(57)【要約】  酵母における組換タンパク質の生成に関する方法および組成物を提供する。１つ以上の突然変異をプロモーターのプリブノー・ボックス様配列に挿入することができる改変ＰLAC4が記載されている。改変プロモーターはベクターの標的遺伝子の上流に配置されると形質転換された細菌における標的遺伝子の発現を顕著に低減するが、酵母における標的遺伝子の効率的発現を生じる。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞内に組換タンパク質を生成する方法であって、
（ａ）目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入されたベクターであって、さらに、細菌内にクローニングされた際に遺伝子の発現が顕著に減少するように改変された改変ＰLAC4を含むベクターを得ること、
（ｂ）酵母細胞を前記ベクターで形質転換すること、
（ｃ）前記酵母細胞中に有効量の前記組換えタンパク質を生成すること
を含む方法。
【請求項２】
前記酵母細胞はクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）酵母細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記改変ＰLAC4は１つ以上のプリブノー・ボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ  ｂｏｘ）様配列に突然変異を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のプリブノー・ボックス様配列はＰＢＩ、ＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異は２つ以上のプリブノー・ボックス様配列に存在することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記改変ＰLAC4はヌクレオチド−１９８〜−２１２に対応する前記プロモーターの第１の領域に１つ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記改変ＰLAC4はヌクレオチド−１３３〜−１４６に対応する前記プロモーターの第２の領域に１つ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記改変ＰLAC4は前記プロモーターの第１の領域および第２の領域に１つ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変ＰLAC4のヌクレオチド−１〜−２８３はサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのホスホグリセレート・キナーゼプロモーターのヌクレオチド−１〜−２８３により置換されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換された酵母細胞内の前記ベクターはエピソーム・プラスミドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換された酵母細胞内の前記ベクターは統合性プラスミドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターは酵母分泌シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターは選択性マーカーをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質転換された酵母細胞の少なくとも５０％が組換タンパク質を発現することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
改変ＰLAC4プロモーターを含むＤＮＡベクター。
【請求項１７】
さらにクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）α−接合因子を含むことを特徴とする請求項１６に記載のＤＮＡベクター。
【請求項１８】
さらにアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ選択性マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項１６に記載のＤＮＡベクター。
【請求項１９】
さらに組換タンパク質をコードする遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を含むことを特徴とする請求項１６に記載のＤＮＡベクター。
【請求項２０】
さらにＰLAC4ターミネーターを含むことを特徴とする請求項１６に記載のＤＮＡベクター。
【請求項２１】
請求項１６に記載の前記ベクターを含む宿主酵母細胞。
【請求項２２】
請求項１６に記載の前記ベクターを含み宿主細菌細胞。
【請求項２３】
請求項１６に記載のベクター、任意にコンピテント酵母細胞、および使用指示を含むキット。
【請求項２４】
ＴＴＡＴＣＡＴＴＧＴ（配列番号２２）がＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡ（配列番号２３）に改変され、かつＴＡＴＴＡＴＴＣＴがＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧに改変された改変ＰLAC4プリブノー・ボックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌転写能を実質的に欠如したクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）におけるクルイベロマイセス・ラクチス−プロモーター変異株の構築および使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ここ１０年ほどの間に、出芽酵母クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（以下、Ｋ．ｌａｃｔｉｓという）は食品および飼料産業において組換タンパク質の工業規模生産に広く使用されているが、その理由としては、（ｉ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓの多くの株が急速にそして培養物中に非常に高い細胞密度に成長すること、（ｉｉ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓはタンパク質を培地中に効率よく分泌されるようにすること、および（ｉｉｉ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓは食品、農業および健康関連用途にその使用が許可されるＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ；一般に安全であるとされている）ＦＤＡ地位を有すること挙げられる。
【０００３】
典型的なＫ．ｌａｃｔｉｓ異種タンパク質製造戦略は、所望のタンパク質が細胞から分泌されて成長培地内に入るようにすることを含む。この方法論は細胞発現方法に対して多くの利点を有する。すなわち、（ｉ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓは比較的少数の内生タンパク質しか分泌しないのでタンパク質はかなり純粋な状態で産生され、（ｉｉ）分泌された真核タンパク質のみに見られる翻訳後のタンパク質の修飾が得られ、かつ（ｉｉｉ）連続的に成長している細胞の培地からタンパク質を収集する戦略を考案することができる。
【０００４】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける高レベルの転写を指令するのに適した強力なプロモーターはＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＬＡＣ４プロモーター（ＰLAC4）（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３参照）。このプロモーターは高度に発現されたラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）をコードするＬＡＣ４遺伝子の発現を天然に促進する。ＬＡＣ４の転写は、ラクターゼにより細胞がラクトースを発酵性の糖に変化させることが可能な成長培地にラクトースまたはガラクトースが存在することに応答して、増加する。ＰLAC4からの異種タンパク質の発現は、酵母発酵では１００ｍｇＬ-1を越えるレベルの分泌組換タンパク質を達成することがある。
【０００５】
残念なことに、Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおいて強力なプロモーターとして機能する能力に加えて、ＰLAC4は構成的に大腸菌における遺伝子発現を促進する。このことは、酵母に導入する前に、大腸菌に有毒なタンパク質をコードする遺伝子を保持するＤＮＡ構築物を組み立てようとするときに特に問題となり得る。この問題を解決するための一つのアプローチがギッブズ他（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．）（非特許文献４）に記載されており、ギッブズ他はシャトルベクターに酵母インストロンを使用している。
【０００６】
【非特許文献１】ディクソン他著  「細胞」第１５巻第１２３−１３０頁、１９７８年［Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５：１２３−１３０（１９７８）］
【非特許文献２】ディクソン、アール．シー．およびエム．アイ．ライリー著  「バイオテクノロジー」第１３巻、第１９−４０頁、１９８９年［Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｉ．Ｒｉｌｅｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１９−４０（１９８９）］
【非特許文献３】ディクソン他著  「分子細胞生物学」第１巻第１０４８−１０５６頁（１９８１年）［Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １５：１２３−１３０（１９７８）］
【非特許文献４】ギッブズ他著  「フェムス・イースト・リサーチ」第４巻第５７３−５７７頁（２００４年）［Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：５７３−５７７（２００４）］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、大腸菌転写能を実質的に欠如したクルイベロマイセス・ラクチスにおけるクルイベロマイセス・ラクチス−プロモーター変異株の構築および使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態では、酵母細胞において組換タンパク質を産生する方法であって、目的タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌に例示される細菌における遺伝子の発現が顕著に減少するように改変されたＰLAC4とともに挿入されたベクターを得る工程と、Ｋ．ｌａｃｔｉｓに例示される酵母細胞を前記ベクターで形質転換する工程と、前記酵母細胞中に有効量の組換えタンパク質を生成する工程を含む方法が提供される。ある実施形態では、少なくとも５０％、さらには少なくとも７０％、さらには少なくとも９０％の形質転換酵母細胞が組換えタンパク質を発現する。本発明の一実施形態では、酵母中に生成された有効量の組換えタンパク質は未改変ＰLAC4プロモーターの制御下で組換遺伝子からのタンパク質の量とほぼ同様である。
【０００９】
上記方法における改変ＰLAC4は任意に１つ以上のプリブノー・ボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ  ｂｏｘ）様配列、例えばＰＢＩ、ＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩ、さらに詳しくはヌクレオチド−１９８〜−２１２に対応するプロモーターの第１の領域に、またはヌクレオチド−１３３〜−１４６に対応するプロモーターの第２の領域に突然変異を含むものであってもよい。ある実施形態では、改変ＰLAC4は前記第１の領域および第２の領域の双方に１つ以上の突然変異を含む。本発明のさらなる実施形態では、改変ＰLAC4のヌクレオチド−１〜−２８３はサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ１）のヌクレオチド−１〜−２８３により置換されている。
【００１０】
ベクターは形質転換酵母細胞ではエピソーム・プラスミドまたは相互作用プラスミドであってもよい。ベクターは改変ＰLAC4プロモーターと任意にＰLAC4ターミネーターとを含む。さらに、ベクターは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  α−接合因子（Ｋｌ  α−ＭＦ）のような酵母分泌シグナル・ペプチド、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）選択可能マーカー遺伝子のような選択可能遺伝子、または組換タンパク質をコードする遺伝子挿入用多重クローニング部位の少なくとも１つをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。
【００１１】
上記ベクターを用いて形質転換された細胞は宿主酵母細胞および／または宿主細菌細胞を含んでいてもよい。
【００１２】
本発明の一実施形態では、上記のようなベクターを含み、かつ任意にコンピテント酵母細胞を含むキットに指示書を付したものが提供される。
【００１３】
本発明の一実施形態は、ＴＴＡＴＣＡＴＴＧＴ（配列番号２２）がＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡ（配列番号２３）に改変され、および／またはＴＡＴＴＡＴＴＣＴがＧＡＧＡＧＣＴＣＴに改変された改変ＰLAC4プリブノー・ボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ  ｂｏｘ）を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
機能的シャトルベクターは酵母細胞に導入して発現される前に細菌内でクローニングされた遺伝子を生成することを可能にする。しかしながら、強い酵母発現系ＰLAC4を用いる酵母発現系は、大腸菌のような細菌宿主細胞においてＰLAC4の制御下にある遺伝子からタンパク質が予期せず発現されることにより悪影響をうけることがある。このプロモーター活性は、その翻訳生成物が細菌に対して有害である可能性がる遺伝子のクローニング効率を阻害することがある。
【００１５】
ＰLAC4の２つのヌクレオチド配列は細菌のプリブノー・ボックス転写要素コンセンサス配列、ＴＡＴＡＡＴに非常によく似ている。これらの配列は転写が開始する部位から約１０ヌクレオチド上流に位置し、大腸菌における主および副転写開始部位に隣接しそれらの上流にある（上記非特許文献２参照）。特に、これらの配列は主転写物については−２０４〜−２０９に位置し、副転写物については−１４４〜−１３６に位置する（図２のＡの四角で囲った配列参照）。
【００１６】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＰLAC4の大腸菌における発現と関連した２つのＲＮＡ転写物の開始部位が既に、天然のＬＡＣ４遺伝子のＡＴＧ開始コドンのアデニン・ヌクレオチドに対して−１９６ｂｐ（主大腸菌転写物の開始）と−１２７ｂｐ（副大腸菌転写物の開始）にマッピングされている（上記非特許文献２参照）。
【００１７】
突然変異プリブノー・ボックス様配列を持つＰLAC4変異体は、部位特異的な変異誘発により形成することができ、この部位特異的な配列はそれらがＫ．ｌａｃｔｉｓ内で未改変プリブノー・ボックス様配列の能力と同じ程度に強いプロモーターとして機能する能力を実質的に保持する。改変プリブノー・ボックス様配列を有するＰLAC4変異体は、クルイベロマイセス属株だけでなく、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）株、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）株、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）株、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）株、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）株、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）株、マグナポース属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ）株およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株から選ばれた他の酵母株において強いプロモーター活性を保持していてもよい。ＤＮＡ配列はプロモーターの強度の決定要因であるという当技術における知識に基づいて、ある突然変異体が同様の条件下で野生型ＰLAC4を用いるよりも多量のタンパク質を生成することが期待される。突然変異はここではＤＮＡ配列における１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または追加のいずれかを意味するものとする。
【００１８】
本発明の一実施形態では、真菌における発現宿主は酵母Ｋ．ｌａｃｔｉｓであり、細菌宿主は大腸菌であり、一連のＰLAC4変異体が、細菌プロモーターの大腸菌プリブノー・ボックス要素に類似し、かつＰLAC4と関連する２つの大腸菌転写開始部位の直ぐ上流に存在する、３つのＤＮＡ配列（ＰＢＩ、ＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩ）の標的変異誘発により形成された。実施例では、ＰLAC4の突然変異は（ａ）プロモーターの−１９８〜−２１２の領域（図２のＢ）、例えば−２０１、−２０３、−２０４、−２０７、−２０９および−２１０の位置であり、これらの突然変異はプロモーターがＫ．ｌａｃｔｉｓにおいて強いプロモーターとして機能する能力を実質的に阻害せず、（ｂ）プロモーターの−１３３〜−１４６の領域、例えば−１３９、−１４０、−１４１、−１４２および−１４４の位置であり、これらの位置は強いプロモーターの能力を実質的に阻害せず、または（ｃ）−１９８〜−２１２および−１３３〜−１４６の領域である。さらなる実施形態では、ハイブリッド・プロモーターが形成され、このものはサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓｃ）ＰＧＫＩプロモーターの２８３ｂｐ（−１〜−２８３）からなり、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＰLAC4の−１〜−２８３領域（図２のＢ）を置換えたものである。
【００１９】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、そしてより一般的には酵母におけるタンパク質の過剰発現は、酵母宿主に導入した際に所望の遺伝子の高レベル転写を指令するのに適した配列を持つＤＮＡフラグメントを含有するシャトルベクターを構築することを含む。このベクターは下記（ｉ）〜（Ｖ）、すなわち、（ｉ）強い酵母プロモーター、（ｉｉ）分泌リーダー配列をコードするＤＮＡ（培地へのタンパク質の分泌を望む場合）、（ｉｉｉ）発現すべきタンパク質をコードする遺伝子、（ｉｖ）転写ターミネーター配列、および（ｖ）酵母選択性マーカー遺伝子のうちの少なくとも１つを含有していることが必要である。これらの配列成分は典型的には大腸菌のプラスミド・ベクター内に組み立てた後、酵母細胞に移転してタンパク質の生成を行う。
【００２０】
ＰLAC4は統合的プラスミドまたはエピソーム・プラスミド、例えばｐＫＤ１−系ベクター、２ミクロン−含有ベクターおよび動原体ベクター上に存在するときに酵母においてタンパク質発現のための強いプロモーターとして機能することができる。分泌リーダー配列（培地へのタンパク質の分泌を望む場合）はＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローニングされたＳｃα−ＭＦプレプロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）分泌リーダー・ペプチドを含んでいてもよい。他の原核または真核分泌シグナル・ペプチド（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子プレプロ分泌シグナル・ペプチド、Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー・トクシン・シグナル・ペプチド）または合成分泌シグナル・ペプチドも使用することができる。あるいはまた、分泌リーダーをベクター全体から省いて所望のタンパク質の細部発現を達成することができる。
【００２１】
転写ターミネーター配列の一例はＴＴLAC4である。
【００２２】
酵母選択性マーカー遺伝子は、例えば、Ｇ４１８またはａｍｄＳ遺伝子であってもよい。形質転換酵母細胞におけるアセトアミダーゼの発現により単純窒素源を欠いているがアセトアミドを含有する培地で形質転換酵母細胞が成長することが可能になる。アセトアミダーゼはアセトアミドを分解してアンモニアにし、このアンモニアが窒素源として細胞に利用可能になる。この選択方法の利点は、ｐＫＬＡＣ１系発現ベクターを複数個直列に統合して導入し単一統合よりも多くの組換タンパク質を生成する細胞に対する形質転換体の個体数を増加させることである（図５）。
【００２３】
上記の突然変異体ＰLAC4は大腸菌／Ｋ．ｌａｃｔｉｓ統合シャトルベクター、例えば図１および図４に示すｐＧＢＮ１およびｐＫＬＡＣ１に統合されており、コンピテント宿主細胞の形質転換後にＫ．ｌａｃｔｉｓのゲノムに統合され、その後タンパク質の発現を指令する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｋ．ｌａｃｔｉｓをｐＫＬＡＣ１系構築物で形質転換した後にアセトアミド・プレート上に生じる形質転換体の少なくとも５０％、さらに詳しくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％が異種タンパク質、例えばＨＳＡまたは大腸菌マルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）、毒性プロテアーゼ・エンテロキナーゼ、マウス・トランスサイレチン、海容生物由来の毒性膠タンパク質および細菌セルラーゼを発現する。これらの例は本発明を限定するものではない。このシステムは改変ＰLAC4の下流に配置された任意のタンパク質コード遺伝子に対して有用である。
【００２５】
ＰLAC4およびその突然変異体の下でのタンパク質の発現レベルをいくつかの異なるタンパク質について決定した。例えば、ＰＢＩの突然変異はリポーター・タンパク質（ＧＦＰ）の細菌における発現を〜８７％低下したが、ＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩの突然変異は細菌宿主細胞におけるＧＦＰ発現にほとんど影響しなかった。３つの配列のすべてを欠失させると、細菌宿主細胞におけるＧＦＰ発現が完全に消失した。ＨＳＡについては、実施例と図３のＢから、野生型または突然変異体ＰLAC4から発現されたときに、約５０ｍｇＬ-1のＨＳＡがＫ．ｌａｃｔｉｓにより分泌されたことが分かる。
【００２６】
上記および下記の引用文献および米国仮出願第６０／５６０，４１８号明細書（２００４年４月８日出願）は本明細書において引用されることによりそれらの内容が本発明の一部を構成するものである。
【実施例】
【００２７】
酵母株、形質転換および培養条件
原栄養菌株Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＧＧ７９９株（ＭＡＴα［ｐＧＫ１１＋］）を常法によりＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）に３０℃で成長し、維持した。ＧＧ７９９細胞の形質転換前に、関心のある遺伝子を含有するｐＧＢＮ１系またはｐＫＬＡＣ１系発現ベクターの１μｇをＳａｃＩＩ消化により線状化した。線状化発現ベクターを市販のコンピテントＫ．ｌａｃｔｉｓＧＧ７９９細胞［ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー市、マサチュセッツ州）］の統合的形質転換（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に供給元の指示に従って用いた。ｐＧＢＮ１、ｐＧＢＮ１PGK1、ｐＧＢＮ１Hyb、ｐＧＢＮ１PBI、またはｐＧＢＮ１PBII-PBIIIベクターで形質転換した細胞のコロニーを２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社、セントルイス市、ミズーリー州）を含有するＹＰＤ寒天プレート上で３０℃で２〜３日間成長させることにより選択した。ｐＫＬＡＣ１系ベクターで形質転換した細胞のコロニーは酵母カーボン・ベース［ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー市、マサチュセッツ州）］１．１７％、５ｍＭアセトアミド［ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー市、マサチュセッツ州）］および３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨを含有する寒天プレート上で３０℃で４〜５日間成長させることにより選択した。異種遺伝子を発現するＫ．ｌａｃｔｉｓ株はガラクトース２％を含有するＹＰ培地（ＹＰＧａｌ）中で３０℃で４８〜９６時間培養した。
【００２８】
ポリメラーゼ連鎖反応
本発明で用いるプライマーを表１に示す。ＰＣＲによる増幅を高信頼度ディープ・ベント［Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）］ＤＮＡポリメラーゼ［ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー市、マサチュセッツ州）］を用いて行った。典型的なＰＣＲ混合物は０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（各種）、各プライマー０．５μｇ、１×サーモプール緩衝液［ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー市、マサチュセッツ州）］およびテンプレートＤＮＡ１００ｎｇを全反応液１００μｌに含有するものであった。熱サイクルは典型的には、「ホット・スタート」９５℃５分間と、９４℃３０秒、５８℃３０秒および７２℃（ＤＮＡのｋｂ当り１分間）の連続インキュベーションを３０サイクルとからなる。熱サイクル後、最終発現を７２℃で１０分間行った。
【００２９】
ｐＧＢＮ１におけるＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＰLAC4変異体の構築
プロモーター変異体はすべて統合的発現ベクターｐＧＢＮ１に存在する野生型ＰLAC4、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ／大腸菌シャトル・ベクターに由来し、このベクターは２３１７ｂｐのＰLAC4  ＤＮＡを含有し、このＤＮＡはｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡにより１６６３ｂｐフラグメントと６５４ｂｐフラグメントに分離されている（図１）。この分離はＳａｃＩＩにより認識される独自の制限部位において起きる。２８３０ｂｐのＵＣ１９ベクターＤＮＡがこの独自の制限部位に挿入されている。これにより、上記発現ベクターがＳａｃＩＩまたはＢｓｔＸＩを用いた消化および酵母細胞への導入の後にＫ．ｌａｃｔｉｓ染色体の天然ＬＡＣ４遺伝子座に統合することが可能になる。加えて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ染色体のＬＡＣ４以外の遺伝子座へのベクターの統合を指令するＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＤＮＡをベクター挿入することができる。ｐＵＣ１９  ＤＮＡ配列の代わりに、細菌の複製原点と選択性マーカー遺伝子を含有する任意のＤＮＡを用いることができる。野生型ＰLAC4配列またはｐＧＢＮ１にクローニングされた任意のＰLAC4突然変異体あるいはハイブリッドの位置は分泌リーダー配列のためのコード領域のすぐ上流である。
【００３０】
加えて、ｐＧＢＮ１はＰLAC4のすぐ下流のＳｃα−ＭＦプレプロドメインをコードするＤＮＡを含有して異種発現タンパク質の分泌を指令する。最後に、ｐＧＢＮ１はＰADH1から発現されたゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）耐性遺伝子を担持し、酵母中で優勢的に選択される。ｐＧＢＮ１PGK1プラスミドを形成するには、４８８塩基対のサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＧＫ１プロモーターを含有するＰｍｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをクローニングしてｐＧＢＮ１プラスミドのＨｐａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入して天然ＰLAC4の１０６７塩基対を置換した（図２のＢ）。プライマーＰ１とプライマーＰ２を用いてサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＧＫ１プロモーターの２８３塩基対をｐＧＢＮ１PGK1プラスミドをテンプレートとして用いて増幅した。この２８３ｂｐフラグメントをクローニングしてｐＧＢＮ１プラスミドのＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入してｐＧＢＮ１Hybプラスミドを生成した。プライマーＰ３を図２のＢに詳細を示すように、大腸菌主転写開始部位の上流に存在する推定プリブノー・ボックス様配列（ＰＢＩ）に突然変異を導入するように設計した。プライマーＰ２およびＰ３を用いてＰＢＩに突然変異を含むＰLAC4フラグメントをｐＧＢＮ１プラスミドをテンプレートとして用いて増幅した。この最初のＰＣＲからの増幅されたＤＮＡを、プライマーＰ２およびＰ４をテンプレートとして用いる第２のＰＣＲ用にテンプレートとして用いた。最終ＤＮＡ生成物をクローニングしてｐＧＢＮ１プラスミドのＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入してｐＧＢＮ１PBIプラスミドを生成した。ＰＣＲ接合法を用いて大腸菌副転写開始部位の上流に存在するＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩ配列（図２のＢ）を相補プライマーＰ５およびＰ６を用いて突然変異させた。プライマーＰ２およびＰ５並びにプライマーＰ４およびＰ６を用いて５８６ｂｐおよび１６０ｂｐの突然変異ＰLAC4ＤＮＡフラグメントをそれぞれ増幅した。各増幅ＤＮＡ生成物をキアクイック［ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）］ＰＣＲ精製スピン・カラム・クロマトグラフィー［キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社、米国カリフォルニア州バレンシア市］により精製し、プライマーＰ２およびＰ４含有する第２の増幅反応においてテンプレートとして結合した。突然変異を起こしたＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩ部位を含有する増幅ＰLAC4ＤＮＡフラグメントをクローニングしてｐＧＢＮ１プラスミドのＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入してｐＧＢＮ１PBII-PBIIIプラスミドを生成した。
【００３１】
増幅ＰLAC4におけるプリブノー・ボックス様配列の標的変異誘発
一連の４種類のＰLAC4変異体を生成してＰLAC4の大腸菌プロモーター活性を図２のＢに示すようにＰＢＩおよびＰＢＩＩ／ＰＢＩＩＩにおける点突然変異を置換または導入することにより除去した。
（ｉ）ｐＧＢＮ１PGK1ベクターは１０６７ｂｐの天然ＰLAC4の代わりに４８５ｂｐのサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＧＫ１プロモーター（ＰPGK1）を導入し、それによりガラクトース−応答性上流活性化配列（ＵＡＳＩおよびＵＡＳＩＩ）と３種のプリブノー・ボックス様配列のすべてをともに除去する。
（ｉｉ）ｐＧＢＮ１HybベクターはＰLAC4の３´末端を含む２８３ｂｐの代わりにＰＰPGK1の３´末端からの２８３ｂｐを導入し、その結果３種類のプリブノー・ボックス様配列のすべてが欠失したが、両ＵＡＳ配列は無傷のまま残った。
（ｉｉｉ）ｐＧＢＮ１PBIベクターは、ＰLAC4のヌクレオチド−２０４と−２０９の間のＰＢＩのプロブノー・コンセンサス配列を除去する６点突然変異を含む。
（ｉｖ）ｐＧＢＮ１PBII-PBIIIベクターは、ＰLAC4のヌクレオチド−１３６と−１４４の間のＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩのプロブノー・コンセンサス配列を除去する５点突然変異を含む。
【００３２】
大腸菌におけるＧＦＰのクローニングおよび発現解析
ＧＦＰをｐＧＦＰｕｖプラスミド［クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社、米国カリフォルニア州パロ・アルト市］をテンプレートとして用い、プライマーＰ７およびＰ８でＰＣＲ増幅した。増幅されたＧＦＰをイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で種々のｐＧＢＮベクター（前節参照）のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ部位のα−ＭＦプレプロ・ドメインを用いてクローニングした。種々のｐＧＢＮ−ＧＦＰ構築物を含む細菌の溶解産物を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地において３０℃で一夜成長させた培養物５０ｍｌから調製した。培養物を遠心分離し、細胞ペレットをドライアイスで凍結し、室温で融解し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）１０μｌ中に再懸濁した。細胞をソニケーター［Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（登録商標）］［ヒート・システムズ−ウルトラソニクス（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）社、米国ニューヨーク州プレインビュー市］で段階７で１５秒間破砕し、細胞残滓（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｆｉｓ）を１５、０００×ｇで１０分間遠心分離することにより除去した。各溶解産物のタンパク質濃度をその２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより決定した。各様海産物中のタンパク質（１００μｇ）をＴｒｉｓ−グリシン  １０〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および５％脱脂ミルク（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）中で４℃で一夜ブロックした。５％脱脂ミルクを含有するＰＢＳ−Ｔに１：１０００希釈した抗ＧＦＰモノクローナル抗体［クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社、米国カリフォルニア州パロ・アルト市］を用いてブロットをプローブした後、５％脱脂ミルク（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）に１：２０００に希釈した西洋わさびオキシダーゼ結合抗マウス第２抗体（ＫＰＬ社、米国ミヅーリー州ゲイザーズバーグ市）とともにインキュベーションした。タンパク質−抗体複合体をルミグロ（ＬｕｍｉＧｌｏ）検出試薬［セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国マサチュセッツ州ビバリー市］を用いて検出した。大腸菌内で生成されたＧＦＰの量をモレキュラー・イメージャー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｅｒｆ）ＦＸ［バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ市］およびクウォンティティ・ワン（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ）ソフトウェアを用いて写真濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）により測定した。
【００３３】
各ｐＧＢＮベクターのサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α接合因子プレプロ・ドメインでイン・フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）クローニングしたＧＦＰをコードするリポーター遺伝子の大腸菌発現を駆動する能力について各ＰLAC4変異体を試験した。大腸菌溶解産物中の各ＰLAC4変異体から生成されたＧＦＰの存在をウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析により分析した。突然変異によりＰＢＩ配列が除去されると、野生型ＰLAC4（図３のＡ、レーン２）により生成されるＧＦＰに対して写真濃度測定により測定されるように、ＧＦＰ発現が８７％低下した（図３のＡ、レーン５）。しかしながら、ＰＢＩＩとＰＢＩＩＩ配列の双方を突然変異すると（図３のＡ、レーン６）、ＧＦＰの下方制御は検出できなかった。ＰLAC4からの３つのプリブノー・ボックス様配列の全てをＰPGK1ＤＮＡで置換すると（図３のＡ、レーン３および４）、検出可能なＧＦＰ発現が完全に失われる。これらの結果は、大腸菌におけるＰLAC4発現の大半がＰＢＩ配列の存在に依存していることを示している。
【００３４】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるエンテロキナーゼおよびＨＳＡのクローニングと発現
プライマーＰ９およびＰ１０を用いてＨＳＡをコードする遺伝子を増幅し、次いでこれを種々のｐＧＢＮベクターのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位のα−ＭＦ配列デイン・フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でクローニングした。プライマー９はＨＳＡオープン・リーディング・フレームのすぐ上流のＫ．ｌａｃｔｉｓ  Ｋｅｘ１プロテアーゼ切断部位（ＫＲ↓）をコードしてゴルジ内のタンパク質の正確な処理を確実にするように設計されている。統合されたｐＧＢＮ−ＨＳＡ  ＤＮＡを含有するＫ．ｌａｃｔｉｓ株をＹＰＧａｌの２ｍｌ培養物中で３０℃で４８時間成長させた。ＨＳＡの分泌レベルを１５μｌの使用済み培地を１０〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル上で分離し、次いでクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色することにより視覚的に評価した。ＥＫLをコードするＤＮＡフラグメントをプライマーＰ１１およびＰ１２でＰＣＲＦ増幅し、クローニングしてＰＬＡＣ４変異体を含有する種々のｐＧＢＮベクターのＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ制限部位に、またはｐＫＬＡＣ１ベクター（下記参照）に導入した。種々のｐＧＢＮ−ＥＫLまたはｐＫＬＡＣ１−ＥＫLベクター中のＥＫLのＤＮＡ配列をヌクレオチド配列決定により確認した。統合されたｐＫＬＡＣ１−ＥＫL構築物を含有するＫ．ｌａｃｔｉｓ株によるエンテロキナーゼの分泌の評価を、細胞をＹＰＧａｌ  ２ｍｌ中で３０℃で４８時間成長し、使用済み培地のエンテロキナーゼ活性下記のように測定することによって行った。
【００３５】
エンテロキナーゼ活性の測定
ｐＫＬＡＣ１−ＥＫLを統合したＫ．ｌａｃｔｉｓの飽和培養物１ｍｌを１５、８００×ｇで１分間ミクロ遠心することにより使用済み培地を分離して細胞を除去した。エンテロキナーゼ活性を、蛍光性ペプチド基質ＧＤＤＤＤＫ−β−ナフチルアミド［ベイチャム（Ｂａｃｈｅｍ）社、米国ペンシルバニア州プラッシア市］を用いて測定した。使用済み培地（５０μｌ）をエンテロキナーゼ測定緩衝液（０．８８ｍＭ  ＧＤ４Ｋ−β−ナフチルアミド、ジメチルスルホキシド１７．６％を含有する１２４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８．０）５０μｌと混合し、蛍光強度（励起３３７ｎｍ、発光４２０ｎｍ）を経時的に測定した。精製エンテロキナーゼ［ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュセッツ州ビバリー市］の測定量と関連する酵素活性の量の、使用済みＫ．ｌａｃｔｉｓ培地中に存在する活性に対する比較を用いてＫ．ｌａｃｔｉｓ株により分泌された活性エンテロキナーゼの量を評価した。ＹＰＧａｌ培地がエンテロキナーゼ測定に対して有する軽い阻害的効果を補償するために、精製エンテロキナーゼを先ず未トランスフェクションＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞の培養物からの使用済み培地に希釈してからエンテロキナーゼ活性を上記のように測定する。
【００３６】
ＰLAC4の変異体はＫ．ｌａｃｔｉｓにおいて完全なプロモーター活性を保持
ＰLAC4の変異体がＫ．ｌａｃｔｉｓにおいて異種遺伝子の発現を指令することが可能であるか否かを試験紙、ＨＳＡをコードする遺伝子をクローニングしてｐＧＢＮベクターのそれぞれに導入し、ＨＳＡをその高発現および野生型ＰLAC4のから発現されたときのＫ．ｌａｃｔｉｓからの効率的分泌によりリポーター・タンパク質として選択した（フリア他、バイオ・テクノロジー第９巻第９６８〜９７５行（１９９１年）（Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９：９６８−９７５（１９９１））。統合されたｐＧＢＮ１−ＨＳＡ発現ベクターのそれぞれを含有するＫ．ｌａｃｔｉｓ株をＹＰＧａｌ培地で飽和するまで成長し、使用済み培地に分泌されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色により検出した。ＨＳＡは６６ｋＤａバンドとして移動し、このバンドは未濃縮使用済み培地において容易に検出可能であり、その同一性を抗ＨＳＡ抗体を用いるウェスタン・ブロッティングにより確認した。統合されたｐＧＢＮ１PBI−ＨＳＡ、ｐＧＢＮ１Hyb−ＨＳＡおよびｐＧＢＮ１PBII-PBII−ＨＳＡベクターを含有するＫ．ｌａｃｔｉｓ株は、ＨＳＡが野生型ＰLAC4から発現されるｐＧＢＮ１−ＨＳＡを保持する対照株に匹敵する量でＨＳＡを分泌した（図３のＢ、レーン２）。これらのデータは、ＰLAC4のＰＢＩ、ＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩ配列の突然変異または欠失がプロモーターがＫ．ｌａｃｔｉｓ内で機能する能力を顕著に変更しないことを示している。ｐＧＢＮ１PGK1−ＨＳＡを保持する細胞（図３のＢ、レーン３）からは野生型ＰLAC4（図３のＢ、レーン２）または他のＰLAC4変異体（図３のＢ、レーン４〜６）のいずれかからＨＳＡを発現する細胞に比してＨＳＡの分泌が顕著に少ないことは注目に値する。このことはガラクトース誘導発現に必要とされる両ＵＡＳ配列が欠失されたためにＰPGK1からのＨＳＡ発現がガラクトース含有培地では抑制されることと一貫性がある。
【００３７】
牛エンテロキナーゼのクローニング効率に対するＰLAC4変異体の効果
牛エンテロキナーゼは商業的に重要なプロテアーゼであり、改変された融合タンパク質からアフィニティー標識を截断するのによく用いられる。大腸菌におけるエンテロキナーゼの商業的生産は細菌においてそのタンパク質が毒性を有するために低収率である。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ
【００３８】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるエンテロキナーゼの発現はここでは細菌における低発現を回避する手段として示される。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ発現ベクターを大腸菌に組み込む試みが数多くなされており、ＥＫLをコードするＤＮＡが野生型ＰLAC4の下流に配置しているが、ＥＫLをコードする配列内の機能欠失突然変異（例えばフレームシフトまたは早期停止）を含むクローンが広範に単離された。大腸菌における発現が低減しまたは撤廃されたＰLAC4変異体はここでは、酵母に導入する前に、大腸菌において毒性ＥＫLをクローニングしてＫ．ｌａｃｔｉｓ発現ベクターに組み込むのを容易にする。ＥＫL遺伝子は高信頼性ポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅され、クローニングによりｐＧＢＮ１ベクターにおける種々のＰLAC4変異体の下流に導入される（図２のＢ参照）。多数の単離されたクローンの全ＥＫL遺伝子（７０８ｂｐ）を配列決定して機能喪失突然変異の存在を決定した。野生型ＰLAC4の制御下にクローニングされてｐＧＢＮ１に導入されると、試験したクローン１２のうち１１（９２％）が機能喪失突然変異を含んでいた。しかしながら、ｐＧＢＮ１PGK1ベクター（９クローンを配列決定）またはｐＧＢＮ１Hyb（７クローンを配列決定）、大腸菌プロモーター機能を完全に欠くＰLAC4を含むベクターにクローニングされたＥＫLには突然変異は見出されなかった。さらに大腸菌発現がＰＢＩにおける突然変異のため〜８６％に低下したｐＧＢＮ１PBIベクター（９クローンを配列決定）にクローニングされたＥＫLには突然変異は見出されなかった。さらに、ｐＧＢＮ１PBII-PBIIのＥＫLクローン１０のうち３（３０％）は機能喪失突然変異を含んでいた。併せるとこれらのデータは、大腸菌における野生型ＰLAC4の機能は毒性遺伝子のクローン効率に悪影響を与ることを示すとともに、大腸菌における機能を欠失しているか非常に機能が低下しているＰLAC4変異体は細菌におけるＫ．ｌａｃｔｉｓ発現構築物の組み立てにより良く適していることを示している。
【００３９】
統合性Ｋ．ｌａｃｔｉｓ発現ベクターｐＫＬＡＣ１の構築
Ｋ．ｌａｃｔｉｓからタンパク質を商業的に分泌するための新規なＫ．ｌａｃｔｉｓ統合性発現ベクター（ｐＫＬＡＣ１）を形成した。このベクターは、ＰＢＩ（図２のＢ、ｐＧＢＮ１PBI）に突然変異を含み、ＰＢＩ−欠失ＬＡＣ４プロモーター、Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子分泌リーダー配列、多重クローニング部位、Ｋ．ｌａｃｔｉｓＬＡＣ４転写ターミネーター、ＰADHIから発現されたアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子を含む選択性マーカー・カセット、並びに大腸菌複製原点およびアンピシリン耐性遺伝子を（５′から３′への順序で）含み、大腸菌におけるその増殖を可能にするＰLAC4-PBIに基づいている。
【００４０】
このベクターをＳａｃＩＩまたはＢｓｔＸＩで消化するとＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞に導入した際にＫ．ｌａｃｔｉｓのＰLAC4遺伝子座のプロモーター領域に統合される線状発現カセットが生成される。形質転換された酵母を５ｍＭアセトアミドを含有する酵母カーボン・ベース培地で窒素源選択により単離するが、このアセトアミドは発現カセット（ａｍｄＳ遺伝子を含む）が染色体に統合された場合にのみ単純窒素源に転換され得る（米国特許第６，０５１，４３１号明細書）。
【００４１】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓα−ＭＦプレプロ・ドメインをコードするＤＮＡをＫ．ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡからプライマー１３および１４を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＬｉｔｍｕｓ２９［ニュー・イングランド・バイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチュセッツ州ビバリー市］のＳＡｃＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。次いで、クローニングされたＫ．ｌａｃｔｉｓα−ＭＦ接合配列をｐＧＢＮ１PBIプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングしてｐＧＢＮ１PBI−Ｋｌα−ＭＦプラスミドを生成した。最初の１２８ｂｐを除くアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子のすべてを含む１５２０ｂｐＤＮＡフラグメントをプライマーＰ１５およびＰ１６並びにテンプレートとしてのクローニングされたａｍｄＳ遺伝子［ＤＳＭバイオロジクス・ベー・ヴェー（ＤＳＭ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｂ．Ｖ．）社、オランダ国デルフト市］を用い増幅した。このフラグメントをｐＧＢＮ１PBI−Ｋｌα−ＭＦプラスミドのＢＡｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングしてＧ４１８耐性遺伝子を置換し、ｐＧＢＮ１PBI−Ｋｌα−ＭＦ−１５２０プラスミドを生成した。ａｍｄＳ遺伝子の５′末端の残存する１２８ｂｐをプライマーＰ１６およびＰ１７でＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＢＮ１PBI−Ｋｌα−ＭＦ−１５２０プラスミドのＢａｍＨＩ部位にクローニングし、このフラグメントの正しい向きをＤＮＡ配列決定により確認した。得られたベクターをｐＫＬＡＣ１［ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＡＹ９６８５８２］と命名され、米国マサチュセッツ州ビバリー市のニュー・イングランド・バイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社から市販されている。
【００４２】
大腸菌内に発現ベクターを成功裏に組み立てた（ｐＫＬＡＣ１−ＥＫL）後、ｐＫＬＡＣ１ベクターを用いてＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞からエンテロキナーゼを分泌した。統合されたｐＫＬＡＣ１−ＥＫLを保持する株をＹＰＧａｌ培地で２日間培養した。使用済み培地のエンテロキナーゼタンパク質分解活性を蛍光性ペプチドの切断速度を測定することにより検定した。７種のｐＫＬＡＣ１−ＥＫL統合株からの培養上清で行われた活性の測定は、７種がすべて活性エンテロキナーゼ（ＫＬＥＫ）を分泌したことを示している（図５）。しかしながら、７株のうち２株（ＫＬＥＫ−Ｓ１およびＫＬＥＫ−Ｓ４）は他の５株よりも高いレベルのエンテロキナーゼ活性を分泌した。サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）分析により、ＫＬＥＫ−Ｓ１およびＫＬＥＫ−Ｓ４株は統合されたｐＫＬＡＣ１−ＥＫLの多重直列コピーを含むことが見出された。震盪フラスコで成長したＫＬＥＫ−Ｓ１株から分泌されたエンテロキナーゼの収率は上記の分泌された酵素活性の既知量の生成エンテロキナーゼの活性に対する比較に基づいて〜１．１ｍｇ／Ｌであると見積もられた。
【００４３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は大腸菌／クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）統合性発現ベクターｐＧＢＮ１を示す図である。  遺伝子は、同じ翻訳読取フレーム内の多重クローニング部位（ＭＣＳ）にサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−接合因子分泌リーダー配列（Ｓｃα−ＭＦ）としてクローニングされる。転写はＰLAC4およびＬＡＣ４転写ターミネーター配列（ＴＴLAC4）により、それぞれ開始および停止される。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１プロモーター（ＰADH1）は酵母のＧ４１８に耐性を与える細菌遺伝子の発現を駆動する。大腸菌ベクター配列をＰLAC4の唯一のＳａｃＩＩ部位に挿入して大腸菌における増殖を可能にした。このベクターはＳａｃＩＩまたはＢｓｔＸＩで消化して線状化してＫ．ｌａｃｔｉｓ染色体のＬＡＣ４プロモーター遺伝子座に挿入するようにした。
【図２】図２はＰLAC4内のプリブノー・ボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ  ｂｏｘ）様配列およびＰLAC4変異体発現ベクターの構築を示す図である。  図２のＡはプリブノー・ボックス様配列ＰＢＩ、並びにＰＢＩＩおよびＰＢＩＩＩ（配列番号１および２）をＰLAC4と関連した主および副大腸菌転写開始部位に対して、かつプリブノー・ボックス・コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴと整列して示す。上記コンセンサス配列と一致するヌクレオチドを四角で囲った。  図２のＢはＰLAC4変異体を含む発現ベクターを示す。大腸菌の主および副転写開始部位の概略位置をｐＧＢＮ１について図式的に示す。ガラクトース応答要素、上流活性化配列（ＵＡＳ）ＵＡＳＩおよびＩＩの概略位置を各構築物について示す。ＰLAC4ＤＮＡのＰＧＫ１プロモーターのフラグメントで置換した領域を黒で示す。ｐＧＢＮ１PBIおよびｐＧＢＮ１PBII-PBIIIプラスミドのＰLAC4ＤＮＡにおけるプリブノー・ボックス様配列の突然変異した塩基を各塩基（配列番号３および４）の上の黒点で示す。数字を付した位置はすべてＳｃα−ＭＦ分泌リーダーのＡＴＧ開始コドンのアデニンに対するものであり、このアデニンの位置を＋１と指定している。
【図３】図３は大腸菌における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のおよびＫ．ｌａｃｔｉｓにおけるヒト血清アルブミンのＰLAC4変異体発現を示す図である。  図３のＡは種々のＰLAC4変異体のそれぞれの下流にクローニングされたＧＦＰを示す。各発現構築物を担持する大腸菌の溶解産物からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＧＦＰをウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析により検出した。  レーン１：負の対照として用いたｐＧＢＮ１。溶解産物は空のｐＧＢＮ１プラスミドを含む細菌由来である。  レーン２：未改変ＰLAC4を含む第２の対照として用いられたｐＧＢＮ１／ＰLAC4。  レーン３〜６：使用した溶解産物はＰLAC4がｐＧＢＮ１PGK1、ｐＧＢＮ１Hybrid、ｐＧＢＮ１LAC4-PBI、またはｐＧＢＮ１LAC4-PBII-PBIIIで置換されているｐＧＢＮ１で形質転換された大腸菌からのものである。  図３のＢは各ＰLAC4の下流にクローニングされてＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞内で発現するようにしたＨＳＡを示す。種々の統合されたＨＳＡ発現ベクターを含むＫ．ｌａｃｔｉｓ株の使用済み培地中に分泌されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％アクリルアミド）およびクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色により分解した。ＨＳＡは見掛け質量６６ｋＤａを有する単一バンドとして現れた。  レーン１：負の対照としての、染色体に統合された空のｐＧＢＮ１を含む酵母株からの使用済培地  レーン２〜６：ＰＧＮＩLAC4−ＨＳＡ／ＰLAC4、ＰＧＮＩPGK1−ＨＳＡ／ＰPGK1、ＰＧＮＩHybrid−ＨＳＡ／ＰHybrid、ＰＧＮＩLAC4-PBI−ＨＳＡ／ＰLAC4-PBIおよびＰＧＮＩLAC4-PBII-PBIII−ＨＳＡ／ＰLAC4-PBII-PBIIIで形質転換したＫ．ｌａｃｔｉｓからの使用済培地。
【図４】図４はｐＫＬＡＣ１、大腸菌／Ｋ．ｌａｃｔｉｓ統合性発現ベクターを示す図である。ｐＫＬＡＣ１ベクター［ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＡＹ９６８５８２］をｐＧＢＮ１と同様に下記の改変：（１）遺伝子を天然Ｋｌα−ＭＦリーダー配列と同じ翻訳読取フレームの多重クローニング部位にクローニングを持つようにする改変、および（ｉｉ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける発現はＰLAC4-PBI変異体により開始されるようにする改変、を持つように組織化した。ＰADH1はアセトアミド培地上の成長により形質転換体を選定するためのアセトアミダーゼ−選択性マーカー（ａｍｄＳ）遺伝子の発現を駆動する。
【図５】図５は統合されたｐＫＬＡＣ１−ＥＫL（エンテロキナーゼ触媒サブユニットをコードする遺伝子）を含むＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞の使用済み培地中の分泌エンテロキナーゼの活性を示す図である。ｐＫＬＡＣ１−ＥＫLおよび野生型ＧＧ７９９細胞を保持するＫ．ｌａｃｔｉｓの７株をＹＰＧａｌ培地で４８時間成長した。清澄化された使用済培地のエンテロキナーゼ活性を、蛍光ペプチドの経時切断を測定することにより検定した。ＫＬＥＫ−Ｓ１およびＫＬＥＫ−Ｓ４はサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）分析により決定された統合されたｐＫＬＡＣ１−ＥＫLの多重コピーを含む２つの株である。他の株はすべてｐＫＬＡＣ１−ＥＫLの単一統合されたコピーを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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