(57)【要約】  本発明は、細胞タイプの表現型の変化を引き出す能力を有する作用物質を識別する自動化された方法およびシステムに関する。この方法は、総称因子名、因子レベルおよび実験ランを含む統計的計画を用意するステップと、ソフトウェアプログラムを利用して統計的計画のコンピュータ表現を生成するステップであって、コンピュータ表現が、作用物質の識別を総称因子名にマップし、作用物質の濃度または量を因子レベルにマップし、容器の位置を実験ランにそれぞれ自動的にマップすることによって生成されるステップとを含む。この方法はさらに、統計的計画のコンピュータ表現に基づいて、アレイの容器の中にペプトンなどの単独作用物質のさまざまな混合物を入れ、その混合物を細胞と接触させ、接触させた細胞から実験データを取得し、取得されたデータを統計的計画と比較して、細胞培養条件を最適化するペプトンの組合せおよび濃度を識別するアルゴリズムを含むプロセッサを利用することを含む。
2007517524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養条件を最適化する複数の物質の最適濃度をさまざまな反応に基づいて識別する最適化戦略を提供する自動化された方法であって、
複数のそれぞれの物質をそれぞれの総称因子名にマップする統計的計画を生成するステップと、
さらに、それぞれの前記物質の少なくとも１つの濃度をそれぞれの因子レベルにマップする前記統計的計画を生成するステップと、
さらに、第１の容器アレイの中の複数の容器のそれぞれの位置をマップする前記統計的計画を生成するステップと、
前記統計的計画に従って第１の表現を生成するステップに応じて、前記物質のうちのある濃度の１つの物質と前記物質のうちのある濃度の他の物質とを、組合せ物質として、前記第１の容器アレイの中の少なくとも１つの前記容器の中に入れるステップと、
前記容器の中に入れられた組合せ物質を関心のある細胞と接触させるステップと、
前記関心のある細胞と前記組合せ物質との間の接触による、前記関心のある細胞の表現型の変化を示すデータを取得するステップに応じて、所望の表現型の変化をもたらす最適な組合せ物質および前記最適な組合せ物質のうちの前記物質の最適濃度を決定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記容器の中に入れるステップは、前記物質のうちのあるそれぞれの濃度の２つの物質を、組合せ物質として、それぞれの前記容器の中に入れるステップを含み、
前記接触させるステップは、前記関心のある細胞を、前記容器の中のそれぞれの前記組合せ物質と接触させるステップを含み、
前記データを取得するステップは、前記関心のある細胞と前記組合せ物質との間の接触による前記関心のある細胞の表現型の変化を示すそれぞれの前記データを取得し、それに応じて、前記所望の表現型の変化をもたらす前記最適な組合せ物質および前記最適な組合せ物質のうちの前記物質の前記最適濃度を決定するステップを含む
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組合せ物質は、
前記物質のうちの第１の濃度値を有する前記１つの物質と、前記物質のうちの第２の濃度値を有する前記他の物質との組合せ、および
前記物質のうちの第３の濃度値を有する前記１つの物質と、前記物質のうちの第４の濃度値を有する前記他の物質との組合せ
のうちの１つを含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記物質のうちの前記１つの物質の前記第１の濃度値は、前記物質のうちの前記１つの物質の前記第３の濃度値よりも小さいか、またはそれに等しく、
前記物質のうちの前記他の物質の前記第２の濃度値は、前記物質のうちの前記他の物質の前記第４の濃度値よりも小さいか、またはそれに等しい
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、第２の容器アレイの中の複数の容器のそれぞれの位置をマップする前記統計的計画を生成するステップと、
前記統計的計画に従って第２の表現を生成するステップに応じて、前記物質のうちのある濃度の１つの物質、前記物質のうちのある濃度の他の物質および前記物質のうちのある濃度のさらに別の物質を、３元組合せ物質として、前記第２の容器アレイの中の少なくとも１つの前記容器の中に入れるステップと、
前記容器の中に入れられた３元組合せ物質を関心のある細胞と接触させるステップと、
前記関心のある細胞と前記３元組合せ物質との間の接触による前記関心のある細胞の表現型の変化を示す第２のデータを取得するステップに応じて、第２の所望の表現型の変化をもたらす最適な３元組合せ物質および前記最適な３元組合せ物質のうちの前記物質の最適濃度を決定するステップと
をさらに含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記容器の中に入れるステップは、前記物質のうちのあるそれぞれの濃度の３つの物質を、３元組合せ物質として、前記第２の容器アレイのそれぞれの前記容器の中に入れるステップを含み、
前記接触させるステップは、前記関心のある細胞を、前記第２の容器アレイの前記容器の中のそれぞれの前記３元組合せ物質と接触させるステップを含み、
前記データを取得するステップは、前記関心のある細胞と前記３元組合せ物質との間の接触による前記関心のある細胞の表現型の変化を示すそれぞれの前記第２のデータを取得し、それに応じて、前記第２の所望の表現型の変化をもたらす前記最適な３元組合せ物質および前記最適な３元組合せ物質のうちの前記物質の前記最適濃度を決定するステップを含む
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記３元組合せは、
前記物質のうちの第１の濃度値を有する前記１つの物質と、前記物質のうちの第２の濃度値を有する前記他の物質と、前記物質のうちの第３の濃度値を有する前記さらに別の物質との組合せを含む
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、第３の容器アレイの中の複数の容器のそれぞれの位置をマップする前記統計的計画を生成するステップと、
前記統計的計画に従って第３の表現を生成するステップに応じて、前記最適な組合せ物質を、前記第３の容器アレイの中の少なくとも１つの容器の中に入れ、前記最適な３元組合せ物質を、前記第３の容器アレイの中の少なくとも１つの他の容器の中に入れるステップと、
前記容器の中に入れられた最適な組合せ物質および前記容器の中に入れられた最適な３元組合せ物質を、関心のある細胞と接触させるステップと、
前記関心のある細胞と前記最適な組合せ物質および前記最適な３元組合せ物質との間の接触による前記関心のある細胞の表現型の変化を示す第３のデータを取得するステップに応じて、第３の所望の表現型の変化をもたらす前記最適な組合せ物質および前記最適な３元組合せ物質のうちの前記物質の最適濃度を決定するステップと
をさらに含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記容器の中に入れるステップは、前記最適な組合せ物質を複数の前記容器の中に入れ、前記最適な３元組合せ物質を、前記第３の容器アレイの中の前記容器のうちの他の複数の容器の中に入れるステップを含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記容器の中に入れるステップはさらに、少なくとも１つの他の３元組合せ物質を前記第３の容器アレイの中のさらに他の前記容器の中に入れるステップを含み、
前記接触させるステップはさらに、前記容器の中に入れられた他の３元組合せ物質を前記関心のある細胞と接触させるステップを含み、
前記データを取得するステップは、前記関心のある細胞と前記最適な組合せ物質、前記最適な３元組合せ物質および前記他の３元組合せ物質との間の接触による前記関心のある細胞の表現型の変化を示す前記第３のデータを取得するステップに応じて、前記第３の所望の表現型の変化をもたらす前記最適な組合せ物質、前記最適な３元組合せ物質および前記他の３元組合せ物質のうちの前記物質の前記最適濃度を決定するステップを含む
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養条件を最適化する複数の物質の最良の濃度をさまざまな反応に基づいて識別する最適化戦略を提供する自動化された方法であって、
複数のそれぞれの物質をそれぞれの総称因子名にマップする統計的計画を生成するステップと、
さらに、それぞれの前記物質の少なくとも１つの濃度をそれぞれの因子レベルにマップする前記統計的計画を生成するステップと、
さらに、第１、第２および第３の容器アレイの中の複数の容器のそれぞれの位置をマップする前記統計的計画を生成するステップと、
前記第１の容器アレイの中の前記容器の中の前記物質のそれぞれの２元組合せと接触して置かれた前記関心のある細胞の反応に基づいて、最適な組合せ物質を決定するステップと、
前記第２の容器アレイの中の前記容器の中の前記物質のそれぞれの３元組合せと接触して置かれた前記関心のある細胞の反応に基づいて、最適な３元組合せ物質を決定するステップと、
前記第３の容器アレイの中の前記容器のうちのある容器の中の前記最適な組合せ物質および前記第３の容器アレイの中の前記容器のうちの他のある容器の中の前記最適な３元組合せ物質と接触して置かれた前記関心のある細胞の反応に基づいて、最適な物質濃度を決定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記決定するステップは、前記最適な組合せ物質、前記最適な３元組合せ物質および前記最適な物質濃度を、前記第１、第２および第３の容器アレイの前記容器の中の前記関心のある細胞の観察されたそれぞれの表現型の変化に基づいて決定することを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２元組合せはそれぞれ、前記物質のうちのある濃度の２つの物質を含み、前記３元組合せはそれぞれ、前記物質のうちのある濃度の３つの物質を含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記２元組合せの前記物質のうちの前記濃度の前記２つの物質は、
前記２つの物質のうちの第１の濃度値の一方の物質、および前記２つの物質のうちの第２の濃度値の他方の物質と、
前記２つの物質のうちの第３の濃度値の一方の物質、および前記２つの物質のうちの第４の濃度値の他方の物質と
のうちの一方を含み、
前記３元組合せの前記物質のうちの前記濃度の前記３つの物質は、それぞれの第５の濃度値の前記３つの物質を含む
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２つの物質のうちの前記一方の物質の前記第１の濃度値は、前記２つの物質のうちの前記一方の物質の前記第３の濃度値よりも小さいか、またはそれに等しく、
前記２つの物質のうちの前記他方の物質の前記第２の濃度値は、前記２つの物質のうちの前記他方の物質の前記第４の濃度値よりも小さいか、またはそれに等しい
ことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数の物質の最適濃度をさまざまな反応に基づいて識別する最適化戦略を提供する自動化された方法であって、
部分集合の最適濃度評価に含めるための少なくとも１つの２物質組合せ部分集合を、統計学的に作成された第１のプレートレイアウトを使用して識別するステップと、
部分集合の最適濃度評価に含めるための少なくとも１つの３物質組合せ部分集合を、統計学的に作成された第２のプレートレイアウトを使用して識別するステップと、
前記識別された前記２物質組合せ部分集合および前記３物質組合せ部分集合から、少なくとも１つの最適物質濃度を、統計学的に作成された第３の最適化プレートレイアウトを使用して識別するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
第１の物質と第２の物質が組み合わされ、少なくとも一方の物質濃度レベルが、高濃度レベルと低濃度レベルの間で変更された複数の物質から、少なくとも１つの２物質組合せ部分集合を識別するステップをさらに含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１６に記載の自動化された方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの３物質組合せ部分集合を、第１、第２および第３の物質が組み合わされた複数の物質から識別するステップをさらに含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１６に記載の自動化された方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの物質濃度レベルが複数の物質濃度レベル間で変更された、前記２物質組合せ部分集合および前記３物質組合せ部分集合から、少なくとも１つの最適物質濃度を識別するステップをさらに含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１６に記載の自動化された方法。
【請求項２０】
前記２物質組合せ部分集合および前記３物質組合せ部分集合から、少なくとも１つの最適物質濃度を、前記２物質組合せ部分集合および前記３物質組合せ部分集合と接触して置かれた場合の関心のある細胞の表現型の変化を示すデータに基づいて識別するステップをさらに含むことを特徴とする最適化戦略を提供する請求項１６に記載の自動化された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、高処理能力スクリーニング法の分野に関する。本発明は、所望の反応を引き出す作用物質混合物を識別する目的に使用することができ、具体的には、細胞培養条件を最適化する２種または３種のペプトンからなる最良の集合および／または部分集合を、抗体分泌、細胞数、ピーク抗体分泌までの時間などのさまざまな反応に基づいて識別する目的に使用することができる、コンピュータによって実現されるスクリーニングシステムおよびスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの病気を治療し、または、治癒させる療法で細胞を使用するためには、これらの細胞がインビトロ（in vitro）培養で維持される場合に、細胞の運命（cell fate）、例えば細胞の生存、増殖および分化を制御することが望ましい。したがって、細胞表面レセプタとリガンドとの間の相互作用を制御する必要がある。例えば、細胞とインビトロ培養基板（culture substrate）上に存在するリガンドとの間の相互作用を制御するために、ポリスチレンなどの適当な培養基板を、培養基（culture medium）に血清タンパクが使用されている場合でも細胞の付着を許さないポリマーでコーティングすることができる。したがってこのコーティングは、血清タンパクの無制御かつ不定の吸着を排除する。次いで、細胞表面レセプタと相互作用させるのに適した生物学的に活性のリガンドを、そのリガンドの生物学的活性を保ったまま、このコーティング上に固定することができる。この発想は当業者によく知られている。例えば、ヒアルロン酸またはアルギン酸を表面コーティングとして使用し、このコーティングの表面に、コーティングと細胞接着リガンドとの間に安定な共有結合を形成する反応を使用して細胞接着リガンドを固定することができることが知られている。これは、細胞接着リガンドが可溶化され、表面から離れることを防ぐ。また、コーティング自体は細胞接着を支援しない（特許文献１参照）。
【０００３】
さらに、所望の細胞の運命を得るためには、作用物質の特定の混合物が必要となる。多数の成長エフェクタ分子が知られている。これらには成長因子、ホルモン、ペプチド、小分子および細胞外結合分子が含まれる。しかしながら、所与の細胞タイプに対して所望の細胞の運命を得るための適当な成長エフェクタまたは成長エフェクタの組合せを見つけ出す作業は、時間のかかる根気の要る作業になりがちである。
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第１０／２５９７９７号明細書（同一所有権者の同時係属出願。２００２年９月３０日出願）
【特許文献２】米国特許第５８０８９１８号明細書（Ｆｉｎｋ他）
【特許文献３】米国特許出願第１０／２５９８１７号明細書（同一所有権者の同時係属出願。２００２年９月３０日出願）
【非特許文献１】E. Junowicz and S. Charm, "The Derivatization of Oxidized Polysaccharides for Protein Immobilization and Affinity Chromatography," Biachimica et. Biophysica Acta, Vol. 428: 157-165 (1976)
【非特許文献２】"Protein Immobilization: Fundamentals and Applications" Richard F. Taylor編、M. Dekker社刊、NY, 1991
【非特許文献３】"Peptide Growth Factors and Their Receptors I" M.B. Sporn and A.B. Roberts編、Springer-Verlag社刊、NY, 1990
【非特許文献４】Kleinman et al., "Use of Extracellular Matrix Components for Cell Culture," Analytical Biochemistry 166: 1-13 (1987)
【非特許文献５】Freshney, "Cell Culture, A Manual of Basic Technique",  第３版、Wiley-Liss社刊、NY, 1994.
【非特許文献６】Taylor et al., "Automated Assay Optimization With Integrated Statistics And Smart Robotics", Journal Of Bimolecular Screening, 5(4): 213-225, August 2000
【非特許文献７】Wolcke et al., "Miniaturized HTS Technologies - uHTS", Drug Discovery Today, 6 (12): 637-646, June 15, 2001
【非特許文献８】Lutz et al., "Experimental Design For High-Throughput Screening", Drug Delivery Today, 1 (7): 277-286, July 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、所与の細胞タイプに対して所望の細胞の運命を得るために有用な作用物質を識別する、高処理能力のシステムおよび方法が求められている。これは、従来の細胞培養系では生存しない細胞、またはその分化状態を抜本的に変化させないと生存しない細胞に関して特に興味深い。このような細胞の適例は哺乳類の１次細胞である。具体的には当技術分野では、所望の細胞の運命を得るために必要な因子の混合物間の相互作用を系統的に調べるための、コンピュータによって実現される統計的に計画された実験方法、ならびにそれを実施するためのシステムが求められている。本発明にかかる高処理能力のシステムおよび方法は、ペプトンなどの可能ないくつかの作用物質のリストから出発することを含み、細胞培養条件を最適化する２種または３種のペプトンからなる最良の部分集合をさまざまな反応に基づいて識別する最適化戦略を実現することが好ましい。これらの反応には、抗体分泌、細胞数およびピーク抗体分泌の期間が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、細胞の表現型の変化を引き起こす作用物質を識別するための自動化されたシステムおよび方法を提供することにある。この方法は、アレイの形態の容器を用意し、総称因子名（generic factor name）、因子レベルおよび実験ラン（experimental run）を含む統計的計画を用意することを含む。この方法はさらに、統計的計画のコンピュータ表現に従って、選択された容器の中に単独作用物質のさまざまな混合物を入れ、ソフトウェアプログラムを利用して計画のコンピュータ表現を生成することを含む。このソフトウェアは、作用物質の識別を総称因子名に自動的にマップし、作用物質の濃度または量を因子レベルにマップし、アレイ中の容器の位置を実験ランにマップする。計画のコンピュータ表現に従って容器の中にさまざまな混合物が正確に入れられた後、入れられた混合物を、自身の表現型を変化させる能力がある完全な細胞と接触させる。
【０００７】
本発明の他の目的は、接触させた細胞の表現型の変化を示すデータを取得する方法を提供し、取得されたデータを統計的計画と比較して、どの作用物質混合物および／またはどの単独作用物質が、接触させた細胞の表現型の変化を引き起こすのに有効であるのかを識別するアルゴリズムを含むプロセッサを利用することを含む。この方法はさらに、統計的計画、作用物質の識別、計画のコンピュータ表現、取得された実験データおよびアルゴリズム比較の結果を、１つまたは複数のデータベースに記憶することを含む。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記方法を実施するためのシステムを提供することを含み、容器のアレイを含み、このうちの選択された容器が、（ｉ）単独作用物質のさまざまな質混合物と（ii）細胞を含む流体とを受け取る。このシステムはさらに、総称因子名、因子レベルおよび実験ランを含む統計的計画と、この計画のコンピュータ表現を生成するためのソフトウェアプログラムとを含む。このソフトウェアプログラムは、作用物質の識別を総称因子名に自動的にマップし、作用物質の濃度または量を因子レベルにマップし、アレイ中の容器の位置を実験ランにマップする。このシステムはさらに、細胞の表現型の変化を指示する取得された実験データと、実験データを統計的計画と比較して、細胞の表現型の変化を引き起こすのに有効な混合物および／または単独作用物質を識別するアルゴリズムを含むプロセッサとを含む。このシステムにはさらに、統計的計画、作用物質の識別、計画のコンピュータ表現、取得された実験データおよびアルゴリズム比較の結果を記憶するための１つまたは複数のデータベースが含まれる。
【０００９】
本発明の他の目的は、ＭＰＭ／ＣＡＴＳＢＡソフトウェアおよびロボット液体取扱いプラットホームを使用してユーザが媒質成分（例えば因子）を最適化することができる、自動媒質最適化技術を適用することにある。特定の因子を使用して、ＭＰＭ／ＣＡＴＳＢＡソフトウェアは、統計的に計画されたマルチウェルプレートフォーマットの実験を自動的に生み出し、ロボット液体取扱いプラットホーム（例えばＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓまたは同様のプラットホーム）を使用して適切な実験条件を準備するのに必要なファイルを生成する。このソフトウェアおよびそれが備えるデータベースを使用して、多数のフォーマットのデータ（例えば蛍光、吸光度、細胞数など）を自動的に分類し解析する。ソフトウェアユーザは、関連した全ての統計解析を自動化された方法で実行することができ、関連した全ての報告が自動的に生成され、このデータベースに記憶される。関連した全ての統計解析が実行された後、ユーザは、メタアナリシスおよびデータマイニングのために複数の実験の結果を結合することができる。
【００１０】
本発明のこれらの目的、利点および新規の特徴、ならびに他の目的、利点および新規の特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面を参照して読んだときに、より容易に理解されよう。
【発明の効果】
【００１１】
以上説明したように、本発明によれば、細胞の表現型の変化を引き起こす作用物質を識別するための自動化されたシステムおよび方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書では「作用物質（agent）」が、細胞に結合し、標的細胞または組織の生存、分化、増殖または成熟を調節する成長エフェクタ分子と定義される。本発明の実施形態で使用される適当な作用物質の例には、ペプトン、成長因子、細胞外基質分子、ペプチド、ホルモンおよびサイトカインが含まれ、これらは溶解状態で存在し、またはウェル表面、スカフォルド（scaffold）表面、ビーズ表面などの培養表面に結合して存在することができる。
【００１３】
本明細書では用語「作用物質固定材（agent-immobilizing material）」が、培養表面と作用物質との間の結合の役目を果たすことができる生物適合性ポリマーと定義される。
【００１４】
本明細書では用語「固定する（immobilize）」、「固定される（immobilized）」等が、作用物質、すなわち成長エフェクタ分子を、ウェル表面、ウェルの中に含まれるスカフォルドの表面などの培養表面で不動化することと定義される。この用語は、培養表面への作用物質の受動吸着、および培養表面への作用物質の直接または間接の共有結合性付着を包含する。
【００１５】
「因子（factor）」は実験の変量の名称であり、実験の１つの試行ないしラン（run）（例えば１つのウェル）と次の試行ないしランとの間で変更される要素を表す。本発明の実施形態では、「因子」が、単独作用物質または単独作用物質の混合物の総称名である。因子は、統計的計画に従って組み合わせられて、実験のさまざまな混合物を形成する。
【００１６】
本明細書では「統計的計画（statistical design）」が、最良の実験結果をもたらす調整可能な変量（すなわち因子）の組合せを見つけ出す際にユーザを支援し、その目的を達成するために必要な実験の数を劇的に減らす実験計画と定義される。本発明の実施形態では、試験される作用物質を表す総称因子名を使用して適当な統計的計画が生成される。この計画は、因子の量および／または濃度とすることができる因子レベルを含み、あるいは因子の実際の量および／または濃度に変換することができる因子レベルを含む。この計画はさらに番号が付けられた実験ランを含む。実験ランは、試験する因子とそれらの因子のレベルの組合せを指定し、それぞれの実験ランは、マルチウェルプレート上の単一のウェルに対応することができる。実験ランは、総称（generic）マルチウェルプレート上のウェルにマップすることができる。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「前処理（pre-treatment）」および「前処理された（pre-treated）」は、続いて形成される作用物質固定材（すなわち生物適合性ポリマー）との共有結合に化学的に関与する官能基を、表面または他の基板に付加することを指す。例えば、作用物質固定材が結合することができる高アミン（amine-rich）表面を生み出すために、マイクロタイターウェルの表面をアミノ−プラズマ処理にかけることができる。
【００１８】
本明細書では用語「アレイ（array）」、「容器（receptacle）アレイ」等が、行／列などのように規則的に配置された管、ウェルなどの複数の独特の容器と定義される。
【００１９】
本明細書では用語「表現型」、「表現型の変化」等が、遺伝子構造および環境の影響によって決定される、生物の観測可能な物理的または生化学的特徴を含む。これには、抗体分泌、細胞数、ピーク抗体分泌までの時間など、遺伝子および環境の影響に基づく特定の特性の発現が含まれる。
【００２０】
前述のとおり、所望の細胞の運命を得るためには単独作用物質の混合物が必要となる可能性が高い。例えば、細胞表面レセプタに結合し、これらの細胞の生存、分化、増殖または成熟を調節する成長エフェクタ分子には、成長因子、細胞外基質分子、ペプチド、ホルモンおよびサイトカインが含まれ、これらには多くの例がある。したがって、細胞と接触させて所望の細胞の運命を得るための適当な成長エフェクタまたは成長エフェクタの組合せを見つけ出す作業は、時間のかかる根気の要る作業になりがちである。
【００２１】
本発明の実施形態は、所与の細胞タイプに対して最適な作用物質を識別する、コンピュータを用いて実現される高処理能力の方法を提供することによって、当技術分野の１つの課題を解決する。具体的には、後に詳細に説明するシステムおよび方法が、ペプトンなどのいくつかの可能な作用物質のリストを調べ、細胞培養条件を最適化する２種または３種のペプトンからなる最良の部分集合を、抗体分泌、細胞数、ピーク抗体分泌までの時間などのさまざまな反応に基づいて識別する。
【００２２】
図１Ａおよび１Ｂは、細胞の表現型の変化を引き出す能力を有するユニークな混合物および／または単独作用物質を識別することができる、本発明の一実施形態に基づくプロセスの一例の流れ図である。後述する実施形態では、使用されるフォーマットがマイクロウェルアレイである。自動ピペッタおよびプレートリーダが容易に使用可能であるため、このようなアレイは一般に自動化によく適している。
【００２３】
流れ図１０の最初のステップでは、ブロック１００においてユーザが、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）から入手可能なＪＭＰ（商標）などの市販ソフトウェアを使用して実験計画を作成し、またはシステムのソフトウェアの中に既に含まれているアルゴリズムに基づいて統計的計画を生成する。ブロック１００の計画には、総称因子名、因子レベル、実験ランおよび総称マイクロウェルアレイへの実験ランのマッピングが含まれる。この統計的計画は、ブロック１０２においてデータベースに記憶される。ユーザは次いでブロック１０４において、具体的な作用物質ならびにそれらの濃度および／または量をソフトウェアに入力する。このユーザ入力は、ブロック１０６においてデータベースに記憶される。
【００２４】
ブロック１０７においてユーザは、特定の統計的計画を選択することができる。続いてブロック１０８において、ソフトウェアプログラムを利用して、この特定の統計的計画のコンピュータ表現が生成される。この計画のコンピュータ表現は、例えば９６ウェルレイアウトに変換することができるスプレッドシートとすることができる。具体的には、このコンピュータ表現を生成するために使用されるソフトウェアプログラムが、具体的な作用物質の名称をその計画の総称因子名にマップし、作用物質の濃度および／または量をその計画の因子レベルにマップし、具体的な作用物質ならびにそれらの濃度および／または量に基づいて実験ランを生成し、特定のマイクロウェルアレイ上のウェル位置を実験ランにマップする。次いでブロック１１０において、このコンピュータ表現がデータベースに記憶される。
【００２５】
ブロック１１２において、この計画のコンピュータ表現に基づくロボットシステムのためのコンピュータプログラムが生成される。図１Ｂの流れ図１５に示されたブロック１１４において、このロボットシステムは、この計画のコンピュータ表現に従って作用物質をウェルに分配して、マイクロウェルアレイの選択されたウェルの中に、２種および３種の作用物質の部分集合混合物を含む異なる混合物が生成されるようにする。好ましくは、このロボットシステムは、マイクロウェルアレイの他のウェルに単独作用物質を分配することができる。試薬の添加の他に、このロボットシステムによって回収および洗浄ステップを実行することができる。あるいはこれらのステップの一部または全部を手動で実行することもできる。作用物質は、アルギン酸、ヒアルロン酸などの生物適合性ポリマーを介してウェルまたは他の培養表面に共有結合によって結び付けておくことができ、あるいは溶解状態で存在することができる。
【００２６】
作用物質が正確にウェルに入れられた後、ロボットシステムはブロック１１６において、完全な細胞を含む流体をマイクロウェルアレイのウェルに分配する。ブロック１１８において、細胞の表現型の変化を指示していると思われる実験データを取得する。この取得したデータは、ブロック１２０において、この実験データがこの計画のコンピュータ表現に関連付けられるようにして、データベースに記憶される。次いでブロック１２２において、記憶した実験データを記憶した統計的計画と比較して、最良の混合物および／または最良の作用物質を識別するアルゴリズム、具体的には所望の生物学的反応を引き出した（すなわち細胞の表現型の変化を引き出した）２種または３種からなる部分集合を識別するアルゴリズム、を含むプロセッサを利用する。任意選択で、複数の実験にわたって作用物質の混合物または単独作用物質の性能を比較して、傾向またはパターンを決定する別のアルゴリズムを使用することもできる。どちらの場合もブロック１２４において、このアルゴリズム比較の結果をデータベースに記憶し、ユーザに表示することができ、定期的に更新することもできる。
【００２７】
図１Ａおよび１Ｂに示されたデータベースは、単一の統合または連合（federated）データベースとすることができる。所望ならばブロック１２６において、最良の混合物の部分集合または最良の作用物質の部分集合を用いてこのプロセスのステップを繰り返すことができる。さらに、所望ならば、最良の作用物質と最良の混合物中の作用物質の部分集合とを組み合わせた部分集合を用いて、これらのステップを繰り返すこともできる（図示せず）。さらにブロック１２８において、最良の混合物の中の作用物質の濃度および／または量を変更して、このプロセスのステップを繰り返すことができる。さらに、ブロック１２２におけるアルゴリズム比較によって取得された情報を最適に使用して、ブロック１３０において、生物学的モデルを作成し、または修正することができる。
【００２８】
次に図２を参照すると、図１Ｂのブロック１２２および１２４の情報を使用して生物学的モデルを作成し、または既存のモデルを修正することができる、本発明に基づくプロセスの一例の流れ図が示されている。流れ図２０の最初のステップでは、ブロック２００において、論文、雑誌、書籍、専門家、実験、内部情報などのさまざまな情報源から科学情報が集められる。科学情報は、遺伝子発現データ、タンパク質発現データ、細胞表現型データ、信号変換（signal transduction）データ、細胞経路（cellular pathway）に関するデータ、およびこれらの組合せを含むことができる。ただし、これらに限定されるわけではない。このような科学情報は、１つまたは複数のデータベースに記憶することができる。この情報は、インターネットなどを介して、コンピュータによって抽出することができる。
【００２９】
抽出された情報は、ブロック２０２において、図１Ｂのブロック１２２において識別された作用物質混合物および／または単独作用物質と比較される。この比較に基づいて、ブロック２０４において生物学的モデルを作成し、または修正することができる。この生物学的モデルは、表現型の変化に関与する生体系および生体系間の関連伝達機構を定義することができる。例えばブロック２０４において、細胞の表現型の変化に関連する特定の細胞経路、タンパク質または遺伝子を識別することができる。一実施形態では、図１Ｂに記載されたプロセッサがさらに、細胞経路、タンパク質または遺伝子が、識別された単独作用物質の混合物に関連した細胞の表現型の変化に関与する可能性を計算する第１のアプリケーションプログラムを含む。細胞経路、タンパク質または遺伝子は、抽出された科学情報を使用して決定される。
【００３０】
図２では、生物学的モデルをコンピュータ実行可能モデルとすることができ、このコンピュータ実行可能モデルは、ブロック２０６において実行され、ブロック２０８において正確さがチェックされ、必要ならばブロック２１０において修正される。このモデルが正確であると判定されると、ブロック２１２において、このモデルを使用することができる。生体系のコンピュータ実行可能モデルの一例が、特許文献２に記載されている。このモデルは、計算、更新、比較および視覚化をサポートすることができることが望ましい。
【００３１】
図３に、作用物質混合物（Ｍ）の生体系に対する作用に関して仮定された細胞経路のモデルの一例を示す。図３のモデル３０では、作用物質混合物（Ｍ）は、仮定の生物学的経路３００および３０２と相互作用することによって細胞に作用する。混合物（Ｍ）とこれらの経路の間の弧（arc）は、これらの経路に対する混合物（Ｍ）の可能な作用を表している。細胞に対する混合物（Ｍ）の全作用は、これらの２つの経路のうちの一方または両方に対する混合物（Ｍ）の作用の組合せとして表現できると仮定する。本明細書で使用される場合、細胞経路は一般に、関係する細胞成分の集合と理解され、この集合のそれぞれの細胞成分は、ある生物学的機構に従って、この集合の他の１つまたは複数の細胞成分から影響を受ける。特定の細胞経路を構成する細胞成分は、細胞の生物学的状態の任意の態様、例えば転写状態または翻訳状態または活性状態または生物学的状態の混合態様から取り出すことができる。
【００３２】
細胞経路の細胞成分は、ｍＲＮＡレベル、タンパク質量、タンパク質活性、タンパク質または核酸修飾（例えばリン酸化またはメチル化）の程度、これらのタイプの細胞成分の組合せなどを含むことができる。それぞれの細胞成分は、その集合の他の少なくとも１つの細胞成分から、ある生物学的機構によって影響を受ける。１つの細胞成分から他の細胞成分への影響は、それが直接であるか、または間接であるかに関わらず、２つの細胞成分間の弧として表され、経路全体は、細胞成分を細胞経路にリンクする弧のネットワークとして提示される。
【００３３】
図３では、生物学的経路３００が、タンパク質Ｐ１（例えば、Ｐ１の量または活性）および遺伝子Ｇ１、Ｇ２およびＧ３（例えば、それらの転写されたｍＲＮＡレベル）を含む。生物学的経路３００はさらに、Ｐ１からこれらの３つの遺伝子まで延びる弧として表された、タンパク質Ｐ１のこれらの３遺伝子に対する直接または間接の影響を含む。この影響は例えば、タンパク質Ｐ１がこれらの遺伝子のプロモータに結合することができ、それらの転写産物の量を増大させることができることによって生じる。図３には細胞経路３０２も示されている。この経路では、タンパク質Ｐ２およびＰ３の両方が、直接に遺伝子Ｇに影響を及ぼす。遺伝子Ｇは、おそらく間接的に遺伝子Ｇ４、Ｇ５およびＧ６に影響を及ぼす。
【００３４】
特定の経路、タンパク質または遺伝子を確認するため、細胞の生物学的状態、例えば転写状態、翻訳状態または活性状態の態様は、細胞の表現型の変化を引き出すと識別された単独作用物質の混合物の存在下で測定することができる。これは、図１Ｂのブロック１２２に対応する。一例では、識別された単独作用物質混合物の存在下で細胞によって発現された遺伝子および／またはタンパク質を識別することによって、細胞経路または機構を識別することができる。他の例では、識別された単独作用物質混合物の存在下で活性化された細胞上のレセプタを識別することによって、細胞経路または機構を識別することができる。
【００３５】
図４に、図１から３で説明した方法の実施に適したコンピュータシステムの一例を示す。ブロック図４０には、図示の実施形態ではコンピュータシステム４００が、内部コンポーネントを含み、外部コンポーネントに接続されているものとして示されている。内部コンポーネントには、メインメモリ４０４と相互接続したプロセッサ４０２が含まれる。一例ではコンピュータシステム４００が、メインメモリ３２Ｍｂ以上を有し、クロックレート２００ＭＨｚ以上のＩｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ベースのプロセッサである。外部コンポーネントには、一般にプロセッサおよびメモリと一緒に実装される１つまたは複数のハードディスク４０６が含まれる。外部コンポーネントにはさらに、協力して実験データをコンピュータシステム４００に伝えることを可能にするインタフェースボード４０５、マイクロウェルプレートリーダ４０７およびマイクロウェルアレイ４０９が含まれる。外部コンポーネントにはさらに、図４に示された１０個の細胞外基質タンパク質（ＥＣＭ）などの実験因子を、ユーザによって選択された統計的計画に従ってマイクロウェルアレイ４０９の容器（receptacle）に入れるロボットシステム４１１が含まれる。
【００３６】
他の外部コンポーネントには、モニタおよびキーボードとすることができるユーザインタフェース装置４０８、および「マウス」または他のグラフィック入力装置（図示せず）とすることができるポインティングデバイス４１０が含まれる。一般にコンピュータシステム４００は、さらにネットワークリンク４１２にリンクされ、ネットワークリンク４１２は、他のローカルコンピュータシステム、リモートコンピュータシステムまたはインターネットへのＥｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）リンクの一部とすることができる。このネットワークリンク４１２は、コンピュータシステム４００が、他のコンピュータシステムとデータおよび処理タスクを共有することを可能にする。
【００３７】
メモリ４０４には、当業者によく知られている標準のソフトウェアコンポーネントと、本発明の実施形態に特有のコンポーネントの両方がいくつかロードされる。これらのソフトウェアコンポーネントは協力して、コンピュータシステム４００が、本発明の少なくとも１つの実施形態の方法に従って機能するようにする。これらのソフトウェアコンポーネントは一般に、ハードディスク４０６上に記憶される。ソフトウェアコンポーネント４１４は、コンピュータシステム４００およびそのネットワーク相互接続の管理に責任を負うオペレーティングシステムを表す。適当なオペレーティングシステムの例は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９８またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴである。ソフトウェアコンポーネント４１５は、マイクロウェルプレートリーダ４０７からの画像を解析するために提供され、ソフトウェアコンポーネント４１６は、システム４００上に存在し、この実施形態に固有の方法を実現するプログラムを支援する、共通言語および関数を表す。これらの解析法のプログラミングに使用することができる言語は、Ｊａｖａ（登録商標）を含むが、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃまたは他のコンピュータ言語を含んでもよい。
【００３８】
一例では、この方法を、使用されるアルゴリズムを含む式および高位処理指定の記号入力を可能にし、それによって個々の式またはアルゴリズムを手順を踏んでプログラムする必要性からユーザを解放する数学ソフトウェアパッケージでプログラムすることができる。このようなパッケージには、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社（米マサチューセッツ州Ｎａｔｉｃｋ）から入手可能なＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米イリノイ州Ｃｈａｍｐａｉｇｎ）から入手可能なＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、Ｍａｔｈｓｏｆｔ社（米ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ）から入手可能なＳ−Ｐｌｕｓ、Ｍａｔｈｓｏｆｔ社（米マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）から入手可能なＭａｔｈＣＡＤ、およびＲ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから入手可能な「Ｒ」が含まれる。したがって、ソフトウェアコンポーネント４１８は、手続き型言語または記号パッケージ（symbolic package）でプログラムされた方法を表す。
【００３９】
図４のシステムでは、ソフトウェアコンポーネント４１８がさらに、図５のブロック図５０に示すように互いに相互作用するいくつかのソフトウェアコンポーネントを含む。ソフトウェアコンポーネント５００はデータベースを表し、これは、コンピュータシステム４００のオペレーションのために必要なデータを含む単一の統合または連合データベースであることが好ましい。このようなデータには、統計的計画、統計的計画のコンピュータ表現、実験データ、アルゴリズム結果、具体的な試験作用物質の名称、試験作用物質の量および／または濃度、ならびに実験で使用されるウェル位置（well locations）が含まれることが好ましい。
【００４０】
ソフトウェアコンポーネント５０２はユーザインタフェース（ＵＩ）を表し、これは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００、Ｘ１１などのオペレーティングシステムを表示するグラフィック方法であるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）であることが好ましい。ユーザインタフェース５０２は、統計的計画、具体的な作用物質、それらの濃度および／または量、ならびに任意選択の実験データに関する制御および入力をコンピュータシステム４００のユーザに提供する。ユーザインタフェースはさらに、ハードドライブ４０６、リムーバブルメディア（例えばＣＤ−ＲＯＭ）、またはインターネットなどのネットワークを介してシステムと通信している別のコンピュータシステムから、実験データなどの情報をロードするための手段を含むことができる。
【００４１】
ソフトウェアコンポーネント５０４は、コンピュータシステムの他のソフトウェアコンポーネントを制御するＵＩサーバと呼ぶことができる、制御ソフトウェアを表す。ソフトウェアコンポーネント５０６は、本発明の解析方法を実行するアルゴリズムを含むデータ整理／計算コンポーネントを表す。コンポーネント５０６は例えば、取得された実験データを統計的計画と比較して最良の混合物および／または最良の作用物質を識別するためのアルゴリズムを含むことができる。このデータをソフトウェアにインポートし、このデータに完全な注釈が付けられ、統計解析にすぐに使用できるように、統計的計画に自動的に関連付けることができる。コンポーネント５０６はさらに、複数の実験にわたって混合物または作用物質の性能を比較して、傾向またはパターンを決定するアルゴリズムを含むことができ、この傾向またはパターンは、記憶し、所望ならば定期的に更新することができる。一実施形態ではソフトウェアコンポーネント５０６が線形回帰アルゴリズムを含む。これは、統計的計画に使用されている作用物質ごとに係数が推定される方法である。
【００４２】
ソフトウェアコンポーネント４１８はさらに、統計的計画のコンピュータ表現を生成するためのソフトウェアコンポーネント５０８、およびロボットシステムが、データベース５００に記憶された統計的計画に基づいてアレイ４０９のウェルに作用物質を正確に入れるためのソフトウェアコンポーネント５１０を含むことができる。例えばユーザは、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓなどのロボット試料調製プラットホームにインポートすることができるコンピュータファイルを生成するオプションを、ユーザインタフェース５０２を介して選択することができる。これらのコンピュータファイルを使用して、マイクロウェルアレイ上の適切な実験条件を自動的に準備し、細胞を培養し、流体分配、流体回収または洗浄ステップを実行して、表現型の分析を実行することができる。
【００４３】
さらに、実験が実施されている実際の実験室から遠く離れた顧客位置から前述の方法を実施することができる。これは、ウェブベースのインタフェースを含み、またはシッククライアント（thick-client）ソフトウェアアプリケーションの顧客への配布を含むことができる。実験室と顧客との間の対話のレベルはさまざまであることができる。例えば、顧客はプロセスを完全に制御することでき、あるいは顧客は、最適な作用物質混合物を得る際の進捗に関する定期報告だけを実験室から受け取ることができる。
【００４４】
次に図６を参照すると、試験ウェルの例６０および６５が示されており、これらはそれぞれアレイ（図示せず）として提供された容器１０を含む。容器１０は表面１２を含み、この表面は前処理することができる。作用物質固定材１６を付着させることができる高アミン表面１４を生み出すため、一例では表面１２がアミノ−プラズマ処理される。後に詳述するとおり、作用物質固定材１６は、アミノ化された表面１４に結合された、生物適合性ポリマーであることが好ましい。
【００４５】
図示された実施形態では、単独作用物質２０、例えば２０ａ〜ｄの混合物１８が、共有結合によって作用物質固定材１６に固定されている。しかし、試験作用物質の一部または全部が培養表面には結合しておらず溶解状態で存在することもできる。この方法の一例では、単独作用物質の混合物が、共有結合によって、容器の表面、容器の中に含まれるカフォルドの表面などの培養表面の作用物質固定材に固定される。他の例では、単独作用物質の混合物を、培養表面に受動的に吸着させることができる。さらに、混合物中の作用物質の一部または全部が溶解状態で存在することができ、前述のとおり、試験に適した作用物質には、成長因子、細胞外基質分子、ペプチド、ホルモンおよびサイトカインが含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。さらに、小分子、金属、キレート剤または酵素を作用物質としてウェルに加えることができる。
【００４６】
単独作用物質２０のさまざまな混合物１８が、後に詳述する統計的計画に従って容器１０に入れられる。図６に示すように、容器１０ａの中の作用物質２０ａ〜ｄの組成は、単独作用物質２０ｅ〜ｈを含む第２の容器１０ｂの中の組成とは異なる。しかし、２つ以上の容器が同じ作用物質を含むことができることに留意されたい。例えば、所与の作用物質が、他の作用物質のある組合せによって取り囲まれた場合には、所望の細胞の運命の達成に対して肯定的な効果を有し、この同じ作用物質が、作用物質の別の組合せによって取り囲まれた場合には、所望の細胞の運命の達成に対して中立の効果を有し、または効果を全く持たないこともできる。したがって、これらの効果を評価するため、他の作用物質とのさまざまな組成で作用物質を提供することが有益であろう。
【００４７】
図６を再び参照すると、統計的計画に従って作用物質２０を異なる混合物としてさまざまな容器１０に入れた後、これらの混合物１８を全細胞（whole cell）２２と接触させる。作用物質２０は細胞２２に結合し、作用物質２０は、接触した細胞内に所望の生物学的反応を生み出す能力を有する。所与の作用物質混合物またはこの混合物内の単独作用物質がその細胞タイプ内に所望の反応を引き出す効果に関する判定は、取得された実験データに基づいて確認される。このデータは、免疫細胞化学分析、顕微鏡法または機能分析（functional assay）を含む方法を使用して取得することができる。ただし方法はこれらに限定されるわけではない。
【００４８】
次に、図７から９を参照して統計的計画の諸態様を詳細に説明する。図７を参照すると、行Ａ〜Ｈおよび列１〜１２からなる９６ウェルプレートなどのマイクロウェルアレイ２４に対応する容器１０が、図７のレイアウト７０として示されている。図７に示すように、図６の単独作用物質２０または混合物１８の識別が総称因子名によって表されている。これらの因子は実験の変量である。例えば図７に示した実施形態では、総称因子１〜１０が、囲み２８の中に示された１０個の単独細胞外基質タンパク質を表す。この例では、総称因子１がコラーゲンＩ、総称因子２がコラーゲンＩＩＩなどとなっている。これらの各因子を１つまたは複数の他の因子と組み合わせて、このプレートレイアウト用の混合物を生成することができる。
【００４９】
次に図７に示した実施形態を参照して、図８Ａ、８Ｂ、９Ａおよび９Ｂを説明する。これらの図ではそれぞれの総称因子１〜１０が、所与の濃度または量（すなわち因子レベル）の単独作用物質に対応する。
【００５０】
図８Ａおよび８Ｂに示すように、容器１０内の流体体積全体が１０の等容積区画３２に分割されるシナリオ８０が提示される。９６ウェルプレートのウェルはそれぞれ、１０の因子（例えば単独作用物質）を全て含み、またはこれらの因子の部分集合を含むことができる。図８Ａに示すように、シナリオ８０では、１０の因子が全て存在し、１０の因子全てが流体区画３２を占める。図８Ａに示されたウェル１０の全体因子濃度はしたがって、
［１０／１０］＝［１］
である。これは、１ウェルあたり［１］の全体因子濃度を提供する。
【００５１】
図８Ｂは、例えば同じ９６ウェルプレート上の別のウェルシナリオを表す。シナリオ８５では、１０の因子のうち５つの因子しか存在しない。この場合も流体体積は１０の等しい区画３２に分割される。シナリオ８５では、因子が存在する場合、流体区画はその因子で満たされる。しかし８５では、１０の容積区画のうちの５つが因子で満たされておらず、それらは培養基などの「プレースホルダ（place holder）」で満たされている。図８Ｂでは全体因子濃度が以下のようになる。  
［５／１０］＝［０．５］
【００５２】
したがって、図８Ｂに示したウェルの全体因子濃度は、１ウェルあたり［０．５］である。シナリオ８０の全体因子濃度とシナリオ８５の全体因子濃度とは異なる。したがって、それぞれの容器内の作用物質の全体濃度は異なることができる。さらに、シナリオ８０とシナリオ８５とでは、共に単一の因子の濃度がウェル間で同じである。例えば、単一のコラーゲンＩリガンドを表すことができる因子１の濃度は、シナリオ８０のウェルとシナリオ８５のウェルとで同じである。
【００５３】
次に図９Ａおよび９Ｂを参照すると、表面化学要件に特定の考慮が与えられた別の２つのシナリオが提示されている。具体的にはこれらのシナリオでは、全体因子密度がウェル間で一定に保たれ、ウェル間で因子組成だけを変更することができる。言い換えると、ウェル間で因子の濃度は異なっていてもよいが、それぞれのウェルは全体として固定された同じ量の因子を有する。
【００５４】
図９Ａおよび９Ｂに示すように、所与のウェル内に存在する流体体積全体は、存在する因子の数に基づいて分割される。この場合も、簡単にするために１つの因子が１つの単独作用物質に対応すると仮定することができるが、示された実施形態は、１つの単独作用物質に限定されない。図９Ａのシナリオ９０に示すように、１０の因子が全て存在し、全体因子濃度は
［１０／１０］＝［１］
であり、１ウェルあたりの全体因子濃度は［１］である。
【００５５】
図９Ｂのシナリオ９５では、１０の因子のうち５つだけが存在するが、これら５つのそれぞれの因子の流体体積３２は、図９Ａに示したそれぞれの因子の容積３２の２倍である。その結果、図９Ｂに示した全体因子濃度は、図９Ａに示した全体因子濃度と同じであり、１ウェルあたりの全体因子濃度は［１］である。
【００５６】
したがって、それぞれの容器の中の作用物質の全体濃度は同じである。図９Ａおよび９Ｂに基づくと、全体因子濃度は、９Ａに示したウェルと９Ｂに示したウェルとの間で一定だが、単一の因子の濃度はこれらのウェル間で異なることができることが理解される。具体的には、コラーゲンＩを表すことができる因子１に関して、図９Ｂの中のこの単独作用物質の濃度は、図９Ａに示したそれの２倍になろう。したがって、他の例では、個々の作用物質の濃度が容器間で異なる。図８および９に示したシナリオはそれぞれ実行可能であり、これらを、単独作用物質の混合物のスクリーニングに使用することができることに留意されたい。
【００５７】
前述の方法は、マイクロウェルアレイなどのフォーマットを使用して、複数の異なる作用物質混合物を所与の細胞タイプに結合し、その細胞の中で望ましい反応を引き出す能力に関して同時にクリーニングする。これらの方法は、マルチウェルプレートの選択されたウェルの中に、統計的計画に従って異なる作用物質混合物を入れることを含む。これらの方法はさらに、それ以外のウェルに単独作用物質を入れる任意選択のステップを含むことができる。
【００５８】
これらの方法はさらに、細胞タイプを含む流体試料をウェルに送達することを含む。これらのさまざまなウェルの中での細胞と試料との間の適当な培養（incubation）時間の後に、細胞とウェル成分との間の相互作用の形跡を、直接または間接に検出することができる。例えば、抗体分泌、細胞数およびピーク抗体分泌などの反応を測定するために、機能分析、免疫細胞化学または顕微鏡法を使用してデータを取得することができる。
【００５９】
本発明の実施形態と共に使用される適当な統計的計画には、一部実施要因計画（fractional factorial design）、Ｄ−最適計画（D-optimal design）、混合計画（mixture design）およびプラケット−バーマン計画（Plackett-Burman design）が含まれる。ただし、これらに限定されるわけではない。統計的計画は、カバレッジ基準に基づく空間充填計画（space-filling design）、格子計画（lattice design）またはラテン方格計画（latin square design）とすることもできる。
【００６０】
前述のとおり、作用物質は培養表面（例えば容器表面またはスカフォルド表面）に結合された状態、または溶解状態で存在することができる。例えば一例では、培養表面が作用物質固定材でコーティングされる。培養表面は前処理されていてもよい。作用物質固定材は、細胞接着は支援しないが、培養表面と作用物質の間の柔軟な結合またはテザー（tether）として機能することができる生物適合性ポリマーであることが望ましい。適当なポリマーの例には、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシルエチルメタクリレート、ポリアクリルアミドのような合成ポリマー、ならびにヒアルロン酸およびアルギン酸などの天然ポリマーが含まれる。
【００６１】
培養表面（例えばウェル表面）は、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロカーボンおよびナイロンから選択される。ただし、これらに限定されるわけではない。培養基板はさらに、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体などのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチレート、ポリホスファゼン、ポリプロピルフマレート（polypropyl fumarate）、生物分解性ポリウレタンなどの生物分解性材料を、完全にまたは部分的に含むことができる。
【００６２】
培養表面はさらに、前処理することができる。例えば、アンモニア環境でのポリマーのプラズマ放電処理によって、第１級アミンを有する細胞培養表面を調製することができる。一例では、先に参照した特許文献１に記載されているように、標準固定化反応（standard immobilization chemistry）を使用して、これらのアミノ化された表面に作用物質固定材を共有結合によって付着させることができる。
【００６３】
処理された組織培養ポリスチレンを生み出す、商業的に使用される２つのプロセスは、いずれも当業者によく知られている大気プラズマ処理（コロナ放電としても知られている）および真空プラズマ処理である。プラズマは、ガス状イオンとフリーラジカルとの、非常に反応性の高い混合物である。アミノ−プラズマ処理または酸素／窒素プラズマ処理を使用して高アミン表面を生み出すことができ、この高アミン表面には、先に参照した特許文献１に記載されたカルボジイミド生物共役反応（bioconjugate chemistry）を使用して、ヒアルロン酸（ＨＡ）、またはアルギン酸（ＡＡ）などの生物適合性ポリマーをカルボキシル基を介して結合させることができる。その結果得られる表面は、細胞培養基中に高濃度の血清タンパク、例えば濃度１０〜２０％の血清タンパクが存在しても、細胞の付着を許さない。
【００６４】
作用物質固定材を介して作用物質を共有結合させるために使用することができる、前処理された組織培養ポリスチレン製品の例は、ポリスチレンの酸素−窒素プラズマ処理を使用して生み出され、酸素および窒素を含むアミノ基、アミド基などの官能基が取り込まれた、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社から入手可能なＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）組織培養製品である。
【００６５】
続いて、細胞外基質タンパク質、ペプチドなどの作用物質を、前述のＨＡまたはＡＡ表面に共有結合させることができ、これには、タンパク質／ペプチド上のアミン基と、ＨＡまたはＡＡ上のカルボキシル基、あるいは例えば過ヨウ素酸ナトリウムなどの物質を使用した酸化によってＨＡまたはＡＡ上に生み出されたアルデヒド基とを利用することができる。
【００６６】
一例では、ヒトの胎盤のヒアルロン酸の末端の糖を、非特許文献１に記載された過ヨウ素酸法によって活性化することができる。この手法は、過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸カリウムをヒアルロン酸溶液に加え、それによって末端の糖を活性化することを含み、この末端の糖は、作用物質の遊離アミノ基、例えば細胞外基質タンパク質の末端アミノ基に化学的に架橋することができる。
【００６７】
他の例では、カルボジイミドを架橋剤として使用して、ＨＡまたはＡＡなどの生物適合性ポリマーの遊離カルボキシル基を、作用物質の遊離アミノ基に化学的に架橋させる。他の標準固定化反応は当業者によく知られており、それらを使用して、培養表面を生物適合性ポリマーに接合し、生物適合性ポリマーを作用物質に接合することができる（特許文献１または非特許文献２参照）。
【００６８】
生物適合性ポリマーを介して作用物質をアミノ化された組織培養表面に結び付け、または生物適合性ポリマーを介して作用物質を、標準固定化反応を使用してカルボキシ化された表面またはヒドロキシル化された表面に結び付けることができる。付着作用物質の例には、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロリド、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシドおよびマレイミドが含まれる。繰返しになるが、作用物質は溶解状態で存在することができ、培養表面に結合されている必要はないことに留意されたい。
【００６９】
前述のとおり、この方法は、培養表面に結合されて、または溶解状態で存在することができる、選択された容器の中に含まれる作用物質の混合物を提供する。さらに、それ以外の容器が単独作用物質を含んでもよく、これらの作用物質は望ましい割合で組み合わせることができる。容器の中に存在する異なる作用物質の相対量は例えば、容器に分配される組成物中の作用物質の濃度によって制御することができる。
【００７０】
さらに、作用物質が生物適合性ポリマーを介して容器表面に共有結合によって付着される場合には、培養表面に結合された生物適合性ポリマーの容量を調整することによって装填密度を制御することができる。これは、作用物質と反応することができるポリマー上の反応基の数を制御することによって、または培養表面の生物適合性ポリマー分子の密度を制御することによって達成することができる。さらに、最初に作用物質を別々に生物適合性ポリマー（すなわちテザー）に結合させ、次いでこの「装填された」テザーを望ましい割合で混合し、前処理された基板に付着させることもできる。
【００７１】
作用物質は溶解状態にあり、かつ／または表面に結合されていることができる。例えば、作用物質は、高アミン表面であることが好ましい前処理された組織培養表面に生物適合性ポリマーを介して共有結合によって固定することができる。あるいは、作用物質は、作用物質を表面に受動吸着させることによって容器表面に固定することもできる。作用物質はさらに、ビーズなどの固体担体上に予め固定され、次いでこれらのビーズを容器に加えることができる。続いて、容器の中のビーズと接触した細胞タイプの反応を検出することができる。単独作用物質を含むビーズの混合物を組み合わせて、作用物質混合物を形成することができる。あるいは、単独作用物質の混合物をビーズに固定することもできる。
【００７２】
また、作用物質をスカフォルド上に固定し、またはスカフォルド内に含浸させ、このスカフォルドを容器に入れ、細胞を含む流体と接触させることができる。上述の実施形態で使用される適当なスカフォルド、および作用物質をスカフォルドに固定し、またはスカフォルドの内部に固定するための方法が、特許文献３に記載されている。
【００７３】
上述の実施形態で使用される容器は通常の任意の形態をとることができるが、マイクロウェルまたは管（tube）であることが好ましい。マイクロタイター（microtitre）ウェル、管などの構成は特に有用であり、多数の試料の自動同時検定を効率的に実行することを可能にする。自動ピペッタおよびプレートリーダが使用可能なため、マイクロタイターウェルは広範囲にわたる自動化が可能である。他の固相、特に他のプラスチック固体担体を使用することもできる。
【００７４】
一例では、容器が、９６ウェルマイクロタイタープレート（すなわちマイクロウェルアレイ）のウェルを備える。当業者に知られているこのようなマイクロタイタープレート用の試薬添加および洗浄ステップのための自動ピペッティング装置および色リーダは既に存在する。このような自動化された装置の一例は、ピペッティングステーションおよび検出装置（例えばプレートリーダ）を含むことができ、このピペッティングステーションは、サーモスタット環境（すなわち温度制御環境）において特定の時点に試薬をウェルに加え、試薬を除去する順次操作を実行する能力を有する。
【００７５】
前述のとおり、これらの実施形態で使用される作用物質には、細胞表面のレセプタに結合し、あるいはイオンチャネルまたはイオン輸送によって取り込まれ、標的細胞または組織の成長、複製または分化を調節する成長エフェクタ分子が含まれる。一例では、これらの作用物質が細胞接着リガンドおよび／または外部因子である。他の例では、作用物質を、細胞外基質タンパク質、細胞外基質タンパク質断片、ペプチド、成長因子、サイトカインおよびこれらの組合せとすることができ、細胞培養条件を最適化するために使用される２種および３種のペプトンからなる集合および部分集合を含む、後に詳細に説明する例を含む。
【００７６】
好ましい作用物質は、成長因子、細胞外基質分子、サイトカイン、ペプチド、ホルモン、金属、キレート剤または酵素である。成長因子の例には、血管内皮由来成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子、ヘパリン結合因子、インスリン様成長因子ＩまたはＩＩ、線維芽細胞成長因子、エリトロポエチン神経成長因子、骨形態形成タンパク質、筋形態形成タンパク質、および当業者に知られている他の因子が含まれる。ただし、これらに限定されるわけではない。他の適当な成長因子は、非特許文献３に記載されている。
【００７７】
このような成長因子は、当業者によく知られている方法を使用して組織から分離することができる。例えば、成長因子は組織から分離し、または組換え手段によって生成することができる。上皮成長因子はマウスの顎下腺から分離することができ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（米カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）はＴＧＦ−βを組換えによって生成している。他の成長因子も天然体と組換え体の両方の形態が、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（米ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏｎ（米カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）などの販売会社から入手可能である。
【００７８】
この実施形態で使用される適当な細胞外基質分子の例には、ビトロネクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびプロテオグリカンが含まれる。その他の細胞外基質分子は、非特許文献４に記載されている。
【００７９】
上述の方法において有用な追加の作用物質には、インターロイキン、ＧＭコロニー刺激因子などのサイトカインおよびインスリンなどのホルモンが含まれる。これらは先に参照した文献に記載されており、市販されている。
【００８０】
これらの実施形態と共に使用される細胞は、作用物質に潜在的に反応することができ、または成長のためにその作用物質を必要とする任意の細胞である。例えば細胞は、株化細胞系から得ることができ、または分離された組織から分離することができる。適当な細胞には、ほとんどの上皮および内皮細胞タイプ、例えば肝細胞などの実質細胞、膵島細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、外分泌細胞、腸管起源の細胞、胆管細胞、副甲状腺細胞、上皮小体細胞、甲状腺細胞、副腎−視床下部下垂体アクセス（adrenal-hypothalamic-pituitary access）の細胞、心筋細胞、腎臓上皮細胞、腎臓尿細管細胞、腎臓基底膜細胞、神経細胞、血管細胞、ならびに骨および軟骨、平滑筋および骨格筋を形成する細胞が含まれる。
【００８１】
他の有用な細胞には、選択された作用物質混合物に反応して表現型の変化を受けることができる幹細胞が含まれる。他の適当な細胞には、血球、臍帯血由来細胞、臍帯血由来幹細胞、臍帯血由来前駆細胞、臍帯由来細胞、胎盤由来細胞、骨髄由来細胞および羊水由来の細胞が含まれる。これらの細胞は遺伝子操作することができ、かつ／または９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルなどの容器の中で、作用物質と共に培養することができる。これらの細胞は、非特許文献５に記載されている技法など、当業者によく知られている多数の細胞培養法のいずれかを使用して培養することができる。その他の細胞培養基および細胞培養法は当業者によく知られており、それらを、本発明の上述の実施形態で使用することもできる。
【００８２】
細胞は、溶解状態の作用物質またはマイクロタイタープレートなどの標準組織培養容器に結合された作用物質の存在下で培養することができる。直径が１０ミクロン程度であることが好ましいビーズまたは繊維に結び付けられた作用物質を使用して、懸濁液中で細胞を培養することができる。培養基に加えられると、これらの粒子は細胞に付着し、それによって細胞の成長を刺激し、付着信号を発すると考えられる。
【００８３】
特定の一応用では、上述のシステムおよび方法を適用して、細胞培養条件を最適化する２種または３種のペプトンからなる最良の部分集合を、さまざまな反応に基づいて識別することができる。いくつかの可能なペプトンのリストから出発して、細胞培養条件を最適化する２種または３種のペプトンからなる最良の部分集合を、抗体分泌、細胞数、ピーク抗体分泌までの時間などのさまざまな反応に基づいて識別するための最適化戦略を生み出すことができる。最適化技法は、非特許文献６、７および８でも論じられている。
【００８４】
このシステムおよび方法を、ＭＰＭ／ＣＡＴＳＢＡソフトウェアおよびロボット液体取扱いプラットホーム（robotic liquid-handling platform）を使用してユーザが媒質成分（すなわち因子）を最適化することができる、自動媒質最適化技術として提供することができる。このような特定の因子を使用して、このソフトウェアは、統計的に計画されたマルチウェルプレートフォーマットの実験を自動的に生み出すことができる。このソフトウェアは次いで、ロボット液体取扱いプラットホーム（例えばＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓまたは同様のプラットホーム）を使用して、適切な実験条件を準備するのに必要なファイルを生成する。次いで、このソフトウェアおよびそれが備わっているデータベースを使用して、多数のフォーマットのデータ（すなわち蛍光性、吸光度、細胞数など）を自動的に分類し解析することができる。次いでソフトウェアユーザは、関連した全ての統計解析を自動化された方法で実行することができ、関連した全ての報告が自動的に生成され、このデータベースに記憶される。関連した全ての統計解析が実行された後、ユーザは、メタアナリシスおよびデータマイニングのために複数の実験の結果を結合することができる。
【００８５】
この例では、このシステムおよび方法は、最初のステップにおいて、試験の策定および基本的な細胞培養条件の決定を開始する。具体的には、図１Ａのブロック１００に示されているように、ユーザは、因子（すなわちペプトン）およびそれらの因子の濃度を、ＧＵＩを介して、ソフトウェア（すなわちＭＰＭ／ＣＡＴＳＢＡ）に指示する。ユーザは、ブロック１０７に示されているように、適当な統計的計画を選択し、ソフトウェアは、ブロック１０８に示されているように、特定の因子およびそれらの因子の濃度を含む適切な実験プロトコルを自動的に作成する。次いでユーザは、ブロック１１２に示されているように、ロボット試料調製プラットホーム（例えばＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓまたは同様のプラットホーム）によってインポートすることができる必要なコンピュータファイルを自動的に作成する、ソフトウェアの中の１つのオプションを選択する。
【００８６】
第２のステップでは、ペプトンの最適濃度を１つずつ決定するために、９６ウェルプレートに希釈系列が提供される。これらのコンピュータファイルを使用して、図１Ｂのブロック１１４に示されているように、９６ウェルプレート上に適切な実験条件を自動的に準備する。作用物質が正確にウェルに入れられた後、ロボットシステムはブロック１１６において、完全な細胞を含む流体をマイクロウェルアレイのウェルに分配する。分析の結果がソフトウェアにインポートされ、このデータに完全な注釈が付けられ、統計解析にすぐに使用できるように、実験の記述に自動的に関連付けられる。
【００８７】
具体的には、ブロック１１８において、細胞の表現型の変化を指示していると思われる実験データが取得され、この取得されたデータはブロック１２０において、この実験データがこの計画のコンピュータ表現に関連付けられるようにして、データベースに記憶される。次いでブロック１２２において、記憶された実験データを記憶された統計的計画と比較して、所望の生物学的反応を引き出した（すなわち細胞の表現型の変化を引き出した）最適濃度を識別するアルゴリズムを含むプロセッサが利用される。ブロック１２４において、このアルゴリズム比較の結果をデータベースに記憶し、ユーザに表示することができ、定期的に更新することもできる。
【００８８】
９６ウェルプレートにて得られた実験を使用して、２種および／または３種のペプトンからなる最良の部分集合を識別し、振盪フラスコ内で検証する。すなわち、９６ウェルプレートでの最適化実験は、最良の部分集合中のペプトンの最良の濃度を決定し、フラスコ内で検証する。
【００８９】
次いでベークオフ（bake-off）が、９６ウェルプレートの中のカスタマー媒質（customer medium）および適当な制御に対する最良の部分集合／最良の濃度を提供し、これらが振盪フラスコ内で検証される。図１Ａおよび１Ｂに再び戻ると、使用されたカスタマー媒質および適当な制御を含むデータベースは、単一の統合または連合データベースとすることができる。ブロック１２６において、最良の混合物の部分集合または最良の作用物質の部分集合を用いてこのプロセスのステップを繰り返すことができる。さらに、所望ならば、最良の作用物質と最良の混合物中の作用物質の部分集合とを組み合わせた部分集合を用いてこれらのステップを繰り返すこともできる。さらにブロック１２８において、最良の混合物の中の作用物質の濃度および／または量を変更してこのステップを繰り返すことができ、これらのステップは、追加のバリデーションおよび品質管理（ＱＣ）を用いて、これらの最良の条件をスケールアップすることができる。ブロック１２２のアルゴリズム比較によって取得された情報を最適に使用して、ブロック１３０において、生物学的モデルを作成し、または修正することができる。
【００９０】
ユーザは、関連する全ての統計解析を、ソフトウェアアプリケーションによって提供された情報から、自動化された方法で実行することができる。次いでレポートを生成し、結果をデータベースに記憶することができる。統計解析の結果に基づいて、ユーザは、最初のステップに戻って次の実験を開始し、または、最良の媒質処方（formulation）のスケールアップに進むことができる。
【００９１】
この特定の例では、作用物質または因子はペプトンに限定されているが、前述のシステムおよび方法は、細胞培養基に加えることができる任意の試薬または因子に応用することができる。前述の実施形態の自動化された最適化の応用では、後に詳述する表において８種のペプトン集合を使用するが、この数は、戦略に影響を及ぼすことなく変更することができる。ただし、特定の計画パラメータの変更は必要となるだろう。
【００９２】
この特定の例は、２種および３種のペプトンからなる最良の部分集合の検出を対象とするが、同じ戦略の範囲内で、最良の部分集合の評価に含まれるペプトンの数を増やし、または減らすことができる。ただし、前述のとおり、特定の計画パラメータの変更が必要となるだろう。さらに、以下の例は９６ウェルプレートを含むが、プレートの実際のフォーマットは変更することができ、それでも戦略全体は依然として有効である。これよりも大きなプレートまたは小さなプレートが使用される場合、計画はそれに応じて修正される必要がある。
【００９３】
この例では、システムおよび方法が、どの部分集合が最良かを決定するために、２種および３種のペプトンからなるペプトンの組合せを一度に対象とする。それぞれが少なくとも２つの異なる濃度レベルを有する８種のペプトンを用いて、この実施形態は、表１に示すように、１枚のプレート上で、２元組合せ（two-way combination）（すなわち、８つから２つを選択する組合せ＝２８通り）の全部を、高濃度と低濃度（すなわち高濃度／高濃度と低濃度／低濃度）の両方で実行することができ、制御のためにいくつかのウェルが残される。さらに、外側のウェルは蒸発のため使用されない。例えば、表１では、ＣＧ  Ｓｏｙが、濃度３．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、ＣＧ  Ｓｏｙの低濃度）および４．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、ＣＧ  Ｓｏｙの高濃度）で評価され、Ｐｈｙｔｏｎｅなどの残りのペプトンは、濃度９．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、Ｐｈｙｔｏｎｅの低濃度）および１０．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、Ｐｈｙｔｏｎｅの高濃度）で評価される。
【００９４】
第２のプレートでは、システムおよび方法が、表２に示すように、１枚のプレート上での、３元組合せ（three-way combination）（すなわち、８つから３つを選択する組合せ＝５６通り）を対象とし、ペプトンごとに単一の濃度レベルが選択され、制御のためにいくつかのウェルが提供される。それぞれのプレート上の制御は、プレート間の比較を可能にし、追加の統計解析を可能にする。例えば、表２では、ＣＧ  Ｓｏｙが、濃度３．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、ＣＧ  Ｓｏｙの単一濃度）で評価され、Ｐｈｙｔｏｎｅ、Ｐｈｙｔｏｎｅ  ＵＦなどの残りのペプトンが、濃度９．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、Ｐｈｙｔｏｎｅの単一濃度）および２．０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、Ｐｈｙｔｏｎｅ  ＵＦの単一濃度）で評価される。
【００９５】
８種のペプトンの集合から、２種のペプトンからなる最良の部分集合が検出されるプレート１のアレイの一例が表１に示されており、これにはさらにいくつかの制御ウェルおよびプレート２から複製されたいくつかのウェルが含まれる。
【００９６】
【表１−１】
2007517524.tif 000003
【００９７】
【表１−２】
2007517524.tif 000004
【００９８】
表１では、ＣＧ  ＳＯＹ、Ｐｈｙｔｏｎｅ、Ｐｈｙｔｏｎｅ  ＵＦ、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ３、Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｗｈｅａｔ、ＹｅａｓｔｏｌａｔｅおよびＹｅａｓｔｏｌａｔｅ  Ｐｌｕｓを含む８種のペプトンが評価に使用される。ペプトンはそれぞれ低濃度または高濃度で含まれる。例えば、ＣＧ  Ｓｏｙは、低濃度として３．０ｍｇ／ｍｌ、高濃度として４．０ｍｇ／ｍｌを含む濃度で使用される。低濃度として９．０ｍｇ／ｍｌ、高濃度として１０．０ｍｇ／ｍｌを含む濃度で使用されるＰｈｙｔｏｎｅとの比較によって示されるように、これらの値はペプトン間で異なることができる。ウェルＩＤ番号は、指示された濃度のペプトンの組合せが入れられるマイクロウェルアレイのウェルを示す。
【００９９】
表１に示すように、ロボットシステムは、選択された所望のペプトン濃度の組合せを、図１Ａのステップ１００〜１１２で作成されたコンピュータ表現に基づいて、自動化された手順で、マイクロウェルアレイのウェルの中に入れる。前述のとおり、表１は、８種のペプトンを使用する応用（application）を表し、この応用は、２種のペプトンからなる全ての２元組合せ（すなわち、８つから２つを選択する組合せ＝２８通り）を、低濃度および高濃度で、１枚のプレートのウェルに入れるための十分な空間を与える。
【０１００】
このシステムおよび方法は次いで、接触させた細胞の表現型の変化を指示する実験データを取得する。具体的には、この例では、指示データが、抗体の成長（すなわち増殖）および分泌（すなわちＩｇＧ分泌／細胞増殖）を含む。システムは次いで、この実験データを、実験計画のコンピュータ表現へのリンクと共に、データベースに記憶することができる。そうすることによって、後に詳述するように、次いでアルゴリズムを適用して、実験データを統計的計画と比較し、ペプトンの最良の組合せ、より具体的には、部分集合の濃度の評価に含めるための２種のペプトンからなる１つの最良の組合せを識別することができる。次いで、８種のペプトンの集合からの３種のペプトンの部分集合に対してこの手順を繰り返すことができる。
【０１０１】
３種のペプトンからなる最良の部分集合が検出されるプレート２のアレイの一例が表２に示されており、これにはさらにいくつかの制御ウェルおよびプレート１から複製されたいくつかのウェルが含まれる。
【０１０２】
【表２−１】
2007517524.tif 000005
【０１０３】
【表２−２】
2007517524.tif 000006
【０１０４】
表２では、ＣＧ  ＳＯＹ、Ｐｈｙｔｏｎｅ、Ｐｈｙｔｏｎｅ  ＵＦ、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ３、Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｗｈｅａｔ、ＹｅａｓｔｏｌａｔｅおよびＹｅａｓｔｏｌａｔｅ  Ｐｌｕｓを含む表１の８種のペプトンが再び評価に使用される。この評価では、それぞれのペプトンが、ペプトンごとに単一の濃度で含まれる。例えば、ＣＧ  Ｓｏｙは、単一の濃度値３．０ｍｇ／ｍｌで使用される。前述のとおり、単一の濃度値９．０ｍｇ／ｍｌで使用されるＰｈｙｔｏｎｅとの比較によって示されるように、これらの値はペプトン間で異なることができる。前述のとおり、ウェルＩＤ番号は、指示された濃度のペプトンの組合せが入れられるマイクロウェルアレイのウェルを示す。
【０１０５】
表２に示すように、ロボットシステムは再び、選択された所望のペプトン濃度の組合せを、図１Ａのステップ１００〜１１２で作成されたコンピュータ表現に基づいて、自動化された手順で、マイクロウェルアレイのウェルの中に入れる。前述のとおり、表２は、８種のペプトンを使用する応用（application）を表し、この応用は、３種のペプトンからなる全ての３元組合せ（すなわち、８つから３つを選択する組合せ＝５６通り）を、それぞれ単一の濃度で、１枚のプレートのウェルに入れるための十分な空間を与える。
【０１０６】
表１と同様に、このシステムおよび方法は次いで、接触させた細胞の表現型の変化を指示する実験データを取得し、この実験データを、実験計画のコンピュータ表現へのリンクと共にデータベースに記憶する。そうすることによって、後に詳述するように、アルゴリズムを適用して、実験データを統計的計画と比較し、ペプトンの最良の組合せ、より具体的には、部分集合の濃度の評価に含めるための３種のペプトンからなる３つの最良の組合せを識別することができる。
【０１０７】
この例では、このシステムおよび方法を適用して、８種のペプトンからなるグループから選択された、２種および３種のペプトンからなる部分集合の最適濃度を決定する（すなわち最適化する）。上記の最良の部分集合の実験の結果は、試験された組合せの中から最良であると判定された、２種および３種のペプトンからなるいくつかの組合せを提供する。ペプトンのこれらの部分集合は、後に詳述する自動化された別の実験に渡され、図１Ｂのブロック１２６および／または１２８において示された標準統計的方法を使用して、それぞれの部分集合に対する最良の濃度が決定される。
【０１０８】
表３の実験計画は、表１から得られた２種のペプトンからなる１つの最良の部分集合、および表２から得られた３種のペプトンからなる３つの最良の部分集合を調べる、最適化プレートの一般的なテンプレートである。異なる集合の中のペプトンは、重複することができる。ペプトンの集合ごとに、中心となる混合計画がプレート上にレイアウトされる。プレートの内側の６０個のウェルを使用して、２種および３種のペプトンからなる最良の部分集合のさまざまな組合せを、最適な濃度に関して評価することができる。
【０１０９】
【表３】
2007517524.tif 000007
【０１１０】
【表４】
2007517524.tif 000008
【０１１１】
表３では、値が、使用されたペプトンのコード化されたレベルを反映する。表３のペプトンは、総称因子Ｆ０１、Ｆ０２、．．．、Ｆ１１として割り当てられている。この例には８種のペプトンしか含まれていないが、異なる部分集合のペプトンは重複することができる。この例では、Ｆ０１およびＦ０２が、表１から決定された、次に最適化される２種のペプトンからなる最良の部分集合の中に含まれるペプトンを表す。部分集合Ｆ０３〜Ｆ０５、Ｆ０６〜Ｆ０８およびＦ０９〜Ｆ１１は、表２から決定された、次に最適化される３種のペプトンからなる３つの最良の部分集合を表す。
【０１１２】
表３のウェルＩＤ番号は、指示された濃度のペプトンの組合せが入れられるマイクロウェルアレイのウェルを示す。計画ＩＤ欄は、どの部分集合の濃度が変更されているかを示す。例えば、計画ＩＤ欄は、２種のペプトンからなる部分集合の濃度が変更された全てのウェルについて、値１を有する。計画ＩＤ欄は、３種のペプトンからなる３つの部分集合（すなわちＦ０３〜Ｆ０５、Ｆ０６〜Ｆ０８およびＦ０９〜Ｆ１１）の濃度が変更されたウェルに対して、それぞれ値２、３および４を有する。表３でＮＡが存在する場合、指示された因子またはペプトンは、そのウェルに含まれない。
【０１１３】
表３を参照すると、最初の欄は、９６ウェルプレートの中の実験ランのそれぞれに対するウェルＩＤ番号を示す。この例では、６０個のランがある。表３のＦ０１、Ｆ０２、．．．、Ｆ１１と記載された欄の数字（−１．４１、−１、０、１、１．４１など）は、因子またはペプトンのレベルまたは濃度のコード化された値を表す。集められた情報から、ペプトンごとに、最適濃度がその中に存在すると考えられる可能な最適濃度の範囲が決定される。この範囲には、後に詳細するように、応答曲面法（Response Surface Methodology : RSM）などの技法を使用して相対値（relative value）が割り当てられる。
【０１１４】
この例では、欄Ｆ０１およびＦ０２に関して、値−１．４１および１．４１がそれぞれ、最初の２種のペプトンの可能な最適濃度の範囲をまたぐ（span）と仮定された最高および最低濃度に対応する。コード化された値−１、０および１に対応するペプトンの濃度は、−１．４１および１．４１の最高濃度と最低濃度との間に位置し、単純な線形変換によって決定することができる。例えば、コード化されたレベル０は、最高濃度と最低濃度との中間の濃度に対応する。
【０１１５】
欄Ｆ０３からＦ１１に関しては、値−１．６８および１．６８がそれぞれ、Ｆ０３からＦ１１として割り当てられた対応するペプトンの可能な最適濃度の範囲をまたぐと仮定された最高および最低濃度に対応する。−１、０および１に対応する濃度は、前述のとおりに決定することができる。このような範囲を定義し、続いて相対値を割り当てる手順の特定の例については、後に詳細に説明する。
【０１１６】
例えば、表１から、２種のペプトンからなる最良の組合せが、濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＣＧ  Ｓｏｙと濃度９．０ｍｇ／ｍｌのＰｈｙｔｏｎｅとの組合せであると判明した場合、これらの値を表３の最適化に適用することができる。表３に関して先に述べたとおり、Ｆ０１およびＦ０２は、表１から最適化すると決定された２種のペプトンからなる最良の部分集合の中に含まれるペプトンを表す。
【０１１７】
この最適化実験では、それぞれのペプトンに対して、最適濃度が存在すると考えられる濃度範囲が決定され、この範囲に相対値が割り当てられる。この範囲を決定する場合には、現在の最良の値（すなわち表１の値）を中心値（center value）として選択することができ、次いで、最適条件を調べるための現在の最良の値の周囲の範囲を定義するために、より高い値およびより低い値を選択することができる。この範囲は、真の最適条件に対する最良の推定値を含むように十分に広くなければならず、良好な統計モデルを提供するように十分に狭くなければならない。多くの応用ではこれが、細胞生物学者や統計学者などの熟練したユーザによる入力を必要とする。
【０１１８】
上記の例に関しては、表３で使用されるＣＧ  Ｓｏｙの範囲に対して、以下の定義された範囲に基づく相対値を割り当てることができる。
Ｘ０＝０⇒ＣＧ  Ｓｏｙ濃度３．０ｍｇ／ｍｌに対応
Ｘ−１＝−１⇒ＣＧ  Ｓｏｙ濃度２．０ｍｇ／ｍｌに対応
Ｘ＋１＝＋１⇒ＣＧ  Ｓｏｙ濃度４．０ｍｇ／ｍｌに対応
ただし、Ｘ０はＣＧ  Ｓｏｙの範囲の中心を表し、Ｘ−１は範囲の下側の増分を表し、Ｘ＋１は範囲の上側の増分を表す。
【０１１９】
コード化された値１の単位変化は、濃度値１ｍｇ／ｍｌであり、したがって、以下のように表すことができる。
Ｘ−１．４１＝−１．４１⇒３．０−（１．４１×１．０）＝ＣＧ  Ｓｏｙ濃度１．５９ｍｇ／ｍｌに対応
Ｘ＋１．４１＝＋１．４１⇒３．０＋（１．４１×１．０）＝ＣＧ  Ｓｏｙ濃度４．４１ｍｇ／ｍｌに対応
【０１２０】
ただし、Ｘ−１．４１はＣＧ  Ｓｏｙの範囲の下側境界を表し、Ｘ＋１．４１は範囲の上側境界を表す。Ｐｈｙｔｏｎｅ値に対しても、同じ手順を適用することができる。
Ｙ０＝０⇒Ｐｈｙｔｏｎｅ濃度９．０ｍｇ／ｍｌに対応
Ｙ−１＝−１⇒Ｐｈｙｔｏｎｅ濃度７．０ｍｇ／ｍｌに対応
Ｙ＋１＝＋１⇒Ｐｈｙｔｏｎｅ濃度１１．０ｍｇ／ｍｌに対応
【０１２１】
コード化された値１の単位変化は、濃度値２ｍｇ／ｍｌであり、したがって、以下のように表すことができる。
Ｙ−１．４１＝−１．４１⇒９．０−（１．４１×２．０）＝Ｐｈｙｔｏｎｅ濃度６．１８ｍｇ／ｍｌに対応
Ｙ＋１．４１＝＋１．４１⇒９．０＋（１．４１×２．０）＝Ｐｈｙｔｏｎｅ濃度１１．８２ｍｇ／ｍｌに対応
【０１２２】
同様の手順は、表２において判明した３種のペプトンからなる最良の組合せにも適用される。表３に関して先に述べたとおり、部分集合Ｆ０３〜Ｆ０５、Ｆ０６〜Ｆ０８およびＦ０９〜Ｆ１１は、表２から最適化すると決定された３種のペプトンからなる３つの最良の部分集合を表す。
【０１２３】
例えば、表２から、３種のペプトンからなる最良の組合せが、濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＣＧ  Ｓｏｙ、濃度２．０ｍｇ／ｍｌのＰｈｙｔｏｎｅ  ＵＦ、濃度７．０ｍｇ／ｍｌのＷｈｅａｔの組合せであると判明した場合、これらの値を表３の最適化に適用することができる。前述のとおり、この範囲は、最適条件を含む領域の最良の推定値として選択される。これらの３つのペプトンの範囲のうちの１つについて、計算例を以下に示す。表３で使用されるＷｈｅａｔの範囲に、以下の定義された範囲に基づく相対値を割り当てることができる。
Ｚ０＝０⇒Ｗｈｅａｔ濃度７．０ｍｇ／ｍｌに対応
Ｚ−１＝−１⇒Ｗｈｅａｔ濃度６．５ｍｇ／ｍｌに対応
Ｚ＋１＝＋１⇒Ｗｈｅａｔ濃度７．５ｍｇ／ｍｌに対応
【０１２４】
コード化された値１の単位変化は、したがって濃度値０．５ｍｇ／ｍｌであり、以下のように表すことができる。
Ｚ−１．６８＝−１．６８⇒７．０−（１．６８×０．５）＝７．０−０．８４＝６．１６
Ｚ＋１．６８＝＋１．６８⇒７．０＋（１．６８×０．５）＝７．０＋０．８４＝７．８４
【０１２５】
上記の実施形態の多くの応用では、２つおよび３つの可変最適化実験における同じ因子に対して、異なる濃度レベルを選択することができる。すなわち、２種および３種のペプトンからなる最良の組合せの両方に因子が存在し、したがって表３の複数の位置で使用される場合、表３の単一のペプトンの範囲が同一である必要はない。
【０１２６】
総称因子名は表３の最上列に示されており、これらは、この例の表１および２に示されたペプトンのさまざまな部分集合に対応する。具体的には、表１におけるペプトンの評価から得られた２種のペプトンからなる最良の部分集合の中の実際のペプトンが、総称因子Ｆ０１およびＦ０２に代入される。表２におけるペプトンの評価から得られた３種のペプトンからなる最初の最良の部分集合の中の実際のペプトンが、総称因子Ｆ０３、Ｆ０４およびＦ０５に代入される。以下同様である。同じペプトンが複数の最良の部分集合に現れる可能性があるため、同じペプトンが、総称因子Ｆ０１、Ｆ０２、．．．、Ｆ１１のうちの２つ以上に対応することがある。
【０１２７】
表１および２のように、ロボットシステムは、選択された所望のペプトン濃度の部分集合を、自動化された手順でマイクロウェルアレイのウェルの中に入れる。表３の評価では、最低または低（すなわち−１．４１）、やや低（すなわち−１）、中間（すなわち０）、やや高（すなわち１）および最高または高（すなわち１．４１）濃度レベルを有する２種のペプトンからなる２元組合せを１枚のプレートのウェルに入れ、最低または低（すなわち−１．６８）、やや低（すなわち−１）、中間（すなわち０）、やや高（すなわち１）および最高または高（すなわち１．６８）濃度を有する３種のペプトンからなる３元組合せを１枚のプレートのウェルに入れるための十分な空間が得られる。しかし、これらの濃度は、同じペプトンに対する表１および２に示された濃度に必ずしも対応せず、これらの濃度は、前述のとおり、特定のペプトンの可能な最適濃度の範囲をまたぐと仮定される濃度である。
【０１２８】
このシステムおよび方法は次いで、接触させた細胞の表現型の変化を示す実験データを取得し、この実験データを、実験計画のコンピュータ表現へのリンクと共にデータベースに記憶する。そうすることによって、次いでアルゴリズムを適用して、実験データを統計的計画と比較し、最良のペプトン濃度値を識別することができる。
【０１２９】
さらに、細胞内の所望の反応を生み出す因子の最適な部分集合を得るため、部分集合を用いてこの実験を繰り返すことができる。さらに、作用物質の濃度を変更して、この実験を繰り返すことができる。さらに、統計学的に有意の主効果を有した単一作用物質の部分集合を用いて、または最良の単一作用物質の部分集合を最良の混合物の中で識別された部分集合と組み合わせることによって、フォローアップ実験を実行することができる。
【０１３０】
上記の実施形態によって提供される結果の一例を、図１８、１９および２０に示す。２種のペプトン組合せの最良のウェル解析を図１８、１９および２０に示す。具体的には、８種の媒質成分を用いた実験から得られたデータを解析し、この最良のウェル解析が、それらのペプトンのうちの３つ、すなわちＰｒｏｔｅｏｓｅ３、ＷｈｅａｔおよびＳｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅが一貫して正の効果を有することを示した。
【０１３１】
図１８は、濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｏｓｅ３を濃度８．０ｍｇ／ｍｌのＷｈｅａｔと組み合わせた、表１のウェルＩＤ番号Ｄ１０によって提供された結果を示す。同様に図１９は、濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｏｓｅ３を濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＳｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅと組み合わせた、表１のウェルＩＤ番号Ｄ１１によって提供された結果を示す。図２０は、濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＳｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅを濃度８．０ｍｇ／ｍｌのＷｈｅａｔと組み合わせた、表１のウェルＩＤ番号Ｃ１１によって提供された結果を示す。この解析によれば、これらの３種のペプトンは、ＨＢ６７細胞およびＩｇＧの分泌および増殖に対して正の効果を有する。次いでこれらの３種のペプトンの部分集合を表３の自動化された最適化テンプレートを使用してさらに評価して、最適濃度を決定することができる。
【０１３２】
上述の実施形態は、従来の実験よりも短時間で完了することができる。具体的には、２種のペプトンからなる最良の部分集合の全てを、１枚のプレート（すなわち表１）上で評価することができ、３種のペプトンからなる最良の部分集合の全てを、別の１枚のプレート（すなわち表２）上で評価することができる。その複製を含めこれらのプレートは共に、他の別個のプレート（すなわち表３）上での１回の実験で同時に評価することができる結果（すなわち部分集合）を提供する。この自動化された実験は、マルチウェルプレートで実施されない従来の実験よりもはるかに高速で効率的である。それぞれのサイズ（すなわち２種および３種）の部分集合は全て、それぞれ同じプレート上で評価されるため、得られるデータはより直接に比較でき、信頼できる。さらに、このフォローアップ最適化実験は、２種および３種のペプトンからなるいくつかの部分集合を、同じプレート上の同じ実験で最適化することを可能にする。これは、別個のプレート上で、かつ／または別個の時刻に、かつ／またはマルチウェルプレートの代替フォーマットで実験を実施するよりも効率的である。
【０１３３】
ＭＰＭ／ＣＡＴＳＢＡソフトウェアなどのソフトウェアパッケージを使用することによって、本発明の上記の実施形態は、最適化戦略の自動化された実現を通して、細胞培養および細胞実験における固有のヒューマンエラーの多くを排除する。これらの実施形態は、物理プレートレイアウトを、自動化された方法で複雑な統計的計画から作成するソフトウェアの実現を可能にする。これらの複雑なプレートレイアウトは次いで、最良の部分集合の課題に対する解答の自動化された評価および決定を、現在使用可能は方法よりも効率的な方法で可能にする。具体的にはこの例では、最適化戦略の自動化された実現（implementation）を使用して、抗体分泌、細胞数およびピーク抗体分泌値までの時間に基づいて、ペプトンの組合せの最良の部分集合を効率的に識別し、その後に、細胞培養条件を最適化する最良のペプトン濃度を効率的に識別する。
【０１３４】
実験計画の知識と自動化された試料調製用のロボットの知識を結合することによって、これらの実施形態は、従来の細胞培養にコンピュータを組み込み、この技術を使用して、単に分析条件を最適化するのではなく、生物系（biological system）を最適化する。
【０１３５】
プレートレイアウト、液体取扱いコマンドおよびデータ解析機能は全て、ソフトウェアを使用して自動的に生成される。この自動化されたプラットホームは、実験プロセスからほとんどのヒューマンエラーを排除する。この技術が使用される前、実験は、ロボット液体取扱いプラットホームに手動でプログラムされ、または実験は、ベンチトップ上に手動で作成された。これらの実験法は共に、手動の操作およびプログラミングエラーによる固有のエラーを含む可能性が高い。
【０１３６】
さらに、ＭＰＭソフトウェアは全てのデータを自動的に解析し、これを使用して、フォローアップ最適化実験を提案することができる。このシステムは、より複雑な媒質最適化問題に対する解答を、非常に効率的な方法で可能にする。さらに、最良の部分集合をピックアップし、続けてそれらの部分集合の濃度を最適化するこの戦略は、計画および実現（implementation）の両面で新規である。この戦略は、複雑なプレートレイアウトを自動化された方法で作成することを可能にし、手動システムにおいて可能なものとは非常に異なる実験および観察をもたらす。例えば、媒質成分のある組合せにおける相乗効果を観察することができる。
【０１３７】
上記の実施形態はさらに、はるかに速いピペッティング速度を提供し、より大きなコスト削減、改善されたデータ解析時間およびロボットプログラミング時間を提供する。試薬コストの削減は、必要な反複回数に、実験方法ごとに必要な最適化実験の回数を掛け、次いで従来の結果を上記の最適化の結果で割ることによって計算される。
【０１３８】
実験が実施されている実際の実験室から遠く離れた顧客位置から前述の方法を実施することができる。これは、ウェブベースのインタフェースを含み、またはシッククライアント（thick-client）ソフトウェアアプリケーションの顧客への配布を含むことができる。対話のレベルは、最適化の現在の状態を示す、動的に生成されたレポートといった単純なものから、顧客によるプロセスの完全な制御までの範囲にわたることができる。さらに、これらの実施形態は、カスタム媒質最適化サービス、カスタムデータ、試薬および実験計画マネジメントサービスに適用できる。
【０１３９】
本発明の実施形態に基づく、追加の統計学的に計画された実験を、以下で詳細に説明する。
（実施例１）
高アミン組織培養表面へのヒアルロン酸の結合
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社は、酸素／窒素プラズマを使用して、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）組織培養製品を作り出す。具体的には、ポリスチレン製品の酸素／窒素プラズマ処理によって、酸素および窒素を含むアミノ基、アミド基などの官能基を取り込む。この実験では、非特許文献２または特許文献１に記載されているものなどの当技術分野でよく知られているカルボジイミド生物共役反応を使用して、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標）マルチウェルプレート上の高アミン表面に、ＨＡのカルボキシル基を介してＨＡを結合させた。
【０１４０】
（実施例２）
ヒアルロン酸へのＥＣＭタンパク質の結合
培養表面に結び付けられた実施例１のＨＡポリマーに、ＥＣＭ作用物質を共有結合によって付着させた。具体的には、非特許文献１に記載された過ヨウ素酸法を使用した酸化によって、ＨＡ上にアルデヒド基を生成させた。この手法は、ＨＡ溶液に過ヨウ素酸ナトリウムを加え、それによって末端の糖を活性化することを含む。続いてこの活性化されたＨＡを、非特許文献２または特許文献１に記載されているものなどの標準固定化反応を使用して、ＥＣＭタンパク質のアミン基に結合させた。
【０１４１】
（実施例３）
統計的に計画された実験（混合物計画）を使用した、異なる１０種類のＥＣＭタンパク質の同時スクリーニング
この実施例では、統計的計画が混合物計画である。この計画を使用して、細胞反応に対して肯定的な効果を有する因子対または単独因子を識別した。この計画は、２つのＥＣＭ間の相互作用を見ることを可能にする。この実施例では、それぞれが単一の「因子」を表す１０種類の単独ＥＣＭを使用して、図７に示した９６ウェルプレートのウェルの中に入れるＥＣＭ混合物を生成する。ＥＣＭは、培養表面の生物適合性ポリマーに共有結合によって付着する（実施例１および２参照）。この実験のための統計的計画がなければ、所与の１つの細胞タイプについてこれらの１０種類のＥＣＭをそれぞれ試験するのに、２１０（１０２４）個の単独実験、すなわち１１枚の９６ウェルプレートが必要となることに留意されたい。
【０１４２】
この実施例では、１０種類の接着リガンドからなる１つのグループを選択し、このスクリーニングのためのフォーマットとして９６ウェルアレイを選択した。不均一な蒸発に起因する周辺効果を排除するため、この実験では９６ウェルアレイの内側の６０個のウェルだけが使用される。したがって、プレートの外側の行および列のウェルは、適当な制御のために使用することができる。
【０１４３】
細胞培養試薬として一般的に使用されていること、市販されていること、および価格に基づいて、以下の１０種類の接着リガンドが選択された：コラーゲンＩ（ＣＩ）、コラーゲンＩＩＩ（ＣＩＩＩ）、コラーゲンＩＶ（ＣＩＶ）、コラーゲンＶＩ（ＣＶＩ）、エラスチン（ＥＬＡ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）、ラミニン（ＬＡＭ）、ポリリジン（ＰＬ）およびポリオルニチン（ＰＯ）。
【０１４４】
表面化学要件に対して特定の考慮を有する統計的計画を作成した。具体的にはこの実験では、全体の接着リガンド密度がウェル間で一定に保たれ、接着リガンド組成だけを変更することができる図９に示したシナリオを使用した。言い換えると、単一の接着リガンドの濃度はウェル間で異なってもよいが、それぞれのウェルは全体として固定された同じ量の接着リガンドを有する。このシナリオは以前に詳細に説明した。このような計画の一例が、図１０のスプレッドシートに示されている。このスプレッドシートは、データベースに記憶された計画のコンピュータ表現の役目を果たす。図９の１番上の行には、この特定のスクリーニングで使用される１０種類の因子（Ａ〜Ｋ）およびそれらの対応する識別が記入されている。図示されたスプレッドシートでは、因子Ａがフィブロネクチンを表し、因子ＢがコラーゲンＩを表す。以下同様である。第１列は、９６ウェルプレート中のウェル、例えばこのケースでは５２個のウェルに変換される実験点のリストである。スプレッドシートの中の数字は因子レベルである。この実施例では、これらのレベルが、特定のウェルに加えられる因子の実際の体積（μｌ）である。この特定の計画では、因子が３段階の体積でウェルに加えられ、例えば５μｌ、２５μｌまたは５０μｌの因子が加えられる。この場合のウェル全体の体積は５０μｌである。したがって、１つの因子が５０μｌ加えられたウェルでは、最終的なウェル組成物が、ウェル表面に共有結合によって固定された単一の接着リガンドを含む。したがって、ウェルにある因子２５μｌが加えられた場合、第２の因子も２５μｌ加えられ、最終的なウェル組成物は、ウェル表面に共有結合によって固定された２種類の異なる細胞接着リガンドからなる混合物を含む。ある１つの因子が５μｌ加えられた場合には、他の９つの因子はそれぞれ同様に５μｌ加えられ、１０種類の全ての細胞接着リガンドからなる混合物をウェル表面に含むウェルが得られる。１０種類の全ての接着リガンドを含むこれらの実験点は「中点（mid point）」と呼ばれ、この実施例の統計的計画の不可欠な部分である。
【０１４５】
次に図１１を参照すると、図１０に示した特定の統計的計画から変換された９６ウェルプレートレイアウトが示されている。具体的にはこの９６ウェルプレートは、それぞれのウェルの底に固定された図１０に示されたウェル組成物、例えば細胞接着リガンドの組合せを含む。具体的には、図１０の実験ランは、図１１の行／列に以下のように対応する：図１０の計画のラン１〜１０はそれぞれ図１１のアレイ上の行Ｂの列２〜１１を表し、ラン１１〜２０は行Ｃの列２〜１１を表し、ラン２１〜３０は行Ｄの列２〜１１を表し、ラン３１〜４０は行Ｅの列２〜１１を表し、ラン４１〜５０は行Ｆの列２〜１１を表し、ラン５１および５２は行Ｇの列２および３を表す。図１０の統計的計画および図１１の対応する９６ウェルプレートレイアウトによって示されているとおり、作用物質の混合物の他に、単独作用物質を容器に入れることができることは本発明の一実施形態である。
【０１４６】
（実施例４）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞に特有なＥＣＭのスクリーニング
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、デューク大学（Duke University）のＬ．Ｄ．Ｑｕａｒｌｅｓ博士によって分離され、米ノースカロライナ州Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌのノースカロライナ大学（University of North Carolina）のＧａｌｅ  Ｌｅｓｔｅｒ博士のご好意で提供いただいたものである。この細胞を、標準細胞培養法を使用して成長させた。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、よく特徴付けされた、急速に成長する骨芽細胞系であり、これを選択したのは、最も一般的に使用されている組織培養表面に積極的に付着するためである。
【０１４７】
トリプシン−ＥＤＴＡを使用し、当技術分野でよく知られている方法に従って、細胞培養フラスコから細胞を取り出した。細胞を計数し、遠心処理し、血清を含まない培養基あるいはウシ胎仔血清を１０％含む培養基に再懸濁させた。図１１に示し、先の実施例３で説明したレイアウトに従って、細胞を９６ウェルマイクロアレイのウェルに平板培養した。接種密度は約１０，０００細胞／ウェルであった。プレート上の細胞は、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、培養基およびウェル表面の固定された作用物質に接着していない細胞を除去した。接着した細胞は、ホルマリンに少なくとも１５分間曝露することによって固定した。ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）を使用して、前記固定された接着細胞の核を蛍光標識した。蛍光顕微鏡（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社の子会社、米ペンシルバニア州Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ）を使用して、ＥＣＭスクリーニングプレート中のウェルに付着し、蛍光標識された細胞の画像を取得した。９６ウェルプレートから取得された画像の一例を図１２に示す。具体的にはこのレイアウトは、行Ｇの列４〜１１が制御ウェルとして使用されている以外は、図１１に示したものと同じである。図１２では、ウシ胎仔血清を１０％含む培養基中のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、ヒアルロン酸表面に結び付けられた作用物質の混合物を含むウェル（ただし、ウェルＧ４〜Ｇ９はヒアルロン酸表面だけを含み、ウェルＧ１０およびＧ１１は組織培養等級のポリスチレンだけを含む）に入れた。予想どおり、ウェルＧ４〜Ｇ９のヒアルロン酸表面だけが細胞接着を妨げた。ウェルＧ１０およびＧ１１のポリスチレン表面への細胞接着は、この例では意外にも低かった。対照的に、それぞれが接着した細胞の核を表す多数の白斑から分かるように、細胞接着リガンドを含むいくつかのウェルは強い細胞接着を示した。
【０１４８】
画像解析ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｔａ  Ｍｏｒｐｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社の子会社、米ペンシルバニア州Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ）を使用して、図１２の蛍光標識された細胞核を数えた。ウシ胎仔血清を含まない培養基中の細胞と、ウシ胎仔血清を１０％含む培養基中の細胞との両方の核計数結果を図１３に示す。図１３のウェル１〜１０は図１２の行Ｂの列２〜１１に対応し、図１３のウェル１１〜２０は、図１２の行Ｃの列２〜１１に対応する。以下同様である。
【０１４９】
図１３では、１０％ウシ胎仔血清の存在下で、いくつかのウェルで細胞接着が観察された。血清がない場合、細胞接着は低減されたが、いくつかのウェルで依然として観察された。両方のケースで、統計的に計画された実験に従って細胞接着リガンドを含むいくつかのウェルの細胞接着は、組織培養等級のプレーンなポリスチレン上で培養された細胞のそれを上回った（図１３のウェル５９および６０）。この得られた結果から、最も一般的に使用されている細胞培養担体である組織培養等級のポリスチレンよりも良好にＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ接着をサポートするいくつかの表面が識別できた。
【０１５０】
表面を最適化するため、２つの手がかり、例えば「最良のウェル」組成または「最良の因子」に従うことができる。「最良の因子」の決定は、実験結果の厳格な統計解析後になされる。
【０１５１】
「最良のウェル」法では、最良の実験結果を有するウェルが選択されて、追加の最適化が実施される。図１３に示した例では、細胞核数が最も多いウェル４０（すなわちウェルＥ１１）が選択される。図１１に示したプレートレイアウトによれば、このウェルは、コラーゲンＶＩ型とコラーゲンＩＩＩ型との混合物を含む。ＥＣＭスクリーニングプレート調製の固定化ステップに対して選択されたコラーゲンＶＩ型とコラーゲンＩＩＩ型の濃度は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用い、モデルＥＣＭであるフィブロネクチンを使用した初期の濃度依存調査に基づくものである。調査対象の１つの細胞タイプに対して最適である濃度は、他の細胞タイプに対しては最適ではないかもしれないことに留意されたい。また、所与の細胞タイプに対して最適である特定のＥＣＭの濃度は、同じ細胞タイプが使用されたとしても、他のＥＣＭに対する最適の濃度ではないかもしれない。同様に、「ヒットウェル（hit well）」中の混合物の組成は最適でないかもしれない。例えば、「最良のウェル」であったウェルＥ１１の表面は、コラーゲンＶＩ型とコラーゲンＩＩＩ型の５０／５０混合物を含んでいた。フォローアップ実験を実行して、固定化ステップに対して選択される両方のリガンドの濃度を最適化し、所与の細胞タイプに対する「ヒット」ウェルの表面に結合された混合物の組成（５０／５０混合物は最適の組成でないかもしれない）を最適化することができる。
【０１５２】
「最良の因子」法では、統計モデルを使用して実験結果が解析される。前述の実施例に関しては、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１データの混合物モデル解析によれば、コラーゲンＩＶ、ラミニンおよびポリ−Ｌ−リジン（効果は限定的）は、血清がない場合、それらがかなりの量存在する場合に、図１４に示すように細胞数を増大させるようである。全ての線が交差する点は、１０種類の全てのＥＣＭが５μｌずつ存在する中点に対応する。このグラフは、ウェル組成がこの基準「中点」ブレンドからどのくらい離れているかに応じて、細胞数がどのように変化するかを指示している。見て分かるとおり、コラーゲンＩＶまたはラミニンの量が増大するにつれて、細胞数は増大している。
【０１５３】
次に図１５を参照すると、血清が１０％存在する場合には、図１４では見られたポリ−Ｌ−リジンの効果が低下し、コラーゲンＩＶおよびラミニンだけが細胞数に対する肯定的な効果を示し続ける。
【０１５４】
「最良のウェル」法と「最良の因子」法の両方が有効であるが、それぞれの方法が異なる表面組成を選択することがありうることに留意されたい。この実施例では、「最良のウェル」法はコラーゲンＶＩ型およびコラーゲンＩＩＩ型を含む表面を選択し、「最良の因子」法はコラーゲンＶＩおよびラミニンを含む表面を選択する。
【０１５５】
（実施例５）
統計的に計画された実験（プラケット−バーマン計画）を使用した、異なる３０種類の作用物質のスクリーニング
計画
この実施例は、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）の市販ソフトウェアパッケージＪＭＰ（商標）を使用して生成された図１６（ａ〜ｂ）に示すプラケット−バーマン（ＰＢ）計画を説明する。具体的には、このスクリーニング計画は、ＳＡＳ／ＪＭＰ  Ｖ  ４．０．５のカスタム計画機能を使用して生成された。このソフトウェアパッケージはＧＵＩ指向のパッケージであり、したがって示すべきコードはない。図１６ａを参照すると、最初の列は、９６ウェルプレートの単一ウェル、例えばこのケースでは、６０個のウェルに変換される実験点（ラン）のリストである。スプレッドシート中の数字（−１または１）（図１６ａ〜ｂ）は、因子レベルの指示である。この実施例では、「１」が因子の存在を指示し、「−１」が因子の不在を指示する。さらにこの実施例では、ある因子が所与のウェルの中に存在する場合、その因子の濃度は常にウェルの総体積に関して同じである。対応する実験ランに含まれる作用物質の数に基づいて、ウェルごとの作用物質の全体濃度は異なってもよい。総称因子名は図１６ａ〜ｂの一番上の行に示されている。図１７は、この実験の総称因子Ｆ０１〜Ｆ３０のそれぞれの識別を示す。例えば、最初の列の実験ラン１は、９６ウェルプレートのウェル１を表すことができる。図１６（ａ〜ｂ）に示した統計的計画から、ウェル１の中には以下の因子が存在する（すなわちレベル「１」）ことが分かる：Ｆ０４、Ｆ０８、Ｆ０９、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１４、Ｆ１６、Ｆ２０、Ｆ２３、Ｆ２５、Ｆ２６、Ｆ２７およびＦ２９。
【０１５６】
提案されたデータ取得および統計解析
図１６（ａ〜ｂ）のスプレッドシートに示された計画に従って、９６ウェルプレートのウェルの中に細胞が平板培養される。接種密度は約１０，０００細胞／ウェルである。プレート上の細胞を３７℃で一晩インキュベートする。次の日、培養基およびウェル表面の固定された作用物質に接着していない細胞を除去し、接着した細胞は、ホルマリンに１５分間曝露することによって固定する。固定された付着細胞の核を蛍光標識し、実施例４で先に説明した蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。画像解析ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｔａ  Ｍｏｒｐｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して蛍光標識された細胞核を数え、細胞の核計数結果を得る。これらの結果に基づいて、最良の実験結果（例えば最も多い細胞核数）を有するウェルが選択されて、追加の最適化が実施される。最良の結果を与えるウェルの内容を調べることによって、どの因子および／または因子群が有益な効果をもたらすかについての情報が得られる。この計画に多くの因子を含めることによって、潜在的に、因子間のより複雑な相互作用を判定することができる。フォローアップスクリーニング実験では、最初のスクリーニングラウンドで発見された、特に興味深い因子の組合せに集中することができる。
【０１５７】
最初のスクリーニングの後で主効果（main effect）が推定され、チェックされる。「主効果」とは、独立に作用している単独作用物質の効果を意味する。相互作用効果は、２種類以上の単独作用物質が協力して（非独立に）作用する場合のこれらの単独作用物質の併用効果を意味する。この時点では、作用物質間の関連相互作用は一般に統計モデルでは推定されないが、作用物質間の相互作用は最良の実験ラン、すなわち最良のウェルに帰着すると予想される。最初のスクリーニングラウンドの後、これらのウェル（レベル＝「１」）に含まれる最良のウェルおよび因子が識別される。それぞれの最良のウェルに対して、予備的な統計解析でそれらのウェルが肯定的、中立のまたは否定的な効果を有していたか否かに関わらず、ウェルの中に含まれる全ての因子を使用してフォローアップ実験を実行することができる。細胞内に望ましい反応を生み出す因子の最適な部分集合を得るため、最良のウェルの中の識別された作用物質の部分集合を用いて、この実験を繰り返すことができる。さらに、最良のウェル中の作用物質の濃度を変更して、この実験を繰り返すこともできる。さらに、統計学的に有意の主効果を有する単独作用物質の部分集合を用いて、または最良の単独作用物質の部分集合を、最良の混合物中の識別された部分集合と組み合わせることによって、フォローアップ実験を実行することもできる。
【０１５８】
細胞外条件による細胞表現型の制御を、細胞外環境内の因子間の高次相互作用によって管理することが提案されている。ここで提示されたプラケット−バーマン計画は、主効果の良好な統計推定値を提供すると考えられ、さらにその実験ランの中で、因子の組合せの多様な集合を観察する機会を提供する。この場合、高次相互作用は、特定の実験ランが、その最良のウェルの中の作用物質の個々の主効果から予測することができるものを凌ぐ「最良のウェル」を与えると予想される。
【０１５９】
本発明の例示的な実施形態をいくつか説明したが、本発明の新規の教示および利点から実質的に逸脱することなく、これらの例示的な実施形態の多くの変更が可能であることを当業者は容易に理解しよう。したがって、このような変更は全て、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１Ａ】細胞の表現型の変化を引き出す能力を有する最良の混合物および／または最良の作用物質を高処理能力で識別することができる本発明の一実施形態に基づく自動プロセスの一例の流れ図である。
【図１Ｂ】細胞の表現型の変化を引き出す能力を有する最良の混合物および／または最良の作用物質を高処理能力で識別することができる本発明の一実施形態に基づく自動プロセスの一例の流れ図である。
【図２】図１Ａおよび１Ｂのプロセスから得られた情報を使用して生物学的モデルを作成しかつ／または修正することができる本発明の一実施形態に基づくプロセスの一例の流れ図である。
【図３】生体系に対する作用物質混合物（Ｍ）の作用に関して仮定される例示的な細胞経路のモデルの一例を示す図である。
【図４】図１〜３の方法を実施するために使用することができる、本発明の一実施形態に基づくコンピュータシステムの一例のブロック図である。
【図５】本発明の一実施形態に基づくシステムのコンポーネントの一例を示すブロック図である。
【図６】本発明の一実施形態に基づく試験ウェルの一例の概略図である。
【図７】本発明の一実施形態に基づく、異なる単独作用物質混合物を含む９６ウェルプレートレイアウトの一例の概略図であり、このレイアウトは統計的計画を使用して作成され、統計的計画では、計画中の総称因子が単独作用物質を表し、これらが組み合わされてさまざまな混合物が形成される。
【図８Ａ】本発明の一実施形態にかかる、方法の統計的計画を作成する際に使用することができるシナリオの一例を示すブロック図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態にかかる、方法の統計的計画を作成する際に使用することができるシナリオの一例を示すブロック図である。
【図９Ａ】本発明の一実施形態にかかる、方法の統計的計画を作成する際に使用することができるシナリオの他の例を示すブロック図である。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態にかかる、方法の統計的計画を作成する際に使用することができるシナリオの他の例を示すブロック図である。
【図１０】本発明の一実施形態にかかる、図９Ａおよび９Ｂのシナリオを使用して作成された、ウェル内の全体流体体積が存在する因子の数に基づいて分割された９６ウェルプレートのレイアウトを有する、混合物計画のスプレッドシートコンピュータ表現の一例を示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態にかかる、図１０のスプレッドシートの統計的計画に基づく９６ウェルプレートレイアウトの一例を示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態にかかる、図１１に示されたレイアウトを有する９６ウェルプレートのウェルに付着させた、蛍光標識された細胞の蛍光顕微鏡画像の一例である。
【図１３】本発明の一実施形態にかかる、図１２の顕微鏡画像の解析の結果得られたウェル番号に対する核数のグラフの一例を示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態にかかる、図９〜１３からの情報の混合物モデル解析を使用して得られた基準ブレンドからの偏差に対するＬｎ（細胞数（血清なし）＋１）のグラフの一例を示す図である。
【図１５】本発明の一実施形態にかかる、図９〜１３からの情報の混合物モデル解析を使用して得られた基準ブレンドからの偏差に対するＬｎ（細胞数（１０％血清）＋１）のグラフの一例を示す図である。
【図１６Ａ】本発明の一実施形態にかかる、９６ウェルプレートレイアウト用のプラケット−バーマン統計的計画を示すスプレッドシートの例を示す図である。
【図１６Ｂ】本発明の一実施形態にかかる、９６ウェルプレートレイアウト用のプラケット−バーマン統計的計画を示すスプレッドシートの例を示す図である。
【図１７】本発明の一実施形態にかかる、図１６の統計的計画の例における因子の識別の一例を示す図である。
【図１８】本発明の一実施形態にかかる、第１の物質についての分泌および細胞増殖を、時間を追って示すグラフの一例を示す図である。
【図１９】本発明の一実施形態にかかる、第２の物質についての分泌および細胞増殖を、時間を追って示すグラフの一例を示す図である。
【図２０】本発明の一実施形態にかかる、第１および第２の物質についての結合した分泌および細胞増殖を、時間を追って示すグラフの一例を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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