(57)【要約】  ヒトとメラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）抗原性部位を表す癌細胞を分離して、確認する方法で腫瘍を治療するための癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）  １１  ＢＤ−２Ｅ１１−２の使用。モノクローナル抗体１１  ＢＤ−２Ｅ１１−２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５６４３）（それはＭＣＳＰ抗原性部位を結合する）は、抗原性部位を表す癌細胞に細胞毒性である。モノクローナル抗体１１  ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト腫瘍の疾患進行を遅延させることに役立つ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患に罹ってる患者を処置する方法は、以下を含む：
それについて、ガン組織の細胞に対して細胞毒性にしながら特徴づけられる癌疾患の処置に有用である抗癌抗体、前記抗体またはフラグメントの生産のための方法に従って生じられて、前記患者にそれの抗癌抗体またはフラグメントを投与して、非癌細胞に基本的に良性であること；
それのそこで前記抗体またはフラグメントは、医薬的に許容される佐剤で混合物に置かれて、前記癌疾患の治療の媒介となるために、効果的量で投与される；
前記抗体単離モノクローナル抗体またはそれについて前記ガン組織（ＰＴＡ−５６４３と同程度モノクローナル抗体の同一化している特徴をＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体によって結合されて特徴づけられる前記抗原性部位）によって表される抗原性部位と結合する抗原結合フラグメントである、癌疾患に罹ってる患者を処置する方法。
【請求項２】
請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法、そこで前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントは、ヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項３】
請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法は、以下を含む：
接合することは毒素、酵素、放射性合成物と血液原細胞からなる群から選択されるメンバーでそれの抗体または抗原結合フラグメントを言った。そして、それによって抗体複合体を形成した；
そして、前記患者に前記抗体複合体または抱合型のフラグメントを投与すること；
そこで前記抗体複合体または抱合型のフラグメントは、医薬的に許容される佐剤で混合物に置かれて、前記癌疾患の治療の媒介となるために、効果的量で投与される。
【請求項４】
それの前記抗体またはフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項３の方法。
【請求項５】
そこで請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、抗体従属する細胞毒性を通して媒介となられる。
【請求項６】
そこで請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、補体従属する細胞毒性を通して媒介となられる。
【請求項７】
そこで請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となられる。
【請求項８】
そこで請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となられる。
【請求項９】
そこで請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となられる。
【請求項１０】
請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始さ細胞シグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となられる。
【請求項１１】
請求項１に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する。
【請求項１２】
癌疾患に罹ってる患者を処置する方法は、以下を含む：
癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産のための方法に従って生じられて、前記患者にそれの抗体または抗原結合フラグメントを投与することは、ガン組織の細胞に対して細胞毒性で、非癌細胞に基本的に良性の抗体を言った；
そこで前記抗体はＰＴＡ−５６４３としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体であって、医薬的に許容される佐剤で混合物に置かれて、前記癌疾患の治療の媒介となるために、効果的量で投与される。
【請求項１３】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法、そこで前記抗体またはそれのフラグメントは、ヒト化またはキメラ化である。
【請求項１４】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法は、以下を含む：
抗体複合体が形成されるそれによって毒素、酵素、放射性合成物と血液原細胞からなる群から選択されるメンバーでそれの前記抗体またはフラグメントを活用さ細胞こと；
そして、前記患者に前記抗体複合体またはそれのフラグメントを投与すること；
そこで前記抱合型の抗体は医薬的に許容される佐剤で混合物に置かれて、前記癌疾患の治療の媒介となるために、効果的量で投与される。
【請求項１５】
前記抗体またはフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１４の方法。
【請求項１６】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、抗体従属する細胞毒性を通して媒介となられる。
【請求項１７】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、補体従属する細胞毒性を通して媒介となられる。
【請求項１８】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となられる。
【請求項１９】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となられる。
【請求項２０】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となられる。
【請求項２１】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
それの前記抗体またはフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始さ細胞シグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となられる。
【請求項２２】
請求項１２に従って癌疾患に罹ってる患者を処置する方法：
生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する。
【請求項２３】
細胞表面の上でＭＣＳＰ抗原性部位を表すヒト腫瘍細胞の細胞毒性の媒介となる方法は、以下を含む：
単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントによる前記腫瘍細胞、前記抗体または結合している抗原を接触さ細胞ことは、それについてそれについて前記表されたＭＣＳＰ抗原性部位（ＰＴＡ−５６４３、それによって細胞細胞傷害が前記結合の結果として起こるのと同程度モノクローナル抗体の同一化している特徴をＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体によって結合されて特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを分解する。
【請求項２４】
請求項２３のプロセスでは、そこで、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化であることになっていた。
【請求項２５】
請求項２３のプロセスでは、そこで前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが抗体複合体が形成されるそれによって細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで抱合型であるというクレームのプロセス。
【請求項２６】
請求項２５のプロセスでは、そこで、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化であることになっていた。
【請求項２７】
請求項２３のプロセスでは、そこで、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスであることになっていた。
【請求項２８】
ヒト腫瘍組織試料が胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項２３のプロセス。
【請求項２９】
特にＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体と結合するＭＣＳＰ抗原性部位を表す細胞またはそれの抗原結合フラグメントの存在を決定する結合アッセイは、以下を含む：
細胞試料を提供すること；
孤立した単クローン抗体またはそれの抗原結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて前記表されたＭＣＳＰ抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の確認している特徴をクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位は、ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣで寄託した；
前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触さ細胞こと；
そして、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定すること；
それによって、特に前記単離モノクローナル抗体と結合するＭＣＳＰ抗原性部位を表す細胞の存在またはそれの抗原結合フラグメントは、決定される。
【請求項３０】
細胞試料が胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
特に単離モノクローナル抗体と結合するＭＳＣＰ抗原性部位を表す試料の細胞のための分離することまたはスクリーニングのプロセスまたはそれの抗原結合フラグメント（モノクローナル抗体の確認している特徴を成り立っているＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位）：
細胞試料を提供すること；
孤立した単クローン抗体またはそれの抗原結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて前記表されたＭＣＳＰ抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の確認している特徴をクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位は、ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣで寄託した；
前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触さ細胞こと；
そして、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定すること；
特にＰＴＡ−５６４３としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体と結合するＭＣＳＰ抗原性部位を表すそれによって前記細胞は前記結合で分離される、そして、前記細胞試料のそれらの存在は確認される。
【請求項３２】
細胞試料が胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項３１のプロセス。
【請求項３３】
前記腫瘍が特にモノクローナル抗体と結合する抗原を表す、または、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および／または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を施すことを成立している受入れ番号ＰＴＡ−５６４３が延長されるにつれて、モノクローナル抗体の確認している特徴をクローンでコードしておく抗原結合フラグメントがそれについてＡＴＣＣで寄託した哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および／または遅延疾患進行を延長する方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を起動さ細胞請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウス抗体である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３の方法
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項３３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断と癌疾患の治療、特に腫瘍細胞の細胞毒性を調節することに関し、さらに詳しくは癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用（任意に、細胞毒性応答を始めるための手段として、一つ以上の化学療法剤と結合する）関する。更なる発明は結合アッセイに関するもので、本発明のＣＤＭＡＢを利用する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトとメラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）抗原性部位を表す癌細胞を分離して、確認する方法で腫瘍を治療するための癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）  １１  ＢＤ−２Ｅ１１−２の使用。モノクローナル抗体１１  ＢＤ−２Ｅ１１−２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５６４３）（それはＭＣＳＰ抗原性部位を結合する）は、抗原性部位を表す癌細胞に細胞毒性である。モノクローナル抗体１１  ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト腫瘍の疾患進行を遅延さ細胞ことに役立つ。メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）は、ヒトの転移性のメラノーマ細胞ラインにモノクローナル抗体を産生した数人の研究者によって、それぞれに確認された。いくつかの抗体が、黒色腫細胞表面を伴う特異性抗原と反応するとわかった。これらの抗体の独立発現は標的抗原の名前の多様性に導いた。そして、その全てはＭＣＳＰであるとその後決定された。高分子量の黒色腫が抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ヒト黒色腫プロテオグリカン（ＨＭＰ）、ｍｅｌａｎｏｍａ−関連するプロテオグリカン抗原（ＭＰＧ）と黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（メル−ＣＳＰＧ）を結合したので、ＭＣＳＰは従って、参照されもして、さまざまな特異抗体の抗原もと確認された。そして、その幾つかは下にならべられた。ＭＣＳＰが８０パーセント以上、ラット・プロテオグリカンＮＧ２で相同性であるともわかって、それ故、その名前にもよって参照される。
【０００３】
ＭＣＳＰは、＞４５０ｋＤａ、２５０ｋＤａとプロテオグリカン成分のＮにリンクされた糖蛋白からなる糖蛋白−プロテオグリカン複合体である。コンドロイチン硫酸の追加による遊離した糖蛋白または変性のとして、中心的な糖蛋白は、黒色腫細胞の表面で存在する。ＭＣＳＰの分子クローニングは、いくつかの構造特徴の識別に導いた。合計１０のシステイン（５つの潜在的ジスルフィド架橋）、１５の可能なＮにリンクされた糖化部位と１１の潜在的コンドロイチン硫酸付着点を含んでいる３つの細胞外領域が、ある。膜貫通の部分は一つのシステインを持っている、しかしながら、その残りの機能的な有意性は確立されなかった。細胞質の領域はプロテインキナーゼＣによってリン酸化反応のために部位として用いられる可能性がある３つのトレオニン残りを持つ、しかし、ＭＣＳＰがリン酸化されることをまだ示されなかった。ＭＣＳＰが大部分の黒色腫癌で表されることを示された、そして、それが正常細胞の上で非常に限られた配布をすると最初は思われた、そして、他の腫瘍はタイプする。この結論に導いた１つの初期試験は標準の上で免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用した、そして、腫瘍組織は抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５を使用しているＭＣＳＰの配布を決定するためにホルムアルデヒドまたはメタノールで固定した。この研究において、抗体Ｂ５が、腫瘍が試験した２２の黒色腫、試験される２つの星細胞腫からの２と試験される２３のＣＡのいずれからも１７で反応しないとわかった。試験される２２の正常組織から、Ｂ５が皮膚ケラチノサイト、肺肺胞上皮と血管内皮だけを結合するとわかった。
【０００４】
ＭＳＣＰの生体内分布を調べられるもう一つの検査は、ａｎｔｉ−によって凍結組織切片を使用しているＭＣＳＰ抗体９．２．２７を定義した。また、反応経過は組織と細胞系が試験した全ての黒色腫で発見された、しかし、反応性が腫瘍が試験した６つのさまざまな癌の何にもなかった。試験される７つの胎児の組織から、反応性は皮膚で観察されるだけだった、そして、かすかに、成体組織での間大動脈で、反応性は試験される１３の組織から３で見られるだけだった。以降の検査は、ａｎｔｉ−を使用しているＭＣＳＰの配布を調べたＭＣＳＰ抗体Ｂ５、９．２．２７、２２５．２８ＳとＡ０１２２（いずれがＭＣＳＰの異なったエピトープを認識するかという全て）。
【０００５】
本研究は、凍結組織の上で実行された。抗ＭＣＳＰ抗体の全てが類似の染色パターンを持つことが判明した。そして、以前、負のＭＣＳＰであると思われた、神経で、間充織で、上皮起源の正常で悪性腫瘍で反応した。具体的には、抗体Ｂ５は試験された２４の器官のさまざまな上皮で、結合で、神経で、筋骨たくましい組織と反応して、試験される３４のさまざまな腫瘍から、２８で反応した。著者はそれらの知見と前の報告の違いが改善されてより一貫したＩＨＣ技術の活用法によると説明した。そして、固定液の選択の余地が重要だった点に注意した。そして、おそらく、ＭＣＳＰ抗原の重要な特徴がＩＨＣに関係する処理ステップに対するその感度であるという結論に導いた。
【０００６】
更なる検査は、超微細構造的なレベルでＭＣＳＰを局所化するために行われた。電子顕微鏡検査法を使用している免疫学的局在決定研究は、ＭＳＣＰが微小突起（細胞細胞接触と細胞基層癒着で役割を果たす可能性がある黒色腫細胞表面の微小ドメイン）にほぼ排他的に局所化されることを証明した。腫瘍細胞線のＭＣＳＰ表現の１９９６の動作可能ノーザンブロット解析のＭＣＳＰとＭＣＳＰ相補ＤＮＡを用いた正常な人体組織の分子クローニングは、深く探る。細胞系が試験した８つのさまざまな腫瘍から、ＭＣＳＰの表示は、メラノーマ細胞ラインだけで観察された。ＭＣＳＰ表現は、１６人の通常の成人と４つの通常の胎児の組織の何でも、試験されるのを見られなかった。ＭＣＳＰの組織限局化の異なる研究で見つかる矛盾は、更なる検査がこの抗原の実際の発現パターンを説明するか、既報告だった違いを説明することを要求される可能性があることを示す。プロテオグリカンが細胞とｃｅｌｌ−細胞外基質（ＥＣＭ）相互作用の媒介となることが知られていたので、これらの過程のＭＣＳＰの役割は調査された。
【０００７】
ＭＣＳＰは黒色腫細胞のｏβｉ−インテグリン媒介となられた癒着と伝播を刺激することが示された、そして、ＭＣＳＰコアタンパク質を通しての情報伝達が細胞接着と自動運動性を調整する可能性があるｐｌ３℃ａｓの補充とチロシンりん酸化を誘発することを提案された。そして、腫瘍浸潤と転移に関与した。これらの結果の組合せは、ＭＣＳＰが活性化インテグリンと細胞骨格の再編成に導く経路を刺激することによって黒色腫細胞の癒着を強化するために機能する可能性があることを示した。ＭＣＳＰが膜−３型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ３−ＭＭＰ）を一体にするともわかった。そして、ＭＣＳＰのコンドロイチン硫酸成分を通してありそうだった。生体内黒色腫のＭＴ３−ＭＭＰ表現が発達する腫瘍の近くでＥＣＭタンパク質の分解を促進することができたことを示唆された。そして、腫瘍が拡大することができるスペースを提供した。従って、ＭＴ３−ＭＭＰとＭＣＳＰの間の関係は、黒色腫浸潤を促進する活性化ステップである可能性がある。
【０００８】
抗ＭＣＳＰ抗体を使用しているいくつかの生体外分析は、腫瘍浸潤と転移との関連がある過程にＭＣＳＰの役割を調べるために行われた。停泊地から独立した成長のＭＣＳＰの役割は、抗体９．２．２７を使用して評価された。９．２．２７を含んでいる軟寒天で培養される黒色腫細胞は、それらのコロニー形成の６７−７４パーセントの特異的な減少を示した。これらの知見はＭＣＳＰが細胞間相互作用に関係しているかもしれないことを示唆して、アンカー−独立成長に関与する。同じ著者も、内皮（ＢＡＥ）ウシの大動脈の基底膜の上でＭ１４黒色腫細胞の癒着を測定している分析で、９．２．２７で遮断ＭＣＳＰの効果を調べた細胞。９．２．２７処置の効果は、制御モノクローナル抗体Ｗ６／３２（全てのクラスＩ組織適合抗原に向けられる）で、処置と比較された。抗体で前処理されるＭ１４対照細胞とＭ１４細胞は、ＢＡＥ細胞の基底膜の上でメッキをされた。細胞接着の２７パーセントの重要な抑制は９．２．２７処理した細胞で観察されたのに、重要な効果はＷ６／処置された３２細胞で観察されなかった。９．２．２７による細胞前処理のより著明な効果は、走査型電子顕微鏡を使用している超微細構造的なレベルで検査された細胞伝播の抑制であった。黒色腫細胞に対して開発されて、特にＭＣＳＰを認識すると決定した抗体の多数は、それらの抗癌性の効果を決定するために、生体外でインビボの分析で試験された。モノクローナル抗体９．２．２７はＭＣＳＰの中心的な糖蛋白成分を認めて、性質を抑制している腫瘍のために調査される第１抗体のうちの１つであった。
【０００９】
Ｂｕｍｏｌその他は、ヌードマウスで大きくなる黒色腫腫瘍の免疫療法のために、９．２．２７と９．２．２７のジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）複合体を調査した。［  ５Ｓ］メチオニンのタンパク質編入によって示されるように、生体外細胞毒性分析はＭ２１ヒト黒色腫細胞で蛋白合成に関して９．２．２７と９．２．２７−ＤＴＡ複合体の効果を測定することによって最初に実行された。より大きな効果が非抱合型のＤＴＡで見られたにもかかわらず、９．２．２７−ＤＴＡ複合体はＭ２１黒色腫細胞で有意に蛋白合成を禁止した。単独で９．２．２７によって成し遂げられる最小の効果だけが、あった。９．２．２７と９．２．２７−ＤＴＡ複合体は、ヒト黒色腫腫瘍−関係ヌードマウスで、抗腫瘍効果のために調査された。Ｍ２１腫瘍ひき肉は皮下に入れられて、３日の間成長を確立させておかれた、そして、マウスは日３で、そして、その後いずれの９．２．２７もまたは９．２．２７−ＤＴＡ複合体による３日の間隔で処置された。治療をうけているマウスの腫瘍容積は、無処置の制御マウスのそれらと比較された。日１８（データが既報告だった最後の日）で、無処置の対照と比較して、９．２．２７−ＤＴＡ複合体がマウスを処置する間、治療をうけているマウスが腫瘍成長の６４パーセントの抑制に示した９．２．２７は、腫瘍成長の５２パーセントの抑制を示した。この最初の検査において、著者は９．２．２７と９．２．２７−ＤＴＡ複合体がヌードマウスでＭ２１黒色腫腫瘍の成長の抑制に対するそれらの効果においてほぼ等しいと結論した。この最初の調査では９．２．２７で処置によって腫瘍成長のインビボの抑制を報告する間、いくつかの以降の研究（同じ著者によるそれらを含む）は裸の９．２．２７が生体内で少しの抗腫瘍効果も示さなかったことを証明した。
【００１０】
集合的に、下で概説されるように、ヒト腫瘍を処置するために９．２．２７を使用することの有用性を調査するために行われる実験は癌細胞が９．２．２７によって目標とされたにもかかわらず、抗癌性の活性が裸の抗体で処置から生じなかったことを証明した。９．２．２７免疫複合体で後で治療的な研究を予想して９．２．２７の大用量を与えるようになっていた第１相試験は、外へもたらされた。腫瘍が１、１０、５０、１００と２００ｍｇのスケールを拡大している服用に関して毎週二回フローサイトメトリおよび／または免疫ペルオキシダーゼ染色（静脈内に抗体の一般に認められた単回投与）によって９．２．２７で反応した悪性黒色腫８人の患者。患者の誰も転移性黒色腫小結節に局所化される有意な毒性と９．２．２７を経験しなかったにもかかわらず、臨床効果は観察されなかった。後期試験では、９．２．２７は化学療法剤ドキソルビシン（ＤＸＲ）に抱合型だった、そして、複合体は生体外で、そして、生体内で黒色腫の発育阻止のために調査された。ＤＸＲ−９．２．２７複合体で治療されるＭ２１細胞の発育阻止は、［３Ｈ］チミジン編入分析を使用して測定された。複合体は、ＭＣＳＰ負の制御細胞系の上でＭ２１標的細胞と無効の特異的な用量依存的な発育阻止を示した。生体外分析は、単独で９．２．２７の効果を調べて行われなかった。
【００１１】
生体内でＤＸＲ−９．２．２７複合体を調査するために、Ｍ２１細胞は皮下に注射されて、８−１０日の間腫瘍を確立するにまかせられた。注射は、日１０で、そして、その後３０日の間の３日の間隔で静脈内にされた。腫瘍成長の重要な抑制は、ＤＸＲ−９．２．２７複合体で治療されるマウスだけで、見られた。ＤＸＲ処置単独と９．２．２７処置単独は、腫瘍成長を抑制するのに失敗した。９．２．２７とＤＸＲの混合物は、類似の負の効果を示した。もう一つの検査は、９．２．２７複合体の効果を調査して行われた。
【００１２】
Ｓｃｈｒａｐｐｅその他は９．２．２７に化学療法剤４−ｄｅｓａｃｅｔｙｌｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ−Ｓ−カルボキシ・ヒドラジド（ＤＡＶＬＢＨＹ）を接合して、ヒト神経膠腫に対するその効果を試験した。Ｎｕｄｅマウスは皮下にＵ８７ＭＧ（ヒト神経こうしゅ細胞系）細胞による注入されたであった、そして、動物は日２、５、７と９に処置された。腫瘍容積は、９．２．２７−ＤＡＶＬＢＨＹ複合体によって、最も効果的に還元型だった。対照群（それは単独でいずれのＰＢＳもまたは９．２．２７で処置された）は速い発達する腫瘍を呈した、そして、腫瘍容積の減少がＰＢＳを用いた治療を受けるマウスと比較して９．２．２７治療をうけているマウスでなかった。抗体は、２２５．２８ＳヒトＭ２１メラノーマ細胞ラインに対して作られて、まず最初に、高分子量の黒色腫にかかった反応が抗原を結合したと、言われた。この分子は、ＭＣＳＰと同じ分子であることがその後示された。初期試験はヒト・メラノーマ細胞ラインの上で２２５．２８Ｓ（ＩｇＧ２ａ）の細胞溶解性の能力を試験して、それをもう一つの抗ＭＣＳＰ抗体（６５３．４０Ｓ  ＩｇＧｉであったクローン）と比較した。２２５．２８Ｓと６５３．４０Ｓは、ＭＣＳＰの上で同じ（または空間的に近い）抗原決定基を認めると固く決心していた。どちらの抗体も生体外分析で補体と同時に黒色腫細胞を溶解することができないことが判明した。両方の抗体は、６５３．４０Ｓより高い溶解性の活性を示す２２５．２８Ｓで、抗体依存性の細胞性の（ＡＤＣＣ）細胞毒性分析で目標黒色腫細胞の細胞溶解の媒介となることができた。しかしなから、黒色腫細胞の細胞溶解は抗黒色腫抗原抗体を使用している他によって既報告だったよりかなり高い効果器／標的細胞比率で得られるだけだった。
【００１３】
著者は、ヒト補体と同時のこれらの抗体の細胞溶解反応の欠如と細胞溶解がＡＤＣＣに起こることを要求される高い効果器／標的細胞比率がモノクローナル抗体の黒色腫患者への注入が腫瘍細胞の破壊を引き起こしそうでないことを示唆すると結論した。著者は、これらの抗体の免疫療法使用がラジオアイソトープ、化学療法薬または毒物の担体としてそれらを利用することに限られていなければならないように提案した。裸の抗体は、２２５．２８Ｓ、それが２人の末期黒色腫患者に１０ｍｇの用量で静脈内に配達された第１相試験で、その治療的な可能性のために調査された。抗体の投与のものとされることができた臨床的に悪いか主要毒作用が注意されなかっにもかかわらず、陽性の治療反応もなかった。抗体は、２２５．２８Ｓピューロチオニン（特に分裂細胞に有毒である低分子量のポリペプチド）に抱合型で、ヒト・メラノーマ細胞ラインＣｏｌｏ  ３８に、その生体外毒性を見つけるため検査された。Ｃｏｌｏの培養が３８細胞、２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン複合体で２４時間の間３Ｈ−チミジン取り込みを禁止することが判明した。加えて、Ｃｏｌｏの生存度は、３８細胞、７日の間複合体でインキュベートされる培養で激減した。生体外毒性が観察されたにもかかわらず、２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン処置を生き残った一部分の黒色腫細胞がまだあった。著者は悪性しゅよう疾患の免疫療法が毒物の担体として異なった腫瘍関連抗原にモノクローナル抗体の混合に依存しなければならないかもしれないように提案した。そして、２２５．８Ｓの複合体単独が癌の治療に充分でないことを示した。２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン複合体処置の効果は、ヌードマウスでヒト黒色腫の成長に関して評価された。結腸３８、細胞は皮下にまたは腹腔内に、ヌードマウスに移植された。処置は、腹腔内挿入されたマウスのために、そして、皮下の挿入されたマウスのための日１、３、５と２０に日１、３と５になされた。生存は、全てのマウスのための常時監視であった。生存の唯一の統計学的に有意の延長は、２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン複合体で治療された腹腔内挿入されたマウスで観察された。２２５．２８Ｓ単独で、ピューロチオニン単独または２２５．２８Ｓとピューロチオニンの混合物は、腹腔内であるか皮下の挿入されたマウスで、生存を強化しなかった。腫瘍容積は皮下の挿入されたマウスのために原建築費でもあった、そして、２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン複合体処置だけが有意に腫瘍容積を減らすことが判明した。２２５．２８Ｓ単独による処置は、腫瘍容積の減少を結果として〜にならなかった。２２５．２８Ｓは化学療法剤メトトレキサート（メトトレキセート）に抱合型でもあった、そして、腫瘍成長に対するその効果は生体内で調査された。ヌードマウスは皮下にＭ２１ヒト黒色腫細胞を接種されて、日１、４、７、１０と１４に処置された。メトトレキセート−２２５．２８Ｓの複合体は、腫瘍成長を阻害した唯一の処置であった。２２５．２８Ｓ単独で、メトトレキセート単独または２２５．２８Ｓとメトトレキセートの混合物は、腫瘍成長を阻害するのに失敗した。２２５．２８Ｓが、外因性自然の試薬の投与によるヒトで潜在的毒作用を調査するようにな���ている検査で使われた。
【００１４】
８５人の転移性の皮膚黒色腫患者はいずれの完全な２２５．２８Ｓも施された、または、２が分解するＦ（ａｂ’）は１３１Ｉ、１２３Ｉ、『１』『インチ』またはテクネチウム９９でとても標識だった。注入された抗体の量は，  １４〜７５０のμｇの範囲であった。臨床的に検出可能な副作用は、患者の誰でも観察されなかった。本研究が毒論理目的のために設計されたのでそれが必ずしも予想されるというわけではなかったにもかかわらず、臨床効果は既報告でなかった。２２５．２８Ｓは１−３０で抗体ＭＦｌを含むマウスの抗イディオタイプ・モノクローナル抗体を生成するのに用いられた。そして、それはＭＣＳＰの鏡像を支える。１−３０が見せられたＭＦｌは，同質遺伝子的と異種間のシステムにおいて，抗ＭＣＳＰ抗体の発現を引き起す。ＭＦｌ  １−３０は、進行した悪性黒色腫患者で毒性と反応を試験するようになっている用量を拡大する際に、２つの臨床試験で試験された。両方の研究において、抗体の投与によるほとんど副作用があるというわけではなかった、そして、治療は忍容性が高かった。二次試行において、少なくとも１：８の滴定量で抗抗イディオタイプ抗体を開発して、血清ＭＣＳＰのレベルの著しい変化を示さなかった７人の患者の平均的生存は、５５週（１６−９５で変動する）であった、残りの１２人の患者よりかなり高かった（そしてその人は１の滴定量で、抗抗イディオタイプの抗体を産生した：４以下、そして、ＭＣＳＰの血清レベルの増加を示す）、誰の平均的生存が、１９週（８−５７で動する）であったか。抗体７６３．７４は黒色腫細胞にも対して発生して、ＭＣＳＰも認識する。生体外での少しの報告もなかった、または、抗体７６３．７４の活発な抗癌性の結果では、しかしながら、この抗体はマウスのａｎｔｉ−を生成するのにも用いられた。そして、イディオタイプのモノクローナルが抗体であった。
【００１５】
これらの抗体（ＭＫ２−２３）のうちの１つは、抗ＭＣＳＰ抗体７６３．７４によって定義される決定因子の内部イメージを運ぶ。症状発現前実験では、ＭＫ２−２３による免疫化は、両方の同系宿主（ＢＡＬＢ／ｃマウス）で、そして、外因性宿主（ウサギ肉）で抗ＭＣＳＰ抗体の発現を誘発することが示された。それが担体タンパク質スカシガイのヘモシアニン（眼球運動計）に活用して、佐剤で投与されたとき、ＭＫ２−２３の免疫原性は著明に強化された。臨床試験は、黒色腫患者でＭＫ２−２３時までに誘発される体液性応答を特徴づけるために行われた。２５人のＩＶ期の黒色腫患者は、眼球運動計に接合されるＭＫ２−２３の２ｍｇの皮下注射で日０、７と２８に予防接種をされて、バチルス属カルメット・ゲラン（ＢＣＧ）を混ぜ合わせられた。
【００１６】
抗イディオタイプ抗体の滴定量が低い場合、追加的な注射はされた。ＭＫ２−２３で予防接種をされた患者の約６０パーセントは抗ＭＣＳＰ抗体を産生した、しかし、抗ＭＣＳＰ抗体のレベルと親和性は低かった。ＭＫ２−２３で免疫化後に抗ＭＣＳＰ抗体を産生した患者の生存がそうしなかった人々よりかなり長いことが判明した。それらの血清の中の検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体のない９人の患者の生存期間の中央値が１９週（９−４５で変動する）である間、抗ＭＣＳＰ抗体を産生した患者の生存期間の中央値は５２週（１９−９３で変動する）であった。抗ＭＣＳＰ抗体を産生した３人の患者は、それらの疾患の部分寛解を経験した。有望な結果が本研究において成し遂げられたにもかかわらず、ＭＫ２−２３で予防接種をされる患者の４０パーセントは検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体で反応しなかった。また、結局全て部分寛解を成し遂げた３人の患者は、疾患の再発を経験した。試みはシクロホスファミド（走化性）の低用量を有する患者の前処理によってＭＫ２−２３の免疫原性を増加させられた。そして、それは数セットのサプレッサ細胞を選択的に失活さ細胞ことによって腫瘍関連抗原への細胞で体液性の反応を強化することが報告された。しかしながら、ＭＫ２−２３の免疫原性の走化性による前処理の無効は、発見されていた。
【００１７】
モノクローナル抗体４８．７はヒトの転移性のメラノーマ細胞ラインＭ  １７３３に対して開発されて、その後、ＭＣＳＰであると決定される分子に反発することが報告された。４８．７はマウスのモノクローナル抗体９６．５と結合して第１相試験で投与された。そして、それはヒト黒色腫に関して存在するトランスフェリンのような細胞表面糖蛋白ｐ９７に向けられる。５人の患者は、１０を通して日１のｍＡｂｓ  ９６．５と４８．７のそれぞれ２ｍｇ、日２のそれぞれ１０ｍｇと日３のそれぞれ２５ｍｇを受けた。処置は忍容性が高かった；しかしながら、処置に対する臨床効果がなかった、そして、疾患進行は全ての患者に起こった。これらの２つの抗体は、３人の中枢神経系に転移性黒色腫患者がこれらの抗体のいずれの一つもの放射性同位元素標識Ｆａｂフラグメントを用いた治療を受けた別々の臨床試験で調査された。２人の患者は、脳で腫瘍に抗体の侵入を強化する努力で、血液脳関門（ＢＢＢ）を浸透圧性の開くことと同時に、４８．７のＩ−標識Ｆａｂフラグメントの５ｍｇの用量を受けた。浸透圧性のＢＢＢ変形は抗原結合性フラグメントの送達を腫瘍を産する半球と髄液に増やした、しかし、腫瘍に対する抗体のはっきりした持続的な位置確認は示されなかった。著者は、限局化の欠如が抗体の不十分な量による可能性があったと仮定した。
【００１８】
Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅは２つのマウスの抗イディオタイプ抗体、Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ−１（Ｉ−Ｍｅｌ−１）とＭｅｌｉｍｍｕｎｅ−２（Ｉ−Ｍｅｌ−２）の二重標本であった。そして、それはＭＣＳＰの別々のエピトープを模倣する。Ｉ−Ｍｅｌ−１は１−３０で抗イディオタイプ抗体ＭＦｌのサブクローンであった。そして、それは抗ＭＣＳＰ抗体２２５．２８（前述したように）に対して呈された。Ｉ−Ｍｅｌ−１は、ウサギで抗ＭＣＳＰ反応を誘発することが示された。Ｉ−Ｍｅｌ−２は抗ＭＣＳＰ抗体ＭＥＭ１３６に対して開発される抗イディオタイプ抗体であった。そして、２２５．２８がそうするより、それはＭＣＳＰの上で異なるエピトープに反応する。Ｉ−Ｍｅｌ−２は、ウサギで抗ＭＣＳＰ反応を誘発することも示された。
【００１９】
１を含んだＭｅｌｉｍｍｕｎｅ標本：Ｉ−Ｍｅｌ−１とＩ−Ｍｅｌ−２の１つの構成は、転移性疾患の所見なしで、２１人の切除された黒色腫患者の第１相試験で試験された。詳細な免疫応答解析は、一つの機関に登録されるこれらの患者のうちの１２人のために既報告だった。患者は、０．２から４．０ｍｇ（それぞれ０．１〜２．０ｍｇのＩ−Ｍｅｌ−１とＩ−Ｍｅｌ−２）まで変動した用量で、２つの治療スケジュールのうちの１つの上で、Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅを受けた。全ての患者は、１２人の患者からの１０のＩ−Ｍｅｌ−１に対するそれより大きなＩ−Ｍｅｌ−２に、ピークの抗体産生応答でａｎｔｉ−Ｉ−Ｍｅｌ−１とａｎｔｉ−Ｉ−Ｍｅｌ−２抗体を産生した。しかしながら、患者の血清のいずれもどちらの放射性同位元素標識２２５．２８をメル−２１細胞を表しているＭＣＳＰに結合することを阻害することが可能でなかったか、メル−２１細胞に対する放射性同位元素標識ＭＥＭｌ３６で結合でなかった時から、本研究は特異抗体の誘導をＭＣＳＰに示すことができなかった。
【００２０】
直接循環細胞結合アッセイが、患者血清で抗ＭＣＳＰ抗体の存在のために、分析にも使われた。しかしながら、ＦＡＣＳベースの分析でＭ２１細胞にポスト免疫血清と比較して免疫前の血清を結合することの違いが、なかった。Ｉ−Ｍｅｌ−２は、２６人の転移性黒色腫患者が２ｍｇのＩ−Ｍｅｌ−２と筋肉内に隔週に４週の間の佐剤構造調整融資−ｍ引渡済みのいずれの１００か２５０のμｇでも治療されて、それから、疾患進行まで隔月だった別々の臨床試験で試験された。抗ＭＣＳＰ抗体は、抑制放射性同位元素標識免疫測定法を使用している２６人の患者のうちの５人で発見されていた。検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体を有する５人の患者の、１人の患者は完全寛解を経験した、１は安定病態を持った、そして、他３は進行性の病気があった。完全緩解患者は、抗ＭＣＳＰ抗体（１：１５００）で最も高い滴定量を持った。
【００２１】
従来の特許：
ＵＳ５２７０２０２（そして、その関連した特許：ＷＯ９２１６６４６Ａ１（ＥＰ０５７６５７０Ａ１））、抗イディオタイプ抗体、ＭＥＭ１３６に対するＩＭｅｌｐｇ２（別名「ＩＭ３２」）、ヒトのメラノーマ結合プロテオグリカン（別名「ＨＭＷ−ＭＡＡ」）に導かれる抗体を教える。ＩＭｅｌｐｇ２抗体は特にＭＥＭ１３６に導かれることが示されて、診断と細胞がＭＰＧエピトープを表した疾患の治療のために有用なことを示唆された。ＩＭｅｌｐｇ２の効果が腫瘍細胞浸潤の上にあったにもかかわらず、生体外分析で測定されるにつれて、それは最も効果的抗体が試験したどちらでもなかったし、インビボの抗腫瘍効果の徴候がＡｂ３反応を示すことにもかかわらずなかった。
【００２２】
ＥＰ０３８０６０７Ｂ１は、ＨＭＷ−ＭＡＡの未決定のエピトープのために特異性があるマブ２２５．２８に、抗イディオタイプ抗体を教える。これらの抗体は、黒色腫のために活発な免疫療法として有効である。１−３０  ＭＦｌとＩＭｅｌｐｇｌ、そして、２２５．２８に対するポリクローン性抗イディオタイプ抗体は報告されて、黒色腫患者で臨床試験を受けて１−３０でＭＦｌで動物モデルで評価された、しかし、基礎資料がなかった。ＭＦｌ  １−３０は、２２５．２８のイディオタイプ抗体を誘導することができる。ＩＭｅｌｐｇｌ細胞系は、−３０の細胞がマイコプラスマ汚染の欠如のためにＢＭ  Ｃｙｃｌｉｎｅとテストで沿って並ぶＭＦ  １１を処置することに由来した。ＩＭｅｌｐｇｌに対する抗体がウサギ血清で誘導されることができて、Ｃｏｌｏ３８黒色腫細胞と結合することが示されることができるにもかかわらず、生体外でまたは生体内で、殺腫瘍性活性の徴候がなかった。
【００２３】
ＵＳ４８７９２２５は、不溶免疫複合体から抗体作成を教える。この場合、マブ９．２．２７（ＨＭＷ−ＭＡＡに向けられる抗体）に対するラット抗イディオタイプ抗体は、抗原としての使い方のためにプロテインＡ−セファロースの上で９．２．２７を固定することによって発生した。黒色腫細胞に対する抗体は、セファロースに接合される種々の細胞または細胞可溶化物複合体を使用して生産された。マウスのモノクローナル抗体は黒色腫細胞ととても結合した、しかし、正常なＴ細胞またはＢ−細胞は９．２．２７と比較されなかった。９．２．２７に類似の性質を持ったものは、追加特徴のために選択された：ＮＲ−ＭＬ−０２、ＮＲ−ＭＬ−０３、ＮＲ−ＭＬ−０４、ＮＲ−ＭＬ−０５、ＮＲ−ＭＬ−０６。これらの抗体の各々は、抗原関係者として捕獲抗体と可溶化されたＳＫ  ＭＥＬ−２８の黒色腫膜として９．２．２７を使用しているサンドイッチＥＬＩＳＡ分析で陽性だった。更に、これらの抗体は黒色腫腫瘍細胞を認めながら特徴づけられて、更に平滑筋と内皮細胞で反応していた。抗プロテオグリカン抗体がそうであったさらに６１ＮＲ−ＭＬ−０２／ＮＲ−ＭＬ−０４と同じ決定因子を認識している１０で生じる、３つの抗体は、ＮＲ−ＭＬ−０３またはＮＲ−ＭＬ−０５と同じ決定因子を認識した；４５は、５つの抗体で測定するのと同じエピトープを認識しなかった。
【００２４】
ＵＳ５０８４３９６において、これらの抗体は放射性同位元素で識別されて、黒色腫異種移植を支持しているヌードマウスで、腫瘍取り込みのために９．２．２７と比較された。腫瘍取り込みは、ＮＲ−ＭＬ−０５およびＮＲ−  ＭＬ−０２、それから９．２．２７、それから、ＮＲ−ＭＬ−０２のために最も大きかった。これらの発明のどちらにもおいて、これらの抗体が癌疾患の全身腫瘍組織量の減少ももたらしたし、癌疾患があっている哺乳類の生存も強化したという徴候が、なかった。
【００２５】
ＵＳ５０３４２２３は、非−抱合型遮断抗体で前処理することによって腫瘍関連抗原を運んでいる組織に抱合型の抗体の配送を強化する方法を教える。ＨＭＷ−ＭＡＡ（９．２．２７とＮＲ−ＭＬ−０５）に対する抗体は、ｔｅｃｈｎｉｃｉｕｍ  ９９（テクネチウム−９９）に抱合型で、非標識マブＮＲ−２ＡＤ（１人の患者のＢ細胞性リンパ腫だけに特効の抗イディオタイプによる抗体）の以前の投与の後で、臨床設定で投与された。本研究がテクネチウム−９９を使用することを設計されたので、この過程を用いることにより抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体の取り込みが強化されたにもかかわらず、リポーター・ラジオアイソトープ（それは細胞障害能を持たない）またはそこのラジオ切除の効果は抗腫瘍効果の証拠でなかった。
【００２６】
ＵＳ５５８０７７４は、マブ９．２．２７をコードする抗体遺伝子を使用しているキメラ抗体の構造を教える。診断に関する開示またはキメラ抗体を使用している癌疾患の治療は、なされなかった。ＵＳ５４９３００９とＵＳ５７８００２９はマウスの抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３とその複合体を教える。そして、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体（７６３．７４）に向けられる。ＭＫ２−２３は直接７６３．７４と結合することができて、３８の黒色腫細胞をＣｏｌｏに結合していて７６３．７４を阻害することができる。更に、ＭＫ２−２３時までに引き出されるＡｂ３は、ＨＭＷ−ＭＡＡを直接結合することができて、３８の黒色腫細胞をＣｏｌｏに結合していて７６３．７４を競合的に阻害することができる。活発な免疫療法は、ＭＫ２−２３を有するＩＶ期黒色腫患者で、臨床試験で行われた。患者の８９パーセントにおいて、接種後血清はＣｏｌｏで３８の黒色腫細胞を反応させて、Ａｂ３抗体の誘導を提案して、３８細胞、Ｃｏｌｏに７６３．７４の結合を阻害した。１５人の患者のうちの６人において、報告される転移性病巣の寸法縮小があった、しかし、検査詳細は供給されなかった。患者血清の中の抗体の特異性は部分的に特徴づけられた、そして、それが存在した程度まで、７６３．７４の抗体には生来の抗腫瘍効果がなかった時から、Ａｂ３抗体が観察される臨床効果のいずれかの原因となったかどうかは不明である。
【００２７】
ＵＳ５８６６１２４はキメラの抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−ＣＨγｌとその誘導剤を教える。そして、ＭＫ２−２３に由来して抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体（７６３．７４）に向けられる。多数の発明（例えばＵＳ５０１７６９３、ＵＳ５７０７６０３、ＵＳ５８１７７７４、ＵＳ６２４８８７０、ＵＳ５１１２９５４、ＵＳ６２３８６６７）は、ＨＭＷ−ＭＡＡに向けられる抗体に合成物を接合することを教えるが、癌疾患の治療でそれらの有用性を開示するのに失敗する。重要なことに、これらの抗体は単独で抗癌療法として効果的だった、それは細胞障害性であるかｃｙｔｏｓｔａｓｔｉｃな効果を与えることを複合体に要求しない。
【００２８】
これらの特許と特許出願は、ＭＣＳＰ抗原と関連した抗体を特定するが、本発明の単離モノクローナル抗体または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示するのに失敗する。即時の発明者が以前あった。
【特許文献１】ＵＳ５２７０２０２
【特許文献２】ＥＰ０３８０６０７Ｂ１
【特許文献３】ＵＳ４８７９２２５
【特許文献４】ＵＳ５０８４３９６
【特許文献５】ＵＳ５０３４２２３
【特許文献６】ＵＳ５５８０７７４
【特許文献７】ＵＳ５８６６１２４
【発明の開示】
【００２９】
本発明者らに対して、既に米国特許６，１８０，３５７が与えられている。そして、個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と名付けられた。そして、それは癌疾患を処置することに役立つ。この文書のために、用語「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）が同義的に使われる可能性があって、前記免疫グロブリン（例えばキメラでヒト化の免疫グロブリン）に由来するハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）、免疫複合体と（適当であるように）免疫グロブリンフラグメントと組換え型タンパク質によって生産される完全な免疫グロブリンを参照する可能性があることＦ（腹筋』）、そして、２が分解するＦ（腹筋）、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域（Ｆｖ）ｓ、融合タンパク質など。Ｉｔは、若干のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能に対する重要な効果なしでポリペプチドで多彩でありえる当該技術分野で、よく認識される。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換（保存的置換は好まれる）、削除または追加。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢで標準の化学療法（例えば放射性核種）を活用さ細胞ことはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中さ細胞。ＣＤＭＡＢは毒素、細胞毒性部位、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。『モノクローナル抗体を修正している癌疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの３５７の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に１つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害（細胞障害能）か細胞増殖を（細胞分裂停止）性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび／または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、発生する全ての抗体は抗癌抗体のライブラリに加えられる。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数���でも癌疾患を処置するために役立つ可能性がある。
【００３０】
実質的にＵＳ  ６，１８０，３５７のプロセスを用いて、そして、Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２３１で開示されるように、１ＢＤ−２Ｅ１１−２マウス・モノクローナル抗体１は患者の乳房腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。１つのＩＢＤ−２Ｅｌ  １−２抗原は、異なる組織起源からいくつかのヒト細胞系の細胞表面の上で表された。乳癌細胞系ＭＣＦ−７と卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３は、生体外で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の細胞毒性に影響されやすかった。マウス（Ｓ．Ｎ．  １０／７６２，１２９で開示されるように）に移植されるとき、培養のＭＣＦ−７  ＯＶＣＡＲ−３細胞に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２細胞毒性の結果はこれらの癌細胞の方へその抗腫瘍活性によって更に広げられた。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。ヒト乳癌の予防的インビボのモデルにおいて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、腫瘍成長と還元型の全身腫瘍組織量（Ｓ．Ｎ．  １０／７６２，１２９で開示されるように）を予防した。日５１（最後の処置のすぐ後）において，平均１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の腫瘍容積はアイソタイプ制御の２０パーセントであった。モニタリングは、過去２８０日後処理を続けた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与群の４０パーセントは、７．５ヵ月以上のポスト移植で、まだ生存していた。逆に言えば、アイソタイプ対照群は、６．５ヵ月の後処理の後で１００パーセントの死亡率を持った。従って、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２は生存を強化して、ヒト乳癌の安定したモデルで、制御処置群と比較して全身腫瘍組織量を減少させた。
【００３１】
１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２がヒト乳癌の複数のモデルで有効だったかどうか決定するために、乳癌の確立したモデルのＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）細胞に対するその抗腫瘍活性は、決定された。１つの１ＢＤ−２Ｅ１  １−２は、バッファ制御に割に２５パーセント腫瘍成長を減らした。
【００３２】
従って２Ｅ  １  １−２が腫瘍成長を中で予防して効果的だった１  ＩＢＤ−確立する予防乳癌異種移植モデルと同様に。
【００３３】
加えて、１つの１ＢＤ−２Ｅ１  １−２は、乳癌の少なくとも２つの異なるモデルで、抗腫瘍活性を示した。ヒト乳癌のモデルの薬効に加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置も、予防卵巣癌モデル（Ｓ．Ｎ．  １０／７６２，１２９で開示されるように）で、ＯＶＣＡＲ−３細胞に対して抗腫瘍活性を持った。このモデルにおいて、重さがそうであった体は、腫瘍発達の代わりの程度を使用した。日８０  後移植（処置の終わりの後の１６日）、処置群のマウスは、平均のものは重さを具体化する８７．６パーセントを持った対照群（ｐ＝０．０１５）。このように、それがヒト卵巣癌の安定したモデルでバッファ制御処置群と比較して腫瘍発達を遅延させたので、１つのＩＢＤ−２Ｅｌ  １−２処置は有効だった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。
【００３４】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がヒト卵巣癌の複数のモデルで有効だったかどうか決定するために、卵巣癌の確立したモデルのエキスパートシステム−２＋ＳＥＡＰ細胞（ヒトの胎盤分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）で形質移入されるエキスパートシステム−２卵巣の癌細胞）に対するその抗腫瘍活性は、決定された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、バッファ制御に割に投与群でマウスの一団で、生存を強化した。加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２投与群の範囲内の１匹のマウスは、非常に還元型循環ＳＥＡＰレベル後処理を示した。循環ＳＥＡＰレベルが、全身腫瘍組織量の指標として使われることができる。従って、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、中で防止腫瘍成長に効果的だった確立する予防卵巣癌異種移植モデルと同様に。加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト卵巣癌の２つの異なるモデルで、抗腫瘍活性を示した。薬目標として１１ＢＤ−２Ｅ１１−２エピトープを確認するために、冷凍正常な人体組織の１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２抗原の表現度は、決定された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によるＩＨＣ染色によって、大部分の組織は、不可欠な器官（例えば肝臓、腎臓と心臓）の細胞を含む１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原を表すのに失敗した。染色が、組織のほぼ全てで、血管の平滑筋繊維にあった。上皮染色が、組織の一部のためにもあった。
【００３５】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原と乳癌患者の範囲内のその有病率の限局化は、患者に１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫療法の有益性を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要である。癌患者から乳房腫瘍の１つの１ＢＤ−２Ｅ１  １−２抗原表現について述べるために、８人の（７つの追加資料は、マイクロアレイ・スライドの上で完全に分離していたか、腫瘍を代表しなかった）個々の乳癌患者からの腫瘍組織試料は、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２抗原の表現度のために映写された。本研究の結果は、１つのＩＢＤ−２Ｅｌ  １−２抗原のために、組織標本陽染性のその６２パーセントを示した。染色が悪性細胞に制限されたので、患者試料の範囲内の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の表示は癌細胞に特有に見えた。加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳癌患者から正常組織の３つの（２つの追加資料は、再びマイクロアレイ・スライドから完全に分離された）試料のうちの０にしみをつけた。
【００３６】
腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果は１−２で１１ＢＤ−２Ｅ１のために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示しなかった。
【００３７】
しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。この中に概説されるように、付加的な生化学データも１１ＢＤ−２Ｅ１１−２時までに認められる抗原がＭＣＳＰであることを示す。これは１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２免疫沈殿タンパク質がＭＣＳＰのラット相同体に抗体によって認識さたことを示している研究で支えられた、そして、その抗ＭＣＳＰ免疫沈殿タンパク質は１−２で１１ＢＤ−２Ｅ１によって認識された。これらのＩＨＣと生化学結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＳＣＰ抗原と結合したことを証明する。このように、証拠の優越性は１−２がＭＣＳＰの上で出席しているユニークなエピトープの結紮を通して抗癌性の効果の媒介となることをその１１ＢＤ−２Ｅ１に明らかにした。全体として、このデータは、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体をヒト癌組織に結合することを示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。多数の異なった抗ＭＣＳＰ抗体は、開発されて、多くの生体外でインビボのシステムで試験された。症状発現前モデルにおいて、複写されなかった１つの検査を除いては、裸の抗ＭＣＳＰ抗体は、いくつかの異なる黒色腫モデルと１つの神経膠腫モデルで生存の腫瘍減少または強化で効果がないことが示された；他の癌タイプは、抗ＭＣＳＰ抗体でよく見られなかった。ヒトの裸の抗ＭＣＳＰ抗体の全ての試行は、どんな陽性の臨床転帰でも結果として〜になるのに失敗した。裸の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、生存を強化して、ヒト乳癌のマウスのモデルで全身腫瘍組織量を減少さ細胞ことが示された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、腫瘍発達も阻害して、ヒト卵巣癌のマウスのモデルで、生存も強化した。抗ＭＣＳＰ抗体は多数の有毒であるか化学療法薬品に抱合型だった、そして、黒色腫のマウスのモデルで試験されるとき、これらの複合体は陽性のインビボの結果を示した。ヒトで試験される抗ＭＣＳＰ複合体の報告がなかったので、これらの複合体の安全はわかっていない。モノクローナル抗体単独の配送は、しかしながら小さい、あるとしても関連する毒性で忍容性が高かった。従って、裸の抗ＭＣＳＰ抗体をもつ癌患者の治療が陽性の臨床転帰を結果として〜になることができる場合、それは有益で、現在利用できることの進歩であるだろう。毒物に対する接合は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が抗癌性の活性を示すことを要求されない；従って、抗体−毒素複合体の投与と関連する特異的な安全懸念は、該当なしである。
【００３８】
多くの抗ＭＣＳＰ抗体は、ａｎｔｉ−を生成するのにも用いられた動物とヒトで試験されたイディオタイプ抗体。小さい非盲検法による試行において、抗イディオタイプ抗体を有する患者の免疫化が検出可能な抗ＭＣＳＰ免疫応答に帰着したとき、これらの患者の生存期間の中央値の増加が特異的な免疫応答を現さなかった患者と比較してあった。挙げられる例において、陽性の臨床効果を得るターゲッティングＭＣＳＰは、抗イディオタイプ抗体の投与を通して起こる可能性がある。このアプローチに関する問題は、抗イディオタイプ抗体で予防接種をされた全ての患者が抗ＭＣＳＰ反応を開発するというわけではなかったということである。従って、抗ＭＣＳＰ抗体が利用できる場合、それは直接投与の臨床転帰が患者の自身の免疫応答に臨床的な利益を生じることを依存する問題をこんなに解決することを確信していて結果として  になることができる。
それが直接ＭＣＳＰを目標として、症状発現前異種移植腫瘍モデルでａｎｔｉ¬癌効果を示すにつれて、１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２はそのような抗体である。そして、それは治療有効性の有効な予言者と考えられる。
【００３９】
全部で、この発明は、治療薬の目標として、１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の使用を教える‖その投与される、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量（それによって遅延疾患進行）を減らすことができて、そして、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできる。この発明もＣＤＭＡＢ（１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２）とその派生語の用法を教える。そして、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らして、この抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の生存を延長するためにその抗原を目標とする。さらにまた、この発明も、診断に役立つことがありえる癌細胞でＨＢＤ−２Ｅｌ  １−２抗原を見つける効果、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後を教える。患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着している転帰不良を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球による抗癌抗体の送達には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。
【００４０】
あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、抗体の５つのクラスである、そして、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、マウスの免疫グロブリンＭとＩｇＧ２ａ抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のＣＩ構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動さ細胞ことができる。ヒト抗体のために、最も効果的補体活性化抗体は、通常、免疫グロブリンＭとＩｇＧｌである。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。
【００４１】
ＩｇＧｌとＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で（いわゆる触媒抗体）さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。より広く認められる抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに２つの機構がある。
【００４２】
第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第２は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のｗｅｌｌ−認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点（処置が生存に悪影響を与えないところ）は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準は通常、受け入れられる、そして、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のような調節性体はこれらの利点（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）を発生する薬を承認する。
【００４３】
これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。Ｕ．Ｓ．  Ｆ．Ｄ．Ａ．（２００３）より、このプロセス中で承認される１６の薬があった、そして、これらの、４は完全な承認（すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査）に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための１つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、充実性腫瘍研究グループ（癌の一団の国際的な専門家）で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、前臨床モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少（それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある）が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；  ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，  ３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  ２００３，  ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。
【００４４】
したがって、ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。
【００４５】
それのＣＤＭＡＢと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。
【００４６】
細胞毒性がＡＤＣＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、本発明の更なる目的である。
【００４７】
細胞毒性がＣＤＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【００４８】
細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【００４９】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つＣＤＭＡＢを発生することである。
【００５０】
図および実施例（この発明の実施形態が述べられることを確信している）のために、この発明の他の目的と長所は、そこで以下の説明から明らかになる。
【００５１】
（図面の簡単な説明）
この特許のコピーまたはカラー図面（ｓ）による特許出願刊行は、要請と必要な料金の支払いに応じて局によって提供される。
図１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）またはＯＶＣＡＲ−３枚（レーン２）の膜のウエスタンブロットは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で深く探った。膜タンパク質は、還元性の状況の下で切り離された。分子量マーカーは、右で示される。
図２は、１−２で１１ＢＤ−２Ｅ１をＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に結合することの脱グリコシルの効果。脱グリコシル・バッファ（レーン１）だけで、ＰＮＡＧアーゼ、エンドｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミノダーゼ（レーン２）の組合せで、ＰＮＧアーゼ、エンドｏ−グリコシダーゼとシアリダーゼ（レーン３）の組合せで、シアリダーゼ（レーン４）だけで、エンドｏ−グリコシダーゼ（レーン５）だけで、そして、ＰＮＧアーゼ（レーン６）だけで暖められたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合。
図３は、２３１の膜タンパク質が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）とウエスタンブロット（パネルＢ）。レーン１は、分子量標準を表す。そして、レーン２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質である、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が免疫沈降したレーン３材料、そして、アイソタイプ制御が免疫沈降したレーン４材料。
図４は、タンパク質のウエスタンブロットは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（パネルＡ）、ＩｇＧｌアイソタイプ制御（１０７．３のクローンをつくりなさい、Ｐａｎｅｌ  Ｂ）、抗ラットのＮＧ２（ポリクローナル、Ｐａｎｅｌ  Ｃ）、正常なウサギ免疫グロブリンＧ（パネルＤ）、抗ＭＣＳＰ（９．２．２７のクローンをつくりなさい、Ｐａｎｅｌ  Ｅ）とＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｇ１５５−２２８のクローンをつくりなさい、Ｐａｎｅｌ  Ｆ）と深く探った。レーン１：１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物（レーン２）：ＩｇＧｌアイソタイプ制御（クローン１０７．３）免疫沈降物（レーン３）：抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物（レーン４）：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（クローンＧｌ  ５５−２２８）免疫沈降物（レーン５）：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜とレーン６：試料バッファ（負の制御）だけ。
図５は、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２、アイソタイプ制御または抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
図６は、１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）とアイソタイプで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器は、冷凍正常な人体組織配列から、心臓の組織部分の上で、抗体（Ｂ）を制御する。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の染色が、心筋線維にない。拡大は、２００Ｘである。
図７は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、抗アクチン（Ｂ）とアイソタイプで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器は、冷凍正常な人体組織配列から、骨格筋の組織部分の上で、抗体（Ｃ）を制御する。１つのＩＢＤ−２Ｅｌ  １−２は骨格筋を染色しなかった、しかし、染色が血管（矢印）の平滑筋にある。拡大は、２００Ｘである。
図８は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）の代表的な顕微鏡写真器とアイソタイプは、乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）と結合している抗体（Ｂ）を制御する。パネルＡの黒い矢は、腫瘍細胞を示している。拡大は、２００Ｘである。
図９は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果または予防ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関するバッファ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図１０は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による腫瘍を含んだマウス後処理または確立したエキスパートシステム−２異種移植検査のバッファ制御抗体の残存。
図１１は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による処置または確立したエキスパートシステム−２異種移植のバッファ制御の前の、の間の、そして、の後の腫瘍をもったマウスのＳＥＡＰレベルは、研究する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
実施例１
ウエスタンブロット法による結合タンパク質の同定
抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２時までに認められる抗原（ｓ）を特定するために、この抗原を表している細胞膜は、ゲル電気泳動に従属して、この抗体によって見つけられるタンパク質を決定するために膜にウエスタンブロット法を使用して移された。
【００５３】
１．膜調製
従来の作業は、乳癌線ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）まで、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２のＦＡＣＳによって、結合を示した。前の仕事も、卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３に対して、１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２有効性を示した。したがって、これらの２つの細胞系からの膜標本が、抗原識別のために使われた。全体の細胞膜は、ＭＢ−の融合性培養から、２３１の乳癌またはＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞を用意された。媒体は細胞スタックから除去された、そして、細胞はリン酸緩衝食塩水で洗われた。細胞は、プラットフォーム振盪機で３７℃で２０分の間解離バッファ（ギブコ−ＢＲＬ、グランドアイランド、ＮＹ）で分離された。細胞は採取されて、４℃で１０分の間９０Ｏｇで遠心された。遠心分離後、細胞ペレットはＰＢＳの中に再懸濁されて、洗う４℃で、１０分の間９０Ｏｇで再び遠心された。ペレットは貯蔵型だった−８０℃。Ｃｅｌｌペレットは細胞のグラムにつき３ｍＬのバッファの比率で５０ｍＬのＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害薬カクテル（ロシュ、ラヴァルＱＣ）につき１つの錠剤を含んでいる均質化バッファで再懸濁された。細胞懸濁液は、細胞を溶解するために氷の上でポリ公共の秤ホモジナイザーを使用している均質化に従属した。細胞ホモジネートを１５，０００ｇで核微粒子を除去する４℃の１０分時間遠心分離した。上清は収穫されて、管に分けられて、それから、Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔが管から除かれて慎重にあった４℃．で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された、そして、各々の膜ペレットは約５ｍＬの均質化バッファで再懸濁された。全ての管からの再懸濁されたペレットは一緒に１つの管に組み込まれて、管からのＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔが除かれて慎重にあった４℃．で９０分の間７５，６００ｇで遠心された、そして、ペレットは量られた。１パーセントのトリトンＸ−１００を含んでいる可溶化バッファは、膜ペレットのグラムにつき、３ｍＬのバッファの比率で、ペレットに加えられた。膜は、氷の上で１時間の間３００ｒｐｍでプラットフォーム振盪機で振盪によって可溶化された。膜溶液をペレット不溶性物質に対する７５，６０Ｏｇで遠心分離した。タンパク質が、タンパク含有量のために検定されて、管から除かれて慎重にあった可溶化された膜を含んでいる上清、そして、貯蔵型の−８Ｏ℃．
【００５４】
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット
膜タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって切り離された。膜タンパク質の２０のμｇは、１００ｍＭのＤＴＴを含んでいるＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファを混ぜ合わせられて、８パーセントのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンに積まれた。前染色分子量マーカー（インビトロゲン、バーリントン、ＯＮ）の試料を参照レーンで泳動した。電気泳動は１０分の間１００Ｖで実施された。そして、前染色分子量マーカーの充分な解答が守られるまで、１５０Ｖが続いた。タンパク質は、Ｔｒａｎｓｆｅｒがゲルから膜まで着色マーカーの完全な転送に注意して評価された４０のＶ．で、１６時間の間エレクトロブロッティングによってゲルからＰＶＤＦ膜（ミリポア、ビルリカ、ＭＡ）まで移された。転送の後で、膜が２時間０．５パーセントのツイーン−２０（ＴＢＳＴ）を含んでいるトリス−緩衝食塩水の５パーセントの脱脂乳によるブロック状態のであったこと、ＭｅｍｂｒａｎｅｓはＴＢＳＴで一度洗われた、それから、１つの１ＢＤ−２Ｅ１が１−２で、ＴＢＳＴで３回を洗っている２時間のＡｆｔｅｒのためにＴＢＳＴで３パーセントの脱脂粉乳で希釈した５つのμｇ／ｍＬで暖められて、膜はジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（西のグローヴＰＡ）から西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）まで活用するヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（結晶化可能フラグメント）で暖められた。この潜伏の後にＴＢＳＴで３回を洗うことが続いて、ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−で潜伏によってテトラメチル・ベンジジン（ＴＭＢ）（媒介生物Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの基質キット、バーリントンＯＮ）に続いた。図１において１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が明らかに切り離されたＭＢ−２３１（レーン１）とＯＶＣＡＲ−３つ（レーン２）の膜タンパク質の３つの分子量領域と結合すること。分子量にＢｙ比較（ＭＷ）標準、抗体はタンパク質と結合するＭＷ約１５０、２４０と２８０ｋＤａ。より強い反応性がこの細胞系で見られた時から、全ての更なる研究はＭＢ−２３１膜を使用してされた。
【００５５】
実施例２
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２時までに結合される抗原の糖化を決定すること
抗原（ｓ）が抗体１１ＢＤ−２Ｅｌによって１−２が糖蛋白であると認めたかどうか決定するために、ＭＢ−２３１膜は、ＰＮＡＧアーゼ、エンドｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼの異なる組合せで暖められた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で述べられるように、膜はウエスタンブロット法が続くＳＤＳ−ＰＡＧＥによって切り離された。図２は、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２結合の結果を脱グリコシル・バッファ（レーン１）だけで、ＰＮＡＧアーゼ、エンド・オルト・グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミノダーゼ（レーン２）の組合せで、ＰＮＧアーゼ、エンドｏ−グリコシダーゼとシアリダーゼ（レーン３）の組合せで、シアリダーゼ（レーン４）だけで、エンドｏ−グリコシダーゼ（レーン５）だけで、そして、ＰＮＧアーゼ（レーン６）だけで暖められたＭＢ−２３１膜に示す。グリコシダーゼによるＭＢ−２３１膜の処置は１−２で１１ＢＤ−２Ｅ１の結合を除去しない、しかしながら、タンパク質の分子量シフトは全てのレーンで観察される。そして、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２時までに認められる抗原が糖蛋白であったことを示す。
【００５６】
実施例３
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２  １による抗体結合の同定。
１．免疫沈降
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２のための抗原の識別は、抗体で可溶化膜糖タンパク質の免疫沈降を通して同族の配位子を分離することによって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、レークサクセスＮＹ）の１００のμＬは、１ｍＬの０．１Ｍのナトリウム・リン酸緩衝液ｐＨ  ６．０で、３回洗われた。１００のμＬ  ０．１  Ｍナトリウム・リン酸緩衝液ｐＨ  ６．０の総容積の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の１００のμｇは、洗われたビードに加えられた。混合物は、回転性の混合で１時間の間暖められた。解放された抗体は除去された、そして、１−２の被覆ビードがそうであった１１ＢＤ−２Ｅ１は０．１パーセントのツイーン−２０を含んでいる０．５ｍＬ  ０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ  ７．４で３回を洗った。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２被覆ビードは、１ｍＬ  ０．２ＭのトリエタノールアミンｐＨ  ８．２で、２回洗われた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は０．２ＭのトリエタノールアミンｐＨ  ８．２で１ｍＬの０．０２Ｍのジメチルピメリミデートを加えることによってビードに化学的に架橋された、そして、回転性の混合による１５分の間、３０分の間回転性の混合で反応を暖めることは１ｍＬの０．０５ＭのトリスｐＨ  ７．５でビードを暖めることによって止められた。１−２の架橋されたビードがそうであった１１のＢＤ−２Ｅｌは、１ｍＬの１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含んでいる２．７ｍＭのＫＣｌ（ＰＢＳ）で３回を洗った。
【００５７】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋されたビードは、０．１パーセントのツイーン−２０を含んでいる０．１ＭのＰＢＳで３つの洗浄が続く３分の間、０．１Ｍのクエン酸のｐＨ  ３．０で、潜伏によってプレ溶出した。架橋されたビードが同様に用意された抗体の第２セットはトリニトロフェノール（無関係な分子）にマウスＩｇＧｉ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから１０７．３のクローンをつくりなさい、Ｏａｋｖｉｌｌｅ  ＯＮ）を使用することを記載した。そして、それが陰性のＩｇＧｉアイソタイプ制御として使われた。架橋されたビードが４℃で３０分の間回転性の混合で０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ  ７．４で１パーセントのＢＳＡで孵化してブロック状態のであった１１ＢＤ−２Ｅ１１−２。ビードは、０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ  ７．４で、３回洗われた。ＭＢ−２３１細胞からの完全膜標本の５００のμｇは、１−２が回転性の混合でビードを免疫複合体縛られたビードが１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４の１ｍＬ、洗われた３つの時間であった４℃．で２．５時間架橋した１１ＢＤ−２Ｅ１、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２８７ｍＭのＮａＣｌ、１パーセントのトリトンＸ−１００を含んでいる２．７ｍＭのＫＣｌで暖められた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２縛られたタンパク質は、穏やかな混合で３分の間０．１Ｍのクエン酸のｐＨ  ３．０の３０のμＬで、潜伏によって１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋されたビードから溶出された。溶出されたタンパク質は、ＩＭトリスｐＨ  ９の９つのμＬの追加によって、中性のｐＨに持ってこられた。中和された溶出されたタンパク質は、℃、−８０で貯蔵型だった。１−２の架橋されたビードがそうであった１つの１ＢＤ−２Ｅ１は、０．１パーセントのツイーン−２０を含んでいる３ｍＬのＰＢＳで洗った。架橋されたビードがそうであったＩｇＧｉアイソタイプ対照（クローン１０７．３）は、ＭＢ−２３１膜タンパク質で巣について、１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２と同じ方法で、ビードを加工した。記載されて、一緒に結合されるにつれて、ＭＢ−２３１膜タンパク質からの１つの１ＢＤ−２Ｅ１  １−２免疫沈殿タンパク質の２つのバッチは生産された。同じことは、ＩｇＧｌ（クローン１０７．３）アイソタイプ制御ビードのためにされた。この免疫沈降物混合物（ＭＢ−２３１膜タンパク質の６２０のμｇから免疫沈降する対応の総計〜までもタンパク質）の６２パーセントは、４−２０パーセントの勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一つのレーンに積まれた。１０７．３の架橋されたビードから作り出される材料の同じ量は近隣のレーンに載せられた。そして、そのことはＭＢ−２３１膜タンパク質の２０のμｇであった。汚れのない分子量マーカー（インビトロゲン、バーリントンＯＮ）または前染色分子量マーカーの試料は、追い込み参照レーンであった。試料は１０分の間１００Ｖで電気泳動によって切り離された。そして、６０分の間１５０Ｖが続いた。タンパク質は、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ（登録商標）（バイオラド、ミシソーガ、ＯＮ）でゲルを暖めることによって、染色された。。平行したウエスタンブロットでは、ＭＢ−２３１膜タンパク質の１８０のμｇと架橋されるＩｇＧｌアイソタイプ制御（クローン１０７．３）から作り出される材料の同じ量���ら免疫沈降する一致された総計〜までもタンパク質がビーズをつける免疫沈降物混合物の１８パーセントは、電気泳動によって切り離された。タンパク質は転写後、４０のＶ．で１６時間の間エレクトロブロッティングによってゲルからＰＶＤＦ膜（ミリポア、ビルリカ、ＭＡ）まで移された。そして、膜は２時間のためのＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳によるブロック状態のであった膜がＴＢＳＴで３回を洗っている２時間後のためにＴＢＳＴで３パーセントの脱脂粉乳で希釈される５μｇ／ｍＬ  １１ＢＤ−２Ｅ１１−２で探索された、膜は抗ヤギでインキュベートした。そして、マウス免疫グロブリンＧ（結晶化可能フラグメント）が１時間、ＨＲＰを接合される。Ｔ潜伏の後にＴＢＳＴで３回を洗うことが続いた。そして、ＨＲＰ基質ＴＭＢで潜伏が続いた。
【００５８】
図３は、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２によって免疫沈降されるタンパク質から得られるゲルとウエスタンブロットを表す。ゲル（パネルＡ）の上で、レーン１は分子量標準を表す、そして、レーン２はＭＢ−２３１膜タンパク質を表す。２つの異なった帯域があったＭＷ、１１ＢＤ−２Ｅ１を含んでいるレーンの２４０と２８０ｋＤａ、１−２は１０７．３の免疫沈降された材料（レーン４）を含んでいるレーンで存在しなかった材料（レーン３）を免疫沈降した。対応のウエスタンブロット（パネルＢ）で、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、タンパク質を免疫沈降される１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で、強く反応するＭＷ  ２４０と２８０ｋＤａ（レーン３）。ウエスタンブロット上で、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２も１５０ｋＤａで１つの１ＢＤ−２Ｅ１  １−２免疫沈殿タンパク質で、強く付加的な帯域に反応する；この帯域は、染色されたゲルの上で検出可能でなかった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈殿タンパク質に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性側面は、ＭＢ−２３１全体の膜（レーン２）で見られてそれと類似していた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性がＩｇＧｌアイソタイプ制御によって免疫沈降されるタンパク質になかった（１０７．３のクローンをつくりなさい；レーン４）、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を免疫沈殿タンパク質に結合することがはっきりしていて、混在タンパク質の存在によらなかった。
【００５９】
２．質量分析
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（図３、Ｐａｎｅｌ  Ａ、レーン３）で１１ＢＤ−２Ｅ１によって免疫沈降される２４０と２８０ｋＤａのタンパク質に対応しているゲルの大量のＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｔｈｅ領域は、無菌のメスを使用して取り除かれた。これらのゲル・スライスが、それからＭＡＬＤＩ／ＭＳと集線装置／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析法によって、タンパク質の識別のために使われた。
【００６０】
試料はトリプシンを使用しているＰｒｏＧｅｓｔワークステーションで蛋白分解に従属した、そして、一部の結果として生じるダイジェスト上清がＭＡＬＤＩ／ＭＳ分析のために使われた。斑点は、ＺｉｐＴｉｐｓでロボット的に実行された（プロＭＳ）；ペプチドは、マトリックス（α−シアノ４−ハイドロキシ桂皮酸）によるＣ１８材料が６０パーセントのアセトニトリルで準備した溶出された形状（０．２パーセントのＴＦＡ）であった。ＭＡＬＤＩ／ＭＳデータはボイジャーＤＥ−同期送受信器具の上で後天性だった（アプライドバイオシステム、フォスターシティーＣＡと観察されたｍ／ｚ値は、捜しているペプチド質量指紋のために、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（プロテオ測定基準ソフトウェア・パッケージ）に提出された。ＰｒｏＦｏｕｎｄは、ＮＣＢＩｎｒデータベースの局所的に貯蔵型のコピーについてたずねた。ダイジェスト上清の付加的な部分は、２００ｎＬ／分の流速で７５本のμｍ  Ｃ１８柱を使用しているＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ２の上で、ナノ集線装置／ＭＳ／ＭＳによって分析された。ＭＳ／ＭＳデータは、ＭＡＳＣＯＴの局所コピーを使用して検索された。ＭＡＬＤＩ／ＭＳと集線装置／ＭＳ／ＭＳによって特定されるタンパク質は、表１に示される。
【００６１】
【表１】
2007530457.tif 000003
【００６２】
両方の試料は、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）と確認された。
【００６３】
３．  推定上の抗原の確認
確認は、既知の抗ＭＣＳＰ抗体がそばに免疫沈降されるタンパク質と反応するかどうか決定することによって実行された１１ＢＤ−２Ｅ１１−２とその逆。マウス抗ＭＣＳＰの追加で前に以外述べられるように、Ｉｒｎｒｎｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓは同様に準備されたモノクローナル抗体９．２．２７（ＩｇＧ２ａ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）、そして、マウスＩｇＧ２ａ抗体（クローン  Ｇ１５５−１７８  、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；  Ｏａｋｖｉｌｌｅ  ＯＮから入手）トリニトロフェノールに、陰性のＩｇＧ２ａアイソタイプ制御として使われた無関係な分子。１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物（ＩｇＧｌアイソタイプ制御（クローン１０７．３））。免疫沈降物、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物とＭＢ−２３１膜は、６つの反復された１０パーセントのゲル類の上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって切り離された。電気泳動とウエスタンブロット法は、先に述べたように実行された。膜はそうだった１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、ＩｇＧｌアイソタイプ制御（クローン１０７．３）、反対者の５つのμｇ／ｍＬでインキュベートされるＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）（ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（クローンＧ  １５５−２２８））ウサギ・ポリクローナル抗ラットＮＧ２抗体（ＭＣＳＰは、ラットＮＧ２のヒト相同体である；（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）、そして、述べられるように、２．５時間の図４のためにＴＢＳＴで３パーセントの脱脂粉乳で希釈される正常なウサギ免疫グロブリンＧ（シグマ、セイント・ルイスＭＯ）はウエスタンブロット法の結果を示す。図中、（Ｐａｎｅｌ  Ａ）は、１１のＢＤ−２Ｅｌ  １１ＢＤ−２Ｅ１  １−２免疫沈降物（レーン１）、ＩｇＧｌアイソタイプ制御（クローン１０７．３）免疫沈降物（レーン２）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物（レーン３）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（クローンＧ  １５５−２２８）免疫沈降物（レーン４）、ＭＢ−２３１膜（レーン５）と試料バッファ（負の制御）（レーン６）だけに対する１−２の結合である。１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２は、両方のＭＢ−２３１膜で、そして、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物で約１５０、２４０と２８０ｋＤａの同じ３つの帯域を認識した。上部２８０ｋＤａのバンドだけは、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物レーンで認められた。反応がアイソタイプ制御免疫沈降物レーンのどちらにもない。そして、免疫沈降物に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性が特に結合されていて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２と９．２．２７によって免疫沈降されているタンパク質によったことを示す。ＩｇＧｌアイソタイプ対照（クローン１０７．３）と探索される平行した汚点（パネルＢ）において、反応性はレーンの何でも観察されなかった。そして、１−２でＨＢＤ−２Ｅｌで探索される汚点で観察される反応性がはっきりしていたことを示した。図中パネルＣは、平行した汚点に対するウサギ・ポリクローナル抗ラットＮＧ２抗体の結合である。それが他のレーンの何でもこの分子量範囲のタンパク質と結合しない間、抗ＮＧ２が���１ＢＤ−２Ｅ１  １−２免疫沈降物（レーン１）で約１５０と２４０ｋＤａの２つの帯域と結合して。平行した汚点（パネルＤ）において、正常なウサギ免疫グロブリンＧは、ＩｇＧ２ａ免疫沈降物（レーン４）とＭＢ−２３１膜（レーン５）でタンパク質にかすかな非特異的な反応性を見細胞。従って、Ｐａｎｅｌ  Ｃ（ウサギａｎｔｉ−ＮＧ２で徹底調査される）のこれらのレーンの同じ反応性は、非特異性と考えられていなければならない。平行した汚点において、（パネルＥ）抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）は、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物レーン（レーン３は、矢で指示した）で、１つのバンドに非常にかすかな結合だけを見細胞；それが免疫沈降された試料でこんなものですが集中した形状で存在するとき、この帯域が９．２．２７がこの抗原のために低親和性を持つ可能性があって、反応性を示す可能性があるだけのことを示すＭＢ−２３１膜（レーン５）で見られなくて。ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（クローンＧ  １５５−２２８）で探索される最終的な平行した汚点（パネルＦ）において、反応性はレーンの何でも観察されなかった。そして、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）で探索される汚点で観察される反応性がはっきりしていたことを示した。これらの結果はＨＢＤ−２Ｅｌ  １−２免疫沈殿タンパク質がＭＣＳＰのラット相同体によって認識されたことを証明する、そして、その抗ＭＣＳＰ免疫沈殿タンパク質は１−２で２Ｅｌ、１つのＩＢＤ−によって認識された。既知の商業的な抗体を使用している確認と結合される大規模な分光学的な識別は、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２のための抗原がＭＣＳＰであることを証明する。ＭＣＳＰのコアタンパク質が糖蛋白であるにつれて、これは例２の脱グリコシル実験と整合していもする。
【００６４】
実施例４
Ｓ．Ｎ．  １０／７４３，４５１で概説されるように、寄託番号ＰＴＡ−５６４３の下で、２００３年１１月１１日の２０１１０−２２０９  ＡＴＣＣ、１０８０１本の大学大通り、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡで、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は寄託された。ＣＦＲ１．８０８に従って、寄託者は寄託資料が市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。
【００６５】
抗体産生：
１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２モノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度／週でハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）で培養することによって生産された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）で、標準の抗体精製処置によって精製された。
【００６６】
前述のとおり、Ｓ．Ｎ．  １０／３４８，２３１で、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、細胞毒性分析（表２）で、多数の陽性（抗ファス（ＥＯＳ９．１、免疫グロブリンＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧｌ、カッパ、１０マイクログラム／ｍＬ、インテル・メディコ、マーカム、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、カッパ、５マイクログラム／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ホーンビー、ＯＮ）、Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００マイクロモル、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、アジ化ナトリウム（０．１％、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ））で陰性の（１０７．３（抗喘ぎ、ＩｇＧｌ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗喘ぎ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、ＭＰＣ−Ｉ  ｌ（抗原特異性未知数、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、免疫グロブリンＧ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％））対照と比較された。
【００６７】
乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ  １１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ  Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３（ＯＶＣＡＲ））、前立腺癌（ＰＣ−３）と非癌（２７ｓｋチャージカップルドデバイス、Ｈｓ８８８ルテチウム）細胞系は、試験された（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡからの全て）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞毒性分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得られた。分析は、下で概説される変化Ｐ  Ｃ  Ｎ  Ｃｌｔｌｔｔｔ  ｓｅｇａｅｏｎｏｓｏｉｉｖｅｏｎｒｏｓｉｖｒで、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。２日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから、１００マイクロリットルは細胞板に転写されて、５日の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで暖められた。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、３回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。ＤＰＢＳで希釈される蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、３０分の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで３７℃で暖められた。プレートはパーキン−エルマーで１０のＨＴＳ７０００蛍光プレート読本を読んで聞かせられた、そして、データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで分析された、そして、結果は表１で表化された。データは、平均４つの実験が三通りで検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した：４／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋＋）、３／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋）、２／４実験より大きい閾値細胞毒性１５（＋）。表１の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２は胸部と卵巣の癌細胞で特に細胞毒性で、正常細胞に影響を及ぼさなかった。比較のためにも含まれた多数の他の抗体が２０の生物学的細胞分析の限定を与えられて予想通りに実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。全体として、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体が２つの癌細胞タイプに対して細胞毒性活性を持つことを示された。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体はその活性で選択的だった。さらにまた、それが非癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、抗体は機能的な特異性を示した。そして、それは治療的な状況の重要な要素である。
【００６８】
【表２】
2007530457.tif 000004
【００６９】
以下の更なる卵巣癌はフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２と上記パネルの癌および正常細胞系、それに加えて以下の追加卵巣癌細胞系（Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−ｓ、Ｃ−１４、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡ−４２９、およびＥＳ−２＋ＳＥＡＰ）を評価した。
【００７０】
細胞は、まず最初にＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋なしで）で細胞単層を洗うことによって、ＦＡＣＳの準備ができていた。細胞解離バッファ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、バーリントン、ＯＮ）はそれから、細胞が４℃（メディアを洗う）、ＭｇＣｌ２を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、塩化カルシウムと１０の２または２５パーセントのウシ胎児血清（ＦＢＳ）で再懸濁された３７℃．  Ａｆｔｅｒ遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、適当な細胞密度に等分されて、引き伸ばした以上ペレットを細胞とみなした、そして、Ａｌｅｘａフルーアの追加に３０分のＰｒｉｏｒのために氷の上で２０のμｇ／ｍＬで１１ＢＤ−２Ｅ１１−２制御抗体（アイソタイプ制御または抗ＥＧＦＲ）を含んでいる染色メディア（ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２と塩化カルシウム＋／−を含んでいる。そして、２パーセントがＦＢＳである）で再懸濁されて、細胞がそうであった４８８抱合型の１５の二次抗体は洗浄メディアで一度を洗った。染色メディアの中のＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の抗体は、それから細胞がそれから最後の時洗われた２０〜３０分の間加えられて、１つのμｇ／ｍＬプロピジウム・ヨウ化物または１．５パーセントのパラホルムアルデヒドを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、進行中に試料を肉薄することによって評価された。
【００７１】
【表３】
2007530457.tif 000005
【００７２】
【表４】
2007530457.tif 000006
【００７３】
ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）を使用している２０のＦＡＣＳｃａｎ。
細胞のフォワード（国際販売会社）と側方散乱（ＳＳＣ）は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とＳＳＣ探知器に追い迫る。３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２とＦＬ３）のための探知器は、抗体が細胞が約１−５単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、２５の二次抗体を４８８複合体化することをＡｌｅｘａフルーアによってなった純化されたアイソタイプ対照でけがされる細胞を走ら細胞ことによって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外（使われるとき）のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約１０，０００の有効な細胞は、分析のために後天性だった、そして、起こられた示された表３と４で。３と４がアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に示されることを表に記入する：５未満（）；５〜５０の（＋）；５０〜１００（＋＋）；１００の（＋＋＋）より上に、そして、括弧において、細胞のパーセンテージは、染色された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体の代表的なヒストグラムは、図５のために編集された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（表３）とＥＳ−２＋ＳＥＡＰ（表４）を含むいくつかの卵巣腫瘍細胞系と結合している特異的な腫瘍を示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合が非癌細胞にもあった、しかしながら、その結合は細胞毒性を発生しなかった。これは、結合がその同族の抗原の抗体結紮の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結紮の前後関係がちょうど結合している抗体よりむしろ細胞毒性で決定的なことを示唆した。
【００７４】
実施例５
通常の人体組織染色
ＩＨＣ検査は、ヒトで１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原分布を特徴づけるために実行された。ＩＨＣ最適化検査は、更なる実験の条件を決定するために、以前に実行された。１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２モノクローナル抗体は、生産されて、上述の通り精製された。２０の正常な人体組織に対する抗体の結合は、冷凍ヒトの正常な器官組織配列（傾斜マイク、Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ、ＮＹ）を使用して実行された。スライドは、後固定で風乾１０分の間（−２Ｏ℃）アセトン、それから、室温に来させておかれる。スライドは、スライドがそれから、室温で５分のＵｎｉｖｅｒｓａｌ遮断剤（ダコ、トロント、オンタリオ）で潜伏が続いて５分、３回、ＰＢＳですすがれた１０分の間３パーセントの過酸化水素で洗うことで遮断存性ペルオキシダーゼ活性が続くそれぞれ２分の間、３回、４℃冷たいリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすがれた。１  １ＢＤ−２Ｅ１  １−２、抗ヒトの筋肉アクチン（クローンＨＨＦ３５、ダコ、トロント、オンタリオ）またはアイソタイプ制御抗体‖（黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼ（存在しもしなく哺乳類の組織で誘導性でもない酵素）の方へ指示した；ダコ、トロント、オンタリオ）その働く集中（２つのμｇ／ｍＬであった抗アクチン以外の各々の抗体のための５つのμｇ／ｍＬ）に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、オンタリオ）の希釈されて、そして、室温の１時間の間、終夜孵化した。スライドをＰＢＳそれぞれ２分の間の３回で洗浄した。室温で３０分に供給される（ダコＥｎｖｉｓｉｏｎシステム、トロント、オンタリオ）につれて、主要な抗体の免疫反応性はＨＲＰ抱合型二次抗体で発見されていて／視覚化した。これがスライドに段をつけることになることをＰＢＳそれぞれ２分と室温で１０分の間免疫ペルオキシダーゼ染色のＤＡＢ（３，３’−ジアミノ・ベンジジンｔｅｔｒａｈｙｄｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ、ダコ、トロント、オンタリオ）色原体基質解決を加えることによって開発される呈色反応のための３回で洗浄した。スライドを水道水で洗うことは、色素反応を終了した。マイヤーのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（シグマＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）による対比染色の後で、滑り面は段階的なエタノール（９５−１００％）でｄｅｈｙｒｄａｔｅｄされて、キシレンで掃除された。マウンティング・メディア（ダコＦａｒａｍｏｕｎｔ、トロント、オンタリオ）を使用して、スライドはカバーガラスがかけられた。スライドはＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（ツァイス・カナダ、トロント、ＯＮ）を使用して顕微鏡的に調べられた、そして、ディジタル画像はノーザンブロットのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ミシソーガ、ＯＮ）を使用することを得て、保存した。結果は読み込まれて、勝ち取られて、病理学者によって解釈された。
【００７５】
表５は、多数の正常な人体組織の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色の結果の概要を示す。テーブルから、組織染色の２つのメイン・カテゴリーが、あった。一群の組織は、完全に負だった。これらの組織は、通常の甲状腺、気管支と左心室（図６）の心筋を含んだ。組織の第２の群は、染色が組織切片で陽性だった組織を含んだが、血管および／または上皮（図７）の平滑筋線維に限られていた。これらの結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２のための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体がヒトの限定された数の組織だけと結合することを示唆した。１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２の通常の人体組織染色は、抗ＭＣＳＰ抗体のために前に報告されてそれに似ている；Ｂ５。Ｂ５は、以前、皮膚ケラチノサイト、肺肺胞上皮と血管内皮と結合することが示された。
【００７６】
【表５】
2007530457.tif 000007
【００７７】
実施例６
ヒト胸部腫瘍組織染色
ＩＨＣ検査は、ヒト乳癌で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の癌関連を決定するために行われた。
比較は役立たれたアクチン（正の制御）と黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼ（存在しもしなく哺乳類の組織１０（負の制御）で誘導性でもない酵素）に向けられる抗体。
乳癌で非腫瘍性の胸部組織に由来する１５人の乳癌患者と５つの試料に由来する乳癌組織配列
患者が、使われた（傾斜マイク、Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ、ＮＹ）。
以下の情報は、各々の患者に対して用意されていた：
年齢、性と診断。ＩＨＣのために処置から例５は続かれた。１５の表６は、乳癌組織配列の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体染色の結合概要を提供する。各々の配列は、１５人の個々の患者から腫瘍試料を含んだ。全体として、試験される８人の（組織標本のうちの７つは、完全に分離していたか代表的でなかった）患者の６２パーセントは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原が陽性だった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２のためにも、３から０（また、組織標本のうちの２つは、そうだった完全に分離した）、乳癌患者からの正常な胸部組織試料は、陽性だった（図８）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２のために、そこの抗原は、高等腫瘍の病期によるより大きな陽性の表現に向かう傾向であるように見えなかった。しかしながら、この結果は、小さいサンプルサイズのために制限された。染色が特有だった１１ＢＤ−２Ｅ１１−２癌細胞（図８）。染色パターンは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２から、患者試料で、抗体がそれによって悪性細胞に非常に特有だったことを示したそれを魅力的なｄｒｕｇｇａｂｌｅな目標とすること。１−２がとても以前に似ている１つのＩＢＤ−２Ｅｌの胸部腫瘍組織染色は、抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５のために報告した。Ｂ５は、以前、６０パーセントの乳癌腫瘍組織と結合することが示された。
【００７８】
【表６】
2007530457.tif 000008
【００７９】
実施例７
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−４６８定着腫瘍実験
図９に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで２００万のＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが１００のｍｍ３の腫瘍容積に達したとき、５−６のマウスは２つの投与群の各々にランダム化された。１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２またはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、１０ｍｇ／ｋｇ／服用で腹腔内に投与された。抗体は、それから移植後の日６６まで、同じ様式で合計１０の用量のために１週につき３回投与された。腫瘍成長は本研究の期間の間カリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。無作為化時に、平均の腫瘍容積と各群の標準偏差は、同程度だった。統計学的に、群間の体重の違いが、なかった。これは、真性の無作為化が起こったことを示した。図９で示すように、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１は、１−２で３週治療期間（ｐ＝０．５２）の終わりに、バッファ制御に割に２５パーセント腫瘍成長を没収されたる。これが有意差でなかったにもかかわらず、割にバッファ制御に対する還元型の腫瘍容積に向かう傾向は本研究の全体を通じて観察された。従って、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立した乳癌モデルで有効性を示した。
【００８０】
実施例８
インビボのアインスタイニウム−２＋ＳＥＡＰ定着腫瘍実験
図１０と１１に関して、６〜８週間目の雌の胸腺欠損のヌードマウスは、ヒトの胎盤分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を表すために安定に形質移入される１０００万のエキスパートシステム−２＋ＳＥＡＰヒト卵巣癌細胞で、腹腔内に入れられた。１０００万の卵巣癌細胞は、５００マイクロリットルの無血清のα−ＭＥＭの中に再懸濁された。腫瘍成長は、日７に３匹のマウスの犠牲と確認された。日７の腫瘍成長の確認の後で、８匹のマウスは、２つの投与群の各々にランダム化された。１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２またはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、２５０マイクロリットル量で、１０ｍｇ／ｋｇ／服用で腹腔内に投与された。抗体は、それから合計１０の用量のためにさらに５つの用量のために一日おきに、５つの用量とそれから一度のために日につき一度投与された。全身腫瘍組織量に測定循環ＳＥＡＰレベルによって外挿されて、本研究の期間の間剖検に応じて視覚的に評価されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントを達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。血漿を回している無作為化時に、ＳＥＡＰレベル（全身腫瘍組織量を表す）は、分析された。有意差が、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２とバッファ制御投与群の間に平均ＳＥＡＰレベルになかった。しかしながら、群内で、可変的な腫瘍取得−率が、あった。図１０で示すように、１−２が傾向を示した抗体１１ＢＤ−２Ｅ１は、投与群の一団で、生存を改善した。図１１で例示されるように、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置を受けている１匹の動物はほとんどごくわずかなレベルにＳＥＡＰを回すことの減少した量を持った。循環ＳＥＡＰの低レベルは、約６０日ｐｏｓｔ−移植まで続いた。全部で、１−２が発生した１１ＢＤ−２Ｅ１がヒト癌のｍｕｌｉｔｐｌｅモデルで利益を得る（割に処置を制御する改善された生存と減少した全身腫瘍組織量）これらの結果は、人を含む哺乳類で、癌治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を暗示する。図中証拠の優越性は、ＭＳＣＰの上で出席しているエピトープの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が結紮を通してａｎｔｉ¬癌効果の媒介となることをである。この発明の目的で、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞系１１ＢＤ−２Ｅ１１−２時までにコードされるモノクローナル抗体と結合するその能力、それの抗原性の結合フラグメントまたはそれの抗体複合体によって特徴づけられる「ＭＳＣＰ抗原性部位」として定義される。実施例３で、１−２の抗体が同族の抗原を２３１細胞ＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降さ細胞に用いられることができることを１１ＢＤ−２Ｅ１に明らかにされた。更に、１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２抗体が特にそれに対して結合するＭＳＣＰ抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣに限られていない技術を利用した。このように、免疫沈降された１つの１ＢＤ−２Ｅ１  １−２抗原が１１��Ｄ−２Ｅ１１−２をＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に結合することを阻害することができることを示されることができた。更なる（１  １ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体で）他の抗ＭＳＣＰ抗体は他の型のＭＳＣＰ抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原はそれらの抗体を分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織に結合することを阻害するのに用いられることもできる。
【００８１】
この仕様で言及される全ての特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する。そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）またはＯＶＣＡＲ−３枚（レーン２）の膜のウエスタンブロットは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で深く探った。膜タンパク質は、還元性の状況の下で切り離された。分子量マーカーは、右で示される。
【図２】１−２で１１ＢＤ−２Ｅ１をＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に結合することの脱グリコシルの効果。脱グリコシル・バッファ（レーン１）だけで、ＰＮＡＧアーゼ、エンドｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミノダーゼ（レーン２）の組合せで、ＰＮＧアーゼ、エンドｏ−グリコシダーゼとシアリダーゼ（レーン３）の組合せで、シアリダーゼ（レーン４）だけで、エンドｏ−グリコシダーゼ（レーン５）だけで、そして、ＰＮＧアーゼ（レーン６）だけで暖められたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合。
【図３】２３１の膜タンパク質が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）とウエスタンブロット（パネルＢ）。レーン１は、分子量標準を表す。そして、レーン２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質である、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が免疫沈降したレーン３材料、そして、アイソタイプ制御が免疫沈降したレーン４材料。
【図４】タンパク質のウエスタンブロットは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（パネルＡ）、ＩｇＧｌアイソタイプ制御（１０７．３のクローンをつくりなさい、Ｐａｎｅｌ  Ｂ）、抗ラットのＮＧ２（ポリクローナル、Ｐａｎｅｌ  Ｃ）、正常なウサギ免疫グロブリンＧ（パネルＤ）、抗ＭＣＳＰ（９．２．２７のクローンをつくりなさい、Ｐａｎｅｌ  Ｅ）とＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｇ１５５−２２８のクローンをつくりなさい、Ｐａｎｅｌ  Ｆ）と深く探った。レーン１：１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物（レーン２）：ＩｇＧｌアイソタイプ制御（クローン１０７．３）免疫沈降物（レーン３）：抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物（レーン４）：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（クローンＧｌ  ５５−２２８）免疫沈降物（レーン５）：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜とレーン６：試料バッファ（負の制御）だけ。
【図５】１１ＢＤ−２Ｅ１  １−２、アイソタイプ制御または抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
【図６】１つの１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）とアイソタイプで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器は、冷凍正常な人体組織配列から、心臓の組織部分の上で、抗体（Ｂ）を制御する。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の染色が、心筋線維にない。拡大は、２００Ｘである。
【図７】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、抗アクチン（Ｂ）とアイソタイプで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器は、冷凍正常な人体組織配列から、骨格筋の組織部分の上で、抗体（Ｃ）を制御する。１つのＩＢＤ−２Ｅｌ  １−２は骨格筋を染色しなかった、しかし、染色が血管（矢印）の平滑筋にある。拡大は、２００Ｘである。
【図８】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）の代表的な顕微鏡写真器とアイソタイプは、乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）と結合している抗体（Ｂ）を制御する。パネルＡの黒い矢は、腫瘍細胞を示している。拡大は、２００Ｘである。
【図９】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果または予防ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関するバッファ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１０】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による腫瘍を含んだマウス後処理または確立したエキスパートシステム−２異種移植検査のバッファ制御抗体の残存。
【図１１】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による処置または確立したエキスパートシステム−２異種移植のバッファ制御の前の、の間の、そして、の後の腫瘍をもったマウスのＳＥＡＰレベルは、研究する。 
【図１】
2007530457.tif 000009
【図２】
2007530457.tif 000010
【図３】
2007530457.tif 000011
【図４】
2007530457.tif 000012
【図５】
2007530457.tif 000013
【図６】
2007530457.tif 000014
【図７】
2007530457.tif 000015
【図８】
2007530457.tif 000016
【図９】
2007530457.tif 000017
【図１０】
2007530457.tif 000018
【図１１】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年5月20日(2007.5.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患を患う患者を処置するための方法であって、
癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産方法にもとづいて生産されるとともに、癌組織の細胞に対して細胞毒性を示し、かつ非癌細胞に対して本質的に良性であることを特徴とする抗癌抗体またはそのフラグメントを、前記患者に投与することを含み、
前記抗体またはそのフラグメントが医薬的に許容されるアジュバントと混合されて前記癌疾患の処置をもたらすのに有効な量で投与され、
前記抗体が、前記癌組織によって発現された抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定された特徴を有する抗体が結合することで特徴づけられる癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項２】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントと、毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞からなる群から選択される成分とを結合させて、抗体複合体を形成すること、ならびに
前記患者に対して前記抗体複合体またはその結合フラグメントを投与すること、
を含み、
前記抗体複合体または結合フラグメントを医薬的に許容されるアジュバントと混合し、前記癌疾患の処置をもたらすのに有効な量で投与する請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項３にもとづく方法。
【請求項５】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が抗体に依存した細胞毒性によってもたらされる請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項６】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が補体に依存した細胞毒性によってもたらされる請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項７】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が細胞化学結合の加水分解を触媒することによってもたらされる請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項８】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が腫瘍細胞に存在する推定癌抗原に対して免疫応答を生じさせることによってもたらされる、請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項９】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性がそれらの機能を妨げる細胞膜タンパク質の標的化によってもたらされる請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１０】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性がシグナルを生成して細胞致死を起こすのに有効である細胞タンパク質に構造変化を生じさせることによってもたらされる請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１１】
前記生産方法が特定の個体から得られた癌細胞および非癌細胞を含む組織試料を利用する請求項１にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１２】
癌疾患を患う患者を処置するための方法であって、
癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を生産するための方法にもとづいて生産されるとともに、癌組織の細胞に対して細胞毒性を示し、かつ非癌細胞に対して本質的に良性である抗癌抗体またはそのフラグメントを、前記患者に投与することを含み、前記抗体が、ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンまたはそのフラグメントに結合する抗原によってコードされた単離モノクローナル抗体であり、医薬的に許容されるアジュバントと混合されて前記癌疾患の処置をもたらすのに有効な量で投与される癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１３】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１４】
前記抗体またはそのフラグメントと、毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞からなる群から選択される成分とを結合させて、抗体複合体を形成すること、ならびに
前記患者に対して前記抗体複合体またはその結合フラグメントを投与すること、
を含み、
前記抗体またはそのフラグメントが医薬的に許容されるアジュバントと混合されて前記癌疾患の処置をもたらすのに有効な量で投与される請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１５】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項１４にもとづく方法。
【請求項１６】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が抗体に依存した細胞毒性によってもたらされる請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１７】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が補体に依存した細胞毒性によってもたらされる請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１８】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が細胞化学結合の加水分解を触媒することによってもたらされる請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項１９】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が細胞化学結合の加水分解を触媒することによってもたらされる請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項２０】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性がそれらの機能を妨げる細胞膜タンパク質の標的化よってもたらされる請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性が前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性がシグナルを生成して細胞致死を起こすのに有効である細胞タンパク質に構造変化を生じさせることによってもたらされる請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項２２】
前記生産方法が特定の個体から得られた癌細胞および非癌細胞を含む組織試料を利用する請求項１２にもとづく癌疾患を患う患者を処置するための方法。
【請求項２３】
細胞表面上でＭＣＳＰ抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞毒性をもたらすためのプロセスであって、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが前記発現されたＭＣＳＰ抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位がＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体によって結合され、該結合の結果として細胞毒性が生ずる、
細胞表面上でＣＤ４４抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞毒性をもたらすためのプロセス。
【請求項２４】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項２３のプロセス。
【請求項２５】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントを、細胞毒性部位、毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞からなる群から選択される成分と結合させて、抗体複合体を形成する請求項２３のプロセス。
【請求項２６】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項２５のプロセス。
【請求項２７】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがネズミ科のものである、請求項２３のプロセス。
【請求項２８】
前記ヒト腫瘍組織試料が、乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項２３のプロセス。
【請求項２９】
ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部位に特異的に結合するＭＣＳＰ抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、  
細胞試料を提供すること、
前記発現されたＭＣＳＰ抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記ＭＣＳＰ抗原性部位がＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を持つ抗体によって結合されることによって特徴づけられる、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供すること、
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料とを接触させること、ならびに
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を決定することを含み、
それによって前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＭＣＳＰ抗原性部位を発現する細胞の存在が決定される結合アッセイ。
【請求項３０】
前記細胞試料が、乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するとともに、ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体によって結合されることにより特徴づけられるＭＣＳＰ抗原性部位を発現する試料内の細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、
細胞試料を提供すること、
前記発現されたＭＣＳＰ抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記ＭＣＳＰ抗原性部位がＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を持つ抗体によって結合されることによって特徴づけられる、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供すること、
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料とを接触させること、ならびに
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を決定することを含み、
ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントによってコードされた単離モノクローナル抗体に対して特異的に結合するＭＣＳＰ抗原性部位を発現する前記細胞が前記結合によって単離され、前記細胞試料中での前記細胞の存在が確認される、細胞を単離またはスクリーニングするプロセス。
【請求項３２】
前記試料が、乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項３１のプロセス。
【請求項３３】
ほ乳類で、ヒト腫瘍を処置することによる延命、および／または疾患進行の遅延のための方法であって、
前記腫瘍は、寄託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するものであり、
前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で前記モノクローナル抗体を投与することで、疾患進行の遅延および／または延命をおこなう、延命および／または疾患進行の遅延のための方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞毒性部位に結合している請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である、請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を活性化させる請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存性細胞毒性をもたらす請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウス抗体である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項３３の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患の診断および処置、特に腫瘍細胞の細胞毒性のメディエーション（媒介）、最も詳しくは癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用（必要に応じて、細胞毒性応答を開始させるための手段として一種類以上の化学治療薬と併用して）に関する。本発明は、さらに、結合アッセイに関し、該結合アッセイは本発明のＣＤＭＡＢを利用する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）の同定は、ヒト転移性メラノーマ細胞株に対するモノクローナル抗体を開発した数人の研究者によって別個におこなわれた。いくつかの抗体が、メラノーマ細胞表面に結合した特異的抗体と反応することがわかった。これらの抗体が自由に開発され、標的抗原に対して数多くの名称（その全てはその後にＭＣＳＰであると判断された）がつけられることになった。したがって、ＭＣＳＰもまた、抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ヒト・メラノーマ・プロテオグリカン（ＨＭＰ）、メラノーマ結合プロテオグリカン抗原（ＭＰＧ）、およびメラノーマ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ｍｅｌ−ＣＳＰＧ）とも呼ばれており、さらに種々の特定抗体の抗原としても同定されており、そのいくつかを以下に述べる。ＭＣＳＰはまた、ラット・プロテオグリカンＭＧ２との相同性が８０％を上回ることから、その名称によっても呼ばれる。
【０００３】
ＭＣＳＰは、Ｎ−結合糖タンパク質（２５０ｋＤａ）とプロテオグリカン（＞４５０ｋＤａ）とからなる糖タンパク質−プロテオグリカン複合体である。コア糖タンパク質は、遊離糖タンパク質として、またはコンドロイチン硫酸の添加によって修飾されたものとして、メラノーマ細胞の表面上に存在する。ＭＣＳＰの分子クローニングによって、いくつかの構造的特徴が同定される。合計で１０個のシステイン（５つは、潜在的なジスフィルド結合）を含む３つの細胞外ドメイン、１５個の潜在的なＮ−結合グリコシル化部位、および１１個の潜在的なコンドロイチン硫酸結合部位が存在する。膜貫通セグメントは、単一のシステインを有するが、その残基の機能的優位性は証明されていない。細胞質ドメインは、プロテインキナーゼＣによるリン酸化の部位として働くと考えられる３つのスレオニン残基を有している。しかし、ＭＣＳＰのリン酸化については未だ示されていない。
【０００４】
ＭＣＳＰがメラノーマ癌の大部分で発現されることが示されており、また正常細胞および他の腫瘍型での分布は非常に限定されているともともと考えられていた。この結論に到った１つの初期の研究は、抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５を用いてＭＣＳＰの分布を測定するために、ホルムアルデヒドまたはメタノールによって固定された正常および腫瘍組織上での免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いた。この研究では、抗体Ｂ５が、試験したメラノーマ腫瘍２２例のうちの１７例、試験した星状細胞腫２例のうち２例、および試験した上皮性悪性腫瘍２３例のうち０例と反応することがわかった。試験した正常組織２２例のうち、Ｂ５は、皮膚ケラチノサイト、肺胞上皮、および血管内皮のみに結合することがわかった。
【０００５】
別の研究では、凍結組織切片を用いて、抗ＭＣＳＰ抗体９．２．２７によって定義されるＭＳＣＰの組織分布が調べられた。また、反応性は試験した全てのメラノーマ組織および細胞株で見出されたが、試験した６種類の癌腫のいずれでも反応性が見られなかった。試験した７例の胎児組織のうち、反応性は皮膚およびかすかではあるが大動脈のみで観察され、一方成人組織では、反応性は試験した組織１３例のうちの３例のみに見られた。
【０００６】
その後の研究では、抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５、９．２．２７、２２５．２８Ｓ、およびＡ０１２２（それらのすべてがＭＣＳＰの異なるエピトープを認識する）を用いてＭＣＳＰの分布が調べられた。この研究は、凍結組織に対しておこなわれた。抗ＭＣＳＰ抗体の全てが、以前はＭＣＳＰ陰性であると考えられた神経、間葉、および上皮起源の正常および悪性腫瘍に反応する類似の染色性パターンを持つことが判明した。具体的には、抗体Ｂ５は、試験した２４種類の器官の種々の上皮組織、結合組織、神経組織、および筋肉組織と反応し、さらに試験した３４種類の腫瘍のうち２８種類と反応した。著者は、それらの所見と以前の報告との違いは、改善され、かつ一貫性が高まったＩＨＣ技術を用いたことであり、注目すべき点は固定液の選択が重要であり、ＭＣＳＰ抗原の重要な特徴がＩＨＣに関係する処理工程に対する感受性にあるという結論におそらく導かれると説明した。
【０００７】
さらなる研究は、超微細構造レベルでＭＣＳＰを局所化させることについておこなわれた。電子顕微鏡検査法を用いた免疫局在性についての研究は、微小突起（細胞接触および細胞下層癒着に関与すると思われるメラノーマ細胞表面の微小ドメイン）にＭＣＳＰがほぼ排他的に局所化されることを証明した。
【０００８】
１９９６年にＭＣＳＰの分子クローニングがなされることで、ＭＣＳＰのｃＤＮＡプローブを使用して腫瘍細胞株および正常ヒト組織でのＭＣＳＰ発現のノーザンブロット解析が可能になった。試験した８種類の腫瘍細胞株のうち、ＭＣＳＰの発現はメラノーマ細胞株のみに観察された。ＭＣＳＰ発現は、試験した正常成人組織１６件および正常胎児組織４件のいずれにもみられなかった。ＭＣＳＰの組織局在化についての異なる研究で見出された矛盾は、この抗体の実際の発現パターンを明らかにすることまたは報告されている違いを説明する上で、あらたな研究が求められることを示している。
【０００９】
プロテオグリカンが細胞間相互作用および細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用をメディエートする（もたらす）ことが知られていたので、これらのプロセスでのＭＣＳＰの役割が調べられた。ＭＣＳＰがα４β１−インテグリン媒介接着およびメラノーマ細胞の伝播が知られており、またＭＣＳＰコア・タンパク質を介したシグナル伝達が、腫瘍浸潤および転移を調節することが可能なｐ１３０ｃａｓの動員およびリン酸化を誘導する。これらの結果の組み合わせは、ＭＣＳＰが機能してインテグリンの活性化と細胞骨格再配列に到る経路を刺激することの両方によって、メラノーマ細胞の接着を高めることが可能であることを示した。
【００１０】
ＭＣＳＰが、おそらくＭＣＳＰのコンドロイチン硫酸成分を介して、膜３型マトリックス・メタロプレテアーゼ（ＭＴ３−ＭＭＰ）に結合することもわかった。メラノーマでのＭＴ３−ＭＭＰ生体内発現が、成長する腫瘍の近傍でＥＣＭタンパク質の分解を促進して腫瘍が拡大し得る空間を提供することが示唆されている。したがって、ＭＴ３−ＭＭＰとＭＣＳＰとの結合がメラノーマ浸潤を促進する活性化ステップであると考えられる。
【００１１】
抗ＭＣＳＰ抗体を用いるいくつかの生体外定量がおこなわれ、腫瘍浸潤および転移に関連したプロセスでのＭＣＳＰの役割が検討された。アンカーレッジ非依存性成長におけるＭＣＳＰの役割が抗体９．２．２７を用いて評価された。９．２．２７を含む軟寒天で培養したメラノーマ細胞ではコロニー形成の特異的減少が６７〜７４パーセントであった。これらの所見は、ＭＣＳＰが細胞間相互作用に関係し、アンカーレッジ非依存性成長に関与することを示唆した。同一著者は、ウシの大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）の基底膜のＭ１４黒色腫細胞の癒着を測定する定量法で、９．２．２７によるＭＣＳＰ阻害の効果を検討した。９．２．２７処置の効果を対照モノクローナル抗体Ｗ６／３２（クラスＩ組織適合抗原に特異的）による処置と比較した。Ｍ１４対照細胞および抗体による事前処理がなされたＭ１４細胞をＢＡＥ細胞の基底膜上にプレーティングした。９．２．２７処置細胞で細胞粘着の２７パーセントが有意に抑制されることが観察され、一方でＷ６／３２処置細胞では有意な効果は見られなかった。９．２．２７による細胞前処理のより顕著な効果は、走査型電子顕微鏡を用いた超微細構造レベルで確認された細胞拡散の抑制であった。
【００１２】
メラノーマ細胞に対して開発され、かつＭＣＳＰに対する特異的認識について判断された抗体の多くを、生体外および生体内アッセイで試験することにより、それらの抗体の抗癌効果について測定した。
【００１３】
モノクローナル抗体９．２．２７は、ＭＣＳＰの中心的な糖タンパク質成分を認識するものであり、腫瘍抑制特性について調べた最初の抗体の１つであった。ブモル（Ｂｕｍｏｌ）等は、ヌードマウスで増殖するメラノーマ腫瘍の免疫療法について、９．２．２７および９．２．２７のジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）複合体を調べた。生体外細胞毒性アッセイは、最初に、［３５Ｓ］メチオニンのタンパク質取り込みによって示されるように、Ｍ２１ヒト・メラノーマ細胞でのタンパク質合成に対する９．２．２７および９．２．２７−ＤＴＡ複合体の効果を測定することによって、おこなった。９．２．２７−ＤＴＡ複合体は、Ｍ２１メラノーマ細胞でのタンパク質合成を著しく阻害したが、複合体を形成してないＤＴＡではよりいっそう高い効果が見られた。９．２．２７単独によってのみ最小の効果が見られた。９．２．２７および９．２．２７−ＤＴＡ複合体は、ヒト・メラノーマ腫瘍を持つヌードマウスでの抗腫瘍効果について調べられた。Ｍ２１腫瘍をマウスに皮下移植して３日間成長させた後、３日目およびその後は３日毎に、マウスを９．２．２７または９．２．２７−ＤＴＡ複合体で処置した。処置されたマウスの腫瘍容積を、無処置の対照マウスのものと比較した。１８日目（データの最終報告日）では、未処置の対照群と比較して、９．２．２７処置マウスの腫瘍成長が６４パーセント阻害されており、一方９．２．２７−ＤＴＡ複合体処置マウスの腫瘍成長が５２パーセント阻害された。この最初の研究では、著者は９．２．２７および９．２．２７−ＤＮＡ複合体がヌードマウスでＭ２１メラノーマ腫瘍の成長を抑制に対してはほぼ同程度の効果であると結論づけた。この最初の研究で９．２．２７処置による腫瘍成長の生体内抑制が報告される一方で、それに続くいくつかの研究（同一著者による研究を含む）は、裸の９．２．２７は生体内で何ら抗腫瘍効果を示さなかったことを証明した。まとめると、以下に概説されるように、ヒト腫瘍の処置に対する９．２．２７の使用の有用性を調べるために行われる実験は、癌細胞が９．２．２７によって標的にされたにもかかわらず、抗癌活性が裸の抗体による処置では生じなかったことを証明した。
【００１４】
第１相試験（９．２．２７免疫複合体による後の治療的研究を見越して大用量の９．２．２７を投与するように設計）が実施された。悪性メラノーマを有する患者８人（該患者の腫瘍はフローサイトメトリおよび／または免疫ペルオキシダーゼ染色により９．２．２７と反応した）に対して、毎週２回、１、１０、５０、１００、および２００ｍｇの段階投与で、静注による抗体の単回投与がおこなわれた。いずれの患者も有意な毒性が見られず、また９．２．２７が転移性黒色腫小節に局所化したが、臨床効果は観察されなかった。
【００１５】
より最近の研究では、９．２．２７と化学療法薬ドキソルビシン（ＤＸＲ）との複合体が形成され、この複合体は生体外および生体内でメラノーマ成長阻害について調べられた。ＤＸＲ−９．２．２７複合体で処置されたＭ２１細胞の成長阻害は、［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを用いて測定された。この複合体は、Ｍ２１標的赤血球の特異的用量依存性成長阻害を示し、またＭＣＳＰネガティブ対照細胞株に対して効果がないことを示した。９．２．２７単独での効果を調べる生体内アッセイは実施されなかった。生体内でのＤＸＲ−９．２．２７複合体を調べるために、Ｍ２１細胞を皮下注射し、８ないし１０日間にわたって腫瘍の確立を許した。１０日目に静注をおこない、その後、３日毎に３０日間にわたっておこなった。有意な腫瘍増殖の抑制は、ＤＸＲ−９．２．２７複合体により処置されたマウスでのみ見られた。ＤＸＲ処置単独と９．２．２７処置単独の両方で、腫瘍抑制が失敗し、９．２．２７とＤＸＲとの混合物では類似のネガティブ効果が見られた。
【００１６】
９．２．２７複合体の効果を調べるために別の研究が実施された。シュラッペ（Ｓｃｈｒａｐｐｅ）他は、９．２．２７と化学療法剤４−非アセチル・ビンブラスチン−３−カルボキシであるヒドラジド（ＤＡＶＬＢＨＹ）を活用させて、人間の神経膠腫に対するその効果を試験した。ヌードマウスに対してＵ８７ＭＧ（ヒト神経膠腫）を皮下注射し、該ヌードマウスを２日目、５日目、７日目、および９日目に処置がおこなわれた。腫瘍容積は、９．２．２７−ＤＡＶＬＢＨＹ複合体によって、最も効果的に減少した。ＰＢＳまたは９．２．２７単独のいずれかで処置された対照群は、成長の早い腫瘍を生じ、ＰＢＳ処置マウスに比べて９．２．２７処置マウスで腫瘍容量の減少が見られなかった。
【００１７】
ヒトＭ２１メラノーマ細胞ラインに対して抗体２２５．２８Ｓが作られ、最初にこの抗体はメラノーマ結合高分子量抗原と反応するものと記載された。この分子は、その後、ＭＣＳＰと同一の分子であることが示された。初期の研究では、２２５．２２８Ｓ、ＩｇＧ２ａのヒト・メラノーマ細胞に対する細胞毒性能が試験され、別の抗ＭＣＳＰ抗体（ＩｇＧ１であるクローン６５３．４０Ｓ）と比較された。２２５．２８Ｓおよび６５３．４０Ｓは、ＭＣＳＰ上の同一または空間的に近い抗原決定基を認識することが決定された。どの抗体も、生体外アッセイで補体と併用してメラノーマ細胞を溶解することができないことが判明した。両抗体とも、抗体依存性細胞媒介（ＡＤＣＣ）細胞毒性アッセイで標的メラノーマ細胞の溶解をもたらすことができ、この際、２２５．２８Ｓは６５３．４０Ｓよりも高い溶解活性を示した。しかし、メラノーマ細胞の溶解は、抗メラノーマ抗原抗体を用いた他のものにより報告されているものよりも著しく高いエフェクター／標的細胞比によってのみ得られた。著者は、ヒト補体と併用したこれらの抗体の細胞溶解活性の欠如とＡＤＣＣで生じる溶解に必要な高いエフェクター／標的細胞比とは、メラノーマ患者へのモノクローナル抗体の注射が腫瘍細胞の破壊を引き起こすようなものではないことを示すと結論した。著者は、これらの免疫療法的使用は、それらが放射性同位元素、化学療法剤、または毒剤として利用されるものを制限すべきであることを提案した。
【００１８】
裸の抗体２２５．２８Ｓは、該抗体が末期メラノーマを有する患者２人に対して１０ｍｇの用量で静脈内送達される第１相試験で、その治療上の可能性について調べられた。抗体の投与によるものと考えられる臨床上の副作用または毒作用が示されなかったにもかかわらず、ポジティブな治療反応も見られなかった。
【００１９】
抗体２２５．２８Ｓをプロチオニン（特に分裂細胞に有毒である低分子量のポリペプチド）と複合体化させ、ヒト・メラノーマ細胞株Ｃｏｌｏ３８に対して、その生体外毒性が検査された。Ｃｏｌｏ３８細胞を２２５．２８Ｓ−プロチオニン複合体と２４時間培養させることで３Ｈチミジンの取り込みが阻害されることがわかった。さらに、Ｃｏｌｏ３８細胞の生存度は、７日間にわたって上記複合体とともにインキュベートされた培地で急激に減少した。生体外毒性が観察されたにもかかわらず、２２５．２８Ｓ−プロチオニン処置を生き残った一部分のメラノーマ細胞が依然として存在した。著者は、毒剤の担体として腫瘍関連抗原を識別するために、メラノーマ疾患の免疫療法がモノクローナル抗体の混合に依存しなければならないことから、２２５．８Ｓ複合体のみが癌の処置に十分でないことを示した。２２５．２８Ｓ−プロチオニン複合体処置の効果の評価がヌードマウスでヒト・メラノーマの成長に対してなされた。Ｃｏｌｏ３８細胞がヌードマウスに皮下移植または腹膜内移植された。処置は、腹腔内移植されたマウスについて１日目、３日目、および５日目におこなわれ、また皮下移植されたマウスについて１日目、３日目、５日目、および２０日目になされた。生存は、すべてのマウスについてモニタされた。統計学的に有意な生存の延長は唯一、２２５．２８Ｓ−プロチオニン複合体で処置された腹腔内移植マウスで観察された。２２５．２８Ｓ単独、プロチオニン単独または２２５．２８Ｓとプロチオニンとの混合物は、腹腔内または皮下移植されたマウスの生存を高めなかった。腫瘍容積は皮下移植マウスについても記録され、２２５．２８Ｓ−プロチオニン複合体処置のみが有意に腫瘍容積を減らすことが判明した。２２５．２８Ｓ単独による処置は、結果として腫瘍容積の減少をもたらさなかった。
【００２０】
２２５．２８Ｓと化学療法薬メトトレキサート（ＭＴＸ）との複合体も形成され、腫瘍成長に対するその効果が生体内で調べられた。ヌードマウスに対してＭ２１ヒト・メラノーマ細胞の皮下接種をおこない、１日目、４日目、７日目、１０日目、および１４日目に処置をおこなった。ＭＴＸ−２２５．２８Ｓ複合体は、腫瘍成長を阻害した唯一の処置であった。２２５．２８Ｓ単独、ＭＴＸ単独、または２２５．２８ＳとＭＴＸのとの混合物は、腫瘍成長阻害に失敗した。
【００２１】
２２５．２８Ｓが、異種的性質（xenogenic nature）の試薬を投与することによるヒトでの潜在的毒性を調べるように設計された研究で使われた。転移性皮膚メラノーマの患者８５人に対して、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃで標識された完全な２２５．２８ＳまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが投与された。抗体注射量は１４ないし７５０μｇであった。臨床的な反応は何ら報告されなかったが、この研究が毒性学的目的で設計されたのでそれが必ずしも予想されるというわけでもなかった。
【００２２】
２２５．２８Ｓは、ＭＣＳＰの鏡像を持つ抗体ＭＦ１１−３０を含むマウス抗イディオタイプ・モノクローナル抗体を生成するのに用いられた。ＭＦ１１−３０は、同系および異種の系で抗ＭＣＳＰ抗体の発現を誘発することが示された。ＭＦ１１−３０の試験は、進行した悪性メラノーマを有する患者で毒性および反応を試験するために設計された用量を増大する２つの臨床試験でおこなわれた。両研究とも、抗体の投与による副作用はほとんどなく、治療は忍容性が高かった。第２の臨床試験では、力価が少なくとも１：８であり、かつ血清ＭＣＳＰのレベルになんら顕著な変化を示さない抗抗抗イディオタイプ抗体を生じた患者７人の平均生存率は、５５週（範囲１６〜９５）であり、これは平均生存率１９週（範囲８〜５７）である残りの患者１２人（力価１：４以下を有し、かつＭＣＳＰの血清レベルの増加を示す）よりも著しく高かった。
【００２３】
抗体７６３．７４もまた、メラノーマ細胞に対して生成され、ＭＣＳＰを認識する。抗体７６３．７４の生体外および生体内抗癌効果に関する報告は皆無ではあるが、この抗体もまたマウス抗イディオタイプ・モノクローナル抗体の生成に用いられた。これらの抗体のうちの一つであるＭＫ２−２３は、抗ＭＣＳＰ抗体７６３．７４によって定義される決定基の内部イメージを持つ。前臨床実験では、ＭＫ２−２３による免疫化は、同系宿主（ＢＡＬＢ／ｃマウス）および異種宿主（ウサギ）の両方で抗ＭＣＳＰ抗体の発現を誘発することが示された。ＭＫ２−２３の免疫原性は、担体タンパク質アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合してアジュバントとともに投与された場合に著しく高まった。臨床試験は、メラノーマを有する患者でＭＫ２−２３によって誘発される体液性応答を特徴づけるために、おこなわれた。ステージＩＶのメラノーマを有する患者２５人に対して、ＫＬＨに結合させてバチルス・カルメット・ゲラン（Bacillus Calmette Guerin）（ＢＣＧ）と混合したＭＫ２−２３を２ｍｇ、０日目、７日目、および２８日目に免疫化させた。注射の追加は、抗抗イディオタイプ・モノクローナル抗体の力価が低い場合におこなわれた。ＭＫ２−２３によって免疫化された患者の約６０パーセントが抗ＭＣＳＰ抗体を発現し、抗ＭＣＳＰ抗体の親和性が低かった。ＭＫ２−２３による免疫化後、抗ＭＣＳＰ抗体を発現した患者の生存期間は、そのようにしなかった患者よりも有意に長かった。抗ＭＣＳＰ抗体を発現した患者の生存期間の中央値は、５２週（範囲１９〜９３）であり、一方、検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体を持たない患者９人の生存期間の中央値は、１９週（範囲９〜４５）であった。抗ＭＣＳＰ抗体を発現した３人の患者は、それらの疾患の部分寛解を経験した。有望な結果がこの研究で得られたにもかかわらず、ＭＫ２−２３で免疫化される患者の４０パーセントは検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体に反応しなかった。また、部分寛解を成し遂げた患者３人はすべて最終的には疾患の再発を経験した。数セットのサプレッサー細胞を選択的に不活性化することによって腫瘍関連抗原に細胞性および体液性応答を高めることが報告されている低用量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）による患者の前処置によって、ＭＫ２−２３の免疫原性を増加させる試みがなされた。しかし、ＭＫ２−２３の免疫原性に対するＣＴＸによる前処理の効果は検出されなかった。
【００２４】
モノクローナル抗体４８．７はヒト転移性メラノーマ細胞株Ｍ  １７３３に対して発現され、その後にＭＣＳＰと決定される分子に対して反応することが報告された。４８．７は、ヒト・メラノーマに存在するトランスフェリン様細胞表面糖タンパク質ｐ９７に特異的であるマウス・モノクローナル抗体９６．５と組み合わせて第Ｉ相臨床試験で投与された。患者５人に対して、ｍＡｂ９６．５および４８．７の各々２ｍｇを１日目に投与、２日目に各々１０ｍｇを投与、ならびに３日目から１０日目まで各々２５ｍｇを投与した。処置は忍容性が高かったが、処置に対する臨床効果が見られず、疾患進行はすべての患者に起こった。これらの２つの抗体は、中枢神経系に対する転移性メラノーマを有する３人の患者がこれらの抗体のいずれの一つの放射性同位元素標識Ｆａｂフラグメントを用いた治療を受けた別個の臨床試験で調べられた。２人の患者は、脳内腫瘍への抗体の侵入を高めることを目的として、血液脳関門（ＢＢＢ）の浸透開口と連動して、４８．７の１３１Ｉ−標識Ｆａｂフラグメント５ｍｇの投与を受けた。浸透ＢＢＢ修飾は、腫瘍を持つ半球および脊髄液に対するＦａｂの送達を高めるが、腫瘍に対する抗体のはっきりした持続的な局在化は示されなかった。著者は、局在化の欠如が不十分な抗体用量に起因するのではないかと仮定した。
【００２５】
メルイミューン（Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ）は、２種類のマウス抗イディオタイプ抗体、すなわちメルイミューン（Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ）−１（Ｉ−Ｍｅｌ−１）とメルイミューン（Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ）−２（Ｉ−Ｍｅｌ−２）とのの二重製剤であり、該製剤はＭＣＳＰの別個のエピトープを模倣する。Ｉ−Ｍｅｌ−１は、ウサギで抗ＭＣＳＰ反応を誘発することが示された。Ｉ−Ｍｅｌ−１は抗イディオタイプ抗体ＭＦ１１−３０のサブクローンであり、該抗体は抗ＭＣＳＰ抗体２２５．２８（前述したように）に対して発現された。Ｉ−Ｍｅｌ−１は、ウサギで抗ＭＣＳＰ反応を誘発することが示された。Ｉ−Ｍｅｌ−２は抗ＭＣＳＰ抗体ＭＥＭ１３６に対して発現される抗イディオタイプ抗体であり、２２５．２８よりもＭＣＳＰ上で異なるエピトープに反応する。Ｉ−Ｍｅｌ−２は、ウサギで抗ＭＣＳＰ反応を誘発することも示された。Ｉ−Ｍｅｌ−１およびＩ−Ｍｅｌ−２の１：１組成物を含むメルイミューン（Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ）製剤の第Ｉ相試験は、転移性疾患の所見のないメラノーマが切除された患者２１人に対しておこなわれた。詳細な免疫応答解析は、一つの機関に登録されるこれらの患者のうちの１２人について報告された。患者は、０．２から４．０ｍｇ（各々０．１〜２．０ｍｇのＩ−Ｍｅｌ−１およびＩ−Ｍｅｌ−２）までの用量で、２つの処置スケジュールのうちの１つにもとづいてメルイミューン（Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ）を投与された。全ての患者は抗Ｉ−Ｍｅｌ−１および抗Ｉ−Ｍｅｌ−２抗体の両方を発現するとともに、１２人の患者のうちの１０人でＩ−Ｍｅｌ−２に対する抗体応答のピークがＩ−Ｍｅｌ−１よりも高かった。しかし、この研究は、ＭＣＳＰに対する特異的抗体の誘導を示すことができなかった。なぜなら、患者の血清はいずれも、ＭＣＳＰ発現Ｍｅｌ−２１細胞に対する放射性標識２２５．２８の結合またはＭｅｌ−２１細胞に対する放射性標識ＭＥＭ１３６のいずれも結合することができなかった。直接細胞結合もまた、患者血清中の抗ＭＣＳＰ抗体の存在対するアッセイで使用されたが、ＦＡＣＳベースのアッセイでＭ２１細胞に対する免疫後血清と比較した免疫前血清の結合における差はなかった。
【００２６】
Ｉ−Ｍｅｌ−２は別の臨床試験で試験された。この臨床試験では、転移性メラノーマを有する患者２６人は、２ｍｇのＩ−Ｍｅｌ−２と１００または２５０μｇのアジュバントＳＡＦ−ｍとを４週間にわたり、週２回筋注による送達をおこなう処置を受けた。抗ＭＣＳＰ抗体は、抑制放射性同位元素標識免疫測定法を使用して、患者２６人のうちの５人に検出された。検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体を有する患者５人のうち、患者１人は完全寛解を経験し、１人は安定病態を呈し、さらに３人は進行性疾患を呈した。完全寛解患者は、抗ＭＣＳＰ抗体で最も高い力価（１：１５００）を有した。
先行特許
【００２７】
米国特許第５２７０２０２号（特許文献１）（およびその関連特許：ＷＯ９２１６６４６Ａ１、ＥＰ０５７６５７０Ａ１）は、ＭＥＭ１３６に対する抗イディオタイプ抗体ＩＭｅｌｐｇ２（「ＩＭ３２］としても知られている）、ヒト・メラノーマ結合プロテオグリカンに対する抗体（「ＨＭＷ−ＭＡＡ」としても知られている）に対する抗体を教示している。ＩＭｅｌｐｇ２抗体は、ＭＥＭ１３６に対して特異性を示し、細胞がＭＰＧエピトープを発現する疾患の診断および処置に使用されることが示唆された。ＩＭｅｌｐｇ２が腫瘍細胞浸潤に対してあったにもかかわらず、生体外アッセイで測定されるように、それは試験される最も有効な抗体でもなく、またＡｂ３反応を示すことにもかかわらず生体内での抗腫瘍効果の徴候もなかった。
【００２８】
ヨーロッパ特許０３８０６０７Ｂ１（特許文献２）は、ＨＭＷ−ＭＡＡの不確定のエピトープに特異性があるＭａｂ２２５．２８に対する複数の抗イディオタイプ抗体を教示している。これらの抗体は、メラノーマに対するアクティブな免疫療法として有用である。ＭＦ１１−３０およびＩＭｅｌｐｇｌと２２５．２８に対するポリクローン性抗イディオタイプ抗体とが報告されており、これらはＭＦ１−３０を有する動物モデルで評価され、メラノーマ患者での臨床試験を受けたが、なんら支持するデータはなかった。ＭＦ１１−３０は、２２５．２８のイディオタイプ抗体を誘導することができる。ＩＭｅｌｐｇｌ細胞株は、ＢＭサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎｅ）によってＭＦ  １１−３０細胞株を処置し、マイコプラズマ汚染がないことを検査することで、誘導された。ＩＭｅｌｐｇｌに対する抗体がウサギ血清で誘導することができ、Ｃｏｌｏ３８メラノーマ細胞と結合することが示されるにもかかわらず、生体外または生体内で殺腫瘍性活性の徴候がなかった。
【００２９】
米国特許第４８７９２２５号（特許文献３）は、不溶免疫複合体からの抗体作製を教示する。この場合、Ｍａｂ９．２．２７（ＨＭＷ−ＭＡＡに特異的な抗体）に対するラット抗イディオタイプ抗体は、抗原として使用するためにプロテインＡ−セファロース上で９．２．２７を固定化することによって生じた。メラノーマ細胞に対する抗体は、セファロースに複合体を形成される種々の細胞または細胞可溶化物複合体を使用して生産された。メラノーマ細胞と結合したマウス・モノクローナル抗体は、正常Ｔ細胞またはＢ細胞ではないが、９．２．２７と比較された。さらに特徴付けするために９．２．２７に類似の特性を有するもの（すなわち、ＮＲ−ＭＬ−０２、ＮＲ−ＭＬ−０３、ＮＲ−ＭＬ−０４、ＮＲ−ＭＬ−０５、ＮＲ−ＭＬ−０６）を選択した。これらの抗体の各々は、捕獲抗体として９．２．２７を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイではポジティブであり、抗原源としてのＳＫ  ＭＥＬ−２８メラノーマ膜を溶解した。さらにこれらの抗体は、メラノーマ腫瘍細胞を認識するものとして、また平滑筋および内皮細胞と反応するものとして特徴づけられた。さらに６１種類の抗プロテオグリカン抗体は、ＮＲ−ＭＬ−０２／ＮＲ−ＭＬ−０４と同一の決定基として認識される１０種類のものと、ＮＲ−ＭＬ−０３またはＮＲ−ＭＬ−０５と同一の決定基として認識される３種類の抗体とを有し、４５種類は上記５種類の抗体によって測定されるものと同一のエピトープを認識しなかった。米国特許５０８４３９６号（特許文献４）は、これらの抗体は放射性同位元素標識され、メラノーマ異種移植片を有しているヌードマウスでの腫瘍取込みについて、９．２．２７と比較された。腫瘍取込みは、ＮＲ−ＭＬ−０５およびＮＲ−ＭＬ−０２で最も高く、次に９．２．２７、続いてＮＲ−ＭＬ−０２で高かった。これらの発明のどちらでも、これらの抗体が癌性疾患の全身腫瘍組織量の減少をもたらすとともに癌性疾患を有している哺乳類の生存も高めるということも示さなかった。
【００３０】
米国特許第５０３４２２３号（特許文献５）は、非複合化阻害抗体によって前処理された腫瘍関連抗原を持つ組織に対する複合抗体の送達を高める方法を教示している。ＨＭＷ−ＭＡＡ、９．２．２７、およびＮＲ−ＭＬ−０５に対する抗体とテクニチウム９９（Ｔｃ−９９）との複合体を形成し、非標識ＮＲ−２ＡＤ（たった１人の患者のＢ細胞性リンパ腫に対して特異的な抗イディオタイプを持つ抗体）の前投与後の臨床設定で投与された。本研究がＴｃ−９９をレポーター放射性同位元素（細胞毒性を呈しない）または放射性除去効果として用いるように設計されたことから、このプロセスの使用を通して抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体の取り込みが高まったにもかかわらず、抗腫瘍効果に関する証拠は何らなかった。
【００３１】
米国特許第５５８０７７４号（特許文献６）は、Ｍａｂ９．２．２７をコードする抗体遺伝子を用いたキメラ抗体の構造を教示している。キメラ抗体を用いた癌疾患の診断または処置に関する開示はなされていない。
【００３２】
米国特許第５４９３００９号（特許文献７）および米国特許第５７８００２９号（特許文献８）は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体７６３．７４に特異的なマウス抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３およびその複合体を教示している。ＭＫ２−２３は、７６３．７４に特異的に結合し、Ｃｏｌｏ３８メラノーマ細胞に結合する７６３．７４を抑制する。さらに、ＭＫ２−２３によって誘発されるＡｂ３は、ＨＭＷ−ＭＡＡと特異的に結合することができ、Ｃｏｌｏ  ３８メラノーマ細胞に対する７６３．７４の結合を拮抗阻害することができる。アクティブな免疫療法は、ＭＫ２−２３を有するＩＶ期メラノーマ患者での臨床試験で実施された。患者の８９パーセントにおいて、免疫後血清はＣｏｌｏ  ３８メラノーマ細胞に反応し、Ｃｏｌｏ３８細胞に、７６３．７４の結合を阻害したことから、Ａｂ３抗体の誘導が示唆された。患者１５人のうちの６人において、転移性病巣が小さくなったことが報告されたが、研究の詳細は明らかにされなかった。患者血清の抗体の特異性は、部分的に特徴づけられ、またＡｂ３抗体（それらが存在した程度まで）が、７６３．７４抗体には生来の抗腫瘍効果がなかったことから、観察された臨床効果のいずれかの原因となったかどうかは不明である。米国特許第５８６６１２４号（特許文献９）は、ＭＫ２−２３に由来する抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体（７６３．７４）に特異的なキメラ抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−ＣＨγｌとその誘導体とを教示している。
【００３３】
多くの発明（例えば米国特許第５０１７６９３号、米国特許第５７０７６０３号、米国特許第５８１７７７４号、米国特許第６２４８８７０号、米国特許第５１１２９５４号、米国特許第６２３８６６７号）は、ＨＭＷ−ＭＡＡに特異的な抗体と化合物との複合体を形成することを教示しているが、癌性疾患の処置でそれらの有用性を開示することはできない。重要なことに、これらの抗体は単独で抗癌治療として効果的であり、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を与えることは複合体に要求されていない。
これらの特許および特許出願は、ＭＣＳＰ抗原および関連抗体を同定するが、本発明の単離モノクローナル抗体または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示することができない。
【特許文献１】米国特許第５２７０２０２号
【特許文献２】ヨーロッパ特許０３８０６０７Ｂ１
【特許文献３】米国特許第４８７９２２５号
【特許文献４】米国特許５０８４３９６号
【特許文献５】米国特許第５０３４２２３号
【特許文献６】米国特許第５５８０７７４号
【特許文献７】米国特許第５４９３００９号
【特許文献８】米国特許第５７８００２９号
【特許文献９】米国特許第５８６６１２４号
【発明の開示】
【００３４】
発明の概要
本発明は、癌疾患の治療に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するための方法を対象とする「個々に合わせた患者特異的抗癌抗体（Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies）」と題された米国特許第６，１８０，３５７号を既に与えられている。この文書の目的にとって、用語「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とが互換性をもって使用可能であり、それらはハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）、免疫複合体、および必要に応じて、免疫グロブリン・フラグメントおよび該免疫グロブリン・フラグメントに由来する組換えタンパク質（例えばキメラおよびヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組換え免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）、および融合タンパク質）によって産生される完全な免疫グロブリンのことをいう。当該技術分野で、一部のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能に対する有意の効果を生ずることなくポリペプチド内で変化し得ることがよく認識されている。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核酸またはアミノ酸配列における修飾が一般に許容され得る。これらとして、限定されるものではないが、置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加が挙げられる。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢと標準化学療法的手段（例えば放射性核種）との複合体を形成することは、この発明の範囲内にあり、それによって上述の化学療法剤の使用に焦点が合わせられる。ＣＤＭＡＢと、毒素、細胞毒性成分、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞との複合体を形成することで、抗体複合体が形成される。
【００３５】
この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするようなハイブリドーマ細胞株を単離するための’３５７特許に教示された患者特異的抗癌抗体を利用する。これらの抗体を１つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能になる。この出願の文脈の中で、細胞致死（細胞毒性）または細胞成長阻害（細胞分裂抑制）特性を以下、細胞毒性という。これらの抗体は、癌の病期分類および診断の補助として使用することができ、また腫瘍転移の処置に使用することができる。
【００３６】
個々に合せられた抗癌処置は、患者管理方法に変化をもたらすことが期待される。有望な臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて積み上げられるということである。この試料から、既存の癌疾患修飾抗体のパネルをもとに腫瘍の類型分けができる。患者を従来通りに病気分類できるが、利用可能な抗体はさらに患者を病気分類する際に使用し得る。患者の処置は、既存の抗体を用いて直ちにおこなうことができ、さらに／あるいは腫瘍に特有の抗体のパネルを、本明細書中に概説される方法を使用して得ることもでき、あるいは本明細書中に開示される選別法に関連したファージディスプレイ・ライブラリを用いることにより得ることもできる。処置したものと同様のエピトープのいくつかを他の腫瘍が持ち得る可能性があることから、生じた抗体の全てを抗癌抗体のライブラリに加えることができる。この方法にもとづいて生成された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する任意の数の患者の癌疾患を処置する上で有用であると思われる。
【００３７】
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号のプロセスを用いることによって、またＳ．Ｎ．  １０／３４８，２３１に開示されているように、患者乳房腫瘍生検により得られた細胞でマウスの免疫化をおこなった後に、マウス・モノクローナル抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を得た。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原は、異なる組織に由来するヒト細胞株細胞表面上で発現した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７および卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の細胞障害効果の影響を受けやすかった。
【００３８】
培養のＭＣＦ−７およびＯＶＣＡＲ−３細胞に対する生体外での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２細胞毒性の結果は、マウスに移植された際（Ｓ．Ｎ．  １０／７６２，１２９で開示されるように）に、これらの癌細胞の方のその抗腫瘍活性によってさらに拡大した。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の妥当な予測手段と考えられる。
【００３９】
ヒト乳癌の予防生体内モデルにおいて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、腫瘍成長を妨げて、全身腫瘍組織量（Ｓ．Ｎ．  １０／７６２，１２９で開示されるように）を低下させた。５１日目（最終処置直後）では１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与群の平均腫瘍容積は、アイソタイプ対照の２０パーセントであった。モニタリングは、処置後２８０日間にわたって続けた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与群の４０パーセントは、移植後７．５ヵ月以上に生存し続けた。逆に言えば、アイソタイプ対照群は、処置後６．５ヵ月の後、死亡率が１００パーセントであった。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は生存を高め、ヒト乳癌の安定したモデルで、対照投与群と比較して全身腫瘍組織量を減少させた。
【００４０】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がヒト乳癌の複数のモデルで有効であったかどうかを決定するために、確立された乳癌モデルでＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）細胞に対するその抗腫瘍活性を測定した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、緩衝液対照と比較して腫瘍成長を２５パーセント減少させた。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、予防的乳癌異種移植モデルと同様に、確立された乳癌モデルで腫瘍成長を妨げた。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ−１１−２ｈあ、少なくとも２種類の乳癌モデルで抗腫瘍活性を示した。
【００４１】
ヒト乳癌モデルでの有益な効果に加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置も、予防的卵巣癌モデル（Ｓ．Ｎ．  １０／７６２，１２９で開示されるように）においてＯＶＣＡＲ−３細胞に対して抗腫瘍活性を呈した。このモデルでは、腫瘍進行の代用指標として体重を使用した。移植後８０日目（処置終了後１６日）に、投与群のマウスは、対照群の平均体重の８７．６パーセントを有していた（ｐ＝０．０１５）。したがって、ヒト卵巣癌の安定したモデルで緩衝液対照処置群と比較して腫瘍進行を遅延させたことから１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置は有効であった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌治療薬とする。
【００４２】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がヒト卵巣癌の一つ以上のモデルで有効だったかどうか決定するために、卵巣癌の確立したモデルのＥＳ−２＋ＳＥＡＰ細胞（ヒト胎盤分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）でトランスフェクションするＥＳ−２卵巣癌細胞）に対するその抗腫瘍活性は、決定された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、緩衝液対照に割に投与群でマウスの同齢集団で、生存を高めた。加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の中の１匹のマウスは、処置後に非常に減少した循環ＳＥＡＰレベルを示した。循環ＳＥＡＰレベルを全身腫瘍組織量の指標として用いることができる。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、予防的卵巣癌異種移植モデルと同様に、確立されたモデルで腫瘍成長を妨げることに効果的だった。加えて１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト卵巣癌の２つの異なるモデルで、抗腫瘍活性を示した。
【００４３】
薬剤標的として１１ＢＤ−２Ｅ１１−２エピトープを確認するために、冷凍正常ヒト組織の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の発現を測定した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によるＩＨＣ染色によって、重要臓器（例えば肝臓、腎臓、および心臓）の細胞を含む大部分の組織で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の発現が得られなかった。しかし、組織のほぼ全てで血管平滑筋線維の染色が見られた。上皮染色もまた、組織のいくつかで見られた。
【００４４】
乳癌患者での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原およびその有病率の局在化は、患者に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫療法の有益性および有効な臨床試験を設計する際に重要である。癌患者由来の乳癌腫瘍における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原発現に対処するために、個々の乳癌患者８人から得た組織試料（７つの追加試料がマイクロアレイ・スライドから完全に分離し、またはマイクロアレイ・スライド上の腫瘍を表すものではなかった）。本研究の結果は、組織試料の６２パーセントが１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原に関してポジティブに染色された。患者試料内での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の発現は、染色が悪性細胞に制限されることから、癌細胞に対して特異的に見えた。加えて、乳癌患者由来の正常組織試料３つうち１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって染色されたものは０であった（再び２つの追加試料は、マイクロアレイ・スライドから完全に分離した）。腫瘍が病期に基づいて、または癌進行の度合いに応じて分析される場合、腫瘍病期が高まるにつれポジティブ発現が高くなる傾向が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２にあった。しかし、その結果は試料サイズが小さい場合に限定された。
【００４５】
本明細書中に概説されるように、付加的な生化学データも１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識される抗原がＭＣＳＰであることを示す。このことは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈殿タンパク質がＭＣＳＰのラット・ホモログに対する抗体によって認識されること、また抗ＭＣＳＰ免疫沈殿タンパク質が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識されることを示す研究によって支持された。これらのＩＨＣ結果および生化学結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＳＣＰ抗原と結合したことを証明する。したがって、ＭＣＳＰ上に存在するユニークなエピトープのライゲーションを介して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が抗癌効果をもたらすことを示した。
【００４６】
全体として、このデータは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原が癌関連の抗原であって、ヒトで発現されて、病理学的に関連する癌標的であることを証明している。さらに、このデータもヒト癌組織に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を示しており、診断、治療予測、または予後であり得るアッセイに適切に該データを使用することができる。また、この抗原の細胞限局化は、大部分の非悪性細胞で抗原の発現が欠如していることから細胞の癌状態を表し、また、この知見によって、診断、治療予測、または予後であり得るアッセイに使用されるこの抗原、該抗原の遺伝子または誘導体、そのタンパク質あるいはその変異体の使用を可能にする。
【００４７】
多くの異なった抗ＭＣＳＰ抗体を開発して、多くの生体外および生体内系で試験した。前臨床モデルでは、再現されなかった１つの研究を除いて、裸の抗ＭＣＳＰ抗体は、いくつかの異なるメラノーマ・モデルと１つの神経膠腫モデルとで、腫瘍減少または生存の強化に効果がないことを示し、他の癌型については抗ＭＣＳＰ抗体による研究がなされなかった。ヒトにおける裸の抗ＭＣＳＰ抗体のすべての試験は、なんら陽性臨床転帰をもたらすに到らなかった。裸の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト乳癌マウス・モデルで生存を高めて全身腫瘍組織量を減少させることを示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、腫瘍進行も阻害するとともに、ヒト卵巣癌のマウス・モデルでの生存も高めた。抗ＭＣＳＰ抗体は多数の中毒または化学療法剤薬剤と複合体を形成し、これらの複合体をメラノーマのマウス・モデルで試験した場合に該複合体は生体内でポジティブな結果を示した。ヒトで抗ＭＣＳＰ複合体を試験した報告がなかったので、これらの複合体の安全性はわからない。しかし、モノクローナル抗体単独の送達は忍容性が高かく、なんらかの関連する毒性があるとしてもわずかであった。したがって、裸の抗ＭＣＳＰ抗体を有する癌患者の処置が結果として陽性臨床転帰になり得る場合、現在利用可能なものに対しては有益かつ改善されたものとなる。毒剤に対する結合に、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が抗癌活性を示すことは必要ではないことから、抗体−毒素複合体の投与と関連した特定の安全性に関する懸念は該当しない。多くの抗ＭＣＳＰ抗体を抗イディオタイプ抗体の生成にも用い、それらを動物およびヒトで試験した。小さい非盲検法で、抗イディオタイプ抗体を有する患者の免疫が結果として検出可能な抗ＭＣＳＰ免疫応答になった場合に、特異的な免疫応答を発現しなかった患者と比較して、これらの患者の生存期間の中央値の増加があった。挙げられた例では、陽性臨床効果を得るためにＭＣＳＰを標的化することは、抗イディオタイプ抗体の投与を介して生じることが可能である。このアプローチに関する問題は、抗イディオタイプ抗体で免疫化されたすべての患者が抗ＭＣＳＰ反応を発現するというわけではなかったということである。したがって、直接投与に応じて結果として陽性臨床転帰になり得る抗ＭＣＳＰ抗体利用の場合、このことは患者の自身の免疫応答に臨床的な利益を生じることに依存するという問題を解決する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２はＭＣＳＰを直接標的とする抗体であり、前臨床異種移植腫瘍モデルで抗癌効果を示し、該モデルは治療有効性の妥当な予測材料であると考えられる。
【００４８】
全てにおいて、この発明は治療薬の標的としての１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の使用を教示し、投与された場合に哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量（それによって遅延疾患進行）を低下させるとともに、処置された哺乳類の生存を延ばすことができる。この発明も、ＣＤＭＡＢ（１１ＢＤ−２Ｅ１１−２）およびその誘導体の使用することで、哺乳類で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を低下させ、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の生存を延長するためにその抗原を標的化すること教示する。さらにまた、この発明は、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の診断、治療予測、および予後に有用であり得る癌細胞での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の検出の使用も教示する。
【００４９】
患者が治療または転移発現の初期過程対して不応性である場合、腫瘍に特異的な抗体を生成するプロセスを再処置のために繰り返すことができる。さらにまた、抗癌抗体をその患者から得られる赤血球と結合させて転移の処置のために再注入することができる。転移癌に有効な処置はほとんどなく、転移は通常、死に至る転帰不良を予告するものである。しかし、転移癌は一般に血管化が十分なされており、赤血球による抗癌抗体の送達は腫瘍部位に抗体を濃縮させる効果を有し得る。転移前でさえ、ほとんどの癌細胞は宿主の血液供給にそれらの生存が依存しており、赤血球と複合体を形成した抗体は同様に原位置で腫瘍に対して効果的である。あるいは、抗体を他の血液原細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、およびナチュラルキラー細胞）と結合させてもよい。
【００５０】
抗体には５つのクラスがあり、各々がその重鎖によって与えられる機能に関連している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を介してもたらされると通常、考えられている。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１補体と結合することによって、ヒト補体を活性化させることができ、それによって腫瘍溶解をもたらし得る補体活性化の古典経路が活性化する。ヒト抗体に関して、最も有効な補体活性化抗体は一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞殺害をもたらすＦｃ受容体を持つ動員細胞毒性細胞に対して有効である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣをもたらす。
【００５１】
抗体媒介癌殺害の別の可能なメカニズムは、細胞膜およびその関連糖タンパク質または糖脂質にある種々の化学結合の加水分解を触媒する作用を有する抗体（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものが考えられる。
【００５２】
より広範に受け入れられている抗体媒介癌細胞殺害には、さらに２つの機序がある。第１は、癌細胞にある推定上の抗原に対して、からだが免疫応答を生ずるように誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、成長受容体を標的とし、該受容体の機能を妨げ、あるいは下方制御することでその機能を効果的に喪失させるために、抗体を使用することである。
【００５３】
制ガン剤の臨床上の有用性は、患者に対する許容可能なリスクのプロファイルのもとで薬がもとらす利益にもとづいている。癌治療では、生存は、通常、最も求められている有益性ではあるが、延命に加えていくつかの他の周知の利益がある。処置が生存に悪影響を与えないこれら他の利益として、症状緩和、有害事象に対する保護、再発または疾患を生じない生存期間の延長、および進行期間の延長が挙げられる。これらの基準は通常、受け入れられ、米食品医薬品局（ＦＤＡ）等の規制機関はこれらの有益性を生ずる薬を承認する（Hirschfeld et al. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143
2002）。これらの基準に加えて、この種の有益性の前兆となってもよい他の指標があることもよく認められる。一つには、米食品医薬局によって承諾される促進承認プロセスは、患者の利点をおそらく予測する代用物があると認める。年末（２００３）より、このプロセスの過程で承認される１６種類の薬があり、それらのうち４種類は完全承認（すなわち研究が代わりの指標によって予測される直接的な患者の利点を示す追跡調査）に移行した。充実性腫瘍で薬物効果を決定するための１つの重要な指標は、処置に対する反応を測定することによる全身腫瘍組織量の評価である（Therasse
et al. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000）。究極的には、ＲＥＣＩＳＴ基準にもとづく客観的な反応で示されるように、適当な対照群と比較して、全身腫瘍組織量に対して示された効果を持つ薬物は、患者に対して直接的な利益をもたらす傾向がある。前臨床設定では、全身腫瘍組織量は通常、評価および記録に対してよりいっそう直接的にである。前臨床研究が臨床設定に翻訳されることができるという点で、前臨床モデルで生存延長をもたらす薬物は、最大限予想される臨床上の有用性を持つ。臨床治療に対してポジティブな反応を生ずることに類似して、前臨床設定で全身腫瘍組織量を低下させる薬物は疾患に有意の直接的な影響を及ぼすことが可能である。生存の延長が制癌剤処置からの臨床転帰後に最も求められるにもかかわらず、臨床上の有用性を持つ他の有益性があり、疾患進行の遅れ、延命、またはその両方に相関することもある全身腫瘍組織量減少が直接的な有益性に到ることができ、また臨床上の影響もあることは、明らかである（Eckhardt et al. Developmental Therapeutics: Successes and Failures
of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th
Annual Meeting, 2003, pages 209-219）。
【００５４】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞と該ハイブリドーマ細胞株がコードしている対応の単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個人に由来する細胞から、癌細胞について毒性であると同時に、非癌細胞については相対的に非毒性である癌疾患修飾抗体を生産する方法を利用することである。
本発明の別の目的は、ＣＤＭＡＢとその抗原結合フラグメントとを教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＡＤＣＣを介して細胞毒性をもたらすＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、ＣＤＣを介して細胞毒性をもたらすＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞毒性の機能が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼす能力であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
【００５５】
この発明の他の目的および利点は、説明および例示の目的で、この発明の特定の実施形態が述べられる以下の説明から明らかになる。
（図面の簡単な説明）
特許またはファイルは、彩色して作成された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を有するこの特許または特許出願公報の写しを必要な手数料とともに要求に応じて特許庁から提供される。
図１。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２をプローブとしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）またはＯＶＣＡＲ−３（レーン２）膜のウエスタンブロット。膜タンパク質を還元条件下で分離した。分子量マーカーを右側に示す。
図２。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する１１ＢＤ−３Ｅ１１−２の結合に対する脱グリコシルの効果。脱グリコシル化緩衝液のみ(レーン１）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグルコサミノダーゼの組み合わせ（レーン２）、ＰＮＧアーゼ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼ（レーン３）の組み合わせ、シアリダーゼのみ（レーン４）、エンド−Ｏ−グリコシダーゼのみ（レーン５）、およびＰＮＧアーゼのみ（レーン６）でインキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜結合１１ＢＤ−２Ｅ１１−２。
図３。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウエスタンブロット（パネルＢ）。レーン１は分子量標準、レーン２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質、レーン３は１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物質、およびレーン４はアイソタイプ対照免疫沈降物質。
図４。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（パネルＡ）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３、パネルＢ）、抗ラットＮＧ２（ポリクローナル、パネルＣ）、正常
ウサギＩｇＧ（パネルＤ）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７、パネルＥ）、およびＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８、パネルＦ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン１：１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物、レーン２：ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）免疫沈降物、レーン３：抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、レーン４：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物、レーン５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１成分、およびレーン６：試料緩衝液のみ（ネガティブ対照）。
図５。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、アイソタイプ対照、または抗ＥＧＦＲ（いくつかの癌細胞株と非癌細胞とに対して特異的）の典型的なＦＡＣＳヒストグラム。
図６。凍結正常ヒト組織アレイ由来の心臓組織切片上で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプ対照抗体（Ｂ）によって得られた結合パターン（Ａ）を示す典型的な顕微鏡写真。心筋繊維に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の染色は見られない。倍率は２００倍。
図７。凍結正常ヒト組織アレイ由来の骨格筋組織切片上で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、抗アクチン（Ｂ）、およびアイソタイプ対照抗体（Ｃ）によって得られた結合パターン（Ａ）を示す典型的な顕微鏡写真。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、骨格筋を染色しなかったが、血管平滑筋の染色が見られた（矢印）。倍率は２００倍。
図８。乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）に対して結合した１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプ対照抗体（Ｂ）の典型的な顕微鏡写真。パネルＡの黒矢印は、腫瘍細胞を指し示している。倍率は２００倍。
図９。予防的なＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルでの腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを示す。
図１０。確立されたＥＳ−２異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照による処置前、処置中、および処置後の担癌マウスの生存。
図１１。確立されたＥＳ−２異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照による処置前、処置中、および処置後の担癌マウスのＳＥＡＰレベル。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
【実施例１】
【００５７】
ウエスタンブロットによる結合タンパク質の同定
抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識される抗原を同定するために、この抗原を発現する細胞膜をゲル電気泳動にかけ、ウエスタンブロットを用いてメンブランに移すことで、この抗体によって検出されたタンパク質の決定をおこなった。
【００５８】
１．膜標品
以前の研究で、乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２のＦＡＣＳによる結合が示された。以前の研究でも、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の有効性が示された。したがって、これらの２つの細胞株から膜標品を抗原の同定に用いた。細胞膜全体を、ＭＢ−２３１乳癌またはＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の密集培養から調製した。培地を細胞スタックから取り除き、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗った。細胞同士の解離を、プラットフォーム・シェーカー上で３７℃、２０分間、解離用緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）によっておこなった。細胞を４℃で１０分間、９００ｇで遠心した。遠心後、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、再び４℃で１０分間、９００ｇで遠心することで洗った。ペレットを−８０℃で貯蔵した。５０ｍｌあたり１錠のコンプリート・プレオテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，  Ｌａｖａｌ  ＱＣ）を含むホモジナイズ用緩衝液に、細胞１グラムあたり緩衝液３ｍｌの割合で、細胞ペレットを再懸濁させた。細胞を溶解させるために、氷上でポリトロン・ホモジナイザを用いて細胞懸濁液をホモゲナイズした。細胞ホモジネートを４℃で１０分間、１５，０００ｇで遠心し、核微粒子を取り除いた。上清を回収し、複数の試験管に分けた後、４℃で９０分、７５，６００ｇで遠心した。上清を試験管から注意深く取り除き、各々の膜ペレットを約５ｍｌのホモゲナイズ用緩衝液に再懸濁した。全ての試験管の再懸濁ペレットを１本の試験管にまとめ、４℃で９０分間、７５，６００ｇで遠心した。試験管から上清を注意深く取り除き、ペレットの重量を測定した。１パーセントのトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む緩衝液を、膜ペレット１グラムあたり緩衝液３ｍｌの割合で、ペレットに添加した。プラットフォーム・シェーカー上で、氷上１時間にわたり３００ｒｐｍで振とうさせることで、膜の可溶化をおこなった。膜溶液を７５，６００ｇで遠心することで、不溶性物質をペレット化した。可溶化膜タンパク質を含む懸濁液を試験から取り除き、タンパク質含有量を測定し、−８０℃で保存した。
【００５９】
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
膜タンパク質を、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。２０μｇの膜タンパク質を、１００ｍＭのＤＴＴを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、８パーセントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンにロードした。染色前分子量マーカー（Invitrogen, Burlington, ON）の試料を参照レーンで泳動した。電気泳動は１００Ｖで１０分間、その後、染色前分子量マーカーが十分な解像度で観察されるまで１５０Ｖでおこなった。エレクトロブロッティングを４０Ｖで１６時間おこなうことで、タンパク質をゲルからＰＶＤＦメンブラン（Millipore,
Billerica, MA）に移した。ゲルからメンブランへの染色前マーカーの完全な移動に注目することで、移動の評価をおこなった。移動後、０．５パーセントのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水中５パーセントのスキムミルク粉末で、２時間、メンブランをブロックした。メンブランをＴＢＳＴで１回洗った後、３パーセントのスキムミルク粉末を含むＴＢＳＴで希釈された５μｇ／ｍｌの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で、２時間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ジャクソン・イムノロジカルズ（Jackson Immunologicals）  （West Grove PA）から得た西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したメヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）とともに、メンブランをインキュベートした。インキュベーションの後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてＨＲＰ基質３，３’、５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ベクター・ラボラトリ（Vector
Laboratories, Burlington ON）の基質キット）とともにインキュベートした。
【００６０】
図１では、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は明らかに、分かれたＭＢ−２３１（レーン１）およびＯＶＣＡＲ−３（レーン２）膜タンパク質の３つの分子量領域に結合した。分子量（ＭＷ）標準との比較によれば、抗体はＭＷが約１５０、２４０、および２８０ｋＤａのタンパク質に結合する。さらなる研究はすべて、ＭＢ−２３１を用いておこなった。なぜなら、この細胞株の反応性が他のものよりも高かったからである。
【実施例２】
【００６１】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合抗原のグリコシル化の決定
抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識された抗原がグリコシル化したかを決定するために、ＭＢ−２３１膜を異なる組み合わせのＰＮＧアーゼＦ，エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグルコサミニダーゼとともにインキュベートした。膜をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ともに記載されたウエスタンブロッティングをおこなった。図２は、脱グリコシル化緩衝液のみ（レーン１）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグリコサミノダーゼの組み合わせ（レーン２）、ＰＮＧアーゼ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼの組み合わせ（レーン３）、シリアダーゼのみ（レーン４）、エンド−Ｏ−グリコシダーゼのみ（レーン５）、およびＰＮＧアーゼのみ（レーン６）でインキュベートしたＭＢ−２３１膜に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合の結果を示す。グリコシダーゼによるＭＢ−２３１膜の処置は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を排除するものではないが、タンパク質の分子量シフトが全てのレーンで観察され、このことは１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識された抗原が糖タンパク質であったことを示している。
【実施例３】
【００６２】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合抗原の同定
１．免疫沈降
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２に対する抗原の同定を、その抗体による可溶化膜糖タンパク質の免疫沈降を介して同種リガンドを単離することによっておこなった。１００μｌのプロテインＧダイナビーズ（Protein G Dynabeads）（Dynal Biotech, Lake Success NY）を１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で３回洗った。洗われたビーズに対して、１００μｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を含む総量１００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０を添加した。この混合物を回転混合しながら１時間インキュベートした。未結合の抗体を除去し、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２被覆ビーズを、０．１パーセントのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含む０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４で３回洗った。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２被覆ビーズを１ｍｌの０．２ＭトリエタノールアミンｐＨ８．２で２回洗った。０．０２Ｍのジメチルピメルイミデートを含む０．２ＭのトリエタノールアミンｐＨ８．２を添加し、３０分間にわたり回転混合しながらインキュベートすることで、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２をビーズに対して化学的に架橋させた。反応の停止は、１ｍｌの０．０５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．５で１５分間回転混合させながらビーズをインキュベートすることによっておこなった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを０．１パーセントのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含む１ｍｌの１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ（ＰＢＳ）で３回洗った。１１ＢＤ−２Ｅ−１１−２架橋ビーズを、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ３．０ｄｅ３分インキュベートすることで、前溶出をおこなった後、０．１パーセントのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含む１ＭＰＢＳで３回洗浄した。抗体架橋ビーズの第２のセットを、ネガティブＩｇＧ１アイソタイプ対照として使用する無関係の分子であるトリニトロフェノールに対するマウスＩｇＧ１抗体（BD
Biosciences, Oakville ONから得たクローン１０７．３）を用いて、上記と同様にして調製した。
【００６３】
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを、４℃で３０分間にわたり回転混合しながら、１パーセントのＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４中でインキュベートした。ビーズを０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４で３回洗浄した。ＭＢ−２３１細胞から得た５００μｇの全膜標品を、４℃で２．５時間にわたり回転混合しながら、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズとともにインキュベートした。免疫複合体結合ビーズを０．１パーセント・トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む１ｍｌの１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２８７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ（ＰＢＳ）で３回洗った。３０μｌの０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ３．０とともに３分間にわたり穏やかに混合しながらインキュベートすることで、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合タンパク質を１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズから溶出させた。溶出タンパク質に９μｌの１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ９を添加することによって、ｐＨを中性にした。中和された溶出タンパク質を−８０℃で保存した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを０．１パーセントのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含む３ｍｌのＰＢＳで洗った。ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）架橋ビーズを、ＭＢ−２３１膜タンパク質とともにインキュベートし、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ビーズと同様にして処理した。
【００６４】
ＭＢ−２３１膜タンパク質由来の２つのバッチの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質を上記のように生産して組み合わせた。同じことをＩｇＧ１（クローン１０７．３）アイソタイプ対照ビーズに対してもおこなった。この免疫沈降混合物の６２パーセント（６２０μｇのＭＢ−２３１膜から免疫沈降したタンパク質の量に相当）を４〜２０パーセント勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの単一レーンにロードした。１０７．３架橋ビーズから生じた物質を、２０μｇのＭＢ−２３１膜タンパク質と等量で隣接レーンにロードした。未染色の分子量マーカー（Invitrogen, Burlington, ON）または染色前分子量マーカーの試料を参照レーンに泳動させた。１００Ｖで１０分間、続いて１５０Ｖで６０分間にわたり電気泳動することで、試料が分離した。タンパク質を、ゲルをＳＹＰＲＯルビー（Ｒｕｂｙ）（商標）（BioRad, Mississauga, ON）中でインキュベートすることによって染色した。平行したウエスタンブロットで、免疫沈降混合物の１８パーセント（１８０μｇのＭＢ−２３１膜タンパク質から免疫沈降したタンパク質の量）と、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）架橋ビーズから生じた同一量の材料とを電気泳動によって分離した。４０Ｖで１６時間にわたりエレクトロブロッティングをおこなうことで、タンパク質をゲルからＰＶＤＦメンブラン（Millipore, Billerica, MA）へ移した。転写後、メンブランを５パーセントのスキムミルク粉末を含むＴＢＳＴで２時間処理することでブロックした。３パーセントのスキムミルク粉末を含むＴＢＳＴで希釈して得られた５μｇ／ｍｌの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって２時間にわたりプロービング処理した。ＴＢＳＴで３回希釈した後、メンブランをヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）結合ＨＲＰとともに１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてＨＲＰ基質ＴＭＢでインキュベーションした。
【００６５】
図３は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降したタンパク質から得られるゲルとウエスタンブロットとを示す。ゲル（パネルＡ）上で、レーン１は分子量標準を表し、レーン２はＭＢ−２３１膜タンパク質を表す。ＭＷ  ２４０および２８０ｋＤａの２つの異なったバンドは、１０７．３免疫沈降材料を含むレーン（レーン４）には存在しない１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降材料を含むレーン（レーン３）に、見られた。対応するウエスタンブロット（パネルＢ）上で、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ＭＷ  ２４０および２８０ｋＤａ（レーン３）の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質と強く反応する。ウエスタンブロット上で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２も、１５０ｋＤａにある１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質の別のバンドと強く反応する（このバンドは染色ゲル上では検出されなかった）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性プロフィールは、ＭＢ−２３１の全膜（レーン２）で見られるものとそれと類似していた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性が、ＩｇＧｌアイソタイプ対照（クローン１０７．３；レーン４）によって免疫沈降するタンパク質になかったことから、免疫沈降タンパク質に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合は特異的であり、汚染タンパク質の存在に起因したものではないことが示された。
【００６６】
２．質量分析
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降する２４０および２８０ｋＤａのタンパク質に対応しているゲルの領域（図３、パネルＡ、レーン３）を滅菌されたメスを使用して切り出した。次に、これらのゲル・スライスを用いて、ＭＡＬＤＩ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用する質量分析によるタンパク質の同定をおこなった。
【００６７】
プロゲスト（ＰｒｏＧｅｓｔ）ワークステーション上で、試料に対してトリプシンによるタンパク質分解消化をおこない、結果として得られる消化上清の一部分をＭＡＬＤＩ／ＭＳ分析に使用した。ジップチップス（ＺｉｐＴｉｐｓ）によるロボット操作によって、スポッティングをおこなった（ＰｒｏＭＳ）。６０パーセントのアセトニトリル、０．２パーセントのＴＦＡ中で調製されたマトリックス（α−シアノ４−ヒドロキシ桂皮酸）によりＣ１８材料からペプチドが溶出した。ＭＡＬＤＩ／ＭＳデータをボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）ＤＥ−ＳＴＲ機器（Applied Biosystems, Foster City CA）上で獲得し、ペプチド質量フィンガープリント検出のために、観察されたｍ／ｚ値をプロファンド（ＰｒｏＦｏｕｎｄ）（プロテオメトリックス・ソフトウェア・パッケージ）に入力した。プロファンド（ＰｒｏＦｏｕｎｄ）は、ＭＣＢＩｎｒデータベースの局所的に格納されたコピーを問い合わせた。消化上清の付加的な部分を、流速２００ｎｌ／分で７５μｍＣ１８カラムを用いて、マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）Ｑ−Ｔｏｆ２上でナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、分析した。ＭＡＳＣＯＴの局所コピーを用いてＭＳ／ＭＳデータの検索をおこなった。
ＭＡＬＤＩ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって同定されたタンパク質を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2007530457.tif 000020
【００６９】
３．確認
推定上の抗原の確認を、既知の抗ＭＣＳＰ抗体が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降するタンパク質と反応するかどうか、あるいはその逆であるかどうかを決定することによっておこなった。免疫沈降物の調製を、マウス抗ＭＣＳＰモノクローナル抗体９．２．２７（ＩｇＧ２ａ）（Chemicon, Temecula CA）およびマウスＩｇＧ２ａ抗体（クローンＧ１５５−１７８、BD Biosciences,
Oakville ONから入手）をトリニトロフェノール（無関係な分子であり、ネガティブなＩｇＧ２ａアイソタイプ対照として使用）に添加すること以外は、既に記載した通りにおこなった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物、ＩｇＧｌアイソタイプ対照（クローン１０７．３）免疫沈降物、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物、およびＭＢ−２３１膜を、複製された６枚の１０パーセント・ゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。既に述べたようにして電気泳動およびウエスタンブロッティングを実施した。膜を、３パーセントのスキムミルク粉末を含むＴＢＳＴで希釈した５μｇ／ｍｌの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８）、ウサギ・ポリクローナル抗ラットＮＧ２抗体（ＭＣＳＰはラットＮＧ２のヒト・ホモログ；Chemicon, Temecula CA）、および正常ウサギＩｇＧ（Sigma, Saint Louis MO）で、２．５時間にわたってインキュベートした。図４は、記載どおりのウエスタンブロットの結果を示す。図４（パネルＡ）は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物（レーン１）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）目値器沈降物（レーン２）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物（レーン３）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物（レーン４）、ＭＢ−２３１膜（レーン５）、および試料緩衝液のみ（ネガティブ対照）（レーン６）に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を示す。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ＭＢ−２３１膜および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物の両方で、約１５０、２４０、および２８０ｋＤａの同じ３つのバンドを認識した。抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物では上側の２８０ｋＤａのみが認識された。アイソタイプ対照免疫沈降物のレーンのいずれも反応が見られなかったことから、免疫沈降物に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２および９．２．２７の両方に特異的に結合して免疫沈降したタンパク質によるものであることが示された。平行したＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）によってプロービングされたブロット（パネルＢ）では、いっさいのレーンで反応性は観察されなかったことから、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によってプロービングされたブロットで観察される反応性が特異的であることが示された。パネルＣは、平行ブロットに対するウサギ・ポリクローナル抗ラットＮＧ２抗体の結合を示す。抗ＮＧ２は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物（レーン１）にある約１５０および２４０ｋＤａの２本のバンドに結合し、一方他のレーンのいずれかのこの分子量範囲のタンパク質に対しては結合しない。平行したブロット（パネルＤ）では、正常ラビットＩｇＧは、ＩｇＧ２ａ免疫沈降物（レーン４）およびＭＢ−２３１膜（レーン５）の両方でかすかな非特異的反応性を見せる。したがって、パネルＣ上のこれらのレーンの同一の反応性（ウサギ抗ＭＧ２でプロービング）を非特異的であると考えなければならない。平行ブロット（パネルＥ）��は、ブロット（パネルＥ）抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）は、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物レーン（レーン３、矢印で示す）の１つのバンドに対して、かなりかすかな結合のみを示す。このバンドはＭＢ−２３１膜（レーン５）では見られず、９．２．２７がこの抗原に対して低い親和性を有し、免疫沈降した試料内のように濃縮された形態で存在する場合にのみ反応性を示すものと考えられる。ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８）でプロービングされた最終的な平行ブロット（パネルＦ）では、いっさいのレーンで何ら反応性は観察されなかったことから、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）で観察された反応性が特異的なものであることが示された。これらの結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＣＳＰのラット・ホモログによって認識され、しかも抗ＭＣＳＰ免疫沈降タンパク質がＩＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識されたことを示している。
【００７０】
公知の市販抗体を用いた確認と組み合わせた質量分析による同定は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗原がＭＣＳＰであることを示している。このことはまた、ＭＣＳＰのコア・タンパク質が糖タンパク質であることから、実施例２の脱グリコシル化実験とも一致する。
【実施例４】
【００７１】
Ｓ．Ｎ．１０／７４３，４５１に概説されているように、ハイブリドーマ細胞株１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ブダペスト条約にもとづいて、２００３年１１月１１日に寄託番号ＰＴＡ−５６４３としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas,
VA 20110-2209）に寄託されている。ＣＦＲ１．８０８によれば、寄託者は寄託材料の公衆による利用可能性に課せられた制限が特許の付与により最終的に取り払われることを保証する。
【００７２】
抗体産生
回収および再播種を週に２回行いながらＣＬ−１０００フラスコ（BD Biosciences, Oakville ON）で培養することで、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体の産生をおこなった。プロテインＧセファロース４ファスト・フロー（Protein
G Sepharose 4 Fast Flow）（Amersham Biosciences, Baie d’Urfe, QC）による標準的な抗体精製法にもとづいて、抗体の精製をおこなった。
【００７３】
既にＳ．Ｎ．１０／３４８，２３１に記載されているように、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、多数のポジティブ（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、eBioscience, San Diego, CA）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、カッパ、１０マイクログラム／ｍｌ、Inter
Medico, Markham, ON）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５マイクログラム／ｍｌ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，  Ｈｏｒｎｂｙ，  ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００マイクロモル、Sigma,
Oakville, ON）、ＮａＮ３（０．１％、Sigma, Oakville, ON））およびネガティブ（１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、BD
Biosciences, Oakville ON）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、BD Biosciences,
Oakville ON）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ）、Ｊ６０６（抗フラクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ）、ＩｇＧ緩衝液（２％））対照の両方と細胞毒性アッセイで比較した（表２）。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ  １１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ  Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３（ＯＶＣＡＲ））、前立腺癌（ＰＣ−３）、および非癌（ＣＣＤ  ２７ｓｋ、Ｈｓ８８８  Ｌｕ）細胞株を試験した（全て、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手）。生死細胞毒性アッセイ（Live/Dead
cytotoxicity assay）をモレキュラー・プローブス（Molecular Probes）  （Eugene,OR））から得た。以下に概説した変更を加えて、このアッセイを製造元の指示に従っておこなった。予め定めた適当な密度でのアッセイに先立って、細胞を播種した。２日後、精製抗体および対照を培地に希釈し、続いて１００マイクロリットルを細胞プレートに移し、５パーセントＣＯ２インキュベータで５日間インキュベートした。次に、プレートを逆さまにして拭き取ることで空にした。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温ＤＰＢＳをマルチ・チャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、３回たたき、逆さまにして拭き取ることによって空にした。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むＤＰＢＳで希釈した５０マイクロリットルの蛍光カルセイン染料を各ウエルに添加し、５パーセントＣＯ２インキュベータ中で３７℃、３０分間インキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）１０ＨＴＳ７０００蛍光プレート・リーダーで読み取り、データをマイクロソフト・エクセル（Microsoft
Excel）で分析し、さらに結果を表１にまとめた。４回の実験の平均値を表すデータを三重反復で試験し、以下のような様式で定性的に表す。４／４の実験が閾値細胞毒性よりも高い場合を（＋＋＋）、３／４の実験が閾値細胞毒性よりも高い場合を（＋＋）、２／４の実験が閾値細胞毒性よりも高い場合を（＋）とした。表１にあるマークされていない細胞は、不整合性を示し、または閾値細胞毒性よりも低い効果を示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は乳癌および卵巣癌で特異的細胞毒性を示し、正常細胞には影響を及ぼさなかった。細胞毒性を持つ化学物質は該物質の予想される細胞毒性を誘導し、その一方で比較のために含まれる多くの他の抗体もまた予想通りに作用して生物学的細胞アッセイに制限を与えた。全体として１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体が２つの癌細胞型に対して細胞毒性活性を持つことが示された。すべての癌細胞型が影響を受けやすいというわけではないことから、抗体の活性は選択的であった。さらにまた、抗体が非癌細胞型に対して細胞毒性を生じないことから、該抗体は機能性特異性を示し、このことは治療的な状況下で重要な要素である。
【００７４】
【表２】
2007530457.tif 000021
【００７５】
上記した癌および正常細胞株プラス以下の追加の卵巣癌細胞株（Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−Ｓ、Ｃ−１４、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、ＯＣＣ−Ｉ、ＯＶＣＡ−４２９  、およびＥＳ−２＋ＳＥＡＰ）に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合をフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって評価した。最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋なし）で洗浄することで、ＦＡＣＳ用の細胞を調製した。次に、細胞解離緩衝液（Invitrogen, Burlington, ON）を用いて、３７℃の細胞培養プレートから細胞を取り除いた。遠心および回収後、細胞をＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、２または２５パーセントの胎児牛血清（ＦＢＳ）を含む４℃のダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）燐酸緩衝生理食塩水（洗浄培地）に再懸濁し、計数して適当な細胞密度に等分し、遠心して細胞をペレットにし、さらに１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または対照抗体（アイソタイプ対照または抗ＥＧＦＲ）を含む２０μｇ／ｍｌの染色培地（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、±２パーセントＦＢＳを含むＤＰＢＳ）に氷上３０分、再懸濁した。アレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８結合二次抗体を添加する前に、細胞を洗浄培地で１回洗った。次に、アレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８結合二次抗体を染色培地に２０ないし３０分添加した。次に、細胞を最後に洗浄し、１μｇ／ｍｌのプロピジウムヨウ化物または１．５パーセントのパラホルムアルデヒドを含む染色培地に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリによる獲得を、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェア（BD Biosciences, Oakville ON）を用いてＦＡＣスキャン上で流すことで評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器上で電圧および振幅利得を調整することで設定した。３つの蛍光チャンネル（ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３）のための検出器を、精製アイソタイプ対照抗体とそれに続いてアレクサ・フルーア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８結合二次抗体によって染色した細胞を流すことで、細胞が約１ないし５単位の蛍光強度に中央値がくるようにして調節した。生細胞は、ＦＳＣのゲーティングおよびヨウ化プロピジウム排除（使用した場合）によって獲得した。各々の試料について、分析のために約１０，０００個の生細胞を獲得し、結果を表３および表４に示した。表３および表４は、アイソタイプ対照を上回る平均蛍光強度倍率増加平均を表にしたものであり、定性的に、５未満の場合（−）、５ないし５０の場合（＋）、５０ないし１００の場合（＋＋）、１００を上回る場合（＋＋＋）とし、括弧の中を染色された細胞の割合とした。
【００７６】
【表３】
2007530457.tif 000022
【００７７】
【表４】
2007530457.tif 000023
【００７８】
１１ＢＤ−２Ｅ−１１−２抗体の典型的なヒストグラムを図５に合わせた。１１ＢＤ−２Ｅ−１１−２は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（表３）およびＥＳ−２＋ＳＥＡＰを含むいくつかの卵巣腫瘍細胞（表４）に結合する特異的腫瘍を提示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合が非癌細胞にもあったが、その結合は細胞毒性を生じなかった。このことは、結合がその同族の抗原の抗体連結の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、自明でない発見であったという更なる証拠であった。このことは、異なる細胞での抗体連結の状況がまさに抗体結合よりむしろ細胞毒性で決定的なことを示唆した。
【実施例５】
【００７９】
正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究を実施してヒトでの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の特徴付けを実施した。ＩＨＣ最適化研究を、さらなる実験のための条件を決定するために事前におこなった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２モノクローナル抗体を上記のように生産および精製した。
【００８０】
２０種類の正常ヒト組織に対する抗体の結合を、凍結ヒト正常組織アレイ（Clinomics, Watervliet, NY）を用いておこなった。スライドを冷（−２０℃）アセトンで１０分間にわたり後固定した後、室温に戻した。スライドを４℃冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回、各回２分間にわたり濯ぎ、その後に３パーセントの過酸化水素で１０分間洗うことで内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。次に、スライドをＰＢＳで５分間、３回濯いだ吐、ユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ブロッキング溶液（Dako,
Toronto, Ontario）で室温、５分間インキュベートした。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、抗ヒト筋肉アクチン（クローンＨＨＦ３５、Dako,
Toronto, Ontario）、またはアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織では存在も誘導もされない酵素である黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）グルコースオキシダーゼに特異的；Dako,
Toronto, Ontario）を抗体希釈緩衝液（Dako, Toronto, Ontario）で希釈して、その作用濃度（２μｇ／ｍｌである抗アクチンを除いて、各抗体５μｇ／ｍｌ）とし、室温で１時間、一晩中インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回、各２分ずつ洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたままのＨＲＰ結合二次抗体（Dako,
Toronto, Ontario）にっよって（室温で３０分間）、検出／視覚化した。このステップの後、スライドをＰＢＳで３回、各２分ずつ洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色用のクロモゲン基質溶液であるＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン・テトラヒドララクロリド、Dako,
Toronto, Ontario）を添加して室温で１０分間、呈色反応を発現させた。水道水でスライドを洗うことで、クロモゲン反応を停止させた。マイヤーのヘマトキシリン（Meyer’s
Hematoxylin）（Sigma Diagnostics, Oakville, ON）で対比染色させた後、スライドを段階化したエタノール（９５〜１００％）で脱水し、キシレンで汚れを落とした。マウンティング培地（Dako
Faramount, Toronto, Ontario）を用いることで、スライドにカバースリップを載せた。アキシオバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００（Zeiss
Canada, Toronto, ON）を用いてスライドの顕微鏡観察をおこない、さらにノーザン・エクリップス・イメージング・ソフトウェア（Northern
Eclipse Imaging Software））を用いてデジタル画像を得て保存した。結果の読み取り、採点、および解釈は病理学者がおこなった。
【００８１】
表５は、一連の正常ヒト組織の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色の結果をまとめたものを示す。表によれば、組織染色には主要なカテゴリーが２つあった。１群の組織は、完全にネガティブであった。これらの組織には、正常な甲状腺、気管支、および左心室心筋が含まれた（図６）。第２の群の組織として、組織切片ではポジティブに染色された組織が含まれるが、血管および／または上皮の平滑筋繊維に限られていた（図７）。これらの結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２に対する抗原は正常組織で広範囲に発現されるものではなく、しかもその抗体がヒトでは限られた数の組織に対してのみ結合することを示唆した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の正常ヒト組織染色は、抗ＭＣＳＰ抗体であるＢ５に関して既に報告されている。Ｂ５は、皮膚ケラチノサイト、肺肺胞上皮、および血管内皮と結合することが既に示されている。
【００８２】
【表５−１】
2007530457.tif 000024
【００８３】
【表５−２】
2007530457.tif 000025
【実施例６】
【００８４】
ヒト乳癌腫瘍組織染色
ＩＨＣ研究を実施して、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原とヒト乳癌との癌関連性について判断した。比較はアクチン（ポジティブ対照）と、ほ乳類組織には存在せず、また誘導されない酵素である黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）グルコース・オキシダーゼ（ネガティブ対照）に対しておこなった。１５人の乳癌患者に由来する乳癌組織と乳癌患者の非腫瘍性胸部組織に由来する５つの試料とを使用した（Clinomics, Watervliet, NY））。以下の情報、すなわち、年齢、性別、および診断を各々の患者について得た。実施例５のＩＨＣに関する手順に従った。
【００８５】
表６は、乳癌組織群の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体染色の結合概要を提供する。各群は、個々の患者１５人から得た腫瘍試料を含んだ。全体として、試験した患者８人（組織試料のうちの７つが完全に分離または表されなかった）のうちの６２％が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原に対してポジティブであった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２に関しても、乳癌患者由来の試料から得た正常胸部組織３つ（再び組織試料の２つが完全に分離した）のうち０個がポジティブであった（図８）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原に関しては、腫瘍病期が高くなるにしたがってポジティブ発現が大きくなる傾向は見られなかった。しかし、この結果は、試料サイズが小さいことにより制限された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色は、癌細胞に特有のものであった（図８）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２に由来する染色パターンは、患者試料において、抗体は悪性細胞に対しての特異性が高いことから、魅力的な薬物性標的となる。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の乳癌腫瘍組織染色は、抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５について既に報告されているものと類似している。Ｂ５は、乳癌腫瘍組織の６０パーセントと結合することが既に示されている。
【００８６】
【表６−１】
2007530457.tif 000026
【００８７】
【表６−２】
2007530457.tif 000027
【実施例７】
【００８８】
生体内ＭＤＡ−ＭＢ−４６８定着腫瘍実験
図９に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの襟首に、２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットルの食塩水を皮下注射により移植した。腫瘍成長を毎週、カリパーで測定した。同種の大部分が腫瘍容積１００ｍｍ３に達した時、無作為に２つの処置群に各々５ないし６匹のマウスを分け入れた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照を腹膜内投与した。２．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤によってストック濃度から希釈した後、３００マイクロリットルの容量で、１０ｍｇ／ｋｇ／用量を腹膜内投与した。次に、抗体を、移植後６６日後まで同一様式で合計１０用量を１週あたり３回投与した。腫瘍成長を、本研究の期間、カリパーで約７日目毎に、本研究の期間中、または個々の動物がＣＣＡＣエンド・ポイントに達するまで、測定した。動物の体重を本研究中、記録した。本研究終了後、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死した。
【００８９】
無作為に分ける際に、各群の平均腫瘍容積および標準偏差は、同程度だった。統計学的な体重の差は群間にみられなかった。これは、いつわりなく無作為化がなされたことを示している。図９に示すように、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、３週処置期間の終わりに緩衝液対照と比較して、腫瘍成長を２５パーセントまで抑制した（ｐ＝０．５２）。これが有意差でなかったにもかかわらず、緩衝液対照と比較して、腫瘍容積が減少する傾向は本研究の全体を通じて観察された。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立した乳癌モデルで有効性を示した。
【実施例８】
【００９０】
生体内ＥＳ−２＋ＳＥＡＰ定着腫瘍実験
図１０および図１１に関して、６〜８週間目の雌の胸腺欠損ヌードマウスに対して、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するために安定してトランスフェクションさせた１０００万のＥＳ−２＋ＳＥＡＰヒト卵巣癌細胞を腹膜内移植した。１０００万個の卵巣癌細胞を、５００マイクロリットルの無血清α−ＭＥＭに再懸濁した。７日目に３匹のマウスを犠牲にすることで、腫瘍成長の確認をおこなった。７日目での腫瘍成長の確認後、８匹のマウスを２つの処置群の各々にランダムに分けた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照を、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、および２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤でストック濃度を希釈した後、２５０マイクロリットル量で、１０ｍｇ／ｋｇ／用量で腹膜内に投与した。次に、抗体を５用量で１日あたり１回投与し、続いて１日おきに１回、さらに５用量を投与することで、合計１０用量投与した。全身腫瘍組織量を、循環ＳＥＡＰレベルを測定することで外挿されるだけでなく、本研究の期間中あるいは個々の動物がＣＣＡＣエンド・ポイントを達するまで、剖検の際に視覚的に評価した。本研究の期間中、動物の体重を記録した。研究終了後、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインしたがって安楽死させた。
【００９１】
無作為に分ける際に、循環血漿ＳＥＡＰレベル（全身腫瘍組織量を表す）を分析した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２と緩衝液対照処置群との間に、平均ＳＥＡＰレベルの差はみられなかった。しかし、群内で、可変腫瘍テイク・レート（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）があった。図１０に示すように、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は処置群の同齢集団で生存を改善した。図１１に示されるように、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置を受けた１匹の動物は、循環ＳＥＡＰの量をほとんど無視できるレベルまで減少させた。移植後約６０日まで、低レベルの循環SEAPが続いた。全体で、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が多数のヒト癌モデルで有益性（対照処置と比較して生存が改善され、かつ全身腫瘍組織量が減少）を発生したこれらの結果は、ヒトを含む哺乳類で、癌治療のための抗体の薬理学および製薬的利点を示唆する。
【００９２】
証拠の優越性は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＳＣＰに存在しているエピトープの連結を通して抗癌効果をもとらすことを示している。この発明の目的のために、上記エピトープは、ハイブリドーマ細胞株１１ＢＤ−２Ｅ−１１−２によってコードされたモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、またはその抗原結合複合体に結合する能力によって特徴づけられる「ＭＳＣＰ抗原性部位」として定義される。実施例３で、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞等の発現細胞から同族抗原を免疫沈降させるのに用いることができる。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体を、限定されるものではないがＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって説明される技術を用いて、該抗体に特異的に結合するＭＳＣＰ抗原性部位を発現する細胞および／または組織の検出に用いることができる。
【００９３】
したがって、免疫沈降１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原は、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを用いたそのような細胞または組織に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を阻害することができることを示すことができた。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体と同様に、他の抗ＭＳＣＰ抗体を用いてＭＳＣＰ抗原の他の形態の免疫沈降および単離をおこなうことができ、またこの抗原を用いて、同一種類のアッセイにより抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害させることができる。
【００９４】
この明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを表す。全ての特許および刊行物が、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個々に援用されるのと同程度に、本明細書中に援用される。
本発明の特定の形態が例示される一方で、本明細書に記載および示された構成要素の特定の形態または構成に限定されるものではない。
種々の変更を本発明の範囲から逸脱することなく行うことが可能であり、また本発明は明細書に示され、かつ記載されるものに限定されるものではないことを理解すべきである。当業者は、本発明が、目的を実施して上記した目標および利点をもともと内在しているものと同様に得ることにかなり適していることを容易に理解する。本明細書中に述べられる任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手法、および技術は、現在のところ好ましい実施形態を表わしており、典型的なことを意図しており、範囲に対する制限を意図しない。その中での変化および他の用途は、本発明の精神の範囲内で含まれて、かつ添付の請求の範囲によって定義される当業者に思い出される。本発明が特異的な好ましい実施形態と関連して述べられたクレームされた発明はそのような特異的な実施形態に過度に制限されてはなないことを理解すべきである。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための上記様式の種々の修飾は、以下の請求の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２をプローブとしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）またはＯＶＣＡＲ−３（レーン２）膜のウエスタンブロット。膜タンパク質を還元条件下で分離した。分子量マーカーを右側に示す。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する１１ＢＤ−３Ｅ１１−２の結合に対する脱グリコシルの効果。脱グリコシル化緩衝液のみ(レーン１）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグルコサミノダーゼの組み合わせ（レーン２）、ＰＮＧアーゼ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼ（レーン３）の組み合わせ、シアリダーゼのみ（レーン４）、エンド−Ｏ−グリコシダーゼのみ（レーン５）、およびＰＮＧアーゼのみ（レーン６）でインキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜結合１１ＢＤ−２Ｅ１１−２。
【図３】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウエスタンブロット（パネルＢ）。レーン１は分子量標準、レーン２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質、レーン３は１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物質、およびレーン４はアイソタイプ対照免疫沈降物質。
【図４】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（パネルＡ）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３、パネルＢ）、抗ラットＮＧ２（ポリクローナル、パネルＣ）、正常ウサギＩｇＧ（パネルＤ）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７、パネルＥ）、およびＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８、パネルＦ）をプローブとしたタンパク質のウエスタンブロット。レーン１：１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物、レーン２：ＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン１０７．３）免疫沈降物、レーン３：抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、レーン４：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物、レーン５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１成分、およびレーン６：試料緩衝液のみ（ネガティブ対照）。
【図５】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、アイソタイプ対照、または抗ＥＧＦＲ（いくつかの癌細胞株と非癌細胞とに対して特異的）の典型的なＦＡＣＳヒストグラム。
【図６】凍結正常ヒト組織アレイ由来の心臓組織切片上で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプ対照抗体（Ｂ）によって得られた結合パターン（Ａ）を示す典型的な顕微鏡写真。心筋繊維に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の染色は見られない。倍率は２００倍。
【図７】凍結正常ヒト組織アレイ由来の骨格筋組織切片上で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、抗アクチン（Ｂ）、およびアイソタイプ対照抗体（Ｃ）によって得られた結合パターン（Ａ）を示す典型的な顕微鏡写真。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、骨格筋を染色しなかったが、血管平滑筋の染色が見られた（矢印）。倍率は２００倍。
【図８】乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）に対して結合した１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプ対照抗体（Ｂ）の典型的な顕微鏡写真。パネルＡの黒矢印は、腫瘍細胞を指し示している。倍率は２００倍。
【図９】予防的なＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルでの腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ−１１−２または緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを示す。
【図１０】確立されたＥＳ−２異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照による処置前、処置中、および処置後の担癌マウスの生存。
【図１１】確立されたＥＳ−２異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液対照による処置前、処置中、および処置後の担癌マウスのＳＥＡＰレベル。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図５】
2007530457.tif 000028
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2007530457.tif 000029
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
2007530457.tif 000030
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１１】
2007530457.tif 000031
【国際調査報告】
2007530457.tif 000032
2007530457.tif 000033
2007530457.tif 000034