(57)【要約】  本発明は、美容的および皮膚科学的な日焼け止めを分類するために使用できる、ＵＶＡ放射線およびＵＶＢ放射線の両者を包含する統合太陽光保護因子（ＳＰＦまたはｉＳＰＦ）を決定する方法に関する。この方法は、スピントラップを含浸させた皮膚の定められた領域に、定められた量の日焼け止めを塗布するステップと；前記皮膚基質を、太陽シミュレータにより、定められた量のＵＶＡ線およびＵＶＢ線に露出させるステップと；前記放射線に露出された皮膚基質に対して、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定を施すことと；実数×１０12遊離ラジカル／皮膚サンプル１ｍｇとして、トラップされた遊離ラジカルの数を記録するステップと；式（１）（２）および（８）に従って、統合太陽光保護因子ＳＰＦを決定するステップを具備する：          ＳＰＦ＝Ｅ0／Ｅ                                       （１）          ｌｏｇ10（Ｅ）＝ａｌｏｇ10（Ｘ・１０００）＋ｂ        （２）          Ｅ＝１０log10(E)                                      （８）【選択図】なし
2007532896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
美容的および皮膚科学的な日焼け止めのための、ＵＶＡ放射線およびＵＶＢ放射線の両者を包含する統合太陽光保護因子を決定する方法であって、
（ａ）定められた量の日焼け止めを、スピントラップとして作用する既知の物質を先に含浸させた皮膚の定められた領域に直接塗布するステップと；
（ｂ）前記皮膚基質を、太陽シミュレータのような放射線源により、天然の太陽露出条件に従って、ＵＶＡ線およびＵＶＢ線を含んでなる定められた量の放射線に露出させるステップと；
（ｃ）前記放射線に露出された皮膚基質に対して、前記露出後の１〜１２０分以内に、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定を施すことと；
（ｄ）遊離ラジカルの数が知られている標準サンプルと比較したときの、遊離ラジカル発生値ＲＧを正規化し、サンプル１ｍｇ当りの実数Ｘに１０12を乗じた数、即ちＲＧ＝Ｘ１０12遊離ラジカル／皮膚サンプル１ｍｇとして、トラップされた遊離ラジカルの数を記録するステップと；
（ｅ）統合太陽光因子ＳＰＦを、次式（１）に従って決定するステップと；
ＳＰＦ＝Ｅ0／Ｅ          （１）
ここでのＥ0は、日焼け止め製品を塗布された皮膚サンプルに対して与えられる、式（７）で計算されるｍＪ／ｃｍ2でのＵＶ量を意味し、
Ｅ0＝Ｉｔ              （７）
Ｉ＝太陽シミュレータ照射量（ｍＷ／ｃｍ2）
ｔ＝秒での露出時間
Ｅは、ステップ（ｂ）の際に発生した遊離ラジカルの検出量に関連した、ｍＪ／ｃｍ2での有効ＵＶ量を意味し、
ここでのｌｏｇ10Ｅは、ステップ（ｄ）における遊離ラジカル発生値の実数Ｘに従って次式（２）で計算され、
ｌｏｇ10（Ｅ）＝ａｌｏｇ10（Ｘ・１０００）＋ｂ        （２）
ここでの遊離ラジカルの数はＵＶ量に比例せず、またａおよびｂは、ＵＶ量の常用対数関数と遊離ラジカル発生の実数との間の線型関係の最小二乗評価法による補正を達成するための調節ステップにおいて決定された実験パラメータであり、
また、Ｅは次式（８）に従って計算される；
Ｅ＝１０log10(E)          （８）
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記基質表面に直接塗布される日焼け止めの定められた量が、所定の日焼け止め濃度において、皮膚表面１ｃｍ2当り１〜４ｍｇの範囲である方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、定められた量の放射線を放出する放射線源と皮膚基質との間に標準の放射線低減フィルタを配置することによって、日焼け止めの他の濃度がシミュレートされ、較正される方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、使用される前記放射線低減フィルタは、１、２、５、１０および２０の低減因子を有する減光フィルタである方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記放射線への露出が３０、６０、１５０，３００および６００秒継続され、また日焼け止めの光安定性を評価すべきときには更に継続される方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記ＥＳＲ測定は、放射線への露出後に１〜１２０分、好ましくは１５〜６０分行われる方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記ＥＳＲ測定のために使用されるスペクトロメータが下記のパラメータを有する方法：
マイクロ波周波数ｆ0＝９．５２ＧＨｚ、
マイクロ波電力Ｐμ＝２０ｍＷ、
変調周波数ｆｍ＝１００ｋＨｚ
変調振幅Ｂｍ＝０．２ｍＴ
磁場走査Ｂｓ＝２０ｍＴ、
走査時間ｔｓ＝６０ｓ。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記使用されるスピントラップが、フェニル−tert−ブチルニトロン、またはジメチル−1−ピロリン−N−オキシドから選択される方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記日焼け止めは美容的または薬学的製剤の一部であり、該製剤は、ベンゾフェノン−３、ベンゾフェノン−４、メトキシ桂皮酸オクチル、ホモサレート（Homosalate）、フェニルベンゾイミダゾールスルホン酸、メトキシ桂皮酸エチルヘキシル、Ｐ−メトキシ桂皮酸イソアミル、エチルヘキシルトリアゾン、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、4-メトキシベンジリデン樟脳、ＰＡＢＡ、エチルヘキシルジメチルＰＡＢＡ、サリチル酸エチルヘキシル、オクトクリレン、イソアミル−ｐ−メトキシシンナメート, ブチルメトキシジベンゾイルメタン、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、ビス−エチルヘキシルオキシフェノール メトキシフェニルトリアジン、およびこれらの混合物からなる群から選択される１以上の既知の物理的または有機的フィルタを含有してなる方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記測定すべき美容的または薬学的製剤が、既知の抗酸化剤分子または遊離ラジカルスカベンジャー分子を組込んでいる方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記皮膚基質が、皮膚生検片、人口皮膚、およびブタ皮膚片、好ましくはブタ耳皮膚片からなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容的および皮膚科学的な日焼け止めを分類するために使用できる、ＵＶＡおよびＵＶＢ放射線を包含する統合太陽光因子（ＳＰＦまたはｉＳＰＦ）を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＶ放射線は、皮膚における遊離ラジカルの生成を顕著に増大させる。ヒドロキシラジカル*ＯＨ、スーパーオキシドアニオンラジカルＯ2*、および一重項分子状酸素1Ｏ2、のような反応性酸素種が生成すると、次いでこれらは脂質ラジカルＬ*を生じさせる。従って、美容的および皮膚科学的な日焼け止め製剤は、ＵＶフィルタ物質に加えて、少量の抗酸化剤を含有している。
更に、22nd IFSCC Congress, Edinburgh 2002の議事録, Oral Papers, Vol. 2, Zastrow et al.等の刊行物から知られているように、ＵＶＡおよびＵＶＢ線が異なる深さまで皮膚を貫通することも、電子スピン共鳴（ＩＳＲ）撮像によって確認されている。波長が２９０〜３２０ｎｍのＵＶＢ線は、約５０μｍの深さまでしか貫通しないのに対して、ＵＶＡ放射線は更に下層真皮、即ち、約３ｍｍの深さに達する。
その寿命範囲が０．３ｎｓ（*ＯＨラジカル）〜数秒（Ｌ*ラジカル）であり、且つその下層真皮における生成が主に太陽光スペクトルのＵＶＡ範囲に属する放射線に起因する遊離ラジカルの発生は、ＤＭＰＯ（５，５′−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド）または ＰＢＮ （フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン）、およびＥＳＲ法のようなスピントラップによって測定することができる。
【０００３】
普通に入手可能な日焼け止めは、それらのラベル上では、２〜１００、好ましくは４〜５０の範囲に亘る慣用的な太陽光保護因子（ＳＰＦ）または光保護因子（「Lichtschutzfaktoren」−ＬＳＦ）を有している。そこに含まれている情報は、ユーザが、彼等の皮膚を太陽放射線により長時間、即ち、それぞれの倍率を乗じた紅斑（日焼け）を発生するために必要とされる時間（分）だけ露出できるというユーザの知識に基づいている。発明者自身の発見によれば、一般には、一定のＵＶ照射量から生じる炎症（紅斑）とみなすべき皮膚の発赤と、遊離ラジカルの発生との間には線型の相関は存在しない。更に、日焼け止めは、異なる量のＵＶＡフィルタおよび／またはＵＶＢフィルタを含有しており、従って、殆どの場合に、遊離ラジカルに対する十分に変化する提供せず、且つ定量可能な保護を提供しない。ＵＶＢの効果にのみ関連する現在のＳＰＦ／ＬＳＦは、最早、日焼け止めの保護効果を適正に示すためには適していないように思える。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の目的は、皮膚上および皮膚の一定の深さにおけるＵＶＡ放射線およびＵＶＢ放射線の全体の効果を包含する、統合太陽光保護因子を決定する方法を提供することである。
【０００５】
本発明によれば、美容的および皮膚科学的な日焼け止めのための、ＵＶＡ放射線およびＵＶＢ放射線の両者を包含する統合太陽光保護因子を決定する方法は、
（ａ）定められた量の日焼け止めを、スピントラップとして作用する既知の物質を先に含浸させた皮膚の定められた領域に直接塗布するステップと；
（ｂ）前記皮膚基質を、太陽シミュレータのような放射線源により、天然の太陽露出条件に従って、ＵＶＡ線およびＵＶＢ線を含んでなる定められた量の放射線に露出させるステップと；
（ｃ）前記放射線に露出された皮膚基質に対して、前記露出後の１〜１２０分以内に、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定を施すことと；
（ｄ）遊離ラジカルの数が知られている標準サンプルと比較したときの、遊離ラジカル発生値ＲＧを正規化し、サンプル１ｍｇ当りの実数Ｘに１０12を乗じた数、即ちＲＧ＝Ｘ１０12遊離ラジカル／皮膚サンプル１ｍｇとして、トラップされた遊離ラジカルの数を記録するステップと；
（ｅ）統合太陽光因子ＳＰＦを、次式（１）に従って決定するステップ
ＳＰＦ＝Ｅ0／Ｅ          （１）
とを具備し、
ここでのＥ0は、日焼け止め製品が塗布された皮膚サンプルに対して与えられる、式（７）で計算されるｍＪ／ｃｍ2でのＵＶ量を意味し、
Ｅ0＝Ｉｔ              （７）
Ｉ＝太陽シミュレータ照射量（ｍＷ／ｃｍ2）
ｔ＝秒での露出時間
Ｅは、ステップ（ｂ）の際に発生した遊離ラジカルの検出量に関連した、ｍＪ／ｃｍ2での有効ＵＶ量を意味し、
ここでのＥは、ステップ（ｄ）における遊離ラジカル発生値の実数Ｘに従って次式（２）で計算され、
ｌｏｇ10（Ｅ）＝ａｌｏｇ10（Ｘ・１０００）＋ｂ        （２）
ここでの遊離ラジカルの数はＵＶ量に比例せず、またａおよびｂは、ＵＶ量の常用対数関数と遊離ラジカル発生の実数との間の線型関係の最小二乗評価法による補正を達成するための調節ステップにおいて決定された実験パラメータであり、
また、Ｅは次式（８）
Ｅ＝１０log10(E)            （８）
に従って計算される。
【０００６】
上記ステップ（ａ）に従う日焼け止めの定められた量は、例えば、皮膚表面１ｃｍ2当り１〜４ｍｇ、有利には２ｍｇ／ｃｍ2である。使用される皮膚サンプルは、例えば、エクスビボで処理される皮膚生検片、皮膚基質（人口皮膚）、またはブタ皮膚片、好ましくはブタ耳皮膚片から得られる。前記皮膚サンプルを、以下では「皮膚基質」または「基質」と称する。日焼け止めは、該基質表面に直接塗布される。
先ず、スピントラップ、特にＰＢＮを基質に塗布し、例えばサンプルをインキュベートすることによって、安定な長時間検出可能なアダクトを作製する。
【０００７】
スピントラップ技術を使用して、露光の際に皮膚生検片中に発生した遊離ラジカル／ＲＯＳ（ＲＯＳ＝反応性酸素種）を研究した。この技術は、典型的には、反磁性「スピントラップ」の二重結合に対して反応性で短寿命の遊離ラジカルを付加させて、遥かに安定性の高い遊離ラジカルである「ラジカルアダクト」を形成することを含んでいる。スピントラップの適用は、スピントラップアダクトの形成によって、ヒドロキシラジカル（*ＯＨ）、スーパオキシドアニオンラジカル（Ｏ2*）および脂質ラジカル（Ｌ*）のような最も反応性の遊離ラジカル／ＲＯＳの寿命（１０-9ｓ〜１０-3ｓ）でさえも延長させ（分〜時）、これはＥＳＲ技術によって測定することができる。好ましいスピントラップはＰＢＮ（フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン）であり、これは長時間（約６０分）に亘って非常に安定なＥＳＲ信号を提供することができ、また異なるＵＶ照射量の後に皮膚において発生した遊離ラジカルを定量するために特に良く適合する。 この試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｍｕｎｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙから購入された。ＰＢＮとの反応は次のようにして生じる。
【０００８】
【化１】
2007532896.tif 000003
【０００９】
基質は、ＵＶ照射の前に、例えば３０分間、スピントラップ溶液を含浸される。該スピントラップＰＢＮは、例えば、水／エタノール（５０／５０）溶液中に溶解され、４００ｍＭ濃度を生じさせる。
その後、例えば水／エタノールで基体表面を洗浄し、乾燥し、短時間放置した後に、予め定められた量（例えば２ｍｇ／ｃｍ2）の日焼け止めを直接この基体に広げる。
この基体を５〜６０分間、好ましくは１０〜１５分間放置し、有利には、該基質から打ち抜かれた皮膚片を、ＵＶＡ範囲については１７．５３ｍＷ／ｃｍ2で、またＵＶＢ範囲については０．３７ｍＷ／ｃｍ2で、ステップ（ｂ）に従って太陽シミュレータからの放射線に露出させる。前記パラメータは、概ね天然の太陽光露出条件に対応している。測定は、１〜１２０分後にＥＳＲスペクトロスコピーによって行った。
【００１０】
蛍光または化学発光のような光学的方法に対するＥＳＲスペクトロスコピーの重要な利点は、使用した電磁波の生物学的組織における貫通深さである。ＥＳＲの波長は、他の技術よりも約１０5倍長く、これはヒト組織において約１０ｍｍの貫通深さをもたらす。下層真皮までの、全体の皮膚の乱されない研究が可能である。この測定範囲は、全皮膚の最深層におけるＵＶ放射線の影響を検出するために、非常に興味深いものである。この性質は、保護因子の評価のために、ＥＳＲスペクトロスコピーを予定している。しかし、ＥＳＲ信号強度からの直接の計算は、スピントラップが存在しなければ、保護因子の過小評価を導く可能性がある。
放射線に対する露出と測定との間の時間は、スピントラップ、および遊離ラジカルによって形成されたアダクトの限定された寿命に依存する。有利には、それは１〜９０分である。
【００１１】
スピントラップＰＢＮの利点は、定量的分析を可能にするアダクトの高い安定性と、ヒドロキシラジカルまたは炭素中心ラジカルのようなトラップされた異なるタイプのラジカル間の非選択性から生じる高信号応答である。この信号形状は全てのトラップされた遊離ラジカルについて同じであり、より高いピーク強度を達成する。
発生した遊離ラジカルの定量は、ＰＢＮアダクトのピーク対ピークの信号振幅（低フィールドピーク）によって行われた。この信号振幅は、既知数の遊離ラジカルを用いて、キャリブレーションサンプル（標準）の振幅に対して正規化された。この標準化は、ＲＧ値（ラジカル発生値＝ＲＧＶ）を計算するための基礎である。ＲＧＶは、トラップされた遊離ラジカルの数を記述するものであり、研究サンプル１ｍｇに対して正規化された１０12を乗じた実数Ｘ、即ち、ヒト皮膚および厚さ約１ｍｍについて密度１を仮定したときに、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍの体積エレメントに対する平均として提示される。
【００１２】
本発明の方法の評価およびキャリブレーションのための日焼け止めの異なる濃度は、定められた量の放射線を放出する放射線源と皮膚基体との間に、標準の放射線低減フィルタを配置することによってシミュレートされる。
使用される好ましい放射線低減フィルタは、１、２、５、１０および２０の低減因子を有する減光フィルタ（Ｌｏｔ  Ｏｒｉｅｌ，  Ｆｒａｎｃｅ）である。この減光フィルタは、金属の薄層が蒸着された溶融シリカ基板で構成される。該コーティングの厚さが光学密度を決定する。吸光度は、ＵＶ帯（２９０〜４００ｎｍ）における波長から殆ど独立しており、また美容的標準に固有の適用モードから独立している。
【００１３】
全ての既知の日焼け止め（ＵＶフィルタ）、例えば4-アミノ安息香酸誘導体、桂皮酸のエステル、ベンジリデン樟脳誘導体、ベンゾフェノン誘導体、メトキシベンゾイルメタン誘導体等は、本発明の方法を用いて測定することができる。これラン日焼け止めは、例えば、ベンゾフェノン−３、ベンゾフェノン−４、メトキシ桂皮酸オクチル、ホモサレート（Homosalate）、フェニルベンゾイミダゾールスルホン酸、メトキシ桂皮酸エチルヘキシル、Ｐ−メトキシ桂皮酸イソアミル、エチルヘキシルトリアゾン、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、４−メトキシベンジリデン樟脳、ＰＡＢＡ、エチルヘキシルジメチルＰＡＢＡ等を含んでいる。また、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、ＺｒＯ2等のような物理的フィルタも測定することができる。例えば、次の略号を有するＵＶフィルタが、本発明の方法に従って測定された。ＥＳ＝サリチル酸エチルヘキシル；ＯＣ＝オクトクリレン；ＩＭＣ＝Ｐ−メトキシ桂皮酸イソアミル；ＢＭＤＢＭ＝ブチル・メトキシジベンゾイルメタン ；ＭＢＢＴ＝メチレンビス-ベンゾトリアゾイル・テトラメチルブチルフェノール（５０％水性分散液として供給された）。後者は、「Ｔｉｎｏｓｏｒｂ  Ｍ」の商標名で供給される。ＢＥＭＴ＝ビス-エチルヘキシルオキシフェノール・メトキシフェニルトリアジン。後者は、「Ｔｉｎｏｓｏｒｂ  Ｓ」の商標名で供給される。
【００１４】
異なる日焼け止めのＵＶ吸収スペクトルは、Cosmetics and Toiletries, Vol. 118, no.10, October 2003に記載された分光学的方法により、Ｌａｂｓｐｈｅｒｅ  ＵＶ  １０００Ｓ透過光分析器を用いて実行される。日焼け止めサンプルは、１．２ｍｇ／ｃｍ2で、透明な粗面化されたＰＭＭＡプレート上に広げられた。インビボＳＰＦは、ＣＯＬＩＰＡ太陽光保護因子試験法（SPF Test Method. Colipa Ref: 94/289 (1994)）に従って決定された。インビボＵＶＡ保護因子は、終点として持続的色素黒化（ＰＰＤ）を使用して決定された（Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 16, 245-249 (2000)）。
本発明による方法は、先ず最初に、全ＵＶの作用に関連した皮膚損傷の起源が、生成した遊離ラジカルの合計数であることを考慮する。この数は、ＵＶ放射線の強度ではなく、全体のＵＶ線量に依存する。生成した遊離ラジカルの合計数は、ＥＳＲによって正確に測定することができ、また、ＵＶからの保護の実際の程度に関する正確な情報をユーザに提供す統合ＳＰＦを決定することができる。
【００１５】
このようなＳＰＦは、二つの意味において積分される：それは、全体のＵＶスペクトル、並びにＵＶ放射線によって損傷を受ける可能性のある完全な深さを包含している。
もう一つの利点は、倫理的に問題な放射線に対する露出の後に試験ヒト皮膚の紅斑の外観を測定する代りに、各１ｃｍ2でヒトの皮膚手術または皮膚基体（人工皮膚）から得た２〜４の皮膚フラップ片を使用して、またはブタ皮膚に対して直接に、同一かまたは増大した信頼性で、ｉＳＰＦ（ＩＳＰＦまたは∫ＳＰＦ）を測定できることである。この方法では、新規な測定方法は被検人間を全く必要としないから、被検人間の皮膚に対する放射線に誘導された損傷は存在しないであろう。ＣＯＬＩＰＡ標準によれば、１０〜２０人のボランティアが必要とされる。加えて、結果を受取る前の長い待ち時間の結果が回避され、既知の方法における評価のためのレファレンスとして必要な一定の標準を定義する必要もない。
【００１６】
現在既に、ＲＧＶ測定は、ＳＰＦを決定するための従来の方法に必要なコストの１／２〜１／３であるから、この新しい方法は、装置および方法の両方の観点からコストを著しく低減する。
加えて、ｉＳＰＦ（ＩＳＰＦまたは∫ＳＰＦ）は、概ね１０％の精度で測定および計算できるのに対して、従来のＳＰＦ測定法、即ちＣＯＬＩＰＡ（ＵＶＢ保護）法では、２０〜２５％、更に、異なる試験設備で測定される高ＳＰＦについては３０〜５０％であるに過ぎない。
【００１７】
今日既に、黒色皮膚タイプについて使用するときは、ＰＰＤ法は複雑かつ不正確である。即ち、この点に関する改良は、利用可能な方法の範囲を拡大させ、より信頼性のある結果を導くであろう。本発明の方法は、皮膚の種類に依存せず、且つ民族的な皮膚の色からも独立している。
本発明による方法のもう一つの利点は、複雑さの少ない装置しか必要としない点にある。大きな皮膚表面をＵＶ放射線に露出させるための大表面ランプシステムは、より小さく且つより強力な点型放射線ユニットで置換えることができる。
【００１８】
皮膚生検片のＵＶ照射の際に発生した遊離ラジカルの測定は、整列されたＥＳＲ・Ｘ帯スペクトロメータを使用して、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）で行われた。このスペクトロメータは、下記のスペクトロメータ設定を備えたＥＲＳ３００＋（ドイツ国ＺＷＧ；ドイツ国ガレヌスにより改変された）であった：マイクロ波周波数ｆ0＝９．５２ＧＨｚ、マイクロ波電力Ｐμ＝２０ｍＷ、変調周波数ｆｍ＝１００ｋＨｚ、変調振幅Ｂｍ＝０．２ｍＴ、磁界走査Ｂｓ＝２０ｍＴ、走査時間ｔｓ＝６０ｓ。
おそらく、以下のスペクトロメータ設定も使用可能である：マイクロ波電力Ｐμ＝10〜100ｍＷ、変調振幅Ｂｍ＝０．０５〜０．５ｍＴ、磁界走査Ｂｓ＝５〜２０ｍＴ、走査時間ｔｓ＝１０〜１２０ｓ。
【００１９】
測定されるべき美容的または薬学的な製剤は、当該技術の現状において既知の全ての抗酸化剤分子または遊離ラジカルスカベンジャー分子を組込むことができる。このような物質には、ビタミンＣおよびその誘導体、例えば酢酸アスコルビル、リン酸アスコルビル、およびパルミチン酸アスコルビル；ビタミンＡおよびその誘導体；葉酸およびその誘導体；ビタミンＥおよびその誘導体、例えば酢酸トコフェリル；スーパーオキシドディスムターゼ；フラボンまたはフラボノイド；アミノ酸、例えばヒスチジン、グリシン、チロシン、トリプトファンおよびその誘導体；カロテノイドおよびカロテン、例えばαカロテン、βカロテン；尿酸およびその誘導体；α−ヒドロキシ酸、例えばクエン酸、乳酸、リンゴ酸；スチルベンおよびその誘導体等のようなビタミンが含まれる。
【００２０】
測定すべき製剤のための更に好ましい抗酸化剤は、高ラジカル保護因子を備えた活性物質であり、これは白色ケブラチョ皮の抽出およびその後の酵素的加水分解により得られた、マイクロカプセルに結合された少なくとも９０重量％のプロアントシアニジンオリゴマーおよび１０重量％以下の没食子酸を含む生成物、更には、セクロピン（Cecropine）ペプチド、アミノ酸およびビタミン混合物を含む抽出により得られた蚕の抽出物、更には、非イオン性、陽イオン性または陰イオン性のヒドロゲルまたはヒドロゲル混合物、更に一つまたは幾つかのリン脂質および水が含まれる。また、該複合製剤は酵母の超音波分解生成物を含むことができ、該生成物には少なくとも１ｍＬ当り１５０単位のスーパーオキシドディスムターゼ、および１以上のシクロデキストリンが含まれる。該複合製剤は、ＷＯ９９／６６８８１の実施例１もしくは２、またはＷＯ  ０１／２６６１７の実施例１に従う生成物であることができる。また、アルコール溶液中の植物抽出物のもまた、抗酸化剤として好ましいものである。この複合剤は、０．１〜２重量％の生コーヒービーンズ抽出物、０．１〜２重量％のＣａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ抽出物、０．１〜２重量％のＰｏｎｇａｍｉａ  ｐｉｎｎａｔａ抽出物、および０．１〜２重量％のＡｎｇｅｌｉｃａ  ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ根抽出物、並びに全体を１００％にするための一価のＣ2〜Ｃ5アルコールを含有する。
【００２１】
以下の実施例において、本発明を更に詳細に説明する。
＜実験結果＞
ＵＶ線量と遊離ラジカル発生（ＲＧ）と間の関係：
皮膚生検片に対する異なる照射強度の供給は、フィルタをかけないＵＶ光源（減光因子１）、および減衰因子が２、５、１０および２０の減光フィルタによりフィルタされたＵＶ光源によって行われた。それらは、丁度サンプルホルダの開口部において、ＵＶ光源と皮膚生検片との間に配置される。減光フィルタは、全波長の光線を同じ因子で減衰させる。５回の異なる時間の照射が用いられた；３０、６０、１５０、３００および６００秒。減衰されないＵＶ光源の場合、これは約１．７分、３．５分、８．７分、１７．４分および３４．８分の自然太陽光露出に対応する。また、これは０．１１、０．２１、０．５４、１．０７および２．１４ＭＥＤに対応する。
【００２２】
最初に、可逆原理が十分に確立しているかどうかをチェックした。これは、発生した遊離ラジカルのレベルが線量のみに依存し、適用時間に依存しないことを立証することを意味する。これは、現実的な保護因子を計算するためのもう一つの前提条件である。
照射時間は、減光フィルタ減衰にリンクした線量プログレッションを達成するように選択された。例えば、減衰２アッセイは、減衰１アッセイ（ｔ＝３０秒）よりも２倍多い露出時間（ｔ＝６０秒）で達成することができる。従って、ＵＶ線量は、異なる照射時間を使用して供給できるであろう。
これは、異なる露光時間および種々の光学的減衰に従ってＵＶ誘導された、遊離ラジカルの測定量（ＲＧ＝×１０12ラジカル／ｍｇ）を記録した表１に示されている。ＵＶ線量（ｍＪ／ｃｍ2）は、次式（６）を用いることにより計算された（表１には記録されていない）。
ＵＶ線量＝Ｉ・ｔ／Ａｔｔ              （６）
Ｉ＝太陽光シミュレータの照射量（ｍＷ／ｃｍ2）；
ｔ＝露光時間（ｓ）；
Ａｔｔ＝減光フィルタ減衰。
【００２３】
五つの照射時間（３０、６０、１５０、３００および６００秒）、並びに五つの減光因子（１、２、５、１０および２０）に従って、一定のＵＶ線量（５３７ｍＪ／ｃｍ2）が、表１の対角線（頂部左側から底部右側）に沿って達成できた。可逆則が有効であれば、等量の遊離ラジカルが測定されるはずである。
低い相対的標準偏差（これら５つの値について僅か７．０３％）で、この全体の時間範囲に沿った準一定のラジカル発生：ＲＧ平均＝１．３６×１０12ラジカル／ｍｇ皮膚生検片を認めることができる。
また、異なる反復ＵＶ線量に対応する他の一定のＲＧ値を、表１の幾つかの少ない対角線において認めることができる。それらは、特別の陰影／ドットにより特定されている。
従って、表１は、大きなＵＶ線量範囲において可逆則が十分に有効であることを確認している。
表１：異なるフィルタ減衰および異なる照射時間に従って、皮膚生検片上で測定
されたＲＧ値（×１０12ｒａｄ／ｍｇ）
【００２４】
【表１】
2007532896.tif 000004
【００２５】
第二に、ＵＶ線量とラジカル発生（ＲＧ）の間の関係を研究した。
四つの減光フィルタおよびフィルタなしのＵＶ光源、五つの異なる照射時間で、１３の異なるＵＶ線量（表１参照）に対応して２５の異なるＵＶ露出を与えることができた。
ＵＶ線量に従って、図２のグラフ中に、皮膚における有利ラジカル発生をプロットする。異なる露出時間にもかかわらず、個々の実験データプロットの全てが、単一の曲線の回りに良くグループ化および配置されているのを見て取ることができる。プロットは、如何なる露光時間を考慮したときにも、非線型の関係に従って連結することができる。これは明らかに、可逆則が有効であることの結果である。遊離ラジカル発生ｖｓ．ＵＶ線量は、高ＵＶ線量についての飽和を示している。
【００２６】
しかし、二重ｌｏｇスケールが適用されれば、単純な線型関数は実験プロットに重なることができるであろうし、このことは、非常に容易に当該方法を較正することを可能にする。このような表現が図３のグラフに示されており、ここではｌｏｇＵＶ線量ｖｓ．ｌｏｇＲＧがプロットされている。今回の研究においては、対数関数変換による負のデータを回避するために、ＲＧデータの実数Ｘに因子１０００が乗じられた。以下の線型関数は、最小二乗エラー法を介したパラメータａおよびｂの単純な数字調節に従って、実験データとの良好な相関を達成している。
ｌｏｇ（ＵＶ線量）＝ａ・ｌｏｇ（１０００・Ｘ）＋ｂ      （２ｂ）
【００２７】
この関係（図３の最初の関係に対する逆）は、日焼け止め製品が広げられた皮膚生検片において、遊離ラジカル（ＲＧ）の検出された量に関連したＵＶ線量を計算することを可能にする。
保護因子：
上記実験結果は、保護因子を決定するための方法を開発することを可能にする。それらは、一般的に使用されるＵＶ線量の比として計算される。該方法は、図１に概略的に記載されている：
・Ｅ0は、システム保護層／皮膚生検片に印加されたＵＶ線量である；
・Ｅは、ＥＳＲスペクトロスコピーによって測定された遊離ラジカルの数Ｘから、較正された式２により得られたＵＶ線量である。 この「有効」ＵＶ線量は、保護された生検片（２ｍｇ／ｃｍ2の日焼け止め層を広げたもの）について測定された遊離ラジカルの同じ量を与えるように、保護されない生検片に対して与えられるべきである。
【００２８】
表２には、表１から受け取ったデータおよび図３に記録された式２のパラメータ値を用いた、この方法に基づく保護因子が含まれている。それらは、レファレンスとして働く減光フィルタの減衰値と比較される。それぞれの計算された保護因子は、異なる照射時間に対応する五つの値の平均である。減光フィルタの減衰および計算された保護因子は非常に近接している。
【００２９】
表２：表１に記録されたＲＧデータからの減光フィルタの保護因子の計算
2007532896.tif 000005
【００３０】
統合ＳＰＦ：
ＵＶ線量とＲＧ値との間の上記に記載した関係は、インビボＳＰＦと同じ方法で保護因子を計算することを可能にする。これらの新規な保護因子の有効性は、標準保護層として減光フィルタを使用することによりチェックされた。
【００３１】
従って、インビボＳＰＦ決定におけると同じ方法を使用する：
定義：ＳＰＦ＝ＭＥＤp／ＭＥＤu（紅斑終点について）、
ここで、ＭＥＤp＝保護された皮膚に与えられる最小紅斑ＵＶ線量
ＭＥＤu＝保護されない皮膚（ブランク）に与えられた最小紅斑ＵＶ線量
概略的説明（図１）に従えば、ＭＥＤpおよびＭＥＤuは、紅斑終点がＥＳＲスペクトロスコピーで検出された遊離ラジカルＲＧの量で置換えられるときには、Ｅ0およびＥに対応する。
【００３２】
ＥＳＲ・Ｘ帯スペクトロスコピーによる遊離ラジカルの定量的測定は、新たな太陽光保護因子を決定することを可能にする。しかしながら、ＥＳＲスペクトロスコピーのより大きな貫通深さは、ＵＶＢおよびＵＶＡの全範囲、並びにその表面から皮下組織までの皮膚縦軸をカバーする皮膚の完全な調査を可能にする。これにより、我々は、この新規な保護指標を、統合太陽光保護因子（ｉＳＰＦ、ＩＳＰＦまたは∫ＳＰＦ）と命名することを提案する。
【００３３】
∫ＳＰＦの決定：
原理的方法を図１に示した。以下のステップが行われる：
１）ＵＶ線量と遊離ラジカル発生（ＲＧ）との間の数的関係が樹立された（式２のパラメータａおよびｂの評価）。これら式パラメータは両者とも、異なるＵＶ線量を受けた保護されていない生検片における遊離ラジカル発生を測定することによって、時間毎に調節（較正）されるべきである。
２）保護された生検片（上皮表面に広げられた、２ｍｇ／ｃｍ2の日焼け止め製品）が照射された。各時間露出（ｔ）について、遊離ラジカル発生がＥＳＲスペクトロスコピーによって評価される。従って、保護された生検片のＲＧ値＝Ｘt（測定値）である。
３）各露光時間について、保護された生検片に与えられた対応するＵＶ線量（Ｅ0）tが計算される：
（Ｅ0）t＝照射時間              （３）
４）同じ量の遊離ラジカル（Ｘt）を発生させるために必要な有効ＵＶ線量（Ｅ）tは、式２のパラメータａおよびｂに従って計算される。
ｌｏｇ（Ｅ）t＝ａ・ｌｏｇ（１０００・Ｘt）＋ｂ        （２ａ）
５）日焼け止め製品の統合ＳＰＦは、同じ露光時間についてのＵＶ線量の比として計算される：
∫ＳＰＦ＝（Ｅ０）t／（Ｅ）t              （１ａ）
【００３４】
実施例１および２：
二つの異なる日焼け止めサンプルを試験し、両方ともＵＶＢにおける高い保護、および異なるＵＶＡ保護レベルを達成した：日焼け止めＡは、ＳＰＦ＝２６で、ＵＶＡ・ＰＦ（ＰＰＤ）＝５の物理的なＴｉＯ2日焼け止めである；日焼け止めＢは、ＳＰＦ＝３９で、ＵＶＡ・ＰＦ（ＰＰＤ）＝１２の有機ＵＶフィルタ日焼け止めである。
両方の製品とも、２ｍｇ／ｃｍ2で皮膚表面に塗布され、３回の照射に従って試験された。カバーされない皮膚生検片も並列に試験され、一組が太陽光シミュレータに直接露出され、第二の組は、減衰３０の減光フィルタを通して露光された。表３に記録した各遊離ラジカル発生データは、四つの生検片について平均された。
【００３５】
表３：異なる照射時間による遊離ラジカル発生（ＲＧ＝Ｘ・１０12ｒａｄ／ｍｇ）
2007532896.tif 000006
【００３６】
第一のステップにおいて、遊離ラジカル発生（Ｘｔ・１０００）とＵＶ線量との間の関係が、その再現性を試験するために再度確立された。減光フィルタなしで、および該フィルタと共に、被覆されていない皮膚生検片を使用した。これら皮膚生検片が受けたＵＶ線量は、式（６）に従って計算された。
【００３７】
キャリブレーションデータが二重対数ＸＹ軸のグラフにプロットされると、一方は、次式（５）に従って正確な式（２）のパラメータを受取る：
Ｌｏｇ（ＵＶ線量）＝２．０９４７Ｌｏｇ（１０００・Ｘ）−３．７４６３  （５）
式（５）が図３に提示された線型関係に非常に近いことを認めることができる。
表３の全てのデータは、線型の関係を得るために、対数関数（底は１０）を通して変換された。
表３ａ
【００３８】
【表２】
2007532896.tif 000007
【００３９】
次いで、Ｌｏｇ（ラジカル）対Ｌｏｇ（ＵＶ線量）が、式２を通して補正される。
【００４０】
表３ｂ
ａおよびｂパラメータ調節
2007532896.tif 000008
【００４１】
次いで、合計二乗差デルタａ2を最小化するように、ａおよびｂの値を決定した。こうして、式２は、ａ＝２．０９４７、およびｂ＝３．７４６３を用いて、実験値に良く調節される。調節した後に、式２を使用して、差Ｘ値に従ってＬｏｇＥを見出す。ＵＶ線量は、表３のラジカル発生データから計算することができる。それらは表４に記載されている。この計算方法は、最初に、ブランクおよび減光フィルタ３０について、計算されたＵＶ線量を供給されたＵＶ線量と比較することによりチェックされる。１３％の最大偏差で、小さい差のみが検出された。第二に、日焼け止め製品ＡおよびＢについて、有効ＵＶ線量が計算された。保護された生検片（２ｍｇ／ｃｍ2の日焼け止め層が広げられたもの）に対して測定される同じ量の遊離ラジカルを生じるように、これらＵＶ線量は、保護されない生検片に対して与えられるべきである。
【００４２】
表４：表３のラジカル発生データに従い、式（５）から計算された
ＵＶ線量（ｍＪ／ｃｍ2）
2007532896.tif 000009
【００４３】
表４のＵＶ線量に従って、同じ露出時間についての計算値（有効）で供給されたＵＶ線量の比として、保護因子（∫ＳＰＦ）が計算される（式１）。結果は表５に記載されている。精度指数は、ブランクおよび減光フィルタ３０試験でチェックされる。日焼け止めの新規な保護因子が、同じ表の欄４および５に記載されている。
不確実性（±９５％信頼性幅）もまた、全ての測定値に従って計算された（各露出時間について４生検片）。
【００４４】
表５：表４に記載されたＵＶ線量の比に基づいて計算された太陽光保護指数∫ＳＰＦ
∫ＳＰＦ
2007532896.tif 000010
【００４５】
第一の所見として、統合ＳＰＦはＵＶフィルタ幅の広さと共に増大することを認めることができる。最良のインビボＵＶＡ（ＰＰＤ）を有する日焼け止めＢについて、最も高い値が見出される。両方の試験サンプルにおいて、統合ＳＰＦはインビボ紅斑ＳＰＦよりも明らかに低い。
【００４６】
実施例３〜８
異なるＵＶフィルタ幅についての統合ＳＰＦ選択性を決定するために、異なるＵＶＢおよび／または広帯域ＵＶＡ／Ｂフィルタを用いて特定の日焼け止め処方を得た。
実施例３＝日焼け止めＣ＝ＵＶフィルタなしのＯ−Ｗベース
実施例４＝日焼け止めＤ＝ベース＋ＵＶフィルタ１（５％ＩＭＣ）
実施例５＝日焼け止めＥ＝ベース＋ＵＶフィルタ２（１０％ＩＭＣ）
実施例６＝日焼け止めＦ＝ベース＋広帯域ＵＶＡ／ＵＶＢフィルタ１
（１．５％ＢＭＤＢＭ＋３％ＭＢＢＴ）
実施例７＝日焼け止めＧ＝ベース＋広帯域ＵＶＡ／ＵＶＢフィルタ２
（３％ＢＭＤＢＭ＋８％ＭＢＢＴ＋２％ＢＥＭＴ）
実施例８＝日焼け止めＨ＝ベース＋ＵＶフィルタ１（５％ＩＭＣ）
＋広帯域ＵＶＡ／ＵＶＢフィルタ２
（３％ＢＭＤＢＭ＋８％ＭＢＢＴ＋２％ＢＥＭＴ）
上記六つの日焼け止めサンプルを、三つの異なる照射時間（３０、６０および１５０秒）を用いて、説明した通りに試験した。
【００４７】
表６に記載した各ラジカル発生データＸは、四つの生検片測定の平均である。
∫ＳＰＦ（統合ＳＰＦ）が、同じ露光時間について、供給されたＵＶ線量の有効ＵＶ線量に対する比として計算された（式１）。それぞれの記録された∫ＳＰＦは、異なる照射時間に対応する三つの計算の平均である。また、不確実性（±９５％信頼性幅）も計算され、表６に記載されている。
【００４８】
表６：  異なる照射時間に従うＲＧデータ（ＲＧ＝Ｘ・１０12ｒａｄ／ｍｇ）
平均∫ＳＰＦが三つの異なる露光時間から計算された
2007532896.tif 000011
【００４９】
これらの実施例は、∫ＳＰＦがＵＶフィルタの幅および強度に従って明らかに増大することを確認している。十分にバランスされていないＵＶＢ／ＵＶＡ日焼け止めは、保護の増強を達成しなかった。これは、単一のＵＶＢフィルタが組込まれた日焼け止めＤおよびＥのように、ＵＶＡフィルタリングの乏しい日焼け止めで劇的に観察された。これらの製品に付いては、∫ＳＰＦで与えられるＵＶ放射線に対する現実の生物学的な関連の保護は、紅斑ＳＰＦで表された仮定に対して劇的に低い。
【００５０】
実施例９
インビボＰＰＤおよびインビボＳＰＦに比較して、∫ＳＰＦは、全体の太陽光スペクトル（ＵＶＢ＋ＵＶＡ）を考慮に入れている。
ＥＳＲのこれら測定効果（皮膚の深さにおいて）は、他方において、ＵＶＢによって生じた遊離ラジカルの定量値の誤った解釈を導く可能性がある。示され得るように、この値は約０．２４・１０12ラジカル／ｍｇである。しかし、全てのこれらＲＯＳは、平均表皮についての５０マイクロメータの仮定において、１ｍｍ・１ｍｍ・０．０５ｍｍの体積要素の中に含まれる。従って、表皮中に生じた遊離ラジカルの数は、ＵＶＡの影響下に皮膚の深い層におけるもの（約１．５８・１０12遊離ラジカル／ｍｇ）よりも３倍高い。
【００５１】
ＵＶＢ単独で生じる表皮体積要素中における概略４．８・１０12これらラジカルの数は、紅斑または関連のＤＮＡ損傷のような生物学的効果の形成にとって、非常に関連する可能性がある。最初の効能指標は、ＵＶＢに誘導されたＤＮＡ損傷が、非常に高い量の抗酸化剤で防止され得ることを示している。Ｌｉｎ  ＆  ａｌは、ブタ皮膚において測定された、ビタミンＣおよびＥの組合せによるチミン二量体形成に対する保護を報告した。
【００５２】
この実験を完成させるために、良好なＵＶＡ保護のみを持った日焼け止めが、サンプルパネルに添加された。５．０％のＢＭＤＢＭを化粧品基材に組込み、ＵＶＡにおける強力な吸収およびＵＶＢにおける低い吸収を達成した（日焼け止めＮ、図４）。予測された通り、低いインビボ紅斑ＳＰＦ＝４．７（±１．３）が測定された。統合ＳＰＦに関する疑問が生じる：ＵＶＢ放射線についての我々の皮膚モデルの可能な感受性欠如に従って、それは非現実的な高い値に向って甚だしく大きくなるのであろうか？  製品Ｎに対して当該新しい方法を適用することにより、我々は、インビボＳＰＦに匹敵する統合ＳＰＦを得た：∫ＳＰＦ＝５．１（±１．２）。従って、図４に示すように、低いＵＶＢ保護および高いＵＢＡ保護が同じサンプルに対して実現されるときでも、ＵＶ保護の過大評価は生じ得ない。
【００５３】
逆に、インビボＳＰＦでは如何なる相関も示されなかった。
ＵＶフィルタ処方に応じて、インビボＳＰＦデータは、統合ＳＰＦを大きく超え（日焼け止め中に強力なＵＶＢ保護が存在するとき）、またはこれと同等である。勿論、紅斑ＳＰＦはＵＶフィルタ幅の重要性を考慮しておらず、従って、主に高いＳＰＦ値について、劣悪な安全性の感覚を消費者に誘起させることはできない。この観点から、新規な∫ＳＰＦは価値のある情報を提供する。
図４のグラフは、紅斑ＳＰＦおよび統合ＳＰＦの間の主な相違を示す四つの典型的な例を纏めている。日焼け止めＥは、ＵＶＢ保護を有するがＵＶＡ保護を持たない。日焼け止めＮは、ＵＶＡ保護を有するが、ＵＶＢ保護は少ししかない。日焼け止めＧは、ほぼ同じＵＶＢおよびＵＶＡ保護を有する。日焼け止めＨは、ＵＶＡ保護よりも高いＵＶＢ保護を有する。
【００５４】
スペクトル指標および保護指標は、紅斑ＳＰＦがＵＶＢフィルタに対して非常に感受性であるが、ＵＶＡフィルタに対しては非常に僅かしか感受性でないことを示している。逆に、本発明の∫ＳＰＦは、ＵＶＢフィルタおよびＵＶＡフィルタの両方に対して感受性であることが分かった。
本発明の方法によれば、幅広いＵＶＢ／ＵＶＡフィルタを持った製品のみが、高い統合ＳＰＦを達成できることが明らかである。これは、ＵＶＡおよびＵＶＢ放射線が皮膚生検片の全体（表皮＋真皮）において遊離ラジカルの発生に関連するとの事実に一致している。更に、ＥＳＲスペクトロスコピーから提示されるこの新規な保護因子は、ＵＶＢに由来する紅斑の外観を十分に含んでおり、また、示すことができたように、インビボＵＶＡ・ＰＰＤとの十分に相関している。
【００５５】
統合ＳＰＦは、従来のインビボＵＶ指標のように解釈することができる：
∫ＳＰＦ＝１０の保護は、保護されない皮膚よりも１０倍長い時間、日焼けすることなく太陽光の中にいることができるであろうことを意味し、またＰＰＤ反応に達するために必要な時間よりも十分に低い。従って、∫ＳＰＦ＝１０の製品での１時間の一定の太陽光露出は、皮膚に対して僅かな遊離ラジカル損傷を生じ、これは保護されない直接の太陽光露出の僅か６分に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】保護因子評価の概略図である。
【図２】ＲＧデータ（表１からの×１０12）ｖｓ．ＵＶ線量
【図３】図２のデータに従う、ｌｏｇ（ＵＶ線量）とｌｏｇ（遊離ラジカル発生）との間の線型関係。
【図４】日焼け止めＥ、Ｎ、ＧおよびＨのＵＶスペクトル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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