(57)【要約】受容体チロシンキナーゼ阻害剤の同定および／または確認のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が記載される。上記方法は以下の段階を特徴とする：ａ）受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインを含むペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を提供すること、ここで上記ペプチドは膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを欠如し、そして細胞質の上記チロシンキナーゼ活性は増殖阻止を導く：ｂ）上記宿主細胞と候補化合物を接触させること、およびｃ）候補化合物によるチロシンキナーゼ活性の調節が細胞成長を導くような適切な条件下における上記宿主細胞の培養による上記チロシンキナーゼ活性の阻害剤の同定。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤の同定および／または確認のための方法：
ａ）受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインまたはその機能的フラグメントを含むペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を提供すること、ここで前記ペプチドは膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを欠如し、そして細胞質の前記チロシンキナーゼ活性が宿主細胞の増殖阻止を導く、
ｂ）前記宿主細胞と候補化合物を接触させること、そして
ｃ）候補化合物によるチロシンキナーゼ活性の改変が細胞増殖を導くような適切な条件下における、前記宿主細胞の培養により、前記チロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定すること。
【請求項２】
前記核酸構築物が前記受容体チロシンキナーゼの全細胞質部分を含むペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドがさらに二量体化ドメインまたはその機能的フラグメントを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記二量体化ドメインがｃ−Ｆｏｓロイシンジッパー、ｃ−ＪｕｎロイシンジッパーおよびＧｃｎ４ロイシンジッパーから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が２種のペプチドを含む、請求項３または４に記載の方法であって、第１ペプチドがｃ−Ｆｏｓロイシンジッパーを含み、そして第２ペプチドがｃ−Ｊｕｎロイシンジッパーロイシンジッパーを含む、前記方法。
【請求項６】
前記ペプチドがさらにペプチドの膜係留を導く配列、とりわけ膜係留のためのミリストレーションシグナルを含む、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体チロシンキナーゼがＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２，ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ―１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ―１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＲＦ１〜３、ＦＧＦＲ１〜４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６からなる群から選択される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記受容体チロシンキナーゼがＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＧＲＦ−１、ＴＲＫＡ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ４、ＡＸＬ、ＴＥＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記受容体チロシンキナーゼがヒト起源を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸構築物が、前記ペプチドの発現を制御する誘導プロモーター、好ましくはガラクトース誘導プロモーターを含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が酵母細胞または細菌細胞である、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、Ｓ．セレビジアエ細胞、より好ましくはＡＢＣトランスポーター遺伝子に突然変異を係留するＳ．セレビジアエ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが前記ペプチドの核局在を導くシグナル配列および／またはペプチドを欠如する、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインまたはその機能的フラグメントを含むペプチドをコードする核酸配列を含む、酵母発現ベクターであって、前記ペプチドが膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを欠如し、そして前記ペプチドの核局在を導くシグナル配列および／またはペプチドを欠如する、前記ベクター。
【請求項１５】
前記ペプチドがさらに二量体化ドメインまたはその機能的フラグメントを含む、請求項１４に記載の酵母発現ベクター。
【請求項１６】
前記二量体化ドメインがｃ−Ｊｕｎロイシンジッパー、ｃ−ＦｏｓロイシンジッパーおよびＧｃｎ４ロイシンジッパーから選択される、請求項１５に記載の酵母発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４〜１６に記載の酵母発現ベクターを含む、酵母細胞。
【請求項１８】
請求項１４〜１６に記載の酵母発現ベクターおよび／または請求項１７に記載の酵母細胞を含む、受容体チロシンキナーゼ阻害剤の同定および／または確認のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤の同定および／または確認のための細胞を使用した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は細胞成長、増殖、分化、生存および代謝を制御する細胞間コミュニケーションの重要な調節因子である。類似の構造、すなわち、リガンドのための細胞外結合部位、膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインを共有する、約２０種の異なるＲＴＫファミリーが同定されている（１）。細胞外リガンド結合は受容体二量体化を誘導するか、または安定化し、増大したＲＴＫキナーゼ活性を導く。細胞内触媒ドメインはＲＴＫ間で最も高い保存レベルを示し、細胞質チロシン残基の受容体自己りん酸化を触媒するＡＴＰ−結合部位を含有し、そして前記チロシン残基はＧｒｂ２，Ｓｈｃ、Ｓｒｃ、Ｃｂ１またはホスホリパーゼＣγのようなＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）‐およびホスホチロシン‐結合（ＰＴＢ）ドメイン‐含有蛋白質のためのドッキング部位として役立つ。これらの蛋白質はその後、ＳＨ２、ＳＨ３、ＰＴＢおよびプレクストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同性（ＰＨ）ドメインを含有する付加的なエフェクターを活性化受容体に動員し、それが膜における情報伝達複合体の集合および細胞内生化学的シグナルカスケードの活性化を引き起こす。ＲＴＫによって活性化される最も重要な下流情報伝達カスケードには、Ｒａｓ‐細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）‐マイトジェン活性化（ＭＡＰ）キナーゼ経路、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）‐ＡｋｔおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路が挙げられる。ＲＴＫが引き金となる複合情報伝達網は、結局種々の遺伝子のサブセットを活性化または抑制のいずれかの状態にし、そうして与えられたシグナルに対する生物学的反応を明らかにする。
【０００３】
ＲＴＫの活性およびそれらに媒介される細胞情報伝達は、正常細胞では正確に調整され、厳しく制御される。成長因子による刺激および／または遺伝的改変のいずれかによる、ＲＴＫ情報伝達系の脱調節の結果、チロシンキナーゼ活性は脱調節される。これらの異常の結果、一般にＲＴＫが構成的、または強く促進されたキナーゼ活性およびその後の情報伝達能力を持ち、それが悪性の形質転換を導く。したがって、それらはしばしばヒトの癌、さらに乾癬のような別の増殖亢進性疾患につながる（２）。構成的ＲＴＫ情報伝達を導く最も重要な機序には、ＲＴＫの過剰発現および／または遺伝子増幅、細胞外ドメイン内の欠失および突然変異のような遺伝的改変、および触媒部位の改変、または異常な成長因子ループを介したオートクリン‐パラクリン刺激が挙げられる。
【０００４】
たとえば、多くのヒトの癌では、ＲＴＫの遺伝子増幅および／または過剰発現が見出され、そしてそれが癌細胞の反応を正常な成長因子レベルまで増大させる可能性がある。さらに、細胞表面の特定のＲＴＫの過剰発現は活性化リガンドの非存在下でさえも、受容体二量体化の発生率を増大させる。多くの場合、これがＲＴＫの構成的活性化となり、異常で、制御できない細胞増殖および腫瘍形成を導く。そのような予想の重要な例としては、ＲＴＫの上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーに属し、ＥｒｂＢ２としても公知の、ＨＥＲ２が挙げられる。ＨＥＲ２の過剰発現は種々の型のヒト癌、とりわけヒト乳癌および卵巣癌に見出された（３）。最も重要なことには、異常に上昇したＨＥＲ２レベルは、疾患のいっそう侵襲的な進行および低下した患者の生存時間と相関する（４）。分子クローニングされることになる最初の受容体チロシンキナーゼであったＥＧＦＲ（５）はまた、腫瘍形成において基礎的な役割を果たす。ＥＧＦＲは、非小細胞肺、膀胱、頸部、卵巣、腎臓および膵臓癌において、ならびに頭頸部の扁平上皮癌においてしばしば過剰発現される（６）。ＥＧＦＲ過剰発現を導く主な機序は遺伝子増幅であり、ある種の腫瘍では細胞毎に６０に及ぶコピーが報告された（７）。一般に、上昇したレベルのＥＧＦＲ過剰発現は高い転移率、および増大した腫瘍増殖を伴う（８）。
【０００５】
チロシンキナーゼは多様な癌の徴候に関与しているため、ＲＴＫおよび活性化情報伝達カスケードは、標的‐選択的抗癌剤の開発に関する前途有望な領域を表す。異常なＲＴＫ情報伝達を阻止するための一方法は、それらの固有のチロシンキナーゼ活性を選択的に妨害し、それによって受容体自己りん酸化および下流シグナルトランスジューサーの活性化を遮断する小分子薬の開発である（９）。
【０００６】
ＲＴＫ‐特異的阻害剤を同定するための化合物ライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの方法が開発されていて、それらの多くは生化学的アッセイを利用する（１０）。効果的なチロシンキナーゼ阻害剤の選択を考慮するための１つの重要な側面は、これらの化合物が細胞膜を透過し、必要な期間、細胞内環境で機能することが可能でなければならないことである。さらに、潜在的な薬物候補になるためには、キナーゼ阻害剤は細胞毒性効果を示してはならない。したがって、ＲＴＫ活性を阻止することが可能な化合物の一次スクリーニングのための細胞系を持つことが好ましい。そのようなｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのための必要条件は、明示された標的によって引き起こされる具体的な細胞過程を検討するための能力、およびハイスループットスクリーニング系（ＨＴＰ）においてその出力を容易に測定するための手段である。遺伝的に細胞および微生物を改変するためのますます増大するバイオテクノロジー手段の有用性は、ＨＴＳの自動システムに容易に適用することができる、細胞過程の簡単な読み取りアッセイの発達を可能にしてきた（１１〜１４）。細胞のスクリーニングは理想的にはヒト起源の細胞によって行うべきであり、そしてそれは明らかに最も生理学的に適切なモデル系を提供する。しかし、測定された出力に対する冗長な過程の効果が、明確にされた標的に特異的であると予想される作用を制御し、それらを識別することを困難にする可能性があり；そして哺乳動物細胞の遺伝的操作は一般に多くの問題をかかえ、多くの時間を必要とする。さらに、ヒト細胞は培養に費用が掛かり、時にはＨＴＳに使用される自動化された装置で増殖させることが困難である。酵母のような微生物は、異種起源であるが、細胞（真核生物）環境において明示されたヒト蛋白質の活性を測定するための都合のよい代替物を提供する。酵母細胞では、ヒト蛋白質の機能はしばしば再構成が可能であり、酵母とヒト細胞間の基本的な分子および細胞機序が高度に保存されているため、いくつかのヒトの生理的過程の側面は再現することができる（１４〜１７）。酵母において多くのヒト蛋白質が機能するという事実は、要求される形態、安定性、蛋白質‐蛋白質相互作用などがこの真核細胞生物において生じていることを示唆する。
【発明の開示】
【０００７】
受容体チロシンキナーゼ阻害剤単離のための方法は既に存在するが、細胞膜を通り抜け、そして細胞毒性ではない受容体チロシンキナーゼ阻害剤の同定および／または確認のための、細胞を基礎にした、信頼性の高い方法の必要性が存在する。
【０００８】
発明の開示
したがって、受容体チロシンキナーゼ活性阻害剤の同定および／または確認のための方法を提供することが本発明の概略の目的である。上記方法は以下の工程を含む：
ａ）受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインまたはその機能的フラグメントを含むペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を提供すること、[上記ペプチドは膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを欠如し、そして細胞質の上記チロシンキナーゼ活性が上記宿主細胞の増殖阻止を導く]
ｂ）上記宿主細胞と候補化合物を接触させること、そして
ｃ）適切な条件下における上記宿主細胞の培養により上記チロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定すること、[それは候補化合物によるチロシンキナーゼ活性の改変が細胞増殖を導くような条件である]。
【０００９】
本発明の好ましい態様において、上記核酸構築物は上記受容体チロシンキナーゼの全細胞質部分を含有するペプチドをコードする。
【００１０】
別の好ましい態様において、上記ペプチドは上記ペプチドの核局在を導くシグナル配列および／またはペプチドを欠如する。
【００１１】
さらに好ましい態様において、上記ペプチドは二量体化ドメインまたはその機能的フラグメントをさらに含有する。上記二量体化ドメインは好ましくはｃ−Ｆｏｓロイシンジッパー、ｃ−ＪｕｎロイシンジッパーおよびＧｃｎ４ロイシンジッパーから選択される。
【００１２】
さらに好ましい態様において、宿主細胞は２種のペプチドを含有し、ここで第１のペプチドはｃ−Ｆｏｓロイシンジッパーを含有し、第２のペプチドはｃ−Ｊｕｎロイシンジッパーを含有する。
【００１３】
別の好ましい態様において、上記ペプチドは、ペプチドの膜係留を導く配列、とりわけ膜係留のためのミリストレーションシグナルを含有する。
【００１４】
本発明の方法において使用のためのチロシンキナーゼ活性は任意の受容体チロシンキナーゼに由来してよい。好ましい受容体チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２，ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ―１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ―１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＲＦ１〜３、ＦＧＦＲ１〜４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６である。
【００１５】
さらに好ましい態様において、上記チロシンキナーゼ活性はＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＧＲＦ−１、ＴＲＫＡ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ４、ＡＸＬ、ＴＥＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳから選択される。
【００１６】
別の好ましい態様において、上記受容体チロシンキナーゼはヒト起源を有する。
【００１７】
別の好ましい態様において、上記核酸構築物は上記ペプチドの発現を制御する誘導プロモーター、好ましくはガラクトース誘導プロモーターを含む。
【００１８】
さらに別の好ましい態様において、上記宿主細胞は酵母細胞または細菌細胞、好ましくはＳ．セレビジアエ細胞、より好ましくはＡＢＣトランスポーター遺伝子に突然変異を係留するＳ．セレビジアエ細胞である。
【００１９】
別の側面において、本発明は本発明の核酸構築物を含有する酵母発現ベクター、および受容体チロシンキナーゼ阻害剤の同定および／または確認のためのキットに関する。
【００２０】
以下の本発明の詳細な説明を考慮するとき、本発明はよりよく理解され、そして先に明らかにした目的以外のものが明らかになるであろう。そのような説明は添付の図面に言及する。
【００２１】
発明を実施するための形態
本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、好ましくはヒトＲＴＫの特異的阻害剤の同定および／または確認のための細胞を用いた系を提供する。この系では、明示されたＲＴＫフラグメントを条件付きで発現する宿主細胞、好ましくは酵母細胞は、蛋白質キナーゼ活性の阻害または不活性化によってだけ増殖が可能である。そのような正の読み出しは、さらに可溶性であり、安定であり、そして非毒性でなければならない具体的なキナーゼ阻害剤の選択を可能にする。
【００２２】
本発明の細胞を基礎にした系では、ＲＴＫのチロシンキナーゼドメインまたはその機能的フラグメント、好ましくはＲＴＫの細胞質ドメインまたはその機能的フラグメントは、そのようなものとして、または強力な二量体を形成することが公知の蛋白質配列との融合ペプチドとして宿主細胞の細胞質に発現される。細胞、好ましくは酵母細胞におけるこれらの蛋白質の発現は、ＧＡＬ１遺伝子の誘導プロモーターのようなプロモーターによって好ましくは制御される。二量体化ＲＴＫ誘導体の発現は、選択的条件下において著しく酵母細胞の成長を低下させる（図１ａおよび１ｂ）。そのような成長阻害は、チロシンキナーゼ活性の二量体化依存的活性化のためである。なぜならば、活性部位における点突然変異の導入がＲＴＫのチロシンキナーゼ機能を妨害し、成長阻害効果を除去するからである（図１ａおよび１ｂ）。抗‐ホスホチロシン抗体による細胞抽出物のウェスタンブロット解析は、たとえばｃ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲβのようなＲＴＫの成長阻害効果がチロシンりん酸化を触媒するその能力と相関することを示す（図２ｂ）。
【００２３】
膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメント、とりわけＲＴＫの膜貫通ドメインを含むＲＴＫペプチド、および蛋白質Ｎ−末端のＥＲ内腔および細胞外間隙への局在のためのシグナルペプチドの発現は完全に成長阻害効果を遮断する（図１ａおよび１ｂ）が、それはチロシンりん酸化を触媒する膜貫通ＲＴＫの能力を低下させない（図２ｂ）。活性なＲＴＫ細胞質ドメインの細胞膜のサイトソル部分へのターゲッテイングは、明らかにチロシンりん酸化および成長阻害効果に適切ではない。なぜならば、普通のＲＴＫ細胞質ドメインと、膜係留のためのミリストレーションシグナルを持つ同じ配列間に差が認められないからである（図１ａ、１ｂおよび２ａ）。
【００２４】
先行技術は、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）における全長細胞質チロシンキナーゼｃ−ｓｒｃの発現が細胞死を導くこと（１８）およびＳ．セレビジアエのｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃの発現が成長阻止を導くこと（１９）を開示する。機能的Ｎ−末端ミリストレーションシグナルを欠如するｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃ突然変異体は成長阻止の部分的阻害だけを引き起こす（１９）、すなわち、Ｓ．セレビジアエにおいてｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃ発現により誘導される完全な成長阻止は、ｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃがその天然の細胞コンパートメントを標的にする場合だけ認められてよいことを開示する。本発明の発明者らは先行技術とは対照的に、酵母細胞における全長ＲＴＫの発現は成長阻止を導かない、すなわち酵母細胞においてその天然の細胞コンパートメントへのＲＴＫのターゲッテイング（膜貫通局在）は成長阻止を導かないことを見出している。
【００２５】
本発明の典型的な態様では、ＲＴＫ  ＰＤＧＦＲβの二量体化フラグメントを発現する遺伝子工学的に操作された酵母細胞への具体的なチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の投与が、このＲＴＫの二量体化依存的キナーゼ活性を遮断し、選択的条件下において成長を回復させることを示した（図３）。具体的なチロシンキナーゼ阻害剤Ｇｌｅｅｖｅｃによって影響されないことが公知である、異なるＲＴＫ（たとえばＲＥＴ）によって引き起こされた成長阻害はこの化合物の存在において軽減されなかった（図３）。
【００２６】
細菌および酵母細胞は内因性哺乳動物型チロシンキナーゼを持たないため、この細胞を基礎にした系は、ＲＴＫの発現およびこれらの膜結合キナーゼの特異的阻害剤のスクリーニングのための、哺乳動物細胞によって得ることができない特権的な状況であるヌルバックグラウンドの利点を提供する。
【００２７】
本発明のペプチドは、染色体外遺伝子構築物、たとえば宿主細胞において融合蛋白質の発現を可能にするエピゾームベクターから発現されてもよい。融合ペプチドをコードする核酸構築物は宿主細胞のゲノムに統合されてもよい。核酸は、細胞に核酸配列を取り込ませる任意のトランスフェクション法によって細胞に導入することができる。そのような方法は当業者に公知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１に記載されている。
【００２８】
本発明で使用のための適切な宿主細胞および別の分子生物学的試薬、たとえば融合ペプチド構築物の構築は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１に記載されたような標準分子生物学的技術を使用して行うことができる。
【００２９】
当業者は、その上、使用される細胞の検出および／または生存を可能にする適切な培養条件を決定することができる。上記条件は使用される遺伝子構築物および宿主細胞に依存する。
【００３０】
本発明のスクリーニング法によってスクリーニングすることができる、少なくとも３種の異なるカテゴリーの化合物が存在する：化学ライブラリー、天然生成物ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリー。化学ライブラリーは公知の化合物の構造類似体から構成される。天然生成物ライブラリーは、微生物、動物、植物または海洋生物の収集物であり、それらは、たとえば土壌、植物または海洋微生物由来の培養液の発酵および抽出、または植物もしくは海洋微生物の抽出によってスクリーニングのための混合物を生み出すために使用される。コンビナトリアルライブラリーは、混合物としての多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物から構成される。それらは、たとえば伝統的な合成法、ＰＣＲまたはクローニングによって比較的容易に調製することができる。
【００３１】
本発明は、ここで実施例によりさらに詳細に説明される：
実験１
この実験の結果は図１ならびに図２ａおよび２ｂに示す。
【００３２】
ＲＴＫ遺伝子の発現が抑制される、グルコースプレート上での細胞成長およびコロニー形成は左の列に示す。ＲＴＫ遺伝子の発現が誘導されるガラクトースプレート上での細胞成長およびコロニー形成は右のレーンに示す。ＲＴＫ  ｃ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲβの活性な細胞質ドメインの発現は、酵母細胞のキナーゼ依存的成長阻害を引き起こす（図１ａおよび１ｂ、レーン１および４）。これらのＲＴＫのＡＴＰ結合ポケットにおける保存されたリシン残基（Ｌｙｓ＝Ｋ）の突然変異を介したキナーゼ活性の不活性化は成長阻害効果を抑制する（図１ａおよび１ｂ、レーン３および６）。これらのＲＴＫの単離された細胞質ドメインとは対照的に、これらの蛋白質のそれぞれの膜貫通ドメイン、その上にＥＲ局在および分泌のためのシグナルペプチドの含有は、細胞成長に対する阻害効果の除去を引き起こした（図１ａおよび１ｂ、レーン２および５）。
【００３３】
Ｃ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲβを構成的に活性化するために、異種二量体化ドメインを、Ｃ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲβ細胞質ドメイン、または天然の膜貫通ドメインを含有する、より長いＣ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲβ誘導体に融合した。ｃ−ＪｕｎロイシンジッパーまたはＦｏｓロイシンジッパーは、Ｃ−Ｍｅｔ（ＡＡ９３２〜１３６６）およびＰＤＧＦＲβ（ＡＡ５２４〜１０６７）の細胞質ドメインのＮ−末端、膜貫通ドメインを持つＣ−Ｍｅｔ（ＡＡ９０５〜１３６６）およびＰＤＧＦＲβ（ＡＡ４９６〜１０６７）構築物の細胞質ドメインのＮ−末端のいずれかに骨格で融合した。酵母細胞における構築物の発現を解析するために、ＨＡまたはＭｙｃエピトープは二量体化ドメインとキナーゼドメインの融合部位間に挿入された。細胞質構築物の場合、ミリストレーションシグナル（膜に係留したブラックバー）によって膜への局在が行われた。膜貫通ドメインを含む融合蛋白質の適切な分泌を確実にするために、酵母Ｓｕｃ２シグナル配列（ＳＳ）を二量体化ドメインのＮ−末端に融合した。
【００３４】
示されたハイブリッド蛋白質の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗‐Ｍｙｃ抗体によるウェスタンブロットによりモニターした（図２ａ）。検出のためのＭｙｃエピトープ、ヘテロダイマー形成のためのＦｏｓロイシンジッパー、および膜係留のためのミリストレーションシグナルは、検出された蛋白質の機能的に等価な配列のかわりにＨＡエピトープおよびパートナーＪｕｎロイシンジッパーを持つ類似の構築物と一緒にすべて発現された。蛋白質のりん酸化（ＲＴＫの自己りん酸化、および性状不明の基質蛋白質のトランスりん酸化）は、抗‐ｐＴｙｒ抗体によるウェスタンブロットにより検出した（図２ｂ）。膜貫通ドメイン（ＴＭ）を持つＣ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲβ誘導体は発現され、これらのＲＴＫの単離された細胞質ドメインの活性に匹敵する程度に活性である（レーン１と２、およびレーン４と５を比較されたい）が、それらは酵母増殖を阻止しない。予想されるように、不活性化されたキナーゼ変異体は全くチロシンりん酸化を示さなかった（図２ｂ、レーン３および６）。
【００３５】
実験２
この実験結果は図３に示す。
【００３６】
酵母における受容体チロシンキナーゼ活性の特異的阻害の選択。酵母におけるヒト受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦＲ‐βおよびＲＥＴの発現は、両方の細胞培養物のＯＤ６００ｎｍ光散乱測定によって確認されるように、細胞成長の強い抑制を引き起こす。ＰＤＧＦＲ‐βを阻止するがＲＥＴを阻止しないことが公知のイマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を濃度５０μＭで酵母培養物に添加すると、ＰＤＧＦＲ‐βを発現している酵母細胞の成長はとりわけ回復するが、ＲＥＴを発現している細胞の成長は回復しない。
【００３７】
ここで、本発明の好ましい態様を示し、説明するが、本発明はそれらに限定されず、以下の特許請求の範囲内で様々に異なって具体化し、実行してもよいことを理解すべきである。
【００３８】
【表１−１】
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【００３９】
【表１−２】
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】３種のｃ−Ｍｅｔ構築物および酵母成長に対するそれらの発現の効果を示す。
【図１ｂ】３種のＰＤＧＦＲβ構築物および酵母成長に対するそれらの発現の効果を示す。グルコース＝抑制条件、すなわちペプチドは発現されない、およびガラクトース＝許容条件、すなわちペプチドは発現される。
【図２ａ】抗‐ｍｙｃ抗体による細胞抽出物のウェスタンブロット解析を示す。
【図２ｂ】抗‐ホスホチロシン抗体による細胞抽出物のウェスタンブロット解析を示す。
【図３】酵母細胞におけるＧｌｅｅｖｅｃによるＰＤＧＦＲβの受容体チロシンキナーゼ活性の阻害を示す。
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年10月6日(2006.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤の同定および／または確認のための方法：
ａ）受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインまたはその機能的フラグメントを含むペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を提供すること、ここで前記ペプチドは膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを欠如し、そして細胞質の前記チロシンキナーゼ活性が宿主細胞の増殖阻止を導く、
ｂ）前記宿主細胞と候補化合物を接触させること、そして
ｃ）候補化合物によるチロシンキナーゼ活性の改変が細胞増殖を導くような適切な条件下における、前記宿主細胞の培養により、前記チロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定すること。
【請求項２】
前記核酸構築物が前記受容体チロシンキナーゼの全細胞質部分を含むペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドがさらに二量体化ドメインまたはその機能的フラグメントを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記二量体化ドメインがｃ−Ｆｏｓロイシンジッパー、ｃ−ＪｕｎロイシンジッパーおよびＧｃｎ４ロイシンジッパーから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が２種のペプチドを含む、請求項３または４に記載の方法であって、第１ペプチドがｃ−Ｆｏｓロイシンジッパーを含み、そして第２ペプチドがｃ−Ｊｕｎロイシンジッパーロイシンジッパーを含む、前記方法。
【請求項６】
前記ペプチドがさらにペプチドの膜係留を導く配列、とりわけ膜係留のためのミリストレーションシグナルを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体チロシンキナーゼがＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２，ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ―１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ―１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＲＦ１〜３、ＦＧＦＲ１〜４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記受容体チロシンキナーゼがＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＧＲＦ−１、ＴＲＫＡ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ４、ＡＸＬ、ＴＥＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記受容体チロシンキナーゼがヒト起源を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸構築物が、前記ペプチドの発現を制御する誘導プロモーター、好ましくはガラクトース誘導プロモーターを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が酵母細胞または細菌細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、Ｓ．セレビジアエ細胞、より好ましくはＡＢＣトランスポーター遺伝子に突然変異を係留するＳ．セレビジアエ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが前記ペプチドの核局在を導くシグナル配列および／またはペプチドを欠如する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインまたはその機能的フラグメントを含むペプチドをコードする核酸配列を含む、酵母発現ベクターであって、前記ペプチドが膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを欠如し、そして前記ペプチドの核局在を導くシグナル配列および／またはペプチドを欠如する、前記ベクター。
【請求項１５】
前記ペプチドがさらに二量体化ドメインまたはその機能的フラグメントを含む、請求項１４に記載の酵母発現ベクター。
【請求項１６】
前記二量体化ドメインがｃ−Ｊｕｎロイシンジッパー、ｃ−ＦｏｓロイシンジッパーおよびＧｃｎ４ロイシンジッパーから選択される、請求項１５に記載の酵母発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の酵母発現ベクターを含む、酵母細胞。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の酵母発現ベクターおよび／または請求項１７に記載の酵母細胞を含む、受容体チロシンキナーゼ阻害剤の同定および／または確認のためのキット。
【国際調査報告】
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