(57)【要約】  本発明は、ジンセノサイドＦ１及びＥＧＣＧを含有する皮膚保護用組成物に関し、前記ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧを同時に処理することによって、低い濃度でも優れた皮膚保護効果を示し、特に、紫外線の照射により誘導される皮膚細胞の死滅を抑制する皮膚細胞死滅抑制剤及び皮膚細胞の死滅を防止する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０−Ｏ− β −Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナックサトリオール（ジンセノサイドＦ１）及び（−）エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）を有効成分として含有する皮膚保護用組成物。
【請求項２】
前記皮膚保護は、前記有効成分による細胞死滅抑制による皮膚保護であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞死滅抑制は、低線量の紫外線の照射により誘導される細胞死滅の抑制であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞死滅抑制は、Ｂｃｌ−２発現調節によるものであることを特徴とする請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｂｃｌ−２発現調節は、Ｂｒｎ−３ａ発現調節によるものであることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ジンセノサイドＦ１及びＥＧＣＧは、組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％の量で含有されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの比率は、重量比で１：０．１〜１０の範囲であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ジンセノサイドＦ１及びＥＧＣＧを有効成分として含有することを特徴とするＲｂ蛋白質の脱リン酸化抑制剤。
【請求項９】
低濃度のジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧ混合物を有効成分として含有し、紫外線の露出による細胞損傷を防止することを特徴とする皮膚損傷抑制剤。
【請求項１０】
ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧ混合物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記ジンセノサイドＦ１（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナックサトリオール）及びＥＧＣＧ（（−）エピガロカテキン−３−ガレート）を含有する皮膚損傷防止用組成物に関する。より詳細には、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧを少量含有しても、その相乗効果によって、紫外線の照射により誘導される皮膚損傷を防止できる組成物及び皮膚損傷を防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、人体の一次防御膜であって、体内の諸器官を温度及び湿度変化や紫外線、公害物質など外部環境の刺激から保護し、且つ、体温調節などの生体恒常性の維持に重要な役割をしている。しかし、皮膚は、外部に露出されているため、外部からの刺激によって損傷を受けやすい。このような外部的刺激として紫外線による刺激が主であるが、このような紫外線は、皮膚の老化を誘導すると共に、皮膚において細胞の死滅を誘導する。
【０００３】
皮膚老化の最も重要な要因として、２８０〜３２０ｎｍ波長の紫外線Ｂ（ＵＶＢ）が挙げられる。皮膚が紫外線に露出される場合、ＤＮＡ、蛋白質などの細胞成分が損傷され、日焼け（ｓｕｎｂｕｒｎ）細胞が生成され、これらは、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）酵素の活性化及び酵素の作用によるＤＮＡ断片化現象を伴う細胞死滅過程を経ながら死滅するようになる。このように、細胞死滅現象は、損傷された細胞の死滅を誘導し、これらが腫ように発展するのを防ぐ。
【０００４】
Ｂｃｌ−２は、このような細胞死滅過程において重要な役割を行う遺伝子であって、核膜とミトコンドリア外膜に存在する２６ｋＤａの蛋白質を暗号化する。発現蛋白質であるＢｃｌ−２は、Ｂａｘのような細胞死滅を促進する蛋白質に付着してこれらの機能を妨害することによって、細胞死滅を抑制する役割をする。Ｂｃｌ−２蛋白質とＢａｘ蛋白質間の濃度比によって、細胞が死滅されるか否かが決定される。
【０００５】
現在までＢｃｌ−２は、皮膚細胞において紫外線の照射によりその発現が急激に減少されると報告された。また、Ｂｃｌ−２を過発現させた細胞は、紫外線の照射による細胞死滅が抑制されることが報告された。しかしながら、Ｂｃｌ−２の過発現は、むしろ深刻なＤＮＡ損傷を有する細胞の死滅まで阻害し、癌を誘発する可能性を有する。したがって、Ｂｃｌ−２の発現を特異的に調節することが非常に重要である。
【０００６】
一方、緑茶のポリフェノール成分であるＥＧＣＧは、強力な抗酸化機能と有害なラジカルを効果的に除去する機能を有している。また、この化合物は、紫外線による炎症反応と皮膚癌誘発を防止すると知られている。最近、ＥＧＣＧが人体の正常角質形成細胞においてＢｃｌ−２の発現を増加させ、Ｂａｘの発現を減少させて、紫外線による細胞死滅を防止するという報告がある。しかし、扁平上皮癌細胞にＥＧＣＧを処理すれば、むしろＢａｘ蛋白質のリン酸化を減少させ、癌細胞の増殖を抑制する効果を示した。しかし、未だ細胞死滅と細胞増殖と関連した信号伝達過程のうちＥＧＣＧのターゲットは知られていない。
【０００７】
レチノブラストーマ（Ｒｂ：Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）蛋白質は、癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）により発現される蛋白質であって、発生、癌、細胞成長と分化、死滅において重要な役割をする。この蛋白質は、核蛋白質で、細胞周期やＤＮＡ損傷をもたらす要因によりリン酸化が調節され、Ｅ２Ｆ転写因子と一緒に細胞死滅に関与する。また、Ｂｃｌ−２の過発現がＲｂ蛋白質の脱リン酸化を抑制して安定化させることによって、細胞死滅を抑制するのに関与すると知られている。
【０００８】
しかし、現在まで人間の皮膚細胞において損傷程度が弱い細胞を保護して細胞死滅を抑制し、一方では、損傷程度が激しい細胞に対しては、細胞死滅を誘導することによって、皮膚においての細胞死滅を調節して皮膚を保護することができる、人体に無害で且つ人間への適用が容易な物質について特に知られていない。
【発明の開示】
【０００９】
これより、本発明者らは、ジンセノサイドＦ１（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナックサトリオール）及びＥＧＣＧ（（−）エピガロカテキン−３−ガレート）を含有する組成物が、皮膚細胞を保護し、その損傷を防止するのに優れた効果があることを知見し、本発明を完成した。
【００１０】
特に、前記ジンセノサイドＦ１（ginsenoside F1）及びＥＧＣＧ（(−)epigallocatechin-3-gallate）の各々を低濃度で含有する組成物は、特別な皮膚保護効果を示さないが、前記濃度のジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧを混合する場合、その相乗効果によって、優れた皮膚保護効果を示すことができる。すなわち、前記２つの化合物の相乗効果によって、単独処理時には効果がない低い濃度でも、混合によってはじめて紫外線の照射に対応してＢｃｌ−２の発現を調節できる能力が生じる。
【００１１】
したがって、本発明は、下記化学式１で表されるジンセノサイドＦ１及び下記化学式２で表されるＥＧＣＧを有効成分として含有する皮膚損傷防止用組成物に関する。
【化１】
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【００１２】
本発明に係る組成物は、皮膚細胞死滅などに関与し、皮膚老化防止、皮膚細胞活性維持などの作用をする。
【００１３】
好ましくは、前記ジンセノサイドＦ１及びＥＧＣＧは、組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％の量で含有されるのがよい。また、前記ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの比率は、重量比で１：０．１〜１０の割合で含有されることが好ましい。
【００１４】
より具体的には、本発明は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧ混合物を有効成分として含有する、低線量の紫外線により誘導される細胞死滅抑制剤を提供する。
また、本発明は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧ混合物を有効成分として含有する、紫外線によりその発現が減少されるＢｃｌ−２のための発現調節剤を提供する。
また、本発明は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧ混合物を有効成分として含有する、紫外線により減少されるＢｒｎ−３ａ発現調節剤を提供する。
【００１５】
本発明によれば、ジンセノサイドＦ１自体は、Ｂｃｌ−２の発現を増加させないが、紫外線によりＢｃｌ−２の発現が減少するのを抑制することが分かる。すなわち、ジンセノサイドＦ１は、Ｂｃｌ−２の転写調節因子であるＢｒｎ−３ａの発現を調節することによって、Ｂｃｌ−２の発現濃度を正常細胞水準に維持し、これにより、低線量の紫外線により皮膚細胞が死滅されるのを防止することができる。一方、高線量の紫外線の照射に対しては、Ｂｃｌ−２発現が減少し、損傷された細胞の細胞死滅過程がそのまま進行されるので、損傷された細胞が皮膚癌に発展する危険性を除去することができる。
【００１６】
また、本発明では、ジンセノサイドＦ１が、上記した効果において、ＥＧＣＧと相乗作用をすることを、後述する実施例から確認した。より具体的に、単独処理時には効果がない低い濃度の２つの化合物を混合して、人間皮膚細胞株であるＨａＣａＴ細胞に処理した時、紫外線の照射により減少したＢｃｌ−２の発現が正常な濃度に維持され、これにより、細胞死滅が抑制されることを確認した。また、以前の研究結果に基づいて、ＥＧＣＧとの相乗作用においても、細胞死滅抑制効果がＢｃｌ−２に特異的な転写調節因子であるＢｒｎ−３ａの発現を調節することによって生じることを確認した。しかも、２つの化合物を同時に処理した時にのみ、癌抑制蛋白質であるＲｂの脱リン酸化を阻害し、細胞死滅を抑制するという効果を確認した。
【００１７】
上述の結果から、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧは、低い濃度で使用しても、互いに相乗作用を通じて細胞内に常に一定量のＢｃｌ−２の濃度が維持され得るようにし、Ｒｂ蛋白質の脱リン酸化を阻止し、細胞が死滅されるのを阻害する効能を有することが分かる。
【００１８】
したがって、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧは、互いに相乗作用を通じて細胞内に常に一定量のＢｃｌ−２の濃度が維持され得るようにして、細胞が死滅されるのを防止することができる。また、ジンセノサイドＦ１自体は、Ｂｃｌ−２の発現を増加させないので、癌に成長する可能性がある細胞が死滅されることを阻止するわけではないので、損傷された細胞が癌に発展する副作用がない。したがって、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧは、紫外線による細胞死滅を抑制、細胞損傷を防止して、皮膚老化を抑制できる物質としての活用可能な用途を提供する。
【００１９】
これより、本発明は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧ混合物を有効成分として含有する皮膚保護用組成物を提供する。本発明の組成物は、紫外線による皮膚損傷及びこれによる皮膚老化を抑制する効果を期待することができる。本発明の組成物は、例えば化粧料のように、皮膚外用剤として剤型化することができる。しかしながら、前記組成物の用途及び剤型は、これに限定されるものではない。
【００２０】
本発明に用いられるジンセノサイドＦ１は、人参から製造された精製サポニンを水や緩衝溶液のような水性溶媒、または水や緩衝溶液のような水性溶媒と有機溶媒の混合液に溶解させた後、ペニシリウム属から分離したナリンジナーゼ及びアスペルギルス属から分離したペクチナーゼのうち少なくとも１つと反応させることによって得られた化合物である。しかしながら、ジンセノサイドＦ１を得る方法については、上記の方法に限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の権利範囲がこれらの実施例に限定されるものではないことは、この技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００２２】
＜参照例１＞人参精製サポニンの製造：
紅参（タバコ人参公社、６年産紅参）２Ｋｇに水を含むメタノール４Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、濾過布を用いた濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離された濾液を減圧濃縮した。濃縮液を水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去した。水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出して得た１−ブタノール層全体を５％ＫＯＨで処理した後、蒸留水で洗浄した。次に、減圧濃縮して１−ブタノール抽出液を得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加した。得られた沈殿物を乾燥し、人参精製サポニン７０ｇを得た。
【００２３】
＜参照例２＞ジンセノサイドＦ１の製造：
参照例１の人参精製サポニン１０ｇをシトレート緩衝溶液（ｐＨ４．０）１０００ｍＬに溶解させ、これにペニシリウム属から分離したナリンジナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１５ｇを添加し、４０℃の水浴上で４８時間攪拌させながら反応させた。反応が終了した後、１０分間加熱して酵素を失活させ、反応液は、同量のエチルアセテートで３回抽出して濃縮した。得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で分離し、ジンセノサイドＦ１を１．５ｇ得た。
【００２４】
＜実施例１＞ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＨａＣａＴ細胞の死滅抑制効果：
［段階１］細胞株と細胞培養
人体皮膚細胞株（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴ（Ｄｒ．Ｎ．Ｅ．Ｆｕｓｅｎｉｇ（ＤｅｕｔｓｃｈｅｓＫｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ（ＤＫＦＺ）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した）を１０％牛血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ１２１０−００３８）で培養した。培
養は、いずれも３７℃、５％ＣＯ2培養器で行った。
【００２５】
［段階２］ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理による、紫外線の照射時に誘導されるＨａＣａＴ細胞の死滅抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシンで処理し、単一細胞の懸濁液を作った後、６−ｗｅｌｌに２×１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。次に、牛血清が含まれないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、２μＭのジンセノサイドＦ１；１０μＭのＥＧＣＧ；２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合したもの；５μＭのジンセノサイドＦ１；及び５０μＭのＥＧＣＧを各々処理した。
参考として、ジンセノサイドＦ１は、１００％エタノールに溶解し、常に培地の１／１０００の濃度で準備し、ＥＧＣＧ（Ｓｉｇｍａ）は、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）に溶解し、培地の１／１０００の濃度で準備し、各培養液に必要な量だけ添加することによって、添加量を調節した。
【００２６】
２４時間各化合物を処理した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳを入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。次に、ＰＢＳを捨てて、さらに同じ濃度の各化合物が含まれた培地に交換した。薬物を処理しない細胞を対照区として同一に培養した。
【００２７】
紫外線を照射してから２４時間後、各化合物を処理した細胞と処理しない細胞に３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ）溶液を入れ、３７℃で４時間培養した。その後、ＤＭＳＯを入れて溶解した後、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．）を用いて５４０ｎｍの波長で形成されたホルマザンダイの光学的濃度（ＯＤ）を測定した。紫外線を照射しない細胞のＯＤ値を１００％に計算して、相対的な値を細胞の生存数で示し、その結果を図１に示した。
【００２８】
図１から明らかなように、２μＭのジンセノサイドＦ１または１０μＭのＥＧＣＧを単独で処理した場合には、処理しない対照区と比較して、紫外線により死滅される細胞数に差異がなかった。しかし、２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合して処理した細胞の場合、処理しない細胞に比較して、紫外線に露出された場合、約２倍程度細胞死滅が抑制された。これは、５μＭのジンセノサイドＦ１単独または５０μＭのＥＧＣＧ単独を各々処理した場合と同じ程度の細胞死滅抑制効果を示した。
【００２９】
＜実施例２＞ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＰＡＲＰ蛋白質の切断抑制効果：
［段階１］細胞株と細胞培養
実験に利用された細胞株と細胞培養は、実施例１の段階１と同様である。
【００３０】
［段階２］ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理による、紫外線の照射時に誘発されるＰＡＲＰ蛋白質の切断抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシンで処理して単一細胞の懸濁液を作った後、６−ｗｅｌｌに２×１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。次に、牛血清が含まれないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、２μＭのジンセノサイドＦ１；１０μＭのＥＧＣＧ；２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合したもの；５μＭのジンセノサイドＦ１；及び５０μＭのＥＧＣＧを各々処理した。ジンセノサイドＦ１は、１００％エタノールに溶解し、常に培地の１／１０００の濃度が含まれるようにし、ＥＧＣＧ（Ｓｉｇｍａ）は、ＤＭＳＯに溶解し、培地の１／１０００の濃度が含まれるようにした。２４時間にわたって各化合物を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。次に、ＰＢＳを捨てて、さらに同じ濃度の各化合物が含まれた培地に交換した。薬物を処理しない細胞を対照区として同一に培養した。
【００３１】
紫外線を照射してから２４時間後、薬物を処理した細胞と処理しない細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンを処理して細胞を回収した。これに、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍチオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）、２ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１００μｇ／μロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）が含有された蛋白質抽出緩衝溶液５００μＬを処理した後、１０分間常温で放置した。次に、４℃で１０分間１５，０００×ｇの重力加速度で遠心分離し、上層液を回収した後、ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔTMを用いて蛋白質を定量した。蛋白質２０μｇを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて大きさ別に分離した後、５０Ｖで１２時間ＰＤＦ（ＢｉｏＲａｄ）膜にブロッティングした。このブロットを５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、１次抗体としてｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットを用いて抗体反応させた。反応させたブロットは、Ｘ線Ｆｕｊｉフィルムに感光させた後、現像して蛋白質発現程度を確認した。フィルム上のバンドは、ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ  ２１００  ＸＬ（ＵＭＡＸ）を用いてスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）イメージ分析プログラムを用いて分析した。ＰＡＲＰ蛋白質の切断された量は、対照区の切断された量を基準として相対的な値で示した。その結果を図２に示した。
【００３２】
図２から明らかなように、２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合して処理した細胞の場合、処理しない細胞または同じ濃度の各化合物を単独で処理した時と比較して、紫外線の照射により生ずるＰＡＲＰ蛋白質の切断化現象が１．４倍程度減少した。
【００３３】
＜実施例３＞ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＢｃｌ−２の発現減少抑制効果：
［段階１］細胞株と細胞培養
実験に利用された細胞株と細胞培養は、実施例１の段階１と同様である。
【００３４】
［段階２］ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理による、紫外線の照射時に誘発されるＢｃｌ−２の発現減少抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシンで処理して単一細胞の懸濁液を作った後、６−ｗｅｌｌに２×１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。次に、牛血清が含まれないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、２μＭのジンセノサイドＦ１；１０μＭのＥＧＣＧ；２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合したもの；５μＭのジンセノサイドＦ１；及び５０μＭのＥＧＣＧを各々処理した。ジンセノサイドＦ１は、１００％エタノールに溶解し、常に培地の１／１０００の濃度が含まれるようにし、ＥＧＣＧ（Ｓｉｇｍａ）は、ＤＭＳＯに溶解し、培地の１／１０００の濃度が含まれるようにした。２４時間にわたって各化合物を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。次に、ＰＢＳを捨てて、さらに同じ濃度の各化合物が含まれた培地に交換した。薬物を処理しない細胞を対照区として同一に培養した。
【００３５】
紫外線を照射してから２４時間後、薬物を処理した細胞と処理しない細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンを処理して細胞を回収した。これに、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍチオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）、２ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１００μｇ／μロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）が含有された蛋白質抽出緩衝溶液５００μＬを処理した後、１０分間常温で放置した。次に、４℃で１０分間１５，０００×ｇの重力加速度で遠心分離し、上層液を回収した後、ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔTMを用いて蛋白質を定量した。蛋白質２０μｇを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて大きさ別に分離した後、５０Ｖで１２時間ＰＤＦ（ＢｉｏＲａｄ）膜にブロッティングした。このブロットを５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、１次抗体としてｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｂｃｌ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットを用いて抗体反応させた。反応させたブロットは、Ｘ線Ｆｕｊｉフィルムに感光させた後、現像して蛋白質発現程度を確認した。フィルム上のバンドは、ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ  ２１００  ＸＬ（ＵＭＡＸ）を用いてスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）イメージ分析プログラムを用いて分析した。その結果を図３に示した。
【００３６】
図３から明らかなように、紫外線を照射した時、薬物を処理しない細胞の場合、Ｂｃｌ−２蛋白質は、ほとんど発現されなかった。２μＭのジンセノサイドＦ１または１０μＭのＥＧＣＧを単独で処理した時にも、薬物を処理しない対照区と比較してＢｃｌ−２発現に大きな差異がなかった。しかし、２つの化合物を同時に処理した細胞の場合、紫外線を照射した時にも、照射しない場合と比較してほとんど差異がない程度に発現が維持された。すなわち、２つの化合物を同時に処理すれば、処理しない場合、または各化合物を単独で処理した場合と比較して、Ｂｃｌ−２蛋白質の発現が３倍程度増加した。
【００３７】
＜実施例４＞ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＢｒｎ−３ａの発現減少抑制効果：
［段階１］細胞株と細胞培養
実験に利用された細胞株と細胞培養は実施例１の段階１と同様である。
【００３８】
［段階２］ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理による、紫外線の照射時に誘発されるＢｒｎ−３ａの発現減少抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシンで処理して単一細胞の懸濁液を作った後、６−ｗｅｌｌに２×１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。次に、牛血清が含まれないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、２μＭのジンセノサイドＦ１；１０μＭのＥＧＣＧ；２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合したもの；５μＭのジンセノサイドＦ１；及び５０μＭのＥＧＣＧを各々処理した。ジンセノサイドＦ１は、１００％エタノールに溶解し、常に培地の１／１０００の濃度が含まれるようにし、ＥＧＣＧ（Ｓｉｇｍａ）は、ＤＭＳＯに溶解し、培地の１／１０００の濃度が含まれるようにした。２４時間にわたって各化合物を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。次に、ＰＢＳを捨てて、さらに同じ濃度の各化合物が含まれた培地に交換した。薬物を処理しない細胞を対照区として同一に培養した。
【００３９】
紫外線を照射してから２４時間後、薬物を処理した細胞と処理しない細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンを処理して細胞を回収した。これに、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍチオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）、２ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１００μｇ／μロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）が含有された蛋白質抽出緩衝溶液５００μＬを処理した後、１０分間常温で放置した。次に、４℃で１０分間１５，０００×ｇの重力加速度で遠心分離し、上層液を回収した後、ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔTMを用いて蛋白質を定量した。蛋白質２０μｇを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて大きさ別に分離した後、５０Ｖで１２時間ＰＤＦ（ＢｉｏＲａｄ）膜にブロッティングした。このブロットを５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、１次抗体としてｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｂｒｎ−３ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットを用いて抗体反応させた。反応させたブロットは、Ｘ線Ｆｕｊｉフィルムに感光させた後、現像して蛋白質発現程度を確認した。フィルム上のバンドは、ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ  ２１００  ＸＬ（ＵＭＡＸ）を用いてスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）イメージ分析プログラムを用いて分析した。その結果を図４に示した。
【００４０】
図４から明らかなように、Ｂｒｎ−３ａ蛋白質は、紫外線の照射によりその発現が減少したが、２つの化合物を同時に処理した時にのみ、さらに発現が回復された。
【００４１】
＜実施例５＞ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＲｂ蛋白質の脱リン酸化抑制効果：
［段階１］細胞株と細胞培養
実験に利用された細胞株と細胞培養は、実施例１の段階１と同様である。
【００４２】
［段階２］ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理による、紫外線の照射時に誘発されるＲｂ蛋白質の脱リン酸化抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシンで処理して単一細胞の懸濁液を作った後、６−ｗｅｌｌに２×１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。次に、牛血清が含まれないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、２μＭのジンセノサイドＦ１；１０μＭのＥＧＣＧ；２μＭのジンセノサイドＦ１と１０μＭのＥＧＣＧを混合したもの；５μＭのジンセノサイドＦ１；及び５０μＭのＥＧＣＧを各々処理した。ジンセノサイドＦ１は、１００％エタノールに溶解し、常に培地の１／１０００の濃度が含まれるようにし、ＥＧＣＧ（Ｓｉｇｍａ）は、ＤＭＳＯに溶解し、培地の１／１０００の濃度が含まれるようにした。２４時間にわたって各化合物を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。次に、ＰＢＳを捨てて、さらに同じ濃度の各化合物が含まれた培地に交換した。薬物を処理しない細胞を対照区として同一に培養した。
【００４３】
紫外線を照射してから２４時間後、薬物を処理した細胞と処理しない細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンを処理して細胞を回収した。これに、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍチオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）、２ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１００μｇ／μロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）が含有された蛋白質抽出緩衝溶液５００μＬを処理した後、１０分間常温で放置した。次に、４℃で１０分間１５，０００×ｇの重力加速度で遠心分離し、上層液を回収した後、ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔTMを用いて蛋白質を定量した。蛋白質２０μｇを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて大きさ別に分離した後、５０Ｖで１２時間ＰＤＦ（ＢｉｏＲａｄ）膜にブロッティングした。このブロットを５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、１次抗体としてｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｒｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；全ての形態のＲｂ（過リン酸化、低リン酸化形態など）感知）を、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットを用いて抗体反応させた。反応させたブロットは、Ｘ線Ｆｕｊｉフィルムに感光させた後、現像して蛋白質発現程度を確認した。同じブロットを６．２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール溶液で５０℃で１０分ずつ２回洗浄した。また、５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、１次抗体としてｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｕｎｄｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；低リン酸化形態のＲｂだけを感知）を、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットを用いて抗体反応させた。反応させたブロットは、Ｘ線Ｆｕｊｉフィルムに感光させた後、現像して蛋白質発現程度を確認した。フィルム上のバンドは、ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ  ２１００  ＸＬ（ＵＭＡＸ）を用いてスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）イメージ分析プログラムを用いて分析した。その結果を図５に示した。
【００４４】
図５から明らかなように、Ｒｂ蛋白質は、薬物単独処理時や処理しない時には、紫外線の照射により脱リン酸化が生じ、低リン酸化形態が現れたが、２つの化合物を混合して同時に処理した時には、このようなＲｂ蛋白質の脱リン酸化が抑制され、全ての形態のＲｂ蛋白質が存在するようになった。
【００４５】
以下、本発明に係るジンセノサイドＦ１及びＥＧＣＧを含有する外用剤組成物について、剤型例を例にとって説明するが、本発明の外用剤組成物の剤型がこれらの例に限定されるものではない。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２】
2007530531.tif 000005
【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
【表５】
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【００５１】
【表６】
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【００５２】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上説明したように、本発明において、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧとを、それぞれ単独で処理した時には効果がない低い濃度で２つの化合物を同時に処理する場合、相乗作用によって、紫外線の照射時に誘発されるＢｃｌ−２の発現減少及びその転写因子であるＢｒｎ−３ａの発現減少を抑制することによって、また、Ｒｂ蛋白質の脱リン酸化を阻害することによって、紫外線による細胞死滅を防止することができる。したがって、本発明は、低い濃度のジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧとを同時に処理して、紫外線による細胞損傷を防止し、皮膚老化を抑制できる物質として活用可能な用途を提供する。また、本発明によれば、コストが高い２つの化合物を低い濃度（単独使用時、各々２．５倍、５倍の濃度が必要）で使用することによって、原料費を低減し、高機能性製品をさらに安価で供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理による皮膚細胞の死滅抑制効果を示すためのＭＴＴ還元反応実験結果グラフである。
【図２】図２は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＰＡＲＰ蛋白質（ｐｏｌｙ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の切断抑制効果を示すために、ウェスタンブロッティング（Western-blot analysis）を行った結果である。Ａは、紫外線を照射しない場合であり、Ｂは、６０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線を照射した結果である。Ｈｓｐ７０は、同じ蛋白質量が使われたことを示す。図２において、各々の試料は、１番は、対照区；２番は、２μＭのジンセノサイドＦ１で処理；３番は、１０μＭのＥＧＣＧで処理；４番は、“２μＭのジンセノサイドＦ１＋１０μＭのＥＧＣＧ”で処理；５番は、５μＭのジンセノサイドＦ１で処理；及び６番は、５０μＭのＥＧＣＧで処理；したことを示す。
【図３】図３は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＢｃｌ−２の発現減少抑制効果を示すためにウェスタンブロッテイングを行った結果である。Ａは、紫外線を照射しない場合であり、Ｂは、６０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線を照射した結果である。Ｈｓｐ７０は、同じ蛋白質量が使われたことを示す。試料別処理量は、図２と同様である。
【図４】図４は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＢｒｎ−３ａの発現減少抑制効果を示すためにウェスタンブロッテイングを行った結果である。Ａは、紫外線を照射しない場合であり、Ｂは、６０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線を照射した結果である。Ｈｓｐ７０は、同じ蛋白質量が使われたことを示す。試料別処理量は、図２と同様である。
【図５】図５は、ジンセノサイドＦ１とＥＧＣＧの同時処理によるＲｂ蛋白質の脱リン酸化抑制効果を示すためにウェスタンブロッテイングを行った結果である。上記のブロットは、全てのリン酸化形態のＲｂ蛋白質を感知する抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行った結果であり、下記のブロットは、同じメンブレインを低リン酸化形態のＲｂだけを感知する抗体を用いて行った結果である。また、Ａは、紫外線を照射しない場合であり、Ｂは、６０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線を照射した結果である。試料別処理量は、図２と同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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