(57)【要約】本発明は、免疫グロブリン産生に関連したBrightの同定、病的免疫グロブリン産生に関連した病態の治療のためのその機能の標的化に関する。同様にBright-阻害活性を有する候補物質を同定する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化されたB細胞における免疫グロブリン産生を抑制する方法であり、該細胞をBrightポリペプチド機能のインヒビターと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
インヒビターが、アンチセンス分子である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
インヒビターが、干渉RNAである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
インヒビターが、リボザイムである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
インヒビターが、Bright-由来のペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが、Bright二量体化ドメインの少なくとも一部を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ペプチドが、Bright DNA結合ドメインの少なくとも一部を含む、請求項5記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが、Btk-相互作用ドメインの少なくとも一部を含む、請求項5記載の方法。
【請求項９】
インヒビターが、ドミナント-ネガティブBrightポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
インヒビターが、抗-Bright抗体またはそれらの断片である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
抗-Bright抗体またはそれらの断片が、F'ab、ヒト化抗体、または1本鎖抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
インヒビターが、脂質送達ビヒクルにおいて該細胞へ送達される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
インヒビターが、ポリペプチドまたは核酸であり、および該インヒビターが、プロモーターの制御下にインヒビターコード領域を含む発現コンストラクトを介して、該細胞へ送達される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
発現コンストラクトが、ウイルス発現ベクターである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ-随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはポリオーマウイルスベクターである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ウイルス発現ベクターが、B細胞向性である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
B細胞向性ウイルス発現ベクターが、エプスタインバーウイルスである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
発現コンストラクトが、非-ウイルス発現ベクターである、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
プロモーターが、誘導性プロモーターであり、かつ該方法が、該細胞を該プロモーターのインデューサーと接触させる工程を更に含む、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
プロモーターが、B細胞特異的プロモーターである、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項13記載の方法。
【請求項２２】
対象へBrightポリペプチド機能のインヒビターを投与する工程を含む、過剰な免疫グロブリン産生に関連した病態に罹患した対象を治療する方法。
【請求項２３】
インヒビターが、アンチセンス分子である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
インヒビターが、干渉RNAである、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
インヒビターが、リボザイムである、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
インヒビターが、Bright-由来のペプチドである、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
ペプチドが、Bright二量体化ドメインの少なくとも一部を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ペプチドが、Bright DNA結合ドメインの少なくとも一部を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
ペプチドが、Btk-相互作用ドメインの少なくとも一部を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
インヒビターが、ドミナント-ネガティブBrightポリペプチドである、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
インヒビターが、抗-Bright抗体またはそれらの断片である、請求項22記載の方法。
【請求項３２】
抗-Bright抗体またはそれらの断片が、F'ab、ヒト化抗体、または1本鎖抗体である、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
インヒビターが、脂質送達ビヒクルにおいて該対象へ投与される、請求項22記載の方法。
【請求項３４】
インヒビターが、ポリペプチドまたは核酸であり、および該インヒビターが、プロモーターの制御下でインヒビターコード領域を含む発現コンストラクトを介して該対象へ投与される、請求項22記載の方法。
【請求項３５】
発現コンストラクトが、ウイルス発現ベクターである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
ウイルス発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ-随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはポリオーマウイルスベクターである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
ウイルス発現ベクターが、B細胞向性である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
B細胞向性ウイルス発現ベクターが、エプスタインバーウイルスである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
発現コンストラクトが、非-ウイルス発現ベクターである、請求項34記載の方法。
【請求項４０】
プロモーターが、誘導性プロモーターであり、および該方法が、該細胞を該プロモーターのインデューサーと接触させる工程を更に含む、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
プロモーターが、B細胞特異的プロモーターである、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
インヒビターが、TATペプチドに融合されているペプチドまたはポリペプチドである、請求項22記載の方法。
【請求項４４】
抗-炎症性組成物を該対象へ投与する工程を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項４５】
病態が、全身性エリスマトーデス、関節リウマチ、全身性硬化症、多発性筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応、グレーヴス病、重症筋無力症、グロブリン過剰血症を特徴とする癌、単核球症、および高-Ig症候群からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項４６】
インヒビターが、1回よりも多く投与される、請求項22記載の方法。
【請求項４７】
インヒビターが、長期基準で投与される、請求項22記載の方法。
【請求項４８】
以下の工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法：
(a)少なくとも2種のBrightポリペプチドを提供する工程；
(b)該Brightポリペプチドを候補物質と接触させる工程；および
(c)Bright二量体形成を評価する工程；
ここで該候補物質の非存在下で認められたBright二量体形成と比較した、Bright二量体形成の減少が、該候補物質を免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する、方法。
【請求項４９】
候補物質が、ペプチド、非-機能性Brightアナログ、抗体もしくは抗体断片、または小分子の有機製剤である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
以下の工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法：
(a)少なくとも1種のBrightポリペプチドおよび1種のBtkポリペプチドを提供する工程；
(b)該ポリペプチドを候補物質と接触させる工程；および
(c)BtkとのBright相互作用を評価する工程；
ここで該候補物質の非存在下で認められたBtkとのBright相互作用と比較した、BtkとのBright相互作用の減少が、該候補物質を、免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する、方法。
【請求項５１】
候補物質が、ペプチド、非-機能性Brightアナログ、抗体もしくは抗体断片、または小分子の有機製剤である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
以下の工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法：
(a)少なくとも1種のBrightポリペプチドおよび1種のTFII-Iポリペプチドを提供する工程；
(b)該ポリペプチドを候補物質と接触させる工程；および
(c)TFII-IとのBright相互作用を評価する工程；
ここで該候補物質の非存在下で認められたTFII-IとのBright相互作用と比較した、TFII-IとのBright相互作用の減少が、該候補物質を、免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する、方法。
【請求項５３】
候補物質が、ペプチド、非-機能性Brightアナログ、抗体もしくは抗体断片、または小分子の有機製剤である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
以下の工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法：
(a)BrightポリペプチドおよびBtkポリペプチドを発現し、かつスクリーニング可能マーカーまたは選択可能マーカーに連結された免疫グロブリンプロモーターを更に含む組換え細胞を提供する工程；
(b)該細胞を候補物質と接触させる工程；および
(c)該マーカーの発現を評価する工程；
ここで該候補物質の非存在下で認められたマーカーの発現と比較した、該マーカーの発現の減少が、該候補物質を、免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する、方法。
【請求項５５】
組換え細胞が、TFII-Iを更に発現する、請求項54記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の技術分野
本発明は概して、免疫学および分子生物学の分野に関する。より詳細に述べると、これは、過剰なまたは不適切な免疫グロブリン産生の状況におけるBright機能の阻害に関する。具体的には本発明は、疾患の治療におけるBrightインヒビターの使用、およびBright機能のインヒビターを見つけるスクリーニング法に関する。
【０００２】
本出願は、2004年1月23日に出願され、その全体の内容が本明細書に参照として組入れられている、米国特許仮出願第60/538,866号の優先権の恩典を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
2.関連技術の説明
免疫グロブリン(Ig)としても公知である抗体は、ヒト免疫応答において重要な部分を形成する。Bリンパ球により産生されるこれらの大きい二価の受容体-様分子は、細胞表面に結合および体液中に遊離の両方で認められる。遺伝子再編成および体細胞の高頻度変異の複雑な遺伝子システムのために、ヒトの抗体レパートリーは膨大であり、B細胞をは、自己(selt)抗原および非-自己抗原のほぼ無限のアレイに結合する抗体を産生することが可能である。場合によっては、抗原の結合単独で、その有害機能を実現する抗原の能力に影響を及ぼすのに十分である。別の状況において、抗体は、他の免疫細胞(食細胞、T-細胞など)によるか、または補体カスケードによる更なる除去または破壊のために、抗原に印をつける。
【０００４】
残念なことに、Ig産生は常に有益なわけではない。全身性エリスマトーデス、関節リウマチ、全身性硬化症、多発性筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応、グレーヴス病、重症筋無力症、グロブリン過剰血症を特徴とする癌、単核球症、および高-Ig症候群を含む、過剰なまたは不適切な免疫グロブリン産生により特徴付けられた多くの病態が同定されている。多くの場合において、産生されたIgは、宿主細胞抗原を攻撃し、炎症および組織破壊を引き起こす。従って、病的Ig産生のダウンレギュレーションの機序を同定し、そのような方法を前述の病態の治療として使用することは非常に恩恵がある。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
従って本発明に従い、細胞をBrightポリペプチド機能のインヒビターと接触させる工程を含む、活性化されたB細胞における免疫グロブリン産生を抑制する方法が提供される。このインヒビターは、アンチセンス分子、干渉RNA、またはリボザイムであってよい。このインヒビターは、Bright-由来のペプチド、例えばBright二量体化ドメインの少なくとも一部、Bright DNA結合ドメインの少なくとも一部、またはBtk-相互作用ドメインの少なくとも一部を含むペプチドであってよい。このインヒビターは、ドミナント-ネガティブBrightポリペプチドまたは抗-Bright抗体もしくはそれらの断片であってもよい。抗-Bright抗体またはそれらの断片は、F'ab、ヒト化抗体、または1本鎖抗体であってよい。このインヒビターは、脂質送達ビヒクルにおいて細胞に送達されてよい。
【０００６】
このインヒビターは同じく、ポリペプチドまたは核酸であってよく、ならびにこのインヒビターは、プロモーターの制御下にインヒビターコード領域を含む発現コンストラクトにより細胞へ送達されてもよい。この発現コンストラクトは、ウイルスの発現ベクター、例えばアデノウイルスベクター、アデノ-随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはポリオーマウイルスベクターであってよい。ウイルスの発現ベクターは、B細胞向性(例えばエプスタインバーウイルス)であることができる。発現コンストラクトは、非-ウイルス発現ベクターでもあってよい。プロモーターは、誘導性プロモーターであってよく、およびこの方法は更に、細胞を、B細胞特異的プロモーターのようなプロモーターのインデューサーと接触させる工程を含むことができる。このプロモーターは、構成的プロモーターであってよい。
【０００７】
別の態様において、本発明は、Brightポリペプチド機能のインヒビターを対象に投与する工程を含む、過剰な免疫グロブリン産生に関連した病態に罹患した対象を治療する方法を提供する。このインヒビターは、アンチセンス分子、干渉RNA、またはリボザイムであることができる。このインヒビターは、Bright-由来のペプチド、例えばBright二量体化ドメインの少なくとも一部、Bright DNA結合ドメインの少なくとも一部、またはBtk-相互作用ドメインの少なくとも一部を含むペプチドであることができる。このインヒビターは、ドミナント-ネガティブBrightポリペプチドまたは抗-Bright抗体もしくはそれらの断片であることもできる。抗-Bright抗体またはそれらの断片は、F'ab、ヒト化抗体、または1本鎖抗体であることができる。このインヒビターは、脂質送達ビヒクルにおいて細胞へ送達することができる。
【０００８】
このインヒビターは、ポリペプチドまたは核酸であることもでき、およびこのインヒビターは、プロモーターの制御下でインヒビターコード領域を含む発現コンストラクトにより細胞へ送達することができる。この発現コンストラクトは、ウイルス発現ベクター、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはポリオーマウイルスベクターであることができる。このウイルス発現ベクターは、B細胞向性(例えばエプスタインバーウイルス)であることができる。この発現コンストラクトは、非-ウイルス発現ベクターであってもよい。このプロモーターは、誘導性プロモーターであり、およびこの方法は更に、細胞を、B細胞特異的プロモーターのようなプロモーターのインデューサーと接触させる工程を含む。このプロモーターは、構成的プロモーターであってよい。このインヒビターは、TATペプチド、または他の核局在化ペプチドの輸送体(transport)に融合されているペプチドもしくはポリペプチドであってもよい。
【０００９】
この方法は更に、抗-炎症性組成物を対象へ投与する工程を含むことができる。この病態は、全身性エリスマトーデス、関節リウマチ、全身性硬化症、多発性筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応、グレーヴス病、重症筋無力症、グロブリン過剰血症を特徴とする癌、単核球症、および高-Ig症候群をからなる群から選択することができる。このインヒビターは、長期を基準にするように、1回よりも多く投与することができる。
【００１０】
更に別の態様において、(a)少なくとも2種のBrightポリペプチドを提供する工程；(b)Brightポリペプチドを候補物質と接触させる工程；および、(c)Brightの二量体形成を評価する工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法が提供され、ここで候補物質の非存在下で認められたBright二量体形成と比べ、Bright二量体形成の減少は、その候補物質を、免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する。候補物質は、ペプチド、非-機能性Brightアナログ、抗体もしくは抗体断片、または小分子の有機製剤を含む。
【００１１】
更に別の態様において、(a)少なくとも1種のBrightポリペプチドおよび1種のBtkポリペプチドを提供する工程；(b)これらのポリペプチドを候補物質と接触させる工程；ならびに、(c)BtkとのBright相互作用を評価する工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法が提供され、ここで候補物質の非存在下で認められたBtkとのBright相互作用と比べ、BtkとのBright相互作用の減少は、その候補物質を免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する。候補物質は、ペプチド、非-機能性Brightアナログ、抗体もしくは抗体断片、または小分子の有機製剤である。
【００１２】
更なる態様において、(a)少なくとも1種のBrightポリペプチドおよび1種のTFII-Iポリペプチドを提供する工程；(b)このポリペプチドを候補物質と接触させる工程；ならびに、(c)TFII-IとのBright相互作用を評価する工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法が提供され、ここで候補物質の非存在下で認められたTFII-IとのBright相互作用と比べ、TFII-IとのBright相互作用の減少は、その候補物質を免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する。候補物質は、ペプチド、非-機能性Brightアナログ、抗体もしくは抗体断片、または小分子の有機製剤である。
【００１３】
なお更なる態様において、(a)BrightポリペプチドおよびBtkポリペプチドを発現し、ならびにスクリーニングマーカーまたは選択マーカーに連結された免疫グロブリンプロモーターを更に含む組換え細胞を提供する工程；(b)細胞を候補物質と接触させる工程；ならびに、(c)該マーカーの発現を評価する工程を含む、免疫グロブリン産生のサプレッサーをスクリーニングする方法が提供され、ここで候補物質の非存在下で認められたマーカー発現と比較した、マーカー発現の減少は、その候補物質を免疫グロブリン産生のサプレッサーとして同定する。組換え細胞は更に、TFII-Iを発現することができる。
【００１４】
本明細書において使用される単数形("a"または"an")は、1またはそれよりも多くを意味することができる。本明細書の「特許請求の範囲」において使用される単語「含む("comprising")」と組合せて使用される場合、単語"a"または"an"は、1または1よりも多くを意味することができる。本明細書において使用される「別の("another")」は、少なくとも二番目またはそれ以降のものを意味することができる。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、当業者にはこの詳細な説明から本発明の精神および範囲内での様々な変更および修飾は明らかであるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、同時に単なる例証を目的として提供されることは理解されなければならない。
【００１５】
具体的態様の説明
先に説明したように、自己免疫障害、特に病的免疫グロブリン産生に関連しているものを治療する改善された方法の大きい必要性が存在する。本発明者らの先の研究は、マウスのBright活性と、X-連鎖した免疫不全症の間の連関を示した(Webb et al., 2000)。ヒトもX-連鎖した免疫不全症に罹患するが、マウスよりもはるかに重度の表現型を有するので、ヒトBrightはBリンパ球において発現されたかどうか、およびこれはBtkと会合しているかどうかを決定するために、これらが探索された。加えて先のヒトBrightの分析は、タンパク質レベルへ拡大されていなかった(Kortschak et al., 1998)。そこに示されたデータは、Brightは、全てのヒトBリンパ球亜集団においては発現されないことを明らかにし、およびBright/Btkに会合したDNA-結合複合体は、一部のヒトB細胞株に存在することを示している。ヒトおよびマウスBrightの形質転換されないB細胞における発現および活性は類似しており、このことはヒトBrightは、免疫グロブリン産生の調節などの、重要な機能を、マウスタンパク質と共有していることを示している。
【００１６】
I. Bright
転写因子Bright(IgH転写のためのB細胞調節因子(B cell regulator of IgH transcription))は、高度に保存されたA+T-リッチ相互作用ドメインまたはARIDを介してDNAと相互作用するタンパク質増殖ファミリーのメンバーである(Herrscher et al., 1995)。現在、Brightは、標的配列が同定されており、および配列-特異的様式でDNAに結合するこのファミリーの唯一のメンバーである。ARIDファミリータンパク質は、ショウジョウバエの腸管および眼瞼おける系統決定において重要な役割を果たし、および胚の卵割に必要である、ショウジョウバエタンパク質Dead ringerおよびeyelid(Gregory et al., 1996；Treisman et al., 1997)；細胞周期-特異的様式で網膜芽腫タンパク質と相互作用する網膜芽腫結合タンパク質(Rbp1)(Fattaey et al., 1993)；ならびに、同じく網膜芽腫タンパク質(Rb)と相互作用する新規タンパク質としてツー-ハイブリッドスクリーニングにおいて同定された遍在的に発現されるヒトタンパク質であるBDP(Numata et al., 1999)を含む。酵母タンパク質SWI/1は、Brightと相同性を有し、その生物においてクロマチン組織化の変調に役立つ比較的大きいタンパク質複合体の成分である(Peterson and Herskowitz, 1992；Burns and Peterson, 1997)。同様にヒトSWI-SNF複合体は、同じくARIDファミリーのメンバーである非-配列特異的DNA結合活性を伴う270kDaタンパク質を含む(Dallas et al., 2000)。従ってこのファミリーのメンバーは、系統決定、細胞周期制御、腫瘍抑制およびクロマチン変調に関与し得る。これらの機能は、互いに排除されず、および重複する機構から生じることがある。
【００１７】
ほとんどのARIDファミリータンパク質は、遍在的に発現される。しかしマウスのBright発現は、Bリンパ球系統の成体細胞に大きく制限され、そこでその発現は密に調節され、かつプレ-B細胞およびピーナッツアグルチニン-高度胚中心細胞集団にmRNAレベルで制限される(Herrscher et al., 1995；Webb, 1991；Webb et al., 1998)。マウスにおける活性化された脾B細胞は、抗原結合後Brightを発現するよう誘導することができるが、このタンパク質は、末梢IgM+B細胞の多くには存在しない(Webb et al., 1991；Webb et al., 1998)。リポ多糖類または抗原を使用するB細胞株または成熟型活性化されたBリンパ球におけるBright発現の誘導は、IgH転写の基準レベルをおよそ3〜6倍上回るアップレギュレーションを生じる(Herrscher et al., 1995；Webb et al., 1991；Webb et al., 1989)。転写活性化は、一部のVHプロモーターの5'側またはイントロン性のEμエンハンサー内のDNA結合部位と密に関連している。
【００１８】
イントロン性のEμエンハンサーに会合したBright結合部位も、マトリックス-会合領域またはMAR、クロマチン転写活性ドメインへ組織化するために提唱されているA＋Tリッチ領域として機能する(Herrscher et al., 1995；Webb et al., 1991)。NFμNR(核因子μネガティブ調節因子)は、Bright結合部位に重複しているDNA配列に結合する別のMAR-結合タンパク質複合体である。NFμNRは、遍在的に発現されたCAAAT置換タンパク質(CDP/Cut/Cux)を含む(Wang et al., 1999)。マウスの非-B細胞はNFμNRを発現するが、Bリンパ球は一般にそのようなタンパク質複合体を示さない。これらのデータは、BrightおよびNFμNRは、免疫グロブリンの遺伝子座の調節において逆の役割を果たすという仮説につながる(Webb et al., 1999)。BrightおよびCDPが同時発現されたトランスフェクション試験は、Brightの抑制を示した(Wang et al., 1999)。従ってBrightは、転写を直接的に、またはクロマチンリモデリングを介してもしくは追加のタンパク質とのより複雑な相互作用を介して間接的に活性化することができる。NFμNRは、その活性に対し反対に作用することができる(Wang et al., 1999)。
【００１９】
本発明者らは、BrutonのチロシンキナーゼまたはBtkは、活性化されたマウスのBリンパ球においてBrightと会合することを最近決定した(Webb et al., 2000)。Btkは、ヒトおよびマウスの両方においてBリンパ球の適切な発達および維持に重要なチロシンキナーゼをコードしているX-連鎖遺伝子である((Conley et al., 1994；Satterthwaite and Witte, 1996)において検証された)。この酵素の欠損は、ヒトの重症B細胞免疫不全症の90％を占め、および発達のプロ-B細胞工程のブロックおよび重度に抑制された血清抗体レベルを特徴とする免疫不全状態であるX-連鎖した無γグロブリン血症(XLA)を生じる(Conley et al., 1994)。Btkは明らかにヒトおよびマウス疾患の欠損遺伝子産物であるが、Btk欠損がB細胞発達のブロックを生じる分子機序は現在不明である。興味深いことに、XLAのマウスモデルであるX-連鎖した免疫欠損(xid)マウスは、Brightとの安定した複合体を形成することができない変異したBtkタンパク質を産生する(Webb et al., 2000)。これらのデータは、Brightは、XLAにおいて重要な同じシグナル伝達経路の成分として機能し得ることを示唆している。
【００２０】
ヒトBrightタンパク質に関する入手可能な情報は、非常に少ない。従って本発明者らは、ヒトBrightホモログを特徴付けることおよびBリンパ球亜集団においてその発現を決定することを求めた。Brightは、ヒトB細胞ライブラリーからクローニングされ、その配列はDril1として先に公開されたものと同一であることが決定された(Kortschak et al., 1998)。これらの研究は、Dril1またはヒトBrightのmRNAは、複数の組織において発現されることを示唆した(Kortschak et al., 1998)が、タンパク質およびDNA結合活性は調べられなかった。本発明者らのデータは、Bright/Dril1 mRNAは、これまで考えられたものよりも少ない数の組織において発現されることを示している。更にこれらのデータは、ヒトタンパク質は、Brightプロトタイプ配列モチーフに効果的に結合することを明らかにしている。選別されたB細胞亜集団の研究は、ヒトBright発現は、多くの方式で、マウスホモログの発現に類似しているが；しかしBright mRNAは、マウスよりもヒトにおいて、正常B細胞発達のわずかに早い工程で発現されたことを明らかにした。他方で、ヒトの形質転換された細胞株におけるBrightタンパク質の発現は、マウスにおいて認められるものとは劇的に異なった。最後に、結果は、ヒトBrightおよびBtkは会合し、DNA-結合複合体を形成し、これは更にBtk基質TFII-Iに関与し得ることを明らかにしている。
【００２１】
II. ペプチドおよびポリペプチド
ある態様において、本発明は、Brightタンパク質分子に関連している。本明細書において使用される「タンパク質」または「ポリペプチド」は一般に、約100個のアミノ酸よりも大きいタンパク質または遺伝子の完全長内在性配列の翻訳された形を意味するが、これらに限定されるものではない。ペプチドは、約3〜約100個のアミノ酸である。先に説明された「タンパク質性」の用語は全て、本明細書において互換的に使用されてよい。ヒトBrightポリペプチド配列は、SEQ ID NO：2に示している。
【００２２】
タンパク質は、組換えにより生成するか、または天然の給源から精製される。比較的短いペプチド分子が、常法に従い、溶液中または固相支持体上で合成される。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従い使用することができる。例えば、Stewart and Young(1984)；Tam et al., (1983)；Merrifield(1986)；および、Barany and Merrifield(1979)の論文を参照し、これらは各々本明細書に参照として組入れられている。
【００２３】
ある態様において、少なくとも1個のタンパク質性分子のサイズは、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、 約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75、約76、約77、約78、約79、約80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、および約505個のアミノ分子残基、ならびにそれらから導き出される範囲のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本明細書において使用される「アミノ酸」は、当業者に公知であるように、任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸擬体を意味する。ある態様において、タンパク質性分子の残基は、アミノ分子残基の配列を妨害する非-アミノ分子を伴わずに連続している。別の態様において、この配列は、1個または複数の非-アミノ分子部分を含むことができる。特定の態様において、タンパク質性分子の残基の配列は、1個または複数の非-アミノ分子部分により妨害されてよい。
【００２５】
ある態様において、タンパク質性組成物は、少なくとも1種のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。更なる態様において、タンパク質性組成物は、生体適合性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。本明細書において使用される用語「生体適合性」は、ここに説明された方法及び量に従い所定の生物へ適用または投与した場合に、重大な有害作用をもたらさない物質を意味する。このような有害作用または望ましくない作用は、重大な毒性または有害な免疫学的反応のようなものである。好ましい態様において、生体適合性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含有する組成物は一般に、各々毒素、病原体および有害な免疫原を本質的に含まない、哺乳類タンパク質もしくはペプチドまたは合成タンパク質もしくはペプチドである。
【００２６】
タンパク質性組成物は、当業者に公知のいずれかの技術により作製することができ、これはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの標準分子生物学的技術による発現、タンパク質性化合物の天然の給源からの単離、またはタンパク質性物質の化学合成を含む。様々な遺伝子に関するヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの配列は、先に明らかにされており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースにおいて認めることができる。そのようなデータベースのひとつは、National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPeptデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov)である。これらの公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に明らかにされた技術または当業者に公知の技術を使用し、増幅および／または発現することができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に公知である。
【００２７】
ペプチドは、他のタンパク質性組成物に融合し、これによりそれらの特性を変更または補充することができる。特定の態様において、Bright由来のペプチドまたはポリペプチドの細胞輸送を促進する標的化部分を、提供することができる。特に、Tatなどの配列は、核局在化シグナルを提供し、これによりペプチドを核に輸送することができる。
【００２８】
ある態様において、タンパク質性化合物は、精製することができる。一般に「精製された」は、様々な他のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを除去するための分画が施された、特定のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの組成物を意味し、その組成物は、例えば特定のまたは望ましいタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドについて当業者に公知であるタンパク質アッセイにより評価されるように、実質的にその活性を維持する。
【００２９】
III. 核酸
本発明のある態様において、Bright、Btkおよび／またはTFII-I由来のまたはこれらをコードしている核酸が提供される。ある局面において、核酸は、これらの遺伝子の野生型または変異体型を含んでよい。特定の局面において核酸は、転写された核酸をコードしているかまたは含んでいる。別の局面において核酸は、SEQ ID NO：1の核酸セグメント、またはそれらの生物学的機能同等物を含む。特定の局面において、核酸は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードしている。
【００３０】
用語「核酸」は、当技術分野において周知である。本明細書において使用される「核酸」は一般に、核酸塩基を含む、DNA、RNAまたはそれらの誘導体もしくはアナログの分子(すなわち鎖)を意味する。核酸塩基は、例えばDNA(例えば、アデニン"A"、グアニン"G"、チミン"T"またはシトシン"C")またはRNA(例えば、A、G、ウラシル"U"またはC)において認められる、天然のプリンまたはピリミジン塩基を含む。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を含み、各々用語「核酸」の亜属である。用語「オリゴヌクレオチド」は、長さ約3〜約100個の核酸塩基の分子を意味する。用語「ポリヌクレオチド」は、長さが約100個よりも大きい核酸塩基の少なくとも1個の分子を意味する。
【００３１】
これらの定義は一般に、1本鎖分子を意味するが、特定の態様においては、1本鎖分子と部分的、実質的または完全に相補的である追加の鎖も包含するであろう。従って核酸は、1本または複数の相補鎖を含む2本鎖分子もしくは3本鎖分子、または分子を含む特定の配列の「相補体」も包含する。本明細書において使用されるように1本鎖核酸は接頭辞"ss"により、2本鎖核酸は接頭辞"ds"により、および3本鎖核酸は接頭辞"ts"により示すことができる。
【００３２】
1. 核酸の調製
核酸は、例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成などの当業者に公知の技術のいずれかにより作製することができる。合成核酸の非限定的例(例えば合成オリゴヌクレオチド)は、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホロアミダイト化学を使用するインビトロにおける化学合成、および本明細書に参照として組込まれた欧州特許第266 032号に開示されたような固相技術により、または各々、本明細書に参照として組込まれた、Froehlerら(1986)の論文および米国特許第5,705,629号に開示されたような、デオキシヌクレオシドH-リン酸中間体を介して生成された核酸を含む。本発明の方法において、1種または複数のオリゴヌクレオチドが使用される。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機序は、例えば米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号に開示されており、これらは各々本明細書に参照として組入れられている。
【００３３】
酵素的に生成された核酸の非限定的例は、PCR(商標)のような増幅反応において酵素により生成されたもの(例えば、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号を参照し、これらは各々本明細書に参照として組入れられている)、または本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,645,897号に開示されたオリゴヌクレオチドの合成を含む。生物学的に生成された核酸の非-限定的例は、生存細胞において生成された(すなわち複製された)組換え核酸、例えば細菌において複製された組換えDNAベクターを含む(例えば、Sambrook et al. 2001を参照、これは本明細書に参照として組入れられている)。
【００３４】
2. 核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心勾配、または当業者に公知の他の手段により精製することができる(例えば、Sambrook et al., 2001参照、これは本明細書に参照として組入れられている)。
【００３５】
ある局面において、本発明は、単離された核酸である核酸に関する。本明細書において使用される用語「単離された核酸」とは、1個または複数の細胞の総ゲノムのおよび転写された核酸のバルクから、単離され非含有であるか、またはそうでなければこれを取り除いたような核酸分子(例えば、RNAまたはDNA分子)を意味する。ある態様において、「単離された核酸」は、例えば脂質もしくはタンパク質のような巨大分子、小型生物学的分子などの、細胞成分またはインビトロ反応成分のバルクから、単離され非含有であるか、またはそうでなければこれを取り除いたような、核酸を意味する。
【００３６】
3. 核酸セグメント
ある態様において、核酸は、核酸セグメントである。本明細書において使用される用語「核酸セグメント」は、核酸のより小さい断片、例えば非-限定的例において、Brightの一部のみをコードしているものなどである。従って「核酸セグメント」は、Brightの約2個のヌクレオチドから完全長までの遺伝子配列のいずれかの部分を含んでよい。ある態様において、核酸セグメントは、プローブまたはプライマーであってよい。本明細書において使用される「プローブ」は一般に、検出法または組成物に使用される核酸を意味する。本明細書に使用される「プライマー」は一般に、伸長または増幅の方法または組成物において使用される核酸を意味する。
【００３７】
4. 核酸相補物
本発明は、Bright-コードしている核酸に相補的である核酸も包含している。特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO：1に示した配列に相補的である核酸または核酸セグメントを包含している。核酸は、標準ワトソン-クリック、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の結合相補則に従い、別の核酸と塩基対形成することが可能である場合に、「相補体」であるか、または別の核酸に「相補的」である。本明細書において使用される「別の核酸」は、個別の分子または同じ分子の空間的に区別された配列を意味することができる。
【００３８】
本明細書において使用される用語「相補的」または「相補体」は、例え全てよりも少ない核酸塩基が対応する核酸塩基と塩基対形成しない場合であっても、別の核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズすることが可能である、連続する核酸塩基または半連続する核酸塩基の配列を含む核酸(例えば、1個または複数の核酸塩基部分はその分子内に存在しない)も意味する。ある態様において、「相補的」核酸は、ハイブリダイゼーションの間に、核酸塩基配列の約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％から約100％まで、およびそれから導かれる範囲のいずれかが、1本鎖または2本鎖核酸分子と対形成することが可能であるような配列を含む。ある態様において、用語「相補的」は、当業者に理解されるように、ストリンジェントな条件下で別の核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズすることができる核酸を意味する。
【００３９】
ある態様において「部分的に相補的な」核酸は、低ストリンジェントな条件で1本鎖または2本鎖核酸にハイブリダイズすることができる配列を含むか、または核酸塩基配列の約70％未満がハイブリダイゼーションの間に1本鎖または2本鎖核酸分子と塩基対形成することが可能である配列を含む。
【００４０】
5. ハイブリダイゼーション
本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーションが可能な」は、2本鎖もしくは3本鎖の分子または部分的2本鎖もしくは3本鎖の性質を伴う分子の形成を意味すると理解される。本明細書において使用される用語「アニール」は、「ハイブリダイズ」と同義語である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーションが可能な」は、用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」、および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」を包含している。
【００４１】
本明細書において使用される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、相補的配列を含む1個または複数の核酸鎖の間のまたはその中でのハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションは排除するものである。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖の間のミスマッチの忍容性があったとしてもわずかである。このような条件は、当業者に周知であり、高い選択性が必要である適用に好ましい。非-限定的適用は、核酸の単離、例えば遺伝子もしくはそれらの核酸セグメントの単離、または少なくとも1種の特異的mRNA転写産物またはそれらの核酸セグメントの検出などを含む。
【００４２】
ストリンジェントな条件は、温度約50℃〜約70℃の約0.02M〜約0.15M NaClにより提供されるような、低塩および／または高温の条件を含んでよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基含量、核酸の帯電組成、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムもしくは他の溶媒の存在または濃度により、一部決定されることが理解される。
【００４３】
ハイブリダイゼーションのこれらの範囲、組成および条件は、単に非限定的例として言及され、および特定のハイブリダイゼーション反応に関する望ましいストリンジェンシーは、1種または複数の陽性または陰性対照との比較により、経験的に決定されることが多いことも理解される。想起された適用に応じて、標的配列に対する核酸の変動する選択性の程度を実現するために、ハイブリダイゼーションの変動する条件を使用することが好ましい。非限定的例において、ストリンジェントな条件下では核酸にハイブリダイズしない関連した標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度のハイブリダイゼーションにより実現することができる。このような条件は「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と称され、ならびに低ストリンジェンシーの非限定的例は、約0.15M〜約0.9M NaClで、温度約20℃〜約50℃の範囲で実行されるハイブリダイゼーションを含む。当然、特定の適用に適合するための、低または高ストリンジェンシー条件の更なる変更は、当業者の技術内である。
【００４４】
本明細書において使用される「野生型」は、生物ゲノム内の遺伝子座での天然の核酸配列、またはそのような核酸から転写もしくは翻訳された配列を意味する従って用語「野生型」は、核酸によりコードされたアミノ酸配列も意味する。遺伝子座は個体の集団において1種よりも多い配列または対立遺伝子を有することがあるので、用語「野生型」はこのような天然の対立遺伝子を全て包含している。本明細書において使用される用語「多形」は、集団の個体においてある遺伝子座に変動が存在すること(すなわち、2種またはそれよりも多い対立遺伝子が存在する)を意味する。本明細書において使用される「変異体」は、人工の結果である核酸またはそのコードされたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの配列の変化を意味する。
【００４５】
本発明は、当業者に公知のまたは本明細書に説明された組換え核酸技術の適用による、組換えコンストラクトまたは組換え宿主細胞の単離または作製にも関する。組換えコンストラクトまたは宿主細胞は、Bright-コードしている核酸を含み、およびBrightタンパク質、ペプチドもしくはペプチド、またはそれらの少なくとも1種の生物学的機能同等物を発現することができる。
【００４６】
ここである態様の「遺伝子」は、転写される核酸を意味する。ある局面において、遺伝子は、転写、またはメッセージ産生もしくは組成物に関連した調節配列を含む。特定の態様において、この遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしている転写された配列を含む。当業者に理解されるように、この機能的用語「遺伝子」は、ゲノム配列、RNAもしくはcDNAの配列、または遺伝子の転写されないプロモーターまたはエンハンサー領域を含むが、これらに限定されるものではない転写されない遺伝子部分の核酸セグメントを含むより小さい操作された核酸セグメントの両方を含む。より小さい操作された遺伝子核酸セグメントは、核酸操作技術を用い、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および／または変異体などを発現することができるか、または発現するように適合することができる。
【００４７】
「実質的に他のコード配列から単離された」とは、関心のある遺伝子が、核酸のコード領域の重要な部分を形成すること、または核酸が天然のコードしている核酸の大きい部分、例えば大きい染色体断片、他の機能的遺伝子、RNAもしくはcDNAコード領域を含まないことを意味する。当然これは、当初に単離されたような核酸を意味し、人工的に後でその核酸に追加された遺伝子またはコード領域を排除するものではない。
【００４８】
本発明の核酸は、1種または複数の核酸コンストラクトを作製するために、配列それ自身の長さとは無関係に、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、制限酵素切断部位、マルチクローニング部位、コーディングセグメントなどを含むが、これらに限定されるものではない他の核酸配列と組合わせることができる。本明細書において使用される「核酸コンストラクト」は、人工的に操作されたまたは変更された核酸であり、一般には人工的に組織化された1種または複数の核酸配列を含む。
【００４９】
非限定的例において、SEQ ID NO：1と同一または相補的なヌクレオチドの連続するひと配列を含む1種または複数の核酸コンストラクトを調製することができる。核酸コンストラクトは、長さが約3、約5、約8、約10〜約14、または約15、約20、約30、約40、約50、約100、約200、約500、約1,000、約2,000、約3,000、約5,000、約10,000、約15,000、約20,000、約30,000、約50,000、約100,000、約250,000、約500,000、約750,000〜約1,000,000個のヌクレオチドに加え、より大きいサイズの、最大染色体サイズを含む(全ての中間の長さおよび中間の範囲を含む)コンストラクトであることができ、酵母人工染色体のような核酸コンストラクトの出現をもたらすことが当業者に公知である。ここで使用される「中間の長さ」および「中間の範囲」は、引用された値を含むまたはその間の任意の長さまたは範囲(すなわち、そのような値を含むおよびその間の全ての整数)を意味することは容易に理解されるであろう。中間の長さの非限定的例は、約11、約12、約13、約16、約17、約18、約19個など；約21、約22、約23個など；約31、約32個など；約51、約52、約53個など；約101、約102、約103個など；約151、約152、約153個など；約1,001、約1002個など；約50,001、約50,002個など；約750,001、約750,002個など；約1,000,001、約1,000,002個などを含む。中間の範囲の非限定的例は、約3〜約32、約150〜約500,001、約5,000〜約15,000、約20,000〜約1,000,000個などを含む。
【００５０】
用語「生物学的機能同等物」は、当技術分野においてよく理解されており、本明細書において更に詳細に定義されている。従って、そのアミノ酸の約70％〜約80％；またはより好ましくは、約81％〜約90％；または更により好ましくは約91％〜約99％が、SEQ ID NO：2のアミノ酸と同一または機能的に同等である配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性が維持されるならば、「本質的にSEQ ID NO：2と記される」配列であろう。表1は、好ましいヒトコドンのリストを提示している。
【００５１】
（表１）
2007523895.tif 000002
【００５２】
アミノ酸配列または核酸配列は、追加の残基、例えば追加のN-もしくはC-末端アミノ酸または5'もしくは3'配列、またはそれらの様々な組合せを含み、ならびに配列がタンパク質性組成物の発現が関係する場合の生物学的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド活性の維持を含む、先に示した基準に合致する限りは、更に本質的に本明細書に明らかにされた配列のひとつを示すことも理解されるであろう。末端配列の追加は、例えばコード領域の5'および／もしくは3'部分のいずれかに隣接する様々な非-コード配列を含むか、または遺伝子内に生じることがわかっている様々な内部配列、例えばイントロンを含むことができる核酸配列に、特に適用される。
【００５３】
本発明は、イントロン領域およびフランキング領域を除き、かつ遺伝暗号の縮重を可能にし、ヌクレオチドの約70％〜約79％；またはより好ましくは約80％〜約89％；または更に特に約90％〜約99％が、SEQ ID NO：1のヌクレオチドと同一である核酸配列も提供する。
【００５４】
本発明は、SEQ ID NO：1または2の特定の核酸またはアミノ酸配列に限定されないことも理解されるであろう。従って組換えベクターおよび単離された核酸セグメントは、これらのコード領域それら自身、基本的コード領域に選択された変更または修飾を持つコード領域を様々に含むことができ、かつこれらはそれにもかかわらずそのようなコード領域を含むより大きいポリペプチドまたはペプチドをコードすることができるか、もしくは変種アミノ酸配列を有する生物学的機能が同等のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードすることができる。
【００５５】
本発明の核酸は、生物学的機能が同等なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを包含している。このような配列は、核酸配列またはそのようにコードされたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドにおいて天然に生じることがわかっているコドンの縮退または機能的同等性の結果として生じることがある。あるいは、機能的に同等なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、組換えDNA技術の適用により作出され、ここでタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド構造の変化は、交換されるアミノ酸の特性の考察を基に、操作することができる。人工的にデザインされた変化が、例えばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの抗原性の改善または変更を導入するために、例えば本明細書において以下に考察するような位置-指定突然変異誘発技術の適用により導入される。
【００５６】
本発明により、比較的小さいペプチドまたは融合ペプチド、例えばSEQ ID NO：2に示したものの、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75、約76、約77、約78、約79、約80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、約100個のアミノ酸の長さ、より好ましくは約15〜約30個のアミノ酸長のペプチドなどをコードしている核酸配列が包含される。
【００５７】
IV. スクリーニング法
本発明は更に、過剰な抗体産生に関連した病理を予防または治療または逆転するのに有用であるBright活性のインヒビターを同定する方法を含む。これらのアッセイは、候補物質の大規模ライブラリーのランダムスクリーニングを含むことができるか；あるいは、これらのアッセイを使用し、おそらくそれらをBright機能を阻害するようにすると考えられる構造属性について目視により選択された化合物の特定のクラスに焦点をあてることができる。
【００５８】
Brightインヒビターを同定するために、一般には候補物質の存在および非存在下でのBright機能を決定するであろう。例えば、方法は一般に以下の工程を含む：
(a)Brightを発現する活性化されたB細胞を提供する工程；
(b)該細胞を候補インヒビター物質と接触させる工程；および
(c)Bright-関連した活性を測定する工程；
ここで未処理の細胞のBright活性と比較した、Bright関連した活性の減少は、候補物質をBright活性のインヒビターとして同定する。活性は、免疫グロブリン産生の刺激、Brightホモ二量体化、BrightのBtkとの相互作用、またはBrightのTFII-Iとの相互作用を含む。アッセイは、単離された細胞、細胞抽出物、器官、または生存生物において行うこともできる。
【００５９】
当然、本発明の全てのスクリーニング法は、有効な候補は見つからないかもしれないという事実であっても、それら自身有用であることは理解されるであろう。本発明は、候補を見つける単なる方法ではなく、このような候補をスクリーニングする方法を提供する。
【００６０】
A. モジュレーター
本明細書において使用される用語「候補物質」は、活性Brightを阻害する可能性のある任意の分子を意味する。候補物質は、タンパク質またはそれらの断片、小分子、または核酸でさえある。最も有用な薬理学的化合物は、Brightに構造的に関連している化合物、またはBright相互作用タンパク質、例えばBtkもしくはTFII-Iなどであるような場合であることは証明される。改善された化合物の開発を補助するためのリード化合物の使用は、「理論的薬物デザイン」として知られており、これは公知のインヒビターおよびアクチベーターとの比較のみではなく、標的分子の構造との関係を推定することも含む。
【００６１】
理論的薬物デザインの目標は、生物学的に活性のあるポリペプチドまたは標的化合物の構造アナログを作製することである。このようなアナログを作製することにより、天然の分子よりもより活性があるかもしくはより安定した薬物、変更し易さが異なる薬物、または様々な他の分子の機能に影響を及ぼし得る薬物を創り出すことが可能になる。ひとつの方法において、標的分子またはそれらの断片の三次元構造の作製を試みる。これは、x-線結晶解析、コンピュータモデリング、または両方の方法の組合せにより実現される。
【００６２】
標的化合物、アクチベーター、またはインヒビターの構造を確認するために抗体を使用することも可能である。原則として、この方法は、その後の薬物デザインが基礎とし得るようなファルマコアを生じる。機能的に薬理学的に活性のある抗体に対する抗-イディオタイプ抗体を作製することにより、タンパク質結晶解析を迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗-イディオタイプの結合部位は、当初の抗原のアナログであると予想される。次に抗-イディオタイプを使用し、化学的-または生物学的に-作製されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。選択されたペプチドは次に、ファルマコアとして使用される。抗-イディオタイプは、抗体を抗原として使用し、抗体産生に関するここで説明された方法を用いて作製することができる。
【００６３】
他方で、様々な商業的供給業者から、有用な化合物の同定を「総当たりで調べる」努力において有用な薬物の基本的基準に合致すると考えられる小さい分子ライブラリーを簡単に入手することができる。コンビナトリアルに作製されたライブラリー(例えば、ペプチドライブラリー)を含む、そのようなライブラリーのスクリーニングは、非常に多数の関係した(および無関係の)化合物を活性についてスクリーニングするための迅速かつ有効な方法である。コンビナトリアル的方法はそれら自身、活性についてモデル化されたが、それ意外は望ましくない化合物の第二、第三、および第四世代の化合物の作製により、可能性のある薬物の迅速な進化を手助けする。
【００６４】
候補化合物は、天然の化合物の断片または一部を含むか、またはそれ以外は不活性である、公知の化合物の活性の組合せとして認めることができる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物給源、ならびに海洋性試料などの天然の給源から単離された化合物は、可能性のある有用な薬学的物質の存在に関する候補としてアッセイすることができることが提唱される。スクリーニングされる薬学的物質は、化学組成物または人工の化合物に由来するかまたはそれらから合成することもできることは理解されるであろう。従って、本発明により同定される候補物質は、既知のインヒビターまたは刺激物質を出発とする理論的薬物デザインによりデザインされたペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子インヒビターまたはいずれか他の化合物であることが理解される。
【００６５】
他の適当なモジュレーターは、各々が標的分子に特異的である、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体(1本鎖抗体を含む)を含む。このような化合物は、本明細書において別所により詳細に説明されている。例えば翻訳もしくは転写の開始部位、またはスプライス接合点に結合したアンチセンス分子は、理想的な候補インヒビターであろう。
【００６６】
本発明者らは、最初に同定されたモジュレーター化合物に加え、他の立体的に類似した化合物を、モジュレーターの構造の重要な部分を模倣するように公式化する(formulate)ことも企図した。このような化合物は、ペプチドモジュレーターのペプチド擬体を含むが、これを最初のモジュレーターと同様の様式で使用することができる。
【００６７】
B. インビトロアッセイ
試行する上で迅速で高価でなくかつ容易なアッセイは、インビトロアッセイである。このようなアッセイは一般に、単離された分子を使用し、迅速に多数を試行することができ、これにより短期間に入手可能な情報量が増大する。アッセイを試行するために、試験管、プレート、ディッシュおよびディップスティックまたはビーズなどの他の表面を含む、様々な容器を使用することができる。インビトロアッセイの一般的形は、結合アッセイである。
【００６８】
化合物のハイスループットスクリーニング技術は、国際公開公報第84/03564号に開示されている。非常に多数の小型ペプチド被験化合物が、プラスチックピンまたはいくつか他の表面などの固形基板上で合成される。
【００６９】
C. インサイトアッセイ
本発明は、細胞内でのBright活性を変調するそれらの能力に関する化合物のスクリーニングも企図している。この目的のために特別に操作された細胞を含む、様々なB細胞およびB細胞株を、このようなスクリーニングアッセイに利用することができる。他の細胞は、脾細胞および骨髄細胞(マウスおよびヒト)、ヒトの臍帯血細胞および末梢血細胞を含む。特に興味深いのは、選択またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に連結されたIgプロモーターを含む細胞である。 
【００７０】
D. インビボアッセイ
インビボアッセイは、生物内の異なる細胞に到達しおよび作用する候補物質の能力を測定するために使用することができる、特異的欠損を有するかまたはマーカーを保持するように操作されたトランスジェニック動物を含む、様々な動物モデルの使用に関連している。それらのサイズ、取扱いの容易さ、ならびに生理的および遺伝子的組立てに関する情報のために、特にトランスジェニックについて、マウスが好ましい態様である。しかし他の動物も同じく適しており、これはラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマおよびサル(チンパンジー、テナガザルおよびヒヒを含む)を含む。インヒビターのアッセイは、これらの任意の種に由来する動物モデルを用いて実行することができる。
【００７１】
被験化合物による動物の処置は、この化合物の適当な形での動物への投与に関連するであろう。投与は、臨床目的で利用することができる任意の経路であってよいであろう。化合物のインビボにおける有効性の決定は、様々な異なる基準に関連し得る。同じく毒性および用量反応の測定を、動物において、インビトロまたはインサイトのアッセイよりもより意味のある様式で行うことができる。
【００７２】
V. 過剰な免疫グロブリン産生性疾患の治療
A. 病態
全身性エリスマトーデス(SEL)
SLEは、組織損傷につながる、自己抗体および免疫複合体の組織への沈積を特徴とする自己免疫リウマチ性疾患である(Kotzin, 1996)。MSおよび1型糖尿病などの自己免疫疾患とは対照的に、SLEは、複数の臓器システムに直接関連する可能性があり、その臨床的症状発現は多様でありかつ変動する(Kotzin and ODellの検証, 1995)。例えば一部の患者は、原発性の皮疹および関節痛を呈し、自然寛解を示し、ほとんど投薬が必要ない。このスペクトルの他端では、患者は、高用量のステロイドおよびシクロホスファミドなどの細胞毒性薬物による治療を必要とする重症の進行性の腎臓の関与を呈する(Kotzin, 1996)。より最近になって、リツキシマブ(抗-CD2)による治療が試みられている。
【００７３】
SLEの血清学的特徴、および利用可能な一次診断試験は、2本鎖DNA(dsDNA)、1本鎖DNA(ss-DNA)、およびクロマチンなどの細胞核の構成要素に対するIgG抗体の血清レベルの上昇である。これらの自己抗体の中で、IgG抗-dsDNA抗体は、狼瘡性糸球体腎炎の発症において主要な役割を果たす(Hahn and Tsao, 1993；Ohnishi et al., 1994)。糸球体腎炎は、腎臓の血液を精製する糸球体の毛細管壁が、糸球体基底膜の上皮側への付着成長により肥厚し始める重篤な状態である。この疾患は、慢性化し進行することが多く、最終的には腎不全に至ることがある。
【００７４】
自己抗体がこれらの自己免疫疾患において誘導される機序は、依然明らかではない。診断および／または治療を指示するようなSLEの原因はわかっていないので、治療は、根本原因に対するものよりもむしろ、例えばマクロライド系抗生物質などにより免疫応答を抑制することを指示している(例えば米国特許第4,843,092号)。
【００７５】
関節リウマチ(RA)
RAの正確な病因は依然不明であるが、関節疾患の最初の徴候は、滑膜内層に出現し、滑膜線維芽細胞の増殖および関節縁での関節表面へのそれらの付着を伴う(Lipsky, 1998)。引き続きマクロファージ、T細胞および他の炎症細胞が、その関節に動員され、そこでこれらは、骨および軟骨の破壊につながる慢性的続発症に寄与するサイトカイン類であるインターロイキン-1(IL-1)、ならびに炎症において重要な役割を果たす腫瘍壊死因子(TNF-α)を含む多くのメディエーターを産生する(Dinarello, 1998；Arend and Dayer, 1995；van den Berg, 2001)。血漿中のIL-1の濃度は、RA患者において、健常個体よりも有意に高く、明白に血漿IL-1レベルはRA疾患活性に相関している(Eastgate et al., 1988)。更に滑液IL-1レベルは、RAの様々なX線写真および組織学の特徴と相関している(Kahle et al., 1992；Rooney et al., 1990)。
【００７６】
正常な関節において、これらおよび他の前炎症性サイトカインの作用は、様々な抗-炎症性サイトカインおよび調節因子によりバランスがとれている(Burger and Dayer, 1995)。このサイトカインバランスの意義は、一日のうちに周期的発熱を伴う若年性RA患者において例証されている(Prieur et al., 1987)。各発熱のピーク後に、IL-1の作用をブロックする因子が、血清および尿中に認められる。この因子は、単離され、クローニングされ、かつIL-1遺伝子ファミリーの一員であるIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)として同定された(Hannum et al., 1990)。IL-1Raは、その名が示すように、IL-1と、I型IL-1受容体への結合について競合し、結果的にIL-1の作用をブロックする天然の受容体アンタゴニストである(Arend et al., 1998)。10〜100倍過剰なIL-1Raが、IL-1を効果的にブロックするために必要であるが；しかしRA患者から単離された滑膜細胞は、IL-1の作用に対抗するのに十分なIL-1Raを産生することは明らかにしていない(Firestein et al., 1994；Fujikawa et al., 1995)。
【００７７】
全身性硬化症
全身性硬化症(SSc)は、皮膚、皮下組織、および内臓の線維化；異常な微小血管；および、免疫機能障害を特徴とする、病因が不明の結合組織疾患である。文献は、皮膚の変化を事実上「ケロイド」と称している。60年代の初期の全米調査において、SSc発生数は、年間100万人集団当たり12例と報告された。より新しい研究は、100,000人の集団当たり19〜75例の桁の、SScのより高い有病率を報告している。
【００７８】
SScは、皮膚、消化管、肺、心臓、腎臓および骨格筋システムを含む、多種多様な臓器および組織に影響を及ぼし得る。コラーゲン、フィブロネクチン、およびグリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分の沈積の増加を特徴とする変更された結合組織代謝が、SScにおいて認められる。IL-2、IL-4、およびIL-6のようなリンホカインが、硬皮症患者の血清中に認められるが、健常な対照対象においては認められない。活性化されたT細胞および／または抗体-依存型補体カスケードは、恐らく内皮性サイトカインの放出を刺激し、引き続き内皮を損傷し、これはT細胞および単球の接着および遊走を促進するであろう。
【００７９】
多発性筋炎
多発性筋炎は、筋力低下度の変動を引き起こす炎症性筋肉疾患である。この疾患は、徐々に発症し、一般に20代後半に始まる。主な症状は、筋肉衰弱であり、通常体幹に最も近い(近位)筋肉が罹患する。最終的には患者は、坐位から立ち上がること、階段を上ること、物を持ち上げること、または頭上に上げることが困難になる。場合によっては、遠位筋(体幹に近くない筋肉)も、疾患の経過において後に罹患することがある。嚥下困難(嚥下障害)も生じることがある。この疾患は、他のコラーゲン血管障害、自己免疫障害または感染性障害に関連することがある。治療は一般に、プレドニソロンまたはアザチオプリンおよびメトトレキセートなどの免疫抑制剤からなる。
【００８０】
シェーグレン症候群
シェーグレン症候群は、体の免疫系が、自己の水分分泌腺を誤って攻撃する全身性自己免疫疾患である。シェーグレン症候群は、最も有病率の高い自己免疫障害のひとつであり、4,000,000名ものアメリカ人が悩まされ、患者の90％は女性である。平均の発症年齢は40代後半であるが、シェーグレン症候群は、女性および男性の両方において全ての年齢群で生じる。
【００８１】
シェーグレン症候群時の約50％は単独で発症し、およびその時点の50％は、他の結合組織疾患の存在下で生じる。シェーグレン症候群と同時に存在する4種の最も一般的な診断は、関節リウマチ、全身性エリスマトーデス、全身性硬化症(硬皮症)および多発性筋炎/皮膚筋炎である。研究者らは時には、これらの状態を「続発性シェーグレン症候群」と称する。
【００８２】
シェーグレン症候群は、ドライアイおよびドライマウスを特徴とし、ならびに腎臓、胃腸管、血管、肺、肝臓、膵臓、および中枢神経系などの他の臓器の乾燥も引き起こし得る。多くの患者が、衰弱した疲労および関節痛を経験する。症状は、プラトーであるか、増悪するか、または寛解に向かう。一部は軽度の症状を経験するが、他は生活の質を大きく損なう衰弱性症状に冒される。
【００８３】
移植拒絶反応
組織および臓器移植は、疾患および損傷を治療する強力な道具であるが、免疫抑制療法が存在しない場合は急性の移植拒絶反応を生じ得るような強力な免疫応答を惹起する。40年代および50年代に行われた先駆的研究は、同種移植拒絶反応が、免疫応答によるものであることを確立し、後にこれはT-リンパ球に関連付けられた。移植拒絶反応の原因である特異的免疫エフェクター機序は、細胞傷害性T-細胞、遅延型過敏症および抗体-依存型作用を含む。同種移植片-指示した反応の標的である「ヒト白血球抗原(HLA)」と称される細胞-表面分子は、最初に1958年にDaussetにより説明された。HLAは高度に多形性であり、免疫認識において特別な役割を果たす。
【００８４】
グレーヴス病
神経質および過剰刺激により明らかになるグレーヴス病は、過活動性甲状腺(甲状腺機能亢進)の結果である。甲状腺ホルモンは、代謝および体温を調節し、正常な成長および受胎能に必須である。しかし過剰量で、これらは、甲状腺疾患の比較的一般的型で認められる燃え尽き(burn-out)につながる。この問題点の引金となるものは不明であるが、免疫系は関与している。グレーヴス病患者においては、甲状腺を刺激するように特別にデザインされた抗体が見つかる。
【００８５】
グレーヴス病患者は、神経質および多動と共に、頻脈、疲労、湿った皮膚、増加した感熱性、震え、不安、食欲亢進、体重減少および睡眠困難に悩まされることがある。患者は以下の少なくとも1種も有する：甲状腺肥大(甲状腺腫)、腫脹眼、または脛を覆う皮膚の盛り上がり(raised area)。
【００８６】
多くの症例において、甲状腺分泌量を低下する薬物が、この状態を制御するのに十分である。甲状腺活性を劇的に低下する放射性ヨウ素による短期間の治療は、出産適齢期を過ぎた患者にとって別の選択肢である。一部の症例において、甲状腺の全てまたは一部を摘出する手術(甲状腺切除術)が必要である。手術は、グレーヴス病のいくつかの症状も緩和することができる。例えば腫脹眼は、隣接する洞腔内に眼球をより正常な位置に配置するのに十分な余分な空間を作製することにより、正すことができる。
【００８７】
重症筋無力症
米国単独における重症筋無力症患者の数は、人口の0.014％、または約36,000症例と推定されるが；しかし、重症筋無力症は低めに診断されているであろう。先に女性は、男性よりもより頻繁に罹患することが明らかにされ、好発年齢は20代から30代の女性、および70代および80代の男性である。集団が加齢するにつれ、対応して平均発症年齢は上昇し、現在男性は女性よりもより頻繁に罹患し、症状の発症は通常50歳以降である。
【００８８】
患者は、特定の筋肉の衰弱を訴えるが、全身の疲労は訴えない。眼球運動混乱、下垂または複視は、患者の2/3において重症筋無力症の初期症状である。口腔咽頭の筋肉の衰弱、咀嚼、嚥下または会話の困難は、患者の1/6において初期症状であり、四肢の衰弱はわずかに10％である。稀に初期の衰弱は、首もしくは指の伸筋または腰の屈筋などの単独の筋肉群に制限される。衰弱の重症度は、日変動し、通常朝が最も軽く、一日が進むにつれ、特に罹患した筋肉の長時間使用後に悪化する。疾患の経過は様々であるが、通常進行性であり、永久的筋肉の衰弱を生じる。筋無力症の症状を憎悪する因子は、感情的動揺、全身性疾患(特にウイルス性呼吸器感染症)、甲状腺機能低下症または甲状腺機能亢進症、妊娠、月経周期、神経筋伝達に影響する薬物、および体温上昇である。
【００８９】
後天性重症筋無力症において、シナプス後筋線維膜が、変形されかつ単純化され、正常な折り畳まれた形状を失う。筋終板膜上のACh受容体濃度は低下し、抗体がこの膜に付着する。AChは正常に放出されるが、シナプス後膜に対するその作用は低下する。接合部後膜は、適用されたAChに対する感受性が低下し、神経インパルスが筋肉の活動電位を引き起こす可能性は低下する。
【００９０】
癌
本発明は、慢性リンパ性白血病、形質細胞腫および骨髄腫などの、様々な癌におけるBrightの過剰発現も企図している。特に、グロブリン過剰血症を特徴とする癌を治療することができる。
【００９１】
単核球症
伝染性単核球症または「腺熱」は、エプスタインバーウイルスにより引き起こされる。通常は重症ではないが、脾臓破壊が、脾臓肥大に続発する可能性がある。ほとんどのヘルペスウイルス同様、EBVは、活動性感染の沈静化後、神経節に潜伏する。単球(mono)を伴う患者の一部は、疲労、発熱、咽喉痛および頭痛など、症状が最も少ない。慢性、亜急性の感染症の存在も報告されている。一旦曝露されると、ほとんどの患者は、免疫を形成し、再感染しないであろう。注目すべき特徴のひとつは、疾患名の基でもある、上昇した白血球数の存在である。本疾患の重症型において、高-IgM産生が認められる。
【００９２】
高-IgM症候群
X-連鎖した高-IgM(XHIGM)症候群の患者は、T-リンパ球の表面に認められるタンパク質であるCD40リガンドの欠失または欠損を有する。CD40リガンドは、X染色体上の遺伝子により作製される。従って、この原発性免疫不全症は、X-連鎖した劣性遺伝として遺伝し、通常少年においてのみ認められる。それらのCD40リガンドの欠損の結果として、罹患した患者のT-リンパ球は、B-リンパ球に、IgMからIgGおよびIgAへそれらのγグロブリン産生をスイッチすることを指示することができない。この原発性免疫不全症患者は、血清IgGおよびIgAのレベルが低下し、およびIgMレベルは正常または上昇する。加えてCD40リガンドは、T-リンパ球の他の機能にとって重要であるので、患者はそれらのT-リンパ球の保護機能の一部も欠失している。常染色体劣性の高-IgM症候群の他の形も発見されているが、原因となる変異はまだ確定されていない。
【００９３】
高-IgD症候群
この症候群は、発症時の非常に若い年齢(中央値、0.5歳)および一生続く周期熱が特徴である。特徴的に攻撃は、4〜8週間毎に生じ、3〜7日間続くが、個体変動が大きい。攻撃は、熱の急上昇を特徴とし、患者の76％は悪寒が先行する。リンパ節症が通常存在する(患者の94％)。攻撃時に、患者の72％は、異常な疼痛を、56％は吐気を、82％は下痢を、および52％は頭痛を訴える。関節の関与は、高-IgD症候群において一般的であり、患者の80％において多発関節痛を、および68％において主に大きい関節(膝および踝)で非-破壊的関節炎を伴う。
【００９４】
高-IgE症候群
高-IgE症候群(HIES)は、再発性感染症および顕著な免疫グロブリンIgEの上昇特徴とする原発性免疫不全症欠損である。
【００９５】
B. 薬学的インヒビター
事実上あらゆる有機製剤化合物は、望ましい作用を生じることができる。このような化合物は、先に説明されたスクリーニング法に従い同定することができる。
【００９６】
C. アンチセンスコンストラクト
Brightを阻害する別の方法は、アンチセンスである。アンチセンス法は、核酸は、「相補的」配列と対となる傾向があるという事実を利用する。相補性とは、ポリヌクレオチドは、標準ワトソン-クリック相補則に従い塩基対形成が可能であるものであることを意味する。すなわちより大きいプリンは、より小さいピリミジンと塩基対形成し、シトシンと対形成したグアニン(G:C)、およびDNAの場合はチミンと対形成したアデニン(A:T)、またはRNAの場合はウラシルと対形成したアデニン(A:U)の組合せを形成する。ハイブリダイズする配列において、イノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンなどの頻度の低い塩基の包含は、対形成と干渉しない。
【００９７】
ポリヌクレオチドによる2本鎖(ds)DNAの標的化は、3本らせん形成につながり；RNAの標的化は、二重らせん形成につながる。標的細胞へ導入される場合アンチセンスポリヌクレオチドは、それらの標的ポリヌクレオチドへ特異的に結合し、転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳および／または安定化を妨害する。アンチセンスRNAコンストラクト、またはそのようなアンチセンスRNAをコードしているDNAは、インビトロまたはインビボのいずれかで、ヒト対象を含む宿主動物内のような宿主細胞内の遺伝子の転写もしくは翻訳または両方を阻害するために、使用することができる。
【００９８】
アンチセンスコンストラクトは、遺伝子のプロモーターおよび他の制御領域、エキソン、イントロンまたは更にはエキソン-イントロン境界に結合するようにデザインすることができる。最も有効なアンチセンスコンストラクトは、イントロン/エキソンスプライス接合点に相補的な領域を含むことも企図されている。従って好ましい態様は、イントロン-エキソンスプライス接合点の50〜200塩基以内の領域に相補性のあるアンチセンスコンストラクトを含むことが提唱される。一部のエキソン配列は、それらの標的選択性に重大な影響を及ぼすことなくコンストラクト内に含むことができることが認められる。含まれるエキソン性物質の量は、使用される具体的なエキソンおよびイントロン配列に応じて変動するであろう。余りにも多いエキソンDNAが含まれたかどうかは、簡単にインビトロにおいてコンストラクトを試験し、正常な細胞機能が影響を受けたかどうかまたは相補的配列を有する関連する遺伝子の発現が影響を受けたかどうかを決定することにより、容易に試験することができる。
【００９９】
前述のように「相補的」または「アンチセンス」は、それらの全長にわたり実質的に相補的でありかつ塩基ミスマッチが非常に少ないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さが15塩基の配列は、13または14の位置に相補的ヌクレオチドを有する場合に、相補的と称される。当然、完全に相補的である配列は、それらの全長を通じ全く相補的でありかつ塩基ミスマッチを有さない配列であろう。相同性が低い他の配列も企図される。例えば高い相同性の制限された領域を有するが、相同でない領域も含むアンチセンスコンストラクト(例えばリボザイム；下記参照)がデザインされる。これらの分子は、50％未満の相同性を有するが、適当な条件下で標的配列に結合する。
【０１００】
ゲノムDNAの一部をcDNAまたは合成配列と組合わせ、特異的コンストラクトを作製することは利点がある。例えば最終的なコンストラクトにおいてイントロンが望ましい場合、ゲノムクローンを使用することが必要であろう。cDNAまたは合成されたポリヌクレオチドは、そのコンストラクトの残りの部分により都合の良い制限部位を提供することができ、その結果その配列の残余が使用される。
【０１０１】
D. リボザイム
インヒビターの別の一般的クラスは、リボザイムである。タンパク質は核酸の触媒に伝統的に使用されてきたが、別のクラスの巨大分子が、この試みに有用なものとして登場してきた。リボザイムは、位置-指定様式で核酸を切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する(Kim and Cook, 1987；Gerlach et al., 1987；Forster and Symons, 1987)。例えば多数のリボザイムが、リン酸エステル転移反応を高度の特異性を伴い促進し、時にはオリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのただひとつを切断する(Cook et al., 1981；Michel and Westhof, 1990；Reinhold-Hurek and Shub, 1992)。この特異性は、この基質は、化学反応の前に、特異的塩基対形成相互作用を介して、リボザイムの内部誘導配列("IGS")に結合するという必要要件のせいである。
【０１０２】
リボザイム触媒は、核酸に関連する配列-特異的切断/連結反応の一部として主に認められている(Joyce, 1989；Cook et al., 1981)。例えば米国特許第5,354,855号は、あるリボザイムは、公知のリボヌクレアーゼよりも大きく、およびDNA制限酵素のそれに近い配列特異性を伴うエンドヌクレアーゼとして作用することを開示している。従って遺伝子発現の配列-特異的リボザイム-媒介した阻害は、治療的適用に特に適している(Scanlon et al., 1991；Sarver et al., 1990)。リボザイムは、それらが適用される一部の細胞株において遺伝的変化を誘起することができ；変更された遺伝子は、癌遺伝子H-ras、c-fosおよびHIV遺伝子を含むことも示されている。この研究のほとんどは、特異的リボザイムにより切断された特異的変異体コドンを基にした、標的mRNAの修飾に関連している。
【０１０３】
E. RNAi
RNA干渉(同じく「RNA-媒介した干渉」またはRNAiとも称される)は、それによりタンパク質発現が低下または排除される別の機序である。2本鎖RNA(dsRNA)は、多工程プロセスであるこの低下を媒介することが認められている。dsRNAは、細胞をウイルス感染およびトランスポゾン活性から防御するように機能するように見える転写後遺伝子発現サーベイランス機序を活性化する(Fire et al., 1998；Grishok et al., 2000；Ketting et al., 1999；Lin et al., 1999；Montgomery et al., 1998；Sharp et al., 2000；Tabara et al., 1999)。これらの機序の活性化は、破壊のために成熟型dsRNA-相補的mRNAを標的化する。RNAiは、遺伝子機能の研究に関する大きい実験的利点をもたらす。これらの利点は、非常に高度の特異性、細胞膜を横断する移動の容易さ、および標的化された遺伝子の延長されたダウンレギュレーションを含む(Fire et al., 1998；Grishok et al., 2000；Ketting et al., 1999；Lin et al., 1999；Montgomery et al., 1998；Sharp, 1999；Sharp et al., 2000；Tabara et al., 1999)。更にdsRNAは、植物、原生動物、真菌、線虫、トリパノソーマ、ショウジョウバエおよび哺乳類を含む、広範なシステムにおいて遺伝子をサイレンシングすることが示されている(Grishok et al., 2000；Sharp, 1999；Sharp et al., 2000；Elbashir et al., 2001)。RNAiは、破壊のために、転写後標的化RNA転写産物に作用することは、一般に受入れられている。核および細胞質の両RNAを標的化することができることは明らかである(Bosher et al., 2000)。
【０１０４】
siRNAは、関心のある遺伝子の発現の抑制において特異的かつ有効であるようにデザインされなければならない。標的配列、すなわちそれに向かいsiRNAが分解機構を導くであろう関心のあるひとつまたは複数の遺伝子中に存在するそのような配列を選択する方法は、siRNAのガイド機能と干渉し得る配列を避ける一方で、ひとつまたは複数の遺伝子に特異的である配列を含むように指示されている。典型的には、長さが約21〜23ヌクレオチドのsiRNA標的配列が、最も有効である。この長さは、先に説明したような、はるかに長いRNAのプロセッシングから生じる消化産物の長さを反映している(Montgomery et al., 1998)。
【０１０５】
siRNAの作製は、主に直接の化学合成により；ショウジョウバエ胚溶解液に対する曝露による比較的長い2本鎖RNAのプロセッシングにより；または、S2細胞由来のインビトロシステムによるものである。細胞溶解液またはインビトロプロセッシングの使用は、短い21〜23ヌクレオチドsiRNAの溶解液などからの引き続きの単離に更に関連し、プロセスを若干煩雑かつ高価なものにしている。化学合成は、2個の1本鎖RNA-オリゴマーの作製、それに続く2個の1本鎖オリゴマーの2本鎖RNAへのアニーリングにより進行する。化学合成の方法は、多様である。非限定的例は、明白に本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,889,136号、第4,415,732号および第4,458,066号、ならびにWincottらの論文(1995)に開示されている。
【０１０６】
siRNA配列へのいくつかの更なる修飾が、それらの安定性を変更するかまたはそれらの有効性を改善するために示唆されている。ジヌクレオチドの突出を有する合成的相補的21-mer RNA(すなわち、19個の相補的ヌクレオチド＋3'側非-相補的な二量体)は、最大レベルの抑制を提供することが示唆されている。これらのプロトコールは主に、ジヌクレオチド突出として2個の(2'-デオキシ)チミジンヌクレオチドの配列を使用する。これらのジヌクレオチド突出は、それらをRNAに組込まれた典型的ヌクレオチドから識別するために、dTdTと記載されることが多い。文献は、RNAの化学合成経費を削減する必要性がdT突出の使用の大きい動機となることを示している。dTdT突出は、UU突出よりもより安定していることも示唆されるが、入手可能なデータは、UU突出を伴うsiRNAと比較したdTdT突出のわずかな(＜20％)改善のみを示している。
【０１０７】
化学的に合成されたsiRNAは、これらが濃度25〜100nMで細胞培養物中に存在する場合、最適に作用することが認められる。これは、Elbashirらにより明らかにされており(2001)、ここで濃度約100nMは、哺乳類細胞における発現の有効な抑制を実現した。siRNAは約100nMで、哺乳類細胞培養において最も有効である。しかしいくつかの例において、化学的に合成されたsiRNAのより低い濃度が使用される(Caplen et al.,2000;Elbashir et al., 2001)。
【０１０８】
国際公開公報第99/32619号および第01/68836号は、siRNAにおいて使用するためのRNAは、化学的または酵素的に合成されることを示唆している。これらの文書は両方ともそれらの全体が本明細書に参照として組入れられている。これらの参照において企図されている酵素合成は、当技術分野において公知であるような、発現コンストラクトの使用および作製を介した、細胞RNAポリメラーゼまたはバクテリオファージRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)による。米国特許第5,795,715号参照。企図されたコンストラクトは、標的遺伝子の一部と同じヌクレオチド配列を含むRNAを産生する鋳型を提供する。これらの参照により提供された同一配列の長さは、少なくとも25塩基であり、長さが400以上と多い塩基であることもできる。この参照の重要な局面は、著者らは、インビボにおいて長いdsRNAをsiRNAへ転換する内在性ヌクレアーゼ複合体による、より長いdsRNAの21〜25mer長への消化を企図していることである。彼らはインビトロ転写された21〜25mer dsRNAの合成および使用に関するデータを説明または提示していない。そのRNA干渉の使用において化学的または酵素的に合成されたdsRNAを予想される特性間で区別することはできない。
【０１０９】
同様に本明細書に参照として組入れられている国際公開公報第00/44914号は、RNAの1本鎖を、酵素的または部分的/全体的有機合成により作製することができることを開示している。好ましくは1本鎖RNAは、DNA鋳型のPCR(商標)産物から酵素的に合成され、好ましくはクローニングされた鋳型およびRNA産物は、数百個のヌクレオチドを含み得るそのcDNAの完全な転写産物である。本明細書に参照として組入れられている国際公開公報第01/36646号は、siRNAが合成される方法を限定せず、RNAは、手動および／または自動化された手法を使用し、インビトロまたはインビボにおいて合成されることを提供している。この参照は、インビトロ合成は、例えば内在性DNA(もしくはcDNA)鋳型または両方の混合物の転写のためにクローニングされたRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)を使用し、化学的または酵素的であることができることも提供している。再度、RNA干渉の使用に関する望ましい特性は、化学的または酵素的に合成されたsiRNAの間で区別できない。
【０１１０】
米国特許第5,795,715号は、単独の反応混合物中での2種の相補的DNA配列鎖の同時転写を開示しており、ここではこれら2種の転写産物は即座にハイブリダイズされる。使用される鋳型は、好ましくは40〜100塩基対であり、これはプロモーター配列の各末端に装備されている。これらの鋳型は好ましくは、固形物表面に付着されている。RNAポリメラーゼによる転写後、得られるdsRNA断片を使用し、核酸標的配列のアッセイを検出することができる。
【０１１１】
F. 抗体
本発明のある局面において、抗体は、Brightのインヒビターとしての用途を認めることができる。本明細書において使用される用語「抗体」は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEなどのあらゆる適当な免疫学的結合物質を広範に意味することが意図されている。一般にIgGおよび／またはIgMは、生理的状況において最も一般的な抗体でありおよびこれらは実験室の状況において最も容易に作成されるので、これらが好ましい。
【０１１２】
用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体-様分子も意味し、これはFab'、Fab、F(ab')2、シングルドメイン抗体(DABs)、Fv、scFV(1本鎖Fv)などの抗体断片を含む。様々な抗体-ベースのコンストラクトおよび断片を調製および使用する技術は、当技術分野において周知である。
【０１１３】
モノクローナル抗体(MAb)は、ある種の利点、例えば再現性および大規模生産などを有し、およびそれらの使用が一般に好ましいことが認められる。従って本発明は、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、更にはニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。調製の容易さおよび試薬の即時の入手可能性のために、マウスのモノクローナル抗体が好ましいことが多い。
【０１１４】
1本鎖抗体は、米国特許第4,946,778号および第5,888,773号において開示されており、これらは各々、本明細書に参照として組入れられている。
【０１１５】
ヒト定常領域ドメインおよび／または可変領域ドメインを有するマウス、ラットまたは他の種由来のキメラ抗体、二重特異性抗体、組換えおよび操作された抗体ならびにそれらの断片のような、「ヒト化された」抗体も企図されている。患者の歯科疾患に「合わせて作製された(custom-tailored)」抗体の開発法が同じく公知であり、このような合わせて作製された抗体も企図されている。
【０１１６】
G. ペプチド
ペプチドは、DNA、Btk、TFII-Iまたは他の分子と結合または相互作用するBrightドメインと競合するかまたはこれを模倣する、Bright機能の有用なインヒビターであることが証明されている。従ってBright-由来のペプチドは、Bright機能の阻害において有用であることが証明された化合物の特定型である。
【０１１７】
ペプチドは、Brightなどのポリペプチドの、タンパク質分解性酵素(トリプシン、キモトリプシンなど)または化学物質による切断により作製することができる。ペプチドは、組換え技術または化学合成のいずれかを使用し、合成的に作製することもできる。これらのペプチドは、存在する構造、すなわちBrightの一部を中心にしてデザインするか、またはこれらはランダムライブラリーから機能について選択することができる。 
【０１１８】
H. ドミナント-ネガティブBright
ドミナント-ネガティブタンパク質は、両方が同じ環境に存在する場合に、正常な機能的タンパク質の作用を否定することができる、欠損タンパク質である。多くの場合、ドミナント-ネガティブタンパク質は、ホモ-多量体化し、その結果1種または複数の機能性タンパク質を含む複合体を「毒する」ことができる。正にこの様式で作用するBrightのドミナント-ネガティブ型が作製される。ドミナント-ネガティブBright分子のデザインにおいて、いくつかの領域に、変異に有用な点が存在する。第一に、DNA結合をブロックするDNA結合ドメイン(ARID)の変化は、ドミナント-ネガティブ作用を生じる。第二に、核移行をブロックする核局在化配列の変更も、Brightのドミナント-ネガティブ型を生じる。第三に、相互作用ドメインの操作も、ドミナント-ネガティブ機能を生じることができる。
【０１１９】
I. 併用療法
別の態様において、他の治療モダリティと組合せたBright機能のインヒビターの使用が想起されている。従って先に説明された療法に加え、より「標準的」高免疫療法を患者に提供することもできる。他の療法の例は、抗-炎症化合物を含む。
【０１２０】
併用は、細胞を両方の物質を含有する単独の組成物または薬理学的製剤と接触させることによるか、または細胞を2種の個別の組成物もしくは製剤に同時に接触することにより、実現することができる。あるいは、Brightインヒビターを使用する療法は、数分から数週間までの範囲の間隔をあけ、他の物質の投与に先行するか、または投与に続くことができる。これらの物質が個別に細胞に適用される態様において、意味のある(significant)期間は、各送達時点の間で失効せず、その結果これらの物質は、細胞に有益な組合せ作用を発揮することができることは一般に確実である。このような場合、典型的には細胞は、両方のモダリティと互いに約12〜24時間以内に、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に接触され、わずかに約12時間の遅れが最も好ましいことが企図される。しかし一部の状況においては、各投与の間に数日(2、3、4、5、6または7)から数週間(1、2、3、4、5、6、7または8)の経過するよう、治療期間は著しく延長されることが望ましい。
【０１２１】
インヒビターまたは他の物質のいずれかの1種よりも多い投与が望ましいことも考えられる。これに関して、様々な組合せを使用することができる。例として、Brightインヒビターが「A」でありおよび他方の物質が「B」である場合、合計3および4回投与を基に以下の順列が例示される：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  B/A/A  A/B/B  B/B/B/A  B/B/A/B
A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A  B/A/A/B  B/B/B/A
A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A  A/B/B/B  B/A/B/B  B/B/A/B
同じく他の組合せも企図される。
【０１２２】
J. 治療薬
薬理学的治療薬および投与法、用量などは、当業者に周知であり(例えば「Physicians Desk Reference」、Goodman and Gilmanの「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、「Remington's Pharmaceutical Sciences」および「The Merck Index, Thirteenth Edition」参照、これらは関連部分が本明細書に参照として組入れられている)、本明細書の開示を考慮し、本発明と組合せることができる。用量の若干の変動は、治療される対象の状態に応じて必要であろう。投与責任者は、あらゆる事象において、適当な投与量を決定し、このような個々の決定は、当業者の技術の範囲内である。
【０１２３】
製剤および治療法の考察において、任意の化合物の言及は、薬学的に許容できる塩、更には薬学的組成物を含むことも意味することは、理解されるであろう。臨床適用が企図される場合、薬学的組成物は、意図された用途に適した形で調製されるであろう。一般にこれは、パイロジェン、更にはヒトまたは動物に有害である他の不純物を本質的に含まない組成物の調製を伴うであろう。
【０１２４】
一般に、送達ベクターを安定化しおよび標的細胞により取込ませるために適当な塩および緩衝液を使用することは望ましいであろう。緩衝液は、組換え細胞が患者へ導入される場合に使用されるであろう。本発明の水性組成物は、薬学的に許容できる担体または水性媒体中に溶解または分散された、有効量のベクターまたは細胞を含有する。語句「薬学的または薬理学的に許容できる」は、動物またはヒトへ投与される場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応を生じない、分子実体および組成物を意味する。本明細書において使用される「薬学的に許容できる担体」は、ヒトへの投与に適した医薬品などの、医薬品の製剤における使用のために許容できる、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などをを含む。薬学的活性物質のこのような媒体および物質の使用は、当技術分野において周知である。通常の媒体または物質が本発明の活性成分と不適合である場合を除いて、その治療的組成物中での使用が企図されている。補充的活性成分も、それらがこの組成物のベクターまたは細胞を失活しないならば、この組成物へ混入することができる。
【０１２５】
本発明の具体的態様において、薬学的製剤は、迅速な放出を介し送達するために製剤され、企図された他の態様は、定時放出、徐放型放出および持続放出を含むが、これらに限定されるものではない。製剤は、固体または液体のいずれかの形の経口懸濁剤であることができる。更なる態様において、製剤は、非経口送達による送達のために調製されるか、または坐剤として使用されるか、または皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、舌下、経皮、または鼻咽喉内送達であることが企図される。
【０１２６】
活性成分を含有する薬学的組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップ、水性または油性懸濁剤、分散可能な散剤または顆粒剤、乳剤、硬または軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤のような、経口用途に適した形であることができる。経口使用が意図された組成物は、薬学的組成物の製造に関する当技術分野において公知の方法に従い調製され得、このような組成物は、薬学的に洗練されかつ口当たりがよい調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および防腐剤からなる群より選択される1種または複数の物質を含有することができる。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適している、無毒の薬学的に許容できる賦形剤に混合して含有する。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど；顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸など；結合剤、例えばスターチ、ゼラチンまたはアカシアゴム、ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどであってよい。錠剤は、コートされないか、またはこれらは、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延し、これにより長期間の持続作用を提供するために、公知の技術によりコートされてもよい。例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような遅延物質を使用することができる。これらは、制御された放出のための浸透型治療用錠剤を形成するために、米国特許第4,256,108号、第4,166,452号および第4,265,874号に開示された技術によりコートすることもできる(以後参照により組込まれる)。
【０１２７】
経口用途のための製剤は、活性成分が例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性固形希釈剤と混合されている、硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が、例えばピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの水性もしくは油性媒体と混合されている、軟カプセル剤として提示することもできる。
【０１２８】
水性懸濁剤は、活性物質を、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合して含有する。このような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムなどであり；分散剤または湿潤剤は、天然のホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレン-オキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートである。水性懸濁剤は、1種または複数の保存剤、例えばエチル、またはn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香酸など、1種または複数の着色剤、1種または複数の矯味矯臭剤、ならびに1種または複数の甘味剤、例えばショ糖、サッカリンまたはアスパルタームを含有することもできる。
【０１２９】
油性懸濁剤は、活性成分を、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油など、もしくは流動パラフィンのような鉱油中に懸濁することにより製剤することができる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えばビーズワックス、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。前述のような甘味剤、および矯味矯臭剤を添加し、口当たりの良い経口調製物を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような酸化防止剤を添加し保存することができる。
【０１３０】
水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散可能な散剤および顆粒剤は、活性成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および1種または複数の保存剤と混合して提供する。適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、先に言及したものにより例証される。例えば甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤などの追加の賦形剤が存在することもできる。
【０１３１】
薬学的組成物は、水中油型乳剤の形であってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、例えば流動パラフィンもしくはこれらの混合物であってよい。適当な乳化剤は、天然のホスファチド、例えばダイズ、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。乳剤は、甘味剤および矯味矯臭剤も含有することができる。
【０１３２】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、ポリエチレングリコール、ソルビトールまたはショ糖などと共に製剤することができる。このような製剤は、緩和薬、保存剤および矯味矯臭剤および着色剤を含有することもできる。薬学的組成物は、適当な注射用水性または油性懸濁剤の形であることができる。懸濁剤は、前述の適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用し、当技術分野に従い製剤することができる。滅菌注射用調製物は、無毒の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液としての滅菌注射用液剤または懸濁剤であってよい。使用することができる許容できるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて滅菌した不揮発油が、溶媒または懸濁媒体として常用される。この目的のためには、合成モノ-またはジグリセリドを含む、任意の銘柄の不揮発油が使用される。加えてオレイン酸などの脂肪酸が、注射用調製物中で使用される。
【０１３３】
化合物は、薬物の直腸投与のための坐薬の形で投与することもできる。これらの組成物は、治療薬を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、その結果直腸内で溶融し薬物を放出する適当な非-刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。このような物質は、ココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１３４】
局所的用途のために、治療用化合物を含有するクリーム剤、軟膏剤、ゼリー剤、ゲル剤、表皮用液剤または懸濁剤などが使用される。この塗布の目的に関して、局所用塗布は、含嗽剤およびうがい薬を含むこととする。
【０１３５】
製剤は、ナノ粒子、リポソーム、顆粒剤、吸入剤、点鼻液または静脈内混合物として投与することもできる。
【０１３６】
任意の製剤中の活性成分の量は変動し、特定の治療および投与様式によって左右される剤形を形成することができる。更に患者への具体的投与は、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄率、併用薬および治療される特定疾患の重症度を含む様々な要因により左右されることが理解される。
【０１３７】
VI. クローニング、遺伝子導入および発現のためのベクター
ある態様において、Bright、ペプチド、抗体またはそれらの断片、アンチセンス分子、リボザイムまたは干渉RNAを含む、様々な生成物を発現するために、発現ベクターが使用される。発現は、適当なシグナルが、宿主細胞において関心のある遺伝子の発現を駆動するウイルスおよび哺乳類の両給源由来のエンハンサー/プロモーターなどの様々な調節エレメントを含むベクター内に提供されることを必要とする。宿主細胞においてメッセンジャーRNAの安定性および翻訳可能性を最適化するようにデザインされたエレメントも、定義される。ポリペプチドを発現するための薬物選択マーカーの発現に連結したエレメントのような、この生成物を発現する永久に安定した細胞クローンを確立するための、多くのドミナントな薬物選択マーカーの使用の条件も、提供される。
【０１３８】
A. 調節エレメント
本明細書を通じ、用語「発現コンストラクト」は、核酸コード配列の一部または全てが転写可能であるような遺伝子産物をコードしている核酸を含む、任意の型の遺伝子コンストラクトを含むことを意味する。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしもではない。ある態様において、発現は、遺伝子の転写およびmRNAの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。別の態様において、発現は、関心のある遺伝子をコードしている核酸の転写のみを含む。
【０１３９】
ある態様において、遺伝子産物をコードしている核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、細胞の合成機構により認識された、または合成機構に導入された遺伝子の特異的転写の開始に必要なDNA配列を意味する。語句「転写制御下」とは、プロモーターが、RNAポリメラーゼの始動および遺伝子の発現の制御のために、核酸に対し正確な位置および方向にあることを意味する。
【０１４０】
用語プロモーターは、ここでは、RNAポリメラーゼIIの開始位置の周囲でクラスター化される転写制御モジュールの群を意味するように使用される。いかにプロモーターが組織化されるかに関する多くの考察は、HSVチミジンキナーゼ(tk)およびSV40初期転写ユニットに関するものを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来している。最近の研究により増大されたこれらの研究は、プロモーターは、個別の機能的モジュールにより構成され、各々はおよそ7〜20bpのDNAからなり、転写アクチベーターまたはレプレッサータンパク質の1個または複数の認識部位を含むことを示している。
【０１４１】
各プロモーター中の少なくとも1種のモジュールは、RNA合成の開始点を設定するように機能する。その最良の公知の例は、TATAボックスであるが、哺乳類末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターのような一部のプロモーターにおいては、TATAボックスが欠けており、その開始部位に重複する個別のエレメントが、開始部位を固定することを補助している。
【０１４２】
追加のプロモーターエレメントは、転写開始頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは、更に開始部位の下流に機能的エレメントを含むことが最近示された。プロモーターエレメント間の間隔は、自在であることが多く、その結果エレメントが別のものに対して倒置または移動される場合も、プロモーター機能は保存される。tkプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が漸減し始める前に、50bp離れるように増加することができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために、共に操作できるようにまたは独立してのいずれかで機能するように見える。
【０１４３】
ある態様において、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)極初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、Rous肉腫ウイルス長末端反復配列、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを使用し、関心のあるコード配列の高-レベルの発現を得ることができる。関心のあるコード配列の発現を実現するための、当技術分野において周知である、他のウイルスまたは哺乳類細胞またはバクテリオファージのプロモーターの使用も、発現レベルが所定の目的に十分であることを条件として、企図されている。
【０１４４】
周知の特性を持つプロモーターを使用し、トランスフェクションまたは形質転換後の関心のあるタンパク質発現のレベルおよびパターンを、最適化することができる。更に具体的生理的シグナルに反応して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にすることができる。表2および3は、本発明の状況において、関心のある遺伝子の発現を調節するために使用することができるいくつかの調節エレメントを列記している。このリストは、遺伝子発現の促進に関連する全ての可能性のあるエレメントを残らず記すことは意図するものではなく、それらの単なる例である。
【０１４５】
エンハンサーは、DNAの同じ分子上の離れた位置に位置したプロモーターからの転写を増加する遺伝的エレメントである。エンハンサーは、プロモーターそっくりに組織化される。すなわち、これらは各々が1種または複数の転写タンパク質に結合する多くの個々のエレメントで構成される。
【０１４６】
エンハンサーとプロモーターの間の基本的区別は、機能性による。全体としてのエンハンサー領域は、少し離れた転写を刺激することができなければならず；このことは、プロモーター領域またはその成分エレメントにとっては必ずしもあてはまらない。他方でプロモーターは、特定の位置および特定の方向に、RNA合成の開始を指示する1種または複数のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、重複しおよび隣接することが頻繁であり、非常に類似したモジュレーター機構であるように見えることが多い。
【０１４７】
以下は、発現コンストラクトにおいて関心のある遺伝子をコードしている核酸と組合せて使用することができる、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター/エンハンサーおよび誘導性プロモーター/エンハンサーのリストである(表2および表3)。加えて、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ(プロモーターデータベースEPDBに従う)も、遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。適当な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部または追加の遺伝子発現コンストラクトのいずれかとして提供される場合に、真核細胞は、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【０１４８】
（表２）プロモーターおよび/またはエンハンサー
2007523895.tif 000003
2007523895.tif 000004
2007523895.tif 000005
（表３）誘導性エレメント
2007523895.tif 000006
【０１４９】
特に興味深いのは、B細胞を選択的に活性化するプロモーターである。この群の特定のプロモーターは、CD19プロモーターである(Maas et al., 1999)。
【０１５０】
cDNAの挿入が使用される場合、典型的には、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化を実行するために、ポリアデニル化シグナルを含むことが望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明をうまく実践する上で重要であるとは考えられず、ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの、いずれかのそのような配列を使用することができる。同じく発現カセットのエレメントとしてターミネーターも企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、およびカセットから他の配列への読み取りを最小化するために役立つ。
【０１５１】
B. 選択マーカー
ある本発明の態様において、これらの細胞は、本発明の核酸コンストラクトを含み、発現コンストラクト中にマーカーを含むことにより、細胞はインビトロまたはインビボにおいて同定され得る。このようなマーカーは、発現コンストラクトを含む細胞へ同定可能な変化をもたらし、細胞の容易な同定を可能にする。通常薬物選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび選択を補助し、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールなどに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)などの酵素を使用することができる。免疫原性マーカーも使用することができる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードしている核酸と同時に発現されることが可能である限りは、重要であるとは考えられない。選択マーカー更なる例が、当業者に周知である。
【０１５２】
C. マルチ遺伝子コンストラクトおよびIRES
本発明のある態様において、内部リボソーム進入部位(IRES)エレメントを使用し、マルチ遺伝子、またはポリシストロン性メッセージを作製する。IRESエレメントは、5'メチル化されたCap依存した翻訳のリボソームをスキャニングするモデルを迂回し、および内部で翻訳を開始することができる(Pelletier and Sonenberg, 1988)。ピコナ(picano)ウイルスファミリーの2つのメンバー(ポリオおよび脳心筋炎)由来のIRESエレメント(Pelletier and Sonenberg, 1988)に加え、哺乳類メッセージ由来のIRES(Macejak and Sarnow, 1991)が説明されている。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームは、一緒に転写することができ、各々IRESにより分離され、ポリシストロン性メッセージを作製する。IRESエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効果的翻訳のために、リボソームへアクセス可能である。複数の遺伝子は、単独のメッセージを転写するために単独のプロモーター/エンハンサーを用い、効果的に発現され得る。
【０１５３】
任意の異種オープンリーディングフレームを、IRESエレメントへ連結することができる。これは、分泌タンパク質、個々の遺伝子によりコードされたマルチ-サブユニットタンパク質、細胞内もしくは膜結合型タンパク質および選択マーカーのための遺伝子を含む。この方法において、いくつかのタンパク質の発現は、単独のコンストラクトおよび単独の選択マーカーにより、細胞へ同時に操作することができる。
【０１５４】
D. 発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞へ導入する多くの方法が存在する。本発明のある態様において、発現コンストラクトは、ウイルスまたはウイルスゲノム由来の操作されたコンストラクトを含む。あるウイルスの受容体-媒介したエンドサイトーシスにより細胞へ進入し、宿主細胞ゲノムへ組込みおよびウイルス遺伝子を安定しかつ効果的に発現する能力は、それらを外来遺伝子の哺乳類細胞への導入にとって魅力的な候補としている(Ridgeway, 1988；Nicolas and Rubenstein, 1988；Baichwal and Sugden, 1986；Temin, 1986)。遺伝子ベクターとして使用される第一のウイルスは、パポーバウイルス(シミアンウイルス40、ウシパピローマウイルス、およびポリオーマ)(Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986)およびアデノウイルス(Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986)を含む、DNAウイルスである。これらは、外来DNA配列について比較的低い収容能力を有し、および制限された宿主スペクトルを有する。更に許容細胞においてそれらの発癌能および細胞変性作用は、安全性の懸念を生じる。これらはわずかに最大8kBの外来遺伝物質を収容することができるが、様々な細胞株および実験動物へ容易に導入することができる(Nicolas and Rubenstein, 1988；Temin, 1986)。
【０１５５】
インビボ送達に関する好ましい方法のひとつは、アデノウイルス発現ベクターの使用に関する。「アデノウイルス発現ベクター」は、(a)コンストラクトのパッケージングを支援し、および(b)そこにクローニングされたアンチセンスポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含むそのようなコンストラクトを含むことを意味する。この状況において、発現は、遺伝子産物が合成されることは必要としない。
【０１５６】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形を含む。36kBの直鎖状2本鎖DNAウイルスというアデノウイルスの遺伝的組織の知識は、アデノウイルスDNAの大きい破片(piece)の最大7kBの外来配列との置換を可能にする(Grunhaus and Horwitz, 1992)。アデノウイルスDNAは遺伝毒性の可能性を伴わずにエピソーム様式で複製することができるので、レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組込みを生じない。同じくアデノウイルスは、構造的に安定しており、ゲノム再構成は豊富な増幅後に検出されない。アデノウイルスは、それらの細胞周期の工程とは無関係に、事実上全ての表皮細胞に感染することができる。これまでのところ、アデノウイルス感染は、ヒトの急性呼吸器疾患のような軽度の疾患にのみ関連するように見える。
【０１５７】
アデノウイルスは、その中等度のゲノムサイズ、容易な操作、高い力価、広範な標的細胞および高い感染性のために、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。このウイルスゲノムの両端は、100〜200塩基対の逆方向末端反復配列(ITR)を含み、これはウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なcisエレメントである。ゲノムの初期(E)および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始により分割される異なる転写単位を含む。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムおよびわずかな細胞遺伝子の転写の調節に寄与するタンパク質をコードしている。E2領域(E2AおよびE2B)の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現および宿主細胞シャット-オフに関連している(Renan, 1990)。ウイルスのキャプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター(MLP)により生じた単独の主要転写産物の意味のあるプロセッシング後にのみ発現される。このMLP(16.8m.u.に位置する)は、感染の後期相期間に特に有効であり、および全てのこのプロモーターから生じたmRNAは、それらを翻訳に好ましいmRNAとする5'-三部分リーダー(TPL)配列を有する。
【０１５８】
現在のシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターの間の相同組換えにより作製される。2種のプロウイルスベクターの間の可能性のある組換えのために、野生型アデノウイルスは、このプロセスから作製される。従って、個々のプラークからウイルスの単独のクローンを単離しおよびそのゲノム構造を試験することは重要である。
【０１５９】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの作製および繁殖は、ヒト胚性腎細胞からAd5 DNA断片により形質転換されおよびE1タンパク質を構成的に発現している293と称される独自のヘルパー細胞株によって決まる(Graham et al., 1977)。E3領域はアデノウイルスゲノムには非必須であるので(Jones and Shenk, 1978)、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助により、E1、D3のいずれかまたは両方の領域において、外来DNAを保持する(Graham and Prevec, 1991)。実際にアデノウイルスは、約105％の野生型ゲノムをパッケージングし(Ghosh-Choudhury et al., 1987)、約2kb余分のDNAの収容能を提供している。E1およびE3領域と置換可能である約5.5kbのDNAと組合せ、現在のアデノウイルスベクターの最大収容能は、7.5kb以下であるか、またはベクターの全長の約15％である。アデノウイルスゲノムの80％よりも多くは、ベクター骨格中に残り、ベクターが生じる細胞毒性の源である。同じく、E1-欠失したウイルスの複製欠損は、不完全である。
【０１６０】
ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞もしくは上皮細胞などの、ヒト細胞に由来することができる。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性(permissive)である他の哺乳類種の細胞に由来することができる。このような細胞は、例えばベロ細胞または他のサルの胚性間葉細胞または上皮細胞を含む。前述のように、好ましいヘルパー細胞株は293である。
【０１６１】
Racherら(1995)は、293細胞を培養し、およびアデノウイルスを繁殖する改善された方法を明らかにした。ひとつの様式において、天然の細胞凝集は、個々の細胞の、培地100〜200mlの入った、1Lシリコン処理した攪拌フラスコ(Techne, Cambridge, 英国)への接種により増殖される。40rpmでの撹拌後、細胞生存度が、トリパンブルーにより概算される。別の様式において、Fibra-Celマイクロキャリア(Bibby Sterlin, Stone, 英国)(5g/L)が以下のように使用される。細胞接種材料を、培地5ml中に再懸濁し、250mlエーレンマイヤーフラスコ中の担体(50ml)に添加し、時折攪拌しながら1〜4時間静置した。その後培地を、新鮮な培地50mlと交換し、振盪を開始した。ウイルス産生のために、細胞は、集密度約80％まで増殖させ、その後培地を交換し(最終容積の25％まで)、アデノウイルスをMOI 0.05で添加した。培養物を一晩静置し、その後容積を100％に増加し、更に72時間振盪を開始した。
【０１６２】
アデノウイルスベクターは複製欠損であるか、または少なくとも条件付きで欠損しているという必要要件以外のアデノウイルスベクターの性質は、本発明の実践が成功する上で重要であるとは思えない。アデノウイルスは、42種の異なる公知の血清型または亜群A-Fのいずれかであってよい。亜群Cのアデノウイルス5型は、本発明において使用するための条件付き複製-欠損アデノウイルスベクターを得るための、好ましい出発物質である。その理由は、アデノウイルス5型は、非常に多くの生化学的および遺伝的情報が知られているヒトアデノウイルスであり、およびこれは歴史的にベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築のために使用されてきたからである。
【０１６３】
前述のように、本発明の代表的ベクターは、複製欠損であり、かつアデノウイルスE1領域を有さない。従ってこれは、関心のある遺伝子をコードしているポリヌクレオチドをE1-コード配列が除去された位置に導入するためには、最も都合がよいであろう。しかし、アデノウイルス配列内のコンストラクトの挿入位置は、本発明にとって重要ではない。関心のある遺伝子をコードしているポリヌクレオチドも、Karlssonら(1986)が説明したように、E3置換ベクターにおいて欠失したE3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがE4欠失を補足しているE4領域へ、挿入することができる。
【０１６４】
アデノウイルスは、容易に増殖および操作され、インビトロおよびインビボにおいて広範な宿主範囲を示す。この群のウイルスは、例えば109〜1012プラーク形成単位/mlのような、高い力価で得ることができ、これらは高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みは必要ではない。アデノウイルスベクター由来の外来遺伝子は、エピソーム性であり、その結果宿主細胞に対し低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスのワクチンの研究において、副作用は報告されておらず(Couch et al., 1963；Top et al., 1971)、インビボ遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および治療能を明らかにしている。
【０１６５】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現(Levrero et al., 1991；Gomez-Foix et al., 1992)、およびワクチン開発(Grunhaus and Horwitz, 1992；Graham and Prevec, 1991)において使用されている。最近の動物試験は、遺伝子治療に組換えアデノウイルスを使用することができることを示唆した(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991；Stratford-Perricaudet et al., 1990；Rich et al., 1993)。組換えアデノウイルスを異なる組織へ投与する研究は、気管注入(Rosenfeld et al., 1991；Rosenfeld et al., 1992)、筋肉注射(Ragot et al., 1993)、末梢静脈内注射(Herz and Gerard, 1993)、および脳への定位固定された(stereotactic)接種(Le Gal La Salle et al., 1993)を含む。
【０１６６】
レトロウイルスは、逆転写のプロセスにより感染細胞においてそれらのRNAを2本鎖DNAへ転換する能力により特徴付けられる1本鎖RNAウイルス群である(Coffin, 1990)。その後得られるDNAは、プロウイルスとして細胞染色体へ安定して組込まれ、およびウイルスタンパク質の合成を指示する。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、各々、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードしている3種の遺伝子gag、polおよびenvを含む。gag遺伝子の上流に認められる配列は、このゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含む。2種の長末端反復(LTR)配列は、このウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、ならびに宿主細胞ゲノム中の組込みにも必要である(Coffin, 1990)。
【０１６７】
レトロウイルスベクターを構築するために、関心のある遺伝子をコードしている核酸が、複製-欠損であるウイルスを生じるある種のウイルス配列の代わりに、このウイルスゲノムへ挿入される。ビリオンを作製するために、gag、polおよびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分は含まないパッケージング細胞株が、構築される(Mann et al., 1983)。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にcDNAを含む組換えプラスミドがこの細胞株へ導入される場合(例えばリン酸カルシウム沈降法により)、このパッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写産物のウイルス粒子へのパッケージングを可能にし、これは次に培養培地へ分泌される(Nicolas and Rubenstein, 1988；Temin, 1986；Mann et al., 1983)。この組換えレトロウイルスを含有する培地は、その後収集され、任意に濃縮され、遺伝子導入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型に感染することができる。しかし組込みおよび安定した発現は、宿主細胞の分裂を必要とする(Paskind et al., 1975)。
【０１６８】
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされた新規方法が、乳糖残基のウイルスエンベロープへの化学付加による、レトロウイルスの化学修飾を基に近年開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能にする。
【０１６９】
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するおよび特異的細胞受容体に対するビオチン化された抗体が使用される組換えレトロウイルスを標的化する様々な方法がデザインされた。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することにより、ビオチン成分と結合された(Roux et al., 1989)。主要組織適合性複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を用い、それらの表面抗原を生じる様々なヒト細胞の自己向性ウイルスによるインビトロにおける感染を明らかにした(Roux et al., 1989)。
【０１７０】
本発明の全ての局面におけるレトロウイルスベクターの使用にはある種の制限が存在する。例えば、レトロウイルスベクターは通常、ランダム位置で細胞ゲノムに組込まれる。このことは、宿主遺伝子の遮断によるかまたは隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入による、挿入の突然変異誘発につながり得る(Varmus, et al., 1981)。欠損レトロウイルスベクターの使用に伴う別の懸念は、パッケージング細胞内の野生型複製-受容性の(competent)ウイルスの出現の可能性である。これは、組換えウイルス由来の無傷の配列が、宿主細胞ゲノムに挿入されたgag、pol、env配列の上流に挿入されるような組換え事象から生じる。しかし組換えの可能性を大きく低下した新たなパッケージング細胞株が、現在入手可能である(Markowitz et al., 1988；Hersdorffer et al., 1990)。
【０１７１】
本発明において、他のウイルスベクターを発現コンストラクトとして使用することができる。ワクシニアウイルス(Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986；Coupar et al., 1988)、アデノ-随伴ウイルス(AAV)(Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986；Hermonat and Muzycska, 1984)、およびヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを、使用することができる。これらは様々な哺乳類細胞にとっていくつかの魅力的特徴をもたらす(Friedmann, 1989；Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986；Coupar 1988；Horwich et al., 1990)。
【０１７２】
EBVと称されることが多いエプスタイン-バーウイルスは、ヘルペスウイルスファミリーの一員であり、最も一般的なヒトウイルスのひとつである。このウイルスは世界中に生じ、ほとんどのヒトが、生存中にいつかはEBVに感染し始める。米国においては、年齢35〜40歳の成人の95％と多くが感染している。EBVによる感染は、青年期または若成年に生じる場合、その時点で35％〜50％が伝染性単核球症を発症する。EBVベクターを使用し、DNA配列を細胞へ、特にBリンパ球へ効率的に送達する。Robertsonら(1986)は、遺伝子治療のベクターとしてEBVを検証している。
【０１７３】
欠損B型肝炎ウイルスの認識により、異なるウイルス配列の構造-機能関係への新たな洞察が得られた。インビトロ研究は、このウイルスはヘルパー-依存型パッケージングの能力を維持し、かつそのゲノムの最大80％の欠失にもかかわらず逆転写することを示した(Horwich et al., 1990)。このことは、このゲノムの大部分は、外来遺伝物質と置き換わることを示唆した。肝臓向性(hepatotropism)および持続性(組込み)は、肝臓-指定した遺伝子導入にとって特に魅力的な特性である。Changらは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子をアヒルのB型肝炎ウイルスゲノムへポリメラーゼ表面およびプレ-表面コード配列の代わりに導入した。これは、野生型ウイルスと共にトリヘパトーマ細胞株へ同時-トランスフェクションした。高力価の組換えウイルスを含有する培養培地を使用し、初代コガモ肝細胞を感染した。安定したCAT遺伝子発現が、トランスフェクション後少なくとも24日間検出された(Chang et al., 1991)。
【０１７４】
センスまたはアンチセンス遺伝子コンストラクトの発現を行うためには、この発現コンストラクトは、細胞へ送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験室手法のようにインビトロで、またはある病態の治療のようにインビボもしくはエクスビボで実現される。送達のひとつの機序は、発現コンストラクトが感染性ウイルス粒子内にキャプシド形成されたウイルス感染によるものである。
【０１７５】
発現コンストラクトの培養された哺乳類細胞への導入のためのいくつかの非-ウイルス法も、本発明により企図されている。これらは、リン酸カルシウム沈降法(Graham and Van Der Eb, 1973；Chen and Okayama, 1987；Rippe et al., 1990)、DEAE-デキストラン法(Gopal, 1985)、電気穿孔法(Tur-Kaspa et al., 1986；Potter et al., 1984)、直接微量注入法(Harland and Weintraub, 1985)、DNA-負荷したリポソーム法(Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979)、ならびにリポフェクタミン-DNA複合体、細胞音波処理法(Fechheimer et al., 1987)、高速微量注入を使用する遺伝子銃(Yang et al., 1990)、および受容体-媒介型トランスフェクション(Wu and Wu, 1987；Wu and Wu, 1988)を含む。これらの技術の一部は、インビボまたはエクスビボ使用にうまく適合することができる。
【０１７６】
一旦発現コンストラクトが細胞へ送達されると、関心のある遺伝子をコードしている核酸は、異なる位置に配置されかつ発現される。ある態様において、遺伝子をコードしている核酸は、細胞のゲノムへ安定して組込むことができる。この組込みは、相同組換え(遺伝子交換)によりコグネイトな位置内および方向であることができるか、またはランダムに、非特異的位置に組込まれる(遺伝子増強)ことができる。なお更なる態様において、核酸は、個別にDNAのエピソームのセグメントとして安定して維持される。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは独立したまたは同調した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードしている。発現コンストラクトが細胞へどのように送達されるかおよび細胞のどこで核酸が留まるかは、使用される発現コンストラクトの種類によって決まる。
【０１７７】
更に別の本発明の態様において、発現コンストラクトは、単純に裸の組換えDNAまたはプラスミドからなる。このコンストラクトの導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性とする前述の方法のいずれかにより実行される。これは特に、インビトロ導入に適用可能であるが、更にインビボ使用に適合することができる。Dubenskyら(1984)は、リン酸カルシウム沈降法の形で、ポリオーマウイルスDNAを成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓へ注入することに成功し、活発なウイルス複製および急性感染を明らかにした。BenvenistyおよびNeshif(1986)も、リン酸カルシウムで沈降したプラスミドの直接の腹腔内注射は、トランスフェクションされた遺伝子の発現を生じることを明らかにした。関心のある遺伝子をコードしているDNAも、同様の様式でインビボへ導入されかつ遺伝子産物を発現することができることが想起される。
【０１７８】
本発明の更に別の態様において、裸のDNA発現コンストラクトの細胞への導入には、粒子銃が関与することができる。この方法は、DNA-コートされた微量注入物を高速へ加速し、それらが細胞膜を貫通しかつ細胞を殺傷することなく細胞に進入することを可能にする能力に左右される(Klein et al., 1987)。小型粒子の加速のためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置のひとつは、高電圧放電に頼り、電流を発生し、これは次に推進力を提供する(Yang et al., 1990)。使用される微量注入物は、タングステンまたは金ビーズのような、生物学的不活性物質からなる。
【０１７９】
ラットおよびマウスの肝臓、皮膚および筋肉組織を含む選択された臓器は、インビボにおいて衝突される(Yang et al., 1990；Zelenin et al., 1991)。これは、銃と標的臓器の間の組織の介入を排除するために、組織または細胞の手術による露出を必要とし、すなわちエクスビボ処置である。再度特定の遺伝子をコードしているDNAも、この方法により送達され、かつ更に本発明により組込まれる。
【０１８０】
本発明の更なる態様において、発現コンストラクトは、リポソーム内に捕獲されてよい。リポソームは、リン脂質二層膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重層リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰な水溶液中に懸濁された場合に、自然発生する。この脂質成分は、閉鎖構造を形成する前に自己-再構成を受け、脂質二層間に水および溶解した溶質を捕獲する(Ghosh and Bachhawat, 1991)。同じくリポフェクタミン-DNA複合体が企図されている。
【０１８１】
リポソーム-媒介型核酸送達および外来DNAのインビトロ発現は、非常にうまくいく。Wongら(1980)は、リポソーム-媒介型送達および外来DNAの培養されたニワトリ胚、HeLa細胞およびヘパトーマ細胞における発現の実行可能性を明らかにした。Nicolauら(1987)は、ラットにおける静脈内注射後のリポソーム-媒介型遺伝子導入の実施に成功した。
【０１８２】
本発明のある態様において、リポソームは、赤血球凝集するウイルス(HVJ)と複合することができる。これは、細胞膜との融合を促進し、およびリポソームに封入されたDNAの細胞進入を促進することが示されている(Kaneda et al., 1989)。別の態様において、リポソームは、非-ヒストン核染色体タンパク質(HMG-1)と複合されるかまたはこれと共に使用される(Kato et al., 1991)。更に別の態様において、リポソームは、HVJおよびHMG-1の両方と複合されるかまたはこれらと共に使用される。その場合、そのような発現コンストラクトは、核酸のインビトロおよびインビボにおける導入および発現にうまく使用され、従ってこれらは本発明に適用可能である。細菌プロモーターがDNAコンストラクトにおいて使用される場合、リポソーム内に適当な細菌ポリメラーゼを含むことも望ましいであろう。
【０１８３】
特定の遺伝子をコードしている核酸の細胞への送達に使用することができる他の発現コンストラクトは、受容体-媒介型送達ビヒクルである。これらは、ほとんど全ての真核細胞における受容体-媒介型エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取込みを利用する。様々な受容体の細胞型-特異的分布のために、この送達は高度に特異性がある(Wu and Wu, 1993)。
【０１８４】
受容体-媒介型標的化ビヒクルは、一般に細胞受容体-特異的リガンドおよびDNA-結合物質のふたつの成分からなる。いくつかのリガンドが、受容体-媒介型遺伝子導入に使用される。最も広範に特徴付けられたリガンドは、アシアロオロソムコイド(ASOR)(Wu and Wu, 1987)およびトランスフェリン(Wagner et al., 1990)である。最近、ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質(neoglycoprotein)が、遺伝子送達ビヒクルとして使用され(Ferkol et al., 1993；Perales et al., 1994)、かつ表皮増殖因子(EGF)も、遺伝子の扁平癌細胞への送達に使用されている(Myers, EPO 0273085)。
【０１８５】
別の態様において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含むことができる。例えばNicolauら(1987)は、リポソームに組込まれたラクトシル-セラミド、ガラクトース-末端アシアロガングリオシドを使用し、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みの増加を認めた。その結果、特定の遺伝子をコードしている核酸を、リポソームを伴うまたは伴わないいくつかの受容体-リガンドシステムにより細胞型へ特異的に送達することも実行可能である。例えば表皮増殖因子(EGF)を、EGF受容体のアップレギュレーションを示している細胞への核酸の送達を媒介するための受容体として使用することができる。マンノースを使用し、肝細胞上のマンノース受容体を標的化することができる。同じく、CD5(CLL)、CD22(リンパ腫)、CD25(T-細胞白血病)およびMAA(メラノーマ)に対する抗体も、標的化部分として同様に使用することができる。
【０１８６】
ある態様において、遺伝子導入は、エクスビボ条件下でより容易に行うことができる。エクスビボ遺伝子療法は、動物からの細胞の単離、インビトロにおける核酸の細胞への送達、およびその後の改変された細胞の動物への戻しを意味する。これは、動物からの組織/臓器の手術による摘出、または細胞および組織の初代培養に関連することがある。
【０１８７】
VII. Brightに反応性または阻害性の抗体の調製
更に別の局面において、本発明は、Brightに対し免疫反応性もしくは阻害性である抗体、またはそれらの一部を企図している。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができ、これはヒト化された1本鎖、または更にはFab断片であってもよい。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体である。抗体を調製および特徴決定する手段は、当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane, 1988参照)。
【０１８８】
簡単に述べると、ポリクローナル抗体は、動物の本発明のポリペプチドを含有する免疫原による免疫処置、およびその免役した動物からの抗血清の収集により調製される。広範な動物種を、抗血清の生成に使用することができる。典型的には、抗-抗血清の作製に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ブタまたはウマを含む非-ヒト動物である。ウサギの血液は比較的大量であるために、ウサギがポリクローナル抗体の作製のための好ましい選択肢である。
【０１８９】
抗原のアイソフォームに特異的なポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体は、従来の免疫処置技術を当業者に一般に公知であるように用いて調製することができる。発明の化合物の抗原性エピトープを含有する組成物を用い、1匹または複数のウサギまたはマウスのような実験動物を免疫処置し、その後これは本発明の化合物に対する特異的抗体の産生を促進する。ポリクローナル抗血清は、抗体産生を可能にする時間の後、動物の放血、および全血からの血清試料の調製により得ることができる。
【０１９０】
本発明のモノクローナル抗体は、ELISAおよびウェスタンブロット法などの標準免疫処置学手法、ならびに組織染色などの免疫組織化学的手法、更にはBrightエピトープに特異的な抗体を利用することができる他の手法における適用において有用であることが提唱されている。
【０１９１】
一般に、Brightに対するポリクローナル、モノクローナル、および1本-鎖抗体の両方を、様々な態様において使用することができる。そのような抗体の特に有用な適用は、例えば抗体親和性カラムを使用する、未変性のまたは組換えBrightの精製である。全ての許容できる免疫学的技術の操作は、本発明の開示を考慮し、当業者に公知である。
【０１９２】
抗体を調製および特徴決定する手段は、当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane(1988)参照、これは本明細書に参照として組入れられている)。モノクローナル抗体調製のより詳細な例が、下記実施例において示されている。
【０１９３】
当技術分野において周知であるように、所定の組成物は、その免疫原性を変動することができる。従って担体へのペプチドまたはポリペプチド免疫原の結合により実現されるような、宿主免疫システムのブーストが必要であることが多い。例証的および好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)である。他のアルブミン、例えばオボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンも、担体として使用することができる。ポリペプチドを担体タンパク質へ結合する手段は、当技術分野において周知であり、かつグルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス-ビアゾチジドベンジジンを含む。
【０１９４】
当技術分野において周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非-特異的刺激物質の使用により、増強することができる。例証的および好ましいアジュバントは、フロイントの完全アジュバント(死滅された結核菌を含有する免疫応答の非-特異的刺激物質)、フロイントの不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを含む。
【０１９５】
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫処置に使用される免疫原の性質に加え動物に応じて変動する。様々な経路を使用し、免疫原を投与することができる(皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内)。ポリクローナル抗体の産生は、免疫処置後の様々な時点での免疫処置された動物の血液の採取により、モニタリングすることができる。二次ブースター注射も投与することができる。ブーストおよび力価検定のプロセスは、適当な力価が達成されるまで、反復される。望ましい免疫原性レベルが得られる場合、免疫処置された動物は繁殖され、血清が単離および貯蔵され、および／またはこの動物を使用しmAbが作製される。
【０１９６】
MAbは、米国特許第4,196,265号に開示されたもののような、周知の技術を用い、容易に調製することができ、この特許は本明細書に参照として組入れられている。典型的には、この技術は、例えば精製されたまたは部分的に精製されたPKDタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたは高レベルのPKDを発現している細胞のような選択された免疫原組成物による、適当な動物の免疫処置が関連している。免疫処置組成物は、抗体産生細胞を刺激するために有効な様式で投与される。マウスおよびラットなどの齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、カエルの細胞の使用も可能である。ラットの使用は、ある利点を提供することができる(Goding, 1986)が、マウスが好ましく、BALB/cマウスが最も好ましく、最も日常的に使用され、一般に安定した融合を比較的高い割合で生じる。
【０１９７】
免疫処置後、抗体産生の可能性のある体細胞、特にB-リンパ球(B-細胞)が、mAb産生プロトコールにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃腺もしくはリンパ節から、または末梢血試料から得ることができる。脾細胞および末梢血細胞が好ましく、前者は分裂している形質芽球工程にある抗体-産生細胞の給源が豊富であるので、および後者は末梢血は容易に入手可能であるので好ましい。時には、動物のパネルが、免疫処置され、および最高の抗体力価を伴う動物脾臓が摘出され、脾リンパ球を、シリンジによる脾臓のホモジネートにより得た。典型的には免疫処置したマウス由来の脾臓は、約5x107〜2x108個のリンパ球を含有する。
【０１９８】
その後免疫処置した動物由来の抗体-産生Bリンパ球が、一般に免疫処置した動物と同じ種の不死化した骨髄腫細胞に融合される。ハイブリドーマ-産生融合手法における使用に適した骨髄腫細胞株は、好ましくは非-抗体-産生であり、高い融合効率、および酵素欠損を有し、このことは所望の融合細胞(ハイブリドーマ)のみの増殖を支援するある選択培地において増殖することが不可能であるようにする。
【０１９９】
当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のいずれかひとつを使用することができる(Goding, 1986；Campbell, 1984)。例えば免疫処置した動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、SP210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7およびS194/5XX0 Bulを使用することができ；ラットについて、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983Fおよび4B210を使用することができ；ならびに、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6は全て、細胞融合に関連して有用である。
【０２００】
抗体-産生する脾臓またはリンパ節の細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを作製する方法は、通常体細胞を骨髄腫細胞と2:1の比での混合を用い、この比は細胞膜の融合を促進する単独または複数の物質(化学的または電気的)の存在下で、各々約20:1から約1:1まで変動することができる。センダイウイルスを使用する融合法(Kohler and Milstein, 1975；1976)、およびGefterら(1977)による37％(v/v)PEGのようなポリエチレングリコール(PEG)を使用する方法が説明されている。電気的に誘導される融合法の使用も、適している(Goding, 1986)。
【０２０１】
融合手法は、通常およそ1x10-6〜1x10-8と低い頻度で、生存可能なハイブリッドを生じる。しかし生存可能な融合されたハイブリッドは、選択培地での培養により、親の非融合細胞(特に通常無限に分裂し続ける非融合の骨髄腫細胞)からは分化しないので、これは問題点を示さない。選択培地は一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドの新規合成をブロックする物質を含有するものである。例証的および好ましい物質は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成をブロックするのに対し、アザセリンはプリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンおよびチミジンがヌクレオチド給源として補充される(HAT培地)。アザセリンが使用される場合、その培地にはヒポキサンチンが補充される。
【０２０２】
好ましい選択培地はHATである。ヌクレオチド救出(salvage)経路を操作することが可能な細胞のみが、HAT培地中で生存することができる。骨髄腫細胞は、救出経路の重要な酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を欠損しており、ならびにこれらは生存することができない。B細胞はこの経路を操作することができるが、これらは培養時には限定された生存期間を有し、一般に約2週間以内に死滅する。従って選択培地において生存することができる細胞のみが、骨髄腫およびB-細胞から形成されたそれらのハイブリッドである。
【０２０３】
この培養は、それから特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート内での単-クローン希釈による細胞の培養、それに続く所望の反応性に関する個々のクローン性上清の試験(約2〜3週間後)により実行することができる。このアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合(dot immunobinding)アッセイなど、感度が良く、簡便でかつ迅速である。
【０２０４】
その後選択されたハイブリドーマは、連続希釈され、個々の抗体-産生細胞株へクローニングされ、このクローンはその後無限に増殖され、mAbを提供する。これらの細胞株は、２つの基本的方法によりmAb生成を調べることができる。ハイブリドーマ試料は、当初の融合について体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合した動物へ注射することができる(頻繁には腹腔へ)。注射された動物は、融合した細胞ハイブリッドにより産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。血清または腹水のような、動物の体液を取り出し(tap)、高濃度でmAbを提供する。個々の細胞株をインビトロで培養することもでき、ここで培養培地へ天然に分泌され、そこからそれらを高濃度で容易に得ることができる。いずれかの手段で産生されたmAbは、望ましいならば、濾過、遠心、ならびにHPLCおよびアフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用い、更に精製される。
【０２０５】
VIII. 実施例
下記実施例は、本発明の様々な局面を更に例証するために含まれる。当業者により、下記実施例において明らかにされた技術は、本発明の実施において良く機能するために本発明者らにより発見された技術および／または組成物を表し、従ってその実施に好ましい様式を構成すると見なされることは理解されなければならない。しかし当業者は、本開示を考慮し、明らかにされた特定の態様において、多くの変更を行うことができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を依然得ることを理解しなければならない。
【０２０６】
実施例1−材料および方法
クローニングおよび抗体調製
プラークハイブリダイゼーションおよびファージDNA調製は、本質的に説明されたように実施した(Webb et al., 1989)。Bリンパ球において発現されたヒトBright配列を得るために、ヒトBリンパ球cDNAライブラリー(Clontech, パロアルト, CA)を、2kBマウスBright cDNAプローブでスクリーニングした(Herrscher et al., 1995)。3種の独自のクローンが、このマウスプローブとハイブリダイズした。これらの各々は、ライブラリー構築から生じる同じ5'Eco RI部位を共有し、およびアミノ酸238から3'側非翻訳配列を通じマウスBrightに相同であった。最長のクローンは、1.1kbの3'側非翻訳配列を含んだ。Kortschakら(1998)は、本発明者らのものと同じ配列をクローニングしかつ公開し、このタンパク質をショウジョウバエタンパク質DRIとの相同性のために、Dril1と称した(SEQ ID NO：2)。完全長クローンを、RT-PCRにより、CL01 B細胞株から増幅した(SEQ ID NO：1)。全ての配列は、OMRF sequencing core facilityを用いて確認し、Vector NTIソフトウェアにより解析した。インビトロで翻訳されたタンパク質を、TNTウサギ網状赤血球溶解液で産生した(Promega, マジソン, WI)。
【０２０７】
ポリクローナル抗-ヒトBrightペプチド血清および抗-マウスペプチド血清を、アミノ末端ドメインからのヒトアミノ酸配列GRGREGPGEEHE(SEQ ID NO：3)および類似領域ALHGSVLEGAGHAE(SEQ ID NO：4)からの対応するマウス配列を含有するMAP-ペプチドでヤギを免疫処置することにより調製した。マウスおよびヒトの両方に由来したARIDペプチドRTQYMKYLTPYE(SEQ ID NO：5)と共通の追加の血清も作製された。血清は、酵素結合免疫吸着アッセイにより免疫処置ペプチドとの特異的反応性について試験し、かつペプチドカラム上でアフィニティ精製した。免疫前血清を、対照のために採取した。
【０２０８】
ウェスタンブロット
タンパク質に、7.5％アクリルアミド中の標準変性条件下で、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を施し、ニトロセルロース膜に移し、0.5％ゼラチンおよび0.05％チメロソール中でブロックした(Webb et al., 2000)。Brightは、ポリクローナルウサギ抗-Brightおよびアルカリホスファターゼ標識したヤギ抗-ウサギ免疫グロブリン(Southern Biotech, バーミンガム, AL)で検出した。ラミンBは、ニワトリ抗体およびヤギ抗-ニワトリ二次試薬(Santa Cruz Biologicals)により検出した。アルカリホスファターゼ-複合ウサギ抗-ヤギIgG(Southern Biotech)またはホースラディッシュペルオキシダーゼ-複合ウサギ抗マウスIgGを、二次試薬として使用した。二次試薬は、バックグラウンドを低下するために、細胞株BCg3R-1d由来の核抽出物に対し、あらかじめ吸着した。ホスファターゼ基質は、BioRadから購入し、およびSuperSIgnal West Pico化学発光基質を、Pierce(ロックフォード, IL)から購入した。
【０２０９】
細胞株および組織調製
異なる分化工程を示す形質転換されたB細胞株を使用し、これは以下を含んだ：Nalm 16(プロ-B)、697(プレ-B)、CL01(成熟型B、バーキットリンパ腫、P. Casali(Cornell U., N. Y.)のご厚意により入手)、BL2(成熟型B、EBV陰性)、Ramos(成熟型B、EBV陰性、バーキットリンパ腫)、DaudiおよびRaji(成熟型B、EBV陽性、バーキットリンパ腫)、および300212(EBV-形質転換された末梢血細胞株)。使用した他の細胞株は以下であった：JurkatおよびMolt-4(Tリンパ芽球)、K562(多能性前駆細胞)、U937(骨髄単球)およびHeLa(上皮細胞株)。全ての細胞は、7％熱失活したウシ胎仔血清(FCS)、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5x10-5M 2-MEおよび1mMピルビン酸ナトリウムを補充したRPMI 1640において増殖した。ジメチルスルホキシド中のホルボールミリスチン酸アセテート(PMA)を補充し、最終濃度10μMで使用した。
【０２１０】
骨髄、扁桃腺および胸腺を、非-血液学的障害を伴う小児および成人から術後入手した。血液試料は、成人志願者から得た。臍帯血を、正常な満期出産乳児の胎盤から出産後に入手した。全ての試験は、ヒト対象の使用に関する施設の審査委員会の規制に従って実行した。骨髄、臍帯血および末梢血リンパ球(PBL)由来の単核細胞は、標準Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離の後、＞95％純粋であった(Medina et al., 2001)。接着細胞を、37℃で1時間のインキュベーションにより除去し、単核細胞懸濁剤を、更なる分離またはタンパク質抽出のために、新鮮な培地に懸濁した。単独の細胞懸濁液を、既報のように扁桃腺から(Pascual et al., 1994)、および新鮮な手術時の胸腺から、機械的破壊、それに続くウールカラムを通る濾過および2回の連続Ficoll-Hypaque勾配により、調製した。
【０２１１】
インサイチュハイブリダイゼーションを、Roche非-放射性インサイチュハイブリダイゼーションキットにより、製造業者の指示に従い行った。 簡単に述べると新鮮な扁桃腺を連続切片とし、固定し、かつ830塩基の3'非翻訳領域と共にヒトBrightのエキソン3-8を含む標識したアンチセンス鎖またはセンス鎖RNAとハイブリダイズした。十分洗浄した後、切片を呈色し、顕微鏡検査した。3/4の連続切片を、各スライド上で試験し、2個の独立した扁桃腺を試験した。
【０２１２】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
核抽出物を、低張溶解液から抽出し、タンパク質濃度を、Bradford試薬(BioRad, CA)により算出し、既報のように、γ-32P-標識したプローブと37℃で15分間インキュベーションした後、EMSAを4％非変性アクリルアミドゲルにおいて行った(Buchanan et al., 1995)。S107 V1 5'フランキング配列由来のプロトタイプのBright結合部位(bf150と称される150塩基対Bam HI-Fok I断片)(Webb et al., 1991)を、プローブとして使用した。場合によっては、抗体をプローブとのインキュベーション前5分に添加した。スーパーシフトに使用した抗体は以下であった：アフィニティ精製したヤギ抗-ヒトBrightペプチド血清、ヤギ-抗-Bright P29ペプチド血清(Webb et al., 1998)、免疫前ヤギ血清、マウスモノクローナル抗-Btk(Upstate Biotechnology, レークプラシッド, NY)、マウスBrightに対するポリクローナルウサギ抗血清(P. Tucker, University of Texas, オースチン, TXより寄贈)、対照腹水SK7094、およびNFμNR(Wang et al., 1999)と反応性のポリクローナルウサギ抗-CDP/Cux(E. Neufeld, Yale University, ニューヘブン, CTより寄贈)。Webbら(1991)の説明したbf150内に45塩基対のフットプリンティングしたBrigt結合部位を含む2本鎖オリゴを、特異的競合者として漸増濃度で使用し、ならびに
2007523895.tif 000007
に対応する2本鎖配列を含むそのオリゴヌクレオチドの変異された変種を、非-特異的競合者として使用した。下線を付けたヌクレオチドは、プロトタイプからの変化を示す。競合アッセイを、既報のように行った(Webb et al., 1991)。
【０２１３】
免疫蛍光分析および選別
磁気選別による非-B系統細胞の枯渇後のB細胞亜集団の同定のために、4色免疫蛍光分析を用いた。生存リンパ系細胞を、光散乱の特徴を用いて同定し、ならびにOMRF Flow Cytometry Core and Flow Cytometry and Cell Sorting Laboratory(Oklahoma Center for Molecular Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center)の援助により、FACStar plus(Becton Dickinson)およびMoFlo(Cytomation, フォートコリンズ, CO)細胞選別装置を用い分析した。細胞は、濃度107個細胞/mlで4℃で15分間、以下のビオチン化したFITC-、PE-またはAPC-複合抗体で染色した：Pharmingenより、抗-CD24(クローンML5)、抗-IgM(DA4-4)、抗-IgD(IA6-2)、および抗-CD19(1D3)；Becton Dickinsonより、抗-CD23および抗-CD38；ならびに、Caltag(Burlingame, CA)より、抗-CD10；Southern Biotechより、ヤギ抗-ヒトIgGおよびIgA；BD Biosciences(マウンテンビュー, CA)より、抗-CD34(HPCA-2)；ならびに、Immunotech(ウェストブルック, ME)より、抗-CD77。ビオチン化された抗体は、Streptavidin Red 63(Invitrogen, カールスバッド, CA)により顕在化し、対応する蛍光色素で標識されたアイソタイプが合致する対照抗体を用い、バックグラウンド染色を決定した。選別後分析は、典型的には試料中で純度＞95％を得、細胞数は評価するのに十分であった。
【０２１４】
RT-PCR分析
組織および選別された細胞集団由来の総mRNAを、TriReagent(MRC, シンシナティ, OH)を用いて抽出した。cDNAの合成は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素と共に42℃で1.25時間行った。試料を、60℃で30秒、72℃で2分間、および93℃で30秒で、35〜40サイクル増幅した。相対RNAレベルを制御するために、β-アクチンプライマー(Stratagene)を使用し、臭化エチジウム染色により検出した。使用したBrightプライマーは以下であった：エキソン2-8フォワード：
2007523895.tif 000008
およびリバース：
2007523895.tif 000009
；
ならびに、エキソン4-7フォワード：
2007523895.tif 000010
およびリバース：
2007523895.tif 000011
選択された試料からの増幅産物を配列決定し、それらの同一性を確認した。試料は、0.8％アガロースゲルにより電気泳動し、サザンブロットのためにGeneScreen Plusハイブリダイゼーションメンブレン(NEN LifeScience Products, ボストン, MA)に移し、32P-標識した1.8kBヒトBright cDNAプローブとのハイブリダイゼーションにより、余り豊富でないBright転写産物を検出した。
【０２１５】
実施例2−結果
形質転換された細胞株におけるBrightタンパク質発現
ヒトBrightタンパク質は、マウスの601個のアミノ酸形と比べ、505個のアミノ酸長であり、全体でマウスアミノ酸配列と79％同一である。組換えマウスおよびヒトタンパク質の発現は、ウェスタンブロットにおいて推定されたサイズの1本の顕著なバンドを示した(図1A)。わずかに高い分子量のBrightバンドが、マウスBCg3R-1d細胞株およびヒトB細胞株CL01の両方で明らかであった。本発明者らは先に、マウスBrightの2種の追加型の存在を報告したが(Webb et al., 1998)、ヒトまたはマウス型のいずれかが、選択的スプライシングされたアイソフォームの結果であることを明らかにすることはできなかった。これらのタンパク質試料のホスファターゼによる処理は、これらのバンドを除去することができず、このことはこれらは翻訳後リン酸化事象の結果ではないことを示唆している(Webb et al., 1998)。
【０２１６】
図1Bに一部示したBおよび非-Bリンパ球細胞株の広範なパネルの試験は、Brightタンパク質は、プレ-B細胞株697および成熟型B細胞株Raji、RamosおよびDaudiを含む、多くのヒトB細胞株において発現されないことを示唆した。同様にBrightタンパク質は、試験したT細胞株のいずれにおいても存在しなかった。しかし初期赤芽球前駆体K562はBrightタンパク質を産生した。従ってヒトB細胞株におけるBrightタンパク質発現は、対応するマウス細胞株よりもより制限された。
【０２１７】
ヒトBrightはDNAコンセンサスモチーフに結合する
マウスおよびヒトBrightのARID DNA-結合ドメインは97％同一であるので、本発明者らは、ヒトBrightは、bf150 BrightプロトタイプDNA結合モチーフに結合すると推測した(Webb et al., 1998)。移動度シフトアッセイは、組換えヒトBrightは、Bright配列に結合し、および本発明者らの作製した新規抗-Brightペプチド試薬の両方と反応したことを明らかにした(図2A)。免疫前血清は、Brightタンパク質複合体をスーパーシフトしなかった。マウスBright同様(Webb et al., 1991)、ヒトタンパク質の結合は、非標識bf150断片それ自身とは特異的に競合したが、無関係のDNA断片とはしなかった(図示せず)。従って予想されたように、マウスおよびヒトBrightは、類似したDNA-結合活性を示す。
【０２１８】
ヒト細胞株のパネル由来の核抽出物は、Brightモチーフとの反応性の予想されたよりもより複雑なパターンを示した。マウスBright DNA-結合複合体は、初期プレ-およびプロ-B細胞株以外は、試験した全てのB細胞株において認められたが、代わりにNFμNR複合体を発現した非-B系統株には存在しなかった(Webb et al., 1998)。マウスシステムにおける本発明者らの知見と一致し、線維芽細胞(HeLa)および単球系統細胞(U937)は、Bright結合活性を示さなかった(図2B)。しかしウェスタンブロットによりBrightタンパク質を示したCL01およびK562を含むいくつかの細胞株は、Bright配列と反応するふたつの主要な複合体(IおよびIIと記された)を形成した。更に一般の成熟型B細胞株(Raji、Ramos、Daudi、BL-2)、ならびにプロ-およびプレ-B細胞株Nalm-6および697は全て、ウェスタンブロットにおいてBrightタンパク質が存在しないにもかかわらず(図1B参照)、Brightモチーフと結合したタンパク質複合体を示した(複合体I、図2B)。抗-Bright血清の分析は、タンパク質II複合体のみが、ヒト胚中心B細胞株CL01(Cerutti et al., 1998)、多能性前駆細胞株K562(Lozzio et al., 1981)、およびBrightタンパク質を含んだEBV-形質転換されたB細胞株300212において認められた(図2C)ことを明らかにした。これらの知見は、いくつかの細胞株について、ヒトBrightの3種の異なるドメインに対する抗血清を用いおよび図1A-Bに示したようなウェスタンブロットにより確認した。697およびMolt-4を含むT細胞株において認められたタンパク質II複合体の同一性は不明であるが、本発明者らは、これらはヒトデータベースにおいて、他のARIDファミリータンパク質から生じたと推測した。
【０２１９】
図2Dの抗-Bright抗体と反応するタンパク質複合体は、Bright結合部位に特異的であることを確認するために、Bright結合モチーフに広がる2本鎖オリゴヌクレオチドの存在下で、競合実験を行った。同じ長さの変異されたオリゴヌクレオチドを使用し、Bright結合部位について移動度シフトされた複合体の特異性を明らかにした。図2DからのBright血清に加え、組換えBrightと反応した複合体の各々は、Bright結合モチーフにより特異的に阻害されたが、非-特異的競合者ではなかった。細胞株300212に関するデータを図2Dに示した。
【０２２０】
B細胞株由来のものの多くを含む、いくつかの抽出物において認められたより遅く移動するタンパク質複合体Iは、マウスの非-B細胞の大半において認められるNFμNRリプレッサーを連想させた(Wang et al., 1999)。この複合体はNFμNR(Wang et al., 1999)のように、CDP/Cut/Cuxを含むかどうかを決定するために、CDPに対する抗体がこのアッセイに含まれた(図2C)。抗-CDPは、B細胞株において認められたものを含む、ヒト各株において複合体Iをスーパーシフトした(図2C、およびデータは示さず)。この反応性の機能的意義は不明であるが、PMAによるCL01細胞の刺激は、Bright活性の増加、および抗-CDP-反応性複合体Iのレベル低下の両方をもたらした(図2C)。同様に3％血清中、マウスのBright産生を低下することが先に示された条件で増殖されたCL01細胞は、Brightに対し増加したレベルの複合体Iを示した。従ってCDP-様複合体のDNA-結合活性は、Brightと同時調節されることが明らかであり、これはマウスにおいてBrightおよびNFμNRが同時調節されること(Wang et al., 1999)を示唆する本発明者らおよび他の知見と一致する。これらのデータは、NFμNR-様複合体は、ヒト細胞に存在すること、およびヒトB細胞株におけるBright発現は、マウス細胞株を用いて観察されたパターンとは実質的に異なることを示している。
【０２２１】
正常ヒト組織におけるBright発現
ヒトゲノムは、保存されたARID DNA結合ドメインを伴う少なくとも10種の追加のタンパク質を含み、および本発明者らのEMSAデータは、追加のARIDファミリーメンバーは図2A-Cにおいて試験された細胞株において発現されることを示唆しているので、本発明者らは、完全長cDNAを用い、Bright mRNAの組織分布を再試験した。先の実験は、プローブとしてBrightのARIDドメインのみを使用した(Kortschak et al., 1998)。ヒト組織由来の市販のmRNAパネルを、2kBヒトBrightプローブによりストリンジェント条件下でハイブリダイズした(図3A-B)。Bright発現は、明確に胎盤において最も豊富であった。しかし胎児肝臓、骨髄、尾状核、心臓、虫垂、胎児胸腺、腎臓、精巣、小腸、肺、胎児肺、胃、リンパ扁桃、および肝臓は、非常に弱い反応性であった。これらのデータは、結腸における高度の発現を示唆している初期の報告(Kortschak et al., 1998)と矛盾しているが、図3A-Bに示したRNA転写産物データは、造血組織におけるマウスBright mRNA発現は豊富でないことを示す本発明者らの初期の知見と一致している(Webb et al., 1998)。
【０２２２】
Brightは初期Bリンパ球前駆体において発現される
Brightは骨髄由来のB系統亜集団において発現されるかどうかを決定するために、成体骨髄単核細胞を、Rossiら(2001)に従い、プロ-B(CD34+、CD38+、CD10+)、プレ-B(CD34-、CD19+、IgM-、CD24+)、未熟型B(CD34-、IgM+、IgD-、CD24hi)、成熟型B(CD34-、CD19+、IgM+、CD24hi、IgD+)および再循環B細胞(CD34-、IgM+、IgD+、CD24lo)工程に分離した。Bright mRNAは、プロ-Bおよびプレ-B細胞に加え、骨髄中の再循環B細胞におけるRT-PCRにより検出されたが、未熟型または成熟型B細胞においては検出されなかった(図4A)。各試料は、エキソン2および8ならびに4および7由来の両プライマー対により個別に増幅し、完全長転写産物の存在を確認した。使用したPCR条件下で、高度に関連したBDP cDNAクローン(Numata et al., 1999)は増幅しなかった。初期骨髄集団の極初期幹細胞(幹細胞I：CD34+、CD38-、CD10-、CD19-、および幹細胞II：CD34+、CD38+、CD10-、CD19-)への更なる分離(Rossi et al., 2001)は、最初期CD34+幹細胞は、Bright mRNAを産生し、マウス幹細胞および胎児肝における発現に類似していたことを示唆した(Webb et al., 1998)。プロ-B細胞集団のCD19-(プロ-B III)またはCD19+(プロ-B IV)細胞への分離は、Bright発現は、CD19の発現と共に再発することを示唆した(図4B)。従って、骨髄におけるBright発現は、B細胞分化の3種の個別の集団、極初期の幹細胞においてプロ-Bからプレ-B細胞工程の間、および再循環する抗原-刺激された細胞を生じる。
【０２２３】
Brightは胚中心細胞において発現される
Bright発現は他のリンパ球-リッチな組織において生じるかどうかを決定するために、更なる分析を行った。試験した5種の末梢血試料中1種のみが、EMSAにより非常に低レベルのBrightタンパク質を含み、試験した3種の臍帯血試料中2種がウェスタンにより低レベルのBrightタンパク質を示し、ならびに試験した3種の胸腺のいずれも検出可能なBrightタンパク質を含まなかった。しかし扁桃腺単核細胞は、Brightコンセンサス部位に結合した弱いタンパク質複合体を示し、かつこれは抗-Bright抗体との相互作用により阻害された(図示せず)。
【０２２４】
本発明者らがマウス脾臓において認めたように、ヒト扁桃腺におけるBright発現は胚中心細胞に限定されるかどうかを決定するために、扁桃腺切片に、Bright mRNAセンスプローブおよびアンチセンスプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションを施した。図5Aは、ふたつの倍率で、形態学的に検出可能な胚中心内の増加したハイブリダイゼーション(暗褐色)を示している(左側パネル)。Brightセンスプローブは、胚中心と特異的に反応しなかった(右側パネル)。その後扁桃腺Bリンパ球を、既報のように(Pascual et al., 1994)、細胞表面タンパク質マーカーを基に、B細胞の5種の亜集団に分画した。これらは以下のものである：IgD+、CD23-、CD38-濾胞性マントル細胞(Bm1)；IgD+、CD23+、CD38-濾胞性創始細胞(Bm2)；IgD-、CD77+、CD38+胚中心の中心芽細胞(Bm3)；IgD-、CD77-、CD38+中心細胞(Bm4)；および、IgD-、CD38-メモリー細胞(Bm5)。各集団から得られた選別された細胞の数は、タンパク質をEMSAまたはウェスタンのいずれかにより検出するには非常に少なかったが、RT-PCR分析は、Bright発現は、胚中心の創始細胞(Bm2)において最初に明らかであり、暗色ゾーンの中心芽細胞(Bm3)においてピークであり、および明色ゾーンの中心細胞(Bm4)においてより低いレベルであり続けたことを明らかにした(図5B)。従ってヒトBright発現は、扁桃腺の胚中心B細胞の亜集団に限定される。
【０２２５】
分析したヒトB細胞亜集団、それらの同定に使用した表面マーカー、ならびにBright mRNAの存在または非存在の各々の概略を、図6に示した。これらのデータは、後期プレ-B細胞工程よりもむしろヒトのプロ-B細胞において最初に生じたヒトBright mRNA発現以外は、マウスB細胞による初期の実験に対応している(Webb et al., 1998). 
【０２２６】
ヒトBright DNA-結合複合体は会合したBtkを含む
マウスにおけるBright DNA-結合複合体はBtkを含んだ(Webb et al., 2000)。従って本発明者らは、BtkもヒトBrightに会合するかどうかを調べた。図7は、抗-Btk抗体と反応性であるBright複合体は、B細胞株CL01および300212の両方に存在することを明らかにしている。Btkのプレクストリン相同(PH)ドメインに対する抗体は、CDP-反応性複合体の直下に移動した曖昧なバンドを生じるCL01細胞株中に存在するBright複合体をスーパーシフトした。抗-Btkも、300212細胞株由来のBright複合体の結合に影響したが、いずれの希釈においても明らかにスーパーシフトしたバンドの形成には失敗し、このことはこのような抗体-タンパク質複合体は不安定であることを示唆している。抗-CDP血清もアイソタイプ-合致した対照腹水(図示せず)も、Bright複合体の結合には影響しなかった。加えてMolt-4 T細胞株において観察されたタンパク質複合体は、Bright複合体と特異的反応性を示す抗-Btkにより影響されなかった。これらのデータは、ヒトBrightは、Btkに会合したDNA-結合した複合体として存在することができることを示している。
【０２２７】
実施例3−考察
本発明者らの先の研究は、マウスにおけるBright活性とX-連鎖した免疫不全症の間の連関を示した(Webb et al., 2000)。ヒトもX-連鎖した免疫不全症に罹患するが、マウスよりもはるかに重度の表現型を有するので、ヒトBrightは、Bリンパ球において発現されるかどうか、およびこれはBtkに会合するかどうかを決定することを求めた。加えてヒトBrightの先の分析は、タンパク質レベルへは拡大されなかった(Kortschak et al., 1998)。本明細書に示されたデータは、Brightは、全てのヒトBリンパ球亜集団においては発現されないことを明らかにし、およびBright/Btk会合したDNA-結合複合体が一部のヒトB細胞株に存在することを示している。形質転換されないB細胞におけるヒトおよびマウスBright発現および活性は類似しており、このことはヒトBrightは、マウスタンパク質と重要な機能を共有し得ることを示している。
【０２２８】
末梢血リンパ球からクローニングされたヒトBrightタンパク質は、先に公表されたDril1配列と同じである(Kortschak et al., 1998)。興味深いことに、本発明者らのmRNA発現データは、Dril1 mRNA発現は、筋肉、結腸および視床で最高であることを認めた、Kortschakらにより得られたデータ(1998)とは異なった。これらの研究において、ARIDドメインを、mRNAプローブとして使用した。完全長cDNAプローブを使用する発現パターンの差は、漸増数の同定されたARIDファミリータンパク質の他の一員へのハイブリダイゼーションの欠損を反映している。例えばBDPタンパク質は、ARID領域内でBrightと95％相同であり、Bright DNA配列に結合し、かつ遍在的に発現される(Numata et al., 1999)。組織分析は、ヒトBrightは、幹細胞以外のいくつかの非-B系統亜集団において発現されることを示唆している。しかしBrightタンパク質発現は、今日まで形質転換されないB細胞においては明らかにされていない。
【０２２９】
ヒトBrightは、マウスタンパク質よりもわずかに小さいが、Bright DNAコンセンサスモチーフに同等に良好に結合し、かつマウスにおいて先に説明されたように(Webb et al., 2000)、翻訳後修飾型で存在し得る。推定上の修飾されたアイソフォームは、Brightの3種の異なるポリペプチドに対して調製された抗体と反応するが、ホスファターゼの処理により影響を受けない(Webb et al., 2000)。従ってより大きいアイソフォームは、チロシンリン酸化の結果ではないが、より大きい見かけのサイズを生じるこの修飾型は依然不明である。
【０２３０】
形質転換されないヒト細胞におけるBright発現は、マウスBrightについて認められたものに類似していた。マウスおよびヒトの両Bright mRNAは、プレ-拘束された(pre-committed)リンパ球前駆体、プレ-B細胞、および胚中心細胞において発現された。これらの実験の結果は、図6に図示している。ヒトBright mRNAの胚中心における発現は、中心芽細胞および中心細胞の工程でピークである。これらのデータは、ベースラインを上回るDril1ハイブリダイゼーションは、中心芽細胞または中心細胞のいずれの工程においても検出されなかった、2つの他の研究室のマイクロアレイ分析とは対照的であったが、メモリーB細胞に関する本発明者らのデータは、Alizadehら(2000)；Kleinら(2003)の知見と一致した。胚中心亜集団における相違の理由は不明であるが、評価した細胞集団の違いから、またはマイクロアレイデータはヒトBright配列由来の比較的小さいオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションから得たという事実から生じたかもしれない。
【０２３１】
本発明者らのデータは、8個のエキソン全てに広がるオリゴヌクレオチドを用いて入手し、これはBrightの完全長mRNAの存在を反映している。本発明者らの研究(hand)において、ARIDドメインまたは高度に保存されたタンパク質-相互作用ドメイン内のオリゴヌクレオチドの使用は、全コード配列に広がるオリゴヌクレオチドにより認められる結果と相関していない発現パターンを生じることが多い。RT-PCRデータは、ピーナッツアグルチニン-高い胚中心細胞は、豊富なBright活性を発現する一方で、Brightは、ほとんどの脾B細胞において存在しないことを示している、マウスにおける先の知見と一致する(Webb et al., 1998)。ヒトの未熟型も成熟型も末梢血B細胞は、Brightの検出可能なmRNAを発現しなかった。マウスにおける脾B細胞は、LPS、CD40リガンドおよびインターロイキン-5プラス抗原を含む多くの刺激剤により、Brightの発現を誘導することができる(Webb et al., 1998)が、ヒト末梢血細胞におけるBright発現は、PMA、LPSおよびヤマゴボウマイトジェンを含む一般的マイトジェンのいずれによっても誘導されなかった(図示せず)。しかしBright発現は、PMAによる処置後、CL01細胞株において増加し、誘導にはカルシウムイオノホアであるイオノマイシンが不要であった(図2C)。これらのデータは、ヒトBリンパ球発達時のBright発現は、マウスにおけるそれのように、転写レベルで厳密に調節されることを示唆している。
【０２３２】
明らかに形質転換された細胞株で生じたマウスとヒトのBright発現間に、最大差が認められた。Brightを均一に発現するマウスB細胞株とは対照的に、多くのヒトB細胞株は、Brightタンパク質を発現しなかった。加えてプロ-およびプレ-B細胞株Nalm-16および697は、Brightタンパク質を発現しなかった(図1A-B、および未発表の結果)が、形質転換されないプロ-およびプレ-B細胞は、Brightの豊富なmRNAを産生した。しかしリンパ系株は全て、Bright DNA-結合モチーフに結合したタンパク質を発現した。いくつかのBおよび非-B細胞株は、EMSAにおいてBrightと同様に移動したが、抗-Bright抗体とは反応しないタンパク質を発現した。これらのタンパク質は、迅速に増殖するARIDファミリーの他の一員を示すが、これらは抗-BDP血清と反応することはできない(データは示さず)。
【０２３３】
更にこれらの細胞株のほとんどは、マウス免疫グロブリン遺伝子座においてBright結合部位と競合しかつBright-誘導した転写を阻害するマウスのNFμNRリプレッサー複合体を連想させるCDP-関連したタンパク質複合体の変動するレベルを発現した(Wang et al., 1999)。NFμNR-様複合体がヒトB細胞株において発現される理由は明らかではない。ヒトB細胞株は表面免疫グロブリンを発現し、そのためこのCDP-関連した複合体は、これらの細胞において免疫グロブリン遺伝子座を抑制するようには見えない。それにもかかわらず、本発明者らは、CL01細胞株におけるBrightとこの複合体の間の反比例関係を認めており(図2C)、これはこれらの複合体が、同時に調節されることを示唆している。あるいはNFμNR-様複合体は、マウスにおいて認められるものと機能的に異なり得る。
【０２３４】
移動度シフトアッセイは、BrightおよびBtkの両方に対する抗体と反応するマウスBrightに認められるものに類似したヒトタンパク質複合体を明らかにした(Webb et al., 2000)。マウスにおけるBrightの機能は、免疫グロブリン重鎖転写を増大することであり(Herrscher et al., 1995；Webb et al., 1991)、Brightはヒト細胞においても同様の機能を果たすはずである。他の者は、T細胞受容体レベルは、T細胞成熟が適切に進行するための特異的閾値を上回り維持されなければならないことを示した。これらのデータと調和して、Tecキナーゼは、TCR転写のアップレギュレーションに重要である(Novina et al., 1999；Cheriyath et al., 1998)。従って、Bright、および会合したTecキナーゼ一員であるBtkは、活発に分裂しかつ分化している細胞における表面免疫グロブリンレベルが閾値を上回り維持されることを確実にするために、プレ-B細胞および胚中心の工程で必要である。
【０２３５】
マウスにおける初期の研究は、Brightとxid欠失の間の連関を示唆した(Webb et al., 2000)。ヒトBrightとBtkの間の会合は、Bright機能とX-連鎖した免疫不全症の間の別の連関を示唆している。同じくBrightはヒト疾患XLAに連関し得るという考えと一致し、ヒトBright発現は最初にプロ-B細胞において生じる。このことは、マウスにおいてBrightが最初に発現される初期の大規模プレ-B細胞工程にわずかに先行する(Webb et al., 1998)。XLAにおけるB細胞分化のブロックは、プロ-Bからプレ-B細胞への移行(transition)時に生じるが、xidマウスにおいて、B細胞は未熟型工程で蓄積する(Conley et al., 1994；Satterthwaite and Witte, 1996)。しかし最新の研究は、xid B細胞も、プロ-Bからプレ-B細胞への移行時のわずかな欠失を示していることを示唆している(Kouro et al., 2001；Middendorp et al., 2002)。
【０２３６】
実施例4−材料および方法
細胞株およびトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)を、7％熱失活したウシ胎仔血清(FCS)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5x10-5M 2-ME、および1mMピルビン酸ナトリウムを補充したDMEMにおいて維持した。各々B細胞株M12.4およびBCL1B1のトランスフェクションされた誘導体であるM12g3RiおよびBCg3R-1d細胞株は、T15イディオタイプ免疫グロブリンのコード配列を含み(Webb et al., 1989)、かつ同じ補充物を含むRPMI 1640中で維持した。CHO細胞は、Fugene(Boehringer Mannheim, インディアナポリス, IN)を製造業者の指示に従い用い、トランスフェクションした。M12g3Ri細胞は、Gene Pulser(BioRad, リッチモンド, CA)で0.24kVの電気穿孔によりトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、10％FCSを含む完全RPMI 1640中で維持した。場合によっては、細胞は、10mg/ml LPS(Sigma, セントルイス, MO)で48時間刺激し、トランスフェクション後内在性Bright発現を誘導した。トランスフェクションされた細胞は、Flow Cytometry,  Cell Sorting, and Confocal  Microscopy Laboratory, Oklahoma Center for Molecular Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and the Oklahoma Medical Research Foundation Flow Cytometry Core施設で、MoFlo細胞選別装置(Cytomation, Inc., フォートコリンズ, CO)を使用するGFP発現に関する選別により濃厚化した。典型的選別実験は、GFP発現に関して＞90％濃厚化された細胞を生じた。
【０２３７】
カラムクロマトグラフィー
完全長Bright発現プラスミドによりトランスフェクションされたCHO細胞由来の核抽出物(Herrscher et al., 1995)は、10,000xgで遠心し、凝集物を除去し、0.05M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M KCl、および20％グリセロール中の予め-キャリブレーションしたBio-Gel A 0.5mサイズ排除カラム(Bio-Rad, ハーキュラス, CA)へ、製造業者の指示に従い装加した。このカラムは、Bio-Radゲル濾過標準を使用する前後にキャリブレーションし、カラムの完全性の維持を確実にした。100μl画分を収集し、既報のように(Webb et al., 2000)、Brightについてウェスタンブロットを施した。
【０２３８】
変異体構築および発現ベクター
pBKCMV中の完全長マウスBright cDNAクローン(Herrscher et al., 1995)を鋳型として使用し、Stratagene(ラホヤ, CA)のQuickChange Site Directed突然変異誘発キットを使う位置指定突然変異誘発により、1個のアミノ酸変化または小さい欠失をBrightコード配列に導入した。使用したPCR条件は以下であった：95℃で40秒、それに続く95℃で40秒、60℃で1分、および68℃で16分間を17サイクル、更には68℃で20分間で反応を完了。作出された変異は以下であった：GCGからGCCへ、アミノ酸286位(P286A)；TGGからGCGへ、W299A；TTCからGCAへ、F317A；TATからGCAへ、Y330A；アミノ酸455-460位のREKLESのAEALEAへの変化；ならびに、402-404位のアミノ酸IKKをコードしているヌクレオチドの欠失。W299AおよびY330Aの両変異を含む二重変異体(DP)も作製した。全ての配列は、OMRF配列決定施設およびVector NTIソフトウェアを使用し証明した。
【０２３９】
野生型および変異体Brightは、ベクターpcDNA4/TO/myc-His B(Invitrogen, カールスバッド, CA)を使用し、myc-his配列によりカルボキシ末端にタグを付けた。簡単に述べると、Brightは、5'EcoR I部位および3'Xba I部位を追加する一方で、内在性停止コドンを欠失しているオリゴヌクレオチドによりPCR増幅し、ならびにEcoR IおよびXba Iで消化したベクター断片へライゲーションした。更に配列を、MiGR1レトロウイルスベクターにサブクローニングし、内部リボソーム進入部位からグリーン蛍光タンパク質(GFP)発現を可能にし、Brightを発現している細胞の視認を可能にした(Pear et al., 1998)。コード配列の-574から+146へのV1 S107ファミリー配列を含み、ならびに先に説明したBright結合部位および完全なイントロン重鎖エンハンサー配列を含む1kb Xba I断片を含むμ重鎖発現ベクター(Webb et al., 1991)を、リポーターコンストラクトとして使用した。使用したその他のプラスミドは、GFP-Btk(Webb et al., 2000)、リバース方向のBright配列を含むMiGR1ベクターおよびpUC19であった。
【０２４０】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
既報のように(Buchanan et al., 1995)、プロテアーゼインヒビターPMSF(5x10-5M)、ロイペプチン(1x10-2mg/ml)およびアプロチニン(5x10-3mg/ml)を含む低張溶解により、核抽出物を調製し、タンパク質濃度を、Bradford試薬(BioRad)を使用し決定した。タンパク質は、γ-32P-標識したDNAプローブと共に37℃で15分間インキュベーションし、EMSAを、既報のように(Webb et al., 1991)4％非変性アクリルアミドゲルにおいて行った。DNAプローブは、プロトタイプBright結合部位を含む、S107 V1 5'-フランキング配列から150bpのBamH I-Fok I断片(bf150)(Webb et al., 1991)であった。スーパーシフトアッセイのために、抗体およびタンパク質を、プローブ添加前に、5分間プレ-インキュベーションした。使用した抗体は、ポリクローナルウサギ抗-マウスBright(P. Tucker, University of Texas, オースチン, TXの寄贈)、マウスモノクローナルIgG1抗-myc(Invitrogen)、ポリクローナルウサギ抗-CDP/Cux(E. Neufeld, Yale University, ニューヘブン, CTの寄贈)、および免疫前血清であった。
【０２４１】
共焦点顕微鏡およびフローサイトメトリー
細胞を収集し、3％FCSを含むPBSで洗浄し、かつ既報のように(Webb et al., 2000)、GFP発現について選別した。1％パラホルムアルデヒドで37℃で15分間固定後、細胞をBrightのアミノ末端ドメイン由来のペプチドALHGSVLEGAGHAE(SEQ ID NO：4)に対するポリクローナルアフィニティ精製したヤギ抗-ペプチドマウスBrightで染色した。免疫前血清を、免疫処置前に収集し、IgGを陰性対照として単離した。一次抗体に続けて、ウサギ抗-ヤギIgG-Alexa568(Molecular Probes, ユージーン, OR)と15分間、各々氷上でインキュベーションした。細胞質染色から核を識別するために、DAPI(Molecular Probes)を、最終洗浄前に、細胞に2分間添加した。Zeiss LSM510共焦点顕微鏡を、分析に使用した。約50μmの切片を採取し、Oklahoma Medical Research Foundation Imaging Core Facilityの助けを借り、Zeiss LSM Image Browserソフトウェア(Carl Zeiss, ソーンウッド, NY)を用いて分析した。フィコエリトリン複合したストレプトアビジン(Caltag)抗-CD19ビオチン、抗-CD138(B-D Pharminge)、抗-IgDおよび抗-IgM(Southern Biotech)を、フローサイトメトリー分析に使用した。
【０２４２】
ウェスタンブロットおよび免疫沈降
インビトロ翻訳されたタンパク質を、TNTウサギ網状赤血球溶解液(Promega, マジソン, WI)で作製した。タンパク質試料に、7.5％アクリルアミドゲルを流れる標準の変性条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を施し、ニトロセルロースメンブレンに既報(Webb et al., 2000)のように移した。Brightは、ウサギ抗-Brightまたは抗-myc(Invitrogen)、その後アルカリ-ホスファターゼ複合したヤギ抗-ウサギIgG(Southern Biotechnology, バーミンガム, AL)またはウサギ-抗-マウスIgG1(Invitrogen)により検出した。ブロットは、アルカリホスファターゼ基質(BioRad)で呈色した。免疫前ヤギ血清またはマウス抗-Sp1(Santa Cruz Biotechnology, サンタクルズ, CA)を、アイソタイプ合致した対照として使用した。
【０２４３】
タンパク質は、0.1％Tween20を含有するリン酸-緩衝生理食塩水(PBS)中で抗体と共に1.25時間室温でゆっくり回転しながらインキュベーションした後、プロテインA/Gプラス-アガロースビーズ(Santa Cruz Biotechnology)により、免疫沈降した。ビーズ-複合体を、0.1M Tris、0.5M NaClおよび0.1％ Tween20で充分洗浄し、その後SDS試料緩衝液中で懸濁した。試料を、95℃で5分間加熱し、短時間遠心し、上清をウェスタンブロットで分析した。
【０２４４】
レトロウイルスベクターおよび形質導入
EcoPack2細胞を、10％FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび2mM L-グルタミンを補充したDMEMにおいて維持し、標準リン酸カルシウム手法(Pear et al., 1993)を用いMIgR1コンストラクトでトランスフェクションした。上清を収集し、前記方法(Pear et al., 1993)を使用する3T3細胞の感染によりウイルス力価を決定した。力価1〜5x106が、日常的に得られた。6〜10週齢のC57/B6マウスから脾Bリンパ球を、既報(Webb et al., 2000)のように単離し、24時間刺激し、その後25μg/ml LPSで形質導入した。形質導入は、Krebsら(1999)に従い、8μg/mlポリブレンにより行った。簡単に述べると、細胞を、1x106個細胞/mlで再懸濁し、2mlのウイルス上清と共に、300xg、32℃で30分間遠心し、引き続き37℃で30分間インキュベーションし、ならびに更に2mlのウイルス上清と共に遠心した。細胞は、37℃で8時間インキュベーーションし、洗浄し、ポリブレンを除去し、およびRPMI-1640(20％FCS)中に48〜72時間再懸濁した。細胞は収集し、GFP発現している細胞をフローサイトメトリーにより単離した。
【０２４５】
リアルタイムおよびRT-PCR
RNAを、製造業者(MRC, シンシナティ, OH)のプロトコールに従いTriReagentを用いて単離し、Dnase(2U)(Ambion, オースチン, TX)で37℃で30分間処理し、フェノール-クロロホルム抽出を施し、SuperScript II RnaseHリバース転写酵素キット(Invitrogen)により、cDNAを作製するために使用した。免疫グロブリン転写を、PrimerExpressソフトウェア(Applied Biosystems)を使用しデザインされならびにApplied BiosystemsまたはIDT DNA Technologies(ワシントンDC)から入手した250nmの特異的プライマーおよび5pmoleのTaqManプローブにより、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用い、リアルタイム定量的RT-PCRにより測定した。
【０２４６】
GAPDHに使用したプライマーおよびプローブは以下であった：マウスμ重鎖のプライマーは、エキソン1と2の間のイントロンを超えて増幅することができ、かつ以下であった：フォワード
2007523895.tif 000012
およびリバース
2007523895.tif 000013
マウスμ重鎖のために使用した特異的プローブは、
2007523895.tif 000014
であった。V1リポーターコンストラクトの発現は、下記プライマーおよびプローブを用いて測定した：フォワード
2007523895.tif 000015
；リバース
2007523895.tif 000016
；および、プローブ
2007523895.tif 000017
増幅産物は、エチジウムゲル電気泳動により試験し、これらの配列を、Oklahoma Medical Research Foundation sequencing coreによるDNA配列決定により確認した。増幅反応(25ml)は、下記の条件下で96-ウェルプレートにおいて3つ組で実行し：50℃で2分間、95℃で10分間、および95℃で15秒、および55℃で1分間を40サイクル、ABI Prism 7700 SDS(PE Applied Biosystems, フォスターシティー, CA)により分析した。計算は、製造業者により示されたように、下記式に従い行った：2-ΔΔCT。例えばΔCTは、μおよびGAPDH発現の間のサイクル閾値の変化であり；ΔΔCT＝ΔCT,q−ΔCT,cb(式中、ΔCT,qは、DPベクターに関して得られた値であり、ΔCT,cbは、空のベクター対照について得られた値である。)。加えてJ鎖、Pax-5およびアクチンの発現は、連続希釈したcDNAプライマーを使用する従来のPCRによっても評価した。J鎖のPCRプライマーは、Leeら(2003)により説明されており；Pax-5プライマー、アクチンプライマーが説明されている(Lin and Grosschedl, 1995；Webb et al., 1998)。PCRは、93℃で1分間、その後93℃で30秒、55℃で30秒および72℃で30秒を35サイクル(Pax-5およびアクチン)または40サイクル(J鎖)、その後最後に伸長期間72℃で2分間の反応条件で行った。
【０２４７】
実施例5−結果
Bright変異体の作製
Brightは、アミノ酸相同性の予測および欠失変異体の分析に従い、5個のタンパク質ドメインへ小さく分割された(Herrscher et al., 1995)。これらのドメインは、図8に示しているが、未知の機能の酸性アミノ末端、DNA結合活性にとって重要であると推測されるARIDドメイン、コンセンサス核局在化配列を含む推定活性化ドメイン、ヘリックス-ターン-ヘリックス構造を伴うタンパク質/タンパク質相互作用ドメイン(Suzuki et al., 1998)、ならびに短いカルボキシ末端を含んだ。位置指定突然変異誘発を使用し、BrightのDNA-結合機能に影響するように仮定されたアミノ酸変化を作出した。具体的には、DNA相互作用に関連すると推測された(Iwahara and Clubb, 1999)ARIDドメイン内の4種の帯電した残基は、独立してアラニンに変異されるか(図8)、または第5番目の変異体へ同時に導入され、二重変異体(DP)を作製する。加えて推定核局在化配列KIKKは、細胞質内に内在性Brightを隔離する(sequester)ために推定されたタンパク質を産生するためにその配列の最後の3個のアミノ酸の欠失により変更した(図8)。最後にBrightを含むいくつかのARIDファミリーメンバーは、推定タンパク質相互作用ドメイン内のアミノ酸相同性を延長された領域に示すので(Herrscher et al., 1995；Iwahara and Clubb, 1999)、変異を、タンパク質相互作用ドメイン内に作製し、配列REKLES内の帯電したアミノ酸を配列AEALEAへ変化した。
【０２４８】
ARIDドメイン内の変異はDNA-結合活性を低下する
全てのBright変異体は、インビトロ転写および翻訳システムにおいて発現され、タンパク質発現の同等レベルについてウェスタンブロットにより評価した(図9A)。これらのインビトロ翻訳された変異体タンパク質のEMSAによる更なる分析は、ARIDドメイン内の各変異体が、DNAへの結合に失敗したことを示した(図9B)。しかし予想されたように、推定核局在化配列(KIKK)の変異は、インビトロにおけるこのタンパク質のDNA結合活性に影響を及ぼさなかった。更にREKLES配列の変更は、DNA-結合を防止するには不充分であった(図9B)。
【０２４９】
Brightの細胞内局在化
内在性Brightは、核マトリックスタンパク質に会合しているBリンパ球の細胞質および核の両方に存在する(Kaplan et al., 2001)。変異体Brightタンパク質は変更された細胞内局在化を示すかどうかを決定するために、CHO細胞を、GFPおよびヒスチジン-myc-タグ付きBrightタンパク質の両方を産生するコンストラクトによりトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、GFP発現により同定し、Brightは、抗-Bright抗体およびAlexa-568に複合した二次抗体を用いて発光させた(図10A)。野生型BrightまたはARID変異によりトランスフェクションされた細胞の共焦点顕微鏡比較は、核内の大きいBright発現を伴う、同様の染色パターンを示した。従ってARIDドメインの変異は、Brightの核移行する能力に有害に作用しなかった。K(---)変異体を発現する細胞の染色は、野生型またはARID変異体のいずれかにより認められるものよりも、より高いレベルの細胞質染色を示した；しかし、核領域内の若干のBright染色も存在する。従ってKIKKコンセンサス以外の配列も、Brightの核局在化に寄与し得る。
【０２５０】
Brightは二量体として存在し、変異体タンパク質とヘテロマー複合体を形成することができる
先のデータは、Brightは、単量体としてDNAに結合することができないことを示し、これは四量体としてDNAに結合したことが示唆された(Herrscher et al., 1995)。しかし、トランスフェクションされたCHO細胞およびB細胞株BCg3R-1dの両方からの核抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーは、Brightは溶液中に二量体として存在することを示した(図11A)。Brightタンパク質は、四量体形成と一致する分子量に対応する画分においては明らかではなかったが、若干のBrightタンパク質が、単量体型で存在することができる。REKLES配列の変更は、二量体形成を干渉しなかった(図示せず)。
【０２５１】
変異されたタンパク質は、野生型Brightと共にヘテロ二量体を形成したかどうかを決定するために、Brightのhis-myc-タグ付き変異体型を、CHO細胞において、未変性の野生型Brightと共に同時-発現した。タグ付きタンパク質は、ウェスタンブロットにおいて、わずかなサイズの差により未変性のBrightから識別され(図11B)、抗-tag抗体を用い確認された(図示せず)。抗-myc抗体を用い、タグ付きタンパク質を免疫沈降し、ブロットを抗-Brightにより呈色した(図11B)。全ての場合において、未変性のBrightの存在を反映した低分子量バンドが検出された。his-mycタグの存在は、二量体形成とは干渉しなかった。このことは、変異体タグ付きタンパク質の各々は、未変性のBrightと共にヘテロマー複合体をうまく形成したことを示唆している。これらのデータは、Bright二量体の存在を確認している。
【０２５２】
ARID/野生型ヘテロ二量体は変更されたDNA-結合活性を示す
野生型および変異体Brightで同時トランスフェクションされたCHO細胞の全細胞抽出物からのタンパク質を、EMSAにより分析し、変異体Brightの過剰発現が野生型Bright活性に影響を及ぼすかどうかを決定した。ARID C-末端myc-hisタグ付き変異体のみでトランスフェクションされたCHO細胞由来の抽出物は、対応するインビトロ翻訳されたタンパク質について先に示されたものと同様のDNA結合プロファイルを示した(図12A)。W299A変異体単独はDNAに結合しなかったが(図12B)、これは野生型タンパク質のDNA結合活性を効果的に阻害しなかった。他方でY330A変異体は、野生型結合を完全に廃棄し、DP変異体は大半のBright DNA結合活性を阻害した。従って一部のARID変異体はドミナント-ネガティブタンパク質として機能する。
【０２５３】
ドミナント-ネガティブBright変異体は免疫グロブリン転写を活性化することに失敗する
野生型Brightおよびドミナント-ネガティブDP変異体は、Brightも免疫グロブリンのいずれも発現しないCHO細胞において、Brightにより調節されたV1重鎖リポータープラスミドにより一過性に発現した(Webb et al., 1991)。V1免疫グロブリン転写産物のリアルタイムPCR分析は、野生型Brightは、V1重鎖免疫グロブリン遺伝子座の転写を5〜7倍増加したことを示した(図13)。このレベルの転写誘導は、先に説明されたBright活性と一致している(Herrscher et al., 1995；Lorch et al., 1987)。しかしDP変異体が、野生型Brightと同時発現される場合、転写の増加は認められなかった。従ってドミナント-ネガティブBrightタンパク質は、恐らくDNAに結合しない繁殖不能の(sterile)Brightヘテロ二量体を産生することにより、Brightの転写活性化機能と干渉した(図12A-B)。
【０２５４】
変異体はB細胞において内在性Bright DNA結合活性を阻害する
これらの変異体は、Bリンパ球内の内在性Bright機能を阻害することにより、ドミナント-ネガティブとしても機能したかどうかを決定するために、myc-hisタグ付きタンパク質を、低レベルの内在性Brightを構成的に発現するM12g3Ri細胞において発現した。細胞は、未変性のBrightタンパク質の新規産生を誘導するために、トランスフェクション後に、LPSにより刺激し、かつGFP発現を基にフローサイトメトリーにより単離した。核タンパク質は、選別された細胞から単離し、ウェスタンブロットにより評価し、Bright DNA-結合活性についてEMSAにより分析した(図14A-C)。
【０２５５】
ウェスタンブロットにより明らかにされたように、同等レベルのBrightが、全て3種の試料において発現され、およびトランスフェクションされたBright由来のタンパク質レベルも類似している(図14A)。トランスフェクションされない対照細胞は、タグ付けされた-WT Brightベクターによりトランスフェクションされた細胞からの抽出物のように、内在性Bright活性を示した(図14B)。抗-Brightは、両方の場合においてBrightバンドをスーパーシフトした。WTタンパク質に対する抗-myc 抗体の添加も、Brightバンドをスーパーシフトし、かつ内在性Bright結合活性のレベルを低下した。このことは、タグ付きBrightは、B細胞内の内在性Brightと相互作用することを示唆している。
【０２５６】
これらの知見と一致し、DP Brightを発現している細胞由来の抽出物は、抗-myc抗体と反応しなかった非常に低レベルのBright DNA-結合活性を示し、おそらくLPS刺激前に形成された内在性Bright二量体を反映している。各場合において、上方へ移動度-シフトした複合体は、CAAT交換タンパク質(CDP)に対する抗体と反応した。このタンパク質複合体は、Bright活性について競合しかつBrightと重複するDNA配列に結合するタンパク質複合体として、本発明者らの実験室および他の実験室において先に説明された(Herrscher et al., 1995；Wang et al., 1999；Webb et al., 1991)。しかしながらこれらの実験は、DP Brightは、新たに発現された内在性Bright DNA-結合活性との干渉により、B細胞においてドミナント-ネガティブとして機能することを示唆している。
【０２５７】
LPS-刺激したB細胞におけるBright活性の阻害は血漿細胞マーカーに影響を及ぼす
DP Brightも、形質転換されないBリンパ球においてドミナント-ネガティブタンパク質として作用するかどうかを決定するために、脾B細胞を、T細胞枯渇により単離し、LPSで20時間刺激し、その後DP Brightを産生するレトロウイルスベクターまたは空のウイルスベクター対照で、形質導入した。細胞は、48時間後GFP産生を基に選別し、形質導入された細胞を単離した。μ重鎖転写産物に関するリアルタイムPCRを、形質導入された細胞から単離されたmRNAについて行い、およびデータを図15Aに示した。ひとつの実験は、DP Bright-発現するウイルスが形質導入された細胞において、対照ウイルスと比較しμ重鎖転写産物の約3-倍の減少を示し、3種の追加実験は、μ重鎖転写における有意差を示さなかった。
【０２５８】
LPS刺激は、B細胞のレトロウイルス形質導入および内在性Bright発現の誘導を可能にするために必要であるが(Webb et al., 1998)、アイソタイプスイッチングの誘導およびμ重鎖遺伝子座の欠失を含む、培養物中におけるB細胞の分化も引き起こす。従って本発明者らは、DP Brightの発現に対する反応の変化に関して、血漿細胞分化の他のマーカー(Lin et al., 2002)を試験した。血漿細胞分化時に表面タンパク質CD19およびCD138は変化し、その結果CD19発現は漸減しおよびCD138発現は増加した。図15Bは、対照ベクターに対し、DP Brightを発現している形質導入された細胞の表面発現プロファイルを示している。血漿細胞マーカーは、対照およびDP Brightを発現している集団において同等に発現されたが、対照ベクターで形質導入された細胞よりも、DP Brightにより形質導入された細胞は約2倍多く、CD19発現を維持した。IgMおよびIgDレベルは、対照およびDP形質導入された細胞の間で同等であった(図示せず)。
【０２５９】
選別された形質導入されたB細胞から(form)精製されたmRNAのRT-PCRによる追加の血漿細胞分化マーカーの試験は、J鎖発現は、DP Brightを発現する細胞および対照形質導入細胞において同等に十分に誘導されたことを明らかにした(図15C)。同様にBLIMPおよびPax-5レベルも類似していた。
【０２６０】
実施例6−考察
B細胞-制限された転写因子Brightの機能の理解を増加するために、8種の変異体を作出し分析した。ARIDドメインにおける変異は、低下したDNA結合活性を生じたが、Bright二量体の形成には影響しなかった。保存されたアミノ酸配列KIKKおよびREKLESの変異は、DNA-結合活性または二量体化のいずれかを破壊するには不充分であった。各変異体は、野生型Brightと相互作用し、ヘテロ二量体を形成することができ、およびいくつかのARID変異は、野生型BrightのDNA結合機能と干渉した。これらのタンパク質のひとつは、免疫グロブリン発現プラスミドを発現するトランスフェクションされた細胞における野生型Brightの転写活性化能とも干渉した。これらのデータは、ARID変異体は、Bright機能と干渉するために、ドミナント-ネガティブタンパク質として機能することができることを示唆している。最後に、LPS-刺激された脾B細胞におけるドミナント-ネガティブBrightの発現は、多くの血漿細胞分化マーカーの発現は変更しなかったが、CD19の発現に影響を及ぼした。
【０２６１】
Herrscherら(1995)による初期の相同分析および欠失研究は、ARIDおよびタンパク質相互作用ドメインの両方が、DNA-結合活性に必要であることを示唆した。IwaharaおよびClubb(1999)は、BrightのショウジョウバエホモログであるDriのARIDドメインの結晶構造を解明した。NMR分光法は、少なくともDriを伴うこのタンパク質は、ヘリックス5および6のヘリックス-ループ-ヘリックス領域内でDNAと接触することを明らかにした(Iwahara et al., 2002)。P268での変異は、DNA結合活性を大きく減少した。この変異は、タンパク質-DNA相互作用における安定化因子として役立つと推測されるβ-シート内である(Iwahara et al., 2002)。ヘリックス5内のW299、ヘリックス6内のF317およびヘリックス7内のY330が認められた。これらの変異体はいずれもDNAと結合せず、ヘリックス5および6は、DNA結合活性に重要であることを確認した。加えてこれらのデータは、ヘリックス7の特異的残基も、Bright DNA結合活性に重要であることにも関連している。従ってこれらの研究はここで、ARID領域の予想された重要性を確認することを報告し、かつ先の知見を拡大し、重要なヘリックスの点変異であっても、DNA-結合および完全長タンパク質の機能と干渉することを明らかにした。
【０２６２】
完全長Brightを欠失変異体と共に用いる混合試験は、Brightは、そのDNA-結合部位と複数の複合体を形成することを示唆し、他のものがそれが四量体としてDNAに結合することを提唱することに繋がった(Herrscher et al., 1995)。全体の推定タンパク質相互作用ドメインの欠失は、これらの試験においてDNA-結合を無効にした。サイズ排除分析は、Brightは、核抽出物中に二量体として存在することを明らかにしている。しかし、特にBrightがDNAへ結合する場合に、より高い次数の複合体が形成され得ることを除外することはできない。実際他のものは、Brightは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の複数の部位に結合し、かつその遺伝子座内にDNAループを形成することを提唱している(Kaplan et al., 2001；Webb et al., 1999)。これらのデータは、この仮説に影響を与えないが、タグ付きBrightの野生型Brightとの同時沈降は、二量体Bright複合体の形成を確認し、かつタンパク質相互作用ドメインのREKLES領域の破壊は、DNA-結合活性と干渉するには十分ではないことを示唆している。マウスBrightの推定活性化ドメイン内に、E2Fとの相互作用に必要であることがわかっている、E2FBP1であるヒトE2F結合タンパク質において認められるヘリックス-ターン-ヘリックスドメインと90％相同である領域がある(Iwahara et al., 2002)。REKLES配列は、第一のヘリックス内に認められ、および先に認められないヘテロマー複合体形成の可能性を示している。
【０２６３】
転写因子としてのBrightは、細胞質から核へ運搬されなければならない。40〜45kDaよりも小さいタンパク質のみが、多孔質複合体を介して核へ受動的に移行する(Jans, (1995)；Miller, (1991)において検証)。Brightは70kDaタンパク質であり、そのため核局在化シグナル(NLS)を含まなければならない。NLSは、SV40ラージT-抗原のプロトタイプのNLSにおいて認められた塩基性領域PKKKRKV(SEQ ID NO：17)を含むことは周知である(Jans, 1995)。従ってNLSとして作用するBright内のKIKK配列は、一般に他のNLSコンセンサスモチーフ一致する。
【０２６４】
いくつかのARID変異体は、非-B細胞において発現された場合DNAとの結合に失敗するが、わずかに数種のそれらの変異体が、野生型BrightのDNAへの結合を阻害した。これは恐らく、この変異体タンパク質の、野生型Brightとの不活性ヘテロ二量体を形成する能力のために生じたであろう。更にここに示されたデータは、DP Bright変異体も、免疫グロブリンプロモーターリポーターアッセイを使用する転写アッセイにおいて、野生型Bright機能と干渉することを示している。従ってこのタンパク質は、ドミナント-ネガティブタンパク質として機能する。
【０２６５】
この変異体のB細胞におけるドミナント-ネガティブ活性の評価は、より複雑であった。構成的Brightタンパク質を発現するトランスフェクションされたB細胞株において、ドミナント-ネガティブBrightによるトランスフェクション前に、増強されたレベルの新規内在性Bright合成を誘導するために、細胞が最初にLPSにより刺激されない限りは、作用は認められなかった。この場合、内在性およびタグ付き変異体Brightのヘテロ二量体形成は可能であった。しかし、既にその細胞株に存在する内在性Bright二量体は、ドミナント-ネガティブタンパク質の導入により影響を受けるようには見えなかった。
【０２６６】
大半の脾B細胞は、Brightタンパク質を発現しない(Webb et al., 1998)。従ってドミナント-ネガティブBrightは、未変性のBrightの誘導に付随して、それらの細胞へ導入された。レトロウイルスの形質導入は、細胞増殖を必要とする。LPS刺激は、両方のB細胞増殖を誘導し、ドミナント-ネガティブBrightのそれらの細胞への形質導入および内在性Bright活性の誘導を可能にする(Webb et al., 1998)。しかしLPSは、血漿細胞分化およびアイソタイプスイッチングも誘導する。μ転写において差は認められなかったが、形質導入された細胞におけるCD138の発現は、これらの細胞の一部は、ドミナント-ネガティブBrightの存在下であっても、血漿細胞へ分化したことを明確に確立した。従ってこれらは、アイソタイプスイッチングおよびμ遺伝子座欠失も受け、ドミナント-ネガティブBrightが内在性μ転写産物発現と干渉するかどうかを決定することが不可能になる。他方で、B細胞は血漿細胞へ分化するので、CD19発現はダウンレギュレーションされる。ドミナント-ネガティブBrightを発現しているB細胞は、ベクター対照単独で形質導入されたものよりも、約2倍のCD19発現細胞の数を示した。従って、ドミナント-ネガティブBrightの発現は、それらの細胞において血漿細胞分化を阻害または遅延することが可能である。しかしドミナント-ネガティブBrightを発現している細胞のほとんどは、CD19発現を喪失していた。この結果は、不適切なドミナント-ネガティブBrightレベルの発現によるか、または形質導入されたタンパク質の産生前の安定した野生型Bright二量体の初期発現のいずれかによる、これらの細胞におけるBright活性の不完全な阻害により説明される。他方でいくつかの他の血漿細胞マーカーは、ドミナント-ネガティブBright発現により影響されるようには見えなかった。従ってBright活性の阻害は、血漿細胞分化に影響するには十分ではなく、およびBrightは後期B細胞分化には重要ではない。
【０２６７】
Brightは、マウスのプレ-B細胞においても発現され(Webb et al., 1998)、これらの細胞におけるその機能は不明である。これらのデータは、Brightの免疫グロブリンリポーター遺伝子をトランス活性化する能力を確認するが、B細胞分化におけるBright機能の決定的な証明は、ドミナント-ネガティブBrightが、内在性野生型B細胞タンパク質よりも早期に発現され得るトランスジェニックモデルにおけるドミナント-ネガティブBrightの発現を予期している。 
【０２６８】
実施例7−材料および方法
培養および一過性トランスフェクション
接着チャイニーズハムスター卵巣細胞株(CHO)(ATCC, マナサス, VA)を、10％熱失活したウシ胎仔血清(FCS)(Atlanta Biologicals, ノルクロス, GA)および先に説明された増殖補充物を含むDMEM(Invitrogen, カールスバッド, CA)内で培養した(Webb et al., 2000)。トランスフェクションは、Fugene 6トランスフェクション試薬を、製造業者(Roche, インディアナポリス, IN)のプロトコールに従い用いて行った。簡単に述べると、各プラスミドDNA 3μgおよびトランスフェクション試薬30μlを、血清非含有DMEM中で15分間インキュベーションし、その後60％集密度でT-75フラスコに添加した。
【０２６９】
コンストラクト
V1リポーターコンストラクトは、転写開始部位に対し-574塩基対から+146塩基対までのS107 V1重鎖ゲノム配列を含み、ならびにリーダー配列、第一イントロンおよび146塩基の追加のコード配列を含んだ(Webb et al., 1991)。これは、Eμエンハンサーを含む1kb XbaI断片により、pGEM-4Z(Invitrogen)へサブクローニングした。V1 5'-フランキング配列の欠失を含むコンストラクトを、先に説明したように作製した(Webb et al., 1991)。pBKCMV内の完全長マウスBright cDNAクローン(Herrscher et al., 1995)をBrightコード配列内にアミノ酸変化を生じるための鋳型として使用し、W299AおよびY330A変異を伴う二重点変異体(DPBr)を生じたところ、これらは最早DNAに結合しなかった(Nixon et al., 2004)。野生型およびDPBrは、ベクターpcDNA4/TO/myc-His B(Invitrogen)を使用し、カルボキシ末端にmyc-his配列でタグを付けた。簡単に述べると、Brightを、5'EcoR Iおよび3'Xba I部位を追加する一方、内在性停止コドンを欠失したオリゴヌクレオチドによりPCR(商標)増幅し、かつベクター内のこれらの部位に連結した。配列は、トランスフェクションされた細胞の視認を可能にするために、内部リボソーム進入部位からグリーン蛍光タンパク質(GFP)を発現しているMiGR1レトロウイルスベクターへサブクローニングした。Btk-GFP融合コンストラクトは、Dr. William Rodgers(Oklahoma Medical Research Foundation, OMRF)から寄贈された。Btk野生型、K430Rおよびxid遺伝子を、ワクシニアウイルスクローン由来のPfuポリメラーゼ(Stratagene, ラホヤ, CA)により増幅した(Fluckiger et al., 1998)。Btk PHTH欠失は、野生型遺伝子の最初の211コドンを除去するPCR(商標)突然変異誘発により作製した。全てのBtkコンストラクトは、真核細胞および原核細胞での発現のために、各々、pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)およびpET15b(Novagen, マジソン, WI)へサブクローニングした。全てのコンストラクトは、OMRF Sequencing Core Facilityにより配列決定し、それらの同一性を使用前に確認した。
【０２７０】
リアルタイム定量的RT-PCR
トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後36時間のGFP発現により同定し、ならびに200,000個のGFP陽性細胞(純度＞95％)を、OMRFまたはUniversity of Oklahoma Health Sciences Center Flow Cytometry CoresによりMoFlo Cell Sorter(Cytomation, Inc., フォートコリンズ, CO)を用い、RNA単離のために収集した。RNAは、Tri-Reagent(Molecular Research Center, シンシナティ, OH)を用いて単離し、および即座にDNaseIにより製造業者(Ambion, オースチン, TX)のプロトコールに従い処理し、フェノール-クロロホルムで抽出し(Clontec, パロアルト, CA)、分光光度法により定量した。cDNAを生成する反応液は、300ng RNA、1mM dNTP混合液、25pM V1特異的プライマーまたはランダムプライマー(Integrated DNA Technologies, コラルビル, IA)、40単位リボヌクレアーゼインヒビターRNasin(Promega, マジソン, WI)、および200単位SuperScript II(商標)RNase-Hリバース転写酵素(RT)(Invitrogen)を含有した。RTを含まない陰性対照反応を、平行して行い、ベースラインCT値36〜40を、慣習的に得た。
【０２７１】
リアルタイム定量的RT-PCRを、PrimerExpressソフトウェア(PE Applied Biosystems, フォスターシティ, CA)を用いてデザインされたV1遺伝子に特異的なTaqManプライマーおよびプローブを用いて行い、Applied Biosystems and Integrated DNA Technologiesにより合成した：
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反応は、250nMの各プライマーおよび500nMプローブにより、96ウェルプレート中で3つ組で、1xTaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)において、以下の条件を用い行った：50℃で2分間、95℃で10分間、引き続き、95℃を15秒、および55℃を1分間を40サイクル。V1遺伝子を含むプラスミドの10倍連続希釈(20〜10-4ngまで)を行った3つ組反応液についてCT値を平均化することにより、標準曲線を作製した。3μlのcDNAを鋳型として用い、V1転写を定量し、および標準を、各実験と共に試行し、データをngに変換した。データは、ABI Prism 7700 SDS分析ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて分析した。
【０２７２】
ウェスタンブロットおよび免疫沈降
全細胞抽出物を、先に説明された(Buchanan et al.,1995)低張溶解液を用い、トランスフェクション後36時間で、トランスフェクションされたCHO細胞から調製した。簡単に述べると、細胞を、PBSで2回洗浄し、500μM DTTおよびプロテアーゼインヒビター(500μMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、20μMロイペプチン、750nMアプロチニンおよび30mM NaVO3)を含有する抽出緩衝液(20mM HEPES(pH7.9)、420mM NaCl、1mM MgCl2、0.2mM EDTA、20％グリセロール)中に懸濁し、ペストルでホモジネートし、氷上で30分間インキュベーションした。溶解液を、12,000g、4℃で15分間遠心した後収集し、プロテアーゼインヒビターを含有する貯蔵緩衝液(20mM HEPES(pH7.9)、100mM KCl、0.2mM EDTA、20％グリセロール)に対し室温で2時間透析した。タンパク質濃度を、改変Bradfordアッセイ(BioRad, ハーキュラス, CA)により測定し、ウェスタンブロットを先に説明したように行った(Webb et al., 1993)。ブロットは、ヤギ抗-Btk(C-20, Santa Cruz Biotechnology, サンタクルズ, CA)、ウサギ抗-Bright(Dr. P. W. Tucker, U. Texas, オースチン, TXの寄贈)、ヤギ抗-BAP135/TFII-Iペプチド抗体(本研究室において先に説明したように調製(Yang and Desiderio, 1997))またはマウス抗-ホスホチロシン4G10(Upstate USA, シャルロッテビレ, VA)およびAP-標識されたウサギ抗-ヤギIg、HRP-標識された抗-マウスIgGまたはAP-標識された抗-ウサギIg(Southern Biotech, バーミンガム, AL)を適宜使用し、顕在化した。
【０２７３】
細胞溶解液150μgをプロテアーゼインヒビターを含有するPBS中の抗体と共に、4℃で2時間揺動することにより、溶解液は、抗-Btk(C-20)、抗-myc(Invitrogen)または対照抗体(抗-Sp1もしくはヤギIg)により免疫沈降した。タンパク質A/G Plus-アガロースビーズ(Santa Cruz)(25μl；1:1スラリー)を添加し、4℃で12時間インキュベーションした。免疫沈降物は、プロテアーゼインヒビターを含有する洗浄緩衝液(100mM Tris-Cl、500mM NaCl、0.1％ Tween20, pH8)で5回洗浄し、かつタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試料緩衝液の添加、および5分間の煮沸により溶離した。試料を、8％SDS-ポリアクリルアミドゲル上を流し、標準プロトコールを用い、先に説明したようにウェスタンブロットのために移した。
【０２７４】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
Bright移動度シフトアッセイを、先に説明したように、4％非変性ポリアクリルアミドゲル上で行った(Buchanan et al., 1995)。α-32Pで標識されたV1 S107 5'フランキング配列(Webb et al., 1991)由来のプロトタイプのBright-結合部位(bf150と称される150bp BamHI断片)を、プローブとして使用した。Brightタンパク質を、TNTカップリングしたウサギ網状赤血球溶解液(Promega)により、インビトロにおいて生成した。Btkタンパク質を、大腸菌における組換え体として作出し、その後封入体から精製した(Lin et al., 1994)。Btkプラスミドを欠いた大腸菌から平行して処理されたタンパク質試料を、陰性対照として使用した。
【０２７５】
抗体が促進したDNA-沈降
BCg3R-1d細胞を、20μg/ml LPSで20時間刺激し、Bright活性を誘導するか(Webb et al., 1989)、または陰性対照Tハイブリドーマ細胞KD3B5.8(Dr. D. Farris, Oklahoma Medical Research Foundation寄贈)に、Fernandezら(2001)に従い、架橋および免疫沈降を施した。簡単に述べると、細胞に、1％ホルムアルデヒド中で37℃で10分間架橋を施し、0.125Mグリシンで5分間かけて停止し、その後プロテアーゼインヒビター(500μM PMSF、750nMアプロチニンおよび20μMロイペプチン)を含有する冷PBSで2回洗浄し、その後プロテアーゼインヒビターを含有するSDS溶解緩衝液(1％SDS、10mM EDTA、50mM Tris pH8)中に再懸濁した。氷上で10分間インキュベーションした後、懸濁液を音波処理し、DNA長を200〜1000bpへ短かくし、4℃で10分間遠心し、上清を免疫沈降に使用した。音波処理した抽出物を、プロテインA/Gビーズ(Santa Cruz)＋50μgサケ精子DNAにより、4℃で30分間予備透明化し(preclear)、その後抗-Bright、抗-Btkまたは対照ヤギIgのいずれかと共に4℃で一晩インキュベーションした。免疫複合体は、ブロックされたプロテインA/Gビーズと共に1時間、沈降した。これらのビーズは、低塩緩衝液(0.1％ SDS、1％ Triton X-100、2mM EDTA、20mM Tris、pH8、150mM NaCl)で1回、高塩緩衝液で1回(500mM NaCl含有)、LiCl緩衝液で1回(0.25M LiCl、1％NP-40、1％NaDOC、1mMEDTA、10mM Tris、pH8)、ならびにTris-EDTA緩衝液で2回洗浄した。免疫複合体は、0.1M NaHCO3、0.2％SDSで溶離し、ならびに架橋は、65℃で4時間インキュベーションすることにより逆行させた。10μgプロテアーゼK(Invitrogen)および2μl DNase-非含有RNase A(10mg/ml)(Roche)を、50℃で2時間添加した。残余の免疫沈降したDNAを、フェノール-クロロホルムで精製し、プライマー
2007523895.tif 000019
を用いるPCRを施し、V1遺伝子の150bp Bright結合領域を増幅した(Webb et al., 1991)。使用したPCR(商標)条件は、95℃で40秒、60℃で1分、72℃で2分を40サイクルと、72℃で10分間の伸長。
【０２７６】
実施例8−結果
Btkは免疫グロブリンリポーター遺伝子のBright活性化に決定的に必要である
先の研究は、ヒトおよびマウスの両BrightはBtkへ会合し、DNA-結合複合体を作製することを明らかにした(Nixon et al.,  2004；Webb et al., 2000)。しかしこれらふたつのタンパク質の機能的関係は示されていない。BtkはBrightの機能に転写アクチベーターとして寄与するかどうかを決定するために、IgプロモーターリポーターコンストラクトのBright-誘導した転写を、Btkを伴うまたは伴わずに測定した。このリポーターコンストラクトは、B細胞株におけるV1重鎖遺伝子のアップレギュレーションに必要であることが先に示された(Webb et al., 1991)、ふたつのBright結合部位を含んだ。加えて未変性のマウスV1 Ig重鎖プロモーターは、リーダー、第一のイントロンを通り、V1コード配列の引き続きのエキソンへと伸長し(Buchanan et al., 1995)、イントロンを超えるPCR(商標)増幅を可能にしている。V1 Ig mRNA発現は、リアルタイムPCRにより定量した。標準曲線を、V1 cDNAを使用し作製した(図16A)。増幅は、臭化エチジウム染色したゲルにおいて単独バンドを作製し、配列決定はその同一性を確認した。V1遺伝子を含むプラスミドDNAの連続希釈物は、Taqmanプローブの存在下で増幅し、鋳型DNAの10-3ng〜10-1ngのCT値は、この曲線の直線領域に収まった。
【０２７７】
BtkはBright活性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、BrightもBtkも発現していないCHO細胞を、マウスのBright/Btk発現ベクターおよびV1リポーターコンストラクトで同時トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞におけるBrightおよびBtkのタンパク質発現を示すウェスタンブロットを、図16Bに示した。リバース方向にクローニングされたBrightコード配列、または空のBtkベクターを含む対照ベクターを、各トランスフェクションにおいて等量のDNAを維持するために使用した。Brightおよび対照の両ベクターは、内部リボソーム進入部位からGFPを同時発現した。トランスフェクションされた細胞の同等数を含む細胞集団を得るために、GFP+細胞を、48時間後各トランスフェクションされた集団から、細胞選別により単離し、ならびにmRNAを、定量的PCR(Q-PCR)分析のために単離した。トランスフェクション効率は、典型的には5％未満まで変動し、選別された細胞の純度は＞95％であった。各場合において、選別された細胞の平均蛍光強度は、同等であった。逆転写酵素を欠いている反応は、トランスフェクションされたベクターからではなくむしろV1 cDNAの増幅から生じた作製されたデータを確実にするために、平行して試行し、ベースラインCT値を得た。図16Cは、BtkおよびBrightの同時トランスフェクションは、BrightまたはBtkのいずれか単独でトランスフェクションされた細胞との比較において、V1転写の有意な増加を生じることを示している。実際BrightおよびBtkが単独でトランスフェクションされた細胞は、対照レベルを上回るV1転写を示すことに失敗したのに対し、BrightおよびBtkは、リポーターコンストラクトの転写を3〜12倍増加した。これらの知見は、この細胞モデルのBright-依存型転写活性化は、TecキナーゼBtkの同時発現に完全に左右されることを示している。
【０２７８】
BrightのBtk非存在下でのV1遺伝子発現のトランス活性化の失敗は、Brightはこれらの条件下でDNAに結合することができないことの結果である。先に説明されたトランスフェクション体由来の抽出物のEMSA分析を使用し、Bright DNA結合活性に関するBtkの必要要件を試験した(図16D)。Bright複合体は、Brightを含まない抽出物において形成されなかった。しかしBrightは、同時トランスフェクションされたBtkの非存在下でDNAに結合した(レーン3)。従って、トランスフェクションされたCHO細胞におけるBright DNA-結合活性には、Btkは不要である。しかしBright転写活性は、Btkが決定的に必要である。
【０２７９】
Bright DNA-結合活性は、転写活性化に必須である
BrightのDNA結合活性はV1転写に必要であることを確認するために、DNA結合に失敗したタンパク質を生じる変異W299AおよびY330Aを含むBright変異体(DPBr)(Nixon et al., 2004)を、CHOリポーターシステムにおいて野生型Btkと共に発現した。このモデルで一貫して、V1 Ig転写産物は、DPBr存在下では生成されなかった(図17A-C)。移動度シフトアッセイは、DPBrは、豊富なタンパク質発現にも関わらず、DNAに結合しなかったことを確認した(図17Bおよび17C)。加えてBrightはDNAへ二量体として結合するので、本発明者らは、Bright発現レベルの増加はV1転写を促進するかどうかも調べた。しかしBrightの過剰発現(最大2倍)は、同時発現されたBtkの非存在下でV1転写を促進しなかった(図17A)。従ってBright活性は、これらの細胞において、Bright産生のレベルと相関しなかった。むしろこれらのデータは、Bright DNA-結合活性はBright機能に必要であるが、DNA-結合活性単独は転写活性には十分ではないことを示唆している。まとめると、これらの知見は、Bright転写活性は、Btkにより直接または間接に調節されることを示唆した。
【０２８０】
V1プロモーターのBright活性化は5'Bright結合モチーフにより左右される
これらの試験において使用した完全長V1プロモーターコンストラクト(図17C)は、ふたつのBright結合部位を含み、一方は約-550および他方は-225であった(Webb et al., 1991)。初期の分析は、Bリンパ球におけるV1転写の基本的レベルは、-125〜転写開始部位までの配列を必要とすることを示した(Webb et al., 1991)。これらのデータは、V1プロモーター配列のわずかに125塩基のみを発現したV1トランスジェニックマウスにおいて確認された(Avitahl and Calame, 1996)。しかし-225の単独のBright結合部位を含むベクターは、B細胞株におけるV1転写の3〜6倍の増強を生じ、同様の結果が、ふたつのBright結合モチーフを含む-574コンストラクトについて得られた(Webb et al., 1991)。これらの先の試験は、成熟型B細胞を利用した。V1プロモーターの転写は、非リンパ系細胞株においてはこれまで可能ではなく((Herrscher et al., 1995)および本発明者らの未発表のデータ)、恐らくBtkの欠如のためであろう。CHOトランスフェクション体において観察された転写活性化には、一方または両方のBright結合部位が必要であるかどうかを決定するために、本発明者らは、下記のいずれかを使用し、Btk＋BrightでトランスフェクションされたCHO細胞におけるV1の転写レベルを比較した：ふたつのBright結合部位を伴う完全長V1コンストラクト(-574)；または、Bright結合部位をひとつ含む(-251)または含まない(-125)切断型V1コンストラクト。先のデータは、図1に示し、および図2は、転写産物が0.035ngと定量された-574コンストラクトについて得られた。従ってこの平均値は、100％活性と設定した(図18)。1個のBright結合部位を含まないかまたは含む切断型ベクターは、各々、完全長コンストラクトと比べ、0.0075％(-125)および3.5％(-251)活性を生じた(図18)。陰性対照値(0.001％)は、先に説明されたように、BrightまたはBtkタンパク質のいずれかの非存在下で完全長ベクターにより得られた。これらの結果は、-550 Bright結合部位の存在は、このシステムにおける転写活性に必須であることを示唆している。
【０２８１】
転写アクチベーターとしてのBright機能はBtkキナーゼ活性およびBtkのPH/THドメイン内の領域が必要である
Btkの変異型は、マウスおよびヒトの両方において免疫不全症を生じる(Genevier and Callard, 1997；Rawlings et al., 1993；Thomas et al., 1993)。どのようにBtk失活型がBright活性に影響するかを評価するために、本発明者らは、BtkのK430R(キナーゼ失活)(Li et al., 1997)、xid(R28C)ならびにプレクストリンおよびtec相同ドメイン欠失(ΔPHTH)変異体が、V1転写レベルに影響するかを調べた(図19A)。CHO細胞は、Bright、完全長V1リポーターコンストラクトおよびBtkの野生型または変異型体で同時トランスフェクションした。トランスフェクション体中での変異体および野生型Btkタンパク質の発現を、ウェスタンブロットにより示した(図19B)。キナーゼ失活Btkおよび野生型Brightを発現しているトランスフェクション体は、野生型Btkにより生じたV1転写の＜10％を示した(図19C)。同様にΔPHTH Btkは、このシステムにおけるV1転写の増強に失敗した。他方で、xid点変異を発現するトランスフェクション体は、野生型Btkにより観察されたV1転写の〜50％を示した。これらのデータは、 PHTHドメイン内のアミノ酸配列は、完全な活性に重要であることを示した。更にこのデータは、Btkキナーゼ活性はBright転写活性化に決定的に必要であることを示した。
【０２８２】
Btkは、B細胞の細胞質において優先的に認められるが、本発明者らおよび他の研究者らは、細胞核内にBtkを認めた(Mohamed et al., 2000；Webb et al., 2000)。Btk変異体のBright機能支援の失敗に関する可能性のある説明(図19A-C)は、変異体Btkタンパク質、またはBrightのいずれかが、それらの細胞において核への進入に失敗したことである。この可能性を試験するために、BrightおよびBtkの細胞内局在化および分布を、共焦点顕微鏡により調べた。抗-Brightおよび抗-BtkによりトランスフェクションされたCHO細胞の免疫染色は、両方の野生型タンパク質の細胞質および核の両方の局在化を明らかにした(図示せず)。BtkのK430R、xidおよびΔPHTH変異は、Brightの細胞内局在化を肉眼では変更していなかった。従って、Btkの変異型のBright-誘導した転写の促進の不能を説明するこのモデルシステムにおいて、Brightの局在化に対し大きい作用は存在しない。
【０２８３】
BtkのPHTHドメインは、Bright DNA-結合活性のBtk-依存型の増強に必要である
本発明者らの初期の研究は、最適以下レベルのBrightタンパク質への組換え野生型Btkの添加は、移動度シフトアッセイにおいてBright DNA-結合活性を増強することを示した(Webb et al., 2000)。Bright結合活性の安定化によりBtkは作用するかどうかを決定するために、本発明者らは、Bright結合親和性が、Btkの存在または非存在下で異なるかどうかを調べた。EMSAを、インビトロ翻訳されたBrightおよび非放射性(cold)競合DNAで行った(図20A)。レーン3-6および8-11において、100モル過剰な非標識の競合DNAを、電気泳動前に、0、2、8および10分間添加した。レーン8-12において、組換えBtkもこれらのタンパク質に添加した。Btk非存在では、Bright結合活性は、競合DNAと10分間一緒にした後、80％低下した(図20B)。Btkの存在下で、Bright結合活性は、競合DNAと10分間一緒にした後、50％未満低下した。これらのデータは、Btkのひとつの機能は、Bright DNA-結合親和性を増強することであることを示唆している。
【０２８４】
BtkのK430R、ΔPHTHおよびxid型は、BrightによるV1転写活性化を補助することに失敗した。これらのBtk変異体がBright機能の補助を失敗する理由を調べるために、本発明者らは、それらがBright DNA-結合活性を野生型Btkと同様に増強したかどうかを調べた。1:16希釈では、Bright DNA-結合活性は、インビトロ翻訳された抽出物において明らかではなかった(図20C、レーン3)。しかし更に低レベルの組換え野生型Btkは、BrightのDNA結合活性を回復した(レーン4-6)。K430Rおよびxid変異体も、Bright DNA-結合活性の回復において有効であった。野生型、K430Rおよびxid Btk単独は、Brightなしには、DNAへ結合しなかった (レーン16-18)。使用されたBtk組換えタンパク質の相対タンパク質レベルは、右側パネルに示した(図20C)。他方で、PHTHドメインを欠くBtkは、このアッセイにおいて、変異体Btkタンパク質のいずれかの濃度でも、Bright結合活性を増強しなかった(図20C、レーン10-12)。これらのデータは、BtkのPHTHドメイン内の領域は、BtkによるBright DNA-結合活性の促進が必要であることを示唆している。
【０２８５】
Brightは試験したBtk変異体の各々と会合する
本発明者らの初期の研究は、BtkおよびBrightは、直接または間接のいずれかで相互作用することを示した。Btk変異体がBrightへ結合することに失敗したために、それらはV1遺伝子のBright-誘導した転写を促進することに失敗したかどうかを決定するために、同時免疫沈降実験を行った。WTBrおよびWtまたは変異体BtkでトランスフェクションされたCHO細胞からの抽出物を、Brightのカルボキシ末端のmycタグに対する抗体で免疫沈降した。沈殿したタンパク質は、抗-Brightおよび抗-Btkで検出した(図21)。アイソタイプ対照(α-Sp1)はBrightまたはBtkを沈降しなかったが(レーン1)、野生型BrightはBtkと同時沈降した(レレーン5)。抗-mycは、Brightの非存在下でBtkを沈降することに失敗した(レーン6)。他方で、Btkは、ドミナント-ネガティブBrightと同時沈降し(レーン2)、これはDPBrは依然Btkと相互作用することができることを示している。この知見は、図17A-BにおいてDPBrにより認められた転写活性化の非存在は、Btkとの適切な会合の失敗よりもむしろ、変異体BrightのDNAへの結合不能によるものであることを示唆している。K430R変異体(レーン4)も、Brightと沈降され、これは図20A-Cにおいて示されたように、DNAへのBright親和性を増加するその能力と一致している。Brightは、ΔPHTH変異体と弱く会合した(レーン3)が、このBtk変異体は、DNAへのBright親和性を増加しなかった。同様に、全ての場合において、Btk変異体のSH1ドメインを認識した抗体との免疫沈降も、Brightを同時沈降した(図21、レーン9-21)。これらのデータは、Bright/Btk会合は、Bright DNA-結合ドメイン内またはBtkキナーゼおよびPHドメイン内の点変異により破壊されないことを示している。更にPHTHドメインは、Bright/Btk複合体形成は不要である。これらのデータは、Brightの増加したDNAへの親和性は、BtkのPHTHドメインにより促進されるが、Btkの追加の領域、または第三のタンパク質との会合は、Brightと会合するその能力を説明することを示唆している。
【０２８６】
Btk基質はBrightと会合する
キナーゼはBrightと同時沈降したBtkを失活するが(図21)、これは図19A-Bの免疫グロブリン転写の増強において有効ではなかった。本発明者らの先のデータは、Brightは、認知できるようにチロシンリン酸化されなかったことを示唆した(Webb et al., 2000)。従って本発明者らは、第三のタンパク質およびBtk基質が、BrightおよびBtkと会合すると仮定した。CHO細胞は、myc-タグ付きBrightおよび/またはBtkタンパク質でトランスフェクションし、抗-mycと免疫沈降し、ならびにBrightおよびホスホチロシンの両方とイムノブロットした(図22A)。抗-ホスホチロシンと反応性の107kDaのバンドは、レーン3においてBrightと同時沈殿した。強度が弱い同様のバンドは、Btkを伴わないBrightを含む抽出物(レーン5)およびキナーゼ失活したBtkを伴うBrightを含む抽出物(レーン2)中でも明らかであった。リン酸化されたバンドは、Brightを含む抽出物中のリン酸化されたBrightの予想されたサイズである、70kDaでは認められなかった。これらのデータは、107kDaの第三のチロシン-リン酸化されたタンパク質がBrightとの同時沈殿することを示唆している。リン酸化されたバンド強度は常に野生型BtkおよびBrightを含有する抽出物においてより大きく、このタンパク質のチロシンリン酸化は、単にBtkにより左右されるものではない。
【０２８７】
活性化されたB細胞におけるBtkの先に同定された基質は、転写因子BAP135/TFII-Iである(Cheriyath et al., 1998；Yang and Desiderio, 1997)。図22Aにおいてリン酸化されたタンパク質の同一性の範囲を絞るために、同様の免疫沈降実験を実行し、ブロットを抗-BAP135/TFII-Iにより顕在化した(図22B)。各場合において、Brightは、CHO細胞から、抗-BAP/135抗体と反応した107kDaタンパク質と同時沈降した。これらの結果は、血清学的にBAP135/TFII-Iと関連している第三のタンパク質は、Btkによりチロシンリン酸化され、ならびにこれはBrightおよびBtkへ会合するという仮定と一致している。更にこれらのデータは、Brightは、Btkの非存在下でこのタンパク質と会合することができることを示唆している。
【０２８８】
Bright/Btk複合体はB細胞株において重鎖プロモーターと相互作用する
先の実験から得たデータは、Btkは、V1重鎖の転写を増強するために必要であることを強力に示唆し、これらのデータは全て、人工的にトランスフェクションされた非-B細胞に由来している。BrightおよびBtkがB細胞においてV1プロモーターと相互作用するかどうかを決定するために、本発明者らは、V1μ重鎖遺伝子を発現するB細胞株BCg3R-1dを利用した(Webb et al., 1989)。改変されたクロマチン免疫沈降アッセイは、抗-Bright、抗-Btk(C20)または対照抗体を、Brightを発現するLPS刺激されたBCg3R-1d細胞(Webb et al., 1991；Webb et al., 1998)ならびにBrightまたはBtkのいずれも発現しないT細胞ハイブリドーマ(KD3B5.8)と共に使用し行った。PCR(商標)プライマーは、V1プロモーターの-574〜-425のBright結合部位を含む領域を増幅するようにデザインした(Webb et al., 1991)。図23は、BCg3R-1dまたはKD3B5.8のいずれかから得られた投入DNAの10％を使用する、V1 Bright部位の増幅を示している。B細胞株由来の抗-Brightおよび抗-Btkの両方で免疫沈降したDNAは、V1 Bright部位を含んだが、しかしいずれの抗体も、T細胞株由来のDNAのその領域は沈降しなかった。加えて対照抗体は、BまたはT細胞株のいずれかに由来するV1 Bright結合部位を沈殿することはできなかった。これらのデータは、BrightおよびBtkの両方は、BCg3R1-d B細胞株のV1プロモーター上に複合体として存在することを示唆している。更にこれらのデータは、BrightおよびBtkの会合はV1転写を促進することを示唆する、トランスフェクションされたCHO細胞における実験と一致する。
【０２８９】
実施例9−考察
本発明者らの先の研究は、BtkおよびBrightは会合し、DNA-結合複合体を形成することを示唆している(Webb et al., 2000)。しかしこの会合は、何らかの機能的意義を有するかどうかは明らかではなかった。本試験において、非-リンパ系細胞株を用い、Bright活性の新規モデルを開発した。このモデルを使用し、IgプロモーターコンストラクトのBright-依存型転写は、同時発現された機能性Btkに完全に左右されることを明らかに示した。Bright DNA-結合はその転写活性に必要であるが、これはIg転写を増強するには十分ではない。更にキナーゼ失活したBtkは、このシステムにおいてBright活性化された転写を促進せず、このことはBtkキナーゼ活性は、Bright機能にとって重要であることを示している。これらの知見と一致して、第三のチロシンリン酸化されたタンパク質が、CHO細胞においてBrightと同時沈降することがわかった。このタンパク質は、先に同定されたBtk基質BAP135/TFII-Iと血清学的に類似している。更に改変されたChIP実験は、Bright/Btk複合体は、B細胞株中のV1プロモーター内のBright結合部位に結合し、これはB細胞内のBright/Btk複合体の役割と一致することを明らかにしている。これらのデータは、非-B細胞株におけるBright活性を明らかにする最初のものであり、BtkはIg重鎖発現に必要な更なるB細胞-特異的情報を提供することを示唆している。
【０２９０】
このようなモデルシステムは、異所性に発現された変異体タンパク質を使用しタンパク質/タンパク質相互作用の重要性を評価することができるが、得られたデータは、生理的関係および発現レベルを常に正確に反映するものではない。抗体スーパーシフト実験は、BrightおよびBtkは、マウスおよびヒトの両B細胞由来のタンパク質抽出物中にDNA-結合複合体を形成することを示唆した(Nixon et al., 2004；Webb et al., 2000)。COS7細胞におけるBrightおよびBtkの同時トランスフェクションも、CHO細胞において認められた結果に類似した結果を生じた(図示せず)。更に本発明者らはここで、改変されたChIP分析において、BtkおよびBrightはB細胞株BCg3R-1dにおいてV1プロモーター上に複合体を形成することの証拠を示している(図23)。従って、本発明者らのインビトロモデルシステムにおいて認められたタンパク質会合の一部は、豊富なレベルの異所性発現されたタンパク質、または不適切に細胞内局在化した一部のタンパク質を部分的に反映していることを除外することはできず、複数の証拠の系統が、機能性BtkのBright転写複合体の重要な成分としての役割を現在裏付けている。
【０２９１】
本発明者らの先の研究(Webb et al., 2000)、および図22A-Bは、Brightは、チロシン残基上で認知可能にリン酸化されず、その結果Btkの直接基質として作用しないことを示している。しかし現在のデータは、Bright機能におけるBtkキナーゼ活性の必要要件を明らかに示している。まとめると、これらのデータは、Btkキナーゼ基質を含む追加のタンパク質成分は、Bright依存した転写活性に恐らく必要であることを示唆している。TFII-Iは、TATAボックスを欠いているプロモーターの転写を増強し、かつイニシエーターエレメントとの相互作用を通じてT細胞受容体β遺伝子座のプロモーター活性を調節する(Cheriyath et al., 1998；Novina et al., 1998；Wu and Patterson, 1999)。一部のIgH遺伝子プロモーターは良好なコンセンサスTATAボックスを含むが、このシステムにおいて使用されるV1重鎖プロモーターは、TATA-非含有(less)である(Buchanan et al., 1997)。図22A-Bのデータは、107kDaチロシンリン酸化されたタンパク質は、CHO細胞抽出物中のBrightと同時免疫沈降することを示している(図22A-B)。このタンパク質は、血清学的にTFII-Iに対する抗体と反応するが、その正確な同一性は現在不明である。TFII-I関連タンパク質をコードしている少なくとも3種の遺伝子ファミリーが存在し、これらのファミリーの個々のメンバーは、ほとんどの細胞型において認められ、かつ複数のアイソフォームとして発現され得る(Hinsley et al., 2004)。ハムスターTFII-Iファミリータンパク質に関して何もわかっていない。更にキナーゼ失活したBtkのBrightとの同時トランスフェクションは、107kDaタンパク質の抗-ホスホチロシン抗体と反応する能力を完全に排除しなかった(図22A-B)。従って、これらの実験から、Btkは107kDaタンパク質をリン酸化すると結論付けることはできない。TFII-Iは、JAK2、ERKおよびSrcにより、更にはBtkによりリン酸化されることが、先に示された(Cheriyath et al., 2002；Kim and Cochran, 2000；Kim and Cochran, 2001；Sacristan et al., 2004)。加えてBtkを伴わないTFII-Iの残基のリン酸化は、他の研究者により認められた(Sacristan et al., 2004)。JAK2およびBtkは両方とも、TFII-Iのチロシン248をリン酸化することができる(Kim and Cochran, 2001；Sacristan et al., 2004)。Bright/Btk複合体は、Bリンパ球のTFII-Iと会合するかどうか、およびBright活性には会合したタンパク質のチロシンリン酸化が必要であるかどうかを決定するためには、追加の試験が必要である。しかしながら、ここで報告された試験の結果は、Btk-会合したタンパク質BAM11は、Btkにより、異所性に発現されたリポーターコンストラクトの増加した転写活性を示したという他の研究室のデータと一致している(Hirano et al., 2004；Kikuchi et al., 2000)。これらの試験において、TFII-Iのシステムへの添加は、転写活性化を更に増強した(Hirano et al., 2004)。同様に本発明者らのデータは、それによりBrightは、V1免疫グロブリンプロモーター上でBtkおよびBtk基質をつなぐように作用し、その結果転写活性化が生じるというモデルと一致する。V1プロモーターコンストラクトの転写は、BrightのBright結合モチーフへの結合を必要とした。DNAへ結合することができないDP Brightも、例えそれがBtkと会合していても(図22A-B)、V1転写の増強時には無効である(図17A-B)。V1プロモーターにおけるBright結合モチーフの欠失も、V1転写を無効にする(図18)。単独のBright結合部位(V1コンストラクト内で-250)の存在が、V1転写を活性���しない理由は明らかではない。しかし、-250および-550のBright結合モチーフは、配列内で同じではなく、および-550部位のみが、マトリックス会合領域であることが示されている(Webb et al., 1991a；Webb et al., 1991b)。別の可能性は、イントロン性のエンハンサーおよびそのBrightに対する間隔が、活性には重要であることである。この反応におけるそのエンハンサーの機能を説明する試験は、進行中である。いずれかの場合において、図20A-Cに示されたデータは、Btkは、Bright DNA-結合活性に、その結合親和性を増加することにより寄与することを示唆している。まとめるとこれらのデータは、Bright DNA-結合活性と完全な機能性Btkの必要要件の間の連関を示唆している。PHドメインは、チロシンキナーゼのTecファミリーの特徴的性質である。これは、タンパク質-タンパク質相互作用に(Lowry et al., 2001)、およびホスファチジルイノシトール-3,4,5-ビスリン酸(PIP2)への結合に(Saito et al., 2003)、ならびにマスト細胞およびB細胞におけるプロテインキナーゼC(PKC)への結合(Yao et al., 1994)に重要である。加えてPHTHドメインは、PI5K、Vav、Gタンパク質、F-アクチン、チロシンキナーゼFAK、ホスホチロシンリン酸化酵素PTPD1およびBCR下流シグナリング1(BRDG1)の基質との相互作用にとって重要であることが示されている(Qui and Kung, 2002；Saito et al., 2003；Satterthwaite and Witte, 2000；Yang et al., 2000)。本発明者らのデータは、PH/THドメイン内の領域も、Bright/Btk活性にとって重要であることを示唆している。BtkのPHTH欠失変異体がBrightと同時発現される場合、この変異体は、V1転写をアップレギュレーションすることに失敗した。更にBtkの完全長型とは異なり、これはBright DNA-結合活性をインビトロにおいて促進することに失敗した。これらの結果は、ΔPHTHタンパク質の不適切なフォールディングにより説明することができるが、免疫沈降実験は、これがBrightと弱く会合することを示唆した。しかし本発明者らのデータはここで、Brightは、Btkの非存在下でCHO細胞においてTFII-I関連タンパク質と相互作用することを示している(図22B)。従ってこの第三のタンパク質とのその会合を通じ、Btkが、Brightと間接的に相互作用する可能性を排除することができない。これらの相互作用を更に解明するためには、追加の研究が必要であろう。
【０２９２】
マウスにおいてPHドメイン内の単独のアミノ酸の変化は、xid欠失を引き起こす(Rawlings et al., 1993；Thomas et al., 1993)。このxid変異体は、Brightと同時沈降し(図示せず)、かつインビトロ翻訳されたBrightへ添加された場合に、Bright DNA-結合活性を増強することが可能であった。更に、xid変異体はBrightと共同してV1転写を誘導したが、これは野生型Btkのわずかに半分の有効性であった。この知見は、xid変異体はキナーゼ活性を維持するという事実と一致している。野生型Btkと同じように有効な転写活性化の失敗は、V1転写に必要なBrightまたは第三のTFII-I-関連タンパク質成分とのその会合の親和性に影響を及ぼすPHドメインのコンホメーションの変化に起因し得る。他の研究者らは、BAP135/TFII-Iは野生型Btkおよびキナーゼ-失活したBtkへ構成的に会合するが、xid Btkは会合しないことを報告した(Novina et al., 1999)。興味深いことに、xidマウスは、ホスホリルコリンによる免疫に反応してV1重鎖を使用するB細胞の産生に失敗したが、このV1遺伝子は、メスの同腹仔および他の野生型マウスの両方によるこの反応において優先的に使用される(Brown et al., 1985)。本発明者らのデータは、適当なV1発現のためのBtkの必要要件は、一部そのBright-誘導したV1プロモーター活性のための必要要件を反映していることを示唆している。
【０２９３】
マウスにおいて、xid変異またはBtkタンパク質発現の完全な欠損は、未熟型B細胞工程でのB細胞発達のブロックを引き起こし、かつII型T-独立した抗原に対する損なわれた反応、IgG3へのアイソタイプスイッチングの不全、および低い血清Ig産生を生じる。ヒトにおいて、Btkの変異は一般に、大半のB細胞のプロ-B細胞工程を超えた分化の失敗により引き起こされる、正常血清Igレベルの1％未満を生じる(Nomura et al., 2000)。従ってマウス疾患は、ヒト欠失よりも重症度が低い。xid Btkの、マウスV1プロモーターのIg転写を部分的に活性化する能力は、xidマウスにおける未熟型B細胞の存在が原因であると憶測することは興味深い。 
【０２９４】
Brightは、B細胞活性化後重鎖転写を3〜6倍増強するが(Webb et al., 1991)、この転写のアップレギュレーションが、B細胞分化に寄与する方法は明らかではない。実際、B細胞発達においてBrightが果たす役割の定義は、不完全なままである。しかしBright機能はBtk キナーゼ活性が決定的に必要であるという事実は、BrightもB細胞分化の重要なメディエーターであることを示唆している。別の研究は、正常なB細胞発達に関するBtkキナーゼ活性の重要性を明らかにした。Btkのキナーゼ失活型が導入遺伝子として導入されたBtk欠損マウスにおいて、欠損Btkは、Btk欠損に関連した欠失の一部を救済するが、他は救済しない(Middendorp et al., 2003)。IgλL鎖の調節は、キナーゼ独立型であり、プレ-B細胞マーカー発現の変調は、単に部分的にキナーゼ活性に左右される(Middendorp at al., 2003)。Bright欠損マウスは、BtkのようにBrightが、初期または後期B細胞発達の特異的事象にとって決定的に重要であるかどうかを決定するために必要であろう。 
【０２９５】
実施例10
Bright導入遺伝子発現のレベルが変動する、3種のトランスジェニックマウス系統が作出され、およびこの導入遺伝子は、初期骨髄B細胞前駆体において発現されることが明らかにされた。発現は、高レベルで成熟工程を通じて続き、それとは対照的に、内在性Brightにより、発現は活性化されたプレ-B細胞に制限されることが認められる。16週齢までに、試験したメス全てが、血清中に強力な抗-核抗原抗体を示した。最高レベルのBrightを発現する系統は、4週齢で血清中にANAを示した。ELISAも、抗-DNA抗体が、このマウスの一部に存在するが、この系統の自己免疫の傾向はチェックされることを明らかにしている。加えて、最高レベルのBrightを発現するこの系統の複数のマウスも、胸腺B細胞数の増加を伴う退縮した(involuted)胸腺を示した。この特性は、一部の自己免疫マウスにおいて認められている。最後に、中間レベルのBright発現を伴う2匹のマウス由来の腎切片の染色は、糸球体内にIgGを示し、同じく自己免疫を示唆している。
【０２９６】
実施例11
本発明者らはここで、変異されたヒトBrightを有し、かつドミナント-ネガティブマウスBrightを作出するために使用した同じアミノ酸配列は、同じくドミナント-ネガティブヒトBrightを生じることを示した(図24および25)。加えてこれらは、TFII-IとヒトBrightは相互作用し、その相互作用にはBtkを必要としないことを確認した。最後に本発明者らは、TFII-Iとの相互作用に必要とされるBrightの19個のアミノ酸ペプチド領域を同定した(図25および26)。従って本発明者らの現在のモデルは、Brightは、TFII-IおよびBtkの両方をIg遺伝子に動員し、そこでBtkはTFII-Iを活性化し、その後これはIg産生をアップレギュレーションすることを示唆している。従って本発明者らは、小型の19個アミノ酸ペプチドも、Bright/TFII-I活性のインヒビターとして作用し得ると仮定している。
【０２９７】
本明細書において開示されかつ請求された組成物および方法は全て、本発明の開示を考慮し、過度の実験を行うことなく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明されているが、当業者には、これらの組成物および方法、ならびに本明細書に説明された方法の工程または工程の順番を、本発明の概念、精神および範囲から逸脱しない限りは、変更することができることは明らかであろう。より詳細に述べると、化学的および生理学的に関連したある物質は、本明細書に説明された物質と置き換えることができる一方で、同じまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような類似した置換および修飾は、添付された「特許請求の範囲」により規定される本発明の精神、範囲および概念内であると考えられる。
【０２９８】
IX. 参照
以下の参照は、本明細書で言及したものを補う例証的手法または他の詳細を提供するものであり、本明細書に具体的に参照として組入れられている。
米国特許第4,166,452号、米国特許第4,196,265号、米国特許第4,256,108号、米国特許第4,265,874号、米国特許第4,415,732号、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,659,774号、米国特許第4,682,195号、米国特許第4,683,202号、米国特許第4,816,571号、米国特許第4,843,092号、米国特許第4,946,778号、米国特許第4,959,463号、米国特許第5,141,813号、米国特許第5,264,566号、米国特許第 5,354,855号、米国特許第5,428,148号、米国特許第5,554,744号、米国特許第5,574,146号、米国特許第5,602,244号、米国特許第5,645,897号、米国特許第5,705,629号、米国特許第5,795,715号、米国特許第5,888,773号、米国特許第5,889,136号
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2007523895.tif 000022
欧州出願 EP 266 032
欧州出願 EPO 0273085
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PCT 出願  WO 00/44914
PCT 出願  WO 01/68836
PCT 出願  WO 84/03564
PCT 出願  WO 99/32619
PCT 出願  WO 01/36646
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【図面の簡単な説明】
【０２９９】
下記図面は、本明細書の一部を形成し、および本発明のある種の局面を更に明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書に提示された具体的態様の詳細な説明と組合せてこれらの図面を1個または複数参照することにより、より良く理解され得る。
【図１】ヒトB細胞株におけるBrightタンパク質発現は制限される。(図1A)。ウェスタンブロットを、ポリクローナルウサギ抗-Brightを用い、インビトロで翻訳されたヒトおよびマウスBright(レーン1および2)ならびに線維芽細胞CHO細胞株由来の核抽出物10μg(最後のレーン)ならびに内在性Brightを発現しているマウス(BCg3R-1d)およびヒト(CLO1)B細胞株により行った。Brightは矢印で示した。(図1B)ヒト細胞株のパネルからの核抽出物(造血前駆細胞(K562)、単球(U937)、2種のT細胞株(Molt-4およびJurkat)、プレ-B細胞(697)、成熟型B(Raji)および胚中心(CL01))を、図1Aにおけるように、ウェスタンブロットによりBrightタンパク質発現について分析した。同じブロットを、ラミンBに対する抗体で明らかにした。データは、3回の実験を代表するものである。
【図２】ヒトBrightはプロトタイプのDNA配列モチーフに結合するが、Bright結合活性は全てのB細胞株に存在しない。(図2A)インビトロで翻訳されたヒトBrightは、移動度シフトアッセイにおいて、抗-マウスペプチドBright、抗-ヒトペプチドBrightおよび免疫前ヤギ血清の存在または非存在下で、bf150 Bright結合部位へ結合した。(図2B)移動度シフトアッセイを、bf150 Bright結合部位および細胞株のパネルから調製した核抽出物5μgを用いて行った。2種の顕著な複合体が、細胞株の多くにおいて認められ、ならびにIおよびIIで記した。(図2C)移動度シフトアッセイを、抗-ヒトBright抗体、CDPに対する抗血清、または免疫前対照血清の存在下で繰り返した。2種の追加の抗-Bright試薬を使用した場合、同様の結果が得られた。マウスB細胞株BCg3R-1d(BCg)を、陽性対照として使用し、その細胞株中のBrightタンパク質複合体を矢印で示した。同じ見かけの移動度の追加のタンパク質複合体は、抗-Bright血清と反応せず、Brightタンパク質を含まないことに注意。(図2D)移動度シフトアッセイを、10〜1000モル過剰な非標識の競合DNAの存在下で300212細胞株からの核抽出物を用いて行った。使用した特異的インヒビターは、Bright結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであったが、非特異的インヒビターは、Bright結合配列中に変異を含んだ。抗-ヒトBright抗血清(抗-HuBr)を、最後のレーンに追加し、この複合体の結合を取り消した。データは、4回の個別の実験の最小を代表するものである。
【図３】Bright mRNAは、正常なヒト組織において発現される。(図3A)ドットブロット(Clontech)を、2kbヒトBright cDNAプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズした(左側パネル)。標識されたユビキチンプローブを製造業者の指示に従い使用し、各組織由来のRNAの相対量を明らかにした(右側パネル)。この実験は2回行った。(図3B)各組織のBrightの相対発現を、ユビキチンプローブによる総RNAレベルの変動について正規化した後示した。
【図４】Bright mRNAは、初期骨髄B系統亜集団において発現される。骨髄初期B系統前駆体幹細胞集団、プロ-およびプレ-B細胞、未熟型および再循環B細胞から選別されたRNAに、Bright-特異的プライマーによりRT-PCRを施した。増幅産物は、Bright cDNAプローブに広がるエキソン1-8とハイブリダイズすることにより検出した。場合によっては、追加のより小さい増幅産物が認められ、これはマウス試料において認められるものに類似している代わりのスプライシング産物を表している(Webb et al., 1989)。臭化エチジウム染色したゲルは、アクチンmRNAレベルを示している。一部の亜集団の細胞数は非常に低いので、臭化エチジウムによるアクチンバンドの検出は不可能であった。しかしこれらの場合、Brightは明らかに示された。データは、3回の個別の選別実験を代表するものである。
【図５】Brightは、扁桃腺胚中心細胞において発現される。(図5A)ヒト扁桃腺組織切片のアンチセンスヒトBright RNA(AおよびC)または対照センスRNA(BおよびD)によるインサイチュハイブリダイゼーションを示している。暗色のハイブリダイズしている楕円形の胚中心がAにおいて、および加えてCにおいてより高倍率で明らかである。2個の個別の扁桃腺の複数の切片は同様の結果を示した。(図5B)未変性のマントル細胞(Bm1)、創始細胞(Bm2)、暗色ゾーン胚中心芽細胞(Bm3)、明色ゾーン中心細胞(Bm4)およびメモリー(Bm5)B細胞に選別された扁桃腺単核細胞由来のRNAに、Brightプライマーおよびアクチンプライマーを用い、RT-PCR分析を施した。逆転写酵素を伴わない(RT-)および伴う(RT+)反応を分析した。Bright-ハイブリダイズするバンドは、図4に説明したように同定し、矢印により示した。アクチンの増幅は、臭化エチジウム染色により示している。アクチンRT-レーンはネガティブであった。データは、3回の選別実験を代表するものである。
【図６】Bright mRNAは、リンパ球分化のいくつかの個別の工程で発現される。ヒトBリンパ球分化の概略的表示は、幹細胞からのメモリー細胞を通る発達を示している。亜集団間の識別に使用した表面マーカーが示され、およびBright mRNAを発現する分化工程は、星印で示した。大きい星印は、ピークの転写産物発現レベルを示している。
【図７】Btkは、DNA-結合した複合体のサブセット中のBrightに会合する。移動度-シフトアッセイを、2種のB細胞株(CL01および300212)ならびにT細胞株Molt-4からの核抽出物で行った。CDPまたはBtkのプレクストリンドメインに対する抗-血清を、図2A-Dのように添加した。場合によっては、抗-Btk血清は、添加前に、PBS(0.1)により1:10に希釈した。データは、6回の実験を代表するものである。
【図８】Brightタンパク質ドメイン構造および変異。ドメイン構造および標的化された変異を示す、Brightの概略図である。
【図９】DNA結合活性に対する変異の作用を示す。(図9A)インビトロ翻訳されたタンパク質変異体および野生型(WT)Brightのウェスタンブロット分析は、予想されたサイズのタンパク質を明らかにした。細胞株BCg3R-1d由来の核抽出物を、陽性対照として使用した。(図9B)プロトタイプのBright結合部位を使用するEMSA分析は、わずかに2種の変異体REKLESおよびKIKKのみが、DNA結合活性を維持したことを示した。データは、3回の実験を代表するものである。
【図１０】Brightの細胞内局在は、Brightの変異により変更されない。トランスフェクションされたCHO細胞は、Brightに対する抗体(赤色)および核DAPI染色(青色)により染色し、共焦点顕微鏡を使用し視認した。細胞中心を通る50μmの切片が示された。
【図１１】タグ付きBrightタンパク質は未変性のBrightと二量体化する。(図11A)Brightタンパク質を発現している細胞からの核抽出物に、サイズ排除クロマトグラフィーを施し、タンパク質画分を、Brightについてウェスタンブロットにより分析した(下側パネル)。データは、上側パネルにおいて、分子量標準に対して図により示し、これは4回の実験を代表するものである。(図11B)C-末端をmyc-hisタグ付けしたBrightは、CHO細胞において単独でまたは未変性のBrightと同時にのいずれかで発現した。上側パネルは、抗-Bright抗体により明らかにされた各トランスフェクションからの核抽出物10μgを示している。抗-myc Ab(中央パネル)およびアイソタイプ対照として抗-Sp1(下側パネル)を使用する免疫沈降を、各トランスフェクションされた抽出物を用い行い、抗-Bright試薬により明らかにした。矢印は、二次試薬との免疫グロブリン重鎖交差-反応を示している。データは、2回の個別の実験を代表するものである。
【図１２】ARID変異体は、未変性のBright DNA-結合活性と干渉する。トランスフェクションされたCHO細胞由来の全細胞抽出物3μgのEMSA分析を、図9Bのように行った。細胞は、単独でトランスフェクションされるか、または未変性のBright発現のためのベクターと同時トランスフェクションされるかのいずれかであった。bf150プローブは単独で、第二パネルの第一のレーンに示されている。B細胞株BCg3R-1d(BCg)からの核抽出物を、陽性対照として使用した。矢印は、Bright複合体を示している。データは、3〜4回の実験を代表するものである。
【図１３】ARID変異体は、ドミナント-ネガティブタンパク質として機能し、野生型Brightの転写活性と干渉する。DN Bright、野生型Brightで形質導入されたCHO細胞から単離されたmRNAを用い、リアルタイムPCRアッセイを行い、リポーター遺伝子は、V1 S107ファミリー重鎖リーダー、およびプロモーターの574塩基対を含む第一のエキソンおよび予め特徴付けられたふたつのBright結合部位を伴う5'フランキング配列を含む(Novina et al., 1999)。V1発現は、標準曲線を用い定量した。データは、3つ組値で得られた3回の個別の実験の平均を表している。
【図１４】内在性Bright活性は、変異体Brightの同時発現により変更される。B細胞(M12g3Ri)は、タグ付きBrightでトランスフェクションし、LPSで48時間刺激し、およびGFP発現について選別した。トランスフェクションされない、野生型、およびDM由来の核タンパク質は、EMSAにより、単独で、およびBright、myc、CDPまたは免疫前対照に対する抗体の存在下で分析した。BrightおよびCDPは、矢印により示した。データは、3回の個別の実験を代表するものである。
【図１５】ドミナント-ネガティブBrightの形質細胞マーカーに対する作用を示す。脾B細胞を、LPSにより20時間刺激し、その後ドミナント-ネガティブBrightを含むレトロウイルスで、更に48〜72時間形質導入し、GFP発現について選別した。(図15A)これらの細胞由来のcDNAを、μの転写産物についてリアルタイムPCRで分析した。ドミナント-ネガティブBrightを発現している細胞は、対照ベクターを発現している細胞に対して、μ発現の差をほとんど示さなかった。(図15B)GFP-発現している形質導入された細胞上のCD19およびCD138の表面発現のFACS分析。平均蛍光強度に加え、陽性細胞の割合を示した。データは、2回の実験を代表するものである。(図15C)形質導入された細胞由来のmRNAの半-定量的RT-PCRは、mRNAの相対発現レベルを示している。アクチン発現を対照として使用した。データは、3回の個別の実験の代表を示した。
【図１６】免疫グロブリンリポーター遺伝子のBright活性化はBtkを必要とする。(図16A)リアルタイムPCRにより、V1 DNAの標準曲線を作製した。各点は、4回の実験から得た3つ組CT値の平均を反映している。y-切片式を示した。(図16B)BrightおよびBtk発現を、Bright(Br)、BtkおよびBr+Btk(レーン3-5)でトランスフェクションされたCHO細胞におけるウェスタンブロットにより評価した。レーン1は、対照B細胞株(BCg3R-1d)からの抽出物を含み、およびレーン2は、対照ベクターでトランスフェクションされたCHO細胞株からの抽出物を含む。(図16C)V1発現は、(図16A)標準曲線を用い、Btk、Br、Br+Btkおよび対照ベクターを発現しているCHO細胞について、3回の実験からの3つ組試料から平均化した。値は、3つ組値の各々について式y＝-1.097Ln(x)+17.868を用いて計算し、平均の標準誤差(SEM)を示した。使用したV1リポーターコンストラクトの概略を下に示している。プライマー(→ ←)およびプローブ(・)位置を示した。Bright結合部位(x)を示した。エキソンはボックスとして示した。(図16D)(図16B)からの抽出物を、bf150を用いてEMSAにより、Bright DNA-結合活性について評価した。レーン番号は(図16B)に示した番号に対応している。Fは、遊離プローブを示し(第一レーン)、Bright複合体は矢印で示した。
【図１７】DNA-結合活性は、転写アクチベーターとしてBright機能に必要である。(図17A)平均V1発現は、3回の個別の実験からの3つ組試料を使用するリアルタイムPCRにより、二重点変異Bright(DPBr)および／または野生型Bright＋BtkによりトランスフェクションされたCHO細胞において定量した。Br＋Brは、細胞がBr/Btkトランスフェクション体で使用されたBrightベクターDNAの2倍量でトランスフェクションされたことを示している。データは、Br + Btkによる活性を任意に100％と設定して、表した。SEMバーを示している。(図17B)EMSAは、野生型Bright(WT Br)由来の抽出物およびBtkで同時トランスフェクションされたDPBr細胞中に存在するBright結合複合体(矢印)を示している。(図17C)ウェスタンブロットは、トランスフェクションされたCHO細胞におけるBrightおよびBtk発現レベルを示している。
【図１８】V1プロモーター中の遠位Bright結合モチーフはBright機能に必要である。0(-125)、1(-251)および2(-574)のBright結合部位を含むV1欠失コンストラクトを、Br+Btkで、CHO細胞へトランスフェクションした。V1発現は、3回のリアルタイムPCR実験から3つ組値を用いて測定した。完全長(-574)コンストラクトからの平均値を100％と設定し、他の値を、その値の活性の割合として表した。SEMバーを示している。対照のトランスフェクションされた細胞は、完全長ベクター(-574)を陰性対照BrightおよびBtkプラスミドと共に含んだ。
【図１９】機能性BtkはBright活性に必要である。(図19A)概略図は、野生型Btkおよび使用した変異体のプレクストリン(PH)、tec(TH)およびsrc(SH1-3)相同ドメインを示している。R28Cは、xid変異であり；K430Rは、Btkキナーゼ失活とし；ならびに、ΔPHTHは、プレクストリンおよびtec相同ドメインを欠失している。(図19B)ウェスタンブロットは、トランスフェクションされたCHO細胞抽出物中でのBright(Br)およびBtk変異体の発現を示している。(図19C)-574完全長プロモーターコンストラクトからのV1発現を、先の図の説明文に説明したようにリアルタイムPCRにより、野生型Brightおよび野生型または変異体BtkのいずれかによりトランスフェクションされたCHO細胞において測定した。各トランスフェクションは、最低3回行い、データは各実験の3つ組試料から計算した。各トランスフェクションの平均値は、100％と設定された野生型Btk＋Brightで得られた値の活性の割合として表した。SEMを示している。対照のトランスフェクションされた細胞は、空のBtkベクター、Bright逆方向ベクターおよびV1リポーターコンストラクトを含んだ。
【図２０】Bright DNA-結合活性は、Btkにより促進され、およびこの増強された結合はBtkのPHTHドメインを必要としている。(図20A)bf150およびインビトロ翻訳されたBright(IVTBr)を用い、外因性組換え野生型Btk(rBtk)の添加を伴うかまたは伴わずに、EMSAを行った。未標識の競合DNA(100モル過剰)を、0〜10分間一部のレーンで試料に添加した後、電気泳動を開始した。Bright複合体は、矢印で示している。(図20B)(図20A)からのレーン3-6および8-11のバンドの濃度定量は、Btkの存在下でのBright DNA-結合活性の安定化を示している。(図20C)EMSAを、インビトロ翻訳されたBright(IVT Br)または漸増量の組換えBtk(三角)を伴うIVT Brightの次善のレベル(1:16希釈、レーン3-15)を用い行った。矢印は、Bright複合体を示している。プローブ単独は、第一レーンに示した。最後の3個のレーンは、Brightの非存在下で使用した最大レベルの各Btkタンパク質により生じた結合活性の非存在を明らかにしている。組換えBtkタンパク質の発現は、右側のボックス付きパネル中にウェスタンブロットにより示されている。データは、3回の実験を代表するものである。
【図２１】Btk/Bright複合体の形成は、Btkキナーゼ活性もしくはそのPHTHドメイン、またはBrightのDNA-結合活性に左右されない。野生型(Btk)または変異体(ΔPHTH, K430R)Btkおよび野生型(Br)またはDPBr BrightがトランスフェクションされたCHO細胞からの全細胞抽出物を、Bright上のmycタグ(レーン1-7)または抗-Btk(レーン8-14)と反応性の抗体と免疫沈降した。その後タンパク質を、抗-Bright(上側パネル)または抗-Btk抗体(下側パネル)で免疫ブロットした。Btkおよび抗-mycの両モノクローナルの無関係の抗体抗-Spl(レーン1および8)を、対照として使用した。レーン6、7、13および14において、BtkまたはBrightのいずれかがわずかに発現した。レーン15-20(負荷)は、免疫沈降前のタンパク質レベルを示している。アスタリスクは、免疫沈降したIg重鎖バンドを示している。
【図２２】第三のタンパク質はBrightに会合する。myc-タグ付きBrightおよび／またはBtkでトランスフェクションされたCHO細胞からの抽出物を、抗-myc抗体(レーン2-5)またはアイソタイプ対照抗-Spl(レーン1)で免疫沈降し、ならびに抗-Bright、抗-ホスホチロシン(図22A)または抗-BAP135/TFII-I抗体(図22B)で免疫ブロットした(IB)。分子量マーカーの位置を示した。データは、2回の個別の実験を代表するものである。
【図２３】Bright/Btk複合体は、B細胞株内のBright部位に結合する。抗-Bright、抗-Btkまたは対照ヤギ抗体(gtIg)を、B細胞株BCg3R-1dおよびT細胞ハイブリドーマKD3B5.8の溶解液との、改変されたクロマチン免疫沈降実験において使用した。免疫沈降されたDNAは、Bright結合部位(V1)の存在下で、最終希釈1:100、1:500および1:1000(三角で表す)でPCR増幅した。各免疫沈降に使用したDNAの20％は、陽性対照(Input)として使用した。データは、3回の実験を代表するものである。
【図２４】Bright欠失コンストラクトを示す。
【図２５】BrightコンストラクトおよびBright欠失コンストラクトのTFII-Iとの相互作用を示す。
【図２６】TFII-Iとの相互作用に必要なヒト/マウスBright配列を示す。(SEQ ID NO：23-26)
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
2007523895000001.app
【国際調査報告】
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2007523895.tif 000072
2007523895.tif 000073
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