(57)【要約】  本発明は、不活性化前は２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）から２，５−ジケトグルコン酸（２，５−ＤＫＧ）への変換を触媒していた、内在性膜結合２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）を不活性化することにより、２−ＫＤＧを蓄積するための細菌宿主細胞を改変する方法に関する。【選択図】図２
2007500507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌宿主細胞において２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）の蓄積を増加させる方法であって、
ａ）炭素源の存在下、２−ＫＤＧを酵素的変換することにより２，５−ジケトグルコン酸（２，５−ＤＫＧ）を生成できる細菌宿主細胞において、２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）活性に必要な少なくとも１の内在性遺伝子を不活性化させて、改変細菌細胞を得る工程；及び
ｂ）前記改変細菌細胞を適当な培養条件下で培養して、２−ＫＤＧを生成する工程、
を含む方法。
【請求項２】
さらに２−ＫＤＧを回収する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに２−ＫＤＧをエリスロビン酸に変換する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細菌宿主細胞がエルウィニア、エンテロバクター、コリネバクテリア、アセトバクター、シュードモナス、クレブシエラ、グルコノバクター、パンテア、バチルス及びエシェリキア細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌宿主細胞がパンテア細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１の内在性遺伝子がデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をエンコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号４の配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２−ＫＤＧＤＨが３つのサブユニットから構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１のサブユニットが配列番号２に少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有し、第２のサブユニットが配列番号４に少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有し、及び第３のサブユニットが配列番号６に少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により得られる改変細菌細胞。
【請求項１１】
細菌宿主細胞において２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）を蓄積させる方法であって、
ａ）グルコースの存在下、２−ＫＤＧを酵素的変換することにより２，５−ジケトグルコン酸（２，５−ＤＫＧ）を生成できる細菌宿主細胞において、２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素をエンコードするオペロンを不活性化させて、改変細菌細胞を得る工程であって、当該オペロンがデヒドロゲナーゼ遺伝子及びシトクロムｃ遺伝子を含み；
ｂ）前記改変細菌細胞を適当な培養条件下で培養して、２−ＫＤＧを生成する工程；及び
ｃ）前記改変細菌細胞中に２−ＫＤＧを蓄積させる工程、
を含む方法。
【請求項１２】
さらに蓄積した２−ＫＤＧを回収する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１の方法に従って得られる改変細菌細胞。
【請求項１４】
改変細菌細胞がエルウィニア細胞、クレブシエラ細胞、パンテア細胞、またはエシェリキア細胞である、請求項１３の改変細菌細胞。
【請求項１５】
デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
シトクロムｃ遺伝子が配列番号６に少なくとも９５％配列同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
非機能的２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素を含むように遺伝子組換えされた、炭素源から２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成できる、改変細菌細胞。
【請求項１８】
２−ＫＤＧＤＨ酵素が３つのサブユニットから構成され、デヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも１のサブユニットが不活性化された、請求項１７の改変細菌細胞。
【請求項１９】
細菌細胞がエルウィニア、エンテロバクター、コリネバクテリア、アセトバクター、シュードモナス、クレブシエラ、グルコノバクター、パンテア、バチルス及びエシェリキア細胞からなる群より選択される、請求項１７の改変細菌細胞。
【請求項２０】
細菌細胞がパンテア細胞である、請求項１９の改変細菌細胞。
【請求項２１】
細菌培養において２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）の利用可能性を増加させる方法であって、
ａ）グルコースの存在下、２−ＫＤＧの酵素的変換から２，５−ジケトグルコン酸（２，５−ＤＫＧ）を生成できる細菌宿主細胞において、２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素をエンコードするオペロンを不活性化させて、改変細菌細胞を得る工程であって、当該オペロンがデヒドロゲナーゼ遺伝子及びシトクロムｃ遺伝子を含み；及び
ｂ）前記改変細菌細胞を適当な培養条件下で培養して、２−ＫＤＧを生成する工程、
を含む方法。
【請求項２２】
前記２−ＫＤＧを細菌細胞培地から回収する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
２−ＫＤＧがエリスロビン酸に変換される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）活性を有する酵素をエンコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記酵素が３つのサブユニットから構成され、第１のサブユニット、サブユニットＡは配列番号２に少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有し；第２のサブユニット、サブユニットＢは配列番号４のアミノ酸配列を有し；及び第３のサブユニット、サブユニットＣが配列番号６に少なくとも９５％配列同一性を有する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
サブユニットＡが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２４の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
サブユニットＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項２４の単離ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の背景
本発明は２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）を蓄積するために、内在性膜結合２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）を不活性化させることにより細菌宿主細胞を改変する方法に関し、不活性化前は当該内在性膜結合２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼは２−ＫＤＧから２，５−ジケトグルコン酸（２，５−ＤＫＧ）への変換を触媒する。本発明は特に、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）菌株において２−ＫＤＧの生合成による蓄積を高めることに関し、そのようにして生成した２−ＫＤＧの使用に関する。
【０００２】
Ｌ−アスコルビン酸中間体などの商業的に関心が高い多数の生成物は遺伝子組換え宿主細胞において生物触媒的に生成されてきた。多くの場合、生物変換による望ましい最終生成物はＬ−アスコルビン酸（ＡＳＡ、ビタミンＣ）であるが、ＡＳＡ中間体の独立した用途も存在し、これらのＡＳＡ中間体は生物変換による望ましい生成物となり得る。
【０００３】
グルコースをＡＳＡ中間体へ変換するなどの一般的な代謝産物を生物触媒的に変換する１の方法を図１に示す。酸化工程によりグルコースは２−ＫＤＧ及び２，５−ＤＫＧに変換される（米国特許第３，７９０，４４４号）。また、ＡＳＡ中間体、２−ケト−Ｌ−グルコン酸（２−ＫＬＧ）を生成するための生物変換方法に関して、Ｌａｚａｒｕｓ、他（１９８９、“Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ：Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ビタミンＣ：組換えＤＮＡ手段による生物変換）”、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（米国微生物学会），ワシントンＤ．Ｃ．、Ｃ．Ｌ．Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ編集）に開示されている。炭素源から２−ＫＬＧへのこの生物変換は多数の中間体と関わり、当該酵素的工程は共同因子である依存性２，５−ＤＫＧレダクターゼ活性（ＤＫＧＲ）に関連する。さらに、組換えＤＮＡ技術は、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）中、単一の発酵工程でグルコースを２−ＫＬＧに生物転換するために用いられてきた（Ａｓｄｅｒｓｏｎ，Ｓ、他、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１４４−１４９）。
【０００４】
この出願において、本発明者は細菌株中におけるＡＳＡ中間体、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）の蓄積の増加について取組む。好ましくは、内在性膜結合２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素の活性により２−ＫＤＧから２，５−ＤＫＧに変換できる細菌性宿主細胞は２−ＫＤＧＤＨ酵素が不活性化されるように改変される。
【０００５】
２−ＫＤＧは、本発明に包含される改変細菌細胞中に蓄積し、種々の工業的及び商業的用途において用いることができる。例えば、２−ＫＤＧはリン酸塩の可溶化に用いることができ、または米国特許第３，９８１，８６０号に開示されているような除草化合物の合成において中間体として用いることができる。さらに、２−ＫＤＧはさらにエリソルビン酸など、望ましい最終生成物に変換できる。エリソルビン酸はＡＳＡの立体異性体であり、Ｄ−アラボアスコルビン酸としても知られる。この化合物はＲｅｉｃｈｓｔｅｉｎ及びＧｒｕｓｓｎｅｒ（１９３４）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １７：３１１−３２８の方法に従って、化学的に合成できる。エリソルビン酸は公知の食品添加物、保存料、及び酸化防止剤であり、工業的及び特殊な化学用途において用いられる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、グルコースやその他の一般的な微生物代謝産物などの炭素源の存在下、改変宿主細胞を培養することにより、細菌宿主細胞中に２−ＫＤＧを蓄積する方法に関する。より具体的には、膜結合２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素をエンコードする内在性遺伝子を不活性化することにより、２−ＫＤＧは中間体２，５−ＤＫＧに変換されず、改変宿主細胞中に２−ＫＤＧが蓄積する。それから２−ＫＤＧは改変宿主細胞から単離でき、種々の商業的用途に使用でき、さらにエリソルビン酸などのその他の望ましい化合物を生成するために使用できる。
【０００７】
第１の側面において、本発明は細菌宿主細胞において、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）を蓄積する方法に関し、ａ）２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）活性に必要な細菌細胞における１以上の内在性遺伝子を不活性化することにより改変細菌細胞を得る工程であって、当該細菌宿主細胞はグルコースなどの炭素源の存在下、２，５−ＤＫＧを生成でき；ｂ）２−ＫＤＧを生成するために適した培養条件下で改変細菌細胞を培養する工程；及びｃ）２−ＫＤＧを蓄積させる工程、を含む。第１の実施態様において、さらに当該方法は２−ＫＤＧを回収する工程を含む。第２の実施態様において、当該方法はさらに、２−ＫＤＧを第２の生成物、特にエリソルビン酸に変換させる工程を含む。第３の実施態様において、細菌宿主細胞は、エルウィニア、エンテロバクター、コリネバクテリア、アセトバクター、シュードモナス、クレブシエラ、グルコノバクター、パンテア、バチルス及びエシェリキアからなる群より選択される。特に好ましい実施態様において、細菌宿主細胞はパンテア細胞であり、より特定するとパンテア・ｃｉｔｒｅａである。第４の実施態様において、１の遺伝子が不活性化される。第５の実施態様において、２つの遺伝子が不活性化される。第６の実施態様において、内在性２−ＫＤＧＤＨは３つのサブユニットから構成される。第７の実施態様において、当該サブユニットは配列番号２、配列番号４、配列番号６に示すアミノ酸配列及びそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。第８の実施態様において、サブユニットＢに指定される、配列番号４により表されるサブユニットが不活性化される。第９の実施態様において、１以上の遺伝子は１以上の遺伝子の欠失により不活性化される。
【０００８】
第２の側面において、本発明は本発明の方法に従って得られる改変細菌細胞に関する。１の実施態様において、改変細菌細胞はパンテア細胞である。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は細菌宿主細胞中に２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）を蓄積する方法に関し、ａ）細菌宿主細胞において内在性２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素をエンコードするオペロンを不活性化することにより改変細菌細胞を得る工程であって、当該細菌宿主細胞はグルコースの存在下で２，５−ＤＫＧを生成でき；及び当該オペロンはデヒドロゲナーゼ遺伝子及びシトクロムｃ遺伝子を含む工程；ｂ）２−ＫＤＧを生成するために適した培養条件下で改変細菌細胞を培養する工程、及びｃ）２−ＫＤＧを蓄積させる工程を含む。１の実施態様において、当該方法はさらに、２−ＫＤＧを回収する工程を含む。第２の実施態様において、当該方法はさらに２−ＫＤＧを第２の生成物、特にエリソルビン酸に変換させる工程を含む。
【００１０】
他の側面において、本発明は、遺伝子組換えにより不活性化されたオペロンを含む遺伝子組換えパンテア細胞に関し、前記オペロンは不活性化前は、内在性２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）酵素をエンコードする。１の実施態様において、パンテア細胞はパンテアｃｉｔｒｅａ細胞である。第２の実施態様において、内在性２−ＫＤＧＤＨ酵素は３つの遺伝子によりエンコードされ、ここで１の遺伝子は配列番号２のアミノ酸配列をエンコードし、またはその配列に少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列をエンコードする。第３の実施態様において、不活性化は２−ＫＤＧＤＨをエンコードする１以上の遺伝子の完全なまたは部分的な欠失による。第４の実施態様において、さらに改変パンテア細胞は不活性化グルコン酸輸送タンパク、非機能的グルコキナーゼ遺伝子、非機能的グルコノキナーゼ遺伝子、過剰発現グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、過剰発現グルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはこれらの組み合わせを含む。
【００１１】
さらなる側面において、本発明は単離ポリヌクレオチドに関し、当該ポリヌクレオチドは２−ＫＤＧＤＨ活性を有する酵素をエンコードする。１の実施態様において、単離ポリヌクレオチドはサブユニットＡ、サブユニットＢ、及びサブユニットＣに指定される３つのサブユニットから構成される酵素をエンコードし、ここでサブユニットＡは配列番号２に示すアミノ酸配列またはその配列に少なくとも９６％同一性を有する配列を含み；サブユニットＢは配列番号４に示すアミノ酸配列を含み、サブユニットＣは配列番号６に示すアミノ酸配列またはその配列に少なくとも９４％同一性を有する配列を含む。第２の実施態様において、本発明は配列番号２のアミノ酸またはその配列に少なくとも９６％同一性を有するアミノ酸をエンコードする単離ポリヌクレオチドに関する。第３の実施態様において、本発明は配列番号４のアミノ酸配列をエンコードする単離ポリヌクレオチドに関する。第４の実施態様において、本発明は配列番号６のアミノ酸またはその配列に少なくとも９４％同一性を有するアミノ酸をエンコードする単離ポリヌクレオチドに関する。１の好ましい実施態様において、単離ポリヌクレオチドは配列番号１の核酸配列を有する。他の好ましい実施態様において、当該ポリヌクレオチドは配列番号３の核酸配列を有する。さらなる好ましい実施態様において、単離ポリヌクレオチドは配列番号５の核酸配列を有する。
【００１２】
さらなる側面において、本発明はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、配列番号３、または配列番号５の少なくとも２０の連続配列をプローブとして用い、相同配列を発見する方法に関し、ここで当該相同配列は２−ＫＤＧＤＨ活性を有するタンパク質をエンコードする。１の実施態様において、当該相同配列は配列番号２の配列に少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有するタンパク質をエンコードする。他の実施態様において、相同配列は配列番号６の配列に少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有するタンパク質をエンコードする。さらなる実施態様において、配列番号３に対する相同配列はデヒドロゲナーゼタンパク質をエンコードする。他の実施態様において、配列番号５に対する相同配列はシトクロムＣタンパク質をエンコードする。
【００１３】
３．好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の実施は、別段に示さない限り、当業者の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来技術を用いる。当該技術は文献中において十分に説明されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（研究所マニュアル），第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新手順）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、１９８７及び年次改訂版）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（オリゴヌクレオチド合成）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編集、１９８４）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応），（Ｍｕｌｌｉｓ、他、編集、１９９４）；Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（工業微生物学及びバイオテクノロジーのマニュアル）、第二版（Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、他、編集、１９９９）；Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（一般細菌学に関する方法のマニュアル）（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｅｉｇ及びＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、編集）、第２１０−２１３頁、米国微生物学会、ワシントン、ＤＣ、及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー）：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（工業微生物学教本）（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓがある。
【００１４】
Ａ．定義
別段に定義しない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は本発明が属する当業界において通常の知識を有する者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学及び分子生物学の辞典）、第二版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９４）及びＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ハーパー生物学辞典），Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ニューヨーク（１９９１）は当業者にとって本発明で用いる多くの用語の一般的な辞書となるものである。
【００１５】
ここで用いる、“２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）”及び“２−ＫＤＧＤＨ活性を有する酵素”は膜結合タンパク質をいい、細菌細胞中のグルコースまたはグルコン酸を発端とする酸化経路中で２−ＫＤＧから２，５−ＤＫＧへの変換を触媒できるタンパク質である。２−ＫＤＧＤＨの用語は機能定義を有し、膜結合性であり、２−ＫＤＧから２，５−ＤＫＧへの変換を触媒する任意の酵素をいう。
【００１６】
“デヒドロゲナーゼタンパク質”または“デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質”とは１の基質から水素除去する酸化還元反応及び他の分子へのその輸送、通常は補酵素への輸送を触媒する酵素を意味し、例えば、ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、及びフラビン・アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。
【００１７】
“シトクロムＣタンパク質”とは１または数個のヘムｃ基を有し、システイン残基のスルフィドリル基を含む１以上、通常は２個のチオエーテル結合によりヘムｃ基が当該タンパク質に結合した電子伝達タンパク質をいう。第５ヘム鉄配位子は常にヒスチジンアミノ酸残基により提供される（Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ、他、（１９８７）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｃ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ（シトクロムｃ、生物学的側面），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ベルリン；Ｍｏｏｒｅ、他（１９９０）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｃ：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ（シトクロムｃ、進化的、構造的及び生理化学的側面）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン；及びＡｍｂｌｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０５８：４２−４７）。
【００１８】
ここで用いる“炭素源”の用語は微生物により通常使用される適当な炭素基質を包含し、六炭糖など、例えば限定されないが、グルコース（Ｇ）、グロース、乳糖、ソルボース、フラクトース、イドース、ガラクトース及びマンノースのＤまたはＬ型の全てであり、または六炭糖の組み合わせ、例えばグルコースとフラクトース、及び／または六炭糖酸など、例えば限定されないが、２−ケト−Ｌ−グルコン酸、イドン酸（ＩＡ）、グルコン酸（ＧＡ）、６−ホスホグルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２ＫＤＧ）、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、２−ケトグルコン酸ホスフェート、２，５−ジケト−Ｌ−グルコン酸、２，３−Ｌ−ジケトグルコン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリスロビン酸（ＥＡ）、及びＤ−マンノン酸などである。
【００１９】
オペロン、遺伝子またはタンパク質に関して言及する際の“非機能的”、“不活性”及び“不活性化”の用語は、オペロン、遺伝子またはタンパク質の公知の通常機能または活性が除去、崩壊、または高度に低減されたことを意味する。オペロン、遺伝子またはタンパク質を非機能的にする不活性化は核酸配列中における欠失、変異、置換、阻害、または挿入などの方法を含む。
【００２０】
ここで使用するオペロンまたは遺伝子の“欠失”は１以上の遺伝子の全体的なコード配列の欠失、１以上の遺伝子のコード配列の部分的な欠失、調節領域の欠失、翻訳シグナルの欠失、または１以上の遺伝子のフランキング領域を含むコード配列の欠失をいう。
【００２１】
ここで用いる“遺伝子”の用語は、ポリペプチドの生成に関係するＤＮＡ断片を意味し、コード領域に先行する領域及び後に続く領域及び個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００２２】
“ポリヌクレオチド”及び“核酸”の用語はここで交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドの多量体型である、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかをいう。これらの用語は、一本、二本または三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン及びピリミジン基を含むポリマー、またはその他の天然、化学的、生化学的に修飾された非天然、または誘導体化ヌクレオチド基を含む。以下は非限定的なポリヌクレオチドの例である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド、ウラシル、その他の糖、及びフルオロリボース（ｆｌｕｏｒｏｒｉｂｏｓｅ）及びチオアートなどの架橋基及びヌクレオチド分岐を含んでもよい。ヌクレオチド配列は非ヌクレオチド成分により阻害されていてもよい。
【００２３】
ここで用いる“オペロン”の語は一般的なプロモーターからの１の転写単位として転写される２以上の遺伝子を意味する。いくつかの好ましい実施態様において、オペロンを含む遺伝子は連続遺伝子である。
【００２４】
ここで用いる“プロモーター”の語は下流遺伝子の転写を導くように機能する核酸配列をいう。
【００２５】
“転写制御下”または“転写制御する”とは、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始または促進に寄与する因子に動作可能に連結することに依存していることを示す用語であるということが当業界において理解される。
【００２６】
“動作可能に連結”とは当該因子が機能できるような配置で並んでいることをいう。“翻訳制御下”とは、ｍＲＮＡが形成された後に起こる調節工程を示す用語であることが当業界において理解される。
【００２７】
“過剰発現”の語は宿主細胞における同じ遺伝子産物のコピー数の増大を意味する。
【００２８】
タンパク質及びそれをエンコードする遺伝子について説明する際に、ここで用いる遺伝子に関する用語は大文字で始めず、すなわちｇｌｋＡとする。タンパク質に関する用語は最初の文字を大文字とし、すなわちＧｌｋＡとする。
【００２９】
“タンパク質”及び“ポリペプチド”の語はここで交換可能に用いられる。
【００３０】
ここで用いる“アスコルビン酸（ＡＳＡ）中間体”はグルコン酸（ＧＡ）；２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）；２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）；２−ケト−Ｌ−グルコン酸（２−ＫＬＧ）；及びＬ−イドン酸（ＩＡ）を意味する。これらのいくつかの化合物の化学式を図１に示す。
【００３１】
ここで用いる宿主細胞の“酸化経路”は、宿主細胞がＤ−グルコースなどの炭素源及び／またはその代謝産物を酸化する少なくとも１の酵素を含むことを意味する。宿主細胞における酸化経路は１個、２個、３個、またはそれ以上の酵素を含むことができる。酸化経路の例としては、グルコースデヒドロゲナーゼの活性によりグルコースからグルコン酸を形成することを含む。酸化経路の他の例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性によりグルコースから２−ＫＤＧを形成することである。酸化経路の他の例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ及び２−ＫＤＧＤＨの活性によりグルコースから２，５−ＤＫＧを形成することである。
【００３２】
ここで用いる宿主細胞の“異化経路”とは、宿主細胞が少なくとも１の代謝中間体を生成する少なくとも１の酵素を含むことを意味する。非常に多くの場合、代謝中間体の形成は例えばＤ−グルコースなどの炭素源及び／またはその代謝産物をリン酸化することにより、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、またはＮＡＤＨの生成に連結する。宿主細胞における細胞内異化経路とは宿主細胞が宿主細胞細胞質ゾル中に少なくとも１の酵素の活性を含むことを意味する。いくつかの実施態様において、異化経路は２個、３個またはそれ以上の酵素の活性を含む。異化経路は限定されないが、解糖、ペントース経路及びＴＣＡ回路経路を含む。
【００３３】
ここで用いる“細胞”の語は原核生物である任意のグループの微生物、すなわち膜結合核及び細胞小器官を有しない微生物をいう。全ての細胞は、細胞の内外の物質の流れを調節する脂質膜により囲まれている。剛体細胞壁は完全に細菌を囲み、膜外側に位置している。多種多様な細菌が存在し、そのいくつかとしては、限定されないが、バチルス、ストレプトマイセス、シュードモナス、及び腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する株が挙げられる。
【００３４】
ここで用いる“腸内細菌”ファミリーはグラム陰性であり、条件的嫌気性である一般的特性を有する細菌株をいう。ＡＳＡ中間体生成のために、好ましい腸内細菌株はＤ−グルコースまたは当該株によりＤ−グルコースに変換できる炭素源から２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を作ることができる株である。（Ｋａｇｅｙａｍａ、他、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４２：２０３（１９９２））。腸内細菌ファミリーに含まれるものは、エルウィニア、エンテロバクター、グルコノバクター、クレブシエラ、エシェリキア及びパンテアである。本発明において、２−ＫＤＧ生成のために好ましい腸内細菌発酵株はパンテア種である。
【００３５】
パンテア属は、Ｐ．アグロメランス、Ｐ．ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｐ．プンクタータ、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ｔｅｒｒｅａ、Ｐ．アナナス、及びＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）を含み、特にパンテアｃｉｔｒｅａである。パンテアｃｉｔｒｅａはＡＴＣＣ（Ｍｎａｓｓａｓ、バージニア州）から、例えばＡＴＣＣ番号３９１４０が得られる。パンテアｃｉｔｒｅａはエルウィニアｃｉｔｒｅｕｓまたはアセトバクターｃｅｒｉｎｕｓとして言及されることもある。従って、パンテア属は再分類された種を含むものとし、限定されないが、エルウィニアｃｉｔｒｅｕｓまたはアセトバクターｃｅｒｉｎｕｓを含む。
【００３６】
ここで用いる“バチルス”ファミリーとは、グラム陽性であり、酸素の存在下で耐性内生胞子を生成できる一般特性を有する桿菌株をいう。バチルスの例としては、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．チューリンジェンシス及びＢ．ブレビスが挙げられる。
【００３７】
本発明に従う“改変細菌宿主”または“改変細菌細胞”は、内在性２−ＫＤＧＤＨの作用により酵素的に２−ＫＤＧを２，５−ＤＫＧに変換可能であった細菌細胞であり、ここで内在性２−ＫＤＧＤＨ酵素が非機能的にされている細菌細胞をいう。１の実施態様において、改変細菌細胞は、本質的に同じ培養条件下で成長した対応する非改変細菌宿主細胞において蓄積（または一時的に蓄積）した２−ＫＤＧのレベルと比較して、より高いレベルの蓄積２−ＫＤＧを有する。
【００３８】
本発明に従う“非改変細菌細胞”または“非改変細菌宿主”とは、２−ＫＤＧＤＨが不活性化されておらず、当該２−ＫＤＧＤＨ酵素が機能的なままであるので２−ＫＤＧから２，５−ＤＫＧへの酸化を生じる細菌細胞である。
【００３９】
“より高いレベルの蓄積２−ＫＤＧ”とは、本質的に同じ条件で培養された場合、対応する非改変細菌宿主細胞における２−ＫＤＧの量と比較した改変細菌細胞における２−ＫＤＧの量をいう。例えば、より高いレベルの蓄積２−ＫＤＧとは、対応する非改変細菌宿主において生成された２−ＫＤＧ量よりも多く、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上の増加である。蓄積レベルの増加は多数の方法により表すことができ、例えば重量％（ｇｍ生成物／ｇｍ基質）または時間単位当りのｇｍ／Ｌである。より高いレベルの蓄積２−ＫＤＧは機能的２−ＫＤＧＤＨを生成するために必要な１以上の遺伝子の不活性化により生じる。
【００４０】
ここで用いる“染色体統合”とは、それにより導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞染色体内に組み込まれるプロセスである。当該プロセスは好ましくは相同組換えにより起こる。
【００４１】
ここで用いる、宿主細胞により生じるタンパク質または酵素活性レベルの“修飾”とは、培養時に生じるタンパク質または酵素的活性のレベルを制御して当該レベルを所望により増加または減少させることをいう。
【００４２】
ここで用いる、核酸またはポリヌクレオチドに関して言及する際の“修飾”の語は、野生型核酸と比較して、何らかの方法で核酸が変異されたことを意味し、例えば、核酸の全部または一部の変異、欠失、または転写調節領域に動作可能に連結することによる。ここで用いる、核酸に関して言及する際の“変異”の語は、当該核酸の生成物が一部または全部が不活性化されるような核酸中の任意の変異をいう。変異の例としては、限定されないが、２−ＫＤＧＤＨをエンコードする遺伝子の点変異、フレームシフト変異、及び当該遺伝子の一部または全部の欠失が挙げられる。
【００４３】
ここで用いる“望ましい生成物”とは、炭素基質が生物変換された望ましい化合物をいう。望ましい生成物の例としては、グルコン酸、２−ＫＤＧ、及び５−ケト−Ｄ−グルコン酸である。
【００４４】
ここで細胞、核酸またはタンパク質に関して用いる“組換え体”の語は細胞、核酸またはタンパク質が異種核酸の導入により、または天然核酸の変異により修飾されたことを示し、または当該細胞はそのように修飾された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は細胞の天然型（非組換え体）内では見られない遺伝子を発現し、または天然型であれば過少発現または全く発現しない天然遺伝子を発現する。いくつかの実施態様において、本発明の改変細菌宿主細胞は組換え細胞である。
【００４５】
ここで用いる“内在性”の語は宿主中に天然に発生する核酸によりエンコードされる核酸またはタンパク質をいう。
【００４６】
ここで用いる“異種”の語は、当該宿主細胞内に天然に発生しない核酸またはアミノ酸配列をいう。
【００４７】
ここで用いる“単離”または“精製”の語は、天然に関連した少なくとも１の成分から除去された酵素、核酸、タンパク質、ペプチドまたは共同因子をいう。
【００４８】
ここで用いる“ベクター”の語は、核酸を１以上の細胞型内に導入するように設計されたポリヌクレオチド構築体をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を含む。
【００４９】
他の配列に対して特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、または９９％）の“配列同一性”を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、配列された場合に、２つの配列を比較してその割合で塩基またはアミノ酸が同じであることを意味する。この配列及び相同性率または配列同一性は当業界で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定でき、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、１９８７）補遺３０、セクション７．７．１８に記載のものである。好ましい配列プログラムはＡＬＩＧＮプラス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ペンシルバニア）であり、好ましくは以下の初期設定値を用いる：ミスマッチ＝２；オープンギャップ＝０；伸長ギャップ＝２。使用できる他の配列ソフトウェアプログラムはＴＦａｓｔＡデータ・サーチングプログラムであり、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（配列分析ソフトウェアパッケージ）  バージョン６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）が市販されている。
【００５０】
糖類の酸性誘導体はその周囲の媒体、固体形態で調製される場合、調製される溶液中または溶液外であるか、に応じて種々の電離状態で存在できることは当業界においてよく理解されている。例えば、グルコン酸などの用語の使用は、当該分子は言及される有機分子の全ての電離状態を含むものとする。従って、例えば、“グルコン酸”及び“グルコン酸塩”は同じ有機成分をいい、特定の電離状態または化学形態を意図するものではない。
【００５１】
ここで用いる“培養”の語は、反応容器内での炭素基質から望ましい生成物への発酵生物変換をいう。生物変換とは、炭素基質を微生物に接触させて、当該炭素基質を望ましい生成物に変換することをいう。
【００５２】
ここで用いる“含む”の語及びその同語族は包括的な意味で用いられる。すなわち、“含有する”及びその対応同語族と同等のものである。
【００５３】
単数の語は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数も含む。
【００５４】
ここで用いる“トランスポーター”の語は細胞内膜を横切る分子の輸送を触媒するタンパク質をいう。グルコーストランスポーターはグルコースの細胞質内への輸送を触媒する。グルコン酸トランスポーターはグルコン酸の輸送を触媒し、その他の糖酸分子または糖−ケト酸の細胞膜を横切る輸送も触媒する。
【００５５】
“細胞質”または“細胞質性”とは、細胞内膜内にあることをいう。細胞外または細胞内膜の外側とは、細胞質から反対側の膜上の細胞位置をいい、限定されないが、ペリプラズムを含む。細胞内膜または内膜（ペリプラズム膜として言及する場合もある）とは、ペリプラズムから細胞質を分離する防壁をいう。細胞内とは、細胞質ゾルに最も近い膜の側の細胞部分をいう。
【００５６】
ここで用いる“グルコキナーゼ”（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．２）の語は、その６番目の炭素においてＤ−グルコースまたはＬ−グルコースをリン酸化する酵素を意味し、例えばＧｌｋＡである。
【００５７】
ここで用いる、“グルコノキナーゼ” （Ｅ．Ｃ．−２．７．１．１２）の語は、その６番目の炭素においてＤ−グルコン酸またはＬ−グルコン酸をリン酸化する酵素を意味し、例えばＧｎｔＫである。
【００５８】
Ｂ．好ましい実施態様
ポリヌクレオチド及びタンパク質：
本出願は、２−ＫＤＧＤＨ酵素をエンコードする単離ポリヌクレオチドに関する。多くの細菌種が２−ＫＤＧＤＨ酵素を含むことが見つかっている。国際生化学分子生物学連合（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会は番号ＥＣ１．１．９９．４を２−ＫＤＧＤＨに割当てた。より具体的には、２−ＫＤＧＤＨは中位鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＭＤＲ）分類の酵素に属する。これは約１０００個の酵素を含む大きな酵素スーパーファミリである。２−ＫＤＧＤＨは、ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）活性を示すＭＤＲ分科に分類された（Ｎｏｒｄｌｉｎｇ、他、（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４２６７−４２７６）。
【００５９】
２−ＫＤＧＤＨ酵素は好ましくはパンテア、アセトバクター、エルウィニア、またはグルコノバクター種から単離される膜結合酵素であり、特にパンテアｃｉｔｒｅａまたはパンテア・アグロメランスから単離される。これらの種は２−ＫＤＧ及びグルコン酸の変換から２，５−ＤＫＧを生成することが示されている。
【００６０】
１の実施態様において、２−ＫＤＧＤＨ酵素は３つの遺伝子を含むオペロンによりエンコードされる多量体である。好ましくは３つの遺伝子は連続しており、単一の転写単位として編成されている。オペロンの第１の遺伝子はタンパク質指定サブユニットＡをエンコードする。オペロンの第２の遺伝子はタンパク質指定サブユニットＢをエンコードし、サブユニットＢはデヒドロゲナーゼタンパク質である。１の好ましい実施態様において、サブユニットＢデヒドロゲナーゼはフラビンタンパク質である。フラビンタンパク質は補欠分子族としてリボフラビンの誘導体を含む酵素である。オペロンの第３の遺伝子はタンパク質指定サブユニットＣをエンコードし、サブユニットＣはシトクロムｃタンパク質である。
【００６１】
１の実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有するアミノ酸を含むサブユニットＡタンパク質をエンコードする。他の実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有するアミノ酸を含むサブユニットＢデヒドロゲナーゼタンパク質をエンコードする。さらなる実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有するアミノ酸を含むサブユニットＣシトクロムＣタンパク質をエンコードする。当業者は遺伝コードの縮退について熟知しており、２以上のコドンによりアミノ酸がコードされ得ることもよく知っている。これらのばらつきは本発明の一部として含まれる。
【００６２】
さらなる実施態様において、２−ＫＤＧＤＨ複合体のサブユニットＡをエンコードする単離ポリヌクレオチドは配列番号１の核酸配列を含み、サブユニットＢとして指定されるデヒドロゲナーゼタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチドは配列番号３の核酸配列を含み、及びサブユニットＣとして指定されるシトクロムＣタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチドは配列番号５の核酸配列を含む。
【００６３】
また、本発明は、他の微生物において２−ＫＤＧＤＨ酵素を検出するためのプローブとして配列番号１、３または５に示されるポリヌクレオチド配列を用いる方法も提供する。１の実施態様において、配列番号１、３または５のいずれかから少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上の連続配列をプローブとして用いて、２−ＫＤＧＤＨ酵素複合体のサブユニットＡ、サブユニットＢまたはサブユニットＣをエンコードするポリヌクレオチドを検出できる。他の実施態様において、配列番号１、３または５のいずれかから少なくとも２０の連続配列をプローブとして用いることができる。さらに、配列番号３から少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上の連続配列をプローブとして用いることができる。さらに、本発明で有用なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２、４または６の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の連続アミノ酸残基を有するポリペプチドをエンコードする核酸配列を含むことができる。
【００６４】
他の微生物及び具体的にはパンテア種において見られる２−ＫＤＧＤＨ酵素または２−ＫＤＧＤＨ酵素サブユニットを同定する方法は当業者に公知であり、ハイブリダイゼーション研究を含む。従って、例えば、高ストリンジェンシーな条件下において図３Ａ、４または６に示す配列またはこれらの相補体にハイブリダイズする核酸配列も２−ＫＤＧＤＨ酵素のサブユニットＡ、サブユニットＢ、またはサブユニットＣとして機能するタンパク質をエンコードできる。ハイブリダイゼーションは塩基対合により核酸鎖が相補鎖に接合する方法を含む。高ストリンジェンシーな条件は当業界に公知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（研究所マニュアル）、第二版（１９８９）及びＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編集、Ａｕｓｕｂｅｌ、他、を参照されたい。ストリンジェントな条件は配列依存であり、種々の環境により異なる。ハイブリダイズする配列がより長ければ温度もより高温でする。核酸ハイブリダイゼーションの広範囲な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｓｓａｙｓ（生化学及び分子生物学の技術−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション原理の概説及び核酸分析の方針）（１９９３）において見られる。通常、ストリンジェントな条件は特定のイオン強度及びｐＨでの特定配列の熱的融点Ｔｍよりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（特定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍナトリウムイオン未満、通常は約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度が少なくともショートプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関して３０℃、ロングプローブ（例えば、５０より多いヌクレオチド）に関して少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成することもできる。他の実施態様において、より低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いる。例えば、中間または低ストリンジェント条件を用いることができる。
【００６５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も相同配列を選別するために用いることができ、Ｃｈｅｎ、他、（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（バイオ技術）１８（４）：６０９−６１２を参照されたい。その他の方法はタンパク質バイオアッセイまたは免疫学的検定技術を含み、核酸またはタンパク質の検出及び／または定量のための膜ベース、溶液ベース、またはマイクロチップを用いた技術がある。
【００６６】
さらに、本発明は配列番号６に示すアミノ酸配列を有する単離シトクロムｃタンパク質及び配列番号４に示すアミノ酸配列を有する単離デヒドロゲナーゼを目的とする。配列番号１に示す核酸配列を有するサブユニットＡは、配列番号２に示すアミノ酸配列をエンコードし、Ｐｕｊｏｌ及びＫａｄｏ（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：２２３０−２２３７に開示のケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼサブユニット前駆体をエンコードするポリヌクレオチドとそれぞれ８９．６％同一性及び９５．８％同一性を有する。配列番号３に示す核酸配列を有するサブユニットＢは、配列番号４に示すアミノ酸配列をエンコードし、Ｐｕｊｏｌ及びＫａｄｏ（２０００）上記に開示のケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼサブユニット前駆体をエンコードするポリヌクレオチドとそれぞれ８９．９％同一性及び９９．８％同一性を有する。配列番号５に示す核酸配列を有するサブユニットＣは、配列番号６に示すアミノ酸配列をエンコードし、Ｐｕｊｏｌ及びＫａｄｏ（２０００）上記に開示のケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼサブユニット前駆体をエンコードするポリヌクレオチドとそれぞれ８５．５％同一性及び９４．３％同一性を有する。Ｐｕｊｏｌ及びＫａｄｏに開示の推定上の２−ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼオペロンのヌクレオチド配列はアクセッション番号ＡＦ１３１２０２としてジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託されている。
【００６７】
デヒドロゲナーゼ分析は公知であり、Ｂｏｕｖｅｔ、他、（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：６１−６７に記載の方法から、２ＫＤＧを補充したＭＧＹ上で成長した細胞を用いて採用できる。Ｓｈｉｎａｇａｗａ及びＡｍｅｙａｍａ（１９８２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８９：１９４−１９８も参照されたい。
【００６８】
さらに、グルコン酸、２−ＫＤＧ及び２，５−ＤＫＧ検出の定性分析は当業界に公知であり、例えば、ＨＰＬＣの使用により得られる。
【００６９】
２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化方法
一般に、染色体遺伝子を非機能的にする方法は当業界に公知であり、多数の技術を用いて２−ＫＤＧＤＨ活性を有する酵素を不活性化することができる。これらの方法のいくつかは遺伝子工学技術を含み、その他の方法はスクリーニング及び突然変異誘発などの技術を含む。
【００７０】
本発明に従う２−ＫＤＧＤＨ酵素は２−ＫＤＧＤＨ酵素複合体を含む３つのサブユニットのいずれかを不活性化することにより非機能的にできる。これらのサブユニットはサブユニットＡ、デヒドロゲナーゼ活性を有するサブユニットＢ、及びサブユニットＣ（シトクロムｃタンパク質）に指定した。
【００７１】
１の好ましい実施態様において、サブユニットＢを非機能的にし、このサブユニットの不活性化は２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化を生じるものである。他の実施態様において、サブユニットＣを非機能的にし、このサブユニットの不活性化は２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化を生じるものである。他の実施態様において、サブユニットＡを非機能的にし、このサブユニットの不活性化は２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化を生じるものである。
【００７２】
さらなる実施態様において、２つのサブユニットを非機能的にし、例えば、サブユニットＢ及びサブユニットＣの両方であり、これにより２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化を生じる。さらなる実施態様において、不活性化遺伝子、例えば欠失遺伝子の発現生成物は、生物活性が変化している限り、短縮タンパク質である。生物活性の変化は活性の変化でもよいが、好ましくは生物活性の喪失である。
【００７３】
不活性化の１の好ましい方法は２−ＫＤＧＤＨ酵素のサブユニットの一つをエンコードする少なくとも１の遺伝子の欠失である。１の実施態様において、欠失される遺伝子はサブユニットＢ、デヒドロゲナーゼ酵素をエンコードする。他の実施態様において、欠失される遺伝子はサブユニットＣ、シトクロムＣタンパク質をエンコードする。他の実施態様において、欠失される遺伝子はサブユニットＡをエンコードする。さらなる実施態様において、２つの遺伝子が欠失されてもよく、例えばサブユニットＢ及びサブユニットＣをエンコードする遺伝子である。好ましくは、サブユニットＢをエンコードする遺伝子は欠失により不活性化される。全ての場合において、染色体中に残った配列が問題の遺伝子の生物活性のためには短すぎる限り、欠失は部分的なものであってもよい。
【００７４】
本発明に従う２−ＫＤＧＤＨ酵素サブユニットを欠失させる１の方法は、目的のサブユニットコード配列の相同フランキング領域を含むベクターの構築を含む。フランキング領域は５’及び３’末端に約１ｂｐ〜約５００ｂｐ含むことができる。ベクターのフランキング領域は５００ｂｐよりも大きくてもよく、ある実施態様においては、２−ＫＤＧＤＨオペロンを包含する他の遺伝子であって、当該オペロンがこれらの遺伝子も同様に不活性化または欠失するものを含んでもよい。ベクター構築体は例えば、形質転換により宿主細胞内に導入でき、次に宿主細胞染色体内に統合できる。最終結果は導入ＤＮＡが２−ＫＤＧＤＨ酵素をエンコードする１以上の内在性遺伝子の欠失を生じ、従って非機能的２−ＫＤＧＤＨ酵素を生じる。
【００７５】
例えば、図８に示すように、不活性化カセットは２−ＫＤＧＤＨサブユニットＢ（２−ＫＤＧＤＨ−Ｂ）遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクター内に第１のクローニングを行うことにより構築される。２−ＫＤＧＤＨ−Ｂ遺伝子を不活性化するために、抗生物質耐性遺伝子（すなわち、クロラムフェニコール、ＣｍＲ遺伝子）を２−ＫＤＧＤＨ−Ｂ遺伝子内に見られる特異制限部位内にクローンする。２−ＫＤＧＤＨ−Ｂ遺伝子内への抗生物質マーカーの挿入はその通常のコード配列を阻害する。不活性化カセットはｐＧＰ７０４（Ｍｉｌｌｅｒ、他、（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５−２５８３）のような非複製Ｒ６Ｋベクターを用いて相同組換えにより宿主細胞染色体に輸送される。宿主細胞染色体内へのカセットの輸送は宿主細胞によるＣｍＲの包含により選択される。２−ＫＤＧＤＨ−Ｂ遺伝子の不活性化が確認できると、ＣｍＲを２−ＫＤＧＤＨ−Ｂコード領域から取除き、当該コード領域中に阻害スペーサー（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ  ｓｐａｃｅｒ）（この例においてｌｏｘＰ部位のコピーを含む）を残し、コード領域を不活性化する（Ｐａｌｍｅｒｏｓ、他、（２０００）Ｇｅｎｅ２４７：２５５−２６４）。
【００７６】
他の実施態様において、不活性化は挿入によるものである。挿入不活性化は染色体コード領域の阻害を含む。例えば、サブユニットＢをエンコードする遺伝子が不活性化される遺伝子である場合、ＤＮＡ構築体はサブユニットＢをエンコードする核酸配列を含み、ここで当該コード配列は選択マーカーにより阻害される。選択マーカーはサブユニットＢコード配列部分の両側に隣接する。ＤＮＡ構築体は宿主染色体におけるサブユニットＢ遺伝子と本質的に同一な配列と編成し、ダブルクロスオーバーイベント（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｅｖｅｎｔ）において、サブユニットＢ遺伝子は選択マーカーの挿入により不活性化される。選択マーカーは、当該ベクターを含む宿主の選択を容易にする宿主微生物において発現できる遺伝子をいう。そのような選択マーカーの例としては、限定されないが、抗生物質耐性遺伝子であり、例えば、エリスロマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリンである。上に一般的に描写した方法はサブユニットＡ、サブユニットＢ、またはサブユニットＣをエンコードする配列を用いて行うことができる。
【００７７】
細菌性生物においてベクターとして用いることができるプラスミドは公知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：研究所マニュアル）、第二版（１９８９）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９）及びＢｒｏｎ，Ｓ，第３章、Ｐｌａｓｍｉｄｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，編集、Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，（１９９０）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．を参照されたい。
【００７８】
非天然タンパク質または非天然酵素をエンコードするポリヌクレオチドを腸内細菌株内に組換え導入するための好ましいプラスミドはＲＳＦ１０１０、可動性、であるが、広範囲の細菌宿主において複製できる能力を有する自己伝達性プラスミドではなく、グラム陰性及びグラム陽性細菌を含む。（Ｆｒｅｙ、他、１９８９、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＩｎｃＱ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ（ＩｎｃＱプラスミドの分子生物学）．Ｉｎ：Ｔｈｏｍａｓ（編集）、Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｇｒａｍ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（グラム陰性細菌の広宿主域プラスミド）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、第７９−９４頁）。Ｆｒｅｙ、他、は発見した３つの領域がＲＳＦ１０１０の可動性特性に影響を与えることについて報告した（Ｆｒｅｙ、他、（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１３：１０１−１０６）。
【００７９】
他の実施態様において、不活性化はベクターとしてプラスミドを用いたシングルクロスオーバーイベント（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｅｖｅｎｔ）における挿入によるものである。例えば、２−ＫＤＧＤＨサブユニット、例えば配列番号３に開示した核酸配列を有するサブユニットＢなどをエンコードする染色体遺伝子は、配列番号３の配列または遺伝子コード配列の一部及び選択マーカーを含むプラスミドを用いて編成される。選択マーカーは遺伝子コード配列内、または遺伝子から分離されるプラスミドの一部上に位置できる。当該ベクターは細菌染色体内に統合でき、当該遺伝子はコード配列中のベクター挿入により不活性化される。
【００８０】
不活性化は遺伝子突然変異により起こすこともできる。遺伝子を突然変異させる方法は当業界に公知であり、限定されないが、化学的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異の発生、及びギャップ二本鎖法が挙げられる。（米国特許第４，７６０，０２５号；Ｍｏｒｉｎｇ、他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６（１９８４）；及びＫｒａｍｅｒ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１（１９８４））。他の公知の方法はトランスポゾンによるランダム突然変異の使用を含む（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｈ．（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３７２−３８０頁）。突然変異発生後、望ましい特性を有する変異体は種々の方法、例えば選択培地上の選択的単離により選択できる。
【００８１】
いくつかの実施態様において、変異原性ベクターは、好ましくは少なくとも１の当該ベクターに特異な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング部位カセットを含んで構築され、容易な核酸操作を促進する。好ましい実施態様において、ベクターは１以上の選択マーカーも含む。
【００８２】
本発明に従う改変細菌株において、２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化は好ましくは安定しており、不可逆な不活性化である。
【００８３】
宿主細胞
本発明に従う特に好ましい細菌宿主細胞は腸内細菌細胞である。好ましい腸内細菌宿主は大腸菌、クレブシエラ、及びパンテア細胞である。特に好ましいパンテア細胞はＰ．ｃｉｔｒｅａ及びＰ．アグロメランスである。そのような微生物源はＡＴＣＣ及び商業的供給源などの公営の集積所を含む。例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号２１９９８、１３１８２、及び３９１４０である。さらに、米国特許第５，０３２，５１４号及びＴｒｕｅｓｄｅｌｌ、他、（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６６５１−６６５６を参照されたい。バチルス種は宿主細胞としても機能する。非機能的な２−ＫＤＧＤＨ酵素を含む改変細菌宿主細胞は組換え宿主細胞であってもよい。
【００８４】
１の実施態様において、不活性化前の２−ＫＤＧＤＨ酵素は２−ＫＤＧから２，５−ＤＫＧへの変換を触媒でき、当該不活性化２−ＫＤＧＤＨ酵素を含む本発明の改変細菌細胞は、サブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣに指定される３つのタンパク質サブユニットをエンコードする３つの遺伝子を含有するオペロンを含む。いずれか一つのサブユニットの欠失またはいずれか一つのサブユニットの一部の欠失などの修飾は内在性２−ＫＤＧＤＨを非機能的にできる。
【００８５】
好ましい実施態様において、本発明の改変細菌細胞を得るために修飾されるのはサブユニットＣ及び／またはサブユニットＢである。好ましくはサブユニットＢはコード領域の一部の欠失または挿入不活性化により修飾される。
【００８６】
１の実施態様において、デヒドロゲナーゼタンパク質であるサブユニットＢは配列番号３に示す配列を有するポリヌクレオチドによりエンコードされ、または配列番号３の配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドによりエンコードされる。さらなる実施態様において、シトクロムｃタンパク質であるサブユニットＣは配列番号５に示す配列を有するポリヌクレオチドによりエンコードされ、または配列番号５の配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドによりエンコードされる。
【００８７】
２−ＫＤＧＤＨ酵素の不活性化の結果として、当該不活性化が例えば２−ＫＤＧＤＨ酵素複合体の１、２または３個のサブユニットの不活性化または欠失のいずれのものであるかに関わらず、２−ＫＤＧから２，５−ＤＫＧへの変換は減少し、２−ＫＤＧが細胞環境内に蓄積される。本発明のこの側面に従って、改変細菌細胞は対応する非改変細菌宿主細胞と比較して増加した、またはより高い２−ＫＤＧ蓄積レベルを有し、２−ＫＤＧが一時的に蓄積する。
【００８８】
追加的遺伝子修飾
上述の通り、細菌宿主細胞は組換え宿主細胞であってもよい。宿主細胞の修飾は２−ＫＤＧＤＨの不活性化前、同時、または後に達成できる。当該修飾は染色体遺伝子に対して起こすことができ、及び当該修飾は内在性染色体遺伝子の欠失または阻害などの不活性化を含み、内在性染色体遺伝子の増加した発現を生じる修飾及び異種遺伝子の包含も含む。
【００８９】
本発明により包含される細菌宿主細胞内へ組み込むことができる追加的修飾のより具体的な例としては、限定されないが、ｉ）グルコン酸トランスポーターをエンコードする遺伝子の修飾；ｉｉ）グルコーストランスポーターをエンコードする遺伝子の修飾（Ｐｅｅｋｈａｕｓ、他、１９９７、Ｆｅｍｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．１４７：２３３−２３８）；ｉｉｉ）ＫＤＧトランスポーターをエンコードする遺伝子の修飾；ｉｖ）遺伝子過剰発現を生じる遺伝子修飾、例えばグルコシダーゼデヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現、グルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはｃｃｍ遺伝子などのシトクロムｃの生物発生に関連する遺伝子の過剰発現（Ｋｒａｎｚ、他、（１９９６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：３２８３−３９６）；ｖ）例えば、Ｄ−グルコースまたはＤ−グルコン酸をその６番目の炭素でリン酸化する酵素を不活性化することによる、及びより具体的にはヘキソキナーゼ酵素、グルコキナーゼ遺伝子またはグルコノキナーゼ遺伝子、すなわちｇｎｔＫ及び／またはｇｌｋＡを不活性化することによる、酸化経路から異化経路を分離するポリヌクレオチドの修飾（ＷＯ０２／０８１４４０を参照）；及びｖｉ）２−ＫＤＧを基質として使う酵素、例えば２−ケト−レダクターゼまたは２−ケト−キナーゼをエンコードする遺伝子の修飾がある。
【００９０】
特定の好ましい実施態様において、本発明に従う改変細菌株は不活性化ｇｎｔＫ及び／または不活性化ｇｌｋＡ遺伝子を含む。他の好ましい実施態様において、本発明に従う改変細菌株は不活性化グルコン酸トランスポーターを含む。
【００９１】
特定の実施態様において、不活性化２−ＫＤＧＤＨを含む改変細菌株はさらにその他の不活性化遺伝子を含むことができ、例えば、不活性化遺伝子２つ、不活性化遺伝子３つ、不活性化遺伝子４つ、不活性化遺伝子５つ、不活性化遺伝子６つ、またはそれ以上である。当該不活性化遺伝子は互いに隣接していてもよく、細菌染色体の分離した領域に位置していてもよい。不活性化染色体遺伝子は特定条件下で必要な機能を有すことができるが、当該遺伝子は研究所条件下で必ずしも生存可能な細胞株である必要はない。好ましい研究所条件は、限定されないが、培養器、振とうフラスコ、プレート媒体内での成長などの条件が挙げられる。
【００９２】
１の実施態様において、不活性化２−ＫＤＧＤＨを含む本発明に従う改変細菌細胞はさらに、不活性化グルコノキナーゼ遺伝子を含む。他の実施態様において、宿主細胞は、グルコースまたはその他の一般的な代謝産物の変換に影響することが公知の酵素をエンコードする遺伝子を含むように設計でき、当該変換はこれらを含むことが知られる有機体における２−ＫＤＧまたは２−ＫＬＧへの変換である。一般的な代謝産物から２−ＫＤＧまたは２−ＫＬＧへの変換に影響を与える酵素の例としては、Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．他、（１９８０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４４：３０１−３０８；Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．他、（１９８１）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４５：８５１−８６１；Ｓｍｉｔｈ、他、（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１：９７３；及びＮｅｉｊｓｓｅｌ、他、（１９８９）Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅａｕｖｅｎｈｏｅｋ  ５６（１）：５１−６１）；及びＤ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｃｌｎｔｉｒｅ，Ｗ．他、（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３１：６５１−６５４；Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．他、（１９７６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４０：４７５−４８３；Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．他、（１９７８）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４２：１０５５−１０５７；及びＭａｔｓｕｓｈｉｔａ、他、（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１１７３）；５−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．他、（１９８１）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４５：１０７９−１０８５及びＳｔｒｏｓｈａｎｅ（１９７７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ＢｉｏＥｎｇ．１９（４）４５９）；及び２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（米国特許第５，７９５，７６１号、第５，３７６，５４４号；第５，５８３，０２５号；第４，７５７，０１２号；第４，７５８，５１４号；第５，００８，１９３号；第５，００４，６９０号；及び第５，０３２，５１４号）がある。他の実施態様において、宿主細胞は２−ＫＤＧを他の商業的に有用な生成物に変換する酵素をエンコードする遺伝子を含むように設計してもよい。
【００９３】
本発明に従う好ましい改変細菌株は組換えパンテア株及び特にＰ．ｃｉｔｒｅａ株である。いくつかの実施態様において、組換え株は任意で、不活性化グルコン酸トランスポーター遺伝子；不活性化グルコキナーゼ遺伝子；不活性化グルコニキナーゼ遺伝子；不活性化グリセロールキナーゼ遺伝子；及び不活性化グルコーストランスポート系を単独でまたは組合わせて含む。グルコン酸が細胞膜を横切って輸送されない場合、酸化経路において２−ＫＤＧへの変換に利用可能なグルコン酸がより多く存在できる。
【００９４】
ＡＳＡ中間体の回収、同定、及び精製
エリソルビン酸（Ｄ−アラボアスコルビン酸）、Ｌ−アラボアスコルビン酸、及びＤ−キシロアスコルビン酸などのＡＳＡ中間体、ＡＳＡ、及びＡＳＡ立体異性体を検出する方法は、２，６−ジクロロインドフェノール（Ｂｕｒｔｏｎ、他、（１９７９）Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｕｂ．Ａｎａｌｙｓｔｓ  １７：１０５）またはその他の適当な試薬を用いた酸化還元滴定；陰イオン交換を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；及び電解酸化還元手順（Ｐａｃｈｉａ，（１９７６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４８：３６４）の使用を含む。当業者であれば、これらの検出方法の使用に適用される制御機器について熟知している。もしくは、当該中間体は発酵液または生物反応器から直接処方することもでき、顆粒にでき、または液剤に仕込むことができる。本発明に従って生成及び蓄積された２−ＫＤＧはさらに当業者に公知の手段によりエリソルビン酸に転換でき、例えば、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓｎｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１７，３１１−３２８（１９３４）を参照されたい。
【００９５】
遺伝子導入
細菌細胞のための遺伝子導入技術は公知であり、これらの技術は形質転換、形質導入、接合及び原形質融合を含む。遺伝子導入は遺伝子またはポリヌクレオチドを細胞に導入する方法であり、外から加えたＤＮＡは細菌により取り込まれる。一般的な形質転換手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第１巻、Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８７、第９章）に教示されており、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストランを用いる形質転換及びエレクトロポレーションが挙げられる。所定の宿主細胞内に核酸を導入するための種々の形質転換手順が当業者に公知である。（米国特許第５，０３２，５１４号；Ｐｏｔｔｅｒ  Ｈ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７４：３６１−３７３；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；及びＦｅｒｒａｒｉ、他、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５７−７２頁、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ、他、編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐも参照されたい。）
宿主細胞の形質転換は目的核酸が存在するかどうかを示唆できるマーカー遺伝子発現の存在／不存在により検出できる。しかしながら、その発現は追認すべきである。例えば、サブユニットＢデヒドロゲナーゼタンパク質をエンコードする核酸がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、当該挿入を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不存在により同定できる。もしくは、マーカー遺伝子は単一のプロモーターの制御下で、デヒドロゲナーゼをエンコードする核酸と前後して位置できる。導入または選択に対するマーカー遺伝子の発現は通常、タンパク質または酵素の発現も示す。上述の通り変換を実行できる細菌微生物が作成されると、組換えタンパク質のための発現ベクター構築の性質及び宿主の成長特性に応じて、本発明の方法を種々の手順で行うことができる。
【００９６】
細胞培養及び発酵
細菌細胞の維持及び成長に適した方法は公知であり、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（一般細菌学の方法のマニュアル）、編集、Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，他、米国微生物学会、ワシントンＤＣ（１９８１）及びＴ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、マサチューセッツ州、を参照されたい。
【００９７】
細胞前培養−通常、細胞培養基は適当な培地中、２５〜３２℃で成長し、好ましくは約２８または２９℃である。本発明において有用な成長培養基の例としては、一般的な商業的に調製される培養基であり、例えば、限定されないが、ＬＢ培地、サブローデキストロース（ＳＤ）培地または酵母培養基（ＹＭ）である。これらは例えば、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）から得られる。その他の確立したまたは合成の成長培地も用いることができ、特定の細菌微生物の成長に適した培地は細菌学または発酵科学の当業者に公知である。発酵に好ましく適したｐＨ範囲はｐＨ５〜ｐＨ８である。播種フラスコ（ｓｅｅｄ  ｆｌａｓｋｓ）に好ましい範囲はｐＨ７〜ｐＨ７．５であり、反応容器に好ましい範囲はｐＨ５〜ｐＨ６である。発酵プロセスに影響を及ぼす多数の因子がアスコルビン酸中間体生成のために最適化され、制御されなければならないことは発酵細菌学の当業者において当然に理解されることである。ｐＨ、炭素源濃度及び溶存酸素レベルなどのこれら因子の多くはアスコルビン酸中間体生成に用いる細胞型に応じて酵素プロセスに影響を与え得る。
【００９８】
ＡＳＡ中間体生成は発酵環境中において進行させることができ、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境、または非発酵環境、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境、またはｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境の組み合わせにおいて進行させることができる。発酵または生物反応器はバッチ処理または連続処理で実行できる。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ生体触媒環境：
生体触媒は本発明に従う改変宿主細胞を、腸内細菌またはその他の細菌株により一般的に用いられる適当な炭素源を用いる環境において培養させることから始める。適当な炭素源は六炭糖、例えばグルコース、または六炭糖酸、または六炭糖及び／または六炭糖酸の組み合わせを含む。その他の炭素源は、限定されないが、ガラクトース、ラクトース、フルクトース、またはこれらの酵素的誘導体を含む。
【０１００】
さらに、発酵培地は適当な炭素基質を含んでいなければならず、当該炭素基質は、限定されないが、単糖類、例えばグルコース、オリゴ糖、例えば乳糖またはスクロース、多糖類、例えばデンプンまたはセルロース、及び再生可能な供給原料由来の非精製混合物、例えば乳清浸透物（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、甜菜糖液、及び大麦麦芽を含む。本発明で利用される炭素源は広範囲の炭素含有基質を含むことができ、有機体の選択によってのみ限定されると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース及びスクロース及びこれらの混合物を含む。グルコース及びフルクトースとの混合物をここに記載の改変細菌株と組合わせて用いることにより、宿主細胞の代謝要求を満たすフルクトースを利用しながら、異化経路から酸化経路を分離して、改善された収率及び望ましいＡＳＡ中間体への変換のためのグルコースの使用が可能になる。発酵培地は、アスコルビン酸中間体生成に必要な酵素経路の成長または培養及び促進に適した、適当な鉱物、塩、ビタミン、共同因子、及び緩衝液も含んでいなければならない。
【０１０１】
バッチ及び連続発酵：
本発明はバッチ発酵プロセス、フェッドバッチと呼ばれる修正バッチ発酵プロセス、または連続発酵プロセスを用いることができる。古典的なバッチ発酵は、培地組成が発酵の最初に設定され、発酵中は人工的な変更を受けない閉鎖系である。発酵の最初に、当該培地に望ましい細菌微生物を植菌し、当該系に何も加えないで発酵を生じさせる。しかしながら、通常、“バッチ”発酵は炭素源の追加に関するバッチであり、ｐＨ及び酸素濃度などの制御因子で試みることが多い。バッチ系において、当該系の代謝産物及びバイオマス組成は発酵が止まる時間まで絶えず変化する。バッチ培養物内において、細胞は静的誘導期から高成長対数期を通って穏やかになり、最終的に成長速度が減速または停止する静止期に至る。何ら処理しなければ、静止期の細胞は最終的には死滅する。対数期の細胞は通常、望ましい生成物または中間体の生成の大半に関与する。
【０１０２】
標準バッチ系の変形にフェッドバッチ系がある。フェッドバッチ発酵プロセスも本発明に適しており、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される以外は通常のバッチ系を含む。フェッドバッチ系は異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合であって、培地中の基質量が限定されることが望ましい場合に有用である。フェッドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、従って、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの排ガスの分圧など測定可能な因子の変化を基に見積もられる。バッチ及びフェッドバッチ発酵は当業界によく知られており、Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，マサチューセッツ州にその例が記載されている。
【０１０３】
１の実施態様において、供給溶液中の炭素基質濃度は、重量／重量ベースで約５５％〜約７５％である。好ましくは、当該濃度は重量／重量ベースで約６０〜約７０％である。最も好ましくは、使用される当該濃度は６０％〜６７％グルコースである。
【０１０４】
連続発酵は、処理のため、特定の発酵培地を連続的に生物反応器に加え、同時に同量の調整培地が除去される開放系である。連続発酵は通常、一定の高密度で培養基を維持し、細胞は主に対数期成長にある。連続発酵は細胞成長または最終生成物濃度に影響を与える１の因子またはかなりの数の因子の調節が可能である。例えば、１の方法は炭素源などの制限的栄養物質または窒素レベルを定率で維持し、他の全てのパラメーターの調節を可能とする。他の系では、培地濁度により測定した細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を与える多数の因子を連続的に変更できる。連続系は成長条件の定常状態に保つようにするものであり、従って、取除かれた培地に起因した細胞消失は発酵における細胞成長速度と釣り合いが保たなければならない。連続発酵プロセスのための栄養物質及び成長因子を調節する方法及び生成物発酵の速度を最大化する技術は工業微生物学の当業界において公知であり、種々の方法の詳細がＢｒｏｃｋ、前述、に記載されている。
【０１０５】
ＡＳＡ経路由来の望ましい生成物の増加した収率
本発明に従う改変細菌宿主細胞における増加した２−ＫＤＧの蓄積に加えて、さらなる実施態様は、ＡＳＡ酸化経路由来の異化経路の分離を生じ、２−ＫＤＧ生成のためのグルコン酸の利用可能性を増加させることができる。
【０１０６】
図２に示すように、グルコン酸は内部細胞膜を通って細胞質に輸送できる。グルコン酸は次に例えば、グルコン酸−６−ホスフェートにリン酸化され、ペントース経路において異化代謝に利用可能である。さらに、グルコン酸は細胞質中において５−ＫＤＧまたは２−ＫＤＧに酵素的に還元されることができる。グルコン酸トランスポーターをエンコードする核酸の不活性化によるグルコン酸トランスポーターレベルの不活性化または修飾は、酸化ＡＳＡ生成経路に利用可能な増加した量のグルコン酸を生じることができる。さらに、グルコノキナーゼ遺伝子の不活性化は減少したグルコン酸リン酸化反応を生じることができ、酸化ＡＳＡ生成経路及びエリスロビン酸生成に利用可能なグルコン酸の量をさらに増加させることができる。
【０１０７】
本発明を実施する手段及び方法は以下の実施例を参照することにより当業者にさらに十分に理解され、当該実施例は本発明及び請求項の範囲をいかなる手段においても限定する趣旨のものではない。ここに言及される全ての文献及び特許文献はここに引用するものとする。
【０１０８】
６．実施例
実施例１
Ｐ．ｃｉｔｒｅａにおける２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨ）活性をエンコードするｏｒｆｓ２４１８−２４２０の不活性化：
Ａ．ＫＤＧＤＨオペロンのクローニング：
株１３９−２ａ／Ｐｓ−を２−ＫＤＧＤＨオペロンをクローニングするために用いた。この株はＡＴＣＣアクセッション番号３９１４０の株１３９−２ａの誘導体であり、潜在性プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）（ｐＳ）をＷＯ９８／５９０５４に開示の方法により除去する。Ｔｒｕｅｓｄｅｌｌ、他、（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６６５１−６６５６も参照されたい。
【０１０９】
ＫＤＧＦ１及びＫＤＧＲ１の２つのプライマーを用いて、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ  １３９−２ａ／Ｐｓ株の染色体由来の２−ＫＤＧＤＨオペロンを包含する２．８−ｋｂ  ＤＮＡ断片を標準技術により増幅した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）第二版）。
【化１】
2007500507.tif 000003
【０１１０】
当該ＤＮＡ断片は、宿主として大腸菌ＴＯＰ１０細胞を用いて、ｌａｃプロモーター（ｌａｃＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を有するｐＺｅｒｏＢｌｕｎｔベクター内にクローンした。これにより、プラスミドｐＫＤＧ２（６．３２−ｋｂ）を生じた。ＬＡ＋Ｋａｎ５０プレートにおいて（１．５％寒天及び５０ｐｐｍカナマイシンにより凝固したＬＢ培地）、３つのＫａｎＲ形質転換体が得られた。適当な制限酵素（ＥｃｏＲＩ、Ｓｃａｌ＋Ｓｐｅｌ、Ｓａ／Ｉ＋Ｓｐｅｌ）を用いて消化することによりチェックした場合、３つ全ての形質転換が挿入及び転写方向を有することがわかり、これら全てはｌａｃＰの配向と逆であった。
【０１１１】
Ｂ．Ｐ．ｃｉｔｒｅａ染色体由来の２−ＫＤＧＤＨオペロンを欠失するために用いるノックアウトプラスミドの構築：
一般的にプラスミドを用いた相同組換えにより遺伝子を不活性化するために用いられる方法については前述した。さらに、Ｍｉｌｌｅｒ、他、（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５−２５８３を参照されたい。この一般手順は２−ＫＤＧＤＨオペロンを不活性化するために用いた。
【０１１２】
上記実施例１Ａに従って得られたｐＫＤＧ２プラスミドをＨｐａｌ＋Ｓｃａｌ酵素を用いて消化し、Ｂサブユニット（２−ＫＤＧＤＨ−Ｂ）の中心からＣ−末端までの０．９９３−ｋｂ領域を除去した。次に、当該プラスミドを２つのｌｏｘＰ部位に隣接されたｃａｔカセット（１．０８０−ｋｂ）（Ｐａｌｍｅｒｏｓ、他、（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５−２６４）を用いて挿入し、プラスミドｐＫＤＧＣａｔ１（６．４１−ｋｂ；ＫＤＧＤＨオペロンと反対に走るｃａｔ）を生じた。このプラスミドをＮｏｔｌ、Ｓａｃｌ及びＸｂａｌ酵素を用いて消化することにより確認した。ＣｏｌＥ１  Ｏｒｉ領域を含む１．５−ｋｂ  ＡａｔＩＩ＋Ｓｐｅｌ断片をプラスミドｐＫＤＣａｔ１から除去し、それから複製（ｏｒｉ）領域の最小Ｒ６Ｋ起源を含む５０２−ｂｐ  ＡａｔＩＩ＋ＳｐｅＩ  ＤＮＡ断片と連結した。Ｒ６Ｋ  ｏｒｉ  ＤＮＡはプライマーを含むＰＣＲ基質としてプラスミドｐＧＰ７０４を用いてＰＣＲにより得た（Ｍｉｌｌｅｒ、他、（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５−２５８３）。従って、最終的なノックアウトプラスミドｐＫＤＧＣａｔＲ６（５．３７−ｋｂ）を得た。大腸菌ＰＩＲ１株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）をＳａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）第二版に記載の手順を用いて形質転換した。この最終的なノックアウト構築体において、相同な９６０−ｂｐ及び８４０−ｂｐ領域がＫＤＧＤＨオペロンの５’−及び３’−末端で利用可能であり、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ染色体における相同組換えを可能にする。相同領域は図４及び５のサブユニットＢにおいて説明されるｏｒｆにより表される。
【０１１３】
Ｃ．改変株を得るためのＰ．ｃｉｔｒｅａ株への形質転換：
最終的なノックアウトプラスミドｐＫＤＧｃａｔＲ６（５．３７ｋｂ）をＨｉｎｄＩＩＩ消化を用いて確認した後、当該プラスミドをＰ．ｃｉｔｒｅａ  １３９−２ａ／Ｐｓ−（ｐＫＤ４６）コンピテント細胞内に電気穿孔し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）第二版）、当業界に公知の技術を用いてＬＡ＋Ｃｍ１０プレート（ＬＡはＬＢに１０ｐｐｍＣｍを含む寒天プレートを加えたもの）上でクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）形質転換に関して選択した。シングル及びダブルクロスオーバーイベントを区別するために、ＣｍＲ形質転換体をカナマイシン感受性（ＫａｎＳ）についてＬＡ＋Ｋａｎ３プレート上でチェックした。１３個のＣｍＲ形質転換体のうち９個がＫａｎＳであり、これらは２−ＫＤＧＤＨオペロンを不活性化するダブルクロスオーバー組換えイベントを受けたことを示唆する。
【０１１４】
４個の形質転換、番号４、５、８及び９を下記に記載の内部及び外部両方のプライマーを用いてＰＣＲによりチェックした。
【０１１５】
Ｄ．ノックアウト株のＰＣＲ検査：
ＫＤＧＤＨオペロン欠失を確認するために、２つの外側プライマーにより、機能的ＫＤＧＤＨオペロンを含む野生型及びＫＤＧＤＨオペロンが欠失されたと推定される変異体（改変株）の両方において同じ大きさのバンドを増幅させる。（０．９９３−ｋｂを１．０８−ｋｂ  ｃａｔ−ｌｏｘＰ  ＤＮＡで交換した上述の実施例１Ｃを参照）。
【０１１６】
従って、１のｃａｔ−遺伝子−特異プライマーを含む外側プライマーを推定変異体の組換え接合を確認するために用いた。ｃａｔ３＋ＫＤＧＲ２プライマーを用いて、４個全ての形質転換体は、増幅がなかった非改変株と比較して、予測された１．１４−ｋｂバンドを増幅した。ＫＤＧＦ２＋ｃａｔ４プライマーを用いて、当該形質転換体は予測された１．１７−ｋｂバンドを増幅した。この結果により、予測通り、当該４個の形質転換体はＫＤＧ座において、ダブルクロスオーバー組換えイベントを受け、それによりオペロンを不活性化したことが明らかになった。
【化２】
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【０１１７】
Ｅ．ｐＫＤ４６プラスミドの除去
改変株は依然としてプラスミドｐＫＤ４６プラスミドを含むので（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６６４０−６６４５）、以下の通りこのプラスミドを回復した。細胞をカルベニシリン（Ｃａｒｂ）を含まない液体培地中、３０℃で、３代（３日）成長させ、単一コロニーを被覆（ｐｌａｔｉｎｇ）及び単離した。ＬＡ＋Ｃａｒｂ２００プレート上、Ｃａｒｂ感受性に関して試験すると、単離された全ての単一コロニーがｐＫＤ４６プラスミドを損失していた（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ（上述）、及びＰａｌｍｅｒｏｓ、他、（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５−２６４）。さらに、標準手順を用いてプラスミドＤＮＡを単離したとき、単離したいずれの単一コロニーにおいてもプラスミドは検出されなかった（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、上述）。プラスミドｐＫＤ４６を回復した改変パンテア細胞を得て、ＷＫＤＧ４と指定した。
【０１１８】
実施例２
パンテアｃｉｔｒｅａを用いた発酵実験
細菌細胞の成長に用いた全ての試薬及び材料は、別に定めない限り、Ｄｉｆｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（デトロイト、ミシガン州）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（アルドリッヒ・ケミカルズ）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（シグマケミカル社）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。
【０１１９】
種トレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）：指示された株ＷＫＤＧ４を含み、液体窒素中で保管されていた培養瓶を空気中で解凍し、０．７５ｍＬを５００ｍＬの種培地を含有する無菌２−Ｌエレンマイヤーフラスコに加えた。フラスコを２９℃、２５０ｒｐｍで１２時間培養した。移動指標は、２．５より大きいＯＤ５５０である。
【０１２０】
種フラスコ培養液。培地組成を以下の通りとした：ＫＨ２ＰＯ４（１２．０ｇ／Ｌ）；Ｋ２ＨＰＯ４（４．０ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．０ｇ／Ｌ）；Ｄｉｆｃｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（２．０ｇ／Ｌ）；クエン酸ナトリウム（０．１ｇ／Ｌ）；フルクトース（５．０ｇ／Ｌ）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（１．０ｇ／Ｌ）；ニコチン酸（０．０２ｇ／Ｌ）；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．４ｇ／Ｌ保存溶液の５ｍＬ／Ｌ）；微量塩（以下の溶液の５ｍＬ／Ｌ：０．５８ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３４ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）。培養液のｐＨは、２０％ＮａＯＨを用いて７．０±０．１単位に調節した。２０ｍｇ／Ｌ（１０ｇ／Ｌの保存溶液の２ｍＬ／Ｌ）の最終濃度まで、テトラサイクリンＨＣｌを添加した。その後、得られた培養液を、０．２μのフィルターユニットでろ過無菌化（ｆｉｌｔｅｒ  ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ）をした。当該無菌培養液を前もって加圧減菌したフラスコに加えた。
【０１２１】
生産発酵槽。無菌化前の反応容器への添加物は以下を含む：ＫＨ２ＰＯ４（３．５ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１．０ｇ／Ｌ）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．９２ｇ／Ｌ）；グルタミン酸モノナトリウム（１５．０ｇ／Ｌ）；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５．７９ｍｇ／Ｌ）；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３．４４ｍｇ／Ｌ）；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（４．７０ｍｇ／Ｌ）；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２．２０ｍｇ／Ｌ）；塩化コリン（０．１１２ｇ／Ｌ）及びＭａｚｕ  ＤＦ−２０４（０．１６７ｇ／Ｌ）消泡剤。
【０１２２】
上記構成要素の培養液を１２１℃で４５分間無菌化した。タンクの無菌化後、以下を発酵槽に添加した：ニコチン酸（１６．８ｍｇ／Ｌ）；パントテン酸カルシウム（３．３６ｍｇ／Ｌ）；グルコース（２５ｇ／Ｌ）及びフルクトース（２５ｇ／Ｌ）。
【０１２３】
無菌化及び無菌化後成分の添加の後の最終的な容量は、６．０Ｌであった。このように調製した槽と培養液を上述の通り調製した種フラスコの全容量と接種し、容量は６．５Ｌとなった。
【０１２４】
成長条件は、２９℃及びｐＨ６．０であった。攪拌速度、背圧、及び風量は、溶存酸素が０より大きくなるように随時調節した。培養液に最初にバッチされた糖が消耗されたとき、前述したフェッドバッチプロセスを用いた。バッチプロセス中、基質としてグルコース及びフルクトースを用い、フェッドバッチ中は基質としてグルコースのみ用いた。
【０１２５】
下の表１から観測されるように、代表的な発酵操作に関して、フェッドバッチ発酵下で株ＷＫＤＧ４を用いて３０時間経時変化後に得られた２−ＫＤＧの生成は、２，５−ＤＫＧに変換される前に一時的にのみ２−ＫＤＧを生成する同系の野生型株（１３９−２ａ／Ｐｓ−）と比較して著しいものであった。
【表１】
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【０１２６】
他の代表的な発酵操作の結果を図９に示し、ここで改変株、ＷＫＤＧ４及び非改変野生型株、１３９−２ａ／Ｐｓ−を上述の通り成長させる。図からわかるように、株１３９−２ａ／Ｐｓ−は主に２，５−ＤＫＧを生成し、１８０ｇ／Ｌで最高に達する。２−ＫＤＧはほんの２０ｇ／Ｌの高さまで一時的に蓄積し、操作の最後では、２−ＫＤＧは１０ｇ／Ｌのレベルまでしか蓄積しなかった。一方、改変株（ＷＫＤＧ４）は非常に異なった側面を有する。２，５−ＤＫＧは検出されず、２−ＫＤＧは操作の終わりには３０２ｇ／Ｌ程度の高さのレベルまで蓄積した。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１はアスコルビン酸（ＡＳＡ）生成のための酸化経路を示す。Ｅ１はグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を表す；Ｅ２はグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＨ）を表す；Ｅ３は２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（２−ＫＤＧＤＨまたは２−ＫＧＤＨ）を表す；及びＥ４は２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２，５ＤＫＧＲ）を表す。
【図２】図２はパンテアｃｉｔｒｅａなどの細菌宿主細胞におけるグルコース同化に関係するいくつかの代謝経路の略図である。図は解糖、ペントース及びトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路間の最も一般的な関係を示す。以下の略語を図中で用い、当該開示全体にわたって適用する：グルコースデヒドロゲナーゼ＝（ＧＤＨ）；グルコン酸デヒドロゲナーゼ＝（ＧＡＤＨ）；２−ケト−Ｄ−グルコン酸＝（２−ＫＤＧ）；２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ＝（２−ＫＤＧＤＨまたは２−ＫＧＤＨ）；２，５−ジケトグルコン酸＝（２，５−ＤＫＧ）；２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ＝（２，５ＤＫＧＲ）；２−ケト−Ｌ−グルコン酸＝（２−ＫＬＧ）；２−ケトレダクターゼ＝（２ＫＲ）；５−ケトレダクターゼ＝（５ＫＲ）；５−ケト−Ｄ−グルコン酸＝（５−ＫＤＧ）；イドネート（ｉｄｏｎａｔｅ）デヒドロゲナーゼ＝（ＩＡＤＨ）；グルコキナーゼ＝（ＧｌｋＡ）及びグルコノキナーゼ＝（ＧｎｔＫ）。本発明に従って２−ＫＤＧＤＨの不活性化により影響される酵素工程は“Ｘ”により示す。四角で囲った“Ｔ”は推定上のトランスポーターを表す。
【図３】図３Ａはパンテアｃｉｔｒｅａ２−ＫＤＧＤＨ酵素のサブユニットＡのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列（配列番号１）を表す。図３Ｂは配列番号１によりエンコードされるサブユニットＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を表す。
【図４】図４はパンテアｃｉｔｒｅａ２−ＫＤＧＤＨ酵素のサブユニットＢのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列（配列番号３）を表す。
【図５】図５は配列番号３によりエンコードされるサブユニットＢ（配列番号４）のアミノ酸配列を表す。
【図６】図６はパンテアｃｉｔｒｅａ２−ＫＤＧＤＨ酵素のサブユニットＣのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列（配列番号５）を表す。
【図７】図７は配列番号５によりエンコードされるサブユニットＣ（配列番号６）のアミノ酸配列を表す。
【図８】図８はパンテアｃｉｔｒｅａにおける２−ＫＤＧＤＨオペロンを不活性化するために用いられる方法を示す一般的な概略図である。Ａは３つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）から構成される染色体２−ＫＤＧＤＨオペロンを表す。ｏｒｆ２４１８はサブユニットＡを表し、ｏｒｆ２４１９はサブユニットＢを表し、及びｏｒｆ２４２０はサブユニットＣを表す。矢印はプライマーの向きを示し、ここで１はプライマーＫＤＧＦ２を表し、２はプライマーＫＤＧＦ１を表し、３はプライマーＫＤＧＲ１を表し、及び４はプライマーＫＤＧＲ２を表す。Ｂはプライマー２及び３の使用により生じたＰＣＲ産物を表し、制限部位ＨｐａＩ及びＳｃａＩを含む。ＢからのＰＣＲ産物はｌｏｘＰ−ｃａｔカセット（ｃ）とともに用いられ、カナマイシン耐性遺伝子（Ｄ）を有する非複製Ｒ６Ｋベクター内に輸送される。当該ベクターはパンテア宿主内に形質転換され、当該ベクターの相同領域と宿主染色体中の２−ＫＤＧＤＨオペロンのエンコード領域の相同領域間で相同組換えを起こさせる。実施例１も参照されたい。
【図９】図９は本発明に包含される改変細胞株（ＷＫＤＧ４）及び実施例２でさらに説明される非改変（同系野生型）株（１３９−２ａ／Ｐｓ−）による２−ＫＤＧ及び２，５−ＤＫＧの形成について説明する。ここで、黒塗り四角形はＷＫＤＧ４における２−ＫＤＧ蓄積を表し；白塗り四角形は１３９−２ａ／Ｐｓ−における２−ＫＤＧ蓄積を表し；黒塗り円印はＷＫＤＧ４における２，５−ＤＫＧ蓄積を表し、及び白塗り円印は１３９−２ａ／Ｐｓ−における２，５−ＤＫＧ蓄積を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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