(57)【要約】本発明は、BRAF遺伝子のエクソン15又はコドン599を含むその一部を含むオリゴヌクレオチドプローブの、メラノーマ細胞の悪性度の検出のための使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
BRAF遺伝子のエクソン15若しくはコドン599を含むその一部又はその相補鎖を含むオリゴヌクレオチドプローブの、メラノーマ細胞の悪性度の検出のための使用。
【請求項２】
配列番号1の配列を含むオリゴヌクレオチド若しくは配列番号1に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はコドン599を含む前記配列の一部あるいはその対立変異体が、メラノーマ細胞の悪性度の検出のために使用される、請求項1のオリゴヌクレオチドプローブの使用。
【請求項３】
コドン599が突然変異を有する、請求項1又は2のオリゴヌクレオチドプローブの使用。
【請求項４】
バリン(Val、V)、グルタミン酸(Glu、E)及びアスパラギン酸(Asp、D)からなる群から選択されるアミノ酸をコドン599がコードする、請求項1又は2のオリゴヌクレオチドプローブの使用。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号5若しくは配列番号6の配列又は配列番号5若しくは配列番号6に相補的な配列或いは前記配列と80%を超える相同性を有する配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブの使用。
【請求項６】
BRAF遺伝子のエクソン15又はコドン599を含むその一部における、コドン599の突然変異の存在が決定される、メラノーマ細胞の悪性度の検出方法。
【請求項７】
バリン(wildtyp)のグルタミン酸(Glu、E)又はアスパラギン酸(Asp、D)への置き換えを導くコドン599の突然変異の存在が決定される、請求項6の方法。
【請求項８】
コドン599の突然変異の検出が、BRAF遺伝子のエクソン15若しくはコドン599を含むその一部のシークエンシングによって、又はBRAF遺伝子のエクソン15オリゴヌクレオチド若しくはコドン599を含むその一部をBRAF遺伝子のエクソン15配列若しくはその一部と相補的な配列を有するレポーターオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることによって行われる、請求項6又は7の方法。
【請求項９】
配列番号5若しくは配列番号6の配列又は配列番号5若しくは配列番号6と80%を超える相同性を有する配列或いは前記配列と相補的な配列を含むレポーターオリゴヌクレオチドの、メラノーマ細胞の悪性度の決定のための使用。
【請求項１０】
配列番号5若しくは配列番号6の配列又は配列番号5若しくは配列番号6と80%を超える相同性を有する配列或いは前記配列と相補的な配列を含む、標識レポーターオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、BRAF遺伝子の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブの、メラノーマ細胞の悪性度の決定のための使用及びメラノーマ細胞の悪性度の決定方法に関する。
【０００２】
特に転移細胞の発生に対応する、腫瘍の悪性度の迅速な決定は、腫瘍の最善な処置の提供に重要である。悪性メラノーマ腫瘍のステージの診断のための新規方法を確立するために、腫瘍細胞の悪性度と相関した特定マーカーの同定が望まれる。
【０００３】
BRAFキナーゼをコードするBRAF遺伝子は腫瘍形成に結びつきがあることが、ほぼ十年前に示唆されていた(S.M. Storm & U. Rapp, Toxicol. Lett. 67, 201-210, 1993)。しかしながら、ヒト癌におけるBRAFの役割を論証する臨床データは、公表されていない。
【０００４】
最近の公表物(H. Davies et al., Nature 417, 949-954, 2002)に、コドン599における突然変異によってバリンコドンがグルタミン酸コドンに置き換わる(V599E)、BRAF遺伝子のエクソン15中の突然変異の存在が記載された。該突然変異は、BRAFキナーゼの構成性活性変異体を導く。しかしながら、限られた数の原発腫瘍メラノーマのみが検査され、メラノーマはその臨床ステージによって分類されない。
【０００５】
大パネルのマーカーが利用可能になることで、異なる臨床ステージのメラノサイト性腫瘍間のより良い識別及び今後の腫瘍のより精錬された処置が許容され得る。
【０００６】
本発明の目的は、腫瘍の悪性度と相関する新規マーカー及びその使用を提供すること、並びに前記マーカーを使用したメラノーマの臨床ステージの決定方法を提供することである。
【０００７】
ヒト悪性メラノーマの、ある生検サンプルのみが、BRAF遺伝子のエクソン15におけるV599E突然変異を高割合で有することが見出された。驚くべきことに、V599E突然変異を有する患者サンプルは、悪性、特に転移腫瘍に由来した。野生型(599位にバリンコドン)のみを包含する患者サンプルは、より悪性でない、特に、非転移原発腫瘍に由来した。
【０００８】
V599E突然変異とメラノーマの悪性度との相関に基づき、本発明の実施態様は、BRAF遺伝子のエクソン15若しくはコドン599を含むその一部、又はその相補鎖を含むオリゴヌクレオチドプローブの、メラノーマ腫瘍又は細胞の悪性度の検出のための使用である。
【０００９】
特定のBRAF遺伝子のエクソン15配列を配列番号1に示す：
【００１０】
【化１】
2007513616.tif 000002
【００１１】
下線ヌクレオチドは、野生型BRAF遺伝子(配列番号2)のバリンコドン599を示す。
【００１２】
配列番号1の配列を含むオリゴヌクレオチド或いは配列番号1に相補的な配列若しくはコドン599を含む前記配列の一部又はその対立変異体(allelic variant)を含むオリゴヌクレオチドは、メラノーマ細胞の悪性度の検出のために好ましい。
【００１３】
特に、BRAF遺伝子のコドン599を包含する配列番号1の適当な部分は、少なくとも10、より良くは少なくとも20ヌクレオチドを好ましくは有する。
【００１４】
本発明は、配列番号1由来のオリゴヌクレオチドの使用に限定されない。特に、その全ての対立変異体、特に、BRAF遺伝子のコドン599の突然変異を有するオリゴヌクレオチドもまた包含される。対立変異体は、メラノーマプローブ由来(例えば患者由来)を包含するオリゴヌクレオチドと定義され、ストリンジェントな条件下、配列番号1又はその相補鎖でオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。対立変異体は、通常、配列番号1に対し、60%より大きい、特に80%より大きいの配列相同性を有する。特に好ましいのは、相同性が少なくとも90%の配列のオリゴヌクレオチドである。
【００１５】
本発明の非常に好ましい実施態様において、コドン599(GTG、GTA、GTC又はGTT)が、グルタミン酸をコードするコドンGAG若しくはGAAで置き換えられたか、又はアスパラギン酸をコードするコドンGGG、GGA、GGC若しくはGGTで置き換えられたオリゴヌクレオチドが使用されるが、コドン599において他の突然変異を有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明に使用することが出来る。
【００１６】
記載のオリゴヌクレオチドプローブは、メラノーマ腫瘍の悪性度に対立関連(allelic association)して使用することが出来る。これは、個人のメラノーマのゲノタイプ化(genotyping)方法を創生する可能性を開く。従って、本発明の他の実施態様は、メラノーマ腫瘍の悪性度の検出方法であり、ここで、BRAF遺伝子のエクソン15又はコドン599を含むその一部におけるコドン599の突然変異の存在が、コドン599を有するBRAF遺伝子の部分を包含するオリゴヌクレオチド又はその相補鎖を含むメラノーマプローブにおいて決定される。
【００１７】
BRAF遺伝子のエクソン15からの核酸配列を含むゲノムサンプルプローブの調製方法は、H. Davies et al., Nature 417, 949-954, 2002に記載される。得られたオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号3及び配列番号4のプライマーを使用して、PCRによって増幅することが出来る。しかし、ゲノムBRAF遺伝子由来の核酸配列のみを本発明において用いることが出来るのではなく、対応するmRNA及びcDNA又はその一部も、メラノーマ細胞の悪性度の決定のために使用することが出来る。そのようなゲノムDNA、mRNA、cDNA、その増幅産物又はその一部は、用語「核酸配列」の用語「オリゴヌクレオチド」にそれぞれ明らかに包含される。
【００１８】
BRAF遺伝子のエクソン15のコドン599の突然変異の検出は、全ての既知の方法、例えば、単離又は増幅オリゴヌクレオチドのシークエンシングによって、ノーザンブロッティング、サザンブロッティングによって、或いは単離又は増幅核酸配列を、バイオチップ上で、BRAF遺伝子のエクソン15若しくはその一部に対する相補配列を有する適当なレポーターオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、行うことが出来る。
【００１９】
適当なレポーターは、例えば、配列番号5(野生型レポーター)及び配列番号6(変異型レポーター)の配列、又は実質的に相同の配列(特に、少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%の相同性である)を含むオリゴヌクレオチドである。好ましいレポーターオリゴヌクレオチドは、標識されている。可能な既知の標識は、例えばCy(登録商標)3若しくはCy(登録商標)5(Amersham Pharmacia)のような色素、蛍光団又は放射線の、オリゴヌクレオチド標識である。メラノーマ細胞又は腫瘍の悪性度の決定のための適当なレポーターオリゴヌクレオチドの使用及び前記レポーター自体は、本発明の他の実施態様である。
【００２０】
メラノーマ細胞又は腫瘍の悪性度の好ましい検出方法は、ストリンジェントな条件下での、標識野生型レポーターと、異なる標識でマークした変異型レポーターとのパラレルハイブリダイゼーションによって特徴付けられる。検査サンプルのゲノタイプ(同型接合体 野生型、異型接合体 変異型／野生型、同型接合体 変異型／変異型)は、ハイブリダイズしたレポーター由来のシグナルの強度比を介して決定することが出来る。
【００２１】
用語「ストリンジェントな条件下ハイブリダイズする」は、Sambrook, et al. Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA中に記載されるような標準ハイブリダイズ条件下で、2のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズできることを意味する。この目的のために、通常のストリンジェントなハイブリダイズ条件(例えば、60℃、0.1 x SSC、0.1% SDS)を使用することが可能である。
【００２２】
以下の実施例は、BRAF遺伝子のエクソン15のコドン599、特にバリンコドンのグルタミン酸コドンへの置き換えを導く突然変異が、患者の腫瘍細胞の臨床ステージの診断において価値ある予後(prognostic)マーカーであることを示す。
【実施例】
【００２３】
本実施例において、悪性メラノーマのBRAF突然変異状態は「原発腫瘍(primary tumors)」又は「転移腫瘍(metastasising tumors)」のいずれかに分類される。腫瘍サンプルはWuerzburg大学によって分類され、DNAサンプルはこの機関から快く提供された。
【００２４】
77μlの水(bidest)、10μlの10x 反応緩衝液(Promega)、8μlの25mM MgCl2、2μlの10mM dNTPs、1μlのTaq Polymerase (Promega)、0.6μlの100μM プライマー 5’-tagcctcaattcttaccatc-3’ (配列番号3)、0.6μlの100μM プライマー 5’ビオチン-cataatgcttgctctgatagg-3’(配列番号4)及び1μlのゲノムDNAを含有するPCR反応にて各サンプルからのBEAFエクソン15配列を増幅した。
【００２５】
増幅パラメータは：95℃で2分、35サイクル(95℃で30秒、55℃で20秒、72℃で25秒)及び72℃で5分。PCR増幅物(amplicon)を、次いで、近ごろ記載されたように(H. A. Behrensdorf et al., Nucl. Acids Res., e64, 2002)精製し、NanoChip(商標)DNAマイクロアレイに供した。次いで、カートリッジを0.1MのNaOHで5分インキュベートし、5mlの50mM ヒスチジンでリンスし、500μlの高塩緩衝液(50mM NaCl、500mM NaPO4、pH 7.5)でリンスした。
【００２６】
野生型BRAF配列(wt、5’Cy3-CAT CGA GAT TTC A-3’(Cy(商標)3標識 配列番号5))又はBRAF V599E変異体(mut、5’Cy5-CAT CGA GAT TTC T-3’(Cy(商標)5標識 配列番号6))のいずれかに相補的な標識オリゴヌクレオチド及び安定剤オリゴヌクレオチド5’-CTG TAG CTA GAC CAA AAT CAC CTA TTT TTA C-3’(配列番号7)を、次いで混合し、各レポーターオリゴヌクレオチド1μM及び安定剤オリゴヌクレオチド2μMの最終濃度になるまで、高塩緩衝液で希釈した。次いで、混合物をマイクロアレイ表面と5分インキュベートした。
【００２７】
マイクロアレイを1mLの高塩緩衝液で洗浄後、Cy(商標)3及びCy(商標)5蛍光それぞれについてアレイをスキャンした。次いで、アレイを175μlの低塩緩衝液(50mM NaPO4)で34℃にて3回洗浄し、Cy(商標)3及びCy(商標)5蛍光それぞれについてスキャンした。この、洗浄及びスキャン工程を、35℃、36℃及び37℃にて繰り返した。通常、35℃又は36℃でそれぞれ、はっきりした(robust)識別が観察された。同型接合野生型コントロールサンプルにおいて緑／赤比が > 5:1のとき、及び同型接合変異型コントロールサンプルにおいて緑／赤比が < 1:5のときに、このポイントに達した(異型接合体サンプルにおいて緑／赤比を任意に1:1にセットする)。その後、NanoChip(商標)Workstation’sソフトウェアを使用して、サンプルのゲノタイプ化を行った。結果を以下の表1に示した。
【００２８】
検査した患者について、野生型ゲノタイプを有するグループ及び主に変異型ゲノタイプを有する他のグループの2グループの存在が、分析によって明らかになった。驚くべきことに、ゲノタイプと腫瘍の悪性度との間の相関が見出された。「野生型」グループ(wt/wt)は非転移メラノーマに苦しむ(実施例1〜12)一方、「変異型」グループ(V599E/wt; V599E/V599E)は転移メラノーマに苦しむ(実施例13〜29)。
【００２９】
【表１】
2007513616.tif 000003
【配列表】
2007513616000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月14日(2006.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
エクソン15のコドン599を含むBRAF配列を含む患者サンプルを提供する工程；
第1の標識を含む第1のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程(ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは、コドン599を含む野生型BRAF配列と相補的である)；
第2の標識を含む第2のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程(ここで、該第2のオリゴヌクレオチドプローブは、コドン599において突然変異を含む変異型BRAF配列と相補的である)；
前記患者サンプルと前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブとを接触させて、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つと前記患者サンプルとをハイブリダイズする工程；及び
前記患者サンプルとハイブリダイズした前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つを検出する工程；
を含む、患者サンプル中のメラノーマ細胞の悪性度の検出方法。
【請求項２】
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号5、配列番号5と相補的な配列、配列番号5と実質的に相同な配列及び配列番号5と実質的に相同な配列と相補的な配列からなる群から選択される配列を含む、請求項1の方法。
【請求項３】
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号1、配列番号1と相補的な配列、配列番号1と実質的に相同な配列及び配列番号1と実質的に相同な配列と相補的な配列からなる群から選択される配列を含む、請求項1の方法。
【請求項４】
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号6、配列番号6と相補的な配列、配列番号6と実質的に相同な配列及び配列番号6と実質的に相同な配列と相補的な配列からなる群から選択される配列を含む、請求項1の方法。
【請求項５】
コドン599がバリンをコードする、請求項1の方法。
【請求項６】
コドン599がGTG、GTA、GTC及びGTTからなる群から選択される、請求項5の方法。
【請求項７】
突然変異を含むコドン599が、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸をコードする、請求項1の方法。
【請求項８】
突然変異を含むコドン599が、GAG、GAA、GGG、GGA、GGC及びGGTからなる群から選択される、請求項7の方法。
【請求項９】
以下の工程：
エクソン15のコドン599を含むBRAF配列を含む患者サンプルを提供する工程；
前記患者サンプルをシークエンシングする工程；及び
エクソン15のコドン599における突然変異の存在を決定する工程；
を含む、患者におけるメラノーマ細胞の悪性度の検出方法。
【請求項１０】
突然変異を含むコドン599が、グルタミン酸又はアスパラギン酸をコードする、請求項9の方法。
【請求項１１】
前記患者サンプルをシークエンシングする前に該患者サンプルを増幅する工程を更に含む、請求項9の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
BRAF遺伝子のエクソン15、コドン599を含むBRAF遺伝子のエクソン15の一部及びその相補鎖からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
前記オリゴヌクレオチドプローブと、配列番号5の配列及び第1の標識を含む野生型レポーターとをハイブリダイズする工程；
前記オリゴヌクレオチドプローブと、第2の標識を含む変異型レポーターとをハイブリダイズする工程(ここで、該変異型レポーターは、配列番号6の配列、配列番号5に相補的な配列、配列番号6に相補的な配列、配列番号6と80%を超える相同性を有する配列、配列番号5に相補的な配列と80%を超える相同性を有する配列及び配列番号6に相補的な配列と80%を超える相同性を有する配列からなる群から選択される)；及び
第1の標識からのシグナル及び第2の標識からのシグナルを検出する工程；
を含む、メラノーマ細胞の悪性度の検出方法。
【請求項１３】
第1の標識からのシグナルと第2の標識からのシグナルとの比を決定する工程を更に含む、請求項12の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、BRAF遺伝子のエクソン15の一部である、請求項12の方法。
【請求項１５】
前記BRAF遺伝子のエクソン15の一部が、配列番号1、配列番号1と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、コドン599を含む配列番号1の一部及び配列番号1の対立変異体からなる群から選択される、請求項14の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドプローブがコドン599を含み、ここでコドン599がバリン(Val、V)をコードする、請求項12の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドプローブがコドン599における突然変異を含む、請求項12の方法。
【請求項１８】
前記突然変異がグルタミン酸(Glu、E)又はアスパラギン酸(Asp、D)をコードする、請求項17の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドプローブのコドン599における突然変異を検出する工程を更に含む、請求項12の方法。
【国際調査報告】
2007513616.tif 000004
2007513616.tif 000005
2007513616.tif 000006