(57)【要約】  本発明は、キシロースを製造するための２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の酵素的脱炭酸に関する。本発明はまた、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼを使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ（細胞内）でキシロースを検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ケト−Ｌ−グロン（２−ＫＬＧ）酸から、キシロースへの酵素的脱炭酸を含むキシロースの製造方法。
【請求項２】
前記２−ＫＬＧが、ピルビン酸デカルボキシラーゼを用いて脱炭酸される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キシロースを濃縮する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、植物、酵母、真菌、または細菌から得られる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモバクター・パルマエ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅから得られるものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キシロースを還元してキシリトールを形成する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キシロースが、化学的に還元されてキシリトールを形成する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キシロースが、微生物的に還元されてキシリトールを形成する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、プロモーターおよび転写終結配列に操作可能に連結されたピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞から調製される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする前記核酸配列が、植物、酵母、真菌、および細菌からなる群から選択される生物に由来する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が、ザイモバクター・パルマエに由来する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラジリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、デスルホモナス属（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎａｓ）、ゲオスピリルム属（Ｇｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スクシノモナス属（Ｓｕｃｃｉｎｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ハロクロマチウム属（Ｈａｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、フィブロバクター属（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシドバクター属（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、スルホバチルス属（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、アナエロバクター属（Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、テルモビフィダ属（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、サルシナ属（Ｓａｒｃｉｎａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉａ）、リゾープス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび２−ＫＬＧを含む混合物中、２−ＫＬＧをキシロースに変換する工程；および
ｂ）前記キシロースを精製する工程、を含む無細胞系でキシロースを製造する方法。
【請求項１５】
前記混合物が、ｐＨを約５から約８までに維持するための緩衝剤をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合物が、ｐＨを約６から約７までに維持するための緩衝剤をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物が、ｐＨを約６から約８までに維持するための緩衝剤をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合物が、ｐＨを約６．５から約７．５までに維持するための緩衝剤をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記混合物が、ｐＨを約５．７５に維持するための緩衝剤をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、植物、酵母、真菌、または細菌から得られる請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモバクター・パルマエから得られるものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記２−ＫＬＧが、精製された形態である請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記無細胞系が、ピルビン酸デカルボキシラーゼを含有する細胞ライセートを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞ライセートが、グルコノバクター属、リゾビウム属、ブラジリゾビウム属、アルカリゲネス属、ロドバクター属、ロドコッカス属、アゾスピリルム属、ロドスピリルム属、スフィンゴモナス属、バークホルデリア属、デスルホモナス属、ゲオスピリルム属、スクシノモナス属、アエロモナス属、シェワネラ属、ハロクロマチウム属、シトロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、ジモモナス属、ザイモバクター属、フィブロバクター属、アシドバクター属、バクテロイデス属、スフィンゴバクテリウム属、アクチノミセス属、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属、プロピオニバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属、バチルス属、ゲオバチルス属、パエニバチルス属、スルホバチルス属、クロストリジウム属、アナエロバクター属、ユーバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、テルモビフィダ属、セルロモナス属、サルシナ属、アセトバクター属、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ピチア属、ジゴサッカロミセス属、ストレプトミセス属、カンジダ属、リゾープス属、およびアスペルギルス属からなる群から選択された生物の細胞培養物に由来する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞ライセートが、大腸菌細胞培養物に由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
キシロースをキシリトールに化学的に還元する工程をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）宿主細胞を用いてピルビン酸デカルボキシラーゼを生産する工程、
ｂ）ｉ）Ｄ−グルコースまたはＬ−ソルボースから２−ＫＬＧを製造する微生物を培養する工程、および
ｉｉ）蓄積された２−ＫＬＧを単離する工程、を含むＤ−グルコースまたはＬ−ソルボースから２−ＫＬＧを製造する工程、
ｃ）前記２−ＫＬＧと前記ピルビン酸デカルボキシラーゼとを接触させ、キシロースを製造する工程、を含むキシロースの製造方法。
【請求項２８】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、植物、酵母、真菌、または細菌から得られる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモバクター・パルマエから得られるものである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、グルコノバクター属、リゾビウム属、ブラジリゾビウム属、アルカリゲネス属、ロドバクター属、ロドコッカス属、アゾスピリルム属、ロドスピリルム属、スフィンゴモナス属、バークホルデリア属、デスルホモナス属、ゲオスピリルム属、スクシノモナス属、アエロモナス属、シェワネラ属、ハロクロマチウム属、シトロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、ジモモナス属、ザイモバクター属、フィブロバクター属、アシドバクター属、バクテロイデス属、スフィンゴバクテリウム属、アクチノミセス属、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属、プロピオニバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属、バチルス属、ゲオバチルス属、パエニバチルス属、スルホバチルス属、クロストリジウム属、アナエロバクター属、ユーバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、テルモビフィダ属、セルロモナス属、サルシナ属、アセトバクター属、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ピチア属、ジゴサッカロミセス属、ストレプトミセス属、カンジダ属、リゾープス属、およびアスペルギルス属からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、大腸菌である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
２−ＫＬＧを生産する前記微生物が、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７またはＮＲＲＬ  Ｂ−２１６３０からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記キシロースが、キシリトールに化学的に還元される請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）ＮＡＤ＋の存在下、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼとＬ−キシロースとを接触させる工程；および
ｂ）ＮＡＤＨを測定する工程、
を含むキシロースの製造を測定する方法。
【請求項３５】
ＮＡＤＨが、３４０ｎｍで分光光度計により測定される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼが、オクロバクトラム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）に由来する請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、キシロースを製造するための新規な酵素的方法およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでキシロースを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
キシロースは、五炭糖である。Ｄ−キシロースは、主として植物および動物に見られる形態である。キシロースは、添加物として；食品として；キシリトールの前駆体として；甘味剤として；糖尿病患者用のグルコース代替物として（キシロースは、グルコースのようなインスリン応答を引き起こさない）；肝炎患者のトランスアミナーゼおよびケトンレベル減少、結合組織障害および変形性関節症の治療剤として；および染色、なめし、フルフラール製造、塗料、酢酸製造、乳酸製造、生分解性プラスチックポリマー製造、糊、樹脂、ビタミンＣ製造、およびエタノール燃料製造などの産業利用のために有用であることが認められている。
【０００３】
キシロースは、ヘミセルロースの主要成分である。ヘミセルロースは、植物、例えば、飼料植物、木本植物、樹皮、ブナ、トウモロコシ皮、エンバク殻、中空茎、コーヒー残渣、ストロー、およびバルク植物産物に見られるリグノセルロースの成分である。キシロースは、酢酸または硫酸を用いる酸加水分解により良好な収率で農業廃棄物および硬木から回収できる。しかしながら、キシロースと同じ調製法におけるヘミセルロースの酸加水分解は、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、およびグルコースなど、多くの六炭糖類および五炭糖類が種々の量で存在する結果となる。
【０００４】
しかしながら、リグノセルロースの酸加水分解は、Ｄ糖およびＬ糖の混合物などの種々の糖類、ならびに他のものの中でフルフラール類、酢酸、ヒドロキシ安息香酸およびバニリンを遊離させる。したがって、バルク植物産物あるいはヘミセルロース源またはリグノセルロース源からのキシロース処理は、酸加水分解による多くの産物が存在するという不利を被り、これら副産物からのキシロースの抽出には費用がかかる。これらの副産物の幾つか、特にフルフラール類は、微生物の増殖を阻害する。したがって、キシロース製造のためにヘミセルロース源またはリグノセルロース源を用いる１つの不利な点は、ヘミセルロースまたはリグノセルロースの酸加水分解により生成する多くの産物が、微生物代謝および引き続く糖類の利用を阻害することである（Ｏｏｉら、「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．」１（３）、（２００２年））。多数の副産物のため、キシロース産物のさらなる精製が必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、副産物の生成をより少なくする、キシロース製造法の改良に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な要約
１つの改良方法は、費用効率が高い方法でのキシロースの調製を提供することである。該方法は、２−ＫＬＧのキシロースへの酵素的変換を含む。本発明の第１の態様は、キシロースを製造する方法に関する。本発明の方法によれば、Ｌ−キシロースは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）を用いる２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の酵素的脱炭酸により製造され、ＰＤＣは、基質として２−ＫＬＧを受け入れ、このような脱炭酸の結果、生成物としてＬ−キシロースを生成する。この反応の基質である２−ＫＬＧは、純粋であるか、または混合物、例えば、発酵混合物の一部であり得る。製造されるＬ−キシロースは、直接使用できるか、または他の産物、例えば、商業的により価値の高い産物であるキシリトールを製造するために利用でき、キシリトールは、例えば、キシロースの化学的還元により製造できる。
【０００７】
本発明の第２の態様は、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いてキシロースを検出する方法に関する。
【０００８】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は双方とも、単に例示的な説明であり、請求項に記載された本願発明のさらなる説明を提供することが意図されていることを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
種々の基質をキシロースへ変換する方法がここで提供される。本発明の一態様において、２−ＫＬＧは、グルコースまたはソルビトールなどの前駆体製品から製造される。本発明の他の態様において、ＰＤＣおよびＰＤＣの組換え体が、微生物中および無細胞系において２−ＫＬＧをキシロースに変換するために利用される。本発明の他の態様は、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いてキシロースを検出する方法を含む。キシロースは、種々の医療用品および農業用品を製造する上で有用である。
【００１０】
定義
本明細書に用いられる用語「酵素的脱炭酸」とは、分子からカルボキシル基を除去するための酵素の使用を称す。例えば、これらに限定しないが、２−ＫＬＧからカルボキシル基を除去するためのピルビン酸デカルボキシラーゼの使用である。
【００１１】
本明細書に用いられる用語「基質」とは、酵素が作用する有機分子を称す。本発明の特定の基質としては、これらに限定はしないが、２−ＫＬＧ、グルコース、ソルボース、ソルビトール、２，５−ＤＫＧ、グロン酸などが挙げられる。  
【００１２】
本明細書に用いられる用語「補因子」とは、酵素が機能するために酵素と結合しなければならない金属イオンまたは補酵素などの分子を称す。例えば、これらに限定はしないが、マグネシウムイオン、およびチアミンピロリン酸である。
【００１３】
本明細書に用いられる用語「異種タンパク質」とは、発現される宿主において天然には生じないタンパク質またはポリペプチドを称す。
【００１４】
本明細書に用いられる用語「宿主細胞」とは、所望の機能を達成するために所望の核酸配列が該細胞に導入されている原核細胞または真核細胞を称す。該宿主細胞の代謝過程および代謝経路は、前記配列が宿主細胞のゲノムに挿入されていてもされていなくても、典型的に外来性核酸配列を維持、複製、および任意に発現できる。限定はしないが、細菌、真菌、および植物細胞などの本発明に利用できる種々の好適な宿主細胞がある。
【００１５】
本明細書に用いられる用語「好適な媒体」とは、培養における宿主細胞の増殖を支持および／または維持できる任意の媒体または物質を意味する。
【００１６】
本明細書に用いられる用語「遺伝子」とは、特定の産物をコードし、発現することのできるＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸配列のセグメントを称す。この産物は、タンパク質もしくはポリペプチドあるいは構造的もしくは機能的核酸であり得る。より広い意味で、該産物がタンパク質でも、ポリペプチドでもまたは核酸であっても、遺伝子は、任意の所望の産物を産生できる。機能的または構造的核酸類、例えば、ｒＲＮＡ、リボソーム類、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）もまた、遺伝子産物であると考え得る。「遺伝子」はまた、限定はしないが、発現配列の転写を促進させるために発現配列に「操作可能に連結された」プロモーター類、エンハンサー類およびターミネーター類などの調節要素を含有する配列を含有できる。該発現配列はまた、イントロン類を含有できる。
【００１７】
本明細書に用いられる用語「ｐｄｃ遺伝子」とは、生物に由来し得るピルビン酸デカルボキシラーゼまたはｐｄｃ（ＰＤＣ）をコードする核酸配列または遺伝子を意味し、該生物としては、限定はしないが、偽巣性コウジ菌およびコウジカビ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０９８２９３、配列番号：３）などのアスペルギルス属；他にある中でもトウモロコシ、マメ科植物、タバコ、アラビドプシス（例えば、シロイヌナズナＰＤＣ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１２４８７８、配列番号：４；シロイヌナズナＰＤＣ−１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１１９４６１、配列番号：５）、コメ、およびコムギまたはコムギ胚芽などの植物細胞；細菌、ザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４７４１４５、配列番号：２）、およびアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３６８４３５、配列番号：１）；サッカロミセス属クリヴェリ（Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３０２４６９、配列番号：６；ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）およびジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびビール酵母などの酵母；およびストレプトミセス属、カンジダ属グラブラータ（ｇｌａｂｒａｔａ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ５４５４３２、配列番号：７）、およびリゾープス属を含む真菌細胞が挙げられる。一実施態様において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、アセトバクター属パスツリア（配列番号：１）に由来し、または、幾つかの他の実施形態において、Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）（配列番号：２）が挙げられる。
【００１８】
本明細書に用いられる用語「ベクター」は、ＤＮＡなどの遺伝子物質を１つの細胞から別の細胞へ移送する核酸分子に関して用いられる。レトロウィルスベクター類は、ＲＮＡを移送し、次いでこれがＤＮＡに逆転写される。しかしながら、本発明は、レトロウィルスベクターまたは何らかの他の特定ベクターに限定されることは意図していない。
【００１９】
本明細書に用いられる用語「発現ベクター」とは、特定の宿主生物において所望のコード配列および操作可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含有する組換え分子を称す。原核生物の発現に必要な核酸配列は、通常、しばしば他の配列と共にプロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター類、エンハンサー類、ならびに終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００２０】
本明細書に用いられる用語「操作可能な組合せで」、「操作可能な順序で」および「操作可能に連結した」とは、所望の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指揮する核酸分子が産生されるような核酸配列の結合を称す。該用語はまた、機能性タンパク質が産生されるようなアミノ酸配列の結合を称す。
【００２１】
本明細書に用いられる用語「プロモーター要素」および「プロモーター」とは、ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子の前に配置され、遺伝子からｍＲＮＡへの転写開始のための部位を提供するＤＮＡ配列をいう。
【００２２】
本明細書に用いられる用語「選択性マーカー」とは、その選択性マーカーが発現される細胞に抗生物質または薬剤に対する耐性を付与する酵素活性をコードする遺伝子の使用を称す。選択性マーカー類は、「優性」であり得、優性の選択性マーカーは、任意の真核細胞系において検出できる酵素活性をコードする。優性の選択性マーカー類の例としては、哺乳動物細胞において薬物Ｇ４１８に対する耐性を付与する細菌性アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオ遺伝子とも称される）；抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する細菌性ヒグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子；およびマイコフェノール酸の存在下、増殖能力を付与する細菌性キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも称される）が挙げられる。他の選択性マーカーは関連する酵素活性を欠く細胞系と組合わせてそれらを使用しなければならないという点で優性ではない。非優性の選択性マーカーの例としては、ｔｋ７細胞系と組合わせて用いられるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞と組合わせて使用されるＣＡＤ遺伝子、およびｈｐｒｆ細胞系と組合わせて用いられる哺乳動物のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子が挙げられる。哺乳動物の細胞系における選択性マーカーの使用のレビューは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９年）１６．９−１６．１５頁に提供される。
【００２３】
本明細書に用いられる用語「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド単位の任意の配列を意味する。該ポリヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、およびチミジン（Ｔ）と略される）の配列であり得る。あるいは、該ポリヌクレオチドは、塩基のアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン（Ｕ）などのリボヌクレオチドの配列であり得、特定のデオキシリボヌクレオチド配列おいて、各チミジンは、リボヌクレオチドのウリジンにより置換される。
【００２４】
本明細書に用いられる用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合則によって関連しているポリヌクレオチド類に関して用いられる。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は、幾つかの核酸塩基だけが、塩基対合則に従って合致して「部分的」であり得る。または、核酸間で「完全な」または「全体の」相補性があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率性および強度に対してかなりの効果を有する。これは、増幅反応ならびに核酸間の結合に依存する方法における検出では特に重要である。
【００２５】
本明細書に用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸類の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの因子によって影響を受ける。
【００２６】
本明細書に用いられる用語「Ｔｍ」は、「融解温度」に関して用いられる。該融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が、１本鎖に半分解離する温度である。核酸類のＴｍを算出する式は、当業界に周知である。標準対照による示されるように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液にある場合、Ｔｍ値の簡単な推定値は、式：Ｔｍ＝８１．５℃＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）により算出できる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の参考文献には、Ｔｍの算出のために構造的ならびに配列特性を考慮したより精巧な計算方法が含まれている。
【００２７】
本明細書に用いられる用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが実施される温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在という条件に関して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件下で、核酸塩基対形成は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でのみ生じる。したがって、「弱い」または「低い」ストリンジェンシーの条件は、相補的配列の頻度が通常少ないので遺伝子的に多様である生物に由来する核酸類に必要とされることが多い。
【００２８】
本明細書に用いられる用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法により増幅できる核酸類に関して用いられる。「増幅可能な核酸」は、通常「サンプルテンプレート」を含むことが考慮されている。
【００２９】
本明細書に用いられる用語「サンプルテンプレート」とは、「標的」の存在に関して分析されるサンプルを出所とする核酸を称す。対照的に、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプルに存在し得るか、または存在し得ないサンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられる。バックグラウンドテンプレートは、ほとんどの場合、偶発的である。それは、キャリーオーバーの結果であるか、またはサンプルから精製されることが求められる核酸不純物の存在のためであり得る。
【００３０】
本明細書に用いられる用語「プライマー」とは、精製された制限消化物におけるような天然のものであろうと、または合成的に生成されたものであろうと、核酸鎖に相補的であるプライマー拡張産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド類およびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導化剤の存在下、好適な温度およびｐＨで）に置かれた場合、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを称する。プライマーは、増幅における最大効率のために１本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、プライマーは、拡張産物の調製に使用される前に先ずその鎖を分離するために処理される。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘導化剤の存在下、拡張産物の合成をプライムするのに十分に長くなければならない。プライマー類の正確な長さは、温度、プライマー源および使用方法など多くの因子に依る。
【００３１】
本明細書に用いられる用語「プローブ」とは、精製された制限消化物におけるような天然のものであろうと、合成的に生成されたものであろうと、別の対象のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド類の相対的に短い配列）を称する。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明に用いられるいずれのプローブも、限定はしないが、酵素系（例えば、ＥＬＩＳＡならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光系、放射性系および発酵系など、任意の検出系で検出できるように「レポーター分子」により標識されることが考慮されている。さらに、対象のオリゴヌクレオチド（すなわち、検出される）が、レポーター分子により標識されることが考慮されている。また、プローブおよび対象のオリゴヌクレオチドの双方とも、標識されることが考慮されている。本発明は、何らかの特定の検出系または標識に限定されることを意図していない。
【００３２】
本明細書に用いられるポリメラーゼ連鎖反応に関して、用語「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマーによって結合される核酸領域を称す。したがって、「標的」は、他の核酸配列から選別されることが求められる。他の実施形態において、該用語は、対象の任意の核酸（または核酸領域）を称す。「セグメント」は、標的配列内の核酸領域として定義される。
【００３３】
本明細書に用いられる用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングまたは精製していないゲノムＤＮＡの混合物において標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法に関して、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、および米国特許第４，９６５，１８８号明細書の方法を称し、それら全ては、参照として本明細書に組み込まれている。標的配列を増幅させる本法は、大過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に導入し、次いでＤＮＡポリメラーゼの存在下、正確な配列の熱的サイクリングよりなる。２種のプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を実施するためには、混合物を変性させてから、プライマーを、標的分子内の相補的配列にアニーリングさせる。アニーリング後、プライマー類は、相補鎖の新たな対を形成するようにポリメラーゼにより伸長される。変性、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長のステップは、多数回反復して（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長によって１「サイクル」が構成され；多数回の「サイクル」があり得る）所望の標的配列の高濃度の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに関連するプライマーの相対的な位置により決定し、したがってこの長さは、制御可能なパラメータである。本工程の反復態様のため、本法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後「ＰＣＲ」）と称される。標的配列の所望の増幅セグメントが、混合物中の主要な配列（濃度の点で）となることから、それらは、「ＰＣＲ増幅」されている。
【００３４】
ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを数種の方法論（例えば、標識プローブによるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマー類の取込み、次いでアビジン酵素複合体の検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識ヒドロキシヌクレオチド三リン酸類の増幅セグメントへの取込み）により検出可能な濃度に増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列を、プライマー分子の適切なセットにより増幅できる。特にＰＣＲ工程自体により創製された増幅セグメントは、それら自体、引き続くＰＣＲ増幅にとって効率的なテンプレートである。
【００３５】
「増幅」は、テンプレート特異性に関与する核酸複製の特定のケースである。それは、非特異的テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存ではあるが、特定のテンプレートに依存しない複製）と対照的であり得る。ここでテンプレート特異性は、複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性と区別される。テンプレート特異性は、「標的」特異性の点で記述されることが多い。標的配列は、他の核酸から選別されることが求められる意味で「標的」である。増幅技法は、主としてこの選別のためにデザインされている。
【００３６】
テンプレート特異性は、大部分の増幅法では酵素の選択による達成される。増幅酵素は、それらが用いられる条件下で、核酸の異種混合物において核酸の特定の配列だけを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡは、レプリカーゼに特異的なテンプレートである（Ｋａｃｉａｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ」、６９：３０３８頁（１９７２年））。他の核酸は、この増幅酵素により複製されない。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素は、それ自身のプロモーターに対してストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」、２２８：２２７頁（１９７０年））。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、該酵素は、連結接合部においてオリゴヌクレオチド基質とテンプレートとの間にミスマッチがある２つのオリゴヌクレオチドを結合しない（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」、４：５６０頁（１９８９年））。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕなどの耐熱性ポリメラーゼ類は、高温で機能する能力のため、結合する配列に高特異性を示すことが見出されており、したがって、プライマー類により規定され；高温によって、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに好適で、非標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに適さない熱力学的条件がもたらされる。
【００３７】
ＰＣＲおよび核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの幾つかの増幅法は、標的を増幅してから検出する方法を採用し；ローリング循環増幅（例えば、パドロックプローブによる）などの他の方法は、標的を検出してからプローブを増幅する。この方法にかかわらず、核酸は、増幅を高効率で生じさせるために阻害物の無い状態でなければならない。
【００３８】
本明細書に用いられる用語「ＰＣＲ産物」、「単位複製配列」および「増幅産物」とは、変性、アニーリングおよび伸長の２回以上のＰＣＲ工程のサイクル完了後に生じた化合物の混合物を称す。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上のセグメントの増幅があった場合を包含する。
【００３９】
本明細書に用いられる用語「ネステッドプライマー」とは、ＰＣＲを開始するために用いられるアニーリング境界内にある領域における標的配列にアニーリングするプライマー類を称す（Ｍｕｌｌｉｓら、「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ」、１１巻、２６３−２７３頁、１９８６年）。ネストされたプライマーは、開始プライマーのアニーリング境界内の標的にアニーリングするため、開始プライマーの主要なＰＣＲ増幅産物は、ネステッドプライマーのアニーリング境界に規定された配列よりも、必然的に長い配列である。ネステッドプライマーのＰＣＲ増幅産物は、標的配列の増幅セグメントであり、したがって開始プライマーとアニーリングできない。ネステッドプライマーの使用の有利な点としては、特異性の程度が大きいこと、ならびにより小さなサンプル部分が使用でき、しかも特異的かつ効率的な増幅を得ることができるという事実が挙げられる。
【００４０】
本明細書に用いられる用語「増幅試薬」とは、プライマー、核酸テンプレートおよび増幅酵素を除いて、増幅に必要とされる試薬（デオキシリボヌクレオシド三リン酸類、緩衝剤など）を称す。典型的に、増幅試薬は、他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れられ、含有される。
【００４１】
本明細書に用いられる用語「制限エンドヌクレアーゼ類」および「制限酵素」とは、典型的に細菌性酵素を称し、それらの各々は、二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列で、またはその近辺で切断する。
【００４２】
本明細書に用いられる用語「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的方法の手段によって一緒に結合されるＤＮＡのセグメントからなるＤＮＡ分子を称す。
【００４３】
１つのモノヌクレオチド五炭糖環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を経て一方向でその隣接の３’酸素に結合されるような仕方で、モノヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを作製するように反応することから、ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、５’リン酸が、モノヌクレオチド五炭糖環の３’酸素に結合していない場合、「５’末端」と称され、３’酸素が、引き続くモノヌクレオチド五炭糖環の５’リン酸に結合していない場合、「３’末端」と称される。本明細書に用いられる核酸配列は、より大型のオリゴヌクレオチドの内部にあっても、５’末端および３’末端を有すると言ってもよい。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、個別の要素は、「上流」または「下流」の５’または３’要素と称される。この用語は、ＤＮＡ鎖に沿って５’から３’様式で転写が進行するという事実を反映している。結合遺伝子の転写を方向付けるプロモーターおよびエンハンサー要素は、一般にコード領域の５’または上流に位置される。しかしながら、エンハンサー要素は、プロモーター要素およびコード領域の３’に位置している場合でもそれらの効果を及ぼすことができる。転写終止およびポリアデニル化シグナルは、典型的にコード領域の３’または下流に位置している。
【００４４】
本明細書に用いられる用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列」とは、遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ配列または言い換えると遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を意味する。該コード領域は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ形態で存在し得る。エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、ポリアデニル化シグナルなどの好適な制御要素は、必要ならば、適切な転写開始および／または転写一次ＲＮＡ産物の正しい処理を可能にするために遺伝子のコード領域に近接して配置され得る。
【００４５】
あるいは、本発明に利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、介在配列、ポリアデニル化シグナル類など、または内因性および外因性制御要素双方の組合わせを含有できる。
【００４６】
本明細書に用いられる用語「転写単位」とは、転写の開始部位と終止部位との間のＤＮＡのセグメントならびに効率的な開始および終止に必要な調節要素を称す。例えば、エンハンサー／プロモーター、コード領域ならびに開始および終止配列を含むＤＮＡのセグメントは、転写単位を含む。
【００４７】
本明細書に用いられる用語「調節要素」とは、核酸配列の発現の幾つかの態様を制御する遺伝子要素を称す。例えば、プロモーターは、操作可能に連結されたコード領域の転写開始を促進する調節要素である。他の調節要素は、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナルなどである。
【００４８】
真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」要素および「エンハンサー」要素を含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短い配列のＤＮＡ配列からなる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２３６：１２３７頁（１９８７年））。プロモーター要素およびエンハンサー要素は、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの種々の真核生物源ならびにウィルスから単離されている（類似の制御要素、すなわちプロモーター類は、原核生物にも見出されている）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現するためにどの細胞型が使用されるかに依存する。幾つかの原核生物のプロモーターおよびエンハンサーは、幅広い宿主範囲を有するが、他は、細胞型の限定されたサブセットにおいて機能的である（レビューに関してＶｏｓｓら、「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．」、１１：２８７頁（１９８６年）；およびＭａｎｉａｔｉｓら、上記文献（１９８７年）を参照）。例えば、ＳＶ４０の早期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳動物種からの多種多様の細胞型において極めて活性であり、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に広く使用されている（Ｄｉｊｋｅｍａら、「ＥＭＢＯ  Ｊ．」、４：７６１頁（１９８５年））。広範囲の哺乳動物細胞型において活性なプロモーター／エンハンサー要素の２つの他の例は、ヒトの伸長因子１α遺伝子（Ｕｅｔｓｕｋｉら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２６４：５７９１頁（１９８９年）；Ｋｉｍら、「Ｇｅｎｅ」、９１：２１７頁（１９９０年）；およびＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．」、１８：５３２２頁（１９９０年））およびラウス肉腫ウィルスの長い末端反復（Ｇｏｒｍａｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、７９：６７７７頁（１９８２年））ならびにヒトのサイトメガロウィルス（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ｃｅｌｌ」、４１：５２１頁（１９８５年））からのものである。
【００４９】
本明細書に用いられる用語「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーター機能およびエンハンサー機能（すなわち、プロモーター要素およびエンハンサー要素により提供される機能、これらの機能に関する検討に関しては上記参照）の双方を提供できる配列を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。例えば、レトロウィルスの長い末端反復（ＬＴＲｓ）は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の双方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「非相同的」であり得る。「内因性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノムにおいて所与の遺伝子と天然に結合しているものである。「外因性」または「非相同的」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が、結合したエンハンサー／プロモーターにより方向付けられるように遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子に並列して配置されるものである。
【００５０】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在によって、組換え転写体のより高レベル発現がもたらされることが多い。スプライシングシグナルは、転写一次ＲＮＡ産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナーおよびアクセプター部位からなる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９年）、１６．７〜１６．８頁を参照）。一般に使用されるスプライスドナーおよびアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ  ＲＮＡからのスプライス接合部である。
【００５１】
真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現のためには、生じた転写体の効率的な終止およびポリアデニル化を方向付けるシグナル発現が必要である。転写終止シグナル類は、一般にポリアデニル化シグナルの下流に見られ、長さが２、３百のヌクレオチドである。
【００５２】
本明細書に用いられる用語「ポリＡ側」または「ポリＡ配列」とは、新生ＲＮＡ転写体の終止およびポリアデニル化を方向付けるＤＮＡ配列を意味する。ポリＡ尾部を欠く転写体は、不安定であり、急速に分解するので、組換え転写体の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターに利用されるポリＡシグナルは、「非相同的」または「内因性」であり得る。内因性ポリＡシグナルは、ゲノムにおける所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然で見られるものである。非相同的ポリＡシグナルは、１つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’に配置されるものである。一般に使用される非相同的ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは、２３７ｂｐ  Ｂａｍ  ＨＩ／Ｂｃｌ  Ｉ制限断片上に含まれ、終止およびポリアデニル化の双方を方向付ける（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献の１６．６〜１６．７頁に）。
【００５３】
真核生物の発現ベクターは、「ウィルスレプリコン」または「複製のウィルス起源」を含有することもできる。ウィルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を考慮に入れるウィルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０または複製のポリオーマウィルス源のいずれかを含有するベクターは、適切なウィルス抗原を発言する細胞において高コピー数（１０４のコピー／細胞）で複製する。ウシパピロウィルスまたエプスタイン・バルウィルスからのレプリコンを含有するベクター類は、低コピー数（約１００のコピー／細胞）で染色体外的に複製する。
【００５４】
用語「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来性ＤＮＡの導入および組込みを称す。用語「安定なトランスフェクタント」とは、ゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた外来性ＤＮＡを有する細胞を称す。
【００５５】
用語「一過性トランスフェクション」および「一過性にトランスフェクトされた」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムに外来性ＤＮＡを組み込むことができない細胞への外来性ＤＮＡの導入を称す。外来性ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞の核に数日間保存される。この期間、外来性ＤＮＡは、染色体中の内因性遺伝子の発現を制御する調節制御に供される。用語「一過性トランスフェクタント」とは、外来性ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことができなかった細胞を称す。
【００５６】
本明細書に用いられる用語「核酸分子のコード」、「ヌクレオチド配列のコード」、「ＤＮＡ配列のコード」および「ＤＮＡのコード」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を称す。これらデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。したがってＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に関してコードする。
【００５７】
本明細書に用いられる用語「養子移入」は、別の細胞または生物への１つの機能の移入に関して用いられる。
【００５８】
本明細書に用いられる用語「化学的に還元された」とは、化学両論的に平衡な化学反応により分子にプロトンを付加することを意味する。
【００５９】
本明細書に用いられる用語「微生物的に還元された」とは、微生物に見られるように酵素的反応により分子にプロトンを付加することを意味する。
【００６０】
本明細書に用いられる用語「無細胞系」とは、生きた細胞全体を使用しない系を称す。「無細胞系」としては、限定はしないが、細胞ライセートの使用、細胞抽出物、または細胞断片を挙げることができる。
【００６１】
本明細書に用いられる用語「細胞ライセート」とは、細胞の内容物が、膜によってもはや含有されず、溶解させた細胞組成物を称す。
【００６２】
Ａ．ピルビン酸デカルボキシラーゼ
ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）は、エタノール発酵における重要ステップである、ピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換を触媒する。該酵素は、各モノマーがマグネシウムイオンと会合した、１分子の補因子チアミン二リン酸（３−［（４−アミノ−２−メチルピリジン−５−イル）メチル］−５−（２−ジホスホ−エチル）−４−メチル−１，３−チアゾリウム）を含有するテトラマーである。通常、該酵素は、以下のとおりアセトアルデヒドおよび二酸化炭素へのピルビン酸の分解を触媒する：
【化１】
2007534338.tif 000002
【００６３】
ＰＤＣは、基質として２−ＫＬＧを受け入れて、産物がＬ−キシロースとなることが今回見出されている。
【００６４】
２−ＫＬＧおよびキシロースの構造は、下記に示される。
【化２】
2007534338.tif 000003
本発明により、この特性が、２−ＫＬＧからＬ−キシロースを生産するために用いられる。
【００６５】
本明細書に十分に特徴付けられているように、本発明の方法に有用であるＰＤＣは、任意の所望の供給源から精製または単離できる。例えば、本発明の方法に有用なＰＤＣを細菌類、植物、酵母、または真菌類から抽出できるか、またはさらに単離できる。本発明の方法に有用なＰＤＣの例は、ＣａｎｄｙおよびＤｕｇｇｌｅｂｙ（「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、１３８５：３２３−３３８頁（１９９８年））、ならびにＫｏｅｎｉｇ（「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、１３８５：２７１−２８６頁（１９９８年））により記載された細菌性ＰＤＣである。ある一定のＰＤＣ相同体に関するヌクレオチドおよび核酸配列のさらなる例は、アセトバクター属パスツリア科（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３６８４３５、配列番号：１）および、ザイモバクター・パルマエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４７４１４５、配列番号：２）に由来する。
【００６６】
ＰＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応は、溶解性形態において、固定化され、または他に、Ｌ−キシロース産物からの酵素の除去を促進する半透膜などの構造内に含有され得る。ＰＤＣはまた、タンパク質を沈殿させるために用いられる種々の試剤のいずれか、例えば、硫酸アンモニウムアセトン、トリクロロ酢酸による沈殿、または当業者に公知の他の方法により反応混合物から除去できる。
【００６７】
Ｂ．無細胞系
本発明の方法は、無細胞系、あるいは１種以上の必要な酵素が、他の生物、特に微生物により産生されるか、または提供されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で実施できる。一実施形態は、キシロースの生産に必要な酵素および補因子を含有する微生物の粗製抽出物または細胞ライセートの使用を含む。無細胞系において、酵素活性を促進するか、または可能にする好適な緩衝液を有するアッセイ媒体中、他の必要な反応基質および補因子と共にＰＤＶおよび／または２−ＫＬＧを精製形態で加えることができる。
【００６８】
特定の一実施形態において、酵素活性を促進するか、または可能にするｐＨのアッセイ媒体中、他の必要な反応基質および補因子と共に無細胞形態または精製形態でＰＤＣを提供することにより、キシロースを産生できる。同時にまたは連続的に、２−ＫＬＧを、ピルビン酸デカルボキシラーゼを含有するアッセイ媒体に導入すると、２−ＫＬＧは、ピルビン酸デカルボキシラーゼにより脱炭酸してキシロースを産生する。次いでキシロースを精製する。ＰＤＣが基質として２−ＫＬＧを受け入れる限り、任意のＰＤＣを、ＰＤＣ酵素活性源として使用できる。基質として２−ＫＬＧを受け入れるＰＤＣの能力は、当業者に公知の方法により判定できる。
【００６９】
特定の一実施形態において、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系など、酵素活性を促進するか、または可能にする好適な緩衝液とｐＨを有するアッセイ媒体中、他の必要な反応基質および補因子と共に２−ＫＬＧを精製形態で加える。このアッセイは、典型的には２−ＫＬＧ基質を使い尽くすか、またはＬ−キシロースの回収を可能にするために十分なＬ−キシロースを生産させる上で十分な時間実施される。
【００７０】
１．ライセート
幾つかの実施形態において、限定はしないが、ＰＤＣおよび２−ＫＤＧレダクターゼなどの酵素類は、ライセートの形態であり得る。該ライセートは、部分精製、実質精製できるか、または本発明の微生物に含有し得る。該ライセートは、２−ＫＬＧのキシロースへの変換を触媒するＰＤＣなど、酵素に所望の産物を産生するなどの意図された機能を実施させる任意の形態であり得る。微生物は、透過性細胞全体、または所望の最終結果を得るために必要な細胞の膜、または他の部分であり得る。微生物は、緩衝溶液または媒体などの適切な溶液に懸濁し、リンスして媒体を除くか、あるいはアセトンなどの公知の試薬を用いて凍結乾燥または化学的に乾燥できる。微生物は、意図された用途で支持体が細胞を支持する限り、限定はしないが、ポリビニルピロリドンヒドロゲル、ポリアクリルアミドゲル、クロマトグラフィ用媒体などのヒドロゲル、または合成支持体、例えば、複数ウェルプレート、ビーズ、マトリックスなどの上に固定できる。微生物は固定、架橋できるが、基質、中間体または産物が、細胞壁を有するか、または有さない透過性膜をより容易に通過することができるように、細胞壁を有するか、または有さない透過性膜を有することができる。
【００７１】
Ｃ．２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）
２−ＫＬＧは、純粋形態で提供できるか、あるいは細胞代謝物または他の細胞過程の産物として細胞内に産生できる。２−ＫＬＧは、商品として購入できるか、または合成的に、特に工業スケールで製造できる。例えば、２−ＫＬＧを製造する一方法では、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓｎｅｒ、「Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ」  １７：３１１頁（１９３４年）およびＣｈｏｔａｎｉ，Ｇ．ら、「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＡＣＴＡ」、１５４３：４３４−４５５頁（２０００年））を使用し、Ｄ−グルコースを水素化してＤ−ソルビトールを形成し、これをＬ−ソルボースへと発酵させる。Ｌ−ソルボースを、アセトン化によりジアセトン−Ｌ−ソルボースに変換する。次いでジアセトン−Ｌ−ソルボースを、酸化および加水分解により２−ＫＬＧに変換する。
【００７２】
１．ｉｎ  ｖｉｖｏ  ２−ＫＬＧ製造
２−ＫＬＧ製造のための１つまたは複数の反応は、ｉｎ  ｖｉｖｏすなわち生細胞中でも実施できる。細胞膜が基質に透過性である限り、適切な基質を細胞に提供できる。例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，９８９，８９１号明細書を参照されたい。
【００７３】
ａ．基質としてグルコースを用いる２−ＫＬＧの製造
別の実施形態において、２−ＫＬＧは、以下に従って細胞内でＤ−グルコースから合成される。
【化３】
2007534338.tif 000004
【００７４】
Ｄ−グルコースからの２−ＫＬＧの製造は、Ｃｈｏｔａｎｉら、「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、１５４３：４３４−４５５頁（２０００年）にレビューされており、より詳細には上記文献に記載されている。
【００７５】
手短に言えば、２−ＫＬＧは、微生物を用いてＤ−グルコースから２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）の合成、次いで２，５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの還元により製造できる。上記の文献を参照されたい。例示例としては、ＥＰ０４６２８４号明細書；米国特許第５，９９８，６３４号明細書；米国特許第３，９６３，５７４号明細書；Ｓｏｎｏｙａｍａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３０３９−３０４７頁（１９８７年）；およびＣｈｏｔａｎｉら、「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、１５４３：４３４−４５５頁（２０００年）が挙げられる。本実施形態に用いられる微生物宿主細胞を、遺伝子技術的に操作して２，５−ＤＫＧレダクターゼなどの２，５−ＤＫＧの処理に関与する酵素を産生させる。次に宿主細胞株はまた、Ｄ−グルコースから２，５−ＤＫＧを合成して、２，５−ＤＫＧレダクターゼにより２，５−ＤＫＧを内因的に還元し、同じ細胞内で２−ＫＬＧを産生できる。例示例としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２３０：１４４−１４９頁（１９８５年）；Ｃｈｏｔａｎｉら、（２０００年）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｄ．Ｊ．「Ｎａｔｕｒｅ」、１８３：１１３３−１１３４頁（１９５９年）；ＥＰ１３２  ３０８号明細書；米国特許第５，９９８，６３４号明細書；米国特許第４，７５７，０１２号明細書；米国特許第４，７５８，５１４号明細書；米国特許第５，００４，６９０号明細書；米国特許第５，００８，１９３号明細書；米国特許第５，０３２，５１４号明細書；国際公開第９８／５９０５４号パンフレットおよび国際公開第００／３７６６７号パンフレット；および特開昭３９−１４４９３号公報、特開昭５３−２５０３３号公報、特開昭５６−１５８７７号公報、および特開昭５９−３５２９０号公報が挙げられる。
【００７６】
Ｄ−グルコースの２，５−ＤＫＧへの微生物酸化、次いで２−ＫＬＧへの微生物還元または化学的還元を含む同様の工程もまた実施できる。例えば、特定の一実施形態において、グルコースを、酵素的または非酵素的にグルコン酸に酸化でき、次いで２−ＫＤＧに変換してから、最終的に２−ＫＬＧに還元する。
【００７７】
ｂ．基質としてソルボースまたはソルビトールを用いたＫＬＧの製造
さらに別の実施形態において、Ｌ−ソルボースおよび／またはＤ−ソルビトールを２−ＫＬＧへと発酵させる細菌株を用いて２−ＫＬＧを製造できる。例示例は、Ｓａｉｔｏら、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、６３：４５４−４６０頁、（１９９７年）；Ｓｈｉｎｊｏｈら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」、１８４：８６１−８６３頁、（２００２年）；およびＣｈｏｔａｎｉら、（２０００年）；および米国特許第６，５４１，２３９号明細書、米国特許第６，３１９，６９９号明細書、米国特許第５，９８９，８９１号明細書、および米国特許第５，８３４，２３１号明細書に記載されている。
【００７８】
米国特許第６，５４１，２３９号明細書、米国特許第６，３１９，６９９号明細書および米国特許第５，９８９，８９１号明細書は、微生物をＬ−ソルボースと十分な時間接触させてから蓄積された２−ＫＬＧを単離することを含む２−ＫＬＧの製造工程を開示している。この発酵工程は、典型的にＬ−ソルボースを含有する合成培養培地または天然培養培地中、微生物を十分な時間培養させてから、培養培地および／または微生物の細胞から蓄積された２−ＫＬＧを単離することを含む。
【００７９】
２−ＫＬＧを製造する細菌類、酵母、真菌類、植物または動物などの宿主を開発するために遺伝子工学的方法を使用できる。例えば、他にＬ−ソルボースなどの他の場合では、２−ＫＬＧまたは２−ＫＬＧ前駆体に変換できない基質から２−ＫＬＧを生産するか（Ｓａｉｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３：４５４−４６０頁（１９９７年））、またはＤ−グルコースから２−ＫＬＧを作製するような宿主を遺伝子工学操作するために遺伝子工学的方法を使用できる。
【００８０】
一実施形態において、限定はしないが、純粋培養発酵によりＬ−ソルボースから少なくとも約４０  ｇ／Ｌの２−ＫＬＧを製造できる、細菌株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７（ＡＤＭ  Ｘ６Ｌ、ケトグロニゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）またはその変異体が、２−ＫＬＧを製造するために使用される。米国特許第６，５４１，２３９号明細書を参照されたい。株ＡＤＭ  Ｘ６Ｌは、ブダペスト条約規定下、１９９６年１０月１日、農業研究事業団カルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）、１８１５ノースユニバーシティストリート、イリノイ州ペオリア６１６０４、米国に寄託され、登録番号ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７が付与された。
【００８１】
天然株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７（ＡＤＭ  Ｘ６Ｌ）に加えて、その変異株および変異体もまた、本発明の方法に使用できる。特定の実施形態において、これらの変異株および変異体は、モノカルチャー中、Ｌ−ソルボースから少なくとも約４０  ｇ／Ｌの２−ＫＬＧを製造できる。参照として本明細書に組み込まれている米国特許第６，５４１，２３９号明細書を参照されたい。
【００８２】
さらに別の実施形態において、株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７（ＡＤＭ  Ｘ６Ｌ）の変異株（ＡＤＭ  ８６−９６）は、ブダペスト条約規定下、１９９６年１０月１５日、農業研究事業団カルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）、１８１５ノースユニバーシティストリート、イリノイ州ペオリア６１６０４、米国に寄託され、登録番号ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６３０が付与された。Ｌ−ソルボースに関する培養における２−ＫＬＧ製造のための有用な細菌株の例を提供している、米国特許第６，５４１，２３９号明細書を参照されたい。
【００８３】
本発明によれば、２−ＫＬＧを製造するために用いられる微生物株またはその変異株または変異体を、Ｌ−ソルボースと十分な時間接触させる。蓄積された２−ＫＬＧを単離し、キシロース製造のために脱炭酸する。特定の一実施形態において、微生物株を、Ｌ−ソルボースを含有する天然培地または合成培地中で２−ＫＬＧ生産のために一定期間培養して、引き続き蓄積された２−ＫＬＧを単離する。あるいは、ライセートなど、微生物株の細胞由来の調製物を、Ｌ−ソルボースと十分な時間接触させてから、蓄積された２−ＫＬＧを従来の手段により単離する。
【００８４】
一定の実施形態において、出発物質のＬ−ソルボースは、微生物株の導入前に培地中に存在するか、または株の導入後に、始めに一度に全部、または連続的にあるいは培養を通して分割して培地に添加する。あるいは、Ｌ−ソルボースは、Ｄ−ソルビトールの発酵変換によりｉｎ  ｓｉｔｕで産生される。使用されるＬ−ソルボース量は、当業者により経験的に決定されるが、少なくとも約４０ｇ／Ｌの２−ＫＬＧを製造するために微生物株に対して少なくとも十分な量である。一実施形態において、Ｌ−ソルボースは、培養培地の３％〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５％〜２０％を含む。Ｌ−ソルボースおよび／またはＤ−ソルビトールに加えて、天然または合成培養培地は、窒素源、好適な無機塩類、また適宜、微生物株の培養に好適な種々の微量栄養物、成長因子などを含有し、また少なくとも１種の補足的な炭素源を含有してもよい。使用されるこれらの追加成分の各量は、２−ＫＬＧ生産を最大にするために選択されることが好ましい。本発明の特定の一実施形態において、培養培地は、約１０％（ｗ／ｖ）のＬ−ソルボース、約３％（乾燥固体重量／ｖ）のコーンスティープリカー、および約０．２％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有し、ｐＨは、ＮＨ４ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ２）またはＣａＣＯ３により調節する。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７（ＡＤＭ  Ｘ６Ｌ）またはＮＲＲＬ  Ｂ−２１６３０（ＡＤＭ  ８６−９６）などの変異株または変異体は、２２℃〜３５℃の範囲、好ましくは約３０℃の温度で、５．０〜８．０の範囲のｐＨ、好ましくは５．５〜７．５の範囲、より好ましくは約６．０〜６．８の範囲のｐＨで培養される。使用される培養条件は、もちろん２−ＫＬＧ製造を最大にするために、適切であれば培養中の種々の時点で公知の方法により変わり得る。
【００８６】
３．２−ＫＬＧ単離および精製
本明細書に開示された方法により製造された２−ケト−Ｌ−グロン酸は、標準的な手段により培養培地から単離し、精製できる。２−ＫＬＧは、好ましくは約７０％純粋、より好ましくは約８０％純粋、より好ましくは約９０％純粋、より好ましくは約９５％純粋、最も好ましくは約１００％純粋である。十分な時間、例えば、１０時間〜１５０時間培養後、細胞および／または培養ブロスに蓄積された２−ＫＬＧを、当業者に公知の任意の方法に従って単離する。培養に使用される条件に好適な任意の方法を使用できる：２−ＫＬＧの回収に好適な方法の例示例は、米国特許第５，４７４，９２４号明細書；米国特許第５，３１２，７４１号明細書；米国特許第４，９６０，６９５号明細書；米国特許第４，９３５，３５９号明細書；米国特許第４，８７７，７３５号明細書；米国特許第４，９３３，２８９号明細書；米国特許第４，８９２，８２３号明細書；米国特許第３，０４３，７４９号明細書；米国特許第３，９１２，５９２号明細書；米国特許第３，９０７，６３９号明細書；および米国特許第３，２３４，１０５号明細書に記載されている。
【００８７】
このような方法の一つによれば、２−ＫＬＧを生産する微生物を、遠心分離またはろ過などの公知の方法により培養ブロスから先ず取り出し、生じた溶液を減圧濃縮する。次に結晶性の２−ＫＬＧをろ過により回収し、所望ならば、再結晶により精製する。同様に、２−ＫＬＧは、イオン交換樹脂、溶媒抽出、沈殿、塩析の使用などの公知の方法を用いて回収できる。米国特許第５，９８９，８９１号明細書を参照されたい。
【００８８】
２−ＫＬＧが、遊離酸として回収される場合、所望ならば、それを、従来の方法を用いてナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムまたは同様のカチオン類の塩に変換できる。あるいは、２−ＫＬＧが、塩として回収される場合、それを、従来の方法を用いてその遊離形態または異なる塩に変換できる。米国特許第６，５４１，２３９号明細書を参照されたい。
【００８９】
Ｄ．キシロース形成のためのＰＤＣによる２−ＫＬＧの脱炭酸
２−ＫＬＧの脱炭酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）および２−ＫＬＧを含む反応混合物中で達成される。２−ＫＬＧからキシロースの製造に好適な範囲内に混合物のｐＨを維持するために、該反応混合物は、典型的に緩衝液または緩衝系を含有する。種々の実施形態において、２−ＫＬＧのキシロースへの変換は、約５〜約７、約６〜約７、約６〜約８、約７〜約８、または約７〜約９の緩衝液のｐＨ範囲で生じる。一定の実施形態において、好ましいｐＨ範囲としては、約５．５〜約７．５または約６．５〜約７．５が挙げられ、１つの好ましい目標のｐＨは約５．７５である。
【００９０】
ある一定の実施形態において、Ｌ−キシロースは、Ｄ−グルコースまたはＬ−ソルボースから２−ＫＬＧを生産する微生物を培養することにより製造される。微生物を、十分な時間好適な培地中で培養することにより、２−ＫＬＧを抽出または単離できる。次にＬ−キシロースを製造するために、２−ＫＬＧが、ＰＤＣにより脱炭酸される条件下で、ＰＤＣを含有する適切なアッセイ培地に２−ＫＬＧを添加する。
【００９１】
１．組換えＰＤＣ
ＰＤＣは、ＰＤＣをコードする遺伝子を含む宿主細胞を用いて組換え技法により生産できる。遺伝子材料を宿主細胞に導入する方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）などの典型的な分子生物学用実験室マニュアルに記載されているものを含めて当業技術者に周知である。これらの方法としては、限定はしないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、液体媒介またはリポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔またはウィルス媒介感染が挙げられる。本発明の一実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９２】
ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するプラスミドを含む微生物において生産できる。本発明の宿主細胞としては、限定はしないが、グルコノバクター属、リゾビウム属、ブラジリゾビウム属、アルカリゲネス属、ロドバクター属、ロドコッカス属、アゾスピリルム属、ロドスピリルム属、スフィンゴモナス属、バークホルデリア属、デスルホモナス属、ゲオスピリルム属、スクシノモナス属、アエロモナス属、シェワネラ属、ハロクロマチウム属、シトロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、ザイモバクター属、フィブロバクター属、アシドバクター属、バクテロイデス属、スフィンゴバクテリウム属、アクチノミセス属、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属、プロピオニバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属、バチルス属、ゲオバチルス属、パエニバチルス属、スルホバチルス属、クロストリジウム属、アナエロバクター属、ユーバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、テルモビフィダ属、セルロモナス属、およびアセトバクター属が挙げられる。代表的な酵母細胞としては、限定はしないが、サッカロミセス属クルイベロミセス、ピチア属およびジゴサッカロミセス属が挙げられる。代表的な真菌細胞としては、限定はしないが、ストレプトミセス属、カンジダ属、リゾープス属、およびアスペルギルス属が挙げられる。本発明の好ましい宿主細胞としては、限定はしないが、大腸菌、およびエルウィニア属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、バチルス属、ラクトバチルス属、およびストレプトミセス属が挙げられる。
【００９３】
基質として２−ＫＬＧを使用できるＰＤＣをコードする任意の核酸配列が、本明細書に記載されている方法に有用であると考えられる。米国特許出願公開第２００３／００８７３６８号明細書（「'３６８出願」）は、本発明に有用であると思われるピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするＺｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ（配列番号：２）に由来する核酸分子に関するものであり、参照として本明細書に組み込まれている。
【００９４】
本発明の一実施形態は、発現ベクター、例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）遺伝子を有するプラスミドを含む。該ベクターはまた、限定はしないが、当業界に周知であるプロモーター、エンハンサー、転写終止シグナル（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル）および／またはオペレーター配列など、宿主細胞においてｐｄｃ配列を発現するために好適な調節配列を含む。ＰＤＣをコードするポリヌクレオチド配列および任意の調節配列は、「操作可能に連結」される。すなわち、それらは、意図された仕方でｐｄｃ配列に関連して作用するために発現ベクター上に配置される。該ベクターはまた、天然の発現制御配列および／または染色体およびエピソーム由来の制御配列、例えば、細菌外来性プラスミド、バクテリオファージに由来するベクター、コスミドおよびファージミドなど、それらの組合わせに由来するベクターを含む発現制御配列を含有できる。
【００９５】
本発明の特定の一実施形態において、組換え発現ベクターは、転写プロモーターおよびポリアデニル化配列に操作可能に結合した単離または組換えｐｄｃＤＮＡ配列を含む転写単位を含有する。該発現ベクターは、エンハンサー、プロモーター、ならびに上流および下流調節配列などの全ての必要な調節配列、またｐｄｃ遺伝子の発現および／または複製に必要な任意の他の配列と共に、ｐｄｃ遺伝子の完全長または機能性断片を含有する。特定の実施形態に用いられる発現ベクターの例としては、リトマス２８ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）およびｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられる。
【００９６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドｐｄｃ挿入体およびシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドシグナルを、限定はしないが、ファージラムダＰＬプロモーター、ファージラムダＰＲプロモーター、ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター類（Ｋａｌｎｉｎｓ  Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：５９３−５９７頁（１９８３年））などの大腸菌ｌａｃプロモーター類、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター類、Ｔ３およびＴ７プロモーター類、ｔｒｃプロモーターおよびｇｐｔプロモーターなど、天然プロモーターまたは宿主由来プロモーターを含む適切なプロモーターに操作可能に結合させる。代りの実施形態において、プロモーターは、本質的に構成的サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの真核生物プロモーターであり得る。別の実施形態において、プロモーターは、タンパク質発現の量およびタイミングを調節できる誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、限定はしないが、ＴｅｔＯｎおよびＴｅｔＯｆｆが挙げられる。ＴｅｔＯｎは、テトラサイクリンの存在下で活性化される。該プロモーターに操作可能に結合される対象遺伝子の発現量は、テトラサイクリン量に比例する。ＴｅｔＯｆｆは、逆様式で働き、そのため、テトラサイクリンの存在により該プロモーターは不活化される。他の好適なプロモーターも当業者に知られている。
【００９７】
該発現ベクターはまた、転写の開始、終止のための部位、および転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。ベクターにより発現された成熟転写体のコード部分は、始めに翻訳開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終止コドンを含むことができる。
【００９８】
該発現ベクターはまた、該発現ベクターの複製を促進する複製起点または他の配列を含有する。例えば、大腸菌の複製起点。あるいは、該発現ベクターは、限定はしないが、エルウィニア属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、バチルス属、ラクトバチルス属、またはストレプトコッカス属などの細菌類に機能的である複製起点を含有する。
【００９９】
該発現ベクターは典型的に、トランスフェクション成功の確認を可能にする１種以上の選択性マーカーを含有する。選択性マーカーは、典型的には抗生物質耐性遺伝子である。選択性マーカーとしては、アミカシン、アウグメンチン（アモキシシリンプラスクラブロン酸）、アンピシリン、セファゾリン、セフォキシチン、セフタチジム、セフチオフル、セファロチン、エンロフロキサチン、フロルフェニコール、ゲンタマイシン、イミペネム、カナマイシン、ペニシリン、サラフロキシシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサクリン、チカルシリン、チルミコシン、またはクロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられる。他の好適なマーカー類は、当業技術者にとって容易に明白であろう。
【０１００】
本発明の特定の実施形態において、宿主細胞は、ｐｄｃ遺伝子を含有することができる。ｐｄｃ遺伝子は、エキソソーマル（ｅｘｏｓｏｍａｌ）である（染色体に組み込まれない）か、または染色体に組み込むことができる。ｐｄｃ遺伝子含有発現ベクターの組込みは、限定はしないが、市販されているＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いる組換えによるなど、当業界において任意の数の標準的技法を用いて達成できる。宿主細胞は、本発明のｐｄｃ遺伝子構成産物の産生を増加させるために改変されている天然遺伝子を含有し得る。例えば、天然のプロモーターをより強力なプロモーターによって置き換えて、該構築体によってコードされたタンパク質の産生を増加させることができる。別の例において、対象の遺伝子、すなわちＴＫＴ遺伝子の活性化を発現しないために天然シグナルに優先する外因性調節配列をスプライスできる。Ｒａｊら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２年、６８：２８６９−２８７６頁もまた参照されたい。
【０１０１】
代りの実施形態において、宿主細胞は、デカルボキシラーゼ活性を改善した、および／または熱安定性を改善したＰＤＣをコードする核酸配列を含むことができる。別の実施形態において、宿主細胞は、限定はしないが、２−ＫＬＧなどの基質をキシロースへ変換するために、より高い親和性またはより高い活性を有するＰＤＣをコードする核酸配列を含むことができる。さらに別の実施形態において、宿主細胞は、ＰＤＣ生産を増強させるための修飾を含むことができる。例えば、ＰＤＣに関する合成経路に関与する酵素活性を増強させることにより、および／またはＰＤＣ生産を制御する代謝経路のフィードバック阻害を排除または減少させることよりＰＤＣ合成の増大が達成できる。
【０１０２】
一定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、翻訳されたＰＤＣポリペプチドを含有できる。翻訳されたポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾形態で発現でき、追加の非相同的機能性領域を含むことができる。精製または引き続く取り扱いおよび保存中の宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に、例えば、追加の特に荷電アミノ酸の領域を加えることができる。また、精製を促進させるために、アフィニティークロマトグラフィなどの方法を用いてポリヒスチジンタグなどのペプチド部分をポリペプチドに付加することができる。
【０１０３】
ＰＤＣ精製および単離
ＰＤＣの精製は、当業界に公知の標準法を用いて、また、米国公開特許第２００３／００８７３６８号明細書に記載されているとおりに実施できる。一実施形態において、大腸菌発現系が用いられる。ｐｄｃ遺伝子を含む大腸菌は、遠心分離により採集でき、当業界に公知の方法を用いて細胞を溶解できる（例えば、米国公開特許第２００３／００８７３６８号明細書を参照）。細胞片を除去するために細胞ライセートを処理でき、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥまたはＤＥＡＥなどのイオン交換カラムクロマトグラフィ媒体；フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、またはブチルＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどの疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体；ＳＵＰＥＲＤＥＸ、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ、ＳＵＰＥＲＯＳＥ、またはＵＬＴＲＯＧＥＬ  ＡｃＡなどのゲルろ過クロマトグラフィ媒体、または当業界に公知の他の媒体、またはそれらの任意の組合わせに適用できる。
【０１０４】
培養培地
本明細書に記載された微生物および宿主細胞の培養は、好適な培養培地中で実施される。本明細書に用いられる培地は、固体であってもまたは液体であってもよく、合成であってもまたは天然であってもよく、本発明の微生物株の培養に十分な栄養物を含有する。一定の実施形態において、使用される培地は、液体培地、または合成液体培地である。本発明の微生物株の培養は、エアリフト、伝統的な散布攪拌デザイン、または振とう培養などの当業者に公知の任意の液中発酵法を用いて達成できる。培養培地中での宿主細胞の培養に続いて、所望のポリペプチドを、本明細書に記載された公知の方法によって培養培地から分離する。
【０１０５】
本発明に典型的に用いられる天然または合成培養培地は、窒素源、好適な無機塩、および適宜、微生物株の培養に好適な微量栄養物質、成長因子などを含有し、また、少なくとも１種の補足炭素源を含有し得る。特定の実施形態において、これらの付加成分各々の量は、目標タンパク質の製造を最大化するために選択される。特定の一実施形態において、目標タンパク質の精製を促進させるために、限定はしないが、Ｍ９最少塩培地（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）プラスグルコースなどの無タンパク質培地が用いられる。付加成分の量は、当業界に公知の種々の方法および技術にしたがって、当業者により、実験的に決定できる。該培地は、ペプトン又はＮ−Ｚアミン、補足炭素源および／または種々のビタミン類などの他の成分を適宜含有できる。
【０１０６】
好適な補足炭素源の例示例としては、限定はしないが、グルコース、フルクトース、マンニトール、澱粉又は澱粉加水分解物、セルロース加水分解物および糖蜜などの他の炭水化物；酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマール酸；およびグリセロールなどのアルコール類が挙げられる。
【０１０７】
好適な窒素源の例示例としては、限定はしないが、気体アンモニアおよび水性アンモニアなどのアンモニア；塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムなどの無機または有機酸のアンモニウム塩；尿素；硝酸塩または亜硝酸塩、ならびに精製または粗製調製物としてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚肉、魚加水分解物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆ケーク加水分解物、酵母抽出物、乾燥酵母、エタノール酵母蒸留物、大豆粉、綿実荒粉などの他の窒素含有物質が挙げられる。
【０１０８】
好適な無機塩の例示例としては、限定はしないが、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅および他の微量元素、ならびにリン酸の塩が挙げられる。
【０１０９】
適切な微量栄養物質、成長因子などの例示例としては、限定はしないが、補酵素Ａ、パントテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、他のビタミン類、精製又は部分的精製化学化合物としての、または天然材料に存在するシステイン、チオ硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、ナイアシンアミドなどのアミノ酸が挙げられる。
【０１１０】
一定の実施形態において、温度、ｐＨ、通気速度、攪拌速度、培養時間などの、用いられる培養条件は、タンパク質製造を最大化するために、当業者により実験的に決定できる。特定の培養条件の選択は、使用される本発明の特定の微生物、培地組成およびタイプ、培養方法、ならびに類似考慮事項などの因子に依存する。培養に引き続き、特定の実施形態において、培養培地中の宿主細胞、所望のピルビン酸デカルボキシラーゼを、公知の方法により、培養培地から分離する。本明細書に記載されたいずれかのｐｄｃ遺伝子によってコードされた翻訳タンパク質は、回収され、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、免疫沈澱、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、分取高圧液体クロマトグラフィまたは高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ)、またはそれらの組み合わせなどの周知の方法により精製できる。Ｒａｊら、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００２年、６８：２８６９−２８７６頁を参照されたい。
【０１１１】
Ｅ．キシロースからキシリトールへの変換
本発明は、本発明の方法のいずれかによって製造されたキシロースをキシリトールへと化学的に還元する方法をさらに含む。キシロースは水素化処理によってキシリトールへと変換される。キシロースおよびキシリトールの構造は以下に示されている。
【化４】
2007534338.tif 000005
【０１１２】
特定の一実施形態において、キシロースは、ラニーニッケル触媒の存在下、キシリトールへと触媒的に水素化される。この反応は典型的に、高温度および高圧で生じる。
【０１１３】
キシロースはまた、微生物手段によってキシリトールへ変換することもできる。特定の一実施形態において、キシロースは、ＮＡＤＰＨ依存キシロースレダクターゼによって、微生物中、キシリトールへと変換される。参照として本明細書に組み込まれている、ＳａｈａおよびＢｏｔｈａｓｔ、「Ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ，Ｃｈ．１７，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘｙｌｉｔｏｌ」、３０７−３１９頁、１９９７年を参照されたい。本発明の一実施形態は、ＰＤＣにより、２−ＫＬＧからのキシロースの製造を含み得、キシリトールは、化学的手段または微生物手段のいずれかでキシロースから変換される。
【０１１４】
Ｆ．キシロース産生を測定する診断的方法
本発明は、オクロバクトラム・アントロピ（Ｏｃｈｒｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）由来のＬ−キシロースデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１１３）を用いたキシロースの検出を含む、キシロース産生を測定する方法をさらに含む。ＳａｓｊｉｍａおよびＳｉｎｓｋｅｙ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」、５７１：１２０−１２６頁（１９７９年）を参照されたい。
【０１１５】
Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼは、オキシドレダクターゼであり、Ｌ−キシロースからＬ−キシロノ−１，４−ラクトン（キシロン酸）を触媒する：
【化５】
2007534338.tif 000006
【０１１６】
Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼは、オクロバクトラム・アントロピにおいて特性化されている（ＳａｓｊｉｍａおよびＳｉｎｓｋｅｙ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」、５７１：１２０−１２６頁（１９７９年））。Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼはまた、ＮＡＤＨ−キシロースレダクターゼおよびＬ−キシロース  ＮＡＤ  １−オキシドレダクターゼとしても知られている。Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼは、キシロースを酸化するよりは低率ではあるが、Ｄ−アラビノースおよびＬ−グルコースもまた酸化できる。
【０１１７】
キシロースがキシロン酸に変換される際、キシロースは脱水素化され、Ｈ−上の水素化物がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を水素化してＮＡＤＨを形成する。ＮＡＤＨの生産量は、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼによって脱水素化されたキシロースの量に直接相関する。ＮＡＤＨの形成は、分光光度法を用いてモニターできる。
【０１１８】
以下の実施例は、単に例示的なものであり、添付の請求項によって規定された本発明の範囲を制限する意図はない。本発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の修正および変更をなし得ることは、当業者に明白であろう。したがって、本発明は、添付の請求項およびそれらの等価物の範囲に入る条件で、本発明の修正および変更を含む。
【実施例】
【０１１９】
実施例
実施例１
ザイモバクター・パルマエ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）由来ｐｄｃ遺伝子のクローニング。  ｐｄｃ遺伝子は、大腸菌中でクローン化し、配列決定し、発現させた（Ｒａｊら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２年、６８：２８６９−２８７６頁）。ゲノムＤＮＡは、ＨａｒｗｏｏｄおよびＣｕｔｔｉｎｇにより記載された方法に基づき、ザイモバクター・パルマエから調製された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９０年）。ザイモバクター・パルマエのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ５１６２３）のＰＣＲにより、ＰＤＣ酵素のオープンリーディングフレームを含有するＤＮＡ断片の増幅および単離がもたらされる。プライマーは、Ｒａｊらにおいて公開された（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２年、６８：２８６９−２８７６頁）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４７４１４５の配列に基づいて合成された。ＰＤＣのオープンリーディングフレームを含有するＰＣＲ産物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を、ベクタープラスミド、ｐＴｒｃ９９に結合させた。該プラスミドを、大腸菌株ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に形質転換させた。形質転換させた大腸菌を、ルリア−バータニ（ＬＢ）培地中で増殖させ、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、該遺伝子の発現を誘導した。該細胞を採集し、遠心分離によって洗浄し、音波処理して抽出物を製造した。該抽出物を、Ｒａｊらによって記載された方法（Ｒａｊら、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００２年、６８：２８６９−２８７６頁）に基づき、ＰＤＣ活性に関してアッセイした。
【０１２０】
実施例２
ＰＤＣによる２−ＫＬＧの脱カルボキシル化。  大腸菌ＰＤＣ酵素抽出物のサンプルを準備した。大腸菌はＺ．ｐａｌｍａｅ由来のＰＤＣ酵素を過剰発現した。ＰＤＣ酵素活性を、Ｒａｊらによって記載された方法（Ｒａｊら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２年、６８：２８６９−２８７６頁）によって判定した。
【０１２１】
酵素抽出物を用いて、２−ＫＬＧの最初の脱カルボキシル化を実施した。該反応混合物は、ｐＨ５．８、５ｍＭのＭｇＣｌ２を有する５０ｍＭのクエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ミズーリ州セントルイス）中、Ｚ．ｐａｌｍａｅ由来のＰＤＣ、１ｍＭのチアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ミズーリ州セントルイス）および０．１％〜１％の２−ＫＬＧを含有した。該反応混合物を、５０℃で１５時間温置した。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲のキシロースが、用量依存様式で生成した。キシロースの生産量は、用いられたＰＤＣの濃度に直接相関した。
【０１２２】
実施例３
キシロースの生成を確認する上で最適な条件を用いて、別の実験を行った。該反応混合物は、ｐＨ５．７５で、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴＰＰ、３００ｍＭの２−ＫＬＧ、０．１％のエタノールを有する５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、および下表１に挙げられた量の細菌抽出物由来ＰＤＣを含有し、全量は２．５ｍＬであった。反応混合物中、６０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌのキシロースが、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて検出され、トリメチルシラン（ＴＭＳ）による誘導体化後、ガスクロマトグラフィによって確認された。ＨＰＬＣ分析には、Ｃａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ２０（３×１５０ｍｍ）カラム（Ｄｉｏｎｅｘ、カリフォルニア州サニーベール）を用いた。キシロースは、１０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を用いてカラムから溶出させた。
【０１２３】
【表１】
2007534338.tif 000007
【０１２４】
実施例３
２−ＫＬＧに対する活性改善のためのＰＤＣオープンリーディングフレームのＰＣＲ変異誘発。２−ＫＬＧは、ＰＤＣに対する天然基質ではない。本発明の新規酵素反応であるＰＤＣによる２−ＫＬＧの脱カルボキシル化は、該酵素のさらなる遺伝子技術によって改善することができる。２−ＫＬＧとのより高い活性を有するために、該酵素の改変を目的として、ＤＮＡ組換え法を用いることができる。
【０１２５】
特に、ＰＣＲ法により変異を生じさせるために、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  キット（番号６００５０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）を用いた。変異誘発ＰＣＲ反応には、実施例１のプラスミドをテンプレートとして用い、同じプライマーを用いた。該ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローン化した。ＰＤＣ活性に関し、および２−ＫＬＧを脱炭酸する能力に関して、２０種のクローンを特性化した。変異を有さない対照株に比較して、２０株のほとんどは、天然基質のピルベートに対し、ならびに２−ＫＬＧに対して特異的活性がより小さかった。これにより、酵素の活性にとって重要な該酵素の部分に変異が生じたことが示された。
【０１２６】
ＰＤＣの活性または生成をさらに改善するために、該酵素またはキシロースの生産に至る本発明の経路のフィードバック調節成分のいずれかにおける改変を行うこともできる。キシロースの生産はまた、遺伝子工学的方法または他の代謝操作法によって行うこともできる。
【０１２７】
実施例４
キシロースの生産量を測定するための診断的方法。  Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性は、オクロバクトラム・アントロピ株（ＡＴＣＣ  ２９２４３、バージニア州マナサス）において、ＳａｓａｊｉｍａおよびＳｉｎｓｋｅｙにより同定されている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、５７１：１２０−１２６頁）。ＳａｓａｊｉｍａおよびＳｉｎｓｋｅｙの方法は、参照として、本明細書に組み込まれている。これらの方法は、オクロバクトラム・アントロピを増殖させ、その抽出物を作製するために実施された。ＮＡＤＨを測定することによって、所与の反応において生成したキシロースの量をアッセイするために、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いた。キシロースがキシロン酸に変換される際、キシロースは脱水素化され、水素化物イオン、Ｈ−がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を水素化して、ＮＡＤＨを形成する。ＮＡＤＨの生産量は、Ｌ−キシロースデヒドロゲナーゼによって脱水素化されるキシロースの量に直接相関する。該反応液は、ｐＨ１０．０で、２ｍＭのＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）、Ｏ．アントロピの酵素抽出物である０．０１ｍｇの蛋白質および種々の量のキシロースを有する１００ｍＭのグリシン緩衝液を含有した。ＮＡＤＨの形成は、分光光度計を用いてモニターし、３４０ｎｍでの吸光度の増加を測定した。この方法は、ＰＤＣ酵素工学用のハイスループット環境におけるＰＤＣ類の活性評価において使用するために、当業者により変更できる。
【０１２８】
実施例５
キシロースからキシリトールへの変換。  十分に攪拌して反応させると、該反応混合物は、ｐＨ５．０、２％ラニーニッケル触媒で、水溶液中、４０％〜４５％のキシロースを含有する。該反応液を、１３００ｐｓｉｇ水素圧で維持する。該反応を、６０℃の温度で開始し、５０分かけて、１４０℃へランプさせる。該反応を、およそ４５分間、１４０℃および１３００ｐｓｉｇの圧力に保持する。次いで、水素ガスを止め、該反応液を、およそ３０分の間に約８５℃に冷却する。キシロースをキシリトールに変換するために、限定はしないが、水素化ホウ素ナトリウム還元などの、当業者の公知の他の方法を用いることもできる。
【０１２９】
実施例６
グルコースまたはソルボース由来の２−ＫＬＧからのキシロース製造法。  ２−ＫＬＧは、米国特許出願第６，５４１，２３９号明細書、第６，３１９，６９９号明細書、および第５，９８９，８９１号明細書に詳述されているとおり、微生物中、ソルボースから製造できる。あるいは、２−ＫＬＧは、ＥＰ０４６２８４号明細書；米国特許出願第５，９９８，６３４号明細書；米国特許出願第３，９６３，５７４号明細書；Ｓｏｎｏｙａｍａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３０３９−３０４７頁（１９８７年）；およびＣｈｏｔａｎｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１５４３：４３４−４５５頁（２０００年）に詳述されているとおり、グルコースから製造できる。２−ＫＬＧは、上記で検討したとおり、当業者に公知の手段によって単離できる。次いで、単離された２−ＫＬＧは、実施例１におけるように、宿主細胞から産生させたＰＤＣと共に使用できる。該２−ＫＬＧを該ＰＤＣに接触させて、キシロースを製造できる。他の代替法において、２−ＫＬＧをキシロース、またはキシリトールへ変換する能力の増大した、また、グルコースまたはソルボースを２−ＫＬＧに変換する能力を有するＰＤＣ遺伝子を発現するように、微生物を操作できる。したがって、形質転換生物によって、グルコースまたはソルボースから直接、Ｌ−キシロースまたはキシリトールを作製できる。
【０１３０】
本発明を十分に説明したが、本発明の範囲またはその任意の実施形態に影響を与えることなく、条件、製剤および他のパラメータの広範な、また等価な範囲内で、同じものが実施できることは、当業者に理解されるであろう。本明細書に引用した全ての特許および刊行物は、参照として、それらの全体が完全に組み込まれている。
【配列表】
2007534338000001.app
【国際調査報告】
2007534338.tif 000008
2007534338.tif 000009
2007534338.tif 000010
2007534338.tif 000011
2007534338.tif 000012