(57)【要約】  グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体を還元末端に持つ、糖供与体を、グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基が保護されているＮ−アシルガラクトサミン誘導体を還元末端に有する糖受容体と、特定のプロモーターの存在下でグリコシル化反応させる工程とする。  ４以上の構成糖からなる意図する鎖長のオリゴグリコサミノグルカンを、高立体選択的に、高収率、高純度で製造する方法を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体を還元末端に有する糖供与体（Ａ−１）を、
グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基が保護されているＮ−アシルガラクトサミン誘導体を非還元末端に有する糖受容体（Ａ−２）と、
プロモーターとして、該糖供与体の脱離基に対する活性化剤であるルイス酸（Ａ−３）の存在下で、グリコシル化反応させる工程を含むことを特徴とする、オリゴグリコサミノグリカンまたはその中間体の製造方法。
【請求項２】
前記中間体が、下記一般式（４’）によって示される化合物である、請求項１の方法：
【化１】
2007530713.tif 000028
［上記一般式（４’）中、
Ｒ’は、アルキル基、アルケニル基、アラリキル基及びアリール基からなる群より選択され；
Ｐ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され；
Ｐ４は、アルキル基、アルケニル基、及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され（これらのうち２つの基が架橋して１つになったものも含む）；
Ｇ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、アリール基、及び下記一般式（４−１）：
【化２】
2007530713.tif 000029
｛上記式（４−１）中、
ｍは、０〜４の整数であり、
Ｒ６及びＲ７は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ１０は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され（これらのうち２つの基が架橋して１つになったものも含む）、
Ｇ１’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、及び下記一般式（４−１’）によって表される化合物からなる群から選択される｝
【化３】
2007530713.tif 000030
（式（４−１’）中、
Ｐ７は、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基及びアリール基からなる群から選択され、
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ１０は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択される）
によって表される化合物からなる群から選択され；
Ｇ２は、水素原子、アルケニル基、アシル基、アラルキル基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及び下記一般式（４−２）に示される化合物：
【化４】
2007530713.tif 000031
｛式（４−２）中、
λは、０から４の整数であり；
Ｒ４及びＲ５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され；
Ｐ２及びＰ３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され；
Ｐ４は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｐ６及びＰ６’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され；
Ｇ２’は、水素原子、アルケニル基、アシル基、アラルキル基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、および下記一般式（４−２’）で表される化合物からなる群から選択される｝
【化５】
2007530713.tif 000032
（式（４−２’）中、
Ｒ４及びＲ５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ５は、アルケニル基、アシル基、アラルキル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ６及びＰ６’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択される）
からなる群から選択される］。
【請求項３】
前記プロモーターが、下記一般式（１）により示される化合物である、請求項１又は２に記載の方法：
【化６】
2007530713.tif 000033
［上記一般式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又はそれぞれ独立して、置換されていないか少なくとも１つの水素原子が置換されている、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基または芳香族基を表し、Ｔｆは、トリフルオロメタンスルフォニル基を示す］。
【請求項４】
前記糖供与体が、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体、或いはグリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体であり、
前記糖受容体が、グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体、或いはグリコシル化に付する還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体である、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ａ）の工程の後、更に
（Ｂ）前記（Ａ）の工程で得られたオリゴ糖誘導体の非還元末端における１つの保護基を脱離し、
（Ｃ）該１つの保護基を脱離したオリゴ糖誘導体を、前記プロモーターの存在下、前記糖受容体と、グリコシル化反応させる工程を、
１から８回の任意の回数繰り返して行なう、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖供与体が、下記一般式（２）：
【化７】
2007530713.tif 000034
［上記一般式（２）中、
Ｒ４及びＲ５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基及びフタロイル基からなる群より選択され、
Ｉｍは、任意にハロゲンで置換されたイミドイル基であり、
Ｐ２及びＰ３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ４は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ５は、アルケニル基、アシル基、アラルキル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ６及びＰ６’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択される］
によって表されるコンドロイチン誘導体であり；
前記糖受容体が、下記一般式（３）：
【化８】
2007530713.tif 000035
［上記一般式（３）中、
Ｒ６及びＲ７は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ７は、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基及びアリール基からなる群から選択され、
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基及びアシル基からなる群から選択され、
Ｐ１０は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択される（これらのうち２つの基が架橋して１つになったものを含む）］
によって表される還元末端グルクロン酸型コンドロイチン誘導体である、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記糖供与体が、下記一般式（２’）：
【化９】
2007530713.tif 000036
［上記一般式（２’）中、
Ｉｍは、任意にハロゲンで置換されたイミドイル基であり、
Ｐ２及びＰ３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ４は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ５は、アルケニル基、アシル基、アラルキル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択される］
によって表されるコンドロイチン誘導体であり；
前記糖受容体が、下記一般式（３）：
【化１０】
2007530713.tif 000037
［上記一般式（３）中、
Ｒ６及びＲ７は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ７は、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基及びアリール基からなる群から選択され、
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基及びアシル基からなる群から選択され、
Ｐ１０は、アルキル基、アルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択される（これらのうち２つの基が架橋して１つになったものを含む）]
によって表される還元末端グルクロン酸型コンドロイチン誘導体である、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記糖供与体におけるグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体の２位の置換基が、オルトエステルを安定化させるアシル基で保護されている請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、水素原子であるか、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基である、請求項３から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）である、請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）の工程を１〜５回繰り返す、請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（Ｄ−１）更に、前記（Ａ）又は（Ｃ）の工程で得られたオリゴ糖誘導体の全保護基を脱離させる工程を含む、請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（Ｄ−２）更に、前記（Ａ）又は（Ｃ）の工程で得られたオリゴ糖誘導体の全保護基を脱離させ、各Ｎ−アシルガラクトサミンを４位及び６位で選択的に硫酸化する工程を含む、請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖供与体が、前記一般式（２）又は（２’）によって表される化合物であり、前記糖受容体が、前記一般式（３）によって表される還元末端グルクロン酸型コンドロイチン誘導体であり、
前記（Ａ）又は（Ｃ）の工程で得られたオリゴ糖誘導体が、その非還元末端にＮ−アシルガラクトサミン誘導体を有する場合には、該非還元末端のＮ−アシルガラクトサミン誘導体の４位及び６位以外の水酸基をピバロイル基で保護し、
各Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体の４位及び６位を保護する基を脱離し、
該脱保護したオリゴ糖を硫酸化して、各Ｎ−アシルガラクトサミンにおける４位及び６位を選択的に硫酸化する、請求項１から１１及び１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記保護基が、ベンジリデン、アルコキシベンジリデン又はシクロヘキシリデンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記一般式（４’）によって表される、オリゴグリコサミノグリカン中間化合物：
【化１１】
2007530713.tif 000038
［上記一般式（４’）中、Ｒ’、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１１、Ｐ１１’、Ｇ１及びＧ２は、請求項２に定義する通りである］
【請求項１７】
下記一般式（４）で表される、還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン若しくは還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、またはそれらの塩若しくは誘導体：
【化１２】
2007530713.tif 000039
［上記一般式（４）中、
ｎは、２〜１０の整数であり；
Ｒ８は、水素原子または保護基を表し；
Ｒ９〜Ｒ１１は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子又は保護基を表し；
Ｒ１２及びＲ１３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群より選択され；
Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、水素原子、或いは任意にナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、アンモニウム、バリウム及びリチウムからなる群から選択されるいずれか１つで置換されている硫酸基又はリン酸基を表し；
Ｒ１６は、水素原子、又は下記一般式（５）で表されるグルクロン酸誘導体若しくはイズロン酸誘導体を示す］
【化１３】
2007530713.tif 000040
｛上記一般式（５）中、
Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子又は保護基、或いはナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、アンモニウム、バリウム又はリチウムを表し、
Ｒ２０は、水素原子または保護基を示す｝。
【請求項１８】
前記一般式（４）において、Ｒ１４及びＲ１５が、任意にナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、アンモニウム、バリウム及びリチウムからなる群から選択される１つで置換されている硫酸基である、請求項１７に記載の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、またはその塩若しくは誘導体。
【請求項１９】
ｎが、３〜６である、請求項１７又は１８に記載の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン若しくは還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、またはそれらの塩若しくは誘導体。
【請求項２０】
請求項１７から１９の何れか１項に記載の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン及び還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、並びにそれらの塩及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１つと、製剤上許容される担体とを含有する、医薬組成物。
【請求項２１】
ＣＤ４４分子によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防するための、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
自己免疫疾患、関節炎、アレルギー性疾患又は癌を治療するため、或いは免疫の調節、細胞分化の誘導又は細胞アポトーシスの誘導のために用いられる請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ＣＤ４４分子によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防する医薬組成物の製造のための、請求項１７から１９の何れか１項に記載の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン若しくは還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、またはそれらの塩若しくは誘導体の使用。
【請求項２４】
請求項１７から１９の何れか１項に記載の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン若しくは還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、またはそれらの塩若しくは誘導体を投与して、ＣＤ４４分子によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４個以上、特に５個以上の構成糖からなるオリゴグリコサミノグリカンを効率的に製造する化学的な製造方法に関する。また本発明は、ＣＤ４４分子の関与により誘発する症状若しくは疾患の改善、治療及び予防に有用な、５糖以上の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型コンドロイチン硫酸オリゴ糖及びこれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは、ウロン酸若しくはガラクトースまたはそれらの誘導体とヘキソサミンまたはその誘導体とからなる基本２糖単位の繰り返し構造を持つ多糖である。グリコサミノグリカンは、生体内では、基本２糖単位の約４０から１００回の繰り返しにより形成される非常に長い糖鎖として存在し、その多くはプロテオグリカン中のコア蛋白に共有結合している。
【０００３】
グリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸、へパリン、ケラタン硫酸などが知られている。コンドロイチン硫酸では、グルクロン酸若しくはその誘導体とＮ−アシルガラクトサミン若しくはその誘導体とが基本２糖単位を構成する。デルマタン硫酸では、イズロン酸若しくはその誘導体とＮ−アシルガラクトサミン若しくはその誘導体とが基本２糖単位を構成する。ケタラン硫酸では、ガラクトース若しくはその誘導体とＮ−アシルガラクトサミン若しくはその誘導体とが基本２糖単位を構成する。
【０００４】
近年、これらグリコサミノグリカンの細胞認識機能に高い関心が寄せられており、各種細胞において発現しているグリコサミノグリカンを含む糖鎖が細胞外成分との相互作用を介して種々の生理的機能に関与することが明らかにされている。
【０００５】
例えば、ＪＰ特表２００３−５１２８０７号では、イズロン酸と硫酸化アセチルガラクトサミンを有する２糖の繰り返し単位で構成される１６〜１００糖単位のデルマタン硫酸が、トロンビン生成及び補体活性化の阻害剤として有用であることが開示されている。また、ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ  ＆  ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．４，１９９９，ｐｐ．６５９−６６８では、マウスの関節リュウマチモデルにおいて、生体中に存在するヒアルロン酸が、様々な細胞機能に関与することが知られているＣＤ４４抗原と相互作用すること、並びに特定の抗体によりヒアルロン酸のＣＤ４４への結合を阻害すると、関節リュウマチの症状が軽減されることが開示されている。
【０００６】
更に、最近の研究では、生体から採取した長鎖のグリコサミノグリカンを切断して得ることができる、オリゴグリコサミノグリカン（以下、本明細書で「オリゴ」とは、２〜２０個の構成糖からなることを意味する。）であっても、細胞外成分と相互作用して、生理的機能に関与することが示唆若しくは指摘されている。
【０００７】
例えば、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖｏｌ．２７７，Ｎｏ．１５，ｐｐ．１２９２１−１２９３０，２００２には、４の構成糖からなるコンドロイチン硫酸Ｅは、Ｌ−セクレチン及びＰ−セクレチンと相互作用することが開示されている。但し、同文献では、硫酸化が一部若しくは全くなされていない対応コンドロイチンファミリーでは、Ｌ−セクレチン及びＰ−セクレチンと相互作用しないこともまた述べられている。さらに、同文献は、２個の構成糖からなるグリコサミノグリカンがＣＤ４４と相互作用することも開示しており、より具体的には、２個の構成糖からなるコンドロイチン、デルマタン及びヒアルロン酸が、その硫酸化若しくは非硫酸化とは無関係にＣＤ４４と相互作用すること、即ち、糖鎖上の硫酸基がＣＤ４４との相互作用に寄与しないことを指摘している。
【０００８】
同文献は、プラズモン共鳴アッセイにより各オリゴグリコサミノグリカンとＣＤ４４との相互作用を分析したことを記載するものであり、実際の生理的機能については実証していない。
【０００９】
この点、ＷＯ９６／１６９７３には、硫酸化アセチルグルコサミンを還元末端に有する２〜５の構成糖からなるオリゴケラタン硫酸が、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調整剤、細胞の分化誘導剤、及びアポトーシス誘導剤として有用であることが開示されている。
【００１０】
また、ＪＰ特開平５−１７８８７６号には、Ｄ−ガラクトサミン誘導体及びＤ−グルクロン酸誘導体からなる基本２糖単位を有する２〜８個の構成糖からなるオリゴコンドロイチンが、抗アレルギー作用、抗炎症作用及びヒアルロニダーゼ阻害作用を有することが記載されている。
【００１１】
但し、この特許文献では、単糖からなる糖供与体を逐次グリコシル結合させる開示の製造工程から明らかなように、実際に４個以上の糖からなるオリゴ糖が製造されたとの記載はない。当然に、この文献においては、２個の構成糖からなるコンドロイチンのみについて、薬理学的活性が実証されている。
【００１２】
また、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．３４，ｐｐ．３２２５９−３２２６５，２００３では、６〜１４個の構成糖からなる異なる鎖長のオリゴヒアルロン酸を含むオリゴマー混合物が、ＣＤ４４の分解を誘発し、その一方で、１０００個以上の構成糖からなるヒアルロン酸、並びに２個の構成糖からなるヒアルロン酸では、ＣＤ４４分解を誘発しないことが指摘されている。
【００１３】
ところで、オリゴグリコサミノグリカンの機能に対する関心が高まるにつれ、特定の鎖長、特定の位置に硫酸化等により特定の基を付加することにより形成される修飾基、及び特定の立体構造を有するオリゴグリコサミノグリカンを選択的に製造する方法に対する要求が強まってきている。
【００１４】
従来、オリゴグリコサミノグリカンを得る方法の１つとして、生体から採取した長鎖のグリコサミノグリカンを、分解酵素を用いて切断する方法が知られている（ＷＯ９６／１６９７３及びＪＰ特開平５−０５８７１６号）。
【００１５】
しかし、この酵素法による製造方法では、医薬製造へ適用する際に、他の生体成分の混入による副作用が問題と成り易い。また、この酵素による方法では、意図する鎖長のグリコサミノグリカンを得ることができず、実際に得られるものは殆ど２個の構成糖からなるものであった。また、修飾基、及び立体構造は、基本的に生体内から採取されるグリコサミノグリカンによって決定されるという制限もあった。
【００１６】
他方、不純物の混入がなく、意図する鎖長、意図する位置にある修飾基、及び／又は意図する立体構造を有するグリコサミノグリカンを得る方法として、化学的な合成方法が注目されている。
【００１７】
例えば、前記ＪＰ特開平５−１７８８７６号には、Ｄ−ガラクトサミン誘導体とＤ−グルクロン酸誘導体とをグリコシル結合を介して相互に逐次結合して、これら基本２糖単位の繰り返しからなる２〜８個のオリゴ糖を製造する方法が開示されている。
しかし、この方法は、単糖を逐次結合させる度に保護基による保護及びその離脱の工程を要するにも拘らず、４個以上の構成糖からなるグリコサミノグリカンを高収率で得るための配慮は何らなされていない。実際、同文献には、４個以上の構成糖からなるグリコサミノグリカンの製造を実証する例は何ら記載されていない。また、この文献には、特定の位置の水酸基を選択的に硫酸化する方法についても何ら開示されていない。
【００１８】
これに対して、本発明者らは、アジド化した２個の構成糖からなる糖供与体を、同じくアジド化した２個の構成糖からなる糖受容体と、ルイス酸であるＢＦ３・ＯＥｔ２の存在下で反応させることで、還元末端グルクロン酸型４糖コンドロイチン硫酸を得る方法を報告している（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０５（１９９８）４３−６３及びＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．１３，ｐｐ．１３５１−１３５４，１９９５）。
【００１９】
この方法は、上記特許公報に開示の方法における問題を解決し、還元末端グルクロン酸型４糖コンドロイチン硫酸を５０％の収率で得られるものである。
【００２０】
もっとも、これら文献に記載の製造方法では、５個以上の構成糖からなるアセチルガラクトサミンを合成する場合、アジド基をアセトアミド基に変換できず、５以上の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型コンドロイチン硫酸を合成することが困難であった。
【００２１】
また、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２６（２０００）８８−９７には、グリコサミノグリカンの意図する水酸基を選択的に硫酸化する方法が開示されている。しかし、同文献の方法は、Ｎ−アシルガラクトサミンをその４位又は６位の何れかで硫酸化する方法であり、４位及び６位の両方を選択的に硫酸化できるものではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、上述の従来技術の問題に鑑みてなされたものであり、４個以上、特に５個以上の構成糖からなる意図する鎖長及び構造のオリゴグリコサミノグリカンを、高収率、高純度で、高い立体選択性をもって製造できる方法を提供することを目的とする。また本発明は、この本発明の製造方法により初めて得られる、５以上の意図する数の構成糖からなる高純度の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸及びこれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、上記Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０５（１９９８）４３−６３に記載の製造方法について検討した。それで、本発明者らはアセトアミド化した構成糖からなる糖供与体及び糖受容体を用い、更に、プロモーターとして、当該糖供与体及び糖受容体に対するカウンターイオンとなるルイス酸、例えばトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル又はその類似化合物を用いることで、４以上の構成糖からなる意図する鎖長のオリゴグリコサミノグリカンを、高収率、高純度で製造し得ることを見出した。かくして、この知見により本発明を完成するに到った。
【００２４】
すなわち、本発明は、（Ａ）グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付加され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、還元末端にグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体を持つ糖供与体を、グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基が保護されている、非還元末端にＮ−アシルガラクトサミン誘導体を持つ糖受容体と、プロモーターとして、当該糖供与体に対するカウンターイオンとして存在するルイス酸、例えば後記一般式（１）：
【化１】
2007530713.tif 000002
によって表される化合物の存在下、グリコシル化反応に供する工程を含むことを特徴とする、オリゴグリコサミノグリカンまたはその特有のグリコシル化反応工程中に得られる特徴的な中間体の製造方法を提供するものである。
【００２５】
本発明はまた、好適な一実施形態において、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付加され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体、或いはグリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体（通常２から１０の構成糖からなる）を含有する糖供与体を；グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている非還元末端のグルクロン酸若しくはイズロン酸の誘導体、或いはグリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸若しくはイズロン酸の誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体からなる糖受容体と；前記プロモーターの存在下でグリコシル化反応に供する工程（Ａ）を含むことを特徴とする、オリゴグリコサミノグリカン又はその中間体の製造方法を提供する。
【００２６】
本発明の製造方法は、好適な一実施形態において、上記（Ａ）工程に加え、前記（Ａ）の工程で得られたオリゴ糖誘導体の非還元末端における１個の保護基を脱離する工程（Ｂ）と、当該１個の保護基を脱離したオリゴ糖誘導体を、前記プロモーターの存在下、前記糖供与体、好ましくは１又は２個の構成糖からなる前記糖供与体と、グリコシル化反応に供する工程（Ｃ）とを含む。また、当該（Ｂ）及び（Ｃ）の工程を、１から８回の所定の回数繰り返すことで、５以上の構成糖からなる意図する鎖長のオリゴグリコサミノグリカンを製造することができる。高収率化の点では、当該（Ｂ）及び（Ｃ）の工程を１〜５回繰り返すことで、意図する鎖長のオリゴグリコサミノグリカンを製造することが好ましい。
本発明の製造方法では、目的とするオリゴグリコサミノグリカンに応じて前記糖供与体及び糖受容体を選択すればよい。例えば、還元末端グルクロン酸型オリゴグリコサミノグリカン若しくはその誘導体を製造する場合には、糖供与体として、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体、或いは全水酸基が保護されているＮ−アシルガラクトサミン誘導体と、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体（通常、２から１０の構成糖からなる）を用いることができる。
【００２７】
より具体的には、オリゴコンドロイチン又はその誘導体を製造する場合には、下記一般式（２）又は（２’）：
【化２】
2007530713.tif 000003
で表される１又は２の構成糖からなる糖供与体を用いることができる。
【００２８】
同様に、還元末端グルクロン酸型オリゴグリコサミノグリカン又はその誘導体を製造する場合には、糖受容体として、グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体、或いはグリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているＮ−アシルガラクトサミン誘導体と、全水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体（通常、２から１０の構成糖からなる）を用いることができる。
【００２９】
より具体的には、オリゴコンドロイチン又はその誘導体を製造する好適な実施の形態においては、下記一般式（３）：
【化３】
2007530713.tif 000004
で表される２個の構成糖からなる糖供与体を用いることができる。
【００３０】
また、本発明で用いられるプロモーターは、前記一般式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、同一又はそれぞれ独立して、水素原子であるか、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基である前記一般式（１）によって表される化合物が好ましい。例えばトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）等、当該アルキル基の炭素数が５以下の化合物が特に好ましい。
【００３１】
本発明の製造方法は、通常、前記（Ａ）又は（Ｃ）工程で得られたオリゴ糖の全保護基を脱離させる工程を含む。また、目的に応じて、前記（Ａ）又は（Ｃ）工程で得られたオリゴ糖の全保護基を脱離させる工程とともに、４位及び／又は６位で各Ｎ−アセチルグルコサミンを選択的に硫酸化する工程を含ませることもできる。言うまでもないが、これらの保護基脱離工程及び／又は硫酸化工程は、前記（Ａ）又は（Ｃ）工程と切り離して、異なる者が行い得る。
【００３２】
好適な一実施形態において、本発明は、前記（Ａ）又は（Ｃ）工程で得られたオリゴ糖誘導体の各Ｎ−アシルガラクトサミンにおける４位及び６位の水酸基をベンジリデン、アルコキシベンジリデン及び／又はシクロヘキシリデンで保護し、オリゴ糖非還元末端の構成糖における４位及び６位以外の位置にある水酸基をピバロイル基で保護し、４位及び６位の水酸基を保護させたベンジリデン、アルコキシベンジリデン及び／又はシクロヘキシリデンを脱離し、その後、脱保護された４位及び６位の水酸基を硫酸化することにより、各Ｎ−アシルガラクトサミンにおける４位及び６位を選択的に硫酸化する工程を含むことができる。
【００３３】
本発明はまた、本発明の製造方法の工程中に生じる特徴的な構造を有する、下記一般式（４’）：
【化４】
2007530713.tif 000005
によって表されるオリゴグリコサミノグリカンの中間体をも包含するものである。
【００３４】
本発明はさらに、上記本発明の製造方法により得られる、新規の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン、還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、還元末端イズロン酸型オリゴコンドロイチン又は還元末端イズロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸、或いはそれらの塩又は誘導体（以下、「還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等」と略記することがある）を提供する。
【００３５】
具体的には、本発明は、下記一般式（４）：
【化５】
2007530713.tif 000006
で表わされる、還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等を提供する。
【００３６】
本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等においては、ＣＤ４４に対するシェディング誘導能の点で、後記一般式（４）中、少なくともＲ１４及びＲ１５の何れか１つが任意にナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、アンモニウム、バリウム及びリチウムからなる群から選択される何れか１つで置換されている硫酸基である一般式（４）によって表される化合物が好ましく、Ｒ１４及びＲ１５のいずれも任意にナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、アンモニウム、バリウム及びリチウムからなる群から選択される何れか１つで置換されている硫酸基である一般式（４）によって表される化合物が特に好ましい。また、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等は、効率的な生産及びＣＤ４４に対するシェディング誘導能の点で、上記一般式（４）中、ｎが３〜６である一般式（４）によって表される化合物が好ましい。
【００３７】
また、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等は、他の生体成分である脂質、蛋白等の不純物は全く含有していない。
【００３８】
本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等は、ＣＤ４４に対するシェディング誘導能に関し高い活性を有するため、ＣＤ４４分子によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防するための活性成分として使用することができる。
【００３９】
かくして、本発明は、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等と、製剤上許容される担体とを含有する、ＣＤ４４分子によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防するための、医薬組成物も提供するものである。
【００４０】
また、本発明によれば、ＣＤ４４分子の作用によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防する医薬組成物の製造のための、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）の使用も提供される。
【００４１】
更に、本発明によれば、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等を対象に投与する、ＣＤ４４分子の作用によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の製造方法は、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基が付与され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体を末端に持つ糖供与体を、グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基が保護されているＮ−アシルガラクトサミン誘導体を末端に持つ糖受容体と、特定のルイス酸型のプロモーターの存在下、グリコシル化反応に供する工程（Ａ）を含むものである。
【００４３】
また、本発明の製造方法は、その好適な一実施形態において、更に前記（Ａ）の工程で得られたオリゴ糖誘導体の非還元末端における保護基を脱離する工程（Ｂ）と、非還元末端にフリーの水酸基を持つ当該オリゴ糖誘導体を、前記プロモーターの存在下、前記糖受容体とグリコシル化反応させる工程（Ｃ）とを含み、この工程（Ｂ）及び（Ｃ）を１から８回の意図する回数を繰り返すものである。
【００４４】
以下、本発明の一実施形態における反応スキームを示す図１〜５並びに図１１を参照しながら、各工程について具体的に説明する。図１〜５並びに図１１は、代表的な例として、後述する５又は６の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型コンドロイチン硫酸を得るための反応スキームを示すものである。従って、本発明は、これらの図面によって何ら制限されるものではない。他のオリゴグリコサミノグリカンを製造する場合には、目的とするオリゴグリコサミノグリカンに応じて、適宜、対応する糖供与体、糖受容体及び保護基が選択されるものと理解されるべきである。
【００４５】
以下で述べる本発明においては、「アルキル」、「アルケニル」、「アラルキル」、「アルコキシ」、「アリール」、「アルキリデン」、「アシル」及び「エーテル」の基は、それぞれ、通常、以下に記載する数の炭素原子を有する：
アルキル基：通常１から１０、好ましくは１から７、より好ましくは１から５；
アルケニル基：通常２から１０、好ましくは１から７、より好ましくは１から５；
アラルキル基：通常６から３０、好ましくは７から２０、より好ましくは６から１５；
アルコキシ基：通常１から１０、好ましくは１から７、より好ましくは１から５；
アリール基：通常５から２０、好ましくは６から１５、より好ましくは６から１３；
アルキリデン基：通常１から１０、好ましくは１から７、より好ましくは１から５；
アシル基：通常１から２０、好ましくは１から１０、より好ましくは２から７；及び
エーテル基：通常２から２０、好ましくは２から１０、より好ましくは２から７。
【００４６】
（Ａ）アセトアミド化した糖供与体と糖受容体とのグリコシル化
（Ａ−１）糖供与体
図１及び図１１に示すように、本発明で用いられる糖供与体は、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基（図１及び図１１中、Ｉｍで示す）が付加され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護（図１及び図１１中、Ｐ２−Ｐ６及びＰ６’で示す）されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体を還元末端に有するものであればよい。また、グリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基（図１１中、Ｉｍで示す）が付加され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護（図１１中、Ｐ２−Ｐ５’で示す）されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体、或いはグリコシル化に付する還元末端の水酸基に脱離基（図１中、Ｉｍで示す）が付加され、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護（図１中、Ｐ２−Ｐ６及びＰ６’で示す）されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体（通常、２から１０の構成糖からなる）が好ましい。
【００４７】
このようなアセトアミド化した構成糖からなる糖供与体を用いることで、４糖以上に伸長させた時にアセトアミド化することから生じる低収率の問題を回避することができる。
【００４８】
本発明で用いられる糖供与体は、その他の点では特に制限はなく、目的とするオリゴグリコサミノグリカンの種類に応じて選択すればよい。
【００４９】
例えば、オリゴコンドロイチン硫酸を製造する場合には、糖供与体は、還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がイミデート化されており、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸誘導体、或いは還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がイミデート化されており、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体を含んでよい。
【００５０】
同様に、デルマタン硫酸を製造する場合には、糖供与体は、非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がイミデート化されており、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているイズロン酸誘導体、或いは非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がイミデート化されており、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とイズロン酸誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体等を含んでよい。また、ケタラン硫酸を製造する場合には、非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がイミデート化されており、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているガラクトース誘導体、或いは非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がイミデート化されており、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とガラクトース誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体を含んでよい。
【００５１】
これら糖供与体の保護基としては、例えば、メチル及びエチル等のアルキル基、ベンジル及びメチルベンジル等のアラルキル基、ｐ−メトキシベンジル等のアルコキシベンジル基、トリフェニルメチル等のトリフェニルアルキル基、アリル等のアルケニル基、ハロゲン、チオメチル基等のチオアルキル基、イソプロピリデン等のアルキリデン基、ベンジリデン及びアルコキシベンジリデン（例えば、ｐ−メトキシベンジリデン）等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたベンジリデン基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシクロヘキシリデン、ベンゾイル、アセチル及びモノクロロアセチル等のハロゲンで任意に置換されたアシル基、スルホニル基、又はアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル若しくはシリルエーテル基等を含むことができる。
【００５２】
本発明においては、グリコシル化反応による伸長、及び選択的な硫酸基の付加等により、所望の構造の化合物が得られるように、その目的化合物に応じて、適当に、保護基、置換基を設計することが望ましい。
【００５３】
例えば、後の追加の糖供与体とのグリコシル化反応に付する位置の保護基（例えば、図１のＰ５）は、グリコシル化に先立って所望の位置の保護基のみを脱離できるように、ハロゲンで任意に置換されたアセチル基、アリル等のアルケニル基、アシル基、アラルキル基、又はトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基が好ましく、特にモノクロロアセチル、ｐ−メトキシベンジル又はレブリノイルが好ましい。
【００５４】
また、安定なカルボカチオンオルトエステル構造を有する反応中間体を経由させて所望の最終生産物を高収率で得るためには、糖供与体の２位の水酸基を電位供与置換基、例えばアシル基で保護することが好ましく、特にオルトエステルカルボカチオンの共役系が長く、安定なカチオン構造を取り易い、アルキル基又はアルコキシ基で任意に置換されたベンゾイル基で保護することが好ましい（図１及び１１中、２位の保護基をＰ２で示す）。
【００５５】
そのような任意に置換されているベンゾイル系の置換基としては、ベンゾイル、メチルベンゾイル、エチルベンゾイル、プロピルベンゾイル、ジメチルベンゾイル、メトキシベンゾイル、エトキシベンゾイル及びジメトキシベンゾイル等があり、中でもメトキシベンゾイルが好ましい。
【００５６】
さらに、各Ｎ−アシルガラクトサミンの４位及び６位（図１中、４位及び６位の保護基をＰ６及びＰ６'で示す）で選択的に硫酸化を行なわせるためには、これらの位置をベンジリデン、ｐ−メトキシベンジリデン等のアルコキシベンジリデン、又はシクロヘキシリデンで保護しておくことが好ましい。
【００５７】
また、製造工程全般に亘って、特定の位置を保護する場合には、メチル等のアルキル基、ベンジル及びメチルベンジル等のアラルキル基、トリフェニルメチル等のアルキル芳香族基、ｐ−メトキシベンジル基等のアルコキシベンジル基、アリル等のアルケニル基、又はベンゾイル、アセチル及びモノクロロアセチル等のハロゲンで任意に置換されているアシル基を保護基として使用することが好ましい。これら保護基は、当業者に周知の方法により形成することができる。
【００５８】
本発明で用いられる糖供与体の好適な例として、後述する還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸を製造するために用いられる糖供与体を下記一般式（２）及び（２’）に示す。
【化６】
2007530713.tif 000007
【００５９】
一般式（２）および（２’）中、Ｒ４及びＲ５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、任意にハロゲンで置換されたアセチル基、アルキル基、アリル等のアルケニル基、任意にハロゲンで置換されたアシル基及びフタロイル基からなる群より選択され、好ましくはアセチル、ハロアセチル、ベンゾイル及びフタロイルからなる群より選択される。
【００６０】
Ｉｍは、任意にハロゲンで置換されたイミドイル基であり、好ましくはトリクロロアセトイミドイル、トリフルオロアセトイミドイル及びアセトイミドイルからなる群から選択される脱離基である。
【００６１】
Ｐ２及びＰ３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、好ましくはベンジル、アルキルベンジル、トリフェニルアルキル及びシリルからなる群から選択される。
【００６２】
Ｐ４は、アルキル基、アリル等のアルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、好ましくはベンジル、アルキルベンジル及びハロアルキルからなる群から選択される。
【００６３】
Ｐ５及びＰ５’は、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたベンジル基、アリル等のアルケニル基、任意にハロゲンで置換されたアセチル等の任意にハロゲンで置換されたアシル基、アラルキル基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、好ましくはモノクロロアセチル、ｐ−メトキシベンジル及びレブリノイルからなる群から選択される。
【００６４】
また、Ｐ６及びＰ６’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され、好ましくはベンジル、ベンジリデン及びシリルからなる群から選択される。
【００６５】
上記糖供与体の具体的な例としては、メチル（２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−レブリノイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−＞４）−２，３−ジ−Ｏ−（４−メチルベンゾイル）−１−Ｏ−トリクロロアセトイミドイル−α−Ｄ−グルコピラヌロネート並びにメチル２，３−ジ−Ｏ−（４−メチルベンゾイル）−１−Ｏ−トリクロロアセトイミドイル−α−Ｄ−グルコピラヌロネート等がある。
【００６６】
このような糖供与体は、従来知られている方法で得ることができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０５（１９９８）４３−６３に記載の方法で得ることができる。
【００６７】
（Ａ−２）糖受容体
図１および図１１に示すように、本発明において用いられる糖受容体は、グリコシル化に付する非還元末端の水酸基がフリーであり、その他の水酸基が保護されているＮ−アシルガラクトサミン誘導体（１個の構成糖からなる場合には、グルクロン酸又はイズロン酸の誘導体）を末端に有するものであればよい。そのような糖受容体は、非還元末端の構成糖におけるグリコシル化に付する水酸基がフリーであり（図１中、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体の３位の水酸基がこれに相当する）、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護（図１及び１１中、保護基をＰ７−Ｐ１１及びＰ１１’で示す）されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体との基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体（通常は、２から１０の構成糖からなる）、或いは非還元末端のグリコシル化に付する水酸基がフリーであり（図示せず）、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸又はイズロン酸の誘導体が好ましい。
【００６８】
糖供与体と同様に、アセトアミド化した構成糖からなる糖受容体を用いることで、４糖以上に伸長させた時にアセトアミド化することより生じる低収率の問題を回避することができる。
【００６９】
糖受容体も、その他の点では特に制限はなく、目的とするオリゴグリコサミノグリカンの種類に応じて選択すればよい。
【００７０】
例えば、オリゴコンドロイチン硫酸を製造する場合に、糖受容体としては、非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているグルクロン酸誘導体、或いは非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とグルクロン酸誘導体とからなる基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体等がある。
【００７１】
同様に、デルマタン硫酸を製造する場合に、糖受容体としては、非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているイズロン酸誘導体、或いは非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とイズロン酸誘導体との基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体等がある。また、ケタラン硫酸を製造する場合に、糖受容体としては、非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されているガラクトース誘導体、或いは非還元末端の構成糖においてグリコシル化に付するための水酸基がフリーであり、その他の水酸基及びカルボキシル基が保護されている、Ｎ−アシルガラクトサミン誘導体とガラクトース誘導体との基本２糖単位を基本構成単位として有するオリゴ糖誘導体等がある。
【００７２】
これら糖受容体の保護基としては、例えば、メチル及びエチル等のアルキル基、ベンジル等のアラルキル基、トリフェニルメチル等のトリフェニルアルキル基、アリル等のアルケニル基、ハロゲン、チオメチル等のチオアルキル基、イソプロピリデン等のアルキリデン基、ｐ−メトキシベンジリデン等のアルコキシベンジリデン基及びベンジリデンなどのアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたベンジリデン基、アルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシクロヘキシリデン基、アセチル及びモノクロロアセチル等のハロゲンで任意に置換されたベンゾイル又はアセチルなどのハロゲンで任意に置換されたアシル基、スルホニル基、シリルエーテル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基又はアルケニル基等がある。
【００７３】
本発明においては、糖供与体と同様に、その目的化合物に応じて、適当に糖受容体の保護基及び置換基を設計しておくことが望ましい。
【００７４】
例えば、還元末端の構成糖におけるアノマー性炭素の位置の水酸基（図１及び１１中、そのような水酸基のための保護基はＰ７で示す）は、ｐ−メトキシフェニル等のアルコキシ芳香族基で保護することが好ましい。
【００７５】
同様に、例えば、各Ｎ−アシルガラクトサミンの４位及び６位（図１及び１１中、４位及び６位の保護基をＰ１１及びＰ１１’で示す）に、選択的に硫酸化を行なわせるためには、これらの位置をベンジリデン；ｐ−メトキシベンジリデン等のアルコキシベンジリデン、又はシクロヘキシリデンで保護することが好ましい。
【００７６】
また、製造工程全般に亘って、特定の位置を保護する場合には、メチル等のアルキル基、ベンジル及びメチルベンジル等のアラルキル基、トリフェニルメチル等のアルキル芳香族基、ｐ−メトキシベンジル等のアルコキシベンジル基、アリル等のアルケニル基、例えば、アセチル又はモノクロロアセチル等のハロゲンで任意に置換されたベンゾイル及びアセチルなどのハロゲンで任意に置換されたアシル基を保護基として使用することが好ましい。これら保護基の形成は、当業者に周知の方法により行なうことができる。
【００７７】
ここで、本発明で用いられる糖受容体の好適な一実施形態として、後述する還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸を製造するために使用する糖受容体の一例を下記一般式（３）に示す。
【化７】
2007530713.tif 000008
【００７８】
一般式（３）中、Ｒ６及びＲ７は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、ハロゲンで任意に置換されたアセチル等のハロゲンで任意に置換されたアシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、好ましくはアセチル、ハロアセチル、ベンゾイル及びフタロイルからなる群から選択される。
【００７９】
また、Ｐ７は、アルキル基、アラルキル基、アリル等のアルケニル基及びアリール基からなる群から選択され、好ましくはフェニル、アルキルフェニル、アルコキシフェニル、ベンジル、アルキルベンジル、アルコキシベンジル、ナフチル及びトリフェニルアルキルからなる群から選択される。
【００８０】
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、好ましくはベンジル、アルキルベンジル、トリフェニルアルキル及びシリルからなる群から選択される。
【００８１】
また、Ｐ１０は、ハロゲンで任意に置換されたアルキル基、アリル等のアルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、好ましくはベンジル、アルキルベンジル及びハロアルキルからなる群から選択される。
【００８２】
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基、アルケニル基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され、好ましくはベンジル、ベンジリデン及びシリルからなる群から選択され、両者間を架橋するものを含む。
【００８３】
上記糖受容体の具体的な例としては、メチル（２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−＞４）−［４−メトキシフェニル−２，３−ジ−Ｏ−（４−メチルベンゾイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド］ウロナートがある。
【００８４】
このような糖受容体は、従来より知られている方法で得ることができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる前記Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０５（１９９８）４３−６３又はＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．１３，ｐｐ．１３５１−１３５４，１９９５に記載の方法により得ることができる。
【００８５】
（Ａ−３）プロモーター
図１および図１１に示すように、本発明においては、上記糖供与体を、上記糖受容体と、これら糖供与体及び糖受容体に作用し得るプロモーターとして使用される、カウンターイオンを有するルイス酸によりグリコシル化反応させる。
【００８６】
本発明においては、特に下記一般式（１）で示す化合物をプロモーターとして用いることが好ましい。
【化８】
2007530713.tif 000009
上記一般式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又はそれぞれ独立して、ハロゲン原子、或いは置換されていないか少なくとも一部の水素原子が置換されている、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基または芳香族基を示し、Ｔｆは、トリフルオロメタンスルフォニル基を示す。
【００８７】
上記プロモーターを用いることで、驚くべきことに、従来の方法、すなわちＢＦ３・ＯＥｔ２を用いる方法に比べ、２０％以上収率を向上させることができる。
【００８８】
また本発明の方法は、従来の方法では合成することができなかった、５個以上の構成糖からなるコンドロイチン型糖鎖（アセトアミド型の糖鎖）或いは当該糖鎖に変換可能な糖鎖を合成することができる。
【００８９】
上記プロモーターとしては、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリエチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリプロピルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸ジメチルエチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリベンジルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリナフチルシリル又はトリフルオロメタンスルホン酸トリベンジルメチルシリルがある。
【００９０】
本発明においては、収率の点で、上記一般式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、水素原子又は直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基である一般式（１）によって表されるプロモーターが特に好ましい。通常、入手が容易であることから、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）を用いる。
【００９１】
本発明における当該グリコシル化反応は、通常−４０℃〜４０℃の温度で、１２〜４８時間行なう。また、モレキュラーシーブ等の捕捉体により、系内の水及びハロゲン化水素酸等を除去しておくことが好ましい。
【００９２】
（Ｂ）糖鎖還元末端の構成糖におけるグリコシル化に付する位置の保護基の脱離
本発明の製造方法において更に糖鎖を伸長させる場合、（Ｃ）の項で述べる伸長反応に先立って、図２に示すように、上記（Ａ）の工程で得られたオリゴ糖について、グリコシル化に付する位置に存する保護基（例えば図１中のＰ５）を脱離する工程を行なう。
【００９３】
当該脱離工程は、グリコシル化に付する位置の保護基（Ｐ５）及びその他の保護基（Ｐ２−Ｐ４及びＰ６−Ｐ１１’）に応じて、好適な脱離反応を選択することにより行えばよい。
【００９４】
例えば、グリコシル化に供する位置の保護基（Ｐ５）として、レブリノイル、モノクロロアセチル等を用いる場合には、（Ａ）の工程で得られたオリゴ糖を、エタノール／トルエン混合液等の有機溶媒に溶解後、例えばヒドラジン酢酸等と反応させることにより、目的の保護基を脱離することができる。
【００９５】
当該脱離反応は、通常０〜６０℃で０．５〜５時間行なう。また、通常、保護基を脱離した目的のオリゴ糖を、高収率、高純度で単離するために、反応後、溶媒を留去し、残さをゲル濾過等で精製する。
【００９６】
（Ｃ）伸長反応
図３に示すように、本発明の一実施形態においては、上記（Ｂ）工程によりグリコシル化に供する位置にある保護基（Ｐ５）を脱離したオリゴ糖を、更に、（Ａ）工程と同様のプロモーターの存在下、（Ａ）工程と同様の糖供与体とグリコシル化させることにより、５個以上の構成糖を有するオリゴグリコサミノグリカンを製造することができる。
【００９７】
本発明においては、この工程においても（Ａ）工程と同様のプロモーター、及び糖供与体を用いるため、構成糖が５個以上の意図する鎖長を有するオリゴグリコサミノグリカンを、高い収率で化学合成することができる。
【００９８】
この工程の各種条件は、前記（Ａ）の工程で述べたものと基本的に同様である。
【００９９】
本発明の一実施形態においては、前記保護基脱離工程（Ｂ）とこの伸長工程（Ｃ）を、１から８回の意図する回数繰り返すことで、５個以上の構成糖からなる意図する鎖長のオリゴグリコサミノグリカンを製造することができる。本発明においては、単にこの反応サイクルの回数を決定するだけで目的のオリゴグリコサミノグリカンの鎖長を制御する。従って、停止反応は不要である。また、所望の鎖長を有するオリゴグリコサミノグリカンのみを簡易に得ることができる。もっとも、高い収率を維持して、所望のオリゴグリコサミノグリカンを効率的に製造するためには、保護基脱離工程（Ｂ）及び伸長工程（Ｃ）を１〜６回繰り返すことが好ましく、１〜５回繰り返すことがより好ましく、１〜４回繰り返すことが特に好ましい。
【０１００】
（Ｄ）全保護基の脱離、並びに選択的硫酸化
本発明の製造方法は、前記（Ａ）又は（Ｃ）工程の後、更に、図４に示すような、これらの工程で得られたオリゴ糖の全保護基（例えば図１中のＰ２−Ｐ１１’）を脱離させる工程、或いは前記（Ａ）又は（Ｃ）工程で得られたオリゴ糖の全保護基（例えば図１中のＰ２−Ｐ１１’）を脱離させる工程と、各構成糖を特定の位置で選択的に硫酸化する工程（例えば、図５及び図１１では、４位及び６位の水酸基に結合している硫酸Ｎａを表している）を含ませることができる。
【０１０１】
前記（Ａ）又は（Ｃ）工程で得られたオリゴ糖の保護基の脱離は、従来の方法を利用して行えばよく、前記の保護基の種類に応じて、適切な反応手順により、保護基を脱離することが好ましい。
【０１０２】
例えば、保護基が、レブリノイルの場合には、（Ａ）又は（Ｃ）の工程で得られたオリゴ糖を、エタノール／トルエン混合液等の有機溶媒に溶解後、例えばヒドラジン酢酸等と反応させることにより、目的の保護基を脱離することができる。また、保護基がベンジリデン、アルコキシベンジリデン又はシクロヘキシリデンの場合には、ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール混合液等に、（Ａ）又は（Ｃ）の工程で得られたオリゴ糖或いは追加の他の保護基脱離工程に付したオリゴ糖を溶解し、次いで、カンファースルホン酸、酢酸、塩酸等の酸で加水分解することにより、保護基を脱離することができる。
【０１０３】
また、アセチル、ベンゾイル等のアシル基は、水性テトラヒドロフラン等の溶媒中で、水酸化リチウム及び水酸化ナトリウム等のアルカリを用いた加水分解により除去することができる。
【０１０４】
（Ａ）又は（Ｂ）の工程で得られたオリゴ糖の全保護基を脱離させるとともに、各構成糖における特定位置の水酸基を選択的に硫酸化するには、その他の水酸基を保護しながら硫酸化する位置の保護基のみを選択的に脱離させることにより、硫酸化を行なうことが望ましい。
【０１０５】
具体的には、例えば、各Ｎ−アシルガラクトサミンの４位及び６位で選択的に硫酸化するためには、各Ｎ−アシルガラクトサミンの４位及び６位を、ベンジリデン、アルコキシベンジリデン及びシクロヘキシリデンの少なくとも１つで保護し、各グルクロン酸誘導体の総ての水酸基及びカルボキシル基を、アルキル基又はアシル基で保護した糖供与体及び糖受容体を用いて、前記（Ａ）又は（Ａ）〜（Ｃ）の工程からなるプロセスを行なう。
【０１０６】
次いで、（Ａ）又は（Ｃ）の工程で得られたオリゴ糖の非還元末端にある構成糖がＮ−アシルガラクトサミンの場合には、その４位及び６位以外の水酸基をピバロイル基で置換する。
【０１０７】
例えば、レブリノイル等の保護基をピバロイル基で置換する場合には、レブリノイル基等の保護基を持つオリゴ糖を、エタノール／トルエン混合液等の有機溶媒に溶解後、ヒドラジン酢酸と反応させて、レブリノイル等の保護基を脱離させ、次いで、得られた化合物を、例えばピリジン等に溶解後、塩化ピバロイルと、Ｎ，Ｎジメチルアミノピリジン等の触媒の存在下で、反応させればよい。
【０１０８】
次いで、ピバロイル化されたオリゴ糖のベンジリデン、アルコキシベンジリデン及び／又はシクロヘキシリデンを脱離させ、Ｎ−アシルガラクトサミンの４位及び６位を選択的に脱保護する。
【０１０９】
例えば、ベンジリデンの脱離は、ジクロロメタン／メタノール混合液等に、硫酸化の対象であるオリゴ糖を溶解し、次いでカンファースルフォン酸、酢酸及び塩酸等の酸で加水分解することにより、実施できる。
【０１１０】
硫酸化は、例えばＮ−アシルガラクトサミン構成糖の所望の位置、例えば、上記のように４位及び６位の位置で脱保護された対象オリゴ糖を、ジメチルホルムアルデヒド等の溶媒に溶解し、次いでこのオリゴ糖を例えば三酸化硫黄トリメチルアミン錯体等と反応させて行なえばよい。この反応中の反応温度は、通常０〜１００℃であり、反応時間は、通常１２〜７２時間である。
【０１１１】
保護基脱離工程の他の事項は、前記した通りである。また、目的のオリゴ糖を、高収率、高純度で単離するために、各工程終了後、溶媒を留去し、残さを例えばゲル濾過等で精製することが好ましい。
【０１１２】
（Ｅ）中間体
次に、以上のような方法により得られる、オリゴグリコサミノグリカンの特徴的中間体について説明する。
【０１１３】
本発明の中間体の一実施形態は、下記一般式（４’）で表されるものである：
【化９】
2007530713.tif 000010
［上記一般式（４’）中、
Ｒ’は、アルキル基、アルケニル基、アラリキル基及びアリール基からなる群より選択され、好ましくはフェニル、メチルフェニル、エチルフェニル、プロピルフェニル、ジメチルフェニル、メトキシルフェニル、エトキシルフェニル及びジメトキシルフェニルからなる群から選択され；
Ｐ３は、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され；
Ｐ４は、アルキル基、アリル等のアルケニル基、及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され（これらのうち２つの基が架橋して１つになったものも含む）；
Ｇ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリル等のアルケニル基、アリール基、及び下記一般式（４−１）：
【化１０】
2007530713.tif 000011
｛式（４−１中、
ｍは、０から４の整数であり、
Ｒ６及びＲ７は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ１０は、アルキル基、アリル等のアルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ１１及びＰ１１’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され（これらの２つの基が架橋して１つになったものも含む）、
Ｇ１’は、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、及び下記一般式（４−１’）によって表される化合物からなる群から選択される｝
【化１１】
2007530713.tif 000012
（式（４−１’）中、
Ｐ７は、アルキル基、アラルキル基、アリル等のアルケニル基及びアリール基からなる群から選択され、
Ｐ８及びＰ９は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ１０は、アルキル基、アリル等のアルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択される）
によって表される化合物からなる群から選択され；
Ｇ２は、水素原子、アリル等のアルケニル基、アシル基、アラルキル基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及び下記一般式（４−２）によって表される化合物：
【化１２】
2007530713.tif 000013
｛式（４−２）中、
λは、０から４の整数であり、
Ｒ４及びＲ５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ２及びＰ３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ４は、アルキル基、アリル等のアルケニル基及びアラルキル基からなる群から選択され、
Ｐ６及びＰ６’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択され、
Ｇ２’は、水素原子、アリル等のアルケニル基、アシル基、アラルキル基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、および下記一般式（４−２’）によって表される化合物からなる群から選択される｝
【化１３】
2007530713.tif 000014
（式（４−２’）中、
Ｒ４及びＲ５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アシル基、及びフタロイル基からなる群から選択され、
Ｐ５は、アリル等のアルケニル基、アシル基、アラルキル基、及びトリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基からなる群から選択され、
Ｐ６及びＰ６’は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、アラルキル基、アリール基、トリメチルシリル等のアルキル基若しくはアルコキシ基で任意に置換されたシリル基、及びアルキリデン基からなる群から選択される）
からなる群から選択される］。
【０１１４】
この中間体は、ルイス酸のカウンターイオンによって安定化されているオルトエステル型中間体及び当該オルトエステル型中間体が更に他の供与体又は受容体のアセトアミド基における酸素原子に結合している中間体である。
【０１１５】
これらの中間体は、その安定化されたオルトエステル構造により、所望のオリゴグリコサミノグリカン及びその類似体を、高い立体選択性をもって高い収率及び高い純度で得ることを可能にしている。
【０１１６】
（Ｅ）新規オリゴグリコサミノグリカン
次に、上記の化学的合成方法により得られる、本発明の新規オリゴグリコサミノグリカンについて説明する。
【０１１７】
本発明の新規オリゴグリコサミノグリカンは、還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等に関するものであり、下記一般式（４）で表されるものである。
【化１４】
2007530713.tif 000015
［上記一般式（４）中、
ｎは、２〜１０の整数であり；
Ｒ８は、水素原子または保護基を示し；
Ｒ９〜Ｒ１１は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子又は保護基を示し；
Ｒ１２及びＲ１３は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル等のアルケニル基、任意にハロゲンで置換されたアシル基、及びフタロイル基からなる群より選択され、好ましくはそれぞれアセチル、ハロアセチル、ベンゾイル及びフタロイルからなる群より選択され；
Ｒ１４及びＲ１５は、同一又はそれぞれ独立して、水素原子、或いは任意にナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、アンモニウム、バリウム及びリチウムからなる群から選択される１つでその水素原子が置換されている硫酸基又はリン酸基を示し；
Ｒ１６は、水素原子、保護基、又は下記一般式（５）によって表されるグルクロン酸誘導体若しくはイズロン酸誘導体を示す。］
【化１５】
2007530713.tif 000016
｛上記一般式（５）中、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は、前記一般式（４）のＲ９〜Ｒ１１と同じであり、Ｒ２０は、前記一般式（４）のＲ９と同じである｝
【０１１８】
本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等においては、上記式（４）中のＲ８、Ｒ９〜Ｒ１１及びＲ１６が示す保護基について特に制限はないが、例えばメトキシフェニル基がある。
また、次に述べるＣＤ４４に対するシェディング誘導能の点で、上記一般式（４）中のＲ１４及びＲ１５の少なくとも１つが硫酸基であるものが好ましく、Ｒ１４及びＲ１５が硫酸基であるものが特に好ましい。
【０１１９】
また、一般式（４）に表される還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン若しくは還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸またはそれらの誘導体の塩としては、それらの金属塩が好ましく、特にそれらのカリウム及びナトリウム塩が好ましい。
【０１２０】
本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等は、上記の如く、還元末端は常にグルクロン酸若しくはその誘導体であり、酵素分解による方法では得られない構造を有する。しかも、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等は、生体の他の成分である脂質や蛋白等の混入は全くない。更には、特定の１つの鎖長を有するもののみからなる点でも酵素分解による方法で得られるものとは異なる。
【０１２１】
更に、前記本発明の製造方法による結果、従来の化学合成法では得られない５個以上の構成糖からなるオリゴコンドロイチン又はその硫酸化物を初めて提供できるものである。この新規のオリゴコンドロイチン又はその硫酸化物は、この分野の研究に大きく寄与するであろう。
【０１２２】
次に、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等の医薬的応用について説明する。
【０１２３】
本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等は、ＣＤ４４分子に対するシェディング誘導能に関し、高い生理活性を有するものである。
【０１２４】
従って、ＣＤ４４分子によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防するための、活性成分として用いることができる。
【０１２５】
具体的には、本発明の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等を、そのまま、ＣＤ４４分子の関与によって誘発される疾患または症状を、改善、治療または予防するための医薬として用いることができる。勿論、本発明によれば、還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン（硫酸）等を製剤上許容される担体等と共に含有する医薬組成物を提供することもできる。
【０１２６】
本発明の医薬は、ＣＤ４４分子の関与によって誘発される疾患または症状に広く適用可能であるが、具体的には、例えば慢性関節リュウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、シューグレン症候群、橋本病、アジソン病、又はＩ型糖尿病等の自己免疫疾患、例えば変形性関節症、乾癬性関節炎、腰痛症、肩関節周囲炎、顎関節症又は腱周囲炎等の関節炎、例えばアレルギー性鼻炎、花粉症、失神、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎又は気管支喘息等アレルギー性疾患、又は癌を改善、治療または予防するため、或いは、免疫調節するため、又は細胞分化若しくは細胞アポトーシスを誘導するために用いることができる。
【０１２７】
特に、後述する実施例で示すように、Ｎ−アシルガラクトサミンの４位及び６位を硫酸化したオリゴコンドロイチン硫酸は、ＣＤ４４分子に対するシェディング誘導能が大きいため、上記適応症に対する治療効果が大きい。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、投与形態、剤型について特に制限はなく、経口、径皮、吸収、注射（筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、関節腔内投与、眼内投与及び腹腔内投与）等の投与形態に応じて、製剤化することができる。剤型としては、例えば注射剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、又は眼軟膏剤等がある。成人における１日の投与量は、通常、０．１〜１０００ｍｇであるが、患者の体重、症状等によって適宜変更する場合がある。また、本発明の医薬組成物は、賦型剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、又は崩壊剤等の通常用いられる他の成分を含有することができる。また、有効成分として、他の自己免疫疾患治療剤、関節炎治療剤、アレルギー性疾患治療剤、免疫調節剤、細胞分化誘導剤又は細胞アポトーシス誘導剤を含有することもできる。
【０１２９】
以下、本発明をより詳細に説明するために、本発明の実施例について説明する。但し、本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１３０】
以下に示す実施例では、各工程に適用した処理または得られた化合物の分析を以下の条件で行なった。
【０１３１】
（１）旋光度
ＨＯＲＩＢＡ  ＳＥＰＡ−２００により２２±３℃で測定した。
【０１３２】
（２）１Ｈ  ＮＭＲ
ＪＥＯＬ  ＥＣＰにより５００ＭＨｚで測定した。内部標準にＭｅ４Ｓｉを用い（重水に対してはｔ−ＢｕＯＨ＝１．２３ｐｐｍ）、化学シフトは、例えば糖残基３のＣ−１に結合したプロトンを１３のごとく表した。
【０１３３】
（３）シリカゲルクロマトグラフィー
シリカゲルは、和光純薬社製のＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｃ−２００及びＣ−３００と、関東化学社製のＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ（中性、球状、４０−１００μｍ）を使用した。ゲルろ過担体はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０及びＬＨ−６０を使用した。
【０１３４】
（４）モレキュラーシーブス（ＭＳ）
モレキュラーシーブスは、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のモレキュラーシーブスを使用し、減圧下１８０℃で乾燥して用いた。
【０１３５】
（５）薄層クロマトグラフィー
Ｍｅｒｋ社製のＳｉｌｉｃａＧｅｌＦ２５４を使用し、トルエン／酢酸エチル系溶媒又は酢酸エチル／メタノール系溶媒を用いた。
【０１３６】
（実施例１）６の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸の合成
β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（１→［４］−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→３）−β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（１→）２４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→ＯＭＰ  （２０）又はβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ（４，６−ｄｉ−ＯＳＯ３Ｎａ）−（１→［４］−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→３）−β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ（４，６−ｄｉ−ＯＳＯ３Ｎａ）−（１→）２４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→ＯＭＰ（２１）の製造方法。
【０１３７】
本実施例の反応工程を、その概略を示す図６−１及び図６−２を参照しながら以下に具体的に説明する。
【０１３８】
（Ａ）４の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチンの合成
（Ａ−１）糖供与体の調整
【０１３９】
図６−１中、式（１０）で表わされる２個の構成糖からなる化合物は周知であり、［Ｊ．Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３０５，４３−６３（１９９８）］に記載の方法に従って調製した。簡単に説明すると、単糖の糖供与体と単糖の糖受容体をグルコシル化した後、得られた化合物の保護基をイミデート化することにより得た。
【０１４０】
式（１０）で表される２個の構成糖からなる化合物（１７２．７ｍｇ，０．１８４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ，８ｍＬ）と水（２ｍＬ）の混合液に溶解し、これに、硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ，５００ｍｇ）を加えて、１時間撹拌した。
【０１４１】
反応終了後、反応液をクロロホルム（ＣＨＣｌ３）と飽和食塩水で希釈した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性，１０ｇ，トルエン／酢酸エチル３：２〜１：５または酢酸エチル／メタノール５０：１）で精製し、ヘミアセタール化合物（１２５．７ｍｇ）を得た。
【０１４２】
次いで、得られたヘミアセタール化合物を、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２，５ｍＬ）で希釈し、トリクロロアセトニトリル（ＣＣｌ３ＣＮ，０．５ｍＬ）を加え、撹拌しながら、０℃で１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１滴）を加えた。３０分後、室温にてＣＣｌ３ＣＮ（０．２ｍＬ）を添加し、さらに１０分間撹拌を続けた。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ−２００，３０ｇ，トルエン／酢酸エチル２：１〜１：５０）で精製し、式（１１）の２糖化合物（１３１．１ｍｇ）を７３％の収率で得た（Ｒｆ値は、０．５８（酢酸エチル／メタノール１０：１）であった。）。この化合物はこれ以上精製せず、糖供与体としてグリコシル化反応に使用した。
【０１４３】
（Ａ−２）糖受容体
図６−１中、式（１２）で表される２個の構成糖からなる化合物は周知であり、［Ｊ．Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３０５，４３−６３（１９９８）］に記載の方法に従って調製した。簡単に説明すると、単糖の糖供与体と単糖の糖受容体をグルコシル化した後、脱保護することにより得た。
【０１４４】
（Ａ−３）４糖体（式（１３）の化合物）の合成
上述した、式（１１）で表される糖供与体（１．１８ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）と、式（１２）で示される糖受容体（８５８．６ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４３ｍＬ）溶液に、乾燥モレキュラーシーブスＡＷ３００（ＭＳＡＷ３００（５ｇ））を加え、溶液を室温にて１時間撹拌した。この溶液を−２０℃に冷却し、撹拌しながらトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ，２１３μＬ，１．１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を徐々に室温にまで上昇させ、１日後、反応液にトリエチルアミンと飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、ＣＨＣｌ３で希釈した。
【０１４５】
不溶物をろ過し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）とシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ−２００，３０ｇ，トルエン／酢酸エチル２：１〜１：２）で精製し、式（１３）の化合物（１．２０ｇ，７１％）を得た。物性データは、［Ｊ．Ｔａｍｕｒａ  ｅｔａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３０５，４３−６３（１９９８）］で示すデータと一致した。
【０１４６】
（Ｂ）４糖体（式（１３）の化合物）のレブリノイル基の除去
上述のようにして得られた式（１３）で表される４個の構成糖からなる化合物（７１．８ｍｇ，４３．３μｍｏｌ）のエタノール／トルエン５：１溶液（５ｍＬ）に、ヒドラジン酢酸（４０．０ｍｇ，４３４μｍｏｌ）を加え、溶液を室温にて２０分間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）で精製し、以下の物性値を示す式（１４）の化合物を収率９２％（６２．０ｍｇ）で得た。
【０１４７】
2007530713.tif 000017
【０１４８】
（Ｃ）伸長反応による６糖体（式（９）の化合物）の合成
図６−１中、式（１１）で表される化合物（１４４．３ｍｇ，０．１４８ｍｍｏｌ）と式（１４）で表される化合物（１６０．６ｍｇ，０．１０３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（７ｍＬ）溶液に、ＭＳＡＷ３００（７００ｍｇ）を加え、溶液を室温にて１時間撹拌した。この溶液を−２０℃に冷却し、撹拌しつつＴＭＳＯＴｆ（１９μＬ，０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を徐々に室温にまで上昇させ、１日後、反応液にトリエチルアミンと飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、溶液をＣＨＣｌ３で希釈した。
【０１４９】
不溶物をろ過し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣をゲルろ過（ＬＨ−６０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）とシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ−３００，６ｇ，トルエン／酢酸エチル１：１〜１：５、酢酸エチル／メタノール１００：１）で精製し、以下の物性値を有する式（９）の化合物（１６１．４ｍｇ，６６％）を得た。
【０１５０】
2007530713.tif 000018
【０１５１】
（Ｄ）６糖体（式（９）の化合物）のレブリノイル基の除去
図６−２に示すように、上述のようにして得られた式（９）で表される化合物（３０．８ｍｇ，１３．０μｍｏｌ）のエタノール／トルエン４：１溶液（２．５ｍＬ）に、ヒドラジン酢酸（１２．６ｍｇ，２８．２μｍｏｌ）を加え、溶液を室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）で精製し、以下の物性値を有する式（１５）の化合物（２９．９ｍｇ）を得た。
【０１５２】
2007530713.tif 000019
【０１５３】
（Ｅ）他の保護基（ベンジリデン及びアシル）の除去
上述のようにして得られた式（１５）で表される上記化合物（１７．８ｍｇ，７．８２μｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２／メタノール１：１溶液（１．６ｍＬ）に、カンファースルホン酸（４．２ｍｇ）を加え、溶液を室温にて１２時間撹拌した。カンファースルホン酸（６．６ｍｇ）を追加し、溶液を室温にてさらに２４時間撹拌した。反応液に過剰のジイソプロピルエチルアミンを加え、溶媒を減圧留去し、残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）で精製し、式（１７）の化合物を収率７８％（１２．２ｍｇ）で得た。
【０１５４】
１Ｈ  ＮＭＲにより式（１５）の化合物からベンジリデン基が除去されたことを確認した後、式（１７）の化合物（５．４ｍｇ）を、テトラヒドロフラン／水１５：１溶液（１．６ｍＬ）に溶解し、撹拌しながら１．２５Ｍ水酸化リチウム水溶液（４５μＬ）を０℃で加えた。１時間溶媒を減圧留去し、残渣にメタノール（１．５ｍＬ）を加え、この溶液に０．１Ｍナトリウムメトキシド（０．５ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３日後、５０％酢酸で反応を停止し、溶媒を減圧留去した。残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，１％酢酸）で精製し、下記式（２０）に示す化合物を、収率９２％（３．３ｍｇ）で得た。
【化１６】
2007530713.tif 000020
【０１５５】
得られた化合物の物性値を以下に示す。
2007530713.tif 000021
【０１５６】
（Ｆ）選択的硫酸化（式（２１）の化合物の合成）
図６−２に示すように、式（１５）で表される化合物（２８．７ｍｇ，１２．６μｍｏｌ）のピリジン溶液（１．５ｍＬ）に、塩化ピバロイル（３０μＬ）と触媒量のＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え、その溶液を８０℃にて３時間撹拌した。塩化ピバロイル（９０μＬ）を追加し、その溶液を８０℃でさらに２時間撹拌した。反応液を室温に戻し、過剰のメタノールを加え、反応液をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）で精製して、式（１６）の化合物（２７．０ｍｇ，８９％）を得た。
【０１５７】
次いで、式（１６）で表される化合物（８．６ｍｇ，３．６μｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２／メタノール１：１溶液（１ｍＬ）に、カンファースルホン酸（２．９ｍｇ）を加え、その溶液を室温にて２０時間撹拌した。反応液に過剰のジイソプロピルエチルアミンを加え、溶媒を減圧留去し、残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）で精製して、式（１８）の化合物（８．１ｍｇ）を得た。
【０１５８】
次いで、式（１８）で表される化合物（８．１ｍｇ，３．６μｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（０．５ｍＬ）に、三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（６０ｍｇ）を追加し、その溶液を５７℃にて２２時間撹拌した。三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（５９ｍｇ）を追加し、５７℃にてさらに２６時間撹拌した。反応液を室温に冷却し、反応液をゲルろ過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３／メタノール１：１）とイオン交換樹脂［Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（Ｎａ＋）、メタノール／水８：１］で精製し、式（１９）の化合物（９．６ｍｇ，９１％）を得た。
【０１５９】
最後に、式（１９）の化合物（９．６ｍｇ）を、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）と水（０．０４ｍＬ）の混合溶液に溶解し、撹拌しながら１．２５Ｍ水酸化リチウム水溶液（０．２ｍＬ）を０℃で加えた。撹拌を室温で一晩続けた。溶媒を減圧留去し、残渣にメタノール（０．５ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（０．１５ｍＬ）を加え、この溶液に０．５Ｍ水酸化ナトリウム（０．３ｍＬ）を撹拌しつつ滴下した。２２時間後、５０％酢酸で反応を停止し、溶媒を減圧留去した。残渣をゲルろ過（ＬＨ−２０，１％酢酸）で精製し、下記式（２１）に示す化合物を収率５４％（３．７ｍｇ）で得た。
【化１７】
2007530713.tif 000022
【０１６０】
得られた化合物の物性値を以下に示す。
2007530713.tif 000023
【０１６１】
（比較例１）
図７に示すように、上記実施例１のプロモーターに代えてＢＦ３・ＯＥｔ２の存在下で、上記実施例１の糖供与体及び糖受容体に代えて図７中式（３）及び（４）で表されるアジド化した糖供与体と糖受容体を用いてグリコシル化反応を行ない、次いで図中の式（６）で表す化合物と糖供与体との伸長反応によって得られた式（８）で表される反応生成物を、酢酸エチル中リンドラー触媒の存在下で水素添加、還元してＮアセチル化したこと以外は、上記実施例１と同様にして、６個の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン及びその硫酸化物を製造した。
【０１６２】
（参考例）
Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９５；５（１３）：１３５１−１３５４には、上記比較例１の製造方法のＬｉｎｄｌａｒ触媒に代え、チオ酢酸を用いた製造方法が提案されている。
【０１６３】
（結果）
プロモーターとしてトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）を用い、二糖体の段階でアジドの還元を行なった後、各糖鎖ユニットをグリコシド結合させた実施例１の製造方法では、図６−１の式（１３）で表される４個の構成糖からなる化合物が７１％、式（２０）及び（２１）で表される６個の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン及び還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸が６６％という高い収率で得られた。
【０１６４】
これに対して、プロモーターとしてＢＦ３・ＯＥｔ２を用い、アジドタイプの糖供与体とアジドタイプの糖受容体とをグリコシル化して伸長反応を行ない、４糖体又は６糖体となった段階でアジド基を還元してＮアセチル基に変換した比較例１の製造方法では、アジド化した４糖体を還元反応に付した場合の収率が５０％であり実施例１より２０％以上低かった。また、アジド化した６糖体（６）を還元反応させたところ、Ｎアセチル基への変換が起こらず目的とする式（９）の化合物は得られなかった。
【０１６５】
また、参考例の方法では、アジド化した４糖体を還元反応に付したところ、収率は４３％であり実施例１の方法に比べ、約３０％低かった。
【０１６６】
（実施例２）５個の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチンの合成
（Ａ）５糖体の調製
【０１６７】
Ｍｅｔｈｙｌ（２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）−（１→３）−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４，６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１→４）−｛ｍｅｔｈｙｌ  ２，３−ｄｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ｝−（１→３）−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４，６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１→４）−｛４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ２，３−ｄｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ｝ｕｒｏｎａｔｅ（３４）の調整
【０１６８】
（Ａ−１およびＡ−２）糖供与体および糖受容体
図６−３に示す、糖受容体（３１）は、［Ｊ．Ｔａｍｕｒａ  ＆  Ｍ．Ｔｏｋｕｙｏｓｈｉ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８，２４３６−２４４３（２００４）］に従って調製し、同様に、糖供与体（３２）は、［Ｊ．−Ｃ．Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９，１５３−１８１（１９９０）］に従って調製した。
【０１６９】
（Ａ−３）５糖体（式（３４）の化合物）の合成
図６−３に示すように、糖受容体（３１）（２０７．４ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ）と、糖供与体（３２）（２０５．６ｍｇ，０．４３０ｍｍｏｌ）とのジクロロメタン（８．３ｍＬ）溶液に、ＭＳＡＷ３００（４６４ｍｇ）を加え、得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応液を−２０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２３μｌ、０．１３ｍｍｏｌ、糖供与体（３２）に対して０．３当量）をそれに加え、連続的に室温まで温度を上昇させながら１晩撹拌した。反応終了後、セライト濾過を行い、濾液をＣＨＣｌ３で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した。その後、濾液を濃縮し、ゲル濾過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）にて精製し粗生成物を得た。この生成物をシリカゲルカラム（Ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝２：１〜１：２０〜ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：８０〜１：６０）で更に精製し、以下の物性値を有するシロップ状の式（３４）の化合物（６９．６ｍｇ，３７．１μｍｏｌ）を２８％の収率で得た。
【０１７０】
2007530713.tif 000024
【０１７１】
ＴＭＳＯＴｆを糖供与体（３２）に対して０．７当量使用した以外同様に縮合を行った場合には、式（３４）の化合物の収率は３０％であった。
【０１７２】
（Ｂ）保護基の除去
Ｍｅｔｈｙｌ（２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）−（１→３）−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１→４）−｛ｍｅｔｈｙｌ  ２，３−ｄｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ｝−（１→３）−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１→４）−｛４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ２，３−ｄｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ｝ｕｒｏｎａｔｅ（３６）の調製
【０１７３】
化合物（３４）（２３．９ｍｇ，１２．７μｍｏｌ）をジクロロメタン（１．４ｍＬ）とメタノール（１．４ｍＬ）に溶解し、ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（９．８ｍｇ）をそれに加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、トリエチルアミンを加えて中和し、トルエンで共沸して溶液を濃縮した。濃縮残渣をゲル濾過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）にて精製し、下記物性値を有する式（３６）の化合物（１８．２ｍｇ，１０．７μｍｏｌ）を８４％の収率で得た。１Ｈ−ＮＭＲでベンジリデンが除去されたことを確認し、それ以上精製せず、次の反応に使用した。
【０１７４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ｓｅｌｅｃｔｅｄ）δ７．７９−７．６５（ｍ，８Ｈ，Ｐｈ），７．１４−７．０７（ｍ，８Ｈ，Ｐｈ），６．７６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ），６．６７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ），３．６９，３．６６，３．６０，３．５７（４ｓ，３Ｈｘ４，４ＯＭｅ），２．２７，２．２６，２．２４，２．２３（４ｓ，３Ｈｘ４，４ＰｈＭｅ），１．９２，１．８８，１．８６，１．８５，１．２０（５ｓ，３Ｈｘ５，３ＯＡｃ，２ＮＡｃ）．
【０１７５】
（Ｃ）硫酸化
β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４，６−ｄｉ−Ｏ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４，６−ｄｉ−Ｏ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（３８）Ｍ＝１４６６．０６の調製
【０１７６】
化合物（３６）（１８．２ｍｇ，１０．７μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２ｍＬ）に溶解し、ＳＯ３・Ｍｅ３Ｎ（１１９．２ｍｇ）を得られた溶液に加え、溶液を６０℃で一晩撹拌した。翌日、６０℃に保ったままＳＯ３・Ｍｅ３Ｎ（１１９．９ｍｇ）を溶液に追加し、さらに溶液を一晩撹拌した。反応終了後、反応液の温度を室温に戻し、溶液をゲル濾過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）にて精製し、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０（Ｎａ＋）カラムで硫酸化物（２１．２ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）を９４％の収率で溶離した。この硫酸化物をＴＨＦ（１．４ｍＬ）と水（６ｄｒｏｐｓ）に溶解し、氷冷下１．２５Ｎ  ＬｉＯＨ（０．６ｍＬ）を溶液に加え、連続的に室温まで温度を上昇させながら一晩撹拌した。反応終了後、溶液を濃縮し、濃縮残渣をメタノール（１．４ｍＬ）とジクロロメタン（０．４２ｍＬ）に溶解し、０．５Ｎ  ＮａＯＨ（０．８ｍＬ）を加え室温で４時間半撹拌した。反応終了後５０％  ＡｃＯＨを加えて溶液を中和し、ゲル濾過（ＬＨ−２０，１％  ＡｃＯＨ）にて精製し、下記物性値を有する式（３８）の化合物（９．２ｍｇ，６．２８μｍｏｌ）を２工程で５９％の収率で得た。
【化１８】
2007530713.tif 000025
【０１７７】
式（３８）の化合物の物性値を以下に示す。
2007530713.tif 000026
【０１７８】
（実施例３）５個の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチンの合成（２）
（Ａ）５糖体の調製
Ｍｅｔｈｙｌ｛２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ｝−（１→３）−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４，６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１→４）−｛ｍｅｔｈｙｌ  ２，３−ｄｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ｝−（１→３）−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４，６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１→４）−｛４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ２，３−ｄｉ−Ｏ−（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ｝ｕｒｏｎａｔｅ（３５）の調製
【０１７９】
（Ａ−１およびＡ−２）糖供与体および糖受容体
図６−３に示す、糖受容体（３１）は、［Ｊ．Ｔａｍｕｒａ  ＆  Ｍ．Ｔｏｋｕｙｏｓｈｉ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８，２４３６−２４４３（２００４）］に従って調製した。同様に、糖供与体（３３）は、［Ｆ．Ｇｏｔｏ  ＆  Ｔ．Ｏｇａｗａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３，６８４１−６８４４（１９９２）］に従って調製した。
【０１８０】
（Ａ−３）５糖体（式（３５）の化合物）の合成
図６−３に示すように、糖受容体（３１）（１１０．０ｍｇ，７０．５μｍｏｌ）と、糖供与体（３３）（１０１．７ｍｇ，１４４μｍｏｌ）とのジクロロメタン（４．５ｍＬ）溶液にＭＳＡＷ３００（２３１．６ｍｇ）を加え、得られた溶液を室温で１時間撹拌した。
【０１８１】
反応液を−２０℃に冷却後、ＴＭＳＯＴｆ（２３μｌ、０．１３ｍｍｏｌ、糖供与体（３３）に対して０．７当量）を溶液に加え、溶液を連続的に室温まで温度を上昇させながら１晩撹拌した。反応終了後、セライト濾過を行い、濾液をＣＨＣｌ３で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し濾過した。その後、濾液を濃縮し、ゲル濾過（ＬＨ−２０，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）にて精製し粗精製物を得た。この粗精製物をシリカゲルカラム（Ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝７：１〜１：５〜ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：６０〜１：２０）で更に精製し、シロップ状の下記物性値を有する式（３５）の化合物（７４．４ｍｇ，３５．４μｍｏｌ）を５０％の収率で得た。
【０１８２】
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【０１８３】
ＴＭＳＯＴｆを糖供与体（３３）に対して０．３当量使用した場合、式（３５）の化合物の収率は２３％であった。
【０１８４】
（考察）
（１）  本発明におけるイミデートを用いるグリコシル化反応では、イミドイルオキシ基が脱離して糖供与体の１位にカチオンが生じる。このカチオン中間体と糖受容体のフリーの水酸基が結合、即ちグリコシル化反応を生じる。実施例１のプロセスで高収率となったのは、プロモーターとしたトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）がカチオン中間体とイオンペアを形成して不安定なカチオン中間体を安定化し、その分解を抑制したためと考えられる。従って、前記一般式（１）に包含される化合物であれば、同様の効果を有することが期待できる。
【０１８５】
また、糖供与体としてアセトアミドタイプの２糖ユニットを用いたことも高収率化に大きく貢献していると考えられる。
【０１８６】
（２）上記実施例１の（１１）＋（１４）――＞（９）の反応において、反応物を薄層クロマトグラフィーで展開したところ、反応開始当初は、主にそれぞれＲｆ＝０．０７，０．３８，０．４９，０．６２及び０．７８のスポットが確認されたが、反応終了時には、これらのスポットがＲｆ＝０．４１のスポットに収束した。
【０１８７】
通常、グルコシル化反応は、糖供与体が分解してマルチスポットを呈することはあるが、その場合には、これらのスポットは収束しない。したがって、この結果は、本発明の実施例における反応が、複数の中間生成物を経由して目的の縮合物を生じることを示す。
【０１８８】
この点、図１２に示すように、ルイス酸の存在下でグルコシル化反応を生じさせた場合には、通常、糖供与体のイミドイル基が活性化され、潜在的なカチオンとなった糖供与体の１位の炭素原子を糖受容体が攻撃して、両者が縮合するか（経路Ａ）、糖供与体の２位の水酸基がアシル基で保護されている場合には、活性化された糖供与体の１位の炭素原子をアシル基のカルボニル酸素が攻撃して反応中間体（ＩＩ）を形成し、この中間体（ＩＩ）の１位の炭素原子を糖受容体の酸素原子が攻撃して両者が縮合すると考えられる（経路Ｃ）。
【０１８９】
しかし、この両経路では、本発明の実施例における上記マルチスポット現象並びにその後の収束現象及びβ選択性を説明することができず、上記（１１）＋（１４）――＞（９）の反応では、上記経路Ａ及びＣとは異なる反応経路の存在が示唆された。
【０１９０】
本発明者は、この現象に関し、本発明の実施例における反応が、図１２に示す経路Ｄを経由すると考えている。すなわち、本発明の方法においては、糖受容体のアセトアミド基の酸素原子が中間体ＩＩのオルトエステル炭素原子を攻撃して、反応中間体ＩＩＩを形成し、この反応中間体ＩＩＩの１位の炭素原子を、糖受容体の酸素原子が攻撃して、目的とするβ選択的縮合物が合成されていると予想される。
【０１９１】
この予想される反応機構は、上記マルチスポット現象並びにそのマルチスポットが収束していく現象と合致している。即ち、マルチスポット現象は、糖供与体と糖受容体で３つのアセトアミドが存在し、反応中間体ＩＩＩのサブグループが多数存在するためと考えられる。またその後の収束は、反応中間体ＩＩＩと糖供与体との縮合によるβ選択的縮合物の生成により説明することができる。
【０１９２】
また、上記反応経路（Ｄ）を経由する場合、糖供与体の１位の炭素原子は立体制御を受け、反応中間体ＩＩは、オルトエステルのない側からしか攻撃を受けない。本発明により得られる最終生成物がこの経路を経由するという事実は、実施例１及び３でβグルコシドのみが得られた結果と整合する。
【０１９３】
また、実施例２及び３より、糖供与体の２位がベンゾイル系の置換基で保護された場合では、アセチル系の置換基で保護された場合に比べ、収率が著しく改善されることが証明された（式３５の化合物は、収率５０％であるのに対して、式３４の化合物は収率３０％である）。この結果は、糖供与体の２位をアセチル基で保護した場合に比べ、ベンゾイル系の置換基で保護した場合の方が中間体ＩＩのオルトエステル型カルボカチオンの共役系が長く、より安定である、という事実と整合する。
【０１９４】
（実施例４）
合成オリゴ糖によるＣＤ４４シェディング誘導
実施例１で得られた式（２０）及び（２１）の化合物について、癌細胞におけるＣＤ４４シェディング誘導能を、図８に示す試験方法に従って評価した。
【０１９５】
＜試験結果＞
図９及び１０に示すように、硫酸化されていない６個の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型コンドロイチンであっても、ＣＤ４４のシェディングが誘導された。また、Ｎ−アシルガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されている６の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型コンドロイチン硫酸Ｅによって、還元末端グルクロン酸型コンドロイチンよりも強くＣＤ４４のシェディングが誘導された。
【０１９６】
このことから、還元末端グルクロン酸型コンドロイチン硫酸Ｅの幹をなす還元末端グルクロン酸型コンドロイチン主鎖自体が、ＣＤ４４シェディング誘導能に関与していることが実証された。またこのことから、還元末端グルクロン酸型コンドロイチン主鎖上の硫酸基も、ＣＤ４４シェディングの誘導に関与していることが実証された。
【０１９７】
なお、ＣＤ４４分子が、広く様々な疾患に関与することは既に知られている。従って、本発明の６個以上の構成糖からなる還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸が、その高いＣＤ４４シェディング誘導能に基づき、ＣＤ４４分子が関与する疾患及び症状で有効であることは自明である。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
以上説明したように、本発明によれば、４個以上、特に５個以上の構成糖からなる意図する鎖長及び構造のオリゴグリコサミノグリカンを、高い立体選択性で高収率、高純度で製造できる簡易な方法を提供することができる。また本発明によれば、５個以上の意図する数の構成糖からなる高純度の還元末端グルクロン酸型オリゴコンドロイチン硫酸及びこれを含む医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、本発明の製造方法の一実施形態における（Ａ）工程の概略を示す反応式である。
【図２】図２は、本発明の製造方法の一実施形態における（Ｂ）工程の概略を示す反応式である。
【図３】図３は、本発明の製造方法の一実施形態における（Ｃ）工程の概略を示す反応式である。
【図４】図４は、本発明の製造方法の一実施形態における保護基脱離工程の概略を示す工程図である。
【図５】図５は、本発明の製造方法の一実施形態における選択的硫酸化の工程の概略を示す工程図である。
【図６−１】図６−１は、実施例１の製造方法の概略を示す工程図である。
【図６−２】図６−２は、実施例１の製造方法の概略を示す工程図である。
【図６−３】図６−３は、実施例２及び３の製造方法の概略を示す工程図である。
【図７】図７は、比較例１の製造方法の概略を示す工程図である。
【図８】図８は、実施例２で行なった試験方法の概略を示す工程図である。
【図９】図９は、実施例４で行なった試験の泳動結果を示す泳動写真のコピーである。
【図１０】図１０は、実施例４で行なった試験におけるＣＤ４４シェディング指数を示すグラフである。なお、ＣＤ４４シェディング指数は、無刺激の状態を１として求めた。
【図１１】図１１は、本発明の製造方法の他の実施形態を示す工程図である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態における反応機構の概要を示す反応式である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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