(57)【要約】生物学的または化学的アッセイに使用するのに適合した基体プレートまたは器具が開示されている。この器具は、プローブ種を固定化するための各ウェル内の支持表面の一部分として三次元多孔質層を有するマルチウェルプレートの形態をとってもよい。この多孔質層は、近接する固体材料のマトリクスにより画成された複数の相互に連結した空隙を有するものとして特徴付けられる。方法とその変更例も記載されている。
2007532906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも側壁によりそれぞれ画成された多数のウェルを有するフレーム、および多数の第１と第２の区域を持つ表面を有する平面基体を備えたアッセイ器具であって、前記第１の区域の各々が多孔質層を有し、前記第２の区域がそのような多孔質層を有さず、該第１と第２の区域が互いに隣接しており、前記第２の区域が、下部構造の一部分として、前記多孔質層の各々の支持体として機能を果たし、前記フレームおよび前記平面基体が互いに連結して、マルチウェルプレートを形成しており、そこで、前記第１の区域の各々が前記ウェルの底面の一部分を形成していることを特徴とする器具。
【請求項２】
前記多孔質層が、約０．０５μｍ以上の所定の平均サイズの複数の相互連絡した空隙をその中に分散して有し、前記空隙が、近接した固体材料の網状構造により画成されて、約９９．７％までの気孔率を持つ三次元構造を形成することを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項３】
前記空隙の固体材料および含有量が、互いに対して屈折率において高い対比を示すことを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項４】
前記多孔質層が、顆粒モルホロジーを持つ種類の材料から形成されており、前記材料が、相互連絡したチャンネルを持つフリットベースの材料または高分子材料であることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項５】
前記多孔質層が、ａ）未修飾であるか、またはｂ）前記多孔質層への生物学的種の付着を向上させる表面化学成分により修飾されており、前記多孔質層が未修飾のもとのままの表面である場合、該多孔質層は、該多孔質層の空隙によりプローブ分子を物理的に捕獲するように適合されていることを特徴とする請求項４記載の器具。
【請求項６】
前記表面の化学成分が、シラン、ポリマー、または生物学的コーティングから選択されることを特徴とする請求項５記載の器具。
【請求項７】
前記フレームが、多数の前記第２の区域で前記平面基体に連結されており、該フレームが、ガラスまたはポリマー、もしくはそれらの組合せのいずれかからなることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項８】
マイクロプレートを製造する方法であって、ガラスの支持体を提供し；顆粒モルホロジーを有する種類の材料を提供し；前記顆粒材料を前記支持体の上に付着させて顆粒材料の所定の区域を形成し；前記顆粒材料の個々の粒子を互いに付着させて、前記支持体に付着した相互連絡した空隙の多孔質層を形成し；少なくとも側壁によりそれぞれ画成された多数のウェルを持つフレームを提供し；前記フレームと前記支持体を組み立てて、マイクロプレートを製造する各工程を有してなる方法。
【請求項９】
マイクロプレートに用いられる基体を製造する方法であって、多数の多孔質パッチを形成するためのテンプレートを提供し；平らな硬質の非多孔質下部構造を提供し；前記テンプレート内で、前記下部構造の頂面に顆粒粒子による材料層を施す各工程を有してなり、前記テンプレートが、前記マイクロプレートにおけるウェルの配列に対応するように各多孔質パッチの位置を画成するアダプタとして機能することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記顆粒粒子が固結されて、前記下部構造に付着した多孔質ウェハーが形成されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２００４年４月１２日に出願された米国特許出願第１０／８２２３８５号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生物学的または化学的アッセイに使用するのに適合した基板または器具に関する。本発明は、より詳しくは、各ウェル内の支持表面の一部分として三次元または多孔質の基体を有するマルチウェルプレートに関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、ゲノムに基づくアッセイ技法によって、多くの潜在的な薬剤の対象が発見された。この進歩によって、一般に、プロテオミクスの分野に、特に、異なる種類のスクリーニングアッセイの分野に関心が寄せられ、発展に至った。遺伝子がタンパク質をエンコードし、転じて、タンパク質が細胞における生命機能のほぼ全てを果たすので、タンパク質の機能を解読することよりも重要なことは実質的には何もない。何故ならば、タンパク質は、ほとんどの薬剤がそれに作用するように設計された対象であるからである。提案されてきた様々な手法の中で、アレイに基づく発現分析および多くの遺伝子の突然変異マッピングが、生物学に、また薬剤の発見と開発に大きな影響を与えた。化学または薬剤の対象の群集を１つずつ選別することが非常に高く付くことを考えれば、この事実により、多くの対象のエラー強さのある平行分析を可能にするスクリーニング技術が要望されるようになった。
【０００４】
ゲノミクス、進歩した科学技術およびハイスループットスクリーニングと共に、タンパク質マイクロアレイ技術には、生物系またはシステム生物学の理解において、並びに将来の新薬の開発において役立つ将来性がある。機能性タンパク質マイクロアレイでは、天然のタンパク質を、基体表面上に配列されたプローブとして使用する。このタイプのアレイは、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−小分子の相互作用などの、天然のタンパク質の活動の並行研究にとって有用である。しかしながら、タンパク質の表面との相互作用のために、タンパク質マイクロアレイの調製が複雑になる。この問題は、(i)タンパク質は水溶液と固体表面との間の界面で変性し得るために、また(ii)表面上のタンパク質の無作為な固定化により、タンパク質の活性部位が標的の結合に接近不可能になるかもしれないために生じる。構造と活性が大部分保持された状態で表面上のタンパク質の最大の結合能力と所望の安定性を達成するために、固体支持体の表面は、一般に、再作製する必要がある。例としては、タンパク質を固定化するための「変形可能な」ポリマーグラフト表面（例えば、マサチューセッツ州、ボストン所在のパーキンエルマー・ライフ・サイエンス(PerkinElmer Life Science)社のＨｙｄｒｏＧｅｌ被覆スライド）、タンパク質の共有結合のためのアミンまたはチオール反応性表面、またはタンパク質の特異的結合のための官能基担持表面が挙げられる。官能基担持表面としては、ビオチン化タンパク質のためのアビジン被覆表面、ヒスチジン標識タンパク質のためのＮｉ+2キレート化表面、または天然のタンパク質のための抗体修飾表面が挙げられる。
【０００５】
従来、生物学的マイクロアレイは、ガラススライドの表面などの、二次元の大きな基体表面上に製造または印刷されてきた。最近、生物学的マイクロアレイのための多孔質基体が提案され、実施されるまでに至った（例えば、ここに引用する、特許文献１または２を参照のこと）。多孔質基体には、従来の二次元基体よりも優れた利点がいくつかある。これらの利点としては、例えば、関連する潜在的な高い結合能力と、一般には標的分子に関する高い結合特異性による、各マイクロスポット内のプローブに関する高い装填能力、並びに標的がその補体プローブと反応する可能性を増加させる、各マイクロスポット内のプローブへの標的のより大きくなった接近可能性が挙げられる。この後者の現象は、そこで、プローブの大部分が多孔質マトリクス内の微小または超微小のチャンネル中に捕捉される多孔質表面の三次元特性の結果であると考えられている。
【０００６】
従来の多孔質スライドまたは他の基体は、一般に、近接した多孔質層により構成される。そのような状況下では、たとえアレイ内の個々のマイクロスポットが別個のものであり、互いから物理的に隔てられているかもしれないが、下にある多孔質マトリクスはそうではない。このように構造が物理的に分離されていないために、汚染やクロストークに関連する問題が引き起こされる。多数の試料を１つの基体に施す場合、それらの試料溶液は、広がり、多孔質基体内の下に横たわる相互に連結したチャンネルを通した毛管吸上作用によって、一緒に合体する傾向にある。それゆえ、多孔質基体は、１つの基体上の多重化アッセイには、直ちに使用されるまでになっていない。この制限のために、多重化用途から、容易に利用できる手段と関連する利点が奪われている。
【特許文献１】国際公開第０１／１６３７６Ａ１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／６１２８２Ａ１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、クロストークの問題を克服し、それによって、マイクロプレート形式におけるアレイのための固定化された生物学的または化学的分子を用いたバイオアッセイのための多孔質基体の用途を拡大適用する。例えば、標準形式のマイクロプレートのウェル内における同一のＤＮＡおよびタンパク質アレイの作製が、ハイスループット分析にとって多大な利益となり得る。何故ならば、結果として形成されたマイクロプレートの各々により、同じまたは異なる複製生物学的アレイに対して多くの異なる試験試料を並行して処理することができるからである。多孔質基体の独特の性質を、標準形式のマイクロプレートのハイスループット能力を組み合わせることによって、生物学的マイクロアレイを含む表面媒介バイオアッセイの優れた性能を達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、多数の生物学的または化学的アッセイを並行して実施するための器具を提供する。この器具は、多数のアッセイ溶液または試料が同じ基体上に施されたときに、単一の多孔質バイオアッセイ基体に関連するクロストークおよび汚染の問題に対処するものである。本発明によりクロストークの課題が克服されるので、多孔質基体の用途を、マイクロアレイ形式の多重化生物学的アッセイの範囲にまで拡張することができる。この器具は、マイクロタイタウェルプレートの底面支持体を形成する実質的に平面の基体を含む。この基体は、生物学的または化学的分析物を取り付けるための多数の個別の多孔質パッチまたは表面を有する。これら個々の多孔質パッチは、各ウェルの底面の一部分を形成する。各多孔質パッチはウェル内に作りつけられているので、浸透や吸上作用によりウェル間で交差汚染を生じる傾向がなくなる。
【０００９】
各多孔質パッチは、平らな硬質の非多孔質下部構造に付着している。多孔質パッチは、その中に分散した約０．０５μｍ以上の所定の平均サイズを持つ複数の開放した相互に連結した空隙を有するものとして特徴付けられる。これら空隙チャンネルは、多孔質パッチの頂面まで延在する。これらの空隙は、好ましくは約０．０５μｍ以上の所定の平均サイズを持つ、近接したか連続した材料のマトリクスまたは網状構造により画成され、空隙の体積および固体材料は、互いに対して屈折率において高いコントラストを示す。言い換えれば、多孔質パッチは、硬質の三次元のスポンジ状構造を持つものとして特徴付けられ、約９９．７％までの気孔率を有することができる。
【００１０】
多孔質表面は、顆粒モルホロジーを有する高分子有機材料または無機材料いずれかから得ることができる。多孔質パッチに無機材料を使用する場合、この材料は、ガラスや金属酸化物などの、非晶質または単結晶材料の固体の形態にあるときには、赤外線や紫外線を含む光に対して透過性であり、非吸収性であると特徴付けられる。例えば、より具体的には、この材料は、ケイ酸塩ガラス、アルミノケイ酸塩ガラス、ボロアルミノケイ酸塩ガラス、ホウケイ酸ガラス、ＴｉＯ2、ＳｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3、Ｃｒ2Ｏ3、ＣｕＯ、ＺｎＯ、およびＺｒＯ2からなる群より選択されるであろう。
【００１１】
好ましい実施の形態において、多孔質表面は、無機下部構造の熱膨張係数（ＣＴＥ）に適合するＣＴＥを有することが好ましい、個々の粒子のフリットベースの層から得られる（ＣＴＥ±１０〜２０％）。ＣＴＥが一致していることが好ましい。前記基体は、空隙の表面積の少なくとも一部および多孔質パッチの頂面に亘り、またある実施の形態では、多孔質層と下部構造との間に配置された中間層に亘り、結合剤の均質コーティングをさらに含んでもよい。この中間層は、下部構造から多孔質層が剥離するのを防ぐために、多孔質層および下部構造に適合する熱膨張係数を有する。
【００１２】
各多孔質パッチの厚さが、少なくとも約５μｍであることが好ましい。無機材料のマトリクスは、無機材料粒子を互いに接着させること、または焼結することによって、形成される。これら粒子の所定の平均サイズは、好ましくは約０．５μｍから約５μｍの範囲、より好ましくは約０．５μｍから約３．５μｍの範囲にある。多孔質無機層内の空隙の所定の平均サイズは、好ましくは約０．５μｍから約５μｍの範囲、より好ましくは約０．５μｍから約３．５μｍの範囲にある。また、これら空隙に入っているものは、基体、液体、または固体のいずれかである。
【００１３】
本発明の器具の実施の形態によれば、多孔質被覆基体プレートは、（１）有機高分子材料または無機材料いずれかから製造され、行列に配列された一組のウェルを有する穴あきマイクロプレート、（２）穴あきマイクロプレートの各ウェルに対応する位置に配列された、多数の多孔質パッチを備えた、ガラス材料から製造された下部構造支持プレートを備えている。
【００１４】
本発明はまた、この器具に用いられる基体を製造する方法にも関する。この方法は、多数の多孔質パッチを形成するためのテンプレートを提供し、平らな硬質の非多孔質下部構造を提供し、このテンプレート内で、無機下部構造の頂面に顆粒粒子の材料層を施す各工程を有してなる。このテンプレートは、マイクロプレートにあるウェルの配列に対応するまたは準拠するように、各多孔質パッチの位置を規定するアダプタとしての機能を果たす。このテンプレートは、金属、非金属、または他の材料（例えば、固形化したガラス）から製造できる。多孔質材料を下部構造に施した後、顆粒粒子は、その材料の性質に応じて、下部構造に付着した多孔質ディスクまたはウェハーを形成するように固結させてもよい。その後、多孔質パッチを備えた下部構造に、穴あきマイクロプレートを取り付けるまたは付着させて、本発明の器具を形成することができる。穴あきマイクロプレートの付着は、最新式の接着剤、音波溶着、赤外線溶着、または熱結合技法により実施することができる。
【００１５】
好ましい実施の形態によれば、多孔質被覆底部プレートを製造する方法は、（１）所定のサイズのフリットをフリット懸濁液で提供する工程、（２）所定の位置で下部構造（例えば、平面のガラス支持体）上に懸濁液を付着させて、フリット粒子の多数のパッチを形成する工程、および（３）フリット粒子を一緒に固結または焼結して、多孔質ウェハーを形成すると同時に、多孔質ウェハーを下部構造に結合させる工程を有してなる。多孔質層を固結させる焼結工程は、比較的高温（例えば、約６４５℃から約７５０℃）で行うことが好ましい。
【００１６】
あるいは、その方法は、（１）多数のウェルを有するアダプタを提供する工程、（２）アダプタを支持基体上で位置決めする工程、（３）アダプタの各ウェル内に所定のサイズを持つ材料粒子の層を施す工程であって、粒子が乾燥粉末または溶媒懸濁液いずれかの形態にある工程、（４）粒子が付着して多孔質ウェハーを形成し、多孔質ウェハーをガラス支持プレートに付着させるのに十分な温度で、系全体を焼結する工程、および（５）焼結の前または後にアダプタを取り除く工程を有してなる。個々の材料粒子は、個々の粒子の間のある量の気孔率のために、空隙および空隙チャンネルを保存しながら、一緒に結合される。支持プレートに対してアダプタを物理的に押し付けるように、圧力をアダプタに加えることが好ましい。各ウェル内の各多孔質パッチの厚さまたは高さは均一であるべきである。これは、高さ調節装置により行うことができる。多孔質層の厚さは、アダプタ自体の厚さにより規定されることが好ましい。アダプタは、金属、溶融温度の高い（例えば、８００℃以上（コーニングコード１７３７））ガラス、またはセラミック材料から製造できる。
【００１７】
別の実施の形態において、前記方法は、有機または高分子多孔質層を有する支持プレートを製造するために適用できる。この方法は、（１）多孔質マトリクスを形成するように互いに付着した個々の顆粒粒子から形成された有機または高分子層を提供する工程、（２）下部構造支持プレート上に多孔質層を配置する工程、（３）加圧と、（ａ）マイクロプレートの構造を持つ加熱プラテンまたはアダプタを用いた熱結合、または（ｂ）マイクロプレートの同じ構造を持つ「スタンプ」アダプタを用いた接着化学反応いずれかとによって、多孔質層を支持プレートに取り付ける工程を有してなる。（ａ）および（ｂ）の両方の手法において、多孔質層のあるセクションは、他の区域から分離される。すなわち、マイクロプレートの各ウェルの底面を形成する多孔質層のセクションは多孔質のままであり、一方で、ウェルの中の多孔質層間の連絡は切断されている。穴あきマイクロプレートに接触する多孔質層のセクションは、クロストークを防ぐために封止されている。熱結合手法によれば、加熱プラテンは溶融し、それが接触する多孔質層の区域を封止する。スタンピング手法によれば、アダプタは、接着組成物または溶液を、穴あきマイクロプレートのフレームが取り付けられる高分子多孔質層の区域に転移させる。接着組成物は、それらの区域で基体の空隙または細孔を満たし、塞ぎ、封止して、ウェル間の交差汚染を防ぐ。それゆえ、多孔質層は、マイクロプレートのフレームと下部構造支持プレートとの間に挟まれている。
【００１８】
本発明の追加の特徴と利点を、以下の詳細な説明に述べる。先の概要と、以下の詳細な説明および実施例は、単に本発明を表すものであり、特許請求の範囲に記載された発明を理解するための概要を提供することが意図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
セクションＩ  −  序論
基体プレート器具、並びにその製造および使用方法を提供する。以下の説明において、最初に、一般的に、また具体的には実施例によって、器具を論じ、次いで、その製造方法を説明する。次に、実施例により、本発明の装置が用いられる説明のための用途をいくつか説明する。
【００２０】
本発明を詳細に説明する前に、ここに用いた技術は、特定の実施の形態のみを説明する目的のためであり、制限を意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられているように、名詞の単数形は、文脈に明らかに別記されていない限り、複数のものを含む。文脈内において別に定義されていない限り、ここに用いた全ての技術用語と科学用語は、本発明が関連する当業者によって従来のように理解される、通常の意味を持つ。
【００２１】
「マイクロスポット」という用語は、生物学的または化学的プローブ種を含有する、基体の表面上の別個のまたは所定の区域、位置、またはスポットを称する。
【００２２】
「プローブ」という用語は、ビー・フィミスター(B. Phimister)(Nature Genetics 1999,21 Supplement, pp.1-60)により推奨された命名法により、基体表面に固定化された、生物学的または化学的分子または実体（例えば、Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、生体膜、脂質または脂質膜、細胞溶解産物、オリゴ糖類、抗体、タンパク質、または核酸）を称する。プローブが、マイクロスポットのアレイを形成するように、空間的に指定可能な様式で配置されていることが好ましい。
【００２３】
「標的」という用語は、概して、関心のある試料中の生物学種または化学種（例えば、抗体、タンパク質、毒素、製薬化合物）を称する。
【００２４】
ここに用いている「多孔質層」、「多孔質パッチ」、「多孔質基体」、「多孔質表面」、または「多孔質ウェハー」という用語は、平面基体またはプレートの一部であり、プローブを固定化するための安定な基体を形成できる、多孔質の固体または半固体材料（例えば、微小規模または超微小規模の細孔）を称する。
【００２５】
セクションII  −  説明
本発明の器具の主な使用方法の１つは、ハイスループットの表面媒介生物学的アッセイ、特に、マイクロアレイ形式のアッセイを実施するためのものである。この目的のために、生物学的または化学的プローブは、マイクロプレートの各ウェル内の多孔質基体または表面上の予め定められたまたは所定の位置に固定化される。多孔質基体表面は、ある実施の形態によれば、固定化プローブを向上させるために修飾された表面の化学的性質を有することができる。プローブ分子は、試料中に存在する、標的分子または分析物分子と反応するまたは結合するように設計される。生物学的アッセイにおいて一般的に、試料中に標的分子または標的分子と共存する参照分子は、蛍光染料などの、光学的活性マーカーにより標識付けられる。例えば、マーカーの蛍光または発光は、プローブと標的（または参照分子）との間の反応中に増加する。それゆえ、試料流体の組成の定性分析および／または定量分析は、各ウェルの内容物を照らし、光学的にイメージングまたは走査することによって実施することができる。
【００２６】
本発明によれば、基体プレート器具は、（１）多数の穴を持ち、行列に配列されたウェルのアレイを有するフレームまたはプレート、（２）穴あきマイクロプレートのフレーム内の各ウェルの底部にそれぞれ対応する、所定の位置で支持表面上の多数の多孔質パッチを形成するために互いに付着した顆粒粒子（例えば、フリット）がその上に施される下部構造支持体を含む。フレームおよび下部構造支持体の各々または両方は、ガラス材料、セラミック材料、結晶質材料、または高分子プラスチック材料、もしくはこれらの材料の組合せから製造できる。本発明による基体プレート器具には、特に、基礎研究、製薬、臨床および診断用途のためのマイクロアレイに基づくアッセイを含む表面媒介バイオアッセイに用途が見出されている。さらに、本発明の器具は、表面媒介バイオアッセイに関する著しい利点を提供する。従来の底部がガラスまたはポリマーのマイクロプレートと比較して、多孔質基体を使用すると、一般に、ずっと高い装填能力、並びに多孔質基体の表面上に固定化されたプローブへの標的分子の高い結合特異性および接近可能性が生じる。さらに、ガラスが底部の支持プレートを使用すると、従来の普及した光学に基づく検出に望ましい、ガラス材料の優れた光学的性質が提供されるだけでなく、マイクロプレート全体に亘る優れた全面の平面度も提供され、これによりウェル間の変動性が減少する。
【００２７】
本発明はまた、具体的に、もとのまま(bare)の化学的に未修飾の多孔質基体上に付着した生体膜または膜−タンパク質マイクロアッセイを説明する。現在の最新技術の考えは、多孔質基体の表面修飾は生物学的マイクロアレイにとって好ましいということである。本発明は、アッセイの感度も結合特異性も損なわずに、未修飾の多孔質基体上に生体膜マイクロアレイを製造できることを実証するものである。未修飾の多孔質基体表面を使用することには、関連する利点がいくつかある。以下は、制限として捉えるべきではないいくつかの実施例のみを挙げている。第１に、未修飾の基体は、潜在的に無制限の貯蔵寿命を有することができる。何故ならば、時間の経過により、劣化したり、酸化されたり、汚染されたりする表面の化学成分または他の修飾部が存在しないからである。もとのままの多孔質表面は汚染されるかもしれないが、基体は、使用前に、単純な洗いまたは洗浄工程により処理できる。反対に、修飾または被覆基体は、一般に、復元するのが不可能ではないかもしれないが難しい、汚染または環境との反応のために、限られた貯蔵寿命を有する。
【００２８】
本発明は、もとのままの多孔質層上のＧ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）マイクロアレイの製造、およびリガンドのアゴニズムおよび化合物スクリーニング両方のためのＧＰＣＲマイクロアレイの使用も説明する。もとのままのすなわち未処理の多孔質基体上の生体膜マイクロアレイは、現在まで実証されていない。もとのままの多孔質層は、多孔質層の頂面上に単に固定化される代わりに、多孔質マトリクスの内部に生体膜、特に、ＧＰＣＲを物理的に捕捉する。しかしながら、一旦、マトリクス内に入ったら、生体膜はまだ、自然のままの移動度を有し、それゆえ、ＧＰＣＲは、完全な生体機能性を維持し、生体膜断片の両側が、標的化合物または生物学的種に完全に接触可能である。
【００２９】
Ａ．−  多孔質基体を担持するマイクロプレート
一般論として、本発明のアッセイプレート器具は、それぞれ少なくとも側壁により画成された多数のウェルを有するフレーム、多数の第１と第２の区域を持つ表面を有する平面基体を備えている。第１の区域の各々は、プローブ種を固定するための多孔質層またはパッチを有し、第２の区域はそのような多孔質層を持たない。第１と第２の区域は互いに隣接し、第２の区域は、下部構造の一部分として、これら多孔質層の各々の支持体として機能を果たす。第１の各区域内にある多孔質層は、第２の区域の少なくとも部分的なオーバーレイヤーを形成する。フレームと平面基体は、互いに結合して、マルチウェルプレートを形成し、ここで、第１の各区域がウェルの底面の一部分を形成する。
【００３０】
図１は、本発明の実施の形態によるアッセイプレート器具の概略図である。この図は、頂面に英数ラベルが付された、９６ウェル（８×１２）を有するプレート１０を示しているが、この器具は、任意のマイクロプレート形式にしたがうウェルの行列を持つように構成してもよい。この配列が、業界基準の形式（例えば、３８４、１５３６）に準拠することが好ましい。図２Ａは、マイクロプレート１０における側壁１２ａにより画成されたウェル１２の内の１つの拡大図である。このウェルは、ウェル１２の下部構造すなわち底部１６の一部を形成する、多孔質層またはウェハー１４を有する。この概念は、ウェル１２の側面断面図である、図２Ｂの概略図により明らかに示されている。
【００３１】
様々な実施の形態によれば、穴あきプレートフレーム１１、下部構造、または多孔質層を含む、器具全体は、様々な高分子または無機材料もしくはそれらの組合せから構成してもよい。すなわち、例えば、下部構造および多孔質層は無機であり、穴あきプレートはプラスチックであっても差し支えない。相互連絡したチャンネルを有するので、多孔質層は、顆粒モルホロジーを持つような固体材料から形成することが好ましい（例えば、米国特許出願公開第２００３−０００３４７４Ａ１号明細書参照）。
【００３２】
ある実施の形態において、固体材料は高分子材料であってよく、他の実施の形態において、フリットベースの材料であってもよい。好ましい有機成分は、例えば、疎水性ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリレート、メタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエステル−ケトン、ポリオレフィンまたは環状オレフィン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、またはここに引用する、米国特許第６６５３４２５号、同第６１６６１２５号、同第６５９３４１５号、または同第６５９００３６号の各明細書に記載されたような高分子組成物から選択してよい。
【００３３】
無機材料については、ケイ酸塩、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、ボロアルミノケイ酸塩などの様々なタイプのガラスが好ましいが、ガラスセラミック、セラミック、ケイ素などの半導体または結晶質材料を用いてもよい。製造または特定のアッセイプロトコルまたは条件のための特定のパラメータを満たす、またはそれに適合した、熱膨張係数（ＣＴＥ）、耐久性、または化学反応性（例えば、浸出またはバックグラウンド信号／ノイズ）などの所望の材料特徴を与えるために、特定のタイプのガラスが選択されるであろう。
【００３４】
光透過率または光導波路のための性質を有する、ガラス、ガラスセラミック、または高純度溶融シリカ、もしくはクリスタライトの相分離からの散乱中心または呼び出し波長での高いバックグラウンド自己蛍光を生じない官能基を持つ、屈折率の均一な光学的に透明なポリマーまたはプラスチックなどの有機材料が好ましい。
【００３５】
製造において、光沢剤または漂白剤を含まずに済む、熱押出用または成形用光学プラスチックを使用してよい。あるいは、製造後に、バックグラウンド信号を除去するために、ホウ化水素（例えば、ＮａＢＨ4）などの還元剤で様々な材料表面を処理してもよい。
【００３６】
多孔質層は、生物学的種の多孔質層への付着を向上させる表面成分により、ａ）未修飾であるか、またはｂ）修飾されている。表面成分は、シラン、ポリマー、または生物学的コーティングから選択してよい。シランコーティングは、３−アシルオキシプロピルトリメトキシシラン、アリルトリクロロシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピル−トリメトキシシラン、ビス（トリエトキシシリル）メタン、２−（３−シクロヘキセニルエチル）トリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシランからなる群より選択してよい。ポリマーコーティングは、キトサン、エポキシを有するポリマー、無水物を有するポリマー、ＮＨＳ−エステルを有するポリマー、アルデヒドを有するポリマー、ポリエチレンアミン、およびポリリシンからなる群より選択してよい。生物学的コーティングは、抗体、タンパク質−Ａ、タンパク質−Ｇ、レクチン、小麦胚凝集素からなる群より選択してよい。フレームは、以下の技法、熱溶着、音波溶着、赤外線溶着、または化学接着剤の内の少なくとも１つによって、少なくとも多数の第２の区域を支持し、第１の区域の多孔質層を露出させるように、基体に結合される。
【００３７】
Ｂ．  −  多孔質基体を担持するガラスの底部プレートを製造する方法
本発明はまた、マイクロプレートのウェルの底部に対応する所定の位置に配置された少なくとも１つの多孔質パッチを有する底部支持プレートを製造する方法を提供する。ある実施の形態によれば、この方法は、有機溶媒中に懸濁された所定のサイズ（例えば、好ましくは約０．５から約３．５または５．０マイクロメートルの範囲にあることが好ましい）のフリット粒子を提供し；所定の位置で下部構造支持体（例えば、ガラス板またはスライドが好ましい）上に懸濁液を付着させて、多数のフリットパッチを形成し；個々のフリット粒子を多孔質マトリクスに結合させ、多孔質マトリクスを下部構造支持体に付着させる各工程を有してなる。
【００３８】
フリットは、どのようなガラス組成物であっても差し支えないが、ホウケイ酸塩、アルミノケイ酸塩、ボロアルミノケイ酸塩、またはケイ酸塩フリットもしくは純粋なシリカ粉末から選択されることが好ましい。固体ビーズを懸濁させるのに用いられる溶媒は、例えば、テキサノール／エンフォス(enphos)ＰＶＢまたはイソプロパノールいずれであってよい。フリット粒子は、特定のメッシュサイズの領域を持つスクリーンを用いた、スクリーン印刷技法、またはテープキャスティング装置などの塗布プロセスを用いてパターンで堆積させてもよい。顆粒フリット粒子は、焼結などの熱誘発融着プロセス中に互いに結合する。個々の粒子が互いに融着する程度を調節し、それゆえ、固結と気孔率の量に影響を与えるように、焼結プロセスの温度を操作してよい。焼結工程は、材料の組成に応じて、通常約６００〜８００℃で、好ましくは６７５〜７４０℃で行われる。低温では、得られる基体全体に亘り、９８％または９９％までの空隙の高い気孔率を達成できる。
【００３９】
あるいは、多孔質被覆底部プレートを製造する方法は、（１）金属から製造された、多数のウェルを有するアダプタを提供し；（２）支持基体上にアダプタを配置し；（３）アダプタの各ウェルに、粉末または溶媒中の懸濁液いずれかとして顆粒粒子を充填し；（４）アセンブリ全体を高温度で熱処理して、粒子を互いに融着し、得られた多孔質層を支持プレートと融着し；（５）アダプタを取り除く各工程を有してなる。アダプタが支持基体に対して物理的に押し付けられることが好ましい。各ウェル内の顆粒粒子が一貫したまたは均一な厚さのものであることを確実にするために、レベラ装置を用いても差し支えない。多孔質高分子コーティング層を製造するために、この方法を適用しても差し支えない。最初に、高分子材料の多孔質シートを提供し、多孔質シートを無機下部構造支持体上に配置し、（ａ）溶融し、プラテンと接触する多孔質シートの区域において空隙を密封する、穴あきマイクロプレートの構成を有する加熱プラテン、または（ｂ）同様に空隙を密封し、互いから多孔質区域を隔離する、多孔質シートの所定の区域に接着剤を移行させるための穴あきマイクロプレートと同じ構成の「スタンプ」アダプタのいずれかを用いて、多孔質シートを下部構造支持体に取り付ける。
【００４０】
Ｃ．  −  修飾多孔質基体表面上のＧＰＣＲマイクロアレイ
生物学的アレイ、特に、膜タンパク質またはＧＰＣＲマイクロアレイの製造は、非常にやりがいがあるが困難な場合もある。これは主に、ＧＰＣＲを、その正確な折り畳みコンフォメーションおよび機能を維持するために、脂質膜と結合させる必要があるという事実のためである。以前、この分野の研究者は、膜全体を基体表面に共有結合により固定化することを試みてきた。そのような技法は、横への可動性が、生体膜に固有の生理的に重要な性質であるから、望ましくない。さらに、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体は、表面にアレイ状に形成された後に保存すべきである。何故ならば、受容体とＧタンパク質の正確な配置は、生理的結合親和性による作用物質の受容体への結合にとって必須条件であるからである。この表面は、受容体の構造と機能性に重大な影響を与えるだけでなく、固定化された脂質膜の構造安定性および機械的安定性において重要な役割を果たし得る。
【００４１】
米国特許出願公開第２００２−００１９０１５Ａ１号および同第２００２−００９４５４４Ａ１号の各明細書において、ファン(Fang)等により、ロボット印刷技法を用いた、二次元のアミン被覆無機基体（例えば、ガンマ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）表面）への生体膜−タンパク質アレイの製造が記載された。ファン等により、ＧＰＣＲマイクロアレイは、所望の構造、横への流動性、および重要な機械的安定性を維持しながら、細胞膜断片または調製物を用いて製造できることが実証された。マイクロアレイによって、リガンドの、アレイ中のそれら同種の受容体への特異的結合が可能になる。これらのリガンドの結合親和性およびプロファイルは、溶液ベースのまたは細胞ベースのアッセイを含む従来の方法を用いて得られたものと似ている。
【００４２】
ここに引用する米国特許出願公開第２００３−０００３４７４Ａ１号明細書に述べられているような、スクリーン印刷やテープキャスティングなどの製造技法を使用することによって、無機支持プレート上にシリカフリットの９６、３８４、または１５３６個のパッチのアレイを調製できる。ある実施の形態によるシリカフリットは、有機系溶液中に懸濁され、均質化されて、フリット粒子がマスクまたはスクリーン中に広げられる。印刷後、フリットパッチは、例えば、約６５０〜７５０℃の温度で焼結されて、それら粒子を硬化し、互いに融着し、または、所望の密度に固結して、支持プレートと安定に結合した多孔質ウェハーまたはマトリクスを形成する。各多孔質ウェハーはＧＡＰＳにより被覆されている。その後、多孔質ウェハーを担持する支持プレートは、続いて、ウェルプレートと組み合わせられ、したがって、各多孔質ウェハーが各ウェルの底部の一部を形成する。
【００４３】
生体膜アレイが各多孔質ウェハー上に付着させられる。アレイの内容物は、ウェル毎に同じであっても異なっていても差し支えない。生体膜は、細胞膜断片調製物、再構成膜タンパク質を含有する脂質小胞、または膜タンパク質を含有する脂質ミセル、少なくとも関心のある膜タンパク質を含有するエキソソーム小胞であり得る。ＧＰＣＲマイクロアレイを用いた結合アッセイについて、標的化合物の存在下または不在下のいずれかにおける標識リガンドのカクテル液を各アレイに施す。インキュベーション後、溶液を各ウェルから吸引し、各アレイを洗浄水溶液により三回洗浄し、乾燥させる。その後、ＣＣＤカメラに基づく検出装置またはＰＭＴに基づくスキャナを用いて、各アレイを検査または画像化する。
【００４４】
図３および４に示した実施例において、３タイプのＧＰＣＲのマイクロアレイが、吸引および分配をプログラミングするためのソフトウェアを備えたクイル・ピン(quill-pin)プリンタ（カーテシアン・テクノロジーズ(Cartesian Technologies)モデルＰＳ５０００）を用いて各ウェル内に印刷する。３種類の受容体は、ムスクリニック(muscrinic)受容体サブタイプ２（Ｍ２）、デルタ２オピオイド受容体（ＯＰ１）およびムスクリニック受容体サブタイプ１（Ｍ１）である。各受容体は４つの複製を有する。図３ＡおよびＢは、それぞれ、非標識リガンドの存在下および不在下における標識リガンドの「カクテル液」でアッセイされた後の、ＧＰＣＲのマイクロアレイの着色蛍光像を示している。標識リガンドのカクテル液は、２ｎＭのＣｙ３Ｂ−テレンツピン(telenzpine)、および４ｎＭのＣｙ５−ナルトレキソンを含有する。非標識リガンドは、１μＭのテレンツピンおよび１μＭのナルトレキソンを含有する。図４は、図３Ａおよび３Ｂから生じたアッセイ結果を要約している。図４は、マイクロアレイが、非標識リガンドの存在下（黒いバー）および不在下（白いバー）における標識リガンドのカクテル液でアッセイされた後、マイクロスポットの関数としての信号強度を表している。標識リガンドのそれらの同種の受容体への全結合能力により示されるように、各マイクロスポットにおけるＧＰＣＲの装填能力は、二次元ＧＡＰＳ被覆表面上のものよりも著しく高い（５０倍以上）。標識リガンドのそれらの対応する受容体への結合特異性は、蛍光偏光アッセイまたはラジオアクティブアッセイなどの、溶液中で測定されるものと実質的に同じである。このアッセイの信号対雑音比は、二次元表面上で達成されたものよりも著しく良好である。
【００４５】
Ｄ．  −  未修飾でもとのままの多孔質基体表面上のＧＰＣＲマイクロアレイ
先のセクションに記載したような被覆多孔質表面とは反対に、本発明の別の態様では、膜タンパク質アレイについて、未修飾すなわちもとのままの多孔質表面を使用する。構造および機能活性を概ね維持しながら、表面上のタンパク質の最大の結合能力および所望の安定性を達成するために、生物学的マイクロアレイには、表面成分により注意深く修飾または製作された固体支持表面が必要である。しかしながら、タンパク質の表面との相互作用のために、タンパク質マイクロアレイの調製は複雑になる。これは、（ｉ）タンパク質は、水溶液と固体表面との間の界面で変性し得、（ｉｉ）表面上のタンパク質の無作為の固定化により、タンパク質の活性部位が結合にとって接触不可能となるかもしれないからである。もとのままの多孔質基体を使用することによって、生体膜を多孔質マトリクス内に物理的に捕捉することができるであろう。それゆえ、生体膜は、標的種と反応したときに、生体機能性および所定のアレイのマクロ構造を維持しながら、表面からの立体干渉をほぼ避けることができる。
【００４６】
多孔質ウェハー上にコーティングがないことを除いて、先のセクションＣに記載したものと同様のマイクロプレートを使用すると、各ウェル内のもとのままの未修飾の多孔質ウェハー上に生体膜マイクロアレイを直接付着させることができる。多孔質基体は、生体膜の固定化を向上させるための、どのような化学的または生物学的材料によっても修飾されていない。アレイ印刷の前に、そのプレート表面は、表面を浄化するために約５分間に亘りＵＶ／オゾン曝露により処理される。図５に示す実施例において、３または４個の複製があるニューロテンシン受容体サブタイプ１（ＮＴＲ１）のマイクロアレイが各ウェル内に印刷され、非標識の過剰のニューロテンシン（２μＭ）の存在下または不在下において、４ｎＭのＣｙ５−標識ニューロテンシン（Ｃｙ５−ＮＴ）を含有する溶液によりアッセイされる。図５Ａおよび５Ｂの画像に示したように、Ｃｙ５−ＮＴのアレイ中のＮＴＲ１への結合は、非標識の過剰のニューロテンシンにより阻害することができる。このことは、結合が特異的であることを示している。図５Ｃのグラフに示したように、アッセイの差異（ＣＶ）は、Ｃｙ５−ＮＴのＮＴＲ１への全結合について、約９％であり、Ｃｙ５−ＮＴのＮＴＲ１への非特異的結合のＣＶは約１５％である。アッセイの信頼性（Ｚ’因子）は約０．４４であり、これは、約０．４である任意の所定のＧＰＣＲベースのアッセイについての業界基準に匹敵する（Zhang,J.et al. (1999)J.Biomol Screening 4,67-73参照のこと）。
【００４７】
もとのままの多孔質基体上のＧＰＣＲマイクロアレイの潜在的な機構をさらに調査する。最初に、マウス抗−Ｇｉ抗体により修飾されたＮＴＲ１膜調製物を用いて製造したＮＴＲ１のマイクロアレイを、結合緩衝液中の約４ｎＭのＣｙ５−ＮＴの溶液を用いてアッセイする。次いで、同じアレイを、連続して、１ｎＭのＣｙ５−抗−マウスＩｇＧを含有する溶液とインキュベーションする。Ｃｙ５−抗−マウスＩｇＧの染色区域は、同じマイクロスポットにおけるＮＴＲ１受容体へのＣｙ５−ＮＴの結合のものよりも大きい（約５０％大きい）ことが分かった。このことは、抗体は印刷区域を超えて拡散できるが、ＧＰＣＲ膜断片は、図６に示したように、所定のマイクロスポットの周辺（ピン接触区域とも称される）に留まることを示している。
【００４８】
第２に、Ｃｙ３−標識ウシ血清アルブミン（Ｃｙ３−ＢＳＡ）により修飾されたＯＰ１膜調製物を用いて製造したデルタ−２−オピオイド（ＯＰ１）のマイクロアレイを、約４ｎＭのＣｙ５−ナルトレキソンを含有する溶液でアッセイする。Ｃｙ３−ＢＳＡの染色区域は、同じマイクロスポットのＯＰ１受容体へのＣｙ５−ナルトレキソンの結合のものよりもずっと大きい（約１００％以上）ことが分かった。このことは、ＢＳＡが印刷区域を超えて拡散できるが、ＧＰＣＲ膜断片は、図７に示したように、所定のマイクロスポットの周辺に留まることを示している。要約すると、これらの結果は、印刷中のプローブ分子の拡散はサイズに依存することを示している。これらの結果は、ＢＳＡおよび抗体などの個々のタンパク質は、印刷区域を超えて多孔質層の内部に拡散できるが、膜断片は超えないことを示している。ＧＰＣＲ膜断片のサイズは一般に５０〜１００ｎｍの範囲にあり、これは、ＢＳＡ（約５ｎｍ）および抗体（約１０ｎｍ）よりもずっと大きいことが知られている。
【００４９】
調査した次の現象は、大きなサイズを持つ粒子が、印刷中に多孔質マトリクスの空隙内にどのように留まるかである。この目的のために、４０ｎｍの直径を持つ金のナノ粒子を、ＧＰＣＲ膜断片を表すモデルとして用いる。何故ならば、これらの粒子は、ＧＰＣＲ膜断片とサイズが同じかまたはそれよりわずかに小さく、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で識別できるからである。図８に示すように、金のナノ粒子は、接近可能な露出表面から多孔質マトリクス中に約２５μｍの深さまで拡散でき、多孔質マトリクス内に物理的に捕獲されることが観察された。この結果は、ＧＰＣＲ調製物を含む生体膜は、表面に印刷された後に、多孔質マトリクス内に拡散し、物理的に捕捉され得ることを示している。このことは、プローブには、複雑な取り付け化学成分を必要としないことを意味している。未修飾表面上のある比率の生体膜プローブの固定化は、マイクロアレイの物理的安定性にも寄与するであろう。
【００５０】
Ｅ．  −  他のバイオアッセイの実施例
本発明から恩恵を受けるであろう代わりの用途としては、ゲノム研究またはプロテオーム研究いずれかに有用な他のタイプの生物学的結合アッセイが挙げられる。これと他のアレイおよび用途のいくつかの実施例が以下に続く。
【００５１】
前述したように、自動化ハイスループット表面媒介バイオアッセイを実施するために、所定の位置または区域で多孔質基体上に生物学的または化学的プローブ分子が固定化される。基体プレート器具の各ウェルに、標的分子を含有する試料溶液が施される。試料中に存在する標的または分析物がプローブ分子と反応する。一般に、試料中の標的分子または標的分子と共存する参照分子は、光学的に活性な化合物により標識付けられ、その蛍光または発光が、例えば、標的（または参照分子）とプローブとの間の反応中に増加する。それゆえ、試料流体の組成の定性分析および／または定量分析を、ウェルの内容物を照らし、光学的に走査することによって実施できる。
【００５２】
ある実施の形態において、公知の配列を持つ一組のプローブ核酸分子が表面に所定の位置で拘束または固定化されているＤＮＡプローブマイクロアレイが用いられる場合、検出される標的分析物は核酸である。標的配列は、遺伝子、調節塩基配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡとｒＲＮＡを含むＲＮＡなどの一部であってよい。標的配列は、一本鎖形式で使用することが好ましいが、二本鎖構造の標的配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）を、変性後に用いてもよい。標的配列は、蛍光画像化技法を直接用いてプローブのマイクロスポットへの標的配列の結合を検出することができる蛍光染料分子などの検出可能な部分により、またはプローブのマイクロスポットへの標的配列の結合を検出するために、標識抗ビオチンまたは抗ビオチン被覆金ナノ粒子を用いた逐次分析工程が必要とされるビオチン部分により標識付けられていることが好ましい（Bao et al. Anal.Chem.2002,74,1792-1797）。ここで「プローブ核酸」または「プローブ配列」により、公知の配列または所定の配列を持つ核酸配列を意味する。プローブ核酸は、ｃＤＮＡ、所定の配列を持つオリゴヌクレオチド、または所定の配列を持つ修飾オリゴヌクレオチドである。本発明の核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含むが、ある場合には、以下に概説するように、例えば、ホスホラミド（Beaucage, et al., Tetrahedron 1993,49,1925）、ペプチド核酸主鎖および結合（Egholm,J.,Am.Chem.Soc.1992,114, 1895; Neilsen,Nature,1993,365,566）を含む代わりの主鎖を有するであろう核酸類似物が含まれる。当業者には理解されるように、これらの核酸類似物の全ては、本発明に用途が見出されるであろう。
【００５３】
別の実施の形態において、プローブタンパク質マイクロアレイが用いられる場合、標的分析物は製薬化合物またはリガンドである。ここで「標的化合物」または「標的リガンド」は、同定／発生量／結合親和性および特異性を検出すべき、化学的または生化学的または生物学的化合物を意味する。標的化合物は、合成のものであっても、天然に生じるものでも、生物学的に産生されるものであってもよい。標的化合物は、乱用薬物、薬剤候補、化学物質（イオン塩を含む有機または無機化合物）、生化学物質（例えば、合成脂質、オリゴ糖類、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシドなど）、生物学的物質（例えば、天然に生じる脂質、タンパク質、抗原、抗体、成長因子など）であってよい。標的化合物は、活性化剤、阻害剤、エフェクター、結合パートナー、またはプローブタンパク質の酵素基質であってよい。標的化合物は、選択されたまたは無作為な化合物ライブラリの一部であって差し支えない。ここで「プローブタンパク質」または「プローブポリペプチド」は、公知の配列を持つポリペプチドを意味する。プローブタンパク質は、天然の供給源から得ても、必要に応じて、組み換えＤＮＡ法を用いて過剰発現してもよい。プローブタンパク質は、従来の手法を用いて精製しても、未精製（例えば、細胞溶解産物）であってもよい。プローブタンパク質としては、以下に限られないが、細胞内タンパク質、細胞表面タンパク質、可溶性タンパク質、毒素タンパク質、合成ペプチド、生物活性ペプチド、およびタンパク質ドメインが挙げられる。細胞内タンパク質の例としては、以下に限られないが、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、リンタンパク質、および突然変異誘発(mutator)トランスポゾン、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ホメオボックス、ＨＭＧ、ＰＡＸ、ヒストン、ＤＮＡ修復、ｐ５３、ＲｅｃＡ、リボソームタンパク質など）、電子伝達タンパク質（例えば、フラボドキシン）、アダプタータンパク質、イニシエーターカスパーゼ、エフェクターカスパーゼ、炎症性カスパーゼ、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、Ｇタンパク質制御因子(regulator)、小Ｇタンパク質、ミトコンドリア結合タンパク質、ＰＤＺアダプタータンパク質、ＰＩ−４−キナーゼなどが挙げられる。未知の機能の組み換えタンパク質を用いてもよい。適用できる細胞表面タンパク質としては、以下に限られないが、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体など）、Ｇタンパク質、イオンチャンネル（ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムおよびカリウムチャンネルなど）、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体）、免疫受容体、インテグリン、および他の膜結合タンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質またはタンパク質機能ドメインの突然変異株または一時的変異株もしくはそのようなタンパク質の任意の組み換え形態を用いてもよい。毒素タンパク質としては、���下に限られないが、コレラ毒素、破傷風毒素、志賀毒素、易熱性毒素、ボツリヌス毒素ＡおよびＥ、デルタ毒素、百日咳毒素などが挙げられる。毒素ドメインまたはサブユニットを用いてもよい。この実施の形態において、プローブタンパク質マイクロアレイは、小分子結合タンパク質の同定のために用いても（Zhu,H., et al. "Global analysis of protein activities using proeome chips," Science 2001,293,1201-2105）、タンパク質キナーゼの活性を測定するために用いても（Houseman,B.t., Huh,J.H., Fron,S.J., Mrksich,M. "Peptide chips for the quantitative evaluation of protein kinase activity," Nature Biotechnology 2002,20,270-274）、化合物薬理学的プロファイリング（結合親和性、選択性、および特異性）および化合物スクリーニングのために用いても（Fang,Y., et al. "Membrane protein microarrays," J.Am.Chem.Soc.2002,124,2394-2395;およびFang,Y. et al., "Membrane biochips," BioTechniques,2002,33,S62-S65）よい。
【００５４】
さらに別の実施の形態において、標的分析物は、抗原、ホルモン、サイトカイン、免疫抗体、タンパク質、脂質、またはプローブ抗体マイクロアレイが用いられる場合には、未精製細胞溶解産物の混合物である。ここで「標的生物製剤」により、その同一性／発生量が検出される、生きている細胞または細胞小器官または生体流体からの生物製剤を意味する。プローブ抗体としては、以下に限られないが、イムノグロブリン（例えば、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、治療または診断関連抗体（例えば、ヒトアルブミンに対する抗体、アポリポタンパク質Ｅを含むアポリポタンパク質、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、αフェトプロテイン、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、アンチトロンビン、抗癲癇薬（フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン(carbariezepin)、エトスクシミド、バルプロ酸、およびフェノバルビタール）、心臓作用薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド）、気管支拡張薬（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、サルファ剤）、抗鬱薬、免疫抑制剤、乱用薬物（アンファタミン、メタアンフェタミン、カンナビノイド、コカインおよびアヘン剤））、任意のウイルスに対する抗体（例えば、インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ、６およびＣを含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＰウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩを含む）、パポバウイルス（例えば、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルスなど）、および炭疽菌など）に対する抗体、細菌に対する抗体（例えば、バシラス属；ビブリオ属、例えば、コレラ菌；エシェリキア属、例えば、毒素原性大腸菌、赤痢菌、例えば、志賀赤痢菌；サルモネラ属、例えば、チフス菌；ミコバクテリウム属、例えば、ヒト型結核菌、ライ菌；クロストリジウム属、例えば、ボツリヌス菌、破傷風菌、ディフシル菌、ウェルチ菌；コリネバクテリウム属、例えば、ジフテリア菌；連鎖球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎球菌；ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌；ヘモフィルス属、例えば、インフルエンザ菌；ナイセリア属、例えば、髄膜炎菌、淋菌；エルジニア属、例えば、ランブル鞭毛虫ペスト菌；シュードモナス属、例えば、緑膿菌、シュードモナス・プチダ；クラミジア属、例えば、トラコーマクラミジア；ボルデテラ属、例えば、百日咳菌；トレポネーマ属、例えば、梅毒トレポネーマなど含む、関心のある様々な病原性および非病原性原核生物に対する抗体）、細菌毒素に対する抗体（例えば、ジフテリア毒素、炭疽菌毒素、テトロドトキシン���サキシトキシン、バトラコトキシン、グラヤノトキシン、ベラトリジン、アクトニチン(actonitine)、サソリ、イソギンチャク毒液、サソリ毒、デンドロトキシン、ハナトキシン、イソギンチャク毒素、ホロレナ(Holorena)、カルシクルジン(calcicludine)、ブンガロトキシン、コレラ毒素、コナントキンなどに対する抗体）が挙げられる。
【００５５】
別の実施の形態において、プローブ抗体アレイは、タンパク質のプロファイリング、血中のタンパク質の量の測定、サイトカインの量の測定、試料（環境における水、または食品資源）中の細菌毒素の検出、並びに白血球の捕獲／白血病の表現パターンの検査のために用いてよい。これらの標的種は、以下に限られないが、血液、リンパ液、唾液、膣液および肛門液、尿、糞、汗および涙を含む体液、並びに肝臓、脾臓、骨髄、肺、筋肉、脳などを含む固体組織を含むいくつの異なる試料タイプで存在してもよい。代わって、「プローブ」は抗原であっても差し支えなく、この場合、抗原アレイは、自己免疫抗体およびアレルギーを測定するためのリバース・イムノアッセイに用いられるであろう。
【００５６】
別の実施の形態において、オリゴ糖類または多糖類の制限された位置における表面への固定化を含む糖質マイクロアレイが、試料中の糖質結合タンパク質標的を検出するため（Fukui,S., Feizi,T., Galustian,C., Lawson,A.M., and Chai,W. "Oligosaccharide microarrays for high-throughout detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions," Nature Biotechnology,2002,20,1011-1017）、および細菌と宿主細胞の交差反応性分子マーカーを同定するため（Wang,D., Liu,S., Trummer,N.J., Deng,C. and Wang,A., "Carbodydrate microarrays for recognition of cros-reactive molecular markers of microbes and host dells" Nature Biotechnology,2002,20,275-281）、並びに特定のウイルスや細菌や胞子を同定するために用いられる。
【００５７】
本発明を、一般に、また実施例により詳細に説明してきた。当業者には、本発明は、開示された特定の実施の形態に必ずしも限定されるものではないことが理解されよう。現在公知の同等の構成物、または本発明の範囲で使用されるであろうこれから開発される同等の構成物を含む、特許請求の範囲またはその同等物により定義される本発明の範囲から逸脱せずに、改変および変更を行ってもよい。それゆえ、本発明の範囲からそのような変化が逸脱しない限り、それらの変化は、ここに含まれるものと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、９６ウェル（８×１２）を有する、本発明によるプレート１０の実施の形態の概要を示す。
【図２】図２Ａは、ウェルの底部１６の全表面積を実質的に覆う、三次元多孔質層１４がその中で調製され、位置している、図１のプレートのウェル１２をのぞき込んだ図を示す。図２Ｂは、多孔質層が底部支持表面の一部分を形成している、図２Ａのウェルの側面断面図を示す。
【図３】図３ＡおよびＢは、それぞれ、非標識リガンドの存在下および不在下における標識リガンドの「カクテル液」でアッセイされた後の、ＧＰＣＲのマイクロアレイの着色蛍光像である。テレンツピンは、Ｍ１およびＭ２のアンタゴニストであり、一方で、ナルトレキソンは、ＯＰ１のアンタゴニストである。
【図４】図４は、マイクロアレイが、非標識リガンドの存在下（黒いバー）および不在下（白いバー）における標識リガンドのカクテル液でアッセイされた後、マイクロスポットの関数として三種類の受容体の信号強度をグラフで表している。
【図５】図５Ａは、４ｎＭのＣｙ５−ＮＴ２−１３でアッセイした後の、もとのままのシリカベースの多孔質基体上のＮＴＲ１マイクロアレイの着色蛍光像である。対応する結合信号は、総結合信号と称される。図５Ｂは、２μＭの非標識ＮＴの存在下で、４ｎＭのＣｙ５−ＮＴ２−１３でアッセイした後の、第２のＮＴＲ１マイクロアレイの着色蛍光像である。対応する結合信号は、非特異的結合信号と称される。図５Ｃは、図５Ａおよび５Ｂの結果を要約したグラフである。総結合信号および非特異的結合信号が、マイクロスポットの数の関数として表されている。それぞれ４つの複製がある、７つの個々のマイクロアレイの２つのサブセットを分析し、プロットした。
【図６】図６Ａは、４ｎＭのＣｙ５−ＮＴ２−１３でアッセイした後の、もとのままのシリカベースの多孔質基体上のＮＴＲ１マイクロアレイの着色蛍光像である。ＮＴＲ１膜調製は、Ｇαｉタンパク質により修飾した。図６Ｂは、１ｎＭのマウス抗−Ｇαｉにより、続いて１ｎＭのＣｙ５−抗マウスＩｇＧにより連続してアッセイした後の、図６Ａと同じＮＴＲ１マイクロアレイの着色蛍光像である。Ｃｙ５−抗マウスＩｇＧの、マイクロスポットに予め結合したマウス抗−Ｇｉ抗体への結合は、マイクロスポット内の受容体へのＣｙ５−ＮＴ２−１３の結合よりもずっと大きな染色区域を生じた。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、４ｎＭのＣｙ５−ナルトレキソンとインキュベーションした後のもとのままのシリカベースの多孔質基体上のデルタ２オピオイド（ＯＰ１）マイクロアレイのＣｙ３およびＣｙ５の両方のチャンネルにおける着色蛍光像である。ＯＰ１の膜調製物は、０．１％のＣｙ３−標識ＢＳＡを含有する溶液中で修飾されている。Ｃｙ５−ナルトレキソンは、ＯＰ１受容体のアンタゴニストである、ナルトレキソンの蛍光類似物である。これらの結果は、マイクロスポット区域におけるＣｙ３  ＢＳＡの分布（図７Ｂ）は、同じマイクロスポットにおけるＣｙ５−ナルトレキソンのＯＰ１への結合（図７Ａ）よりもずっと大きい染色区域を有することを示している。
【図８】図８は、４０ｎｍの金ナノ粒子とインキュベーションした後のシリカベースの多孔質基体の断面（基体の頂面より２５μｍ下に位置する）の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。この写真から、４つのナノ粒子が観察され、金のナノ粒子が頂面から拡散し、多孔質マトリクスの内部に物理的に捕捉され得ることを示唆している。
【符号の説明】
【００５９】
１０    プレート
１２    ウェル
１４    多孔質層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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