(57)【要約】  哺乳類組織において、組織因子細胞質ドメインのリン酸化（つまり、ＴＦの細胞質尾部のＳｅｒ２５８のリン酸化）を調節することによって、ＰＡＲシグナル伝達経路（例、ＰＡＲ−１又はＰＡＲ−２シグナル伝達経路）を調節することを含む、哺乳類の組織における血管新生を調節する方法。好ましい方法において、哺乳類における病理学的血管新生は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤の治療効果のある量を投与することによって治療される。好ましくは、哺乳類はヒトである。
2007532668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類組織におけるプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）シグナル伝達経路を調節することを含む、該組織における血管新生を調節する方法。
【請求項２】
調節がＰＡＲ−２シグナル伝達経路の阻害を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
調節がＰＡＲ−１シグナル伝達経路の阻害を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ＰＡＲシグナル伝達経路が組織における組織因子細胞質ドメインのリン酸化を調節することによって調節される、請求項１の方法。
【請求項５】
病理学的血管新生疾病状態にある哺乳類へＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤の治療効果のある量を投与することによってＰＡＲシグナル伝達経路が調節される、請求項１の方法。
【請求項６】
ＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤がＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達阻害剤である、請求項５の方法。
【請求項７】
ＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達阻害剤が、活性部位により阻害される因子ＶＩＩａ（ＶＩＩａｉ）、線虫抗凝固ペプチドｃ２（ＮＡＰｃ２）、ＶＩＩａ因子に特異的な抗体、組織−ＶＩＩａ因子複合体（ＴＦ−ＶＩＩａ複合体）に特異的な抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
ＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤がＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達阻害剤である、請求項５の方法。
【請求項９】
ＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達阻害剤がＰＤＧＦ−ＢＢに特異的な抗体である、請求項８の方法。
【請求項１０】
ＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤が組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤である、請求項３の方法。
【請求項１１】
疾病状態が腫瘍の発達を包含する癌であるか又は虚血性網膜症である、請求項５の方法。
【請求項１２】
哺乳類がヒトである、請求項１の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、本明細書に参照により組み込まれる２００４年４月１６日に出願された特許シリアル番号６０／５６２，８２１についての米国仮出願の利点を請求する。
【０００２】
（政府の権利）
本発明は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成金第ＥＹ１１２５４号及びＨＬ１６４１１号の下での政府の支持でなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（本発明の分野）
本発明は、血管新生を調節するための方法に関する。特に、本発明は、ＰＡＲ−２シグナル伝達経路を調節することによって、哺乳類における血管新生を刺激するか又は阻害するために血管新生を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
予め存在する血管からの新しい血管の形成である血管形成は、正常な発達中の決定的な役割である、創傷治癒及び虚血後組織修復における組織の再生を担う。腫瘍膨張及び虚血性網膜症における血管新生は、血管新生により駆動された疾病進行（病理学的血管新生）の例である。生理学的血管新生及び病理学的血管新生を制御する基本的なメカニズムに関する理解が深まれば、効率のよい血管新生前療法及び抗血管新生療法の開発を支援するであろう。組織因子（ＴＦ）は、血管新生に及ぼす有力な制御効果でタンパク質分解断片を生じる凝固プロテアーゼカスケードの阻害剤である。ＴＦは、Ｇタンパク質により結合され、プロテアーゼにより活性化される受容体（ＰＡＲ）を通じてシグナル伝達するための凝固プロテアーゼを活性化し表す細胞外共受容体として作用する。ＰＡＲは、受容体の細胞外タンパク質分解を包含する独特のメカニズムを通じて活性化される。試験管内で、ＴＦ−ＶＩＩａ複合体は、Ｘａ因子と同様ＰＡＲ−２を活性化する。Ｘａ因子は、最初に同定されたトロンビン受容体であるＰＡＲ−１も開裂できる。Ｘａ因子は、三元のＴＦ−ＶＩＩａ−Ｘａ複合体において最も効率よくシグナル伝達する。
【０００５】
試験管内データは、ＴＦがＰＡＲシグナル伝達における共受容体として作用するが、生体内におけるＰＡＲシグナル伝達におけるＴＦ細胞質ドメインの役割はほとんど定義されていないままであることを示唆する。腫瘍細胞による発現されるＴＦは、腫瘍の進行に関与する。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のＴＦ細胞質ドメイン依存性上方制御は、病理学的血管新生に関与することが示唆されてきたが、広く確立されてはいない。さらに、ＴＦは、悪性乳癌における内皮に局在化し、ＴＦの直接的な阻害剤が腫瘍の成長及び血管新生を抑制することがわかってきた。ＰＡＲ−１及びＰＡＲ−２は血管新生においても包含されるが、ＴＦにより惹起される凝固によるＰＡＲ活性化を連結する生体内データは散在するままである。
【０００６】
腫瘍の発達は、血管新生と関連することが周知である。例えば、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤などの血管新生阻害剤は、腫瘍の成長を遅延させるか又は逆転させることが示されてきた。腫瘍血管新生に関与する新たな生理学的経路を発見し、及び公知の血管新生経路を阻害するための新たな標的を発見する尽力は絶え間ない。
【０００７】
加齢関連黄斑変性症（ＡＲＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、先進国における失明の筆頭原因であり、異常な網膜血管新生の結果として起こる。網膜は、ニューロン要素、グリア要素、及び血管要素の明確な層からなるため、血管増殖又は浮腫においてみられるものなどの比較的小さな混乱が視覚機能の有意な低下に至りうる。網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性は、細動脈狭小化及び血管萎縮などの血管異常とも関連する。未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児と関連した網膜性疾患である。ＲＯＰは、網膜における異常な血管の成長であり、生後最初の数日間で開始し、急速に進行して（例、数週間にわたって）盲目に至りうる。赤ん坊が未熟児で産まれるとき、正常な血管成長が停止し、新たな異常血管が成育し始めるかもしれず、それによって経時的に網膜に線維状瘢痕を生じることができ、網膜剥離に至ることができ、盲目に至りうる。有意な進行が血管新生を促進及び阻害する因子を同定する上でなされてきたが、眼の血管新生性疾患を特異的に治療するのに現在入手可能な治療はない。
【０００８】
腫瘍の発達及び虚血性網膜症などの病理学的血管新生を包含する疾病を治療するための必要性がある。本発明はこの要求を満たす。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の要約
本発明は、哺乳類の組織における血管新生を調節する方法を提供する。方法は、組織においてＰＡＲ−１シグナル伝達経路又はＰＡＲ−２シグナル伝達経路などのＰＡＲシグナル伝達経路を調節することを含む。ＰＡＲシグナル伝達経路は、組織における組織因子細胞質ドメインのリン酸化を調節することによって調節できる。ＰＡＲシグナル伝達経路は、ＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤の組織への投与によって調節できる。
【００１０】
本発明の方法は、特にヒトにおける病理学的血管新生を包含する疾病状態を治療するのに有用である。
【００１１】
好ましい実施態様の詳細な記述
本明細書及び付属の請求項において使用されるように、ＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達の阻害剤、ＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達、及び組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤を含む、ＰＡＲ−２シグナル伝達経路又はＰＡＲ−１シグナル伝達経路などのＰＡＲシグナル伝達経路の阻害剤に関する、治療上効果のある量という語は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ投与されるときに望ましくない血管新生を低下させるか又は除去する阻害剤の量を意味する。投与は、一連の時間にわたって又は無限に単回投与又は複数回投与で存在しうる。治療効果のある量は、当業者によって迅速に測定できる。
【００１２】
ＰＡＲシグナル伝達は、哺乳類組織における血管新生に衝撃を与えうる。組織因子細胞質ドメインのリン酸化（つまり、ＴＦの細胞質尾部のＳｅｒ２５８のリン酸化）は、このようなリン酸化が生じる組織におけるＰＡＲ発現を刺激し、それが病理学的血管新生に至る。したがって、例えば、組織因子細胞質ドメインのリン酸化によるＰＡＲシグナル伝達の調節は、血管新生を調節する（つまり、血管新生を促進するか又は阻害する）のに利用できる。
【００１３】
ＰＡＲシグナル伝達経路による血管新生の調節は、多くの因子及び他のシグナル伝達経路との交差を包含し、後者にはＴＦ−ＶＩＩａ複合体シグナル伝達、Ｘａ因子シグナル伝達、及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体βシグナル伝達が含まれる。哺乳類組織における血管新生を調節するための方法は、組織におけるＰＡＲシグナル伝達を調節すること、好ましくはＰＡＲ−２シグナル伝達経路を調節することを含む。
【００１４】
哺乳類における病理学的血管新生は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へＰＡＲシグナル伝達経路阻害剤の治療効果のある量を投与することによって治療される。好ましくは、哺乳類はヒトである。ＰＡＲシグナル伝達経路の好ましい阻害剤の制限のない例には、ＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達の阻害剤、ＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達経路の阻害剤、及び組織因子細胞質ドメインリン酸化の阻害剤が含まれる。
【００１５】
本発明のある好ましい方法の態様は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ、ＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達阻害剤の治療効果のある量を投与することを含む。好ましいＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達阻害剤の制限のない例には、活性部位により阻害されるＶＩＩａ（ＶＩＩａｉ）、線虫抗凝固ペプチドｃ２（ＮＡＰｃ２）、ＶＩＩａ因子特異的抗体及びＴＦ−ＶＩＩａ複合体特異的抗体、及びそれらの類似物が含まれる。
【００１６】
本発明の別の好ましい方法の態様は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ、ＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達阻害剤の治療効果のある量を投与することを含む。ＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達阻害剤の制限のない例には、ＰＤＧＦ−ＢＢ特異的抗体、及びその類似物が含まれる。
【００１７】
本発明のさらに別の好ましい方法の態様は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤の治療効果のある量を投与することを含む。
【００１８】
本発明の方法によって治療できる病理学的血管新生を包含する疾病状態の制限のない例には、（例、乳癌、肺癌、及びそれらの類似物における）腫瘍の発達及び、糖尿病性網膜症、加齢関連黄斑変性、未熟児網膜症、及びそれらの類似物などの虚血性網膜症疾患が含まれる。
【実施例１】
【００１９】
マウスの系及び試薬
ＴＦ細胞質ドメインの１８カルボキシル末端残基を欠失するＴＦΔＣＴマウスの系、及び（Ｐ．Ａｎｄｒａｄｅ−Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔによって親切に提供された）ＰＡＲ−２欠乏性マウスを、Ｃ５７／ＢＬ６の遺伝的背景と９０％超の相同性を生じるよう戻し交配させた。ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性二重ノックアウトを、戻し交配の５世代後に雑種形成することによって生じた。試薬供給源は次のとおりであった。すなわち、マトリゲル（Ｂｅｃｋｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、内皮細胞成長培地（ＥＧＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、成長因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＯＰＲＯ及びイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア（ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＣＤ３１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）並びにＳＭＡ及びＧＦＡＰ（ＳＩＧＭＡ）に対する抗体、Ｋｉ−６７（ＮＯＶＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。ＴＦ、ＶＩＩａｉ、ヒルジン、ＶＩＩａに対するヤギ抗体及びモノクローナル抗体は、Ｒｉｅｗａｌｄ，Ｍ．及びＲｕｆ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，  ７７４２−７７４７（２００１）によってすでに記載された。ＮＡＰｃ２及びＮＡＰ５は、Ｇ．Ｖｌａｓｕｋ（Ｃｏｒｖａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によって親切に提供された。ヒトＴＦ（１−２６３）及びヒトＴＦ（１−２４３）のアデノウィルスコンストラクトは、Ｄｏｒｆｌｅｕｔｎｅｒ，Ａ．及びＲｕｆ，Ｗ．，Ｂｌｏｏｄ  １０２，  ３９９８-４００５（２００３）によって記載された。プロテアーゼにより活性化される受容体２を、ヒト内皮細胞における炎症性仲介物質により誘導し、ＧＦＰを同時発現するＡｄ５血清型ベクターを同様に発生させた。
【００２０】
腫瘍の成長
動物検査はすべて、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内動物取り扱い及び使用委員会により認可された。４×１０５個のＴ２４１線維肉腫細胞を７週齢ないし９週齢の野生型マウス及びＴＦΔＣＴマウスへと皮下注射し、＞９７％Ｃ５７ＢＬ／６であった。１４日目の腫瘍体積及び最終的な重量を測定した後、ＯＣＴにおける腫瘍の包埋を実施した。１０μｍの凍結切片をアセトンで固定し、ＣＤ３１について染色し、血管密度／顕微鏡視野を蛍光顕微鏡によって、野生型マウス及びＴＦΔＣＴマウスから各々２つの腫瘍の６枚ないし８枚の切片から測定した。
【００２１】
血管新生アッセイ
生体外血管新生アッセイを、Ｍａｓｓｏｎほか、Ｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄ．４，  ２４−３１（２００２）及びＮｉｃｏｓｉａほか、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６３，  １１５−１２２（１９９０）によって記載されるラット大動脈出芽モデルから採用した。８週齢ないし１１週齢のいずれかの性別の野生型マウス、ＴＦΔＣＴマウス、ＰＡＲ−２欠乏マウス、及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏マウス由来の胸部大動脈をマトリゲルに包埋し、５％血清、成長因子、又は次の濃度の阻害剤で補充したＥＧＭと重ねた。すなわち、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＰＤＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ、ヒルジン：５００ｎＭ、ＶＩＩａｉ：１００ｎＭ、ＮＡＰｃ２：２００ｎＭ、ＮＡＰ５：１μＭ、ＶＩＩａ：５０ｎＭである。たいていの場合、大動脈出芽の数を遺伝子型の知識なしで３日目及び４日目に測定した。大動脈リングＲＮＡを標準的な手段を使用してトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出によって単離し、ＤＮＡａｓｅＩで切断した後、β−アクチン及びＴＦについてＲＴ−ＰＣＲを実施した。大動脈切片に、全長ヒトＴＦ（１−２６３）又は切断したヒトＴＦ（１−２４３）についてのアデノウィルスコンストラクトを無血清ＤＭＥＭ中で約２０時間ないし２４時間形質導入した後、出芽アッセイへと包埋した。検査は、高（１．１×１０１０ウィルス粒子／ｍｌ）及び低（５×１０９粒子／ｍｌ）と呼ぶ２つの異別のウィルス投与量を使用した。共焦点蛍光顕微鏡観察について、最低取り囲んでいるマトリゲルを有する大動脈切片を４％パラホルムアルデヒド及びメタノールで固定し、一次抗体及び二次抗体でインキュベートし（各２４時間）、及び抗退色液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。あるいは、ＯＣＴ包埋した大動脈の凍結切片をアセトンで固定し、前述のように染色した。
【００２２】
新生児血管新生を査定するため、網膜全体のマウントを準備し、血管新生をＤｏｒｒｅｌほか、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３，  ３５００−３５１０（２００２）によって記載されるように定量化した。網膜の数及び個々の遺伝子型について使用される異別の同腹子は、野生型（６同腹子からの２０の網膜）、ＴＦΔＣＴ（５同腹子からの２４の網膜）、ＰＡＲ−２欠乏性（３同腹子からの１０の網膜）、及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性（４同腹子からの１６の網膜）であった。摘出した網膜を４％パラホルムアルデヒド中で固定した後、メタノール固定し、一次抗体又は蛍光共役したイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア（ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）中で一晩インキュベートした後、二次抗体インキュベーションを実施し、マウントした。網膜を同一の倍率、解像度、明暗度因子を使用して画像化した。画像を単一網膜モンタージュとして重合し、血管新生の直径を、ＬａｓｅｒＰｉｘソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して定量した（１時、２時、３時、４時、５時、及び６時由来の６個の直径の測定結果＋２回の無作為な直径測定結果）。血管関連Ｋｉ−６７＋核の総数を、血管平面内で焦点合わせすることによって決定した。この平面内での焦点合わせは、計数から増殖中のニューロン細胞を除去した。
【００２３】
眼の試料の分析
ヒト組織を試用するすべての検査を、認可されたヒト用プロトコールにしたがって、及び告知した患者からの了解の下で実施した。臨床的な理由で除去されることがすでに計画されていた虹彩の試料を直ちに約４℃の２０％ショ糖に浸漬した後、凍結切片を作製した。血管新生網膜の試料をＳａｎ  Ｄｉｅｇｏアイバンクから得た。この眼を２５年間糖尿病性網膜症と臨床的に診断された患者から得た。摘出後、網膜を４％ＰＦＡで一晩約４℃にて固定した後、２０％ショ糖中で凍結保護し、凍結切片を作製した。凍結切片を一時抗体について処理し、アレクサ４８８、アレクサ５６８、又はアレクサ６３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のいずれかと共役した二次抗体を使用して共焦点顕微鏡観察のために検出した。ＣＤ３１（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、１：５０）及びインテグリンαｖβ３（ＬＭ６０９、１：５００）に対するマウス抗体、ローダミンにより共役されたＵｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓアグルチニン１（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：１０００）、ＴＦ細胞外ドメインに対するウサギ抗体（Ｒ４５６３、２５μｇ／ｍｌ）、Ｓｅｒ２５８によりリン酸化されたＴＦ細胞質ドメインに対するウサギ抗体（Ｒ６９３６、２５μｇ／ｍｌ）、及びＰＡＲ２に対するウサギ抗体（Ｒ６７９７、２５μｇ／ｍｌ）を使用した。Ｒ６９３６及びＲ６７９７についての免疫原として使用されるペプチドを約５０μｇ／ｍｌで添加し、特異性を呈示した。
【００２４】
ＴＦ細胞質ドメインの欠失は血管新生を増強させる。
腫瘍血管新生におけるＴＦ細胞質ドメインの役割を査定するため、我々は、野生型同腹子子孫との比較の上でのＴＦ細胞質ドメインの欠失したマウス（ＴＦΔＣＴ）における先天性腫瘍の成長を研究した（図１、パネルａ）。腫瘍の膨張及び最終的な腫瘍の重量は、野生型マウスと比較してＴＦΔＣＴにおいて約２倍増強した。しかしながら、野生型マウス及びＴＦΔＣＴマウス由来の腫瘍は、同様の終末段階の血管密度を示し（図１、パネルａ）、腫瘍の膨張が血液供給の増大の後に続き、腫瘍細胞がこれらのマウスで同様の血管新生を確立するという意見と一致した。しかしながら、これらのデータは、宿主間質細胞によって発現されるＴＦがＴＦΔＣＴマウスにおける血管新生の加速に関与するという可能性を排除しなかった。定義された条件下で血管細胞におけるＴＦ細胞質ドメインの調節の役割を直接分析するため、我々は、血管新生を刺激する自家性のマウス血清の存在下で実施される大動脈リングアッセイを採用した。ＴＦΔＣＴマウス大動脈からの微小血管の出芽は、野生型の大動脈と比べ２倍増強した（図１、パネルｂ、ｃ）。大動脈出芽細胞は、ＣＤ３１についてのポジティブ染色及び平滑筋細胞アクチン（ＳＭＡ）についてのネガティブ染色によって示されるように、主として内皮であった（図１、パネルｂ）。我々は、出芽しているＴＦΔＣＴ及び野生型の大動脈における同様のＴＦ発現レベルを観察し（図１、パネルｄ）、調節解除したＴＦ発現よりもむしろＴＦ細胞質尾部の損失が、ＴＦΔＣＴマウスにおける内皮細胞出芽の加速を生じることを示した。
【００２５】
ＴＦ細胞質ドメインシグナル伝達が腫瘍細胞によるＶＥＧＦ発現を調節する上で関与するため、我々は、野生型大動脈がＶＥＧＦにおける相対的な欠乏性による出芽の低下を呈するかどうかを検査した。血清にＶＥＧＦを補充しても、ＴＦΔＣＴ大動脈対野生型大動脈から出芽する上での差異はなくならなかった。しかしながら、血清のない場合でのＶＥＧＦにより刺激された大動脈は非常に制限された出芽を示し、血清がＴＦΔＣＴ大動脈からの血管新生の加速に必要であることを示した（図２、パネルａ）。ＴＦΔＣＴマウス血清（血清交換）の存在下での野生型大動脈からの出芽は増強せず、血清因子又は循環しているＴＦのレベルの上昇よりもむしろＴＦΔＣＴ血管細胞により発現されるＴＦが血管新生前の表現型を付与することを示した（図２、パネルａ）。
【００２６】
ＴＦ−ＶＩＩａシグナル伝達はＴＦΔＣＴ大動脈における血管新生を加速する。
ＴＦΔＣＴ出芽表現型の血清依存性は、ＴＦ細胞質尾部の遺伝的切除が凝固因子血管新生前活性を隠さないかもしれないことを示唆した。大動脈リング出芽モデルにおける凝固プロテアーゼを遮断する阻害効果を研究した（図２、パネルｂ）。ヒルジンによるトロンビンの阻害は、線虫抗凝固ペプチド（ＮＡＰ）５によるＸａの不活性化と同様、出芽に何ら影響せず、凝固カスケードにおいて下流のプロテアーゼからの関与を排除した。活性部位は、ＴＦ−ＶＩＩａ複合体形成を遮断する高い親和性競合アンタゴニストである、活性部位に阻害されたＶＩＩａ（ＶＩＩａｉ）は、捕捉されたＴＦ−ＶＩＩａ−Ｘａ複合体を形成することによってＴＦ−ＶＩＩａを阻害する線虫阻害剤ＮＡＰｃ２と同様、ＴＦΔＣＴ出芽表現型を逆転するが、野生型大動脈からの出芽には影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＴＦ細胞質ドメインがＴＦ−ＶＩＩａプロテアーゼシグナル伝達を負に調節することを示す。
【００２７】
血管新生におけるＶＩＩａ因子（「ＶＩＩａ」）の役割を直接分析するため、大動脈リングモデルにおいて血清をＶＩＩａと置換した。ＴＦ−ＶＩＩａは、野生型大動脈及びＴＦΔＣＴ大動脈の両者からの出芽を効率的には誘導しなかった。内皮細胞の出芽は、成長因子のシグナル伝達に典型的に依存するため、我々はさらに、定義される血管新生前成長因子、つまりＶＥＧＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、又は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下でのＴＦΔＣＴ大動脈からの出芽をさらに特徴付けた。先行データと一致して、これらの因子のいずれもが実質的な出芽を促進せず、ＴＦΔＣＴの血管新生前表現型は、成長因子いずれか単独の存在下では明白ではなかった。しかしながら、ＴＦ−ＶＩＩａをＰＤＧＦ−ＢＢと組み合わせることは、血清条件下で観察されるＴＦΔＣＴの血管新生前表現型を選択的に反復した（図２、パネルｃ）。野生型大動脈からの出芽に及ぼすＰＤＧＦ−ＢＢ及びＶＩＩａの付加的な効果に関する証拠は、線維芽細胞の移動について記載されるように観察されなかった。ＰＤＧＦ−ＡＡは、ＰＤＧＦ受容体αについての選択的なアゴニストであるが、ＰＤＧＦ受容体βを活性化できない。ＶＩＩａは、ＴＦ細胞質ドメインによるネガティブな調節が欠失する場合、ＰＤＧＦ受容体βシグナル伝達と協同することが明らかである。
【００２８】
ＰＡＲ−２とのＴＦ−ＶＩＩａのシグナル伝達のクロストークは血管新生を調節する。
ＴＦ−ＶＩＩａ依存性ＰＡＲ−２活性化は、ＰＤＧＦ−ＢＢと協同してＴＦ細胞質ドメイン欠失マウスにおける血管新生を加速させる。ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性二重トランスジェニックマウスにおける大動脈リング出芽は、野生型レベルへと逆転し（図２、パネルｄ）、ＴＦ細胞質ドメインの損失がＰＡＲ−２依存性の加速した血管新生に至ることを示した。ＰＡＲ−２欠乏性大動脈における表現型の欠失はさらに、ＴＦ細胞質尾部がＰＡＲ−２の血管新生前効果を抑制する上で非常に効率的であることを示し、そのことは、ＴＦ指向性阻害剤（ＶＩＩａｉ及びＮＡＰｃ２）が野生型大動脈からの出芽を低下しなかったという知見によっても支持される（図２、パネルｂ）。
【００２９】
ＴＦΔＣＴマウスの表現型がＴＦ細胞質ドメインシグナル伝達に関連しないことを排除するため、全長のヒトＴＦ（１−２６３）又はコントロールとして細胞質ドメインの欠失したヒトＴＦ（１−２４３）のいずれかを、野生型又はＴＦΔＣＴ大動脈におけるアデノウィルス形質導入によって回復した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヒト特異的抗ＴＦ抗体による染色の同時発現は、取り囲んでいるマトリゲルへの内皮出芽細胞の移動がヒトＴＦ（１−２６３）によっては抑制されるが、ヒトＴＦ（１−２４３）では抑制されないことを示した（図３、パネルａ）。ＣＤ３１によるヒトＴＦの同時局在化はさらに、アデノウィルス形質導入のための標的としての内皮細胞を同定した。発現レベルを、ウェスタンブロットにおけるヒトＴＦを検出することによって大動脈リングアッセイからの抽出物中で測定し、そのことはＴＦの両形態の等しい発現レベルを確認した（図３、パネルｂ）。より高いウィルス投与量で、ヒトＴＦ（１−２６３）は、野生型大動脈及びＴＦΔＣＴ大動脈の両者からの出芽を抑制する（図３、パネルｃ、左）のに対し、より少ない量のウィルスを投与すると、ＴＦΔＣＴ出芽は野生型レベルへと選択的に逆転した（図３、パネルｃ、右）。すべての場合において、切断したヒトＴＦ（１−２４３）は何ら影響を有さず、抑制はＴＦ細胞質尾部に依存することを示した（図３、パネルｃ）。これらのデータは、適切なレベルで導入される場合、ＴＦ細胞質ドメインが血管新生におけるＰＡＲ−２シグナル伝達の負の調節を回復できるという概念を支持する。
【００３０】
ＴＦ細胞質止め因果血管新生におけるＰＡＲ−２シグナル伝達を以下に抑制するかに関するメカニズムへのさらなる洞察を得るため、ＴＦΔＣＴ大動脈の血管新生前表現型の逆転を検討し、シグナル伝達及び導入されたヒトＴＦとの細胞外プロテアーゼ重合体を要するかどうかを決定した。ヒト特異的モノクローナル抗体によるＴＦ（１−２６３）の細胞外ドメインの遮断は、ＴＦΔＣＴマウスの出芽表現型ノ増加の逆転を防止した（図３、パネルｄ）。ＰＡＲ−２の関与については、ヒトＴＦ（１−２６３）の高レベルの発現が野生型大動脈からの出芽を抑制したという知見に基づいて利用することによって取り組まれた。等価のウィルス投与量は、ＰＡＲ−２欠乏性大動脈からの出芽を低下せず、ＴＦ細胞質ドメインの抑制機能がＰＡＲ−２発現を要することを示した（図３ｄ）。集約的に、これらのデータは、ＴＦ細胞質ドメインによる血管新生の負の調節がＰＡＲ−２シグナル伝達の脈絡において特異的に生じることを示す。
【００３１】
ＴＦ細胞質ドメインは生理学的血管新生を調節する。
生体内でのＴＦ細胞質ドメインの役割にさらに取り組むため、常同性の方法で視神経乳頭から生じる血管ネットワークを発達させる新生児の網膜における生理学的血管新生を研究した。新生児マウスにおいて、ＴＦΔＣＴの表層部の血管神経叢直径は、野生型マウスのそれの２倍であり、ＴＦ細胞質尾部が生後の発育中の生体内血管新生を負に調節することを示した（図４、パネルａ）。新生児ＴＦΔＣＴ網膜における血管新生の程度は、２日齢（Ｐ２）野生型網膜に匹敵した（図４、パネルｂ）。大動脈リングアッセイにおけるデータと一致して、新生児ＰＡＲ−２欠乏性マウス由来の網膜は、ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性二重トランスジェニックマウスと同様、加齢による適切な血管新生を示した（図４、パネルａ）。各遺伝子型の少なくとも３回の異別の妊娠から派生した少なくとも１０個の網膜の評価は、ＴＦΔＣＴマウスの観察された表現型と、ＰＡＲ−２の同時欠失によるその逆転との一致を確認した（図４、パネルｃ）。
【００３２】
ＴＦΔＣＴ網膜におけるＴＦの血管細胞特異的局在化は、星状細胞によるＴＦの顕著な発現のため、ＣＮＳにおける確立されたＴＦを発現する細胞タイプを、下にある神経線維による有力なＴＦ発現と同様、評価するのが困難であった。星状細胞のためのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色は、染色パターンに明白な差異のない野生型新生児マウス及びＴＦΔＣＴ新生児マウス由来の網膜の周辺部に星状細胞が同様に及ぶことを示した。したがって、血管の発達は、ＴＦΔＣＴ網膜における発達する星状細胞の移動の加速には間接的には追随しなかった。血管のアポトーシスは、発達のこの段階にある野生型マウスにおいてあまり頻繁には観察されず、アポトーシス由来の保護がＴＦΔＣＴマウスにおける血管新生の加速の原因ではなさそうである。血管の発達の亢進は、細胞増殖の亢進から生じるかもしれないが、Ｋｉ−６７染色に基づいた血管細胞の増殖は、新生児のＴＦΔＣＴ網膜及びＰ２野生型網膜の両者において匹敵する数で存在する（図５、パネルｂ、ｃ）。Ｐ０  ＴＦΔＣＴ網膜の神経叢は、Ｐ２野生型網膜と比較してより伸展するのが明白である（図４、パネルａ、ｂ）。このことは、移動する細胞の先端縁にＭＡＰキナーゼ経路を局在化させるＰＡＲ−２の足場機能と一致した上皮細胞移動の亢進に反映する。ＴＦは悪性胸部腫瘍と関連した血管新生内皮細胞において発現する。試験管内研究は、生体内で毛細管内皮細胞に関して検出可能なＰＤＧＦ受容体−βの活性化を介する一次内皮細胞移動及びコード／チューブ形成に及ぼすＰＤＧＦ−ＢＢの直接的な効果を示した。
【００３３】
ＰＤＧＦ−ＢＢシグナル伝達は、血管アーキテクチャーの再構築を安定化及び調節する壁細胞／周皮細胞の集団の動員及び膨張にも重要である。さらに、ＴＦ遺伝子の完全な欠失は、周皮細胞の動員における関連した低下を有する卵黄嚢における胚性血管神経叢の不完全な血管再構築を生じた。血管新生出芽中の内皮細胞と壁細胞との密接な関係によって、内皮細胞に及ぼすＰＤＧＦ−ＢＢの自己分泌効果と、動員される壁細胞に及ぼす二次的なパラ分泌効果とを区別するよう検証される。ＳＭＡ染色を周皮細胞特異的マーカーとして使用することで、同様の染色パターンが新生児ＴＦΔＣＴマウス及びＰ２野生型マウス由来の網膜血管において観察された（図５、パネルｄ）。各場合における周皮細胞の染色は、出芽の先まで伸びていた（図５、パネルｄ、はめ込み）。Ｐ２  ＰＡＲ−２欠乏性又はＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性マウスの血管神経叢はＰ２野生型マウスとは区別できず、ＰＡＲ−２欠乏性マウスにおける欠陥のある血管の発達が比較的早期には明白ではないという可能性を排除した。周皮細胞は、発達中の網膜血管神経叢を再構築する上で重要な役割を担う。Ｐ６ＴＦΔＣＴ網膜及びＰ８野生型網膜の等価に伸びた表層血管神経叢は、匹敵する毛細血管網密度、動脈又は静脈の分布、及びＳＭＡ染色のパターンも示す（図５、パネルｅ）。網膜の血管新生の比較的後期の段階におけるこれらの類似性は、周皮細胞の機能の変化の反証となる。ＴＦΔＣＴ網膜における血管の発達の加速は、網膜のより深層への成熟前内皮細胞の出芽が観察される日である少なくともＰ６まで持続した。集約的に、これらのデータは、ＴＦΔＣＴマウスにおける異常な周皮細胞の動員よりもむしろ、表層部の血管神経叢の発達における内皮細胞の移動の加速の表現型と一致する。
【００３４】
新生血管性眼疾患におけるＴＦ細胞質ドメインリン酸化
ＴＦリン酸化が病理学的血管新生の他の場合に生じるかどうかを検討するため、糖尿病患者から摘出された血管新生した虹彩の試料を分析した。
【００３５】
ＴＦ細胞質ドメインは、内皮細胞において典型的にはリン酸化されない。リン酸化は、ＴＦ細胞質ドメインの負の調節効果を放出するかも知れず、したがって病理学的血管新生を促進するかも知れない。実際、Ｓｅｒ２５８でリン酸化したＴＦを特異的に認識する抗体による染色は、６名の異別の患者由来の試料において、血管新生の部位でのみＴＦ細胞質ドメインのリン酸化を同定した（図６、パネルａ、ｂ、ｃ）。これらの病理学的血管におけるＴＦのリン酸化はＰＡＲ−２発現と同時局在し（図６、パネルａ）、そのことは、病理学的血管新生中の調節されていないＰＡＲ−２シグナル伝達についての役割を支持した。重要なことに、リン酸化されたＴＦ及びＰＡＲ−２染色は、糖尿病又は病理学的血管新生の病歴を有さない緑内障患者由来のコントロール虹彩試料において観察されなかった（図６、パネルｄ）。
【００３６】
ＴＦリン酸化及びＰＡＲ−２上方制御を、糖尿病性網膜症を有する患者から得られた網膜における新生血管においても特に観察した。ＴＦ細胞外ドメインに対する抗体による染色は、グリア細胞タイプ及びニューロン細胞タイプ、成熟血管（図６、パネルｅ、矢じり）及び血管新生の部位（図６、パネルｅ、白矢印）でのＴＦの幅広い発現を示した。しかしながら、ＴＦリン酸化は、膨張した病理学的血管においてのみ観察された（図６、パネルｅ）。病理学的血管におけるリン酸化されたＴＦの染色は、抗原性ペプチドとの競合によって完全に排除された（図６、パネルａ、ｆ）。免疫原によって不完全に競合された非特異的点状染色は、網膜試料における異別の抗体による非特異的染色について周知の領域である内側及び外側の制限する膜において時々観察された。
【００３７】
ＴＦリン酸化は、正常な成熟した網膜の血管において観察されず、病理学的血管新生中のＴＦリン酸化に対する特異的な役割を支持した。連続切片において、顕著なＰＡＲ−２発現がＴＦリン酸化の観察された同一血管に特異的に観察された（図６、パネルｆ）。ＴＦリン酸化が新生血管特異的であることを確認するため、我々は、血管増殖の公知のマーカーであるインテグリンαｖβ３について糖尿病性網膜を染色した（図６、パネルｇ、ｈ）。リン酸化ＴＦＧは、αｖβ３陽性新生血管と一致して同時局在化したのに対し、正常な網膜微小血管は両者について陰性であった（図６、パネルｇ、ｈ）。
【実施例２】
【００３８】
この例は、組織因子シグナル伝達におけるｐ５３の役割を説明する。ＴＦΔＣＴマウス及びＴＦΔＣＴ／ｐ５３二重変異体マウス由来の網膜を、生後０日（Ｐ０）及び生後６日（Ｐ６）で検討した。発達中の網膜の加速した血管新生を呈する組織因子細胞尾部の欠失した（ＴＦΔＣＴ）新生児マウスの網膜表現型は、ＴＦΔＣＴ／ｐ５３二重変異体マウスにおいて逆転し、腫瘍抑制因子タンパク質として本来見られるｐ５３がＴＦシグナル伝達と相互作用することを示した。
【実施例３】
【００３９】
この例は、ＴＦΔＣＴマウス、ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２マウス及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−１マウスに及ぼす酸素加剰の効果を説明する。病理学的血管新生における組織因子細胞質尾部及びプロテアーゼにより活性化される受容体（ＰＡＲ）１及び２の役割を、酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）についてのマウスモデルを使用して研究した。新生児野生型（ｗｔ）、ＴＦΔＣＴ、ＰＡＲ−２欠乏性及びＰＡＲ−１欠乏性マウス（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔのご好意により提供）を、ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−１欠乏性二重変異体と同様、Ｐ７で酸素加剰（７５％酸素）へ５日間暴露した。ＴＦΔＣＴでは網膜血管新生の速度が加速するため、網膜の血管新生がＰ７の野生型に匹敵するＰ５でマウスを酸素加剰に置いた。Ｐ１２及びＰ１７で（それぞれ正常酸素圧へ戻した直後及び５日後）、網膜を摘出し、４％ＰＦＡ中で固定し、フルオレセインにより共役されたイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア（ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）でインキュベートした。網膜を、共焦点顕微鏡を使用して画像化し、閉塞及び新生血管房の領域を定量した。
【００４０】
酸素加剰暴露直後、閉塞の程度はすべてのマウスで同様であった。図７は、ＴＦΔＣＴマウス及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−１欠乏性二重変異体を野生型マウスとグラフで比較する。図７の上パネルは、野生型マウスと二重変異体が血管閉塞の同様のレベルを有するのに対し、ＰＡＲ−１欠乏性マウスにおいて、閉塞領域の再血管新生が野生型マウスと比較して有意に遅延したことを示す。ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−１欠乏性二重変異体において、この再血管新生の遅延は、新生血管房形成によって明白なように（図７、下パネル）、部分的に逆戻りした。
【００４１】
図８は、ＴＦΔＣＴマウス及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性二重変異体を野生型マウスとグラフで比較する。図８の上パネルは、ｐ１７で、ＴＦΔＣＴマウスが野生型マウスと比べ有意に小さな網膜血管閉塞領域を呈したことを示し、そのことは、ＴＦ細胞質尾部の損失が閉塞した領域の再血管新生の亢進を生じることを示した。ＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性二重変異体はＴＦΔＣＴ表現型を逆戻りさせ、ＰＡＲ−２シグナル伝達が病理学的血管新生における組織因子の細胞質尾部によって調節されることを示した。閉塞の程度における有意な変化はＰＡＲ−２ノックアウトでは観察されなかった。閉塞領域の再血管新生において観察される差異とは対照的に、新生血管房の形成における有意差は、Ｐ１７での野生型マウスと比較してトランスジェニックマウスのいずれにおいても観察されなかった（図８、下パネル）。
【実施例４】
【００４２】
この例は、ＯＩＲモデルにおけるマウスにおけるＰＡＲシグナル伝達阻害因子（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ及びＲｕｆ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９７；  ２７２：  １９８７５−１９８７９によって記載される方法によって調製される活性部位により阻害されるＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａｉ））の注入の効果を説明する。ＯＩＲのマウスモデルにおけるＴＦシグナル伝達の役割をさらに研究するため、自然に発生するＶＩＩ因子よりもＴＦに対する高い親和性を有する組換え型の活性部位により変異されるＶＩＩ因子阻害剤（ＦＶＩＩａｉ）を、マウスが正常酸素圧に戻された直後に硝子体内に注射した。ＦＶＩＩａｉを注射されたマウスにおける反体側のコントロール眼に、コントロールとしてのＰＢＳを注射した。網膜を注射４日後に分析した。ＦＶＩＩａｉ注射は、閉塞領域の再血管新生を亢進した（図９、上パネル）のに対し、新生血管房の形成は低下した（図９、下パネル）。
【００４３】
考察
血管新生は、凝固の活性化が顕著である、癌、新生血管眼疾患及び関節炎に観察される病変の重要な要素である。実際、凝固は、フィブリンが豊富な暫定的細胞外マトリックスの生成、活性化された血小板からの親血管新生因子及び抗血管新生因子並びに内皮細胞ＰＡＲ−Ｉを通じたトロンビンシグナル伝達など、複数の効果によって間接的に血管新生を支えている可能性がある。本データは、ＰＡＲ−２シグナルがＴＦ細胞質ドメインによって強固に制御されていることを実証することによって、凝固シグナルが血管新生を制御する方法について、新規且つ予測できない洞察を与える。ＴＦ細胞質ドメインの遺伝的欠失は、加速された生理的及び病理的血管新生をもたらす。このため、ＴＦ細胞質ドメインによる負の制御的調節の喪失は、ＰＡＲ−２の血管新生促進シグナル伝達を作動させることができる新規経路である。
【００４４】
ＰＡＲ−１は、内皮細胞中で恒常的に発現されているのに対して、ＰＡＲ−２は、ＴＦも誘導する炎症性サイトカイン刺激時に特異的に上方制御される。しかしながら、ＴＦ発現は、内皮細胞中での付随するＶＥＧＦシグナル伝達によって相乗的に増強される。ＴＦ及びＰＡＲ−２の発現並びにＴＦ−Ｐ  ＡＲ−２シグナル伝達経路の機能性は、このため、血管新生増殖因子及び炎症性サイトカインの両方の利用可能性に依存している。動員された単球／マクロファージによる炎症性サイトカイン産生は、血管新生及び血管の側枝増殖にとって重要であると認識されている。これらの適応過程は、傷害を受けた組織から病原体を除去するために先天性免疫系の活動に典型的に付随する創傷治癒と共通点を有している。付随する炎症が存在する場合の創傷治癒の間の加速された血管新生は、ＴＦ−ＰＡＲ−２シグナル伝達経路の生理的機能であるかもしれず、このため、脊椎動物におけるＴＦ細胞質ドメイン構造及び制御要素の進化的保存を説明する可能性がある。
【００４５】
負の制御調節機序が失われた場合に、生理的応答経路は、しばしば、病変を引き起こす。ＴＦ細胞質ドメインは、内皮細胞中のＰＫＣα依存性経路を通じたＳｅｒリン酸化による翻訳後修飾に対する標的である。ＴＦは、主として、リン酸化されておらず、パルミトイル化がアゴニストによって誘導されたリン酸化を抑制する。さらに、ＰＡＲ−２の活性化は、内皮細胞中でＴＦ細胞質ドメインリン酸化を引き起こすが、ＰＡＲ−１は引き起こさない。このため、パルミトイル化の喪失は、ＰＡＲ−２の上方制御と相まって、ＴＦ細胞質ドメインリン酸化の程度を決定する。この考え方は、糖尿病性癌組織から得られるインビボデータによって裏付けられ、上方制御されたＰＡＲ−２の、リン酸化されたＴＦとの同時存在は、新生血管においてのみ観察される。このため、ＴＦのリン酸化は、病理的なＰＡＲ−２−依存性血管新生を促進するための負の制御調節のスイッチを切る機序である可能性がある。
【００４６】
ＴＦ−Ｐ  ＡＲ−２シグナル伝達は、ＴＦΔＣＴ大動脈中で、ＰＤＧＦ−ＢＢと選択的に協調するが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ又はＰＤＧＦ−ＡＡとは協調しなかった。ＰＤＧＦ−ＢＢは、局所的凝固に関連する、活性化された血小板からの放出によって、又は発芽している内皮細胞からの合成によって容易に利用可能である。ＶＥＧＦを標的とした抗血管新生療法は、ある種の疾病において有効であるように見受けられるが、別の協調的経路を標的とする分子との併用療法から、さらなる利点が得られるかもしれない。例えば、ＰＤＧＦ受容体は、ＶＥＧＦによって誘導されたアプローチと組み合わせて、ＰＤＧＦ受容体を阻害することは相乗的な利点を有する。ＰＤＧＦ−ＢＢシグナル伝達は、周皮細胞の動員と成熟した脈管構造を安定化させる上で極めて重要であるので、全身的なＰＤＧＦ受容体の遮断は明確な制約を有している。実際、内皮細胞特異的ＰＤＧＦ−ＢＢの結果、血管の周皮細胞密度が減少することによって、マウスに微小血管性の血管症が引き起こされる。
【００４７】
本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施形態の様々な改変及び修飾を行うことが可能である。例えば、このような治療を必要としている患者への、リン酸化された細胞質ドメインを有するＴＦの治療的有効量の全身的又は局所的投与によって、虚血を治療することが可能である。本明細書に例示されている具体的な実施形態に関して限定を意図するものではなく、又は示唆されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、ＴＦΔＣＴマウスにおける腫瘍成長の亢進及び血管新生を示す。ａ、１４日目の同系のＴ２４１線維肉腫腫瘍体積及び最終重量を、野生型（ＷＴ）及びＴＦΔＣＴのマウスにおいて測定した（ｎ＝５、＊ｔ検定、ｐ＜０．０５）。腫瘍膨張の亢進は、別の腫瘍モデルであるルイス肺癌腫で確認された（データ非表示）。右パネル：ＣＤ３１染色に基づいたＴ２４１腫瘍の腫瘍血管密度。ｂ、生体外血管新生。上パネル：マトリゲルに包埋された３日目の野生型及びＴＦΔＣＴの大動脈切片の代表的な光学顕微鏡写真（２０×元の倍率）。下パネル：示されたように染色した後の共焦点蛍光顕微鏡写真（１０×元の倍率）。ｃ、３日目の野生型及びＴＦΔＣＴの大動脈からの出芽の定量（平均±標準誤差、ｎ＝７４；  ＊ｔ検定、ｐ＜０．０５）。ｄ、ＴＦ発現：  野生型及びＴＦΔＣＴの大動脈における４日目のＴＦ及びβ−アクチンについての半定量的ＰＣＲ。
【図２】図２は、血管新生におけるＴＦ−ＶＩＩａ及びＰＤＧＦ−ＢＢ相乗作用を示す。ａ、示された条件下での３日目の野生型（ＷＴ）及びＴＦΔＣＴの大動脈出芽（平均±標準誤差、ｎ＝１０ないし１５、＊ｔ検定、ｐ＜０．０５）。ｂ、野生型及びＴＦΔＣＴの大動脈を血清中で３日目について示されるようにプロテアーゼ阻害剤の添加とともにインキュベートした（＊ＴＦΔＣＴコントロールとは有意に異別である。；ｔ検定、ｐ＜０．０５）。ｃ、示されるとおり補充したＥＧＭ中での野生型及びＴＦΔＣＴの大動脈からの４日目での出芽（平均±標準誤差、ｎ＝５ないし１９、＊野生型とは有意に異別である。ｔ検定、ｐ＜０．０５）。ｄ、ＴＦΔＣＴ動脈殻の出芽の増強にはＰＡＲ−２発現を要する。：  野生型動脈出芽、ＴＦΔＣＴ動脈出芽、ＰＡＲ−２−欠乏性動脈出芽、及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性動脈出芽（平均±標準誤差、ｎ＝２１ないし３７、＊野生型とは有意に異別である。ｔ検定、ｐ＜０．０５）。ｅ、個々の遺伝子型由来の代表的な大動脈切片（２０×元の倍率）。
【図３】図３は、組織因子の細胞質ドメインがＰＡＲ−２依存性血管新生を抑制することを示す。ａ、上パネル：  高ウィルス投与量で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヒトＴＦ（１−２６３）又はヒトＴＦ（１−２４３）で共形質導入した３日目のＴＦΔＣＴ大動脈切片の蛍光顕微鏡写真（倍率２０×）。下パネル：  ヒトＴＦ（１−２６３）（左）又はヒトＴＦ（１−２４３）及びＧＦＰ（右）で形質導入した後、示されるように染色したＴＦΔＣＴ大動脈出芽の共焦点蛍光顕微鏡写真（倍率１０×）。ｂ、ヒトＴＦを、４日目の形質導入した（高投与量）大動脈切片の界面活性剤抽出物から免疫沈降し、ＴＦに対するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出した。ｃ、高ウィルス投与量（左パネル）又は低ウィルス投与量（右パネル）でヒトＴＦ（１−２６３）又はヒトＴＦ（１−２４３）で形質導入した野生型（ＷＴ）及びＴＦΔＣＴの大動脈からの出芽（平均±標準誤差、ｎ＞１３；＊コントロールとは有意に異別である。ｔ検定、ｐ＜０．０５）。ｄ、ヒトＴＦ（１−２６３）による出芽の抑制は、ＰＡＲ−２発現及びＴＦ細胞外活性を要する。：野生型、ＴＦΔＣＴ、及びＰＡＲ−２欠乏性動脈を高投与量のヒトＴＦ（１−２６３）で形質導入した後、血清中でヒトＴＦ細胞外ドメインに対する抗体のある場合（＋抗ＴＦ）又はない場合でインキュベートした。出芽数を４日目に測定した（平均±標準誤差、ｎ＞１７；  ＊コントロールとは有意に異別である。ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、ＴＦΔＣＴマウスにおける加速して発達する血管新生を示す。ａ、Ｐ０野生型（ＷＴ）、ＴＦΔＣＴ、ＰＡＲ−２−欠乏性、及びＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性マウスからの代表的な網膜。ｂ、Ｐ２野生型網膜を比較のために示す。画像は、２０×倍率で撮影された４枚の個々の画像のモンタージュとして生じた。ｃ、示された遺伝子型由来のＰ０網膜の平均血管神経叢直径の定量。誤差バーは、測定結果の標準誤差を示す。
【図５】図５は、ＴＦΔＣＴマウスにおける正常な星状細胞形態及び周皮細胞動員を示す。ａ、ＧＦＡＰ染色は、Ｐ０野生型（ＷＴ）及びＴＦΔＣＴ網膜における同様の星状細胞テンプレートを示す（２０×倍率で撮影された画像のモンタージュ）。左パネルは、発達中の血管神経叢（赤）の拡大図（４０×倍率）を示す。ｂ、血管関連核のＫｉ−６７染色は、Ｐ０ＴＦΔＣＴ網膜及びＰ２野生型網膜の間の血管細胞増殖活性における差異がないことを示した（２０×倍率）。ｃ、Ｋ１−６７＋核の定量（誤差バーは平均の標準偏差を示す。）。ｄ、周皮細胞動員（ＳＭＡ）は、Ｐ０ＴＦΔＣＴ、及びＰ２野生型網膜、ＰＡＲ−２欠乏性網膜、又はＴＦΔＣＴ／ＰＡＲ−２欠乏性網膜において同様であった（２０×倍率、はめ込みは６０×倍率で撮影されている。）。ｅ、リモデリングした表層の血管叢アーキテクチャーは、Ｐ６ＴＦΔＣＴ網膜及びＰ８野生型網膜においても同様であった（１０×倍率で撮影された画像のモンタージュ）。すべての場合において、血管をイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア（ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）で染色することによって可視化した。
【図６】図６は、眼の血管新生におけるＴＦリン酸化及びＰＡＲ−２発現を示す。ａ、ＴＦ細胞質ドメインＳｅｒ２５８リン酸化特異的抗体（Ｐ−ＴＦ）又は（ＰＡＲ−２開裂を遮断することが確認されている）ＰＡＲ−２に対するポリクローナル抗体により染色した虹彩試料１番。特異性を示すため、ペプチド免疫原の存在下でも染色を実施した（倍率２０×）。ｂ、ｃ、糖尿病患者由来のさらなる独立した虹彩試料は、病理学的血管におけるＴＦリン酸化を示す（ｂ、１０×倍率の画像のモンタージュ、はめ込みは４０×倍率、ｃ、２０×倍率）。ｄ、非糖尿病性緑内障患者由来の虹彩試料は、リン酸化されたＴＦのないことを示す。ｅないしｈ、増殖性糖尿病性網膜症と臨床的に診断された患者由来の試料（１０×倍率）。ｅ、抗ＴＦ細胞ガイドメイン抗体（ＴＦ）による染色は、網膜におけるＴＦの幅広い発現を示す。病理学的（矢印）であるが正常ではない（矢じり）血管は、リン酸化されたＴＦに対する染色を示す（倍率４０×）。ｆ、ＰＡＲ−２染色は、異常な網膜新生血管内で及びそれに隣接して観察される（倍率４０×）。ｇ、ｈ、リン酸化されたＴＦは異常な網膜新生血管に局在化し、そのことはインテグリンαｖβ３に対して特異的なＬＭ６０９抗体で同時染色することによって確認される（ｇ、倍率４０×、ｈ、倍率２０×）。
【図７】図７は、酸素加剰へ暴露した新生児マウスにおける血管閉塞（上パネル）及び新生血管房形成（下パネル）の程度をグラフで示す（ｗｔ＝野生型マウス；  Ｐａｒ−１＝ＰＡＲ−１欠乏性マウス；  ｄＣＴＰａｒ１＝ＴＦΔＣＴ変異も有するＰＡＲ−１欠乏性マウス）。
【図８】図８は、酸素加剰へ暴露した血管閉塞（上パネル）及び新生血管房形成（下パネル）の程度をグラフで示す（ｗｔ＝野生型マウス；  ｄＣＴ＝ＴＦΔＣＴ変異を有するマウス；  ＰＡＲ−２＝ＰＡＲ−２欠乏性マウス；  ｄＣＴ／ＰＰＡＲ−２＝ＴＦΔＣＴ変異も有するＰＡＲ−２欠乏性マウス；  Ｐ１５＝生後１５日目；  Ｐ１７＝生後１７日目）。
【図９】図９は、酸素加剰へ暴露され、ＰＡＲシグナル伝達の阻害剤対コントロール物質で処理された新生児野生型マウスにおける血管閉塞（上パネル）及び新生血管房形成（下パネル）の程度をグラフで示す（ＦＶＩＩａｉ＝活性部位の変異されたＶＩＩ因子で処理されたマウス）；  ＰＢＳ＝リン酸化塩類緩衝液でのみ処理されたコントロールマウス）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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