(57)【要約】  本発明は、腫瘍壊死因子α誘導因子（ＴＡＩＦ）またはインターロイキン３２（ＩＬ−３２）と称されるインターロイキン１８誘導サイトカインに関する組成物及び方法に関する。特に、本発明は、部分的に腫瘍壊死因子α発現を調節することにより自己免疫疾患及び癌を治療するための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５と少なくとも８０％同一であり、ＩＬ−３２をコードし、ＩＬ−３２のエキソン３及びエキソン４を実質的に隣接関係で含む配列を含む精製核酸。
【請求項２】
ＩＬ−３２が配列番号７のアミノ酸配列を含むα−イソ型である請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＩＬ−３２が配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−イソ型である請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ＩＬ−３２が配列番号１０のアミノ酸配列を含むδ−イソ型である請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
配列がＩＬ−３２のイントロン４を欠いている請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
配列が配列１５と少なくとも９０％同一である請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
配列が配列番号３、配列番号４及び配列番号６からなる群から選択される請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
配列が異種プロモーターに機能し得る形で連結されている請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
核酸がベクター内に含まれている請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１の核酸によりコードされる精製タンパク質。
【請求項１２】
ＩＬ−３２が配列番号７のアミノ酸配列を含むα−イソ型である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＩＬ−３２が配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−イソ型である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＩＬ−３２が配列番号１０のアミノ酸配列を含むδ−イソ型である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
ＩＬ−３２がγ−イソ型でない請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＩＬ−３２が配列番号１４のアミノ酸配列を含まない請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＩＬ−３２が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される細胞において発現される組換えタンパク質である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１８】
組換えタンパク質が融合タンパク質である請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
請求項１１に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のモノクローナル抗体のＦａｂ断片。
【請求項２２】
モノクローナル抗体が３２−４及び３２−９から選択される請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体が標的細胞によるＩＬ−３２誘導ＴＮＦα産生を抑制する請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体が標的細胞においてＩＬ−３２誘導ＩκＢ分解を抑制する請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が標的細胞において迅速なＩＬ−３２誘導ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化を抑制する請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２７】
少なくとも１つの細胞をＴＮＦα産生を誘導するのに適した条件下でＩＬ−３２タンパク質と接触させることを含むＴＮＦα産生の誘導方法。
【請求項２８】
ＩＬ−３２タンパク質をα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの細胞が白血球からなる請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
白血球を単核及びマクロファージからなる群から選択する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）被験者及びＩＬ−３２に結合する抗体を用意し、ｂ）前記被験者に前記抗体を投与することを含む被験者の治療方法。
【請求項３２】
ＩＬ−３２をα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
被験者が自己免疫疾患を有している、自己免疫疾患を有していると疑われる、または自己免疫疾患を有する恐れがある請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
自己免疫疾患が多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、１型糖尿病、グレーブス病、橋本病、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、脈管炎、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症、シェーグレン症候群、乾せん、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡及び白斑からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体がヒトモノクローナル抗体及びヒト化マウスモノクローナル抗体からなる群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
投与が自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を緩和するのに適した条件下で行われる請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
被験者が敗血症患者である請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）請求項１１に記載のＩＬ−３２タンパク質及び少なくとも１つの薬物候補を用意すること、
ｂ）前記ＩＬ−３２タンパク質の少なくとも１つの活性に対する前記薬物候補の効果を分析すること
を含むＩＬ−３２阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項３９】
ＩＬ−３２がα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される組換えタンパク質である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
薬物候補がＩＬ−３２反応性モノクローナル抗体及びドミナントネガティブＩＬ−３２バリアントからなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＩＬ−３２タンパク質の少なくとも１つの活性がＴＮＦα発現の上方制御を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）被験者及び請求項１１に記載のＩＬ−３２タンパク質を用意すること、
ｂ）前記ＩＬ−３２タンパク質を前記被験者に投与すること
を含む被験者の治療方法。
【請求項４３】
ＩＬ−３２がα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される組換えタンパク質である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
被験者が癌を有している、癌を有していると疑われる、または癌を有する恐れがある請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子α誘導因子（ＴＡＩＦ）またはインターロイキン３２（ＩＬ−３２）と称されるインターロイキン１８誘導サイトカインに関する組成物及び方法に関する。特に、本発明は、部分的に腫瘍壊死因子α発現を調節することにより自己免疫疾患及び癌を治療するための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、世界中の成人の約１％を襲っている一般的な慢性炎症性関節炎であり、女性が多く、ピーク発病は３０歳代である（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，“Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０００）；及びＣｏｈｅｎ，“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，フィラデルフィアに所在のＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９年）発行，ｐ．１０６７−１０８８参照）。滑膜性の連結で強い炎症が起こり、滑膜に単核食細胞、リンパ球及び好中球が浸潤しているために強い関節痛が生じている。加えて、ＲＡ患者は通常関節の周りの軟膏及び硬骨が損失して、可動性が失われる。
【０００３】
ＲＡの原因は正確に定義されていないが、病気の諸特徴がＲＡ病因に対する自己免疫成分を示している。特に、関節リウマチではマクロファージ及び線維芽細胞誘導サイトカインが大量に発現している（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：３３４７（１９９４））。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターロイキン（ＩＬ−１）は、過剰発現は動物モデルにおいて関節炎を誘発させ得るが、いずれも滑膜細胞増殖、コラゲナーゼ産生及びプロスタグランジン放出を誘導できる点で主要な病原因子であるようである（上掲のＦｉｒｅｓｔｅｉｎ（２０００））。ＩＬ−１８はＲＡ関節中にも存在し、炎症誘発性サイトカインを産生するようにマクロファージを直接活性化できる（Ｇｒａｃｉｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：１３９３（１９９９））。
【０００４】
現在のＲＡ治療は鎮痛、炎症のコントロール及び病気経過の変更に向けられている。より攻撃的な治療アプローチが最近しばしば採用されており、ＲＡ患者は直ぐに非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）から第２系統物質（例えば、メトトレキセート）への変更を要求している。残念ながら、多くの患者でメトトレキセート単独ではＲＡを十分にコントロールできず、医者は追加治療または一連の単一物質、例えばレフルノミド、スルファサラジンまたはＴＮＦ阻害剤のいずれかを選択している（上掲のＦｉｒｅｓｔｅｉｎ（２０００））。ＲＡを治療するために使用してある程度成功したＴＮＦ阻害剤にはＴＮＦ反応性モノクローナル抗体（インフリキシマブ／ＲＥＭＩＣＡＤＥ及びアダリムマブ／ＨＵＭＩＡ）及び可溶性ＴＮＦ受容体／免疫グロブリン融合タンパク質（エタネルセプト／ＥＮＢＲＥＬ）が含まれる。しかしながら、この衰弱させる病気の進行を停止させるべく単独でまたは組み合わせて使用するために追加治療を医者に提供することが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腫瘍壊死因子α誘導因子（ＴＡＩＦ）またはインターロイキン３２（ＩＬ−３２）と称されるインターロイキン１８誘導サイトカインに関する組成物及び方法に関する。特に、本発明は、部分的に腫瘍壊死因子α発現を調節することにより自己免疫疾患及び癌を治療するための組成物及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、配列番号１５と少なくとも８０％同一であり、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）をコードし、ＩＬ−３２のエキソン３及びエキソン４を実質的に隣接関係で含む配列を含む精製核酸を提供する。幾つかの好ましい実施態様では、ＩＬ−３２は配列番号７のアミノ酸配列を含むα−イソ型、配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−イソ型または配列番号１０のアミノ酸配列を含むδ−イソ型である。他の実施態様では、上記配列はＩＬ−３２のイントロン４を欠き、特に好ましい実施態様では上記配列は配列番号１５と少なくとも９０％同一である。配列番号３、配列番号４及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む精製核酸も提供される。幾つかの実施態様では、配列は異種プロモーターに対して機能し得る形で連結されている。好ましい実施態様では、核酸はベクター内に含まれている。更に、ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０００７】
加えて、本発明は、配列番号１５と少なくとも８０％同一であり、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）をコードし、ＩＬ−３２のエキソン３及びエキソン４を実質的に隣接関係で含む配列を含む核酸によりコードされる精製タンパク質を提供する。幾つかの好ましい実施態様では、ＩＬ−３２は配列番号７のアミノ酸配列を含むα−イソ型、配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−イソ型または配列番号１０のアミノ酸配列を含むδ−イソ型である。他の実施態様ではＩＬ−３２はγ−イソ型ではなく、好ましい実施態様ではＩＬ−３２は配列番号１４のアミノ酸配列を含まない。幾つかの好ましい実施態様では、ＩＬ−３２は細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される細胞において発現される組換えタンパク質である。これらの実施態様のサブセットでは、組換えタンパク質は融合タンパク質である。
【０００８】
本発明はまた、ＩＬ−３２に結合する抗体も提供する。幾つかの好ましい実施態様では抗体はモノクローナル抗体であり、他の実施態様ではモノクローナル抗体のＦａｂ断片が提供される。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は３２−４及び３２−９から選択されるが、これらに限定されない。３２−４  ｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞はバージニア州マナサスに所在のＢｏｕｌｅｖａｒｄ大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。３２−９  ｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞もＡＴＣＣに寄託されている。更に、幾つかの好ましい実施態様では、モノクローナル抗体はキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体から選択されるが、これらに限定されない。これらの実施態様のサブセットでは、モノクローナル抗体は標的細胞によるＩＬ−３２誘導ＴＮＦα産生を抑制し、標的細胞におけるＩＬ−３２誘導ＩκＢ分解を抑制し及び／または標的細胞における迅速なＩＬ−３２誘導ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化を抑制する。
【０００９】
更に、本発明は、少なくとも１つの細胞とＩＬ−３２タンパク質をＴＮＦα産生を誘導するのに適した条件下で接触させることを含むＴＮＦα産生の誘導方法を提供する。好ましい実施態様では、ＩＬ−３２タンパク質はα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、少なくとも１つの細胞は白血球を含む。これらの実施態様のサブセットでは、白血球は単球及びマクロファージからなる群から選択される。
【００１０】
本発明はまた、被験者及びＩＬ−３２を結合する抗体を用意し、前記被験者に前記抗体を投与することを含む被験者の治療方法も提供する。好ましい実施態様では、ＩＬ−３２はα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される。特に好ましい実施態様では、被験者は自己免疫疾患を有している、自己免疫疾患を有していると疑われている、または自己免疫疾患を有する恐れのある者である。幾つかの実施態様では、自己免疫疾患は多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、１型糖尿病、グレーブス病、橋本病、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、脈管炎、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症、シェーグレン症候群、乾せん、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡及び白斑から選択されるが、これらに限定されない。本発明はヒトモノクローナル抗体及びヒト化マウスモノクローナル抗体から選択される抗体を提供するが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、投与は自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を緩和するのに適した条件下でなされる。
【００１１】
更に、本発明は、ＩＬ−３２タンパク質及び少なくとも１つの薬物候補を用意し、前記薬物候補のＩＬ−３２タンパク質の少なくとも１つの活性に対する効果を分析することを含むＩＬ−３２阻害剤のスクリーニング方法も提供する。幾つかの実施態様では、ＩＬ−３２タンパク質はα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択され組換えタンパク質である。好ましい実施態様では、薬物候補はＩＬ−３２反応性モノクローナル抗体及びドミナントネガティブＩＬ−３２バリアントから選択されるが、これらに限定されない。特に好ましい実施態様では、ＩＬ−３２タンパク質の少なくとも１つの活性はＴＮＦα発現の上方制御を含む。
【００１２】
本発明はまた、被験者及びＩＬ−３２タンパク質を用意し、前記被験者に前記ＩＬ−３２タンパク質を投与することを含む被験者の治療方法も提供する。好ましい実施態様では、ＩＬ−３２タンパク質はα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される組換えタンパク質である。特に好ましい実施態様では、被験者は癌にかかっている、癌にかかっていると疑われる、または癌にかかる恐れのある者である。
【００１３】
本発明はまた、被験者由来の血清及びＩＬ−３２反応性抗体を用意し、前記血清を前記抗体を用いてＩＬ−３２を定量するのに適した条件下でスクリーニングすることを含む被験者の血清中のＩＬ−３２濃度を測定するための方法及びキットも提供する。幾つかの実施態様では被験者は自己免疫疾患患者であり、他の実施態様では被験者は敗血症患者である。幾つかの好ましい実施態様ではスクリーニングは電気化学ルミネッセンスアッセイにより実施され、他の実施態様ではスクリーニングは酵素結合免疫検定法により実施される。幾つかの実施態様では、ＩＬ−３２反応性抗体はポリクローナル家兎及びヒト−ＩＬ−３２抗体及びモノクローナルマウス抗ヒトＩＬ−３２抗体から選択されるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
本発明の理解を助けるために、多数の用語及び成句は以下のように定義される。
【００１５】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。前記ポリペプチドは、完全長または断片の所望活性または機能性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が維持される限り完全長コード配列またはコード配列の一部によりコードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域及び遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するように５’及び３’の両末端のコード領域に隣接して位置している配列も包含する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’、すなわち下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は遺伝子のｃＤＮＡ形態及びゲノム形態を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」または「介在配列」と称される非コード領域で中断され得るコード領域を含む。イントロンは核または一次転写産物から除去または“スプライシング”され、従ってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは翻訳中新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
【００１６】
特に、用語「ＴＡＩＦ遺伝子」及び「ＩＬ−３２遺伝子」は、完全長ＩＬ−３２ヌクレオチド配列を指す。しかしながら、この用語はＩＬ−３２ヌクレオチド配列の断片及び完全長ＩＬ−３２ヌクレオチド配列内の他のドメイン（例えば、機能ドメイン）を包含すると意図される。更に、用語「ＩＬ−３２遺伝子」、「ＩＬ−３２ヌクレオチド配列」及び「ＩＬ−３２ポリヌクレオチド配列」はＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、用語「プラスミド」は、ＤＮＡの小さい独立的に複製する片を指す。また、用語「裸プラスミド」は、通常トランスフェクションに影響を及ぼすために使用される外来材料が欠けているプラスミドＤＮＡを指す。本明細書中で使用する場合、「裸プラスミド」はカルシウム−ホスフェート、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソーム及び／またはポリアミンを実質的に含まないプラスミドを指す。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、用語「精製された」は、自然環境から取り出された、単離または分離された分子（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指す。「実質的に精製された」分子は、天然に結合している他の成分を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【００１９】
用語「組換えＤＮＡ」は、分子生物学的技術により一緒に連結されているＤＮＡセグメントからなるＤＮＡ分子を指す。また、用語「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡから発現されるタンパク質分子を指す。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、用語「融合タンパク質」は、２つの遺伝子配列を組み合わせることにより作成されるハイブリッド遺伝子の発現により形成されるタンパク質を指す。通常、これはｃＤＮＡを既存遺伝子とインフレームで発現ベクターにクローン化することにより実施される。融合パートナーは、レポーター（例えば、βｇａｌ）として作用し得、単離目的のための道具を提供し得（例えば、ＧＳＴ）、またはインビボでタンパク質の半減期を向上させ得る（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ）。
【００２１】
組換えタンパク質を産生するための適当な系には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫（例えば、バキュロウイルス）、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）、植物（例えば、サフラワー）及び無細胞系（例えば、家兎網状赤血球）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、用語「コード領域」は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチド中に存在するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は真核生物において５’側では開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット“ＡＴＧ”、３’側では終止コドンを特定する３トリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡ）と接している。
【００２３】
天然に存在するタンパク質分子に関連してアミノ酸配列を本明細書中に示すとき、用語「アミノ酸配列」及び類似用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」はアミノ酸配列が当該タンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定されるとは意味しない。
【００２４】
用語「野生型」は、天然起源から単離したとき遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は最も頻繁に集団中に見られるものであり、よって任意に遺伝子の「通常」すなわち「野生型」形態を指す。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、遺伝子または遺伝子産物に関して用語「ミュータント」、「多形」及び「バリアント」は、野生型遺伝子または親遺伝子産物と比較して配列及び／または機能性（すなわち、各種特性）の点での変化を指す。幾つかの好ましい実施態様では、用語「ミュータント」は突然変異の結果として親遺伝子または遺伝子産物とは異なる遺伝子または遺伝子産物を指す。天然及び誘導ミュータントは単離され得ることに注目されたい。これらは、野生型遺伝子または親遺伝子産物と比較して変化した特性を有しているという事実により同定される。加えて、ミュータント遺伝子は実験室において人工的（例えば、部位特異的変異）または合成的に作成され得る。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「インターロイキン−３２」、「ＩＬ−３２」、「ＴＡＩＦ」、「腫瘍壊死因子α誘導因子」、「ＮＫ４」及び「ナチュラルキラー細胞転写物４」は、ヒトＩＬ−３２遺伝子（例えば、配列番号１１のホモサピエンス）及びその遺伝子産物（例えば、野生型α、β、γ及びδイソ型、並びにそのバリアント）を指す。残基の２０％以下（好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、最も好ましくは１％以下）が野生型ＩＬ−３２配列と異なるＩＬ−３２バリアントも本発明の方法及び組成物において使用するのに適している（これには配列番号１２として開示されているマウスｃＤＮＡ断片に対応する遺伝子産物が含まれるが、これに限定されない）。対照的に、本明細書中で使用する場合、用語「ＮＫ４」、「ＴＡＩＦ」及び「ＩＬ−３２」は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の特定アンタゴニスト（Ｄａｔｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２０：１−６（１９９７））であるＨＧＦ／ＮＫ４と称される（または、Ｎ末端ヘパリンドメイン及びその後の４つのクリングルドメインについて単にＮＫ４と称される）ＨＧＦの内部断片を指さない。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション」は相補的核酸の対形成を指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合力）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ及び核酸内のＧ：Ｃ比のような諸因子により影響される。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、用語「Ｔｍ」は「融点」に関して使用される。融点は、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離するようになる温度である。核酸のＴｍを計算する式は当業界で公知である。一般的文献に記載されているように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌで水溶液中にあるときにはＴｍ値の簡単な推定値は式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）により計算され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５））。他の文献には、Ｔｍを算出するために構造及び配列特徴を考慮するより高性能な計算が含まれている。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションを実施する温度、イオン強度及び他の化合物（例えば、有機溶媒）の存在の条件に関して使用される。当業者は「ストリンジェンシー」条件が個別にまたはまとめて記載されているパラメーターを変化させることにより変更され得ることを認識している。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸対形成は高頻度の相補的塩基配列を有している核酸断片間でのみ生ずる（例えば、「高ストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは約８５〜１００％の同一性、好ましくは約７０〜１００％の同一性を有するホモログ間で起こり得る）。「中ストリンジェンシー」条件では、核酸対形成は中頻度の相補的塩基配列を有している核酸間で生ずる（例えば、「中ストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは約５０〜７０％の同一性を有するホモログ間で起こり得る）。よって、“弱”または“低”ストリンジェンシーの条件は、相補配列の頻度が通常低いので遺伝的に異なる生物から誘導される核酸の場合にしばしば必要である。
【００３０】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、用語「高ストリンジェンシー条件」及び「ストリンジェントな条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いるとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ，６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート試薬及び１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリダイゼーション及びその後の０．１×ＳＳＰＥ、１．０％  ＳＤＳを含む溶液中での４２℃での洗浄に等しい条件を含む。
【００３１】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、用語「中ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いるとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ，６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート試薬及び１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリダイゼーション及びその後の１．０×ＳＳＰＥ、１．０％  ＳＤＳを含む溶液中での４２℃での洗浄に等しい条件を含む。
【００３２】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、用語「低ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いるとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ，６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．１％  ＳＤＳ、５×デンハート試薬［５０×デンハートは５００ｍｌあたり５ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ（タイプ４００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇ  ＢＳＡ（フラクションＶ，Ｓｉｇｍａ）］及び１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリダイゼーション及びその後の５×ＳＳＰＥ、１．０％  ＳＤＳを含む溶液中での４２℃での洗浄に等しい条件を含む。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、用語「ノーザンブロット」は、その後のハイブリダイゼーションアッセイで使用するために変性ＲＮＡを固体支持体上へ移す方法を指す。通常、全ＲＮＡまたはポリＡ富化ＲＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、膜に移し、放射性標識したＤＮＡまたはＲＮＡ断片を用いてプローブすると、特定のＲＮＡ配列が検出される。ノーザンブロットは当業界でルーチンに使用されている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）；及びＡｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨークに所在のＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４年）発行参照）。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、用語「サザンブロット」は、その後のハイブリダイゼーションアッセイで使用するためにアガロース電気泳動により分画した変性ＤＮＡを固体支持体に移す方法を指す。この方法は、通常アガロース電気泳動前にゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、このＤＮＡを膜に移し、特定のＤＮＡ配列を検出するために放射性標識したＤＮＡまたはＲＮＡ断片とインキュベーションすることを含む。サザンブロットは当業界でルーチンに使用されている（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３−５１７（１９７５）；及び上掲のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９４年）参照）。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、クローニングまたは精製することなくＤＮＡ混合物中の標的配列のセグメントの濃度を高める方法を指す（例えば、参照により本明細書に含まれるとする米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書及び同第４，９６５，１８８号明細書参照）。この標的配列の増幅方法は、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを所望標的細胞を含むＤＮＡ混合物に導入した後ＤＮＡポリメラーゼの存在下で熱サイクルを正確に繰り返すことを含む。前記した２つのプライマーは２本鎖標的配列の各鎖に対して相補性である。増幅を実施するためには、混合物を変性し、その後プライマーを標的分子内の相補性配列にアニーリングする。アリーリング後、プライマーをポリメラーゼを用いて延長させて新しい対の相補鎖を形成する。この変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ延長のステップ（すなわち、変性、アニーリング及び延長が１“サイクル”を構成する）を複数回繰り返すと、所望標的配列の増幅セグメントが高濃度で得られ得る。所望標的配列の増幅セグメントの長さは、プライマーの相互の相対位置により決められ、従ってこの長さは制御可能なパラメーターである。前記プロセスの反復性により、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応（以下、“ＰＣＲ”）」と称される。標的配列の所望増幅セグメントは（濃度の点で）混合物中の優勢な配列となるので、これらのセグメントは“ＰＣＲ増幅される”ものである。鋳型がＲＮＡの場合、逆転写（ＲＴ）ステップは増幅サイクル前に意図される。よって、この変法は“ＲＴ−ＰＣＲ”と称される。
【００３６】
用語「抗体」はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を指す。当該タンパク質またはその断片に対する免疫反応の結果として動物において形成されるポリクローナル抗体は、その後公知方法を用いて血液から容易に単離され、例えばカラムクロマトグラフィーにより精製され得る。モノクローナル抗体も公知方法（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９（１９９１）参照）により作成され得る。本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、組換え技術で作成し、修飾された抗体及びその抗原結合断片、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性抗体、一本鎖抗体及びＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２断片を包含する。抗体に関して使用される用語「反応性」は、抗体が当該抗原に結合できることを意味する。例えば、ＩＬ−３２反応性抗体は、ＩＬ−３２またはＩＬ−３２断片に結合する抗体である。
【００３７】
用語「ドミナントネガティブミュータント」は、野生型活性を欠くが、基質、受容体等に関して野生型分子と効果的に競合し、よって野生型分子の活性を阻害する分子を指す。好ましい実施態様では、用語「ＩＬ−３２ドミナントネガティブミュータント」は、ＩＬ−３２受容体に関して野生型ＩＬ−３２タンパク質と競合するが、ＩκＢの分解、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化及びＴＮＦα産生のような下流効果を誘導できないＩＬ−３２ミュータントタンパク質を指す。適当なドミナントネガティブＩＬ−３２ミュータントはランダムＩＬ−３２ミュータントのライブラリーから選択され得、またはＴＮＦ系（Ｓｔｅｅｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：１８９５−１８９８（２００３））に記載されているように合理的に設計され得る。
【００３８】
ヌクレオチド配列に関して使用される場合、用語「一部」は、１０ヌクレオチド〜全ヌクレオチド配列−１ヌクレオチドのサイズを有する前記配列の断片を指す。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語「生物学的に活性な」は、野生型ＩＬ−３２分子の構造、調節及び／または生化学的機能を有する分子を指す。幾つかの例では生物学的に活性な分子は哺乳動物ＩＬ−３２分子のホモログであり、他の例では生物学的に活性な分子は哺乳動物ＩＬ−３２分子の一部である。本発明の組成物及び方法に使用される他の生物学的に活性な分子には、ミュータント（例えば、少なくとも１つの欠失、挿入または置換を有するミュータント）哺乳動物ＩＬ−３２分子が含まれるが、これに限定されない。生物学的活性は、例えば実施例に記載されているインビトロでのＴＮＦ−α誘導を測定することにより調べられる。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、用語「動物」は、細胞壁及びクロロフィルの不在及び自発運動能力の点で植物細胞とは異なる細胞を有する生物を含む動物界のメンバーを指す。本発明の好ましい実施態様は、主に動物界の脊椎動物（脊柱または脊索）メンバーである。
【００４１】
用語「患者」及び「被験者」は、医学的治療を受ける候補者である哺乳動物（ヒトまたは動物）を指す。
【００４２】
用語「対照」は、実験被験者またはサンプルを比較するための基礎を与える被験者またはサンプルを指す。例えば、対照被験者またはサンプルを用いると、実験手順の有効性が確認できる。幾つかの実施態様では、用語「対照被験者」は偽治療（例えば、ＰＢＳ単独または食塩液中正常家兎ＩｇＧ）を受ける動物を指す。
【００４３】
用語「サンプル」及び「試料」は広義で使用される。この用語は試料または培養物を含むと意味する一方、この用語は生物学的及び環境サンプルの両方を含むと意味する。この用語にはヒト及び他の動物から得られるあらゆるタイプのサンプルが包含され、体液（例えば、尿、血液、便、脊髄液、精液、唾液及び創傷滲出液）及び固体組織が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、これらの例は本発明に適用されるサンプルの種類を限定すると解釈されない。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「白血球」は、身体が感染及び他の疾患と戦うのを助ける白血球と称される細胞を指し、顆粒球（例：好中球、好酸球、好塩基球）、単核食細胞及びリンパ球（例：Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞）が例示される。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、用語「単球」は、後に組織に移出し、マクロファージに分化する血液中に循環している単核食細胞を指す。用語「マクロファージ」は、血液単球から誘導される哺乳動物組織の比較的長命の食細胞を指す。異なる部位からのマクロファージは明らかに異なる特性を有する。主タイプは腹腔及び肺胞マクロファージ、組織マクロファージ（組織球）、肝臓のクッパー細胞及び破骨細胞である。マクロファージは、幾つかの細菌、原生細胞及び腫瘍細胞の死滅、免疫系の他の細胞を刺激する物質の放出及びプロセス抗原のＴリンパ球への提示において重要な役割を発揮する。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「炎症」は、血流及び白血球の組織への進入の多さを特徴とし、膨潤、発赤、高い温度及び痛みが生ずることを特徴とする外傷に対する組織応答を指す。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「症状」は、病気または患者の状態（例えば、幾つかの身体的または精神状態を示す患者の状態の変化）の主観的証拠を指す。
【００４８】
例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の関係における成句「炎症の症状」は、本明細書において腹痛、下痢、直腸出血、体重減少、発熱、食欲不振及び他の重大な合併症（例えば、脱水、貧血及び栄養不良）のような症状が含まれると定義されるが、これらに限定されない。多くの症状は定量分析（例えば、体重減少、発熱、貧血等）を受ける。幾つかの症状は血液検査（例えば、貧血）または血液の存在（例えば、直腸出血）を検出する検査から容易に判明する。
【００４９】
また、ＩＢＤの関係における成句「症状が軽減する状態で」は、ＩＢＤの検出可能な症状が定性的または定量的に軽減する程度を指し、病気からの回復度（例えば、体重増加率）または腹痛、下痢、直腸出血、体重減少、発熱、食欲不振、脱水、貧血、膨張、線維化、炎症腸管及び栄養不良の症状の少なくとも１つの軽減に対する検出可能な影響が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
用語「自己免疫疾患」は、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害（例えば、ギラン−バレー）、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、１型糖尿病、グレーブス病、橋本病、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、脈管炎（例えば、ウェグナー肉芽腫症）、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、シェーグレン症候群、乾せん、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡及び白斑が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、用語「関節リウマチ」及び「ＲＡ」は、関節が破壊している慢性炎症性疾患を指す。ＲＡは、免疫複合体が関節に形成され、炎症性応答（複合体媒介過敏反応）を促す自己免疫疾患と見なされる。細胞媒介（ＩＶ型）過敏反応も起こり、その結果マクロファージが蓄積し、滑膜が破壊する。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「ＩＢＤ」及び「炎症性腸疾患」は幾つかの病的プロセス、最も一般的には潰瘍性大腸炎及びクローン病を包含する一般的用語である。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、用語「クローン病」は胃腸管の炎症性疾患を指す。一般的症状には、再発する腹痛、発熱、悪心、嘔吐、体重減少、及び時々血が混じる下痢が含まれる。
【００５４】
用語「化合物」及び「薬物候補」は、身体機能の疾患、病気、疾病または障害を治療または予防するために使用され得る化学的または生物学的単位（例えば、医薬品、薬物等を含む）を指す。化合物は公知の治療用化合物及び潜在的な治療用化合物を含む。化合物はスクリーニングにより、例えば本発明のスクリーニング方法を用いて治療用であるかが調べられ得る。「公知の治療用化合物」は、治療または予防において有効であることが（例えば、動物実験によりまたはヒトに投与した今までの経験で）立証されている治療用化合物を指す。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、用語「アゴニスト」は、「天然」または「自然」化合物の作用に似せた分子または化合物を指す。アゴニストはコンフォメーション、電荷または他の特性に関して天然化合物と相同であり得る。よって、アゴニストは細胞表面で発現する受容体により認識され得る。この認識により、天然化合物が存在していたのと同様に細胞がアゴニストの存在と反応するように細胞内で生理学的及び／または生化学的変化が生じ得る。アゴニストには、ＩＬ−３２結合タンパク質に結合または相互作用するタンパク質、核酸、炭水化物または他の分子が含まれ得る。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、用語「アンタゴニスト」及び「阻害剤」は、「天然」または「自然」化合物の作用を抑制する分子または化合物を指す。アンタゴニストはコンフォメーション、電荷または他の特性に関して天然化合物と相同であってもなくてもよい。よって、アンタゴニストは、アゴニストが認識する同一または異なる受容体により認識され得る。アンタゴニストは、アゴニストの作用を防止する（例えば、天然ＩＬ−３２がＩＬ−３２受容体に結合するのを防止する）アロステリック効果を有し得る。アゴニストと対照的に、アンタゴニスト化合物は、あたかも天然化合物が存在していたようにして細胞がアゴニストに対して反応するようには細胞内で生理学的及び／または生化学的変化を生じさせない。アンタゴニスト及び阻害剤には、ＩＬ−３２結合タンパク質に結合または相互作用するかまたは機能的ＩＬ−３２マルチマーの形成を防止するタンパク質、核酸、炭水化物または他の分子が含まれ得る。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、用語「調節する」は生物学的活性の変化または変更を指す。調節はタンパク質活性の上昇または低下、結合特性の変化、またはタンパク質または他の興味深い構造物の活性に関連する生物学的、機能的または免疫学的特性の他の変化であり得る。
【００５８】
発明の説明
インターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、先天性及び適応免疫応答の両方において役割を有する多機能サイトカインである。ＩＬ−１８は、広範囲のＴｈ１またはＴｈ２関連自己免疫疾患における効果について研究されてきた（Ｏｋａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３７８：８８−９１（１９９５）；Ｎａｋａｎｉｓｈｉら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，１２：５３−７２（２００１）；Ｏｋａｍｕｒａら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７０：２８１−３１２（１９９８））。ＩＬ−１及びＩＬ−１８は構造類似性を有するＩＬ−１ファミリーに属し、プロセシングのためにカスパーゼ１を必要とする（Ｂａｚａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：５９１（１９９６）；及びＧｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：２０６−２０９（１９９７））。ＩＬ−１８はまた、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）の補充、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６とのＩＲＡＫ複合体の形成及びＩκＢα／ＮＦ−κＢのカスケードの活性化を含めた類似のシグナル伝達経路を誘因する（Ｋｏｊｉｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４４：１８３−１８６（１９９８）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３４：４５４−４５７（１９９７）；及びＲｏｂｉｎｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：５７１−５８１（１９９７））。ＩＬ−１サイトカインファミリーのメンバーは自己免疫疾患及び炎症性疾患において病理学的役割を発揮すると考えられている。なぜならば、ＩＬ−１及びＩＬ−１８活性を阻止すると関節リウマチ及び全身炎症を持っている被験者の病気重篤度を低下させるからである（Ａｒｅｎｄ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５４：１６７−２２７（１９９３）；Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｂｌｏｏｄ，８７：２０９５−２１４７（１９９６）；Ｎｏｖｉｃｋら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１０：１２７−１３６（１９９９）；及びＢａｎｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：２１００−２１０５（２００３））。しかしながら、ヒトＮＫ及びＫＧ−１細胞系のような少数の細胞系しかＩＬ−１８に応答しないのでＩＬ−１８誘導遺伝子の研究を妨げるものがある。加えて、これらの細胞系はＩＬ−１８に応答するが、ＩＬ−１８応答性を発現させるためには補助刺激因子、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５を必要とする（Ａｈｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９５：２１２５−２１３１（１９９７）；Ｏｈｔｓｕｋｉら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｖ．，１７：３２５３−３２５８（１９９７）；Ｌａｕｗｅｒｙｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：１８４７−１８５３（２０００）；及びＨｏｓｈｉｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：５１−５９（１９９９））。補助刺激因子が必要なことから、遺伝子発現のＩＬ−１８誘導の独立評価が妨げられる。
【００５９】
ＩＬ−１８は２つの公知受容体鎖、すなわちリガンド結合ＩＬ−１８Ｒα鎖及びシグナル伝達ＩＬ−１８Ｒβ鎖を有する。ＩＬ−１８受容体の両鎖はＩＬ−１受容体ファミリーに属し、細胞外領域中の３つのＩｇ様ドメインから構成されている（Ｋａｔｏら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０：９６６−９７１（２００３）；及びＹａｍａｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１７：１８１−１８６（２００４））。ＩＬ−１８調節に関与する追加成分はＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である。ＩＬ−１８ＢＰはＩＬ−１８シグナル伝達複合体の一部ではなく、むしろＩＬ−１８活性を拮抗させる（Ｋｉｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１１９０−１１９５（２０００）；及びＮｏｖｉｃｋら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１０：１２７−１３６（１９９９））。ＩＬ−１８ＢＰは単一Ｉｇ様ドメインからなる分泌受容体様分子である。ＩＬ−１８ＢＰはウイルスタンパク質と高い相同性を有し、ヒトＩＬ−１８の生物学的活性を中和する（Ｘｉａｎｇ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５７：２９７−３０２（１９９９）；Ｒｅａｄｉｎｇ及びＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：９９６０−９９６８（２００３）；Ｅｓｔｅｂａｎ及びＢｕｌｌｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２３：１９７−２０７（２００４）；及びＥｓｔｅｂａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８５：１２９１−１２９９（２００４））。
【００６０】
補助刺激剤の非存在下では、ＩＬ−１８Ｒβ鎖は全くまたは殆ど発現しないので非免疫細胞はＩＬ−１８に応答しない（Ｔｈｏｍａｓｓｅｎら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１８：１０７７−１０８８（１９９８）；及びＣｈａｎｄｒａｓｅｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０３：１１５２−１１５８（２００３））。従って、ＩＬ−１８シグナルの伝達のためにはこの受容体成分が必要であるので、ＩＬ−１８Ｒβ鎖を発現する安定なクローンを作成しなければならなかった（上掲のＴｈｏｍａｓｓｅｎｔら（１９９８）；及びＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１４８−１５４（２００１））。ＩＬ−１８Ｒβ鎖の安定な発現はヒト肺癌Ａ５４９細胞（Ａ５４９−Ｒβ）において実現され、前記細胞を補助刺激の非存在下でもＩＬ−１８に応答性とする。安定なＡ５４９−Ｒβクローンはマイクロアレー分析によりＩＬ−１８誘導遺伝子を同定するために使用された。実施例１に記載されていたマイクロアレー研究で、１２年前はナチュラルキラー細胞転写物４または単にＮＫ４として記載されていたサイトカイン様分子のＩＬ−１８誘導が分かった（Ｄａｈｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：５９７−６０３（１９９２））。用語「ＮＫ４」は現在は肝細胞成長因子のバリアントを表すために使用されていることに留意すべきである（Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９２：２６８−２７５（２００２））。肝細胞成長因子バリアントとＮＫ４／ＩＬ−３２転写物の間に配列相同性はない。より最近では、悪性メラノーマのために高量のＩＬ−１２治療を受けている患者からのＰＢＭＣで高いＮＫ４発現が報告されている（Ｐａｎｅｌｌｉら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，３（７）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３５（２００２））が、ＮＫ４の機能は本発明の開発に至るまで未知のままであった。
【００６１】
実施例に詳記するように、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）または腫瘍壊死因子α誘導因子（ＴＡＩＦ）と称される新規な炎症性サイトカインがＡ５４９−Ｒβ細胞のマイクロアレー分析から同定された。加えて、ＩＬ−３２の遺伝子構造、発現パターン及び機能も解明された。本発明が開発されるまで、ＩＬ−３２の単一イソ型（ＴＡＩＦγ／ＮＫ４）は機能が未知のリンパ球転写物として記載されていた（Ｄａｈｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：５９７−６０３（１９９２））。前記転写物は、家族性地中海熱遺伝子座内またはそれに隣接しているヒト染色体１６ｐ１３．３から転写された（Ｂｅｒｎｏｔら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５０：１４７−１６０（１９９８））。本明細書中に記載されているように、ＩＬ−３２は、公知のサイトカインファミリーとの配列相同性を欠いているが、ＴＮＦα分泌を誘導し、公知の炎症誘発性サイトカインの古典的経路を介してシグナル伝達する能力により明らかにサイトカインである。更に、ＩＬ−３２は、ＩＬ−３２調節における類似性及び明白なシグナルペプチドがない点でＩＬ−１サイトカインファミリーのメンバーであると見なされる（Ｇｈａｙｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６１９−６２３（１９９７）；Ｃｅｒｒｅｔｔｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：９７−１００（１９９２）；及びＫｕｉｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：２０００−２００３（１９９５））。加えて、ＩＬ−１及びＩＬ−１８のように、ＩＬ−３２は主に刺激細胞から分泌される。本明細書中で最初に示したように、ＩＬ−３２は典型的な炎症誘発性サイトカインシグナル伝達経路ＮＦκＢ及びｐ３８  ＭＡＰＫを誘因し、それにより炎症誘発性サイトカインＴＮＦαの産生が誘導される。同様に、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８及びＬＰＳはＩＬ−３２発現を誘導し、活性化ＮＫまたはＴ細胞におけるＮＫ４の元の記載とは異なり、各種臓器で偏在性ＩＬ−３２発現が観察された。ＩＬ−３２発現パターンは各種組織により産生されるＩＬ−１５と似ている。これは、専ら活性化Ｔ細胞により産生されるＩＬ−２と対照的である（Ｂａｍｆｏｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２８９７−２９０２（１９９６）；及びＧｒａｂｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：９６５−９６８（１９９４））。
【００６２】
ＩＬ−３２によるＴＮＦαの誘導から、このサイトカインが自己免疫／炎症性疾患病因において重要な役割を有することが分かる。本発明が開発されるまで、（健康人の血清中で観察されたＩＬ−３２レベルと比較して）数人の敗血症患者の循環中で高レベルのＩＬ−３２が観察されることも示されていなかった。すなわち、ＩＬ−３２活性を阻止することが、有効なＴＮＦαブロック手法（Ｄａｖｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．Ｄｉｓ．，５９Ｓｕｐｐｌｌ：１４１−３（２０００）；及びＳｈａｎａｈａｎ及びＳｔＣｌａｉｒ，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０３：２３１−２４２（２００２））と同様に各種自己免疫疾患における非常に有効な治療アプローチであると考えられる。ＩＬ−３２を主成分とする組成物は癌の治療及びＴＮＦα産生を含む細胞死またはアポトーシスの誘導が有効である他の疾患において使用されるであろうとも考えられる。
【００６３】
加えて、マウスＲａｗ２６４．７マクロファージ細胞系はＩＬ−３２受容体を発現し、この受容体はＩＬ−３２により結合したとき活性化される（細胞外ＩＬ−３２機能）と考えられている。しかしながら、ＩＬ−３２が細胞ライゼート中でも検出されたので、ＩＬ−３２は細胞内機能を有しているとも考えられる。よって、ＩＬ−３２は、ＩＬ−１α（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：５０８−５１３（１９９７））及び高易動性グループ１（Ｗａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：２４８−２５１（１９９９））に類似の細胞内及び細胞外タンパク質として活性であると考えられる。
【００６４】
明白なシグナルペプチドの非存在下でのＩＬ−３２の分泌は幾つかのサイトカインファミリーの特徴である（Ｃｅｒｒｅｔｔｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：９７−１００（１９９２）；Ｋｕｉｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：２０００−２００３（１９９５）；及びＧｈａｙｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６１９−６２３（１９９７））。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８と同様に、ＩＬ−３２は刺激一次細胞の細胞培地及び細胞系中に可溶性タンパク質として分泌される。ＩＬ−３２は一次配列分析により可能性あるカスパーゼ１切断部位を持たず、新しいスプライスバリアントが見つかったが、いずれもＮ末端に典型的な疎水性シグナルペプチドを有していない。
【００６５】
複数の種中でのＩＬ−３２の存在は、炎症の調節において重要な役割を果たすと考えられる進化的に保存された分子の証である。数少ないＩＬ−３２イソ型は他の哺乳動物種で同定されたが、この結果はこれらの種でのＥＳＴの相対欠乏を反映し得る。また、マウスＩＬ−３２ホモログの広範囲の研究は不成功に終わった。しかしながら、ウマ及びウシＩＬ−３２ホモログはヒトＩＬ−３２と３１．８〜２８．１％の配列同一性しか有していないので、推定マウスＩＬ−３２遺伝子がヒト遺伝子と非常に低い相同性を有している可能性がある。
【００６６】
本発明の幾つかの好ましい実施態様、すなわち（Ｉ）ＩＬ−３２ポリヌクレオチド、（ＩＩ）ＩＬ−３２ポリペプチド、（ＩＩＩ）ＩＬ−３２抗体、（ＩＶ）ＩＬ−３２ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を含む医薬組成物、及び（Ｖ）ＩＬ−３２阻害剤の同定方法を以下のセクションで記載する。
【００６７】
Ｉ．  ＩＬ−３２ポリヌクレオチド
本発明は、ＩＬ−３２タンパク質、ホモログ、バリアント及びミュータント（例えば、配列番号３、４、６）をコードする核酸を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、ハイブリダイズし得るポリヌクケオチド配列が天然ＩＬ−３２遺伝子のＴＮＦα誘導活性を維持しているタンパク質をコードする限り、高ストリンジェシー条件下で配列番号３、４、６にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列を提供する。幾つかの実施態様では、天然ＩＬ−３２遺伝子のＴＮＦα誘導活性を保持しているタンパク質は野生型ＩＬ−３２と８０％相同、好ましくは９０％相同、より好ましくは９５％相同、最も好ましくは９９％相同である。特に好ましい実施態様では、ＩＬ−３２生物活性を保持しているタンパク質は連続アミノ酸配列ＬＫＡＲＭＨＱＡＩＥＲＦＹＤＫＭＱＮＡＥＳＧＲＧＱＶ（配列番号１３）をコードし、野生型ＩＬ−３２（ＩＬ−３２α、ＩＬ−３２β、ＩＬ−３２γ、ＩＬ−３２δ）と９９％相同である核酸配列を含む。幾つかの好ましい実施態様では、核酸配列は配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードしない。これらの実施態様のサブセットでは、核酸配列は配列番号１５（エキソン４に隣接してエキソン３）に記載されている配列を含む。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づき、定義のセクションで上記した定義「ストリンジェンシー」を与える。
【００６８】
本発明の他の実施態様では、ＩＬ−３２の対立遺伝子を提供する。好ましい実施態様では、対立遺伝子は突然変異（例えば、核酸配列の変化）により生じ、通常構造または機能が変更されているまたは変更されていない変更ｍＲＮＡまたはポリペプチドを生じる。所与の遺伝子は、対立遺伝子形態を、含まず、１つ含み、多数含み得る。対立遺伝子を生ずる一般的な突然変異変化は、通常核酸の欠失、付加または置換の結果と見なされる。これらの変化の各々は単独でまたは他の変化と組み合わせて、所与の配列で１回以上の割合で生じ得る。
【００６９】
本発明の他の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、いろいろな理由でＩＬ−３２コード配列を変化させるように工学操作され得る。前記理由には、遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／または発現を修飾する変更が含まれるが、これに限定されない。例えば、突然変異は当業界で公知の技術（例えば、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先度の変化等のための部位特異的変異）を用いて導入され得る。
【００７０】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を例えば置換、欠失または付加により変更した修飾ペプチドが産生され得る。幾つかの好ましい実施態様ではこれらの修飾は修飾ＩＬ−３２（例えば、ＩＬ−３２アゴニスト）のＴＮＦα誘導活性に大きな影響を与えず、他の好ましい実施態様ではこれらの修飾は修飾ＩＬ−３２（例えば、ＩＬ−３２アンタゴニスト）のＴＮＦα誘導活性を除去する。換言すると、所与の構築物は、構造的よりはむしろ機能的に規定される本発明の修飾またはバリアントＩＬ−３２の属のメンバーであるかどうかを調べるために評価され得る。好ましい実施態様では、バリアントまたはミュータントＩＬ−３２の活性は実施例２に記載されている方法（ＴＮＦα誘導）により評価される。
【００７１】
更に、上記したように、ＩＬ−３２のバリアント形態も本明細書に詳記されているペプチド及びＤＮＡ分子と均等であると見なされる。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンでの分離置換、アスパルテートのグルタメートでの分離置換、スレオニンをセリンでの分離置換、またはアミノ酸を構造的に関連しているアミノ酸での類似置換（すなわち、保存的突然変異）は生じる分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと考えられている。従って、本発明の幾つかの実施態様は保存的置換を含む本明細書に記載されているＩＬ−３２のバリアントを提供する。保存的置換は側鎖に関連あるアミノ酸のファミリー間で起こるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は４つのファミリー、すなわち（１）酸性（アスパルテート、グルタメート）、（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）及び（４）非帯電性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）に分類され得る。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時々芳香族アミノ酸としてまとめて分類されている。同様に、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパルテート、グルタメート）、（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、セリン及びスレオニンは場合により脂肪族−ヒドロキシとして別に分類される、（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）及び（６）硫黄含有（システイン及びメチオニン）として分類され得る（例えば、Ｓｔｙｅｒ編，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐ．１７−２１，第２版，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９８１年）発行）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的ホモログを生ずるかどうかは、バリアントペプチドが野生型タンパク質と同様に機能する能力を評価することにより容易に調べることができる。１つ以上の置換を有するペプチドは同様にして容易に検査することができる。
【００７２】
非常にまれに、バリアントは“非保存的”変化（例えば、グリシンのトリプトファンでの置換）を含む。相似のマイナーな変化はアミノ酸欠失及び／または挿入をも含み得る。生物学的活性を無効にすることなくいずれのアミノ酸を置換、挿入または欠失し得るかを決めるガイダンスはコンピュータープログラム（例えば、ウィスコンシン州マディソンに所在のＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．製ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）を用いて見つけることができる。
【００７３】
ＩＩ．  ＩＬ−３２ポリペプチド
他の実施態様では、本発明はＩＬ−３２ポリペプチド配列をコードするＩＬ−３２ポリヌクレオチド配列を提供する。ＩＬ−３２ポリペプチド（例えば、配列番号７、８、１０）は図４に記載されている。本発明の他の実施態様はＩＬ−３２タンパク質の断片、融合タンパク質または機能的均等物を提供する。本発明の更に他の実施態様では、各種ＩＬ−３２ホモログ及びミュータントに相当する核酸配列は適当な宿主細胞においてＩＬ−３２ホモログ及びミュータントを発現させる組換えＤＮＡ分子を作成するために使用され得る。本発明の幾つかの実施態様ではポリヌクレオチドは天然精製産物であり得、他の実施態様ではポリペプチドは化学合成手順の生成物であり得、更に他の実施態様ではポリペプチドは原核または真核宿主を用いて（例えば、培養されている細菌、酵母、高級植物、昆虫及び哺乳動物により）産生され得る。幾つかの実施態様では、組換え産生法で使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。他の実施態様では、本発明のポリペプチドは当初のメチオニンアミノ酸残基をも含み得る。
【００７４】
本発明の１実施態様では、遺伝コードの固有縮重のために配列番号３、４及び６のポリヌクレオチド配列以外であり、実質的に同一または機能的に均等なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列がＩＬ−３２をクローン化し、発現させるために使用され得る。
【００７５】
（Ａ）  ＩＬ−３２の産生のためのベクター
本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを組換え技術により産生するために使用され得る。例えば、ポリヌクレオチドはポリペプチドを発現させるための各種発現ベクターの１つに組み込まれ得る。本発明の幾つかの実施態様では、ベクターには染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ；バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるプラスミド、ウイルスＤＮＡ（例：ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病））が含まれるが、これらに限定されない。宿主において複製可能であり、生存可能である限り、任意のベクターが使用できると考えられる。
【００７６】
特に、本発明の幾つかの実施態様は上に広く説明した配列（例えば、配列番号３、４、６）の１つ以上を含む組換え構築物を提供する。本発明の幾つかの実施態様では、構築物はベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを含み、このベクターには本発明の配列が順または逆方向に挿入されている。更に別の実施態様では、異種構造配列が翻訳開始及び停止配列と適当な相中で合体されている。本発明の好ましい実施態様では、適当なＤＮＡ配列が各種手順を用いてベクターに挿入される。通常、ＤＮＡ配列は適当な制限エンドヌクレアーゼ中に当業界で公知の手順により挿入される。
【００７７】
多数の適当なベクターが当業界で公知であり、市販されている。前記ベクターには、
１）細菌ベクター：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及び
２）真核ベクター：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ１２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
が含まれるが、これらに限定されない。宿主中で複製可能であり、製造可能である限り、他のプラスミドまたはベクターも使用可能である。本発明の幾つかの実施態様では、哺乳動物発現ベクターは複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサー、更に必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列及び５’フランキング非転写配列を含む。他の実施態様では、ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列及びポリアデニル化部位が必要な非転写遺伝因子を与えるために使用され得る。
【００７８】
（Ｂ）  ＩＬ−３２産生のための宿主細胞
更なる実施態様で、本発明は上記構築物を含む宿主細胞を提供する。本発明の幾つかの実施態様では、前記宿主細胞は高級真核細胞（例えば、哺乳動物または昆虫細胞）である。本発明の他の実施態様では、宿主細胞は下級真核細胞（例えば、酵母細胞）である。本発明の更に別の実施態様では、宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞の具体例には大腸菌、ねずみチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、枯草菌、シュードミナス属、ストレプトミセス属、ストレプトコッカス属及びスタフィロコッカス属中の各種種、並びにサッカロミセス・セレビシエ、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ショウジョウバエＳ２細胞、ヨトウＳｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、Ｃ１２７、３Ｔ３、２９３、２９３Ｔ、ヒーラ細胞及びＢＨＫ細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するための慣用の方法で使用され得る。幾つかの実施態様では、構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより実施され得る。或いは、幾つかの実施態様では、ＩＬ−３２ポリペプチドは慣用のペプチド合成装置を用いて産生される。
【００８０】
（Ｃ）  ＩＬ−３２の精製
本発明はまた、組換え細胞培養物からＩＬ−３２を回収し、精製するための方法を提供する。これらの方法には硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレシチンクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。本発明の他の実施態様では、必要に応じて、成熟タンパク質の立体配置を完成させる際にタンパク質リフォルディングステップを使用し得る。本発明の更に他の実施態様では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製ステップのために使用され得る。
【００８１】
本発明は更に、本発明のポリペプチドを精製できる、コード配列がマーカー配列にインフレームで融合されているポリヌクレオチドを提供する。マーカー配列の非限定例は、ベクター、好ましくはｐＱＥ−９ベクターにより供給され得るヘキサヒスチジンタグであり、細菌宿主ではマーカーに融合されているポリペプチドが精製される。または、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を使用するときにはマーカー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。
【００８２】
（Ｄ）  ＩＬ−３２融合タンパク質
本発明はまた、ＩＬ−３２の全部または一部を含む融合タンパク質を提供する。従って、本発明の幾つかの実施態様では、ポリペプチドのコード配列は、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として導入され得る。このタイプの発現系は、ＩＬ−３２タンパク質の免疫原性断片を産生したい状況下で使用されると考えられる。
【００８３】
免疫原性を高めるために融合タンパク質を使用することに加えて、融合タンパク質はタンパク質（例えば、本発明のＩＬ−３２タンパク質）の発現を促進させ得ると広く認められている。従って、本発明の幾つかの実施態様では、ＩＬ−３２はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（すなわち、ＧＳＴ融合タンパク質）として作成され得る。このＧＳＴ融合タンパク質により、例えばグルタチオン誘導化マトリックスを用いることによりＩＬ−３２を容易に精製できると考えられる。本発明の別の実施態様では、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子、例えばＩＬ−３２の所望部分のＮ末端のポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列により、発現ＩＬ−３２融合タンパク質をＮｉ２＋金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。本発明の更に別の実施態様では、その後精製リーダー配列はエンテロキナーゼでの処理により除去され得る。
【００８４】
（Ｅ）  ＩＬ−３２バリアント
本発明の更に他の実施態様はＩＬ−３２のミュータントまたはバリアント形態を提供する。治療または予防効果、または安定性（例えば、エキソビボの保存寿命及び／またはインビボでのタンパク質分解に対する耐性）を高めるような目的でＩＬ−３２の活性を有するペプチドの構造を修飾させることができる。この修飾ペプチドは本明細書で定義されているＩＬ−３２タンパク質の活性を有するペプチドの機能均等物と見なされる。アミノ酸置換、欠失または付加等によりアミノ酸配列が変更されている修飾ペプチドが産生され得る。幾つかの実施態様では好ましいＩＬ−３２バリアントにはＩＬ−３２アゴニスト（例えば、ＴＮＦα誘導活性を有するＩＬ−３２バリアント）が含まれ、他の好ましいＩＬ−３２バリアントにはＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、ＴＮＦα誘導活性を持たず、野生型ＩＬ−３２タンパク質のＴＮＦα誘導活性を阻害するＩＬ−３２バリアント）が含まれる。
【００８５】
ＩＩＩ．  ＩＬ−３２抗体
ＩＬ−３２タンパク質を検出できるように抗体が作成され得る。前記抗体は各種免疫原を用いて作成され得る。１実施態様では、免疫原は、ヒトＩＬ−３２を認識する抗体を作成するためのヒトＩＬ−３２ペプチドである。前記抗体にはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
当業界で公知の各種手順がＩＬ−３２に対するポリクローナル抗体を作成するために使用され得る。抗体を作成するためには、各種宿主動物にＩＬ−３２エピトープに対応するペプチドを注射することにより前記動物を免疫化し得る。前記動物には家兎、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、ペプチドを免疫原性担体（例えば、ジフテリア毒素、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）にコンジュゲート形成する。免疫応答を高めるために、宿主の種類に応じて各種アジュバントが使用され得る。前記アジュバントにはフロイント（完全及び不完全）、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルーロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント（例：カルメット−ゲラン桿菌））が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
ＩＬ−３２に対するモノクローナル抗体を作成するためには、培養されている連続的経代細胞系により抗体分子を産生する技術が本発明で使用されると考えられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行を参照）。これらにはハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）参照）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５年）発行，ｐ．７７−９６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
加えて、一本鎖抗体を作成するために記載されている技術（参照により本明細書に含まれるとする米国特許第４，９４６，７７８号明細書）がＩＬ−３２特異的単鎖抗体を作成する際に使用されると考えられる。本発明の追加実施態様では、ＩＬ−３２に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ簡単に同定するためにＦａｂ発現ライブラリーの構築について記載されている技術を用いる（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。
【００８９】
抗体断片を作成するのに適した技術が抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片を作成する際に使用されると考えられる。例えば、前記断片には抗体分子をペプシン消化させることにより産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元させることにより作成され得るＦａｂ’断片、及び抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより作成され得るＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
抗体を作成する際、所望抗体のスクリーニングは当業界で公知の方法（例えば、ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫検定法）、“サンドイッチ”イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、（例えば、コロイド状金、酵素、放射性同位元素標識を用いる）ｉｎ−ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ等）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ及び免疫電気泳動アッセイ等により実施されると考えられる。
【００９１】
１実施態様では、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の実施態様では、一次抗体はこの一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。更なる実施態様では、二次抗体を標識する。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当業界で公知であり、本発明の範囲に含まれる。当業界で公知のように、免疫原性ペプチドは免疫化プロトコルで使用した担体分子を含むべきではない。例えば、ペプチドがＫＬＨにコンジュゲート形成されていたならば、ＢＳＡにコンジュゲート形成しても、または直接スクリーニングアッセイで使用してもよい。
【００９２】
上記抗体は、ＩＬ−３２の局在化及び構造（例えば、ウェスタンブロッティングのため）、適当な生物学的サンプル中のそのレベルを測定する等に関する当業界で公知の方法で使用され得る。前記抗体は個人由来の生物学的サンプル中のＩＬ−３２を検出するために使用され得る。前記生物学的サンプルは生物学的流体であり得、この流体の例には細胞を含む血液、血清、血漿、腸液、尿、脳脊髄液等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
その後、生物学的サンプルは適当な方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイ）及びフォーマット（例えば、マイクロウェル、ディップスティック等）を用いてヒトＩＬ−３２の存在について直接検査され得る。或いは、サンプル中のタンパク質は、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在または不在下及び免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）により検出されるＩＬ−３２の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりサイズ分離され得る。免疫ブロット法は通常タンパク質のエピトープに相当するペプチドに対して作成した抗体を用いるとより有効であり、よって本発明に特に適している。
【００９４】
本発明の特に好ましい実施態様は、関節リウマチのような自己免疫疾患を治療するためのＩＬ−３２抗体を含む。ＩＬ−３２のＴＮＦα誘導活性を中和するＩＬ−３２反応性抗体は、少なくとも１つのＲＡ疾患症状を軽減すると考えられ、特に好ましい実施態様ではＲＡ疾患の進行を遅らすと考えられる。更に、ＩＬ−３２系に適用され得ると考えられる治療用抗体の作成及び使用に関連する教示は、治療用ＴＮＦ反応性抗体に関する米国特許第６，２７７，９６９号明細書及び同第６，４４８，３８０号明細書（いずれも、参照により本明細書に含まれるとする）に記載されている。
【００９５】
ＩＶ．  ＩＬ−３２核酸、ペプチドまたは抗体を含む医薬組成物
本発明は更に、ＩＬ−３２ポリヌクレオチド配列の全部または一部、ＩＬ−３２ポリペプチド、抗体を含めたＩＬ−３２生物活性の阻害剤またはアンタゴニストを単独でまたは少なくとも１つの他の物質（例えば、安定化化合物）と組み合わせて含み得、滅菌の生体適合性医薬用担体中の形態で投与され得る医薬組成物を提供する。前記担体には食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の方法は、自己免疫疾患及び癌を治療する際に使用される。ペプチドは患者に対して生理食塩水のような医薬的に許容され得る担体中の形態で静脈内に投与され得る。ペプチドを細胞内に送達するための標準的方法（例えば、リポソームを介する送達）が使用され得る。前記方法は当業者に公知である。本発明の組成物は非経口投与、例えば静脈内、皮下、筋肉内及び腹腔内投与のために使用される。治療のためのポリペプチドの細胞内投与は遺伝子治療を用いても実施され得る。
【００９７】
医学界で公知のように、一人の患者に対する用量は患者の体格、体表面積、年齢、投与しようとする特定化合物、性別、投与時間及びルート、全身健康状態及び同時に投与される他の薬物との相互作用を含めた諸因子に依存する。
【００９８】
従って、本発明の幾つかの実施態様では、ＩＬ−３２ヌクレオチド及びＩＬ−３２アミノ酸配列は患者に対して単独で、または他のヌクレオチド配列、薬物またはホルモンと組み合わせて、または賦形剤または他の医薬的に許容され得る担体が混合されている医薬組成物の形態で投与され得る。本発明の１実施態様では、医薬的に許容され得る担体は医薬的に不活性である。本発明の別の実施態様では、ＩＬ−３２ヌクレオチド配列及びＩＬ−３２アミノ酸配列は単独で病気を患っている個人に投与され得る。
【００９９】
他の実施態様では、本発明の医薬組成物は経口投与に適した剤形で当業者に公知の医薬的に許容され得る担体を用いて製剤化され得る。前記担体により、医薬組成物は治療を受ける患者が経口または経鼻摂取するために錠剤、ピル剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤等として製剤化され得る。
【０１００】
本発明において使用するのに適した医薬組成物には、活性成分が所期目的を達成するのに有効な量含有されている組成物が含まれる。例えば、有効量のＩＬ−３２はＴＮＦαの産生を誘導する量であり得る。有効量の決定は当業者の能力の範囲内であり、特に本明細書の開示内容にてらしてなし得る。
【０１０１】
本発明の方法に使用される化合物の場合、治療有効量はまず細胞培養アッセイから推定され得る。次いで、好ましくは、ＴＮＦαレベルを調節する所望の循環濃度範囲を得るために用量を動物モデル（特に、マウスモデル）において決定する。
【０１０２】
治療有効量は、病的状態（例えば、癌）の少なくとも１つの症状を緩和するＩＬ−３２の量または病的状態（例えば、関節リウマチのような自己免疫疾患）の少なくとも１つの症状を緩和するＩＬ−３２抗体またはアンタゴニストの量を指す。前記化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物において一般的な薬学手順により決定され得る（ＬＤ５０は集団の５０％が致死する量であり、ＥＤ５０は集団の５０％において治療上有効な量である）。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び追加の動物研究から得たデータはヒトに使用するための用量範囲を決定する際に使用され得る。前記化合物の用量は毒性は全くまたは殆どなく、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。用量は、この範囲内で使用する剤形、患者の感受性及び投与ルートに応じて変更される。通常の用量は、投与ルートに応じて０．１〜１００，０００μｇ、最高約１ｇの全用量の範囲で変更され得る。
【０１０３】
Ｖ．  ＩＬ−３２を用いる薬物スクリーニング
本発明は、炎症誘発性サイトカイン応答（例えば、ＴＮＦα産生）を変更できる薬物をスクリーニングするための標的としてＩＬ−３２を用いるための方法及び組成物を提供する。
【０１０４】
薬物スクリーニング方法は、ＩＬ−３２ペプチドに対して適当な結合アフィニティーを有する化合物の高スループットスクリーニングを提供し、参照により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第８４／０３５６４号パンフレットに詳記されている。簡単に説明すると、多数の各種小ペプチド試験化合物を固体基質（例えば、プラスチックピンまたは幾つかの他の表面）上で合成する。次いで、ペプチド試験化合物をＩＬ−３２ペプチドと反応させ、洗浄する。次いで、結合したＩＬ−３２ペプチドを当業界で公知の方法により検出する。
【０１０５】
別の方法では、上記したように作成したＩＬ−３２抗体を用いている。このＩＬ−３２ペプチドに特異的に結合できる抗体はＩＬ−３２に対する結合に関して試験化合物と競合する。こうして、前記抗体はＩＬ−３２ペプチドの１つ以上の抗原決定基を有するペプチドの存在を検出するために使用され得る。
【０１０６】
本発明は、化合物をスクリーニングするための多くの他の手段も意図している。上に挙げた例は利用できる方法の範囲を単に例示するために記載されている。当業者は、多くの他のスクリーニング方法が使用可能であることを認識している。
【０１０７】
特に、本発明は、活性に関して化合物をスクリーニングするための、特にコンビナトリアルライブラリー（例えば、１０４個以上の化合物を含有するライブラリー）からの化合物の高スループットスクリーニングのためのＩＬ−３２及びそのバリアントもしくはミュータントをトランスフェクトした細胞系の使用を考えている。本発明の細胞系は各種スクリーニング方法において使用され得る。幾つかの実施形態では、細胞は細胞表面受容体を活性化後のシグナル伝達をモニターするセカンドメッセンジャーアッセイにおいて使用され得る。他の実施態様では、細胞は転写／翻訳レベルで細胞応答をモニターするレポーター遺伝子アッセイにおいて使用され得る。
【０１０８】
セカンドメッセンジャーアッセイでは、宿主細胞に上記したようにＩＬ−３２またはそのバリアントもしくはミュータントをコードするベクターをトランスフェクトすることが好ましい。その後、宿主細胞を（例えば、コンビナトリアルライブラリーからの）１つまたは複数の化合物で処理し、応答の有無についてアッセイする。コンビナトリアルライブラリー中の少なくとも一部の化合物はベクターによりコードされるタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーターまたは阻害剤として機能し得ると考えられている。また、コンビナトリアルライブラリー中の少なくとも一部の化合物はシグナル伝達経路中のベクターによりコードされるタンパク質の上流または下流で作用するタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーターまたは阻害剤として機能し得ると考えられている。
【０１０９】
上記細胞はレポーター遺伝子アッセイにおいても有用である。レポーター遺伝子アッセイは、レポーター遺伝子に対するコード配列にスプライスされる標的遺伝子（すなわち、病気標的の生物学的発現及び機能を制御する遺伝子）の転写制御因子を含む核酸をコードするベクターをトランスフェクトした宿主細胞の使用を含む。従って、標的遺伝子を活性化するとレポーター遺伝子産物が活性化される。
【０１１０】
実験
下記実施例は本発明の特定の好ましい実施態様及び態様を示し、更に説明するために提示するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されない。
【０１１１】
以下の実験の開示内容中、次の略号を用いる：ｅｑ（当量）、Ｍ（モル）、μＭ（マイクロル）、Ｎ（規定）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、ｌまたはＬ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、℃（セ氏）、Ｕ（単位）、ｍＵ（ミリ単位）、ｍｉｎ（分）、ｓｅｃ（秒）、％（パーセント）、ｋｂ（キロベース）、ｂｐ（塩基対）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）。
【０１１２】
加えて、以下の細胞及びバイオアッセイを用いた。ヒトＮＫ細胞系は、Ｈａｎｓ  Ｋｌｉｎｇｅｒｍａｎ博士（イリノイ州シカゴに所在のＲｕｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手し、１０％  ＦＣＳ、ＩＬ−２（５０ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１５（２００ｐｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ニュージャージ州ロッキーヒルに所在のＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）において培養した。マウスマクロファージＲａｗ  ２６４．７細胞、ヒトＡ５４９肺癌細胞、サルＣｏｓ７腎臓細胞、Ａｎｊｏｕ６５（ヒト線維芽細胞２９３Ｔ株のサブクローン）、ヒト上皮Ｗｉｓｈ細胞及びヒト単球ＴＨＰ−１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、与えられた指示に従って維持した。バイオアッセイは９６ウェルプレートで実施した。
【０１１３】
簡単に説明すると、Ｒａｗ細胞（５×１０５／ｍｌ，０．１ｍｌ／ウェル）、Ａ５４９−Ｒβ細胞（２×１０５／ｍｌ，０．１ｍｌ／ウェル）及びヒトＮＫ細胞（５×１０５／ｍｌ，０．１ｍｌ／ウェル）を９６ウェルプレートに接種し、細胞がプレートに接着するまで培養した。Ｒａｗ細胞アッセイの場合には、使い尽くした培地を除去し、細胞を５μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（オハイオ州ベッドフォードに所在のＢｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下で異なる濃度のｒＩＬ−３２を含有する新鮮培地（０．２ｍｌ）で刺激した。Ａ５４９−Ｒβ細胞アッセイの場合には、使い尽くした培地を除去し、細胞を（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１４８−１５４（２００１）に記載されているように産生した）ＩＬ−１８を含有する新鮮培地（０．２ｍｌ）で刺激した。ＮＫ細胞アッセイの場合には、細胞をＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ−１８または両サイトカインで刺激した。ＴＨＰ−１細胞（５×１０５／ｍｌ，０．１ｍｌ／ウェル）をＦＣＳの非存在下で９６ウェルプレートに接種した後、各種ソースからのｒＩＬ−３２で刺激した。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）ＴＨＰ−１分化アッセイの場合には、ＴＨＰ−１細胞（０．２５×１０５／ｍｌ，０．１ｍｌ／ウェル）を２４ウェルプレートに接種した後、１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）で４８時間刺激し、細胞をＦＣＳを欠く培地で洗浄し、細胞をｒＩＬ−３２で処理した。プレートを細胞培養インキュベーターに６〜２０時間置いた後、培養上清をサイトカイン測定のために収集した。
【０１１４】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｉｎｖｅｎｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認されていたＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて健康ドナーの血小板フェレーシスに従って残存白血球から単離した。ＰＢＭＣ（１．５×１０７）を６ウェルプレート中の１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ（３ｍｌ）に接種し、ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）（２０μｇ）で刺激した。プレートを細胞培養インキュベーターに６０時間置いた後、培養上清及び細胞ライゼートをＩＬ−３２測定のために収集した。
【０１１５】
大腸菌において産生したｒＩＬ−３２と哺乳動物細胞において産生したｒＩＬ−３２の間で活性レベルに差があり、バッチ間で活性レベルに差があったので、ＩＬ−３２を生物学的活性の単位によって評価した。１単位のＩＬ−３２は、上記したアッセイ条件下でそれぞれＰＭＡ分化ＴＨＰ−１細胞及びマウスＲａｗ細胞においてヒトまたはマウスＴＮＦαの２倍増加をもたらすＩＬ−３２の量と定義される。１単位の大腸菌ｒＩＬ−３２のおおよその濃度は２０ｎｇ／ｍｌになり、１単位の哺乳動物ｒＩＬ−３２のおおよその濃度は０．１ｎｇ／ｍｌになる（ＥＣＬ及びウェスタンブロットにより計算）。
【実施例１】
【０１１６】
ＮＫ４／ＩＬ−３２を含めたＩＬ−１８誘導遺伝子の同定
野生型ヒトＡ５４９肺癌細胞（Ａ５４９−ＷＴ）はＩＬ−１８Ｒαを発現するが、ＩＬ−１８Ｒβを発現しない。よって、Ａ５４９細胞において機能性ＩＬ−１８受容体を発現させるために、Ａ５４９細胞にＩＬ−１８Ｒβ鎖発現ベクターをトランスフェントした。簡単に説明すると、トランスフェクションの前日に、ヒト肺癌Ａ５４９細胞（３×１０５／ウェル）を６ウェルプレートに接種した。次いで、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（カリフォルニア州カールスバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（２ｍｌ）で洗浄し、新鮮培地（１ｍｌ）において２５分間インキュベートした。各ウェルあたりのトランスフェクション混合物溶液を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（１００μｌ）中にリポフェクタミン２０００（５μｌ）を混合し、その後組織培養フードにおいて５分間インキュベートすることにより調製した。次いで、プラスミドＤＮＡのｐＴＡＲＧＥＴ／ｈｕＩＬ−１８Ｒβ（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１４８−１５４（２００１））（２μｇ）を添加した後、２０分間インキュベートした。トランスフェクション混合物溶液をウェルに添加し、プレートを３７℃で更に４時間インキュベートした。各ウェルに１０％  ＦＣＳを含有する細胞培地（２ｍｌ）を添加することによりトランスフェクションを停止した。翌日、細胞をトリプシン処理し、１５ｃｍプレートに移した。細胞がプレートに接着したら、培地を８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する新鮮培地と交換した。選択培地は３日毎に、個々のコロニーが現れる（〜１０〜１４日）まで新鮮培地と交換した。円形３ＭＭペーパーの小片を滅菌し、トリプシンで湿らし、その後各コロニーを選ぶために使用した。コロニーを、１ｍｌ／ウェルの選択培地を収容している２４ウェルプレートに移した。１０６細胞が得られるまで各コロニーを増殖させ、次いで各コロニーをトランスフェクトした遺伝子の発現についてＲＴ−ＰＣＲにより試験し、２４時間ＩＬ−１８刺激後細胞培地中のＩＬ−６及びＩＬ−８を測定するバイオアッセイにおいて試験した。３コロニーはＲＴ−ＰＣＲ及びバイオアッセイによりポジティブであった。単クローンを得るために限界希釈培養物を作成した。
【０１１７】
図１のパネルＡに図示するように、ＩＬ−１８Ｒβ構築物（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１４８−１５４（２００１））をトランスフェクトしたＡ５４９細胞（Ａ５４９−Ｒβ）は、ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＩＬ−１８Ｒα鎖及びＩＬ−１８Ｒβ鎖を発現した。安定なクローン（Ａ５４９−Ｒβ）は、１６時間ＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）刺激後のＩＬ−８の誘導について試験した。Ａ５４９細胞においてＩＬ−１８Ｒβを発現させると、Ａ５４９−Ｒβ細胞はＩＬ−６及びＩＬ−８を産生させることにより補助刺激物質の非存在下でＩＬ−１８に応答し、Ａ５４９親細胞系（Ａ５４９−ＷＴ）はＩＬ−１８に応答しないままであった（図１のパネルＢ及びＣ参照、Ｎ＝７）。
【０１１８】
その後、Ａ５４９−Ｒβ細胞を用いて、マイクロアレーによりＩＬ−１８誘導遺伝子発現を研究した。簡単に説明すると、実験の前日にＡ５４９−Ｒβ細胞を９ｃｍプレートに２×１０６で接種した。次いで、細胞をＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激し、この時点で処理細胞及び対照を収集した。全ＲＮＡをＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔを用いて単離し、ＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて精製した。次いで、全ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの指示に従ってマイクロアレー分析のために使用した。全ＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡに変換した。第２鎖ｃＤＮＡはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成した。第２鎖合成後、反応混合物をＧｅｎｅＣｈｉｐから供給されたキットを用いて清浄した。ｃＲＮＡ合成をＲＮＡ転写物標識キットを用いて実施して、ビオチン標識ｃＲＮＡを作成した。ビオチニル化ｃＲＮＡはハイブリダイゼーション前に分画した。サンプルをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨＧ−Ｕ１３３にハイブリダイズし、データをコロラド健康科学センター大学のマイクロアレーコア実験室で分析した。
【０１１９】
マイクロアレーデータは、ＩＬ−１８がＩＬ−６及びＩＬ−８を含めた幾つかのサイトカイン遺伝子を誘導したことを示した。その発現がＩＬ−１８誘導性であると既に公知であるインターフェロン−β２及びＩＬ−１βを含めた幾つかのケモカインは、ＩＬ−１８処理に応答して発現が３倍以上（ｌｏｇベース２）増加することが判明している群にあった（２つの独立実験からのデータを示している表１参照）。興味深いことに、ナチュラルキラー細胞転写物４（ＮＫ４）もかなり誘導された（５．３倍）。ＮＫ４遺伝子は元々活性化ＮＫまたはＴ細胞産物として記載されていた（Ｄａｈｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：５９７−６０３（１９９２））が、この遺伝子に関する機能的データは集められていなかった。ＮＫ４  ｍＲＮＡの発現を、マイクロアレー研究のために使用したと同一の全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲにより調べた。第１鎖ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（カリフォルニア州カールスバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡ（約１μｇ）から合成した。ＰＣＲ反応は、センスプライマー５’−ＣＴＧＴＣＣＣＧＡＧ  ＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴ−３’（配列番号１）及びアンチセンスプライマー５’−ＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧ  ＴＧＧＴＣＡＧＴＡＴ  Ｃ−３’（配列番号２）を用いて、９４℃で４５秒間、７０℃で２分間、５９℃で１分間を１サイクルとして３０サイクル実施した。ＮＫ４転写物はＩＬ−１８処理Ａ５４９−Ｒβ細胞中で検出されたが、非刺激Ａ５４９−Ｒβ細胞中では検出されなかった（図１のパネルＤ参照）。
【０１２０】
【表１】
2007513609.tif 000002
ＮＫ４遺伝子発現もＮＫ９２細胞系（Ｈｏｓｈｉｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：５１−５９（１９９９））において調べた。ＮＫ４遺伝子は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の両方を含有する調整培地に維持したときこの細胞系において構成的及び高度に発現された。調整培地中のＩＬ−２は、ＮＫ９２細胞系において観察された高レベルのＮＫ４遺伝子に関与すると考えられる。
【実施例２】
【０１２１】
組換えＮＫ４／ＩＬ−３２によるＴＮＦα誘導
余り記載されていない遺伝子産物の機能を調べるために、ＮＫ４  ｃＤＮＡ（図３のＩＬ−３２α参照）をＮＫ９２細胞（参照により本明細書に含まれるとする上掲のＤａｈｌら（１９９２））から配列決定するためにｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した後、インサートを大腸菌での発現のためにはｐＰＲＯＥＸ／Ｈｔａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または哺乳動物発現のためにはｐＴＡＲＧＥＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に移した。組換えＮＫを大腸菌で発現させ、組換えタンパク質のＮ末端にＨｉｓ６タグを導入することによりＴＡＬＯＮアフィニティーカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により精製した。ＴＡＬＯＮアフィニティー精製したタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５，ＡＫＴＡＦＰＬＣ）にかけ、タバコエッチウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４℃で１６時間消化して、Ｈｉｓ６タグを除去した。切断された組換えタンパク質をリン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ９）で透析した。この物質は後にイオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＱＦＦ，ＡＫＴＡＦＰＬＣ）にかけた。３つの連続ステップ（Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィー）を用いて精製した組換えＮＫタンパク質は１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中約２０ｋＤａの均一バンドとして流れ、その後クーマシーブルーにより染色した（図２のパネルＡ参照）。
【０１２２】
その後、３度精製した組換えＮＫ４タンパク質は、ポリミキシンＢ（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下でのマウスＲａｗ  ２６４．７マクロファージ細胞によるＴＮＦα分泌を測定することにより生物学的活性について試験した。マウスＲａｗ  ２６４．７マクロファージ細胞は組換えＮＫ４に応答し、大量のＴＮＦαを産生することによりイオン交換カラムから溶離するタンパク質のピークフラクションと一致していた（図２のパネルＡ参照）。ＮＫ４の新しく発見された生物学的活性を認識する際、前記分子の名前はＩＬ−３２／ＴＮＦα誘導因子（ＴＡＩＦ）に変えられた。図２のパネルＢに示すように、ＩＬ−３２αは４００ｐｇ／ｍｌ（ＩＬ−３２αの１４．８ｋＤａ計算分子量に基づいて２７ピコモル）くらい低いＩＬ−３２α濃度で大量のＴＮＦαを誘導し、用量依存的にＴＮＦα産生を増加させた。ＴＮＦαが多数の炎症性及び自己免疫疾患において原因的役割を発揮する複数の炎症性を有していることは公知である（Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，２４：２１６−２３０（１９９８））。
【０１２３】
組換えＩＬ−３２αは、Ｃｏｓ−７細胞（８×１０６）にＤＥＡＥ−デキストラン技術（Ｓａｍｐａｙｒａｃら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７５７５−７５７８（１９８１））を用いてｐＴＡＧＥＴ／ＩＬ−３２β発現ベクターを一過的にトランスフェントすることにより哺乳動物細胞においても産生された。図２のパネルＣに示すように、ＩＬ−３２αをトランスフェクトした細胞の濃縮上清から得た組換えＩＬ−３２α（１００ｐｇ／ｍｌ）はＴＮＦα産生を誘導し、偽トランスフェクト細胞からの濃縮上清はＴＮＦα産生を誘導しなかった。Ｃｏｓ−７上清中の組換えＩＬ−３２αの濃度はＥＣＬ及びイムノブロットにより推定した。更に、哺乳動物細胞において産生したＩＬ−３２αは、細菌細胞において産生した組換えＩＬ−３２αよりも高いＴＮＦα誘導活性を有していることが判明した。
【実施例３】
【０１２４】
ＩＬ−３２ゲノム構造及びスプライスバリアントの同定
ＩＬ−３２遺伝子の構造及びそのヒトゲノム内での局在化を分析した。ＩＬ−３２をヒトＮＫ９２細胞系からＲＴ−ＰＣＲによりクローン化し、ＩＬ−２（５０ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１５（２００ｐｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。この目的のために以下のプライマー、すなわちセンス５’−ＣＴＧＴＣＣＣＧＡＧ  ＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号１）及びアンチセンス５’−ＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧ  ＴＧＧＴＣＡＧＴＡＴ  Ｃ−３’（配列番号２）を用いた。図３及び５に示すように、ＩＬ−３２の３つのスプライスバリアント（ＩＬ−３２αは配列番号３及びジェンバンク受託番号ＡＹ４９５３３１として；ＩＬ−３２βは配列番号４及びジェンバンク受託番号ＡＹ４９５３３２として；ＩＬ−３２δは配列番号５及びジェンバンク受託番号ＡＹ４９５３３３として開示されている）はＮＫ９２細胞から誘導したＲＮＡから同定され、別のスプライスバリアント（ＩＬ−３２γは配列番号６及びジェンバンク受託番号ＢＫ００４０６５として開示されている）は以前はＮＫ４転写物（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００４２２１）として報告されていた。よって、ＩＬ−３２は選択的ｍＲＮＡスプライシングのために少なくとも４つのバリアントとして発現される。
【０１２５】
ＮＣＢＩウェブサイトからのＢｌａｓｔプログラムを用いて、ＩＬ−３２遺伝子が染色体１６ｐ１３．３にあるかを調べた。ＩＬ−３２遺伝子（配列番号１及びジェンバンク受託番号ＡＹ４９５３３４として開示されている）を包囲する約５ｋｂの配列は、ヒト染色体１６配列（ジェンバンク受託番号ＡＣ１０８１３４）の１８０ｋｂ範囲から同定された。スプライスバリアントの配列とゲノム配列を比較することにより、ＩＬ−３２遺伝子は８個の小エクソンを含み、第２及び第３エクソンはＡＴＧ開始コドンを有することが判明した。ＩＬ−３２γは、エクソン３と４の間にスプライシングが存在しないのでＮ末端に追加の４６アミノ酸（配列番号１４）を有している。しかしながら、ＩＬ−３２δでは、第２エクソンは存在せず、よって第２エクソン中のＡＴＧの代わりに第３エクソン中にＡＴＧ開始コドンを使用した。ＩＬ−３２αは最も豊富なｃＤＮＡクローンであり、従ってこのイソ型を本明細書に記載されている多くの実験で使用した。ＩＬ−３２αは、エクソン７と８の間のスプライシングのためにＣ末端の５７アミノ酸残基が欠失しており、Ｃ末端をコードする１つの大きなエクソンを有している他のバリアントと対照的である。ＩＬ−３２アミノ酸配列の分析から、３つの可能性あるＮ−ミリストイル化部位及び１つの可能性あるＮ−グリコシル化部位の存在が明らかとなった（図４Ａ参照）。
【０１２６】
Ｂｌａｓｔプログラムを用いて、ＩＬ−３２のホモログに関するＮＣＢＩデータベースを探した。このようにして、ウマ、ウシ、ヒツジ及びブタＩＬ−３２の発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンを同定した。ウマＩＬ−３２βタンパク質配列（ジェンバンク受託番号ＣＤ４６９５５４及びＢＩ９６１５２４）はヒト配列と最高の相同性（３１．８％）を有しており、次いでウシ（ジェンバンク受託番号ＣＫ８３４３３９及びＣＫ８３２４８９）、ヒツジ（ジェンバンク受託番号ＣＯ２０２３６４）及びブタ（ジェンバンク受託番号ＣＢ２８７２９２）の順であった。ヒト、ウマ及びウシＩＬ−３２βタンパク質配列のアラインメントを図４Ｂに示す。特に、ヒツジ及びブタのイソ型Ａは同定されており、イソ型Ａ及びＢはウマで同定されており、イソ型Ｂ及びＣはウシで同定されている。ウマＩＬ−３２β及びウシＩＬ−３２γの配列はそれぞれ２つのＥＳＴクローンから合わされ、オープンリーディングフレームは合わせた配列から推定された。
【実施例４】
【０１２７】
ＩＬ−３２発現の分析
ＩＬ−３２の各種ヒト組織における発現をノーザンブロットにより調べた。簡単に説明すると、ＩＬ−３２α及びアクチンｃＤＮＡインサートをプラスミドベクターから適当な制限酵素を用いて切除し、サイズ分画し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩキット（カリフォルニア州カールスバッドに所在のＱ−ＢＩＯ  ｇｅｎｅ）を用いて精製した。ｃＤＮＡをクレノウ酵素（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるランダムプライミングにより３２Ｐ−ｄＣＴＰ（マサチューセッツ州ボストンに所在のＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で標識した。各種組織からのヒトポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含有する膜（ヒトＭＴＮブロットＩＩ）をｃＤＮＡプローブとインキュベートし、その結合をオートラジオグラフィーにより検出した。図８Ａに示すように、１．２ｋｂのＩＬ−３２転写物が多くの組織が検出され、他の細胞タイプに比して免疫細胞において高レベルのＩＬ−３２が検出された。免疫組織におけるＩＬ−３２  ｍＲＮＡの高い発現は、ブロットをアクチン断片で再プローブすることにより明らかなようにローディングの差に起因しなかった。
【０１２８】
内因性ＩＬ−３２発現もタンパク質レベルで検出された。簡単に説明すると、Ａ５４９−Ｒβ細胞を６ウェルプレートに１０６細胞／ｍｌで接種した。細胞がプレートに接着した後、Ｆ１２Ｋ培地を除去し、無血清培地を入れた。数個のウェルでは、無血清培地はＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（５００ｎｇ／ｍｌ）を含んでいた。４８時間後、上清を収集し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置で１０倍に濃縮した。図８Ｂに示すように、内因性ＩＬ−３２に対応する約３０ｋＤａ種をアフィニティー精製した家兎抗ヒトＩＬ−３２αポリクローナル抗体を用いるイムノブロットにより検出した。アミノ酸配列の分析から可能性あるＮ結合グリコシル化及びミリストイル化部位の存在が明らかとなったので、大腸菌由来のｒＩＬ−３２と内因性ＩＬ−３２間の分子量の差は内因性分子の翻訳後修飾によるものと考えられる。ＩＬ−３２はＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（５００ｎｇ／ｍｌ）で処理した細胞の細胞培地中に分泌されるが、非刺激細胞（対照）によっては分泌されなかった。ＩＬ−３２はそのＮ末端に典型的な疎水性シグナルペプチドを持たないが、ＩＬ−３２は細胞培地中で分泌分子として検出された。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１βやＬＰＳよりも高度にＩＬ−３２発現を誘導した。６０ｋＤａバンドも観察され（データ示さず）、これはＩＬ−３２の二量体化形態であると考えられる。モノマーと同様に、６０ｋＤａバンドは処理細胞の上清中で見られたが、非刺激細胞の上清には存在しなかった。
【０１２９】
Ｗｉｓｈ細胞は通常抗ウイルスアッセイのため及びＩＦＮγの他の生物学的活性を評価するために使用されているので、ＩＦＮγで処理したヒト上皮Ｗｉｓｈ細胞におけるＩＬ−３２の誘導も調べた。ＩＬ−３２産生の時間経過に関して、Ｗｉｓｈ細胞、Ａ５４９−ＷＴ細胞及びＡ５４９−Ｒβ細胞を６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで接種し、一晩インキュベートした後、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞培地中のＩＬ−３２をイムノブロットにより検出するためにアフィニティー精製した家兎抗ＩＬ−３２αを使用した。ブロットを増強化学ルミネッセンス（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて展開するためにペルオキシダーゼコンジュゲートした二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。ＩＬ−３２を電気化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）により検出するために、アフィニティー精製した抗ＩＬ−３２α抗体のアリコートをビオチンで標識し、別のアリコートを製造業者（メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＩｇｅｎ）の指示に従ってルテニウムで標識した。ビオチン−及びルテニウム−標識抗体を用いて、組換えＩＬ−３２αを用いて標準曲線を作成した。液相ＥＣＬ法を用いて、細胞培地及び血清サンプル中の各種サイトカインを調べた。電気化学ルミネッセンスの量はＯｒｉｇｅｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｇｅｎ）を用いて測定した。
【０１３０】
図９Ａに示すように、ＩＬ−３２はヒト上皮細胞の細胞ライゼート中で時間依存的に誘導され、４６時間後に漸減するが、ＩＬ−３２は未刺激細胞中では誘導されなかった。また、ＩＬ−１８及びＩＬ−１βはＡ５４９−Ｒβ細胞のライゼート中での内因性ＩＬ−３２の発現を時間依存的に増加させた（図９Ｂ）が、ＩＬ−３２はＡ５４９−ＷＴ細胞ではＩＬ−１βによってしか誘導されなかった（図９Ｃ）。加えて、ＩＦＮγもＡ５４９−ＷＴ細胞のライゼート中でＩＬ−３２を誘導することが観察された（データ示さず）。
【０１３１】
哺乳動物細胞においてＩＬ−３２α及びβのｃＤＮＡから発現させた組換えタンパク質が内因性ＩＬ−３２と類似しているかどうかを調べるために、Ｃｏｓ７細胞にＩＬ−３２α及びβ  ｃＤＮＡを一時的にトランスフェクトした。図９Ｄ及び９Ｅに示すように、組換えＩＬ−３２α及びＩＬ−３２βはイムノブロットで調べると細胞培地及びトランスフェクト細胞のライゼートの両方中に存在していた。イムノブロットにおける組換え哺乳動物ＩＬ−３２の分子サイズは、図８Ｂに示す内因性ＩＬ−３２の分子サイズと同一であった。ＩＬ−３２βは主に細胞結合しているＩＬ−３２αに比してより効率的に分泌されるようであるが、ＥＣＬアッセイは培地及びライゼート中のＩＬ−３２α及びＩＬ−３２βの類似分泌を示した。
【０１３２】
ポリクローナル抗ヒトＩＬ−３２抗体を、アガロースビーズ（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ  １５）に固定させたＩＬ−３２αを含有するカラムを用いてアフィニティー精製した。ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗家兎免疫グロブリン二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから入手した。抗ヒトＩＬ−３２抗体は内因性トＩＬ−３２を特異的に認識するので、ヒト被験者（健康人及び敗血症患者）の血清中のＩＬ−３２レベルをＥＣＬにより測定した。ＩＬ−３２は健康人の血清で検出された（４２サンプル中５サンプル）が、ＩＬ−３２レベルは７０ｐｇ／ｍｌ未満であった。対照的に、敗血症患者の血清中の平均ＩＬ−３２レベルは健康人からの血清より３５倍高かった。本発明の開発中に初めて、ＩＬ−３２は細菌感染に応答して（直接または間接的に）産生される炎症誘発性サイトカインであることが分かった。加えて、ＩＬ−３２は活動型間接リウマチ患者で検出された。このことから、ＩＬ−３２が自己免疫においても役割を果たすことが示されれる。
【０１３３】
ＩＬ−３２産生の調節を調べるために、ＩＬ−３２を各種細胞系の細胞培地及びヒトＰＢＭＣにおいて調べた。ＩＬ−３２はＩＬ−１８またはＩＬ−１β刺激後のＡ５４９−Ｒβの培地中で検出されたが、対照培地では検出されなかった（図１０Ａ）。ＮＫ４（ＩＬ−３２）遺伝子はＩＬ−２活性化ＮＫ細胞から単離されたので、ヒトＮＫ細胞系をＩＬ−１２＋ＩＬ−１８の組み合わせで刺激した。図１０Ｂに示すように、ＮＫ細胞ではＩＬ−１２またはＩＬ−１８によりＩＬ−３２が有意に誘導され、これら２つのサイトカインの組み合わせの効果は相加的のようであった。対照的に、前記細胞系をＩＬ−１２またはＩＬ−１８により刺激するとＩＦＮγの誘導は全くまたは殆どなかったのに対して、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８の組み合わせによるＩＦＮγの産生は非常に相乗的である（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１０９９８−１１００３（２００２））。ＮＫ細胞を中和抗ＩＦＮγ抗体の存在下でＩＬ−１２及びＩＬ−１８で刺激することにより、（ＩＦＮγを介する）ＩＬ−３２の誘導を調べた。この組合せはＩＬ−３２誘導に効果はなかった（データ示さず）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は主にＴ細胞を含み、単球及びＢ細胞は少数である。新たに調製したＰＢＭＣをＬＰＳまたはＣｏｎＡで刺激し、上清及びライゼートを収集し、ＩＬ−３２濃度についてアッセイした。６０時間後、ＬＰＳで刺激したＰＢＭＣの上清またはライゼート中にＩＬ−３２は検出されなかった（データ示さず）。しかしながら、ＣｏｎＡは常にＩＬ−３２を誘導し、これが上清及びライゼート中で検出された。図１０Ｃに示すように、ライゼートは上清よりもＩＬ−３２を多く含んでいた。
【実施例５】
【０１３４】
ＩＬ−３２応答性シグナル伝達経路の同定
本実施例は、カッパＢ（ＩκＢ）のシグナル伝達分子阻害剤及びｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）に対するサイトカインＩＬ−３２の効果を評価するために実施した実験の詳細を記載する。簡単に説明すると、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を５μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（オハイオ州ベッドフォードに所在のＢｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂ）の存在下でＩＬ−３２α（５０ｎｇ／ｍｌ）で指定時間（分）刺激した。細胞をキナーゼ溶解緩衝液（Ｈａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：４７１６７−４７１７４（２００２））で溶解した。細胞内容物を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移し、この膜はその後３％  ＢＳＡでブロックした。膜を家兎抗ＩκＢでプローブし、ヤギ抗アクチン（カリフォルニア州サンタクルーズに所在のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標準化した。図１１Ａに示すように、ＩＬ−３２αは時間依存的にＩκＢ分解を誘導し、処理から１５分後に始まり、４５分で最高レベルに達し、９０分後に回復した。
【０１３５】
膜を家兎抗ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫでプロープし、家兎抗ｐ３８  ＭＡＰＫ（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で標準化した。図１０Ｂに示すように、ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫはＩＬ−３２αによる刺激から５分後に劇的に上昇し、その後１５〜３０分間低下した。興味深いことに、ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化の第２上昇は４５分に見られ、その後よりゆっくり低下した。
【実施例６】
【０１３６】
ＩＬ−３２結合タンパク質の同定
組換えＩＬ−３２α（または、ＩＬ−３２β、ＩＬ−３２δ及びＩＬ−３２γ）を大腸において発現させ、実施例２に記載されている３連続ステップを用いて精製する。精製ＩＬ−３２α（約５ｍｇ）をＡｆｆｉ−ｇｅｌ  １５アガロースビーズ（カリフォルニア州ヘラクレスに所在のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に固定化する。いろいろな可能性ある受容体源（例えば、ヒト血清、またはＩＬ−３２αに応答してＴＮＦαを分泌するＲａｗ２６４．７細胞のような細胞のライゼート）をＩＬ−３２αアフィニティーカラムにかける。ＩＬ−３２αアフィニティーカラムを十分に洗浄し、その後ＩＬ−３２受容体を溶離緩衝液（例えば、５０ｍＭ  クエン酸，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．５）で溶離する。直ちに、溶離フラクションを２Ｍ  トリス塩基で中和する。このようにして単離したＩＬ−３２結合タンパク質を更に化学分析（例えば、エドマン分解によりペプチド配列分析及び／または質量分析）及びバイオアッセイ（例えば、精製または組換え受容体をＲａｗ２６４．７細胞によるＩＬ−３２α誘導ＴＮＦα分泌を阻止する能力について調べる）により特性づける。標準ＩＬ−３２結合タンパク質は（ＴＮＦＢＰで観察されたものと類似の）ＩＬ−３２生物学的活性を阻害する能力を有していると考えられる。標準ＩＬ−３２結合タンパク質の他のタイプは（ＩＬ−６リガンド結合鎖で観察されたものと同様の）ＩＬ−３２生物学的活性を強化する能力をも有していると考えられる。
【実施例７】
【０１３７】
関節炎のマウスモデルにおけるＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２阻害剤の治療効果
本実施例は、マウスにおいてＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、可溶性ＩＬ−３２受容体、ドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント、小分子阻害剤等）のコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を治療するための治療薬としての効果を評価するために実施した実験の詳細を記載する。簡単に説明すると、当業界で公知のように（Ｂａｎｄａら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４６：３０６５（２００２））、ＣＩＡを８〜１０週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（メーン州バーハーバーに所在のＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）においてＩＩ型ウシコラーゲン（ＣＩＩ）を皮内注射することにより誘発させる。０日目及び２１日目に、各マウスに不完全フロイントアジュバント中に２００μｇのＣＩＩ及び２００μｇの不活化結核菌（ミシガン州デトロイトに所在のＤｉｆｃｏ）を含有する注射液（１００μｌ）を与える。マウスを２１〜４２日の間３日毎にＩＰ注射として与えた３つの治療、すなわち２ｍｇ／マウスの正常家兎ＩｇＧ；２ｍｇ／マウスのＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（スウェデンのウプサラに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）を用いて作成した中和家兎抗ＩＬ−３２；及び２ｍｇ／マウスの組換えＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−３２受容体−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質またはドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント）の１つで治療する。４２日目に、マウス（各群５匹と５匹の未処理マウス）を麻酔及び頸椎脱臼により屠殺する。
【０１３８】
ＣＩＡの臨床疾患活動度を２１〜４２日の間１日おきにブラインド観察者により各肢を３点スケールを用いて評価した。０＝関節は正常；１＝僅かな炎症及び発赤；２＝使用の妨げを伴い、肢全体に影響を及ぼすひどい紅斑及び腫張、及び３＝強直、関節の硬直及び機能損失を伴い、肢または関節の変形。臨床疾患活動度の全スコアは四肢全てに基づいており、各動物の最大スコアは１２である。屠殺後、４２日目に両前肢及び右外肢を外科的に取り出し、当業界で公知のように（Ｂｅｎｄｅｌｅら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４３：２６４８（２０００））組織サンプルの作成及び組織学的分析のために１０％  緩衝ホルマリンに固定する。（治療に対してブラインドな）経験ある観察者は
肢、足首及び膝の組織学的所見を採点する。データは０〜５のスケールに基づいて炎症、パンヌス、軟膏損傷及び硬骨損傷について平均スコア及び全スコアとして表す。
【０１３９】
公開されている方法（Ｂａｎｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：２１００−２１０５（２００３））を用いて、各種免疫パラメーターを測定した。前記パラメーターには、脾臓及びリンパ節細胞によるＣＩＩ特異的増殖、抗コラーゲン抗体の産生、脾臓細胞によるＣＩＩ誘導サイトカイン分泌（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡを用いる）及び関節における定常状態サイトカインｍＲＮＡレベル（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＭＩＦ、ＴＮＦβ、ＬＴβ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の幾つかの好ましい実施態様は、臨床疾患活動度スコア及び関節損傷の組織学的スコアを少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％）低下させるＩＬ−３２抗体またはＩＬ−３２アンタゴニストを含む。他の好ましい実施態様は、ＣＩＩ誘導リンパ球増殖及び／またはコラーゲン結合ＩｇＧ抗体の血清レベルを少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％）低下させるＩＬ−３２抗体またはＩＬ−３２アンタゴニストを含む。特に好ましい実施態様は、単離関節中のＴＮＦα、ＩＦＮγ及び／またはＩＬ−１βの定常状態ｍＲＮＡレベルを少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％）低下させるＩＬ−３２抗体またはＩＬ−３２アンタゴニストを含む。重要なことは、本明細書に記載されているＩＬ−３２抗体またはＩＬ−３２アンタゴニストを含む好ましい実施態様は、ＴＮＦ反応性抗体（インフリキシマブ／ＲＥＭＩＣＡＤＥ及びアダリムマブ／ＨＵＭＩＡ）及び可溶性ＴＮＦ受容体／免疫グロブリン融合タンパク質（エタネルセプト／ＥＮＢＲＥＬ）を投与するために使用される方法と同様の方法を用いてヒト関節リウマチ患者の治療に使用されると考えられる。
【実施例８】
【０１４０】
組換えＩＬ−３２の生物学的活性
ＩＬ−３２αは大量のＴＮＦα及びＭＩＰ−２を誘導し、図６Ａに示すように両サイトカインの産生を用量依存的に増加させた。その後、ＩＬ−３２αの生物学的活性を完全Ｃ末端を有するＩＬ−３２βの生物学的活性と比較した。ＩＬ−３２βはマウスマクロファージＲａｗ細胞系においてＩＬ−３２αと同等レベルのＴＮＦα及びＭＩＰ−２を誘導した（図６Ｂ）。実験はすべてポリミキシンＢ（５μｇ／ｍｌ）の存在下で実施したが、大腸菌で産生させた組換えタンパク質のエンドトキシン汚染の可能性は除外できなかった。
【０１４１】
エンドトキシン汚染を避けるために、組換えＩＬ−３２を哺乳動物系でも産生させた。ｒＩＬ−３２βを哺乳動物細胞の３つの異なる源、すなわちＡｎｊｏｕ６５安定クローン、Ｃｏｓ７安定クローン（Ｃｏｓ７−Ｓ）及びＣｏｓ７一過性トランスフェクタント（Ｃｏｓ７−Ｔ）から産生させた。一過性及び安定なクローン化細胞を０．５％  ＦＣＳ中で４日間培養してから、収集した。哺乳動物ｒＩＬ−３２βの最大収率はたった１ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ−３２αは１００ｐｇ／ｍｌ濃度以下であったので、エンドトキシンを含まない哺乳動物ｒＩＬ−３２βの各々を、精製中の微生物汚染を避けるためにアジ化ナトリウム（０．２％）の存在下でアガロースビーズ（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｈｚ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に抗ＩＬ−３２β  ｍＡｂを固定化することにより作成したアフィニティーカラムを用いて精製した。精製したｒＩＬ−３２をペニシリン／ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩに対して４℃で一晩透析した後、バイオアッセイのために使用した。３つの哺乳動物ｒＩＬ−３２β調製物はいずれもヒトＰＭＡ分化ＴＨＰ−１細胞及びマウスＲａｗ細胞においてＴＮＦαを誘導した（図６Ｃ）。大腸菌ｒＩＬ−３２α及び哺乳動物ｒＩＬ−３２βはＰＭＡ分化ＴＨＰ−１細胞において用量依存的にヒトＴＮＦα産物を増加させた（図６Ｄ）。更に、高単位の大腸菌ｒＩＬ−３２α及び哺乳動物Ａｎｊｏｕ６５  ｒＩＬ−３２ＩＬ−３２β調製物は非分化ＴＨＰ−１細胞においてヒトＩＬ−８を誘導したが、偽Ａｎｊｏｕ６５トランスフェクタントは誘導しなかった（図６Ｅ）。
【実施例９】
【０１４２】
抗ＩＬ−３２モノクローナル抗体の中和Ｆａｂ断片の作成
５週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）中に乳化させたｒＩＬ−３２β抗原（２０μｇ）を用いて免疫化した。１４日目及び２１日目に、マウスにフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）中に乳化させた抗原を静脈内及び腹腔内注射した。３回注射した後、マウスを屠殺し、脾臓を無菌的に収集し、脾細胞を融合のために得た。簡単に説明すると、１×１０７個の脾細胞及び１×１０６個のＮＳ−１マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ）をポリエチレングリコール１５００（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて融合した。融合細胞を１０％  ＦＣＳ及びＨＡＴを含むハイブリドーマ増殖培地において１×１０６／ｍｌで再懸濁させ、９６ウェルにおいて平板培養した。２週間後、ハイブリドーマの培養上清を間接ＥＬＩＳＡで滴定した。モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスはＩＭＭＵＮＯ−ＴＹＰＥマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて製造業者の指示に従って決定した。
【０１４３】
約５×１０６細胞の２つのハイブリドーマ３２−４（ＩｇＧ１）及び３２−９（ＩｇＧ１）を８週齢の雌Ｂａｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。１週間後、腹水を滅菌皮下注射針を用いて収集した。腹水上清由来の抗体をタンパク質Ａセファロースカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製し、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶離させた。溶離させたｍＡｂをＰＢＳで透析し、精製抗体をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置（ＹＭ−５０，ミシガン州アナーバーに所在のＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて濃縮した。精製抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
【０１４４】
ｒＩＬ−３２βに対するアフィニティー精製モノクローナル抗体（３２−４）は高バックグラウンドレベルのｍＴＮＦαを誘導したので、このモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦａｂ断片を作成した。簡単に説明すると、精製抗ＩＬ−３２  ｍＡｂ（３２−４）のＦａｂ断片は、３７℃で固定化ペプシン（イリノイ州ロックフォードに所在のＰＩＥＲＣＥ）と４時間インキュベートすることにより作成した。Ｆｃ断片及び残存非切断ｍＡｂをタンパク質Ｇセファロース（スウェーデンのウプサラに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて除去した。Ｆａｂ断片をＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、切断が完全であることを確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＦＣ断片を除去後バックグラウンドレベルは劇的に低下し、抗ｒＩＬ−３２β  ｍＡｂのＩＬ−３２中和活性が評価できた。図７Ａに示すように、３２−４  ｍＡｂのＦａｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）は大腸菌ｒＩＬ−３２αの生物学的活性を７０％以上阻害した。図７Ｂに示すように、同一Ｆａｂはアフィニティー精製したＣｏｓ７−Ｓ  ｒＩＬ−３２βの生物学的活性を６５％以上阻害する。高濃度のＦａｂ断片はこれらのアッセイではＩＬ−３２誘導ＴＮＦα産生を更に阻害しなかった。
【実施例１０】
【０１４５】
炎症性腸疾患のマウスモデルにおけるＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２阻害剤の治療効果
本実施例は、マウスにおいてデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎を治療するための治療薬としてのＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、可溶性ＩＬ−３２受容体、ドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント、小分子阻害剤等）の効果を評価するために実施した実験の詳細を説明する。
【０１４６】
簡単に説明すると、当業界で公知のように（Ｓｉｖａｋｕｍａｒら，Ｇｕｔ，５０：８１２−８２０（２００２））、８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において０〜７日目まで飲料水中２％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ，分子量４０，０００，ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を自由に与え、その後通常の水に戻すことにより大腸炎を誘発させる。０日目から毎日マウスの体重を測定し、１３日目まで体重変化を記録する。各マウスの体重変化は次のように計算する：体重変化％＝（特定日の体重−０日目の体重）／０日目の体重×１００。マウス群は、それぞれ１回の注射用量を２００μｌ（エンドトキシン非含有ＰＢＳ）として、対照タンパク質（５０μｇまたは５００μｇ）、マウス抗ＩＬ−３２  ｍＡｂ（５０μｇまたは５００μｇ）及び組換えＩＬ−３２アンタゴニスト（例えばＩＬ−３２受容体−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質またはドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント，５０μｇまたは５００μｇ）で治療する。マウスに０〜７日間ＩＰ注射する。ＤＳＳ治療開始から０、２、４、６または８日目にマウスを麻酔及び頸部脱臼により屠殺し、当業界で公知の方法によりＲＮＡ抽出、組織病理検査及びサイトカイン分析するために組織（例えば、大腸、リンパ節）を取り出し、処理する。ＩＬ−３２アンタゴニストの投与はマウスにおいてＤＳＳ誘発大腸炎の炎症を緩和するのに適しており、中和ＩＬ−３２活性は腸疾患に関連する炎症を緩和するのに有効であると考えられる。
【実施例１１】
【０１４７】
肝炎のマウスモードにおけるＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２阻害剤の治療効果
本実施例は、熱死滅させた座瘡プロピオニバクテリウム（Ｐ．ａｃｎｅｓ）でプライミングしたマウス（Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介肝疾患のモデル）においてＬＰＳ誘発肝障害を治療するための治療薬としてのＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、可溶性ＩＬ−３２受容体、ドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント、小分子阻害剤等）の効果を評価するために実施した実験の詳細を説明する。
【０１４８】
簡単に説明すると、肝炎を８〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において５００μｇ／マウスの熱死滅させたＰ．ａｃｎｅｓ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＩＶ投与することにより誘発させ、１２日後当業界で公知のように（Ｆａｇｇｉｏｎｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：５９１３−５９２０（２００１））５０μｇ／ｋｇのＬＰＣでＩＶ攻撃する。マウス群は、それぞれ１回の注射用量を２００μｌ（エンドトキシン非含有ＰＢＳ）として、対照タンパク質（５０μｇまたは５００μｇ）、マウス抗ＩＬ−３２  ｍＡｂ（５０μｇまたは５００μｇ）及び組換えＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−３２受容体−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質またはドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント，５０μｇまたは５００μｇ）で治療する。Ｐ．ａｃｎｅｓの投与時またはＬＰＳ攻撃の１０分前にマウスにＩＰ注射する。マウスは生存についてモニターするか、または組織学的検査、ｍＲＮＡ及びケモカイン測定のために肝臓、当業界で公知の方法を用いる血清ＩＦＮγ及びトランスアミナーゼ測定のために血液を集めるために屠殺する。ＩＬ−３２アンタゴニストの投与は、Ｐ．ａｃｎｅｓプライミングしたマウスをＬＰＳ攻撃する１０分前に投与したときＬＰＳ誘発肝障害及びＩＦＮγ及びＦａｓリガンド発現を防止するのに適していると考えられる。加えて、ＩＬ−３２アンタゴニストの投与はＰ．ａｃｎｅｓのプライミング時に与えたときＰ．ａｃｎｅｓ誘発肉芽腫形成、マクロファージ炎症性タンパク質１α及びマクロファージ炎症性タンパク質２産生を低下させるのに適していると考えられる。よって、ＨＣＶ誘発肝炎、自己免疫性肝炎及び原発性胆汁性肝硬変のような肝疾患の患者はＩＬ−３２アンタゴニストを含む臨床レジメンの恩恵を受けるであろうと考えられる。
【実施例１２】
【０１４９】
虚血性疾患のマウスモデルにおけるＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２阻害剤の治療効果
本実施例は、虚血性損傷に応答して組織血管新生を刺激するための治療薬としてのＩＬ−３２抗体及びＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、可溶性ＩＬ−３２受容体、ドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント、小分子阻害剤等）の効果を評価するために実施した実験の詳細を説明する。
【０１５０】
簡単に説明すると、雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、当業界で公知の方法（Ｍａｌｌａｔら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９１：４４１−４４８（２００２））を用いて片側後肢に虚血を誘発するための手術を受ける。イソフルラン吸入により動物を麻酔する。伏在動脈と膝窩動脈の分岐から０．５ｃｍの範囲の右大腿動脈を結さつし、通常の条件下で３日間または２８日間収容する。マウス群は、それぞれ１回の注射用量を２００μｌ（エンドトキシン非含有ＰＢＳ）として、対照タンパク質（５０μｇまたは５００μｇ）、マウス抗ＩＬ−３２  ｍＡｂ（５０μｇまたは５００μｇ）及び組換えＩＬ−３２アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−３２受容体−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質またはドミナントネガティブＩＬ−３２バリアント，５０μｇまたは５００μｇ）で治療した。マウスには０日目及び７日目にＩＰ注射する。血管形成の程度を３日目及び１０日目に細血管造影法により血管密度を測定することにより定量し、血管新生における虚血誘発変化はレーザードップラー灌流イメージングによりモニターする。ＩＬ−３２アンタゴニストの投与が虚血性損傷に応答して組織血管新生を刺激するのに適していると考えられる。
【０１５１】
本明細書に挙げられている刊行物及び特許文献はすべて参照により本明細書に含まれるとする。発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく本明細書に記載されている本発明の方法及び系をいろいろに修飾及び変更することは当業者に自明である。本発明を特に好ましい実施態様に関連して説明してきたが、本発明はこれらの特定実施態様に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学、遺伝学、免疫学または関連分野の当業者に自明である本発明を実施するための本明細書に記載のモードの各種修飾が本発明の範囲内であると解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】ヒトＡ５４９肺癌細胞における機能性ＩＬ−１８Ｒβ鎖の発現及び活性を示す。パネルＡは、トランスフェクトＡ５４９細胞及び野生型Ａ５４９細胞におけるＩＬ−１８Ｒβ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。パネルＢ及びＣはそれぞれ、野生型及びトランスフェントＡ５４９細胞におけるＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）刺激に応答した１６時間後のＩＬ−６及びＩＬ−８分泌を示すグラフ（Ｎ＝７）である。パネルＤは、ＩＬ−１８の存在下及び非存在下でのトランスフェクト細胞におけるＮＫ４（ＩＬ−３２）ＲＮＡ発現の誘導を示す。
【図２】マウスＲａｗ２６４．７マクロファージ細胞をポリミキシンＢの存在下で組換えＩＬ−３２α（ＴＡＩＦ）で処理したときのＴＮＦα発現の誘導をグラフで示す。パネルＡは、イオン交換クロマトグラフィー分画中の組換えＩＬ−３２αのレベルが処理細胞が分泌したＴＮＦαのレベルと相関していたことを示している。各イオン交換クロマトグラフィー分画は１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クーマシーブルー染色した後に示されている。パネルＢは、細菌において発現させた組換えＩＬ−３２αは用量依存的にＴＮＦα発現を誘導したことを示している。パネルＣは、哺乳動物細胞において発現させた組換えＩＬ−３２αもＴＮＦαの発現を誘導したことを示している。組換えＩＬ−３２αの量はイムノブロットにより推定した。
【図３Ａ】４つのＩＬ−３２スプライスバリアント（ＩＬ−３２αは配列番号３として；ＩＬ−３２βは配列番号４として；ＩＬ−３２γは配列番号５として；ＩＬ−３２δは配列番号６として開示されている）のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列のアラインメントを示す。アラインメントをＥＭＢｎｅｔのＳｗｉｓｓノードのウェブサイト上で入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて実施し、手動で補正した。Ｍｙｒ及びＧｌｙはそれぞれ可能性あるＮ−ミリストイル化またはＮ−グリコシル化部位を示す。
【図３Ｂ】４つのＩＬ−３２スプライスバリアント（ＩＬ−３２αは配列番号３として；ＩＬ−３２βは配列番号４として；ＩＬ−３２γは配列番号５として；ＩＬ−３２δは配列番号６として開示されている）のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列のアラインメントを示す。アラインメントをＥＭＢｎｅｔのＳｗｉｓｓノードのウェブサイト上で入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて実施し、手動で補正した。Ｍｙｒ及びＧｌｙはそれぞれ可能性あるＮ−ミリストイル化またはＮ−グリコシル化部位を示す。
【図４】パネルＡには、４つのヒトＩＬ−３２スプライスバリアント（ＩＬ−３２αは配列番号７として；ＩＬ−３２βは配列番号８として；ＩＬ−３２γは配列番号９として；ＩＬ−３２δを配列番号１０として開示されている）のアラインメント及び幾つかの哺乳動物種からのＩＬ−３２βタンパク質配列（ヒト配列は配列番号８として；ウマ配列は配列番号１６として；ウシ配列は配列番号１７として開示されている）のアラインメントを示す。アラインメントをＥＭＢｎｅｔのＳｗｉｓｓノードのウェブサイト上で入手可能なプログラムを用いて実施し、手動で補正した。
【図５】染色体１６ｐ１３．３上のヒトＩＬ−３２遺伝子の構造を示す。エキソンは点刻ボックスで示されている。ＩＬ−３２遺伝子の図の上及び下の数字は８個のエキソンを表し、この５ｋｂゲノム断片の配列は配列番号１１として本明細書中に示す。４つのＩＬ−３２バリアント（α、β、γ及びδ）のスプライシングも示す。
【図６】ｒＩＬ−３２がマクロファージ細胞（Ｒａｗ）及び単球（ＴＨＰ−１）において炎症誘発性サイトカインを誘導することを示している。パネルＡは、大腸菌で産生したｒＩＬ−３２αは用量依存的にＭＩＰ−２及びＴＮＦαの両方の分泌を誘導することを示している。ＩＬ−３２濃度をｘ軸に単位／ｍｌで示す。パネルＢは、ＩＬ−３２α（１０Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−３２β（１０Ｕ／ｍｌ）バリアントはマウスＲａｗ２６４．７マクロファージ細胞を活性化することを示している。パネルＣは、ＩＬ−３２βの各種ソースにより誘導されたヒト及びマウスＴＮＦαのグラフである。Ｒａｗ細胞及びＰＭＡ分化ＴＨＰ−１細胞を１Ｕ／ｍｌのＡｎｊｏｕ６５及びＣｏｓ−７Ｓ、または２Ｕ／ｍｌのＣｏｓ７−Ｔで処理した。大腸菌中で産生したＩＬ−３２α及び哺乳動物細胞中で産生したＩＬ−３２βはＰＭＡ分化ＴＨＰ−１細胞において用量依存的にＴＮＦα発現を誘導した。パネルＥは、高濃度の大腸菌ｒＩＬ−３２（２０Ｕ／ｍｌ）または哺乳動物ｒＩＬ−３２β（Ａｎｊｏｕ６５，１０Ｕ／ｍｌ）は未分化ＴＨＰ−１細胞においてＩＬ−８分泌を誘導することを示している。
【図７】大腸菌ｒＩＬ−３２及び哺乳動物ｒＩＬ−３２活性が抗ＩＬ−３２Ｆａｂ（３２−４）処理により中和されることを示している（３つの別々の実験の平均値±ＳＥＭ）。パネルＡは、大腸菌ｒＩＬ−３２α（３Ｕ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−３２  Ｆａｂの存在下で培養したマウスＲａｗ細胞によるＴＮＦα分泌の用量依存的減少を示している。パネルＢは、哺乳動物（Ｃｏｓ７−Ｓ）ｒＩＬ−３２β（２Ｕ／ｍｌ）誘導ｍＴＮＦα分泌が抗ＩＬ−３２  Ｆａｂ（４０ｎｇ／ｍｌ）により抑制されたことを示している。
【図８】ｍＲＮＡ６レベル及びタンパク質レベルでのＩＬ−３２の内因性発現を示す。パネルＡは、ノーザンブロットにより測定した各種ヒト組織におけるＩＬ−３２  ｍＲＮＡの発現を示す。左側の数字はｍＲＮＡのサイズを示す。パネルＢは、可溶性ＩＬ−３２がウェスタンブロットにより測定して細胞培養上清中に存在していることを示している。安定なＡ５４９−ＲβクローンをＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、図示するようにＦＣＳの非存在下で４８時間刺激した。上清を収集し、アフィニテイー精製抗ＩＬ−３２α抗体でプローブした。
【図９】細胞ライゼートにおけるＩＬ−３２の検出を示す。ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激したときのＷｉｓｈ細胞（パネルＡ）、Ａ５４９−Ｒβ細胞（パネルＢ）及びＡ５４９−ＷＴ細胞（パネルＣ）によるＩＬ−３２産生を示す。データは４つの独立した実験の１つを示す。Ｃｏｓ７細胞をＩＬ−３２α及びＩＬ−３２β  ｃＤＮＡで一過性トランスフェクトしたときのＩＬ−３２発現をイムノブロットにより細胞培養上清（パネルＤ）及び細胞ライゼート（パネルＥ）において検出した。パネルＦは、ＥＣＬにより測定した上清及びライゼート中のＩＬ−３２濃度の比較を示す。データは５つの別々の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図１０】内因性ＩＬ−３２の電気化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）による測定を示す。パネルＡでは、図９Ｂにおいてイムノブロットのために用いた同一サンプル中でＥＣＬアッセイによりＩＬ−３２が検出された。パネルＢでは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８で処理した後のヒトＮＫ細胞系の上清中でＩＬ−３２が検出された。データは４つの別々の実験の平均値±ＳＥＭを示す。パネルＣでは、ＣｏｎＡ誘導ＩＬ−３２がヒトＰＢＭＣの上清及びライゼートの両方で検出された（Ｎ＝７）。
【図１１】マウスＲａｗ２６４．７マクロファージ細胞をＩＬ−３２α（２０Ｕ／ｍｌ）で処理後のＩＬ−３２α誘導ＩκＢ分解（パネルＡ）及びｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化（パネルＢ）を示す。正規化目的で、膜をヤギ抗アクチンまたは家兎抗ｐ３８  ＭＡＰＫでプローブした。
【図１２】パネルＡ及びＣにはそれぞれウマＩＬ−３２αのアミノ酸配列（配列番号１８）及びウマＩＬ−３２βのアミノ酸配列（配列番号１６）を示し、パネルＢ及びＤにはそれぞれウマＩＬ−３２αのｃＤＮＡ配列（配列番号１９）及びウマＩＬ−３２βのｃＤＮＡ配列（配列番号２０）を示す。
【図１３】パネルＡ及びＣにはそれぞれウシＩＬ−３２βのアミノ酸配列（配列番号１７）及びウシＩＬ−３２γのアミノ酸配列（配列番号２２）を示し、パネルＢ及びＤにはそれぞれウマＩＬ−３２βのｃＤＮＡ配列（配列番号２１）及びウシＩＬ−３２γのｃＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す。
【図１４】パネルＡ及びＢにはそれぞれヒツジＩＬ−３２αのアミノ酸配列（配列番号２４）及びｃＤＮＡ配列（配列番号２５）を示す。パネルＣ及びＤにはそれぞれブタＩＬ−３２αのアミノ酸配列（配列番号２６）及びｃＤＮＡ配列（配列番号２７）を示す。
【図１】
2007513609.tif 000003
【図２】
2007513609.tif 000004
【図３Ａ】
2007513609.tif 000005
【図３Ｂ】
2007513609.tif 000006
【図４】
2007513609.tif 000007
【図５】
2007513609.tif 000008
【図６】
2007513609.tif 000009
【図７】
2007513609.tif 000010
【図８】
2007513609.tif 000011
【図９】
2007513609.tif 000012
【図１０】
2007513609.tif 000013
【図１１】
2007513609.tif 000014
【図１２】
2007513609.tif 000015
【図１３】
2007513609.tif 000016
【図１４】
2007513609.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月19日(2007.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５と少なくとも８０％同一であり、ＩＬ−３２をコードし、ＩＬ−３２のエキソン３及びエキソン４を実質的に隣接関係で含む配列を含む精製核酸。
【請求項２】
ＩＬ−３２が配列番号７のアミノ酸配列を含むα−イソ型である請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＩＬ−３２が配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−イソ型である請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ＩＬ−３２が配列番号１０のアミノ酸配列を含むδ−イソ型である請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
配列がＩＬ−３２のイントロン４を欠いている請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
配列が配列番号１５と少なくとも９０％同一である請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
配列が配列番号３、配列番号４及び配列番号６からなる群から選択される請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
配列が異種プロモーターに機能し得る形で連結されている請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
核酸がベクター内に含まれている請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１の核酸によりコードされる精製タンパク質。
【請求項１２】
ＩＬ−３２が配列番号７のアミノ酸配列を含むα−イソ型である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＩＬ−３２が配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−イソ型である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＩＬ−３２が配列番号１０のアミノ酸配列を含むδ−イソ型である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
ＩＬ−３２がγ−イソ型でない請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＩＬ−３２が配列番号１４のアミノ酸配列を含まない請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＩＬ−３２が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される細胞において発現される組換えタンパク質である請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１８】
組換えタンパク質が融合タンパク質である請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
請求項１１に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のモノクローナル抗体のＦａｂ断片。
【請求項２２】
モノクローナル抗体が３２−４及び３２−９から選択される請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体が標的細胞によるＩＬ−３２誘導ＴＮＦα産生を抑制する請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体が標的細胞においてＩＬ−３２誘導ＩκＢ分解を抑制する請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が標的細胞において迅速なＩＬ−３２誘導ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化を抑制する請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２７】
少なくとも１つの細胞をＴＮＦα産生を誘導するのに適した条件下でＩＬ−３２タンパク質と接触させることを含むＴＮＦα産生の誘導方法。
【請求項２８】
ＩＬ−３２タンパク質がα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの細胞が白血球を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
白血球が単核及びマクロファージからなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）被験者及びＩＬ−３２に結合する抗体を用意し、ｂ）前記被験者に前記抗体を投与することを含む被験者の治療方法。
【請求項３２】
ＩＬ−３２がα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
被験者が自己免疫疾患を有している、自己免疫疾患を有していると疑われる、または自己免疫疾患を有する恐れがある請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
自己免疫疾患が多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、１型糖尿病、グレーブス病、橋本病、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、脈管炎、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症、シェーグレン症候群、乾せん、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡及び白斑からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体がヒトモノクローナル抗体及びヒト化マウスモノクローナル抗体からなる群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
投与が自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を緩和するのに適した条件下で行われる請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
被験者が敗血症患者である請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）請求項１１に記載のＩＬ−３２タンパク質及び少なくとも１つの薬物候補を用意すること、
ｂ）前記ＩＬ−３２タンパク質の少なくとも１つの活性に対する前記薬物候補の効果を分析すること
を含むＩＬ−３２阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項３９】
ＩＬ−３２がα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される組換えタンパク質である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
薬物候補がＩＬ−３２反応性モノクローナル抗体及びドミナントネガティブＩＬ−３２バリアントからなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＩＬ−３２タンパク質の少なくとも１つの活性がＴＮＦα発現の上方制御を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）被験者及び請求項１１に記載のＩＬ−３２タンパク質を用意すること、
ｂ）前記ＩＬ−３２タンパク質を前記被験者に投与すること
を含む被験者の治療方法。
【請求項４３】
ＩＬ−３２がα−イソ型、β−イソ型、γ−イソ型及びδ−イソ型からなる群から選択される組換えタンパク質である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
被験者が癌を有している、癌を有していると疑われる、または癌を有する恐れがある請求項４２に記載の方法。
【国際調査報告】
2007513609.tif 000018
2007513609.tif 000019
2007513609.tif 000020
2007513609.tif 000021