(57)【要約】本発明は、ＨＬＡ遺伝子型を分析するためのオリゴヌクレオチド組成物およびその検査方法に関する発明である。その好適な態様は、組織移植の際に必要な組織適合性検査を施すためにＨＬＡ遺伝子型を分析するためのオリゴヌクレオチドチップ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈｉｐ）組成物である。具体的にはＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群で構成されるグループより選択された一つ以上のプローブ群を含む、ＨＬＡ遺伝子型を決定するための複数のオリゴヌクレオチドプローブを有する組成物である。その製造方法と結果の検出方法も提供する。2007530031.tif 000028
2007530031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列情報１から配列情報４１に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ａ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；配列情報４２から配列情報８９に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ｂ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；配列情報９０から配列情報１１２に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ｃｗ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；および配列情報１１３から配列情報１４０に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群で構成されるグループより選択された一つ以上のプローブ群を含む、ＨＬＡ遺伝子型を決定するための複数のオリゴヌクレオチドプローブを有する組成物。
【請求項２】
請求項１のプローブ組成物および該組成物が固定化される支持体とを含む試験支持体。
【請求項３】
前記支持体が、フィルター、ストリップ、マイクロスフェア、チップ、スライド、マルチウェルプレート、メンブレンおよび光ファイバーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の支持体。
【請求項４】
請求項１または請求項２のプローブと目的遺伝子との間のハイブリダイゼーション反応を検出するために用いられる、配列情報１４１から配列情報１５７に示される塩基配列からなる群より一つ以上を選択された、ＨＬＡ遺伝子型を決定するためのプライマー。
【請求項５】
上記のプライマーの中で、配列情報１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２または１５４に示される塩基配列からなる群より選択されるアンチセンスプライマーは、ビオチンまたはローダミンが付着されていることを特徴とする請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
上記のプライマーの中でビオチンが付着されたアンチセンスプライマーはストレプトアビジン‐シアニンと相互作用することを特徴とする請求項５に記載のプライマー。
【請求項７】
ａ）血液、細胞および組織からＨＬＡ ＤＮＡを調製する段階；
ｂ）調製したＤＮＡを用いて非対称ＰＣＲを実施する段階；
ｃ）上記の非対称ＰＣＲ産物と請求項１または請求項２のプローブとを結合させる段階；
ｄ）上記の結合を確認する段階；および
ｅ）確認された結合を、ＨＬＡタイピングプログラムを用いてＨＬＡ遺伝子型を分析する段階；
を含むＨＬＡ遺伝子型の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドチップ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈｉｐ）
組成物およびその製造方法に関する発明であり、詳しくは組織移植の際に必要な組織適合性検査を施すためにＨＬＡ遺伝子型を分析するためのオリゴヌクレオチドチップ組成物およびその製造方法と結果の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合性複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）とは、遺伝子レベルで制御されている複雑な抗原系であって、臓器組織を移植する際に拒絶反応（免疫反応)に関係する一連の遺伝子群を称し、すべての哺乳動
物に存在する。ヒトのＭＨＣは、白血球表面の抗原を認識する抗白血球因子で初めて発見され、ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬＡ）と称し、第６番染色体の短腕に位置する。このＨＬＡ遺伝子座は、免疫学的特性および分子構造、遺伝子の位置と分布する細胞のタイプによって３群（ＨＬＡ‐ｃｌａｓｓ I,II,III)に分類され、この中で第１群の抗原部位のＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ遺伝子座と第２群の抗原部位のＨＬＡ‐ＤＲが組織拒絶反応と密接な関係があるとされる。
【０００３】
ＨＬＡ遺伝子の代表的な特徴は以下のようである。第一に、ＨＬＡ遺伝子は数十個を超える対立遺伝子を有するため、人体の数多い遺伝標識子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ
）中でも、最も高い遺伝的多型性（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)を現わす。第二に、半数体型（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）レベルにおける遺伝象である。ＨＬＡ遺伝子群に属する多くの遺伝子は第６染色体上で極めて接近して位置するため、親から子に遺伝される際に一つの単位に纏められて遺伝され、このような対立遺伝子における特定の組み合わせをＨＬＡ半数体型と称する。第三に、人種間のＨＬＡ遺伝的多型性を挙げることができる。ＨＬＡ対立遺伝子の分布は、他の遺伝子に比べ各人種間で著しく大きい差異を示している。このような様相はＨＬＡ半数体型において一層の人種間差異を示している。種族によってあるＨＬＡ遺伝子は強い連鎖不均衡（ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂ
ｒｉｕｍ)を示すため、特定種のＨＬＡ半数体型はある人種に特徴的に存在するようにな
る。このようなＨＬＡの遺伝的多型性現象により、種族間でＨＬＡ遺伝子の遺伝子型頻度（ｇｅｎｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ)と半数体型頻度（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｆｒｅｑｕｅｎ
ｃｙ)とが異なるため、人種間の遺伝的背景の相違を研究する強力なマーカーとして用い
られる。第四にＨＬＡ遺伝子のさらに他の重要な機能は、免疫反応に関係することである。免疫反応は、ＨＬＡ‐ｃｌａｓｓ I分子とｃｌａｓｓ II分子が細胞内で抗原と結合し
た後に細胞表面に提示され、Ｔリンパ球の表面にあるＴ細胞抗原受容体がＨＬＡ分子に結合された抗原を認識することによって発現される。
【０００４】
このようにＨＬＡ遺伝子の高い遺伝的多型性と免疫反応に深く関与する特性のために、臓器移植、疾病との関連性、輸血、親子鑑定といった法医学的応用および人類学的研究に至るまで広く応用されている。現在、腎臓および骨髄の移植プログラムにおいてはＨＬＡ検査が必須である。提供者と受与者についてＡＢＯ血液型検査、ＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ、およびＤＲ型検査を実施し、移植する前に交差適合試験を施す。もし、骨髄、腎臓などを移植する際に提供者と受与者間のＨＬＡ型が互いに異なる場合、移植された臓器に対する拒絶反応が生じるであろう。通常、骨髄移植は免疫細胞の移植であるために、患者と提供者間に完璧な遺伝的一致が要求され、移植する際には、受与者と同一タイプのＨＬＡを有する提供者を予め選別しなければならないということが重要である。特に、急性もしくは慢性の白血病や免疫不全、または再生不良性貧血などにおいて試みられる骨髄移植に
おいては、ＨＬＡ遺伝子型が完全に一致しなければならない。このため骨髄提供者としては同一のＨＬＡタイプを遺伝的に受け継ぐ兄弟または姉妹が最も適合する。しかし家族がいない場合には、血縁関係のない人々の中で提供する人を探さなければならない。このとき多くの人について検査し、ＨＬＡ遺伝子型を同定することが必須的に要求される。
【０００５】
分子生物学の進歩によりＨＬＡ抗原を支配する対立遺伝子の塩基配列が詳しく明らかになるにつれて、塩基配列の相違を通じてＨＬＡの多様性を見出すことができるＨＬＡ遺伝子解析が可能となった。特に、ＰＣＲ法の導入によりＨＬＡのＤＮＡタイピング分野は急速に発展し、ＨＬＡ抗原の多型性がＤＮＡレベルでほとんど明らかになっている。ＰＣＲ法を用いるＨＬＡ対立遺伝子の類別には、ＨＬＡ分子の細胞表面での発現量に関係なくすべての有核細胞をサンプルとすることができるために、Ｔリンパ球とＢリンパ球の分離が必要なく、リンパ球が含まれていない体液、組織などにおいても遺伝子型の解析が可能であるという利点がある。また、ＤＮＡは比較的安定した分子であるために、冷蔵保管すれば数ヶ月、冷凍保管すればほとんど永久的に保管することができる。ＤＮＡタイピング方法が有している多くの有利な点の中で最も重要な利点は、多数のＨＬＡ対立遺伝子の類別が可能であるということである。
【０００６】
現在、一般に用いられているＨＬＡ ＤＮＡタイピング手法を見てみると、まずＰＣＲ
‐ＳＳＰ法がある。この手法は、各対立遺伝子の塩基配列に特異なプライマーを合成してＰＣＲを実施することから、数十個の対立遺伝子を判別するためには数十対のプライマーが必要となる。この方法は分析時間が短く簡便な方法であるが、そうしたプライマーを合成する際には細心な注意と知識および時間が要求されるため、大量の検体分析には限界がある。加えて対立遺伝子が多いほどＰＣＲ‐ＳＳＰの数も多くなるため、多数の検体を一度に扱うのは難しいという欠点がある。第二のＰＣＲ‐ＲＦＬＰ法を用いたＨＬＡ遺伝子型の類別は、対立遺伝子の制限酵素に対する反応形態を調べる比較的単純な方法であり、様々な制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片の大きさで対立遺伝子型を類別する。この方法は結果の判定が易しく方法も簡単ではあるが、制限酵素が認識できる部位が限定された場合に判別が困難となり、ポリアクリルアミドゲルを使用しなければならないため、大量の検体や数十個の対立遺伝子を同時に類別することは難しい。このため対立遺伝子の数が少ない遺伝子型の類別に適した方法である。第三の方法としてＰＣＲ‐ＳＳＣＰ法は、ＰＣＲ産物をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）などの変性剤を添加して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性させた後に、非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する方法である。電気泳動においてｓｓＤＮＡは、その塩基配列に基づく特有の構造を有し、電気泳動中に固有の移動速度を示してそれぞれ異なるタイプのバンドを形成する。このような性質を利用してＨＬＡ遺伝子型を類別する方法であって、複雑かつ難易度の高い技術が必要であり、その結果の解析にも経験と知識が必要とされる。第四として配列依拠のタイピング法は、ＨＬＡ遺伝子についてそれぞれＰＣＲした後にＤＮＡの塩基配列を決定して調べることである。この方法を利用したキットとしては、ＡＢＩ社（米国)のＨＬＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｔｙｐｉｎｇ（ＳＢＴ)があるが、キットの価格が非常に高く、高
価な装置も必要であり、実験過程も複雑である。第五のＰＣＲ‐ＳＳＯＰ法は、遺伝的多型性を示す領域の塩基配列に相補的なプローブを合成し、該プローブとＰＣＲ増幅産物とのハイブリダイゼーションについての可否を分析する方法である。これは数多くのプローブが必要であり、塩基配列が類似している他の対立遺伝子とハイブリダイゼーション反応が起き易いために、その適切な温度と反応条件の設定などに経験と技術が要求される方法である。この方法は、プローブの種類によっては正確な結果を得ることができるが、フィルターを使用するために多数のプローブを固定するに限界がある。一つのフィルターで一つのタイプのみを分析できるだけであるから、多くの検体を処理して分析するのに時間と手間が多く消耗される。この方法を用いて商用化されている商品としては、ＨＬＡ ｃｌ
ａｓｓIとｃｌａｓｓ IIに対して各々のＳＳＯＰを用いて逆ハイブリダイゼーション（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するラインプローブ・アッセイ（ｌｉｎｅ
ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）方法である、ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ社（ベルギー)のＩＮ
ＮＯ ＬｉＰＡ キットとＤＹＮＡＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（米国)のＤｙｎａｌ ＲＥＬＩTM ＳＳＯ ＨＬＡ Ｔｙｐｉｎｇ キットがある。
【０００７】
上述したようにＨＬＡ遺伝子を分析するために様々なタイピング方法が用いられており商品化もされているが、これらの方法の共通した欠点は、ＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ、‐ＤＲを同時にタイピングするには極めて多い時間と労動力が要求され、特に大量の検体を分析するにはさらに難しいという点である。
【０００８】
ごく最近、微小な大きさのスライドグラスやシリコンなどの基板上に非常に少ない量のＤＮＡを高密度で付着させることができ、また、同時に多数を検索することができるＤＮＡチップ技術を通じて、遺伝子発現分析、遺伝子診断、遺伝子の突然変異検索、医薬品の検査および疾病診断などに使用することができる新しい次元の分析システムが開発された。本発明は、このＤＮＡチップの技術を用いてＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ、‐ＤＲを一つのスライド上で同時に分析することで可能である。即ち、一つのアルデヒドガラススライド（aldehyde glass slide）上で、５つの区域に各々のプローブを集積させる。スライド上に集積されたこのプローブ類と非対称ＰＣＲ法を用いて増幅させたＨＬＡ遺伝子とをハイブリダイズさせる。反応が現われたプローブをＨＬＡタイピングプログラムを用いて調べることによってＨＬＡ遺伝子型を類別する。
【０００９】
本発明は上記方法の問題点を解決し、上述の必要性に応じて案出されたものである。本発明の目的は、ＨＬＡ遺伝子型を解析するための組成物を含むオリゴヌクレオチド組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、上記組成物を用いてＨＬＡ遺伝子型を分析する改善された方法を提供することである。
上記の目的を果たすために、本発明は、配列情報１から配列情報４１に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ａ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；配列情報４２から配列情報８９に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ｂ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；配列情報９０から配列情報１１２に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ｃｗ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；および配列情報１１３から配列情報１４０に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群で構成されるグループより選択された一つ以上のプローブ群を含む、ＨＬＡ遺伝子型を決定するための複数のオリゴヌクレオチドプローブを有する組成物を提供する。
【００１１】
また本発明は、
配列情報１から配列情報４１に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ａ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；配列情報４２から配列情報８９に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ｂ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；配列情報９０から配列情報１１２に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐Ｃｗ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群；および配列情報１１３から配列情報１４０に示される塩基配列に示される塩基配列からなる群より選択されるプローブであって、ＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型を決定するための二つ以上のプローブからなる群で構成されるグループより選択された一つ以上のプローブ群を含む、ＨＬＡ遺伝子型を決定するための複数のオリゴヌクレオチドプローブを有する組成物がその上に固定化されている試験支持体（test support）を提供する。
【００１２】
本発明の前記支持体は、フィルター、ストリップ、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）、チップ、スライド、マルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）、メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）および光ファイバーからなる群より選択される支持体であることが望ましい。
【００１３】
また本発明は、配列情報１４１から配列情報１５７に示される塩基配列からなる群より選択された、一つ以上のＨＬＡ遺伝子型を決定するためのプライマーを含み、これが上記のプローブと目的遺伝子との間のハイブリダイゼーション反応を検出するのに用いられることを特徴とするプライマーである。
【００１４】
本発明のプライマーの中で、配列情報１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２または１５４に示されるアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）プライマーの好ましい例は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）またはローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）が付着されたことを特徴とするプライマーであり、これらのプライマーの中でビオチンが付着されたアンチセンスプライマーは、ストレプトアビジン‐シアニン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｃｙａｎｉｎｅ）と相互作用することを特徴とする。
【００１５】
また本発明は、
ａ）血液、細胞および組織よりＨＬＡ ＤＮＡを調製する段階；
ｂ）調製したＤＮＡを用いて非対称ＰＣＲを実施する段階；
ｃ）上記の非対称ＰＣＲの産物と第１項または第２項のプローブとを結合させる段階；および
ｄ）上記の結合を確認する段階；
を含むＨＬＡ遺伝子型の分析方法を提供する。
【００１６】
本発明において、上記の確認段階は、ローダミンを用いたり、ビオチンと結合するストレプトアビジン‐シアニンを用い、マイクロアレイスキャナを用いて結果を確認し、ＨＬＡタイピングプログラムを用いて分析することによって、ＨＬＡ遺伝子型を便利に確認することを特徴とする。本発明においては、最近開発されたＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて一つのスライド上でＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、Ｃｗ、ＤＲを同時に分析することができるＨＬＡオリゴヌクレオチドチップを開発した。すなわちＨＬＡ遺伝子型を決定するために、ＨＬＡ‐Ａの２１タイプと特異的に反応することができる３８個のオリゴヌクレオチド、ＨＬＡ‐Ｂの３６タイプと特異的に反応することができる４６個のオリゴヌクレオチド、ＨＬＡ‐Ｃｗの１４タイプと特異的に反応することができる２０個のオリゴヌクレオチド、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１／３／４／５の１６タイプと特異的に反応することができる２２個のオリゴヌクレオチド、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１のＢ１＊３、＊８、＊１１、＊１２、＊１３、＊１４、＊１５および＊１６なる８タイプと特異的に反応することができる１７個のオリゴヌクレオチドを作製し、これらを一枚のアルデヒドガラス・スライド上の５区域に集積させた。非対称ＰＣＲ法を利用して増幅させたＨＬＡ遺伝子を該スライドに集積させたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション反応させた。これを蛍光反応法の利用により反応が現われたプローブを分析して総ＨＬＡに対する８７個の遺伝子型を類別した。
【００１７】
図１は、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップのスライド全体を示す写真である。すなわち一枚のスライド上でＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ、‐ＤＲＢ遺伝子型を同時に分析するために、表示された数字により指定される５個の「チャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）」で構成されている。
【００１８】
このスライド上には表に示されるように、ＨＬＡ‐Ａ遺伝子型を類別するための３８個
のプローブ、陽性コントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いられる
２個のプローブと陰性コントロール（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いら
れる１個のプローブ、ＨＬＡ‐Ｂ遺伝子型を類別するための４６個のプローブと陽性コントロールおよび陰性コントロールとして用いられる各々１個のプローブ、ＨＬＡ‐Ｃｗ遺伝子型を類別するための２０個のプローブと陽性コントロールとして用いられる２個のプローブと陰性コントロールとして用いられる１個のプローブ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１／３／４／５遺伝子型を類別するための２２個のプローブと陰性コントロールおよび陽性コントロールとして用いられる各々１個のプローブ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１／３／４／５遺伝子型を類別するプローブがＤＲＢ３／４／５遺伝子型により影響を受けるためにＨＬＡ‐ＤＲＢ１遺伝子型の分析が一部曖昧となる点を補ってＨＬＡ‐ＤＲＢ１の遺伝子型類別の判別能力を向上させるための１７個のプローブと陰性コントロールおよび陽性コントロールとして用いられる各々１個のプローブを、総数１５５個のプローブとして各遺伝子群を区分して二重に固定化した。
【００１９】
そして、このプローブ上にＣｏｖｅｒｗｅｌｌ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ（ＳＩＧＭＡ、米国)を付着し、各遺伝子群を判別するプローブを別々に混合、反応させる
ことができるように分離させてＨＬＡオリゴヌクレオチドチップを作製した。
【００２０】
図２から図６までは、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップのＨＬＡ‐Ａ＊１１／＊３１、Ｂ＊２７、Ｃｗ＊０６、ＤＲＢ１＊０１／＊１１／ＤＲＢ３タイプに関する蛍光反応の結果を示す写真であり、図１のスライドにおける５個のチャンバで起こった反応をイメージ拡大したものである。
【００２１】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション反応の際には蛍光性のプライマーおよびプローブを用い、それらの結果の解析にはＧｅｎｅＰｉＸ４０００スキャナ（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ社、米国)を用いて、蛍光を示すプローブの種類を、ＨＬＡタイピングプ
ログラムを用いてＨＬＡ遺伝子型を分析した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を限定的に解されるべきでない実施例を通じて、さらに説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないのは当業界における通常の知識を持つ者にとっては自明であろう。
【実施例１】
【００２３】
ＨＬＡプライマーの合成およびその塩基配列
ＨＬＡ ＰＣＲプライマーは、表１に示したようにＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗはエクソ
ン（ｅｘｏｎ）２番と３番で、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１／３／４／５はエクソン２番で共通して反応できる部位を、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１はエクソン２番でＢ１＊３、＊８、＊１１、＊１２、＊１３、＊１４、＊１５、＊１６のような８種の特定遺伝子型のみを特異的に増幅できる部位を分析することにより非対称ＰＣＲにおいて用いた。
【００２４】
非対称ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーの５'末端に、ハイブリダイゼーション
反応後に蛍光反応によって確認できるようにローダミンを付着させ、あるいはハイブリダイゼーション反応後にストレプトアビジン‐シアニンと結合するようにビオチンが付着された。ここで用いたプライマーは、ドイツのＭｅｔａｂｉｏｎ社に依頼し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ３版（ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２００１年)の１０.４２に記載されたオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成された。
【００２５】
【表１−１】
2007530031.tif 000003
【００２６】
【表１−２】
2007530031.tif 000004
【実施例２】
【００２７】
ＨＬＡ ＤＮＡの抽出と非対称ＰＣＲ反応
１）ＨＬＡ ＤＮＡは、Ｇｅｎｔｒａ ｓｙｓｔｅｍｓ社のＰＵＲＥＧＥＮＥTM ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて単離した。ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ,９００μｌと血液３００μｌとを混ぜて、常温で１分間、１０回程度振盪させながら反応さ
せた後、１３,０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離し、上澄液を２０μｌくらい残して除去
した。
【００２８】
２）残っている上澄液を、１０秒間ボーテクス（ｖｏｒｔｅｘ）して白血球細胞を再浮遊させた後、ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３００μｌを加えた後、ピペット
で細胞を溶解させた。
【００２９】
３）細胞が溶解された溶液にタンパク質沈澱溶液１００μｌを加え、２０秒間ボーテクスして混ぜた後、１３,０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４）ＤＮＡが含まれている上澄液を１００％ イソプロパノールと混ぜた後、チューブ
を５０回振盪して混合し、次いで１３,０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【００３０】
５）上澄液を捨ててから７０％ エタノール３００μｌでペレットを洗浄し、１３,０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
６）上澄液を捨ててペレットを乾燥させた後、ＤＮＡ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ,１００μｌでペレットを再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）した。
【００３１】
７）表２のような方法で非対称ＰＣＲ反応を、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ 
９６００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社、米国)で実施した。
【００３２】
８）非対称ＰＣＲが終了した産物５μｌに、ゲルローディングバッファー（０.２５％ ブロモフェノール ブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ），０.２５％ キシレンシアノール（ｘｙｌｅｎｅ ｃｙａｎｏｌ） ＦＦ，１５％ フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）４
００）１μｌを加えて混合した。１μg／ｍｌ 臭化エチジウム（ＥｔＢｒ)を含有する２
％ アガロースゲルで電気泳動を行なった。ＰＣＲバンドを、ＵＶ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒが装着されたイメージアナライザ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ社、フラ
ンス)で確認した。
【００３３】
【表２】
2007530031.tif 000005
【実施例３】
【００３４】
ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップを作製するためにプローブの合成およびその塩基配列
アルデヒドガラス（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｇｌａｓｓ）上に共有結合させるためにすべてのプローブの各５'末端にアミノリンクを付着させ、ハイブリダイゼーション反応を容易
にするために１０〜２０個のオリゴ（ｄＴ)を付着した後、表３に示す塩基配列をＡｍｉ
ｎｏ ｌｉｎｋ‐Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ)10〜20に付着させた。つまり「Ａｍｉｎｏ ｌｉｎｋ
‐Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ)10〜20‐プローブ塩基配列」の順からなるプライマーを、ドイツの
Ｍｅｔａｂｉｏｎ社に依頼して合成した。このとき同定されたＨＬＡ遺伝子型の塩基配列は、表３に示したようにＨＬＡ‐Ａは２１種、ＨＬＡ‐Ｂは３６種、ＨＬＡ‐Ｃｗは１４種、およびＨＬＡ‐ＤＲは１６種の遺伝子を分析することにより決定した。
【００３５】
表４から７に示される塩基配列において、中央に大文字で表記された塩基配列が最も重要な部分である。これを中心として約１３ｂｐから３０ｂｐの大きさにしたプライマーを、Ｔｍ値とＧＣ％を考慮し約６０〜６５℃となるように合成した。
【００３６】
【表３】
2007530031.tif 000006
【００３７】
【表４−１】
2007530031.tif 000007
【００３８】
【表４−２】
2007530031.tif 000008
【００３９】
【表４−３】
2007530031.tif 000009
【００４０】
【表４−４】
2007530031.tif 000010
【００４１】
【表４−５】
2007530031.tif 000011
【００４２】
【表５−１】
2007530031.tif 000012
【００４３】
【表５−２】
2007530031.tif 000013
【００４４】
【表５−３】
2007530031.tif 000014
【００４５】
【表５−４】
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【００４６】
【表５−５】
2007530031.tif 000016
【００４７】
【表５−６】
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【００４８】
【表５−７】
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【００４９】
【表６−１】
2007530031.tif 000019
【００５０】
【表６−２】
2007530031.tif 000020
【００５１】
【表６−３】
2007530031.tif 000021
【００５２】
【表７−１】
2007530031.tif 000022
【００５３】
【表７−２】
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【００５４】
【表７−３】
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【００５５】
【表８−１】
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【００５６】
【表８−２】
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【００５７】
【表８−３】
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【実施例４】
【００５８】
ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの作製
１）オリゴヌクレオチドチップを作製するために、Ｎｕｒｉｃｅｌｌ社（大韓民国）またはＣｅｌｌ社（米国)のアルデヒドガラス・スライドを使用した。アミノ基が付着され
ているプローブ,１００ｐｍｏｌｅ／μｌと同量の３Ｘ ＳＳＣとをよく混合してスライド上に固定し、１６時間室温で反応させた。次に該スライドを０.２％ ＳＤＳで５分間２回洗浄してから、蒸溜水で５分間２回洗浄した。次いで該スライドは９５℃に加熱された蒸溜水で２分間１回洗浄した後、蒸溜水を用いて５分間１回室温で洗浄した。
【００５９】
２）水素化ホウ素ナトリウム（１.３ｇ ＮａＢＨ4、３７５ｍｌ ＰＢＳ、１２５ｍｌ 
１００％ ＥｔＯＨ)に上記スライドを５分間反応させた後、０.２％ ＳＤＳで１分間３回洗浄し、蒸溜水で１分間２回洗浄した後に室温で乾燥させた。
【００６０】
３）５個のＨＬＡ ＰＣＲ反応物を分離して反応させるために、ＳＩＧＭＡ社のＣｏｖ
ｅｒｗｅｌｌ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒを上記スライドに付着させて、チャンバ（Ｃｈａｍｂｅｒ）を分離させた。このように完成したＨＬＡオリゴヌクレオチドチップは、使用前まで室温の暗所で保管した。
【実施例５】
【００６１】
ＨＬＡ ＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーション反応
１）ローダミンまたはビオチンが結合したＨＬＡ ＰＣＲ産物と、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（３Ｘ ＳＳＣ、０.３％ ＳＤＳ)とを１:９の割合で混合した。蛍光反応を起こ
すためにビオチンを用いた場合には、ストレプトアビジン‐シアニンを１μg／ｍｌ濃度
で添加して反応させた。
【００６２】
２）チャンバを覆ったまま９０μｌのハイブリダイゼーションバッファーをスライド上のチャンバに滴下し、６２℃で１時間反応させた。
３）前記スライドを１Ｘ ＳＳＣを用いて室温で５分間洗浄し、次いで０.１Ｘ ＳＳＣ
で２分間洗浄してから室温で乾燥させた。
【００６３】
４）結果の確認
スキャナ（ＧｅｎｅＰｉＸ４０００、Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国)を使用し、蛍光を示すプローブを本発明者が開発したＨＬＡタイピングプログラムを用いてＨＬＡ遺伝子型を解析した。
【００６４】
表４から７に示される塩基配列において、中央に大文字で表記された塩基配列が最も重要な部分であって、これを中心として約１３ｂｐから３０ｂｐの大きさにしたプライマーを、Ｔｍ値とＧＣ％を考慮して６０〜６５℃となるように合成した。
【００６５】
その結果を図２〜図６に示した。これらの図においては、ＰＣＲとハイブリダイゼーション反応の際に蛍光性のプライマーおよびプローブを用い、結果の解析には、ＧｅｎｅＰｉＸ４０００スキャナ（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国)を使用して蛍光を示すプローブを本発明者が開発したＨＬＡタイピングプログラムを用いてＨＬＡ遺伝子型を解析した。
【００６６】
ＨＬＡタイピングプログラムは、本発明のＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの各「チャンバ」に位置したプローブの結果を分析して、適切に正規化する（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）方法を生みだす。該プログラムは陰陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を判別することができる境界値のような概念を取り入れた中間帯（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｚｏｎｅ）を生じる。その境界値を基準として各プローブの陰陽性が判別
される。プローブの陰陽性形態（ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｉｔｙ）をプログラム内に格納された陰陽性形態の対照表と比べることにより一致するＨＬＡ遺伝子型を調べることができるように開発した。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明ではＨＬＡ遺伝子を解析してＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ、‐ＤＲ遺伝子型を診断するオリゴヌクレオチドチップが開発された。これを用いたＨＬＡ遺伝子型の分析は、既存の商品化されているキットに比べて、人件費、材料費および時間が著しく節減できる。すなわち既存の検査方法およびキットは、ＨＬＡ タイピングにおいてＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ
、‐Ｃｗ、‐ＤＲ遺伝子型を同時に分析することができないため、それぞれ別途で試験を行わなければならないという煩雑さがあったが、本発明のＨＬＡ ＤＮＡ チップを用いれば一回の実験でＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ、‐Ｃｗ、‐ＤＲ遺伝子型がすべて判別されるだけでなく、ＨＬＡ対立遺伝子の数が多くなってもプローブをスライド上に高密度で固定化するため、一つのスライドだけでも充分である。さらに本発明方法は蛍光物質を使用するものであるため、発色工程が要らないだけでなく、従来方法の試験で必要とされる段階、すなわち洗浄、発色反応などが省略されるため、結果を見るまでの時間が非常に短縮される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップのスライド全体を示す写真である。
【図２−ａ】図２ａは、ＨＬＡ‐Ａ＊１１型とＨＬＡ‐Ａ＊３１型とを同時に有する試料に対する、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの蛍光反応の結果を示す写真である。４１個のプローブの中で表４の「反応ＨＬＡ型」に示されるように、Ａ＊１１型に関連した１３番、１４番、１５番、１７番、１８番、２３番、２９番、３０番、３３番のプローブと、Ａ＊３１型に関連した１１番、１３番、１５番、１８番、２１番、２５番、２６番、２９番、３２番、３９番、４０番のプローブについて同時に陽性反応が起きたものである。また、プローブ０１番と４１番は陽性コントロールとしてすべての反応で現われるようにし、ならびにプローブ０６番は陰性コントロールとしていずれの反応でも現われないようにすることによって、実験の正確性を確認することができる。それぞれ２個の同一の点が現われるようにしたのは、間違いを減らし正確を期するために同一プローブを二重に固定化したためである。
【図２−ｂ】図２ｂは、スライド上に固定化したプローブの位置を示したものである。
【図３−ａ】図３ａは、ＨＬＡ‐Ｂ＊２７型を有する試料に対する、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの蛍光反応の結果を示す。４８個のプローブの中で表５の「反応ＨＬＡ型」に示されるように、Ｂ＊２７型に関連した０９番、１２番、２１番、３０番、３１番、３２番、３６番、３７番、４２番、４７番のプローブに陽性反応が起きた。また、プローブ０１番は陽性コントロールとしてすべての反応で現われるようにし、ならびにプローブ０６番は陰性コントロールとしていずれの反応でも現われないようにすることによって、実験の正確性を確認することができる。それぞれ２個の同一の点が現われるようにしたのは、間違いを減らし正確を期するために同一プローブを二重に固定化したためである。
【図３−ｂ】図３ｂは、スライド上に固定化したプローブの位置を示したものである。
【図４−ａ】図４ａは、ＨＬＡ‐Ｃｗ＊０６を有する試料に対する、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの蛍光反応の結果を示す。２３個のプローブの中で表６の「反応ＨＬＡ型」に示されるように、Ｃｗ＊０６と関連した０６番、０８番、１３番、１７番のプローブに陽性反応が起きた。また、プローブ０１番と２３番は陽性コントロールとしてすべての反応で現われるようにし、ならびにプローブ０４番は陰性コントロールとしていずれの反応でも現われないようにすることによって、実験の正確性を確認することができる。それぞれ２個の同一の点が現われるようにしたのは、間違いを減らし正確を期するために同一プローブを二重に固定化したためである。
【図４−ｂ】図４ｂは、スライド上に固定化したプローブの位置を示したものである。
【図５−ａ】図５ａは、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１タイプとＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊１１タイプを同時に有する試料に対する、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの蛍光反応の結果を示す写真である。４１個のプローブの中で表７の「反応ＨＬＡ型」に示されるように、ＤＲＢ１＊０１型に関連した０７番、１０番プローブと、ＤＲＢ１＊１１型に関連した０４番、１０番、１３番、１６番プローブと、ＤＲＢ１＊１１型とともに遺伝されるＤＲＢ３型に関連した１６番、２４番プローブに同時に陽性反応が起きた。また、プローブ０１番は陽性コントロールとしてすべての反応で現われるようにし、ならびにプローブ０５番は陰性コントロールとしていずれの反応でも現われないようにすることによって、実験の正確性を確認することができる。それぞれ２個の同一の点が現われるようにしたのは、間違いを減らし正確を期するために同一プローブを二重に固定化したためである。
【図５−ｂ】図５ｂは、スライド上に固定化したプローブの位置を示したものである。
【図６−ａ】図６ａは、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１タイプとＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊１１タイプとを同時に有する試料に対する、ＨＬＡオリゴヌクレオチドチップの蛍光反応の結果を示す。１９個のプローブの中で表８の「反応ＨＬＡ型」に示されるように、選択的に増幅されるＤＲＢ１＊１１型に関連した０７番、１０番、１３番のプローブに同時に陽性反応が起きた。また、プローブ０１番は陽性コントロールとしてすべての反応で現われるようにし、ならびにプローブ０４番は陰性コントロールとしていずれの反応でも現われないようにすることによって、実験の正確性を確認することができる。それぞれ２個の同一の点が現われるようにしたのは、間違いを減らし正確を期するために同一プローブを二重に固定化したためである。
【図６−ｂ】図６ｂは、スライド上に固定化したプローブの位置を示したものである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
2007530031.tif 000038
【図６ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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