(57)【要約】抗体結合体、式（Ｉ）の抗体−薬物結合体、抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび代謝産物を投与した後に、親和性分離、クロマトグラフィー、および質量分析法によって生物学的サンプルを検出する、スクリーニングする、および定量する方法が開示される。式Ｉ：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ（式中、Ａｂは、抗体である；Ｄは、薬物成分である；ＬはＡｂへ共有結合し、そしてＤへ共有結合したリンカーである；およびｐは１、２、３、４、５、６、７、または８である）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体−薬物結合体化合物を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）式Ｉ：
ＡＢ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ          Ｉ
を有する抗体−薬物結合体化合物を提供する工程であって、
式中、
Ａｂは、抗体である；
Ｄは、薬物成分である；
Ｌは、Ａｂへ共有結合され、かつＤへ共有結合されているリンカーである；そして
ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８である、工程と；
（ｉｉ）該抗体−薬物結合体化合物および必要に応じて式Ｉ（式中、ｐは０である）の抗体またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を、生物学的起源と接触させる工程と；
（ｉｉｉ）該生物学的起源から生物学的サンプルを採取する工程と；
（ｉｖ）分析サンプルを生成するために該生物学的サンプルを処理する工程と；
（ｖ）１つより多いサンプル構成成分の分離を行うために、該分析サンプルを分離媒体へ塗布する工程であって、分離されたサンプル構成成分が式Ｉ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有する抗体−薬物結合体化合物またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を含む、工程と；
（ｖｉ）質量分析法によって、１つ以上の分離されたサンプル構成成分の質量もしくは質量対電荷比を確定する工程と、を包含する方法。
【請求項２】
工程（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）を、１回以上繰り返す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的起源が、哺乳動物、組織、および細胞培養物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルが、血液、胆汁、尿、または便である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルが血液であり、該血液が処理されて血漿を生成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルが血液であり、該血液が処理されて血清を生成する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的サンプルが、インビボ生物学的起源から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的起源が哺乳動物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが、血液サンプルまたは排出物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルが、インビトロ生物学的起源から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記インビトロ生物学的起源が、細胞、組織、および器官から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的サンプルが、調製する工程、固定化する工程、遠心分離、単離する工程、消化する工程、血球凝固を誘導もしくは防止する工程、加水分解工程、または精製工程によって処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルが、免疫親和性膜選択によってさらに処理される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析サンプルが、細胞溶解液、組織溶解液、または器官溶解液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析サンプルが変性させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析サンプルが、ホルムアミド、ジメチルホルムアミドおよびアセトニトリルから選択される変性剤によって変性させられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分析サンプルが、還元剤を用いて処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記還元剤が、ＤＴＴまたはＴＣＥＰである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分析サンプルが、前記生物学的起源由来のサンプルを免疫親和性吸着剤と接触させる工程および該分析サンプルの溶出によって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫親和性吸着剤が、ポリスチレン、制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、アガロース、デキストラン、セルロース、ならびにそれらのコポリマー、混合物およびグラフトから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫親和性吸着剤が、小粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細加工チップ、アルカンチオール−金層、および無孔表面から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫親和性吸着剤がアゾラクタム官能基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫親和性吸着剤が多孔性ポリマーモノリスを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫親和性吸着剤が、収集リザバーと流体連絡している少なくとも１つの貫通チャネルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫親和性吸着剤が、貫通容器内に構成されており、ここで前記生物学的起源由来のサンプルが、１つの端部もしくは開口部から導入され、そしてサンプルが別の端部もしくは開口部から溶出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫親和性吸着剤が、各々が別個の収集レザバーと流体連絡している複数の貫通チャネル内に分配されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記容器およびリザバーが、１２×８（列×行）の９６マイクロタイターウェルフォーマット、または２４×１６（列×行）の３８４マイクロタイターウェルフォーマットで構成されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫親和性吸着剤が、有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、抗原、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、および分子認識に関係するタンパク質表面ドメインから選択される固定化リガンドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記固定化リガンドが抗原である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
脱グリコシル化試薬を用いて分析サンプルを処理する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱グリコシル化試薬がＰＮＧａｓｅＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記分析サンプルが分離媒体へ断続的に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記分析サンプルが分離媒体へ連続的に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記分離媒体がクロマトグラフィー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記クロマトグラフィー支持体が逆相吸着剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記逆相が、ポリスチレン、またはポリスチレンのグラフトもしくはコポリマーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記クロマトグラフィー支持体からの流出物が、質量分析法によって断続的に分析され、１つより多い分離かつ除去された前記構成成分の質量対電荷比を確定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記分離かつ除去された構成成分の質量対電荷比が、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）質量分析法によって確定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
質量分析法によって１つ以上の分離されたサンプル構成成分を定量する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
サンプル構成成分が重鎖抗体フラグメントまたは軽鎖抗体フラグメントを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記重鎖抗体フラグメントまたは軽鎖抗体フラグメントが１つ以上の薬物成分をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ａｂが抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、二重抗体、直鎖抗体、および一本鎖抗体分子から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ａｂが、ヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
Ａｂがヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ａｂが抗ＥｒｂＢ２抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
Ａｂが、４Ｄ５エピトープへ結合する抗ＥｒｂＢ２抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
式Ｉを有する前記抗体−薬物結合体化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物が、前記生物学的起源内の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体へ結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体−薬物結合体化合物の抗体が、以下（１）〜（３５）：
（１）  ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０３）；
（２）  Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３４８６）；
（３）  ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１２４４９）；
（４）  ０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，  ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６１４８６）；
（５）  ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球促進因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５８２３）；
（６）  Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質キャリアファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６４２４）；
（７）  Ｓｅｍａ  ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマホリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７トロンボスポンジンリピート（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短細胞質ドメイン、（セマホリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４０８７８）；
（８）  ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３５８６２８）；
（９）  ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７５４６３）；
（１０）  ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７７６３）；
（１１）  ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−Ｉ、ＰＣＡＮＡＰｌ、ＳＴＡＭＰｌ、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４５５１３８）；
（１２）  ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体潜在的カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７６３６）；
（１３）  ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）；
（１４）  ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２  Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２６００４）；
（１５）  ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６２６）；
（１６）  ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰｌＡ（リン酸アンカータンパク質１ａを含有するＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７６４）；
（１７）  ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１１７３０）；
（１８）  ＮＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１８７２８）；
（１９）  ＭＤＰ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１７０２３）；
（２０）  ＩＬ２０Ｒα（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８４９７１）；
（２１）  Ｂｒｅｖｉｃａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２９０５３）；
（２２）  Ｅｐｈｂ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４４２）；
（２３）  ＡＳＬＧ６５９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＸ０９２３２８）；
（２４）  ＰＳＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２９７４３６）；
（２５）  ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２６０７６３；
（２６）  ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、ＮＰ＿４４３１７７．１）；および
（２７）  ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、ＮＰ−００１７６２．１）；
（２８）  ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連α、Ｉｇβ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用して表面上にＩｇＭ分子との複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関係するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７７４．１）；
（２９）  ＣＸＣＲ５（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球移動および体液性防衛において機能し、ＨＩＶ−２感染およびおそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、および白血病の発生において役割を果たすＧタンパク質結合受容体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７０７．１）；
（３０）  ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合してそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球へ提示するＭＨＣクラスＩＩ分子のβサブユニット（Ｉａ抗原）、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１１１．１）；
（３１）  Ｐ２Ｘ５（細胞外ＡＴＰによって作動させられるイオンチャネルであるプリン作動性受容体Ｐ２Ｘリガンド作動性イオンチャネル５は、シナプス伝達および神経組織発生に関係している可能性があり、欠損は特発性排尿筋不安定の病理生理学の原因となることがある、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２５５２．２）；
（３２）  ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７７３．１）；
（３３）  ＬＹ６４（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）のＩ型膜タンパク質であるリンパ球抗原６４（ＲＰ  １０５）は、Ｂ細胞活性化およびアポトーシスを調節し、機能の消失は全身性紅斑性狼瘡を有する患者における疾患活動性の上昇と関連している、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＮＰ＿００５５７３．１）；
（３４）  ＦＣＲＨ１（Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含有する免疫グロブリンＦｃドメインに対する推定受容体であるＦｃ受容体様タンパク質１は、Ｂリンパ球分化に役割を果たす可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４４３１７０．１）；および
（３５）  ＩＲＴＡ２（Ｂ細胞発生およびリンパ球発生において役割を果たす可能性がある推定免疫受容体である免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２；転位による遺伝子の調節不全が一部のＢ細胞悪性腫瘍において発生する、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１２５７１．１）、
から選択される１つ以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体へ結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体−薬物結合体化合物が、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で哺乳動物へ投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
Ｌが、Ａｂのアミノ、カルボキシル、またはチオール基へ共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｌが、Ｎ−スクシンイミジル−４（２−ピリジルチオ）プロパノエート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）から選択されるリンカー試薬から形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
Ｌが、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、およびマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
Ｄが、構造：
【化１】
2007532882.tif 000043
（式中、波線は、抗体−薬物結合体のリンカー（Ｌ）へのＤの硫黄原子の共有結合を示しており、
Ｒは、独立してＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される）
を有するメイタンシノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
Ｄが、構造：
【化２】
2007532882.tif 000044
を有するＤＭ１である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
Ｄがオーリスタチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
Ｄが、構造：
【化３】
2007532882.tif 000045
を有するＭＭＡＥである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｄが、構造：
【化４】
2007532882.tif 000046
を有するＭＭＡＦである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体−薬物結合体が、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦであり、分離されたサンプル構成成分が、約８１７８ａｍｕの質量を有する代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記代謝産物が、インビボ血漿サンプル由来の抗オーリスタチン抗体親和性膜上で捕捉される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物中において化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物の相対クリアランスを決定するために、抗体−薬物結合体化合物の混合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ          Ｉ
を有する抗体−薬物結合体化合物を提供する工程であって、
式中、
Ａｂは、抗体である；
Ｄは、薬物成分である；
Ｌは、Ａｂへ共有結合し、かつＤへ共有結合しているリンカーである；そして 
ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり、
該混合物は、必要に応じて抗体、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を含み、このとき、ｐは０である、工程と；
（ｉｉ）該混合物を哺乳動物へ投与する工程と；
（ｉｉｉ）該混合物が投与された哺乳動物から血液サンプルもしくは排出物を採取する工程と；
（ｉｖ）必要に応じて該血液サンプルもしくは排出物を処理し、分析サンプルを生成する工程と；
（ｖ）該血液サンプル、排出物、もしくは分析サンプルを分離媒体へ適用し、１つより多いサンプル構成成分の分離を行う工程であって、このとき分離されたサンプル構成成分が式Ｉ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有する抗体−薬物結合体化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を含む、工程と；
（ｖｉ）質量分析法によって、１つ以上の分離されたサンプル構成成分の質量もしくは質量対電荷比を確定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記血液サンプルもしくは排出物が、前記分析サンプルを生成するために調製する工程、固定化する工程、単離する工程、消化する工程、加水分解する工程、または精製工程によって処理される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
工程（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）を、１回以上繰り返す工程をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
化合物を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）抗体−薬物結合体化合物の不均質混合物について質量分析法を実施する工程と；
（ｉｉ）該混合物の１つ以上の化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を検出する工程であって、このとき該抗体−薬物結合体化合物の不均質混合物が、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ          Ｉ
式中、
Ａｂは、抗体である；
Ｄは、薬物成分である；
Ｌは、Ａｂへ共有結合し、かつＤへ共有結合しているリンカーである；そして 
該混合物は１つより大きい薬物負荷値ｐを有する化合物を包含し、ｐは１、２、３、４、５、６、７、または８であり得る、工程と、
を包含する、方法。
【請求項６７】
前記混合物の化合物の量が、選択的イオンモニタリング質量分析法によって決定される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
質量分析法を実施する前に、前記混合物を還元剤と接触させる工程をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
質量分析法を実施する前に、前記混合物を変性剤と接触させる工程をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
抗体−薬物結合体化合物を検出するための方法であって：
（ｉ）抗体結合体化合物を処理して分析サンプルを生成する工程であって、このとき該抗体結合体化合物が、リンカーによって薬物成分、蛍光色素成分、および親和性標識から選択される小分子成分へ共有結合された抗体を含む工程と；
（ｉｉ）分析サンプルを分離媒体へ適用し、１つ以上のサンプル構成成分の分離を行う工程であって、このとき分離されたサンプル構成成分が抗体結合体化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を含む工程と；
（ｉｉｉ）質量分析法によって、１つ以上の分離されたサンプル構成成分の質量もしくは質量対電荷比を確定する工程と、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３７ＣＦＲ§１．５３（ｂ）の下で出願されたこの非仮出願は、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下で、２００４年４月７日に出願された米国仮特許出願第６０／５６０，５３０号、および２００５年２月１７日に出願され、「ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ  ＯＦ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ」という名称の、出願番号がまだ割り当てられていない仮特許出願の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、質量分析法によって、抗体−薬物結合体を含む抗体結合体化合物、ならびにそれらのフラグメントおよび代謝産物を検出、分析、スクリーニング、特性解析、および定量するための方法に関する。本発明は、薬物動態試験のための質量分析サンプルを調製するための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
標的化された抗癌治療薬は、従来型の癌化学療法と比較して、非特異的毒性を減少させて有効性を高めるように設計される。このアプローチは、癌細胞に対して高力価の結合体化小分子治療薬を限定的に送達する、モノクローナル抗体の強力な標的化能力によって具現化される。抗体の薬物動態および生体内分布は、臨床におけるその使用が成功するかどうかを決定する際に重要な役割を果たす。ここで抗体は、作用部位へ送達されて、その目的を達成するために必要とされる長さの時間にわたってその場所に保持されなければならない。これらの抗体−薬物結合体のそのような薬物動態および毒性などの特性を評価するためには、血漿、尿、およびその他の生物学的サンプルからそれらを特性解析して定量できることが有用である。さらに、同一サンプルおよび同一クロマトグラフィー注入試料からこの方法における（抗体に結合体していない）遊離薬物を定量する能力もまた有用である。
【０００４】
薬物動態試験においては、小分子治療薬を同定および定量するために、電子衝撃（ＥＩ）、化学イオン化（ＣＩ）、脱離化学イオン化（ＤＣＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、ならびに逆重畳用のイオン選択の単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モード（Ｓｏｕｐｐａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ７７４：１９５−２０３；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍ．７６５：５５−６２；Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ７１８：７７−８５；Ａｂｄｅｌ−Ｈａｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ７５３：４０１−４０８；Ｍａｒｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍ．７６２：８７−９５）を含むタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ７５２：９−１６；Ｒｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．９：４９５−５０２）などの様々な質量分析技術が使用されてきた。これらの方法および機器は、十分な感受性を得るために生体液からの様々な分析物の分離を必要とする。そのような精製は、大きな労働力を必要とし、緩徐で、細胞培地、ヒト血漿、尿、および胆汁などのサンプル中に含まれる当該分析物の濃度が低いために大量のサンプル液を必要とする。
【０００５】
分離／単離／精製のフロントエンド工程と質量分析法による検出／特性解析／定量とを結び付けた直接的組み合わせは、複雑な生物学的サンプルについての代謝試験のために有効である。代表的には、ＬＣ／ＭＳは抗体の特性解析のために使用され（非特許文献１；特許文献１；特許文献２）、そしてＥＬＩＳＡは生物学的マトリックス内での定量のために使用される（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５５：４１−５６；Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ４３（２）：８３−９５）。ＥＬＩＳＡアッセイは、代表的にはハイスループットスクリーニングに対して感受性であり、敏感に反応する。
【０００６】
質量分析法（ＭＳ）によるタンパク質分析における最近の進歩は、フロントエンド気相イオン化、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ、ＵＳ２００３／００２７２１６）および表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ、ＵＳ６０２０２０８）などの技術の導入、ならびに機器感度、分解能、質量正確性、バイオインフォマティクス、およびソフトウェア逆重畳アルゴリズムにおける向上によるものである（非特許文献２；非特許文献３）。タンパク質の一次（配列）、二次構造、および三次構造は、ＭＳを用いて精査かつ解明することができる。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、液体サンプルの大気圧イオン化（ＡＰＩ）を提供する。エレクトロスプレープロセスは、蒸発下では、溶液内に含有される種に例示的なイオンを作り出す高電離液滴を作り出す。質量分析計のイオンサンプリングの開口部は、質量分析のためにこれらの気相イオンをサンプリングするために使用できる。質量分析計検出器によって測定された分析物の反応は、液体中の分析物の濃度に依存し、液体流量には依存しない。
【０００７】
抗体療法は、癌、免疫障害および血管新生障害を有する患者の標的化された治療および診断について確立されている。一例として、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）は、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質であるＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へ選択的に結合する組み換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体（ＥｒｂＢ２）である（米国特許第５，８２１，３３７号；第６，０５４，２９７号；第６，４０７，２１３号；第６６，３９０，５５号；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−９；Ｓｌａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−１２）。トラスツズマブは、ＨＥＲ２へ結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域（ｃｄｒ）とともにヒトフレームワーク領域を含有するＩｇＧ１κ抗体である。トラスツズマブはＨＥＲ２抗原に結合し、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害する（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。単剤としてのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有しており、それらの転移性疾患のための１つ以上の化学療法レジメンを受けていた患者の処置に適応である。パクリタキセルとＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）との併用は、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有しており、転移性疾患のために化学療法を受けていなかった患者の処置に適応である。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、以前に広範な抗癌療法を受けていたＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳癌を有する患者において臨床的に活性である（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７−７４４）。
【０００８】
抗体療法および診断の目的は、特定の病変または障害の検出および／または処置を可能にするために、高特異性と抗体−抗原相互作用の親和性との組み合わせを活用することである。抗体は、単独で使用されるか、または検出標識、薬物動態修飾因子、放射性同位体、毒素、もしくは薬物などの他の成分と結合体化（すなわち、積載）される。癌の処置において、腫瘍細胞を殺滅もしくは阻害するために細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤を局所送達するための抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）、すなわち免疫結合体の使用（非特許文献７；非特許文献８；特許文献３）は、理論的には、腫瘍への薬物成分の標的化された送達および細胞内蓄積を可能にする。ここで、これらの結合体化されていない薬剤の全身性投与は、許容できないレベルの毒性を、排除が求められる腫瘍細胞のみならず正常細胞にも生じさせ得る。（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（編），ｐｐ．４７５−５０６）。それにより、最小の毒性を伴う最高の有効性が探求される。ＡＤＣを設計および精錬するための努力は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の選択性ならびに薬物結合特性および薬物放出特性に焦点が当てられてきた。ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびビンデシンを含む薬物結合ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、いずれもこれらの戦略において有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。抗体−毒素結合体において使用された毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）などの小分子毒素が挙げられる。毒素および薬物は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって細胞毒性および細胞抑制作用を発揮する。一部の細胞毒性剤は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドに結合体化すると、不活性もしくは低活性になる傾向がある。
【０００９】
例示的な抗体−薬物結合体としては、注射による急性骨髄性白血病の処置のために２０００年に承認された、カリケアマイシンに結合したｈｕＣＤ３３抗体であるＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４，９７０，１９８号；第５，０７９，２３３号；第５，５８５，０８９号；第５，６０６，０４０号；第５，６９３，７６２号；第５，７３９，１１６号；第５，７６７，２８５号；第５，７７３，００１号）が挙げられる。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬物成分ＤＭ１へ結合されたｈｕＣ２４２抗体から構成される抗体−薬物結合体であるカンツズマブメルタンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は、結腸癌、膵臓癌、胃癌などのＣａｎＡｇを発現する癌を処置するための第ＩＩ相試験に進行している。同様にＤＭ１へ結合した抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成される抗体−薬物結合体であるＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、前立腺腫瘍の有望な治療法として開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびドラスタチンのモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）合成アナログは、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌上のＬｅｗｉｓ  Ｙに対して特異的）およびｃＡＣ１０（血液悪性腫瘍上のＣＤ３０に対して特異的）へ結合体化させられ、治療剤開発中である（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：１４５８−１４６５）。
【００１０】
治療的使用が承認されたか、または開発中である上記の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、抗体への薬物成分の共有結合のプロセスが大部分は制御されておらず、結果として生じる結合体化生成物が完全に特性解析されていない不均質な混合物である。さらに、薬物負荷（薬物／Ａｂ比）は、組成物または調製物中のＡＤＣ分子の収集物についての統計的平均である。抗体−薬物結合体組成物の不均質性のために、投与後の生物学的起源から採取された薬物動態サンプルを評価するのは困難である。ＥＬＩＳＡアッセイは、抗体−抗原結合の検出に限定される（非特許文献９）。ＵＶ分光計は、所定の蛍光またはＵＶ活性薬物成分もしくは代謝産物の全吸光度を測定することはできるが、遊離薬物と抗体−薬物結合体とを区別することはできない。
【特許文献１】国際公開第０３／０４６５７１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０４６５７２号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４，９７５，２７８号明細書
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）４０：ｐ．１８９−２０１
【非特許文献２】Ｃｏｌｅ，Ｒ．Ｂ．，編、「Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、（１９９７）Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３】Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．Ｃ．およびＢｒｏｗｎ，Ｗ．Ｅ．，編、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ」、（２００２）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐ．７１−１０２
【非特許文献４】Ｈｕｄｚｉａｋ  ＲＭら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８９）９：ｐ．１１６５−７２
【非特許文献５】Ｌｅｗｉｓ  ＧＤら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（１９９３）３７：ｐ．２５５−６３
【非特許文献６】Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９８）５８：ｐ．２８２５−２８３１
【非特許文献７】ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）１９：ｐ．６０５−６１４
【非特許文献８】Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（１９９７）２６：ｐ．１５１−１７２
【非特許文献９】ＤｉＪｏｓｅｐｈら、Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３：ｐ．１８０７−１８１４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの態様は、親和性分離、クロマトグラフィー、および質量分析法によって、抗体結合体化合物および組成物、抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび代謝産物を検出、スクリーニング、および定量するための方法を包含する。質量分析の例示的な方法としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）質量分析法（ＭＳ）が挙げられる。ＳＩＭの実施または技術は、選択イオンモニタリングまたは選択的イオンモニタリングと呼ばれることがある。
【００１２】
本発明の１つの態様は、抗体−薬物結合体化合物を検出する方法であって：
（ｉ）式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ          Ｉ
（式中、
Ａｂは、抗体である；
Ｄは、薬物成分である；
Ｌは、Ａｂへ共有結合しており、そしてＤへ共有結合しているリンカーである；および
ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８である）
を有する抗体−薬物結合体化合物を提供する工程と、
（ｉｉ）前記抗体−薬物結合体化合物および必要に応じて式Ｉ（式中、ｐは０である）の抗体、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物と、生物学的起源とを接触させる工程と；
（ｉｉｉ）その生物学的起源から生物学的サンプルを採取する工程と；
（ｉｖ）分析サンプルを生成するためにその生物学的サンプルを処理する工程と；
（ｖ）前記分析サンプルを分離媒体へ適用して、１つより多いサンプル構成成分の分離を行う工程であって、このとき分離されたサンプル構成成分が式Ｉ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有する抗体−薬物結合体化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を含む、工程と；
（ｖｉ）質量分析法によって１つ以上の分離されたサンプル構成成分の質量もしくは質量対電荷比を確定する工程と、
を包含する方法、を包含する。
【００１３】
本発明は、哺乳動物、組織、または細胞培養などの生物学的起源中の化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物の相対クリアランスを決定するために、抗体−薬物結合体化合物の混合物をスクリーニングするための方法を包含する。
【００１４】
本発明は、質量分析法によって、式Ｉを有する抗体−薬物結合体化合物の不均質な混合物の化合物を検出する方法を包含し、このとき混合物は１より多い薬物負荷値ｐを有しており、このときｐは１、２、３、４、５、６、７、または８であり得、この方法は、抗体−薬物結合体化合物の不均質な混合物を含むサンプルについて質量分析法を実施する工程と、および混合物の１つより多い化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を検出する工程と、を包含する。
【００１５】
本発明は、単一の分析で、ＬＣ／ＭＳによって血漿中の遊離薬物および抗体−薬物結合体両方のレベルを定量する方法を包含する。
【００１６】
本発明は、抗体−薬物結合体のインビボ代謝を試験する方法を包含する。
【００１７】
本発明は、哺乳動物へ投与した後の抗体−薬物結合体の薬物動態分析方法を包含する。
【００１８】
本発明は、抗体−薬物結合体治療方法への感受性および応答を測定することによる患者のプロファイリング方法を包含する。
【００１９】
本発明は、哺乳動物、組織、または細胞培養への抗体−薬物結合体の投与によるタンパク質もしくは抗原の過剰発現を特徴とする状態または疾患の存在または不存在を診断する診断方法を包含する。
【００２０】
本発明は、血漿中の抗体−薬物結合体を単離、浄化、および検出するために、免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択を有する免疫親和性膜／ＬＣ／ＭＳ方法およびバックエンド質量分析法（ＭＳ）と組み合わせた逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ）フロントエンド工程を含んでいる。
【００２１】
本発明の方法によって分析された抗体結合体および抗体についてのＳＩＭ結果は、驚くべきものであり、予想外である。なぜなら、ＳＩＭはこれまでそのような大きな分子のために有用であるとは認識されていなかったからである。本発明の方法は、デクラスタリング（ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）ポテンシャル、ｐＨ、および移動相の制御によって、イオンの高分解能およびイオンエンベロープの安定性を結び付けている。さらに、ＳＩＭにとって最も豊富な最高ピークイオン以外の高質量イオンの選択によって、低質量範囲で代表的なマトリックス干渉が回避される。
【００２２】
本発明は、添付の図面、図、および実施例と組み合わせて、以下の例示的な実施形態の詳細な説明を参照することによって理解され得る。以下の考察は、説明的、例示的、かつ代表的であり、任意の添付の請求項によって規定された範囲を限定すると見なされてはならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の特定の実施形態に対して、参照が詳細になされる。本発明の実施零は、添付の構造および式に図示されている。本発明を列挙した実施形態と組み合わせて記載するが、その列挙された実施形態は、本発明をその形態に限定することは意図されていないことが理解される。対して、本発明は、請求項によって規定された本発明の範囲内に含まれ得る全ての変更、修飾、および等価物を含み得るが意図されている。
【００２４】
当業者は、本発明の実施において使用することができるであろう、本明細書に記載した方法および材料に類似するか、または同等の多数の方法および材料を認識する。本発明は、決して本明細書に記載した方法および材料には限定されない。
【００２５】
他に規定されない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同一の意味を有しており、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）“Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およびＪａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋと一致している。
【００２６】
本明細書において商標名を使用する場合は、本出願人らは独立して商標製品調製物、ジェネリック薬、および商標製品の薬学的有効成分を含むことを意図している。
【００２７】
（定義）
他に記載しない限り、本明細書で使用した以下の用語および熟語は以下の意味を有することが意図されている：
本明細書で使用する用語「抗体」は、極めて広い意味で使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種由来であり得る。
【００２８】
抗体は、特異的抗原を認識してそれに結合できる免疫系によって生成されるタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般に多重抗体上でＣＤＲによって認識されるエピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有している。様々なエピトープへ特異的に結合する各抗体は、相違する構造を有する。そこで、１つの抗原は、１つより多い対応する抗体を有し得る。
【００２９】
本明細書で使用する用語「抗体」はまた、全長免疫グロブリン分子または全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち当該の標的の抗原もしくはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子も意味しており、そのような標的としては、自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を生成する癌細胞が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に開示された免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、クラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。免疫グロブリンは、任意の種由来であってよい。しかし、１つの態様では、免疫グロブリンはヒト、マウス、またはウサギ起源である。
【００３０】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部分、一般にその抗原結合領域またはその可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重抗体；直鎖抗体；Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、ＥＣＤ（細胞外ドメイン）、および癌細胞抗原、ウイルス抗原もしくは微生物抗原、一本鎖抗体分子に免疫特異的に結合する上記の任意のエピトープ結合フラグメント；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用する「インタクトな抗体」は、ＶＬおよびＶＨドメイン、ならびに、完全軽鎖および重鎖定常領域を含む抗体である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から入手された抗体を意味する。すなわちその集団を構成している個々の抗体は、少量で存在している可能性がある天然型突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一抗原部位に対して惹起されている。さらに、様々な決定因子（エピトープ）に対して惹起された様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して惹起される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されずに合成できる点で有益である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の性質が抗体の実質的に均質な集団から入手されることを示しており、そして任意の特定方法による抗体の生成を必要とすると見なすべきではない。例えば、本発明によって使用すべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製できる、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製できる。さらに「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７の中に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３３】
本明細書で使用するモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントを包含する。この「キメラ」抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定種に由来する抗体中の対応する配列と同一もしくは同種であるか、または特定抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、他方鎖の残りはまた別の種に由来する抗体内の対応する配列と同一もしくは同種または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属している（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５）。本明細書で使用するキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例、旧世界ザル、類人猿など）およびヒト定常領域配列由来の可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。
【００３４】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分、例えばその抗原結合領域または可変領域を含んでいる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重抗体；直鎖抗体；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００３５】
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例、ヒト天然配列定常ドメイン）であっても、それらのアミノ酸配列変異体であってもよい。
【００３６】
インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得る。エフェクター機能とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に寄与する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。
【００３７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体はさらに様々な「クラス」に割り当てられ得る。インタクトな抗体には５つの主要クラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびにこれらの数種はさらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分類できる。様々なクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
【００３８】
用語「アミノ酸配列変異体」は、天然配列ポリペプチドからある程度相違するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。必要に応じて、アミノ酸配列変異体は、天然抗体の少なくとも１つの受容体結合ドメインまたは天然受容体の少なくとも１つのリガンド結合ドメインと、少なくとも約７０％（好ましくは、約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％）の配列同一性を有する。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の所定の位置で置換、欠失、および／または挿入を有する。アミノ酸は、慣習的な名称、１文字および３文字コードによって表示される。
【００３９】
「配列同一性」は、配列をアライメントして、必要であれば最大配列同一性率を達成するためにギャップを導入した後に、アミノ酸配列変異体内の同一である残基のパーセンテージと規定される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。そのようなコンピュータプログラムの１つは、１９９１年１２月１０日に米合衆国著作権局（ワシントンＤＣ２０５５９）にユーザー文書を持って提出された、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．によって起草された「Ａｌｉｇｎ  ２」である。
【００４０】
有用なモノクローナル抗体は、特定抗原決定因子に相同である抗体集団である（例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学物質、核酸、またはそれらのフラグメント）。当該抗原に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、細胞中の連続細胞系による抗体分子の生成を提供する当該分野において公知の任意の技術を使用することによって調製できる。これらとしては、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、それらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにそれらの任意のサブクラスであり得る。本発明において有用なＭＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。
【００４１】
有用なモノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはキメラヒト−マウス（もしくは他の種）モノクローナル抗体が挙げられるが、それらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多数の技術のいずれかによって作製できる（例、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２−７９；およびＯｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，３−１６）。
【００４２】
抗体は、二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、１アームでは第１結合特異性を備えるハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームではハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（二次結合特異性を提供する）を有し得る。この非対称性構造は、二重特異性分子の２分の１内の免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を提供するため、望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進する（ＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８６，１２１：２１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６９５４−６９６１；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６３−４７０；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７７−６８１）。二重特異性抗体の作製方法は、当該分野において公知である（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９；ＷＯ９３／０８８２９；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）。そのような技術を用いるて、二重特異性抗体は、本明細書に規定した疾患の処置または予防において、ＡＤＣとして結合体化するために調製できる。
【００４３】
様々なアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を備える抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させられる。融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであり得る。第１重鎖定常領域（ＣＨ１）は、少なくとも融合の１つ内に存在する軽鎖結合のために必要な部位を含有し得る。免疫グロブリン重鎖融合、および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードする配列を備える核酸は、別個の発現ベクター内に挿入され、適切な宿主および生物に同時トランスフェクトされる。これは、構造内に使用される３本のポリペプチド鎖の非同等比率が最適な収率を生じさせる場合は、実施形態内の３つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調整する際に大きな柔軟性を提供する。しかし、同等比率内の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収率を生じさせる場合、または比率が特に重要ではない場合は、１つの発現ベクター内に２もしくは全３本のポリペプチド鎖に対するコーディング配列を挿入することは可能である。
【００４４】
ハイブリッドまたは二官能抗体は、生物学的に（すなわち細胞融合技術により）か、または化学的（特に架橋剤もしくはジスルフィド架橋形成試薬を用いて）のいずれかによって、誘導することができ、そしてインタクトな抗体またはそのフラグメントを含み得る（ＥＰ１０５３６０；ＷＯ８３／０３６７９；ＥＰ２１７５７７）。
【００４５】
抗体は、癌細胞抗原、ウイルス抗原、もしくは微生物抗原、または腫瘍細胞もしくはマトリックスへ結合した他の抗体に免疫特異的に結合する抗体の、機能的に活性なフラグメント、誘導体もしくはアナログであり得る。これに関連して、「機能的に活性」とは、フラグメント、誘導体もしくはアナログが、抗体（この抗体から、そのフラグメント、誘導体もしくはアナログが誘導される）が認識した同一の抗原を認識する抗抗イディオタイプ抗体を惹起し得ることを意味する。具体的には、例示的な実施形態では、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列に対してＣ末端にあるフレームワークおよびＣＤＲ配列の欠失によって、強化することができる。どのＣＤＲ配列が抗原に結合するのかを決定するために、ＣＤＲ配列を含有する合成ペプチドは、当該分野において公知の任意の結合アッセイによる抗原との結合アッセイにおいて使用できる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ；Ｋａｂａｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２５（３）：９６１−９６９を参照されたい）。
【００４６】
その他の有用な抗体としては、抗体分子のペプチン消化によって生成できる可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有するＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成できるＦａｂフラグメントなどの抗体のフラグメントが挙げられる。他の有用な抗体は、抗体の重鎖および軽鎖二量体、またはＦｖもしくは一本鎖抗体などの任意の最小フラグメント（ＳＣＡ）（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４に記載されている）、またはその抗体と同一特異性を備える任意の他の分子である。
【００４７】
さらに、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの標準組み換えＤＮＡ技術を用いて作製できるヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組み換え抗体は、有用な抗体である。キメラ抗体は、様々な部分が様々な動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子）である（米国特許第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号、これらは本明細書中に参考として援用される）。キメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えばＷＯ８７／０２６７１；ＥＰ１８４，１８７；ＥＰ１７１４９６；ＥＰ１７３４９４；ＷＯ８６／０１５３３；ＵＳ４８１６５６７；ＥＰ１２０２３；Ｂｅｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；ＵＳ５２２５５３９；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０（これらは、各々が本明細書中に参考として援用される）に記載された方法を使用して、当該分野において公知の組み換えＤＮＡ技術によって生成できる。
【００４８】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することのできるトランスジェニックマウスを用いて生成できる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて、通常の方法で免疫される。この抗原に対して惹起されたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて入手できる。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再配列し、続いてクラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。そこで、そのような技術を使用すると、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するための技術の概観については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術、ならびにそのような抗体を生成するためのプロトコールについての詳細な考察には、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号（各々が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。他のヒト抗体は、例えばＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（カリフォルニア州サンノゼ）から市販で入手できる。
【００４９】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて生成できる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３）。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリーを含む、当該分野において公知の様々な技術を用いて生成することもできる（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。
【００５０】
抗体は、抗体の融合タンパク質、またはその機能的に活性なフラグメントであり得る。この融合タンパク質は、例えば抗体が共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかで抗体ではない他のタンパク質（または、その一部（そのタンパク質の少なくとも１０、２０または５０アミノ酸部分など））のアミノ酸配列へ融合している。抗体またはそのフラグメントは、定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質へ共有結合し得る。
【００５１】
抗体は、その抗体がその抗原結合免役特異性を保持することを共有結合が許容する限り、任意のタイプの分子の共有結合によっていずれも修飾されたアナログおよび誘導体を包含する。例えば、抗体の誘導体もしくはアナログは、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、細胞抗体単位もしくは他のタンパク質へのリンケージによってさらに修飾されている誘導体もしくはアナログを含んでいる。任意の多数の化学修飾は、限定されるものではないが特異的化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの存在下での代謝合成など（ただし、決してこれらに限定されない）の公知の技術によって実施できる。さらに、アナログもしくは誘導体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含有し得る。
【００５２】
ＡＤＣ中の抗体は、Ｆｃ受容体およびアミノ酸残基中に修飾（例、置換、欠失または付加）を有する抗体を包含する。特に、抗体は、抗ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基内に修飾を有する抗体を包含する（例えば、ＷＯ９７／３４６３１（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照されたい）。癌細胞抗原に免疫特異的な抗体は、例えばＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から市販で入手できる、または例えば化学合成もしくは組み換え発現技術などの当業者に公知の任意の方法によって生成することができる。癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースまたはそれに似たデータベースから、文献刊行物から、または日常的クローニングおよびシーケンシングによって入手できる。
【００５３】
用語「受容体」は、細胞表面上で固有に発現もしくは過剰発現され、そして循環する標的剤（例えば、抗体−薬物結合体）との相互作用を許容する様式で細胞表面上に曝露される、任意のペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ポリ炭水化物、または脂質を包含する。受容体を有する細胞は、腫瘍細胞を含んでいる。
【００５４】
用語「患者」は、ヒトおよび獣医学被験体を包含する。抗体−薬物結合体を投与するため、または抗体−薬物結合体と接触させるための「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農耕動物、非ヒト霊長類、および哺乳動物組織を有する任意の他の動物と分類される任意の動物を意味する。
【００５５】
用語「生物学的サンプル」は、（ｉ）血液、胆汁、尿、または便；（ｉｉ）組織抽出物；および（ｉｉｉ）細胞培地、細胞溶解液、または細胞抽出物、を意味する。
【００５６】
用語「生物学的起源」は、（ｉ）マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、またはヒトなどの哺乳動物；（ｉｉ）哺乳動物組織；および（ｉｉｉ）培養細胞、を意味する。
【００５７】
用語「標識」は、抗体に共有結合することができ：（ｉ）検出可能なシグナルを提供するため；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１標識もしくは第２標識から提供される検出可能なシグナルを修飾するため（例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移））；（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドを用いて相互作用を安定化させるため、または結合親和性を増加させるため；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、もしくは物理的パラメータによって移動度、例えば電気泳動移動度、または細胞透過性に影響を及ぼすため、または（ｖ）リガンド親和性、抗体／抗原結合、もしくはイオン性複合体形成を調節するために捕捉成分を提供するために機能する、任意の成分を意味する。
【００５８】
「アルキル」は、標準、二次、三次もしくは環状炭素原子を含有するＣ１−Ｃ１８炭化水素成分である。アルキルラジカルの例には：メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３、１−ヘプチル、１−オクチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルなどのＣ１−Ｃ８炭化水素成分が含まれる。
【００５９】
「アリール」は、親芳香環系の単一炭素原子からの１つの水素原子の除去によって引き出される６〜２０個の炭素原子の一価芳香族炭化水素ラジカルを意味する。一部のアリール基は、例示的構造内で「Ａｒ」として表される。典型的なアリール基には、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから引き出されたラジカルが含まれるが、それらに限定されない。
【００６０】
「置換アルキル」、および「置換アリール」は、１つまたは複数の水素原子が各々独立して置換基と置換されているアルキルおよびアリールを意味する。典型的な置換基には、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−ＮＲ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−ＳＯ３−、−ＳＯ３Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−ＰＯ−３、−ＰＯ３Ｈ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２−、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２、−Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ２（式中、各Ｘは独立してハロゲン：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、もしくはＩである；および各Ｒは独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１４複素環、または保護基である）が含まれるが、それらに限定されない。上述したアルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基もまた同様に置換されていてよい。
【００６１】
「ヘテロアリール」、「ヘテロシクリル」、および「複素環」はすべて、１つまたは複数の環状原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素、および硫黄である環系を意味する。複素環ラジカルは、１〜２０個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される１〜５個のヘテロ原子を含んでいる。複素環は、３〜７個の環員を有する単環式（２〜６個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択された１〜３個のヘテロ原子）または例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系である７〜１０個の環員（４〜９個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択された１〜３個のヘテロ原子）を有する二環式であってよい。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  Ｌｅｏ  Ａ．；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｗ．Ａ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６８），特に１章、３章、４章、６章、７章および９章；“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９５０〜現在），特に１３巻、１４巻、１６巻、１９巻および２８巻；およびＪ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（１９６０）  ８２：５５６６に記載されている。
【００６２】
複素環の例には、例示するためで限定するためではなく、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、酸化硫黄テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、プテリジニル、４Ａｈ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナンスロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシンドリル、ベンゾキサゾリニル、およびイサチノイルが含まれる。
【００６３】
例示するためで限定するためではなく、炭素結合複素環はピリジンの２、３、４、５、もしくは６位、ピリダジンの３、４、５、もしくは６位、ピリミジンの２、４、５、もしくは６位、ピラジンの２、３、５、もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールもしくはテトラヒドロピロールの２、３、４、もしくは５位、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの２、４、もしくは５位、イソキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの３、４、もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３、もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、もしくは８位、またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、もしくは８位で結合させられる。さらにより典型的には、炭素結合複素環には、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、または５−チアゾリルが含まれる。
【００６４】
例示するためであって限定するためではなく、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位で、イソインドールもしくはイソインドリンの２位で、モルホリンの４位で、およびカルバゾール、またはβ−カルボリンの９位で結合させられている。さらにより典型的には、窒素結合複素環には、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、および１−ピペリジニルが含まれる。
【００６５】
「炭素環」および「カルボシクリル」は、単環としての３〜７個の炭素原子または二環としての７〜１２個の炭素原子を有する飽和または不飽和環を意味する。単環式炭素環は３〜６個の炭素原子、より典型的には５もしくは６個の環状原子を有している。二環式炭素環は、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配列された７〜１２個の環状原子、またはビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配列された９もしくは１０個の環状原子を有する。単環式炭素環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキス−１−エニル、１−シクロヘキス−２−エニル、１−シクロヘキス−３−エニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれる。
【００６６】
「反応性官能基」には、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、炭酸塩、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン（チオール）、硫化物、二硫化物、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸塩、エナミン、イナミン、ウレア、プソイドウレア、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が含まれるが、それらに限定されない。例示的な反応性官能基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、パラ−ニトロフェニル（ＰＮＰ）炭酸塩、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）炭酸塩、およびマレイミドが含まれる。例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，  Ｅｄｓ．  “Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９８９を参照されたい。
【００６７】
「リンカー」、「リンカー単位」、または「リンク」は、共有結合または抗体を薬物成分へ共有結合させる原子の鎖を含む化学成分を意味する。様々な実施形態では、リンカーはＬと規定されている。リンカーには、アルキレン、アリールジイル、ヘテロアリールジイル、例えば−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−、アルキルオキシの反復単位（例、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（例、ポリエチレンアミノ、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（商標））などの部分などの二価ラジカル；ならびにスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート、およびカプロアミドを含む二酸エステルおよびアミドが含まれる。
【００６８】
例示的なリンカーの略語には：ＭＣ＝６−マレイミドカプロイル、ＭＰ＝マレイミドプロパノイル、ｖａｌ−ｃｉｔ＝プロテアーゼ開裂型リンカー内のジペプチド部位であるバリン−シトルリン、ａｌａ−ｐｈｅ＝プロテアーゼ開裂型リンカー内のジペプチド部位であるアラニン−フェニルアラニン、ＰＡＢ＝ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（リンカーの「自己犠牲的」部分））、ＳＰＰ＝Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート、ＳＭＣＣ＝Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート、ＳＩＡＢ＝Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノ安息香酸が含まれる。
【００６９】
用語「キラル」は、鏡像パートナーと重なり合うことができないという特性を有する分子を意味し、他方用語「アキラル」は、それらの鏡像パートナーに重なり合うことができる分子を意味する。
【００７０】
用語「立体異性体」は、同一の化学構造を有するが、空間内の原子または基の配列に関して相違する化合物を意味する。
【００７１】
「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラリティーの中心を備え、それらの分子が相互の鏡像ではない立体異性体を意味する。ジアステレオマーは、相違する物理的特性、例えば融点、沸点、スペクトル特性、および反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動法やクロマトグラフィーなどの高分解能分析方法下では分離することがある。
【００７２】
「エナンチオマー」は、相互の重なり合わない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を意味する。
【００７３】
本明細書で使用する立体化学的定義および決まりは、一般にＳ．Ｐ．  Ｐａｒｋｅｒ，編，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓ．，  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにしたがうものとする。多くの有機化合物は光学活性形で存在する。すなわち、それらは平面偏光の平面を回転する能力を有する。光学活性化合物について記載する場合は、そのキラル中心の周囲での分子の絶対配置を意味するために接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳを使用する。接頭辞ｄおよびｌまたは（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転の記号を表示するために使用するが、このとき（−）もしくはｌは化合物が左旋性であることを意味する。（＋）もしくはｄが前に付いた化合物は、右旋性である。所定の化学構造に対しては、これらの立体異性体は、それらが相互の鏡像であることを除けば同一である。特異的立体異性体は、エナンチオマーとも呼ばれることがあり、そのような異性体の混合物はしばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物はラセミ混合物もしくはラセミ化合物とも呼ばれ、これは化学反応もしくはプロセス内に立体選択もしくは立体特異性がなかった場合に発生することがある。用語「ラセミ混合物」および「ラセミ化合物」は、光学活性が欠けている２つのエナンチオマー種の等モル混合物を意味する。
【００７４】
本明細書で使用する慣用句「医薬上許容される塩」は、ＡＤＣの医薬上許容される有機塩または無機塩を意味する。例示的な塩には、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、スクシネート、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマレート、グルコネート、グルクロネート、サッカレート、ホルメート、ベンゾエート、グルタメート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、およびパモエート（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩が含まれるが、それらに限定されない。医薬上許容される塩は、酢酸イオン、スクシネートイオンまたはその他の対イオンなどの他の分子の封入体を含むことができる。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機または無機成分であってよい。さらに、医薬上許容される塩は、その構造内に１つより多い荷電原子を有していてよい。複数の荷電原子が医薬上許容される塩の一部である場合は複数の対イオンを有することができる。したがって、医薬上許容される塩は、１つまたは複数の荷電原子および／または１つもしくは複数の対イオンを有することができる。
【００７５】
「医薬上許容される溶媒和物」は、１つまたは複数の溶媒分子とＡＤＣとの結合を意味する。医薬上許容される溶媒和物を生成する溶媒の例には、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンが含まれるがそれらに限定されない。
【００７６】
以下の頭字語、用語、および略語を本明細書で使用するが、指示した定義を有する：
ＢｏｃはＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）、ｃｉｔはシトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ｄａｐはドラプロイン、ＤＣＣは１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＥＡはジエチルアミン、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレート、ＤＥＰＣはジエチルホスホリルシアニデート、ＤＩＡＤはジイソプロピルアゾジカルボキシレート、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ｄｉｌはドライソロイン、ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＥはエチレングリコールジメチルエーテル（または１，２−ジメトキシエタン）、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ｄｏｅはドラフェニン、ｄｏｖはＮ，Ｎ−ジメチルバリン、ＤＴＮＢは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＤＴＴはジチオトレイトール、ＥＤＣＩは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＥＥＤＱは２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、ＥＳ−ＭＳはエレクトロスプレー質量分析法、ＥｔＯＡｃは酢酸エチル、ＦｍｏｃはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ｇｌｙはグリシン、ＨＡＴＵはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＨＰＬＣは高圧液体クロマトグラフィー、ｉｌｅはイソロイシン、ｌｙｓはリシン、ＭｅＣＮ（ＣＨ３ＣＮ）はアセトニトリル、ＬＣ／ＭＳは液体クロマトグラフィーおよび質量分析法、ＭｅＯＨはメタノール、Ｍｔｒは４−アニシルジフェニルメチル（または４−メトキシトリチル）、ｎｏｒは（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルフェドリン、ＰＢＳはリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）、ＰＥＧはポリエチレングルコール、Ｐｈはフェニル、Ｐｎｐはｐ−ニトロフェニル、ＰｙＢｒｏｐはブロモトリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＳＥＣはサイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｕはスクシンイミド、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィー、ＵＶは紫外線、およびｖａｌはバリンである。
抗体
式Ｉの抗体単位（Ａｂ−）は、その範囲内に、受容体、抗原、または所定の標的細胞集団と結び付いている他の受容性成分と結合する、または反応性に結び付く、または複合体生成する抗体（Ａｂ）の任意単位を含んでいる。抗体は、治療的、さもなければ生物学的に修飾しようとされる細胞集団の１成分に結合する、それと複合体生成する、またはそれと反応する任意のタンパク質もしくはタンパク質様分子であってよい。１つの態様では、抗体単位は、それと抗体単位が反応する特定の標的細胞集団へ薬物単位を送達するように作用する。そのような抗体には、全長抗体および抗体フラグメントなどの高分子量タンパク質が含まれるがそれらに限定されない。
【００７７】
式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）内にＡｂを含む有用な非免疫反応性タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド抗体には、トランスフェリン、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、血小板由来成長因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（「ＴＧＦ」）、ワクシニア成長因子（「ＶＧＦ」）、インスリンおよびインスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、レクチンならびに低密度リポタンパク質由来のアポタンパク質が含まれるがそれらに限定されない。
【００７８】
式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）内にＡｂを含み、そして癌の治療において有用な可能性がある抗体には、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が含まれるがそれらに限定されない。そのような腫瘍関連抗原は当技術分野において知られており、当技術分野においてよく公知の方法および情報を用いて抗体を生成する際に使用するために調製できる。癌の診断および療法のための有効な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者らは１つまたは複数の正常非癌性細胞に比較して１つまたは複数の特定タイプの癌細胞の表面上で特異的に発現する膜貫通さもなければ腫瘍関連ポリペプチドを同定することを目指してきた。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上に比較して癌細胞の表面上でより富裕に発現する。そのような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体に基づく療法を介して破壊するために癌細胞を特異的に標的とする能力を生じさせてきた。
【００７９】
ＴＡＡの例には、以下に列挙するＴＡＡ（１）〜（３５）が含まれるがそれらに限定されない。便宜性のために、これらの抗原に関する情報は、それらはすべて当技術分野において知られているが、下記に列挙する。これらの情報は、抗原の名称、代替の名称、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号および主要な参考文献を含んでいる。抗体によって標的化された腫瘍関連抗原には、言及した参考文献に同定された配列に比較して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％配列同一性を有する、または言及した参考文献に見いだされる配列を有するＴＡＡと同一の生物学的特性もしくは特徴を実質的に示すすべてのアミノ酸配列変異体およびアイソフォームが含まれる。例えば、変異体配列を有するＴＡＡは、一般に列挙した対応する配列を備えるＴＡＡに特異的に結合する抗体へ特異的に結合することができる。本明細書で詳細に列挙した参考文献内の配列および開示は、明示的に参照して組み込まれる。
腫瘍関連抗原（１）〜（３５）：
（１）  ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０３）  ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４（５１５５）：１０１−１０４（１９９４），  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４（１１）：１３７７−１３８２（１９９７））；ＷＯ２００４０６３３６２（請求項２）；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＵＳ２００３１３４７９０−Ａ１（第３８〜３９頁）；ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３；第２９６頁）；ＷＯ２００３０５５４４３（第９１〜９２頁）；ＷＯ２００２９９１２２（実施例２；第５２８〜５３０頁）；ＷＯ２００３０２９４２１（請求項６）；ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２；図１１２）；ＷＯ２００２９８３５８（請求項１；第１８３頁）；ＷＯ２００２５４９４０（第１００〜１０１頁）；ＷＯ２００２５９３７７（第３４９〜３５０頁）；ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７；第３７６頁）；ＷＯ２００１４８２０４（実施例；図４）  ＮＰ＿００１１９４  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｔｙｐｅ  ＩＢ  ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１−相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８；ＮＰ＿００ｌ１９４．１；ＮＭ＿００１２０３＿１
（２）  Ｅ１６（ＬＡＴｌ、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３４８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２５５（２），  ２８３−２８８（１９９９），  Ｎａｔｕｒｅ  ３９５（６６９９）：２８８−２９１（１９９８），  Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，  Ｈ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７（１６）：１１２６７−１１２７３）；ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）；ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）；ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）；ＷＯ２００２９９０７４（請求項１９；第１２７〜１２９）；ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７；第２２２頁、第３９３頁）；ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０；第２９３頁）；ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３；第９３〜９５頁）；ＷＯ２０００１４２２８（請求項５；第１３３〜１３６頁）；ＵＳ２００３２２４４５４（図３）；ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２；第１５０頁）；ＮＰ＿００３４７７  ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ７（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｙ＋ｓｙｓｔｅｍ），  ｍｅｍｂｅｒ  ５  ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３  −  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  相互参照：ＭＩＭ：６００１８２；ＮＰ＿００３４７７．３；ＮＭ＿０１５９２３；ＮＭ＿００３４８６＿１
（３）  ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１２４４９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１（１５），  ５８５７−５８６０（２００１），  Ｈｕｂｅｒｔ，  Ｒ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９６（２５）：１４５２３−１４５２８）；ＷＯ２００４０６５５７７（請求項６）；ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｌ）；ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）；ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＵＳ２００３１５７０８９（実施例５）；ＵＳ２００３１８５８３０（実施例５）；ＵＳ２００３０６４３９７（図２）；ＷＯ２００２８９７４７（実施例５；第６１８〜６１９頁）；ＷＯ２００３０２２９９５（実施例９；図１３Ａ、実施例５３；第１７３頁、実施例２；図２Ａ）；ＮＰ＿０３６５８１  ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５；ＮＰ＿０３６５８１．１；ＮＭ＿０１２４４９＿１
（４）  ０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６１４８６）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（２９）：２７３７１−２７３７５（２００１））；ＷＯ２００４０４５５５３（請求項１４）；ＷＯ２００２９２８３６（請求項６；図１２）；ＷＯ２００２８３８６６（請求項１５；第１１６〜１２１）；ＵＳ２００３１２４１４０（実施例１６）；ＵＳ２００３０９１５８０（請求項６）；ＷＯ２００２０６３１７（請求項６；第４００〜４０８頁）；相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１
（５）  ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球強化因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５８２３）Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９（２），  ８０５−８０８（１９９４），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（１９９９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９３（ｌ）：１３６−１４０（１９９６），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０（３７）：２１９８４−２１９９０（１９９５））；ＷＯ２００３１０１２８３（請求項１４）；（ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３；第２８７−２８８号）；ＷＯ２００２１０１０７５（請求項４；第３０８〜３０９）；ＷＯ２００２７１９２８（第３２０〜３２１頁）；ＷＯ９４１０３１２（第５２〜５７頁）；相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１；ＮＰ＿００５８１４．２；ＮＭ＿００５８２３＿１
（６）  Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６４２４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７（２２）：１９６６５−１９６７２（２００２），  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２（２）：２８１−２８４（１９９９），  Ｆｅｉｌｄ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２５８（３）：５７８−５８２）；ＷＯ２００４０２２７７８（請求項２）；ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）；ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３；第３２６頁）；ＥＰ８７５５６９（請求項１；第１７〜１９頁）；ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０；第３２９頁）；ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）；ＷＯ２００１７５１７７（請求項２４；第１３９〜１４０頁）；相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７；ＮＰ＿００６４１５．１；ＮＭ＿００６４２４＿１
（７）  Ｓｅｍａ  ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマホリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復配列（１型および１型様）、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマホリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４０８７８）  Ｎａｇａｓｅ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．  ７（２）：１４３−１５０）；ＷＯ２００４０００９９７（請求項１）；ＷＯ２００３００３９８４（請求項１）；ＷＯ２００２０６３３９（請求項１；第５０頁）；ＷＯ２００１８８１３３（請求項１；第４１〜４３頁、第４８〜５８頁）；ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）；ＷＯ２００３１０１４００（請求項１１）；アクセッション番号：Ｑ９Ｐ２８３；ＥＭＢＬ；ＡＢ０４０８７８；ＢＡＡ９５９６９．１．  Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７；
（８）  ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３５８６２８）；ＵＳ２００３１２９１９２（請求項２）；ＵＳ２００４０４４１８０（請求項１２）；ＵＳ２００４０４４１７９（請求項１１）；ＵＳ２００３０９６９６１（請求項１１）；ＵＳ２００３２３２０５６（実施例５）；ＷＯ２００３１０５７５８（請求項１２）；ＵＳ２００３２０６９１８（実施例５）；ＥＰ１３４７０４６（請求項１）；ＷＯ２００３０２５１４８（請求項２０）；相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８；ＡＡＱ８８９９１．１；ＡＹ３５８６２８＿１
（９）  ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７５４６３）；Ｎａｋａｍｕｔａ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １７７，  ３４−３９，  １９９１；Ｏｇａｗａ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １７８，  ２４８−２５５，  １９９１；Ａｒａｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｐｎ．  Ｃｉｒｃ．  Ｊ．  ５６，  １３０３−１３０７，  １９９２；Ａｒａｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  ３４６３−３４７０，  １９９３；Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ａ．，  Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １７８，  ６５６−６６３，  １９９１；Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ  Ｎ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  ３８７３−３８７９，  １９９３；Ｈａｅｎｄｌｅｒ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０，  Ｓｌ−Ｓ４，  １９９２；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ２２８，  ４３−４９，  １９９９；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９，  １６８９９−１６９０３，  ２００２；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８２，  ３１１６−３１２３，  １９９７；Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２１５８９−２１５９６，  １９９７；Ｖｅｒｈｅｉｊ  Ｊ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０８，  ２２３−２２５，  ２００２；Ｈｏｆｓｔｒａ  Ｒ．Ｍ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５，  １８０−１８５，  １９９７；Ｐｕｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｅ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ７９，  １２５７−１２６６，  １９９４；Ａｔｔｉｅ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４，  ２４０７−２４０９，  １９９５；Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５：３５１−３５４，  １９９６；Ａｍｉｅｌ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５，  ３５５−３５７，  １９９６；Ｈｏｆｓｔｒａ  Ｒ．Ｍ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １２，  ４４５−４４７，  １９９６；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０３，  １４５−１４８，  １９９８；Ｆｕｃｈｓ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７，  １１５−１２４，  ２００１；Ｐｉｎｇａｕｌｔ  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  １１１，  １９８−２０６；ＷＯ２００４０４５５１６（請求項１）；ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）；ＷＯ２００４０４００００（請求項１５１）；ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）；ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）；ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）；ＷＯ２００２６１０８７（図１）；ＷＯ２００３０１６４９４（図６）；ＷＯ２００３０２５１３８（請求項���２；第１４４頁）；ＷＯ２００１９８３５１（請求項１；第１２４〜１２５頁）；ＥＰ５２２８６８（請求項８；図２）；ＷＯ２００１７７１７２（請求項１；第２９７〜２９９頁）；ＵＳ２００３１０９６７６；ＵＳ６５１８４０４（図３）；ＵＳ５７７３２２３（請求項１ａ；第３１〜３４段）；ＷＯ２００４００１００４；
（１０）  ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７７６３）；ＷＯ２００３１０４２７５（請求項１）；ＷＯ２００４０４６３４２（実施例２）；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＷＯ２００３０８３０７４（請求項１４；第６１頁）；ＷＯ２００３０１８６２１（請求項１）；ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２；図９３）；ＷＯ２００１６６６８９（実施例６）；相互参照：Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ：５４８９４；ＮＰ＿０６０２３３．２；ＮＭ＿０１７７６３＿１
（１１）  ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２、６回膜貫通型前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４５５１３８）  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８２（１１）：１５７３−１５８２（２００２））；ＷＯ２００３０８７３０６；ＵＳ２００３０６４３９７（請求項１；図１）；ＷＯ２００２７２５９６（請求項１３；第５４〜５５頁）；ＷＯ２００１７２９６２（請求項１；図４Ｂ）；ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１１）；ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１６）；ＵＳ２００４００５５９８（請求項２２）；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＵＳ２００３０６０６１２（請求項１２；図１０）；ＷＯ２００２２６８２２（請求項２３；図２）；ＷＯ２００２１６４２９（請求項１２；図１０）；相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８；ＡＡＮ０４０８０．１；ＡＦ４５５１３８＿１
（１２）  ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体潜在的カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７６３６）  Ｘｕ，  Ｘ．Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８（１９）：１０６９２−１０６９７（２００１），  Ｃｅｌｌ  １０９（３）：３９７−４０７（２００２），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８（３３）：３０８１３−３０８２０（２００３））；ＵＳ２００３１４３５５７（請求項４）；ＷＯ２０００４０６１４（請求項１４；第１００〜１０３頁）；ＷＯ２００２１０３８２（請求項１；図９Ａ）；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７；第３９１頁）；ＵＳ２００３２１９８０６（請求項４）；ＷＯ２００１６２７９４（請求項１４；図１Ａ−Ｄ）；相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６；ＮＰ＿０６０１０６．２；ＮＭ＿０１７６３６＿１
（１３）  ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）  Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８（７）：１９８７−１９９１（１９８９），  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４９（３）：５５５−５６５（１９９１））；ＵＳ２００３２２４４１１（請求項１）；ＷＯ２００３０８３０４１（実施例１）；ＷＯ２００３０３４９８４（請求項１２）；ＷＯ２００２８８１７０（請求項２；第５２〜５３頁）；ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２；図５８）；ＷＯ２００２１６４１３（請求項１；第９４〜９５頁、第１０５頁）；ＷＯ２００２２２８０８（請求項２；図１）；米国特許第５，８５４，３９９号（実施例２；第１７〜１８段）；米国特許第５，７９２，６１６号（図２）；相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５；ＮＰ＿００３２０３．１；ＮＭ＿００３２１２＿１
（１４）  ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２  Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２６００４）  Ｆｕｊｉｓａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４（４）：２１１８−２１２５）；Ｗｅｉｓ  Ｊ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６７，  １０４７−１０６６，  １９８８；Ｍｏｏｒｅ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４，  ９１９４−９１９８，  １９８７；Ｂａｒｅｌ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５，  １０２５−１０３１，  １９９８；Ｗｅｉｓ  Ｊ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８３，  ５６３９−５６４３，  １９８６；Ｓｉｎｈａ  Ｓ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５０，  ５３１１−５３２０；ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）；ＵＳ２００４００５５３８（実施例１）；ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）；ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）；ＷＯ９１０２５３６（図９．１〜９．９）；ＷＯ２００４０２０５９５（請求項１）；アクセッション番号：Ｐ２００２３；Ｑ１３８６６；Ｑ１４２１２；ＥＭＢＬ；Ｍ２６００４；ＡＡＡ３５７８６．１．
（１５）  ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６２６または１１０３８６７４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）  １００（７）：４１２６−４１３１，  Ｂｌｏｏｄ（２００２）  １００（９）：３０６８−３０７６，  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２（６）：１６２１−１６２５）；ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２、図１４０）；ＷＯ２００３０８７７６８，  ＵＳ２００４１０１８７４（請求項１、第１０２頁）；ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）；ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）；ＵＳ２００２１５０５７３（請求項５、第１５頁）；ＵＳ５６４４０３３；ＷＯ２００３０４８２０２（請求項１、第３０６および３０９頁）；ＷＯ９９／５５８６５８，  ＵＳ６５３４４８２（請求項１３、図１７Ａ／Ｂ）；ＷＯ２０００５５３５１（請求項１１、第１１４５〜１１４６頁）；相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５；ＮＰ＿０００６１７．１；ＮＭ＿０００６２６＿１
（１６）  ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含有するＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７６４）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３（１０）：２２６５−２２７０（２００３），  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４（２）：８７−９５（２００２），  Ｂｌｏｏｄ  ９９（８）：２６６２−２６６９（２００２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８（１７）：９７７２−９７７７（２００１），  Ｘｕ，  Ｍ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８０（３）：７６８−７７５；ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）；ＷＯ２００３０７７８３６；ＷＯ２００１３８４９０（請求項５；図１８Ｄ−１〜１８Ｄ−２）；ＷＯ２００３０９７８０３（請求項１２）；ＷＯ２００３０８９６２４（請求項２５）；相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９；ＮＰ＿１１０３９１．２；ＮＭ＿０３０７６４＿１
（１７）  ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１１７３０）  Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）  ２３０（４７３０）：１１３２−１１３９）；Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１９，  ２３０−２３４，  １９８６；Ｓｅｍｂａ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２，  ６４９７−６５０１，  １９８５；Ｓｗｉｅｒｃｚ  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １６５，  ８６９−８８０，  ２００４；Ｋｕｈｎｓ  Ｊ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ３６４２２−３６４２７，  １９９９；Ｃｈｏ  Ｈ．−Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２１，  ７５６−７６０，  ２００３；Ｅｈｓａｎｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，  ４２６−４２９；ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）；ＷＯ２００４０２７０４９（図１１）；ＷＯ２００４００９６２２；ＷＯ２００３０８１２１０；ＷＯ２００３０８９９０４（請求項９）；ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）；ＵＳ２００３１１８５９２；ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）；ＷＯ２００３０５５４３９（請求項２９；図１Ａ〜Ｂ）；ＷＯ２００３０２５２２８（請求項３７；図５Ｃ）；ＷＯ２００２２２６３６（実施例１３；第９５〜１０７頁）；ＷＯ２００２１２３４１（請求項６８；図７）；ＷＯ２００２１３８４７（第７１〜７４頁）；ＷＯ２００２１４５０３（第１１４〜１１７頁）；ＷＯ２００１５３４６３（請求項２；第４１〜４６頁）；ＷＯ２００１４１７８７（第１５頁）；ＷＯ２０００４４８９９（請求項５２；図７）；ＷＯ２０００２０５７９（請求項３；図２）；米国特許第５，８６９，４４５（請求項３；第３１〜３８段）；ＷＯ９６３０５１４（請求項２；第５６〜６１頁）；ＥＰ１４３９３９３（請求項７）；ＷＯ２００４０４３３６１（請求項７）；ＷＯ２００４０２２７０９；ＷＯ２００１００２４４（実施例３；図４）；アクセッション番号：Ｐ０４６２６；ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６７；ＡＡＡ３５８０８．１．  ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６１；ＡＡＡ３５８０８．１．
（１８）  ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１８７２８）；Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３，  ５９−６６，  １９８８；Ｔａｗａｒａｇｉ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １５０，  ８９−９６，  １９８８；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９：１６８９９−１６９０３，  ２００２；ＷＯ２００４０６３７０９；ＥＰ１４３９３９３（請求項７）；ＷＯ２００４０４４１７８（実施例４）；ＷＯ２００４０３１２３８；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）；ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７；第４２７頁）；ＷＯ２００２６０３１７（請求項２）；アクセッション番号：Ｐ４０１９９；Ｑ１４９２０；ＥＭＢＬ；Ｍ２９５４１；ＡＡＡ５９９１５．１．  ＥＭＢＬ；Ｍ１８７２８；
（１９）  ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１７０２３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９（２６）：１６８９９−１６９０３（２００２））；ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）；ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３；第８５〜８７頁）；ＪＰ０５００３７９０（図６〜８）；ＷＯ９９４６２８４（図９）；相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０；ＡＡＨ１７０２３．１；ＢＣ０１７０２３＿１
（２０）  ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８４９７１）；Ｃｌａｒｋ  Ｈ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３，  ２２６５−２２７０，  ２００３；Ｍｕｎｇａｌｌ  Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，  ８０５−８１１，  ２００３；Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １０４，  ９−１９，  ２００１；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７，  ３５４５−３５４９，  ２００１；Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４７５１７−４７５２３，  ２００２；Ｐｌｅｔｎｅｖ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１２６１７−１２６２４；Ｓｈｅｉｋｈ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２，  ２００６−２０１０；ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）；ＵＳ２００４００５３２０（実施例５）；ＷＯ２００３０２９２６２（第７４〜７５頁）；ＷＯ２００３００２７１７（請求項２；第６３頁）；ＷＯ２００２２２１５３（第４５〜４７頁）；ＵＳ２００２０４２３６６（第２０〜２１頁）；ＷＯ２００１４６２６１（第５７〜５９頁）；ＷＯ２００１４６２３２（第６３〜６５頁）；ＷＯ９８３７１９３（請求項１；第５５〜５９頁）；アクセッション番号：Ｑ９ＵＨＦ４；Ｑ６ＵＷＡ９；Ｑ９６ＳＨ８；ＥＭＢＬ；ＡＦｌ８４９７１；ＡＡＦ０１３２０．１．
（２１）  Ｂｒｅｖｉｃａｎ（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２９０５３）  Ｇａｒｙ  Ｓ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ２５６，  １３９−１４７，  ２０００；Ｃｌａｒｋ  Ｈ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３，  ２２６５−２２７０，  ２００３；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９，  １６８９９−１６９０３，  ２００２；ＵＳ２００３１８６３７２（請求項１１）；ＵＳ２００３１８６３７３（請求項１１）；ＵＳ２００３１１９１３１（請求項１；図５２）；ＵＳ２００３１１９１２２（請求項１；図５２）；ＵＳ２００３１１９１２６（請求項１）；ＵＳ２００３１１９１２１（請求項１；図５２）；ＵＳ２００３１１９１２９（請求項１）；ＵＳ２００３１１９１３０（請求項１）；ＵＳ２００３１１９１２８（請求項１；図５２）；ＵＳ２００３１１９１２５（請求項１）；ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）；ＷＯ２００２０２６３４（請求項１）；
（２２）  ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４４２）  Ｃｈａｎ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｗａｔｔ，  Ｖ．Ｍ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６（６），  １０５７−１０６１（１９９１）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０（５）：８９７−９０５（１９９５），  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２１：３０９−３４５（１９９８），  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  １９６：１７７−２４４（２０００））；ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）；ＷＯ２０００５３２１６（請求項１；第４１頁）；ＷＯ２００４０６５５７６（請求項１）；ＷＯ２００４０２０５８３（請求項９）；ＷＯ２００３００４５２９（第１２８〜１３２頁）；ＷＯ２０００５３２１６（請求項１；第４２頁）；相互参照：ＭＩＭ：６００９９７；ＮＰ＿００４４３３．２；ＮＭ＿００４４４２＿１
（２３）  ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＸ０９２３２８）  ＵＳ２００４０１０１８９９（請求項２）；ＷＯ２００３１０４３９９（請求項１１）；ＷＯ２００４０００２２１（図３）；ＵＳ２００３１６５５０４（請求項１）；ＵＳ２００３１２４１４０（実施例２）；ＵＳ２００３０６５１４３（図６０）；ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３；第２９９頁）；ＵＳ２００３０９１５８０（実施例２）；ＷＯ２００２１０１８７（請求項６；図１０）；ＷＯ２００１９４６４１（請求項１２；図７ｂ）；ＷＯ２００２０２６２４（請求項１３；図１Ａ〜１Ｂ）；ＵＳ２００２０３４７４９（請求項５４；第４５〜４６頁）；ＷＯ２００２０６３１７（実施例２；第３２０〜３２１頁、請求項３４；第３２１〜３２２頁）；ＷＯ２００２７１９２８（第４６８〜４６９頁）；ＷＯ２００２０２５８７（実施例１；図１）；ＷＯ２００１４０２６９（実施例３；第１９０〜１９２頁）；ＷＯ２０００３６１０７（実施例２；第２０５〜２０７頁）；ＷＯ２００４０５３０７９（請求項１２）；ＷＯ２００３００４９８９（請求項１）；ＷＯ２００２７１９２８（第２３３〜２３４頁、第４５２〜４５３頁）；ＷＯ０１１６３１８；
（２４）  ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２９７４３６）  Ｒｅｉｔｅｒ  Ｒ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５，  １７３５−１７４０，  １９９８；Ｇｕ  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，  １２８８−１２９６，  ２０００；Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）  ２７５（３）：７８３−７８８；ＷＯ２００４０２２７０９；ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）；ＵＳ２００４０１８５５３（請求項１７）；ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）；ＷＯ２００２８１６４６（請求項１；第１６４頁）；ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０；第２８８頁）；ＷＯ２００１４０３０９（実施例１；図１７）；ＵＳ２００１０５５７５１（実施例１；図１ｂ）；ＷＯ２０００３２７５２（請求項１８；図１）；ＷＯ９８５１８０５（請求項１７；第９７頁）；ＷＯ９８５１８２４（請求項１０；第９４頁）；ＷＯ９８４０４０３（請求項２；図ＩＢ）；アクセッション番号：０４３６５３；ＥＭＢＬ；ＡＦ０４３４９８；ＡＡＣ３９６０７．１．
（２５）  ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２６０７６３）；ＡＡＰ１４９５４、脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質／ｐｉｄ＝ＡＡＰ  １４９５４．１  −  ホモ・サピエンス種：ホモ・サピエンス（ヒト）  ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）；ＷＯ２００３０００８４２（請求項１）；ＷＯ２００３０２３０１３（実施例３、請求項２０）；ＵＳ２００３１９４７０４（請求項４５）；相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９；ＡＡＰ１４９５４．１；ＡＹ２６０７６３＿１
（２６）  ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４４３１７７．１）；ＮＰ＿４４３１７７  ＢＡＦＦ受容体／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１  −  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５３７），  ２１０８−２１１１（２００１）；ＷＯ２００４０５８３０９；ＷＯ２００４０１１６１１；ＷＯ２００３０４５４２２（実施例；第３２〜３３頁）；ＷＯ２００３０１４２９４（請求項３５；図６Ｂ）；ＷＯ２００３０３５８４６（請求項７０；第６１５〜６１６頁）；ＷＯ２００２９４８５２（第１３６〜１３７段）；ＷＯ２００２３８７６６（請求項３；第１３３頁）；ＷＯ２００２２４９０９（実施例３；図３）；相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ＿４４３１７７．１；ＮＭ＿０５２９４５＿１
（２７）  ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ−００１７６２．１）；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｓｅｅｄ，  Ｂ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５（６２７０），  ７４−７７（１９９０）；ＵＳ２００３１５７１１３；ＵＳ２００３１１８５９２；ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）；ＷＯ２００３０７２０３６（請求項１；図１）；ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）；相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６；ＮＰ＿００１７６２．１；ＮＭ＿００１７７１＿１
（２８）  ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，  ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連α、Ｉｇβ（ＣＤ７９Ｂ）と共有的に相互作用してＩｇ  Ｍ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に含まれるシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍｐｇｇｐｇｖ．．．ｄｖｑｌｅｋｐ（１．．２２６；２２６  ａａ），  ｐＩ：４．８４，  ＭＷ：２５０２８  ＴＭ：２［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：１９ｑ１３．２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７７４．１０）  ＷＯ２００３０８８８０８，  ＵＳ２００３０２２８３１９；ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）；ＵＳ２００２１５０５７３（請求項４、第１３〜１４頁）；ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１６）；ＷＯ９２０７５７４（図１）；ＵＳ５６４４０３３；Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（５）：１５２６−１５３１；Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２：１６２１−１６２５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０（４）：２８７−２９５；Ｐｒｅｕｄ’ｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９０（ｌ）：１４１−１４６；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（２）  ６３３−６３７；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７（ｌｌ）：３４５７−３４６４；
（２９）  ＣＸＣＲ５（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走および体液防衛において機能し、ＨＩＶ−２感染およびおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、および白血病の発生において重要な役割を果たすＧタンパク質結合受容体）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍｎｙｐｌｔｌ．．．ａｔｓｌｔｔｆ（１．．３７２；３７２  ａａ），  ｐＩ：８．５４  ＭＷ：４１９５９ＴＭ：７［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：１１ｑ２３．３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７０７．１）  ＷＯ２００４０４００００；ＷＯ２００４０１５４２６；ＵＳ２００３１０５２９２（実施例２）；ＵＳ６５５５３３９（実施例２）；ＷＯ２００２６１０８７（図１）；ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、第２６９頁）；ＷＯ２００１７２８３０（第１２〜１３頁）；ＷＯ２０００２２１２９（実施例１、第１５２〜１５３頁、実施例２、第２５４〜２５６頁）；ＷＯ９９２８４６８（請求項１、第３８頁）；ＵＳ５４４００２１（実施例２、第４９〜５２段）；ＷＯ９４２８９３１（第５６〜５８頁）；ＷＯ９２１７４９７（請求項７、図５）；Ｄｏｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２：２７９５−２７９９；Ｂａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３０９：７７３−７７９；
（３０）  ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合し、それらをＣＤ４＋  Ｔリンパ球へ提示するＭＨＣクラスＩＩ分子のβサブユニット（Ｉａ抗原））  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍｇｓｇｗｖｐ．．．ｖｌｌｐｑｓｃ（１．．２７３；２７３  ａａ，  ｐＩ：６．５６  ＭＷ：３０８２０  ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：６ｐ２１．３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１１１．１）  Ｔｏｎｎｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４（ｌｌ）：２８３９−２８４７；Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９（６）：４１１−４１３；Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２８：４３３−４４１；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１６８９９−１６９０３；Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：８７５９−８７６６；Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５５：１−１３；Ｎａｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５９：５１２−５１９；ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１５）；ＵＳ６１５３４０８（第３５〜３８段）；ＵＳ５９７６５５１（第１６８〜１７０段）；ＵＳ６０１１１４６（第１４５〜１４６段）；Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３０（ｌ）：６６−６８；Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０（２６）：１４１１１−１４１１９；
（３１）  Ｐ２Ｘ５（細胞外ＡＴＰによって作動するイオンチャネルであるプリン性受容体Ｐ２Ｘリガンド作動性イオンチャネル５は、シナプス伝達および神経発生に関与することがあり、欠損症は特発性排尿筋不安定性の病理生理学の原因となることがある）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍｇｑａｇｃｋ．．．ｌｅｐｈｒｓｔ（１．．４２２；４２２  ａａ），  ｐＩ：７．６３，  ＭＷ：４７２０６  ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：１７ｐｌ３．３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２５５２．２）  Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１８（１−２）：１９５−１９９；ＷＯ２００４０４７７４９；ＷＯ２００３０７２０３５（請求項１０）；Ｔｏｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０：１６５−１７３；ＷＯ２００２２２６６０（請求項２０）；ＷＯ２００３０９３４４４（請求項１）；ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）；ＷＯ２００３０２９２７７（第８２頁）；
（３２）  ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍａｅａｉｔｙ．．．ｔａｆｒｆｐｄ（１．．３５９；３５９  ａａ），  ｐＩ：８．６６，  ＭＷ：４０２２５  ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：９ｐｌ３．３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７７３．１）  ＷＯ２００４０４２３４６（請求項６５）；ＷＯ２００３０２６４９３（第５１〜５２頁、第５７〜５８頁）；ＷＯ２０００７５６５５（第１０５〜１０６頁）；Ｖｏｎ  Ｈｏｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４（１２）：４８７０−４８７７；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１６８９９−１６９０３；
（３３）  ＬＹ６４（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であるリンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）は、Ｂ細胞の活性化およびアポトーシスを調節し、機能の消失は全身性紅斑性狼瘡を有する患者における疾患活動性の増加と関連している）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍａｆｄｖｓｃ．ｒｗｋｙｑｈｉ（１．．６６１；６６１  ａａ），  ｐＩ：６．２０，  ＭＷ：７４１４７  ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：５ｑｌ２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５５７３．１）  ＵＳ２００２１９３５６７；ＷＯ９７０７１９８（請求項１１、第３９〜４２頁）；Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８（３）：２９９−３０４；Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｌｏｏｄ  ９２：２８１５−２８２２；ＷＯ２００３０８３０４７；ＷＯ９７４４４５２（請求項８、第５７〜６１頁）；ＷＯ２０００１２１３０（第２４〜２６頁）；
（３４）  ＦＣＲＨｌ（Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含有する免疫グロブリンＦｃドメインに対する推定受容体であるＦｃ受容体様タンパク質１は、Ｂリンパ球分化に役割を果たす可能性がある）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍｌｐｒｌｌｌ．．．ｖｄｙｅｄａｍ（１．．４２９；４２９  ａａ），  ｐＩ：５．２８，  ＭＷ：４６９２５  ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：Ｉｑ２１−１ｑ２２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４４３１７０．１）  ＷＯ２００３０７７８３６；ＷＯ２００１３８４９０（請求項６、図１８Ｅ−１〜１８−Ｅ−２）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（１７）：９７７２−９７７７；ＷＯ２００３０８９６２４（請求項８）；ＥＰ１３４７０４６（請求項１）；ＷＯ２００３０８９６２４（請求項７）；
（３５）  ＩＲＴＡ２（Ｂ細胞発生およびリンパ腫発生に役割を果たす可能性がある推定的免疫受容体である免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連型２；転移による遺伝子の脱調節が一部のＢ細胞悪性腫瘍において発生する）  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  Ｆｕｌｌ  ｍｌｌｗｖｉｌ．．．ａｓｓａｐｈｒ（１．．９７７；９７７  ａａ），  ｐＩ：６．８８  ＭＷ：１０６４６８  ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：１ｑ２１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１２５７１．１）  ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９７）；Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２７７（１）：１２４−１２７；ＷＯ２００３０７７８３６；ＷＯ２００１３８４９０（請求項３、図１８Ｂ−１〜１８Ｂ−２）；
腫瘍関連抗原およびそれに対する特異的抗体に関する他の開示については、それらのすべてが全体として参照して本明細書に組み込まれる：ＷＯ０４／０４５５１６（２００４年６月３日）；ＷＯ０３／０００１１３（２００３年１月３日）；ＷＯ０２／０１６４２９（２００２年２月２８日）；ＷＯ０２／１６５８１（２００２年２月２８日）；ＷＯ０３／０２４３９２（２００３年３月２７日）；ＷＯ０４／０１６２２５（２００４年２月２６日）；ＷＯ０１／４０３０９（２００１年６月７日）、および２００３年１１月１７日に提出された米国仮特許出願第６０／５２０８４２号の“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲ  ＯＦ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ  ＯＲＩＧＩＮ”を参照されたい。
【００８０】
その他の例示的な抗体およびそれらの略語としては、以下が挙げられる：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）＝全長の、ヒト化抗ＨＥＲ２（ＭＷ  １４５１６７）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｆ（ａｂ’）２＝酵素により抗ＨＥＲ２から誘導された（ＭＷ  １０００００）、４Ｄ５＝ハイブリドーマ由来の、全長の、マウス抗ＨＥＲ２、ｒｈｕ４Ｄ５＝一過性発現した、全長ヒト化抗体、ｒｈｕＦａｂ４Ｄ５＝組み換えヒト化Ｆａｂ（ＭＷ  ４７７３８）、４Ｄ５Ｆｃ８＝突然変異ＦｃＲｎ結合ドメインを有する全長のマウス抗ＨＥＲ２。
【００８１】
本発明の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の抗体は、ＥｒｂＢ遺伝子によってコードされた受容体へ特異的に結合し得る。抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から選択されるＥｒｂＢ受容体へ、特異的に結合し得る。ＡＤＣは、ＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインへ特異的に結合し、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）は、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へ選択的に結合する（米国特許第５，８２１，３３７号；第６，０５４，２９７号；第６，４０７，２１３号；第６，６３９，０５５号；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−９；Ｓｌａｍｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−１２を参照のこと）。トラスツズマブは、ＨＥＲ２へ結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域（ｃｄｒ）とともにヒトフレームワーク領域を含有するＩｇＧ１κ抗体である。トラスツズマブはＨＥＲ２抗原に結合し、そこでＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害する（Ｈｕｄｚｉａｋ  ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１１６５−７２；Ｌｅｗｉｓ  ＧＤ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ；３７：２５５−６３；Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２８２５−２８３１）。
【００８２】
ＡＤＣの抗体は、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７またはｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ）であり得る。抗体は、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）であり得る。
【００８３】
癌を処置または予防するための公知の抗体が、ＡＤＣとして結合体化され得る。癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体は、市販で入手できるか、または例えば組み換え発現技術などの当業者に公知の任意の方法によって生成することができる。癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースまたは類似のデータベース、文献刊行物、または日常的クローニングおよびシーケンシングによって入手できる。癌を治療するために利用可能な抗体の例としては、転移性乳癌を有する患者を処置するためのヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体；非ホジキンリンパ腫を有する患者を処置するためのキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）；卵巣癌を処置するためのマウス抗体であるＯｖａＲｅｘ（ＡｌｔａＲｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州）；結腸直腸癌を処置するためのマウスＩｇＧ２ａ抗体であるＰａｎｏｒｅｘ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、ノースカロライナ州）；頭頸部癌などの上皮成長因子陽性癌を処置するための抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧキメラ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州）；肉腫を処置するためのヒト化抗体であるＶｉｔａｘｉｎ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、メリーランド州）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を処置するためのヒト化ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ  Ｉ／Ｈ（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ、メリーランド州）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するためのヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ  ＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）；非ホジキンリンパ腫を処置するためのヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体であるＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州）；非ホジキンリンパ腫を処置するためのヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲであるＳｍａｒｔ  ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）；非ホジキンリンパ腫を処置するための放射標識マウス抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体であるＯｎｃｏｌｙｍ（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）；ホジキン病または非ホジキンリンパ腫を処置するためのヒト化ＣＤ２  ＭＡｂであるＡｌｌｏｍｕｎｅ（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ、カリフォルニア州）；肺癌および結腸直腸癌を処置するための抗ＶＥＧＦヒト化抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）；非ホジキンリンパ腫を処置するための抗ＣＤ２２抗体であるＥｐｒａｔｕｚａｍａｂ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州およびＡｍｇｅｎ、カリフォルニア州）；ならびに結腸直腸癌を処置するためのヒト化抗ＣＥＡ抗体であるＣＥＡｃｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、ニュージャージー州）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
（標識抗体）
本発明の抗体は、システインチオールもしくはリシンアミノなどの反応性官能基を通して抗体へ共有結合させることのできる任意の標識成分と結合体化することができる（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５；Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ  Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。結合された標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供するため；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１標識もしくは第２標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾し、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を起こすため；（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドを用いて相互作用を安定化させるため、または結合親和性を増加させるため；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、または物理的パラメータによって移動度（例えば、電気泳動移動度）または細胞透過性に影響を及ぼすため、あるいは（ｖ）リガンド親和性、抗体／抗原結合、またはイオン性複合体形成を調節するための捕捉成分を提供するために機能し得る。
【００８５】
本発明の標識抗体は、さらにまた親和性精製剤として使用することもできる。このプロセスでは、標識抗体は、当該分野において周知の方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの固相上に固定化され得る。固定化された抗体は、精製すべき抗原を含有するサンプルと接触させられ、その後支持体は、固定化ポリペプチド変異体へ結合している精製すべき抗原を除くサンプル内の全物質を実質的に除去するであろう適切な溶媒を用いて洗浄される。最後に、支持体はグリシン緩衝液（ｐＨ５．０）などのポリペプチド変異体から抗原を放出させる別の適切な溶媒を用いて洗浄される。
【００８６】
ポリペプチド変異体は、診断アッセイにおいて、例えば特異的細胞、組織、または血清中の当該抗原の発現を検出するためにも有用であり得る。
【００８７】
診断的適用のためには、抗体は、代表的には検出可能な成分で標識されるであろう。一般に以下のカテゴリーに分類できる多数の標識を利用できる：
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉなどの放射性同位体。抗体は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻および第２巻，Ｃｏｌｉｇｅｎら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載された技術を使用して、放射性同位体を含むか、または試薬が抗体の遺伝子組み換えシステインチオールと反応性である場合は放射性同位体と複合体形成できる試薬を用いて、標識され得る。
（ｂ）希土類キレート剤（ユーロピウムキレート剤）もしくはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドなどの蛍光標識が、利用可能である。蛍光標識は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記）に開示した技術およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）からの蛍光標識試薬を用いて、ポリペプチド変異体へ結合体させることができる。
（ｃ）複合体金属イオンと複合体形成できるＤＯＴＡまたはクラウンエーテルなどのキレート試薬（ＵＳ２００２／０００６３７９）。
（ｄ）様々な酵素−基質標識が、利用可能であるか、または開示されている（米国特許第４，２７５，１４９号）。この酵素は、一般に様々な技術を用いて測定できる色素産生基質の化学変化を触媒する。例えば、この酵素は、分光光度計によって測定できる基質内の変色を触媒することができる。または酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させることができる。蛍光における変化を定量するための技術は、上述されている。化学発光基質は、化学反応によって電気的に誘起され、その後で（例えば、化学照度計を使用して）測定できるか、または蛍光受容体へエネルギーを供与する光線を発光できる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。酵素を抗体へ結合体させるための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６（１９８１）に記載されている。
【００８８】
酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば以下のものが挙げられる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、ここで水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）色素産生基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸塩を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および
（ｉｉｉ）色素産生基質（例、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄガラクトシダーゼ）または蛍光産生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【００８９】
多数の他の酵素−基質の組み合わせが、当業者にとって利用可能である。これらの一般的概論については、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【００９０】
時々、標識は、ポリペプチド変異体と間接的に結合体化される。当業者は、これを達成するための様々な技術を認識している。例えば、ポリペプチド変異体は、ビオチンと結合体化することができ、そして上記で言及した任意の標識のカテゴリーはアビジンと結合体することができ、その逆もまた考えられる。ビオチンはアビジンへ選択的に結合するため、そこで標識はこの間接的方法でポリペプチド変異体と結合体することができる。または、標識とポリペプチド変異体との間接的結合体化を達成するためには、ポリペプチド変異体は小ハプテン（例、ジゴキシン）と結合体させられ、そして上述した様々なタイプの標識の１つは抗ハプテンポリペプチド変異体（例えば、抗体）と結合体化される。そこで、標識とポリペプチド変異体との間接的結合体化を達成できる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．（１９９６）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【００９１】
本発明のポリペプチド変異体は、競合的結合アッセイ直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｚｏｌａ，（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）などの任意の公知のアッセイ法において使用できる。
【００９２】
ポリペプチド変異体は、さらにまたインビボ診断アッセイのためにも使用できる。一般に、ポリペプチド変異体は、免疫またはそれを発現する細胞の所在位置を免疫シンチグラフィーにより確認できるように放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、または３５Ｓ）を用いて標識される。
【００９３】
検出標識は、結合または認識事象を、局在化し、可視化し、そして定量するために有用であり得る。本発明の標識抗体は、細胞表面受容体を検出できる。検出可能な標識抗体のためのまた別の使用は、ビーズを蛍光標識抗体と結合体化させる工程、およびリガンド結合の際の蛍光シグナルを検出する工程を包含する、ビーズに基づく免疫捕捉法である。類似の結合検出方法は、抗体−抗原相互作用を測定および検出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）作用を利用する。
【００９４】
抗体を染色または標識するために一般に適合する検出標識は、以下の特性を有し得る：（ｉ）標識抗体は、無細胞アッセイおよび細胞ベースアッセイの両方で検出される少量のバイオポリマーを高感受性で検出できるように、低バックグラウンドの高シグナルを生成するはずであり；かつ（ｉｉ）標識抗体は、顕著な光の退色なしで、蛍光シグナルを観察、監視および記録できるように光安定性でなければならない。膜または細胞表面、特に生細胞への標識抗体の細胞表面結合を含む適用のためには、標識は、好ましくは（ｉｉｉ）有効な結合体濃度および検出感受性を達成するための良好な水溶性を有し、かつ（ｉｖ）細胞の正常な代謝プロセスを中断させることがない、または早期細胞死を誘発しないように生細胞にとって非毒性である。検出可能なシグナルを提供する標識成分としては、蛍光色素、化学発光色素（Ｂｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．１：１０５１−１０５８（１９９７）が挙げられる。
【００９５】
ペプチド標識方法は周知である。Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２；Ｇｌａｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｔ．Ｓ．ＷｏｒｋおよびＥ．Ｗｏｒｋ編）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．およびＮｏｙｅｓ，Ｃ．Ｍ．（１９８４）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，第Ｉ巻および第ＩＩ巻，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｇ．（１９８５）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｈ．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ編、Ｗａｌｔｅｒ  ＤｅＧｒｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＷｏｎｇ（１９９１）“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）を参照のこと。
【００９６】
十分に近くで２つの成分、蛍光レポーターおよびクエンチャーを用いて標識されたペプチドは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を起こす。レポーター基は、代表的には、最高輝度で発光させるために適切なストークスシフトで、特定の波長の光によって励起され、アクセプター（もしくはクエンチャー）基へエネルギーを転移させる蛍光色素である。蛍光色素としては、フルオレセインおよびローダミン、ならびにそれらの誘導体などの拡張芳香族性を有する分子が挙げられる。蛍光レポーターは、インタクトなペプチド内でクエンチャー成分によって部分的または有意にクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによりペプチドが開裂すると、蛍光の検出可能な増加を測定できる（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）“Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８−３４）。
【００９７】
標識試薬は、代表的には、（ｉ）標抗体の反応性官能基と直接的に反応して識抗体を生成するか、（ｉｉ）リンカー試薬と反応してリンカー標識中間物を生成するか、または（ｉｉｉ）リンカー抗体と反応して標識抗体を生成し得る、反応機能性を有している。標識試薬の反応官能基としては：マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびホスホルアミダイトが挙げられるが、他の官能基もまた使用され得る。
【００９８】
例示的な反応官能基は、検出可能な標識（例えば、ビオチンまたは蛍光色素）のカルボキシル基置換基であるＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。標識のＮＨＳエステルは、実施、単離、精製、および／または特性付けるされ得る。またこのＮＨＳエステルは、インサイチュで形成され、抗体の求核基と反応し得る。代表的には、標識のカルボキシル形態は、標識のＮＨＳエステルを生じさせるためにカルボジイミド試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、またはウロニウム試薬、例えばＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、もしくはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの一部の組み合わせを反応させる工程によって達成される。一部の場合には、標識および抗体は、１つの工程で標識−抗体結合体を生成するために標識のインサイチュ活性化および抗体との反応によって結合させることができる。他の活性化および結合試薬としては、ＴＢＴＵ（２−（ｌＨ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチルウロニウム２−フルオロ−ヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ｔｒｉｓ−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（ｌ−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、およびアリールスルホニルハロゲン化物、例えばトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリドが挙げられる。例示的な抗体およびテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）蛍光色素結合体は：
【００９９】
【化５】
2007532882.tif 000002
として示される。
【０１００】
図示したように、抗体の１つ以上の反応性アミノ基（例えばリシン）は、ＴＡＭＲＡなどの蛍光色素のＮＨＳ活性エステルのヒドロキシスクシンイミド基を置換し、１つ以上のＴＡＭＲＡ色素成分の抗体への結合体化をもたらす。他の蛍光色素に近接する所定の蛍光色素は自己消光することがある。蛍光またはＵＶ吸光度によって測定される輝度（分子吸光係数）が分子内の色素成分の数と線形に相関していない場合には、自己消光作用が認められる。図８は、脱グリコシル化後のトラスツズマブ−ローダミン結合体の逆重畳スペクトルを示している。図９は、定量のために使用される図８の脱グリコシル化後のトラスツズマブ−ローダミン結合体のスペクトルの逆重畳前の荷電イオン（ｍ／ｚ）を示している。本発明の分離法、検出法、および定量法は、色素負荷および生成物分布（図３９）を特性解析できるが、他方蛍光またはＵＶ分光法では特性解析できない。
【０１０１】
（薬物成分）
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬物成分（Ｄ）は、細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する任意の化合物、成分、または基を含んでいる。薬物成分は、ミクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡインターカレーターとして機能できる化学療法薬を含んでいる。式Ｉの抗体−薬物結合体内の薬物成分は、他の作用機序を有する可能性があり、任意のそのような機序に限定されない。
【０１０２】
式Ｉの抗体−薬物結合体化合物内の例示的薬物成分Ｄは、細胞毒性剤、特に癌治療に使用される細胞毒性剤である。そのような薬物としては、一般に、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗剤、天然産物およびそれらのアナログが挙げられる。例示的なクラスの細胞毒性剤としては、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤およびチミジル酸シンターゼなどの酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ開裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン系、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤、およびタキソールが挙げられる。例示的な薬物成分としては：メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンならびにエトポシドもしくはエトポシドリン酸塩などのポドフィロトキシン誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン、エンジイン、ならびにそれらの誘導体およびアナログが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０３】
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬物成分（Ｄ）は、構造：
【０１０４】
【化６】
2007532882.tif 000003
（式中、波線は、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）のリンカー（Ｌ）へのＤの硫黄原子の共有結合を示している。Ｒは、独立してＨであってもＣ１−Ｃ６アルキルであってもよい。アミド基を硫黄原子へ結合させるアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであり得る。すなわち、ｍは１、２、または３である）を有するメイタンシノイドを含む。
【０１０５】
メイタンシン化合物は、タンパク質、チューブリンの重合の阻害により、有糸分裂中の微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：１００２−１００５；米国特許第５，２０８，０２０号）。メイタンシンは、東アフリカの灌木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離され、メトトレキセート、ダウノルビシン、およびビンクリスチンのような従来の抗癌化学療法薬より１００倍から１，０００倍以上細胞毒性であることが証明されている（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、一部の微生物が、メイタンシノールおよびメイタンシノールのＣ−３エステルなどのメイタンシノイドも生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。メイタンシノールの合成Ｃ−３エステルおよびメイタンシノールのアナログについてもまた報告されている（Ｋｕｐｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１：３１−３７；Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：７２１−７２２；Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：３４４１−３４５１）。メイタンシノールのアナログ（これからＣ−３エステルが調製される）は、芳香環（例えば、デクロロ）上およびＣ−９、Ｃ−１４（例、ヒドロキシル化メチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０およびＣ−４，５で修飾されたメイタンシノールを含んでいる。天然型および合成Ｃ−３エステルは、以下の２つの群に分類できる：
（ａ）単純なカルボン酸を有するＣ−３エステル（米国特許第４，２４８，８７０号；第４，２６５，８１４号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；および第４，３３１，５９８号）、および
（ｂ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体を有するＣ−３エステル（米国特許第４，１３７，２３０号および第４，２６０，６０８号；およびＫａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：３４４１−３４５１）。（ｂ）群のエステルは、（ａ）群のエステルよりはるかに細胞毒性であることが見いだされた。
【０１０６】
メイタンシンおよびメイタンシノイドは、高度に細胞毒性であるが、癌治療におけるそれらの臨床使用は、主として腫瘍に対する選択性が乏しいことによる重度の全身性副作用によって、大きく限定されている。メイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系および消化器系への重篤な副作用のために中止されていた（Ｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｃａｎ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｒｅｖ．５：１９９−２０７）。
【０１０７】
メイタンシノイド薬物成分は、それらが：（ｉ）醗酵もしくは化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的入手し易い、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーによる結合体化に適合する官能基を用いた誘導体化に受け入れられる、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、そして（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるために、抗体−薬物結合体における魅力的な薬物成分である。
【０１０８】
他の薬物成分を用いた場合と同様に、メイタンシノイド薬物成分の全ての立体異性体（すなわちＤのキラル炭素でのＲおよびＳ立体配置の任意の組み合わせ）は、本発明の化合物であると企図される。１つの実施形態では、メイタンシノイド薬物成分（Ｄ）は、以下の立体化学配置を有する：
【０１０９】
【化７】
2007532882.tif 000004
メイタンシノイド薬物成分の例示的な実施形態は、構造：
【０１１０】
【化８】
2007532882.tif 000005
を有するＤＭ１、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２；ＤＭ３、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）；およびＤＭ４、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２を含む。
【０１１１】
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬物成分（Ｄ）はまた、ドラスタチンおよびそれらのペプチドアナログおよび誘導体、オーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号；第５，７８０，５８８号）も含む。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分割を妨害し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、そして抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）および抗真菌活性を有する（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）ことが証明されている。ドラスタチンおよびオーリスタチン薬物成分は、ペプチド薬物成分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端により抗体へ結合させることができる（ＷＯ０２／０８８１７２）。オーリスタチンＥの変異体は、米国特許第５，７６７，２３７号；第６，１２４，４３１号に開示されている。
【０１１２】
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬物成分（Ｄ）の実施形態には、“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”，  ＵＳ  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  １０／９８３，３４０，  ｆｉｌｅｄ  Ｎｏｖ．  ５，  ２００４に開示されており、構造：
【０１１３】
【化９】
2007532882.tif 000006
を有するＮ末端結合モノメチルオーリスタチン薬物成分ＤＥおよびＤＦを含む。式中、ＤＥおよびＤＦの波線はリンカーのＡ、Ｗ、またはＹに対する共有結合部位を示しており、各場所では独立しており：
Ｒ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ６−Ｃ２０アリール）、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環およびＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ６−Ｃ２０アリール）、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環およびＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され；
Ｒ５は、Ｈおよびメチルから選択され；
またはＲ４およびＲ５は一緒に炭素環を形成して式−（ＣＲａＲｂ）ｎ−（式中、ＲａおよびＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキルおよびＣ３−Ｃ８炭素環から選択され、ｎは２、３、４、５および６から選択される）を有し；
Ｒ６は、ＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ６−Ｃ２０アリール）、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環およびＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され；
各Ｒ８は、独立してＨ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環およびＯ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）から選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｃ６−Ｃ２０アリールまたはＣ３−Ｃ８複素環から選択され；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１２（式中、Ｒ１２はＣ１−Ｃ８アルキルである）であり；
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８複素環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、または−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され；
ｍは、１〜１０００の範囲内の整数であり；
Ｒ１３は、Ｃ２−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１４は、ＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１５の各発生は、独立してＨ、ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、または−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１６の各発生は，独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり；
Ｒ１８は、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ６−Ｃ２０アリール）、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８複素環）、および−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）から選択され；そして
ｎは、０〜６の範囲内の整数である。
【０１１４】
薬物成分ＤＥの例示的な実施形態は、ＭＭＡＥである：
【０１１５】
【化１０】
2007532882.tif 000007
薬物成分ＤＦの例示的な実施形態は、ＭＭＡＦである：
【０１１６】
【化１１−１】
2007532882.tif 000008
ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ免疫結合体は、Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３，２００４年３月２８日提出、に開示されている。
【０１１７】
代表的には、ペプチドをベースとする薬物成分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメント間でペプチド結合を生成する工程によって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成法（例えば、Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｅｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，第１巻，ｐｐ．７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）によって調製することができる。オーリスタチン／ドラスタチン薬物成分は：米国特許第５，６３５，４８３号；第５，７８０，５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５；ならびにＰｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３の方法によって調製することができる。
【０１１８】
式Ｉの化合物のために有用なまた別のクラスの薬物成分は、カリケアマイシン（米国特許第５，０５３，３９４号；第４，９７０，１９８号；第５，０７９，２３３号；第５，７７３，００１号；第５，６０６，０４０号；第５，７３９，１１６号；第５，２６４，５８６号；第５，３８４，４１２号）およびエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）のエン−ジインファミリーである。
【０１１９】
（リンカー）
「リンカー」（Ｌ）は、１つ以上の薬物成分（Ｄ）および抗体単位（Ａｂ）へ連結させて式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）を生成するために使用できる二官能または多官能成分である。抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、薬物および抗体へ結合させるために反応性官能基を有するリンカーを使用して簡便に調製できる。システインチオール、リシンアミノ、アスパラギン酸カルボン酸を含む抗体（Ａｂ）の様々な官能基は、薬物成分または薬物−リンカー試薬の官能基との結合を生成することができる。
【０１２０】
１つの態様では、リンカーは、抗体上に存在するシステインなどの求核基と反応性である求電子基を有する。例えば、抗体のシステインチオールは、リンカー上の求核基と反応性であり、リンカーとの共有結合を生成する。有用な求電子基としては、マレイミドおよびハロアセトアミド基が挙げられるが、それらに限定されない。抗体のシステインチオールは、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３の第７６６頁、および実施例４のプロトコールによると、薬物成分−リンカー、またはリンカー試薬のマレイミドもしくはα−ハロカルボニルなどの求電子性官能基と反応することができる。
【０１２１】
１つの実施形態では、ＡＤＣのリンカーＬは式：
−Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−
（式中、
Ａは、抗体（Ａｂ）のシステインチオールへ共有結合したストレッチャー単位（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ  ｕｎｉｔ）である；
ａは、０または１である；
各Ｗは、独立してアミノ酸単位である；
ｗは、独立して０〜１２の範囲内の整数である；
Ｙは、薬物成分へ共有結合したスペーサー単位である；および
ｙは、０、１または２である）を有する。
【０１２２】
例示的な実施形態は、Ｄはアミノ酸のＣ末端カルボキシル基と、ｙが１または２である場合にスペーサー単位と結合を形成し得、ｙが０である場合にスペーサー単位のカルボキシル基と結合を形成し得、ｗおよびｙが各々０である場合にストレッチャー単位のカルボキシル基と、そしてａ、ｗ、およびｙが各々０である場合に薬物単位のカルボキシル基との結合を形成し得る窒素原子を有する薬物単位（成分）である実施形態を含む。用語「薬物単位」および「薬物成分」は同義語であり、本明細書では互換的に使用されることが理解される。
【０１２３】
（ストレッチャー単位）
ストレッチャー単位（Ａ）は、存在する場合は、抗体単位をアミノ酸単位（Ｗ）へ連結させることができる。これに関連して、抗体（Ａｂ）は、ストレッチャー単位の求電子性官能基との結合を形成できる遊離システインチオール基を有する。本実施形態の例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩＩａおよびＩＩＩｂ（式中、Ａｂ、Ｗ、Ｙ、Ｄ、ｗおよびｙは上記に定義したとおりであり、およびＲ１７は、（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（ＣＨ２）ｒ−、アリール、（ＣＨ２）ｒ−アリール、アリール−（ＣＨ２）ｒ−、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｒは独立して１〜１０の範囲内の整数である）から選択される二価ラジカルである）の大括弧内に記載されている。
【０１２４】
ＩＩＩ−ＶＩなどの式Ｉの例示的な実施形態すべてからのＡＤＣは、明示的に記載していない場合でさえ、１〜４つの薬物成分が抗体に連結していると理解されたい（ｐ＝１〜４）。
【０１２５】
【化１１−２】
2007532882.tif 000009
例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩＩａのストレッチャー単位であり、マレイミド−カプロイル（ＭＣ）（式中、Ｒ１７は−（ＣＨ２）５−である）に由来する：
【０１２６】
【化１２】
2007532882.tif 000010
例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩＩａのストレッチャー単位であり、マレイミド−プロパノイル（ＭＰ）（式中、Ｒ１７は−（ＣＨ２）２−である）に由来する：
【０１２７】
【化１３】
2007532882.tif 000011
また別の例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩＩａ（式中、Ｒ１７は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ｒは２である）のストレッチャー単位である：
【０１２８】
【化１４】
2007532882.tif 000012
また別の例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩＩａ（式中、Ｒ１７は（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ））ｒ−ＣＨ２−（式中、ＲｂはＨであり、各ｒは２である）のストレッチャー単位である：
【０１２９】
【化１５】
2007532882.tif 000013
また別の例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩＩｂ（式中、Ｒ１７は−（ＣＨ２）５−である）のストレッチャー単位である：
【０１３０】
【化１６】
2007532882.tif 000014
また別の実施形態では、ストレッチャー単位は抗体単位の硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子との間のジスルフィド結合を介して、抗体単位と連結している。この実施形態の例示的なストレッチャー単位は、式ＩＶ（式中、Ｒ１７、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記に定義したとおりである）の大括弧内に記載されている。
【０１３１】
【化１７】
2007532882.tif 000015
さらにまた別の実施形態では、ストレッチャーの反応基は、抗体の遊離システインチオールとの結合を形成できるチオール反応性官能基を含有する。チオール反応性官能基の例には、マレイミド、α−ハロアセチル、スクシンイミドエステルなどの活性化エステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸性塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが含まれるが、それらに限定されない。この実施形態の例示的なストレッチャー単位は、式ＶａおよびＶｂ（式中、−Ｒ１７−、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記に定義したとおりである）の大括弧内に記載されている。
【０１３２】
【化１８】
2007532882.tif 000016
また別の実施形態では、リンカーは、分枝状多官能リンカー成分を通して１つより多い薬物成分を抗体へ共有結合させるための樹状型リンカーであり得る（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８）。樹状型リンカーは、薬物対抗体のモル比、すなわちＡＤＣの力価に関連している負荷量を増加させることができる。そこで、抗体が反応性システインチオール基を１つしか有していない場合は、樹状型リンカーを通して多数の薬物成分を結合させることができる。樹状型リンカー試薬の以下の例示的な実施形態は、クロロエチルナイトロジェンマスタード官能基との反応によって９つまでの求核薬物成分試薬を結合体するのを可能にする。
【０１３３】
【化１９】
2007532882.tif 000017
（アミノ酸単位）
リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。アミノ酸単位（−Ｗｗ−）は、存在する場合は、本発明の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）内で抗体（Ａｂ）を薬物成分（Ｄ）に連結する。
【０１３４】
アミノ酸単位−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、またはドデカペプチド単位である。アミノ酸単位を含むアミノ酸残基としては、天然型、ならびに小さなアミノ酸およびシトルリンなどの非天然型アミノ酸アナログが挙げられる。各−Ｗ−単位は、独立して以下の大括弧内に記載した式：
【０１３５】
【化２０】
2007532882.tif 000018
（式中、Ｒ１９は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
【０１３６】
【化２１】
2007532882.tif 000019
である）を有しており、ｗは０〜１２の範囲内の整数である）を有する。
【０１３７】
Ｒ１９が水素以外である場合は、Ｒ１９が結合している炭素原子はキラルである。Ｒ１９が結合している各炭素原子は、独立して（Ｓ）または（Ｒ）立体配置、またはラセミ混合物にある。従って、アミノ酸単位は、エナンチオマー的に純粋であっても、ラセミ性であっても、またはジアステレオマー性であってもよい。
【０１３８】
例示的な実施形態では、ｗは、１、２、または３であり、一本鎖アミノ酸、ジペプチド、およびトリペプチドアミノ酸単位各々を生成し得る。アミノ酸単位Ｗは、天然および非天然アミノ酸から選択される。側鎖を有する炭素は、ＤまたはＬ（ＲまたはＳ）のいずれかの立体配置であり得る。アミノ酸単位Ｚは、アラニン、２−アミノ−２−シクロヘキシル酢酸、２−アミノ−２−フェニル酢酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γ−アミノ酪酸、α，α−ジメチルγ−アミノ酪酸、β，β−ジメチルγ−アミノ酪酸、オルニチン、およびシトルリン（Ｃｉｔ）であり得る。アミノ酸単位Ｚは、必要に応じて、側鎖の反応性官能基が保護されているアミノ酸の保護形態を含む。アセチル、ホルミル、トリフェニルメチル（トリチル）、およびモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）を用いて保護されたリシンを含む保護アミノ酸試薬および中間産物は、周知である。他の保護アミノ酸単位としては、トシルもしくはニトロ基で保護されたアルギニン、アセチルまたはホルミル基で保護されたオルニチンが挙げられる。
【０１３９】
アミノ酸単位は、１つの実施形態では、腫瘍関連プロテアーゼを含む１つ以上の酵素によって酵素分解され、薬物成分（−Ｄ）を遊離させ得る。このアミノ酸単位は、薬物（Ｄ）を放出して提供する際に、インビボでプロトン化される。有用な−Ｗｗ−単位は、特定の酵素（例えば、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼ）による酵素分解に対する選択性について、設計および最適化され得る。
【０１４０】
例示的な−Ｗｗ−アミノ酸単位としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては：バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）を含んでいる。例示的なトリペプチドには：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）をが挙げられる。
【０１４１】
（スペーサー単位）
存在する場合（ｙ＝１または２）、スペーサー単位（−Ｙｙ−）は、アミノ酸単位が存在する場合（ｗ＝１〜１２）はアミノ酸単位（−Ｗｗ−）を薬物成分（Ｄ）へ連結させる。または、スペーサー単位は、アミノ酸単位が存在しない場合にはストレッチャー単位を薬物成分へ連結させる。スペーサー単位は、さらにアミノ酸単位およびストレッチャー単位のいずれも存在しない場合（ｗ、ｙ＝０）は、薬物成分を抗体単位へ連結させる。スペーサー単位には、自己犠牲的および非自己犠牲的の２つの一般的タイプがある。非自己犠牲的スペーサー単位は、スペーサー単位の一部または全部が抗体−薬物結合体または薬物成分−リンカーからのアミノ酸単位の開裂、特に酵素的開裂後に薬物成分に結合したままであるスペーサー単位である。グリシン−グリシンスペーサー単位またはグリシンスペーサー単位を含有するＡＤＣが腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼまたはリンパ球関連プロテアーゼによって酵素的開裂を受ける場合は、グリシン−グリシン−薬物成分またはグリシン−薬物成分はＡｂ−Ａａ−Ｗｗ−から開裂される。１つの実施形態では、独立した加水分解反応が標的細胞内で発生し、グリシン−薬物成分結合を開裂させて薬物を遊離させる。
【０１４２】
また別の実施形態では、−Ｙｙ−は、そのフェニレン部分がＱｍ（式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノである；およびｍは０〜４の範囲内の整数である）と置換されているｐ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）単位（スキーム２および３を参照）である。
【０１４３】
非自己犠牲的スペーサー単位（−Ｙ−）の例示的な実施形態は：−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−；−Ｇｌｙ−；−Ａｌａ−Ｐｈｅ−；−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である。
【０１４４】
１つの実施形態では、スペーサー単位（ｙ＝０）、または薬学的に受容可能な塩もしくはその溶媒和物が存在しない薬物成分−リンカーまたはＡＤＣが提供される。
【０１４５】
または、自己犠牲的スペーサー単位を含有するＡＤＣは、−Ｄを遊離することができる。１つの実施形態では、−Ｙ−は、ＰＡＢ基のアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−へ連結されており、炭酸塩、カルバメートもしくはエーテル基を介して−Ｄへ直接的に結合されているＰＡＢ（パラ−アミノベンジルオキシカルボニル）基であるが、このときＡＤＣは例示的な式Ｘ：
【０１４６】
【化２２】
2007532882.tif 000020
（式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロもしくは−シアノである；ｍは０〜４の範囲内の整数である；およびｐは１〜４の範囲内である）を有する。
【０１４７】
自己犠牲的スペーサーとしては、ＰＡＢ（Ｃａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９−４８０；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６：６３８−６４４；米国特許第６，２１４，３４５号）、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体などのＰＡＢ基に電子的に類似する芳香族化合物（Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）、およびオルトもしくはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられる。アミド結合加水分解されると環化する、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９４：５８１５）ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８６７）などのスペーサーを使用できる。グリシンで置換されているアミン含有薬物の除外（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７：１４４７）もまた、ＡＤＣにおいて有用な自己犠牲的スペーサーの例である。
【０１４８】
スペーサー単位（−Ｙｙ−）には、さらにまた式ＸＩおよびＸＩＩ：
【０１４９】
【化２３】
2007532882.tif 000021
によって表されるものが含まれる。
【０１５０】
式Ｉの抗体−薬物結合体化合物の実施形態には、ＸＩＩＩａ（ｖａｌ−ｃｉｔ）、ＸＩＩＩｂ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、ＸＩＩＩｃ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）：
【０１５１】
【化２４】
2007532882.tif 000022
【０１５２】
【化２５】
2007532882.tif 000023
が含まれる。
【０１５３】
式Ｉａの抗体−薬物結合体化合物の他の例示的な実施形態にはＸＩＶａ−ｅ：
【０１５４】
【化２６】
2007532882.tif 000024
【０１５５】
【化２７】
2007532882.tif 000025
そしてＲは、独立してＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；ｎは１〜１２である、
が含まれる。
【０１５６】
（抗体−薬物結合体）
式ＩのＡＤＣの例示的な実施形態は、以下の構造および略称：
【０１５７】
【化２８】
2007532882.tif 000026
【０１５８】
【化２９】
2007532882.tif 000027
を有する。
【０１５９】
その他の例示的な抗体−薬物結合体は、抗体、例えばトラスツズマブ（Ｔｒ）がアミノ基を通してリンカーへ連結しており、およびｐが１〜約８である構造：
【０１６０】
【化３０】
2007532882.tif 000028
【０１６１】
【化３１】
2007532882.tif 000029
を有する。
【０１６２】
ＤＭ１がＢＭＰＥＯリンカーを通してトラスツズマブのチオール基へ連結している例示的な抗体−薬物結合体は、構造：
【０１６３】
【化３２】
2007532882.tif 000030
（式中、Ｔｒはトラスツズマブである；ｎは０、１、または２である；およびｐは１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有する。
【０１６４】
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、以下に略述する合成方法を用いて作製できる。ＡＤＣは、薬物および抗体へ結合させるために反応性官能基を有するリンカー試薬または薬物−リンカー試薬を使用して簡便に調製できる。１つの態様では、リンカー試薬は、抗体上に存在する求核基と反応性である求電子基を有する。抗体上の有用な求核基としては、スルフヒドリル、ヒドロキシルおよびアミノ基が含まれるが、それらに限定されない。抗体の求核基のヘテロ原子は、リンカー試薬上の求核基と反応性であり、リンカーとの共有結合を生成する。有用な求電子基としては、マレイミドおよびハロアセトアミド基が挙げられるが、これらに限定されない。求電子基は、抗体結合のための簡便な部位を提供する。
【０１６５】
別の実施形態では、リンカー試薬または薬物−リンカー試薬は、共有結合を生成するために抗体上に存在する求電子基と反応性である反応性求核官能基を有する。抗体上の有用な求電子基としては、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が挙げられるが、それらに限定されない。リンカー上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、それらに限定されない。抗体上の求電子基は、リンカーへ結合するための簡便な部位を提供する。
【０１６６】
カルボン酸官能基およびクロロホルメート官能基もまた、リンカーにとって有用な反応性部位である。なぜなら、それらは、薬物の第２級アミノ基と反応し、アミノ結合を生成し得るからである。さらにまた反応性部位として有用であるのは、カルバメート結合を生成するために薬物のアミノ基（例えば、Ｎ−メチルバリンであるが、それに限定されない）と反応し得るリンカー上の炭酸塩官能基（例えば、ｐ−ニトロフェニル炭酸塩であるが、これに限定されない）である。代表的には、ペプチドをベースとする薬物は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメント間でペプチド結合を生成する工程によって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野においてよく知られている液相合成法（Ｅ．ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｅｂｋｅ，（１９６５）“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ．７６−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）によって調製することができる。
【０１６７】
抗体単位は、リンカー、ストレッチャー単位、アミノ酸単位、スペーサー単位、または薬物成分のいずれかとの直接的結合を形成できる。抗体単位は、抗体のヘテロ原子を介してリンカー単位との結合を形成できる。抗体単位上に存在する可能性のあるヘテロ原子には、硫黄（１つの実施形態では、抗体のスルフヒドリル基から）、酸素（１つの実施形態では、抗体のカルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基から）、および窒素（１つの実施形態では、抗体の第１または第２級アミノ基から）が含まれる。これらのヘテロ原子は、抗体の自然状態にある抗体、例えば天然型抗体上に存在することもできるし、化学修飾を介して抗体内に導入することもできる。
【０１６８】
１つの実施形態では、抗体は、１つ以上のスルフヒドリル基を導入するように化学修飾できる１つ以上のリシン残基を有する。抗体単位は、スルフヒドリル基の硫黄原子を介してリンカー単位へ結合する。リシンを修飾するために使用できる試薬としては、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ酢酸塩（ＳＡＴＡ）および２−イミノチオラン塩酸塩（Ｔｒａｕｔ試薬）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６９】
別の実施形態では、抗体は、１つ以上のスルフヒドリル基を導入するように化学修飾できる１つ以上の炭水化物基を有することができる。抗体単位は、スルフヒドリル基の硫黄原子を介してリンカー（例えば、ストレッチャー単位）へ結合する。
【０１７０】
さらにまた別の実施形態では、抗体は、酸化されてアルデヒド（−ＣＨＯ）基を提供し得る１つ以上の炭水化物基を有することができる（例えば、Ｌａｇｕｚｚａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２（３）：５４８−５５を参照のこと）。対応するアルデヒドは、ストレッチャー上の反応性部位との結合を形成できる。抗体上のカルボニル基と反応できるストレッチャー上の反応性部位としては、ヒドラジンおよびヒドロキシルアミンが挙げられるが、それらに限定されない。薬物単位を結合または会合させるためにタンパク質を修飾するための他のプロトコールは、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”，  ｖｏｌ．  ２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２００２）に記載されている（本明細書中に参考として援用される）。
【０１７１】
代表的には、ペプチドタイプのリンカーは、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメント間でペプチド結合を生成する工程によって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野において周知の液相合成法（Ｅ．ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｅｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ．７６−１３６，（１９６５），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）によって調製することができる。
【０１７２】
また別の実施形態では、リンカーは、溶解性または反応性を変調した基を用いて置換することができる。例えば、スルホネート（−ＳＯ３−）またはアンモニウムなどの荷電置換基は、試薬の水溶性を増加させ、リンカー試薬と抗体もしくは薬物成分との結合反応を促進するか、またはＡＤＣを調製するために使用された合成経路に依存してＡｂ−Ｌ（抗体−リンカー）とＤ、もしくはＤ−Ｌ（薬物−リンカー試薬）とＡｂとの結合反応を促進することができる。
【０１７３】
本発明の化合物は、架橋剤試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸）、ならびにＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｃｕｓｔｏｍｅｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １１７，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．６１１０５  ＵＳＡ，１−８００−８７４−３７２３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＋８１５−９６８−０７４７から市販で入手できるビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）３およびＢＭ（ＰＥＯ）４を用いて調製されたＡＤＣを明示的に企図しているが、これらに限定されない。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ，２００３−２００４の第４６７〜４９８頁を参照のこと。ビス−マレイミド試薬は、逐次的または同時的な方法において、抗体のシステイン残基のチオール基のチオール含有薬物成分またはリンカー中間物への結合を可能にする。抗体のチオール基、薬物成分、標識、またはリンカー中間物と反応性であるマレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
【０１７４】
【化３３】
2007532882.tif 000031
有用なリンカー試薬は、他の市販入手源（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（コロラド州ボールダー））を通して入手され得るか、またはＴｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２；Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第６，２１４，３４５号；ＷＯ０２／０８８１７２；ＵＳ２００３１３０１８９；ＵＳ２００３０９６７４３；ＷＯ０３／０２６５７７；ＷＯ０３／０４３５８３；およびＷＯ０４／０３２８２８に記載されている方法にしたがって合成され得る。
【０１７５】
マレイミドストレッチャー単位およびパラ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）自己犠牲的スペーサー単位を有する例示的なバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔもしくはｖｃ）ジペプチドリンカー試薬は構造：
【０１７６】
【化３４】
2007532882.tif 000032
（式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロもしくは−シアノである；およびｍは０〜４の範囲内の整数である）を有する。
【０１７７】
マレイミドストレッチャー単位およびＰＡＢスペーサー単位を有する例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ）ジペプチドリンカー試薬は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０によって調製することができ、構造：
【０１７８】
【化３５】
2007532882.tif 000033
（式中、Ｍｔｒはモノ−４−メトキシトリチルであり、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロもしくは−シアノである；およびｍは０〜４の範囲内の整数である）を有する。
【０１７９】
例示的な薬物−リンカー試薬には：マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−ヒドロキシメチルアミノベンジルオキシカルボニル−ＭＭＡＦ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）：
【０１８０】
【化３６】
2007532882.tif 000034
が含まれる。
【０１８１】
マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−ヒドロキシメチルアミノベンジルオキシカルボニル−ＭＭＡＥ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）：
【０１８２】
【化３７】
2007532882.tif 000035
マレイミドカプロイル−ＭＭＡＦ（ＭＣ−ＭＭＡＦ）：
【０１８３】
【化３８】
2007532882.tif 000036
およびマレイミドカプロイル−ＭＭＡＥ（ＭＣ−ＭＭＡＥ）：
【０１８４】
【化３９】
2007532882.tif 000037
そして、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、Ｂｌｏｏｄ  １０２：１４５８−１４６５；および“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”，米国特許出願第１０／９８３，３４０号（２００４年１１月５日出願）に従って調製され得る。
【０１８５】
抗体−薬物結合体化合物は、抗体の結合間ジスルフィド結合を還元し、その後にチオエーテル結合を介してマレイミド薬物を還元された抗体のシステインチオール基へ結合体化させることによって合成できる。その結果として、これらの抗体結合体は非共有的ファンデルワール相互作用によって一緒に保持され、ジスルフィド結合還元後に、変性条件（逆相クロマトグラフィー）下で軽鎖および重鎖に分離される。アミノ基（例えば、リシン残基）を通して結合体化されている抗体は、結合間ジスルフィド結合の還元および開裂を必要としない。
【０１８６】
抗体結合体は、逆相ＨＰＬＣ法（ＰＬＲＰ−Ｓ  ２．０×５０ｍｍ、８μｍ、１０００Åカラム）と、ＡＰＩ  ３０００質量分析計とを組み合わせて、最初に特性解析された。図１５は、（上）トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ；ならびに還元および変性後にクロマトグラフィーにより単離されたフラグメント：軽鎖、ｍ／ｚ＝１６７５（上から２番目）；１ＭＭＡＥを備える軽鎖、ｍ／ｚ＝２２５１（上から３番目）；および３ＭＭＡＥを備える重鎖、ｍ／ｚ＝１８３２（下）のクロマトグラムを示している（Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．およびＭａｎｎ，Ｅ．“Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ”，５１ｓｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，２００３年６月８日〜１２日）。
【０１８７】
（薬物負荷）
薬物負荷値は、式Ｉの分子内の１抗体当たりの薬物成分の平均数であるｐによって表される。式ＩのＡＤＣの組成物には、１〜約８種の範囲内の薬物と結合体化抗体の収集物、すなわち混合物が含まれる。抗体と薬物成分との結合体化によるＡＤＣの各調製物は、抗体に結合した１つ以上の薬物を有する製剤分子の潜在的分布をもたらすか、または抗体が薬物成分に連結されていない場合は、ｐ＝０である。結合体化反応からのＡＤＣの調製物における１抗体当たりの薬物の平均数は、本発明の方法、すなわちＬＣ／ＭＳによって特性解析することができる。結合体化反応からのＡＤＣの調製物中の１抗体当たりの薬物の平均数は、本発明の方法、すなわちＬＣ／ＭＳによって特性解析することができる、そしてＳａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２に記載されたように、遊離薬物のレベルを測定するためのカテプシンＢ開裂後のＥＬＩＳＡアッセイによって、間接的に特性解析することができる。どちらの方法も１抗体当たりの薬物の平均数を提供するが、ＬＣ／ＭＳ法はインタクトな１抗体当たりのｐ（薬物）の分布、ならびに軽鎖フラグメントおよび重鎖フラグメントについてのさらなる情報を提供する。この重要な分布パラメーターは、ＡＤＣ組成物の個別分子の分離ならびにそれらの特性解析および定量により、本発明の方法によって決定され得る。サンプルの構成要素の分離は、本方法の分離媒体工程および質量分析法工程の両方で行われる。本発明の方法の分離媒体工程の高分解能は、複雑な不均質ＡＤＣサンプルから分離されたサンプル構成成分の分離、精製、および定量を提供する。本発明の方法の質量分析法工程の高分解能および正確性は、分離されたサンプル構成成分の検出および定量を提供する。
【０１８８】
本発明の方法は、ＡＤＣの１抗体当たりの結合薬物の量（負荷）ならびに重鎖および軽鎖などのフラグメント上の薬物成分の分布を決定することができ、そして抗体のサブフラグメント位置、または特定アミノ酸残基で共有結合した薬物成分の位置を確認することさえできる。
【０１８９】
一部のＡＤＣについては、ｐは、抗体上の結合部位数によって限定され得る。例えば、上述した例示的な実施形態におけるように、結合が抗体のシステインチオールに対してである場合は、抗体はシステインチオール基を１つしか有していないかまたは数個有していることもあるし、十分に反応性のチオール基（それを通してリンカーを結合し得る）を１つしか有していないかまたは数個有していることもある。リシンなどの低反応性アミノ酸残基は、結合体化すべき抗体内でより多数である場合があるが、非反応性および薬物成分または薬物−リンカー試薬との反応には利用できない場合がある。例えば、ｐ＞５などの高い薬物負荷は、所定の抗体−薬物結合体の凝集、不溶性、毒性、有効性の欠如、または細胞透過性の消失を引き起こすことがある。
【０１９０】
代表的には、理論的最大値よりも少ない薬物成分が結合体化反応中に抗体へ結合体化される。抗体は、例えば、アミン反応性薬物−リンカー中間物またはリンカー試薬と反応しない多数のリシン残基を含有することができる。最も反応性のリシン基しかアミン反応性リンカー試薬と反応しない可能性がある。同様に、最も反応性のシステインチオール基しかチオール反応性リンカー試薬と反応しない可能性がある。一般に、抗体は、もしあったとしても、多くの薬物成分に連結し得る遊離および反応性システインチオール基は含有しない。本発明の化合物の抗体における大多数のシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在し、部分または完全還元条件下で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの還元剤を用いて還元させなければならない。さらに、リシンまたはシステインなどの反応性求核基を明らかにするための変性、または部分変性条件に曝露させることができる。ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）は、（ｉ）抗体に対する薬物−リンカー中間物もしくはリンカー試薬のモル過剰を限定すること、（ｉｉ）結合体化反応時間もしくは温度を限定すること、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的もしくは限定的還元条件、を含む数種のパラメーターによって制御できる。
【０１９１】
抗体の１つより多い求核基が薬物−リンカー中間物、またはリンカー試薬、およびその後に薬物成分試薬と反応する場合は、その結果として生じた生成物は、抗体へ結合した薬物成分の分布（例えば、１、２、３）を有するＡＤＣ化合物の混合物である。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）および疎水的相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、薬物負荷値によって混合物中の化合物を分離することができる。単一の薬物負荷（ｐ）を有するＡＤＣの調製物が、単離され得る（“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”，Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００４年３月２７日〜３１日，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，２００４年３月；“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００４年３月２７日〜３１日，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，２００４年３月）。しかし、これらの単一負荷値のＡＤＣは、薬物成分が抗体上の相違する部位でリンカーを介して結合され得るため、それでもまだ不均質混合物であることがある。
【０１９２】
（抗体−薬物結合体の投与）
本発明の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、処置すべき状態にとって適切な任意の経路によって、生物学的起源と接触させるか、または生物学的起源に投与することができる。ＡＤＣは、代表的には哺乳動物へ、非経口的（すなわち、点滴、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下、および硬膜外）に投与される。式ＩのＡＤＣと接触させられ得る、すなわち投与され得る生物学的起源としては、（ｉ）マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、またはヒトなどの哺乳動物；（ｉｉ）哺乳動物組織；および（ｉｉｉ）培養細胞、が挙げられる。生物学的サンプルは、生物学的起源から１回、または定期的、周期的、もしくは無作為間隔で採取される。生物学的サンプルとしては、（ｉ）血液、胆汁、尿、または便；（ｉｉ）組織抽出物；および（ｉｉｉ）細胞培地、細胞溶解液、または細胞抽出物が挙げられる。
【０１９３】
（薬学的処方物）
本発明の治療用抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬学的処方物は、薬学的に受容可能な非経口キャリアを用いて、そして単位用量注射形態で、代表的には非経口投与、すなわちボーラス、静脈内、腫瘍内投与用に調製される。所望の純度を有する抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、凍結乾燥調製物または水溶液の形状で、任意で薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤または安定剤と混合される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編）。
【０１９４】
受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤、および安定剤は、使用される用量および濃度では生物学的起源受容者にとって非毒性であり、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化物質；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメチオニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグアールガムやデキストリンを含む他の炭水化物；グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。例えば、凍結乾燥抗ＥｒｂＢ２抗体調製物は、ＷＯ９７／０４８０１（明示的に本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【０１９５】
薬学的有効成分は、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製された、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン内のマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に取り込むことができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１９６】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、ＡＤＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは成形された製品（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態にある。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェアなどの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１９７】
（抗体−薬物結合体の代謝産物）
本発明の範囲内には、本明細書に記載したＡＤＣ化合物のインビボ代謝産物もまた、そのような代謝産物が先行技術に照らして新規かつ非自明である範囲で包含される。そのような代謝産物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素的開裂などの結果として生じ得る。したがって、本発明は、その代謝産物を産生するために十分な期間にわたって本発明の化合物を哺乳動物と接触させる工程を含むプロセスによって生成される、新規かつ非自明な化合物を包含する。本発明の方法は、抗体、および分離されたサンプル構成成分である抗体−薬物結合体の代謝産物の、検出および特性解析をさらに包含する。
【０１９８】
代謝産物は、代表的には、抗体−薬物結合体混合物を検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇより多い）でラット、マウス、モルモット、サルなどの動物、またはヒトへ、代謝が起こるのに十分な時間（代表的には、約３０秒間〜３０時間）にわたって投与する工程と、尿、血液、もしくは他の生物学的サンプルを処理してその代謝産物を単離する工程とによって同定され得る。代謝産物の構造は、本発明の質量分析方法によって決定される。
【０１９９】
そのような代謝産物の例は、インビボαＨｅｒ２（トラスツズマブ）−ＭＣ−ＭＭＡＦカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＴＫ試験からの血漿サンプルの分析中に観察された。図４１は、抗オーリスタチン親和性膜によって捕捉かつ単離された小タンパク質（８１７８ＭＷ）を示す。図４２において薬物動態プロファイルが示すように、このタンパク質の濃度は１０時間後にプラトーに到達するまで経時的に増加し、試験期間（５日間）を通してその濃度を維持する。
【０２００】
（薬物動態）
半減期、クリアランス、曲線下面積（ＡＵＣ）、および分布容積を含む、哺乳動物における薬物動態（ＰＫ）を決定するための治療剤の循環レベルのモニタリングは、安全性／毒性限界および適切な投与レジメンを確定するために不可欠である（Ｗｅｌｌｉｎｇ，Ｐ．（１９９７）、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。バイオアベイラビリティは、通常は投与された用量のパーセンテージとして表示される、投与された化合物が投与された剤形から全身循環に到達する程度である。化合物の半減期は、化合物のピーク血漿濃度の５０％が排泄または生体内変換（代謝）によって取り除かれるために必要な時間である。治療指数は、その化合物の所望の治療活性と望ましくない毒性副作用との間の選択性を表示する。本発明の方法からの薬物動態測定値は、抗体と抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の吸収、分布、代謝、および排泄（ＡＤＭＥ）を解明する。
【０２０１】
（生物学的サンプルの処理）
生物学的起源への抗体−薬物結合体混合物の投与後に、式Ｉの抗体−薬物結合体化合物、またはそれらのフラグメントもしくは代謝産物を含む生物学的サンプルが採取される。生物学的サンプルは、シリンジまたはカニューラによる液体の抜去を含む、任意の手段によって採取できる。生物学的サンプルは、血液もしくは血清、血漿などの血液製剤、脳脊髄液もしくは他の体液、例えば唾液、尿、リンパ、胆汁、便、汗、または呼吸蒸気であり得る。
【０２０２】
質量分析のための抗体−薬物結合体サンプルの調製は、公知の技術によって一般に実施できる。例えば、“Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ”，Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（２００２）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ．を参照のこと。
【０２０３】
生物学的サンプルの処理は、不純物を除去し、サンプル構成成分の分離を妨害するかまたはデータ収集もしくは分析を不明瞭にし得るサンプル不均質性を減少させるために役立つ。あるいは、もしくは加えて、処理は、サンプルの取り扱いを単純にし、分解から保護し、サンプル容積を最小限に抑え、または質量分析において当該のサンプル構成成分（分析物）を選択する。または、もしくはそれに加えて、処理は、生物学的サンプルを、薬物代謝もしくは薬物動態作用を決定する際に対象となる代謝産物、フラグメント、または誘導体へ転換する。
【０２０４】
分析用サンプルを生成するための生物学的サンプルの処理は、さらにまた、調製する工程、固定化する工程、遠心分離、単離する工程、消化する工程、血球凝固を誘導もしくは防止する工程、加水分解工程、または精製工程によって実施できる。
【０２０５】
免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択クロマトグラフィー（固定化抗原を使用する）は、血漿から抗体−薬物結合体を選択的に単離した（実施例１、２、３）。免疫親和性技術は、強力な非共有的抗原−抗体相互作用に起因して高特異性を提供する。抗原は固相支持体上に固定化され、タンパク質を含有する生物学的起源由来のサンプルが加えられ、例えばアルブミンのような非特異的タンパク質が洗い流され、そして当該のタンパク質が溶出される。例示的な免疫親和性膜選択媒体としては：ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＡＬ−５０樹脂、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭ（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉａ（登録商標）、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、スロベニア）エポキシディスクおよびＥＭＰＯＲＥ（登録商標）親和性膜（３Ｍ、ミネソタ州セントポール）が含まれる。質量分析計に導入する前に自動カラム洗浄およびスイッチングのためには、ＰＲＯＳＰＥＫＴ−２（登録商標）機器（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．、オンタリオ州ブロックビル）が使用された（実施例１）。
【０２０６】
図２８は、ＬＣ／ＭＳ分析用の分析サンプル形成のための免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択結合のマルチウェル型真空マニホールド法を示す（実施例２）。投与された抗体−薬物結合体の抗体に対して特異的な抗原は、マルチウェルプレートを構成する容器各々における膜へ共有結合されている。抗体−薬物結合体組成物を摂取した哺乳動物（生物学的起源）由来の血漿または血清サンプルは、手動ピペッティングまたは自動ロボット式分注によって適用される。膜結合抗原に対して特異的なサンプル構成成分が結合させられる。膜が洗浄され、非特異的タンパク質および他の非特異的サンプル構成成分を溶出する。結合した抗体は、例えばＰＮＧａｓｅＦを用いて膜上で脱グリコシル化され得る。結合したサンプル構成成分は、隔離された受容容器もしくはウェルを備えるサンプルプレート内に溶出させることができる。溶出されたサンプルは、次に手動ピペッティングまたはロボット式移動によって取り扱い、逆相クロマトグラフィーによって分離し、そして分離したサンプル構成成分を質量分析法によって分析した。
【０２０７】
例示的な実施形態では、生物学的サンプルはトリプシン消化を用いて消化することができる。トリプシン消化のためには、サンプルは、ＤＴＴで還元され、ヨード酢酸ナトリウムをでＳ−カルボキシメチル化され、そして次いでトリプシンで消化され得る。消化したサンプルは：（ｉ）逆相ＨＰＬＣ、例えばＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８カラム；（ｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、例えばＴＳＫ  ３０００ＳＷｘＬカラム；または（ｉｉｉ）ＴＳＫボロン酸塩カラムを使用するボロン酸塩親和性クロマトグラフィーを含む方法によって処理することができる。
【０２０８】
（分離方法および媒体）
分析サンプルを生成するためには、１つより多いサンプル構成成分の分離を実行するために生物学的サンプルを分離媒体へ適用することができる。分離方法としては、親和性、クロマトグラフィー、および電気泳動法が挙げられる。親和性方法としては、親和性クロマトグラフィー、抗体／抗原免疫親和性、免疫親和性クロマトグラフィー、吸着、免疫吸着、および固定化親和性マトリックスが挙げられる。クロマトグラフィー法としては、ＨＰＬＣ、疎水的相互作用（ＨＩＣ）、アニオン交換、カチオン交換、逆相、順相、イオン対逆相、薄層、およびサイズ排除が挙げられる。電気泳動法としては、一次元、スラブゲル、キャピラリー、ポリアクリルアミド、変性、天然、自由溶液、濾紙、二次元、等電集束、および勾配電圧が挙げられる。その他の分離方法としては：透析、遠心分離、磁気、磁気ビーズ、免疫磁気（ＷＯ２００３０８７７７２）、沈殿、浮遊、沈降、免疫沈降、およびゲル濾過が挙げられる。
【０２０９】
分離方法は、１つ以上の物理−化学的特性（溶出時間、疎水性、親水性、移動時間、比率、速度、クロマトグラフィー保持時間、溶解性、分子量もしくはサイズ、正味電荷、荷電状態、イオン電荷、等電点、解離定数（ｐＫａ）、抗体親和性、電気泳動移動度、イオン化ポテンシャル、双極子モーメント、水素結合能力、および気相内でのイオン移動度が挙げられるが、それらには限定されない）によって、生物学的サンプルの構成成分の分離を行い得る。
【０２１０】
抗体−薬物結合体は、分析前にＰＮＧａｓｅＦを用いて酵素的に脱グリコシル化することができる。インタクトな結合体および還元された結合体の両方を分析するために、ＡＰＩ  ３０００質量分析計に結合した逆相カラム（ＰＬＲＰ−Ｓ  ２．０×５０ｍｍ、８μｍ、４０００Å）を使用した（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＤＭ１  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ−ＭＳ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ”，５１ｓｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，２００３年６月８日〜１２日）。トラスツズマブ−ＤＭ１サンプルを分析した（図６および７）。還元方法は、結合体した抗体と１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）とを３７℃で３０分間にわたり反応させる工程を包含した（図１３および１４）。ＤＭ１もまた還元中に開裂されるが、１１６ダルトンのリンカーフラグメントは、結合体化部位に結合されたままである。トラスツズマブ−ＤＭ１結合体ロットおよびそれらの対応する前駆体（トラスツズマブ−ＳＰＰリンカー結合体）は、ＬＣ／ＭＳを用いてインタクトのサンプルおよび還元されたサンプルを分析する工程によって評価した。各軽鎖（０、１、または２）および重鎖（０、１、２、３、４、または５）上のＤＭ１またはリンカー成分の数は相違することがあり、各抗体は、多数の可能な組み合わせを可能にする１対の軽鎖および重鎖を有している。
【０２１１】
例示的な逆相クロマトグラフィー吸着剤は、ＰＬＲＰ−Ｓ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州アマースト）などの高度に架橋結合したポリスチレン粒子である。
【０２１２】
例示的な実施形態では、生物学的サンプルはＤｉｏｎｅｘ  Ｐｒｏ  Ｐａｃ  ＷＣＸ−１０カラム上でのカチオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によって精製することができる。画分を採取し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０を用いて濃縮した。
【０２１３】
（質量分析法）
本発明の方法は、生物学的サンプルに由来する抗体混合物の分析に適している。ここでこの混合物の様々な化学的構成成分が、最初に、親和性またはクロマトグラフィーを含む１つ以上のプロセスによって単離、分離、または部分分離される。このプロセスは、構成成分を連続的に、またはバッチ法で溶出させるか、あるいは質量分析法によって直接的に検出されるようにする。フラグメント化、脱アミド化、グリコシル化、酸化、例えばＮ末端およびＣ末端の部分配列情報、二量体および凝集状態を含む抗体の様々な構造的特徴および特性は、質量分析から引き出すことができる。生物学的サンプル内の１つ以上の化学的構成成分は、投与される抗体−薬物結合体の配列、構造、および分子量が分かっているため、その正確な質量の測定によって高度に特異的方法で特性解析できる。
【０２１４】
高い質量正確性、高感受性、および高分解能が可能である様々な質量分析システムが、当該分野において公知であり、本発明の方法において使用できる。そのような質量分析計の質量分析装置としては、四極子（Ｑ）、飛行時間（ＴＯＦ）、イオントラップ、磁気セクターもしくはＦＴ−ＩＣＲまたはそれらの組み合わせが含まれる。質量分析計のイオン源は、主にサンプル分子イオン、または偽性分子イオン、および所定の特性解析可能なフラグメントイオンを産生するはずである。そのようなイオン源の例としては、大気圧イオン源、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩは、質量分析のためにタンパク質をイオン化するために最も一般的に使用される２つの方法である。ＥＳＩおよびＡＰＣＩはＬＣ／ＭＳのために最も一般的に使用されるイオン源技術である（Ｌｅｅ，Ｍ．“ＬＣ／ＭＳ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”（２００２）、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０２１５】
表面増強レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、ハイスループット質量分析を可能にする表面に基づくイオン化技術の例である（米国特許第６，０２０，２０８号）。代表的には、ＳＥＬＤＩは、タンパク質および他の生体分子の複合混合物を分析するために使用される。ＳＥＬＤＩは、溶液中で分析物、例えばタンパク質と相互作用するための「タンパク質チップ」などの化学的に反応性の表面を使用する。そのような表面は、分析物と選択的に相互作用し、そしてそれらをその上に固定化する。そこで、本発明の分析物はチップ上で部分精製し、次に質量分析計において迅速に分析することができる。基質表面上の様々な部位で様々な反応性成分を提供することによって、スループットを増加させることができる。
【０２１６】
市販で入手できる質量分析計は、サンプリングして、全質量スペクトルを同時に、かつ混合物内の複数の構成成分に対して十分なスペクトルを獲得して質量分析シグナルの強度またはピーク面積が定性的に表示していることを保証することを可能にする頻度で記録することができる。これは、全質量について観察される溶出時間が質量分析装置によって修飾されたり歪曲されたりしないことも保証し、さらにこれは定量的測定値が一過性シグナルの存在度を測定する必要によって弱化されないことを保証するのに役立つ。
【０２１７】
ＬＣ／ＬＣ／ＭＳによって小分子および抗体−薬物結合体を同時定量するための方法が開発された。これを完遂するために、各部分を独立して開発し、後に組み合わせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法は、さらにまたオンライン固相抽出法（ＳＰＥ）のためのＰＲＯＳＰＥＫＴ−２（登録商標）機器（Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ）、クロマトグラフィー分離のためのＳＹＮＥＲＧＩ（商標）Ｃ１２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州トランス）逆相クロマトグラフィー、および検出用のＡＰＩ  ３０００質量分析計（Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．およびＭａｎｎ，Ｅ．“Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ”，５１ｓｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，２００３年６月８日〜１２日；Ｂｅａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１２：１２１６−１２２２；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１２：７５−８２）を使用して、そして実施例１に詳述されるように、薬物成分および代謝産物を定量するために開発した。本方法のこの小分子部分は、オーリスタチンおよびメイタンシノイド薬物について０．３〜７５０ｎｇ／ｍＬの範囲を有していた。血漿中の線形曲線を得た（Ｒ２＝０．９９９）。
【０２１８】
抗体種の定量は、当該の各種由来のイオン（ＬＣおよびＬＣ＋１Ｄ）を用いる単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって遂行した。これにより、血漿中の相対量の各結合体種の比較が可能になった。溶液および血漿中の線形曲線は、抗体の未修飾（ＬＣ）および結合体化（ＬＣ＋Ｄ）軽鎖両方について、各々図１６および１７に示されている。
【０２１９】
図１８は、０．１ｎｇ／ｍＬのＬＯＱの、ラット血漿中の遊離薬ＭＭＡＥについての検量線を示した図である。ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ抗体法は、ＰＲＯＳＰＥＫＴ−２機器上で小分子ＳＰＥ法と組み合わせた。組み合わされた方法は、抗体結合体の親和性単離、遊離薬のオンラインＳＰＥ抽出、小分子の逆相分離を実施し、その後に結合体した抗体の逆相分離を実施する。免疫親和性カラム（遊離薬物を含有する）からの廃棄物の流れは、それが廃棄される前にＣ１８  ＳＰＥカートリッジを通して方向付けられる。ＳＰＥカートリッジが溶出され、その間に血漿が親和性カラムから洗浄され、最後に親和性カラムが溶出される。２つのデータファイルは、そこで１回の血漿注入から注入され、インビボでの結合体化抗体のための貴重な定量データを提供する。
【０２２０】
（エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析）
抗体などの相当に高分子量の化合物の質量は、大多数の質量分析計によって容易に決定できる質量対電荷比（ｍ／ｚ）で検出することができる（２０００〜３０００までの代表的なｍ／ｚ範囲）。エレクトロスプレーイオン化質量分析ＥＳＩ−ＭＳは、特に、荷電、極性または塩基性化合物のために、そして優秀な検出限界で多荷電化合物を分析するために適合する。ＥＳＩは、１５０，０００以上の分子量（ＭＷ）の抗体および抗体−薬物結合体などの大きな生体分子の検出および特性解析を可能にする。高質量イオンについては、代表的には一連の多荷電分子イオンが観察される。陽イオンについての分子量は、測定されたｍ／ｚ比−カチオン（Ｃ＋）の質量にそのイオン上の電荷数（ｎ）を積算することによって決定される。
【０２２１】
ＭＷ＝ｎ（ｍ／ｚ−ｎＣ＋）
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、液体分離法（フロントエンド）ならびにＭＳ／ＭＳ法（バックエンド）と適合する（“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｃｏｌｅ，Ｒ．Ｂ．編（１９９７）Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ペプチド、タンパク質、または他の生体分子の希釈溶液は、シリンジポンプ、フローインジェクション、またはＬＣ／ＭＳによって質量分析計システムへ導入することができる。ＥＳＩ−ＭＳデータは、多数のスキャンを一緒に平均化する工程と、良好なピーク強度および形状を提供するためにデータを平滑化する工程とによって獲得することができる。低質量化合物については、観察された最も豊富なピークは、しばしば作製された陽イオン中の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンおよび作製された陰イオン中の［Ｍ−Ｈ］−イオンである。二価および三価イオンならびに二量体もまた観察されることがある。二価陽イオンは、質量（ＭＷ＋２Ｃ＋）÷２（式中、ＭＷは分子量であり、Ｃ＋は、Ｈ＋、Ｎａ＋、またはＮＨ４＋などのイオン化カチオンである）で観察される。極めて低質量の化合物を除いて、検出されたイオンは多価である。ＥＳＩのソフトなイオン化状態のために、しばしば多価イオンが観察される。このため、単一分子量を表す高分子についてのＥＳＩスペクトルでは多数のｍ／ｚピークが観察される。分子量の計算は、２つの未知数を有する２つの方程式を解くか、または高分子の質量を自動的に計算できる供給業者からの逆重畳積分ソフトウェアを購入するかのいずれかによって遂行できる。
【０２２２】
タンパク質のＥＳＩは、分子量が増加するにつれて増加する傾向を示す電荷数の多価イオンを生成する。所定のイオン種上の電荷数は、：（ｉ）１つの電荷が相違する２つの荷電状態を比較し、連立方程式を解く工程；（ｉｉ）同一電荷を有するが相違する付加質量を有する種を探す工程；および（ｉｉｉ）分解同位体クラスターについて質量対電荷比を試験する工程などの方法によって決定することができる。ＥＳＩおよびＥＳＩ−ＭＳの方法ならびにこれらの方法を実施するために必要とされるパラメーターは、当該分野において周知である。エレクトロスプレーイオン化プロセスの穏やかさにより、質量分析法によってインタクトな抗体結合体を直接的に検出することが可能になる。
【０２２３】
１つの実施形態では、タンパク質、抗体、抗体フラグメントまたは抗体−結合体（高分子）のＱ１質量スペクトルは、本方法の一部として行われる。高分子の適切な質のＱ１質量スペクトルは、以下のとおりに入手できる：
タンパク質エンベロープが移動する可能性が存在するため、クロマトグラフィーのために使用されるすべての溶媒は新しく生成され、観察された範囲内でスペクトルエンベロープの位置を解明するために溶出溶媒へ酸が添加される。１００，０００質量単位を超えるタンパク質については、ギ酸などの酸を、例えば溶媒Ａ（水）およびＢ（アセトニトリル）の両方の溶出溶媒中において約０．１％（容量）で使用できる。１００，０００質量単位以下のタンパク質については、ＡおよびＢ溶媒の両方についてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸を約０．０５％（容量）で使用できる。酸、溶媒およびＤＰのパラメーターはインタクトなおよび還元された抗体のイオン化に影響を及ぼす。図１には、酸を還元する０．２％〜０．０５％のイオン化作用が示されている。ギ酸の量が減少するにつれて、インタクトなグリコシル化抗体であるトラスツズマブは、より多数の電荷を取り上げ、エンベロープをさらに左へ、そしてｍ／ｚの観察された範囲（１８００〜３０００ｍ／ｚ）へ移動させる。図１における質量スペクトルＣおよびＤは、デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）電圧が３０〜１２０Ｖから７０〜１９０Ｖへ増加するにつれて、抗体上の電荷はよりさらに増加することを示している。従って、印加電圧、溶媒組成、およびイオン対合剤は、考慮および調整しなければならない因子である。
【０２２４】
タンパク質エンベロープが移動しないことを証明するために、イオンを広範囲のｍ／ｚから選択し、濃度対ピーク強度をプロットした（図２）。広範囲のｍ／ｚにわたって直線性を得ることができる。図２は、抗体の軽鎖のＱ１スキャンから入手された抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））の荷電状態を示している。インタクトな抗体もしくは重鎖、フラグメントもしくはＡＤＣの量を定量するためには、抗体の脱グリコシル化が提案されている。グリコシル化は低イオン化効率、したがって減少した感受性に寄与する。それはさらに、一般に非線形（二次）検量線を生じさせる。図３は、グリコシル化されたトラスツズマブのＥＳＩ−ＭＳおよびスペクトラル逆重畳を示した図である。図４は、インタクトなトラスツズマブ（αＨｅｒ２）および脱グリコシル化されたインタクトなトラスツズマブのＥＳＩ−ＭＳによる定量のための検量線を示している。図５は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の還元されたトラスツズマブのＥＳＩ−ＭＳによる定量のための検量線を示した図である。
【０２２５】
抗体もしくは抗体フラグメント結合体を定量する場合は、抗体の脱グリコシル化は質量スペクトルの不均質性を減少させ、感受性を増加させる可能性があり、したがって分析を単純化する。図６は、ＰＮＧａｓｅＦを用いた脱グリコシル化およびＤＭ１の加水分解的開裂後の、抗体結合体であるトラスツズマブ−ＳＰＰ−ＤＭ１のＥＳＩ−ＭＳを示した図である。図７は、図６の生データの逆重畳スペクトルを示した図である。
【０２２６】
１つの実施形態では、定量のための荷電イオン範囲が決定される。定量のために荷電イオン範囲を選択する場合は、マトリックス干渉を示さないスペクトル範囲が選択される。これは各タンパク質について実験的に、そしてＱ１スペクトル（図２１）を実行し、２２５１．９（このときスペクトルの領域にはマトリックス干渉は見られない）などの荷電イオンを選択する工程によって決定される。
【０２２７】
別の実施形態では、各種を定量する目的で正確な質量対電荷比（ｍ／ｚ）を決定するために逆重畳積分表が使用される。Ａｎａｌｙｓｔ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）などの逆重畳分析ソフトウェアプリケーションは市販で入手でき、そして／または質量分析計を用いて提供される。逆重畳ソフトウェアは一般に、ユーザーへ逆重畳質量の表ならびにこれらの質量を計算するために使用される、ｍ／ｚイオンのサブテーブル（それからＳＩＭ法のために選択されたイオンを抽出できる）を提供する。
【０２２８】
正確なｍ／ｚを使用して、定量すべき全種についてＳＩＭ法が生成される。最大の信号雑音比を備える荷電状態はマトリックス干渉のために必ずしも定量にとって最高の荷電状態であるとは限らないため、各種についての数個のｍ／ｚ荷電イオンを選択することができる。マトリックス干渉および分解能が欠如するために、しばしば最高の荷電状態はより高いｍ／ｚ範囲（約１８００〜２７００）内にある。１つの例示的な実施形態では、１〜１０個のイオンについての滞留時間は各々１５０〜２００マイクロ秒である。１０個を超えるイオンがモニタリングされる場合は、滞留時間は７５〜１００へ調整されなければならない。
【０２２９】
図２２は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択、還元および変性によって単離されたラット血漿および溶液サンプルのクロマトグラムを示している。図２３は、ラット血漿中でのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの脱グリコシル化され還元されたフラグメントの単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）を示した図である：（上）軽鎖；（中）１ＭＭＡＥを備える軽鎖；（下）３ＭＭＡＥを備える重鎖。図２４は、１４９ｎｇ／ｍＬのＬＯＱを備える、ラット血漿中のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの１ＭＭＡＥ薬物成分（ＬＣ＋１ＭＭＡＥ）を備える軽鎖の２２５１ｍ／ｚイオンについての検量線を示した図である。
【０２３０】
ＳＩＭ法は、所望の種を定量するためにサンプルマトリックスにおける検量線を調製するために使用できる。ＤＰは各イオンについて調整することができ、試験サンプルは、図１に示したような各種についてこの変量を実験により決定するために実行することができる。良好なＤＰ開始点は、１０電圧単位の増分で５０〜１５０ボルトである。図１０におけるトラスツズマブ結合体のＬＣ＋１ＭＭＡＥの定量下限（ＬＯＱ）は１４０ｎｇ／ｍＬである。この方法が最適化されると、サンプルマトリックスにおいて検量線が作成され、市販で入手できるソフトウェアを用いて獲得されたデータが処理される。二重親和性カラム法（実施例１）は直線性、および全プレート変動性について試験した。この膜から回収された２つの抗体からの抗体検量線は、０．１４μｇ／ｍＬ〜７５μｇ／ｍＬの範囲について大きな直線性（Ｒ２＝０．９９９３）（図１０）、および全プレート精密度（図１１）を証明した。
【０２３１】
定量は、当該の各種由来のイオン（ＬＣおよびＬＣ＋１）を用いる単一イオン・モニタリング（ＳＩＭ）によって遂行した。これは血漿中の相対量の各結合体種の比較を可能にした。溶液（Ｒ２＝０．９９９３および０．９９８６）ならびに血漿（Ｒ２＝０．９９８０および０．９９９４）中の検量線は、未修飾トラスツズマブ（図１６）および抗体−薬物結合体であるトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図１７）各々について入手された（Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．およびＭａｎｎ，Ｅ．“Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ”，５１ｓｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，２００３年６月８日〜１２日）。図１９は、（上）還元された、および変性したトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの全イオンクロマトグラム；（中）１ＭＭＡＥを有する軽鎖の質量スペクトル；および（下）３ＭＭＡＥを有する重鎖の質量スペクトルを示している。図２０は、還元されたトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ：（上）ＬＣ＋１ＭＭＡＥおよび（下）ＨＣ＋３ＭＭＡＥのフラグメントの逆重畳質量スペクトルを示した図である。
【０２３２】
図２５は、抗ＥｐｈＢ２Ｒ抗体−薬物結合体である２Ｈ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの２つの調製物のＬＣ分析を示した図である。フラグメントの指定；ＬＣ＋０、ＬＣ＋１、ＨＣ＋０、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２、ＨＣ＋３、ＨＣ＋４。２Ｈ９は、エフリンＢ受容体に対する強度の親和性を有するＩｇＧ１抗体である。２Ｈ９はさらにまた、還元後に１０個までの反応性システインチオール基に対するポテンシャルを有する、５個のジスルフィド基を有する。図２６は、特性解析のためのＱ１データ収集を用いた、２つの調製物２Ｈ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＬＣ／ＭＳ分析を示した図である。表１は、ＡＤＣの２つの調製物である２Ｈ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのフラグメントの統合領域をまとめており、軽鎖および重鎖上の薬物負荷、したがって１抗体当たりの相薬物負荷を確定している。２Ｈ９当たりの全平均薬物負荷は、２つのＨＣおよび２つのＬＣフラグメントの合計から計算した。図２５および２６の一番上にあるＡＤＣ調製物についての２Ｈ９当たりの総平均薬物負荷は、３．５ＭＭＡＥ／２Ｈ９であった。図２５および２６の一番下にあるＡＤＣ調製物についての２Ｈ９当たりの総平均薬物負荷は、５．１ＭＭＡＥ／２Ｈ９であった。
【０２３３】
【表１】
2007532882.tif 000038
抗体−薬物結合体であるトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの類似のＬＣ／ＭＳ同定および特性解析を実施した。１つの調製物は、１．０（ＭＭＡＥ／ＬＣ）の軽鎖負荷および２．９（ＭＭＡＥ／ＨＣ）の重鎖負荷、このため７．８（ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）の総薬物負荷を生じさせた。また別の調製物は、１．０（ＭＭＡＥ／ＬＣ）の軽鎖負荷および１．６（ＭＭＡＥ／ＨＣ）の重鎖負荷、このため５．１（ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）の総薬物負荷を生じさせた。
【０２３４】
図２８〜３１は、ＬＣ／ＭＳによる血漿サンプルの薬物動態（ＰＫ）分析の結果を示している。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットに抗体、トラスツズマブ当たり平均８．７〜５．３ＭＭＡＥの薬物成分が負荷されたトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの２つの調製物いずれかが投与された。図２８および２９は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（８．７ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）、２ｍｇのＭＭＡＥ／ｋｇ（図２８）；およびトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．３ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）、２ｍｇのＭＭＡＥ／ｋｇ（図２９）が投与されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットからの血漿由来ＬＣ／ＭＳサンプルについてのＰＫ分析を示した図である。結合体した薬物成分を含む、および含まない様々な重鎖および軽鎖の濃度を計算した。図３０は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．３ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）のＬＣ（軽鎖）およびＨＣ（重鎖）フラグメントのＭＭＡＥ結合体化のレベルの百分率比のプロットを示した図である。図３１は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの２種の調製物についての経時的な薬物（ＭＭＡＥ）対抗体（トラスツズマブ）比率変化の比較を示した図である。１つの調製物は、８．７ＭＭＡＥ／トラスツズマブの薬物対抗体比を有しており、もう１つの調製物は、５．３の比率を有する図３１に示した調製物である。
【０２３５】
図３２〜３６は、薬物負荷作用についての比較薬物動態試験の結果を示している。単一ロットの抗体−薬物結合体であるトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを調製した。クロマトグラムからのピークは、抗体、トラスツズマブ当たりの２、４、および６ＭＭＡＦの薬物負荷を示したＭＳによって同定した（図３２）。図３２は、（上）０、２、４、６の薬物負荷値を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＦの粗混合物；（上から２番目）６の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＦ；（中央）４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＦ；（下から２番目）２の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＦ；（下）トラスツズマブの疎水的相互作用クロマトグラム（ＨＩＣ）を示している。
【０２３６】
各主要ピーク下の構成成分を分離し、単離し、そしてＬＣ／ＭＳによって特性解析した。図３３は、（上）２の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（中央）４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（下）６の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの還元および変性後のＬＣ／ＭＳ分析を示した図である。２の薬物負荷（上）を有するサンプルは、軽鎖フラグメントの５３．１％  ＬＣおよび４６．９％  ＬＣ＋１ならびに重鎖フラグメントの５１％  ＨＣおよび４９．０％  ＨＣ＋１を示した。ＬＣ、ＬＣ＋１、ＨＣ、およびＨＣ＋１についての全面積は、１．９ＭＭＡＦ／Ａｂの総薬物負荷計算値を生じさせた。４の薬物負荷（中）を有するサンプルは、軽鎖フラグメントの６０．１％  ＬＣおよび３９．９  ＬＣ＋１ならびに重鎖フラグメントの４９．１％  ＨＣ＋１、４８．１％  ＨＣ＋２、および２．８％  ＨＣ＋３を示した。ＬＣ、ＬＣ＋１、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２、およびＨＣ＋３についての全面積は、３．９ＭＭＡＦ／Ａｂの総薬物負荷計算値を生じさせた。６の薬物負荷（下）を有するサンプルは、軽鎖フラグメントの５５．２％  ＬＣおよび４４．９％  ＬＣ＋１ならびに重鎖フラグメントの７．６％  ＨＣ＋１、４６．７％  ＨＣ＋２、および４５．７％  ＨＣ＋３を示した。ＬＣ、ＬＣ＋１、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２、およびＨＣ＋３についての全面積は、５．５ＭＭＡＦ／Ａｂの総薬物負荷計算値を生じさせた。図３４は、（上）２の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（中央）４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（下）６の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの重鎖上の０、１、２、および３ＭＭＡＦ薬物成分を有するフラグメントの質量による特性解析を伴うＭＳ分析を示した図である。
【０２３７】
遊離薬物であるＭＭＡＦは、２（５１．７３ｇのＡＤＣ／ｋｇ）の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；４（２６．１２ｍｇのＡＤＣ／ｋｇ）の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；および６の薬物負荷（１７．５９ｍｇのＡＤＣ／ｋｇ）を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが投与されたラット由来の血漿中で検出された。第５日に、２の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを摂取したラットにおいて遊離ＭＭＡＦは１．８０ｎｇ／ｍＬであった。第５日に、４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを摂取したラットにおいて遊離ＭＭＡＦは９．０９ｎｇ／ｍＬであった。第４日に、６の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを摂取したラットにおいて遊離ＭＭＡＦは５０．８１ｎｇ／ｍＬであった。血漿中の遊離薬物の存在は、２、４、および６の薬物負荷を有する３種のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが投与されたラット由来の血漿中で検出された経時的な薬物／Ａｂ比において測定された減少と一致している（実施例９）。
【０２３８】
図３５は、免疫親和性膜選択膜／ＬＣ／ＭＳによって分析されたラット血漿サンプル由来の、２の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；および６の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのクリアランスについての経時的な薬物（ＭＭＡＦ）対抗体（トラスツズマブ）比の変化の比較を示した図である（実施例２）。図３６は、免疫親和性膜選択膜／ＬＣ／ＭＳによって分析されたラット血漿サンプル由来の２、４および６の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦについて経時的に軽鎖および重鎖の結合体化レベルの比較によって薬物対抗体比の変化をさらに詳細に示している。
【０２３９】
図３７および３８は、類似の薬物負荷を用いて、抗体−薬物結合体中の薬物成分ＭＭＡＥとＭＭＡＦとの間の差についての比較薬物動態試験の結果を示している。ラットには、ビヒクル対照；５．３の平均薬物負荷を有する２０．２ｍｇのＡＤＣ／ｋｇのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ；および４の薬物負荷を有する２６．１２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが投与された。これらの投与は、投与された薬物の量を本質的に標準化する。第４日のＬＣ／ＭＳ分析は、クリアランスされたトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ血漿サンプルが、重鎖フラグメントは結合体されたままの薬物を本質的に有しておらず、軽鎖フラグメントはＬＣ当たり０．９ＭＭＡＥを有していることを示すことを証明した。第４日のＬＣ／ＭＳ分析は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ血漿サンプルが、重鎖フラグメントがＨＣ当たりの０．９ＭＭＡＦを有しており、軽鎖フラグメントはＬＣ当たり０．４ＭＭＡＦを有していることを証明した。図３７は、５．３の平均薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥラット血漿サンプル；および４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦについて経時的に薬物（ＭＭＡＥ）対ＬＣ（軽鎖）および薬物（ＭＭＡＥ）対ＨＣ（重鎖）比における経時的な薬物／抗体比への変化の比較を示した図である。このグラフは、フラグメントの分解の相対比は：ＨＣ−ＭＭＡＥ＞ＨＣ−ＭＭＡＦ＞ＬＣ−ＭＭＡＦ＞ＬＣ−ＭＭＡＥであることを示している。図３８は、平均薬物負荷値５．３を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥラット血漿サンプル；および４の薬物負荷を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの対ＨＣ（重鎖）からのＬＣ（軽鎖）および薬物（ＭＭＡＥ）の相対薬物消失率を示した図である。
【０２４０】
抗ＨＥＲ２抗体Ｆａｂである４Ｄ５は、メイタンシノイド薬物成分ＤＭ１との結合体化の前後に分析した。図４０は、毎秒カウント数（ｃｐｓ）対原子量単位（ａｍｕ）における強度をプロットしている逆重畳質量分析解析を示している。裸の４Ｄ５  Ｆａｂ（左上）は、主として単一質量を示している。ジスルフィド基の還元後に、裸の４Ｄ５は軽鎖および重鎖に分離する（左下）。抗体−薬物結合体の調製物である４Ｄ５  Ｆａｂ−ＳＰＰ−ＤＭ１は、０、１、２、３、および４つのＤＭ１薬物成分を有する種の分布を示している（右上）。抗体ジスルフィド基とＳＰＰリンカーのジスルフィド結合の還元後に、４Ｄ５  Ｆａｂ−ＳＰＰ−ＤＭ１の調製物は、フラグメントに残留している部分リンカー（ＳＰ）を有する重鎖および軽鎖種（右下）へ指定できるフラグメントを示した。
【０２４１】
抗体−薬物結合体の代謝産物は、薬物動態サンプルから本発明の方法によって単離かつ特性解析することができる。例えば、図４１は、カニクイザルのインビボ血漿サンプル由来の抗オーリスタチン抗体親和性膜上に捕捉された８１７８ａｍｕの質量を有するトラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの代謝産物の計数毎秒（ｃｐｓ）対原子質量単位（ａｍｕ）での強度をプロットした質量分析を示した図である。図４２は、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの投与１２０時間後までの複数の時点に採取された、カニクイザルからのインビボ血漿サンプル由来の抗オーリスタチン抗体親和性膜上に捕捉された８１７８質量単位（＋１６３６ｍ／ｚの５イオン）の代謝産物のピーク面積を示した図である。
【０２４２】
図４３は、カニクイザルへのトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与後に複数の時点（時間）に採取された血漿サンプル由来の質量分析法によって検出された軽鎖フラグメントのプロットを示した図である。軽鎖フラグメントは、０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したようなそれらの質量を特徴とし、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総軽鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【０２４３】
図４４は、インキュベーション時点（時間）での、緩衝液（ＰＢＳおよび０．５％  ＢＳＡ）中のトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のサンプルから質量分析法によって検出された軽鎖フラグメントのプロットを示した図である。軽鎖フラグメントは、０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したようなそれらの質量を特徴とし、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総軽鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【０２４４】
図４５は、カニクイザルへのトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与後に複数の時点（時間）で採取された血漿サンプル由来の質量分析法によって検出された重鎖フラグメントのプロットを示した図である。重鎖フラグメントは、０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したようなそれらの質量を特徴とし、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総重鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【０２４５】
図４６は、インキュベーション時点（時間）での、緩衝液中のトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のサンプルから質量分析法によって検出された重鎖フラグメントのプロットを示した図である。重鎖フラグメントは、０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したようなそれらの質量を特徴とし、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総重鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【０２４６】
図４７は、（上の線）抗体薬物結合体の緩衝液サンプル、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦ；および（下の線）７０時間までの複数の時点に、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの投与後のカニクイザルから採取された血漿サンプル内の薬物成分に結合体化したままである抗体のプロットを示した図である。薬物成分に結合体した抗体の分画は、ＬＣ／ＭＳ法（実線）および二重ＥＬＩＳＡ試験（点線）によって測定された。ＬＣ／ＭＳおよびＥＬＩＳＡ法は、緩衝液およびインビボの両方での薬物動態サンプルについて良好に相関している。
【０２４７】
図４８は、ＬＣ／ＭＳ（点線）およびＥＬＩＳＡ試験（実線）によって６０時間までの時点に、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの投与後のカニクイザルから採取された血漿サンプル中のＦａｂ抗体薬物結合体、４Ｄ５  Ｆａｂ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのμｇ／ｍＬでの定量のプロット図を示した図である。結果の比較は、表２に提供されている。
【０２４８】
【表２】
2007532882.tif 000039
【実施例】
【０２４９】
（サンプルおよび試薬）
ＨＰＬＣ用アセトニトリルは、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ（ミシガン州マスキーゴン）から購入した。ギ酸（ＦＡ）はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（ニュージャージー州フィリップスバーグ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール（ＤＴＴ）は、Ａｖｏｃａｄｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（マサチューセッツ州ワードヒル）から購入した。ＰＮＧａｓｅＦ酵素は、Ｐｒｏｚｙｍｅ（カリフォルニア州サンリアンドロ）から購入した。ＰＬＲＰ−Ｓポリマーカラムは、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州アマースト）から購入した。
【０２５０】
（機器器械）
本明細書に記載した本発明の実施形態のためには、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）から購入したＡＰＩ  ３０００質量分析計を使用した。ＣＴＣ  ＨＴＳ−ＰＡＬオートサンプラーは、Ｌｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニュージャージー州カールボロ）から購入した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプ（ＬＣ−１０ＡＤ）およびシステムコントローラー（ＳＣＬ−１０Ａ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州コロンビア）から購入した。Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ホットポケットカラムヒーターは、Ｔｈｅｒｍｏ（メリーランド州ウォルサム）から購入した。スイッチング弁は、Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．（テキサス州ヒューストン）から購入した。
【０２５１】
（小タンパク質のためのＨＰＬＣ法）
逆相ＨＰＬＣ法は、ＰＬＲＰ−Ｓ  ８μ、１０００Å、２．０×５０ｍｍ架橋結合ポリスチレン／ジビニル−ベンゼンカラムを用いて還元された抗体検出のために使用した。移動相ＡおよびＢは、各々水およびアセトニトリル中の０．０５％  ＴＦＡから構成された。カラム温度を７０℃へ加熱した。標準物質およびサンプル分析のために９分勾配を使用した：（０．０〜１．０分、５００μＬ／分、０％  Ｂ；１．０〜１．１分、５００〜２５０μＬ／分、０〜３０％  Ｂ；１．０〜１．１分、２５０μＬ／分、３０％  Ｂ；１．１〜１．５分、２５０μＬ／分、３０％  Ｂ；１．５〜５．５分、２５０μＬ／分、３０−５０％  Ｂ；５．５〜６．５分、２５０μＬ／分、５０〜８０％  Ｂ；６．５〜７．５分、２５０μＬ／分、８０％  Ｂ；７．５〜７．６分、２５０μＬ／分、０％  Ｂ；７．６〜９．０、２５０μＬ／分、０％  Ｂ）。この方法のための注入量は、サンプルが希釈液であるために１００〜３００μＬである。特性解析のための注入量は、１０〜２０μＬであり得、一方膜サンプルのための注入量は２００〜５００μＬであり得る。スイッチング弁（Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏ，Ｉｎｃ．、テキサス州ヒューストン）を使用してサンプル緩衝液は、廃棄物へ転換される（０．０〜１．８分間）。抗体の軽鎖（ＬＣ）、および重鎖（ＨＣ）は、各々およそ４．４１および４．７６分間で溶出する。
【０２５２】
（大タンパク質のためのＨＰＬＣ法）
逆相ＨＰＬＣ法はＰＬＲＰ−Ｓ  ８μ、４０００Å、２．０×５０ｍｍ架橋結合ポリスチレン／ジビニル−ベンゼンカラムを用いてインタクトな抗体検出のために使用した。移動相ＡおよびＢは、各々水およびアセトニトリル中の０．１％  ＦＡから構成された。カラム温度を７０℃へ加熱した。８分勾配を標準物質およびサンプル分析のために使用した：（０．０〜２．５分、５００μＬ／分、０％  Ｂ；２．５〜３．５分、５００μＬ／分、５０％  Ｂ；３．５〜５．０分、５００μＬ／分、５０〜１００％  Ｂ；５．０〜６．４分、５００μＬ／分、１００％  Ｂ；６．４〜６．５分、５００μＬ／分、１００〜０％  Ｂ；６．５〜８．０、５００μＬ／分、０％  Ｂ）。この方法のための注入量は１０μＬである。スイッチング弁はサンプル緩衝液を廃棄物へ転換させる（０．０〜２．５分間）。インタクトな抗体は約３．５分間で溶出する。
【０２５３】
（質量分析計（ＭＳ）の条件）
小タンパク質のためにはＱ１スキャンモード（１２００〜２５００ｍ／ｚ、および高分子のためには１８００〜３０００ｍ／ｚ）を使用して全スキャンモードのためにＡＰＩ  ３０００上のデータを獲得した。デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）は、起源での流量溶液に依存して３０〜１２０または７０〜２５０ボルトへ傾斜した。以下の追加のパラメーターを使用した：ネブライザーガス（ＮＥＢ）は１２．０、カーテンガス（ＣＵＲ）は１０．０、イオンスプレー電圧（ＩＳ）は５５００、温度（ＴＥＭ）はカラム流量に依存して３００〜５００、集束ポテンシャル（ＦＰ）は４００Ｖ、入口ポテンシャルは１０．０Ｖ、およびデフレクター（ＤＦ）は−１００Ｖであった。還元された抗体の単一イオン・モニタリング（ＳＩＭ）法は、７５ＶのＤＰ電圧を使用した。
【０２５４】
（実施例１）
（免疫親和性クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣカラムスイッチング法）
ＡＤＣを分析して小分子薬物成分および代謝産物を定量するための、カラムスイッチング、免疫親和性／ＬＣ／ＭＳ法を使用した。質量分析計に導入する前に自動カラム洗浄およびスイッチングのためにはＰＲＯＳＰＥＫＴ−２（登録商標）機器（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．、オンタリオ州ブロックビル）を使用した。免疫親和性／ＬＣ／ＭＳ法。免疫親和性／ＬＣ／ＭＳ法は、抗体結合体の親和性単離、遊離薬のオンラインＳＰＥ抽出、小分子の逆相分離を実施し、その後に結合体した抗体の逆相分離を含んでいる。免疫親和性カラム（遊離薬物を含有する）からの廃棄物の流れは、それが廃棄される前にＣ１８  ＳＰＥカートリッジを通して方向付けられる。ＳＰＥカートリッジが溶出され、その間に血漿が親和性カラムから洗浄され、最後に親和性カラムが溶出される。２つのデータファイルは１回の血漿注入から注入され、インビボでの結合体化抗体のための貴重な定量データを提供する。
【０２５５】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法は、オンラインＳＰＥ（固相抽出）のためにＰＲＯＳＰＥＫＴ−２機器、クロマトグラフィー分離のための逆相クロマトグラフィー（ＳＹＮＥＲＧＩ  Ｃ１２）、および検出のためのＡＰＩ  ３０００質量分析法を使用する。小分子方法は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦオーリスタチン薬物について０．３〜７５０ｎｇ／ｍＬの範囲を有していた。血漿中の線形曲線を得た、Ｒ２＝０．９９９（Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．およびＭａｎｎ，Ｅ．“Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ”，  ５１ｓｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｊｕｎｅ  ８−１２，２００３）。さらに、本方法の抗体部分は０．１４〜３００μｇ／ｍＬの範囲を有し、溶液および血漿中のどちらでも線形であった（Ｒ２＝０．９９９）。
【０２５６】
（実施例２）
（免疫親和性膜の選択および逆相ＨＰＬＣ法）
生物学的サンプルを特性解析かつ定量するために免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択および逆相ＨＰＬＣ法が開発された（Ｍａｎｎ，Ｅ．およびＫａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ／ＭＳ  ａｎｄ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ”，５２ｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，２００４年５月２３日〜２７日）。９６のサンプルの同時浄化を可能にする９６ウェルフォーマットで、市販で入手できる親和性膜を使用した。膜の負荷、洗浄および溶出のために圧ゲージ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を装備した真空マニホールドを使用した。圧ゲージは全洗浄のための２０ｐｓｉ、ならびに抗原の固定化、血漿サンプルの適用およびタンパク質溶出などの重要な工程のためには５ｐｓｉで維持した。血漿などの生物学的サンプルを各ウェルに送達し、インキュベートし、洗浄し、そして０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、ＬＣ／ＭＳによるサンプル分析のためにオートサンプラー内へ直接的に配置した２ｍＬの四角形９６ウェルプレート内へ送達した。
【０２５７】
ＬＣ／ＭＳサンプル分析のためには、逆相カラム（ＰＬＲＰ−Ｓ、２．０×５０ｍｍ、８μ、１０００Å）を装備したＡＰＩ  ３０００四重極質量分析計を使用した。０．０５％  ＴＦＡを含むアセトニトリルおよび水を用いて８分のＨＰＬＣ勾配を利用した。
【０２５８】
抗原固定化および抗体捕捉条件を評価して調整した（緩衝液の選択、濃度、およびｐＨ）。ＥＭＰＯＲＥ膜上のアゾラクトン官能基と抗体抗原（Ａｂ）上のアミン基との間の安定性結合形成を含む固定化化学は下記の通りである。トラスツズマブを捕捉するための、抗ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）（米国特許第５，８２１，３３７号；第６，０５４，２９７号；第６，４０７，２１３号；第６，６３９，０５５号；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−９；Ｓｌａｍｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−１２）。洗浄の回数および順序（ＰＢＳ、希釈ｔｗｅｅｎ  ２０洗浄剤、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）水）は最高効率の洗浄戦略を決定するために最適化した。最適な溶出量は、各抗原−抗体系について最適化する必要がある。ＥＭＰＯＲＥ膜は、有害な作用を伴わずに、例えば３０回まで正常に再使用可能である。
【０２５９】
【化４０】
2007532882.tif 000040
アザラクトン親和性膜は、最適化条件を利用して調製し、直線性および全プレート変動性について試験した。この膜から回収された２つの抗体からの抗体検量線は、７５μｇ／ｍＬ〜０．１４μｇ／ｍＬの範囲について大きな直線性（Ｒ２＝０．９９９３）を証明した（図１０）。全プレート変動性実験は全プレートについて６．０％  ＣＶならびに図１１における９６ウェル（８×１２）を表す以下の行および列については２．５から８．０％を生じさせた。そこで曲線計数下面積は、全プレートにわたって受容可能な精密度を示している。
【０２６０】
所定の抗体は、１つ以上の糖残基を用いてグリコシル化される。図１２で分析されたモノクローナル抗体は、脱グリコシル化の前（上）および後（下）のグリコシル化抗体のスペクトルを示している。荷電イオンの不均質性は、大きな正確度および感受性を生じさせる糖除去によって大きく減少させられる。ＰＮＧａｓｅＦを用いる脱グリコシル化などの膜上酵素反応を実施できる（図１２）。
【０２６１】
（親和性膜固定化法）
１）固定化のための抗原化合物の調製。当該の分析物を捕捉するために適切な抗原または抗体が選択され、そしてタンパク質は固定化の前に、（１Ｍ硫酸ナトリウムおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．５）または（１Ｍクエン酸アンモニウムおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．５）のどちらかの高塩溶液に転換させられなければならない。アザラクトン親和性膜を用いた反応効率は、ｐＨが高くなるに伴って増加することがある（ｐＨ＝９まで）。しかしタンパク質は高ｐＨレベルでは不安定性であるため、７．５〜８．０のｐＨは反応性と安定性との間で最適な妥協である可能性がある。ＮＡＰ  ５、１０または２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）はサンプルを緩衝液交換するために使用される。タンパク質は、さらにまた最高の反応条件のために可能な最高濃度で維持されなければならない。
【０２６２】
２）３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ（商標）親和性９６ウェルプレートへの抗原／抗体の固定化。親和性膜は、タンパク質が添加されるまで密封容器内で直立していなければならない。代表的標的量のタンパク質は１ウェル当たり１００μｇである（だが意図された使用に基づいてこれより多量または少量を加えることができる）。１ウェル当たり必要とされる高塩タンパク質溶液の容量（工程１）は、８０μＬの最小量を用いて計算される。親和性膜を含有するパッケージが開封され、１ウェル当たり１００μｇのタンパク質が加えられる。膜は２時間にわたり３７℃でインキュベートされる。溶液の添加から初期５分間以内に、膜は目に見えて膨潤する可能性がある。
【０２６３】
３）３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ（商標）親和性膜をクエンチする。タンパク質溶液は軽度の真空（−１０ｍｍＨｇ）を用いて膜を通して吸引されなければならない。膜上の未反応アザラクトン部位をクエンチするためにはエタノールアミンを使用する。約５００μＬの３Ｍエタノールアミンを加えてｐＨを８へ調製し、真空マニホールドを用いて膜を通して吸引する。また別の５００μＬの３Ｍエタノールアミン（ｐＨ＝８）を加え、３７℃で１時間にわたり膜をインキュベートする。膜を通して真空によってエタノールアミンを吸引し、５００μＬ  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）を用いて各ウェルを洗浄する。
【０２６４】
４）非特異的結合部位のブロッキング。親和性膜の各ウェルに約１ｍＬの０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた。これを室温で１５分間にわたりインキュベートした。真空によって各ウェルを通してＢＳＡ溶液を吸引し、さらに１ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄した。これで膜の使用準備が整う。膜は、１ウェル当たりＰＢＳ中に溶解された２００μＬの０．０２％アジ化ナトリウムと一緒に４℃で被覆された溶液中に保存する。必要であれば、ウェルが乾燥するのを防止するために追加のＰＢＳを追加する。
【０２６５】
（親和性膜の使用方法）
１）３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ（商標）親和性９６−ウェル膜上の標的の捕捉。血漿中の標的タンパク質または抗体を捕捉するためには、固定化抗原／抗体を用いて調製された免疫親和性膜を使用する。溶液中の標的タンパク質／抗体は膜を用いて捕捉できるが、しかしウェルへの非特異的結合は問題となることがある。使用前に、１ｍＬ  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）を用いて各ウェルを洗浄する。標的タンパク質／抗体を含有する純粋の血漿または血清１００μＬを膜へ加える。膜を３７℃で３０分間インキュベートする。穏やかな真空（−１０ｍｍＨｇ）を用いて膜を通してサンプルを吸引する。
【０２６６】
２）捕捉された標的を洗浄／脱グリコシル化する。各ウェルは、１ｍＬ洗浄液を用いて連続して洗浄しなければならない：１回はＰＢＳを用いて、１回はＰＢＳ＋１．６％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて、そして水を用いて３回。捕捉された化合物の脱グリコシル化が所望である場合は、膜の各ウェルへ１００μＬの脱グリコシル化液を添加し、３７℃で２時間にわたり膜上でインキュベートする。膜脱グリコシル化反応に続いて１ｍＬの水を用いて各ウェルを２回洗浄する。（脱グリコシル化溶液＝１１０μＬのＮ−グリカナーゼ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ）＋８１４０μＬの水＋２７５０μＬの８０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５）。
【０２６７】
３）標的の溶出。各抗体−抗原対は、親和性に基づいて固有の溶出容積を有する。使用前に化合物のために必要な溶出容積を実験によって決定する。各ウェルに２ｍＬを加えて３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅブロッキング緩衝液を用いて２ｍＬのｓｑｕａｒｅ  ｗｅｌｌ  ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ９６ウェルプレートを処理し、プレートを３７℃で１５分間インキュベートし、水でプレートを５回すすぎ洗いし、そしてプレートを乾燥させる。これは標的の粘着を防止するためにプレートを被覆する。この被覆は、それが有機溶媒中に溶解するため、水溶液中でしか使用できない。高ｐＨ（代表的には３００〜５００μＬの０．２％  ＴＦＡ）を用いて標的を、穏やかな真空によりブロックされた９６ウェルプレート内へ溶出させる。溶出した標的は、分析の用意が整う。
【０２６８】
４）サンプルの還元。サンプル還元が必要とされる場合は、９６ウェルプレート内のサンプルへ８μＬの還元液を加える。ピペットを用いて穏やかに混合する。被覆された９６ウェルプレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートする。（還元液＝９００μＬの５  Ｍ酢酸アンモニウムおよび１００μＬの１Ｍ  ｔｒｉｓ−（２−カルボキシ−エチル）−塩酸ホスフィン（ＴＣＥＰ））。
（実施例３）
ＮＡＮＯＭＡＴＥ  ＥＳＩチップ法
抗体−薬物結合体血漿サンプルを質量分析するための自動ナノエレクトロスプレーチップ法が開発された（Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．およびＭａｎｎ，Ｅ．“Ｒａｐｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ  Ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ／ＭＳ”，５２ｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，５月２３〜２７，  ２００４）。
【０２６９】
ＮＡＮＯＭＡＴＥ  １００およびＥＳＩ  ＣＨＩＰを装備したＡＰＩ  ３０００を使用した。ＮＡＮＯＭＡＴＥ  １００機器システムは、質量分析計内へ自動ナノスプレー注入を行うために１００本の個別ノズルを含有するＥＳＩチップを利用する市販で入手可能なナノスプレーインターフェースであり、高感受性（低ＬＯＱ）、減少したサンプル消耗、自動化、およびサンプル・キャリーオーバー利得の排除とともに低く制御された流量を生じさせた。サンプルは導電性ピペットチップに通して吸引して、チップ上のノズルの背部へ送達された。ピペットに高電圧を適用し、１００ｎｌ／分のエレクトロスプレー噴流を形成した。ＮＡＮＯＭＡＴＥの設定は、サンプルピークの前に０．２分のベースライン値を提供するために５ｍＬのサンプル吸引量の後に３ｍＬのエアギャップであった。使用したガス圧は０．４ｐｓｉであり、ナノスプレーのための適用電圧は陽モードで１．６ｋＶであった。１分間の注入時間が最適のＳ／Ｎ（信号対雑音）比を有すると見いだされた。
【０２７０】
ＮＡＮＯＭＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖｉｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州イサカ）ＥＳＩチップ法を用いて、インタクトな抗体および還元された抗体各々を分離するために２種の相違する溶媒系を使用した。還元法は、還元剤としてのＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）−塩酸ホスフィン、およびアルキル化剤としてのＮ−エチルマレイミドを使用する工程を含んでいた。全サンプルは、ＮＡＰ５カラムを用いて溶媒交換した。最終組成物は、０．１％ギ酸を含む５０％アセトニトリル中の２．５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。
【０２７１】
インタクトな抗体および還元された抗体のためのイオン化条件は、酸百分率、イオン対剤濃度および有機溶媒の選択などの様々なパラメーターを調査することによって最適化した。ＤＰ電圧は、高品質データを入手する際に重要なパラメーターであった。最適化条件を用いて、様々な抗体の特性解析は炭水化物分布についての情報を明らかにした。
【０２７２】
ナノエレクトロスプレー流量（１００ｎＬ／分）によって入手した検量線は、５〜１５％の範囲内のＣＶ（％）の従来型ＬＣ／ＭＳ流量（３００μＬ／分）と比較したときに感受性における４０倍の増加を示した。本方法の線形範囲は、１分間の注入時間を用いて４００フェムトグラム（２．７アトモル）の絶対感受性で４〜３００ｐｇ／μＬであった。
（実施例４）
トラスツズマブおよびＭＣ−ＭＭＡＥの結合体化によるトラスツズマブーＭＣ−ＭＭＡＥの調製
５００ｍＭのホウ酸ナトリウムおよび５００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）中に溶解したトラスツズマブを過剰の１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で処理した。３７℃で約３０分間インキュベーションした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂に通して溶出することで緩衝液を交換し、１ｍＭ  ＤＴＰＡを含むＰＢＳを用いて溶出した。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍでの吸光度およびＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ワイオミング州ミルウォーキー）との反応によるチオール濃度からの還元された抗体濃度の決定および４１２ｎｍでの吸光度の決定によってチェックした。ＰＢＳ中に溶解した還元された抗体は氷上で冷却した。
【０２７３】
ＤＭＳＯ中に溶解した薬物リンカー試薬、マレイミドカプロイル−モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわちＭＣ−ＭＭＡＥを知られている濃度でアセトニトリルおよび水中に希釈し、ＰＢＳ中の冷却した還元された抗体トラスツズマブへ添加した。約１時間後、反応をクエンチし、任意の未反応抗体チオール基をキャッピングするために、過剰なマレイミドを加えた。反応混合物は遠心分離によって濃縮し、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＥを生成し、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂に通した溶出によって脱塩し、無菌条件下で０．２μｍフィルターに通して濾過し、貯蔵のために冷凍した。
（実施例５）
トラスツズマブおよびＭＣ−ＭＭＡＥの結合体化によるトラスツズマブーＭＣ−ＭＭＡＦの調製
トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦは、実施例４の方法にしたがってトラスツズマブおよびＭＣ−ＭＭＡＦの結合体化によって調製した。
（実施例６）
トラスツズマブおよびＭＣ−ＶＡＬ−ＣＩＴ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの結合体化によるトラスツズマブー−ＭＣ−ＶＡＬ−ＣＩＴ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの調製
トラスツズマブ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、実施例４の方法にしたがってトラスツズマブおよびＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの結合体化によって調製した。
（実施例７）
トラスツズマブおよびＭＣ−ＶＡＬ−ＣＩＴ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの結合体化によるトラスツズマブ−ＭＣ−ＶＡＬ−ＣＩＴ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの調製
トラスツズマブ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦは、（“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”，  ＵＳ  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  １０／９８３，３４０，  ｆｉｌｅｄ  Ｎｏｖ．  ５，  ２００４）および実施例４の方法にしたがってトラスツズマブおよびＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの結合体化によって調製した。
（実施例８）
ラットにおけるトラスツズマブ−ＭＣ−ＶＡＬ−ＣＩＴ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの薬物動態試験
４２匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（各７５〜８０ｇ）には、ビヒクル（第１群）、抗体−薬物結合体であるトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（第２〜６群）、または遊離薬物であるモノメチルバリンオーリスタチン、ＭＭＡＥ（第７群）を投与した。第２および３群には、８．７ＭＭＡＥ／Ｔｒの平均薬物負荷を備えるＴｒ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの調製物を投与した。第４、５および６群には、５．３ＭＭＡＥ／Ｔｒの平均薬物負荷を備えるＴｒ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの調製物を投与した。ＡＤＣの用量は、薬物成分への匹敵する曝露を送達するように、すなわち第２および４群（８４０μｇのＭＭＡＥ／ｍ２）、ならびに第３および５群（２１０５μｇのＭＭＡＥ／ｍ２）に調整した。第６群は４２０９μｇのＭＭＡＥ／ｍ２の最高用量を摂取した。
【０２７４】
【表３】
2007532882.tif 000041
投与溶液は、試験第１日に１０ｍＬ／ｋｇの容量で単回静脈内ボーラス尾静脈注射によって投与した。全投与溶液は所定濃度の１０％以内であった。動物の体重は、試験第１日の投与前およびその後は１日１回測定した。全血は、血液パラメーターおよび完全血球数のためにＥＤＴＡ含有チューブ内へ採取した。臨床化学パラメーターのために全血を血清分離装置内へ採血した。血液サンプルは、試験第４日ならびに試験第３および５日の投与前に採血した。全血サンプルはさらにリチウムヘパリン含有チューブ内へ採血し、血漿は後の分析のために−７０℃で冷凍した。
【０２７５】
第１、２、３、４、５、および７群における全動物は、試験中の５日間を通して健康であるように見えた。４０．４ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．３、システイン）が投与された第６群の動物２匹は試験第４日に死亡しているのが見いだされた。この群の残り４匹の動物は瀕死であり（不活発で、尿路生殖領域における黄色排泄物）であったため、第４日に安楽死させて剖検した。第２、４、および７群における動物には匹敵する量のＭＭＡＥ（８４０μｇ／ｍ２）を投与し、匹敵する体重変化を示した。しかし１２．５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（８．７種の薬物／抗体）が投与された第３投与群および２０．２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．３種の薬物／抗体）が投与された第５群における高用量のＭＭＡＥ（２１０５μｇ／ｍ２）が投与された動物は、第５日までに体重における有意に相違する変化を有した（ｐ＜０．０５）。
（実施例９）
ラットにおけるトラスツズマブ−ＭＣ−ＶＡＬ−ＣＩＴ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの薬物動態試験
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（各７５〜８０ｇ）には、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ（第１、２、３群）、または裸の、非結合体抗体トラスツズマブ（第４群）のＨＰＬＣ単離系を各々投与した。第１群ラットは、ＨＰＬＣ生成した、２種の薬物／Ａｂ結合体を摂取した。第１群ラットは、ＨＰＬＣ生成した、４種の薬物／Ａｂ結合体を摂取した。第１群ラットは、ＨＰＬＣ生成した、６種の薬物／Ａｂ結合体を摂取した。各ラットは、時点０に単回ボーラス注射を摂取した。
【０２７６】
【表４】
2007532882.tif 000042
血液（０．２ｍＬ）を次の時点に採血した：第１〜４群：投与の０、３分後、１、６および２４時間後、２、３、４、８、１１、１４、２１、２８日後。血漿サンプルは、実施例２の免疫親和性膜選択および逆相ＨＰＬＣ法によって分析した。薬物動態試験結果は、図３５および３６にプロットした。
（実施例１０）
カニクイザルの毒性／安全性
ラット薬物動態試験に類似して、カニクイザルをＡＤＣで処置し、その後に血漿サンプルの分析、ならびに肝酵素測定、そして様々な器官に及ぼす作用の検査および分析を実施した。肉眼的観察所見は、体重の変化ならびに病変および出血の徴候を含んでいた。臨床的病理学パラメーター（血清化学および血液学）、組織病理学、および剖検を投与された動物について実施した。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】図１は、様々なギ酸（ＦＡ）濃度およびデクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）下での、インタクトなグリコシル化抗体トラスツズマブのＱ１質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、Ｑ１スキャンからのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの軽鎖の広範囲の荷電状態にわたる標準曲線から抽出された、Ｑ１イオンの直線性を示す。
【図３】図３は、グリコシル化されたトラスツズマブのＥＳＩ−ＭＳおよびスペクトラル逆重畳を示す。
【図４】図４は、様々な濃度でのインタクトなトラスツズマブ（αＨｅｒ２）および脱グリコシル化されたインタクトなトラスツズマブの、ＥＳＩ−ＭＳによる定量のための検量線を示す。
【図５】図５は、還元されたトラスツズマブの様々な濃度での軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の、ＥＳＩ−ＭＳによる定量のための検量線を示す。
【図６】図６は、脱グリコシル化後の、抗体−リンカー結合体であるトラスツズマブ−ＳＰＰのＥＳＩ−ＭＳを示す。
【図７】図７は、図６の生データの逆重畳スペクトルを示す。
【図８】図８は、脱グリコシル化後のトラスツズマブ−ローダミン結合体の逆重畳スペクトルを示す。
【図９】図９は、定量のために使用される、図８の脱グリコシル化後のトラスツズマブ−ローダミン結合体のスペクトル逆重畳前の荷電イオン（ｍ／ｚ）を示す。
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体−薬物結合体の軽鎖についての血漿検量線を示す。ＬＯＱ＝定量の下限。
【図１１】図１１は、血漿中のモノクローナル抗体（３μｇ）の全プレート正確性および精度を示す。
【図１２】図１２は、親和性膜上で実施されたモノクローナル抗体重鎖の脱グリコシル化の作用を示す。
【図１３】図１３は、還元されたトラスツズマブ−ＳＰＰ−ＤＭ１のクロマトグラム（上）および質量スペクトル（中および下）を示す。
【図１４】図１４は、還元されたトラスツズマブ−ＳＰＰ−ＤＭ１軽鎖および重鎖の逆重畳質量スペクトルを示す。
【図１５】図１５は、（上）トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ；および全イオンクロマトグラムから抽出された個別イオン：軽鎖、ｍ／ｚ＝１６７５（上から２番目）；１ＭＭＡＥを有する軽鎖、ｍ／ｚ＝２２５１（上から３番目）；および３ＭＭＡＥを有する重鎖、ｍ／ｚ＝１８３２（下）、のクロマトグラムを示す。
【図１６】図１６は、還元されたトラスツズマブ軽鎖の血漿および溶液サンプルについてのＬＣ／ＬＣ／ＭＳ検量線を示す。
【図１７】図１７は、１ＭＭＡＥを有する還元されたトラスツズマブ軽鎖（ＬＣ＋１ＭＭＡＥ）の血漿および溶液サンプルについての、ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ検量線を示す。
【図１８】図１８は、０．１ｎｇ／ｍＬのＬＯＱを有する、ラット血漿中の遊離薬物ＭＭＡＥについての検量線を示す。
【図１９】図１９は、還元され、かつ変性したトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの（上）全イオンクロマトグラム；（中）１ＭＭＡＥを有する軽鎖の質量スペクトル；および（下）３ＭＭＡＥを有する重鎖の質量スペクトルを示す。
【図２０】図２０は、還元されたトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの逆重畳質量スペクトルを示す：（上）ＬＣ＋１ＭＭＡＥおよび（下）ＨＣ＋３ＭＭＡＥのフラグメント。
【図２１】図２１は、３種の濃度（１００ｎＭ（上）；１０００ｎＭ（中）；および２０００ｎＭ（下））の血漿溶液中のでのトラスツズマブの質量スペクトルＱ１スキャンを示す。
【図２２】図２２は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択、還元および変性によって単離されたラット血漿および溶液サンプルのクロマトグラムを示す。
【図２３】図２３は、ラット血漿中でのトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの、脱グリコシル化されて還元されたフラグメントの単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）を示す：（上）軽鎖；（中）１ＭＭＡＥを有する軽鎖；（下）３ＭＭＡＥを有する重鎖。
【図２４】図２４は、１４９ｎｇ／ｍＬのＬＯＱを有する、ラット血漿中のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの１ＭＭＡＥ薬物成分（ＬＣ＋１ＭＭＡＥ）を有する軽鎖の、２２５１ｍ／ｚイオンについての検量線を示す。
【図２５】図２５は、抗ＥｐｈＢ２Ｒ抗体−薬物結合体である２Ｈ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの２つの調製物のＬＣ分析を示す。フラグメントの指定；ＬＣ＋０、ＬＣ＋１、ＨＣ＋０、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２、ＨＣ＋３、ＨＣ＋４。上のクロマトグラムは、３．５ＭＭＡＥ／２Ｈ９である。下のクロマトグラムは、５．１ＭＭＡＥ／２Ｈ９である。
【図２６】図２６は、抗体のＭＭＡＥ分布を決定し得る、２Ｈ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの２つの調製物のＱ１  ＬＣ／ＭＳ特性解析を示す。上の質量スペクトルのＬｏｔ  Ａは、３．５ＭＭＡＥ／２Ｈ９である。下の質量スペクトルのＬｏｔ  Ｂは、５．１ＭＭＡＥ／２Ｈ９である。各種の複数ピークは、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の添加によるものであることに注意されたい。
【図２７】図２７は、ＬＣ／ＭＳ分析の前の抗体単離のための、９６ウェル、真空マニホールド、免疫親和性膜（ＩＡＭ）選択を使用するためのサンプル調製工程を示す。
【図２８】図２８は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（８．７ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）が２ｍｇＭＭＡＥ／ｋｇで投与された、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの血漿由来ＬＣ／ＭＳサンプルについてのＰＫ分析を示す。
【図２９】図２９は、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．３ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）、２ｍｇ  ＭＭＡＥ／ｋｇが投与された、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの血漿由来ＬＣ／ＭＳサンプルについてのＰＫ分析を示す。
【図３０】図３０は、ラット血漿由来の、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．３ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）のＬＣ（軽鎖）およびＨＣ（重鎖）フラグメントの、ＭＭＡＥ結合体化レベルの百分率比のプロットを示す。
【図３１】図３１は、ラット血漿由来の２種の調製物である、トラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ：８．７および５．３ＭＭＡＥ／トラスツズマブ）についての、経時的な薬物（ＭＭＡＥ）対抗体（トラスツズマブ）比の変化の比較を示す。
【図３２】図３２は、（上）０、２、４、６の薬物負荷のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの粗混合物；（上から２番目）薬物負荷６のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（中央）薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（下から２番目）薬物負荷２のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（下）トラスツズマブの疎水的相互作用クロマトグラム（ＨＩＣ  ＨＰＬＣ）を示す。
【図３３】図３３は、（上）薬物負荷２のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（中央）薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（下）薬物負荷６のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの、還元後のＬＣ／ＭＳ分析を示す。
【図３４】図３４は、（上）薬物負荷２のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（中央）薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；（下）薬物負荷６のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの、重鎖のＭＳ分析を示す。
【図３５】図３は、免疫親和性膜選択膜／ＬＣ／ＭＳによって分析されたラット血漿サンプル由来の、薬物負荷２のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；および薬物負荷６のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのクリアランスについての、経時的な薬物（ＭＭＡＦ）対抗体（トラスツズマブ）比の変化の比較を示す。
【図３６】図３６は、免疫親和性膜選択膜／ＬＣ／ＭＳによって分析されたラット血漿サンプル由来の、薬物負荷２のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；および薬物負荷６のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのクリアランスについての、経時的な薬物（ＭＭＡＦ）対ＬＣ（軽鎖）および薬物（ＭＭＡＦ）対ＨＣ（重鎖）比の変化の比較を示す。
【図３７】図３７は、平均薬物負荷値５．３のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥラット血漿サンプル；および薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦについて、経時的な薬物（ＭＭＡＥ）対ＬＣ（軽鎖）および薬物（ＭＭＡＥ）対ＨＣ（重鎖）比の変化の比較を示す。
【図３８】図３８は、平均薬物負荷値５．３のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥラット血漿サンプル；および薬物負荷４のトラスツズマブ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのＨＣ（重鎖）からの薬物消失およびＬＣ（軽鎖）からの薬物（ＭＭＡＥ）消失の相対比率を示す。
【図３９】図３９は、抗体に対する１当量、５当量、８当量、１２当量、および２０当量のモル過剰のＴＡＭＲＡ−ＮＨＳで、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）のＮＨＳエステルの抗体２Ｈ７に対する５回の結合体化反応のＬＣ分析を示す。
【図４０】図４０は、４Ｄ５  Ｆａｂ（左上）、４Ｄ５還元（左下）、４Ｄ５  Ｆａｂ−ＤＭ１（右上）、および４Ｄ５  Ｆａｂ−ＤＭ１還元（右下）の計数毎秒（ｃｐｓ）対原子質量単位（ａｍｕ）での強度をプロットした、逆重畳質量分析を示す。
【図４１】図４１は、カニクイザルのインビボ血漿サンプル由来の抗オーリスタチン抗体親和性膜上に捕捉された、８１７７．９ａｍｕの質量を備えるトラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの代謝産物の計数毎秒（ｃｐｓ）対原子質量単位（ａｍｕ）での強度をプロットした質量分析を示す。
【図４２】図４２は、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの投与１２０時間後までの複数の時点において採取された、カニクイザルからのインビボ血漿サンプル由来の抗オーリスタチン抗体親和性膜上に捕捉された８１７８質量単位（＋１６３６ｍ／ｚの５イオン）の代謝産物のピーク面積を示す。
【図４３】図４３は、カニクイザルへのトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与後に複数の時点（時間）において採取された血漿サンプル由来の質量分析法によって検出された軽鎖フラグメントのプロットを示す。軽鎖フラグメントは、その質量によって０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したと特性解析され、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総軽鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【図４４】図４４は、インキュベーション時点（時間）での、質量分析法によって検出された緩衝液中のトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のサンプルから軽鎖フラグメントのプロットを示した図である。軽鎖フラグメントは、その質量によって０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したと特性解析され、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総軽鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【図４５】図４５は、カニクイザルへのトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与後に質量分析法によって検出された、複数の時点（時間）で採取された血漿サンプル由来の重鎖フラグメントのプロットを示す。重鎖フラグメントは、その質量によって０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したと特性解析され、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総重鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【図４６】図４６は、インキュベーション時点（時間）での、質量分析法によって検出された緩衝液中のトラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のサンプルから重鎖フラグメントのプロットを示した図である。重鎖フラグメントは、その質量によって０、１、および２つのＤＭ１薬物成分へ結合体したと特性解析され、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１からの総重鎖フラグメントに対する百分率比が指定されている。
【図４７】図４７は、（上の線）抗体薬物結合体、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの緩衝液サンプル；および（下の線）７０時間までの複数の時点に、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの投与後のカニクイザルから採取された血漿サンプル内の薬物成分に結合体したままである抗体のプロットを示す。薬物成分に結合体した抗体の分画は、ＬＣ／ＭＳ法（実線）および二重ＥＬＩＳＡ試験（点線）によって測定された。
【図４８】図４８は、ＬＣ／ＭＳ（点線）およびＥＬＩＳＡ試験（実線）によって６０時間までの時点に、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦの投与後のカニクイザルから採取された血漿サンプル中のＦａｂ抗体薬物結合体、４Ｄ５  Ｆａｂ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのμｇ／ｍＬでの定量のプロット図を示す。
【図１】
2007532882.tif 000047
【図２】
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【図３】
2007532882.tif 000049
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【国際調査報告】
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