(57)【要約】     【課題】    【解決手段】本発明は、組織標本（新鮮または固定組織切片、ホモジナイズした組織、及び培養細胞を含むがこれに制限されない）の形態及び高原性を保持すると同時に、前記組織から多量の生体分子（タンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡを含むがこれに制限されない）を抽出するための非破壊高分子抽出（ＮＤＭＥ）装置を提供するものである。前記装置は基部、スライドカバー、及び温度制御装置を含む。前記組織標本は、基部上に置かれる。前記スライドカバーは、抽出用液を添加する空間を形成するように基部へ備えられる。前記装置は、任意でスライドカバーの上にチェンバーカバーを有する。前記チェンバーカバー及びスライドカバーは反応室を形成し、該反応室には組織の湿度を維持するために蒸気が送り込まれる。抽出溶液は界面活性剤を含む。また、同様に本発明は抽出方法を提供する。【選択図】      図１
2007532918.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織標本からの生体分子抽出装置であり、
上面及び底面を有する基部であって、前記基部の上面に前記組織標本を保持している基部と、
前記基部の上面に設置したスライドカバーであって、内面を有し、前記基部の上面と前記スライドカバーの内面が抽出緩衝液を保持するための空間を形成しているスライドカバーと、
前記基部の底面に接続された温度制御装置と、
を含むことを特徴とする組織標本からの生体分子抽出装置。
【請求項２】
前記生体分子が、タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡからなる群から少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項３】
前記スライドカバーの内面がスライドカバーの中心部で前記基部に向かって突出し、
それによって前記基部の上面とスライドカバーの内面の間に形成された前記空間が前記中心部の周辺で浅くなっていることを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項４】
前記基部がスライドガラスであることを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項５】
前記温度制御装置が、ヒートブロック、クールブロック、熱電対、超音波装置、マイクロ波装置から選択されることを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項６】
前記組織標本が、冷凍組織またはパラフィン包埋固定組織の薄片、均質化した組織、細胞塗抹標本、微生物、細胞、または細胞培養であることを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項７】
前記固定組織が、ホルマリン、アセトン、アルコール、及びカルノア液からなる群から選択される固定液で固定されることを特徴とする請求項６に記載された装置。
【請求項８】
前記抽出溶液が変性剤を含有することを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項９】
前記変性剤が、約０．０１〜５重量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることを特徴とする請求項８に記載された装置。
【請求項１０】
前記抽出溶液が、約０．５重量％のＳＤＳを含有することを特徴とする請求項９に記載された装置。
【請求項１１】
前記抽出溶液が水を含有することを特徴とする請求項９に記載された装置。
【請求項１２】
前記抽出溶液が、タンパク質及び／またはペプチド抽出用であることを特徴とする請求項１１に記載された装置。
【請求項１３】
さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことを特徴とする請求項８に記載された装置。
【請求項１４】
前記抽出溶液が、核酸抽出用であることを特徴とする請求項１３に記載された装置。
【請求項１５】
前記抽出緩衝液を前記基部の上面と前記スライドカバーの内面の間にある空間へ添加するために、前記スライドカバーが前記中心部に開口を有することを特徴とする請求項１に記載された装置。
【請求項１６】
前記スライドカバーが、さらに周囲部に少なくとも一つの外面孔を含むことを特徴とする請求項１５に記載された装置。
【請求項１７】
さらに前記スライドカバーを覆うために設置されたチャンバーカバーを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
請求項１に記載された組織標本からの生体分子の抽出方法であって、
前記組織標本を前記基部の上面へ置く段階と、
前記組織標本を覆うため、前記スライドカバーを前記基部の上面へ設ける段階と、
前記抽出溶液を前記基部の上面と前記スライドカバーの内面との間にある空間へ添加する段階と、
前記温度制御装置を前記基部の底面へ接続する段階と、
前記温度制御装置により温度を調節する段階と、
前記組織標本から抽出した生体分子を含む前記抽出溶液を採取する段階と、
を含むことを特徴とする組織標本からの生体分子抽出方法。
【請求項１９】
前記温度制御装置によって温度を調節した後に、さらに前記スライドカバーをチャンバーカバーで覆う段階を含むことを特徴とする請求項１８に記載された方法。
【請求項２０】
さらに、前記チャンバーカバー内で湿度を維持するために、前記チャンバーカバー内へ蒸気を送り込む段階を含むことを特徴とする請求項１９に記載された方法。
【請求項２１】
前記組織標本が、凍結組織またはパラフィン包埋固定組織の薄片、均質化された組織、細胞塗抹標本、微生物、細胞、または細胞培養であることを特徴とする請求項１８に記載された方法。
【請求項２２】
前記パラフィン包埋固定組織が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）であることを特徴とする請求項２１に記載された方法。
【請求項２３】
前記温度制御装置の温度が、前記凍結組織またはパラフィン包埋固定組織、均質化された組織、微生物、細胞、または細胞培養に対して約−２０〜１２０℃に調節されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記温度制御装置の温度が、前記凍結組織、均質化された組織、または細胞培養に対して約４〜２５℃に調節されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体分子が、前記凍結組織、均質化された組織、または細胞培養から約５〜４５分で抽出されることを特徴とする請求項２４に記載された方法。
【請求項２６】
前記温度が約１００℃を超えて調節される場合に、前記生体分子が、前記凍結組織、均質化された組織、または細胞組織から約５分未満で抽出されることを特徴とする請求項２３に記載された方法。
【請求項２７】
前記温度制御装置の温度が、前記パラフィン包埋固定組織に対して約５０〜１２０℃に調節されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度が約１００℃であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体分子が、前記パラフィン包埋固定組織から約５〜４５分で抽出されることを特徴とする請求項２７に記載された方法。
【請求項３０】
前記抽出溶液が変性剤を含有することを特徴とする請求項１８に記載された方法。
【請求項３１】
前記変性剤が、約０．０１〜５重量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることを特徴とする請求項３０に記載された方法。
【請求項３２】
前記ＳＤＳが約０．５重量％であることを特徴とする請求項３１に記載された方法。
【請求項３３】
前記抽出溶液が水を含有することを特徴とする請求項３１に記載された方法。
【請求項３４】
前記抽出溶液が、タンパク質及び／またはペプチド抽出用であることを特徴とする請求項３３に記載された方法。
【請求項３５】
さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことを特徴とする請求項３０に記載された方法。
【請求項３６】
前記抽出溶液が、核酸抽出用であることを特徴とする請求項３５に記載された方法。
【請求項３７】
約５〜２５０μｌの前記抽出溶液が、前記基部の上面と前記スライドカバーの内面の間にある空間へ添加されることを特徴とする請求項１８に記載された方法。
【請求項３８】
前記組織標本の生体分子が抽出された後に、前記凍結組織またはパラフィン包埋固定組織の薄片が組織病理学的染色に適用されることを特徴とする請求項２１に記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、好ましくは組織標本由来のタンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡ抽出のための非破壊高分子抽出（以下、「ＮＤＭＥ」という）装置に関し、組織標本は凍結組織またはパラフィン包埋固定組織の薄片、均質化した組織層、及び／または組織培養を含むがこれに限定されるものではない。組織標本の形態は抽出完了後も破壊されずに維持されている。また、本発明は凍結組織またはパラフィン包埋固定組織の切片（特にホルマリン固定）からの生体分子抽出方法、及び病理学的研究のための組織標本の優れた処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトが完了に近づくにつれ、研究の中心は個々の遺伝子が産生するタンパク質の構造、機能、及び相互作用を特定し、がん及びその他の疾病におけるそれらの役割を決定するという莫大な作業へと転換している（Marte B. Nature 2003, 422 (Suppl.):191-237; Liotta L et al., Nat. Reviews 2000, 1:40-56; Emmert-Buck et al.， Am J Pathol. 2000, 156:1109-1115）。組織タンパク質及びｍＲＮＡ転写物の分析は、現在の臨床材料保存技術によって制限を受けている。従来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本は優れた形態、及び臨床材料の容易な長期保存をもたらす。しかしながら、ＦＦＰＥ標本は、大部分の高分子の回復が次善的であるため、現在の分子技術に必ずしも対応するものではない。  
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
抽出におけるこのような問題のため、分子研究には凍結組織が好まれる。しかしながら、凍結組織の大規模な処理及び保存は非実用的であり、費用もかかる。病理の通常業務においては、ＦＦＰＥによってもたらされる優れた形態の必要性が、分子診断の必要性を上回る。この状況は生検の制限によりさらに問題視される。したがって、ＦＦＴＰ組織に最良の形態を与えると同時に、該組織から分子診断法をいくらでも行える量の高品質なタンパク質及び核酸を効果的に抽出することのできる方法は、これら多くの問題に理想的な解決をもたらすだろう。
【０００４】
現在使用可能な全ての分子抽出法では、分子分析及び組織学的診断の両方を行う際に多様な標本を処理しなければならないため、固定組織または新鮮組織の均質化ないし破壊が必要とされる（Clark et al.， J Histochem Cytochem 1986, 34 (5):679-682; Conti et al., J Histochem Cytochem 1988, 36 (5):547-550; Ikeda et al. J Histochem Cytochem 1998, 46(3):397-403）。タンパク質と核酸間が架橋結合しているため、ＦＦＰＥ臨床材料から高分子を抽出することは極めて難しい。Ｃｌａｒｋ及びＤａｍｊａｎｏｖ博士は１９８６年に、−３０℃下で凍結させるか、またはカルノア液中で固定した胎盤組織からはケラチンタンパク質を抽出することができたが、ホルマリン固定組織からは抽出できなかったことを報告した（Clark et al., J Histochem Cytochem 1986, 34 (5):679-682）。アセトン、アルコール、またはカルノア液のような非架橋固定液で固定した組織に由来するタンパク質は、抽出、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシーブルー染色による分析、及び免疫ブロット法を容易に実施することができる（Gillespie et al., Am J Pathol 2002, 160(2): 449-457; Shibutani et al.， Lab Invest. 2000, 80(2):199-208）。しかしながら、類似するホルマリン固定組織からの抽出では、クマシーブルー染色ゲルにおいて検出可能なバンドは生じず、ポリクローナル抗体によって検出可能な極めて少量の高分解バンドが生じた（Conti et al.， J Histochem Cytochem 1988, 36 (5):547-550）。これらの知見は、ホルマリン固定が高分子を破壊し、他の非架橋固定液と同様に組織を保存し得るものではないという疑いを研究者に与えた。１９９０年代初め、いくつかのグループにより、ＦＦＰＥ中にＤＮＡ及びＲＮＡが良好に保存され、ｍＲＮＡのサイズが大幅に低減したものの、ＰＣＲ増幅のために抽出することができたことが報告された（von Weizsacker et al.， Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 174:176-180; Neubauer et al., Oncogene 1992, 7:1019-1025; Krafft et al.， Nucleic Acids Res. 1999, 27(22):4436-43）。最近になってやっと、研究者達はＦＦＰＥのためのタンパク質抽出法を開発することに成功した（Ikeda et al. J Histochem Cytochem 1998, 46(3):397-403; Izawa et al., Oncol Rep. 2002， 9(6):1313-1318; Murphy et al.， Am J Clin Pathol. 2001, 116(1):135-42）。しかしながら、これらの工程は破壊的であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に十分なタンパク質収量を満たすためには数時間、大量の組織、及び高い塩濃度を必要とする。
【０００５】
以下に記載される本発明は、これらの問題を装置と、容易、迅速且つ非破壊的な分子抽出（ＮＤＭＥ）法によって克服するものである。前記装置及び方法は、凍結またはホルマリン固定パラフィン包埋組織標本から大量のタンパク質及び核酸を抽出することができるだけでなく、生体分子を抽出した後も組織形態及び抗原性を完全な状態で維持することができ、組織病理学的研究に有用である。５００を超える組織標本が、本装置及びＮＤＭＥ法を用いて試験された。ＮＤＭＥ装置及び方法は、少なくとも次の３つの利用可能性を示している。すなわち、１）難しい臨床例に対するヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、免疫組織化学（ＩＨＣ）、切片上ハイブリッド形成法（ＩＳＨ）を含むプロテオミクス、ゲノム研究、及び組織学的分析の同時実施、２）各種疾病、特に未調査の疾病に対する遡及研究の実施、及び３）疾病撹乱タンパク質（disease-perturbed proteins）のレベルと薬物治療に対する応答性の関係を同定し、最終的には臨床医が形態学的診断を行うだけでなく、どの治療が最高の効果をもたらすかを決めることを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施例の一つでは、組織標本から生体分子（例えばタンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡ）を抽出するための非破壊高分子抽出（「ＮＤＭＥ」）装置を開示している。ＮＤＭＥ装置は、（１）上面及び底面を有する基部、（２）基部の上面に設けられたスライドカバー、（３）前記基部の底面と接続した温度制御装置を含む。組織標本は基部の上面に置かれる。
【０００７】
基部は組織標本を支えるに適した物質で作られる。好適な基部はスライドガラスのようなガラス製のものである。スライドカバーは、スライドカバーの中心部近くに突出した内面を有することが好ましい。基部の上面及びスライドカバーの内面は、抽出溶液を保持する空間を形成している。前記空間は、基部の上面とスライドカバーの内面の間が中央部では浅く、周囲部では深いことが好ましい。スライドカバーは中央部に開口を有し、基部の上面とスライドカバーの内面の間にある空間へ抽出溶液を加えることが可能である。一つ以上の外面孔がスライドカバーの周囲部に設けられている。さらに、該装置は任意でスライドカバーの上部を覆うチャンバーカバーを包含する。
【０００８】
設定温度に応じて、温度制御装置はヒートブロック、クールブロック、熱電対、超音波装置、マイクロ波装置とすることが可能である。組織標本は凍結組織またはパラフィン包埋固定組織の薄片、均質化した組織層、細胞塗抹標本、微生物または細胞培養である。パラフィン包埋標本の組織は通常、固定液で固定されていることが好ましく、固定液としてはホルマリン、アセトン、アルコールまたはカルノア液が挙げられる。
【０００９】
抽出溶液は変性剤を含有する。好適な抽出溶液としては、タンパク質／ペプチド抽出用のもの（すなわち、ＮＤＭＥ−ＰＥ溶液）と、核酸抽出用のもの（すなわち、ＮＤＭＥ−ＮＥ溶液）の二つが挙げられる。ＮＤＭＥ−ＰＥ溶液は水及び、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を約０．０１〜５重量％、好ましくは約０．１〜２重量％、さらに好ましくは約０．５重量％含有する。ＮＤＭＥ−ＮＥ溶液は変性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び任意でクエン酸塩を含有する。
【００１０】
別の実施例においては、組織標本からの生体分子抽出法を開示している。前記方法は次の段階を包含するものである。すなわち、（１）組織標本を前記基部の上面へ置く段階、（２）組織標本を覆うため、スライドカバーを基部の上面へ設ける段階、（３）抽出溶液（標本のサイズにより約５〜２５０μｌの範囲で添加することが好ましい）を基部の上面とスライドカバーの内面との間にある空間へ加える段階、（４）基部の底面へ温度制御装置を接続する段階、（５）組織標本を所望の温度に調節するため、温度制御装置を操作する段階、（６）組織標本から抽出した生体分子を含む抽出溶液を採取する段階である。
【００１１】
温度制御装置により温度調節をした後、任意でスライドカバーに被せるチャンバーカバーを取り付ける。チャンバーカバーは、チャンバー内に蒸気を送り込み、抽出処置の間、組織標本の湿度を維持するという利便性を付加するものである。
ＮＤＭＥ法において、組織標本から生体分子を抽出する温度としては、−２０〜１２０℃の範囲が好適である。温度が高くなるほど抽出に費やされる時間は短縮するが、凍結組織、均質化した組織、または固定していない細胞培養標本に対しては、前記範囲の低温域が抽出により適する。これらの組織標本における最適な抽出時間及び温度は、約４〜１００℃下における約１０〜３０分間の抽出である。もし１００℃で抽出するならば、抽出時間は５分を越えるべきではない。
【００１２】
パラフィン包埋固定組織標本、特にホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）組織標本に対する抽出温度は約５０〜１２０℃の範囲が最適であり、約１００℃が最も好ましい。最適な抽出時間は、約５〜４５分である。
凍結組織またはパラフィン包埋固定組織の薄片について、その組織切片は生体分子抽出後の組織病理学的染色に適する。なぜなら、ＮＤＭＥ法は組織形態及び抗原性を破壊しないからである。組織病理学的染色を成功させるためには、抽出中及び抽出後に切片の乾燥を避けることが重要である。基部の上面に置かれた標本から抽出緩衝液を除いた後、基部を標本ごとＰＢＳ溶液中へ入れておくことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、非破壊高分子抽出（ＮＤＭＥ）装置、及び組織形態を破壊せずに組織標本から高分子を抽出する方法を提供するものである。組織標本としては、組織（新鮮または固定）及び組織切片、細胞塗抹標本、細胞、細胞培養及び微生物が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＮＤＭＥ技術は、固定組織中のホルマリン架橋タンパク質を最適な解離処理条件下で、自然な状態に近い非固定の状態へと解離することを目的としている。ＮＤＭＥ技術は、ＦＦＰＥ／凍結組織切片から可溶性タンパク質を抽出することができるだけでなく、抽出後も組織構造形態の完全性及び抗原性の回復を維持することが可能である。また、ＮＤＭＥ技術には、細胞塗抹標本、細胞標本、微生物、細胞培養を適用することもできる。本技術は、迅速且つ非破壊的抽出方法を用いることによって、ゲノム研究だけでなくプロテオミクス研究をも可能にする。さらに、抽出前及び抽出後の両方の標本について、免疫組織化学（ＩＨＣ）、切片上ハイブリッド形成法（ＩＳＨ）、ＩＳＨ−ＰＣＲ、ＩＳＨ−ＲＴ−ＰＣＲ、及び染色体転座を含む現在知られる全ての病理学的診断の評価を行うことができる（例えば、図１２を参照）。
【００１４】
ＮＤＭＥ装置は、４−２５ｍｍ２×５μｍの単独の組織切片から、組織形態を破壊することなくプロテオミクス及びゲノム分析に十分な量の高分子を抽出することができる。当業者によって変形が企図されるにせよ、ＮＤＭＥ装置の好適な実施形態は、図１−３に示すとおり、次のように説明される。
１．基部：図１−３に示すように、基部（５）は組織標本を保持し、装置の他の部品の中心基材となるように設計されている。基部（５）はガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレンまたはポリプロピレン）、テフロン(登録商標)、シリコンウエハー、セラミック、及び金属製であることが好ましい。最も好適な物質はガラスである。
２．スライドカバー：図１−３に示すように、ＮＤＭＥ装置のスライドカバー（１）は、特に基部上に装着することが可能で、抽出溶液を封じ込める密閉環境を備えることができるように設計されている。スライドカバー（１）は、組織切片及び／または緩衝液／抽出物と反応を起こすことのない不活性物質で作られていることが好ましい。スライドカバーに適した物質の例としては、金属、ガラス、テフロン(登録商標)、膜、及び高分子材料（例えば、ポリスチレン及び／またはポリプロピレン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。図２Ｂに示すように、スライドカバーは、 基部とともに水密の抽出室を形成するために、ゴムフレームを備えていることが好ましい。図１に示すように、スライドカバー（１）の中心部は基部上に置かれた組織切片から約１−２ｍｍ離れており、スライドカバー（１）のゴムフレーム内側の縁はスライドから離れるようにくぼんでいる。この設計が、毛管作用により中心部の組織切片上のみに抽出溶液を留めることを可能にしている。図１、２（Ｄ）、及び３に示すように、スライドカバーは抽出溶液を添加及び除去するための中央開口部（２）を有する。また、図１、２（Ａ）−２（Ｄ）、及び３に示すように、スライドカバー（１）はくぼんだ縁に２つの小さな外面孔（３ａ及び３ｂ）を有しており、空気が出入するように設計されている。抽出の間、中央開口部（２）はキャップ（１９）で塞ぐことができるが、２つの外面孔（３ａ及び３ｂ）は加熱／冷却中の圧力のバランスを保つため、常に開けておく。組織切片の大きさ及び厚さにもよるが、抽出室は５−２５０μＬの緩衝液を保持することが好ましい。また、スライドカバー（１）は抽出の間、隙間なく完全に密閉することも可能である。
３．温度制御装置：可溶性高分子の溶解を促進するため、ＮＤＭＥ技術は主に物理的力、特に温度及び任意で湿度の制御を規定時間適用することに基づく。したがって、温−冷蒸気循環／発生器、ホットブロック、コールドブロック、熱電対（１８）のような温度制御装置は、抽出工程を加速するための温度制御を備えている（図３）。さらに、マイクロ波は内部加熱／撹拌を誘起し得る電磁気力をもたらし、超音波は局所的なキャビテーション及び超高圧／高温を誘起する。これらはタンパク質の溶解、細胞膜の浸透、及び酵素活性の抑制の促進に有用である（図３）。マイクロ波はマイクロ波発生器（１６）によってもたらされる。超音波は超音波振動子（１３）及び超音波発生器（１４）によってもたらされ、超音波検出器（１７）によって測定される。
【００１５】
ＮＤＭＥ装置は、−２０℃と１２０℃の間の温度で動作することが好ましい（高温：１２０〜５０℃、中温：５０〜１５℃、低温：１５〜１℃、凍結温度：０〜−２０℃）。
上記した３つの主要部分に加え、ＮＤＭＥ装置は任意でチャンバーカバー（６）を包含する。図３に示すように、チャンバーカバーには、蒸気を送り込む吸気口（７）と蒸気を排出する排気口（８）が備えられている。チャンバーカバー（６）は吸気口（７）及び排気口（８）との併用によりＮＤＭＥ装置の湿り／冷却空気／蒸気を制御し、それが装置内における迅速な温度変換と湿度制御を次々と可能にする。蒸気または湿りガスは、蒸気／湿度発生器（１０）によって供給される。さらに、チャンバーカバー（６）は、蒸気圧を開放するバルブ（９）を有する。チャンバーカバー（６）により形成されるチェンバーは密閉することができ、蒸気／湿りガスの出入が内部の温度を速やかに変えることを可能にしている。温度はＣＰＵ（１５）によって探知及び制御される。
【００１６】
温度制御装置及びチャンバーカバーの併用効果により、ＮＤＭＥ装置は抽出工程を効果的に機能させることができる。ＮＤＭＥ装置は−２０℃と１２０℃の間という広い範囲で使用することが可能であるが、凍結組織切片、均質化された組織、及び／または細胞培養を含む凍結標本においては通常低温から温和な温度（４〜２５℃）で制御する。１００℃のような高温を選択した場合は、５分以下のような比較的短時間で標本を抽出することが好ましい。凍結標本を高温に長時間曝すことにより、標本の完全性及び形態を破壊する可能性がある。抽出工程が凍結温度（−２０℃から０℃）で実施される場合、低温によって酵素活性が部分的に抑制され、タンパク質構造への影響が少なくなるため、５から４５分といった長時間の抽出でも十分に機能する。
【００１７】
固定標本、特にホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片に対しては、５０〜１００℃のような中温から高温下で抽出を実施することが好ましい。ＦＦＰＥ組織標本に最も好適な温度は約１００℃である。抽出が約７０〜１２０℃で実施される場合、このような高温により酵素活性の抑制及びタンパク質の変性が起こる。したがって、抽出物及び組織標本を乾燥から守るために湿り蒸気をチャンバーへ送り込むことが好ましい。しかしながら、抽出工程中にスライドカバー（１）の中央開口部（２）及び２つの外面孔（３ａ及び３ｂ）をキャップ（１９）を使用して封じるならば、乾燥空気でも十分に機能する。
【００１８】
抽出は全抽出時間を通じて一定の温度下か、または温度サイクル下で行うことができる。加熱−凍結−解凍（−２０から１２０℃の範囲）サイクルが細胞及び／または微生物の膜を壊し、可溶性タンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡの放出する助けになり得る。温度設定を動かす場合、段階的に調節することも、または加熱／冷却温度調節スイッチを直接オン／オフすることによって調節することも可能である。
温度調節に加え、抽出溶液中の成分変更と、超音波／マイクロ波の継続時間、強度、頻度、及び温度のように様々な物理的力のパラメーターを適用することにより抽出を促進させることができる。例えば、標本が核酸の含量の少ない組織を含んでいる場合、加熱及び超音波環境下でＲＮＡを抽出することができる。高温環境下では、疎水性タンパク質、膜タンパク質、及び細胞質タンパク質を濃縮することができる。
【００１９】
また、ＮＤＭＥシステムの効果と効率は、抽出工程中で使用される抽出溶液のタイプによって決定される。程度の差はあるものの、水、塩類溶液、及び市販の緩衝液を含むいかなる溶液を用いてもＮＤＭＥ装置により組織標本から生体分子を抽出することは可能であるが、溶液中に変性剤を適用することで最高の性能が発揮される。変性剤を含有しない抽出緩衝液は、スライドカバー（１）と組織切片（４）との間にある空間へ注入添加することが非常に難しい。ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０、Ｕｒｅａ、Ｔｈｉｏｕｒｅａ、スルホベタイン、トリブチルホスフィン、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０等の変性剤が本発明への使用に適している。好適な変性剤はＳＤＳであり、特に水と併せて使用することが好ましい。ＳＤＳの濃度は０．１〜２重量％が好適であり、約０．５重量％がより好ましい。
【００２０】
本発明のＮＤＭＥ装置は、特定のチャンバーカバー（６）を特定のスライド標本へ使用して汚染を避けること、最少量の緩衝液を用いて最高の抽出濃度を得るための最高の組織被覆率を得ること、液体蒸発を防ぐこと、速やかな高温または低温切替を可能にすること、物理的力による損傷から組織形態を守ること、及び容易に緩衝液の添加と抽出物の除去を行うことが可能である。
【００２１】
以下に具体的な実施例を示すが、本発明の範囲を制限するものではない。当業者の想起するような適度の変更は、本発明の範囲から外れることなくここに織り込まれる。また、本発明の記載において、内容を明確にするために特定の専門用語が使用されている。しかしながら、本発明はここで選択された特定の専門用語に制限されるものではない。それぞれの特定要素は、同様の方法で同様の目的を達成するために機能する全ての技術的対応語句を含む。
【実施例１】
【００２２】
ＮＤＭＥ装置
ＮＤＭＥ装置はＢｉｏ−Ｑｕｉｃｋ社（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，  ＭＤ）によって設計され、前記装置は任意で抽出効率を促進するための超音波またはマイクロ波を実装し、良好な温度及び湿度調節を示した。
図３に示されるように、ＮＤＭＥ装置はチャンバーカバー（６）、基部（５）上のスナップオン式スライドカバー（１）に覆われた反応チャンバーを有する。温度制御装置（例えば、ホットブロック（１１）、コールドブロック（１２）、超音波発生器（１４）によって制御される超音波振動子（１３）、マイクロ波発生器（１６）、超音波検出器（１７）、及び／または熱電対（１８））は、物理的力（例えば、熱及び攪拌）をＮＤＭＥ装置に与えるため、基部（５）の底面に接続されている。反応チャンバーはチャンバーカバー（６）とスライドカバー（１）の間に形成される。反応チャンバーは、反応チャンバー内へ蒸気を送り込む吸気口（７）、及び反応チャンバーから蒸気を排出する排気口（８）を有している。
【００２３】
ＮＤＭＥ装置は、分子抽出のための化学的力として、組織標本由来の生体分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡ）の溶出を促進する抽出溶液を使用する。前記抽出溶液は変性剤を含有していることが好適である。ＮＤＭＥでの使用に適した変性剤の例としては、ＳＤＳ，ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０、Ｕｒｅａ、Ｔｈｉｏｕｒｅａ、スルホベタイン、トリブチルフォスフィン、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＮＤＭＥ法と併用するにおいて、次の２つの抽出用液が特に有用である。一つは水及び約０．５％のＳＤＳを含むＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液であり、タンパク質／ペプチド抽出に対して特に効果的である。もう一つはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＥＤＴＡ、及び任意でクエン酸塩（例えば、リン酸緩衝食塩水中に０．０１Ｍクエン酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）及びＲＮＡ抑制剤を含むＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液である。
【００２４】
湿度及び温度は、攪拌とともに温度制御装置及び反応チャンバーによって制御されている。基部（５）にしっかりと取付けることのできるスライドカバー（１）が、組織切片を覆う抽出溶液の薄層を保持するように設計されている。スライドカバーは、基部とスライドカバーの間に形成された空間へ抽出溶液を添加及び除去するための中央開口部（２）を有している。また、スライドカバー（１）は縁に２つの外面孔（３ａ及び３ｂ）を有している。加熱及び冷却処理の後、抽出溶液を前記空間から採取し、分子解析を進めることができる。
【実施例２】
【００２５】
試料調製
Ａ．材料及び方法
Ｉ．組織の選択及び準備
脳、乳房、心臓、すい臓、肝臓、肺、脾臓、リンパ節、大腸、及び前立腺に由来するＦＦＰＥ組織及び凍結組織について試験を行った。ＦＦＰＥ組織切片は保存期間３ヶ月から５０年のものに及ぶ。抽出前に、ＦＦＰＥ切片を２分間キシレン中に浸す処理を５回行って脱パラフィンし、同じく１００％アルコールで２回処理した後、９５％アルコールで処理して再水和させ、その後室温で５分間風乾した。
【００２６】
II.タンパク質及びＲＮＡ抽出
Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）のＴｉｓｓｕｅ−ＰＥ  ＬＢ緩衝液、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０１Ｍクエン酸ナトリウムを含む一般的な抗原回復処理液２種、Ｂｉｏ−Ｑｕｉｃｋ社（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，  ＭＤ）のＮＤＭＥ−ＰＥ（タンパク質の抽出に好適）、ＮＤＭＥ−ＮＥ（核酸の抽出に好適）及びＮＤＭＥ−Ｕ（タンパク質及び核酸の抽出用）抽出緩衝液を用い、抽出効率について試験を実施した。Ｂｉｏ−Ｑｕｉｃｋ社（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，  ＭＤ）製作のスナップオン式カバースリップ付の脱パラフィン化スライド切片上に、組織切片の大きさに応じて抽出緩衝液を５〜２５０μＬ添加した。
【００２７】
図３に示されるように、組織標本はＮＤＭＥ装置（実施例１のＢｉｏ−Ｑｕｉｃｋ社製）の基部（５）上に置かれ、スライドカバー（１）で覆われた。５μＬから２５０μＬの抽出液が、中央開口部（２）を通じてスライドカバー（１）と基部（５）との間にある空間へ添加された。チャンバーカバー（６）はＮＤＭＥ装置へ接続された。温度制御装置を作動させ、約１００℃で５〜３０分間加熱し、それと同時に吸気口（７）からチャンバーカバー（６）とスライドカバーの間にある反応チャンバー内へ湿り蒸気を送り込み、排気口（８）から排出させた。反応完了後、装置を速やかに４℃に冷却した。スライドカバー（１）の中央開口部（２）を通じて抽出物を取出し、これ以上の精製は行わずにゲル性のタンパク質分析やＰＣＲに使用するか、または後の使用のため−７０℃で保存した。ＲＮＡ分析のため、抽出物はデオキシリボヌクレアーゼＩで処理し、変性させ、第一鎖ｃＤＮＡに逆転写し、その後ＰＣＲ増幅を行った。抽出処理後、スライド切片は、Ｈ＆Ｅ、ＩＨＣＣＩＳＨ、及びＦＩＳＨのような組織学的診断に用いるためＰＢＳ緩衝液で濯いだ。あるいは、通常のＦＦＰＥスライド切片として長期保存用に処理した。
【００２８】
ＩＩＩ．ＩＨＣ染色
ＮＤＭＥ処理を行っていない組織切片にＩＨＣ染色を施す場合、慣用プロトコルに従った抗原回復を要するだろう。ＮＤＭＥ処理後の組織切片にＩＨＣ染色を行う場合は、これ以上抗原回復処理を行う必要はない。様々な希釈のＰＡＰ、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２、ＥＲ、サイクリンＥ、ＣＥＡ、ＬＣＡ、ＣＤ５、サイトケラチン、ＣＤ２０、ＣＤ３０、及び／またはＨＩＶ  ｐ２４に対する抗体と共にインキュベートする前に、内在性ペルオキシダーゼ及び非特異的タンパク質結合を抑えるため、組織切片を３％Ｈ２Ｏ２で１０分間、１０％ウシ血清アルブミンで２０分間、それぞれ室温にて処理した。ＰＢＳ中で洗浄した後、全てのスライド切片はビオチンを結合させた抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体のどちらかと共に室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、全てのスライド切片は、ＡＢＣキットと共に室温で３０分間インキュベートした。その後、ＤＵＢ基質（Ｄａｋｏ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）を用いて発色を行った。一次抗体を使用しない染色、または不適切な一次抗体を使用した染色をネガティブコントロールとした。
【００２９】
ＩＶ．ＣＩＳＨ及びＩＳＨ染色
ＮＤＭＥ処理後、スライド切片上で直接ＩＳＨ染色を行った。κ型及びλ型免疫グロブリンのｍＲＮＡに特異的なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識プローブ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，  Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，  ＣＡ）を組織切片に適用し、スリップカバーで覆い、１００℃のスチーマー内で５分間処理して変性させた。組織切片を冷却し、室温で約１時間をかけてプローブとハイブリッド形成させた。組織切片は２倍濃度ＳＳＣ中でそれぞれ３分間２回洗い、モノクローナルマウス抗ＦＩＴＣと３０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中でそれぞれ３分間２回洗浄した。組織切片はビオチン化二次抗体と共に室温で３０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で３分間の洗浄を２回行い、その後ストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と共に３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、着色のためスライド切片を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム試薬で処理した。それぞれの反応において、ＢｉｏＧｅｎｅｘから得た適当なポジティブ及びネガティブコントロールを使用した。ｃ−Ｍｙｃ転座ＣＩＳＨ染色は、Ｚｙｍｅｄ社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）の使用説明に従って行った。
【００３０】
Ｖ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法
１〜５μｇのタンパク質、またはＮＤＭＥ装置から回収された２０μＬの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加液と混合し、終末濃度を６５ｍＭトリス、５％２−メルカプトエタノール、３％ＳＤＳ、１０％グリセロール、及びブロモフェノール・ブルーとした。その後７０℃で１０分間変性させ、４〜１５％ＮｕＰＡＧＥ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を適用した。電気泳動の後、ゲルを取り除き、抽出された高分子の分布を視覚化するため、製造者の使用説明（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）に従って銀染色またはクマシーブルーによる染色を行った（クマシーブルーでタンパク質のみを染色し、銀染色でタンパク質及びＤＮＡ／ＲＮＡを染色した）。
【００３１】
ウェスタンブロット分析のため、分離後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２０容量％エタノール、０．０２％ＳＤＳを含む転写緩衝液中にて１００Ｖで１時間処理し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上に転写した。前記膜はＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で一度洗い、５％ミルクを含むＴＢＳ緩衝液中で振盪しながら室温にて１時間から一晩かけてブロッキングを行った。その後、膜は一次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＴＴＢＳ（ＴＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を付加）で３回洗い、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ結合抗ＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートした。ＴＴＢＳで３回洗浄した後、前記膜はタンパク質バンドを視覚化するために、ＬｕｍｉＧＬＯ  ＥｌｉｔｅまたはＡＰ  Ｃｏｌｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（ＫＰＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，  ＭＤ）で処理した。
【００３２】
ＶＩ．逆相タンパク質アレイ（Reverse-Phase Protein Arrays）
プロテオーム解析法はＰａｗｅｌｅｔｚら（Oncogene. 2001;20:1981-1989）によってすでに説明されている。つまり、ニトロセルロースを被覆したＦＡＳＴスライド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，  Ｋｅｅｎｅ，  ＮＨ）上に組織抽出物をアレイした。各標本はそれぞれ希釈を繰り返しながら順次１：２希釈曲線にスポットした。抽出緩衝液のみによるスポットは、ネガティブコントロールとした。スライドは、Ｍｉｌｄ  Ｒｅ−Ｂｌｏｔ  Ｐｌｕｓの１０％溶液中で１０分間インキュベートし、続いてカゼインを主としたブロッキング溶液であるＩ−Ｂｌｏｃｋ中で少なくとも１時間インキュベートしてシグナル発生に備えた。シグナルは、ビオチン化抗体−リガンド複合体の部位で結合するビオチン−チラミドの酵素介在沈殿物に基づくＣＳＡシステムを用いて発生させた。アレイはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  ＵＫ）を用いて解析した。バックグラウンド補正後のスポット強度は、標的タンパク質の濃度に比例した（Paweletz et al., Oncogene. 2001;20:1981-1989）。同様に、シプロルビーによる染色後に総タンパク質量が決定され、これをタンパク質負荷の規準化に使用した。
【００３３】
ＶＩＩ．ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ＮＤＭＥ抽出物中のタンパク質は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）の疎水性逆相チップ（hydrophobic reverse phase chip）（Ｈ４）を用いて精製及び濃縮した。２μＬのアセトニトリルをスポットにセットすることによりチップを準備しておき、アセトニトリルが完全に蒸発する直前に２μＬのタンパク質抽出物をその表面に適用する。タンパク質標本と表面とを相互作用させるため、チップを高湿度下で２０分間インキュベートした。インキュベート後、チップは５μＬの３０％アセトニトリルで５回洗浄し、空気乾燥させた。結合タンパク質と共結晶化するために、それぞれのタンパク質結合チップスポットへ５０％アセトニトリル及び０．５％トリフルオロ酢酸中に飽和溶解したシナピン酸を１μＬ添加した。その後チップをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  １  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ＰＢＳ−ＩＩ）のチップリーダー内へ移し、データ自動収集プロトコルに従って結合タンパク質の分子量を測定した。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．０の使用によりデータ解析を増強した。
【００３４】
ＶＩＩＩ．β−アクチンｍＲＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲ分析
細胞質のβ−アクチン遺伝子を選出し、増幅した。なぜならば、この遺伝子は全細胞に存在する構造タンパク質をコードしているからである。１５０から１０００ｂｐを超える様々なサイズの単位複製配列を作るためのプライマーが合成された。ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）のＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに準じて実施した。ＰＣＲ反応は、適切なコントロールと同様に通常３０〜４０の増幅周期で行った。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲル上に分離させた。
【００３５】
ＩＸ．組織形態に対するＮＤＭＥ法の影響
ＮＤＭＥ−ＮＥ及びＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液を用い、高湿度下で１００℃の加熱処理を２０分間行うＮＤＭＥ法により、リンパ節及び前立腺がんのＦＦＰＥ組織切片を抽出した。また、ＮＤＭＥ−ＮＥ及びＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液を用い、高湿度下で１００℃の加熱処理を５分間行うＮＤＭＥ法により、リンパ節及び前立腺がんの凍結組織切片を抽出した。Ｈ＆Ｅ染色により、ＮＤＭＥ処理後のＥＥＰＥ及び凍結組織切片の形態学的調査を行った。抽出された可溶性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００３６】
Ｘ．組織形態及び抗原性に対する様々なＮＤＭＥ緩衝液の影響
ＮＤＭＥ−ＮＥまたはＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液を用い、ＮＤＭＥ法によりリンパ節のＦＦＰＥ標本を抽出した。組織切片はＨ＆Ｅ及びＩＣＨで染色した。
【００３７】
ＸＩ．形態学的分析及びプロテオミクス分析の同時実施によるプリオン病の調査
中枢神経系（ＣＮＳ）の進行性変性に起因する海綿状脳症としても知られているプリオン病は、大脳皮質及び小脳に空胞状変化、神経細胞脱落、及びグリオーシスをもたらす。プリオン病は動物とヒトの両方に発生することで知られている。ＣＤＪ（クロイツフェルト・ヤコブ病）はヒトを侵す最も一般的なプリオン病である。例えばヒツジ（スクレピー）及び乳牛（ウシ海綿状脳症）のような家畜におけるプリオン病は、農産物市場及び食品関連市場に重大な経済的損失をもたらす可能性を有している。
【００３８】
プリオンとは、タンパク質を基礎とした感染症を表す。プリオンタンパク質は、３つのα−ヘリックスをもつ正常なＰｒＰｃ型と、２つのα−ヘリックス及び１つのβ−シートをもつ疾患を誘起するＰｒＰｓｃ型の２種の高次構造を有している（ｃはｃｅｌｌｕｌａｒ（細胞の）、ｓｃはＳｃｒａｐｉｅ（スクレピー）を表す）。これら２種のプリオンタンパク質の立体構造上の相違から、プロテイナーゼＫはＰｒＰｃのみを消化し、ＰｒＰｓｃを消化しない。
【００３９】
正常な脳及びプリオン脳の組織切片にプロテイナーゼＫを含む消化処理、またはプロテイナーゼＫを含まない消化処理を行った。その後、これらの標本に対し、ＮＤＭＥ−ＰＥ抽出溶液を用い、高湿度下で２５分間１００℃に加熱するＮＤＭＥ法を施した。正常例及びプリオン症例から抽出された可溶性タンパク質は、ウェスタンブロット法を用いて分析し、標本はＩＨＣ染色により分析した。両試験ではプロテイナーゼＫによる消化の前後に、プリオン特異抗体（３Ｆ４）を使用してプリオンタンパク質のサイズ及び位置を決定した。
【００４０】
ＸＩＩ．がんの診断及び調査
前立腺がん（ＰＣａ）はホルモン反応性腫瘍であるため、前立腺におけるステロイド代謝に関するタンパク質の研究は、疾患の生物学及び臨床経過に光明を投じる可能性がある。近年、広域性の遺伝子発現調査により、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）が悪性の前立腺組織で過剰発現されるいくつかのタンパク質の一つとして特定された。ＡＭＡＣＲはステロイドホルモンの中間体を含む長鎖分岐脂肪酸の代謝に関わる酵素である。ＡＭＡＣＲは８０％以上の前立腺がんにおいて強力且つ特異的に陽性を示す。そのＰｃａに対する高感度及び高特異性が、ＰＣａの発生におけるＡＭＡＣＲの生物学的機能が不明であるにも関わらず、ＡＭＡＣＲを有望なＰＣａバイオマーカーになさしめている。
【００４１】
ＮＤＭＥ法は組織を破壊せずに組織由来のタンパク質及び核酸の分析を可能にするため、単独の組織切片（及び顕微解剖された標本）について、その組織を形態及び局在性の調査に用いると同時に、組織抽出物を分子サイズでの識別及び同定に用いることができる。この発明は、微量の組織を用いてＡＭＡＣＲ変異体とＰＣａの相互関係を分子レベル（タンパク質及びｍＲＮＡ）と形態レベルの両面から解明する初の技術である。
ＰＣａ類を含む前立腺針生検凍結標本のタンパク質発現パターンを比較する盲検的なＮＤＭＥ試験を実施した。これらの標本からＮＤＭＥ法によってタンパク質抽出物を得た後、ＬＮＣａｐ及び２９３細胞株から得たタンパク質抽出物と比較した。ＡＭＡＣＲのサイズ及び強度は、Ａｂｃａｍ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）より得たＡＭＡＣＲに対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を用いてウェスタンブロット法により分析した。
【００４２】
ＸＩＩＩ．ＦＦＰＥ前立腺がんＬＣＭ標本の調査
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）によってＦＦＰＥ組織標本より選出した５〜６０００細胞の腫瘍性及び良性の前立腺上皮からＮＤＭＥ抽出物を採取し、ウェスタンブロット法によりＡＭＡＣＲを分析した。
【００４３】
ＸＩＶ．古い組織切片標本の調査
天然痘は痘瘡ウィルスに起因する高い伝染性及び毒性をもつ感染症であり、ワクチン接種のない集団において罹患率が９０％、致死率が最高３０％にのぼる。ワクシニアは天然痘に対する効果的な予防接種に用いられるウィルス株である。１９８０年の風土病性天然痘の撲滅により、世界中でワクチン接種が中止された。
【００４４】
他のポックスウィルスと同様に、痘瘡の完全なゲノムは１０年前まで入手可能であったが、痘瘡タンパク質に関する信頼性のあるデータは実質的に存在しない。天然痘の検出に関する最近の進展は、ＤＮＡ同定法の容易性及び有用性により大部分が痘瘡ウィルスのＤＮＡに基づく方法に集中している。痘瘡ＤＮＡの速やかな同定のため、作成された組換えプラスミドまたは保存された組織標本からの抽出物を用いた多くの実時間ＰＣＲ法が開発されている。ウィルスＤＮＡは切片上ハイブリッド形成法により、組織切片上で直接識別を行うことも可能である。ＰＣＲの実施がより迅速且つ簡便であると同時に、ウィルスの標的となる特定細胞を切片ハイブリッド形成法により同時同定することも可能となる。
【００４５】
痘瘡ウィルスが入手不能であり、痘瘡タンパク質の調査が不十分であるため、天然痘に対する特異抗体は存在しない。ＮＤＭＥ技術は、保存された組織からタンパク質及びＲＮＡ／ＤＮＡを抽出する効果的な方法、及び、多くの保存された疾病、特に天然痘のような現在直面していない疾病についての遡及的プロテオミクス研究を実行する効果的な方法を提供する。
【００４６】
５０年を経た天然痘患者の組織切片及び他の保存切片由来の単独スライド切片、及びコントロール、すなわち正常な皮膚、ワクシニア感染組織、単純ヘルペスウィルス感染組織からのタンパク質及び核酸の抽出にＮＤＭＥ技術を適用した。ＮＤＭＥ抽出物にはＰＣＲ及び免疫化学的染色が施された。
【００４７】
Ｂ．結果
１．ＦＦＰＥ組織からのタンパク質と核酸のＮＤＭＥ抽出
ＦＦＰＥ組織切片から様々な抽出緩衝液で抽出した生体分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較した。一般的に、クマシーブルー染色は０．３〜１μｇ／ｂａｎｄのレベルでタンパク質を検出するが、ＤＮＡ／ＲＮＡは検出しない。一方、銀染色はタンパク質とＤＮＡ／ＲＮＡの両方を非常に高感度（２ｎｇ／ｂａｎｄ）で検出する。
【００４８】
図４Ａに示すように、ＮＤＭＥ−ＰＥ（レーンＢ）は他の緩衝液（レーンＸ、Ｅ、Ｃ、及びＰ）よりも著しく多量のタンパク質を抽出した。銀染色ではクマシーブルー染色よりも多くの高分子量の類が見られ、溶液中に多量の核酸が存在することを示している。また、組織切片から抽出されたタンパク質の量は予想どおり、組織が新鮮ないしホルマリン固定されているかどうかに影響された（図４Ｂ）。通常、典型的な新鮮組織切片（５μｍ×１ｃｍ２）からは、約５〜１０μｇの総タンパク質、約０．１〜０．３μｇの総核酸が抽出された。従来のＦＦＰＥ組織から抽出された高分子の量は、新鮮組織の約１０〜２５％であった。本試験はＮＤＭＥ技術によりタンパク質と核酸の両方が抽出可能であることを示し、また緩衝液成分の変更により選択抽出が可能であることを示唆している。
【００４９】
リンパ節、肝臓、脳、肺、及び前立腺から抽出されたタンパク質は異なるバンドパターンを示しており（図４Ｃ）、ＦＦＰＥ切片から異なるタイプ及び異なる量のタンパク質が抽出されたことを示唆している。抽出されたタンパク質には、高分子量の類よりも低分子量の類の方が多く含まれていたが、１８８ＫＤもの高分子量を有するタンパク質が多少抽出されたことから、ＮＤＭＥ抽出法が高分子とホルムアルデヒドの架橋を効果的に解離することが示唆される。抽出時間を延長すれば相対的に多量の高分子が得られるが、長時間の抽出過程の間に組織の形態が破壊されるため、完全性が失われる。
【００５０】
２．ＮＤＭＥ処理後に保存される組織形態
ＮＤＭＥ法が他の抽出法に比べて独特な点は、抽出後に同じ組織切片を用いてスライドに基づく形態及び局在性の調査ができるよう、抽出処理後も組織形態を保存するという能力にある。図５Ａに示すように、ＮＤＭＥ処理を行った組織切片上におけるＨ＆Ｅ染色は、通常、ＮＤＭＥ処理を行わないものよりも鮮やかであった。ＮＤＭＥ処理を行わない組織切片に比べ、ＮＤＭＥ処理後のリンパ節切片では、好酸性細胞質（eosinophoilic cytoplasm）がより染色されていることが低倍率下（１００倍）の観察で明らかになった（利用可能なデータ）。高倍率下（１０００倍）では、細胞−細胞の空間／間隙が消失したように感じられ、細胞と核がわずかに膨張して核小体が一層観察し易くなった。好酸性顆粒、好酸球の二葉核、好塩基性細胞質、及び丸い斑状をした形質細胞の染色質核小体といった微細構造が、無傷のまま残存していた。
【００５１】
ＮＤＭＥ処理はＨ＆Ｅ染色に加えてＩＨＣ染色をも増進し、抗原回復の必要性が排除された。処理時間を延ばしながらＮＤＭＥ抽出処置を行った連続的なＦＦＰＥ組織切片上に、抗ＣＤ５抗体を用いた免疫組織化学法を施した（図５Ｂ）。抽出溶液はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した（図５Ｃ）。ＮＤＭＥ処理を行わなかった切片（０分）では、ホルマリン固定後の激しい抗原マスキングのため、スライド切片に可視的なＩＨＣシグナルは現れなかった。抽出時間の増加により、組織切片上のＩＨＣシグナル強度と抽出される分子の量の両方が増大した。ＮＤＭＥ−ＰＥ中における５分間のインキュベーションでは、タンパク質はわずかしか得られなかった。２０分を超える抽出処理においては、さらに大量のタンパク質、特により高分子量のものが観察された。ＩＨＣシグナルは３０分に至る抽出処理時間の増加と共に増進し、さらに２０分に至るまでは組織形態の大部分が変化せずに残存していた。詳細な抗原位置及び形態を明瞭に観察することができた。パネルＡにおいて青色のヘマトキシリン対比染色が消失していることからも明らかなように、抽出３０分後に恐らくは核構造の損失によるものと思われる顕著な形態変化が見られた。この試験は、大きなタンパク質ほど多くの架橋を解離する必要があるため、放出に時間がかかることを示している。さらに、切断表面にないタンパク質、及び膜や細胞粒子に埋没したタンパク質は、溶液中へ再溶出するのに時間を要するであろう。
【００５２】
また、図１２に示すように、ＮＤＭＥ処理は抽出処理後も組織形態を保持し、抽出後も同じ組織切片をスライドに基づいた形態性及び局在性の調査に使用することができた。ＦＦＰＥ組織切片上におけるＨ＆Ｅ染色は、ＮＤＭＥで処理した組織切片（図１２（Ｂ））の方が、無処理のもの（図１２（Ａ））よりも概して鮮明であった。また、リンパ節切片における細胞質染色もＮＤＭＥ抽出後に増進した。細胞−細胞の空間／間隙が消失したように感じられ、また、個々の細胞と核が少し肥大して高倍率（１０００倍）下で核小体が一層容易に観察できるようになった。好酸球の好酸性顆粒のような細胞質構造、及び形質細胞核の斑状のクロマチンパターンのような核機構が、無傷のまま残存していた。凍結組織切片上におけるＨ＆Ｅ染色は、概して増進した。ＮＤＭＥで処理した組織切片の核染色（図１２（Ｄ））は、無処理のもの（図１２（Ｃ））よりも高い分解能を示した。
【００５３】
ＮＤＭＥ処理を施した組織切片におけるＨ＆Ｅ染色は、処理を施さないものよりも概して鮮明であった（図１３（Ａ））。様々なＮＤＭＥ緩衝液を比較すると、ＮＤＭＥ−ＰＥ処理後のリンパ節ＦＦＰＥ組織切片（図１３（Ｃ））の方が、ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液で処理した切片（図１３（Ｂ））よりも、高倍率（１０００倍）下において好酸性細胞質（eosinophoilic cytoplasm）がより多く染色された。ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液による抽出によって、細胞と核はさらに少し膨張し、核小体及び微細構造が消失した。しかしながら、好酸性顆粒、好酸球の二葉核、好塩基性細胞質、及び丸い斑状をした形質細胞の染色質核小体は、無傷のまま残存していた。
【００５４】
また、図１４（１４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の左パネル）に示すように、様々なＮＤＭＥ緩衝液（Ａ＝コントロール、Ｂ＝ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液、Ｃ＝ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液）が使用された場合、低倍率（１００倍）下においてはリンパ節のＨ＆Ｅ染色に違いは見られない（図１４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の左パネル）。しかしながら、Ｂｃｌ−６抗原のＩＨＣ染色（図１４（Ａ）の中央パネル）では、ＮＤＭＥ処理を行わない切片の染色が陰性を示した。ＮＤＭＥ処理を行った切片の染色は、陽性であった（図１４（Ｂ）及び（Ｃ）の中央パネル）。ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液で処理した組織切片（図１４（Ｃ））は、ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液で処理した組織切片（図１４（Ｂ））よりも強く染色された。前立腺がん組織切片上におけるＡＭＡＣＲ抗原のＩＨＣ染色において、ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液で処理した組織切片（図１４（Ｃ）の右パネル）にはＡＭＡＣＲの陽性染色が強く認められたが、ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液で処理した切片（図１４（Ｂ）の右パネル）の染色では陰性であった。
【００５５】
図１３及び１４の結果は、ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液がタンパク質の抽出により適していることを裏付けた。ＮＤＭＥ処理後、組織切片の形態及び抗原性は保存され、Ｈ＆ＥとＩＨＣの両染色において優れたコントラストを呈した。
【００５６】
３．ＮＤＭＥ抽出物中及びＮＤＭＥ抽出後の組織切片上におけるタンパク質の分析
ＮＤＭＥ処置により抽出されたタンパク質が完全性（サイズ）及び抗原性を保持しているかどうかを詳細に調査するため、図６に示すように、保存されたＦＦＰＥ切片から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、及び４つの抗体と免疫ブロットさせた。４つの抗体は全て、予期したサイズで対応する抗原を認識した。パネルＡにおいて、２４ＫＤのＨＩＶカプシドタンパク質に特異的な抗体である抗ｐ２４は、ＨＩＶ陽性（＋）リンパ節においてバンドを検出したが、ＨＩＶ陰性（−）の反応性リンパ節（ＬＮ）においては検出しなかった。一方で、同じ反応性ＬＮに由来する抽出物において、一般的な膜糖タンパク質に対応する３２ＫＤのバンドが予想通り観察された。パネルＢにおいて、抗サイクリンＥは未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）及びバーキットリンパ腫（ＢＬ）の両組織に由来する抽出物に５２ＫＤの一般的な核タンパク質バンドを検出した。対照的に、抗ＣＤ３０は予想通り、ＡＬＣＬ切片にゴルジ小粒（Golgi particles）で処理される８５ＫＤの前駆タンパク質及び成熟した１２０ＫＤのタンパク質を検出したが、ＢＬ切片においては検出されなかった（パネルＣ）。分子解析（図６Ｂ）は、ＡＬＣＬがサイクリンＥ及びＣＤ３０の両方を発現し、ＢＬはサイクリンＥのみを発現したという点でＮＤＭＥ処理後の組織切片上におけるＩＨＣ（図６Ｃ）とかなりの相関を示した。１８０ＫＤのＣＥＡ及び２２０ＫＤのＬＣＡのような大型の膜タンパク質が、ＮＤＭＥ法によって抽出された（利用可能なデータ）。この試験は、分子分析によりタンパク質のサイズ及び量に関する情報が与えられ、さらにＩＨＣが細胞形態の詳細及びタンパク質発現の分布をもたらすことを明らかにした。
【００５７】
４．近代技法によるタンパク質抽出物の分析
非破壊性の分子抽出法を開発する根源的な理由は、古典的な病理学的診断と、タンパク質アレイ及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Fetsch et al.， Am J Clin Pathol. 2002, 118(6):870-6）のような技術的にさらに進んだタンパク質バイオチップ技術及びタンパク質プロファイリングとを組合せることにある。ＮＤＭＥ処置によって様々な組織から抽出されたタンパク質は、ＮＤＭＥ−ＰＥで順次２倍に希釈し、逆相タンパク質溶解マイクロアレイ（reverse-phase protein lysate microarrays）（図７）を行うためにニトロセルロースを被覆したスライドガラス上にセットした。凍結組織由来の抽出物（Ｎｏ．１）に比べ、エタノール固定組織（Ｎｏ．３）またはホルマリン固定組織（その他残り）からはかなり多量のタンパク質が抽出された。一般的なケラチンタンパク質は様々な種類の組織で見られたものの、前立腺特異タンパク質であるＰＳＡ（前立腺特異抗原）及びＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）は、専ら３つの前立腺組織（Ｎｏ．８〜１０）のみにおいて発現した。
【００５８】
図８はＦＦＰＥ組織切片からＮＤＭＥ技術によって抽出されたタンパク質のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。ＦＦＰＥ組織切片由来のタンパク質抽出物は市販の疎水性逆相タンパク質チップと結合させることにより濃縮及び脱塩し、その後結合タンパク質をＳＥＬＤＥ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。ＦＦＰＥ組織及び凍結組織から抽出したタンパク質の総合的な分析結果は明らかに類似していた。この所見は、低質量電荷比（ｍ／ｚ）範囲及び１０Ｋ〜２０Ｋの高ｍ／ｚ範囲に示されるスペクトル拡散に対して当てはまった（図８Ａ）。緩衝液成分は、組織切片から抽出される分子の種類及び量（図４）のみならず、タンパク質チップの結合親和力及び結合選択性に対しても影響を及ぼした。そのため、タンパク質の分析結果は、組織の保存方法よりも抽出緩衝液の種類に強く影響を受けた。タンパク質のプロファイルが新鮮組織のものに最も近づくように、新鮮組織及び各固定組織に最適な緩衝液を見出すための系統的研究がさらに必要であるが、図８はＮＤＭＥ技術が多量且つ広範囲のタンパク質の抽出によく適し、タンパク質アレイ及び質量分析のような現代の分子分析技術に適合するものであることを示している。
【００５９】
５．ＮＤＭＥ技術の感度及び特異性
ＮＤＭＥ技術は高効率であった。低感度のウェスタンブロットゲル分析に十分な量のタンパク質を３ｍｍ２の組織切片から抽出することができた。図９に示すように、１．５×２ｍｍ２に顕微解剖したＦＦＰＥ組織切片は、他の標準サイズの切片に比べて確認できるタンパク質が非常に少量であるにもかかわらず、ウェスタンブロット上にＥＲ特有のバンドを示すに十分なシグナルを発した。ＥＲ陰性であった症例２にはＥＲバンドが検出されなかった。ＮＤＭＥ抽出後、組織切片はさらに形態的組織化学的評価に用いられた。症例１はＨｅｒ−２陽性（＋）及びＥＲ陰性（−）の乳がんのものである。前記乳がんは少数の正常な腺を除き、ほとんどの腺が腫瘍性であり、且つＨｅｒ−２陽性であった（図１０Ｃ）。正常な腺はＥＲ陽性であり、腫瘍性の腺はＥＲ陰性であった。そのため、ウェスタンブロット上における症例１由来抽出物のＥＲバンドは、症例３のＥＲ陽性（＋）の乳がん由来のものほど強くはなかった。さらに、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションによって選定された５〜６０００細胞の腫瘍性及び良性前立腺上皮に由来するＮＤＭＥ抽出物からは、ウェスタンブロットによってＰＡＳ、ＰＡＰ、及びＡＭＡＣＲを検出することができた（入手可能なデータ）。これらの結果は、ＮＤＭＥ技術が高い感度及び特異性を有し、顕微解剖後の選択的なタンパク質分析及びプロファイリングを可能にすることを示している。
【００６０】
６．ＮＤＭＥ抽出物中及び抽出後の組織切片上におけるＤＮＡ／ＲＮＡの分析
ＮＤＭＥ技術、及び下流ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ増幅の直接的な補助により、品質及び完全性の高いＤＮＡ及びＲＮＡが抽出された（図１０）。定量分析はＦＦＰＥ組織切片から抽出したｍＲＮＡの量が凍結組織由来のものの５０％未満であったことを示し、組織固定処理の間にＲＮＡがいかによく保存されたかに依存している。ＮＤＭＥ技術を用い、３０年保存されたＦＦＰＥ網膜組織の単独切片から得た抽出物は、６つのサンプル中４つに長さ３６７ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を生じた（図１０Ａ）。同様に組織抽出物から１３０９ｂｐのＰＣＲ産物を得た（図８Ｃ）。さらに、図１０Ｂ及び１０Ｄに示すように、ＮＤＭＥ処理後の組織切片は、ＲＮＡ−ＩＳＨ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，  Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，  ＣＡ）及びＣＩＳＨ（Ｚｙｍｅｄ  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）といったスライド切片に基づく局在性分析に用いることができた。ＮＤＭＥ処置の後もなお、組織切片は十分な細部形態と優れたハイブリダイゼーションシグナルとを備えていた。青色染色（図１０Ｂ）により、伝染性単核球症リンパ節の連続切片上のエプスタイン・バーウィルス初期ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）の位置が明らかになった。ＮＤＭＥ処理の前後でハイブリダイゼーションパターン及び強度に検出可能な違いはなかったが、ＮＤＭＥ後の対比染色強度には低下が認められた。さらに、ＮＤＭＥ前後のバーキットリンパ腫組織切片において、明らかなｃ−Ｍｙｃ転座が認められた。
【００６１】
７．形態及びプロテオームの同時分析によるプリオン病の調査
正常な脳組織、プリオン症例Ｉ及びプリオン症例ＩＩの組織切片におけるＮＤＭＥ処理の結果を、それぞれ図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃに示す。プリオン病症例（図１５Ｂ及び１５Ｃ）のウェスタンブロット（中央パネル）及びＩＨＣ染色（下パネル）にのみ、プロテイナーゼＫ抵抗性ＰｒＰＳＣが観察された。前記結果は、ＮＤＭＥ技術がさらなるプロテオーム分析に十分な量のタンパク質を抽出すると同時に、組織切片の形態を保持していたことを示している。
【００６２】
８．がんの診断及び調査
前立腺全摘除術中に得た４つの凍結生検標本の分析を行った。図１６に示すように、標本３及び５は未分化腫瘍に分類される類似の組織像を示し、さらに類似する標本２及び４は高分化型腫瘍に分類することができた（図１６Ｂ）。これらの標本に由来する組織抽出物中には異なるＡＭＡＣＲ発現パターンが観察され、これはＰＣａの組織像にある程度関連すると思われた。症例２及び４に由来する抽出物は２つのＡＭＡＣＲバンド、すなわち３８ｋＤａに強いバンド、４９ｋＤａに弱いバンドを示し、症例３及び４に由来する抽出物では４９ｋＤａに強いバンドが認められた。さらに、同じ標本の良性（１）領域及びがん性（２）領域を解剖し、両領域から別々にタンパク質を抽出した。良性領域由来のＡＭＡＣＲは、がん性のＢ領域におけるＡＭＡＣＲ発現と異なり、４９ｋＤａに微かなバンドを示すのみであった。前立腺がん細胞株ＬｎＣａｐは３８ｋＤａに強いバンドを示し、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３では、６２ｋＤａと１７０ｋＤａに２つのバンドが認められた。この２つの高分子は、分子量が５４〜２５ｋＤａの間である有力な５つのＡＭＡＣＲ変異体の範囲からは外れている。これらの高分子は、ダイマリゼーション及び／または転写後修飾の結果によるものであろうと予想された。
ＮＤＭＥ法を施すことにより、単独のスライド切片を用いて前立腺組織の組織像及びＡＭＡＣＲタンパク質発現パターンが得られることが明らかになった。
【００６３】
９．ＦＦＰＥ前立腺がんＬＣＭ標本の研究
図１７に示すように、前立腺がん症例１及び２と、症例３、４及び５との間で、抽出物中にサイズ及び強度の異なるＡＭＡＣＲが観察された。これらの結果は、ＮＤＭＥ技術が顕微解剖後に選択的なタンパク質の分析及びプロファイリングを可能にするほどの効率性及び特異性を有していることを示している。
【００６４】
１０．古い組織切片標本の研究
２０９ｂｐからなるオルトポックス・ウィルスの血球凝集素遺伝子産物に対応するＰＣＲ産物が、天然痘組織（症例４）のＮＤＭＥ抽出物から増幅された。結果を図１８Ｅに示す。ワクシニア血球凝集素遺伝子産物に対応する実時間ＰＣＲ産物が、ワクシニア感染組織（症例３）のＮＤＭＥ抽出物から増幅された。結果を図１８Ｆに示す。さらに、５０年を経た天然痘感染臨床標本（症例１及び４）は、ＮＤＭＥ処理後、抗ワクシニア抗体による免疫化学的染色で陽性を示した（図１８Ｂ）。ワクシニア感染組織（症例３）は、ポジティブコントロールであり、単純ヘルペスウィルス感染組織（症例５）及び正常皮膚組織はネガティブコントロールであった（症例２）。
【００６５】
ワクシニアウィルスによる感染組織から天然痘ウィルスを感染させたヒト皮膚組織において、様々なタンパク質産物を認識する抗ワクシニア抗体が使用された。ワクシニアビリオンに対する他の抗体のように、この抗ワクシニアポリクローナル抗体は天然痘ウィルスと交差反応する。しかしながら、前記抗体は天然痘感染組織（症例１及び４）抽出物においては６５ｋＤの単独のタンパク質と結合したが、全般的なワクシニア感染組織（症例３）抽出物においては２００ｋＤの大きなタンパク質及び６５ｋＤの小さなタンパク質と結合した（図１８Ｃ）。ハウスキーパーケラチンタンパク質（housekeeper keratin proteins）は、抗パンケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３と反応した（図１８Ｄ）。表皮有棘層細胞の肥大変性に一致する症例１、３及び４の標準的なＨ＆Ｅによる形態学的特徴は、細胞内の膨張、細胞間浮腫、及び最終的に微小胞の形成に至る細胞溶解を示す結果となった（図１８Ａ）。
【００６６】
ＮＤＭＥが遡及調査研究に対して有用な手段であることが明らかになった。ＮＤＭＥ技術は、標本抽出物のタンパク質同定及びＰＣＲ分析への使用を可能とするだけでなく、分子抽出後の組織切片を組織病理学的研究、免疫化学的研究、及び切片上ハイブリダイゼーション研究に使用することも可能にした。
【００６７】
Ｃ．考察
上記実施例は、ＮＤＭＥ技術がＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、及びＲＴ−ＰＣＲのような分子検出を行うに十分な可溶性タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡを単独の新鮮凍結又はＦＦＰＥ組織切片から抽出したことのみならず、抽出後も組織形態の完全性、タンパク質の抗原性、及び無傷の染色体構造を維持したことを示している。したがって、この技術は単独の組織切片上で組織学的診断と分子診断の両方を実施し、且つ両者を比較するための有用な方法を提供する。
【００６８】
一般的に、ＦＦＰＥ組織はバイオチップ分子プロファイリングのような高処理量分析に用いることはできないと考えられている。しかしながら、ホルマリンによるタンパク質の架橋が可逆的であること（Jackson, Cell 1978, 15(3):945-954）、及び、ホルマリン固定の過程で起こる前記架橋が新鮮組織に存在する二次構造を保持すること（Mason et al., J Histochem Cytochem. 1991, 39(2):225-229）は長い間知られていた。さらに、ホルマリンが誘起する高分子架橋は高温下で解離可能であることが明らかになっている（Mason et al., J Histochem Cytochem. 1991, 39(2):225-229）。本発明者は加熱、マイクロ波、及び超音波を含む様々な方法の全てが、このような架橋をある程度解離し得ることを見出した。２０分程の高湿度加熱に続いて急速な冷却を行うという、ここに記載されるＮＤＭＥ処置は、ＦＦＰＥ切片におけるタンパク質の架橋を解離し、プロテオーム解析のためにタンパク質を放出することを可能にする。対照的に、非加熱または５分間の最低限の加熱を伴って新鮮凍結組織切片へ抽出緩衝液を添加すれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＣＲ増幅のためにタンパク質及び核酸を放出することが可能である（図４Ｂ、５Ａ及び１０Ｃ）。固定組織からのタンパク質抽出は、タンパク質架橋の解離、非架橋タンパク質の緩衝液への可溶化、及び緩衝液中におけるタンパク質の安定化という３つの基本的段階を要する。本発明者は、図１１に描かれるように、ＮＤＭＥ処理が抽出緩衝液に浸っている組織切片の露出面からの高分子の放出を促進していると仮定した。マイクロ波及び超音波エネルギーの導入は、架橋の解離及び緩衝液の組織への浸透を促進し、可溶高分子を緩衝液中に放出することを可能にしている。
【００６９】
従来の抽出法は全て新鮮ないし固定組織の均質化を要するため、多くの人々は無傷のスライド切片からの分子抽出の実現性を疑問視する。本発明者は、４〜５ミクロンという組織切片の厚さが分子抽出を促進するために重要な役割を果たしていると確信する。基礎的な組織学によれば、Ｔリンパ球は直径約６〜７ミクロンの最小の細胞である。組織切片法では実質的にほとんどの細胞が横断され、細胞及び核内容物はあらゆる接触溶液に曝露される。ＮＤＭＥ処置は架橋の解離を促進し、タンパク質及び核酸の放出を助け、抽出緩衝液中に放出された高分子を安定化する。したがって、抽出緩衝液の組成は、抽出される分子の種類及び量に大きな影響を及ぼす。タンパク質、核酸または汎用にも適した緩衝液のいくつかは、本発明者によって処方されている。
【００７０】
試験結果によって示されるように、抽出時間、保存方法、温度、及び抽出緩衝液の組成は全て、凍結及び固定組織切片からＮＤＭＥ法を用いて抽出されるタンパク質及び核酸の量及び品質に何らかの影響を及ぼす。ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液が、ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液、または一般的な抗原回復緩衝液及び市販の緩衝液を含むその他の緩衝液よりもタンパク質の抽出に効果的であることが見出された。ＮＤＭＥ緩衝液の組成は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）及びタンパク質結合バイオチップアレイ（protein-binding biochip arrays）のような下流分子の分析に適合することが必要となる。様々な用途によって様々な抽出条件が必要とされるため、抽出緩衝液の組成の変更、またはマイクロ波ないし超音波処理の持続時間及び／または強度の変更が求められる。これらのパラメーターの変更は、選択的な高分子の放出を可能にする（利用可能なデータ）。溶解緩衝液（lyses buffer）は細胞の両極性脂質膜の破壊に不可欠であり、タンパク質の安定化及び変性によってタンパク質を遊離及び可溶化し、さらには沈殿を防ぐ。ある種の試薬は疎水性タンパク質の溶解を増進するが、後で行う電気泳動や質量分析を妨げる可能性がある（利用可能なデータ）。
【００７１】
架橋の解離及び抗原回復の機構は明確に理解されていない。これらの機構の解明は、高分子抽出の最適化に非常に役立つであろう。従来の抗原回復方法には、プロテイナーゼ前消化（proteinase pre-digestion）（Huang, Lab Invest. 1975, 33(1):88-95）、化学的前処理、及び加熱によるエピトープ回復（heat-induced epitope retrieval）が含まれる。本発明において、発明者は組織切片の元の形態を維持すること、及び、抽出したタンパク質の損傷を避けることを追求した。したがって、組織の完全性及び抗原性はプロテイナーゼＫの酵素活性の結果失われてしまうため、本発明者は抗原回復の方法からプロテイナーゼ消化を除外した。ギ酸または尿素を含む溶液による前処理が、ＩＨＣ染色における抗原のアンマスキングを向上することを示している（Kitamoto et al., Lab Invest. 1987, 57(2):230-6;及び、Hausen et al., Stain Technol. 1982, 57(5):321-324）。Ｓｈｉらはさらに、マイクロ波で２０分間組織切片を加熱することにより、最適な抗原回復が促進されることを明らかにした（Shi et al.， J Histochem Cytochem. 1991, 39(6):741-748）。低温である程、同じ結果を得るために長時間の処理を要した。
【００７２】
手術標本の処理を十分に制御できなかった場合、本発明において、ＮＤＭＥ技術は実質的に異なる標本のホルマリン固定レベルに合わせて処理を行うことができる。通常業務において、手術組織標本はホルマリン中で一晩固定され、その後段階的な濃度のアルコール、キシレン及びパラフィンでさらに１２から２０時間処理される。しかし場合によって、組織は４８時間もの間ホルマリン中に置かれる。長時間の前処理後であっても、過固定の標本は抗原回復が困難であることはよく知られている。一般的に、ＮＤＭＥ処置が長くなるほど高分子は放出され、組織形態は元の姿から逸脱していく。過固定の組織ではＮＤＭＥ処置の際に長時間の加熱を要し、新鮮組織切片は加熱を必要としない。
【００７３】
本発明は実施例及び好適な実施形態を通じて記載されるものであるが、当然のことながら本発明は開示された実施形態に限定されるものではない。それどころか、当業者にとって明らかであるような様々な変形を網羅することを意図している。したがって、添付の特許請求の範囲の及ぶ範囲は、そのような変形の全てを包含するように広く解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、ＮＤＭＥ装置の好適な実施形態におけるスライドカバー（１）及び基部（５）の正面断面図である。スライドカバー（１）は中央開口部（２）及び一対の外面孔（３ａ、３ｂ）を有している。凍結切片、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片、均質化された組織、または細胞培養を適用し得る組織標本（４）は、基部（５）の上面に置かれる。
【図２】図２Ａは、図１に示される基部及びスライドカバーの斜視図である。スライドカバーは基部上に設置されている。図２Ｂはスライドカバーの上面図である。図２Ｃはスライドカバーの底面図である。図２Ｄは結合したスライドカバー及び基部の正面断面図であり、スライドカバーの内面の中央部分が基部に向かって突出し、且つスライドカバーの内面の周囲部はくぼんでおり、基部の上面とスライドカバーの内面との間に中央部は浅く、周囲部では深い空間を形成するようになっている。図２Ｅは結合したスライドカバー及び基部の正面図である。
【００７５】
【図３】図３はＮＤＭＥ装置の好適な実施形態における正面断面図であり、重要要素としてスライドカバー（１）、基部（５）、及び温度制御装置を包含している。この図に示すように、温度制御装置には、ホットブロック（１１）、コールドブロック（１２）、超音波発生器（１４）によって制御される超音波振動子（１３）、ＣＰＵ（１５）、マイクロ波発生器（１６）、超音波検出器（１７）、及び／または熱電対（１８）を適用することができる。ここに挙げられたどの温度制御装置も、個々または他のものと組合せて使用することができる。スライドカバーは中央開口部（２）、及び２つの外面孔（３ａ、３ｂ）を有している。キャップ（１９）は抽出溶液の蒸発を防ぐため、スライドカバー（１）の中央開口部（２）に付けられる。組織標本（４）は基部（５）の上面に置かれる。チャンバーカバー（６）は、蒸気を取り込むための吸気口（７）、蒸気を排出するための排気口（８）、蒸気圧を制御するためのバルブ（９）、及び蒸気を発生させるための蒸気／湿度発生器（１０）を有する。ピペット（２０）は、基部の上面とスライドカバーの内面との間にある空間へ抽出溶液が加えられる場合に用いる。
【００７６】
【図４】図４は、様々な緩衝液を適用したＮＤＭＥ法によって新鮮組織またはＦＦＰＥ組織切片から抽出したタンパク質の、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の結果を示したものである。（Ａ）次の緩衝液を用いてＦＦＰＥ扁桃腺組織を抽出した。すなわち、Ｂ＝Ｂｉｏ−Ｑｕｉｃｋ（水及び０．５％ＳＤＳを含む）から得たＰＥ緩衝液、Ｘ＝Ｂｉｏ−Ｑｕｉｃｋ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．０１Ｍクエン酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びＲＮＡ阻害剤を含む）から得たＮＥ緩衝液、Ｅ＝０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｃ＝１０ｍＭクエン酸塩、Ｐ＝Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈから得たＴｉｓｓｕｅ−ＰＥ  ＬＢ、Ｍ＝低分子量（low-range）タンパク質質量マーカーである。右画像はクマシーブルー染色を示し、左画像は銀染色を示す。（Ｂ）ＰＥ緩衝液を用いてリンパ節組織を抽出した。１＝新鮮組織、２＝通常のＦＦＰＥ固定組織、３＝ＦＦＰＥ過固定組織である。（Ｃ）ＰＥ緩衝液を用いて様々な組織を抽出した。Ｌｎ＝リンパ節、Ｌｖ＝肝臓、Ｂｎ＝脳、Ｌｕ＝肺、Ｐｒｏ＝前立腺である。
【００７７】
【図５】図５は大量のタンパク質を組織から抽出した後の、組織形態の保存におけるＮＤＭＥ法の非破壊効果を示す。（Ａ）リンパ節組織切片のＨ＆Ｅ染色であり、ＮＤＭＥ処理なしのＦＦＰＥ組織切片（左画像）、ＮＤＭＥ処理を行ったＦＦＰＥ組織切片（中央画像）、ＮＤＭＥ処理を行った凍結組織切片（右画像）を示す。結果は、ＦＦＰＥ組織切片上における２０分のＮＤＭＥ処理及び凍結組織切片上における５分のＮＤＭＥ処理によって、組織切片の形態が変わらなかったことを示している（１０００倍）。（Ｂ）ＰＥ緩衝液を用いたＮＤＭＥ処理を各々０、５、１０、１５、２０、３０分間行ったＦＦＰＥリンパ節組織切片上における、ＣＤ５に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色（４００倍）である。結果は、ＮＤＭＥ処理の延長が、形態的な損傷の増加と引換えにＩＨＣシグナルの増光をもたらしたことを示している。（Ｃ）図５Ｂに由来する抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシーブルーで染色した。結果は、ＮＤＭＥ処理の延長が、より多くのタンパク質をもたらしたことを示している。
【００７８】
【図６】図６は、ＮＤＭＥ処理を施したＡＩＤＳ及び様々なリンパ腫の患者に由来するＦＦＰＥリンパ節組織の、タンパク質（Ａ及びＢ）及び形態（Ｃ）分析を示す。ＬＮ＝反応性リンパ節、Ｍ＝分子マーカー、ＨＩＶ＋＝ＨＩＶ陽性ＡＩＤＳリンパ節、ＡＬＣＬ＝未分化大細胞リンパ腫、ＢＬ＝バーキットリンパ腫を示す。（Ａ）及び（Ｂ）はＮＤＭＥ処理後のＦＦＰＥ組織切片由来抽出物のウェスタンブロットであり、抗ＣＤ２０（Ａの左パネル、膜糖タンパク質）、抗ＨＩＶ  ｐ２４（Ａの右パネル、ウィルスのカプシドタンパク質）、抗ＣＤ３０（Ｂの左パネル、ゴルジの前駆タンパク質）、抗サイクリンＥ（Ｂの右パネル、核タンパク質）を検出に使用した。（Ｃ）ＡＬＣＬ（左上及び右上パネル）及びＢＬ（左下及び右下パネル）組織切片のＮＤＭＥ処理後のＩＨＣ（パネルＢの２００倍）であり、ＡＬＣＬ及びＢＬがサイクリンＥに対して陽性（右上及び右下パネル）であるが、ＣＤ３０の発現に対してはＡＬＣＬのみが陽性（左上パネル）であったことを示している。
【００７９】
【図７】図７は凍結、エタノール固定、ホルマリン固定組織切片に由来し、順次２倍に希釈したＮＤＭＥ抽出物を用いた逆相タンパク質アレイ（reverse-phase protein array）によるタンパク質の検出を示す。すなわち、１＝凍結リンパ節（ＬＮ）、２＝ホルマリン固定ＬＮ、３＝エタノール固定ＬＮ、４〜６＝ホルマリン固定腎臓、７＝ホルマリン固定脾臓、８〜１０＝ホルマリン固定前立腺、１１〜１２＝ホルマリン固定乳房、１３＝ホルマリン固定肺である。全てのタンパク質はシプロルビーで染色を行った。ＰＡＰ（Ｂ）、ＰＳＡ（Ｃ）、またはケラチン（Ｄ）に対する抗体との反応が、様々な組織におけるタンパク質発現量を示している。（Ａ）は総タンパク質量を示す。
【００８０】
【図８】図８はＮＤＭＥ技術がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるタンパク質プロファイリングを支持することを示す。（Ａ）ＮＤＭＥ−ＰＥによって抽出されたタンパク質は、疎水性逆相タンパク質チップ（hydrophobic reverse phase protein chip）で識別し、製造者によって提供されたソフトウェアを用いてＰＢＳ−ＩＩ  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。グラフの全幅はそれぞれ０〜４０ｋ  ｍ／ｚ（左パネル）、４００〜１５００ｍ／ｚ（中央パネル）、１０ｋ〜２１ｋ  ｍ／ｚ（右パネル）である。Ｃは凍結組織切片、ＦはＦＦＰＥ組織切片を表す。ＦＦＰＥ組織のタンパク質分析結果は、新鮮組織のものと類似している。（Ｂ）凍結すい臓切片（左の４パネル）とホルマリン固定すい臓切片（右の４パネル）とを対比するタンパク質分析結果は、組織の固定方法及び使用した抽出緩衝液に多大な影響を受けた（上部４パネルはＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液、下部４パネルはＮＤＭＥ−Ｕ緩衝液）。
【００８１】
【図９】図９は、顕微鏡のスライドガラス上の組織切片（Ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質分析結果（Ｂ）、及びＮＤＭＥ処理後の組織切片のＩＨＣ染色を示す。（Ａ）は組織切片がＮＤＭＥ抽出の完了後、スライドガラス上に置かれていることを示す。スライド１＝Ｈｅｒ−２（＋）及びＥＲ（−）の乳がん、スライド２＝ＥＲ（−）の子宮内膜間質肉腫、スライド３＝ＥＲ（＋）の乳がん、スライド４＝ＥＲ（＋）の乳がんの解剖体（〜１．５×２ｍｍ２）である。（Ｂ）はＮＤＭＥ抽出物中の全てのタンパク質（左パネル）及びＥＲ特異タンパク質（右パネル）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。（Ｃ）は（Ａ）に示すスライド１から４の組織切片の、ＮＤＭＥ処理後における抗ＥＲ抗体によるＩＨＣの結果を示す。Ｃ１中の矢印は、ＥＲ（＋）良性腺が一つ残留していることを示す。Ｃ１中の挿入画像は、抗Ｈｅｒ−２抗体によるＩＨＣである。Ｃ４は、２０倍及び４００倍下における切片４の顕微鏡像である。
【００８２】
【図１０】図１０は、３００塩基対の生成物の出現（Ａ）により証明される３０年保管されたＦＦＰＥレチナール標本からＲＮＡを抽出する能力、伝染性単核球症患者のリンパ節組織切片においてエプスタイン・バーウィルス（ＲＮＡウィルスであり、黒色点で示される）を顕微鏡的に検出（Ｂ）する能力、１３００塩基対のバンドの出現（Ｃ）により証明されるＦＦＰＥ及び凍結組織切片からＤＮＡを抽出する能力、バーキットリンパ腫組織切片における染色体転座（すなわち、ｃ−Ｍｙｃ転座であり、細胞中に分離した緑色点及び赤色点として示される）を顕微鏡的に検出（Ｄ）する能力をＮＤＭＥ技術が有していることを示す。（Ａ）ＲＮＡは３０年保管されたＦＦＰＥレチナール標本から抽出され、３００塩基対（ｂｐ）を超える単位複製配列を示した。６つの異なるレチナール標本（レーン１〜６）からＦＦＰＥ−ＮＥ緩衝液中に抽出された組織抽出物を用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行い、その後３６７ｂｐのアクチンタンパク質に対応するプライマーを用いてデオキシリボヌクレアーゼ処理を行った。（Ｂ）伝染性単核球症リンパ節の連続切片のＲＮＡ−ＩＳＨである（２００倍）。青色染色がＮＤＭＥ処理前後のエプスタイン・バーウィルス初期ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）ハイブリダイゼーションの結果を示している。（Ｃ）ＦＦＰＥ及び凍結組織切片からのＮＤＭＥ抽出物のＰＣＲが、１３００ｂｐを越えるＤＮＡ断片を産出した。（Ｄ）ＮＤＭＥ処理前後のバーキットリンパ腫組織切片におけるｃ−Ｍｙｃ転座のＣＩＳＨ検出である。
【００８３】
【図１１】図１１はＮＤＭＥ系によって支持される臨床診断及び生体分子分析における潜在用途の概略図を示す。ＮＤＭＥ処置によって単独の組織切片（すなわち、ＦＦＰＥ及び凍結標本の両方）から得た抽出物は、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡを含んでいる。前記抽出物は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２Ｄゲル、ＨＰＬＣ／ＣＥ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ、及びタンパク質チップによる下流タンパク質配向の分析に有用である。抽出されたＤＮＡ／ＲＮＡは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡアレイ技術による下流ゲノム研究に有用である。ＮＤＭＥ処理後に同一の組織切片を用いて、さらに染色体転座、ＩＨＣ及びＩＳＨ−ＦＩＳＨのような組織病理学的技術による試験を行うことが可能である。このようにして、ＮＤＭＥは単独の標本上に分子情報及び定位情報の両方をもたらす有用な手段を提供する。
【００８４】
【図１２】図１２は、ＦＦＰＥ及び凍結組織切片のＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色における、ＮＤＭＥ法の形態的な非破壊効果を示す。すなわち、ＮＤＭＥ法による処理を行わないＦＦＰＥ組織切片（Ａ）及び処理を行ったＦＦＰＥ組織切片（Ｂ）、ＮＤＭＥ法による処理を行わない凍結組織切片（Ｃ）及び処理を行った凍結組織切片（Ｄ）である。試験結果は、ＮＤＭＥ法が組織切片の形態を破壊しないだけでなく、染色の分解能を増進することを示している。
【００８５】
【図１３】図１３は、ＦＦＰＥ組織切片のＨ＆Ｅ染色における、様々なＮＤＭＥ緩衝液の影響を示す。すなわち、（Ａ）無処理の切片、（Ｂ）ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．０１Ｍクエン酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＲＮＡ阻害剤を含む）で抽出した切片、（Ｃ）ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液（水及び０．５％ＳＤＳを含む）で抽出した切片である。
【００８６】
【図１４】図１４は、組織切片の形態及び抗原性における、様々なＮＤＭＥ緩衝液の影響を示す。（Ａ）ＮＤＭＥ処理を行わない組織切片、（Ｂ）ＮＤＭＥ−ＮＥ緩衝液で処理した組織切片、（Ｃ）ＮＤＭＥ−ＰＥ緩衝液で処理した組織切片である。また、Ｈ＆Ｅ染色（左パネル）、Ｂｃｌ−６抗原によるＩＨＣ染色（中央パネル）、ＡＭＡＣＲ抗原によるＩＨＣ染色（右パネル）をそれぞれ示す。
【００８７】
【図１５】図１５は、ＮＤＭＥ技術による処理後の正常脳（Ａ）、プリオン症例Ｉ（Ｂ）、プリオン症例ＩＩ（Ｃ）の脳組織切片における、形態的分析及びプロテオミクス分析の結果を示す。上部パネルはスライドガラス上の組織切片、及びＨ＆Ｅ染色による形態分析の結果を示す。中央パネルは、プリオン症例Ｉ及びＩＩにおいて、プリオン特異抗体（３Ｆ４）によって検出されるＰｒＰタンパク質がＮＤＭＥによって抽出されたが、プロテイナーゼＫ消化後の正常脳においては抽出されなかったことを示すウェスタンブロッティングの結果である。下部パネルは、プロテイナーゼＫ消化及びＮＤＭＥ処理後の組織切片の３Ｆ４抗体による染色が、プリオン症例Ｉ及びＩＩにおいては可能であるが、正常脳切片においては可能ではないことを示すＩＨＣの結果である。
【００８８】
【図１６】図１６は、ＮＤＭＥ処理後の前立腺がん凍結標本の組織学的分析及びタンパク質分析の結果を示す。（Ａ）は４つの標本からの５つの領域のＨ＆Ｅ染色を示す。（Ｂ）は全タンパク質のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＡｂｃａｍから得た抗ＡＭＡＣＲ  ｐＡｂによるウェスタンブロットを示す。１及び２＝同一組織由来の良性及びがん性領域、３〜５＝前立腺がん組織、６及び７＝ＬＮＣａｐ及び２９３細胞株由来の抽出物をそれぞれ示す。
【００８９】
【図１７】図１７は、ＦＦＰＥ前立腺がんＬＣＭ標本のＮＤＭＥの結果を示す。（Ａ）はＬＣＭ前のＦＦＰＥ標本を示す。（Ｂ）はＬＣＭ後のＦＦＰＥ標本を示す。（Ｃ）はスライド／キャップ上に残存した標本を示す。（Ｄ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。（Ｅ）は抗ＡＭＡＣＲによるウェスタンブロットを示す。１＝ケース３２６Ｔ、２＝ケース３２６Ｔ、３＝ケース４３０Ｔ、４＝ケース４８８Ｔ、５＝ケース５６４Ｔである。
【００９０】
【図１８】図１８は、５０年を経た天然痘患者由来の組織切片のＮＤＭＥ調査を示し、１及び４＝５０年を経た組織切片、２＝正常皮膚、３＝ポジティブコントロールであるワクシニア感染組織、５＝ポジティブコントロールである単純ヘルペスウィルス感染組織である。（Ａ）はＨ＆Ｅ染色、（Ｂ）はＮＤＭＥ処理後のＩＨＣの結果を示す。（Ｃ）は、抗Ｖａｃ抗体によるウェスタンブロッティングの結果であり、天然痘感染組織（症例１及び４）のＮＤＭＥ抽出物においては６５ｋＤの単一タンパク質を結合したが、ワクシニア感染組織（症例３）のＮＤＭＥ抽出物では２００ｋＤの大きなタンパク質と６５ｋＤの小さなタンパク質を結合したことを示している。（Ｄ）は、ハウスキーピングタンパク質としてケラチンの様々なアイソフォームとのみ反応する抗パンケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３によるウェスタンブロッティングの結果を示す。（Ｅ）は２０９ｂｐのオルトポックス・ウィルス血球凝集素遺伝子産物に対応するＰＣＲ産物が、天然痘組織（Ｄ＝症例４）ＮＤＭＥ抽出物から増幅されたことを示す。（Ｆ）は、ワクシニア血球凝集素遺伝子産物に対応する実時間ＰＣＲ産物が、ワクシニア感染組織（Ｃ＝症例３）ＮＤＭＥ抽出物から増幅されたことを示す。
【符号の説明】
【００９１】
１  スライドカバー
２  中央開口部
３  外面孔
４  組織標本
５  基部
６  チャンバーカバー
７  吸気口
８  排気口
９  バルブ
１０  蒸気／湿度発生器
１１  ホットブロック
１２  コールドブロック
１３  超音波振動子
１４  超音波発生器
１５  ＣＰＵ
１６  マイクロ波発生器
１７  超音波検出器
１８  熱電対
１９  キャップ
２０  ピペット
【図１】
2007532918.tif 000003
【図２】
2007532918.tif 000004
【図３】
2007532918.tif 000005
【図４】
2007532918.tif 000006
【図５】
2007532918.tif 000007
【図６】
2007532918.tif 000008
【図７】
2007532918.tif 000009
【図８】
2007532918.tif 000010
【図９】
2007532918.tif 000011
【図１０】
2007532918.tif 000012
【図１１】
2007532918.tif 000013
【図１２】
2007532918.tif 000014
【図１３】
2007532918.tif 000015
【図１４】
2007532918.tif 000016
【図１５】
2007532918.tif 000017
【図１６】
2007532918.tif 000018
【図１７】
2007532918.tif 000019
【図１８】
2007532918.tif 000020
【国際調査報告】
2007532918.tif 000021