(57)【要約】  新規病原性ウシエンテロウイルスの単離を記載する。本新規病原性ウシエンテロウイルスは、本新規病原性ウシエンテロウイルスに対する、抗体及び免疫原性組成物を開発するために使用される。診断アッセイについて述べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され及び精製された病原性ウシエンテロウイルス。
【請求項２】
前記病原性ウシエンテロウイルスが、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａを有する、請求項１に記載の、単離され及び精製された病原性ウシエンテロウイルス。
【請求項３】
前記病原性ウシエンテロウイルスが、エーテルに対して非感受性であることと、及び３０ｎｍより小さいサイズを有することとを特徴とし、該病原性ウシエンテロウイルスは、ウシからの血清抗体と特異的に反応性があり、該血清抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａを経鼻的にウシに接種し、接種後２５日から４０日後に該接種を行ったウシから血清抗体を回収することにより得られる、請求項１に記載の単離され及び精製された病原性ウシエンテロウイルス。
【請求項４】
前記病原性ウシエンテロウイルスが弱毒化されている、請求項１に記載の病原性ウシエンテロウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項５】
前記病原性ウシエンテロウイルスが不活性化されている、請求項１に記載の病原性ウシエンテロウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項６】
前記病原性ウシエンテロウイルスが、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａを有し、該病原性ウシエンテロウイルスが、弱毒化されているか又は不活性化されている、請求項１に記載の病原性ウシエンテロウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項７】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に対する原因物質である不活性化ウイルスを含み、該ウイルスは、エーテルに対して非感受性であることと、及び３０ｎｍより小さいサイズを有することとを特徴とし、該ウイルスは、ウシからの血清抗体と特異的に反応性があり、該血清抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａを経鼻的にウシに接種し、接種後２５日から４０日後に該接種を行ったウシから血清抗体を回収することにより得られる、ウシにおいて免疫反応を生じさせるための免疫原性組成物。
【請求項８】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に対する原因物質である弱毒化ウイルスを含み、該ウイルスは、エーテルに対して非感受性であることと、及び３０ｎｍより小さいサイズを有することとを特徴とし、該ウイルスは、ウシからの血清抗体と特異的に反応性があり、該血清抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａを経鼻的にウシに接種し、接種後２５日から４０日後に該接種を行ったウシから血清抗体を回収することにより得られる、ウシにおいて免疫反応を生じさせるための免疫原性組成物。
【請求項９】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に罹患したウシからの組織を均質化して、病原性ウシエンテロウイルスを含むホモジェネートを形成することと；及び動物細胞を介して該病原性ウシエンテロウイルスを継代することを含むプロセスにより、該ホモジェネート中の該病原性ウシエンテロウイルスを弱毒化して、ウシにおいて非動物病原性である弱毒化病原性ウシエンテロウイルスを形成させることと；を含む、請求項４に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１０】
動物細胞を介して該病原性ウシエンテロウイルスを継代して、ウシにおいて非動物病原性である弱毒化病原性ウシエンテロウイルスを形成させることを含む、請求項４に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１１】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に罹患したウシからの組織を均質化して、病原性ウシエンテロウイルスを含むホモジェネートを形成することと；細胞培養物に該ホモジェネートを接種して、病原性ウシエンテロウイルスを増殖させることと；該細胞培養物から病原性ウシエンテロウイルスを回収することと；及び不活性化物質を添加することにより、該病原性ウシエンテロウイルスを不活性化することと；を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１２】
不活性化物質を添加することにより、前記病原性ウシエンテロウイルスを不活性化させることを含む、請求項５に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１３】
ウシから肺組織試料を得ることと；
該試料の液体ホモジェネートを形成させることと；
該液体ホモジェネートを支持体に固定化することと；
モノクローナル抗体を該固定化ホモジェネートに添加して、該液体ホモジェネート中のウイルス性因子と複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａのタンパク質に特異的に結合する。）；及び
該複合体を検出することと（該複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の存在を示す。）；
を含む、ウシにおいて病原性ウシエンテロウイルス疾患を診断するための方法。
【請求項１４】
病原性ウシエンテロウイルスに感染している疑いのあるウシからの組織試料の液体ホモジェネートを形成させることと；
該液体ホモジェネートにモノクローナル抗体を添加して、該ホモジェネート中でウイルス性因子との沈殿複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａのタンパク質に特異的に結合する。）；及び該沈殿複合体を検出することと（該沈殿複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の診断である。）；
を含む、ウシにおいて病原性ウシエンテロウイルス疾患を診断するための方法。
【請求項１５】
ウシから肺組織試料を得ることと；
該組織試料の液体ホモジェネートを形成させることと；
細胞を培養するのに有効な条件下で、細胞調製物とともに該液体ホモジェネートをインキュベーションすることと；
細胞解体物を与えるために該培養細胞を処理することと；
該細胞剥離物を支持体に固定化することと；
モノクローナル抗体を該固定化細胞解体物に添加して、該固定化細胞解体物中のウイルス性因子と複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａのタンパク質に特異的に結合する。）；及び
該複合体を検出することと（該複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の診断である。）；
を含む、ウシにおいて病原性ウシエンテロウイルス疾患を診断するための方法。
【請求項１６】
ウシから肺組織試料を得ることと；
該肺組織試料を支持体に固定化することと；
モノクローナル抗体を該固定化肺組織試料に添加して、該固定化肺組織試料中のウイルス性因子と複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａのタンパク質に特異的に結合する。）；
該複合体を検出することと（該複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の診断である。）、を含む、病原性ウシエンテロウイルスを診断するための方法。
【請求項１７】
請求項４、請求項５又は請求項６に記載の免疫原性組成物をウシに投与することを含む、病原性ウシエンテロウイルスに対してウシにおいて免疫反応を生じさせる方法。
【請求項１８】
病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａのタンパク質に結合する、モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユニークな病原性ウシエンテロウイルスの単離、そのウイルスに対するワクチン、そのウイルスと結合する抗体及びその診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシエンテロウイルスは、ピコルノウイルス（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）である。これは、１本鎖のセンスＲＮＡを有し、直径が約２５から３０ｎｍである。そのバイロンは、エンベロープに包まれていない２０面体である。このウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する。ウシエンテロウイルスは、エーテル非感受性である。
【０００３】
ウシエンテロウイルスは、特徴がよく調べられている。ウシエンテロウイルスのヌクレオチド配列は、１９８８年に完了した（Ｅａｒｌｅ  ＪＡら、“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ”，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：Ｐａｒｔ  ２，ｐｐ．２５３−６３（１９８８年２月））。ウシエンテロウイルスを同定するために（Ｈｏｆｎｅｒ  ＭＣ，“Ａｎ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１：２  ｐｐ．２３９−４３（１９９３年２月）及び、動物におけるウシエンテロウイルスに結合する抗体の検出のために（Ｚｈａｎｇ  ＡＱら、“Ａ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｄｓ  ２４：１−２，ｐｐ２２３−６（１９８９年４月から５月））、ＥＬＩＳＡアッセイが開発された。合成ペプチドを用いて、中和抗体を作製することができる（Ｓｍｙｔｈ  ＭＳら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２６：１−４，ｐｐ  ２１−３３（１９９２））。ウシエンテロウイルスが、口蹄疫ウイルスとある程度の交差抗原性を有する一方（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＡＡ，“Ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｔｅｒｒｉｔｏｒｉｅｓ  ｌ５  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ”，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３９：１，ｐｐ５９−６３（１９７８年１月）、通常、ウシエンテロウイルスが、ウシ及びヒトの両方で安全であることが広く認められている。現に、他では、癌治療に対してウシエンテロウイルスを使用することが示唆されている（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ＭＷら、“Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ａｎ  ａｉｄ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ａｎｄ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ＰＮＡＳ  ６８：４、ｐｐ．８３６−４０（１９７１年４月）及びＳｍｉｔｈ  Ｍら、“Ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ：Ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１０：１，ｐｐ．４９−５３（２００２年７月）を参照のこと。）。
【０００４】
最近、呼吸器疾患を有するウシからの組織試料の試験により、ウシエンテロウイルスがその疾患の原因物質であることが明らかとなっている。この特定のウシエンテロウイルスを単離し、家畜において呼吸器疾患を引き起こすことを示すことができる。そのようなものとして、ウシエンテロウイルスに対するワクチンは、家畜における疾患予防に有用である。この特定のウシエンテロウイルスに対する抗体を有することは有用であり、これは、抗体を診断アッセイのために使用できるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新規病原性ウシエンテロウイルスを単離し特徴を調べることである。本発明のさらなる目的は、動物においてこのウイルスを診断するためのアッセイ及びこのアッセイを行うための方法である。本発明のまた別の目的は、この新規病原性ウシエンテロウイルスに対する免疫原性組成物、この免疫原性組成物を生成させるための方法及びこの免疫原性組成物を用いて動物で免疫反応を刺激するための方法を有することである。
【０００６】
本発明の目的は、この新規病原性ウシエンテロウイルスに結合する、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を有することである。本発明の別の目的は、この新規病原性ウシエンテロウイルスの感染について動物を試験するための診断アッセイのために、これらのポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を使用することである。本発明の別の目的は、免疫原性組成物の生成の際にこれらのポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を使用することである。
【０００７】
本発明の目的は、動物において病原性ウシエンテロウイルスに対する免疫反応を生じさせる免疫原性組成物を有することである。本発明のさらなる目的は、本免疫原性組成物が、不活性化病原性ウシエンテロウイルス、弱毒化病原性ウシエンテロウイルス、病原性ウシエンテロウイルスからの、抗原性タンパク質又はポリペプチド、抗原性タンパク質もしくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は、動物に投与した際に動物に病原性ウシエンテロウイルスに対する免疫反応を生じさせる、その他の免疫刺激組成物を有することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、新規病原性ウシエンテロウイルスの単離に関する。本発明はまた、この新規病原性ウシエンテロウイルスに対する診断アッセイの開発及びこの疾患に罹患している家畜を治療するための、及び／又は、この疾患に家畜が罹患しないよう予防するための、免疫原性組成物に関する。
【０００９】
この病原性ウシエンテロウイルスに対する免疫原性組成物は、感染したウシ肺組織もしくはこの特定の病原性ウシエンテロウイルスの特徴的な病巣を示す他のウシ組織から処理した接種材料由来の、又は深部鼻腔綿棒標本からの、不活性化病原性ウシエンテロウイルス又は弱毒化病原性ウシエンテロウイルスのいずれかを含有し得る。サブユニット、ベクター、組み換え及び合成ペプチド免疫原性組成物などを含む、病原性ウシエンテロウイルスの機能的派生物も本発明の一部である。
【００１０】
病原性ウシエンテロウイルスの単離
病原性ウシエンテロウイルスは、場合によっては血液を含有し得る重度の鼻汁があるウシから、Ｄａｃｒｏｎが先に付いた長い綿棒を用いて、深部鼻腔綿棒標本を取り、単離することができる。この感染動物はまた、約１０３から１０４°Ｆの体温上昇、摂食減少（「オフフィーディング（ｏｆｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ）」とも呼ばれる。）及び元気のない様子も示す。感染したウシの動物死亡率は低い。使用するまで、−２０℃にて、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２ｍＬの最小必須培地（ＭＥＭ）中にチップとともにその綿棒標本を保存することができる。あらゆる他の医薬適合性の水溶液（生理食塩水、リンガー溶液、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩緩衝溶液）など）中でこの綿棒標本を保存することができる。４３検体を得て、病原性実体を単離するために使用する。
【００１１】
それぞれの深部鼻腔綿棒標本試料を室温で解凍し、次に、０．２μシリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に通し、濾過試料を得る。次に、９６穴プレート中の３種類の異なる真核細胞単層に接種するために、それぞれの濾過試料を使用する。それぞれのウェルは、約８０％から１００％コンフルエントで、次の細胞株の１つを含有する：Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、Ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ（アカゲザル腎臓）（ＲＭＫ）及びヒト直腸腫瘍細胞（ＨＲＴ）細胞株。各濾過試料  ２０μｌを１つのウェルに添加し、各濾過試料に対して全部で４ウェルに接種する。各ウェルは、１００μｌＭＥＭ及びゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する。これらプレートを４％  ＣＯ２雰囲気中で、３５℃から３７℃にて３０分から６０分間インキュベーションする。次に、ＭＥＭ及びゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  １００μｌを各ウェルに添加し、これらプレートを、３５℃から３７℃にて４％  ＣＯ２雰囲気中で、３日から５日間インキュベーションする。
【００１２】
２回目のインキュベーション（３日から５日間）の後、細胞変性（細胞が丸くなる、濃縮するなど）の影響について、光学顕微鏡を用いてその細胞を調べ、ウェルの底面から剥がす。細胞死が起こる。細胞変性の影響が観察されない場合は、細胞をプレートウェルの底から剥がし、単離し、−７０℃にて約３０分以上凍結し、次いで解凍する。次に、凍結融解試料  ２０μｌを、約８０％から１００％コンフルエントで既に使用したものと同じ細胞株を含有する別のウェルに添加し、上述のようにして処理する。再び、細胞変性の影響が観察されない場合は、その試料を再び凍結融解し、同じ細胞株を別のウェルで再インキュベーションする。この凍結融解プロセスは、明らかな細胞変性の影響（ＣＰＥ）を欠く全試料に対して最大３回行う。
【００１３】
結果を以下に示す：
−２８試料は、侵襲性を示し、ＭＤＢＫ細胞においてＣＰＥが高レベルである。
−この２８試料のうち７試料は、ＨＲＴ細胞において＋／−であるとみなされる細胞変性変化を示す。
−他の試料はＨＲＴ細胞又はＭＤＢＫ細胞においてＣＰＥの徴候を示さない。
−ＲＭＫ細胞での３回の継代後、いずれの試料でもＣＰＥは観察されない。
【００１４】
病原性ウシエンテロウイルスはまた、場合よっては血液を含有し得る重度の鼻汁を示すウシからの肺組織又は鼻−洞組織からの接種物として、単離することができる。感染動物はまた、約１０３から１０４°Ｆの体温上昇、摂食減少（「オフフィーディング（ｏｆｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ）」とも呼ばれる。）及び元気のない様子も示し、感染したウシの動物死亡率は低い。このようなウシを解剖し、それらの肺組織を取り出す。この肺組織を光学顕微鏡を用いて調べる。組織病理学的評価から、単核白血球浸潤及び変性細胞を示す病巣を有する、気管支炎及び／又は気管支梢炎が示され；肺胞中隔が細胞の浸潤とともに厚くなり得；過剰な破片が肺胞に存在し得る。上記の身体診察によるこれらの特徴は、病原性ウシエンテロウイルスの存在を示唆する。
【００１５】
組織ホモジェネートがそのホモジェネートの１０％重量／体積量を含有するように、医薬適合性の水溶液とともに所望する組織を均質化する。次に、このホモジェネートを約０．１から１０μの間の孔径のフィルターに通し、好ましくは、孔径が小さくなっていく一連のフィルターに通し（１μ、０．６μ及び０．２μなど）、病原性ウシエンテロウイルスを含有する濾過試料を調製する。約１μより大きくない、より好ましくは０．２μより大きくない大きさの生物学的粒子をこの濾過試料が含有することが好ましいものであり得る（エンテロウイルスは、直径０．２３から０．２８μの粒子サイズを有し、０．２μのフィルターを通過しない。）。
【００１６】
病原性ウシエンテロウイルスの精製形態を調製するために、この濾過試料を、上述のような一連のインビトロ細胞調製物に接種することができる。あるいは、腎臓、肝臓、心臓及び脳、肺、脾臓、睾丸、鼻甲介、白血球及び赤血球及びリンパ節などの哺乳動物器官細胞を伴う細胞調製物、ならびに、昆虫及び鳥類胚調製物を使用することができる。これらの細胞調製物に適した培養液には、ウシ胎仔血清及び寒天、血液寒天（ｂｌｏｏｄ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ａｇａｒ）、脳−心臓グルコースブロス及び寒天など、哺乳動物細胞の増殖を促進するものが含まれる。好ましくは、この哺乳動物細胞は、ＭＤＢＫ細胞である。
【００１７】
濾過試料を用いて細胞調製物を接種して培養物を増殖させた後、培養細胞の個々の塊を回収し、凍結融解し、細胞とともに滅菌培養液に再導入する。一連のものの最後の培養からの培養液により、病原性ウシエンテロウイルスの精製形態が得られる。また、一連の繰り返し回収を行った後、この培養物を増殖させることができ、この培養液体を回収し、その液体を様々な細胞種に対する接種材料として使用する。このようにして、様々な種の培養からの培養液体により病原性ウシエンテロウイルスの精製形態が得られるように、病原性ウシエンテロウイルスを弱毒化することができる。
【００１８】
病原性ウシエンテロウイルスの特徴
本病原性ウシエンテロウイルスは、生理化学的特性（大きさ、脂質溶媒に対する感受性、プロテアーゼに対する感受性、レクチンに対する結合など。）を測定することにより、ＤＮＡ配列及び／又はアミノ酸配列を調べることなどにより、特徴を調べることができる。下記は、ウシエンテロウイルスとしてウイルスを同定するためのいくつかのアッセイの、プロトコール及び結果である。
【００１９】
核酸の決定
ハロゲン化ヌクレオシド（５−ブロモ−２−デオキシウリジン、５−フルオロ−２−デオキシウリジン及び５−ヨード−デオキシウリジン）は、特定の動物ウイルス内に含有される核酸のタイプを同定するために使用されることが多い、３種類の異なる化学的に関連する代謝阻害剤である。これらのハロゲン化ヌクレオシドならびにマイトマイシンｃは、ＤＮＡウイルスの複製を阻害し、殆どのＲＮＡウイルスの複製には影響を与えない。レトロウイルス科においては、初期ＤＮＡ合成がこれらのウイルスに対して必要であるために、これらのヌクレオシド及びマイトマイシンｃは阻害効果を与える。これらの化学物質の影響は、チミジンにより反転させられる。
【００２０】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）中で１８個のＴ−２５ｃｍ２細胞培養フラスコにおいて、ＭＤＢＫ細胞のコンフルエントの層を増殖させる。コンフルエントになったら、ＤＭＥをデカントし、５−ヨード−２−デオキシウリジン（ＩＤＵＲ）１００μｇ／ｍｌを含有するチミジン欠乏ＤＭＥで置き換える。３７℃にて２４時間インキュベーションした後、チミジン欠乏、ＩＤＵＲ＋ＤＭＥを細胞培養物から除去する。４つのＭＤＢＫ細胞培養物に、３種類の対照ウイルス（ＩＢＲＶ（感染性ウシ鼻気管炎ウイルス）、公知のウシエンテロウイルス（ＢＥＶ３型、ＰＳ８９株、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７５５）及びウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１ａ型、ＫＹ−２２株））及び病原性ウシエンテロウイルスであることが疑われる単離ウイルスのそれぞれを、全部で１６種類の感染細胞培養物になるように、接種する。３７℃にて１時間感染細胞培養物をインキュベーションし、各フラスコをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌで洗浄することにより、非吸着ウイルスを除去する。
【００２１】
チミジン２０μｇ／ｍｌを含有するＤＭＥ増殖培地１０ｍｌを、各試験ウイルスのそれぞれに対する４つの感染細胞培養物のうち２つに添加し、１００μｇ／ｍｌＩＤＵＲを含有するＤＭＥ  増殖培地１０ｍｌを、感染させた試験ウイルス培養物の半分に添加する。非処理対照フラスコとして、その４種類それぞれの各ウイルスで感染させた別の２つのＴ−２５ｃｍ２  ＭＤＢＫ培養フラスコを含める。３７℃でその培養物をインキュベーションし、ＣＰＥについて毎日調べる。チミジンが入ったＤＭＥを含有するウイルス感染フラスコにおいてＣＰＥが見える場合（時間は、調べている特定のウイルスに依存する。）、同じウイルスに感染した試験培養物の全セットならびにそのウイルスに対する対照培養物を回収し、ウイルス感染性についてタイターを調べ、比較する。ＩＤＵＲを２０μｇ／ｍｌマイトマイシンｃに置き換えることにより、マイトマイシンｃに対して同じプロトコールを使用することができる。
【００２２】
ＩＤＵＲ又はマイトマイシンＣの存在は、ＤＮＡウイルスである、ＩＢＲＶの感染性において負の方向の影響を有する。この負の方向の影響は、細胞培養にチミジンを添加することにより軽減される。ＩＤＵＲ又はマイトマイシンＣの存在は、両者ともＲＮＡウイルスである、ＢＥＶ  ３型及びＢＶＤＶの感染性において影響がない。細胞培養へのチミジンの添加は影響がない。上記のように単離され、病原性ウシエンテロウイルスである疑いのあるウイルスに対して、ＩＤＵＲ又はマイトマイシンＣの存在は、その感染性に影響を与えず、その細胞培養へのチミジンの添加もまた何ら変化を引き起こさない。このアッセイは、病原性ウシウイルスであることが疑われるウイルスがＲＮＡウイルスであることを確認するために使用することができる。
【００２３】
エーテル感受性
有機溶媒は、その構造に脂質を含有するウイルスのヌクレオカプシド又は外殻から必須の脂質を除去し、この処理により、非感染性物質になる。したがって、それらのヌクレオカプシドを取り囲むエンベロープを保持する殆どの動物ウイルスは、エーテルなどの脂質溶媒に対して感受性がある。
【００２４】
疑いのある病原性ウシエンテロウイルス及び４種類の対照ウイルス（ＢＡＶ（ウシアデノウイルス５型、ｂａｒｔｈａ株）、ＢＥＶ（ウシエンテロウイルス３型、ＰＳ８９株、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７５５）、ＢＶＤＶ（ウシウイルス性下痢ウイルス、１ａ型、ＫＹ−２２株）及びＩＢＲＶ（感染性ウシ鼻気管炎ウイルス）を用いて、エーテル１部に対して各試験ウイルス４部を混合し、混合物を試験管ローラー上で４℃にて２４時間インキュベーションする。非エーテル処理ウイルス懸濁液のネガティブ対照を同じインキュベーション条件下で同時にインキュベーションする。
【００２５】
２４時間後、全処理試験管を１０００ｘｇで２０分間遠心する。ＭＤＢＫ細胞株において、ウイルス感染性に関して、エーテル処理物及び非処理対照懸濁液からの液層のタイターを調べる。非処理ウイルス懸濁液と比較した場合のエーテル処理試料中での１．０ｌｏｇ１０以上のウイルスタイターにおける減少から、ジエチルエーテルに対する感受性が強いことが示される。
【００２６】
ＢＡＶ５型及びＢＥＶ３型両者の場合、エーテル処理はウイルス感染性に影響を与えず、このことから、これらのウイルスがエンベロープのないウイルスであることが示される。ＩＢＲＶ及びＢＶＤＶの場合、エーテル処理によりウイルスの感染性が少なくとも１．０ｌｏｇ１０低下するが、このことから、これらのウイルスがエンベロープを有するウイルスであることが示される。上記で単離され、病原性ウシエンテロウイルスである疑いのあるウイルスの場合、エーテル処理はウイルス感染性に影響を与えず、このことから、ＢＥＶ  ３型と同様に、このウイルスがエンベロープを持たないウイルスであることが示される。
【００２７】
ｐＨ不安定性／安定性
ｐＨ３への３０分間にわたるウイルスの曝露により、あるウイルスでは感染性が低下し（例えば、ピコルナウイルス科の一員であるライノウイルス）、一方、同じ科の一員でもあるエンテロウイルスなどの他のウイルスでは影響がない。
【００２８】
ライノウイルス属は、酸性状態に対して感受性があり、ｐＨ５以下で失活する。ウイルスは、酸性不安定（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｅ）（１．０ｌｏｇ１０以上低下）又は酸性安定（ａｃｉｄ  ｓｔａｂｉｌｅ）（タイターが低下しないか、又は１．０ｌｏｇ１０未満の低下）と特徴付けることができる。
【００２９】
病原性ウシエンテロウイルスである疑いのある単離ウイルスのウイルス懸濁液及び４種類の対照ウイルス（ＢＥＶ（ウシエンテロウイルス３型、ＰＳ８９株、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７５５）、ＩＢＲＶ（感染性ウシ鼻気管炎ウイルス）、ＢＲＳＶ（ウシ呼吸器合胞体ウイルス、Ｌｅｈｍｋｕｈｌ３７５株）及びウシライノウイルス２型、ＥＣ−１１株（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３９２）を４つに等分する。ＤＭＥがｐＨ３、ｐＨ５及びｐＨ７．２になるように、ＤＭＥのｐＨを調整する。各試験ｐＨにおいて、各ウイルス懸濁液１部をＤＭＥ増殖培地９部と混合する。その混合物を２５℃にて２時間インキュベーションする。ＭＤＢＫ細胞株においてウイルス感染性について全試料のタイターを調べ、比較する。
【００３０】
ＩＢＲＶ、ＢＲＳＶ及びウシライノウイルス２型の場合、各ウイルスの感染性は、ｐＨ５及びｐＨ３で少なくとも１．０ｌｏｇ１０低下する。一方で、ＢＥＶ  ３型及び病原性ウシエンテロウイルスである疑いのあるウイルスの場合、感染率は、このｐＨ範囲にわたり一定である。このアッセイは、単離病原性ウイルスがウシエンテロウイルスであることの確認の一助となる。
【００３１】
陽イオン安定化
５０℃にて１時間曝露した場合、高濃度の、塩化マグネシウムなどの２価陽イオンは、ある一定のウイルス（エンテロウイルス及びレオウイルス）を安定化させるが、一方、他のウイルスの熱不活性化を促進する（アデノウイルス、単純ヘルペス及びワクシニア）。
【００３２】
病原性ウシエンテロウイルスであることが疑われる単離ウイルス及び４種類の対照ウイルス（ＢＥＶ（ウシエンテロウイルス３型、ＰＳ８９株、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７５５）、ＩＢＲＶ（感染性ウシ鼻気管炎ウイルス）、ＢＡＶ（ウシアデノウイルス５型、ｂａｒｔｈａ株）及びウシロタウイルス（ＮＣＤＶ−Ｌｉｃｏｌｎ株）を用いて、各ウイルス分離株をそれぞれ、１ＭＭｇＣｌ２及び蒸留水（対照）中で１０倍希釈する。その試験管を水浴中、５０℃にて１時間インキュベーションする。インキュベーション後、ＭＤＢＫ細胞株及びＭＡ−１０４細胞株（ウイルスに依存する。）において感染性について処理試料の全ペアのタイターを調べ、非加熱対照ウイルスの感染性と比較する。
【００３３】
ＩＢＲＶ及びＢＡＶ  ５型の場合、水中で１時間、５０℃に加熱した後、ウイルスの感染率は、０に低下する。１ＭＭｇＣｌ２のウイルス懸濁液への添加により、ＩＢＲＶ及びＢＡＶ  ５型に関する結果は向上しない。ＢＥＶ３型及びＩＢＲＶの場合、水中で１時間、５０℃に加熱した後、ウイルスの感染率は、０に低下する。１ＭＭｇＣｌ２のウイルス懸濁液への添加により、非加熱対照と比較してウイルスの感染性が約１．０ｌｏｇ１０低下するというように、結果が良くなる。病原性ウシエンテロウイルスである疑いのある単離ウイルスの場合、１ＭＭｇＣｌ２のウイルス懸濁液への添加により、非加熱対照と比較して、ウイルスの感染性が約１．０ｌｏｇ１０低下する。このアッセイは、単離した病原性ウイルスがウシエンテロウイルスであることを確認する一助となる。
【００３４】
病原性ウシエンテロウイルスの単離の確認
上述のように、感染したウシから得た病原性ウシエンテロウイルスは、ウイルスの生理化学的特性を調べることを促進するために、及び治療方法及びウイルスの病原性を評価するのを促進するために、健康なウシに接種を行うのに使用することができる。
【００３５】
健康な新生仔ウシを得て、Ｂｊｏｒｎｅｂｙ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９，ｐｐ．１１７２−１１７６（１９９１）に記載のプロトコールを使用して、病原体不含環境で維持しする。上述のようにして得た濾過試料  ５ｍｌを使用して、シリンジでその仔ウシの鼻孔に接種材料をスプレーすることによりその仔ウシに接種する。接種した仔ウシは、感染ウシの臨床的徴候及び症候を発現する。これらの接種仔ウシからの肺、肝臓、腎臓、脾臓、心臓及び脳を、接種後８日から１４日に回収し、感染の証拠を調べる。
【００３６】
Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙのプロトコールのもと、本病原性ウシエンテロウイルスの試料（３Ａ１１５株、ＮＡＨ−１０１３として同定される。）を、２００４年１１月１７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ−３３５５５Ａが付された。
【００３７】
免疫原性組成物
あらゆる濾過試料（深部鼻腔綿棒標本又は組織ホモジェネートより。）を使用して、免疫原性組成物を生成させることができる。発明者らは、免疫原性組成物を生成させるために、深部鼻腔綿棒標本から、適宜、１つの濾過試料を選択する。純粋で外来物質不含であることが調べられた（細菌又は他のウイルスの存在をスクリーニングするための標準的培養法を使用して。）種ウイルスをＭＤＢＫ細胞単層に接種（０．００１から０．００００１ＭＯＩ（感染多重度））し、２日から３日後にそのＭＤＢＫ細胞を播種する。
【００３８】
７５ｃｍ２、１５０ｃｍ２又はあらゆる大きさのフラスコを使用できる。大きさの上限はないが、１７５０ｃｍ２より大きいフラスコを使用しないことが好ましいものであり得る。ＭＤＢＫ細胞をＭＥＭ及びゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）中で、３５℃から３７℃にて、４％  ＣＯ２雰囲気中で増殖させる。完全な細胞変性の影響は、接種後１２時間から７２時間（通常２４時間）で発現し、１リットルから５０リットルの間の大きさの範囲であり得る滅菌容器に集めることによりウイルスを含有するウイルス液を回収する（最も一般的なのは２０リットルである。）。そのウイルス液を場合によっては不活性化前に４℃から８℃の間で保存する。そのウイルスを不活性化するために、常に撹拌しながら、ベータ−プロリオラクトン（ｐｒｏｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＢＰＬ）を用いて、ウイルス液１リットルにつき１ｍｌで、そのウイルス液を化学的に処理する。
【００３９】
不活性化は通常、ｐＨ７．２から７．４に維持するために、５ＮＮａＯＨを用いて一定のｐＨに調整して、２２℃から２７℃にて、２４時間から３６時間かかる。あるいは、使用することができる不活性化剤には、これらに限定されないが、バイナリーエチルアミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）、ホルマリン、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドなどを含むアルデヒド剤；クレゾール、フェノールなどを含む反応性酸性アルコール；安息香酸、ベンゼンスルホン酸などの酸；ベータプロイオラクトン（ｂｅｔａ  ｐｒｏｉｏｌａｃｔｏｎｅ）及びカプロラクトンなどのラクトン類；活性化ラクタム、カルボジイミド及びカルボニルジヘテロ芳香族化合物（カルボニルジイミダゾールなど）；及びサポニンが含まれる。紫外線及びγ線照射を用いたものなどの照射及び／又は熱もまた、病原性ウシエンテロウイルスを不活性化又は殺滅するために使用できる。不活性化後、そのアジュバントの最終濃度が約１８％から２４％最終投与体積となるように、不活性化ウイルス液を場合によってはアジュバントと混合する。アジュバントには、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；ＰＯＬＹＧＥＮ（Ｒ）、ＤＥＡＥデキストラン、硫酸デキストラン及びメチルアクリレートなどのポリマー；臭化ジメチルオデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）；ＢＡＹＰＡＭＵＮＥ（Ｒ）、ＡＶＩＲＤＩＮＥ（Ｒ）、リピッドＡなどのポックスウイルスタンパク質；ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（Ｒ）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ  ＰＬＵＳ（Ｒ）、ＳＵＰＲＩＭＭ（Ｒ）などの油（及び油と水との混合物）；スクアラン及びスクアレンなどの動物油；Ｄｒａｋｅｏｌ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅｓなどの鉱物油；ピーナツ油などの植物油；ブロックコポリマー；サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ及びＱＳ２１などのトリテルぺノイドグリコシド；Ｔｗｅｅｎ−８０及びＰｌｕｒｏｎｉｃなどの界面活性剤；フロインド不完全アジュバント、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（プロピオニバクテリウム）及びＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ミコバクテリウム）などの細菌性成分アジュバント；インターロイキン、モノカイン及びインターフェロン；リポソーム；ＩＳＣＯＭｓ；ムリアミル（ｍｕｒｙａｍｙｌ）ジペプチド及びそれらの誘導体、コレラ毒素などの合成糖タンパク質；又はそれらの組合せが含まれる。
【００４０】
好ましくは、そのアジュバントは、油性アジュバント及び水性アジュバント、例えばＳＵＰＲＩＭＭ（Ｒ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｃｙｒｕｓ，ＫＳ）などである。これらに限定されないが、食塩水溶液、ＤＥＡＥデキストラン、ラクトース及びポリプロピレングリコールなどの医薬適合性の担体を、本免疫原性組成物に添加することができる。
【００４１】
あるいは、病原性ウシエンテロウイルスは、病原性ウシエンテロウイルスの毒性のある複製能を喪失させるような、非ウシ哺乳動物細胞又は鳥類細胞を用いた培養での繰り返し継代もしくは増殖により、弱毒化され得る。弱毒化ウイルスは、場合によっては、動物への投与前に、上述の、様々なアジュバント及び医薬適合性の担体と混合することができる。
【００４２】
不活性化ウイルス免疫原性組成物の場合の投与あたりの抗原（ウイルス）量は、１０４から１０１２ＴＣＩＤ５０／投与の間の範囲、好ましくは、１０４から１０８ＴＣＩＤ５０／投与の間の範囲、より好ましくは約１０５ＴＣＩＤ５０／投与であり得る。このタイター決定は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＦＡなどの免疫アッセイにおける、又は酵素基質検出試験による、病原性ウシエンテロウイルスに結合する抗体を用いた測定により遂行される。免疫原性組成物の投与量は、１ｍｌから５ｍｌの間の範囲であり得、２ｍｌであることが好ましい。
【００４３】
本発明の免疫原性組成物は、ウシにおける病原性ウシエンテロウイルス感染を予防及び治療することができる。インビボでの効果的な予防的使用及び抗感染的使用の場合、本免疫原性組成物は、殺滅又は弱毒化病原性ウシエンテロウイルス、免疫原性ウイルス成分、抗イディオタイプ抗体又はその他の公知の免疫原性組成物を含有する。本免疫原性組成物は、単独で、ウシに適合する医薬担体と組み合わせて、アジュバントと組み合わせて、又は医薬担体及びアジュバントと組み合わせて、投与し得る。本免疫原性組成物は、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、膣内、肛門内又は何らかの他の投与経路で投与し得る。
【００４４】
免疫原性組成物の投与量に関係する因子には、例えば、ウシにおける年齢、体重及び母親由来抗体レベルが含まれる。ある一定の容量の範囲は、１ｍｌから５ｍｌの投与で、約１０４から１０１２ＴＣＩＤ５０／投与の間の範囲、好ましくは１０４から１０８ＴＣＩＤ５０／投与の間の範囲であり、より好ましくは、１０５ＴＣＩＤ５０／投与である。防御免疫は、１回投与により達成し得るか、又は、病原性ウシエンテロウイルスに対する防御免疫を与えるために、２、３週間以上離して複数回投与を行い得る。
【００４５】
病原性ウシエンテロウイルスに対する免疫原性組成物は、様々な異なる剤形で投与し得る。殺滅又は弱毒化病原性ウシエンテロウイルスを含有する水性媒体は、錠剤、カプセルなどを形成する場合は、乾燥させ、医薬適合性の不活性賦形剤及び緩衝剤（ラクトース、デンプン、炭酸カルシウム又はクエン酸ナトリウムなど。）と混合し得る。これらの組合せはまた、これらの粉末及び／又は溶液が動物の餌又は動物の飲用水に添加できるように、粉末にされるか、又は水溶液中に懸濁され得る。これらの粉末又は溶液は、適切に、ウシによる本免疫原性組成物の経口摂取が促進されるように、様々な公知の物質により、甘味又は香味を付加される。
【００４６】
非経口投与の場合は、本免疫原性組成物は、生理食塩水、水、プロピレングリコールなどの医薬適合性の担体と組み合わせることができる。本免疫原性組成物はまた、本免疫原性組成物の送達及び投与量を調節するために、医薬適合性の希釈剤とともに、乳化及び／又は懸濁剤も含み得る。
【００４７】
殺滅及び弱毒化病原性ウシエンテロウイルス免疫原性組成物の他に、サブユニット免疫原性組成物又は、病原性ウシエンテロウイルスの抗原性成分を動物に与える、その他のタイプの免疫原性組成物を使用することができる。
【００４８】
この抗原性成分は、タンパク質、糖タンパク質、脂質結合タンパク質もしくは糖タンパク質、修飾脂質部分、又は、動物に注射される場合、その動物が野生型病原性ウシエンテロウイルスに対して防御免疫を発現するように、動物において免疫反応を刺激する、その他のウイルス性成分である。サブユニット免疫原性組成物のために、上述のように、本病原性ウシエンテロウイルスを動物細胞において培養することができる。この細胞培養物を均質化することができ、その細胞培養ホモジェネートを適切なカラム、適切な孔径のフィルターに通すか、又はその細胞培養ホモジェネートを遠心分離することにより、免疫原性組成物を単離することができる。
【００４９】
好ましくは、毒性のある病原性ウシエンテロウイルスの存在について、本免疫原性組成物をスクリーニングし、毒性のある病原性ウシエンテロウイルスが存在するであろう免疫原性組成物を廃棄し得る。
【００５０】
抗原性成分がタンパク質である場合、次に、そのタンパク質をコードする核酸を単離し、その単離核酸を含有する免疫原性組成物を生成させることができる。抗原性成分をコードする核酸は、プラスミドの、真核生物プロモーターのシグナル配列の下流に置くことができる。そのプラスミドは、１又は複数の選択可能なマーカーを含有することができ、弱毒化原核生物（サルモネラ属（Ｓａｌｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）又は他の適切な細菌など）にトランスフェクション導入することができる。次に、ウシがその抗原性成分に対して防御免疫反応を生じることができるように、その細菌をウシに投与する。例えば、Ｈｏｎｅらに対する米国特許第５，８８７，１５９号及びＨｏｎｅらによる米国特許出願公開第２００２−０１９３３３０を参照のこと。あるいは、その抗原性成分をコードする核酸は、原核生物プロモーターの下流に置かれ、１又は複数の選択可能なマーカーを有し、弱毒化原核生物（サルモネラ属（Ｓａｌｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）又は他の適切な細菌など）にトランスフェクション導入することができる。次に、その細菌を、関心のある抗原に対する免疫反応を必要とする真核生物対象に投与する。例えば、Ｈｏｎｅらに対する米国特許第６，５００，４１９号を参照のこと。さらに、病原性ウシエンテロウイルスのタンパク質性抗原性成分をコードする核酸は、免疫原性反応を生じさせるために、ウシの粘膜組織に投与することができる。例えば、Ｍａｌｏｎｅらに対する米国特許第６，１１０，８９８号を参照のこと。あるいは、Ｄｒａｂｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．ら；Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｖｏｌ  ３（２）；ｐｐ．２４９−５５（２００１）中でのべられているものと同様の方法を用いて、免疫反応を生じさせるために、病原性ウシエンテロウイルスの抗原性成分をコードする裸のポリヌクレオチドをウシにエレクトロポレーション導入することができる。
【００５１】
サブユニット免疫原性組成物の場合、病原性ウシエンテロウイルスのタンパク質性の抗原性成分をコードする核酸を、国際特許出願公開ＷＯ００／３２０４７（Ｇａｌｅｎ）及び国際特許出願公開ＷＯ０２／０８３８９０（Ｇａｌｅｎ）に記載のもののようなプラスミドにクローニングすることができる。次に、そのプラスミドを細菌にトランスフェクション導入することができ、その細菌は、所望する抗原性タンパク質を産生することができる。両特許出願に記載の様々な方法により、その所望する抗原性タンパク質を単離及び精製することができる。
【００５２】
抗体
ポリクローナル抗体は、動物において免疫反応を起こすための抗原性物質として病原性ウシエンテロウイルスを使用することにより、生成させることができる。上述のように調製した、培養液もしくは濾過試料もしくは精製ウイルスを、刺激アジュバントとともに、又はそれ無しで、ウマ、ヤギ、マウス、ウサギ、魚類又はニワトリなどの非ウシ動物に投与することができる。本発明のためのポリクローナル抗体のためにウサギを使用する。繰り返し免疫した後、血清の一部を取り出し、採血した動物の血清において典型的に見出されるそれらの疾患特異的な抗体に対して、固定化した抗体を用いて、抗原性の面で精製することができる。例えば生理食塩水を用いたサッカリドゲルカラムでの、クロマトグラフィーによる半精製血清のさらなる処理及び少なくとも１０ｋＤａの分子量のタンパク質性成分の回収により、治療又は診断において使用するための精製ポリクローナル抗体が得られる。
【００５３】
モノクローナル抗体調製
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術により作製することができる。マウス、ブタ、ラット、ウサギ又はその他の適切な動物を病原性ウシエンテロウイルス（上述のように精製）もしくは濾過試料（上述）もしくは細胞培養上清（上述）で免疫した後、その動物の脾臓を取り出し、全細胞調製物を調製することができる。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−９７（１９７５））の方法に従い、ハイブリドーマを作製するために、脾臓細胞調製物からの免疫細胞を骨髄腫細胞に融合させることができる。そのハイブリドーマを培養し、病原性ウシエンテロウイルスを含有する、液体又は接種材料に対して、その培養液を試験することにより、病原性ウシエンテロウイルスに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを単離することができる。そのハイブリドーマを宿主種の腹膜に導入することにより、ハイブリドーマが腹膜で増殖するようになる。腹水を回収して、病原性ウシエンテロウイルスに対するモノクローナル抗体を含有する体液を得る。ハイブリドーマ細胞株からの細胞培養上清もまた、モノクローナル抗体を単離するために使用することができる。好ましくは、そのモノクローナル抗体は、その抗体がＩｇＧ又はＩｇＭ型の免疫グロブリンである、マウス由来ハイブリッド細胞株により産生される。受動免疫法及び免疫原性組成物調製物に対する抗イディオタイプ抗体を含め、様々な診断及び治療組成物及び方法のために、モノクローナル抗体を使用することができる。
【００５４】
ハイブリドーマ融合の日の８週間前に、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウスに、ｉ．ｐ．で熱不活性化病原性ウシエンテロウイルス及び完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）の１：１懸濁液を接種する。使用するＢＰＬ不活性化病原性ウシエンテロウイルスの量は、不活性化ウイルスの免疫原性及び毒性に依存する。最大でマウス１匹あたり０．３ｍｌＣＦＡを使用する。最初の免疫から５週間後に、マウスにＢＰＬ不活性化病原性ウシエンテロウイルス及びＣＦＡの追加抗原投与の注射を行う。融合の１週間前に、マウスをｉ．ｐ．により、生理食塩水中のＢＰＬ不活性化病原性ウシエンテロウイルスを用いて免疫する。融合の２日前に、マウスをｉ．ｐ．により、ＢＰＬ不活性化病原性ウシエンテロウイルス及び生理食塩水を用いて免疫する。融合の２日前に、マウスに、ｉ．ｖ．により、ＢＰＬ不活性化病原性ウシエンテロウイルス及び生理食塩水を接種する。
【００５５】
ＢＰＬ不活性化病原性ウシエンテロウイルスの注射を受けたマウスを安楽死させ、無菌的手法により脾臓を摘出し、その脾臓を、５ｍｌ血清不含の冷  ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有する滅菌ペトリ皿に移す。外科用メスの刃を用いて長軸に沿って脾臓に切れ目を入れ、脾臓細胞を培地に放出するように、その脾臓に沿って穏やかに擦る。ピペットを用いて遊離細胞及び培地を１５ｍｌ遠心管に移し、脾臓は残しておく。遠心管中の組織塊を５分間沈ませ、新しい管に単一細胞の懸濁液を移す。
【００５６】
その細胞を２００ｘｇで５分間遠心し、上清を捨て、血清不含の冷ＤＭＥＭでペレットを再び洗浄する。その細胞を血清不含のＤＭＥＭ１ｍｌに再懸濁し、融合の準備が整うまでその細胞を氷上で保存する。
【００５７】
１０％  ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭにおいてマウス骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１８）を維持する。ある典型的なマウス脾臓から得られたＢ細胞との融合には、約１０７から１０８個の細胞が必要である。ハイブリドーマ融合直前に、５０ｍｌ遠心管に対数期培養から骨髄腫細胞を採取し、２００ｘｇで５分間遠心することにより細胞を沈殿させる。上清を除去し、血清不含のＤＭＥＭで細胞を２回洗浄し、次いで、２００ｘｇで５分間遠心する。１ｍｌ血清不含ＤＭＥＭに１０７から１０８個の細胞を含有するよう、ペレットを再懸濁する。
【００５８】
骨髄腫細胞を含有する遠心管に脾臓細胞を添加し、５００ｘ  ｇで５分間遠心する。上清を全て除去し、その管の側面を軽く叩いて細胞ペレットを緩める。全試薬及び細胞を３７℃に維持し、１ｍｌ５０％  ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ  ４０００，Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）をその管に１分間にわたり穏やかに混合しながら滴下添加する。その混合物を１分間、３７℃に静置する。穏やかに撹拌しながら、１ｍｌの血清不含の温ＤＭＥＭを１分間にわたり滴下添加する。最後に、２０ｍｌの血清不含  ＤＭＥＭを４分間にわたり滴下添加し、次に、すぐに細胞を２００ｘ  ｇで５分間遠心する。上清を捨て、２０％ウシ胎仔血清、０．２ユニット／ｍｌインスリン、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭオキサロ酢酸、２ｍＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸及び１０％ＮＣＴＣ−１０９リンパ球培地（ＳＤＭＥＭ）を含有する、４７ｍｌＤＭＥＭ中で細胞を再懸濁する。
【００５９】
細胞懸濁液  １ｍｌ体積を２枚の２４穴平底組織培養プレートのウェルに添加する。骨髄腫細胞対照ウェルを含め、そのプレートを３７℃、１０％ＣＯ２にてインキュベーションする。
【００６０】
一晩インキュベーションを行った後、細胞層を乱さないようにして各ウェルから培地  ０．５ｍｌを採取する。０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジン（ＨＡＴ）を含有する１ｍｌＳＤＭＥＭを、各ウェルに添加し、３７℃、１０％ＣＯ２にて、インキュベーションを継続する。週に３回、２週間から３週間の間、使用済み培地  １ｍｌを新鮮なＤＭＥＭ＋ＨＡＴ１ｍｌで交換し続ける。顕著なクローンの増殖が明らかになったら、ＥＬＩＳＡ、間接的ＦＡ又は他の免疫アッセイ系により、特異的抗体の存在についてウェルをアッセイする。
【００６１】
安定的な細胞株を得て他のクローンによる過剰増殖を避けるために、病原性ウシエンテロウイルスに特異的な抗体について陽性となった初代ウェルをすぐにサブクローニングする。
【００６２】
選択した初代ウェルからの細胞を懸濁し、トリパンブルー染色及び血球計算板を用いて細胞計数を行う。ＳＤＭＤＭ＋ＨＡＴ中で約２細胞／ｍｌの最終濃度になるように、その細胞を希釈する。５０μｌ沈層細胞（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ）／１００ｍｌ（培地）を添加することにより、フィーダー層として非インキュベーションマウスから得られた正常脾臓細胞を使用する。
【００６３】
９６穴プレートの各ウェルに細胞懸濁液  ２００μｌを添加し、３７℃、１０％ＣＯ２にて、インキュベーションする。２週間から３週間中にクローンが見えるようになり、顕著な増殖が明らかとなったら、単一のクローンを含有するウェルからの上清をアッセイする。特異的抗体に対して陽性となったウェルについて、このクローニング手段を繰り返す。さらに特徴を調べて低温保存するために、選択したクローンを組織培養フラスコにゆっくりと広げる。
【００６４】
ハイブリドーマ細胞接種の２週間前に、０．５ｍｌプリスチンをｉ．ｐ．で与えてＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウスを前処置する。ハイブリドーマ細胞を得て、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩緩衝溶液）（ＨＢＳＳ）で１回洗浄する。ＨＢＳＳで細胞を再懸濁し、前処置したマウスにｉ．ｐ．で、１０４から１０６個の生存能力のある細胞を接種する。
【００６５】
腹水発生が明らかとなったら（通常は、接種後１週間から２週間）、１６Ｇ１．５”の針を鼠径部において腹側に挿入することにより排出させる。針の中央を遠心管の上に保持し、管中に腹水を排出させる。腹水を２００ｘｇで遠心し、０．２ｎｍフィルターを介して濾過し、凍結保存する。
【００６６】
診断アッセイ
病原性ウシエンテロウイルスの診断のための方法は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用する。固定化タンパク質に対して、ポリスチレン表面と、又は、別のポリマー表面と接触させることにより、抗体、深部鼻腔綿棒標本試料、組織試料又は組織ホモジェネートのいずれかを固定化することができる。次に、深部鼻腔綿棒標本試料、組織ホモジェネート又は組織試料を添加する（抗体が固定化されている場合）か、又は、抗体を添加して（深部鼻腔綿棒標本試料、組織ホモジェネート又は組織試料が固定化されている場合）、インキュベーションし、例えば洗浄により、非固定化物質を除去する。次に、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（どれを使用するかに依存する。）に結合する、標識した種特異的抗体を添加し、標識の存在及び量を調べる。標識を調べることにより、アッセイ組織中の病原性ウシエンテロウイルスの存在が示される。この方法の通常の実施形態には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＦＡ、ノーザン、サザン及びウェスタンブロット免疫アッセイが含まれる。免疫−ＰＣＲ技術、免疫化学発光技術又はその他の検出アッセイを用いることもできる。
【００６７】
本発明を具体的な実施形態を参照して説明してきたが、これらの方法及び組成物における変形が使用され得ること、及び、本明細書中で具体的に述べられる以外に、本発明が実施され得ることを意図することは、当業者にとって明らかであろう。したがって、本発明は、本請求の範囲により定義されるように、本発明の精神及び範囲内に包含される全ての変形を含む。
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月10日(2006.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され及び精製された病原性ウシエンテロウイルス。
【請求項２】
前記病原性ウシエンテロウイルスが、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６を有する、請求項１に記載の、単離され及び精製された病原性ウシエンテロウイルス。
【請求項３】
前記病原性ウシエンテロウイルスが、エーテルに対して非感受性であることと、及び３０ｎｍより小さいサイズを有することとを特徴とし、該病原性ウシエンテロウイルスは、ウシからの血清抗体と特異的に反応性があり、該血清抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６を経鼻的にウシに接種し、接種後２５日から４０日後に該接種を行ったウシから血清抗体を回収することにより得られる、請求項１に記載の単離され及び精製された病原性ウシエンテロウイルス。
【請求項４】
前記病原性ウシエンテロウイルスが弱毒化されている、請求項１に記載の病原性ウシエンテロウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項５】
前記病原性ウシエンテロウイルスが不活性化されている、請求項１に記載の病原性ウシエンテロウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項６】
前記病原性ウシエンテロウイルスが、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６を有し、該病原性ウシエンテロウイルスが、弱毒化されているか又は不活性化されている、請求項１に記載の病原性ウシエンテロウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項７】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に対する原因物質である不活性化ウイルスを含み、該ウイルスは、エーテルに対して非感受性であることと、及び３０ｎｍより小さいサイズを有することとを特徴とし、該ウイルスは、ウシからの血清抗体と特異的に反応性があり、該血清抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６を経鼻的にウシに接種し、接種後２５日から４０日後に該接種を行ったウシから血清抗体を回収することにより得られる、ウシにおいて免疫反応を生じさせるための免疫原性組成物。
【請求項８】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に対する原因物質である弱毒化ウイルスを含み、該ウイルスは、エーテルに対して非感受性であることと、及び３０ｎｍより小さいサイズを有することとを特徴とし、該ウイルスは、ウシからの血清抗体と特異的に反応性があり、該血清抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６を経鼻的にウシに接種し、接種後２５日から４０日後に該接種を行ったウシから血清抗体を回収することにより得られる、ウシにおいて免疫反応を生じさせるための免疫原性組成物。
【請求項９】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に罹患したウシからの組織を均質化して、病原性ウシエンテロウイルスを含むホモジェネートを形成することと；及び、動物細胞を介して該病原性ウシエンテロウイルスを継代することを含むプロセスにより、該ホモジェネート中の該病原性ウシエンテロウイルスを弱毒化して、ウシにおいて非動物病原性である弱毒化病原性ウシエンテロウイルスを形成させることと；を含む、請求項４に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１０】
動物細胞を介して該病原性ウシエンテロウイルスを継代して、ウシにおいて非動物病原性である弱毒化病原性ウシエンテロウイルスを形成させることを含む、請求項４に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１１】
病原性ウシエンテロウイルス疾患に罹患したウシからの組織を均質化して、病原性ウシエンテロウイルスを含むホモジェネートを形成することと；細胞培養物に該ホモジェネートを接種して、病原性ウシエンテロウイルスを増殖させることと；該細胞培養物から病原性ウシエンテロウイルスを回収することと；及び不活性化物質を添加することにより、該病原性ウシエンテロウイルスを不活性化することと；を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１２】
不活性化物質を添加することにより、前記病原性ウシエンテロウイルスを不活性化させることを含む、請求項５に記載の免疫原性組成物を生産するための方法。
【請求項１３】
ウシから肺組織試料を得ることと；
該試料の液体ホモジェネートを形成させることと；
該液体ホモジェネートを支持体に固定化することと；
モノクローナル抗体を該固定化ホモジェネートに添加して、該液体ホモジェネート中のウイルス性因子と複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６のタンパク質に特異的に結合する。）；及び
該複合体を検出することと（該複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の存在を示す。）；
を含む、ウシにおいて病原性ウシエンテロウイルス疾患を診断するための方法。
【請求項１４】
病原性ウシエンテロウイルスに感染している疑いのあるウシからの組織試料の液体ホモジェネートを形成させることと；
該液体ホモジェネートにモノクローナル抗体を添加して、該ホモジェネート中でウイルス性因子との沈殿複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６のタンパク質に特異的に結合する。）；及び該沈殿複合体を検出することと（該沈殿複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の診断である。）；
を含む、ウシにおいて病原性ウシエンテロウイルス疾患を診断するための方法。
【請求項１５】
ウシから肺組織試料を得ることと；
該組織試料の液体ホモジェネートを形成させることと；
細胞を培養するのに有効な条件下で、細胞調製物とともに該液体ホモジェネートをインキュベーションすることと；
細胞解体物を与えるために該培養細胞を処理することと；
該細胞剥離物を支持体に固定化することと；
モノクローナル抗体を該固定化細胞解体物に添加して、該固定化細胞解体物中のウイルス性因子と複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６のタンパク質に特異的に結合する。）；及び
該複合体を検出することと（該複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の診断である。）；
を含む、ウシにおいて病原性ウシエンテロウイルス疾患を診断するための方法。
【請求項１６】
ウシから肺組織試料を得ることと；
該肺組織試料を支持体に固定化することと；
モノクローナル抗体を該固定化肺組織試料に添加して、該固定化肺組織試料中のウイルス性因子と複合体を形成させることと（該モノクローナル抗体は、病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６のタンパク質に特異的に結合する。）；及び
該複合体を検出することと（該複合体の存在は、病原性ウシエンテロウイルス疾患の診断である。）；
を含む、病原性ウシエンテロウイルスを診断するための方法。
【請求項１７】
請求項４、請求項５又は請求項６に記載の免疫原性組成物をウシに投与することを含む、病原性ウシエンテロウイルスに対してウシにおいて免疫反応を生じさせる方法。
【請求項１８】
病原性ウシエンテロウイルスＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６のタンパク質に結合する、モノクローナル抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙのプロトコールのもと、本病原性ウシエンテロウイルスの試料（３Ａ１１５株、ＮＡＨ−１０１３として同定される。）を、２００４年１１月１７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０６が付された。
【国際調査報告】
2007513620.tif 000002
2007513620.tif 000003
2007513620.tif 000004