(57)【要約】  本願は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター、ポリリンカー、および、標的遺伝子に特異的なスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸を含むレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターに関する。前記ｓｈＲＮＡを細胞に導入する際、標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ分解が、ＲＮＡ干渉により誘導される。【選択図】  図６
2007508842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プロモーター；
（ｂ）ポリリンカー領域；
（ｃ）二本鎖ＲＮＡを含む標的遺伝子に特異的なインサート、
を含み、ここにおいて、該二本鎖ＲＮＡは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む、標的遺伝子の発現を改変するために、細胞へ標的遺伝子に特異的なインサートを運搬するレトロウイルスベクター。
【請求項２】
プロモーターは、
（ａ）ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）のＵ６プロモーター配列；および、
（ｂ）Ｈ１プロモーター（配列番号１４）、
からなる群より選択される、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】
ポリリンカー領域は：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項４】
標的遺伝子に特異的なインサートのセンスおよびアンチセンス領域は、それぞれ１９〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項５】
標的遺伝子に特異的なインサートのセンスおよびアンチセンス領域は、それぞれ１９〜２５個の長さのヌクレオチドを含む、請求項４に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項６】
標的遺伝子に特異的なインサートのセンスおよびアンチセンス領域は、それぞれ１９〜２３個の長さのヌクレオチドを含む、請求項５に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項７】
標的遺伝子は、腫瘍遺伝子である、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項８】
レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）である、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項９】
（ａ）レンチウイルスの内因性ＣＭＶプロモーターが除去されており；そして、
（ｂ）ＲＥＶ応答配列（ＲＲＥ）に結合するＲＥＶ要素が挿入されている改変レンチウイルスである、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１０】
ゲノム中に前記標的遺伝子を含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクターで感染させた細胞。
【請求項１１】
（ａ）レンチウイルスの内因性ＣＭＶプロモーターが除去されており、ここにおいて：
（ｉ）ＲＥＶ応答配列（ＲＲＥ）に結合するＲＥＶ要素が挿入されており；
（ii）ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）のＵ６プロモーター配列；および、
（iii）ポリリンカー領域；
を含み、ここにおいて、該二本鎖ＲＮＡは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む、標的遺伝子の発現を改変するために二本鎖ＲＮＡを細胞に運搬するための改変レンチウイルスベクター。
【請求項１２】
ポリリンカー領域は：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）、からなる群より選択される、請求項１１に記載の改変レンチウイルスベクター。
【請求項１３】
レポーター遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の改変レンチウイルスベクター。
【請求項１４】
レポーター遺伝子は、ＢｌａｓｔｉおよびｈｒＧＦＰからなる群より選択される、請求項１３に記載の改変レンチウイルスベクター。
【請求項１５】
（ａ）ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−Ｂｌａｓｔｉ（配列番号８のヌクレオチド配列を含む）；および、
（ｂ）ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰ（配列番号９のヌクレオチド配列を含む）、
からなる群より選択される、請求項１４に記載の改変レンチウイルスベクター。
【請求項１６】
（ａ）プロモーター；および、
（ｂ）ポリリンカー領域、
を含み、ここにおいて、該二本鎖ＲＮＡは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む、標的遺伝子の発現を改変するために二本鎖ＲＮＡを細胞に運搬するための、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクター。
【請求項１７】
プロモーターは：
ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）、
のＵ６プロモーター配列である、請求項２６に記載のＭＳＣＶベクター。
【請求項１８】
ポリリンカー領域は：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）、からなる群より選択される、請求項１７に記載のＭＳＣＶベクター。
【請求項１９】
レポーター遺伝子をさらに含む、請求項１８に記載のＭＳＣＶベクター。
【請求項２０】
レポーター遺伝子は、Ｈｙｇｒｏ、ＰｕｒｏおよびｈｒＧＦＰからなる群より選択される、請求項１９に記載のＭＳＣＶベクター。
【請求項２１】
（ａ）ＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｈｙｇｒｏ（配列番号１０のヌクレオチド配列を含む）；
（ｂ）ＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｐｕｒｏ（配列番号１１のヌクレオチド配列を含む）；および、
（ｃ）ＭＳＣＶ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰ（配列番号１２のヌクレオチド配列を含む）、
からなる群より選択される、請求項２０に記載のＭＳＣＶベクター。
【請求項２２】
請求項１６に記載のＭＳＣＶベクターで感染させた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、細胞に干渉ＲＮＡを運搬するためのレトロウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的遺伝子の一部と同一な、または、それらに高度に類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在により、前記標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解が起こるという現象を言う（Ｓｈａｒｐ  ２００１年）。Ｆｊｏｓｅ等は、ＲＮＡ干渉に関するメカニズムを提唱している［Ｆｊｏｓｅ等，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，第７巻，１０〜５７頁（２００１年）］。まず、二本鎖ＲＮＡ配列（ｄｓＲＮＡ配列）は、一方の鎖を提供するが、これは、標的遺伝子と同一であるか、または、それらに高度に類似しており、標的遺伝子の転写物（センス鎖）、および、センス鎖に相補的なアンチセンス鎖から生産されたｍＲＮＡに相補的である。従って、このアンチセンス、センス鎖は、標的遺伝子の転写によって生じるｍＲＮＡの部分と同一な配列、または、それらに高度に類似した配列を含む。
【０００３】
次に、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉヌクレアーゼによって短い二本鎖フラグメントに切断され（その長さは、１８〜２５個のヌクレオチドの範囲で様々であり得る）、標的遺伝子の転写によって生産されたｍＲＮＡに結合する。次に、上記短いｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が上記ｍＲＮＡにアニールし、ｄｓＲＮＡの「アンチセンス」鎖を置き換え、ｍＲＮＡがその末端で切断されるように、ヘリカーゼ活性を有するＲＮＡｉ酵素が上記短いｄｓＲＮＡとｍＲＮＡとの変換を触媒する。その結果として、ｍＲＮＡは破壊され、ｍＲＮＡ分子の翻訳は起こらない。その上、ＲＮＡｉヌクレアーゼに結合したままの短いｄｓＲＮＡのセンス鎖は、新しいアンチセンス鎖を生産し、標的遺伝子の転写によって生産されたその他のｍＲＮＡの破壊に使用するための新しいｄｓＲＮＡ分子を形成するためのテンプレートとして役立つ。従って、ＲＮＡｉは、触媒活性を示す（同文献より）。
【０００４】
標的遺伝子の発現をＲＮＡｉによって特異的にノックダウンできることには、明確な利益がある。例えば、ＲＮＡｉは、遺伝子の機能を研究するために、本物の遺伝学的「ノックアウト」動物を模擬する動物を生産するのに用いてもよい。加えて、ＲＮＡｉは、特定の遺伝子または遺伝子群の異常発現、または、特定の突然変異または多型を有する遺伝子の発現によって生じる病気または障害の治療において有用な場合もある。例えば、癌性の状態に寄与する遺伝子（例えば腫瘍遺伝子）を阻害することもあり得る。加えて、ウイルス遺伝子、および筋緊張性ジストロフィー、嚢胞性線維症、アルツハイマー病、パーキンソン病等のような遺伝病を引き起こす突然変異遺伝子が阻害されることもあり得る。また、シクロオキシゲナーゼまたはサイトカインのような遺伝子を阻害することは、関節炎のような炎症性疾患を治療するのに使用できることもあり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、細胞内の特定の標的遺伝子の発現を調節するために、特にそれらをダウンレギュレートするために干渉ＲＮＡを利用することにおいて、細胞に異種ＲＮＡを運搬する媒体が必要である。
【０００６】
本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、このような参考文献が本願の「従来技術」として利用可能であると認めるものと解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、特定のタンパク質の発現を調節するためにＲＮＡ干渉を利用することにおいて、細胞へ異種ＲＮＡを運搬することができる、有用で、これまで知られていないレトロウイルスのウイルスベクターを提供する。
【０００８】
概して言えば、本発明は、標的遺伝子の発現を調節するために、細胞へ標的遺伝子に特異的なインサートを運搬するレトロウイルスベクターも含む。このような本発明のレトロウイルスベクターは、プロモーター、ポリリンカー領域、および、二本鎖ＲＮＡを含む標的遺伝子に特異的なインサートを含み、このインサートは、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。従って、上記二本鎖ＲＮＡのセンスとアンチセンス部分がアニールし、二本鎖ＲＮＡは折り畳まれる。
【０００９】
多数のプロモーターが、本発明のレトロウイルスベクターで使用可能である。本発明のレトロウイルスベクターで使用可能なものの具体的な例は、以下に示すＵ６プロモーター配列である：
ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）。
【００１０】
本発明のレトロウイルスベクターで使用可能なその他のプロモーター領域は、Ｈ１プロモーターであり、これは、
−１
ｃｃｃｔｔｔｃｔｃａｃｃａｇａｇｔａｔｇｔｃｔｔｇａａｔａｔｔｃｔａａｇｇｇｔｔｔａｇｇｔｔｔｃｔｇｔａａａｇｔｇｃａａａｔａｃｃａｃｔａａａｇｇｇｔｃｔｔｇｔｇｔａｔｃｇｃｔｇｔａｃｇｔｔｔａｔａａ−１００（配列番号１４）で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
同様に、多数のポリリンカー領域が、本発明のレトロウイルスベクターで容易に使用可能である。本発明のレトロウイルスベクターで使用可能なポリリンカー領域の例は、以下の通りである：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）。
【００１２】
本発明のレンチウイルスのレトロウイルスベクターに関して、ポリリンカー配列は、以下に示すような標的遺伝子インサートを挿入できるように、ＡｇｅＩ制限部位、および、ＥｃｏＲＩ制限部位を含んでいてもよい：
AgeI +1                     ループ                  ターム    EcoRI
CCGGT G  (20を超える塩基)   TTCAAGAGA  (21塩基)     TTTTT     GGAA G
A C  (20を超える塩基)   AAGTTCTCT  (21塩基)     AAAAA     CCTT CTTAA
【００１３】
このインサートは、ＡｇｅＩ制限部位と、ＥｃｏＲＩ制限部位とを含む。「２０またはそれを超える塩基」とは、標的遺伝子インサートの二本鎖ヌクレオチド配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかであり得る。当然ながら、上記の「２１塩基」も、アンチセンスまたはセンス鎖のいずれかであり得る。しかしながら、これらの鎖の両方が相補的であり、そして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるようにアニールすることが重要である。さらに、上述の９ｍｅｒのループは単なる一例にすぎない。異なる大きさを有するその他のループを、本発明で容易に用いることができる。
【００１４】
その上、本発明のレトロウイルスベクターにおいて、標的遺伝子に特異的なインサート中の二本鎖ＲＮＡのセンスおよびアンチセンス部分の長さは、様々であってよい。例えば、これらの部分の長さは、それぞれ、１９〜３０個のヌクレオチド、特に、１９〜２５個のヌクレオチド、より詳しくは、１９〜２３個のヌクレオチドであり得る。
【００１５】
当然ながら、多数の遺伝子が、本発明のレトロウイルスベクターに関する標的遺伝子となり得る。標的遺伝子の具体例は、特定の病気または障害に関連する遺伝子が挙げられ、例えば、ｐ５３またはＭａｔ８のような腫瘍遺伝子である。また、標的遺伝子は、神経変性疾患または障害に関連する遺伝子であってもよく、例えば、アルツハイマー病に関連する突然変異アミロイド前駆タンパク質、または、プレセニリン遺伝子が挙げられる。また、標的遺伝子は、イオンチャンネルタンパク質、ホルモン等をコードする遺伝子であってもよい。実際に、発現の中断が望まれるあらゆる遺伝子が、本発明のレトロウイルスベクターに関する標的遺伝子として使用可能である。以下で説明される具体的な実施例において、標的遺伝子はｐ３８である。
【００１６】
多数のレトロウイルスが本発明のレトロウイルスベクターで使用可能である。例えば、本発明のレトロウイルスベクターは、いくつか例を挙げると、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、フレンドウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、レンチウイルスのようなレトロウイルスから構築されていてもよく、または、例えばＷＯ９５／０２６９７で開示されたような欠陥レトロウイルスベクターから構築されていてもよい。本発明で使用可能な具体的なレトロウイルスは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）である。本発明で使用可能なその他の具体的なレトロウイルスは、改変レンチウイルスであり、ここにおいて、（ａ）その内因性ＣＭＶプロモーターが除去されており；および、（ｂ）ＲＥＶ応答配列（ＲＲＥ）に結合するＲＥＶ要素が、該ウイルスに挿入されている。
【００１７】
その上、本発明のレトロウイルスベクターは、レポーター遺伝子をさらに含んでいてもよく、例えば、ｈｒＧＦＰ、Ｂｌａｓｔｉ、Ｈｙｇｒｏ、Ｐｕｒｏ、ｅＧＦＰ−Ｐｕｒｏ融合体等が挙げられる。
【００１８】
その他の実施形態において、本発明は、本発明のレトロウイルスベクターで感染させた細胞も含む。このような感染は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボのいずれで発生したものでもよい。
【００１９】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を改変するために、細胞に二本鎖ＲＮＡを運搬するための、改変レンチウイルスベクターも含み、ここにおいて：
（ａ）レンチウイルスの内因性ＣＭＶプロモーターが除去されており、ここにおいて：
（ｉ）ＲＥＶ応答配列（ＲＲＥ）に結合するＲＥＶ要素が挿入されており；
（ii）ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）のＵ６プロモーター配列；および、
（iii）ポリリンカー領域；
（iv）前記二本鎖ＲＮＡを含む標的遺伝子インサート；
を含み、ここにおいて、この二本鎖ＲＮＡは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
【００２０】
多数のポリリンカー領域が、本発明の改変レンチウイルスベクターで使用可能である。具体的な例としては、いくつか例を挙げると、以下の通りであるが、これらに限定されない：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）。
【００２１】
本発明の改変レンチウイルスのレトロウイルスベクターにおいて、ポリリンカー配列は、以下に示すような標的遺伝子インサートを挿入できるように、ＡｇｅＩ制限部位、および、ＥｃｏＲＩ制限部位を含んでいてもよい：
AgeI +1                     ループ                  ターム    EcoRI
CCGGT G  (20を超える塩基)   TTCAAGAGA  (21塩基)     TTTTT     GGAA G
A C  (20を超える塩基)   AAGTTCTCT  (21塩基)     AAAAA     CCTT CTTAA
【００２２】
このインサートは、ＡｇｅＩ制限部位、および、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む。上記の「２０またはそれを超える塩基」は、標的遺伝子インサートの二本鎖ヌクレオチド配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかであり得る。当然ながら、上記の「２１塩基」も、アンチセンスまたはセンス鎖のいずれかであり得る。しかしながら、これらの鎖の両方が相補的であり、そして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるようにアニールすることが重要である。さらに、上述の９ｍｅｒのループは単なる一例にすぎない。異なる大きさを有するその他のループを、本発明で容易に用いることができる。
【００２３】
その上、本発明の改変レンチウイルスは、場合により、Ｂｌａｓｔｉ、ｈｒＧＦＰルシフェラーゼ等のようなレポーター遺伝子を含んでいてもよい。
【００２４】
本明細書で説明される本発明の改変レンチウイルスの具体的な例は、以下の通りである：
（ａ）ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−Ｂｌａｓｔｉ（配列番号８のヌクレオチド配列を含む）（図１）；および、
（ｂ）ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰ（配列番号９のヌクレオチド配列を含む）（図２）。
【００２５】
その上、本発明は、細胞中で標的遺伝子の発現を調節する方法も含み、本方法は、本発明のレトロウイルスベクターで細胞を感染させることを含み、ここにおいて、遺伝子インサートの二本鎖ＲＮＡのセンス領域は、標的遺伝子のアンチセンスに相補的であり、さらに、標的遺伝子インサートの二本鎖ＲＮＡのアンチセンス領域は、そのセンス領域に相補的であり、それにより、二本鎖ＲＮＡのアンチセンス領域とセンス領域とがアニールし、二本鎖ＲＮＡが折り畳まれる。
【００２６】
本発明はまた、標的遺伝子の発現を改変するために二本鎖ＲＮＡを細胞に運搬するためのマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターも含み、ここにおいて、本ベクターは：
（ａ）プロモーター；および、
（ｂ）ポリリンカー領域；
（ｃ）前記二本鎖ＲＮＡを含む標的遺伝子インサート；
を含み、ここにおいて、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、該インサートは順に、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
【００２７】
様々なプロモーター配列が、本発明のＭＳＣＶレトロウイルスベクターで用いることができる。このようなプロモーター配列の具体的な例は、ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）のＵ６プロモーター配列である。
【００２８】
本発明で使用可能なその他のプロモーターは、Ｈ１プロモーター（配列番号１４）である。
【００２９】
その上、多数のポリリンカー領域が、本発明のＭＳＣＶレトロウイルスベクターで使用可能である。具体的な例としては、いくつか例を挙げると、以下の通りであるが、これらに限定されない：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）。
【００３０】
場合により、本発明のＭＳＣＶレトロウイルスベクターはまた、レポーター遺伝子を含ませることもでき、例えば、Ｈｙｇｒｏ、Ｐｕｒｏ、ｈｒＧＦＰ、ルシフェラーゼ、または、ｅＧＦＰ−Ｐｕｒｏ融合体が挙げられる。
【００３１】
本発明のＭＳＣＶレトロウイルスベクターの具体的な例としては、いくつか例を挙げると、以下の通りである：
（ａ）ＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｈｙｇｒｏ（配列番号１０のヌクレオチド配列を含む）（図３）；
（ｂ）ＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｐｕｒｏ（配列番号１１のヌクレオチド配列を含む）（図４）；および、
（ｃ）ＭＳＣＶ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰ（配列番号１２のヌクレオチド配列を含む）（図５）。
【００３２】
従って、本発明の形態は、折り畳まれて二重鎖を形成する遺伝子標的インサートを有するレトロウイルスベクターを提供することであり、ここにおいて、上記二重鎖の一方の鎖は、センス鎖であり、上記二重鎖の他方の鎖は、アンチセンス鎖である。レトロウイルスベクターが細胞内でプロセシングされる場合、ベクターから二重鎖が切断され、標的遺伝子の発現の調節において干渉ＲＮＡとして使用するための短いｄｓＲＮＡが形成される。
【００３３】
本発明のその他の形態は、標的遺伝子インサートのセンス鎖が、特定の病気または障害に関連する標的遺伝子と同一であるか、またはそれらに高度に類似しているレトロウイルスベクターを提供することである。このようなレトロウイルスベクターは、容易に、標的遺伝子の発現に関連する病気または障害の治療で使用可能である。
【００３４】
本発明のその他の形態は、本発明のレトロウイルスベクターで感染させた細胞を提供することである。このような感染は、インビトロ、インビボ、または、エクスビボのいずれで発生したものでもよい。この感染の結果、細胞のゲノムを用いた標的遺伝子の発現は調節され、特に減少する。
【００３５】
本発明のさらにその他の形態は、干渉ＲＮＡを用いて細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供することであり、ここにおいて、該細胞を、標的遺伝子と同一な、または、それらに高度に類似したセンス鎖を有する標的遺伝子インサートを含む本発明のレトロウイルスベクターで感染させる。
【００３６】
本発明の上記形態、およびその他の形態は、以下の図および詳細な説明を参照することによってよりよく理解することができるだろう。
【００３７】
添付図面において：
図１：本発明の、Ｂｌａｓｔｉレポーター遺伝子およびＵ６プロモーター配列を含む改変レンチウイルスベクターであるｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−Ｂｌａｓｔｉのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図２：本発明の、ｈｒＧＦＰレポーター遺伝子およびＵ６プロモーター配列を含む改変レンチウイルスベクターであるｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図３：本発明の、Ｈｙｇｒｏレポーター遺伝子およびＵ６プロモーター配列を含むＭＳＣＶベクターであるＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｈｙｇｒｏのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
【００３８】
図４：本発明の、Ｈｙｇｒｏレポーター遺伝子およびＵ６プロモーター配列を含むＭＳＣＶベクターであるＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｈｙｇｒｏのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図５：本発明の、ｈｒＧＦＰレポーター遺伝子およびＵ６プロモーター配列を含むＭＳＣＶベクターであるＭＳＣＶ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図６：本発明の、ＧＦＰレポーター遺伝子を含む改変レンチウイルスの模式図である。（１）は、標的遺伝子インサート、すなわち折り畳まれる二本鎖ＲＮＡである。
図７：標的遺伝子インサートを欠失させた本発明の改変レンチウイルスで感染させた細胞（コントロール）におけるｐ３８の発現と、細胞の内因性ｐ３８遺伝子の部分に相補的になるように設計された標的遺伝子インサートを有する本発明の改変レンチウイルスで感染させた細胞におけるｐ３８の発現とを比較した、ウェスタンブロットである。このブロットによれば、明確に、本発明の改変レンチウイルスは、ｐ３８の発現を、コントロールにおける発現に対して減少させたことが示されている。
【００３９】
上記で説明したように、本発明は概して、特定の標的遺伝子の発現を調節する、より詳しくはそれらをダウンレギュレートすることにおいて、細胞に干渉ＲＮＡを運搬するのに使用可能な、有用で未知のレトロウイルスベクターに関する。このような、本発明のレトロウイルスベクターは：
（ａ）プロモーター、
（ｂ）ポリリンカー領域、および、
（ｃ）二本鎖ＲＮＡを含む標的遺伝子に特異的なインサート、
を含み、ここにおいて、この二本鎖ＲＮＡは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
【００４０】
細胞中で、折り畳まれる標的遺伝子に特異的なインサートは、短いｄｓＲＮＡ二重鎖にプロセシングされ、その二重鎖のセンス鎖は、干渉ＲＮＡとして用いることができる。この干渉ＲＮＡは、標的遺伝子の発現を調節する、より詳しくは、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする。驚くべきことに、そして意外なことに、細胞を感染させるのに用いられる本発明のレトロウイルスベクターは、一般的には、標的遺伝子の発現をわずか５〜６日しかダウンレギュレートしないことがわかっている裸のｓｉＲＮＡを単に細胞に挿入するのとは対照的に、細胞の寿命にわたり、標的遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる。
【００４１】
本発明のレトロウイルスベクターは、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるので、本レトロウイルスベクターは、特定の標的の発現に関するか、または突然変異もしくは多型を含む特定の標的遺伝子の発現に関する多種多様な病気または障害を治療するのに使用可能である。
【００４２】
本発明では、当業界の技術の範囲の、従来の分子生物学、微生物学、および、組換え核酸分子技術を用いることができる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９年）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（本明細書では、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編．１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｌｉｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編．１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ［ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９９４年）を参照。
【００４３】
それゆえに、以下の用語は、本明細書で用いられる場合、以下に記載の定義を有するものとする。
【００４４】
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス  または  コスミドのような、細胞または有機体に遺伝物質を移送するのに用いられる物質である。
【００４５】
「異種」核酸分子は、細胞内または細胞の染色体部位に天然には存在しない核酸分子を意味する。
【００４６】
「核酸分子」または「ヌクレオチド配列」は、同じ意味で用いることができ、一本鎖型、または、二本鎖へリックスのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ  分子」）または  デオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、または、デオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、または、それらのあらゆるリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルのリン酸エステル重合体型を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、および、ＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。
【００４７】
核酸分子の一本鎖型が、適切な温度条件、および、溶液のイオン強度条件下で、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのようなその他の核酸分子にアニールできる場合、その核酸分子はその他の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。温度条件およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸分子の予備的なスクリーニングのためには、Ｔm＝５５°に相当する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、例えば、５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、０.２５％ミルク、および、ホルムアミド非含有；または、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳである）。中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴmに相当し、例えば、５×または６×ＳＳＣを含む４０％ホルムアミドである。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴmに相当し、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣである。ハイブリダイゼーションは、２種の核酸分子が、相補的な配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが起こる可能性がある。核酸分子をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、核酸分子の長さ、および、相補性の程度、当業界周知の変数に依存する。２種のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなればなるほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴm値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴmに相当する）は、以下の順に減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個のヌクレオチドより長いハイブリッドに関して、Ｔmを計算するための方程式が導かれている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，９.５０〜０.５１を参照）。より短い核酸分子、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，１１.７〜１１.８を参照）。ハイブリダイズ可能な核酸分子の最短の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチド；具体的には、少なくとも約４０個のヌクレオチドであり；より具体的には、この長さは、少なくとも約３０個のヌクレオチド；より具体的には、少なくとも約６０個のヌクレオチド、さらにより具体的には少なくとも１００個のヌクレオチドである。
【００４８】
その上、本発明で用いられる用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、Ｔm＝５５℃を意味し、上記の条件を利用する。好ましい実施形態において、Ｔmは、６０℃であり；より好ましい実施形態において、Ｔmは、６５℃である。
【００４９】
核酸分子の「コード配列」または「センス鎖」は、正しいリーディングフレーム内で遺伝子コードのコドンを用いてポリペプチドまたはそれらの部分をコードする真核性のゲノムＤＮＡ分子に関する核酸分子またはそれらの部分である。以下のコドンが、それぞれ特定のアミノ酸をコードするのに互換的に用いることができることは、当業界周知である：
【表１】
2007508842.tif 000003
【００５０】
当然ながら、上記で特定したコドンはＲＮＡ配列のためのものである。対応するＤＮＡのコドンは、Ｕの代わりにＴを用いたものである。
【００５１】
本発明で用いられる、ヌクレオチド配列に関する「部分」という用語は、前記配列の、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドの長さを有するが、前記ヌクレオチド配列全体の長さより短い一部を意味する。
【００５２】
「プロモーター配列」または「プロモーター」は、核酸分子の調節領域であって、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができる。プロモーター配列内において、転写開始部位（都合のよい形態としては、例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。本発明で使用可能な具体的なプロモーター配列としては、以下に記載のヌクレオチド配列を有するＵ６プロモーター配列が挙げられる：
ｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇ（配列番号７）。
【００５３】
本発明のベクターで使用可能なプロモーター配列のその他の例は、Ｈ１プロモーター（配列番号１４）である。
【００５４】
本発明で用いられる用語「ポリリンカー」または「ポリリンカー領域」は、同じ意味で用いられ、本発明のレトロウイルスベクターに挿入されており、そして特定の制限酵素のための複数の制限部位を含むヌクレオチド配列を意味する。従って、特定の制限酵素を用いて、本発明のベクターにヌクレオチド配列を挿入することができる。本発明のベクターで使用可能なポリリンカーの具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号１）；
（ｂ）ａａｔｔｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号２）；
（ｃ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｇｇｃａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号３）；
（ｄ）ｇａｔｃｃ  ｇｃｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｔｔｇｃａｔｇ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｃａｔｇｃａａａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号４）；
（ｅ）ａａｔｔｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号５）；および、
（ｆ）ｇａｔｃｃ  ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ  ｔｔｃａａｇａｇａ  ｇｔａｇａｔｔａｃｃａｃｔｇｇａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｇａａ  ａ（配列番号６）。
【００５５】
本発明の特定の実施形態（例えば、改変レンチウイルスのレトロウイルスベクター）において、ポリリンカー配列は、以下に示すような標的遺伝子インサートを挿入できるように、ＡｇｅＩ制限部位、および、ＥｃｏＲＩ制限部位を含んでいてもよい：
AgeI +1                     ループ                  ターム    EcoRI
CCGGT G  (20を超える塩基)   TTCAAGAGA  (21塩基)     TTTTT     GGAA G
A C  (20を超える塩基)   AAGTTCTCT  (21塩基)     AAAAA     CCTT CTTAA
【００５６】
このインサートは、ＡｇｅＩ制限部位、および、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む。「２０またはそれを超える塩基」は、標的遺伝子インサートの二本鎖ヌクレオチド配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかであり得る。当然ながら、上記の「２１塩基」も、アンチセンスまたはセンス鎖のいずれかであり得る。しかしながら、これらの鎖の両方が相補的であり、二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるようにアニールすることが重要である。さらに、上述の９ｍｅｒのループは単なる一例にすぎない。異なる大きさを有するその他のループが、本発明で容易に用いることができる。
【００５７】
本発明で用いられる用語「感染（させる）」は、本発明のレトロウイルスベクターでの細胞のコンタミネーションを意味し、ここにおいて、これら細胞は、そのゲノム内に遺伝子標的を有する。従って、適切な標的遺伝子インサートを含む本発明のレトロウイルスベクターで細胞を感染させると、感染した細胞において標的遺伝子の発現の調節が起こる。
【００５８】
本発明で用いられる用語「調節（する）」または「〜を調節すること」は、感染した細胞において標的遺伝子の正常な発現を改変することを意味する。特に、これらの用語は、本発明のレトロウイルスベクターで感染させる前に測定された細胞内の標的遺伝子の発現量と比較して、感染した細胞において標的遺伝子の発現量を減少させること、または、感染していないコントロール細胞における標的遺伝子の発現と比較して、感染した細胞における標的遺伝子の発現量を減少させることを意味する。
【００５９】
レトロウイルスベクター
上記で説明したように、本発明は、標的遺伝子の発現を改変するために、細胞へ標的遺伝子に特異的なインサートを運搬するレトロウイルスベクターに関し、本ベクターは：
（ａ）プロモーター；
（ｂ）ポリリンカー領域；
（ｃ）二本鎖ＲＮＡを含む標的遺伝子に特異的なインサート、
を含み、ここにおいて、上記二本鎖ＲＮＡは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖ＲＮＡが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
【００６０】
レトロウイルスは、分裂する細胞に感染する統合型のウイルスである。レトロウイルスのゲノムは、２つのＬＴＲ、カプセル化配列、および、３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。本発明で使用可能なレトロウイルスの具体的な例としては、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、フレンドウイルスのようなレトロウイルス、および、欠陥レトロウイルスベクター（例えばＷＯ９５／０２６９７（その全体を参照により本発明に加入させる）で開示されたもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
一般的に、核酸配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、その核酸配列（本発明の場合、上述のような標的遺伝子に特異的なインサートおよびポリリンカー領域を含むＲＮＡ配列である）を含むプラスミドを構築する。場合により、このＲＮＡ配列に、レポータータンパク質をコードする核酸を含ませることもできる。次に、この構築物は、パッケージング細胞株をトランスフェクションするのに用いられ、この細胞様は、トランスで、プラスミド中で欠損しているレトロウイルスの機能を供給することができる。従って、パッケージング細胞株は通常、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このようなパッケージング細胞株は、従来技術で説明されており、特に、細胞株ＰＡ３１７（ＵＳ４,８６１,７１９）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ９０／０２８０６）、および、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞株（ＷＯ８９／０７１５０）が挙げられる。構築後、本発明のレトロウイルスベクターを当業者既知の標準的な技術で精製することができる。本発明のレトロウイルスベクター構築の詳細な説明は、以下に記載する。
【００６２】
本発明のレトロウイルスベクターで使用可能なレトロウイルスの具体的なタイプは、有糸分裂後の細胞および／または非分裂細胞に感染することができる改変レンチウイルスである。このような細胞のタイプは、肝臓および筋肉のニューロンで発見することができる。本発明の改変レンチウイルスベクターにおいて、レンチウイルスの内因性ＣＭＶプロモーターは除去され、ＲＥＶ要素が、ウイルスに挿入されている。
【００６３】
本発明のレトロウイルスベクターで使用可能なその他のレトロウイルスのタイプは、ＭＳＣＶウイルスである。
【００６４】
感染、トランスフェクションまたは形質転換による本発明のレトロウイルスベクターの投与
本発明はさらに、本発明のレトロウイルスベクターで感染させた細胞に関し、ここにおいて、感染した細胞は、そのゲノム内に標的遺伝子を含む。従って、本発明のレトロウイルスベクターで細胞を感染させることにより、細胞内で標的遺伝子の発現を調節でき、特に、減少させることができる。このような感染は、インビボ、インビトロ、または、エクスビボのいずれで発生したものでもよい。多数の細胞のタイプを、本発明のレトロウイルスベクターで感染させることができる。例えば、このような細胞は、原核細胞でもよいし、または真核細胞でもよく、例えば、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母細胞または哺乳動物細胞である。その上、このような細胞は、例えば、毛髪もしくは皮膚、または、体液、例えば血液、唾液もしくは精液等のような生物学的サンプルから得ることができる。しかしながら、上記で説明したように、細胞が、そのゲノム内に標的遺伝子を含むことが重要である。
【００６５】
場合により、細胞は、慣例的な実験技術を用いて、本発明のレトロウイルスベクターで形質転換またはトランスフェクションされていてもよく、このような技術としては、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃またはＤＮＡベクター輸送体の使用が挙げられる（例えば、Ｗｕ等，１９９２年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４；１９９０年３月１５日付で出願された、Ｈａｒｔｍｕｔ等，カナダ特許出願番号２,０１２,３１１号を参照）。
【００６６】
当然ながら、トランスフェクションまたは形質転換は、インビボで発生させてもよい。例えば、本発明のレトロウイルスベクターは、リポフェクションによって、インビボで導入することができる。リポソームは、インビトロでの核酸のカプセル化やトランスフェクションに用いられている。リポソーム介在トランスフェクションで遭遇する困難や危険性を制限するように設計された合成カチオン脂質を用いて、本発明のレトロウイルスベクターのインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを製造することができる。カチオン脂質の使用は、負電荷を有する核酸のカプセル化を促進することもあり、負電荷を有する細胞膜との融合を促進することもある［ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７〜３８８（１９８９年）］。インビボで本発明のレトロウイルスベクターを特定の臓器に投与するためのリポフェクションの使用は、ある種の実用的な利点を有する。このような利益の一つの領域として、リポソームの特定の細胞への分子ターゲティングが挙げられる。当然ながら、特定の細胞型へトランスフェクションを標的化することは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような、細胞が不均質な組織において特に有利であると予想される。特に、レンチウイルスは、肝臓や筋肉のニューロンで発見することができる有糸分裂後の細胞および／または非分裂細胞に感染することができるため、このような標的化されたトランスフェクションは本発明の改変レンチウイルスベクターに関して有用である。
【００６７】
本発明のレトロウイルスベクターを含む医薬組成物
本発明はまた、本発明のレトロウイルスベクターを投与するための、本発明のレトロウイルスベクター、および、製薬上許容できるキャリアーを含む医薬組成物に関する。本発明で用いられる成句「製薬上許容できる」は、生理学的に許容でき、典型的には、例えば異常亢進、眩暈などのアレルギー反応または同様の不都合な反応を起こさない分子団および組成物を意味する。好ましくは、本発明で用いられる用語「製薬上許容できる」は、連邦政府もしくは州政府の管理機関で承認されていること、または、米国薬局方、または、動物、より具体的にはヒトで使用するのに一般的に認識されているその他の薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリアー」は、化合物がそれらと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような製薬用のキャリアーは、滅菌液が可能であり、例えば、水、および、鉱油、動物性、植物性または合成源のオイル、例えば落花生油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などが挙げられる。特に注射用溶液に関して、好ましくは、水または食塩水、および、デキストロース水溶液およびグリセロール溶液がキャリアーとして用いられる。適切な製薬用キャリアーは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著の「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」で説明されている。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、注射での投与用、または、経口投与用、肺、鼻、または、その他の投与形態用にすることが可能であり、様々な緩衝物質（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤（例えば、トゥイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、および、充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）；高分子化合物の粒状の製剤（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸等）またはリポソームへ材料を取り込んだものを含んでいてもよい。また、ヒアルロン酸を用いてもよい。このような組成物は、物理的な状態、安定性、および、インビボでの放出速度に影響を与える可能性がある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０年，マーク・パブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．），イーストン，ペンシルベニア州，１８０４２）の１４３５〜１７１２頁を参照（これは、参照により本発明に加入させる）。本組成物は、液体の形態で製造してもよいし、または、乾燥粉末（例えば凍結乾燥の形態）であってもよい。
【００６９】
本発明の典型例として提供される以下の非限定的な実施例を参照すれば、本発明をより理解することができる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより詳細に説明するために記載したものである。しかしながら、本発明の広範な範囲を限定するものとは解釈されないことは当然である。
【実施例】
【００７０】
ｓｈＲＮＡのレンチウイルスベクターＬＵＧへのクローニング：
まず、ショートヘアピンヌクレオチド配列（２１塩基のセンス鎖、９塩基のループ、および、２１塩基のアンチセンス）の、上部の鎖と下部の鎖を得た。これらは、生産してもよいし、または、オリゴ販売業者から購入してもよい。次に、この２種の鎖を９６ウェルフォーマットのウェル中で一緒にした。
【００７１】
次に、５０ｐｍｏｌ／μｌの上記鎖をアニールさせ、０.０５ピコモルのアニールした鎖を用いて、ライゲートさせた。これらのオリゴを、９６ウェルプレートの一つのウェル中で上部および下部の鎖が一緒に混合されるようにした。全プロセスを、９６ウェルのハイスループットフォーマットで行った。
【００７２】
アニーリング反応のために、オリゴミックス５μｌを、アニーリングミックス４５μｌ［水（４０μｌ）＋ＮＥＢ緩衝液２（５μｌ）］に添加した。この混合物を、サーモサイクラーで９８℃で２分間加熱することによってアニールさせ、次に、ベンチトップで少なくとも２時間冷却した。次に、アニールしたオリゴを１：１００に希釈し、希釈したアニールしたオリゴ（すなわち標的遺伝子インサートの二本鎖ＤＮＡ）１μｌを、レトロウイルスベクター主鎖のポリリンカー（ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで予め切断された）にライゲートした。ライゲーションを４℃で一晩行った。このライゲーションの２μｌを、ＳＵＲＥ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））４０μｌの形質転換に用い、形質転換されたものを、１２ウェルのカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）グリッドプレートで平板培養した。次の日、コロニーを、スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）に採取し、ＨＴＰ配列解析にまわした。次に、この培養物をミニプレップで処理し、配列解析した。その配列を解析し、陽性のものをマキシプレップで処理し、ウイルス生産のためのＤＮＡを得た。
【００７３】
２９３ＦＴ細胞での改変レンチウイルスの生産：
トランスフェクション手順：
トランスフェクションの１日前に、トリプシン処理し、２９３ＦＴ細胞数をカウントし、それらを１０ｃｍプレート１枚あたり５×１０6細胞でプレーティングした。細胞を、血清を含む増殖培地１０ｍｌにプレーティングした。
【００７４】
トランスフェクション当日に、２９３ＦＴ細胞から培地を除去し、血清を含む増殖培地（または、血清を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ(R)Ｉ培地）５ｍｌで交換した。抗生物質は、含まれていてはならない。
【００７５】
それぞれのトランスフェクションサンプルのためのＤＮＡ−リポフェクトアミンＺ２０００複合体を、以下を行うことによって製造した：
・Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ(R)Ｉ培地（血清非含有）１.５ｍｌ中に、最適化したパッケージングミックス９μｇと、ｐＬｅｎｔｉ発現プラスミドＤＮＡ３μｇ（総量で１２μｇ）を希釈した。穏やかに混合した。
【００７６】
・使用前にリポフェクトアミン２０００を穏やかに混合し、次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ(R)Ｉ培地（血清非含有）１.５ｍｌ中に、３６μｌを希釈した。穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。
【００７７】
・５分間インキュベートした後、希釈したＤＮＡと、希釈したリポフェクトアミン２０００とを合わせた。穏やかに混合した。
【００７８】
・室温で２０分間インキュベートし、ＤＮＡ−リポフェクトアミン２０００複合体を形成させた。この溶液に曇りが生じることがあるが、これは、トランスフェクションを妨害するものではない。
【００７９】
４．各プレートに、ＤＮＡ−リポフェクトアミン２０００複合体を滴下して添加した。プレートを前後に揺すって穏やかに混合した。この細胞を、ＣＯ2インキュベーター中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８０】
５．次の日、ＤＮＡ−リポフェクトアミン２０００複合体を含む培地を除去し、完全培地（すなわち、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０.１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、および、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ）で交換した。
【００８１】
当業者であれば、ＶＳＶ  Ｇ糖タンパク質の発現により、２９３ＦＴ細胞が融合し、多核の融合細胞の外観が生じることに留意すべきである。この形態学的な変化は正常であり、レンチウイルスの生産に影響を与えない。また、本発明を実施する際、それは感染性物質と相互作用することにも留意すべきである。
【００８２】
６．トランスフェクションの４８〜７２時間後に、培地を除去することによって、１５ｍｌのキャップされた滅菌コニカルチューブにウイルスを含む上清を回収した。上清の回収がトランスフェクション後４８時間でも７２時間でも、ウイルスの収率において最小限の差しか観察されなかった。
【００８３】
７．３０００ｒｐｍで１５分間、＋４℃で遠心分離し、細胞の残屑をペレット化した。
８．必要に応じてろ過工程を行った。
９．ウイルス上清をクライオバイアルにピペットで移し、１ｍｌのアリコートにした。ウイルスのストックを−８０℃で保存する。
【００８４】
ＧＰ２−２９３細胞でのＭＳＣＶの生産：
１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧが追加されたＤＭＥＭの完全培地中で、細胞を維持した。
【００８５】
凍結ストックからの細胞の増殖：
１．バイアルを水槽中で３７℃で融解させた。
２．細胞を、予め温めた完全培地９ｍｌを含むチューブに移した。
３．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
４．上清を除去した。
５．細胞を完全培地１０ｍｌ中に穏やかに再懸濁し、１０ｃｍのポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたプレートにプレーティングした。
６．細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2中で、インキュベートした。
ポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたプレートは、融解後の付着を促進するために最初の一週間用いた。その後、この細胞は、通常のプレートで培養された。
【００８６】
パッケージング細胞の維持
１．培地を吸引し、細胞を予め温めたＰＢＳで１回洗浄した。
２．このプレートに、トリプシン−ＥＤＴＡ１ｍｌを添加した。３０秒〜１分間インキュベートした。
３．トリプシンを阻害するために、完全培地４ｍｌを添加した。
４．この細胞を上下に数回ピペッティングすることによって再懸濁した。
５．細胞１ｍｌを、１０ｃｍの完全培地９ｍｌを含むプレートに移した。
【００８７】
この細胞は、細胞が８０％密度である場合、３日毎に１：５に分けるべきである。その上、結果的に細胞が塊状になる傾向があり、うまく平面にならないと予想されるため、細胞を過剰にトリプシン処理すべきではない。また、それらのパッケージング能力に影響を与えるため、細胞を過剰に密集させておいてはならず、またトランスファー／継代＃４０の後の細胞は、タイターが落ちるため、使用すべきではない。
【００８８】
ＧＰ２−２９３細胞の感染：
１日目：（午後三時前後）
１０ｃｍプレート１枚あたり３〜３.９×１０6細胞でプレーティングした（ポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたプレート使用）。
２日目：（昼１２時前後）
感染の４時間前に、細胞に新鮮な培地（抗生物質を含まない）１０ｍｌを再度与えた。
【００８９】
感染方法１（リン酸カルシウム／ＨＢＳ）
１．１０ｃｍのプレート１枚のトランスフェクションあたり、発現ベクター（ｐＭＫ０.１）（ＤＮＡ１）１２μｇ、および、ＶＳＶ−Ｇプラスミド（ＤＮＡ２）１２μｇを使用した。
２．チューブに、以下を添加した：
ＤＮＡ１  １２μｇ
ＤＮＡ２  １２μｇ。
【００９０】
本発明のレトロウイルスベクターは、例えばプラスミド内などで増殖させることができるように、ｄｓＤＮＡベクターとして存在することが可能である。しかしながら、本発明のレトロウイルスベクターがパッケージングされている場合、それはレトロウイルスであり、感染により、ウイルスの核タンパク質コア（大部分がｇａｇから生じたタンパク質、ＲＮＡベクター、および、逆転写酵素タンパク質からなる）の注入が起こる。逆転写酵素は、本発明のレトロウイルスベクターをＤＮＡに再変換し、感染した細胞のゲノムへの安定した統合を可能にする。その上、統合された（または一時的にトランスフェクションされた）ＤＮＡベクターは、Ｕ６プロモーターに結合し、ベクターにクローニングされたｓｈＤＮＡからｓｈＲＮＡを複製するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのテンプレートとして役立つ。上記ＤＮＡ１は、ＤＮＡベクター（ｓｈＲＮＡを運搬するための）であり、ＤＮＡ２は、パッケージングプラスミドである。
【００９１】
水
２ＭのＣａＣｌ2  ６２μｌ
総量  ５００μｌ。
【００９２】
３．別個のチューブに、２ＸＨＢＳ５００μｌを分配した。
４．ボルテックスで混合しながら、ＤＮＡ／ＣａＣｌ2混合物に２ＸＨＢＳを滴下して添加した。
５．室温で２０分間インキュベートした。
６．ＤＮＡ／ＣａＣｌ2混合物を穏やかにボルテックスで混合した。
７．この混合物を、ピペットを用いてパッケージング細胞に滴下して添加した。
８．溶液が平らに分布するようにこのプレートを前後に揺すった。
９．この細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2でインキュベートした。
【００９３】
トランスフェクション方法２（リポフェクトアミン２０００）
１．１０ｃｍプレート１枚のトランスフェクションあたり、発現ベクター（ｐＭＫ０.１）６μｇ、および、ＶＳＶ−Ｇプラスミド６μｇを使用した。
２．チューブにＤＮＡを添加した。
３．別個のチューブで、リポフェクトアミン２０００（７２μｌ）をピペットを用いて無血清培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ）１.５ｍｌに移した。
４．穏やかに混合した。室温で５分間インキュベートした。
５．ＤＮＡにリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物を添加し、穏やかに混合した。
６．室温で１５分間インキュベートした。
７．ＤＮＡ／リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏ）／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物を、ピペットを用いてパッケージング細胞に滴下して添加した。
８．溶液が平らに分布するようにこのプレートを前後に揺すった。
９．この細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2でインキュベートした。
トランスフェクション複合体を、１６時間を超えて細胞と接触させないようにすること。
【００９４】
３日目：（午前）
１．培地を吸引した。
２．予め温めたＰＢＳで１回、細胞を穏やかに洗浄した。
３．ウイルス上清を濃縮するために、１０ｃｍプレート１枚あたり完全培地５ｍｌを添加した。
４．この細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2でインキュベートした。
【００９５】
４日目：（午前）
１．培地を回収し、０.４５ミクロンシリンジフィルターを通過させてろ過した。
２．ウイルスをアリコートにし、−８０℃で保存した。
３．細胞に完全培地５ｍｌを再度与えた。
これは、「２４時間のウイルス上清」である。２４時間後のパッケージング細胞株からウイルスを回収したものが、２４時間のウイルス上清である。
【００９６】
５日目：（午前）
１．培地を回収し、０.４５ミクロンシリンジフィルターを通過させてろ過した。
２．ウイルスをアリコートにし、−８０℃で保存した。
３．プレートを捨てた。
これは、「４８時間のウイルス上清」である。４８時間後のパッケージング細胞株からウイルスを回収したものが、４８時間のウイルス上清である。
【００９７】
エコトロピック・ウイルスでは、ＥｃｏＰａｃｋパッケージング細胞株にパッケージングした。ＡＮ両種性ウイルスでは、ＡｍｐｈｏＰａｃｋパッケージング細胞株にパッケージングした。ポリトロピック・ウイルスでは、ＧＰ２−２９３パッケージング細胞（ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを含むコトランスフェクションベクター）にパッケージングした。
【００９８】
結果
上述の手法を用いて、本発明のレトロウイルスベクターを生産し、続いて、ゲノム中に標的遺伝子を有する細胞を本発明のレトロウイルスベクターで感染させることによって、標的遺伝子の発現がうまく減少した。特に、ｐ３８のための標的遺伝子インサートが用いられたが、この標的インサートに関する配列は以下の通りである。
ＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＣＣＴＧＡＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧ（配列番号１３）。
【００９９】
図７では、本発明の、細胞中でのｐ３８の発現に干渉するように設計された、配列番号１３に記載の二本鎖ＲＮＡの標的遺伝子インサートを有する改変レンチウイルスが、コントロール細胞におけるｐ３８の発現と比較して、細胞におけるｐ３８の発現を明らかに減少させていることが明確に示されている。
【０１００】
本発明は、本明細書で説明された特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。実際に、当業者であれば、本明細書で説明されたものに加えて、前述の説明と添付の図から本発明の様々な改変が明白であろう。このような改変は、添付の請求項の範囲内に含まれる。
【０１０１】
さらに当然ながら、全ての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、および、核酸またはポリペプチドに関して示された全ての分子量または分子質量は、およその値であり、説明のために示されたものである。
【０１０２】
本明細書において、様々な出版物が引用されており、これらの開示は、それらの全体を参照により本明細書に加入させる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１−１】本発明のｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−Ｂｌａｓｔｉのヌクレオチド配列である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２−１】本発明のｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰのヌクレオチド配列である。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３−１】本発明のＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｈｙｇｒｏのヌクレオチド配列である。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４−１】本発明のＭＳＣＶ−Ｕ６−Ｈｙｇｒｏのヌクレオチド配列である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５−１】本発明のＭＳＣＶ−Ｕ６−ｈｒＧＦＰのヌクレオチド配列である。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６】本発明の、ＧＦＰレポーター遺伝子を含む改変レンチウイルスの模式図である。
【図７】標的遺伝子インサートを欠失させた本発明の改変レンチウイルスで感染させた細胞（コントロール）におけるｐ３８の発現と、細胞の内因性ｐ３８遺伝子の部分に相補的になるように設計された標的遺伝子インサートを有する本発明の改変レンチウイルスで感染させた細胞におけるｐ３８の発現とを比較した、ウェスタンブロットである。
【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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