(57)【要約】  本発明は、哺乳動物の組織内の黒色腫、又は他の皮膚癌のような癌を検出する方法に関するものである。本方法は、本発明のパッチを、外部接触可能な組織表面に局所的にあてることを含む。第一のプローブ、又は第二のプローブ、或いはその両方は組織内に組織内に拡散することができ、第一のタンパク質分解酵素、又は第二のタンパク質分解酵素、或いはその両方が存在する場合には、第一のプローブが第一のタンパク質分解酵素と結合し、第二のプローブが第二のタンパク質分解酵素と結合し、結果として、関連ペプチド基質の酵素的切断が生じ、それにより、第一の切断生成物、又は第二の切断生成物、或いはその両方が形成され；次に、適当な検出手段を適用することにより、第一の切断生成物、又は第二の切断生成物、或いはその両方の存在又は不在を検出し、それによって、癌に特有なタンパク質分解作用が示され、それにより癌を検出する。
2007509610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外分泌酵素である第一のタンパク質分解酵素のペプチド基質を含む第一のプローブを含む医薬的に許容される水溶液を含むキャリヤ層であって、
前記第一のタンパク質分解酵素の活性が癌に特異的であり、存在する場合には、前記第一のタンパク質分解酵素による前記ペプチド基質の切断の後、検出可能な第一の切断生成物を形成させるものであり、
前記第一のプローブ及び前記第一の切断生成物に対して透過性である半透性表面を含み、該半透性表面は、前記第一のプローブ及び前記第一の切断生成物が該キャリヤ層の該半透性表面を通って拡散できるように外部接触可能な組織表面と接触するように適合している前記キャリヤ層を含む、
癌を検出するためのパッチ。
【請求項２】
前記ペプチド基質は、前記第一のタンパク質分解酵素のオリゴペプチド基質アナログである
ことを特徴とする、請求項１に記載のパッチ。
【請求項３】
前記第一の切断生成物は、特異的抗体、アプタマー、又はナノ粒子との相互作用により検出可能である
ことを特徴とする、請求項１に記載のパッチ。
【請求項４】
前記第一のプローブは、前記第一のタンパク質分解酵素による前記オリゴペプチド基質アナログの切断の後、検出可能な標識を持つ第一の切断生成物が形成されるように、前記検出可能な標識をさらに含む
ことを特徴とする、請求項１に記載のパッチ。
【請求項５】
前記標識が蛍光色素である
ことを特徴とする、請求項４に記載のパッチ。
【請求項６】
前記標識が放射性同位体である
ことを特徴とする、請求項４に記載のパッチ。
【請求項７】
前記標識が安定同位体である
ことを特徴とする、請求項４に記載のパッチ。
【請求項８】
前記医薬的に許容される水溶液は、細胞外分泌酵素である第二のタンパク質分解酵素のペプチド基質を含む第二のプローブをさらに含み、
存在する場合には、前記第二のタンパク質分解酵素による前記ペプチド基質の切断の後、検出可能な第二の切断生成物が形成され、及び
前記キャリヤ層の前記半透性表面はさらに、前記第二のプローブ及び前記第二の切断生成物に対して透過性である
ことを特徴とする、請求項１に記載のパッチ。
【請求項９】
前記第二のタンパク質分解酵素の前記ペプチド基質は、該第二のタンパク質分解酵素のオリゴペプチド基質アナログである
ことを特徴とする、請求項８に記載のパッチ。
【請求項１０】
前記第二の切断生成物は、特異的抗体、アプタマー、又はナノ粒子との相互作用により検出可能である
ことを特徴とする、請求項８に記載のパッチ。
【請求項１１】
前記第二のプローブは、前記第二のタンパク質分解酵素による前記ペプチド基質の切断の後、検出可能な標識を持つ第二の切断生成物が形成されるように、前記検出可能な標識をさらに含む
ことを特徴とする、請求項８に記載のパッチ。
【請求項１２】
前記標識は蛍光色素である
ことを特徴とする、請求項１１に記載のパッチ。
【請求項１３】
前記標識は放射性同位体である
ことを特徴とする、請求項１１に記載のパッチ。
【請求項１４】
前記標識は安定同位体である
ことを特徴とする、請求項１１に記載のパッチ。
【請求項１５】
皮膚癌に特異的な活性を有する細胞外分泌酵素である第一のタンパク質分解酵素のオリゴペプチド基質アナログを含む分子内消光蛍光原の第一のプローブを含む医薬的に許容される水溶液を含むキャリヤ層
を含み、前記第一のプローブは、前記第一のタンパク質分解酵素の前記オリゴペプチド基質アナログの切断前には蛍光原消光されており、
存在する場合には、前記第一のタンパク質分解酵素による前記オリゴペプチド基質アナログの切断の後、第一の波長で蛍光を発する蛍光性の第一の切断生成物が形成され、及び
前記キャリヤ層は、前記第一のプローブ、及び前記第一の切断生成物に対して透過性である半透性表面を含み、かつ、該半透性表面は、前記第一のプローブ、及び前記第一の切断生成物が該キャリヤ層の該半透性表面を通って拡散できるように、外部接触可能な組織表面と接触することができる
ことを特徴とする、皮膚癌を検出するためのパッチ。
【請求項１６】
前記医薬的に許容される水溶液は、細胞外分泌酵素である第二のタンパク質分解酵素のオリゴペプチド基質アナログを含む分子内消光蛍光原の第二のプローブをさらに含み、
前記第二のタンパク質分解酵素の前記オリゴペプチド基質アナログの切断前には、前記第二のプローブは蛍光原消光されており、
前記第二のタンパク質分解酵素による前記オリゴペプチド基質アナログの分割の後、前記第一の波長とは異なる第二の波長で蛍光を発する蛍光性の第二の切断生成物が形成され、及び
前記キャリヤ層の前記半透性表面はさらに、前記第二のプローブ及び前記第二の切断生成物に対して透過性である
ことを特徴とする、請求項１５に記載のパッチ。
【請求項１７】
前記第一又は第二のタンパク質分解酵素、或いはその両方が、セリンプロテアーゼ、カテプシン、又はメタロプロテイナーゼである
ことを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６のいずれかに記載のパッチ。
【請求項１８】
（Ａ）請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６のいずれかに記載のパッチを、哺乳動物組織の外部接触可能な表面に局所的に当てるステップ、
（Ｂ）第一のプローブ、又は第二のプローブ、或いはその両方を前記組織内に拡散させ、第一のタンパク質分解酵素、又は第二のタンパク質分解酵素、或いはその両方が前記組織内に存在する場合には、前記第一のプローブが前記第一のタンパク質分解酵素に結合し、前記第二のプローブが前記第二のタンパク質分解酵素に結合し、かつ結果として前記ペプチド基質の酵素的切断分割が生じ、それにより、第一の切断生成物、又は第二の切断生成物、或いはその両方が形成されるステップ、及び
（Ｃ）適当な検出手段を適用することによって、前記第一の切断生成物、又は前記第二の切断生成物、或いはその両方の存在又は不在を検出し、それにより、癌に特有なタンパク質分解活性が示され、それによって癌を検出するステップ
を含むことを特徴とする、哺乳動物組織内の癌を検出する方法。
【請求項１９】
（Ａ）請求項１５に記載のパッチを、哺乳動物組織の外部接触可能な表面に局所的に適用するステップ、
（Ｂ）第一のプローブを組織内に拡散させ、第一のタンパク質分解酵素が前記組織内に検出可能に存在する場合には、前記第一のプローブが前記第一のタンパク質分解酵素に結合し、結果としてペプチド基質の酵素的切断分割が生じ、それにより、第一の切断生成物を形成させるステップ、及び
（Ｃ）第一の波長における蛍光の存在又は不在を検出し、それにより、前記第一の波長における蛍光の存在が皮膚癌に特有な前記第一のタンパク質分解酵素の活性を示し、それによって皮膚癌を検出するステップ
を含むことを特徴とする、哺乳動物組織における皮膚癌を検出する方法。
【請求項２０】
前記外部接触可能な表面が粘膜である
ことを特徴とする、請求項１８、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記外部接触可能な表面が表皮である
ことを特徴とする、請求項１８、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が黒色腫である
ことを特徴とする、請求項１８、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一又は第二のタンパク質分解酵素、或いはその両方が、セリンプロテアーゼ、カテプシン、又はメタロプロテイナーゼである
ことを特徴とする、請求項１８、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記パッチに検出手段を適用することにより、前記第一の切断生成物、又は前記第二の切断生成物、或いはその両方の存在又は不在を検出することを実施する
ことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記パッチから前記切断生成物を抽出して抽出物を得て、該抽出物に検出手段を適用すること
をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
蛍光検出手段を前記パッチに適用することにより、蛍光の存在又は不在を検出することを実施する
ことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記切断生成物を前記パッチから抽出して抽出物を得て、該抽出物に蛍光検出手段を適用すること
をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を検出するためのパッチに向けられたものである。本発明はまた、哺乳動物の組織内の黒色腫、又は他の皮膚癌のような癌を検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮、及び皮下組織の３つの層を持つ。皮膚の最上層である表皮は非常に薄く、皮膚のより深い層、及び内部器官を保護する働きをする。表皮自体は、基底細胞から成る上層、中層、及び下層の３つの層を持つ。これらの基底細胞は分裂して、ケラチンを作るケラチン生成細胞（また、扁平上皮細胞とも呼ばれる）を形成する。表皮には、メラニン細胞もまた存在する。これらの細胞は、メラニンと呼ばれる色素を作り出す。メラニンは、皮膚に日焼け色或いは茶色を与え、日光の有害な影響から皮膚のより深い層を保護するのを助ける。細胞外マトリックスから成る基底膜が、皮膚のより深い層から表皮を隔てている。
【０００３】
多数の異なる形式の皮膚癌が存在する。非黒色腫（通常、基底細胞癌、及び扁平上皮細胞癌）が、皮膚の最も一般的な癌である。それらは、メラニン細胞以外の皮膚細胞から生じるので、非黒色腫と呼ばれる。それらは、体内のどこか他の場所に広がることはめったにない。黒色腫は、皮膚のメラニン細胞システムの細胞内で始まる癌であり、黒色腫の転移は一般的である。黒色腫は、皮膚癌のすべてのケースのたったの約４％しか占めないが、それは、皮膚癌関連の死を最も引き起こす。
【０００４】
様々な形の皮膚癌は、細胞外プロテイナーゼの特定のパターンの発現によって特徴付けられる。皮膚癌の分類及び予後のために、ｕ‐ＰＡ、及びｔ‐ＰＡのようなセリンプロテイナーゼの働きを使用した。（Ｍａｇｕｉｒｅ他著,  皮膚の基底細胞腫瘍内の低レベルのウロキナーゼプラスミノゲン活性成分,  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ.８５（４）：４５７−９[２０００]；Ｆｅｒｒｉｅｒ他著,  肢部の初期の黒色腫内の高いｔＰＡの発現は良好な予後と互いに関係がある,  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ.８３（１０）：１３５１−９［２０００］）
【０００５】
皮膚癌において、他のプロテイナーゼの群（マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＭＭＰｓ）の働きの増大もまた示された。基底膜、及び細胞外マトリックスの劣化は、皮膚癌細胞の遊走、浸潤、及び転移形成における必須のステップである。マトリックスメタロプロテイナーゼ、及びそれらの抑制物質は、これらの複雑な複数ステップの過程において、重大な役割を果たす。皮膚癌細胞は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、ＭＴ  Ｉ−ＭＭＰ、及びその他のような多数のマトリックスメタロプロテイナーゼ族のメンバ（Ｄｕｍａｓ他著,  皮膚の基底細胞及び扁平上皮細胞の癌腫における基底膜抗原、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ２及び９の発現,  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９（４Ｂ）：２９２９−３８［１９９９］；Ｗａｌｋｅｒ  ＲＡ,Ｗｏｏｌｌｅｙ  ＤＥ著,  人間の黒色腫におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ１、‐２及び‐３の免疫局在性の研究,  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４３５（６）：５７４−９［１９９９］；Ａｉｒｏｌａ  Ｋ,Ｆｕｓｅｎｉｇ  ＮＥ,  良性及び悪性のケラチン生成細胞におけるＭＭＰ−１発現の示差的間質制御,  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ.１１６（１）：８５−９２［２００１］；Ｂｏｄｅｙ他著,  悪性黒色腫におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの発現：浸潤及び転移における腫瘍の細胞外マトリックスの相互作用,  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ１５（１）：５７−６４［２００１］；Ｋｅｒｋｅｌａ他著,  上皮の皮膚癌におけるストロメライシン‐２（ＭＭＰ‐１０）、及びＭＴ１‐ＭＭＰ（ＭＭＰ‐１４）の発現の示差的パターン,  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ８４（５）：６５９−６９［２００１］；Ｐａｐａｔｈｏｍａ他著,  マウスの皮膚の発癌現象の進行におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ９の役割,  Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ.３１（２）：７４−８２［２００１］）、並びにそれらの組織阻害因子ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、及びＴＩＭＰ−３（検討のため、Ｈｏｆｍａｎｎ他著,  ヒト黒色腫におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ,  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ１１５（３）：３３７−４４［２０００］を参照）を発現する。
【０００６】
特定の皮膚の障害が、特定の細胞外プロテイナーゼのセットを発現するので、それを使用して、皮膚癌のための診断ツールを開発することができる。例えば、米国特許第５,３２４,６３４号は、癌を検出するための、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織抑制物質（ＴＩＭＰｓ）と複合体を形成するＭＭＰｓの生体外免疫検定法を説明している。（Ｚｕｃｋｅｒ著,  進行癌、及び転移癌の検出のためのゼラチナーゼ／阻害因子の複合体を測定するための診断試験,  米国特許第５,３２４,６３４号）
【０００７】
個々の細胞外プロテイナーゼは、固有の基質特異性を持つ。それゆえ、特定の基質を使って、複雑な混合物（例えば、腫瘍のサンプル）内の個々のプロテイナーゼの存在、及び働きを特定することが可能である。多数のこれらの基質は市販されており、それらの多くは蛍光原であって、ペプチドライブラリの選別は、新しく、かつより具体的な基質を特定するのに役立ち得る。（Ｒｏｓｓｅ他著,  コンビナトリアルペプチドライブラリを使った、新奇なプロテアーゼについての基質の高速な識別,  Ｊ  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ２（５）：４６１−６［２０００］；Ｓｈｅｐｐｅｃｋ他著,  プロテアーゼ特異性を測定するための統計的に網羅的な蛍光ペプチド基質ライブラリの合成,  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ１０（２３）：２６３９−４２[２０００]）
【０００８】
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ、又はカテプシンのような細胞外マトリックスの分泌されたタンパク質分解酵素の基質特異性を利用して、癌、特に黒色腫のような皮膚癌の幾つかの形のための高速かつ非侵襲性の診断試験を提供する。
【０００９】
（本発明の要約）
本発明は、癌を検出するためのパッチに向けられたものである。パッチは、必ずしもそうではないが、例えばヒドロゲル、或いは重合又は共重合基質内に保持、又は収容され得る医薬的に許容された水溶液を含むキャリヤ層を含む。キャリヤ層は、対象の第一（第二、第三、又はそれに続く）のタンパク質分解酵素のペプチド基質を含む第一のプローブ（又は、更なる第二、第三、又はそれに続く様々なプローブ）を含む。このタンパク質分解酵素は、細胞外分泌酵素であり、その働きは、例えば、黒色腫他のような皮膚癌といった癌に特有なものである。キャリヤ層は半透過性表面を含み、この反透過性表面は、皮膚、唇、鼻孔の内部、又は粘膜（例えば、口、のど、洞、直腸、又は膣の粘膜）のような外部接触可能な組織表面と局所的に接触するように適合したものである。プローブは、そのキャリヤ層の半透性表面を通って拡散することができる。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に、タンパク質分解酵素が存在し、接触媒的に活性である場合には、ペプチド基質は切断されて、検出可能な第一（又は、第二、第三、或いはそれに続く）の切断生成物を作り出し、次にそれは、それに対して透過性である半透性表面を通ってパッチ内に拡散し戻る。切断生成物の検出は、組織内の癌の存在を示している。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物の組織内の黒色腫、又は他の皮膚癌のような癌を検出する方法に関するものである。本方法は、本発明のパッチを、外部接触可能な組織表面に局所的にあてることを含む。そのような外部接触可能な組織表面は、皮膚、唇、鼻孔の内部、又は粘膜（例えば、口、のど、洞、直腸、又は膣の粘膜）を含む。第一のプローブ、又は第二のプローブ、或いはその両方は組織内に拡散することができ、第一のタンパク質分解酵素、又は第二のタンパク質分解酵素、或いはその両方が前記組織内に存在する場合には、第一のプローブが第一のタンパク質分解酵素と結合し、第二のプローブが第二のタンパク質分解酵素と結合し、結果として、関連ペプチド基質の酵素的切断が生じ、それにより、第一の切断生成物、又は第二の切断生成物、或いはその両方が形成される；次に、適当な検出手段を適用することにより、第一の切断生成物、又は第二の切断生成物、或いはその両方の存在又は不在を検出し、それによって、癌に特有なタンパク質分解作用が示され、それにより癌を検出する。いずれかの適切な手段によりパッチ内の切断生成物を直接に、或いはそのかわりに、切断生成物の検出のために、切断生成物を初めにパッチから抽出してる、、切断生成物の検出、及び定量化を行うことができる。
【００１１】
本発明のパッチ及び方法、及びその実施形態を、以下で詳細にさらに説明するが、これは、癌、特に黒色腫のような皮膚癌の非侵襲性かつ高速な診断に備えるものである。
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
キャリヤ層を含む本発明のパッチは、任意の適当なパッチ技術を用いることができる。例えば、パッチは、基質形式の経皮性、或いは経粘膜性のパッチとすることができる（例えば、Ｃｈｉｅｎ他著,  米国特許第４,９０６,１６９号及び第５,０２３,０８４号；Ｃｌｅａｒｙ他著,  米国特許第４,９１１,９１６号；Ｔｅｉｌｌａｕｄ他著,  米国特許第５,６０５,７０２号；Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒａｎ他著,  米国特許第５,７８３,２０８号；Ｅｂｅｒｔ他著,  米国特許第５,４６０,８２０号；Ｅｂｅｒｔ他著,  粘着性の上張り、及び剥離封止ディスクを持つ経皮性デリバリーシステム,  米国特許第５,６６２,９２５号；Ｃｈａｎｇ他著,  皮膚又は粘膜に対する活性因子を管理するための装置,  米国特許第４,８４９,２２４号、及び第４,９８３,３９５号）。パッチの基質は、アクリル、又はエチレン／ビニルアセテート共重合体、又はポリエチレン発泡体、又はセルロース物質のような重合体、又は共重合体の基底支持層を含むことができる。
【００１３】
特に経粘膜的な使用例に向けられた本発明の実施形態により、医薬的に許容される様々な経粘膜性パッチシステムが、この技術分野で既知であり、役立っている。例として、例えば粘着層、裏当て層、水溶液を収容する貯蔵器を定める浸透膜、その膜の下にある剥離封止ディスク、一又はそれ以上のヒートシール、及び取り外し可能な解放ライナの積層複合物を含む、経粘膜性パッチシステム（Ｅｂｅｒｔ他著,  粘着性上張り、及び剥離封止ディスクを持つ経皮性キャリヤシステム,  米国特許第５,６６２,９２５号、Ｃｈａｎｇ他著,  皮膚又は粘膜に対する活性因子を管理するための装置,  米国特許第４,８４９,２２４号及び第４,９８３,３９５号）。幾つかの有用な経粘膜性システムは、浸透促進剤とともに、非イオン洗剤を用いる。
【００１４】
本発明に適用可能なこれらの有用なパッチ技術の例は、単に例証に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００１５】
本発明のパッチの幾つかの実施形態では、キャリヤ層はまた、そのキャリヤ層の半透性表面を超えた基質及び生成物の移送を促進、及び／又は高めることのできるペプチド安定剤及び／又は化合物を含む。浸透促進剤の例は、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、Ｎ‐メチル‐２‐ピロリドン、Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ピロリドン、又は３‐ヒドロキシ‐Ｎ‐メチル‐２‐ピロリドン、胆汁塩又はフシデート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、ペクチン、ポリビニルピロリドン、でんぷん、ゼラチン、或いはこの目的のために有用と知られる多数の他のポリマのいずれかのような親水性ポリマのような浸透、又は浸入促進剤を含むが、それらに限定されない。
【００１６】
本発明のパッチは、使用の間、医薬的に許容された水溶液を乾燥させないようにする気密及び液密の外部層、又は膜を含むことが好ましい。この外部層は、外部接触可能な組織表面と接している半透性表面と反対側にある。
【００１７】
本発明のパッチの幾つかの実施形態は、パッチを表皮、又は粘膜のような外部接触可能な組織表面に接着するためのポリシロキサン等のような接着剤を含む粘着層、をさらに含む。そのかわりに、パッチを、（例えば、接着剤、ガーゼ、又は他の形式のバンデージのような）上に重ねたバンデージ、又は所定の時間の間、キャリヤ層の半透性表面を組織表面と接触させたまま保つようにされた適当な圧力装置又は手段によって、外部接触可能な組織表面と接触させ、所定の位置に保持することができる。
【００１８】
他の実施形態は、裏当て層、又は使用の前の保管の間のパッチの運用性を保つ剥離可能なシール或いはライナを含む特徴を含む。また、医薬的に許容される水溶液、又は重合体或いは共重合体基質内に、細菌発育阻止剤を含めることもできる。
【００１９】
本発明のパッチにより、キャリヤ層は、対象のタンパク質分解酵素の一又は複数のペプチド基質を含む一又はそれ以上の特定のプローブを含む医薬的に許容される水溶液を含む。本発明により、パッチのキャリヤ層は、対象の第一、第二、第三、又はそれに続く異なるタンパク質分解酵素をターゲットにするための、第一、第二、第三、又はそれに続く異なるプローブを含むことができる。そのペプチド基質は、対象のタンパク質分解酵素のオリゴペプチド基質アナログであることが好ましいが、必須ではない。対象の第一、第二、又は後に続くタンパク質分解酵素は、例えば、セリンプロテアーゼ、カテプシン、又はメタロプロテイナーゼとすることができる。
【００２０】
幾つかの好ましい実施形態では、医薬的に許容される水溶液中に、プローブを溶かすことができる。これらの実施形態では、プローブは、半透膜を通って、組織内に自由に拡散することができる。
【００２１】
他の実施形態では、プローブは、キャリヤ層内の重合又は共重合基質について複合体を形成し、及び、存在する場合には、パッチ内に拡散して、プローブと反応し、本発明による検出可能な切断生成物の生成という結果となり得る対象の第一（第二、第三、又はそれに続く）のタンパク質分解酵素に対して、半透膜は透過性である。
【００２２】
皮膚癌のような癌を検出する本発明のパッチ、及び方法の幾つかの実施形態では、特異的抗体又はアプタマーとの相互作用により、或いは特に対象の切断生成物を結びつける検出可能なナノ粒子のような他の反応物との分子相互作用により、切断生成物は検出可能である（例えば、Ｎａｍ  ＪＭ,  Ｔｈａｘｔｏｎ  ＣＳ,  Ｍｉｒｋｉｎ  ＣＡ著,  タンパク質の超高感度検出のためのナノ粒子ベースの生物バーコード,  Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１（５６４１）：１８８４−６[２００３]；Ｃｏｇｎｅｔ  Ｌ,  Ｔａｒｄｉｎ  Ｃ,  Ｂｏｙｅｒ  Ｄ,  Ｃｈｏｑｕｅｔ  Ｄ,  Ｔａｍａｒａｔ  Ｐ,  Ｌｏｕｎｉｓ  Ｂ著,  細胞内のタンパク質検出のための単一金属ナノ粒子の画像化,  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ.２００３  Ｓｅｐ  ３０；１００（２０）：１１３５０−１１３５５［２００３］）。
【００２３】
「アプタマー」(aptamer)は、タンパク質、又は代謝産物のような特定の分子ターゲットに結合する、例えばＤＮＡ、又はＲＮＡ分子のようなオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、既知の手法により合成することができ、市販されている（例えば、Ｈａｍａｇｕｃｈｉ,Ｎ他著,  タンパク質の検出のためのアプタマービーコン,  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９４：１２６−１３１［２００１］）。
【００２４】
「抗体」は、対象とする特異的なターゲット結合能力を有する抗体全体および抗体断片、すなわち抗原特異的、又はハプテン特異的な標的化リガンドを含む。抗体断片は、例えばＦａｂ,  Ｆａｂ’,  Ｆ（ａｂ’）2,  Ｆ（ｖ）断片を含む。また、抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とすることができる。抗体はまた、リンカ部分によってキャリヤ分子にと複合体を形成した抗原特異的、又はハプテン特異的な標的化リガンドも含む。
【００２５】
本発明のパッチ及び方法の他の実施形態では、プローブは、対象のタンパク質分解酵素によるオリゴペプチド基質アナログの切断の後、検出可能な標識を持つ切断生成物を形成するように、検出可能な標識をさらに含む。これらの実施形態により、基質の構造内の代謝に適当な位置、すなわち酵素的切断により同位体標識が切断生成物中で捕捉されるという結果を生じる位置に標識が置かれた状態で基質が合成される限り、標識は、蛍光色素、放射性同位体、又は安定（すなわち、非放射性）同位体とすることができるが、それらに限られない。
【００２６】
有用なことに、蛍光色素は、分子内消光蛍光プローブ内に含まれることができる。本発明を実践するのに役立つ分子内消光蛍光プローブ、及び蛍光検出を作り出す方法は、既知である（例えば、Ｗｅｉｓｓｉｅｄｅｒ他著,  分子内消光近赤外蛍光プローブ,  米国特許第６,０８３,４８６号；Ｂｅｅｋｍａｎ,Ｂ他著,  マトリックスメタロプロテイナーゼの活性の便宜的な蛍光定量法、及び生物学媒体におけるその使用例,  １９９６.ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ３９０：２２１［１９９６］；Ｂｅｅｋｍａｎ  Ｂ他著,  選択的な蛍光原定量法によって特定されるリウマチ滑液流体内の活性スストロメライシンのレベルの大きな増大,  １９９７.ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ４１６：３０５［１９９７］；Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ  Ｖ,  Ｂｒａｍｅｒ  Ｃ,  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ,Ｒ著,  近赤外光による蛍光画像化：生体内分子画像化を可能にする新しい技術の進歩,  Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ  １３：１９５−２０８［２００３］；Ｍａｈｍｏｏｄ  Ｕ,  Ｔｕｎｇ  ＣＨ,  Ｂｏｇｄａｎｏｖ  Ａ  Ｊｒ,  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ著,  腫瘍検出のためのプロテアーゼの活性の近赤外光画像化,  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２１３（３）：８６６−７０［１９９９］；Ｂｒｅｍｅｒ  Ｃ,  Ｂｒｅｄｏｗ  Ｓ,  Ｍａｈｍｏｏｄ  Ｕ,  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ,  Ｔｕｎｇ  ＣＨ著,  腫瘍内のマトリックスメタロプロテイナーゼ２の活性の光学画像化：マウスモデルにおける実現可能性の検討,  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２１（２）：５２３−９［２００１］；Ｂｒｅｍｅｒ  Ｃ,  Ｔｕｎｇ  ＣＨ,  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ著,  マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害の生体内分子標的評価,  Ｎａｔ  Ｍｅｄ.７（６）：７４３−８,  Ｃｏｍｍｅｎｔ  ｏｎ  ６５５−６［２００１］；Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ  Ｖ,  Ｔｕｎｇ  ＣＨ,  Ｂｒｅｍｅｒ  Ｃ,  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ著,  蛍光分子トモグラフィが生体内のプロテアーゼの活性を解明する,  Ｎａｒ  Ｍｅｄ８（７）：７５７−６０［２００２］；Ｔｕｎｇ  ＣＨ,  Ｍａｈｍｏｏｄ  Ｕ,  Ｂｒｅｄｏｗ  Ｓ,  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ著,  新奇の分子レポータを使用したタンパク質分解酵素の活性の生体内画像化,  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６０（１７）：４９５３−８［２０００］；Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ  Ｏ,  Ｌｕｃａｒｉｎｉ  Ｇ,  Ｂｒａｎｃｏｒｓｉｎｉ  Ｄ,  Ｎｉｔａ  Ｐ,  Ｂｅｒｎａｅｄｉｎｌ  ＭＬ,  Ｂｉａｇｎｉｌ  Ｇ,  Ｏｆｆｉｄａｎｉ  Ａ著,  皮膚のメラニン細胞の傷害における血管内皮成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ９の免疫組織化学的発現,  Ｃａｎｃｅｒ９５（９）：１９６３−７０［２００２］）。また、本発明の方法により、酵素「フィンガープリント」、又は特定の腫瘍型のプロファイルを得ることもできる。
【００２７】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、第一の切断生成物、又は第二の切断生成物、或いはその両方の存在、又は不在を検出することは、パッチに検出手段（例えば、蛍光、放射線、核磁気共鳴、免疫又はその他の検出手段）を直接適用することによって実施される。他の実施形態では、切断生成物をパッチから抽出して抽出物を得て、適当な検出手段をその抽出物に適用する。
【００２８】
蛍光の存在（又は不在）を検出するための適当な方法は、蛍光検出手段による分光蛍光測定、蛍光共鳴エネルギー移送（ＦＲＥＴ）、及びキャピラリー電気泳動を含むが、それらに限定されない。パッチ自身内の生成物の直接検出は、パッチの照明、及び裸眼、又はパッチ内で使用される蛍光原基質の光学特性に依って、通常光、赤外光、近赤外光、及び／又は紫外光を利用した光学装置のアレイを使用することによる放射光の検出により、遂行できる。
【００２９】
有用な放射性同位体標識は、35Ｓ、14Ｃ、又は3Ｈ等を含むが、それらは、適当な放射線検出手段を使用して検出可能である。そのかわりに、13Ｃ、2Ｈ、17Ｏ、又は18Ｏ等のような安定同位体を、標識として用いることもできる。安定同位体の検出は、典型的には、質量分光法、又は核磁気共鳴のような手法で遂行することができる。
【００３０】
腫瘍の酵素フィンガープリントを得るために、一より多くの異なる標識を付した基質を使用しなければならない。例えば、各々が異なるプロテイナーゼに特異的であり、かつ各々が異なる蛍光色素で標識された、二又はそれ以上の基質を用いることができる。例えば、スペクトル（例えば、蛍光）特性、又は同位体特性のような、それらの異なる特性に基づいて、異なる標識を持つ切断生成物を特定する。
【００３１】
本発明の方法により、対象のタンパク質分解酵素が存在する場合には、検出可能な量の切断生成物がパッチ内に拡散するのに充分な時間の間、パッチの半透性表面を、外部接触可能な組織表面と接触させたままに保持する。この期間は、部分的には、用いられる検出手段に依存している。例えば、識別用放射性同位元素を用いることは、典型的には、切断生成物の抗体ベースの検出を用いるより高い感度を提供することができる。一般的には、約１５分から約３０分の期間が好ましいが、約１時間から約２時間、或いはそれ以上のより長い期間を用いることもできる。
【００３２】
本出願で引用された全ての参考文献は、それら全体が引用により組み入れられる。
【００３３】
本発明をその好ましい実施形態について説明する一方で、当業者は、本出願で開示される方法及び構成の厳密な例から離れるが、それにもかかわらず本発明を具現化する変形を作ることができることがわかるであろう。
【実施例】
【００３４】
例１．  セルロース膜パッチを使用したタンパク質分解の蛍光生成物の検出
【００３５】
実験を実施して、蛍光原ペプチド基質がセルロースパッチからＭＭＰ源へ拡散し、かつ酵素反応の蛍光生成物がパッチへ拡散し戻り、紫外（ＵＶ）光を使って検出することができることを実証した。
【００３６】
２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．６、２，５ｍＭのＺｎＳＯ4、及び５ｍＭのＣａＣｌ2内の電気泳動等級の寒天（シグマ粒子）を溶かし、６０ｍｍのペトリ皿に注ぎ込む。次に、０．５マイクロリットルの活性ＭＭＰ２、及びＭＭＰ６（濃度０．００１マイクログラム／マイクロリットル,Oncogene Research Products社）を、寒天内（表面下０、２、及び５ｍｍ）に注入する。酵素を含まない緩衝液を、対照として使用した。注入部位を、予めＭＭＰに対して高い親和性の蛍光原基質（10-5MのDABCYL-GABA-Pro-Gin-Gly-Leu-Glu(EDANS)-Ala-Lys-NH2［配列番号１］；タンパク質分解生成物について、励起最大値λ＝340nmおよび放射最大値λ＝485nm；Calbiochem社、カタログ第444256、および／または、DABCYL-GABA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu(EDANS)-Ala-Lys-NH[配列番号２]、Nva＝ノルバリン；タンパク質分解生成物については励起最大値λ＝360nm、放射最大値λ＝490NM；Calbiochem社、カタログ第444257）の溶液内に浸しておいたセルロース膜パッチで被覆した。３０、６０、及び１２０分後に、膜パッチを取り除いて、、励起最大値３４０〜３６０ｎｍ、及び放射最大値４６０〜４９０ｎｍを持つ「ＤＡＰＩ」フィルタを使用した蛍光顕微鏡で観察することにより、蛍光を半定量的に分析した。実験状況のもとで、蛍光はパッチ内で検出されたが、対照実験では検出されなかった。表１に示すように、関連する蛍光は、寒天表面におけるパッチからの基質の距離とインキュベーション時間と間接的に相関しており、これは切断生成物のパッチ内への拡散と合致している。
【００３７】
表１．  蛍光原基質のタンパク質分解生成物の蛍光強度への拡散の効果（＋＝非常に弱いシグナル；＋＋＝弱いシグナル；＋＋＋＝よく検出されたシグナル；＋＋＋＋＝強いシグナル；＋＋＋＋＋＝非常に強いシグナル）
表１
2007509610.tif 000003
【００３８】
例２.  「パッチ手法」を使用した、ヒト黒色腫細胞のアガロースサンドイッチ培養における細胞外マトリックス内のタンパク質分解の蛍光生成物の検出
【００３９】
実験を実施して、パッチ手法を使用して、ヒト黒色腫の培養におけるＭＭＰの活性を検出できることを実証した。全てのin vitro実験を３回行い、最低でも２回繰り返した。
【００４０】
ヒト黒色腫細胞株ＳＫ‐ＭＥＬ‐２８、及びＷＭ  ２６６‐４、及びマウスの黒色腫細胞株Ｂ１６を、アメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、ＡＴＣＣの推奨（ＤＭＥＭ,  １０％  ＦＣＳ,  ペニシリン＋ストレプトマイシン）に従って培養した。実験室における２回の継代の後、細胞を実験に使用した。これらの実験において、６０ｍｍペトリ皿内のコンフルエント培養物を使用した。液体培地を取り除き、ＤＭＥＭ中に低融解温度のアガロース（シグマ体、細胞培養グレード）で置き換えた。（ほぼ１〜２ｍｍの厚さの）ゲルを形成させた後、実験１で説明したように、ＭＭＰについて高親和性の蛍光原基質の溶液内に前もって浸されたセルロース膜をゲル上に置いた。３０、６０、１２０、及び３６０分後に、膜を取り出して、例１に記載したように蛍光を分析した。１２０、及び３６０分間寒天と接触させたパッチにおいて蛍光が検出されたが、対照実験では検出されなかった。
【００４１】
例３．  黒色腫のマウスモデルにおけるＭＭＰ活性のin vivo検出
【００４２】
実験を実施して、本発明の方法を使用して、黒色腫の動物モデルにおいてin vivoでのＭＭＰの働きを検出できることを実証した。
【００４３】
マウスの黒色腫細胞株Ｂ１６を使用した。上で説明するように、Ｂ１６細胞を培養及び継代した。全部で５ｘ１０6個の細胞を、３匹の同系交配Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウスの左右の肢内の皮下又は皮内に注入した。注入して４日後、黒色腫病巣が非常に大きく（直径約３〜５ｍｍ）なった時、その動物を犠牲にして、隣接する無傷の皮膚と共に黒色腫を取り出した。例１で説明したように、ＭＭＰについて高親和性の蛍光原基質の溶液に前もって浸したセルロース膜パッチを、取り出した試験体の外部表面上に置いて、その膜パッチを対象の時間の間皮膚に付着させるため、その膜を粘着性のバンデージで覆た。例１で説明するように、６０及び１２０分後に、その膜パッチを取り出して、蛍光を分析した。６０分又は１２０分のいずれかの間、黒色腫の腫瘍と接触させたパッチにおいて蛍光が検出されたが、蛍光原基質のない対照実験では検出されなかった。
【００４４】
他の実験では、上で説明したように、マウスの黒色腫細胞株Ｂ１６を培養して、ほぼ５x１０6個の細胞を、３匹のＣ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウスの左右の肢内の皮下又は皮内に注入した。４日後、黒色腫が直径ほぼ２ｍｍである時、例１で説明したように、膜パッチを黒色腫を呈する皮膚の上に直接置き、上で説明するように粘着性のバンデージで貼った。９０分後、パッチを取り除いて、蛍光を分析した。黒色腫の全ての場合において、ＵＶ光を使って、蛍光シグナルを可視化した。
【００４５】
さらに他の実施形態では、ＡＴＣＣの推奨（ＤＭＥＭ,  １０％ＦＣＳ,  ペニシリン／ストレプトマイシン）に従って、ヒト黒色腫細胞株ＳＫ‐ＭＥＬ‐２８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ‐７２）、及びＷＭ２６６‐４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１６７６）を培養した。５x１０6個の細胞（両方の細胞系の１：１の混合物）を、２匹のＨｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ‐ｎｕマウスの左右の肢内の皮下又は皮内に注入した。腫瘍は動きやすく（すなわち、腫瘍は緊密な細胞塊を形成し、表皮及び筋肉に浸潤していない）、無傷の表皮で完全に覆われていた。
【００４６】
例１で説明するようなセルロース膜パッチを、黒色腫腫瘍を持つ皮膚上に置いた。対照実験では、蛍光原ＭＭＰ基質を装填したパッチを、無傷の（生きている）マウスの皮膚にあてた。７０分後、パッチを取り出し、ＵＶ光を使って蛍光シグナルを可視化した。皮膚の黒色腫を覆ったパッチにおいて、タンパク質分解の蛍光生成物が検出された。これに対して、健康な皮膚にあてた試験パッチはまったく蛍光を示さなかった。
【００４７】
例４  人間における黒色腫、及び非悪性病巣のパッチ分析
【００４８】
研究は、７人の黒色腫の患者、及び６人の非悪性病巣を持つ患者を含んだ。パッチ分析を使用して、黒色腫、及び非悪性病巣における蛍光原ペプチドを使用したＭＰＰのタンパク質分解活性を比較した。
【００４９】
材料
【００５０】
パッチ：セルロース膜
【００５１】
ペプチド：２つのペプチドの混合物
【００５２】
１．DABCYL-GABA-Pro-GLN-Gly-Leu-Glu(EDANS)-Ala-Lys-NH（Calbiochem社）  −  使用前に、２０ｍＭのトリス緩衝液,  ｐＨ７．６,  ２．５ｍＭのＺｎＳＯ4及び５ｍＭのＣａＣｌ2における１０-5Ｍのペプチドの溶液内に、膜を浸けた。
【００５３】
２．DABCYL-GABA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg--Glu(EDANS)-Ala-Lys-NH（Calbiochem社）  −  使用前に、２０ｍＭのトリス緩衝液,  ｐＨ７．６,  ２．５ｍＭのＺｎＳＯ4及び５ｍＭのＣａＣｌ2における１０-5のペプチドの溶液内に、膜を浸けた。
【００５４】
パッチ  −  １００μｌのペプチド混合物を加えた１ｃｍ2のセルロース膜。病巣の外科的除去の前に、２時間の間、皮膚の上にあてる。全ての病巣は腕上にあった。セルロース膜をバンドエイドで固定した。
【００５５】
除去の後即座に、ＵＶ光のもとでパッチを観測して、次に、続いて２０ｍＭの緩衝液,ｐＨ７．６を使ってペプチドを抽出した。１ｍｌの緩衝液内にパッチを１時間定温放置した後、蛍光を測定した。
【００５６】
結果表２
【００５７】
７人の黒色腫患者のうちの５人が、パッチ内に検出可能な蛍光シグナルを持ち、これに対して、非悪性皮膚病巣を持つ６人の患者のうちの５人において、シグナルが検出不可能であったことを、結果の分析は示した。
表２
2007509610.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】黒色腫のような皮膚癌を検出するための本発明のパッチの実施形態の概略図を示している。
【図１】
2007509610.tif 000005
【国際調査報告】
2007509610.tif 000006
2007509610.tif 000007
2007509610.tif 000008