(57)【要約】  本発明は、幹細胞、詳細には胚幹細胞に関する。それらの増殖が阻害されるようにこれらの幹細胞が封入された場合は、それらが幹細胞および新生腫瘍性および／または過剰増殖性の、しかし他の点では正常な細胞を含む他の封入されていない細胞の増殖を阻害する物質を産生する。さらにまた、封入された癌細胞は幹細胞の増殖を阻害する物質を産生するであろうこともまた見いだされている。さらに、幹細胞の封入がそれらの分化を阻害すること、そして封入プロセスが封入された細胞の少なくとも一部分の未分化状態を維持するための長期貯蔵容器として機能できることもまた見いだされている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性の選択的透過性構造物内に封入された幹細胞のサンプルを含む組成物であって、前記幹細胞のサンプルの封入が前記封入された幹細胞の少なくとも一部分の増殖を阻害する組成物。
【請求項２】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物幹細胞が、マウス幹細胞である請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記幹細胞が、アガロース中に封入されている請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記アガロースが、アガロースでコーティングされている請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記幹細胞が、アガロースおよびコラーゲンの混合物中、またはアガロースおよびゼラチンの混合物中に封入される請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記アガロースおよびコラーゲンの混合物、または前記アガロースおよびゼラチンの混合物がアガロースでコーティングされている請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
幹細胞の集団の少なくとも一部分の増殖を阻害するプロセスであって、前記幹細胞を、前記幹細胞がそれらの増殖を阻害する因子を産生することを誘導する生体適合性の選択的透過性構造物内に封入する工程を含むプロセス。
【請求項１１】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞である請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞が、マウス幹細胞である請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記幹細胞が、アガロース中に封入される請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記アガロースが、アガロースでコーティングされる請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記幹細胞が、アガロースおよびコラーゲンの混合物中、またはアガロースおよびゼラチンの混合物中に封入される請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記アガロースおよびコラーゲンの混合物、またはアガロースおよびゼラチンの混合物がアガロースでコーティングされる請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
封入されていない細胞集団の少なくとも一部分の増殖を阻害するための方法であって、請求項１に記載の組成物の存在下で前記細胞集団を培養する工程を含む方法。
【請求項２０】
前記細胞集団が、幹細胞集団である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞集団が、前記組成物中に封入された細胞の起源の種とは異なる種由来である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞集団が、前記組成物中に封入された細胞の起源の種と同一種由来である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞集団が、癌細胞集団である請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞集団が、哺乳動物細胞集団である請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞集団が、過剰増殖性細胞集団である請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物細胞集団が、ヒト細胞集団である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物細胞集団が、マウス細胞集団である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
細胞集団の少なくとも一部分の増殖を阻害するための方法であって、請求項１に記載の組成物を、それを必要とする被験者に、前記細胞集団の少なくとも一部分の増殖を阻害するために十分な量および十分な部位に投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記細胞集団が、幹細胞集団である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞集団が、新生物細胞を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞集団が、過剰増殖性細胞集団である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物中に封入された細胞が、前記被験者とは異なる種由来である請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物中に封入された細胞が、前記被験者と同一種由来である請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、前記被験者に対して自家性である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験者が、ヒトである請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験者が、ヒトである請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
封入されていない細胞集団の増殖を阻害するための方法であって、請求項１に記載の組成物を、培地中で前記培地内への細胞増殖阻害性物質の拡散を許容するために十分な時間にわたり培養する工程と、前記封入されていない細胞集団の増殖を阻害するために十分な時間にわたり前記培地を前記封入されていない細胞集団へ接触させる工程、とを含む方法。
【請求項３８】
前記封入されていない細胞集団が、幹細胞集団である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記封入されていない細胞集団および前記組成物中に封入された細胞が異なる種由来である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記封入されていない細胞集団および前記組成物中に封入された細胞が、同一種由来である請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞集団が、哺乳動物細胞集団である請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物細胞集団が、ヒト細胞集団である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物細胞集団が、マウス細胞集団である請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記培地を、細胞集団の増殖を阻害することを必要とする被験者に接触させる工程を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞集団が、幹細胞集団である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞集団が、新生物細胞を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物中に封入された細胞が、前記被験者とは異なる種由来である請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物中に封入された細胞が、前記被験者と同一種由来である請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、前記被験者に対して自家性である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
幹細胞の封入されていない集団の増殖を阻害するための方法であって、生体適合性の選択的透過性構造物内に封入された癌細胞のサンプルを含む組成物の存在下で前記幹細胞を培養する工程を含み、前記癌細胞のサンプルが前記幹細胞の増殖を阻害する物質を産生する方法。
【請求項５１】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物幹細胞が、マウス幹細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記幹細胞および癌細胞が、同一種を起源とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記幹細胞および癌細胞が、異なる種を起源とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
封入されていない幹細胞の増殖を阻害するための方法であって、生体適合性の選択的透過性構造物内に封入された癌細胞のサンプルを含む組成物を培養する工程であって、前記癌細胞のサンプルが幹細胞の増殖を阻害する、そして培養培地中へ拡散する物質を産生する工程と、および前記培養培地を前記幹細胞へ接触させる工程、とを含む方法。
【請求項５８】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞である請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物幹細胞が、マウス幹細胞である請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記幹細胞および癌細胞が、同一種を起源とする請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記幹細胞および癌細胞が、異なる種を起源とする請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
生体適合性の選択的透過性構造物内に封入された幹細胞のサンプルを含む組成物であって、前記幹細胞のサンプルの封入が、前記封入された幹細胞の少なくとも一部分が未分化状態で残存することを引き起こす組成物。
【請求項６５】
幹細胞の集団の少なくとも一部分の分化を阻害するプロセスであって、前記幹細胞を、前記幹細胞がそのような部分が未分化状態で残存することを引き起こす因子を産生することを誘導する生体適合性の選択的透過性構造物内に封入する工程を含むプロセス。
【請求項６６】
幹細胞の集団の少なくとも一部分の分化を阻害する方法であって、前記幹細胞を生体適合性の選択的透過性構造物内に封入する工程を含み、そのような封入が、前記幹細胞の少なくとも一部分が未分化状態で残存することを引き起こす方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば幹細胞などの封入された細胞に関する。封入された細胞（entrapped cells）は、封入物質中で培養すると、それが他の封入されていない、自由な成長細胞(freely growing cells)とインビトロもしくはインビボで接触したときにそれらの増殖を阻害する生成物を産生する。さらに、幹細胞の封入は、封入された幹細胞の少なくとも一部の増殖を阻害するように機能し、そして封入された幹細胞の少なくとも一部分の分化を阻害することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞などの生物学的物質の封入は、様々な目途に使用されてきた技術である。この分野における代表的な特許文献は、これら全てが参照として全体に組み込まれる米国特許第６，３０３，１５１号（アシナ（Asina）ら）；第６，２２４，９１２号（アシナ（Asina）ら）；第５，８８８，４９７号（ジェイン（Jain）ら）；第５，６４３，５６９号（ジェイン（Jain）ら）、および再発行特許第３８，０２７号（ジェイン（Jain）ら）である。この一連の関連特許は、癌細胞および島細胞をアガロース、アガロース／コラーゲン混合物、およびアガロース／ゼラチン混合物などの生体適合性マトリックス中に封入して、次にアガロースでコーティングすることができることを証明している。結果として生じる、封入された細胞は、特にその中に細胞が保持されている透過性生体適合性マトリックスから拡散し、そして有用な生物学的特性を有する物質を産生する。島細胞の場合には、インスリンが産生される。癌細胞の場合は、物質がマトリックスから拡散し、そしてこの物質は癌細胞の成長および増殖に影響を及ぼす。上記に挙げた‘９１２号および‘１５１号特許で精査されたようにこの作用は種を超える、すなわち所定の種からの封入もしくは被包化された癌細胞は、前記癌細胞が発現した種と同様に、他の種からの癌細胞の成長および／または増殖を阻害する物質を産生する。
【０００３】
封入技術についての追加の例には、例えば米国特許第５，２２７，２９８号（ウェーバー（Weber）ら）；第５，０５３，３３２号（クック（Cook）ら）；第４，９９７，４４３号（ウォルトホール（Walthall）ら）；第４，９７１，８３３号（ラーソン（Larsson）ら）；第４，９０２，２９５号（ウォルトホール（Walthall）ら）；第４，７９８，７８６号（タイス（Tice）ら）；第４，６７３，５６６号（グーセン（Goosen）ら）；第４，６４７，５３６号（モスバック（Mosbach）ら）；第４，４０９，３３１号（リム（Lim））；第４，３９２，９０９号（リム（Lim））；第４，３５２，８８３号（リム（Lim））；および、第４，６６３，２８６号（ツァン（Tsang）ら）が含まれる。これらの参考文献は、全てが参照として組み込まれる。
【０００４】
封入は、封入された細胞へ必ずしも肯定的な影響を生じさせるものではない。例えば、ロイド‐ジョージ（Lloyd-George）ら、  Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech., 21(3): 323-333 (1993)；シンシティン（Schinstine）ら、Cell Transplant, 41(1): 93-102 (1995)；チチェポーティチェ（Chicheportiche）ら、Diabetologica, 31: 54-57 (1988)；ジェーガー（Jaeger）ら、Progress In Brain Research, 82:41-46 (1990)；ゼコム（Zekom）ら、Diabetologica, 29: 99-106 (1992)；ゾウ（Zhou）ら、Ann. J. Physiol., 274: C1356-1362 (1998)；ダークィ（Darquy）ら、Diabetologica, 28: 776-780 (1985)；ツェ（Tse）ら、Biotech. & Bioeng., 51: 271-280 (1996)：ジェーガー（Jaeger）ら、J. Neurol., 21-469-480 (1992)；ホーテラノ（Hortelano）ら、Blood, 87(12): 5095-5103 (1996)：ガーディナー（Gardiner）ら、Transp. Proc., 29: 2019-2020 (1997)を参照されたい。これらの参考文献は、全てが参照として組み込まれる。
【０００５】
上述した参考文献は、いずれも胚幹細胞を含む幹細胞として知られているクラスの細胞を取り扱っていない。
【０００６】
参照として組み込まれるレヤ（Reya）ら、Nature, 414: 105-111 (2001)によって進められた幹細胞の１つの定義は、自己再生を通して不滅化する、及び分化を通して特定組織の成熟細胞を産生する能力を有する細胞としての幹細胞を意味する。神経細胞、血管リンパ球、骨髄細胞、および様々な器官由来の他のタイプの幹細胞を含む様々なタイプの幹細胞を入手できる。これらは全部が、特定の器官もしくは組織に成長する可能性を有している。胚幹細胞などの所定の幹細胞は、それらの分化経路が完全には決定されていない、そしてそれらが様々な器官および組織に成長できるという点で多分化能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
幹細胞を投入できる様々な治療的使用についての考察はよく知られているので、ここで考察する必要はない。本明細書に記載した発明に関係するので、幹細胞は極めてまれであり、他の細胞タイプからのそれらの精製および分離は労力を要して困難であること、そして幹細胞はこれを防止するための何らかの方法で処置されない限り成熟細胞に分化するであろうことを言及する価値がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
現在において、封入方法はジェイン（Jain）らおよびイワタ（Iwata）ら、Journ. Biomedical Material and Res., 26; 967 (1992)  によって開示された方法に即して極めて望ましい方法で幹細胞に影響を及ぼすことが見いだされている。精緻化するために、封入された幹細胞は、幹細胞および癌細胞を含む様々な細胞タイプの増殖を阻害する物質を産生する。この物質の作用は、種系を越える。さらに、幹細胞は、本明細書に記載したように封入されたときに、無期限の期間に渡ってそれらの多分化能を含む分化能力を維持することが見いだされている。
【０００９】
これらの特徴、ならびにその他の特徴は、以下の開示から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
下記の実施例は、特に、例えば癌細胞および幹細胞を含むがそれらに限定されない細胞の増殖を抑制する物質を産生するために使用できる物質の組成物を含む本発明について記載している。これらの組成物は、封入された細胞の増殖を制限する構造物を形成するために選択的な透過性のある物質内に封入された、胚幹細胞などの幹細胞を含んでいる。それらが制限される結果として、細胞は、他の細胞の増殖を抑制する予想外に多量の物質を産生する。制限された細胞は、対応の制限されていない細胞より多くの物質を産生する。
【００１１】
本発明の構造物を作製するために使用される物質は、幹細胞の成長を制限し、それによってより多量の細胞増殖抑制物質を産生することをそれらに誘導するあらゆる生体適合性物質が含まれる。この構造物は、上記の物質が外部環境へ拡散できるような、そして宿主の免疫系からの生成物もしくは細胞が前記構造物に進入すること、および細胞の拒絶を惹起することを防止できるような、またはさもなければそれらが生残し、および所望の物質を産生し続ける能力を損傷させるような適切な孔径を有する。構造物を形成するために使用される物質は、好ましくは数年間までの期間にわたり、適正な栄養素の進入および細胞廃棄物の除去、ならびに適合性の物理化学的構造物内環境を提供することによって、インビトロおよびインビボの両方において生存性（増殖が限定された、しかし生残する）細胞を維持することもできるであろう。結果として生じた構造物は、幹細胞およびそれらの様々な分化、転写および核因子についての長期試験にとって適切な環境を提供する。その結果は、他の幹細胞の所望の分化を導くために使用できる。この構造物を調製するために使用された物質は、好ましくはインビボに移植されたときに、最も好ましくは宿主内の全移植期間にわたって良好に忍容される。
【００１２】
利用できる物質および物質の組み合わせの非限定的リストには、アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リジン）；アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸塩；アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リジン）−ポリエチレンイミン；キトサン−アルギン酸塩；ポリヒドロキシルエチル−メタクリレート−メチルメタクリレート；カルボニルメチルセルロース；Ｋ−カラゲナン；キトサン；アガロース−ポリエーテルスルホン−ヘキサジ−メチリン−ブロミド（ポリブレン）；エチルセルロース；シリカゲル；およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００１３】
物質の組成物を含む構造物は、例えばビーズ、球形、円筒形、カプセル形、シート、または被験者に埋植するため、および／またはインビトロ環境内での培養に適合する他の形状のように多数の形状をとってよい。この構造物のサイズは、当業者に明白であるように、その最終的な使用に依存して変動する可能性がある。
【００１４】
本発明の構造物は、栄養素は前記構造物内に進入することができ、そして増殖阻害性物質ならびに細胞廃棄物は前記構造物から離れることができるように選択的な透過性である。インビボ使用のためには、前記構造物が細胞の拒絶を惹起するであろう、またはさもなければ増殖抑制性物質を産生する細胞の能力を損傷させるであろう、宿主の免疫系の生成物もしくは細胞の進入を防止するのが好ましい。
【００１５】
本明細書で使用した「封入された」は、細胞が前記構造物を取り囲んでいる環境、インビトロまたはインビボ環境へ抜け出るのを防止する構造物内に含有されている。それから漏れ出ることができないにかかわらず、細胞は水、栄養素などの分子の進入を許容し、そして細胞によって生成された廃棄物および分子生成物の構造物からの通過の両方を供する構造物の中に含まれている。したがって細胞がその中に含有されている構造物は、長期間にわたり細胞の持続的な生存性／生残を支持している。これはさらに、構造物／物質の性質に依存して、その中に含有される物質が、増殖、分化の状態および／または表現型発現を含むそれらの挙動を変化させることを引き起こす可能性もある。分化を阻害することによって、事実上、幹細胞などの幹細胞を維持するために有用な貯蔵容器を有する。典型的には、しかし排他的ではなく、細胞を封入する手段にはそれらを被包化するステップ、それらを包装するステップ、それらを密封するステップ、またはさもなければ一部の透過性物質を用いて全面でそれらを取り囲むステップが含まれる。封入を介して、封入された幹細胞の増殖は阻害される。さらに、封入された集団の少なくとも一部は同様に全く分化されない状況が存在する。
【００１６】
本発明のまた別の態様には、細胞増殖を抑制する際に有用である組成物が含まれる。これらの組成物は、適切な培地中で上述したように制限された細胞を培養するステップによって調製され、その後に結果として生じた馴化培地の回収が行なわれる。濃縮液は、次に馴化培地から形成できる。
【００１７】
本発明はいずれか特定タイプの幹細胞種には限定されない；あらゆる幹細胞タイプを本発明によって使用できる。使用できる細胞の代表的タイプはヒトもしくはマウス幹細胞、並びに他の種、特に哺乳動物種由来の幹細胞である。特別には胚幹細胞が好ましいが、様々な器官および／または器官系から得られた幹細胞も同様に使用できる。
【００１８】
本開示から明白になるように、本発明のまた別の態様は、例えば多嚢胞性腎臓疾患、（瘢痕形成を含む）肥厚性組織反応、自己免疫疾患、リンパ組織増殖性障害、真性赤血球増加症、ならびに良性および悪性細胞新生物などの細胞増殖性疾患を患っている個体を治療するための治療方法である。治療の状況において使用すると、後述するように、構造物内に制限される細胞のタイプは、個体がそれに患っている疾患を引き起こしている細胞と同一タイプである必要はないが、同一タイプであってもよい。そのような１つの方法は、本発明の構造物の少なくとも１つを、被験者における細胞増殖の抑制を惹起するために十分な量で前記被験者内に挿入するステップを含んでいる。好ましくは、被験者はヒトであるが、例えば家畜動物などの他の動物、またはあらゆるタイプの動物に適用することができる。
【００１９】
本発明の組成物は様々な細胞増殖性疾患の治療における一次療法として、そして他の療法と組み合わせた補助療法として使用できる。例えば、癌などの新生腫瘍性疾患では、患者は本明細書に記載した組成物および方法を用いて、放射線療法、化学療法、またはサイトカイン、アンチセンス分子、ステロイドホルモン、遺伝子療法などの他の生物学的活性物質を用いた治療と併用して治療することができる。さらに、本発明の組成物および方法は、例えば再増殖および転移を防止するために腫瘍の切除後に前記構造物を移植するステップによって、癌などの疾患を治療するための外科的方法と併用することもできる。手術不能な状態で存在する癌は、本発明の抗増殖性組成物を用いた治療によって手術可能にすることができる。適正な器官系の機能のための必要とされない、または所望でない、例えば真性赤血球増加症もしくは多嚢胞性腎臓疾患などの新生腫瘍性ではない細胞の過剰な増殖もまた、この手段によって治療することができる。真正赤血球増加症および多嚢胞性腎臓疾患などの過剰増殖性疾患は、過剰な増殖を示すがその他の点では正常な（すなわち、非新生腫瘍性もしくは形質転換）細胞を産生する細胞を含んでいる。適正な器官の機能にとって必要とされない、もしくは所望ではない極めて多数の細胞を結果として生じさせるような疾患もまた、これらの手段によって治療できる。さらに、肥厚性瘢痕などの、過剰増殖性の正常細胞を特徴とする状態もまたこの方法で治療することができる。この中の１つのような状態では、正常細胞、すなわち線維芽細胞は治癒に必要である以上に増殖してきたが、新生腫瘍とは相違して、それらはそれ以上の持続的な無秩序な増殖を特徴としない。この現象を特徴とする他の状態は当業者にはよく知られており、本明細書で記載する必要はない。
【００２０】
本発明の組成物は、さらにまた細胞増殖性疾患を患うことについて高リスク状態にある個体、個々のリスク因子の存在、一般的なの家族歴、特定タイプの家族歴（例、乳癌）、および職業的もしくは他の問題のある物質への曝露を示す被験者において予防的に使用することができる。癌に対する予防のためには、予防的有効量の本発明の構造物が１つ以上のリスク因子が同定された後に個体へ投与される。
【００２１】
上記の実施例によって示したように、抗増殖性作用は使用される細胞のタイプにも、さらにそれを起源とする幹細胞の種にも限定されない。そこで、第１タイプの幹細胞を含有する構造物を様々な種の被験者に投与することができる。例えば、マウス幹細胞を本発明の構造物内に制限し、そして次にヒトへ投与することができる。当然ながら、これらの構造物は治療されている種と同一種由来の幹細胞を含有していてよい。さらにまた、幹細胞は治療される個体から採取し、封入し、制限し、そして次に同一個体へ投与することができる。
【００２２】
本発明の構造物を作製するためのプロセスもまた本発明の一部である。
【実施例】
【００２３】
実施例１
２種のマウス胚幹（ＥＳ）細胞系（すなわち、どちらも公的に入手できる、ＥＳ−Ｄ３およびＳＣＣ−ＰＳＡ１）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）から入手した。
【００２４】
どちらの系も、単層の、上層「ＳＴＯ」胚線維芽支持細胞としての増殖を含む、標準培養条件下で増殖させた。これらもまたＡＴＣＣから入手した。幹細胞は、１００％  ＥＳ−認定ウシ胎児血清、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、およびβ−メルカプトエタノールが補給されているＤＭＥＭ培地（集合的に、「培地Ａ」）中で培養した。受領時に低温保存した細胞を解凍し、少なくとも３継代後に培養として株化し、その後に上述したように培養した。
【００２５】
３日後、ＥＳ細胞は７０〜８０％のコンフルエントになったので、それらの全部が参照して組み込まれる米国特許第６，３０３，１５１号；第６，２２４，９１２号；および第５，８８８，４９７号に基づき、これをトリプシン処理し、次にアガロースビーズ内に封入し、アガロースでコーティングした。しかし、要するに、Ｓｉｇｍａ  ＸＩＩアガロースを約１．０％の初期濃度で使用した。このアガロース溶液の１００μＬ分量を３４μＬの細胞懸濁液に添加した。結果として生じたビーズは、２．０×１０５±１．５×１０４ｃｅｌｌｓのマウス胚幹細胞を含有していた。これらのビーズに約５．０％の濃度でアガロースの第２コーティングを施した。これらのビーズは、ＬＩＦもしくは生存（viable）ＳＴＯ支持細胞が存在していなかったことを除いて、上述したように培地中で培養した（「培地Ｂ」）。
【００２６】
標準的な組織化学的および顕微鏡的検査、ならびに標準的ＭＴＴアッセイによって、様々な時点に、ビーズから取り出した、またはビーズ内に維持された細胞を使用して、ビーズ内の細胞の生存能を経時的に評価した。
【００２７】
封入された幹細胞は最初にコーティングされた時点にそれらの代謝活性を増加させることが観察された。この後に、アポトーシスを介して細胞が死滅するために活性の減少が続き、ほぼ第２１日には代謝活性の最低点に到達した。しかしこの低点の後には、生残している細胞が緩徐に増殖し、そして全代謝活性は封入第３５日まで、そしてそれを越えて徐々に増加することが見いだされた。これは、封入された癌細胞に関する観察所見と対応する。
【００２８】
形態学的には、ビーズのアガロースの内層内で癌細胞によって形成されたコロニーと幹細胞によって形成されたコロニーとの間には有意差が存在した。どちらのタイプのコロニーも形状は卵形であるが、癌細胞によって形成されたコロニーは、エオシン好性の（eosiniphilic）細胞細片の中心帯を備える生存細胞の辺縁帯（一般に厚さが２から３個の細胞）を特徴とする。他方、幹細胞によって形成されたコロニーは完全に生存細胞に占有されており、細胞細片の中心帯は存在しない。
【００２９】
実施例２
これらの実験では、他の幹細胞の増殖に及ぼす幹細胞の阻害作用について試験した。
【００３０】
幹細胞（ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞）を含有する１０週齢アガロース／アガロースビーズを上述したようなＭＴＴアッセイを用いて生存性について試験し、実施例１において考察した培地Ｂ中で６日間にわたり培養した。６日後、培地は封入された幹細胞によって馴化されていた。このため、これは幹細胞馴化培地（Stem-cell Conditioned Medium：ＳＣＭ）と呼ばれている。
【００３１】
これらの６日後、新鮮ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞を含有する６ウェルプレートへＳＣＭを移した。これらのプレートは各々が、１．５×１０４  ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞で被覆された９×１０５  ＳＴＯ支持細胞を含有していた。ＳＴＯ細胞は、増殖を防止するためにマイトマイシンＣを用いて処置されていた。３種のコントロール、すなわち培地Ｂ（非馴化培地）を含有するウェル、およびＳＣＭを含有する３つのウェルを用意した。
【００３２】
３日後、標準方法を用いて、全ウェルの内容物をトリプシン処理し、全細胞を計数した。未加工の計数は、９×１０５支持細胞を説明するために補正した。結果は下記のとおりである。
【００３３】
【表１】
2007513057.tif 000002
【００３４】
類似の実験を実施し、下記の結果が得られた。
【００３５】
【表２】
2007513057.tif 000003
【００３６】
さらに、ＥＳ−ＤＳ細胞が培地に添加された場合の下記の結果によって証明されるように、この作用は細胞系特異的ではなかった。
【００３７】
【表３】
2007513057.tif 000004
【００３８】
実施例３
実施例２は、幹細胞の増殖阻害作用が細胞系特異的ではないことを証明した。本実施例で示した実験では、封入された幹細胞が癌細胞の増殖を阻害する能力について試験した。
【００３９】
これらの実験では、ＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を使用した。１ウェルに付き計１５，０００個の腫瘍細胞を播種した。上述したように、ＳＣＭ（ＳＣＣ−ＰＳＡ１またはＥＳ−Ｄ３のどちらかを用いて馴化した）を使用し、同様に上述したようにコントロール培地（培地Ｂ）も使用した。
【００４０】
ＳＣＭに関して、馴化は５日間以上行なわれた。本アッセイは３２週間にわたり実施した。ＲＥＮＣＡ細胞の阻害は１００％メタノールを用いて細胞を固定し、次にニュートラルレッドを用いて染色し、ＳＤＳを用いて溶解させ、そして分光光度計を用いてスキャニングすることにより、１ウェル当たりの細胞数と比例している細胞可溶化物中のニュートラルレッドの含量を測定した。
【００４１】
これらの結果は、各々ＥＳ−Ｄ３、およびＳＣＣ−ＰＳＡ１幹細胞を用いた研究を表している下記の２つの表にまとめた。第１から３週についての結果は、実施例１において考察した結果と相関している、すなわち、封入された幹細胞の死滅、第２１日における低点への到達、その後に再分化（regeneration）が続いた。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
2007513057.tif 000006
【００４４】
実施例４
先行実験では、封入された幹細胞が幹細胞および癌細胞の増殖を阻害する能力が試験されて証明された。本実施例の次の実験は、封入された癌細胞が幹細胞の増殖を阻害できるかどうかを測定するために計画された。
【００４５】
幹細胞は、上述した方法と同一方法でプレーティングかつ培養した。米国特許第６，３０３，１５１号；第６，２２４，９１２号；および、第５，８８８，４９７号に記載されたとおりに調製したＲＥＮＣＡ細胞を含有するビーズを、培地Ｂ中で馴化させるために５日間にわたり培養した。このＲＥＮＣＡ馴化培地（ＲＣＭ）をプレーティングした幹細胞へ添加し、これらの幹細胞を３日後に計数した。下記の結果は、最初はＥＳ−Ｄ３細胞、および次にＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞についてのデータを示している。
【００４６】
【表６】
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【００４７】
【表７】
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【００４８】
これらの結果は、封入された癌細胞が幹細胞の増殖を阻害したことを示している。
【００４９】
実施例５
幹細胞研究に関わる１つの問題は、それらの性質によって幹細胞が分化するという事実である。まず、最初に幹細胞を固定してそれらが分化しないようにするのが困難であるので、できる限り長い期間にわたりそれによって幹細胞を未分化状態で維持できる方法を利用することが望ましいであろう。
【００５０】
このために、幹細胞を上記の実施例１に記載したように封入した。結果として生じた構造物を上述した培地Ｂ中に保存し、２年間を超える期間にわたり試験した。
【００５１】
この２年間にわたって、幹細胞を封入構造物から遊離させ、標準条件（ＳＴＯ同時培養およびＬＩＦ培地添加物を含む）下で培養した。すべての場合に、遊離した細胞は、非分化様式で増殖したが、自発的に分化する能力を維持した伝統的な幹細胞単層を樹立した。これは、幹細胞の封入が、伝統的な分化阻害剤（例、ＳＴＯおよびＬＩＦ）の不在下で、２年間を越えて非分化表現型を維持できることを証明している。
【００５２】
この事実にもかかわらず、短期間後に細胞が必要な物質を受け入れない場合は、それらは分化し始める。
【００５３】
上記の実施例は、特に、例えば癌細胞および幹細胞を含むがそれらに限定されない細胞の増殖を抑制する物質を産生するために使用できる物質の組成物を含む本発明について記載している。これらの組成物は、封入された細胞の増殖を制限する構造物を形成するために選択的な透過性のある物質内に封入された、胚幹細胞などの幹細胞を含んでいる。それらが制限される結果として、細胞は、他の細胞の増殖を抑制する予想外に多量の物質を産生する。制限された細胞は、対応の制限されていない細胞より多くの物質を産生する。
【００５４】
本発明の構造物を作製するために使用される物質は、幹細胞の成長を制限し、それによってより多量の細胞増殖抑制物質を産生することをそれらに誘導するあらゆる生体適合性物質が含まれる。この構造物は、上記の物質が外部環境へ拡散できるような、そして宿主の免疫系からの生成物もしくは細胞が前記構造物に進入すること、および細胞の拒絶を惹起することを防止できるような、またはさもなければそれらが生残し、および所望の物質を産生し続ける能力を損傷させるような適切な孔径を有する。構造物を形成するために使用される物質は、好ましくは数年間までの期間にわたり、適正な栄養素の進入および細胞廃棄物の除去、ならびに適合性の物理化学的構造物内環境を提供することによって、インビトロおよびインビボの両方において生存性（増殖が限定された、しかし生残する）細胞を維持することもできるであろう。結果として生じた構造物は、幹細胞およびそれらの様々な分化、転写および核因子についての長期試験にとって適切な環境を提供する。その結果は、他の幹細胞の所望の分化を導くために使用できる。この構造物を調製するために使用された物質は、好ましくはインビボに移植されたときに、最も好ましくは宿主内の全移植期間にわたって良好に忍容される。
【００５５】
利用できる物質および物質の組み合わせの非限定的リストには、アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リジン）；アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸塩；アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リジン）−ポリエチレンイミン；キトサン−アルギン酸塩；ポリヒドロキシルエチル−メタクリレート−メチルメタクリレート；カルボニルメチルセルロース；Ｋ−カラゲナン；キトサン；アガロース−ポリエーテルスルホン−ヘキサジ−メチリン−ブロミド（ポリブレン）；エチルセルロース；シリカゲル；およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００５６】
物質の組成物を含む構造物は、例えばビーズ、球形、円筒形、カプセル形、シート、または被験者に埋植するため、および／またはインビトロ環境内での培養に適合する他の形状のように多数の形状をとってよい。この構造物のサイズは、当業者に明白であるように、その最終的な使用に依存して変動する可能性がある。
【００５７】
本発明の構造物は、栄養素は前記構造物内に進入することができ、そして増殖阻害性物質ならびに細胞廃棄物は前記構造物から離れることができるように選択的な透過性である。インビボ使用のためには、前記構造物が細胞の拒絶を惹起するであろう、またはさもなければ増殖抑制性物質を産生する細胞の能力を損傷させるであろう、宿主の免疫系の生成物もしくは細胞の進入を防止するのが好ましい。
【００５８】
本明細書で使用した「封入された」は、細胞が前記構造物を取り囲んでいる環境、インビトロまたはインビボ環境へ抜け出るのを防止する構造物内に含有されている。それから漏れ出ることができないにかかわらず、細胞は水、栄養素などの分子の進入を許容し、そして細胞によって生成された廃棄物および分子生成物の構造物からの通過の両方を供する構造物の中に含まれている。したがって細胞がその中に含有されている構造物は、長期間にわたり細胞の持続的な生存性／生残を支持している。これはさらに、構造物／物質の性質に依存して、その中に含有される物質が、増殖、分化の状態および／または表現型発現を含むそれらの挙動を変化させることを引き起こす可能性もある。分化を阻害することによって、事実上、幹細胞などの幹細胞を維持するために有用な貯蔵容器を有する。典型的には、しかし排他的ではなく、細胞を封入する手段にはそれらを被包化するステップ、それらを包装するステップ、それらを密封するステップ、またはさもなければ一部の透過性物質を用いて全面でそれらを取り囲むステップが含まれる。封入を介して、封入された幹細胞の増殖は阻害される。さらに、封入された集団の少なくとも一部は同様に全く分化されない状況が存在する。
【００５９】
本発明のまた別の態様には、細胞増殖を抑制する際に有用である組成物が含まれる。これらの組成物は、適切な培地中で上述したように制限された細胞を培養するステップによって調製され、その後に結果として生じた馴化培地の回収が行なわれる。濃縮液は、次に馴化培地から形成できる。
【００６０】
本発明はいずれか特定タイプの幹細胞種には限定されない；あらゆる幹細胞タイプを本発明によって使用できる。使用できる細胞の代表的タイプはヒトもしくはマウス幹細胞、並びに他の種、特に哺乳動物種由来の幹細胞である。特別には胚幹細胞が好ましいが、様々な器官および／または器官系から得られた幹細胞も同様に使用できる。
【００６１】
本開示から明白になるように、本発明のまた別の態様は、例えば多嚢胞性腎臓疾患、（瘢痕形成を含む）肥厚性組織反応、自己免疫疾患、リンパ組織増殖性障害、真性赤血球増加症、ならびに良性および悪性細胞新生物などの細胞増殖性疾患を患っている個体を治療するための治療方法である。治療の状況において使用すると、後述するように、構造物内に制限される細胞のタイプは、個体がそれに患っている疾患を引き起こしている細胞と同一タイプである必要はないが、同一タイプであってもよい。そのような１つの方法は、本発明の構造物の少なくとも１つを、被験者における細胞増殖の抑制を惹起するために十分な量で前記被験者内に挿入するステップを含んでいる。好ましくは、被験者はヒトであるが、例えば家畜動物などの他の動物、またはあらゆるタイプの動物に適用することができる。
【００６２】
本発明の組成物は様々な細胞増殖性疾患の治療における一次療法として、そして他の療法と組み合わせた補助療法として使用できる。例えば、癌などの新生腫瘍性疾患では、患者は本明細書に記載した組成物および方法を用いて、放射線療法、化学療法、またはサイトカイン、アンチセンス分子、ステロイドホルモン、遺伝子療法などの他の生物学的活性物質を用いた治療と併用して治療することができる。さらに、本発明の組成物および方法は、例えば再増殖および転移を防止するために腫瘍の切除後に前記構造物を移植するステップによって、癌などの疾患を治療するための外科的方法と併用することもできる。手術不能な状態で存在する癌は、本発明の抗増殖性組成物を用いた治療によって手術可能にすることができる。適正な器官系の機能のための必要とされない、または所望でない、例えば真性赤血球増加症もしくは多嚢胞性腎臓疾患などの新生腫瘍性ではない細胞の過剰な増殖もまた、この手段によって治療することができる。真正赤血球増加症および多嚢胞性腎臓疾患などの過剰増殖性疾患は、過剰な増殖を示すがその他の点では正常な（すなわち、非新生腫瘍性もしくは形質転換）細胞を産生する細胞を含んでいる。適正な器官の機能にとって必要とされない、もしくは所望ではない極めて多数の細胞を結果として生じさせるような疾患もまた、これらの手段によって治療できる。さらに、肥厚性瘢痕などの、過剰増殖性の正常細胞を特徴とする状態もまたこの方法で治療することができる。この中の１つのような状態では、正常細胞、すなわち線維芽細胞は治癒に必要である以上に増殖してきたが、新生腫瘍とは相違して、それらはそれ以上の持続的な無秩序な増殖を特徴としない。この現象を特徴とする他の状態は当業者にはよく知られており、本明細書で記載する必要はない。
【００６３】
本発明の組成物は、さらにまた細胞増殖性疾患を患うことについて高リスク状態にある個体、個々のリスク因子の存在、一般的なの家族歴、特定タイプの家族歴（例、乳癌）、および職業的もしくは他の問題のある物質への曝露を示す被験者において予防的に使用することができる。癌に対する予防のためには、予防的有効量の本発明の構造物が１つ以上のリスク因子が同定された後に個体へ投与される。
【００６４】
上記の実施例によって示したように、抗増殖性作用は使用される細胞のタイプにも、さらにそれを起源とする幹細胞の種にも限定されない。そこで、第１タイプの幹細胞を含有する構造物を様々な種の被験者に投与することができる。例えば、マウス幹細胞を本発明の構造物内に制限し、そして次にヒトへ投与することができる。当然ながら、これらの構造物は治療されている種と同一種由来の幹細胞を含有していてよい。さらにまた、幹細胞は治療される個体から採取し、封入し、制限し、そして次に同一個体へ投与することができる。
【００６５】
本発明の構造物を作製するためのプロセスもまた本発明の一部である。
【００６６】
本発明のまた別の様相は、当業者には明白であり、本明細書で記載する必要はないであろう。
【００６７】
使用してきた用語および表現は限定するためではなく説明のために使用されており、そのような用語および表現の使用においては本明細書に示して記載した特徴の同等物もしくはその部分を排除することは意図しておらず、様々な修飾を本発明の範囲内に含めることが可能であると認識されている。