(57)【要約】  本発明は、ヒトＯＡＴＰ−Ｃにおける多型が、人体におけるスタチン薬物動態（ＰＫ）、特にロスバスタチン薬物動態に対する影響と関連していることから、スタチン療法におけるそれらの使用に関するものである。本発明はまた、肝臓への取込がＯＡＴＰ−Ｃを介するものであるスタチン、特にロスバスタチンの有効性および安全性の予測におけるＯＡＴＰ−Ｃ多型の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送される治療剤による処置を必要とするものとして確認されたヒトからの生物学的サンプルであって、ＯＡＴＰ−Ｃをコード化する核酸を含むサンプルを提供し、
（ｂ）少なくとも１個の対立遺伝子における、
（ｉ）配列番号１の１７４位に対応する位置にあるアラニンをコード化するコドン、または
（ii）（ｉ）との連鎖不平衡にある多型の対立遺伝子
の存在について核酸を試験し、そして
（ｃ）（ｉ）または（ii）が少なくとも１個の対立遺伝子から見出される場合、細胞へ治療剤を輸送する能力が低下した可能性があるものとしてヒトを診断する
ことを含む診断方法。
【請求項２】
（ｂ）（ii）の多型が、−２６Ａ＞Ｇ、−１１８Ａ＞Ｃ、−３０９Ｔ＞Ｃ、−８７８Ａ＞Ｇ、−９０３Ｃ＞Ｔ、−１０５４Ｇ＞Ｔ、−１２１５Ｔ＞Ａ、または−１５５８Ｔ＞Ｃ、全て配列番号２、またはＴ２１２２Ｇ、Ｃ２１５８Ｔ、Ａ２５２５Ｃ、またはＧ２６５１Ａ、全て配列番号３である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）（ii）の多型が、配列番号２の−１１８Ａ＞Ｃおよび−１５５８Ｔ＞Ｃから選択される、請求項１から２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
治療剤がスタチンであり、ヒトが一用量レベルのスタチンで処置されており、さらに段階（ｃ）が、細胞へのスタチン輸送能力の低下に起因する利益−危険比の減少についてのモニターを含む別のスタチン高用量レベルへのタイトレーションに適切なものとしてヒトを診断することを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
治療剤がロスバスタチンである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
治療剤が、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチンまたはシムバスタチンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヒトを１日当たり少なくとも５ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ヒトを１日当たり少なくとも１０ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項５記載の方法。
【請求項９】
ヒトを１日当たり少なくとも２０ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
ヒトを１日当たり少なくとも４０ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）ＯＡＴＰ−Ｃにより細胞へ輸送される治療剤による処置を必要とするものとして確認されたヒトからの生物学的サンプルであって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドを含むサンプルを提供し、
（ｂ）配列番号１の１７４位に対応するＯＡＴＰ−Ｃのアミノ酸がバリンであるか否かを測定し、そして
（ｃ）アミノ酸がバリンではない場合、細胞へ治療剤を輸送する能力が低下した可能性があるものとしてヒトを診断する
ことを含む診断方法。
【請求項１２】
治療剤がスタチンであり、ヒトが一用量レベルのスタチンで処置されており、さらに段階（ｃ）が、細胞へのスタチン輸送能力の低下に起因する利益−危険比の減少についてのモニターを含む別のスタチン高用量レベルへのタイトレーションに適切なものとしてヒトを診断することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに１７４位にバリンおよび／またはアラニンを伴うＯＡＴＰＣポリペプチドのレベルを測定することにより、ＯＡＴＰ−Ｃ核酸における−１１８Ａ＞Ｃ多型の存在または非存在を決定することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、ＯＡＴＰ−Ｃ＊１５対立遺伝子の存在または非存在についてＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドを測定することにより、ＯＡＴＰ−Ｃ核酸における−１１８Ａ＞Ｃ多型の存在または非存在を決定することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
１７４位のアミノ酸がアラニンであると決定されている、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
治療剤がロスバスタチンである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
治療剤が、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチンまたはシムバスタチンである、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトを１日当たり少なくとも５ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ヒトを１日当たり少なくとも１０ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
ヒトを１日当たり少なくとも２０ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
ヒトを１日当たり少なくとも４０ｍｇのロスバスタチンにより処置している、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＯＡＴＰ−Ｃにおける多型が、ヒトにおけるスタチン薬物動態（ＰＫ）、特にロスバスタチン薬物動態に対する効果と関連していることから、スタチン療法でのそれらの使用に関するものである。本発明はまた、肝臓へのその取込がＯＡＴＰ−Ｃを介するものであるスタチン類、特にロスバスタチンの有効性および安全性の予測におけるＯＡＴＰ−Ｃ多型の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子（ＬＳＴ１、ＯＡＴＰ２、ＳＬＣＯ１Ｂ１、ＳＬＣ２１Ａ６またはＯＡＴＰ１Ｂ１と呼ばれることもある）は、異なる４グループによりクローン化され、ＥＭＢＬ受入番号ＡＢ０２６２５７（ＯＡＴＰ−Ｃ、２４５２ｂｐ）、ＡＦ２０５０７１（ＯＡＴＰ２、２８３０、本明細書における配列表）、ＡＪ１３２５７３（ＯＡＴＰ２、２７７８）、およびＡＦ０６０５００（ＬＳＴ−１）として注釈および公開されている。Konig（２０００）J Biol Chem ２７５、２３１６１−２３１６８は、ＯＡＴＰ１、２および８のゲノム構成について報告している。国際特許出願ＷＯ００／０８１５７号は、ヒトアニオン輸送体遺伝子および若干の多型について記載している。
【０００３】
Ｎａ＋非依存性有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）Ｃ遺伝子は、有機アニオンの多機能輸送に関与するＯＡＴＰ超遺伝子ファミリーの一員である。ＯＡＴＰ−Ｃは、多様な範囲の分子、例えば有機アニオンタウロコール酸、複合ステロイド：ＤＨＥＡＳ、エストラジオール１７β−Ｄ−グルコロニドおよびエストロン−３−サルフェート、エイコサノイド：ＰＧＥ２、トロンボキサンＢ２、ロイコトリエンＣ４およびＥ４、および甲状腺ホルモンＴ４およびＴ３を輸送する。ＯＡＴＰ−Ｃはまた、生体内異物、および脂質低下に関与する薬物、例えばスタチン類の輸送に関与することが示されている。スタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を阻害する薬剤の種類である。それらは、アテローム性動脈硬化症の患者にとっては重要な治療法であり、一般的に耐容性良好であるが、全市販スタチンにおいて稀に見られる有害な事象が注目されている。スタチン間における薬物動態の差異は、利益−危険比の差異と関連している（Igel（２００２）J Clin Pharmacol ４２：８３５−４５）。
【０００４】
一般的に、スタチン治療から最大の利益−危険比を得るためには、処方用量を治療目標および応答に応じて個別に配慮すべきであると勧告されている。例えば、推奨されるロスバスタチンの通常出発用量は、高コレステロール血症および混合脂質代謝異常患者の場合１日１回１０ｍｇであるが、５ｍｇ用量も利用可能である。著しい高コレステロール血症（ＬＤＬ−Ｃ＞１９０ｍｇ／ｄＬ）および強度の脂質標的を示す患者については、２０ｍｇの出発用量が考えられ得る。２０ｍｇで目標ＬＤＬ−Ｃを達成しなかった患者については、４０ｍｇ用量を確保するべきである。ロスバスタチンの治療開始後および／またはタイトレーション時、２〜４週間以内に脂質レベルを分析し、それに応じて投薬量を調節するべきである。
【０００５】
プラバスタチンは、ＯＡＴＰ−Ｃ輸送体を介して循環系から肝臓へ能動輸送される（Hsiang、B.Journal of Biological Chemistry、２７４（５２）、３７１６１−３７１６８、１９９９）。ロスバスタチンは、インビトロでＯＡＴＰ−Ｃについての基質であることが示された（Brown（２００１）Atherosclerosis Supplements ２、９０頁、ポスター・アブストラクトＰ１７４）。ＯＡＴＰ−Ｃにおける非常に多数の多型は、文献およびＳＮＰデータベースで報告されている。ＯＡＴＰ−ＣにおけるＳＮＰの同定は、欧州特許第１１８６６７２号で報告されている。ＯＡＴＰ−Ｃにおける多型は、Tamai et al（２０００）、BBRC、２７３、２５１−６０により報告され、Tirona（２００２）Adv Drug Deliery Reviews ５４：１３４３−５２に概説されている。Tironaは、Ｖ１７４Ａ変異型を含むＯＡＴＰ−Ｃ多型の中には、インビトロでの内在性基質の輸送低下と関連しているものもあることを示した。異なる細胞系を用いることにより、Nozawa et al（２００１）J Pharmacol Exp Ther、３０２、８０４−１３は、Ｖ１７４Ａ（ＯＡＴＰＣ＊５）変異型が基質輸送には影響しないことを見出した。Tironaは、ＯＡＴＰ−Ｃ多型のインビボ関連性については依然として測定されていないと述べている。
【０００６】
Niemi et al（２００４年７月）Pharmacogenetics １４（７）、４２９−４４０は、プロモーターＳＮＰを含むＯＡＴＰＣにおけるＳＮＰについて記載している。著者らは、健康なボランティアのコーホートにおけるプラバスタチンＰＫ（薬物動態）とプロモーターＳＮＰを含むハプロタイプ間の顕著な相関関係を報告している。
【０００７】
Nishizato（２００３）Clin Pharmacol Ther ７３：５５４−６５は、Ｎ１３０ＤおよびＶ１７４多型の両方を含むＯＡＴＰＣ＊１５対立遺伝子が、健康な日本人ボランティアにおけるプラバスタチンの薬物動態に対して効果があることを示すインビボデータを発表した。Nishizatoは、日本人集団からは現在までのところ検出されたことのないＯＡＴＰ−Ｃ＊５対立遺伝子の効果について報告したのではなく、この効果を調べるには大規模な臨床試験が必要であると述べていた。プラバスタチンを摂取している患者においてこれまでに薬物動態試験が実施されたことはない。健康なボランティアまたはロスバスタチンを摂取している患者に関する薬理遺伝学試験も実施されたことはない。このため、健康な日本人ボランティアで実施されたNishizato et alの観察は、患者または他集団のＰＫプロファイル、または種々の輸送体についての親和力が異なり得る他のスタチンのＰＫプロファイルを予測するものではない。
【０００８】
ロスバスタチン臨床開発プログラムでアストラゼネカが集めたデータを用いた集団ＰＫモデリング解析により、健康なボランティアと患者は、ロスバスタチンの分布の点で異なることが確認されている。脂質を低下させるためスタチンを投与されている患者は、ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送される他の薬剤を服用している可能性があり、そのため薬剤−薬剤相互作用は、スタチンのＰＫプロファイルに影響を及ぼし得る（Int J Clin Pharmacol Ther （２００２）、４０、４３９−５０）。スタチンが処方された患者はまた、スタチンの分布および排出に影響する他の肝臓および腎臓合併症を有し得る。テキストブックのClinical Pharmacokinetics（第１６章、１９９５年度第３版における２４８−２６６頁、Rowland & Tozer、Williams & Wilkinsにより出版）には、「病気は、薬剤応答の変動をもたらす主原因である。多くの病気の場合、これは主として薬物動態の差異に起因する…」から始まる完全な一章がある。
【０００９】
このため、ＯＡＴＰ−Ｃにおけるどの多型が、血管疾患またはその素因を有する患者においてロスバスタチンおよび他のスタチンのインビボ薬物動態に効果を有するかを確認することが要望されている。我々の発明は、Ｖ１７４Ａ多型および／またはそれと連鎖不平衡にある多型が患者におけるスタチン薬物動態に統計的に有意な効果を有するという発見に基いている。Ｖ１７４Ａ多型は、スタチン類、特にロスバスタチンへの応答に影響を及ぼし得る。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の一側面によると、
ａ）ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送される治療剤による処置を必要とするものとして確認されたヒトからの生物学的サンプルであって、ＯＡＴＰ−Ｃをコード化する核酸を含むサンプルを提供し、
（ｂ）少なくとも１個の対立遺伝子における、
（ｉ）配列番号１の１７４位に対応する位置にあるアラニンをコード化するコドン、または
（ii）（ｉ）との連鎖不平衡にある多型の対立遺伝子
の存在について核酸を試験し、そして
（ｃ）（ｉ）または（ii）が少なくとも１個の対立遺伝子から見出される場合、細胞へ治療剤を輸送する能力が低下した可能性があるものとしてヒトを診断する
ことを含む診断方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、（ｂ）（ii）の多型は、−２６Ａ＞Ｇ、−１１８Ａ＞Ｃ、−３０９Ｔ＞Ｃ、−８７８Ａ＞Ｇ、−９０３Ｃ＞Ｔ、−１０５４Ｇ＞Ｔ、−１２１５Ｔ＞Ａ、または−１５５８Ｔ＞Ｃ、全て配列番号２、またはＴ２１２２Ｇ、Ｃ２１５８Ｔ、Ａ２５２５Ｃ、またはＧ２６５１Ａ、全て配列番号３である。
【００１２】
さらに好ましくは、（ｂ）（ii）の多型は、配列番号２の−１１８Ａ＞Ｃまたは−１５５８Ｔ＞Ｃである。−１１８および−１５５８における多型の対立遺伝子は、配列番号１の１７４位にあるアラニン対立遺伝子と顕著な連鎖不平衡にある（それぞれｐ＝０.００９および０.０２５、ＡＳＳＯＣＩＡＴＥプログラムにより解析、Ott J（１９９９）Analysis of human genetic linkage、第３版参照。ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・プレス、バルチモア）。
【００１３】
最も好ましくは、（ｂ）（ii）の多型は、配列番号２の−１１８Ａ＞Ｃである。後記実施例２はこの多型の機能的効果について記載している。
【００１４】
変異型の位置、例えば−２６Ａ＞Ｇについて言えば、これは２６位においてＡがＧにより置換されていることを示す。これは、その位置にＧを検出するかまたはその位置にＡが存在しないことを検出することにより試験され得る。どの変異型の位置についても同様の考え方が適用される。
【００１５】
好ましくは、治療剤はスタチンであり、ヒトは一用量レベルのスタチンで処置されており、さらに段階（ｃ）は、細胞へのスタチン輸送能力の低下に起因する利益−危険比の減少についてのモニターを含む別のスタチン高用量レベルへのタイトレーションに適切なものとしてヒトを診断することを含む。
【００１６】
さらに好ましくは、治療剤はロスバスタチンである。
【００１７】
別の実施態様において、治療剤は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチンまたはシムバスタチンのうちの一つである。
【００１８】
好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも５ｍｇのロスバスタチンにより処置する。さらに好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも１０ｍｇのロスバスタチンにより処置する。さらに好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも２０ｍｇのロスバスタチンにより処置する。さらに好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも４０ｍｇのロスバスタチンにより処置する。
【００１９】
本発明の別の側面によると、
（ａ）ＯＡＴＰ−Ｃにより細胞へ輸送される治療剤による処置を必要とするものとして確認されたヒトからの生物学的サンプルであって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドを含むサンプルを提供し、
（ｂ）配列番号１の１７４位に対応するＯＡＴＰ−Ｃのアミノ酸がバリンであるか否かを測定し、そして
（ｃ）アミノ酸がバリンではない場合、細胞へ治療剤を輸送する能力が低下した可能性があるものとしてヒトを診断する
ことを含む診断方法が提供される。
【００２０】
好ましくは、治療剤はスタチンであり、ヒトは一用量レベルのスタチンで処置されており、さらに段階（ｃ）は、細胞へのスタチン輸送能力の低下に起因する利益−危険比の減少についてのモニターを含む別のスタチン高用量レベルへのタイトレーションに適切なものとしてヒトを診断することを含む。
【００２１】
好ましくは、本発明方法は、さらに１７４位にバリンおよび／またはアラニンを伴うＯＡＴＰＣポリペプチドのレベルを測定することにより、ＯＡＴＰ−Ｃ核酸における−１１８Ａ＞Ｃ多型の存在または非存在を決定することを含む。
【００２２】
好ましくは、本発明方法は、さらにＯＡＴＰ−Ｃ＊１５対立遺伝子の存在または非存在についてＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドのレベルを測定することにより、ＯＡＴＰ−Ｃ核酸における−１１８Ａ＞Ｃ多型の存在または非存在を決定することを含む。
【００２３】
理論的な考え方に拘束されるわけではないが、ＯＡＴＰＣの種々の対立遺伝子形態の各々についてタンパク質発現レベルが測定され得、Ａｌａ１７４変異型の発現レベルは、結合した−１１８Ｃプロモーター変異型の存在下でプロモーター活性が高められるために増加することがわかる。例えば、Ｖａｌ１７４：Ａｌａ１７４タンパク質イソ型の比率を測定することにより、Ａｌａ１７４機能低下タンパク質は、アミノ酸配列１７４位でのヘテロ接合体対象においてはＶａｌ１７４正常機能輸送体より多く存在することがわかる。別の例では、Ａｌａ１７４ホモ接合体対象においてＯＡＴＰＣ発現の絶対レベルを測定し、そしてその絶対発現レベルを、Ｖａｌ１７４変異型に関するホモ接合体対象についての集団平均の場合と比較することにより、Ａｌａ１７４対立遺伝子の相対発現が、−１１８Ａプロモーター変異型と結合されたＡｌａ１７４対立遺伝子と比べて、−１１８Ｃ結合プロモーター対立遺伝子の存在下では高められることがわかる。別の例では、Ａｌａ１７４ホモ接合体対象においてＯＡＴＰＣ発現の絶対レベルを測定し、その絶対発現レベルを集団平均の場合と比較することにより、ＯＡＴＰＣ発現が最高レベルであるＡｌａ１７４ホモ接合体対象は、ＯＡＴＰＣプロモーターの少数対立遺伝子形態の転写活性増加を通して−１１８Ｃプロモーター変異型の１つまたはそれ以上のコピーを有するものと予測され得る。
【００２４】
好ましくは、１７４位のアミノ酸はアラニンであると測定されている。さらに好ましくは、治療剤はロスバスタチンである。
【００２５】
別の実施態様において、治療剤は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチンまたはシムバスタチンのうちの一つである。
【００２６】
好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも５ｍｇのロスバスタチンにより処置する。さらに好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも１０ｍｇのロスバスタチンにより処置する。さらに好ましくは、ヒトを１日当たり少なくとも２０ｍｇのロスバスタチンにより処置する。ヒトを１日当たり少なくとも４０ｍｇのロスバスタチンにより処置する。
【００２７】
本発明の一側面によると、最小限推奨用量レベルを越えるスタチン用量レベルを必要とする可能性がある患者を同定するかまたは最小限推奨用量レベルを超えるスタチン用量レベルへのタイトレーションをモニターするべき患者を同定するインビトロ診断方法であって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドおよび／またはそれと連鎖不平衡である多型の１７４位におけるアラニンの存在について患者からの生物学的サンプルを試験することを含む方法が提供される。
【００２８】
生物学的サンプルは、好都合には個体から得られる血液、気管支肺胞洗浄液、唾液、肝臓または他の体液または組織のサンプルである。試験サンプルは、試験サンプルにおける配列に対応する核酸配列と均等内容であり得る、すなわちサンプルの核酸における領域の全部または一部は、対立遺伝子変異解析の前に、好都合な技術、例えばＰＣＲを用いて最初に増幅され得るものとする。好ましくは、直接ポリペプチド解析により、またはポリペプチドをコード化する遺伝物質の解析を通して１７４位におけるアラニンの存在について患者を試験する。患者は２コピーのＯＡＴＰＣ遺伝子をもつため、彼らはホモ接合またはヘテロ接合遺伝子型であり得る。１７４位のアラニンと連鎖不平衡にある多型は、直接１７４位におけるアラニンの存在を測定する代替手段として試験され得る。
【００２９】
本発明の１つまたはそれ以上の多型位置における変異型ヌクレオチドの存在または非存在の検出に使用され得る多数の解析手順があることは、当業者であれば容易に理解できるはずである。一般に、対立遺伝子変異の検出は、突然変異識別技術、所望により増幅反応および所望によりシグナル発生系を必要とする。表１は、若干の突然変異検出技術を列挙しており、中にはＰＣＲに基くものもある。これらは、若干のシグナル発生系と組合わせて使用され得、その選択は表２に列挙されている。さらなる増幅技術は、表３に列挙されている。対立遺伝子変異の多くの現行検出方法については、Nollau et al.、Clin.Chem.４３、１１１４−１１２０（１９９７）および標準テキストブック、例えばLaboratory Protocols for Mutation Detection、U.Landegren編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（１９９６）および PCR、Newton & Grahamによる第２版、ＢＩＯＳ サイエンティフィック・パブリッシャーズ・リミテッド（１９９７）により概説されている。
【００３０】
【表１】
2007500005.tif 000002
【００３１】
表１−突然変異検出技術
一般：ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定
走査：ＰＴＴ＊、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、クリーバーゼ（Cleavase）、ヘテロ２本鎖解析、ＣＭＣ、酵素ミスマッチ（誤対合）開裂
＊注：プロモーター多型の検出に有用ではない。
【００３２】
ハイブリダイゼーション法
固相ハイブリダイゼーション：ドット・ブロット、ＭＡＳＤＡ、リバース・ドット・ブロット、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）
液相ハイブリダイゼーション：Ｔａｑｍａｎ（登録商標）−米国特許第５２１００１５号および米国特許第５４８７９７２号（Hoffmann-La Roche）、分子ビーコン−Tyagi et al（１９９６）、Nature Biotechnology、１４、３０３；国際公開第９５／１３３９９号（パブリック・ヘルス・インスティテュート、ニューヨーク）
伸長法：ＡＲＭＳ（登録商標）、ＡＬＥＸ（登録商標）−欧州特許第ＥＰ３３２４３５Ｂ１号（ゼネカ・リミテッド）、ＣＯＰＳ−Gibbs et al（１９８９）、Nucleic Acids Research、１７、２３４７。
取込法：ミニ−シーケンシング、ＡＰＥＸ
制限酵素法：ＲＦＬＰ、制限部位生成ＰＣＲ
連結反応法：ＯＬＡ
その他：インベーダー検定法
【００３３】
表２−シグナル発生または検出システム
蛍光法：ＦＲＥＴ、蛍光消光、蛍光偏光−英国特許第２２２８９９８号（ゼネカ・リミテッド）
その他：化学発光、電気化学発光、ラマン、放射能、比色、ハイブリダイゼーション保護検定法、質量分析法
【００３４】
表３−さらに別の増幅方法
ＳＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ｂ−ＤＮＡ
【００３５】
表４−タンパク質変異検出方法
イムノアッセイ
免疫組織学
ペプチドシーケンシング
【００３６】
好ましい突然変異検出技術には、ＡＲＭＳ（登録商標）、ＡＬＥＸ（登録商標）、ＣＯＰＳ、Ｔａｑｍａｎ、分子ビーコン、ＲＦＬＰ、および制限部位に基くＰＣＲおよびＦＲＥＴ技術がある。イムノアッセイ技術は当業界では公知であり、例えばD M Kemenyによる A Practical Guide to ELISA、ペルガモン・プレス、１９９１；Principles and Practice of Immunoassay、第２版、C P Price & D J Newman、１９９７、アメリカ合衆国およびカナダのストックトン・プレスおよび英国のマクミラン・レファレンスにより出版。組織学的技術は、J D Bancroft & A StevensによるTheory and Practice of Histological Techniques、第４版、チャーチル・リビングストン（１９９６）に記載されている。タンパク質配列決定は、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、９巻、第２版、Sequencing of Proteins and Peptides、G Allen、第２改訂版、エルセビア（１９８９）に記載されている。
【００３７】
特に好ましい方法には、ＡＲＭＳ（登録商標）およびＲＦＬＰに基く方法がある。ＡＲＭＳ（登録商標）は、特に好ましい方法である。
【００３８】
抗体は、任意の適切な方法を用いて製造され得る。例えば、精製ポリペプチドは、特異抗体の製造に使用され得る。「抗体」の語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および様々なタイプの抗体構築物、例えばＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂおよび１本鎖Ｆｖを包含するものとする。抗体が約１０７Ｍ−１と同等またはそれより大きいＫａでＯＡＴＰ−Ｃの対立遺伝子変異型と結合する場合、それらは特異的に結合していると定義される。結合の親和力は、慣用的技術、例えばScatchard et al.、Ann.N.Y.Acad.Sci.、５１：６６０（１９４９）に記載されたものを用いて測定され得る。
【００３９】
ポリクローナル抗体は、当業界でよく知られている手順を用いて、様々な供給源、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから容易に作製され得る。一般に、抗原は、典型的には非経口注射を通じて宿主動物に投与される。抗原の免疫原性は、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。ブースター免疫化後、血清の小試料を集め、抗原に対する反応性について試験する。上記測定に有用な様々な検定法の例には、Antibodies：A Laboratory Manual、Harlow および Lane（編）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８８）に記載された方法；並びに例えば向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロット検定法、およびサンドイッチ検定法といった方法がある、米国特許第４３７６１１０および４４８６５３０号参照。
【００４０】
モノクローナル抗体は、公知手順を用いて容易に作製され得る、例えば、米国特許第ＲＥ３２０１１号、同第４９０２６１４号、同第４５４３４３９号および同第４４１１９９３号；Monoclonal Antibodies,Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses、プレナム・プレス、Kennett、McKearn、およびBechtol（編）（１９８０）に記載された手順参照。
【００４１】
モノクローナル抗体は、別の技術、例えばAlting-Mees et al.、“Monoclonal Antibody Expression Libraries：A Rapid Alternative to Hybridomas”、Strategies in Molecular Biology ３：１−９（１９９０）（出典明示により援用する）により記載された技術を用いても製造され得る。同様に、結合パートナーは、特異結合抗体をコード化する遺伝子の可変域を組込む組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る。かかる技術は、Larrick et al.、Biotechnology、７：３９４（１９８９）に記載されている。
【００４２】
単離および精製後、抗体を用いることにより、確立された検定プロトコールを用いて試料における特定ポリペプチド変異型の存在が検出され得る、例えば英国オックスフォード、ペルガモン・プレス、D.M.Kemenyによる“A Practical Guide to ELISA”参照。
【００４３】
人体での使用が既に承認されているスタチンには、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチンおよびシムバスタチンがある。さらなる情報については、以下の参考文献を参照：Drug and Therapy Perspectives （１９９７年５月１２日）、９：１−６；Chong（１９９７）Pharmacotherapy １７：１１５７−１１７７；Kellick（１９９７）Formulary ３２：３５２；Kathawala（１９９１）Medicinal Research Reviews、１１：１２１−１４６；Jahng（１９９５）Drugs of the Future ２０：３８７−４０４、および Current Opinion in Lipidology、（１９９７）、８、３６２−３６８。好ましいスタチン薬剤は、Watanabe（１９９７）Bioorganic and Medicinal Chemistry ５：４３７−４４４における化合物３ａ（Ｓ−４５２２）；いわゆるロスバスタチンであり、Olsson（２００１）American Journal of Cardiology、８７、補遺１、３３−３６頁参照。
【００４４】
好ましくは、スタチンはロスバスタチンである。好ましくは、患者には１日当たり少なくとも４０ｍｇのロスバスタチンを処方し、さらに好ましくは、患者には１日当たり少なくとも６０ｍｇのロスバスタチンを処方し、特に患者には１日当たり少なくとも８０ｍｇのロスバスタチンを処方する。
【００４５】
好ましくは、患者をＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドの１７４位におけるバリンの存在について追加試験し、１７４位におけるバリンおよびアラニンの両方の存在は、この遺伝子座におけるヘテロ接合性を示す。
【００４６】
好ましくは、アラニン１７４ ＯＡＴＰ−Ｃと連鎖不平衡にある多型は、
ａ）Ａｓｐ１３０ ＯＡＴＰ−Ｃ；または
ｂ）転写開始部位（配列番号２）に対して−２６Ａ＞Ｇまたは−１１８Ａ＞Ｃの位置にある共通ＮＦ１転写因子結合部位；または
ｃ）−３０９Ｔ＞Ｃ、−８７８Ａ＞Ｇ、−９０３Ｃ＞Ｔ、−１０５４Ｇ＞Ｔ、−１２１５Ｔ＞Ａまたは−１５５８Ｔ＞Ｃ（これらのヌクレオチド位置は転写開始部位（配列番号２）に対するものである）、または
ｄ）Ｔ２１２２Ｇ、Ｃ２１５８Ｔ、Ａ２５２５Ｃ、およびＧ２６５１Ａから選択されるＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子の３'ＵＴＲ領域における多型（このヌクレオチド位置はＡＴＧに対するものであり、ＡＴＧのＡはヌクレオチド＋１である（配列受入番号ＡＦ２０５０７１および配列番号３））
のうちの少なくとも一つから選択される。
【００４７】
転写開始部位は、Jung,D.２００１ Journal of Biological Chemistry、２７６（４０）、３７２０６−３７２１４で特定されている。
【００４８】
一実施態様では、ポリペプチドをコード化する遺伝物質の解析を通じてＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドのある位置におけるアミノ酸の存在について生物学的サンプルを試験する。
【００４９】
本発明の別の側面は、スタチン療法に関連した有害事象に関する患者のインビトロモニター方法であって、有害事象を示すパラメーターについて患者からの生物学的サンプルを試験することを含み、患者が本明細書記載の方法により上記モニターについて選択される方法を提供する。
【００５０】
好ましくは、患者はＯＡＴＰＣ＊５または１５遺伝子型である。患者は２コピーのＯＡＴＰＣ遺伝子をもつため、彼らはホモ接合またはヘテロ接合遺伝子型であり得る。
【００５１】
本発明の別の側面によると、ヒトでのＯＡＴＰＣにおける多型の検出方法であって、以下の多型位置：
ａ）転写開始部位に対して−２６Ａ＞Ｇまたは−１１８Ａ＞Ｃの位置にある共通ＮＦ１転写因子結合部位；または
ｂ）−３０９Ｔ＞Ｃ、−８７８Ａ＞Ｇ、−９０３Ｃ＞Ｔ、−１０５４Ｇ＞Ｔ、−１２１５Ｔ＞Ａまたは−１５５８Ｔ＞Ｃ（これらのヌクレオチド位置は転写開始部位に対するものである）、または
ｃ）Ｔ２１２２Ｇ、Ｃ２１５８Ｔ、Ａ２５２５Ｃ、およびＧ２６５１Ａから選択されるＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子の３'ＵＴＲ領域における多型（このヌクレオチド位置はＡＴＧに対するものであり、ＡＴＧのＡはヌクレオチド＋１である（配列受入番号ＡＦ２０５０７１および配列番号３））
の少なくとも一つにおけるヒトの配列を決定することを含む方法が提供される。
【００５２】
本発明の別の側面によると、本発明で特定された位置の一つまたはそれ以上において変異型対立遺伝子多型を含むヒトＯＡＴＰＣ遺伝子またはその相補鎖または少なくとも１つの新規多型を含む少なくとも２０塩基対のそのフラグメントが提供される。
【００５３】
本発明の別の側面によると、好ましくは本発明で特定された位置の一つまたはそれ以上においてＯＡＴＰＣ遺伝子多型を検出し得る対立遺伝子特異的プライマーが提供される。
【００５４】
対立遺伝子特異的プライマーは、増幅反応、例えばＰＣＲ反応において、一般的には一定のプライマーと一緒に使用され、例えばＡＲＭＳ（登録商標）検定法に使用された要領で特定配列位置における一対立遺伝子の選択的増幅を通して対立遺伝子間の区別を可能にする。対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００５５】
対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは検出すべき対立遺伝子と正確に対応するが、３'末端におけるヌクレオチドの約６〜８個が検出すべき対立遺伝子と一致し、残りのヌクレオチドの１０以下、例えば８以下、６、４、２または１個が、プライマーの特性にたいして影響を及ぼすこと無く改変され得る場合にはその誘導体も考慮に入れられる。
【００５６】
プライマーは、任意の慣用的合成方法を用いて製造され得る。上記方法の例は、標準テキストブック、例えば“Protocols for Oligonucleotides and Analogues : Synthesis and Properties”、Methods in Molecular Biology Series； ２０巻、Sudhir Agrawal編、ヒュマナＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３、第１版から見出され得る。必要ならば、プライマー（複数も可）は、検出を容易にするため標識され得る。
【００５７】
本発明の別の側面によると、好ましくは本発明で特定された位置の一つまたはそれ以上で、ＯＡＴＰＣ遺伝子多型を検出し得る対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００５８】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００５９】
上記プローブの設計は、当技術分野の分子生物学者にとっては明白なものである。上記プローブは、好都合な長さ、例えば５０塩基以下、４０塩基以下、さらに好都合には３０塩基以下の長さ、例えば８〜２５または８〜１５塩基長を有する。一般に、上記プローブは、遺伝子における対応する野生型または変異型遺伝子座と全体的に相補的な塩基配列を含む。しかしながら、オリゴヌクレオチドプローブの識別力が過度に影響されるのでなければ、必要な場合一つまたはそれ以上の誤対合が導入され得る。本発明プローブは、検出を容易にするために一つまたはそれ以上の標識を伴い得る。
【００６０】
本発明の別の側面によると、本発明で特定された位置の一つでＯＡＴＰＣ遺伝子多型を検出し得る対立遺伝子特異的プライマーまたは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００６１】
本発明の別の側面によると、本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブおよび／または本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含む診断キットが提供される。
【００６２】
診断キットは、適切なパッケージおよび本発明方法における使用説明書を含み得る。上記キットは、さらに適切な緩衝液（複数も可）およびポリメラーゼ（複数も可）、例えば熱安定性ポリメラーゼ、例えばｔａｑポリメラーゼを含み得る。
【００６３】
本発明の別の側面によると、スタチンによる処置を必要とする患者の処置方法であって、
ｉ）最小限推奨用量レベルを越えるスタチン用量レベルを必要とする可能性がある患者を同定するかまたは最小限推奨用量レベルを超えるスタチン用量レベルへのタイトレーションをモニターするべき患者を同定するインビトロ診断方法であって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドおよび／またはそれと連鎖不平衡である多型の１７４位におけるアラニンの存在について患者からの生物学的サンプルを試験することを含む方法を使用し、そして
ii）薬剤の有効量を投与する
ことを含む方法が提供される。
【００６４】
本発明の別の側面は、血管疾患またはその素因を有する患者を処置するための医薬の製造におけるスタチンの使用に関するものであり、最小限推奨用量レベルを越えるスタチン用量レベルを必要とする可能性がある患者を同定するかまたは最小限推奨用量レベルを超えるスタチン用量レベルへのタイトレーションをモニターするべき患者を同定するインビトロ診断方法であって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドおよび／またはそれと連鎖不平衡である多型の１７４位におけるアラニンの存在について患者からの生物学的サンプルを試験することを含む方法により患者を同定する。
【００６５】
本発明の別の側面によると、スタチン療法を必要とする患者の分類方法であって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドおよび／またはそれと連鎖不平衡にある多型の１７４位におけるアラニンの存在について患者からの生物学的サンプルを試験することを含む方法が提供される。
【００６６】
本発明の別の側面によると、有害事象モニターを必要とするスタチン療法についての患者の同定方法であって、ＯＡＴＰ−Ｃポリペプチドおよび／またはそれと連鎖不平衡にある多型の１７４位におけるアラニンの存在について患者からの生物学的サンプルを試験することを含む方法が提供される。
【００６７】
「有害事象」とは、医薬品との因果関係が認められる場合と認められない場合のいずれであるにせよ、医薬品への曝露後または曝露中における望ましくない医学的状態の発生または先在する医学的状態の悪化を意味する。望ましくない医学的状態は、症状（例、悪心、胸痛）、徴候（例、頻脈、肝臓肥大）または異常な調査結果（例、検査結果、心電図）であり得る。
【００６８】
「連鎖不平衡」とは、偶然として予想されるよりも、遺伝子座における対立遺伝子の特定の組合わせの頻度が高くなる現象をいう。
「患者」とは、医学的処置を受けている人をいう。
【００６９】
「用量」とは、一度に投与される量、例えば薬剤の特定量をいう。ロスバスタチンの場合、成人出発用量は、通常１日当たり１０ｍｇである。患者によっては、望ましい脂質プロフィールを生じさせるのに高用量を必要とする場合もあり得る。
【００７０】
「利益危険比」は、所定の処置または手順の危険および利益間における関係を意味する。
【００７１】
許容され得る危険は、病気または損傷を誘発する物質または方法の使用に伴う利益と引き替えに個人が耐容しうる病気または損傷に罹患する可能性に関するものである。危険の許容性は、科学的データ、社会的、経済的および政治的要因、および問題の危険（複数も可）をもたらす化学物質または方法から生じる認知された利益により異なる。
【００７２】
本発明の別の側面によると、患者における有害事象についての試験方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送される治療剤による処置を必要とし、そして
（ii）（Ａ）配列番号１の１７４位に対応するＯＡＴＰ−Ｃのアミノ酸位置にあるアラニン、または（Ｂ）（Ａ）と連鎖不平衡にある多型を有する
患者を同定し、
（ｂ）患者が治療剤による処置を受けた後の患者からの生物学的サンプルを提供し、そして
（ｃ）治療剤による処置に関連した有害事象を示すパラメーターについてサンプルを試験する
ことを含む方法が提供される。
【００７３】
本発明の別の側面によると、
（ａ）ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送される治療剤による処置を必要とする患者を同定し、
（ｂ）患者が、
（ｉ）配列番号１の１７４位に対応するＯＡＴＰ−Ｃのアミノ酸位置にあるアラニン、または
（ii）（ｉ）と連鎖不平衡にある多型
のいずれか一方または両方を有するか否かを測定し、そして
（ｃ）治療剤の適切な投薬量を処方する
ことを含む処置方法が提供される。
【００７４】
好ましくは、上記方法は、さらに
（ｄ）治療剤の輸送低下に関連する有害事象について患者をモニターする
ことを含む。
【００７５】
本発明の別の側面によると、ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送される薬剤による処置を必要とするものとして同定されたヒト患者の遺伝子型の特性確認方法であって、
（ａ）患者からの核酸サンプルであって、配列番号１の６２０位に対応する位置に第一ヌクレオチドを含むサンプルを提供し、
（ｂ）サンプルを試験することにより第一ヌクレオチドの同一性を測定し、
（ｃ）プリントまたは機械読取可能媒体に第一ヌクレオチドの同一性を記録し、そして
（ｄ）患者または患者の介護者に第一ヌクレオチドの同一性を伝える
ことを含む方法が提供される。
【００７６】
本発明の別の側面によると、ヒトにおけるＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子の評価方法であって、
（ａ）クライアントから、ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送され得る治療剤による処置を必要とするヒトのハプロタイプ解析の実施要求を受け、
（ｂ）ヒトの核酸サンプルを受入れ、
（ｃ）サンプルを試験することにより本明細書記載の変異型の存在を測定し、そして
（ｄ）当事者に試験結果を提供する
ことを含む方法が提供される。
【００７７】
本発明の別の側面によると、薬剤の薬理遺伝学的特性の評価方法であって、
（ａ）ヒトからの核酸サンプルを提供し、
（ｂ）本明細書記載のＯＡＴＰ−Ｃ変異型の存在を測定し、そして
（ｃ）（ｉ）ヌクレオチドの同一性と（ii）薬剤投与後におけるヒトの応答との相関関係を明らかにすることにより、薬剤の薬理遺伝学的特性を評価する
ことを含む方法が提供される。
【００７８】
本発明の別の側面によると、複数の記録を含むデータベースを含むコンピューターアクセス可能媒体が提供され、その場合各記録は（ａ）対象を同定する情報と（ｂ）対象が本明細書記載の変異型を有するか否かを示す情報を関連付けるものであり、さらに各記録は（ａ）と（ｃ）対象へのＯＡＴＰ−Ｃ輸送可能薬剤の投与から生じる対象における有害事象の存在または非存在を確認する情報を関連付けるものである。
【００７９】
本発明の別の側面によると、コンピューター読取可能媒体品であって、そこに指令がコード化されている媒体品が提供され、その指令がプロセッサーに
（ａ）対象が本明細書記載の変異型を有するか否かを示す情報を受取り、そして
（ｂ）（ａ）の情報に基づいて、ＯＡＴＰ−Ｃ輸送可能薬剤の適切な投薬量を示す
ことを含む方法を実施させる。
【００８０】
好ましくは、媒体品は、示された投薬量をプリントまたは電子フォーマットで表示させるものである。
【００８１】
以下の非限定的実施例により本発明をさらに説明する：
図１は、ロスバスタチンの血漿レベルに対するＶ１７４Ａ多型の効果を示す。ＯＡＴＰ−Ｃにおける３つの非同義ＳＮＰについての遺伝子型、および用量正規化血漿ロスバスタチン値（ｎｇ／ｍｌ／ｍｇ）間の相関関係は、１７４Ａｌａ変異型が高い血漿濃度と関連していることを説明している。（ＷＴ＝野生型ホモ接合体、ＨＥＴ＝ヘテロ接合体、ＶＡＲ＝ホモ接合変異型）。分析された５２対象の中に、Ｖａｌ１７４ＡｌａまたはＰｒｏ１５５Ｔｈｒ変異型についてのホモ接合変異型は無かった。分析された５２対象のうち、４２は白色人種系として記録された。他の１０対象は、ヒスパニック系、黒色系またはアジア系であった。
【００８２】
図２は、ロスバスタチンの血漿レベルに対するＯＡＴＰ−Ｃ＊１５ハプロタイプの効果を示す。ＯＡＴＰ−Ｃハプロタイプおよび用量正規化血漿ロスバスタチン値（ｎｇ／ｍｌ／ｍｇ）間の相関関係は、ＯＡＴＰ−Ｃ＊１５ハプロタイプが高い血漿濃度と関連していることを説明している。各ハプロタイプに関するアミノ酸変異型の種類については下表１参照。ｎ＝３またはそれ未満の対象ハプロタイプ対（＊１５／＊１４、＊１ｂ／＊１４、＊１ｂ／＊１５）についての結果は示されていない。
【００８３】
図１および２において、「ボックス」の下方および上方の線は、サンプルの２５番および７５番目の１００分順位である。ボックスの上部と下部間の距離は、４分位数間領域である。ボックスの中間にある線は、サンプルメディアンである。ボックスの上方および下方に伸びる「ホイスカー」は、サンプルの残りの範囲を示す（アウトライアーが存在しない場合）。アウトライアーが無いものと仮定すると、サンプルの最大は上方ホイスカーの先端である。サンプルの最小は、下方ホイスカーの底部である。デフォルトにより、アウトライアーは、ボックスの上方または下方から離れた距離が４分位数間領域の１.５倍を越える値である。個々のデータポイントはアウトライアーである。
【００８４】
図３は、異なる用量のロスバスタチンで６週間処置された患者におけるロスバスタチンの血漿レベルに対するＶａｌ１７４Ａｌａ変異型の効果を示す。６週間目の血漿ロスバスタチンレベルは、分析用に用量正規化されている。平均血漿ロスバスタチンレベルは、ホモ接合野生型対象（Ｖａｌ／Ｖａｌ）と比べたところ、Ｖａｌ１７４Ａｌａ多型に関するヘテロ接合対象における方が高かった。Ｖ１７４Ａ変異型対立遺伝子および血漿ロスバスタチンＰＫレベル間の関連性は、高いロスバスタチン用量では非常に明白であった。
【００８５】
図４は、ＳＮＰａｚ０００５５３７についてのヘテロ接合である対象では平均血漿ロスバスタチン濃度に増加傾向があることを示す。このＳＮＰは、転写開始の−１１８ｂｐ上流における推定ＮＦ１転写因子結合部位内に位置する。示されたデータは、ＰＫデータが収集された２つの独立III相試験に関するものである。遺伝子型１１は、野生型ホモ接合遺伝子型（ａｚ０００５５３７ Ａ／Ａ）であり、遺伝子型１２はヘテロ接合遺伝子型（ａｚ０００５５３７ Ａ／Ｃ）である。
【００８６】
図５は、結合１７４Ａ変異型およびａｚ０００５５３７ ＳＮＰでの少数Ｃ対立遺伝子を有する対象が、Ｖ１７４変異型および主たる共通ａｚ０００５５３７対立遺伝子（Ａ）を有する対象と比べて平均血漿ロスバスタチン濃度が高くなる傾向を有することを示す。このため、変異型ａｚ０００５５３７対立遺伝子（Ｃ）は、血漿ロスバスタチンレベルに対する追加効果を有すると思われる。
【００８７】
ＳＮＰ ａｚ０００５５３７の対立遺伝子はＯＡＴＰＣ Ｖ１７４Ａの対立遺伝子と連鎖不平衡にあるため、プロモーター領域におけるＳＮＰでの変異型対立遺伝子は、機能低下ＯＡＴＰＣ対立遺伝子の発現を増加させ得ることにより、これらの多型変異型の両方を有する対象において血漿ロスバスタチンレベルの増加をもたらし得る。示されたデータは、ＰＫデータを収集した２つのIII相臨床試験から組合わせたものである。Ｖ１７４Ａ変異型についてのヘテロ接合対象を、プロモーターａｚ０００５５３７多型についての遺伝子型に基いて２つのグループに等級別分類した。ＮＦ１ ＷＴ＝ａｚ０００５５３７ ＳＮＰにＡ／Ａ野生型遺伝子型をもつ対象。ＮＦ１ ｈｅｔ＝ＡＺ０００５５３７ ＳＮＰにＡ／Ｃヘテロ接合遺伝子型をもつ対象。
【実施例】
【００８８】
実施例１
ＯＡＴＰ−Ｃにおける多型は、患者におけるスタチンのインビボ傾向に影響を及ぼす
簡単に述べると、ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子を、７９名のヒト臨床試験対象で配列決定した。これらの患者のうち５２名には、脂質代謝異常疾患について少なくとも６週間ロスバスタチンを与え、６週間の処置後に血漿ＰＫ測定を行った。これら５２名についてのデータを用いることにより、ＯＡＴＰ−Ｃにおける多型変異型の中にはスタチンの血漿レベルに機能的に重要な効果を有するものもあることが示された。
【００８９】
方法
ＯＡＴＰ−Ｃのプロモーター、エキソンおよび３'未翻訳領域を、臨床試験で７９対象から集められたＤＮＡにおけるＤＮＡターミネーター配列決定により完全に配列決定した。配列決定トレースを用いて、ＯＡＴＰ−Ｃにおける既知（すなわち、文献またはＳＮＰデータベースから入手可能）ＳＮＰについての遺伝子型を記録した。若干の新規ＳＮＰが、ＯＡＴＰ−Ｃのプロモーターおよび３'ＵＴＲ領域から見出された。
【００９０】
平均用量正規化血漿ロスバスタチン濃度を、ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子における各多型変異型の遺伝子型について測定した。３ＳＮＰについてのＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子型データ、すなわちアミノ酸１３０位アスパラギン→アスパラギン酸（Ａｓｎ１３０Ａｓｐ）、１５５プロリン→トレオニン（Ｐｒｏ１５５Ｔｈｒ）および１７４バリン→アラニン（Ｖａｌ１７４Ａｌａ）を用いて、各対象についてのハプロタイプ対を測定した。平均用量正規化血漿ロスバスタチン濃度を、ハプロタイプ対によりグループ分けした対象について測定した。
【００９１】
それに続いて、初めの５２患者を含む、２臨床試験からの、了承を得た全ロスバスタチン処置対象（ｎ＝２７１）に対し、ＯＡＴＰ−Ｃ変異型についてＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いて遺伝子解析を行った。Ｎ１３０Ｄ、Ｐ１５５ＴおよびＶ１７４Ａ変異型を誘発するＳＮＰについてのデータを用いて、以前に記載した要領で、ＯＡＴＰＣハプロタイプ対を各対象に割当てた。
【００９２】
結果
配列決定データは、以前に報告されたことのない若干のＳＮＰ、すなわちＯＡＴＰ−Ｃのプロモーター領域における８（Jung,D. ２００１ Journal of Biological Chemistry、２７６（４０）、３７２０６−３７２１４）および３'ＵＴＲ領域における４ＳＮＰを示した。これらのＳＮＰは、本発明の別の側面を表す。これら１２の新規ＳＮＰは、７９対象におけるＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子の配列決定により同定された。これら新規ＳＮＰのうち、８ＳＮＰは、ＯＡＴＰ−Ｃプロモーターに位置していた。これらのＳＮＰのうち２つは、転写開始部位に対して−２６Ａ＞Ｇおよび−１１８Ａ＞Ｃ位置にある共通ＮＦ１転写因子結合部位に位置していた（配列番号２参照）。他の新規上流ＳＮＰは、−３０９Ｔ＞Ｃ、−８７８Ａ＞Ｇ、−９０３Ｃ＞Ｔ、−１０５４Ｇ＞Ｔ、−１２１５Ｔ＞Ａおよび−１５５８Ｔ＞Ｃを含むが、これらのヌクレオチド位置は、Jung et al.により報告された転写開始部位に対するものである（配列番号２）。さらなる４新規ＳＮＰは、ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子の３'ＵＴＲ領域に位置しており、すなわちＴ２１２２Ｇ、Ｃ２１５８Ｔ、Ａ２５２５ＣおよびＧ２６５１Ａであるが、これらのヌクレオチド位置はＡＴＧに対するものである（配列番号３参照）。
【００９３】
３ＳＮＰ、Ａｓｎ１３０Ａｓｐ、Ｐｒｏ１５５ＴｈｒおよびＶａｌ１７４ＡｌａについてのＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子型データを用いて、ハプロタイプを決定した。パッケージＳＮＰＨＡＰ（Clayton、David ＳＮＰＨＡＰｖ０.２ ２００２ http://www-gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/snphap.txt）をこの解析に使用した。ハプロタイプはまた、ＰＨＡＳＥパッケージ（Stephens,M.２００１ American Journal of Human Genetics、６８、９７８−９８９）を用いても予測され、同じ予測ハプロタイプを与えることが見出された。ハプロタイプは、先に報告されたもの（Tirona ２００１）と一致することが見出された。ＮＦ１結合部位における−１１８Ａ＞ＣプロモーターＳＮＰは、Ｖａｌ１７４Ａｌａコーディング変異型と強い連鎖不平衡にあった（デルタ＝０.３）。
【００９４】
【表２】
2007500005.tif 000003
【００９５】
【表３】
2007500005.tif 000004
【００９６】
【表４】
2007500005.tif 000005
【００９７】
【表５】
2007500005.tif 000006
【００９８】
表４は、２つのIII相試験におけるロスバスタチン血漿ＰＫレベルの分布に基いて「高」および「低」ＰＫグループに分類された対象間におけるＶ１７４Ａ変異型に関する遺伝子型の分布を示す。高および低サブグループは、完全試験コホートについて観察された血漿ＰＫ値の分布と比較してＰＫ値が１０番および９０番目の１００分順位である対象を表す。Ｖａｌ／Ａｌａヘテロ接合遺伝子型は、血漿ＰＫレベルが「高い」対象ではより一般的であり、Ｖ１７４Ａ変異型の集団対立遺伝子頻度に基いて偶然により予想される場合より高頻度である［カイ二乗 ｎ＝５２（全対象）のときｐ＝０.０３７およびｎ＝４２（白色人種対象のみ）のときｐ＝０.０１９］および［正確検定 ｎ＝５２（全対象）のときｐ＝０.０５５およびｎ＝４２（白色人種対象のみ）のときｐ＝０.０４３］。
【００９９】
７９対象からの配列および遺伝子型データを用いて、対立遺伝子およびハプロタイプ頻度を測定した。血漿ロスバスタチン濃度は、これら７９対象のうち５２についてしか入手できなかったため、ハプロタイプ対グループの中には少数の対象しか存在しないものがあった。
【０１００】
Ｖ１７４Ａ変異型は、通常ＯＡＴＰＣ＊１５対立遺伝子として見出される。Ｖ１７４Ａ変異型はまた、日本人集団ではなく、白色人種系集団でＯＡＴＰＣ＊５対立遺伝子について観察される。しかしながら、集団間におけるこれらの対立遺伝子の頻度における統計的に有意な差異は観察されなかった。
【０１０１】
表５−配列
Ａ）タンパク質配列
受入番号ＡＦ２０５０７１であるｃＤＮＡの翻訳により決定されたタンパク質配列
１）ＯＡＴＰＣタンパク質ＯＡＴＰＣ＊１ａ（Ｎ１３０およびＶ１７４）の配列
−配列番号１
【表６】
2007500005.tif 000007
【０１０２】
２）ＯＡＴＰＣタンパク質ＯＡＴＰＣ＊１５（Ｄ１３０およびＡ１７４）の配列
−配列番号４
【表７】
2007500005.tif 000008
【０１０３】
３）ＯＡＴＰＣタンパク質ＯＡＴＰＣ＊５（Ｎ１３０およびＡ１７４）の配列
−配列番号５
【表８】
2007500005.tif 000009
【０１０４】
Ｂ）３'ＵＴＲ ＳＮＰについてのＯＡＴＰＣ ｃＤＮＡ（ＡＦ２０５０７１）の配列
コーディング領域は、ヌクレオチド１３５〜２２１０である。ＡＴＧ（大文字）から下流にある多型の位置が記載されており、ＡＴＧのＡは＋１である。
【０１０５】
多型Ｔ２１２２Ｇ、Ｃ２１５８Ｔ、Ａ２５２５Ｃ、Ｇ２６５１Ａには、下線が施されている。
配列番号３
【表９】
2007500005.tif 000010
【表１０】
2007500005.tif 000011
【０１０６】
Ｃ）ＡＣ０２２３３５からのＯＡＴＰＣプロモーター領域の配列
−２６Ａ＞Ｇまたは−１１８Ａ＞Ｃ、および−３０９Ｔ＞Ｃ、−８７８Ａ＞Ｇ、−９０３Ｃ＞Ｔ、−１０５４Ｇ＞Ｔ、−１２１５Ｔ＞Ａまたは−１５５８Ｔ＞Ｃ、これらのヌクレオチド位置は転写開始部位（Jung et alにより特定された）に対するものであり、以下のプロモーターおよび５'フランキング配列（ＡＣ０２２３３５から）に従っている。
【０１０７】
転写開始には、矢印が付されている。ＳＮＰは大文字で記されている。
配列番号２
【表１１】
2007500005.tif 000012
【０１０８】
結論
インビボ遺伝子型−表現型関係の証拠は、ＯＡＴＰ−Ｃ変異型および、高コレステローブ血症／脂質代謝異常の処置で使用される一般的な種類の薬剤であるスタチンの薬物動態プロフィール間で測定された。Ａｌａ１７４ ＯＡＴＰ−Ｃ変異型をもつ患者においてロスバスタチンの高い血漿濃度が観察されたということは、Ａｌａ１７４変異型によるロスバスタチンの輸送がＶａｌ１７４ ＯＡＴＰ−Ｃ変異型の場合より低下していることを示している。すなわちＡｌａ１７４変異型は、肝臓におけるスタチンの取込低下を誘発し、その結果血漿レベルを増加させる。血漿薬物濃度は、スタチン療法の利益−危険比の改変における一因子である。ＯＡＴＰ−Ｃ変異型Ｎ１３０ＤおよびＰ１５５Ｔは、ロスバスタチンの薬物動態傾向に影響を及ぼすとは思われない。
【０１０９】
ＯＡＴＰ−Ｃ変異型およびスタチンのインビボ血漿レベル間における遺伝子型−表現型相関関係を利用することにより、ＳＮＰまたはタンパク質変異型についての診断検定法を通して、各個体に適切なものである、スタチン用量が最適化され得る。血漿レベルの最適化は、コレステロールレベルを所望の閾値まで十分に低下させるために高用量のスタチンを必要とする対象においては重要である。
【０１１０】
ＯＡＴＰ−Ｃにおける多型がスタチンのインビボ傾向に影響を及ぼすという証拠は、ＯＡＴＰ−Ｃ変異型が、ＯＡＴＰ−Ｃにより輸送されるスタチンおよび他の臨床的に関連性のある薬剤に対する臨床応答に影響を及ぼし得ることを示している。ＯＡＴＰ−Ｃにおける多型と、異なる用量のロスバスタチンで６週間処置された対象において測定された、処置最終用量−正規化血漿ロスバスタチン濃度の相関関係は、ＯＡＴＰ−Ｃ変異型がロスバスタチンのインビボ薬物動態傾向に機能的効果を有することを示していた。Ｖａｌ１７４Ａｌａ変異型についてのヘテロ接合対象は、アミノ酸１７４位での野生型Ｖａｌ１７４変異型についてのホモ接合対象と比べてロスバスタチン平均血漿濃度の増加を示していた。単コピーのＯＡＴＰ−Ｃ＊１５対立遺伝子をもつ対象（Ｖａｌ１７４ＡｌａおよびＡｓｎ１３０Ａｓｐ変異型についてのヘテロ接合）は、ＯＡＴＰ−Ｃ＊１ａ、ＯＡＴＰ−Ｃ＊１ｂおよびＯＡＴＰ−Ｃ＊１４ハプロタイプをもつ対象よりも高い平均血漿濃度を有することが見出された。Ａｌａ１７４ ＯＡＴＰ−Ｃ変異型をもつ対象において高い濃度のロスバスタチンが観察されるということは、Ａｌａ１７４変異型による輸送がＶａｌ１７４ ＯＡＴＰ−Ｃ変異型の場合より低下していることを示している。Ａｌａ１７４変異型は、肝臓へのスタチンの取込低下を誘発し、スタチンに対する臨床応答に強い影響を与える。スタチンの薬物動態プロフィールに影響を及ぼすＯＡＴＰ−Ｃ変異型は、循環系に高濃度でスタチンが存在する結果としてスタチン療法の利益−危険比の減少との関連性を有し得る。ＯＡＴＰ−Ｃ変異型およびスタチンのインビボ血漿レベル間における遺伝子型−表現型相関関係を利用することにより、ＳＮＰまたはタンパク質変異型についての診断検定法を通して、各個体に適切なものであるスタチン用量が最適化され得る。血漿レベルの最適化は、コレステロールレベルを所望の閾値まで十分に低下させるために高用量のスタチンを必要とする対象においては重要である。
【０１１１】
実施例２
ＮＦ１ ＳＮＰ（ａｚ０００５５３７）の機能的重要性についての証拠
図４は、ＳＮＰａｚ０００５５３７についてヘテロ接合である対象では平均血漿ロスバスタチン濃度に増加傾向があることを示している。このＳＮＰは、転写開始の上流−１１８ｂｐにおける推定ＮＦ１転写因子結合部位内に位置する。
【０１１２】
図５は、結合１７４Ａ変異型およびａｚ０００５５３７ ＳＮＰでの少数Ｃ対立遺伝子をもつ対象は、Ｖ１７４変異型および主たる共通ａｚ０００５５３７対立遺伝子（Ａ）をもつ対象と比べて平均血漿ロバスタチン濃度が高くなる傾向を有することを示している。このため、変異型ａｚ０００５５３７対立遺伝子（Ｃ）は、血漿ロスバスタチン濃度に対して追加効果を有すると思われる。
【０１１３】
ＳＮＰａｚ０００５５３７の対立遺伝子は、ＯＡＴＰＣ Ｖ１７４Ａの対立遺伝子と連鎖不平衡にあるため、プロモーター領域におけるＳＮＰでの変異型対立遺伝子は、機能低下ＯＡＴＰＣ対立遺伝子の発現を増加させることにより、これらの多型変異型の両方を有する対象において血漿ロスバスタチンレベルを増加させ得る。
【０１１４】
サンプルの完全コホート（ｎ＝２６７）によりＶ１７４単独を考えたとき、Ｖ１７４Ａヘテロ接合体と比べてＶ１７４Ａ ＷＴは、ｐ＝０.０５５のｔ検定値を有する。しかしながら、Ｖ１７４Ｖ ＷＴ対Ｖ１７４Ａ＆ＮＦ１（ａｚ０００５５３７）複合ヘテロ接合体を考える場合、ｔ検定値はｐ＝０.０３２であり、統計的に有意である。これは、ＯＡＴＰＣ ＮＦ１ ＳＮＰがまたロスバスタチンの薬物動態傾向の決定因子であり得ることを示唆している。予備インビトロ機能データは、変異型Ｃ ａｚ０００５５３７対立遺伝子が発現増加と関連しているという仮説を裏付けている。プロモーター多型は、特異な対立遺伝子発現を駆動し得、機能低下ＯＡＴＰＣ対立遺伝子の多大な発現を伴う。
【０１１５】
実施例３
連鎖不平衡
配列番号２の多型−１１８Ａ＞Ｃまたは−１５５８Ｔ＞Ｃを下記の要領で解析した。
【０１１６】
−１１８および−１５５８での多型の対立遺伝子は、配列番号１の１７４位のアラニン対立遺伝子と顕著な連鎖不平衡にある（それぞれｐ＝０.００９および０.０２５、ＡＳＳＯＣＩＡＴＥプログラムにより解析、Ott J（1999）Analysis of human genetic linkage, 第３版、バルチモアのジョーンズ・ホプキンズ・ユニバーシティー・プレス参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、ロスバスタチンの血漿レベルに対するＶ１７４Ａ多型の効果を示す。
【図２】図２は、ロスバスタチンの血漿レベルに対するＯＡＴＰ−Ｃ＊１５ハプロタイプの効果を示す。
【図３】図３は、異なる用量のロスバスタチンで６週間処置された患者におけるロスバスタチンの血漿レベルに対するＶａｌ１７４Ａｌａ変異型の効果を示す。
【図４】図４は、ＳＮＰａｚ０００５５３７についてのヘテロ接合である対象では平均血漿ロスバスタチン濃度に増加傾向があることを示す。
【図５】図５は、結合１７４Ａ変異型およびａｚ０００５５３７ ＳＮＰでの少数Ｃ対立遺伝子を有する対象が、Ｖ１７４変異型および主たる共通ａｚ０００５５３７対立遺伝子（Ａ）を有する対象と比べて平均血漿ロスバスタチン濃度が高くなる傾向を有することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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