(57)【要約】  電気化学的センサストリップは、ベース（１０）ならびにベース上の第一の電極（２０）及び第二の電極（３０）を有する。酸化還元酵素及び媒介物が第一の電極上にあり、可溶性レドックス種が第二の電極上にある。可溶性レドックス種は、有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体、電気活性有機分子又はそれらの混合物であることができる。
2007509355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベースと、
前記ベース上の第一の電極と、
前記ベース上の第二の電極と、
前記第一の電極上の酸化還元酵素及び媒介物と、
前記第二の電極上の可溶性レドックス種と
を含む電気化学的センサストリップ。
【請求項２】
前記可溶性レドックス種が、電気活性有機分子、有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体及びそれらの混合物からなる群より選択される要素を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３】
前記可溶性レドックス種がフェロシアン化物又はフェリシアン化物を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項４】
前記可溶性レドックス種がルテニウム（II）ヘキサアミン又はルテニウム（III）ヘキサアミンを含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項５】
前記可溶性レドックス種が、補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、置換ベンゾキノン類、置換ナフトキノン類、Ｎ−オキシド類、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン類、オキシン類、フラビン類、フェナジン類、フェノチアジン類、インドフェノール類、インダミン類、フェナジニウム塩、フェノキサジニウム塩及びそれらの混合物からなる群より選択される電気活性有機分子を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項６】
前記第二の電極上に第二のレドックス種をさらに含み、前記可溶性レドックス種が、前記第一の種及び前記第二の種を含むレドックス対の第一のレドックス種であり、前記第一のレドックス種と前記第二のレドックス種とのモル比が約１．２：１よりも大きい、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項７】
前記第一のレドックス種と前記第二のレドックス種とのモル比が約２：１よりも大きい、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項８】
前記第一のレドックス種と前記第二のレドックス種とのモル比が約１０：１よりも大きい、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項９】
前記第二のレドックス種が約１ppt未満の量で存在する、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１０】
前記第一のレドックス種が＋０．２４ボルト以上の標準還元電位を有する、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１１】
前記第一のレドックス種が約＋０．３５ボルト以上の還元電位を有する、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１２】
前記第一の電極上に前記第二のレドックス種をさらに含む、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１３】
前記媒介物が、補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、置換ベンゾキノン類、置換ナフトキノン類、Ｎ−オキシド類、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン類、オキシン類、フラビン類、フェナジン類、フェノチアジン類、インドフェノール類、インダミン類、フェナジニウム塩、フェノキサジニウム塩及びそれらの混合物からなる群より選択される電気活性有機分子を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１４】
前記媒介物が３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１５】
前記媒介物が３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンを含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１６】
前記酸化還元酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、リポタンパク質リパーゼ、グリセリンキナーゼ、グリセリン３−リン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ、グルタチオン還元酵素及び一酸化炭素酸化還元酵素からなる群より選択される、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１７】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素を含み、前記可溶性レドックス種が還元性種である、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１８】
前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項１７記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１９】
前記酸化還元酵素がレダクターゼを含み、前記可溶性レドックス種が酸化性種である、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２０】
ふたをさらに含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２１】
前記第二の電極が、非イオン化導電性材料を含む表面層を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２２】
前記表面層が炭素を含む、請求項２１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２３】
前記第二の電極が非イオン化導電性材料を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２４】
前記ベース上の第三の電極及び前記第三の電極上の第二の可溶性レドックス種をさらに含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２５】
前記第二の可溶性レドックス種が前記第二の電極上の前記可溶性レドックス種と実質的に同一である、請求項２４記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２６】
ベースと、
前記ベース上の第一の電極と、
前記ベース上の第二の電極と、
前記第一の電極上の、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれらの混合物からなる群より選択される酵素と、
前記第一の電極上の媒介物と、
前記第二の電極上の可溶性レドックス種と
を含み、前記可溶性レドックス種が、有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体及びそれらの混合物からなる群より選択される還元性種である電気化学的センサストリップ。
【請求項２７】
前記媒介物が、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項２６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２８】
前記可溶性レドックス種が、フェリシアン化物及びルテニウム（III）ヘキサアミンからなる群より選択される、請求項２６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２９】
前記ベース上の第三の電極及び前記第三の電極上の第二の可溶性レドックス種をさらに含む、請求項２６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３０】
前記第二の可溶性レドックス種が前記第二の電極上の前記可溶性レドックス種と実質的に同一である、請求項２９記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３１】
電気化学的センサストリップを製造する方法であって、
第一の電極を、ベース上に付着させる工程と、
第二の電極を、前記ベース上に付着させる工程と、
酸化還元酵素及び媒介物を含む第一の層を、前記第一の電極に適用する工程と、
可溶性レドックス種を含む第二の層を、前記第二の電極に適用する工程と
を含む方法。
【請求項３２】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素を含み、前記可溶性レドックス種が還元性種である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記酸化還元酵素がレダクターゼを含み、前記可溶性レドックス種が酸化性種である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記第二の層が第二のレドックス種をさらに含み、前記可溶性レドックス種が、前記第一の種及び前記第二の種を含むレドックス対の第一のレドックス種であり、前記第一のレドックス種と前記第二のレドックス種とのモル比が約１０：１よりも大きい、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記第二のレドックス種が前記第二の層中に約１ppt未満の量で存在する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記第一のレドックス種が＋０．２４ボルト以上の標準還元電位を有する、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記第一のレドックス種が約＋０．３５ボルト以上の還元電位を有する、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記第一の電極の付着が、導電性炭素のパターンをスクリーン印刷することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
前記第二の電極の付着が、導電性炭素のパターンをスクリーン印刷することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４１】
前記第二の電極の付着が、非イオン化導電性材料のパターンを付着させることを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
前記ベースの一部を、前記第一及び第二の層が露出するように誘電体層で覆うことをさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
ふたを、前記第一及び第二の電極ならびに前記第一及び第二の層にかぶさるように前記ベースと嵌合させることをさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
前記第一の層の適用が、前記酸化還元酵素及び前記媒介物を含む第一の水性組成物をディスペンスすることを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４５】
前記第一の水性組成物が前記酸化還元酵素のためのレドックス補因子をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記第一の水性組成物が結合剤をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記第一の水性組成物が緩衝剤をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記第二の層の被着が、前記可溶性レドックス種を含む第二の水性組成物をディスペンスすることを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４９】
前記第二の水性組成物が緩衝剤をさらに含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
第三の電極を前記ベース上に付着させる工程と、第三の層を前記第三の電極に被着させる工程とをさらに含み、前記第三の層が第二の可溶性レドックス種を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項５１】
前記第二の可溶性レドックス種が前記第二の層の前記可溶性レドックス種と実質的に同一である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記第三の層の組成が前記第二の層の組成と実質的に同一である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
試料中の分析対象物を定量する方法であって、
試料を、第一の電極及び前記第一の電極上の第一の層を含み、前記第一の層が酸化還元酵素及び媒介物を含むものであり、さらに第二の電極及び前記第二の電極上の第二の層を含み、前記第二の層が可溶性レドックス種を含むものである電気化学的センサストリップと接触させる工程と、
前記第一の電極と前記第二の電極との間に電位を印加する工程と、
前記第一及び第二の電極ならびに前記試料を通過する電流を計測する工程と、
前記電流を分析対象物の濃度と相関させる工程と
を含む方法。
【請求項５４】
前記可溶性レドックス種が前記試料中に溶解し、前記酵素及び前記媒介物と混合する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質である、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記分析対象物が前記酸化還元酵素の補因子及び前記酵素の基質である、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
前記酸化還元酵素が、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素を含み、前記可溶性レドックス種が還元性種である、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
前記可溶性レドックス種が、フェリシアン化物及びルテニウム（III）ヘキサアミンからなる群より選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記酸化還元酵素がレダクターゼを含み、前記可溶性レドックス種が酸化性種である、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
前記分析対象物がグルコースを含み、前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項６１】
前記媒介物が、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項６２】
前記電気化学的センサストリップが、前記可溶性レドックス種を含む第三の電極をさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項６３】
前記第三の電極が前記第三の電極と前記第一の電極との間の第二の電位を計測し、計測された第二の電位を使用して前記第一の電極と前記第二の電極との間の電位を調節する、請求項６２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
医学的状態及び医学的状態を治療する努力に対する患者の応答をモニタする場合には、迅速かつ正確で患者にとって簡便な分析法を使用することが望ましい。体液、特に血液試料中の特定の分析対象物を定量するためには電気化学的方法が有用であった。通常、そのような分析対象物は、特定の酵素と接触すると酸化還元反応を起こし、そのような反応によって発生する電流を分析対象物の濃度と相関させることができる。患者が、健康管理提供者又は臨床技術者を要することなく、特定の分析対象物のレベルを自らモニタすることを可能にする分析用電気化学的セルの小型版が開発されている。典型的な患者操作式電気化学的センサは、必要な回路及び出力系を収容する１個の計測ユニットを使用する。使用中、このユニットは、使い捨て分析ストリップであって、電極及びそのストリップに塗布される試料の電気化学的性質を計測するために必要な試薬を収容するストリップに接続される。これらの小型電気化学的系のもっとも一般的なものは、血糖値の計測を提供するグルコースセンサである。理想的には、グルコース用の小型センサは、血液１滴、通常は１〜１５マイクロリットル（μL）を分析することによって正確な血糖値の読みを提供するべきである。
【０００２】
典型的な分析用電気化学的セルでは、系のサイズにかかわらず、分析対象物を伴う酸化又は還元の半電池反応が電子を生成又は消費する。電子が、分析される試料と接触する作用電極と相互作用することができるならば、その電子の流れを計測することができる。電気回路は、同じく試料と接触する対電極を介して完成する。また、対電極では化学反応が起こり、この反応は、作用電極での反応に対して反対のタイプ（酸化又は還元）の反応である。たとえば、Fundamentals Of Analytical Chemistry, 4th Edition, D. A. Skoog and D. M. West; Philadelphia: Saunders College Publishing (1982), pp 304-341を参照すること。
【０００３】
診断に使用される一部の従来式小型電気化学的系では、統合型の対／参照電極が使用されている。このタイプの統合型電極は、参照電極材料がその不溶性によって分析溶液の反応成分から分離されている場合に可能である。対／参照電極は通常、分析溶液の水性環境でのその成分の不溶性のために安定な電気化学的性質を示す、銀（Ａｇ）と塩化銀（ＡｇＣｌ）との混合物である。使用中にＡｇとＡｇＣｌとの比は有意に変化しないため、電極の電気化学的性質も同じく有意には変化しない。
【０００４】
Ａｇ／ＡｇＣｌ電極は、参照電極としては良好に機能するが、対電極としてのその機能においては理想的とはいえない。Ａｇ／ＡｇＣｌ材料は抵抗率が高く、それが電流を運ぶその能力を阻害する。したがって、センサを作動させるために高い電圧及び／又は電流レベルが必要になりうる。小型電気化学的分析ストリップでは、小さな不確かさ及び変動が計測感度を劇的に低下させるおそれがあるため、これは特に問題になる。分析対象物の反応によって発生する高い電流が対電極によって妨げられるならば、高濃度の分析対象物を含有する試料について誤った結果が生ずるおそれがある。
【０００５】
一部の従来式小型電気化学的ストリップのもう一つの特徴は、作用電極及び対電極の両方にかぶさる一つの試薬層の存在である。この試薬層の成分は、分析対象物の酸化還元反応を促進する酵素及び酸化還元反応と作用電極との間の電子移動を助長する何らかの媒介物又は他の物質を含む。一つの試薬層の使用は、一つの付着工程だけで電極を材料で被覆することができるため、ストリップの簡単な製造を提供することができる。１層構造の欠点は、装置の使用時に、各電極が同じ環境と接触するということである。したがって、電極機能にとって最適な条件を提供するように各電極の個々の環境を制御することができない。この最適化の欠如もまた、系の感度を低下させるおそれがある。
【０００６】
患者の試料中の分析対象物の濃度に対する感度が改善された小型電気化学的系が要望される。小型電気化学的ストリップが、高い導電性を有する独立して最適化された電極を含むことが望ましい。
【０００７】
概要
本発明の一つの態様で、ベースと、ベース上の第一の電極と、ベース上の第二の電極と、第一の電極上の酸化還元酵素及び媒介物と、第二の電極上の可溶性レドックス種とを含む電気化学的センサストリップが得られる。
【０００８】
本発明のもう一つの態様で、ベースと、ベース上の第一の電極と、ベース上の第二の電極と、第一の電極上の、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ又はそれらの混合物である酵素と、第一の電極上の媒介物と、第二の電極上の可溶性レドックス種とを含む電気化学的センサストリップが得られる。可溶性レドックス種は、好ましくは、有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体又はそれらの混合物である。
【０００９】
本発明のさらに別の態様で、電気化学的センサストリップを製造する方法であって、第一の電極をベース上に付着させることと、第二の電極を前記ベース上に付着させることと、酸化還元酵素及び媒介物を含むものである第一の層を第一の電極に被着させることと、可溶性レドックス種を含むものである第二の層を第二の電極に被着させることとを含む方法が得られる。
【００１０】
本発明のさらに別の態様で、試料中の分析対象物を定量する方法であって、試料を、第一の電極及び第一の電極上の第一の層を含み、第一の層が酸化還元酵素及び媒介物を含むものであり、さらに第二の電極及び第二の電極上の第二の層を含み、第二の層が可溶性レドックス種を含むものである電気化学的センサストリップと接触させることと、第一の電極と第二の電極との間に電位を印加することと、第一及び第二の電極ならびに試料を通過する電流を計測することと、電流を分析対象物の濃度と相関させることとを含む方法が得られる。
【００１１】
詳細な説明
本発明は、試料中の物質の存在又は量を測定するための電気化学的バイオセンサに関する。バイオセンサは、それぞれが少なくとも部分的に別々の試薬層で覆われている作用電極及び対電極を含むセンサストリップを含む。作用電極上の試薬層は、酸化還元反応を介して分析対象物と相互作用する酵素を含み、さらに媒介物を含む。対電極上の試薬層は、分析対象物との反応に対して反対のタイプの酸化還元反応を起こすことができる可溶性レドックス種を含む。可溶性レドックス種は、好ましくは、対電極試薬層中、その対応物種のモル量よりも多いモル量で存在し、レドックス種とその対応物種とはいっしょになってレドックス対である。本発明のセンサは、精度、分析の範囲及び貯蔵寿命の改善を提供することができる。
【００１２】
用語「試料」は、未知の量の分析対象物を含有する組成物と定義される。通常、電気化学的分析の試料は液体形態であり、好ましくは、試料は水性混合物である。試料は、生物学的試料、たとえば血液、尿又は唾液であってもよい。試料は、生物学的試料に由来するもの、たとえば抽出物、希釈物、ろ液又は再構成沈殿物であってもよい。
【００１３】
用語「分析対象物」は、その存在又は量が測定される、試料中の物質と定義される。分析対象物は、分析中に存在する酸化還元酵素と相互作用し、その酸化還元酵素の基質、補酵素又は酸化還元酵素とその基質との間の相互作用に影響する別の物質であることができる。
【００１４】
用語「酸化還元酵素」は、基質の酸化又は還元を促進する酵素と定義される。用語酸化還元酵素は、分子酸素が電子受容体である酸化反応を促進する「オキシダーゼ」、分析対象物が還元され、分子酸素が分析対象物ではない還元反応を促進する「レダクターゼ」及び分子酸素が電子受容体ではない酸化反応を促進する「デヒドロゲナーゼ」を包含する。たとえば、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition, A. D. Smith, Ed., New York: Oxford University Press (1997) pp. 161, 476, 477 and 560を参照すること。
【００１５】
用語「酸化還元」反応は、二つの種の間の、一方の種から他方の種への少なくとも１個の電子の移動を伴う化学反応と定義される。このタイプの反応は「レドックス反応」とも呼ばれる。反応の酸化部分は、種の一方による少なくとも１個の電子の損失を伴い、還元部分は、他方の種への少なくとも１個の電子の付加を伴う。酸化される種のイオン電荷は、移動する電子の数に等しい量だけプラスを増す。同様に、還元される種のイオン電荷は、移動する電子の数に等しい量だけプラスを減らす。
【００１６】
用語「酸化数」は、化学種、たとえば原子の形式イオン電荷と定義される。高めの酸化数、たとえば（III）はプラスがより大きく、低めの酸化数、たとえば（II）はプラスがより小さい。中性種はゼロのイオン電荷を有する。種の酸化は、その種の酸化数の増大を生じさせ、種の還元は、その種の酸化数の減少を生じさせる。
【００１７】
用語「レドックス対」は、異なる酸化数を有する化学物質の二つの種と定義される。高い方の酸化数を有する種の還元が、低い方の酸化数を有する種を生成する。あるいはまた、低い方の酸化数を有する種の酸化が、高い方の酸化数を有する種を生成する。
【００１８】
用語「酸化性種」は、レドックス対のうち、低い方の酸化数を有し、したがって、高い方の酸化数を有する種へと酸化されることができる種と定義される。同様に、用語「還元性種」は、レドックス対のうち、高い方の酸化数を有し、したがって、低い方の酸化数を有する種へと還元されることができる種と定義される。
【００１９】
用語「可溶性レドックス種」は、酸化又は還元を受けることができ、水（ｐＨ７、２５℃）１リットルあたり少なくとも１．０グラムのレベルで可溶性である物質と定義される。可溶性レドックス種としては、電気活性有機分子、有機遷移金属錯体及び遷移金属配位錯体がある。用語「可溶性レドックス種」は、元素金属及び孤立金属イオン、特に水に不溶性又は難溶性であるものを除く。
【００２０】
「ＯＴＭ」錯体とも呼ばれる用語「有機遷移金属錯体」は、遷移金属がσ結合（遷移金属にσ結合した炭素原子で−１の形式電荷）又はπ結合（遷移金属にπ結合した炭素原子で０の形式電荷）を介して少なくとも１個の炭素原子に結合している錯体と定義される。たとえば、フェロセンは、２個のシクロペンタジエニル（Ｃｐ）環を有し、各環がその５個の炭素原子を介して２個のπ結合及び１個のσ結合によって鉄中心に結合しているＯＴＭ錯体である。ＯＴＭ錯体のもう一つの例は、６個のシアノ配位子（６個の配位子それぞれで−１の形式電荷）がシアノ基の炭素原子を介して鉄中心にσ結合しているフェリシアン化物（III）及びその還元フェロシアン化物（II）対応物である。
【００２１】
用語「配位錯体」は、明確に画定された配位形状、たとえば八面体又は正方形平面形状を有する錯体と定義される。結合によって定義されるＯＴＭ錯体とは違い、配位錯体はその形状によって定義される。したがって、配位錯体は、ＯＴＭ錯体（たとえば前述のフェリシアン化物）であることもできるし、炭素以外の非金属原子、たとえば窒素、硫黄、酸素及びリンをはじめとするヘテロ原子が遷移金属中心に供与結合している錯体であることもできる。たとえば、ルテニウムヘキサアミンは、６個のＮＨ3配位子（６個の配位子それぞれで０の形式電荷）がルテニウム中心に供与結合している、明確に画定された八面体形状を有する配位錯体である。有機遷移金属錯体、配位錯体及び遷移金属結合のより完全な論述は、CollmanらのPrinciples and Applications of Organotransition Metal Chemistry (1987)及びMiessler & TarrのInorganic Chemistry (1991)に見いだすことができる。
【００２２】
用語「媒介物」は、酸化又は還元されることができ、第一の物質と第二の物質との間で１個以上の電子を移動させることができる物質と定義される。媒介物は、電気化学的分析における試薬であり、分析対象物ではない。きわめて単純な系では、媒介物は、酸化還元酵素が適切な基質との接触によって還元又は酸化されたのち、酸化還元酵素とレドックス反応を起こす。そして、この酸化又は還元された媒介物は、電極で反対の反応を起こし、その元の酸化数まで再生される。
【００２３】
用語「電気活性有機分子」は、金属を含有せず、酸化又は還元反応を起こすことができる有機分子と定義される。電気活性有機分子は、レドックス種として挙動することもできるし、媒介物として挙動することもできる。電気活性有機分子の例は、補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ベンゾキノン類及びナフトキノン類、Ｎ−オキシド類、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン類、オキシン類、フラビン類、フェナジン類、フェノチアジン類、インドフェノール類及びインダミン類を含む。
【００２４】
用語「電極」は、電気化学的分析の間、固定状態にとどまる導電性物質と定義される。電極材料の例は、固体金属、金属ペースト、導電性炭素、導電性炭素ペースト及び導電性ポリマーを含む。
【００２５】
用語「非イオン化材料」は、分析対象物の電気化学的分析の間にイオン化しない材料と定義される。非イオン化材料の例は、炭素、金、白金及びパラジウムを含む。
【００２６】
用語「上」は、「上方」と定義され、記載されている方向に相対的である。たとえば、第一の要素が第二の要素の少なくとも一部に付着しているならば、第一の要素は、第二の要素の「上に付着している」といわれる。もう一つの例では、第一の要素が第二の要素の少なくとも一部の上方に存在するならば、第一の要素は、第二の要素の「上」にあるといわれる。用語「上」の使用は、記載されている上下の要素の間の物質の存在を排除しない。たとえば、第一の要素がその上面に被覆を有してもよく、その場合でも、第一の要素及びその上面被覆の少なくとも一部の上方の第二の要素は、第一の要素の「上」にあると記載することができる。したがって、用語「上」の使用は、関連する二つの要素が互いに物理的に接触していることを意味してもよいし、それを意味しなくてもよい。
【００２７】
電気化学的分析センサは、多様な方法で、多様な材料を使用して造ることができる。たとえば、いずれも引用例として本明細書に取り込む米国特許第５，１２０，４２０号及び第５，７９８，０３１号を参照すること。図１〜３及び１２〜１５を参照すると、一般に、電極材料がベース材料１０の上に付着している。ベース材料は、好ましくは、電気化学的系をその周囲から絶縁するために、絶縁体である。電極材料は、たとえば導体１２及び１４を介して外部回路に接続するように構成することができる。これらの接続が、センサの電気化学的応答をモニタ及び／又は操作することを可能にする。好ましくは、電極材料及びセンサ全体が、既存の電気分析用計測装置と適合性であるように構成されている。加えて、電極材料は、分析される試料との接触を提供するように構成されている。各電極は、適切な分析試薬を含有する材料の層で被覆されている。作用電極２０は、酸化還元酵素及び媒介物を含有する第一の層２６で被覆されている。対電極３０は、可溶性レドックス種を含有する第二の層３６で被覆されている。電極は、電極のうち、試薬層と接触する部分を、電極を外部回路に接続する部分から絶縁するため、誘電体層４０、たとえば絶縁性ポリマーによって部分的に覆われていてもよい。この誘電体層は、存在する場合、電極を適切な試薬層で被覆する前、最中又はその後に付着させることができる。そして、アセンブリ全体が少なくとも部分的にふた５０で覆われる。好ましくは、試料を付着させ、分析するための空間を提供するため、ふたは、試薬層を覆うが、試薬層と接触はしない。任意の第三の電極７０は、可溶性レドックス種を含有する第三の層７６で被覆されている。任意の第三の電極は、導体１３を介して外部回路と接続するように構成されていてもよい。
【００２８】
各電極は、金属、導電性ポリマー及び導電性炭素をはじめとする導電性物質を含有することができる。導電性材料の例は、金属、たとえば金、銀、白金、パラジウム、銅又はタングステンの薄い層及び導電性炭素粉末の薄い層を含む。好ましくは、センサの使用中に試料と接触する電極は、分析中に正味の酸化又は正味の還元を受けないよう、不活性材料でできている。より好ましくは、センサの使用中に試料と接触する電極は、非イオン化材料、たとえば炭素、金、白金及びパラジウムでできている。場合によっては、銀のようなイオン化材料は、センサの使用中に系の計測電流又は電位に悪影響を及ぼしかねないレドックス種を形成するおそれがある。
【００２９】
金属は、金属箔の付着、化学蒸着又は金属のスラリーの付着によってベース材料に付着させることができる。導電性炭素は、たとえば、炭素含有材料の熱分解又は炭素粉末のスラリーの付着によって付着させることができる。スラリーは、２種以上の導電性材料を含有することができる。たとえば、スラリーは、パラジウム及び炭素粉末を含有することができる。スラリー付着の場合、米国特許第５，７９８，０３１号に記載のようにして、流体混合物をインクとしてベース材料に塗布することができる。
【００３０】
図２に示す例は、それぞれが主導体２２又は３２及び任意の表面導体２４又は３４を含む作用電極２０及び対電極３０を示す。所与の電極系の構成要素の配置及び数は、試料が分析されているときに起こる電気化学反応に対する電極の電気的応答を最適化するために広く変化させることができる。主導体（２２又は３２）が一つの導電性物質の部分の一端であり、接続する導体（１２又は１４）がその部分の他端にあることが望ましいことがある。そして、任意の表面導体は、電気化学的シグナルを、導電性物質を介して計測ユニットに伝達される（すなわち、２２から１２に流れる）固体電子流に変換するように機能することができる。一例では、主導体２２及び３２は、接続導体１２及び１４と隣接する金属箔のピースであり、表面導体２４及び３４は、導電性炭素粉末の層である。
【００３１】
図１５に示す例は、それぞれが主導体３２又は７２及び任意の表面導体３４又は７４を含む対電極３０及び第三の電極７０を示す。第三の電極構成要素もまた、センサの全体性能を最適化するために変化させることができる。主導体７２が一つの導電性物質の部分の一端であり、接続導体１３がその部分の他端にあることが望ましいことがある。一例では、主導体７２は、接続導体１３と隣接する金属箔のピースである。任意の表面導体７４は、たとえば、導電性炭素粉末の層である。可溶性レドックス種を含有する第三の層７６は、第二の層３６の組成とは異なる組成を有するものでもよいし、第二の層と第三の層とが同一であってもよい。一例では、第三の層は、導体３２（及び場合によっては３４）ならびに７２（及び場合によっては７４）を覆うように構成されている第二の層の一部である。
【００３２】
電極が表面電極を含むならば、表面電極は、非イオン化導電性材料であることが好ましい。電極が、その表面に別個の導電層を有しない単なる導電性材料の層であるならば、導電性材料は、非イオン化性であることが好ましい。より好ましくは、主導体とは別個の層であってもよいし、別個の層でなくてもよい対電極の表面は、非イオン化材料である。
【００３３】
作用電極の試薬層と対電極の試薬層とは、互いに異なる組成を有する。この区別が、試薬層を別個に最適化して、改善された電気化学的分析性を有するセンサストリップを提供することを可能にする。作用電極上の層は、分析対象物の反応ならびにその反応の結果の電極及び接続された回路への伝達を促進する成分を含有することができる。対電極上の層は、分析される試料と電極及びその接続された回路との間の電子の自由な流れを促進する成分を含有することができる。系をさらに最適化するため、第三の電極が、分析される試料と電極及びその接続された回路との間の電子の自由な流れを促進する成分を含有する層を有してもよい。各層は、電気化学的セルにおける酸化還元反応に直接的には関与しない不活性成分を独立して含有してもよい。そのような不活性成分の例は、結合剤、たとえばベントーン（bentone）、ポリエチレンオキシド又はカルボキシメチルセルロース、増粘剤、たとえばシリカ又はポリエチレンオキシド及び１種以上の緩衝剤を含む。
【００３４】
作用電極上の層は、好ましくは、酸化還元酵素を含有する。酸化還元酵素は、分析対象物である基質に特異的であってもよい。酸化還元酵素は、酸化還元酵素とその基質との反応が分析対象物の存在又は量によって影響されるような基質に特異的であってもよい。酸化還元酵素及びそれらの特異的基質の例を表Ｉに示す。たとえば、アルコールオキシダーゼを試薬層に使用すると、試料中のアルコールの存在に感度を示すセンサを提供することができる。そのような系は、血中アルコール濃度を計測するのに有用でありうる。もう一つの例では、グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼを試薬層に使用すると、試料中のグルコースの存在に感度を示すセンサを提供することができる。この系は、たとえば糖尿病であることがわかっている、又はその疑いのある患者の血糖濃度を計測するのに有用でありうる。二つの異なる物質の濃度が既知の関係によってリンクされるならば、物質の一方の、酸化還元酵素とのその相互作用による計測が、他方の物質の濃度の計算を提供することができる。たとえば、酸化還元酵素が、特定の基質に感度を示すセンサを提供することができると、この基質の計測濃度を使用して分析対象物の濃度を計算することができる。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
作用電極上の層は、１種以上の媒介物質を含有することができる。媒介物の存在は、酵素によって促進されたレドックス反応から電極材料への電気シグナルの伝達を増強することができる。解釈の理論によって拘束されることを望まないが、媒介物は、初期酵素反応におけるレドックス補因子として作用することもできるし、反応が起こった後で酵素もしくは他の種から電子を受容する、又は酵素もしくは他の種に電子を供与するためのレドックスコレクタとして作用することもできる。レドックス補因子の状況では、媒介物は、基質のレドックス反応を均衡させる種であると考えられている。したがって、基質が還元されるならば、媒介物は酸化される。レドックスコレクタの状況では、別の種が最初に酸化又は還元されて基質のレドックス反応を均衡させていることがある。この種は、酸化還元酵素そのものであってもよいし、別の種、たとえばレドックス補因子であってもよい。
【００３７】
酵素的電気化学的セル中の媒介物は、たとえば、引用例として本明細書に取り込む米国特許第５，６５３，８６３号に記載されている。場合によっては、媒介物は、酸化還元酵素を再生するように機能することができる。たとえば、酵素が基質を酸化させるならば、酵素そのものは還元される。酵素と媒介物との相互作用は、媒介物の還元とともに、酵素のその元の非反応状態への酸化を生じさせることができる。適切な電位での媒介物と電極との相互作用は、電極への１個以上の電子の放出とともに、媒介物のその元の非反応状態への酸化を生じさせることができる。
【００３８】
媒介物の例は、フェロセン化合物、たとえば１，１′−ジメチルフェロセンならびに米国特許第５，６５３，８６３号に記載されている錯体、たとえばフェロシアン化物及びフェリシアン化物をはじめとするＯＴＭ及び配位錯体を含む。また、媒介物の例は、補酵素、たとえば補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、引用例として本明細書に取り込む米国特許第４，７４６，６０７号に開示されている置換ベンゾキノン類及びナフトキノン類、引用例として本明細書に取り込むＥＰ０３５４４４１に具体的に開示されているＮ−オキシド類、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン類及びオキシン類、引用例として本明細書に取り込むＥＰ０３３０５１７に開示されているフラビン類、フェナジン類、フェノチアジン類、インドフェノール類、置換１，４−ベンゾキノン類及びインダミン類ならびに引用例として本明細書に取り込む米国特許第３，７９１，９８８号に開示されているフェナジニウム塩及びフェノキサジニウム塩をはじめとする電気活性有機分子を含む。生物学的レドックス系の電気化学的媒介物の考察は、Analytica Clinica Acta. 140 (1982), pages 1-18に見いだすことができる。電気活性有機分子媒介物の例はまた、引用例として本明細書に取り込む米国特許第５，５２０，７８６号に記載されているもの、たとえば３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン（ＰＩＰＴ）及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン（ＰＩＰＯ）を含む。
【００３９】
対電極上の試薬層は可溶性レドックス種を含有する。可溶性レドックス種は、酸化還元酵素の基質の反応に対して反対の反応を起こし、その際、レドックス対のその対応物種へと転換される。たとえば、分析対象物が還元されるならば、可溶性レドックス種は酸化され、分析対象物が酸化されるならば、可溶性レドックス種は還元される。レドックス対の対応物種は、層中に存在することもできるが、好ましくは、主レドックス種の濃度よりも低い濃度で存在する。より好ましくは、対電極上の試薬層中のレドックス種は、排他的に、酸化還元酵素の基質の反応に対して反対の反応を起こす可溶性レドックス種である。
【００４０】
可溶性レドックス種は、電気活性有機分子であってもよいし、有機遷移金属錯体であってもよいし、遷移金属配位錯体であってもよいし、これらのいずれかの混合物であってもよい。たとえば、補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、置換ベンゾキノン類及びナフトキノン類、Ｎ−オキシド類、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン類、オキシン類、フラビン類、フェナジン類、フェノチアジン類、インドフェノール類、インダミン類、フェナジニウム塩及びフェノキサジニウム塩のような有機分子それぞれが可溶性レドックス種であることができる。
【００４１】
可溶性レドックス種は、有機遷移金属錯体又は遷移金属配位錯体であることができる。多くの遷移金属は、水素、酸素、硫黄又は他の遷移金属との化合物として天然に存在し、これらの遷移金属は一般に一つ以上の酸化状態で見られる。たとえば、鉄、クロム及びコバルトは通常、＋２（すなわちII）又は＋３（すなわちIII）の酸化状態で見いだされる。したがって、鉄（II）及び鉄（III）は、一つのレドックス対の二つの種である。しかし、多くの元素金属又は金属イオンは水性環境に難溶性であり、電気化学的分析系における酸化還元反応を均衡させる際のレドックス種としての用途が制限される。配位子に結合又は配位した金属イオンは、これらの配位子との会合によってより可溶性にすることができる。通常、有機遷移金属錯体又は遷移金属範囲錯体中の金属は、その錯体中の実際に還元又は酸化される部分である。たとえば、フェロセン［Ｆｅ（II）（Ｃ5Ｈ6）2］及びフェロシアン化物イオン［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］4-中の鉄中心は＋２形式酸化状態にあり、フェリシアン化物イオン［Ｆｅ（III）（ＣＮ）6］3-は鉄をその＋３形式酸化状態で含有する。フェロシアン化物とフェリシアン化物とがいっしょになってレドックス対を形成し、作用電極上で使用される酸化還元酵素のタイプに依存して、いずれか一方が対電極上の試薬層中の可溶性レドックス種として機能することができる。遷移金属配位錯体を含有するレドックス対の例は、二つのルテニウムヘキサアミン種［Ｒｕ（III）（ＮＨ3）6］3+及び［Ｒｕ（II）（ＮＨ3）6］2+の組み合わせである。
【００４２】
第一の種と呼ばれる、対電極上の試薬層中に存在するレドックス対の種は、好ましくは、同じレドックス対のその対応物種（すなわち第二の種）よりも大きなモル量で存在する。好ましくは、第一の種と第二の種とのモル比は少なくとも１．２：１である。より好ましくは、第一の種と第二の種とのモル比は少なくとも２：１である。さらに好ましくは、第一の種と第二の種とのモル比は少なくとも１０：１である。さらに好ましくは、第一の種と第二の種とのモル比は少なくとも１００：１である。さらに好ましくは、レドックス対の第二の種は、分析におけるセンサストリップの使用前で１ppt（１０００分の１）以下の量で存在する。さらに好ましくは、レドックス対の第二の種は、分析におけるセンサストリップの使用前で１ppm（１００万分の１）以下の量で存在する。
【００４３】
好ましくは、可溶性レドックス種は、試料中に可溶化され、分析対象物及び他の試料成分と混合する。可溶性レドックス種は時間とともに酵素及び媒介物と混合するが、これは、分析の過程で計測可能な程度には起こらないといえる。可溶性レドックス種は、機械的バリヤによって液体試料から分離されているわけでもなく、液体試料とは異なる別個の相で存在しているために液体試料から分離しているわけでもない。
【００４４】
もう一つの好ましい実施態様では、標準水素電極（ＳＨＥ）に対して＋０．２４ボルト以上の標準還元電位を有する可溶性レドックス種が選択される。さらに別の好ましい実施態様では、ＳＨＥに対して＋０．３５ボルト以上の標準還元電位を有する可溶性レドックス種が選択される。さらに別の好ましい実施態様では、ＳＨＥに対して約＋０．４８ボルトの還元電位を有する可溶性レドックス種（０．０１Ｍ  ＨＣｌ中）が選択される。
【００４５】
したがって、酸化還元酵素、媒介物及び可溶性レドックス種の多様な組み合わせを使用して電気化学的分析センサを調製することができる。レドックス対中の対応物種に対して高い又は低い酸化数を有する可溶性レドックス種の使用は、作用電極で実施される反応のタイプによって指示される。一例では、分析対象物は、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼとの相互作用によって酸化を受ける。この場合、対電極上のより高濃度のレドックス種がより高い酸化数を有する。この状況の具体例は、グルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコースの分析である。もう一つの例では、分析対象物は、レダクターゼとの相互作用によって還元を受ける。この場合、対電極上のより高濃度のレドックス種がより低い酸化数を有する。これらの例のいずれでも、媒介物は、対電極上のより高濃度のレドックス種と同じ物質であってもよいし、別のレドックス対のレドックス種であってもよい。
【００４６】
第三の電極がセンサ中に存在する場合、それはまた、対電極試薬層に関して記載した可溶性レドックス種を含有する試薬層を含む。好ましくは、第三の電極試薬層は対電極試薬層と同一である。第三の電極上の試薬層と対電極上の試薬層とが同一である場合、両方の電極を試薬層組成物の一つの部分で単に被覆することが望ましいかもしれない。
【００４７】
電気化学的センサを使用して、作用電極上の酸化還元酵素の基質である分析対象物又は酸化還元酵素とその基質との反応に影響する分析対象物の量を計測することができる。患者によって操作されることになっているセンサの場合、試料は、患者からの少量の体液であることが望ましい。希釈、試薬もしくは他の物質の添加又はろ過もしくは他の試料の精製方法の必要なしで試料を直接分析することが望ましい。容易に得ることができる体液の例は、血液、尿及び唾液を含む。図４を参照して、計測ユニットに接続するストリップの端部とは反対側のストリップの入力端６０に設けられた開口に１滴の試料を付着させることにより、試料が電極に適用される。試料は、上のふたと下の作用電極及び対電極との間の区域に移動する。ふたが、液体試料を適用したときにストリップの中の空気を抜くための開口５４を有することが好都合である。ふたとベースとの間の区域が、液体を保持し、試料及びその内容物を電極の周囲の区域に固定化する物質を含有してもよい。このような物質の例は、水膨潤性ポリマー、たとえばカルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールならびに多孔質ポリマーマトリックス、たとえばデキストラン及びポリアクリルアミドを含む。
【００４８】
試料が酸化還元酵素の基質を含有する場合、ひとたび試薬層と試料とが接触すると、基質と酵素との間のレドックス反応を開始することができる。このレドックス反応から発生又は消費される電子は、作用電極と対電極との間に電位（すなわち電圧）を印加し、電流を計測することによって測定することができる。電気化学的ストリップ系が既知の量の基質を含有する試料で較正されているならば、この電流を試料中の基質の濃度と相関させることができる。計測ユニットは、好ましくは、有用な情報、たとえば試料中の基質の濃度、患者体内の基質の濃度又は計測された基質に関連する別の物質の関連濃度を提供するために必要な回路及びマイクロプロセッサを含む。
【００４９】
酸化還元酵素とその基質との反応によって発生又は消費される電子は、対電極によって閉回路が設けられると、計測可能な電流に変換される。対電極で起こる反応は、作用電極で起こる反応と反対である。したがって、対電極は、作用電極で起こるレドックス反応のタイプに依存して、試薬層の１種以上の成分の反応を通じて電子を試料に供与又は受容する。たとえば、作用電極で酸化が起こるならば、対電極では還元が起こる。
【００５０】
電圧が印加されたのち所与の時間まで系中の電流の計測を遅らせることが望ましいことがある。試料内での電気化学反応の複雑な力学的性質のために、レドックス反応は、反応速度が１秒の何分の１から数分の期間安定化している「定常状態」に達しないことがある。この定常状態が達成される前又は達成された後の計測は、電流、ひいては分析対象物濃度の誤った計測を提供するおそれがある。好ましくは、電流計測は、試料の塗布の約２０秒後に開始する。
【００５１】
好ましくは、まず、試料の付着と同時又はその直後に電圧を系に印加する。初期の電圧印加を１０秒間維持したのち停止し、１０秒の遅延期間、電圧が印加されないようにする。この遅延時間ののち再び電圧を印加し、１０秒の読み取り期間に電流をモニタする。
【００５２】
第三の電極を含むセンサストリップの場合、印加された電圧は、第三の電極を介してモニタすることができる。電位の所期値におけるドリフトが第三の電極を介して回路へのフィードバックを提供して、電圧を適切に調節することができるようにする。
【００５３】
第三の電極の使用は、一部の用途において望ましいことがある。印加電圧における精度の増大が、分析対象物の計測においてより高い精度を提供することができる。また、第三の電極を使用する場合、対電極のサイズを減らしたり、より少量のレドックス種を対電極に被着させたりすることが可能となることがある。図１４に示すように第三の電極が対電極の上流に位置するならば、「充填不足」と呼ばれる状況である、不十分な試料しかストリップに適用されていない場合を検出することが可能となることがある。充填不足検出は、作用電極と第三の電極との間に回路を完成するのに十分な試料があるが、対電極を覆うのには十分ではない場合に起こりうる。セル中の電流の欠如は、さらなる試料をストリップに加えるようユーザに指示するユーザへのシグナルへと電子的に変換することができる。
【００５４】
作用電極及び対電極のために別々に最適化された試薬層を含有する電気化学的センサストリップは、従来のセンサストリップに対して改善された性能を提供することができる。基質に対して反対のタイプの酸化還元反応を起こす対電極上のレドックス対の種は、通常に使用される１：１の比よりも大きなモル比で存在するべきである。この大きめのレドックス種のモル比は、分析に必要な期間中に作用電極の近くで起こる酸化還元反応に対して有意な干渉を生じさせない。また、高濃度のレドックス種は、対電極にとって比較的安定な電気化学的環境を提供する。レドックス種は消費される（すなわち、その対応物種に転換される）が、分析のタイムスケールで計測電流と分析対象物濃度との間に比較的一定の線形関係が存在するような十分な高さの濃度を維持する。
【００５５】
また、対電極上の可溶性レドックス種の大きなモル比は、センサストリップの貯蔵寿命を延ばすことができる。可溶性レドックス種からその対応物種への小さな程度の自然発生的転換が、ストリップの製造と試料を用いてのその使用との間の期間に起こることがある。それでも、相対濃度は高いままであるため、センサは正確な結果を出すことができる。
【００５６】
実施例
実施例１―ベース上の電極対の調製
米国特許第５，７９８，０３１号及び第５，１２０，４２０号に記載されている技術を使用して、絶縁材料のベース上に電極を形成した。図１を参照して、銀ペーストをスクリーン印刷によってポリカーボネートストリップ１０に付着させた。このペーストをパターン１２及び１４に印刷して電気接点及び電極の下層を形成した。次に、図２を参照して、導電性炭素及び結合剤を含有するインクをスクリーン印刷によってパターン２４及び３４に塗布して各電極の上層を形成した。図３を参照して、アクリレート改質ポリウレタンを含有する誘電体層をベース及び電極の下層にパターン４０に付着させたのち、ＵＶ線への露光によって硬化させた。
【００５７】
実施例２―対電極上に一つの可溶性レドックス種を有するセンサストリップ
実施例１に記載したようにして調製したベース上の１対の電極を使用してセンサストリップを製造した。図２を参照して、電極の一方を、酵素グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を１マイクロリットルあたり２０単位の補酵素ＰＱＱ、２４mMの３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン（ＰＩＰＴ）、８mMのフェロシアン化物及び１％ＣＭＣポリマーと組み合わせた水性混合物２６を電極に付着させることにより、作用電極にした。これらの成分は、ｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液に含有されていた。他方の電極は、ｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液中２００mMのフェリシアン化物及び１００mMのＮａＣｌの水性混合物３６を電極に付着させることにより、対電極にした。
【００５８】
図４を参照して、これらの水性混合物を乾燥させたのち、ベース、誘電体層及び被覆された電極をふた５０に接合してセンサストリップを形成した。ふたの製造は、米国特許第５，７９８，０３１号に記載されているように実施した。水性ポリウレタン分散系の被覆溶液をポリカーボネートストリップの片側に塗布し、乾燥させた。エンボス加工によって凹部５２を形成し、穴５４を打ち抜くことにより、このストリップをふたに形成した。ふたとベースとを整合させ、接触させたのち、構造の周囲の接触区域に熱を加えることにより、ふたをベースに接合した。
【００５９】
図５を参照して、ふたによって覆う前に、電極構造を光学顕微鏡によってイメージングした。作用電極は左側の円であり、対電極は右側の円である。
【００６０】
実施例３―対電極上にレドックス対の二つの種を有するセンサストリップ
対電極を形成するために付着させた混合物がフェリシアン化物（１００mM）及びフェロシアン化物（１００mM）の両方を含有することを除き、実施例２のようにしてセンサストリップを造った。
【００６１】
実施例４―センサストリップのサイクリックボルタンメトリー実験
実施例２〜３のセンサストリップそれぞれをサイクリックボルタンメトリーによって分析した。ストリップをｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液で再水和させた。各ストリップを、電圧源及び電流計測装置を含む分析装置に取り付けた。電圧を−０．６Ｖにセットし、＋０．６Ｖに上げ、０．０２５Ｖ/secの速度で再び−０．６Ｖに下げ、電圧サイクルを通して電流を計測した。各センサストリップに関して印加電圧の関数として電流を計測したサイクリックボルタモグラムのプロットを図６に示す。各サイクリックボルタモグラムは、ＰＩＰＴ媒介物の酸化のため、正電流でピーク（酸化ピーク）を示す。酸化ピークは、実施例２のストリップでは−０．２Ｖ近くで起こり、実施例３のストリップでは−０．１５Ｖ近くで起こる。これらの酸化ピークは、最大電流応答を得るために特定のストリップを作動させるべきであるところの電位を示す。
【００６２】
実施例５―センサストリップを使用するグルコースの定量
実施例２及び３のセンサストリップに関して、試料中のグルコース濃度の関数として発生する電流を研究した。ｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液中に所定の量のグルコースを含有する試料を、実施例２又は実施例３にしたがって製造した個々のセンサストリップに別々に適用した。＋０．４Ｖの電位を電極対に１０秒間印加したのち、１０秒間電位を加えなかった。次に、＋０．４Ｖの電位を再び１０秒間印加し、この１０秒の間に電流を計測した。図７は、この計測期間の総電流を実施例２及び実施例３の場合のグルコース濃度の関数としてプロットしたものである。
【００６３】
実施例２のセンサは、１デシリットルあたり０〜４００ミリグラム（mg/dL）のグルコース濃度について平均電流の線形の増大を示した。実施例３のセンサは、０〜２００mg/dLのグルコース濃度について平均電流の線形の増大を示した。したがって、線形応答の範囲は、レドックス対の酸化種、この場合はフェリシアン化物の量に依存する。電流応答の非線形性は、対電極におけるレドックス対の酸化種の欠乏によるものと考えられ、そのため、高めのグルコース濃度の場合に作用電極での酸化反応を維持することはできない。実施例３のセンサは、レドックス対の酸化種を半分しか含有しないため、実施例２のセンサよりもはるかに小さな濃度範囲で線形応答を示す。
【００６４】
実施例６―作用電極上のフェロシアン化物なしのセンサストリップ
作用電極を形成するために付着させた混合物がフェロシアン化物を含有しなかったことを除き、実施例２のようにしてセンサストリップを造った。
【００６５】
実施例７―作用電極上の可溶性レドックス種の量を減らしたセンサストリップ
作用電極を形成するために付着させた混合物がフェロシアン化物を４mMしか含有しなかったことを除き、実施例２のようにしてセンサストリップを造った。
【００６６】
実施例８―媒介物の影響
実施例２、６及び７のセンサストリップそれぞれをサイクリックボルタンメトリーによって分析した。分析混合物は、グルコースを含有しない４０％ヘマトクリット全血であった。ストリップを４０％全血試料で再水和させた。各ストリップを、電圧源及び電流計測装置を含む分析装置に取り付けた。電圧を−０．８Ｖにセットし、＋０．６Ｖに上げ、０．０２５Ｖ/secの速度で再び−０．８Ｖに下げ、電圧サイクルを通して電流を計測した。各センサストリップに関して印加電圧の関数として電流を計測したサイクリックボルタモグラムのプロットを図８に示す。
【００６７】
実施例６のセンサのボルタモグラム（曲線「ａ」）は、−０．４Ｖと＋０．４Ｖとの間に明りょうなＰＩＰＴの酸化ピークを示した。また、実施例２（曲線「ｃ」）及び７（曲線「ｂ」）のセンサのサイクリックボルタモグラムでは、−０．３Ｖ付近で電流の局所的ピークが示された。しかし、これらのセンサの主ピークは０Ｖ〜＋０．１Ｖの間で起こった。これらの電位すべては、対電極でのフェリシアン化物の還元のための半電池電位に相対的である。
【００６８】
正電位での酸化ピークは、作用電極でのフェロシアン化物の酸化によるものである。実施例２のセンサは、実施例７のセンサに対して２倍のモル量のフェロシアン化物を作用電極上に有したため、実施例２のサイクリックボルタモグラムにおけるフェロシアン化物によるピーク電流は、実施例７で見られたもののおよそ２倍である。実施例６のセンサのサイクリックボルタモグラムは、フェロシアン化物酸化の証拠を示さなかった。実施例６のセンサは作用電極上にフェロシアン化物を含有しなかったため、これらの結果は、分析のタイムスケールの間には対電極から作用電極までの検出可能なフェロシアン化物の移動がないことを示す。フェロシアン化物は、元から対電極上に付着していたフェリシアン化物の還元によって対電極で生成される。加えて、これらの結果は、本発明の電気化学的バイオセンサが、作用電極上の媒介物及び対電極上のレドックス対の一方の種（媒介物が対電極上のレドックス対のもう一方の種ではない場合）とで作動することができることを実証する。
【００６９】
実施例９―対電極レドックス対の干渉の試験
様々なグルコース濃度を有する４０％ヘマトクリット全血試料を使用して、実施例６のセンサのサイクリックボルタモグラムを実施した。電圧を−０．８Ｖにセットし、＋０．６Ｖに上げ、０．０２５Ｖ/secの速度で再び−０．８Ｖに下げ、電圧サイクルを通して電流を計測した。印加電圧の関数として電流を計測したサイクリックボルタモグラムのプロットを図９に示す。約−０．２Ｖでの酸化ピークで計測したピーク電位は、グルコース濃度の増大とともによりプラスになった。実施例８でグルコースの非存在下で実施したサイクリックボルタンメトリーの場合に観察されたように、対電極で生成されるフェロシアン化物の作用電極への検出可能な移動はない。
【００７０】
実施例１０―白血球中のグルコースの定量
実施例６のセンサストリップに関して試料中のグルコース濃度の関数として発生した電流を研究した。ＹＳＩグルコース分析装置を参照法として使用して、４０％ヘマトクリットを有する全血試料をグルコース濃度に関して分析した。様々な試料の実際のグルコース濃度を決定したら、試料を、実施例６にしたがって製造した個々のセンサストリップに別々に適用した。＋０．４Ｖの電位を電極対に１０秒間印加したのち、１０秒間電位を印加しなかった。次に、＋０．４Ｖの電位を再び１０秒間印加し、この１０秒の間に電流を計測した。図１０は、この計測期間の総電流を実施例６の場合のグルコース濃度の関数としてプロットしたものである。実施例６のセンサは、０〜約６００mg/dLの血糖濃度の関数として電流の線形応答を示した。
【００７１】
実施例１１―作用電極及び対電極上にＰＩＰＴを有するセンサストリップ
対電極に付着させた混合物がＰＩＰＴを２５mM含有したことを除き、実施例１のようにしてセンサストリップを製造した。このようにして製造したセンサストリップを、分析対象物が様々なグルコース濃度を有する場合で、ｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液混合物中でサイクリックボルタンメトリーによって分析した。電位を−０．４Ｖと＋０．６Ｖとの間で０．０２５Ｖ/secの速度で循環させた。これらのストリップのサイクリックボルタモグラムを図１１に示す。
【００７２】
ＰＩＰＴの酸化は対電極でのそれ自体のレドックス電位に対して計測されるため、酸化／還元ピークは中心が０ボルト付近になる。他方、作用電極上のフェロシアン化物の酸化ピークは、ＰＩＰＴピークに対してより高い酸化電位にシフトした。これらの実験は、対電極上のレドックス種としてＰＩＰＴを使用する可能性を示した。作用電極は、この実施例で分析したように、ＰＩＰＴを含有することもできるし、媒介物としてフェリシアン化物を含有することもできる。
【００７３】
実施例１２―３個の電極を含むセンサストリップの調製
第三の電極をベースに被着させたことを除き、実施例１に記載したようにして絶縁材料のベース上に電極を形成した。図１２〜１４を参照して、銀ペーストをスクリーン印刷によってポリカーボネートストリップ１０に付着させた。このペーストをパターン１２、１３及び１４に印刷して電気接点及び電極の下層を形成した。次に、導電性炭素及び結合剤を含有するインクをスクリーン印刷によってパターン２４、３４及び７４に塗布して各電極の上層を形成した。アクリレート改質ポリウレタンを含有する誘電体層を、電極を露出させるようなパターンでベース及び電極の下層に付着させたのち、ＵＶ線への露光によって硬化させた。
【００７４】
電極の一つを、酵素グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を１マイクロリットルあたり２０単位の補酵素ＰＱＱ、２４mMの３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン（ＰＩＰＴ）及び１％ＣＭＣポリマーと組み合わせた水性混合物２６を電極に付着させることにより、作用電極にした。これらの成分は、ｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液に含有されていた。
【００７５】
他の電極の一方を、ｐＨ７．４の１００mMリン酸緩衝液中２００mMのフェリシアン化物及び１００mMのＮａＣｌの水性混合物３６を電極に付着させることにより、対電極にした。残る電極を試薬層７６で覆うことによって第三の電極を造った。試薬層７６の付着は、第三の水性混合物を用いる別個の工程として実施してもよいし、試薬層７６を、対電極を製造するために付着させた同じ水性混合物の一部として被着させてもよい。
【００７６】
これらの水性混合物を乾燥させたのち、ベース、誘電体層及び電極をふたに接合してセンサストリップを形成した。水性ポリウレタン分散系の被覆溶液をポリカーボネートストリップの片側に塗布し、乾燥させた。エンボス加工によって凹部を形成し、穴を打ち抜くことにより、このストリップをふたに形成した。ふたとベースとを整合させ、接触させたのち、構造の周囲の接触区域に熱を加えることにより、ふたをベースに接合した。
【００７７】
本発明を、その特定の例示的な実施態様を参照しながら記載し、例示したが、本発明は、そのような例示的な実施態様に限定されることを意図しない。当業者は、請求の範囲によって定義される本発明の真の範囲及び本質を逸することなく、改変及び変形を加えることができることを認識するであろう。したがって、請求の範囲及びその均等物の範囲に入るそのような改変及び変形すべてを本発明に含めることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】作用電極及び対電極を含むセンサベースの平面図である。
【図２】図１のセンサベースの端面図である。
【図３】誘電体層の下のセンサベース及び電極の平面図である。
【図４】完全に組み立てられたセンサストリップの斜視図である。
【図５】別々の試薬層を有する作用電極及び対電極の顕微鏡写真である。
【図６】対電極上に様々な層を有するセンサストリップに関するサイクリックボルタモグラムのセットである。
【図７】様々な対電極を有するセンサストリップに関する、グルコース濃度の関数としての計測電流のグラフである。
【図８】様々な作用電極を有するセンサストリップに関するサイクリックボルタモグラムのセットである。
【図９】対電極上にフェリシアン化物を有するが、作用電極上にフェロシアン化物を有しないセンサストリップに関する、様々なグルコース濃度でのサイクリックボルタモグラムのセットである。
【図１０】センサストリップに関する、グルコース濃度の関数としての計測電流のグラフである。
【図１１】作用電極及び対電極の両方に３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンを有するセンサストリップに関する、様々なグルコース濃度でのサイクリックボルタモグラムのセットである。
【図１２】作用電極、対電極及び第三の電極を含むセンサベースの平面図である。
【図１３】作用電極、対電極及び第三の電極を含むセンサベースの平面図である。
【図１４】作用電極、対電極及び第三の電極を含むセンサベースの平面図である。
【図１５】図１３のセンサベースの切欠き図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月10日(2005.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベースと、
ベース上の第一の電極と、
電気活性有機分子及び基質の酸化還元反応を促進することができる酸化還元酵素を含む、第一の電極上の第一の試薬層と、
ベース上の第二の電極と、
有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体及びそれらの混合物からなる群より選択される、基質とは反対の酸化還元反応を行うことができる第一の可溶性レドックス種を含む、第二の電極上の第二の試薬層と、
を含む電気化学的センサストリップ。
【請求項２】
第一の試薬層の組成が、第二の試薬層の組成と異なる、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３】
酸化還元酵素が、実質的に第一の試薬層にのみに存在する、請求項２記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項４】
電気活性有機分子が、実質的に第一の試薬層のみに存在する、請求項２記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項５】
第一の可溶性レドックス種が、実質的に第二の試薬層のみに存在する、請求項２記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項６】
第二の試薬層が第二のレドックス種をさらに含み、第二のレドックス種が、第一の可溶性レドックス種と第二のレッドクス種を含むレドックス対の種であり、第一の可溶性レドックス種と第二のレドックス種とのモル比が１．２：１よりも大きい、請求項２記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項７】
第一の可溶性レドックス種と第二のレドックス種とのモル比が２：１よりも大きい、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項８】
第一の可溶性レドックス種と第二のレドックス種とのモル比が約１０：１よりも大きい、請求項７記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項９】
第二のレドックス種が１ppt未満の量で存在する、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１０】
第一の可溶性レドックス種が＋０．２４ボルト以上の標準還元電位を有する、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１１】
第一の可溶性レドックス種が＋０．３５ボルト以上の標準還元電位を有する、請求項１０記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１２】
第一の試薬層が第二のレドックス種をさらに含む、請求項６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１３】
第一の可溶性レドックス種がフェロシアン化物又はフェリシアン化物を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１４】
第一の可溶性レドックス種がルテニウム（II）ヘキサアミン又はルテニウム（III）ヘキサアミンを含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１５】
電気活性有機分子が、補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、置換ベンゾキノン類、置換ナフトキノン類、Ｎ−オキシド類、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン類、オキシン類、フラビン類、フェナジン類、フェノチアジン類、インドフェノール類、インダミン類、フェナジニウム塩、フェノキサジニウム塩、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン類及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１６】
電気活性有機分子が３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１７】
電気活性有機分子が３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンを含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１８】
酸化還元酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、リポタンパク質リパーゼ、グリセリンキナーゼ、グリセリン３−リン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ、グルタチオン還元酵素及び一酸化炭素酸化還元酵素からなる群より選択される、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項１９】
酸化還元酵素が、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素を含み、第一の可溶性レドックス種が還元性種である、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２０】
酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項１９記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２１】
酸化還元酵素がレダクターゼを含み、第一の可溶性レドックス種が酸化性種である、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２２】
ふたをさらに含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２３】
第二の電極が、非イオン化導電性材料を含む表面層を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２４】
表面層が炭素を含む、請求項２３記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２５】
第二の電極が非イオン化導電性材料を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２６】
ベース上の第三の電極及び第三の電極上の第三の試薬層を含み、第三の試薬層が第三の可溶性レドックス種を含む、請求項１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２７】
第三の可溶性レドックス種が、実質的に第一の可溶性レドックス種と同一である、請求項２６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２８】
ベース上の第三の電極及び第三の電極上の第三の試薬層を含み、第三の試薬層が第三の可溶性レドックス種を含む、請求項２記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項２９】
第三の可溶性レドックス種が、実質的に第一の可溶性レドックス種と同一である、請求項２８記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３０】
ベースと、
ベース上の第一の電極と、
電気活性有機分子ならびにグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれらの混合物からなる群より選択される酵素を含む、第一の電極上の第一の試薬層と、
ベース上の第二の電極と、
有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体及びそれらの混合物からなる群より選択される還元性種である第一の可溶性レドックス種を含む、第二の電極上の第二の試薬層と、
を含む電気化学的センサストリップ。
【請求項３１】
第一の試薬層の組成が、第二の試薬層の組成と異なる、請求項３０記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３２】
電気活性有機分子及び酵素が、実質的に第一の試薬層のみに存在し、第一の可溶性レドックス種が、実質的に第二の試薬層のみに存在する、請求項３１記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３３】
電気活性有機分子が、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３０記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３４】
第一の可溶性レドックス種が、フェリシアン化物及びルテニウム（III）ヘキサアミンからなる群より選択される、請求項３０記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３５】
ベース上の第三の電極及び第三の電極上の第三の試薬層を含み、第三の試薬層が第三の可溶性レドックス種を含む、請求項３０記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３６】
第三の可溶性レドックス種が、実質的に第一の可溶性レドックス種と同一である、請求項３０記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項３７】
電気化学的センサストリップを製造する方法であって、
第一の電極を、ベース上に付着させる工程と、
第二の電極を、ベース上に付着させる工程と、
電気活性有機分子及び基質の酸化還元反応を促進することができる酸化還元酵素を含む第一の試薬層を、第一の電極上に適用する工程と、
有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体及びそれらの混合物からなる群より選択される、基質とは反対の酸化還元反応を行うことができる第一の可溶性レドックス種を含む、第二の試薬層を、第二の電極上に適用する工程と、
を含む方法。
【請求項３８】
酸化還元酵素が、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素を含み、可溶性レドックス種が還元性種である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
酸化還元酵素がレダクターゼを含み、可溶性レドックス種が酸化性種である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
第一の電極の付着が、導電性炭素のパターンをスクリーン印刷することを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
第二の電極の付着が、導電性炭素のパターンをスクリーン印刷することを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
第二の電極の付着が、非イオン化導電性材料のパターンを付着させることを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
ベースの一部を、第一及び第二の試薬層が露出するように誘電体層で覆うことをさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
ふたを、第一及び第二の電極ならびに第一及び第二の試薬層にかぶさるようにベースと嵌合させることをさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
第一の試薬層の組成が、第二の試薬層の組成と異なる、請求項３７記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項４７】
電気活性有機分子及び酸化還元酵素が、実質的に第一の試薬層のみに存在し、第一の可溶性レドックス種が、実質的に第二の試薬層のみに存在する、請求項４６記載の電気化学的センサストリップ。
【請求項４８】
第二の試薬層が第二のレドックス種をさらに含み、第二のレドックス種が、第一の可溶性レドックス種及び第二のレドックス種を含むレドックス対のレドックス種であり、第一の可溶性レドックス種と第二のレドックス種とのモル比が１０：１よりも大きい、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
第二のレドックス種が第二の試薬層中に１ppt未満の量で存在する、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
第一の可溶性レドックス種が＋０．２４ボルト以上の標準還元電位を有する、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
第一の可溶性レドックス種が＋０．３５ボルト以上の標準還元電位を有する、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
第一の試薬層の適用が、酸化還元酵素及び電気活性有機分子を含む第一の水性組成物をディスペンスすることを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５３】
第一の水性組成物が酸化還元酵素のためのレドックス補因子をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
第一の水性組成物が結合剤をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
第一の水性組成物が緩衝剤をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
第二の試薬層の適用が、第一の可溶性レドックス種を含む第二の水性組成物をディスペンスすることを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５７】
第二の水性組成物が緩衝剤をさらに含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
第三の電極をベース上に付着させる工程と、第三の試薬層を第三の電極に被着させる工程とをさらに含み、第三の試薬層が第三の可溶性レドックス種を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項５９】
第三の可溶性レドックス種が、第一の可溶性レドックス種と実質的に同一である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
第三の試薬層の組成が、第二の試薬層の組成と実質的に同一である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
試料中の分析対象物を定量する方法であって、
第一の電極及び第一の電極上の第一の試薬層を含み、第一の試薬層が電気活性有機分子と基質の酸化還元反応を促進することができる酸化還元酵素を含むものであり、さらに第二の電極及び第二の電極上の第二の試薬層を含み、第二の試薬層が有機遷移金属錯体、遷移金属配位錯体及びそれらの混合物からなる群より選択される、基質とは反対の酸化還元反応を行うことができる可溶性レドックス種を含むものである、電気化学的センサストリップに、試料を接触させる工程と、
第一の電極と第二の電極との間に電位を印加する工程と、
第一及び第二の電極ならびに試料を通過する電流を計測する工程と、
電流を分析対象物の濃度と相関させる工程と
を含む方法。
【請求項６２】
可溶性レドックス種が試料中に溶解し、電気活性有機分子及び酸化還元酵素と混合する、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
分析対象物が酸化還元酵素の基質である、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
分析対象物が酸化還元酵素の補因子である、請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
酸化還元酵素が、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素を含み、可溶性レドックス種が還元性種である、請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
可溶性レドックス種が、フェリシアン化物及びルテニウム（III）ヘキサアミンからなる群より選択される、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
酸化還元酵素がレダクターゼを含み、可溶性レドックス種が酸化性種である、請求項６１記載の方法。
【請求項６８】
分析対象物がグルコースを含み、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６９】
電気活性有機分子が、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項７０】
電気化学的センサストリップが、可溶性レドックス種を含む第三の電極をさらに含む、請求項６１記載の方法。
【請求項７１】
第三の電極が第三の電極と第一の電極との間の第二の電位を計測し、計測された第二の電位を使用して第一の電極と第二の電極との間の電位を調節する、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
第一の試薬層の組成が、第二の試薬層の組成と異なる、請求項６１記載の方法。
【請求項７３】
電気活性有機分子及び酸化還元酵素が、実質的に第一の試薬層のみに存在し、可溶性レドックス種が、実質的に第二の試薬層のみに存在する、請求項７２記載の電気化学的センサストリップ。
【国際調査報告】
2007509355.tif 000019
2007509355.tif 000020
2007509355.tif 000021
2007509355.tif 000022