(57)【要約】本発明は、少なくとも北極型突然変異（E693G）および更なるＡＤ（アルツハイマー病）病原性突然変異を含む異種のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列か、またはＡペプチドを含む細胞内可溶性Ａの凝集量の増加をもたらし、ＡＤ発症に作用する更なるトランスジーンを含む、少なくとも1つのトランスジーンを発現する、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、前記トランスジェニック動物を作製する方法およびアルツハイマー病の治療もしくは診断に有用な治療薬または診断薬をスクリーニングする方法に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも北極型突然変異（E693G）および更なるＡＤ（アルツハイマー病）病原性突然変異を含む異種のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列か、またはＡβペプチドを含む細胞内可溶性Ａβの凝集量の増加をもたらしＡＤ発症に作用する更なるトランスジーンを含む、少なくとも1つのトランスジーンを発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
トランスジーンがゲノムＤＮＡに組み込まれた、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記トランスジーンが前記動物の脳組織において前記遺伝子の発現に有効なプロモーターと機能し得る形で連結した、請求項１または２のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
内在性ＡＰＰが発現性または非発現性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記の更なるトランスジーンが、ＡＤ病原性突然変異を有するヒトプレセニリン−１および／またはプレセニリン−２トランスジーンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記の更なるトランスジーンが、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J（クラステリン）、α１アンチキモトリプシン（ACT）またはそれらの断片をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記の更なるＡＤ病原性突然変異が、ＡＰＰ突然変異KM670/671DF、KM670/671DY、KM670/671EFまたはKM670/671EYのうちの１つである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記の更なるＡＤ病原性突然変異が、ＡＰＰ突然変異KM670/671NL、KM670/671NY、KM670/671NF、KM670/671KL、KM670/671DLまたはKM670/671ELのうちの１つであって、ここでKM670/671NL（スウェーデン型突然変異）が好ましい、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
トランスジェニック動物が、北極型突然変異（E693G）およびスウェーデン型突然変異（KM670/671NL）のみを含む、１つのトランスジーンのみを発現する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物であって、更にネプリライシンまたはインスリン分解酵素（IDE）遺伝子の少なくとも1つに対して、相同的に組み込まれた標的構築物を含み、これは、それらの遺伝子を遺伝子除去（ノックアウト）を通して崩壊させ、そしてＡβ−40および／またはＡβ−42北極型ペプチド生産を上昇させる、前記トランスジェニック動物。
【請求項１１】
トランスジェニック動物が齧歯類である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
トランスジェニック動物がネズミ科動物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
トランスジェニック動物がマウスである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を作製する方法であって、少なくとも北極型突然変異（E693G）および更なるＡＤ（アルツハイマー病）病原性突然変異を含む異種のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列か、またはＡＤ発症に作用する更なるトランスジーンを含む、少なくとも1つのトランスジーンをゲノムＤＮＡに組み込むことを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記トランスジーンが前記動物の脳組織において、前記遺伝子の発現に有効なプロモーターと機能し得る形で連結した、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
内在性ＡＰＰが場合により非発現性となる、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記の更なるトランスジーンが、ＡＤ病原性突然変異を有するヒトプレセニリン−１および／またはプレセニリン−２トランスジーンである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記の更なるトランスジーンが、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J（クラステリン）、α１アンチキモトリプシン（ACT）またはそれらの断片をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記の更なるＡＤ病原性突然変異が、ＡＰＰ突然変異KM670/671DF、KM670/671DY、KM670/671EFまたはKM670/671EYのうちの１つである、請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記の更なるＡＤ病原性突然変異が、ＡＰＰ突然変異KM670/671NL、KM670/671NY、KM670/671NF、KM670/671KL、KM670/671DLまたはKM670/671ELのうちの１つであって、ここでKM670/671NL（スウェーデン型突然変異）が好ましい、請求項１４のいずれかに記載方法。
【請求項２１】
更にネプリライシンまたはインスリン分解酵素（IDE）遺伝子の少なくとも1つに対して、相同的に組み込まれた標的構築物を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物が、アルツハイマー病を治療、予防または阻止するのに有用な薬剤のスクリーニングに使用される、スクリーニングの方法。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物が、アルツハイマー病に対する診断薬をスクリーニングするために使用される、スクリーニングの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
トランスジェニックモデル
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病および関連する神経疾患のトランスジェニック動物モデルに関する。本発明はまた、前記トランスジェニック動物を作製する方法、およびアルツハイマー病の治療または診断に有用な、治療薬または診断薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は進行性かつ不可逆的な神経変性疾患であり、認知、記憶および行動障害をもたらす。これは高齢者人口における認知症の最も一般的な原因であって、65歳以上の約5％および80歳以上の20％の人々が罹患している。ＡＤは、多様な認知機能における潜行性の発症および進行性の変質を特徴とする。神経病変は、細胞外および細胞内双方における銀親和性タンパク質性沈着物を含む。細胞外沈着物は神経突起斑と呼ばれ、主にジストロフィー性神経突起（膨張、歪曲した神経突起）によって囲まれたβアミロイド（Ａβ）ペプチドによる。これらの細胞外沈着物中のＡβペプチドは、それらの特徴であるβプリーツシート構造内の繊維である。これらの沈着物中のＡβは、特定の色素（例えばコンゴレッド）で染色することができ、繊維状の微細構造を示す。神経突起斑の繊維構造中のＡβペプチドに適合するこれらの特徴は、一般名アミロイドの定義である。脳において沈着する、いくつもの神経突起斑および神経原線維変化は、ＡＤに対する診断基準であり、患者が死亡した時に行われる。ＡＤ脳はまた、微小な脳萎縮、神経細胞消失、局所的炎症（小膠細胞症および星状細胞増加症）、および多くの場合、大脳血管壁におけるコンゴレッド親和性アミロイド血管症（CAA）を示す。
【０００３】
Ａβペプチドの２つの型であるＡβ40およびＡβ42は、ＡＤ神経突起斑の優占種であり（Mastersら、1985年）、一方、Ａβ40はＡＤに関わる脳血管アミロイドにおいて重要な種である（GlennerおよびWong, 1984年）。酵素活性は、健康な被験体およびＡＤに苦しむ被験体双方における身体の全細胞において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大きなタンパク質から、これらのＡβが継続的に形成されることを可能にする。２つの主要なＡＰＰ処理事象であるβおよびγセクレターゼ活性は、酵素的切断を介してＡβペプチドの産生を可能にし、一方、αセクレターゼ活性と呼ばれる３つ目は、Ａβペプチド配列内を切断することによってＡβペプチドを抑制する（Selkoe, 1994年；US5604102に概説される）。Ａβ42は、42アミノ酸長のペプチド（つまり、Ａβ40と比較して、C末端において2アミノ酸分長い）である。Ａβ42ペプチドはより疎水性であり、そしてＡβ二量体、Ａβ四量体、Ａβオリゴマー、ＡβプロトフィブリルまたはＡβフィブリル等のＡβペプチドの大きい構造により容易に凝集する。Ａβフィブリルは、疎水性かつ不溶性である一方、他の構造はすべてより疎水性が低く、そして可溶性である。Ａβペプチドのこれらの高度な分子構造すべてが、それらの生物物理学的および構造的性質（例えば、電子顕微鏡において）ならびにそれらの生化学的特徴（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー／ウエスタンブロットでの解析による）に基づいて個々に定義される。これらのＡβペプチド、特にＡβ42は、生涯の間に徐々に集合してＡβの種々の高度な分子構造となる。年齢に強く依存した疾患であるＡＤは、この集合処理が個体の脳においてより迅速に起こる場合、生涯のより初期に起こるだろう。これは、ＡＤの「アミロイドカスケード仮説」の核心であって、ＡＰＰ処理、Ａβ42レベルおよびそれらの高度な分子構造への集合が、すべてのＡＤ発症の主因であると主張する。その他すべてのＡＤ脳の神経病変および認知症等のＡＤの症状は、どうもＡβペプチドおよびそれらの集合形成によって引き起こされる。「アミロイドカスケード仮説」に対する強い証拠は、優性形質の家族性ＡＤの早期発症によって苦しむ家族における個人の遺伝学的研究によって得られる。これらの研究は、ＡＰＰ遺伝子におけるまれな突然変異が、ＡＤの重症型を発生させるのに十分であるということを明らかにしてきた。突然変異はＡβ１−42のC末端のわずかに下流のVal717およびその周辺に集まっており（Goateら、1991年、Chartier-Harlanら、1991年、Murrelら、1991年）、そしてスウェーデンの家族におけるＡβのN末端のすぐ上流の唯一の二重突然変異（670〜671）である（Mullanら、1992年；US5795963）。Ａβペプチド配列を構成するＡＰＰ突然変異は、Ａβ40およびＡβ42産生の双方を増加すること（「スイス」突然変異；Citronら、1992年、Caiら、1993年）、またはＡβ42／Ａβ40産生の比率が増加し、そしてまた、Ａβペプチドにおける病原性突然変異を含むようにC末端が伸長したＡβペプチド（例えばＡβ50）を生じること（”717”突然変異は46番目；Suzukiら、1994年；Roherら、2003年）が後になって明らかになった。従って、「717」突然変異は、野生型のＡβ40および野生型Ａβ42に加えて、ロンドン型Ａβペプチド（V717I）およびインディアナ型Ａβペプチド（V717F、Ａβ46およびＡβのより長い形状）を生じ、これらは迅速にＡβフィブリルを形成する。反対に、スウェーデン型突然変異は、野生型Ａβ40およびＡβ42ペプチドのレベル上昇のみをもたらす。早期発症型家族性ＡＤは、大抵はプレセニリン1における突然変異（染色体14；US5986054；US5840540；US5449604）、および場合によってはプレセニリン2における突然変異（染色体1）における突然変異によって生じる。プレセニリン1およびプレセニリン2はどちらもポリトピック型の膜貫通タンパク質であり、3種の他のタンパク質、ニカストリン、aph1およびpen-2と共に、γセクレターゼ複合体に不可欠な機能性コアを構成して、ＡＰＰの酵素的切断を介してＡβペプチド形成を可能にしている（Edbauerら、2003年）。プレセニリン1およびプレセニリン2タンパク質におけるすべてのＡＤ病原性突然変異は、Ａβ1〜42の過剰産生が顕著に増加する（Schuenerら、1996年）。アポリポタンパク質E（ApoE）は、年齢とは別に、遅発性ＡＤに対する最も重要な危険因子である。ヒトには、ApoEタンパク質における1つのアミノ酸置換による3種のApoEタンパク質の変異体がある。ApoE4変異体はＡＤの危険性の増加をもたらし、一方、ApoE2変異体は優勢なApoE3変異体と比較して安全である（Strittmatterら、1993年；Corderら、1993年）。これらのタンパク質変化は決定的ではないが、しかし人々のＡＤ進行に対する感受性の増進または低減をもたらす。ＡＤのＡＰＰトランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイド沈着を促進するApoE変異体の能力は、ApoE4が最も高く、ApoE3は中間、そしてApoE2が最も低く、このことは、ApoEのＡＤ発症のメカニズムが、Ａβペプチドの集合および／またはアミロイド沈着を増進するということを示唆する（Faganら、2002年）。α1アンチキモトリプシン（Nilssonら、2001年）およびApoJ／クラステリン（DeMattosら、2002年）等の他のタンパク質もまた、ApoEと同様にＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるＡβペプチド集合および／またはアミロイド沈着を増進する。ネプリライシン（NEP）およびインスリン分解酵素（IDE）はＡβペプチドを分解し、そしてＡＤに関与すると考えられる。しかし、これらのタンパク質はどれも、人類遺伝学によってはＡＤに関与することが証明されていない。将来のＡＤ研究における重要な課題は、Ａβレベルの増進またはそれらの凝集が、ＡＤ患者においてどのように認知症および機能低下を引き起こすのかをより理解することである。長年に渡り、神経突起斑の主要成分である不溶性アミロイドフィブリルが、ＡＤ脳における病原性種であると考えられてきた。高濃度のＡβフィブリルが、脳の神経細胞の細胞培養モデルにおいて細胞傷害性となることが示されてきた（Pikeら、1991年；LorenzoおよびYanknerら、1994年）。しかし、アミロイドフィブリルが主要な神経毒性種であるという仮説は、神経突起斑密度とＡＤ認知症の程度との間の相関関係が弱いこと、および現在のＡＰＰトランスジェニックマウスにおける神経変性のわずかな徴候とも矛盾する。可溶性神経毒性Ａβ中間体種ならびにそれらの形成および分布する適切な細胞内部位は、アミロイド仮説をよりよく説明付けるであろう失われた環であるかも知れない。この考えは、早期発症型ＡＤを引き起こす北極型（E693）ＡＰＰ突然変異の最近の発見から支持を得てきた（WO0203911；Nilsberthら���2001年）。突然変異はＡβペプチド配列の内部に位置する。従って突然変異保持者は、Ａβペプチドの変異体（例えば北極型Ａβ40および北極型Ａβ42）を生産するだろう。北極型Ａβ40および北極型Ａβ42の双方は、Ａβペプチドの高度な分子構造にはるかに容易に集合し、これは可溶性であり、そしてこれらの構造における線維、特にLSAP（大型可溶性アミロイドプロトフィブリル）と命名されるＡβプロトフィブリルではない。従って、北極型突然変異の発症メカニズムは、他のＡＰＰ、PS1およびPS2突然変異とは異なり、可溶性のＡβペプチドの高度な分子構造（例えばＡβプロトフィブリル）がＡＤの原因であることを示唆する。最近、Ａβプロトフィブリル等の可溶性オリゴマーＡβペプチドが、長期増強（LTP）、海馬における記憶形成に反映すると考えられているシナプス可塑性の程度を低減させることが示されてきた（Walshら、2001年）。更に、オリゴマー北極型Ａβペプチドが、野生型Ａβよりも脳におけるLPTにおいて、はるかに深刻な阻害効果を示し、それらのＡβプロトフィブリルを形成する強い傾向によると考えられる（Klyubinら、2003年）。
【０００４】
ヒト疾患の特徴を有するＡＤの動物モデルは、ＡＤ発症をよりよく理解するために、そして新規の治療薬の効果を評価するために非常に必要である。ＡＤの理想的な動物モデルは、完全なＡＤの神経変性および臨床表現型（例えば、進行性の記憶および認知機能障害）を起こさなければならない。この使用法における大きな進歩は、ＡＤ病原性突然変異を有するＡＰＰのトランスジェニック過剰発現を使用することで達成された。現在のＡＤのＡＰＰトランスジェニックモデルは、脳においてびまん性斑および神経突起斑の両方が、年齢依存的かつ部位特異的に形成される等のＡＤ発症の重要な特徴を示す。アミロイド病変は、過剰リン酸化タウ、局所的炎症（小膠細胞症および星状細胞増加症）、および様々な程度でコンゴレッド親和性アミロイド血管症（CAA）と関連する。これらのモデルは、特に脳の神経細胞における、ヒトＡＰＰの非常に高度なトランスジーンの発現によって作製されてきた。このトランスジーンは常にＡＤ病原性突然変異を有する。従って、「717」ＡＰＰ突然変異（V717F；Gamesら 1995年；US2002104104；US5720936；US5811633）または「スウェーデン型」突然変異（KM670/671NL；Hsiaoら、1996年；Sturchler-Pierratら、1997年；WO 09803644；US2002049988；US6245964；US5850003；US5877399；US5777194）が使用されてきた。突然変異体ＡＰＰおよび突然変異体プレセニリン−１トランスジーンの双方を含むダブルトランスジェニックマウスは、アミロイド斑形成が急速に進行するが、しかし動物はわずかな精神的損傷を示したままで、NFT、神経細胞および脳の萎縮を示さないままである（Holcombら、1998年；US5898094；US2003131364）。更に、現在のＡＰＰトランスジェニックモデルは、ＡＤ発症に非常に重要であり得るＡβプロトフィブリル等のＡβ線維形成プロセスにおける可溶性中間体のレベルが低いようである。いくつかのＡＤ病原性突然変異は、あらかじめ1つの単独のトランスジーンに融合され、例えば「スウェーデン型」突然変異（KM670/671NL）および「717」ＡＰＰ突然変異（インディアナ型，V717F））が、繊維状Ａβペプチドの形成および神経突起斑形成を、増強および増進させるのに使用されてきた（Janusら、2001年）。同様に、「スウェーデン型」（KM670/671NL）、「北極型」（E693G）および「717」ＡＰＰ突然変異（ロンドン型，V717I）が、スウェーデン型＋インディアナ型ＡＰＰトランスジェニックモデルのもののように（Janusら、2001年）融合されて、より早く多い斑形成を生み出すことを試みるのに使用されてきているのは（Teppnerら、2003年）、ロンドン型ＡβペプチドがＡβフィブリル形成を強く促進するためである（Teppnerら、2003年；Roherら、2003年）。北極型Ａβ40および北極型Ａβ42が、多量の安定なプロトフィブリルを形成するという独特の特徴が示されてきた（Nilsberthら、2001年；Lashuelら、2003年）。ロンドン型ＡＰＰ突然変異（Lantosら、1992年；Cairnsら、1993年）と北極型ＡＰＰ突然変異の保持者との間の、ヒトＡＤ脳における病変の顕著な違いは、ロンドン型Ａβペプチドおよび北極型Ａβペプチドの神経病理学についての化学的特徴における違いを補強する。
【０００５】
以下の参考文献は、現在、最も重要であると考えられる。：
Stenh C.らが”Metabolic consequences of the arctic (E693G) APP alzheimer mutation”, Society for Neuroscience. Abstract Viewer and Itenary Planner 2002年, 神経科学学会(the Society for Neuroscience)第３２回年次総会，2002年１１月２〜７日，要約No. 296.6およびNeuroreport 13, 1857-60 (2002年)において、「スウェーデン型」（KM670/671NL）および「北極型」（E693G）突然変異の双方を含むＡＰＰ ｃＤＮＡを有するトランスフェクトされた発癌性細胞系を開示する。
【０００６】
Hsiaoら、Science 274, 99-102 (1996年)は、「スウェーデン型」（KM670/671NL）のみを有するトランスジェニックマウスを開示する。
【０００７】
Mullanら、Nature Genet. 1, 345-347(1992年)は、アルツハイマー病の家族における「スウェーデン型」（KM670/671NL）の優性遺伝を開示する。
【０００８】
Nilsberthら、Nat. Neurosci. 4, 887-893 (2001年)は、アルツハイマー病の家族における「北極型」（E693G）の優性遺伝を開示する。
【０００９】
Teppnerら、6th Internat. Conf. AD/PD, Seville, Spain, 議会番号５２(2003年)は、「スウェーデン型」（KM670/671NL）、「北極型」（E693G）および「ロンドン型」（V717I）突然変異を有するトランスジェニックマウスを作製するための予備試験を開示する。病状は記載されない。
【００１０】
Roherら、J Biol Chem. 279(7): 5829-36 (2004年)は、「ロンドン型」突然変異（V717F）を有する患者由来のアルツハイマー脳において、Ａβペプチドはアミノ酸42を超過する（例えばＡβ１−46およびＡβ１−50）ことを開示する。
【００１１】
Kangら、Nature 325, 733-6 (1987年)は、ヒトAPP695 ｃＤＮＡのクローニングを記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の要旨
従来技術モデルの欠点を考慮して、本発明の目的は、定量可能なアルツハイマー病（ＡＤ）病変の表現型を早期に示すトランスジェニック動物モデルを提供することである。これは、医薬およびバイオテクノロジー産業において、より迅速かつ費用効率の高い医薬品のスクリーニングを可能にするだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はこの課題を、増進されたＡβ−40および／またはＡβ−42北極型ペプチドならびにＡβ北極型プロトフィブリル産生の病変、ならびに早期に可溶性オリゴマーおよびプロトフィブリルのＡβ北極型ペプチドが促進させる病変（脳のニューロン内部でのＡβ凝集を含む）を有する、ＡＤおよび関連する神経疾患の動物モデルの提供によって解決する。
【００１４】
Ａβ免疫陽性ニューロン内染色（点状および強いもの）は、濃縮したギ酸による前処理に対して抵抗性があった。これはアミロイド、つまりβシート構造で凝集するＡβ（プロトフィブリル）の典型的な特徴であり、そして、前記染色は、脳の他のニューロンに加えて、大脳皮質における下層の海馬内および点在するニューロン内のCA1錐体細胞層に局在化していた。
【００１５】
1つの態様によると、本発明は齧歯類等、より好ましくはネズミ科動物および最も好ましくはマウス等の、新規のＡＤトランスジェニック動物（非ヒト）に関するものであり、これらは、確実に測定可能な早期かつ増進された細胞内Ａβ凝集を示す。この細胞内Ａβ凝集は細胞外斑形成の発症する前に起こり、そして量が徐々に増加する。早期かつ増進された可溶性ニューロン内Ａβ凝集は病的なＡＤ表現型であり、先に記載したＡＰＰトランスジェニックマウスモデルをしのぐ。このＡＤ表現型は本発明の動物モデルが有し、従来の動物モデルに見られるいかなるＡＤマーカーよりはるかに早い。
【００１６】
本発明は、アルツハイマー病のプロセスを初期段階において妨害、遅延または阻止する薬剤を同定する手段を提供する。そのような薬剤は、初期段階のアルツハイマー病の治療またはその徴候の予防のために臨床的に有意な重要性があるだろう。本発明の動物モデルの提供は、そのような薬剤をスクリーニングするために必要な時間を非常に短縮することができる。
【００１７】
従って、細胞内Ａβの凝集の程度を測定することにより、後の細胞外Ａβ沈着を余裕を持って予測することができる。この予測は、ＡＤ神経病変が進行して早ければ１〜２ヶ月で行うことが可能である。従来技術では１５ヶ月後にしかできない。従って、本発明は、ＡＤ神経病変をより初期の段階において予防、阻止および回復させることが可能な薬剤を、より迅速かつ費用効率よくスクリーニングするために使用され得る。
【００１８】
本発明が提供するトランスジェニックマウスはまた、脳重量の減少が見られ、このことは、通常ＡＤの発症に苦しむヒト脳において見られるような、脳における萎縮変化を示唆する。
【発明の効果】
【００１９】
基本的な実施形態によると、このトランスジェニック動物は、少なくとも北極型突然変異（E693G）およびＡβxペプチドの細胞内レベルを上昇させる突然変異を更に含む、異種のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む、少なくとも1つのトランスジーンを発現する。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載する任意のＡＰＰトランスジーン（野生型のものまたは病原性ＡＤ突然変異を含むもの）を、内在性ＡＰＰ対立遺伝子へ導入することを包含する。
【００２１】
別の実施形態によると、北極型突然変異（E693G）を含むトランスジーンは、前記トランスジェニック動物の組織において、Ａβ−40およびＡβ−42ペプチドの細胞内レベルを上昇させる、ＡＤ発症に作用する更なるトランスジーンと組み合わされる。前記の更なるトランスジーンは、例えば、少なくとも1つのＡＤ病原性突然変異を有するヒトプレセニリン−１および／またはプレセニリン−２トランスジーンである。前記の更なるトランスジーンはまた、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J（クラステリン）、α１アンチキモトリプシン（ACT）またはそれらの断片をコードするＤＮＡ配列を有するトランスジーンであってもよい。
【００２２】
別の実施形態によると、本発明のトランスジェニック動物は、ネプリライシンまたはインスリン分解酵素（IDE）遺伝子の少なくとも1つに対する、相同的に組み込んだ標的構築物を更に含み、これは、それらの遺伝子を遺伝子除去（ノックアウト）を通して崩壊させ、そしてＡβ−40および／またはＡβ−42北極型ペプチド生産を増加させる。
【００２３】
現在好ましい実施形態によると、トランスジェニック動物は北極型突然変異（E693G）およびスウェーデン型突然変異（KM670/671NL）からなる、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードし、それ以上ＡＰＰ突然変異を持たないトランスジーンを有するマウスである。
【００２４】
トランスジェニック動物ＡＤモデルは、請求項１に定義する。
【００２５】
別の態様によると、本発明はまた、前記トランスジェニック動物を作製する方法に関する。前記トランスジェニック動物を作製する方法は、請求項１４に定義する。
【００２６】
別の態様によると、本発明はまたスクリーニングの方法にも関し、ここで、トランスジェニック動物はアルツハイマー病を治療、予防または阻止するのに有用な薬剤をスクリーニングするために使用される。前記方法は、請求項２２に定義する。
【００２７】
別の態様によると、本発明はまたスクリーニングの方法にも関し、ここで、トランスジェニック動物はアルツハイマー病に対する診断薬をスクリーニングするために使用される。前記方法は、請求項２３に定義する。
【００２８】
本発明は、Ａβプロトフィブリル形成およびニューロン内部のＡβペプチド凝集が増進した病変を有するＡＤおよび関連する神経疾患に対するモデルを提供する。
【００２９】
トランスジェニック動物およびそれらの子孫で、一般的に、脳組織において北極型Ａβペプチドを産生するものが、他の用途に加え、疾患の変化および薬剤のスクリーニング、種々の化合物の試験、診断マーカーの評価のためのモデルとして使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の詳細な説明
本発明のトランスジーンは、ポリヌクレオチド配列、更に特定的には本明細書に記載する突然変異を含む異種のＡＰＰポリペプチドを含み、トランスジェニック動物において異種のＡＰＰポリペプチドの発現を行うことが可能な転写プロモーターと、機能し得る形で連結している。
【００３１】
前記プロモーターは構成的または誘導的であり得、そして全体的または組織特異的な様式でポリヌクレオチドの発現に作用し得る。組織特異的なプロモーターは、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖（NF-L）およびニューロフィラメント重鎖（NF-H）プロモーター、プリオンタンパク質（PrP）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、血小板由来増殖因子（PDGF）プロモーター、thy1糖タンパク質プロモーター、βアクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、シミアン・ウイルス40（SV40）プロモーター、およびＡＰＰプロモーター等の遺伝子特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、普遍的に発現する膜貫通糖タンパク質の一群を含み、これらの異種性は選択的なスプライシングおよび翻訳後修飾の双方により生じる（Selkoe, D. J.(1994年)NCBI登録番号P05067, 配列番号１）。全身の非ニューロン細胞において高度に発現する751および770残基スプライシング型は別として、ニューロンは695残基アイソフォームを最も盛んに発現する。すべてのアイソフォームは、種々の代謝産物の前駆体であり、これらは生理学的または病理学的条件によって誘導される異なるタンパク質分解的切断によって生じる。ＡＰＰ自体は、本発明の本質に従って使用されるように、この分子のあらゆる選択的なスプライシング型であり得、そしてグリコシル化型または非グリコシル化型のどちらかとして使用され得る。
【００３３】
更なる実施形態において、北極型突然変異を含むトランスジーンは、Ａβ−40および／またはＡβ−42北極型ペプチド生産を増強させる更なるトランスジーンと組み合わされる。前記の増加は、可溶性型Ａβペプチドの生産の増加または除去機能の低下によるものであり得る。
【００３４】
そのような更なるトランスジーンは、例えばＡＤ病原性突然変異を有する異種性のプレセニリン−１またはプレセニリン−２をコードするトランスジーンであり、更なるトランスジーンがγセクレターゼ切断によるＡβ−40および／またはＡβ−42北極型ペプチド生産レベルを増加させ、ゆえに北極型およびスウェーデン型突然変異を含むトランスジーンとして記載されるのと同様の表現型、つまり早期かつ増進された細胞内Ａβ凝集が生じる。ＡＤ病原性突然変異は、当技術分野において知られており、そして例えば以下に開示するものより選択され得る：
http://www.alzforum.org/res/com/mut/pre/table1.asp（プレセニリン−１）および
http://www.alzforum.org/res/com/mut/pre/table2.asp（プレセニリン−２）は、本出願の出願時においては以下の通りであった。
【００３５】
プレセニリン−１突然変異   V94M                      T116N
A79V                      V96F                       P117L
V82L                      F105L                      P117R
Leu85Pro                  Y115C                      E120D
Cys92Ser                  Y115H                      E120D2
E120K                     F237I
E123K                     A246E
N135D                     L250S
M139I                     Y256S
M139T                     A260V
M139V                     V261F（痙攣性不全対麻痺）
I143F                      L262F
I143M                     C263R
I143T                      P264L
M146I                     P267S
M146L                     R269G
M146V                     R269H
T147I                      E273A
H163R                     R278T
H163Y                     E280A
W165C                     E280G
S169L                      L282R
S169P                      A285V
L171P                      L286V
L173W                     S290C
Leu174Met                 S290C2
G183V                     S290C3
E184D                     G378E
G209V                     G384A
I213F                      S390I
I213T                      L392V
L219F                     N405S
L219P                     A409T
Q222H                     C410Y
L226R                     L424R
A231T                     A426P
A231V                     P436Q
M233L                     P436S
M233T
L235P
プレセニリン−２突然変異
R62H
T122P
Ser130Leu
N141I
V148I
Q228L
M239I
M239V
【００３６】
更なる実施形態において、更なるトランスジーンはアポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J（クラステリン）またはα１アンチキモトリプシン（ACT）を過剰発現して、Ａβ−40および／もしくはＡβ−42北極型ペプチドならびに／またはＡβプロトフィブリルの線維形成プロセスを促進させ、その結果、類似の表現型（つまり、早期および増進された細胞内Ａβ凝集）が生じる。
【００３７】
更なる実施形態において、動物は内部の染色体位置に相同的に組み込まれた標的構築物を含むことで、北極型突然変異（E693G）を有するそのようなトランスジェニック動物の組織において、除去機能の低下、例えばネプリライシンおよび／またはインスリン分解酵素（IDE）遺伝子の遺伝子除去（ノックアウト）を介して、Ａβ−40および／またはＡβ−42北極型ペプチドレベルを上昇させ、その結果、本発明に記載するのと同様の表現型、つまり早期かつ増進された細胞内Ａβ凝集が生じる。
【００３８】
トランスフェクションの前に、前記の更なるトランスジーンを北極型突然変異を含むトランスジーンと交雑させる。
【００３９】
本発明は更に、トランスジェニック動物、好ましくはマウスを提供し、これは本発明のトランスジーンまたは標的構築物を少なくとも1コピー有し、内部の染色体位置に相同的または非相同的のどちらかで組み込まれることにより、北極型Ａβペプチドを産生する。そのようなトランスジェニック動物は、一般的にトランスジーンまたは標的構築物を、受精卵または胚性幹（ES）細胞内へ、主にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションまたは遺伝子銃によって導入することで作製される。
【００４０】
本発明のトランスジェニック動物は、少なくとも1つの不活性化内在性ＡＰＰ対立遺伝子を有し、好ましくは不活性化ＡＰＰ対立遺伝子についてホモ接合性であり、そして実質的に内在性（つまり野生型）ＡＰＰの効果的な発現が導けない。
【００４１】
好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスは、不活性化内在性ＡＰＰ対立遺伝子についてホモ接合性であり、そして内在性（つまり、天然の）ＡＰＰ遺伝子によってコードされるマウスＡＰＰの産生が実質的に不可能である。不活性化内在性ＡＰＰ遺伝子を有するそのようなトランスジェニックマウスは、異種性のＡＰＰポリペプチド、好ましくはＡβ−40およびＡβ−42北極型ペプチド産生を上昇させるヒト北極型突然変異およびスウェーデン型ＡＰＰ突然変異（KM670/671NL）（番号APP770）をコードするトランスジーンのための、好ましい宿主受容体である。
【００４２】
前記スウェーデン型突然変異は、KM670/671DL、KM670/671DF、KM670/671DY、KM670/671EL、KM670/671EF、M670/671EY、KM670/671NY、KM670/671NF、KM670/671KL（番号APP770）等の類似した突然変異と置き換えられ得る。
【００４３】
しかし、スウェーデン型突然変異（KM670/671NL）は、現在北極型突然変異と最も好ましく組み合わされる突然変異である。
【００４４】
不活性化内在性ＡＰＰ遺伝子を有するそのようなトランスジェニックマウスもまた、ヒト北極型突然変異を、Ａβ−40および／またはＡβ−42ペプチド産生を上昇させる更なるトランスジーン（例えば、ＡＤ病原性突然変異を有する異種性のプレセニリン−１またはプレセニリン−２をコードする更なるトランスジーン）と共に含む、異種性のＡＰＰポリペプチドをコードするトランスジーンのための、好ましい宿主受容体である。そのような異種性のトランスジーンは、相同組換えまたは遺伝子変換によって、プレセニリン−１またはプレセニリン−２遺伝子座に組み込んでもよく、それにより、同時的な内在性プレセニリン−１またはプレセニリン−２遺伝子（もしくはその一部）のノックアウトおよびヒトプレセニリン−１またはプレセニリン−２遺伝子（もしくはその一部）との置き換えに有効である。
【００４５】
Ａβ北極型ペプチド発現に作用すること、あるいはＡβ北極型ペプチドおよび／もしくはＡβプロトフィブリル等の、Ａβ北極型ペプチドの凝集型のあらゆる種々の生化学的作用を、促進または阻害することが見出された化合物は、後にＡＤおよび／または関連する神経疾患の治療において更に試験され、そして使用される。
【００４６】
本発明の別の態様によると、トランスジェニック動物またはその子孫は、合理的な薬剤設計のための出発点として使用され得ることにより、リガンド、治療薬または他のタイプの小さな化学分子が、タンパク質、抗体または天然物と同様に提供される。あるいはまた、先に記載した、および前記のスクリーニングアッセイによって同定された、小さな分子または別の化合物は、合理的な薬剤設計において「リード化合物」として供給され得る。
【実施例】
【００４７】
一般的方法
当技術分野で知られる標準的な分子生物学技術および特に記載しないものは、一般的にSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, ニューヨーク (1989年、1992年),およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989年)に従った。当技術分野で知られる、外来遺伝子をマウス由来の受精卵内に導入するための標準的なトランスジェニック技術および特に記載しないものは、一般的にNagyら、Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, ニューヨーク(1986年、1994年、2002年),ISBN 0-87969-574-9に従った。（図１および２）。免疫組織化学における一般的方法：当技術分野において知られる標準的な方法および特に記載しないものは、一般的にStitesら（監修）, Basic and Clinical Immunology (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994年)およびJohnstoneおよびThorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, オックスフォード,1982年に従った（図４〜５、７〜８および１０）。
【００４８】
発現ベクターThy-SweArcＡＰＰのサブクローニング
本研究で使用するトランスジェニック構築物は、マウスThy-1発現ベクターおよびヒトＡＰＰ ｃＤＮＡを含む。脳において優勢なＡＰＰアイソフォームであるAPP695アイソフォームを使用した。NruI（＋145nt）とSmaI（＋3100）との間のヒトＡＰＰ ｃＤＮＡクローンの修飾は、Transfomer 突然変異誘発キット（Clontech）を用いた酵素的なプライマー伸長によって作成した。以下のプライマー：
ＣＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＣ（配列番号２）
およびＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧ（配列番号３）を使用して、翻訳の開始を改良するために、NotI部位およびコザック配列を隣接させて組み込んだ。
【００４９】
ＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣ（配列番号４）は、KM670/671NL突然変異を導入するために、および、
ＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＴＧＧＧＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧ（配列番号５）は、E693G突然変異を導入するために使用した。クローンは初めに、PCRの後の制限酵素切断を通して選択され、そして選択されたクローンをアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の全コード領域を通したＤＮＡシークエンシングによって確認した。最後に正しいクローンをNotIで切断し、平滑末端をThy1発現カセットのXhoI部位に連結した。構築したＤＮＡをNotIで線状化することにより、バックボーンベクターの配列を発現カセットから除去することを可能とした。βアガラーゼ（Invitrogen）によるβアガロースゲル（SeaPlaque GTG）からの精製、およびフェノール−クロロホルム抽出の後、線状化ＤＮＡ構築物（2μg/ml）を雑種マウスB6-CBA-F1系統（B&M, デンマーク）の前核卵母細胞内にマイクロインジェクションを行った。前核マイクロインジェクション技術が好ましい。本発明の組換えＤＮＡ構築物から得た転写単位を、動物胚の前核内に注入し、そして得られた初代トランスジェニックは、トランスジェニック系統を確立するために育成された。
【００５０】
同腹の子の遺伝子型決定
得られた子孫を、離乳児の尾の先端を切断し、Qiagen ＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡを抽出し、そしてＡＰＰからThy-1糖タンパク質の基本プロモーターに渡るコード配列をPCRで解析することにより、遺伝子型を決定した。2つのプライマー対は、Thy-1 Prom（ＧＡＡＴＣＣＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴ，配列番号６）をAPP-SQ6（ＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡ，配列番号７）と共に、またAPP-SQ3（ＧＣＣＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＡ−ＣＣＡＣ，配列番号８）をAPP-SQ7（ＧＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡ，配列番号９）と共に設計した（図１）。
【００５１】
動物の管理ならびに脳組織の解剖および処理
スウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスは、0.4mlアバーティン（25ml/ml）で麻酔して、脊髄反射の喪失を確認し、次に心臓内を0.9％生理食塩水でかん流した。脳を準備し、そして2つの脳半球に切断した：そのうち1つは4％PFA（パラホルムアルデヒド）/1×SPB（ソレンソンリン酸バッファー，23 mM KH2PO4, 70.5 mM Na2HPO4×2H2O, 5 mM NaN3, pH7.4）中に一晩4℃で浸した。その後、脳を10％、20％および30％（重量／体積）ショ糖/0.1×SPB溶液中に順次移し、そして各々一晩浸した。ショ糖処理は、冷凍後の組織形態をよりよく保存するために行った。脳は、凍結切片を作製するまで30％ショ糖溶液中に保持した（図３〜１０）。
【００５２】
タンパク質解析
脳の左脳半球を異なる初代系統から解剖し、そして重量を（測定した他の器官と同様に）測定した（図９）。脳組織を、プロテアーゼ阻害剤のタブレット（カタログ番号1836153, Roche, 1つのタブレットは10mlの抽出溶液に対して十分である）を含む1×PBS中の0.2％Tween-20中で抽出した（図３）。抽出割合は1：10（組織重量：抽出バッファー）であり、組織を氷上で2×10ストローク行って抽出した。抽出溶液を4℃で17900gで15分間遠心分離した。上清を一定分量に分注し、−20℃で保存した。あるいはまた、ウエスタンブロットに使用する脳組織は、1：10（組織抽出物の体積比）でプロテアーゼ阻害剤を含有する50 mM NaCl（pH11.5）を含む100 mM Na2CO3中でホモジナイズして、4℃で100,000gで1時間遠心分離し、上清を解析の前に−80℃で凍結して保存した。沈殿物を2％ SDS中で再抽出し、手早く超音波分解をして、前記の通りに遠心分離した。最後にSDS不溶性沈殿物を70％ギ酸中で再抽出した（図６）。すべてのサンプル（各々タンパク質〜40μg）を、1％メルカプトエタノールおよび1×サンプルバッファー（最終濃度）の添加により変性させ、サンプルを混合して5分間煮沸し、次に4〜20％Tris-グリシンゲル（InVitrogen）上にロードした。1×サンプルバッファーは、10％グリセロール、2％ SDS、50 mM Tris-HClおよびブロモフェノールブルー（1.5％ストックから40倍に希釈）を含む。使用するSDS-PAGE泳動バッファーは、250 mM Tris-塩基、1.9 M グリシンおよび35 mM SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む。ゲルは95Vで泳動した。ニトロセルロースフィルターをddH2O中で事前にぬらし、次に20％メタノールを含む1×転写バッファー（30 mM Tris-塩基，230 mMグリシン，pH8.3）中で平衡化させた。転写セットは転写バッファー中に組み立て、そして転写は55V、4℃で一晩行った。抗体インキュベーションの前に、ニトロセルロースフィルターを1×PBS中で5分間煮沸することにより、固定化してＡβ中のエピトープの露出を増加させた。次にフィルターを新たに調製した1×TBSバッファー（100 mM Tris-塩基，0.9％ NaCl, pH7.5）中の1％ w/v脱脂粉乳、0.1％ Tween-20において、1時間室温でブロッキングした。ブロッキングの後、フィルターを1×TBSバッファー中の0.1％ Tween-20中で、一次抗体（0.5μg/ml 6E10または2μg/ml 22C11）と共に、1時間室温でインキュベーションした。次に、室温にした1×TBSバッファー中の0.1％ Tween-20中で、3〜4回（5分間）洗浄した。室温にした1×TBSバッファー中の1％ w/v脱脂粉乳、0.1％ Tween-20中で、二次抗体（0.2μg/ml抗マウスIgG/IgM-HRP（Pierce））およびフィルターを、この溶液中で30分間インキュベーションした。次にフィルターを1×TBSバッファー中の0.1％ Tween-20中で、更に3回洗浄し、最後に、SuperSignal（Pierce-ECL）中で5分間インキュベーションする前に、Tweenを含まない1×TBSバッファー中で最終リンスをした。すべてのインキュベーションは、振盪台上で進行させた。最後にブロットフィルターをECL-Hyperfilm（Amersham）に対してインキュベーションした（図３、６）。ＡβELISA：SDS可溶性脳組織抽出物を、Ａβ１−40およびＡβ１−42レベルについて、Amyloid Beta 1-40および1-42 ELISAキット（Signet Laboratories）を説明書に従って使用して、ELISAにより解析した。ELISAで使用する抗体による、北極型と野生型Ａβとの間での等しいエピトーブ認識を確実にするため、単量体型の合成Ａβ１−40北極型およびＡβ１���40野生型の希釈シリーズを、Amyloid Beta 1-40 ELISAキットで解析した。
【００５３】
免疫組織化学
初代系統由来の脳半球を凍結台に載せ、そしてスレッジミクロトームで25μm切片を切り、使用するまで＋４℃で保存した。免疫染色には、VectorのM.O.M.キットを使用した。凍結固定した組織切片を、予熱したクエン酸バッファー（25 mM，pH7.3）中で5分間85℃でインキュベーションした。その次に、1×PBS中でリンスした。凍結固定した組織切片を、濃縮したギ酸（96％）中で5分間室温でインキュベーションして、次に水中で10分間リンスした。その後、切片を50％DAKOブロック／50％ 1×PBS中のH2O2（0.3％）で15分間室温でインキュベーションして、内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。M.O.M.マウスIgG ブロッキング試薬で1時間インキュベーションする前に、脳切片をもう一度1×PBS中でリンスして、非特異的な結合をブロックした。次に、切片を1×PBS（pH7.4）＋0.4％ Triton X-100で5分間透過性化し、1×PBS（pH7.4）中で2回手早くリンスして、表面張力を増加させた。M.O.M.マウス希釈液を、非特異的結合をブロックするために5分間インキュベーションするのに使用し、過剰分は除去した。MOM希釈液／0.1％ Triton X-100中の0.2μg/ml 6E10、14μg/ml GFAP（クローンG-A-5； 1×1500）1.5μg/ml Ａβ42および1.7μg/ml Ａβ40抗体（一次抗体）でのインキュベーションを、一晩＋4℃で進行させた。1×PBSバッファー中で別に洗浄した後、切片をM.O.M.希釈液／0.1％ Triton -100中のM.O.M.ビオチン化抗マウスまたは抗ウサギIgG試薬で、8分間インキュベーションした。切片をもう一度1×PBSバッファー中でリンスした。M.O.M.キットのABC複合体（アビジン−ビオチン複合体）で30分間のインキュベーションを進行させ、次に1×PBS中でリンスした。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼを基剤とした基質キット（NOVA Red, Vector）を使用して、10分間染色を進めた。最後に、切片をddH2O中で手早く洗浄し、70％、95％、99.5％エタノール中で脱水し、空気乾燥させ、キシレン中で脱水し、そして光学顕微鏡のためのDPX（フタル酸ジブチルキシレン，VWR
）封入剤中でマウントした。前記のすべてのインキュベーションは、特に他に記載がない限り、室温で振盪台上で実施された（図４〜５、７〜８および１０）。コンゴレッド染色は、組織切片を飽和アルカリ性塩化ナトリウム溶液（10 mM NaOH）で20分間の後に、飽和アルカリ性塩化ナトリウム溶液（10 mM NaOH）中のコンゴレッド（0.2％ w/v）で15分間インキュベートし、70％、95％、99.5％エタノール中で脱水することで実施した。組織切片を空気乾燥させ、キシレン中で脱水し、偏光下での光学顕微鏡のためのDPX（フタル酸ジブチルキシレン，VWR）封入剤中でマウントした。
【００５４】
画像解析（図７〜８）
海馬の吻側−尾側軸に沿った等間隔の冠状組織切片（各動物由来の4〜5枚の組織切片）を、各々の別々の組織切片から4つの異なる画像領域を記録することにより調査した。6E10 Ａβ−免疫反応染色は、定められた光およびフィルター設定で、冷却カラーCCDカメラを備えたLeica顕微鏡において、400倍で記録した。背側海馬のCA1錐体神経におけるニューロン内Ａβ凝集を記録した画像は、グレースケール画像に変換し、描写機能で加工することで境界を明確にし、正確な区分けを可能にした。画像は、自動スレッシホールドコマンドで区分けした（Qwin, Leica）。結果は面積比（染色面積tot／測定面積tot、％表示）として表し、解析した個々のトランスジェニックマウス由来の組織切片間の平均±標準誤差として提示される。
【００５５】
結果
PCRスクリーニング
PCR遺伝子型決定法の結果を右に示す（図１）。双方のプライマー対は、mThy1-スウェーデン北極型ｈＡＰＰ構築物を有する4種の初代系マウス（13種中）を同定し、これらの4種の初代系統が確立された；Thyスウェーデン北極型ＡＰＰ系統A〜D。上流プライマー対による428bpの長さ（A）および下流プライマー対による441bpの長さ（B）のＤＮＡ断片を検出することができた。各初代系の子孫は、同様に遺伝子型の決定がなされた（図１）。
【００５６】
スロットブロット
コピー数を、スロットブロットを用いて個々のトランスジーン陽性の子孫について解析した。4種のThyスウェーデン北極型ＡＰＰ初代系統は、種々の数のＤＮＡコピーを組み込み、最も多くのコピー数（41±2）を有する初代系統Bを含み、非トランスジェニックマウスが2コピーの内在性Thy1遺伝子を有することを考慮する（図２）。
【００５７】
ウエスタンブロットおよびELISA
異なるThyスウェーデン北極型初代系統の脳抽出物由来の、ヒトＡＰＰおよびＡβ合成を示す。図はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および抗体によって標的とされるＡＰＰ内のエピトープを図解する。APP770タンパク質アイソフォームにおいて、標的とされるエピトープは、22C11の66〜81番アミノ酸および6E10の672〜687番アミノ酸である。このスポットの感度を、Scion Imageソフトウェアで解析し、そして異なる初代系における相対的なＡＰＰ過剰発現を計算した。ゲルの均等なローディングは、クーマシー染色および総タンパク質解析で確認した。相対的なＡＰＰ発現は、内在性マウスＡＰＰおよびヒトトランスジーンＡＰＰの双方を検出可能な抗体22C11で推定することができる。一方、抗体6E10は、ヒトトランスジーンＡＰＰおよびＡβペプチドしか検出しない。Thyスウェーデン北極型ＡＰＰ初代系統Bは、3倍のＡＰＰ過剰発現を示すことが明らかになった（図３）。生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウス由来の脳組織の連続的な化学的抽出は、大半のＡβが可溶性（つまり、炭酸バッファー中での穏やかな化学的抽出によって回収され得る）であり、そして1％SDSまたは70％ギ酸中での再抽出を経た組織中に残留するＡβ（つまり不溶性Ａβ）はほとんどないことを示す（図６，ａ）。Ａβ１−40（図６，ｂ）およびＡβ１−42レベル（図６，ｃ）は、ELISAで測定すると、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウスでは、同月齢でトランスジーン（ヒトＡＰＰタンパク質）を同量発現するThyスウェーデン型トランスジェニックマウスと比較すると減少している。対照的に、全Ａβレベル（つまり、Ａβ１−40およびＡβ１−42の両方をウエスタンブロットで一緒に測定したもの）は、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウス由来の脳組織において、同月齢でトランスジーン（ヒトＡＰＰタンパク質）を同量発現するThyスウェーデン型トランスジェニックマウスと比較すると5倍増加している（図６，ｄ）。結果（図６，ｂ〜ｄ）は、プロトフィブリル等の可溶性Ａβの凝集が、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウスの脳に存在することを強く示唆し、それはウエスタンブロットが可溶性Ａβの凝集がそれらの個々の成分（つまり、単独のＡβペプチド）に分離する変性法であるためであり、従って、より高い数値測定がされる。一方、ELISAは非変性であり、各々の可溶性Ａβの凝集は1つの単独ユニットとして、そしてそれらの個々の成分の総計に対して測定されるだろう。
【００５８】
免疫組織化学
示されるＡＰＰ免疫組織化学の結果は、生後１ヶ月のThyスウェーデン北極型ＡＰＰ、初代系Bマウス（図４，ａ〜ｂ）において見られ、一方、非トランスジェニック同腹子においては広範囲におけるバックグラウンド染色が現れるだけである（図４，ｃ）。生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型ＡＰＰマウスの大脳皮質における、Ａβ凝集を示す点状のニューロン内Ａβ免疫染色を矢印で指す。同等のＡＰＰ発現をする生後２ヶ月のThyスウェーデンAPPマウスにおいては、ニューロン内Ａβはほとんどなく、そして非常にわずかである（図５，ｂ）。生後１５ヶ月のThyスウェーデン型APPマウスにおいて、一部の皮質ニューロンはニューロン内Ａβ凝集を含む（図５，ｃ）。非トランスジェニックマウスにおいては、Ａβ免疫染色は見られなかった（図５，ｄ）。本発明者らは、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの海馬におけるCA1の錐体細胞層、および大脳皮質における下層の散在神経において、ニューロン内Ａβ免疫陽性封入物を見出す（図５，ｅ）。Ａβ免疫陽性染色は、濃縮したギ酸での前処理に耐性であり、これがアミロイドの典型的な特徴（つまり、Ａβはβシート構造で凝集する）である。縮尺バーは20μmを表す（図５，ａ〜ｄ）。生後２ヶ月（図７，ｂ）および５ヶ月（図７，ｄ）のThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの海馬におけるＡβ凝集を示す、点状のニューロン内Ａβ免疫染色（図５，ａ〜ｄの矢印が指す）。同等のＡＰＰ発現をする生後２ヶ月（図７，ａ）および５ヶ月（図７，ｃ）のThyスウェーデン型APPマウスにおいては、ニューロン内Ａβはほとんどなく、そして非常にわずかである。画像解析は、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスを、Thyスウェーデン型APPトランスジェニックマウスと比較すると、11倍（２ヶ月；1.91±0.16(4)を0.17±0.02(3)と比較；平均±標準誤差(n)）および7倍（５ヶ月；2.66±0.28(3)を0.38±.10(4)と比較；平均±標準誤差(n)）のニューロン内Ａβ免疫染色でカバーされる領域の割合の増加を示す（図７，ｅ）。CA1錐体神経におけるニューロン内Ａβ凝集の面積比（左y軸）、および海馬における細胞外Ａβ斑沈着の頻度（右y軸、対数目盛り）を、様々な月齢のThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの集団において数値化した。各々の黒塗りの四角は、単独のマウスのニューロン内Ａβ（％面積比）を表し、一方、対応する白抜きの四角は大抵は下方に位置するが、同じマウスにおけるＡβ斑の頻度を表す。結果は、個々のトランスジェニックマウス由来の各々の組織切片の解析の平均±標準誤差を表す（図８）。細胞外老人斑もまた、Ａβ42およびＡβ40特異的抗体が示すように、この月齢のThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの海馬尾部に存在した（図１０，ａ〜ｂ）。Ａβ免疫反応は、濃縮したギ酸での前処理に耐性であり、かつそれにより増強された。矢印（図１０，ａ〜ｂ）は、高倍率で表示されるＡβ免疫反応性沈着を指す（図１０，ａおよびｂの横の中央の画像）。コンゴレッドとGFAP免疫染色との組み合わせは、小さなアミロイド斑を囲む強固なアストログリア反応を示し（図１０，ｃ）、これは偏光中で古典的な金色〜緑色の複屈折を示す（図１０，ｄ）。
【００５９】
脳重量
脳を解剖し、そしてその2つの脳半球に分割した。個々の左脳半球の脳重量の間の平均および分布を示す散布図。後に、脳組織をヒトAPPおよびＡβ合成について生化学的に解析した。左脳半球は初めに秤で重量測定して、脳の萎縮変性の程度とした（図９）。
【００６０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】上流（A）プライマー対で428bpおよび下流（B）プライマー対で441bpの長さを有するＤＮＡ断片の陽性PCRシグナルの存在を示す、エチジウムブロミド染色ＤＮＡゲル。異なる初代マウス由来のゲノムＤＮＡを解析し、そしてPCR陽性のThyスウェーデン型北極型ＡＰＰ初代に、ゲルの上部に表示する通り、初代系統番号A、B、CおよびDを割り当てた。ＤＮＡ分子量スタンダード（”mw-std.”）は、種々の所定のＤＮＡ断片の長さを示す。2つのプライマー対は、トランスジーンＡＰＰの全コード領域およびThy-1プロモーターの基本プロモーターを構成する。
【図２】異なる初代系統（Thyスウェーデン北極型ＡＰＰ系A、B、CおよびD）および非トランスジェニックマウスの個々のマウス由来のゲノムＤＮＡサンプルとハイブリダイズした、ｃＲＮＡプローブ由来の放射性放出物を反映するスロットブロット蛍光撮像装置画面であり、写真のシグナル（左）と、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰマウスの異なる初代系統のコピー数を測定するそれらの定量推定（右）とを対応させて、前記の個々のマウス各々を表示する。
【図３】ＡＰＰの選択的スプライシングを可能にするクニッツ領域（斜線）を有するＡＰＰタンパク質を描いたグラフ。Ａβペプチド領域（黒塗り）は、一部が膜貫通領域内に存在する。本実験で使用したＡＰＰ抗体のエピトープの位置を示す。APP770タンパク質アイソフォームにおいて、エピトープはアミノ酸66〜81（22C11）とアミノ酸672〜687（6E10）との間に位置する。22C11抗体は、ヒトおよび内在性のマウスＡＰＰの双方を検出し、一方、6E10抗体は、ヒトＡＰＰのみを検出する。初代系統BのThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳において、３倍の相対的なＡＰＰ過剰発現を示すウエスタンブロット。クーマシー染色（”Cooma”）は、ゲルにロードした全タンパク質の指標である（A）。初代系統BのThyスウェーデン北極型（SweArc）ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳において、ヒトAPPおよび北極型Ａβペプチドが存在すること（”B”）、ならびに非トランスジェニックマウス（”ntr”）の脳において存在しないこと（B）は、6E10抗体での染色によって確認した。前記抗体はヒトAPPの存在のみを検出するため、トランスジーンの機能性が確認される。
【図４】若いThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるAPPタンパク質。生後１ヶ月の初代系統BのThyスウェーデン北極型ＡＰＰマウス（ａ−左半球およびｂ−海馬）、ならびに非トランスジェニックマウス（ｃ−海馬）の脳で発現するAPPタンパク質を、6E10（Ａβにおけるエピトープ1〜16、この抗体はヒトAPPおよびＡβに対して特異的である）で染色したもの。染色は、脳におけるAPPタンパク質合成の、ニューロン分布を視覚化する。
【図５】本発明のThyスウェーデン北極型ＡＰＰマウス（ａ，矢印で示す）およびスウェーデン型APPトランスジェニックマウス（ｂおよびｃ）の大脳皮質におけるＡβ凝集を示す、点状のニューロン内Ａβ免疫染色。マウスは同程度のＡＰＰ発現および解剖学的発現パターンを有した（これらのパラメーターのどちらも、マウスの年齢と同様に、いずれのトランスジェニックマウスモデルにおいてもＡＤ表現型にも強く影響する）。少量かつ非常にわずかなニューロン内Ａβが、生後２ヶ月のThyスウェーデン型ＡＰＰマウスに見られた（ｂ）。Thyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウス（ｃ）において、生後１５ヶ月でいくつかの皮質ニューロンがニューロン内Ａβ凝集を含むが、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウス（ａ）より、非常に弱くそして頻度が低いままである。Ａβ免疫染色は、非トランスジェニックマウス（ｄ）においては見出されなかった。（ｅは、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳の右半球におけるＡβ凝集の概観を示す。矢印は、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰのCA1錐体神経における顕著なギ酸耐性Ａβ免疫反応染色を示す。縮尺バーは20μmを表す（ａ〜ｄ）。
【図６】生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型ＡＰＰマウス（初代系統B）、およびThyスウェーデン型ＡＰＰトランスジェニックマウスにおける、Ａβタンパク質。脳組織の連続した化学的抽出は、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰマウスにおける大半のＡβが可溶性であり（つまり、炭酸バッファー中で穏やかに化学的抽出をすることによって回収することができる）、そして1％SDSまたは70％ギ酸中での再抽出で残留する組織内のＡβ（つまり、不溶性Ａβ）はほとんどない（ａ，FA＝ギ酸）。Ａβ１−40（ｂ）およびＡβ１−42（ｃ）レベルは、ELISAで測定すると、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウスにおいて、同月齢でトランスジーン（ヒトＡＰＰタンパク質）を同量発現するThyスウェーデン型トランスジェニックマウスと比較して減少している。対照的に、全Ａβレベル（つまり、Ａβ１−40およびＡβ１−42の双方を一緒にウエスタンブロットで測定したもの）は、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウス由来の脳組織において、同月齢でトランスジーン（ヒトＡＰＰタンパク質）を同量発現するThyスウェーデン型トランスジェニックマウスと比較して5倍の増加を示す（ｄ）。結果（ｂ〜ｄ）は、プロトフィブリル等の可溶性Ａβの凝集が、生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型トランスジェニックマウスの脳に存在することを強く示唆し、それはウエスタンブロットが、可溶性Ａβ凝集をそれらの個々の成分に分離する変性法であり、そして単独のＡβペプチドはより高い数値を示すためである。一方、ELISAは非変性技術であり、そのため各々の可溶性Ａβ凝集が1つの単独ユニットとして測定され、そして数値がより低くなるだろう。
【図７】点状のニューロン内Ａβ（A〜D中の矢印）は、生後２ヶ月（B）および５ヶ月（D）の双方のThyスウェーデン北極型（SweArc）ＡＰＰにおいて、非常に強くまた頻出する。反対に、生後２ヶ月（A）および５ヶ月（C）の双方の時点で、Thyスウェーデン（Swe）APPにおいて、（トランスジーンＡＰＰ発現と一致して）ニューロン内免疫染色Ａβは、頻度が低くそしてわずかである。定量画像解析（E）は、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰ（黒塗りのバー）における点状のニューロン内Ａβ免疫染色が、Thyスウェーデン型APP（白抜きのバー）と比較して、7倍以上増加していることを示す。
【図８】細胞外Ａβ斑沈着の増加よりも少なくとも２ヶ月前に、ニューロン内Ａβ凝集が増加することを示すグラフ。CA1錐体神経におけるニューロン内Ａβ凝集の面積比（左y軸）、および海馬における細胞外Ａβ斑沈着の頻度（右y軸、対数目盛）を、様々な月齢のThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの集団において測定した。各々の黒塗りの四角は、一匹のマウスのニューロン内Ａβ（％面積比）を表し、一方、対応する白抜きの四角は大抵は下方に位置するが、同じマウスにおけるＡβ斑の頻度を表す。結果は、個々のトランスジェニックマウス由来のいくつかの組織切片の解析の平均±標準誤差を表す。
【図９】生後２ヶ月のThyスウェーデン北極型ＡＰＰおよびThyスウェーデン型APPトランスジェニックマウスの集団から分析した、個々の左脳半球重量間の群平均（ライン）および分布を示す散布図。Thyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳重量（221±9mg；n＝9）は、Thyスウェーデン型APPトランスジェニックマウス（239±5mg；n＝8）と比較して減少が見られ、このことは、ＡＤ発症に苦しむヒトの脳において通常観察されるような、Thyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳における萎縮変化を示唆する。
【図１０】生後７ヶ月のThyスウェーデン北極型ＡＰＰトランスジェニックマウスの海馬における細胞外老人斑。Ａβ免疫活性は二種の異なる抗体で観察され、これらはＡβ42（ａ）およびＡβ40（ｂ）のC末端における短いアミノ酸断片に特異的であって、ゆえにAPPまたはAPP断片を検出しない（Naslundら、2000年）。Ａβ免疫活性は、濃縮したギ酸で前処理することで耐性となり、そして増強される。矢印は、より高倍率で表したＡβ免疫活性沈着を示す（ａとｂとの間の画像）。コンゴレッドとGFAP免疫染色との組み合わせは、小さなアミロイド斑（ｃ）を囲む強固なアストログリオーシス（astrogliosis，星膠症）を示し、これは偏光中で古典的な金色〜緑色の複屈折を示す（ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007530035.tif 000011
【国際調査報告】
2007530035.tif 000012
2007530035.tif 000013
2007530035.tif 000014
2007530035.tif 000015
2007530035.tif 000016
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