(57)【要約】  転写因子STAT6を標的とし、肺細胞におけるSTAT6 mRNA、STAT6タンパク質およびSTAT6の機能の発現を抑制するsiRNA分子が開示されている。喘息や鼻炎のような気道のアレルギー性疾患を治療する際にSTAT6特異性siRNA分子を利用することが開示されている。【選択図】 図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
STAT6核酸またはタンパク質の発現を抑制または沈黙化させる単離された二本鎖の短鎖干渉型リボ核酸(short interfering ribonucleic acid: siRNA)分子。
【請求項２】
前記siRNAのセンス鎖が隣接ヌクレオチド鎖を含んでいて、前記センス鎖の塩基配列が、ヒト、マウスまたはラットのSTAT6ヌクレオチド配列(配列番号10、12または14)の一つによってエンコードされるmRNA配列に含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列の塩基配列に対して少なくとも70%の配列同一性を備えている、請求項１に記載されたとおりのsiRBA。
【請求項３】
前記mRNA配列に含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列が、配列番号5-8のいずれか一つのRNA配列、または配列番号15-18のいずれか一つによってエンコードされるRNA配列である、請求項２に記載のsiRNA。
【請求項４】
siRNAのアンチセンス鎖が一個の隣接ヌクレオチド配列を含んでいて、そのアンチセンス鎖の塩基配列が、ヒト、マウスまたはラットのSTAT6ヌクレオチド配列(配列番号10、12または14)によってエンコードされるRNA配列の一つに含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列の塩基配列に対して少なくとも70%の配列相補性を備えている、請求項１、２または３のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項５】
前記RNA配列に含まれる対応する長さの前記隣接ヌクレオチド配列が配列番号１５−１８のいずれか一つによってエンコードされる、請求項４に記載のsiRNA配列。
【請求項６】
前記配列同一性または相補性の程度が少なくとも80%である、請求項２から５のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項７】
前記配列同一性または相補性の程度が少なくとも90%である、請求項２から５のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項８】
前記配列同一性または相補性の程度が少なくとも95%である、請求項２から５のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項９】
前記配列同一性または相補性の程度が少なくとも97%である、請求項２から５のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項１０】
前記アンチ−センス鎖が前記センス鎖に相補的である、請求項１から９のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項１１】
前記センス鎖およびアンチセンス鎖が同じ長さである、請求項１から１０のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項１２】
それぞれの鎖が10個から30個の範囲内のヌクレオチドの長さである、請求項１から１１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項１３】
それぞれの鎖が15個から25個の範囲内のヌクレオチドの長さである、請求項１から１１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項１４】
それぞれの鎖が18個から23個の範囲内のヌクレオチドの長さである、請求項１から１１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項１５】
それぞれの鎖が19個、20個、21個、または22個のヌクレオチドの長さである、請求項１から１１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖が、高い、もしくは非常に高い緊縮条件で配列番号10、12または14の一つによってエンコードされるmRNAにハイブリダイズする、前記の請求項のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項１７】
前記センス鎖が、高い、もしくは非常に高い緊縮条件で配列番号10、12または14の一つにハイブリダイズする、前記の請求項のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項１８】
前記センス鎖またはアンチセンス鎖が、高い、もしくは非常に高い緊縮条件で配列番号1-4の一つの対応する他の鎖にハイブリダイズする、前記の請求項のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項１９】
siRNAのそれぞれの鎖が、配列番号1-4のいずれか一つの対応する鎖に対して少なくとも70%の配列同一性を備えている、前記の請求項のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項２０】
前記アンチセンス鎖が、STAT6タンパク質についてコードしているRNA配列の一部分またはフラグメントに前記siRNAの完全長を比較して少なくとも70%の配列相補性を備えている、前記の請求項のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項２１】
前記センス鎖が、STAT6のmRNAの部分またはフラグメントに前記siRNAの完全長を比較して少なくとも70%の配列同一性を備えている、前記の請求項のいずれか一項に記載のsiRNA。
【請求項２２】
前記RNA配列またはmRNAは、配列番号10、12もしくは14の一つによってエンコードされるRNAもしくはｍRNAである請求項２０または２１に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項２３】
配列番号1を含む、前記請求項のいずれか一項に記載されたsiRNA。
【請求項２４】
配列番号2を含む、前記請求項のいずれか一項に記載されたsiRNA。
【請求項２５】
配列番号3を含む、前記請求項のいずれか一項に記載されたsiRNA。
【請求項２６】
配列番号4を含む、前記請求項のいずれか一項に記載されたsiRNA。
【請求項２７】
配列番号1のsiRNA。
【請求項２８】
配列番号2のsiRNA。
【請求項２９】
配列番号3のsiRNA。
【請求項３０】
配列番号4のsiRNA。
【請求項３１】
前記siRNAはSTAT6タンパク質の機能を抑制する、請求項１から３０のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項３２】
アレルギー性疾患または非−アレルギー性疾患の治療で使用できる、請求項１から３０のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA。
【請求項３３】
請求項１から３１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNAを含む薬学的組成物。
【請求項３４】
前記薬学的組成物は、経口投与または鼻腔内投与用に配合される、請求項３３に記載されたとおりの薬学的組成物。
【請求項３５】
さらに薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む、請求項３３または３４に記載されたとおりの薬学的組成物。
【請求項３６】
前記担体が親油性担体またはビヒクルである請求項３５に記載されたとおりの薬学的組成物。
【請求項３７】
アレルギー性または非−アレルギー性疾患の治療用医薬品の製造における、請求項１から３１のいずれか一項に記載されたsiRNAの利用。
【請求項３８】
前記医薬品が、経口投与、吸入投与または鼻腔内投与のために配合されている請求項３７に記載された利用。
【請求項３９】
アレルギー性または非−アレルギー性疾患の治療を必要としている患者に請求項１から３６のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNAまたは薬学用組成物を投与する行程を含む、そのような患者のアレルギー性または非−アレルギー性疾患を治療する方法。
【請求項４０】
前記siRNAが、前記患者に投与される薬学的組成物の一部として配合される請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記薬学的組成物は、経口、吸入または鼻腔内への投与用に配合される請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記アレルギー性または非−アレルギー性疾患が、喘息、非−アトピー性の喘息および／または鼻炎から選択される気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患である、請求項３２から４１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNA、薬学的組成物、利用または方法。
【請求項４３】
インビトロで細胞を請求項１から３１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNAと接触させる行程を含む、インビトロでSTAT mRNAおよび／またはタンパク質の細胞発現を抑制するための方法。
【請求項４４】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項４３に記載された方法。
【請求項４５】
前記細胞がヒト細胞である請求項４３に記載された方法。
【請求項４６】
前記細胞が気道から得られるか、または気道から得られる細胞の子孫である請求項４３から４５のいずれか一項に記載された方法。
【請求項４７】
インビトロでSTAT6タンパク質もしくは核酸の発現または機能が、抑制またはサイレント化されている細胞。
【請求項４８】
前記細胞が請求項１から３１のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNAを含む請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項４７または４８に記載された細胞。
【請求項５０】
前記細胞がヒト細胞である請求項４７から４９のいずれか一項に記載された細胞。
【請求項５１】
気道由来または気道由来の細胞の子孫である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患の治療のための物質および方法に関し、さらに限定的ではないが特定すると、細胞STAT6のリボ核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を抑制するのに使用できる核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
気道のアレルギー性疾患を治療することについての負担およびコストは増加しつつある。そのためコスト−効率が良く、有効性がより高い、即ち抑制的な治療法が望まれている。
【０００３】
そのようなアレルギー性疾患の一つは喘息であり、喘息での炎症性の病状は、STAT6(signal transducer and activator of transcription 6：転写のシグナルトランスデューサおよびアクチベータ６)として知られている一般的な細胞内の転写因子を利用するサイトカインによって支配的に仲介されている。STAT6はアレルギーの発生、粘膜／気道の炎症、および喘息にとって決定的である(STAT6−欠乏動物は、正常のマウスで喘息を誘導する方法で刺激しても喘息にはならない。)。
【０００４】
特異的かつ効果的にSTAT6を標的とする薬物は細胞内の環境で残存して機能するものであって、それを開発するのは困難であることが明らかになっている。例えば抗−STAT6ペプチドが研究された13）が、それはSTAT6タンパク質の発現をほんの限られたかなり一過性の時間(分)だけしか抑制できないことがわかっている。それが一過性の効果であることは、内在性の細胞プロテアーゼ類によるペプチド分解に起因すると考えられる。
【０００５】
インビボでSTAT6の発現を抑制しようとする試みはあるが、アンチセンスDNA技術15）はうまくいかないことがわかった。このアプローチは一連の問題を欠点として持っている。例えば高濃度のアンチセンスDNAでもSTAT6発現についてほんの少しの阻害が得られるが、その効果は一過性であってアンチセンス分子は対象物を崩壊させてしまい、それが適切な分子内の位置に向かうことは困難である。幾分かの役立つ効果を生じさせるのに必要な高濃度のアンチセンスDNAは、抗原性の性質を示すアンチセンスDNAを引き起こすことがよくあり、免疫応答を生じさせる可能性がある。さらにSTAT6に向かうアンチセンスDNAを用いて処理したマウスはアレルギー症状の改善を示さず、脾腫、即ち毒性の副作用を発生させる。
【０００６】
しがたって今日では、STAT6は治療上有用な方法で効果的に阻害したり抑制したりするのが非常に難しい分子であることが証明されている。いくらかの試行はあるものの、非−特異的な副作用を引き起こすことなく効果的にSTAT6を標的とする首尾の良好な薬物または組成物は開発されていない。
【０００７】
STAT6
STAT6は、転写のシグナルトランスデューサおよびアクチベータ６(signal transducer and activator of transcription 6)である。無傷細胞で機能を持つためにはSTAT6はリン酸化されていなくてはならない。ヒトSTAT6についての配列データは、受け入れ番号NP_003144(NM_003153)およびU16031のもとでNCBI(www. ncbi. nlm. nih. gov)から入手できる。
【０００８】
RNA干渉(RNAi)
RNAiは、遺伝子コードを翻訳して機能性タンパク質にするために細胞が用いるプリカーサー分子であるメッセンジャーRNA(mRNA)を標的とする小さな二重鎖RNA分子(dsRNA)を用いる。RNAiの天然のプロセスでは、dsRNAは長さが21ヌクレオチドの短鎖−干渉型RNA(siRNA)の二重鎖に酵素的に切断される。その後siRNA二重鎖のアンチセンス鎖が、タンパク質の細胞質複合体に組み入れられる(RNA−誘導性サイレンス複合体、即ちRISC)。アンチセンスsiRBA鎖を含むRISC複合体はまた、アンチセンス鎖に相補的な配列を持つmRNAも結合しており−アンチセンスsiRNA鎖とセンスmRNA分子の間で相補的塩基−対の形成が可能になっている。続いてmRNA分子はRISCと関連する酵素(RNase)によって特異的に開裂し、結果的に特定の遺伝子がサイレント化する3,4）。遺伝子のサイレント化(即ち、mRNAの開裂)を発生させるためには、アンチセンスRNA(即ち、siRNA)がRISCに組み入れられるようにする必要がある。これは、全ての核を持つ細胞で起こる自然でかつ非常に効率のよいプロセスであり、その開始点は輸送可能な要素(例えばウイルス)からの保護作用を仲介する場合、また遺伝子発現を正常に調節する場合に存在すると考えられる。したがってそれは、細胞にアンチ−センスDNA分子を導入する人工的なプロセス、即ちmRNAのターゲット化が、むき出しのままのアンチ−センスDNAがそのRNA標的物に簡単な塩基−対を形成することにより起こるというプロセスとは異なっている。
【０００９】
DNAアンチ−センスオリゴヌクレオチドのような別の遺伝子−標的化戦略に勝るRNAiの利点としては、その相対的な特異性、その効率の良さ、および全ての細胞に固有の天然のRNAi経路にsiRNA処理を送り込めるという事実が挙げられる。
【００１０】
しかしながら遺伝子の抑制またはサイレント化におけるRNAiの好首尾は予測できないものであって、実際はその成果は非常に変化に富んでおり、標的となる細胞型における遺伝子のターゲット(即ちmRNA)の受け入れ能力や、RNAiの有効性といったさまざまな因子に依存して変わるようである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明者らはSTAT6のsiRNA(短鎖干渉型RNA)を設計し、そしてインビトロでテストした。このアプローチの効力が内因的に予測不可能であるとはいうものの、肺組織に存在している細胞型において、STAT6 mRNAの発現が特異的でかつ高い効率で阻害された結果が得られており、このことはこれらの分子がインビボでSTAT6の効果的かつ特異的な標的化をもたらしていることを示している。
【００１２】
ここに示された証拠は、STAT6のsiRNAがカチオン性脂質−仲介型トランスファーによって細胞に移行された場合、それは実際に機能してSTAT6 mRNAを効率的に阻害すること、そしてヒト細胞では明らかな副作用を生じないでタンパク質の発現を阻害することを証明している。
【００１３】
ヒトの気道から入手した標本細胞にこれらのsiRNAを標的化することによって発明者らは、鼻炎や喘息のような気道のアレルギー性疾患に対する新規な治療上の処置法としての基礎を提供した。非−アトピー性喘息もSTAT6 siRNA治療法に対して敏感に反応するようである。特定するとSTAT6 siRNAを、リポソームのような供給系を経たり、あるいは標準的なネブライザー装置によって噴霧状にしたりして気道にある局所的な細胞を治療するために用いることができる。
【００１４】
siRNAが特異的かつ効率的に標的のSTAT6に供給された場合、それらはSTAT6遺伝子の発現を＞90%までも減少させる。さらにSTAT6−特異的siRNAを用いて処理した細胞は検出できるほどのSTAT6タンパク質の発現を示さず、またそれらは、インターロイキン-4を用いた生理的刺激に反応した場合のSTAT6タンパク質のリン酸化を示さない。言い換えると、特有のSTAT6 siRNAを用いて処理された細胞は、喘息およびアレルギー性鼻炎などの気道のアレルギー性免疫応答および関連する疾患の発生に重苦しく関わっている細胞内経路を通る信号伝達の能力を喪失している。
【００１５】
発明者らはまた、STAT6標的型siRNAは低濃度(ナノモル、nM)のsiRNAで肺細胞においてSTAT6発現の持続的な阻害作用をもたらすことを明らかにした。そのうえ機能的STAT6タンパク質の阻害は、インターフェロンの応答を誘導することなく達成できる。この応答は、長い(＞30bp)二重鎖RNAが哺乳動物細胞に導入された場合によくみられるものである。即ちインターフェロンの応答はdsRNAを係留するウイルスに応答して自然界で起こり、それは結果的に細胞の遺伝子発現の非−特異的抑制をもたらす。標的細胞グループではそのような応答がみられないという事実は、発明者らによって採用されたsiRNAアプローチの効力の別の指標である。
【００１６】
発明者らは、STAT6標的型siRNAが非常に低濃度で能力があって、非−毒性であり、STAT6機能のインヒビターを提供することを示した。
【００１７】
気道のアレルギー性炎症の治療は、STAT6 siRNAを供給するためのネブライザーまたは鼻のスプレーを利用することによって達成できる。これらの供給方法は、慣用の治療法ですでに標準化されている。さらに喘息または鼻炎に対しては、siRNAの供給は、エアロゾルまたは液体状態で商業的に入手できる配合剤(例えば、スマルティクルズ(Smarticles)(商標)、Novosom AG, Germany)を利用できる。
【００１８】
その最も総体的には本発明は、核酸、特にsiRNAに関し、また核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を抑制したりサイレント化したりする場合のそれらの利用に関する。
【００１９】
さらに特定すると本発明は、STAT6のリボ核酸(例えば、mRNA)、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現の抑制に関する。リボ核酸、特定するとsiRNAの形態になっているリボ核酸は、STAT6タンパク質についてコードしている少なくとも一種のRNA配列の全て、もしくは部分、もしくはフラグメントにそれらの長さに沿った実質的な配列同一性または相補性を持つように提供される。そのようなRNA配列は、STAT6タンパク質(例えば、アミノ酸配列の配列番号9、11または13の一つによってエンコードされるタンパク質)をエンコードするRNA配列(例えば、mRNA)、または配列番号10、12もしくは14の一つによってエンコードされるRNA配列の一つを含んでいるであろう。
【００２０】
気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患である例えば喘息または鼻炎を治療する場合、および気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患を治療するための医薬品を製造する場合、それとともに気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患を治療する方法において、そのようなリボ核酸(siRNA)の利用法が提供される。
【００２１】
発明者らは、インビトロでSTAT6のリボ核酸(mRNA)またはタンパク質の発現を抑制したり、サイレント化したりする方法、さらにSTAT6リボ核酸またはタンパク質の発現が抑制されていて、そのような方法によって入手可能な細胞も提供した。
【００２２】
本発明の一観点では、リボ核酸、特定すると二重鎖のsiRNAが、個体の気道のアレルギー性疾患を治療する際に利用すべく提供される。
【００２３】
リボ核酸(siRNA)は好ましくはSTAT6リボ核酸(mRNA)、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を抑制する。好ましくはSTAT6のリボ核酸(mRNA)またはタンパク質の機能も抑制される。
【００２４】
本発明にかかる核酸はDNAであってもよいしRNAであってもよく、また一本鎖であってもよいし二重鎖であってもよい。好ましくはその核酸はRNAであって、二本鎖である。
【００２５】
好ましい核酸には、配列番号1-8のいずれかの配列、またはその配列に相補的な配列を持つRNA分子、および配列番号1-8の一つまたはその相補的配列に少なくとも60%の配列同一性を持つ、より好ましくは少なくとも70、80、85、90、95％もしくは100％の配列同一性を持つ核酸が含まれる。これらの配列を含むRNAをエンコードするDNA分子も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
配列番号1-8のいずれかの配列、またはその配列に相補的な配列を持つRNA分子、配列番号1-8の一つまたはその相補的配列に少なくとも60%の配列同一性を持つ、より好ましくは少なくとも70、80、85、90、95％もしくは100％の配列同一性を持つ核酸、およびこれらの配列を含むRNAをエンコードするDNA分子を含む単離された核酸が、本発明の別の観点を形成する。
【００２７】
本発明のさらに別の観点では、述べられている核酸、例えば二重鎖のsiRNAは、気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患である例えば喘息や鼻炎を治療するための医薬品を製造するのに利用するために提供される。好ましくはこの治療法のメカニズムには、インビボでSTAT6リボ核酸(mRNA)および／またはタンパク質の発現を抑制することが含まれる。
【００２８】
本発明のさらに別の観点では、このような治療法を必要としている個体の気道にあるアレルギー性疾患を治療するための方法が提供される。この方法は、この明細書に記載されていて、これらの疾患の症状を治療するのに有効な一個またはそれ以上のリボ核酸、例えばsiRNAのある量を個体に投与する行程を含むであろう。
【００２９】
治療すべき個体は治療を必要としている患者であろう。患者は何らかの動物であってもよいし、ヒトであってもよい。患者は非−ヒトの哺乳動物(例えば、齧歯目由来のマウス、ラットまたは他の哺乳動物)であってもよいが、より好ましいのはヒトの患者である。患者は男性であっても女性であってもよい。
【００３０】
本発明の観点にかかる医薬品および薬学的組成物は、多くのルートで投与できるように、限定するわけでないが、非経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、経口、経口吸入、および鼻腔内のルートで投与できるように配合するとよい。医薬品および組成物は、液状または固体状の剤形で配合できる。液状の配合剤は、ヒトまたは動物の体内の選択された領域に注入して投与できるように配合することができる。液状の配合剤は、エアロゾルにして投与することが可能なように形成してもよい。
【００３１】
本発明の別の観点では、インビトロでSTAT6リボ核酸(mRNA)またはタンパク質の細胞内の発現を抑制したり、サイレント化したりするための方法が提供される。その方法は、この明細書に記載された核酸、例えばsiRNAのようなリボ核酸と、一個または複数の細胞とを接触させることによって、その核酸(例えばsiRNA)を細胞に入れる行程を含むであろう。一つの計画では核酸(例えばsiRNA)は担体と、例えば核酸が細胞膜を横切って通過するのを助けたり、および／または高めたりできる親油性の担体と複合化させるとよい。
【００３２】
したがって、STAT6リボ核酸(mRNA)またはタンパク質の発現が抑制またはサイレント化されている細胞が提供できる。
【００３３】
好適な細胞は、ヒト細胞から選択してもよいし、その他には非−ヒト細胞、好ましくはラット、マウスまたは他の齧歯動物由来の細胞(齧歯目に含まれる何らかの動物から得た細胞を含む)から選択してもよい。他の好ましい非−ヒト細胞は、例えばブタ、ヒツジ、非−ヒトの霊長類、もしくは他の非−ヒトの脊椎動物の生物体から得てもよいし、および／または非−ヒトの哺乳動物細胞であってもよい。
【００３４】
本発明のリボ核酸は、その核酸に添加して例えば親油性担体もしくはビヒクルなどの担体、またはアジュバントを含む薬学的組成物の一部として調製することができる。本発明の薬学的組成物および医薬品は、経口吸入投与または鼻腔内投与用として配合できるし、また、経口投与、静脈内投与または筋肉内投与用としても配合できる。
【００３５】
気道のアレルギーを治療するための好適な医薬品または治療薬としては、鼻腔および／口腔内への投与(好ましくは吸入によって)に好適なものが挙げられ、それは適当なネブライザーまたは吸入器を使用することで気道と肺に散布できる医薬品の噴霧飛沫を発生させるのに適した溶液として形成することができる。本発明にかかる組成物および医薬品は、気道に供給できるように、例えば鼻腔内で、吸入で、または経口で供給できるように配合するとよい。このような組成物および医薬品は適当なsiRNA分子を含んでおり、適切なトランスフェクション試薬9）を用いてもよいし、あるいは用いないくてもよい。
【００３６】
siRNA分子のインビボでの供給に適した数多くのトランスフェクション試薬が当業者には既知である。そのような試薬の例としては、リポソーム、またはネプフェクチン(Neophectin)(登録商標)(Neopharm)およびスマルティクレス(Smarticles)(登録商標)(Novosom AG)のような商標的に入手できる試薬などの、親油性の試薬が挙げられる。また肺用の界面活性剤を、肺にsiRNAを供給するために用いてもよい。肺用の界面活性剤は商業的に入手でき(例えば、クロサルフ(CuroSurf)(登録商標))、それらは臨床的にすでに確立されていて、人で使用する安全性についても確認されているという利点がある。
【００３７】
本発明の一観点によると、STAT6核酸(例えば、mRNAのようなSTAT6リボ核酸)またはタンパク質の発現を抑制またはサイレント化する、二重鎖の短鎖干渉型リボ核酸(siRNA)分子の単離物が得られる。
【００３８】
siRNAのセンス鎖は隣接ヌクレオチド配列を含んでいて、そのセンス鎖の塩基配列は、ヒト、マウスまたはラットのSTAT6ヌクレオチド配列(配列番号10、12または14)の一つによってエンコードされるmRNA配列に含まれる(即ち、その中に埋め込まれているか、またはその一部分、全て、もしくは一フラグメントである)対応する長さの隣接ヌクレオチド配列の塩基配列に少なくとも70％の配列同一性を持っている。そのmRNA配列に含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列は、配列番号5-8のいずれか一つのRNA配列であることもできるし、あるいは配列番号15-18のいずれか一つによってエンコードされるRNA配列であることもできる。
【００３９】
siRNAのアンチセンス鎖は隣接ヌクレオチド配列を含んでいて、そのアンチセンス鎖の塩基配列は、ヒト、マウスまたはラットのSTAT6ヌクレオチド配列(配列番号10、12または14)の一つによってエンコードされるmRNA配列に含まれる(即ち、その中に埋め込まれているか、またはその一部分、全て、もしくは一フラグメントである)対応する長さの隣接ヌクレオチド配列の塩基配列に少なくとも70％の配列相補性を持っている。そのmRNA配列に含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列は、配列番号5-8のいずれか一つのRNA配列であることもできるし、あるいは配列番号15-18のいずれか一つによってエンコードされるRNA配列であることもできる。
【００４０】
配列同一性または配列相補性の度合いを特定すると、少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％であろう。
【００４１】
アンチ−センス鎖は前記センス鎖に完全に相補的であってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。それぞれの鎖は、10個から30個の範囲のヌクレオチド、15個から25個の範囲のヌクレオチド、または18個から23個の範囲のヌクレオチドからなる長さを持っていることが可能である。より好ましくはそれぞれの鎖は、19個、20個、21個または22個のヌクレオチドのうちの一つであるような長さを持っているとよい。
【００４２】
本発明にかかるsiRNAは、高い、または非常に高い緊縮条件で配列番号10、12または14の一つによってエンコードされるmRNAにハイブリダイズするアンチセンス鎖を持っていることも可能である。
【００４３】
同様に本発明にかかるsiRNAは、高い、または非常に高い緊縮条件で配列番号10、12または14の一つにハイブリダイズするセンス鎖を持っていてもよい。
【００４４】
一計画では、そのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、高い、または非常に高い緊縮条件で配列番号1-4の一つの対応する別の鎖にハイブリダイズできる。
【００４５】
別の計画では、siRNAは配列番号1-4のいずれか一つの対応する鎖に対して少なくとも70％の配列同一性を持っているであろう。
【００４６】
さらに別の計画ではアンチセンス鎖が、STAT6タンパク質に対してコードしているRNA配列の一部分、即ちフラグメントに前記siRNAの完全長を比較して、少なくとも70％の配列相補性を持っているであろう。さらに別の計画ではセンス鎖が、STAT6のmRNAの一部分、即ちフラグメントに前記siRNAの完全長を比較して、少なくとも70％の配列同一性を持っているであろう。RNA(即ちmRNA)配列は、配列番号10、12または14のいずれか一つによってエンコードされる配列であることもできる。
【００４７】
本発明にかかるsiRNAは、配列番号1、2、3または4のいずれか一つを含んでいてもよいし、あるいはそれらの配列そのものであってもよい。
【００４８】
好ましいsiRNAは、STAT6 mRNAおよび／またはSTAT6 タンパク質の機能および／または発現を抑制するように作用する。本発明にかかるsiRNAは、気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患を治療する際に利用できるように提供できる。本発明にかかるsiRNAを含む薬学的組成物も提供される。好適な薬学的組成物は、経口投与用または鼻腔内投与用に配合することが可能であるし、また薬学的に許容できる希釈剤、担体またはアジュバントを含んでいてもよい。好適な担体の一つのタイプは親油性の担体またはビヒクルである。
【００４９】
本発明の別の観点では、本発明にかかるsiRNAは気道のアレルギー性疾患の治療のための医薬品の製造で、または非−アトピー性の喘息で使用できるように形成される。その医薬品は経口投与または鼻腔内投与用に調剤するとよい。
【００５０】
本発明のさらに別の観点では、そのような治療を必要としている患者のアレルギー性または非−アレルギー性疾患を治療する方法が提供されるのであるが、その方法は、本発明にかかるsiRNAまたは薬学的組成物をその患者に投与する行程を含んでいる。好適な薬学的組成物は経口投与または鼻腔内投与のために配合するとよい。
【００５１】
本発明の一部を構成するsiRNA、薬学的組成物、利用法、および治療方法は、気道のアレルギー性または非−アレルギー性疾患を治療する際に役立つであろう。そのアレルギー性疾患は喘息や鼻炎であろう。非−アレルギー性疾患としては、非−アトピー性の喘息を挙げることができる。
【００５２】
本発明のさらに別の観点では、インビトロで本発明にかかるsiRNAと細胞を接触させる行程が行われる、インビトロでSTAT6タンパク質の細胞発現を抑制するための方法が提供される。
【００５３】
本発明のさらに別の観点では、STAT6タンパク質もしくはリボ核酸の発現または機能が抑制され、即ちサイレント化されている細胞が、インビトロで提供される。その細胞は好ましくは、本発明にかかるsiRNAを含む。
【００５４】
適切な細胞は、哺乳動物の細胞(非−ヒトの哺乳動物細胞)またはヒトの細胞を含んでいてもよく、また気道から得られる細胞、もしくは気道から得られる細胞の子孫、例えば気管支の上皮細胞であることができる。気道の構成要素としては、気管、肺、気管支、または肺胞があろう。
【００５５】
本発明の核酸は、以下の二重鎖、または一本鎖のRNA配列のいずれかを含むことができる。
【表１】
2007523658.tif 000003
【００５６】
さらに本発明のリボ核酸は、非常に高い、または高い、または中程度の緊縮条件で配列番号1から8のいずれかとハイブリダイズするリボ核酸分子であることができる。
【００５７】
本発明のsiRNAは、この技術分野で入手可能なSTAT6のリボ核酸およびタンパク質に対する配列情報を利用して設計するとよい。図４から６は、ヒト、マウスおよびラットのSTAT6遺伝子に対するヌクレオチド配列情報を示している。そのようなヌクレオチド配列から、STAT6の発現および／または機能を特異的に標的とするsiRNA分子を設計することが可能である。例えば、配列番号10、12、または14の一つによってエンコードされるRNAのフラグメントに相補性のヌクレオチドの配列からなるアンチセンス鎖を持つsiRNA分子を設計して合成でき、そこではRNAフラグメントは、配列番号10、12、または14のいずれか一つからなるどれかの選択されたヌクレオチドで開始する対応するDNAフラグメントによってエンコードされるとよい。相補性のセンス鎖も容易に設計し、合成することによって、二重鎖のSTAT6  siRNAを提供できる。
【００５８】
本発明のsiRNAは、siRNAの部分として、siRNA分子の一方の鎖またはそれぞれの鎖の3'末端に二つの隣接するチミン塩基を任意で組み入れるように設計してもよい。これらのチミン塩基は好ましくは、反対の鎖の5'末端を「突出している」。これらのチミン塩基は好ましくは、siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖が基づいている天然のDNA鎖またはRNA鎖の一部(またはそれらによってエンコードされる)である。またそれらは、siRNAを合成する際に慎重に導入すると良い。
【００５９】
本発明のsiRNAはある程度の長さであればよいが、好ましい核酸は小さく、ヌクレオチドが少なくとも10個であって、かつヌクレオチドが50個以上にはならないような鎖長であるとよい。特に好適なsiRNAは、10個から30個の範囲内のヌクレオチドからなる鎖長であり、そしてさらに好ましくは15から25個の範囲内のヌクレオチドからなる鎖長である。選択されたsiRNAは、長さが15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個または25個のうちのいずれか一つのヌクレオチドからなる鎖長である。いわゆる21個のヌクレオチドからなる鎖長の二重鎖siRNAとは、二重らせんのそれぞれの鎖の長さが21個のヌクレオチドからなっているという意味である。二重鎖siRNAのそれぞれの鎖が同じ長さであると好ましいであろうが、これは絶対というわけではなく、それぞれの鎖が別個の決まった長さであってもよい。
【００６０】
このように、上記のとおりに選択された特定の長さを持つSTAT6特異性のsiRNA分子は、配列番号10、12または14のいずれか一つによってエンコードされるRNA分子の選択された一部分またはフラグメントに対して特定の度合いの相補性を持つアンチセンス鎖を備えているように調製することができる。アンチセンス鎖は、配列番号10、12または14の一つによってエンコードされるRNAの選択された一部分またはフラグメントに対して実質的な配列相補性(即ち、少なくとも70％、より好ましくは80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％または100％の一つ)を備えているとよい。ここでその部分またはフラグメントはこの明細書のとおりに選択された長さであって、またその部分またはフラグメントは、配列番号10、12または14のうちの一つの対応する部分またはフラグメントによってエンコードされるヌクレオチドの隣接配列を備えていて、さらにそのエンコードしている部分またはフラグメントは、配列番号10、12または14のうちのいずれか一つにおけるヌクレオチドの位置、即ち、
【表２】
2007523658.tif 000004
2007523658.tif 000005
2007523658.tif 000006
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のいずれか一カ所から開始するらしい。
【００６１】
例えば配列番号１は、配列番号10のヌクレオチド643-663に基づく(このヌクレオチドを含む)アンチセンス鎖を持っていて、21個のヌクレオチドからなる鎖長の二重鎖siRNA分子を表している。配列番号2は、配列番号10のヌクレオチド1903-1923に基づくアンチセンス鎖を持つ二重鎖siRNA分子を表している。配列番号3は、配列番号10のヌクレオチド2399-2417に基づくアンチセンス鎖を持つ二重鎖siRNA分子を表している。配列番号4は、配列番号10のヌクレオチド1277-1296に基づくアンチセンス鎖を持つ二重鎖siRNA分子を表している。
【００６２】
したがって、かなり様々な二重鎖siRNA分子を調製し、利用することが可能であり、気道のアレルギー性および／または非−アレルギー性疾患を治療するための治療方法においてそれらを使用できることからも、それらのそれぞれは本発明の一部を構成している。
【００６３】
センス鎖およびアンチセンス鎖
この明細書では、二重鎖のsiRNA分子に関する以下の定義は、専門用語の「センス」および「アンチセンス」に当てはまる。
【００６４】
得られる二重鎖のsiRNA分子は通常RNAの二本鎖からなっていて、それぞれの一本は、ワトソン／クリックの塩基対によって二重らせんを形成すべく共に結合できるように、もう一方の鎖に対して実質的に配列相補性を持っている。本発明のsiRNA分子は、二重らせんの一方の鎖が標的のリボ酢酸に結合できるようにする目的で設計されているであろう。この明細書では標的のリボ核酸は通常、STAT6のmRNAである。
【００６５】
siRNA二重らせんの一方の鎖は、標的のmRNAのRNA配列の部分を構成するヌクレオチドの隣接配列に対して、実質的な配列相補性(即ち、一般的には少なくとも70％の相補性)を備えている。siRNA二重らせんのこの鎖はアンチセンス鎖を任されており、そしてそのアンチセンス鎖がsiRNAの作用機構の一部として結合することが意図される標的のmRNAの一部に対して、siRNA二重らせんのこの鎖は相補性、または実質的に相補性である。
【００６６】
二重らせんsiRNAのもう一方の鎖は、標的のmRNA配列の部分を構成するヌクレオチドの隣接配列に対応し、実質的な配列同一性(即ち、通常は少なくとも70％の同一性)を持っている。これはsiRNAの二重らせんの「センス」鎖を任されている。
【００６７】
抑制およびサイレント化
本発明のリボ核酸は、標的のリボ核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を抑制、またはサイレント化するため、あるいはそのようなリボ核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の機能を抑制するために設計されている。
【００６８】
発現を抑制すると結果的に、標的の量が減少し、好ましくは標的のタンパク質、例えばSTAT6の量が減少することになる。例えば、所定の細胞において本発明のリボ核酸を投与することによって標的(例えば、STAT6タンパク質)を抑制すると、未処理の細胞に比較して標的の量が減少するという結果が得られる。
【００６９】
機能を抑制すると、mRNAの転写や、ペプチドまたはポリペプチドの翻訳が減少するであろう。
【００７０】
抑制は部分的であってもよい。好適な抑制の程度は少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、70％、80％、85％または90％のうちの一つである。90％と100％との間の抑制レベルであれば、発現または機能が「サイレント化」したと考えられる。
【００７１】
配列同一性
配列同一性のパーセント(％)は、提示されている列挙された配列(配列番号と言われる)内の残基と同一である候補配列において、最大の配列同一性を達成させるために必要であれば配列を整列させてギャップを導入した後で核酸残基のパーセントとして定義される。配列同一性は好ましくは、それぞれの配列の完全長と比較して算出される。
【００７２】
特別にことわらない限り、整列させた配列の長さが異なっている場合、短い方の配列の配列同一性は長い方の配列の完全長を比較して決定される。例えば、与えられた配列が100個のヌクレオチドを含んでいて、また候補の配列が10個のヌクレオチドを含んでいる場合、候補の配列は与えられた配列の完全長に対して最大で10％の同一性を持つことしかできない。このことは、以下の例でもさらに示されている。
【００７３】
（A）
与えられた配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ  (15ヌクレオチド)
比較配列：      ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹ        (12ヌクレオチド)
【００７４】
％配列同一性＝並べると全く同じに適合しているヌクレオチドを、与えられた配列のヌクレオチドの全数で割った数、即ち(5を15で割る)×100＝33.3％。
【００７５】
（B）
与えられた配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ            (10ヌクレオチド)
比較配列：      ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＺＺＹＺ  (15ヌクレオチド)
【００７６】
％配列同一性＝並べると同一のヌクレオチドを、与えられた配列のヌクレオチドの全数で割った数、即ち(5を10で割る)×100＝50％。
【００７７】
ヌクレオチド配列同一性のパーセントを決定する目的で整列させることは、この技術分野に入るさまざまな方法で達成できる。
【００７８】
ハイブリダイゼーションの緊縮性
本発明によると、適当なレベルの配列同一性を備えた核酸は、ハイブリダイゼーションを利用し、そして適当な緊縮性の条件を受け入れることによって同定することができる。
【００７９】
例えばRNA−RNAハイブリダイゼーションは、当業者に周知のハイブリダイゼーション法、例えばSambrockら(「分子クローニング、実験マニュアル、Cold  Spring Harbor Laboratory Press, 2001)の方法にしたがって行えばよい。
【００８０】
所定の塩濃度における融解温度(Tm)の算出は、ハイブリダイゼーション緊縮度を決定する一つの手段である。配列同一性の低い核酸二重らせんは、配列同一性の高い核酸二重らせんよりもTmが低いであろう。
【００８１】
融解温度の最も正確な誘導法の一つは、最隣接法(nearest-neighbour method)である。この方法は当業者に周知であって、短鎖核酸のTmを算出するのに好適であり、そしてそれは塩濃度および核酸の濃度はもちろんのこと、オリゴヌクレオチドの実際の配列までも考慮に入れている。
【００８２】
DNAおよびRNAのどちらをベースとするオリゴヌクレオチドに対しても最隣接法の等式は、
【数１】
2007523658.tif 000017
である。式中、△H°(Kcal/モル)はハイブリッドについての最隣接エンタルピー変化の合計であり、Aはへリックスの開始を補正する定数(-10.8)であり、△S°は最隣接のエントロピー変化の合計であり、Rは気体定数(1.99cal K-1mol-1)であり、そしてCtはオリゴヌクレオチドのモル濃度である。DNAおよびRNAの最隣接塩基についての△H°値および△S°値は、刊行物より入手できる(例えば、Genosys Biotechnologies Inc.より)。
【００８３】
非常に高い緊縮条件でのRNA-RNAハイブリダイゼーションでは通常、100％の配列同一性を備えたRNA二重らせんの融解温度は、だいたい60℃よりも高いか、60℃位であると予測できるが、ある所定の二重らせんの実際のTmは経験的な計算法を用いる必要がある。
【００８４】
したがってヌクレオチド配列は、上記の等式を用いて適切に選択される別個のハイブリダイゼーションと、選別性の緊縮条件の下でハイブリダイズできる能力によって、または当業者に既知の別の同様の方法によって分類できる。
【００８５】
95−100％の配列同一性を示す配列はかなり高い緊縮条件でハイブリダイズすると考えられ、85−95％の同一性を示す配列は高い緊縮条件でハイブリダイズすると考えられ、70−85％の同一性を示す配列は中程度の緊縮条件でハイブリダイズすると考えられ、60−70％の同一性を示す配列は低い緊縮条件でハイブリダイズすると考えられ、そして50−60％の同一性を示す配列はかなり低い緊縮条件でハイブリダイズすると考えられる。
【００８６】
STAT6
この明細書においてSTAT6は、STAT6核酸、ポリペプチド、またはその何らかの相同体、突然変異体、誘導体、もしくはフラグメントを示すであろう。
【００８７】
この明細書においてSTAT6ポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号9、11もしくは13のいずれか一つに対して、または配列番号9、11もしくは13のいずれか一つのフラグメントに対して特定の度合いの配列同一性を備えたアミノ酸配列を持つペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってもよいし、あるいは配列番号10、12もしくは14のいずれか一つのヌクレオチド配列によって、または配列番号10、12もしくは14のいずれか一つのフラグメントによってエンコードされるペプチドもしくはポリペプチドであってもよい。特定の度合いを持つ配列同一性とは、少なくとも60％から100％の配列同一性であればよい。さらに好ましくは特定の度合いの配列同一性は、少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性のうちのいずれかであってもよい。
【００８８】
この明細書におけるSTAT6核酸とは、配列番号10、12もしくは14のいずれか一つに対して、これらの配列のいずれか一つのRNA転写物に対して、前述した配列のいずれか一つのフラグメントに対して、またはこれらの配列もしくはフラグメントのいずれか一つの相補的配列に対して特定の度合いの配列同一性を備えたヌクレオチド配列を持つ何らかの核酸(DNAまたはRNA)であろう。またSTAT6核酸は、高い緊縮条件、またはかなり高い緊縮条件でこれらの配列の一つにハイブリダイズするものであってもよい。特定の度合いの配列同一性は、少なくとも60％から100％の配列同一性であればよい。さらに好ましくは特定の度合いの配列同一性は、少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性のうちの一つであることができる。
【００８９】
ヒトSTAT6のポリペプチドおよびヌクレオチド配列は、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のデータベースより、受け入れ番号NM_003153(GI:23397677)として入手できる(図４も参照)。
【００９０】
マウスSTAT6のポリペプチドおよびヌクレオチド配列は、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のデータベースより、受け入れ番号NM_009284(GI:6678154)として入手できる(図５も参照)。
【００９１】
ラットSTAT6のポリペプチドおよびヌクレオチド配列は、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のデータベースより、受け入れ番号XM_343223(GI:34865760)として入手できる(図６も参照)。
【００９２】
STAT6核酸は好ましくは、ヒトSTAT6のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその相同体をエンコードする核酸を示す。
【００９３】
またはSTAT6は、非−ヒトのSTAT6ポリペプチドまたはその相同体をエンコードする核酸のことを指してもよい。非−ヒトSTAT6は、好ましくはラット、マウスまたは他の齧歯動物(齧歯目に属する何らかの動物を含む)のいずれか一つから選択してもよいし、また、ブタ、ヒツジ、非−ヒトの霊長類もしくは他の非−ヒトの脊椎動物生物、または非−ヒトの哺乳動物から選択することもできる。
【００９４】
STAT6相同体は、採用した生物のSTAT6配列に対して少なくとも60％の配列同一性を備えていると好ましい。より好ましくは配列同一性のレベルは少なくとも70、80、90または95％である。
【００９５】
フラグメント
フラグメントは、対応する完全長の配列の一部分をエンコードするヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含む。この明細書では対応する完全長の配列は、配列番号9から14のいずれか一つである。前記の部分は、決まった長さであってもよいし、決まった最小および／または最大の長さであってもよい。
【００９６】
したがってそのフラグメントは、小さくても、言い換えると最小の長さが対応する完全長の配列の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98または99％の長さを持つものである。そのフラグメントは最大の長さが、言い換えると対応する完全長の配列の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98または99％以上にはならない長さを持つものであろう。
【００９７】
このフラグメントは少なくとも、即ち最小の長さが10個のヌクレオチドまたはアミノ酸であって、より好ましくは最小の長さが少なくとも11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、100個、150個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個、1500個、1600個、1700個、1800個、1900個、2000個、2100個、2200個、2300個、2400個、2500個、2600個、2700個、2800個、2900個、3000個、3100個、3200個、3300個、3400個、3500個、3600個、3700個、3800個、3900個、もしくは4000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むであろう。
【００９８】
このフラグメントは最大の長さが10個のヌクレオチドまたはアミノ酸を持っていてもよく、即ち10個以上にはならないヌクレオチドまたはアミノ酸を持っていてもよく、より好ましくは11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、100個、150個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個、1500個、1600個、1700個、1800個、1900個、2000個、2100個、2200個、2300個、2400個、2500個、2600個、2700個、2800個、2900個、3000個、3100個、3200個、3300個、3400個、3500個、3600個、3700個、3800個、3900個、もしくは4000個以上にはならない長さのヌクレオチドまたはアミノ酸を含むであろう。
【００９９】
そのフラグメントは前記最小の長さと最大の長さの間のどこかの長さを持つとよい。
【０１００】
本発明は、記載された観点と好ましい特徴の組み合わせを含んでいるが、ただしそのような組み合わせが明らかに許されない、即ち明白に避けるべきである場合は除かれる。
【０１０１】
本発明の観点および態様は、添付した図面を参照して実施例としてここに例示される。更なる観点および態様が当業者には明らかになるであろう。この本文で述べられている全ての資料は、参照文献としてこの明細書に組み入れられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０２】
本発明を行うに際して発明者らによって企画された最良形態の特定な説明が、実施例として以下に列挙されている。本発明がこれらの特定の説明に制限されることなく実施できることは、当業者には明らかであろう。
【０１０３】
STAT6 siRNA
siRNAによる標的化のために、STAT6のmRNA(GenBank, U16031)のコード領域にある配列のみを選択した。
【０１０４】
開始コドンに近い領域(75個の塩基内)は、調節性タンパク質結合部位を含む可能性があるため避けた。
【０１０５】
特異性を確保するために、選択された標的部位を、他の既知のコード配列との相同性についてBLAST(登録商標)(NCBI)サーチによって比較した。また標的配列は、続くsiRNAにおいてGC含有量＜40％となること、またチミジン突出部(ｔｔ)ができるようにAAで開始することに基づいて選択される(図１)。
【０１０６】
純粋なSTAT6のsiRNA二重らせんは、Ambion Inc. (Austin, TX, USA)による発明者らの設計に従って化学的に合成され、乾燥済みRNAオリゴヌクレオチドとして提供された。再構築したsiRNAを続く細胞処理実験で用いた。
【０１０７】
STAT6 siRNAによるSTAT6遺伝子発現の標的化
STAT6−発現性である肺上皮細胞(A549)を特有のSTAT6 siRNAを用いて処理し、その後STAT6の発現を阻害する能力についてSTAT6 mRNAとSTAT6タンパク質の両方の発現を測定することによって調べた(図２)。効果的な細胞標的化を確実にするためにsiRNAを商業的に入手可能なカチオン性液体試薬(Lipofectamine(登録商標)、Invitrogen)と複合化してから細胞にトランスフェクトした。
【０１０８】
STAT6 siRNAを、商業的に入手可能なGAPDH(「ハウスキーピング」遺伝子)のsiRNAと、またヒトmRNA配列(Ambion, Inc.)に対して既知の相同性を持たないスクランブルしたGAPDH siRNAと対照させて確認した。これらの実験では、STAT6 siRNAの二重らせんが、処理した細胞においてSTAT6 mRNAとSTAT6タンパク質の両方の発現を阻害することが示された。さらにこの抑制作用はSTAT6−特異性であって、GAPDHのような非−関連性のハウスキーピング遺伝子の発現には影響がなかった。
【０１０９】
STAT6の機能はSTAT6 siRNAの処理によって阻止される
RNAiが首尾の良い治療となるためには、遺伝子を標的化することで処理した細胞内のタンパク質の機能が喪失することになることが必須である。したがってSTAT6の発現を測定すること(上記に示されたように)に加えて、私たちは細胞内におけるSTAT6の活性に対するsiRNA処理の効果を測定した。STAT6タンパク質はその効果を仲介するためには細胞内でリン酸化されなくてはならず、私たちは無傷の細胞におけるリン酸化STAT6の量を直接的に測定する検定法を用いた。この検定法は、リン酸化したSTAT6タンパク質を発現する細胞を蛍光標識できる抗−リン酸−STAT6抗体(BD-PharMingen)を利用している。IL-4で処理した細胞内で検出できる蛍光量(フローサイトメトリーによって測定した)は、リン酸化STAT6の量に直接的に関連している(図３)。
【０１１０】
STAT6を活性化する目的で細胞を、アレルギー反応を起こす際に産生し、細胞内でSTAT6を常態で活性化する化学メッセンジャーである、インターロイキン−4(IL-4)を用いて刺激した。この検定法を用いて私たちは、STAT6のRNAiが細胞におけるSTAT6の機能の減少をもたらすことを明確に証明できた。
【０１１１】
遺伝子発現の90％の阻害は、STAT6タンパク質の発現の完全な喪失、およびそれによって推定される細胞内における機能の喪失と必然的に関連しない。したがって抗体染色した実験(フロサイトメトリー−図３)が行われる。これらの結果は、STAT6 siRNAの処理がSTAT6機能の喪失をもたらすことを示している。STAT6タンパク質の発現はsiRNA処理の後で阻害され(ウエスタンブロット法によって示されているように)、そしてこの欠点は、インターロイキン-4の刺激に応答して起こるSTAT6−リン酸化がフローサイトメトリーによって検出できないことが絶対的であると考えられる。
【０１１２】
ヒト肺上皮細胞におけるRNAiによるSTAT6発現の阻害は数日間持続する
この結果を参照して図７で説明する。A549細胞は0日目に、100 nMのSTAT6 siRNA １−4(配列番号1−4)を用いてトランスフェクトした。タンパク質およびRNAのフラクションは、トランスフェクションをした後の3日目、5日目、および7日目に採取した細胞から調製し、STAT6 siRNAタンパク質／mRNAの発現についてそれぞれウエスタンブロット法(図７−上部のパネル)とリアル−タイムのRT-PCR法によって分析した。3日目にはSTAT6タンパク質の発現はSTAT6 siRNAの処理によって完全に阻止された(GAPDHレベルは変化しなかった)。対照的に、スクランブルしたsiRNA(SC)はSTAT6(またはGAPDH)タンパク質の発現を阻害しなかった、同じ効果は５日目と７日目にも認められた。siRNA−4処理を行った７日目には、幾分かの回復が検出できた(図７−左のブロット)。
【０１１３】
ヒトSTAT6−特異的プライマーを用いるRT-PCR分析法によってSTAT6の阻害が確認され(SC siRNAを用いた処理に比較して、標準化した変化倍数、△△Ct)、STAT6 mRNAの発現は処理後の全ての時点で有意に抑制された。
【０１１４】
STAT6 siRNAは、10 nMほどの低い濃度で効力がある
STAT6 RNAiの効力をテストするために、A549肺上皮細胞を種々の濃度の別個のSTAT6 siRNA１−4(配列番号1−4)を用いてトランスフェクトした。その結果が図８に並べられている。細胞をトランスフェクション後の3日目に採取して、それからタンパク質とRNAのフラクションを、それぞれウエスタンブロット法(図８−上部のパネル)とリアル−タイムのRT-PCR法によるSTAT6 siRNAタンパク質／mRNAの発現についての分析にかけた。
【０１１５】
STAT6 siRNAはテストした全ての濃度でSTAT6の発現を阻害できることがわかったが、これに対してスクランブル(SC) siRNAはSTAT6の発現に対して効果がなかった(GAPDHレベルはどちらの処理によっても影響がなかった)。RT-PCR分析法は、STAT6 mRNA阻害に関しては50 nMが最も強力なsiRNA濃度であることを示しており(変化倍数、△△Ct)、そしてこのことはウエスタンブロット法によってタンパク質レベルで確認された。しかしながら10 nMのsiRNA(0.13 ng/mlのdsRNAと等価)を用いてもSTAT6発現の抑制は有意であった。
【０１１６】
STAT6 siRNA−1(配列番号１)とSTAT6 siRNA−3(配列番号３)は、10 nMでSTAT6タンパク質の発現を完全に阻害した、。STAT6−2(配列番号２)およびSTAT6−4(配列番号４)は、10 nMの濃度で弱めの阻害を示した(ウエスタンブロット法ではかすかなバンドが観察できた)。
【０１１７】
RNAiは、インターフェロンの応答を誘導することなく機能的STAT6タンパク質の発現を阻止する
ヒト肺上皮細胞(A549)は、20 nMのSTAT6 siRNA−１(配列番号１)(三つの右側パネル)、または既知のヒト遺伝子(mRNA)と非−相同性であるスクランブル(SC)siRNA、20 nMのいずれかを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後の3日目に細胞を100 ng/mlのヒトrIL-4を用いて60分間刺激し、続いて収穫してから固定化し、リン酸化STAT6を細胞内で発現させるに際してAlexa-Fluor-488を結合した抗−ヒト ホスホ−STAT6(BD PharMingen)を用いて染色した。dsRNA(いくつかのsiRNAを含んでいる)がある種のヒト細胞型でインターフェロンの応答を活性化することが報告されている場合、細胞もSTAT1−リン酸化(STAT1はインターフェロン−受容体の信号伝達によって特異的にリン酸化される)に際してホスホ−STAT1−特異的抗体(BD−PharMingen)を用いて染色した。
【０１１８】
その結果が図９に並べて記載されている。IL-4の刺激がない場合、SC−siRNA−処理細胞はイソタイプコントロールの染色細胞と比較して、検出可能なSTAT6リン酸化を示さなかった(図９−左のパネル)。対照的にIL-4はSC-siRNA処理細胞においてSTAT6リン酸化(Alexa-Fluor-488蛍光)を容易に誘導できた。細胞をSTAT6-1 siRNAを用いて処理した場合、蛍光染色が存在しないことによって示されているとおり、言い換えるとSTAT6 siRNA−１(配列番号１)で処理した細胞において、機能性STAT6タンパク質が存在していないことが示されているとおり、STAT6をリン酸化できるIL-4のこの能力が阻止された。抗−ホスホ−STAT1を用いて細胞内の染色を行うと、siRNA−処理細胞(SCまたはSTAT6-1)においてSTAT1−リン酸化反応が完全に阻止されていることが示されたが、このことはインターフェロンの信号伝達がsiRNA−処理によって誘導されなかったことを示している(このことは、インターフェロン−応答遺伝子OAS-1はsiRNA−処理をすると調節されないことを示す発明者らのRT-PCRデータと一致している)。
【０１１９】
インターフェロン−応答性を確認するために、並行的なsiRNA−処理した上皮細胞培養物を外来性のヒトrIFN-γ(60分間で10 ng/ml)を用いて刺激した。これらの条件下ではSTAT1−リン酸化は、特異的抗体染色法によって容易に検出できた(図９−右側のパネル)。
【０１２０】
これらの研究から得られる結果を合わせると、20 nMのSTAT6 siRNAによって上皮細胞における機能的STAT6タンパク質の発現が容易かつ特異的に阻止されること、およびsiRNAの処理を行えば標的細胞において検出できるほどのインターフェロンの応答が誘導されないことを示している。データは少なくとも5種の特有の実験を表している。
【０１２１】
RNAiによるSTAT6の抑制は、種々のヒト肺細胞タイプで容易に達成できる
HL細胞(肺の繊維芽細胞)は、種々の濃度のSTAT6 siRNA(配列番号１)およびトランスフェクションの3日後に採集した細胞を、ウエスタンブロット法、リアル−タイムRT-PCR法、およびフローサイトメトリー分析法によってSTAT6の発現に対して分析した。その結果が図１０に並べられている、
【０１２２】
上皮細胞と同様に、繊維芽細胞におけるSTAT6タンパク質の発現も、STAT6 siRNA−１(配列番号１)の処理によって完全に、かつ特異的に破壊された(GAPDHレベルは変わらなかった)。100 nM、50 nMおよび10 nMのSTAT6 siRNA-1(配列番号１)は全て、トランスフェクションの3日後までにSTAT6タンパク質の発現を阻害した(図１０−上部のパネル)。対照的にスクランブルsiRNA(SC)は、STAT6またはGAPDHタンパク質の発現を調節しなかった。RT-PCR分析はSTAT6阻害を確認したが、そこではSC／ハウスキーピングコーントロール(△△Ct)に比較して、STAT6 mRNAの発現がすべてのsiRNA濃度で有意に抑制されていた。
【０１２３】
この細胞型では、10 nMのSTAT6-1 siRNAはSTAT6 mRNAレベルの最大の阻害を仲介した(STAT6 mRNAの発現をSC siRNAを用いる処理に比較した場合の正規化された平均的倍数変化＝−97)。さらにノックダウンを確認するために、siRNA−処理細胞を100 ng/mlのヒトrIL-4で60分間刺激し、STAT6−リン酸化をフローサイトメトリー分析法によって測定した(下方−右側のパネル)。ホスホ−STAT6−特異的抗体(BD-PhatMingen)を用いることによって、STAT6−リン酸化反応が、STAT6 siRNA−１(配列番号１)−処理され／IL-4刺激された細胞において、全ての濃度のSTAT6 siRNA−１(配列番号１)で完全に破壊されたことを示しており、このことはこれらの細胞において機能的STAT6タンパク質が存在しないことを指示している。対照的にSC siRNA(100 nM)は、HL細胞でSTAT6をリン酸化するIL-4の能力を阻害しなかった(蛍光が相対的に増加したことで示される)。
【０１２４】
STAT6のRNAiは、ヒト肺上皮細胞におけるエオタキシン−1 のmRNA発現を増加調節させるIL-4の能力を破壊した
機能的STAT6の阻害をさらに確認するために、STAT6−処理細胞において、既知のSTAT6−応答遺伝子(エオタキシン−１)の発現を操作するIL-4の能力を測定した。その結果が図１１に示されている。
【０１２５】
肺上皮細胞(A549)を、STAT6-1 siRNA(配列番号１)またはスクランブルSC siRNA(最終濃度が20 nM)を用いてトランスフェクトし、そのトランスフェクションの3日後にヒトrIL-4(10、50 ng/ml)を用いてさらに12時間処理した。それから全RNAを収穫した細胞より抽出し、STAT6／エオタキシン-1  mRNAの発現をリアル−タイムのRT-PCRによって測定した。
【０１２６】
図１１(左側のパネル)に示されているように、STAT6のmRNA発現は、STAT6-1のsiRNA(配列番号１)を処理することによって有意に阻害された(相対的変化倍数、△△Ct)。対照的にSC siRNAは、STAT6 mRNAの相対的レベルに影響を与えなかった。エオタキシン−１ mRNAの転写物レベルをヒトエオタキシン-1の特異的プライマーを用いて同じサンプルで測定すると(図１１−右側のパネル)、IL-4がSC−siRNA−処理細胞においてエオタキシン-1のmRNAレベルの相対的レベル(非刺激細胞に比較した△△Ct)を増加−調節することがわかった。対照的にIL-4は、STAT6-1 siRNA(配列番号１)−処理細胞においてエオタキシン-1のmRNA発現を有意には調節しなかった。
【０１２７】
これらの発見は予備的であって、タンパク質レベルで確認する必要があるが、それらはヒト肺上皮細胞におけるエオタキシン−１遺伝子の発現のIL-4誘導性調節がSTAT6−依存性であることを示しており、また、エオタキシン−１がSTAT6−調節遺伝子であるマウスおよびヒトで独立した発見であると確認している。
【０１２８】
これらの発見はまた、ヒトSTAT6の機能を研究するためのツールとしてのSTAT6  RNAiの利用性も説明しており、また、アレルギー性喘息におけるIL-4−STAT6−エオタキシンからなる軸についての報告済みの重要性をもたらしていて、このことはインビボでのこの経路を阻害することの潜在的な治療上の利点を示している。
【０１２９】
論考
記載されたこの結果は、STAT6に特異的なsiRNAを設計することによって、喘息に関与する細胞型においてSTAT6の遺伝子(mRNA)およびタンパク質の発現の効果的な阻害が達成できることを示している。重要なことにその結果はまた、STAT6 siRNAを用いて細胞の処理を行うと、生理的刺激で刺激した場合のSTAT6の機能が阻止されるに至ることを証明している。
【０１３０】
この結果は、STAT6に向かうsiRNAが非常に低濃度で、例えば10 nM以下の濃度でSTAT6の細胞発現および活性をうまく抑圧できる点で活性であることを示している。うまくゆかないことが明らかになっている従来技術のアンチセンス法は、かなり高濃度のアンチセンスDNAが必要であり、それは100倍以上の高濃度である場合もよくある。ここで実例が示されている低濃度のSTAT6指向性siRNAの持つ効力は、従来技術よりも有意に改善されている。特にこのような低濃度での治療効力は、効能を得られるのに充分な時間、活性薬が崩壊されてしまうことなく細胞に残ったままになるほどの高濃度の活性薬を供給することによる多くの問題点を軽減する。
【０１３１】
STAT6は、気道のアレルギー性疾患で起こっている多くの調節異常行程の中心的メディエーターであることが知られているため、このアプローチでその遺伝子を標的とすることは、喘息、鼻炎、およびSTAT6がやはり関連している非−アレルギー性喘息といった疾患の独特の治療ルートを提供する。
【０１３２】
したがって、STAT6 siRNAをベースとする気道のアレルギー性疾患のための治療法は、喘息または鼻炎の場合に用いられる方法であって、STAT6の発現を選択的に減少−調節し、患者のSTAT6のアレルギー性炎症−誘導効果を改善させることによって効果を現す。
【０１３３】
参照文献
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２．Izuhara, K., Shirakawa, T., Adra, C. N., Hamasaki, N. & Hopkin, J. M. アレルギーにおける治療ターゲットの出現：IL-4RaおよびStat6。Emerging Theraputic Targets 3, 381-389 (1999).
３．Caplen, N. J. 遺伝子発現の阻害に対する新しいアプローチ。Trends Biotech. 20, 49-51 (2002).
４．Elbashir, S, M, ら,  21-ヌクレオチドRNAの二重らせんが、培養された哺乳動物細胞におけるRNA干渉を仲介する。Nature 411, 494-498 (2001).
５．Elbashir, S, M, ら，21-ヌクレオチドRNAの二重らせんが、培養された哺乳動物細胞におけるRNA干渉を仲介する。Nature 411, 494-498 (2001).
６．Foster, P. S. STAT6: アレルギー性疾患を抑制するための細胞内ターゲット。Clin. Exp. Allergy 29, 12-16 (1999).
７．Izuhara, K., Shirakawa, T., Adra, C. N., Hamasaki, N & Hopkin, J. M. アレルギーにおける治療ターゲットの出現：IL-4RaおよびStat6。Emerging Theraputic Targets 3, 381-389 (1999).
８．Bertrand, J-Rら，細胞培養物における、およびインビボにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとsiRNAとの比較。Biochemical and Biophysical Research Communications 296 (2002) 1000-1004.
９．Bitko, Vら，鼻腔内投与したsiRNAによる呼吸器ウイルスの阻害。Nature Medicine Vol 11 No.1 January 2005 50-55.
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１１．Sioud, Mら，成体マウスにおけるカチオン性リポソーム−仲介されるsiRNAの供給。Biochemikal and Biophysical Research Communications 312 (2003) 1220-1225.
１２．Massaro, Dら，マウス肺胞への小さな阻害性RNAおよび他の薬物の非侵襲性供給。Am J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol L1066-L1070, 2 July 2004.
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１４．Popescu, F-D. 遺伝子発現に対して作用する新規な喘息治療薬。J Cell Mol Med Vol 7 No.4 2003 475-486.
１５．WO 98/40478.
１６．Danahay, H; Hill, S; Owen, C. E. (2000). マウスSTAT6に標的化させたアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロおよびインビボでの薬理学。Inflamm. Res. 49: 692-699.
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】STAT6を標的とするsiRNAの設計。STAT6 mRNAの部分をエンコードする標的化DNA配列(配列番号15−18)と、作成したsiRNA(配列番号1−4)の対応する二重らせん構造が示されている。
【図２】RNAiによるSTAT6発現の阻害。A549細胞は、最終濃度100nMで特有のsiRNAを用いて処理した。  （A）処理してから60時間後に細胞のタンパク質を採取し、等量(10μｇ)を電気泳動法を用いて分子量ごとに分離してから合成膜に固定化した(ウェスターンブロット法)。続いてSTAT6タンパク質(120kDa)の存在をポリクローナル抗−STAT6抗体(Santa Cruz Biotechnology, Ca., USA)を用いて検出した。その際の各サンプルにおけるSTAT6の発現量はバンド強度と相関している。STAT6 (1)のsiRNA(配列番号1)を用いて処理した細胞では、STAT6タンパク質については検出できるほどの発現はなかった(可視バンドはなし)。レーン2および3[STAT6 (2)(配列番号2)−処理、STAT6 (3)(配列番号3)−処理]ではSTAT6タンパク質のバンドはかすかに検出できるほどであり、それはかなり阻害されていること(＞95％)を示している。STAT6 (4)のsiRNA(配列番号4)はSTAT6の発現を90％までも阻害したが、最低限の有効性であった。対照的にコントロールのスクランブルsiRNA(scGAPDH、レーン6)はSTAT6の発現に対して効果がなかった。同様にSTAT6 siRNAは、37kDタンパク質のバンド(GAPDH−特異的抗体を用いた)として容易に検出可能なGAPDHの発現に対しては効果がなかった。  （B）siRNA−処理した細胞におけるSTAT6遺伝子の発現(mRNAの形成)は、遺伝子の絶対的定量が可能なリアル−タイム RT-PCR法で測定した。STAT6の発現量をハウスキーピング遺伝子のGAPDHに対して比較すると(即ち、STAT6発現／GAPDH発現の比：ｙ−軸)、siRNAの特異的効果が測定できる。示されたように、STAT6 siRNA(1−4)はSTAT6 mRNAを≧90％も阻害する。対照的にscGAPDHのsiRNAを用いて処理した細胞ではSTAT6 mRNA発現の減少は何らみられず、このことはトランスフェクション行程自体はSTAT6遺伝子を発現しないことを示している。
【図３】STAT6のRNAiはSTAT6機能の喪失を導く。STAT6活性を測定する目的でA549細胞をIL-4(1 ng/ml)の存在下(右側のヒストグラム)または非存在下(左側のヒストグラム)で30分間培養し、抗−ホスホ−STAT6、即ちAlexaフロロ−647標識抗体(BD PharMingen, Oxford, UK)を用いて染色した。唯一この抗体が、チロシン残基641がリン酸化されているSTAT6分子を認識する。染色工程を終えた後、細胞の蛍光をフローサイトメトリーで測定した。ヒストグラムでは、結合した抗体の量は個々の細胞において検出可能な蛍光の相対量として示されている(ｘ−軸)。バックグラウンドレベル上で検出可能な蛍光の量は、P2とマークされた囲まれた領域に指示されている。示されているようにIL-4は、蛍光が増加することで示されているように、細胞のSTAT6を活性化する能力があった(上のヒストグラムの並びを見ると、刺激されていない細胞における5.1％のバックグラウンドに対して35.5％に増加している)。対照的に細胞をSTAT6−特異性のsiRNAで処理した場合では、STAT6を活性化するIL-4の能力は完全に破壊される(下側の並びを見ると、刺激されている細胞も刺激されていない細胞もどちらも11.2％の蛍光を示している)。
【図４】ヒトSTAT6に対するアミノ酸配列(配列番号9)およびヌクレオチド配列(配列番号10)を示す、NCBIデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の受け入れ番号NM003153[gi: 23397677]由来の抽出物。
【図５】マウスSTAT6に対するアミノ酸配列(配列番号11)およびヌクレオチド配列(配列番号12)を示す、NCBIデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の受け入れ番号NM009284[gi: 6678154]由来の抽出物。
【図６】ラットSTAT6に対するアミノ酸配列(配列番号13)およびヌクレオチド配列(配列番号14)を示す、NCBIデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の受け入れ番号XM343224[gi: 34865760]由来の抽出物。
【図７】RNAiによるヒト肺上皮細胞におけるSTAT6発現の阻害は数日間続く。(G＝GAPDH siRNA、J＝ジャルカット(Jurkatt)細胞ライゼート、M＝サイズマーカー、全てのレーン＝10μgのタンパク質、ブロットは、少なくとも3種の別個の実験を表示している。)
【図８】STAT6 siRNAは、10nM程度の低い濃度で有効である。(G＝GAPDH siRNA、bA＝b−アクチンsiRNA、J＝ジャルカット(Jurkatt)細胞ライゼート、M＝サイズマーカー、全てのレーン＝10μgのタンパク質、結果は、3種の別個の実験を表示している。)
【図９】RNAiは、インターフェロンの反応を誘導することなく機能性STAT6タンパク質の発現を阻止する。
【図１０】RNAiによるSTAT6の抑制は、異なるヒト肺細胞型で容易に達成できる。
【図１１】STAT6のRNAiは、ヒト肺の上皮細胞においてエオタキシン-1 mRNAの発現を増加−調節するIL-4の能力を阻止する。
【図１】
2007523658.tif 000018
【図４−１】
2007523658.tif 000019
【図４−２】
2007523658.tif 000020
【図４−３】
2007523658.tif 000021
【図５−１】
2007523658.tif 000022
【図５−２】
2007523658.tif 000023
【図５−３】
2007523658.tif 000024
【図６−１】
2007523658.tif 000025
【図６−２】
2007523658.tif 000026
【図６−３】
2007523658.tif 000027
【図８】
2007523658.tif 000028
【図１１】
2007523658.tif 000029
【図２】
2007523658.tif 000030
【図３】
2007523658.tif 000031
【図７】
2007523658.tif 000032
【図９】
2007523658.tif 000033
【図１０】
2007523658.tif 000034
【配列表】
2007523658000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月17日(2006.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
STAT6核酸またはタンパク質の発現をインビトロで少なくとも抑制する性質を持っていて、かつ隣接するヌクレオチド鎖を含むセンス鎖と、相補的な隣接するヌクレオチド鎖を含むアンチセンス鎖とを持っており、そのアンチセンス鎖とセンス鎖のそれぞれの長さが10個から30個の範囲内のヌクレオチドである、単離された二本鎖の短鎖干渉型リボ核酸(short interfering ribonucleic acid: siRNA)。
【請求項２】
前記センス鎖および／またはアンチセンス鎖が隣接ヌクレオチド鎖を含んでいて、その塩基配列が、ヒト、マウスまたはラットのSTAT6ヌクレオチド配列(配列番号10、12または14)の一つによってエンコードされるmRNA配列に含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列の塩基配列に対して少なくとも70%の配列同一性を備えている、請求項１に記載のsiRNA。
【請求項３】
前記mRNA配列に含まれる対応する長さの隣接ヌクレオチド配列が、配列番号5-8のいずれか一つのRNA配列、または配列番号15-18のいずれか一つによってエンコードされるRNA配列である、請求項２に記載のsiRNA。
【請求項４】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4を含むsiRNA。
【請求項５】
薬学的に許容されるその希釈剤、担体またはアジュバントと共に、請求項１から４のいずれか一項に記載されたとおりのsiRNAを含む薬学的組成物。
【国際調査報告】
2007523658.tif 000035
2007523658.tif 000036
2007523658.tif 000037
2007523658.tif 000038
2007523658.tif 000039