(57)【要約】  本発明は、リボ核酸を加水分解するための方法及び化合物に関する。特に、ＲＮＡの特定の位置において、リン酸ジエステル結合の選択的な切断に使用される化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造を有し、核酸を加水分解する化合物であって、
オリゴ−スペーサー−カッター
オリゴは８個以上のヌクレオチド又はその模倣体のリボ核酸であり、
末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から４〜８個離れたヌクレオチドとハイブリダイズする方法で、標的核酸とハイブリダイズすることが可能であり、
スペーサーはカッターを前記オリゴの前記末端ヌクレオチドに共有結合させ、オリゴからカッターの直鎖に２個以上の原子を含み、
カッターは２個以上の窒素原子を有するポリアミンである化合物。
【請求項２】
オリゴがヌクレオチド模倣体としてＰＮＡを含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
オリゴがヌクレオチド模倣体として２´−Ｏ−アルキル、好ましくはメチル、ホスホロチオエートを含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項４】
スペーサーが１又は複数個のアミノ酸、とりわけグリシンを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の化合物。
【請求項５】
スペーサーがアミド結合を介してオリゴと結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の化合物。
【請求項６】
カッターがエチレンジアミンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の化合物。
【請求項７】
オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から４位置離れていて、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が４〜６個、好ましくは５個であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の化合物。
【請求項８】
オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から５位置離れていて、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が１０〜１２個、好ましくは１１個であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の化合物。
【請求項９】
標的リボ核酸が請求項１〜８のいずれか記載の化合物と接触する所定の位置でリボ核酸を加水分解する方法。
【請求項１０】
リボ核酸がＲＮＡ、とりわけｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか記載の化合物と医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
薬物としての請求項１〜８のいずれか記載の化合物の使用。
【請求項１３】
診断ツールとしての請求項１〜８のいずれか記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を加水分解するための方法及び化合物に関する。特に、ＲＮＡの特定の位置でリン酸ジエステル結合を選択的に切断することに使用可能な化合物に関する。よって、本発明は、タンパク質工学の分野及び医療の分野において、特にアンチセンス戦略の観点から、分子生物学的技術に関する研究のための有用なツールを提供する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス技術とは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの転写又は翻訳が、標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドを使用して調節できる、という知見に基づいている。そのようなアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、実際のＤＮＡ又はＲＮＡ標的核酸に相補的であり、反対方向の配列を有するヌクレオチドとして理解されている。天然のオリゴヌクレオチドが、アンチセンス戦略において使用される場合、すなわち、標準、天然塩基及びバックボーンのオリゴヌクレオチドは、通常１７個以上の塩基を含んでいて、リボヌクレアーゼＨ活性を効果的に活性化し、遺伝子発現をダウンレギュレートする。
【０００３】
当該分野が発展するにつれ、オリゴヌクレオチドに対し、それらを使用する条件下で、さらに安定化させる多様な修飾が提案されている。特に、アンチセンス・オリゴヌクレオチドをインタクトな細胞に導入する場合、活性化の減少を引き起こすＲＮＡ特異的ヌクレアーゼ及びＤＮＡ特異的ヌクレアーゼによる攻撃に曝される。ヌクレアーゼによる分解を抑制する修飾は公開されていて、２´−Ｏ-アルキル、アルケニル（アリル）又はアルキニル・ヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート、モルフォリノなどである。
【０００４】
一方、人工リボヌクレアーゼは、遺伝子操作において利用可能性があるために注目を集めている。特に、ＲＮＡ切断分子は、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）の末端に結合している。オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡにおける特定の配列にハイブリダイズし、後に特定部位で切断する。この点においては、特に、分子内の酸塩基協同を経て、シトシンとアデノシン（ＣＡ）間のリン酸ジエステル結合の加水分解に対する感受性を利用している。加水分解は３´側のシトシン・ヌクレオチドで起こる。
【０００５】
Komiyamaらは、カルバメート結合によってＤＮＡ１９−ｍｅｒの５´末端に固定したジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）のハイブリッドが、直鎖状のＲＮＡを３´末端のシトシンで選択的に加水分解して、３´−リン酸末端を有する２２−ｍｅｒＲＮＡ断片を得た、ということをJ. Chem. Soc., Chem. Commun, 1995, 77-78で報告している。その選択的切断は、アンモニウム・カチオン及びＤＮＡ−ＤＥＴＡ付加体のエチレンジアミン［−Ｎ(ＣＨ２)２ＮＨ２］部分の中性アミンの分子内の酸塩基協同に起因していた。ｐＨ８、５０°Ｃで４時間のインキュベーション後、加水分解していたのは、わずか１０ｍｏｌ％ＲＮＡだけであった。
【０００６】
この状態を改善するために、Verheijenは１０−ｍｅｒＰＮＡを有するＤＥＴＡ付加体を開示している（Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372）。ＰＮＡは、生分解に抵抗性であるオリゴヌクレオチドとして選択され、天然のオリゴヌクレオチドよりも強くＲＮＡ（又はＤＮＡ）に結合するので、ＰＮＡモノマー１０個のオリゴマーは、ハイブリダイズするのに充分な長さであった。ＤＥＴＡ切断部分は尿素結合を経由してＰＮＡと結合した。標的ＲＮＡでは、付加的な切断部位は、グアノシンをシトシンに置換することにより導入した。実際に、標的ＲＮＡは２箇所で加水分解され、ＲＮＡ加水分解に対する総置換量は、ｐＨ７、４０°Ｃで４時間インキュベーションした後では約２９％であった（これらの条件は、Komiyamaが用いた条件よりも、生理的条件がより優れた条件であることに留意のこと）。
【０００７】
以下は、これら２つの先行文献の配列図である。最初に、Komiyamaらにより用いられたＤＮＡ−ＤＥＴＡを有するＲＮＡ（３０−ｍｅｒ）の複合体を示し、次に、VerheijenらのＰＮＡ−ＤＥＴＡを有するＲＮＡ（２５−ｍｅｒ）の複合体を示す。ＤＥＴＡはＮＨ(ＣＨ２)２ＮＨ(ＣＨ２)２ＮＨ２を表す。ヌクレオチドユニットは大文字で記載し、ＰＮＡユニットは小文字で記載する。矢印は、ＤＮＡ−ＤＥＴＡ又はＰＮＡ−ＤＥＴＡによる加水分解のＲＮＡにおける切断位置を示している。KomiyamaＲＮＡのグアノシンは、１９位でVerheijenＲＮＡのシトシンと置換されていることに留意のこと。
2007528224.tif 000002
【０００８】
上述のように、VerheijenＲＮＡは、２箇所で、すなわち３´側のＣ１７及びＣ１９で加水分解される。７時間インキュベーションした後のＲＮＡ：ＰＮＡ−ＤＥＴＡの割合は１：３３であり、該ＲＮＡの約５０％は加水分解され、３´側のＣ１７では約１５％、Ｃ１９では約３５％であった。さらに、Verheijenは、３´側のＵ６での切断に伴う微量な分解生成物に注目した。この切断は次に述べる事実に起因していて、それは、１０−ｍｅｒのＰＮＡ−オリゴマーは１ヘリックス・ターンに相当し、ＲＮＡ●ＰＮＡ−ＤＥＴＡ複合体、Ｕ６とＧ７のリン酸ジエステル結合の近くにあるエチレンジアミン残基に位置するという事実である。
【０００９】
他に、考慮の対象となる関連する先行技術としては、Nucleic Acids Symposium Series No. 29,1993, 197-198におけるKomiyamaらの「加水分解する人工ヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼの分子設計」がある。この文献では、標的ｔＲＮＡにおける可能な２箇所の加水分解するリン酸ジエステル結合により、末端のハイブリダイズするヌクレオチドから３個離れた遠位結合が、末端のハイブリダイズするヌクレオチドから１個離れた結合よりも、さらに容易に加水分解する、ということを示している。しかし、Komiyamaらの加水分解する人工ヌクレアーゼは、分子モデル研究の成果であるということに留意すべきである。これらのヌクレアーゼは、ハイブリダイゼイションの位置及び加水分解する位置を最適化する結果から得られる、ということを当業者に教示している。
【００１０】
Komiyamaのヌクレアーゼは、Verheijenら（上記参照のこと）及びVlassovら（Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 1997, vol. 7,39-42参照のこと）の原点となっている。Verheijenら及びVlassovらは、加水分解するリン酸ジエステル結合が離れていればいるほど、容易に加水分解するというKomiyamaと同じ結論に達している。Vlassovらは、ポリアミンをベースとする切断基をオリゴヌクレオチドに結合するリンカー構造の長さと硬直性を最適化することにより、また、リンカーがオリゴヌクレオチドに付着する位置を最適化することにより、加水分解すなわち切断効率を改善する余地があることを示唆している。しかし、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡにハイブリダイズする位置をさらに変更することを示唆しているのではない。
【００１１】
本発明の目的は、先行技術の化合物を改良して、加水分解効率が改善した化合物を提供することにより、ポリアミンが介する切断により核酸を加水分解すること、具体的には加水分解の速度を増加させることである。
【非特許文献１】Komiyama et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun.,1995,77-78
【非特許文献２】Verheijen, Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372
【非特許文献３】Komiyama et al., Nucleic Acids Symposium Series No.29,1993, 197-198
【非特許文献４】Vlassov et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 1997, vol. 7, 39-42
【発明の開示】
【００１２】
核酸からポリアミンが結合しているオリゴヌクレオチドへの加水分解に関与するポリアミン部分の距離と、核酸が最適に加水分解する位置に関連性があることが見い出された。これより以下、加水分解に関与するポリアミン部分を、カッターと名付ける。カッターが結合するオリゴヌクレオチドは、以下短縮してオリゴと名付ける。カッターとオリゴの距離は、その２つを共有結合的に結合する構造エレメントにより確立され、以下スペーサーと名付ける。スペーサーによって決定される距離は、オリゴからカッターの原子数によって便宜上記載する。数える原子はオリゴからカッターの直鎖を形成する原子である。あり得る置換基や鎖の枝分れは、スペーサーによって定義される原子数としては数えない。
【００１３】
意外なことに、ヌクレオチドが４個以上離れて、オリゴヌクレオチド末端の複合体が加水分解する予測位置、及び直鎖において原子が２個以上となる、加水分解に関与するポリアミン部分とオリゴヌクレオチドとの距離に関連する場合、シトシン−アデノシン配列の３´末端のシトシンにおける基質ＲＮＡの加水分解は、先行技術の化合物に比較して２倍であった。
【００１４】
よって、本発明は、リボ核酸の加水分解に関与する２個以上の窒素原子を含むカッターに結合し、並びに、オリゴ及び前記カッターの末端ヌクレオチド又はその模倣体（mimic）に結合する直鎖に２個以上の原子を含んだスペーサーを有するオリゴ又はその模倣体が、加水分解される予測位置から４〜８個離れてハイブリダイズする、リボ核酸加水分解の方法に関する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、
オリゴ−スペーサー−カッター
構造を有するリボ核酸加水分解のための化合物に関する。オリゴは、８個以上のヌクレオチド又はその模倣体のリボ核酸であって、末端ヌクレオチド又はその模倣体が加水分解される位置から４〜８個離れたヌクレオチドにハイブリダイズする方法によって標的核酸にハイブリダイズ可能となる。スペーサーは、カッターを前記オリゴの末端ヌクレオチドに共有結合的に結合させ、オリゴからカッターの直鎖に２個以上の原子を含み、カッターは２個以上の窒素原子を有するポリアミンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
遺伝子発現を効率的に確実に制御する方法の研究において、本発明者らは、選択的に標的リボ核酸を加水分解する可能性を研究した。この点において、リン酸ジエステル結合の切断を媒介するポリアミンを介して反応する人工ヌクレアーゼを対象にした。
【００１７】
Verheijen (上記参照)により報告された先行技術のシステムでは、インキュベーション７時間後に相当な量である約５０％の標的核酸が加水分解されたが、インキュベーション２４時間後では８５％の標的核酸が加水分解しただけであった。さらに、加水分解のための２箇所の予測部位に加えて、第３の予想外の加水分解部位を含む標的核酸が存在したことは、注目に値する。よって、この先行技術による人工ヌクレアーゼの加水分解効率には、改善の余地が多く残されている。具体的には、加水分解のための部位が、３箇所や２箇所ではなく、任意の１箇所のみである標的核酸についてである。
【００１８】
上記に記載した先行技術の標的核酸に基づき、以下の合成ＲＮＡ配列が使用された。
2007528224.tif 000003
加水分解のための予測位置には下線が引かれている。加水分解は、３´末端の下線を引いたシトシンで起こる。加水分解される位置からヌクレオチドが何個離れているかを数えると、シトシン又はアデノシンのどちらかが、それぞれ５´末端又は３´末端のどちらかの方向に応じて、オリゴのハイブリダイズに関与している。よって、上記のＲＮＡ配列の例では、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体は、加水分解される位置から４個以上離れた位置でハイブリダイズし、この末端ヌクレオチドは、５´末端方向にある第１のウラシル（Ｕ１３）にハイブリダイズする。３´末端方向では、加水分解される位置から４個離れた位置が２２位（Ｕ２２）のウラシルである。
【００１９】
上記エチレンジアミンを導入した標的核酸における予測位置の加水分解では、エチレンジアミンはカッターとして使用された。スペーサーの長さが多様であるために、グリシン残基をオリゴとカッターの間に挿入した。
【００２０】
加水分解される位置から２個又は３個離れた位置でハイブリダイズしたオリゴは、スペーサーにおけるグリシン残基が０、１又は２個にかかわりなく、同じような加水分解率を示した。ＲＮＡ対オリゴ−スペーサー−カッターの割合が１対３３、ｐＨ７、４０℃で７時間インキュベーションし、中程度である１０〜２０％の加水分解率が得られた。２４時間インキュベーション後の加水分解率は２０〜３０％の間で様々であった。
【００２１】
しかし、加水分解される位置から４位置離れてハイブリダイズしたオリゴでは、加水分解された標的リボ核酸の量において顕著な改善を示した。具体的には、スペーサーが５個の原子を含む化合物に対し、ＲＮＡ対オリゴ−スペーサー−カッターの割合が１対３３、ｐＨ７、４０℃で７時間インキュベーション後、加水分解は５０％を超え、また、２４時間後では９５％を超えていた。
【００２２】
本明細書で使用する用語「オリゴ」は、リボ核酸又はその模倣体に言及する。この用語には、生理条件下でオリゴをさらに安定化するリボ核酸の誘導体が含まれる。適切な誘導体としては、２´−Ｏ−アルキル、アルケニル（アリル）若しくはアルキニルヌクレオチド、２´−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）、及び／又は２´−デオキシ２´−フルオロヌクレオチドが挙げられ、２´−メチル及び２´−Ｏ−アリルヌクレオチドが好ましい。任意でも、又は代わりにリン酸ジエステル結合が誘導体化される可能性があり、例えば、Ｏ−アルキル化したリン酸ジエステル、又は好ましくはホスホロチエートとなることもある。ヌクレオチドの模倣体を含むオリゴは、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ等を含むヌクレオチドに言及する。
【００２３】
オリゴの適当な塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、２，６−ジアミノプリン、キサンチン、ヒポキサンチン、さらに、アルキル、アミノ、アザ及び／若しくはハロ置換塩基、又はデアザ（deaza）塩基等の塩基の誘導体がある。塩基のさらなる修飾は適していることもあり、当業者に公知である。
【００２４】
本発明のオリゴは、８個以上のヌクレオチド又はその模倣体の長さを有している。通常、充分なハイブリダイゼイションを行なうためには２５個を超えるヌクレオチド（又はその模倣体）の長さは必要ではないが、１０個以上のヌクレオチド（又はその模倣体）の長さが好ましい。
【００２５】
オリゴは、スペーサーが付着可能となる位置を２箇所有する。スペーサーは５´−Ｏ原子又は３´−Ｏ原子のどちらかに付着する。オリゴがその末端にヌクレオチドの模倣体を含む場合には、スペーサーは、５´−Ｏ原子又は３´−Ｏ原子に対応するヌクレオチドの模倣体の原子に付着する。
【００２６】
本明細書において使用される「スペーサー」という用語は、原子の数により、オリゴとカッターの距離を定義する。原子の数は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体の５´−Ｏ原子又は３´−Ｏ原子に結合する第１の原子から、カッターに結合する最後の原子までの直鎖において数える。スペーサーは、標的ＲＮＡにおけるリン酸ジエステル結合の切断に関与するカッターの第１の窒素原子で終わる。スペーサーの原子は、熟練技術者に公知である任意の適当な原子でもよく、同じであるか又は異なっていてもよく、Ｃ、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰから選択されることが好ましい。
【００２７】
スペーサーは分枝していてもよく、及び／又は、スペーサーの原子は官能基で置換されてもよい。そのような置換基は、本発明の化合物を検出可能とする官能性を有することもあり、例えば、蛍光標識でスペーサーを置換することも可能であり、そのような標識は周知となっている。代わりに又は加えて、スペーサーは細胞膜の通過を促進する基で置換されることもある。そのような基は、細胞膜の脂質二重層と容易に相互作用する疎水基でもよく、及び／又は、細胞膜を通過する運搬に関与する受容体若しくは酵素と相互作用する基でもよい。
【００２８】
スペーサー−カッター部分は、例えば、専らポリエチレンアミンからなる可能性もあるということが理解される。オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体に付着している始めの２個の原子は、リン酸ジエステル結合の加水分解に関与しているとは考えられず、よって、カッターの部分とはならない。
【００２９】
本明細書で使用する「カッター」という用語は、２個以上の窒素原子を有するポリアミンに言及する。カッターは少なくとも１個の二級窒素原子又は三級窒素原子を含み、任意でまた、少なくとも１個のさらなる二級窒素原子又は三級窒素原子を含み、好ましくは、少なくとも１個のさらなる一級の窒素原子を含む。リン酸ジエステル結合のポリアミンを介した切断は、当該分野で周知であり、熟練技術者は、適当なカッター部分を利用することができる。適当なカッターには、例えばエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、エチレンアミン系デンドリマー、ペンタエリスリチルテトラアミン、スペルミン、スペルミジン、ジアゾ−、トリアザ−、又はテトラアザシクロアルキル化合物、例えば、ピペラジン、サイクレン、テトラアザシクロペンタデカン、テトラアザシクロテトラデカン、テトラアザウンデカン、トリアザシクロノナン、トリアザシクロドデカン等、及びその誘導体が挙げられる。
【００３０】
ある実施形態では、本発明の化合物におけるオリゴは、ヌクレオチド模倣体として、ＰＮＡを含む。
【００３１】
別の実施形態では、本発明の化合物のオリゴは、ヌクレオチド模倣体として、２´−Ｏ−アルキル、好ましくはメチル又はアリル、ホスホロチエ−トを含む。
【００３２】
ある実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から４位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が４〜６個、好ましくは５個の化合物である。
【００３３】
リボ核酸が加水分解される予測位置からさらに４位置よりも離れて、オリゴがハイブリダイズする場合は、スペーサーの長さを延長することが好ましい。オリゴが加水分解される予測位置から離れて加水分解し、その位置が４位置を超えて離れる場合、その各位置に対するある実施形態では、スペーサーの長さを６個以上の原子で延長する。よって、加水分解される予測位置から原子が５個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは８個以上の原子を含み、加水分解される予測位置から原子が６個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは１４個以上の原子を含み、加水分解される予測位置から原子が７個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは２０個以上の原子を含み、加水分解される予測位置から原子が８個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは２６個以上の原子を含む、等となる。
【００３４】
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から５位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が１０〜１２個、好ましくは１１個の化合物である。
【００３５】
その上、さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から６位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が１６〜１８個、好ましくは１７個の化合物である。
【００３６】
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から７位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が２２〜２４個、好ましくは２３個の化合物である。
【００３７】
その上、さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から６位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が２８〜３０個、好ましくは２９個の化合物である。
【００３８】
末端ヌクレオチド又はその模倣体がハイブリダイズする、加水分解される予測位置から離れた位置の上限は、８位置であり、好ましくは、７位置、さらに好ましくは、６位置である。また、スペーサーの最大の長さは原子３０個である。
【００３９】
本発明の化合物は、当該分野において公知の方法により合成可能である。化合物を合成するには、自動化手順を使用するのが好ましい。例えば、オリゴの望ましい長さ及び組成物は、通常ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーで合成可能である。望ましいカッターに結合する望ましい長さのスペーサーを含むスペーサー−カッター部分を製造することは、当業者にとっては通常のことである。例として、Verheijen et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372)を参照のこと。そのようなスペーサー−カッター部分は、末端ヌクレオチド又はヌクレオシドの３´−Ｏ又は５´−Ｏ（好ましい）に結合し、望ましい機能を有している。また、当業者が、５´−Ｏを５´−Ｎに代えて、望ましい機能を有するスペーサー−カッター部分を付着して窒素に結合することは、一般的な方法であり、例えば、上記について論じたKomiyamaに開示された方法がある。適当な方法として、J.Org. Chem., 2000, 65, 4900-4907、Angew. Chem. hit. Ed., 2001, 40, 2004-2021、及びさらに具体的には、J. Org. Chem., 2003, 68, 609-612、Bioconjug. Chem., 2003, 14, 276- 281を参照のこと。別の方法として、５´−Ｓの導入、又は通常のマレイミド結合を介することが必要なジスルフィド架橋を使用することができる。また、適当な方法では、標準的なホスホラミダイト（phosphoramidite）化学を使用して、スペーサー−カッター部分をヌクレオシドに結合する。よって、本発明の化合物において、リボヌクレオチド（類似体）又はその模倣体のいずれのタイプも組み入れ可能である。例として、Bioconjugate, Chem. 2002, 13 (5), 1071を参照のこと。
【００４０】
ヌクレオチド・ビルディングブロックとしてＰＮＡを含む本発明の化合物を製造する適当な方法は、上記のVerheijenに開示されている。
【００４１】
本発明は、多様な治療、診断、農業、標的の確認、ゲノムの発見、遺伝子操作、及び薬理ゲノミクスに利用するための有用な化合物及び方法を提供する。
【００４２】
ある態様においては、本発明は、標的リボ核酸が本発明の化合物に接触する所定の位置でリボ核酸を加水分解する方法に関する。
【００４３】
本発明の化合物は、多様なＲＮＡ分子を標的にすることにより、遺伝子発現を阻害するように設計可能である。ある実施形態では、本発明の化合物を使用することにより、標的遺伝子に対応する多様なＲＮＡを標的としている。限定されないＲＮＡの例としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、標的遺伝子の選択的ＲＮＡスプライスバリアント、標的遺伝子の転写後のＲＮＡ修飾、標的遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡを含む。選択的スプライシングにより、適当なエクソンを使用することで区別される転写産物のファミリーが生成される場合、本発明を使用して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害又は区別する適当なエクソンにより、遺伝子発現を阻害することができる。
【００４４】
本発明の化合物は、診断、治療並びに研究用試薬及びキットに利用可能である。また、適当な医薬的に許容できる希釈液や担体に本発明の化合物の有効な量を加えることにより、医薬組成物として利用できる。さらに、望ましくないタンパク質の生成を特徴とする疾患を有する生物体を治療するために利用できる。望ましくないタンパク質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリッド形成可能な配列を有する本発明の化合物を、生物体と接触させることができる。よって、遺伝子発現を制御するためには、調節されるＲＮＡ部分は、前もって選択されていて、生成が調節されるタンパク質をコードするＲＮＡ部分を含むことが好ましい。したがって、使用するオリゴは、標的ＲＮＡの前もって選択された部分に特異的にハイブリダイズするように設計する。ある実施形態では、オリゴは、その生成が調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的に結合するように設計される。
【００４５】
医薬組成物の製剤及びその投与は、当該分野の技術範囲内で行なうことができる。一般的に、治療法により、そのような治療が必要とされる患者には、通常薬学的に許容できる担体で、患者の年齢及び治療する疾患状態の重症度に応じて、体重１ｋｇあたり０．０１／mｇから１００ｇの用量で、本発明の化合物を投与する。さらに治療は、単回投与のこともあり、又はある期間継続する治療のこともあり、特定の疾患の性質、疾患の重症度及び患者の全身状態に応じて異なっていて、医師により決定される。症例によっては、従来の治療方法と併用して、本発明の化合物により患者を治療することは、さらに効果的である。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、局所または全身の治療を必要とするかどうかにより、また、治療する場所により、多くの方法で投与することが可能である。投与は、局所（眼、膣内、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口又は非経口投与のこともある。非経口投与では、点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、又はくも膜下若しくは脳室内投与がある。
【００４７】
局所投与の製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐薬、スプレー、液体、粉剤がある。従来の医薬担体、水溶性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが、必要とされるか又は望ましいこともある。また、塗布コンドーム、手袋などが有用のこともある。
【００４８】
経口投与の組成物には、粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性媒体における懸濁液又は溶液、カプセル、小袋若しくは錠剤が含まれる。増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、結合剤が望ましいこともある。
【００４９】
くも膜下又は脳室内投与のための組成物には、緩衝剤、希釈剤、及び他の適当な添加剤をさらに含むこともある無菌水溶液を含有していてもよい。
【００５０】
非経口投与の製剤には、緩衝剤、希釈剤、及び他の適当な添加剤をさらに含むこともある無菌水溶液を含有していてもよい。
【００５１】
本発明は、単細胞原核生物及び真核生物から多細胞真核生物の範囲にわたる多様な生物体において実施可能である。ＤＮＡ−ＲＮＡ転写又はＲＮＡ−タンパク質翻訳を、遺伝性、代謝性、又は細胞機構の基礎部分として利用する生物体はいずれも、このような治療及び／又は予防療法の影響を受けやすい。細菌、酵母、原生動物、藻、植物、及び温血動物を含む高等動物体などの様々な生物体が、このような方法で治療可能と思われる。さらに、多細胞真核生物の各細胞は、細胞活動の不可欠な部分として、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写及びＲＮＡ−タンパク質翻訳に関与し、そのような治療及び／又は診断などは、そのような細胞集団においても実施可能である。さらにまた、真核細胞のミトコンドリア及び葉緑体などの多くの細胞小器官は、転写及び翻訳機序にも関与する。単細胞、細胞集団又は細胞小器官なども、本発明の治療又は診断の化合物で治療可能な生物体の定義内に含むことができる。ここで使用されているように、治療は、疾患状態の根絶、細菌、原生動物、若しくは他の感染症などの生物体の死滅、或は、異常な若しくは望ましくない細胞増殖又は細胞発現のコントロールの両方を意味する。
【実施例１】
【００５２】
自動標準ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーで使用する適当なビルディングブロックとして、以下に記載のホスホラミダイドを使用する。左下の構造式において、リンカーは上記に記載したようにスペーサーの部分であり、よって、以下の一般構造式から除かれることもある。保護基のＰＧ鎖としては、塩基不安定性であることが好ましい。リンカーはグリシンの部分であってもよく、ＰＧは以下の構造式にあるようにＦｍｏｃ基のこともある。このホスホラミダイトは、ＲＮＡ（オリゴ）又はその模倣体のいずれのタイプにも組み入れることができる。
【化１】
2007528224.tif 000004
【００５３】
スペーサーが１０個の原子を組み入れている上記のホスホラミダイトを、オリゴに組み入れると、左下に表わされる構造が得られる。この実施例では、スペーサーは１０個の原子を有している。オリゴ模倣体２´−Ｏ−メチルホスホロチエートの例として、ＲＮＡ及びＰＮＡは、それぞれ、中央と右に記載されている。
【化２】
2007528224.tif 000005
【００５４】
別の方法として、５´−末端に結合できるスペーサー−カッター部分を使用する。以下を参照のこと。スペーサー−カッター部分におけるスペーサーの長さは可変である。以下の詳細な実施例においては、スペーサーは４個及び１０個の原子である。スペーサーの長さが容易に変化可能であることは明らかである。
【化３】
2007528224.tif 000006
【実施例２】
【００５５】
切断実験に使用された合成ＲＮＡ（点変異を有するｔＲＮＡＰｈｅの部分：Ｃ−１６はＧ−１６により置換されている）（下線：切断の位置）：
5’  - UCC UGU GUU CGA UCC GCA GAA UUC G -  3’
以下のＰＮＡ−カッター配列を合成した。Ｇｌｙはグリシンを表し、ｎ＝０〜２、カッターは以下の通りである。：
【化４】
2007528224.tif 000007
3’ - H2NCO- ca caa gct agg (Gly)n-COCH2-cutter      （２）
3’ - H2NCO- aca caa gct ag (Gly)n-COCH2-cutter      （３）
3’ - H2NCO- g aca caa gct a (Gly)n-COCH2-cutter     （４）
3’ - H2NCO- gg aca caa gct (Gly)n-COCH2-cutter      （５）
3’ - H2NCO- gg aca caa gct (Gly)3-COCH2-cutter      （５）
【００５６】
（２）（３）（４）及び（５）の番号は、加水分解される予測位置から離れた位置でオリゴがハイブリダイズする位置番号に言及している。（２）（３）（４）及び（５）の各々は、０．１又は２のＧｌｙ残基を組み入れるスペーサーの長さにおいて変化した。
【００５７】
ＰＮＡ合成
本研究で使用されたＰＮＡは、ＰＮＡシンセサイザー（Perseptive Biosystem社製、Expedite Nucleic Acid Synthesis System）を使用して固相合成法により作製した。すべての溶剤（Biosolve）は一般に容認されたものを使用した。リンカーとしてリンク−アミドを有する固定担体としてＰＥＧ−ＰＳビーズで、固相合成法を行なった（添加：０．１７mｍоｌ−ｍｇ−１）。シンセサイザーマニュアルに記載された標準プロトコルを使用して、Ｆｍｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及び環外アミンがＢｈｏｃで保護されたモノマー（Perseptive Biosystems社製）を使用する２mｍоｌスケールで、ＰＮＡのアセンブリーを構築した。まず、カップリングを２回行なった。Ｆｍｏｃ-グリシン及びｄｉＢｏｃで保護されたカッター・ビルディングブロックは、シンセサイザー中で有効な位置及び２回のカップリングのための標準プロトコルを使用して、樹脂上に保持されたままのＰＮＡ−オリゴマーのＮ末端（５´）に結合した。ｄｉＢｏｃで保護されたカッター・ビルディングブロック（HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc）は、単純な液相有機化学により合成し、そのマススペクトル並びに１Ｈ−及び１３Ｃ  ＮＭＲ−スペクトルにより完全に解析した。
【００５８】
オリゴマーを、樹脂から切断し、酸性条件下で完全に脱保護した（ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ， ９／１／１， ｖ／ｖ／ｖ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製及び分析を、Altima C18カラム（１０×２５０ｍｍ）を備えたＪＡＳＣＯ  ＨＰＬＣシステムで行なった。勾配溶離は、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）から開始する勾配で、緩衝液Ｂ（アセトニトリル／水が３／１，ｖ／ｖにおける０．１％ＴＦＡ溶液）を用いて、４０°Ｃ、流速４ｍＬ／ｍｉｎで行なった。得られたＰＮＡは、凍結乾燥し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）及びＲＰ−ＨＰＬＣを用いて解析した。
【００５９】
切断実験
３２Ｐ ５´−Ｌａｂｅｌｅｄ ＲＮＡ ２５−ｍｅｒを、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）を含むトリス緩衝液中（１０ｍＭ、ｐＨ７）でＰＮＡカッターを用いて処理し、以下の濃度を得た。［ＲＮＡ］＝６０ｎＭ、［ＰＮＡ−カッター］＝２μＭ。サンプル（７０μＬ）を４０℃で７時間又は２４時間インキュベート後、ＮａＯＡｃ (３Ｍ、ｐＨ５、７μＬ)、ＥｔＯＨ（２２５μＬ）及び１０μｇ／μＬのｔＲＮＡ（１μＬ）を添加して、直ぐにＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡは、遠心分離により回収し、乾燥させ、水（５μＬ）及び添加液（５μＬ）に再溶解した。これらの溶液を９０℃で１分間加熱し、遠心分離し、尿素８Ｍを含む２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。使用したコントロールは、ＲＮＡ、ＲＮＡ塩基ラダー及びＲＮＡのＴ１消化である。
【００６０】
結果
インキュベーション７時間後及び２４時間後に、コントロールＲＮＡは約１０％加水分解された。化合物（２）及び（３）におけるＲＮＡは加水分解は、インキュベーション７時間後には約２０％以下に、インキュベーション２４時間後には約４０％以下であった。化合物（４）におけるＲＮＡのみが、適切な割合で加水分解された。すなわち、Ｎ＝０、１及び２では、ＲＮＡはインキュベーション７時間後には少なくとも約３０％加水分解され、インキュベーション２４時間後に、化合物（４）、ｎ＝１については、ほぼ定量的に加水分解された。
【００６１】
化合物（４）、ｎ＝１の最適化により、インキュベーション２時間後には、既に約５０％のＲＮＡが、ＲＮＡ対本発明の化合物の割合が１対１０で加水分解された。１対４０の割合では、２時間後には、約７５％が加水分解された。１対１０及び１対２０の割合では、それぞれ８時間後及び６時間後には、７５％あるいはそれ以上のＲＮＡが加水分解された。後者の割合では、インキュベーション２４時間後には、ほぼ定量的に加水分解された。
【００６２】
化合物（５）では、ｎ＝２で最適に加水分解が開始される。
【実施例３】
【００６３】
切断実験で使用した合成ＲＮＡ（E. Coli AcpP  ｍＲＮＡの部分）
（下線：切断部分）：
5’  - A UUU AAG AGU AUG AGC ACU AUC GAA -  3’
以下のＰＮＡカッター配列を合成した。Ｇｌｙはグリシンを表わし、カッターは以下の通りである。：
【化５】
2007528224.tif 000008
3’ - H2NCO- aaa ttc tca t - Cys(NHR)S-CH2CO- Gly- NHCH2CH2-cutter
式中：R=Ac  又は                                    （Ａ）
CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2  又は            （Ｂ）
CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2                   （Ｃ）
化合物Ｂ及びＣは、スペーサー内にペプチドLys(PhePheLys) 3を含み、細胞膜を通過する化合物を補助するということに注目のこと。
【００６４】
インビトロＲＮＡ分解研究
緩衝液はすべて、高純度ミリＱ水で作製し、使用前に滅菌した。放射活性物質で標識したＲＮＡ２５−ｍｅｒ及びテストする複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ、コントロールとしてＲＮＡ及びカッターを含まないＣ）を、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）に混合し、Ａ２６０ユニットの測定により、次の濃度を得た。［ＲＮＡ］＝６０ｎＭ、［複合体］＝２μＭ。サンプル（７０μＬ）を４０℃で１６時間インキュベーションした。インキュベーション後、３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５、７μＬ）、ＥｔＯＨ（２２５μＬ）及び１０μｇ  μＬ−１、ｔＲＮＡ（１μＬ）を添加して、ＲＮＡを直ぐに沈殿させた。沈殿したＲＮＡは、遠心分離により回収し、乾燥させ、水（５μＬ）及び添加液（５μＬ）に再溶解した。これらの溶液を８０℃で１分間加熱し、遠心分離し、２０％変性ゲル電気泳動で分析した。ゲルを蛍光スクリ−ン（Molecular Dynamics）に曝露し、ＲＮＡフラグメントの強度を、Personal Molecular Imager FX System (Bio-Rad)で曝露したスクリーンをスキャンすることにより定量化し、次にQuantity One software (Bio-Rad)でコンピュータ解析した。
【００６５】
結果
化合物Ａ、Ｂ及びＣ並びにネガティブ・コントロールを、E. Coli AcpP ｍＲＮＡの部分に類似する配列を有する２５−ｍｅｒ３２Ｐ標識したＲＮＡでインキュベートした。ｐＨ７、４０℃で１６時間後、ＲＮＡフラグメントを沈殿させ、２０％変性ゲル電気泳動を行なって定量した。有難いことに、ＲＮＡとペプチド欠損ＰＮＡ−ＤＥＴＡ  Ａと同様にＢ及びＣの複合物とのインキュベーションでは、印を付けたＣＡ及びＵＡ部位の切断から生じるメジャーなＲＮＡ分解生成物が２個形成した。切断部位は、バンドの移動度を、ＲＮＡのＴ１消化及び塩基加水分解ラダーのバンドと比較することにより決定された。フラグメント・スポットの強度により、ＲＮＡとＰＮＡ−ＤＥＴＡ  Ａのインキュベーションでは、約３．５％の切断のバックグランドを示すのみであるネガティブ・コントロール（すなわち、カッターを含まないＰＮＡ−ペプチド複合体及び複合体を含まないＲＮＡ）に比較して、ＲＮＡが有意に切断する（２０％）とういことを、明らかにした。また、複合物ＢとＣの加水分解効率が予想外に異なることが示された。複合物Ｃが標的ＲＮＡの１０％を切断する一方で、ポジティブ・コントロール１８（２０％）と比較して、複合物Ｂは、同等の改善した切断効率（３０％）を示した。
【実施例４】
【００６６】
３´末端にスペーサ−カッターを含むオリゴ
Ｄｄｅリンカーを含む市販の樹脂を使用してＰＮＡを合成する。
【化６】
2007528224.tif 000009
この樹脂から開始して、続いてのＰＮＡ合成は、以下のオリゴとなる。
3’ - cutter-CH2CH2NH-(Gly)n-CO-PNA sequence-NHAc - 5’
ここでのカッターは以下のように定義される：
【化７】
2007528224.tif 000010
「ＣＯ」はＰＮＡ−オリゴの３´末端であり、ＮＨＡｃは５´末端である。ＤＮＡ／ＲＮＡをベースにしたオリゴの３´末端のスペーサー−カッターには、実施例１の方法が用いられる。
【国際調査報告】
2007528224.tif 000011
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