(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞または前癌細胞に由来するゲノムDNAまたはcDNAを含有する非樹状細胞と、抗原提示細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を含むワクチンを、治療上有効な用量で、癌患者または前癌病変を有する患者に投与することによって、癌を治療および予防する方法、ならびに前癌病変を治療する方法に関する。特定の実施形態では、そのようなワクチンを、細胞傷害性T細胞(CTL)応答および/または体液性免疫応答を刺激するサイトカインまたは他の分子と共に併用投与する。本発明は、抗原提示細胞と、治療または予防すべき感染症を引き起こす感染性因子に由来するゲノムDNAまたはcDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を含むワクチンを、治療上有効な用量で、被験体に投与することによって、感染症を治療および予防する方法にも関する。本発明は、本発明の方法で使用される融合細胞を産生する方法にも関するものであった。本発明は、本発明の方法で使用される融合細胞を含む組成物も提供する。
2007528375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、前記非樹状細胞が癌細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)癌細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項３】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で予防すべき癌と同じ種類である癌細胞から単離される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で予防すべき癌から得られる癌細胞から単離される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の前癌病変を治療する方法であって、前記方法が、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が前癌病変の細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項６】
哺乳動物の前癌病変を治療する方法であって、前記方法が、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)前癌病変の細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項７】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物の少なくとも1つのMHCクラスIアレルを組換え発現する、請求項2または6に記載の方法。
【請求項８】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物にとって同種異系である細胞から生成される、請求項2または6に記載の方法。
【請求項９】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物にとって同系である細胞から生成される、請求項2または6に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で治療すべき前癌病変と同じ種類である前癌病変の細胞から単離される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で治療すべき前癌病変から単離される前癌病変の細胞から単離される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１３】
体液性免疫応答または細胞傷害性T細胞免疫応答を刺激する分子の投与をさらに含む、請求項1、2、5または6に記載の方法。
【請求項１４】
前記分子がサイトカインである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインがインターロイキン-12である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹状細胞がヒト血中単球から得られる、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１９】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項２０】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系であり、かつ、前記非樹状細胞が、前記哺乳動物と同じMHCクラスIハプロタイプを有する、請求項1または5に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1、2、5または6に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群から選択される、請求項1、2、5または6に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２５】
前記前癌病変が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される癌の前駆物である、請求項5または6に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト抗原提示細胞とヒト非樹状細胞とを融合させる方法であって、抗原提示細胞の集団および非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件下に置くことを含み、前記非樹状細胞が腫瘍細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記腫瘍細胞に関連した少なくとも1つの抗原をコードする、前記方法。
【請求項２７】
前記ゲノムDNAが、腫瘍細胞から取得され、非樹状細胞中にトランスフェクトされている、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって同種異系である、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって同系である、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞融合が電気融合によって達成される、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
抗原提示細胞と非樹状細胞との融合細胞であって、前記融合細胞が腫瘍細胞のゲノムDNAを含み、前記腫瘍細胞のゲノムDNAが、前記腫瘍細胞に関連した少なくとも1つの抗原をコードする、前記融合細胞。
【請求項３２】
1つまたは複数の容器に、(i)抗原提示細胞の集団と、(ii)非樹状細胞の集団と、(iii)投与を必要とする哺乳動物に投与するために前記抗原提示細胞を非樹状細胞と融合させるための説明書とを含むキット。
【請求項３３】
(i)細胞からゲノムDNAを得るための物質と、(ii)前記ゲノムDNAを非樹状細胞中にトランスフェクトするための物質とをさらに含む、請求項32に記載のキット。
【請求項３４】
電気融合に適したキュベットをさらに含む、請求項32に記載のキット。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞が凍結保存されている、請求項32に記載のキット。
【請求項３６】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子と、癌を予防または治療するために前記キットを使用するための説明書とをさらに含む、請求項32に記載のキット。
【請求項３７】
前記分子がサイトカインである、請求項36に記載のキット。
【請求項３８】
前記サイトカインがIL-12である、請求項37に記載のキット。
【請求項３９】
抗原提示細胞および非樹状細胞を含む融合細胞を含む医薬組成物であって、前記非樹状細胞が腫瘍細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記腫瘍細胞に関連した少なくとも1つの抗原をコードする、前記医薬組成物。
【請求項４０】
前記樹状細胞がヒト細胞である、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記非樹状細胞がヒト細胞である、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子をさらに含む、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記分子がサイトカインである、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記分子がIL-12である、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子と、
(ii)前記哺乳動物の少なくとも1つのMHCクラスIアレルと、
(iii)前記癌に関連する少なくとも1つの抗原と、
を組換え発現するように細胞を遺伝子操作するステップを含む、哺乳動物の癌を治療するための細胞。
【請求項４６】
前記細胞が、前記哺乳動物で治療すべき癌の種類に由来するゲノムDNAをトランスフェクトされている、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、前記哺乳動物で治療すべき癌の種類に由来する1つまたは複数のcDNAをトランスフェクトされている、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
請求項45に記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項４９】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５０】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように構築されており、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５１】
前記非樹状細胞が、癌細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
前記普遍的抗原提示細胞が、癌細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌細胞が、前記哺乳動物で治療すべき癌と同じ種類のものである、請求項49または50に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌細胞が、前記哺乳動物で治療される癌から得られる、請求項49または50に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物の前癌病変を治療する方法であって、前記方法が、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５６】
哺乳動物の前癌病変を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５７】
前記非樹状細胞が、前癌病変の細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
前記普遍的抗原提示細胞が、前癌病変の細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
前記前癌病変の細胞が、前記哺乳動物で治療または予防すべき前記前癌病変と同じ種類である前癌病変の細胞である、請求項57または58に記載の方法。
【請求項６０】
前記前癌病変の細胞が、前記哺乳動物で治療すべき前記前癌病変の細胞である、請求項57または58に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６２】
体液性免疫応答または細胞傷害性T細胞免疫応答を刺激する分子の投与をさらに含む、請求項49、50、55、または56に記載の方法。
【請求項６３】
前記分子がサイトカインである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記サイトカインがインターロイキン-12である、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記樹状細胞がヒト血中単球から得られる、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６８】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６９】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系であり、かつ、前記非樹状細胞が哺乳動物と同じMHCクラスIハプロタイプを有する、請求項49または55に記載の方法。
【請求項７１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項49、50、55、または56に記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群から選択される、請求項49、50、55、または56に記載の方法。
【請求項７３】
前記癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される、請求項49または50に記載の方法。
【請求項７４】
前記前癌病変が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される癌の前駆物である、請求項55または56に記載の方法。
【請求項７５】
ヒト抗原提示細胞とヒト非樹状細胞とを融合させる方法であって、抗原提示細胞の集団および非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件下に置くことを含み、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが癌に関連した抗原をコードする、前記方法。
【請求項７６】
前記非樹状細胞が、癌細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
前記前癌性非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって自家性である、請求項75に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞融合が電気融合によって達成される、請求項75に記載の方法。
【請求項７９】
腫瘍細胞に関連した抗原をコードするcDNAを含む、抗原提示細胞および非樹状細胞の融合細胞。
【請求項８０】
前記融合細胞が、腫瘍細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項79に記載の融合細胞。
【請求項８１】
1つまたは複数の容器に、(i)抗原提示細胞の集団と、(ii)非樹状細胞の集団と、(iii)投与を必要とする哺乳動物に投与するために前記抗原提示細胞を非樹状細胞と融合させるための説明書とを含むキット。
【請求項８２】
前記キットが、腫瘍、癌、または前癌病変に関連した抗原をコードする少なくとも1つのcDNAをさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８３】
前記キットが、以下：(i)細胞からmRNAを得るための物質と、(ii)mRNAからcDNAを生成させるための物質と、(iii)cDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための物質とのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８４】
電気融合に適したキュベットをさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８５】
前記抗原提示細胞が凍結保存されている、請求項81に記載のキット。
【請求項８６】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子と、癌を予防または治療するために前記キットを使用するための説明書とをさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８７】
前記分子がサイトカインである、請求項86に記載のキット。
【請求項８８】
前記サイトカインがIL-12である、請求項87に記載のキット。
【請求項８９】
抗原提示細胞および非樹状細胞を含む融合細胞を含む医薬組成物であって、前記非樹状細胞が、腫瘍細胞に関連した抗原をコードする少なくとも1つのcDNAを含む、前記医薬組成物。
【請求項９０】
前記非樹状細胞が、腫瘍細胞から単離されたmRNAから生成された複数のcDNAを含む、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
前記樹状細胞がヒト細胞である、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記非樹状細胞がヒト細胞である、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子をさらに含む、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記分子がサイトカインである、請求項93に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
前記分子がIL-12である、請求項94に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
1つまたは複数の容器に、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されている普遍的抗原提示細胞と、(ii)細胞からmRNAを得るための物質と、(iii)mRNAからcDNAを生成させるための物質と、(iv)cDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための物質と、を含むキット。
【請求項９７】
1つまたは複数の容器に、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されている普遍的抗原提示細胞と、(ii)細胞からゲノムDNAを得るための物質と、(iii)ゲノムDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための物質と、を含むキット。
【請求項９８】
1つまたは複数の容器に、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3のうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数のDNA分子と、(ii)細胞にDNA分子を導入するための物質と、を含むキット。
【請求項９９】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を融合細胞とともにインキュベートすることを含み、前記融合細胞が抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、前記非樹状細胞が癌細胞または前癌病変の細胞のゲノムDNAを含み、かつ、前記ゲノムDNAが、前記癌または前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードする、前記方法。
【請求項１００】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を普遍的抗原提示細胞とともにインキュベートすることを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、かつ、(ii)癌細胞または前癌病変の細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌または前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードする、前記方法。
【請求項１０１】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を融合細胞とともにインキュベートすることを含み、融合細胞が抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、癌または前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードする、前記方法。
【請求項１０２】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を普遍的抗原提示細胞とともにインキュベートすることを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、かつ、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、癌または前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードする、前記方法。
【請求項１０３】
前記免疫エフェクター細胞および前記融合細胞が、少なくとも1つの共通のMHCクラスIアレルを共有する、請求項99または101に記載の方法。
【請求項１０４】
前記免疫エフェクター細胞および前記普遍的抗原提示細胞が、少なくとも1つの共通のMHCクラスIアレルを共有する、請求項100または102に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、2004年3月2日出願の米国特許仮出願第60/549,888号に基づく利益を主張し、この開示を参照により全体として本明細書に組み入れる。
【０００２】
1. 序論
本発明は、抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞に由来するゲノムDNAまたはcDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を含むワクチンを、治療上有効な用量で、癌患者または前癌病変を有する患者に投与することによって、癌を治療および予防する方法、ならびに前癌病変を治療する方法に関する。特定の実施形態では、そのようなワクチンを、細胞傷害性T細胞(CTL)応答および/または体液性免疫応答を刺激するサイトカインまたは他の分子と共に併用投与する。本発明は、抗原提示細胞と、治療または予防すべき感染症を引き起こす感染性因子に由来するゲノムDNAまたはcDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を含むワクチンを、治療上有効な用量で、被験体に投与することによって、その感染症を治療および予防する方法にも関する。本発明は、本発明の方法で使用される融合細胞を産生する方法にも関するものであった。本発明は、本発明の方法で使用される融合細胞を含む組成物も提供する。本発明は、普遍的抗原提示細胞(universal antigen presenting cell)と、腫瘍細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子に由来するゲノムDNA、cDNA、またはmRNAを含有する普遍的抗原提示細胞をも提供する。本発明は、そのような普遍的抗原提示細胞を被験体に投与する方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
癌の予防に効果的な免疫療法用組成物の開発には、大きな関心が寄せられている。そのような免疫療法アプローチの成功には、非常に強い免疫応答を誘発でき、かつ、同時に、標的の腫瘍または感染細胞に極めて特異的である組成物の開発が必要であろう。
【０００４】
2.1 免疫応答
免疫系の細胞は、分化の2つの主要経路、すなわちリンパ球系統および骨髄系統を経て、多分化能性幹細胞から生じる。リンパ球系統は、T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞などのリンパ球を産生し、一方、骨髄系統は、単球、マクロファージ、好中球、ならびに、樹状細胞、血小板、および肥満細胞などの他の補助細胞を産生する。リンパ球系統のT細胞には、2つの主なタイプ、すなわち、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)とヘルパーT細胞とがあり、胸腺内で成熟し、選択が行われるが、これらは、2つの表面マーカーのうちの1つ、すなわち、CD8(CTL)またはCD4(ヘルパーT細胞)の存在によって識別される。
【０００５】
リンパ球は循環し、侵入している外来病原体と、脾臓およびリンパ節などの二次リンパ器官内に捕捉される傾向がある抗原を探索する。抗原は、末梢において二次リンパ器官に移動する抗原提示細胞(APC)によって取り込まれる。T細胞とAPCとの相互作用は、B細胞および抗体産生の活性化、CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CD8+ CTL)の活性化、および、T細胞によるサイトカイン産生への刺激を含めたいくつかのエフェクター経路を誘発する。
【０００６】
ナイーブB細胞の活性化は、抗体を産生するために、2つのシグナル、すなわち、
(1)BCR関連シグナル伝達分子と一緒になって後にクラスターを形成する、表面結合受容体(B細胞受容体、すなわちBCR)による、特定抗原の認識および結合と、
(2)活性化Tヘルパー細胞(Th)の表面に保持されたCD40Lリガンドによる、B細胞表面のCD40受容体の結合によって生じた共刺激シグナルとを必要とする。活性化されたB細胞は、クローン増殖、体細胞超変異、親和性成熟、およびアイソタイプスイッチングを受け、アイソタイプスイッチングにおいて、分泌される抗体の重鎖クラスが確立される。次に、この抗体重鎖クラスの選択は、アイソタイプスイッチングが行われた時点でそのB細胞に接触しているサイトカインの集合によって決定される。
【０００７】
抗体の重鎖定常領域(Fc)は、in vivoでその抗体の機能に影響を与える。例えば、IgGクラスの抗体のFc部分は、マクロファージおよび好中球などの専門的食細胞の細胞表面受容体によって認識および結合され、それによって、この様にしてオプソニン化されたIgG結合抗原および/または細胞の摂食および破壊を促進する。加えて、例えば複数コピーの細胞表面抗原に結合したIgG抗体の集団は、補体系に結合して、これを活性化するであろう。そして、それによって、その細胞の破壊が導かれる。
【０００８】
BCRおよび抗体による抗原の認識および結合とは対照的に、T細胞は、抗原の起源が細胞内であるか、または細胞外であるかに応じて、抗原タンパク質が2つの異なるルートのうちの1つで処理されて、細胞表面結合複合体の一部として提示されることを必要とする。細胞内または内因性のタンパク質抗原は、腫瘍細胞を含めたほとんどの細胞型で発現されているクラスI主要組織適合複合体(MHC)分子によってCD8+ CTLに提示される。細胞外の抗原決定基は、CD4+「ヘルパー」T細胞によって認識されるクラスII MHC分子-抗原複合体として、樹状細胞およびマクロファージなどの「特殊化」または「専門的」APCの細胞表面に提示される(全般的に、W.E. Paul編、「Fundamental Immunology」、New York、Raven Press社、1984を参照)。
【０００９】
クラスIおよびクラスII MHC分子は、知られているなかでは最も多型性の強いタンパク質である。クラスIおよびクラスII MHC分子の組合せによって、MHCハプロタイプとして知られる、さらに高い程度のMHC分子の異質性が生成される。ヒトでは、単一の染色体上に位置する3つの異なる遺伝子座、すなわちHLA-A、HLA-B、およびHLA-Cが、クラスI分子をコードしている。T細胞受容体は、抗原性ペプチドとMHC分子の多型部分とを含む複合体に特異的に結合するので、異なった遺伝子型のMHC分子に遭遇した場合、T細胞の応答は弱いものとなる。この特異性は、MHC拘束性のT細胞認識およびT細胞細胞傷害性の現象をもたらす。
【００１０】
リンパ球は末梢を循環し、適切なシグナルに遭遇するとリンパ器官内で「感作された」状態となる(BretscherおよびCohn、1970、Science 169:1042-1049参照)。第1のシグナルは、APC表面のクラスI MHC分子によって提示されている抗原性ペプチドにT細胞受容体が結合した後T細胞受容体を介して受容される。第2のシグナルは、インターロイキン-1(IL-1)、インターフェロンγ、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-7(IL-7)、およびインターロイキン-12(IL-12)など、CD4+ヘルパーT細胞または樹状細胞によって産生される分泌性の化学シグナルまたはサイトカインによって、あるいは、抗原提示細胞の細胞膜に存在する、B7(B7.1分子およびB7.2分子を含む用語)などの原形質膜結合した共刺激分子によって提供され、これらの共刺激分子は、Igスーパーファミリーのメンバーである、CD28と呼ばれる、ヘルパーT細胞表面の補助受容体によって認識される。インターフェロンγおよびIL-12の産生は、CD8+T細胞の生成を促進するTH1として知られているヘルパーT細胞サブタイプと関連しており、IL-4の産生は、抗体産生B細胞の生成および活性化を促進するTH2として知られているヘルパーT細胞サブタイプと関連する。
【００１１】
抗原提示の際の抗原特異的相互作用に加えて、Tリンパ球のAPCへの結合を安定化する抗原非特異的な接着もT細胞刺激に関与している。より詳細には、ICAM-1/CD54、LFA-3/CD58、およびB7など、APC上の受容体分子が、T細胞上の対応する補助受容体に結合する。両方のシグナルを受容したヘルパーT細胞は、活性化されて、増殖し、様々なインターロイキンを分泌する。両方のシグナルを受容したCTLは、活性化されて、CTL活性化を最初に誘導したのと同じクラスI MHC分子および同じ抗原を保持する標的細胞を殺す。したがって、CD8+ CTLは、癌および病原体に対する抵抗に重要であり、また、同種移植の拒絶にも重要である(Terstappenら、1992、Blood 79:666-677)。しかし、共刺激の非存在下に第1のシグナルを受容したT細胞は、アネルギー化された(anergized)状態になり、それによって寛容となる(Lambら、1983、J. Exp. Med. 157:1434-1447; Muellerら、1989、Annu. Rev. Immunol. 7:445-480; Schwartz、1992、Cell 71:1065-1068; MuellerおよびJenkins、1995、Curr. Opin. Immunol. 7:375-381)。
【００１２】
2.2 癌の病理生物学
癌は、主として、所与の正常な組織に由来する異常細胞の数の増大、これらの異常細胞による隣接組織への侵襲、そして、リンパまたは血液を介した、局部リンパ節および遠方の部位への悪性細胞の伝搬(転移)を特徴とする。臨床データおよび分子生物学的研究は、癌が、新生物発生前の小さな変化によって始まる多段階過程であり、この変化が特定の条件下で新生物に進行しうることを示している。したがって、この多段階過程の進行中に、正常細胞と前癌細胞とを区別する少なくとも1つの遺伝子アレルを含む、前癌細胞が蓄積する。そのような遺伝的差異によって、腫瘍特異抗原の発現、正常細胞タンパク質の過剰発現、ならびに/あるいは、正常抗原および/または腫瘍特異抗原の細胞分布の改変がもたらされることがある。特定の場合には、これらの改変によって、改変された細胞表面タンパク質、または通常は細胞表面に輸送されない正常タンパク質の、細胞表面への発現をもたらすことがある。
【００１３】
前癌性細胞の蓄積は、過形成または化生、そして最も際だったものとしては、異形成によって例示される前悪性の異常細胞成長として検出される(そのような異常成長状態に関する概説には、RobbinsおよびAngell、1976、「Basic Pathology」、第2版、W.B. Saunders Co.社、Philadelphia、68-79を参照のこと)。過形成は、構造または機能の重大な改変がないまま組織または臓器の細胞数の増大を起こす制御された細胞増殖の形態である。過形成の一例が、子宮内膜増殖症であり、これは、しばしば子宮内膜癌に先行して起こる。化生は、制御された細胞増殖の形態であり、その際、あるタイプの成体細胞、すなわち完全に分化した細胞が、別のタイプの成体細胞で置換される。化生は、上皮組織または結合組織の細胞で起こることがある。非定型的な化生には、いくらか無秩序な化生上皮を伴う。異形成は、癌の前兆であることが頻繁にあり、主として上皮で見出される。異形成は、最も無秩序な形態の非腫瘍性成長であり、個々の細胞の均一性の減失、および細胞の構築的な配向性を伴う。異形成の細胞は、しばしば、深く染色される異常に大きな核を有し、また、多形性を示す。異形成は、特徴的には、慢性的な刺激または炎症が存在するところで起こり、頚管、気道、口腔、および胆嚢で見出されることが多い。
【００１４】
腫瘍性病変は、上述の前癌性細胞および癌細胞を含み、特に腫瘍細胞が宿主の免疫監視を回避するような条件下において、前癌性細胞の蓄積として、侵襲、成長、転移、および異質性に関する増強された能力を与える複数の遺伝子変化を、クローン的に進展させることがある(Roitt, I.、Brostoff, J.、およびKale, D.、1993、「Immunology」、第3版Mosby社、St. Louis、17.1-17.12)。
【００１５】
2.3 癌に対する免疫療法
細胞障害性T細胞応答は、抗原性腫瘍細胞の成長を制御するのに極めて重要な宿主応答である(Anichinniら、1987、Immunol. Today 8: 385-389)。実験動物の腫瘍を用いた研究、そして、自然発生ヒト腫瘍を用いた研究は、多くの腫瘍が、免疫応答を誘導できる抗原を発現することを実証した。一部の抗原はその腫瘍に特有であり、また、一部のものはその腫瘍と正常細胞との両方に存在する。腫瘍の抗原性には、例えば、関与した特定のタイプの発癌性物質、ならびに宿主の免疫能および潜伏期を含めたいくつかの因子が影響を与える(Oldら、1962、Ann. N.Y. Acad. Sci.101:80-106; Bartlett、1972、J. Natl. Cancer. Inst. 49:493-504)。T細胞媒介性免疫が、ウイルス誘発性および化学誘発性の腫瘍の拒絶反応に決定的に重要であることが実証されている(Kleinら、1960、Cancer Res. 20:1561-1572; Tevethiaら、1974、J. Immunol. 13:1417-1423)。
【００１６】
腫瘍に対する養子免疫療法は、その細胞が確立されている腫瘍の退縮を直接的または間接的に引き起こすことを目的とし、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を腫瘍保持宿主に投与する治療方法を指す。腫瘍によって免疫抑制反応が既に誘発されている場合があるので、確立された腫瘍を保持する宿主に、腫瘍細胞または腫瘍抗原で、あるいは自然発生した腫瘍で免疫化を行っても、効果がないことが多かった(Greenberg、1987、「Basic and Clinical Immunology」、第6版、Stites, StoboおよびWells編、Appleton and Lange社、第14章、186-196; Bruggen、1993)。したがって、免疫療法の前に、腫瘍保持宿主中の腫瘍塊を減少させ、すべてのT細胞を枯渇させる必要があった(Greenbergら、1983、「Basic and Clinical Tumor Immunology」、Herbermanm RR編、Martinus Nijhoff社、301-335)。
【００１７】
進行した腫瘍を保持する宿主を、腫瘍特異的な同系T細胞の導入によって治療できる動物モデルが開発された(Muleら、1984、Science 225: 1487-1489)。国立ガン研究所(National Cancer Institute(NCI))の研究者は、いくつかのヒト癌を治療するために、皮下リンパ小節の生検試料から得た、末梢血液リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のT細胞培養の自家性再注入を用いた(Rosenberg, S.A.、1987年9月1日交付の米国特許第4,690,914号; Rosenbergら、1988、N. Engl. J. Med.、319:1676-1680)。例えば、IL-2の存在下にin vitroで増殖したTILが、癌患者に養子導入され、その結果、転移性の黒色腫を有する選択された患者で腫瘍退縮がもたらされた。IL-2存在下で増殖した黒色腫TILは、CD3+活性化Tリンパ球として同定されたが、これらは、主として、特有のin vitro抗腫瘍特性を有するCD8+細胞である。長期の黒色腫TIL培養の多くは、特異的なクラスI MHC抗原複合体中でT細胞受容体依存的に自家腫瘍を溶解させる(Topalianら、1989、J .Immunol 142:3714)。
【００１８】
ヒト癌を治療するためのこれらの方法の適用には、患者に存在する特定のセットの癌反応性リンパ球を単離すること、これらの細胞をin vitroで多数に増殖させること、および、その後、複数回の注入によってこれらの細胞を宿主に戻すことが伴うであろう。IL-2の存在下で増殖したT細胞は、その生存がIL-2に依存しているので、細胞を導入した後にIL-2を注入することによって、生存が長びき、かつ培養T細胞の治療効力が増大する(Rosenbergら、N.Engl J.Med 1987、316:889-897)。しかし、高用量のIL-2および活性化されたリンパ球による処置は、毒性が無視できず、それには、高熱、低血圧、毛細血管漏出症候群による内皮壁の損傷、ならびに、不整脈および心筋梗塞などの、心臓における様々な有害事象が含まれる(Rosenbergら、1988、N. Engl. J. Med.、319:1676-1680)。さらに、TILを生成させるのに必要な技術的専門知識が過度に要求の高いものであること、必要材料の量、および、重度に有害な副作用によって、これらの技法の使用は専門的治療センターに制限されている。
【００１９】
クラスI MHC-ペプチド複合体に特異的なCTLは、癌の治療または予防に使用できる可能性があり、in vivoでのプライミングを必要とせずにin vitroでそのようなCTLを生成させる方法が探索されてきた。これらには、適切な抗原をパルス投与された樹状細胞(Inabaら、1987、J. Exp. Med. 166: 182-194; Macatoniaら、1989、J. Exp. Med. 169:1255-1264; De Bruijnら、1992、Eur J. Immunol. 22:3013-3020)、ペプチドを搭載したRMA-S細胞(RMA-S細胞は「空」の細胞表面クラスI MHC分子を多数発現する変異体細胞)(De Bruijnら、1991、Eur. J. Immunol. 21:2963-2970; De Bruijnら、1992、同上; Houbiersら、1993、Eur. J. Immunol. 26: 2072-2077)、および、食作用によってマクロファージに取り込まれたペプチドを搭載したビーズ(De Bruijnら、1995、Eur. J. Immunol. 25, 1274-1285)の使用が含まれる。
【００２０】
B細胞または樹状細胞を腫瘍細胞と融合させると、動物モデルで抗腫瘍免疫応答が誘発されることが以前に明らかにされている(Guoら、1994、Science、263:518-520; StuhlerおよびWalden、1994、Cancer Immunol. Immuntother. 1994, 39:342-345; Gongら、1997、Nat. Med. 3:558-561; Celluzzi、1998、J. Immunol. 160: 3081-3085; Gong、1998年10月23日付けの国際公開第98/46785号)。詳細には、腫瘍細胞と抗原提示細胞との雑種細胞を用いた免疫化は、様々なげっ歯類モデルで防御免疫をもたらすことが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかし、現在の治療は、防御免疫を刺激するものではあるが、既に確立されている疾患にかかっている患者を常に効果的に治療するものではなく、すなわち、疾患を有する被験体に融合細胞を投与した場合、その疾患を除去するのに十分な程の免疫応答を、常に刺激するわけではない。そのような治療は、通常、腫瘍を有しないかもしれないが前癌病変を保持する患者の癌の予防には効果的でない。したがって、新生物疾患の予防および新生物疾患の再発防止に使用でき、かつ、患者における既存の腫瘍の退縮を引き起こす治療用組成物の必要性が存在する。さらに、最終的に新生物疾患が発症することを強く予測する1つまたは複数の遺伝子マーカーまたはアレルを保持することが分かっている患者に予防的処置を行うための組成物がとりわけ緊急に必要である。
【００２２】
さらに、現在の治療は、融合細胞を産生するための腫瘍細胞の利用可能性によって制限されている。腫瘍細胞の利用可能性は、治療される被験体からの自家腫瘍細胞が融合細胞の産生に使用されることになる場合、また、そのような腫瘍細胞の外科的除去が禁忌である場合には、とりわけ問題がある。一部の場合には、患者の腫瘍細胞が培養によって増殖される場合、十分な量の腫瘍細胞を入手することのみは可能でありうるが、その場合、その治療の完全な恩恵をその患者に提供するには時間がかかり過ぎる場合がある。したがって、より少ない数の腫瘍細胞から養子免疫療法用の融合細胞を生成させる方法の必要性が存在する。
【００２３】
本明細書における参照文献の引用または考察は、そのようなものが本発明の従来技術であると承認するものではないと理解するべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
3. 発明の概要
本発明は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を投与することによって、癌を予防する方法に関し、その際、これらの融合細胞は、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激する分子と共に併用投与されることもある。本発明は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、腫瘍細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を投与すると、その結果、その癌の発生に対する、増強された免疫応答、ならびに、その癌の治療および予防が得られることの発見および実証に一部基づいている。そのような融合細胞は、ゲノムDNAがそれから抽出された腫瘍細胞の特異的な抗原性と、樹状細胞の活発な免疫活性化効果を組み合わせるものであり、それによって、強力かつ特異的な免疫応答を誘発するが、さらにこれを、免疫賦活剤の同時投与によって強化することもできる。
【００２５】
本発明は、抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞の投与、ならびに、抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞の、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激するサイトカインまたは他の分子との同時投与を提供し、それによって、治療の効果を著しく強化する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、哺乳動物の癌を予防する方法を提供し、この方法は、抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞を、そのような予防を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量で、投与することを含む。好ましい一実施形態では、融合細胞が、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激する分子と共に併用投与される。この実施形態の別の態様では、CTLおよび/または体液性免疫応答の共刺激物質も、その共刺激物質をコードする遺伝物質を用いて融合細胞を形質転換またはトランスフェクトすることによって提供される。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の癌を予防する方法を提供し、前記方法は、前記予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の融合細胞を投与することを含み、その際、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と、腫瘍細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞との融合によって形成され、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有し、腫瘍細胞から抽出されたゲノムDNAを含む前記非樹状細胞が、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原を少なくとも1つ提示する。より具体的な一実施形態では、前記抗原は前記癌に特異的なものである。この方法の具体的な一実施形態では、非樹状細胞が、予防または治療すべき癌を構成する細胞型と同じ細胞型の腫瘍細胞からのゲノムDNAを含む。別のある実施形態では、この方法は、体液性免疫応答または細胞傷害性T細胞免疫応答を刺激する分子の投与をさらに含む。一実施形態では、前記分子がサイトカインである。一実施形態では、前記サイトカインがインターロイキン-12である。別の実施形態では、樹状細胞はヒト血中単球から得られる。別の実施形態では、前記非樹状細胞が、前記哺乳動物に由来する非樹状細胞の初代培養から得られる。別の実施形態では、腫瘍細胞が、前記哺乳動物に由来する腫瘍細胞の初代培養から得られる。別の実施形態では、前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって自家性である。別の実施形態では、前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である。別の実施形態では、前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系であり、前記非樹状細胞が前記哺乳動物と同じMHCクラスIハプロタイプを有する。ある実施形態では、抗原提示細胞が普遍的抗原提示細胞(セクション4.7を参照)である。別の実施形態では、前記哺乳動物がヒトである。別の実施形態では、前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群から選択される。
【００２８】
この方法の別の実施形態では、治療または予防される癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の前癌病変を治療する方法を提供し、前記方法は、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と、前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞との融合によって形成され、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する。特定の実施形態では、前癌細胞のゲノムDNAを含有する前記非樹状細胞が、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原を提示する。より具体的な一実施形態では、前記抗原は前記前癌病変に特異的なものである。具体的な一実施形態では、ゲノムDNAがそれから抽出される前癌細胞が、前癌病変を構成する細胞型と同じ細胞型のものである。別のある実施形態では、前記前癌細胞が、前記前癌病変から単離される。別のある実施形態では、この方法は、体液性免疫応答または細胞傷害性T細胞免疫応答を刺激する分子の投与をさらに含む。一実施形態では、前記分子がサイトカインである。一実施形態では、前記サイトカインがインターロイキン-12である。別の実施形態では、樹状細胞がヒト血中単球から得られる。別の実施形態では、前記非樹状細胞が、前記哺乳動物に由来する非樹状細胞の初代培養から得られる。別の実施形態では、ゲノムDNAがそれから抽出される前記前癌細胞が、前記哺乳動物から得られた前癌細胞の初代培養から得られる。別の実施形態では、前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって自家性である。別の実施形態では、前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である。別の実施形態では、前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系であり、前記非樹状細胞が、前記哺乳動物と同じMHCクラスIハプロタイプを有する。ある実施形態では、抗原提示細胞が普遍的抗原提示細胞(セクション4.7を参照)である。別の実施形態では、哺乳動物がヒトである。別の実施形態では、前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群から選択される。
【００３０】
別の実施形態では、前記前癌病変が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される癌の前駆物である。
【００３１】
本発明は、ヒト抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含むヒト非樹状細胞とを融合させる方法をさらに提供し、この方法は、抗原提示細胞の集団および非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件下に置くことを含む。一実施形態では、前記非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって自家性である。別の実施形態では、細胞融合が電気融合によって達成される。別の実施形態では、この方法は、融合細胞の集団を不活性化するステップをさらに含む。別の実施形態では、融合細胞の集団の不活性化が、これらの細胞にγ線照射することによって達成される。ある実施形態では、活性な腫瘍細胞または前癌病変の細胞のいかなる混入も回避するため、ゲノムDNAまたはmRNAを抽出する前に、腫瘍細胞または前癌病変の細胞をγ線照射によって不活性化する。
【００３２】
本発明は、1つまたは複数の容器に、抗原提示細胞の集団と、非樹状細胞の集団と、腫瘍細胞または前癌細胞のゲノムDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための、および、それを必要とする哺乳動物に投与するために前記抗原提示細胞を非樹状細胞と融合させるための説明書とを含むキットをさらに提供する。一実施形態では、このキットは、体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群から選択された免疫応答を刺激する分子と、癌を予防または治療するためにこのキットを使用するための説明書とをさらに含む。一実施形態では、前記分子がサイトカインである。別の実施形態では、前記サイトカインがIL-12である。別の実施形態では、キットが、電気融合に適したキュベットをさらに含む。別の実施形態では、抗原提示細胞が凍結保存されている。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含む非樹状細胞に融合させた樹状細胞を含む融合細胞を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、非樹状細胞は、初代細胞培養から新たに単離または得られる。ある実施形態では、腫瘍細胞または前癌細胞は、初代細胞培養から得られる。別の実施形態では、医薬組成物が、体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群から選択された免疫応答を刺激する分子をさらに含む。別の実施形態では、前記分子がサイトカインである。別の実施形態では、前記分子がIL-12である。別の実施形態では、樹状細胞が前記哺乳動物にとって自家性である。別の実施形態では、非樹状細胞が前記哺乳動物にとって自家性である。別の実施形態では、腫瘍細胞または前癌細胞が、治療される被験体から得られる。別の実施形態では、樹状細胞がヒト細胞である。別の実施形態では、非樹状細胞がヒト細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞、または前癌細胞、または腫瘍細胞が、予防すべき癌または前癌病変を構成する細胞型と同じ細胞型である。別の実施形態では、前癌細胞または腫瘍細胞が、治療すべき前癌病変または癌と同じ細胞型である。別の実施形態では、前癌細胞が、前記哺乳動物にとって自家性である前癌病変から単離され、前記前癌病変が予防すべき癌の前駆物である。別の実施形態では、前癌細胞が、前記組成物で治療すべき哺乳動物の前癌病変から単離される。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含む非樹状細胞に融合した樹状細胞を含む融合細胞を提供する。好ましい一実施形態では、樹状細胞、非樹状細胞、および腫瘍細胞または前癌細胞がヒト細胞である。本発明は、少なくとも10%から15%の細胞が融合しており、好ましくは20%から30%の細胞が融合している、融合細胞の集団も包含する。ある実施形態では、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の細胞が融合している。ある実施形態では、最大10%まで、最大20%まで、最大30%まで、最大40%まで、最大50%まで、最大60%まで、最大70%まで、最大80%まで、最大90%まで、または最大95%までの細胞が融合している。
【００３５】
本明細書で使用される場合、サイトカインなどの化合物が融合細胞などの別の化合物と共に「同時投与される」、または「併用」投与されると言及されるのは、両方の化合物の生理作用、または、両方の化合物の血清中濃度の上昇が同時に測定できる場合である。内因性サイトカイン産生のレベルを増強する化合物を用いて、「同時投与」または「併用」された場合、内因的に産生されたサイトカイン、および投与されたもう一方の薬剤(すなわち融合細胞)の血清中濃度も、同時に測定できる。したがって、化合物は、別々の組成物または混合組成物として同時に投与してもよく、あるいは、それらの血清中レベルの上昇が投与期間中のある時点で同時に観測できるという条件で、それらを逐次的に投与してもよい。
【００３６】
別段の言及がない限り、本明細書において、「併用療法」および「複合療法」という用語は、対象となる融合細胞と、CTL応答および/または体液性免疫応答を刺激する分子との同時投与を用いた治療処方計画を記述するのに使用し、その際、その治療処方計画によって癌が予防され、それは、例えば、形成する腫瘍細胞の数が減少していることを実証すること、または、遺伝学的に患者の前癌病変または腫瘍を発生する素因を有する患者で前癌病変もしくは腫瘍が発生しないこと、ならびに、1つもしくは複数の前癌病変が腫瘍に進行しないか、もしくは進行の速度が低下していることによって測定できる。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、1つまたは複数の容器に、抗原提示細胞の集団を含有する試料と、癌の予防にそれを使用するための説明書とを含むキットを提供する。別の実施形態では、キットは、電気融合に適したキュベットをさらに含む。別の実施形態では、抗原提示細胞が凍結保存されている。さらに別の実施形態では、キットは、体液性免疫応答および/または細胞傷害性T細胞応答を刺激する分子を含む。より好ましい一実施形態では、刺激分子がサイトカインであり、これは、限定されるものではないが、インターロイキン-12などである。
【００３８】
本発明の方法は、腫瘍、癌、新生物疾患および/または前癌病変を治療および/または予防するのに使用できる。ある実施形態では、本発明の方法は、患者体内での癌細胞、腫瘍細胞、または前癌病変の細胞の成長を抑制または低減させるのに使用される。ある実施形態では、本発明の方法は、患者において治療すべき癌または新生物疾患に対する、患者の免疫応答を刺激または増大させるのに使用される。
【００３９】
他の実施形態では、本発明の方法は、感染症の治療および予防に関する。本発明の、感染症を治療または予防する方法は、感染症の治療または予防がされるべき被験体に融合細胞を投与することを含み、その際、融合細胞は、感染性因子から、あるいは感染性因子に感染した細胞から抽出されたゲノムDNAを含む非樹状細胞に抗原提示細胞を融合させることによって生成される。本発明の方法では、様々な非樹状細胞を用いてもよい。好ましい一実施形態では、非樹状細胞が、治療される被験体から得られる。ある実施形態では、融合細胞が、治療される被験体のMHCクラスIアレルと同一のMHCクラスIアレルを少なくとも1つ含む。好ましい一実施形態では、前記ゲノムDNAが、治療される被験体が感染しているか、または感染する危険にある感染性因子と同じ種からのゲノムDNAを含有する。より具体的な一実施形態では、治療される被験体から感染性因子を取得する。
【００４０】
本発明は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞に由来するcDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞の投与によって、癌を予防する方法をさらに提供し、その際、これらの融合細胞が、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激する分子と共に併用投与されることもある。本発明は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、前記感染症を引き起こす感染性因子または前記感染性因子に感染した細胞に由来するcDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞の投与によって、感染症を治療または予防する方法を提供し、その際、これらの融合細胞が、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激する分子と共に併用投与されることもある。
【００４１】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物の癌を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、その際、普遍的抗原提示細胞は、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)癌細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する。
【００４２】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物の癌を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の融合細胞を投与することを含み、その際、融合細胞は、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する。
【００４３】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物の癌を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、その際、普遍的抗原提示細胞は、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する。
【００４４】
ある実施形態では、本発明は、ヒト抗原提示細胞とヒト非樹状細胞とを融合させる方法を提供し、この方法は、抗原提示細胞の集団および非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件下に置くことを含み、ここで、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが癌に関連した抗原をコードする。
【００４５】
ある実施形態では、本発明は、抗原提示細胞および非樹状細胞の融合細胞を提供し、その際、融合細胞が、腫瘍細胞に関連した抗原をコードするcDNAを含む。
【００４６】
ある実施形態では、本発明は、1つまたは複数の容器に、(i)抗原提示細胞の集団と、(ii)非樹状細胞の集団と、(iii)それを必要とする哺乳動物に投与するために前記抗原提示細胞を非樹状細胞と融合させるための説明書とを含むキットを提供する。
【００４７】
ある実施形態では、本発明は、抗原提示細胞および非樹状細胞を含む融合細胞を含む医薬組成物を提供し、その際、非樹状細胞は、腫瘍細胞に関連した抗原をコードする少なくとも1つのcDNAを含む。
【００４８】
3.1 図面の簡単な説明
（下記を参照）
3.2 略語および約束事
略語
MC38   マウス結腸腺癌細胞系
CTL    細胞傷害性Tリンパ球
DC     樹状細胞
FC     融合細胞
本明細書で使用される場合、「ゲノムDNA」という用語は、細胞の遺伝的性質を構成する細胞中のいかなるDNA配列も意味し、染色体DNAに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
4. 本発明の詳細な説明
本発明は、被験体の癌および前癌病変を予防および治療するための方法を提供し、この方法では、融合細胞が被験体に投与され、前記融合細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成される。予防量または治療量のそのような融合細胞を、そのような予防または治療を必要とする被験体に投与する。ある実施形態では、そのような融合細胞を、治療上有効な量の、体液性免疫応答および/または傷害性Tリンパ細胞応答(CTL)を刺激する分子と共に併用投与する。好ましい一実施形態では、本発明は、治療上有効な量の融合細胞を、限定されるものではないがIL-12などのサイトカインと共に併用投与することを含む方法に関する。
【００５０】
本明細書に記載の方法によれば、樹状細胞などの抗原提示細胞が、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞に融合され、前記非樹状細胞は、予防または治療すべき癌の抗原特性を含有する。理論に拘泥するものではないが、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAは、治療すべき癌の抗原またはエピトープ特性をコードする。他の実施形態では、非樹状細胞において、そして、非樹状細胞との樹状細胞の融合の際に、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAが、それぞれ治療または予防されるべき癌または前癌病変でもレベルが上昇しているタンパク質の、上昇したレベルでの発現を引き起こす。この結果得られる、抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞とを含む融合細胞が、融合細胞によって発現される抗原を含む腫瘍を予防するための有効な組成物として使用される。
【００５１】
本発明のある実施形態では、融合細胞は、腫瘍または前癌病変の抗原性を示す1つまたは複数の分子を含有する。本発明のある実施形態では、融合細胞が、腫瘍または前癌病変の1つまたは複数の抗原またはエピトープを含有する。ある実施形態では、その抗原が、腫瘍または前癌病変に関連している。ある実施形態では、腫瘍または前癌病変において、その腫瘍または前癌病変を有する被験体のいかなる他の組織よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いレベルでその抗原が発現される。ある実施形態では、腫瘍または前癌病変において、その腫瘍または前癌病変が由来する組織または細胞型よりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いレベルでその抗原が発現される。特定の腫瘍または癌に関連している抗原の例をセクション4.8に示す。腫瘍関連抗原または癌関連抗原には、p53およびその変異体、Rasおよびその変異体、Bcr/Ablブレークポイントペプチド、HER-2/neu、HPV E6、HPV E7、癌胎児抗原、MUC-1、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV、p15、gp100、MART-1/MelanA、チロシナーゼ、TRP-1、β-カテニン、MUM-1、およびCDK-4が含まれるが、これらに限定されない。他の腫瘍関連腫瘍抗原には、KS 1/4全癌抗原(PerezおよびWalker、1990、J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal、1988、Hybridoma 7(4):407-415); 卵巣癌抗原(CA125)(Yuら、1991、Cancer Res. 51(2):468-475); 前立腺酸性リン酸(Tailerら、1990、Nucl. Acids Res. 18(16):4928); 前立腺特異抗原(HenttuおよびVihko、1989、Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeliら、1993、Cancer Res 53:227-230); 黒色腫関連抗原p97(Estinら、1989、J. Natl. Cancer Inst. 81(6):445-446); 黒色腫抗原gp75(Vijayasardahlら、1990、J. Exp. Med.171(4):1375-1380); 高分子量黒色腫抗原(Nataliら、1987、Cancer 59:55-63)、および前立腺特異的膜抗原が含まれる。特定の、より具体的な一実施形態では、融合細胞と、腫瘍または前癌病変との間で共通の抗原またはエピトープがその腫瘍または前癌病変に特異的である。
【００５２】
一実施形態では、前癌細胞に関する場合に通常そうであるように、特異的抗原が容易に同定できない場合に、このアプローチが有利である。ヒト癌の予防には、例えば、患者の前癌病変から直接、例えば生検によって前癌細胞を得る。次に、ゲノムDNAを前癌細胞から抽出し、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションする。この場合、そのような非樹状細胞と抗原提示細胞とから形成される融合細胞、およびそのような融合細胞を含む組成物は、予防すべき癌に高い特異性を示す。
【００５３】
ある実施形態では、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションする前に、腫瘍細胞または前癌病変の細胞から抽出されたゲノムDNAを増幅する。腫瘍細胞または前癌病変からのゲノムDNAの増幅は、生検によって得られた組織の量が非常に少ない場合に必要となることがある。ある実施形態では、ゲノムDNAは、全ゲノム増幅(Whole Genome Amplification)(WGA)を用いて増幅する。より具体的な一実施形態では、WGAは、ランダムオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて行う。ある実施形態では、ゲノムDNAは、MDA(multiple displacement amplification)法を用いて増幅する(例えば、Deanら、2002、PNAS 99(8):5261-5266を参照)。具体的な一実施形態では、ゲノムDNAを増幅するのに、GenomiPhi(商標)(Amersham Biosciences社)を用いる。
【００５４】
癌および前癌病変を治療および予防する方法を以下に記述する。詳細には、セクション4.1.1および4.1.2は、本発明の方法でゲノムDNAの供給源として使用できる前癌細胞および腫瘍細胞と、抗原提示細胞との融合に使用できる非樹状細胞と、非樹状細胞との融合に使用できる抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞と抗原提示細胞との融合によって形成された本発明で使用される融合細胞とについて、加えて、これらの細胞の単離、調製、および/または作製の方法について記述する。そのような組成物を使用して治療または予防できる標的の癌は、下記セクション4.12に記載されている。
【００５５】
ある実施形態では、融合細胞の作製に使用される抗原提示細胞が自家性であり、非樹状細胞が自家性または異種性である。ある実施形態では、融合細胞の作製に使用される非樹状細胞が自家性であり、抗原提示細胞が自家性または異種性である。ある実施形態では、MHCに関して、非樹状細胞、樹状細胞、またはこれらの両方が、治療される被験体と一致している。ある実施形態では、少なくとも1つのMHCクラスIアレルが、樹状細胞もしくは非樹状細胞またはこれら両方と、治療される被験体との間で共通である。ある実施形態では、抗原提示細胞が普遍的抗原提示細胞である(セクション4.7を参照)。
【００５６】
本発明は、被験体の癌および前癌病変を予防および治療する方法を提供し、その方法では、融合細胞を被験体に投与し、その際、融合細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたmRNAから合成された相補DNA分子(「cDNA」)を含有する非樹状細胞とを融合させることによって形成される。そのような融合細胞は、そのような予防または治療を必要とする被験体に投与する。ある実施形態では、そのような融合細胞を、体液性免疫応答および/または傷害性Tリンパ細胞応答(CTL)を刺激する分子と共に併用投与する。
【００５７】
本発明は、本発明の方法で使用できる融合細胞にも関する。ある実施形態では、本発明の融合細胞は、樹状細胞または普遍的抗原提示細胞(セクション4.7を参照)などの抗原提示細胞と、非樹状細胞とを融合させることによって形成された融合細胞であり、その際、非樹状細胞は、癌細胞または前癌病変の細胞から抽出されたゲノムDNA;癌細胞または前癌病変の細胞に由来するcDNAもしくはcDNAライブラリー;腫瘍関連抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体;感染性因子から抽出されたゲノムDNA;感染性因子に感染している細胞から抽出されたゲノムDNA;感染性因子に由来するcDNA;感染性因子に感染している細胞に由来するcDNA;または、感染性因子に特異的な抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体を含む。ある実施形態では、本発明の融合細胞は、治療または予防すべき癌の1つまたは複数の抗原を発現する。ある実施形態では、本発明の融合細胞は、治療または予防すべき感染性因子の1つまたは複数の抗原を発現する。
【００５８】
ある実施形態では、本発明の融合細胞は、腫瘍細胞からのゲノムDNAまたはcDNAを含有する非樹状細胞と普遍的抗原提示細胞とを融合させることによって形成される。そのような普遍的抗原提示細胞については、セクション4.7で記述する。
【００５９】
本発明のある実施形態では、非樹状細胞を抗原提示細胞に融合させる前に、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子から得られたmRNAを非樹状細胞に導入する。そのような融合細胞は、その後、上述の通り、それぞれ癌または感染症の治療および予防に使用することができる。ある実施形態では、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子から単離されたmRNAから調製されたcDNAを用いてmRNAを転写し、その後、これを非樹状細胞に導入することができる。ある実施形態では、腫瘍関連抗原、または感染性因子に特異的な抗原をコードするmRNAを非樹状細胞に導入する。腫瘍関連抗原については、セクション4.8で記述する。
【００６０】
本発明のある実施形態では、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子から得られたmRNAを普遍的抗原提示細胞(セクション4.7を参照)に導入する。そのような普遍的抗原提示細胞は、その後、融合細胞に関して上述した通り、それぞれ癌または感染症の治療および予防に用いることができる。ある実施形態では、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子から単離されたmRNAから調製されたcDNAを用いてmRNAを転写し、その後、これを普遍的抗原提示細胞に導入することができる。ある実施形態では、腫瘍関連抗原、または感染性因子に特異的な抗原をコードするmRNAを普遍的抗原提示細胞に導入する。
【００６１】
4.1 腫瘍細胞からのゲノムDNAで形質転換された非樹状細胞
腫瘍細胞または前癌細胞から抽出されたゲノムDNAを含有する非樹状細胞を抗原提示細胞と融合させるのに、様々なタイプの非樹状細胞、および様々な起源からの非樹状細胞を用いることができる。ゲノムDNAは、様々な起源から、当業者に知られている任意の方法で得ることができる。ゲノムDNAは、当業者に知られている任意の方法で、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションすることができる。
【００６２】
融合細胞を作製するための本発明の方法で使用される非樹状細胞は、ゲノムDNAを用いて形質転換またはマイクロインジェクションすることが可能なものでなくてはならず、かつ、樹状細胞に融合させることが可能なものでなくてはならない。ある非樹状細胞が本発明の方法に適しているかどうか判定するために、当業者に知られているいかなる方法を用いることもできる。ある非樹状細胞が本発明の方法での使用に良く適しているかどうかを判定するのに、いくつかの基準を用いることができる。一態様では、本発明の方法で使用される非樹状細胞は、ゲノムDNAでトランスフェクトまたはマイクロインジェクションすることが可能なものであるべきである。別の態様では、非樹状細胞は、樹状細胞に融合させることが可能なものである。別の態様では、本発明の方法で使用される非樹状細胞の、培養中で増殖する能力も、考慮されるべき因子である場合もある。
【００６３】
ある実施形態では、非樹状細胞が、治療される被験体の種と異なった種に由来する。別法では、非樹状細胞が、治療される被験体の種と同じ種に由来する。ある実施形態では、非樹状細胞が、治療される被験体にとって異種である。他の実施形態では、非樹状細胞が、治療される被験体にとって自家性である。ある実施形態では、非樹状細胞が、細胞培養中で維持され、かつ/または増殖する。
【００６４】
ある実施形態では、抗原提示細胞が由来する種と異なった種に、非樹状細胞が由来する。別法では、抗原提示細胞が由来する種と同じ種に、非樹状細胞が由来する。非樹状細胞が初代細胞培養から得られたものである場合があり、この初代細胞培養は、融合細胞の調製に使用される抗原提示細胞の起源に応じて、被験体にとって自家性、同系、または同種異系でありうる。一実施形態では、樹状細胞が患者にとって同種異系である場合、この非樹状細胞は、治療される哺乳動物と同じクラスI MHCハプロタイプであるMHC Iアレルを少なくとも1つ有するものでありうる。別の実施形態では、樹状細胞が患者にとって自家性である場合、非樹状細胞は、治療される哺乳動物にとって同種異系または自家性でありうる。
【００６５】
別の実施形態では、適当な非樹状細胞が、好ましくはレシピエントから単離され、あるいは、それよりは好ましくないが、少なくとも1つのMHCアレル、好ましくはクラスI MHCハプロタイプを、意図されているレシピエントと共有し、かつ、予防される癌の前癌病変を保持する、家族の一員または個体から単離される。
【００６６】
同種異系の抗原提示細胞が使用される場合、同種異系の抗原提示細胞との融合細胞を産生するのに使用される非樹状細胞は、哺乳動物で免疫応答を誘発するために、少なくとも1つの共通のMHCアレルを有するものでなければならない。最も好ましいのは、意図されたレシピエントから得られた非樹状細胞であり、すなわち、この前癌性の非樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与されることになっている患者にとって自家性である。一実施形態では、自家性ではないが、レシピエントの標的前癌性細胞または癌細胞と少なくとも1つのMHCアレルを共有する非樹状細胞を使用する場合がある。同一個体または同系個体から非樹状細胞が得られる場合、そのような細胞は、同じクラスI MHCハプロタイプを有するであろう。それらがすべて同一の被験体または同系供給源から得られない場合、血清学的試験およびMHC遺伝子座のDNA分析などの当技術分野で周知の標準的なHLA型判定技法によってMHCハプロタイプを決定することができる。MHCハプロタイプ判定は、本発明の融合細胞を産生する手順を実行する前に実行する必要はない。
【００６７】
具体的な一実施形態では、非樹状細胞が線維芽細胞である。さらに具体的な一実施形態では、非樹状細胞がNIH 3T3細胞である。具体的な一実施形態では、非樹状細胞は単離されている。さらに具体的な一実施形態では、非樹状細胞が精製されている。
【００６８】
非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションするためのゲノムDNAは、癌細胞、腫瘍細胞、または前癌病変から得ることができる。ある実施形態では、ゲノムDNAは、被験体で治療される腫瘍、癌、または前癌病変と同じ種類の腫瘍、癌、または前癌病変から取得する。ある実施形態では、被験体で治療される腫瘍、癌、または前癌病変が発生した組織型と同じ組織型から発生した腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムDNAを取得する。ある実施形態では、培養した腫瘍細胞からゲノムDNAを取得する。ある実施形態では、治療される被験体とは異なった被験体の腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムDNAを抽出する。好ましい一実施形態では、治療される被験体の腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムDNAを抽出する。好ましい一実施形態では、被験体で治療される腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムDNAを抽出する。
【００６９】
ある実施形態では、生検を用いて被験体から取得された腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムDNAを抽出する。より具体的な一実施形態では、腫瘍、癌、または前癌病変の細胞が、穿刺生検を用いて取得されたものである。より具体的な一実施形態では、腫瘍、癌、または前癌病変の細胞が、治療される被験体から生検によって取得された。
【００７０】
当業者に知られているいかなる方法も、腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムDNAを抽出するのに用いることができる。ゲノムDNAを単離するための例示的方法が、「Short Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons社、1999のユニット2.2.に記載されている。あるある実施形態では、DNAの剪断を回避するために、ゲノムDNAの処理を極めて穏やかに行う。他の実施形態では、より小さいDNA断片を得るために、ゲノムDNAを剪断する。ある実施形態では、いかなるタンパク質性物質もDNAから除去するために、DNアーゼ不含プロテアーゼでDNAを処理する。他の実施形態では、ゲノムDNAをプロテアーゼで処理せずに、代わりに、ゲノムDNAに結合しているタンパク質を乱さないように注意する。ある実施形態では、DNアーゼ不含RNアーゼでDNAを処理する。
【００７１】
ゲノムDNAは、当業者に知られているいかなる方法を用いて非樹状細胞に導入することもできる。ある実施形態では、ゲノムDNAを、非樹状細胞内にトランスフェクトする。より具体的な一実施形態では、リポフェクションを用いて、ゲノムDNAを非樹状細胞にトランスフェクトする。非樹状細胞にゲノムDNAを導入するための例示的方法が、「Short Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons社、1999の第9章に記載されている。
【００７２】
非樹状細胞内に導入されるゲノムDNAの最適な量は、当業者に周知の標準的な技法によって決定することができる。ある実施形態では、複数の異なった集団の融合細胞を生成させるが、その際、異なった集団相互における唯一の相違は、非樹状細胞に導入されたゲノムDNAの量である。その後、腫瘍の予防または治療における、それらの異なった集団の融合細胞の有効性を試験する。腫瘍の予防または治療における、本発明の融合細胞の有効性を試験する方法に関しては、セクション5の記述を参照されたい。他の実施形態では、in vitroアッセイを用いて融合細胞を試験する(セクション4.11を参照)。ある実施形態では、非樹状細胞1細胞あたりに導入されるゲノムDNAの量が、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも1ゲノム当量(the equivalent of 1 genome)、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも10-1ゲノム当量、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも10-2ゲノム当量、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも10-3ゲノム当量、腫瘍細胞もしくは前癌性細胞の少なくとも10-4ゲノム当量、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも10-5ゲノム当量、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも10-6ゲノム当量、または腫瘍細胞もしくは前癌細胞の少なくとも10-7ゲノム当量に相当する。ある実施形態では、非樹状細胞1細胞あたりに導入されるゲノムDNAの量が、腫瘍細胞または前癌細胞の最大1ゲノム当量まで、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-1ゲノム当量まで、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-2ゲノム当量まで、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-3ゲノム当量まで、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-4ゲノム当量まで、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-5ゲノム当量まで、腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-6ゲノム当量、または腫瘍細胞もしくは前癌細胞の最大10-7ゲノム当量までに相当する。
【００７３】
ゲノムDNAがその中に導入された非樹状細胞を同定および単離するのに、いかなる方法を用いることもできる。ある実施形態では、ゲノムDNAと同時に、マーカー遺伝子をコードするDNAを非樹状細胞に導入する。マーカー遺伝子に関して陽性の細胞は、ゲノムDNAも有する。当業者に知られているいかなるマーカー遺伝子も使用できる。マーカー遺伝子の例示的な例には、その遺伝子産物が特定の抗生物質に対する耐性(例えばネオマイシン耐性)を細胞に与える遺伝子、通常、増殖するためにその細胞によって必要とされる物質を欠失した培地中で細胞が増殖するのを、その遺伝子産物が可能にする遺伝子、または、視覚的マーカーを、その遺伝子産物がコードする遺伝子が含まれる。本発明の方法で使用できる視覚的なマーカーの1つが、例えばGFPである。視覚的なマーカーをコードするDNAおよびゲノムDNAが導入された細胞は、FACSを用いて単離することができる。
【００７４】
ある実施形態では、マイクロインジェクションを用いてゲノムDNAを非樹状細胞に導入する。
【００７５】
ある実施形態では、ゲノムDNAを増殖させるために、ゲノムDNAの断片をベクター中にパッケージングする。そのようなベクターには、バクテリオファージ、コスミド、またはYACが含まれるが、これらに限定されない。ゲノムDNAをパッケージングして、増殖させるための、当業者に知られているいかなる方法も使用できる。
【００７６】
理論に拘泥するものではないが、ひとたび非樹状細胞にゲノムDNAが導入されれば、非樹状細胞は、ゲノムDNAがそれから単離された腫瘍細胞、新生物細胞、または前癌病変の細胞によって発現される1つまたは複数の抗原を発現する。本発明のある実施形態では、腫瘍または前癌病変の抗原性を示す1つまたは複数の分子を、融合細胞が含有する。他の実施形態では、その抗原は腫瘍または前癌病変に関連したものである。ある実施形態では、腫瘍または前癌病変において、その腫瘍または前癌病変を有する被験体のいかなる他の組織よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いレベルでその抗原が発現される。ある実施形態では、腫瘍または前癌病変において、その腫瘍または前癌病変が由来する組織または細胞型でよりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いレベルでその抗原が発現される。ある実施形態では、融合細胞、および腫瘍細胞または前癌細胞は、その腫瘍細胞または前癌細胞に特有であって、かつ、治療される被験体におけるいかなる他の組織にも存在しない少なくとも1つのエピトープを共通に共有する。理論に拘泥するものではないが、そのようなエピトープは、前癌細胞または腫瘍細胞のゲノムにおける突然変異誘発事象によって前癌細胞または腫瘍細胞で発現されるものである。特定の、より具体的な実施形態では、融合細胞と、腫瘍または前癌病変との間で共通の抗原またはエピトープが、その腫瘍または前癌病変に特異的である。
【００７７】
ある実施形態では、ゲノムDNAを含む細胞の同定、濃縮、および/または単離を容易にするために、ゲノムDNAを、マーカー遺伝子と共に非樹状細胞に導入する。ある実施形態では、ゲノムDNAおよびマーカー遺伝子で、非樹状細胞に同時トランスフェクトを行う。他の実施形態では、ゲノムDNAおよびマーカー遺伝子を非樹状細胞に同時注入する。ゲノムDNAを含有し、かつマーカーも含有する細胞は、マーカー遺伝子の性質に応じて、そのマーカーの存在について選択性のある培地中で増殖させることによって、選択することができる。マーカーが細胞に生物発光を与えるものである場合、FACSを用いてトランスフェクト細胞を選択することができる。
【００７８】
4.1.1 前癌細胞
ゲノムDNAがそれから単離される前癌細胞は、正常細胞と前癌細胞とを識別する少なくとも1つのアレルを有するいかなる前癌細胞でもよい。そのような前癌細胞は、限定されるものではないが、予防処置を必要とする患者の前癌病変などの様々な起源から単離できる。そのような前癌細胞を単離および調製する方法を、本明細書中の下記に詳述する。
【００７９】
前癌細胞の起源は、予防される癌に従って選択される。好ましくは、前癌細胞は、治療される患者にとって自家性である。この方法では前癌性細胞のゲノムDNA全体を使用するので、この方法を実施する前に、いかなる抗原も、単離または特徴付けする必要がなく、さらにそれらの正体を知る必要さえもない。具体的な一実施形態では、前癌性細胞のゲノムDNAは、前癌性細胞に特異的な少なくとも1つの抗原をコードする。
【００８０】
ある実施形態では、本発明は、前癌細胞、そして、それから発生する癌細胞によって発現される少なくとも1つの抗原、例えば、そのような前癌性細胞またはそれから発生する癌細胞に対して免疫応答を誘発できる腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原を発現する融合細胞を提供する。本発明の一実施形態では、ゲノムDNAを抽出するのに、前癌病変、または前癌病変の組織から単離された細胞を使用し、次に、これらを非樹状細胞に導入する。本発明の方法で治療可能な癌の非限定的な例をセクション4.12に示す。
【００８１】
前癌細胞の単離は、いかなる前癌病変の外科的切除術または生検によって行ってもよく、そのような前癌病変の多くが当技術分野で知られている。一実施形態では、例えば、食道腺癌の前駆物である、バーレット化生(Barrett's metaplasia)と呼ばれる医学的に認識されている前癌病変の外科的切除または生検によって、前癌細胞を単離する。この病変は通常、胃と食道との接合部領域で見出される異種病変である。そのような病変から単離された前癌性細胞クローンは、例えば、p53変異、p16変異、および異数性を含めた遺伝的および生物学的な異質性を示す。これらの変化には、細胞増殖、分化、およびアポトーシスにおける個別的な変化が伴い、それらが、正常細胞から化生-異形成-腺癌ステージを経た進行の基礎となり、これによって、前癌細胞が腫瘍細胞に変化する。同様に、胃噴門の腸上皮化生は、胃噴門腺癌の前癌病変であると提案されている(例えば、Jankowskiら、1999、「Molecular Evolution of the Metaplasia - dysplasia - adenocarcinoma Sequence in the Esophagus」、Am. J. Pathol. 154(4):965-73; Jankowskiら、2000、「Barrett's Metaplasia」、Lancet 356(9247):2079-85; Haringsmaら、2001、「Autofluorescence Endoscopy: Feasibility of Detection of GI Neoplasms Unapparent to White Light Endoscopy with an Evolving Technology」、Gastrointest Endosc 53(6):642-50;および、Ruolら、2000、「Intestinal Metaplasia is the Probable Common Precursor of Adenocarcinoma in Barrett Esophagus and Adenocarcinoma of the Gasric Cardia」、Cancer 88(11):2520-28)。
【００８２】
別の実施形態では、胃腸管ポリープの外科的切除または生検によって前癌細胞を単離するが、胃腸管ポリープは、多くの場合、経時的に腺癌へと進行する前癌病変を表す。そのようなポリープを同定および切除する方法は当技術分野で周知である。そのようなポリープは、散発性結直腸癌の発生の際に、遺伝性疾患である家族性大腸腺腫症(FAP)、遺伝性非ポリポーシス大腸癌(HNPCC)、および若年性ポリポーシス(JFS)の発生および進行の際に生じる(例えば、Souza, A、2001、「Molecular Rationale for the How, When, and Why of Colorectal Cancer Screening」、Ailment Pharmacol Ther 15(4): 451-62)。FAPおよびHNPCCは、遺伝性結直腸癌の明確に定義された2つの形態を表す。すなわち、(a)家族性大腸腺腫症(FAP)は、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)遺伝子の生殖細胞系変異によって引き起こされ、そして、(b)遺伝性非ポリポーシス大腸癌(HNPCC)は、ミスマッチ修復遺伝子の生殖細胞系変異によって引き起こされる(Boland C.R.、「Malignant tumors of the colon」、Textbook of Gastroenterology、第2版、(Yamada T編)、1967-2026(J.B.Lippincot Company社、Philadelphia(1995)); Kinzlerら、1991、「Identification of FAP locus genes from chromosome 5q21」、Science 253:661-665; Lynchら、1996、「Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer(Lynch Syndrome); An updated review」、Cancer 78:1149-1167; Peltomakiら、1997、「Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectal Cancer: database and results of a collaborative study」、Gastroenterology 113:1146-1158)。これらの遺伝性結腸直腸癌は、それらの早期発症および高死亡率を特徴とする。すべてのFAP患者において、患者年齢中央値16歳で腺腫性ポリープが発生し、実質的にすべての罹患者が、年齢中央値39歳までに癌を発症する(Boland C.R.、「Malignant tumors of the colon」、Textbook of Gastroenterology、第2版、(Yamada T編)、1967-2026(J.B.Lippincot Company社、Philadelphia(1995))。APC遺伝子の変異は、散発性大腸癌患者の70〜80 %でも観測されている(Nakamura Y.、1997、「Cleaning up on β-catenin」、News & Views. Nature Medicine 3, 499-500)。
【００８３】
さらに別の実施形態では、管内上皮異形成の外科的切除または生検によって前癌細胞を単離するが、管内上皮異形成は、腎細胞癌の、医学的に認識されている最も一般的な前駆物である。この実施形態の別の態様では、フォンヒッペルリンドウ症候群の詳細な記載のある前癌病変のうち1つまたは複数の外科的切除または生検によって前癌細胞を単離する。この疾患では、前癌性の単純な嚢胞から、上皮過形成に伴う異形の嚢胞を経て、嚢胞性または固形の腎細胞癌に進行する変化が存在する。さらに、前癌性の腺腫性病変から癌腫に進行する発生順序は、乳頭状腎細胞癌でも観測された。したがって、そのような前癌病変の腺腫性病変は、前癌病変の非樹状細胞を単離するための有用な供給源である(例えば、VanPoppelら、「Precancerous Lesions in the Kidney」、Scand. J. Urol. Nephrol. Suppl 205:136-65(2000)参照)。
【００８４】
別の実施形態では、スクリーニングのための内視鏡的逆行性胆道膵管造影(ERCP)操作の間に検出された異形成の外科的切除によって、または、好ましくは生検によって、前癌細胞を単離する。ERCPスクリーニングは、家族性膵臓癌の場合、および遺伝性膵炎の場合に追及され、遺伝性膵炎は、40%の確率で一生の間に膵管腺癌を発生する危険を伴っている(例えば、Howesら、「Screening for Early Pancreatic Ductal Adenocarcinoma in Hereditary Pancreatitis」、Med Clin. North Am. 84(3):719-38(2000);および、Brentnall、「Cancer Surveillance of Patients from Familial Pancreatic Cancer Kindreds」、Med. Clin. North Am. 84(3):707-18(2000)を参照のこと)。
【００８５】
別の実施形態では、日光角化症、良性母斑、および異形成母斑の外科的切除または生検によって前癌細胞を単離する。ボーエン病(上皮内扁平上皮癌)に特徴的な日光角化症および前癌病変は、扁平上皮癌(SSC)の発生への前駆物である非癌性の細胞を提供し、一方、良性母斑および異形成母斑は、悪性黒色腫の潜在的前駆物である(例えば、Glosterら、「The Epidemiology of Skin Cancer」、Dermatol. Surg. 22(3):217-26(1996);およびに、Soberら、「Precursors to Skin Cancer」、Cancer 75(2 Suppl.): 645-50(1995)を参照)。
【００８６】
別の実施形態では、乳癌へと通じる前癌病変の外科的切除術または生検によって前癌細胞を単離する。異型胆嚢管(atypical cystic duct)(ACD)と悪性腫瘍との間に観測された組織学的な連続性に基づいて、また、ACD中でのp53タンパク質の発現により、ACDが乳癌の前癌病変であると報告されている(Kusamaら、「Clinicopathological Characteristics of Atypical Cystic Duct(ACD)of the Breast: Assessment of ACD as a Precancerous Lesion」、Pathol. Int. 50(10):793-800(2000))。同様に、非面皰性の腺管上皮内癌(DCIS)病変、そして、特に面皰性の腺管上皮内癌病変は、侵襲性の乳癌を発生する高いリスク(8倍超)と関連しており、したがって、本発明で有用な前癌性の非樹状細胞を単離するための供給源である(例えば、Lawrenceら、「A High-Rish Lesion for Invasive Breast Cancer, Ductal Carcinoma in Situ, Exhibits Frequent Overexpression of Retinoid X Receptor」、Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 7(1): 29-35(1998)を参照)。
【００８７】
さらに別の実施形態では、高度の前立腺上皮内腫瘍病変の外科的切除または生検によって前癌細胞を単離するが、この病変は、特に、隣接して異形腺が伴う場合に、腫瘍発生に重要であると認識されている前癌病変である(Sakrら、「Histological Markers of Risk and the Role of High-Grade Prostatic Intraepithelial Neoplasia」、Urology 57(4):115-20(2001); Zlottaら、「Clinical Evolution of Prostatic Intraepithelial Neoplasia」、Eur. Urol. 35(5-6):498-503(1999); Alsikafiら、「High-Grade Prostatic Intraepithelial Neoplasia with Adjacent Atypia is Associated with a Higher Incidence of Cancer on Subsequent Needle Biopsy Than High-Grade Prostatic Intraepithelial Neoplasia Alone」、Urology 57(2):296-300(2001);および、Molinie、「Prostatic Intraepithelial Neoplasia」、Ann. Pathol. 21(3): 245-254(2001)を参照)。
【００８８】
さらに別の実施形態では、肺癌の前癌細胞を含むと考えられている少なくとも3つの異なった病変、すなわち、(1)上皮内扁平上皮異形成および癌;(2)異形の腺腫状過形成;および、(3)びまん性特発性肺神経内分泌細胞過形成のうちのいずれか1つの外科的切除または生検によって前癌細胞を単離する(Kerr、「Pulmonary Preinvasive Neoplasia」、J. Clin. Pathol. 54(4):257-71(2001))。
【００８９】
別の実施形態では、口腔粘膜上の白斑として現れることのある口腔白板症の外科的切除または生検によって前癌細胞を単離するが、口腔白板症は、口腔癌へと発生する高い確率を有する前癌病変として認識されている(Mao、「Leukoplakia: Molecular Understanding of Pre-malignant Lesions and Implications for Clinical Management」、Mol. Med. Today, 3(10):442-48(1997))。
【００９０】
結腸直腸癌、前立腺癌、食道癌、腎癌、膵臓癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、および口腔癌に関して、前癌細胞の特定の供給源を上記に開示したが、本発明は、これらのある実施形態に限定されない。すなわち、当業者には明白なことであるが、前癌性の組織は、過形成の組織、化生の組織、および異形成の組織として容易に特徴付けられ、そして、これらの組織は、前癌細胞を正常細胞から識別する少なくとも1つの遺伝子アレルを有する前癌細胞を含む。加えて、現在利用可能であり、さらに、ヒトゲノムの分析法として開発されるであろう遺伝子検査により、癌発生の危険性の増大に関連している特定のアレルの存在を迅速かつ正確に同定できるようになる遺伝子検査が行われる。したがって本発明の前癌性の非樹状細胞の供給源としての使用に適した前癌性の組織の同定および分析の実施は、とりわけ腫瘍学者、より詳細には分子腫瘍学の当業者には容易である。
【００９１】
ある実施形態では、前癌細胞を新たに単離せず、代わりに培養して、抗原提示細胞と融合することになっている非樹状細胞に導入するためのゲノムDNAをそれから単離する前癌細胞を選択し、それによって、前癌性ではない健康な細胞が、前癌細胞の集団に混入するのを予防または制限する。
【００９２】
好ましい一実施形態では、融合細胞含有組成物のレシピエントになる哺乳動物から外科的に摘出された前癌病変から本発明の前癌細胞を単離する。使用する前に、固形の前癌性組織または集合した前癌細胞を、標準的な技法によって、好ましくは機械的に、単個細胞浮遊液に分散させることができる。限定されるものではないが、癌細胞を分散させるのに、コラゲナーゼおよびDNアーゼなどの酵素を用いてもよい。しかし、ある実施形態では、予め細胞を分散させずに、前癌性の組織からゲノムDNAを単離する。前癌細胞を培養することになっている場合には、予め細胞を分散させるのが好ましい実施形態である。別の好ましい実施形態では、初代細胞培養、すなわち、身体から取得された原細胞の培養から本発明の前癌細胞を取得する。
【００９３】
収集される前癌細胞の量は、ゲノムDNAを含む非樹状細胞を抗原提示細胞と融合させて本発明のワクチン用の融合細胞を十分に調製するのに十分なゲノムDNA含有非樹状細胞を生成させるのに十分なゲノムDNAを単離するのに十分なものであるべきである。
【００９４】
別の実施形態では、適当な前癌細胞が、好ましくは、抑制が所望されている癌と同じ細胞型のものであり、レシピエントから、あるいは、それよりは好ましくないが、意図されているレシピエントと少なくとも1つのMHCアレル、好ましくはMHCクラスIハプロタイプを共有し、かつ、予防される癌の前癌病変を保持する、家族の一員または個体から単離される。
【００９５】
癌細胞の抗原性を有する抗原を含有する細胞など、前癌細胞は、当技術分野で知られている任意の方法で同定および単離することができる。例えば、前癌細胞は、形態解析、酵素アッセイ、増殖検定、または発癌性ウイルスの存在によって同定することができる。目的の抗原の特徴が既知の場合、前癌細胞も、当技術分野で知られている任意の生化学的または免疫学的方法によって同定または単離することができる。例えば、手術、内視鏡検査法、他の生検技法、アフィニティークロマトグラフィー、および蛍光活性化セルソーティング(例えば、蛍光タグを付けた前癌性非樹状細胞によって発現された抗原に対する抗体を用いる)によって前癌細胞を単離することができる。
【００９６】
前癌性非樹状細胞のクローン集団もしくは均質集団、または精製された集団を使用する必要はない。細胞の混合物も、その混合物中のかなりの数の細胞が、標的である前癌細胞の1つまたは複数の抗原を含有しているという条件で、使用することができる。具体的な一実施形態では、前癌細胞および/または抗原提示細胞を精製する。
【００９７】
理論に拘泥するものではないが、前癌性細胞における突然変異誘発事象の結果、その前癌性細胞による、その前癌性細胞に特有な抗原の発現が引き起こされる。
【００９８】
4.1.2 腫瘍細胞
ゲノムDNAがそれから単離される腫瘍細胞は、腫瘍細胞を正常細胞から識別する少なくとも1つのアレルを保持するいかなる腫瘍細胞でもよい。腫瘍細胞は、限定されるものではないが、予防処置を必要とする患者の腫瘍など、様々な供給源から単離できる。そのような腫瘍細胞を単離および調製する方法を、本明細書中の以下に詳細に記述する。
【００９９】
理論に拘泥するものではないが、癌または腫瘍の組織は、以下のこと、すなわち、増殖シグナルの自己充足性、抗増殖シグナルに対する無感受性、組織侵襲および転移、持続的な血管新生、ならびに、アポトーシスの回避のうちの1つまたは複数を特徴とする。癌に関するより詳細な記述は、例えば、HanahanおよびWeinberg、2000、Cell 100:57-70に見出すことができ、この開示を全体として本明細書に組み入れる。
【０１００】
腫瘍細胞の起源は、治療または予防される腫瘍に応じて選択される。腫瘍細胞は、治療される患者にとって自家性であることが好ましい。この方法では、腫瘍細胞の全ゲノムDNAを使用するので、この方法を実施する前に、いかなる抗原も、単離または特徴付けする必要がなく、さらにそれらの正体を知る必要さえもない。具体的な一実施形態では、腫瘍細胞のゲノムDNAが、腫瘍細胞に特異的な少なくとも1つの抗原をコードする。
【０１０１】
ある実施形態では、本発明は、腫瘍細胞によって発現され、かつそのような腫瘍細胞に対して免疫応答を誘発できる少なくとも1つの抗原、例えば腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原を発現する融合細胞を提供する。本発明の一実施形態では、腫瘍組織から単離された細胞を、ゲノムDNAを抽出するのに使用し、次に、それを非樹状細胞に導入する。本発明の方法で治療可能な癌の非限定的な例をセクション4.12に示す。
【０１０２】
腫瘍細胞の単離は、いかなる前癌病変の外科的切除術または生検によって行ってもよく、そのような前癌病変の多くが当技術分野で知られている。ある実施形態では、腫瘍細胞を新たに単離せず、その代わりに、培養して、抗原提示細胞と融合することになっている非樹状細胞に導入するためのゲノムDNAを単離する腫瘍細胞を選択し、それによって、前癌性ではない健康な細胞が、前癌細胞の集団に混入するのを予防または制限する。
【０１０３】
好ましい一実施形態では、融合細胞を含有する組成物のレシピエントになるであろう哺乳動物から外科的に摘出された腫瘍から、本発明の腫瘍細胞を単離する。使用する前に、固形腫瘍組織を、標準的な技法によって、好ましくは機械的に、単個細胞浮遊液に分散させることができる。限定されるものではないが、癌細胞を分散させるのに、コラゲナーゼおよびDNアーゼなどの酵素を用いてもよい。しかし、ある実施形態では、予め細胞を分散させずに、腫瘍組織からゲノムDNAを単離する。腫瘍細胞を培養することになっている場合、予め細胞を分散させるのが好ましい実施形態である。さらに別の好ましい実施形態では、初代細胞培養、すなわち、身体から取得された原細胞の培養から本発明の方法で使用するための腫瘍細胞を取得する。
【０１０４】
ある実施形態では、収集される腫瘍細胞の量は、ゲノムDNAを含む非樹状細胞を抗原提示細胞と融合させて本発明のワクチン用の融合細胞を十分に調製するのに十分なゲノムDNA含有非樹状細胞を生成させるのに十分なゲノムDNAを単離するのに十分な量である。治療または予防用の融合細胞を十分に生成するのに十分なゲノムDNAを単離することができない場合、当業者に知られている任意の技法でゲノムDNAを増幅することができる。特定の、より具体的な一実施形態では、ゲノムDNAを全ゲノム増幅によって増幅する。
【０１０５】
別の実施形態では、適当な腫瘍細胞は、好ましくは抑制が所望されている癌と同じ細胞型のものであり、レシピエントから、あるいは、それよりは好ましくないが、意図されているレシピエントと少なくとも1つのMHCアレル、好ましくはMHCクラスIハプロタイプを共有し、かつ、予防される癌の前癌病変を保持する、家族の一員または個体から単離される。
【０１０６】
癌細胞の抗原性を有する抗原を含有する細胞など、腫瘍細胞は、当技術分野で知られている任意の方法で同定および単離することができる。例えば、腫瘍細胞は、形態、酵素アッセイ、増殖検定、または発癌性ウイルスの存在によって同定することができる。目的の抗原の特徴が既知の場合、腫瘍細胞も、当技術分野で知られている任意の生化学的または免疫学的方法によって同定または単離することができる。例えば、手術、内視鏡検査法、他の生検技法、アフィニティークロマトグラフィー、および蛍光活性化セルソーティング(例えば、蛍光タグを付けた前癌性非樹状細胞によって発現された抗原に対する抗体を用いる)によって腫瘍細胞を単離することができる。
【０１０７】
前癌性非樹状細胞のクローン集団もしくは均質集団、または精製された集団を使用する必要はない。細胞の混合物も、その混合物中のかなりの数の細胞が、標的である腫瘍細胞の1つまたは複数の抗原を含有しているという条件で、使用することができる。具体的な一実施形態では、腫瘍細胞および/または抗原提示細胞を精製する。
【０１０８】
理論に拘泥するものではないが、前癌性細胞における突然変異誘発事象の結果、その前癌性細胞による、その腫瘍細胞に特有な抗原の発現が引き起こされる。
【０１０９】
理論に拘泥するものではないが、腫瘍細胞または癌細胞における突然変異誘発事象の結果、その腫瘍細胞または癌細胞による、その腫瘍細胞または癌細胞に特有な抗原の発現が引き起こされる。
【０１１０】
4.2 感染性因子からのDNAを含む非樹状細胞
本発明のある実施形態では、感染症を治療および/または予防するために融合細胞を作製する。そのような融合細胞は、抗原提示細胞を非樹状細胞に融合させることによって生成し、その際、感染性因子のDNAが非樹状細胞に導入されている。ある実施形態では、感染性因子のDNAを感染性因子から直接抽出する。他の実施形態では、非樹状細胞に導入するDNAを、感染性因子に感染した細胞から抽出する。
【０１１１】
非樹状細胞は、融合細胞の調製に使用される抗原提示細胞の起源に応じて、被験体にとって自家性、同系、または同種異系でありうる初代細胞培養に由来するものでよい。一実施形態では、樹状細胞が患者に対して同種異系である場合、この非樹状細胞は、治療される哺乳動物と同じクラスI MHCハプロタイプであるMHC Iアレルを少なくとも1つ有するものでありうる。別の実施形態では、樹状細胞が患者に対して自家性である場合、非樹状細胞は、治療される哺乳動物にとって同種異系または自家性でありうる。
【０１１２】
別の実施形態では、適当な非樹状細胞が、好ましくはレシピエントから単離され、あるいは、それよりは好ましくないが、少なくとも1つのMHCアレル、好ましくはクラスI MHCハプロタイプを、意図されているレシピエントと共有し、かつ、その感染性因子に感染しているか、または、その感染性因子に感染する危険のある、家族の一員または個体から単離される。
【０１１３】
同種異系の抗原提示細胞が使用される場合、哺乳動物で免疫応答を誘発するためには、同種異系の抗原提示細胞との融合細胞の生成に使用される非樹状細胞が少なくとも1つの共通のMHCアレルを有するものでなければならない。意図されているレシピエントから得られた非樹状細胞が最も好ましい。すなわち、この非樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与されることになっている患者にとって自家性である。一実施形態では、非自家性であるが、レシピエントにおける標的の前癌性細胞または癌細胞と少なくとも1つのMHCアレルを共有する非樹状細胞が使用されることがある。同一個体または同系個体から非樹状細胞が得られる場合、そのような細胞は、同じクラスI MHCハプロタイプを有するであろう。それらがすべて同一の被験体または同系供給源から得られない場合、血清学的試験およびMHC遺伝子座のDNA分析などの当技術分野で周知の標準的なHLA型判定技法によってMHCハプロタイプを決定することができる。本発明の融合細胞を産生する手順を実行する前にMHCハプロタイプの判定を実行する必要はない。
【０１１４】
具体的な一実施形態では、非樹状細胞が線維芽細胞である。さらに具体的な一実施形態では、非樹状細胞がNIH 3T3細胞である。具体的な一実施形態では、非樹状細胞は単離されている。さらに具体的な一実施形態では、非樹状細胞は精製されている。
【０１１５】
DNAがそれから単離される感染細胞は、治療される被験体から得られた感染細胞でよい。他の実施形態では、治療される被験体である第2の被験体とは異なる第1の被験体から、DNAがそれから単離される細胞を取得し、その際、第1の被験体は、第2の被験体で治療または予防されることになっている感染性因子に感染しているか、あるいは曝露されていたものである。他の実施形態では、感染細胞からDNAを取得し、その際、感染細胞をin vitroで維持し、かつ増殖させる。標的の感染症および例示的な感染症をセクション4.2.1で記述する。
【０１１６】
ゲノムDNAを抽出するのに、ゲノムDNAを非樹状細胞に導入するのに、非樹状細胞を抗原提供細胞に融合させるのに、融合細胞を維持するのに、融合細胞を不活性化するのに、そして融合細胞を投与するのに、当業者に知られているいかなる方法も使用できる。詳細には、癌を治療するために融合細胞を産生および使用するのに使用できる方法と同じ方法を、感染症の治療および予防用の融合細胞に用いることができる。感染性因子に感染した細胞にゲノムDNAが由来する場合、非樹状細胞1細胞あたりに導入されるゲノムDNAの量は、感染細胞の少なくとも1ゲノム当量、感染細胞の少なくとも10-1ゲノム当量、感染細胞の少なくとも10-2ゲノム当量、感染細胞の少なくとも10-3ゲノム当量、感染細胞の少なくとも10-4ゲノム当量、感染細胞の少なくとも10-5ゲノム当量、感染細胞の少なくとも10-6ゲノム当量、または感染細胞の少なくとも10-7ゲノム当量に相当する。ある実施形態では、非樹状細胞1細胞あたりに導入されるゲノムDNAの量が、感染細胞の最大1ゲノム当量まで、感染細胞の最大10-1ゲノム当量まで、感染細胞の最大10-2ゲノム当量まで、感染細胞の最大10-3ゲノム当量まで、感染細胞の最大10-4ゲノム当量まで、感染細胞の最大10-5ゲノム当量まで、感染細胞の最大10-6ゲノム当量まで、または、感染細胞の最大10-7ゲノム当量までに相当する。
【０１１７】
具体的な一実施形態では、感染性因子が、そのゲノム全体が宿主ゲノム中に部分的または完全に組み込まれるウイルスである場合、非樹状細胞に導入されるゲノムDNAは、ウイルスゲノムがそのゲノム中に組み込まれている宿主細胞のゲノムDNAである。
【０１１８】
ある実施形態では、感染因子がRNAウイルスであり、すなわち、このウイルスのゲノムがRNAで構成されている。そのような場合、本発明の方法で、ゲノムRNAを使用するか、あるいは、そのRNAウイルスのゲノムRNAをコードするcDNAを調製し、そのcDNAを本発明の方法で使用する。
【０１１９】
4.2.1 標的の感染症
本発明の方法によって治療または予防できる感染症は、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、蠕虫、および寄生虫を含めた感染性因子によって引き起こされるものである。併用療法は、本発明の医薬組成物の投与に加えて、感染症の予防または治療の補助となる1つまたは複数の物理療法の使用を包含し、この物理療法には、抗生物質、抗ウイルス薬、抗原虫化合物、抗真菌化合物、および抗蠕虫薬が含まれるが、これらに限定されない。感染症を治療または予防するのに使用できる他の治療用物理療法には、上述の通り、免疫療法薬、ポリヌクレオチド、抗体、サイトカイン、およびホルモンが含まれる。
【０１２０】
ヒトおよび非ヒト以外の脊椎動物両方の感染性ウイルスとしては、レトロウイルス、RNAウイルス、およびDNAウイルスが含まれる。ヒトで見出されたウイルスの例には、レトロウイルス科(例えばヒト免疫不全症ウイルス、すなわちHIV-1(HTLV-III、LAVもしくはHTLV-III/LAV、またはHIV-IIIとも呼ばれる)、およびHIV-LPなどの他の単離株など);ピコルナウイルス科(例えば、小児マヒウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウィルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カリシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こすウイルス株);トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラビウイルス科(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス);コロナウイルス科(例えばコロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(例えばエボラウイルス);パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス);オルソミクソウイルス科(例えばインフルエンザウイルス);ブニヤウイルス科(例えば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス);アレナウイルス科(出血熱ウイルス);レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス);ビルナウイルス科;ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(パルボウイルス);パポーバウイルス科(乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス科(ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、およびヘルペスウイルス);ポックスウイルス科(痘そうウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);イリドウイルス科(例えばアフリカブタコレラウイルス);および未分類のウイルス(例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体(欠陥を有する、B型肝炎ウイルスのサテライトウイルスと考えられている)、非A型非B型肝炎の病原体(クラス1=内部伝染するもの(internally transmitted);クラス2=非経口的に伝染するもの(すなわちC型肝炎);ノーウォークウイルスおよびその近縁のウイルス、ならびにアストロウイルス)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
企図されているレトロウイルスとしては、単純レトロウイルスおよび複雑型レトロウイルスの両方が含まれる。単純レトロウイルスには、B型レトロウイルス、C型レトロウイルス、およびD型レトロウイルスの下位群が含まれる。B型レトロウイルスの一例が、マウス乳癌ウイルス(MMTV)である。C型レトロウイルスには、C型グループA(ラウス肉腫ウイルス(RSV)、トリ白血病ウイルス(ALV)、およびトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)が含まれる)、およびC型グループB(マウス白血病ウイルス(MLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、マウス肉腫ウイルス(MSV)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、脾臓壊死症ウイルス(SNV)、細網内皮症ウイルス(RV)、およびサル肉腫ウイルス(SSV)が含まれる)の下位群が含まれる。D型レトロウイルスには、Mason-Pfizerサルウイルス(MPMV)およびサルレトロウイルス1型(SRV-1)が含まれる。複雑型レトロウイルスには、レンチウイルス、T細胞白血病ウイルス、および泡沫状ウイルスの下位群が含まれる。レンチウイルスには、HIV-1が含まれるが、さらに、HIV-2、SIV、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、およびウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)も含まれる。T細胞白血病ウイルスには、HTLV-1、HTLV-II、サルT細胞白血病ウイルス(STLV)、およびウシ白血病ウイルス(BLV)が含まれる。泡沫状ウイルスには、ヒト泡沫状ウイルス(HFV)、サル泡沫状ウイルス(SFV)、およびウシ泡沫状ウイルス(BFV)が含まれる。
【０１２２】
脊椎動物における抗原であるRNAウイルスの例としては、オルトレオウイルス属(哺乳類レトロウイルスおよびトリレトロウイルス両方の複数の抗原型)、オルビウイルス属(ブルータングウイルス、ユーベナンジーウイルス、ケメロボウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス)、ロタウイルス属(ヒトロタウイルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウイルス、海洋ロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、トリロタウイルス)を含めたレオウイルス科のメンバー;エンテロウィルス属(ポリオウイルス、コクサッキーウイルスAおよびB、エコー(ECHO; enteric cytopathic human orphan)ウイルス、A型肝炎ウイルス、サルエンテロウィルス、海洋脳脊髄炎(ME)ウイルス、マウスポリオウイルス(Poliovirus muris)、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、カルジオウイルス属(脳心筋炎ウイルス(EMC)、メンゴウイルス)ライノウイルス属(少なくとも113のサブタイプを含めたヒトライノウイルス;他のライノウイルス)、アフトウイルス属(口蹄病(FMDV))を含めたピコルナウイルス科;水疱性発疹症のブタウイルス、サンミゲルアシカウイルス、ネコピコルナウイルス、およびノーウォークウイルスを含めたカリチウイルス科;アルファウイルス属(東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オンニョニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス)、フラビウイルス属(蚊媒介の黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中部ヨーロッパ型ダニ媒介性脳炎ウイルス、極東型ダニ媒介性脳炎ウイルス、キィアサヌアフォレストウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス)、ルビウイルス属(風疹ウイルス)、ペスチウイルス属(粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス)を含めたトガウイルス科;ブンヤウイルス属(ブンヤムウェラウイルスおよびその近縁のウイルス、カリフォルニア脳炎グループのウイルス)、フレボウイルス属(サシチョウバエ熱のシチリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、ナイロウイルス属(クリミア-コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス)、および、ウクウイルス属(ウクニエミ(Uukuniemi)およびその近縁のウイルス)を含めたブニヤウイルス科;インフルエンザウイルス属(インフルエンザウイルスA型、ヒトにおける多数の亜型);ブタインフルエンザウイルス、ならびにトリおよびウマインフルエンザウイルス;インフルエンザB型(ヒトにおける多数の亜型)、およびインフルエンザC型(別の属の可能性がある)を含めたオルソミクソウイルス科;パラミクソウイルス属(パラインフルエンザウイルス1型、センダイウイルス、HAウイルス(Hemadsorption virus)、パラインフルエンザウイルス2〜5型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス)、モルビリウイルス属(麻疹ウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス)、ニューモウイルス属(呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス)を含めたパラミクソウイルス科;森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オンニ��ニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス)、フラビウイルス属(蚊媒介の黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中部ヨーロッパ型ダニ媒介性脳炎ウイルス、極東型ダニ媒介性脳炎ウイルス、キィアサヌアフォレストウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス)、ルビウイルス属(風疹ウイルス)、ペスチウイルス属(粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス);ブンヤウイルス属(ブンヤムウェラウイルスおよびその近縁のウイルス、カリフォルニア脳炎グループのウイルス)、フレボウイルス属(サシチョウバエ熱のシチリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、ナイロウイルス属(クリミア-コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス)、および、ウクウイルス属(ウクニエミおよびその近縁のウイルス)を含めたブンヤウイルス科;インフルエンザウイルス属(インフルエンザウイルスA型、ヒトにおける多数の亜型);ブタインフルエンザウイルス、ならびにトリおよびウマインフルエンザウイルス;インフルエンザB型(ヒトにおける多数の亜型)、およびインフルエンザC型(別の属の可能性がある)を含めたオルソミクソウイルス科;パラミクソウイルス属(パラインフルエンザウイルス1型、センダイウイルス、HAウイルス、パラインフルエンザウイルス2〜5型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス)、モルビリウイルス属(麻疹ウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス)、ニューモウイルス属(呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス)を含めたパラミクソウイルス科;ベシクロウイルス(VSV)属(チャンディプラウイルス、フランダースハートパークウイルス)、リッサウイルス属(狂犬病ウイルス)、サカナラブドウイルス、およびラブドウイルスの可能性のある2つのウイルス(マールブルグウイルスおよびエボラウイルス)を含めたラブドウイルス科;リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCM)、タカリベウイルス複合体、およびラッサ熱ウイルスを含めたアレナウイルス科; 伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸コロナウイルス、およびネコ伝染性腹膜炎(ネココロナウイルス)を含めたコロナウイルス科が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
脊椎動物における抗原である例示的DNAウイルスとしては、オルソポックスウイルス属(大痘瘡、小痘瘡、サル痘疹ワクチニア、牛痘、バッファロー痘、家兎痘、エクトロメリア)、レポリポックスウイルス属(粘液腫、線維腫)、アビポックスウイルス属(鶏痘、他のトリポックスウイルス)、カプリポックスウイルス属(ヒツジ痘、ヤギ痘)、スイポックスウイルス属(ブタ痘)、パラポックスウイルス属(伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス)を含めたポックスウイルス科;イリドウイルス科(アフリカブタコレラウイルス、カエルウイルス2および3、サカナリンホシスチウイルス);アルファヘルペスウイルス(単純ヘルペス1および2型、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス2および3、仮性狂犬病ウイルス、ウシ伝染性角結膜炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス)、ベータヘルペスウイルス(ヒトサイトメガロウイルス、ならびに、ブタ、サル、およびげっ歯動物のサイトメガロウイルス);ガンマヘルペスウイルス(エプスタインーバーウイルス(EBV)、マレク病ウイルス、ヘルペスサイミリ(Herpes saimiri)、ヘルペスウイルスアテレス、ヘルペスウイルスシルビラガス(Herpes virus sylvilagus)、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス)を含めたヘルペスウイルス科;マストアデノウイルス属(ヒト亜群A、B、C、D、Eおよび未分類のもの;シミアンアデノウイルス(少なくとも23の抗原型)、イヌ伝染性肝炎、ならびに、ウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、および他の多くの種のアデノウイルス)、アビアデノウイルス属(トリアデノウイルス);および培養不可能なアデノウイルスを含めたアデノウイルス科;パピローマウイルス属(ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス、および他の種の様々な病原性パピローマウイルス)、ポリオーマウイルス属(ポリオーマウイルス、サル空胞ウイルス(SV-40)、ウサギ空胞ウイルス(RKV)、Kウイルス、BKウイルス、JCウイルス、そして、リンパ趨向性パピローマウイルスなどの他の霊長類パピローマウイルス)を含めたパポーバウイルス科;アデノ随伴ウイルス属、パルボウイルス属(ネコ汎白血球減少ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシアンミンク病ウイルスなど)を含めたパルボウイルス科が含まれるが、これらに限定されない。最後に、DNAウイルスには、クルおよびクロイツフェルト-ヤコブ病ウイルス、ならびに慢性感染性神経障害病原体(chronic infectious neuropathic agent)など上記の科に収まらないウイルスも含まれることがある。
【０１２４】
本発明の複合体と併用できる抗ウイルス化合物の例が、当技術分野で多数知られており、それらには、リファンピシン、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(例えば、AZT、ddI、ddC、3TC、d4T)、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(例えば、エファビレンツ、ネビラピン)、プロテアーゼ阻害剤(例えば、アプレナビル(aprenavir)、インジナビル、リトナビル、およびサキナビル)、イドクスウリジン、シドフォビル、アシクロビル、ガンシクロビル、ザナミビル、アマンタジン、およびパリビズマブが含まれるが、これらに限定されない。抗ウイルス薬の他の例には、アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン、アルビルセプトスドトックス(Alvircept Sudotox)、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、アテビルジンメシラート、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン(Cipamfylline)、塩酸シタラビン、メシル酸デラビルジン、デスシクロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、ホサリラート、フォスカメットナトリウム(Foscamet Sodium)、ホスホネトナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、ケトクサル(Kethoxal)、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、サキナビルメシラート、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、ビダラビンリン酸、ビダラビンリン酸水素ナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ジドブジン、ジンビロキシムが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明の方法によって治療または予防できる細菌感染または疾患を引き起こす細菌としては、ミコバクテリア(例えば、ヒト型結核菌(Mycobacteria tuberculosis)、ウシ型結核菌、トリ型結核菌、癩菌、またはアフリカ型結核菌)、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジア、およびレジオネラなど、その生活環の中に細胞内ステージを有する細菌が含まれるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、企図されている細菌感染の他の例には、以下の細菌によって引き起こされるものが含まれる。すなわち、グラム陽性桿菌(例えば、リステリア、バシラスすなわち炭疽菌、エリシペロトリックス属諸種など)、グラム陰性杆菌(例えば、バルトネラ、ブルセラ、カンピロバクター、エンテロバクター、大腸菌、フランシセラ、ヘモフィルス、クレブシエラ、モルガネラ、変形菌、プロビデンシア、シュードモナス、サルモネラ、セラシア、赤痢菌、ヴィブリオ、およびエルシニア諸種)、スピロヘータ細菌(例えば、ライム病を引き起こすライム病ボレリアを含めたボレリア属諸種)、嫌気性細菌(例えば、アクチノミセスおよびクロストリジウム属諸種)、グラム陽性および陰性球菌、腸球菌諸種、レンサ球菌諸種、肺炎菌諸種、ブドウ球菌諸種、ナイセリア諸種である。感染性細菌の特定の例には、ヘリコバクターピロリ、ライム病ボレリア、レジオネラ菌、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウムイントラセルラール、マイコバクテリウムカンサシ、マイコバクテリウムゴルドナ(M. gordonae)、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリアモノサイトゲネス、化膿レンサ球菌(A群レンサ球菌)、ストレプトコッカスアガラクティエ、(グループ13レンサ球菌)、ビリダンス型レンサ球菌、大便レンサ球菌、ストレプトコッカスボビス、肺炎レンサ球菌、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌C、破傷風菌、エンテロバクターエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラムルトシダ、フゾバクテリウムナクレタム、モニリフォルミスレンサ杆菌、梅毒トレポネーマ、トレポネーマペルテヌ(Treponema pertenue)、レプトスピラ、リケッチア、およびイスラエル放線菌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明の複合体と併用できる抗菌薬または抗生物質としては、アミノグリコシド抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン)、アムフェニコール抗生物質(例えば、アジダムフェニコール(azidamfenicol)、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアムフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えばリファミド(rifamide)およびリファンピン)、カルバセフェム(例えばロラカルベフ)、カルバペネム(例えばビアペネムおよびイミペネム)、セファロスポリン(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン(cefazedone)、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム)、セファマイシン(例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナン、およびティゲモナム(tigemonam))、オキサセフェム(例えばフロモキセフ、およびモキサラクタム)、ペニシリン(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン(fenbenicillin)、フロキサシリン、ペナムシリン(penamccillin)、ペネタメートヒドリオダイド(penethamate hydriodide)、ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリン0、ペニシリンV、ベンザチンペニシリンV、ペニシリンVヒドラバミン(penicillin V hydrabamine)、ペニメピサイクリン(penimepicycline)、およびフェンシヒシリンカリウム(phencihicillin potassium))、リンコサミド(例えばクリンダマイシンおよびリンコマイシン)、マクロライド(例えば、アジスロマイシン、カルボマイシン、クラリスオマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、およびエリスロマイシンアシストラート)、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン(例えば、アピサイクリン(apicycline)、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン(clomocycline)、およびデメクロサイクリン)、2、4-ジアミノピリミジン(例えばブロデモプリム)、ニトロフラン(例えばフラルタドンおよび塩化フラゾリウム)、キノロンおよびその類似体(例えば、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパグロクサシン(grepagloxacin))、スルホンアミド(例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド(noprylsulfamide)、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン、およびスルファシチン)、スルホン(例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン)、サイクロセリン、ムピロシンおよびツベリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
抗菌薬のさらなる例としては、アセダプソン、アセトスルホンナトリウム、アラメシン(Alamecin)、アレキシジン、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アミサイクリン(Amicycline)、アミフロキサシン、アミフロキサシンメシラート、アミカシン、硫酸アミカシン、アミノサリチル酸、アミノサリチル酸ナトリウム、アモキシシリン、アンホマイシン、アンピシリン、アンピシリンナトリウム、アパラシリンナトリウム、アプラマイシン、アスパルトシン、硫酸アストロマイシン、アビラマイシン、アボパルシン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズロシリンナトリウム、塩酸バカンピシリン、バシトラシン、バシトラシンメチレンジサリシレート、バシトラシン亜鉛、バンベルマイシン、ベンゾイルパスカルシウム、ベリスロマイシン、硫酸ベタミシン(Betamicin Sulfate)、ビアペネム、ビニラマイシン(Biniramycin)、塩酸ビフェナミン、ビスピリシオンマグスルフェックス(Bispyrithione Magsulfex)、ブチカシン、硫酸ブチロシン、硫酸カプレオマイシン、カルバドクス、カルベニシリンナトリウム、カルベニシリンインダニルナトリウム、カルベニシリンフェニルナトリウム、カルベニシリンカリウム、カルモナンナトリウム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファマンドールナファート、セファマンドールナトリウム、セファパロール(Cefaparole)、セファトリジン、セファザフルラナトリウム(Cefazaflur Sodium)、セファゾリン、セファゾリンナトリウム、セフブペラゾン、セフジニール、セフェピム、塩酸セフェピム、セフェテコール(Cefetecol)、セフィキシム、塩酸セフメノキシム、セフメタゾール、セフメタゾールナトリウム、セホニシド1ナトリウム、セホニシドナトリウム、セホペラゾンナトリウム、セフォラニド、セホタキシムナトリウム、セホテタン、セホテタンニナトリウム、塩酸セフォチアム、セフォキシチン、セホキシチンナトリウム、セフピミゾール、セフピミゾールナトリウム、セフピラミド、セフピラミドナトリウム、硫酸セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジ、セフロキサジン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシムナトリウム、セフトリアキソンナトリウム、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフロキシムピボキセチル、セフロキシムナトリウム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、塩酸セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、塩酸セトサイクリン(Cetocycline Hydrochloride)、セトフェニコール、クロラムフェニコール、パルミチン酸クロラムフェニコール、クロラムフェニコール-パントテン酸複合体、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、クロルヘキシジンホスファニレート、クロロキシレノール、重硫酸クロルテトラサイクリン、塩酸クロルテトラサイクリン、シノキサシン、シプロフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、シロルマイシン(Cirolemycin)、クラリスロマイシン、塩酸クリナフロキサシン、クリンダマイシン、塩酸クリンダマイシン、塩酸パルミチン酸クリンダマイシン、リン酸クリンダマイシン、クロファジミン、ベンザチンクロキサシリン、クロキサシリンナトリウム、クロキシキン、コリスチンメタナトリウム��硫酸コリスチン、クーママイシン、クーママイシンナトリウム、シクラシリン、サイクロセリン、ダルホプリスチン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメサイクリン(Demecycline)、デノフンギン(Denofungin)、ジアベリジン、ジクロキサシリン、ジクロキサシリンナトリウム、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、ジピリチオン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンカルシウム、ドキシサイクリンホスファテックス、ドキシサイクリンヒクレート(Doxycycline Hyclate)、ドロキサシンナトリウム、エノキサシン、エピシリン、塩酸エピテトラサイクリン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストラート、エリスロマイシンエストレート、エチルコハク酸エリスロマイシン、エリスロマイシングルセプテート、ラクトビオン酸エリスロマイシン、プロピオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、塩酸エタンブトール、エチオナミド、フレロキサシン、フロキサシリン、フルダラニン、フルメキン、ホスホマイシン、ホスホマイシントロメタミン、フモキシリン(Fumoxicillin)、塩化フラゾリウム、酒石酸フラゾリウム、フシジン酸ナトリウム、フシジン酸、硫酸ゲンタマイシン、グロキシモナム(Gloximonam)、グラミシジン、ハロプロジン、ヘタシリン、ヘタシリンカリウム、ヘキセジン、イバフロキサシン、イミペネム、イソコナゾール、イセパマイシン、イソニアジド、ジョサマイシン、硫酸カナマイシン、キタサマイシン、レボフラルタドン、レボプロピルシリンカリウム(Levopropylcillin Potassium)、レキスロマイシン(Lexithromycin)、リンコマイシン、塩酸リンコマイシン、ロメフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、ロメフロキサシンメシラート、ロラカルベフ、マフェニド、メクロサイクリン(Meclocycline)、スルホサリチル酸メクロサイクリン、リン酸メガロマイシンカリウム、メキドクス、メロペネム、メタサイクリン、塩酸メタサイクリン、メテナミン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メチシリンナトリウム、メチオプリム、塩酸メトロニダゾール、リン酸メトロニダゾール、メツロシリン、メズロシリンナトリウム、ミノサイクリン、塩酸ミノサイクリン、塩酸ミリンカマイシン(Mirincamycin Hydrochloride)、モネンシン、モネンシンナトリウム、ナフシリンナトリウム、ナリジキシン酸ナトリウム、ナリジキシン酸、ナタマイシン、ネブラマイシン、パルミチン酸ネオマイシン、硫酸ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、硫酸ネチルマイシン、ニュートラマイシン(Neutramycin)、ニフラデン、ニフラルデゾン、ニフラテル、ニフラトロン、ニフルダジル、ニフリミド、ニフルピリノール、ニフルキナゾール、ニフルチアゾール、ニトロサイクリン(Nitrocycline)、ニトロフラントイン、ニトロミド、ノルフロキサシン、ノボビオシンナトリウム、オフロキサシン、オルメトプリム、オキサシリンナトリウム、オキシモナム(Oximonam)、オキシモナムナトリウム、オキソリン酸、オキシテトラサイクリン、オキシテトラサイクリンカルシウム、塩酸オキシテトラサイクリン、パルジマイシン(Paldimycin)、パラクロロフェノール、パウロマイシン、ペフロキサシン、ペフロキサシンメシラート、ペナメシリン(Penamecillin)、ベンザチンペニシリンG、ペニシリンGカリウ��、ペニシリンGプロカイン、ペニシリンGナトリウム、ペニシリンV、ベンザチンペニシリンV、ペニシリンVハイドラバミン、ペニシリンvカリウム、ペンチジドンナトリウム、アミノサリチル酸フェニル、ピペラシリンナトリウム、ピルベニシリンナトリウム(Pirbenicillin Sodium)、ピリジシリンナトリウム(Piridicillin Sodium)、塩酸ピルリマイシン、塩酸ピバンピシリン、パモ酸ピバンピシリン、ピバンピシリンプロベネート(Pivampicillin Probenate)、硫酸ポリミキシンB、ポルフィロマイシン、プロピカシン(Propikacin)、ピラジナミド、ピリチオン亜鉛、酢酸キンデカミン、キヌプリスチン、ラセフェニコール(Racephenicol)、ラモプラニン、ラニマイシン(Ranimycin)、レロマイシン(Relomycin)、レプロマイシン、リファブチン、リファメタン(Rifametane)、リファメキシル(Rifamexil)、リファミド、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロリテトラサイクリン、硝酸ロリテトラサイクリン、ロザラマイシン、酪酸ロザラマイシン、プロピオン酸ロザラマイシン、ロザラマイシンリン酸水素ナトリウム、ステアリン酸ロザラマイシン、ロソキサシン、ロキサルソン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン(Sancycline)、サンフェトリネムナトリウム(Sanfetrinem Sodium)、サルモキシシリン(Sarmoxicillin)、サルピシリン(Sarpicillin)、スコパフィンジン(Scopafingin)、シソマイシン、硫酸シソマイシン、スパルフロキサシン、塩酸スペクチノマイシン、スピラマイシン、塩酸スタリマイシン(Stallimycin Hydrochloride)、ステフィマイシン(Steffimycin)、硫酸ストレプトマイシン、ストレプトニコジド(Streptonicozid)、スルファベンズ、スルファベンズアミド、スルファセタミド、スルファセタミドナトリウム、スルファシチン、スルファジアジン、スルファジアジンナトリウム、スルファドキシン、スルファレン、スルファメラジン、スルファメーター、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファモキソール、スルファニル酸亜鉛、スルファニトラン、スルファサラジン、スルファソミゾール、スルファチアゾール、スルファザメト、スルフイソキサゾール、スルフイソキサゾールアセチル、スルフイソキサゾールジオラミン、スルフォミキシン(Sulfomyxin)、スロペネム、スルタミシリン、サンシリンナトリウム(Suncillin Sodium)、塩酸タランピシリン、タイコプラニン、塩酸テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、塩酸テトラサイクリン、テトラサイクリンリン酸複合体、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チフェンシリンカリウム(Thiphencillin Potassium)、チカルシリンクレジルナトリウム、チカルシリン2ナトリウム、チカルシリン1ナトリウム、チクラトン、塩化チオドニウム、トブラマイシン、硫酸トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、硫酸トリメトプリム、トリスルファピリミジン(Trisulphapyrimidine)、トロレアンドマイシン、硫酸トロスペクトマイシン(Trospectomycin Sulfate)、チロトリシン、バンコマイシン、塩酸バンコマイシン、バージニアマイシン、ゾルバマイシン(Zorbamycin)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明の方法によって治療または予防できる真菌病としては、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリクム症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、接合菌症、およびカンジダ症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明の複合体と併用できる抗真菌化合物としては、ポリエン(例えば、アンホテリシンb、カンジサイジン、メパルトリシン、ナタマイシン、およびナイスタチン)、アリルアミン(例えばブテナフィンおよびナフチフィン)、イミダゾール(例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、およびラノコナゾール)、チオカルバミド酸エステル(例えば、トルシクラート、トリンダート、およびトルナフテート)、トリアゾール(例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、サペルコナゾール、およびテルコナゾール)、ブロモサリシルクロラニリド(bromosalicylchloranilide)、ブクロサミド、プロピオン酸カルシウム、クロルフェネシン、シクロピロクス、アザセリン、グリセオフルビン、オリゴマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、ピロルニトリン、シッカニン、ツベルシジン、およびビリジンが含まれるが、これらに限定されない。抗真菌化合物の追加の例には、アクリソルシン、アンブルチシン(Ambruticin)、アンホテリシンB、アザコナゾール、アザセリン、バジフンギン、ビホナゾール、塩酸ビフェナミン、ビスピリシオンマグスルフェックス、硝酸ブトコナゾール、ウンデシレン酸カルシウム、カンジサイジン、石炭酸フクシン、クロルダントイン、シクロピロクス、シクロピロックスオラミン、シロフンギン(Cilofungin)、シスコナゾール、クロトリマゾール、クプリミキシン、デノフンギン、ジピリチオン、ドコナゾール、エコナゾール、硝酸エコナゾール、エニルコナゾール、硝酸エソナム(Ethonam Nitrate)、フェンチコナゾール硝酸、フィリピン、フルコナゾール、フルシトシン、フンギマイシン(Fungimycin)、グリセオフルビン、ハマイシン、イソコナゾール、イトラコナゾール、カラフンギン、ケトコナゾール、ロモフィンギン(Lomofingin)、リジマイシン(Lydimycin)、メパルトリシン、ミコナゾール、硝酸ミコナゾール、モネンジン、モネンシンナトリウム、塩酸ナフチフィン、ウンデシレン酸ネオマイシン、ニフラテル、ニフルメロン、塩酸ニトラミン、ナイスタチン、オクタン酸、硝酸オルコナゾール、硝酸オキシコナゾール、塩酸オキシフンギン、塩酸パルコナゾール、パルトリシン(Partricin)、ヨウ化カリウム、プロクロノール、ピリチオン亜鉛、ピロルニトリン、ルタマイシン(Rutamycin)、塩化サングイナリウム、サペルコナゾール、スコパフンギン(Scopafungin)、硫化セレン、シネフンギン、硝酸スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チラム、チクラトン、チオコナゾール、トルシクラート、トリンダート、トルナフテート、トリアセチン、トリアフンギン、ウンデシレン酸、ビリドフリルビン(Viridoflilvin)、ウンデシレン酸亜鉛、および塩酸ジノコナゾールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明の方法で治療または予防できる寄生虫病としては、アメーバ症、マラリア原虫、リーシュマニア、コクシジウム症、ランブル鞭毛虫症、クリプトスポリジア症、トキソプラズマ症、およびトリパノソーマ症が含まれるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、蛔虫症、鉤虫症、鞭虫病、糞線虫症、トキソカリアシス(toxoccariasis)、旋毛虫病、フィラリア回旋糸状虫症、およびジロフィラリア症など、様々な虫による感染も包含される。限定されるものではないが、住血吸虫病、肺吸虫症、および肝吸虫症など、様々な吸虫による感染も包含される。これらの疾患を引き起こす寄生虫は、それらが細胞内のものであるか、あるいは細胞外のものであるかに基づいて分類することができる。本明細書で使用する場合、「細胞内寄生虫」は、その全生活環が細胞内である寄生虫である。ヒトの細胞内寄生虫の例には、リーシュマニア諸種、マラリア原虫諸種、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、バベシア諸種、および旋毛虫(Trichinella spiralis)が含まれる。本明細書で使用する場合、「細胞外寄生虫」は、その全生活環が細胞外である寄生虫である。ヒトを感染させることのできる細胞外寄生虫には、赤痢アメーバ、ランブルベンモウチュウ、エンテロシトゾーンビネウシ(Enterocytozoon bieneusi)、ネグレリア、およびアカントアメーバが含まれ、さらに、ほとんどの蠕虫も含まれる。さらに別のクラスの寄生虫は、主として細胞外であるが、それらの生活環の重要なステージで偏性の細胞内存在であるものとして定義される。そのような寄生虫は、本明細書において「偏性細胞内寄生虫」と呼ばれる。これらの寄生虫は、それらの生涯の大部分を細胞外環境で存在するものも、それらの生涯の小さな一部分のみを細胞外環境で存在するものもあるが、それらはすべて、それらの生活環において少なくとも1つの偏性の細胞内ステージを有する。この後者の範疇にある寄生虫には、ローデシアトリパノソーマおよびガンビアトリパノソーマ、イソスポーラ諸種、クリプトスポリジウム諸種、アイメリア諸種、ネオスポラ諸種、サルコシスチス諸種、住血吸虫諸種が含まれる。
【０１３１】
4.3 ゲノムDNA
当業者に公知の任意の方法によって、腫瘍細胞、前癌細胞、感染性因子に感染した細胞、または感染性因子からゲノムDNAを得ることができる。哺乳動物組織からゲノムDNAを調製する方法の例は、Short Protocols in Molecular Biology、第4版、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons社、1999のユニット2.2に記載されている。ある実施形態では、腫瘍細胞、前癌病変の細胞、感染性因子に感染した細胞、または感染性因子から抽出したゲノムDNAを、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションする前に増幅する。生検によって得られた組織が非常に少量ならば、腫瘍細胞または前癌病変からのゲノムDNAの増幅が必要なことがある。ある実施形態では、全ゲノム増幅法(WGA)を使用してゲノムDNAを増幅する。より具体的な一実施形態では、プライマーとしてランダムオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用してWGAを行う。ある実施形態では、MDA法を使用してゲノムDNAを増幅する(例えばDeanら、2002、PNAS 99(8):5261-5266参照)。具体的な一実施形態では、GenomiPhi(商標)(Amersham Biosciences)を使用してゲノムDNAを増幅する。当業者に公知の他の任意の方法を使用してゲノムDNAを増幅してもよい。
【０１３２】
ある実施形態では、ゲノムDNAをRNアーゼで処理して任意のRNA分子を除く。ある実施形態では、ゲノムDNAをプロテアーゼで処理して、ゲノムDNAと会合しうる任意のタンパク質物質を除く。ある実施形態では、ゲノムDNAをあるサイズのDNA断片の断片に断片化する。ある実施形態では、ゲノムDNA断片の平均サイズは、少なくとも0.1kb、0.25kb、0.5kb、1kb、2kb、5kb、10kb、15kb、25kb、50kbまたは少なくとも100kbである。ある実施形態では、ゲノムDNA断片の平均サイズは、最大0.1kb、0.25kb、0.5kb、1kb、2kb、5kb、10kb、15kb、25kb、50kbまたは最大100kbである。ある実施形態では、ゲノムDNA断片は、0.1kbから0.5kbの間、0.1kbから1kbの間、0.1kbから2.5kbの間、0.1kbから5kbの間、0.1kbから10kbの間、0.1kbから25kbの間、0.1kbから50kbの間、0.1kbから100kbの間、0.5kbから1kbの間、0.5kbから2.5kbの間、0.5kbから5kbの間、0.5kbから10kbの間、0.5kbから25kbの間、0.5kbから50kbの間、0.5kbから100kbの間、1kbから2.5kbの間、1kbから5kbの間、1kbから10kbの間、1kbから25kbの間、1kbから50kbの間、1kbから100kbの間、2.5kbから5kbの間、2.5kbから10kbの間、2.5kbから25kbの間、2.5kbから50kbの間、2.5kbから100kbの間、5kbから10kbの間、5kbから25kbの間、5kbから50kbの間、5kbから100kbの間、10kbから25kbの間、10kbから50kbの間、10kbから100kbの間、25kbから50kbの間、25kbから100kbの間、または50kbから100kbの間である。当業者に公知の任意の方法を使用してゲノムDNAを分画できる。ある例示的な実施形態では、剪断力により、例えばDNAに注射器を通過させることによりゲノムDNAを断片化する。別の例示的な実施形態では、超音波処理によりDNAを断片化する。
【０１３３】
ある実施形態では、ゲノムDNA断片は、細胞に効率的に形質転換されるのに十分なほど小さいが、少なくとも1つの平均サイズのオープンリーディングフレームを含むのに十分なほど大きいものである。
【０１３４】
ある実施形態では、レーザキャプチャ顕微解剖を使用して腫瘍細胞または前癌病変の細胞を得る。例示的な一実施形態では、AutoPix(商標)自動レーザキャプチャ顕微解剖(LCM)システム(Arcturus、California)を使用して組織試料から腫瘍細胞または前癌病変の細胞を単離できる。
【０１３５】
続いて、レーザキャプチャ顕微解剖によって得た細胞からゲノムDNAを調製できる。当業者に公知の任意の方法によりゲノムDNAを増幅できる。具体的な一実施形態では、被験体からの生検によって組織を得て、その組織を固定して、続いてレーザキャプチャ顕微解剖に供して、その組織から腫瘍細胞または前癌病変の細胞を得る。ある実施形態では、腫瘍細胞または前癌病変を形態に基づいて選択する。他の実施形態では、腫瘍細胞または前癌病変に特異的なマーカーを使用して、これらの腫瘍細胞または前癌病変を周辺組織と区別する。
【０１３６】
4.4 抗原提示細胞と、腫瘍細胞、前癌細胞または感染性因子に由来するcDNAを含む非樹状細胞との融合
本発明は、被験体での癌および前癌病変の予防および治療のための方法も提供し、この方法では、被験体に融合細胞が投与され、その融合細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出したmRNAから合成した相補的DNA分子(「cDNA」)を含む非樹状細胞とを融合させることによって形成されるものである。そのような融合細胞の予防または治療量を、そのような予防または治療を必要とする被験体に投与する。ある実施形態では、そのような融合細胞を、体液性免疫応答および/または細胞傷害性Tリンパ球応答(CTL)を刺激する分子の治療上有効な量と併用投与する。好ましい実施形態では、本発明は、IL-12などであるがそれに限定されるわけではないサイトカインと治療上有効な量の融合細胞とを併用投与することを含む方法に関する。
【０１３７】
本明細書に記載する方法によれば、樹状細胞などの抗原提示細胞を、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出したmRNAから合成したcDNAを含む非樹状細胞と融合され、その非樹状細胞は、予防または治療すべき癌の抗原またはエピトープ特性を含む。理論に拘束されないが、腫瘍細胞または前癌細胞のmRNAから合成した1つまたは複数のcDNAは、予防または治療すべき癌の抗原またはエピトープ特性をコードする。他の実施形態では、腫瘍細胞または前癌細胞のmRNAから合成した1つまたは複数のcDNAは、非樹状細胞(および樹状細胞がその非樹状細胞と融合されたときは、融合細胞)において、治療または予防すべき癌または前癌病変でもそれぞれ高レベルであるタンパク質を高レベルで発現させる。高レベルのタンパク質とは、非癌細胞に対する癌細胞または前癌細胞中のタンパク質レベルを指す。抗原提示細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞に由来するcDNAを含む非樹状細胞とを含む、得られた融合細胞は、その融合細胞によって発現される抗原を有する腫瘍を予防するための強力な組成物として使用される。
【０１３８】
本発明のある実施形態では、融合細胞は腫瘍または前癌病変の抗原性を示す1つまたは複数の分子を含む。本発明のある実施形態では、その融合細胞は腫瘍または前癌病変の1つまたは複数の抗原またはエピトープを含む。他の実施形態では、その抗原は腫瘍または前癌病変に関連する。ある実施形態では、その抗原は、腫瘍または前癌病変を有する被験体の他の任意の組織に比べて、その腫瘍または前癌病変に少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いレベルで発現する。ある実施形態では、その抗原は、腫瘍または前癌病変が由来する組織または細胞型に比べて、その腫瘍または前癌病変に少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いレベルで発現する。さらに具体的なある実施形態では、融合細胞と腫瘍または前癌病変との間で共通な抗原またはエピトープは、その腫瘍または前癌病変に特異的である。
【０１３９】
本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを少なくとも10-8g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを少なくとも10-9g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを少なくとも10-10g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを少なくとも10-11g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを少なくとも10-12g導入する。
【０１４０】
本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを最大10-8g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを最大10-9g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを最大10-10g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを最大10-11g導入する。本発明のある実施形態では、非樹状細胞または普遍的抗原提示細胞1個あたりcDNAを最大10-12g導入する。
【０１４１】
一実施形態では、前癌細胞に関して一般的にみられるように、特異的抗原を容易に同定できないときに、この手法は有利である。ヒトの癌の予防のために、例えば生検によって患者の前癌病変から例えば前癌細胞を直接得る。続いて、その前癌細胞からmRNAを抽出して、そのmRNAからcDNA分子を合成する。ある実施形態では、続いてcDNAを増幅する。ある実施形態では、cDNAは腫瘍特異的cDNAまたは腫瘍関連cDNAが濃縮されている。ある実施形態では、腫瘍細胞または前癌細胞から得られたcDNAからcDNAライブラリーを作製する。ある実施形態では、腫瘍特異的cDNAもしくは腫瘍関連cDNAが増幅もしくは濃縮されているか、またはcDNAライブラリーの形態であってもよいcDNAを、次に非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションする。この場合、抗原提示細胞を用いてそのような非樹状細胞から形成した融合細胞と、そのような融合細胞を含む組成物とは、予防される癌に対して高度に特異的である。
【０１４２】
当業者に公知の任意の方法により、癌細胞または前癌細胞からmRNAを得ることができる。例示的な一実施形態では、商業的に、例えばAmbion社から入手できる多くのキットの任意の1つを使用して癌細胞または前癌細胞からまず総RNAを得る。続いて、例えばオリゴ-dTカラムを使用してその総RNAからポリ(A)RNAを単離できる。別の実施形態では、商業的に、例えばAmbion社から入手できる多くのキットのうち任意の1つを例えば使用することによって、組織からポリ(A)RNAを直接単離する。次に、逆転写を使用したcDNA合成用のテンプレートとしてそのポリ(A)RNAを使用できる。逆転写の結果として、一本鎖cDNAがもたらされる。次に、当業者に公知の任意の方法を使用して第2鎖を合成できる。具体的な一実施形態では、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を使用して第2鎖を合成する。cDNAの5'末端で逆転写により生成した相補的尾部から形成するヘアピンループにより、ポリメラーゼ反応用のプライマーを用意する。別の実施形態では、RNアーゼH、大腸菌DNAポリメラーゼI、およびDNAリガーゼを使用してcDNAの第2鎖を合成する。次に、PCRを使用してcDNAを増幅でき、また、cDNA分子をクローニングベクターに連結してcDNAライブラリーを作製することができる。ある実施形態では、そのcDNAに公知の配列のオリゴヌクレオチドを連結でき、それらの配列に相補的なオリゴヌクレオチドをPCR用のプライマーとして使用する。生検によって得られた組織が非常に少量ならば、腫瘍細胞または前癌病変からのcDNAの増幅が必要なことがある。当業者に公知の任意の方法によってcDNAを増幅できる。
【０１４３】
ある実施形態では、治療または予防される癌に特異的な抗原をコードするcDNAは、本発明の方法で使用されるcDNAプールまたはcDNAライブラリーに濃縮されている。当業者に公知の任意の方法を使用して、治療される癌に特異的なcDNAを濃縮できる。具体的な一実施形態では、BD BiosciencesからのPCR-Select(商標)cDNAサブトラクションキットを使用して、腫瘍に特異的な抗原をコードするcDNAを濃縮する。ある実施形態では、腫瘍細胞または前癌細胞からのcDNAは、その腫瘍細胞または前癌細胞が由来する細胞ではなく、その腫瘍細胞または前癌細胞に存在するcDNAが、濃縮されている。
【０１４４】
ある実施形態では、非樹状細胞に1つまたは複数のcDNAを導入し、そのcDNAは腫瘍関連抗原または腫瘍関連エピトープをコードする。ある実施形態では、cDNAは、非癌細胞に比べて癌で発現が上方制御される抗原またはエピトープをコードする。腫瘍関連エピトープは、例えば癌と関連することが公知の突然変異が原因で、野生型タンパク質とは異なる構造を有するタンパク質の領域でありうる。ある実施形態では、1つまたは複数の発現ベクターを非樹状細胞に導入し、その発現ベクターから腫瘍関連抗原または腫瘍関連エピトープを発現できる。ある実施形態では、1つまたは複数の発現ベクターを非樹状細胞に導入し、非癌細胞に比べて癌で上方制御される抗原またはエピトープをその発現ベクターから発現できる。続いて、cDNAおよび/または発現ベクターを有する非樹状細胞を抗原提示細胞と融合する。次に、その融合細胞を用いて、腫瘍関連抗原もしくは腫瘍関連エピトープ、または非癌細胞に比べて癌細胞で上方制御される抗原もしくはエピトープに対する免疫応答を刺激できる。
【０１４５】
当業者に公知の任意の技法により、cDNAを非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる。ある実施形態では、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在性トランスフェクションを使用して非樹状細胞にcDNAをトランスフェクトする(Short Protocols in Molecular Biology、Ansubelら(編)、John Wiley & Sons社、1999の第9章参照)。
【０１４６】
ある実施形態では、感染性因子のmRNAから合成したcDNAを非樹状細胞に導入して、次にその非樹状細胞を抗原提示細胞と融合する。そのような融合細胞を用いて、cDNAが得られた感染性因子に対する免疫応答を促進できる。感染性因子から、または感染性因子に感染した細胞から、cDNAを合成するためのmRNAを得ることができる。特に、感染性因子が公知でないならば、感染症に悩む被験体の細胞からcDNAを取り出す。
【０１４７】
非樹状細胞と、腫瘍細胞または前癌細胞に由来するゲノムDNAをトランスフェクトした細胞とを融合するための、セクション4.1.1および4.1.2に記載した抗原提示細胞および非樹状細胞の方法および供給源を、抗原提示細胞と、前癌細胞または腫瘍細胞からのcDNAをトランスフェクトした非樹状細胞との融合にも使用できる。本発明の融合細胞を用いて治療または予防できる標的癌を、下記のセクション4.12に述べる。
【０１４８】
任意の方法を使用して、cDNAを導入した非樹状細胞を同定および単離できる。ある実施形態では、マーカー遺伝子をコードするDNAをcDNAと同時に非樹状細胞に導入する。マーカー遺伝子が陽性の細胞は、そのcDNAも保持する。当業者に公知の任意のマーカー遺伝子を使用できる。マーカー遺伝子の例示的な例には、遺伝子産物が特定の抗生物質に対する耐性(例えばネオマイシン耐性)を細胞に付与する遺伝子、遺伝子産物が細胞によって増殖に通常必要とされる物質を欠如した培地上でその細胞を増殖できるようにする遺伝子、または遺伝子産物が視覚的マーカーをコードする遺伝子がある。本発明の方法で使用できる視覚的マーカーは、例えばGFPである。視覚的マーカーおよびcDNAをコードするDNAが導入された細胞を、FACSを使用して単離できる。
【０１４９】
本発明のある実施形態では、抗原提示細胞に非樹状細胞を融合する前に、癌細胞または前癌病変の細胞に由来するmRNAをcDNAの代わりに非樹状細胞に直接導入する。次に、抗原提示細胞と、癌細胞または前癌病変の細胞に由来するcDNAを含む非樹状細胞との融合体の代わりに、そのような融合細胞を上記のように癌の治療および予防のために使用できる。ある実施形態では、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子から単離したmRNAから調製したcDNAを使用してmRNAを転写でき、次に、そのmRNAを非樹状細胞に導入する。ある実施形態では、腫瘍関連抗原をコードするmRNAを非樹状細胞に導入する。腫瘍関連抗原をセクション4.8に記載する。
【０１５０】
本発明のある実施形態では、感染性因子由来のmRNAを非樹状細胞に導入してから、抗原提示細胞に非樹状細胞を融合する。次に、そのような融合細胞を、融合細胞について本明細書に記載したような感染症の治療および予防に使用できる。ある実施形態では、感染性因子から単離したmRNAから調製したcDNAを使用してmRNAを転写でき、次に、そのmRNAを非樹状細胞に導入する。ある実施形態では、感染性因子に特異的な抗原をコードするmRNAを非樹状細胞に導入する。腫瘍関連抗原についてセクション4.8に説明する。
【０１５１】
ある実施形態では、抗原提示細胞は成熟樹状細胞である(例えばセクション4.5および4.9参照)。
【０１５２】
4.5 抗原提示細胞
被験体の血液もしくは骨髄、または例えば脾臓、リンパ節、扁桃、腸のパイエル板もしくは骨髄などであるがそれに限定されるわけではない二次リンパ器官から、当技術分野で公知の任意の方法によって、樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞を単離または発生できる。好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される樹状細胞は、最終分化した樹状細胞である。一実施形態では、樹状細胞はヒト血液単球から単離される。ある実施形態では、樹状細胞は本発明の融合細胞が投与される被験体にとって自家性である。代替の実施形態では、樹状細胞は本発明の融合細胞が投与される被験体にとって同種異系である。ある実施形態では、抗原提示細胞と治療される被験体との間で少なくとも1つのMHCクラスIアレルが共通である。ある実施形態では、抗原提示細胞は普遍的抗原提示細胞である(セクション4.7参照)。
【０１５３】
そのような供給源から得られた免疫細胞は、概して様々な分化段階および成熟段階で再循環中のリンパ球およびマクロファージを主に含む。標準的な技法によって樹状細胞調製物を濃縮できる(例えばCurrent Protocols in Immunology、7.32.1-7.32.16、John Wiley and Sons社、1997参照)。例えば一実施形態では、T細胞および接着細胞を枯渇した後の密度勾配遠心分離によって樹状細胞を濃縮できる。蛍光標識した細胞の分取によって、または抗CD83mAb磁気ビーズを使用することによって樹状細胞を場合によってはさらに精製できる。
【０１５４】
あるいは、血液試料または骨髄に存在する樹状細胞前駆細胞を、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびインターロイキン4(IL-4)などのサイトカインで処理することによって、樹状細胞のかなり均一な集団を高い収率で得ることができる。そのような条件で、単球は細胞増殖せずに樹状細胞に分化する。TNFαなどであるがそれに限定されるわけではない薬剤を用いたさらなる処理は、樹状細胞の最終分化を刺激する。
【０１５５】
ある実施形態では、樹状細胞が単離される個体に有効量のFLT3リガンドを投与することによって樹状細胞の収率を増加することができる(例えばFongら、2000、Altered Peptide Ligand Vaccination with Fit 3 Lig and Expanded Dendrite Cells from Tumor、Immunaotherapy、Proc. Natl. Sci. USA 98(15): 8809-14参照)。
【０１５６】
限定ではなく一例として、標準法により血液単球から樹状細胞を得る(例えばSallustoら、1994、J. Exp. Med. 179:1109-1118参照)。健康な血液ドナーからの白血球を白血球搬出パック、またはFicoll-Paque密度勾配遠心分離およびプラスチック接着を使用したバフィコート調製物によって収集する。成熟樹状細胞を望むならば、以下のプロトコールを使用して樹状細胞を培養できる。細胞を37ECで4時間プラスチック皿に接着させる。非接着細胞を除き、接着した単球を、0.1μg/ml顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子および0.05μg/mlインターロイキン-4を含む培地で7日間培養する。樹状細胞を調製するために、腫瘍壊死因子αを5日目に加え、細胞を7日目に収集する。
【０１５７】
このように得られた樹状細胞は、細胞表面マーカーCD83を特徴的に発現する。さらに、そのような細胞は、高レベルのMHCクラスII分子と、細胞表面マーカーCD1α、CD40、CD86、CD54、およびCD80とを特徴的に発現するが、CD14の発現を欠如している。他の細胞表面マーカーには、特徴的にT細胞マーカーCD2およびCD5と、B細胞マーカーCD7と、骨髄性細胞マーカーCD13、CD32(FcγRII)、CD33、CD36、およびCD63と、多数の白血球関連抗原とがある。
【０１５８】
場合によっては、形態観察および免疫化学染色などの標準的な技法を使用して樹状細胞の存在を立証できる。例えば、上に述べた1つまたは複数の特徴的な細胞表面マーカー、例えばCD83、HLA-ABC、HLA-DR、CD1α、CD40、および/またはCD54に対する蛍光色素標識抗体を使用したフローサイトメトリーによって、樹状細胞の純度を評価できる。この技法を使用して、分化した成熟樹状細胞に存在しないが分化した未熟樹状細胞に存在するCD14に対する蛍光色素標識抗体を用いて未熟樹状細胞を区別することもできる。
【０１５９】
ある実施形態では、本発明の方法で、抗原提示細胞としてセクション4.7に記載するような普遍的抗原提示細胞を使用する。ある実施形態では、セクション4.7に記載するような普遍的抗原提示細胞を抗原提示細胞として使用して、本発明の融合細胞を作製する。
【０１６０】
4.6 融合細胞の作製
以下のようにして非樹状細胞を抗原提示細胞と融合できる。細胞を無菌的に洗浄し、当技術分野の任意の細胞融合法（その技術が哺乳動物に注射するのに適した、癌を予防するための融合細胞の混合物をもたらす限りに置いて）に従って融合させる。ある実施形態では、電気融合を使用する。電気融合法は当技術分野で周知である(StuhlerおよびWalden、1994、Cancer Immunol. Immunother. 39: 342-345;Changら(編)、Guide to Electroporation and Electrofusion. Academic Press、San Diego、1992参照)。
【０１６１】
例示的な一実施形態では、非樹状細胞5×107個を融合細胞の形成のための出発材料として使用する。一実施形態では、融合細胞の形成のために非樹状細胞約1×106〜1×109個を使用する。別の実施形態では、非樹状細胞5×107〜2×108個を使用する。なお別の実施形態では、非樹状細胞1×107〜1×1010個を使用する。融合細胞を調製するために他の量の非樹状細胞を使用することは、本発明の範囲内である。
【０１６２】
具体的で例示的で非限定的な実施形態では、以下のプロトコールを使用する。第1段階で、ゲノムDNAまたはcDNAを導入した非樹状細胞約5×107個と樹状細胞5×107個とを0.3Mグルコース中に懸濁し、電気融合キュベットに移す。その試料を誘電泳動的に整列させて、100V/cmで5〜10秒間、細胞試料にパルスをかけることによって細胞-細胞結合体を形成させる。場合によっては、エレクトロポレーション用キュベットの一面に誘電ワックス1滴を適用して電界を「不均一」にして、最高の電界強度の領域に細胞を向けることによって整列を最適にできる。第2段階で、融合パルスをかける。電気融合には様々なパラメータを使用できる。例えば一実施形態では、融合パルスは１回のパルス〜三回のパルスであってよい。別の実施形態では、約25μFで500から1500V/cm、好ましくは1200V/cmを用いて電気融合を達成する。
【０１６３】
好ましい実施形態では、非樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される患者にとって自家性である。別の好ましい実施形態では、抗原提示細胞は本発明の融合細胞が投与される患者にとって自家性である。なおさらに好ましい実施形態では、非樹状細胞と抗原提示細胞との両方が、本発明の融合細胞が投与される患者にとって自家性である。
【０１６４】
別の実施形態では、以下のプロトコールを使用する。第一に、骨髄を単離して赤血球を塩化アンモニウム(Sigma、St. Louis、MO)で溶解する。骨髄細胞からリンパ球、顆粒球および抗原提示細胞を枯渇させ、残りの細胞を24ウェル培養プレート(細胞1×106個/ウェル)で5%熱不活性化FBS、50μM 2-メルカプトエタノール、2mMグルタミン酸塩、100U/mlペニシリン、100pg/mlストレプトマイシン、10ng/ml組換え顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF;Becton Dickinson、San Jose、CA)、および30U/ml組換えインターロイキン-4(IL-4;Becton Dickinson)を補充したRPMI1640培地に入れて平板培養する。第二に、培養5日目に非接着細胞および緩く接着した細胞を収集し、100mmペトリ皿(細胞1×106個/ml;10ml/皿)で再平板培養する。次に、RPMI培地に溶かしたGM-CSFおよびIL-4を細胞に加え、DC 1×106個を、照射した(50Gy、日立MBR-1520R、線量率:1.1Gy/min)前癌性非樹状細胞3×106個と混合する。48時間後にポリエチレングリコール(PEG1500;Sigma、St. Louis、MO)の50%溶液500μlを60秒かけて滴下することによって融合を開始する。無血清RPMI培地30mlを徐々に加えることによって融合を停止する。RPMI培地中でGM-CSFおよびIL-4の存在下で100mmペトリ皿の中で融合細胞を48時間平板培養する。
【０１６５】
別の実施形態では、樹状細胞および非樹状細胞を上記のように融合する。続いて、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激する分子をコードする遺伝物質を用いて、融合した細胞を形質転換するか、またはその遺伝物質をその細胞にトランスフェクトする。好ましい実施形態では、その遺伝物質はIL-12をコードするmRNAである。トランスフェクションの好ましい方法には、エレクトロポレーション、または陽イオン性ポリマー存在下での形質転換もしくはトランスフェクションがある。
【０１６６】
非樹状細胞および抗原提示細胞の集団内の融合細胞形成度を、当技術分野で公知の多数の診断法によって決定できる。一実施形態では、それぞれ例えば赤色および緑色細胞内蛍光色素で抗原提示細胞および非樹状細胞を標識して、両方の色の発光を検出することによって雑種を特定する。非樹状細胞の不在下の抗原提示細胞の試料と、抗原提示細胞不在下の非樹状細胞の試料とを、融合していない前癌性非樹状細胞と抗原提示細胞との混合物と同様に、陰性対照として使用できる。
【０１６７】
ある実施形態では、哺乳動物に(免疫刺激分子の同時投与下または非投与下で)融合細胞を投与する前に、例えば照射によってその融合細胞を不活性化して、融合細胞の増殖を防止する。好ましくは、融合細胞集団を200Gyで照射し、それ以上選択せずに注射する。一実施形態では、この方法によって調製された融合細胞は、総細胞集団の約10および20%を占める。なお別の実施形態では、この方法によって調製された融合細胞は、総細胞集団の約5から50%を占める。
【０１６８】
4.7 普遍的抗原提示細胞からの分子ワクチン
ある実施形態では、前癌細胞または癌細胞からのゲノムDNAを普遍的抗原提示細胞に導入する。1つまたは複数の共刺激分子(例えばB7、ICAM-Iおよび/またはICAM-II)を細胞にて組換え発現させることによって普遍的抗原提示細胞を調製する。ある実施形態では、細胞に以下の1つまたは複数の分子、すなわちB7、ICAM-I、ICAM-II、MHCクラスI、MHCクラスIIおよび/またはLFA-3を組換え発現させることによって普遍的抗原提示細胞を調製する。当業者に公知の任意の方法を使用して、どの共刺激分子がその細胞によって内因性発現されるかを決定できる。次に、その細胞を遺伝子操作して、ある追加の共刺激分子を結果的に発現させる。
【０１６９】
ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-Iを組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-IおよびMHCクラスIを組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、MHCクラスI、およびB7を組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、MHCクラスII、およびMHCクラスIを組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、MHCクラスI、MHCクラスII、およびB7を組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-IおよびICAM-IIを組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、ICAM-IIおよびMHCクラスIを組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、ICAM-II、MHCクラスI、およびB7を組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、ICAM-II、MHCクラスII、およびMHCクラスIを組換え発現するように作製する。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞をICAM-I、ICAM-II、MHCクラスI、MHCクラスII、およびB7を組換え発現するように作製する。ある実施形態では、その細胞を操作してLFA-3を組換え発現させる。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞を操作してB7.1(CD80)および/またはB7.2(CD86)を組換え発現させる。ある実施形態では、細胞にて組換え発現されて普遍的抗原提示細胞を作製する分子は、治療される被験体からの遺伝子のアレルと同じであるその遺伝子のアレルによってコードされる。ある実施形態では、その抗原提示細胞は治療される被験体と主要組織適合遺伝子複合体(MHC)が一致する。さらに具体的なある実施形態では、少なくとも1つのMHCクラスIアレルは、融合細胞のレシピエントと普遍的抗原提示細胞との間で共通である。
【０１７０】
共刺激分子は、抗原提示細胞およびT細胞の表面でそれぞれ発現する受容体-リガンド対の間の相互作用に関与する。受容体-リガンド対の一例は、樹状細胞の表面上のB7共刺激分子と、T細胞上のその対受容体(counter-receptor)であるCD28またはCTLA-4とである(Freemanら(1993) Science 262: 909-911; Youngら(1992) J. Clin. Invest 90: 229;およびNabaviら、Nature 360: 266)。他の重要な共刺激分子は、CD40、CD54、CD80、およびCD86であり、それらを本発明の方法および組成物で単独または組み合わせて使用することもできる。
【０１７１】
普遍的抗原提示細胞を任意の細胞型から調製できる。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞を作製するために使用される細胞は、治療される被験体の種と同じ種由来である。ある実施形態では、容易にトランスフェクトできる細胞から普遍的抗原提示細胞を調製する。本発明のある実施形態では、培養して容易に増殖する細胞から普遍的抗原提示細胞を調製する。具体的で例示的な一実施形態では、本発明の普遍的抗原提示細胞は293P細胞である。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞を操作して、例えばIL-12であるがそれに限定されるわけではないサイトカインを組換え発現させる。
【０１７２】
当業者に公知の任意の方法を使用して、細胞に共刺激分子を発現させて、普遍的抗原提示細胞を作製することができる。ある実施形態では、共刺激分子をコードする発現ベクターを細胞に一過的にトランスフェクトする。他の実施形態では、細胞に永続的にトランスフェクトして共刺激分子を発現させる。当業者に公知の任意の方法によって、発現構築体のDNAを細胞に導入できる。例示的な実施形態では、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在性トランスフェクションによってDNAを導入する(Short Protocols in Molecular Biology、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons社、1999の第9章参照)。他の実施形態では、共刺激因子をコードするDNA分子をマイクロインジェクションによって細胞に導入する。普遍的抗原提示細胞を発生させるために使用される特定の細胞型での発現に適した任意のプロモーターを、共刺激因子の発現構築体に使用できる。共刺激因子を発現させるためのベクターは、哺乳動物細胞での複製および発現に使用される、当技術分野で公知のプラスミド性、ウイルス性などでありうる。共刺激因子の発現は、普遍的抗原提示細胞を発生させるために使用される細胞において作用することが当技術分野で公知の任意のプロモーターによるものでありうる。そのようなプロモーターは、誘導性または構成性でありうる。そのようなプロモーターには、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon、1981、Nature 290、304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3長鎖末端リピートに含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980、Cell 22、787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78、1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982、Nature 296、39-42)などがあるが、それに限定されるわけではない。任意の種類のプラスミド、コスミド、YAC、またはウイルスベクターを使用して、細胞にトランスフェクトするために使用できる組換えDNA構築体を調製できる。
【０１７３】
本明細書に記載するような癌に対するワクチンとして、癌細胞または前癌細胞のゲノムDNAを含む普遍的抗原提示細胞を使用できる。
【０１７４】
ある実施形態では、腫瘍細胞または前癌細胞から抽出したmRNAから合成した相補的DNA分子(「cDNA」)を普遍的抗原提示細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる(セクション4.4参照)。
【０１７５】
ある実施形態では、感染性因子から抽出したmRNAから合成した相補的DNA分子(「cDNA」)もしくはcDNAライブラリーを、または感染性因子のゲノムDNAを、普遍的抗原提示細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる。
【０１７６】
当業者に公知の任意の技法を使用して、治療される被験体からMHCクラスI、MHCクラスII、または共刺激分子のアレルを得ることができる。具体的な一実施形態では、治療される被験体からDNAを得て、MHCクラスI、MHCクラスII、および/または共刺激分子をコードする遺伝子をPCRを使用して増幅する。別の実施形態では、治療される被験体からRNAを単離して、RT-PCRを使用してMHCクラスI、MHCクラスII、および/または共刺激分子をコードするオープンリーディングフレームを得る。次に、適切なプロモーターを用いてそのDNAをベクターにクローニングして、続いて細胞にトランスフェクトして普遍的抗原提示細胞を発生させることができる。当業者は認識しているであろうが、プロモーターの適切性は、普遍的抗原提示細胞を発生させるために使用する細胞型に依存する。
【０１７７】
本発明は、普遍的抗原提示細胞を作製するための方法と、抗原提示細胞および非樹状細胞を用いた融合細胞を作製するための方法と、腫瘍細胞のゲノムDNA、または腫瘍細胞から単離されたmRNA由来のcDNAを含む普遍的抗原提示細胞を作製するための方法とにも関する。本発明は、これらの方法により作製された細胞にも関する。
【０１７８】
本発明のある実施形態では、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子に由来するmRNAを普遍的抗原提示細胞に導入する。次に、融合細胞について上に記載したように、そのような普遍的抗原提示細胞を癌または感染症の治療および予防にそれぞれ使用できる。ある実施形態では、癌細胞、前癌病変の細胞、または感染性因子から単離したmRNAから調製したcDNAを用いてmRNAを転写でき、そのmRNAを次に普遍的抗原提示細胞に導入する。ある実施形態では、腫瘍関連抗原、または感染性因子に特異的な抗原をコードするmRNAを普遍的抗原提示細胞に導入する。
【０１７９】
4.8 抗原提示細胞と、腫瘍関連抗原をコードするDNAを含む非樹状細胞との融合
ある実施形態では、本発明は被験体での癌を治療または予防する方法を提供し、その方法は、その被験体に融合細胞を投与することを含み、そのような融合細胞は、抗原提示細胞と非樹状細胞とを融合することによって作製されるものであり、その非樹状細胞は1つまたは複数の腫瘍関連抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体を含む。
【０１８０】
腫瘍関連抗原(または癌関連抗原)には、p53およびその突然変異体、Rasおよびその突然変異体、Bcr/Ablブレークポイントペプチド、HER-2/neu、HPV E6、HPV E7、癌胎児性抗原、MUC-1、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15、gp100、MART-1/MelanA、チロシナーゼ、TRP-1、ベータ-カテニン、MUM-1、およびCDK-4があるが、それに限定されるわけではない。他の腫瘍関連腫瘍抗原には、KS1/4汎癌腫抗原(pan-carcinoma antigen)(PerezおよびWalker、1990、J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal、1988、Hybridoma 7(4):407-415);卵巣癌抗原(CA125)(Yuら、1991、Cancer Res. 51(2):468-475);前立腺酸性リン酸塩(Tailerら、1990、Nucl. Acids Res. 18(16):4928);前立腺特異抗原(HenttuおよびVihko、1989、Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910;Israeliら、1993、Cancer Res. 53:227-230);黒色腫関連抗原p97(Estinら、1989、J. Natl. Cancer Inst. 81(6):445-446);黒色腫抗原gp75(Vijayasardahlら、1990、J. Exp. Med. 171(4):1375-1380);高分子量黒色腫抗原(Nataliら、1987、Cancer 59:55-63)、および前立腺特異的膜抗原がある。
【０１８１】
当業者に公知の任意の方法を使用して非樹状細胞に腫瘍関連抗原を発現させることができる。ある実施形態では、腫瘍関連抗原をコードする発現ベクターを非樹状細胞に一過的にトランスフェクトする。他の実施形態では、非樹状細胞に永続的にトランスフェクトして腫瘍関連抗原を発現させる。当業者に公知の任意の方法によって発現構築体のDNAを細胞に導入できる。例示的な実施形態では、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在性トランスフェクションによってDNAを導入する(Short Protocols in Molecular Biology、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons社、1999の第9章参照)。他の実施形態では、腫瘍関連抗原をコードするDNA分子をマイクロインジェクションによって細胞に導入する。融合細胞を発生させるために使用される特定の細胞型の非樹状細胞に発現させるのに適した任意のプロモーターを、腫瘍関連抗原の発現構築体に使用できる。そのようなプロモーターは誘導性または構成性でありうる。そのようなプロモーターには、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon、1981、Nature 290、304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3長鎖末端リピートに含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980、Cell 22、787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78、1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982、Nature 296、39-42)などがあるが、それに限定されるわけではない。腫瘍関連抗原の発現用のベクターは、哺乳動物細胞に複製および発現させるために使用される当技術分野で公知のプラスミド性、ウイルス性などでありうる。任意の種類のプラスミド、コスミド、YAC、またはウイルスベクターを使用して、細胞にトランスフェクトするために使用できる組換えDNA構築体を調製できる。
【０１８２】
具体的な一実施形態では、意図するレシピエントの非樹状細胞に、腫瘍関連抗原をコードする発現ベクターを導入し、続いて、その非樹状細胞を樹状細胞と融合し、結果として生じた融合細胞をそのレシピエントに投与する。
【０１８３】
ある実施形態では、感染性因子に関連するか、または感染性因子に特異的な抗原をコードするcDNAまたはmRNAを非樹状細胞に導入する。
【０１８４】
ある実施形態では、本発明は融合細胞を含む組成物を提供し、そのような融合細胞は、樹状細胞または普遍的抗原提示細胞のような抗原提示細胞を、非樹状細胞と融合することによって作製され、その非樹状細胞は1つまたは複数の腫瘍関連抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体を含む。ある実施形態では、本発明は、1つまたは複数の腫瘍関連抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体を含む普遍的抗原提示細胞4.7を含む組成物を提供する。
【０１８５】
ある実施形態では、本発明は融合細胞を含む組成物を提供し、そのような融合細胞は、樹状細胞または普遍的抗原提示細胞のような抗原提示細胞と、非樹状細胞とを融合することによって作製され、その非樹状細胞は、感染性因子に特異的な1つまたは複数の抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体を含む。ある実施形態では、本発明は、感染性因子に特異的な1つまたは複数の抗原をコードする1つまたは複数の発現構築体を含む普遍的抗原提示細胞4.7を含む組成物を提供する。
【０１８６】
4.9 融合細胞または普遍的抗原提示細胞を用いた免疫エフェクター細胞の教化
本発明のある実施形態では、本発明の融合細胞または本発明の普遍的抗原提示細胞を用いて抗原特異的免疫エフェクター細胞を作製することができる。免疫エフェクター細胞としては、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、およびT細胞があるが、それに限定されるわけではない。ある実施形態では、本発明の融合細胞または本発明の普遍的抗原提示細胞を用いて免疫エフェクター細胞を教化できる。ある実施形態では、本発明の融合細胞または本発明の普遍的抗原提示細胞を用いて、抗原特異的ではない免疫エフェクター細胞から抗原特異的免疫エフェクター細胞を作製することができる。ある実施形態では、本発明の方法は、培養した本発明の融合細胞を用いた免疫エフェクター細胞の増殖に関する。ある実施形態では、その方法は、免疫エフェクター細胞を本発明の融合細胞と共に共培養することを含む。
【０１８７】
免疫エフェクター細胞を教化し、かつ/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖もしくは発生させるために使用できる本発明の融合細胞は、樹状細胞または普遍的抗原提示細胞などの抗原提示細胞と非樹状細胞とを融合することによって形成することができ、その非樹状細胞は、癌細胞もしくは前癌病変の細胞から抽出したゲノムDNA;癌細胞もしくは前癌病変の細胞に由来するcDNAもしくはcDNAライブラリー;腫瘍関連抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;感染性因子から抽出したゲノムDNA;感染性因子に感染した細胞から抽出したゲノムDNA;感染性因子由来のcDNA;感染性因子に感染した細胞由来のcDNA;感染性因子に特異的な抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するmRNA;または癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するcDNAから転写されたmRNAを含む。ある実施形態では、本発明の融合細胞は治療または予防される癌の1つまたは複数の抗原を発現する。ある実施形態では、本発明の融合細胞は、治療または予防される感染性因子の1つまたは複数の抗原を発現する。ある実施形態では、その融合細胞を調製するために使用される抗原提示細胞は普遍的抗原提示細胞である。
【０１８８】
ある実施形態では、癌細胞もしくは前癌病変の細胞から抽出したゲノムDNA;癌細胞もしくは前癌病変の細胞に由来するcDNAもしくはcDNAライブラリー;腫瘍関連抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;感染性因子から抽出したゲノムDNA;感染性因子に感染した細胞から抽出したゲノムDNA;感染性因子由来のcDNA;感染性因子に感染した細胞由来のcDNA;感染性因子に特異的な抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するmRNA;または癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するcDNAから転写されたmRNAを含む普遍的抗原提示細胞(セクション4.7参照)を使用して免疫エフェクター細胞を教化し、かつ/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖もしくは発生させることができる。
【０１８９】
ある実施形態では、融合細胞または普遍的抗原提示細胞を用いて、その融合細胞または普遍的抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させることによって、その免疫エフェクター細胞を教化し、かつ/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖もしくは発生させる。
【０１９０】
ある実施形態では、免疫エフェクター細胞を教化し、かつ/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖もしくは発生させるために使用される融合細胞または普遍的抗原提示細胞は、癌または前癌病変に関連する1つまたは複数の抗原を発現する。さらに具体的な一実施形態では、その抗原は癌または前癌病変に特異的である。さらに具体的なある実施形態では、その抗原は融合細胞または普遍的抗原提示細胞の細胞表面に発現している。
【０１９１】
ある実施形態では、免疫エフェクター細胞を教化し、かつ/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖もしくは発生させるために使用される融合細胞または普遍的抗原提示細胞は、感染性因子に関連する1つまたは複数の抗原を発現する。さらに具体的な一実施形態では、その抗原は感染性因子に特異的である。さらに具体的なある実施形態では、その抗原は融合細胞または普遍的抗原提示細胞の細胞表面に発現している。
【０１９２】
ある実施形態では、免疫エフェクター細胞および本発明の融合細胞は共通に少なくとも1つのMHCクラスIアレルを共有する。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞および本発明の融合細胞は同種異系である。
【０１９３】
ある実施形態では、本発明の融合細胞または普遍的抗原提示細胞をナイーブ免疫エフェクター細胞と混合する。より具体的な一実施形態では、免疫エフェクター細胞は腫瘍細胞を特異的に認識し、治療される患者の腫瘍生検試料から濃縮されている。場合によっては、サイトカイン、例えばIL-2またはIL-12の存在下でこれらの細胞を培養してもよい。ある実施形態では、培養は、抗原特異的免疫エフェクター細胞が融合細胞または普遍的抗原提示細胞よりも速い速度で増殖するような条件である。ある実施形態では、融合細胞または普遍的抗原提示細胞を1回または複数の回数だけ共培養物に加える。
【０１９４】
ある実施形態では、本発明は、本発明の融合細胞を代償として免疫エフェクター細胞を増殖させることにより得られた免疫エフェクター細胞にも関する。
【０１９５】
免疫エフェクター細胞を増殖させる方法の例は、2002年4月11日公表の米国出願公開第2002/0,041,868号(2001年2月12日出願の出願番号第09/782,492号)に記載されており、その出願公開はその全体が参照により本明細書に組み入れる。
【０１９６】
ある実施形態では、本発明は、融合細胞を代償として免疫エフェクター細胞を増殖させることに関し、その融合細胞は成熟樹状細胞と腫瘍細胞との融合体である。例えばセクション4.6に記載するように、当業者に公知の任意の方法によってこれらの融合細胞を発生させることができる。
【０１９７】
限定ではなく一例として、成熟樹状細胞を血液単球から以下のように得ることができる。末梢血単球を標準法によって得る(例えばSallustoら、1994、J. Exp. Med. 179:1109-1118)。健康血液ドナーからの白血球を白血球搬出パック、またはFicoll-Paque密度勾配遠心分離およびプラスチック接着を使用したバフィコート調製により収集する。細胞を37℃で4時間プラスチック皿に接着させる。非接着細胞を除き、0.1μg/ml顆粒球-単球コロニー刺激因子および0.05μg/mlインターロイキン-4を含有する培地で、接着した単球を7日間培養する。成熟樹状細胞を調製するために、腫瘍壊死因子α(TNF-α)を好ましくは5日目に加え、細胞を7日目に収集する。
【０１９８】
このように得られた樹状細胞は、細胞表面マーカーCD83を特徴的に発現する。さらに、そのような細胞は高レベルのMHCクラスII分子と、細胞表面マーカーCD1α、CD40、CD86、CD54、およびCD80とを特徴的に発現するが、CD14の発現を欠如している。他の細胞表面マーカーには、T細胞マーカーCD2およびCD5と、B細胞マーカーCD7と、骨髄性細胞マーカーCD13、CD32(FcγRII)、CD33、CD36、およびCD63と、多数の白血球関連抗原とが特徴的にある。
【０１９９】
場合によっては、形態観察および免疫化学染色のような標準的な技法を使用して樹状細胞の存在を立証できる。例えば、上に述べた1つまたは複数の特徴的な細胞表面マーカー、例えばCD83、HLA-ABC、HLA-DR、CD1α、CD40、および/またはCD54に対する蛍光色素標識抗体を使用したフローサイトメトリーによって、樹状細胞の純度を評価できる。この技法を使用して、成熟DCに存在しないが未熟DCに存在するCD14に対する蛍光色素標識抗体を使用して成熟DCと未熟DCとを区別することもできる。
【０２００】
本発明は、本発明の融合細胞または普遍的抗原提示細胞を用いて発生した免疫エフェクター細胞を用いた治療方法にも関する。ある実施形態では、方法は、被験体に免疫エフェクター細胞を投与することを含み、その免疫エフェクター細胞は融合細胞または普遍的抗原提示細胞を用いて増殖され、かつ/または発生もしくは教化されたものである。
【０２０１】
4.10 免疫細胞活性化分子
本発明は、樹状細胞と非樹状細胞との融合から作製され、融合前に腫瘍細胞または前癌細胞のゲノムDNAがその非樹状細胞に導入された融合細胞を、第1に含み、ある実施形態では、細胞傷害性T細胞(CTL)応答および/または体液性応答を刺激または誘導できるサイトカインまたは他の分子をさらに含む組成物を提供する。
【０２０２】
好ましい実施形態では、CTL刺激分子はIL-12である。IL-12は、免疫応答でのエフェクター細胞の遊走および妥当な選択の調節に主な役割を果たす。IL-12遺伝子産物は、免疫応答をTヘルパー細胞TH1サブセットに向けて一般的に極性化し、CTL活性を強く刺激する。高用量のIL-12は、全身投与されると毒性を表すため、IL-12を好ましくは局所投与する。追加の投与様式を下記セクション4.13に述べる。
【０２０３】
IL-12受容体β2(IL-12R-β2)の発現は、IL-12応答性の維持およびTH1系列への分化の方向付けの制御に必要である。さらに、IL-12シグナル伝達は、STAT4の活性化、すなわちSTAT4のリン酸化の増加およびインターフェロンγ(IFN-γ)産生によって測定される活性化をもたらす。このように、一実施形態では、本発明はSTAT4を活性化できるIL-12ではない分子、例えばコンビナトリアルケミストリーの使用によって同定されたSTAT4の低分子活性化因子の使用を意図する。
【０２０４】
ある実施形態では、インターフェロンγの生成を増加させるIL-12以外の分子を融合細胞と組み合わせて使用する。
【０２０５】
代替的な実施形態では、免疫刺激分子はIL-18である。なお別の実施形態では、免疫刺激分子はIL-15である。なお別の実施形態では、免疫刺激分子はインターフェロンγである。
【０２０６】
別の実施形態では、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激または誘導する、本明細書に記載する分子またはサイトカインの任意の組合せを、治療される患者に投与する。
【０２０７】
あまり好ましくない実施形態では、細胞傷害性T細胞プール、すなわちTH1細胞亜集団を増加させるために、抗IL-4抗体を加えてTH2細胞へのTヘルパー細胞の分化の極性化を阻害することによって、Tヘルパー細胞のTH1サブセットへの選択圧を生み出すことができる。さらに、抗IL-4抗体をIL-12の投与と同時に投与して、TH細胞を誘導してTH1細胞に分化させることができる。分化後に細胞を洗浄し、例えば緩衝生理食塩水に再懸濁し、好ましくは静脈内投与によって患者に再導入することができる。
【０２０８】
別の実施形態では、体液性応答を増強するために、IL-4を加えてTH2ヘルパーT細胞の生成を刺激して、治療された個体の前癌細胞または腫瘍細胞に特異的に結合する抗体の合成を促進する。
【０２０９】
本発明は、上記のインターロイキン類の変異体にも関する。そのような変異体は、CTLおよび/または体液性免疫応答を促進するアゴニスト(模倣体)として機能できる改変アミノ酸配列を有する。変異体は、突然変異誘発、例えば、別個の点突然変異またはトランケートによって作製されうる。アゴニストは、天然型タンパク質の生物学的活性と同じ活性、またはそのサブセットを実質的に保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、対象となるタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流の構成員に競合的に結合することによって、天然型タンパク質の1つまたは複数の活性を阻害できる。このように、機能の限定された変異体を用いた治療によって、特異的な生物学的効果を誘発できる。天然型タンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体を用いた被験体の治療は、天然型タンパク質を用いた治療に比べて被験体での副作用を少なくすることができる。
【０２１０】
突然変異体、例えば、トランケート型突然変異体のコンビナトリアルライブラリーのアゴニスト活性をスクリーニングすることによって、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激することができる分子の変異体を同定できる。一実施形態では、変化に富んだ変異体ライブラリーが、コンビナトリアル突然変異誘発によって核酸レベルで作製され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。潜在的なタンパク質配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして、あるいは、より大きな融合タンパク質のセット(例えば、ファージディスプレイ用)として発現できるように、例えば、合成オリゴヌクレオチド混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって、変化に富んだ変異体ライブラリーを産生できる。IL-12の潜在的変異体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から産生するのに使用できる様々な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で公知である(例えば、Narang、1983、Tetrahedron 39:3;Itakuraら、1984、Annu. Rev. Biochem.、53:323;Itakuraら、1984、Science、198:1056;Ikeら、1983、Nucleic Acid Res.、11:477参照)。
【０２１１】
さらに、CTLおよび/または体液性免疫応答を促進できるインターロイキンのコード配列断片のライブラリーを使用して、変異体のスクリーニングと、それに続く選択とのために、変化に富んだポリペプチド集団を発生させることができる。例えば、一分子あたり約1回しかニッキングが起こらないという条件で、対象となるコード配列の二本鎖PCR断片をヌクレアーゼで処理し、得られた二本鎖DNAを変性させ、DNAを再生して、ニックの入った異なる生成物からのセンス/アンチセンス対を含むことができる二本鎖DNAを形成させ、S1ヌクレアーゼを用いた処理によって、再編成した二重鎖から一本鎖部分を除去し、結果として生じた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することによって、コード配列断片のライブラリーを発生させることができる。この方法により、様々なサイズの対象タンパク質のN末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０２１２】
点突然変異またはトランケートによって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする技法、および選ばれた性質を有する遺伝子産物をcDNAライブラリーからスクリーニングする技法は、当技術分野でいくつか知られている。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に従う最も広く用いられている技法は、概して、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換し、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。その発現は、所望の活性の検出によって、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件で行う。リカーシブアンサンブル突然変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)(REM)は、ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める技法であり、これをスクリーニングアッセイと併用して、CTLおよび/または体液性免疫応答を促進できるインターロイキン変異体を同定できる(ArkinおよびYourvan、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:7811-7815;Delgraveら、1993、Protein Engineering、6(3):327-331)。
【０２１３】
4.11 免疫応答を測定するためのアッセイ
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、抗原性について本発明の融合細胞または普遍的抗原提示細胞をアッセイできる。限定ではなく一例として、以下の手順のうちの1つを使用できる。
【０２１４】
ELISAを含むがそれに限定されるわけではない標準的な検出アッセイを用いて体液性免疫応答を測定して、治療されていない被験体での抗体量に対して、治療された被験体の血清中の標的抗原を認識する抗体の相対量を決定することができる。本明細書に記載するクロム放出アッセイを含めた標準的なイムノアッセイを使用して、CTL応答を測定できる。より詳細には、刺激因子の不在下でのCTL活性に対する、刺激因子を投与した際のCTL活性の測定可能な差異によって、CTL応答を決定する。
【０２１５】
4.11.1  MLTCアッセイ
混合リンパ球T細胞培養(MLTC)アッセイを用いて、本発明の融合細胞および普遍的抗原提示細胞の抗原性を試験できる。例えば、融合細胞1×107個をγ線照射し、Tリンパ球と混合する。様々な間隔で、Tリンパ球の細胞傷害性を4時間の51Cr放出アッセイで試験する(Palladinoら、1987、Cancer Res. 47:5074-5079参照)。このアッセイでは、種々のエフェクター:標的(E:T)比(通常は1:1から40:1)になるように、混合リンパ球培養物を標的細胞懸濁物に加える。51Crを500μCi/ml含む培地中で標的細胞1×106個を37ECで1時間インキュベートすることによって、これらの標的細胞を予め標識しておく。標識後、これらの細胞を3回洗浄する。各アッセイ点(E:T比)を3回繰り返して実施し、適切な対照を組み込んで、51Crの自然放出(リンパ球をアッセイに加えない)および100%放出(細胞を界面活性剤で溶解)を測定する。細胞混合物を4時間インキュベートした後に、細胞を200×gで5分間遠心分離してペレットにする。上清に放出された51Crの量をガンマ線計数器で測定する。細胞傷害性パーセントを(被験試料のcpm-自然放出cpm)/(界面活性剤により放出した総cpm-自然放出cpm)として測定する。
【０２１６】
MHCクラスIカスケードを遮断するために、K-44ハイブリドーマ細胞(抗MHCクラスIハイブリドーマ)由来の濃縮ハイブリドーマ上清を被験試料に加えて終濃度を12.5%にする。
【０２１７】
4.11.2 抗体応答アッセイ
本発明の一実施形態では、ワクチン接種に応答して生成する抗体を、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)アッセイなどの抗体応答アッセイによって測定することにより、融合細胞または普遍的抗原提示細胞の抗原性を決定する。そのようなアッセイの方法は当技術分野で周知である(例えばCurrent Protocols in Immunology、Coliganら(編)、John Wiley and Sons社 1997のセクション2.1参照)。一実施形態では、マイクロタイタープレート(96ウェルImmuno Plate II、Nunc)に、4ECで16時間および20ECで1時間で、組成物中に使用された精製前癌性細胞の0.75μg/ml PBS溶液を50μl/ウェルで被覆する。ウェルを空にして、ウェル1個あたりPBS-T-BSA(0.05%(v/v)TWEEN20および1%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有するPBS)200μlで20ECで1時間ブロッキングし、次に、PBS-Tで3回洗浄する。(モデルマウスまたはヒト患者などの)ワクチン接種された動物から得た血漿またはCSF 50μl/ウェルを20ECで1時間適用し、そのプレートをPBS-Tで3回洗浄する。次に、PBS-T-BSAで1:1500に希釈したワサビペルオキシダーゼと必要に応じて結合させた50μl/ウェルのヒツジ抗マウス免疫グロブリンまたはヒツジ抗ヒト免疫グロブリンと共に、それから(PBS-Tで上記のようにさらに3回洗浄後)o-フェニレンジアミン(OPD)-H2O2基質溶液50μlと共に20ECで1時間インキュベートした後に、抗原抗体活性を熱量測定により測定する。5分後に2M H2SO4 150μlで反応を停止させ、光度計で492nm(参照620nm)で標準的な技法を使用して吸光度を決定する。
【０２１８】
4.11.3 サイトカイン検出アッセイ
特定のサイトカインのレベルを検出および定量することによって、融合細胞または普遍的抗原提示細胞に対するCD4+T細胞増殖応答を測定できる。一実施形態では、例えば、細胞内サイトカインをIFN-γ検出アッセイを用いて測定して、融合細胞-サイトカイン組成物の抗原性を試験できる。この方法の一例では、融合細胞-サイトカイン組成物で治療された患者から得た末梢血単核細胞を、ムチンペプチド抗原またはHer2/neu由来エピトープなどのペプチド抗原で刺激する。次に、フローサイトメトリーで検出できるT細胞特異的標識抗体、例えば、FITC結合抗CD8抗体およびPerCP標識抗CD4抗体を用いて細胞を染色する。洗浄後、細胞を固定し、透過性にして、ヒトIFN-γ(PE-抗IFN-γ)と反応する色素標識抗体と反応させる。標準的な技法を使用してフローサイトメトリーで試料を分析する。
【０２１９】
あるいは、フィルターイムノアッセイである酵素結合免疫スポットアッセイ(enzyme-linked immunospot assay)(ELISPOTアッセイ)を使用して、T細胞周囲の特異的サイトカインを検出できる。一実施形態では、例えば、ニトロセルロースで裏打ちされたマイクロタイタープレートに精製サイトカイン特異的一次抗体、すなわち、抗IFN-γを被覆する。このプレートをブロッキングして、他のタンパク質の非特異的結合が原因のバックグラウンドを避ける。融合細胞を、または融合細胞とサイトカイン組成物などの免疫刺激因子とをワクチン接種された患者から得られた、サイトカイン分泌細胞を含む単核血液細胞の試料を、マイクロタイタープレートのウェル中に希釈する。標識(例えば、ビオチン標識)二次抗サイトカイン抗体を加える。次に、抗体-サイトカイン複合体を、例えば、酵素結合ストレプトアビジンによって検出でき、サイトカイン分泌細胞が目視法、顕微鏡法または電子検出方法によって「スポット」として出現するであろう。
【０２２０】
4.11.4 四量体染色アッセイ
別の実施形態では、「四量体染色」アッセイ(Altmanら、1996、Science 274: 94-96)を使用して、抗原特異的T細胞を同定できる。一実施形態では、腫瘍関連抗原などの特異的ペプチド抗原を含むMHC分子を多量体化して、可溶性ペプチド四量体を作製し、例えば、ストレプトアビジンと複合することによって標識する。次に、得られたMHC複合体を、融合細胞組成物で治療された患者から得られたT細胞集団と混合する。次に、ビオチンを使用して対象となる抗原、すなわち、腫瘍関連抗原を発現するT細胞を染色する。
【０２２１】
細胞傷害性T細胞は、プロセシングを受けて標的細胞の抗原を提示している抗原提示細胞(APC)によって活性化されたCD8陽性の免疫細胞である。この抗原提示は、B-7/CTLA-4およびCD40などの共刺激分子を活性化すると共に、標的に対するT細胞の感作を引き起こし、その結果、抗原を発現している細胞の破壊がもたらされる。
【０２２２】
CD8を発現しているとして一般に特徴付けされる細胞傷害性T細胞は、TNF-β、パーフォリン、およびIL-2も分泌した。本明細書の実施例に示すように、治療された被験体由来のT細胞を用いた51Cr放出アッセイで、治療されていない被験体由来のT細胞に比べて標的細胞の増加した溶解、ならびに治療されていない被験体よりも治療された被験体でのIFN-γおよびIL-2のレベルが増加していることを測定することを含めるが、それに限定されるわけではない様々なアッセイで、細胞傷害性T細胞応答を測定することができる。
【０２２３】
4.12 標的となる癌
本発明の融合細胞を用いて、予防されうる癌および発癌性疾患、ならびに、これらの癌および発癌性疾患の発現を引き起こす、本発明の融合細胞を用いて予防および治療できる前癌病変としては、ヒト肉腫および癌腫、例えば腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫;白血病、例えば急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病);慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ性白血病);および真性多血症、リンパ腫(ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症およびH鎖病があるが、それに限定されるわけではない。
【０２２４】
4.13 製剤および投与方法
本発明の組成物製剤は、免疫有効量の融合細胞または普遍的抗原提示細胞を含み、それらの細胞は、CTLおよび/または体液性免疫応答を刺激することができる1つまたは複数の分子（サイトカインなどであるがそれに限定されるわけではない）の非存在下または存在下のいずれかで投与される。本発明の医薬組成物の融合細胞は、樹状細胞または普遍的抗原提示細胞などの抗原提示細胞と非樹状細胞とを融合することによって形成した融合細胞であってよく、その非樹状細胞は癌細胞もしくは前癌病変の細胞から抽出したゲノムDNA;癌細胞もしくは前癌病変の細胞に由来するcDNAもしくはcDNAライブラリー;腫瘍関連抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;感染性因子から抽出したゲノムDNA;感染性因子に感染した細胞から抽出したゲノムDNA;感染性因子由来のcDNA;感染性因子に感染した細胞由来のcDNA;感染性因子に特異的な抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するmRNA;または癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するcDNAから転写されたmRNAを含む。ある実施形態では、本発明の融合細胞は治療または予防される癌の1つまたは複数の抗原を発現する。ある実施形態では、本発明の融合細胞は、治療または予防される感染性因子の1つまたは複数の抗原を発現する。
【０２２５】
ある実施形態では、本発明は普遍的抗原提示細胞(セクション4.7参照)を提供する。本発明のある実施形態では、本発明の普遍的抗原提示細胞は、癌細胞もしくは前癌病変の細胞から抽出したゲノムDNA;癌細胞もしくは前癌病変の細胞に由来するcDNAまたはcDNAライブラリー;腫瘍関連抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;感染性因子から抽出したゲノムDNA;感染性因子に感染した細胞から抽出したゲノムDNA;感染性因子由来のcDNA;感染性因子に感染した細胞由来のcDNA;感染性因子に特異的な抗原をコードする1つもしくは複数の発現構築体;癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するmRNA;または癌細胞、前癌病変の細胞、もしくは感染性因子に由来するcDNAから転写されたmRNAを含む。当業者に公知の任意の方法によって、そのゲノムDNAまたはcDNAまたは発現構築体を普遍的抗原提示細胞に導入できる。
【０２２６】
融合細胞または融合細胞-サイトカイン組成物の適切な調製物には、好ましくは液体溶液である注射用製剤がある。
【０２２７】
多数の方法を使用して本発明の組成物製剤を導入できる。これらの方法には、皮下注射、リンパ管内、皮内、筋肉内、静脈内、および乱切(例えば分岐針を用いた皮膚上層を介した引っ掻き)があるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、融合細胞および融合細胞-サイトカイン組成物を皮内注射する。
【０２２８】
さらに、望むならば、組成物製剤は、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、および/または組成物の有効性を増強する化合物などの少量の補助物質も含むことができる。融合細胞に対する抗体の誘導を測定することによって、補助物質の有効性を決定できる。
【０２２９】
この組成物が投与される哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えばニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含むが、それに限定されるわけではない非ヒト動物の場合もある。
【０２３０】
4.14 有効量
癌または前癌病変を予防または治療する治療上有効な量で、本発明の組成物を患者に投与できる。治療上有効な量は、例えば、前癌病変の退縮、または人間、特に癌を発現するリスクを有する個体でのそのような病変の形成の予防などの、そのような疾患または障害の症状を予防または改善するのに十分な量の融合細胞を指す。本発明の組成物の有効量(免疫量)は、動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿することもできる。組成物製剤に採用される融合細胞の厳密な用量は、予防される疾患の個々のタイプにも依存するであろう。例えば、腫瘍の発現を予防するつもりならば、投与量を考慮するときに、腫瘍の攻撃性が重要な考慮事項になる。他の重要な考慮事項は、投与経路および患者の性質である。このように、標準的な臨床技法に従って、担当医の判断および各患者の状況、例えば、患者の免疫状態に応じて、厳密な投与量を決定すべきである。
【０２３１】
好ましい実施形態では、例えば、ヒト腫瘍の形成を予防するために、抗原提示細胞と融合された患者の前癌性非樹状細胞を含む融合細胞または融合細胞-サイトカイン組成物を、その前癌病変から離れた部位、好ましくはリンパ組織の近くに投与する。適切な間隔、例えば、3〜6カ月毎の後で、1回の投与あたり細胞約1×108個を用いて、この組成物の投与を繰り返すことができる。
【０２３２】
このように、本発明は、治療上有効な量の本発明の融合細胞または融合細胞-サイトカイン組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物を免疫化し、かつ哺乳動物での前癌病変またはその進行の発現を予防または治療する方法を提供する。
【０２３３】
ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも5×104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも5×105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも5×106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも5×107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも5×108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を少なくとも109個投与する。
【０２３４】
ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大5×104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大5×105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大5×106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大5×107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大5×108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり融合細胞を最大109個投与する。
【０２３５】
ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも5×104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも5×105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも5×106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも5×107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも5×108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を少なくとも109個投与する。
【０２３６】
ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大5×104個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大5×105個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大5×106個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大5×107個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大5×108個投与する。ある実施形態では、治療される被験体の体重1kgあたり普遍的抗原提示細胞を最大109個投与する。
【０２３７】
4.15 スクリーニング法
ある実施形態では、本発明は腫瘍特異的または腫瘍関連抗原の同定のためのスクリーニング法を提供する。本発明のスクリーニング法は、腫瘍細胞から抽出されたDNAを次に非樹状細胞にトランスフェクトし、次にはその非樹状細胞を樹状細胞と融合した場合に、そのDNAがその融合細胞に腫瘍特異的抗腫瘍活性を付与できるという観察に基づく。従って、理論に拘束されないが、そのDNAは、融合細胞によって発現される腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原をコードする。
【０２３８】
ある実施形態では、腫瘍からcDNAライブラリーを作製する。具体的な一実施形態では、単一細胞からcDNAライブラリーを作製する(例えばDulacおよびAxel、1995、Cell 83(2):195-206参照)。好ましい実施形態では、治療または予防される腫瘍の種類と同じ種類の腫瘍からcDNAライブラリーを作製する。次に、そのライブラリーからのcDNAプールを非樹状細胞に導入し、続いてその非樹状細胞を用いて種々の融合細胞集団(すなわち融合細胞の各集団はcDNAの異なるプールを含む)を作製する。その種々の融合細胞集団についてセクション5に記載するような抗腫瘍活性を試験する。次に、融合細胞集団に導入された、最高の抗腫瘍活性を有するcDNAを同定する。具体的な一実施形態では、ライブラリーのすべてのcDNAを配列決定し、注釈を付ける。別の実施形態では、最高の抗腫瘍活性を有する融合細胞集団のcDNAだけを配列決定する。ある実施形態では、種々のプールを別々に増幅してcDNAの同定を容易にする。最高の抗腫瘍活性を有する融合細胞集団のcDNAがいったん同定されたならば、融合細胞を発生させて、その融合細胞について抗腫瘍活性を試験するために、cDNAの小さいプールまたは個別のcDNAを非樹状細胞に導入する。個別に、または組合せで本発明の融合細胞に抗腫瘍活性を付与するcDNAを、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原をコードするとして同定する。
【０２３９】
4.16 キット
本発明は、本発明の方法による免疫治療用組成物の送達を容易にするキットをさらに提供する。好都合には、例えば臨床現場において、癌の症状を表している患者、または癌を発現するリスクを有する患者を治療するために、本明細書に記載するキットを使用できる。一実施形態では、例えば、1つまたは複数の容器に、a)抗原提示細胞集団の試料と、b)非樹状細胞の試料とを含むキットを提供する。ある実施形態では、キットに用意される抗原提示細胞は普遍的樹状細胞である。細胞に共刺激分子(例えばB7、ICAM-Iおよび/またはICAM-II)を組換え発現させることによって普遍的抗原提示細胞を調製する。普遍的抗原提示細胞を任意の細胞型から調製できる。ある実施形態では、普遍的抗原提示細胞を操作してIL-12などであるがそれに限定されるわけではないサイトカインを組換え発現させる。ある実施形態では、抗原提示細胞は、治療される被験体と主要組織適合遺伝子複合体(MHC)が一致する。普遍的抗原提示細胞のさらに詳細な説明については、セクション4.7を参照されたい。
【０２４０】
本発明のキットは、針生検を行うための材料などの、被験体由来の前癌性細胞、腫瘍細胞および/または感染性因子に感染した細胞を単離するための手段をさらに含むことがある。本発明のキットは、前癌細胞、腫瘍細胞、感染性因子に感染した細胞および/または感染性因子からゲノムDNAを抽出するための手段をさらに含むことがある。本発明のキットは、例えばリポフェクションを行うための材料などの、非樹状細胞にゲノムDNAを導入するための手段をさらに含むことがある。
【０２４１】
本発明のキットは、ゲノムDNAが導入された非樹状細胞と抗原提示細胞とを融合するための手段をさらに含むことがある。融合のための手段は、細胞の電気融合を行うための手段、またはポリエチレングリコールを用いて細胞を融合するための手段のことがあるが、それに限定されるわけではない。
【０２４２】
本発明のキットは、前癌細胞、腫瘍細胞、感染性因子に感染した細胞および/または感染性因子からmRNAを抽出するための手段をさらに含むことがある。本発明のキットは、mRNAからcDNAを合成するための手段をさらに含むことがある。本発明のキットは、例えばリポフェクションを行うための材料などの、非樹状細胞にcDNAを導入するための手段をさらに含むことがある。本発明のキットは、cDNAが導入された非樹状細胞と抗原提示細胞とを融合するための手段をさらに含むことがある。融合のための手段は、細胞の電気融合を行うための手段またはポリエチレングリコールを用いて細胞を融合するための手段のことがあるが、それに限定されるわけではない。
【０２４３】
本発明のキットの他の構成要素には、癌もしくは感染症を治療するか、またはそれらから防御する方法にそのキットを使用するための説明書が含まれることがある。投与前に成分を混合できるように、滅菌希釈液のアンプルを用意することができる。別の実施形態では、そのキットは電気融合に適したキュベットをさらに含む。一実施形態では、抗原提示細胞を凍結保存する。さらなる一実施形態では、そのキットは体液性免疫応答および/または細胞傷害性T細胞応答を刺激する分子を含む。より好ましい一実施形態では、その刺激性分子は、インターロイキン-12などであるが、それに限定されるわけではないサイトカインである。
【０２４４】
ある実施形態では、本発明のキットは、腫瘍関連抗原または腫瘍関連エピトープをコードするcDNAまたは発現ベクターをさらに含む。ある実施形態では、本発明のキットは、非癌細胞に比べて治療される癌で上方制御されている抗原またはエピトープをコードするcDNAまたは発現ベクターをさらに含む。
【０２４５】
ある実施形態では、本発明のキットは、腫瘍関連抗原をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含む非樹状細胞を含む(セクション4.8参照)。ある実施形態では、本発明のキットは、治療される被験体から非樹状細胞を得るための手段、腫瘍関連抗原をコードする1つもしくは複数の発現ベクターを得るための手段、および/またはその非樹状細胞にその発現ベクターをトランスフェクトするための手段を含む。
【０２４６】
本発明のある実施形態では、キットは普遍的抗原提示細胞を含む。ある実施形態では、キットは、普遍的抗原提示細胞と、(i)哺乳動物から腫瘍細胞、前癌病変の細胞、感染性因子に感染した細胞、および/または感染性因子を得るための手段、(ii)細胞からゲノムDNAを単離するための手段、(iii)細胞からmRNAを単離するための手段、(iv)mRNAからcDNAを調製するための手段、(v)mRNA、ゲノムDNA、またはcDNAを細胞に導入するための手段、(vi)細胞を融合するための手段、(vii)普遍的抗原提示細胞または融合細胞を被験体に投与するための手段、(iix)哺乳動物から非樹状細胞を得るための手段とを含む。
【実施例】
【０２４７】
5. 実施例I: 融合細胞を用いたワクチン接種による腫瘍発生の予防
本実施例は、種々の腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトした非樹状細胞と融合した抗原提示細胞の融合によって形成された融合細胞の予防的および治療的使用を実証する。
【０２４８】
腫瘍細胞のゲノムDNAを保有する非樹状細胞と、抗原提示細胞との間で形成された融合細胞を用いたマウスのワクチン接種および治療は、種々の種類の腫瘍を用いたチャレンジ後の腫瘍の発生を阻止した。すなわち、処置されたマウスの腫瘍体積は未処置対照マウスの腫瘍体積よりも小さかった。
【０２４９】
よって、これらのデータは、腫瘍細胞のゲノムDNAを保有する非樹状細胞と融合した抗原提示細胞を含む融合細胞ワクチンの予防的効力および治療的効力を裏付けるものである。最後に、本実施例で使用したマウスモデルの非樹状細胞は腫瘍細胞から生成したものであるが、前癌性非樹状細胞の単離と、癌に対する予防および治療用ワクチンに使用するための融合体を作製するためのそれらの使用とに、本明細書に記載する技法を適用することができ、それによりモデルとして用いることができる。
【０２５０】
5.1 材料および方法
マウス、腫瘍モデルおよび細胞系
マウス線維芽細胞系NIH3T3と、マウス悪性腫瘍細胞系B16およびMC38とをAmerican Type Culture Collection(ATCC、Rockville、MD)から得た。CT-2A神経膠腫細胞をSeyfried博士から親切に提供を受けた(13)。これらの細胞系を100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、および10%熱不活化ウシ胎仔血清(FBS;BRL、Gaithersburg、MD)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Cosmo Bio、東京、日本)中で単層培養として維持した。理研細胞バンク(つくば、日本)から得たYac-1細胞を、10%FBSを補充したRPMI-1640(BRL)中で維持した。雄性C57BL/6JマウスをSankyo Laboratory(静岡、日本)から購入した。6週齢のマウス(体重25±2g)を本実験に使用した。
【０２５１】
すべての実験手順を慈恵大学の動物保護に関するガイドラインに準拠して実施した。
【０２５２】
マウスに腫瘍を誘導するために、B16腫瘍細胞またはMC38腫瘍細胞をそれぞれマウスの左側腹部に皮下注射した。
【０２５３】
抗原提示細胞および融合細胞の調製ならびに非樹状細胞との融合
Inabaら(Inabaら、1993、Generation of Large Numbers of Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow Cultures Supplemented with GM-CSF.J Exp Med 176、1693-1702;Inabaら、1993、Granulocytes, Macrophages and Dendritic Cells Arise from a Common Major Histocompatability Complex ClassII-negative Progenitor in Mouse Bone Marrow、Proc Natl Acad Sci USA 90、3038-3042)によって記載された方法により樹状細胞を調製した。リポフェクタミンを用いて、B16細胞から抽出したゲノムDNAとpSV2-neoとをNIH3T3線維芽細胞に共トランスフェクトした。
【０２５４】
Gongら(Gongら、1997、Induction of Antitumor Activity by Immunization with Fusion of Dendritic and Carcinoma Cells、Nat Med 3、558-561)に従って、樹状細胞を、トランスフェクト後のNIH3T3線維芽細胞と融合した。
【０２５５】
さらに具体的には、APC1309マウスの長骨から流し出した骨髄から樹状細胞を単離し、赤血球を塩化アンモニウム(Sigma、St. Louis、MO)で溶解させた。リンパ球、顆粒球、およびT細胞を骨髄細胞から枯渇させ、得た細胞を、5%熱不活化FBS、50μM 2-メルカプトエタノール、2mMグルタミン酸塩、100U/mlペニシリン、100pg/mlストレプトマイシン、10ng/ml組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF;Becton Dickinson、San Jose、CA)、および30U/ml組換えマウスインターロイキン-4(IL-4;Becton Dickinson)を補充したRPMI1640培地中で、24ウェル培養プレートに播いた(細胞1×106個/ウェル)。培養5日目に非接着細胞および緩く接着した細胞を収集し、100mmペトリ皿(細胞1×106個/ml;10ml/皿)に再び播いた。RPMI培地に含有させたGM-CSFおよびIL-4をその細胞に加え、樹状細胞1×106個を、トランスフェクト後のNIH3T3線維芽細胞3×106個と混合した。48時間後にポリエチレングリコール(PEG1500;Sigma、St. Louis、MO)の50%溶液500μlを60秒かけて滴下することによって融合を開始させた。無血清RPMI培地30mlを徐々に加えることによって融合を停止した。RPMI培地中、GM-CSFおよびIL-4の存在下で100mmペトリ皿で融合細胞を48時間平板培養した。
【０２５６】
ゲノムDNAのNIH3T3細胞へのトランスフェクション
製造業者の説明書に従ってLipofectAMINE(BRL)を使用してNIH3T3細胞にゲノムDNAとpSVNeo(Y. Manome博士から親切に提供を受けた;図15も参照)との両方をトランスフェクトした。簡潔には、ゲノムDNA 2μgをpSV2neo 2μgと混合した。次に、その混合物をLipofectAMINEと混合し、NIH3T3細胞1×104個に加えた。48時間後に、800μg/ml G418(BRL)を含有する選択培地を加えた。形質導入されたNIH-3T3細胞の生存コロニーを使用して融合に使用した。得られたトランスフェクタントをそれぞれNIH/B16、NIH/CT-2A、およびNIH/NIHと名付けた。
【０２５７】
腫瘍細胞へのレトロウイルスのトランスフェクション
マウスの処置および腫瘍の計数
融合細胞(2×105個/マウス)を被験体マウスの尾静脈に注射した。腫瘍細胞を用いたチャレンジ後の種々の時点でマウスを屠殺し、腫瘍体積を測定した。
【０２５８】
B16腫瘍細胞に対する脾臓細胞の細胞傷害性のアッセイ
スチールメッシュで脾臓を穏やかに破壊し、50U/mlヒト組換えIL-2を含有する培地中で4日間培養することによって脾臓細胞を調製し、次にこれらの脾臓細胞についてB16腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を検討した。B16腫瘍標的細胞(1×104個/ウェル)を51Crで標識し、洗浄し、それを、10%熱不活化融合細胞を補充したRPMI-1640培地200μl中で37℃で4時間、10:1〜80:1の範囲のエフェクター:標的比の脾臓細胞とともにインキュベートした。遠心分離によって細胞を沈降させた後で、放射活性を測定するために上清100μlを収集した。以下の式により比51Cr放出パーセントを計算した:51Cr放出パーセント=100×(実験放出cpm−自然放出cpm)/(最大放出cpm−自然放出cpm)。最大放出は、0.33N HClを加えてインキュベートした標的細胞から得られたものであり、自然放出はエフェクター細胞不在下でインキュベートした標的細胞から得られたものであった。
【０２５９】
5.2 結果
14日目および7日目にマウスに融合細胞を注射してから、そのマウスを腫瘍を用いてチャレンジした(図14参照)。使用した融合細胞は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞(NIH/B16);トランスフェクトしていないNIH3T3線維芽細胞と、樹状細胞との融合細胞(NIH3T3);または樹状細胞と、CT-2A神経膠腫細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞(NIH/CT2A)であった。図1に、0日目にB16またはMC38腫瘍細胞でそれぞれチャレンジした後の腫瘍体積を示す。NIH/B16を使用して、B16細胞を用いたチャレンジから防御したときに、腫瘍発生の最も高い程度の予防を実現した。図2に、0日目にB16腫瘍細胞でチャレンジした後の腫瘍体積を示す。NIH3T3またはNIH/CT2Aをそれぞれ投与しても、チャレンジ前のNIH/B16投与に比べて、腫瘍に対する防御がもたらされなかった。さらに、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをDNAアーゼで処理してから、NIH3T3細胞にそのDNAをトランスフェクトした。樹状細胞と、DNアーゼで処理したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞(NIH/B16DNase)を用いたワクチン接種は、マウスをB16腫瘍発生から保護しなかった。
【０２６０】
NIH3T3線維芽細胞のトランスフェクションに必要なゲノムDNAの量を見積もるために、その線維芽細胞に、B16細胞から抽出したゲノムDNAを種々の量でトランスフェクトした。図3は線維芽細胞104個あたりゲノムDNA 2μgのトランスフェクションが腫瘍の有効な治療をもたらしたことを示す。1/10または1/100の量は、腫瘍の治療に効果が無かった。
【０２６１】
腫瘍の治療のために、0日目にマウスをB16腫瘍細胞でチャレンジした(図13)。3日目および10日目に融合細胞を投与した。図4は、NIH/B16融合細胞を用いた担B16腫瘍マウスの処置が、トランスフェクトしていないNIH3T3線維芽細胞を用いて作製した融合細胞を用いた処置よりも腫瘍の治療においてより効果的であったことを示す。図5に示したデータは、B16細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞が単独では腫瘍のわずかな治療しかもたらさないことを実証している。しかし、トランスフェクトしたNIH3T3細胞を樹状細胞と融合すると、腫瘍の効果的な治療がもたらされた。腫瘍の治療効率に及ぼすDNAの熱処理の影響を評価するために、B16細胞から抽出したゲノムDNAを熱で変性させてから、NIH3T3細胞にそのゲノムDNAをトランスフェクトした。図6に示すデータは、トランスフェクション前にゲノムDNAを変性させることによって、トランスフェクトした細胞から作製された融合細胞が腫瘍を治療する効率が減少することを実証している。
【０２６２】
融合細胞で免疫化したマウスに由来する脾臓細胞の細胞傷害活性
図7に示すデータは、種々の種類の融合細胞を用いて処置したマウスから単離した脾臓細胞の細胞傷害活性が、樹状細胞と、B16細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞との融合細胞を用いた場合に最も高いことを実証している。脾臓細胞の細胞傷害活性がB16細胞に特異的であることは、YAC1細胞に対する細胞傷害性がB16細胞に対する細胞傷害性に比べて大幅に減少しているという事実によって実証されている。
【０２６３】
5.3 考察
強力な抗原提示細胞である樹状細胞は、癌免疫療法のためのアジュバントとして近年利用されてきた。癌細胞は、宿主の免疫サーベイランスを回避する種々の戦略を獲得して、有効な免疫療法の開発を阻んでいる。Gongらは、腫瘍細胞と融合した樹状細胞の接種がマウスに抗腫瘍免疫を誘導したと報告した(Gongら、1997、Nat Med 3、558-561)。腫瘍細胞と融合した細胞の臨床適用の成功もドイツから報告された(Kuglerら、2000、Nat Med 6、332-336)。APC1309マウスの結腸癌由来樹立細胞系であるAPC1309腫瘍細胞と融合した樹状細胞の静脈内投与は、腫瘍数の増加を阻止したことが示された。未処置のAPC1309マウスでは、10週齢時に約100個の腫瘍が消化管全体に発生した。融合細胞による処置により、腫瘍数は未処置対照の2分の1に減少した。インターロイキン-12と組み合わせた融合細胞を用いた処置は、観察された腫瘍数にさらなる減少をもたらした。融合細胞とインターロイキン-12とで処置したマウスでは、腫瘍数は6週齢時よりも10週齢時で有意に少なかった。インターロイキン-12の抗腫瘍活性は、Brunda(Brundaら、2000、J Exp Med 178、1223-1230)およびNastala(Nastalaら、1994、J Immunol 153、1697-1706)によって報告された。しかし、インターロイキン-12単独を用いたマウスの処置は、本研究では腫瘍数の増加を有意に抑制しなかった。これは、インターロイキン-12が、下記に論じるように融合細胞を用いた処置によって誘導される抗腫瘍免疫を増強することを示唆している。
【０２６４】
CTLは、腫瘍抗原を有する樹状細胞によって誘導された、抗腫瘍免疫でのエフェクター細胞であると報告されている(Pagliaら、1996、J Exp Med 183: 317-322; Mayordomoら、1996、Nature Med 1(12)、1297-1302; Butterfieldら、1998、J Immunol 161: 5607-13; Condonら、1996、Nature Medicine 2:、1122-1128; Gongら、1997、Nat Med 3: 558-561)。
【０２６５】
しかし、本研究では、種々の腫瘍のゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞と融合した樹状細胞は、腫瘍の成長を阻止および低減できることが示された。この融合細胞は、非樹状細胞に導入したゲノムDNAが、治療または予防すべき腫瘍と同じ種類の腫瘍から抽出された場合に、最も有効であった。このように、本発明の融合細胞の抗腫瘍活性の特異性が、融合細胞の作製に使用した非樹状細胞に導入したゲノムDNAの供給源に依存することを実証している。
【０２６６】
非樹状細胞にゲノムDNAを導入する前に、そのゲノムDNAをDNアーゼで処理することによって、融合細胞の抗腫瘍活性の喪失が生じた。さらに、非樹状細胞に導入するゲノムDNAの量を1/10に減らすと、やはり、融合細胞の抗腫瘍活性の喪失が生じた。このように、ゲノムDNAは本発明の方法の本質的な特徴である。理論に拘束されることなく、これらの結果は、本発明の融合細胞の抗腫瘍活性が、腫瘍特異的抗原へのゲノムDNAの混入が原因でないことも実証している。
【０２６７】
本結果は、腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを保有する非樹状細胞と融合した樹状細胞を用いた免疫化が、腫瘍発生の予防に有用であり、腫瘍の治療にも有用であることを実証している。
【０２６８】
6. 実施例II: 樹状細胞と、腫瘍細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトした線維芽細胞とから構成される融合体の抗腫瘍効果
6.1 序説
樹状細胞(DC)は、T細胞を活性化する独特の能力を有する専門的な抗原提示細胞(APC)である。DCは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)、接着分子、および共刺激分子を高レベルに発現する(1)。ヒトDCとマウスDCとの両方を効率的に単離および調製することが今や可能である(2、3)。よって、悪性腫瘍の治療にDC系ワクチンを潜在的に使用できるであろう。
【０２６９】
成熟DCは抗原を取込む能力を失っていることから、成熟DCの使用は、DCに腫瘍関連抗原(TAA)を組み込むための効率的な方法を必要とする。これまでに、抗腫瘍免疫を誘導するためにDCを用いるいくつかの方法が検討されてきた。すなわち、腫瘍細胞から抽出したタンパク質またはペプチドをパルス投与したDCを用いる方法(4)、TAAをコードする遺伝子をトランスフェクトしたDCを用いる方法(5)、腫瘍細胞と共に培養したDCを用いる方法(6)、および腫瘍細胞と融合させたDC(融合細胞)を用いる方法(7〜9)である。以前に本発明者らが報告したように、組換えインターロイキン12と、樹状細胞および腫瘍細胞を含む融合細胞(FC)とを用いた全身的ワクチン接種は、担腫瘍マウスの生存を長引かせた(7)。これらの実験的知見に基づき、再発悪性腫瘍に対するFCおよび組換えヒトIL-12を使用したワクチン療法の臨床治験が始まっている。このワクチン接種の利点は、1)FCを使用して未知のTAAに対する抗腫瘍免疫を誘導でき、2)正常細胞に対する自己免疫応答の誘導を避けられることである。他方で、その欠点は、1)培養した腫瘍細胞が必要であり、2)照射された腫瘍細胞がin vivoで依然として腫瘍形成性を示すおそれがあることである。
【０２７０】
古くからの研究は、ゲノムDNAのトランスフェクションが、外因性DNAを取込む細胞の遺伝子型および表現型の両方を安定的に改変できることを示している(10)。さらに、腫瘍細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトした線維芽細胞を使用した免疫療法が、担腫瘍マウスの生存を延長したことが報告されている(11、12)。これらの報告に基づき、本発明者らは、自家樹状細胞と、腫瘍細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトした同種異系線維芽細胞とを含む融合体の抗腫瘍効果を検討した。腫瘍細胞のゲノムDNAをトランスフェクトした線維芽細胞の使用は、融合細胞療法の欠点を克服する。すなわち、培養した腫瘍細胞は必要でなく、たとえ線維芽細胞が腫瘍形成性を獲得しても、同種異系線維芽細胞は宿主によって拒絶され、よって、腫瘍の形成が回避される。本研究は、DCと、腫瘍由来ゲノムDNAをトランスフェクトした線維芽細胞と、を含むFCを用いた免疫療法の抗腫瘍効果および治療的効力を実証している。
【０２７１】
6.2 材料および方法
細胞系および動物
マウス線維芽細胞系NIH3T3と、マウス悪性腫瘍細胞系B16およびMC38とをAmerican Type Culture Collection(ATCC、Rockville、MD)から得た。CT-2A神経膠腫細胞は、Seyfried博士から親切に提供を受けた(13)。これらの細胞系を100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、および10%熱不活化ウシ胎仔血清(FBS;BRL、Gaithersburg、MD)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Cosmo Bio、東京、日本)中で単層培養として維持した。理研細胞バンク(つくば、日本)から得たYac-1細胞を、10%FBSを補充したRPMI-1640(BRL)中で維持した。雄性C57BL/6JマウスをSankyo Laboratory(静岡、日本)から購入した。6週齢のマウス(体重25±2g)を本実験に使用した。
【０２７２】
DNAの抽出およびトランスフェクション
製造業者の説明書に従ってDNA抽出キット(Qiagen、Hilden、ドイツ)を使って、腫瘍細胞ゲノムDNAをB16、CT-2A、またはNIH3T3細胞から抽出した。一部の例では、ゲノムDNAを、95℃で5分間加熱して5℃で5分間氷冷することによって変性させるか、またはDNアーゼ酵素で消化した(TOYOBO、東京、日本;ゲノムDNA 1μgに酵素1U)。
【０２７３】
マウス線維芽細胞へのゲノムDNAのトランスフェクション
製造業者の説明書に従ってLipofectAMINE(BRL)を使用して、NIH3T3細胞に、ゲノムDNAとpSVNeo(Y. Manome博士から親切に提供を受けた)との両方をトランスフェクトした。簡潔には、ゲノムDNA 2μgをpSV2neo 2μgと混合した。次に、その混合物を、LipofectAIMINEと混合し、NIH3T3細胞1×104個に加えた。48時間後に、800μg/ml G418(BRL)を含有する選択培地を加えた。形質導入したNIH-3T3細胞の生存コロニーを費やして融合に使用した。得られたトランスフェクタントをそれぞれNIH/B16、NIH/CT-2A、およびNIH/NIHと名付けた。
【０２７４】
腫瘍細胞へのレトロウイルスのトランスフェクション
緑色蛍光タンパク質遺伝子プラスミドpCMV-GFP(14)は、Y. Manome博士から親切に提供を受けた。PAMP51レトロウイルス産生細胞(15)(Yoshimatsu博士から親切に提供を受けた)にpCMV-GFPをトランスフェクトした(PAMP51/pCMV-GFP)。PAMP51/pCMV-GFPからの上清を使用して標的MC38細胞にトランスフェクトした。感染後に800μg/ml硫酸ゲネチシン(geneticine sulfate)を用いてMC38細胞を選択した。14日後に持続的選択を終了し、GFPの発現を蛍光顕微鏡でモニターした。
【０２７５】
DCの調製
以前に記載したようにマウス骨髄からDCの分離を行った(7)。簡潔には、マウスの長骨から骨髄を流し出し、赤血球を塩化アンモニウム(Sigma、St. Louis、MO)で溶解させた。リンパ球および顆粒球を骨髄細胞から枯渇させ、その細胞を、5%熱不活化FBS、50μM 2-メルカプトエタノール、2mMグルタミン酸塩、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(すべてSigma)、10ng/ml組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF;Becton Dickinson、San Jose、CA)、および10ng/ml組換えマウスインターロイキン-4(IL-4;Becton Dickinson)を補充したRPMI1640培地中で、残った細胞を24ウェル培養プレートに播いた(細胞1×106個/ウェル)。培養5日目に非接着細胞および緩く接着した細胞をDCとして収集した。
【０２７６】
樹状細胞と遺伝子操作したNIH3T3細胞との融合
以前に記載したように、DCを、遺伝子操作したNIH3T3細胞と融合した(7)。簡潔には、DC 1×106個を、遺伝子操作したNIH3T3細胞(NIH/B16、NIH/CT-2A、またはNIH/NIH)1×106個と混合した。次に、ポリエチレングリコール(PEG;Sigma)の50%溶液500μlを60秒かけて滴下することによって融合を開始した。無血清RPMI培地を徐々に加えることによって融合を停止した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Cosmo Bio)で3回洗浄した後で、RPMI培地中、GM-CSFおよびIL-4の存在下で100mmペトリ皿上で融合細胞(FC)を24時間平板培養した。様々なFCをそれぞれFC/B16、FC/CT-2A、およびFC/NIHとして特定した。
【０２７７】
融合効率の分析
以下のように融合効率を検討した。製造業者の説明書に従って、DCおよびNIH3T3細胞をフルオレセインイソチオシアネート標識抗マウスCD80モノクローナル抗体(Pharmingen、San Diego、CA、米国)およびPKH-26(Sigma)でそれぞれ染色した。直ちにこれらの細胞を上記のように融合した。FCを緩衝液(PBSに溶かした1%BSA、0.1%アジ化ナトリウム)に再懸濁し、FACScanフローサイトメータ(Becton Dickinson、San Jose、CA)を使用して分析した。二重陽性細胞を融合細胞であると決定した。融合効率を以下：融合効率=二重陽性細胞/総細胞×100(%)のように計算した。
【０２７８】
動物モデル
FCをPBSで2回洗浄してから、1×106個/mlの密度でPBSに懸濁した。FC(3×105個)を0日目および7日目にC57/6マウスの側腹部に皮下(s.c.)接種した。続いて、B16腫瘍細胞(1×106個)を14日目に側腹部にs.c.接種した。
【０２７９】
細胞溶解活性のアッセイ
標準的な51Cr放出アッセイを使用して脾臓細胞(SPC)の細胞溶解活性を試験した(16)。個々のマウスからのSPCの単細胞懸濁液を洗浄し、6ウェルプレート(Falcon Labware、Lincoln Park、NJ)に1×107個/mlの密度で10%FCS-RPMIに再懸濁した。接着細胞を除いた後で、10U/ml組換えヒトIL-2を1日おきに培養物に加えた。培養を開始してから4日後に、細胞を採集し、細胞傷害性T細胞(CTL)活性を決定した。51Crと共に37℃で90分間インキュベートすることによって標的細胞を標識し、次にそれをエフェクターリンパ球と共に4時間、共培養した。エフェクター:標的比は10:1から80:1の範囲であった。すべての測定を3回繰り返して行い、溶解パーセントを式(実験cpm-自然発生cpm/最大cpm-自然発生cpm)×100%を用いて計算した。
【０２８０】
抗体除去研究
以前に記載したようにリンパ球サブセットのin vivo除去を実現した(16)。簡潔には、0日目および7日目にC57/6マウスの側腹部にFC 3×105個を皮下接種した。14日目にB16腫瘍細胞(1×106個)を側腹部に接種した。-1、3、7、および10日目に抗アシアロGM1(Wako Pure Chemicals、東京、日本)をi.p.注射した(0.5mg/一注射/マウス)。
【０２８１】
6.3 結果
腫瘍DNAの導入はコード遺伝子のMC38細胞による発現を引き起こす
まず、GFP遺伝子を含むレトロウイルス構築体をMC38細胞に安定的にトランスフェクトした。MC38/GFP細胞から単離したゲノムDNAをNIH3T3細胞に導入し、48時間培養した後に、形質導入された細胞についてGFPの発現を蛍光顕微鏡によって試験した。GFPを発現している細胞の集団が、形質導入された細胞に存在した(図8-A)。フローサイトメトリーから、約8%のレシピエント細胞がGFPを発現していることが確認された(データは示さず)。大部分のMC38/GFP細胞はGFPが陽性であり(図8-B)、親NIH3T3細胞は陰性であった(図8-C)。これらのデータから、レシピエント細胞の表現型が、遺伝子改変MC38細胞からのゲノムDNAの導入により改変されたことが示された。
【０２８２】
融合効率
DCおよび遺伝子操作した線維芽細胞を、抗マウスCD80モノクローナル抗体およびPKH-26でそれぞれ染色し、PEGを使用することによって融合させた。二重陽性細胞を融合細胞であると決定した。図9Aに、85%のDCは抗CD80モノクローナル抗体が陽性であったことを示す。97%を超えるNIH/B16細胞はPKH26が陽性であった(図9B)。二重陽性細胞のパーセンテージは30.3%であった(図9C)。これらの実験を3回繰り返し、代表的なデータを示した。
【０２８３】
FCを用いた免疫化に続く腫瘍の接種
FCを用いた事前免疫化が皮下腫瘍に及ぼす抗腫瘍効果を調べた。0日目および7日目にDCおよびNIH/B16を含むFC(FC/B16)(3×105個)、NIH/B16細胞(DCと融合していない)3×105個、DCおよびNIH/CT-2Aを含むFC(FC/CT-2A)3×105個、または対照としてNIH3T3細胞3×105個をC57/6マウスの側腹部にs.c.注射した(各群n=5)。14日目に、B16細胞1×106個を側腹部にs.c.接種した。FC/B16の投与は腫瘍が出現する前の潜伏期間を延長したが、FC/CT-2A、NIH/B16またはNIH3T3細胞の投与は腫瘍が出現する前の潜伏期間を短縮しなかった(p<0.05)(図10A)。DC単独、PBS単独、ならびにDCおよびNIH/B16細胞の混合物のワクチン接種は、抗腫瘍効果を有さなかった(データは示さず)。
【０２８４】
続いて、この抗腫瘍効果が、NIH3T3細胞に導入されたゲノムDNAの質に依存するかどうかを検討した。DCと、DNアーゼで消化したB16ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH/3T3と、を含むFC、または陰性対照として変性DNAを使用した。FC/NIH(DCと、NIH3T3由来ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3と、を含むFC)も使用した。これらのFCを用いた免疫化は、腫瘍が出現する前の潜伏期間を短縮しなかった(p<0.05)(図10B)。これは、FC/B16によって誘導された抗腫瘍効果がNIH3T3細胞に導入された腫瘍由来ゲノムDNAの質に依存したことを示している。
【０２８５】
さらに、抗腫瘍効果がNIH/3T3細胞にトランスフェクトしたゲノムDNAの用量に依存するかどうかも調べた。NIH/3T3細胞(3×105個)にB16細胞由来ゲノムDNAを2、0.2、または0.02μg用いてトランスフェクトした。DCとそれぞれの種類のNIH/3T3とを含むFCを、それぞれFC/high、FC/mid、およびFC/lowとして特定した。0日目および7日目にFCをC57/6マウスにs.c.注射した(各群n=5)。14日目に、B16細胞1×106個を側腹部にs.c.接種した。FC/midまたはFC/lowを用いて免疫化した場合に抗腫瘍効果に差異は観察されなかった(p>0.05)が、一方でFC/highを用いた免疫化によって皮下腫瘍の成長は顕著に阻害された(p<0.05)。これは、FC/B16によって誘導された抗腫瘍効果がDNAの用量に依存したことを示している(図10C)。
【０２８６】
CTL活性の誘導
51Cr放出アッセイを使用してCTL活性を分析した。FCを用いた免疫化(0日目および7日目)の後に、SPCを未処置のマウスから分離し、14日目にこれらのマウスをFCを用いて免疫化した。図11に、FC/B16を用いて免疫化したマウス由来の腫瘍細胞に対するCTL活性が、対照または他の免疫化の場合よりもかなり高く、FC/B16を用いて免疫化したマウス由来のYac-1細胞に対する抗腫瘍活性が増加したことを示す。FC/B16を用いて免疫化したマウス由来のNIH/3T3およびCT-2A細胞に対する抗腫瘍活性は増加しなかった(データは示さず)。これらの結果は、FC/B16のワクチン接種が全身性抗腫瘍免疫を誘導したことを示唆している。
【０２８７】
FCの抗腫瘍効果にNK細胞が必要である
FCのワクチン接種によって生成される抗腫瘍応答に果たすNK細胞の役割を調べた。B16細胞およびFCの注射を受けたマウスに抗アシアロGM1を投与することによってNK細胞を枯渇させた。0日目および7日目に、側腹部にFC/B16を皮下接種した。続いて、14日目にB16細胞を同じ側腹部に接種した。抗アシアロGM1を-1、3、7、および10日目にi.p.注射した。NK細胞が枯渇したマウスでは、対照に比べて抗腫瘍効果が減少した(各群n=5)(図12)。これは、これらの実験でFC/B16を用いた免疫化によって誘導される抗腫瘍効果にNK細胞が必要であることを示唆している。
【０２８８】
6.4 考察
本研究の結果は、DCと、腫瘍由来ゲノムDNAを形質導入した線維芽細胞とを含むFCのワクチン接種が抗腫瘍免疫を誘発することを実証している。今日まで、抗腫瘍免疫の誘導のためにDCを使用したいくつかの方法が検討された(4〜8)。本方法の利点は、1)線維芽細胞が腫瘍形成性を示さず、2)これらの細胞が腫瘍形成性をたとえ獲得しても同種異系線維芽細胞は拒絶され、3)培養した腫瘍細胞は必要なく、4)未知TAAに対する抗腫瘍免疫を誘導でき、かつ5)いくつかの種類の、遺伝子操作した線維芽細胞(例えばIL-12を形質導入した線維芽細胞)を予め調製できることである。線維芽細胞は腫瘍形成性を示さないが、遺伝子操作した線維芽細胞が、腫瘍形成性を獲得するように改変されるかどうかは依然として明らかではない。本研究では同種異系線維芽細胞を使用した。よって、それらの細胞が腫瘍形成性を獲得したとしても宿主はそれらの線維芽細胞を拒絶した。
【０２８９】
以前の研究では、遺伝子操作したDCを使用して抗腫瘍免疫を誘発した。通常のDCに、IL-2、IL-12、GM-CSF、ケモカイン、およびTAAの遺伝子を始めとする遺伝子をアデノウイルスによって形質導入した(5、17〜20)。この方法の欠点は、DCを使用する都度にトランスフェクションを行わねばならないことであった。他方では、ナイーブ線維芽細胞を本研究に使用したが、特定の遺伝子を予めトランスフェクトした線維芽細胞をナイーブ線維芽細胞の代わりに使用して抗腫瘍効果を増強することができた。IL-12生成線維芽細胞またはCD40リガンド発現線維芽細胞などの遺伝子操作した線維芽細胞に腫瘍由来DNAを形質導入することによって、より強力な抗腫瘍免疫が誘導されると予想される。DCと、CD40Lおよび腫瘍由来ゲノムDNAの両方をトランスフェクトした遺伝子操作した線維芽細胞とを含む融合体の抗腫瘍効果を現在検討している。
【０２９０】
遺伝子操作した線維芽細胞が単独で抗腫瘍免疫を誘発するという研究が報告されている(11)。これらの研究では、線維芽細胞がAPCとして使用された。Schoenbergerらは、CTLの誘導には遺伝子操作した線維芽細胞がCD80分子を発現する必要があると報告した(21)。これらの線維芽細胞に腫瘍ペプチドをパルス投与した。よって、これらの線維芽細胞はTAAと共刺激分子との両方を発現した。他方で、我々の研究では腫瘍細胞由来ゲノムDNAの輸送体として線維芽細胞を使用し、TAAと共刺激分子との両方がDC上に発現した。以前に我々が報告したように、CD54とCD80との両方を発現する遺伝子操作した腫瘍細胞を用いたワクチン接種は、腫瘍の成長を阻害した(22)。これは、単一の共刺激分子が抗腫瘍効果を誘導できなかったことを示唆している。DCは高レベルのMHC、接着分子および共刺激分子を発現する。よって、本研究に使用したFCは遺伝子操作した線維芽細胞単独よりも強い抗腫瘍免疫を誘発した。さらに、同種異系線維芽細胞の注射は、宿主に同種異系反応を誘導して、増強した抗腫瘍効果をもたらしうる。
【０２９１】
DCはMHC拘束的に特定抗原に対してCD4+T細胞を感作できる。CD4+T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球と抗原非特異的エフェクター免疫応答との両方の感作に決定的に重要であり、これは、CD4+およびCD8+T細胞の両方が等しく抗腫瘍免疫に重要であることを意味する。以前に報告したように、CD4+T細胞およびNK細胞の役割はあまり明らかでないが、DCと腫瘍細胞とが融合した細胞の抗腫瘍効果は、CD8+T細胞によって仲介される(7)。本研究では、FCを用いて免疫化したマウス由来のB16細胞とYac-1細胞との両方に対するCTL活性は、対照および別の方法で免疫化したマウスの場合よりもかなり高かった。さらに、NK細胞が枯渇したマウスでは抗腫瘍効果が減少していた。これらの結果は、FCの抗腫瘍効果が主にNK細胞により仲介されたことを示唆している。NK細胞とDCとの共培養は、NK細胞の細胞傷害性の顕著な増強を招き(23)、これは、本研究に使用したFCがNK細胞を直接刺激しうることを示している。しかし、FCの投与によって皮下腫瘍が治癒したマウスは、親腫瘍に対する長期全身免疫を生起した(データは示さず)。さらに、FC/CT-2Aのワクチン接種はB16細胞の成長を阻害しなかった。これは、このモデルでの抗腫瘍効果が腫瘍特異的および非特異的の両方であり、Tリンパ球がFCを用いたワクチン接種によって誘導された抗腫瘍効果にも役割を果たすことを示唆している。
【０２９２】
結論として、我々のデータは、DCと腫瘍由来DNAをトランスフェクトした線維芽細胞とを含むFCのワクチン接種を用いて、マウスモデルでの悪性腫瘍を治療できることを示唆している。本研究では、同種異系線維芽細胞を融合パートナーとして使用した。しかし、同じ器官から得られた同種異系腫瘍細胞を、線維芽細胞の代わりに潜在的に使用できる。本方法の長所は、共通腫瘍抗原に対する抗腫瘍免疫を誘導できることである。将来的な研究は、同系DCと、腫瘍由来ゲノムDNAをトランスフェクトした同種異系腫瘍細胞とから構成される融合細胞を用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を検討することに向けられるであろう。
【０２９３】
参考資料
2007528375.tif 000003
2007528375.tif 000004
2007528375.tif 000005
【０２９４】
本発明は、本発明の個々の態様の単独の例示として意図された、記載された具体的な一実施形態によって範囲を限定されるべきではなく、機能的に同等の方法および構成要素も本発明の範囲内に属する。実際に、本明細書に表示および記載されたもの以外に、本発明の様々な変更形態は、前述の記載および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更形態も、添付の特許請求の範囲の技術的範囲内に入ることが意図される。
【０２９５】
本明細書に引用したすべての参照は、すべての目的でその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０２９６】
【図１】図１は融合細胞をワクチン接種した後の担B16マウスおよび担MC38マウスの腫瘍体積をそれぞれ示す図である。NIH/B16は、抗原提示細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH3T3は、トランスフェクトしていないNIH3T3線維芽細胞と樹状細胞との融合細胞を表す。0日目は腫瘍でチャレンジした日である。
【図２】図２は、融合細胞をワクチン接種した後の担B16および担MC38マウスの腫瘍体積をそれぞれ示す図である。NIH/B16は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH3T3は、トランスフェクトしていないNIH3T3線維芽細胞と樹状細胞との融合細胞を表す。NIH/CT2Aは、樹状細胞と、CT2A腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH/B16DNaseは、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを熱処理したものをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。0日目は腫瘍でチャレンジした日である。
【図３】図３は、融合細胞をワクチン接種した後のB16腫瘍の腫瘍体積を示す図である。NIH/B16*1は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出した1×ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH/B16*1/10は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出した0.1×ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH/B16*1/100は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出した0.01×ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH3T3は、トランスフェクトしていないNIH3T3と樹状細胞との融合細胞を表す。0日目は腫瘍でチャレンジした日である。
【図４】図４は、融合細胞で処置後のB16腫瘍の腫瘍体積を示す図である。NIH/B16は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH3T3は、樹状細胞をトランスフェクトしていないNIH3T3線維芽細胞と樹状細胞との融合細胞を表す。0日目は腫瘍でチャレンジした日である。
【図５】図５は、融合細胞による、またはB16細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞による処置後の、B16腫瘍の腫瘍体積を示す図である。N/Bは、B16細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞を表す。N/B16+CDは、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。0日目は腫瘍でチャレンジした日である。
【図６】図６は、融合体で処置後のB16腫瘍の腫瘍体積を示す図である。N/B16は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。N/Nは、樹状細胞と、NIH3T3細胞由来DNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞との融合細胞を表す。N/denatNは、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを変性させたものをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。0日目は腫瘍でチャレンジした日である。
【図７】図７は、種々の融合細胞で処置したマウスから単離した脾臓細胞によるB16細胞の特異的溶解のパーセンテージを示す図である。NIH/B16-1は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。このアッセイでは、NIH/B16で処置したマウスの脾臓細胞についてB16細胞に対する細胞傷害性を試験した。NIH/B16DNaseは、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを熱処理したものをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH/CT2Aは、樹状細胞と、CT2A腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。NIH3T3は、樹状細胞をトランスフェクトしていないNIH3T3線維芽細胞と樹状細胞との融合細胞を表す。NIH/B16-YAC1は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞との融合細胞を表す。このアッセイでは、NIH/B16で処置したマウスの脾臓細胞について、YAC1細胞に対する細胞傷害性を試験した。
【図８】図８は、GFPの発現を示す図である。GFPを発現している細胞の集団が、形質導入された細胞の間に存在した(A)。大部分のMC38/GFP細胞はGFPが陽性であり(B)、親のNIH3T3細胞は陰性であった(C)。
【図９】図９は、融合効率を示す図である。DCおよび遺伝子操作された線維芽細胞を抗マウスCD80モノクローナル抗体およびPKH-26でそれぞれ染色し、PEGを用いて融合させた。二重陽性細胞を融合細胞であると決定した。A:85%のDCが抗CD80モノクローナル抗体について陽性であった。B:97%を超えるNIH/B16細胞がPKH26について陽性であった。C:二重陽性細胞の率は30.3%であった。
【図１０】図１０は、FCを用いた免疫化の抗腫瘍効果を示す図である。A: 皮下腫瘍に対する、FCを用いた事前免疫化の抗腫瘍効果。0日目および7日目にC57/6マウスの側腹部に、FC/B16(●)、NIH/B16細胞(DCとは融合していない;□)、FC/CT-2A(■)、または対照としてNIH3T3細胞(○)をs.c.注射した(各群n=5)。14日目にB16細胞1×106個を側腹部にs.c.接種した。FC/B16の投与は腫瘍が出現する前の潜伏期間を延長したが、FC/CT-2A、NIH/B16、またはNIH3T3細胞の投与は、腫瘍が出現する前の潜伏期間を短縮しなかった。B: DCと、DNアーゼで消化したB16ゲノムDNA(黒三角)または陰性対照として変性DNA(▽)をトランスフェクトしたNIH/3T3と、を含むFCを使用した。FC/NIH(□)も使用した。これらのFCを用いた免疫化は腫瘍が出現する前の潜伏期間を短縮しなかった。C: NIH/3T3細胞にB16細胞由来ゲノムDNAを2μg(●)、0.2μg(■)、または0.02μg(▽)トランスフェクトした。DCとそれぞれの種類のNIH/3T3とを含むFCをそれぞれFC/high、FC/mid、およびFC/lowとして特定した。FC/lowまたはNIH3T3(○)を用いた免疫化に応答した抗腫瘍効果の差異は観察されなかったが、FC/highまたはFC/midを用いた免疫化は皮下腫瘍の成長を顕著に阻害した。
【図１１】図１１は、担腫瘍マウス由来脾臓細胞の細胞傷害性を示す図である。0日目および7日目にFC/B16を注射したマウス(●、○)；DCと、DNアーゼで消化したB16ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH/3T3とを含むFCを注射したマウス(黒三角)；FC/CT-2Aを注射したマウス(■)；またはNIH3T3細胞を注射したマウス(□)から、SPCを分離した。SPCは、14日目にマウスから分離した。FC/B16を用いて免疫化したマウス(●)由来のB16細胞に対するCTL活性は、対照および他のマウスよりもかなり高く、FC/B16を用いて免疫化したマウス由来のYac-1細胞に対する抗腫瘍活性は増加した(○)。
【図１２】図１２は、FCの抗腫瘍効果にNK細胞が必要であることを示す図である。B16細胞およびFCの注射を受けたマウスに抗アシアロGM1を投与することによってNK細胞を枯渇させた。0日目および7日目に側腹部にFC/B16を皮下接種した。続いて、14日目にB16細胞を同じ側腹部に接種した。-1、3、7、および10日目に抗アシアロGM1をi.p.注射した。対照に比べて、NK細胞を枯渇したマウスでは抗腫瘍効果が減少していた(各群n=5)。
【図１３】図１３は、動物実験での治療について腫瘍細胞および融合細胞の投与スケジュールを示す図である。融合細胞は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3細胞との間の融合細胞である。腫瘍細胞はB16細胞である。
【図１４】図１４は、動物実験での予防について腫瘍細胞および融合細胞の投与スケジュールを示す図である。融合細胞は、樹状細胞と、B16腫瘍細胞由来ゲノムDNAをトランスフェクトしたNIH3細胞との間の融合細胞である。腫瘍細胞はB16細胞である。
【図１５】図１５は、B16黒色腫細胞由来ゲノムDNAをNIH3T3細胞にトランスフェクトするためのプロトコールを示す図である。
【図１】
2007528375.tif 000006
【図２】
2007528375.tif 000007
【図３】
2007528375.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007528375.tif 000018
【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年11月30日(2005.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、前記非樹状細胞が癌細胞から抽出したゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)癌細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項３】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で治療または予防すべき癌と同じ種類である癌細胞から単離される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で治療または予防すべき癌から得られる癌細胞から単離される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の前癌病変を治療する方法であって、前記方法が、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が前癌病変の細胞から抽出したゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項６】
哺乳動物の前癌病変を治療する方法であって、前記方法が、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)前癌病変の細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項７】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物の少なくとも1つのMHCクラスIアレルを組換え発現する、請求項2または6に記載の方法。
【請求項８】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物にとって同種異系である細胞から生成される、請求項2または6に記載の方法。
【請求項９】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物にとって同系である細胞から生成される、請求項2または6に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で治療すべき前癌病変と同じ種類である前癌病変の細胞から単離される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムDNAが、前記哺乳動物で治療すべき前癌病変から単離される前癌病変の細胞から単離される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１３】
体液性免疫応答または細胞傷害性T細胞免疫応答を刺激する分子の投与をさらに含む、請求項1、2、5または6に記載の方法。
【請求項１４】
前記分子がサイトカインである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインがインターロイキン-12である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹状細胞がヒト血中単球から得られる、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１９】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項２０】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項1または5に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系であり、かつ、前記非樹状細胞が、前記哺乳動物と同じMHCクラスIハプロタイプを有する、請求項1または5に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1、2、5または6に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群から選択される、請求項1、2、5または6に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２５】
前記前癌病変が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される癌の前駆物である、請求項5または6に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト抗原提示細胞とヒト非樹状細胞とを融合させる方法であって、抗原提示細胞の集団および非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件下に置くことを含み、前記非樹状細胞が腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記腫瘍細胞に関連した少なくとも1つの抗原をコードする、前記方法。
【請求項２７】
前記ゲノムDNAが、腫瘍細胞から取得され、非樹状細胞中にトランスフェクトされている、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって同種異系である、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって同系である、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞融合が電気融合によって達成される、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
抗原提示細胞と非樹状細胞との融合細胞であって、前記融合細胞が腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを含み、前記腫瘍細胞のゲノムDNAが、前記腫瘍細胞に関連した少なくとも1つの抗原をコードする、前記融合細胞。
【請求項３２】
1つまたは複数の容器に、(i)抗原提示細胞の集団と、(ii)非樹状細胞の集団と、(iii)投与を必要とする哺乳動物に投与するために前記抗原提示細胞を非樹状細胞と融合させるための説明書とを含むキット。
【請求項３３】
(i)細胞からゲノムDNAを得るための物質と、(ii)前記ゲノムDNAを非樹状細胞中にトランスフェクトするための物質とをさらに含む、請求項32に記載のキット。
【請求項３４】
電気融合に適したキュベットをさらに含む、請求項32に記載のキット。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞が凍結保存されている、請求項32に記載のキット。
【請求項３６】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子と、癌を予防または治療するために前記キットを使用するための説明書とをさらに含む、請求項32に記載のキット。
【請求項３７】
前記分子がサイトカインである、請求項36に記載のキット。
【請求項３８】
前記サイトカインがIL-12である、請求項37に記載のキット。
【請求項３９】
抗原提示細胞および非樹状細胞を含む融合細胞を含む医薬組成物であって、前記非樹状細胞が腫瘍細胞から抽出したゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記腫瘍細胞に関連した少なくとも1つの抗原をコードする、前記医薬組成物。
【請求項４０】
前記抗原提示細胞がヒト細胞である、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記非樹状細胞がヒト細胞である、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子をさらに含む、請求項39に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記分子がサイトカインである、請求項42に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記分子がIL-12である、請求項42に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
哺乳動物の癌を治療するための普遍的抗原提示細胞を作製する方法であって、
(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子と、
(ii)前記哺乳動物の少なくとも1つのMHCクラスIアレルと、
(iii)前記癌に関連する少なくとも1つの抗原と、
を組換え発現するように細胞を遺伝子操作するステップを含む、前記方法。
【請求項４６】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物で治療すべき癌の種類に由来するゲノムDNAをトランスフェクトされている、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記普遍的抗原提示細胞が、前記哺乳動物で治療すべき癌の種類に由来する1つまたは複数のcDNAをトランスフェクトされている、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
請求項45に記載の普遍的抗原提示細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項４９】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５０】
哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように構築されており、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記癌に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５１】
前記非樹状細胞が、癌細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
前記普遍的抗原提示細胞が、癌細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌細胞が、前記哺乳動物で治療すべき癌と同じ種類のものである、請求項49または50に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌細胞が、前記哺乳動物で治療される癌から得られる、請求項49または50に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物の前癌病変を治療する方法であって、前記方法が、前記治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の融合細胞を投与することを含み、融合細胞が、(i)抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(ii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５６】
哺乳動物の前癌病変を治療または予防する方法であって、前記方法が、前記治療または予防を必要とする哺乳動物に、有効な量の普遍的抗原提示細胞を投与することを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードし、かつ、(iii)少なくとも1つのMHCクラスIアレルを前記哺乳動物と共有する、前記方法。
【請求項５７】
前記非樹状細胞が、前癌病変の細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
前記普遍的抗原提示細胞が、前癌病変の細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
前記前癌病変の細胞が、前記哺乳動物で治療または予防すべき前記前癌病変と同じ種類である前癌病変の細胞である、請求項57または58に記載の方法。
【請求項６０】
前記前癌病変の細胞が、前記哺乳動物で治療すべき前記前癌病変の細胞である、請求項57または58に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６２】
体液性免疫応答または細胞傷害性T細胞免疫応答を刺激する分子の投与をさらに含む、請求項49、50、55、または56に記載の方法。
【請求項６３】
前記分子がサイトカインである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記サイトカインがインターロイキン-12である、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記樹状細胞がヒト血中単球から得られる、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６８】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって自家性である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項６９】
前記非樹状細胞が前記哺乳動物にとって同種異系である、請求項49または55に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗原提示細胞が前記哺乳動物にとって同種異系であり、かつ、前記非樹状細胞が哺乳動物と同じMHCクラスIハプロタイプを有する、請求項49または55に記載の方法。
【請求項７１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項49、50、55、または56に記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群から選択される、請求項49、50、55、または56に記載の方法。
【請求項７３】
前記癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される、請求項49または50に記載の方法。
【請求項７４】
前記前癌病変が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病;慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびH鎖病からなる群から選択される癌の前駆物である、請求項55または56に記載の方法。
【請求項７５】
ヒト抗原提示細胞とヒト非樹状細胞とを融合させる方法であって、抗原提示細胞の集団および非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件下に置くことを含み、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが癌に関連した抗原をコードする、前記方法。
【請求項７６】
前記非樹状細胞が、癌細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
前記前癌性非樹状細胞が前記抗原提示細胞にとって自家性である、請求項75に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞融合が電気融合によって達成される、請求項75に記載の方法。
【請求項７９】
腫瘍細胞に関連した抗原をコードするcDNAを含む、抗原提示細胞および非樹状細胞の融合細胞。
【請求項８０】
前記融合細胞が、腫瘍細胞から単離されたmRNAから生成された複数の異なったcDNAを含む、請求項79に記載の融合細胞。
【請求項８１】
1つまたは複数の容器に、(i)抗原提示細胞の集団と、(ii)非樹状細胞の集団と、(iii)投与を必要とする哺乳動物に投与するために前記抗原提示細胞を非樹状細胞と融合させるための説明書とを含むキット。
【請求項８２】
前記キットが、腫瘍、癌、または前癌病変に関連した抗原をコードする少なくとも1つのcDNAをさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８３】
前記キットが、以下：(i)細胞からmRNAを得るための物質と、(ii)mRNAからcDNAを生成させるための物質と、(iii)cDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための物質とのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８４】
電気融合に適したキュベットをさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８５】
前記抗原提示細胞が凍結保存されている、請求項81に記載のキット。
【請求項８６】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子と、癌を予防または治療するために前記キットを使用するための説明書とをさらに含む、請求項81に記載のキット。
【請求項８７】
前記分子がサイトカインである、請求項86に記載のキット。
【請求項８８】
前記サイトカインがIL-12である、請求項87に記載のキット。
【請求項８９】
抗原提示細胞および非樹状細胞を含む融合細胞を含む医薬組成物であって、前記非樹状細胞が、腫瘍細胞に関連した抗原をコードする少なくとも1つのcDNAを含む、前記医薬組成物。
【請求項９０】
前記非樹状細胞が、腫瘍細胞から単離されたmRNAから生成された複数のcDNAを含む、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
前記樹状細胞がヒト細胞である、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記非樹状細胞がヒト細胞である、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
体液性免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびこれらの組合せからなる群より選択される免疫応答を刺激する分子をさらに含む、請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記分子がサイトカインである、請求項93に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
前記分子がIL-12である、請求項94に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
1つまたは複数の容器に、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されている普遍的抗原提示細胞と、(ii)細胞からmRNAを得るための物質と、(iii)mRNAからcDNAを生成させるための物質と、(iv)cDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための物質と、を含むキット。
【請求項９７】
1つまたは複数の容器に、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されている普遍的抗原提示細胞と、(ii)細胞からゲノムDNAを得るための物質と、(iii)ゲノムDNAを非樹状細胞にトランスフェクトするための物質と、を含むキット。
【請求項９８】
1つまたは複数の容器に、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3のうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数のDNA分子と、(ii)細胞にDNA分子を導入するための物質と、を含むキット。
【請求項９９】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を融合細胞とともにインキュベートすることを含み、前記融合細胞が抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、前記非樹状細胞が癌細胞または前癌病変の細胞から抽出したゲノムDNAを含み、かつ、前記ゲノムDNAが、前記癌または前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードする、前記方法。
【請求項１００】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を普遍的抗原提示細胞とともにインキュベートすることを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、かつ、(ii)癌細胞または前癌病変の細胞のゲノムDNAを含み、前記ゲノムDNAが、前記癌または前記前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する少なくとも1つの抗原をコードする、前記方法。
【請求項１０１】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を融合細胞とともにインキュベートすることを含み、融合細胞が抗原提示細胞と非樹状細胞との融合によって形成され、非樹状細胞が1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、癌または前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードする、前記方法。
【請求項１０２】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、免疫エフェクター細胞を普遍的抗原提示細胞とともにインキュベートすることを含み、普遍的抗原提示細胞が、(i)ICAM-I、ICAM-II、B7、およびLFA-3からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子を組換え発現するように遺伝子操作されており、かつ、(ii)1つまたは複数のcDNAを含み、少なくとも1つのcDNAが、癌または前癌病変に関連した抗原の抗原性を有する抗原をコードする、前記方法。
【国際調査報告】
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