(57)【要約】本発明は、Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２レセプター複合体を認識するモノクローナル抗体、およびＴＬＲ４／ＭＤ２複合体ならびにＭＤ−２と複合体化してない場合のＴＬＲ４を認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、さらに、治療剤としてモノクローナル抗体を用いる方法を提供する。また、本発明は、可溶性キメラ蛋白質、可溶性キメラ蛋白質を発現させ、精製する方法、およびスクリーニングアッセイにおいて、および抗体の産生において、可溶性キメラ蛋白質を治療剤として用いる方法も提供する。
2007517503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体に免疫特異的に結合する抗体であって、ここで該抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度においてヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の５０％を超える阻害を示す、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ＴＬＲ４に複合体化していない場合、ＭＤ−２蛋白質に免疫特異的に結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、さらに、可溶性ＴＬＲ４に免疫特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、さらに、細胞表面のＴＬＲ４に免疫特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＤＹＷＩＥ（配列番号１３）；ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＤＦＫＤ（配列番号１４）；ＥＥＲＡＹＹＦＧＹ（配列番号１５）；ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮ（配列番号１８）；ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）；ＬＱＶＴＨＶＰＰＴ（配列番号２０）；ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、３つのＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＤＹＷＩＥ（配列番号１３）；ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＤＦＫＤ（配列番号１４）；ＥＥＲＡＹＹＦＧＹ（配列番号１５）；ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖と、ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮ（配列番号１８）；ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）；ＬＱＶＴＨＶＰＰＴ（配列番号２０）；ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号２、１２、２２および３２からなる群より選択される重鎖可変アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号７、１７、２７および３７からなる群より選択される軽鎖可変アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号２、１２、２２および３２からなる群より選択される重鎖可変アミノ酸配列と、配列番号７、１７、２７および３７からなる群より選択される軽鎖可変アミノ酸配列とを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
異常なＴＬＲ４シグナル伝達に関連する病理の症状を軽減する方法であって、該方法は、そのような軽減が所望される被験体に、該被験体において該病理の症状を軽減するのに十分な量にて請求項１に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記被験体がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記異常なＴＬＲ４シグナル伝達に関連する病理の症状を軽減するのに十分な請求項１に記載の抗体の量が、ＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を低下させるのに十分な量である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記病理が、敗血症、ベンチレーター誘導肺損傷、急性炎症、慢性炎症、自己免疫疾患、および内因性可溶性ストレス因子によって誘導される障害からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記慢性炎症が、アレルギー状態、または喘息に関連する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記病理が、炎症性腸障害またはアテローム性動脈硬化症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
内因性可溶性ストレス因子によって誘導される前記障害が、変形性関節症または慢性関節リウマチである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記内因性可溶性ストレス因子が、Ｈｓｐ６０、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−ディフェンシン−２または界面活性剤プロテインＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の抗体とキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体を含む、キット。
【請求項２３】
ＭＤ−２アクセサリーポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体をコードする核酸配列に結合されたＴＬＲ４ポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２５】
Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２（ＴＬＲ４／ＭＤ２）複合体に免疫特異的に結合する抗体を作製する方法であって、該方法は、請求項２４に記載の細胞の第一の投薬量を被験体に投与する工程を包含し、ここで該第一の投薬量は、該被験体において免疫応答を生じさせるのに十分である、方法。
【請求項２６】
前記細胞の第二の投薬量を前記被験体に投与する工程をさらに包含する方法であって、ここで該第二の投薬量は、該被験体において免疫応答を生じさせるのに十分である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
産生された抗体が、前記被験体においてＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるシグナル伝達を中和する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＤアクセサリーポリペプチドに作動可能に連結された、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、単離されたキメラポリペプチド。
【請求項２９】
前記ＭＤアクセサリーポリペプチドが、ＭＤ−１またはＭＤ−２であって、前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０およびＲＰ１０５からなる群より選択される、請求項２８に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項３０】
前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、該ｔｏｌｌ様レセプターの細胞外部分の少なくともフラグメントを含む、請求項２８に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項３１】
前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、リンカーによって前記ＭＤアクセサリーポリペプチドに作動可能に連結される、請求項２８に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項３２】
前記リンカーが、グリシン−セリンリンカーである、請求項３１に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項３３】
前記グリシン−セリンリンカーが、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３（ＧＧＧＧＳ３）リンカーである、請求項３１に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項３４】
可溶性キメラ融合蛋白質を産生するための方法であって、該方法は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドをＭＤアクセサリーポリペプチドに結合させる工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記ＭＤアクセサリーポリペプチドが、ＭＤ−１またはＭＤ−２であって、前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０およびＲＰ１０５からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、リンカーによって前記ＭＤアクセサリーポリペプチドに作動可能に連結される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記リンカーが、グリシン−セリンリンカーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記グリシン−セリンリンカーが、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３（ＧＧＧＧＳ３）リンカーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ＭＤアクセサリーポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体をコードする核酸配列に結合された、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項３９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４１】
可溶性キメラ融合蛋白質を産生するための方法であって、該方法は、ＭＤアクセサリーポリペプチドに結合されたｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドを含む融合蛋白質の産生を可能とする条件下で、請求項４０に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記ＭＤアクセサリーポリペプチドが、ＭＤ−１またはＭＤ−２であって、前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０およびＲＰ１０５からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドが、グリシン−セリンリンカーによって前記ＭＤアクセサリーポリペプチドに結合される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
異常なｔｏｌｌ様レセプター機能に関連する病理の症状を軽減する方法であって、該方法は、そのような軽減が所望される被験体に、該被験体において該症状を軽減するのに十分な量にて請求項２８に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
前記被験体がヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記異常なｔｏｌｌ様レセプター機能に関連する病理の症状を軽減するのに十分な請求項２８に記載のポリペプチドの量が、前記被験体においてｔｏｌｌ様レセプターの活性化を低下させるのに十分な量である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記病理が、敗血症、急性炎症、慢性炎症および自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記病理が関節炎である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項２８に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項５０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５２】
ｔｏｌｌ様レセプターに結合し、そしてｔｏｌｌ様レセプター活性を調節するリガンドをスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ）請求項２８に記載のポリペプチドに起因する特性または機能を有するポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）細胞を候補化合物を含む組成物と接触させる工程；および
（ｃ）該候補化合物が、該ポリペプチドに起因する特性または機能を変更するか否かを決定する工程
を包含し、それにより、該候補化合物の存在下における該ポリペプチドに起因する特性または機能の変更は、該候補化合物がｔｏｌｌ様レセプター活性を調節するリガンドであることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、中和モノクローナル抗体の創製、特に、Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２レセプター複合体を認識するモノクローナル抗体、Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２レセプター複合体およびＭＤ−２と複合体化していない場合のＴｏｌｌ様レセプター４を共に認識するモノクローナル抗体、および上記モノクローナル抗体を治療剤として用いる方法に関する。また、本発明は、可溶性キメラ蛋白質、可溶性キメラ蛋白質を発現させ、精製する方法、およびスクリーニングアッセイにおいて、および抗体の産生において、可溶性キメラ蛋白質を治療剤として用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で最初に発見されたＴｏｌｌレセプターは、蛋白質の細胞外部分におけるロイシン−リッチのリピート（ＬＲＲ）、および１または２のシステイン−リッチのドメインを有するＩ型膜貫通蛋白質である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｔｏｌｌレセプターの哺乳動物ホモログは「Ｔｏｌｌ様レセプター」（ＴＬＲ）として知られている。ＴＬＲは、微生物粒子を認識し、次いで、これらの微生物粒子の源に対して免疫細胞を活性化することによって、先天性免疫で役割を演じている。
【０００３】
現在、１０の型のＴｏｌｌ様レセプターがヒトで同定されてきた、ＴＬＲ１ないし１０。これらのＴＬＲはＩＬ−１レセプターのそれに対するそれらの細胞内ドメインの相同性によって、および細胞外ロイシン−リッチのリピートの存在によって特徴づけられる。異なる型のＴＬＲは異なる型の微生物粒子によって活性化される。例えば、ＴＬＲ４は主としてリポ多糖（ＬＰＳ）によって活性化され、他方、ＴＬＲ２はリポテイコ（ＬＴＡ）、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）；リポ蛋白質（ＢＬＰ）、およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）によって活性化される。ＲＰ１０５のようなＴｏｌｌレセプターホモログも同定されている。
【０００４】
骨髄分化プロテイン−２（ＭＤ−２）、ＴＬＲ４アクセサリー蛋白質が同定され、特徴づけられている。この蛋白質がＴＬＲ４と直接相互作用することが見出されており、ＭＤ−２はＴＬＲ４の翻訳後修飾を可能とし、ならびに細胞表面へのその輸送を容易とする能力を有する。ＴＬＲ４およびＭＤ−２は細胞表面で複合体を形成する。
【０００５】
リポ多糖（ＬＰＳ）、グラム−陰性菌の成分は、先天性免疫系を強く活性化することができる微生物粒子である。ＬＰＳは、主なシグナル伝達成分としてＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を含む、そのマルチ−鎖レセプターを介して免疫細胞にシグナルを送達する。
【０００６】
従って、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるシグナル伝達を変調する方法および組成物に対する要望が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、細胞表面に発現されるＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプターを認識するモノクローナル抗体を提供する。上記抗体はＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生をブロックすることができる。幾つかの場合においては、本発明のモノクローナル抗体は、ＭＤ−２と複合体化していない場合のＴＬＲ４も認識する（例えば、可溶性ＴＬＲ４蛋白質、細胞表面で発現されたＴＬＲ４）。例示的なモノクローナル抗体が１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１および７Ｅ３を含む。
【０００８】
本発明の抗体は、配列番号２、１２、２２または３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７、１７、２７または３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、３つの重鎖ＣＤＲは、ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＤＹＷＩＥ（配列番号１３）；ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＤＦＫＤ（配列番号１４）；ＥＥＲＡＹＹＦＧＹ（配列番号１５）；ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一なアミノ酸配列、ならびにＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮ（配列番号１８）；ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）；ＬＱＶＴＨＶＰＰＴ（配列番号２０）；ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを持つ軽鎖を含む。上記抗体はＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に、ＭＤ−２と複合体化していない場合のＴＬＲ４に、または双方に結合する。
【０００９】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を、治療または予防が所望される被験体に投与することによって、異常なＴＬＲ４／ＭＤ−２活性化および／または異常なＬＰＳ活性（例えば、異常なＩＬ−８産生）に関連する病理を治療し、または予防し、またはそのような病理に関連する症状を軽減する方法を提供する。治療すべき被験体は、例えば、ヒトである。モノクローナル抗体は、病理に関連する症状を治療し、予防し、または軽減するのに十分な量で投与される。被験体において病理を治療または予防するのに十分なモノクローナル抗体の量は、例えば、ＩＬ−８のＬＰＳ誘導産生を低下させるのに十分な量である。本明細書中で用いるように、用語「低下した」とは、本発明のモノクローナル抗体の存在下におけるＩＬ−８の減少した産生をいい、ここに、上記産生は、例えば、（例えば、炎症した組織の部位における）局所的ＩＬ−８産生、または全身的ＩＬ−８産生である。本発明のモノクローナル抗体の存在下におけるＩＬ−８産生のレベルが、ＩＬ−８産生の対照レベル（すなわち、モノクローナル抗体の不存在下におけるＩＬ−８産生のレベル）よりも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％低いよりも大きいか、またはそれと等しい場合に、ＩＬ−８のＬＰＳ誘導産生が減少する。ＩＬ−８産生のレベルは、例えば、本明細書中に記載されたヒト全血またはｈｕＴＬＲ４／ＭＤ２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞アッセイを用いて測定される。当業者であれば、例えば、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを含めた種々のアッセイを用いて、ＩＬ−８産生のレベルを測定することができるのを認識するであろう。
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体を用いて治療されおよび／または予防される病理は、例えば、微生物産物によって誘導される敗血症、急性炎症、慢性炎症（例えば、アレルギー性疾患および喘息に関連する慢性炎症）、自己免疫疾患（例えば、ＩＢＤおよびアテローム性動脈硬化症）、および機械的ストレスが内因性可溶性ストレス因子（例えば、Ｈｓｐ６０、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−ディフェンシン−２および界面活性剤プロテインＡ）の発現を誘導する疾患を含む。機械的ストレスが内因性可溶性ストレス因子の発現を誘導する病理は、例えば、変形性関節症および慢性関節リウマチを含む。機械的ストレスに関連する病理はレスピレーター、ベンチレーターおよび他の呼吸−援助デバイスに置かれた被験体および患者でも起こり得る。そのような病理は、例えば、換気−関連肺損傷（「ＶＡＬＩ」）とも言われるベンチレーター誘導肺損傷（ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ）（「ＶＩＬＩ」）を含む。
【００１１】
本発明による薬学的組成物は本発明の抗体およびキャリアを含むことができる。これらの薬学的組成物は、例えば、診断キットのようなキットに含めることができる。
【００１２】
また、本発明は、（ｔｏｌｌ様レセプター蛋白質とも本明細書中ではいわれる）可溶性キメラｔｏｌｌレセプター蛋白質、ｔｏｌｌレセプター蛋白質を発現させる方法、および可溶性形態のそのような蛋白質を精製する方法も提供する。
【００１３】
本発明は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体がＭＤアクセサリーポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体に作動可能に連結されたキメラポリペプチドを提供する。上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、ＴＬＲ１ないし１０およびＲＰ１０５からなる群より選択されるポリペプチドである。
【００１４】
ＭＤアクセサリーポリペプチドは、例えば、ＭＤ−１またはＭＤ−２である。ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、幾つかの場合には、柔軟性グリシン−セリンリンカーを用いてＭＤアクセサリーポリペプチドに作動可能に連結されており、これは、ｔｏｌｌレセプターを発現の間に安定にし、かつ精製の間に可溶性とする。例えば、本発明のキメラポリペプチドは、柔軟性グリシン／セリンリンカーを介して成熟ＭＤ蛋白質（すなわち、ＭＤ−１またはＭＤ−２）のそのＣ末端ないしＮ末端に融合したｔｏｌｌレセプターの細胞外部分を含む。
【００１５】
また、本発明は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体をＭＤアクセサリーポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体にカップリングすることによって可溶性キメラ融合蛋白質を産生する方法も提供する。また、本発明は、ＭＤアクセサリーポリペプチド（またはその生物学的に活性な誘導体）をコードする核酸配列にカップリングされたｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド（またはその生物学的に活性な誘導体）をコードする核酸配列を含むベクターを構築し；細胞をこのベクターでトランスフェクトし；ＭＤアクセサリーポリペプチドにカップリングされたｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドを有する融合蛋白質の産生を可能とする条件下で上記細胞を培養し；次いで、その融合蛋白質を単離することによって、可溶性キメラ融合蛋白質を産生する方法も提供する。上記ＭＤアクセサリーポリペプチドは、例えば、ＭＤ−１またはＭＤ−２であり、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドはＴＬＲ１ないし１０およびＲＰ１０５からなる群より選択されるポリペプチドであり得る。ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、柔軟性グリシン−セリンリンカーによってＭＤアクセサリーポリペプチドに作動可能に連結されており、これは、ｔｏｌｌレセプターを発現の間に安定に、および精製の間に可溶性とする。
【００１６】
また、本発明は、本発明の可溶性キメラポリペプチドを、治療または予防または軽減が所望される被験体に、被験体において病理、またはその症状を治療または予防または軽減するのに十分な量で投与することによって、異常なｔｏｌｌ様レセプター機能に関連する病理を治療し、または予防し、或いはこれらの病理に関連する症状を軽減する方法も提供する。治療すべき上記被験体は、例えば、ヒトである。被験体において病理を治療または予防するのに十分な可溶性キメラポリペプチドの量は、治療すべき被験体におけるｔｏｌｌ様レセプターの活性化を変調する（例えば、低下させるまたは妨げる）のに十分な量である。ｔｏｌｌ−レセプターの活性化は、本発明のキメラ蛋白質の存在下におけるｔｏｌｌ−レセプター活性化のレベルが、ｔｏｌｌ様レセプター活性化の対照レベル（すなわち、キメラ蛋白質の不存在下における活性化のレベル）よりも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％低いよりも大きいか、またはそれに等しい場合に、低下されているかまたは減少されている。ｔｏｌｌ−レセプター活性化のレベルは、当該分野で知られた種々の技術のいずれかを用いて測定される。例えば、ＴＬＲ４活性化のレベルは、ＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生のレベルを検出することによって測定することができる。当業者であれば、ｔｏｌｌ−レセプター活性化のレベルもまた、例えば、プロ−炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ６、ＴＮＦ−アルファ）をコードする遺伝子の転写を開始させる、ＮＦ−カッパＢまたはＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎ末端キナーゼ）の、もしあれば、活性化を検出することによって測定することもできることを認識するであろう。ＪＮＫおよび／またはＮＦ−カッパＢの活性化は、１以上のプロ−炎症性サイトカインのレベルを測定することによって検出することができる。
【００１７】
幾つかの実施形態において、治療すべき病理は敗血症、急性炎症、慢性炎症または自己免疫疾患である。例えば、病理は種々のタイプの関節炎のいずれか１つである。
【００１８】
また、本発明は、例えば、モノクローナル抗体またはヒト化抗体のような本発明の可溶性キメラポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体も含む。
【００１９】
本発明により薬学的組成物は本発明の可溶性キメラポリペプチド、および／または本発明の抗体およびキャリアを含むことができる。薬学的組成物は、例えば、診断キットのようなキットに含めることができる。
【００２０】
また、本発明は、ｔｏｌｌ様レセプターに結合し、ｔｏｌｌ様レセプター活性を変調するリガンドをスクリーニングする方法を提供する。本発明のこれらの方法によると、これらのリガンドは、そのポリペプチドに帰すことができる特性または機能を有する本発明のキメラポリペプチドを供し；キメラポリペプチドを候補化合物と接触させ；次いで、候補化合物がポリペプチドに帰すことができる特性または機能を改変するか否かを決定することによって同定され、ここに、候補化合物の存在下におけるポリペプチドに帰すことができる特性または機能の改変は、候補化合物がｔｏｌｌ様レセプター活性を変調するリガンドであることを示す。
【００２１】
当業者であれば、本発明のキメラポリペプチドおよび抗体は種々の用途を有することを認識するであろう。例えば、本発明のキメラ蛋白質は、例えば、敗血症、急性炎症、慢性炎症、自己免疫疾患および種々の形態の関節炎のような障害においてＴＬＲの活性化を防止するための治療剤として用いられる。また、本発明のキメラ蛋白質は、抗−ＴＬＲ抗体の結合およびブロッキングを生じさせるより効果的な方法において、免疫原として用いることもでき、および／またはキメラポリペプチドは、ＴＬＲ活性の小分子量バインダーおよびブロッカーにつきスクリーニングするアッセイにおいて試薬として用いることができる。また、本発明のキメラ蛋白質および／または抗体は、診断キットにおいて試薬として、または診断ツールとしても用いられ、あるいはこれらのキメラ蛋白質および／または抗体は、治療剤を創製するための競合アッセイで用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体の活性化を中和するモノクローナル抗体を提供する。特に、本発明は、細胞表面に発現されたＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を認識するモノクローナル抗体を提供する。これらのモノクローナル抗体はＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生をブロックする。加えて、本発明のいくつかのモノクローナル抗体は、ＭＤ−２と複合体化していない場合のＴＬＲ４も認識する。本発明の例示的な抗体は、例えば、１８Ｈ１０抗体（図６Ａないし６Ｆ）、１６Ｇ７抗体（図１３Ａないし１３Ｆ）、１５Ｃ１抗体（図１８Ａないし１８Ｆ）および７Ｅ３抗体（図２５Ａないし２５Ｆ）を含む。
【００２３】
また、本発明は、（ｔｏｌｌ様レセプター蛋白質ともここではいわれる）可溶性キメラｔｏｌｌレセプター蛋白質、ｔｏｌｌレセプター蛋白質を発現する方法、および可溶性形態のそのような蛋白質を精製する方法を提供する。上記キメラ蛋白質は、例えば、抗体を作り出すにおいて有用である。
【００２４】
ＴＬＲは微生物粒子を認識し、これらの微生物粒子の源に対して免疫細胞を活性化するここに引用してその全体を援用する（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：３３５−７６（２００３）参照）。ＴＬＲ４およびＭＤ−２は細胞表面で複合体を形成することが示されており、ＭＤ−２の存在はＬＰＳを含めた、種々のリガンドに対するＴＬＲ４の応答性で必須であるように見える。ＬＰＳは、先天性免疫系を強く活性化することができるグラム陰性菌の外側膜糖脂質である。ＬＰＳはグラム陰性感染に由来する酷い一般的な炎症の間に免疫系を活性化する主な因子のうちの１つとして関連付けられてきた（ここに引用してその全体を援用する、Ｌａｋｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１５：２７８−２８２（２００３））。
【００２５】
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体が主なシグナル伝達成分であるそのマルチ−鎖レセプターを介して免疫系にシグナルを送達する。ＬＰＳは、ＴＬＲ４を通ってのシグナル伝達を介する免疫系に対してその効果を発揮することが知られている。ＬＰＳは血流中でリポ多糖−結合蛋白質（ＬＢＰ）に迅速に結合し、この形態において、ＬＰＳはＧＰＩ−係留細胞表面蛋白質ＣＤ１４と相互作用する。次いで、ＬＰＳはＴＬＲ４に移され、これは細胞内活性化シグナルを変換する。もう１つの蛋白質ＭＤ−２は、ＴＬＲ４を介するシグナル変換が起こるのに必要であることが判明している。ＭＤ−２はＴＬＲ４と直接相互作用し、その翻訳後修飾および細胞内トラフィッキングにおいて重要な役割を演じる。加えて、ＭＤ−２はＬＰＳに直接結合することが示されており、これは、ＬＰＳレセプター複合体におけるこのアクセサリー蛋白質の重要性を示す（ここに引用してその全体を援用する、Ｍｉｙａｋｅ  Ｋ．，  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：１１９−１２８（２００３）参照）。
【００２６】
従って、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されたＬＰＳシグナル伝達の中和は、例えば、グラム陰性菌感染によって誘導された急性全身炎症および敗血症のような障害の治療において潜在的治療戦略である。
【００２７】
（定義）
特に断りのない限り、本発明の関連で用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって通常理解される意味を有するべきである。さらに、文脈により他の事が要求されない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むべきである。一般に、本明細書中で記載される細胞および組織培養、分子生物学、および蛋白質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションの関連で、またはその技術の関連で用いられる命名法は、当該分野でよく知られ、通常に使用される。標準的技術が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）で用いられる。酵素反応および精製技術は製造業者の規格に従って、あるいは当該分野で通常達成されるように、あるいは本明細書中に記載されるように行われる。前記技術および手法は、一般には、当該分野でよく知られ、および本明細書を通じて引用され、議論される種々の一般的およびより具体的文献に記載された慣用的方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、および医学および医薬化学の実験室的手法および技術に関連して利用される命名法は当該分野でよく知られ通常用いられるものである。標準的技術が化学合成、化学分析、医薬調製、処方、および送達、および患者の治療で用いられる。
【００２８】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、特記しない限り、以下の意味を有するものと理解されるべきである：
本明細書中で用いるように、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子をいう。「特異的に結合する」または「と免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の１以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応せず、またはかなり低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖｓ、およびＦａｂ発現ライブラリーを含む。
【００２９】
基本的抗体構造ユニットはテトラマーを含むことが知られている。各テトラマーはポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０ないし７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ−末端部分は、主として抗原認識を担う約１００ないし１１０以上のアミノ酸可変領域を含む。各鎖のカルボキシ−末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質によって相互に異なる、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連する。あるクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびその他のようなサブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
【００３０】
本明細書中で用いるように、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」とは、ユニークな軽鎖遺伝子産物およびユニークな重鎖遺伝子産物よりなる抗体分子のただ１つの分子種を含有する抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は集団の全ての分子において同一である。ＭＡｂは、それに対するユニークな結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００３１】
用語「抗原−結合部位」または「結合部分」とは、抗原結合に参画する免疫グロブリン分子の部分をいう。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）および軽（「Ｌ」）鎖のＮ−末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」といわれる重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様なストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られたより保存されたフランキングストレッチの間に置かれる。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリンにおける超可変領域の間に、およびそれに隣接して天然で見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子においては、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間的に相互に対して置かれて、抗原−結合表面を形成する。抗原−結合表面は結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性−決定領域」または「ＣＤＲ」といわれる。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、免疫学的興味の蛋白質のＫａｂａｔ配列の定義に従う（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７），  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）。
【００３２】
本明細書中で用いるように、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ−細胞レセプターに対して特異的に結合することができるいずれの蛋白質決定基も含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ−細胞レセプターに特異的に結合することができるいずれの蛋白質決定基も含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングよりなり、通常、特異的な三次元構造特徴、ならびに特異的な電荷の特徴を有する。例えば、抗体はポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端ペプチドに対して生起させることができる。抗体は、解離定数が≦１μＭ；好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭである場合に抗原に特異的に結合するといわれる。
【００３３】
本明細書中で用いるように、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」とは、免疫グロブリン分子および上記免疫グロブリンがそれに対して特異的な抗原の間で起こるタイプの非共有結合相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は相互作用の解離定数（Ｋｄ）換算で表すことができ、より小さなＫｄはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は当該分野でよく知られた結合を用いて定量することができる。１つのそのような方法は、抗原−結合部位／抗原複合体形成の速度を測定することを含み、そこでは、その速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および量方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）は共に濃度、および会合および解離の現実の速度の計算によって決定することができる（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３）参照）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率は親和性に関連しない全てのパラメーターのキャンセリングを可能とし、解離定数Ｋｄに等しい（一般に、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３）。本発明の抗体は、Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体に、またはＭＤ−２に複合体化していない場合のＴＬＲ４に特異的に結合するといわれており、その場合、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に知られた同様なアッセイのようなアッセイによって特定して、平衡結合定数（Ｋｄ）は≦１μＭ、好ましくは、≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、最も好ましくは≦１００ｐＭないし約１ｐＭである。
【００３４】
本明細書中で用いるように、用語「単離されたポリペプチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源、またはそのいくつかの組合せポリヌクレオチド、を意味すべきであり、その起源によって、「単離されたポリペプチド」（１）は「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見出されるポリヌクレオチドの全てまたは部分に会合せず、（２）それが天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結され、または（３）より大きな配列の一部として天然では起こらない。
【００３５】
本明細書中でいう用語「単離された蛋白質」は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成起源、またはそのいくつかの組合せの蛋白質を意味し、その起源または由来の源により、「単離された蛋白質」（１）は天然で見出される蛋白質と会合しておらず、（２）同一源からの他の蛋白質を含まず、例えば、海洋蛋白質を含まず、（３）異なる種からの細胞によって発現され、または（４）天然では起こらない。
【００３６】
用語「ポリペプチド」は、本明細書中においては、天然蛋白質、フラグメント、またはポリペプチド配列のアナログをいうように一般的用語として用いられる。よって、天然蛋白質のフラグメント、およびアナログはポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドは図６Ｂ、１３Ｂ、１８Ｂおよび２５Ｂに示されたヒト重鎖免疫グロブリン分子、および図６Ｅ、１３Ｅ、１８および２５に示されたヒト軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子と共に重鎖免疫グロブリン分子を含む組合せによって形成された抗体分子、およびその逆、ならびにそれらのフラグメントおよびアナログを含む。
【００３７】
目的物に適用されるように本明細書中で用いられる用語「天然に存在する」とは、目的物が天然で見出すことができるという事実をいう。例えば、天然で源から単離することができ、かつ実験室においてヒトによって意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在するものである。
【００３８】
本明細書中で用いる用語「作動可能に連結した」とは、そのように記載された成分の位置がそれらがその意図したように機能するのを可能とする関係にあることをいう。コーディング配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【００３９】
本明細書中で用いる用語「制御配列」とは、それが連結されるコーディング配列の発現およびプロセッシングを行うのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に応じて異なり、そのような制御配列は、一般には、プロモーター、リボソーム結合部位、および真核生物における転写終止配列を含み、一般には、そのような制御配列はプロモーターおよび転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現およびプロセッシングに必須である全ての成分を含むことを意図し、また、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。本明細書中で言及する用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも長さが１０塩基のヌクレオチドのポリマーボロン、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド、またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態いずれかを意味する。上記用語はＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。
【００４０】
本明細書中でいう用語オリゴヌクレオチドは天然に存在するヌクレオチド、天然に存在するのと一緒に連結された修飾されたヌクレオチド、および天然に存在するオリゴヌクレオチド結合を含む。オリゴヌクレオチドは、一般には２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましいオリゴヌクレオチドは長さが１０ないし６０塩基であり、最も好ましくは長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ないし４０塩基である。オリゴヌクレオチドは、例えば、プローブについては通常は一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異体の構築で用いるには二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドいずれかである。
【００４１】
本明細書中でいう用語「天然に存在するヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書中でいう用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾されたまたは置換された糖基などを持つヌクレオチドを含む。本明細書中でいう用語「オリゴヌクレオチド結合」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデートなどのようなオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），  Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），  Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ  （１９９１））；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）参照。所望であれば、オリゴヌクレオチドは検出用の標識を含むことができる。
【００４２】
本明細書中でいう用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能にかつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントは、非特異的核酸への検出可能な結合の認識可能な量を最小とするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で核酸ストランドに選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を用いて、当該分野で知られたように、かつここで議論するように、選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することができる。一般には、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびフラグメント、および注目する核酸配列の間の核酸配列相同性は少なくとも８０％であり、より典型的には、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％および１００％の増大する相同性である。もしそれらの配列の間に部分的または完全な同一性があれば、２つのアミノ酸配列は相同である。例えば、８５％相同性は、２つの配列が最大マッチングのために整列させた場合に、アミノ酸の８５％は同一であることを意味する。（マッチングさせる２つの配列のいずれかにおける）ギャップは、マッチングギャップを最大化するにおいて許容されており、５以下の長さが好ましく、２以下がより好ましい。別法として、かつ好ましくは、本明細書中でこの用語を用いるように、もし突然変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティーにてプログラムＡＬＩＧＮを用いてそれらが（標準偏差ユニットにおいて）５を超える整列スコアを有するならば、２つの蛋白質配列（または長さが少なくとも３０アミノ酸のそれらに由来するポリペプチド配列）は相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の別冊２，  ｐｐ．１−１０参照。もしＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列させた場合にアミノ酸が５０％以上同一であれば、２つの配列またはその部分はより好ましくは相同である。用語「に対応する」は、本明細書中においては、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または部分に対して相同である（すなわち、同一である、厳格ではなく進化の過程で関連する）、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列に同一であることを意味するように用いられる。対照的に、用語「に相補的」は、本明細書中においては、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または部分に対して相同であることを意味するように用いられる。説明として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００４３】
以下の用語は、２以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列の関係を記載するのに用いられる：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的同一性」。「参照配列」は配列比較のための基礎として用いられる定義された配列であり、参照配列は、例えば、配列表に与えられた全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとしてのより長い配列のサブセットであり得るか、あるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含むことができる。一般に、参照配列は長さが少なくとも１８ヌクレオチドまたは６アミノ酸であり、頻繁には、少なくとも長さが２４ヌクレオチドまたは８アミノ酸であり、しばしば、長さが少なくとも４８ヌクレオチドまたは１６アミノ酸である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、各々、（１）２つの分子の間で同様である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含み、および（２）２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で多様である配列をさらに含むことができるので、２（またはそれ以上）の分子の間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つの分子の配列を比較して、配列同様性の局所的領域を同定し、比較することによって行われる。本明細書中で用いるように、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも１８連続ヌクレオチド位置または６アミノ酸の概念的セグメントをいい、ここに、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を、少なくとも１８連続ヌクレオチドまたは６アミノ酸配列の参照配列と比較することができ、およびここに、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の上記部分は、２つの配列の最適な整列のための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、２０パーセント以下の付加、欠失、置換など（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の同様性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、またはＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅｓ）、または精査によって行うことができ、種々の方法によって創製された最良な整列（すなわち、比較ウィンドウにわたって相同性の最高パーセンテージが得られるもの）が選択される。
【００４４】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチド間または残基間で）同一であることを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較し、同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が双方の配列で起こる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の合計数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割り、次いで、結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本明細書中で用いる用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば、少なくとも２４ないし４８ヌクレオチド（８ないし１６アミノ酸）位置のウィンドウにわたって、参照配列と比較して、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０ないし９５パーセント配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセント配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ここに、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０パーセント以下の欠失または付加を含むことができる配列に対して参照配列を比較することによって計算される。参照配列はより大きな配列のサブセットであってもよい。
【００４５】
本明細書中で用いるように、２０の慣用的アミノ酸およびそれらの略語は慣用的用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （第２版，  Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７  Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０の慣用的アミノ酸、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の慣用的でないアミノ酸のような非天然アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた本発明のポリペプチドについての適当な成分であり得る。慣用的でないアミノ酸の例は：４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の同様なアミノ酸、およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書中で用いるポリペプチドの表記において、標準的用法および約束に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、右側方向はカルボキシ末端方向である。
【００４６】
同様に、特に断りのない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向といわれる。生じて直ぐのＲＮＡ転写体の５’ないし３’付加の方向はＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡストランド上の転写方向配列領域といわれ、ＲＮＡ転写体の５’末端に対して５’側であることは「上流配列」といわれ、ＲＮＡと同一配列を有し、ＲＮＡ転写体の３’末端に３’側であるＤＮＡストランド上の配列領域は「下流配列」といわれる。
【００４７】
ポリペプチドに適用されるように、用語「実質的同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォールトギャップ重みを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるような最適に整列された場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９パーセント配列同一性を有することを意味する。
【００４８】
好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。
【００４９】
保存的アミノ酸置換とは、同様な側鎖を有する残基の相互交換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり；アミド−含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；および硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００５０】
本明細書中で議論するように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における些細な変動は本発明に含まれると考えられ、但し、アミノ酸配列中の変動は少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％を維持するものとする。特に、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝子にコードされたアミノ酸は、一般的には、ファミリーに分けられ：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸はリシン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非−極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、および（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンおよびスレオニンを含む。疎水性アミノ酸はアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。アミノ酸の他のファミリーは（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；および（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを含む。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの、アスパラギン酸とグルタミン酸との、スレオニンとセリンとの単離された置換、あるいはアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との同様な置換は、特に、もし上記置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まないならば、得られた分子の結合または特性に対して主要な効果を有しないであろうと予測するのは合理的である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に判断することができる。アッセイは本明細書中において詳細に記載する。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたはアナログは、当業者によって容易に調製することができる。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ−およびカルボキシ−末端は、機能的ドメインの境界近くで起こる。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列のデータを公のまたは所有されている配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピュータ化比較方法を用いて、公知の構造および／または機能の他の蛋白質で起こる配列モチーフまたは予測される蛋白質立体配座ドメインを同定する。公知の三次元構造に折り畳まれる蛋白質配列を同定する方法は知られている。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。かくして、これまでの例は、当業者であれば、本発明に従って構造的および機能的ドメインを規定するのに用いることができる配列モチーフおよび構造立体配座を認識できることを示す。
【００５１】
好ましいアミノ酸置換は（１）蛋白質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）蛋白質複合体を形成するための結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、および（４）そのようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を付与し、または修飾するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含むことができる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸の置換）を、（好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分において）天然に存在する配列において見なすことができる。保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特徴を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は親配列で起こるラセンを破壊する傾向がないべきであり、または親配列を特徴付ける二次構造の他のタイプを破壊すべきではない）。当該分野で認められたポリペプチドの二次および三次構造の例はＰｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【００５２】
本明細書中で用いるように、用語「ポリペプチドフラグメント」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ−末端欠失を有するポリペプチドをいうが、ここに、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列中の対応する位置と同一である。フラグメントは、典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸の長さであり、好ましくは、少なくとも１４のアミノ酸の長さであり、より好ましくは少なくとも２０のアミノ酸の長さであり、通常、少なくとも５０の長さのアミノ酸であり、なおより好ましくは少なくとも７０の長さのアミノ酸である。本明細書中で用いる用語「アナログ」とは、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的同一性を有し、適当な結合条件下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体またはＴＬＲ４単独に対する特異的結合を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントよりなるポリペプチドをいう。典型的には、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。アナログは、典型的には、少なくとも２０のアミノ酸の長さであり、好ましくは、少なくとも５０のアミノ酸の長さまたはそれより長く、しばしば、全長の天然に存在するポリペプチド程長くあり得る。
【００５３】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドのそれと同様な特性を持つ非ペプチド薬物として医薬産業で通常用いられる。これらのタイプの非−ペプチド化合物は「ペプチドミメティックス」または「ペプチドミメティックス」といわれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６），  Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。そのような化合物は、しばしば、コンピュータ化分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチドミメティックスを用いて、同等な治療的または予防でき効果を生じさせることができる。一般に、ペプチドミメティックスはヒト抗体のような範例ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に同様であるが、当該分野でよく知られた方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって所望により置き換えられていてもよい１以上のペプチド結合を有する。共通配列の１以上のアミノ酸の同一タイプのＤ−アミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりのＤ−リシン）を用いて、より安定なペプチドを生じさせることができる。加えて、共通配列、または実質的に同一な共通配列変動を含む拘束されるペプチドは、当該分野で知られた方法によって（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））；例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィドブリッジを形成することができる内部システイン残基を加えることによって生じさせることができる。
【００５４】
用語「剤」は、本明細書中においては、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的マクロ分子、または生物学的物質から作成された抽出物を示すのに用いられる。
【００５５】
本明細書中で用いるように、用語「標識」または「標識された」とは、例えば、放射性標識アミノ酸の取り込みによる検出可能なマーカーの取り込み、またはマークされたアビジンによって検出することができるビオチニル部位のポリペプチドへの付着（例えば、光学的にまたは熱的方法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）をいう。ある実施形態においては、標識またはマーカーは治療剤でもあり得る。ポリペプチドおよび糖蛋白質を標識する種々の方法が当該分野で知られており、それを用いることができる。ポリペプチドについての標識の例は、限定されるものではないが、以下の：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドホスフォル）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、ケミルミネセント、ビオチニル基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態において、標識は、種々の長さのスペーサーアームによって付着させて、潜在的立体障害を低下させる。本明細書中で用いるように、用語「医薬剤または薬物」とは、適切に患者に投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物をいう。
【００５６】
本明細書中における他の化学用法は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋａｒ  Ｓ．編，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））によって例示されるように、当該分野における慣用的用法に従って用いられる。
【００５７】
用語「抗新形成剤」は、本明細書中においては、ヒトにおける新生物、特に、癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病のような悪性（癌性）病巣の発症または進行を阻害する機能的特性を有する剤をいうように用いる。
【００５８】
本明細書中で用いるように、「実質的に純粋な」は、目的の種が（すなわち、組成物中のいずれかの他の個々の種よりもそれが豊富であるというモラーに基づいて）存在する圧倒的種であることを意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全てのマクロ分子種の少なくとも約５０％（モラーベース）を含む組成物である。
【００５９】
一般に、実質的に純粋な組成物は組成物に存在する全てのマクロ分子種の約８０％を超えて、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、および９９％を超えて含むであろう。最も好ましくは、目的の種は本質的均一性まで精製され（汚染種は慣用的検出方法によって組成物で検出できない）、そこでは、組成物は単一のマクロ分子種より実質的になる。
【００６０】
用語患者はヒトおよび動物被験体を含む。
【００６１】
（抗体）
本発明のモノクローナル抗体は、ＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する能力を有する。阻害は、例えば、本明細書中に記載されるヒト全血およびｈｕＴＬＲ４／ＭＤ２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞アッセイで測定される。例示的なモノクローナル抗体は、例えば、「１８Ｈ１０」、「１６Ｇ７」、「１５Ｃ１」および「７Ｅ３」とここでいわれる抗体を含む。１８Ｈ１０抗体はＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を認識するが、ＴＬＲ４と複合体化していない場合のＭＤ−２蛋白質を認識しない。１６Ｇ７、１５Ｃ１および７Ｅ３モノクローナル抗体はＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を認識する。１５Ｃ１および１６Ｇ７もまた、ＭＤ−２と複合体化していない場合のＴＬＲ４を認識する。
【００６２】
また、本明細書中に記載される抗体と同一エピトープに結合する抗体も本発明に含まれる。当業者であれば、過度の実験無くして、前者が、後者がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に、またはＭＤ−２に複合体化していない場合のＴＬＲ４に結合するのを妨げるか否かを確認することによって、モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１および／または７Ｅ３）と同一の特異性を有するかを決定することが可能であることを認識するであろう。もしテストされるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、本発明のモノクローナル抗体と競合すれば、２つのモノクローナル抗体は同一の、または密接に関連するエピトープに結合するようである。モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを判断するもう１つの方法は、（それが通常それと反応する）ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体または可溶性ＴＬＲ４蛋白質と共に本発明のモノクローナル抗体をプレ−インキュベートし、次いで、テストすべきモノクローナル抗体を加えて、テストすべきモノクローナル抗体が、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合する、またはＴＬＲ４およびＭＤ−２と複合体化したＴＬＲ４に結合するその能力が阻害されるかを決定することである。もしテストすべきモノクローナル抗体が阻害されれば、全くありそうには、それは本発明のモノクローナル抗体と同一の、または機能的に同等なエピトープ特異性を有する。本発明のモノクローナル抗体のスクリーニングは、ＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を測定し、次いで、テストモノクローナル抗体がＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を中和できるかを判断することによって行うこともできる。
【００６３】
当該分野で知られた種々の手法は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して、またはＭＤ−２に複合体化していないＴＬＲ４に対して、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログまたはオルソログに対して向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生で用いることができる。（例えば、ここに引用して援用するＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，  １９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ参照）。
【００６４】
抗体は、主として免疫血清のＩｇＧ画分を供する、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのようなよく知られた技術によって精製される。引き続いて、または別法として、求められる免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープをカラムに固定化して、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製することができる。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡによって公表されたＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  Ｖｏｌ．１４，  Ｎｏ．８（Ａｐｒｉｌ  １７，２０００），  ｐｐ．２５−２８）によって議論されている。
【００６５】
本発明の抗体（例えば、１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１および７Ｅ３）はモノクローナル抗体である。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるＬＰＳ−シグナル伝達を中和するモノクローナル抗体は、例えば、その表面で高レベルのＴＬＲ４およびＭＤ−２を発現する細胞トランスフェクタント、および柔軟性リンカー配列によって連結されたＴＬＲ４およびＭＤ−２を共に含む組換え可溶性キメラ蛋白質の組合せでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化することによって作り出される。次いで、ミエローマ／Ｂ細胞融合に由来するハイブリドーマを、このＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する反応性につきスクリーニングする。
【００６６】
モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製される。ハイブリドーマ方法においては、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫化剤で免疫化して、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。
【００６７】
免疫化剤は、典型的には、蛋白質抗原、そのフラグメントまたはその融合蛋白質を含む。一般には、もしヒト起源が望まれるならば、いずれかの末梢血液リンパ球を用い、あるいはもし非−ヒト哺乳動物源が望まれるならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用い、リンパ球を不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマを形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）  ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含有する適当な培養基中で培養することができる。例えば、もし親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマについての培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、その物質はＨＧＰＲＴ−結合細胞の成長を妨げる。
【００６８】
好ましい不死化細胞系は効果的に融合し、選択された抗体−産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、かつＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化細胞系はネズミミエローマ系であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることができる。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトへテロミエローマ細胞系もまた、モノクローナル抗体の産生につき記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８７）  ｐｐ．５１−６３参照）。
【００６９】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養基を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の存在につきアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。そのような技術およびアッセイは当該分野で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスカチャード分析によって測定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療的適用においては、標的抗原に対して高度な特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定するのが重要である。
【００７０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手法によってクローンをサブクローンし、標準的な方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）ｐｐ．５９−１０３参照）。この目的での適当な培養基は、例えば、ダルベッコの修飾イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。別法として、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物における腹水液としてインビボで増殖させることができる。
【００７１】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的免疫グロブリン精製手法によって培養基または腹水液から単離し、または精製することができる。
【００７２】
また、モノクローナル抗体は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたもののような組換えＤＮＡ方法によって作成することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは慣用的手法を用いて（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として働くことができる。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これをシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリン蛋白質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。また、ＤＮＡは、例えば、相同なネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに代えてコーディング配列で置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））、あるいは非−免疫グロブリンポリペプチドについてのコーディング配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合連結させることによって修飾することもできる。そのような非−免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常ドメインに代えて置き換えることができるか、あるいは本発明の抗体の１つの抗原−組合せ部位の可変ドメインに代えて置き換えて、キメラ二化抗体を作り出すことができる。
【００７３】
十分にヒト抗体は、ＣＤＲを含めた、軽鎖および重鎖の双方の全配列がヒト遺伝子から生起する抗体分子である。そのような抗体は「ヒト抗体」または「十分にヒト抗体」とここではいわれる。モノクローナル抗体は、トリオーマ技術で；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）；およびモノクローナル抗体を生じさせるためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６参照）によって調製することができる。モノクローナル抗体はヒトハイブリドーマを用いることによって（Ｃｏｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、またはインビトロでヒトＢ−細胞をエプスタインバールウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５  Ｉｎ：  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６）、利用し、産生することができる。
【００７４】
加えて、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーを含めたさらなる技術を用いて産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１参照）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスに導入することによって作成することができる。挑戦に際して、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子再編成、組立、および抗体レパートリーを含めた全ての点でヒトで見られるものに密接に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【００７５】
ヒト抗体は、加えて、抗原による挑戦に応答して動物の内因性抗体よりはむしろ十分にヒト抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて産生することができる（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２）。非ヒト宿主における免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内因性遺伝子は無力とされており、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座は宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて取り込まれる。次いで、全ての所望の修飾を提供する動物が、修飾の十分な補充よりも少数を含む中間トランスジェニック動物を交雑させることによって子孫として得られる。そのような非ヒト動物の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されたＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭといわれるマウスである。この動物は、十分にヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の調製として、注目する免疫原の免疫化後に動物から直接得ることができ、あるいは別法としてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物に由来する不死化Ｂ細胞から得ることができる。加えて、ヒト可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現させて、抗体を直接得ることができるか、あるいはさらに修飾して、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子のような抗体のアナログを得ることができる。
【００７６】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く、マウスが例示される非ヒト宿主を産生する方法の例は米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。それは、胚性幹細胞において少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失して、遺伝子座の再編成を妨げ、再編成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写体の形成を妨げ、上記欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有する標的化ベクターによって行われ；次いで、その体細胞および染色細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から産生することを含む方法によって得ることができる。
【００７７】
ヒト抗体のような注目する抗体を産生する１つの方法は米国特許第５，９１６，７７１号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをもう１つの哺乳動物宿主細胞に導入し、次いで、２つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成することを含む。上記ハイブリッド細胞は重鎖および軽鎖を含有する抗体を発現する。
【００７８】
この手法に対するさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および高親和性でもって関連エピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する関連方法はＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／５３０４９に開示されている。
【００７９】
抗体は、前記した単一鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターによって発現させることができる。
【００８０】
これらはベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント−援助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテル等を含む。ベクターは標的化部位（例えば、細胞表面レセプターに対するリガンド）、および核酸結合部位（例えば、ポリリシン）を有するＷＯ  ９３／６４７０１に記載されたような化学コンジュゲート、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、標的部位（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部位（例えば、プロタミン）を含有する融合蛋白質であるＰＣＴ／ＵＳ  ９５／０２１４０（ＷＯ  ９５／２２６１８）に記載されたような融合蛋白質、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは染色体、非−染色体、または合成したものであり得る。
【００８１】
好ましいベクターはウイルスベクター、融合蛋白質および化学コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターはモロニーネズミ白血病ウイルスを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターはオルソポックスまたはアピポックスベクターのようなポックスベクター、単純疱疹Ｉウイルス（ＨＳＶ）ベクターのようなヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１１４９（１９９０）参照），アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ３：２１９  （１９９３）；Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）参照）およびアデノ−関連ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，  Ｍ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｇｅｎａｔ．８：１４８（１９９４）参照）を含む。
【００８２】
ポックスウイルスベクターは遺伝子を細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期間発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を神経細胞に導入するのに好ましい。アデノウイルスベクターは、ＨＳＶベクターよりも短いアデノ−関連ウイルス（約４ヶ月）よりも短期間の発現（約２ヶ月）をもたらす。選択された特定のベクターは標的配列および治療すべき疾患に依存するであろう。導入は標準的な技術、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によることができる。遺伝子導入の態様の例は、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターを含む。
【００８３】
ベクターを使用して、実質的にいずれの所望の標的細胞も標的化することができる。例えば、定位注射を用いて、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に向けることができる。加えて、粒子は、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ注入システムのようなミニポンプ注入システムを用いて脳室内（ｉｃｖ）注入によって送達することができる。対流と言われるバルク流動に基づく方法もまた、脳の拡大された領域へ大きな分子を送達するにおいて効果的であることが判明しており、ベクターを標的細胞へ送達するのに有用である（例えば、Ｂｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２−３０５（１９９４）参照）。用いることができる他の方法はカテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、および経口または他の公知の投与経路を含む。
【００８４】
これらのベクターを用いて、種々の方法で用いることができる多量の抗体を発現させることができる。例えば、試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体および／またはＴＬＲ４の存在を検出するため。抗体を用いて、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体−関連シグナル伝達に結合し、それを破壊することを試みることもできる。
【００８５】
本発明の抗原性蛋白質に特異的な一本鎖抗体の産生に技術を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）。加えて、蛋白質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログに対する所望の特異性でもって、モノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能とするために、Ｆａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）の構築に方法を適合させることができる。蛋白質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、限定されるものではないが：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって生じたＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することによって生じたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理によって生じたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含めた当該分野で知られた技術によって生じさせることができる。本発明はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２抗−ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体フラグメントまたは抗−ＴＬＲ４フラグメント、一本鎖抗−ＴＬＲ４／ＭＤ２または抗−ＴＬＲ４抗体、二特異的抗−ＴＬＲ４／ＭＤ２または抗−ＴＬＲ４抗体およびヘテロコンジュゲート抗−ＴＬＲ４／ＭＤ２または抗−ＴＬＲ４抗体も含む。
【００８６】
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体である。本発明の場合には、結合特異性のうちの１つはＴＬＲ４／ＭＤ２複合体および／またはＭＤ−２と複合体化していない場合のＴＬＲ４である。第二の結合標的はいずれかの他の抗原であり、有利には、細胞−表面蛋白質またはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【００８７】
二特異的抗体を作成する方法は当該分野で知られている。伝統的には、二特異的抗体の組換え産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、そこでは、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、そのうち１つのみが正しい二特異的構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じる。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様な手法は１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ  ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【００８８】
所望の結合特異性（抗体−抗原合わせ部位）を持つ抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。上記融合は、好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および、もし所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に共トランスフェクトする。二特異的抗体を生じさせるためのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １２１：２１０（１９８６）を参照されたし。
【００８９】
ＷＯ  ９６／２７０１１に記載されたもう１つのアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え体の細胞培養から回収されるホモダイマーのパーセンテージを最大化するように作成することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この方法においては、第一の抗体分子の界面からの１以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖に対する同一または同様なサイズの補償「キャビティー」を第二の抗体分子の界面に生じさせる。これは、ホモダイマーのような他の望まない最終産物よりもヘテロダイマーの収率を増大させるメカニズムを提供する。
【００９０】
二特異的抗体は全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異的抗体）として調製することができる。抗体フラグメントから二特異的抗体を生じさせるための技術は文献に記載されている。例えば、二特異的抗体は化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体を蛋白質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせる手法を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合体化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生じたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異的抗体を形成する。生じた二特異的抗体を、酵素の選択的固定化用の剤として用いることができる。
【００９１】
加えて、Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、二特異的抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は十分にヒト化二特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントはＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、インビトロにて向けられた化学カップリングに付されて、二特異的抗体を形成した。かく形成された二特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球溶解活性をトリガーすることができた。
【００９２】
組換え体細胞培養から直接的に二特異的抗体フラグメントを製造し、単離するための種々の技術もまた記載されている。例えば、二特異的抗体はロイシンジッパーを用いて産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎ蛋白質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域において還元して、ホモダイマーを形成し、次いで、再度酸化して、抗体へテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの産生で利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディー」技術は、二特異的抗体フラグメントを作成するための別のメカニズムを提供している。上記フラグメントは、余りにも短くて、同一鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とすることができないリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインをもう１つのフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合させ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二特異的抗体フラグメントを作成するためのもう１つの戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）参照。
【００９３】
２を超える価を持つ抗体が考えられる。例えば、三特異的抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【００９４】
例示的な二特異的抗体を、その少なくとも１つが本発明の蛋白質抗原に由来する２つの異なるエピトープに結合させることができる。別法として、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームを、Ｔ−細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような白血球上のトリガリング分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御メカニズムを特定の抗原を発現する細胞に集中させることができる。また、二特異的抗体を用いて、細胞傷害性剤を特定の抗原を発現する細胞に向けることもできる。これらの抗体は抗原−結合アーム、および細胞傷害性剤、あるいはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡのような放射性核種キレーターに結合するアームを保有する。注目するもう１つの二特異的抗体は本明細書中に記載された蛋白質抗原に結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【００９５】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内のものである。ヘテロコンジュゲート抗体は２つの共有結合接合抗体よりなる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まない細胞に標的化する（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号参照）と、およびＨＩＶ感染の治療に対して（例えば、ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）で提唱されている。抗体は、架橋剤に関連するものを含めた、合成蛋白質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製することができると考えられる。例えば、免疫トキシンは、ジスルフィド交換反応を用い、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的のための適当な試薬の例はイミュノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチロイミデート、および例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものを含む。
【００９６】
本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾して、例えば、異常なＬＰＳシグナル伝達に関連する疾患および障害を治療するにおける抗体の有効性を増強させるのは望ましくあり得る。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能とすることができる。かく生じたホモダイマー抗体は改良された内部化能力および／または増大された補体−媒介細胞殺傷および抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することができる（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照）。別法として、デュアルＦｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を作成することができる。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ３：２１９−２３０（１９８９）参照）。
【００９７】
また、本発明は、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性なトキシン、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）のような細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。
【００９８】
用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカカランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパノナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびチオテセンを含む。種々の放射性核種がラジオコンジュゲーテッド抗体の産生で入手できる。その例は２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅを含む。
【００９９】
抗体および細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣｌのような）イミドエステルの二機能的誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリエン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二機能的蛋白質−カップリング剤を用いて作成される。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ラジオヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的キレート化剤である（ＷＯ  ９４／１１０２６参照）。
【０１００】
当業者であれば、広く種々の可能な部位を本発明の得られた抗体にカップリングさせることができるのを認識するであろう（例えば、ここに引用してその全内容を援用する、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，  Ｊｒ（編），  Ｃａｒｇａｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８９）参照）。
【０１０１】
カップリングは、抗体および他の部位がそれらの各活性を保有する限りは、２つの分子に結合するであろういずれの化学反応によって達成することもできる。この結合は多くの化学メカニズム、例えば、共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合および複合体化を含むことができる。しかしながら、好ましい結合は共有結合である。共有結合は存在する側鎖の直接的縮合によって、あるいは外部ブリッジング分子の取り込みによって達成することができる。多くの二価または多価連結剤は、本発明の抗体のような蛋白質分子を他の分子にカップリングさせるのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤はチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンのような有機化合物を含むことができる。このリストは、当該分野で知られた種々のクラスのカップリング剤に限定されることを意図せず、むしろ、より通常のカップリング剤の例である（Ｋｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５−２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６２：１８５−２１６（１９８２）；およびＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）参照）。
【０１０２】
好ましいリンカーは文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載するＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４）参照）。また、オリゴペプチドリンカーによって抗体にカップリングしたハロゲン化アセチルヒドラジン誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたし。特に好ましいリンカーは（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボンリウ−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，  カタログ（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，  カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピアナミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．カタログ番号２１６５−Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートしたスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）を含む。
【０１０３】
前記したリンカーは異なる属性を有する成分を含有し、かくして、異なる物理化学的特性を持つコンジュゲートに導く。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳエステル含有リンカーはスルホ−ＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは立体的に障害を受けたジスルフィド結合を含み、増大した安定性を持つコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合は、一般には、他の結合よりも安定性は低い。なぜならば、ジスルフィド結合はインビトロで切断され、利用できる少ないコンジュゲートをもたらすからである。スルホ−ＮＨＳは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強させることができる。（ＥＤＣのような）カルボジイミドカップリングは、スルホ−ＮＨＳと組み合わせて用いた場合、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対して抵抗性であるエステルを形成する。
【０１０４】
本明細書中に開示された抗体はイムノリポソームとして処方することもできる。上記抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されたような、当該分野で公知の方法によって調製される。増強された循環時間を持つリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１０５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発方法によって作成することができる。リポソームは規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出して、所望の直径を持つリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド−相互交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたリポソームにコンジュゲートすることができる。
【０１０６】
（ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に対する抗体およびＴＬＲ４に対する抗体の使用）
本発明による治療体の投与は適当なキャリア、賦形剤、および改良された移動、送達、許容性などを供するために処方に配合される他の剤と共に投与されることは認識されるであろう。多数の適当な処方が全ての医薬化学者に知られた処方書：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１５版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ（１９７５））、特に、Ｂｌａｕｇ，  Ｓｅｙｍｏｕｒによるその中の８７章に見出すことができる。これらの処方は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭのような）脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。前記した混合物のいずれも本発明に従って処置および療法で適当であり得るが、但し、処方中の有効成分は処方によって不活化されず、かつ処方は投与の経路に生理学的に適合し、許容されるものとする。また、医薬化学者によく知られた処方、賦形剤およびキャリアに関するさらなる情報については、Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．」  Ｒｅｇｕｌ，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００），  Ｗａｎｇ  Ｗ．「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００），  Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ「Ｌｉｐｉｄｓ，  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｓｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．」  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００），  Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）およびその引例を参照されたし。
【０１０７】
本発明のモノクローナル抗体を含む本発明の治療処方を用いて、免疫−関連障害に関連する症状を治療し、または軽減する。また、本発明は、免疫−関連障害に関連する症状を治療または軽減する方法も提供する。治療計画は、被験体、例えば、免疫−関連障害に罹った（またはそれを発症する危険性がある）ヒト患者を標準的な方法を用いて同定することによって行われる。
【０１０８】
ＬＰＳ誘導ＩＬ−８を阻害することができる本発明の抗体は、例えば、微生物産物（例えば、ＬＰＳ）によって誘導された急性炎症および敗血症のような障害、および例えば、慢性閉塞性肺疾患および喘息のようなこの急性炎症から生起した亢進の治療において有用な治療ツールである（ここに引用してその全体を援用する、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３９６−４０３（２００３）参照）。そのような抗体は、神経変性自己免疫疾患を治療するのにも有用である（ここに引用してその全体を援用する、Ｌｅｈｎａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：８５１４−８５１９（２００３））。
【０１０９】
加えて、本発明の抗体は、例えば、ＴＬＲ４をトリガーする内因性可溶性「ストレス」因子を誘導する機械的ストレスによって引き起こされる変形性関節症のような疾患の治療において治療試薬としても有用である。内因性可溶性ストレス因子は、例えば、Ｈｓｐ６０（Ｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５８−５６１（２０００）参照）およびフィブロネクチン（Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１０２２９−１０２３３（２００１）参照）およびヘパラン硫酸、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−ディフェンシン−２または界面活性剤プロテインＡ（例えば、その各々をここに引用してその全体を援用する、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３（１−２）：１５−４４（２００３）参照）を含む。本発明の抗体は、例えば、レスピレーター、ベンチレーターおよび他の呼吸−デバイス援助に置かれた被験体および患者に関連する機械的ストレスのような機械的なストレスに関連する種々の障害の治療でも有用である。例えば、本発明の抗体は、換気−関連肺損傷（「ＶＡＬＩ」）ともいわれるベンチレーター誘導肺損傷（「ＶＩＬＩ」）の治療で有用である。
【０１１０】
ＴＬＲ４機能の阻害が有益であり得る他の疾患領域は、例えば、慢性炎症（例えば、アレルギー疾患および喘息に関連する慢性炎症）、自己免疫疾患（例えば、炎症性腸疾患）およびアテローム性動脈硬化症を含む（ここに引用してその全体を援用する、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３９６−４０３（２００３）参照）。
【０１１１】
これらの免疫−関連障害に関連する症状は、例えば、しばしば炎症領域に局所化される、炎症、発熱、一般的倦怠感、発熱、疼痛、速い脈拍、関節疼痛または苦痛（関節痛）、速い呼吸または他の異常な呼吸パターン、悪寒、混濁、見当識障害、動揺、眩暈、咳、呼吸困難、肺感染、心不全、呼吸不全、浮腫、体重増加、粘液膿性再発、悪液質、ぜん鳴、頭痛、および例えば、腹部疼痛、下痢または便秘のような腹部症状を含む。
【０１１２】
治療の効率は、特定の免疫−関連障害を診断または治療するためのいずれかの公知の方法に関連させて判断される。免疫−関連障害の１以上の症状の軽減は、上記抗体が臨床的利益を付与することを示す。
【０１１３】
所望の特異性を保有する抗体をスクリーニングする方法は、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で知られた他の免疫学的媒介技術を含む。
【０１１４】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して向けられた、またはＭＤ−２（またはそのフラグメント）と複合体化していない場合のＴＬＲ４に対する抗体は、（例えば、適当な生理学的試料内でのＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４のレベルを測定するのに用いる、診断方法で用いる、蛋白質をイメージングするのに用いるなどの）ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の突き止めおよび／または定量に関連する当該分野で知られた方法で用いることができる。与えられた実施形態において、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、またはＴＬＲ４に特異的な抗体、または抗体由来抗原結合ドメインを含有する、その誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログは薬理学的に活性な化合物（以下、「治療剤」という）として利用される。
【０１１５】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４に対して特異的な抗体を用いて、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈澱のような標準的な技術によってＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、またはＴＬＲ４ポリペプチドを単離することができる。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４蛋白質に対して向けられた抗体（またはそのフラグメント）を診断に用いて、臨床テスト手法の一部として組織における蛋白質レベルをモニターし、例えば、与えられた治療計画の効率を判断することができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって容易とすることができる。検出可能な物質の例は種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な補欠分子族の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な経口物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを含み；ルミネセント物質の例はルミノールを含み；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリンを含み；および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【０１１６】
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および十分にヒト化抗体を含めた本発明の抗体は治療剤として用いることができる。そのような剤は、一般には、被験体において異常なＴＬＲ４シグナル伝達に関連する疾患または病理を治療または予防するのに使用される。抗体調製物、好ましくは、その標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを被験体に投与し、それは一般には標的とのその結合のため効果を有する。抗体の投与は標的（例えば、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体）のシグナル伝達機能を妨げ、または阻害し、またはそれに干渉することができる。抗体の投与は、それに対して天然で結合する内因性リガンド（例えば、ＴＬＲ４またはＭＤ−２アクセサリー蛋白質）との標的（例えば、ＴＬＲ４）の結合を妨げ、または阻害し、それに干渉することができる。例えば、抗体は標的に結合し、ＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を中和する。
【０１１７】
治療上有効量の本発明の抗体は、一般には、治療目的を達成するのに必要な量に関する。前記したように、これは、抗体およびその標的抗原の間の結合相互作用であり得、これは、ある場合には、標的の機能化に干渉する。投与するのに必要な量は、さらに、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、また、投与される抗体がそれが投与される他の被験体の遊離容量から枯渇する速度にも依存するであろう。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療上有効用量の通常の範囲は、非限定的例であるが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重ないし約５０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。通常の投与頻度は、例えば、毎日２回ないし１週間に１回の範囲とすることができる。
【０１１８】
本発明のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４蛋白質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、薬学的組成物の形態で、異常なＬＰＳシグナル伝達に関連する障害の治療で投与することができる。そのような組成物を調製するに関与する原理および考慮、ならびに成分の選択におけるガイダンスは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．編集者）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，  Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，  Ｐａ．，  １９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．４），  １９９１，  Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで供される。
【０１１９】
抗体フラグメントを用いる場合、標的蛋白質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的蛋白質配列に結合する能力を保有するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは組換えＤＮＡ技術によって化学的に合成し、および／または産生することができる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９０：７８８９−７８９３（１９９３）参照）。上記処方は、治療すべき特定の適応症の必要に応じて１以上の活性化合物、好ましくは、相互に悪影響しない補足的活性を持つものを含有することもできる。別法として、またはそれに加えて、組成物は、例えば、細胞傷害性剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長−阻害剤のような、その機能を増強させる剤を含むことができる。そのような分子は、適切には、意図した目的で効果的な量で組み合わせて存在させる。
【０１２０】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合法によって調製された、マイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、各々、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕獲することもできる。
【０１２１】
インビボ投与で用いるべき処方は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。
【０１２２】
持続−放出製剤を調製することができる。持続−放出製剤の適当な例は抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスを含み、そのマトリックスは成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続−放出マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非−分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびリュープロライド酢酸から構成される注射マイクロスフィア）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日にわたる分子の放出を可能とするが、ある種のヒドロゲルはより短い時間の間蛋白質を放出する。
【０１２３】
本発明による抗体は試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４蛋白質（またはその蛋白質フラグメント）の存在を検出するための剤として用いることができる。いくつかの実施形態において、抗体は検出可能な標識を含有する。抗体はポリクローナル、より好ましくはモノクローナルである。無傷抗体、またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ）２）を用いる。プローブまたは抗体に関連して、用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに直接的に標識されるもう１つの剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を含むことを意図する。間接的標識の例は、蛍光−標識二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびそれが蛍光−標識ストレプトアビジンで検出できるようなＤＮＡプローブのビオチンでの末端−標識を含む。用語「生物学的試料」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および流体を含むことを意図する。従って、用語「生物学的試料」の用法内には、血液、および血清、血漿またはリンパ液を含めた血液の画分または成分が含まれる。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物学的試料中の分析物ｍＲＮＡ、蛋白質、またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、分析物ｍＲＮＡの検出用のインビトロ技術はノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを含む。分析物蛋白質の検出用のインビトロ技術は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈澱、および免疫蛍光を含む。分析物ゲノムＤＮＡの検出用のインビトロ技術はサザーンハイブリダイゼーションを含む。イムノアッセイを行うための手法は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｖｏｌ．４２，  Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（編）  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  １９９５；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，  Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  １９９６；および「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，  Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  １９８５に記載されている。さらに、分析物蛋白質の検出用のインビボ技術は、被験体に標識された抗−分析物蛋白質抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、被験体におけるその存在および位置を標準的なイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０１２４】
（キメラポリペプチド）
本発明のキメラポリペプチドは一緒に作動可能に連結された第一および第二のドメインを含む。第一のドメインはｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの少なくとも部分を含み、他方、第二のドメインはＭＤアクセサリー蛋白質の少なくとも部分を含む。第一および第二のドメインはペプチド中でいずれかの順序で起こることができ、上記ペプチドは各ドメインの１以上を含むことができる。キメラ蛋白質は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドまたはＭＤアクセサリー蛋白質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。キメラペプチドは可溶性である。可溶性とは、流体に溶解する能力を意味する。
【０１２５】
「ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド」とは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの少なくとも部分に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、例えば、ＴＬＲ１ないし１０およびＰＲ１０５を含む。ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、および／またはｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で知られ、例えば、ここに引用してその全体を援用する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（ＣＡＨ７２６２０；ＣＡＨ７２６１９；ＮＰ  ００３２５４；ＮＰ  ００３２５５；ＮＰ  ００３２５９；ＮＰ  ００６０５９；ＮＰ  ０５７６４６；ＮＰ  ００３２５６；ＡＡＨ３３６５１；ＣＡＤ９９１５７；ＡＡＭ２３００１；ＢＡＢ４３９５５；ＡＡＦ０５３１６；ＡＡＫ２６７４４；ＡＡＦ７８０３７；ＡＡＦ７８０３６；ＡＡＦ７８０３５；ＢＡＢ１９２５９；ＡＡＦ６４０６１；ＡＡＦ６０１８８；ＡＡＦ８９７５３；ＡＡＦ０７８２３；ＢＡＡ７８６３１；ＡＡＣ３４１３５；ＡＡＣ３４１３４；ＡＡＣ３４１３３；ＡＡＣ３４１３７）に記載されているｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドコーディング配列を用いて構築することができる。キメラ蛋白質内では、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドはｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの全てまたは部分に対応することができる。好ましくは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは上記ポリペプチドの細胞外部分を含む。
【０１２６】
「ＭＤアクセサリー蛋白質」とは、ＭＤアクセサリー蛋白質の少なくとも部分に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＭＤ蛋白質は、例えば、ＭＤ−１またはＭＤ−２である。ＭＤアクセサリー蛋白質、および／またはＭＤアクセサリー蛋白質をコードする核酸は、当該分野で知られ、かつ例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｏ９５７１１（ＭＤ−１）；ＡＡＣ９８１５２（ＭＤ−１）；Ｑ９Ｙ６Ｙ９（ＭＤ−２）；ＮＰ  ０５６１７９（ＭＤ−２）；ＡＡＨ２０６９０（ＭＤ−２）；およびＢＡＡ７８７１７（ＭＤ−２）に記載されているＭＤアクセサリー蛋白質コーディング配列を用いて構築することができる。例示的なＭＤアクセサリー蛋白質および核酸配列は図３２Ａ、３２Ｂ、３３Ａおよび３３Ｂに示されている。キメラ蛋白質内では、ＭＤアクセサリー蛋白質はＭＤアクセサリー蛋白質の全てまたは部分に対応することができる。
【０１２７】
キメラ蛋白質は１以上のさらなる部位に連結させることができる。例えば、キメラ蛋白質は、加えて、ＧＳＴ融合蛋白質に連結させることができ、そこでは、糖蛋白質Ｉｂα融合蛋白質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ−末端に融合されている。そのような融合蛋白質はキメラ蛋白質の精製を容易とすることができる。
【０１２８】
もう１つの実施形態において、キメラ蛋白質は、そのＮ−末端において異種シグナル配列（すなわち、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドまたはＭＤアクセサリー蛋白質核酸によってコードされたポリペプチドには存在しないポリペプチド配列）を含む。例えば、天然ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド配列を除去し、もう１つの蛋白質からのシグナル配列で置き換えることができる。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）においては、キメラ蛋白質の発現および／または分泌は異種シグナル配列の使用を通じて増加させることができる。
【０１２９】
本発明のキメラ蛋白質は標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結用の平滑−末端またはスタガー−末端、適当な末端を供するための制限酵素消化、適切な粘着末端のフィリング−イン、望ましくない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素連結を使用することによって、慣用的技術に従って一緒にイン・フレーム連結される。もう１つの実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含めた慣用的技術によって合成することができる。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続遺伝子フラグメントの間の相補的突出を生起させるアンカープライマーを用いて行うことができ、これは、引き続いて、アニールし、再度増幅して、キメラ遺伝子配列を作成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編）  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９２参照）。さらに、融合部位（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。糖蛋白質Ｉｂαコーディング核酸を、融合部位が免疫グロブリン蛋白質にイン−フレーム連結されるように、そのような発現ベクターにクローン化することができる。
【０１３０】
キメラ蛋白質内では、用語「作動可能に連結した」とは、第一および第二のポリペプチドが、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリー蛋白質に関連する少なくとも１つの機能を可能とするように（最も典型的には、ペプチド結合のような共有結合を介して）化学的に連結されることを示すよう意図される。キメラ蛋白質をコードする核酸をいうように用いる場合、用語作動可能に連結されたは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドまたはＭＤアクセサリー蛋白質をコードする核酸が相互にイン・フレーム融合することを意味する。ＭＤアクセサリー蛋白質は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合させることができる。所望により、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリー蛋白質はスペーサーアームを介して連結される。スペーサーアームは分子内柔軟性を提供し、あるいはコンジュゲートされた部位の間の分子内距離を調整し、それにより、生物学的活性を維持するのを助けることができる。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリン、セリンまたはグリシンを含むポリペプチド部位の形態であってよい。好ましくは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリー蛋白質は柔軟性グリシン／セリンリンカーを介して連結される。別法として、スペーサーアームは「長鎖ＳＰＤＰ」のような架橋試薬の部分であってよい（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ．，カタログ番号２１６５１  Ｈ）。
【０１３１】
好ましい実施形態において、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリー蛋白質は当該分野で知られたいずれかの適当な方法で化学的カップリングによって連結される。多くの公知の化学架橋方法は非特異的であり、すなわち、それらはｔｏｌｌ様ポリペプチドまたはＭＤアクセサリー蛋白質上のいずれかの特定の部位へのカップリングの点を指令しない。その結果、非特異的架橋剤の使用は機能的部位または立体的ブロック活性部位を攻撃することができ、コンジュゲートした蛋白質を生物学的に不活性とする。
【０１３２】
カップリング特異性を増大させる１つの方法は、架橋すべきポリペプチドの一方または双方において１回または数回のみ見出される官能基への化学カップリングを指令することである。例えば、多くの蛋白質においては、チオール基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは数回のみ起こる。また、例えば、もしポリペプチドがリシン残基を含有しないならば、第一級アミンに特異的な架橋剤はそのポリペプチドのアミノ末端に対して選択的であろう。カップリング特異性を増大させるためのこのアプローチの成功した利用は、ポリペプチドが、分子の生物学的活性の喪失なくして改変することができる分子の領域に適当に稀であって反応性の残基を有することを要求する。
【０１３３】
システイン残基は、それが、架橋反応におけるその参画がそうでなければ生物学的活性に干渉するであろうポリペプチド配列の一部で起これば置き換えることができる。システイン残基が置き換えられると、それは、典型的には、ポリペプチド折り畳みにおける結果としての変化を最小化するのに望ましい。ポリペプチド折畳みの変化は、置き換えがシステインに化学的かつ立体的に同様である場合に最小化される。これらの理由で、セリンはシステインに代えての置き換えとして好ましい。後に実施例で示すように、システイン残基は、架橋目的でポリペプチドのアミノ酸配列に導入することができる。システイン残基を導入する場合、アミノまたはカルボキシ末端における、またはその近くの導入が好ましい。注目するポリペプチドが化学合成または組換えＤＮＡの発現によって生じるか否かを問わず、慣用的な方法がそのようなアミノ酸配列の修飾で利用できる。
【０１３４】
２つの構成要素のカップリングはカップリングまたはコンジュゲーティング剤を介して達成することができる。利用することができるいくつかの分子間架橋剤がある。例えば、Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，  １９７４，  ｐｐ．３９−４３参照。これらの試薬の中には、例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｊ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（その双方はスルフヒドリル基に対して高度に特異的であって、不可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセタミド）または（比較的スルフヒドリル基に対して特異的である）６ないし１１炭素のメチレンブリッジを有する他のそのような試薬；（アミノおよびチロシン基とで不可逆的結合を形成する）１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンがある。この目的で有用な他の架橋試薬は：（アミノおよびフェノール性基とで不可逆的架橋結合を形成する）ｐ、ｐ’−ジフルオロ−ｍ、ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン；（アミノ基に対して特異的である）ジメチルアジピミデート；（主としてアミノ基と反応するフェノール−１，４−ジスルホニルクロライド；（主としてアミノ基と反応する）ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート；（いくつかの異なる側鎖と反応する）グルタルアルデヒドおよび（主としてチロシンおよびヒスチジンと反応する）ジスジアゾベンジジンを含む。
【０１３５】
架橋剤はホモ二機能的である、すなわち、同一反応を受ける２つの官能基を有することができる。好ましいホモ二機能的架橋剤はビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは２つのマレイミド官能基を含有し、これは、温和な条件（ｐＨ６．５ないし７．７）下でスルフヒドリル−含有化合物と特異的に反応する。２つのマレイミド基は炭化水素鎖によって連結される。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの不可逆的架橋で有用である。
【０１３６】
架橋試薬はヘテロ二機能的であってもよい。ヘテロ二機能的架橋剤は異なる官能基、例えば、アミノ−反応性基およびチオール−反応性基を有し、これは、各々、遊離アミンおよびチオールを有する２つの蛋白質を架橋させるであろう。ヘテロ二機能的架橋剤の例はスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの延長された鎖アナログである。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は第一級アミンと反応し、チオール−反応性マレイミドはシステイン残基のチオールとで共有結合を形成する。
【０１３７】
架橋剤は、しばしば、水に低い溶解性を有する。スルホネート基のような親水性部位を架橋試薬に加えて、その水溶解性を改良することができる。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは水溶解性につき修飾された架橋試薬の例である。
【０１３８】
多くの架橋試薬は、細胞条件下で本質的に非−切断性であるコンジュゲートを生じる。しかしながら、いくつかの架橋試薬は、細胞条件下で切断可能なジスルフィドのような共有結合を含有する。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）、および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＤＰ」）はよく知られた切断可能架橋剤である。切断可能架橋試薬の使用は、カーゴ部位が、標的細胞への送達後に輸送ポリペプチドから分離するのを可能とする。直接的ジスルフィド結合も有用であり得る。
【０１３９】
前記したものを含めた多数の架橋試薬は商業的に入手可能である。それらの使用についての詳細な指令は商業的供給業者から容易に入手できる。蛋白質架橋およびコンジュゲート調製についての一般的文献はＷｏｎｇ，  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【０１４０】
また、キメラペプチドおよびこれらのペプチドをコードする核酸の誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび変種も本発明に含まれる。核酸では、ここに供される誘導体、フラグメントおよびアナログは少なくとも６つの（連続）核酸の配列と定義され、それは特異的ハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な長さを有する。アミノ酸では、ここに供される誘導体、フラグメントおよびアナログは少なくとも４つの（連続）アミノ酸の配列と定義され、これは、エピトープの特異的認識を可能とするのに十分な長さである。
【０１４１】
フラグメントの長さは、それからキメラペプチド、またはそれをコードする核酸が由来する対応する全長核酸またはポリペプチドの長さ未満である。誘導体およびアナログは、もし誘導体またはアナログが修飾された核酸またはアミノ酸を含有するならば、全長、または全長以外であり得る。キメラペプチドの誘導体またはアナログは、例えば、同一サイズのアミノ酸配列よりも、あるいは当該整列が当該分野で知られたコンピュータ相同性プログラムによってなされる整列された配列と比較して、種々の実施形態において、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、または９９％さえだけ、ペプチドに対して実質的に相同である領域を含む分子を含む。例えば、配列同一性は、その中のデフォールトパラメーターにて、配列分析ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  １７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．５３７０５）を用いて測定することができる。
【０１４２】
特定のポリペプチドが規定された長さの参照ポリペプチドに対して具体的パーセント同一性を有するといわれる場合、上記パーセント同一性は参照ペプチドに対するものである。かくして、１００アミノ酸長である参照ポリペプチドに対して５０％同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸長部分に対して完全に同一である５０アミノ酸ポリペプチドであり得る。それは、その全長にわたって参照ポリペプチドに対して５０％同一である１００アミノ酸長ポリペプチドでもあり得る。もちろん、他のポリペプチドは同一基準を満足するであろう。
【０１４３】
（薬学的組成物）
（本明細書中においては「活性化合物」ともいわれる）の抗体または可溶性キメラポリペプチド、およびその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは投与に適した薬学的組成物に配合することができる。そのような組成物は、典型的には、抗体または可溶性キメラポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で用いるように、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的組成物に適合する、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーディング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図する。適当なキャリアは、ここに引用して援用する、当該分野における標準的な参照テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最近の改訂版に記載されている。そのようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例は、限定されるものではないが、水、セーライン、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含む。リポソーム、および不揮発性油のような非水性ビークルも用いることができる。医薬上活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの慣用的な媒体または剤が活性化合物に適合しないのを除き、組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性化合物も組成物に配合することもできる。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物は、その意図した投与経路に適合するように処方される。投与経路の例は非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用で用いる溶液または懸濁液は以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または二亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調整のための剤のような緩衝液。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口製剤はガラスまたはプラスチックで作成されたアンプル、ディスポーザブルシリジまたは多用量バイアルに包むことができる。
【０１４５】
注射用途に適した薬学的組成物は滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即席製剤用の滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適当なキャリアは生理食塩水、細菌増殖抑制水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，  Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，  Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性が存在する程度まで流動的でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して維持されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体プロピレングリコールなど）、およびその適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによって実現することができる。
【０１４６】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、前記で例示した成分の１つまたは組合せを含む適当な溶媒に配合し、必要であれば、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般には、分散液は、基本的分散媒体および前記で例示したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビークルに活性化合物を配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、調製の方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、その先に滅菌濾過された溶液から、有効成分＋いずれかのさらなる所望の成分粉末を生じさせる。
【０１４７】
経口組成物は、一般には、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それらはゼラチンカプセルに包み、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的では、活性化合物は賦形剤と共に配合することができ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いられる。経口組成物は、マウスウォッシュとして用いられる流体キャリアを用いて調製することもでき、ここに、流体キャリア中の化合物は経口適用され、ぐちゅぐちゅし、吐き出し、または飲み込む。医薬上適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは以下の成分のいずれか、または同様な性質の化合物を含有することができる：マイクロクリスタリンセルロース、トラガカントガム、またはゼラチンのようなバインダー；澱粉またはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシ澱粉のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のようなグライダント；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーのようなフレーバー剤。
【０１４８】
吸入による投与では、化合物は、適当なプロペラント、例えば、二酸化炭素のようなガスを含有する圧縮容器またはディスペンサー、またはネビュライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１４９】
全身投与は経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与では、浸透すべきバリアに対して適当な浸透剤が処方で用いられる。そのような浸透剤は一般には当該分野で知られており、例えば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐薬の使用を通じて達成することができる。経皮投与では、活性化合物は、当該分野で一般的に知られた軟膏、膏薬、またはクリームに処方される。
【０１５０】
化合物は（例えば、カカオバターおよび他のグリセライドのような慣用的坐薬基剤を含む）坐薬、または直腸投与のための保持浣腸の形態で調製することもできる。
【０１５１】
１つの実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出処方のような、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護するであろうキャリアで調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような処方の調製方法は当業者に明らかであろう。上記物質はＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．から商業的に得ることもできる。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染された細胞に標的化されるリポソームを含めた）リポソーム懸濁液を薬学的に受容可能なキャリアとして用いることもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１に記載されたように、当業者に知られた方法に従って調製することができる。
【０１５２】
経口または非経口組成物を、投与の容易性および用量の均一性のため投与単位形態に処方するのが特に有利である。本明細書中で用いる投与単位形態とは、治療すべき被験体のための単位の用量として適した物理的に区別されるユニットをいい；各ユニットは、必要な医薬キャリアと関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の投与単位形態のための規格は、活性化合物のユニークな特徴および達成すべき特定の治療効果、および個体の治療用のそのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって直接指令され、かつそれに直接依存する。
【０１５３】
薬学的組成物は投与用の指令書と共に容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１５４】
（スクリーニング方法）
本発明は、モジュレーター、すなわち、ＭＤ−２アクセサリー蛋白質へのＴＬＲ４の結合を変調し、またはそうでなければそれに干渉する候補またはテスト化合物または剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティックス、小分子または他の薬物）、またはＴＬＲ４および／またはＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のシグナル伝達機能を変調する、またはそうでなければそれに干渉する候補またはテスト化合物または剤を同定するための（ここでは「スクリーニングアッセイ」ともいわれる）方法を提供する。また、異常なＬＰＳ−シグナル伝達に関連する障害を治療するのに有用な化合物を同定する方法も提供される。本発明は、ここに記載するスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物も含む。
【０１５５】
１つの実施形態において、本発明は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のシグナル伝達機能および／またはＴＬＲ４およびＭＤ−２の間の相互作用を変調する候補またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明のテスト化合物は：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「ワン−ビーズワン−化合物」ライブラリー方法；アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法を含めた、当該分野で知られたコンビナトーリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されており、他方、他の４つのアプローチはペプチド、非−ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ，  １９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５参照）。
【０１５６】
本明細書中で用いる「小分子」は、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうことを意味する。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティックス、炭水化物、脂質または他の有機もしくは無機分子であり得る。真菌、細菌または海藻抽出物のような化学および／または生物学的混合物のライブラリーは当該分野で知られており、本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングすることができる。
【０１５７】
分子ライブラリーの合成用の方法の例は当該分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出すことができる。
【０１５８】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  １９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１参照）、またはビーズ上（Ｌａｍ，  １９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，  １９９３．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６参照）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２３３，４０９号参照）、プラスミド（Ｃｕｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９参照）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  １９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，  １９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９；４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，  １９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；および米国特許第５，２３３，４０９号参照）に供することができる。
【０１５９】
１つの実施形態において、候補化合物を抗体−抗原複合体に導入し、候補化合物が抗体−抗原複合体を破壊するか否かを決定し、そこでは、この複合体の破壊は、候補化合物がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のシグナル伝達機能および／またはＴＬＲ４およびＭＤ−２の間の相互作用を変調することを示す。例えば、抗体はモノクローナル抗体１８Ｈ１０であって、抗原はＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体である。別法として、モノクローナル抗体は１６Ｇ７または１５Ｃ１または７Ｅ３であって、抗原はＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４である。
【０１６０】
もう１つの実施形態において、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体が提供され、少なくとも１つの中和モノクローナル抗体に暴露される。抗体−抗原複合体の形成が検出され、１以上の候補化合物が複合体に導入される。もし１以上の候補化合物の導入に続いて抗体−抗原複合体が破壊されれば、候補化合物は異常なＬＰＳ−シグナル伝達に関連する障害を治療するのに有用である。
【０１６１】
もう１つの実施形態において、本発明の可溶性キメラ蛋白質が提供され、少なくとも１つの中和モノクローナル抗体に暴露される。抗体−抗原複合体の形成が検出され、１以上の候補化合物が複合体に導入される。もし１以上の候補化合物の導入に続いて抗体−抗原複合体が破壊されれば、候補化合物は異常なＬＰＳ−シグナル伝達に関連する障害を治療するのに有用である。
【０１６２】
抗体−抗原複合体に干渉する、またはそれを破壊するテスト化合物の能力の測定は、例えば、テスト化合物を放射性同位体または酵素標識と、テスト化合物の抗原またはその生物学的に活性な部分への結合が複合体中の標識された化合物を検出することによって測定できるように放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成することができる。例えば、テスト化合物は１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的にまたは間接的に標識することができ、放射性同位体は放射線放出の直接的カウンティングによって、またはシンチレーションカウンティングによって検出される。別法として、テスト化合物は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は適当な基質の産物への変換の測定によって検出できる。
【０１６３】
もう１つの実施形態において、上記アッセイは、抗体−抗原複合体をテスト化合物と接触させ、次いで、抗原と相互作用し、またはそうでなければ存在する抗体−抗原複合体を破壊するテスト化合物の能力を測定することを含む。この実施形態において、抗原と相互作用する、および／または抗体−抗原複合体を破壊するテスト化合物の能力の測定は、抗体と比較して、抗原またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合するテスト化合物の能力を測定することを含む。
【０１６４】
もう１つの実施形態において、アッセイは、抗体−抗原複合体をテスト化合物と接触させ、次いで、抗体−抗原複合体を変調するテスト化合物の能力を測定することを含む。抗体−抗原複合体を変調するテスト化合物の能力の測定は、例えば、テスト化合物の存在下において、抗体に結合する、またはそれと相互作用する抗原の能力を測定することによって達成することができる。
【０１６５】
当業者であれば、本明細書中で開示したスクリーニング方法のいずれかにおいて、抗体は、その各々がＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を変調する、またはそうでなければそれに干渉する、モノクローナル抗体１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１および／または７Ｅ３のような中和抗体であってよいことを認識するであろう。
【０１６６】
本明細書中で開示するスクリーニング方法は細胞−ベースのアッセイとして、または無細胞アッセイとして行うことができる。本発明の無細胞アッセイはＴＬＲ４および／またはＭＤ−２と複合体化した場合のＴＬＲ４の可溶性形態または膜結合形態の双方、またはそのフラグメントの使用に適合できる。ＴＬＲ４および／またはＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体の膜結合形態を含む無細胞アッセイの場合において、蛋白質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用するのが望ましいであろう。そのような可溶化剤の例はｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、トリトン（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）のような非−イオン性洗剤を含む。
【０１６７】
１を超える実施形態において、抗体または抗原いずれかを固定化して、候補化合物の導入に続いての一方または双方の未複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易とし、ならびにアッセイの自動化を受け入れるのが望ましいであろう。候補化合物の存在下および不存在下での抗体−抗原複合体の観察は、反応体を含有するのに適当ないずれかの容器中で達成することができる。そのような容器の例はマイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ−遠心管を含む。１つの実施形態において、蛋白質の一方または双方をマトリックスに結合させるのを可能とするドメインを加える融合蛋白質を供することができる。例えば、ＧＳＴ−抗体融合蛋白質またはＧＳＴ−抗原融合蛋白質はグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これは、次いで、テスト化合物と合わせ、複合体形成に導く条件（例えば、塩およびｐＨについいての生理学的条件）下で混合物をインキュベートする。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、いずれの未結合成分も、ビーズの場合には固定化されたマトリックスも除去し、複合体を直接的または間接的に測定する。別法として、複合体をマトリックスから解離させることができ、抗体−抗原複合体形成のレベルを標準的な技術を用いて測定することができる。
【０１６８】
また、蛋白質をマトリックス上に固定化するための他の技術を、本発明のスクリーニングアッセイで用いることもできる。例えば、抗体（例えば、１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１、および／または７Ｅ３）または抗原（例えば、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体および／またはＴＬＲ４蛋白質）いずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーンを利用して固定化することができる。ビオチニル化抗体または抗原分子は、当該分野で良く知られた技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＩＩ）を用い、ビオチン−ＮＳＨ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン−被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化することができる。別法として、注目する抗体または抗原と反応性であるが、注目する抗体−抗原複合体の形成には干渉しない他の抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、未結合抗体または抗原を抗体コンジュゲーションによってウェルに捕獲することができる。そのような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ−固定化複合体について前記したものに加えて、抗体または抗原と反応性であるそのような他の抗体を用いる複合体の免疫検出を含む。
【０１６９】
本発明は、さらに、前記したスクリーニングアッセイのいずれかによって同定された新規な剤および本明細書中で記載された治療のためのその使用に関する。
【０１７０】
（診断アッセイ）
本発明の抗体は、適当なアッセイ、例えば、慣用的なタイプのイムノアッセイによって検出することができる。例えば、サンドイッチアッセイを行うことができ、そこでは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４蛋白質またはそのフラグメントを固相に付着させる。インキュベーションを、試料中の抗体が固体プレート上の固定化されたポリペプチドに結合するのを可能とするのに十分な時間維持する。この最初のインキュベーションの後、固相を試料から分離する。固相を洗浄して、未結合物質、および試料にやはり存在するかもしれない非特異的蛋白質のような干渉物質を除去する。固定化されたポリペプチドに結合した注目する抗体（例えば、モノクローナル抗体１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１および／または７Ｅ３）を含有する固相を、引き続いて、第二の標識された抗体、またはビオチンまたはアビジンのようなカップリング剤に結合した抗体と共にインキュベートする。この第二の抗体はもう１つの抗−ＴＲＬ４／ＭＤ−２複合体抗体、もう１つの抗−ＴＬＲ４抗体またはもう１つの抗体であってよい。抗体についての標識は当該分野で良く知られており、放射性核種、酵素（例えば、マレイン酸レヒドロロゲナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ）フルオル（フルオレセインイソチアシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレスカルミン）、ビオチン等を含む。標識された抗体を固体と共にインキュベートし、固相に結合した標識を測定する。これらのおよび他のイムノアッセイは当業者によって容易に実施できる。
【０１７１】
生物学的試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４蛋白質の存在または不存在を検出するための例示的な方法は、テスト被験体からの生物学的試料を入手し、次いで、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の存在が生物学的試料中で検出できるように、本発明による標識されたモノクローナル抗体と生物学的試料を接触させることを含む。
【０１７２】
本明細書中で用いるように、プローブまたは抗体に関連して、用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに直接的に標識されるもう１つの試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を含むことを意図する。間接的な標識の例は、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびそれが蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるような、ＤＮＡプレオー部のビオチンでの末端−標識を含む。用語「生物学的試料」は、対照から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および流体を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法を用いて、インビトロならびにインビボにて生物学的試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４を検出することができる。例えば、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の検出のためのインビトロ技術は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈澱、および免疫蛍光を含む。さらに、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の検出のためのインビボ技術は、標識された抗−ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体または抗−ＴＬＲ４抗体を対照に導入することを含む。例えば、抗体は、被験体におけるその存在および位置が標準的なイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０１７３】
１つの実施形態において、生物学的試料はテスト被験体からの蛋白質分子を含有する。１つの好ましい生物学的試料は、被験体から慣用的手段によって単離された抹消血液白血球試料である。
【０１７４】
また、本発明は、生物学的試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の存在を検出するキットも含む。例えば、上記キットは：生物学的試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＭＤ−２と複合体化していない場合のＴＬＲ４を検出することができる標識された化合物または剤（例えば、抗−ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体モノクローナル抗体または抗−ＴＬＲ４モノクローナル抗体）；試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の量を測定するための手段；および試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体の量を標準と比較するための手段を含む。上記化合物または剤は適当な容器にパッキングすることができる。上記キットは、さらに、上記キットを用いて試料中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４を検出するための指示書を含むことができる。
【０１７５】
本発明を以下の実施例で更に記載するが、これは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１：１８Ｈ１０モノクローナル抗体の創製のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントの創製）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントをＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞において創製した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞では、Ｎ−末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグをコードするヒトＴＬＲ４  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｃ−末端ｃ−ＭｙｃおよびプロテインＣエピトープタグをコードするヒトＭＤ−２  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。製造業者のガイドラインに従って、Ｆｕｇｅｎｅ６ＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて双方の構築体をＣＨＯ細胞に共トランスフェクトした。抗生物質耐性細胞を、（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの）５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および２５０μｇ／ｍＬのヒグロマイソインＢを含有する培養基にて選択した。
【０１７７】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞につき選択するために、１％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍＬの抗−プロテインＣモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を補足した１×ＰＢＳ中で１×１０７細胞／ｍＬをインキュベートした。細胞を１回洗浄し、次いで、ＰＥ−コンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含む同一緩衝液中でインキュベートした（１：２００希釈；Ａｎｗａｒａ）。引き続いて、細胞を抗−ＰＥμビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートし、Ｍｉｄｉ  ＭＡＣＳ  ＬＳカラムを通した。カラム上に保持された細胞を溶出させ、抗生物質選択にて培養に戻した。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞の均一に陽性の集団が得られるまで、数ラウンドのソーティングを継続した。
【０１７８】
（Ｂ．組換えＭＤ−２およびキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２蛋白質の創製）
組換え可溶性ＭＤ−２を創製するために、選択および精製目的でのＣ−末端ＦＬＡＧおよび６×ＨＩＳタグを持つ上記蛋白質をコードするｃＤＮＡをｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローン化し、引き続いて、相同組換えによって、バクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの創製に続いて、Ｓｆ９細胞をスーパー感染させた。４８時間後、ＮｉＮＴＡアフィニティーマトリックス（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、組換え蛋白質を感染した細胞上清から精製した。
【０１７９】
組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質を創製するために、ＰＣＲを用い、グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に連結されたヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡを組み立てた。検出および精製目的で、ＦＬＡＧおよび６×ＨＩＳタグをＭＤ−２のＣ−末端に含めた。ｃＤＮＡカセットをバキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、引き続いて相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの創製に続いて、Ｓｆ９細胞をスーパー感染させた。４８時間後、抗−ＦＬＡＧＴＭ  Ｍ２  ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を用いて、組換え融合蛋白質を細胞溶解物から精製した。
【０１８０】
（Ｃ．マウスの免疫化）
ここに引用してその全体を引用するＢｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９２：３５２１−３５２８（１９９８）に以前記載されたように、日０、７および２８において、８週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ）をＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の１０６ＣＨＯ細胞／ｍＬの皮下注射（ｓ．ｃ．）で免疫化した。
【０１８１】
（Ｄ．特異的血清力価測定）
マウスを日０および１４に採血した。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた２９３細胞についてのＦＡＣＳ分析によって、ＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的抗体力価を血清中にてアッセイした。細胞を１：２５０、１：２５００および１：２５０００希釈にてマウス血清と共にインキュベートし、洗浄し、ＡＰＣ−コンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートし、ＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で分析した。
【０１８２】
（Ｅ．Ｂ細胞／ミエローマ融合）
特異的ＴＬＲ４／ＭＤ−２血清抗体を有するマウスを、融合から３ないし４日先立って、キメラＴＬＲ４／ＭＤ−２融合蛋白質で皮下（ｓ．ｃ．）「過剰ブースター注射」した。排出リンパ節をマウスミエローマ細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との融合のためのＢ細胞の源として得た。Ｂ細胞抽出および細胞融合は、ここに引用してその全体を援用する、Ｂｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２：３５２１−３５２８（１９９８）に以前記載されたように行った。細胞を１０４ミエローマ細胞／ウェルの近似的濃度で平板培養し、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を補足した培養基中で１０ないし１４日間増殖させた。
【０１８３】
（Ｆ．ハイブリドーマのスクリーニング）
生きたハイブリドーマ細胞を含有するウェルからの上清を、ＦＡＣＳ分析によって、ＴＬＲ４／ＭＤ−２特異性につき、モックトランスフェクトされた細胞  ｖｓ  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたミエローマ細胞に対してスクリーニングした。次いで、細胞を上清およびヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。細胞をＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。
【０１８４】
（Ｇ．ＦＡＣＳによるモノクローナル抗体の特異性）
１０％ＦＢＳを含有する２ｍＬ培養基中で２．５×１０５細胞／ウェルの密度にて、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートで平板培養した。平板培養から１６時間後、製造業者のガイドラインに従って、ＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用い、細胞を０．７５μｇの適当なベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を（図４に示すように）適当なモノクローナル抗体およびＡＰＣ−カップルドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、ＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いて分析した。
【０１８５】
（Ｈ．直接的ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体の特異性）
Ｃ末端ＦＬＡＧおよびヒスチジンエピトープタグを持つ組換え可溶性ＭＤ−２を、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上にて、５０μＬのＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの濃度で被覆した。ウェルを２００μＬのＰＢＳ  ２％ＢＳＡでブロックし、引き続いて、ＰＢＳ  １％ＢＳＡ中の示された濃度にて適当なＭＡｂでインキュベートした。ＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０での３回の洗浄工程に続き、１：５０００  希釈の５０μＬのＨＲＰコンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をウェルに加えた。更なる洗浄工程に続いて、結合をＴＭＢ基質を用いて明らかにした、プレートを６５０ｎｍの波長で読んだ。
【０１８６】
（Ｉ．サンドイッチＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体の特異性）
試料分離のために、前記パラグラフＧに記載されたように、Ｆｕｇｅｎｅ  ６ＴＭトランスフェクション試薬を用い、ＨＥＫ２９３細胞を適当なプラスミド構築体でトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を収集し、遠心によって透明化した。細胞を、引き続いて、ビオチニル化１８Ｈ１０（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、ＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する２０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０中で溶解させた。
【０１８７】
サンドイッチＥＬＩＳＡを行うために、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの濃度にて、Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートウェルを５０μＬの抗−ＦＬＡＧＴＭ  Ｍ２  ＭＡｂ（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。ウェルを２００μＬのＰＢＳ  ２％ＢＳＡでブロックし、引き続いて、示された希釈にて、５０μＬの適当な試料と共にインキュベートした。ウェルを２００μＬのＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、５０μＬの適当な抗体（ビオチニル化１８Ｈ１０および１２Ｄ４については１０μｇ／ｍＬ、ポリクローナル抗−ＭＤ−２  ＭＡｂについては１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。前記した洗浄工程に続き、ウェルを５０μＬの適当な検出抗体と共にインキュベートした（ビオチニル化ＭＡｂについては１：１５００の希釈のＨＲＰコンジュゲーテッドストレプトアビジン、およびポリクローナルウサギＡｂについては１：５０００の希釈のＨＲＰコンジュゲーテット抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））。さらなる洗浄工程の後、結合をＴＭＢ基質を用いて明らかにした。プレートは６５０ｎｍの波長で読んだ。
【０１８８】
（Ｊ．細胞アッセイ１）
モノクローナル抗体をまずプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いてハイブリドーマ細胞上清から精製した。
【０１８９】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートにおいて、５×１０５細胞／ｍＬにて、１０％ＦＢＳを含有する培養基中で平板培養し、一晩接着させた。培養基を、引き続いて、除去し、２％ＦＢＳを含有する１００μＬの培養基、所望の最終濃度の２倍の適当なモノクローナル抗体で、３７℃にて３０分間置き換えた。次いで、ＬＰＳ（Ｋ１２ＬＤ２５，  Ｓｉｇｍａ）を、２％ＦＢＳを含有する１００μＬの培養基中３０ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に加えた。細胞を３７℃にて１６時間インキュベートし、上清を収穫した。モノクローナル抗体の対８０１ＥおよびＭ８０２Ｂ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用い、ＩＬ−８含有量をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１９０】
（Ｋ．細胞アッセイ２）
ヒト全血をＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）中に１：４希釈し、所望の最終濃度の２倍の適当なモノクローナル抗体を含む９６ウェルプレートにおいて１００μＬ／ウェルで３７℃にて３０分間平板培養した。所望の最終濃度の２倍の用量のＬＰＳ（Ｋ１２ＬＤ２５，  Ｓｉｇｍａ）を、引き続いて、５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含有する１００μＬのＲＰＭＩに加え、３７℃にて６時間インキュベートした。次いで、プレートを２０００ｒｐｍにおいて５分間遠心し、各ウェルからの上清を保持した。前記したように、モノクローナル抗体の対８０１ＥおよびＭ８０２Ｂ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用い、ＩＬ−８の濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１９１】
（Ｌ．１８Ｈ１０  ＶＨおよびＶＬ配列）
１０７ハイブリドーマ細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。引き続いて、製造業者のガイドラインに従って全ＲＮＡを抽出した。１８Ｈ１０ハイブリドーマの３つの独立したサブクローンからのＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、製造業者のガイドラインに従ってマウスＳｃＦｖモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって創製した。増幅した産物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）にクローン化し、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
【０１９２】
引き続いて、ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、各々、ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパ定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローン化して、７Ｅ３をキメラＭＡｂ（「キメラ７Ｅ３」）として発現させた。組換えキメラＭＡｂを産生するために、１０％ＦＢＳを含有する２ｍＬ培養基中２．５×１０５細胞／ウェルの密度にて、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに平板培養した。平板培養から１６時間後に、製造業者のガイドラインに従ってＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細胞を０．７５μｇの適当なベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、上清を収穫し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて抗体を精製した。
【０１９３】
（実施例２：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して向けられた１８Ｈ１０  ＭＡｂの創製）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞で免疫化したマウスを、特異的血清力価についてモニターした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すものを、組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質「過剰ブースター注射」した。この戦略は、非特異的ＣＨＯ細胞抗原に対する応答を最小化し、同時に、過剰ブースター注射に際してＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的応答を最大化しつつ、免疫系が最初に立体配座ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に暴露されたことを確認するために選択した。Ｂ細胞／ミエローマ融合に由来するハイブリドーマの上清ＦＡＣＳによるスクリーニングを、モックトランスフェクトされた  ｖｓ  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で行った。ここでは１８Ｈ１０といわれる１つの特定のクローンからのモノクローナル抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する特異的結合を示した（図１）。この抗体は、マウスＩｇイソタイピングＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いるＦＡＣＳによって測定して、ＩｇＧ２ｂ  κイソタイプを有することが判明した。
【０１９４】
（実施例３：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳ活性の１８Ｈ１０  ＭＡｂ中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＩＬ−８の産生を誘導する能力を有することが知られている。このＩＬ−８誘導を阻害する１８Ｈ１０の能力は、ＬＰＳ投与に先立って抗体と共に細胞を予め３０分間インキュベートすることによって分析した。図２は、１８Ｈ１０が、１μｇ／ｍＬ未満の濃度でさえＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
【０１９５】
（実施例４：ヒト全血に対するＬＰＳ活性の１８Ｈ１０  ＭＡｂ中和）
ヒト全血においてＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する１８Ｈ１０の能力をテストした。１８Ｈ１０中和活性は、０．５ないし１０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の濃度の範囲を用い、３つの異なるドナーからの血液でテストした。図３は、イソタイプがマッチした対照と比較して、全ての３つのドナーにおけるＬＰＳによって誘導されたＩＬ−８のレベルを１８Ｈ１０が有意に低下させたことを示す。１８Ｈ１０は、（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）以前に記載されたα−ＴＬＲ４ブロッキングモノクローナル抗体よりも優れていることが判明した。これらの結果は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上の１８Ｈ１０によって認識される中和エピトープもまた全血中の細胞の表面に暴露され、および１μｇ／ｍＬ未満の濃度においてさえ、１８Ｈ１０は全血中のＬＰＳの活性を阻害するのに十分優れていることを示す。
【０１９６】
（実施例５：１８Ｈ１０の特異性）
１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を測定するために、１８Ｈ１０は（以前クローン化された）ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のウサギオルソログを認識しないという事実が利用された。Ｎ−末端ＦＬＡＧＴＭエピトープタグを持つヒトまたはウサギＴＬＲ４、およびＣ−末端ｃ−ＭｙｃおよびプロテインＣエピトープタグを持つヒトまたはウサギいずれかのＭＤ−２についてのｃＤＮＡを以下の組合せにてＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクトした：（１）ヒトＴＬＲ４およびＭＤ−２；（２）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（３）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（４）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。図４は抗体染色に続いてのこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、これは、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体あるいはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２の組合せではなく、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、およびヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２の組合せを発現する細胞を１８Ｈ１０が認識したことを明らかとした。これらの結果は、１８Ｈ１０によって認識されるエピトープはヒトＭＤ−２に位置することを示す（図４）。
【０１９７】
１８Ｈ１０はＭＤ−２に対する特異性を示すが、１８Ｈ１０のみがＴＬＲ４とのその相互作用の関係でＭＤ−２を認識することが示された。直接的ＥＬＩＳＡを用い、バキュロウイルス発現系で創製された組換え可溶性ＭＤ−２への１８Ｈ１０の結合は検出されなかった（図５ａ）。加えて、図５ｂは、１８Ｈ１０のみが、共トランスフェクトされた細胞溶解物から示されるようにＴＬＲ４およびＭＤ−２の複合体に結合し、トランスフェクトされた細胞溶解物／上清中のＭＤ−２単独、またはトランスフェクトされた細胞溶解物中のＴＬＲ４単独いずれも認識しなかったことを明らかとする。これらのデータは、１８Ｈ１０がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して特異的であって、複合体のいずれかの成分を別々に認識しないことを示す。
【０１９８】
（実施例６：１８Ｈ１０  ＶＨおよびＶＬ配列）
１８Ｈ１０ハイブリドーマクローンからのＶＨおよびＶＬ配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析を図６Ａないし６Ｆに示す。
【０１９９】
１８Ｈ１０抗体は、図６Ａに示される配列番号１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号２，図６Ｂ）、および図６Ｄに示される配列番号６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号７，図６Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によって定義された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸を図６Ｂおよび６Ｅにおいて下線を施し、イタリック体で強調し、図６Ｃおよび６Ｆに示す。（Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，  ＥＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｉ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）参照）。１８Ｈ１０抗体の重鎖ＣＤＲは以下の配列：ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）およびＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）を有する。１８Ｈ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは以下の配列：ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；およびＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）を有する。
【０２００】
（実施例７：キメラ１８Ｈ１０はｈＴＬＲ４  ｈＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に結合する）
ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体についてのクローン化された１８Ｈ１０  ＶＨおよびＶＬの特異性を示すために、キメラ１８Ｈ１０  ＭＡｂを用いて、ＦＡＣＳ分析をｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で行った（図６）。ＡＰＣ−標識ヤギ−抗−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を用い、示された濃度におけるＭＡｂの特異的結合を検出した。無関係なイソタイプがマッチしたＩｇＧ１  ＭＡｂを対照として用いた。
【０２０１】
（実施例８：キメラ１８Ｈ１０はｈＴＬＲ４  ｈＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する）
ＬＰＳについてのクローン化された１８Ｈ１０  ＶＨおよびＶＬの中和能力を示すために、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＬＰＳ依存性ＩＬ−８誘導を阻害する１８Ｈ１０の能力を（前記したように）テストした。図７は、元の１８Ｈ１０マウスＭＡｂのそれと非常に同様に、キメラ１８Ｈ１０がＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
【０２０２】
（実施例９：１６Ｇ７モノクローナル抗体の創製のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントの創製）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントをＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞において創製した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞では、Ｎ−末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグをコードするヒトＴＬＲ４  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｃ−末端ｃ−ＭｙｃおよびプロテインＣエピトープタグをコードするヒトＭＤ−２  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。製造業者のガイドラインに従って、Ｆｕｇｅｎｅ  ６ＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、双方の構築体をＣＨＯ細胞に共トランスフェクトした。抗生物質耐性細胞を、（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの）５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および２５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢを含有する培養基において選択した。
【０２０３】
ＨＥＫ２９３細胞では、Ｎ−末端ＦＬＡＧＴＭエピトープタグをコードするヒトＴＬＲ４  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｃ−末端ＦＬＡＧＴＭおよび６×ヒスチジンエピトープタグをコードするヒトＭＤ−２  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。双方の構築体をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、前記したように、（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの）５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および２５０μｇ／ｍＬのヒグロマインシンＢを含有する培養基において、抗生物質耐性細胞を選択した。
【０２０４】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞につき選択するために、１％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍＬの抗−プロテインＣモノクローナル抗体（ＣＨＯ細胞用；Ｒｏｃｈｅ）または抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体（２９３細胞用；Ｓｉｇｍａ）いずれかを補足した１×ＰＢＳ中で、１×１０７細胞／ｍＬをインキュベートした。細胞を１回洗浄し、次いで、ＰＥ−コンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１：２００希釈；Ａｎｗａｒａ）を含む同一緩衝液中でインキュベートした。引き続いて、細胞を抗−ＰＥμビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートし、Ｍｉｄｉ  ＭＡＣＳ  ＬＳカラムを通した。カラムに保持された細胞を溶出させ、抗生物質選択にて培養に戻した。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞の均一に陽性の集団が得られるまで、数ラウンドのソーティングを継続した。
【０２０５】
（Ｂ．マウスの免疫化）
８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ）を実施例１、サブセクションＣに記載したように免疫化した。
【０２０６】
（Ｃ．特異的血清力価測定）
マウス血清力価測定は、実施例１、サブセクションＤにて前記したように行った。
【０２０７】
（Ｄ．Ｂ細胞／ミエローマ融合）
特異的ＴＬＲ４／ＭＤ−２血清抗体を有するマウスを、融合から３ないし４日先立って，ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３で皮下（ｓ．ｃ．）「過剰ブースター注射」した。排出リンパ節を、マウスミエローマ細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との融合のためのＢ細胞の源として得た。Ｂ細胞抽出および細胞融合は、ここに引用してその全体を援用するＢｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９２：３５２１−３５２８（１９９８）に先に記載されたように行った。細胞は１０４ミエローマ細胞／ウェルの近似的濃度で平板培養し、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を補足した培養基中で１０ないし１４日増殖させた。
【０２０８】
（Ｅ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマは、実施例１、サブセクションＦにて前記したようにスクリーニングした。
【０２０９】
（Ｆ．モノクローナル抗体の特性）
１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性は、実施例１、サブセクションＧにて前記したように測定した。
【０２１０】
（Ｇ．細胞アッセイ１）
細胞アッセイＩは、実施例１、サブセクションＪにて前記したように行った。
【０２１１】
（Ｈ．細胞アッセイ２）
細胞アッセイＩＩは、実施例１、サブセクションＫにて前記したように行った。
【０２１２】
（Ｉ．１６Ｇ７  ＶＨおよびＶＬ配列）
１０７ハイブリドーマ細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。引き続いて、製造業者のガイドラインに従って、全ＲＮＡを抽出した、１６Ｇ７クローンからのＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、製造業者のガイドラインに従って、マウスＳｃＦｖモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＲＴ−ＰＣＲによって創製した。増幅された産物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）にクローン化し、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
【０２１３】
（実施例１０：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して向けられた１６Ｇ７  ＭＡｂの創製）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞で免疫化したマウスを特異的血清力価についてモニターした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すものは、ＨＥＫ２９３  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントで「過剰ブースター注射」した。この戦略は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２−特異的応答を同時に最大化しつつ、非−特異的ＣＨＯ細胞抗原に対する応答を最小化するために選択した。Ｂ細胞／ミエローマ融合から得られたハイブリドーマからの上清のＦＡＣＳによるスクリーニングを、モックトランスフェクトされたｖｓ  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で行った。ここでは１６Ｇ７といわれる特異的クローンからのモノクローナル抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する特異的結合を示した（図９）。１６Ｇ７は、マウスＩｇＧイソタイピングＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｋｅｎｓｏｎ）を用いるＦＡＣＳによって測定して、ＩｇＧ１  κイソタイプを有することが判明した。
【０２１４】
（実施例１１：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についてのＬＰＳ活性の１６Ｇ７中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが知られている。このＩＬ−８誘導を阻害する１６Ｇ７の能力は、ＬＰＳ投与に先立って３０分間細胞を各抗体と共にプレインインキュベーティングすることによって分析した。図１０は、サブ−μグラム／ｍＬ濃度においてさえ、ＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を１６Ｇ７が阻害したことを示す。
【０２１５】
（実施例１２：ヒト全血に対するＬＰＳ活性の１６Ｇ７中和）
ヒト全血においてＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する１６Ｇ７の能力をテストした。０．５ないし５μｇ／ｍＬの範囲のモノクローナル抗体の濃度を用いて、１６Ｇ７中和活性を３つの異なるドナーからの血液でテストした。図１１は、イソタイプがマッチした対照と比較して、全ての３つのドナーにおけるＬＰＳによって誘導されたＩＬ−８のレベルを１６Ｇ７が有意に低下させたことを示す。１６Ｇ７は以前記載された（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの）α−ＴＬＲ４ブロッキングモノクローナル抗体よりも優れていることが判明した。（Ｓｈｉｍａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７７７−１７８２（１９９９）参照）。幾つかの場合において、１６Ｇ７は、やはり実験に含めたα−ＣＤ１４ブロッキングモノクローナル抗体と同程度に優れていることが判明した。（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８１８−２４８２３（１９９３）参照）。これらの結果は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についての１６Ｇ７によって認識される中和エピトープもまた全血中の細胞上の表面に暴露され、１６Ｇ７は、１μｇ／ｍＬ未満の濃度においてさえ、全血においてＬＰＳの活性を阻害するのに十分優れていることを示す。
【０２１６】
（実施例１３：１６Ｇ７の特異性）
１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を測定するために、１６Ｇ７が（以前クローン化された）ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のウサギオルソログを認識しないという事実を利用した。Ｎ−末端ＦＬＡＧＴＭエピトープタグを持つウサギまたはヒトいずれかのＴＬＲ４、およびＣ−末端ｃ−ＭｙｃおよびプロテインＣエピトープタグを持つＭＤ−２についてのｃＤＮＡを、以下の組合せにおいてＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクトした：（１）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（２）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（３）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（４）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２．図１２は抗体染色に続いてのこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、これは、１６Ｇ７が、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２の組合せではなく、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、およびヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２の組合せを発現する細胞を認識したことを明らかとした。これらの結果は、１６Ｇ７によって認識されるエピトープがヒトＴＬＲ４に位置することを示す（図１２）。
【０２１７】
（実施例１４：１６Ｇ７  ＶＨおよびＶＬ配列）
１６Ｇ７ハイブリドーマクローンからのＶＨおよびＶＬ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析は図１３Ａないし１３Ｆに示す。（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒに見出すことができるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる）１６Ｇ７  ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列と既知のマウスＶＨおよびＶＬ配列の整列により、１６Ｇ７  ＶＨ配列はＩｇＨＶ１サブファミリーに最も密接に似ており、他方、１６Ｇ７  ＶＬはＩｇＫＶ１サブファミリーに属することを明らかとする。
【０２１８】
１６Ｇ７抗体は図１３Ａに示された配列番号１１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１２，図１３Ｂ）、および図１３Ｄに示される配列番号１６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１７，図１３Ｅ）を含む。Ｃｌｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によって定義されたＣＤＲを含むアミノ酸は図１３Ｂおよび１３Ｅにて下線を施し、イタリック体で強調し、図１３Ｃおよび１３Ｆに示す。１６Ｇ７抗体の重鎖ＣＤＲは以下の配列を有する：ＤＹＷＩＥ（配列番号１３）；ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＤＦＫＤ（配列番号１４）；およびＥＥＲＡＹＹＦＧＹ（配列番号１５）。１６Ｇ７抗体の軽鎖ＣＤＲは以下の配列を有する：ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮ（配列番号１８）；ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）；およびＬＱＶＴＨＶＰＰＴ（配列番号２０）。
【０２１９】
（実施例１５：１５Ｃ１モノクローナル抗体の創製のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントの創製）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントは、実施例９、サブセクションＡにて前記したようにＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞において創製した。
【０２２０】
（Ｂ．組換えＭＤ−２およびキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２蛋白質の創製）
組換え可溶性ＭＤ−２を創製するために、検出および精製目的のＣ末端ＦＬＡＧおよび６×ＨＩＳタグを持つ上記蛋白質をコードするｃＤＮＡをｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローン化し、引き続いて、相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの創製に続き、Ｓｆ９細胞をスーパー感染させた。４８時間後、ＮｉＮＴＡアフィニティーマトリックス（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、組換え蛋白質を感染させた細胞上清から精製した。
【０２２１】
組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質を創製するために、グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に連結されたヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡをＰＣＲを用いて組み立てた。検出および精製目的で、ＦＬＡＧおよび６×ＨＩＳタグをＭＤ−２のＣ−末端に含めた。ｃＤＮＡカセットをバキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、引き続いて、相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの創製に続き、Ｓｆ９細胞をスーパー感染させた。４８時間後、抗−ＦＬＡＧＴＭ  Ｍ２  ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を用い、組換え融合蛋白質を細胞溶解物から精製した。
【０２２２】
（Ｃ．マウスの免疫化）
８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ）を、実施例１、セクションＣにて前記したように免疫化した。
【０２２３】
（Ｄ．特異的血清力価測定）
マウス血清力価測定は、実施例１、サブセクションＤにて前記したように行った。
【０２２４】
（Ｅ．Ｂ細胞／ミエローマ融合）
Ｂ細胞抽出および細胞融合は、実施例９、サブセクションＤにて前記したように行い、分析した。
【０２２５】
（Ｆ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマのスクリーニングは、実施例１、サブセクションＦにて前記したように行った。
【０２２６】
（Ｇ．モノクローナル抗体の特性）
１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性は、実施例１、サブセクションＧにて前記したように行った。
【０２２７】
（Ｈ．細胞アッセイ１）
細胞アッセイＩは、実施例１、サブセクションＪにて前記したように行った。
【０２２８】
（Ｉ．細胞アッセイ２）
細胞アッセイＩＩは、実施例１、サブセクションＫにて前記したように行った。
【０２２９】
（Ｊ．１５Ｃ１  ＶＨおよびＶＬ配列）
１０７ハイブリドーマ細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。引き続いて、製造業者のガイドラインに従って、全ＲＮＡを抽出した。１５Ｃ１クローンからのＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、製造業者のガイドラインに従って、マウスＳｃＦｖモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにてＲＴ−ＰＣＲによって創製した。増幅された産物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）にクローン化し、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
【０２３０】
引き続いて、ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、各々、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローン化して、キメラＭＡｂとして１５Ｃ１を発現させた（「キメラ１５Ｃ１」）。組換えキメラＭＡｂを産生するために、１０％ＦＢＳを含有する２ｍＬの培養基中２．５×１０５細胞／ウェルの密度にて、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに平板培養した。平板培養から１６時間後、製造業者のガイドラインに従って、ＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用い、細胞を０．７５μｇの適当なベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、上清を収穫し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて抗体を精製した。
【０２３１】
（実施例１６：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して向けられたＭＡｂの創製）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞で免疫化したマウスを、特異的血清力価についてモニターした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すものを、ＨＥＫ２９３  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントで「過剰ブースター注射」した。この戦略は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２−特異的応答を同時に最大化しつつ、非特異的ＣＨＯ細胞抗原に対する応答を最小化するために選択した。Ｂ細胞／ミエローマ融合から得られたハイブリドーマからの上清のＦＡＣＳによるスクリーニングを、モック−トランスフェクトされた  ｖｓ  ＴＬＲ４／ＭＤ−２−トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で行った。ここでは１５Ｃ１という特異的クローンからのモノクローナル抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞への特異的結合を示した（図１４）。１５Ｃ１は、マウスＩｇイソタイピングＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いるＦＡＣＳによって測定して、ＩｇＧ１  κイソタイプを有することが判明した。
【０２３２】
（実施例１７：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についてのＬＰＳ活性の中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが知られている。このＩＬ−８誘導を阻害する１５Ｃ１の能力は、ＬＰＳの投与に先立って３０分間、細胞を各抗体と共にプレインキュベートすることによって分析した。図１５は、１５Ｃ１が、サブ−マイクログラム／ｍＬ濃度においてさえ、ＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
【０２３３】
（実施例１８：ヒト全血に対するＬＰＳ活性の中和）
ヒト全血におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する１５Ｃ１の能力をテストした。０．５ないし５μｇ／ｍＬの範囲のモノクローナル抗体濃度を用い、１５Ｃ１中和活性を３つの異なるドナーからの血液においてテストした。図１６は、イソタイプがマッチした対照と比較して、全ての３つのドナーにおけるＬＰＳによって誘導されたＩＬ−８のレベルを１５Ｃ１が有意に低下させたことを示す。１５Ｃ１は、（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの）以前記載されたα−ＴＬＲ４ブロッキングモノクローナル抗体よりも優れていることが判明した。（Ｓｈｉｍａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７７７−１７８２（１９９９）参照）。幾つかの場合において１５Ｃ１は、やはり実験に含めたα−ＣＤ１４ブロッキングモノクローナル抗体と同程度に優れていることが判明した。（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８１８−２４８２３（１９９３）参照）。これらの結果は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についての１５Ｃ１によって認識された中和エピトープもまた全血中の細胞上の表面に暴露され、および１μｇ／ｍＬ未満の濃度においてさえ、１５Ｃ１が全血においてＬＰＳの活性を阻害するのに十分に優れていることを示す。
【０２３４】
（実施例１９：１５Ｃ１の特異性）
１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を測定するために、１５Ｃ１は（以前クローン化された）ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のウサギオルソログを認識しないという事実を利用した。Ｎ−末端ＦＬＡＧＴＭエピトープタグを持つウサギまたはヒトいずれかのＴＬＲ４、およびＣ−末端ｃ−ＭｙｃおよびプロテインＣエピトープタグを持つＭＤ−２についてのｃＤＮＡを、以下の組合せにてＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクトした：（１）モックベクター（２）ヒトＴＬＲ４単独（３）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（４）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（５）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（６）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。図１７は抗体染色に続いてのこれらの細胞のＦＡＣＳの抗体を示し、これは、１５Ｃ１が、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２ではなく、ＴＬＲ４単独、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、およびヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２の組合せを発現する細胞を認識したことを明らかとした。これらは、１５Ｃ１によって認識されたエピトープがヒトＴＬＲ４に位置することを示す（図１７）。
【０２３５】
（実施例２０：１５Ｃ１  ＶＨおよびＶＬ配列）
１５Ｃ１ハイブリドーマクローンからのＶＨおよびＶＬ配列をＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析は図１８Ａないし１８Ｆに示す。
【０２３６】
上記１５Ｃ１抗体は、図１８Ａに示された配列番号２１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号２２，図１８Ｂ）、および図１８Ｄに示された配列番号２６の核酸配列によってコードされた軽鎖可変領域（配列番号２７，図１８Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，  Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によって定義されたＣＤＲを含むアミノ酸は、図１８Ｂおよび１８Ｅにおいて下線を施し、イタリック体で強調し、図１８Ｃおよび１８Ｆに示す。１５Ｃ１抗体の重鎖ＣＤＲは以下の配列を有する：ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；およびＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）。１５Ｃ１抗体の軽鎖ＣＤＲは以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；およびＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）。
【０２３７】
（実施例２１：キメラ１５Ｃ１はｈＴＬＲ４  ｈＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に結合する）
ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体についてのクローン化された１５Ｃ１  ＶＨおよびＶＬの特異性を示すために、キメラ１５Ｃ１  ＭＡｂを用いるｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ分析を行った（図１９）。示された濃度におけるＭＡｂの特異的結合は、ＡＰＣ−標識ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を用いて検出した。無関係なイソタイプがマッチしたＩｇＧ１  ＭＡｂを対照として用いた。
【０２３８】
（実施例２２：キメラ１５Ｃ１はｈＴＬＲ４  ｈＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する）
ＬＰＳについてのクローン化された１５Ｃ１  ＶＨおよびＶＬの中和能力を示すために、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＬＰＳ依存性ＩＬ−８誘導を阻害する１５Ｃ１の能力を（前記したように）テストした。図２０は、キメラ１５Ｃ１が、１５Ｃ１  ＭＡｂのそれと非常に同様にＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
【０２３９】
（実施例２３：７Ｅ３モノクローナル抗体の創製についての材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントの創製）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタントは、実施例９、サブセクションＡにて前記したようにＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞において創製した。
【０２４０】
（Ｂ．組換えＭＤ−２およびキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２蛋白質の創製）
組換え可溶性ＭＤ−２は、実施例１５、サブセクションＢにて前記したように創製した。
【０２４１】
組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質を創製するために、グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に連結されたヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡをＰＣＲを用いて組み立てた。検出および精製目的で、ＦＬＡＧおよび６×ＨＩＳタグをＭＤ−２のＣ−末端に含めた。ｃＤＮＡカセットをバキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、引き続いて、相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの創製に続き、Ｓｆ９細胞をスーパー感染させた。４８時間後、抗−ＦＬＡＧＴＭ  Ｍ２  ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を用い、組換え融合蛋白質を細胞溶解物から精製した。
【０２４２】
（Ｃ．マウスの免疫化）
８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ）を実施例１、サブセクションＣにて前記したように免疫化した。
【０２４３】
（Ｄ．特異的血力価化測定）
マウス血清力価測定は実施例１、サブセクションＤにて前記したように行った。
【０２４４】
（Ｅ．Ｂ細胞／ミエローマ融合）
Ｂ細胞抽出および細胞融合を、実施例９、サブセクションＤにて前記したように行い、分析した。
【０２４５】
（Ｆ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマのスクリーニングは実施例１、サブセクションＦにて前記したように行った。
【０２４６】
（Ｇ．モノクローナル抗体の特異性）
７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性は実施例１、サブセクションＧにて前記したように測定した。
【０２４７】
（Ｈ．細胞アッセイ１）
モノクローナル抗体はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いてハイブリドーマ細胞上清からまず精製した。
【０２４８】
細胞アッセイＩは実施例１、サブセクションＪにて前記したように行った。
【０２４９】
（Ｉ．細胞アッセイ２）
細胞アッセイＩＩは実施例１、サブセクションＫにて前記したように行った。
【０２５０】
（Ｊ．７Ｅ３  ＶＨおよびＶＬ配列）
１０７ハイブリドーマ細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。引き続いて、製造業者のガイドラインに従って、全ＲＮＡを抽出した。製造業者のガイドラインに従って、７Ｅ３クローンからのＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、マウスＳｃＦｖモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＲＴ−ＰＣＲによって創製した。増幅された産物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）にクローン化し、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
【０２５１】
引き続いて、ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、各々、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローン化して、キメラＭＡｂとして７Ｅ３を発現させた（「キメラ７Ｅ３」）。組換えキメラＭＡｂを産生するために、１０％ＦＢＳを含有する２ｍＬの培養基中２．５×１０５細胞／ウェルの密度にて、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートにて平板培養した。平板培養から１６時間後、製造業者のガイドラインに従って，ＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用い、細胞を０．７５μｇの適当なベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、上清を収穫し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて抗体を精製した。
【０２５２】
（実施例２４：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して向けられたＭＡｂの創製）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞で免疫化したマウスを、特異的血清力価についてモニターした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すものを、ＨＥＫ２９３  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクタント「過剰ブースター注射：」した。この戦略は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２−特異的応答を同時に最大化しつつ、非特異的ＣＨＯ細胞抗原に対する応答を最小化するために選択された。Ｂ細胞／ミエローマ融合から得られたハイブリドーマからの上清をＦＡＣＳによるスクリーニングを、モックトランスフェクトされたｖｓ  ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で行った。７Ｅ３とここではいわれる特異的クローンからのモノクローナル抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞への特異的結合を示した（図２１）。７Ｅ３は、マウスＩｇイソタイピングＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いるＦＡＣＳによって測定されるように、ＩｇＧ１  κイソタイプを有することが判明した。
【０２５３】
（実施例２５：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についてのＬＰＳ活性の中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが知られている。このＩＬ−８誘導を阻害する７Ｅ３の能力は、ＬＰＳ投与に先立って３０分間、細胞を各抗体と共にプレインキュベートすることによって分析した。図２２は、サブ−マイクログラム／ｍＬの濃度においてさえ、７Ｅ３がＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
【０２５４】
（実施例２６：ヒト全血についてのＬＰＳ活性の中和）
ヒト全血におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する７Ｅ３の能力をテストした。７Ｅ３中和活性は、０．５ないし５μｇ／ｍＬの範囲のモノクローナル抗体濃度を用いて３つの異なるドナーからの血液でテストした。図２３は、７Ｅ３が、イソタイプがマッチした対照と比較して、全ての３つのドナーにおけるＬＰＳによって誘導されたＩＬ−８のレベルを有意に低下したことを示す。７Ｅ３は（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入された）以前記載されたα−ＴＬＲ４ブロッキングモノクローナル抗体よりも優れていることが判明した。（Ｓｈｉｍａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７７７−１７８２（１９９９）参照）。幾つかの場合において７Ｅ３は、やはり実験に含めたα−ＣＤ１４ブロッキングモノクローナル抗体と同程度優れていることが判明した。（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８１８−２４８２３（１９９３）参照）。これらの結果は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上の７Ｅ３によって認識される中和エピトープもまた全血中の細胞の表面に暴露され、および７Ｅ３が、１μｇ／ｍＬ未満の濃度においてさえ、全血におけるＬＰＳの活性を阻害するのに十分優れていることを示す。
【０２５５】
（実施例２７：７Ｅ３の特異性）
７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を示すために、７Ｅ３は（以前クローン化された）ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のウサギオルソログを認識しないという事実を利用した。Ｎ−末端ＦＬＡＧＴＭエピトープタグを持つウサギまたはヒトいずれかのＴＬＲ４、およびＣ−末端ｃ−ＭｙｃおよびプロテインＣエピトープタグを持つＭＤ−２についてのｃＤＮＡを以下の組合せにてＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクトした：（１）モックベクター（２）ヒトＴＬＲ４単独（３）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（４）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（５）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（６）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。図２４は抗体染色に続いてのこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、これは、７Ｅ３が、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２の組合せではなく、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、およびヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２の組合せを発現する細胞を認識することを明らかとした。これらの結果は、７Ｅ３によって認識されたエピトープがヒトＴＬＲ４に位置するが、ＭＤ−２の存在はＭＡｂ結合で必須でないことを示す（図２４）。
【０２５６】
（実施例２８：７Ｅ３  ＶＨおよびＶｌ配列）
７Ｅ３ハイブリドーマクローンからのＶＨおよびＶＬ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析は図２５Ａないし２５Ｆに示す。
【０２５７】
上記７Ｅ３抗体は、図２５Ａに示される配列番号３１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３２，図２５Ｂ）、および図２５Ｄに示される配列番号３６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号３７，図２５Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によって定義されるＣＤＲを含むアミノ酸は図２５Ｂおよび２５Ｅにて下線を施し、イタリック体で強調し、図２５Ｃおよび２５Ｆに示される。７Ｅ３抗体の重鎖ＣＤＲは以下の配列を有する：ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）。７Ｅ３抗体の軽鎖ＣＤＲは以下の配列を有する：ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）。
【０２５８】
（実施例２９：キメラ７Ｅ３はｈＴＬＲ４  ｈＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に結合する）
ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体についてのクローン化された７Ｅ３  ＶＨおよびＶＬの特異性を示すために、キメラ７Ｅ３  ＭＡｂを用いるｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ分析を行った（図２６）。示された濃度におけるＭＡｂの特異的結合は、ＡＰＣ−標識ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を用いて検出した。無関係なイソタイプがマッチしたＩｇＧ１  ＭＡｂを対照として用いた。
【０２５９】
（実施例３０：キメラ７Ｅ３はｈＴＬＲ４  ｈＭＤ２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生を阻害する）
ＬＰＳについてのクローン化された７Ｅ３  ＶＨおよびＶＬの中和能力を示すために、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＬＰＳ依存性ＩＬ−８誘導を阻害する７Ｅ３の能力を前記したようにテストした。図２７は、キメラ７Ｅ３がＨＥＫ２９３細胞に対するＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
【０２６０】
（実施例３１：ＴＬＲ４／ＭＤ−２融合蛋白質ｃＤＮＡの構築およびｐＦＡＳＴＢＡＣ１へのクローニング）
グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に連結されたＴＬＲ４の細胞外部分をＰＣＲを用いて組み立てた。検出および精製目的で、ＦＬＡＧおよび６×ＨＩＳタグをＭＤ−２のＣ−末端に含めた（図２８）。
【０２６１】
図２８ＡないしＣは、本発明によるこのＴＬＲ４／ＭＤ−２融合蛋白質ｃＤＮＡの構築を説明する。ヒトＴＬＲ４の細胞外部分（ｓＴＬＲ４）をコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ユニークなＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を５’非−アニーリングプライマー延長に導入した。（ＧＧＧＧＳ）３コーディング配列およびユニークなＸｈｏＩ部位をセンスプライマーの５’非−アニーリング延長に導入し、ユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位をアンチセンスプライマーの５’非−アニーリング延長に導入した（パネルＡ）。パネルＢは、増幅されたｓＴＬＲ４および（ＧＧＧＧＳ）３／ＭＤ−２  ｃＤＮＡの、ユニークなＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間のｐＦＡＳＴＢＡＣ１への順次のクローニングを示す。パネルＣは、Ｓｆ９細胞におけるｓＴＬＲ４／ＭＤ−２  ｃＤＮＡの発現に続いての提案された蛋白質産物を示す。
【０２６２】
（実施例３２：Ｓｆ９細胞溶解物および上清におけるＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の発現）
実施例１のｃＤＮＡカセットをバキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、引き続いて、相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの創製に続いて、Ｓｆ９細胞をスーパー感染させ、ＴＬＲ４／ＭＤ−２融合蛋白質の発現を、ウエスタンブロッティングによって、感染から４８時間および７２時間後に細胞溶解物において分析した（図２９）。
【０２６３】
図２９は、Ｓｆ９細胞溶解物および上清における本発明のＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の発現を示す。Ｓｆ９細胞溶解物および上清における蛋白質発現は、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いてウエスタンブロッティングによって検出した：レーン１は感染から４８時間後における清澄化溶解物を示し；レーン２は感染から７２時間後における清澄化溶解物を示し；レーン３は感染から４８時間後における清澄化された上清を示し；レーン４は感染から７２時間後における清澄化された上清を示し；およびレーン５は参照蛋白質（ＦＬＡＧタグド）を含有する。図２９における分子量マーカーのサイズはＫＤａで示す。予測されたＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の分子量はほぼ９０ＫＤａであり、可能性のある分解産物の出現はほぼ２８ＫＤａで起こる。
【０２６４】
（実施例３３：感染されたＳｆ９細胞溶解物からのＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の精製）
融合蛋白質を精製するために、Ｓｆ９細胞をスーパー感染から４８時間後に収穫し、５容量／グラム細胞の濃度のＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む２０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０に溶解させた。４℃における１５時間のインキュベーションに続く、溶解物を遠心（４０００ｒｐｍ）および濾過（０．２２μｍ）によって清澄化し、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を通過させた。２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０および２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで順次洗浄することによって、未結合蛋白質をマトリックスから除去した。結合蛋白質を１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７５）でカラムから溶出させ、０．５ｍＬの画分に収集した。５０μＬの１Ｍトリス（ｐＨ９）の添加を通じて、画分を迅速に中性ｐＨとした。蛋白質の含有量は（ペルオキシダーゼコンジュゲーテッド抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２）でのウエスタンブロッティング、クーマシーブリリアンントブルー染色によって分析した（図３０）。
【０２６５】
図３０は、感染したＳｆ９細胞溶解物における精製されたＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の存在を示す。細胞溶解物中の蛋白質は、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用い、クーマシーブリリアントブルー染色（図３０，左側パネル）またはウエスタンブロッティング（図３０，右側パネル）によって検出した。レーン１ないし５は抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーカラムからの０．５ｍＬの溶出した画分を示す。
【０２６６】
（実施例３４：キメラ可溶性ＴＬＲ４／ＭＤ−２を用いるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害）
リポ多糖（ＬＰＳ）（１５ｎｇ／ｍＬ）を種々の濃度の本発明による精製されたキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２と共にプレインキュベートし、引き続いて、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞と共にインキュベートした。図３１は、処理から２４時間後における細胞培養基でのＩＬ−８の産生を示すグラフである。
【０２６７】
図３１で分かるように、精製されたキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生に対する阻害効果を有することが示され、それにより、本発明の精製されたＴＬＲ４／ＭＤ−２蛋白質は少なくとも部分的には立体配座的に正しいことを示す。
【０２６８】
（他の実施形態）
本発明をその詳細な記載に従って記載してきたが、これまでの記載は例示的なものであって、添付の請求の範囲の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および修飾は請求の範囲の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】図１は、本発明の１つのモノクローナル抗体１８Ｈ１０のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体への結合を示すグラフである。結合の特異性は、モックトランスフェクトされた、またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いるフローサイトメトリーによって示される。モック−トランスフェクトされた細胞を用いる結果は塗りつぶしたグラフ（左側）に示され、他方、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いる結果は概略グラフ（右側）に示される。
【図２】図２は、モノクローナル抗体１８Ｈ１０によるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を１８Ｈ１０、ＨＴＡ１２５（商業的に入手可能な抗−ヒトＴＬＲ４非−ブロッキングＭＡｂ）または示された濃度における抗体対照いずれかと共にインキュベートし、引き続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ処理から１６時間後に評価した。
【図３】図３は、モノクローナル抗体１８Ｈ１０によるヒト全血におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害を示す一連のグラフである。全血は３人の健康なボランティアから吸い取り、ペパリンで処理し、ＲＰＭＩ培地中に１：４希釈した。以下の抗体を示された濃度で添加した：対照モノクローナル抗体；ＨＴＡ１２５および１８Ｈ１０。引き続いて、ＬＰＳを１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のために加え、およびＩＬ−８レベルはＬＰＳ処理から６時間後に測定した。
【図４−１】図４は、ＭＤ−２に対する１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１８Ｈ１０抗体の特異性は、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ―２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を（ＴＬＲ４発現を検出するための）α−ＦＬＡＧＴＭ抗体；（ＭＤ−２発現を検出するための）α−Ｃ−ｍｙｃ抗体または１８Ｈ１０モノクローナル抗体、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体いずれかと共にインキュベートした。
【図４−２】図４は、ＭＤ−２に対する１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１８Ｈ１０抗体の特異性は、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ―２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を（ＴＬＲ４発現を検出するための）α−ＦＬＡＧＴＭ抗体；（ＭＤ−２発現を検出するための）α−Ｃ−ｍｙｃ抗体または１８Ｈ１０モノクローナル抗体、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体いずれかと共にインキュベートした。
【図４−３】図４は、ＭＤ−２に対する１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１８Ｈ１０抗体の特異性は、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ―２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を（ＴＬＲ４発現を検出するための）α−ＦＬＡＧＴＭ抗体；（ＭＤ−２発現を検出するための）α−Ｃ−ｍｙｃ抗体または１８Ｈ１０モノクローナル抗体、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体いずれかと共にインキュベートした。
【図５−１】図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定された、バキュロウィルス−感染昆虫細胞上積みから精製された組換え可溶性ＭＤ−２に対する１８Ｈ１０の特異性の欠如を示すグラフである。蛋白質を９６−ウェルプレートに直接的に被覆し（５μｇ／ｍＬ）、続いて、示された濃度の精製されたＭＡｂ、および抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰで被覆した。
【図５−２】図５Ｂは、ＭＤ−２がそれを認識するためには１８Ｈ１０抗体につきＴＬＲ４と会合されなければならないことを示すグラフである。示されたように一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの溶解物（パネル１、すなわち、上方パネル）または上積み（パネル２、すなわち、下方パネル）を、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２で被覆されたウェル中でインキュベートした。１８Ｈ１０のビオチニル化形態の結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出した。ストレプトアビジン−ＨＲＰと共にビオチニル化１２Ｄ４（抗−ＴＬＲ４  ＭＡｂ）、または抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰと共に可溶性ＭＤ−２に対して生起したポリクローナルウサギＡｂは、各々、ＴＬＲ４およびＭＤ−２の存在を制御した。この実験において、ＴＬＲ４は、Ｎ末端においてＦＬＡＧタグを有し、ベクターｐＣＮＤＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現させた。ＭＤ−２はＣ末端にＦＬＡＧおよび６×ヒスチジンタグを有し、ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現させた。モック細胞は空のプラスミドでトランスフェクトした。
【図６−１】図６Ａないし図６Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１）（図６Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２）（図６Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号６）（図６Ｄ）、および１８Ｈ１０のためのＶＬアミノ酸配列（配列番号７）（図６Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３、４および５）（図６Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号８，９および１０）（図６Ｆ）は図６Ｂおよび６Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調する。
【図６−２】図６Ａないし図６Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１）（図６Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２）（図６Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号６）（図６Ｄ）、および１８Ｈ１０のためのＶＬアミノ酸配列（配列番号７）（図６Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３、４および５）（図６Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号８，９および１０）（図６Ｆ）は図６Ｂおよび６Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調する。
【図７】図７は、キメラＭＡｂ（「キメラ１８Ｈ１０」）として発現される１８Ｈ１０のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列が、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の表面のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合することができることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞へのＭＡｂ結合は、示された濃度のキメラ１８Ｈ１０またはイソタイプにマッチした対照ＭＡｂを用いるフローサイトメトロイーによって示される。
【図８】図８は、キメラ１８Ｈ１０ＭＡｂによるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を示された濃度の１８Ｈ１０、またはキメラ１８Ｈ１０と共にインキュベートし、引き続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ−処理から１６時間後に評価した。キメラ１８Ｈ１０によるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害は、本発明の１８Ｈ１０マウスＭＡｂによる阻害と同様であった。
【図９】図９は、本発明のモノクローナル抗体１６Ｇ７の、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体への結合を示すグラフである。結合の特異性は、モック−トランスフェクトされたまたはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いるフローサイトメトリーによって示される。モックトランスフェクトされた細胞を用いる結果は塗りつぶしたグラフ（左側）で示され、他方、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いる結果は概略グラフ（右側）に示される。
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体１６Ｇ７によるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を示した濃度における１６Ｇ７モノクローナル抗体、ＨＴＡ１２５抗−ＴＬＲ４  ＭＡｂまたは抗体対照と共にインキュベートし、引き続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ処理から１６時間後に評価した。
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体１６Ｇ７によるヒト全血におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害を示す一連のグラフである。全血が３人の健康なボランティアから吸い取り、ヘパリンで処理し、ＲＰＭＩ培地中に１：４希釈した。以下の抗体を示した濃度で添加した：イソタイプにマッチした対照；ＨＴＡ１２５（抗−ヒトＴＬＲ４非−ブロッキングモノクローナル抗体）；１６Ｇ７および２８Ｃ５（抗−ヒトＣＤ１４ブロッキングモノクローナル抗体）。引き続いて、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のためにＬＰＳを加えた。
【図１２−１】図１２は、ＴＬＲ４に対する１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１６Ｇ７抗体の特異性は、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を（ＴＬＲ４発現を検出するための）α−ＦＬＡＧＴＭ抗体；（ＭＤ−２発現を検出するための）α−Ｃ−ｍｙｃ抗体、または１６Ｇ７モノクローナル抗体いずれかと共に、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図１２−２】図１２は、ＴＬＲ４に対する１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１６Ｇ７抗体の特異性は、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を（ＴＬＲ４発現を検出するための）α−ＦＬＡＧＴＭ抗体；（ＭＤ−２発現を検出するための）α−Ｃ−ｍｙｃ抗体、または１６Ｇ７モノクローナル抗体いずれかと共に、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図１２−３】図１２は、ＴＬＲ４に対する１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１６Ｇ７抗体の特異性は、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を（ＴＬＲ４発現を検出するための）α−ＦＬＡＧＴＭ抗体；（ＭＤ−２発現を検出するための）α−Ｃ−ｍｙｃ抗体、または１６Ｇ７モノクローナル抗体いずれかと共に、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図１３−１】図１３Ａないし図１３Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１１）（図１３Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号１２）（図１３Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号１６）（図１３Ｄ）、および１６Ｇ７についてのＶＬアミノ酸配列（配列番号１７）（図１３Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号１３、１４および１５）（図１３Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号１８，１９および２０）（図１３Ｆ）は図１３Ｂおよび図１３Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調される。
【図１３−２】図１３Ａないし図１３Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１１）（図１３Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号１２）（図１３Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号１６）（図１３Ｄ）、および１６Ｇ７についてのＶＬアミノ酸配列（配列番号１７）（図１３Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号１３、１４および１５）（図１３Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号１８，１９および２０）（図１３Ｆ）は図１３Ｂおよび図１３Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調される。
【図１４】図１４は、本発明のモノクローナル抗体１５Ｃ１の、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体への結合を示すグラフである。結合の特異性は、モックトランスフェクトされた、またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いるフローサイトメトリーによって示される。モック−トランスフェクトされた細胞を用いる結果は塗りつぶしたグラフ（左側）に示され、他方、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いる結果は概略グラフ（右側）に示される。
【図１５】図１５は、モノクローナル抗体１５Ｃ１によるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を示された濃度における１５Ｃ１モノクローナル抗体、ＨＴＡ１２５（抗−ヒトＴＬＲ４非−ブロッキングモノクローナル抗体）およびイソタイプがマッチした対照（ＩｇＧ１）と共にインキュベートし、引き続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ処理１６時間後に評価した。
【図１６】図１６は、モノクローナル抗体１５Ｃ１によるヒト全血におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害を示す一連のグラフである。全血は３人の健康なボランティアから吸い取り、ヘパリンで処理し、ＲＰＭＩ培地に１：４希釈した。以下の抗体を示された濃度で加えた：イソタイプがマッチした対照（ＩｇＧ１）；ＨＴＡ１２５（抗−ヒトＴＬＲ４非−ブロッキングモノクローナル抗体）；１５Ｃ１および２８Ｃ５（抗−ヒトＣＤ１４部ロッキングモノクローナル抗体）。引き続いて、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のためにＬＰＳを加えた。
【図１７−１】図１７は、ＴＬＲ４に対する１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１５Ｃ１抗体の特異性は、モックベクター、すなわち、カラムベクター（パネルＡ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を１５Ｃ１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図１７−２】図１７は、ＴＬＲ４に対する１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。１５Ｃ１抗体の特異性は、モックベクター、すなわち、カラムベクター（パネルＡ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を１５Ｃ１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図１８−１】図１８Ａないし１８Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号２１）（図１８Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２２）（図１８Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号２６）（図１８Ｄ）、および１５Ｃ１についてのＶＬアミノ酸配列（配列番号２７）（図１８Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号２３、２４および２５）（図１８Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号２８、２９および３０）（図１８Ｆ）は図１８Ｂおよび１８Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調する。
【図１８−２】図１８Ａないし１８Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号２１）（図１８Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２２）（図１８Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号２６）（図１８Ｄ）、および１５Ｃ１についてのＶＬアミノ酸配列（配列番号２７）（図１８Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号２３、２４および２５）（図１８Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号２８、２９および３０）（図１８Ｆ）は図１８Ｂおよび１８Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調する。
【図１９】図１９は、キメラＭＡｂ（「キメラ１５Ｃ１」）として発現された１５Ｃ１のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列が、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の表面のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合することができることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体へのＭＡｂ結合は、示された濃度におけるキメラ１５Ｃ１またはイソタイプがマッチした対照モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって示される。
【図２０】図２０は、キメラ１５Ｃ１  ＭＡｂによるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を示された濃度における１５Ｃ１またはキメラ１５Ｃ１と共にインキュベートし、続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ処理から１６時間後に評価した。キメラ１５Ｃ１によるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害は、本発明の１５Ｃ１マウスＭＡｂによる阻害と同様であった。
【図２１】図２１は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体への、本発明のモノクローナル抗体７Ｅ３の結合を示すグラフである。結合の特異性は、モックトランスフェクトされた、またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いるフローサイトメトリーによって示される。モック−トランスフェクトされた細胞を用いる結果は塗りつぶしたグラフ（左側）に示され、他方、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされた細胞を用いる結果は概略グラフ（右側）に示される。
【図２２】図２２は、モノクローナル抗体７Ｅ３によるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を示された濃度における７Ｅ３モノクローナル抗体、ＨＴＡ１２５（抗−ヒトＴＬＲ４非−ブロッキングモノクローナル抗体）およびイソタイプがマッチした対照（ＩｇＧ１）と共にインキュベートし、引き続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ処理から１６時間後に評価した。
【図２３】図２３は、モノクローナル抗体７Ｅ３によるヒト全血におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−８産生の阻害を示す一連のグラフである。全血は３人の健康なボランティアから吸い取り、ヘパリンで処理し、ＲＰＭＩ培地中に１：４希釈した。以下の抗体を示された濃度で加えた：イソタイプがマッチした対照（ＩｇＧ１）；ＨＴＡ１２５（抗−ヒトＴＬＲ４非−ブロッキングモノクローナル抗体）；７Ｅ３および２８Ｃ５（抗−ヒトＣＤ１４ブロッキングモノクローナル抗体）。１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のために、引き続いて、ＬＰＳを加えた。
【図２４−１】図２４は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。７Ｅ３の抗体の特異性は、モックベクター（パネルＡＳ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を７Ｅ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図２４−２】図２４は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。７Ｅ３の抗体の特異性は、モックベクター（パネルＡＳ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）いずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞を７Ｅ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）、続いて、ＡＰＣ−カップルドα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートした。
【図２５−１】図２５Ａないし２５Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号３１）（図２５Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号３２）（図２５Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号３６）（図２５Ｄ）、および７Ｅ３についてのＶＬアミノ酸配列（配列番号３７（図２５Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ（配列番号３３、３４および３５）（図２５Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号３８、３９および４０）（図２５Ｆ）は図２５Ｂおよび２５Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調される。
【図２５−２】図２５Ａないし２５Ｆは、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号３１）（図２５Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号３２）（図２５Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号３６）（図２５Ｄ）、および７Ｅ３についてのＶＬアミノ酸配列（配列番号３７（図２５Ｅ）を示す一連の説明図である。ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ（配列番号３３、３４および３５）（図２５Ｃ）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号３８、３９および４０）（図２５Ｆ）は図２５Ｂおよび２５Ｅにおいて下線を施したイタリック体で強調される。
【図２６】図２６は、キメラＭＡｂ（「キメラ７Ｅ３」）として発現された７Ｅ３のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列が、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の表面のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合できることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に結合するモノクローナル抗体は、示された濃度におけるキメラ７Ｅ３またはイソタイプがマッチした対照ＭＡｂを用いるフローサイトメトリーによって示される。
【図２７】図２７は、キメラ７Ｅ３  ＭＡｂによるＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。細胞を示された濃度におけるキメラ７Ｅ３またはイソタイプがマッチしたＭＡｂ対照と共にインキュベートし、続いて、ＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＩＬ−８レベルはＬＰＳ−処理から１６時間後に評価した。
【図２８】図２８は、本発明によるＴＬＲ４／ＭＤ−２融合蛋白質ｃＤＮＡの構築を示す説明図である。
【図２９】図２９は、Ｓｆ９細胞溶解物および上清における本発明のＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の発現を示す説明図である。
【図３０】図３０は、感染されたＳｆ９細胞溶解物からの本発明によるＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラ蛋白質の精製を示す説明図である。
【図３１】図３１は、本発明による可溶性キメラＴＬＲ４／ＭＤ−２蛋白質を用いるリポ多糖−（ＬＰＳ）誘導ＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。
【図３２】図３２Ａは、アクセサリー蛋白質ＭＤ−１をコードする核酸配列を示す（配列番号４１）。図３２Ｂは、本発明の好ましい実施形態における成熟ＭＤ−１アクセサリー蛋白質のアミノ酸配列を示す（配列番号４２）。
【図３３】図３３Ａは、アクセサリー蛋白質ＭＤ−２をコードする核酸配列を示す（配列番号４３）。図３３Ｂは、成熟ＭＤ−２アクセサリー蛋白質のアミノ酸配列を示す（配列番号４４）。
【図１】
2007517503.tif 000003
【図２】
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【図３】
2007517503.tif 000005
【図４−１】
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【図４−２】
2007517503.tif 000007
【図４−３】
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【図５−１】
2007517503.tif 000009
【図５−２】
2007517503.tif 000010
【図６−１】
2007517503.tif 000011
【図６−２】
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【図７】
2007517503.tif 000013
【図８】
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【図９】
2007517503.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
2007517503.tif 000017
【図１２−１】
2007517503.tif 000018
【図１２−２】
2007517503.tif 000019
【図１２−３】
2007517503.tif 000020
【図１３−１】
2007517503.tif 000021
【図１３−２】
2007517503.tif 000022
【図１４】
2007517503.tif 000023
【図１５】
2007517503.tif 000024
【図１６】
2007517503.tif 000025
【図１７−１】
2007517503.tif 000026
【図１７−２】
2007517503.tif 000027
【図１８−１】
2007517503.tif 000028
【図１８−２】
2007517503.tif 000029
【図１９】
2007517503.tif 000030
【図２０】
2007517503.tif 000031
【図２１】
2007517503.tif 000032
【図２２】
2007517503.tif 000033
【図２３】
2007517503.tif 000034
【図２４−１】
2007517503.tif 000035
【図２４−２】
2007517503.tif 000036
【図２５−１】
2007517503.tif 000037
【図２５−２】
2007517503.tif 000038
【図２６】
2007517503.tif 000039
【図２７】
2007517503.tif 000040
【図２８Ａ】
2007517503.tif 000041
【図２８Ｂ】
2007517503.tif 000042
【図２８Ｃ】
2007517503.tif 000043
【図２９】
2007517503.tif 000044
【図３０】
2007517503.tif 000045
【図３１】
2007517503.tif 000046
【図３２】
2007517503.tif 000047
【図３３】
2007517503.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月29日(2006.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007517503000001.app
【国際調査報告】
2007517503.tif 000049
2007517503.tif 000050
2007517503.tif 000051
2007517503.tif 000052