(57)【要約】  本発明は、単離されたＮ−ホルミルバラシクロビル、その調製および参照マーカーおよび／または参照標準としてのその使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＮ−ホルミルバラシクロビル。
【請求項２】
ＨＰＬＣで判断した場合約０．０３面積％〜５面積％のバラシクロビルを含んで成る、請求項１に記載の単離されたＮ−ホルミルバラシクロビル。
【請求項３】
ＨＰＬＣで判断した場合約０．０３面積％〜約２面積％のバラシクロビルを含んで成る、請求項２に記載の単離されたＮ−ホルミルバラシクロビル。
【請求項４】
ＨＰＬＣで判断した場合少なくとも９５面積％の純度である、請求項１に記載の単離されたＮ−ホルミルバラシクロビル。
【請求項５】
Ｎ−ホルミルバラシクロビルの調製方法であって、
ａ）バラシクロビルをギ酸アンモニウムと反応させるステップと；
ｂ）反応混合物を加熱するステップと；
ｃ）ステップａ）由来の反応混合物を熱水と組合せるステップと；
ｄ）反応混合物を加熱するステップと；
ｅ）反応混合物を冷却するステップと；
ｆ）Ｎ−ホルミルバラシクロビルを回収するステップと；
を含んで成る、方法。
【請求項６】
ステップａ）で溶媒が添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−ホルミルバラシクロビルを単離するステップをさらに含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
反応時間が約１〜約１０時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
反応時間が約２〜約４時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
バラシクロビルとギ酸アンモニウムの反応混合物が約１２５℃〜約１４５℃に加熱される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）の熱水が約１００℃の温度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｄ）の反応混合物が熱い間に濾過される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｅ）の反応混合物が室温まで冷却される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ−ホルミルバラシクロビルが再結晶化される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
Ｎ−ホルミルバラシクロビルが水から再結晶される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バラシクロビルのサンプル中の不純物を同定する方法であって、
ａ）参照マーカーおよびバラシクロビルを含んで成る参照サンプルを準備するステップと；
ｂ）参照サンプルについてＨＰＬＣまたはＴＬＣを実施してバラシクロビルと比較した場合の参照マーカーの相対保持時間を決定するステップと；
ｃ）バラシクロビルのサンプルについてＨＰＬＣまたはＴＬＣを実施してバラシクロビルと比較した場合のＮ−ホルミルバラシクロビルの相対保持時間を決定するステップと；
ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）で決定した相対保持時間を比較するステップと；
を含んで成り、
ここで、ステップ（ｂ）および（ｃ）で決定した相対保持時間が実質的に同じである場合、Ｎ−ホルミルバラシクロビルが参照マーカーと同じであるとして同定される方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）および（ｃ）の両方でＨＰＬＣが実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの量を決定する方法であって、
（ａ）既知量の参照標準をバラシクロビルサンプルに添加するステップと；
（ｂ）バラシクロビルをＨＰＬＣにかけるステップと；
（ｃ）Ｎ−ホルミルバラシクロビルに関連するＨＰＬＣピークの面積を同定および測定するステップと；
（ｄ）参照標準に関連するＨＰＬＣピークの面積を同定および測定するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）および（ｄ）の結果に基づいてバラシクロビルサンプル中の不純物の量を計算するステップと；
を含んで成り、
ここで、参照標準がＮ−ホルミルバラシクロビルである、方法。
【請求項１９】
バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの量を決定する方法であって、
ａ）未知の濃度の不純物を含有するバラシクロビルのサンプルを準備するステップと；
ｂ）Ｎ−ホルミルバラシクロビルの既知の濃度のサンプルを準備するステップと；
ｃ）バラシクロビルのサンプルの一部およびＮ−ホルミルバラシクロビルのサンプルの一部をＨＰＬＣにかけるステップと；
ｄ）バラシクロビルのサンプルから、そして不純物のサンプルから得た、Ｎ−ホルミルバラシクロビルピークの面積を測定するステップと；
ｅ）ステップ（ｄ）の測定値から、バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの濃度を計算するステップと；
を含んで成る、方法。
【請求項２０】
バラシクロビルのサンプル中の不純物の量を決定する方法であって、
ａ）実質的に純粋なバラシクロビルの既知の濃度の第１の参照溶液を準備するステップと；
ｂ）既知濃度の実質的に純粋なＮ−ホルミルバラシクロビルの既知濃度の第２の参照溶液を準備するステップと；
ｃ）第１および第２の参照溶液それぞれのアリコートをＨＰＬＣ分析にかけて、バラシクロビルおよびＮ−ホルミルバラシクロビルの反応因子を決定するステップと；
ｄ）バラシクロビルの既知の全濃度の溶液を準備するステップと；
ｅ）ステップ（ｃ）で使用したのと実質的に同じ条件下で、該溶液をＨＰＬＣ分析にかけるステップと；
ｆ）それぞれのピーク面積および反応因子を使用して、溶液中のＮ−ホルミルバラシクロビルの量を計算するステップと；
を含んで成る、方法。
【請求項２１】
バラシクロビルのサンプルがバルクのバラシクロビルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
バラシクロビルがバルクのバラシクロビルである、請求項１８、１９および２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
バラシクロビルのサンプルがバラシクロビルのバッチまたは生産ロットから採取され、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの量がＨＰＬＣで判断した場合１０面積％未満であると決定され、バッチまたは生産ロットが販売／輸出のために引渡される、請求項１８、１９および２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
バラシクロビルが、バラシクロビルを含んで成る１つ以上の医薬剤形から分離されたバラシクロビルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
バラシクロビルが、バラシクロビルを含んで成る１つ以上の医薬剤形から分離されたバラシクロビルである、請求項１８、１９および２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
バラシクロビルを含んで成る医薬剤形がバッチまたは生産ロットから採取され、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの量がＨＰＬＣで判断した場合１０面積％未満であると決定され、バッチまたは生産ロットが販売／輸出のために引渡される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１６、１８、１９および２０に記載の方法のいずれかに従って試験されたバラシクロビルまたは医薬として許容される塩を、担体の賦形剤と一緒に製剤化することを含んで成る、バラシクロビルまたはその医薬として許容される塩を含む医薬組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、引用により本明細書に組み入れられる２００４年９月３日に提出された仮出願Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６０／６０７，２７９の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、バラシクロビルの単離不純物；Ｎ−ホルミルバラシクロビル、その調製および参照標準としてのその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
バラシクロビルは、アシクロビルのＬ−バリルエステルプロドラッグである。アシクロビルは、高い抗ウィルス活性を有することが見出された天然ヌクレオシドの非環式類似物質である。アシクロビルは、ヒトにおけるウィルス感染、特にウィルスのヘルペスグループによって引き起こされる感染の処置および予防に幅広く使用されている。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １１９３−１１９８（９ｔｈ  ｅｄ．１９９６）を参照のこと。
【０００４】
バラシクロビルは、化学名１−バリン、２−［（２−アミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イル）メトキシ］エチルエステルを有する（ＣＡＳ登録番号１２４８３２−２６−４）。バラシクロビルは現在、ＶＡＬＴＲＥＸ（登録商標）として市販されている。バラシクロビルの化学構造を構造Ｉとして示す。
【化１】
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【０００５】
ヒト投与の場合、安全上の考慮事項により、同定されたが、毒物学的に特徴付けられていない不純物の非常に低い限度の、国内および国際規制当局による制定が、活性医薬成分（ＡＰＩ）製品の商品化の前に必要とされることが当分野で周知である。通例、これらの限度は各不純物の約０．１５重量パーセント未満である。同定されていない、そして／あるいは特徴付けられていない不純物の限度は明らかに低く、通例、０．１重量パーセント未満である。したがってＡＰＩの製造において、バラシクロビルなどの製品の純度は、製剤調合薬の製造における活性成分の純度と同様に、商品化前に必要とされる。
【０００６】
ＡＰＩ中の不純物が、貯蔵中の純ＡＰＩの安定性に関連するＡＰＩ自体の分解、そして化学合成を含む製造方法から生じうることも当分野で知られている。工程不純物は、未反応開始物質、開始物質に含有される不純物の化学誘導体、合成副生成物、および分解生成物を含む。
【０００７】
ＡＰＩの貯蔵寿命の因子である安定性に加えて、商業的製造プロセスで生産されるＡＰＩの純度は、明らかに商品化のために必要な条件である。商業的製造プロセス中に導入される不純物は、ごく少量に制限される必要があり、好ましくは実質的に非存在である。たとえばＡＰＩメーカーへのＩＣＨ  Ｑ７Ａガイダンスは、原材料の品質を規定することと、プロセスパラメータ、たとえば温度、圧力、時間および化学量論比を制御することと、精製ステップ、たとえば結晶化、蒸留、および液間抽出を製造方法に含めることとによって、工程不純物を設定限度以下に維持することを要求している。
【０００８】
化学反応の生成物混合物が製薬基準に十分適合する純度を持つ単一の化合物であることはまれである。反応の副生物（Ｓｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および副生成物（ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ならびに反応で使用する添加試薬も大半の場合、生成物混合物中に存在するであろう。ＡＰＩ、たとえばバラシクロビルの処理中のある段階において、それが継続処理に、そして最終的に医薬製品での使用に適しているかどうかを判定するために、通例、ＨＰＬＣまたはＴＬＣ分析によって純度を分析しなければならない。絶対純度は通例は達成できない理論的概念であるため、ＡＰＩは絶対的に純粋である必要はない。むしろ、ＡＰＩが不純物を可能な限り含まないこと、それゆえ臨床使用できるほど安全であることを保証する意図で、純度基準が設定される。上述したように米国では、食品医薬品局ガイドラインは、ある不純物の量を０．１パーセント未満に制限することを推奨している。
【０００９】
一般に、副生物（Ｓｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、副産物（ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、および添加試薬（集合的に「不純物」）は、分光的におよび／または他の物理的方法によって同定され、次にクロマトグラムにおいて、またはＴＬＣプレート上のスポット上においてなどのピーク位置と関連付けられる（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐ．９５３，Ｓｔｒｏｂｅｌ，Ｈ．Ａ．；Ｈｅｉｎｅｍａｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，３ｒｄ  ｄｄ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９））。その後、不純物はたとえば、クロマトグラム内のその相対位置によって同定可能であり、クロマトグラム内の位置は従来的に、カラムへのサンプル注入から、検出器を介した特定の成分の溶出までの分として測定される。クロマトグラム内の相対位置は、「保持時間」として知られている。
【００１０】
保持時間は、器具類の条件はもちろんのこと、他の多くの因子によってその平均値が変化しうる。不純物の正確な同定に対してそのような変動が有する影響を軽減するために、当業者は「相対保持時間」（「ＲＲＴ」）を使用して不純物を同定する（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐ．９２２）。不純物のＲＲＴは、参照マーカーの保持時間で割ったその保持時間である。検出できるほど十分多く、カラムを飽和させないほど十分に少ない量で混合物に添加される、また混合物中に存在する、ＡＰＩ以外の化合物を選択することと、ＲＲＴ決定のための参照マーカーとしてその化合物を使用することとが有利な場合がある。
【００１１】
薬物製造の研究開発の当業者は、比較的純粋な状態の化合物を「参照標準」として使用できることを理解している。「参照標準」は参照マーカーに類似しており、定性分析のみに使用されるが、未知混合物中の参照標準の化合物の量を定量するのにも同様に使用される。参照標準は、既知濃度の参照標準溶液および未知の混合物が同じ技法を用いて分析される場合の「外部標準」である（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐ．９２４，Ｓｎｙｄｅｒ  ｐ．５４９，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｌ．Ｒ．；Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＪＪ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７９））。混合物中の化合物の量は、検出器の反応の大きさを比較することによって決定できる。引用により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，３３３，１９８号も参照のこと。
【００１２】
参照標準は、２つの化合物に対する検出器の感度の差を補正する「反応因子」が予め決定されている場合に、混合物中の別の化合物の量を定量するために使用することもできる（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐ．８９４）。このために、参照標準は混合物に直接添加され、そして「内部標準」として知られている（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐ．９２５，Ｓｎｙｄｅｒ  ｐ．５５２）。
【００１３】
参照標準は、参照標準の意図的な添加なしに、未知の混合物が参照標準化合物の「標準添加」として既知の技法を使用して検出可能な量を含有する場合に、内部標準として作用しうる。
【００１４】
「標準添加技法」において、内部標準の既知の量および異なる量を添加することによって、少なくとも２つのサンプルが調製される（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐｐ．３９１−３９３，  Ｓｎｙｄｅｒ  ｐｐ．５７１，５７２）。添加なしで混合物中に存在する参照標準による検出器反応の比は、各サンプルに添加した参照標準の量に対して検出器反応をプロットすることと、プロットを参照標準のゼロ濃度まで外挿することとによって決定できる（たとえばＳｔｒｏｂｅｌ，Ｆｉｇ．１１．４  ｐ．３９２）。
【００１５】
当業者によって知られているように、工程不純物の管理は、その化学構造および合成経路を理解することによって、そして最終生成物中の不純物の量に影響を及ぼすパラメータを同定することによって、大幅に向上する。
【００１６】
いずれの合成化合物とも同様に、バラシクロビルは、多くの供給源に由来する外来性化合物または不純物を含有することがある。それらは未反応開始物質、反応の副生成物、副反応の生成物、または分解生成物でありうる。
【００１７】
本出願において参照マーカーは、ＡＰＩ中の不純物Ｎ−ホルミルバラシクロビルである。参照マーカーの検出または定量化は、ＡＰＩの純度のレベルを確立するのに役立つ。化合物の参照マーカーとしての使用には、実質的に純粋な化合物のサンプルに頼ることが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
１つの態様において、本発明は単離Ｎ−ホルミルバラシクロビルに関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、反応混合物を得るためにバラシクロビルをギ酸アンモニウムと反応させるステップと、反応混合物を熱水と組合せるステップと、反応混合物と熱水との組合せを加熱するステップと、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの沈殿を得るために組合せを冷却するステップとを含む、Ｎ−ホルミルバラシクロビルを作成する方法に関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、バラシクロビルの定性分析における、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの参照マーカーとしての使用に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、バラシクロビルの純度を分析的に定量するために、Ｎ−ホルミルバラシクロビルを参照標準として使用する方法に関する。
【００２２】
なおさらなる態様において、本発明は、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの、外部標準または内部標準のどちらかである参照標準としての使用を含む、バラシクロビルの純度の定量方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、ＨＰＬＣで判断した場合少なくとも９０面積％である化合物を指す。
【００２４】
「参照マーカー」は、混合物の成分を、たとえばクロマトグラム内または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上での位置に基づいて同定するために、定性分析で使用される（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｐｐ．９２１，９２２，９５３）。このために、化合物は、混合物中に存在する場合、混合物に必ずしも添加する必要はない。「参照マーカー」は定量分析のみに使用されるのに対して、参照標準は定量または定性分析、あるいはその両方に使用できる。それゆえ参照マーカーは参照標準のサブセットであり、参照標準の定義に含まれる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「参照標準」という用語は、活性医薬成分の定量および定性分析の両方で使用される化合物を指す。たとえば化合物のＨＰＬＣ保持時間によって、相対保持時間が決定され、それゆえ定性分析を可能にする。ＨＰＬＣ（またはＧＣ）カラムへの注入前の溶液中の化合物の濃度によって、ＨＰＬＣ（またはＧＣ）ピーク下の面積が比較され、それゆえ定量分析を可能にする。
【００２６】
参照標準は、上述の一般用語で説明される。しかしながら、当業者によって理解されるように、検出器反応はたとえば、得られたクロマトグラムのピーク高さまたは積分ピーク面積、たとえばＨＰＬＣシステムの溶出剤からのＵＶまたは屈折率検出、あるいはたとえばガスクロマトグラフの溶出剤からの炎イオン化検出（ＦＤＤ）または熱伝導度検出、あるいは他の検出器反応、たとえば蛍光ＴＬＣプレート上のスポットのＵＶ吸収でありうる。参照標準の位置は、バラシクロビルおよびバラシクロビルの不純物の相対保持時間を計算するために使用される。
【００２７】
１つの態様において、本発明は、バラシクロビルから単離されたバラシクロビルの不純物である、Ｎ−ホルミルバラシクロビルを、好ましい態様においては、バラシクロビルを実質的に含まずに提供する。別の態様において、本発明は、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの調製方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、バラシクロビルの定性分析における、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの参照マーカーとしての使用に関する。別の態様において、本発明は、バラシクロビルの純度を分析的に定量するためにＮ−ホルミルバラシクロビルを参照標準として使用する方法に関する。なおさらなる態様において、本発明は、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの、外部標準または内部標準のどちらかでありうる参照標準としての使用を含む、バラシクロビルの純度の定量方法に関する。
【００２８】
Ｎ−ホルミルバラシクロビルは、バラシクロビル（Ｖａｌｔｒｅｘ（登録商標））に関するＮＤＡで言及されているが、バラシクロビルから単離された（すなわち独立した、別個の）、実質的に純粋な形で得られたことがない。出願人が最もよく知る限り、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの構造は、これまで発見されていない（Ｎ−ホルミル基の位置は未知である）。
【００２９】
Ｎ−ホルミルバラシクロビルは、特にバラシクロビルが残留プロセス溶媒を含有する場合、バラシクロビルの合成中または貯蔵時に形成されうる。
【００３０】
本発明は、構造（ＩＩ）を有する単離されたバラシクロビル不純物、Ｎ−ホルミルバラシクロビルを提供する。出願人が最もよく知る限り、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの構造は、報告されたことがなく、バラシクロビルから独立した別個の該化合物が入手されたことはない。
【化２】
2007513074.tif 000004
【００３１】
好ましくは、単離されたＮ−ホルミルバラシクロビルは、ＨＰＬＣで判断した場合、約０．０３面積％〜５面積％のバラシクロビルを含んで成る。
【００３２】
さらに好ましくは、ＨＰＬＣで判断した場合、単離されたＮ−ホルミルバラシクロビルは約０．０３面積％〜約２面積％のバラシクロビルを含み、または単離されたＮ−ホルミルバラシクロビルは少なくとも９５面積％の純度である。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、バラシクロビルをギ酸アンモニウムと反応させるステップと、反応混合物を加熱するステップと、生じた高温の反応混合物を熱水と組合せるステップと、反応混合物をさらに加熱するステップと、反応混合物を冷却するステップと、Ｎ−ホルミルバラシクロビルを回収するステップとを含む、単離されたＮ−ホルミルバラシクロビルを作成する方法を提供する。場合により、反応混合物に溶媒を添加する。好ましくは、反応混合物は溶媒の不在下で得られる。好ましくは、反応時間は約１〜約１０時間である。さらに好ましくは、反応時間は約２〜約４時間である。好ましくは、バラシクロビルとギ酸アンモニウムとの反応混合物を約１２５℃〜約１４５℃の温度まで加熱する。好ましくは、熱水は約１００℃の温度である。好ましくは、反応混合物と熱水との得られた組合せを高温の間に濾過する。好ましくは、反応混合物を室温まで冷却する。Ｎ−ホルミルバラシクロビルは当分野で既知のいずれかの手段、たとえば２つのみを挙げれば濾過（重力または吸引）あるいは遠心分離によって回収（単離）できる。
【００３４】
好ましくは、Ｎ−ホルミルバラシクロビルは再結晶化される。さらに好ましくは、Ｎ−ホルミルバラシクロビルは、単離されたＮ−ホルミルバラシクロビルを得るために、水から再結晶される。
【００３５】
製造ロット引渡し基準は、バルク製品中の参照標準の特定の量または濃度を基準にして制定できる。医薬剤形のＡＰＩ中の参照標準の検出および定量化は、医薬剤形の貯蔵寿命の尺度として役立つ。すなわち参照標準のある濃度での検出は、ＡＰＩが劣化を開始して、ＡＰＩのその有効性が損なわれうることを通知する。本明細書で使用する場合、ＨＰＬＣは、高圧液体クロマトグラフィーとも呼ばれる、高性能液体クロマトグラフィーの周知の技法を指す。ＨＰＬＣは、混合物の成分の検出および定量化、たとえば活性医薬成分（ＡＰＩ）などの主要化合物中の不純物の検出および定量化に利用できる。
【００３６】
混合物の成分の検出および特に定量化は、反応因子の使用によって実現できる。ＨＰＬＣにおける検出器（たとえばＵＶ検出器または屈折率検出器）の反応は、ＨＰＬＣカラムから溶出する各化合物について異なることがあり、通例は異なっている。知られているように、反応因子は、カラムから溶出する各種の化合物に対する検出器の反応シグナルのこのような差を説明する。
【００３７】
本発明は、Ｎ−ホルミルバラシクロビルの参照マーカーまたは参照標準としての使用を含む各種の方法を提供する。
【００３８】
バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルを同定する方法であって：
（ａ）参照マーカーおよびバラシクロビルを含んで成る参照サンプルを準備するステップと；
（ｂ）参照サンプルについてＨＰＬＣまたはＴＬＣを実施してバラシクロビルと比較した場合の参照マーカーの相対保持時間を決定するステップと；
（ｃ）バラシクロビルのサンプルについてＨＰＬＣまたはＴＬＣを実施してバラシクロビルと比較した場合のＮ−ホルミルバラシクロビルの相対保持時間を決定するステップと；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）で決定した相対保持時間を比較するステップと；
を含み、ステップ（ｂ）および（ｃ）で決定した相対保持時間が実質的に同じである場合、Ｎ−ホルミルバラシクロビルが参照マーカーと同じであるとして同定される、方法が提供される。
【００３９】
バラシクロビルのサンプル中の不純物の量を決定する方法であって：
（ａ）既知量の参照標準をバラシクロビルサンプルに添加するステップと；
（ｂ）バラシクロビルをＨＰＬＣにかけるステップと；
（ｃ）Ｎ−ホルミルバラシクロビルに関連するＨＰＬＣピークの面積を同定および測定するステップと；
（ｄ）参照標準に関連するＨＰＬＣピークの面積を同定および測定するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）および（ｄ）の結果に基づいてバラシクロビルサンプル中の不純物の量を計算するステップと；
を含み、参照標準がＮ−ホルミルバラシクロビルである、方法も提供される。
【００４０】
バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの量を決定する方法であって：
（ａ）未知の濃度のＮ−ホルミルバラシクロビルを含有するバラシクロビルのサンプルを準備するステップと；
（ｂ）Ｎ−ホルミルバラシクロビルの既知の濃度のサンプルを準備するステップと；
（ｃ）バラシクロビルのサンプルの一部およびＮ−ホルミルバラシクロビルのサンプルの一部をＨＰＬＣにかけるステップと；
（ｄ）バラシクロビルのサンプルから、そしてＮ−ホルミルバラシクロビルのサンプルから得た、Ｎ−ホルミルバラシクロビルピークの面積を測定するステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）の測定値から、バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの濃度を計算するステップと；
を含む方法も提供される。
【００４１】
バラシクロビルのサンプル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの量を決定する方法であって：
（ａ）実質的に純粋なバラシクロビルの既知濃度の第１の参照溶液を準備するステップと；
（ｂ）既知濃度の実質的に純粋なＮ−ホルミルバラシクロビルの既知濃度の第２の参照溶液を準備するステップと；
（ｃ）第１および第２の参照溶液それぞれのアリコートをＨＰＬＣ分析にかけて、バラシクロビルおよびＮ−ホルミルバラシクロビルの反応因子を決定するステップと；
（ｄ）バラシクロビルの既知の全濃度の溶液を準備するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）で使用したのと実質的に同じ条件下で、該溶液をＨＰＬＣ分析にかけるステップと；
（ｆ）それぞれのピーク面積および反応因子を使用して、溶液中のＮ−ホルミルバラシクロビルの量を計算するステップと；
を含む方法も提供される。
【００４２】
反応因子は以下のように計算される：Ｙが第１のまたは主要な成分である場合、化合物Ｘの相対反応因子、すなわちＹ中の不純物および特にＹの不純物の参照マーカーは：
ＲY/X＝［ＭX／ＭY］／［ＡX／ＡY］
のように表され、式中、ＭXおよびＭYは、標準溶液（既知量のＸおよびＹを有する溶液）中のＸおよびＹの既知のモル量または濃度であり、ＡXおよびＡYは種ＸおよびＹそれぞれの検出器反応、たとえばＨＰＬＣのピーク面積である。
【００４３】
次に、サンプルの全量が知られているが、ＹおよびＸの相対が未知である溶液において：
Ｍ’X／Ｍ’Y＝ＲY/X*［Ａ’X／Ａ’Y］
式中、Ｍ’XおよびＭ’Yは、溶液中のＸおよびＹそれぞれの量であり、Ａ’XおよびＡ’Yは、ＸおよびＹの関連する検出器反応である。
【００４４】
反応因子の決定は、特にＸがＹの純度に関する参照マーカーであるときは、実質的に純粋なＸおよびＹのサンプルの入手を必要とする。本発明は、参照標準としての使用に適した、単離型のＮ−ホルミルバラシクロビルを提供する。
【００４５】
たとえば貯蔵寿命および残留効力を評価するためのバラシクロビルを含んで成る医薬剤形でのバラシクロビルの純度の決定は、バラシクロビルを剤形中の賦形剤および他の意図的に添加された成分から分離することを必要とする。これはたとえば、所望ならば粉砕した適当な量の剤形を適当な溶媒と組合せることによって実施できる。適当な溶媒は、バラシクロビルおよびその中の不純物、特にＮ−ホルミルバラシクロビルを溶解させるが、賦形剤および他の意図的に添加された成分は溶解させない。
【００４６】
本発明は、上述の、本発明の一部である方法のいずれかに従って試験されたバラシクロビルまたは医薬として許容される塩を、担体の賦形剤と一緒に製剤化することを含んで成る、バラシクロビルまたはその医薬として許容される塩を含む医薬組成物を調製する方法を提供する。
【００４７】
ＨＰＬＣによる混合物の成分の検出および特に定量化は、成分のピークが十分に分離（分解）されることを必要とする。このことは、以下に述べるような方法に従って分解能因子を決定するシステム適合性チェックを実施することによって確認できる。
【００４８】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の周知の技法は、ＡＰＩの純度の評価にも利用できる。この場合、不純物、たとえば参照マーカーの存在は、参照マーカーの同じ、同時に決定された相対位置ＲF（溶媒前線に対する）において適切に描出された「スポット」の存在によって確立される。
【００４９】
なお別の態様において、本発明は、バルクの、またはバラシクロビルを含んで成る医薬剤形から単離された、どちらかのバラシクロビルの純度を試験または検査する方法を提供する。該方法は、ＨＰＬＣまたはＴＬＣによってバラシクロビルを試験してバラシクロビル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの存在を決定するステップを含む。本明細書で以下に説明するＨＰＬＣ法は、この試験または検査に適した分析技法の例である。
【実施例】
【００５０】
実施例１：バラシクロビル中のＮ−ホルミルバラシクロビルの定量分析
Ａ．クロマトグラフィー法
バラシクロビルの定量分析は、以下のアキラルＨＰＬＣ法を使用して実施される：
クロマトグラフィー法は、適切なクロマトグラフィーカラム、たとえば逆相カラムＣ１８および勾配ＨＰＬＣモードを利用する。
【００５１】
カラムおよびパッキング：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ  ５μ  ２５０ｘ４．６ｍｍ
溶出剤Ａ：１０％  Ｈ3ＰＯ4および２％アセトニトリルを用いてｐＨ３．５に調整した水中の９８％  ０．０１Ｍリン酸二水素カリウム
溶出剤Ｂ：アセトニトリル
【表１】
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平衡時間：７分
流速：１．５ｍＬ／分
検出器：２５４ｎｍ（ＵＶ）
サンプル体積：２０μＬ
希釈剤：溶出剤Ａ
【００５２】
Ｂ．Ｎ−ホルミルバルシクロビルの同定のための、Ｎ−ホルミルバルシクロビルの標準溶液の調製：
Ｎ−ホルミルバルシクロビル標準の希釈剤による溶液を調製した。Ｎ−ホルミルバルシクロビルのピークをＲＴ＝２７．４分にて同定した。標準のクロマトグラムを図１に示す。
【００５３】
Ｃ．Ｎ−ホルミルバルシクロビルの同定のための、マーカー溶液の調製：
Ｎ−ホルミルバルシクロビルを約０．８ｍｇ／ｍＬ希釈剤の濃度で含有するバラシクロビルのマーカー溶液を調製した。バルシクロビルサンプル中のＮ−ホルミルバルシクロビル不純物のピークを同定するために、Ｎ−ホルミルバルシクロビルを含有するマーカー溶液を注入した。Ｎ−ホルミルバルシクロビルのピークを（標準溶液で得られたピークに従って）ＲＴ＝２８．３４５分にて同定した。Ｎ−ホルミルバラシクロビルを含有するマーカーの代表的なクロマトグラムを図２に示す。
【００５４】
Ｄ．サンプル溶液の調製：
約０．８ｍｇ／希釈剤の濃度の、分析用のバラシクロビル溶液を調製した。
【００５５】
Ｅ．手順：
マーカーおよびサンプル溶液をクロマトグラフに注入し、サンプルのクロマトグラムを勾配プログラムの終わりまで継続した。サンプルクロマトグラムを図３に示す。
【００５６】
ピーク面積は、当分野で知られているような適切な積分器を使用して決定した。
計算：
【数１】
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ＲＲＦ−Ｎ−ホルミルバラシクロビルの相対反応因子
ＤＬは約０．０１％である；ＱＬは約０．０３％である。
【００５７】
実施例２：Ｎ−ホルミルバラシクロビルの調製
【化３】
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１５０ｍｌの１口丸底フラスコにマグネットスターラーを装着させ、ＣａＣｌ2管によって閉じて、バラシクロビル１０．８ｇ（．０３Ｍ）ｇおよびギ酸アンモニウム２．１ｇ（．０３３Ｍ）を充填した。不均一反応混合物をサーモスタットで１２５℃に調温した油浴で、フラスコの中身を激しく攪拌しながら２．５時間加熱した。アンモニアガスと水蒸気の放出を伴って、固体混合物が溶融した。
【００５８】
反応混合物を熱い間に沸騰水３０ｍｌと共に結晶化フラスコに移し、それに熱水２５０ｍｌを添加した。混合物が透明に変わるまで加熱した。不溶性不純物はすべて、ガラスウール栓を通じた迅速な高温濾過によって除去した。濾液を室温にて８時間静置して、濾過後に白色粉末９．５ｇを純度８５．３９％で得た。
【００５９】
同じ結晶化手順を熱水（それぞれ１５０ｍｌおよび７５ｍｌ）から２回反復して、４．５ｇを９５．８５面積％の純度で得た。
【００６０】
1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲは２Ｄ実験データと共に、ＣＨＯ基がバラシクロビル分子内のバリン−ＮＨ2部分に結合することを示している。
【００６１】
実施例３：Ｎ−ホルミルバラシクロビルの調製
【化４】
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【００６２】
１５０ｍｌの１口丸底フラスコにマグネットスターラーを装着させ、ＣａＣｌ2管によって閉じて、バラシクロビル１０．８ｇ（．０３Ｍ）ｇおよびギ酸アンモニウム２．１ｇ（．０３３Ｍ）を充填した。不均一反応混合物をサーモスタットで１４５℃に調温した油浴で、フラスコの中身を激しく攪拌しながら２．５時間加熱した。アンモニアガスと水蒸気の放出を伴って、固体混合物が溶融した。
【００６３】
反応混合物を熱い間に沸騰水３０ｍｌと共に結晶化フラスコに移し、それに熱水２５０ｍｌを添加した。混合物が透明に変わるまで加熱した。不溶性不純物はすべて、ガラスウール栓を通じた迅速な高温濾過によって除去した。濾液を室温にて８時間静置して、濾過後に白色粉末１０．４ｇを純度８０％で得た。
【００６４】
同じ結晶化手順を熱水１５０ｍｌから反復して、９．０ｇを９２．４面積％の純度で得た。
【００６５】
実施例４：Ｎ−ホルミルバラシクロビルの調製
マグネットスターラーを装着した１００ｍｌ丸底フラスコにバラシクロビル７．２５ｇ（２０ｍｍｏｌ）、ギ酸アンモニウム１．９７ｇ（３１．２ｍｍｏｌ）を充填して、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）（１５ｍｌ）を添加して、攪拌を開始する。得られた混合物を油浴に置いて、１２５℃にて２時間加熱する。混合物を油浴から外し、室温まで放冷して、高真空ポンプを使用して減圧下で溶媒を除去する。残留物を沸騰水１５０ｍｌから結晶化させて、６．０ｇを純度８０％で得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Ｎ−ホルミルバラシクロビルの標準溶液の分析による代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】Ｎ−ホルミルバラシクロビルのマーカー溶液の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】Ｎ−ホルミルバラシクロビルを含有するバラシクロビルサンプルの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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