(57)【要約】  本発明は、医薬化合物をプロファイリングするための、特に、肝胆除去のモデルとして、インビトロでのツールとして適切な、ヒトＮＴＣＰ（Ｎａ／タウロコール酸共輸送タンパク質；ＳＬＣ１０Ａ１）を、ヒトＢＳＥＰ（胆汁酸排出ポンプ；ＡＢＣＢ１１）、または、ヒトＭＲＰ２（多剤耐性タンパク質；ＡＢＣＣ２）と共に発現する数種の二重にトランスフェクションされた細胞系に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞であって、該面の両方は、該細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、該面の両方は、該細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらが該細胞の両端で局在化することによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＢＳＥＰタンパク質を有する、上記細胞。
【請求項２】
第一面は側底面であり、第二面は頂端面である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
第一面は頂端面であり、第二面は側底面である、請求項１または２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
細胞は、腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
不死化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
組換え細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
ｈＮＴＣＰタンパク質を発現するベクター、および、ｈＢＳＥＰタンパク質を発現するベクターを含むＬＬＣ−ＰＫ１細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
ｈＮＴＣＰタンパク質を発現するベクター、および、ｈＢＳＥＰタンパク質を発現するベクターを含むＭＤＣＫＩＩ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４３として寄託された、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
ａ］哺乳動物細胞を提供し；
ｂ］ｈＮＴＣＰのコード配列を含むベクターを提供し；
ｃ］ｈＢＳＥＰのコード配列を含むベクターを提供し；
ｄ］ａ］に記載の哺乳動物細胞を、ｂ］に記載のベクター、および、ｃ］に記載のベクターで、同時に、または、連続的に形質転換させ；
ｅ］ｄ］に記載の二重の形質転換細胞を同定し、増殖させる、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項１１】
ａ］に記載の哺乳動物細胞は、腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞である、請求項１０に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項１２】
ａ］に記載の哺乳動物細胞は、不死化されている、請求項１０または１１に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項１３】
ｂ］に記載のベクターは、図９（配列番号４）に記載のポリヌクレオチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項１４】
ｃ］に記載のベクターは、図１０（配列番号５）に記載のポリヌクレオチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項１５】
哺乳動物細胞は、寄託された細胞ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４３として確立されている、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項１６】
請求項１〜９に記載の細胞の少なくとも２種を含む、細胞の単分子層。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単分子層を有し、細胞の単分子層が、固体表面の一部または全体を占有していてもよい、固体表面。
【請求項１８】
プラスチックで形成される、請求項１７に記載の固体表面。
【請求項１９】
ペトリ皿の一部である、請求項１７に記載の固体表面。
【請求項２０】
フィルターインサートの一部である、請求項１７に記載の固体表面。
【請求項２１】
請求項１７に記載の細胞の単分子層を有するペトリ皿。
【請求項２２】
請求項１７に記載の細胞の単分子層を有するフィルターインサート。
【請求項２３】
膜の支持体は、ポリカーボネート、および／または、ポリエステルで製造されている、請求項２２に記載のフィルターインサート。
【請求項２４】
膜の支持体の孔径は、０.４μｍである、請求項２２または２３に記載のフィルターインサート。
【請求項２５】
肝胆による除去、および／または、腎臓の排出、および／または、脳の吸収、および／または、腸の吸収に関する薬理学的なプロファイルを決定するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の使用。
【請求項２６】
哺乳動物細胞は、固体表面、および／または、ペトリ皿、および／または、フィルターインサート上の単分子層の一部を形成する、請求項２５に記載の哺乳動物細胞の使用。
【請求項２７】
第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞であって、該面の両方は、該細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、該面の両方は、該細胞が接触する領域とは異なり、そして、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端に局在化することによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＭＲＰ２タンパク質を有する、上記細胞。
【請求項２８】
第一面は側底面であり、第二面は頂端面である、請求項２７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２９】
第一面は頂端面であり、第二面は側底面である、請求項２７または２８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３０】
細胞は、腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３１】
不死化されている、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３２】
組換え細胞である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３３】
ｈＮＴＣＰタンパク質を発現するベクター、および、ｈＭＲＰ２タンパク質を発現するベクターを含むＬＬＣ−ＰＫ１細胞である、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３４】
ｈＮＴＣＰタンパク質を発現するベクター、および、ｈＭＲＰ２タンパク質を発現するベクターを含むＭＤＣＫＩＩ細胞である、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３５】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４４として寄託された、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３６】
ａ］哺乳動物細胞を提供し；
ｂ］ｈＮＴＰＣのコード配列を含むベクターを提供し；
ｃ］ｈＭＲＰ２のコード配列を含むベクターを提供し；
ｄ］ａ］に記載の哺乳動物細胞を、ｂ］に記載のベクター、および、ｃ］に記載のベクターで、同時に、または、連続的に形質転換させ；
ｅ］ｄ］に記載の二重の形質転換細胞を同定し、増殖させる、
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項３７】
ａ］に記載の哺乳動物細胞は、腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞である、請求項３６に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項３８】
ａ］に記載の哺乳動物細胞は、不死化されている、請求項３６または３７に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項３９】
ｂ］に記載のベクターは、図９（配列番号４）に記載のポリヌクレオチドである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項４０】
ｃ］に記載のベクターは、図１１（配列番号６）に記載のポリヌクレオチドである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項４１】
哺乳動物細胞は、寄託された細胞ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４４として確立されている、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の製造。
【請求項４２】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の細胞の少なくとも２種を含む、細胞の単分子層。
【請求項４３】
細胞の単分子層は、固体表面の一部または全体を占有できる、請求項４２に記載の単分子層を有する固体表面。
【請求項４４】
プラスチックで形成される、請求項４３に記載の固体表面。
【請求項４５】
ペトリ皿の一部である、請求項４３に記載の固体表面。
【請求項４６】
フィルターインサートの一部である、請求項４３に記載の固体表面。
【請求項４７】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の細胞の単分子層を有するペトリ皿。
【請求項４８】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の細胞の単分子層を有するフィルターインサート。
【請求項４９】
膜の支持体は、ポリカーボネート、および／または、ポリエステルで製造されている、請求項４８に記載のフィルターインサート。
【請求項５０】
膜の支持体の孔径は、０.４μｍである、請求項４８に記載のフィルターインサート。
【請求項５１】
肝胆による除去、および／または、腎臓の排出、および／または、脳の吸収、および／または、腸の吸収に関する薬理学的なプロファイルを決定するための、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞の使用。
【請求項５２】
哺乳動物細胞は、固体表面、および／または、ペトリ皿、および／または、フィルターインサート上の単分子層の一部を形成する、請求項５１に記載の哺乳動物細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
医薬化合物をプロファイリングするためのインビトロツールとして適切な、ヒトＮＴＣＰとヒトＭＲＰ２の両方でトランスフェクションされた細胞系：肝胆による除去（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）のためのモデルである。
【０００２】
本発明は、医薬化合物をプロファイリングするためのインビトロツールとして適切な、特に、肝胆による除去のモデルとして、ヒトＢＳＥＰ（胆汁酸塩排出ポンプ；ＡＢＣＢ１１）、または、ヒトＭＲＰ２（多剤耐性タンパク質；ＡＢＣＣ２）と共にヒトＮＴＣＰ（Ｎａ／タウロコール酸共輸送タンパク質；ＳＬＣ１０Ａ１）を発現する数種の二重にトランスフェクションされた細胞系に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的な関門を超える経細胞輸送プロセスは、薬物や非生体物質の吸収、分配および除去において必須の役割を果たしている。腸上皮細胞において、輸送タンパク質は、体循環への／体循環からの、薬物の吸収または排除に関与する。血液−脳関門の細胞で発現された輸送タンパク質は、脳からの毒性（さらに、治療的）化合物の除去に関与する。腎臓における近位の尿細管の上皮細胞、および、肝細胞における輸送タンパク質は、様々な内因性および外因性物質の除去に関与する。肝細胞において、この除去プロセスには、（ｉ）側底面の膜を介した血液から細胞への取り込み、および、（ii）頂端面の膜を介した胆汁への除去が介在する。全ての生物学的な関門における傍細胞の拡散は、頂端と側底面の膜区画とを分離する密着結合（隣接する細胞間の極めて堅い接触を提供する分子構造）の形成により予想される。また、生物学的な関門の特徴（密着結合によって分離された側底面および頂端面の膜の区画の発達）を維持している細胞系は、極性細胞系とも呼ばれる。通常これらの細胞系は、単一の細胞からなる層（単分子層という）で成長する。
【０００４】
ヒト肝細胞への化合物の側底面（または、洞様の（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ）、ともいう）の取り込みには、多種多様な異なる輸送タンパク質が介在する：嵩高の（ｂｕｌｋｙ）有機アニオンは、ＯＡＴＰ８（ＳＬＣ２１Ａ８）、ＯＡＴＰ２（ＳＬＣ２１Ａ６、また、ＯＡＴＰ−ＣまたはＬＳＴ１としても知られている）およびＯＡＴＰ−Ｂ（ＳＬＣ２１Ａ９）により取り込まれ、それに対して、胆汁酸、さらに場合によっては胆汁酸に類似したその他の化合物は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドＮＴＣＰ（ＳＬＣ１０Ａ１）に受け入れられる。ＯＡＴ２（ＳＬＣ２２Ａ７）は、小（ｓｍａｌｌ）有機アニオンを肝細胞にインポートし、さらに、ＯＣＴ１（ＳＬＣ２２Ａ１）は、小有機カチオンの細胞の取り込みを容易にすることが報告されている。頂側（または、管側（ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ）、ともいう）膜において、有機アニオンおよび胆汁塩の胆汁への除去には、多剤耐性関連タンパク質ＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）および胆汁酸塩排出ポンプＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）が介在し、これらはいずれも、ＡＢＣ輸送体ファミリー（ＡＴＰ依存性排出ポンプ）の一種である。ヒト肝細胞の管側膜で発現されることもわかっているその他のＡＢＣ輸送体は、乳ガン耐性タンパク質ＢＣＲＰ（ＡＢＣＧ２、また、ＭＸＲとしても知られている）および多剤耐性タンパク質ＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１、また、Ｐ糖タンパク質としても知られている）である。これらの２種のタンパク質は、両親媒性およびカチオン性化合物の管側の分泌プロセスに関係すると考えられる。
【０００５】
多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）ファミリーは、親油性物質とグルタチオン、グロクロネートまたはサルフェートとの結合体のＡＴＰ依存性の一方向性輸送に介在する（総論：Ｋｏｅｎｉｇ  Ｊ．等，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４６１（１９９９）３７７〜３９４）。
【０００６】
胆汁塩のプールは、別個の胆汁輸送タンパク質、例えば管側の胆汁排出ポンプＢＳＥＰ、回腸のＮＡ+依存性胆汁酸塩輸送体ＩＳＢＴ、および、肝類洞のＮＡ+−タウロコール酸共輸送ポリペプチドＮＴＣＰなどによって調節される腸肝循環を受ける。その他の胆汁酸塩輸送体としては、有機アニオン輸送ポリペプチドＯＡＴＰ、および、多剤耐性関連タンパク質２、および、３ＭＲＰ２，２が挙げられる（総論：Ｔｒａｕｎｅｒ等，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８３：６３３−６７１，２００３）。
【０００７】
これまで、薬物の肝胆による除去を調査する唯一の方法は、ラットで行われる胆汁ろうの研究であるが、これは、複雑で時間がかかるインビボの分析である。加えて、胆汁ろうの研究では、除去プロセスの分子機構に関する情報はまったく得られない。ここで、我々は、極性化した（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）イヌ腎細胞系ＭＤＣＫＩＩにおいて、肝臓の取り込み輸送体（この場合、ヒトＮＴＣＰ）が、肝臓の排出ポンプ（通常、ＡＢＣ輸送体、この場合、ヒトＭＲＰ２、または、ヒトＢＳＥＰ）と共に構成的に発現される細胞に基づく分析システムを説明する（参考として、Ｌｏｕｖａｒｄ，１９８０；Ｆｕｌｌｅｒ等，１９８４を参照）。それゆえに、得られた細胞系は、１つの細胞系で２種のトランスジーンを発現する；（ｉ）ヒトＢＳＥＰと共に、ヒトＮＴＣＰ（ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＢＳＥＰ）および（ii）ヒトＭＲＰ２と共に、ヒトＮＴＣＰ（ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ−ｈＭＲＰ２）。このような細胞は、側底面の区画と頂端面の区画とを分離する多孔質フィルター膜上の６−ウェルのフィルターインサートで培養される（図１）。両方向での経細胞（方向性を有する）輸送の測定のために、頂端面または側底面の区画のいずれかに、推定上の基質（例えば、医薬化合物）が添加される。規定のインキュベート時間の後に、各区画からサンプルを採取する。所定の輸送体の組み合わせの基質（この場合、ヒトＮＴＣＰとヒトＢＳＥＰ、または、ヒトＮＴＣＰとヒトＭＲＰ２）は、トランスフェクションされていない細胞、または、１回トランスフェクションされた細胞と比較した場合、側底面の区画から頂端面の区画への顕著な正味の輸送を示す（図４と５）。
【０００８】
説明されている二重にトランスフェクションされた細胞系を用いることによって、輸送体の組み合わせのヒトＮＴＣＰ／ヒトＢＳＥＰ、または、ヒトＮＴＣＰ／ヒトＭＲＰ２が、医薬化合物の肝胆による除去プロセスに関係するかどうかを予測することが可能であると予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
医薬開発の際に、薬物動態学的なプロファイルが弱いために臨床開発を続行できなくなる化合物は多い。この一つの理由としては、それらの肝臓を介した胆汁への迅速な除去が挙げられる。この現象の例は、グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ（ＩＩ型糖尿病患者において将来性のある新規の製薬上の標的）の有力かつ特異的な阻害剤クロロゲン酸誘導体である。薬力学的な研究によれば、数種のクロロゲン酸誘導体の血糖低下作用は、ウィスター・ラットにおけるボーラス静脈内注射の後、ほんの短時間しか継続しないことが示された。胆汁ろうの研究では、この弱い薬力学的な作用は、迅速な肝胆による除去プロセスに起因する不適切な薬物動態学の結果であることが示された。二重にトランスフェクションされた輸送体細胞系を用いれば、除去プロセスに関与する輸送体を同定することができると予想される。次の工程で、これら化合物は、化合物の薬理学を改善するためにそれらの除去輸送体への親和性を緩和するような方式で化学修飾されてもよい。
【００１０】
その他の応用分野は、肝臓における、輸送体のレベルでの将来性のある薬物−薬物相互作用の試験であり得る。例えば、肝臓における１つの輸送体に対する２種の薬物の競合により、両方の化合物の薬物動態学的なプロファイルが著しく改変される可能性がある。加えて、１種の薬物による輸送体の阻害または活性化もまた、輸送体基質の薬理学的な挙動を変化させる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞に関し、ここにおいて、これら面の両方は、このような細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、これら面の両方は、このような細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端で局在化していることによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＢＳＥＰタンパク質を有する。
【００１２】
このような哺乳動物細胞の第一面は、例えば側底面であり、第二面は、頂端面であるか、または、第一面は、例えば頂端面であり、第二面は、例えば側底面である。
【００１３】
哺乳動物細胞は、上皮細胞から選択することができ、特に腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞から選択することができる。
【００１４】
このような細胞は、不死化細胞でもよいし、または、組換え細胞でもよい。このような細胞は、一般的な哺乳動物組織から採取することもでき、または、一次細胞培養物から採取することができる。またこのような細胞は、特に組換えベクターを有する場合、細胞培養物由来の細胞（例えば、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、または、ＭＤＣＫＩＩ細胞）でもよい。
【００１５】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＢＳＥＰタンパク質（配列番号５で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。あるいは、ｈＮＴＣＰおよびｈＢＳＥＰタンパク質は、同じベクターコンストラクトから同時に発現されてもよい。ＭＤＣＫＩＩ細胞は、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＢＳＥＰタンパク質（配列番号５で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。このような、ｈＮＴＣＰタンパク質とｈＢＳＥＰタンパク質を発現させる能力を有する２種の別個のベクターを有するＭＤＣＫＩＩタイプの哺乳動物細胞は、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，マシェローダー・ヴェーク１ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイクに寄託されている。識別番号は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４３である。
【００１６】
本発明はさらに、機能的なヒトＮＴＣＰタンパク質、および、機能的なヒトＢＳＥＰタンパク質を有する哺乳動物細胞の製造に関し、ここにおいて、
ａ］哺乳動物細胞を提供し；
ｂ］ｈＮＴＣＰのコード配列を含むベクターを提供する（例えば、配列番号４に示される、または、それに同等のベクター）；
ｃ］ｈＢＳＥＰのコード配列を含むベクターを提供する（例えば、配列番号５に示される、または、それに同等のベクター）；
ｄ］ａ］に記載の哺乳動物細胞を、ｂ］に記載のベクター、および、ｃ］に記載のベクターで、同時に、または、連続的に形質転換させ；
ｅ］ｄ］に記載の二重の形質転換細胞を同定し、増殖させる。
【００１７】
このような製造のために提供される哺乳動物細胞は、特に腎臓、腸管系、肝臓、または、血液／脳関門の上皮細胞であり得る。また、このような細胞は、不死化細胞でもよいし、または、組換え細胞でもよい。このような細胞は、一般的な哺乳動物組織から採取してもよいし、または、一次細胞培養物から採取してもよい。このような、上述したような製造により得られたｅ］に記載の二重の形質転換細胞は、特に組換えベクターを有する場合、例えばＬＬＣ−ＰＫ１細胞、または、ＭＤＣＫＩＩ細胞であり得る。このようなＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＢＳＥＰタンパク質（配列番号５で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。ｈＮＴＣＰおよびｈＢＳＥＰタンパク質は、同じベクターコンストラクトから同時に発現させてもよい。このようなＭＤＣＫＩＩ細胞は、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＢＳＥＰ（配列番号５で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。このような、ｈＮＴＣＰタンパク質とｈＢＳＥＰタンパク質を発現させる能力を有する２種の別個のベクターを有するＭＤＣＫＩＩタイプの哺乳動物細胞は、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，マシェローダー・ヴェーク１ｂ、Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイクに寄託されている。識別番号は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４３である。
【００１８】
本発明はさらに、第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞の少なくとも２種の細胞を含む細胞の単分子層に関し、これら面の両方は、このような細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、これら面の両方は、このような細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端で局在化していることによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＢＳＥＰタンパク質を有する。
【００１９】
このような単分子層は、固体表面の一部または全体を占有していてもよい。本発明はまた、このような細胞の単分子層を有する固体表面にも関する。
【００２０】
このような固体表面は、プラスチックで形成することができる。このような固体表面はまた、ペトリ皿、または、フィルターインサートの一部であってもよい。
【００２１】
本発明はさらに、上述のような細胞の単分子層を有するペトリ皿、同様に、上述のような細胞の単分子層を有するフィルターインサートに関する。このようなフィルターインサートの膜の支持体は、ポリカーボネート、および／または、ポリエステルで製造することができる。膜の支持体の孔径は、０.４μｍ±０.２μｍであり得る。図１に、それに従ったフィルターインサートの例を示す。前記細胞の単分子層をその上に置くために用いることができるフィルターインサートの製造元がいくつかある。このような製造元は、例えば、「コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，コーニング，ニューヨーク州）」、または、「ミリポア」である。
【００２２】
第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞であって、これら面の両方は、このような細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、これら面の両方は、このような細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端で局在化していることによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＢＳＥＰタンパク質を有しており、このような細胞は、例えば、肝胆による除去、および／または、腎臓の排出、および／または、脳の吸収、および／または、腸の吸収に関する薬理学的なプロファイルを決定するのに用いることができる。このような使用のために、このような哺乳動物細胞が、固体表面および／またはペトリ皿および／またはフィルターインサート上で単分子層の一部を形成していてもよい。
【００２３】
本発明はさらに、第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞に関し、ここにおいて、これら面の両方は、このような細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、これらの面の両方は、このような細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端で局在化していることによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＭＲＰ２タンパク質を有する。
【００２４】
このような哺乳動物細胞の第一面が例えば側底面であり、そして第二面は、頂端面であるか、または、第一面が例えば頂端面であり、そして第二面は、例えば、側底面である。
【００２５】
哺乳動物細胞は、上皮細胞から、特に腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞から選択することができる。
【００２６】
このような細胞は、不死化細胞でもよいし、または、組換え細胞でもよい。このような細胞は、一般的な哺乳動物組織から採取してもよいし、または、一次細胞培養物から採取してもよい。このような細胞は、特に組換えベクターを有する場合、細胞培養物由来の細胞（例えば、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、または、ＭＤＣＫＩＩ細胞）でもよい。
【００２７】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＭＲＰ２タンパク質（配列番号６で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。あるいは、ｈＮＴＣＰおよびｈＭＲＰ２タンパク質は、同じベクターコンストラクトから同時に発現されてもよい。ＭＤＣＫＩＩ細胞は、例えば、ｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＭＲＰ２タンパク質（配列番号６で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包するものとする。このような、ｈＮＴＣＰタンパク質とｈＭＲＰ２タンパク質を発現させる能力を有する２種の別個のベクターを有するＭＤＣＫＩＩタイプの哺乳動物細胞は、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，マシェローダー・ヴェーク１ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイクに寄託されている。識別番号は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４４である。
【００２８】
本発明はさらに、機能的なヒトＮＴＣＰタンパク質、および、機能的なヒトＭＲＰ２タンパク質を有する哺乳動物細胞の製造に関し、ここにおいて、
ａ］哺乳動物細胞を提供し；
ｂ］ｈＮＴＣＰのコード配列を含むベクター（例えば、配列番号４に示される、または、それに同等のベクター）を提供し；
ｃ］ｈＭＲＰ２のコード配列を含むベクター（例えば、配列番号６に示される、または、それに同等のベクター）を提供し；
ｄ］ａ］に記載の哺乳動物細胞を、ｂ］に記載のベクター、および、ｃ］に記載のベクターで、同時に、または、連続的に形質転換させ；
ｅ］ｄ］に記載の二重の形質転換細胞を同定し、増殖させる。
【００２９】
このような製造で提供される哺乳動物細胞は、上皮細胞が可能であり、具体的には腎臓、腸管系、肝臓または血液／脳関門の上皮細胞である。このような細胞は、不死化細胞でもよいし、または、組換え細胞でもよい。このような細胞は、一般的な哺乳動物組織、または、一次細胞培養物から採取することができる。
【００３０】
このような上述したような製造により得られたｅ］に記載の二重の形質転換細胞は、特に組換えベクターを有する場合、細胞培養物由来の細胞（例えば、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞またはＭＤＣＫＩＩ細胞）でもよい。このようなＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＭＲＰ２タンパク質（配列番号６で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。ｈＮＴＣＰおよびｈＭＲＰ２タンパク質は、同じベクターコンストラクトから同時に発現させてもよい。このようなＭＤＣＫＩＩは、例えばｈＮＴＣＰタンパク質（配列番号４で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクター、および、ｈＭＲＰ２（配列番号６で例示されたような）を発現させるのに適した組換えベクターを内包していてもよい。このような、ｈＮＴＣＰタンパク質、および、ｈＭＲＰ２タンパク質を発現させる能力を有する２種の別個のベクターを有するＭＤＣＫＩＩタイプの哺乳動物細胞は、ＤＳＭＺ ― Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，マシェローダー・ヴェーク１ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイクに寄託されている。識別番号は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４４である。
【００３１】
本発明はさらに、第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞の少なくとも２種の細胞を含む細胞の単分子層に関し、ここにおいて、これら面の両方は、このような細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、これら面の両方は、このような細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端で局在化していることによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＭＲＰ２タンパク質を有する。
【００３２】
このような単分子層は、固体表面の一部または全体を占有していてもよい。本発明は、このような細胞の単分子層を有する固体表面に関する。
【００３３】
このような固体表面は、プラスチックで形成することができる。このような固体表面はまた、ペトリ皿、または、フィルターインサートの一部であってもよい。
【００３４】
本発明はまた、上述のような細胞の単分子層を有するペトリ皿、さらに、上述のような細胞の単分子層を有するフィルターインサートにも関する。このようなフィルターインサートの膜の支持体は、ポリカーボネート、および／または、ポリエステルで製造することができる。膜の支持体の孔径は、約０.４μｍ±０.２μｍであり得る。図１に、それに従ったフィルターインサートの例を示す。前記細胞の単分子層をその上に置くために用いることができるフィルターインサートの製造元がいくつかある。このような製造元は、例えば、「コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，コーニング，ニューヨーク州）」、または、「ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）」である。
【００３５】
第一面と第二面とを有する哺乳動物細胞であって、これら面の両方は、このような細胞の外部表面の一部を形成し、さらに、これら面の両方は、このような細胞が接触する領域とは異なり、さらに、第一面および第二面は、それらがこのような細胞の両端で局在化していることによって互いに区別され、ここにおいて、第一面は、機能的なｈＮＴＣＰタンパク質を有し、第二面は、機能的なｈＭＲＰ２タンパク質を有しており、このような細胞は、例えば、肝胆による除去、および／または、腎臓の排出、および／または、脳の吸収、および／または、腸の吸収に関する薬理学的なプロファイルを決定するのに用いることができる。このような使用のために、このような哺乳動物細胞が、固体表面および／またはペトリ皿および／またはフィルターインサート上で単分子層の一部を形成していてもよい。
【００３６】
タンパク質は、生物学的な状況において、特に生きた細胞の一部として活性を示す条件下にある場合、本発明の状況において機能的であるとみなすものとする。このような活性は、例えば分析によって検出可能である。例えば、輸送体が化合物（特に輸送体の生物学的な基質）を、細胞の外側から、その細胞の内側の区画に（または、逆もまた同様）移動させる場合、この輸送体は機能的である。イオン輸送体タンパク質の生物学的な基質は、例えば、１価および／または２価イオンまたはその他のイオンからなる。グルコース輸送体タンパク質の基質は、例えば、グルコースである。多剤耐性タンパク質の基質は、例えば、薬物単独、または、グルタチオンまたはグルコナートに結合した薬物である。
【００３７】
本発明の状況におけるタンパク質の操作は、当業者により、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）出版（編集：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ，Ｈｉｄｄｅ  Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｐａｕｌ  Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ；０−４７１−１１１８４−８−ルーズリーフ；０−４７１−１４０９８−８−ＣＤＲＯＭ）に記載のプロトコールを適用することによって達成できる。
【００３８】
分子生物学に関する技術（例えば、クローニング、細胞の形質転換、配列解析、プロモーターの改変、タンパク質の発現など）の操作は、当業者により、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”ジョン・ワイリー＆サンズ出版（編集：Ｆｒｅｄ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒｏｇｅｒ  Ｂｒｅｎｔ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓｔｒｕｈｌ；０−４７１−５０３３８−Ｘ−ルーズリーフ；０−４７１−３０６６１４ＣＤＲＯＭ）に記載のプロトコールを適用することによって達成できる。
【００３９】
生物学的な細胞の操作は、当業者により、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”ジョン・ワイリー＆サンズ出版（編集：Ｊｕａｎ  Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｍａｒｙ  Ｄａｓｓｏ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊｏｅ  Ｂ．Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍ．Ｙａｍａｄａ；０−４７１−２４１０８−３−ルーズリーフ；０−４７１−２４１０５−９−ＣＤＲＯＭ）に記載のプロトコールを適用することによって達成できる。
【実施例】
【００４０】
細胞系の作製：ＭＤＣＫＩＩ−ｈＢＳＥＰ、および、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＢＳＥＰ：
ＭＤＣＫＩＩ細胞（マディン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎細胞，ＩＩ系）を、１０％ウシ胎仔血清が追加されたダルベッコ改変必須培地で、３７℃、５％ＣＯ2および９５％湿度で培養した。ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＢＳＥＰ細胞系（ＤＳＭ
ＡＣＣ２６４３）を以下のように作製した：ＭＤＣＫＩＩ細胞を、まず、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＢＳＥＰで、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて、製造元（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））によって説明された通りにトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、１０００μｇ／ｍｌゼオシンで選択した。選択の際に、組織培地に、さらに、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを追加した。得られた細胞クローンを、免疫ブロットで、組換えヒトＢＳＥＰ発現に関してスクリーニングし、それに続いて、共焦点レーザー顕微鏡検査法を用いて組換えヒトＢＳＥＰの適切な細胞内局在を解析した。ヒトＢＳＥＰが最高に発現され、それに付随して頂端面の膜で組換えＢＳＥＰの局在化がみられる細胞クローンを、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）−ｈＮＴＣＰでのＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクションに関して選択した。トランスフェクションされた細胞を、８００μｇ／ｍｌゲネチシン、および、１０００μｇ／ｍｌゼオシンで選択した。選択の際に、組織培地に、さらに、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを追加した。二重にトランスフェクションされた細胞系を、免疫ブロットで、組換えヒトＢＳＥＰと組換えヒトＮＴＣＰの両方の発現に関して再度スクリーニングし、それに続いて、共焦点レーザー顕微鏡検査法によって両方のトランスジーンの適切な細胞内局在を解析した。ヒトＢＳＥＰ（頂端面の膜）とヒトＮＴＣＰ（側底面の膜）が最高に発現され、両方の適切な細胞内局在がみられる細胞クローンを、さらなる試験のために選択した。
【００４１】
細胞系の作製：ＭＤＣＫＩＩ−ｈＭＲＰ２、および、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２：
ＭＤＣＫＩＩ細胞（マディン−ダービーイヌ腎細胞，ＩＩ系）を、１０％ウシ胎仔血清が追加されたダルベッコ改変必須培地で、３７℃、５％ＣＯ2および９５％湿度で培養した。ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２細胞系（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４４）を以下のように作製した：ＭＤＣＫＩＩ細胞を、まず、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＭＲＰ２で、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて、製造元（ロシュ）によって説明された通りにトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、１０００μｇ／ｍｌゼオシンで選択した。選択の際に、組織培地に、さらに、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを追加した。得られた細胞クローンを、免疫ブロットで、組換えヒトＭＲＰ２発現に関してスクリーニングし、それに続いて、共焦点レーザー顕微鏡検査法を用いて組換えヒトＭＲＰ２の適切な細胞内局在を解析した。ヒトＭＲＰ２が最高に発現され、それに付随して頂端面の膜での組換えＭＲＰ２の局在化がみられる細胞クローンを、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）−ｈＮＴＣＰでのＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクションに関して選択した。トランスフェクションされた細胞を、８００μｇ／ｍｌゲネチシン、および、１０００μｇ／ｍｌゼオシンで選択した。選択の際に、組織培地に、さらに、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを追加した。二重にトランスフェクションされた細胞系を、免疫ブロットで、組換えヒトＭＲＰ２と組換えヒトＮＴＣＰの両方の発現に関して再度スクリーニングし、それに続いて、共焦点レーザー顕微鏡検査法によって両方のトランスジーンの適切な細胞内局在を解析した。ヒトＭＲＰ２（頂端面の膜）とヒトＮＴＣＰ（側底面の膜）が最高に発現され、両方の適切な細胞内局在がみられる細胞クローンを、さらなる試験のために選択した。
【００４２】
細胞系の作製：ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ：
ＭＤＣＫＩＩ細胞（マディン−ダービーイヌ腎細胞，ＩＩ系）を、１０％ウシ胎仔血清が追加されたダルベッコ改変必須培地で、３７℃、５％ＣＯ2および９５％湿度で培養した。ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ細胞系を製造するために、ＭＤＣＫＩＩ細胞を、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）−ｈＮＴＣＰで、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて、製造元（ロシュ）によって説明された通りにトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、８００μｇ／ｍｌゲネチシンで選択した。選択の際に、組織培地に、さらに、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを追加した。得られた細胞クローンを、免疫ブロットで、組換えヒトＮＴＣＰ発現に関してスクリーニングし、それに続いて、ヒトＮＴＣＰを最高に発現する細胞クローンを機能性について解析した（親のＭＤＣＫＩＩ細胞と比較した、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ細胞におけるタウロコール酸の取り込みの測定）。
【００４３】
化学物質：［3Ｈ（Ｇ）］−ブロモスルホフタレイン（ＢＳＰ）（０.２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を、ハルトマン・アナリティック（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，ブラウンシュヴァイク，ドイツ）から購入した。［２，４−3Ｈ（Ｎ）］−コール酸（０.７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、［カルボキシル−１４Ｃ］−ケノデオキシコール酸（１.９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）および［グリシン−２−3Ｈ］−グリココール酸（０.１５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を、バイオトレンド・ケミカリーエン（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ，ケルン，ドイツ）から得た。［3Ｈ（Ｇ）］−タウロコール酸（０.１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンシズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入した。ゼオシン、ゲネチシン、ペニシリンＧ、および、硫酸ストレプトマイシンを、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。分析純度を有する追加の化学物質を、シグマ（Ｓｉｇｍａ）およびメルク（Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット，ドイツ）から得た。
【００４４】
輸送の分析：
細胞を、１×１０6細胞／インサートの密集度で、６ウェルプレート中のポリエステル膜インサート（孔径０.４μＭ、インサート直径２４ｍｍ、コースター（Ｃｏｓｔａｒ））上で６日間、成長させた。トランスジーンの過剰発現を、１０ｍＭ酪酸ナトリウムを増殖培地に添加することによって２４時間誘導した。次の日、細胞を、輸送分析緩衝液（１４２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭグルコース、１.５ｍＭのＣａＣｌ2、１.２ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１２.５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.３）で１回洗浄し、それに続いて、［3Ｈ］−、または、［14Ｃ］標識化合物のいずれかを頂端面（１.５ｍｌ）または側底面（２.５ｍｌ）区画に添加した。対立する区画を、輸送分析緩衝液で満たした。規定のインキュベート時間（３７℃）の後に、それぞれの区画からサンプルを採取し、シンチレーション計数器（ワラック（Ｗａｌｌａｃ），ウィンスペクトラル１４１４（Ｗｉｎｓｐｅｃｔｒａｌ１４１４）液体シンチレーションカウンター）によって測定した。インプットの経細胞輸送（パーセント）を以下のように計算した：
【００４５】
頂端面の区画から側底面の区画への輸送:
輸送Ａ−Ｂ[％]＝100×(放射活性(t1)側底面[dpm]×2,5[ml])／(放射活性(t0)頂端面[dpm]×1,5[ml]）
【００４６】
側底面の区画から頂端面の区画への輸送:
輸送Ｂ−Ａ[％]＝100×(放射活性(t1)頂端面[dpm]×1,5[ml])／(放射活性(t0)側底面[dpm]×2,5[ml]）
【００４７】
本発明の状況において、以下の生物学的材料を、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，マシェローダー・ヴェーク１ｂ；Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイクに寄託した：
ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４３：ヒトＮＴＣＰ（配列番号４）を発現するベクター、および、ヒトＢＳＥＰ（配列番号５）を発現するベクターを含む、二重にトランスフェクションされたＭＤＣＫＩＩ細胞。
【００４８】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４４：ヒトＮＴＣＰ（配列番号４）を発現するベクター、および、ヒトＭＲＰ２（配列番号６）を発現するベクターを含む二重にトランスフェクションされたＭＤＣＫＩＩ細胞。
【００４９】
図面の説明:
図１：
一般的な分析の計画
細胞を、多孔質膜（ポリエステル膜、孔径０.４μＭ、６ウェル）上のフィルターインサート中で、極性化した密着した単分子層として成長させ、それによって、側底面の区画を頂端面の区画から分離した。図１は、細胞の単分子層を有するフィルターインサートの例を示す。
【００５０】
図２:
分析の計画：ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＢＳＥＰ
ヒトＢＳＥＰ（Ｂ）もしくはヒトＮＴＣＰ（Ｃ）、または、ヒトＮＴＣＰおよびヒトＢＳＥＰ（Ｄ）の両方でトランスフェクションされたＭＤＣＫＩＩ細胞（Ａ）およびＭＤＣＫＩＩ細胞の概略図である。ヒトＮＴＣＰは、側底面の膜に局在し、それに対してヒトＢＳＥＰは、頂端面の膜に局在する。この１回トランスフェクションされた細胞系ＭＤＣＫＩＩ−ｈＢＳＥＰ、および、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰは、コントロールとして役立つ。
【００５１】
図３：
分析の計画：ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２
ヒトＭＲＰ２（Ｂ）もしくはヒトＮＴＣＰ（Ｃ）、または、ヒトＮＴＣＰとヒトＭＲＰ２の両方（Ｄ）でトランスフェクションされたＭＤＣＫＩＩ細胞（Ａ）およびＭＤＣＫＩＩ細胞の概略図である。ヒトＮＴＣＰは、側底面の膜に局在し、それに対してヒトＭＲＰ２は、頂端面の膜に局在する。この１回トランスフェクションされた細胞系ＭＤＣＫＩＩ−ｈＭＲＰ２、および、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰは、コントロールとして役立つ。
【００５２】
図４：
ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＢＳＥＰ  単分子層における、［3Ｈ］グリココール酸、［3Ｈ］タウロコール酸、［3Ｈ］コール酸、［14Ｃ］ケノデオキシコール酸、および、［3Ｈ］ＢＳＰ（ブロモスルホフタレイン）の方向性を有する輸送
ＭＤＣＫＩＩ、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＭＲＰ２、および、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２細胞を、フィルターインサート上で６日間成長させた（１×１０6細胞／ウェル）。トランスジーン発現を、１０ｍＭ酪酸ナトリウムの添加によって２４時間誘導した。指定された量の各化合物を、側底面の区画、または、頂端面の区画のいずれかに別々に与えた。４５および９０分間後に対立する区画からアリコートを採取し、液体シンチレーション計数器で分析した。Ａ−Ｂは、頂端面の区画への化合物の添加、および、側底面の区画からのサンプリングを意味する（方向性を有する頂端面の区画から側底面の区画への輸送）。Ｂ−Ａは、側底面の区画への化合物の添加、および、頂端面の区画からのサンプリングを意味する（方向性を有する側底面の区画から頂端面の区画への輸送）。データは、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。
【００５３】
図５：
ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２単分子層における、［3Ｈ］ＢＳＰ（ブロモスルホフタレイン）、［3Ｈ］コール酸、および、［3Ｈ］タウロコール酸の方向性を有する輸送
ＭＤＣＫＩＩ、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＭＲＰ２、および、ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２細胞を、フィルターインサート上で６日間成長させた（１×１０6細胞／ウェル）。トランスジーン発現を、１０ｍＭ酪酸ナトリウムの添加によって２４時間誘導した。１００ｎＭの各化合物を、側底面の区画、または、頂端面の区画のいずれかに別々に与えた。１および２時間後に、対立する区画からアリコートを採取し、液体シンチレーション計数器で分析した。Ａ−Ｂは、頂端面の区画への化合物の添加、および、側底面の区画からのサンプリングを意味する（方向性を有する頂端面の区画から側底面の区画への輸送）。Ｂ−Ａは、側底面の区画への化合物の添加、および、頂端面の区画からのサンプリングを意味する（方向性を有する側底面の区画から頂端面の区画への輸送）。データは、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。
【００５４】
図６：
ヒトＮＴＣＰ（Ｓｌｃ１０Ａ１）、ｃＤＮＡ配列；長さ：１０６１塩基；示された配列は、配列番号１に対応する。
【００５５】
図７：
ヒトＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）、ｃＤＮＡ配列；長さ：３９６６塩基；示された配列は、配列番号２に対応する。
【００５６】
図８：
ヒトＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）、ｃＤＮＡ配列；長さ：４６５０塩基；示された配列は、配列番号３に対応する。
【００５７】
図９：
ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）−ｈＮＴＣＰ、完全配列；長さ：６４３３塩基；示された配列は、配列番号４に対応する：
ヒトナトリウム依存性タウロコール酸共輸送タンパク質（ｈＮＴＣＰ、ＳＬＣ１０Ａ１）ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）のＭＣＳ（インビトロジェン）にＢａｍＨＩとＸｂａＩを介してクローニングした。ヒトＮＴＣＰｃＤＮＡを、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））からの遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。クローニングされたｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２１８９３の７６〜１１３６位（コード配列：８３〜１１３２位）に対応する。異なる点：６１６位のｃがｔであり（アミノ酸変化なし）、および、７７４位のｔがｃである（ＦからＳのアミノ酸変化）。
【００５８】
図１０:
ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＢＳＥＰ、完全配列；長さ：９０４３塩基；示された配列は、配列番号５に対応する：
ヒト胆汁酸排出ポンプ（ｈＢＳＥＰ、ＡＢＣＢ１１）ｃＤＮＡを、ゲートウェイ・テクノロジー（Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，インビトロジェン）を用いることによってクローニングした。ヒトＢＳＥＰのｃＤＮＡを、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック）からのａｔｔＢ−改変遺伝子特異的プライマー用いてＰＣＲで増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１を介してｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）ベクター（インビトロジェン，ゲートウェイ・デスティネーション・ベクター（Ｇａｔｅｗａｙ  Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を改変）にクローニングした。クローニングしたｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１３６５２３の１２８〜４０９３位（コード配列：１２８位〜４０９３位）に対応する。異なる点：３２１１位のＧがＡである（アミノ酸変化なし）。
【００５９】
図１１：
ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＭＲＰ２、完全配列；長さ：９６５８塩基；示された配列は、配列番号６に対応する：
ヒト多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２、ＡＢＣＣ２）ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）（インビトロジェン）のＭＣＳにＮｈｅＩとＡｆｌＩＩを介してクローニングした。ヒトＭＲＰ２のｃＤＮＡを、ＨｅｐＧ２のｃＤＮＡライブラリーから遺伝子特異的なプライマー用いてＰＣＲで増幅した。クローニングしたｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９６３９５の２６〜４６７５位（コード配列：３８〜４６７５位）に対応する。異なる点：４００９位のＣがＴである（アミノ酸変化なし）。
【００６０】
配列番号の説明：
配列番号１：
図６に、ヒトＮＴＣＰ（Ｓｌｃ１０Ａ１）、ｃＤＮＡ配列；長さ：１０６１塩基；配列番号１を開示する。
配列番号２：
図７に、ヒトＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）、ｃＤＮＡ配列；長さ：３９６６塩基；配列番号２を開示する。
配列番号３：
図８に、ヒトＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）、ｃＤＮＡ配列；長さ：４６５０塩基；配列番号３を開示する。
配列番号４：
図９に、ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）−ｈＮＴＣＰ、完全配列；長さ：６４３３塩基；配列番号４を開示する。
配列番号５：
図１０に、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＢＳＥＰ、完全配列；長さ：９０４３塩基；配列番号５を開示する。
配列番号６：
図１１に、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＭＲＰ２、完全配列；長さ：９６５８塩基；配列番号６を開示する。
【００６１】
参考文献:
1. Louvard D. (1980) Apical membrane aminopeptidase appears at site of cell-cell contact in cultured kidney epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(7): 4132-4136
2. Fuller S, von Bonsdorff C-H, and Simons K (1984) Vesicular Stomatitis Virus infects and matures only through the basolateral surface of the polarized epithelial cell line, MDCK. Cell 38: 65-77。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】細胞の単分子層を有するフィルターインサートの例を示す。
【図２】ヒトＢＳＥＰ（Ｂ）もしくはヒトＮＴＣＰ（Ｃ）、または、ヒトＮＴＣＰおよびヒトＢＳＥＰ（Ｄ）の両方でトランスフェクションされたＭＤＣＫＩＩ細胞（Ａ）およびＭＤＣＫＩＩ細胞の概略図である。
【図３】ヒトＭＲＰ２（Ｂ）もしくはヒトＮＴＣＰ（Ｃ）、または、ヒトＮＴＣＰとヒトＭＲＰ２の両方（Ｄ）でトランスフェクションされたＭＤＣＫＩＩ細胞（Ａ）およびＭＤＣＫＩＩ細胞の概略図である。
【図４】ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＢＳＥＰ  単分子層における、［3Ｈ］Ｇｌｙｃｏコール酸、［3Ｈ］タウロコール酸、［3Ｈ］コール酸、［14Ｃ］ケノデオキシコール酸、および、［3Ｈ］ＢＳＰ（ブロモスルホフタレイン）の方向性を有する輸送を示す。
【図５】ＭＤＣＫＩＩ−ｈＮＴＣＰ／ｈＭＲＰ２単分子層における、［3Ｈ］ＢＳＰ（ブロモスルホフタレイン）、［3Ｈ］コール酸、および、［3Ｈ］タウロコール酸の方向性を有する輸送を示す。
【図６】ヒトＮＴＣＰ（Ｓｌｃ１０Ａ１）、ｃＤＮＡ配列；長さ：１０６１塩基を示す。
【図７−１】ヒトＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）、ｃＤＮＡ配列；長さ：３９６６塩基を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８−１】ヒトＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）、ｃＤＮＡ配列；長さ：４６５０塩基を示す。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９−１】ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ（＋）−ｈＮＴＣＰ、完全配列；長さ：６４３３塩基を示す。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０−１】ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＢＳＥＰ、完全配列；長さ：９０４３塩基を示す。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１０−３】図１０−２の続きである。
【図１１−１】ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）−ｈＭＲＰ２、完全配列；長さ：９６５８塩基を示す。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１１−３】図１１−２の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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