し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［発明の概要］
本発明の実施の形態は、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を操作するための、特に誘導し、惹起し、及び／又は増幅するための方法及び組成物を包含する。
【０００７】
いくつかの実施の形態は、免疫感作方法に関する。この方法は、例えば、第一の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする免疫原を含む第一の組成物を哺乳類に送達する工程、及び増幅ペプチドを含む第二の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与する工程を包含し得、ペプチドは第一の抗原のエピトープに対応し、第一の組成物及び第二の組成物は同一でない。本方法は、エフェクターＴ細胞応答を得て、それに関して検定し、又は検出する工程をさらに包含し得る。
【０００８】
第一の組成物は抗原又はその免疫原性断片をコードする核酸を含み得る。第一の組成物はｐＡＰＣ中のエピトープを発現し得る核酸を含み得る。核酸は原生動物、細菌、ウイルス又はウイルスベクターの一構成成分として送達され得る。第一の組成物は、例えば免疫原性ポリペプチド及び免疫増強剤を含み得る。免疫増強剤はサイトカイン、トール様受容体リガンド等であり得る。アジュバントは免疫刺激配列、ＲＮＡ等を含み得る。
【０００９】
免疫原性ポリペプチドは増幅ペプチドであり得る。免疫原性ポリペプチドは第一の抗原であり得る。免疫原性ポリペプチドは原生動物、細菌、ウイルス、ウイルスベクター又はウイルス様粒子等の一構成成分として送達され得る。アジュバントは原生動物、細菌、ウイルス、ウイルスベクター又はウイルス様粒子等の一構成成分として送達され得る。第二の組成物はアジュバント及び免疫増強剤を含まないものであり得る。送達する工程は哺乳類のリンパ系への直接投与を包含し得る。哺乳類のリンパ系への直接投与はリンパ節又はリンパ管への直接投与を包含し得る。直接投与は２又はそれ以上のリンパ節又はリンパ管に対してであり得る。リンパ節が、例えば、鼠径部、腋窩、頚部及び扁桃リンパ節であり得る。エフェクターＴ細胞応答は細胞傷害性応答であり得る。エフェクターＴ細胞応答は前炎症性サイトカインの産生を包含し得、サイトカインは、例えばγ−ＩＦＮ又はＴＮＦαであり得る。エフェクターＴ細胞応答はＴ細胞ケモカインの産生を包含し得、ケモカインは、例えばＲＡＮＴＥＳ又はＭＩＰ−１αである。
【００１０】
エピトープは、例えば、ハウスキーピングエピトープ又は免疫エピトープであり得る。送達する工程又は投与する工程は、例えば、１回ボーラス注射、反復ボーラス注射を包含し得る。送達する工程又は投与する工程が連続注入を包含し得、注入は、例えば、約８〜約７日間の持続期間を有し得る。この方法は、送達する工程の終了と投与する工程の開始の間の間隔を包含し得、間隔は少なくとも約７日間であり得る。間隔はまた、約７〜約１４日間、約１７日間、約２０日間、約２５日間、約３０日間、約４０日間、約５０日間、約６０日間であり得る。間隔は約７５日、約８０日、約９０日、約１００日を上回ることができる。
【００１１】
第一の抗原は疾患関連抗原であり得、疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原、病原体関連抗原であり得る。実施の形態は、上述した免疫感作方法を利用して疾患を治療する方法を包含する。第一の抗原は標的関連抗原であり得る。標的は新生細胞、病原体感染細胞等であり得る。例えば、いかなる疾患を治療する方法も標的となり得る。病原体感染細胞は、例えばウイルス、細菌、原生動物、真菌、又は、例えば、プリオンにより感染される細胞を包含し得る。
【００１２】
エフェクターＴ細胞応答は、例えばサイトカイン検定、エリスポット検定、細胞傷害性
検定、四量体検定、ＤＴＨ応答、臨床応答、腫瘍縮小、腫瘍クリアランス、腫瘍進行の抑制、病原体力価減少、病原体クリアランス及び疾患症候の寛解から成る群から選択される少なくとも１つの指標により検出され得る。本方法は、エフェクターＴ細胞応答を得て、それに関して検出し、又は検定する過程をさらに包含し得る。
【００１３】
別の実施の形態は、第一の抗原又はその免疫原性断片をコードする核酸を含む第一の組成物を哺乳類に送達すること、及びペプチドを含む第二の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することであって、ペプチドは第一の抗原のエピトープに対応する、直接投与すること、を包含する免疫感作方法に関する。本方法は、抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得て、それに関して検出し、又は検定することをさらに包含し得る。
【００１４】
また、実施の形態は、存在する抗原特異的免疫応答の増大方法に関する。本方法は、ペプチドを含む第二の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することであって、ペプチドは抗原のエピトープに対応し、組成物は免疫応答を誘導するために用いられていない、直接投与することを包含し得る。本方法は抗原特異的免疫応答の増大を得て、それに関して検出し、又は検定することをさらに包含し得る。この増大は応答を長時間持続すること、静止Ｔ細胞を再活性化すること、抗原特異的Ｔ細胞の集団を拡大すること等を包含し得る。いくつかの態様では、この組成物は免疫増強剤を含まなくてもよい。
【００１５】
他の実施の形態は、第一の抗原の少なくとも一部分及び第二の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする免疫原を含む第一の組成物を哺乳類に送達すること、及び、第一のペプチドを含む第二の組成物、及び第二のペプチドを含む第三の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することであって、第一のペプチドは第一の抗原のエピトープに対応し、第二のペプチドは第二の抗原のエピトープに対応する、直接投与することを包含する免疫感作方法に関する。ここで、第一の組成物は第二の又は第三の組成物と同一でない。本方法は、第一の及び第二の抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得て、それに関して検出し、又は検定することをさらに包含し得る。第二の及び第三の組成物はそれぞれ第一の及び第二のペプチドを含み得る。
【００１６】
さらに別の実施の形態は、抗原特異的寛容原性又は調節性免疫応答を発生させる方法に関する。本方法は、アジュバントを含まないペプチドを哺乳類のリンパ系に直接、定期的に投与する工程であって、ペプチドは抗原のエピトープに対応し、哺乳類はエピトープにナイーブである工程、を包含し得る。本方法は、寛容原性又は調節性Ｔ細胞免疫応答を得て、それに関して検出し、又は検定することをさらに包含する。免疫応答は、例えば、炎症性障害の治療を補助し得る。炎症性障害は、例えば、クラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性免疫応答であり得る。免疫応答は免疫抑制性サイトカインの産生を包含し得、サイトカインは、例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＴＧＢ−βである。
【００１７】
実施の形態は、免疫原性用量系列を哺乳類のリンパ系に直接投与することを包含し、系列は少なくとも１惹起用量及び少なくとも１増幅用量を含み、惹起用量は免疫原をコードする核酸を含み得、増幅用量は任意のウイルス、ウイルスベクター又は複製−コンピテントベクターを含有しない、免疫感作方法に関する。本方法は、抗原特異的免疫応答を得ることをさらに包含し得る。本方法は、例えば、１〜６惹起用量を含み得る。本方法は、複数惹起用量を投与することを包含し得、用量は１〜約７日間の期間に亘って投与される。惹起用量、増幅用量、又は惹起及び増幅用量は多数対の注射で投与され得、対の第一成員は、対の第二成員の約4日以内に投与され得、異なる対の第一成員間の間隔は少なくとも約１４日であり得る。最終惹起用量投与及び一次増幅用量投与間の間隔は、例えば約７〜約１００日であり得る。
【００１８】
その他の実施の形態は、１〜６惹起用量及び少なくとも１増幅用量を含む哺乳類におけ
る免疫応答を誘導するための免疫原性組成物セットに関し、惹起用量は免疫原をコードする核酸を含み得、増幅用量はペプチドエピトープを含み得、エピトープは核酸を発現するｐＡＰＣにより提示され得る。１用量はアジュバント、たとえばＲＮＡ、をさらに含み得る。惹起及び増幅用量は、リンパ系、リンパ節等への直接投与に適した担体中に存在し得る。核酸はプラスミドであり得る。エピトープは、例えば、表１〜４に列挙されるクラスＩ  ＨＬＡエピトープであり得る。ＨＬＡは好ましくはＨＬＡ−Ａ２であり得る。免疫原はエピトープアレイを含み得、エピトープアレイは遊離配列を含み得る。免疫原は本質的に標的関連抗原から成り得る。標的関連抗原は腫瘍関連抗原、微生物抗原、他のいかなる抗原等であり得る。免疫原はエピトープクラスターを含むことができる標的関連抗原の断片を含み得る。
【００１９】
別の実施の形態は、１〜６惹起用量及び少なくとも１増幅用量を含む、哺乳類におけるクラスＩ  ＭＨＣ拘束性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物セットを含み得、惹起用量は免疫原又は免疫原をコードする核酸及び免疫増強剤を含み得、増幅用量はペプチドエピトープを含み得、エピトープはｐＡＰＣにより提示され得る。免疫原をコードする核酸は、免疫増強剤として機能する免疫刺激配列をさらに含み得る。免疫原は、ウイルス、又は免疫増強剤を含むか又は誘導する複製コンピテントベクターであり得る。免疫原は細菌、細菌溶解物又は精製細胞壁構成成分であり得る。細菌細胞壁構成成分はまた、免疫増強剤として機能し得る。免疫増強剤は、例えば、ＴＬＲリガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、飲食作用パターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤサポニン、ツカレソール及び前炎症性サイトカインであり得る。
【００２０】
その他の実施の形態は、種々のサイトカインプロフィールの生成方法に関する。本発明のいくつかの実施の形態では、ペプチドの節内投与はプラスミドＤＮＡワクチンを用いて初期誘導された応答を増幅するのに有効であり得る。さらにサイトカインプロフィールは異なり、プラスミドＤＮＡ誘導／ペプチド増幅に関して、一般にＤＮＡ／ＤＮＡ又はペプチド／ペプチドプロトコールより大きいケモカイン（化学誘引物質ケモカイン）並びにより少ない免疫抑制サイトカイン産生を生じることができる。
【００２１】
さらに別の実施の形態は、惹起及び増幅免疫プロトコールにおける使用のためのアジュバントを含まない薬剤の製造におけるペプチドの使用に関する。組成物、キット、免疫原及び化合物は、種々の疾患の治療のために薬剤中に用いられて、本明細書中記載されているように免疫応答を増幅し、特定のサイトカインプロフィール等を生成し得る。実施の形態は、免疫応答を増幅する方法におけるアジュバントを含まないペプチドの使用に関する。
【００２２】
実施の形態は、ＭＨＣ、例えば表１〜４に列挙されたものに対する特異性を有するエピトープに関連した方法、使用、療法及び組成物に向けられる。その他の実施の形態は、表１〜４に列挙された１つ又は複数のＭＨＣ並びにそれらの組合せを包含するが、一方、その他の実施の形態は任意の１つ又は複数のＭＨＣ又はそれらの組合せを特定的に除外する。表３〜４は、列挙されたＨＬＡ抗原に関する頻度を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本出願は、米国特許仮出願第６０／４７９，３９３号（２００３年６月１７日提出、表題：ＭＨＣクラスＩ拘束性免疫応答の制御方法）の全ての方法、図面及び組成物を含む開示内容に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。
【００２４】
本発明の実施形態は、例えば標的細胞に特異的な免疫細胞を生成するための、標的細胞に対する有効免疫応答を指図するための、又は炎症性障害に作用し／治療するための方法
及び組成物を提供する。この方法及び組成物は、例えば免疫原性組成物、例えばワクチン及び治療薬、並びに予防的及び治療的方法を包含し得る。本明細書中で開示されるのは、抗原の形態、配列、並びにそれが投与される時機を選択し、第二のリンパ系器官に直接抗原を送達することにより、免疫応答の大きさだけでなく、質的性質が管理され得る、新規の、予期せぬ発見である。
【００２５】
いくつかの好ましい実施形態は、Ｔ細胞応答を惹起し、増幅するための組成物及び方法に関する。例えばこのような方法は、核酸コード免疫原を含む組成物が動物に送達される惹起工程を包含し得る。組成物は、動物の種々の位置に送達され得るが、好ましくはリンパ系、例えばリンパ節に送達される。惹起工程は、例えば一定期間に亘るか又は一定期間にわたる連続方式での組成物の１又は複数回の送達を包含し得る。好ましくは本方法は、ペプチド免疫原を含む組成物を投与することを包含する増幅工程をさらに含み得る。増幅工程は、例えば一定期間に亘る間隔で、１回大量投与で、又は一定期間に亘って連続的に、１又は複数回実施され得る。全ての実施形態で必要であるというわけではないが、いくつかの実施形態は、免疫増強剤又はアジュバントを含む組成物の使用を包含し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、免疫原の性質並びにそれが遭遇する状況によって、誘発される免疫応答はその特定の活性及び構成が異なり得る。特に、ペプチドを用いた免疫感作は細胞傷害性／細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を発生させ得るが、さらなる注射によりこの応答をさらに増幅する試みは、その代わりに調節性Ｔ細胞集団の拡大及び観察可能なＣＴＬ活性の減少をもたらし得る。したがって付加的免疫増強活性を伴わずにリンパ節内の細胞表面に高ＭＨＣ／ペプチド濃度を付与する組成物は、調節性又は寛容原性応答を意図を持って促進するために用いられ得る。これに対比して、豊富な免疫増強シグナルを提供する免疫原性組成物（例えばトール様受容体リガンド（又はそれらが誘導するサイトカイン／自己分泌因子））は、限定抗原のみを提供する場合でさえ、豊富な抗原（例えば注入ペプチド）とのその後の遭遇が観察された活性の性質を変えることなく応答を増幅するよう、応答を誘導するだけでなく、同様にそれを惹起する。したがっていくつかの実施形態は、免疫応答プロフィール、例えば、得られた応答の種類並びに産生されたサイトカインの種類の制御に関する。いくつかの実施形態は、ＣＴＬの拡大又はさらなる拡大を促進するための方法及び組成物に関し、例えばＣＴＬよりも調節細胞の拡大を促進するための方法及び組成物に関する実施形態が存在する。
【００２７】
開示された方法は、ペプチドのみを用いる、又は惹起−及び増幅方法に従わない多数のプロトコールに対して有益である。上記のように、多数のペプチドベースの免疫感作プロトコール及びベクターベースのプロトコールは、欠点を有する。しかしながら、うまくいった場合、ペプチドベースの免疫感作又は免疫増幅戦略は、他の方法、例えば特に微生物ベクターと比べて有利である。これは、より多くの複合ベクター、例えば生弱毒化ウイルス又は細菌ベクターは、有害副作用、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ複製又は組換えを誘導し得る；又はベクターそれ自体に対する中和抗体の生成のために反復投与時に無力になる、という事実のためである。さらに、強力な免疫原に成るためにこのようにして利用される場合、ペプチドは、プロテアソーム媒介性プロセシングの必要性を回避する（タンパク質又はより複雑な抗原を用いる場合と同様に、「交差プロセシング」又はその後の細胞感染の状況において）。それは、ＭＨＣクラスＩ拘束性提示のための細胞性抗原プロセシングは、妥当な標的に対応するエピトープの免疫原性を潜在的に妨害する亜優勢エピトープを上回る優勢（好ましい）エピトープを固有に選択する現象であるためである。最後に、有効なペプチドベースの免疫感作は、免疫療法の開発の過程を簡単にし、短縮する。
【００２８】
したがって有効なペプチドベースの免疫増幅方法、特に例えば本明細書中に記載された方法は、免疫療法（例えば癌及び慢性感染のための）又は予防的ワクチン接種（ある種の感染性疾患に対する）に対しかなりの利益を有し得る。付加的利益は、特に厄介な、安全
でない又は複雑なアジュバント技法の同時使用の場合、回避することにより達成され得るが、このような技法は本明細書中に記載された種々の実施形態に利用され得る。
【００２９】
定義：
本明細書中の用語の使用の状況から明らかである場合を除いて、以下の列挙された用語は一般に、この記載の目的のために指示された意味を有するであろう。
【００３０】
プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）  −  Ｔ細胞同時刺激分子を保有し、Ｔ細胞応答を誘導し得る細胞。十分に特性化されたｐＡＰＣとしては、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージが挙げられる。
【００３１】
末梢細胞  −  ｐＡＰＣでない細胞。
【００３２】
ハウスキーピングプロテアソーム  −  普通は末梢細胞中で活性であり、そして一般的にはｐＡＰＣ中に存在しないか又は活性が強くないプロテアソーム。
【００３３】
免疫プロテアソーム  −  ｐＡＰＣにおいて一般に活性であるプロテアソーム。免疫プロテアソームは感染組織中の、又はインターフェロンへの曝露後のいくつかの末梢細胞中でも活性である。
【００３４】
エピトープ  −  免疫応答を刺激し得る分子又は物質。好ましい実施形態では、本定義によるエピトープとしては、ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸が挙げられ、この場合、ポリペプチドは免疫応答を刺激し得るが、必ずしもこれらに限定されない。その他の好ましい実施形態では、この定義によるエピトープとしては、細胞の表面上に提示されるペプチドが挙げられ、ペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し得るよう、クラスＩ  ＭＨＣの結合溝に非共有結合的に結合されるが、必ずしもこれに限定されない。クラスＩ  ＭＨＣにより提示されるエピトープは、未熟又は成熟形態であり得る。「成熟」とは、ハウスキーピングエピトープを含むか又は本質的にそれらからなり得るが、プロセシング、例えば単独で又は組合せて、プロテアソーム消化、Ｎ末端トリミング又は外因性酵素活性の作用（これらに限定されない）により除去される一次翻訳産物中の他の配列も含む任意の前駆体（「未熟」）と区別してＭＨＣエピトープを指す。したがって成熟エピトープは、やや長いポリペプチド中に埋め込まれて提供され得、その免疫学的可能性は、少なくとも一部は、埋込みペプチドによるものである；同様に、成熟エピトープは、ＴＣＲにより認識されるＭＨＣ結合溝中で結合され得るその最終形態で提供され得る。
【００３５】
ＭＨＣエピトープ  −  哺乳類クラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に対する既知の又は予測結合親和性を有するポリペプチド。いくつかの特に十分に特性化されたクラスＩ  ＭＨＣ分子は、表１〜４に示されている。
【００３６】
ハウスキーピングエピトープ  −  好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣエピトープであり、そしてハウスキーピングプロテアソームが優勢に活性である細胞上に提示されるポリペプチド断片と定義される。別の好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、１〜数個のさらなるアミノ酸が隣接した、上記の定義によるハウスキーピングエピトープを含有するポリペプチドと定義される。別の好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、上記の定義によるハウスキーピングエピトープをコードする核酸と定義される。例示的ハウスキーピングエピトープは、米国特許出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９Ａ１）（２００２年４月４日提出）及び１０／６５７，０２２に、並びにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６（公開番号ＷＯ０４０２２７０９Ａ２）（２００３年９月５日提出）；並びに米国
特許仮出願第６０／２８２，２１１号（２００１年４月６日提出）；６０／３３７，０１７（２００１年１１月７日提出）；６０／３６３２１０（２００２年３月７日提出）及び６０／４０９，１２３（２００２年９月５日提出）に提示されている。列挙された出願は各々、エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）と表題を付けられている。
【００３７】
免疫エピトープ  −  好ましい実施形態では、免疫エピトープは、ＭＨＣエピトープであり、そして免疫プロテアソームが優勢に活性である細胞上に提示されるポリペプチド断片と定義される．別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、即ち１〜数個のさらなるアミノ酸により隣接される、上記の定義による免疫エピトープを含有するポリペプチドと定義される。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、クラスＩ  ＭＨＣに対する既知又は予測親和性を有する少なくとも２つのポリペプチド配列を有するエピトープクラスター配列を含むポリペプチドと定義される。さらに別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、上記の定義のいずれかによる免疫エピトープをコードする核酸と定義される。
【００３８】
標的細胞  −  好ましい実施形態では、標的細胞は、例えばウイルス又はその他の細胞内寄生生物に感染した細胞、又は新生細胞といった、免疫系の構成成分により作用され得る病原状態に関連した細胞である。別の実施形態では、標的細胞は本発明のワクチン及び方法により標的化される細胞である。この定義による標的細胞の例としては、新生細胞及び細胞内寄生生物、例えばウイルス、細菌又は原生動物が寄生する細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。標的細胞としては、適正なエピトープ遊離並びに免疫プロテアソームを発現する細胞によるプロセシングを確定するか又は確証するための、所望のエピトープに対するＴ細胞特異性又は免疫原性を確定するための検定の一部としてのＣＴＬにより標的化される細胞も挙げられる。このような細胞は遊離配列を発現するよう形質転換され得るし、或いは細胞は単にペプチド／エピトープでパルス標識され得る。
【００３９】
標的関連抗原（ＴＡＡ）  −  標的細胞中に存在するタンパク質又はポリペプチド。
【００４０】
腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）  −  標的細胞が新生細胞であるＴＡＡ。
【００４１】
ＨＬＡエピトープ  −  ヒトクラスＩ又はクラスＩＩ  ＨＬＡ複合体分子に対する既知又は予測結合親和性を有するポリペプチド。特に十分に特性化されたクラスＩ  ＨＬＡは、表１〜４に示されている。
【００４２】
抗体  −  生化学的に得られるか、又は組換えＤＮＡの使用によるか又は任意のその他の手段によるものであれ、全部又は一部のＩｇ結合ドメインから成る天然免疫グロブリン（Ｉｇ）、ポリ又はモノクローナル、或いは任意の分子。例としては、とりわけ、Ｆ（ａｂ）、一本鎖Ｆｖ、及びＩｇ可変部−ファージ被覆タンパク質融合物が挙げられる。
【００４３】
実質的類似性  −  この用語は、配列の検査により判定した場合に、重要でない様式で参照配列と異なる配列を指すために用いられる。同一アミノ酸配列をコードする核酸配列は、縮重位置の違い又は任意の非コード領域の長さ又は組成の小差にかかわらず、実質的に類似する。保存的置換又はわずかな長さ変動のみが異なるアミノ酸配列は、実質的に類似している。さらに、Ｎ末端フランキング残基の数が異なるハウスキーピングエピトープ、或いはいずれかの末端のフランキング残基の数が異なる免疫エピトープ及びエピトープクラスターを含むアミノ酸配列は、実質的に類似する。実質的に類似のアミノ酸配列をコードする核酸は、それ自体も実質的に類似する。
【００４４】
機能的類似性  −  この用語は、生物学的又は生化学的特性試験により判定した場合に、重要でない様式で参照配列と異なる配列を指すために用いられるが、配列は実質的に類
似しない場合がある。例えば２つの核酸は、同一配列のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得るが、異なるアミノ酸配列をコードする。交差反応性ＣＴＬ応答を誘導する２つのペプチドは、それらが非保存的アミノ酸置換により異なる場合でさえ、機能的に類似する（したがって、実質的類似性定義内であり得ない）。同一エピトープを認識する抗体対又はＴＣＲは、どんな構造的差異が存在しようと、互いに機能的に類似であり得る。免疫原性の機能的類似性に関する試験は、「変性」抗原で免疫感作し、標的抗原を認識する誘発応答、例えば抗原応答、ＣＴＬ応答、サイトカイン産生等（これらに限定されない）の能力を試験することにより実行され得る。したがって２つの配列は、同一機能を保持しながら、ある点で異なるよう設計され得る。開示された又は特許請求された配列のこのような設計配列変異体は、本発明の実施形態の１つである。
【００４５】
発現カセット  −  プロモーター並びにその他の転写及び翻訳制御要素、例えばエンハンサー、終了コドン、内部リボソーム進入部位及びポリアデニル化部位（これらに限定されない）に操作可能的に連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。カセットは、一宿主分子から別の分子にそれを動かすのを促す配列も包含し得る。
【００４６】
埋込みエピトープ  −  いくつかの実施形態では、埋込みエピトープは、長いポリペプチド内に全体的に含入されるエピトープである；他の実施形態では、この用語は、エピトープが長いポリペプチドに関して、内部位置に全体的に存在しないよう、Ｎ末端又はＣ末端のみが埋め込まれるエピトープも包含し得る。
【００４７】
成熟エピトープ  −  エピトープがＭＨＣペプチド結合溝中に結合される場合に存在する以上の付加的配列を有さないペプチド。
【００４８】
エピトープクラスター  −  共有ＭＨＣ拘束性因子に対する結合親和性を有する２又はそれ以上の既知の又は予測エピトープを含むタンパク質配列、例えばネイティブタンパク質配列の一セグメントであるポリペプチド又はそれをコードする核酸配列。好ましい実施形態では、クラスター内のエピトープの密度は、完全タンパク質配列内の共有ＭＨＣ拘束性因子に対する結合親和性を有する全ての既知又は予測エピトープの密度より大きい。エピトープクラスターは、米国特許出願第０９／５６１，５７１号（表題：エピトープクラスター（EPITOPE CLUSTERS））に開示され、より詳細に定義されている。
【００４９】
遊離配列  −  例えば免疫プロテアソーム活性、Ｎ末端トリミング及び／又はその他の過程又は活性を含めた、単独での又は任意の組合せでの、プロセシング活性によりハウスキーピングエピトープを遊離させる状況を提供する大型配列中に埋め込まれたハウスキーピングエピトープを含むか又はそれをコードする、設計又は遺伝子工学処理配列。
【００５０】
ＣＴＬｐ  −  ＣＴＬ前駆体は、細胞溶解活性を示すために誘導され得るＴ細胞である。それによりＣＴＬｐが一般的に観察される、二次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解活性は、ナイーブ、エフェクター及びメモリーＣＴＬのｉｎ  ｖｉｖｏでの任意の組合せから生じ得る。
【００５１】
メモリーＴ細胞  −  抗原により予め活性化されたＴ細胞は、身体中のその位置とは関係なく、静止中の生理学的状態にあり、エフェクター機能を獲得するために抗原への再曝露を要する。表現型的には、それらは一般にＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４ｈｉＣＤ１０７α−ＩＧＮ−γ−ＬＴβ−ＴＮＦ−α−であり、そして細胞周期のＧ０にある。
【００５２】
エフェクターＴ細胞  −  抗原との遭遇時に、エフェクター機能を容易に示すＴ細胞。エフェクターＴ細胞は一般に、リンパ系を出て、免疫学的末梢に進入し得る。表現型的には、それらは一般にＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４ｈｉＣＤ１０７α＋ＩＧＮ−γ＋ＬＴβ＋ＴＮＦ−α＋であり、そして活発に循環する。
【００５３】
エフェクター機能  −  一般に、細胞溶解性活性の獲得及び／又はサイトカイン分泌を一般に含むＴ細胞活性化。
【００５４】
Ｔ細胞応答の誘導  −  多数の実施形態においては、ナイーブ細胞、又はいくつかの状況では静止中細胞からＴ細胞応答を発生させて、Ｔ細胞を活性化する工程を包含する。
【００５５】
Ｔ細胞応答の増幅  −  多数の実施形態においては、細胞の数、活性化細胞の数、活性のレベル、増殖の速度、又は特定の応答に関与するＴ細胞の類似のパラメーターを増大する工程を包含する。
【００５６】
惹起  −  多数の実施形態においては、Ｔ細胞の誘導性関連の免疫プロフィールに特定の安定性を付与する誘導を包含する。
【００５７】
トール様受容体（ＴＬＲ）  −  トール様受容体（ＴＬＲ）は、微生物の特定の構成成分及びある種の宿主分子により活性化されるパターン認識受容体の一ファミリーである。生得の免疫系の一部として、それらは多数の病原体に対する最前線の防御に寄与するだけでなく適応免疫においても一役を演じる。
【００５８】
トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド  −  トール様受容体を結合し、活性化し得る任意の分子。例としては：インターフェロンを誘導することに関して既知のポリＩＣ  Ａ合成二本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。ポリマーは、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸の各々の一鎖、二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチド又はその他の免疫刺激配列（ＩＳＳ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、β−グルカン及びイミダゾキノリン、並びにその誘導体及び類似体から作られる。
【００５９】
免疫増強アジュバント  −  ｐＡＰＣ又はＴ細胞を活性化するアジュバント、例えば：ＴＬＲリガンド、飲食作用パターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、キラヤサポニン、ツカレソール、サイトカイン等。いくつかの好ましいアジュバントは、Marciani, D.J. Drug Discovery Today 8: 934-943, 2003に開示されている。
【００６０】
免疫刺激配列（ＩＳＳ）  −  一般に非メチル化ＣｐＧ配列を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド。ＣｐＧは、細菌生産性ＤＮＡ、特にプラスミド中にも埋め込まれ得る。さらなる実施形態は、種々の類似体を包含する：好ましい実施形態の１つは、１つ又は複数のホスホロチオエート結合又は非生理学的塩基を有する分子である。
【００６１】
ワクチン  −  好ましい実施形態では、ワクチンは、疾患の予防を提供するか又は補助する免疫原性組成物であり得る。他の実施形態では、ワクチンは、疾患の治癒を提供するか又は補助し得る。他の実施形態では、ワクチン組成物は、疾患の改善を提供するか又は補助し得る。ワクチン免疫原性組成物のさらなる実施形態は、治療薬及び／又は予防薬として用いられ得る。
【００６２】
免疫感作  −  疾患に対する部分的又は完全防御を誘導するための方法。代替的には抗原に対する免疫系応答を誘導するか又は増幅するための方法。第二の定義では、この方法は、防御的免疫応答、特に前炎症性又は能動免疫を意味し得るが、調節的応答も含み得る。したがっていくつかの実施形態では、免疫感作は寛容化（免疫系が前炎症性又は能動免疫の産生を回避する方法）とは区別され、一方、他の実施形態では、この用語は寛容化を包含する。
【００６３】
【表１】
2007523863.tif 000003
【００６４】
【表１−２】
2007523863.tif 000004
【００６５】
【表１−３】
2007523863.tif 000005
【００６６】
【表１−４】
2007523863.tif 000006
【００６７】
【表２−１】
2007523863.tif 000007
【００６８】
【表２−２】
2007523863.tif 000008
【００６９】
【表２−３】
2007523863.tif 000009
【００７０】
【表３】
2007523863.tif 000010
【００７１】
【表４】
2007523863.tif 000011
【００７２】
【表４−２】
2007523863.tif 000012
【００７３】
【表５】
2007523863.tif 000013
【００７４】
【表５−２】
2007523863.tif 000014
【００７５】
【表５−３】
2007523863.tif 000015
【００７６】
以下の考察は、本発明の実施についての本発明人らの理解を記述する。しかしながらこの考察は、特許請求の範囲に記述されていない実施についてのいかなる特定の理論にも本
特許を限定するものではない。
【００７７】
腫瘍過程又は微生物感染の有効な免疫媒介性制御は一般に、移動、エフェクター機能及びメモリー細胞への分化といったような多数の能力を付与された抗原特異的Ｔ細胞の誘導及び拡大を包含する。免疫応答の誘導は、種々の方法により試みられ、そして異なる形態の抗原の投与を包含し、免疫応答の大きさ及び質に種々の作用を及ぼす。免疫応答の制御を達成する場合の一限定因子は、プロセシングし、その結果生じるエピトープを特定Ｔ細胞に有効に提示し得るｐＡＰＣを標的化することである。
【００７８】
この問題の解決は、第二のリンパ系器官、ｐＡＰＣに富む微小環境及びＴ細胞への直接抗原送達である。抗原は、例えばポリペプチドとして、又は発現抗原として、任意の種々のベクターにより送達され得る。免疫の大きさ及び質に関する結果は、例えばベクターの投与量、処方、性質、並びに分子環境を含めた因子により制御され得る。本発明の実施形態は、免疫応答の制御を増強し得る。免疫応答の制御は、例えば調節的応答から前炎症性応答まで、必要に応じて異なる種類の免疫応答を誘導する能力を包含する。好ましい実施形態は、能動免疫療法のための大きな関心事であるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する応答の大きさ及び質の制御増強を提供する。
【００７９】
従来の免疫感作方法は、一定の重要な制限を示した：第一に、非常にしばしば、ワクチンの力価に関する結論は、超高感度読み出し検定のうちの１つから、又は非常に限定されたパネルから生成された免疫原性データから推定された。しばしば、予防接種療法の推測力価にもかかわらず、臨床応答は有意でないか又は最適状態であった。第二に、免疫感作後、Ｔ調節細胞は、より慣用的なＴエフェクター細胞とともに、生成され及び／又は拡大され、このような細胞は所望の免疫応答の機能を妨害し得る。能動免疫療法におけるこのようなメカニズムの重要性は、近年やっと認識されてきたに過ぎない。
【００８０】
免疫原の節内投与は、免疫応答の大きさ及びプロフィールの制御のための基礎を提供する。このような投与の結果として成し遂げられるｐＡＰＣの有効ｉｎ  ｖｉｖｏ負荷は、その最も簡単な形態で、即ちペプチドエピトープで、あるいは一般に不十分な薬物動態に関連した抗原を用いることによってさえ、免疫の実質的大きさを与えることを可能とする。応答の質は、免疫原の性質、ベクター及び免疫感作のプロトコールにより、さらに制御され得る。このようなプロトコールは、慢性感染又は腫瘍過程における応答を増強し／変更するために適用され得る。
【００８１】
免疫感作は在来、免疫応答の大きさを増大するために抗原の反復投与によってきた。ＤＮＡワクチンの使用は、高い質の応答を生じたが、反復追加免疫用量を用いた場合でさえ、このようなワクチンを用いて高度の大きさの応答を得ることは困難であった。応答の両特質、即ち高い質及び低い大きさは、これらのベクターを用いて達成されるＭＨＣ上の相対的に低レベルのエピトープ負荷によるものと思われる。その代わりに、臨床的有用性に必要とされる応答の高度の大きさを達成するために、生ウイルスベクター中にコードされた抗原を用いてこのようなワクチンを追加免疫することは、より一般的になってきた。しかしながら生ベクターの使用は、例えば潜在的安全性問題、前の投与により誘導されたベクターに対する体液性応答のための後期追加免疫の有効性低減、並びに作製及び製造の経費を含めたいくつかの欠点を伴い得る。したがって生ベクター又はＤＮＡ単独の使用は、高い質の応答を引き出すが、限定的大きさ又は応答の継続性を生じ得る。
【００８２】
本明細書中に開示されるのは、ペプチドに適用される場合、それらを免疫療法ツールとして有効にさせるプロトコールに並びに方法に関する実施形態である。このような方法は、ペプチドの貧ＰＫを回避し、特定の、そしてしばしばより複雑な療法の状況で適用される場合、免疫応答の強い増幅及び／又は制御を生じる。好ましい実施形態では、リンパ系
器官へのペプチドの直接投与は、Ｔｃｌ細胞から成る強力、中等度又は軽度（慣用的技法による検出のレベル又はそれより低いレベル）でありさえする免疫応答を誘導する初回刺激剤後に、免疫応答の予期せぬ強力な増幅を生じる。本発明の好ましい実施形態は免疫感作の全ての段階で抗原のリンパ内投与を用い得るが、アジュバントを含まないペプチドのリンパ内投与が最も好ましい。リンパ内投与を利用するペプチド増幅は、予め誘導された現存免疫応答に適用され得る。先の誘導は、抗原への自然曝露により、又は一般的に用いられる投与経路、例えば皮下、皮内、腹腔内、筋肉内及び粘膜投与（これらに限定されない）により生じ得る。
【００８３】
本明細書中にも示されているように、特異的Ｔ細胞のその後の拡大を生じる最適開始は、富同時刺激状況（例えばリンパ節中）で、限定量の抗原（プラスミドコード抗原の限定されたたびたびの発現に起因し得るような）にナイーブＴ細胞を曝露することにより良好に達成され得る。それは、抗原提示細胞上のＭＨＣ−ペプチド複合体を高親和性で認識するＴ細胞受容体を保有するＴ細胞の活性化を生じ得るし、その後の刺激に対してより反応性であるメモリー細胞の生成を生じ得る。有益な同時刺激環境は、免疫増強剤の使用により増大されるか又は確実にされ、このようにしてリンパ内投与は有益であるが、全ての実施形態において免疫応答の開始のために必要とされるわけではない。
【００８４】
遊離ペプチドの不十分な薬物動態はほとんどの投与経路においてそれらの使用を妨げたが、２次リンパ系器官、特にリンパ節への直接投与は、連続注入又は高頻度（例えば毎日）注射により多少継続的に抗原のレベルが保持される場合、有効であることが立証された。ＣＴＬの生成のためのこのような節内投与は、米国特許出願第０９／３８０，５３４号及び０９／７７６，２３２（公開番号２００２０００７１７３）に、並びにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２８９（公開番号ＷＯ９９０２１８３Ａ２）（各々、表題：ＣＴＬ応答の誘導方法（A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE））に教示されている。本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドの節内投与は、プラスミドＤＮＡワクチンで最初に誘導された応答を増幅するのに有効であった。さらにサイトカインプロフィールは異なり、プラスミドＤＮＡ誘導／ペプチド増幅に関しては、一般にＤＮＡ／ＤＮＡ又はペプチド／ペプチドプロトコールよりも大きいケモカイン（化学誘引物質サイトカイン）及びより低い免疫抑制性サイトカイン産生を生じた。
【００８５】
したがってこのようなＤＮＡ誘導／ペプチド増幅プロトコールは、癌及び慢性感染のための治療用ワクチンを含めた組成物の有効性を改善し得る。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択原理は、米国特許出願第０９／５６０，４６５号、１０／０２６，０６６（公開番号２００３０２１５４２５Ａ１）及び１０／００５，９０５（全て表題：抗原提示細胞におけるエピトープ惹起（EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS））；０９／５６１，０７４（表題：エピトープ発見方法（METHOD OF EPITOPE DISCOVERY））；０９／５６１，５７１（表題：エピトープクラスター（EPITOPE CLUSTERS））；１０／０９４，６９９（公開番号２００３００４６７１４Ａ１）（表題：癌のための抗新脈管調製物（ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER））；及び１０／１１７，９３７（公開番号２００３０２２０２３９Ａ１）及び１０／６５７，０２２、並びにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６（公開番号ＷＯ０４０２２７０９Ａ２）（ともに表題：エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES））に開示されている。ワクチンプラスミドの全体的設計の態様は、米国特許出願第０９／５６１，５７２号（表題：標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS））及び１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）（表題：標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN））；１０／２２５，５６８号（公開番号２００３０１３８８０８）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１（公開番号ＷＯ２０
０４／０１８６６６）及び米国特許第６，７０９，８４４号（表題：プラスミド増殖における望ましくない複製中間体の回避（AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMIND PROPAGATION））に開示されている。特定の癌に対して免疫応答を向ける場合の特定の利点のある特異抗原組合せは、米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号及び米国特許出願第______／______号（代理人ドケット番号：MANNK.035A）及びＰＣＴ特許出願（公開番号______）（ともに表題：（種々の種類の癌のためのワクチン中の腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS））（それぞれ２００３年６月１７日提出）に開示されている。
【００８６】
意外にも、在来の初回抗原刺激−追加免疫スケジュールによるペプチドの反復節内注射は、初回投与単独後に観察された応答と比較して、細胞溶解性応答の大きさ低減を生じた。免疫応答プロフィールの試験は、これが、非応答性というよりむしろ免疫調節（抑制）の誘導の結果であることを示す。これは、ＤＮＡコード化免疫原、典型的にはプラスミドを包含する誘導及び増幅プロトコールと対照を成す。抗原の節内注射によるｐＡＰＣの直接負荷は一般に、他の非経口経路を介して送達される抗原の薬物動態を矯正するために一般的に用いられるアジュバントに対する必要性を減少するか又は不要にする。したがって一般に前炎症性であるこのようなアジュバントがなければ、ペプチド免疫感作を用いて従来観察されているものと異なる（即ち調節性又は寛容原性）免疫応答プロフィールの誘導を促し得る。応答は、以下の実施例に示されるように、初回注射部位から離れた第二のリンパ系器官で測定されるため、このような結果は、進行中の炎症反応を緩和する（抑制する）ための本発明の実施形態による方法及び組成物の使用を支持する。このアプローチは、同一抗原又は炎症の部位に関連した任意の適切な抗原を標的化し、免疫抑制性サイトカインにより媒介される第三者作用に頼ることにより、クラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性病因を有する炎症性障害に関する場合でさえ、有用であり得る。
【００８７】
反復ペプチド投与が細胞溶解性免疫応答の漸減を生じる、という事実にもかかわらず、非複製組換えＤＮＡ（プラスミド）のような作因による誘導はその後の投与に実質的影響を及ぼし、組換えＤＮＡ及びペプチドにより発現されるエピトープに対する免疫の強い増幅を可能にし、その細胞溶解性を惹起させる。実際、組換えＤＮＡベクター又はペプチドの１回又は多数回投与がそれぞれ免疫応答を達成しないか又は適度の免疫応答を達成した場合、ＤＮＡによる誘導及びペプチドによる増幅は、応答体の比率として、並びに応答の大きさとして、実質的により高い応答を達成した。示された例では、組換えＤＮＡ誘導／ペプチド増幅プロトコールを用いることにより、応答速度は少なくとも二倍であり、そして応答の大きさ（平均及び中央値）は少なくとも三倍であった。したがって好ましいプロトコールは、リンパ系及び非リンパ系器官内で、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原細胞を取扱い得る免疫（Ｔｃｌ免疫）の誘導を生じる。ほとんどの癌免疫療法における一限定要因は、おそらくはＭＨＣ／ペプチド提示低減による、免疫媒介性攻撃に対する腫瘍細胞の限定感受性である。好ましい実施形態では、免疫の強い拡大は、ＤＮＡ誘導／ペプチド増幅により達成され、毒性微生物による感染後に一般に観察されるのと一般に等しいか又はそれ以上の免疫応答の大きさを伴う。この大きさ増大は、不十分なＭＨＣ／ペプチド提示を補うのに役立ち得るし、例えばＨＬＡトランスジェニックマウスのような特殊化前臨床モデルにおいて示されるようなヒト腫瘍細胞のクリアランスを生じる。
【００８８】
組換えＤＮＡ惹起投与の特定の配列とその後のリンパ系器官に投与されたペプチド追加免疫を包含するこのような誘導及び増幅プロトコールは、したがって、例えば、感染性又は新生物性疾患の予防又は治療のための、強力なＴ細胞応答の誘導、増幅及び維持の目的のために有用である。このような疾患は、癌腫（例えば腎臓、卵巣、乳房、肺、結腸直腸、前立腺、頭部及び頚部、膀胱、子宮、皮膚）、黒色腫、種々の起源の腫瘍、並びに概して、定義された又は定義可能な腫瘍関連抗原、例えば腫瘍胎児性（例えばＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＲＤ−ＢＰ、Ｄａｓ−１、５Ｔ４、ＴＡＧ−７２等）、組織分化
（例えばメランＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ等）又は癌−精巣抗原（例えばＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１等；表５参照）であり得る。癌−精巣遺伝子及びがん治療に関するそれらの関連性は、Scanlon et al., Cancer Immunity 4: 1-15, 2004で検討されている。腫瘍新脈管系に関連する抗原（例えばＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ−２）も、米国特許出願第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４Ａ１）（表題：癌のための抗新脈管系調製物（ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER））に開示されているように、癌性疾患との結びつきにおいて有用である。この方法及び組成物は、種々の生物体及び疾患状態を標的化するために用いられ得る。例えば標的生物体としては、細菌、ウイルス、原生動物、真菌等が挙げられ得る。標的疾患は、例えばプリオンにより引き起こされるものを包含し得る。例示的疾患、生物体及び抗原、並びに標的生物体、細胞及び疾患に関連したエピトープは、米国特許出願第０９／７７６，２３２号（公開番号２００２０００７１７３Ａ１）に記載されている。検討され得る感染性疾患の中には、慢性感染（ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス、ＣＭＶ、Ｂ及びＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス等）を確立する傾向がある作因により引き起こされるもの、及び／又は急性感染（例えばインフルエンザウイルス、麻疹、ＲＳＶ、エボラウイルス）と結び付けられるものがある。興味深いのは、発癌能力（予防又は治療の見地から）を有するウイルス、例えばパピローマウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス及びＨＴＬＶ−１である。これらの感染性作因は全て、ペプチドエピトープのような組成物を設計するための基礎として用いられ得る定義された又は定義可能な抗原を有する。
【００８９】
このような方法の好ましい用途（例えば図１９参照）としては、好ましくは免疫学的不活性ビヒクル又は処方物中（用量範囲１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ）の、組換えＤＮＡ（用量範囲０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ）の多数回（例えば１〜１０又はそれ以上、２〜８、３〜６、好ましくは約４又は５）投与と、その後のペプチドの１又は複数回（好ましくは約２）の投与、が挙げられる。用量は必ずしも被験体のサイズに伴って直線状に決められるわけではなく、ヒトに関する用量はより低いほうに向かう傾向があり、マウスに関する用量は高いほうに向かう可能性があって、これらの部分は多岐に亘る。注射時のプラスミド及びペプチドの好ましい濃度は、一般に約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましい濃度は約１ｍｇ／ｍｌであり、一般に被験体のサイズ又は種とは関係ない。しかしながら特に強力なペプチドは、この範囲の低末端方向に、例えば１〜１００μｇ／ｍｌに最適濃度を有する。寛容を促進するためにペプチドのみのプロトコールが用いられる場合、これらの範囲の高いほうの末端に向かう用量が一般に好ましい（例えば０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ）。この配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な免疫応答を維持する必要がある限り、反復され得る。さらに、ＤＮＡの最終惹起投与とペプチドの最初の増幅投与間の時間は重要でない。好ましくはそれは約７日又はそれ以上であり、数ヶ月を超え得る。多数回のＤＮＡ及び／又はペプチドの注射は、数日間（好ましくは２〜７日）継続する代替的注入により低減され得る。注射として投与されうるものと同様の物質のボーラスを用いた注入を開始し、その後、緩徐注入（ＤＮＡに関して約２５〜２，５００μｇ／日を送達するために２４〜１２，０００μｌ／日、ペプチドに関して０．１〜１０，０００μｇ／日）するのが有益であり得る。これは、手動で、又はプログラム可能なポンプ、例えばインスリンポンプの使用により成し遂げられ得る。このようなポンプは当該技術分野で既知であり、いくつかの実施形態において所望され得る周期的スパイク及びその他の投与量プロフィールを可能にする。
【００９０】
なお、この方法はタンパク質の接合、アジュバントの付加等を伴わずに、うまくペプチドを使用するが、増幅工程では、このような構成成分の非存在は必要とされない、ということに留意すべきである。したがって接合ペプチド、アジュバント、免疫増強剤等が実施形態において用いられ得る。種々の形態のペプチドエピトープ又は抗原から成るか又はそ
れらを包含するペプチドパルス標識樹状細胞、懸濁液、例えばリポソーム処方物、凝集物、乳濁液、マイクロ粒子、ナノ結晶を含めた、リンパ節に投与される或いはリンパ系に向かわせる能力を有するペプチドのより複雑な組成物は、該方法における遊離ペプチドの代わりに置換され得る。逆に言えば、節内投与によるペプチド追加免疫は、控えめなレベルでもＴメモリー細胞の誘導を達成する任意の手段及び／又は経路により初回刺激の後に実施され得る。
【００９１】
抗原発現のモザイク現象による、或いは抗原の突然変異又は欠失による耐性の出現を低減するためには、多数の、好ましくは約２〜４つの抗原に対して共在的に免疫感作することが有益である。抗原の任意の組合せが用いられ得る。特定の腫瘍の抗原発現のプロフィールを用いて、どの抗原又は抗原の組合せを用いるかを確定し得る。例示的方法は、米国特許仮出願第______／______号（代理人ドケット番号：MANNK.035PR2）（本明細書と同じ日付に提出）（表題：（種々の種類の癌のための診断における腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS））に見出される。選定された癌の治療に特に適している抗原の特定の組合せは、米国特許出願第６０／４７９，５５４号及び______／______号（代理人ドケット番号：MANNK.035A）及びＰＣＴ特許出願（公開番号______）（参照として上記で引用及び援用されている）に開示されている。複数の抗原に対する又は単一抗原からのエピトープに対する免疫応答を誘発するために、これらの方法を用いて、多数の免疫原性存在物を、独立して又は混合物として送達し得る。免疫原が独立して送達される場合、異なる存在物が、異なるリンパ節に、又は同一リンパ節（単数又は複数）に異なる時間に、又は同一リンパ節（単数又は複数）に同一時間に投与される、というのが好ましい。これは、全ての構成成分ペプチドに溶解性及び安定性を提供する単一処方物を考案するのが困難であり得るペプチドの送達に特に関係がある。単一核酸分子は、多数の免疫原をコードし得る。代替的には、複数の抗原に関する全ての構成成分免疫原のうちの１つ又はサブセットをコードする多数の核酸分子は、粘性が問題になるような高濃度の核酸を必要とせずに所望の用量が提供され得る限り、一緒に混合され得る。
【００９２】
好ましい実施形態では、方法は、リンパ系への直接投与を要する。好ましい実施形態では、これはリンパ節へである。輸入リンパ管が同様に好ましい。リンパ節の選択は重要でない。鼠径部リンパ節がそれらのサイズ及び接近可能性のために好ましいが、腋窩及び頚部リンパ節並びに扁桃が同様に有益であり得る。単一リンパ節への投与は、免疫応答を誘導するか又は増幅するために十分であり得る。多数のリンパ節への投与は、応答の信頼性及び大きさを増大し得る。
【００９３】
このような免疫感作方法から利益を得ることができる患者は、彼等のＭＨＣタンパク質発現プロフィール及び全身レベルの免疫応答性を特定するための方法を用いて補充される。さらに彼等の免疫レベルは、標準技法を、末梢血へのアクセスとともに用いてモニタリングされ得る。最後に、治療プロトコールは、誘導又は増幅期に対する応答性、並びに抗原発現における変動に基づいて調整され得る。例えば反復惹起用量は、数セットの惹起用量後に増幅するというよりむしろ、好ましくは検出可能応答が得られるまで投与され得、次に増幅ペプチド用量（単数又は複数）を投与する。同様に、予定された増幅又は維持用量のペプチドは、それらの有効性が徐々に弱まり、抗原特異的調節Ｔ細胞数が増大し、又は寛容のいくつかの他の証拠が観察されたならば、中断され、そしてさらなる惹起が施された後、ペプチドによる増幅を再開し得る。免疫感作方法により免疫応答性を評価し、監視するための診断技法の組込みは、米国特許仮出願第______／______号（代理人ドケット番号：MANNK.040PR）（表題：診断方法を治療方法と統合することによる能動免疫療法の効力改善（IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS））（本出願と同一日付で提出）により完全に考察されている。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例は例証のためにすぎず、いかなる点でも本発明又はその種々の実施形態の範囲を限定するものではない。
【００９５】
実施例１．リンパ内免疫感作による免疫応答の高有効性誘導
ヒトＭＨＣクラスＩ（Ａ＊０２０１、「ＨＨＤ」と呼ばれる；Pascolo et al. J. Exp.
Med. 185(12):2043-51, 1997参照）のキメラ一本鎖バージョンを発現する導入遺伝子を保有するマウスを、以下のように節内投与により免疫感作した。誘導のためにメラン−Ａ２６−３５  Ａ２７Ｌ類似体を発現するプラスミド（ｐＳＥＭ）を用いて、５群のマウス（ｎ＝３）を、異なる注射経路：皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）及びリンパ内（ｉｎ、鼠径部リンパ節中への直接接種を使用）を用いることにより、免疫感作し、１週間後に増幅した。免疫感作及び投与量のスケジュールを、図１Ａに示す。増幅１週間後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を調製して、タグ化抗ＣＤ８ｍＡｂ及びメランＡ２６−３５特異的Ｔ細胞受容体を認識する四量体を用いて染色した。代表的データを図１Ｂに示す。皮下及び筋肉内投与は、約１％又はそれ未満の四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を達成する一方、プラスミドのリンパ内投与は６％より多い頻度を達成した。さらに脾臓細胞をメラン−Ａペプチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激して、種々のＥ：Ｔ比で５１Ｃｒ標識標的細胞（Ｔ２細胞）に対して試験した（図１Ｃ）。リンパ節内注射により免疫感作された動物からの脾臓細胞は、この標準細胞傷害性検定において、種々のＥ：Ｔ比で最高レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解を示した。
【００９６】
実施例２．異なる形態の免疫原が投与される順序の効果
種々の順でのプラスミド（ｐＳＥＭ）又はペプチド（Ｍｅｌ  Ａ；ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１）の節内投与により、ＨＨＤマウスを免疫感作した。ｐＳＥＭによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）（表題：標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN））に開示されている。
【００９７】
免疫感作のプロトコール（図２）は、以下より成る：
ｉ）誘導期／誘導用量：０日目及び４日目での、２５μｇ（マイクログラム）のプラスミド又は５０μｇ（マイクログラム）のペプチドを含有する２５μｌ（マイクロリットル）の滅菌生理食塩水の鼠径部リンパ節への両側注射。
ｉｉ）増幅用量：実施例１に上記したように、誘導期の完了後２週間で開始される。
【００９８】
脾臓細胞の単離と、ｐＡＰＣの存在下でのコグネイトペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後に、標準技法により免疫応答を測定した。多数の検定から生じる結果を考慮に入れ、種々のエフェクター及び調節機能の評価を促し、応答のより全体的な見地を提供することにより、免疫応答のプロフィールを描くのが好ましい。用いられる検定の種類に対する検討がなされ得、単にそれらの数に対しては検討されない；例えば異なる前炎症性サイトカインに関する２つの検定は、１つの検定にケモカイン又は免疫抑制サイトカインに関する検定をプラスしたものと同じ情報を提供するというわけではない。
【００９９】
実施例３．実施例２に記載したように免疫感作されたマウスのＥＬＩＳＰＯＴ（エリスプロット）分析
ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、サイトカイン産生性のペプチド特異的Ｔ細胞の頻度を測定する。図３は、二重反復試験における代表例を示し、図４は、サイトカイン産生細胞の数／１０６個の応答体細胞として個々に表されるデータの要約を示す。結果は、ペプチドで免疫感作されたマウスとは対照的に、プラスミド感作又はプラスミド惹起／ペプチド増幅マウ
スは、メランＡペプチドを認識するＩＦＮ−γ（ガンマ）産生Ｔ細胞の頻度増大を生じた、ということを示す。プラスミドで惹起させ、ペプチドで増幅させた４匹のマウスのうちの４匹が、１／２０００を上回る頻度を示した。これに対して、プラスミドを用いたプロトコールにより免疫感作された４匹のマウスのうち２匹が、１／２０００を上回る頻度を示した。免疫原としてペプチドのみを用いたマウスのうち、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞内で応答増大を始めたものはなかった。実際、ペプチドの反復投与は、プラスミドによる惹起後に投与されたペプチドと鮮明な対照を成して、このような細胞の頻度を減少した。
【０１００】
実施例４．実施例２に記載したように免疫感作されたマウスの細胞溶解活性の分析
各群からプール化脾臓細胞を調製し（採取し、細かく刻み、赤血球溶解した脾臓）、ｒＩＬ−２の存在下で７日間、ＬＰＳ刺激化メランＡペプチド被覆同一遺伝子型ｐＡＰＣとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、メランＡペプチド（ＥＬＡ）でパルス標識した５１Ｃｒタグ化Ｔ２標的細胞を異なる比率で用いて、４時間インキュベートした。上清中に放出された放射能を、γ（ガンマ）計数器を用いて測定した。応答を、溶解％＝（試料シグナル−バックグラウンド）／（最大シグナル−バックグラウンド）×１００（式中、バックグラウンドは、検定培地中でインキュベートした場合に標的細胞単独により放出される放射能を表し、最大シグナルは、界面活性剤で溶解された標的細胞により放出される放射能である）として定量した。図５は、上記の細胞傷害性検定の結果を例示する。ペプチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に達成された細胞溶解活性のレベルは、誘導用量としてペプチドを受容したものより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導用量としてＤＮＡを受容した群に関するほうが非常に大きかった。上記のＥＬＩＳＰＯＴデータと一致して、ＤＮＡ組成物を用いた免疫応答の誘導は、安定した、増幅可能なエフェクター機能をもたらしたが、一方、ペプチドのみを用いる免疫感作は、より少ない応答を生じ、その大きさは反復投与時にさらに減少した。
【０１０１】
実施例５．交差反応性
脾臓細胞を調製し、３つの異なるペプチド：メランＡ類似体免疫原、並びにそれに対応するヒト及びネズミエピトープを表すもの：で被覆された標的細胞に対して、実施例に上記したように用いた。図６に示したように、３つの標的の全てにおいて同様の細胞溶解活性が観察されたが、これは、天然配列に対する応答の交差反応性を実証する。
【０１０２】
実施例６．リンパ節へのペプチドの反復投与は免疫偏向及び調節Ｔ細胞を誘導する
上記の（そして図２に記載した）免疫感作手順により生成される特異的Ｔ細胞のサイトカインプロフィールを、ＥＬＩＳＡ又はルミネックス（Luminex）（登録商標）（ルミネックス（登録商標）分析は、多様な方式で培養中のＴ細胞により産生されるサイトカインを測定するための方法である）により評価した。上記のようにして生成した混合リンパ球培養物の７日目の上清を、以下の生物学的応答変更因子を測定するために用いた：ＭＩＰ−Ｉα、ＲＡＮＴＥＳ及びＴＧＦ−β（捕捉ＥＬＩＳＡ。抗サイトカイン抗体及び特定の試薬（例えばビオチンタグ化抗体、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び比色基質）を被覆したプレートを使用；R & D Systems）。他のサイトカインは、専門のメーカー（BD Pharmingen）により提供されるＴ１／Ｔ２及びＴ炎症キットを用いて、ルミネックス（登録商標）により測定した。
【０１０３】
図７Ａのデータは、３つの異なる免疫感作プロトコールを比較し、免疫応答のプロフィールに及ぼすプロトコールの予期しない作用を示す：プラスミド惹起は前炎症性サイトカインを分泌するＴ細胞の誘導を可能にしたが、一方、反復ペプチド投与は調節性又は免疫抑制サイトカイン、例えばＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−５を生成した。ペプチドのみのプロトコールのために用いられた免疫感作スケジュールは、その代わりに応答のエフェクター期を延長するリンパ系内のエピトープの継続的というよりむしろ周期的存在を提供した、と理解されるべきである。最後に、ペプチド増幅後のプラスミド惹起は、増
大量のＴ細胞ケモカインＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳの産生をもたらした。Ｔ細胞ケモカイン、例えばＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳは、腫瘍又は感染部位に対する遊走を調節するのに重要な役割を演じ得る。免疫サーベイランス中、標的関連抗原に特異的なＴ細胞は、コグネイトリガンドに遭遇して、増殖し、媒介物質、例えばケモカインを産生し得る。これらは、抗原が認識される部位でＴ細胞の動員を増幅し、より強力な応答を可能にする。データは、バルク培養物から得られた上清から作成した（二重反復試験の平均＋ＳＥ、２つの個々の測定値）。
【０１０４】
標準方法により肺間質組織及び脾臓から細胞を取り出して、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＢに対する抗体を、四量体作用物質と一緒に用いて染色し、メランＡ特異的Ｔ細胞を同定した。図７Ｂのデータは、ＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞のゲート集団を表す（ｙ軸ＣＤ４５ＲＢ及びｘ軸ＣＤ６２Ｌ）。
【０１０５】
同時に、結果は、ペプチドのみを注射された動物における免疫偏向を実証する（ＩＦＮ−ガンマ低減、ＴＮＦ−アルファ産生、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−５増大、ＣＤ６２Ｌ−  低ＣＤ４５ＲＢ  ＣＤ８＋四量体＋調節細胞の強い誘導）。
【０１０６】
実施例７．リンパ節に投与される非複製プラスミド（惹起）とペプチド（増幅）を交互に用いることによる免疫応答の高効果誘導
ヒトＭＨＣクラスＩＨＬＡ．Ａ２遺伝子に関してトランスジェニックであるＨＨＤマウスの３群を、メランＡ腫瘍関連抗原に対するリンパ内投与により免疫感作した。ｐＳＥＭプラスミド（２５μｇ／リンパ節）又はＥＬＡペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、メランＡ２６−３５  Ａ２７Ｌ類似体）（２５μｇ／リンパ節）のどちらかを用いた鼠径部リンパ節への直接接種により動物を初回刺激（誘導）し、３日後に、二次注射した。１０日後、同一方式でｐＳＥＭ又はＥＬＡを用いてマウスを追加免疫し、その後、３日後に最終追加免疫して、応答を増幅し（同様の免疫感作スケジュールに関する図１１Ａ参照）、以下の誘導＆増幅組合せを生じた：ｐＳＥＭ＋ｐＳＥＭ、ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ及びＥＬＡ＋ＥＬＡ（マウス１２匹／群）。１０日後、メランＡ特異的四量体試薬（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）−ＰＥ、Beckman Coulter）を用いて、免疫応答をモニタリングした。後眼窩洞静脈を介して個々のマウスを採血し、２０００ｒｐｍで２５分間、密度勾配遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs）を用いてＰＢＭＣを単離した。ＣＤ８に対するマウス特異的抗体（BD Biosciences）及びメランＡ四量体試薬を用いてＰＢＭＣを同時染色し、ＦＡＣＳ口径フローサイトメーター（BD）を用いてフローサイトメトリーにより具体的なパーセンテージを確定した。異なる初回刺激／追加免疫組合せにより生成されたメランＡ特異的ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを、図８Ａ及び８Ｂに示す。プラスミド−初回刺激／ペプチド−追加免疫群（ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ）は、全ての動物間で、４．６の平均四量体パーセンテージを有する強い免疫応答を引き出した。応答動物マウスは２又はそれ以上の四量体パーセンテージを有することが明示されたが、これは、非免疫感作対照群の平均＋標準偏差（ＳＥ）の３倍と等しい値を表す。このような値は、当該技術分野で非常に強い応答と考えられ、通常は、複製ベクターを用いてのみ達成され得る。ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ免疫感作群は、応答体であることが判明した１２匹のマウスのうちの１０匹を含有したが、これは、対照群と比較した場合に申し分ない有意差を表す（ｐ（フィッシャー）＝０．０３６）。その他の２つの免疫感作系列：ｐＳＥＭ＋ｐＳＥＭ及びＥＬＡ＋ＥＬＡは、１２匹の応答体のうち６匹を生じたが、０．０５より大きいｐ値を有し、統計学的有意を低下させた。これらのマウスの免疫を測定するために、ペプチド被覆標的細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて動物に抗原投与した。脾臓細胞を同腹対照ＨＨＤマウスから単離し、２０μｇ／ｍＬのＥＬＡペプチドとともに２時間インキュベートした。次に、これらの細胞をＣＦＳＥｈｉ蛍光で染色し（４．０μＭ、１５分間）、ペプチドとともにインキュベートされていない、ＣＦＳＥｌｏ蛍光（０．４μＭ）で染色された対照脾臓細胞を同一比で用いて、免疫感作マウスに静脈内同時注射した。１８時間後、脾
臓、リンパ節、ＰＢＭＣ及び肺を抗原投与動物（５匹／群）から除去し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより、標的細胞の特異的排除を測定した。結果を図８Ｃに示す。ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ初回刺激／追加免疫群では、５匹のうちの４匹が強い免疫応答を実証し、試験した組織の各々において標的物の約５０％をうまく掃去した。各実験群に関する代表的ヒストグラムを同様に示す（ＰＢＭＣ）。
【０１０７】
実施例８．ＤＮＡで誘導され、四量体レベルがベースラインに近づくまで静止された動物における免疫メモリー細胞を、ペプチド追加免疫は有効に再活性化する
図９Ａに記載したようにして免疫感作後のマウス（５匹／群）において、メランＡ四量体レベルを測定した。免疫感作スケジュールの完了後５週間までに、四量体レベルはベースライン近くに戻っていた。ＥＬＡペプチドを用いて６週目に動物を追加免疫して、免疫応答が回復され得たか否かを確定した。ｐＳＥＭプラスミドを免疫感作前に取得する動物（ＤＮＡ／ＤＮＡ、図９Ｃ）は、ＥＬＡ増幅後のメランＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の非先例的な拡大を実証し、レベルは１０％より大きい範囲であった。他方、ＥＬＡペプチドを注射前に取得する動物（図９Ａ）は、より低頻度の四量体染色細胞により示されるように、ＥＬＡ追加免疫からほとんど利益を得なかった。ＤＮＡを取得し、その後初回免疫感作としてペプチドを摂取したマウスは、他の群と比較して、ペプチド増幅を受けた時点で、有意ではあるが、中間の拡大を示した（図９Ｂ）。これらの結果は、ＤＮＡ／ＤＮＡ−惹起及びペプチド−増幅免疫感作戦略に関する強力な論理的根拠を明瞭に実証する。
【０１０８】
実施例９．リンパ系及び非リンパ系器官において高頻度の特異的Ｔ細胞の頻度を達成するための免疫感作の最適化
図９Ａ〜Ｃに記載したように、プラスミド注射の一連の２つのクラスターによる惹起免疫感作とその後のペプチドによる増幅に付されたマウスは、強力な免疫応答を生じた。これに関するさらなる証拠は、ペプチド投与の前（図１０Ａ）及び後（図１０Ｂ）の四量体レベルを例示する図１０Ａ〜Ｃに示されている。個々のマウスにおける四量体レベルは、Ｔ細胞の全ＣＤ８＋集団の３０％までがＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド免疫感作プロトコールを受けているマウスであることを明瞭に表す。これらの結果を図１０Ｃのグラフに要約する。さらに高四量体レベルは、この厳密な免疫感作プロトコールを受けている動物の血液、リンパ節、脾臓及び肺中で明らかに証明された（図１０Ｄ）。
【０１０９】
実施例１０．プラスミド及びペプチド免疫原の精確な投与順は免疫応答の大きさを確定する
マウスの６群（ｎ＝４）を、鼠径部リンパ節への直接接種による初回刺激及び増幅を用いて、メランＡ２６−３５  Ａ２７Ｌ類似体（ｐＳＥＭ）又はメランＡペプチドを発現するプラスミドで免疫感作した。免疫感作のスケジュールを図１１Ａに示す（５０μｇのプラスミド又はペプチド／リンパ節の用量、両側的）。２群のマウスをプラスミドを用いて開始し、プラスミド又はペプチドで増幅した。逆に、２群のマウスは、ペプチドを用いて開始し、ペプチド又はプラスミドで増幅した。最後に２群の対照マウスを、ペプチドか又はプラスミドで開始したが、増幅しなかった。最終接種後４週目に、脾臓を採取し、脾臓細胞懸濁液を調製し、プールして、抗ＩＦＮ−γ抗体で被覆されたＥＬＩＳＰＯＴプレート中でメランＡペプチドで刺激した。インキュベーション後４８時間目に、検定を展開し、メランＡを認識したサイトカイン産生Ｔ細胞の頻度を自動的に計数した。データを、特異的Ｔ細胞／１００万個の応答体細胞の頻度（三重反復試験の平均＋ＳＤ）として図５Ｂに表した。データは、プラスミド及びペプチドの開始及び増幅用量の順を逆にすると応答の全体的大きさに実質的作用を及ぼし、一方、プラスミド惹起とその後のペプチド増幅は最大応答を生じ、ペプチドの開始用量とその後のプラスミド増幅は、ペプチドの反復投与と同様の、有意に弱い応答を発生する、ということを示した。
【０１１０】
実施例１１．免疫応答と免疫感作のプロトコールとの相関、並びにリンパ系及び非リン
パ系器官内の標的細胞の掃去により明示されるｉｎ  ｖｉｖｏ効力
惹起及び増幅プロトコールにより得られた免疫応答を評価するために、４群の動物（ｎ＝７）をｉｎ  ｖｉｖｏでメランＡ被覆標的細胞を用いて抗原投与した。脾臓細胞を同腹対照ＨＨＤマウスから単離し、２０μｇ／ｍＬのＥＬＡペプチドとともに２時間インキュベートした。次に、これらの細胞をＣＦＳＥｈｉ蛍光で染色し（４．０μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥｌｏ蛍光（０．４μＭ）で染色された対照脾臓細胞を同一比で用いて、免疫感作マウスに静脈内同時注射した。１８時間後、脾臓、リンパ節、ＰＢＭＣ及び肺を抗原投与動物から除去し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより、標的細胞の特異的排除を測定した。図１２Ａ及び１２Ｂは、非免疫感作対照動物又はペプチド／ペプチド、ＤＮＡ／ペプチド若しくはＤＮＡ／ＤＮＡの免疫感作プロトコールを受けている動物の組織からのＣＦＳＥヒストグラムプロットを示す（２匹の代表的マウスを各群から示す）。ＤＮＡ−惹起／ペプチド−増幅群は、リンパ系、並びに非リンパ系器官中の標的細胞の高レベルな特異的死滅を実証し（図１２Ｃ）、そして四量体レベルとの特定の相関を実証した免疫感作プロトコールのみを表す（図１２Ｄ、試験した全組織に関してｒ２＝０．８１又はそれ以上）。
【０１１１】
実施例１２．厳密な惹起及び増幅プロトコールにより免疫感作された動物中のヒト腫瘍細胞のクリアランス
厳密なプロトコールを用いた免疫感作後にヒト黒色腫腫瘍細胞を用いてマウスに抗原投与することにより、メランＡ抗原に対する免疫をさらに試験した。図１３Ａは、試験した３つの群に関して用いられた厳密な免疫感作戦略を示す。免疫感作マウスは、図１３Ｂに例示したようにＣＦＳＥｌｏで標識した等比率の６２４．２８ＨＬＡ．Ａ２−対照細胞と混合されたＣＦＳＥｈｉ蛍光で標識したヒト標的細胞６２４．３８ＨＬＡ．Ａ２＋の２回の静脈内注射を受けた。１４時間後、マウスを屠殺し、肺（ヒト標的が蓄積する器官）を、フローサイトメトリーにより標的細胞の特異的溶解に関して分析した。図１３Ｃは、各群からのマウス由来の代表的ＣＦＳＥヒストグラムプロットを示す。ＤＮＡ−惹起と、その後のペプチド−増幅は、肺中の標的の約８０％の特異的死滅により実証されるように、ヒト腫瘍細胞に対してマウスを明瞭に免疫感作した。より長い系列のＤＮＡ−惹起注射も、メランＡ四量体と反応性であるＣＤ８＋細胞のさらなる頻度増大をもたらした。
【０１１２】
実施例１３．ＤＮＡ−惹起、ペプチド−増幅戦略はＳＳＸ−２由来エピトープＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＳＸ２４１−４９）に対する強い免疫を生じる
図１４Ａに明示された免疫感作スケジュールを用いてＳＳＸ２腫瘍関連抗原に対して免疫感作された動物は、強い免疫応答を実証した。図１４Ｂは、ｐＣＢＰプラスミドで初回刺激（惹起）され、ＳＳＸ２４１−４９Ｋ４１Ｆ又はＫ４１Ｙペプチド類似体で追加免疫された（増幅された）マウスの代表的四量体染色を示す。これらの類似体は、ＳＳＸ２４１−４９エピトープに特異的なＴ細胞と交差反応性である。これらの例は、惹起及び増幅プロトコールが、利用可能なＣＤ８  Ｔ細胞の８０％に近いＳＳＸ２抗原特異性を引き出し得る、ということを例示する。ｐＣＢＰプラスミド及びその設計原理は、米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）（表題：標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN））に開示されている。さらなる方法論、組成物、ペプチド及びペプチド類似体は、米国特許仮出願第______／______号（代理人ドケット番号：MANNK.038PR）（本出願と同じ日付に提出）（表題：ＳＳＸ−２ペプチド類似体（SSX-2 PEPTIDE ANALOGS））に見出される。さらなる方法論、組成物、ペプチド及びペプチド類似体は、米国特許仮出願第______／______号（代理人ドケット番号：MANNK.039PR）（本出願と同じ日付に提出）（表題：ＮＹ−ＥＳＯペプチド類似体（NY-ESO PEPTIDE ANALOGS））に開示されている。
【０１１３】
実施例１４．惹起及び増幅戦略を用いて同時に異なる抗原上に位置するエピトープに対
する免疫応答を引き出し得る
４群のＨＨＤマウス（ｎ＝６）を、ｐＳＥＭ単独；ｐＣＢＰ単独；ｐＳＥＭ及びｐＣＢＰを混合物として用いて；又は左リンパ節にｐＳＥＭ及び右リンパ節にｐＣＢＰを用いて、リンパ節内注射を介して免疫感作した。これらの注射の１０日後に、同一方式でＥＬＡ又はＳＳＸ２ペプチドのどちらかで追加免疫を実施した。全免疫感作マウスを、非免疫感作対照と比較した。同時に２つの抗原標的物の特異的溶解の評価を可能にする三重ピークＣＦＳＥｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性検定を用いて、ＥＬＡ又はＳＳＸ２ペプチドで被覆されたＨＨＤ同腹仔脾臓細胞を用いて抗原投与した。同数の対照−ＣＦＳＥｌｏ、ＳＳＸ２−ＣＦＳＥｍｅｄ及びＥＬＡ−ＣＦＳＥｈｉ細胞を免疫感作マウス中に静脈内注入し、１８時間後、マウスを屠殺して、フローサイトメーターを用いたＣＦＳＥ蛍光により標的細胞排除を脾臓（図１５Ａ）及び血液（図１５Ｂ）中で測定した。図１５Ａ及び１５Ｂは、個々のマウスからのＳＳＸ２及びメランＡ抗原標的物の特異的溶解パーセントを示し、図１５Ｃは、棒グラフフォーマットで結果を要約する。２つのワクチンの混合物による動物の免疫感作は、両抗原に対する免疫を生成し、３０＋／−１１の脾臓中の平均ＳＳＸ２特異的溶解パーセント及びメランＡに関して９７＋／−１を示す最高免疫応答を生じた。
【０１１４】
実施例１５．ＤＮＡ惹起及びペプチド増幅の反復サイクルは強力な免疫を達成し、維持する
３群の動物（ｎ＝１２）は、２サイクルの以下の免疫感作プロトコールを受けた：ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ；ＤＮＡ／ペプチド／ペプチド；又はＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド。免疫感作の各サイクル後のマウスにおいてメランＡ四量体レベルを測定し、図１６に示す。初期ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド免疫感作サイクルは、平均２１．１＋／−３．８パーセントの四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた（他の２つの群の約２倍高い）。２回目の惹起及び増幅免疫感作後、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド群に関する平均四量体パーセンテージは３２．６＋／−５．９に５４．５％増大した（これはＤＮＡ／ペプチド／ペプチドレベルの２．５倍、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ群レベルの８．２５倍高い）。さらにこれらの条件下で、他の免疫感作スケジュールは、四量体陽性Ｔ細胞の頻度の増大をほとんど達成しなかった。
【０１１５】
実施例１６．交互のプラスミド及びペプチドベクターからなる免疫誘導及び増幅療法により誘発される長寿命メモリーＴ細胞
４匹のＨＨＤトランスジェニック動物（３５６３、３５５３、３５６１及び３５７７）は、２サイクルの以下の惹起及び増幅プロトコールを受けた：ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド。最初のサイクルは、−３１、−２８、−１７、−１４、−３、０日目における免疫感作を包含した；第２サイクルは、１４、１７、２８、３１、４２及び４５日目における免疫感作を包含した。１２０日目にペプチドを用いてマウスに追加免疫した。各サイクルの免疫感作後７〜１０日目と２回目の免疫感作サイクル後９０日まで定期的に、マウスにおいてメラン−Ａ四量体レベルを測定した。グラフ中の矢印は、サイクルの完了に対応する（図１７Ａ）。４匹の動物は全て最終追加免疫（増幅）後の応答を見せたが、これは寛容の誘導というよりむしろ免疫メモリーの持続性を実証する。
【０１１６】
５匹のＨＨＤトランスジェニック動物（３５５５、３５５８、３５６６，３５９８及び３５７０）は、２サイクルの以下の惹起及び増幅プロトコールを受けた：ＤＮＡ／ペプチド／ペプチド。前と同様に、最初のサイクルは、−３１、−２８、−１７、−１４、−３、０日目における免疫感作を包含した；第２サイクルは、１４、１７、２８、３１、４２及び４５日目における免疫感作を包含した。１２０日目にペプチドを用いてマウスに追加免疫した。各サイクルの免疫感作後７〜１０日目と２回目の免疫感作サイクル後９０日まで定期的に、マウスにおいてメランＡ四量体レベルを測定した（図１７Ｂ）。比較すると、各サイクルにおける後期ＤＮＡ注射の代わりにペプチドを置き換えるこの惹起及び増幅プロトコールは、この実験では、免疫メモリー減少又は応答性低減を生じた。
【０１１７】
実施例１７．実質的拡大能力を有する長寿命メモリーＴ細胞は節内ＤＮＡ投与により生成される
７匹のＨＨＤトランスジェニック動物は、２サイクルの以下の免疫感作プロトコールを受けた：ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ。最初のサイクルは、−３１、−２８、−１７、−１４、−３、０日目における免疫感作を包含した；第２サイクルは、１４、１７、２８、３１、４２及び４５日目における免疫感作を包含した。１２０日目にペプチドを用いてマウスに追加免疫した。各サイクルの免疫感作後７〜１０日目と２回目の免疫感作サイクル後９０日まで定期的に、マウスにおいてメランＡ四量体レベルを測定した（図１８）。７匹の動物は全て、２回の免疫感作サイクル中又はその後に四量体＋細胞の境界線上頻度％を示したが、ペプチド追加免疫後に強力な応答を見せ、このことは、実質的免疫メモリーを実証する。
【０１１８】
実施例１８．抗原＋免疫増強アジュバントの種々の組合せはＣＴＬ応答の惹起のために有効である
ペプチドの節内投与は、ＴＬＲのようなアジュバントを含むか又は関連した作因（複製性又は非複製性）のリンパ内投与により誘発される免疫応答を増幅するための非常に強力な手段である。
【０１１９】
被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、死微生物又は精製抗原（例えば免疫増強活性を有する細胞壁構成成分）を用いた節内注入又は注射により惹起し、アジュバントを含有しないペプチドの節内注射により増幅する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫の前及び後に測定した免疫応答は、大きさの実質的増大を示す。これに対比して、他の経路によるアジュバントを含有しないペプチドを利用する追加免疫は、免疫応答の同一の増大を達成しない。
【０１２０】
実施例１９．ペプチドの節内投与は、任意の投与経路による抗原＋免疫増強アジュバントにより誘発される免疫応答を増幅するための非常に強力な手段である
被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、死微生物又は精製抗原（例えば免疫増強活性を有する細胞壁構成成分）の非経口的又は粘膜投与により免疫感作し、アジュバントを含有しないペプチドの節内注射により増幅する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫の前及び後に測定した免疫応答は、大きさの実質的増大を示す。これに対比して、節内以外の経路によるアジュバントを含有しないペプチドを利用する追加免疫は、免疫応答の同一の増大を達成しない。
【０１２１】
実施例２０．惹起及び増幅免疫感作プロトコールを用いた寛容性破壊
寛容性を破壊するか又は自己抗原（例えば腫瘍関連抗原）に対する免疫応答性を回復するために、被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、死微生物又は精製抗原で免疫感作し、アジュバントを含有しないペプチド（自己エピトープに対応する）の節内注射により追加免疫する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫の前及び後に測定した免疫応答は、免疫応答の大きさの実質的増大を示す（「寛容性破壊」）。
【０１２２】
実施例２１．惹起及び増幅免疫感作のための臨床的実行
臨床及び実験室判定基準を用いて、新生物又は感染性疾患のための治療を要するとして
、患者を診断し；治療するか、或いは第一段階の治療を用いないで；能動免疫療法に関する評価に言及する。疾患の性質及び治療物質の特質による、付加的判定基準（抗原プロファイリング、ＭＨＣハプロ型分類、免疫応答性）に基づいて、登録を行なう。精確な順でのベクター（プラスミド）及びタンパク質抗原（ペプチド）のリンパ内注射又は注入（ボーラス、プログラム可能なポンプ又はその他の手段）により、治療（図１９）を実行する。最も好ましいプロトコールは、プラスミド惹起とその後のペプチドの増幅投与（単数又は複数）を含む反復周期を包含する。このようなサイクルの頻度及び継続は、免疫学的、臨床的及びその他の手段により測定される応答によって調整し得る。投与される組成物は、一価又は多価であり、多数のベクター、抗原又はエピトープを含有し得る。投与は、１つ又は多数のリンパ節に同時にか、或いは時差的な方式であり得る。この療法を受けている患者は、症候の改善を実証する。
【０１２３】
実施例２２．病原性Ｔ細胞の免疫偏向又は非活性化の誘導のための臨床的実行
自己免疫又は炎症性障害を有する患者を、臨床及び実験室判定基準を用いて診断し、治療するか又は第一段階の治療を用いないで、能動免疫療法に関する評価に言及する。疾患の性質及び治療物質の特質による、付加的判定基準（抗原プロファイリング、ＭＨＣハプロ型分類、免疫応答性）に基づいて、登録を行なう。Ｔ１促進アジュバントを欠くか及び／又は免疫偏向を増幅する免疫修飾物質を伴うペプチドのリンパ内注射又は注入（ボーラス、プログラム可能なポンプ又はその他の手段）により、治療を実行する。しかしながらペプチドボーラス注射は、この方法により免疫偏向を発生させるための好ましい方式である。ペプチドを用いた治療は、免疫に及ぼす所望の作用又は臨床状態が得られるまで、毎週、２週間毎に又は低頻度で（例えば毎月）実行し得る。このような治療は、１回投与、又は図２の群２の場合のような多数回の近い間隔での投与を包含し得る。その後、低頻度注射を包含する調整療法を用いて、維持療法を開始し得る。投与される組成物は、一価又は多価であり、多数のエピトープを含有し得る。組成物は、リンパ系中のペプチドの存在を延長する任意の構成成分を含有しないのが好ましい。投与は、１つ又は多数のリンパ節に同時にか、或いは時差的な方式であり、免疫感作ペプチド又は無関連エピトープ（「エピトープ拡散」）に特異的なＴ細胞を、関連臨床方法に加えて測定することにより、応答をモニタリングし得る。
【０１２４】
実施例２３．免疫原性組成物（例えばウイルスワクチン）
以下のスケジュール：０，３、１４及び１７日目：に従って、鼠径部リンパ節の両側に、２５μｇのプラスミドベクターを、６群（ｎ＝６）のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに注射する。ベクターは、ＨＩＶｇａｇからの３つのＡ２拘束性エピトープ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ、ＶＬＡＥＡＭＳＱＶ、ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ）、ｐｏｌからの２つ（ＫＬＶＧＫＬＮＷＡ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）及びｅｎｖからの１つ（ＫＬＴＰＬＣＶＴＬ）をコードする。最終回の惹起の２週間後、これら５つのペプチド全てを包含する混合物をマウスに注射する（５μｇ／ペプチド／節、両側、３日おき）。平行して、５群のマウスに個々のペプチドを注射する（５μｇ／ペプチド／節、両側、３日おき）。７日後に、マウスを採血し、各ペプチドに対する四量体染色により応答を評価する。その後、マウスの半数に、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｐｏｌを発現する組換えワクシニアウイルスを抗原投与し（１０３ＴＣＩＤ５０／マウス）、７日目に、慣用的プラーク検定を用いて卵巣で、ウイルス力価を測定する。他の半数を屠殺し、脾臓細胞をペプチドで５日間刺激して、ペプチドで被覆された標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。対照として、マウスにプラスミド又はペプチド単独を注射した。プラスミドで惹起させ、ペプチドで増幅させたマウスは、四量体染色及び細胞傷害性により、５つのペプチド全てに対するより強力な免疫を示す。
【０１２５】
より一般的に、寛容性を破壊し、免疫応答性を回復し、又は非自己抗原、例えばウイルス、細菌、寄生生物又は微生物に対する免疫を誘導するために、被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジ
ュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、死微生物又は精製抗原（例えば細胞壁構成成分）で免疫感作し、アジュバントを含有しないペプチド（自己エピトープに対応する）の節内注射により追加免疫する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫の前及び後に測定した免疫応答は、免疫応答の大きさの実質的増大を示す。このような戦略を用いて、感染に対して防御するか、或いはＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＲＳＶ等のような作因により引き起こされる慢性感染を治療し得る。
【０１２６】
本発明の多数の変形及び選択的因子を開示してきた。さらなる変形及び選択因子が当業者には明らかである。本発明の種々の実施形態は、これらの変形又は因子のいずれかを特定的に含むか又は排除し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１Ａ】図１Ａは、リンパ内免疫感作による免疫応答の誘導を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、リンパ内免疫感作による免疫応答の誘導を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、リンパ内免疫感作による免疫応答の誘導を示す図である。
【図２】図２は、抗原の標的化（リンパ節）送達によるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫を制御するか又は操作するためのプロトコールの例を示す図である。
【図３】図３は、図４に記載されたデータに対応する代表的ウエルに関する視覚的透視図を表す図である。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定し、ペプチドを認識するＩＦＮ−γ（ガンマ）産生Ｔ細胞の数（頻度）として表した、図２に記載されたプロトコールの適用に起因する免疫応答の大きさを示す図である。
【図５】図５は、図２に示したような抗原の標的化送達により生成されたＴ細胞の細胞傷害性プロフィールを示す図である。
【図６】図６は、図２に示したプロトコールにより生成されたＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の交差反応性を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、３クラスの生物学的応答変更因子（前炎症性サイトカイン、ケモカイン又は化学誘引物質、並びに免疫調節又は抑制ケモカイン）の成員を産生するリンパ球の能力として表される免疫のプロフィールと、その後の図２に記載した免疫感作プロトコールの適用を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図２に記載した免疫感作プロトコールにより生成されたＴ細胞に関するフローサイトメトリーにより表現型分けされる細胞表面マーカーを示す。リンパ節へのペプチドの反復投与は、免疫偏向及び調節Ｔ細胞を誘導する図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＤＮＡ、ペプチド、或いはＤＮＡ及びペプチドの惹起／増幅配列で免疫感作したマウスにおける、四量体により測定した特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＤＮＡ、ペプチド、或いはＤＮＡ及びペプチドの惹起／増幅配列で免疫感作したマウスにおける、四量体により測定した特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＤＮＡ（「ｐＳＥＭ」）、ペプチド（「ＥＬＡ」＝ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）、或いはＤＮＡ及びペプチドの惹起／増幅配列で免疫感作したマウスにおける、種々のリンパ系及び非リンパ系器官におけるｉｎ  ｖｉｖｏで生じる特異的細胞傷害を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ペプチドで免疫感作し、ペプチドで増幅した動物における循環四量体染色Ｔ細胞の持続性／崩壊を、ペプチド追加免疫後の再生応答とともに示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＤＮＡで惹起し、ペプチドで増幅した動物における循環四量体染色Ｔ細胞の持続性／崩壊を、ペプチド増幅後の再生応答とともに示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＤＮＡで免疫感作し、ＤＮＡで増幅した動物における循環四量体染色Ｔ細胞の持続性／崩壊を、ペプチド追加免疫後の再生応答とともに示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、種々の２サイクル免疫感作プロトコールを用いた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、種々の３サイクル免疫感作プロトコールを用いた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、種々のプロトコールを用いて初回刺激され、ペプチドで増幅された動物における四量体染色により検出される循環抗原特異的Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、リンパ系及び非リンパ系器官における、種々の免疫感作療法後の、そして四量体染色により検出された抗原特異的Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、プラスミドＤＮＡ及びペプチドを用いてマウスを免疫感作する予定表の一例を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、種々の免疫感作プロトコール（それぞれの又は逆の順序でのＤＮＡ及びペプチドの変更）により引き起こされたＥＬＩＳＰＯＴ分析により確定した免疫応答を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、プラスミド及びペプチドで免疫感作したマウスにおける、血液及びリンパ節における抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ欠乏を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、プラスミド及びペプチドで免疫感作したマウスにおける、脾臓及び肺における抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ欠乏を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、１２Ａ、Ｂに提示された結果の要約を示す図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、種々のプロトコールにより免疫感作したマウスにおける特異的Ｔ細胞の頻度及び抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス間の相関を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、プラスミドＤＮＡ及びペプチドでマウスを免疫感作する予定表、並びにそれらのマウスにおいて実施する測定の性質を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、免疫感作マウスにおけるヒト腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの確定のために用いられるプロトコールに関連した予定表を記載する図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、プラスミド及びペプチドで免疫感作したマウスにおける、抗原性標的細胞（ヒト腫瘍細胞）のｉｎ  ｖｉｖｏ欠乏を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、１４Ｂに示した抗ＳＳＸ−２応答を発生させるために用いる免疫感作プロトコールを示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、四量体染色により検出した、循環ＳＳＸ−２特異的Ｔ細胞の拡大と、その後のＤＮＡ惹起／ペプチド増幅療法の適用を示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、メランＡ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）及びＳＳＸ２（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ）のエピトープに対して同時に免疫感作するために種々の惹起及び増幅プロトコールを受けたマウスの脾臓中の抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスを示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、メランＡ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）及びＳＳＸ２（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ）のエピトープに対して同時に免疫感作するために種々の惹起及び増幅プロトコールを受けたマウスの血液中の抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスを示す図である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、図１５Ａ、Ｂに詳細に示した結果を要約する図である。
【図１６】図１６は、２サイクルの種々の惹起及び増幅プロトコールを受けているマウスにおける、四量体染色により測定した循環抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド（Ａ）又はＤＮＡ／ペプチド／ペプチド（Ｂ）から成る２サイクルの惹起及び増幅プロトコールを受けている動物における、循環抗原特異的Ｔ細胞の持続性を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド（Ａ）又はＤＮＡ／ペプチド／ペプチド（Ｂ）から成る２サイクルの惹起及び増幅プロトコールを受けている動物における、循環抗原特異的Ｔ細胞の持続性を示す図である。
【図１８】図１８は、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡから成る２サイクルの惹起及び増幅プロトコールを受けている動物における持続性記憶を示す図である。
【図１９】図１９は、ＤＮＡ／ペプチド惹起及び増幅プロトコールを用いた患者の登録及び処置のための臨床実行スキームを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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