(57)【要約】本発明は、(a)供与体鳥類の精巣を収得する段階；(b)前記精巣から精巣細胞ポピュレーション(population)を分離する段階；(c)前記精巣細胞ポピュレーションを細胞成長因子の含まれた培地で培養して、精原細胞ポピュレーションを収得する段階；及び(d)前記培養した精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションを受容体鳥類の精巣に注入してキメラを生産する段階を含む、精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法及び生殖腺鳥類キメラに関するものである。【選択図】図３
2007502109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法：
(a)  供与体鳥類の精巣を収得する段階；
(b)  前記精巣から精巣細胞ポピュレーション(population)を分離する段階；
(c)  前記精巣細胞ポピュレーションを細胞成長因子の含まれた培地で培養して、精原細胞ポピュレーションを収得する段階；及び
(d)  前記培養した精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションを受容体鳥類の精巣に注入してキメラを生産する段階。
【請求項２】
前記段階(b)は、コラゲナーゼ、トリプシン、またはこれらの混合物を、前記収得した精巣の組織に処理して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞成長因子は、繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、幹細胞因子、及びこれらの組み合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地は、分化抑制因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分化抑制因子は、白血病抑制因子であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培地は、繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、及び白血病抑制因子の混合物を含む補足物を含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培地は、血清及び抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記段階(d)は、精原細胞ポピュレーションまたは精巣細胞ポピュレーションを受容体の精巣細管に注入して行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記段階(d)は、精原細胞ポピュレーションまたは精巣細胞ポピュレーションを受容体の精巣細管の最も上側部分に注入して行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記鳥類は、鶏、鶉、七面鳥、鴨、鵞鳥、雉、または鳩であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記供与体及び受容体は、異種であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記段階(d)の後、検定交配を行って、精原細胞ポピュレーションの注入された受容体がキメラであるか否かを確認する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
供与体の精原細胞を精巣内に保有し、前記精原細胞から精子を形成する能力を有して、且つ、前記精子は、子孫に生殖腺転移される特性を有することを特徴とする、鳥類キメラ。
【請求項１４】
前記鳥類キメラは、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により生産されることを特徴とする、請求項１３に記載の鳥類キメラ。
【請求項１５】
次の段階を含む形質転換鳥類の生産方法：
(a)供与体鳥類の精巣を収得する段階；
(b)前記精巣から精巣細胞ポピュレーション(population)を分離する段階；
(c)前記精巣細胞ポピュレーションを細胞成長因子の含まれた培地で培養して、精原細胞ポピュレーションを収得する段階；
(c’)前記精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションに外来遺伝子を転移させる段階；
(d)前記精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションを受容体鳥類の精巣に注入する段階；及び
(e)前記受容体の子孫を得て、形質転換鳥類を生産する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法、生殖線転移鳥類キメラ、及び形質転換鳥類の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１９９４年微細注入方法(microinjection)により、成功的にマウス精原細胞(spermatogonial cell)の移植(Brinster and Zimmerman, 1994; Brinster and  Avarbock, 1994)が成された後、これに関わる数多い報告書と論文が発表されている。初期段階で、この研究は、精原細胞の受容体精巣細管内への移植技術(transplantation technology)の開発に焦点が合わせられた(Ogawaら, 1997; Nagano and Brinster, 1998; Naganoら, 1998; Russell and Brinster, 1998; Russellら, 1998)。
【０００３】
１９９４年Ｂｒｉｎｓｔｅｒグループから発表された精原細胞に関する研究で、供与体から分離された精原細胞が成功的に移植されて、精子を生産することが報告されて、ＢｒｉｎｓｔｅｒとＺｉｍｍｅｒｍａｎは、遺伝的に不妊の雄マウスの精細管(seminiferous tubule)内への精巣細胞浮遊液(heterogeneous mouse testis cell mixture)の注入による生殖腺キメラ(germline chimera)の生産を報告し、標識遺伝子としてｌａｃ Ｚを含む精巣細胞が、精細管内の管腔(lumen)の最も下側である基底層(basal membrane)まで移動可能であることを確認した。
【０００４】
精原細胞の移植のための微細注入方法は、画期的ではなかったが、以後の技術開発により、精巣網(rete testis)と精巣細管の連結部位(connection)を利用して、受容体(recipient)の精巣細管内部を供与細胞(dornor cell)で満たすことは可能であった。また、ＢｒｉｎｓｔｅｒとＡｖａｒｂｏｃｋは、１９９４年、精  巣細胞の移植(testicular cell transplantation)を通じて、ｌａｃＺ遺伝子を有する精子を受容体精巣内で成功的に生産することができることを報告すると同時に、化学物質を利用した受容体精巣の不妊化(sterilization)に関する研究を進めて、ブスルファン(Busulfan)が、内生(endogenous)の精原細胞を殺すことなく、受容体の精子形成(spermatogenesis)を防ぐことができることを報告し、受容体の不妊化を通じた移植効率増進の可能性を示唆した。
【０００５】
その後、精原細胞移植に関する報告は、ＪｉａｎｇとＳｈｏｒｔにより１９９５年に発表されたが、ここでは、始原生殖細胞(Primordial Germ Cell)と発生後の精巣細胞の移植後、受容体ラットの精巣内における群集(colonization)形態を調べた結果、始原生殖細胞の場合、精巣細管内で、完全な形態ではないが、精巣細管と類似した形態を構成することを観察し、出生以後の精巣(testis)から分離された生殖細胞の場合、受容体の精巣組織と結合して、精子形成過程が進行されることを観察した。
【０００６】
その後、異種間の精原細胞の移植に関する研究が報告されたが(Clouthier ら, 1996)、この研究で、免疫欠乏マウス(SCID mouse)内に移植されたラット(rat)の精原細胞による精子形成がなされ、その結果として、マウスの精子では見られない形態の、即ちラット(rat)精子の頭部の形態を有した精子を、マウスの精巣内で確認することができた。以前までも研究と通念では、セルトリ細胞(sertoli cell)は、精子形成に非常に深く連関されており、これは、決して、異種、即ち外部から移植された他の生殖細胞をサポート(supporting)することができないということであったが、このような異種間移植の成功は、セルトリ細胞の役割に対する既存の認識を転換させるきっかけになった。即ち、セルトリ細胞から分泌される精子形成に必要な物質は、融通性を持って生殖細胞に作用できるという新しい理論が生まれるようになった。
【０００７】
しかしながら、マウスの場合、異なる種間の移植が成功的であったが、他の種の場合、免疫欠乏(immunodeficient)マウスの使用にもかかわらず、生殖細胞の成熟(maturation)による精子生産には失敗した(Ogawaら、1996b; Dobrinski ら、1999b)。これは、免疫拒否反応(allogenic response)による精子形成の失敗というよりは、ラットとマウスにおける結果から、遺伝的にまたは進化的に類似した種の場合のみに種間の移植が限定されると考えられる。最近の研究も、このような問題を解くために、焦点を生殖細胞の発生時点(germ cell developmental timing)に合わせている(Francaら、1998)。即ち、マウス精子の成熟がなされるためには、少なくとも３５日がかかり、ラットの場合は、５２〜５３日がかかる。したがって、このような場合は、ラットの精巣内にマウスの精原細胞を移植したほうが、さらによい効果をもたらす可能性がある。
【０００８】
実体顕微鏡と電子顕微鏡研究が進行されると共に、異種間または同種間に移植された生殖細胞の形態に関する研究が進行されてきたが(Russell and Brinster, 1996)、この研究により、マウスの精巣内に移植されたラットの生殖細胞は、奇形の形態を有する場合があることが観察され、これは、ラットの精子形成がマウスのセルトリ細胞と関わっているからであると考えられている。
【０００９】
この他に、今まで異種間移植に関する研究は、マウス、牛、猿、人間精巣細胞移植(Schlattら、1999)、人間精巣細胞のマウス精巣内への移植(Zhangら、2003)、ウサギと犬の精巣細胞のマウス精巣内への移植(Dobrinskiら、1999)、ハムスター精巣細胞のマウス精巣内への移植(Ogawaら、1999) 家畜類(牛、豚、馬)精巣細胞のマウス精巣内への移植などに関する報告がある。
【００１０】
精原細胞を新しい形質転換技術に応用するためには、精原細胞の貯蔵と体外培養が必須的要素であると言える。その最初の報告として、体外で３ヶ月間培養された精原細胞の成功的な移植が報告された(Brinster and Nagano, 1996)。以後、体外で、移植前まで冷凍貯蔵された精原細胞または精巣細胞浮遊液を利用した成功的な移植が報告された(Avarbockら、1996)。
【００１１】
また、受容体精巣内で移植された供与細胞の群集(colony)の観察も成された(Naganoら、1999; Parreiraら、1998)。この報告によると、移植された精原細胞が精巣細管の最も下側の基底面で観察されることを確認し、パラフィン切片観察(paraffin section)による実験を通じて、移植３ヶ月後、供与細胞由来の精子が平均３０％程度分布することが観察された。
【００１２】
効果的な移植のために、最適濃度の移植する細胞数の決定も必要であったが、最初に映像分析(image analysis)技術を利用して得た最適条件は、１０7供与細胞数/精巣であり(Dobrinskiら、1996b)、この際、低い男性ホルモン(testosteron)濃度で効果が高いと報告された(Ogawaら、1998)。以前の報告からは分からなかったが、以後の研究で抗体を利用した精原細胞の純水分離による移植報告によると、１０倍まで増加された純度の精巣細胞が得られ、これの移植は、受容体内で作られる供与細胞由来群集の数に正比例するということ(Shinoharaら、1999)が分かった。
【００１３】
精原細胞移植に関する研究は、最近、人間に対してもよく進行されている(Schlattら、1999)。人間では、幼いころに保管された精原細胞を、大人になって、不妊やその他の場合に移植して利用することができる可能性があり、精原細胞由来の精子により、体外培養及び体外受精による人工授精にも応用できるような潜在性を有する。   
【００１４】
鳥類では、始原生殖細胞または胚芽生殖細胞株(embryonic germ cell)を利用した生殖腺キメラ生産、これを通じた形質転換鶏生産システムに関する報告があったが、形質転換鶏の生産効率がまだ低い状態である(Chang ら、1996)。最近、鶏の受精卵内に精子を利用して遺伝子を導入するための方法が紹介されたが(Qianら、2001)、このような方法もまだその効率が非常に低い状態であり、個体内への安定的な遺伝子転移が難しく、生殖腺転移(germline transmission)が確認されていないため、形質転換システムを確立するには多くの問題点が残っている状態である。
【００１５】
このような精原細胞の場合、成畜から細胞を多量得やすく、精巣内に移植される場合、生殖腺キメラの生産能力があるため、以前の胚芽幹細胞を利用する時の問題点である時間的、効率的な問題を解決することができる。
【００１６】
また、遺伝子が導入された精原細胞の移植による受容体精巣内での精子形成に関する報告(Naganoら、2000)は、精原細胞を利用した形質転換動物の生産システムへの開発可能性を示唆する。
【００１７】
一方、現在、精原細胞を利用した鳥類キメラ生産に関する報告はない。
【００１８】
本明細書全体にかけて多数の論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者らは、上述のような当業界の要求を解決するために鋭意研究した結果、鳥類の精原細胞を利用してキメラ生産が成功的に成されることを確認し、本発明を完成した。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、生殖腺転移鳥類キメラを提供することにある。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、形質転換鳥類の生産方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲、及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の一様態によると、本発明は、(a)供与体鳥類の精巣を収得する段階；(b)前記精巣から精巣細胞ポピュレーション(population)を分離する段階；(c)前記精巣細胞ポピュレーションを細胞成長因子の含まれた培地で培養して、精原細胞ポピュレーションを収得する段階；及び(d)前記培養した精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションを受容体鳥類の精巣に注入してキメラを生産する段階を含む、精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法を提供する。
【００２５】
本発明は、鳥類において、精原細胞を利用した鳥類キメラ生産システムを確立した最初の発明である。以下、本発明の方法をそれぞれの段階に沿って詳細に説明する。
【００２６】
まず、供与体(donor)から精巣を収得する。本発明が鶏に適用される場合、精原細胞源としての鶏は、好ましくは、発生直後７０週齢、より好ましくは、発生直後５０週齢、最も好ましくは、４〜３０週齢の雄を利用する。鶏の精巣は、頚椎骨を分離した後、切開して得られる。
【００２７】
次いで、前記精巣から精巣細胞ポピュレーションを分離する。前記過程により分離した精巣の周りの結締組織及び膜などを除去し、精巣組織を覆っている白膜を除去する。その後、精巣を、解剖用メスを利用して細かく切断し、様々な分解方法により分解した後、精巣細胞を分離する。
【００２８】
本明細書において、用語‘精巣細胞(testicular cell)’は、精原幹細胞、精原幹細胞由来の全ての生殖細胞を含む精原細胞、セルトリ細胞、間質細胞、そしてその他の結締組織に係る筋肉細胞などを含む精巣組織内の細胞群を意味し、用語‘精巣細胞ポピュレーション’と混用される。
【００２９】
精巣組織の分解は、当業界に公知された多様な方法により行うことができ、好ましくは、精巣から精巣細胞を分離する段階は、コラゲナーゼ、トリプシン、またはこれらの混合物を前記収得した精巣の組織に処理することにより行われる。さらに好ましくは、後述する２段階酵素処理方法、van Pelt(1996)方法、またはコラゲナーゼ−トリプシン処理方法により行われる。
【００３０】
イ．２段階酵素処理方法
この方法は、Ｏｇａｗａら(1997)の方法及びその変形された方法により行われる。コラゲナーゼタイプＩの溶解されたＨＢＳＳ(Hank's Balanced Salt's solution)に前記精巣組織を添加して、一定時間反応した後、トリプシンで処理する。
【００３１】
ロ．van Pelt(1996)方法
コラゲナーゼタイプＩ、トリプシン、ヒアルロニダーゼII、及びＤＮａｓｅ  Ｉが溶解されたＤＭＥＭ培地で前記精巣組織を分解する。
【００３２】
ハ．コラゲナーゼ−トリプシン処理方法
コラゲナーゼタイプＩ及びトリプシンの溶解されたＨＢＳＳで精巣組織を分解し、ピペッティングにより精巣組織の分解をさらに促進させる。
【００３３】
このように分解された精巣組織分解物を適した細胞濾過器(孔径約70μｍ)で濾過し、精巣細胞を回収する。
【００３４】
前記過程により収得した精巣細胞を細胞成長因子の含まれた培地で培養して精原細胞ポピュレーションを収得する。本明細書で用語‘精原細胞ポピュレーション’は、精母細胞を生成する細胞としての精原細胞から構成された細胞群のみならず、精原幹細胞及び他の精巣細胞も一部含まれている細胞群も意味する。
【００３５】
精原幹細胞の培養に利用される培地は、必須成分として細胞成長因子を含むが、好ましくは、繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor；例えば、塩基性繊維芽細胞成長因子)、インシュリン様成長因子−１(insulin-like growth factor-1)、幹細胞因子(stem cell factor)、神経膠由来の神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、またはこれらの組み合せを含み、より好ましくは、繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、幹細胞因子、またはこれらの組み合せを含み、最も好ましくは、繊維芽細胞成長因子及びインシュリン様成長因子−１の混合物を含む。
【００３６】
好ましくは、本発明に利用される培地は、分化抑制因子をさらに含むが、最も好ましくは、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)を含む。したがって、本発明の培地に含有される最も好ましい成長因子及び分化抑制因子の組み合せは、繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、及び白血病抑制因子の混合物である。
【００３７】
また、本発明の培養に利用される培地は、鳥類血清(例えば、鶏血清)、哺乳類血清(例えば、牛胎児血清)、またはそれらの混合物を含むことが好ましい。その他にも、抗酸化剤(例えば、β−メルカプトエタノール)、抗生剤−抗ミコバクテリア剤(antibiotics-antimycotics)、非必須アミノ酸(例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、及びセリン)、緩衝剤(例えば、Hepes緩衝液)、またはそれらの混合物を含むことが好ましい。
【００３８】
前述の精原細胞の培養は、精巣細胞ポピュレーションに含まれているセルトリ細胞を基底細胞として培養されるものであるが、仮に、精原細胞を長期培養する場合は、セルトリ細胞以外の他の細胞を基底細胞として培養することが好ましい。長期培養時利用できる基底細胞は、繊維芽細胞、生殖器基質細胞、精巣基質細胞、及びマウスＳＴＯ細胞株(SIM mouse embryo-derived, Thioguanine- and Quabain-resistant fibroblast cell line)であって、より好ましくは、生殖器基質細胞または精巣基質細胞であり、最も好ましくは、生殖器基質細胞である。本発明の方法が鶏に適用される場合、前記繊維芽細胞、生殖器基質細胞、及び精巣基質細胞は、鶏由来のものを利用することが好ましい。前記基底細胞は、培地の含有されたディッシュまたはプレートの底部に位置し、培地に移された精原細胞は、基底細胞層に付着されて増殖する。
【００３９】
このように培養された精原細胞ポピュレーションを受容体精巣に注入してキメラを生産する。注入される精原細胞は、上述の培養過程において、５日〜４ヶ月、より好ましくは、５日〜３０日間培養したものが好ましい。受容体鳥類は、好ましくは、発生直後７０週齢、より好ましくは、発生直後５０週齢、最も好ましくは、４日〜４０週齢の雄を利用する。
【００４０】
また、培養された精原細胞ポピュレーションのみならず、精原細胞を含む前記精巣細胞ポピュレーションもキメラ生産に直接使用できる。
【００４１】
精原細胞または精巣細胞の精巣内への注入は、鳥類キメラ製作時、非常に重要な段階である。このような注入は、好ましくは、精巣細管内注入方法、精巣上体内注入方法、または精巣網内注入方法により行うことができ、より好ましくは、受容体の精巣細管に注入することであり、最も好ましくは、受容体の精巣細管の最も上側部分に注入する。
【００４２】
本発明の好ましい具現例によると、前記段階(d)以後、検定交配を行って、精原細胞ポピュレーションの注入された受容体がキメラであるか否かを確認する。例えば、供与体が黒色の羽を有する韓国烏骨鶏(i/i)であり、受容体が白色の羽を有する白色レグホーン(I/I)である場合、上述の過程により生産された推定のキメラと韓国烏骨鶏(i/i)を検定交配して、黒色の羽を有する鶏の子孫が出ると、前記推定のキメラは、真正なキメラとして判定できる。
【００４３】
本発明の方法は、多様な鳥類、好ましくは、鶏、鶉、七面鳥、鴨、鵞鳥、雉、または鳩、最も好ましくは、鶏に適用できる。
【００４４】
一方、本発明のキメラ生産方法は、同種間のみならず、異種間にも実施できる。
【００４５】
上述の過程を通じて、改善された効率でより容易に生殖腺キメラ鳥類が生産でき、もし、供与体の精原細胞に外来遺伝子を導入する場合は、安定した形質転換鳥類生産システムを提供することができる。
【００４６】
本発明の他の様態によると、本発明は、供与体の精原細胞を精巣内に保有し、前記精原細胞から精子を形成する能力を有して、且つ、前記精子は、子孫に生殖腺転移される特性を有する鳥類キメラを提供する。
【００４７】
このように、供与体の精原細胞が生殖腺転移される鳥類キメラは、本発明者らにより最初に生産されたものである。
【００４８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の鳥類キメラは、上述した本発明の方法により生産されたものである。
【００４９】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、(a)供与体鳥類の精巣を収得する段階；(b)前記精巣から精巣細胞ポピュレーション(population)を分離する段階；(c)前記精巣細胞ポピュレーションを細胞成長因子の含まれた培地で培養して、精原細胞ポピュレーションを収得する段階；(c’)前記精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションに外来遺伝子を転移させる段階；(d)前記精原細胞ポピュレーションまたは前記精巣細胞ポピュレーションを受容体鳥類の精巣に注入する段階；及び(e)前記受容体の子孫を得て、形質転換鳥類を生産する段階を含む形質転換鳥類の生産方法を提供する。
【００５０】
本発明の方法において、鳥類精原細胞または精巣細胞に外来遺伝子を転移することは、当業界で通常的に公知された遺伝子転移方法により行うことができる。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リポソーム媒介転移方法(Wongら、1980)、及びレトロウイルス媒介転移方法(Chenら、1990; Kopchickら、1991; Lee & Shuman、1990)がある。前記電気穿孔法は、本発明者らが開発した方法により行うことが最も好ましい(参照：大韓民国特許第３０５７１５号)。
【００５１】
本発明の好ましい具現例によると、前記外来遺伝子は、選択マーカーとして抗生剤耐性遺伝子を含み、前記(c)段階の後に、抗生剤耐性を示す精原細胞を選択する段階がさらに含まれて、前記(d)段階は、抗生剤耐性を示す精原細胞により行われる。本発明で利用できる選択マーカーは、真核細胞に抗生剤を付与する遺伝子であれば何でもよく、例えば、ネオマイシン、プロマイシン及びゼオマイシン耐性遺伝子を含む。
【００５２】
鳥類精原細胞または精巣細胞を受容体の精巣に移植する段階は、精巣細管に精原幹細胞を微細注入することが好ましい。
【００５３】
その後、受容体を他の個体と交配することにより子孫が得られ、外来遺伝子を含有した子孫が形質転換鳥類とされる。
【発明の効果】
【００５４】
本発明は、精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法、生殖腺転移鳥類キメラ形質転換鳥類の生産方法を提供する。本発明の方法によると、改善された効率で、より容易に生殖腺鳥類キメラを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【実施例】
【００５６】
［実験動物］
実験動物としては、韓国烏骨鶏と白色レグホーン種を使用し、各実験動物は、精巣から供与細胞の分離、及び分離された供与細胞の受容体精巣内への移植に利用された。
【００５７】
［供与細胞の分離］
供与体である４週または２４週齢の韓国烏骨鶏の精巣から細胞を分離し、これは、１９９４年Ｂｒｉｎｓｔｅｒらの方法である２段階酵素方法(Two step enzymatic method)に基づき、鶏精巣の特性により若干の変形を加えた。
【００５８】
鶏の精巣は、哺乳類とは違って、腹腔内に存在し、その位置は、左右対称的に腹腔の背中側部分に、腎臓に隣接して付着されている。また、左側の精巣が右側の精巣より大きい傾向があり、背中側にぶら下がった形態に腹気嚢(abdominal air sac)により囲まれている。従って、精巣を摘出するために、麻酔及び外科的手術方法が利用された。摘出された精巣は、迅速にＰＢＳ緩衝溶液に保管し、各実験別に、４週齢の精巣は１０〜２０個を摘出し、２４週齢の精巣は２個を摘出した。精巣を摘出した後、精巣の周りの結締組織及び膜などを除去し、微細ピンセットを利用して、精巣組織を覆っている白膜(tunica albuginea)を除去した。精巣は、解剖用メスを利用して、実体顕微鏡下で細かく切断した後、ＨＢＳＳ(Hank's Balanced Salt's solution, Invitrogen)にコラゲナーゼタイプＩ(1mg/ml、Sigma)を溶解した後、３７℃振とう培養機(shaking incubator)で１５分間処理した。ＨＢＳＳで洗浄した後、再び０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡ(Invitrogen)で１５分間処理した。分解された精巣組織物は、７０μｍ細胞濾過機(cell strainer, Falcon 2350)で濾過した後、トリパンブルーを利用して精原細胞の生存率及び細胞数を測定した。
【００５９】
［精原細胞の体外培養］
単一細胞に分離した後、移植前まで、体外で短期間培養した。期間は、０日、５日、１０日及び１５日であって、細胞は、幼い週齢(4週齢)と性成熟以後の週齢(24週齢)の精巣から分離された精巣細胞を利用し、１×１０8細胞を１００ｍｍ細胞培養ディッシュに播いて、それぞれ５％ＣＯ2培養器で３７℃に培養した。
【００６０】
細胞培養液は、ＤＭＥＭ(Dulbecco's minimal essential medium, Gibco Invitrogen)培地に、１０％(v/v) ES cell専用牛胎児血清(FBS, Hyclone, Logan UT)、１×抗生剤−抗ミコバクテリア剤(Invitrogen)、２％鶏血清、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液及び０．５５ｍＭ β−メルカプトエタノールを添加し、成長因子として、１０ｎｇ/Ｍｌ人間白血病抑制因子(Sigma)、１０ｎｇ/Ｍｌ人間塩基性繊維芽細胞成長因子(Sigma)及び１００ｎｇ/Ｍｌ人間インシュリン様成長因子−Ｉ(Sigma)の混合物を添加して使用した。各処理区は、５日、１０日及び１５日間培養した後、５分間の０．２５％トリプシン−1ｍＭ  ＥＤＴＡ酵素処理により培養ディッシュから分離及び遠心分離して、細胞を濃縮した後、移植に使用した。 
【００６１】
［精原細胞の移植］
分離あるいは体外培養された精原細胞は、遠心分離して２×１０7ｃｅｌｌｓ／５０〜１００μｌに濃縮して、受容体精巣内に移植した。移植は、幼い週齢(7週齢)と成畜(24週齢)の受容体鶏に区分して進行し、全身麻酔のために、ケタミン注射液(YUHAN  Corporation)を１０ｍｇ/ｋｇ(20μl)翼静脈内に血管注射した。その後、麻酔された鶏の右側下の腹部を切開し、脊髄の下側に位置した精巣を確認した。精巣の確認後、用意した細胞浮遊液を針付注射器(Hamilton, 100 μｌ, 33G)を利用して精巣内に注入した。注入時、針の先は、精巣の外膜側に位置するが、これは、精巣細管の最も上側部分(upstream)に細胞を移植するためである。注入が終わった後、切開された腹部の内膜と外膜を、手術用縫合糸と針を利用して縫合し、手術部位を消毒した後、抗生剤を投与した。
【００６２】
［精原細胞注入の確認］
鶏の解剖学的構造上、精巣は、腹腔内、脊椎の下に位置しているため、マウスにおける注入方式である手術を通じて精巣を露出させ、顕微鏡下で手術を行うことが難しい。したがって、この際は、注入針の太さと注入時の角度などが重要に作用する。したがって、分離された精巣に、同じゲージの注射針を利用して顕微鏡下でトリパンブルーを注入することにより、精巣細管内への細胞の注入が可能であるか否かを確認した。
【００６３】
［生殖腺キメラの確認のための検定交配］
受容体の白色レグホーンの精巣内に移植された韓国烏骨鶏の精原細胞から精子が形成されるかどうかを検証するために、検定交配を行った。白色レグホーン(I/I)は、黒色に対して優性であるため、黒色の烏骨鶏(i/i)と交配する場合、白色のヒヨコ(I/i)を生産するようになるが、受容体精巣内に移植された烏骨鶏の精原細胞由来精子と雌烏骨鶏の卵子とが結合する場合、正常形態である黒色の烏骨鶏ヒヨコ(i/i)を生産するようになり、これは、生殖腺キメラとして検証できる。
【００６４】
［実験結果］
［精原細胞注入の確認］
鶏の解剖学的構造上、精巣は、腹腔内、脊椎の下に位置しているため、マウスにおける注入方式である手術を通じて精巣を露出させ、顕微鏡下で手術を行うことが難しい。したがって、この際は、注入針の太さと注入時の角度などが重要に作用する。したがって、分離された精巣に、実際の手術時使用されるものと同じゲージの注射針を利用して顕微鏡下でトリパンブルーを注入することにより、精巣細管内に細胞の注入が可能であるか否かを確認した。図２から、トリパンブルー溶液が精細管に沿って注入されることが確認できて、精巣全体に亘って注入がなされる様子を観察することができた。したがって、本研究で確立した手術方法と同一な注射針を利用した場合、受容体精巣内への精原細胞の注入が成功的になされることが分かる
【００６５】
［生殖腺キメラ生産効率の比較］
生殖腺キメラの生産条件を確立するために、検定交配を行った。移植手術後、回復された２週後からの雌烏骨鶏と検定交配を行い、各実験区別に４匹ずつ組み込んだ。本実施例で利用された精原細胞は、５〜１０日間体外培養したものである。
【００６６】
表１及び２から確認できるように、精原細胞を移植して生殖腺キメラの生産が可能であることが分かったが、マウスにおける結果に比べ、その効率が比較的低かった。このような生殖腺キメラの低い生産効率は、移植された精原細胞と、既に存在していた受容体由来精原細胞との競争による結果であると考えられる。これは、ブスルファン(Busulphan)処理のような不妊化技術を適用すれば克服できると判断される。
【００６７】
［表１］
供与体と受容体の週齢による生殖腺キメラ効率の比較
2007502109.tif 000003
【００６８】
［表２］
供与体と受容体の週齢による生殖腺キメラの個体別生殖腺転移効率の比較
2007502109.tif 000004
【００６９】
一方、図３において、白色のヒヨコは、正常の白色レグホーンと烏骨鶏から生産された子孫であり、黒色のヒヨコは、注入された烏骨鶏の精原細胞由来の子孫であって、これは、注入した烏骨鶏の精原細胞が受容体白色レグホーンの精巣で正常的に分裂及び分化したことを意味する。
【００７０】
［精原細胞の体外培養］
体外で短期培養した烏骨鶏精巣細胞の場合、１５日間体外培養で細胞を維持することができた。図４及び５から分かるように、４週齢精巣細胞を体外培養した結果、安定的に維持することができ、１５日以後には、群集(colony)を形成し、細胞数が増加することが分かった。２４週齢の成鶏の精巣細胞を体外培養した結果も、４週齢と同様に、安定的に維持することができ、１５日以後には、群集(colony)を形成し、細胞数が増加することが分かった。
【００７１】
一方、短期間の体外培養後、生殖腺キメラの生産効率を比較した。表３及び４に記載されたように、体外で５日間培養後、１０日間培養後に細胞を移植した場合、生殖腺キメラの生産を確認することができ、後代生産効率、即ち生殖腺転移効率は、体外で５日間培養後移植した場合が最も高かった。
【００７２】
［表３］
体外培養期間による生殖腺キメラ生産効率の比較
2007502109.tif 000005
【００７３】
［表４］
体外培養期間による生殖腺キメラの個体別生殖腺転移効率の比較
2007502109.tif 000006
【００７４】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、本発明の範囲がこれらに限定されないことは明らかであって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【００７５】
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【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の一具現例による精原細胞を利用した鳥類キメラ生産過程を示す模式図である。
【図２】鶏の精巣内に精原細胞の注入が可能であることを示す写真であって、精巣の精細管内がトリパンブルーにより染色されている。
【図３】本発明の方法により生産された生殖腺キメラの子孫を示す写真である。
【図４】４週齢韓国烏骨鶏の精原細胞の体外培養日齢による形態を示す写真である。写真内の数字は、日齢を示す。
【図５】２４週齢韓国烏骨鶏の精原細胞の体外培養日齢による形態を示す写真である。写真内の数字は、日齢を示す。
【図１】
2007502109.tif 000007
【図２】
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【図３】
2007502109.tif 000009
【図４】
2007502109.tif 000010
【図５】
2007502109.tif 000011
【国際調査報告】
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2007502109.tif 000013