(57)【要約】  本発明は、特に腫瘍特異的融合たんぱく質類の検出に関する。それぞれ未改変たんぱく質に対応するアミノ末端断片とカルボキシル末端断片を含む融合たんぱく質をサンプル中で検出する方法であって、融合たんぱく質に存在しない未改変たんぱく質部分に特異的に反応する少なくとも１種の結合分子に対して、前記少なくとも１種の結合分子と前記未改変たんぱく質の複合体を形成できる条件下で、前記サンプルを接触させ、前記複合体を前記サンプルから除去し、融合たんぱく質ではなく前記未改変たんぱく質を前記サンプルから枯渇させ、前記融合たんぱく質に対して作成した少なくとも１種の抗体を用いて前記サンプル中の前記融合たんぱく質を検出する方法が提供される。さらに、本発明の方法を実施するための診断キットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ異なる未改変たんぱく質に対応するアミノ末端断片とカルボキシル末端断片とを含む融合たんぱく質をサンプル中で検出する方法であって、
融合たんぱく質に存在しない未改変たんぱく質の一部分と特異的に反応する少なくとも１種の結合分子に対して、前記少なくとも１種の結合分子と前記未改変たんぱく質の複合体を形成できる条件下で前記サンプルを接触させ、
前記複合体を前記サンプルから除去し、前記未改変たんぱく質を前記サンプルから枯渇させ、
前記融合たんぱく質に対して作成した少なくとも１種の抗体を用いて前記サンプル中の前記融合たんぱく質を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の結合分子が抗体である、またはそれに機能的に等価の結合断片であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種の結合分子が固体粒子、好適にはビーズに結合していることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複合体が前記サンプルから遠心分離によってまたは磁気分離によって除去されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記融合たんぱく質は、少なくとも第１および第２の抗体のセットを用いて検出され、各抗体が前記融合たんぱく質の融合領域の両端にある結合部位を認識可能であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種の抗体が蛍光色素によって標識されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種の抗体がビーズに結合していることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記融合たんぱく質がフローサイトメトリによって検出されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルから前記複合体を除去するステップ後、前記複合体に特異的に結合できる少なくとも１種の試薬を使用して前記複合体を検出し、前記複合体に対する前記少なくとも１種の試薬の結合を、前記サンプルから枯渇させた未改変たんぱく質の量の指標として決定することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記未改変たんぱく質が高含量またはハウスキーピングたんぱく質であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合たんぱく質が、それぞれ異なる非腫瘍特異的たんぱく質に対応するアミノ末端断片およびカルボキシ末端断片を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記融合たんぱく質が、フィラデルフィア染色体異常の結果であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記融合たんぱく質のアミノ末端断片が、ＡＢＬまたはＢＣＲたんぱく質に対応し、前記融合たんぱく質のカルボキシル末端断片がＢＣＲまたはＡＢＬたんぱく質に対応することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の結合分子、好適には抗体が、前記融合たんぱく質ではなくＡＢＬまたはＢＣＲたんぱく質の断片に特異的に反応性であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するための結合分子および少なくとも１種のプローブを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または請求項１５に記載の診断キットの疾患診断および／または分類における使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に腫瘍特異的融合たんぱく質類の検出に関する。さらに詳細には、本発明は、生物試料中における融合たんぱく質の存在を検出することによって染色体転座の存在を示す技術に関する。
【０００２】
白血病、リンパ腫および固形腫瘍のようなさまざまなタイプの癌の診断において、予後と関連させた上でのサブグループへの分類のために染色体異常が頻繁に使用される。これらの染色体異常の多くは融合遺伝子を生ずることになり、すなわち、ひとつの遺伝子の上流部から他の遺伝子の下流部に結合した異常結合遺伝子類等を生ずることになる。融合遺伝子類は融合遺伝子転写物に転写され、融合たんぱく質類に翻訳される。一般的に、融合たんぱく質類は、発癌プロセスにおいて重要な役割を果たす。たとえば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）成人患者の約３５％および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）成人患者の約９５％がその白血病細胞中に特異的な染色体欠損、すなわちフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を作る染色体９と２２の間に転座を有している。この転座は、ＡＢＬと称されているたんぱく質チロシンキナーゼのゲノム中の部位で出現し、ＢＣＲと称される別の遺伝子とＡＢＬ遺伝子のインフレーム融合の遺伝子産物である異常なＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質を生ずる。一般的に、発癌プロセスにおいて融合たんぱく質類は重要な役割を果たしている。たとえば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質中におけるＡＢＬのキナーゼ活性が活性化されかつ脱制御され、ＡＬＬとＣＭＬで観察される無制御細胞増殖を始めさせる。
【０００３】
患者がＡＬＬと診断されると、白血病細胞総数が通常、１０１１から１０１２の範囲になる。細胞増殖抑制性すなわち細胞障害性の処置が、悪性リンパ腫患者の大半において寛解を誘発する。にもかかわらず、これらの患者の多くが再燃する。寛解とは、白血病細胞が完全に体内から消失することを意味せず、そのレベルがこれまでの細胞形態学的方法の感度レベルを超えていることを意味している。細胞形態学的技術の検出限度は悪性細胞１〜５％よりも低くないので、このことは、１０１０個までの悪性細胞がまだ患者中に残っていることを意味し、「最小残留疾患」（ＭＲＤ）とも称されている。現在の治療プロトコールが、これらの再燃性患者において、細胞形態学的基準によるいわゆる寛解に達していたにしても、いわゆる悪性細胞全てを死滅させることはできないということは明らかである。したがって、細胞形態学的技術が治療の有効性について表面的な情報しか提供できないことが明らかである。
【０００４】
初期治療応答時において数少ない残留悪性細胞を検出することにより、化学療法時の腫瘍縮小動態を詳細に評価できるようになる。現在、ＭＲＤ情報が最終的な結果についての強力な予後因子を表すと一般に確認されている。ＭＲＤレベル上昇を検出することで、差し迫った再燃を予測できる。ＭＲＤ検出感度の高い技術は、したがって、誘導治療時における腫瘍マスの縮小および維持療法時の悪性細胞のさらなる撲滅に対してより優れた予想を得るために非常に重要である。
【０００５】
染色体異常検出のこれまでの技術には、サザンブロット法または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析のような細胞遺伝学的分析および生物分子技術のような旧来の技術が含まれる。しかし、細胞遺伝学、ＦＩＳＨ分析およびサザンブロット法の検出感度は、通常、１〜５％よりも低くなく、そのことがそれらをＭＲＤ検出に不適格としている。
【０００６】
ＰＣＲは迅速および大量診断試験またはスクリーニングにおいてさえも基本的には非常に適しているが、ＰＣＲ分析１回当たりに通常分析できる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は０．１乃至４〜５ｋｂにしか過ぎず、そのことが、染色体ストレッチおよび染色体またはその遺伝子産物内部のブレークポイントクラスターすなわち融合領域の迅速スクリーニングにとって非常に障害となっている。ＰＣＲのもうひとつの欠点は、ミスマッチプライマー類に対するその固有感度である。プライマーに相補性の遺伝子断片の核酸配列に常に存在しうる小さな変化によってＰＣＲを所望の効果をもたらすように実施できなくなるであろうし、その結果、診断誤りと誤陰性結果が生じうる。特に、誤陰性結果によりＰＣＲに基づく診断結果は、非常に特異的ではあるものの、信頼性の高い診断というには不適切となり、悪性疾患類を高い信頼性で診断することのみが予後の予見と適切な治療法設計に寄与できるのは言うまでもない。上記にも述べたように、特異的な染色体異常を検出することを目的にした現在利用可能な技術の大半では、染色体または核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）レベルでの解析を必要としている。しかし、たんぱく質レベルでも染色体異常を検出することが可能である。
【０００７】
染色体異常の結果による融合たんぱく質の免疫検出のための適切な技術を開発するために、白血病診断分野においてかなりの努力が傾注されてきた。こうした研究の多くは、腫瘍特異的たんぱく質とのみ限定的に反応し、体によって通常産生される非融合たんぱく質類の免疫検出を同時には行わない免疫試薬類（抗体類）を見出すことに注目してきた（たとえば、Nagasaki et al., J.Imm.Methods 162,235-245、1993およびVan Denderen et
al., J Exp Med.1989 169(1):87-98参照）。通常、このような抗体類は、正常な細胞たんぱく質類と交差反応する。特異的な融合たんぱく質が既知であるときのみ、融合点エピトープに選択的に結合することによって腫瘍特異的たんぱく質とのみ限定的に反応する特異的免疫試薬類を選択することが可能となる。しかし、融合点の変動は患者間（ＤＮＡレベルで異なるブレークポイント）でも患者内部（ｍＲＮＡスライス変異体）でも極めて大きく、特異的免疫検出は数例でしか有効でなく、患者個人ベースでのみ有効であることが多い（Van Dongen et al, Leukemia 1999,13:1901-1928参照）。さらに、融合たんぱく質の融合点を免疫検出する診断試験には、専門的でかつ非常に設備のよい研究室と熟練した高レベルの技術者を必要とするという重大な本質的欠点を有している。また、上記試験は、通常、悪性疾患の疑いのある症例でのみ使用され、染色体異常があるかどうか白血病患者を大規模スクリーニングするためには適していない。
【０００８】
融合たんぱく質Ａ−Ｂのみを限定的に検出できる迅速でかつより便利な免疫方法を開発することは、融合たんぱく質検出を目的にした診断試験領域における大きな前進であった（ＰＣＴ／ＮＬ９８／００２８９参照）。報告の方法では、融合たんぱく質の一部分（パートＡ）を認識するいわゆる捕捉抗体と、融合たんぱく質の他の部分（パートＢ）を認識する標識検出抗体を適用することが必要である。このようなシステムでは、捕捉抗体は、ＥＬＩＳＡプレートまたはディップスティックのような固体支持体層に結合される（
P.Berendes,“Recognition of tumor-specific proteins in human cancer.PhD Thesis
Erasumus University Rotterdam,ISBN 90-73436-36-2”）。捕捉抗体はまた、ビーズに固定することもでき、フローサイトメトリにより分析できる（たとえばＰＣＴ／ＮＬ０１／００９４５参照）。融合たんぱく質を含む疑いのある細胞溶解物をビーズに結合した捕捉抗体とインキュベーションし、次いで、結合した融合たんぱく質を標識検出抗体で検出する。
【０００９】
（ビーズに基づく）捕捉／検出抗体システムにより、融合たんぱく質を限定的に検出できる。このシステムは洗練されており、フローサイトメトリを使用する際には特に実施が容易である。このような検出システムはまた、多くの臨床サンプルの迅速診断を可能にする。融合たんぱく質を含む悪性疾患診断時点において、診断サンプルは通常、未改変（非融合）たんぱく質類を含むかもしれない正常細胞の数に比べて、融合たんぱく質を有する比較的多数の悪性細胞を含む。ＡＬＬと患者が診断された際、白血病細胞の総数は約１０１１乃至１０１２であり、そのうち一般的に約２５％乃至９８％が融合たんぱく質をコードする融合遺伝子を含む。捕捉／検出抗体システムは、したがって、融合たんぱく質を生ずる染色体異常の迅速スクリーニングに適している。しかし、残念なことに、捕捉／検出抗体システムの感度は、正常細胞バックグランドが高いときに低頻度（＜１％）の悪性細胞を検出するには不十分であるように思われることが多い。例として、現在の捕捉／検出抗体システムは、一般的に、治療経過観察時におけるＭＲＤ検出には適していない。捕捉／検出システムの診断適用はしたがって、本質的に、骨髄中または血中悪性細胞の相対頻度が高い（通常、＞１０％）初期診断段階に限定されている。こうしたことを考えると、サンプルが最小量の融合たんぱく質しか含んでいなくても、このサンプル中における融合たんぱく質を限定的にかつ簡便に検出できる方法が特に必要とされている。
【００１０】
現在の方法において、融合たんぱく質と融合していない未改変（すなわち、野生型）たんぱく質が、融合たんぱく質検出に用いたプローブに特異的に結合しようと競合することが現在認められている。たとえば、融合たんぱく質Ａ−Ｂおよび非融合未改変たんぱく質Ａは、捕捉抗体または融合たんぱく質のＡ部分に特に反応性の他のタイプのプローブに対する結合を競合する。同様に、融合たんぱく質Ａ−Ｂおよび非融合未改変たんぱく質Ｂは、融合たんぱく質のＢ部分に反応性の捕捉抗体に対する特異的結合を競合する。したがって、少なくとも２個の未改変たんぱく質類の一部分を含む融合たんぱく質を検出するための捕捉／検出抗体システムの感度は、未改変非融合たんぱく質類に対するサンプル中に存在する融合たんぱく質の比率によって主に決定される。未改変たんぱく質が問題の融合たんぱく質に対して大過剰であるとき、この未改変たんぱく質が捕捉抗体の結合部位全部とはいわないまでもほとんどを占める傾向があり、したがって、本質的に融合たんぱく質の結合を妨害する。さらに、ある融合たんぱく質が捕捉抗体によって効率的に捕捉されるにしても、標識検出抗体の結合を示す信号強度は、信頼性のある試験結果をもたらすだけ十分とはいえないであろう。本発明は、サンプル中の融合たんぱく質を検出する方法の感度を、融合たんぱく質の存在を検出する前に１種以上の未改変たんぱく質類をサンプルから枯渇させることによって高めることができ、１種以上の「競合」未改変たんぱく質類に対して融合たんぱく質をサンプル中で高含量にできるという洞察を提供する。それぞれ異なる未改変たんぱく質に対応するアミノ末端断片とカルボキシル末端断片を含む融合たんぱく質を検出することにより、サンプル中の融合たんぱく質（たとえば、染色体転座の結果）を検出する方法を提供する。この方法は、（ｉ）融合たんぱく質に存在しない未改変たんぱく質部分に特異的に反応性の少なくとも１種の結合分子に対して、その少なくとも１種の結合分子とその未改変たんぱく質の複合体を形成できる条件下で、サンプルを接触させること、（ｉｉ）複合体をサンプルから除去し、融合たんぱく質ではなく未改変たんぱく質をサンプルから本質的に枯渇させること、および（ｉｉｉ）融合たんぱく質に対して作成した少なくとも１種の抗体を用いてサンプル中の融合たんぱく質を検出することを含む。未改変たんぱく質または関連未改変たんぱく質という用語は、ここでは、融合たんぱく質検出に用いたプローブまたは試薬に対する結合を問題の融合たんぱく質と競合できる非融合野生型たんぱく質を称し、たとえば、捕捉抗体のようなものである。本発明の未改変たんぱく質は、正常立体構造（生理的環境にあるときのたんぱく質の３次元構造）または変性立体構造を取ることができる。
【００１１】
本発明によれば、融合たんぱく質は、悪性細胞の融合遺伝子または人工的に作成した融合遺伝子から誘導する。それぞれが未改変たんぱく質に対応するアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を含む融合たんぱく質において、それらの断片は、通常、ブレークポイント融合または融合領域により直接互いに融合するかまたは連結し、これらの断片類がともに全融合たんぱく質を表すようになる。断片の長さまたはサイズは、アミノ末端またはカルボキシ末端にかかわらず変え得る。もし融合領域が融合たんぱく質のおよそ半分のところに位置しているならば、融合たんぱく質は、ほぼ同一サイズのアミノ（Ｎ）末端断片とカルボキシ（Ｃ）末端断片を含む。他の場合には、融合領域が融合たんぱく質のＣ末端またはＮ末端のいずれかにより近く位置しており、融合たんぱく質は、大きなＮ末端断片と小さなＣ末端断片から構成されるか、または大きなＣ末端断片と小さなＮ末端断片からそれぞれ構成されるようになる。本発明の融合たんぱく質は、融合領域の上流および下流に十分なアミノ酸類を含み、融合領域の反対側に位置する融合たんぱく質部分に特異的に反応性である抗体プローブ、またはそれと機能的に等価の結合断片による（エピトープ）認識を可能にする。
【００１２】
本発明の方法においては、１種以上の「競合」未改変たんぱく質類に対して融合たんぱく質をサンプル中に多く含ませる。その結果、融合たんぱく質に対して作製したプローブに対する融合たんぱく質の結合が増大する。提供した方法は、特に、融合たんぱく質検出の捕捉／検出抗体またはサンドイッチシステムの感度を上げるために適している。したがって、本発明は、融合たんぱく質検出に用いた捕捉抗体のような「プローブ」を未改変たんぱく質が飽和するすなわち「消費してしまい」、それによってプローブに対する融合たんぱく質の結合を防止する既存の検出方法を用いた場合に起こる深刻な問題に対する解決策を提供する。未改変たんぱく質によるプローブの飽和により、同一サンプル中に存在する融合たんぱく質の検出感度が低下するのは明らかである。本発明により競合未改変たんぱく質をサンプルから枯渇させることによって、融合たんぱく質／未改変たんぱく質の割合が非常に高まり、したがって、検出プローブの結合および融合たんぱく質の検出に好都合となる。ここで述べる方法により、たとえ融合たんぱく質が限定量しかサンプル中に存在しなくても、比較的迅速かつ簡便に融合たんぱく質の存在を特異的に検出可能となる。たとえば、それにより、多数の競合未改変たんぱく質類を含む正常細胞バックグランドが大きいときでも、少数の融合たんぱく質陽性悪性細胞を含むサンプル中の腫瘍特異的融合たんぱく質の検出に捕捉／検出抗体システムを適用することができるようになる。
【００１３】
さらに、本発明の方法により融合たんぱく質量（悪性細胞量の測定値として）に対する未改変たんぱく質（正常細胞量の測定値として）の量を計算できるようになる。正常たんぱく質対融合たんぱく質について得られた比率を用いて、悪性細胞の相対頻度すなわちＭＲＤレベルを求めることができる。
【００１４】
本発明は、悪性細胞中における、たとえばキメラオンコプロテインのような細胞中融合たんぱく質の存在を検出する感度を、このような細胞から少なくとも１種の関連未改変たんぱく質を枯渇させることによって高めることができるという洞察を提供する。もちろん、融合たんぱく質検出前に１種を超える正常たんぱく質を枯渇させることも可能である。ここで提供する方法を用いることは、融合たんぱく質捕捉に用いたプローブに対する結合を競合できる有意量の未改変たんぱく質類も含むサンプル中の融合たんぱく質を検出するとき、非常に有利である。１つの例では、サンプル中における悪性細胞の存在を決定することによるＭＲＤ検出方法が提供される。この方法は、少なくとも２種の未改変の、非腫瘍特異的たんぱく質類部分を含む腫瘍特異的融合たんぱく質を検出することを含み、検出段階では、サンプルから未改変たんぱく質類の少なくとも１種を枯渇させる「プレクリア」段階が先に行われる。そうしなければ、未改変たんぱく質類は融合たんぱく質の検出と競合するであろう。
【００１５】
本発明の方法においては、少なくとも１種の結合分子が、１種以上の未改変たんぱく質類をサンプルから除去するために、使用される。サンプルは、融合遺伝子によってコードされる融合たんぱく質を発現する１種以上の細胞を含むことができる血液サンプル、血清サンプル、組織サンプル、骨髄、脊髄液サンプル、生検サンプルおよび他のサンプル類のような生物試料を含む。サンプルを、結合分子が十分に未改変たんぱく質にアクセスできるように処理する。多くの細胞性たんぱく質類は細胞内に局在するので、このことは通常、細胞の膜一体性を破壊することによって達成される。たとえば、細胞の機械的破壊によって得られるか、または界面活性剤を含む細胞溶解緩衝液に細胞を暴露することなどで得られる細胞溶解物または細胞ホモジネートをもたらすように、サンプルを処理する。適切な結合分子は、好適には、抗体または抗体断片のようなたんぱく質またはポリペプチドを含む。しかし、他のタイプの結合分子類もまた、提供した方法を実施する際に有利である。特異的抗体またはその断片は、当該技術で公知のさまざまな標準的操作を用いて得ることができ、実験動物にポリクローナル抗体類を産生させる方法類、従来のハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体類を得る方法類、およびファージディスプレイ選択プロセスを用いた一重鎖Ｆｖ抗体断片類（ｓｃＦｖｓ）を得る方法類が含まれる。このような抗体または抗体断片は、ここではさらに「枯渇抗体」とも称する。
【００１６】
未改変たんぱく質と反応性であるがその未改変たんぱく質のある部分を含む融合たんぱく質とは反応性でない結合分子（枯渇抗体のような）の設計または開発のため、未改変たんぱく質のどの部分または断片が融合たんぱく質の部分であり、どの部分がそうでないかを知ることが、当然、非常に重要である。すなわち、検出すべき融合たんぱく質の融合点または融合領域が確立されているのが好適である。本発明の方法は、公知の染色体異常の結果である融合たんぱく質を検出するために好適に用いられる。これらの場合、生成した融合遺伝子類および融合たんぱく質類はしばしば、詳細に特性解析されてきた。周知の例は、ＣＭＬ症例の９５％超および成人ＡＬＬ症例の３０％に見られるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子類、および小児ＡＬＬ症例の２５〜３０％に見られるＴＥＬ−ＡＭＬ１融合遺伝子類をもたらす転座である。しかし、多くの融合遺伝子類およびコードされた融合たんぱく質類は、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＥＴＯ−ＡＭＬ１、およびＰＭＬ−ＲＡＲａのような白血病に関連していることが公知である。
【００１７】
本発明の適用が白血病検出に限定されないことを理解されたい；他の２、３の非白血病疾患は、融合遺伝子類および融合たんぱく質類の出現を特徴とする。たとえば、下記のＡＬＫ融合遺伝子類は、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）で観察でき、融合遺伝子ＮＰＭ−ＡＬＫは、染色体異常ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）の結果であり；融合遺伝子ＴＰＭ３−ＡＬＫは、染色体異常ｔ（１；２）（ｑ２５；ｐ２３）の結果であり；融合遺伝子ＴＦＧ−ＡＬＫは、ｔ（２；３）（ｐ２３；ｑ２１）の結果であり；融合遺伝子ＡＴＩＣ−ＡＬＫはｉｎｖ（２）（ｐ２３ｑ３５）の結果である。本発明により未改変ＡＬＫと反応性であるが融合たんぱく質とは反応性でないサンプルから未改変ＡＬＫたんぱく質を枯渇させると、以下の捕捉／検出アッセイの感度が高まるであろう。別の実施形態において、本発明は、ＥＷＳ−ＦＬＩ１融合たんぱく質をもたらすｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）、ＥＷＳ−ＥＴＶ１融合たんぱく質を生ずるｔ（７；２２）（ｐ２２；ｑ１２）のようなＥｗｉｎｇ肉腫（ＥＷＳ）にみられる染色体異常の検出に有利に適用される。Ｅｗｉｎｇ肉腫（ＥＷＳ）／骨の末梢原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）は、小児および若年成人に通常見られる腫瘍タイプである。ピーク発生は、年齢１０歳から２０歳の間であり、５歳以下の小児および３０歳以上の成人ではそれほど頻繁ではない。Ｅｗｉｎｇ肉腫は体内のいかなる骨でも出現するが、もっとも一般的な部位は、恥骨、大腿、下脚、上腕および肋骨である。本発明によりプレクリア段階において正常細胞性ＥＷＳたんぱく質を枯渇（および／または、適宜ＦＬＩ１、ＥＲＧまたはＥＴＶ１のような融合パートナー遺伝子を枯渇）させると、Ｅｗｉｎｇ肉腫関連融合たんぱく質の検出感度が高まるであろう。
【００１８】
したがって、本発明は、当業者が、それぞれ未改変たんぱく質に対応するアミノ末端断片およびカルボキシ末端断片を含む、融合たんぱく質に翻訳される融合遺伝子の出現に関連したいかなるタイプの疾患の診断または分類に、不当なほどの負担を感じることなく、適用しかつ実施できるようになる。
【００１９】
融合たんぱく質の構造に基づき、未改変たんぱく質のどの部分がその融合たんぱく質に存在していないかを容易に決定できる。この部分またはその（ポリペプチド）ストレッチに特異的に反応する結合分子は、基本的に、サンプルから未改変たんぱく質を除き融合たんぱく質を除かないために用いることができる。当業者は、融合たんぱく質ではなく未改変（野生型）たんぱく質と特異的に反応する結合分子を得るために、どの段階を行えばよいかわかるであろう。好適な実施形態において、このような特異的結合分子は、抗体またはそれに機能的に等価の結合断片である。
【００２０】
抗体作成方法類は、当業者に公知である。たとえば、ポリクローナル抗体を得るため、実験室動物を免疫原で免疫する。本発明の方法において、免疫原は好適には、組み換えたんぱく質断片または未改変たんぱく質の選択したストレッチまたはドメインに対応する合成ペプチドである。動物の免疫応答を、試験血液を採取し反応性の力価を決定することによってモニタリングする。適度に高い力価が得られると、血液を動物から採取し、抗血清を調製する。未改変たんぱく質と反応する抗体類を増加させるため抗血清をさらに分画することも、もし所望であれば行うことができる。たとえば、Harlow et al., Antibodies,
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York (1988)を参照。モノクローナル抗体類は、当該技術で公知のさまざまな技術により得ることができ、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）添加により骨髄腫細胞株と免疫マウスの脾臓細胞を融合させることによって、得ることができる。融合細胞は、たとえば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン混合物を含む培地のような選択培地中で培養する。この選択培地中で生きながらえた融合細胞を、所望の抗体の産生について（たとえば、ＥＬＩＳＡのような固相免疫アッセイによって）試験し、もし陽性であれば、培養物をクローニングして各培養ウェル中に細胞が１種だけあるようにする。これによって、不死化されておりかつモノクローナル抗体産生者である単一祖先からの細胞クローンが得られる。得られた抗体類は、たとえば（組み換え）未改変たんぱく質または（組み換え）融合たんぱく質のいずれかを発現する細胞溶解物を用いるウェスタンブロット法による従来の免疫診断技術を用いて、特性解析できる。融合たんぱく質Ａ−Ｂではなく未改変たんぱく質Ａと反応する抗体のみが、本発明による方法において枯渇抗体としての用途に適している。
【００２１】
本発明によれば、枯渇抗体と未改変たんぱく質の複合体を融合たんぱく質検出前に、サンプルから除去する。１つの実施形態においては、提供した方法は、細胞溶解物またはホモジネートから、たとえば抗体／抗原複合体形成により未改変たんぱく質を迅速かつ選択的に除去するか、沈殿させることを含む。ここで、結合分子と未改変たんぱく質の複合体形成を可能とする条件下で、未改変たんぱく質と特異的に反応する少なくとも１種の結合分子に、サンプルを接触させる。さまざまな分離技術を本発明の方法に用いて、サンプルから複合体を除去できる。粗混合物から抗体／抗原複合体を沈殿させるため通常使用される方法類には、固相免疫沈澱が含まれる。１つの実施形態において、複合体は、固体ビーズまたはその複合体に結合可能な微小球を添加することによりサンプルから除去し、基本的に液体サンプル中でビーズ懸濁物を形成させる。本発明によれば、適切なビーズは、セファロースビーズまたはポリスチレンビーズ、またはサンプルからビーズに結合した複合体を簡便に除去できるあらゆる種類の固体粒子類を含む。固体ビーズの利点は、それらが、一般的には懸濁物の遠心分離によりサンプルから簡便にペレットにできることである。これとは別に、プレクリアしたサンプルは、懸濁物のろ過によって得られる。本発明の１つの実施形態においては、サンプルを枯渇抗体に接触させ、未改変たんぱく質とビーズに固定した免疫グロブリン結合たんぱく質との複合体を形成させ、サンプルから複合体を除去する。さまざまなタイプの免疫グロブリン結合たんぱく質類が存在しており、適切に使用できる（Antibodies,a Laboratory Manual、E.Harlow&D.Lane,(1988)）。これらには、プロテインＡ、プロテインＧおよび黄色ブドウ球菌S.aureusの菌体ゴーストが含まれる。S.aureusは、その表面にプロテインＡと称される特殊なたんぱく質を有しており、それは有用で広範囲のＩｇＧ結合性試薬である。プロテインＡは、その抗原結合を妨害することなく、抗体類（ＩｇＧクラス）のＦｃ部分に結合する。多くの哺乳類種の抗体類は、一般的にプロテインＡに反応するであろう。別の実施形態においては、GammaBind G Type2またはプロテインＧを用いて、サンプルから枯渇抗体と未改変たんぱく質の複合体を除去する。GammaBind（商標） G Type2およびプロテインＧは、連鎖球菌プロテインＧの組み換えエンジニアリングによる形態である。両たんぱく質類ともに、大腸菌Escherichia coli中で産生できる。それらは、多くの種類の免疫グロブリンＧの定常領域に結合し、ＩｇＧ抗体類および抗原／抗体複合体類を検出、定量および精製するために広く用いられている。GammaBind G Type2およびプロテインＧは、利用可能なもっとも普遍的に適用可能な抗体結合たんぱく質類である。プロテインＡに比較して、それらは、緊密かつ特異的に多くの異なる種に由来する抗体類に結合する。たとえば、GammaBind G Type2は、マウスおよびラットＩｇＧにより多く結合し、GammaBind G Type2およびプロテインＧは、選択的にヒトＩｇＧ由来サブクラス全てに結合する。細菌ゴースト、免疫グロブリン結合たんぱく質類および免疫グロブリン結合たんぱく質類を塗布したビーズ類は、Pharmacia Biotech
AB、Sigma AldrichまたはPierceのようなさまざまな業者から市販されている。ここで提供する方法において、未改変たんぱく質と枯渇抗体の複合体を形成させた後、細菌ゴーストまたは塗布ビーズ類を細胞サンプルまたは細胞ホモジネートと混合し、その間免疫グロブリン結合たんぱく質が枯渇抗体に付着する。短時間単に遠心分離するかまたはろ過段階により、サンプルから枯渇抗体／未改変たんぱく質複合体を付着した細菌ゴーストまたはビーズを分離できる。
【００２２】
しかし、好適な実施形態においては、結合分子（好適には枯渇抗体）を直接、ビーズまたは別の固体粒子にカップリングさせるかまたは固定する。合成ミクロビーズ上の生化学試薬類ディスプレイが、生物分析アッセイの開発における圧倒的傾向である。ビーズに基づくディスプレイシステム（たとえば、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン、Ｈｉｓ−ｔａｇ）の商業的供給源（たとえば、Spherotech,IL;Bangs,IN;Polysciences;PA;
Molecular Probes,OR）が現在利用可能である。ビーズに直接結合した枯渇抗体を使用するときには、免疫グロブリン結合たんぱく質を時々使用することが必要でなくなり、通常、特異性が高まるであろう。十分な時間インキュベーションした後、未改変たんぱく質と複合体を形成した枯渇抗体を付着したビーズを、溶解物またはホモジネートのようなサンプルから除去できる。サンプルからビーズを取り除くのは、簡単かつ迅速にたとえば遠心分離によって行うことができる。そうしなければ融合たんぱく質に対して作製したプローブへの結合をその融合たんぱく質と競合するであろう未改変たんぱく質を基本的に枯渇しているサンプルが、その結果生じるであろう。この枯渇段階の結果、「競合」する未改変、非融合たんぱく質に対して融合たんぱく質含量の高いサンプルが生じるので、たとえば捕捉抗体のようなプローブに融合たんぱく質が結合する確率が有意に高まる。たとえば、提供した方法により感度の上昇した捕捉／検出システムを用いて融合たんぱく質を検出できる。
【００２３】
本発明の別の実施形態においては、枯渇抗体、または他のタイプの適切な結合分子を磁気ビーズに結合させる。これにより、免疫磁気分離（ＩＭＳ）を用いてサンプルからビーズ結合複合体を除去できる。ＩＭＳは、問題の抗原と特異的に反応する結合分子を塗布した磁気ビーズを細胞溶解物に添加することを含む技術である。ビーズと溶解物を混合し、その間、枯渇抗体または他の結合分子と未改変たんぱく質の間に複合体を形成させ、（抗原／抗体）複合体を形成させる。あるインキュベーション時間後、磁場を当て付着複合体を有する磁気ビーズまたは磁気粒子を他の物質類から分離し、枯渇または「プレクリア」したサンプルを残す。適切な磁気ビーズは、たとえば、Spherotec社（www.spherotech.
com）によりブランドネームＳＰＨＥＲＯ磁気粒子として市販されているものである。それらは、マグネタイトおよびポリスチレン層を単一分散（すなわち、均一の大きさにした）ポリスチレンコア粒子（米国特許第５０９１２０６号明細書を参照）に塗布することによって調製されている。その結果、粒子は、形状が球であり、性質が常磁性である。それらはまた、大きさが均一である。これらの磁気粒子含量は調整できるが、一般的には、約１０％〜１５％を示す。磁気粒子は容易に懸濁物から磁気により分離できる。これらの粒子は、マグネットからはずすと非磁気的になり、強力な磁場に繰り返し暴露してさえもいかなる検出可能な磁気を保持していない。磁気粒子は、細胞分離、アフィニティ精製、ＤＮＡプローブアッセイ、磁気粒子ＥＩＡ等に使用できる。セファロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズであろうが、さまざまな大きさのビーズが市販されている。好適な実施形態においては比較的小さな直径のビーズを用いるが、その理由は、ある容積のビーズについて、小さなビーズは大きなビーズに比べて大きな表面積を有していることが挙げられる。ビーズ表面が大きければ大きいほど、より多くの結合分子をビーズに固定でき、ビーズ容量当たりより効率的に未改変たんぱく質をサンプルから除去できる。このことは、サンプル容量が小さいサンプルから未改変たんぱく質を除去する際に特に有益である。
【００２４】
上記にも述べたように、本発明は、捕捉／検出抗体システムが、迅速かつ実施が容易であるにもかかわらず、サンプル中の小量の融合たんぱく質存在を検出できるほど感度が十分でないことが多い、という問題を解決する。２つの異なる未改変たんぱく質類部分を含む融合たんぱく質検出するための、それらの未改変たんぱく質のうちのひとつまたは両者に対して問題の融合たんぱく質含量を高めたサンプルを得るための前処理段階を含む、高感度な検出方法が提供される。この高含量のすなわちプレクリアサンプルをさらに処理し、融合たんぱく質の存在を検出する。理論的には、提供された方法を用いて未改変たんぱく質Ａを完全に枯渇させたサンプル中に存在する融合たんぱく質Ａ−Ｂは、Ａ−Ｂ融合たんぱく質のＡ部分に対する単一抗体（またはそれと機能的に等価のもの）を用いて検出できる。しかし、実際にはいかなる未改変たんぱく質Ａも含まないプレクリアサンプルを得ることは非常に難しいので、単一のＡ特異的抗体が常に所望の検出特異性をもたらすことはないであろう。したがって、Ａ−Ｂ融合たんぱく質のみを限定的に検出することを目的とするとき、融合たんぱく質の部分Ｂに対して作製した少なくとも１種の別の抗体を使用するのが好適である。たとえば、融合たんぱく質を、各抗体が融合たんぱく質の融合領域の反対側にある結合部位を認識可能な第１および第２抗体セットを用いて、検出する。本発明の好適な実施形態において、本発明は、融合遺伝子に由来する融合たんぱく質を、フローサイトメトリ検出によって、または少なくとも２種の抗体プローブを用いてビーズ結合蛍光を測定するいかなる他の便利な方法によっても検出できるが、そのうち少なくとも１種が、融合たんぱく質のアミノ末端断片を含むたんぱく質断片に対して作製されており、かつ少なくとも他の１種が融合たんぱく質のカルボキシ末端断片を含むたんぱく質断片に対して作製されている。
【００２５】
サンプル中の抗原類または抗体類検出のため抗原−抗体反応用固体支持体としての微小球、ビーズまたは他の粒子類の使用は、フローサイトメトリに関連させると特に望ましい（たとえば、米国特許第６１５９７４８号明細書参照）。好適な実施形態においては、フローサイトメトリにより融合たんぱく質の検出を可能とするビーズに、抗体プローブを結合させる。フローサイトメーター類は粒子径差を検出できる能力を有しており、非常に高い感度の蛍光検出器である。微小球は、フォワードアングルライトスキャッター（ＦＡＬＳ）またはエレクトロン容量によって大きさを決めることができる。ライトアングルライトスキャッター（ＲＡＬＳ）と関連させて使用すると、フローサイトメーターは、単一および凝集粒子を識別できる。
【００２６】
本発明の方法は、それぞれ異なる非腫瘍特異的たんぱく質に対応するアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を含む腫瘍特異的たんぱく質の検出に、非常に優れている。腫瘍特異的融合たんぱく質は、たとえば、フィラデルフィア染色体異常の結果であり、異常ＢＣＲ−ＡＢＬたんぱく質を生成する。検出前に、未改変たんぱく質類ＢＣＲとＡＢＬのひとつまたは両者を、ＡＢＬまたはＢＣＲたんぱく質（の断片）と特異的に反応するがＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質とは反応しない少なくとも１種の結合分子を用いることによって、解析すべきサンプルから枯渇させる。ＢＣＲおよび／またはＡＢＬを含む複合体を除去した後、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質を好適には少なくとも第１および第２抗体セットを用いて検出するが、ここで、各抗体は融合たんぱく質の融合領域の反対側にある結合部位を認識する。融合たんぱく質は、たとえばフローサイトメトリ、ＥＬＩＳＡまたはディップスティック方法（下記の例も参照）を用いて捕捉／検出システムを用いて検出できる。
【００２７】
本発明の方法は、きわめて少数の融合たんぱく質発現細胞を検出するのに特に適している（ＭＲＤでみられるように１％未満）。しかし、融合たんぱく質存在と相関する疾患の初期診断に用いられるもののような、低検出限界を必要としない検出方法の感度を高めるためにも当然また、有利に使用できる。これらの場合、融合たんぱく質検出前に１種以上の未改変たんぱく質類を除去した結果、感度が高まるであろう。診断段階において、好適には１種の試験管中で同時に異なる融合遺伝子たんぱく質類出現を検討するのが望ましいことが多い。このことは、特定の悪性疾患が１種を超える融合遺伝子たんぱく質を有するからではなく、たとえば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または前駆体Ｂ−ＡＬＬのようなひとつの疾患カテゴリ内で一般的に十分に認められている数種の融合遺伝子たんぱく質類の検出に、１本の試験管を使うのが便利だからである（表１）。
【００２８】
【表１】
2007502404.tif 000002
【００２９】
好適な実施形態において、ここに述べる方法は、異なる融合たんぱく質類の一部分に対する異なるビーズ結合捕捉抗体類と、融合たんぱく質類の他の部分に対する関連対応検出抗体類を用いることによって、好適には１本の試験管中で異なるタイプの融合たんぱく質類をフローサイトメトリで検出することを含む。ＦＡＬＳと蛍光を組み合わせることによって、数種の異なる大きさのビーズを用いるのが実用的であり、各ビーズには異なる捕捉抗体を塗布し、複数の融合たんぱく質類を同時に検出する。微小球にはその化学的構成に応じて受動的にまたは共有結合でたんぱく質類を塗布できる。ビーズのフローサイトメーター特性が異なる（たとえば、大きさ、蛍光色素色、蛍光色素染色強度、またはサイド分散特性）ことに基づき、複数の融合たんぱく質類を同一アッセイで特異的に検出できる。これにはまた、同一標的遺伝子のさまざまな変異体転座に由来する融合たんぱく質類、および変異体ブレークポイントによる転座に由来する融合たんぱく質類の検出も含まれる。本発明による１種以上の融合たんぱく質類検出方法の必須部分は、捕捉／検出システムを用いるにせよあるいは他のいかなる種類の検出操作を用いるにせよ、融合たんぱく質検出前に１種以上の関連する未改変、非融合たんぱく質類を枯渇させることを先に行うことである。このことは、未改変たんぱく質を特異的に認識し、それに結合して複合体を形成できる枯渇抗体のような、１種以上の結合分子類を用いることによって達成できる。異なる結合たんぱく質類はビーズのような異なる単一固体支持体表面に付着させることができる。これとは別に、異なる未改変たんぱく質類と特異的に反応する複数の結合パートナーを、１種のビーズのみが複数の未改変たんぱく質類をサンプルから同時に枯渇させるために使用できるように、同一ビーズに結合させる。本発明の方法を用いて１本の試験管中で同時に異なる融合たんぱく質類出現を調べるときにこのことは特に重要であり、たとえば、１疾患カテゴリ内部で悪性疾患を診断するために特に診断時腫瘍負荷がまだ低い（たとえば、５％未満）患者サンプルを用いるときに重要である。
【００３０】
したがって、本発明の方法により、未改変たんぱく質ＡのＮ末端断片と未改変たんぱく質ＢのＣ末端断片を含む第１融合たんぱく質Ａ−Ｂ、および未改変たんぱく質ＣのＮ末端断片と未改変たんぱく質ＤのＣ末端断片を含む第２融合たんぱく質Ｃ−Ｄを、１本の試験管中で、既存の検出方法に比較して高い特異性と高い感度で同時に検出することができるようになる。この特定例において、腫瘍負荷の小さい患者サンプルを、たとえばたんぱく質ＡのＣ末端断片と特異的に反応する枯渇抗体（抗Ａ）およびたんぱく質ＤのＮ末端断片と特異的に反応する枯渇抗体（抗Ｄ）に接触させ、サンプルから未改変たんぱく質類ＡおよびＤをそれぞれ枯渇させる。抗Ａおよび抗Ｄ枯渇抗体類は、好適には（小さな）ビーズに固定し、効率と使用の簡便さという理由から同一ビーズに固定するのがはるかに好適である。ビーズ／抗Ａ／たんぱく質Ａ／抗Ｄ／たんぱく質Ｄから構成されるこの特定例においては、通常単に遠心分離する段階でサンプルから複合体を十分に分離できる。その結果、未改変たんぱく質類ＡおよびＤが基本的に枯渇しているサンプルが得られる。これにより、融合たんぱく質類Ａ−ＢおよびＣ−Ｄが、たとえば融合たんぱく質Ａ−ＢのＮ末端断片と融合たんぱく質Ｃ−ＤのＣ末端断片とに特異的に反応する捕捉抗体のような、それらの特異的プローブ類によって認識されるであろう。
【００３１】
感度が限定されていることのほかに、サンプル中融合たんぱく質を検出するための現在の方法類には、検出される融合たんぱく質の量の定量可能性が限定されているというよくある問題が対峙している。これらの方法を診断手段として適用する際には、特に、融合たんぱく質を定量または少なくとも半定量するのが非常に望ましい。融合たんぱく質が存在するかしないかにはかかわらず一定であると想定される内部制御因子に対して融合たんぱく質の存在を示す蛍光強度のような検出信号を、もし可能であるならば、発現させることができる。このような因子は、たとえば、分析する細胞の数であってもよいし、またはサンプル中の総たんぱく質含量であってもよい。この相対値を、陽性および陰性コントロールサンプルのような異なるサンプル間での比較目的のため使用できる。１種または両者の非融合たんぱく質（類）に対して２種の未改変たんぱく質類部分を含む融合たんぱく質存在を直接関連付けることが、はるかに情報に富んでいることは明らかであろう。
【００３２】
これまでのところでは、既存の検出方法のどれも、このような定量化は行い得ない。本発明がこの問題に対して簡便でかつ直接的解決策をここで提供していることは重要である。本発明の方法においてサンプルから除去された１種以上の枯渇未改変たんぱく質（類）を含む複合体は、好適には、さらに解析され、サンプルから枯渇させた未改変たんぱく質（類）の量を示す。好適な実施形態において、この解析では、枯渇させたまたは単離された複合体の１種以上の成分類に特異的に結合できる少なくとも１種の試薬を使用し、その後、その複合体に対する試薬の結合をサンプルから枯渇させた未改変たんぱく質の量の指標として決定することを含む。試薬は、好適には、枯渇させた未改変たんぱく質に結合可能な抗体、または機能的に等価のもののような結合パートナーを含む。好適な実施形態において、枯渇させた複合体は、未改変たんぱく質と枯渇抗体の相互作用部位から明瞭に識別される領域において、枯渇未改変たんぱく質に対して作製した試薬を用いて検出される。さらに好適には、融合タンパク質中にも存在する未改変たんぱく質の部分と枯渇未改変たんぱく質を検出する試薬が反応することである。たとえば、枯渇たんぱく質Ａは、試薬としてＡ−Ｂたんぱく質の検出に用いた「捕捉抗体」を用いて有利に検出される。試薬には、好適には、蛍光色素のような枯渇たんぱく質に標識試薬が結合することにより複合体検出を可能とするレポーター分子または標識が付けられている。
【００３３】
複合体を検出しサンプルから枯渇させた未改変たんぱく質の量を求めることは、フローサイトメトリを用いて有利に行われる。１つの実施形態においては、枯渇抗体をビーズに結合させる。適切なビーズは融合たんぱく質検出用に上記で述べたものを含み、それには、フローサイトメトリと両立できる磁気ビーズが含まれる。
【００３４】
枯渇未改変たんぱく質量が既知であれば、この情報を細胞物質量または総たんぱく質含量の指標として用いることができる。すなわち、枯渇たんぱく質は、診断試験において一種の「内部コントロール」として機能することができる。単離した複合体中におけるたんぱく質の存在を細胞物質量または細胞数と関連付けるとき、単離した複合体が試薬によって検出される十分量の未改変たんぱく質を含めば、それはもちろん好適である。したがって、細胞物質量の測定値としてさらに枯渇させ解析する未改変たんぱく質は、細胞中において比較的どこにでもあるたんぱく質を含む。さらに、未改変たんぱく質の発現がたとえば、ひとつひとつの細胞間の大きな変動あるいは異なる細胞条件下における大きな変動を受けないことが重要である。さらに好適な実施形態においては、枯渇させかつさらに解析すべき未改変たんぱく質は、ハウスキーピングたんぱく質のような安定発現する含量の多いたんぱく質である。たとえば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質をサンプル中で検出する際、ＡＢＬは高含量たんぱく質なので未改変ＡＢＬたんぱく質を枯渇させ、その後検出するのがよい。しかし、融合たんぱく質は常に高含量未改変たんぱく質の断片を含むとは限らない。たとえば、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１融合たんぱく質において、塩基性へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子であるＥ２ＡのＮ末端トランスアクチベーションドメインを、前Ｂ細胞白血病転写因子１（ＰＢＸ１）の大部分に結合させる。転写因子は、典型的には、低レベルでかつ細胞タイプに特異的なように発現される。したがって、これらの場合には、内部コントロールとして枯渇未改変たんぱく質類のいずれの使用も好ましくない。代わりに、高含量のたんぱく質を同時にサンプルから枯渇させる付加的（抗体）プローブを使用するのが有利である。これをさらに例示するため、上記に述べた状況において、たとえば細胞溶解物のようなサンプルを２種の抗体類を塗布したビーズに接触させる。これらの抗体類は、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１融合たんぱく質とではなく未改変Ｅ２Ａと反応して、サンプルから競合性のＥ２Ａたんぱく質を枯渇させる抗体と、内部コントロールとして作用するハウスキーピングたんぱく質を同時にサンプルから枯渇させる（ＡＢＬのような）ハウスキーピングたんぱく質と反応する抗体である。
【００３５】
本発明によれば、枯渇正常たんぱく質の（半）定量が、「既知」量の正常たんぱく質に対して測定量（例  蛍光）を関連付ける標準曲線を作成することによって行うことができる。好適には、「既知」サンプルは、「非既知」サンプル類中で予測される未改変たんぱく質類の濃度範囲を（たとえば、正常細胞の（系列）希釈物を用いて）カバーするように選択した量の未改変たんぱく質を含有する。次いで、このような標準曲線を用いて、枯渇複合体を含む「非既知」サンプル（またはその希釈物）中の枯渇未改変たんぱく質物質濃度を求めることができる。
【００３６】
本発明は、当該技術で公知のビオチン、ジギョキシゲニン、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような酵素類のようなレポーター分子類、またはビーズのような他のレポーター分子類、またはレポーター粒子類により標識できるかまたは結合させることができるプローブ類、を用いる上記に述べたような方法を提供する。本発明はさらに、本発明による方法の実施に必要な結合分子類、（結合）ビーズ類、（標識）プローブ類または試薬類または物質類またはインストラクション類のような全ての手段を含む診断キットを提供する。本発明により提供された方法類または診断キット類は、好適には、たとえば白血病のようなある種の癌に見られる染色体異常を検出するために用いられるが、患者の（残留）癌の検出であろうが大きな集団における全体としての癌のスクリーニングであろうが、好適に用いられる。
【００３７】
本発明による方法の強みは、１）複数の融合たんぱく質類を（ほとんどは診断時点に関連しているが）同時に、しかし明確に分析できる能力、２）微小球へのたんぱく質類の結合の簡便さ、３）わずかの粒子径差を検出するフローサイトメトリの能力、および４）異なる蛍光波長検出器としてのフローサイトメトリの優れた感度を同時に有していることである。利用可能な自動サンプリングシステムにより、この点でより一層魅力的なものとなる。
【００３８】
本発明の方法は、血液サンプル、血清サンプル、細胞サンプル、組織サンプル、脊髄液、骨髄、生検サンプルのような生物試料の染色体異常診断試験で有利に用いられる。本発明は、高感度と高特異性を両者ともに必要とする診断試験において用いられる方法を提供する。提供した方法は、融合遺伝子を生ずる染色体転座、反転または欠損を伴うさまざまなタイプの癌患者の追跡において、悪性度の診断とＭＲＤモニタリングを両者ともに可能にする。本発明の方法を、疾患治療前、治療中、治療後に使用し、治療の有効性を評価する。
【実施例】
【００３９】
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質のプレクリア細胞溶解物中における検出
この実施例では、捕捉／検出抗体アッセイによる検出に先立ち、サンプルから正常（すなわち、未改変の）ＡＢＬをいかにして除去しＭＲＤアッセイにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質を検出する感度を上昇させるかを示している。このような「プレクリア」段階は、ＡＢＬのＮ末端部分に対する抗ＡＢＬ抗体によって実施できる。細胞中で発現した全ての正常ＡＢＬが取り除かれるであろうし、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合たんぱく質に存在するＡＢＬ断片のみが、ＡＢＬのＣ末端部分に対する抗ＡＢＬ捕捉抗体を有する検出ビーズに結合するであろう。ビーズに結合したＢＣＲ−ＡＢＬを、その後、蛍光標識に結合させた抗ＢＣＲ検出抗体を用いて検出する。
【００４０】
材料類
１）ＭＲＤ患者から得て培地で培養した白血病細胞
２）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）：ＦＣＳ（熱不活性化）２ｍｌをＰＢＳ、ｐＨ７．８  １００ｍｌに添加する；４℃で保存。
３）放射免疫沈降（ＲＩＰＡ）緩衝液（デオキシコーレートナトリウムなし）：
ＲＩＰＡ緩衝液５０ｍｌの調製
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ原液２．５ｍｌを使用
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ：５Ｍ  ＮａＣｌ原液１．５ｍｌを使用
１％  ＮＰ４０：未希釈ノニデット（Nonidet）Ｐ４０（BDH,#56009 2L）０．５ｍｌを使用
０．１％  ＳＤＳ：１０％ＳＤＳ原液０．５ｍｌを使用
ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ４５ｍｌを添加
４℃で保存
４）プロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma、#P2714：
上記粉末をｍｉｌｌｉ−Ｑ  ２ｍｌに溶解し、５０×濃縮溶液を調製する。４℃で保存。
５）プレクリアビーズ：ＡＢＬのＮ末端に対する枯渇抗体を塗布したポリスチレンビーズ（＞１０μｍ）
６）検出ビーズ：ＡＢＬのＣ末端に対する捕捉抗体を塗布したLuminex,PolyScienceまたはMolecular Probeビーズ
７）検出抗体：ＢＣＲのＮ末端に対するＦＩＴＣ−またはビオチン結合抗体
８）ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＰＥ、Caltag Laboratories,#SA1004-1
【００４１】
方法類
細胞溶解物の調製
１）必要でかつ正確に計算した数の細胞を新しい試験管に移し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄する。融合たんぱく質分析には、一般的に最低でも１×１０６個の細胞が必要である。しかし、ＭＲＤレベル（および、したがって異常融合たんぱく質レベル）が極めて低いと予測されるならば５０×１０６個までの細胞など、より多くの細胞が必要となることもある。
２）その間、細胞溶解物作製に必要なＲＩＰＡ緩衝液容量を計算する：細胞５００，０００個当たりＲＩＰＡ緩衝液５０μｌ。このＲＩＰＡ緩衝液を１５ｍｌの試験管に移し、５０×濃縮プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌ当たりプロテアーゼ阻害剤カクテル２０μｌ）を添加する。
３）プロテアーゼ阻害剤類を含む適当な量のＲＩＰＡ緩衝液（５×１０６／ｍｌ）に上記細胞ペレットを再懸濁させ、上記溶液を新しいエッペンドルフ試験管に移す。
４）氷上で３０分間、インキュベーションする。
５）１０，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離する。
６）上清（細胞溶解物）を新しいエッペンドルフ試験管に移す。
細胞溶解物のプレクリア
７）細胞溶解物サンプル１００μｌに対して１×１０６プレクリアビーズを添加する。
８）氷上で３０分間インキュベーションする。
９）１０，０００×ｇで３分間回転させ、上清を新しいエッペンドルフ試験管に移す。
１０）段階９を繰り返す。
融合たんぱく質の検出
１１）試験管に添加：
プレクリア細胞溶解物サンプル１００μｌ
１０μｌのＰＢＳ＋２％ＦＣＳ中捕捉ビーズ１０，０００個
２５μｌのＰＢＳ＋２％ＦＣＳ中結合検出抗体１〜２μｇ
１２）氷上で３０分間インキュベーションする。
１３）上記ビーズを５００μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄し１４，０００×ｇで１分間回転させる。上清を除去し、この段階を繰り返す。
【００４２】
ビオチン標識検出抗体を用いるとき、段階１４〜１８を継続する。
ＦＩＴＣ標識抗体を用いるとき、段階１７と１８を継続する。
１４）ＳＡ−ＰＥをＰＢＳ／２％ＦＣＳで２００倍希釈し、上記ビーズを試験管１本当たりこの希釈ＳＡ−ＰＥ  ２０μｌに再懸濁させる。
１５）室温で１０分間インキュベーションする。
１６）上記ビーズを５００μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄し１４，０００×ｇで１分間回転させる。上清を除去し、この段階を繰り返す。
１７）２回目の洗浄後、上記ビーズを試験管１本当たり１００〜１５０μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ−試験管に移す。
１８）ビーズ上の標識量をフローサイトメーターで測定する。標識量と初期細胞数の割合が、ＭＲＤレベルの測定値である。
【国際調査報告】
2007502404.tif 000003
2007502404.tif 000004
2007502404.tif 000005
2007502404.tif 000006