(57)【要約】  開示するのは、変形性関節症の犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法及び犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる方法である。本方法は、有効な濃度のオメガ−３脂肪酸であるエイコサペンタエン酸を含む組成物を犬に投与することを含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節症を有する犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法または犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる方法であって、少なくとも約０．２重量％の濃度でＥＰＡを含む組成物を前記犬に供給することを含む方法。
【請求項２】
変形性関節症を有する犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法または犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる方法であって、関節機能回復量のＥＰＡを含む脂肪酸成分を含む組成物に基づいて選択した組成物を前記犬に供給することを含む方法。
【請求項３】
犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる方法または変形性関節症の犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法であって、少なくとも約２７．５mg/kgの体重の量のＥＰＡを含む組成物を前記犬に投与することを含む方法。
【請求項４】
変形性関節症を有する犬におけるより正常に近い関節機能を回復させるためまたは犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させるための薬剤または栄養物の製造におけるＥＰＡの使用において、前記薬剤または栄養物は、少なくとも約２７．５mg/kgの体重の量のＥＰＡを前記動物に提供する、使用。
【請求項５】
前記薬剤または栄養物は、少なくとも約０．２重量％の量のＥＰＡを含む食餌を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物、薬剤または栄養物は、少なくとも約０．３重量％の濃度でＥＰＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項７】
前記組成物、薬剤または栄養物は、オメガ−６脂肪酸対オメガ−３脂肪酸の比約０．２対約１．１を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項８】
前記組成物、薬剤または栄養物は、オメガ−６脂肪酸対ＥＰＡの比約１．０対約１２．５を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項９】
前記組成物、薬剤または栄養物は、フード組成物、トリートまたは栄養補助剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
変形性関節症は一般に、ヒト及びコンパニオン動物において生じる変性関節疾患である（Richardson et al., Vet. Clin. North Amer. Small Animal Practice 27: 883-911,1997 ; Curtis et al., Drug Disc. Today 9 : 165-172,2004）。この疾患は、最小の炎症を有する関節軟骨の進行性劣化を含む（Schoenherr et al. in Small Animal Clinical Nutritio71 4th Ed., Hand et al. Eds. , Walsworth Publishing Company, Marceline, MO, 2000,907-921 ; Hedborn et al., Cell Mol. Life Sci 59 : 45-53,2002; Pool, Front Biosci 4: D662-70,1999）。変形性関節症の管理は、薬理学的治療、手術、ニュートラシューティカル投与（nutraceutical administration）及び食餌の管理を含むことができる。しかしながら、このような現在の管理手法は、症状の緩和に焦点を合わせており、従って、疾患の管理または根底にある病理を治療することに完全に成功したわけではない。従って、依然として、ヒト及びコンパニオン動物における変形性関節症を管理する際の新たな手法に対する必要が存在する。
【発明の開示】
【０００２】
従って、本願発明者らは、本明細書において、有効な量のオメガ−３脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の投与は、犬における変形性関節症の管理のための新たな手法を提供できることを発見することに成功した。本方法は、犬における変形性関節症を管理する際に有効である。
【０００３】
従って、様々な具体例においては、本発明は、変形性関節症を有する犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法を含むことができる。本方法は、少なくとも約０．２重量％の濃度でまたは少なくとも約０．３重量％の濃度でＥＰＡを含む組成物を犬に供給することを含むことができる。
【０００４】
本発明はまた、犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる方法を含むことができる。本方法は、少なくとも約０．２重量％の濃度でまたは少なくとも約０．３重量％の濃度でＥＰＡを含む組成物を犬に供給することを含むことができる。
【０００５】
変形性関節症の犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる本発明の方法はまた、関節機能回復量のＥＰＡを含む脂肪酸成分を含む組成物に基づく組成物を犬に供給することを含むことができる。
【０００６】
犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる本発明の方法は同様に、関節機能回復量のＥＰＡを含む脂肪酸成分を含む組成物に基づく組成物を犬に供給することを含むことができる。
【０００７】
本発明はまた、犬が変形性関節症にかかる可能性を低下させる方法及び変形性関節症の犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法であって、約３７．５mg/kgの体重、約５６．２５mg/kgの体重、約７５mg/kgの体重または約９３．７５mg/kgの体重の量のＥＰＡを含む組成物を犬に投与することを含む方法を含むことができる。このような組成物は、動物用のフード組成物、動物用のトリートまたは動物用の栄養補助剤に含まれることができる。
【０００８】
様々な具体例においては、変形性関節症の犬におけるより正常に近い関節機能を回復させる方法は、犬における変形性関節症を治療するかまたは疾患の症状を低減することを含むことができ、犬が変形性関節症にかかる可能性を減少させる方法は、犬における変形性関節症の出現を予防するかまたは犬における疾患の症状の出現を予防するか若しくは減少させることを含むことができる。
【０００９】
本発明の方法は加えて、全量約３重量％以下のオメガ−６脂肪酸をさらに含む及び／またはオメガ−６脂肪酸対オメガ−３脂肪酸の比約０．２対約１．１及び／またはオメガ−６脂肪酸対ＥＰＡの比約１．０対約１２．５を含む組成物に基づくことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、哺乳類、特に犬における変形性関節症及びこのような疾患の症状を管理する際の、オメガ−３脂肪酸、特にＥＰＡの投与を含むことができる。
【００１１】
ｎ−３脂肪酸としても周知のオメガ−３脂肪酸は、多価不飽和脂肪カルボン酸の群として認識されている。一般に、オメガ−３脂肪酸は、メチレン割り込み二重結合を有し、１２〜２６個の炭素原子を含む。生理学的により重要なオメガ−３脂肪酸は、長さ１８〜２２個の炭素であり、直鎖である。ｎ−３脂肪酸は、分子のメチル末端から測定して３と４の炭素原子の間に二重結合を有する。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びアルファ−レノレン酸（α-lenolenic acid）（ＡＬＡ）は哺乳類における変形性関節症を管理するための重要なｎ−３脂肪酸であり、ＥＰＡは犬における変形性関節症を管理する際に特に重要である。オメガ−３脂肪酸の誘導体もまた、変形性関節症を管理する際に使用することができる。多くのタイプの誘導体は当業者には周知である。適切な誘導体の例は，オメガ−３脂肪酸、特にＥＰＡのエステルの例えば枝分れまたは枝なし及び／または飽和または不飽和Ｃ１〜Ｃ３０シクロアルキルエステル、特にＣ１〜Ｃ６アルキルエステルである。
【００１２】
オメガ−３脂肪酸、特にＥＰＡは、多くの投与経路の例えば、経口、鼻腔内、静脈内、皮下及びその他同様なもののいずれかによって、哺乳類、特に犬に投与することができる。経口経路は特に適切であり、ＥＰＡは、ウエットまたはドライの食餌で経口投与することができ、例えば表面に噴霧、アグロメレーティング、ダスティングまたは沈殿させることによって、食餌の内部にまたは任意の食餌成分の表面に取り入れることができる。これは、栄養食自体またはスナック、栄養補助剤またはトリート中に存在することができる。これはまた、食餌の液体部分の例えば水または別の流体中に存在することができる。ＥＰＡは、粉末、固体としてまたはゲルを含む液体として投与することができる。希望するなら、ＥＰＡをニュートラシューティカルな剤形または医薬剤形の例えばカプセル、錠剤、カプレット、シリンジ、及びその他同様なもので経口投与することができる。剤形内部に、ＥＰＡは粉末または液体の例えばゲルとして存在することができる。通常のニュートラシューティカル（neutraceutical）なキャリアまたは薬剤用キャリアの例えば水、グルコース、スクロース及びその他同様なもののいずれでも、ＥＰＡと一緒に用いることができる。
【００１３】
特定の具体例においては、本発明は、ＤＨＡ及び／またはＡＬＡを本質的に含まないＥＰＡ食餌組成物を含むことができる。ＤＨＡまたはＡＬＡまたはこれらの混合物を本質的に含まないとは、ＤＨＡ及びＡＬＡの片方若しくは両方は実質的に存在しないか、または、ごくわずかな量のＤＨＡ若しくはＡＬＡの片方若しくは両方が、例えば、約０．１％未満、約０．０３％未満、約０．０１％未満、約０．０３％未満または約０．００１％未満存在することを意味することを意図している。ＤＨＡ及び／またはＡＬＡを本質的に含まない具体例においては、存在する任意の量のＤＨＡ及び／またはＡＬＡは十分に低い濃度なので、変形性関節症の犬において、変形性関節症、変形性関節症の進行または変形性関節症によって生じる症状に及ぼす実質的な影響を生じない。
【００１４】
オメガ−３脂肪酸、特にＥＰＡは、様々な形態の変形性関節症並びにリウマチ様関節炎を含む他の形態の関節炎に対して有効である。
【００１５】
オメガ−３脂肪酸であるＥＰＡは、関節軟骨における変性過程の出現を予防するかまたは変性過程を漸減させ、それによって変形性関節症の犬または別の状況で変形性関節症にかかることがあり得る犬における関節を改善するために働く。この影響は、オメガ−３脂肪酸の抗炎症作用に付け加えるものであり、抗炎症作用は、変形性関節症における炎症の関与が限定されているので、犬の変形性関節症においてより重要でないことがある。
【００１６】
下記の実施例に示すように、関節膝軟骨を含むインビトロ外植片手順の使用は、ＥＰＡは軟骨からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の誘導放出を有意に減少するための唯一のオメガ−３脂肪酸であることを証明した。変形性関節症からの関節損傷の予防に関して、ペット、特に犬の特定の標的群は、一般集団とは対照的にこのような予防ケアを必要とすると思われるものである。例えば、ペット、特に大型種の犬の例としてラブラドルレトリーバー、ロットワイラー、ドイツシェパード及びその他同様なものは、こうしたペットにおけるより大きな発生率によって証明されるように、より変形性関節症にかかりやすい。加えて、６才を超えるペット、特に犬は、変形性関節症の有意により大きな発生率を有する。ＥＰＡは、変形性関節症を有する犬及び猫を治療する際にさらに有用となることができる。またＥＰＡと共に存在するのは、他のオメガ−３脂肪酸の例えばＤＨＡ及びＡＬＡ並びにオメガ−６脂肪酸とすることができ、この全ては、魚油のような源中に比較的に多量に見い出すことができる。
【００１７】
用いるべきＥＰＡの量はかなり変化し得る。後の実施例に示すように、実際の用量反応において、ＥＰＡが多い程抗関節炎効果が大きいことが観察された。一般に、最小で少なくとも約０．２重量％は、毎日犬または猫の通常の要件を満たす栄養食の量に基づいている。例えば、通常の栄養食中の特定の量を毎日用いることができるか、または、トリート若しくは栄養補助剤中の同じ１日量を毎日動物に提供できる。加えて、有効な量のＥＰＡが提供される限りは、こうした方法の組合せまたは任意の他の投与手段を用いることができる。ＥＰＡの量の範囲は、重量ベースで、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．３０％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％〜約２％まで、約２．２５％まで、約２．５％まで、約３％まで、約４％まで、または約５％までを含む。全ての重量％は乾物ベース（ＤＭＢ）であることに注意されたい。ＥＰＡはオメガ−３脂肪酸である。一般に、ＥＰＡまたはオメガ−３対オメガ−６脂肪酸の比はかなり変化し得る。様々な具体例においては、オメガ−６：オメガ−３の比は、約１．１０〜０．２のオメガ−６対１．０のオメガ−３または約１．０８〜０．４２のオメガ−６対１．０のオメガ−３、より詳細には、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．８、約１．０、またはこれを超える、とすることができる。様々な具体例においては、オメガ−６対ＥＰＡの比は、約１２．５〜約１．０のオメガ−６対１．０のＥＰＡ、または約１２．４〜１．１２のオメガ−６対１．０のＥＰＡ、より詳細には、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．４、約０．４、約０．６、約０．８、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３、約４、約５、約６、約７．５、約１０、約１２．５またはこれを超える、とすることができる。アラキドン酸（ＡＡ）（オメガ−６）対ＥＰＡの比は、約０．２８〜約０．０１のＡＡ対１．０のＥＰＡ〜約０．２８〜０．０８のＡＡ対１．０のＥＰＡ、より詳細には約０．０１、約０．０２、約０．０４、約０．０６、約０．０８、約１．０、約１．５、約１．０、約１．５、約２．８またはこれを超える、とすることができる。
【００１８】
オメガ−３脂肪酸、特にＥＰＡは、mg/kgの体重として計算した量で投与することができる。従って、例えば、２０kgの犬は、約２７５gの食餌／日を消費することが予想されると思われる。食餌中のＥＰＡの量として約０．２、約０．３、約４、約０．５または約０．６重量％は、それぞれ約２７．５mg/kgの体重、約４１．２５mg/kgの体重、約５５mg/kgの体重、約６８．７５mg/kgの体重または約８２．５mg/kgの体重を犬に投与することになると思われる。より詳細には、ＥＰＡを、約２０mg/kgの体重、約２８mg/kgの体重、約３０mg/kgの体重、約４０mg/kgの体重、約４１mg/kgの体重、約５０mg/kgの体重、約５５mg/kgの体重、約６０mg/kgの体重、約６９mg/kgの体重、約７０mg/kgの体重、約８０mg/kgの体重、約８２mg/kgの体重、約９０mg/kgの体重、約１００mg/kgの体重、約１２０mg/kgの体重、約１５０mg/kgの体重、またはこれを超える量で投与することができる。
【００１９】
上記に示したように、ＥＰＡは、ペットに提供されるフードの形態とすることができる。このようなフードの例は、動物の栄養素の全てを提供する通常の食餌、トリート、栄養補助剤及びその他同様なものである。ＥＰＡは、液体で若しくは医薬剤形の例えばカプセル、錠剤、丸剤、液体で提供することができるか、または、例えばシリンジによって非経口投与さえもすることができる。最も重要な態様は、ペットに有効な量のＥＰＡを提供して、変形性関節症を予防するかまたは治療することである。様々な具体例においては、投与経路は経口とすることができ、ＥＰＡはフード中に取り入れることができる。フードは一般に、ペットフード業界において“ウエット”または“ドライ”と分類される。ウエットフードは比較的に多量の水を有し、空気を実質的にまたは完全に除去した缶または容器中に通常存在する。このようなフードの例は、“チャンク及びグレービー”であり、これは一般にレセプタクルの形状を取る液体グレービーまたはローフタイプ材料の存在下での個別の固体粒子である。ドライフードは一般に、ベークしたかまたは好ましくは押出した材料であり、後者を次に切断して、通常キブルとして周知の個別の成形部分にする。ＥＰＡは従来の手段によって容易にウエットフード中に取り入れられる。カプセル化を用いて、ドライの食餌中のＥＰＡを空気酸化から保護することができる。加えて、抗酸化剤及び包装の窒素スイープの使用もまた用いることができる。これは米国特許第4,895,725号によって例示されており、ここでは、特定の魚油のマイクロカプセル化を特に強調している。高レベルのオメガ−３脂肪酸を有する油は、メンヘーデン、さけ、たら及びその他同様なものである。
【００２０】
本発明はまた、様々な具体例においては、本方法は、実質的な有害反応または副作用無しに、変形性関節症の臨床的徴候の程度及び頻度並びにこの疾患に関連する疼痛を低減するためのＥＰＡを含む組成物の投与を含む。加えて、様々な具体例においては、本発明は、動物の変形性関節症の状態の臨床上の進行を遅らせる方法を提供する。また、様々な具体例においては、動物の変形性関節症の状態全体を実質的に改善し、その結果、変形性関節症の四肢における増大した重量支持によってこの利益が客観的に測定できるような方法が提供される。本発明はまた、様々な薬剤の投与及び／または動物に体重管理食を供給する（この両方は当分野において周知である）ことを含む変形性関節症のための他の治療様式と組み合わせたＥＰＡの投与を含む方法を提供する。
【実施例】
【００２１】
実施例１
この実施例は、培養した犬の軟骨の組織においてオメガ−３脂肪酸によってもたらされるグリコサミノグリカンの放出を示す。
【００２２】
関節軟骨は、犬の左及び右の後ろひざ関節（両方とも大腿骨顆及び脛骨高平部）から得た。軟骨外植片を、３日間１０％ウシ胎仔血を有する培地中で培養し、次に無血清培地中で３回洗浄した。外植片を次に６日間、０、１００または３００μg/mlのｎ３脂肪酸（ＥＰＡ、ＡＬＡまたはＤＨＡ）を含む無血清培地中で培養した。脂肪酸培地中でのこの期間の後に、全ての外植片を無脂肪酸／無血清培地中で３回洗浄した。外植片を次に個別に４日間、添加剤（Ｃ）を含まず、１０−６Mのレチノイン酸（ＲＡ）または５０ng/mlのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含む１mlの脂肪酸及び無血清培地中で培養した。軟骨の入手可能性が理由となって、全ての犬に関して全ての処理が可能なわけではなかった点に注意されたい。培地中へのプロテオグリカンの放出（μg/mgの湿潤重量）を培養の終わりに測定した。下記の表において、４匹の犬の各々につき３回重複培養の場合のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）放出の平均及び標準偏差を与える。加えて、培地ラクテート（μg/mgの重量）濃度を各処理につき与えた。
【表１】
2007502276.tif 000002
【００２３】
表１に示すように、ＯＳＭ処理済み培養中の１００μg/mlのＥＰＡ並びにＲＡ及びＯＳＭ処理済み培養中の３００μg/mlを用いて、ＧＡＧ放出の有意な減少が起きた。ＥＰＡの任意の用量を用いて、培地ラクテート濃度の有意な減少はなかった。
【表２】
2007502276.tif 000003
【００２４】
表２に示すように、ＥＰＡは、ＯＳＭ処理済み培養中のＧＡＧ放出を有意に減少したが、ＡＬＡまたはＤＨＡはそうではなかった。任意の用量の任意の脂肪酸による、培地ラクテート濃度に及ぼす有意な影響はなかった。
【表３】
2007502276.tif 000004
【００２５】
表３に示すように、脂肪酸のいずれも、この特定の動物におけるＲＡ−またはＯＳＭ−刺激軟骨からのＧＡＧ放出を有意に変更しなかった。任意の用量の任意の脂肪酸に関連する培地ラクテートの変化はなかった。
【表４】
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【００２６】
表４に示すように、３００μg/mlのＥＰＡは、ＲＡ処理済み培養からのＧＡＧ放出を有意に減少したが、任意の用量の任意の他の脂肪酸ではそうではなかった。対照における培地ラクテート濃度の有意な減少はなかった。ＲＡ−及びＯＳＭ−処理済み培養には３００μg/mlのＯＳＭ前処理を行った。
実施例２
【００２７】
この実施例は、犬の軟骨細胞膜の中へのｎ−３脂肪酸の取り入れを示す。
【００２８】
こうした実験の大部分は、単層培養を使用して実行したが、単一の実験において犬の軟骨の外植片培養の中への脂肪酸の取り入れを分析した。
単層培養
【００２９】
２４または４８時間にわたり、２匹の犬から得た軟骨細胞膜の中への１８：３ｎ−３脂肪酸であるＡＬＡの取り入れはなかった。培地中単独でインキュベートした軟骨細胞中の１８：３ｎ−３の％は、＜１〜５であり（範囲＝０．３〜０．９％）、１００または３００μg/mlのＡＬＡを用いた２４または４８時間のインキュベーション後にこのパーセントは有意に変化しなかった（範囲＝０．３〜２．５％）。
【００３０】
４８時間にわたり、１匹の犬から得た軟骨細胞膜の中への２０：５ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡの有意な取り入れがあった。培養を、１００または３００μg/mlのＥＰＡを用いて４８時間処理した場合、２０：５ｎ−３の％は、＜１％（範囲＝０．２〜０．６％）から約７％（範囲＝５．６〜８％）に増大した。５％ＦＣＳの存在下でまたは存在しない状態で培養を実行した場合、取り入れは異ならなかった。
【００３１】
４８時間にわたり、１匹の犬から得た軟骨細胞膜（各脂肪酸につき３００μg/mlの用量）の中への２０：５ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡの有意な取り入れがあったが、１８：３ｎ−３脂肪酸であるＡＬＡはそうではなかった。２０：５ｎ−３の％は＜１％から約１５％に増大した。
【００３２】
３または６日間にわたり、１匹の犬から得た軟骨細胞膜（３００μg/mlのＥＰＡの用量）の中への２０：５ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡの有意な取り入れがあった。２０：５ｎ−３の％は＜１％から１６〜１８％に増大し、３〜６日間のインキュベーションの間に差はなかった。
【００３３】
外植片培養
【００３４】
６日間にわたり、１匹の犬から得た軟骨外植片（各脂肪酸につき３００μg/mlの用量）の中への２０：５ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡの明白な取り入れがあったが、１８：３ｎ−３であるＤＨＡまたはｎ−６脂肪酸であるＡＡ（アラキドン酸）はそうではなかった。ｎ−３２０：５の％は、０％（検出可能ではない）から約２％に増大した。
【００３５】
こうしたデータは、ＥＰＡは、単層または外植片培養中の犬の軟骨細胞膜中に取り入れられることを示したが、他のｎ−３脂肪酸はそうではなかった。
実施例３
【００３６】
この実施例は、ｎ−３脂肪酸が犬の軟骨細胞代謝に及ぼす影響を示す。
【００３７】
ｎ−３脂肪酸が犬の軟骨におけるタンパク質及びプロテオグリカン代謝に及ぼす潜在的な影響を評価するために、最後の４日間の培養以外は実施例１において説明したように培養を組み立て、異化刺激（catabolic stimuli）を加えなかった（すなわち、全て“対照”培養だった）。最後の２４時間の培養の最中に、（１）３５ＳＯ４、または（ｉｉ）３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システインを培地に加えて、それぞれ新たに合成したプロテオグリカン及びタンパク質を放射能標識した。軟骨基質の中への放射能標識の取り入れを、培養の終わりに測定した。軟骨から得た放射能標識済み材料の損失を２４時間の標識時間にわたって定量することは試みなかった。３５ＳＯ４（“ＰＧ”）または３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システイン（“ＰＲＯＴ”）（ＤＰＭ／mgの湿潤重量として）の取り入れの平均及び標準偏差を下記の表５に示す。
【表５】
2007502276.tif 000006
【００３８】
表５に示すように、任意のｎ−３脂肪酸がタンパク質合成に及ぼす有意な影響及び基質の中への取り入れはなかった。１００μg/mlのＥＰＡは、プロテオグリカン合成及び取り入れを有意に増大させた。他の用量または脂肪酸は、プロテオグリカン合成及び軟骨基質の中への取り入れを有意に変更した。
【００３９】
逆転写−ＰＣＲを使用して、マトリックスプロテイナーゼ（アグリカナーゼ−１及び−２）、シクロオキシゲナーゼ−１及び−２、リポキシゲナーゼ−５及び１２、並びに潜在的なオートクリンサイトカイン及びそのレセプター（例えばＩＬ−ｌ、ＩＬ−６及びＴＮＦ）のｍＲＮＡメッセージ発現レベルを測定した。
【００４０】
この研究の結果により、アグリカナーゼ−１及びアグリカナーゼ−２ｍＲＮＡメッセージが“正常な”犬の軟骨の組織において発現されることが見い出された。加えて、数匹の犬はシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）メッセージのｍＲＮＡメッセージを発現したが、こうした動物における関節病理学の徴候はなかった。これは，未刺激の犬の関節軟骨外植片において、アグリカナーゼ及びＣＯＸ−２のｍＲＮＡ発現にｎ−３及びｎ−６脂肪酸の補充が及ぼす影響を監視することを可能にした。ＥＰＡは、犬の関節軟骨における分解用酵素であるアグリカナーゼ−１及びアグリカナーゼ−２のためのｍＲＮＡメッセージを低減できる唯一の脂肪酸だった。これは、軟骨劣化の原因である遺伝子を“遮断する”ＥＰＡの能力を証明した。
実施例４
【００４１】
この研究は、犬の変形性関節症の臨床研究におけるオメガ−３脂肪酸の影響を示す。
【００４２】
３つの臨床研究を、変形性関節症を有すると臨床的に診断されたペット犬において行った。一般開業獣医及び整形外科専門家は、特定の適格性判定基準を満たす犬を所有する依頼人を登録した。全ての患者は以下を必要とした：ペット所有者による履歴の説明及び獣医による健康診断に基づく疾患の測定可能な臨床的明示と共に、変形性関節症のＸ線撮影の証拠を有すること；さもなければ、健康診断、ＣＢＣ、血液化学、及び尿分析（urianalysis）に基づき、健康で併発疾患が無いこと；研究に登録する前に３０日間の間中、変形性関節症に対して処方した投薬または栄養補助剤を受ける場合、治療の処方計画を維持すること。
【００４３】
以下の測定を行った。
【００４４】
血清脂肪酸プロフィル：これは、クロロホルム及びメタノールの混合物（２：１）による脂肪酸の抽出、三フッ化ホウ素−メタノール（ＢＦ３：ＭｅＯＨ）試薬を使用したメチル化、続いて化学炎イオン化検出（ＦＩＤ）を含むガスクロマトグラフィー方法によって測定した。脂肪酸メチルエステルを、周知の標準のものとの保持時間の比較によって同定し、内部標準を使用して定量した。
【００４５】
獣医学的臨床評価：獣医は、スクリーニング相の最中に、及び臨床試験の間の供給間隔の各々の終わりに、健康診断及び患者の変形性関節症の状態の臨床評価の両方を行った。獣医は、以下の５つの変形性関節症のパラメータの重症度を評価した：跛行、重量支持に対する抵抗、運動の範囲の減少、反対の四肢を上げることに対する抵抗、及び関節の触診時の疼痛。こうした個々のパラメータのための重症度スコアの変化を、供給期間の継続期間にわたって測定した。食物介入が患者の変形性関節症の状態に及ぼす影響の広範囲にわたる獣医学的臨床評価を、５つの個々のパラメータ全てのための重症度スコアの変化を組み合わせることによって引き出した。
【００４６】
ペット所有者の主観的評価：ペット所有者は、研究に参加する前に登録アンケートを、及び臨床試験の間の供給間隔の各々の終わりに追加のアンケートを完成させることを要求された。
【００４７】
登録アンケート−ペット所有者は、休止から立ち上がる困難、跛行、こわばり、接触した時の痛み、歩行の最中の遅れ、疼痛があるとキャンキャンまたはくんくん鳴く、攻撃的行動、走行の困難、歩行の困難、階段を登攀する困難、跳躍の困難、遊びの困難、運動障害、及び全活動レベルを含む犬の変形性関節症の最も一般的な徴候の観察された頻度及び程度を等級付けした。加えて、所有者は、ペットの変形性関節症の状態全体を等級付けした。
【００４８】
供給アンケート−ペット所有者は、登録の最中に基準となった犬の変形性関節症の徴候の頻度及び程度の変化の両方を等級付けした。加えて、ペット所有者は、変形性関節症に関連する動物の疼痛の程度を等級付けした。
【００４９】
フォースプレート歩行分析（force plate gait analysis）：０、６週、及び１２週に犬をそれぞれの機関でコンピュータ化生物力学的フォースプレート歩行分析を使用して評価した。プレートを１０mの歩行路の表面内の中央に及び表面と同一平面に取り付けた。訓練者は犬をフォースプレートの端から端まで速歩で進ませ、観察者はプレートの端から端までの各通過を評価して、脚の打ち付け（foot-strike）及び歩行を確認した。速度１．７〜２．０m/s、加速変動−０．５〜０．５ms２で犬をフォースプレートの端から端まで速歩で進ませた間に、明確な同じ側の前脚及び後ろ脚の打ち付けがあった場合、試行は妥当であるとみなされた。各試行の最中、ミリ秒タイマー及び２つの光電スイッチを使用して、犬の前進速度を測定した。妥当な脚の打ち付けの検討及び確認のために,各試行をビデオテープに録画した。犬がタイマーを作動させ、一定した速度（訓練者及び観察者によって感知されるように）を各試行の最中プレートの端から端まで維持することを確実にするように注意した。
【００５０】
各試験期間につき５回の妥当な試行を、各犬の各影響された四肢及び各同じ側の四肢につき得た。ピーク垂直力の直交接地反力（orthogonal ground reaction force）、垂直衝撃、制動及び推進ピーク力、並びに制動及び推進衝撃を測定し、特殊ソフトウエアプログラム（アクワイヤ、シャロンソフトウエア、デウィット、ＭＩ（Acquire, Sharon Software, DeWitt, MI））によって記録した。全ての力を、キログラム単位の体重を基準として基準化した。各四肢につき妥当な試行から得たデータを平均して、各期間で各力または衝撃につき平均値を得た。
【００５１】
接地反力データを、各期間で跛行及び同じ側の四肢の間のパーセントの差として、治療及びプラセボ群の間で比較した。跛行状態の四肢に関する反力データのパーセント変化を、供給期間の最初に及び終わりに比較した。
研究＃１
【００５２】
犬の研究を行って、変形性関節症を有すると診断された犬に高レベルのｎ−３脂肪酸を供給することの食物の影響を評価した。１８人の一般開業獣医を、患者を研究に登録するために募集した。合計１３１匹の犬を２つの食物治療に無作為に割り当て、１８０日間供給した。試験及び対照フードは、同様の多量栄養プロフィルを有したが、有意に異なる脂肪酸組成物だった（表６）。試験食は、高レベルのＡＬＡ、ＥＰＡ、及びＤＨＡを含み、低いｎ−６／ｎ−３の比を用いて配合した。対照食は、業界に特有の典型的なレベルのｎ−３脂肪酸及びｎ−６／ｎ−３の比を有する主要な市販のドッグフードだった。
【表６】
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【００５３】
血清脂肪酸及びペット所有者の評価を、０、４５、９０及び１８０日目に記録した。血清脂肪酸プロフィルは、試験フードによって有意に調節された。試験群は、各供給間隔の終わりに、対照群と比較して有意により高い濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、特にＥＰＡ、ＤＨＡ、α−ＡＬＡ、有意により低い濃度のＡＡ（Ｐ＜０．０１）、及び有意により低いｎ−６：ｎ−３の比（Ｐ＜０．０１）を有した（表７）。試験群は、強いプラセボ効果の存在下でさえも、ペット所有者の観察（Ｐ＜０．０５）に基づき、対照群と比較して４５日目に休止から立ち上がる困難、走行、及び遊びに対する有意な改善並びに９０及び１８０日目に歩行に対する有意な改善を示した（表８）。
【表７】
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【表８】
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研究＃２
【００５４】
犬の研究を行って、変形性関節症を有すると診断された犬に高レベルのｎ−３脂肪酸を供給することの食物の影響を評価した。２人の整形外科専門の獣医が患者を研究に登録した。合計３８匹の犬を２つの食物治療に無作為に割り当て、９０日間供給した。上記に説明したように、試験及び対照食を同じロットのフードから製造した（表６）。
【００５５】
血清脂肪酸、フォースプレート歩行分析、及び獣医学的臨床評価を、０、４５、及び９０日目に記録した。血清脂肪酸プロフィルは、試験フードによって有意に調節された。試験群は、各供給間隔の終わりに、対照群と比較して有意により高い血清濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、特にＥＰＡ、ＤＨＡ、ＡＬＡ、９０日目に有意により低い濃度のＡＡ（Ｐ＜０．０１）、及び有意により低いｎ−６：ｎ−３の比（Ｐ＜０．０１）を有した（表９）。
【表９】
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【００５６】
犬の最も重い変形性関節症の四肢の生物力学的評価を、フォースプレート歩行分析を使用して客観的に評価した（表１０）。垂直ピーク力は、影響された四肢の重量支持を決定するために測定した重要なパラメータである。対照群の場合、９０日の供給継続期間にわたって平均垂直ピーク力の有意な変化（Ｐ＝０．９１）はなかったが、試験群の場合、時間と共に平均垂直ピーク力の有意な増大（Ｐ＝０．０１）があった。垂直ピーク力のパーセント平均変化も群間で有意に異なり（Ｐ＜０．０５）、試験群は影響された四肢における増大した重量支持を示したが、対照群は研究の間に重量支持の変化を示さなかった。重量支持能力はまた、各食物群につき垂直ピークのパーセント変化の度数分布を示すことによって表すことができる。９０日間の供給後に対照群における動物の３１％のみが重量支持の改善を示し、一方、試験群における犬の８２％は研究の間に重量支持を増大させた。
【表１０】
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【００５７】
整形外科獣医によって実行された主観的臨床評価は、試験食の有効性のための追加の支持を提供した。広範な獣医学的臨床評価に基づいて、対照フードを消費した犬と比較して（Ｐ＜０．０５）、試験フードを消費した犬のうちの有意により大きなパーセントが改善されたと評価された。獣医学の専門家はまた、試験群におけるより大きなパーセントの犬が、対照群と比較して（Ｐ＝０．０５）関節の触診時の疼痛の低減を示すことを観察した。
研究＃３
【００５８】
犬の研究を行って、変形性関節症を有すると診断された犬に高レベルのｎ−３脂肪酸を供給して用量の影響を決定した。２８人の一般開業獣医が患者を研究に登録した。合計１７７匹の犬を３つの食物治療に無作為に割り当て、９０日間供給した。研究に参加した犬の約３分の２が、評価されるべき治療食を消費したことに加えて、変形性関節症の治療に対して処方した投薬及び／または栄養補助剤を受けた。３つの試験フードは同様の多量栄養プロフィルを有したが、ＥＰＡ及びＤＨＡの組成が変化し、変形例Ａは最低レベルを含み、変形例Ｃは最高レベルを含んだ（表１１）。
【表１１】
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【００５９】
血清脂肪酸、ペット所有者の評価、及び獣医学的臨床評価を、０、２１、４５、及び９０日目に記録した。血清脂肪酸プロフィルは、全ての食物変形例によって有意に調節された。試験変形例Ｂ＆Ｃを供給された犬は、各供給間隔の終わりに、試験変形例Ａを供給された犬と比較して、有意により高い血清濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、特にＥＰＡ、ＤＨＡ、α−ＡＬＡ、有意により低い濃度のｎ−６脂肪酸、特にＡＡ（Ｐ＜０．０１）、及び有意により低いｎ−６：ｎ−３の比（Ｐ＜０．０１）を有した（表１２）。
【表１２】
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【００６０】
ペット所有者は、任意の食物変形例を２１日間消費した犬の場合、１４のうち１３の個々の変形性関節症の徴候の改善を報告した（表１３）。加えて、ペット所有者は、任意の食物変形例を９０日間消費した犬の場合、１４のうち１３の個々の変形性関節症の兆候の程度の減少を報告した（表１４）。犬が任意の食物変形例を９０日間消費した後に、ペット所有者はまた、観察可能な変形性関節症の徴候の頻度の有意な低減を報告した（表１５）。
【表１３】
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【表１４】
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【００６１】
より高い濃度のｎ−３脂肪酸を消費した犬は、獣医の臨床評価に基づいて、最低用量を受けた犬よりも、変形性関節症の状態のより有意な改善及び変形性関節症の進行のより有意な低下を有することが報告された（表１６）。投薬及び／または栄養補助剤を受けた群と非投薬群との間に、変形性関節症の状態の改善または変形性関節症の進行の低下の改善の有意な差はなかった（表１７）。これは，治療食は、変形性関節症を患う犬に追加の利益を提供することによって、他の治療と相乗作用的に作用するかまたは少なくとも他の治療に耐えることを示す。
【００６２】
有害反応または副作用の極めて低い発生率が、この研究に参加した犬の間で報告された。フードを割り当てられた２１５匹の動物のうち５匹の犬のみが、下痢及び嘔吐を有すると報告され、これは食物変形例のうちの１つを消費したことに帰する可能性がある。検討された先の２つの研究において治療食を消費した犬に関して、有害反応または副作用の同様の発生率（それぞれ実施例１及び２に関して１／８８及び１／２６）が報告された。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【００６３】
本明細書において引用する全ての参考文献を、本明細書において参考のために引用する。本明細書において引用する参考文献に関するいかなる検討も、単にその著者によってなされた主張を要約することを意図しており、いかなる参考文献またはこれらの一部分も、関連する従来技術を構成すると認めるものではない。出願人は、引用された文献の正確さ及び適切さに意義を申し立てる権利を有する。
【００６４】
本発明の説明は、性質上単に模範例であり、従って、本発明の要旨から逸脱しない変形例は本発明の範囲内にあるものと意図されている。このような変形例は、本発明の精神及び範囲からの逸脱とみなすべきではない。
【国際調査報告】
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