(57)【要約】  本発明は、−  イオンチャンネルを含む試料を提供； および−  イオンチャンネルの活性の指標としての測定パラメーターの値を測定；の段階を含む、測定パラメーターの値の測定が約１０℃以下の温度で実施される点で特徴づけられる、イオンチャンネルの活性を調べるための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
−イオンチャンネルを含む試料の提供； および
−イオンチャンネルの活性の指標としての測定パラメーターの値の測定；
の段階を含む、
測定パラメーターの値の測定が約１０℃以下の温度で実施される点で特徴づけられる、イオンチャンネルの活性を調べるための方法。
【請求項２】
測定パラメーターの値の測定が、約５℃以下、特に約２℃以下の温度で実施される点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定パラメーターの値の測定が、約１０℃ないし−４℃、特に約５℃ないし−４℃、より好ましくは約５℃ないし０℃、さらにより好ましくは約２℃ないし０℃の温度で実施される点で特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料が、イオンチャンネルを有する一つ以上の細胞または細胞小器官、特にヒトまたは動物細胞または細胞小器官を含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料が、イオンチャンネルを有する一つ以上の小胞を含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料が、膜結合イオンチャンネル、特に、細胞、細胞小器官、小胞の膜に埋め込まれた、または人工膜に埋め込まれたイオンチャンネルを含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
測定パラメーターが、膜電位、好ましく細胞、細胞小器官または小胞の膜電位、または前記膜電位の指標である点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
測定パラメーターがイオン濃度またはその指標である点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
測定パラメーターが、細胞外、細胞内、小胞外および／または小胞内イオン濃度またはその指標である点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
測定パラメーターの値が、イオンチャンネルの活性に影響する可能性のある被験物質の添加の前、間、および／または後に測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
伝達物質依存性イオンチャンネルの活性が調べられる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
電位感受性イオンチャンネルの活性が調べられる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
カリウムチャンネル、塩化物チャンネル、ナトリウムチャンネルまたはカルシウムチャンネルの活性が調べられる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
イオン濃度および／または膜電位の指標の測定が、蛍光法、放射能法または原子吸光分析によって実施される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）カルボシアニン誘導体、特にチア−、インド−、またはオキサ−カルボシアニンまたはカルボシアニンのヨウ化物誘導体、（ｉｉ）ローダミン色素、（ｉｉｉ）オキソノール色素、（ｉｖ）メロシアニン５４０、または（ｖ）スチリル色素の光学反応が膜電位の尺度の役割を果たす点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
電位感受性蛍光色素、好ましくはａＤｉＢＡＣ色素、より好ましくは色素Ｄｉｂａｃ4（３）の蛍光放出が膜電位の尺度の役割を果たす点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ルビジウムの、特に非放射性ルビジウムのイオン濃度が、イオンチャンネルの活性の指標として測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
イオン濃度、特にカルシウムのイオン濃度が、キレート剤を用いて測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
いくつかの測定パラメーターの値が測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
医薬品として活性な物質についての研究における、特に候補のまたは確立された医薬活性物質の中処理量または高処理量スクリーニング、特に潜在的に活性な医薬物質の同定または、候補のまたは確立された医薬活性物質の副作用の測定における使用のための、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
農業研究における、特にたとえば殺虫剤といった農薬に関する研究における使用のための、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記請求項のいずれかに記載の方法のコンダクタンスについての、電位感受性またはイオン感受性指示薬の使用。
【請求項２３】
イオン感受性指示薬がカルシウム指示薬、特にフルオ−カルシウム指示薬、フラ指示薬、インド指示薬、カルシウムグリーン（登録商標）、またはオレゴングリーン（登録商標）であることを特徴とする請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
イオン感受性指示薬がナトリウムまたはカリウム指示薬、好ましくは蛍光ナトリウムまたはカリウム指示薬、特にＳＢＦＩ、ＰＢＦＩ、ナトリウムグリーンＮａ+指示薬、コロナグリーンＮａ+指示薬、またはコロナレッドＮａ+指示薬であることを特徴とする請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
電位感受性指示薬がカルボシアニン誘導体、特にインド−、チア−、またはオキサ−カルボシアニンまたはカルボシアニンのヨウ化物誘導体；ローダミン色素；オキソノール色素；メロシアニン５４０；またはスチリル色素であることを特徴とする請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
オキソノール色素がビス−イソキサゾロンオキソノール色素またはビス−バルビツール酸オキソノール（ＤｉＢＡＣ）色素、特にＤｉＢＡＣ4（３）、ＤｉＳＢＡＣ2（３）またはＤｉＢＡＣ4（５）であることを特徴とする請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
スチリル色素がＡＮＥＰ（アミノナフチルエテニルピリジニウム）色素、特にジ−４−ＡＮＥＰＰＳ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＳ、ジ−２−ＡＮＥＰＥＱ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＱ、ジ−１２−ＡＮＥＰＰＱ、ジ−１−ＡＮＥＰＩＡ、またはジアルキルアミノフェニルポリエニルピリジニウム色素（ＲＨ色素）、特にＲＨ４１４、ＲＨ４２１、ＲＨ７９５またはＲＨ２３７であることを特徴とする請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１から２１のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのためのキレート剤の使用。
【請求項２９】
請求項１から２１のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのための、ルビジウム、特に非放射性ルビジウムの使用。
【請求項３０】
請求項１から２１のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのための、原子吸光分析装置、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダーの使用。
【請求項３１】
請求項２２から２７のいずれかに記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬、請求項２８に記載のキレート剤、および／または請求項２９に記載のルビジウムを用いる、請求項３０の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオンチャンネルの活性を調べるための方法に関する。
【０００２】
生細胞の膜は、細胞および組織の完全性および活性に非常に重要であるさまざまな機能を果たす。細胞内容の境界設定および調節、物質の交換およびシグナルの伝達が、そのような機能の例である。荷電した分子および無機イオン（たとえばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+およびＣｌ(イオン）は単純な拡散によって脂質二重層を通り膜を横切ることはできず、膜の特異的輸送系を必要とする。特に、そのような輸送系はイオンチャンネルを含み、イオンチャンネルのさまざまなものが、特にさまざまな臨床像に対しての非常に大きい重要性のために、特に生化学的および電気生理的性質に関して非常に良く特徴づけられている。そのようなイオンチャンネルは選択的に開閉できるため、イオンは常に通過することはできない。各イオンの正味の流量は、各イオンについての浸透性、イオンの濃度勾配、および膜の両側の間の電位差といった因子によって決定される。一般的に、電位の変化に反応するイオンチャンネルの種類（電位依存性イオンチャンネル）は、特異的なメッセンジャー、いわゆる伝達物質に反応するものと区別される。さらに、イオンポンプは、エネルギーの消費を伴って電気化学勾配に逆らって能動的イオン輸送を与えることが知られている。この方法で、細胞内と細胞外の空間の間のイオン濃度の特徴的な差が生成または維持される。ひとつの重要な例は、エネルギー源としてＡＴＰの消費を伴うナトリウムおよびカリウムの共役輸送を可能にするいわゆるナトリウム−カリウムポンプである。
【０００３】
薬剤を用いてイオンチャンネルの活性に選択的に影響を与えることによって治療されるさまざまな臨床像が知られている。これらは特に、抗不整脈剤、すなわち、心不整脈の治療のための薬剤を含み、それは電気生理的作用機構に従って異なる分類にさらに分けられる。このように、たとえば、カルシウム拮抗剤ベラパミルはカルシウムチャンネルの遮断を通じて作用し、一方、アミオダロンおよびソタロールといったカリウム拮抗剤のメンバーは、カリウムチャンネルを遮断することによって活動電位の持続時間の選択的延長を引き起こす。イオンチャンネルを活性化または遮断することによって影響されうる他の臨床像は、たとえば、多数のＣＮＳ疾患（たとえばてんかん、疼痛、脳卒中、偏頭痛）、自己免疫疾患、がんまたは糖尿病を含む。
【０００４】
医薬品として活性な物質についての研究の範囲内で、そのようなイオンチャンネルに対して医薬品として活性である可能性のある物質の影響を正確に監視できる試験方法があることが望ましい。これは、一方で、作用機構がイオンチャンネルの選択的影響に基づく物質の開発において、および他方で、副作用、すなわち、医薬候補によるイオンチャンネル活性の望ましくない影響の評価において、重要である。
【０００５】
生細胞の膜電位は、細胞内および細胞外ナトリウム、カリウムおよび塩化物イオン濃度によって主に決定される。たとえば、カリウムチャンネルの遮断が生細胞の静止膜電位に及ぼす影響を調べる場合、膜を通るカリウムについての伝導率は基本的に、膜電位に影響するゴールドマン・ホジキン・カッツ式に従って変化する。細胞は、特に、膜を通る他のイオンについての伝導率を変化させて、カリウムチャンネル遮断が膜電位に及ぼす正味の影響を低減または防ぎさえすることによってこの変化に対応しうる。これは、細胞中の、イオンを能動的に輸送するポンプ系の活性化を介して行うことができる。
【０００６】
現在、ある試験法で、候補のまたは公知の薬理的に活性な物質の影響下にある生細胞の膜電位を測定する場合、測定された電位値が、記載された対抗制御機構のために偏る危険性がある。この偏りは、シグナル対ノイズ比が不利に高い場合に膜電位の影響が検出できない可能性があるほど高くなりうる。
【０００７】
したがって、上記の干渉を最小化する、イオンチャンネルの活性を調べるための試験法を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
この目的は、独立請求項１の特性を有する方法によって達成される。請求項１に従属する他の請求項は、本発明の好ましい実施形態に関する。他の請求項は、本発明に記載の方法を実施するための具体的な手段の使用を対象とする。
【０００９】
本発明は、
−  イオンチャンネルを含む試料を提供；および
−  イオンチャンネルの活性の指標としての測定パラメーターの値を設定；
の段階を含む、測定パラメーターの値の設定が通常の室温よりも有意に低い温度、特に約１０℃以下で実施される点で特徴づけられる、イオンチャンネルの活性を調べるための方法に関する。
【００１０】
本発明は、温度を低下させることによって、上述のポンプ系の活性化により膜電位に影響を与える可能性を細胞から奪うことが可能であるという認識に基づく。従来技術で示される、たとえば、カリウムチャンネル遮断剤の評価のための試験法は、典型的には、体温すなわち３７℃にて、または室温にて実施される。温度を低下させることによって、上述のポンプ系の活性化により膜電位に影響を与える可能性が細胞から奪われるならば（またはそのような可能性が少なくとも有意に低下するならば）、細胞は、３７℃にてまたは室温にて反応できるようには、カリウムまたはナトリウムチャンネルを遮断することによって膜電位の変化に効果的に反応できない。
【００１１】
本発明によると、測定パラメーターの測定を、約１０℃以下、特に約５℃以下の温度で実施することが好ましい。約２℃以下の温度が特に好ましい。温度下限は好ましくは０℃である。試験すべき試料（たとえば細胞試料）は典型的には等張緩衝溶液に含まれるため、原理的には、０℃よりわずかに下、典型的には−２℃または−４℃までで測定を実施することもまた可能である。
【００１２】
典型的には、測定は、イオンチャンネルを含む細胞を利用して実施する。そのような細胞は、野生型細胞でよく、または試験中のイオンチャンネルを過剰発現している遺伝子組み換え細胞でもよい。しかし、本発明に記載の測定を、組織についてまたはミトコンドリアといった細胞小器官について実施することもまた可能である。別の一実施形態では、目的のイオンチャンネルを含む膜画分または小胞を調製すること、および本発明に記載の測定をそのような調製物について実施することもまた可能である。膜画分および小胞は、細胞分画の分野で公知である標準的方法に従って、典型的には、細胞の遠心分離から得られた細胞沈澱の、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中での溶解によって、調製されうる。溶解物を次いで典型的には再び遠心分離し細片および小器官を沈澱する。結果として生じる上清を、典型的には遠心して膜を回収する。その後、結果として生じる沈澱を適当な緩衝液中に再懸濁して、本発明に記載の測定を実施する。必要に応じて、均一なサイズを有する小胞を、短時間の超音波処理を経て得ることができる。別の選択肢として、本発明に記載の測定を、人工膜に埋め込まれたイオンチャンネルについて実施できる。
【００１３】
本発明に記載の試験すべきイオンチャンネルは、典型的には、細胞の原形質膜、細胞小器官の膜、小胞膜または人工膜といった膜に結合している。典型的には、ヒトまたは動物細胞および細胞小器官がそのまま用いられ、または小胞または膜画分がそのような細胞および細胞小器官から調製される。本発明に教示される通り、そのようなイオンチャンネルは、室温または体温より低い温度にて、イオンチャンネルの活性の指標としての測定パラメーターの値を測定することによって調べられる。好ましくは、測定パラメーターは、細胞、細胞小器官、小胞または人工膜の膜電位、またはその指標である。別の一実施形態では、測定パラメーターはイオン濃度またはその指標でありうる。カリウム、ナトリウム、塩化物および／またはカルシウムといったイオンの濃度を調べることができる。好ましくは、測定パラメーターは、上述のイオンの細胞外および／または細胞内イオン濃度、またはその指標である。加えて、ルビジウム検定、特に非放射性Ｒｂ+流束検定は、新薬発見および開発においてカリウムおよび非選択的陽イオンチャンネルの分析のために製薬工業で広い用途を見出している。ルビジウムは、カリウムチャンネルについての理想的なトレーサーである。ルビジウムはカリウムと同じサイズおよび同じ電荷を有し、およびカリウムチャンネルを透過可能である。ルビジウムは生体系に存在しないため、好ましい検出標的である。従って、ルビジウムは実験設定に残存バックグラウンドノイズを加えない。
【００１４】
特に、測定パラメーターの値を、試験中のイオンチャンネルの活性に影響する（可能性のある）被験物質の添加の前、間、および／または後に設定することが好ましい。特に、伝達物質依存性イオンチャンネルの活性を調べることができる。しかし、電位感受性イオンチャンネルの活性を設定することもまた可能である。これは、特に、カリウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、塩化物チャンネルまたはカルシウムチャンネルの活性でありうる。
【００１５】
前記イオン濃度または膜電位の指標の設定は、蛍光法、放射能法または原子吸光分析によって実施されうる。
【００１６】
膜電位またはイオン濃度を測定するためには、イオン感受性または電位感受性色素、キレート剤およびルビジウムを含むがそれらに限定されない、多数の異なる方法を用いることができる。
【００１７】
たとえば、電位感受性蛍光色素、特に色素Ｄｉｂａｃ4（３）の蛍光放出は、下記により詳細に示す通り、膜電位の指標の役割を果たしうる。しかし、ルビジウム（交換イオンとして）の、特に非放射性ルビジウムのイオン濃度を測定することもまた好ましい可能性がある。さらに、たとえばカルシウムのイオン濃度を、キレート剤を用いて測定しうる。
【００１８】
膜電位の測定は、本発明によると低温で実施すべきであるが、特に、それ自体が公知である蛍光検定によって、市販の蛍光リーダー（たとえば、モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＦＬＩＰＲ）、共焦点蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー装置を用いて実施しうる。典型的には、潜在的に感受性である蛍光色素、たとえば市販の分布色素 ビス（１，３−ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール（Ｄｉｂａｃ4（３））を用いることができる。Ｄｉｂａｃ4（３）はビスオキソノール型の色素であり、細胞質ゾル中でのその分布は膜が脱分極した際に増加する。この過程は、蛍光強度の増大を伴う。従って、たとえば電位依存性カリウムチャンネルの遮断のために、その色素が細胞の静止膜電位の脱分極に際して細胞に入る場合、蛍光活性の上昇が検出できる。加えて、このオキソノール誘導体の量子収量は、低温によって有利となる。従って、シグナル強度の随伴増大は、細胞ポンプ系の上記の阻害に加えて、さらに改善されたシグナル対ノイズ比を生じうる。
【００１９】
別の長所は、読み取るべきシグナルの安定性に関する。試験が３７℃または室温にて実施される場合、チャンネル遮断剤（カリウムチャンネル遮断剤のような）の細胞への添加によって最初に生じた蛍光シグナル（たとえば、Ｄｉｂａｃ4（３）蛍光）は、特に、内因性イオンポンプの活性によって、短い一過性の上昇後に最初の状態へ回復されうる。このことは、イオンチャンネルに対する物質の作用を測定するための時間枠が狭いことを意味し、そのため、被験物質の添加後に非常に短い時間枠内（典型的には２分未満）にオンライン測定を行うべきであり、このことは測定装置に高度な要求を与える。試験が低温で実施される場合、最初に生じたシグナルのそのような低下は観察されないか、またははるかに低い程度でしか見られない。このことは、調べるべきイオンチャンネルに対する物質の作用の測定を、数時間インキュベート後にも行うことができるという利点を有する。このことは今度は、多数の物質のスクリーニングを顕著に円滑化し、および従って処理量を高める。一過性シグナルの安定な読み出しパラメーターへの変換のためだけで、多数のイオンチャンネルがスクリーニング可能となる。
【００２０】
上述のＤｉｂａｃ4（３）色素以外に、市販の（たとえば供給元モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から）ＤｉＳＢＡＣ2（３）またはＤｉＢＡＣ4（５）といった、ビス−バルビツール酸オキソノール型の他の色素を使用できる。また、ビス−イソキサゾロンオキソノール色素（たとえばオキソノールＶおよびオキソノールＶＩ）といった他のオキソノール色素も使用しうる。他の電位感受性指示薬は、カルボシアニン誘導体（たとえばインド−、チア−、およびオキサ−カルボシアニンおよび、カルボシアニンのヨウ化物誘導体）、ローダミン色素、メロシアニン５４０およびスチリル色素を含む。スチリル色素の中でも、すべて市販されているジ−４−ＡＮＥＰＰＳ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＳ、ジ−２−ＡＮＥＰＥＱ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＱ、ジ−１２−ＡＮＥＰＰＱまたはジ−１−ＡＮＥＰＩＡ（モレキュラー・プローブズ社）といったアミノナフチルエテニルピリジニウム型の色素を用いうる。また、ＲＨ４１４、ＲＨ４２１、ＲＨ７９５またはＲＨ２３７といった、この供給元または他の供給元のＲＨ−色素を用いることができる。イオン感受性指示薬としては、よく知られたおよび市販のカルシウム指示薬（たとえばフルオ−カルシウム指示薬、ベンゾフラニル誘導体のようなフラ指示薬、インドール誘導体のようなインド指示薬、ＣＡＳ番号１８６５０１−２８−０のようなカルシウムグリーン（登録商標）またはＣＡＳ番号１７２６４６−１９−４のようなオレゴングリーン（登録商標）；モレキュラー・プローブズ社）またはナトリウム／カリウム指示薬（たとえばＳＢＦＩ、ＰＢＦＩ、ナトリウムグリーンＮａ+指示薬、コロナグリーンＮａ+指示薬、コロナレッドＮａ+指示薬；モレキュラー・プローブズ社）を使用しうる。この供給元および他の供給元はまた、イオンチャンネル実験のコンダクタンスのためのキレート剤も供給する。さらに、下記に示す実験に用いられたＦＬＩＰＲ膜電位検定キット（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いることもできる。
【００２１】
下記において本発明をさまざまな実験例で説明する。
【実施例】
【００２２】
実施例１：ＨＥＲＧチャンネル
電位依存性カリウムチャンネルＨＥＲＧを安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞をトリプシン処理しおよび遠心分離した。その後、細胞を４μＭ ＤｉＢＡＣ4（３）（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を含む１ｘ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．３、１４０ｍＭ Ｎａ+、２ｍＭ Ｋ+、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2）に取り、および２×１０4／５０μｌ／ウェルにて、底面が透明で下記の物質を予め加えてある３８４ウェルマイクロタイタープレートに加えた：５μｌの緩衝液（２ｍＭ Ｋ+）、５μｌの緩衝液＋３００ｍＭ Ｋ+、および５μｌの緩衝液＋１０μＭ Ｅ４０３１／２ｍＭ Ｋ+。
【００２３】
Ｄｉｂａｃ4（３）は電位依存性蛍光色素として用いられ、細胞膜の脱分極（たとえば、細胞外カリウム濃度の上昇によってまたはカリウムチャンネルの遮断によって引き起こされる）に際して細胞膜を通って細胞に入り、そこで細胞内タンパク質および膜と結合し、その結果として蛍光の増大が生じる。
【００２４】
上記のウェル内で、適当なストック溶液を加えることによってカリウム濃度を２ｍＭ（ゼロ検査）および３０ｍＭ（対照脱分極）とした。ＨＥＲＧカリウムチャンネルの拮抗剤として、Ｅ４０３１をカリウム濃度２ｍＭにて添加した。
【００２５】
氷上での１５０分間のインキュベートおよび続いての３０分間室温にてのインキュベート後、市販の蛍光リーダー（フルオスター（Ｆｌｕｏｓｔａｒ）、ｂｍｇ社）で、励起波長４８５ｎｍおよび放出波長５２５ｎｍにて読み取りを実施した。
【００２６】
上記の試験方法の結果を下記の表１におよび図１に要約する。拮抗剤Ｅ４０３１によりＨＥＲＧカリウムチャンネルを遮断することによって引き起こされた蛍光シグナルの増大は、室温と比較して氷上でのインキュベートで有意に強いことがわかる。シグナルの上昇は、室温にて４１．７６％から氷上で６６．６２％へ増加する。
【表１】
2007517513.tif 000003
＊    ｒｆｕ：相対蛍光強度
＊＊  Ｓｔｄ．ｄｅｖ．：標準偏差
＊＊＊ゼロ検査（２ｍＭＫ+にての蛍光シグナル）と比較した、証明された蛍光シグナルの増大
【００２７】
上記の実施例１に加えて、ＨＥＲＧ−チャンネル以外のイオンチャンネルへの本発明の方法の一般的な適用可能性を示すために他の実験を実施した。実験は下記のイオンチャンネルを用いて実施した：Ｋｖ１．１（実施例２）、Ｋｖ１．５（実施例３）、ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１（実施例４および６）、Ｋｖ１．３（実施例５および７）およびＳＣＮ５ａ（実施例８）。化学薬品、細胞培養、膜電位検定およびデータ解析の下記の概要は、これらの他の実施例２〜８のすべてに関係する。
【００２８】
化学薬品
化学薬品はシグマ社（Ｓｉｇｍａ）、メルク社（Ｍｅｒｃｋ）およびカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社から購入した。ＤｉＢＡＣ４（３）はモレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）からであった。ＦＬＩＰＲ膜電位検定キット（ＦＭＰ）はモレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）からであった。毒素はアロモン・ラブズ社（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）から購入した。
【００２９】
細胞培養
ＣＨＯ細胞株およびＨＥＫ２９３細胞株（野生型および各イオンチャンネルを安定にトランスフェクションされた）は、エボテック（Ｅｖｏｔｅｃ）ＯＡＩ ＡＧ社（ドイツ・ハンブルク）にて維持および確立された。 ＣＨＯ 細胞株は７５ ｃｍ2フラスコ （ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ））で１２ ｍｌのＭＥＭアルファ培地（ギブコ・インビトロジェン社（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で培養した。ＨＥＫ２９３細胞株はＤＭＥＭ（ギブコ・インビトロジェン社）中で培養した。両方の培地に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ・インビトロジェン社）およびＧ−４１８（ジェネテシン）（８００μｇ／ｍｌ）を添加し、および３７℃および５％ＣＯ2にて培養した。細胞を標準的な細胞培養手順に従って分割した。
【００３０】
下記により詳細に記載する膜電位検定の実施のために、細胞を３８４ウェルマイクロプレート（ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ）、ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））に播種し（５０μｌ／ウェル）一夜３７℃および５％ＣＯ2にて上に記載の培地中でインキュベートしてから検定に供し、またはプレートに直接２・１０4細胞／ウェルの密度で検定緩衝液（下記参照）中へ播種した。
【００３１】
膜電位検定
本実施例では、この蛍光に基づく検定は、細胞の膜電位に依存して細胞内へまたは細胞外へ移動する蛍光色素（ＤｉＢＡＣ４（３）およびＦＭＰ色素）を利用する。細胞の脱分極に際して、色素は細胞に入りおよび細胞内の疎水性部位へ結合し、それが今度は色素の光強度の増大に繋がる。
【００３２】
マイクロタイタープレート中で培養した細胞から培地を除去した。細胞を次いで１０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．２、５ｍＭ Ｋ+、１４０ｍＭ Ｎａ+、５ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2）で覆った。それぞれ、ＤｉＢＡＣ４（３）を４μＭの濃度で用い、およびＦＭＰをほぼ取扱説明書通りに用いた。検定で試験すべき化合物を、適当なストック濃度でＤＭＳＯに溶解した。毒素は、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩緩衝液：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4；ｐＨ〜７．３）に溶解した。
【００３３】
接着細胞を使用した場合、培地を除去しおよび各検定緩衝液で置換した。化合物または毒素をその後に加えた。懸濁細胞を使用した場合、化合物および毒素をプレートに加え、およびトリプシン処理後に検定緩衝液に再懸濁した細胞をウェルに加えた。すべての実験で、細胞に加えた３０ｍＭ カリウム（下記参照） が脱分極陽性対照の役割を果たす。
【００３４】
ＤｉＢＡＣ４（３）蛍光シグナルを、記載のインキュベート時間（主に数時間後−下記参照）およびインキュベート温度（０℃ないし４℃）の後に、ＤｉＢＡＣ４（３）の場合はＢＭＧフルオスター（ＦＬＵＯｓｔａｒ）蛍光リーダー（ＢＭＧラブテクノロジーズ社（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））またはサファイア（Ｓａｆｉｒｅ）リーダー（テカン社（Ｔｅｃａｎ））：励起波長４８５ｎｍ（１２ｎｍ帯域幅）、放出波長５２０ｎｍ（３５ｎｍ帯域幅）、またはＦＭＰの場合はサファイアリーダーで励起波長５４０ｎｍ（２．５ｎｍ帯域幅）および放出波長５５５ｎｍ（２．５ｎｍ帯域幅）を用いて測定した。蛍光は下記から測定した。
【００３５】
データ分析
蛍光強度における相対変化は下記の通り計算した：
【数１】
2007517513.tif 000004
Ｆ0：  標準条件（ゼロ対照、２ｍＭまたは５ｍＭカリウム）下でイオンチャンネルを発現しているＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度[ｒｆｕ]
Ｆc：  化合物／毒素の存在下でのイオンチャンネルを発現しているＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度[ｒｆｕ]
【００３６】
実施例２：Ｋｖ１．１
下記の表２は、９５分間４℃にて５ｍＭカリウム（ゼロ対照）、３０ｍＭカリウム（陽性対照）、および１００ｎＭの毒素デルタ−ＤＴＸおよびＤＴＸ−Ｋ（共にアロモン・ラブズ社（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）（イスラエル）から購入）の存在下での細胞のインキュベート後に得られた結果を示す：
【表２】
2007517513.tif 000005
"Ｒｆｕ"は相対蛍光強度を示す。
"Ｓｄｔ．ｄｅｖ．"は標準偏差を示す。
"[％]上昇"は、対照条件下での細胞の蛍光シグナルと比較した、各イオンチャンネル遮断剤の存在下での細胞の蛍光シグナルの上昇を示す（上式参照）。
【００３７】
下記の表３は、同じプレート細胞の、９５分間４℃にてインキュベート後さらに３５分間３７℃にて５ｍＭカリウム（ゼロ対照）、３０ｍＭカリウム（陽性対照）、および１００ｎＭの毒素デルタ−ＤＴＸおよびＤＴＸ−Ｋ（共にアロモン・ラブズ社（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）（イスラエル）から購入）の存在下でのインキュベート後に得られた結果を示す。
【表３】
2007517513.tif 000006
【００３８】
細胞を阻害剤の存在下でインキュベートすることは、細胞が本発明に教示される通り低温でインキュベートされる場合に顕著により明瞭なシグナルに繋がる（毒素デルタＤＴｘおよびＤＴＸ−Ｋの場合の[％]上昇を比較：３７℃にて約１４％から４℃にて〜４０％への上昇）。図２ａおよび２ｂも参照。
【００３９】
実施例３：Ｋｖ１．５
Ｋｖ１．５カリウムチャンネルを有するセムリキ森林熱ウイルスを、ルンドストロム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ）ら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：９１７−９２１に記載の手順に従って調製し、および−２０℃にて保存した。使用前に、アルファ−キモトリプシノーゲン（０．２ ｍｇ／ｍｌ）を用いて１５ 分 室温にてウイルスを活性化した。ウイルスの活性化を、１／５０容のアプロチニン（２０ｍｇ／ｍｌ）の添加によって停止した。ＣＨＯ細胞を前日に、２５ｃｍ2フラスコに播種し、培地（上記の細胞培養の項を参照）を除去し、および１ｍｌの新しい培地、および４５０μｌのウイルス含有上清、および２０μｌのＨＥＰＥＳ−緩衝液（１０ｍＭ Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン酸]ｐＨ６．９）で置換した。９０分間インキュベート後、別の５ｍｌの新しい培地を加え、および細胞を１２時間インキュベートした。
【００４０】
翌日、細胞をトリプシン処理によって採取し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩緩衝液：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4；ｐＨ〜７．３）で１回洗浄し、およびＦＭＰを含む検定緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．２、５ｍＭ Ｋ+、１４０ｍＭ Ｎａ+、５ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2）に再懸濁してから、標準Ｋｖ１．５遮断剤を負荷した３８４ウェルへ加えた。プレートを１５分間室温にてインキュベートし、および続いて１℃へ３０分間冷却した。表４に見られる通り、Ｋｖ１．５特異的遮断剤の存在下での細胞の相対蛍光単位の相対上昇は、細胞が本発明で教示される通り低温でインキュベートされる場合に有意に高い（２６％と比較して６３％相対上昇）。
【表４】
2007517513.tif 000007
【００４１】
実施例４：ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１
下記の表５は、上記の手順に従って懸濁細胞およびＦＭＰ色素を用いた、１５分間室温にて、およびさらに１８０分間、２ｍＭカリウム（ゼロ対照）、３０ｍＭカリウム（陽性対照）、および１０μＭの標準拮抗剤の存在下での細胞のインキュベート後に得られた結果を示す。ここでも、相対シグナル上昇は、細胞が本発明で教示される通り低温でインキュベートされる場合に有意に高い（室温にてインキュベートされる場合の２４％上昇と比較して１０９％相対上昇）。
【表５】
2007517513.tif 000008
【００４２】
実施例５：Ｋｖ１．３
下記の表６は、上記の手順に従って懸濁細胞およびＦＭＰ色素を用いた、１０分間室温にて、およびさらに１１０分間１℃にて５ｍＭカリウム（ゼロ対照）、３０ｍＭカリウム（陽性対照）、および１００ｎＭマルガトキシン（アロモン・ラブズ社（Ａｌｏｍｏｎｅ ｌａｂｓ））の存在下での細胞のインキュベート後に得られた結果を示す。相対シグナルは、細胞が本発明で教示される通り低温でインキュベートされる場合に有意に高い（１０分間室温にてインキュベートされる場合の３％上昇と比較して６８％相対上昇）。
【表６】
2007517513.tif 000009
【００４３】
実施例６：ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１についてのスクリーニング応用
本発明に記載のイオンチャンネルの試験は、本分野で公知である方法と比較して高いシグナル対ノイズ比を提供する。これは、高処理量スクリーニング作戦に十分な統計データを結果として生じる。ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１カリウムチャンネル（Ｉｋｓ）についての対照化合物の、ＨＴＳ条件下で１５３６ウェルプレートでの試験は、０．６より大のｚ'因子を結果として生じた。本発明を応用した１５３６ウェルプレートでのＩｋｓ拮抗剤の試験の例を図３および４に示す。図３は、拮抗剤の漸増濃度に伴う蛍光の増加を反映する。図３の最初の２行および最後の２行に対照値を示す（化合物無し）。これらの対照行での蛍光強度は、化合物が添加されているウェルの蛍光強度を示す行の値よりも有意に低い。３列目から、化合物の０．０１から１０μＭの漸増濃度の結果を示す。化合物の濃度の漸増に伴って、蛍光強度は上昇する。各濃度／反応の関係の一例を図４に示す。
【００４４】
実施例７：Ｋｖ１．３についてのスクリーニング応用
本発明は多数の化合物のスクリーニングに用いられた。本実施例では、２５，０００種類の化合物のＫｖ１．３カリウムチャンネルに関する測定を３８４ウェルプレートで実施した。化合物の試験は、Ｋｖ１．３チャンネルの拮抗剤が細胞へ添加された場合に蛍光の増大を結果として生じた。Ｋｖ１．３カリウムチャンネルを発現する化合物の試験を図５に示す（紫＝陽性対照マルガトキシン；青＝低対照；緑＝ＤＭＳＯ陰性対照；灰＝化合物範囲；赤＝選択されたヒット）。２５，０００種類の化合物のＫｖ１．３に関する試験の平均ｚ'の計算は、図６に示す通り、約０．６の値を結果として生じた。本発明に記載の方法を用いることによってヒットとして検出された化合物は、図７に示す通り電気生理的方法（パッチクランプ法）を用いてＫｖ１．３拮抗剤と確認された。
【００４５】
実施例８：ＳＣＮ５ａ
本実施例では、哺乳類細胞株で発現されるナトリウムチャンネルＳＣＮ５ａを調べる。細胞を標準検定緩衝液中へ、上記のモレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）キットを用いて室温にて３０分間負荷した。負荷後、テトロドトキシン（ＴＴＸ）をさまざまな濃度で加え、およびさらに１０分間インキュベートし、その後ベラトラジンを終濃度５０μＭで加え、およびプレートを氷上でまたは室温にてさまざまな長さの時間インキュベートした。
【００４６】
下記の表は１７分間インキュベート後の結果を示す。
【表７】
2007517513.tif 000010
【００４７】
ＩＣ５０値を両方のインキュベート条件について計算し、および図８に示す。本発明に記載の低温での化合物との細胞のインキュベートは、非常に改善された検出感度およびシグナル対ノイズ比に繋がる。低温インキュベートでは、報告されたＩＣ５０値は文献と大変良く一致する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例1の結果を示す。
【図２】実施例2の結果を示す。
【図３】実施例6の結果を示す。
【図４】実施例6の結果を示す。
【図５】実施例7の結果を示す。
【図６】実施例7の結果を示す。
【図７】実施例7の結果を示す。
【図８】実施例8の結果を示す。
【図１】
2007517513.tif 000011
【図２】
2007517513.tif 000012
【図３】
2007517513.tif 000013
【図４】
2007517513.tif 000014
【図６】
2007517513.tif 000015
【図７】
2007517513.tif 000016
【図８】
2007517513.tif 000017
【図５】
2007517513.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月10日(2006.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−イオンチャンネルを含む試料の提供； および
−イオンチャンネルの活性の指標としての測定パラメーターの値の測定、この測定パラメーターは膜電位、膜電位の指標、イオン濃度またはイオン濃度の指標である；
の段階を含み、
前記測定パラメーターの値の測定が約１０℃以下の温度で、蛍光法、放射能法または原子吸光分析によって実施される点で特徴づけられる、イオンチャンネルの活性を調べるための方法。
【請求項２】
測定パラメーターの値の測定が、約５℃以下、特に約２℃以下の温度で実施される点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定パラメーターの値の測定が、約１０℃ないし−４℃、特に約５℃ないし−４℃、より好ましくは約５℃ないし０℃、さらにより好ましくは約２℃ないし０℃の温度で実施される点で特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料が、イオンチャンネルを有する一つ以上の細胞または細胞小器官、特にヒトまたは動物細胞または細胞小器官を含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料が、イオンチャンネルを有する一つ以上の小胞を含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料が、膜結合イオンチャンネル、特に、細胞、細胞小器官、小胞の膜に埋め込まれた、または人工膜に埋め込まれたイオンチャンネルを含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
測定パラメーターが、細胞、細胞小器官または小胞の膜電位、または前記膜電位の指標である点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
測定パラメーターが、細胞外、細胞内、小胞外および／または小胞内イオン濃度またはその指標である点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
測定パラメーターの値が、イオンチャンネルの活性に影響する可能性のある被験物質の添加の前、間、および／または後に測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
伝達物質依存性イオンチャンネルの活性が調べられる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
電位感受性イオンチャンネルの活性が調べられる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
カリウムチャンネル、塩化物チャンネル、ナトリウムチャンネルまたはカルシウムチャンネルの活性が調べられる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）カルボシアニン誘導体、特にチア−、インド−、またはオキサ−カルボシアニンまたはカルボシアニンのヨウ化物誘導体、（ｉｉ）ローダミン色素、（ｉｉｉ）オキソノール色素、（ｉｖ）メロシアニン５４０、または（ｖ）スチリル色素の光学反応が膜電位の尺度の役割を果たす点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
電位感受性蛍光色素、好ましくはａＤｉＢＡＣ色素、より好ましくは色素Ｄｉｂａｃ4（３）の蛍光放出が膜電位の尺度の役割を果たす点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ルビジウムの、特に非放射性ルビジウムのイオン濃度が、イオンチャンネルの活性の指標として測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
イオン濃度、特にカルシウムのイオン濃度が、キレート剤を用いて測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
いくつかの測定パラメーターの値が測定される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
医薬品として活性な物質についての研究における、特に候補のまたは確立された医薬活性物質の中処理量または高処理量スクリーニング、特に潜在的に活性な医薬物質の同定または、候補のまたは確立された医薬活性物質の副作用の測定における使用のための、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
農業研究における、特にたとえば殺虫剤といった農薬に関する研究における使用のための、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記請求項のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのために使用される、電位感受性またはイオン感受性指示薬。
【請求項２１】
イオン感受性指示薬がカルシウム指示薬、特にフルオ−カルシウム指示薬、フラ指示薬、インド指示薬、カルシウムグリーン（登録商標）、またはオレゴングリーン（登録商標）であることを特徴とする請求項２０に記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬。
【請求項２２】
イオン感受性指示薬がナトリウムまたはカリウム指示薬、好ましくは蛍光ナトリウムまたはカリウム指示薬、特にＳＢＦＩ、ＰＢＦＩ、ナトリウムグリーンＮａ+指示薬、コロナグリーンＮａ+指示薬、またはコロナレッドＮａ+指示薬であることを特徴とする請求項２０に記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬。
【請求項２３】
電位感受性指示薬がカルボシアニン誘導体、特にインド−、チア−、またはオキサ−カルボシアニンまたはカルボシアニンのヨウ化物誘導体；ローダミン色素；オキソノール色素；メロシアニン５４０；またはスチリル色素であることを特徴とする請求項２０に記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬。
【請求項２４】
オキソノール色素がビス−イソキサゾロンオキソノール色素またはビス−バルビツール酸オキソノール（ＤｉＢＡＣ）色素、特にＤｉＢＡＣ4（３）、ＤｉＳＢＡＣ2（３）またはＤｉＢＡＣ4（５）であることを特徴とする請求項２３に記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬。
【請求項２５】
スチリル色素がＡＮＥＰ（アミノナフチルエテニルピリジニウム）色素、特にジ−４−ＡＮＥＰＰＳ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＳ、ジ−２−ＡＮＥＰＥＱ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＱ、ジ−１２−ＡＮＥＰＰＱ、ジ−１−ＡＮＥＰＩＡ、またはジアルキルアミノフェニルポリエニルピリジニウム色素（ＲＨ色素）、特にＲＨ４１４、ＲＨ４２１、ＲＨ７９５またはＲＨ２３７であることを特徴とする請求項２３に記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬。
【請求項２６】
請求項１から１９のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのために使用されるキレート剤。
【請求項２７】
請求項１から１９のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのために使用されるルビジウム、特に非放射性ルビジウム。
【請求項２８】
請求項１から１９のいずれかに記載の方法のコンダクタンスのために使用される、原子吸光分析装置、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダー。
【請求項２９】
請求項２０から２５のいずれかに記載の電位感受性またはイオン感受性指示薬、請求項２６に記載のキレート剤、および／または請求項２７に記載のルビジウムを用いる、請求項２８に記載の原子吸光分析装置、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダー。
【国際調査報告】
2007517513.tif 000019
2007517513.tif 000020
2007517513.tif 000021
2007517513.tif 000022
2007517513.tif 000023