(57)【要約】  第一の特徴点では、本発明は、GPR40の発現を制御するためにプロモーターlpf1/Pdx1を含む、GPR40を過剰発現するトランスジェニック実験動物を提供する。前記トランスジェニック動物は、好ましくはマウスまたはラットのようなげっ歯類であるが、他の有用な実験動物であることもできる。第二の特徴点では、本発明は、a)試験される化合物を準備する工程；b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及びd)前記化合物が、前記動物における血中グルコース濃度、トリグリセリド濃度、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、遊離脂肪酸、および／またはグルコース寛容に対する効果を有するか測定する工程を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPR40の発現を制御するためにプロモーターlpf1/Pdx1を含む、GPR40を過剰発現するトランスジェニック実験動物。
【請求項２】
前記動物がげっ歯類である請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記動物がマウスまたはラットである請求項2に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における血中グルコース濃度に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項５】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物におけるトリグリセリド濃度に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項６】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における低密度リポタンパク質(LDL)に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項７】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における高密度リポタンパク質(HDL)に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項８】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における遊離脂肪酸に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項９】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物におけるグルコース寛容含量に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GPR40と相互作用するリガンドの同定のための動物モデル、特にlpf1/Pdx1プロモーターの制御下のGPR40を過剰発現するトランスジェニックマウスに関する。前記マウスは、GPR40レセプター及びその経路に影響する治療剤をスクリーニングするために使用できる。本発明はまた、治療剤のスクリーニングのためのアッセイ系及び方法に関する。GPR40の相互作用に関与する疾患の例として、糖尿病、肥満症、ガン(Yonezawa等 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, (314) 805-809)。神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンティントン舞踏病）、及び発作のような他の症状が挙げられる。
【０００２】
糖尿病は、GPR40レセプターと相互作用する薬剤で治療できる疾患のまさに一つであり、それ故2型糖尿病についての背景のみが、本発明の例として観察されて良い。
【背景技術】
【０００３】
2型糖尿病は、現在1億5千万の患者が罹患しており、毎年5-6百万のケースの増大が予測される世界同時的に拡大している流行病である。肥満症、西洋の食事習慣、肉体活動の欠如、及び加齢が、ここ十年間で来る2型糖尿病の劇的な増大を支配し続けるであろう。2型糖尿病は、膵臓β細胞からのインスリン分泌の減少と組み合わせた、骨格筋、脂肪、及び肝臓細胞におけるインスリンの作用の減少を示す。2型糖尿病は、β細胞の欠損が生じた後に罹患する。かくして、適応的なβ細胞応答を改良することによって、糖尿病は正しく治療されるであろう。2型糖尿病の新規な新しい治療を見出すために、糖尿病の新規な動物モデル、主に膵臓β細胞を欠損しており、糖尿病に特徴的な一つ以上の疾患または症状を導くモデルに対する需要が存在している。そのようなモデルは、β細胞の欠損を部分的または完全に補う試薬の同定のためのスクリーニングアッセイで機能できるであろう。グルコースは、β細胞における貯蔵顆粒からのインスリン分泌の有効で迅速な刺激因子である。低アフィニティーグルコーストランスポータータイプ2(Glut2)は、β細胞による有効なグルコース取り込みを確保し、当該細胞においてグルコースは、鍵となる糖分解酵素グルコキナーゼによってリン酸化される。次いでその後、グルコースの酸化的代謝が、細胞質ATP/ADP比の増大を導き、次いでATP感受性K+ATP膜貫通チャンネルの閉塞を生ずる。次いで、生成した膜脱分極、及びその後の電圧開閉型Ca2+チャンネルの活性化は、血流へのインスリン及びCペプチドの細胞外放出を刺激するCa2+の流入を導く(レビューのため、Easom等, 2000を参照)。かくして、有効なグルコース取り込み、及びその後の代謝は、グルコース刺激化インスリン分泌(GSIS)に必須である二次シグナルの生成を確保する。アミノ酸及び遊離脂肪酸(FFA)、並びにホルモンのような他の栄養素もまた、インスリン分泌に影響するが、これらの分子は、β細胞からのインスリン分泌を直接刺激するというよりはむしろ、グルコースの刺激効果を増強するようである(Rutter, 2001; Zraika等, 2002)。脂肪酸はGSISを増大するが、高濃度の脂肪酸に対する長期的な曝露はGSISを損傷する(Patane, 2003, Jean E. Schaffer. Curr Opin Lididol, 2003)。しかしながら、GSISに対する脂肪酸の正及び負の効果に存在するメカニズムは、ほとんど未知のままである。
【０００４】
2型糖尿病は、グルコースチャレンジに対して不十分に応答し、即ちグルコース不寛容糖尿病であり、しばしば損傷したGSISの早期の兆候と、第1期インスリン分泌の欠失を示す。ほとんどの場合、このβ細胞機能不全は更に進行し、罹患患者において完全なβ細胞機能不全と明白な糖尿病の露顕を導く。患者の糖尿病の状態、即ち高グルコース血症及び高脂肪血症は、β細胞機能の退行に寄与していると介されるが、関与する分子的メカニズムはほとんど未知のままである(Zraika等, 2002; Kashyap等, 2003)。最近同定されたGタンパク質結合レセプターGPR40は、成人β細胞で発現している(Briscoe等, 2003, Itoh等, 2003, Kotarsky等, 2003, WO-A2-02/057783)。GPR40は、GRPR41及びGPR43をも含むGタンパク質結合レセプターの新規なクラスに属し(Briscoe, Itoh, Kotarsky, 及びBrown等, 2003)、細胞系におけるGPR40の活性化は、細胞内Ca2+濃度の増大を引き起こし、MAPK活性を誘導する(Itoh, 2003)。更に長鎖脂肪酸は、GPR40依存性の態様でインスリノーマ細胞系からGSISを促進する(Itoh, 2003)。それ故GPR40は、FFAとGSISの間の潜在的な候補となるリンクを提供する、即ちFFAの上昇レベルによる混乱したβ細胞機能と重篤に損傷したGSISは、FFAに対する長期的な曝露の後初めに顕在化し、時間とともにFFA応答性レセプターの機能の損失よりむしろ過剰な刺激が、β細胞機能の退行、損傷したGSIS、及び糖尿病の発達を導くことを示唆する。かくして、GPR40活性のアゴニスト及びアンタゴニストは、糖尿病、とりわけ2型糖尿病に対する治療上の価値を有するであろう。アンタゴニストは、FFAの上昇したレベルと脂質毒性の減少とともに、患者における糖尿病の予防のために使用され、かくしてβ細胞の機能を改善し、アゴニストは、GSISを刺激するために糖尿病の治療のために使用できるであろう。更にアンタゴニストは、ガン細胞の増殖を阻害するためにも使用できるであろう。
【特許文献１】WO-A2-02/057783
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一つの目的は、GPR40レセプターと相互作用し、新規薬剤の開発に使用できる治療剤のスクリーニングアッセイ方法を提供することである。
【０００６】
本発明の一つの目的は、GPR40レセプターと相互作用する治療剤のスクリーニング用の動物モデルを提供することである。前記動物は、げっ歯類、例えばラットまたはマウス、好ましくはマウスであって良いが、サル、ウサギ、及びモルモットのような他の実験動物を使用しても良い。
【０００７】
本発明の一つの目的は、GPR40アゴニストとして作用することにより、膵臓β細胞における損傷したインスリン分泌を増大する薬剤、またはFFAの上昇したレベルを有する患者における糖尿病の予防のために使用されるアンタゴニストとして作用する薬剤の同定方法を提供することである。試験試薬は、曝露されたトランスジェニックマウスにおいてGlut2発現を増大する場合、または血中グルコース濃度を低下し、グルコース寛容とプロインスリンプロセッシングを回復する場合に、アンタゴニストとして活性であると決定される。
【０００８】
本発明の一つの目的は、GPR40レセプターと拮抗し、それ故ガンの治療の開発のために細胞増殖を阻害するために使用できる化合物を記載することである。
【０００９】
本発明の一つの目的は、ヒトの2型糖尿病を模倣し、治療の開発のために使用できる動物モデルを提供することである。
【００１０】
本発明の更なる目的は、以下の本発明の簡単な記載及び好ましい実施態様、本発明の説明する図面、並びに添付の特許請求の範囲を参照することから明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の特徴点では、本発明は、GPR40の発現を制御するためにプロモーターlpf1/Pdx1を含む、GPR40を過剰発現するトランスジェニック実験動物を提供する。前記トランスジェニック動物は、好ましくはマウスまたはラットのようなげっ歯類であるが、他の有用な実験動物であることもできる。
【００１２】
第二の特徴点では、本発明は、
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における血中グルコース濃度、トリグリセリド濃度、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、遊離脂肪酸、および／またはグルコース寛容に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
定義
用語「化合物」は、2型糖尿病またはガンに影響すると思われるいずれかの化学分子、医薬、薬剤等を指す。考え得る化合物には、既知の及び潜在的な治療用化合物の両者が含まれる。化合物は、適切な時間量で前記化合物に本発明に係るトランスジェニック動物を曝し、次いで血中グルコース濃度、トリグリセリド濃度、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、遊離脂肪酸、および／またはグルコース寛容のような既知の2型糖尿病またはガンと関連する特徴をモニターすることにより、2型糖尿病またはガンに影響することを測定できる。
【００１４】
化合物がいずれかの所望の経路（例えば経口、静脈内、皮下、動脈内、腹膜内、筋肉内等）によって動物に投与され、前記化合物またはその活性な代謝産物が活性形態で動物の血中に出現する場合に、「前記化合物動物の血中で生体利用可能である投与に適した形態である」と称される。
【００１５】
初期のスクリーニングに引き続き、有望と思われる化合物は、およその治療上の投与量範囲を測定するために、ここで提供されるトランスジェニック動物に各種の濃度の前記化合物を投与することによって更に評価される。
【００１６】
動物試験は、ヒトの患者に対する試験によって補われて確認されて良い。しかしながらここで提供される動物モデルは、ヒトにおけるものに対して多くの重要な点で類似するシステムにおいて、上述の方法及び当該技術分野で既知の他の方法の両者によって、多数の化合物の試験を可能にする。
【００１７】
ここで使用される用語「薬剤」は、化合物、複合体または物質であって天然のものまたは人工的なものを指す。
【００１８】
ここで使用される用語「GPR40」は、例えば文献(Briscoe等, 2003, Itoh等, 2003, Kotarsky等, 2003, WO-A2-02/057783)に開示されているレセプターを指す。GPR40は、配列番号1に記載されたポリペプチド配列と少なくとも95％同一性を有し、且つGPR40機能を有するレセプターポリペプチドを指す。GPR40レセプターの例として、配列番号1のポリペプチド配列が挙げられる。GPR40をコードする核酸配列の例として、配列番号2のものが開示される。
【００１９】
ここで使用される用語「lpf1/Pdx1」は、文献(Apelqvist, 1997)に開示されているプロモーター配列である。
【００２０】
要約
マウスにおけるlpf1/Pdx1プロモーターに引き続くGPR40の過剰発現は糖尿病を導く。糖尿病の表現型は、lpf1/GPR40マウスのβ細胞におけるGlut2の発現の損失からある部分由来して良い。これらのデータは、GPR40のレベル及び／または活性が、正常なβ細胞機能を確保するために注意深く制御する必要があることを示唆する。それ故これらのマウスは、GPR40活性及び／または発現、それ故血中グルコース濃度を調節できる物質のを同定するために使用できる重要な動物モデルを表す。
【００２１】
試験試薬は、合成または天然の化合物のラージライブラリーからスクリーニングされる。サッカリド、ペプチド、核酸、及び複素環ベースの化合物のランダムまたは志向的合成のために、現在数多くの手段が使用されている。活性化合物の例として、当業者に既知である既知のGPCR結合スキャホールドが含まれる。合成化合物は、Chembridge (Russia)、Maybridge Chemical Co. (UK)、Chemical Diversity (Russia)、Comgenex (Hungary)、Asinex (Russia)糖のような会社から市販されている。細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、例えばPan Laboratories (USA)、MycoSearch (USA)から入手可能であり、または容易に生産可能である。前記試薬はまた、製薬学的に許容可能な塩、プロドラッグの形態で存在できる。
【００２２】
本発明の製薬組成物での使用のための製薬学的に許容可能な付加塩の例として、鉱物酸、例えば塩化水素酸、塩化臭素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、及び硫酸、並びに有機酸、例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、及びアリールスルホン酸から由来するものが含まれる。ここに記載される製薬学的に許容可能な賦形剤、例えばビヒクル、アジュバント、キャリアー、または希釈液は、当業者に周知であり、公衆に容易に入手可能である。製薬学的に許容可能なキャリアーは、活性化合物に対して化学的に不活性なもの、及び使用条件下で悪性の副作用または毒性を有しないものであって良い。製薬製剤は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995)に見出される。
【００２３】
プロドラッグの例として、ヒドロキシ官能基のエステル及びカルバマート、カルボキシ官能基のエステル基、N-アシル誘導体、Nマンニッチ塩基が含まれるが、これらに制限されない。プロドラッグに関する一般情報は、例えばBundegaard, H. "Design of Prodrugs" pl-92, Elesevier, New York-Oxford (1985)に見出されて良い。
【００２４】
本発明に係る試薬は、例えば経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻孔内、筋肉内、または腹膜内といったいずれかの投与経路用に調製されて良い。キャリアーまたは他の物質の正確な性質は、投与の経路に依存するであろう。非経口投与のため、非経口的に許容可能な水溶液が使用され、それらは病原体フリーであり、必要なｐＨ、等張性、及び安定性を有する。当業者は適切な溶液を調製することが可能であり、多くの方法が文献に記載されている。ドラッグデリバリーの方法の簡単なレビューは、例えばLanger, Science 249: 1527-1533 (1990)に見出される。
【００２５】
本発明の文脈では、哺乳動物、特にヒトに投与される投与量は、応答時間のフレームに亘り前記哺乳動物において治療応答の作用を有するのにに十分であるべきである。当業者、特定の化合物、患者の年齢、状態、及び体重、並びに疾患のステージ／重篤度を含む各種の因子に投与量が依存することを認識するであろう。前記投与量はまた、投与の経路（投与形態）、時期、及び頻度によって決定されるであろう。経口投与の場合、投与量は一日当たり約0.01mgから約1000mg、または製薬学的に許容可能なその塩の対応量まで変化できる。
【実施例】
【００２６】
いくつかの疾患が、GPR40レセプターと相互作用する化合物によって治療でき、in vivoでGPR40の機能を調査するために、本発明者は、lpf1/Pdx1プロモーター(Apelqvist, 1997)の制御下のGPR40過剰発現β細胞を有するトランスジェニックマウスを生産した（図1参照）。この動物モデルは、2型糖尿病の研究に使用することができた。他の動物モデルを、他の疾患の研究のため同様なアプローチで生産した。GPR40を過剰発現するβ細胞を有する生成したトランスジェニック動物は生存して生まれ、最初は健康のようであるが、年齢とともに糖尿病を形成し（表1参照）、成人β細胞におけるGPR40の強制発現がベータ細胞機能を混乱させることを示唆した。トランスジェニックマウスから得られた以下に記載される結果は、GPR40の発現の操作が糖尿病を導くという新規な方法を示し、糖尿病の治療のための新規な治療薬の研究のために使用できた。
【００２７】
【表１】
2007502614.tif 000002
【００２８】
表１に示されたように、血中グルコース濃度を、野生型の同腹子と比較してlpf-1/GPR40トランスジェニックで評価した。
【００２９】
膵臓
10週齢のマウスの単離した膵臓の分析により、トランスジェニックマウスと野生型の同腹子の間の器官全体のサイズの見かけの差異は示されなかった（示さず）。インスリン、グルカゴン、及びアルファ-平滑筋アクチンに対する抗体を使用するトランスジェニックと野生型のマウスから由来する膵臓の全重量の免疫染色により、トランスジェニックマウスにおける主要な血管の正常な配置とクラスター化膵臓内分泌細胞、即ち島の正常な分布が明らかとなった。（図1参照）。言うまでもなく、島における内分泌細胞の細胞内配置は混乱しているようであり、トランスジェニックマウスの島は、タイトにクラスター化したβ細胞のコアを取り巻くグルカゴン発現α細胞の正常な配置を欠いており、その代わりにグルカゴン発現α細胞は、lpf-1/GPR40マウスの島内に点在しているようである。それ故、トランスジェニックマウスでは、島の色がより紫色である（図1右欄参照）。lpf-1/GPR40マウスでは、島の形態が混乱している。
【００３０】
インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、Isl1、及び膵臓ポリペプチド（PP)に対する抗体を使用する、野生型及びトランスジェニックマウスから由来する断片化膵臓の免疫染色により、トランスジェニックマウスの島内の内分泌細胞の異常な配置が確認された（図2b、3b、及び4b参照）。図2a及び2bは、インスリンとグルカゴンの二重染色を示す。図3a及び3bは、インスリンとソマトスタチンの二重染色を示し、図4a及び4bは、Ist1とPPの二重染色を示す。
【００３１】
分子的欠損
lpf1/GPR40マウスにおける糖尿病の発達の元となる分子的欠損を同定し始めるために、β細胞機能に必須に必要とされることが示されている因子の発現の分析を実施した。
【００３２】
Glut2及びPC1/3
in vitroでの上昇したFFAに対する島の長期的な曝露は、β細胞機能を制御する因子の損傷した発現を導く(Gremlich等, 1997, Zhou等, 2003)。一つのそのような因子はGlut2であり、その発現もまた各種の糖尿病動物モデルで混乱している(Efrat, 2003)。lpf1/GPR40マウスでは、Glut2の発現は現実的に検出不可能であり、Glut2の発現がlpf1/GPR40マウスで下流調節されている証拠を提供した（図5a及び5b参照）。
【００３３】
別の因子はプロホルモンコンベルターゼ1/3（PC1/3) であり、それはプロインスリンからインスリンへのプロセッシングに関与する鍵となる酵素の一つである。PC1/3の発現は、lpf1/GPR40マウスで減少しており（図5c及び5d参照）、それはプロインスリン：インスリン比（P/I比）の増大を生ずる。増大した比は、2型糖尿病と関連する。プロインスリンの免疫反応性は、lpf1/GPR40マウスのβ細胞において容易に検出可能であった（図5e及び5f参照）。Glut2及びPC1/3の減少した発現は、lpf1/GPR40マウスのβ細胞において、混乱したグルコースセンシングとプロインスリンのプロセッシングを導き、これらのマウスで観察される損傷したGSISと糖尿病の発達に寄与するようである。これは、抗プロインスリン特異的抗体を使用する免疫組織化学的分析によって確認され、野生型マウスと比較して、lpf1/GPR40マウスのβ細胞でプロインスリンの量が増大することが明らかとなった（図5e及び5f参照）。これらのデータは、成人β細胞におけるGPR40の発現及び／または活性が、正常なGSISを確保し、それ故グルコースホメオスタシスを確保するためにタイトに均衡を保たれる必要があることを示唆する。
【００３４】
図5は、グルコースセンシングとプロインスリンプロセッシングに関与する因子の発現が、lpf1/GPR40マウスにおいて混乱していることを示す。図5a-d；Glut2（a及びｂ）及びPC1/3（c及びd）の発現の分析により、lpf1/GPR40マウスのβ細胞において、Glut2発現が損傷し、PC1/3発現が減少していることを示す。図5e-g；lpf1/GPR40マウスにおいて、プロインスリンプロセッシングが混乱しており、それ故加えてインスリン（g及びh）、プロインスリン（e及びf）の免疫活性が、lpf1/GPR40マウスのβ細胞において容易に観察される。
【００３５】
プロインスリン及びインスリン
インスリン及びプロインスリンの過剰分泌、及びその後の高インスリン血症は、上述のように2型糖尿病の進行と関連し、上昇したレベルのFFAに対する島の長期的な曝露は、主にプロインスリンの増大した分泌と、インスリン含量の枯渇をも導く(Furukawa等, Diabetes 48, 1395-1401, 1999; Bjorklund & Grill, Diabetes, 48, 1409-1414, 1999)。全膵臓インスリン含量は、lpf1/GPR40マウスにおいてひどく減少し（図6a参照）、lpf1/GPR40マウスにおける混乱したインスリン遺伝子発現及び／またはインスリン貯蔵を示唆する。それ故、lpf1/GPR40マウスで観察された損傷したGSISは、少なくとも部分的に、容易に放出可能なインスリンの貯蔵から由来するであろう。インスリンmRNAレベルのリアルタイムPCR分析により、インスリン遺伝子発現はlpf1/GPR40マウスにおいて正常であることが明らかとなった（図6a参照）。これらのデータをともに併せると、膵臓の発達、β細胞生成、及びインスリン遺伝子発現は正常であるが、膵臓インスリン含量はlpf1/GPR40マウスで減少しており、2型糖尿病及び上昇したFFAに曝露された島で観察される状況と類似することが示される。
【００３６】
lpf1/GPR40マウスにおいては、膵臓インスリン含量が減少しているが、インスリン遺伝子発現は正常である（図6a及び6b参照）。図6aは、全膵臓タンパク質抽出物のインスリン比イムノアッセイ（RIA)を示し、全膵臓インスリン含量は、野生型コントロール（ピンク）と比較して、lpf1/GPR40マウス（ブルー）で〜78％まで減少していることを示す。図6bは、野生型（ブルー、n=3）及びlpf1/GPR40（ピンク、n=3）マウスの単離した島cDNAから得られたインスリンmRNAの定量的リアルタイムPCRを示し、インスリン遺伝子発現がlpf1/GPR40 マウスにおいて正常であることを示す。
【００３７】
グルコース寛容試験
一晩絶食したマウスに対する外因性グルコースに応答する血清インスリンレベルの測定による、グルコース寛容試験(Ulf Ahlgren等, 1998)及びGSISの測定により、これらのマウスでひどく損傷したグルコース寛容が明らかとなり、野生型コントロールと比較してlpf1/GPR40マウスにおいて、第一期インスリン放出の欠損、及び第二期インスリン放出の遅延と鈍化が明らかとなった（図7a及び7b参照）。
【００３８】
図7aは、lpf1/GPR40マウスがグルコース不寛容であることを示す。lpf1/GPR40（◆、n=4）及び野生型マウス（■、n=2）のグルコース寛容試験により、一晩絶食したマウスへのグルコースの腹膜内注射の後、血中グルコース濃度（ｘ軸でmmol/l単位として示される）が示された（平均値）。図7bは、lpf/GPR40トランスジェニックマウスにおける損傷したインスリン分泌を示す。血清インスリン濃度（ｘ軸でng/ml単位として示される）を、一晩絶食した動物へのグルコースの静脈内注射の後、野生型（■、n=2）及びlpf1/GPR40（◆、n=4）で測定した（平均値）。
【００３９】
遊離脂肪酸
ヒト細胞表面レセプターを、遊離脂肪酸及びチアゾリジンジオン薬剤によって活性化した。遊離脂肪酸の測定は、文献(Knut Kotarsky, 2003、及びJean E. Schaffer, 2003)に開示されている。
【００４０】
トリグリセリド濃度、低密度リポタンパク質(LDL)濃度、及び高密度リポタンパク質(HDL)濃度の測定は、当業者に既知である。いくつかの測定法は、US 4125377、US 4920123、及びUS 6764828に開示されている。
【００４１】
UCP2、PPAR、Cpg21、MKP3、及びCREM-17X
二重特異性MAPK-ホスファターゼCpg21、cAMP応答エレメントモジュレーター(CREM)-17X、ペルオキシソーム増殖因子活性化(PPAR)α、及びその下流標的遺伝子カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1(CPT1)及び非カップリングタンパク質2(UCP2)を含む多くの異なる因子は、長期的なFFAに曝された島において、全て下流調節よりむしろ上流調節される(Zraika等, 2002, Zhou, 2003)。リアルタイムPCR分析により、PPARα、UCP2、及び二重特異性MAPKホスファターゼ(MKP)3の発現がlpf1/GPR40マウスにおいて上流調節されている一方、2型糖尿病と結び付く遺伝子であるPPARγの発現は減少していることを示した（図8a及び8b参照）。CPR1の発現は、lpf1/GPR40マウスにおいて6倍上流調節された。Glut2の現実的に破壊された発現は、mRNAレベルで確認された（図8a及び8b参照）。転写因子lpf1/Pdx1及びIst1、線維芽細胞増殖因子レセプター(Fgfr)1、及びグルコキナーゼ(GCK)、Cpg21、及びCREM-17Xを含む多くの遺伝子が、変化なしか穏やかに改変された発現レベルを示した（図8a及び8b及びデータ示さず）。
【００４２】
図8a及び8bは、野生型（ピンク、n=3）及びlfp1/GPR40（ブルー、n=3）マウスから得た島cDNAに対する定量的リアルタイムPCRを示し、Glut2発現が現実的に破壊され、PPARγは減少し、UCP2、MKP3、及びPPARα発現は増大することを表している。
【００４３】
cp-2は、酸化的リン酸化から呼吸を脱共役することによりGSISを損傷することが知られており、次いでATP生産の減少を導く。β細胞機能におけるPPARのその他の役割はあまり理解されていないが、PPARは酸化及び脂質生成に関与する遺伝子を調節する脂肪酸センサーである。PPARαは、UCP2発現を刺激し、インスリノーマ細胞系においてインスリン分泌を損傷することが知られている(Tordjman等, 2002)。マウスβ細胞におけるFGFR1cシグナリンの減弱は、一部としてGlut2及びPC1/3の発現の損傷のため糖尿病を導き(Hart等, 2000)、FGFシグナリングは、MEK/MEPKを活性化することが知られている(Szebenyi等, 1999)。MKP3のような二重特異性ホスファターゼは、次いでERKを脱リン酸化して不活性化することが知られており、MAPK依存性FGFシグナリングの阻害を導く(Keyse, 2000)。かくして、lpf1/GPR40マウスで観察されるMKP3の上流調節は、β細胞におけるFGFR1cシグナリングを損傷する。これらのデータを併せると、in vivoでの成人β細胞におけるGPR40の強制発現は、適切なグルコースセンシング、酸化的代謝、プロインスリンからインスリンへのプロセッシングに必要な因子の発現を破壊することが示される。
【００４４】
lpf1/GPR40トランスジェニックマウスの生産
GPR40をコードするORFを、クローンE7から930塩基対のXbaI-BglII制限断片として単離した(Michael Walker)。5'突出末端の充填に引き続き、単離した断片をlpf1/Pdx1プロモーターの後ろにクローン化した(Apelqvist, 1997)。記載されたように、B6/CBAペアレントから得たF2ハイブリッド卵母細胞内に、GPR40 cDNAが引き続くlpf1/Pdx1プロモーターを包含する精製した6.5kbのNotI-BssHII制限断片の原核注射によって、トランスジェニックマウスを生産した(Hogan B. Manipulating the mouse embryo, 1994)。尾の生検または胚の頭部から抽出したゲノムDNAをPCR分析に使用し、トランスジェニック動物の遺伝子型を測定した。使用されたプライマーは、5'-GGGAAGAGGAGATGTAGACTT-3' (5'側のlpf1/Pdx1プライマー)、及び5'-GTAGAGGGGAGCAAAGTG-3' (3'側のGPR40プライマー)であった。トランスジーンからの発現を、e10胚に対してin situ染色によって確認した。
【００４５】
プロモーター島アミロイド(IAPP)(Hull等, 2004)もまた、β細胞においてGPR40を過剰発現するトランスジェニックマウスを生産するために使用できた。
【００４６】
グルコース及びインスリンの測定
体重のkg当たり1gのグルコースで腹膜内に注射した一晩絶食したマウスを使用して、全ての機能的分析をin vivoで実施した。グルコース注射の前（0分後）及びグルコース注射の後2.5、5、10、20、40、80、及び120分後で、尾の静脈から血液サンプルを採取した。血中グルコース濃度を、Glucometer Elite (Bayer Inc.)を使用して測定し、血清インスリン濃度を、製造者の推奨に従ってELISA (Marcodia)を使用して測定した。
【００４７】
mRNA発現レベルの定量
NucleoSpin RNAII-kit (#635990, Machery-Nagel)及びSuper SMART PCR (#635000, Clontech)を使用して、単離した島から調製した全RNAからcDNAを調製した(Ahren, 1997)。製造者の推奨に従って、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System及びSYBR Green PCR Master Mix (ABI)を使用して、リアルタイムPCR分析を実施した。
【００４８】
in situハイブリダイゼーション及び免疫組織化学
マウスGPR40 cDNAに対応するDIGラベル化プローブを使用して、記載されたようにin situハイブリダイゼーションを実施した(Apelqvist, 1997)。抗原の免疫組織化学的局在、及び二重ラベル免疫組織化学を記載されたように実施した(Apelqvist, 1997)。一次抗体は以下のものを使用した：モルモット抗インスリン(linco)、ウサギ抗グルカゴン(EuroDiagnostica)、ウサギ抗グルコーストランスポーター2(B. Thorens, Lausanne, Switzerlandから頂戴した)、ウサギ抗プロホルモンコンベルターゼ1/3(Chemicon)、ラット抗ソマトスタチン(Biogenesis)、モルモット抗パンクレアチンポリペプチド(Linco)、ウサギ抗島1(T,Edlund, Umea, Swedenから頂戴した)。二次抗体は以下のものを使用した：ALEXA488-抗モルモット(Molecular Probe)、Cy3抗ウサギ及びCY3抗ラット(Jackson laboratory)。
【００４９】
［参考文献］
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2007502614.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図1は、IPF-1/GPR40マウス及び野生型マウスにおける混乱した島の形態を示す。
【図２ａ】図2aは、野生型マウスにおける島とグルカゴンの二重染色を示す。
【図２ｂ】図2bは、IPF-1/GPR40マウスにおける島とグルカゴンの二重染色を示す。
【図３ａ】図3aは、野生型マウスにおける島とソマトスタチンの二重染色を示す。
【図３ｂ】図3bは、IPE-1/GPR40マウスにおける島とソマトスタチンの二重染色を示す。
【図４ａ】図4aは、野生型マウスにおけるIst1とPPの二重染色を示す。
【図４ｂ】図4bは、IPF-1/GPR40マウスにおけるIst1とPPの二重染色を示す。
【図５】図5は、グルコースセンシングとプロインスリンプロセッシングに関与する因子の発現が、野生型マウスにおいて混乱していることを示す。
【図６ａ】図6aは、野生型及びlpf1/GPR40マウスにおける全膵臓タンパク質抽出物のインスリン比イムノアッセイ(RIA)を示す。
【図６ｂ】図6bは、野生型及びlpf1/GPR40マウスの単離した島cDNA由来のインスリンmRNAの定量的リアルタイムPCRを示す。
【図７ａ】図7aは、lpf1/GPR40及び野生型マウスのグルコース寛容試験を示す。
【図７ｂ】図7bは、lpf1/GPR40及び野生型マウスのグルコースチャレンジに応答するインスリン分泌を示す。
【図８ａ】図8aは、lpf1/GPR40トランスジェニックマウスにおける損傷したインスリン分泌を示し、一晩絶食した動物にグルコースを腹膜内注射した後の野生型及びlpf1/GPR40マウスにおいて、血清インスリン濃度を測定した。
【図８ｂ】図8bは、lpf1/GPR40トランスジェニックマウスにおける損傷したインスリン分泌を示し、一晩絶食した動物にグルコースを腹膜内注射した後の野生型及びlpf1/GPR40マウスにおいて、血清インスリン濃度を測定した。
【図９】図9は、構築物のマップを示す。
【００５１】
［配列表］
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPR40の発現を制御するためにプロモーターlpf1/Pdx1を含む、GPR40を過剰発現するトランスジェニック非ヒト実験動物。
【請求項２】
前記動物がげっ歯類である請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記動物がマウスまたはラットである請求項2に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における血中グルコース濃度に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項５】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物におけるトリグリセリド濃度に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項６】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における低密度リポタンパク質(LDL)に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項７】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における高密度リポタンパク質(HDL)に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項８】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物における遊離脂肪酸に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【請求項９】
a)試験される化合物を準備する工程；
b)請求項1に記載のトランスジェニック実験動物を準備する工程；
c)前記動物を前記化合物に曝露する工程；及び
d)前記化合物が、前記動物におけるグルコース寛容含量に対する効果を有するか測定する工程
を含む、トランスジェニック実験動物を使用する、化合物が2型糖尿病を治療するための特定の効果を有するか試験する方法。
【国際調査報告】
2007502614.tif 000027
2007502614.tif 000028
2007502614.tif 000029
2007502614.tif 000030