(57)【要約】  本発明者は、従来の技術及び実験とは対照的に、（ｉ）本明細書に記載の診断試験によってトリシリビンに対する高い感受性を示した患者にのみ当該薬剤を投与すること、（ｉｉ）当該薬剤の毒性を最小限に抑え、なお且つ有効性を示す投与量レベルを採用すること、又は、（ｉｉｉ）当該薬剤の毒性を最小限に抑える、本明細書に記載の投与計画を採用すること、の１つ又は組合せによって、腫瘍及び癌を治療するためのトリシリビンの有効な使用方法を見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腫瘍又は癌を治療する方法であって、
（ｉ）腫瘍又は癌から生物学的試料を得るステップと、（ｉｉ）腫瘍又は癌がＡｋｔキナーゼを過剰発現するかどうかを決定するステップと、（ｉｉｉ）腫瘍又は癌がＡｋｔキナーゼを過剰発現する場合、腫瘍又は癌を、有効量の下記式の化合物で治療するステップと、を含む方法。
【化１】
2007530705.tif 000019
［式中、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基であり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基であり（一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する）、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。］
【請求項２】
被治療者が、乳癌、膵臓癌、卵巣癌及び結腸直腸癌からなる群より選択される癌と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌におけるリン酸化Ａｋｔキナーゼの存在をアッセイすることによって、Ａｋｔキナーゼ発現レベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌におけるリン酸化Ａｋｔキナーゼの存在を、抗体を用いてアッセイすることによって、Ａｋｔキナーゼ発現レベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の腫瘍又は癌を治療する方法であって、
哺乳動物に有効量の下記式の化合物を投与することを含み、
前記化合物を週に１回、３週間投与し、その後の１週間は前記化合物を投与しない方法。
【化２】
2007530705.tif 000020
［式中、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基であり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基であり（一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する）、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。］
【請求項６】
前記投与計画を少なくとも２回繰り返す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記投与計画を少なくとも４回繰り返す、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍が、乳房、膵臓、卵巣及び結腸直腸の腫瘍からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１０ｍｇ／ｍ２の前記化合物を投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
１０ｍｇ／ｍ２以下の前記化合物を投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物の腫瘍を治療する方法であって、
哺乳動物に１０ｍｇ／ｍ２以下の下記式の化合物を投与することを含み、
前記化合物を週に１回投与する方法。
【化３】
2007530705.tif 000021
［式中、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基であり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基であり（一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する）、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。］
【請求項１２】
前記投与計画を少なくとも２週間繰り返す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与計画を３週間繰り返し、その後の１週間は薬剤を投与しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与計画が投与周期を表す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与周期を少なくとも２回繰り返す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌の退縮が実現するまで前記投与周期を繰り返す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤を静脈内投与する、請求項１、５又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
被治療者が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫と診断されている、請求項１、５又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１、５又は１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が下記式ＩＢの化合物である、請求項１、５又は１１に記載の方法。
【化４】
2007530705.tif 000022
【請求項２１】
前記化合物が下記式ＩＩＡの化合物である、請求項１、５又は１１に記載の方法。
【化５】
2007530705.tif 000023
【請求項２２】
腫瘍又は癌を治療するための下記式の化合物の使用であって、
（ｉ）腫瘍又は癌から生物学的試料を得るステップと、（ｉｉ）腫瘍又は癌がＡｋｔキナーゼを過剰発現するかどうかを決定するステップと、（ｉｉｉ）腫瘍又は癌がＡｋｔキナーゼを過剰発現する場合、腫瘍又は癌を有効量の下記式の化合物で治療するステップと、を含む使用。
【化６】
2007530705.tif 000024
［式中、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基であり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基であり（一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する）、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。］
【請求項２３】
被治療者が、乳癌、膵臓癌、卵巣癌及び結腸直腸癌からなる群より選択される癌と診断されている、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
癌におけるリン酸化Ａｋｔキナーゼの存在をアッセイすることによって、Ａｋｔキナーゼ発現レベルを測定する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
癌におけるリン酸化Ａｋｔキナーゼの存在を、抗体を用いてアッセイすることによって、Ａｋｔキナーゼ発現レベルを測定する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
腫瘍又は癌を治療するための下記式の化合物の使用であって、
前記化合物を週に１回、３週間投与し、その後の１週間は前記化合物を投与しない使用。
【化７】
2007530705.tif 000025
［式中、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基であり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基であり（一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する）、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。］
【請求項２７】
前記投与計画を少なくとも２回繰り返す、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記投与計画を少なくとも４回繰り返す、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記腫瘍が、乳房、膵臓、卵巣及び結腸直腸の腫瘍からなる群より選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
少なくとも１０ｍｇ／ｍ２の前記化合物を投与する、請求項２６に記載の使用。
【請求項３１】
１０ｍｇ／ｍ２以下の前記化合物を投与する、請求項２６に記載の使用。
【請求項３２】
腫瘍又は癌を治療するための、１０ｍｇ／ｍ２以下の下記式の化合物の使用であって、
前記化合物を週に１回投与する使用。
【化８】
2007530705.tif 000026
［式中、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基であり、
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基であり（一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する）、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。］
【請求項３３】
前記投与計画を少なくとも２週間繰り返す、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記投与計画を３週間繰り返し、その後の１週間は薬剤を投与しない、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記投与計画が投与周期を表す、請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
前記投与周期を少なくとも２回繰り返す、請求項３２に記載の使用。
【請求項３７】
癌の退縮が実現するまで前記投与周期を繰り返す、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記薬剤を静脈内投与する、請求項２６、３２又は３６に記載の使用。
【請求項３９】
被治療者が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫と診断されている、請求項２６、３２又は３６に記載の使用。
【請求項４０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２６、３２又は３６に記載の使用。
【請求項４１】
前記化合物が下記式ＩＢの化合物である、請求項２６、３２又は３６に記載の使用。
【化９】
2007530705.tif 000027
【請求項４２】
前記化合物が下記式ＩＩＡの化合物である、請求項２６、３２又は３６に記載の使用。
【化１０】
2007530705.tif 000028
【発明の詳細な説明】
【関連出願へのクロスレファレンス】
【０００１】
この出願は、２００４年３月２９日に出願された出願番号第６０／５５７５９９号の米国仮出願の優先権を主張するものであり、その開示内容は、参照されることによって本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
この出願は、腫瘍、癌、及び、異常な細胞増殖に関連する他の疾患の治療のための、トリシリビン及び関連化合物、並びに毒性の低減した組成物の詳細な投与方法を提供する。
【背景】
【０００３】
癌とは、細胞の異常増殖である。空間の制限、他の細胞と共有する栄養素、又は体から送られる増殖停止信号にも関わらず、癌細胞は迅速に増殖する。癌細胞は、健康な細胞とは異なる形状をとることが多く、適切に機能せず、体の多くの領域に広がることができる。異常増殖した組織は腫瘍と呼ばれるが、これは、無制御に増殖分裂することができる細胞の集団である。腫瘍には、良性（非癌性）のものと悪性（癌性）のものとがある。良性腫瘍は、ゆっくり増殖し、広がらない。悪性腫瘍は迅速に増殖し、近くの正常な組織に侵入して破壊し、体全体に広がることができる。
【０００４】
癌は、発生源の体液若しくは組織の種類に従って、又は最初に発生した体の位置に従って分類される。更に、混合型の癌もある。癌は、大雑把に５つの部類、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫に分けることができ、これらは癌の組織分類及び血液分類を示す。癌腫は、器官、腺若しくは体構造の表面又はその内側を覆う、上皮組織という体組織に見出される癌である。例えば、胃の内層の癌は、癌腫と呼ばれる。多くの癌腫は、乳汁を産生する乳房等の、分泌に関連した器官又は腺に影響を及ぼす。癌腫は、癌の全症例の約８０〜９０％を占める。肉腫は、結合組織、例えば、軟骨、脂肪、筋肉、腱及び骨から増殖する悪性腫瘍である。最も一般的な肉腫である骨の腫瘍は、通常青少年に生じる。肉腫の例には、骨肉腫（骨）及び軟骨肉腫（軟骨）が含まれる。リンパ腫は、白血球を産生し、体液を浄化する役割を担うリンパ系の節若しくは腺、又は脳、乳房等の器官で発生する癌のことである。リンパ腫は、２つの部類、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫に分類される。血液癌としても知られる白血病は、骨髄が正常な赤血球、白血球及び血小板を産生しなくなる、骨髄の癌である。白血球は、感染に抵抗するために必要である。赤血球は、貧血を予防するために必要である。血小板は、体が容易に挫傷を形成したり、出血したりするのを妨げる。白血病の例としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病及び慢性リンパ性白血病が挙げられる。骨髄性及びリンパ性という用語は、関連する細胞の種類を示す。最後に、骨髄腫は、骨髄の形質細胞中で増殖する。場合によっては、骨髄腫細胞は１つの骨に集まり、形質細胞腫と称する単一の腫瘍を形成する。しかし、それ以外の場合、骨髄腫細胞は多くの骨に集まり、多くの骨腫瘍を形成する。これは、多発性骨髄腫と呼ばれる。
【０００５】
腫瘍の誘発及び進行は、腫瘍細胞ゲノムにおける変化の蓄積の結果であることが多い。このような変化としては、細胞増殖阻害遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の不活性化、並びに細胞増殖促進遺伝子又は癌遺伝子の活性化が挙げられる。今日までに、何百もの活性型細胞性癌遺伝子が動物モデルで同定されているが、これらの遺伝子でヒト癌に関連することが判明しているのはほんの少数である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ他、１９８９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｎｏｗｅｌｌ  １９９０  Ｃｅｌｌ  ６３  ８６７〜８７４、Ｇｏｄｗｉｎ他、１９９２、Ｏｎｇｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｉｎ  ＷＪ  Ｈｏｓｋｉｎｓ、ＣＡ  Ｐｅｒｅｚ及びＲＣ  Ｙｏｕｎｇ（編）、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇ：ｙｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐｐ  ８７〜１１６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。ヒト癌における癌遺伝子の活性化は、遺伝子コピー数の増加又は構造変化等の要因から生じることがある。これらの要因は、多くの細胞作用の原因となることがあり、例えば、遺伝子産物の過剰発現をもたらすことがある。ヒト癌に関与するいくつかの癌遺伝子は、遺伝子過剰発現によって活性化されることがある。
【０００６】
癌細胞が獲得した遺伝的異常が受け継がれることによって、正常な細胞増殖、細胞分化、及びプログラム細胞死を制御する調節的情報伝達回路の欠陥が引き起こされる（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．及びＲ．Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ、２０００．１００（１）：ｐ．５７〜７００）。これは、次いで、悪性を決定づける、細胞生理機能の基本的な欠陥をもたらす。これらの欠陥としては、ａ）増殖信号の自給自足（すなわち、ＥＧＦＲ等の増殖因子受容体チロシンキナーゼの過剰発現、及びＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ１／２、Ｒａｓ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ等の下流情報伝達経路の異常活性化）、ｂ）抗増殖信号に対する耐性（すなわち、ＴＧＦβ及びその受容体の発現低下）、ｃ）アポトーシスの回避（すなわち、アポトーシス促進性ｐ５３の欠失、生存促進性Ｂｃｌ−２の過剰発現、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔによって媒介される経路等の生存経路の過剰活性化）、ｄ）血管形成の持続（すなわち、ＶＥＧＦ分泌レベルの上昇）、並びにｆ）組織侵襲及び転移（すなわち、細胞外プロテアーゼ及び転移促進インテグリン）、が挙げられる（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．及びＲ．Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ、２０００．１００（１）：ｐ．５７〜７００）。
【０００７】
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＶＥＧＦＲ、インシュリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）等の受容体チロシンキナーゼは、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌及び卵巣癌を含む多くのヒト癌の発症に密接に関与する（Ｋｈａｌｅｇｈｐｏｕｒ，Ｋ．他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００４．２５（２）：ｐ．２４１〜８；Ｓｅｋｈａｒａｍ，Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．６３（２２）：ｐ．７７０８〜１６）。ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１等のリガンドのそれらの受容体への結合は、本来のチロシンキナーゼ活性の刺激、受容体の細胞質ドメインの特定のチロシンの自己リン酸化、及び種々の複合情報伝達経路を引き起こすシグナル伝達タンパク質の動員を促進する（Ｏｌａｙｉｏｙｅ，Ｍ．Ａ．他、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２０００．１９（１３）：ｐ．３１５９〜６７、Ｐｏｒｔｅｒ，Ａ．Ｃ．及びＲ．Ｒ．Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９８．１７（１１  Ｒｅｖｉｅｗｓ）：ｐ．１３４３〜５２）。これは、次いで、多くの腫瘍生存経路及び腫瘍発生経路、例えば、Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ１／２、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路等の活性化を導く。３種の経路はすべて、大腸、膵臓、乳房及び卵巣の腫瘍形成に関与するが、Ａｋｔによって媒介されるこれらの経路は、細胞増殖、抗アポトーシス／生存、侵襲・転移、血管形成等の悪性形質転換の多くの段階に必須であることが示されている（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９９．１３（２２）：ｐ．２９０５〜２７）。
【０００８】
Ａｋｔは、３種のファミリーメンバー、すなわち、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３、を有するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＰＫＢとしても知られている。）である。細胞を増殖因子若しくは生存因子で刺激することによって、ホスホイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）をＰＩＰ３にリン酸化する脂質キナーゼ、ホスホイノシチド−３−ＯＨ−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の受容体への動員を引き起こし、このキナーゼがＡｋｔを細胞膜に動員する。そして、細胞膜において、Ａｋｔは、Ｔｈｒ３０８及びＳｅｒ４７３（Ａｋｔ１）、Ｔｈｒ３０８及びＳｅｒ４７４（Ａｋｔ２）、並びにＴｈｒ３０８及びＳｅｒ４７２（Ａｋｔ３）のリン酸化によって活性化される（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９９、１３（２２）：ｐ．２９０５〜２７）。従って、ＰＩ３Ｋは、ＰＩＰ２をリン酸化してＰＩＰ３に変換することによって、Ａｋｔを活性化する。ホスファターゼＰＴＥＮは、ＰＩＰ３を脱リン酸化してＰＩＰ２に変換し、それによって、Ａｋｔの活性化を阻害する。
【０００９】
ヒト癌の大部分は、過剰活性化したＡｋｔを含有する（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９９．１３（２２）：ｐ．２９０５〜２７、Ｂｅｌｌａｃｏｓａ，Ａ．他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１９９５．６４（４）：ｐ．２８０〜５；Ｓｕｎ，Ｍ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００１．１５９（２）：ｐ．４３１〜７）。特に、Ａｋｔは、ヒト結腸直腸癌の５７％、膵臓癌の３２％、乳癌の２７％、卵巣癌の３６％で過剰発現し、且つ／又は過剰活性化している（Ｒｏｙ，Ｈ．Ｋ．他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２．２３（１）：ｐ．２０１〜５、Ａｌｔｏｍａｒｅ，Ｄ．Ａ．他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００３．８８（１）：ｐ．４７０〜６、Ｓｕｎ，Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１．６１（１６）：ｐ．５９８５〜９１．、Ｓｔａｌ，Ｏ．他、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．５（２）：ｐ．Ｒ３７〜４４、Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９２．８９（１９）：ｐ．９２６７〜７１、Ｙｕａｎ，Ｚ．Ｑ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００．１９（１９）：ｐ．２３２４〜３０）。Ａｋｔの過剰活性化は、Ａｋｔ自体の増幅及び／又は過剰発現、受容体チロシンキナーゼ及び／又はそれらのリガンドの過剰発現を含む、Ａｋｔの上流の遺伝的変化（Ｋｈａｌｅｇｈｐｏｕｒ，Ｋ．他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００４．２５（２）：ｐ．２４１〜８；Ｓｅｋｈａｒａｍ，Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．６３（２２）：ｐ．７７０８〜１６、Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．Ｄ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ、１９９８．６３：ｐ．１９９〜２１０．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ、１９９８．６３：ｐ．１４９〜５７、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｅ．他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９５．６９（７）：ｐ．４３９０〜８、Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７．２３５（４７８５）：ｐ．１７７〜８２、Ａｎｄｒｕｌｉｓ，Ｉ．Ｌ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１９９８．１６（４）：ｐ．１３４０〜９）、並びにホスファターゼＰＴＥＮの欠失による。腫瘍形成においてＡｋｔが実際に関与していることは、Ａｋｔの異所発現が悪性形質転換を誘導し、細胞生存を促進すること（Ｓｕｎ，Ｍ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００１．１５９（２）：ｐ．４３１〜７、Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９７．１４（２３）：ｐ．２７９３〜８０１）、及び、Ａｋｔ経路の破壊が細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導すること（Ｊｅｔｚｔ，Ａ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．６３（２０）：ｐ．６６９７〜７０６）、が示されることによって前臨床的に実証された。
【００１０】
癌及び関連疾患の現在の治療法は、有効性に限界があり、数多くの重篤な、意図しない副作用がある。多くの抗癌剤の臨床的効果が示されているにも関わらず、重度の全身毒性によって有望な化学療法剤の臨床開発が中止されることは少なくない。更に、受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ等）及びそのリガンド（ＩＧＦ−１等）の過剰発現、Ａｋｔの過剰発現、及び／又はＰＴＥＮの欠失（いずれもＡｋｔの過剰活性化をもたらす）は、予後不良、化学療法に対する耐性、及び癌患者の生存期間の短縮に関与する。現在の研究戦略は、危険性の少ない効果的な治療方法の探索に重点を置いている。
【００１１】
（トリシリビン）
トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）（ＴＣＮ、ＮＳＣ−１５４２０２、３−アミノ−１，５−ジヒドロ−５−メチル−１−β−リボフラノシル−１，４，５，６，８−ペンタアザアセナフチレン）、及びその５’−リン酸エステルであるリン酸トリシリビン（ＴＣＮ−Ｐ、ＮＳＣ−２８０５９４）の抗癌作用は、先ず、１９７０年代に確認された（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ＆  Ｍｉｌｎｅ（１９７５）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２５５：９２〜１０３）。ＴＣＮ−Ｐが臨床試験に進んだ化学物質であったのは、親薬物よりも可溶性が高かったからである。８０年代初頭、ＴＣＮ−Ｐは、前臨床試験で、白血病及び癌腫に対して活性を示した。８０年代初頭までに、ＴＣＮ−Ｐは、細胞周期Ｓ期の細胞に選択性を示す、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質合成の阻害剤として同定された（Ｒｏｔｉ−Ｒｏｔｉ他、１９７８  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ａｎｄ  ＡＳＣＯ  １９：４０）。また、ＴＣＮ−Ｐは、当時の他のヌクレオチド抗腫瘍剤とは違い、一リン酸塩のレベルを超えてリン酸化されることがなく、ポリヌクレオチドには取り込まれない、という説が提唱された（Ｂｅｎｎｅｔｔ他、１９７８  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２７：２３３〜２４１、Ｐｌａｇｅｍａｎｎ  ＪＮＣＩ  １９７６  ５７：１２８３〜９５）。また、ＴＣＮ−Ｐは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、血漿酵素によって、また、細胞性エクト−５’−ヌクレオチド分解酵素によってＴＣＮに脱リン酸化される、という説が確立した。細胞の内側では、ＴＣＮは、アデノシンキナーゼによる再リン酸化を受けて、ＴＣＮ−Ｐに変化することができる（Ｗｏｔｒｉｎｇ他、１９８１  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２２：２５７、Ｂａｓｓｅｃｈｅｓ他、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  １９８２  ２３３：２２７〜２３４）。
【００１２】
１９８２年、ＴＣＮ−Ｐについては、進行性難治性悪性腫瘍の患者２０人に対する第Ｉ相臨床試験（Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ及びその共同研究者による。）が開始された（Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ他、１９８３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  ６７：１５９〜１６２）。ＴＣＮ−Ｐは、３週間に１回、静脈内（ｉ．ｖ．）注入により、２５〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量で１５分かけて投与された。この試験の患者は、乳癌、頭部／頸部癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、黒色腫、又は未確認の癌と診断された者である。見られた治療応答性は限定されたものであり、また、重大な毒性が著明に現れた。Ｍｉｔｔｅｌｍａｎのグループは、自分たちの投与計画を用いる更なる臨床試験は正当化されないと結論づけたが、他のグループが、ある特定種の癌についてＴＣＮ−Ｐの作用を調べるのを促した。１９８３年にはまた、Ｌｕ他（ＡＳＣＯ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ｐ３４  Ｃ−１３３）が、３０〜４０ｍｇ／ｍ２のＴＣＮを、５日間の静脈内持続注入により投与された患者におけるＴＣＮの臨床的薬理作用を調べた。Ｌｕ他は、ＴＣＮが肝毒性及び貧血に関与することを報告し、患者のこれらの毒性をモニターすべきであることを提言した。
【００１３】
Ｃｏｂｂ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９８３  ６７：１７３）は、マウスにおける６日間腎皮膜下移植法で、ヒト腫瘍の外科的移植片に対するＴＣＮ−Ｐの活性を報告した。彼らは、乳房、肺、大腸、卵巣及び頸部の腫瘍に相当する８０の腫瘍型を調べた。Ｃｏｂｂ他は、ＴＣＮが種々の腫瘍において２１％（乳房）乃至８８％（頸部）の範囲で応答率が変動することを報告した。
【００１４】
また、他の第Ｉ相試験も、Ｆｅｕｎ他によって１９８４年に報告された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４（８）３６０８〜１２）。Ｆｅｕｎ他は、１０、２０、３０及び／又は４０ｍｇ／ｍ２を、３〜４週間又は６週間間隔で５日間静脈内持続注入することによって投与した。この試験の患者は、結腸直腸癌、肉腫、黒色腫、肺癌、又は「その他」の癌と診断された者である。Ｆｅｕｎ他は、高血糖、肝毒性及び血小板減少症を含む重大な毒性が認められたことを報告した。著者は、１日当たり２０ｍｇ／ｍ２、５日間、６週間の第ＩＩ相試験計画を推奨し、また、毒性のため、患者の肝臓及び膵臓の機能を注意深くモニターし、糖尿病、肝機能障害若しくは広範な肝転移が見られる患者は除外するべきであることを提唱した。
【００１５】
１９８６年、Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８６  ４６：３１４７〜３１５１）は、週１回の静脈内投与計画を用いたＴＣＮ−Ｐの第Ｉ相評価の結果を報告した。この試験は、進行性固形癌の２４人の患者に対して、２週間の休薬期間を含む４２日周期の１、８、１５及び２２日目に、５分間かけてゆっくり静脈内注入することによって実施した。１２〜９６ｍｇ／ｍ２の範囲の５つの投与量レベルについて試験し、治療した患者は各レベルで３〜１２人、投与総数は１０６回であった。この試験の患者は、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、副腎癌、卵巣癌、膵臓癌、肉腫、黒色腫、肺癌、又は「その他」の癌と診断された者である。Ｓｃｈｉｌｃｈｅｒ他は、次のように結論づけた。
「この週１回の計画は、予期せぬ臨床毒性を生じ、実行すべきでない。」
「現時点では、我々のグループは週１回の、又は間欠的な計画でＴＣＮ−Ｐを投与する試験の更なる実施を断念する。ＴＣＮ−Ｐが治療耐性の原発性膵臓癌及び肝臓腫瘍に対して著しいｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示したならば、将来、異なる治療計画（例えば、月１回投与）を用いて第Ｉ〜ＩＩ相試験を再開することができるであろう。」
【００１６】
１９８６年、Ｐｏｗｉｓ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７０：３５９〜３６２）は、第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験中の患者の血中及び血漿中におけるＴＣＮ−Ｐの体内動態を報告した。第Ｉ相試験では、１日２４〜５５ｍｇ／ｍ２、５日間の投与を採用し、他方、第ＩＩ相臨床試験では、２５０ｍｇ／ｍ２の単回投与を採用した。Ｐｏｗｉｓ他は、ＴＣＮ−Ｐの薬物動態パラメータとＴＣＮ−Ｐ毒性との間の相関関係を確認することができなかった。
【００１７】
１９８０年代後半、１９９０年代初頭に、ＴＣＮ−Ｐは、転移性結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌、頸部の進行性扁平上皮細胞癌、及び転移性乳癌の第ＩＩ相試験に移行した。１９８７年、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７１、Ｎｏ．３、３３３〜３４）は、転移性結腸直腸腺癌の患者に対する第ＩＩ相試験の結果を公表した。１６５〜２５０ｍｇ／ｍ２のＴＣＮ−Ｐを、週１回、３週間間隔で、１５分かけて静脈内注射によって患者に投与した。Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ他は、この試験は、転移性結腸直腸腺癌の患者の治療においてＴＣＮ−Ｐの臨床的有用性が不十分であることを示していると結論づけた。更に、１９９１年、Ｌｙｓｓ他（Ｐｒｏｃ  Ａｎｎｕ  Ｍｅｅｔ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、（１９９６）１５  Ａ１１５１）は、進行性非小細胞肺癌患者に、６週間毎に５日間、１日当たり３５ｍｇ／ｍ２を投与する試験の予備的な結果を報告した。
【００１８】
Ｆｅｕｎ他（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９３  １６：５０６〜５０８）は、頸部の進行性扁平上皮細胞癌患者に対するＴＣＮ−Ｐの第ＩＩ相試験の結果を報告した。少なくとも３５ｍｇ／ｍ２の５日間持続注入を６週間毎に繰り返した。評価可能な患者２１人のうち、応答が認められたのは２人のみであった。Ｆｅｕｎ他は、「この用量及び計画では、頸部の転移性又は再発性扁平上皮細胞癌において、ＴＣＮ−Ｐの活性が限定されるようである」と結論づけた。
【００１９】
１９９６年、Ｈｏｆｆｍａｎ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３７  ２５４〜２５８）は、転移性乳癌に対するＴＣＮ−Ｐの第Ｉ〜ＩＩ相試験の結果を報告した。１つの試験では、患者１４人を、６週間毎に１日当たり２０ｍｇ／ｍ２を５日間持続注入することによって治療した。著者は、この用量で応答を認めなかった時点で、用量を３５ｍｇ／ｍ２以上まで増加させ、同様の５日間持続注入計画を採用した。Ｈｏｆｆｍａｎ他は、「ＴＣＮは、試験したすべての用量について有効性がなく、３５ｍｇ／ｍ２以上の用量では、許容できない毒性作用を示す」と結論づけた。
【００２０】
こうして、有効性の限界と許容できない毒性とが相まって、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物の更なる臨床開発は進まなかった。
【００２１】
カリフォルニア大学のＲｅｇｅｎｔｓによる国際公開第０３／０７９７４８号パンフレットは、特定のＺＮＦ２１７阻害剤（トリシリビン等）と他の化学療法剤（ドキソルビシン等）との併用を開示している。
【００２２】
本発明は、腫瘍、癌、及び異常な細胞増殖に関連する他の疾患の治療のための、トリシリビン及び関連化合物、並びに毒性の低減した組成物の投与方法を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明はまた、トリシリビン及び関連化合物を用いて、被治療者の腫瘍又は癌を治療する、改良された方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、全身毒性を制限しながら、被治療者の腫瘍又は癌を治療するための、トリシリビン、リン酸トリシリビン及び関連化合物の新規投与方法を提供する。本発明は、Ａｋｔキナーゼを過剰発現する腫瘍又は癌は、ＴＣＮ及び関連化合物の細胞毒性作用に特に感受性を有するという発見に基づく。本発明者は、従来の技術及び実験とは対照的に、（ｉ）以下に記載の診断試験によってトリシリビンに対する高い感受性を示した患者にのみ当該薬剤を投与すること、（ｉｉ）当該薬剤の毒性を最小限に抑え、なお且つ有効性を示す投与量レベルを採用すること、又は、（ｉｉｉ）当該薬剤の毒性を最小限に抑える、以下に記載の投与計画を採用すること、の１つ又は組合せによって、腫瘍及び癌を治療するためのトリシリビンの有効な使用方法を見出した。
【００２５】
本発明の一態様では、ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び／又は関連化合物の毒性作用に特に感受性を有する腫瘍及び癌を同定する方法を提供する。一実施形態では、（ｉ）腫瘍から生物学的試料を得ること、（ｉｉ）当該腫瘍がＡｋｔキナーゼを過剰発現するかどうかを決定すること、及び、（ｉｉｉ）Ａｋｔキナーゼを過剰発現する腫瘍をトリシリビン、リン酸トリシリビン、又は本明細書も記載の関連化合物で治療すること、を含む、哺乳動物、特にヒトの腫瘍を治療する方法を提供する。一実施形態では、Ａｋｔキナーゼ発現のレベルは、腫瘍又は癌におけるリン酸化Ａｋｔキナーゼの存在を、例えば、リン酸化型を検出可能な抗体を用いてアッセイすることによって測定することができる。他の実施形態では、被治療者から得られた腫瘍又は癌細胞をアッセイし、そのレベルを対照組織と比較することによって、Ａｋｔ発現レベルを測定することができる。ある実施形態では、Ａｋｔは、癌試料において、対照と比較して、少なくとも２、２．５、３又は５倍に過剰発現する。ある実施形態では、過剰発現したＡｋｔキナーゼは、過剰活性化し、且つリン酸化されたＡｋｔキナーゼである。
【００２６】
本発明の他の態様では、ＴＣＮ及び関連化合物の毒性副作用を制限する投与方法を提供する。一実施形態では、このような投与方法は、毒性副作用、例えば、肝毒性、血小板減少症、高血糖、嘔吐、低カルシウム血症、貧血、低アルブミン血症、骨髄抑制、高トリグリセリド血症、高アミラーゼ血症、下痢、胃炎及び／又は発熱（これらに限定されない。）を最小限に抑え、又は取り除く。他の実施形態では、ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物の投与は、被治療者の少なくとも１５、２０又は２５％において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも部分的な、例えば、少なくとも１５、２０又は３０％の応答を、或いは完全な応答をもたらす。
【００２７】
一実施形態では、有効量のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物、例えば、本明細書に記載の化合物を、当該薬剤を週に約１回、約３週間投与し、その後の１週間は当該薬剤を投与しないことを含む投与計画に従って、患者に投与することによって、腫瘍と診断された被治療者を治療する方法を提供する。他の実施形態では、１０ｍｇ／ｍ２以下のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を週１回投与する計画を被治療者に実施することによって、被治療者の腫瘍又は癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、上記化合物は、短期間で、例えば、約５、１０又は１５分で、単回ボーラス投与することができる。他の実施形態では、上記化合物を少なくとも２４、４８、７２、９６又は１２０時間持続注入することによって投与する投与計画を提供する。ある実施形態では、この持続投与は少なくとも週に１回、２週間に１回、及び／又は月に１回繰り返すことができる。他の実施形態では、上記化合物は、少なくとも３週間に１回投与することができる。他の実施形態では、上記化合物は、１日に少なくとも１回、少なくとも２、３、４又は５日間投与することができる。
【００２８】
他の実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物は、腫瘍退縮を引き起こすのに有効な量で患者に投与することができる。ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物の投与は、被治療者の少なくとも１５〜２０％において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも部分的な、例えば、少なくとも１５、２０又は３０％の応答を、或いは完全な応答をもたらすことができる。ある実施形態では、本明細書に開示の化合物の少なくとも２、５、１０、１５、２０、３０又は５０ｍｇ／ｍ２を被治療者に投与することができる。上記化合物の投与は、本明細書に開示の治療計画のいずれかに従って実施することができる。特定の実施形態では、この投与計画は、２０ｍｇ／ｍ２未満のＴＣＮ及び関連化合物の投与を含んでもよい。一実施形態では、１０ｍｇ／ｍ２未満のＴＣＮ又は関連化合物を週１回投与することができる。他の実施形態では、２ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２及び／又は１５ｍｇ／ｍ２未満のＴＣＮ又は関連化合物を被治療者に投与することができる。他の実施形態では、１０ｍｇ／ｍ２未満を少なくとも５日間持続注入することによって被治療者に投与することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ又は関連化合物は、膵臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌及び／又は卵巣癌の治療に使用することができる。
【００２９】
一実施形態では、上記化合物及び／又は本発明の治療計画は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫を予防し、且つ／又は治療するために使用することができる。本発明の他の実施形態では、本明細書に開示の化合物は、固形腫瘍を治療するために使用することができる。更に他の実施形態では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、次の器官又は組織（これらに限定されない）：乳房、前立腺、骨、肺、大腸（結腸直腸を含むが、これに限定されない）、尿路、膀胱、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、腎臓、膵臓、咽頭、甲状腺、胃、脳及び／又は卵巣、の腫瘍又は癌の治療に使用することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ又は関連化合物は、膵臓癌、乳癌、結腸直腸癌及び／又は卵巣癌の治療に使用することができる。本発明の他の実施形態では、本明細書に開示の化合物は、血管形成関連疾患の治療で使用することができる。ある実施形態では、ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を少なくとも２４、４８、７２又は９６時間持続注入することによって、白血病を治療する方法を提供する。他の実施形態では、持続注入は、例えば、２週間、３週間又は４週間に少なくとも１回繰り返すことができる。
【００３０】
特定の実施形態では、宿主における腫瘍、癌、及び異常な細胞増殖に関連する他の疾患を治療する方法であって、宿主に、場合によっては薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に開示の化合物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００３１】
一態様では、上記化合物及び組成物は、少なくとも１種の他の化学療法剤と組み合わせて、又はそれに代えて投与することができる。薬物は、同じ組成物の一部を形成しても、また、同時に、若しくは異なる時に投与するための別個の組成物として提供されてもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、抗血管形成剤と組み合わせることができる。本発明の他の実施形態では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、次の種類の薬剤（これらに限定されない）：増殖阻害剤、有糸分裂阻害剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤若しくはナイトロジェンマスタード、トポイソメラーゼを標的とする薬剤、腫瘍細胞の情報伝達を標的とする薬剤、遺伝子治療薬及びアンチセンス薬、抗体治療薬、ステロイド、ステロイドアナログ、制吐薬及び／又は非ステロイド剤、と組み合わせて、又はそれに代えて使用することができる。
【００３２】
他の実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物は、１種又は複数の薬剤に耐性の腫瘍又は癌を治療するために使用することができる。この腫瘍又は癌、及び薬剤には、本明細書に開示の実施形態が含まれる。一実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物は、薬剤耐性の腫瘍又は癌（例えば、多剤耐性の腫瘍又は癌（例えば、タキソール、ラパマイシン、タモキシフェン、シスプラチン及び／又はゲフィチニブ（イレッサ）に耐性の腫瘍又は癌））の患者の治療のために有効量投与される。一実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物は、他の化学療法剤と共に投与することができる。化学療法剤としては、Ｐ−糖タンパク質阻害剤、例えば、ベラパミル、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、タモキシフェン、カルモジュリン拮抗薬、デクスベラパミル、デクスニグルジピン、バルスポダル（ｖａｌｓｐｏｄａｒ）（ＰＳＣ８３３）、ビリコダル（ｂｉｒｉｃｏｄａｒ）（ＶＸ−７１０）、タリキダル（ｔａｒｉｑｕｉｄａｒ）（ＸＲ９５７６）、ゾスキダル（ｚｏｓｕｑｕｉｄａｒ）（ＬＹ３３５９７９）、ラニキダル（ｌａｎｉｑｕｉｄａｒ）（Ｒ１０１９３３）及び／又はＯＮＴ−０９３が挙げられる。
【００３３】
ある実施形態では、宿主における腫瘍、癌、及び異常な細胞増殖に関連する他の疾患を治療する方法であって、本明細書に開示の化合物、又は当該化合物を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする宿主に投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
一実施形態では、腫瘍又は癌を治療する方法であって、本明細書に開示の化合物、又はその塩、異性体、プロドラッグ若しくはエステルの有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法を提供する。ここで、癌は、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫である。上記化合物、又はその塩、異性体、プロドラッグ若しくはエステルは、場合によっては、それを必要とする個体への望ましい投与経路に合わせて調製され、適切な担体（水等）を含む、薬学的に許容される組成物の形で投与する。場合によっては、上記化合物は、腫瘍又は癌を治療するための少なくとも１種の他の化学療法剤と組み合わせて、又はそれに代えて投与する。
【００３５】
本発明の範囲にはまた、腫瘍又は癌の治療における、本明細書に開示の化合物、又はその塩、プロドラッグ若しくはエステルの使用（場合によっては、薬学的に許容される担体中での使用）、並びに、癌又は腫瘍の治療のための薬剤の製造における、本明細書に開示の化合物、又はその塩、プロドラッグ若しくはエステルの使用（場合によっては、薬学的に許容される担体中での使用）が包含される。
【詳細な説明】
【００３６】
本発明者は、従来の技術及び実験とは対照的に、（ｉ）以下に記載の診断試験によってトリシリビンに対する高い感受性を示した患者にのみ当該薬剤を投与すること、（ｉｉ）当該薬剤の毒性を最小限に抑え、なお且つ有効性を示す投与量レベルを採用すること、又は、（ｉｉｉ）当該薬剤の毒性を最小限に抑える、以下に記載の投与計画を採用すること、の１つ又は組合せによって、腫瘍及び癌を治療するためのトリシリビンの有効な使用方法を見出した。
【００３７】
〔Ｉ．化合物〕
本発明は、増殖性疾患の治療のための、特定の治療計画におけるＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物の使用を提供する。
【００３８】
一実施形態では、本明細書で提供される化合物は、次の構造を有する。
【化１】
2007530705.tif 000002
【００３９】
式中、Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は、各々独立に、水素、置換されていてもよいリン酸若しくはホスホン酸（一、二若しくは三リン酸又は安定化リン酸プロドラッグを含む）、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（低級アルキルを含む）、アミド、アルキル若しくはアリールアルキルを含むスルホン酸エステル、スルホニル（メタンスルホニルを含む。）及びベンジル（ここで、フェニル基は、例えば、本明細書中でアリールを定義する際に挙げた１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは、Ｒ２’、Ｒ３’又はＲ５’が独立にＨ又は一、二若しくは三リン酸である化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する、薬学的に許容される他の脱離基である。
【００４０】
Ｒｘ及びＲｙは、独立に、水素、置換されていてもよいリン酸、アシル（低級アシルを含む）、アミド、アルキル（低級アルキルを含む）、芳香族、ポリオキシアルキレン（ポリエチレングリコール等）、置換されていてもよいアリールスルホニル、脂質（リン脂質を含む）、アミノ酸、炭水化物、ペプチド又はコレステロール、或いは薬学的に許容される他の脱離基である。一実施形態では、当該化合物を、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質として投与する。
【００４１】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アルケニル、ＣＯ−アルキニル、ＣＯ−アリール若しくはヘテロアリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニルである。
【００４２】
一実施形態では、Ｒ２’及びＲ３’は水素である。他の実施形態では、Ｒ２’及びＲ５’は水素である。更に他の実施形態では、Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ５’は水素である。更に他の実施形態では、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ５’、Ｒ１及びＲ２は水素である。
【００４３】
他の実施形態では、上記化合物は下記式で表される。
【化２】
2007530705.tif 000003
【００４４】
式中、Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分枝若しくは環状のアルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル若しくはアルキニル、ＮＨ２、ＮＨＲ４、Ｎ（Ｒ４）２、アリール、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、又は置換されたアリールであり、Ｒ４は、各々独立に、Ｈ、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル等の低級アルキルを含むが、これらに限定されない）、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル又はアリールである。下位の実施形態では、Ｒ３は、直鎖Ｃ１〜１１アルキル、イソプロピル、ｔ−ブチル又はフェニルである。
【００４５】
一実施形態では、本明細書で提供される化合物は次の構造を有する。
【化３】
2007530705.tif 000004
【００４６】
他の実施形態では、本明細書で提供される化合物は次の構造を有する。
【化４】
2007530705.tif 000005
【００４７】
他の実施形態では、本明細書で提供される化合物は次の構造を有する。
【化５】
2007530705.tif 000006
【００４８】
式中、Ｒ６は、Ｈ、アルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ４、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＣＦ３、Ｃ（Ｙ３）３、Ｃ（Ｙ３）２Ｃ（Ｙ３）３、Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−アリール、Ｃ（＝Ｏ）−アルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ４）２であり、Ｙ３は、各々独立に、Ｈ又はハロであり、Ｒ４は、各々独立に、Ｈ、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル等の低級アルキルを含むが、これらに限定されない）、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル又はアリールである。下位の実施形態では、Ｒ６は、エチル、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２−フェニルである。
【００４９】
他の実施形態では、本明細書で提供される化合物は次の構造を有する。
【化６】
2007530705.tif 000007
【００５０】
式中、Ｒ７は、Ｈ、ハロ、アルキル（低級アルキルを含む）、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、ニトロ、シアノ、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ４、ＳＨ、ＳＲ４、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＣＦ３、Ｃ（Ｙ３）３、Ｃ（Ｙ３）２Ｃ（Ｙ３）３、Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−アリール、Ｃ（＝Ｏ）−アルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ４）２又はＮ３であり、Ｙ３は、各々独立に、Ｈ又はハロであり、Ｒ４は、各々独立に、Ｈ、アシル（低級アシルを含む）、アルキル（メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル等の低級アルキルを含むが、これらに限定されない）、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキルである。下位の実施形態では、Ｒ７は、メチル、エチル、フェニル、クロロ又はＮＨ２である。
【００５１】
他の実施形態では、本明細書で提供される化合物は次の構造を有する。
【化７】
2007530705.tif 000008
【００５２】
他の実施形態では、本明細書で提供される化合物は次の構造を有する。
【化８】
2007530705.tif 000009
【００５３】
本明細書に開示の化合物は、キラル中心を含有してもよいことを理解されたい。このようなキラル中心は、（Ｒ）若しくは（Ｓ）配置のいずれかであることが可能で、又はそれらの混合物であることが可能である。従って、本明細書で提供される化合物は、鏡像異性的に純粋であるか、又は立体異性体若しくはジアステレオマーの混合物であることが可能である。本明細書での化合物の開示は、好ましくは本明細書に記載の有用な特性を有する任意のラセミ体、光学活性体、多形体、若しくは立体異性体、又はそれらの混合物を包含し、光学活性体の調製方法、及び本明細書に記載の標準的試験、若しくは当業者に周知の他の同様の試験を用いた活性の測定方法は、当分野で周知であることを理解されたい。化合物の光学異性体を得るために用いることができる方法としては、次のものが挙げられる。
【００５４】
ｉ）結晶の物理的分離：  個々の鏡像異性体の肉眼的結晶を手作業で分離する技術。別々の鏡像異性体の結晶が存在するならば、すなわち、物質が凝集し、その結晶が視覚的に異なるならば、この技術を用いることができる。
【００５５】
ｉｉ）同時結晶化：  個々の鏡像異性体をラセミ化合物溶液から別々に結晶化させる技術。ラセミ化合物が固体状の集合体である場合のみ可能である。
【００５６】
ｉｉｉ）酵素的分割：  鏡像異性体の反応速度の違いによって、ラセミ化合物を酵素で部分的に、又は完全に分離する技術。
【００５７】
ｉｖ）酵素的不斉合成：  合成の少なくとも１段階で、酵素反応を行って、所望の鏡像異性体の鏡像異性的に純粋な、又は濃縮された合成前駆体を得る合成技術。
【００５８】
ｖ）化学的不斉合成：  生成物中に非対称（すなわち、キラリティー）を生じる条件下で、所望の鏡像異性体を光学不活性前駆体から合成する合成技術。キラル触媒又はキラル補助剤を用いて実施してもよい。
【００５９】
ｖｉ）ジアステレオマー分離：  個々の鏡像異性体をジアステレオマーに変換する、鏡像異性的に純粋な試薬（キラル補助剤）と、ラセミ化合物と、を反応させる技術。得られたジアステレオマーを、より明確になった構造的相違によってクロマトグラフィー若しくは結晶化によって分離し、その後、キラル補助剤を除去して、所望の鏡像異性体を得る。
【００６０】
ｖｉｉ）１次及び２次不斉変換法：  ラセミ化合物に由来のジアステレオマーを、所望の鏡像異性体に由来のジアステレオマーが溶液中で優先されるように平衡化する技術。或いは、所望の鏡像異性体に由来のジアステレオマーを優先的に結晶化させて平衡を変動させ、それによって、原理上は全物質を所望の鏡像異性体に由来の結晶性ジアステレオマーに変換させる技術。その後、所望の鏡像異性体をジアステレオマーから遊離させる。
【００６１】
ｖｉｉｉ）動力学的分割：  この技術は、動力学的条件下で、鏡像異性体とキラル、非ラセミ試薬又は触媒との相異なる反応速度によって、ラセミ化合物の部分的な、又は完全な分割（又は、部分的に分割した化合物の更なる分割）を行うものである。
【００６２】
ｉｘ）非ラセミ前駆体からのエナンチオ選択的合成法：  所望の鏡像異性体を非キラル開始物質から得る技術。立体化学的強度が、合成過程全体に渡って減弱しないか、又は僅かしか減弱しない。
【００６３】
ｘ）キラル液体クロマトグラフィー法：  ラセミ化合物の鏡像異性体を、固定相との異なる相互作用によって液体移動相中で分離する技術。固定相をキラル物質から作製するか、又は、異なる相互作用を引き起こす他のキラル物質を移動相に含有させることが可能である。
【００６４】
ｘｉ）キラルガスクロマトグラフィー：  ラセミ化合物を揮発させ、鏡像異性体を、固定された非ラセミのキラル吸着相を含有するカラムとの異なる相互作用を用いて、気体移動相中で分離する技術。
【００６５】
ｘｉｉ）キラル溶媒による抽出：  鏡像異性体を、一方の鏡像異性体を特定のキラル溶媒に優先的に溶解させることによって分離させる技術。
【００６６】
ｘｉｉｉ）キラル膜横断輸送：  ラセミ化合物を薄い膜障壁と接触するように配置する技術。この障壁は、一般に、一方がラセミ化合物を含有する２種の混和可能な液体を分離するものであり、濃度差、圧力差等の原動力によって、膜障壁を横切る選択的輸送が生じる。分離は、ラセミ化合物の一方の鏡像異性体のみを通過させる、膜の非ラセミなキラル性を原因として生じる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、トリシリビン、リン酸トリシリビン（ＴＣＮ−Ｐ）、トリシリビン５’−リン酸（ＴＣＮ−Ｐ）、又はトリシリビンのＤＭＦ付加物（ＴＣＮ−ＤＭＦ）を提供する。ＴＣＮは、当分野で公知の任意の技術、例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ．４９、ｐｐ．４７５７〜４７６０（１９７１）に記載の技術で合成することができる。ＴＣＮ−Ｐは、当分野で公知の任意の技術、例えば、米国特許第４１２３５２４号に記載の技術で合成することができる。ＴＣＮ−ＤＭＦの合成については、例えば、ＩＮＳＥＲＭ、ｖｏｌ．８１、ｐｐ．３７〜８２（１９７８）に記載されている。本明細書に記載の他のＴＣＮ関連化合物は、例えば、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．他、「２’，３’−ジデオキシサンギバマイシン、２’，３’−ジデオキシトヨカマイシン及び２’，３’−ジデオキシトリシリビンの炭素環式アナログの合成」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２０（１０〜１１）：１８２３〜１８３０（２００１年１０月〜１１月）；Ｐｏｒｃａｒｉ，Ａ．Ｒ．他、「６−Ｎ−アシルトリシリビンアナログ：アシル炭素鎖長とＨＩＶ−１に対する活性との間の構造−活性関係」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３（１２）：２４５７〜２４６３（２０００年６月１５日）；Ｐｏｒｃａｒｉ，Ａ．Ｒ．他、「トリシリビンの非環式糖アナログ：抗ウイルス活性及び抗増殖活性の欠如は細胞内リン酸化の低さと相関する」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１８（１１〜１２）：２４７５〜２４９７（１９９９年１１月〜１２月）、Ｐｏｒｃａｒｉ，Ａ．Ｒ．他、「トリシリビンのデオキシ糖アナログ：抗ウイルス活性及び抗増殖活性と細胞内リン酸化との相関」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３（１２）：２４３８〜２４４８（２０００年６月１５日）、Ｐｏｒｃａｒｉ，Ａ．Ｒ．他、「トリシリビンの２−置換アナログの合成及び抗ウイルス活性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２２（１２）：２１７１〜２１９３（２００３年１２月）、Ｐｏｒｃａｒｉ，Ａ．Ｒ．他、「トリシリビンの改変全合成：抗新生物特性及び抗ウイルス特性を備えた三環式ヌクレオシド」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２３（１〜２）：３１〜３９（２００４）、Ｓｃｈｗｅｉｎｓｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．他、「抗腫瘍性三環式ヌクレオシドの代謝物の同定（ＮＳＣ−１５４０２０）」、Ｂｌｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３０（１８）：２５２１〜２５２６（１９８１年９月１５日）、Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｌ．他、「抗ＨＣＭ剤としての新規２’−ベータ−Ｃ−メチル関連トリシリビンアナログの合成」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１４（１３）：３５１７〜３５２０（２００４年７月５日）、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．他、「ある種のペンタアザアセナフチレン、ヘキサアザアセナフチレン及びそれらの対応するヌクレオシドの合成及び生物学的活性」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、１９８６（１７）：４１〜４４（１９８６）、及び／又は、Ｗｏｔｒｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．他、���ＴＣＮのプロドラッグ型としてのリン酸化トリシリビン（ＴＣＮ−Ｐ）の活性化機構」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ．、７０（４）：４９１〜７（１９８６年４月）に開示の方法に従って合成することができる。
【００６８】
（薬学的に許容される塩及びプロドラッグ）
化合物が安定な非毒性の酸塩又は塩基塩を形成するのに十分な塩基性若しくは酸性である場合、この化合物を薬学的に許容される塩として投与することは適切と考えられる。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機又は有機の塩基及び酸から得られたものを含む。適切な塩には、医薬分野で周知の数多くの他の酸の中でも、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属から得られる塩が包含される。特に、薬学的に許容される塩としては、生理学的に許容される陰イオンを形成する、酸で形成された有機酸添加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩及びグリセロリン酸塩が挙げられる。硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩等の適切な無機塩を形成してもよい。
【００６９】
薬学的に許容される塩は、当分野で周知の標準的方法、例えば、アミン等の十分な塩基性の化合物と、生理学的に許容される陰イオンを生成する適切な酸と、を反応させることによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩若しくはリチウム塩）又はアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）を形成してもよい。
【００７０】
本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかを、ヌクレオシドの活性、生物学的利用率、安定性を高めるために、或いはヌクレオシドの特性を変更するために、ヌクレオチドプロドラッグとして投与することができる。いくつかのヌクレオチドプロドラッグリガンドは公知である。一般に、ヌクレオシドの一、二若しくは三リン酸塩のアルキル化、アシル化、又は他の脂溶化は、このヌクレオチドの安定性を増大させる。リン酸部分の１個又は複数の水素を置換することが可能な置換基としては、アルキル、アリール、ステロイド、炭水化物（糖を含む）、１，２−ジアシルグリセロール及びアルコールが挙げられる。多くはＲ．Ｊｏｎｅｓ及びＮ．Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（１９９５）１〜１７に記載されている。所望の効果を実現するために、これらのいずれかを、開示されたヌクレオシドと組み合わせて使用することができる。
【００７１】
一実施形態では、トリシリビン又は関連化合物は、５’−ヒドロキシル脂溶性プロドラッグとして提供される。ヌクレオシドに、好ましくはヌクレオシドの５’−ＯＨ位に共有的に組み込むことが可能な適切な脂溶性置換基又は脂溶性薬剤を開示した米国特許としては、例えば、米国特許第５１４９７９４号（１９２２年９月２２日、Ｙａｔｖｉｎ他）、第５１９４６５４号（１９９３年５月１６日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ他）、第５２２３２６３号（１９９３年６月２９日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ他）、第５２５６６４１号（１９９３年１０月２６日、Ｙａｔｖｉｎ他）、第５４１１９４７号（１９９５年５月２日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ他）、第５４６３０９２号（１９９５年１０月３１日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ他）、第５５４３３８９号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎ他）、第５５４３３９０号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎ他）、第５５４３３９１号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎ他）及び第５５５４７２８号（１９９６年９月１０日、Ｂａｓａｖａ他）（これらの開示内容はすべて、参照されることによって本明細書に組み込まれる。）がある（これらに限定されない）。
【００７２】
本発明のトリシリビン若しくは関連化合物に結合可能な脂溶性置換基又は脂溶性薬剤を開示した外国特許出願としては、例えば、国際公開第８９／１０２７３３号パンフレット、国際公開第９０／１００５５５号パンフレット、国際公開第９１／１１６９２０号パンフレット、国際公開第９１／１８９１４号パンフレット、国際公開第９３／００９１０号パンフレット、国際公開第９４／１２６２７３号パンフレット、国際公開第／１５１３２号パンフレット、ＥＰ０３５０２８７、ＥＰ９３９１７０５４．４及び国際公開第９１／１９７２１号パンフレットがある。
【００７３】
トリシリビン又は関連化合物の他の例としては、以下の刊行物に記載の置換基を含有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの誘導体化されたトリシリビン又は関連化合物は、参考文献に記載の適応症のため、或いは、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤等の抗ウイルス剤として使用することができる。Ｈｏ，Ｄ．Ｈ．Ｗ．（１９７３）、ヒト及びマウスの組織における１β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンのキナーゼ及びデアミナーゼの分布、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３３、２８１６〜２８２０；Ｈｏｌｙ，Ａ．（１９９３）、同極性リン修飾ヌクレオチドアナログ、Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ（著）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｖｏｌ．Ｉ、ＪＡＩ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．１７９〜２３１；Ｈｏｎｇ，Ｃ．Ｉ．、Ｎｅｃｈａｅｖ，Ａ．及びＷｅｓｔ，Ｃ．Ｒ．（１９７９ａ）、コルチゾール及びコーチゾンの１β−３−アラビノフラノシルシトシン複合体の合成及び抗腫瘍活性、Ｂｉｏｅｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８８、１２２３〜１２２９；Ｈｏｎｇ，Ｃ．Ｉ．、Ｎｅｃｈａｅｖ，Ａ．、Ｋｉｒｉｓｉｔｓ，Ａ．Ｊ．Ｂｕｃｈｈｅｉｔ，Ｄ．Ｊ．及びＷｅｓｔ，Ｃ．Ｒ、（１９８０）、潜在的抗腫瘍薬としてのヌクレオシド複合体、３．コルチコステロイド及び選択された脂溶性アルコールの１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン複合体の合成及び抗腫瘍活性、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８、１７１〜１７７；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．、Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．、Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｈ．Ｂ．Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ，Ｈ．及びＲｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９０）、アジドチミジン及び他の抗ウイルスヌクレオシドのリン脂質アナログの合成及び抗レトロウイルス活性、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１１７１４〜１１７１７；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．、Ｋｏｒｂａ，Ｂ．、Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｃ．、Ｇａｒｄｅｎｅｒ，Ｍ．（１９９４ａ）、Ｂ型肝炎感染細胞におけるホスファチジル−ジデオキシシチジンの抗ウイルス活性、及びマウスにおける肝臓摂取の増加、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２４、５９〜６７；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．、Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｃ．Ｎ．、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．、Ｒｉｃｃｉ，Ｊ．、Ｇｅｒｄｅｎｅｒ，Ｍ．Ｆ．、Ｓｅｌｌｅｓｅｔｈ，Ｄ．Ｗ．及びＥｌｌｉｓ，Ｍ．Ｎ．（１９９４ｂ）、ホスファチジルアジドチミジン及びホスファチジル−ｄｄＣ：マウスリンパ系組織における摂取、及びヒト免疫不全ウイルス感染細胞及びローシャー白血病ウイルス感染マウスにおける抗ウイルス活性の評価、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８、２７９２〜２７９７；Ｈｕｎｓｔｏｎ，Ｒ．Ｎ．、Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａ．、ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｔ．、Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｊ．、及びＤｅ  Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．（１９８４）、２’−デオキシ−５−フルオロウリジンから得られたいくつかの環状ホスホトリエステルの合成及び生物学的特性、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７、４４０〜４４４；Ｊｉ，Ｙ．Ｈ．、Ｍｏｏｇ，Ｃ．、Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｇ．、Ｂｉｓｃｈ���ｆｆ，Ｐ及びＬｕｕ，Ｂ．（１９９０）、潜在的抗腫瘍剤としての、７β−ヒドロキシコレステロール及びピリミジンヌクレオシドの一リン酸ジエステル：合成及び抗腫瘍活性の予備評価、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３、２２６４〜２２７０；Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｓ．、ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．Ｔ．、Ｂａｉｚａｒｉｎｉ，Ｊ．及びＤｅＣｌｅｒｃｑ，Ｅ．（１９８４）、いくつかのヌクレオシド環式ホスホラミデートの合成、特性及び生物学的活性、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ、１４７１〜１４７４；Ｊｕｏｄｋａ，Ｂ．Ａ．及びＳｍａｒｔ，Ｊ．（１９７４）、ジトリボヌクレオシド（ｄｉｔｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）ａ（Ｐ□Ｎ）アミノ酸誘導体の合成、Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３９、３６３〜９６８；Ｋａｔａｏｋａ，Ｓ．、Ｉｍａｉ，Ｊ．、Ｙａｍａｊｉ，Ｎ．、Ｋａｔｏ，Ｍ．、Ｓａｉｔｏ，Ｍ．、Ｋａｗａｄａ，Ｔ．及びＩｍａｉ，Ｓ．（１９８９）、アルキル化ｃＡＭＰ誘導体：選択適合性及び生物学的活性、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍ．Ｓｅｒ．、２１、１〜２；Ｋａｔａｏｋａ，Ｓ．、Ｕｃｈｉｄａ，Ｒ．及びＹａｍａｊｉ，Ｎ．（１９９１）、アデノシン３’、５’環状リン酸（ｃＡＭＰ）ベンジル及びメチルトリエステルの便利な合成法、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ  ３２、１３５１〜１３５６；Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．、Ｈａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｊ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｊ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．Ｃ．Ｎ．Ｍ．、Ｄｅｖｉｎｅ，Ｋ．Ｇ．、Ｔａｙｌｏｒ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．、Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，Ｄ．Ｊ．及びＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．（１９９２）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ及びＵＬＶに対するジドブジンホスホラミデート及びホスホロジアミデート誘導体の抗ウイルス作用の比較、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３、１０７〜１１２；Ｋｏｄａｍａ，Ｋ．、Ｍｏｒｏｚｕｍｉ，Ｍ．、Ｓａｉｔｏｈ，Ｋ．Ｉ．、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ｈ．、Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｈ．及びＳａｎｅｙｏｓｈｉ，Ｍ．（１９８９）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン−５’−ステアリルリン酸の抗腫瘍活性及び薬理：１−β−アラビノフラノシルシトシンの経口活性誘導体、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８０、６７９〜６８５；Ｋｏｒｔｙ，Ｍ．及びＥｎｇｅｌｓ，Ｊ．（１９７９）、モルモット心室心筋に対するアデノシン及びグアノシン３’、５’−リン酸ベンジルエステルの作用、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３１０、１０３〜１１１；Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｇｏｅ，Ｐ．Ｌ．、Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｓ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｔ．、Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｊ．及びＤｅ  Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．（１９９０）、いくつかの環状ホスホラミデートヌクレオシド誘導体の合成及び生物学的評価、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３、２３６８〜２３７５；ＬｅＢｅｃ，Ｃ．及びＨｕｙｎｈ−ｄｉｎｈ，Ｔ．（１９９１）、抗癌剤プロドラッグとしての、５−フルオロウリジン及びアラビノシチジンの脂溶性リン酸トリエステル誘導体の合成、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２、６５５３〜６５５６；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．��Ｂａｒｎｅｒ，Ｈ．Ｄ．及びＣｏｈｅｎ  Ｓ．Ｓ．（１９６０）、外部から供給されたヌクレオチドの大腸菌による代謝、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５、４５７〜４６５；Ｌｕｃｔｈｙ，Ｊ．、Ｖｏｎ  Ｄａｅｎｉｋｅｎ，Ａ．、Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ，Ｊ．、Ｍａｎｔｈｅｙ，Ｂ．、Ｚｗｅｉｆｅｌ，Ｊ．、Ｓｏｈｌａｔｔｅｒ，Ｃ．及びＢｅｎｎ，Ｍ．Ｈ．（１９８１）、３種の天然シアノエピチオアルカンの合成及び毒物学的特性、Ｍｉｔｔ．Ｇｅｇ．Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌｕｎｔｅｒｓ．Ｈｙｇ．７２、１３１〜１３３（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．９５、１２７０９３）；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｔｏｌｌｅｒｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．及びＲｉｌｅｙ，Ｐ．Ａ．（１９８９）、抗ウイルス薬Ａｒａのいくつかのリン酸トリエステル誘導体の合成及び生物学的評価、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７、６０６５〜６０７５；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｄｅｖｉｎｅ，Ｋ．Ｇ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｊ．、Ｇａｌｐｉｎ，Ｓ．Ａ．、Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，Ｄ．Ｊ．及びＫｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．（１９９０ａ）、抗ＨＩＶ化合物としての、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のいくつかの新規ホスホラミデート誘導体の合成及び評価、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１、１０７〜１１３；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｏ’ｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｊ．、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｓ．Ｒ．、Ｎｉｃｋｓｏｎ，Ｃ．及びＫｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．（１９９０ｂ）、ＡＺＴ及びｄｄＣｙｄのいくつかの新規置換ジアルキルリン酸誘導体の合成及び抗ＨＩＶ活性、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１、３５５〜３６０；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｓ．Ｒ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｊ．及びＫｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．（１９９０ｃ）、潜在的抗ＡＩＤＳ薬としての、３’−変更ヌクレオシドのいくつかの新規ジアルキルリン酸誘導体の合成、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１、２５〜３３；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｄｅｖｉｎｅ，Ｋ．Ｇ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｊ．及びＫｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．（１９９１）、３’−アジド−３’デオキシチミジン（ＡＺＴ）のいくつかのハロアルキルホスホラミデート誘導体の合成及び抗ＨＩＶ活性、トリクロロエチルメトキシアラニニル化合物の潜在的活性、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１５、２５５〜２６３；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｐａｔｈｉｒａｎａ，Ｒ．Ｎ．、Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｎ．、Ｄｅｖｉｎｅ，Ｋ．Ｇ．及びＨａｙ，Ａ．Ｊ．（１９９２）、ＡＺＴのアリールリン酸誘導体は、ＡＺＴの作用に耐性のある細胞株において抗ＨＩＶ１活性を保持する、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１７、３１１〜３２１；ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｐａｔｈｉｒａｎａ，Ｒ．Ｎ．、Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｍ．、Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．及びＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｊ．（１９９３ａ）、ＨＩＶ阻害剤としてのＡＺＴのホスホラミデート誘導体：カルボキシル末端に関する研究、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４、９７〜１０１、ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．、Ｐａｔｈｉｒａｎａ，Ｒ．Ｎ．、Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｊ．及びＤｅ  Ｃｌｅｒｃｑ，���．（１９９３ｂ）、ＡＺＴのアリールリン酸誘導体による生物活性ＡＺＴヌクレオチドの細胞内輸送、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６、１０４８〜１０５２。
【００７４】
抗ＨＩＶ剤ＡＺＴのアルキル水素リン酸誘導体は、親のヌクレオシドアナログよりも毒性が少ないと考えられる。Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５、２７１〜２７７；Ｍｅｙｅｒ，Ｒ．Ｂ．，Ｊｒ．、Ｓｈｕｍａｎ，Ｄ．Ａ．及びＲｏｂｉｎｓ，Ｒ．Ｋ．（１９７３）、プリンヌクレオシド３’，５’−環状ホスホラミデートの合成、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６９〜２７２；Ｎａｇｙｖａｒｙ，Ｊ．Ｇｏｈｉｌ，Ｒ．Ｎ．、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｃ．Ｒ．及びＳｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．（１９７３）、環状ＡＭＰの中性エステルに関する研究、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．５５、１０７２〜１０７７；Ｎａｍａｎｅ，Ａ．Ｇｏｙｅｔｔｅ，Ｃ．、Ｆｉｌｌｉｏｎ，Ｍ．Ｐ．、Ｆｉｌｌｉｏｎ，Ｇ．及びＨｕｙｎｈ−Ｄｉｎｈ，Ｔ．（１９９２）、グリコシルホスホトリエステルプロドラッグを用いた、ＡＺＴの改善された脳輸送、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５、３９３９〜３０４４；Ｎａｒｇｅｏｔ，Ｊ．Ｎｅｒｂｏｎｎｅ，Ｊ．Ｍ．Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．及びＬｅｓｅｒ，Ｈ．Ａ．（１９８３）、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０、２３９５〜２３９９；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ａ．、Ｂｅｎｔｒｕｄｅ，Ｗ．Ｇ、Ｓｔｓｅｒ，Ｗ．Ｎ．及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９８７）、ヌクレオシド環状３’，５’−一リン酸のリン酸環のイス型ねじれ平衡の問題：チミジンフェニル環状３’，５’−一リン酸のジアステレオマーの１ＨＮＭＲ及びｘ線結晶学研究、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ．１０９、４０５８〜４０６４；Ｎｅｒｂｏｎｎｅ，Ｊ．Ｍ．、Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｓ．、Ｎａｒｇｅｏｔ，Ｊ．及びＬｅｓｔｅｒ，Ｈ．Ａ．（１９８４）、新規光活性化環状ヌクレオチドは、環状ＡＭＰ及び環状ＧＭＰ濃度の細胞内急上昇をもたらす、Ｎａｔｕｒｅ  ３０１、７４〜７６；Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｈｅｒｖｅ，Ｍ．、Ｄｅｂｏｕｚｙ，Ｊ．Ｃ．、Ｇｕｅｒｒａ，Ｆ．Ｉ．、Ｇｏｕｙｅｔｔｅ，Ｃ．、Ｄｕｐｒａｚ，Ｂ．及びＨｕｙｎｈ−Ｄｉｎｈ，Ｔ．（１９８９）、チミジンのグルコシルリン脂質の合成、及びＮＭＲによる膜貫通輸送研究、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１、４２７０〜４２７７；Ｏｈｎｏ，Ｒ．、Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｎ．、Ｈｉｒａｎｏ，Ｍ．、Ｉｍａｉ，Ｋ．Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｈ．、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．、Ｋｏｓａｋａ，Ｍ．、Ｔａｋａｔｕｓｋｉ，Ｋ．、Ｙａｍａｙａ，Ｔ．、Ｔｏｙａｍａ，Ｋ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍａｓａｏｋａ，Ｔ．、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．、Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｔ．、Ｋｉｍｕｒａ，Ｉ．、Ｙａｍａｄａ，Ｋ．及びＫｉｍｕｒａ，Ｊ．（１９９１）、１−β−Ｄ−ラビノフラノシルシトシン−５’−ステアリルリン酸の経口投与による骨髄異形成症候群の治療、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４８、４５１〜４５５；Ｐａｌｏｍｉｎｏ，Ｅ．、Ｋｅｓｓｌｅ，Ｄ．及びＨｏｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｐ．（１９８９）、２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの脳への持続輸送のためのジヒドロピリジン運搬系、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２、６２２〜６２５；Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂａｒｎｅｙ，Ｓ．、Ｗｉｔｔｒｏｃｋ，Ｒ．、Ｃｌａｒｋ，Ｐ．Ｈ．、Ｌｅｖｉｎ，Ｒ．Ｌａｍ��ｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．、Ｐｅｔｔｅｗａｙ，Ｓ．Ｒ．、Ｓｅｒａｆｉｎｏｗｓｋａ，Ｈ．Ｔ．、Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．、Ｈａｒｎｄｅｎ，Ｍ．Ｒ．、Ａｓｈｔｏｎ，Ｒ．、Ｓｕｔｔｏｎ，Ｄ．、Ｈａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｊ．及びＢｒｏｗｎ，Ａ．Ｇ．（１９９３）、ＢＲＬ４７９２３及びその経口用プロドラッグＳＢ２０３６５７Ａの、マウスにおけるローシャーマウス白血病ウイルス感染に対する活性、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０（Ｓｕｐｐｌ．Ｉ）  ８４；Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｃ．、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｃ．Ｊ．，Ｊｒ．、Ｍｏｒｒｉｓ−Ｎａｔｓｃｈｋｅ，Ｓ．Ｌ．、Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．Ｌ．、Ｇｕｍｕｓ，Ｆ．、Ｓｕｒｌｅｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｉｓｈａｑ，Ｋ．Ｓ．、Ｋｕｃｅｒａ，Ｌ．Ｓ．Ｉｙｅｒ，Ｎ．、Ｗａｌｌｅｎ，Ｃ．Ａ．、Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｓ．及びＭｏｄｅｓｔ，Ｅ．Ｊ．（１９９１）、抗ＨＩＶ−１活性のための、新規エーテル脂質ヌクレオシド複合体の合成及び評価、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４、１４０８〜１４１４；Ｐｏｍｐｏｎ，Ａ．、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｉ．、Ｉｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｌ．、Ｋａｈｎ，Ｓ．及びＦａｒｑｕｈａｒ，Ｄ．（１９９４）、細胞抽出物及び組織培養液における、アジドチミジン−５’−一リン酸のモノ及びビス（ピバロイルオキシメチル）エステルの分解経路：ＩＳＲＰ−洗浄ＨＰＬＣ直結技術の適用、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５、９１〜９８；Ｐｏｓｔｅｍａｒｋ，Ｔ．（１９７４）、環状ＡＭＰ及び環状ＧＭＰ、Ａｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４、２３〜３３；Ｐｒｉｓｂｅ，Ｅ．Ｊ．、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．、ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ．、Ｂａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｆ．、Ｓｍｅｅ，Ｄ．Ｆ．Ｄｕｋｅ，Ａ．Ｅ．、Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｔ．Ｒ．及びＶｅｒｈｅｙｄｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｊ．（１９８６）、９−［（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ）メチル］グアニンのリン酸塩及びリン酸誘導体の合成及び抗ヘルペスウイルス活性、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９、６７１〜６７５；Ｐｕｃｃｈ，Ｆ．、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｇ．、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｉ．、Ｐｏｍｐｏｎ，Ａ．、Ａｕｂｅｒｔｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｄｉｍ，Ａ．及びＩｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｌ．（１９９３）、レダクターゼ媒介活性化プロセスによるヌクレオシド一リン酸の細胞内輸送、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２２、１５５〜１７４；Ｐｕｇａｅｖａ，Ｖ．Ｐ．、Ｋｏｃｈｋｅｖａ，Ｓ．Ｉ．、Ｍａｓｈｂｉｔｓ，Ｆ．Ｄ．及びＥｉｚｅｎｇａｒｔ，Ｒ．Ｓ．（１９６９）、産業的雰囲気におけるエチレンスルフィドの毒物学的評価及び健康標準評価、Ｇｉｇ．Ｔｒｆ．Ｐｒｏｆ．Ｚａｂｏｌ．１３、４７〜４８（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．７２、２１２）；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｒ．Ｋ．（１９８４）、レトロウイルス及び腫瘍の阻害剤としてのヌクレオチドアナログの可能性、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１〜１８；Ｒｏｓｏｗｓｋｙ，Ａ．、Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．、Ｒｏｓｓ及びＪ．Ｗｉｃｋ，Ｍ．Ｍ．（１９８２）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンの脂溶性５’−（アルキルリン酸）エステル、及び潜在的プロドラッグとしてのＮ４−アシル及び２，２’−アンヒドロ−３’０−アシル誘導体、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２５、１７���〜１７８；Ｒｏｓｓ，Ｗ．（１９６１）、グルコース予備処理後の塩基性側鎖を有する芳香族ナイトロジェンマスタードに対するウォーカー腫瘍の感受性増加、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．８、２３５〜２４０；Ｒｙｕ，Ｅ．Ｋ、Ｒｏｓｓ，Ｒ．Ｊ．、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．、ＭａｃＣｏｓｓ，Ｍ．、Ｈｏｎｇ，Ｃ．Ｉ．及びＷｅｓｔ，Ｃ．Ｒ．（１９８２）、リン脂質ヌクレオシド複合体、３．１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン５’−ジホスフェート（−）２−ジアシルグリセロールの合成及び生物学的評価、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２５、１３２２〜１３２９；Ｓａｆｆｈｉｌｌ，Ｒ．及びＨｕｍｅ，Ｗ．Ｊ．（１９８６）、種々の供給源から得られた血清による５−ヨードデオキシウリジン及び５−ブロモエオキシウリジンの分解、及びこれらの化合物をＤＮＡへの組込みに用いる際の影響、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．５７、３４７〜３５５；Ｓａｎｅｙｏｓｈｉ，Ｍ．、Ｍｏｒｏｚｕｍｉ，Ｍ．、Ｋｏｄａｍａ，Ｋ．、Ｍａｃｈｉｄａ，Ｊ．、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．及びＹｏｓｈｉｎｏ，Ｈ．（１９８０）、合成ヌクレオシド及びヌクレオチドＸＶＩ、一連の１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン５’−アルキル又はアリールホスフェートの合成及び生物学的評価、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２８、２９１５〜２９２３；Ｓａｓｔｒｙ，Ｊ．Ｋ．、Ｎｅｈｅｔｅ，Ｐ．Ｎ．、Ｋｈａｎ，Ｓ．、Ｎｏｗａｋ，Ｂ．Ｊ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，Ｗ．、Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ，Ｒ．Ｂ．及びＦａｒｑｕｈａｒ，Ｄ．（１９９２）、膜透過性ジデオキシウリジン５’−一リン酸アナログは、ヒト免疫不全ウイルス感染を阻害する、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１、４４１〜４４５；Ｓｈａｗ，Ｊ．Ｐ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．Ａｒｉｍｉｌｌｉ，Ｍ．Ｎ．、Ｌｏｕｉｅ，Ｍ．Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｗ．Ａ．及びＣｕｎｄｙ，Ｋ．Ｃ．（１９９４）、雄のスプラーグドーリーラットにおける、ＰＭＥＡプロドラッグ由来のＰＭＥＡの経口生物学的利用率、第９回ＡＡＰＳ年次総会、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（要旨）；Ｓｈｕｔｏ，Ｓ．、Ｕｅｄａ，Ｓ．、Ｉｍａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｆｕｋｕｋｕａｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．及びＵｅｄａ，Ｔ．（１９８７）、酵素的２段階反応による、５’−ホスファチジルヌクレオシドの容易な１段階合成、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｆｔ．２８、１９９〜２０２；Ｓｈｕｔｏ，Ｓ．、Ｉｔｏｈ，Ｈ．、Ｕｅｄａ，Ｓ．、Ｉｍａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｋｕｋｕｋａｗａ，Ｋ．、Ｔｓｕｊｉｎｏ，Ｍ．Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．及びＵｅｄａ，Ｔ．（１９８８）、５’−（３−ｓｎ−ホスファチジル）ヌクレオシドの容易な酵素的合成、及びその抗白血病活性、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６、２０９〜２１７。好ましいリン酸プロドラッグ基の一つは、Ｓ−アシル−２−チオエチル基であり、「ＳＡＴＥ」とも呼ばれる。
【００７５】
使用可能なプロドラッグの他の例としては、次の特許及び特許出願に記載のものが挙げられる。米国特許第５６１４５４８号、第５５１２６７１号、第５７７０５８４号、第５９６２４３７号、第５２２３２６３号、第５８１７６３８号、第６２５２０６０号、第６４４８３９２号、第５４１１９４７号、第５７４４５９２号、第５４８４８０９号、第５８２７８３１号、第５６９６２７７号、第６０２２０２９号、第５７８０６１７号、第５１９４６５４号、第５４６３０９２号、第５７４４４６１号、第４４４４７６６号、第４５６２１７９号、第４５９９２０５号、第４４９３８３２号、第４２２１７３２号、第５１１６９９２号、第６４２９２２７号、第５１４９７９４号、第５７０３０６３号、第５８８８９９０号、第４８１０６９７号、第５５１２６７１号、第６０３０９６０号、２００４／０２５９８４５、第６６７０３４１号、２００４／０１６１３９８、２００２／０８２２４２、第５５１２６７１号、２００２／００８２２４２、及び／又はＰＣＴ国際公開第９０／１１０７９号パンフレット、国際公開第９６／３９１９７号パンフレット及び／又は国際公開第９３／０８８０７号パンフレット。
【００７６】
（定義）
本明細書では、「癌」及び「癌の」という用語は、無制御な細胞増殖、すなわち、増殖性疾患を一般に特徴とする、哺乳動物の生理学的状態を表す。このような増殖性疾患の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、及び白血病等の癌並びに本明細書に開示の他の癌が含まれる。このような癌のより具体的な例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（例えば、肝癌）、膀胱癌、結腸直腸癌、子宮体癌、腎臓癌及び甲状腺癌が挙げられる。
【００７７】
癌のとしては他に、基底細胞癌、胆道癌、骨癌、脳及びＣＮＳの癌、繊毛癌、結合組織癌、食道癌、目の癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、上皮内新生物、咽頭癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口腔及び咽頭の癌）、膵臓癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、泌尿器系の癌、並びに他の癌腫及び肉腫がある（これらに限定されない）。
【００７８】
本明細書では、「腫瘍」という用語は、悪性又は良性に関わらず、新生物の成長増殖のすべて、並びに前癌性及び癌性の細胞及び組織のすべてを意味する。例えば、ある特定の癌は、固形腫瘤を特徴とする。固形腫瘤が存在するならば、それは原発腫瘤である。原発腫瘤とは、組織の正常な細胞の形質転換の結果、当該組織の癌細胞が増殖して形成されたものである。ほとんどの場合、この原発腫瘤は、嚢の存在によって同定され、肉眼法又は触診法によって、或いは組織の形状、手触り、又は質量の不規則性によって見出すことができる。しかし、いくつかの原発腫瘍は触知できず、Ｘ線等の医用画像技術（例えば、マンモグラフィー）又は針穿刺吸引によってのみ検出することができる。後者の技術の使用は、早期発見ではより一般的である。組織内癌細胞の分子分析及び表現型分析を行えば、通常、その癌が組織に対して内因性のものであるか、或いは病変部が他の部位からの転移によるものか、を確認することができる。
【００７９】
本明細書では、特に断らない限り、アルキルという用語は、例えば、Ｃ１〜Ｃ２４の飽和直鎖、分枝若しくは環状、１級、２級若しくは３級の炭化水素を包含し、具体例としては、メチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル及び２，３−ジメチルブチルが挙げられる。このアルキルは、場合により、例えば、１個又は複数の置換基、例えば、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩ）（例えば、ＣＦ３、２−Ｂｒ−エチル、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＣＦ３若しくはＣＦ２ＣＦ３）、ヒドロキシル（例えば、ＣＨ２ＯＨ）、アミノ（例えば、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨＣＨ３若しくはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、アジド（例えば、ＣＨ２Ｎ３）、シアノ（例えば、ＣＨ２ＣＮ）、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸又はホスホン酸塩、で置換されていてもよい。これらの置換基は、保護されていなくても、また、必要に応じて、当分野で公知の方法、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ他、「有機合成における保護基」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第２版、１９９１（参照されることによって本明細書に組み込まれる。）で教示された方法で保護されていてもよい。
【００８０】
本明細書では、低級アルキルという用語は、特に断らない限り、置換されていても、置換されていなくてもよい、Ｃ１〜Ｃ４の飽和直鎖、分枝、又は環状（例えば、シクロプロピル）（適切な場合）のアルキル基のことである。
【００８１】
アルキルアミノ又はアリールアミノという用語は、それぞれ、１個又は２個のアルキル置換基又はアリール置換基を有するアミノ基を包含する。
【００８２】
アミノ酸という用語は、天然又は合成のα、β、γ若しくはδアミノ酸を包含し、例としては、タンパク質に見出されるアミノ酸、すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジン（これらに限定されない。）が挙げられる。好ましい実施形態では、アミノ酸はＬ型である。或いは、アミノ酸は、アラニル、バリル、ロイシル、イソロイシル、プロリル、フェニルアラニル、トリプトファニル、メチオニル、グリシル、セリル、スレオニル、システイニル、チロシル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタロイル、リシル、アルギニル、ヒスチジル、β−アラニル、β−バリル、β−ロイシル、β−イソロイシル、β−プロリル、β−フェニルアラニル、β−トリプトファニル、β−メチオニル、β−グリシル、β−セリル、β−スレオニル、β−システイニル、β−チロシル、β−アスパラギニル、β−グルタミニル、β−アスパルトイル、β−グルタロイル、β−リシル、β−アルギニル又はβ−ヒスチジルの誘導体であってもよい。アミノ酸という用語が用いられている場合、天然若しくは合成のアミノ酸、例えば、Ｄ体及びＬ体で存在する、α、β、γ若しくはδのグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジン、のエステルの各々が具体的に、且つ独立に開示されているものとみなす。
【００８３】
本明細書では、「保護された」という用語は、特に断らない限り、更なる反応を阻止しするために、又は、他の目的のために、酸素、窒素、硫黄又はリン原子に基が付加されていることを包含する。酸素及び窒素の広範な保護基が有機合成の当業者に知られている（Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ、「有機合成における保護基」、３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９９を参照されたい）。
【００８４】
本明細書では、アリールという用語は、特に断らない限り、フェニル、ビフェニル又はナフチル、好ましくはフェニルを包含する。アリール基は、場合により、１個又は複数の置換基、例えば、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸又はホスホン酸、で置換されている。これらの置換基は、保護されていなくても、また、必要に応じて、当分野で公知の方法、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ他、「有機合成における保護基」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第３版、１９９９で教示された方法で保護されていてもよい。
【００８５】
アルカリール又はアルキルアリールという用語は、アリール置換基を有するアルキル基を包含する。アラルキル又はアリールアルキルという用語は、アルキル置換基を有するアリール基を包含する。
【００８６】
本明細書では、ハロという用語は、クロロ、ブロモ、ヨード及びフルオロを包含する。
【００８７】
アシルという用語は、エステル基の非カルボニル部分が、直鎖、分枝若しくは環状のアルキル若しくは低級アルキル、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含む）、アラルキル（ベンジルを含む）、アリールオキシアルキル（フェノキシメチル等）、アリール（ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アルコキシで置換されていてもよいフェニルを含む）、スルホン酸エステル（アルキル若しくはアラルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む。）等）、一、二若しくは三リン酸エステル、トリチル若しくはモノメトキシトリチル、置換ベンジル、トリアルキルシリル（例えば、ジメチル−ｔ−ブチルシリル）又はジフェニルメチルシリル、から選択されるカルボン酸エステルを包含する。このエステルのアリール基には、場合によってはフェニル基を包含する。「低級アシル」という用語は、非カルボニル部分が低級アルキルであるアシル基のことである。
【００８８】
本明細書では、鏡像異性的純度に関して用いられる、「実質的に含まない」又は「実質的に存在しない」という用語は、特定の鏡像異性体が、組成物中に、少なくとも８５質量％若しくは９０質量％、好ましくは９５〜９８質量％、より好ましくは９９〜１００質量％含まれることを示す。好ましい実施形態では、本発明の方法及び化合物において、当該化合物は実質的に他の鏡像異性体を含まない。
【００８９】
同様に、「単離された」という用語は、化合物の組成物が、当該化合物を、少なくとも８５質量％若しくは９０質量％、好ましくは９５〜９８質量％、より好ましくは９９〜１００質量％含み、残部は他の化学種又は鏡像異性体であることを示す。
【００９０】
本明細書では、「独立に」という用語は、独立に適用される変数が適用毎に独立に変化することを示すために用いられる。従って、Ｒ”ＸＹＲ”で表される化合物では、Ｒ”が「独立に炭素又は窒素である」ならば、両方のＲ”が炭素であっても、両方のＲ”が窒素であっても、また、一方のＲ”が炭素で、他方のＲ”が窒素であってもよい。
【００９１】
本明細書では、「薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ」という用語は、患者に投与されると当該化合物をもたらす、当該化合物の任意の薬学的に許容される形態（例えば、エステル、リン酸エステル、又はエステル若しくは関連基の塩）を表すために用いられる。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機又は有機の塩基及び酸から得られたものを包含する。適切な塩には、医薬分野で周知の数多くの他の酸の中でも、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属から得られる塩が包含される。薬学的に許容されるプロドラッグとは、宿主内で代謝（例えば、加水分解若しくは酸化）を受けて、本発明の化合物を形成する化合物のことである。プロドラッグの典型例には、活性化合物の官能基に生物学的に不安定な保護基を有する化合物が包含される。プロドラッグには、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、脱水酸化、加水分解、脱水、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化を受けて、活性化合物を生じることができる化合物が包含される。
【００９２】
本明細書では、「薬学的に許容されるエステル」という用語は、特に断らない限り、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応等を伴わず、宿主の組織と接触して使用するのに適していると判断され、且つ、リスク便益比が適度であり、企図する用途に有効である、１種又は複数の化合物のエステルを包含する。
【００９３】
本明細書では、「被治療者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのことである。哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えば、ブタ、ヒツジ、ヤギ、メスウシ（ウシ）、シカ、ラバ、ウマ、サル、他の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、又は、他の公知の、若しくは本明細書に開示の動物であってもよい。
【００９４】
〔ＩＩ．ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果／投与計画〕
本発明の他の態様では、ＴＣＮ及び関連化合物の毒性副作用を制限する投与計画を提供される。一実施形態では、このような投与計画は、毒性副作用、例えば、肝毒性、血小板減少症、高血糖、嘔吐、高カルシウム血症、貧血、低アルブミン血症、骨髄抑制、高トリグリセリド血症、高アミラーゼ血症、下痢、胃炎及び／又は発熱（これらに限定されない）、を最小限に抑える。
【００９５】
他の実施形態では、ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物の投与は、被治療者の少なくとも１５〜２０％において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、部分的な、又は完全な応答をもたらす。特定の実施形態では、部分的な応答は、腫瘍の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又は８５％の退縮である。他の実施形態では、この応答は、当該治療法によって治療された患者の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５又は９０％で明瞭に現れる。他の実施形態では、このような応答率は、本明細書に開示の任意の治療計画によって得ることができる。
【００９６】
他の実施形態では、薬剤を週に約１回、３週間投与し、その後の１週間は薬剤を投与しないことを含む（すなわち、２８日周期の）投与計画に従って、有効量のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を患者に投与することによって、癌と診断された被治療者を治療する方法が提供される。他の実施形態では、このような２８日周期を、少なくとも２、３、４若しくは５回、又は腫瘍の退縮が明らかになるまで繰り返すことができる。
【００９７】
他の実施形態では、本明細書に開示の化合物を週１回、４週間投与し、その後の２週間は薬剤を投与しないことが可能な４２日周期を実施する。他の実施形態では、このような４２日周期を、少なくとも２、３、４若しくは５回、又は腫瘍の退縮が明らかになるまで繰り返すことができる。特定の実施形態では、１２ｍｇ／ｍ２未満、１１ｍｇ／ｍ２未満又は１０ｍｇ／ｍ２未満のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を４２日周期で投与することができる。他の特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１ｍｇ／ｍ２のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を４２日周期で投与することができる。
【００９８】
他の実施形態では、１０ｍｇ／ｍ２以下のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を週１回の投与計画で被治療者に投与することによって、被治療者の癌を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を、週に１回、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。
【００９９】
本発明の実施形態では、本明細書に開示の化合物は、短期間で、例えば、約５、１０、１５、２０、３０又は６０分で、単回ボーラス投与することができる。他の実施形態では、化合物を、少なくとも２４、４８、７２、９６又は１２０時間持続注入することによって投与する投与計画が提供される。ある実施形態では、持続注射又はボーラス注射による薬剤の投与は、少なくとも週に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、５週間に１回、６週間に１回、８週間に１回、１０週間に１回及び／又は１２週間に１回、という一定の頻度で繰り返すことができる。投与の種類及び頻度は、投与周期を作り出す、本明細書に開示の任意の方法で組み合わせることができる。薬剤は、一定の投与周期で投与することができ、例えば、２週間に１回、３カ月間、繰り返しボーラス投与することができる。投与周期は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８又は２４カ月間実施することができる。或いは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５又は２０投与周期、患者に対して実施することができる。薬剤は、本明細書に開示の任意の組合せに従って投与することができ、例えば、３週間に１回、３周期投与することができる。
【０１００】
他の実施形態では、上記化合物は、少なくとも１日１回、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間投与することができる。このような投与の後には、薬剤を投与しない一定の期間を設けることができる。
【０１０１】
本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物は、腫瘍退縮を引き起こすのに有効な量で患者に投与することができる。ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも部分的な、例えば、少なくとも１５、２０又は３０％の応答を、或いは完全な応答を、少なくとも１５〜２０％の被治療者でもたらすことができる。ある実施形態では、本明細書に開示の化合物を、少なくとも２、５、１０、１５、２０、３０又は５０ｍｇ／ｍ２の用量で被治療者に投与することができる。ある実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１６５、１７５、２００、２５０、３００又は３５０ｍｇ／ｍ２の用量で被治療者に投与することができる。
【０１０２】
上記化合物の投与は、本明細書に開示の治療計画のいずれかに従って実施することができる。特定の実施形態では、この投与計画は、２０ｍｇ／ｍ２未満のＴＣＮ及び関連化合物の投与を含む。一実施形態では、２０ｍｇ／ｍ２未満のＴＣＮ又は関連化合物を週に１回投与することができる。他の実施形態では、２ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２及び／又は１５ｍｇ／ｍ２のＴＣＮ又は関連化合物を被治療者に投与することができる。他の実施形態では、１０ｍｇ／ｍ２未満を、少なくとも５日間の持続注入によって、被治療者に投与することができる。本発明は、本明細書に開示の投与の種類、頻度、周期の数、及び投与量の任意の組合せを提供する。
【０１０３】
〔ＩＩＩ．患者集団のスクリーニング〕
本発明の他の態様では、トリシリビン（ＴＣＮ）及び関連化合物の毒性作用に感受性を有する癌又は腫瘍を同定する方法が提供される。一実施形態では、（ｉ）腫瘍から生物学的試料を得ること、（ｉｉ）癌又は腫瘍が、Ａｋｔキナーゼ、又は過剰活性化及びリン酸化Ａｋｔキナーゼを過剰発現するかどうかを決定すること、並びに（ｉｉｉ）癌又は腫瘍を、本明細書に記載のトリシリビ若しくは関連化合物で治療すること、を含む、哺乳動物の癌又は腫瘍を治療する方法が提供される。一実施形態では、生物学的試料は生検で得られるものである。他の実施形態では、生物学的試料は、液体、細胞、及び／又は腫瘍若しくは癌から得られた吸引液である。
【０１０４】
生物学的試料は、当業者に公知の任意の技術によって得ることができる。一実施形態では、生検を実施して、生物学的試料を得ることができる。生検は、体から検査用の組織又は細胞を取り出すために実施される方法である。診療所で実施可能な生検もあるが、それ以外は病院施設内で実施する必要がある。また、麻酔で対象領域を麻痺させることが必要な生検もあるが、それ以外はいかなる鎮静も必要としない。ある実施形態では、内視鏡生検を実施する。この種の生検は、体の天然の開口部（すなわち、直腸）又は小切開（すなわち、関節鏡検査）を通じて挿入したファイバースコープ内視鏡（末端に観察用の近接焦点拡大鏡を備えた細長い管）を用いて行われる。内視鏡は、当該器官を観察して、異常な、又は異常の疑いのある領域を見つけ出し、検査用の少量の組織を得るのに用いられる。内視鏡法は、視覚化し、且つ／又は処置する器官又は領域で呼ばれる。医師は、胃腸管（消化管内視鏡）、膀胱（膀胱鏡検査）、腹腔（腹腔鏡検査）、関節腔（関節鏡検査）、胸部の中央部（縦隔鏡検査）、又は気管系及び気管支系（喉頭鏡検査及び気管支鏡検査）に内視鏡を挿入することができる。
【０１０５】
他の実施形態では、骨髄生検を実施することができる。この種の生検は、胸骨又は腸骨稜寛骨（背中下部領域上の骨盤両側の骨領域）のいずれかから実施することができる。皮膚を洗浄し、局所麻酔して、この領域を麻痺させる。長く堅い針を骨髄に挿入し、検査用の細胞を吸引する。この段階は、場合によっては不快である。コア生検（骨髄から小さな骨「小片」を取り除く生検）は、吸引の後に行う。
【０１０６】
他の実施形態では、切除生検又は切開生検を哺乳動物に実施することができる。この種の生検は、皮膚のより広くより深い部分が必要な場合に用いられることが多い。外科用メス（手術用メス）を用いて、更なる検査用に皮膚全層を取り出し、この傷を縫合する（手術用糸で縫い閉じる）。腫瘍全体を取り出す場合は、切除生検術と呼ぶ。腫瘍の一部のみを取り出す場合は、切開生検術と呼ぶ。切除生検は、例えば、黒色腫（皮膚癌の１種）の疑いがある場合に通常好まれる方法である。
【０１０７】
更に他の実施形態では、針穿刺吸引（ＦＮＡ）生検を用いることができる。この種の生検は、腫瘍から非常に小さな切片を取り出すために、細い針を用いることが必要である。局所麻酔を用いて対象領域を麻痺させることもあるが、この試験はあまり不快感を引き起こすことがなく、傷跡も残らない。ＦＮＡは、例えば、色素性母斑の診断には用いられないが、例えば、黒色腫の近くの大きなリンパ節の生検を行って、黒色腫が転移（進展）しているかどうかを診断するのに用いることができる。肺、肝臓等の内部器官内の腫瘍に針を導入するには、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ又はＣＡＴスキャン）を用いることができる。
【０１０８】
他の実施形態では、パンチ生検、シェーブ生検及び／又は皮膚生検を実施することができる。パンチ生検では、組織の短い円柱（「リンゴの芯」）を取り出す生検装置で、皮膚のより深い試料を採取する。局所麻酔を投与した後、真皮、表皮、及び皮下組織（脂肪）の最表面部を含む層全体を切断するまで、この装置を皮膚の表面上で転がす。シェーブ生検では、皮膚の上層を削いで、これを取り除く。シェーブ生検は、局所麻酔下で実施する。皮膚生検では、顕微鏡検査用の皮膚試料を採取して、例えば、黒色腫が存在するかどうかを決定する。この生検も、局所麻酔下で実施する。
【０１０９】
特定の実施形態では、腫瘍がＡｋｔキナーゼを過剰発現するかどうかを決定する方法が提供される。Ａｋｔキナーゼの過剰発現とは、キナーゼのリン酸化状態を意味するということができる。Ａｋｔの過リン酸化は、本明細書に記載の方法によって検出することができる。一実施形態では、腫瘍生検は対照組織と比較して行う。対照組織は、生検を行った哺乳動物の正常な組織でも、また、健康な哺乳動物の正常な組織でもよい。生検で得られた腫瘍が、正常組織よりもＡｋｔキナーゼ及び／又はリン酸化Ａｋｔキナーゼを多く、例えば、対照組織と比較して、少なくとも約１．５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．５、６、７、８、９又は１０倍量含有していれば、Ａｋｔキナーゼの過剰発現又は過リン酸化があると決定することができる。
【０１１０】
一実施形態では、本発明は、被治療者の細胞、細胞抽出物、血清若しくは他の試料、又は前記生物学的試料を、Ａｋｔキナーゼ又はその抗原部分に特異的な免疫反応性分子と接触させ、免疫反応性分子−Ａｋｔキナーゼ複合体形成のレベルをスクリーニングすることによって、被治療者、又は被治療者から得られた生物学的試料における異常なＡｋｔキナーゼ発現を検出する方法であって、正常細胞に比べて複合体の存在量が多いことを、Ａｋｔを発現又は過剰発現する異常細胞の指標とする方法を提供する。一実施形態では、細胞又は細胞抽出物のＡｋｔキナーゼレベルの増加を免疫学的にスクリーニングする。
【０１１１】
他の実施形態では、細胞におけるＡｋｔの異常発現は、Ａｋｔキナーゼをコードする遺伝子の発現レベルをスクリーニングすることによって遺伝子レベルで検出され、ここでは、正常細胞に比べて転写発現産物（すなわち、ｍＲＮＡ）レベルが多いことが異常細胞の指標となる。ある実施形態では、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法を用いて、転写活性を測定することができる。一実施形態では、ｍＲＮＡを、被治療者の細胞から、又は被治療者の生物学的試料から得、また、場合によっては、ｃＤＮＡを作製する。次いで、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを、Ａｋｔキナーゼをコードするヌクレオチド配列又はその相補的ヌクレオチド配列の全部又は一部とハイブリダイズし、且つ／又は増幅させることができる遺伝子プローブと接触させる。そして、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのレベルを検出し、正常対照と比較してｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのレベルが増加しているかどうかを評価する。
【０１１２】
本発明の更に他の実施形態では、定量又は半定量診断キット（アッセイを行うのに必要な試薬をすべて含むことができる。）中で、Ａｋｔキナーゼに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用して、癌細胞の疑いのある患者の細胞におけるＡｋｔキナーゼの相対的レベルを測定する。一実施形態では、ＥＬＩＳＡを実施するのに必要な試薬及び材料を用いたキットが提供される。試薬としては、例えば、洗浄緩衝液、抗体希釈緩衝液、ブロック緩衝液、細胞染色液、発色液、停止液、抗リンタンパク質特異的抗体、抗Ｐａｎタンパク質特異的抗体、第２抗体及び蒸留水が挙げられる。このキットはまた、使用指示書を含んでもよく、また、場合によっては、自動化又は半自動化されているか、或いは自動化機械又はソフトウェアに適合した形態であってもよい。一実施形態では、活性型ＡＫＴ（セリン４７４がリン酸化されたＡｋｔ）を検出する蛍光体−ｓｅｒ−４７３Ａｋｔ抗体を、診断キット中の抗体として用いる。例えば、Ｙｕａｎ他（２０００）、「ヒト卵巣癌におけるホスフィノシチド−３−ＯＨキナーゼ／Ａｋｔ経路の阻害によるＡＫＴ２の頻繁な活性化、及びアポトーシスの阻害」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：２３２４〜２３３０を参照されたい。
【０１１３】
（Ａｋｔキナーゼ）
ＰＫＢ３ともいうＡｋｔは、セリン／スレオニンキナーゼのサブファミリーを表す。このサブファミリーの中では、３種のメンバー：ＡＫＴ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３、が同定されている。Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋに依存して、細胞外刺激によって活性化される（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９）。Ａｋｔの完全な活性化には、活性化ループ中のＴｈｒ３０８、及びＣ末端活性化ドメインのＳｅｒ４７３のリン酸化が必要である。Ａｋｔは、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子によって負に制御される。ＰＴＥＮ中の変異は種々の腫瘍で同定されているが、これはＡｋｔ経路の活性化を引き起こす（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９）。更に、Ａｋｔの増幅、過剰発現及び／又は活性化は、いくつかのヒト悪性腫瘍において検出されている（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９；Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．、及びＮｉｃｏｓｉａ，Ｓ．Ｖ．、腫瘍形成におけるＡＫＴ情報伝達経路、Ｉｎ  Ｓｃｈｗａｂ  Ｄ編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００１．ｐｐ３５〜７）。Ａｋｔ、特に常時活性型Ａｋｔの異所発現は、細胞生存及び悪性転換を誘導し、他方、Ａｋｔ活性の阻害は、種々の哺乳動物細胞においてアポトーシスを刺激する（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９；Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．及びＮｉｃｏｓｉａ，Ｓ．Ｖ．、腫瘍形成におけるＡＫＴ情報伝達経路、Ｓｃｈｗａｂ  Ｄ編  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００１．ｐｐ３５〜７；Ｓｕｎ，Ｍ，他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５９：４３１〜４３７、２００１；Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１４：２７９３〜２８０１、１９９７）。更に、Ａｋｔの活性化は、腫瘍の侵襲性及び化学物質耐性に関与することが示されている（Ｗｅｓｔ，Ｋ．Ａ．他、Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．、５：２３４〜２４８、２００２）。
【０１１４】
Ａｋｔ経路の活性化は、細胞の生存、増殖、移動、及び血管の形成を誘導することによって、悪性転換及び化学物質耐性において重要な役割を果たす。本発明は、Ａｋｔキナーゼ過剰発現のレベル、及び／又は過剰活性化及びリン酸化Ａｋｔキナーゼのレベルを測定する方法を提供する。
【０１１５】
Ａｋｔキナーゼは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３を含む（これらに限定されない）、任意の公知のＡｋｔファミリーキナーゼ、又はそれに関連するキナーゼである。ヒトＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列を、それぞれ、図６ａ〜ｃ、図７ａ〜ｄ及び図８ａ〜ｃに示す。
【０１１６】
（診断アッセイ）
免疫学的アッセイ：
一実施形態では、哺乳動物の細胞、細胞抽出物、血清若しくは他の試料、又は生物学的試料を、Ａｋｔキナーゼ又はその抗原部分に特異的な免疫反応性分子と接触させ、免疫反応性分子−Ａｋｔキナーゼ複合体形成のレベルをスクリーニングし、正常細胞に比べて複合体の存在量が多いかどうかを決定することによって、哺乳動物、又は哺乳動物の生物学的試料におけるＡｋｔキナーゼの異常発現を検出する方法が提供される。
【０１１７】
上記免疫反応性分子は、Ａｋｔキナーゼ又はその抗原部分、相同体、或いはそれらの誘導体に特異性及び結合親和性を有する分子である。一実施形態では、免疫反応性分子は、イムノグロブリン分子である。他の実施形態では、免疫反応性分子は、抗体断片、１本鎖抗体、及び／又は脱免疫分子（ヒト化抗体、Ｔ細胞関連抗原結合分子（ＴＡＢＭ）等）である。特定の一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。免疫反応性分子は、Ａｋｔキナーゼ、より具体的にはＡｋｔキナーゼの抗原決定基又はエピトープに特異性を示す。Ａｋｔキナーゼの抗原決定基又はエピトープには、免疫応答が向けられる分子部分が含まれる。この抗原決定基又はエピトープは、Ｂ細胞エピトープ、又はＴ細胞エピトープ（適切な場合）である。一実施形態では、抗体は蛍光体−ｓｅｒ−４７３Ａｋｔ抗体である。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、哺乳動物の細胞若しくは細胞抽出物、又は被治療者から得られた生物学的試料を、Ａｋｔキナーゼ又はその抗原決定基若しくはエピトープに特異性を有する抗体（Ａｋｔキナーゼ結合有効量）と接触させ、次いで、Ａｋｔキナーゼ−抗体複合体のレベルを定量的若しくは半定量的に測定して、正常細胞と比較して前記複合体のレベルが増加していることを決定することによって、異常なＡｋｔ活性が存在する、哺乳動物における癌若しくは癌様増殖を診断する方法が提供される。
【０１１９】
抗体は、当業者に公知のいずれかの手段によって調製することができる。例えば、ヒトＡｋｔキナーゼ検出用抗体は、一般には、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、メウシ、ブタ、ヤギ、ウマ）、研究実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）及び／又はペット（例えば、イヌ、ネコ）等の非ヒト動物から得られる（得られないこともある）。抗体はまた、組換え技術を用いて、原核又は真核宿主細胞で作製することができる。一般に、抗体をベースとしたアッセイは、生検で得られた細胞又は組織に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。しかし、抗体が適切に脱免疫されるか、又はヒト化される（ヒトで使用する場合）ならば、抗体を、例えば、核タグで標識して、患者に投与し、核標識が蓄積した部位を放射線技術で決定することができる。Ａｋｔキナーゼ抗体は、癌標的薬である。従って、本発明の他の実施形態では、ヒト及び非ヒト患者における癌イメージングで使用する脱免疫型抗体が提供される。
【０１２０】
一般に、Ａｋｔキナーゼに対する抗体を作製するためには、当該酵素を生物学的試料から抽出する必要がある。生物学的試料は、ヒト組織を含む動物から得ても、細胞培養物から（組換え技術によって作製する場合）得てもよい。Ａｋｔキナーゼは、任意の適切な手段で生物学的試料から分離することができる。分離は、例えば、Ａｋｔキナーゼの表面電荷特性、サイズ、密度、生物学的活性、及び他の物質（例えば、それが結合し、又は会合する他のタンパク質又は化合物）に対する親和性、のいずれか１種又は複数を利用して行うことができる。従って、例えば、体液からのＡｋｔキナーゼの分離は、超遠心、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動）、サイズによる分離（例えば、ゲル濾過、限外濾過）、及び親和性を用いた分離（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄ（商標）分離等の磁気ビーズ分離、免疫クロマトグラフィー、免疫沈降（これらに限定されない。）を含む免疫親和性分離）のいずれか１種又は複数を用いて実施することができる。このような、体液からのＡｋｔキナーゼの分離は、キナーゼ上に存在する構造的エピトープを維持することができるものであり、また、それ故、酵素の変性を生じさせる技術を適切に回避するものである。他の実施形態では、上記キナーゼは、親和性分離、ゲル濾過及び／又は限外濾過のいずれか１種又は複数を用いて体液から分離することができる。
【０１２１】
免疫、及びそれに続くモノクローナル抗体の作製は、当業者に公知の標準的方法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９９、１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（７）：５１１〜５１９、１９７６）、Ｃｏｌｉｇａｎ他（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９１〜１９９７）又はＴｏｙａｍａ他（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｋｏｄａｎｓｈａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ出版、１９８７）に記載の方法を用いて実施することができる。基本的には、標準的方法で、Ａｋｔキナーゼ含有体液若しくはそれらの画分、又は組換え型Ａｋｔキナーゼで動物を免疫し、抗体産生細胞、特に、抗体産生体細胞（例えば、Ｂリンパ球）を作製する。次いで、不死化のために、それらの細胞を、免疫した動物から取り出す。ある実施形態では、Ａｋｔキナーゼの断片を用いて抗体を作製する。この断片は、担体に結合させることができる。担体としては、免疫原性が全くないか、不十分な物質（例えば、ハプテン）が天然に、又は人為的に結合して、その免疫原性を高める物質（一般に高分子量）が考えられる。
【０１２２】
抗体産生細胞の不死化は、当業者に周知の方法を用いて実施することができる。例えば、不死化は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を用いた形質転換法（Ｋｏｚｂｏｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：１４０、１９８６）によって実施することができる。他の実施形態では、モノクローナル抗体の作製に広く用いられている細胞融合法（Ｃｏｌｉｇａｎ他、１９９１〜１９９７、前述）を用いて、抗体産生細胞を不死化する。この方法では、抗体を産生する能力のある抗体産生体細胞、特にＢ細胞を骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、初回抗原刺激を受けた動物、好ましくはマウス、ラット等の齧歯類動物のリンパ節、脾臓及び末梢血から得ることができる。特定の実施形態では、マウスの脾臓細胞を用いることができる。他の実施形態ではまた、ラット、ウサギ又はヤギの細胞を用いることができる。特殊化骨髄腫細胞株は、ハイブリドーマを作製する融合過程で用いるために、リンパ球性腫瘍から開発されている（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７６、前述、Ｓｈｕｌｍａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９〜２７０、１９７８；Ｖｏｌｋ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４２（１）：２２０〜２２７、１９８２）。多くの骨髄腫細胞株はまた、融合細胞ハイブリッド（例えば、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ８、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−ＡＧ８．６５３、Ｐ３／ＮＳ１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４及びＳ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１）の作製に用いることができる。Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ８及びＮＳ−１細胞株は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６、前述）に記載されている。Ｓｈｕｌｍａｎ他（１９７８、前述）は、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株を開発している。Ｓ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１細胞株は、Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８（１）：３１３〜３２３、１９７８）によって報告されている。抗体産生脾臓細胞又はリンパ節細胞と骨髄腫とのハイブリッドの作製方法では、通常、細胞膜の融合を促進する１種又は複数の（化学的、ウイルス性、又は電気的）薬剤の存在下で、体細胞と骨髄腫とを１０：１の割合（但し、この割合は約２０：１から約１：１まで変化させることが可能である。）で混合する。融合方法は記載されている（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、前述；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７６、前述；Ｇｅｆｔｅｒ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１〜２３６、１９７７；Ｖｏｌｋ他、１９８２、前述）。それらの研究者によって用いられた融合促進剤は、センダイウイルス及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であった。ある実施形態では、残存する未融合細胞、特に未融合骨髄腫細胞から融合細胞ハイブリッドを選択する手段が提供される。一般に、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドーマの増殖は支持するが、未融合骨髄腫細胞（通常は、無限に分裂を続ける。）の増殖は阻害する培地中で、細胞を培養することによって行うことができる。融合に用いた体細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養において長期生存能力を維持せず、それ故、問題とならない。融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するには数週間���要である。この期間の初期に、後のクローニング及び増殖が可能になるように、所望の抗体を産生するハイブリッドを同定する必要がある。一般に、得られたハイブリッドの約１０％が所望の抗体を産生するが、約１％乃至約３０％の範囲は珍しくない。抗体産生ハイブリッドの検出は、標準的アッセイ（例えば、Ｋｅｎｎｅｔ他（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、ｐｐ３７６〜３８４、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）に記載の酵素結合免疫アッセイ及び放射免疫アッセイ）のいずれかによって、また、ＦＡＣＳ分析（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：８２４〜８３０、１９９８）によって実施することができる。
【０１２３】
一旦所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞株にクローニングされたら、各細胞株を２種の標準的方法のいずれかで増殖させることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液は、組織適合動物に注射する。その後、注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生じる。この動物の体液（血清、腹水等）を採取すれば、高濃度のモノクローナル抗体が得られる。或いは、個々の細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、実験培養容器内で増殖させてもよい。この場合、単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度で含有する培地をデカンテーション、濾過又は遠心によって収集し、その後、これを精製する。
【０１２４】
細胞株は、任意の適切な免疫検出手段によって、Ａｋｔキナーゼを検出する特異性について試験することができる。例えば、細胞株をいくつかのウェルに分注して、インキュベートし、各ウェルの上清を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接的蛍光抗体法等によって分析する。非標的エピトープは認識しないが、標的ＬＩＭキナーゼは認識可能なモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し、次いで、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接培養するか、組織適合動物に注射して、腫瘍を形成させ、必要な抗体を作製、収集、精製する。
【０１２５】
従って、本発明は、試料中でＡｋｔキナーゼ又はその断片、変種若しくは誘導体を検出する方法であって、試料と、抗体又はその断片若しくは誘導体と、を接触させること、並びに、抗体と、Ａｋｔキナーゼ又はその断片、変種若しくは誘導体と、を含有する複合体のレベルを測定し、正常対照と比較して、Ａｋｔキナーゼレベルの増加を決定すること、を含む方法を提供する。上記複合体の形成は、任意の適切な方法を用いて検出することができる。例えば、リポーター分子を結合させた本発明の抗体を、免疫アッセイで使用することができる。このような免疫アッセイとしては、当業者に周知の放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィー（ＩＣＴ）及びウェスタンブロッティングが挙げられる（これらに限定されない）。免疫アッセイはまた、競合アッセイでもよい。本発明は、定性及び定量免疫アッセイを包含する。
【０１２６】
適切な免疫アッセイは、例えば、米国特許第４０１６０４３号、第４４２４２７９号及び第４０１８６５３号に記載されている。これらには、非競合型の１部位（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ）及び２部位（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）アッセイ、並びに従来の競合結合アッセイの両方が包含される。これらのアッセイにはまた、標的抗原に対する標識抗原結合分子の直接結合が包含される。
【０１２７】
本発明は更に、動物、例えば、ヒト癌患者又は癌の疑いのある個体から得られた細胞又は組織試料におけるＡｋｔタンパク質の発現レベル及び活性化レベルを定量する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、画像システムを定量的に用いて、Ａｋｔタンパク質の発現レベル又は活性化レベルを定量する方法を提供する。画像システムは、Ａｋｔタンパク質特異的染色で染色された細胞又は組織試料の画像を受像、増強、処理して、動物から得られた細胞及び組織試料で発現したＡｋｔタンパク質の量又は活性化レベルを測定するのに用いることができる。本発明の方法の実施形態では、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２タンパク質発現の検量線は、ＡＫＴタンパク質の異なる量を発現する少なくとも２種の細胞株について作成することができる。得られた検量線は、細胞又は組織試料で発現したＡＫＴタンパク質の量を定量的に測定するのに用いることができる。活性化特性に特異的な試薬を用いて、類似の検量線を、活性化ＡＫＴタンパク質について作成することができる。これはまた、臨床的癌治療の前後に、ＡＫＴの量及び活性化状態の変化を測定するのに用いることができる。
【０１２８】
本発明の方法の特定の一実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、試料中のＡＫＴタンパク質の量を測定することによって、細胞又は組織試料中のＡＫＴタンパク質の発現を定量する。このような方法は、例えば、米国特許公報第２００２／００１５９７４号に記載されている。
【０１２９】
他の実施形態では、酵素免疫アッセイを用いて、Ａｋｔキナーゼを検出する。このようなアッセイでは、一般にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩を用いて、酵素を第２抗体に結合させる。酵素と共に用いられる基質としては、一般に、対応する酵素による加水分解を受けた場合に、検出可能な色調の変化を生じるものが選択される。発色基質ではなく、蛍光物質を生じる蛍光発生基質を用いることも可能である。酵素標識抗体を第１抗体−抗原複合体に添加し、結合させた後、過剰な試薬を洗い流す。次いで、適切な基質を含有する溶液を、抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。この基質は、第２抗体に結合した酵素と反応して、定量的な可視信号をもたらす。そして、この信号を、通常分光光度法を用いて定量して、試料中に存在した抗原の量を測定する。或いは、フルオレセイン、ローダミン、ユーロピウム（ＥＵ）（ランタニド元素）等の蛍光化合物を、抗体の結合能力を変更することなく、抗体に化学的に結合させてもよい。蛍光色素標識抗体は、特定の波長の光の照射によって活性化されると、光エネルギーを吸収して、分子内の励起状態を誘導し、次いで、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を放射する。蛍光標識抗体は第１抗体−抗原複合体に結合させる。未結合の試薬を洗浄後、残存する三次複合体を適切な波長の光に曝露する。観察される蛍光は抗原の存在を示す。免疫蛍光アッセイ（ＩＦＭＡ）は当分野で十分に確立されているが、本発明の方法において特に有用である。しかし、他のリポーター分子、例えば、放射性同位元素、化学発光分子又は生物発光分子を用いることもできる。
【０１３０】
特定の実施形態では、Ａｋｔキナーゼに対する抗体はまた、特に血清中又は他の循環液中のＡｋｔキナーゼのＥＬＩＳＡによる検出において使用する。これは、抗Ａｋｔキナーゼ抗体を固相支持体に固定し、これを生物学的抽出物（例えば、血清、血液、リンパ液若しくは他の体液、細胞抽出物又は生検細胞）と接触させることによって実施する。次いで、標識抗Ａｋｔキナーゼ抗体を用いて、固定されたＡｋｔキナーゼを検出する。このアッセイは、いくつかのやり方で改変することができる。改変された形態はすべて本発明に包含され、また、当業者に公知である。この方法は、例えば、血清をベースにしたアッセイを用いて、Ａｋｔキナーゼレベルを迅速に検出、定量することを可能にする。
【０１３１】
一実施形態では、Ａｋｔ  Ｅｌｉｓａ測定キットを本発明で用いる。例えば、Ａｋｔ  Ｓ４７３用Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＥＬＩＳＡキット（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を本発明で用いることができる。一実施形態では、この抗体はＡｋｔ  Ｓ４７３を認識する抗ｐａｎ抗体である。Ｅｌｉｓａ測定キットは、抗Ａｋｔ抗体、及び他の試薬（例えば、洗浄緩衝液、抗体希釈液、ブロック緩衝液、細胞染色液、発色液、停止液、第２抗体及び蒸留水。これらに限定されない。）を含有する。
【０１３２】
ヌクレオチド検出：
他の実施形態では、Ａｋｔキナーゼをコードするポリヌクレオチドの細胞内での発現レベルを検出することによって、Ａｋｔキナーゼを検出する方法が提供される。ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の任意の適切な技術を用いて測定することができる。一実施形態では、細胞から得られたＲＮＡ抽出物のノーザンブロットにおいて、Ａｋｔキナーゼをコードする標識ポリヌクレオチドをプローブとして用いる。他の実施形態では、動物の核酸抽出物を、キナーゼをコードするポリヌクレオチドのセンス及びアンチセンス配列、又はその隣接配列、に対応するオリゴヌクレオチドプライマーと合わせて、ＲＴ  ＰＣＲ等の核酸増幅反応で用いる。例えば、Ｆｏｄｏｒ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７〜７７７、１９９１）及びＫａｚａｌ他（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３〜７５９、１９９６）に記載の種々の自動化固相検出法も当業者に利用可能である。
【０１３３】
他の実施形態では、ＲＮＡ転写物をコードするａｋｔキナーゼを検出する方法が提供される。ＲＮＡを、ＡｋｔキナーゼＲＮＡを含有するものと推測される細胞試料から単離することができ、例えば、全（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡをヒト癌組織から単離することができる。ＲＮＡは、当分野で公知の方法、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）を用いて単離することができる。オリゴ−ｄＴ又はランダム配列オリゴヌクレオチド，並びに配列特異的オリゴヌクレオチドは、単離されたＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを調製する逆転写反応のプライマーとして用いることができる。得られた１本鎖ｃＤＮＡは、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応で増幅され、増幅産物を生成する。
【０１３４】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、例えば、米国特許第４６８３１９５号に記載のように、核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの予め選択された断片の量を増幅する方法又は技術のことである。一般に、オリゴヌクレオチドプライマー設計のために、関心のある領域の両末端又はそれ以上の配列情報を用いる。これらのプライマーの配列は、増幅する鋳型の反対鎖と同一であるか、類似している。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、及び全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを増幅するために用いることができる。一般には、Ｍｕｌｌｉｓ他を参照されたい（Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７、Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９）。従って、ＰＣＲによる特定の核酸配列の増幅は、保存されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド（「プライマー」）に依存し、この保存された配列は、関連遺伝子又はタンパク質の配列の並び方、例えば、哺乳動物Ａｋｔキナーゼ遺伝子の配列を比較することによって推定することができる。例えば、アンチセンス鎖とアニールすることが予測される１つのプライマーを調製し、ＡｋｔキナーゼをコードするｃＤＮＡ分子のセンス鎖とアニールすることが予測されるもう１つのプライマーを調製する。一般に、反応混合物に対してアガロースゲル電気泳動又は他の便利な分離法を実施して、増幅産物を検出し、Ａｋｔキナーゼに固有の増幅ＤＮＡの相対的存在量を検出する。例えば、Ａｋｔキナーゼ増幅ＤＮＡは、特定のオリゴヌクレオチドプローブによるサザンハイブリダイゼーションを用いるか、或いは、分子量が公知のＤＮＡ標準物と、電気泳動の移動度を比較することによって検出することができる。増幅ＡｋｔキナーゼＤＮＡの単離、精製及び解析は、ゲルから断片を切り出すか、溶出し（例えば、Ｌａｗｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２：６１０３、１９８１；Ｇｏｅｄｄｅｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．８：４０５７〜１９８０を参照）、適切なベクター、例えば、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクローニング部位に増幅産物をクローニングし、クローニングした挿入部の配列を決定し、ＬＩＭキナーゼの公知の配列とＤＮＡ配列を比較することによって実施することができる。その後、ＬＩＭキナーゼｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの相対量を測定することができる。
【０１３５】
一実施形態では、リアルタイムＰＣＲを用いて、Ａｋｔヌクレオチドの転写レベルを測定することができる。転写活性の測定はまた、入手可能なｍＲＮＡ転写物に基づく潜在的翻訳活性の測定を包含する。リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物の検出のために、ＤＮＡ結合蛍光体、５’エンドヌクレアーゼ、隣接した線状及びヘアピンオリゴプローブ、並びに自家蛍光性単位複製配列の結合等の化学反応が用いられる。これらの化学反応及びリアルタイムＰＣＲ一般については、例えば、Ｍａｃｋａｙ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０（６）：１２９２〜１３０５、２００２；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １５（３）：１２１〜１２７、２００１；Ｌｅｗｉｓ他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９５：６６〜７１、２００１で論じられている。
【０１３６】
他の実施形態では、Ａｋｔの異常発現は、生物学的試料から単離されたヌクレオチド配列と、図６ａ〜ｃ、図７ａ〜ｃ若しくは図８ａ〜ｃのヌクレオチド配列から選択されたＡｋｔ配列又はそれらの断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブと、を接触させ、次いで、そのヌクレオチド配列にプローブをハイブリダイズして、配列を検出し、結果を正常試料と比較することによって同定することができる。生物学的試料に対するプローブのハイブリダイゼーションは、任意の検出薬剤でプローブを標識することによって検出することができる。このプローブは、例えば、放射性同位元素で、又は、ビオチン、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ハプテン、若しくはその抗体が利用可能なタンパク質で標識することができる。検出可能な標識は、所望の手段（分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、放射性同位元素を用いた手段、化学的手段等）によってアッセイすることができる。プローブはまた、オリゴマー制限（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）法、ドットブロットアッセイ、逆ドットブロットアッセイ、ラインプローブ（ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｅ）アッセイ、５’ヌクレアーゼアッセイ等の技術を用いて検出することができる。或いは、プローブは、一般に適用可能なＤＮＡアレイ技術（マクロアレイ、マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロチップ等）のいずれかを用いて検出することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に、図６ａ〜ｃ、図７ａ〜ｃ及び図８ａ〜ｃから選択されたヌクレオチド又はそれらの断片にハイブリダイズする、少なくとも約１４、１５、１６、１８、２０、２５又は２８個のヌクレオチドを含むものである。一般に、約２５又は２８個のヌクレオチドを上回る長さのプローブを用いることは好ましくない。オリゴヌクレオチドプローブは、Ａｋｔヌクレオチド配列を同定することができるように設計する。
【０１３７】
キナーゼアッセイ：
当分野で公知の任意の適切なキナーゼアッセイを用いて、Ａｋｔキナーゼの活性を測定することができる。例えば、Ｈｏｇｇ他（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９４、９：９８〜９６）、Ｍｉｌｌｓ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２、２６７：１６０００〜００６）、Ｔｏｍｉｚａｗａ他  ２００１（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１、４９２：２２１〜７）、Ｓｃｈｍａｎｄｔ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、１５２：９６〜１０５）に記載の方法を用いることができるが、それらに限定されるものではない。また、セリン、スレオニン及びチロシンキナーゼアッセイについては、Ａｕｓｕｂｅｌ他（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、ｕｎｉｔ  １７．６）に記載されている。
【０１３８】
Ａｋｔキナーゼアッセイでは、一般に、Ａｋｔポリペプチド、標識供与体基質、及びＡｋｔに特異的又は非特異的な受容体基質を用いることができる。このようなアッセイでは、Ａｋｔは、標識部分を供与体基質から受容体基質に転移し、キナーゼ活性は、供与体基質から受容体基質に転移された標識部分の量によって測定される。Ａｋｔポリペプチドは、種々の発現系を用いて作製することができ、また、細胞から精製することができる。また、切断された、又は切断されていない組換え融合タンパク質の形態をとることができる。また、非Ａｋｔポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ又はベータ−ガラクトシダーゼをＮ又はＣ末端に有してもよい。測定すべきＡｋｔの供給源として癌細胞株を用いるならば、Ａｋｔ活性をこの癌細胞株で測定することができる。Ａｋｔアッセイに適切な供与体基質としては、Ａｋｔによる脱リン酸化を受けやすい任意の分子、例えば、標識が３３Ｐ、３２Ｐ、３５Ｐ若しくは他の放射性同位元素、又は適切な蛍光マーカーであるガンマ−標識ＡＴＰ及びＡＴＰアナログが挙げられる。Ａｋｔアッセイに適切な受容体基質としては、Ａｋｔによってリン酸化を受けやすいポリペプチド等の分子が挙げられる。受容体基質は、Ａｋｔのｉｎ  ｖｉｖｏ標的の断片に由来するものでもよい。受容体基質の断片の長さは、アミノ酸８〜５０個であり、通常は１０〜３０個、特に約１０、１２、１５、１８、２０及び２５個である。更に、受容体基質は、異なるポリペプチド等の分子のセットを用いて実験的に決定することができる。一旦反応が実施されると、ＴＴＫの受容体基質の標的を、反応の他の成分から精製することができる。この精製は、通常、分子相互作用を用いて行われる。すなわち、受容体基質をビオチン化し、ストレプトアビジンとの相互作用によって精製するか、或いは、受容体基質を特異的に認識可能な特異的抗体を用いて精製する。反応は、種々の条件で、例えば、固相上、ゲル中、溶液中又は生存細胞中で実施することができる。検出方法の選択は、供与体分子に用いられる標識の種類に依存するが、例えば、オートラジオグラフィー、シンチレーション、スキャニング又は蛍光光度分析を用いて、取り込まれた放射線又は蛍光を測定する方法を選択することができる。
【０１３９】
〔ＩＶ．治療方法〕
本明細書で提供される化合物及び医薬組成物は、腫瘍、癌、及び異常細胞増殖に関連する他の疾患を含む状態の治療に使用することができる。一実施形態では、本発明の化合物は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫を治療するために使用することができる。本発明の他の実施形態では、本明細書に開示の化合物は、固形腫瘍を治療するために使用することができる。
【０１４０】
本発明の化合物は、次の器官又は組織（これらに限定されない）：乳房、前立腺、肺、気管支、大腸、尿路、膀胱、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、腎臓、腎臓部、膵臓、上咽頭、甲状腺、胃、脳、多発性骨髄腫、食道、肝臓、肝内胆管、頸部、喉頭、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、心臓等の軟部組織、ホジキンリンパ腫、精巣、小腸、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、肛門、肛門管、肛門直腸、甲状腺、外陰、胆嚢、胸膜、目、鼻腔、中耳、鼻咽頭、尿管、腹膜、網、腸間膜及び胃腸、高悪性度神経膠腫、神経膠芽腫、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、頭部及び頸部の癌、癌腫、腎細胞癌、腺癌、肉腫、血管内皮腫、リンパ腫、白血病、菌状息肉腫等、の癌の治療に使用することができる。他の実施形態では、本発明の化合物は、次の皮膚疾患（これらに限定されない）：悪性疾患血管肉腫、血管内皮細胞腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫及びカポジ肉腫、並びに非悪性疾患若しくは状態、例えば、乾癬、リンパ脈管新生、小児の血管腫、スタージ−ウェーバー症候群、尋常性いぼ、神経線維腫、結節性硬化症、化膿性肉芽腫、劣性栄養障害性表皮水疱症、静脈性潰瘍、ざ瘡、酒さ、湿疹、伝染性軟属腫、脂漏性角化症及び光線性角化症、の治療に使用することができる。
【０１４１】
本発明の組成物は、これらの癌、及び他の癌を治療するために、癌の発見から進行段階までの任意の段階で使用することができる。更に、本発明の組成物は、原発癌及びその転移の治療で使用することができる。
【０１４２】
本発明の他の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、例えば、下記表２に挙げた癌（これらに限定されない。）の治療で使用することができる。
【０１４３】
【表２−１】
2007530705.tif 000010
【０１４４】
【表２−２】
2007530705.tif 000011
【０１４５】
【表２−３】
2007530705.tif 000012
【０１４６】
【表２−４】
2007530705.tif 000013
【０１４７】
本発明の他の実施形態では、本明細書に開示の化合物は、血管形成関連疾患の治療で使用することができる。
【０１４８】
抗血管新生小分子としては、ＮＦｋＢを阻害することによって部分的に作用するサリドマイド；微小管活性化及び低酸素症誘導因子（ＨＩＦ１ａ）活性化に影響を与える２−メトキシエストラジオール；シクロ−オキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）阻害剤；並びに従来の低用量化学治療薬（シクロホスファミド、タキサン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン）等）が挙げられる（Ｄ’Ａｍａｔｏ，Ｒ．Ｊ．他（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９１、３９６４〜３９６８；Ｄ’Ａｍａｔｏ，Ｒ．Ｊ．他（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９１、４０８２〜４０８５）。更に、ある種のチロシンキナーゼ阻害剤は、腫瘍及び間質細胞による、ＶＥＧＦ及び他の血管新生誘発因子の産生を減少させることによって、血管形成を間接的に低減させる。これらの薬剤には、ハーセプチン、イマチニブ（グリベック）及びイレッサが含まれる（Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．他（２００３）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ＩＩＩ、１２８７〜１２９５；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．他（２００１）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７、１４５９〜１４６５；Ｐｌｕｍ，Ｓ．Ｍ．他（２００３）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９、４６１９〜４６２６）。
【０１４９】
最近、血管形成阻害剤は、動物モデルからヒト患者に移行した。血管形成阻害剤は、種々の癌の治療法となることが期待されている。最近、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して親和性の高いアバスチンは、進行した腎細胞癌では、単独で寿命を延長し、進行した大腸癌では、化学療法との併用により寿命を延長することが示された（Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｃ．他（２００３）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４９、４２７〜４３４；Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ，Ｆ．他（２００３）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１、６０〜６５）。
【０１５０】
血管新生関連疾患としては、炎症、自己免疫疾患及び感染性疾患；血管新生依存性癌（例えば、固形腫瘍、血液骨腫瘍（白血病等）及び腫瘍転移）；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫）；関節リウマチ；乾癬；湿疹；目の血管新生疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植後拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後方繊維増殖症、ルベオーシス）；オスラー−ウェーバー症候群；心筋血管形成；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；及び創傷肉芽形成が挙げられる（これらに限定されない）。更に、本発明の組成物は、腸管癒着症、アテローム性動脈硬化、強皮症、いぼ、肥厚性瘢痕（すなわち、ケロイド）等の疾患の治療に使用することができる。本発明の組成物はまた、病理学的な結果として血管形成を生じる疾患（猫引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（ヘリコバクターピロリ）、結核、らい病等）の治療に使用することができる。
【０１５１】
（薬剤耐性腫瘍又は癌）
本発明は、本明細書に開示の癌及び薬剤の実施形態を含む、薬剤耐性癌の治療に使用可能な化合物を提供する。一実施形態では、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物等の化合物を第２の薬剤と共に投与することができる。
【０１５２】
多剤耐性（ＭＤＲ）は、ヒト癌に生じ、化学療法の成功に重大な障害となる可能性がある。多剤耐性は、１種の細胞毒性剤に曝露された腫瘍細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々の構造的及び機能的に関連のない化合物に交差耐性を生じる現象である。更に、ＭＤＲは、化学療法剤に曝露したことがない癌において突発的に生じる場合がある。従って、一実施形態では、本発明は、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物を投与することによって、薬剤耐性癌（例えば、多剤耐性癌）の患者を治療する方法を提供する。ある実施形態では、タキソール、ラパマイシン、タモキシフェン、シスプラチン及び／又はゲフィチニブ（イレッサ）に耐性の癌を治療するために、ＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物を使用することができる。
【０１５３】
一実施形態では、大腸、骨、腎臓、副腎、膵臓、肝臓の薬剤耐性癌、及び／又は当分野で公知の、又は本明細書に開示の任意の他の癌の治療に、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ及び関連化合物を使用することができる。
【０１５４】
（併用療法）
本発明の一態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、少なくとも１種の他の化学療法剤と組み合わせることができる。化学療法剤は、本明細書に開示の化合物と共に、又はその代わりに投与することができる。薬物は、同じ組成物の一部を形成しても、また、同時に、若しくは異なる時に投与するための別個の組成物として提供されてもよい。
【０１５５】
一実施形態では、本明細書に開示の化合物は、効果を高めるために、抗血管新生剤と共に投与するか、或いは、他の抗血管新生剤と一緒にして、他の細胞毒性剤と共に投与することができる。他の実施形態では、固形癌の治療に使用するとき、この化合物及び組成物は、ＩＬ−１２、レチノイド、インターフェロン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、カプトプリル、抗新生物薬（アルファインターフェロン等）、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート及びプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びデキサメタゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ロイコボリンを補助的に併用）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンジオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリサルフェート、血小板因子４、アンジオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、Ｔｅｃｈｇａｌａｎ、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧ及び放射線（これらに限定されない）、から選択された薬剤と共に投与することができる。他の実施形態では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、有糸分裂阻害剤、例えば、細胞骨格要素を標的とする薬剤（例えば、微小管調節剤（タキサン剤（タキソール、パクリタキセル、タキソテール、ドセタキセル等））、ポドフィロトキシン、又はビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン））；代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、プリンアナログ（ペントスタチン等）、メトトレキサート）；アルキル化剤又はナイトロジェンマスタード（例えば、ニトロソウレア、シクロホスファミド、イソファミド）；ＤＮＡを標的とする薬剤（例えば、アントラサイクリン剤（アドリアマイシン、ドキソルビシン、ファモルビシン、エピルビシン））；トポイソメラーゼを標的とする薬剤（例えば、エトポシド）；ホルモン、及びホルモン作用薬若しくは拮抗薬（例えば、エストロゲン、抗エストロゲン剤（タモキシフェン及び関連化合物）、アンドロゲン、フルタミド、リュープロレリン、ゴセレリン、シプロテロン、オクトレオチド）；腫瘍細胞における情報伝達を標的とする薬剤（例えば、抗体誘導体（ハーセプチン等））；アルキル化剤（例えば、白金剤（シスプラチン、カルボンプラチン、オキサリプラチン、パラプラチン）、ニトロソウレア）；腫瘍の転移に影響を及ぼす可能性がある薬剤（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤）；遺伝子治療薬及びアンチセンス薬；抗体治療薬；海洋由来の他の生物活性化合物（特に、ダイデムニン（アプリジン等））；ステロイドアナログ（特に、デキサメタゾン）；抗炎症薬（例えば、非ステロイド剤（アセトアミノフェン、イブプロフェン等）、又はステロイド及びその誘導体（特に、デキサメタゾン）；制吐剤（例えば、５ＨＴ−３阻害剤（グラニセトロン、オンダンセトロン等）、並びにステロイド及びそれらの誘導体（特に、デキサメタゾン））、と組み合わせて、又はその代わりに投与することができる。更に他の実施形態では、本発明の化合物及び組成物は、下記表３に開示した化学療法剤と組み合わせて、又はその代わりに使用することができる。
【０１５６】
【表３−１】
2007530705.tif 000014
【０１５７】
【表３−２】
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【０１５８】
【表３−３】
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【０１５９】
【表３−４】
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【０１６０】
【表３−５】
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【０１６１】
ある実施形態では、本発明の化合物を、インターフェロン（ＩＦＮ）と組み合わせて使用することができる。適切なインターフェロンとしては、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグ化インターフェロンアルファ（インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ等）、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンタウ、インターフェロンオメガ、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）（ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社製）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）（Ｖｉｒａｇｅｎ社製）、ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）（Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ社製）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ社製のオメガインターフェロン、Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の経口インターフェロン、並びにＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社製のインターフェロンガンマ、インターフェロンタウ及びインターフェロンガンマ−１ｂが挙げられる。
【０１６２】
一実施形態では、薬剤耐性癌（例えば、多剤耐性癌）の治療のために、他の化学療法剤（例えば、本明細書又は表３に記載のもの）と組み合わせて、又はその代わりに、本明細書に開示のＴＣＮ、ＴＣＮ−Ｐ又は関連化合物を使用することができる。薬剤耐性癌には、大腸、骨、腎臓、副腎、膵臓及び肝臓の癌、並びに当業者に公知の、又は本明細書に記載の任意の他の癌が含まれる。一実施形態では、化学療法剤はＰ−糖タンパク質阻害剤である。ある実施形態では、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、ベラパミル、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、タモキシフェン、カルモジュリン拮抗薬、デクスベラパミル、デクスニグルジピン、バルスポダル（ｖａｌｓｐｏｄａｒ）（ＰＳＣ８３３）、ビリコダル（ｂｉｒｉｃｏｄａｒ）（ＶＸ−７１０）、タリキダル（ｔａｒｉｑｕｉｄａｒ）（ＸＲ９５７６）、ゾスキダル（ｚｏｓｕｑｕｉｄａｒ）（ＬＹ３３５９７９）、ラニキダル（ｌａｎｉｑｕｉｄａｒ）（Ｒ１０１９３３）及び／又はＯＮＴ−０９３（これらに限定されない）、から選択される。
【０１６３】
〔Ｖ．医薬組成物〕
本明細書で提供される化合物を投与するのに適した医薬担体としては、特定の投与様式に適切であることが当業者に公知の任意の担体を用いることができる。上記化合物は、組成物中の唯一の薬効成分として処方しても、また、他の薬効成分と共に処方してもよい。
【０１６４】
本明細書に開示の化合物を含む組成物は、経口、直腸、経鼻、局所（口腔、舌下等）、膣内又は非経口（皮下、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、眼内、気管内、大槽内、腹腔内、硬膜外、等）投与に適したものとすることができる。
【０１６５】
上記組成物は、好都合にもユニット製剤で提供することができ、また、従来の医薬品技術によって調製することができる。このような技術は、１種又は複数の本発明の組成物と、１種又は複数の医薬担体又は賦形剤と、を混合するステップを有する。
【０１６６】
上記組成物は、適切な医薬製剤（例えば、経口投与用の液剤、懸濁剤、錠剤、分散可能な錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放性製剤若しくはエリキシール、又は、非経口投与用の滅菌溶液若しくは懸濁液、並びに経皮パッチ製剤及び乾燥粉末吸入剤）に調製することができる。一実施形態では、前述の化合物は、当分野で周知の技術及び方法を用いて医薬組成物に調製される（例えば、Ａｎｓｅｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、４版、１９８５、１２６を参照されたい）。
【０１６７】
上記組成物では、有効濃度の、１種又は複数の化合物又はその薬学的に許容される誘導体を、１種又は複数の適切な医薬担体と混合されていてもよい。上記化合物は、製剤化の前に、対応する塩、エステル、エノールエーテル若しくはエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和化合物、水和物又はプロドラッグへ誘導体化することができる。組成物中の化合物の有効濃度とは、投与した場合に、標的疾患若しくは障害の１種又は複数の症状を治療、予防又は軽減する量を送達するのに有効な濃度である。一実施形態では、上記組成物は単回投与用に調製する。組成物を調製するには、治療対象の疾患の緩和、予防、又は１種又は複数の症状の軽減に有効な濃度となるように、一定の質量分率の化合物を、選択した担体に溶解、懸濁、分散、又は混合する。
【０１６８】
経口投与に適した組成物は、例えば、所定量の１種又は複数の組成物を含有するユニット（例えば、錠剤、カプレット、丸剤若しくは糖衣カプセル、又はカシェ剤）；粉末若しくは顆粒；水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液；又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型エマルジョンとして、或いはボーラスとして提供される。
【０１６９】
例えば、薬剤として投与可能な液体組成物の調製は、上記活性化合物、及び医薬補助剤（必要な場合）を、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノール等の担体中で溶解、分散、又は混合して、溶液又は懸濁液を得ることによって行うことができる。投与する医薬組成物はまた、必要に応じて、少量の非毒性補助物質（湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、香料等）（例えば、酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等）を含有してもよい。このような製剤を調製する方法は当業者には公知又は明らかであるが、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１５版、１９７５を参照されたい。
【０１７０】
口内に局所投与するために適した本発明の組成物としては、例えば、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）（風味付けした基剤（通常、スクロース、及びアラビアゴム若しくはトラガカント）中に成分を含有する）、香錠（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）（不活性基剤（例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴム）中に、１種又は複数の本発明の組成物を含有する）、及び口内洗浄剤（適切な液体担体中に、１種又は複数の本発明の組成物を含有する。）が挙げられる。
【０１７１】
錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、１種若しくは複数の次の成分、又は同様の性質の化合物：結合剤、潤滑剤、希釈剤、流動促進剤、崩壊剤、着色剤、甘味剤、香料、湿潤剤、催吐コーティング及びフィルムコーティング、を含有することができる。結合剤としては、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、グルコース溶液、アラビアゴム漿、ゼラチン溶液、糖蜜、ポリビニルピロリドン、ポビドン、クロスポビドン、スクロース及びデンプン糊が挙げられる。潤滑剤としては、例えば、タルク、デンプン、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム、ライカポジウム及びステアリン酸が挙げられる。希釈剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、カオリン、塩、マンニトール及びリン酸二カルシウムが挙げられる。流動促進剤としては、例えば、コロイド状二酸化ケイ素が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、クロスカルメローゼナトリウム、グリコール酸デンプンナトリウム、アルギニン酸、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、ベントナイト、メチルセルロース、寒天及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。着色剤としては、例えば、認可水溶性ＦＤ及びＣ色素、それらの混合物、並びに、水酸化アルミニウムに吸着させた水不溶性ＦＤ及びＣ色素、のいずれかが挙げられる。甘味剤としては、例えば、人工甘味料（スクロース、ラクトース、マンニトール、サッカリン等）、及び噴霧乾燥香料が挙げられる。香料としては、例えば、果実等の植物から抽出された天然香料、及び、快い感覚をもたらす合成化合物ブレンド（ペパーミント、サリチル酸メチル等）が挙げられる。湿潤剤としては、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコール及びポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。催吐コーティングとしては、脂肪酸、脂肪、ワックス、シェラック、アンモニア化シェラック及び酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。フィルムコーティングとしては、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール４０００及び酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。
【０１７２】
皮膚への局所投与に適した組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ジェル及びペーストとして提供される。この場合、１種又は複数の組成物は、薬学的に許容される担体中に含有された状態で投与される。
【０１７３】
直腸投与用組成物は、例えば、適切な基剤（カカオ脂、サリチル酸塩等）を備えた座剤として提供される。
【０１７４】
鼻内投与に適した組成物としては、担体が固体の場合、粒径が例えば２０〜５００ミクロンの粗粉末が挙げられる。このような微粉末は、嗅ぎタバコを吸う要領で（すなわち、鼻に接近させた粉末容器から、鼻内径路を通して迅速に吸入することによって）投与する。担体が液体（例えば、鼻内噴霧剤又は点鼻剤）の場合、１種又は複数の組成物を水性又は油性溶液に混合して、鼻内径路に吸入又は噴霧することができる。
【０１７５】
膣内投与に適した組成物は、例えば、１種又は複数の組成物及び適切な担体を含有する、膣座薬、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡状物質又は噴霧製剤として提供される。
【０１７６】
非経口投与に適した組成物としては、水性及び非水性滅菌注射液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び非投与者の血液で製剤を等張にさせる溶質を含有してもよい）、並びに水性及び非水性滅菌懸濁液（懸濁剤及び増粘剤を含有してもよい。）が挙げられる。この組成物は、ユニットドーズ又はマルチドーズ容器（例えば、密封のアンプル、バイアル）中に入れておくことができる。また、凍結乾燥状態で保存することができ、使用する場合は、使用直前に、滅菌液体担体（例えば、注射用水）を添加するだけでよい。用時調製注射液及び懸濁液は、上述のような滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【０１７７】
上記組成物を製造するために、経腸又は非経口投与に適した有機又は無機の、固体又は液体の医薬担体媒体を使用することができる。ゼラチン、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性油脂、ガム、ポリアルキレングリコール、水、又は他の公知の担体はすべて、担体媒体として適切である。
【０１７８】
上記組成物は、１種又は複数の薬学的に許容される担体媒体及び／又は賦形剤と組み合わせて、活性成分として使用することができる。本明細書では、「薬学的に許容される担体媒体」には、所望の剤形に適した、あらゆる担体、溶媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散若しくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤、補助剤、ビヒクル、送達系、崩壊剤、吸着剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、甘味剤等が含まれる。
【０１７９】
更に、上記組成物は、薬学的に許容される賦形剤、及び、生分解性ポリマー等の徐放性マトリックス（必要な場合）と組み合わせて、治療組成物としてもよい。「薬学的に許容される賦形剤」には、非毒性固形、半固形若しくは液状充填剤、希釈剤、封入物質の他、あらゆるタイプの製剤補助物が含まれる。
【０１８０】
しかし、上記組成物の１日当たりの全用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることを理解されたい。どのような宿主であっても、特定の宿主に固有の治療有効用量レベルは、例えば、治療対象の障害及びその障害の重症度、使用する特定の組成物の活性、使用する特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食事状態、投与時間、投与経路、使用する特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用する特定の組成物と併用して、若しくは同時に使用する薬剤の他、医療分野で周知の他の要素を含む種々の要素に依存する。例えば、組成物の用量を、所望の治療効果を実現するのに必要な量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が実現するまで用量を徐々に増加させることは、当業者の技術の範囲内の技術である。
【０１８１】
組成物は、投与の簡便性及び薬剤の均一性の点で、ユニット製剤に調製されることが好ましい。本明細書では、「ユニット製剤」とは、治療する宿主に適した、物理的に区別された組成物のユニットのことである。各々の製剤は、それ自体で、又は選択された医薬担体媒体と一緒になって、所望の治療効果を生じるように計算された組成物量を含有するのがよい。
【０１８２】
好ましいユニット製剤は、投与成分の１日当たりの用量（ドーズ）若しくはユニット、サブドーズ、又は適切な割合のその一部、を含有するものである。例えば、１日当たりの約１〜５ｍｇの本明細書に開示の化合物は、マウスの固形腫瘍の量を減少させることができる。
【０１８３】
用量は、体重、年齢、表面積、代謝、組織分布、吸収速度、排泄速度等の宿主の要素に依存する。一実施形態では、本明細書に開示の化合物を１日当たり約０．５〜７グラム、ヒトに投与する。場合によっては、この化合物を１日当たり約１〜４グラム、ヒトに投与する。ある実施形態では、０．００１〜５ｍｇ／日をヒトに投与する。治療有効用量レベルは、前述の多くの要素に依存する。更に、組成物の用量を比較的低いレベルで開始し、所望の効果が実現するまで用量を徐々に増加させることは、当業者の技術の範囲内の技術である。
【０１８４】
本明細書に開示の化合物を含む組成物は、酵素的な、又は酸ベースの加水分解又は溶解によって分解可能な物質（通常はポリマー）で形成された徐放性マトリックスと共に使用することができる。一旦体内に取り込まれると、このマトリックスは酵素及び体液の作用を受ける。徐放性マトリックスは、例えば、リポソーム、ポリ乳酸（ポリ乳酸）、ポリグリコール酸（グリコール酸のポリマー）、ポリ乳酸コ−グリコール酸（乳酸及びグリコール酸のコポリマー）、無水重合体、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン等）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、シリコーン等の生体適合性物質から選択される。好ましい生分解性マトリックスは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリ乳酸コ−グリコール酸（乳酸及びグリコール酸のコポリマー）のいずれかのマトリックスである。
【０１８５】
本発明の化合物はまた、リポソームの形態で投与することができる。当分野で公知のように、リポソームは、一般にリン脂質等の脂質物質から得られる。リポソームは、水性媒体に分散した単層又は多層の水和液晶によって形成される。リポソームを形成することができ、生理学的に許容される、代謝可能な非毒性の液体であれば、いかなるものでも使用することができる。上記リポソームは、１種又は複数の本発明の組成物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤等を含有してもよい。脂質としては、天然及び合成のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）が挙げられる。リポソームの形成方法は当分野で公知である。
【０１８６】
上記化合物は、吸入等による投与のために、エアロゾルとして調製することができる。これらの呼吸器投与用製剤は、噴霧器用のエアロゾル若しくは溶液の形態で、又は吸入用微細粉末として、単独で、若しくは不活性担体（ラクトース等）と組み合わせて使用することができる。このような場合、製剤の粒子の直径は、一実施形態では５０ミクロン未満であり、別の一実施形態では１０ミクロン未満である。
【０１８７】
本明細書に開示の化合物を含む組成物は、前述の疾患の治療のための他の組成物及び／又は方法と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍は、１種又は複数の本発明の組成物と組み合わせて、従来のように手術、放射線又は化学療法で治療することができる。そして、１種又は複数の本発明の組成物は、微小転移の休止状態を延長し、残存する原発腫瘍の増殖を安定化、阻害又は低減させるために、引き続き患者に投与することができる。
【０１８８】
他の実施形態：
本発明の医薬組成物は、薬剤として有用な組成物を調製する公知の方法に従って調製することができる。製剤については、当業者に周知で、容易に入手可能な複数の文献に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｔｉｎ  ＥＷ（１９９５）Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９版）には、本発明と併用可能な製剤が記載されている。投与に適した製剤としては、水性及び非水性滅菌注射液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び非投与者の血液で製剤を等張にさせる溶質を含有してもよい）、並びに水性及び非水性滅菌懸濁液（懸濁剤及び増粘剤を含有してもよい。）が挙げられる。この製剤は、ユニットドーズ又はマルチドーズ容器（例えば、密封のアンプル、バイアル）中に入れておくことができる。また、凍結乾燥状態で保存することができ、使用する場合は、使用直前に、滅菌液体担体（例えば、注射用水）を添加するだけでよい。用時調製注射液及び懸濁液は、上述のような滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。本発明の製剤は、特に記載した上述の成分に加えて、当該製剤の種類に応じて当分野で通常用いられる他の薬剤を含有してもよい。
【０１８９】
例えば、癌細胞を阻害する本発明の方法は、例えば、化学療法、放射線療法、Ｒａｓ癌遺伝子シグナル伝達を選択的に阻害する治療、又は癌を治療、管理する当業者に公知の他の任意の治療（例えば、抗癌剤の投与）、のうちの少なくとも１種の治療方法と有利に組み合わせることができる。
【０１９０】
ＡＰＩ−２（トリシリビン）は、塩として投与してもよい。薬学的に許容される塩としては、生理学的に許容される陰イオンを形成する、酸で形成された有機酸添加塩（例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、アルファ−ケトグルタル酸塩及びアルファ−グリセロリン酸塩）が挙げられる。また、適切な無機塩（塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩等）を形成してもよい。
【０１９１】
薬学的に許容される塩は、当分野で周知の標準的方法、例えば、十分な塩基性を有する化合物（アミン等）と、生理学的に許容される陰イオンをもたらす適切な酸と、を反応させることによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩若しくはリチウム塩）、又はアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）を形成してもよい。
【０１９２】
本発明の化合物は、選択された投与経路、すなわち、経口的又は非経口的な静脈内、筋肉内、局所若しくは皮下経路に適合する種々の形態で、医薬組成物として調製し、ヒト患者、患畜等の被治療者に投与することができる。
【０１９３】
従って、本発明の化合物は、例えば、経口的に、薬学的に許容されるビヒクル（すなわち、担体）（例えば、不活性希釈剤、吸収可能な食用担体）と組み合わせて全身投与することができる。これらは、硬ゼラチンカプセル又は軟ゼラチンカプセルに封入しても、錠剤に圧縮しても、また、患者が摂取する食品に直接取り込ませてもよい。経口的な治療投与のために、上記化合物は１種又は複数の賦形剤と組み合わせてもよく、例えば、消化可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル、エリキシール、懸濁剤、シロップ、カシェ剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び製剤は、活性剤を少なくとも０．１％含有するのがよい。組成物及び製剤の割合は変化させることができるのはいうまでもないが、所与のユニット製剤の約２〜約６０質量％の範囲であると好都合である。このような治療上有用な組成物における活性化合物の量は、有効用量レベルが得られるような量である。
【０１９４】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル等はまた、結合剤（トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン等）、賦形剤（リン酸二カルシウム等）、崩壊剤（トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）及び甘味剤（スクロース、フルクトース、ラクトース、アスパルテーム等）を含有してもよい。或いは、香料（ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料等）を添加してもよい。ユニット製剤がカプセルの場合、上記のような材料に加えて、植物油、ポリエチレングリコール等の液体担体を含有させることができる。他の種々の材料を、コーティング用に、或いは、固形ユニット製剤の物理的形態を変更するために添加することができる。例えば、錠剤、丸剤又はカプセルを、ゼラチン、ワックス、シェラック又は糖等でコーティングすることができる。シロップ又はエリキシールは、本発明の化合物の他、甘味剤としてスクロース又はフルクトースを、保存剤としてメチル及びプロピルパラベンを含有してもよく、また、色素及び香料（チェリー、オレンジ香料等）を含有してもよい。いうまでもないが、いずれのユニット製剤の調製に使用するいかなる材料も、薬学的に許容され、且つ、当該使用量を使用した場合に実質的に非毒性でなければならない。更に、本発明の化合物は、徐放性の製剤及び装置に組み込んでもよい。
【０１９５】
活性剤（すなわち、ＡＰＩ−２又はその薬学的に許容される塩）はまた、注入又は注射によって静脈内又は腹腔内に投与することができる。活性剤又はその塩の溶液は、水（必要に応じて、非毒性界面活性剤と混合した水）中で調製できる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン及びそれらの混合物、並びに油中で調製することができる。これらの製剤は、通常の保存及び使用の条件下では、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
【０１９６】
注射又は注入に適した医薬剤形としては、無菌で注射若しくは注入可能な溶液若しくは分散液の用時調製に適合し、活性成分を含有する無菌水性溶液若しくは分散液又は無菌粉末（これらは、リポソームに封入されていてもよい。）が挙げられる。いずれの場合においても、最終的な剤形は、製造及び保存条件下で、無菌且つ安定な液体でなければならない。液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、それらの適切な混合物、等の溶媒又は液体分散媒体である。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成、必要な粒径の維持（分散液の場合）、又は界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等）によって防止することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖、緩衝液、塩化ナトリウム）を含有することが好ましい。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）を組成物中に使用することによって実現することができる。
【０１９７】
注射可能な無菌溶液は、上述の他の種々の成分を含有する適切な溶媒中に必要量の本発明の化合物を組み入れ、更に、必要に応じて、フィルター滅菌することによって調製する。注射可能な無菌溶液の調製に用いる無菌粉末の場合、調製方法としては真空乾燥法及び凍結乾燥法が好ましく、これらの方法により、既に滅菌濾過された溶液中に存在する活性成分及び他の所望の成分の粉末が得られる。
【０１９８】
本発明の化合物は、局所投与の場合は、純粋な形態で、すなわち、液体状態で適用してもよい。しかし、一般には、皮膚に許容される担体（固体でも液体でもよい。）と組み合わせて、組成物又は製剤として皮膚に投与するのが望ましい。
【０１９９】
有用な固形担体としては、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等の超微粒子固形物が挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコール若しくはグリコール、又は水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、これらの担体には、必要に応じて非毒性界面活性剤を用いて、本発明の化合物を有効なレベルで溶解又は分散させることができる。目的の用途に応じて特性を最適化するために、香水等の補助剤、及び他の抗菌剤を添加することができる。得られた液体組成物は、吸収パッドから適用したり、包帯等に染み込ませたり、又はポンプ型若しくはエアロゾル噴霧器を用いて罹患領域に噴霧したりすることができる。
【０２００】
使用者の皮膚に直接適用するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、変性セルロース、変性鉱物等の増粘剤を、液体担体と共に用いて、ペースト、ジェル、軟膏、石けん等を得てもよい。本発明の化合物を皮膚に輸送するのに使用可能な有用な皮膚用組成物の例は、Ｊａｃｑｕｅｔ他（米国特許第４６０８３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４９９２４７８号）、Ｓｍｉｔｈ他（米国特許第４５５９１５７号）及びＷｏｌｔｚｍａｎ（米国特許第４８２０５０８号）に開示されている。
【０２０１】
本発明の医薬組成物の有用な投与量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの活性と、動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの活性と、を比較することによって決定することができる。マウス及び他の動物における有効な投与量をヒトに当てはめる方法は当分野で公知であり、例えば、米国特許第４９３８９４９号を参照されたい。
【０２０２】
一実施形態（限定的なものではない。）では、ローション等の液体組成物における活性剤の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ％、又は約０．５〜１０ｗｔ％である。一実施形態では、ジェル、粉末等の半固形又は固形組成物における濃度は、約０．１〜５ｗｔ％、好ましくは約０．５〜２５ｗｔ％である。一実施形態では、注射、注入又は摂取の場合の１回の投与量は、一般に５〜１５００ｍｇである。すなわち、成人では、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇのレベルになるように、１日に１〜３回投与することができる。本発明における投与量は、１日当たり７．５〜４５ｍｇ（これに限定されない。）であるが、個体の体重で適切に調節した量を経口投与することができる。
【０２０３】
このように、本発明は、本明細書に記載のＡＰＩ−２又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物を包含する。一定量のＡＰＩ−２又はその薬学的に許容される塩を含有する、経口、局所又は非経口投与に適合した医薬組成物は、本発明の好ましい実施形態をなす。本発明の場合、被治療者、特にヒトに投与する用量は、合理的期間で患者の治療的応答が実現するのに十分な量であるのがよい。当業者であれば、投与量は、動物の状態、動物の体重、癌の重症度及びステージ等の種々の要素に依存することは理解するであろう。
【０２０４】
適切な用量とは、腫瘍組織において所望の応答を達成することが知られている活性剤濃度をもたらす用量である。投与量として好ましいのは、制御できない副作用なしに、癌細胞の増殖を最大限に阻害する量である。ＡＰＩ−２（又は薬学的に許容されるその塩）の投与は、持続的に行っても、一定の間隔を置いて行ってもよい（当業者は、いずれにするかを決定することができる）。
【０２０５】
癌細胞の増殖を阻害する開示の方法から利益を得る哺乳動物種としては、例えば、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル等の霊長類；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナム種ポットベリーピッグ、ウサギ、フェレット等の家畜（例えば、ペット）；ウシ、水牛、野牛、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜；一般に動物園で見られる外来種の動物（例えば、クマ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ヌー、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、フクロネズミ、アライグマ、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、カワウソ、ネズミイルカ、イルカ及びクジラ）、が挙げられる。本明細書では、「患者」及び「被治療者」という用語は交換可能であり、ヒト及び非ヒト哺乳動物種を包含するものとする。同様に、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、上記のような哺乳動物種の細胞に対して実施することができる。
【０２０６】
本発明の方法を用いた治療を必要とする患者は、医学の専門家に公知の標準的方法によって同定することができる。
【０２０７】
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定するためのものではない。
【実施例】
【０２０８】
〔実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング〕
（材料）
細胞株及びＮＣＩ多様性セット（ＮＣＩ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ）：
この研究で使用した細胞株はすべて、ＡＴＣＣから、又は文献（Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１４：２７９３〜２８０１、１９９７；Ｗｅｓｔ，Ｋ．Ａ．他、Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．、５：２３４〜２４８、２００２；Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｋ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７３１８〜７３２４、２００１）に記載の方法で購入した。ＮＣＩ構造多様性セット（ＮＣＩ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ）は、ＮＣＩの保管薬剤である約１４００００種の化合物から選択された１９９２種の化合物のライブラリーである。これらの多様性セット化合物の選択、構造及び活性に関する詳細データは、ＮＣＩ開発途上治療プログラムのウェブサイトで見ることができる。
【０２０９】
Ａｋｔ形質転換細胞増殖阻害のスクリーニング：
ＡＫＴ２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はＬＸＳＮベクター形質移入ＮＩＨ３Ｔ３対照細胞（Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１４：２７９３〜２８０１、１９９７）を９６ウェル組織培養プレートに播種した。ＮＣＩ多様性セット化合物５μＭで処理後、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で検出した。ＡＫＴ２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖は阻害するが、ＬＸＳＮ形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞は阻害しない化合物を、Ａｋｔ阻害剤候補と見なし、更に分析を行った。
【０２１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質キナーゼ、細胞生存及びアポトーシスアッセイ：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼは、文献（例えば、Ｊｉａｎｇ，Ｋ．、Ｃｏｐｐｏｌａ他、Ｍｔｇ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：１３９〜１４８、２０００）に記載の方法で実施した。細胞生存はＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で測定した。アポトーシスは、アネキシンＶで検出され、文献（Ｊｉａｎｇ，Ｋ．、  Ｃｏｐｐｏｌａ他、Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：１３９〜１４８、２０００）に記載の方法で実施した。組換えＡｋｔ及びＰＤＫ１は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０２１１】
（結果）
Ａｋｔ情報伝達経路の小分子阻害剤、ＡＰＩ−２の同定：
Ａｋｔの頻繁な変異がヒト癌で検出されているが、Ａｋｔ経路を破壊することによってアポトーシスが誘導され、腫瘍増殖が阻害される（Ｊｅｔｚｔ，Ａ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３：６９７〜７０６、２００３）。従って、Ａｋｔは、新規癌治療薬の開発において魅力的な分子標的と考えられている。Ａｋｔの小分子阻害剤を同定するために、「材料及び方法」に記載の方法で、ＮＣＩ（ＮＣＩ多様性セット）から得た１９９２種の化合物の化学ライブラリーについて、ＡＫＴ２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害できるが、空ベクターＬＸＳＮ形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖は阻害できない薬剤であるかどうかを評価した。繰り返し実験により、３２種の化合物がＡＫＴ２形質転換細胞の増殖のみを阻害することが示された。これらの中で最も能力の高い化合物、ＡＰＩ−２（ＮＣＩ識別子、ＮＳＣ１５４０２０）は、５０ｎＭの濃度で細胞増殖を抑制した。図１Ａは、トリシリビンとしても知られるＡＰＩ−２の化学構造を示す（Ｓｃｈｗｅｉｎｓｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３０；２５２１〜２５２６、１９８１）。ＡＰＩ−２が、形質転換されていない親細胞よりも、ＡＫＴ−２で形質転換された細胞を選択的に阻害するという事実は、ＡＰＩ−２がＡＫＴ２キナーゼの阻害剤であるかどうかの決定を促した。この目的を達成するために、抗ＡＫＴ２抗体を用いて、ＡＫＴ２をＡＫＴ−２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降させ、その後、ＡＰＩ−２で処理した。ＡＫＴ２免疫沈降を抗リン酸Ａｋｔ抗体で免疫ブロットした。図１Ｂに示されるように、ＡＰＩ−２は、ＡＫＴ２の完全な活性化に必要なスレオニン３０９及びセリン４７４の両方におけるＡＫＴ二リン酸化を著しく阻害した（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９）。Ａｋｔの３個のアイソフォームは相同性が高く、構造が類似していることから、これらのキナーゼ活性に対するＡＰＩ−２の作用を評価した。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−Ａｋｔ１、ＨＡ−ＡＫＴ２及びＨＡ−ＡＫＴ３で形質移入し、一晩血清欠乏にして、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）刺激の前に６０分間、ＡＰＩ−２で処理した。３種の実験により、ＡＰＩ−２がＥＧＦ誘導性キナーゼ活性、及びＡｋｔ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３のリン酸化を抑制することが示された（図１Ｃ）。しかし、常時活性型組換えＡＫＴ−２（Ｍｙｒ−ＡＫＴ２）のキナーゼ活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ反応ではＡＰＩ−２によって阻害されなかった（図１Ｄ）。これにより、ＡＰＩ−２がＡｋｔをｉｎ  ｖｉｔｒｏでは直接阻害しないこと、及び、ＡＰＩ−２はＡＴＰの競合相手として機能しないだけでなく、Ａｋｔの活性部位に結合する基質の競合相手としても機能しないことが示唆された。
【０２１２】
ＡＰＴ−２は、Ａｋｔの公知の上流の活性化因子を阻害しない：
Ａｋｔは、細胞外刺激、及び細胞内シグナル分子（活性型Ｒａｓ、Ｓｒｃ等）によって、ＰＩ３Ｋに依存して活性化されることが報告されている。従って、ＡｋｔのＡＰＩ−２による阻害は、Ａｋｔの上流分子を標的とした結果である可能性がある。ＰＩ３Ｋ及びＰＤＫ１は、Ａｋｔの上流制御因子を標的とする（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９）ことから、ＡＰＩ−２がＰＩ３Ｋ及び／又はＰＤＫ１を阻害するかどうかを調べた。ＨＥＫ２９３細胞を血清欠乏にした後、ＥＧＦ刺激の前に３０分間、ＡＰＩ−２、又はＰＩ３阻害剤ウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）で処理した。ＰＩ３Ｋを抗ｐ１１０α抗体で免疫沈降させた。この免疫沈降物について、基質としてＰＩ−４−Ｐを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＩ３Ｋキナーゼアッセイを行った。図２Ａに示されるように、ＥＧＦ誘導性ＰＩ３Ｋ活性はウォルトマンニンでは阻害されたが、ＡＰＩ−２では阻害されなかった。ＰＤＫ１に対するＡＰＩ−２の作用を評価するために、組換えＰＤＫ１がＡＫＴ２ペプチドのスレオニン３０９リン酸化を促進するアッセイを、ホスファチジルイノシトール含有脂質小胞の存在下で行った。図２Ｂに示されるように、このアッセイは、対照ＰＤＫ１阻害剤スタウロスポリンによって潜在的に阻害された（ＩＣ５０＝５ｎＭ）。対照的に、ＡＰＩ−２は、試験した最高濃度（５．１μＭ）でも、２１％の阻害しか示さなかった。これらのデータは、ＡＰＩ−２がＰＤＫ１の潜在的阻害剤ではないことを示している。ＰＤＫ１活性化に対するＡＰＩ−２の効果を更に評価するために、それ自体によってリン酸化され、活性に必須である残基、セリン２４１におけるＰＤＫ１の自己リン酸化レベルを評価し（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９）、その後、ＨＥＫ２９３細胞をＡＰＩ−２で処理した。３回の実験により、ＰＤＫ１のリン酸化レベルはＡＰＩ−２によって阻害されないことが示された（図２Ｂ）。しかし、予測通り、ＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニンは、ＥＧＦで刺激されたＰＤＫ１を阻害した（図２Ｂ）。
【０２１３】
ＡＰＩ−２は、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＥＲＫ情報伝達経路よりもＡｋｔ情報伝達経路に対して選択性が高い：
Ａｋｔは、ＡＧＣ（ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣ）キナーゼファミリーに属する。このファミリーにはまた、ＰＫＡ、ＰＫＣ、血清及びグルココルチコイド誘導性キナーゼ（ＳＧＫ）、ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、マイトジェン及びストレス活性化タンパク質キナーゼ及びＰＫＣ関連キナーゼが含まれる。ＡＧＣキナーゼファミリーの中で、ＰＫＡ、ＰＫＣ及びＳＧＫのタンパク質構造は、他のメンバーに比べて、Ａｋｔキナーゼにより近い。そこで、次に、これらの３種のキナーゼの酵素活性に対するＡＰＩ−２の作用を調べた。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡタグＰＫＡ、ＰＫＣ又はＳＧＫで形質移入した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ及び免疫ブロッティング分析により、ＰＫＡ及びＰＫＣαのキナーゼ活性が、それぞれＰＫＡＩ及びＲｏ  ３１−８２２０（ＰＫＣ阻害剤）によって阻害されるが、ＡＰＩ−２はそれらの活性に何ら影響を及ぼさないことが示された（図２Ｃ及び２Ｅ）。更に、血清誘導性ＳＧＫキナーゼ活性は、ウォルトマンニンによって減弱するが、ＡＰＩ−２によっては減弱しなかった（図２Ｄ）。更に、ＡＰＩ−２が他の癌遺伝子生存経路に影響を及ぼすかどうかを決定した。市販の抗リン酸抗体によるウェスタンブロッティング分析により、Ｓｔａｔ３、ＪＮＫ、ｐ３８及びＥｒｋ１／２のリン酸化レベルは、ＡＰＩ−２処理の影響を受けないことが明らかになった（図２Ｆ）。これらのデータは、ＡＰＩ−２が特異的にＡｋｔ情報伝達経路を阻害することを示している。
【０２１４】
ＡＰＩ−２はＡｋｔ過剰発現／活性化ヒト癌細胞株において細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する：
ＡＰＩ−２がＡｋｔ経路を選択的に阻害することができるという事実は、ＡＰＩ−２が、Ａｋｔが異常に発現／活性化している腫瘍細胞の増殖を選択的に阻害し、且つ／又はそのアポトーシスを誘導することを示唆する。ヒト悪性腫瘍におけるＡｋｔの活性化は、通常、Ａｋｔの過剰発現又はＰＴＥＮ変異から生じるので、ＡＰＩ−２は、ＡＫＴの過剰発現（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ８、ＰＡＮＣ１及びＡＫＴ２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３）又はＰＴＥＮ遺伝子の変異（ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）によって常時活性型Ａｋｔを発現する細胞、及びそれを発現しない細胞（ＯＶＣＡＲ５、ＤＵ−１４５、Ｔ４７Ｄ、ＣＯＬＯ３５７及びＬＸＳＮ−ＮＩＨ３Ｔ３）、並びにＩＧＦ−１によって活性化されてＡＫｔを活性化するが、ＩＧＦ−１による増殖刺激には応答しない黒色腫細胞、を治療するのに用いられる（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｋ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７３１８〜７３２４、２００１）。免疫ブロッティング分析により、Ａｋｔを強く発現しているか、又はＩＧＦ−１刺激に応答している細胞においてのみ、Ａｋｔのリン酸化レベルがＡＰＩ−２によって阻害されることが示された（図３Ａ）。すなわち、ＡＰＩ−２は、Ａｋｔを過剰発現／活性化している細胞では、Ａｋｔのレベルが低い細胞に比べてはるかに強い程度で細胞増殖を阻害した。図３Ｂに示されるように、ＡＰＩ−２処理は、Ａｋｔを過剰発現／活性化している細胞株、すなわち、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡ８、ＰＡＮＣ１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＷＭ３５、において細胞増殖を約５０〜６０％阻害したが、Ａｋｔの発現レベルが低いか、又はＩＧＦ−１による増殖刺激に応答しないＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８、ＣＯＬＯ３５７、Ｔ４７Ｄ及びＷＭ８５２細胞では約１０〜２０％しか阻害しなかった。更に、ＡＰＩ−２は、アポトーシスを８倍（ＯＶＣＡＲ３）、６倍（ＯＶＣＡＲ８）、６倍（ＰＡＮＣ１）及び３倍（ＡＫＴ２−ＮＩＨ３Ｔ３）誘導した。ＯＶＣＡＲ５、ＣＯＬＯ３５７及びＬＸＳＮ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＡＰＩ−２処理及びビヒクル（ＤＭＳＯ）処理の間で、アポトーシスの有意な差が認められなかった。このように、ＡＰＩ−２は、異常なＡｋｔを発現する細胞において選択的に、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する。
【０２１５】
ＡＰＩ−２はＡｋｔの下流標的を阻害する：
Ａｋｔは、いくつかのタンパク質のリン酸化によってその細胞作用を発揮することが示されている（Ｄａｔａ，Ｓ．Ｒ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２９２７、１９９９）。フォークヘッドタンパク質ファミリーのメンバー（ＦＫＨＲ、ＡＦＸ及びＦＫＨＲＬ１）、ツベリン／ＴＳＣ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１、ｐ２７ｋｉｐ１、ＭＤＭ２、Ｂａｄ、ＡＳＫ１、ＩＫＫα等を含む２０個を上回るタンパク質がＡｋｔ基質として同定されている。次に、ＡＰＩ−２がＡｋｔの下流標的を阻害するかどうかを調べた。抗リン酸−ツベリン、抗リン酸−Ｂａｄ、抗リン酸−ＡＦＸ、及び抗リン酸−ＧＳＫ−３β抗体が市販されているので、Ａｋｔによって誘導されるそれらのリン酸化に対するＡＰＩ−２の作用を測定した。ＡＰＩ−２（１□Ｍ）で処理した後、ＯＶＡＲ３細胞を溶解し、個々の抗リン酸抗体で免疫ブロットした。図４Ａは、ツベリンの安定化及びアップレギュレーションをもたらすツベリンのリン酸化レベルがＡＰＩ−２によってかなり阻害されることを示している（Ｄａｎ，Ｈ．Ｃ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：３５３６４〜３５３７０、２００２）。Ｂａｄ、ＧＳＫ−３β及びＡＦＸのリン酸化レベルは、ＡＰＩ−２によって部分的に低減した。これらのデータは、ＡＰＩ−２が、その下流標的のリン酸化を阻害することによって細胞死及び細胞増殖停止を誘導することを示唆している。Ａｋｔ下流標的のＡＰＩ−２による様々な程度の阻害は、これらの標的のリン酸化部位が他のキナーゼによっても制御されているという事実（例えば、Ｂａｄセリン１３６は、Ａｋｔの他に、ＰＡＫ１によってもリン酸化される。）によるものである可能性がある（Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，Ａ．他、Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：４５３〜４６１、２０００）。
【０２１６】
〔実施例２：ヌードマウス腫瘍異種移植モデルにおける抗腫瘍活性〕
腫瘍細胞を収集し、ＰＢＳに懸濁して、文献（Ｓｕｎ，Ｊ．、Ｂｌａｓｋｏｖｉｃ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５９：４９１９〜４９２６、１９９９）に記載の方法で、８週齢雌ヌードマウスの左右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（２×１０６細胞／脇腹）。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達した時点で、動物を無作為化して、薬剤のビヒクル０．２ｍｌを毎日、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。対照動物にはＤＭＳＯ（２０％）ビヒクルを与え、他方、処置動物には、２０％ＤＭＳＯに溶解したＡＰＩ−２（１ｍｇ／ｋｇ／日）を注射した。
【０２１７】
ＡＰＩ−２は、Ａｋｔを過剰発現するヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害する：
ヒト卵巣癌及び膵臓癌では、しばしばＡＫＴ１及びＡＫＴ２の過剰発現／活性化及び／又は増幅が観察されている（Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｑ．、及びＮｉｃｏｓｉａ，Ｓ．Ｖ．、ＡＫＴ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｉｎ  Ｓｃｈｗａｂ  Ｄ、Ｅｄｉｔｏｒ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１、ｐｐ３５〜７）。ＰＩ３Ｋ、ＨＳＰ７０、Ｓｒｃ及びファルネシルトラスフェラーゼの阻害剤でＡｋｔ経路を阻害すると、細胞増殖停止及びアポトーシス誘導が引き起こされる（Ｓｏｌｉｔ，Ｄ．Ｂ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３：２１３９〜２１４４、２００３；Ｘｕ，Ｗ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３：７７７７〜７７８４、２００３）。最近の研究で、Ａｋｔが増加している異種移植片の腫瘍増殖もまた、ドミナントネガティブＡＫｔのアデノウイルスを腫瘍内に注射することによって著しく阻害されることが示された（Ｊｅｔｚｔ，Ａ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３：６９７〜７０６、２００３）。ＡＰＩ−２は、Ａｋｔレベルの高い癌細胞においてのみＡｋｔ情報伝達を阻害し、アポトーシス及び細胞増殖停止を誘導する（図３）ので、Ａｋｔレベルの高い腫瘍の増殖は、ヌードマウスにおいて、Ａｋｔレベルの低い腫瘍の増殖と比較して、ＡＰＩ−２に対して感受性が高いはずである。この目的のために、ｓ．ｃ．Ａｋｔ過剰発現細胞（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ８及びＰＡＮＣ−１）をマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植し、Ａｋｔの発現レベルが低い細胞株（ＯＶＣＡＲ５及びＣＯＬＯ３５７）を左脇腹に移植した。この腫瘍の平均の大きさが約１００〜１５０ｍｍ３に達した時点で、動物を無作為化し、ビヒクル又はＡＰＩ−２（１ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。図４Ｂに示されるように、ビヒクルで処理したＯＶＣＡＲ−５及びＣＯＬＯ３５７腫瘍は、腫瘍移植後４９日目に約８００〜１０００ｍｍ３に増殖した。ビヒクル対照で処理したＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ８及びＰＡＮＣ１腫瘍は、腫瘍移植後４９日目に約７００〜９００ｍｍ３に増殖した。ＡＰＩ−２は、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＡＲ８及びＰＡＮＣ１の腫瘍増殖を、それぞれ９０％、８８％、及び８０％阻害した。対照的に、ＡＰＩ−２は、ヌードマウスにおいて、ＯＶＣＡＲ５及びＣＯＬＯ３５７細胞の増殖にはほとんど影響を与えなかった（図４Ｂ〜４Ｄ、データは示さず）。１ｍｇ／ｋｇ／日の用量では、ＡＰＩ−２は、マウスの血中グルコース濃度、体重、活動性及び食餌摂取に影響を及ぼさなかった。処理された腫瘍試料では、Ａｋｔ総含有量が変化することなく、Ａｋｔ活性がＡＰＩ−２によって阻害された（図４Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＡＰＩ−２が、Ａｋｔレベルの高い腫瘍の増殖を選択的に阻害することを示している。
【０２１８】
〔実施例３：ＴＣＮは野生型Ａｋｔキナーゼ活性を直接阻害する〕
ＡＰＩ−２（ＴＣＮ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＫ１によって誘導される野生型Ａｋｔキナーゼ活性を直接阻害することができる（図１）。この結果は、ＡＰＩ−２が直接的なＡｋｔ阻害剤であること、並びに、基礎となるメカニズムが、ＡｋｔのＰＨドメイン及び／又はスレオニン３０８に対するＡＰＩ−２の結合である可能性があること、を支持するものである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−Ｐ３（ＰＩＰ３）、ＡＰＩ−２、及び基質であるヒストンＨ２Ｂを含有するキナーゼ緩衝液中において、ＰＤＫ１及びＡｋｔの組換え体を用いて実施した。３０分間インキュベートした後、反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、フィルムに曝露した。
【０２１９】
〔実施例４：ＴＣＮは癌耐性細胞において有効である〕
ＴＣＮ（ＡＰＩ−２）の作用を、シスプラチン、パクリタキセル及びタモキシフェン耐性のＡ２７０ＣＰ、Ｃ−１３、ＯＶＣＡＲ４３３及びＭＣＦ／ＴＡＭ細胞で試験した。これらの細胞において、ＡＰＩ−２は、シスプラチン、パクリタキセル及びタモキシフェン耐性を克服した。
【０２２０】
本発明を、好ましい実施形態を参照して説明した。本発明の改変及び変更は、上述の本発明の詳細な説明から当業者には明らかであろう。これらの改変及び変更はすべて、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】ＮＣＩ多様性セットからの、Ａｋｔ阻害剤候補であるＡＰＩ−２（トリシリビン）の同定を示す図である。Ａは、ＡＰＩ−２（トリシリビン）の化学構造を示す。Ｂは、ＡＰＩ−２がＡＫＴ２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＡＫＴ２のリン酸化レベルを阻害することを示す。野生型ＡＫＴ２形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＡＰＩ−２（１□Ｍ）で所定時間処理し、抗リン酸−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体及び抗リン酸−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体で免疫ブロッティング分析を行った（上及び中央のパネル）。下のパネルは、全ＡＫＴ２の発現を示す。Ｃは、ＡＰＩ−２がＡｋｔの３種のアイソフォームを阻害することを示す。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−Ａｋｔ１、ＨＡ−ＡＫＴ２及びＨＡ−ＡＫＴ３で形質移入し、ＥＧＦ刺激の前にＡＰＩ−２（１μＭ）又はウォルトマンニン（１５μＭ）で処理し、この細胞を溶解して、抗ＨＡ抗体で免疫沈降させた。この免疫沈降物について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ（上部）、及び抗リン酸−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体による免疫ブロッティング分析（下部）を行った。中央のパネルは、形質移入したＡｋｔ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３の発現を示す。Ｄは、ＡＰＩ−２がｉｎ  ｖｉｖｏでＡｋｔを阻害しなかったことを示す。常時活性型ＡＫＴ２組換えタンパク質の、ＡＰＩ−２（１μＭ）含有キナーゼ緩衝液中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ（レーン３）。
【図２】ＡＰＩ−２が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、及びＡＧＣキナーゼファミリー中の密接に関連するメンバーを阻害しないことを示す図である。Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＩ３Ｋキナーゼアッセイを示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ＥＧＦ刺激の前に３０分間、血清欠乏状態の下、ＡＩＰ−２（１μＭ）又はウォルトマンニン（１５μＭ）で処理した。細胞は溶解し、抗ｐ１１０α抗体で免疫沈降させた。この免疫沈降物について、基質としてＰＩ−４−Ｐを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＤＫ１活性化（上のパネル）に対するＡＰＩ−２の作用を示す図であり、黒丸はＡＰＩ−２による阻害を示す。白丸は、強力なＰＤＫ１阻害剤（ＩＣ５０＝５ｎＭ）である陽性対照スタウロスポリンによる阻害を示す。下のパネルは、Ｍｙｃ−ＰＤＫ１で形質移入し、ＥＧＦ刺激の前にウォルトマンニン又はＡＰＩ−２で処理したＨＥＫ２９３細胞の免疫ブロッティング分析である。免疫ブロットは、所定の抗体で検出した。Ｃは、ＡＰＩ−２、又は非選択的ＰＫＣ阻害剤Ｒｏ３１−８２２０で処理した後の、抗リン酸−ＰＫＣα−Ｔ６３８抗体（上）及び抗全ＰＫＣα抗体（下）のリン酸化レベルの免疫ブロッティング分析を示す。Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＧＫキナーゼアッセイを示す。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−ＳＧＫで形質移入し、ＥＧＦ処理前にＡＰＩ−２又はウォルトマンニンで処理した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼは、基質としてＭＢＰを用いて、ＨＡ−ＳＧＫ免疫沈降物を用いて実施した（上）。下のパネルは、形質移入されたＨＡ−ＳＧＫの発現を示す。Ｅは、ＰＫＡキナーゼアッセイの結果を示す。免疫精製ＰＫＡを、所定の阻害剤（ＡＰＩ−２又はＰＫＡＩ）及び基質Ｋｅｍｐｔｉｄｅを含有するＡＤＢ緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ社製）中でインキュベートした。キナーゼ活性を定量した。Ｆは、ウェスタンブロットを示す。ＯＶＦＡＲ３細胞をＡＰＩ−２で所定時間処理した。細胞ライセートを所定の抗リン酸抗体（パネル１〜４）及び抗アクチン抗体（下）で免疫ブロッティングした。
【図３Ａ】ＡＰＩ−２がＡｋｔ活性及び細胞増殖を阻害し、Ａｋｔが増加したヒト癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す図である。ＡＰＩ−２で処理した後のウェスタンブロットであり、Ａｋｔのリン酸化レベルは、所定のヒト癌細胞株において抗リン酸−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体で検出した。このブロットを抗全Ａｋｔ抗体（下のパネル）で再検査した。
【図３Ｂ】ＡＰＩ−２がＡｋｔ活性及び細胞増殖を阻害し、Ａｋｔが増加したヒト癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す図である。細胞増殖アッセイが示されている。図に示した細胞株は、異なる用量のＡＰＩ−２で２４時間及び４８時間処理し、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で分析した。
【図３Ｃ】ＡＰＩ−２がＡｋｔ活性及び細胞増殖を阻害し、Ａｋｔが増加したヒト癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す図である。アポトーシス分析が示されている。細胞をＡＰＩ−２で処理し、アネキシンＶ及びＰＩで染色し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【図４】ＡＰＩ−２がＡｋｔの下流標的を阻害し、マウス異種移植片中の、Ａｋｔが上昇した癌細胞株において抗腫瘍活性を示すことを示す図である。Ａは、ＡＰＩ−２がツベリン、Ｂａｄ、ＡＦＸ及びＧＳＫ−３βのＡＫＴリン酸化を阻害することを示す。ＯＶＡＲ３細胞をＡＰＩ−２で処理した後、溶解し、所定の抗体で免疫ブロットした。Ｂは、ＡＰＩ−２が腫瘍増殖を阻害することを示す。ヌードマウスの左側にはＡｋｔレベルの低い腫瘍細胞を、右側にＡｋｔレベルの高い腫瘍細胞を皮下注射した。この腫瘍の平均の大きさが約１００〜１５０ｍｍ３に達した時点で、動物をビヒクル又はＡＰＩ−２（１ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで処理した。各測定値は、１０個の腫瘍の平均を表す。Ｃは、ＡＰＩ−２又はビヒクル（対照）で処理したＯＶＣＡＲ３（右）及びＯＶＣＡＲ５（左）異種移植片を有するマウスの例を示す。Ｄは、実験終了時の腫瘍の大きさ（下）及び質量（上）の例を示す。Ｅでは、ＡＰＩ−２処理（Ｔ３及びＴ４）及び未処理（Ｔ１及びＴ２）のＯＶＣＡＲ−３由来の腫瘍において、抗リン酸−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体（上）及び抗ＡＫＴ２抗体（下）を用いて、腫瘍ライセートの免疫ブロット分析を実施した。
【図５】ＡＰＩ−２（トリシリビン）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｋｔを阻害することを示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−Ｐ３（ＰＩＰ３）、ＡＰＩ−２、及び基質であるヒストンＨ２Ｂを含有するキナーゼ緩衝液中において、ＰＤＫ１及びＡｋｔの組換え体を用いて実施した。３０分間インキュベートした後、反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、フィルムに曝露した。
【図６ａ】ヒトＡｋｔ１のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図６ｂ】ヒトＡｋｔ１のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図６ｃ】ヒトＡｋｔ１のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図７ａ】ヒトＡｋｔ２のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図７ｂ】ヒトＡｋｔ２のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図７ｃ】ヒトＡｋｔ２のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図７ｄ】ヒトＡｋｔ２のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図８ａ】ヒトＡｋｔ３のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図８ｂ】ヒトＡｋｔ３のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図８ｃ】ヒトＡｋｔ３のｍＲＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図（制限酵素部位も示されている。）の一部である。
【図１】
2007530705.tif 000029
【図２】
2007530705.tif 000030
【図３Ａ】
2007530705.tif 000031
【図３Ｂ】
2007530705.tif 000032
【図３Ｃ】
2007530705.tif 000033
【図４】
2007530705.tif 000034
【図５】
2007530705.tif 000035
【図６ａ】
2007530705.tif 000036
【図６ｂ】
2007530705.tif 000037
【図６ｃ】
2007530705.tif 000038
【図７ａ】
2007530705.tif 000039
【図７ｂ】
2007530705.tif 000040
【図７ｃ】
2007530705.tif 000041
【図７ｄ】
2007530705.tif 000042
【図８ａ】
2007530705.tif 000043
【図８ｂ】
2007530705.tif 000044
【図８ｃ】
2007530705.tif 000045
【配列表】
2007530705000001.app
【国際調査報告】
2007530705.tif 000046