(57)【要約】  本発明は、臍帯血（へその緒の血液）由来の血液をヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養することで分離した成体幹細胞である多能性幹細胞及び前記多能性幹細胞を有効成分として含む閉塞性動脈又は静脈疾患による虚血性壊死疾患または心血管疾患用の細胞治療剤に関する。  本発明に係る多能性幹細胞は、成体幹細胞であるにも拘わらず、骨形成細胞または神経細胞または内皮細胞に分化できることから、大腿部の動脈循環の渋滞が抹消循環障害を引き起こし、その結果、微細血管系の組織を崩壊させて虚血性壊死を招く疾病だけではなく、脳梗塞、心筋梗塞、股關節の虚血壊死及び糖尿の後遺症に起因する四肢末端の壊死など虚血性疾病の治療にも有効に利用可能である。
2007528229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血由来の血液を５〜２０％のヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養することにより得られる、下記の特性を有する成体幹細胞：
（ａ）ＣＤ２４，ＣＤ２９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対してすべて陽性の免疫学的な反応を示し、ＣＤ３４，ＣＤ５１／６１，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的な反応を示し；
（ｂ）プラスチックに付着して成長し、丸形状（ｒｏｕｎｄ−ｓｈａｐｅ）または紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的な特性を示し；及び
（ｃ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有する。
【請求項２】
ＳＨ−２及び／またはＳＨ−３に対して陽性の免疫学的な反応をさらに示す請求項１に記載の成体幹細胞。
【請求項３】
ＣＤ４４，ＣＤ１０５及びＣＤ１１７に対して陽性または陰性の免疫学的な反応を示す請求項１に記載の成体幹細胞。
【請求項４】
前記中胚葉由来の細胞は、骨形成細胞、神経細胞または内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）である請求項１に記載の成体幹細胞。
【請求項５】
臍帯血由来の血液を５〜２０％のヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養し、そして成体幹細胞を回収する工程を含む、下記の特性を有する成体幹細胞の製造方法：
（ａ）ＣＤ２４，ＣＤ２９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対してすべて陽性の免疫学的な反応を示し、ＣＤ３４，ＣＤ５１／６１，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的な反応を示し；
（ｂ）プラスチックに付着して成長し、丸形状（ｒｏｕｎｄ−ｓｈａｐｅ）または紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的な特性を示し；及び
（ｃ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有する。
【請求項６】
前記ヒト血清またはプラズマは自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または他家（ａｌｌｏｌｏｇｏｕｓ）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の成体幹細胞を有効成分として含有する閉塞性動脈または静脈疾患による虚血性壊死疾患又は心血管疾患用細胞治療剤。
【請求項８】
前記虚血性壊死疾患は心筋梗塞、脳梗塞、股關節の虚血壊死、バージャー病及び糖尿病性合併症による四肢壞疽病からなる群から選択される閉塞性動脈疾患による虚血性壊死疾患又は心血管疾患用細胞治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯血をヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養することで分離した成体幹細胞である多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）及び、前記多能性幹細胞を有效成分として含む閉塞性動脈疾患による虚血性壊死疾患治療用の細胞治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会における高齢化が進むに伴い、閉塞性動脈疾患による血行障害の症例が増加してきている。かかる血行障害の代表的な疾患としては、心筋梗塞、脳梗塞、手又は足、特に下肢の細動脈や静脈において炎症又は血管壁の変化により血管が収縮したり狭くなったりし、さらに血管が完全に閉塞してしまう閉塞性末梢血管炎であるバージャー病、及び糖尿病性合併症に起因する微小血管や大血管の障害による閉塞性動脈疾患などが挙げられる。
【０００３】
心筋梗塞は、心臓に酸素と栄養を供給する冠状動脈の一部が詰まり、血流の循環が止まり、心臓の壁、すなわち心筋が壊死（えし）する病態である。脳梗塞には、血液の流れが阻害され、それから酸素が足りなくなって脳組織が死んでしまうアテローム性動脈硬化などによって血管が狭くなり、又は詰まる、血栓性脳梗塞及び脳梗塞アテローム性動脈硬化を伴う動脈の血栓から分離した断片（血の塊）が脳血管を沿って流れる間に血管壁で動脈を塞ぎ、妨げるため、それより下流の脳組織が死んでしまう塞栓性脳梗塞がある。
【０００４】
バージャー病は、直接的な原因が明らかになっていないが各種の要素が複合的に作用していると推測されている。年齢や性別、種族遺伝的要因、自己兔疫、職業、喫煙などが２次的原因であると考えられている。また、バージャー病の患者にあっては、血中フィブリノーゲン数値が高いため、血液の過凝固状態や血小板の過凝集状態または交感神経の過敏状態より生じる抹消血管収縮なども原因因子になると推測されている。
【０００５】
また、糖尿合併症のうち最も恐ろしい症状の１つである四肢壊疽は、重病の糖尿病患者に生じ、手足の先が真っ黒く腐ってしまう恐ろしい病気である。正確な原因は不明であるが、外傷、やけど、及び化膿などの症状に起因するとされている。さらに、四肢壊疽は５０歳以後の患者に現れるもので、炎症、水泡、潰瘍、熱などの症状を示し、酷い場合には手足を切断し、さらに命を落としてしまうこともある。
【０００６】
韓国ではこの種の閉塞性動脈疾患の公式統計データがまだ正確にとられていないが、白人より頻度は高く発生し全体抹消動脈疾患の約１５％を占めていると推定されている（Ｌａｏｈａｐｅｎｓａｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，２８（４）：４１８，２００４）。閉塞性動脈疾患とは、遠位の上肢と下肢に小または、中間サイズの動脈と静脈を侵し、ほとんどの四肢末端部の動脈循環の渋滞が抹消循環障害を引き起こすことにより、微細血管系の組織を崩壊させ、結果として、虚血性疾患となる。この虚血性壊死にあっては、動脈血流圧の降下と毛細血管血流の渋滞により白血球と血小板が活性化して血管の内皮を損傷させ、その結果、局部的な低酸素症と代謝変化が招かれる。
【０００７】
閉塞性動脈疾患の治療としては、閉塞された動脈の上下部位間において動脈からの血が円滑に流れるように人造血管などを用いて新しい血管を作る動脈迂回手術がある。また、このほかにも、血管拡張剤を投与する薬物療法と、脚にある小さな血管を拡張するために腰椎部位の交感神経を麻痺する治療法などがある。近年に至り、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １６５）を用いた治療法の開発（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，３６（４）：３３６，２００４）と、自家造血幹細胞の移植を通じた治療法の開発（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１３（４）：４２９，２００４）のための研究が行なわれている。
【０００８】
虚血性壊死の原因は、まだ正確に明らかにされていない、そして疾患が進行性であることから、確実な根治的治療法が確立されていない段階だ。バージャー病などの閉塞性動脈疾患による虚血性壊死を治療の最終的な目標は、動脈血流を円滑にすることである。
【０００９】
一方、幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、自己複製能力を有し、同時に２以上の細胞に分化する能力を有する細胞を言い、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、全能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）及び多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に分類できる。
【００１０】
万能幹細胞とは、単一の完全な個体として生成可能な万能性を有する細胞を言い、卵子と精子が受精してから８細胞期までの細胞がこのような性質を有する。この細胞を分離して子宮に移植すれば、単一の完全な個体として生成可能である。
【００１１】
全能性幹細胞とは、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の各種の細胞及び組織として生成可能な細胞を言い、受精後４〜５日後に現れる胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置する内細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）から由来し、これらの細胞を胚性幹細胞と称する。これは、相異なる組織細胞に分化はできるものの、新しい生命体を形成することはできない。
【００１２】
多能性幹細胞とは、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞にしか分化できない幹細胞を言い、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達はもとより、成体組織の恒常性の保持と組織損傷時の再生を誘導する機能に関与しており、組織特異的な多能性細胞を総称して成体幹細胞と呼ぶ。
【００１３】
今まで知られている臍帯血由来の成体幹細胞としては、骨細胞や骨格筋に分化可能な間葉系幹細胞（Ｌｅｅ，Ｏ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：１６６９，２００４；Ｇａｎｇ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ，３２１：１０２，２００４；Ｇａｎｇ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２２：６１７，２００４）、心臓細胞に分化可能な心臓幹細胞（ＵＳ２００４／０１２６８７９）及び内皮前駆細胞
（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２４：１９２，２００４）などがある。
【００１４】
しかしながら、これらの幹細胞は間葉系幹細胞による骨細胞や骨格筋への分化、心臓幹細胞による心臓細胞への分化、内皮前駆細胞による血管内皮細胞への分化などの限られた組織への分化能しか有さないため、これらの細胞を真の多能性幹細胞と称するには無理がある。また、上述した引用文献においては、幹細胞を分離するプロセスに際してＦＢＳ入り培地を用いているが、これらの方法によれば、得られる細胞の数や種類が限らざるを得ない。
【００１５】
そこで、本発明者らは、臍帯血由来の血液をヒト血清またはプラズマを培地として培養したところ、得られた成体幹細胞がプラスチックへの付着能に優れているだけではなく、骨形成細胞、神経細胞など各種の組織に分化するということを明らかにすると共に、閉塞性動脈疾患による虚血性壊死疾患の細胞治療剤として有効に使用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の主たる目的は、臍帯血由来の成体幹細胞である多能性幹細胞及びその製造方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、前記成体幹細胞を有効成分として含有する閉塞性動脈疾患による虚血性壊死疾患及び心血管疾患の治療用細胞治療剤を提供することにある。
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明は、臍帯血由来の血液を５〜２０％のヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養することにより得られると共に、下記の特性を有する成体幹細胞を提供する：（ａ）ＣＤ２４，ＣＤ２９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対してすべて陽性の免疫学的な反応を示し、ＣＤ３４，ＣＤ５１／６１，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的な反応を示し；（ｂ）プラスチックに付着して成長し、丸形状（ｒｏｕｎｄ−ｓｈａｐｅ）または紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的な特性を示し；及び（ｃ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有する。
【００１９】
また、本発明は、臍帯血由来の血液を５〜２０％のヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養することを特徴とし、前記（ａ）ないし（ｃ）の特性を有する成体幹細胞の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明において、前記成体幹細胞は、ＳＨ−２及び／またはＳＨ−３に対して陽性の免疫学的な反応をさらに示すことを特徴とし、且つ、ＣＤ４４，ＣＤ１０５及びＣＤ１１７に対しては陽性または陰性の免疫学的な反応を示すことを特徴とする。さらに、前記中胚葉由来の細胞は、骨形成細胞、神経細胞または内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）であることを特徴とする。
【００２１】
さらに、本発明は、前記成体幹細胞を有効成分として含有する閉塞性動脈又は静脈疾患による虚血性壊死疾患または心血管疾患用細胞治療剤を提供する。前記虚血性壊死疾患には、心筋梗塞、脳梗塞、股關節の虚血壊死、バージャー病および糖尿病性合併症による四肢壞疽病などがある。
【００２２】
本発明の前記及び他の目的、特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】臍帯血由来の細胞のＦＢＳまたはヒトプラズマ含有培地において培養した場合、細胞接着力を比較したものであって、左側写真は２００倍率で撮影したものであり、右側写真は４００倍率で撮影したものである。
【図２】Ａ及びＢは、臍帯血由来の多能性幹細胞が骨形成細胞に分化されたものであり、Ｃ及びＤは、フォンコッサ（Ｖｏｎ−Ｋｏｓｓａ）染色法で染色したものである。
【図３】臍帯血由来の多能性幹細胞と特異抗原の結合を示すものであって、Ａ及びＢは、それぞれ神経系ニューロンの特異抗原であるＮＳＥ（ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ）と神経系星状細胞の特異抗原であるＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して陽性反応を示すものであり、Ｃ及びＤはその対照群を示すものである。
【図４】フローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた臍帯血由来の多能性幹細胞の免疫学的な特性を示すものである（Ａ及びＥ：対照群、Ｂ：ＣＤ３４、Ｃ：ＣＤ４５、Ｄ：ＳＨ−２、Ｆ：ＳＨ−３）。
【図５】本発明に係る成体幹細胞からの抗原の発現可否を調べるためのＰＡＳ染色結果を示すものである。
【図６】虚血性壊死を伴った対照群マウスの、血管切欠後、３０日の結果を示すもので、赤円は切断現象が発生した部位を示す。
【図７】虚血性壊死を伴ったマウス群の、血管切欠後、本発明による幹細胞の即時投与群の投与後３０日の結果を示すものであり、赤円は切断現象が発生した部位を示す。
【図８】虚血性壊死を伴ったマウス群の、血管切欠後、本発明による幹細胞１日後投与群の投与後の３１日の結果を示すものであり、赤円は切断現象が発生した部位を示す。
【図９】虚血性壊死モデルのマウスにおいて、その症状日及び切断日を図表化したものである。
【図１０】虚血性壊死モデルのマウスにおいて、群別切断率を図表化したものである。
【図１１】虚血性壊死モデルのマウスにおいて、その血管切欠してから３０日後、各群別血管造影法を利用してレントゲン写真を撮ったものである。
【図１２】虚血性壊死を伴ったモデルマウスを剖検後、腿部筋肉部位の組職を切片化することで、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法でヒト特異的プローブ（ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ）を用いてヒト細胞を追跡したことを示すものである。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明は、臍帯血から分離された多能性幹細胞に関する。
【００２５】
本発明における臍帯血は、ヒトを含む哺乳動物において、胎盤と胎児を結ぶ臍帯静脈から採取された血液として定義され、本発明に係る多能性幹細胞は、ヒトの臍帯血が好ましい。
【００２６】
臍帯血から多能性幹細胞を分離・精製する方法には特に制限はないが、下記の方法を用いることができる。すなわち、臍帯血から採取された血液を撹拌するために、ＰＢＳに一定の割合にて希釈して、これを１０〜１５：２０〜３０、好ましくは、１５：２５の割合にてフィコール相分離を行う。このために、１０〜２０ｍＬ、好ましくは、１５ｍＬのフィコール溶液に上記においてＰＢＳと混合、攪拌した血液サンプルを徐々に流して層分離を行った後、遠心分離を行う。その後、３つの相異なる層が形成されれば、その中で中間層のバッフィコートをマイクロピペットで取り、ＨＢＳＳにより２〜５回洗浄した後、遠心分離により臍帯血由来の多能性幹細胞液を得る。
【００２７】
遠心分離により最終的に得られたペレットを１〜５ｍＬの培地［５〜１５％のヒト自家血清またはプラズマ（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｒ  ｐｌａｓｍａ）、あるいはヒト他家血清またはプラズマ（ａｌｌｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｒ  ｐｌａｓｍａ）と塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬを含むＭＳＣＢＭ＋ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ，ＵＳＡ）細胞培養液］に希釈してフラスコに入れ、培養を行う。７５フラスコにシードを行う場合、約１０６〜１０８の細胞を入れた後、５〜２０％のヒト自家または他家血清と塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬを加える。細胞は、５％のＣ０２雰囲気に調節されている３７℃の培養器において培養を行う。フラスコに最初にシードされた細胞は、約１〜２日後に転移される。培地は、約３〜７日おきに１回ずつ入れ替えを行う。
【００２８】
本発明においては、臍帯血由来の多能性幹細胞液を、従来のＦＢＳではなく、ヒト血清またはプラズマを含有する培地において培養を行った。その結果、図１に示すように、５％のＦＢＳ及び１０％のＦＢＳ入り培地において培養を行った場合に比べて、５％及び１０％のヒトプラズマを含有する培地において培養を行った場合の方が、培養皿に付着して成長する細胞の数が遥かに多いということが確認できた。
【００２９】
このようにして得られた臍帯血由来の幹細胞液から所望の表面抗原を発現している多能性幹細胞を得る方法としては、ソート機能を有するフローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（３）：２７５，１９９８）、磁気ビーズを用いる方法、多能性幹細胞を特異的に認識する抗体を用いたパンニング法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１（８）：２７９７，１９９８）などが挙げられる。また、大量の培養液などから多能性幹細胞を得る方法としては、細胞の表面に発現されて分子（以下、表面抗原と称する。）を特異的に認識する抗体を単独で用いるか、または、これらを組み合わせてカラムとして用いる方法が挙げられる。
【００３０】
フローサイトメータによるソート方式としては、水滴に荷電をかける方式、セルキャプチャ方式などが挙げられる。いかなる方法においても、細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光により標識し、標識された抗体と抗原の結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号に変換することにより、細胞の抗原発現量を定量することができる。さらに、用いる蛍光物質の種類を組み合わせることにより、複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。ここに使用可能な蛍光物質としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ），ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ），ＡＰＣ（ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ），ＴＲ（ＴｅｘａｓＲｅｄ：テキサスレッド），Ｃｙ３，ＣｙＣｈｒｏｍｅ，レッド６１３，レッド６７０，ＴＲＩ−カラー、クァンタムレッド（ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄ）などが挙げられる。
【００３１】
フローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法としては、上記において得られた幹細胞培養液を集め、遠心分離などの方法により細胞を分離した後、直接的に抗体で染色する方法と、適宜な培地中において１回だけ培養、増殖を行った後、抗体を染色する方法とが含まれる。細胞の染色は、先ず、表面抗原を認識する１次抗体と目的細胞のサンプルを混合し、氷の上において３０分ないし１時間反応させる。１次抗体が蛍光により標識されている場合には、洗浄後にフローサイトメータを用いて分離を行う。これに対し、１次抗体が蛍光により標識されていない場合には、洗浄後に１次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された２次抗体と１次抗体が反応した細胞を混合し、さらに氷水中で３０分ないし１時間培養する。洗浄後、１次抗体と２次抗体から染色された細胞をフローサイトメータを用いて分離する。
【００３２】
磁気ビーズを用いる方法によれば、所望の表面抗原を発現している細胞を大量に分離することができる。分離された細胞の純度は、上述したフローサイトメータを用いた方法よりは低いものの、精製を繰り返し行うことにより、十分に高い細胞純度を得ることができる。
【００３３】
各種の表面抗原としては、造血関連抗原、間葉細胞の表面抗原または神経系ニューロンの特異抗原などが挙げられる。前記造血関連抗原としては、ＣＤ３４，ＣＤ４５などが挙げられ、間葉細胞の表面抗原としては、ＳＨ−２，及びＳＨ−３などが挙げられ、さらに、神経系ニューロンの特異抗原としては、ＮＳＥ，ＭＡＰ２、及びＧＦＡＰなどが挙げられる。上述した如き各種の抗原を認識する抗体を単独で用いるか、あるいは、組み合わせて用いることにより、目的とする細胞を得ることができる。
【００３４】
本発明は、上記において得られた臍帯血由来の多能性幹細胞を虚血性壊死モデルのマウスモデルに移植したところ、本発明に係る多能性幹細胞を投与した場合には、その壊死症状の誘発が阻害され、切欠された大腿動脈に代えられる新生血管が生成されるということが確認できた。
【００３５】
そこで、本発明に係る多能性幹細胞は、閉塞性動脈または静脈疾患による虚血性壊死疾患及び心血管疾患に対する細胞治療剤として用いることができる。虚血性壊死疾患に対する細胞治療剤としては、本発明に係る多能性幹細胞の中でも、血管細胞への分化能を有する細胞を高純度にて含むものが好適に用いられる。
【００３６】
本発明に係る多能性幹細胞は、虚血性壊死の大きさ及び部位に応じて、所望の血管への分化能を有する細胞を得る為に、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において分化、増殖することができる。また、これを虚血性壊死部位に移植することにより、虚血性壊死疾患の治療に用いることができる。さらに、虚血性壊死の部位または全身的に静脈注射することによりに本発明に係る多能性幹細胞を直接的に移植することもできる。
【００３７】
本発明に係る多能性幹細胞は、単球−マクロファージ系の抗原であるＣＤ４５に対して陽性を示し、造血細胞系の抗原であるＣＤ３４に対して陰性を示すことから、造血細胞から単球への分化が進んでいる幹細胞であると考えられる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲はこれら実施例により限定されないことは当然である。
【００３９】
実施例１：臍帯血からの多能性幹細胞の分離
臍帯血は、臨床試験倫理委員会のガイドライン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に基づき、ソウル大学病院と三星第一病院における満期（ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ）産と早期産（ｐｒｅｔｅｒｍ）の新生児において集めた。
【００４０】
前記集められた臍帯血から採取された血液サンプル７０〜１００ｍＬをＰＢＳと１：１の割合にて希釈して撹拌した。その後、１５：２５の割合にてフィコール相分離を行った。１５ｍＬのフィコール溶液にＰＢＳと１：１の割合にて希釈された血液サンプルを徐々に流して層分離を行った後、遠心分離（２５００ｒｐｍ、２０分）を行った。その後、３つの相異なる層が形成されれば、その中で中問層のバッフィコートをマイクロピペットで取り、ＨＢＳＳにより３回洗浄した後、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１５分）を行い最終的にペレット（臍帯血由来の多能性幹細胞液）を得た。
【００４１】
実施例２：臍帯血由来の多能性幹細胞の骨形成細胞への分化
前記実施例１において得られた臍帯血由来の多能性幹細胞培養液を１ｍＬの骨形成誘導培地［０．１μｍｏｌ／Ｌ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）  ａｎｄ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ），５〜２０％のヒト血清またはプラズマ］に希釈して細胞数を数えた後、フラスコに入れ培養（５％のＣ０２、３７℃で、培地は３〜４日おきに１回ずつ入れ替え）を行うことにより、多能性幹細胞の骨形成細胞への分化を誘導した。培養し始めてから１４日目にフォンコッサ（Ｖｏｎ−Ｋｏｓｓａ）染色法を用いて臍帯血由来の多能性幹細胞が骨形成細胞に分化されたことを確認した（図２参照）。
【００４２】
実施例３：臍帯血由来の多能性幹細胞の神経細胞への分化
前記実施例１において得られた臍帯血由来の多能性幹細胞培養液を１ｍＬの神経形成誘導培地［５〜２０％のヒト血清またはプラズマに１０ｎｇ／ｍＬ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），１０ｎｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）  １０ｎｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を添加］に希釈して細胞数を数えた後、フラスコに入れ、５％のＣ０２、３７℃で培養を行うことにより、多能性幹細胞から神経細胞への分化を誘導した。培養し始めてから１４日目、神経系ニューロンの特異抗原であるＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ：ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ）と神経系星状細胞の特異抗原であるＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質：ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して陽性反応を示すことを確認した。これは臍帯血由来の多能性幹細胞が神経細胞に分化されたことを示唆している（図３参照）。
【００４３】
実施例４：臍帯血由来の多能性幹細胞の免疫学的な特性
前記実施例１において得られた臍帯血由来の多能性幹細胞の免疫学的な特性を把握するために、細胞表面抗原の発現を調べた。すなわち、前記実施例１において培養した細胞２×１０６〜１０７個を用意してＰＢＳ溶液で洗浄し、各抗原に該当する抗体と室温で反応させた。抗原の発現の有無は、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて確認した。また、ＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ）染色をした。
【００４４】
その結果、図４に示すように、本発明の臍帯血由来の多能性幹細胞は、ＣＤ４５に対しては６３．３８％、ＳＨ−２に対しては９６．５４％、ＳＨ−３に対しては６３．９９％の陽性反応をそれぞれ示し、ＣＤ３４に対しては９０％より多い陰性反応を示した。また、他の抗原に対する免疫表現型を確認したところ、ＣＤ５１／６１に対しては陰性、ＣＤ６２Ｌに対しては陰性、ＣＤ６２Ｐに対しては陰性、ＣＤ１３３に対しては陰性、ＣＤ１３５に対しては陰性、ＣＤ９０に対しては陰性、ＣＤ２９に対しては陽性、ＣＤ４４に対しては陽性または陰性、ＣＤ４９Ｂに対して陽性、ＣＤ１０５（ＳＨ−２）に対しては陽性または陰性、ＣＤ９０に対しては陰性の免疫学的な特性をそれぞれ示した。
【００４５】
一方、図５に示すように、ＰＡＳ染色においても陽性反応を示した。
【００４６】
実施例５：虚血性壊死モデルに対する多能性幹細胞の治療効果
（１）実験動物の準備
ＢＡＬＢ／ｃＡＮＣｒｊＢｇｉ−ｎｕ種６週齢のマウス２０匹を（株）オリエントから購入して１週間純化した後、１８匹を選別して下記実験例に用いた。選別した細胞は、温度３２±３℃、相対湿度６０±１０％、換気回数１０〜１２回／時間、照明時間１２時間、照度２５０〜２００ｌｕｘ下で、ＨＥＰＡフィルター付きＭＩ  ｒａｃｋで高圧蒸気滅菌された実験動物用固形飼料（（株）ピュリナ）と高圧蒸気滅菌された飲用水を自由に摂取させながら飼育した。純化期間及び実験期間中にポリカーボネートＭＩケージ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ＭＩ  ｃａｇｅ，２６×４２×１８ｃｍ，ミョンジン機械製）で飼育ボックス当たり７匹を飼育した。
【００４７】
前記飼育したマウスに対して試験前に体重を測定し、群間体重差が出ないようにランダムに３つの群（対照群：７匹、多能性幹細胞の即時投入群：８匹、多能性幹細胞の一日後投与群：３匹）に分けた（表１参照）。
【００４８】
【表１】
2007528229.tif 000003
【００４９】
前記３つの群に、先行論文（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．，１３（１）：６０，１９９２）を応用して、ケタミン１．２ｍｇを腹腔内に注射して麻酔し、各個体の左側大腿部を切開した後、大腿動脈を切欠し、この切欠部を縫合糸で縫合することにより、バージャー病マウスモデルを得た。
【００５０】
前記実施例１において得られた多能性幹細胞をＰＢＳにより２回洗浄した後、０．２５％のトリプシンにより処理して細胞を回収し、さらに遠心分離により上澄み液を除去した。次いで、ＰＢＳにより洗浄してトリプシンを不活性化し、その後、２次遠心分離を行い１．３×１０６〜１０７個の細胞を回収した。これを滅菌生理食塩水１００μｌに浮遊させた後、多能性幹細胞の即時投入群８匹の各大腿部筋肉に投与した（多能性幹細胞の即時投入群）。また、培養培地は３匹のマウスの各左側大腿部筋肉に投与した（培地対照群）。
【００５１】
（２）虚血性壊死モデルの症状日及び切断日の観察
上記の如く虚血性壊死を誘導したマウスに本発明の臍帯血由来の多能性幹細胞を投与した後、３０日間実験動物の大腿部を観察した。症状が現われた日と切断が見られた日を区分して記録し、試験開始前と終了時点で試験動物の体重を測定し、試験終了後に剖検を行った。試験中に測定された試験動物の体重などに関する資料の統計学的分析のために一元配置分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を行い群間の有意性を検定した。この際、有意性が認められた場合、ダネットのｔ検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を行い、対照群と試験群間の統計学的有意性を検定した（ｐ＜０．０５）。
【００５２】
その結果、図６〜図８に示すように、血管切欠３０日後、本発明の臍帯血由来の多能性幹細胞を投与しなかった対照群全ての場合において、いずれも赤円で示される切断現象が発生した（図６参照）。一方、多能性幹細胞の即時投与群の場合、総８匹のうち５匹にのみ切断現象が発生した。６番および８番個体は、バージャー病を誘発させたにも関わらず、ほとんど正常な行動形態を示し、４番個体は、バージャー病による切断が予防された（図７参照）。他方、培地を投与された群の場合、総３匹の実験動物にいずれも切断現象が発生した。これは、多能性幹細胞の即時投与群に比べて血管新生などの治療的効果がほとんどないということを意味する（図８参照）。
【００５３】
また、虚血性壊死モデルの確立日を基準として、各個体別に症状（血管切開部位に冷感があり、レイノー現象が見られる）が見られた日と左側脚や足指に切断が見られた日とを調べた（表２参照）。
【００５４】
【表２】
2007528229.tif 000004
【００５５】
その結果、表２に示すように、症状日及び切断日で、多能性幹細胞の即時投与群において０．０５未満の有意性が示され、他の群においては有意性が示されなかった。各個体別体重を測定して各群別平均と標準偏差を求めたところ、実験の前／後に測定された体重に対する有意的な変化が見られなかった。
【００５６】
一方、対照群と本発明の臍帯血由来の多能性幹細胞投与群との症状日及び切断日を比較した（図９）。その結果、症状日で、多能性幹細胞の即時投与群においては、対照群に比べて統計上０．０５未満の有意的な変化が確認できた。また、切断日で、有意的な変化は確認できなかったが、多能性幹細胞の即時投与群においては、対照群と培地対照群に比べて切断日がより長く、多能性幹細胞の即時投与群では、血管切欠による切断現象が徐々に発生することを示している。
【００５７】
さらに、虚血性壊死モデルの群別切断率を調べた。その結果、図１０に示すように、対照群と多能性幹細胞の一日後投与群は１００％の切断率を示したのに対し、多能性幹細胞の即時投与群は６２．５％の切断率を示した。この結果より、多能性幹細胞を血管切開後直ちに投与すると、切断現象が軽減し、さらに切断率が減少しやすくなることがわかった。
【００５８】
（３）血管造影法
血管造影法とは、Ｘ線を用いた血管検査であって、造影剤（ヨウ素−１３１）をマウスの心臓の血管の中に注入し、血管をＸ線で撮影することを可能にする。この調べによりＸ線の相で血管の異常の有無を判断し、病名や病巣の位置、病気の進行程度を確認することができる。
【００５９】
前記対照群、多能性幹細胞の即時投与群、多能性幹細胞の一日後投与群の剖検の前に各個体をケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔注射で麻酔した後、血管造影剤を投与し、２分経過後にＸ線を利用して各群の大腿動脈と新生血管を調べた。
【００６０】
その結果、図１１に示すように、対照群と多能性幹細胞の一日後投与群においては新生血管が確認できなかったが、血管切開後にも左側下肢の切断現象が生じなかった多能性幹細胞の即時投与群においては新生血管が確認できた。
【００６１】
（４）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
剖検時に心臓からの採血を行い各群のすべての個体から筋肉の血液を取り除いた。４％のリン酸パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液に１．５％のスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液を混ぜた固定液を用いて各個体の左側大腿部と右側大腿部の筋肉組職を固定した。３０％スクロースリン酸（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液に固定された大腿部筋肉組職が沈降するまで４℃で放置した後、各組職をパラフィンで包埋し、ミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて厚さ５μｍの切片に薄切した。それから、プレハイブリダイゼーション（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）溶液（５０％のホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭのＤＤＴ、４×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、’×ＴＥＤ、１００μｇ／ｍＬ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ，２５０μｇ／ｍＬ  ｙｅａｓｔ  ＲＡＮ）を加えて４２℃で１時間反応させた。ここにＤＩＧ標識ＤＮＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え、プレハイブリダイゼーション溶液を２４時間反応させてＤＩＧ標識ヒト特異ＤＮＡプローブをｍＲＮＡに結合させた。大腿部組職を２×ＳＳＣ溶液、１×ＳＳＣ溶液、０．５×ＳＳＣ溶液によりそれぞれ１０分間２回ずつ洗浄した後、スライドグラス（ｓｌｉｄｅ  ｇｌａｓｓ）に固定させた後、室温で２時間乾燥させた。
【００６２】
その結果、図１２に示すように、対照群はヒトプローブ（ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｂｅ）で標識できなかったが、多能性幹細胞投与群の個体は内皮細胞がヒトプローブで標識されたことが確認できた。
【００６３】
以上、本発明の内容の特定部分について詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施の態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されないということは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とその等価物により定義されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
上述したように、本発明は、臍帯血（へその緒の血液）からヒト血清やプラズマを用いて分離された多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を提供する。本発明に係る幹細胞は、成体幹細胞であるにも拘わらず、骨形成細胞、神経細胞などに分化できることから、閉塞性又は虚血性動脈疾患及び心臓血管疾患による虚血性壊死疾患用の細胞治療剤として役立つものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2007528229.tif 000008
【図５】
2007528229.tif 000009
【図６】
2007528229.tif 000010
【図７】
2007528229.tif 000011
【図８】
2007528229.tif 000012
【図９】
2007528229.tif 000013
【図１０】
2007528229.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月24日(2006.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
前記虚血性壊死疾患は心筋梗塞、脳梗塞、股關節の虚血壊死、バージャー病及び糖尿病性合併症による四肢壞疽病からなる群から選択される請求項７に記載の閉塞性動脈疾患による虚血性壊死疾患又は心血管疾患用細胞治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【図１】臍帯血由来の細胞のＦＢＳまたはヒトプラズマ含有培地において培養した場合、細胞接着力を比較したものであって、左側写真は２００倍率で撮影したものであり、右側写真は４００倍率で撮影したものである。
【図２】Ａ及びＢは、臍帯血由来の多能性幹細胞が骨形成細胞に分化されたものであり、Ｃ及びＤは、フォンコッサ（Ｖｏｎ−Ｋｏｓｓａ）染色法で染色したものである。
【図３】臍帯血由来の多能性幹細胞と特異抗原の結合を示すものであって、Ａ及びＢは、それぞれ神経系ニューロンの特異抗原であるＮＳＥ（ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ）と神経系星状細胞の特異抗原であるＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して陽性反応を示すものであり、Ｃ及びＤはその対照群を示すものである。
【図４】フローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた臍帯血由来の多能性幹細胞の免疫学的な特性を示すものである（Ａ及びＥ：対照群、Ｂ：ＣＤ３４、Ｃ：ＣＤ４５、Ｄ：ＳＨ−２、Ｆ：ＳＨ−３）。
【図５】本発明に係る成体幹細胞からの抗原の発現可否を調べるためのＰＡＳ染色結果を示すものである。
【図６】虚血性壊死を伴った対照群マウスの、血管切欠後、３０日の結果を示すもので、赤円は切断現象が発生した部位を示す。
【図７】虚血性壊死を伴ったマウス群の、血管切欠後、本発明による幹細胞の即時投与群の投与後３０日の結果を示すものであり、赤円は切断現象が発生した部位を示す。
【図８】虚血性壊死を伴ったマウス群の、血管切欠後、本発明による培地投与群の投与後の３１日の結果を示すものであり、赤円は切断現象が発生した部位を示す。
【図９】虚血性壊死モデルのマウスにおいて、その症状日及び切断日を図表化したものである。
【図１０】虚血性壊死モデルのマウスにおいて、群別切断率を図表化したものである。
【図１１】虚血性壊死モデルのマウスにおいて、その血管切欠してから３０日後、各群別血管造影法を利用してレントゲン写真を撮ったものである。
【図１２】虚血性壊死を伴ったモデルマウスを剖検後、腿部筋肉部位の組職を切片化することで、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法でヒト特異的プローブ（ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ）を用いてヒト細胞を追跡したことを示すものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】  前記飼育したマウスに対して試験前に体重を測定し、群間体重差が出ないようにランダムに３つの群（対照群：７匹、多能性幹細胞の即時投入群：８匹、培地対照群：３匹）に分けた（表１参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】さらに、虚血性壊死モデルの群別切断率を調べた。その結果、図１０に示すように、対照群と培地投与群は１００％の切断率を示したのに対し、多能性幹細胞の即時投与群は６２．５％の切断率を示した。この結果より、多能性幹細胞を血管切開後直ちに投与すると、切断現象が軽減し、さらに切断率が減少しやすくなることがわかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】  前記対照群、多能性幹細胞の即時投与群、培地投与群の剖検の前に各個体をケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔注射で麻酔した後、血管造影剤を投与し、２分経過後にＸ線を利用して各群の大腿動脈と新生血管を調べた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】  その結果、図１１に示すように、対照群と培地投与群においては新生血管が確認できなかったが、血管切開後にも左側下肢の切断現象が生じなかった多能性幹細胞の即時投与群においては新生血管が確認できた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2007528229.tif 000017
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2007528229.tif 000018
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2007528229.tif 000019
【国際調査報告】
2007528229.tif 000020
2007528229.tif 000021