(57)【要約】本発明はＵＶ照射およびＮ−メチルーＮ’ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような突然変異誘導体を用いて、親株として５’−キサンチル酸を生成するCorynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８を処理して得られる微生物に関するものである。変異体株は、プリン生合成の過程で２つのホルミル基を転移するために用いられるＮ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレートの生合成を高めるために、５−フルオロトリプトファンに耐性を与え、同じ期間の発酵に対し高収率および高濃縮率で培養媒質において５’−キサンチル酸を蓄積することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Corynebacterium ammoniagenesの突然変異体株であり５−フルオロトリプトファンに耐性を有することを特徴とする、５’キサンチル酸を生成する微生物。
【請求項２】
前記微生物がCorynebacterium ammoniagenesＣＪＸＦＴ０３０１（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５３０）である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
請求項１および２記載の微生物を用いることを特徴とする、５’キサンチル酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は５’−キサンチル酸を生成する微生物に関するものである。さらに特に、本発明はCorynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８の変異体株に関し、トリプトファンの代謝類似体である５−フルオロトリプトファンに耐性を与え、プリン生合成を高めるために、プリン生合成経路に含まれるＮ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレートを高め、同じ発酵期間で５’−キサンチル酸を培養基中に高収率高濃度で蓄積させることを可能する。
【背景技術】
【０００２】
５’−キサンチル酸は核酸生合成プロセスの中間体であり、動植物本体では生理学的に重要であり食品、医薬その他のいろいろな分野で重要である。従って、本発明者らは５−フルオロトリプトファンに耐性をもつ変異体株を開発し、既知の株Corynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８からもまた本発明者らは直接の発酵方法によって高収率高濃度で５’−キサンチル酸を生成する。
【０００３】
５’−キサンチル酸はプリンヌクレオチド生合成工程の中間生成物であり、５’−グアニル酸を生成するために重要な物質である。純度と高品質をもつ５’−グアニル酸を生成するため広く用いられる方法は微生物発酵法であり、５’−キサンチル酸を最初生成し、これを５’−グアニル酸に酵素により変換し、従って、５’−グアニル酸を生成し、対応する量の５’−キサンチル酸が必要である。５’−キサンチル酸を生成するための従来の方法は化学合成であり、酵母中でリボ核酸を分解する結果として生成される５’−グアニル酸の脱アミノ化、発酵媒体に前駆体物質としてキサンチンを加える発酵法、微生物の変異体株を用いる発酵法、抗生物質を加える方法（特許文献１および２）、界面活性剤を添加する方法（特許文献３および４）などがある。これらの中で、微生物の変異体株による５’−キサンチル酸の直接発酵方法は産業面に関して非常に有利である。従って、発明者らは、大きい収率で５’−キサンチル酸を生成する特性にCorynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８の存在する特性を変えることによって、５’−キサンチル酸の生産性を増加する変異体株を開発した。
【特許文献１】特公昭４２−１４７７号公報
【特許文献２】特公昭４４−２０３９０号公報
【特許文献３】特公昭４２−３８２５号公報
【特許文献４】特公昭４２−３８３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＸＭＰを生成するための生合成経路は非常に複雑であり、その反応は種々のアミノ酸と補酵素が継続に関与する。特に、Ｎ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレートはＰＲＰＰ（ホスホリボシルピロホスフェート）からＸＭＰへの６段階反応の中、２段階に関与し、各前駆体にホルミル基を変える役を演じる。一方、コリスメートから合成したｐ−アミノベンゾエートはＮ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレートの生合成に必要である。コリスメートはトリプトファン生合成工程では中間生成物であり、本発明者らはコリスメートの生成の増加は、Ｎ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレート生成の増加となると考えた。
【０００５】
従って、本発明者らはプリン合成を増加するために、５−フルオロトリプトファン、トリプトファンの代謝産物類似体に耐性を与え、コリスメートの生合成を高めＮ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレートを増加する変異体株を試験し、５−フルオロトリプトファンに耐性をもつ変異体株が非常に有効であり、高収率高濃縮率で従来技術よりも直接の発酵法によって５’−キサンチル酸を生成できることを見出し、本発明を達成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
さらに、本発明の微生物を分離し取り出す方法を詳細に説明する。
本発明の微生物は、常法に従いＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような突然変異体およびＵＶ照射を用いて、親株としてCorynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８を処理し、異なる濃度水準のフルオロトリプトファン（１０、２０、５０、７０、１００、２００ｍｇ／Ｌ）を添加した媒質（グルコース２０ｇ／Ｌ、一塩基リン酸カリウム１ｇ／Ｌ、二塩基リン酸カリウム１ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１００ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．１ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．８ｍｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／Ｌ、グアニン２０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に成長できるこれらの中で変異体株を選択する。工程において、０−２００ｍｇ／Ｌのフルオロトリプトファンを媒質に添加する。親株は２０ｍｇ／Ｌまでのフルオロトリプトファンに耐性を示したが、５０ｍｇ／Ｌ以上の濃度水準では成長は認められず、従って本発明者らは１００ｍｇ／Ｌのフルオロトリプトファンで成長できる株を分離し、ＣＪＸＦＴ０３０１と命名し、２００３年１１月２５日に韓国微生物培養センターにブダペスト条約の下にＫＣＣＭ１０５３０の寄託番号で寄託した。
【０００７】
本発明の新規変異体株ＣＪＸＦＴ０３０１の生化学的特性は次の表１に示される。表１によれば、本発明の微生物は１００ｍｇ／Ｌのフルオロトリプトファンを添加した培地で成長することができる。
【０００８】
【表１】
2007512850.tif 000002
培地は３０℃で５日間発酵させた。＋：成長、−：成長しない。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は親株としてCorynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８を採用し、これを常法によりＵＶ照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような突然変異誘導体で処理し、変異体株を得た。変異体株は、プリン生合成の過程で２つのホルミル基を転移するために用いられるＮ５，Ｎ１０−テトラヒドロフォレートの生合成を高めるために、５−フルオロトリプトファンに耐性を与え、株は同じ期間の発酵に対し高収率および高濃縮率で媒質において５’−キサンチル酸を蓄積する効果を有する。
【実施例１】
【００１０】
使用した株：Corynebacterium
ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８、Corynebacterium ammoniagenesＣＪＸＦＴ０３０１（ＫＣＣＭ１０５３０）
種子媒質：グルコース３０ｇ／Ｌ、ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母抽出物１５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、尿素３ｇ／Ｌ、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２。
発酵媒質：（１）Ａ媒質：グルコース６０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、アデニン３０ｍｇ／Ｌ、グアニン３０ｍｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２。
（２）Ｂ媒質：一塩基リン酸カリウム１０ｇ／Ｌ、二塩基リン酸カリウム１０ｇ／Ｌ、尿素７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ。
【００１１】
発酵法：５ｍＬの種媒質を直径１８ｍｍの試験管に注入し、常法により加圧下に殺菌した。殺菌後、Corynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８およびCorynebacterium
ammoniagenesＣＪＸＦＴ０３０１をそれぞれに蒔き、１８０ｒｐｍ、３０℃、１８時間振盪し培養した。得られたものを種子培養に用いた。次いで、発酵媒質として、Ａ媒質とＢ媒質を常法により加圧下に別々に殺菌し、２９ｍＬのＡ媒質と１０ｍＬのＢ媒質をそれぞれ殺菌した５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに振盪しながら注入し、１ｍＬの上記の種媒質を蒔き２００ｒｐｍ、３０℃、９０時間発酵させた。発酵完了後、媒質中の５’−キサンチル酸の蓄積量はＫＣＣＭ１０４４８での量が２５．４ｇ／ＬおよびＣＪＸＦＴ０３０１での量が２８．６ｇ／Ｌであった。（蓄積した５’−キサンチル酸は５’−キサンチン酸ナトリウム・７Ｈ２Ｏで与えられる）。
【実施例２】
【００１２】
使用した株：実施例１と同じ。
一次種媒質：実施例１の種媒質と同じ。
二次種媒質：グルコース６０ｇ／Ｌ、一塩基リン酸カリウム２ｇ／Ｌ、二塩基リン酸カリウム２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄２２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム１００ｍｇ／Ｌ、ビオチン１５０μｇ／Ｌ、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、消泡剤０．６ｍＬ／Ｌ、ｐＨ７．２。
【００１３】
発酵媒質：グルコース１５１ｇ／Ｌ、リン酸３２ｇ／Ｌ、水酸化カリウム２５ｇ／Ｌ、アデニン１９８ｍｇ／Ｌ、グアニン１１９ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄６０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛４２ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅２．４ｍｇ／Ｌ、アラニエート２２ｍｇ／Ｌ、ＮＣＡ７．５ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．４ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１５ｇ／Ｌ、シスチネート３０ｍｇ／Ｌ、ヒスチジネート３０ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム１４９ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１５ｍｇ／Ｌ、消泡剤０．７ｍＬ／Ｌ、ＣＳＬ２７ｍＬ／Ｌ、ツナ抽出物６ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３。
【００１４】
一次種媒質：５０ｍＬの一次種媒質を５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに振盪しながら注入し、加圧下に１２１℃で２０分間殺菌した。Corynebacterium ammoniagenesＫＣＣＭ１０４４８およびCorynebacterium
ammoniagenesＣＪＸＦＴ０３０１をそれぞれに蒔き、１８０ｒｐｍ、３０℃、２４時間振盪し培養した。
【００１５】
二次種媒質：二次種媒質を５Ｌの実験発酵浴（それぞれ２Ｌ）に注入し、加圧下に１２１℃で２０分間殺菌した。冷却後、５０ｍＬの上記一次種媒質を播き、０．５ｖｖｍ、９００ｒｐｍ、３１℃、２４時間空気を０．５ｖｖｍ供給しながら培養した。培養工程中、媒質のｐＨ水準を７．３にアンモニウム溶液により調整し保持した。
【００１６】
発酵法：発酵媒質を３０Ｌの実験発酵浴（それぞれ８Ｌ）に注入し、加圧下に１２１℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記二次種媒質を（各１．５Ｌ）播き、４００ｒｐｍ、３３℃、２４時間空気を１ｖｖｍ供給しながら培養した。残りの糖水準が培養工程中に１％以下に下がるときは、殺菌したグルコースを供給し、発酵媒質の全体の糖水準を３０％に保持した。培養工程中に、媒質のｐＨ水準は７．３に保持し、アンモニウム溶液で調整し、この工程を８０時間行った。発酵完了後、媒質中の５’−キサンチル酸の蓄積量はＫＣＣＭ１０４８８量が１４５．２ｇ／Ｌ、ＣＪＦＸＴ０３０１の量は１５５．４ｇ／Ｌであった。（蓄積した５’−キサンチル酸の濃度は５’−キサンチン酸ナトリウム・７Ｈ２Ｏで与えられる）。
【国際調査報告】
2007512850.tif 000003
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