(57)【要約】本発明は、化学化合物、その発見のための方法、およびその治療的用途に関する。特に、本発明は、プログラムされた細胞死、自己免疫、炎症、過増殖、ミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ関連障害等のプロセスの調節不完全に関連した多くの状態を処置するための治療物質としての化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000112
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=O)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、もしくはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2-、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から独立して選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000113
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9は、SO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である；
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000114
式中R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択され；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される；ならびに
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000115
式中、R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；XはOおよびNHからなる群より選択される；Yは、S、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される；
からなる群より選択される式を含む組成物の有効量を被験者に投与する段階を含む、自己免疫障害または過増殖障害を処置する方法。
【請求項２】
自己免疫障害が、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベルガー病またはIgA腎症、セリアックスプルー、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋肉痛、移植片対宿主病、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、および白斑、からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
過増殖障害が癌である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
以下を含む、細胞死を調節する方法：
a．以下を提供する段階：
i  オリゴマイシン感受性付与／F1サブユニットタンパク質を有する標的細胞；
ii  以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000116
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=O)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は、水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、もしくはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2-、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から独立して選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000117
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9は、SO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である；
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000118
式中、R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択され；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される；ならびに
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ、
2007534770.tif 000119
式中、R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；Xは、OおよびNHからなる群より選択される；Yは、S、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される、
からなる群より選択される式を含む組成物、ならびに
b．細胞においてスーパーオキサイドレベルを増加させるために、または細胞のATPレベルを変化させるために、該組成物がオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合するような条件で該細胞を該組成物に曝露する段階。
【請求項５】
標的細胞がインビトロ細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
標的細胞がインビボ細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
標的細胞がエクスビボ細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項８】
標的細胞が癌細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項９】
標的細胞が、B細胞、T細胞、および顆粒球からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
曝露する段階によって、標的細胞の細胞死の増加が起こる、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
以下の式、もしくはそのエナンチオマー：
2007534770.tif 000120
式中R1は脂肪族もしくはアリールである；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、もしくは水素結合に関与する部分である、R5はアリール、複素環式、-R6-NH-C(=O)-R7、もしくは-R6-C(=O)-NH-R7であり、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、もしくは複素環式であり、R3およびR4はそれぞれ独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、アリール、もしくは複素環式である；
を含む少なくとも一つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体の有効量をそのような処置を必要とする患者に投与する段階を含む、患者におけるミトコンドリアF1F0-ATPヒドロラーゼ関連障害を処置する方法。
【請求項１２】
ミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ障害が、心筋梗塞、心室過栄養、冠動脈疾患、非Q波MI、うっ血性心不全、心不整脈、不安定狭心症、慢性安定狭心症、プリンズメタル型狭心症、高血圧症、間欠性跛行、末梢閉塞性動脈疾患、血栓塞栓発作の血栓または血栓塞栓症状、静脈血栓症、動脈血栓症、脳血栓症、肺動脈塞栓症、脳塞栓症、血栓形成傾向、播種性血管内凝固、再狭窄、心房細動、心室肥大、アテローム性動脈硬化性血管疾患、アテローム斑破裂、アテローム斑形成、移植性アテローム性動脈硬化症、血管リモデリングアテローム性動脈硬化症、癌、手術、炎症、全身感染症、人工表面、介入的心臓学、不動症、投薬、妊娠および流産、ならびに網膜症、腎症、および神経症を含む糖尿病合併症から選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
化合物が以下である、請求項11記載の方法：
2007534770.tif 000121
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、化学化合物、その発見のための方法、およびその治療的用途に関する。特に、本発明は、プログラムされた細胞死、自己免疫、炎症、過増殖、ミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ関連障害等のプロセスの調節不完全に関連した多くの状態を処置するための治療物質としての化合物を提供する。なお、本出願は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2004年4月27日に提出された米国特許出願第60/565,788号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多細胞生物は細胞数に対して正確な制御を発揮する。細胞増殖と細胞死のあいだのバランスによってこの恒常性が得られる。細胞死は、壊死によって、またはアポトーシスとして知られる自殺型の細胞死によって、ほぼあらゆるタイプの脊椎動物において起こる。アポトーシスは、共通の遺伝的にプログラムされた死のメカニズムに関与する多様な細胞外および細胞内シグナルによって誘発される。
【０００３】
多細胞生物は、生物の利益のために、損傷したまたは不要な細胞をそれら自身を破壊するよう指図するためにアポトーシスを用いる。したがって、アポトーシスプロセスの制御は、正常な発達にとって非常に重要であり、例えば指および足指の胎児期の発達は、脳における神経シナプスの形成の場合と同様に、過剰量の結合組織がアポトーシスによって制御されて除去されることを必要とする。同様に、制御されたアポトーシスは、月経開始時の子宮の内層（子宮内膜）の脱落の原因である。アポトーシスは、組織の立体的形成および正常な細胞の維持において重要な役割を果たしているが、同様に、生物の安寧を脅かす細胞および侵入物（例えば、ウイルス）に対する主な防御でもある。
【０００４】
多くの疾患が細胞死のプロセスの調節異常に関連していることは意外なことではない。実験モデルはにより、異常なアポトーシスの調節と、様々な新生物、自己免疫およびウイルス疾患のパテノゲニシティ（pathenogenicity）との因果関係が確立された。例えば、細胞性免疫応答において、エフェクター細胞（例えば、細胞障害性Tリンパ球「CTL」）は、感染細胞を、アポトーシスを受けるように誘導することによって、ウイルスに感染した細胞を破壊する。次に生物は、もはや必要でなくなったエフェクター細胞を破壊するためにアポトーシスプロセスに依存する。自己免疫は通常、互いにおよび自身の中でもアポトーシスを誘導するCTLによって阻止される。このプロセスの欠損は、全身性紅斑性狼瘡およびリウマチ性関節炎のような多様な自己免疫疾患に関連している。
【０００５】
多細胞生物はまたアポトーシスを用いて、損傷した核酸（例えば、DNA）が癌様になる前にそれ自身を破壊するように細胞に指図する。いくつかの癌を引き起こすウイルスは、正常なアポトーシスプロセスを中断するように感染（形質転換）細胞を再プログラミングすることによってこの安全装置に打ち勝つ。例えば、いくつかのヒト乳頭腫ウイルス（HPV）は、p53アポトーシスプロモーターを不活化するタンパク質（E6）を産生することによって、形質転換細胞のアポトーシスによる除去を抑制することによって、子宮頚癌の発生に関係している。同様に、単核細胞症およびバーキットリンパ腫の原因物質であるエプスタイン-バーウイルス（EBV）は、正常なアポトーシスによる異常な細胞の除去を阻止するタンパク質を産生するように感染細胞を再プログラムして、このように、癌様細胞を増殖させて生物全体に広める。
【０００６】
さらに他のウイルスは、それによって癌の発生を直接引き起こすことなく細胞のアポトーシス機構を破壊的に操作する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染した個体における免疫系の破壊は、非感染の姉妹細胞にアポトーシスを受けるように指図する感染CD4+ T細胞（約100,000個に1個）を通して進行すると考えられている。
【０００７】
非ウイルス手段によって発生する他の癌も同様に、アポトーシスによる破壊を逃れるための機構を発達させた。例えば、黒色腫細胞は、Apaf-1をコードする遺伝子の発現を阻害することによって、アポトーシスを回避する。他の癌細胞、特に肺癌および結腸癌は、異常な細胞のCTLによる排除の開始を阻害する高レベルの可溶性おとり分子を分泌する。アポトーシス機構の調節不完全はまた、様々な変性状態および血管疾患にも関係している。
【０００８】
アポトーシスプロセスの制御された調節およびその細胞機構が、多細胞生物の生存にとって不可欠であることは明らかである。典型的に、アポトーシスを受けるように指図された細胞において発生する生化学的変化は、順序正しい進行で起こる。しかし、先に示したように、アポトーシスの調節に不備があると、生物において重篤で有害な作用を引き起こしうる。
【０００９】
異常な細胞（例えば、癌細胞）においてアポトーシス機構の調節を制御および回復するために、様々な試みが行われている。例えば、異常な細胞をそれらが増殖する前に破壊するための細胞障害剤を開発するために、多くの研究が行われてきた。そのため、細胞障害剤は、ヒトおよび動物の健康の双方において広い有用性を有し、ほぼ全ての型の癌ならびに紅斑性狼瘡およびリウマチ性関節炎のような過増殖性の自己免疫障害の処置の第一選択薬となっている。
【００１０】
多くの細胞障害剤は、DNAを損傷することによって（例えば、シス-ジアミンジクロロプラチナ（II）はDNAにクロスリンクするが、ブレオマイシンは鎖の切断を誘導する）その作用を発揮する。この核損傷の結果が、p53システムのような細胞因子によって認識されれば、損傷した細胞の死に至るアポトーシスカスケードを開始する。
【００１１】
しかし、既存の細胞障害性化学療法剤は、重篤な欠点を有する。例えば、多くの公知の細胞障害剤は、健康な細胞と死細胞との区別をほとんど示さない。この特異性の欠如によってしばしば、有効性を制限しうる、および／または早期死亡の原因となりうる重度の副作用が起こる。その上、多くの既存の細胞障害剤の持続的な投与によって、さらなる投与をより有効性が低くまたは無効にする耐性遺伝子（例えば、bcl-2ファミリーまたは多剤耐性（MDR）タンパク質）の発現が起こる。いくつかの細胞障害剤は、p53および関連タンパク質において変異を誘導する。これらの検討に基づいて、理想的な細胞障害剤は、疾患を有する細胞のみを殺さなければならず、化学療法剤に対する耐性に感受性があってはならない。
【００１２】
疾患を有する細胞を選択的に殺すための一つの戦略は、疾患を有する細胞において発現された分子を選択的に認識する薬物の開発である。このように、有効な細胞障害性化学療法剤は、疾患を示す分子を認識して、疾患を有する細胞の死を（例えば、直接または間接的に）誘導するであろう。いくつかのタイプの癌細胞上のマーカーが同定されており、治療抗体および低分子の標的となっているが、診断および治療的利用に関する独自の形質は、ほとんどの癌に関してわかっていない。その上、狼瘡のような疾患に関して、薬物開発のための特異的分子標的は同定されていない。
【００１３】
必要であるのは、これらのプロセスの調節不完全を特徴とする疾患および状態（例えば、ウイルス感染症、過増殖性自己免疫障害、慢性炎症状態、および癌）に罹患した被験者におけるアポトーシスプロセスを調節するための改善された組成物および方法である。
【発明の開示】
【００１４】
要約
本発明は、新規化学化合物、その発見のための方法、およびその治療的使用に関する。特に、本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体および他の化合物を提供し、ならびにプログラムされた細胞死、自己免疫、炎症、および過増殖等のプロセスの調節不完全に関連した多くの状態を処置するための治療物質としてベンゾジアゼピン誘導体および他の化合物を用いる方法を提供する。
【００１５】
特定の態様において、本発明は、以下の式、または立体異性体、その薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを含む化合物：
2007534770.tif 000002
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、またはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000003
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9は、SO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である、
と、アポトーシス剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、特定のアポトーシス剤に限定されない。好ましい態様において、本発明は、例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国暫定特許第60/607,599号、および第60/641,040号、ならびに米国特許出願第10/935,333号、第10/886,450号、第10/795,535号、第10/634,114号、第10/427,211号、第10/427,212号、第10/217,878号、第09/767,283号、第09/700,101号、および関連出願において記述されるアポトーシス剤を提供する。好ましい態様において、アポトーシス剤は、以下の式を含む：
2007534770.tif 000004
式中、R1は、ナプタラニン；フェノール；1-ナプタレノール；2-ナプタレノール；
2007534770.tif 000005
およびキノリンからなる群より選択される；R2は以下からなる群より選択される：
2007534770.tif 000006
；ならびにR1およびR2には、RまたはSエナンチオマー型の双方およびラセミ混合物が含まれる。
【００１７】
好ましい態様において、アポトーシス剤は、以下の式、もしくはそのエナンチオマー：
2007534770.tif 000007
式中R1は脂肪族またはアリールである；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、または水素結合に関与する部分である、R5はアリール、複素環式、-R6-NH-C(=O)-R7、もしくは-R6-C(=O)-NH-R7であり、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、または複素環式であり、R3およびR4はそれぞれ独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、アリール、または複素環式である、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体を含む。
【００１８】
本発明はさらに、以下の式を含む化合物、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグの有効量を被験者に投与する段階を含む、自己免疫障害を処置する方法を提供する：
2007534770.tif 000008
R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、もしくはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2-、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000009
ではない；
R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9はSO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である。
【００１９】
好ましい態様において、自己免疫障害は以下からなる群より選択される：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベルガー病またはIgA腎症、セリアックスプルー、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋肉痛、移植片対宿主病、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、および白斑。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、以下の式を含む化合物、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000010
式中R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択され；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される、
と、アポトーシス剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、特定のアポトーシス剤に限定されない。好ましい態様において、本発明は、例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国暫定特許第60/607,599号および第60/641,040号、ならびに米国特許出願第10/427,212号に記述のアポトーシス剤を提供する。好ましい態様において、アポトーシス剤は以下の式を含む：
2007534770.tif 000011
式中R1は、ナプタラニン；フェノール；1-ナプタレノール；2-ナプタレノール；
2007534770.tif 000012
およびキノリンからなる群より選択される；R2は以下からなる群より選択される：
2007534770.tif 000013
；ならびにR1およびR2には、RまたはSエナンチオマー型の双方およびラセミ混合物が含まれる。
【００２２】
好ましい態様において、アポトーシス剤は以下の式、もしくはそのエナンチオマー：
2007534770.tif 000014
式中R1は脂肪族もしくはアリールである；R2は脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、もしくは水素結合に関与する部分である；R5はアリール、複素環式、-R6-NH-C(=O)-R7、もしくは-R6-C(=O)-NH-R7である、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、もしくは複素環式であり、R3およびR4はそれぞれ独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、アリール、もしくは複素環式である、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくはその誘導体を含む。
【００２３】
特定の態様において、本発明は、以下の式を含む化合物、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグの有効量を被験者に投与する段階を含む、自己免疫障害を処置する方法を提供する：
2007534770.tif 000015
式中、R1はH、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択され；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される。
【００２４】
好ましい態様において、自己免疫障害は、以下からなる群より選択される：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベルガー病またはIgA腎症、セリアックスプルー、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋肉痛、移植片対宿主病、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、および白斑。
【００２５】
特定の態様において、本発明は、以下の式：
2007534770.tif 000016
式中、R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；XはOおよびNHからなる群より選択される；Yは、S、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される、
を含む化合物またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグと、アポトーシス剤とを含む、薬学的組成物を提供する。
【００２６】
好ましい態様において、アポトーシス剤は、以下の式を含む：
2007534770.tif 000017
式中R1は、ナプタラニン；フェノール；1-ナプタレノール；2-ナプタレノール；
2007534770.tif 000018
およびキノリンからなる群より選択される；R2は以下からなる群より選択される：
2007534770.tif 000019
；ならびにR1およびR2には、RまたはSエナンチオマー型の双方およびラセミ混合物が含まれる。
【００２７】
好ましい態様において、アポトーシス剤は、以下の式もしくはそのエナンチオマー：
2007534770.tif 000020
式中R1は、脂肪族またはアリールである；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5；もしくは水素結合に関与する部分である；R5はアリール、複素環式、-R6-NH-C(=O)-R7、もしくは-R6-C(=O)-NH-R7である、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーである、ならびにR7は、脂肪族、アリール、もしくは複素環であって、R3およびR4はそれぞれ独立してヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、アリール、もしくは複素環式である、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体を含む。
【００２８】
特定の態様において、本発明は、以下の式を含む化合物またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグの有効量を被験者に投与する段階を含む、自己免疫障害を処置する方法を提供する：
2007534770.tif 000021
式中R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；XはOおよびNHからなる群より選択される；YはS、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される。
【００２９】
好ましい態様において、自己免疫障害は、以下からなる群より選択される：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベルガー病またはIgA腎症、セリアックスプルー、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋肉痛、移植片対宿主病、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、および白斑。
【００３０】
特定の好ましい態様において、本発明は、オリゴマイシン感受性付与タンパク質およびミトコンドリアF1F0-ATPアーゼのF1サブユニットを有する標的細胞と；以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ；
2007534770.tif 000022
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、もしくはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、もしくはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2-、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10もしくはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000023
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環もしくはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9はSO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である；
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000024
式中、R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択される；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される；ならびに
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000025
式中、R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；XはOおよびNHからなる群より選択される；YはS、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される、
からなる群より選択される式を含む組成物とを提供する段階；
ならびに細胞におけるスーパーオキサイドレベルを増加させるためまたは細胞ATPレベルを変化させるために、組成物がオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合するような条件で細胞を組成物に曝露する段階を含む、細胞死を調節するための方法を提供する。
【００３１】
好ましい態様において、標的細胞は、インビトロ細胞、インビボ細胞、および／またはエクスビボ細胞である。好ましい態様において、標的細胞は癌細胞である。他の好ましい態様において、標的細胞は、B細胞、T細胞、および顆粒球からなる群より選択される。
【００３２】
好ましい態様において、曝露する段階によって、標的細胞の細胞死の増加が起こる。
【００３３】
特定の態様において、本発明は、以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000026
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=0)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、またはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000027
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環もしくはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9は、SO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である；
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000028
式中、R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択される；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される；ならびに
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000029
式中、R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；XはOおよびNHからなる群より選択される；YはS、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される、
からなる群より選択される物質を含む薬学的組成物を含む、薬物溶出ステント培地を含む組成物を提供する。
【００３４】
好ましい態様において、本発明は、被験者の血管を組成物に曝露する段階を含む、血管を処置するための方法を提供する。好ましい態様において、血管は、閉鎖血管および／または心血管である。
【００３５】
特定の態様において、本発明は、試料を過増殖上皮細胞、および以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000030
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=0)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、またはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000031
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9はSO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である；
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ：
2007534770.tif 000032
式中、R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択される；R3はH、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される；ならびに
以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグ、
2007534770.tif 000033
式中、R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2はH、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；XはOおよびNHからなる群より選択される；YはS、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される、
からなる群より選択される式を含む組成物と共に提供する段階、ならびに組成物を試料に適用する段階を含む、過増殖上皮細胞を調節する方法を提供する。
【００３６】
好ましい態様において、組成物を試料に適用する段階は、試料内のErk1/2活性化を減少させる。好ましい態様において、組成物を試料に適用する段階は、試料におけるケラチノサイトの増殖を阻害する。
【００３７】
好ましい態様において、組成物は局所コルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド0.1％クリームおよびプロピオン酸ベタメタゾン0.05％クリーム）をさらに含む。好ましい態様において、組成物は、2〜10％コールタールをさらに含む。好ましい態様において、組成物はさらに、ビタミンD-3類似体（例えば、カルシポトリエン）を含む。好ましい態様において、組成物は、角質溶解剤（例えば、0.1〜1％アントラリン）をさらに含む。好ましい態様において、組成物は、局所レチノイド（例えば、トレチノインおよびタザロテン）をさらに含む。
【００３８】
好ましい態様において、試料は生きている被験者である。好ましい態様において、生きている被験者は表皮の過形成を有するヒトである。好ましい態様において、生きている被験者は乾癬を有する。
【００３９】
特定の態様において、本発明は、化合物、治療物質、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００４０】
本発明は、特定の化合物に限定されない。好ましい態様において、本発明は、例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国暫定特許第60/607,599号、および第60/641,040号、ならびに米国特許出願第10/935,333号、第10/886,450号、第10/795,535号、第10/634,114号、第10/427,211号、第10/427,212号、第10/217,878号、第09/767,283号、第09/700,101号、および関連出願において記述される。例えば、本発明は、以下の式、そのエナンチオマーおよび薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む薬学的組成物を提供する：
2007534770.tif 000034
式中R1は炭素原子1〜20個および水素原子1〜20個を有する脂肪族基、または炭素原子20個までおよび水素原子20個までを有するアリール基である；R2およびR3はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、C1-4アルコキシ、ハロ、アミノ、C1-4アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、炭素原子6〜14個を有するアリール基、ならびに窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族環を有する複素環基からなる群より独立して選択される；R4は、脂肪族またはアリールである；R5は炭素原子6〜14個を有するアリール基、窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族環を有する複素環基、-R6-NH-C(=O)-R7、ならびに-R6-C(=O)-NH-R7からなる群より選択される；R6は、炭素1〜6個の脂肪族リンカー基である；ならびにR7は、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、炭素原子6〜14個を有するアリール基、ならびに窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族環を有する複素環基からなる群より選択される。さらなる化合物には、以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない：
2007534770.tif 000035
【００４１】
本発明は、治療物質に限定されない。例えば、少なくとも一つの他の治療物質は、一つまたは複数のカリウムチャンネル開放物質、カルシウムチャンネル遮断剤、ナトリウム水素交換物質阻害剤、抗不整脈剤、抗アテローム性動脈硬化症剤、抗凝固剤、抗血栓剤、プロトロンビン溶解剤、フィブリノーゲン拮抗剤、利尿剤、抗高血圧剤、ATPアーゼ阻害剤、鉱質コルチコイド受容体拮抗剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、抗糖尿病剤、抗炎症剤、抗酸化剤、血管新生調節剤、抗骨粗鬆症剤、ホルモン補充療法、ホルモン受容体調節剤、経口避妊薬、抗肥満剤、抗うつ剤、抗不安剤、抗精神剤、抗増殖剤、抗腫瘍剤、抗潰瘍および胃食道逆流疾患剤、成長ホルモン剤および／または成長ホルモン分泌促進剤、甲状腺模倣剤、抗感染剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、コレステロール／脂質低下剤および脂質プロフィール治療、ならびに虚血状態調整および／または心筋気絶を模倣する物質；ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤から選択される。
【００４２】
好ましい態様において、少なくとも一つの他の治療物質は、一つまたは複数の抗アテローム性動脈硬化症剤、抗凝固剤、抗血栓剤、抗高血圧剤、および抗糖尿病剤から選択される。好ましい態様において、少なくとも一つの他の治療物質は、ACE阻害剤、AT-1受容体拮抗剤、ET受容体拮抗剤、二重ET/AII受容体拮抗剤、およびバソペプシダーゼ阻害剤、またはGPIIb/IIIa遮断剤、P2Y1およびP2Y12拮抗剤、トロンボキサン受容体拮抗剤、およびアスピリンから選択される抗高血圧剤である。
【００４３】
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つの化合物の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与する段階を含む、患者におけるミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ関連障害を処置する方法を提供する。本発明は、特定の化合物に限定されない。好ましい態様において、本発明は、例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国暫定特許第60/607,599号、および第60/641,040号、ならびに米国特許出願第10/935,333号、第10/886,450号、第10/795,535号、第10/634,114号、第10/427,211号、第10/427,212号、第10/217,878号、第09/767,283号、第09/700,101号、および関連出願において記述される化合物を提供する。例えば、本発明は、以下の式からなる群より選択される少なくとも一つの化合物、そのエナンチオマーおよび薬学的に許容される塩を提供する：
2007534770.tif 000036
式中R1は炭素原子1〜20個および水素原子1〜20個を有する脂肪族基、または炭素原子20個までおよび水素原子20個までを有するアリール基である；R2およびR3はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、C1-4アルコキシ、ハロ、アミノ、C1-4アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、炭素原子6〜14個を有するアリール基、ならびに窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族環を有する複素環基からなる群より独立して選択される；R4は、脂肪族またはアリールである；R5は炭素原子6〜14個を有するアリール基、窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族環を有する複素環基、-R6-NH-C(=O)-R7、ならびに-R6-C(=O)-NH-R7からなる群より選択される；R6は、炭素1〜6個の脂肪族リンカー基である；ならびにR7は、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、炭素原子6〜14個を有するアリール基、ならびに窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族環を有する複素環基からなる群より選択される。さらなる化合物には以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない：
2007534770.tif 000037
【００４４】
好ましい態様において、ミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ障害は、心筋梗塞、心室過栄養、冠動脈疾患、非Q波MI、うっ血性心不全、心不整脈、不安定狭心症、慢性安定狭心症、プリンズメタル型狭心症、高血圧症、間欠性は行、末梢閉塞性動脈疾患、血栓塞栓発作の血栓または血栓塞栓症状、静脈血栓症、動脈血栓症、脳血栓症、肺動脈塞栓症、脳塞栓症、血栓形成傾向、播種性血管内凝固、再狭窄、心房細動、心室肥大、アテローム性動脈硬化性血管疾患、アテローム斑破裂、アテローム斑形成、移植性アテローム性動脈硬化症、血管リモデリングアテローム性動脈硬化症、癌、手術、炎症、全身感染症、人工表面、介入的心臓学、不動症、投薬、妊娠および流産、ならびに網膜症、腎症、および神経症を含む糖尿病合併症から選択される。
【００４５】
定義
本発明の理解を促進するために、多くの用語および句を以下に定義する。
【００４６】
本明細書において用いられているように、「ベンゾジアゼピン」という用語は、フェニル環に縮合した、窒素原子2個を複素環の一部として有する7員環の非芳香族複素環を指す。いくつかの局面において、窒素原子2個は、以下の一般構造に示されるように1位および4位に存在する。
2007534770.tif 000038
【００４７】
「ベンゼンより大きい」という用語は、7個またはそれより多い非水素原子を含む任意の化学基を指す。
【００４８】
本明細書において用いられるように、「置換脂肪族」という用語は、脂肪族水素原子の少なくとも一つがハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、または置換環状脂肪族等）に置換されている、炭素原子10個未満を有するアルカンを指す。そのような例には、1-クロロエチル等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４９】
本明細書において用いられるように、「置換アリール」という用語は、芳香環、またはその少なくとも一つが芳香族である3個のみの縮合環からなる縮合芳香環系を指し、環炭素上の水素原子の少なくとも一つが、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、または置換環状脂肪族等）に置換されている。そのような例には、ヒドロキシフェニル等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５０】
本明細書において用いられるように、「環状脂肪族」は、炭素8個未満を有するシクロアルカン、または縮合環状脂肪族環3個のみからなる縮合環系を指す。そのような例には、デカリン等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５１】
本明細書において用いられるように、「置換環状脂肪族」という用語は、炭素10個未満を有するシクロアルカン、または縮合環3個のみからなる縮合環系を指し、脂肪族水素原子の少なくとも一つは、ハロゲン、ニトロ、チオ、アミノ、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、または置換環状脂肪族等）に置換されている。そのような例には、1-クロロデカリル、ビシクロ-ヘプタン、オクタン、およびノナン（例えば、ノルボルニル）等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５２】
本明細書において用いられるように、「複素環式」という用語は、環炭素原子の少なくとも一つが酸素、窒素、または硫黄に置換されている、炭素原子8個未満を有するシクロアルカンおよび／またはアリール環系、または3個のみの縮合環からなる縮合環系を指す。そのような例には、モルホリノ等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５３】
本明細書において用いられるように、「置換複素環」という用語は、環炭素原子の少なくとも一つが酸素、窒素、または硫黄に置換されていて、脂肪族水素原子の少なくとも一つがハロゲン、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族または置換環状脂肪族）に置換されている、炭素8個未満を有するシクロアルカンおよび／またはアリール環系、または3個のみの縮合環からなる縮合環系を指す。そのような例には、2-クロロピラニルが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５４】
本明細書において用いられるように、「リンカー」という用語は、そのような原子が例えば、炭素、窒素、酸素、または硫黄である、異なる二つの構造部分を接続する8隣接原子までおよび8隣接原子を含む鎖を指す。エチレングリコールは一つの非制限的な例である。
【００５５】
本明細書において用いられているように、「低級アルキル置換アミノ」という用語は、脂肪族水素原子の一つがアミノ基に置換されている炭素原子8個までおよび炭素原子8個を含む任意のアルキル単位を指す。そのような例には、エチルアミノ等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５６】
本明細書において用いられるように、「低級アルキル置換ハロゲン」という用語は、脂肪族水素原子の一つがハロゲンに置換されている炭素原子8個までおよび炭素原子8個を含む任意のアルキル鎖を指す。そのような例には、クロロエチル等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５７】
本明細書において用いられるように、「アセチルアミノ」という用語は、アセチル化されている任意の一級または二級アミノを意味する。そのような例には、アセトアミド等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００５８】
本明細書において用いられるように、化合物の「誘導体」という用語は、化学改変が化合物の官能基または芳香環上のいずれかで起こる、化学改変化合物を指す。本発明の1,4-ベンゾジアゼピン誘導体の非制限的な例には、化合物において利用できる任意の窒素でのN-アセチル、N-メチル、N-ヒドロキシ基が含まれてもよい。さらなる誘導体には、フェニル環上でトリフルオロメチル基を有する誘導体が含まれてもよい。
【００５９】
本明細書において用いられる「ステント」または「薬物溶出ステント」という用語は、処置される管腔の壁における一つの部位に接触して留置された場合に、管腔壁でフィブリンを配置して、これを管腔壁に保持するであろう任意の装置を指す。これには特に、冠動脈閉鎖を処置するために、および脾臓、頚動脈、腸骨動脈、膝窩動脈血管の離断または動脈瘤を封鎖するために、経皮送達される装置が含まれる。ステントはまた、その上にフィブリンを適用する基礎となるポリマーもしくは金属構造要素を有しうる、またはステントはポリマーと互いに混合したフィブリンの複合体となりうる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,886,062号に開示されるような変形可能な金属ワイヤステントに、一つまたは複数のコーティングにおいて先に記述のフィブリンをコーティングすることができる（すなわち、フィブリノーゲン溶液およびフィブリノーゲン凝固タンパク質溶液の適用による金属枠組み上でのフィブリンの重合化）、またはフィブリンの輪状締結被膜のような付着させたフィブリンの予成形品を提供することができるであろう。ステントおよびフィブリンを、バルーンカテーテルの遠位末端でバルーンに留置して、通常の経皮手段（例えば、血管形成術の場合のような）によって処置される制限または閉鎖部位に送達することができ、その部位でそれらはバルーンを膨らませることによって膨張して体腔と接触するであろう。次に、カテーテルを引き抜いて、本発明のフィブリンステントを処置部位に留置する。したがって、ステントは処置部位で管腔の支持構造を提供すると共に管腔壁でのフィブリンの確実な留置を支持する構造を提供する可能性がある。一般的に、薬物溶出ステントは、ステント埋め込み部位での特定の薬物の能動的放出を可能にする。
【００６０】
本明細書において用いられるように、「カテーテル」という用語は、体腔または血管に対するアクセスを得るために用いられるチューブを指す。
【００６１】
本明細書において用いられるように、「弁」または「血管」という用語は、哺乳動物における任意の管腔を指す。例には、動脈、静脈、毛細管、および生体腔が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００６２】
本明細書において用いられるように、「再狭窄」という用語は、狭くなった任意の弁を指す。例には、例えばバルーン拡張、剥離、アテローム切除、または動脈のレーザー処置のような、動脈の狭窄部分を開口させるための努力によって引き起こされたその動脈に対する外傷後の末梢または冠動脈の再閉鎖が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００６３】
本明細書において用いられるように、「血管形成術」、「バルーン治療」、「バルーン血管形成術」、「経皮的冠動脈血管形成術」とは、血管を拡大させるためにバルーンカテーテルを用いて、それによって血流を改善することを含む、血管障害を処置する方法を指す。
【００６４】
本明細書において用いられるように、「心カテーテル挿入」または「冠血管造影」は、カテーテル挿入技法を用いて冠動脈疾患を診断するために用いられる試験を指す。そのような技法は、例えばカテーテルによって冠動脈に造影色素を注入して、狭くなったまたは遮断された動脈の可視化を可能にすることを含んでもよい。
【００６５】
本明細書において用いられるように、「被験者」という用語は、本発明の方法によって処置される生物を指す。そのような生物には好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）が含まれるがそれらに限定されるわけではなく、最も好ましくはヒトが含まれる。本発明の状況において、「被験者」という用語は一般的に、アポトーシスプロセスの調節異常を特徴とする状態のために処置（例えば、ベンゾジアゼピン化合物、および任意で一つまたは複数の他の物質の投与）を受けるであろう、または処置を受けた個体を指す。
【００６６】
本明細書において用いられるように、「診断された」という用語は、その徴候および症状（例えば、通常の治療に対する耐性）、または遺伝子分析、病理分析、組織学分析等による疾患の認識を指す。
【００６７】
本明細書において用いられるように、「抗癌剤」または「通常の抗癌剤」という用語は、癌の処置において用いられる任意の化学療法化合物、放射線治療、または外科的介入を指す。
【００６８】
本明細書において用いられるように、「インビトロ」という用語は、人工的環境、および人工的な環境において起こるプロセスまたは反応を指す。インビトロの環境には、試験管および細胞培養が含まれるがそれらに限定されるわけではない。「インビボ」という用語は、天然の環境（例えば、動物または細胞）および天然の環境に起こるプロセスまたは反応を指す。
【００６９】
本明細書において用いられるように、「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボに存在する任意の真核細胞または原核細胞（例えば、哺乳動物細胞、トリ細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞、および昆虫細胞）を指す。
【００７０】
本明細書において用いられるように、「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養を指す。この用語には、連続細胞株（例えば、不死化表現型を有する細胞株）、初代培養細胞培養、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、ならびに卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
【００７１】
好ましい態様において、本発明の組成物および方法の「標的細胞」には、リンパ様細胞または癌細胞が含まれる、それらを指す、しかしそれらに限定されない。リンパ様細胞には、B細胞、T細胞、および顆粒球が含まれる。顆粒球には、好酸球およびマクロファージが含まれる。いくつかの態様において、標的細胞は連続培養細胞または患者の生検から得た非培養細胞である。
【００７２】
癌細胞には、腫瘍細胞、新生物細胞、悪性細胞、転移細胞、および過形成細胞が含まれる。新生物細胞は良性または悪性となりうる。新生物細胞は、それらが浸潤または転移しなければ良性である。悪性細胞は、浸潤および／または転移することができる細胞である。過形成は、構造または機能に有意な変化を及ぼさない組織または臓器における細胞の病的な蓄積である。
【００７３】
一つの特異的態様において、標的細胞は、病的な生長または増殖を示す。本明細書において用いられるように、「病的に増殖または生長する細胞」という用語は、正常な生長の通常の限界によって支配されない、動物における増殖する細胞の局所集団を指す。
【００７４】
本明細書において用いられるように、「非活性化標的細胞」という用語は、G0期に存在するか、または刺激が適用されていないかのいずれかである細胞を指す。
【００７５】
本明細書において用いられるように、「活性化標的リンパ様細胞」という用語は、シグナル伝達カスケードを引き起こすために適当な刺激によってプライミングされているリンパ様細胞、またはG0期に存在しないリンパ様細胞を指す。活性化リンパ様細胞は増殖して活性化誘導細胞死を経る、または一つもしくは複数の細胞毒素、サイトカイン、および細胞タイプ（例えば、CD8+またはCD4+）に特徴的な他の関連する膜会合タンパク質を産生する可能性がある。それらはまた、その表面上で特定の抗原を表示する任意の標的細胞を認識してそれに結合することができ、その後そのエフェクター細胞を放出することができる。
【００７６】
本明細書において用いられるように、「活性化癌細胞」という用語は、シグナル伝達を引き起こすように適当な刺激によってプライミングされている癌細胞を指す。活性化癌細胞はG0期に入っていてもよく、入っていないてもよい。
【００７７】
活性化物質は、標的細胞との相互作用によってシグナル伝達カスケードが起こる刺激である。活性化刺激の例には、低分子、放射エネルギー、および細胞活性化細胞表面受容体に結合する分子が含まれるがそれらに限定されるわけではない。活性化刺激によって誘導された反応は、中でも細胞内Ca2+、スーパーオキサイド、またはヒドロキシルラジカルレベル；キナーゼもしくはホスファターゼのような酵素の活性；または細胞のエネルギー状態、の変化を特徴としうる。癌細胞の場合、活性化物質には同様に形質転換腫瘍遺伝子が含まれる。
【００７８】
一つの局面において、活性化物質は細胞表面活性化受容体に結合する任意の物質である。これらは、T細胞受容体リガンド、B細胞活性化因子（「BAFF」）、TNF、Fasリガンド（FasL）、CD40リガンド、増殖誘導リガンド（「APRIL」）、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、アミノ酸（例えば、グルタメート）、ステロイド、B細胞受容体リガンド、γ線照射、UV照射、細胞ストレスを増強する物質もしくは状態、または細胞表面活性化受容体を特異的に認識してこれに結合する抗体（例えば、抗CD4、抗CD8、抗CD20、抗TACI、抗BCMA、抗TNF受容体、抗CD40、抗CD3、抗CD28、抗B220、抗CD38、抗CD19、および抗CD21）からなる群より選択される。BCMAは、B細胞成熟抗原受容体であり、TACIは、膜貫通活性化因子およびCAML相互作用物質である（Gross, A. et al.(2000)；Laabi, Y. et al.(1992) and Madry, C. et al.(1998)）。抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはその混合物が含まれる。
【００７９】
T細胞リガンドの例には、MHC分子に結合するペプチド、ペプチドMHC複合体、またはT細胞受容体の成分を認識する抗体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００８０】
B細胞リガンドの例には、B細胞受容体の成分に結合する、または成分を認識する分子または抗体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００８１】
細胞表面活性化受容体に結合する試薬の例には、これらの受容体の天然のリガンドまたはそれらに対して作製された抗体（例えば、抗CD20）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。RITUXIN（Genentech, Inc., San Framcisco, CA）は、市販の抗CD20キメラモノクローナル抗体である。
【００８２】
細胞ストレスを増強する物質または条件の例には、熱、放射線、酸化的ストレス、または増殖因子の回収が含まれる。増殖因子の例には、血清、IL-2、血小板由来増殖因子（「PDGF」）等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００８３】
本明細書において用いられるように、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果を得るために十分な化合物（例えば、ベンゾジアゼピン）の量を指す。有効量は、一つまたは複数の投与、適用、または用量において投与されうる、そして特定の製剤または投与経路に限定されると意図されることに限定されない。
【００８４】
本明細書において用いられるように、「細胞死のプロセスの調節異常」という用語は、細胞が壊死またはアポトーシスのいずれかによって細胞死を受ける能力（例えば、素因）の如何なる異常も指す。細胞死の調節異常は、例えば自己免疫障害（例えば、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、移植片対宿主病、重症筋無力症、シェーグレン症候群等）、慢性炎症状態（例えば、乾癬、喘息、およびクローン病）、過増殖障害（例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫等）、ウイルス感染症（例えば、ヘルペス、乳頭腫、HIV）、ならびに変形性関節炎およびアテローム性動脈硬化症のような他の状態を含む、多様な状態に関連するまたはそれらによって誘導される。
【００８５】
調節異常がウイルス感染症によって誘導されるまたはウイルス感染症に関連する場合、ウイルス感染症は調節異常が起こるまたは認められる時期に検出可能であってもなくてもよいことに注目すべきである。すなわち、ウイルスによる調節異常は、ウイルス感染症の症状が消失した後でさえも起こりうる。
【００８６】
本明細書において用いられるように「過増殖障害」は、動物において増殖する細胞の局所集団が、正常な生長の通常の限界によって支配されない如何なる状態も指す。過増殖障害の例には、腫瘍、新生物、リンパ腫等が含まれる。新生物は、浸潤または転移を受けなければ良性であると言われ、これらのいずれかを受ければ悪性であると言われる。転移細胞または組織は、細胞が隣接する体構造に浸潤してこれを破壊できることを意味する。過形成は、構造または機能に有意な変化を及ぼすことなく、組織または臓器における細胞数の増加を含む細胞増殖の一つの型である。化生は、一つのタイプの完全に分化した細胞が、もう一つのタイプの分化した細胞に置換する、制御された細胞生長の形である。化生は、上皮または結合組織細胞において起こりうる。典型的な化生は、いくぶん無秩序な化生上皮を含む。
【００８７】
活性化リンパ様細胞の病的な生長によってしばしば、自己免疫障害または慢性炎症状態が起こる。本明細書において用いられるように、「自己免疫障害」という用語は、生物自身の分子、細胞、または組織を認識する抗体または免疫細胞を生物が産生する如何なる状態も指す。自己免疫障害の非制限的な例には、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベルガー病またはIgA腎症、セリアックスプルー、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋肉痛、移植片対宿主病、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、白斑等が含まれる。
【００８８】
本明細書において用いられるように、「慢性炎症状態」という用語は、生物の免疫細胞が活性化されている状態を指す。そのような状態は、病的な続発症を有する持続的な炎症反応を特徴とする。この状態は、単核細胞の浸潤、線維芽細胞および小血管の増殖、結合組織の増加、ならびに組織破壊を特徴とする。慢性炎症疾患の例には、クローン病、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症、および喘息が含まれるがそれらに限定されるわけではない。リウマチ性関節炎および全身性紅斑性狼瘡のような自己免疫疾患によっても、慢性炎症状態は起こりうる。
【００８９】
本明細書において用いられるように、「同時投与」という用語は、被験者に対して少なくとも二つの物質（例えば、ベンゾジアゼピン）または治療を投与することを指す。いくつかの態様において、二つまたはそれより多い物質／治療の同時投与が同時である。他の態様において、第一の物質／治療が第二の物質／治療の前に投与される。当業者は、用いられる様々な物質／治療の製剤および／または投与経路が変化してもよいことを理解する。同時投与のための適当な用量は、当業者によって容易に決定されうる。いくつかの態様において、物質／治療が同時投与される場合、それぞれの物質／治療は、その単独の投与にとって適した用量より低い用量で投与される。このように、同時投与は、物質／治療の同時投与が、公知のおそらく有害な（例えば、毒性の）物質の必要量を低下させる態様において、特に望ましい。
【００９０】
本明細書において用いられるように、「毒性」という用語は、毒物の投与前の同じ細胞または組織と比較して、細胞または組織に及ぼす任意の不利益なまたは有害な効果を指す。
【００９１】
本明細書において用いられるように、「薬学的組成物」という用語は、組成物をインビボ、インビボまたはエクスビボでの診断的または治療的用途のために特に適するようにする、不活性または活性である担体と活性物質との配合物を指す。
【００９２】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、燐酸緩衝生理食塩液、水、乳剤（例えば、油／水または水／油乳剤のような）および様々なタイプの湿潤剤のような、任意の標準的な薬学的担体を指す。組成物にはまた、安定化剤および保存剤が含まれうる。担体、安定化剤、および補助剤の例に関して。（例えばMartin, 「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 15 th Ed., Mack Publ.Co., Easton, PA[1975]を参照されたい）。
【００９３】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される塩」という用語は、被験者に投与した場合に、本発明の化合物、またはその活性代謝物もしくは残留物を提供することができる本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基に由来してもよい。酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、燐酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、蟻酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。シュウ酸のような他の酸は、それ自身、薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得るために中間体として有用な塩の調製において用いてもよい。
【００９４】
塩基の例には、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、およびWがC1-4アルキル等である式NW4+の化合物が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００９５】
塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンフルスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロ燐酸塩、ヘミスルホン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート、ペクチナート、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピルビン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トシル酸塩、ウンデカン酸塩等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。他の塩の例には、Na+、NH4+、およびNW4+（WはC1-4アルキル基である）等のような適した陽イオンと混合した本発明の化合物の陰イオンが含まれる。
【００９６】
治療的に用いる場合、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると企図される。しかし、薬学的に非許容性である酸および塩基の塩も同様に、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において利用してもよい。
【００９７】
本明細書において用いられるように、「固相支持体」または「固体支持体」という用語は、当業者に利用可能で公知である多数の支持体を指すためにその最も広い意味において用いられる。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチック被膜、ガラスビーズ、ワタ、プラスチックビーズ、アルミナゲル等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられるように、「固体支持体」には、合成抗原提示マトリクス、細胞、リポソーム等が含まれる。適した固相支持体は、様々なプロトコールに関する所望の最終用途および適切性に基づいて選択してもよい。例えば、ペプチド合成に関して、固相支持体は、ポリスチレンのような樹脂（例えば、Bachem, Inc., Peninsula Laboratoriesから得られるPAM樹脂等）、POLYHIPE樹脂（Aminotech, Canadaから得られる）、ポリアミド樹脂（Peninsula Laboratoriesから得られる）、ポリエチレングリコールに移植したポリスチレン樹脂（TENTAGEL, Rapp Polymere, Tubingenm Germany）、またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Milligen/Biosearch, Californiaから得られる）を指してもよい。
【００９８】
本明細書において用いられるように、「病原体」という用語は、宿主において疾患状態（例えば、感染症、癌等）を引き起こす生物学的物質を指す。「病原体」には、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原虫、マイコプラズマ、プリオン、および寄生虫生物が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００９９】
「細菌」および「バクテリウム」という用語は全て、原核生物界における全ての門における生物を含む、全ての原核細胞生物を指す。この用語は、マイコプラズマ（Mycoplasma）、クラミジア（Chlamydia）、アクチノミセス（Actinomyces）、ストレプトミセス（Streptomyces）、およびリケッチア（Rickettsia）を含む、細菌であると考えられる全ての微生物を含むと意図される。球菌、杆菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラスト等を含む全ての型の細菌が、この定義に含まれる。同様に、グラム陰性菌またはグラム陽性菌である原核細胞生物がこの用語に含まれる。「グラム陰性」および「グラム陽性」は、当技術分野で周知であるグラム染色プロセスによる染色パターンを指す。（例えば、Finegold and Martin, 「Diagnostic Microbiology」, 6 th Ed., CV Mosby, St. Louis, pp.13〜15[1982]を参照されたい）。「グラム陽性菌」は、グラム染色において用いられる一次色素を保持する細菌であり、染色された細胞は顕微鏡下で青色から紫色に見える。「グラム陰性菌」は、グラム染色において用いた一次色素を保持しないが、対比染色によって染色される。このように、グラム陰性菌は赤色に見える。
【０１００】
本明細書において用いられるように、「微生物」という用語は、細菌、古細菌、真菌、原虫、マイコプラズマ、および寄生虫生物が含まれるがそれらに限定されるわけではない任意の種またはタイプの微生物を指す。本発明は、本発明に含まれる多くの微生物が被験者に対して病原性であろうと企図する。
【０１０１】
本明細書において用いられるように、「真菌」という用語は、二形性真菌を含む、カビおよび酵母のような真核細胞生物を参照して用いられる。
【０１０２】
本明細書において用いられるように、「ウイルス」という用語は、特定の例外はあるものの、光学顕微鏡によって観察できない、独立した代謝を欠損する、および生きている宿主細胞の体内に限って複製することができる微細な感染物質を指す。個々の粒子（すなわち、ビリオン）は、典型的に核酸およびタンパク質外殻または外皮からなる；いくつかのビリオンはまた、脂質含有膜も有する。「ウイルス」という用語は、動物、植物、ファージ、および他のウイルスを含む全てのタイプのウイルスを含む。
【０１０３】
本明細書において用いられるように、「試料」という用語は、その最も広い意味において用いられる。アポトーシス機能の調節異常を特徴とする状態を示すことが疑われる試料は、細胞、組織、または液体、細胞から単離した染色体（例えば、広がった分裂中期染色体）、ゲノムDNA（溶液中で、またはサザンブロット分析のためのような固体支持体に結合して）、RNA（溶液中、またはノザンブロット分析のためのような固体支持体に結合して）、cDNA（溶液中、または固体支持体に結合して）等を含んでもよい。タンパク質を含むことが疑われる試料は、細胞、組織の一部、一つまたは複数のタンパク質等を含んでもよい。
【０１０４】
本明細書において用いられるように、「精製された」または「精製するため」という用語は、望ましくない成分を試料から除去することを指す。本明細書において用いられるように、「実質的に精製された」という用語は、それらが天然に会合している他の成分を少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、および最も好ましくは90％含まない分子を指す。
【０１０５】
本明細書において用いられるように、「抗原結合タンパク質」という用語は、特異的抗原に結合するタンパク質を指す。「抗原結合タンパク質」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、Fab断片、F(ab')2断片、およびFab発現ライブラリを含む免疫グロブリンが含まれるがそれらに限定されるわけではない。当技術分野において公知の様々な技法が、ポリクローナル抗体を産生するために用いられている。抗体を産生するために、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が含まれるがそれらに限定されるわけではない様々な宿主動物を、所望のエピトープに対応するペプチドの注射によって免疫することができる。好ましい態様において、ペプチドを、免疫原性担体（例えば、ジフテリア毒素、ウシ血清アルブミン（BSA）、またはキーホールリンペットヘモシアニン[KLH]）に共役させる。宿主の種に応じて免疫学的反応を増加させるために、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリ陰イオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（カルメットゲラン杆菌（Bacille Calmette-Guerin））およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）のようなおそらく有用なヒトアジュバントが含まれるがそれらに限定されるわけではない様々なアジュバントが用いられる。
【０１０６】
モノクローナル抗体を調製するために、連続細胞培養によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いてもよい（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies : A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい）。これらには、Kohler and Milsteinによって当初開発されたハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature 256:495〜497[1975]）と共に、トリオーマ技術、ヒトB-細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72[1983]を参照されたい）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., 「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」, Alan R. Liss, Inc., pp. 77〜96[1985]）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１０７】
本発明に従って、一本鎖抗体を産生するために記述される技術（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,946,778号）を、望ましければ特異的一本鎖抗体を産生するように適合させることができる。本発明のさらなる態様は、Fab発現ライブラリを構築するために、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、当技術分野で公知の技術を利用する（Huse et al., Science,246:1275〜1281[1989]）。
【０１０８】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片は、公知の技術によって作製することができる。例えば、そのような断片には、以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない：抗体分子のペプシン消化によって産生されうるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生されうるFab'断片；ならびにパパインおよび還元剤によって抗体分子を処置することによって産生されうるFab断片。
【０１０９】
抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で公知の方法によって単離されうる。抗体の産生において、所望の抗体に関するスクリーニングは、当技術分野で公知の技術（例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散プレシピチン（precipitin）反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素、または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集反応（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集素アッセイ等）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等）によって行うことができる。
【０１１０】
本明細書において用いられたように、「免疫グロブリン」または「抗体」という用語は、特異的抗原に結合するタンパク質を指す。免疫グロブリンには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ、およびヒト化抗体、Fab断片、F(ab')2断片が含まれるがそれらに限定されるわけではなく、以下のクラスの免疫グロブリンが含まれる：IgG、IgA、IgM、IgD、IbE、および分泌型免疫グロブリン（sIg）。免疫グロブリンは一般的に二つの同一の重鎖および二つの軽鎖を含む。しかし、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語はまた、一本鎖抗体および二本鎖抗体も含む。
【０１１１】
本明細書において用いられるように、「エピトープ」という用語は、特定の免疫グロブリンに接触する抗原のその部分を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫する場合、タンパク質の多数の領域が、タンパク質の三次元構造上の所定の領域に対して特異的に結合する抗体の産生を誘導する可能性がある；これらの領域または構造は、「抗原性決定基」と呼ばれる。抗原性決定基は、抗体との結合に関して無傷の抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために用いられる「免疫原」）と競合する可能性がある。
【０１１２】
抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用を参照して用いる場合の「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、相互作用が、タンパク質上の特定の構造（すなわち、抗原性決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；言い換えれば、抗体は、タンパク質全般に対するよりむしろ特異的タンパク質構造を認識して、これに結合している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された「A」および抗体を含む反応において、エピトープA（または遊離の非標識A）を含むタンパク質が存在すれば、抗体に結合した標識Aの量を低減させるであろう。
【０１１３】
本明細書において用いられるように、抗体およびタンパク質またはペプチドの相互作用を参照して用いる場合の、「非特異的結合」および「バックグラウンド結合」という用語は、特定の構造の存在に依存しない相互作用を指す（すなわち、抗体は、エピトープのような特定の構造よりむしろタンパク質全般に結合している）。
【０１１４】
本明細書において用いられるように、「調節する」という用語は、細胞生長、増殖、アポトーシス等が含まれるがそれらに限定されるわけではない細胞機能の一つの局面に影響を及ぼす（例えば、促進するまたは後退させる）化合物（例えば、ベンゾジアゼピン化合物）の活性を指す。
【０１１５】
本明細書において用いられるように、「結合に関して競合する」という用語は、第二の分子（例えば第二のベンゾジアゼピン誘導体またはミトコンドリアATPシンターゼにおけるオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する他の分子等）と同じ基質（例えば、ミトコンドリアATPシンターゼにおけるオリゴマイシン感受性付与タンパク質）に結合する活性を有する第一の分子（例えば、第一のベンゾジアゼピン誘導体）を参照して用いられる。第一の分子による結合効率（例えば動態または熱力学）は、第二の分子に対する基質結合の効率と同じであってもよく、それより大きくてもよく、またはそれより小さくてもよい。例えば、基質に対する結合に関する平衡結合定数（KD）は、二つの分子に関して異なってもよい。
【０１１６】
本明細書において用いられるように、「化合物を被験者に投与するための説明書」という用語、およびその文法的同等物には、細胞または組織におけるアポトーシスプロセスの調節異常を特徴とする状態の処置のために、キットに含まれる組成物を用いるための説明書が含まれる（例えば、投与、投与経路、患者特異的特徴を作用の治療経過に相関させための主治医のための意志決定選択肢を提供する）。この用語はまた、自己免疫障害（例えば、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、移植片対宿主病、重症筋無力症、シェーグレン症候群等）、慢性炎症状態（例えば、乾癬、喘息、およびクローン病）、過増殖障害（例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫等）、ウイルス感染症（例えば、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、HIV）、ならびに変形性関節炎およびアテローム性動脈硬化症のような他の状態等を処置するためのキットに含まれる組成物を用いるための説明書を特異的に指す。
【０１１７】
「試験化合物」という用語は、疾患、病気、疾病、もしくは体機能の障害を処置または予防するために、またはそうでなければ試料の生理的もしくは細胞状態（例えば、細胞または組織におけるアポトーシスの調節異常レベル）を変化させるために用いることができる任意の化学実体、薬剤、薬物等を指す。試験化合物は、公知のおよび可能性がある治療化合物の双方を含む。試験化合物は、本発明のスクリーニング法を用いることによって治療的であると決定されうる。「公知の治療化合物」は、そのような処置または予防において有効であることが示されている（例えば、動物試験を通して、またはヒトへの投与に関するこれまでの経験から）治療化合物を指す。好ましい態様において、「試験化合物」は、細胞においてアポトーシスを調節する物質である。
【０１１８】
本明細書において用いられるように、「第三者」という用語は、アポトーシスプロセスの調節異常を特徴とする状態を処置するための化合物の投与が企図される試験化合物を、販売する、倉庫に入れる、流通させる、または販売目的で提供することに携わる任意の実体を指す。
【０１１９】
発明の一般的説明
一つのクラスの薬物として、ベンゾジアゼピン化合物は広く試験され、多くの疾患を処置するための有効な薬剤であると報告されている。例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,076,823号、第4,110,337号、第4,495,101号、第4,751,223号、および第5,776,946号は、特定のベンゾジアゼピン化合物が鎮痛剤および抗炎症剤として有効であることを報告している。同様に、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,324,726号および米国特許第5,597,915号は、特定のベンゾジアゼピン化合物が、コレシストキニンおよびガストリンの拮抗剤であること、およびこのように特定の胃腸管障害を処置するために有用となる可能性があることを報告している。
【０１２０】
他のベンゾジアゼピン化合物は、中でも心筋虚血、敗血症ショック症候群のようなヒト好中球エラスターゼ媒介状態の処置におけるヒト好中球エラスターゼの阻害剤として研究されている（例えば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,861,380号を参照されたい）。その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,041,438号は、特定のベンゾジアゼピン化合物が抗レトロウイルス剤として有用であることを報告している。
【０１２１】
ベンゾジアゼピン化合物は注目を集めたにもかかわらず、以下の記述から、本発明は、ベンゾジアゼピン化合物ならびに関連化合物および他の化合物の新規使用、および多様な疾患を処置するために公知の化合物と共に化合物を用いる方法を提供することが明らかとなるであろう。
【０１２２】
ベンゾジアゼピン化合物は、中枢神経系（CNS）においてベンゾジアゼピン受容体に結合することが知られており、このように、不安およびてんかんを含む多様なCNS障害を処置するために用いられている。末梢のベンゾジアゼピン受容体も同様に同定されており、その受容体も同様に偶然にCNSに存在する可能性がある。本発明は、ベンゾジアゼピンおよび関連化合物が前アポトーシス特性および細胞障害特性を有することを証明する。これらの化合物の作用経路は、既に同定されたベンゾジアゼピン受容体を通してではない。
【０１２３】
このように、いくつかの態様において、本発明は、多くの化合物を提供する。所望の生物学的結果を得るために。他の態様において、本発明は、生物学的プロセスを調節するためにそのような化合物を用いる方法を提供する。本発明はまた、化合物を同定して最適にするための薬物スクリーニング法を提供する。これらおよび他の研究および治療有用性を以下に記述する。
【０１２４】
発明の詳細な説明
本発明の例示的な組成物および方法を以下の章により詳細に記述する：I．細胞死の調節物質；II．細胞生長および増殖の調節物質；III．例示的な化合物；IV．薬学的組成物、製剤、ならびに例示的な投与経路および投与の検討；V．薬物のスクリーニング；ならびにV．治療応用。
【０１２５】
本発明の実践は、特に示していなければ、当業者の技術範囲内である有機化学、薬理学、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、「Molecular cloning : a laboratory manual」, Second Edition(Sambrook et al., 1989)；「Oligonucleotide synthesis」(M.J. Gait, ed., 1984)；「Animal cell culture」(R.I. Freshney, ed., 1987)；the series「Methods in enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Handbook of experimental immunology」(D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds)；「Gene transfer vectors for mammalian cells」(J.M. Miller & M.P.Calos, eds, 1987)；「Current protocols in molecular biology」(F.M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)；「PCR : the polymerase chain reaction」(Mullis et al., eds., 1994)；および「Current protocols in immunology」(J.E. Coligan et al., eds, 1991)のような文献に十分に説明されている。
【０１２６】
I．細胞死の調節物質
好ましい態様において、本発明は、細胞を化合物に曝露することによってアポトーシスを調節する。化合物の作用は、任意の数の細胞の変化を検出することによって測定することができる。細胞死は、本明細書および当技術分野において記述されるようにアッセイしてもよい。好ましい態様において、細胞株は、適当な細胞培養条件（例えば、気体（CO2）、温度、および培地）で、密度依存的に拘束されることなく、指数的増殖を得るために適当な期間維持される。細胞数および生存率は、トリパンブルー排除／血球計算、またはMTT色素変換アッセイのような標準的な技術を用いて測定される。または、アポトーシスまたは壊死の異常に関連した遺伝子または遺伝子産物の発現に関して、細胞を分析してもよい。
【０１２７】
好ましい態様において、本発明を細胞に曝露することはアポトーシスを誘導する。いくつかの態様において、本発明は、細胞ROSレベル（例えば、O2-）の初回増加を引き起こす。さらなる態様において、本発明の化合物を細胞に曝露すると、細胞O2-レベルの増加を引き起こす。なおさらなる態様において、本発明の化合物に起因する細胞O2-レベルの増加は、O2-と特異的に反応する酸化還元感受性物質（例えば、ジヒロエテジウム（DHE））によって検出される。
【０１２８】
他の態様において、本発明の化合物に起因する細胞O2-レベルの増加は、一定期間（例えば、10分）の後に低下する。他の態様において、本発明の化合物に起因する細胞O2-レベルの増加は、一定期間後に低下して、後に再度増加する（例えば、10時間）。さらなる態様において、本発明の化合物に起因する細胞O2-レベルの増加は、1時間で低下して、4時間後に再度増加する。好ましい態様において、本発明の化合物に起因する細胞O2-レベルの初期増加後の細胞O2-レベルの低下後の細胞O2-レベルのもう一度増加は、異なる細胞プロセスによる（例えば、二相性の細胞メカニズム）。
【０１２９】
いくつかの態様において、本発明は、細胞のミトコンドリア△Ψmの崩壊を引き起こす。好ましい態様において、本発明の化合物に起因する細胞のミトコンドリア△Ψmの崩壊は、ミトコンドリア選択的電位差記録プローブ（例えば、DiOC6）によって検出される。さらなる態様において、本発明に起因する細胞のミトコンドリア△Ψmの崩壊は、細胞O2-レベルの初回増加後に起こる。
【０１３０】
いくつかの態様において、本発明はカスパーゼ活性化を可能にする。他の態様において、本発明は、ミトコンドリアからのチトクロームcの放出を引き起こす。さらに他の態様において、本発明に起因する変化した細胞質チトクロームcレベルは、細胞質分画のイムノブロットにより検出可能である。好ましい態様において、本発明に起因する減少した細胞質チトクロームcレベルは、一定期間（例えば、10時間）後に検出可能である。さらに好ましい態様において、本発明に起因する細胞質チトクロームcレベルの減少は、5時間後に検出可能である。
【０１３１】
他の態様において、本発明は、ミトコンドリアPT孔の開口を引き起こす。好ましい態様において、本発明に起因するチトクロームcの細胞放出は、ミトコンドリア△Ψmの崩壊と一貫する。なおさらに好ましい態様において、本発明は、ミトコンドリア△Ψmの崩壊後およびチトクロームcの放出後の細胞O2-レベルの増加を引き起こす。さらに好ましい態様において、細胞O2-レベルの上昇は、本発明に起因するミトコンドリア△Ψmの崩壊およびチトクロームcの放出によって引き起こされる。
【０１３２】
他の態様において、本発明は、細胞カスパーゼ活性化を引き起こす。好ましい態様において、本発明に起因するカスパーゼ活性化は、汎カスパーゼ感受性蛍光基質（例えば、FAM-VAD-fmk）によって測定可能である。なおさらなる態様において、本発明に起因するカスパーゼ活性化は、ミトコンドリア△Ψmの崩壊の後に続く。他の態様において、本発明は、低二倍性DNAの出現を引き起こす。好ましい態様において、本発明に起因する低二倍体DNAの出現は、カスパーゼ活性化よりわずかに遅れる。
【０１３３】
いくつかの態様において、本発明の分子標的はミトコンドリア内に認められる。さらなる態様において、本発明の分子標的はミトコンドリアATPアーゼを含む。細胞ROSの主な起源には、酸化還元酵素およびミトコンドリア呼吸鎖（以降MRC）が含まれる。好ましい態様において、チトクロームcオキシダーゼ（MRCの複合体IV）阻害剤（例えば、NaN3）は、細胞ROSレベルの本発明に依存的な増加を防止する。他の好ましい態様において、MRC複合体III阻害剤のユビキノール-チトクロームcレダクターゼ成分（例えば、FK506）は、本発明に依存的なROSレベルの増加を排除する。
【０１３４】
いくつかの態様において、本発明の化合物による細胞ROSレベルの増加は、ミトコンドリア内の標的に対する本発明の化合物の結合に起因する。好ましい態様において、本発明の化合物は、2',7-ジクロロジヒドロフルオレセイン（以降DCF）ジアセテートをDCFに酸化する。DCFは、ROSを産生することができる酸化還元活性種である。さらなる態様において、本発明に起因するDCF産生速度は、遅滞期間の後に増加する。
【０１３５】
アンチマイシンAは、ユビキノール-チトクロームcレダクターゼを阻害することによってO2-を産生する。好ましい態様において、本発明は、アンチマイシンAと同等にROS産生速度を増加させる。さらなる態様において、本発明は、状態3の呼吸を支持する嫌気性条件でアンチマイシンAと同等のようにROS産生速度を増加させる。さらなる態様において、本発明の化合物は、MPT孔を直接標的としない。さらなる態様において、本発明の化合物は、細胞下S15分画（例えば、サイトソル；ミクロソーム）において実質的なROSを産生しない。さらにさらなる態様において、本発明の化合物はミトコンドリアが状態4呼吸にある場合には、ROSを刺激しない。
【０１３６】
MRC複合体I〜IIIは、ミトコンドリア内の主なROS源である。好ましい態様において、依存する本発明に起因する細胞ROSレベルの主な増加源は、ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼを阻害した結果としてこれらの複合体から発散される。実際に、なおさらなる態様において、本発明は、ウシミトコンドリア下粒子（以降SMP）のミトコンドリアATPアーゼ活性を阻害する。特に好ましい態様において、本発明の化合物はミトコンドリアF1F0-ATPアーゼのOSCP成分に結合する。
【０１３７】
オリゴマイシンは、ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼに結合して、状態3〜4への遷移を誘導し、その結果としてROS（例えば、O2-）を産生するマクロライド系天然物である。好ましい態様において、本発明の化合物はミトコンドリアF1F0-ATPアーゼのOSCP成分に結合する。好ましい態様において、本発明の化合物はOSCPとF1F0-ATPアーゼのF1サブユニットとのあいだの接合部に結合する。いくつかの態様において、本発明の化合物はF1サブユニットに結合する。特定の態様において、本発明のスクリーニングアッセイは、OSCP、F1、またはOSCP/F1接合部の結合パートナーの検出を可能にする。OSCPは、内因性の蛍光タンパク質である。特定の態様において、本発明の試験化合物の溶液を、OSCPを過剰発現する大腸菌試料に滴定すると、内因性のOSCP蛍光の消光が起こる。他の態様において、蛍光または放射活性試験化合物を直接結合アッセイに用いることができる。他の態様において、競合結合実験を実施することができる。このタイプのアッセイにおいて、試験化合物をOSCPに対する結合に関してBz-423との競合能に関して評価する。いくつかの態様において、本発明の化合物は、OSCP遺伝子の調節を通して、細胞ROSレベルの増加の低減および細胞におけるアポトーシスの低減（例えば、OSCP遺伝子の発現の変化）を引き起こす。さらなる態様において、本発明は、ATPアーゼモーターの分子運動を変化させることによって機能する。
【０１３８】
II．細胞増殖と細胞生長の調節物質
いくつかの態様において、本発明の化合物および方法は、細胞増殖の減少を引き起こす。他の態様において、本発明の化合物および方法は、細胞増殖の減少およびアポトーシスを引き起こす。例えば、本発明の発達の際に行った細胞培養細胞障害性アッセイは、本発明の化合物および方法が長時間（例えば、3日間）の培養後に細胞生長を阻止することを証明した。
【０１３９】
III．処置した細胞の発現分析
本発明の発達の際に、処置および無処置細胞において異なるように発現された遺伝子を同定するために、発現プロフィールを作製した。このプロフィールは、本発明の化合物によって誘導された細胞の遺伝子発現フィンガープリントを提供する。このフィンガープリントは、本発明の化合物に反応してアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子を同定し、同定されたそのような遺伝子は、薬物スクリーニングのためのおよび化合物の治療効果をモニターするための診断マーカーである。遺伝子はまた、本発明の化合物の効果を模倣するための調節のための標的を提供する。Bz-423の存在下でアップレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Aに提示する。Bz-423の存在下でダウンレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Bに提示する。Bz-OMeの存在下でアップレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Cに提示する。Bz-OMeの存在下でダウンレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Dに提示する。
【０１４０】
例えば、発現プロフィールの分析により、オルニチンデカルボキシダーゼアンチザイム1（OAZ1）が新規治療物質として提供される。OAZ1は、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンを含むポリアミンの合成および細胞への輸送を制御する重要な調節タンパク質である。細胞におけるポリアミンの合成は、いくつかの酵素的段階を含むが、オルニチンデカルボキシラーゼは、主にこのプロセスを調節する酵素である。細胞質膜に存在するポリアミン輸送体を阻害することによって、およびタンパク質分解に関してオルニチンデカルボキシラーゼを標的とすることによって、OAZ1は、細胞におけるポリアミンレベルを低減させる。ポリアミンは、細胞の生存および生長にとって必須である。ポリアミンの異常な蓄積は、腫瘍の誘導、癌の生長、および転移に寄与する。ポリアミン生合成の阻害剤、および詳しくはジフルオロメチルオルニチン（DFMO）として同定された分子は、その抗発癌能および治療能を確認するために臨床試験が行われている。本発明の好ましい態様において、OAZ1は、本発明の化合物を処置した細胞において、対照細胞のレベルより16倍高いレベルまで誘導される。OAZ1レベルを誘導するための直接または間接的な如何なる方法も本発明によって企図される（例えば、本発明の化合物による処置、遺伝子治療等）。
【０１４１】
OAZ1は、ポリアミン代謝の重要な調節物質であり、ポリアミン生合成の律速段階を制御するミトコンドリア酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）の阻害剤として作用することによって、ポリアミンレベルを低減させるように機能する。アンチザイムによる阻害の後、ODCはプロテオソーム分解の標的となる。ポリアミンは、細胞の安定性に密接に関連しており、細胞増殖にとって必要である。ポリアミン合成を阻害すると増殖を抑制する。そのため、なおさらなる態様において、所望の生物学的作用を誘発するために、ODC発現または活性を減少させる（例えば、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子治療、公知のまたは後に同定された阻害剤、本発明の化合物等を用いて）。
【０１４２】
アンチザイム1発現は、転写時に、および転写後レベルで調節される。転写後調節は特に重要な役割を果たし、ポリマン（polymane、負のフィードバックを通して）またはアルギニンのもう一つの代謝物であるアグマチンに依存する独自の翻訳フレームシフトによって起こる。ODC活性レベルは、3H-オルニチンを用いてオルニチンのプトレシンへの変換を定量することによって得てもよい。いくつかの態様において、細胞を本発明の化合物によって処置すると、ODC活性を用量依存的に有意に低減させる。なおさらなる態様において、ODC活性の低減は、類似の条件で測定したODCタンパク質レベルの減少と平行である。MnTBAPと共にプレインキュベートした細胞はROSレベルを減少させる。いくつかの態様において、本発明の化合物に曝露したMnTBAPと共にプレインキュベートした細胞は、ODCの阻害の逆転を示す。
【０１４３】
好ましい態様において、高レベル（例えば、＞10μM）の本発明の化合物は、細胞抗酸化剤によって解毒化されない十分量のROSを産生し、それによって短期間のあいだ（例えば、18時間）にアポトーシスが起こる。好ましい態様において、より低いレベル（例えば、＜10μM）の本発明の化合物を処置した細胞は、アポトーシスを誘発するには不十分であるが、ODCを阻害するまたはそうでなければ細胞増殖を遮断することができる低減されたROS反応を誘導する。他の態様において、フェノールのヒドロキシルがClまたはOCH3に置換された本発明の化合物の誘導体は、細胞障害性が最も小さく、細胞において小さいROS反応を生成し、OSCPに対する結合が弱く、ODC活性を阻害する。さらに他の態様において、フェノールヒドロキシルがClに置換された本発明の化合物の誘導体によって処置した細胞は、非改変化合物と同程度に増殖を低減させた。そのため、好ましい態様において、抗増殖効果は、アポトーシスを誘導することなく増殖を遮断する本発明の化合物の化学誘導体を用いて得られる。
【０１４４】
抗原刺激またはマイトゲン刺激に反応して、リンパ球はタンパク質メディエータを分泌して、その一つは、インビトロでのマクロファージの遊走の阻止能から遊走阻害因子（MIF）と命名されている。MIFは、抗腫瘍物質であってもよい。さらに、MIFのマクロファージ遊走阻止能を創傷を処置するために利用してもよい。MIFは、異なる抗原に対する免疫応答を変化させる可能性がある。MIFは、化学および免疫解毒化系に連鎖する。MIFはBz-423によって約10倍誘導された。このように、本発明は、本発明の化合物の標的としてMIFを用いることを企図する。
【０１４５】
プロリフィン（prolifin）は、本発明によって処置した細胞において高レベルで誘導される。プロフィリンは、アクチンモノマーに結合して、いくつかのタンパク質およびホスホイノシチドと相互作用して、細胞骨格に対するシグナル伝達に連結している。プロフィリンは、アクチンモノマーを隔離して、アクチン上でATPのADPへの交換を増加させて、アクチンフィラメントの代謝回転速度を増加させる。いくつかの異なる腫瘍形成癌細胞株と非腫瘍形成細胞株との比較から、腫瘍細胞におけるプロフィリン1レベルが一貫してより低いことが示される。プロフィリン1 cDNAをCAL51乳癌細胞にトランスフェクトすると、プロフィリン1レベルは上昇して、細胞生長に対して突出した作用を有し、ヌードマウスにおいて過剰発現する細胞クローンの腫瘍形成性を抑制した。したがって、プロフィリン1（例えば、本発明の化合物、またはそれ以外によって）の誘導は、癌細胞の腫瘍形成を抑制する可能性がある。
【０１４６】
インターフェロン調節因子4（IRF-4）は、本発明の化合物によって処置した細胞において正常レベルより高く誘導される。IRF-4は、成熟リンパ球の恒常性および機能において本質的な役割を果たすIRF転写因子ファミリーの類リンパ／骨髄限定メンバーである。IRF-4発現は、休止期のプライマリT細胞において調節され、TCRクロスリンクのような刺激による、またはホルボルエステルおよびカルシウムイオノフォア（PMA/イオノマイシン）による処置による活性化後にmRNAおよびタンパク質レベルで一過性に誘導される。Jurkat細胞におけるIRF-4の安定な発現によって、インターロイキン（IL）-2、IL-4、IL-10、およびIL-13の合成における強い増強が起こる。IRF-4は、Tリンパ球がサイトカインの特有のアレイを産生する能力を制御する類リンパ特異的成分の一つを表す。アベルソン形質転換プロB細胞株において、IRF-4の強制的な発現は、生殖系列Igk転写を誘導するために十分である。本発明の化合物がIRF-4を誘導する作用は、BおよびT細胞の優勢なプロセスにおける自己免疫疾患に及ぼすその影響と共に、新生物B細胞クローンの生存に影響を及ぼす能力を説明する可能性がある。
【０１４７】
好ましい態様において、細胞死調節タンパク質GRIM19は、本発明の化合物によって処置した細胞において正常より高いレベルで誘導される。細胞生長抑制におけるインターフェロン（IFN）経路の重要性は公知である。IFNおよびオールトランスレチン酸の併用は、インビトロおよびインビボでの細胞生長をいずれかの物質単独より強く阻害する。IFN/RA誘導細胞死において役割を有する特異的遺伝子は、GRIM遺伝子と呼ばれるアンチセンスノックアウトアプローチによって同定された。GRIM19は、公知の任意のデス遺伝子範疇に含まれない新規細胞死関連遺伝子である。この遺伝子は、核に局在するアミノ酸144個のタンパク質をコードする。GRIM19の過剰発現は、カスパーゼ-9活性を増強して、IFN/RA処置に反応してアポトーシス細胞死を増強する。GRIM19は、前立腺腫瘍抑制にとって必須であるヒト染色体の19p13.2領域に存在し、このことはタンパク質が新規腫瘍抑制因子である可能性があることを意味する。本発明の化合物によるGRIM19の誘導によって、抗腫瘍効果が起こる可能性がある。
【０１４８】
IV．例示的な化合物
本発明の例示的な化合物を以下に提供する。
【０１４９】
いくつかの態様において、本発明の化合物は以下の構造、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを有する：
2007534770.tif 000039
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=O)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、またはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000040
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9は、SO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である。
【０１５０】
さらなる例示的な化合物において、Z-R6は共に以下から選択される：i．任意でR14によって置換されたチオフェニル；ii．任意でR14によって置換されたイミダゾリル；iii．-CH(アリール)(CO2C1-6アルキル)；iv．-CO2-アルキル；v．任意でハロゲンおよび／またはフェニル3個までによって置換された-SO2-アルキル；vi．任意でフェニルによって置換された-SO2-アルケニル；およびvii．
2007534770.tif 000041
式中R15は、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキルである、および／または二つのR15基は共に縮合ベンゾ環または5〜6員環ヘテロアリールを形成する；R16は、水素、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキル、および任意でハロゲン、シアノ、およびC1-4アルコキシの1〜3個によって置換されたフェニルオキシまたはベンジルオキシから選択される；R17はアルキル、アルコキシ、CO2C1-6アルキル、およびSO2フェニルから選択される；ならびにuおよびvは独立して0、1、または2である。
【０１５１】
他の例示的な化合物は以下の構造、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを有する：
2007534770.tif 000042
式中R1およびR5は、フェニル環Aおよびフェニル環Bの任意の利用可能な炭素原子に付着している、およびそれぞれの発生毎に、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、ハロゲン、シアノ、O(C1-6アルキル)、O(フェニル)、O(ベンジル)、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、C(=O)H、C(=O)(C1-6アルキル)、CO2H、CO2(C1-6アルキル)、C(=O)NH2、C(=O)NH(C1-6アルキル)、C(=O)N(C1-6アルキル)2、NHC(=O)(C1-6アルキル)、S(O)2(C1-6アルキル)、NHSO2(C1-6アルキル)、SO2NH2、SO2NH(C1-6アルキル)、SO2N(C1-6アルキル)2、C3-7シクロアルキル、フェニル、5もしくは6員環ヘテロアリール、または4〜7員環ヘテロシクロから独立して選択される、および／またはR1の2個および／またはR5の2個は共に縮合ベンゾ環を形成する；R2およびR3は独立して水素およびC1-4アルキルから選択される；Zは-CO2-、-SO2-である、または存在しない；R6は、任意で置換されたアルキル、アルケニル、アリールおよびヘテロアリールから選択される；mおよびnは、0、1および2から独立して選択される；ならびにqは0または1である。
【０１５２】
他の例示的な化合物は以下の構造、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを有する：
2007534770.tif 000043
式中R1およびR5は、フェニル環Aおよびフェニル環Bの任意の利用可能な炭素原子に付着している、およびそれぞれの発生毎にアルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個は共に接合して縮合ベンゾ環を形成する；R2、R3およびR4は、水素およびアルキルから独立して選択される；Zは-CO2-、-SO2-であるかまたは存在しない；R6は；a）任意で3個までのハロゲン、アリール、およびCO2C1-6アルキルによって置換されたC1-4アルキルまたはC1-4アルケニル；b）任意で3個までのR12によって置換された、および／またはベンゾ環または5〜6員環ヘテロアリールに縮合されたフェニル；c）任意で2個までのR12によって置換される、チオフェニル、イミダゾリル、ピラゾリル、およびイソキサゾリルから選択されるヘテロアリールであって、ただしR2が水素である場合、Z-R6は共に、-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000044
ではない；R7は、水素、ケト(=O)、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、ハロゲン、シアノ、O(C1-6アルキル)、O(フェニル)、O(ベンジル)、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、C(=O)H、C(=O)(C1-6アルキル)、CO2H、CO2(C1-6アルキル-)から選択される；R12は、その発生毎に、C1-6アルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキル、-CO2アルキル、-SO2フェニル、5〜6員環の単環ヘテロアリール、および任意でハロゲン、C1-4アルキル、および／またはO(C1-4アルキル)によって置換されているフェニルオキシまたはベンジルオキシから互いのR12から独立して選択される；ならびにmおよびnは独立して、0、1、または2から選択される。
【０１５３】
さらなる例示的な化合物において、Zは、-SO2である；R6はC1-4アルキル、トリフルオロメチル、ベンジル、フェニルによって置換されたC2-3アルケニル、
2007534770.tif 000045
である；R15は、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキルである、および／またはR15基2個が共に縮合ベンゾ環または5〜6員環ヘテロアリールを形成する；R16は水素、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキル、および任意でハロゲン、シアノ、およびC1-4アルコキシ1〜3個によって置換されているフェニルオキシまたはベンジルオキシから選択される；R17は、アルキル、アルコキシ、CO2C1-6アルキル、およびSO2フェニルから選択される；ならびにuおよびvは独立して、0、1、または2である。
【０１５４】
他の例示的な化合物は以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを有する：
2007534770.tif 000046
式中R1は、H、CN、およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択される；R3は、H、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される。
【０１５５】
他の例示的な化合物は以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを有する：
2007534770.tif 000047
式中R1は、H、2,4-Cl2、2,4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2は、H、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；Xは、OおよびNHからなる群より選択される；Yは、S、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される。
【０１５６】
本発明の特定の例示的な化合物には、以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない：
2007534770.tif 000048
2007534770.tif 000049
2007534770.tif 000050
2007534770.tif 000051
【０１５７】
本発明のさらに例示的な化合物は、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国暫定特許第60/607,599号、および第60/641,040号；ならびに米国特許出願第10/935,333号、第10/886,450号、第10/795,535号、第10/634,114号、第10/427,211号、第10/427,212号、第10/217,878号、第09/767,283号、第09/700,101号および関連出願において記述される。例えば、本発明の例示的な化合物には、以下の式もしくはそのエナンチオマー：
2007534770.tif 000052
式中R1は脂肪族もしくはアリールである；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、もしくは水素結合に関係する部分であって、式中R5はアリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7もしくは-R6-C(=O)-NH-R7であって、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、もしくは複素環であり、R3およびR4のそれぞれは、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、アリール、もしくは複素環である；またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１５８】
上記の構造において、R1は、炭素1〜20個および水素1〜20個のヒドロカルビル基である。好ましくは、R1は、炭素1〜15個、およびより好ましくは炭素1〜12個である。好ましくは、R1は、水素1〜12個を有し、より好ましくは水素1〜10個を有する。このように、R1は、脂肪族基およびアリール基となりうる。
【０１５９】
「脂肪族」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式として一般的に知られる基を表す。本明細書において用いられる「アリール」という用語は、フェニル環のような単一の芳香環、または互いに接続された（例えば、ビフェニル）もしくは共に縮合した（例えば、ナフタレンまたはアントラセン）二つもしくはそれより多い芳香環を表す。アリール基は、任意で、低級脂肪族基（例えば、C1-C4アルキル、アルケニル、アルキニル、またはC3-C6脂環式）によって置換されうる。さらに、脂肪族およびアリール基は-NH2、-NHCOCH3、-OH、低級アルコキシ(C1-C4)、ハロ（-F、-Cl、-Br、または-I）のような一つまたは複数の官能基によってさらに置換されうる。R1は、主に非極性部分であることが好ましい。
【０１６０】
上記の構造において、R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、または水素結合に関与する部分となりえて、式中R5は、アリール、複素環、R6-NH-C(=O)-R7、または-R6-C(=O)-NH-R7であり、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、または複素環である。「脂肪族」および「アリール」という用語は先に定義した通りである。
【０１６１】
本明細書において用いられるように、「水素結合に関与する部分」という用語は、プロトンを受容または供与してそれによって水素結合を形成することができる基を表す。
【０１６２】
水素結合に関与する部分のいくつかの非特異的で非制限的な実施例には、当技術分野で周知のフルオロ、酸素含有、および窒素含有基が含まれる。水素結合に関与する酸素含有基のいくつかの例には：ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級カルボニル、低級カルボキシル、低級エーテルおよびフェノール基が含まれる。本明細書において用いられる「低級」という修飾語句は、それに対してそれぞれの酸素含有官能基が付着する低級脂肪族基（C1-C4）を指す。
【０１６３】
このように、例えば、「低級カルボニル」という用語は、中でもホルムアルデヒド、アセトアルデヒドを指す。
【０１６４】
水素結合形成に関与する窒素含有基のいくつかの非制限的な例には、アミノおよびアミド基が含まれる。さらに、酸素および窒素の双方を含む基も同様に水素結合の形成に関与しうる。そのような基の例には、ニトロ、N-ヒドロキシ、および亜硝酸基が含まれる。
【０１６５】
同様に、本発明における水素結合アクセプターは、芳香環のπ電子となりうることも可能である。しかし、本発明の水素結合に関与する部分には、ホウ素のような金属原子を含む基は含まれない。さらに、本発明の実践の範囲において形成された水素結合には、「二水素結合」として知られる二つの水素間で形成された結合は含まれない（そのような二水素結合に関する詳しい記述に関しては、R.H. Crabtree, Science, 282:2000〜2001[1998]を参照されたい）。
【０１６６】
「複素環」という用語は、例えば、一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族の環を表す。ヘテロ原子は、互いに同じまたは異なりうる。複素環上に存在しうる他のヘテロ原子には、酸素および硫黄が含まれる。
【０１６７】
芳香族および非芳香族複素環基は当技術分野において周知である。芳香族複素環のいくつかの非制限的な例には、ピリジン、ピリミジン、インドール、プリン、キノリンおよびイソキノリンが含まれる。非芳香族複素環式化合物の非制限的な例には、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリジン、およびピラゾリジンが含まれる。酸素含有複素環の例には、フラン、オキシラン、2H-ピラン、4H-ピラン、2H-クロメンおよびベンゾフランが含まれるがそれらに限定されるわけではない。硫黄含有複素環の例には、チオフェン、ベンゾチオフェン、およびパラチアジンが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１６８】
窒素含有環の例には、ピロール、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピリジン、ピペリジン、ピラジン、ピペラジン、ピリミジン、インドール、プリン、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、トリアゾール、およびトリアジンが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１６９】
異なる二つのヘテロ原子を含む複素環の例には、フェノチアジン、モルホリン、パラチアジン、オキサジン、オキサゾール、チアジンおよびチアゾールが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１７０】
複素環は任意で、脂肪族、ニトロ、アセチル（すなわち、-C(=O)-CH3）、またはアリール基から選択される一つまたは複数の基によってさらに置換される。
【０１７１】
R3およびR4はそれぞれ、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、または置換アミノ（低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、またはヒドロキシアミノのような）、または炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基となりうる。R3およびR4のそれぞれが脂肪族基である場合、それは、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノまたは先に記述した置換アミノ基のような一つまたは複数の官能基によってさらに置換されうる。「脂肪族」という用語は先に定義した通りである。または、R3およびR4はそれぞれ、水素となりうる。
【０１７２】
多くの1,4-ベンゾジアゼピンが、タイル（tile）C3位置で複素環に導入されたキラリティのために、光学異性体として存在することは周知である。光学異性体は時に、文献においてL-またはD-異性体として記述される。または、異性体はR-およびS-左右像とも呼ばれる。単純にするために、これらの異性体を左右像またはエナンチオマーと呼ぶ。本明細書に記述の1,4-ベンゾジアゼピン化合物には、そのエナンチオマー型と共にラセミ混合物が含まれる。このように、本明細書において「ベンゾジアゼピンまたはそのエナンチオマー」という語法は、その全ての左右像と共にラセミ混合物を含む、記述の、または描写されたベンゾジアゼピンを指す。
【０１７３】
先の記述から、多くの特異的な例が、先に示された一般式から表されることは明らかである。このように、一つの例において、R1は脂肪族、R2は脂肪族であるが、もう一つの例において、R1はアリールであって、R2は水素結合形成に関与する部分である。または、R1は脂肪族となりえて、R2は-NHC(=O)-R5または水素結合に関与する部分となりえて、式中R5はアリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7、または-R6-C(=O)-NH-R7であり、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、または複素環である。それぞれの置換位置で特定の基を選択することによって生じる広範な副組み合わせが可能であり、そのような全ての組み合わせが本発明の範囲内である。
【０１７４】
さらなる例示的な化合物を以下に提供する：
2007534770.tif 000053
そのエナンチオマーおよび薬学的に許容される塩：
式中、R1は炭素原子1〜20個および水素原子1〜20個を有する脂肪族基または炭素原子20個までおよび水素原子20個までを有するアリール基である；
R2およびR3はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、C1-4アルコキシ、ハロ、アミノ、C1-4アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、炭素原子6〜14個を有するアリール基、ならびに窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族の環を有する複素環基からなる群より独立して選択される；
R4は脂肪族またはアリールである；
R5は、炭素原子6〜14個を有するアリール基、窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族の環を有する複素環基、-R6-NH-C(=O)-R7、ならびに-R6-C(=O)-NH-R7からなる群より選択される。
R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカー基である；ならびに
R7は、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、炭素原子6〜14個を有するアリール基、ならびに窒素、酸素、および硫黄から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員環の芳香族または非芳香族の環を有する複素環基からなる群より選択される。
【０１７５】
いくつかの好ましい態様において、例示的な化合物は、
2007534770.tif 000054
である。
【０１７６】
本発明のさらなる例示的な化合物を以下に提供する：
2007534770.tif 000055
もしくはそのエナンチオマーであって、式中R1は脂肪族またはアリールである；R2は脂肪族、アリール、-NH2-、-NHC(=O)-R5、または水素結合に関与する部分であり、R5はアリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7、または-R6-C(=O)-NH-R7であり、R6は炭素1〜6個の脂肪族リンカーであり、R7は脂肪族、アリール、または複素環であり、R3およびR4はそれぞれ、独立してヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、アリール、または複素環である；またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体。
【０１７７】
本発明の例示的な化合物のさらなる非制限的な例には以下が含まれる：
2007534770.tif 000056
式中R2は、
2007534770.tif 000057
およびジメチルフェニル（全ての異性体）およびジトリフルオロメチル（全ての異性体）である。
【０１７８】
以下の化合物も同様に企図される：
2007534770.tif 000058
【０１７９】
本発明はまた、化合物Bz-423を提供する。
2007534770.tif 000059
【０１８０】
Bz-423は、C-3で疎水性置換基が存在するために、臨床での用途がベンゾジアゼピンとは異なる。この置換によって、末梢のベンゾジアゼピン受容体（「PBR」）に対する結合は弱くなり（Kd約1μM）、中枢のベンゾジアゼピン受容体に対する結合が阻止されて、Bz-423は鎮静的ではない。
【０１８１】
いくつかの態様において、R2は、OSCPに対して化合物を結合させる任意の化学基である。そのようないくつかの態様において、R2は、疎水性芳香族基を含む。好ましい態様のいて、R2は、ベンゼンより大きい疎水性芳香族基（例えば、非水素置換基を有するベンゼン環、2個またはそれより多い芳香環を有する部分、7個またはそれより多い炭素原子を有する部分等）を含む。
【０１８２】
本発明のさらに特異的な化合物には以下が含まれる：
2007534770.tif 000060
2007534770.tif 000061
2007534770.tif 000062
2007534770.tif 000063
2007534770.tif 000064
2007534770.tif 000065
2007534770.tif 000066
2007534770.tif 000067
2007534770.tif 000068
2007534770.tif 000069
2007534770.tif 000070
R1はHまたはヒドロキシである
R2〜R6のそれぞれは、同じまたは異なってもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、類似の大きさの置換脂肪族基、炭素＜10個からなる環状脂肪族基、置換環状脂肪族基、アリールおよび複素環から選択される；
2007534770.tif 000071
R1〜R10のそれぞれは、同じまたは異なってもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、類似の大きさの置換脂肪族基、炭素＜10個からなる環状脂肪族基、置換環状脂肪族基、アリールおよび複素環から選択される；
2007534770.tif 000072
2007534770.tif 000073
2007534770.tif 000074
R1〜R11のそれぞれは、同じまたは異なってもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、類似の大きさの置換脂肪族基、炭素＜10個からなる環状脂肪族基、置換環状脂肪族基、アリールおよび複素環から選択される；
2007534770.tif 000075
R1〜R10のそれぞれは、同じまたは異なってもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、類似の大きさの置換脂肪族基、炭素＜10個からなる環状脂肪族基、置換環状脂肪族基、アリールおよび複素環から選択される；
2007534770.tif 000076
R1〜R10のそれぞれは、同じまたは異なってもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、類似の大きさの置換脂肪族基、炭素＜10個からなる環状脂肪族基、置換環状脂肪族基、アリールおよび複素環から選択される；
2007534770.tif 000077
R1〜R6のそれぞれは、同じまたは異なってもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換アミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、炭素1〜8個および水素1〜20個を有する脂肪族基、類似の大きさの置換脂肪族基、炭素＜10個からなる環状脂肪族基、置換環状脂肪族基、アリールおよび複素環から選択される；
2007534770.tif 000078
2007534770.tif 000079
2007534770.tif 000080
式中R1はナプタラミン、フェノール、1-ナプタレノール、2-ナプタレノール、
2007534770.tif 000081
2007534770.tif 000082
およびキノリンから選択される。
【０１８３】
以下の式を含む組成物：
2007534770.tif 000083
式中R1は、以下から選択される：
2007534770.tif 000084
本発明において具体化した全ての誘導体の立体化学は、R、S、またはラセミである。
【０１８４】
本発明のさらなる特異的化合物の例には以下が含まれる：
以下の式を含む組成物：
2007534770.tif 000085
【０１８５】
以下の式を含む組成物：
2007534770.tif 000086
式中、R1、R2、R3およびR4は：水素；CH3；炭素少なくとも2個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびヒドロキシサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびチオールサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアルデヒドサブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびケトンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびカルボン酸サブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミドサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアシル基少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、および窒素含有部分（例えば、ニトロ、ニトリル等）少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミングループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびエーテルサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびハロゲンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびニトロニウムサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖からなる群より選択される；R5は、OH、NO2、NR'、OR'からなる群より選択され、式中R'は、炭素少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびヒドロキシルサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびチオールサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアルデヒドサブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびケトンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し：およびカルボン酸サブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミドサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアシル基少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、および窒素含有部分（例えば、ニトロ、ニトリル等）少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびハロゲンサ��グループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびニトロニウムサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖からなる群より選択される；R6は、水素、NO2、Cl、F、Br、I、SR'およびNR'2からなる群より選択され、式中R'は、R5において先に定義した通りである；R7は、水素；炭素少なくとも2個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖からなる群より選択される；ならびにR8は、7個またはそれより多い非水素原子を含む任意の化学基を含み、アリールまたは脂肪族環状基である、ベンゼンより大きい脂肪族環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的（例えば、ミトコンドリア）に達するまで、R5の酸素をインビボでの代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位で代謝されて、R5をヒドロキシル基に変換する。
【０１８６】
本発明において有用なさらに例示的な化合物および使用は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2004年1月15日に公表された米国特許公開第2004/0009972号に記述されている。本発明において有用なさらなる例示的な化合物および使用は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国暫定特許第60/607,599号および第60/641,040号、ならびに米国特許出願第10/935,333号、第10/886,450号、第10/795,535号、第10/634,114号、第10/427,211号、第10/427,212号、第10/217,878号、第09/767,283号、第09/700,101号に記述されている。本発明において有用なさらに例示的な化合物および使用は、そのそれぞれの全内容物が、Atwal, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 1027〜1030(2004)およびAtwal, et al., J. Med. Chem. 47, 1081〜1084(2004)；において記述されている。
【０１８７】
さらに、本開示を通して得られた数値範囲は、その範囲内の任意の可能性がある小範囲を企図する柔軟な範囲であると解釈すべきである。例えば、炭素1〜10個の範囲を有する基に関する記述はまた、例えば炭素1〜3個、1〜5個、1〜8個または2〜3個、2〜5個、2〜8個、3〜4個、3〜5個、3〜7個、3〜9個、3〜10個等の小範囲を有する基を企図するであろう。このように、範囲1〜10個は、多くの可能性がある小範囲が明らかに企図される範囲の外領域を表すと理解すべきである。他の状況における範囲を企図するさらなる例は、そのような範囲にその中の類似の小範囲が含まれる、本開示を通して認められうる。
【０１８８】
要約すると、多数の化合物が本明細書において提示される。これらの化合物の一つまたは複数を用いて、本明細書において他所で記述したように細胞死に関連する多様な調節異常障害を処置することができる。さらに、これらの化合物の任意の一つまたは複数を用いて、細胞合成または細胞生存率に影響を及ぼすことなく、ATP加水分解を阻害することができる。さらに、これらの化合物の任意の一つまたは複数を、薬学的組成物において薬学的に許容される担体または希釈剤と共に、少なくとも一つの他の治療物質（例えば、カリウムチャンネル開放剤、カルシウムチャンネル遮断剤、ナトリウム水素交換剤阻害剤、抗不整脈剤、抗アテローム性動脈硬化症剤、抗凝固剤、抗血栓剤、プロトロンビン溶解剤、フィブリノーゲン拮抗剤、利尿剤、抗高血圧剤、ATPアーゼ阻害剤、鉱質コルチコイド受容体拮抗剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、抗糖尿病剤、抗炎症剤、抗酸化剤、血管新生調節剤、抗骨粗鬆症剤、ホルモン補充療法、ホルモン受容体調節剤、経口避妊薬、抗肥満剤、抗うつ剤、抗不安剤、抗精神剤、抗増殖剤、抗腫瘍剤、抗潰瘍および胃食道逆流疾患剤、成長ホルモン剤および／または成長ホルモン分泌促進剤、甲状腺模倣剤、抗感染剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、コレステロール／脂質低下剤および脂質プロフィール治療、ならびに虚血状態調整および／または心筋気絶を模倣する物質、抗アテローム性動脈硬化症剤、抗凝固剤、抗血栓剤、抗高血圧剤、抗糖尿病剤、ならびにACE阻害剤、AT-1受容体拮抗剤、ET受容体拮抗剤、二重ET/AII受容体拮抗剤、およびバソペプシダーゼ阻害剤から選択される抗高血圧剤、またはGPIIb/IIIa遮断剤、P2Y1およびP2Y12拮抗剤、トロンボキサン受容体拮抗剤、およびアスピリンから選択される抗血小板剤）と併用して用いることができる。さらに、これらの化合物の任意の一つまたは複数を用いて、患者におけるミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ関連障害（例えば、心筋梗塞、心室過栄養、冠動脈疾患、非Q波MI、うっ血性心不全、心不整脈、不安定狭心症、慢性安定狭心症、プリンズメタル型狭心症、高血圧症、間欠性は行、末梢閉塞性動脈疾患、血栓塞栓発作の血栓または血栓塞栓症状、静脈血栓症、動脈血栓症、脳血栓症、肺動脈塞栓症、脳塞栓症、血栓形成傾向、播種性血管内凝固、再狭窄、心房細動、心室肥大、アテローム性動脈硬化性血管疾患、アテローム斑破裂、アテローム斑形成、移植性アテローム性動脈硬化症、血管リモデリングアテローム性動脈硬化症、癌、手術、炎症、全身感染症、人工表面、介入的心臓学、不動症、投薬、妊娠および流産、ならびに網膜症、腎症、および神経症を含む糖尿病合併症）を処置することができる。上記の化合物はまた、薬物スクリーニングアッセイおよび他の診断法においても用いることができる。
【０１８９】
V．薬学的組成物、製剤、ならびに例示的な投与経路および用量の検討
企図される様々な薬剤および薬学的組成物の例示的な態様を以下に提供する。
【０１９０】
A．薬剤の調製
本発明の化合物は、細胞死の調節異常、異常な細胞生長、および過増殖に関連した多様な状態を処置するための薬剤の調製において有用である。
【０１９１】
さらに、化合物はまた、化合物の有効性が公知であるかまたは予測される他の障害を処置するための薬剤を調製するために有用である。そのような障害には、神経学的（例えば、てんかん）または神経筋障害が含まれるがそれらに限定されるわけではない。化合物の薬剤を調製するための方法および技術は当技術分野で周知である。例示的な薬学的製剤および送達経路を以下に記述する。
【０１９２】
当業者は、多くの特異的態様を含む、本明細書に記述の化合物の任意の一つまたは複数が標準的な薬学的製造技法を適用することによって調製されることを認識するであろう。そのような薬剤は、薬学的技術分野において周知の送達法を用いて被験者に送達される。
【０１９３】
B．例示的な薬学的組成物および製剤
本発明のいくつかの態様において、組成物は単独で投与されるが、他のいくつかの態様において、組成物は、上記の少なくとも一つの活性成分／物質（例えば、ベンゾジアゼピン誘導体）を、固体支持体と共に、または一つもしくは複数の薬学的に許容される担体と共におよび任意で他の治療物質と共に含む薬学的製剤において存在する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性であって、被験者に対して有害でないという意味において「許容され」なければならない。
【０１９４】
企図される製剤には、適した経口、直腸内、鼻腔内、局所（経皮、口腔内、および舌下を含む）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）、および肺内投与製剤が含まれる。いくつかの態様において、製剤は、薬学の技術分野において公知の任意の方法によって調製される。そのような方法には、活性成分を一つまたは複数の補助成分を構成する担体と会合させる段階が含まれる。一般的に、製剤は、活性成分を、液体担体または細粉化した固体担体またはその双方と均一および十分に会合させる（例えば、混合）段階、ならびに必要であれば産物に成型する段階によって調製される。
【０１９５】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤のような個別の単位として提示されてもよく、それぞれは好ましくは；粉末または顆粒として；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、活性成分の既定量を含む。他の態様において、活性成分は、ボーラス、し剤、またはパスタ剤等として提示される。
【０１９６】
いくつかの態様において、錠剤は少なくとも一つの活性成分と、任意で一つまたは複数の補助成分／担体とを含み、それぞれの物質を圧縮または成型することによって作製される。好ましい態様において、圧縮錠は、粉剤または顆粒剤のような自由に流動する型の活性成分を、任意で結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスリンクしたポビドン、クロスリンクしたカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤と混合して、適した機械において圧縮することによって調製される。成型錠は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末にした化合物（例えば、活性成分）の混合物を、適した機械において成型することによって作製される。錠剤は任意で、コーティングを行うまたは刻み目を入れてもよく、望ましい放出プロフィールを提供するために例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な比率で用いて、活性成分の遅いまたは調節された放出を提供するように調製してもよい。任意で、胃以外の腸管の部分での放出を提供するために、錠剤に腸溶コーティングを提供してもよい。
【０１９７】
口腔内での局所投与に適した製剤には、着香基剤において、通常、蔗糖およびアカシアまたはトラガカントにおいて活性成分を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリン、または蔗糖およびアカシアのような不活性基剤において活性成分を含む香錠；ならびに適した液体担体において活性成分を含むマウスウォッシュが含まれる。
【０１９８】
本発明に従う局所投与のための薬学的組成物は、任意で軟膏、クリーム、坐剤、ローション、粉剤、液剤、パスタ剤、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として製剤化される。もう一つの態様において、局所製剤は、活性成分に含浸して、任意で一つまたは複数の賦形剤または希釈剤を含む包帯または絆創膏のような小片または包帯剤を含む。好ましい態様において、局所製剤には、皮膚または他の弛緩領域を通して活性成分の吸収または浸透を増強する化合物が含まれる。そのような皮膚浸透増強剤の例には、ジメチルスルホキシド（DMSO）、および関連類似体が含まれる。
【０１９９】
望ましければ、クリーム基剤の水相には、例えば、少なくとも約30％w/wの多価アルコール、すなわち、プロピレングリコール、ブタン-1,3-ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、およびポリエチレングリコールのような、二つまたはそれより多いヒドロキシル基を有するアルコールならびにその混合物が含まれる。
【０２００】
いくつかの態様において、本発明の油相乳剤は、公知の方法で公知の成分から構成される。この相は典型的に、単独の乳化剤（そうでなければエマルジェントとして知られる）を含み、同様にこの相に関するいくつかの態様において、脂肪もしくは油、または脂肪および油の双方と共に、少なくとも一つの乳化剤の混合物をさらに含むことが望ましい。
【０２０１】
好ましくは、疎水性乳化剤は、安定化剤として作用するために親油性乳化剤と共に含まれる。いくつかの態様において、油および脂肪の双方を含むことも同様に好ましい。共に、乳化剤は安定化剤と共にまたは安定化剤を含まずにいわゆる乳化ロウを形成し、ロウは油および／または脂肪と共に、クリーム製剤の油分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を形成する。
【０２０２】
本発明の製剤において用いるために適したエマルジェントおよび乳化安定化剤には、Tween 60、Span 80、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、およびラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。
【０２０３】
製剤のための適した油または脂肪の選択は、薬学的乳剤製剤において用いられる可能性が高いほとんどの油における活性化合物／物質の溶解性が非常に低いことから、所望の特性（例えば、整容的特性）を得ることに基づく。このように、クリームは好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を回避するために適した粘ちょう度を有する、非脂肪性、非染色性で洗浄可能な産物でなければならない。ジイソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナッツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸2-エチルヘキシルのような直鎖状もしくは分岐鎖の一塩基もしくは二塩基アルキルエステル、またはCrodamol CAPとして知られる分岐鎖エステルの混合物を用いてもよく、最後の三つが好ましいエステルである。これらを、必要な特性に応じて、単独または併用して用いてもよい。または、白色軟パラフィンおよび／または液体パラフィンまたは他の鉱油のような高融点脂質を用いることができる。
【０２０４】
眼に対する局所投与に適した製剤には、活性成分が適した担体、特に物質の水性溶媒において分散または懸濁している点眼剤が含まれる。
【０２０５】
直腸内投与のための製剤は、例えばカカオバター、またはサリチレートを含む適した基剤を有する坐剤として提示されてもよい。
【０２０６】
膣内投与に適した製剤は、物質の他に、当技術分野において適当であることが公知である担体を含む、ペッサリー、クリーム、ゲル、パスタ、フォーム、またはスプレー製剤として提示されてもよい。
【０２０７】
担体が固体である鼻腔内投与に適した製剤には、例えば約20〜約500ミクロンの範囲の粒子径を有する目の荒い粉末が含まれ、これを鼻から吸入する方法で、すなわち鼻の近くで保持した粉末容器から鼻腔を通しての急速な吸入（例えば、強制的に）によって投与する。担体が投与のための液体である他の適した製剤には、鼻腔スプレー、点鼻剤、またはネブライザーによるエアロゾルが含まれるがそれらに限定されるわけではなく、物質の水溶液または油性溶液が含まれる。
【０２０８】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌等張注射液、懸濁剤および濃化剤が含まれてもよい水性および非水性滅菌懸濁液、ならびに血液成分または一つもしくは複数の臓器に化合物をターゲティングするように設計されたリポソームまたは他の微粒子系が含まれる。いくつかの態様において、製剤は、単位用量、または多用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアルにおいて提示／製剤化され、滅菌液体担体、例えば注射用水を使用直前に加えるだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即時調合注射液および懸濁液は、既に記述された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【０２０９】
好ましい単位投与製剤は、物質の1日量もしくは単位、本明細書において先に引用した1日下量、またはその適当な分画を含む製剤である。
【０２１０】
先に特に言及した成分の他に、本発明の製剤には、問題の製剤のタイプに関して当技術分野で通常である他の物質が含まれてもよく、例えば経口投与に適した製剤には、甘味料、濃化剤、および着香料のようなさらなる物質が含まれてもよいと理解すべきである。同様に、本発明の物質、組成物および方法は他の適した組成物および治療と併用されると意図される。なお他の製剤には、任意で食品添加物（適した甘味料、着香料、着色剤等）、植物栄養（例えば、亜麻仁油）、無機質（例えば、Ca、Fe、K等）、ビタミン、および他の許容される組成物（例えば、複合リノレン酸）、増量剤、および安定化剤等が含まれてもよい。
【０２１１】
C．例示的な投与経路および投与の検討
様々な送達系、例えばリポソームにおける封入、微粒子、マイクロカプセル、受容体媒介エンドサイトーシス等が公知であり、本発明の治療物質（例えば、ベンゾジアゼピン誘導体）を投与するために用いることができる。送達法には、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内および経口経路が含まれるがそれらに限定されるわけではない。特異的態様において、本発明の薬学的組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい可能性がある；これは、例えば手術時の局所注入、注射、またはカテーテルによって行ってもよいがこれらに限定されるわけではない。
【０２１２】
本明細書においてその意図する目的に関して有効であると同定された物質は、標的細胞の病的な生長およびこれに関連した状態に対して感受性があるまたは発症のリスクを有する被験者または個体に投与されうる。物質がマウス、ラット、またはヒト患者のような被験者に投与される場合、物質を薬学的に許容される担体に加えて、これを被験者に全身または局所投与することができる。有用に処置されうる患者を決定するために、組織試料を患者から採取して、細胞を物質に対する感受性に関してアッセイする。
【０２１３】
治療量は経験的に決定され、処置される状態、処置される被験者、ならびに物質の有効性および毒性によって変化する。動物に送達される場合、方法は、物質の有効性をさらに確認するために有用である。動物モデルの一つの例は、MLR/MpJ-lpr/lpr（「MLR-lpr」）（Jackson Laboratories, Bal Harbor, Maineから入手可能）である。MLR-lprマウスは全身性自己免疫疾患を発症する。または腫瘍の生長を誘導することによって、例えば本明細書において定義される過増殖性の癌または標的細胞約105個〜約109個をヌードマウスに皮下接種することによって他の動物モデルを開発することができる。腫瘍が確立された後、本明細書に記述の化合物を例えば腫瘍の周囲に皮下注射することによって投与する。腫瘍の大きさの低減を決定するための腫瘍の測定を、2週間に1回、ベニア（venier）キャリパーを用いて二つの寸法において行う。他の動物モデルも同様に適当であれば用いてもよい。上記の疾患および状態に関するそのような動物モデルは、当技術分野で周知である。
【０２１４】
いくつかの態様において、インビボ投与は一つの用量において、処置期間を通して連続的または間欠的に行われる。最も有効な投与手段および投与用量を決定する方法は当業者に周知であり、治療のために用いられる組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される被験者によって変化する。処置を行う医師によって選択された用量レベルおよびパターンについて、1回または複数回投与を行う。
【０２１５】
適した投与製剤および物質の投与法は、当業者によって容易に決定される。好ましくは、化合物は約0.01 mg/kg〜約200 mg/kg、より好ましくは約0.1 mg/kg〜約100 mg/kg、さらにより好ましくは約0.5 mg/kg〜約50 mg/kgで投与される。本明細書に記述の化合物をもう一つの物質（例えば、感作物質）と同時投与する場合、有効量は、単独で物質を用いる場合より少なくてもよい。
【０２１６】
薬学的組成物は経口、鼻腔内、非経口、または吸入治療によって投与されえて、錠剤、ロゼンジ、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル剤、坐剤、またはエアロゾル型であってもよい。それらはまた、水性または非水性希釈剤、シロップ剤、顆粒剤または粉剤における活性成分の懸濁剤、溶液、および乳剤の形であってもよい。本発明の物質の他に、薬学的組成物はまた、薬学的に活性な他の化合物または本発明の複数の化合物を含みうる。
【０２１７】
より詳しく述べると、本明細書において活性成分と呼ばれる本発明の物質は、経口、直腸内、鼻腔内、局所（経皮、エアロゾル、口腔内および舌下が含まれるがそれらに限定されるわけではない）、膣内、パレンタル（parental、皮下、筋肉内、静脈内、および皮内が含まれるがそれらに限定されるわけではない）および肺内が含まれるがそれらに限定されるわけではない任意の適した経路によって治療のために投与されてもよい。同様に、好ましい経路は、レシピエントとの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変化すると認識される。
【０２１８】
理想的には、物質は、疾患部位で活性化合物のピーク濃度を得るように投与すべきである。これは、例えば、任意で生理食塩液における物質の静脈内注射、または活性成分を含む錠剤、カプセル剤、またはシロップ剤としての経口投与によって達成してもよい。
【０２１９】
物質の望ましい血液レベルは、疾患組織内で活性成分の治療量を提供するために連続的注入によって維持してもよい。効力を有する組み合わせを用いることは、個々の治療化合物または薬物が単独で用いられる場合に必要とされる用量より、必要とされる各成分の抗ウイルス剤の総用量が低く、それによって有害作用を低減させる治療的併用を提供すると企図される。
【０２２０】
D．例示的な同時投与経路および投与検討
本発明にはまた、本明細書に記述の化合物と、一つまたは複数のさらなる活性物質との同時投与を含む方法が含まれる。実際に、本発明の化合物を同時投与することによって、先行技術の治療および／または薬学的組成物を増強する方法を提供することは、本発明のさらなる局面である。同時投与技法において、物質は同時または連続的に投与されてもよい。一つの態様において、本明細書に記述の化合物は他の活性物質の前に投与される。薬学的製剤および投与様式は先に記述した任意のものであってもよい。さらに、二つまたはそれより多い同時投与化学物質、生物学的物質、または放射線をそれぞれ、異なる様式または異なる製剤を用いて投与してもよい。
【０２２１】
同時投与される物質または複数の物質は、処置される状態のタイプに依存する。例えば、処置される状態が癌である場合、さらなる物質は化学療法剤または放射線となりうる。処置される状態が自己免疫疾患である場合、さらなる物質は免疫抑制剤または抗炎症剤となりうる。処置される状態が慢性炎症である場合、さらなる物質は抗炎症剤となりうる。抗癌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤のような同時投与されるさらなる物質は、現在臨床で用いられている物質を含む、当技術分野において周知の任意の物質となりうる。放射線処置の適当なタイプおよび線量の決定は、当業者の範囲内である、または相対的な容易さから決定することができる。
【０２２２】
異常なアポトーシスに関連する様々な状態の処置は、一般的に以下の二つの主な要因によって制限される：（1）薬物耐性の発生、および（2）公知の治療物質の毒性。特定の癌において、例えば化学物質および放射線治療に対する耐性は、アポトーシスの阻害に関連することが示されている。いくつかの治療物質は、非特異的リンパ毒性、腎毒性および骨髄毒性を含む、有害な副作用を有する。
【０２２３】
本明細書に記述の方法は、これらの問題の双方に取り組む。治療の恩典を得るために用量の増加を必要とする薬物耐性は、本明細書に記述の化合物を公知の物質と共に投与することによって克服される。本明細書に記述の化合物は、標的細胞を公知の物質に対して感作する（およびその逆）ように思われ、したがって、治療の恩典を得るために必要なこれらの物質はより少ない。
【０２２４】
請求される化合物の感作機能はまた、公知の治療薬の毒性効果に関連した問題に取り組む。公知の物質が毒性である場合において、全ての場合において、特に薬物耐性によって必須の用量が増加した場合には、投与される用量を制限することが望ましい。請求の化合物が公知の物質と同時投与される場合、それらは、必要な用量を低減させ、それによって有害な効果を低減させる。さらに、請求の化合物は高用量においてそれ自身有効かつ非毒性であることから、これらの化合物を公知の毒性治療より比率的に多く同時投与することは、毒性効果を最小限にしながら所望の効果を得るであろう。
【０２２５】
VI．薬物スクリーニング
本発明の好ましい態様において、本発明の化合物およびおそらく他の有用な化合物を、その生物活性（例えば、単独または他の化合物と併用して細胞死を開始する能力）に関してスクリーニングする。本発明の好ましい態様において、本発明の化合物、およびおそらく他の有用な化合物を、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質（OSCP）部分に対するその結合親和性に関してスクリーニングする。特に好ましい態様において、化合物は、組換え型OSCPタンパク質に対するその結合親和性を測定することによって本発明の方法において用いるために選択される。受容体に対する薬物および他の低分子の結合親和性を測定するための多くの適したスクリーニングが当技術分野において公知である。いくつかの態様において、結合親和性スクリーニングは、インビトロ系において行われる。他の態様において、これらのスクリーニングは、インビボまたはエクスビボ系において行われる。いくつかの態様において、本発明の化合物の投与後にATPの細胞内レベルを定量することは、方法の有効性の指標を提供するが、本発明の好ましい態様は、細胞内ATPまたはpHレベルの定量を必要としない。
【０２２６】
さらなる態様は、本発明の特定の企図される方法および化合物の有効性を測定するために、細胞および／または組織におけるスーパーオキサイドのレベル（例えば、細胞内）を測定することに向けられる。この点において、当業者は、細胞および／または組織におけるスーパーオキサイドレベルを測定するために有用な多くのアッセイおよび方法を認識して、提供することができるであろう。
【０２２７】
いくつかの態様において、本発明の化合物のOSCPに対する結合親和性を予測するための構造に基づく仮想スクリーニング方法論が企図される。
【０２２８】
いくつかの態様において、化合物はミトコンドリアATPシンターゼ活性の調節能に関して、細胞培養またはインビボで（例えば、非ヒト、またはヒト哺乳動物）においてスクリーニングされる。細胞増殖アッセイ（例えば、Promega, Madison, WIおよびStratagene, La Jolla, CAから市販されている）および細胞に基づく二量体形成アッセイ（例えば、Fuh et al., Science, 256;1677[1992]；Colosi et al., J. Biol. Chem., 268:12617[1993]を参照されたい）任意の適したアッセイを利用してもよい。本発明において有用なさらなるアッセイフォーマットには、細胞ATPレベル、および細胞スーパーオキサイドレベルを測定するためのアッセイが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２２９】
ベンゾジアゼピンまたは他の化合物のOSCPに対する結合率または親和性の測定を可能にする任意の適したアッセイを利用してもよい。例には、Bz-423を用いる競合的結合、表面プラズモンレゾナス（resonace）（SPR）および放射免疫沈殿アッセイ（Lowman et al., J. Biol. Chem. 266:10982[1992]）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。表面プラズモン共鳴技術は、その中で表面プラズモンと呼ばれる電磁波が、表面プラズモン共鳴角と呼ばれる特異的角度で入射する光線によって金属ガラス界面上に誘導される、金、銀、クロム、またはアルミニウムのような電導性金属の薄膜をコーティングした表面を含む。捕獲された高分子が結合した後の溶液と金属表面との界面領域の屈折指数の調節によって、直接測定されうる、または金属表面の下面から反射した光の量を変化させるSPR角の変化が起こる。そのような変化は、SPR装置表面に対して結合する分子の質量および他の光学特性に直接関連しうる。そのような原理に基づくいくつかのバイオセンサー系が開示されている（例えば、国際公開公報第90/05305号を参照されたい）。同様に、いくつかのSPRバイオセンサーが市販されている（例えば、BiaCore, Uppsala, Sweden）。
【０２３０】
いくつかの態様において、化合物は、ミトコンドリアATPシンターゼ活性の調節能に関して細胞培養またはインビボ（例えば、非ヒトまたはヒト哺乳動物）でスクリーニングされる。細胞増殖アッセイ（例えば、Promega, Madison, WIおよびStratagene, La Jolla, CAから市販されている）および細胞に基づく二量体形成アッセイ（例えば、Fuh et al., Science, 256;1677[1992]；Colosi et al., J. Biol. Chem., 268:12617[1993]を参照されたい）が含まれるがそれらに限定されるわけではない任意の適したアッセイを利用してもよい。本発明において有用なさらなるアッセイフォーマットには、細胞ATPレベル、および細胞スーパーオキサイドレベルを測定するためのアッセイが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２３１】
本発明はまた、望ましい特性（例えば、結合親和性、活性等）を増加させるために、または望ましくない特性（例えば、非特異的反応性、毒性等）を最小限にするために、本発明の組成物を改変および誘導体化する方法を提供する。化学誘導体化の原理は十分に理解されている。いくつかの態様において、反復設計および化学合成アプローチを用いて、親化合物から誘導体化子化合物のライブラリを産生する。他の態様において、合理的設計法を用いて、ルーチンによる実験によって結果を確認する前に、インシリコリガンド-受容体相互作用を予測してモデルを作製する。
【０２３２】
VII．治療応用
A．一般的治療応用
特に好ましい態様において、本発明の組成物は、罹患細胞または組織（例えば、心筋梗塞、心室過栄養、冠動脈疾患、非Q波MI、うっ血性心不全、心不整脈、不安定狭心症、慢性安定狭心症、プリンズメタル型狭心症、高血圧症、間欠性は行、末梢閉塞性動脈疾患、血栓塞栓発作の血栓または血栓塞栓症状、静脈血栓症、動脈血栓症、脳血栓症、肺動脈塞栓症、脳塞栓症、血栓形成傾向、播種性血管内凝固、再狭窄、心房細動、心室肥大、アテローム性動脈硬化性血管疾患、アテローム斑破裂、アテローム斑形成、移植性アテローム性動脈硬化症、血管リモデリングアテローム性動脈硬化症、癌、手術、炎症、全身感染症、人工表面、介入的心臓学、不動症、投薬、妊娠および流産、ならびに網膜症、腎症、および神経症を含む糖尿病合併症）におけるミトコンドリアATPシンターゼ（ミトコンドリアF0F1 ATPアーゼとも呼ばれる）複合体の活性を調節（例えば、阻害または促進）することによって、多くの状態（例えば、細胞または組織における壊死および／またはアポトーシスの調節異常を特徴とする疾患、異常な細胞生長および／または過増殖を特徴とする疾患等）の任意の一つまたは複数に苦しむ患者に対して治療の恩典を提供する。さらに好ましい態様において、本の組成物は、自己免疫／慢性炎症状態（例えば、乾癬）を処置するために用いられる。さらにさらなる態様において、本発明の組成物は、易罹患（例えば、閉鎖）血管を処置するために狭窄治療と共に用いられる。
【０２３３】
特に好ましい態様において、本発明の組成物は、この多サブユニットタンパク質複合体の特異的サブユニットまたは複数のサブユニットに結合することによって、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体の活性を阻害する。本発明は、投与される物質の作用に関する如何なる特定のメカニズムまたは理解にも限定されないが、いくつかの態様において、本発明の組成物は、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質（OSCP）部分、OSCP接合部、またはF1サブユニットに結合する。同様に、本発明の組成物がOSCPに結合する場合、最初の影響はミトコンドリアATPシンターゼ複合体の全体的な阻害であること、および結合の下流の結果は、ATPまたはpHレベルの変化および反応酸素種（例えば、O2-）の産生であるとさらに企図される。なお他の好ましい態様において、本発明は、投与される物質の作用に関する如何なる特定のメカニズムまたは理解にも限定されないが、フリーラジカルの産生によって最終的に殺細胞が起こると企図される。なお他の態様において、本発明は、投与される物質の作用に関する如何なる特定のメカニズムまたは理解にも限定されないが、本発明の組成物および方法を用いるミトコンドリアATPシンターゼ複合体の阻害は、細胞増殖の治療的に有用な阻害を提供すると企図される。
【０２３４】
したがって、本発明において具体化される好ましい方法は、オリゴマイシン感受性付与タンパク質（OSCP）部分／ミトコンドリアATPシンターゼのF1の複合体に対する結合によって、罹患細胞または組織におけるミトコンドリアATPシンターゼ複合体の活性を調節（例えば、阻害または促進）する本発明の化合物を提供することによって、患者に治療の恩典を提供する。重要なことは、OSCP自身は生物活性を有しない。
【０２３５】
このように、より広い意味において、本発明の好ましい態様は、細胞または組織における壊死および／またはアポトーシスプロセスの調節異常を特徴とする多くの疾患、または異常な細胞生長および／または過増殖を特徴とする疾患を、オリゴマイシン感受性付与タンパク質（OSCP）／そのF1成分に結合することが含まれるがそれらに限定されるわけではない、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体の活性を調節することによって、処置されうるという発見に向けられる。しかし、本発明は、本明細書に明確に記述される組成物および方法の実践に限定されると意図されない。実際に、当業者は、本明細書において特に引用されていない多くのさらなる化合物（例えば、非ベンゾジアゼピン誘導体）が、本明細書に開示の方法においてミトコンドリアATPシンターゼの活性を調節するために用いるために適していることを認識するであろう。
【０２３６】
本発明はこのように、当技術分野において現在公知の、または後に開発された任意の数の適した化合物が、任意で本発明の方法において有用となりうることを特に企図する。例えば、オリゴマイシン、オッサマイシン、シトバリシン、アポプトリジン、バフィロミキシン、レスベラトロール、ピセアタノール、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCD）等を含む化合物は、本発明の方法において有用である。しかし本発明は、先に明記した方法または化合物に限定されると意図されない。一つの態様において、本発明の方法においておそらく有用である化合物は、科学文献に記述されているように適した化合物から選択してもよい（例えば、K.B. Wallace and A.A. Starkov, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 40:353〜388[2000]；A.R. Solomon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 97(26):14766〜14771[2000]を参照されたい）。
【０２３７】
いくつかの態様において、本発明の方法においておそらく有用である化合物を、有効性に関して米国国立癌研究所の癌細胞株（NCI-60）に対してスクリーニングする。（例えば、A.Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83:757〜766[1991]；およびK.D. Paull et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1088〜1092[1989]を参照されたい）。さらなる適したスクリーニング（例えば、自己免疫疾患モデル等）は当業者の範囲内である。
【０２３８】
一つの局面において、例示的な化合物の誘導体（例えば、薬学的に許容される塩、類似体、立体異性体等）または他の適した化合物も同様に、本発明の方法において有用であると企図される。
【０２３９】
他の好ましい態様において、本発明の組成物は、易罹患（例えば、閉鎖）血管を処置するための狭窄治療と共に用いられる。さらなる態様において、本発明の組成物は、易罹患心血管を処置するために狭窄治療と共に用いられる。
【０２４０】
血管の狭窄は、血管（例えば、大動脈弁）が狭くなる場合に起こる状態である。例えば、大動脈弁の狭窄は、心臓の下位左室（左心室）と大動脈と呼ばれる大きい血管とのあいだの弁が狭くなる場合に発症する心状態である。この狭くなること（例えば狭窄）によって、体に血液が流れるための空間が小さくなる。通常、左心室は、体中の動脈系に枝分かれする大動脈を通して体に酸素に富む血液を送り出す。心臓が血液を送り出すと、大動脈弁の三つの弁または小葉が一方向に開いて心室から大動脈へと血液を流す。心拍のあいだに、弁は閉じて血液が弁を通して逆向きに漏れないように堅固な密閉を形成する。大動脈弁が損傷すると、これは狭くなり（狭窄）、心臓自身を含む体の臓器に対する血流が低減する可能性がある。一度症状が発症すると、大動脈弁狭窄を有する人々の長期的な見通しは不良である。無処置の大動脈弁狭窄を有し、心不全の症状を発症する人々の余命は通常、3年またはそれ未満である。
【０２４１】
易罹患弁を処置するためにいくつかのタイプの処置（例えば、バルーン拡張、切除、アテローム切除、またはレーザー処置）が存在する。易罹患心臓弁に関する一つのタイプの処置は血管形成術である。血管形成術は、バルーンを先端に有するチューブまたはカテーテルを、狭いまたは遮断された動脈にそれを開く試みで挿入する段階を含む。バルーンを数回膨らませたりしぼませたりすることによって、医師は通常、動脈を広げることができる。
【０２４２】
血管形成術または弁拡張技法の一般的な制限は再狭窄である。再狭窄は、例えば動脈のバルーン拡張、切除、アテローム切除、またはレーザー処置のような、動脈の狭窄部分を開く努力によって引き起こされたその動脈に対する外傷後の末梢または冠動脈の再閉鎖である。これらの血管形成技法に関して、再狭窄は、定義、血管の位置、病変の長さ、ならびに多くの他の形態学的および臨床変数に応じて約20〜50％の割合で起こる。再狭窄は、血管形成技法によって引き起こされた動脈壁の損傷に対する自然の治癒反応であると考えられている。治癒反応は、損傷部位での血栓メカニズムによって始まる。治癒プロセスの複雑な段階の最終的な結果は、内膜過形成となりえて、これは動脈が再度再狭窄または閉鎖されるまで、その細胞外マトリクス産生と組み合わさった内側平滑筋細胞の制御されない遊走および増殖である。
【０２４３】
再狭窄を予防する試みにおいて、金属製の血管内ステントが冠血管または末梢血管において永続的に埋め込まれている。ステントは典型的に、拡張して動脈壁の疾患部分に接すると言われる血管内腔にカテーテルによって挿入され、それによって内腔の機械的支持体を提供する。しかし、そのようなステントについてもその場で再狭窄がなおも起こりうることが判明している。同様に、ステント自身が望ましくない局所血栓を引き起こしうる。血栓症の問題に取り組むために、ステントを有する人はまた、抗凝固剤および抗血小板薬による広範な全身処置を受ける。
【０２４４】
再狭窄の問題に取り組むために、内皮細胞を播種したステントを提供することが提唱されている（Dichek, D.A. et al.,「 Seeding of Intravascular Stents With Genetically Engineered Endothelial Cells； Circulation 1989； 80:1347〜1353）。その実験において、細菌のβ-ガラクトシダーゼまたはヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のいずれかに関してレトロウイルス媒介遺伝子移入を行ったヒツジ内皮細胞をステンレススチールステント上に播種して、ステントが覆われるまで生長させた。したがって、細胞は血管壁に送達されることができ、そこでそれらは治療タンパク質を提供することができるであろう。国際特許出願国際公開公報第91/12779号「Intraluminal Drug Eluting Prosthesis」および国際特許出願国際公開公報第90/13332号「Stent With Sustained Drug Delivery」のような、ステントによって治療物質を血管壁に提供する他の方法も同様に提唱されている。それらの出願において、抗血小板剤、抗凝固剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗代謝剤、および他の薬物をステントに提供して、再狭窄の発生率を低減させることができるであろうと示唆される。さらに、酸化窒素放出剤のような他の血管反応剤も同様に用いることができる。
【０２４５】
再狭窄のさらなる原因は、処置された組織の過増殖である。好ましい態様において、本発明の抗増殖特性は再狭窄を阻害する。薬物溶出ステントは当技術分野で周知である（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,697,967号、米国特許第5,599,352号、および米国特許第5,591,227号を参照されたい）。好ましい態様において、本発明の組成物は、易罹患（例えば閉鎖）血管の処置において薬物溶出ステントから溶出する。さらなる態様において、本発明の組成物は、易罹患心血管の処置において薬物溶出ステントから溶出する。
【０２４６】
薬学的化合物および製剤を調製する当業者は、本明細書に開示の方法において用いるために任意の化合物を選択する場合、その適格性の検討に、特定の化合物の毒性、安全性、有効性、利用率、および費用が含まれるがそれらに限定されるわけではないことを認識するであろう。
【０２４７】
好ましい態様において、薬学的組成物は、本発明の化合物、および例えば治療物質（例えば、抗アテローム性動脈硬化症剤、抗凝固剤、抗血栓剤、抗高血圧剤、および抗糖尿病剤）を含む。抗高血圧剤には、ACE阻害剤、AT-1受容体拮抗剤、ET受容体拮抗剤、二重ET/AII受容体拮抗剤、およびバソペプチダーゼ阻害剤、またはGPIIb/IIIa遮断剤、P2Y1およびP2Y12拮抗剤、トロンボキサン受容体拮抗剤、およびアスピリンから選択される抗血小板剤が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２４８】
好ましい態様において、本発明の化合物は、患者におけるミトコンドリアF1F0 ATPヒドロラーゼ関連障害（例えば、心筋梗塞、心室過栄養、冠動脈疾患、非Q波MI、うっ血性心不全、心不整脈、不安定狭心症、慢性安定狭心症、プリンズメタル型狭心症、高血圧症、間欠性は行、末梢閉塞性動脈疾患、血栓塞栓発作の血栓または血栓塞栓症状、静脈血栓症、動脈血栓症、脳血栓症、肺動脈塞栓症、脳塞栓症、血栓形成傾向、播種性血管内凝固、再狭窄、心房細動、心室肥大、アテローム性動脈硬化性血管疾患、アテローム斑破裂、アテローム斑形成、移植性アテローム性動脈硬化症、血管リモデリングアテローム性動脈硬化症、癌、手術、炎症、全身感染症、人工表面、介入的心臓学、不動症、投薬、妊娠および流産、ならびに網膜症、腎症、および神経症を含む糖尿病合併症）を処置するために有用である。
【０２４９】
B．自己免疫障害および慢性炎症障害治療応用
自己免疫障害および慢性炎症障害はしばしば、細胞増殖調節および／または細胞アポトーシス調節の機能異常に起因する。ミトコンドリアは、細胞アポトーシスの制御および実行において重要な役割を実行する。ミトコンドリア透過性遷移孔（MPTP）は、ミトコンドリアの内外膜に及ぶ孔であり、前アポトーシス粒子の調節において機能する。一過性のMPTP開口によって、ミトコンドリア内膜腔からのチトクロームcおよびアポトーシス誘導因子の放出が起こり、それによって細胞アポトーシスが起こる。
【０２５０】
オリゴマイシン感受性付与タンパク質（OSCP）は、F0F1ミトコンドリアATPシンターゼ／ATPアーゼのサブユニットであり、ミトコンドリア膜における酵素のF0セクターを超えてプロトン勾配のカップリングにおいて機能する。好ましい態様において、本発明の化合物は、OSCPに結合して、OSCP/F1接合部、またはF1サブユニットはスーパーオキサイドおよびチトクロームcレベルを増加させ、細胞アポトーシスを増加させて、細胞増殖を阻害する。アデニンヌクレオチド転移物質（ANT）は、ミトコンドリア内膜に及ぶ30kDaタンパク質であり、ミトコンドリア透過性遷移孔（MPTP）の中心に存在する。チオール酸化またはアルキル化剤は、ANTのマトリクス側における三つの不対システインの一つまたは複数を改変することによって作用するMPTPの強力な活性化剤である。4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアーセノキシド、
2007534770.tif 000087
はANTを阻害する。
【０２５１】
本発明の化合物および方法は、自己免疫障害および慢性炎症障害の処置において有用である。そのような態様において、本発明は、自己免疫障害および／または慢性炎症障害に苦しむ被験者に、例えば以下の式を含む組成物を提供する：
2007534770.tif 000088
2007534770.tif 000089
式中、R1、R2、R3およびR4は、水素；CH3；炭素少なくとも2個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびヒドロキシサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびチオールサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアルデヒドサブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびケトンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびカルボン酸サブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミドサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアシル基少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、および窒素含有部分（例えば、ニトロ、ニトリル等）少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびエーテルサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびハロゲンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびニトロニウムサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖からなる群より選択される；R5は、OH、NO2、NR'、OR'からなる群より選択され；式中R'は、炭素少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびヒドロキシルサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびチオールサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアルデヒドサブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびケトンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびカルボン酸サブグループで終わる直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミドサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアシル基少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、および窒素含有部分（例えば、ニトロ、ニトリル等）少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびアミンサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびハロゲ��サブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖；炭素少なくとも2個を有し、およびニトロニウムサブグループ少なくとも1個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖からなる群より選択される；R6は水素、NO2、Cl、F、Br、I、SR'およびNR'2からなる群より選択され、式中R'は、R5において先に定義した通りである；R7は、水素；炭素少なくとも2個を有する直鎖状または分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族鎖からなる群より選択される；ならびにR8は、7個またはそれより多い非水素原子を含む任意の化学基を含み、アリールまたは脂肪族環状基である、ベンゼンより大きい脂肪族環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的（例えば、ミトコンドリア）に達するまで、R5の酸素をインビボでの代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位で代謝されて、R5をヒドロキシル基に変換する。
【０２５２】
さらに、好ましい態様において、組成物は以下の構造、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、またはプロドラッグを含んでもよい：
2007534770.tif 000090
式中、R1およびR5はそれぞれ、フェニル環AおよびBの任意の利用可能な炭素原子に付着しており、それぞれの発生毎に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、OR8、NR8R9、C(=O)R8、CO2R8、C(=O)NR8R9、NR8C(=O)R9、NR8C(=O)OR9、S(O)0R9、NR8SO2R9、SO2NR8R9、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個が互いに接合して融合ベンゾ環を形成する；R2、R3、およびR4は水素、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択される、またはR2、R3、およびR4の一つは、R、T、またはYに結合して、他のR2、R3、およびR4は、水素、アルキル、および置換アルキルから選択される；ZおよびYは、C(=O)、-CO2-、-SO2-、-CH2-、-CH2C(=O)-、および-C(=O)C(=O)-から独立して選択される、またはZは存在しなくてもよい；RおよびTは、-CH2-、-C(=O)-、およびQがNR10R11、OR10またはCNである-CH[(CH2)p(Q)]-から選択される；R6は、アルキル、アルケニル、置換アルキル、置換アルケニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールから選択されるが、但しR2が水素である場合、Z-R6は共に-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000091
ではない；R7は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アミノアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ケト(=O)、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから選択される；R8およびR9は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される、またはR8およびR9は共に、複素環またはヘテロアリールを形成するが、例外的にR9はSO2R9の場合のようにスルホニル基に付着している場合には水素ではない；R10およびR11は、水素、アルキル、および置換アルキルから独立して選択される；mおよびnは0、1、2および3から独立して選択される；o、pおよびqは、独立して0、1、または2である；ならびにrおよびtは0または1である。
【０２５３】
さらなる態様において、Z-R6は共に以下から選択される：i．任意でR14によって置換されたチオフェニル；ii．任意でR14によって置換されたイミダゾリル；iii．-CH(アリール)(CO2C1-6アルキル)；iv．-CO2-アルキル；v．任意で3個までのハロゲンおよび／またはフェニルによって置換された-SO2-アルキル；vi．任意でフェニルによって置換された-SO2-アルケニル；およびvii．
2007534770.tif 000092
式中R15は、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキルである、および／または二つのR15基は共に縮合ベンゾ環または5〜6員環ヘテロアリールを形成する；R16は、水素、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキル、および任意でハロゲン、シアノ、およびC1-4アルコキシの1〜3個によって置換されたフェニルオキシまたはベンジルオキシから選択される；R17はアルキル、アルコキシ、CO2C1-6アルキル、およびSO2フェニルから選択される；およびuおよびvは独立して0、1または2である。
【０２５４】
さらに、好ましい態様において、組成物は以下の構造：またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを含んでもよい：
2007534770.tif 000093
式中R1およびR5は、フェニル環Aおよびフェニル環Bの任意の利用可能な炭素原子に付着している、およびそれぞれの発生毎に、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、ハロゲン、シアノ、O(C1-6アルキル)、O(フェニル)、O(ベンジル)、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、C(=O)H、C(=O)(C1-6アルキル)、CO2H、CO2(C1-6アルキル)、C(=O)NH2、C(=O)NH(C1-6アルキル)、C(=O)N(C1-6アルキル)2、NHC(=O)(C1-6アルキル)、S(O)2(C1-6アルキル)、NHSO2(C1-6アルキル)、SO2NH2、SO2NH(C1-6アルキル)、SO2N(C1-6アルキル)2、C3-7シクロアルキル、フェニル、5もしくは6員環ヘテロアリール、または4〜7員環ヘテロシクロから独立して選択される、および／またはR1の2個および／またはR5の2個は共に接合して縮合ベンゾ環を形成する；R2およびR3は独立して水素およびC1-4アルキルから選択される；Zは-CO2-、-SO2-である、または存在しない；R6は、任意で置換されたアルキル、アルケニル、アリールおよびヘテロアリールから選択される；mおよびnは、0、1、および2から独立して選択される；ならびにqは0または1である。
【０２５５】
さらに、好ましい態様において、組成物は以下の構造、または立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを含んでもよい：
2007534770.tif 000094
式中R1およびR5は：フェニル環Aおよびフェニル環Bの任意の利用可能な炭素原子に付着している、およびそれぞれの発生毎にアルキル、置換アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、C(=O)H、アシル、CO2H、アルコキシカルボニル、カルバミル、スルホニル、スルホンアミジル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択され、および／またはR1の2個および／またはR5の2個は共に接合して縮合ベンゾ環を形成する；R2、R3およびR4は、水素およびアルキルから独立して選択される；Zは-CO2-、-SO2-であるかまたは存在しない；R6はa）任意で3個までのハロゲン、アリール、およびCO2C1-6アルキルによって置換されたC1-4アルキルまたはC1-4アルケニル；b）任意で3個までのR12によって置換された、および／またはベンゾ環または5〜6員環ヘテロアリールに縮合したフェニル；c）任意で2個までのR12によって置換される、チオフェニル、イミダゾリル、ピラゾリル、およびイソキサゾリルから選択されるヘテロアリールであって、ただしR2は水素である場合、Z-R6は共に、-SO2-Meまたは
2007534770.tif 000095
ではない；R7は、水素、ケト(=O)、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、ハロゲン、シアノ、O(C1-6アルキル)、O(フェニル)、O(ベンジル)、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、C(=O)H、C(=O)(C1-6アルキル)、CO2H、CO2(C1-6アルキル-)から選択される；R12は、その発生毎にC1-6アルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキル、-CO2アルキル、-SO2フェニル、5〜6員環の単環ヘテロアリール、および任意でハロゲン、C1-4アルキル、および／またはO(C1-4アルキル)によって置換されているフェニルオキシまたはベンジルオキシから互いのR12から独立して選択される；ならびにmおよびnは独立して、0、1、または2から選択される。
【０２５６】
さらなる例示的な化合物において、Zは、-SO2である；R6はC1-4アルキル、トリフルオロメチル、ベンジル、フェニルによって置換されたC2-3アルケニル、
2007534770.tif 000096
から選択される；R15は、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキルである、および／またはR15基2個は共に縮合ベンゾ環または5〜6員環ヘテロアリールを形成する；R16は水素、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、NHC(=O)アルキル、および任意で1〜3個のハロゲン、シアノ、およびC1-4アルコキシによって置換されているフェニルオキシまたはベンジルオキシから選択される；R17は、アルキル、アルコキシ、CO2C1-6アルキル、およびSO2フェニルから選択される；ならびにuおよびvは独立して、0、1、または2から選択される。
【０２５７】
さらに、好ましい態様において、組成物は以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを含んでもよい：
2007534770.tif 000097
式中R1は、H、CN およびSO2-ピペリジンからなる群より選択される；R2は、H、4-Cl-Ph、Ph、および2-Me-イミダゾールからなる群より選択される；R3は、H、CH2-2-イミダゾール、およびCH2-2-オキサゾールからなる群より選択される。
【０２５８】
さらに、好ましい態様において、組成物は以下の式、またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、もしくはプロドラッグを含んでもよい：
2007534770.tif 000098
式中R1は、H、2,4-Cl2、2-4-Me2、および2,5-(CF3)2からなる群より選択される；R2は、H、4-Cl、4-Me、2,4-Cl2、2,4-Me2、3-Clからなる群より選択される；Xは、OおよびNHからなる群より選択される；Yは、S、O、NCN、CO(3-CN-Ph)、CO(4-CN-Ph)、CO(4-Cl-Ph)、およびCOEtからなる群より選択される。
【０２５９】
C．表皮過形成の処置
肥厚した表皮の脱落に関連する表皮の有意な肥厚に至る表皮過形成（例えば、過剰なケラチノサイト増殖）は、乾癬のような疾患の特徴であり（例えば、Krueger GC, et al., (1984)J. Am. Acad. Dermatol. 11:937〜947；Fry L.(1988), Brit. J. Dermatol. 119:445〜461；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）、同様に生理的条件下（例えば、創傷治癒のあいだ）で起こる。
【０２６０】
オールトランスレチン酸（RA）またはその前駆体であるオールトランスレチノール（ROL）によって皮膚を局所処置しても、同様に表皮過形成が起こる（例えば、Varani J, et al., (2001)J. Invest. Dermatol, 117:1335〜1341；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。基礎となる病因は異なるが、これらの過形成は全て増殖しつつあるケラチノサイトにおいて上皮細胞増殖因子（EGF）受容体の活性化を共通して有する（例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Varani J, et al., (2001)J. Invest. Dermatol  117:1335〜1341；Baker BS et al., (1992)Brit. J. Dermatol. 126:105〜110；Gottlieb AB, et al., (1988)J. Exp. Med. 167:670〜675；Elder JT, et al., (1989)Science 243:811〜814；Piepkorn M, et al., (1998)J Invest Dermatol 111:715〜721；Piepkorn M., et al., (2003)Arch Dermatol Res 27:27；Cook PW, et al., (1992)Cancer Res  52:3224〜3227を参照されたい；）。正常な表皮の生長は、過形成生長としてのEGF受容体機能に依存しないように思われる（例えば、Varani J. et al., (2001)J. Invest. Dermatol  117:1335〜1341；Varani J, et al., (1998)Pathobiology 66:253〜259を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照として本明細書に組み入れられる）。同様に、無傷の皮膚における真皮の機能は、EGF受容体機能に依存しない（例えば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Varani J,et al., (2001)J. Invest. Dermatol  117:1335〜1341を参照されたい；）。
【０２６１】
過増殖表皮生長を調節するためのEGF受容体の中心的な役割は、EGF受容体チロシンキナーゼを抗増殖物質の標的とする。同様に、この受容体の下流に関与している一連のシグナル伝達分子は、ケラチノサイト生長が中断されうるさらなる点である。マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）カスケードは、EGF受容体によって活性化される（例えば、Marques, S.A., et al., (2002)J. Pharmacol Exp Ther 300, 1026〜1035を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。過増殖表皮において、細胞外シグナル調節キナーゼ1/2（Erk 1/2）は基底および基底上部ケラチノサイトにおいて活性化され、表皮の過増殖に寄与するが、このことは正常表皮では認められない（例えば、Haase, I., et al., (2001)J Clin Invest 108, 527〜536；Takahashi, H., et al., (2002)J. Dermatol Sci 30, 94〜99を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。培養モデルにおいて、EGFを通してのケラチノサイトの生長の調節によってMAPK活性の増加が起こる。ケラチノサイトにおいて、増殖因子刺激MAPK活性も同様にインテグリンの関与に依存して、インテグリンに結合する細胞外マトリクス分子は、独立してMAPKを活性化する、およびケラチノサイト増殖を増加させることができる（例えば、Haase, I., et al., (2001)J Clin. Invest 108, 527〜536を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。線維芽細胞を含む他の皮膚細胞の増殖は、Erk 1/2活性にはあまり依存せず、Erk阻害は、表皮過形成に対する有用性の可能性に関してリード化合物を評価するために、おそらく有用な特徴である。
【０２６２】
好ましい態様において、本発明の化合物は表皮過形成を処置するために用いられる。
【０２６３】
好ましい態様において、本発明の化合物は乾癬を処置するために用いられる。乾癬は一般的で慢性の表皮過形成である。斑状乾癬は、乾癬の最も一般的なタイプであり、銀色の鱗屑で覆われた赤い皮膚と炎症を特徴とする。痒いまたは焼けるような円形または卵形の紅斑の斑が、斑状乾癬の典型である。斑は通常、腕、脚、体躯、または頭皮に認められるが、皮膚の如何なる部位にも認められる可能性がある。最も典型的な領域は肘および膝である。乾癬は、接触感染性ではなく遺伝性となりうる。喫煙、太陽光の曝露、アルコール依存症、およびHIV感染症のような環境要因は、乾癬が起こる回数および発赤拡張が持続する期間に影響を及ぼす可能性がある。
【０２６４】
乾癬の処置には、局所ステロイド、コールタール、角質溶解剤、ビタミンD-3類似体、および局所レチノイドが含まれる。典型的なステロイドは、斑の形成を低減させるために用いられる物質である。局所ステロイド物質は抗炎症作用を有し、深遠で多様な代謝活性を引き起こす可能性がある。さらに、局所ステロイド物質は、多様な刺激に対する体の免疫応答を改変する。局所ステロイドの例には、トリアムシノロンアセトニド（Artistocort、Kenalog）0.1％クリーム、およびジプロピオン酸ベタメタゾン（Diprolene、Diprosone）0.05％クリームが含まれるがそれらに限定されるわけではない。コールタールは、広汎な罹患領域に用いるためにシャンプーまたはローションとして薬局で販売されている安価な処置である。コールタールは、毛髪を有する領域において特に有用である。コールタールの例は、2〜10％コールタール（DHS Tar、Doctar、Theraplex T）-アンチプルイティック（antipruitic）である。角質溶解剤は鱗屑を除去するため、皮膚を滑らかにするために、および過角化症を処置するために用いられる。角質溶解剤の例は、0.1〜1％アントラリン（Drithocreme、Anthra-Derm）である。ビタミンD-3類似体は、より古い治療に対して耐性の病変または皮膚の薄化が整容上の問題を生じるであろう顔または露出領域における病変を有する患者に用いられる。ビタミンD-3類似体の例は、カルシポトリエン（Dovonex）である。局所レチノイドは、濾胞上皮細胞の凝集性を減少させ、分裂活性を刺激し、それによって濾胞上皮細胞の代謝回転の増加が起こる物質である。局所レチノイドの例には、トレチノイン（Retin-A, Avita）、およびタザロテン（Tazorac）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２６５】
米国において約1〜2％の人々、または約550万人が斑状乾癬を有する。斑状乾癬を有する人々の30％までが乾癬性関節炎を有する。乾癬性関節炎を有する個体は、その関節に炎症を有し、他の関節炎症状を有することがある。時に、斑状乾癬は、膿疱性乾癬または紅皮性乾癬のようなより重度の疾患へと進化しうる。膿疱性乾癬において、皮膚の赤い領域は膿を有する水疱を含む。紅皮性乾癬では、広い領域の赤い鱗屑状の皮膚が典型的であり、これは痒く痛みを伴う可能性がある。本発明は、滴状乾癬、爪乾癬、陳旧性乾癬、および頭皮乾癬が含まれるがそれらに限定されるわけではないさらなるタイプの乾癬を処置するために有用である。
【０２６６】
VIII．ATPアーゼ阻害剤および治療的阻害剤を同定する方法
本発明は、F1F0-ATPアーゼを標的とする化合物を提供する。さらに、本発明は自己免疫障害の処置としてF1F0-ATPアーゼを標的とする化合物、特に毒性の低い化合物を提供する。本発明はさらに、F1F0-ATPアーゼを標的とする化合物を同定する方法を提供する。さらに、本発明は、F1F0-ATPアーゼを標的とする化合物に関する治療応用を提供する。
【０２６７】
真核細胞内のATPの大部分がミトコンドリアF1F0-ATPアーゼによって合成される（例えば、C.T. Gregory et al., J. Immunol., 139:313〜318[1987]；J.P. Portanova et al., Mol. Immunol., 32:117〜135[1987]；M.J. Shlomchik et al., Nat. Rev. Immunol., 1:147〜153[2001]を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。F1F0-ATPアーゼはATPを合成して加水分解するが、通常の生理的条件ではF1F0-ATPアーゼはATPを合成するのみである（例えばNagyvary J, et al., Biochem. Educ. 1999； 27:193〜99を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼは、主要な三つのドメインで構成される：F0、F1 、および末梢のステーター。F1は、触媒部位を含む酵素の一部であり、マトリクスに存在する（例えば、Boyer, PD, Annu Rev Biochem. 1997;66:717〜49を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。このドメインは高度に保存されており、サブユニット組成物α3β3γδεを有する。ウシF1の特徴的なX-線構造は、α3β3が、円柱の中心にγサブユニットが存在する六角形の円柱を形成することが判明した。F0は、ミトコンドリア内膜に存在し、プロトンチャンネルを含む。プロトンが内膜腔からマトリクスに移動すると、ATP合成を駆動するエネルギーを提供する。末梢のステーターは、F0をF1に物理的および機能的に連結させるいくつかのタンパク質で構成される。ステーターは、F0からのコンフォメーションの変化をATP合成を調節する触媒ドメインに伝達する（例えば、Cross RL, Biochim Biophys Acra 2000;1458:270〜75を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２６８】
ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼ阻害剤は、F1F0-ATPアーゼのメカニズム研究に関する貴重なツールである（例えば、James AM, et al., J Biomed Sci 2002;9:475〜87を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。F1F0-ATPアーゼ阻害剤は、しばしば細胞障害性であることから、それらは癌および他の過増殖障害に関する薬剤として開発されている。マクロライド（例えば、オリゴマイシンおよびアポプトリジン）は、F1F0-ATPアーゼの非競合的阻害剤である（例えば、Salomon AR, et al., PNAS 2000;97:14766〜71；Salomon AR, et al., Chem Biol 2001;8:71〜80を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。マクロライドはF0に結合し、これはチャンネルの中のプロトンの流れを遮断して、それによってF1F0-ATPアーゼの阻害が起こる。マクロライドは強力（例えば、オリゴマイシンのIC50＝10 nM）であり、[ATP]の大きい減少に至る。そのため、マクロライドは、許容されないほど狭い治療指数を有し、非常に毒性が高い（例えば、齧歯類におけるオリゴマイシンのLD50は1日量0.5 mg/kgを2回である）（例えば、Kramar R, et al., Agents & Actions 1984, 15:660〜63を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。F1F0-ATPアーゼの他の阻害剤には、Bz-423が含まれ、これはF1におけるOSCPに結合する（本明細書において他所で記述される）。Bz-423のKiは〜9 μMである。Bz-423は、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/634,114号、第10/427,211号、第10/427,212号、第10/217,878号、第09/767,283号、第09/700,101号、および関連出願において記述される。
【０２６９】
能動的に呼吸する（状態3呼吸として知られる）細胞において、F1F0-ATPアーゼを阻害すると、呼吸を遮断して、ミトコンドリアは休止状態（状態4として知られる）に置かれる。状態4では、MRCは状態3と比較して低減し、これは複合体IIIでのO2からO2-への還元に都合がよい（例えば、N. Zamzami et al., J. Exp. Med., 181:1661〜1672[1995]を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、細胞をいずれかのオリゴマイシンによって処置すると、複合体Vの阻害の結果として、細胞内O2-の上昇が起こる。オリゴマイシンの場合、細胞にATPを補給すると、細胞死に対して保護するが抗酸化剤は保護せず、細胞死がATPの低下に起因することを示している（例えば、Zhang JG, et al., Arch Biochem Biophys 2001;393:87〜96；McConkey DJ, et al., 「The ATP switch in apoptosis」、 In Nieminen La, ed.「Mitochondria in Pathogenesis」、New York:Plenum, 2001:265〜77を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。Bz-423による細胞死は抗酸化剤によって遮断され、細胞にATPを補給しても影響を受けず、このことはBz-423がROS依存的死反応に関与していることを示している（例えば、N.B. Blatt, et al., J. Clin. Invest., 2002, 110, 1123を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。そのため、F1F0-ATPアーゼ阻害剤は毒性（例えば、オリゴマイシン）または治療的（例えば、Bz-423）のいずれかとなる。
【０２７０】
本発明は、毒性のF1F0-ATPアーゼ阻害剤と治療的F1F0-ATPアーゼ阻害剤とを区別する方法を提供する。治療能を有するF1F0-ATPアーゼ阻害剤は、新規阻害様式を表す。具体的には、治療能を有するF1F0-ATPアーゼ阻害剤は、高い基質濃度で酵素-基質複合体のみに結合して、kcat/Km比を変化させない非競合的阻害剤である。この知識は、治療能を有するF1F0-ATPアーゼ阻害剤を同定して毒性化合物と区別するための基礎となる。
【０２７１】
本発明は、自己免疫障害の処置としてF1F0-ATPアーゼを標的とする化合物を提供する。特に、本発明はkcat/Km比を変化させずにF1F0-ATPアーゼを標的とする化合物を同定する方法を提供する。さらに、本発明は、F1F0-ATPアーゼを標的とする化合物に関する治療応用を提供する。
【０２７２】
A．ATPアーゼ阻害化合物
本発明は、F1F0-ATPアーゼを阻害する化合物を提供する。いくつかの態様において、化合物は遊離のF1F0-ATPアーゼに結合せずに、むしろF1F0-ATPアーゼ-基質複合体に結合する。化合物は高い基質濃度で最大活性を示し、低い基質濃度で最小活性（例えば、F1F0-ATPアーゼの阻害）を示す。好ましい態様において、化合物はF1F0-ATPアーゼのkcat/Km比を変化させない。本発明のF1F0-ATPアーゼ阻害剤の特性は、急性毒性を示して致死的であるF1F0-ATPアーゼ阻害剤であるオリゴマイシンとは対照的である。オリゴマイシンは、遊離のF1F0-ATPアーゼおよびF1F0-ATPアーゼ-基質複合体の双方に結合する非競合的阻害剤であり、kcat/Km比を変化させる。
【０２７３】
F1F0-ATPアーゼを阻害するがkcat/Km比を変化させない本発明の化合物は、いくつかの態様において、本明細書において他所で記述した構造を有する。しかし、本発明の方法によって治療的阻害剤として同定された他の構造の化合物も同様に、本発明に含まれる。
【０２７４】
B．ATPアーゼ阻害剤の同定
本発明は、自己免疫障害を処置するために有用な化合物を同定（例えば、スクリーニング）する方法を提供する。本発明は、特定のタイプの化合物に限定されない。好ましい態様において、本発明の化合物には、薬学的組成物、低分子、抗体、高分子、合成分子、合成ポリペプチド、合成ポリヌクレオチド、合成核酸、アプタマー、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドが含まれるがそれらに限定されるわけではない。本発明は、自己免疫障害を処置するために有用な化合物を同定する特定の方法に限定されない。好ましい態様において、自己免疫障害を処置するために有用な化合物は、kcat/Km比を変化させずにF1F0-ATPアーゼの阻害能を有すると同定される。
【０２７５】
C．F1F0-ATPアーゼ阻害剤による治療応用
本発明は、障害（例えば、神経変性疾患、アルツハイマー病、虚血性リプロフュージョン（reprofusion）損傷、神経運動障害、非ホジキンリンパ腫、リンパ球性白血病、皮膚T細胞白血病、自己免疫障害、癌、固形腫瘍、リンパ腫、および白血病）を処置する方法を提供する。本発明は、特定の型の処置に限定されない。好ましい態様において、処置には、症状の改善、症状の予防、障害の予防、および障害の改善が含まれるがそれらに限定されるわけではない。本発明は、インビボ、インビトロ、および／またはエクスビボの状況において適用可能な自己免疫障害を処置する方法を提供する。
【０２７６】
いくつかの態様において、本発明は、標的細胞の阻害を通して自己免疫障害を処置する。本発明は、特定の型の細胞阻害に限定されない。好ましい態様において、細胞の阻害には、細胞生長の阻止、細胞増殖の阻止、および細胞死が含まれるがそれらに限定されるわけではない。好ましい態様において、標的細胞の阻害は、標的細胞を、本発明のF1F0-ATPアーゼ阻害剤に接触させることを通して行われる。さらなる態様において、標的細胞の阻害は、F1F0-ATPアーゼを、本発明のF1F0-ATPアーゼ阻害剤と共にターゲティングすることを通して行われる。本発明は、特定のF1F0-ATPアーゼ阻害剤に限定されない。好ましい態様において、F1F0-ATPアーゼ阻害剤は、kcat/Km比を変化させずにF1F0-ATPアーゼの阻害能を有する。
【０２７７】
本発明はさらに、治療を必要とする被験者において標的細胞の病理を選択的に阻害するための方法を提供する。本発明は、標的細胞の病理を阻害する特定の方法に限定されない。好ましい態様において、標的細胞の病理は、本発明の化合物の有効量を投与することを通して阻害される。本発明は、特定の化合物に限定されない。好ましい態様において、化合物はF1F0-ATPアーゼ阻害剤である。さらに好ましい態様において、化合物は、kcat/Km比を変化させずにF1F0-ATPアーゼを阻害する。
【０２７８】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を証明およびさらに説明するために提供されるのであって、その範囲を制限すると解釈されない。
【０２７９】
実施例1
化合物の調製
ベンゾジアゼピン化合物は、固相または液相組み合わせ合成法のいずれかを用いると共に、十分に確立された技術の個々の基礎に基づいて調製される。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Boojamra, C.G. et al.(1996)；Bunin, B.A., et al.(1994)；Stevens, S.Y. et al., (1996)；Gordon, E.M., et al., (1994)；および米国特許第4,110,337号および第4,076,823号を参照されたい。説明のために、以下の全般的な方法論を提供する。
【０２８０】
1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン化合物の調製
多様な1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン誘導体を非常に高い総収率で調製するための改善された固相合成法が文献に報告されている。（例えば、Bunin and Ellman, J. Am. Chem. Soc., 114:10997〜10998[1992]を参照されたい）。これらの改善された方法を用いて、三つの異なる成分:すなわち2-アミノベンゾフェノン、α-アミノ酸、および（任意で）アルキル化剤から1,4-ベンゾジアゼピン-2-オンを固相支持体上で構築する。
【０２８１】
好ましい2-アミノベンゾフェノンには、置換2-アミノベンゾフェノン、例えば4-ハロ-4'-ヒドロキシ-2-アミノベンゾフェノンのようなハロ-、ヒドロキシ-、およびハロ-ヒドロキシ-置換2-アミノベンゾフェノンが含まれる。好ましい置換2-アミノベンゾフェノンは、4-クロロ-4'-ヒドロキシ-2-アミノベンゾフェノンである。好ましいα-アミノ酸には、共通の天然に存在するα-アミノ酸20個と共に、ホモフェニルアラニン、ホモチロシン、およびチロキシンのようなα-アミノ酸模倣構造が含まれる。
【０２８２】
アルキル化剤には、活性化および不活性化求電子剤の双方が含まれ、広範な求電子剤が当技術分野において周知である。好ましいアルキル化剤には、活性化求電子剤であるp-ブロモベンジルブロミドおよびt-ブチル-ブロモアセテートが含まれる。
【０２８３】
そのような合成の第一段階において、周知の方法を用いてヒドロキシまたはカルボン酸官能基のいずれかを通して、および市販の[4-(ヒドロキシメチル)フェノキシ]酢酸のような酸切断型のリンカーを用いて、2-アミノベンゾフェノン誘導体を、ポリスチレン固体支持体のような固体支持体に付着させて、支持された2-アミノベンゾフェノンを生じる。（例えば、Sheppard and Williams, Intl. J. Peptide Protein Res., 20:451〜454[1982]を参照されたい）。アミノベンゾフェノンの2-アミノ基は好ましくは、連結試薬との反応の前に、例えばFMOC-Cl（9-フルオレニルメチルクロロホルメート）との反応によって保護され、保護されたアミノ基2'-NHFMOCを生じる。
【０２８４】
第二段階において、保護された2-アミノ基を脱保護して（例えば、-NHFMOC基を、ジメチルホルムアミド（DMF）中でピペリジンによって処置することによって脱保護してもよい）、脱保護された2-アミノベンゾフェノンをアミド連結によってα-アミノ酸（そのアミノ基はそれ自身、例えば-NHFMOC基によって保護されている）にカップリングさせて、中間体を生成する。一般的な固相ペプチド合成のために用いられる標準的な活性化法（カルボジイミドおよびヒドロキシベンズトリアゾールまたはペンタフルオロフェニル活性エステルを用いるような）を用いて、カップリングを促進する。しかし、好ましい活性化法は、酸スキャベンジャーである4-メチル-2,6-ジ-tert-ブチルピリジンの存在下でフッ化α-N-FMOC-アミノ酸の塩化メチレン溶液によって2-アミノベンゾフェノンを処置すると、アミド連結によって完全なカップリングを生じることを利用している。この好ましいカップリング法は、非反応のアミノベンゾフェノン誘導体に関しても有効であることが判明しており、4-クロロおよび3-カルボキシ脱活性化置換基の双方を有する誘導体に関して本質的に完全なカップリングを生じる。
【０２８５】
第三段階において、保護されたアミノ基（アミノ酸を起源とする）をまず脱保護して（例えば、-NHFMOCをDMFにおいてピペリジンによって-NH2に変換してもよい）、脱保護されたBz-423sをDMFにおいて酸、例えば5％酢酸と60℃で反応させて、支持された1,4-ベンゾジアゼピン誘導体を生成してもよい。この方法を用いて、広く異なる立体および電子特性を有する多様な2-アミノベンゾフェノン誘導体に関して、完全な環状化が報告されている。
【０２８６】
任意の第四段階において、1,4-ベンゾジアゼピン誘導体を、適したアルキル化剤と塩基との反応によってアルキル化して、支持された完全に誘導体化された1,4-ベンゾジアゼピンを生成する。標準的なアルキル化法、例えば、LDA（リチウムジイソプロピルアミド）またはNaHのような強塩基の過剰量を用いる；しかし、そのような方法によって、他の酸性官能基の望ましくない脱プロトン化および過剰アルキル化が起こる可能性がある。ベンゾジアゼピン誘導体（例えば、エステルおよびカルバメート官能基を有するベンゾジアゼピン誘導体）の過剰アルキル化を阻止する可能性がある好ましい塩基は、アニリド官能基を完全に脱プロトン化するために十分に塩基性であるが、アミド、カルバメート、またはエステル官能基を脱プロトン化するほど塩基性ではない塩基である。そのような塩基の例は、リチウム化5-(フェニルメチル)-2-オキサキソリジノンであり、これはテトラヒドロフラン（THF）において-78℃で1,4-ベンゾジアゼピンと反応する。脱保護後、上記のような適したアルキル化剤を加える。
【０２８７】
最終段階において、完全に誘導体化した1,4-ベンゾジアゼピンを固体支持体から切断する。これは、例えば、トリフルオロ酢酸、水、およびジメチルスルフィドの混合物（85：5：10容積比）のような適した酸に対する曝露によって（随伴した不安定酸保護基の除去と共に）得られる。または、上記のベンゾジアゼピンを液相において調製する。合成方法論は、参照により本明細書に組み入れられる、Gordon et al., J. Med. Chem., 37:1386〜1401[1994]によって概要された。簡単に説明すると、方法論は、適当な置換2-アミノベンゾフェノンイミンとアミノ酸樹脂とをトランスイミド化して、樹脂結合イミンを生成する段階を含む。これらのイミンを環状化して、上記の固相合成における技法と類似の技法によって繋ぐ。上記の方法論を用いて調製したベンゾジアゼピンの全体的な純度は約90％またはそれ以上である。
【０２８８】
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの調製
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの固相合成に関する一般的な方法は、C.J. Boojamra et al., J. Org. Chem., 62:1240〜1256[1996]に詳細に報告されている。この方法を用いて、本発明の化合物を調製する。
【０２８９】
Merrifield樹脂、例えば(クロロメチル)ポリスチレンを、4-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシベンズアルデヒドナトリウムとのアルキル化によって誘導体化して、樹脂結合アルデヒドを提供する。α-アミノエステルをDMFにおいて1％酢酸においてNaBH(OAc)3を用いて還元的アミノ化によって誘導体化支持体に付着させる。この還元的アミノ化によって、樹脂結合二級アミンが形成される。
【０２９０】
二級アミンを広範な非保護アントラニル酸によってアシル化すると、支持体に結合した三級アミドが得られる。アシル化は、カルボジイミドおよび三級アミンの塩酸塩の存在下でカップリング反応を行うことによって最善に得られる。一つの良好なカップリング物質は、1-エチル-8-[8-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩である。反応は典型的に、無水1-メチル-2-ピロリジノンの存在下で行われる。カップリング技法は典型的に、完全なアシル化を確実にするためにもう一度繰り返される。
【０２９１】
アシル誘導体の環状化は、ベンゾジアゼピンの複素環の窒素上の1-位に置換基を同時導入するために、アルキルハロゲン化物と反応するであろうアニリド陰イオンの形成を通して塩基触媒ラクタム化を通して行われる。アセトアニリドのリチウム塩は、反応を触媒するために良好な塩基である。このように、Bz-423を、DMF/THF（1：1）においてリチウムアセトアニリドと30時間反応させた後、適当なアルキル化剤による反応を行うと、完全に誘導体化された支持体結合ベンゾジアゼピンが提供される。化合物は、TFA/DMS/H2O（90：5：5）を用いて良好な収率および高い純度で支持体から切断される。
【０２９２】
本発明において用いられるα-アミノ酸開始材料、アルキル化剤、およびアントラニル酸誘導体のいくつかの例は、Boojamra（1996）、前記の1246によって記載される。さらなる試薬は容易に決定され、市販されているか、または当業者によって容易に調製されて、本発明において開示される新規置換基に達する。
【０２９３】
例えば、Boojamra、前記から：アルキル化剤がR1置換基を提供すること；α-アミノ酸開始材料がR2置換基を提供すること、およびアントラニル酸がR4置換基を提供することが認識される。適当に置換されたこれらの開始材料を用いることによって、望ましい1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンに達する。R3置換基は、α-アミノエステル開始材料のアミンを適当に置換することによって得られる。立体的な混雑が問題となる場合、1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-オンを単離した後に、R3置換基を従来の方法を通して付着させる。
【０２９４】
実施例2
キラリティ
本発明のベンゾジアゼピンの多くは、立体中心がα-アミノ酸およびそのエステル開始材料によって導入されるキラリティにより、光学異性体として存在することを認識すべきである。上記の一般的な技法は、α-アミノ酸またはエステル開始材料のキラリティを保存する。多くの場合において、そのようなキラリティの保存は望ましい。しかし、α-アミノ酸またはエステル開始材料の望ましい光学異性体が入手できないまたは高価である場合、ラセミ混合物を産生して、これを対応する光学異性体に分離して、望ましいベンゾジアゼピンエナンチオマーを単離する。
【０２９５】
例えば、2,5-ジオン化合物の場合、Boojamra、前記は、NaBH(OAc)3を加える前に、エナンチオマーとして純粋なα-アミノ酸エステル開始材料の塩酸塩をi-Pr2-EtNの0.3等量および樹脂結合アルデヒドによって6時間予め平衡にすることによって、完全なラセミ化が得られることを開示している。上記の合成技法の残りは同じままである。必要であれば1,4-ベンゾジアゼピン-2-ジオン化合物の場合も同様に、類似の段階を用いる。
【０２９６】
個々のベンゾジアゼピンを調製する方法は当技術分野で周知である。（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第3,415,814号；第3,384,635号；および第3,261,828号,を参照されたい）。上記の任意の方法において適当に置換された開始材料を選択することによって、本発明のベンゾジアゼピンは比較的容易に調製される。
【０２９７】
実施例3
試薬
Bz-423は上記のように合成される。FK506はFujisawa（Osaka, Japan）から得る。N-ベンゾイルカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトン（z-VAD）は、Enzyme Systems（Livermore, CA）から得る。ジヒドロエチジウム（DHE）およびヨウ化3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニン（DiOC6(3)）は、Molecular Probes（Eugene, OR）から得る。FAM-VAD-fmkはIntergen（Purchase, NJ）から得る。マンガン(III)メソ-テトラキス(4-安息香酸)ポルフィリン（MnTBAP）は、Alexis Biochemicals（San Diego, CA）から購入する。ベンゾジアゼピンは、記述されたとおりに合成する（例えば、B.A. Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:4708〜4712[1994]を参照されたい）。他の試薬はSigma（St. Louis, MO）から得た。
【０２９８】
実施例4
動物および薬物の送達
雌性NZB/Wマウス（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）を、処置群および対照群に無作為に分ける。対照マウスには溶媒（DMSO水溶液50μl）を与え、処置マウスには溶媒に溶解したBz-423（60 mg/kg）を腹腔内注射を通して投与する。血清を調製するために、末梢血を尾静脈から得る。脾臓および腎臓の試料を10％緩衝ホルマリンにおいて、またはOCTにおいて凍結することによって保存する。各動物からの脾臓のさらなる切片を単細胞浮遊液の調製のために保存する。
【０２９９】
実施例5
初代培養脾細胞、細胞株、および培養条件
初代培養脾細胞を、赤血球の等張的溶解による脾臓の機械的破壊によって6ヶ月齢のマウスから得た。B-細胞に富む分画を、CD4、CD8a およびCD11bコーティングマイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Auburn, California）による磁気細胞ソーティングを用いて、陰性選択によって調製する。Ramos株はATCC（Monassis, Georgia）から購入する。細胞を10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）およびL-グルタミン（290μg/ml）を添加したRPMIにおいて維持する。初代培養細胞のための培地はまた、2-メルカプトエタノール（50μM）を含む。全てのインビボ試験は、0.5％DMSOおよび2％FBSによって行う。インビトロ実験は、2％FBSを含む培地において行う。有機化合物は、0.5％DMSOを含む培地に溶解する。
【０３００】
実施例6
組織学
ホルマリン固定腎切片をヘマトキシリン-エオジン（H＆E）によって染色して、糸球体の免疫複合体沈着物を、FITC共役ヤギ抗マウスIgG（Southern Biotechnology, Birmingham, AL）によって染色した凍結組織を用いて直接免疫蛍光によって検出する。切片を、0〜4+の尺度を用いて腎炎およびIgG沈着に関して盲検的に分析する。リンパ様過形成の程度は、H＆Eによって染色した脾臓切片を用いて0〜4+の尺度で採点する。B細胞を同定するために、切片をビオチン化抗B220（Pharmingen；1μg/mL）によって染色した後、ストレプトアビジン-Alexa 594（Molecular Probes；5μg/mL）によって染色する。凍結した脾臓切片をインサイチューCell Death Detectionキット（Roche）を用いてTUNEL陽性細胞に関して分析して、0〜4+尺度を用いて評価する。
【０３０１】
実施例7
TUNEL染色
凍結した脾臓切片をインサイチューCell Death Detectionキット（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）を用いて分析する。切片を盲検的に評価して、TUNEL陽性染色の量に基づいてスコア（0〜4+）を割付する。B細胞は、ビオチン化抗B220による染色（Pharmingen, San Diego, CA；1μg/ml、1時間、22℃）の後にストレプトアビジン-Alexa 594（Molecular Probes, Eugene, Oregon；5μg/ml、1時間、22℃）による染色によって同定される。
【０３０２】
実施例8
処置動物からの脾細胞のフローサイトメトリー分析
表面マーカーを蛍光共役抗Thy1.2（Pharmingen、1μg/mL）および／または抗B220（Pharmingen、1μg/mL）によって検出(15m, 4℃)する。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、製造元のプロトコール（Roche Molecular Biochemicals）に従って、細胞をFITC-共役アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム（PI）と共にインキュベートする。TUNEL-陽性細胞のフローサイトメトリーによる検出は、APO-BRDUキット（Pharmingen）を用いる。スーパーオキサイドおよびMPTは、細胞を10μM ジヒドロエチジウムおよび2μM ヨウ化3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニン（DIOC6(3)）（Molecular Probes）と共に27℃で30分間インキュベートすることによって評価する。試料をFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Diego, CA）において分析する。
【０３０３】
実施例9
B細胞の刺激
Ramos細胞を可溶性のヤギFab2抗ヒトIgM（Southern Biotechnology Associates, 1μg/ml）および／または精製抗ヒトCD40（Pharmingen、クローン5C3、2.5μg/ml）によって活性化する。マウスB細胞を、培養ウェルに固定したアフィニティ精製したヤギ抗マウスIgM（ICN, Aurora, Ohio；20μg/ml）および／または可溶性の精製抗マウスCD40（Pharmingen, クローンHM40-3、2.5μg/ml）によって活性化する。LPSを10μg/mlで用いる。刺激を適用した直後にBz-423を培養に加える。阻害剤をBz-423の前に30分間加える。
【０３０４】
実施例10
統計分析
SPSSソフトウェアパッケージを用いて統計分析を行う。統計学的有意性はMann-Whitney U検定を用いて評価して、変数間の相関を二元ANOVAによって評価する。報告されたp-値は全て片側であり、データを平均値±SEMとして表す。
【０３０５】
実施例11
細胞死および低二倍体DNAの検出
細胞生存率を、ヨウ化プロピジウム（PI、1μg/ml）による染色によって評価する。PI蛍光は、FACScaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Diego, CA）を用いて測定する。低二倍体DNAの測定は、DNA-標識溶液（0.2％トライトンおよび10μg/mL RNアーゼAを含むPBSにおいて50μg/mL PI）において細胞を4℃で終夜インキュベートした後に行う。データは、凝集物を除いてCellQuestソフトウェアを用いて分析する。
【０３０６】
実施例12
O2-、Ψm、およびカスパーゼ活性化の検出
O2-を検出するために、細胞をDHE（10μM）と共に37℃で30分間インキュベートして、フローサイトメトリーによって分析して、エチジウム蛍光を測定する。ミトコンドリア膜貫通電位（Ψm）に関するフロー分析を、DiOC6(3)（20 nM）によって細胞を37℃で15分間標識することによって行う。Ψmの破壊に関する陽性対照は、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP、50μM）を用いて確立される。カスパーゼ-活性化アッセイは、FAM-VAD-フルオロメチルケトンによって行う。基質の処理は、フローサイトメトリーによって評価する。
【０３０７】
実施例13
細胞下分画およびチトクロームc検出
Ramos細胞（250×106個／試料）をBz-423（10μM）または溶媒によって1〜5時間処置した。細胞を沈降させて、緩衝液（68 mM蔗糖、220 mMマンニトール、10 mM HEPES-NaOH、pH 7.4、10 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、10μg/mLロイペプチン、10μg/mLアプロチニン、1 mM PMSF）に浮遊させて、氷中で10分間インキュベートした後、ホモジナイズした。ホモジネートを4℃で5分間（800 g）2回遠心して、核酸および破片を沈降させて、4℃で15分間（16,000g）遠心して、ミトコンドリアを沈降させた。上清を濃縮して12％SDS-PAGEゲルにおいて電気泳動して、Hybond ECLメンブレン（Amersham, Piscataway, NJ）に転写した。ブロッキング（5％ドライミルクおよび0.1％Tweenを含むPBS）の後、メンブレンを抗チトクロームcモノクローナル抗体（Pharmingen, San Diego, CA；2μg/mL）によってプロービングした後、抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ共役二次抗体によってプロービングして化学発光によって検出した（Amersham）。
【０３０８】
実施例14
単離されたミトコンドリアにおけるROS産生
雄性のLong Evansラットを終夜飢えさせて、断頭により屠殺する。肝臓試料を氷冷緩衝液A（250 mM蔗糖、10 mM Tris、0.1 mM EGTA、pH 7.4）においてホモジナイズして、核酸および細胞の破片を沈降させる（10分、830 g、4℃）。ミトコンドリアを遠心（10分、15,000 g、4℃）によって回収して、上清をS15分画として回収する。ミトコンドリア沈降物を緩衝液B（250 mM蔗糖、10 mM Tris、pH 7.4）によって3回洗浄して、緩衝液Bに20〜30 mg/mLで浮遊させる。ミトコンドリアを、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセテート（DCFH-DA、1μM）を含む緩衝液C（200 mM蔗糖、10 mM Tris、pH 7.4、1 mM KH2PO4、10μM EGTA、2.5μMロテノン、5 mMスクシネート）において希釈（0.5 mg/mL）する。状態3の測定に関して、ADP（2 mM）を緩衝液に含めて、Bz-423を加える前に、ミトコンドリアを2分間帯電させた。状態4を誘導するために、オリゴマイシン（10μM）を緩衝液Cに加える。DCFHの2',7'-ジクロロフルオレセイン（DCF）への酸化を、分光蛍光計（λex：503 nm；λem：522 nm）によって37℃でモニターする。O2-およびΔΨmに及ぼす効果を検出するために、ミトコンドリアを緩衝液Cにおいて溶媒、Bz-423、またはCCCP含有DHE（5μM）またはDIOC6(3)（20 nM）と共に37℃で15分間インキュベートして、蛍光顕微鏡による分析のために少量を採取する。
【０３０９】
実施例15
脾細胞のフローサイトメトリー分析
脾細胞を機械的破壊によって調製して、赤血球を等張的溶解によって除去した。細胞を蛍光共役抗Thy1.2（Pharmingen；1μg/mL）および／または抗B220（Pharmingen； 1μg/mL）と共に4℃で15分間染色した。外膜のホスファチジルセリンを検出するために、細胞をFITC-共役アネキシンVおよびPI（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN；1μg/mL）と共にインキュベートする。
【０３１０】
実施例16
ROSのインビボ定量
Bz-423または溶媒を処置した4ヶ月齢のNZB/Wマウスから脾臓を採取して、OCTにおいて凍結する。ROS産生を、E.D. Kerverら（E.D. Kerver et al., Histochem. J., 29:229〜237[1997]）において記述されるようにマンガン(II)3,3,9-ジアミノベンジジンを用いて測定する。
【０３１１】
実施例17
IgG力価、BUN、およびタンパク尿症
抗DNAおよびIgG力価を、P.C. Swansonら（P.C. Swanson et al., Biochemistry, 35:1624〜1633[1996]を参照されたい）において記述されるようにELISAによって決定する。血清BUNは、ミシガン大学病院臨床検査室によって測定される。タンパク尿症は、ChemStrip 6（Boehringer Mannheim）を用いてモニターする。
【０３１２】
実施例18
ベンゾジアゼピン試験
動物におけるベンゾジアゼピンの試験は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2001年8月23日に公表された米国特許公開第20010016583号において記述されている。
【０３１３】
実施例19
Bz-423誘導アポトーシスのメディエータ
Bz-423が関与する細胞死メカニズムの特徴を調べるために、細胞内ROS、△Ψm,チトクロームc放出、カスパーゼ-活性化、およびDNA断片化を経時的に測定した（表した結果は、B細胞に関するものであるが、多くの異なる細胞タイプにおける反応の特徴を調べる）。Bz-423に対する曝露後に検出された最初の事象は、O2-と特異的に反応する酸化還元感受性試薬であるジヒロエテジウム（dihyroethedium、DHE）によって染色される細胞の分画の増加である。
【０３１４】
O2-レベルは、1時間目での初期の最大値の後に減少した後、持続的な処置の4時間後に再度増加した。この二相性のパターンは、O2-を制限する細胞メカニズムに向けられ、「初期」および「後期」O2-最大値が異なるプロセスに起因することを示唆した。
【０３１５】
△Ψmの崩壊は、ミトコンドリア選択的電位測定プローブであるDIOC6(3)を用いて検出した。勾配の変化は、初期O2-反応後に始まり、5時間までに細胞の＞90％において認められた。
【０３１６】
カスパーゼ活性化を可能にする重要な段階であるミトコンドリアからのチトクロームc放出を、サイトソル分画をイムノブロットすることによって調べた。溶媒によって処置した細胞における量より多いサイトソルチトクロームcレベルが5時間までに検出された。この放出は、△Ψmの破壊と一致して、共にこれらの結果はPT孔の開口と一致した。実際に、O2-における後の増加は△Ψm崩壊およびチトクロームcの放出の後に続き、O2-の二次的な上昇がこれらのプロセスに起因することを示唆した。
【０３１７】
カスパーゼ-活性化は、汎カスパーゼ-感受性蛍光基質FAM-VAD-fmkのプロセシングによって測定した。カスパーゼ活性化は△Ψmの後に続いたが、低二倍体DNAの出現は、カスパーゼ活性化に関してわずかに遅れた。集合的に、これらの結果はBz-423がミトコンドリア依存的アポトーシス経路を誘導することを示した。
【０３１８】
実施例20
Bz-423はミトコンドリアを直接標的とする
初期O2-が他の細胞事象に先行することから、このROSは調節的役割を有する可能性があった。非貪食細胞において、MRCと共に酸化還元酵素は、主なROS源である。この反応の基礎を決定するために、これらのシステムの阻害剤をBz-423誘導O2-の調節能に関してアッセイした。これらの試薬の中で、主にチトクロームcオキシダーゼに対して作用する（ミトコンドリア呼吸鎖MRCの複合体IV）NaN3のみ、およびMRC複合体IIIのユビキノール-チトクロームc還元酵素成分によるO2-の形成を遮断するFK506のマイクロモル濃度がBz-423を調節した。これらの知見は、ミトコンドリアがBz-423誘導O2-の起源であること、およびMRCの成分が反応に含まれることを示唆した。FK506による阻害はカルシニューリンまたはFK506結合タンパク質のいずれかに対する結合に起因する可能性があるが、これらのタンパク質に堅固に結合する天然物（それぞれ、ラパマイシンおよびシクロスポリンA）はBz-423のO2-反応を低下させなかった。
【０３１９】
Bz-423によるO2-産生は、ミトコンドリア内、またはミトコンドリアにシグナルを送ってROSを生成するもう一つの区画における標的内のタンパク質に対する結合に起因する可能性がある。これらの代案を区別するために、単離されたラット肝臓ミトコンドリアを、Bz-423の存在下および非存在下で2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセテートの2',7'-ジクロロフルオレシンへの酸化をモニターすることによってROS産生に関してアッセイした。このアッセイにおいて、DCF産生速度は、内因性の還元同等物が消費される遅延時間の後に増加し、プローブ上のアセテート部分が加水分解されて、酸化還元活性種である2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンを生成した。状態3呼吸を支持する好気性条件下で、ユビキノール-チトクロームc還元酵素を阻害することによってO2-を産生するアンチマイシンA、およびBz-423はいずれも、それぞれの曲線の勾配と対照との比較に基づいて、誘導相の後、ROS産生速度をほぼ2倍増加させた。膨張は認められず、Bz-423がMPT孔を直接標的としていないことを証明した。Bz-423もアンチマイシンAも、細胞下S15分画（サイトソルおよびミクロソーム）において実質的なROSを生成せず、Bz-423はミトコンドリアが状態4にある場合、ROSを刺激しないが、アンチマイシンAはこれらの条件で活性である。併せて、これらの実験は、ミトコンドリアがBz-423の分子標的を含むこと、および状態3呼吸がO2-反応にとって必要であることを証明する。
【０３２０】
実施例21
Bz-423誘導ROSはミトコンドリアに由来する
MRC複合体IおよびIIIはミトコンドリア内の主なROS源である。先に提示した証拠は、Bz-423誘導ROSがミトコンドリアに由来することを示唆している。この仮説を調べるために、MRC機能をノックアウトして、得られた細胞をBz-423に反応したROSに関して調べた。MRCにおける複合体I〜IVは、ミトコンドリアDNA（mtDNA）によって部分的にコードされる。細胞をエチジウムブロミドの存在下で長期間培養すると、mtDNAが除去され、このことはmtDNAコードタンパク質が産生されずに、MRCに沿った電子輸送が起こらないことを示唆している（mtDNAおよび関連タンパク質を欠損する細胞はしばしばρ0細胞と呼ばれる）。エチジウムブロミドはRamos細胞に対して毒性であることから、これらの実験は、もう一つの成熟B細胞株であるNamalwa B細胞について行った。Namalwaρ0細胞をBz-423によって処置したところ、RamosおよびNamalwaρ+細胞の双方において認められたように、ROS反応は起こらなかった。
【０３２１】
初期ROSは、Bz-423誘導アポトーシスにとって重要であることから、Namalwaρ0細胞によって検出された結果はおそらく、これらの細胞がBz-423の毒性作用から保護されるであろうことを予測するであろう。しかし、6時間後、MPTは誘発され、Namalwaρ0細胞は、Bz-423に反応してアポトーシスを受けた。ρ+細胞では、MRCによるプロトンポンピングは、ミトコンドリア勾配△Ψmを維持した。機能的MRCはρ0細胞には存在しないことから、△Ψmは、ATPアーゼとして機能する複合体V（F1F0-ATPアーゼ）によって支持される（ρ0細胞におけるサブユニット6およびbの欠失は、この酵素のシンターゼ活性を消失させる）。この場合、複合体V ATPアーゼの阻害は、勾配の崩壊およびその後の細胞死を引き起こすであろう。
【０３２２】
実施例22
Bz-423はミトコンドリアF1F0-ATPアーゼを標的とする
ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼに結合するマクロライド天然物であるオリゴマイシンは、状態3から4への遷移を誘導して、Bz-423のようにO2-を産生する。これらの類似性に基づいて、F1F0-ATPアーゼもまた、Bz-423の分子標的である可能性がある。この仮説を調べるために、ミトコンドリア下粒子（SMP）におけるATP活性に及ぼすBz-423の効果を調べた。実際に、Bz-423は、約5 μMのED50でウシSMPのミトコンドリアATPアーゼ活性を阻害した。
【０３２３】
生物活性にとって必要なこの新規物質に及ぼす要素を決定するために、Bz-423の40を超える誘導体が開発された。これらの化合物を細胞全体のアポトーシスアッセイにおいて評価したところ、C'4位のヒドロキシル基およびほぼナプチル部分の大きさの芳香環が有用であることが判明した。細胞に基づくアッセイにおけるこれらの類似体の効力は、SMPを用いるATPアーゼ阻害実験におけるED50値と相関した。これらの知見は、ミトコンドリアATPアーゼがBz-423の分子標的であることを示した。これらの誘導体が細胞障害性である濃度（80μM）では、他のベンゾジアゼピンおよびPBRリガンド（例えば、PK11195および4-クロロジアゼパム）は、ミトコンドリアATPアーゼ活性を有意に阻害せず、Bz-423の分子標的がこれらの他の化合物の分子標的とは異なることを示唆している。
【０３２４】
実施例23
Bz-423はOSCPに結合する
Bz-423のメカニズムに関する一連の初期の一部として、N-メチル基を、それに対してビオチンが共有的に付着するヘキシルアミノリンカーに置換することによって、ビオチン化類似体を合成した（この改変はBz-423の活性を変化させなかった）。この分子を用いて、T7ファージの先端において融合タンパク質として発現されるヒト乳癌cDNA（Invitrogen）のディスプレイライブラリをプロービングした。新規FK506結合タンパク質を同定するために、KF506のビオチン化型を用いてAustinおよび共同研究者によって記述されたスクリーニング法の後、ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼのOSCP成分がBz-423の結合タンパク質として同定された（図1）。
【０３２５】
Bz-423が実際にOSCPに結合するか否かおよび相互作用の親和性を決定するために、ヒトOSCPを大腸菌において過剰発現させた。Bz-423の溶液をOSCPに滴定することによって、内因性のタンパク質蛍光の消光が起こり、Kd 200±40 nM（図2）が与えられた。いくつかのBz-423類似体の結合も同様に測定したところ、OSCPに関するその親和性は、細胞全体の細胞障害アッセイのみならずSMPを用いるATPアーゼ阻害実験の双方においてその効力が匹敵することが判明した。これらのデータは、Bz-423がミトコンドリアATPアーゼにおいてOSCPに結合するという力強い証拠を提供した。Bz-423は、OSCPに対する結合を通して機能する公知の唯一のATPアーゼ阻害剤である。OSCPはATP結合部位を含まず、プロトンチャンネルを含まないことから、Bz-423はATPアーゼモーターの分子運動を変化させることによって機能する可能性がある。
【０３２６】
さらなるOSCP結合アッセイを行った。表1に示すように、さらなるベンゾジアゼピン誘導体化合物はOSCPに結合する。OSCPに結合するベンゾジアゼピン誘導体化合物には、以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない：
2007534770.tif 000099
2007534770.tif 000100
2007534770.tif 000101
2007534770.tif 000102
（表１）
2007534770.tif 000103
2007534770.tif 000104
2007534770.tif 000105
【０３２７】
実施例24
OSCPのRNAiノックアウトはBz-423誘導細胞死に対して保護する
先に記述した化学および生化学標的の同定およびバリデーション試験を補足するために、細胞全体においてOSCPをノックアウトする実験を行った。インビトロにおいて、ATPアーゼからのOSCPを除去すると、酵素の加水分解活性を変化させることなく、シンターゼ機能が消失する。酵母において、OSCPノックアウトは致死的ではない；これらの細胞において、ATPの加水分解は、△Ψmを支持する化学的電位を提供して、それによってミトコンドリアの完全性を維持する。酵母のOSCPは哺乳動物タンパク質に対して限定的な配列相同性（〜30％）を有することから、これらの実験は、ヒト起源からの細胞株において行った。
【０３２８】
OSCPは核コードされることから、転写後遺伝子沈黙化を得ることができる技術であるRNA干渉（RNAi）を用いて、このタンパク質をノックアウトした。これらの実験に関して、HEK 293細胞に、OSCP配列に対して特異的な化学合成された低分子干渉RNA分子（siRNA）3個のそれぞれを、オリゴフェクタミンを用いてトランスフェクトした。これらの細胞は、オリゴフェクタミンによって非常に効率的に（90％）トランスフェクトされた。OSCP発現を、トランスフェクション後24時間、48時間、72時間および96時間目にイムノブロットによって分析した。OSCP発現の最大沈黙化（64％）はトランスフェクションの72時間後に起こった（図3）。OSCP siRNAをトランスフェクトしたHEK 293細胞は、スクランブル配列対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、Bz-423に反応したBz-ROSの低減およびアポトーシスを示した。これらの結果は、siRNAがOSCPの低減に有効であることを示し、Bz-423媒介細胞死シグナル伝達がOSCPを含むことを示唆した。
【０３２９】
実施例25
細胞増殖に及ぼすBz-423の効果
ほとんどの1,4-ベンゾジアゼピンと同様に、Bz-423はウシ血清アルブミン（BSA）に強く結合し、これは溶液中で遊離の薬物の有効濃度を低減させる。例えば、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）を含む組織培養培地では、約99％の薬物がBSAに結合する。したがって、BSAに対する結合を低減させて、遊離の[Bz-423]を増加させるために、細胞培養細胞障害アッセイを2％FBSを含む培地において行う。これらの条件において、用量反応曲線は非常に鋭く、Bz-423がごく部分的に有効である濃度範囲は限定されている。いくつかのベンゾジアゼピンは、抗増殖特性を有することが知られていることから、ED50より低い濃度でのBz-423の効果を注意深く分析したところ、アポトーシスの誘導の他に、Bz-423が培養3日後に細胞の生長を阻止することが観察された。これらの低い血清条件において、細胞障害および抗増殖効果は重なり合い、それぞれの効果を独立して調べることは難しい。しかし、[BSA]を増加させる、またはFBSを10％まで増加させることによって、用量反応曲線は平坦化して（細胞障害性ED50は増加して）、Bz-423による細胞障害性を、増殖に及ぼす効果と明らかに区別することができる。より低い量の薬物では（例えば、10〜15μM）、Bz-423は最小の細胞障害性を示したのに対し、20 μMより高い濃度では、アポトーシスのみが観察された（二相性のROS反応を含む上記のデス経路、および同様に10％FBSを含む培地において認められた）。より大量の薬物も同様に増殖を遮断する可能性があるが、増殖に及ぼす効果が認められる前にアポトーシスを引き起こした。用量反応曲線は、10％FBSを含む培地を模倣するために2％FBSを含む培地にBSAを加えた実験の場合と類似であり、このことは抗増殖および細胞障害性が血清の他の構成成分によって影響を受けないことを証明した。
【０３３０】
処置3日後の対照細胞と比較して、細胞数の減少が増殖の減少によるものであって、増殖によって均衡を保っていた細胞死によるものではないことを確認するために、細胞数の計数の他に、細胞分裂を調べた。PKH-67は細胞膜に非可逆的に結合して、細胞分裂によって娘細胞に等しく分配される蛍光プローブであり、フローサイトメトリーによって細胞分裂を定量することが可能である。PKH67によって染色してBz-423によって処置したRamos細胞は、細胞障害濃度より下ではより少ない細胞分裂を示し、このことは、細胞数の減少が抗増殖効果によるものであって細胞死によるものではないことを確認した。Bz-423誘導抗増殖がRamos細胞に対して特異的であるか否かを決定するために、細胞数および細胞周期の実験を他のB細胞株および固形腫瘍に由来する細胞株において行った。表2において認められるように、増殖の遮断に及ぼす効果はリンパ様細胞に独自ではなく、多数の組織タイプに共通の標的が増殖の遮断を媒介することを示唆した。
（表２）10％FBSを含む培地において72時間処置した細胞の抗増殖に関するED50（μM）。試験のための細胞には、Ramos細胞ならびにBcl-2およびBcl-XLを過剰発現するようにトランスフェクトされたクローン；ヌルp53を有する卵巣細胞（SKOV3）；神経芽腫細胞株（IMR-32、Lan-1、SHEP-1）；ならびに悪性B細胞株が含まれた。
2007534770.tif 000106
【０３３１】
実施例26
Bz-423を処置した細胞の遺伝子プロファイリング
遺伝子プロファイリング実験を行って、それによってBz-423が細胞増殖を遮断するメカニズムを探索した。シクロヘキシミドをタンパク質合成の阻害剤として用いる試験において、Bz-423誘導細胞死は、新規タンパク質合成に依存しないことが判明した。したがって、遺伝子発現における変化は、抗増殖のメカニズムのみに関連する可能性がより高かった。下流の効果よりむしろシグナル-反応カップリングに関係する変化を検出する可能性を増加させるために、Bz-423を3時間処置した細胞のプロフィールを調べた。これはROS初期最大値の直後であるが、ミトコンドリア透過性孔の開口を含む他の細胞変化が起こる前の時点である。
【０３３２】
Bz-423の病原性細胞タイプに対する前アポトーシス、細胞障害性、および生長阻害特性の発見により、このクラスの物質が自己免疫障害、癌、および他の新生物疾患に対して治療的である可能性が同定された。この物質によって誘導される遺伝子発現の変化の分析からのさらなる実験的証拠は、この化合物の作用のメカニズムの理解を拡大させて、それが調節する治療効果を収集するための一助となる。
【０３３３】
Bz-423によって誘導された遺伝子発現の変化（mRNAレベルで）を決定するために、Ramos細胞によるインビトロ試験を、密度500,000個/mlで細胞を培養することによって行った。溶媒対照（DMSO、最終濃度0.1％V/V）、Bz-423、またはBz-OMe（10μM）を細胞に加えた。4時間後、細胞を回収してTrizol試薬（#15596-018、Life Technologies, Rockville, MD）およびRNeasy Maxiキット（#75162、Qiagen, Valencia, CA）を用いて製造元のプロトコールに従ってRNAを調製した。一本鎖cDNAを、開始の総RNA試料に存在するポリ(A)RNAを用いて逆転写によって合成した。一本鎖cDNAを二本鎖cDNAに変換した後、ビオチン化UTPおよびCTPの存在下でインビトロ転写を行い、ビオチン標識cRNAを産生した。cRNAをMg2+の存在下で断片化して、ヒトゲノムU133A Genechipアレイ（Affymetrix）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション結果を、GeneArrayスキャナを用いて定量して、Affymetrixによって提供された説明書に従って分析を行った。
【０３３４】
Bz-423、Bz-OMe、または溶媒対照を処置した細胞から単離したRNAを用いる発現プロファイリングを、ヒト遺伝子約22,000個を表すHGU133A Affymetrix遺伝子チップについて行った。p＜0.01を含む基準を用いて、遺伝子16個が対照細胞と比較して8倍またはそれ以上発現される。Bz-423の分子標的に基づいて予測されるように、これらの遺伝子の多くが解糖に関係していた。
【０３３５】
データを分析して、対数変換した平均シグナルが溶媒対照試料と比較して処置試料において少なくとも4倍変化する、および対照値の分散係数（n＝4）が10％未満であるという基準に従って、Bz処置の遺伝子変化を検出した。これらの遺伝子は治療反応を媒介する可能性がある標的を表す。
【０３３６】
Bz-423およびBz-Omeに関する遺伝子発現結果はそれぞれ、情報の独自のフィンガープリントを提供する。Bz-OMeの構造は以下の通りである：
2007534770.tif 000107
【０３３７】
いくつかの遺伝子の発現は、Bz-423およびBz-OMeの双方に対する暴露後、類似に変化する。このように、二つの化合物のあいだで共通に調節される遺伝子は、より一般的なクラスの化合物を通しての遺伝子調節を理解するために特に関連する。図4は、Bz-423およびBz-OMeによって処置した細胞の遺伝子発現プロフィールを示すデータを表す。
【０３３８】
実施例27
ODCレベルおよび活性に及ぼすBz-423の効果
RNAプロファイリングデータから示唆されるように、ODC活性およびポリアミン代謝がBz-423によって影響を受けるか否かを決定するために、Bz-423を処置した細胞におけるODC活性を、溶媒対照と比較して直接測定した。これらの実験において、オルニチンのプトレシンへの変換を、3H-オルニチンを用いて定量した。比較のために、対照細胞を、溶媒対照またはオルニチンデカルボキシラーゼの強力な阻害剤であるジフルオロメチルオルニチン（DFMO）（Bz-423と同様にDFMOは強力な抗増殖剤である）によって処置した。図3において認められるように、細胞をBz-423によって4時間処置すると、ODC活性は用量依存的に有意に低減し、これは中でもRNAプロファイリングから示唆されるように、アンチザイム1の増加と一貫する。ODC活性の低減は、同じ条件で測定したODCタンパク質レベルの減少に匹敵した。
【０３３９】
先に記述したように、Bz-423誘導アポトーシスは、状態3から4への遷移の結果としてMRC複合体IIIから生じたROS反応によってシグナルが伝達された。アポトーシスにとって重要であるROS反応も同様に、ODCに及ぼすこれらの作用を媒介するか否かを決定することを、次に求めた。ODC活性の減少にROSが必要であれば、同様にBz-423に対する抗増殖反応のおそらく一部として関係しているであろう。これを調べるために、Ramos細胞をBz-423、DFMO、または溶媒対照によって4時間処置した。平行して、第二の群の細胞をMnTBAPと共にプレインキュベートして、ROSを限定した後、Bz-423、DFMOおよび溶媒対照と共に培養した。MnTBAPはBz-423によるODCの阻害を有意に逆転した。
【０３４０】
集合的に、これらのデータは、高い[Bz-423]（例えば、＞10μM）が、細胞の抗酸化剤によって解毒化できないROSの有意な量を産生し、それによって18時間以内にアポトーシスが起こるという可能性がある解釈を示唆した。より低い[Bz-423]は比例してより小さいROS反応を誘導し、これはアポトーシスを誘発するためには不十分であった。しかし、この場合、ROSはODCを阻害することができる、または細胞増殖を遮断することができる可能性がある。
【０３４１】
この仮説と一致して、フェノールヒドロキシルをClに置換した化合物（Bz-Clと命名される）は、細胞障害性が最小であり（Bz-423と比較して活性の約80％の減少）細胞において小さいROS反応を生成し、同様にOSCPに対してあまり堅固に結合しなかった（Kd≒5μM）。この化合物はまた、上記の仮説から予測されるように、ODC活性を阻害した（図3）。生長停止の媒介における提唱された役割およびBz-423誘導ROSの性質を考慮して、Bz-Clを、表4における細胞のパネルに対して試験したところ、3日後にBz-423と類似の程度に増殖を低減させ、同等のED50値を有することが判明した。これらの結果は、これらの化合物の抗増殖効果が、アポトーシスを誘導することなく増殖を遮断するBz-423の化学類似体を用いて得られうることを証明した。
【０３４２】
実施例28
新規細胞障害性ベンゾジアゼピンの構造活性研究
Bz-423のこれらの特性に基づき、一連のBz-423誘導体を合成して、結合および活性にとって重要なこの新規化合物の構造要素を探索した。N-メチル基または塩素を水素に置換しても、不死化されたRamos B細胞またはJurkat T細胞の培養物に対するリンパ球毒性活性に対してほとんど効果を示さなかった。同様に、Bz-423の双方のエナンチオマーは、等しい効力を有し、このことはBz-423とその分子標的との相互作用が2点の結合を含むことを示している。これらのデータとは対照的に、ナフタラニンを除去する（表3を参照されたい）。本発明は、特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は、本発明の実践にとって必ずしも必要ではない、それにもかかわらず、部分またはフェノールヒドロキシル基を水素に置換すると全ての細胞障害活性が消失すると企図される（表2）。これらの知見に基づいて、C'3およびC'4位への変化を調べた。1-ナフトールを2-ナフトに置換しても、殺細胞に対してほとんど効果を示さない。同様に、ナプチルアラニンを同等の大きさの他の疎水性基に置換しても、Bz-423の細胞障害活性に対してほとんど効果を示さなかった。対照的に、キノリン7-9はそれぞれBz-423ほど強力ではなかった。本発明は、特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではないが、それにもかかわらず、これらのデータは、Bz-423に関する結合部位内の疎水性置換基に対する選択性を示唆すると企図される。より小さいC3置換基はBz-423よりいくぶん効力が弱いが、酸素を含む芳香族基を有する化合物は、有意に細胞障害性が低かった。これらのデータは、かさの高い疎水性芳香族置換基が最適な活性にとって有用であることを明らかに示している。
（表３）Bz-423誘導体の効力。それぞれの化合物の用量依存的な存在下でRamos B細胞を培養することによって、細胞死を評価した。細胞の生存率は、フローサイトメトリーを用いて24時間後にヨウ化プロピジウムの排除によって測定した。このアッセイにおいて、PK11195、ジアゼパム、および4-Cl-ジアゼパムのEC50は、＞80μMである。
2007534770.tif 000108
a それぞれのEC50値は1試料当たり3個ずつ2回測定し、を有する。
【０３４３】
ヒドロキシル（16）に対してオルトの位置にメチル基を置いても、Bz-423の活性を変化させないが、ヒドロキシルをC'4（17）位に移動させると、効力は2倍減少した（表3）。対照的に、ヒドロキシルを塩素もしくはアジドに置換する、またはフェノールをメチル化すると、Bz-423の細胞障害活性を有効に消失させる。本発明は、特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではないが、それにもかかわらず、これらのデータは、C'4位の炭素にヒドロキシル基を置くことが、標的の結合時に重要な接触を作製することによって、最適な活性にとって必要であることを示していると企図される。しかし、フェノールサブ構造を有する分子も同様に、MRCにおいて代わりの電子担体として作用しうる。そのような物質は、MRC酵素から電子を受容して、これをより高い還元能の点で鎖に転移させる。このタイプの「酸化還元サイクリング」は、内因性の還元同等物（例えば、グルタチオン）をピリミジンヌクレオチドと共に消費して、それによって細胞死が起こる。これらの代用物を区別するために、標準的なNADHおよびNAD(P)H酸化アッセイを用いて、ミトコンドリア下粒子の存在下でBz-423が酸化還元を循環させるか否かを決定した。陽性対照（ドキソルビシンおよびメナジオン）とは異なり、Bz-423は基質の酸化を引き起こさず、酸化還元を循環させないことを示唆している。本発明は特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではないが、それにもかかわらず、集合的に、データは、化合物18〜20の活性の減少は、その標的タンパク質に対するBz-423の結合を媒介する相互作用を除去したことに起因すると企図される。
（表４）Bz-423誘導体の効力。細胞死は、表1に記述したように評価した。
2007534770.tif 000109
【０３４４】
細胞はBz-423に反応して急速にO2-を産生し、このシグナルを遮断すると（例えば、Bz-423に反応してO2-を産生する酵素であるユビキノールチトクロームcレダクターゼを阻害することによって）アポトーシスが阻止される。Bz-423誘導体がBz-423と類似の方法（おそらく共通の分子標的に結合した結果として）で細胞を殺すか否かを決定するために、そのマイクロモル量がユビキノールチトクロームcレダクターゼを有効に阻害するFK506が、細胞死に対して保護するか否かを調べた。FK506による阻害（≒60％）は、ベンゼンより大きい疎水性C3側鎖を有する化合物である3〜6、12、13、16、および17に関して認められたに過ぎない。これらの化合物（Bz-423を含む）のそれぞれによって誘導された細胞死も同様に、18、19、または20のいずれかによって細胞を前処置（＞40μMで）することによって阻害された（≒60％）。化合物18、19および20は、表4に記載の他のベンゾジアゼピンの細胞障害活性の遮断に効果を示さなかった（≒20％の阻害）。本発明は特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではないが、それにもかかわらず、これらのデータは、Bz-423が3〜6、12、13、16、および17と共に標的タンパク質内の同じ部位に結合して、共通のメカニズムを通してアポトーシスを誘導することを強く示唆すると企図される。他の化合物は、この部位で結合せず、異なる経路を通して死の反応を誘導する。
【０３４５】
実施例29
ATPアーゼ活性の測定
ミトコンドリアは、既に記述されているように屠殺したばかりのウシの心臓から単離した（例えばGraham, J.M., 「Subcellular Fractionation and Isolation of Organelles : Isolation of Mitochondria from Tissues and Cells by Differential centrifugation, in Current Protocols in Cell Biology. 1999, John Wiley & Sons, Inc: New York. p.3.3.3〜3.3.4を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。緩衝液は全て2-メルカプトエタノール（5 mM）を含んだ。ミトコンドリア下粒子（SMP）は、0.5インチのチタンプローブを備えたMisonix超音波装置3000をエネルギー設定8.5で用いて、ミトコンドリア浮遊液のそれぞれの部分を超音波処理のあいだに2分の間隔を設けて40秒間で3回超音波処理したことを除き、Walkerら（例えば、Walker, J.E., et al., Methods Enzymol, 1995, 260:p.163〜90を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）に従って、ウシ心臓ミトコンドリアの超音波処理によって調製した。ミトコンドリアF1F0-ATPアーゼ活性は、ADPの産生をピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ反応によるNADHの酸化にカップリングさせた後、NADH酸化速度を分光光度法によって340 nmで30℃でモニターすることによって測定した（例えば、McEnery, M.W., et al, J Biol Chem, 1986. 261(4):p.1745〜52；Harris, D.A., Spectrophotometric Assays, in Spectrophotometry and Spectrofluorimetry, D.A. Harris, Bashford, C.L., Editor. 1987, IRL Pressを参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。反応混合物（最終容積0.25 mL）は以下を含んだ；Tris-HCl（100 mM）、pH 8.0、ATP（0〜2 mM）、MgCl2（2 mM）、KCl（50 mM）、EDTA（0.2 mM）、NADH（0.2 mM）、ホスホエノールピルビン酸（1 mM）、ピルビン酸キナーゼ（0.5 U）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（0.5 U）。それぞれの試料は、様々な濃度のBz-423（または溶媒対照）と共にプレインキュベートした（30℃で5分）SMP（7μg）または精製F1-ATPアーゼ（0.29 μg）を含んだ。
【０３４６】
実施例30
過形成実験の試薬
Bz-423は既に記述されたように合成して（例えば、Lattmann, E., et al., (2002)Drug Des Discov 18, 9〜21を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）、20 mg/mlでジメチルスルホキシド（DMSO）水溶液に溶解した。DMSOは、全ての実験において最終濃度0.5％（v/v）またはそれ未満で存在した。本試験において用いた他の全てのベンゾジアゼピンは、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から得た。RAはSigma-Aldrichから得た。レチノイドはDMSOにおいて20 mg/mlで希釈して凍結保存した。使用時に、RA保存液を培養培地において希釈して、最終濃度1.0μg/mlで用いた。細胞内シグナル伝達試験において用いた試薬には、EGF受容体の総および燐酸化型、ならびに総および燐酸化-Erk 1/2に対する抗体（Cell Signaling Technologies, Inc.; Beverly, MA）が含まれた。β-チューブリンに対する抗体は、Santacruz Biotech（Santa Cruz, CA）から得た。他の化学試薬はSigma-Aldrichから購入して、例外については表記した。
【０３４７】
実施例31
過形成実験に関するヒト皮膚臓器培養
太陽光から保護された臀部の皮膚の2 mmの完全な厚みの穿孔生検を若い成人ボランディアから得た。この試験プロジェクトにおけるヒト被験者の参加は、ミシガン大学内倫理委員会によって承認され、被験者は全員、試験への参加前に書面でのインフォームドコンセントを提出した。生検の直後に、組織を、ケラチノサイト基本培地（KBM）（Cambrex Bioscience, Walkersville, MD）からなる培養培地に浸した。KBMは低Ca2+で、高密度ケラチノサイト生長のために最適化したMCDB-153培地の無血清改変版である。これにCaCl2を添加してCa2+の最終濃度を1.4 mMにした。氷に入れて研究室に運んだ後、生検を、さらなる処置を行って、または行わずに（例えば、RAおよび／またはBz-423）Ca2+添加KBM 250μlを含む24ウェル皿においてインキュベートした。培養物を、95％空気および5％CO2の大気中で37℃でインキュベートした。培地の最小容積において組織を維持する以外に、厳密な空気-液体界面を確保するためにそれ以上のことを行わなかった。インキュベーションは8日間行い、培地の交換および新しい処置は2日おきに行った。インキュベーション期間の終了後、組織を10％緩衝ホルマリンにおいて固定して、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色した後、組織学的に調べた。表皮の厚さの測定は、それぞれの組織切片において5カ所の部位で行い、平均した。無処置、レチノイド曝露、およびレチノイド＋Bz-423処置生検に関して、厚さの値の平均値を決定した。臓器培養技法は過去に記述されている（例えば、VaraniJ,  et al., (1993)Amer. J. Pathol. 142:189〜198, 1993；Varani J,  et al., (1994)J. Clin. Invest. 94:1747〜1753を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３４８】
実施例32
過形成実験に関する単層培養におけるヒト表皮ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞
新生児の環状切除から得た包皮組織を表皮ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞源として用いた。このプロジェクトにおいて包皮組織を用いることは、ミシガン大学内倫理委員会によって承認された。表皮ケラチノサイトは、既に記述されているように包皮組織から単離した（例えば、Varani J, et al., (1994)J. Clin. Invest. 94:1747〜1753を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。初代培養および初期継代細胞をケラチノサイト増殖培地（KGM）（Cambrex Bioscience.）において維持した。KGMは、KBMと同じ基本培地を含むが、0.1 ng/ml EGF、0.5μg/mlインスリン、および0.4％ウシ下垂体抽出物を含む増殖因子混合物をさらに添加した。同じ包皮組織から得た線維芽細胞を、非必須アミノ酸および10％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変最小基本培地（DMEM-FBS）を用いて単層培養において生長させた。ケラチノサイトおよび線維芽細胞はいずれも、95％空気および5％CO2の大気中で37℃で維持した。細胞をトリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）に対する曝露によってサブ培養して継代2〜3回で用いた。
【０３４９】
実施例33
過形成実験に関する増殖アッセイ
ケラチノサイトを、24ウェルプレートにおいてKGMを培養培地として用いて5×104個/ウェルで播種してた。細胞を接着させた後、細胞を洗浄して異なる濃度のBz-423または図の説明文に示される他のベンゾジアゼピンと共にKGMにおいて培養した。増殖は、細胞をトリプシン／EDTAによって放出させて、粒子カウンター（Coulter Electronics, Hialeah, FL）を用いてそれらを計数することによって3日目に測定した。線維芽細胞の増殖試験は、1.4 mM Ca2+を添加したKBMを培養培地として用いたことを除き、同じ方法で行った。
【０３５０】
実施例34
過形成実験のための細胞溶解物の調製およびシグナル伝達中間体のイムノブロットアッセイ
ケラチノサイトを、6ウェル皿のウェルにおいてKGMを培養培地として用いて3×105個/ウェルで播種した。細胞を終夜接着させた。翌日、細胞を洗浄してEGF（10 ng/ml）およびBz-423（0.5または1.0μg/ml）の存在下または非存在下でKGMにおいてインキュベートした。5または15分間のインキュベーション後、細胞を、20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、2 mMバナジン酸ナトリウム、1.0 mMフッ化ナトリウム、100 mM NaCl、1％NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、25μg/ml各アプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチン、ならびに2 mM EDTAおよびEGTAからなる1×細胞溶解緩衝液において溶解した。溶解は、細胞を溶解緩衝液に掻き取って試料を超音波処理することによって4℃で行った。細胞溶解物を氷中で30分間インキュベートした後、16000 gで15分間微量遠心することによってきれいにした。上清の液体を回収して、BioRad DCタンパク質アッセイキット（BioRad, Hercules, CA）を用いてタンパク質濃度を推定した。
【０３５１】
等量のタンパク質（総タンパク質40μg/レーン）を含む細胞抽出物を10％SDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。EGF受容体の総および燐酸化型および総Erk 1/2および燐酸化Erk 1/2に関するウェスタンブロッティングを既に記述されているように行った（例えば、Zeigler ME, et al., (1999)J Cell Physiol 180:271〜284を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３５２】
実施例35
過形成実験に関する細胞内反応性酸素種（ROS）の検出
2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセテート（DCFH-DA, Molecular Probes, Eugene, OR）を、それぞれの使用前にDMSOにおける10 mM保存液として調製した。48ウェルプレートにおいて生長させた細胞を、培養培地に直接加えたDCFH-DA（100μM）と共にローディングして（37℃で30分）、洗浄した後、処置前に新鮮な培地に入れた。表記の処置の後、酸化された産物2',7'-ジクロロフルオレセイン（DCF）の蛍光を、FACSCalibur（BD Bioscience, San Diego, CA）を用いてフローサイトメトリーによってモニターした。各試料に関して、事象10,000個を記録して、データを分析して蛍光強度の中央値を決定した。
【０３５３】
実施例36
Bz-423は、過形成実験に関して臓器培養においてRA処置ヒト皮膚の表皮の厚みを低減させる
臓器培養において8日間インキュベートした健康なボランティアからのヒト皮膚の2 mm穿孔生検は、正常な皮膚の組織学的特徴を維持した（図5A & 5D）。同じ被験者からの同一生検をRA（1μg/ml、DMSO溶媒の最終濃度0.01％）の持続的な存在下で培養した場合、表皮の過形成が起こった（図5B＆5E）。生検標本をRA（1μg/ml）およびBz-423（0.5μg/ml）の双方を含む培地において培養した場合、表皮の過増殖反応が阻害された（図5C＆5F）。
【０３５４】
異なるヒトドナー5人からの皮膚に関する表皮の厚み測定の平均値から、RA誘発表皮の肥厚がBz-423によって低減することが判明した（図5、下のパネル）。無処置皮膚において、表皮の厚みの平均値は23±3 μm2であった。RA（1μg/ml）の存在下、表皮の厚みは50±4μm2まで増加したが、RA（1μg/ml）＋Bz-423（0.5μg/ml）の存在下では、表皮の厚さは33±3μm2（p＜0.05）であった（図5、下のパネル）。臓器においてBz-423を処置した生検標本の注意深い顕微鏡評価を行っても、さらなる組織学的変化をBz-423に帰することができなかった。特に、真皮の細胞密度または構造に差がないこと、真皮-表皮界面に差がないこと、およびケラチノサイト分化および角質化に効果を示さないことが同定された。さらに、Bz-423処置標本は、アポトーシス細胞が増加していないことが顕著であった。
【０３５５】
さらなる試験において、RA曝露皮膚を異なる濃度のBz-423によって処置して、表皮の厚さに関して調べた。0.1μg/mlでは、表皮の肥厚は低減したが、0.5μg/ml未満のレベルでは低減しなかった。表皮の肥厚の低減はまた、Bz-423のより高濃度（例えば、1および5μg/ml）においても認められた。5μg/mlでは、壊死を認めた。
【０３５６】
実施例37
Bz-423はケラチノサイトおよび線維芽細胞においてROSを増加させる
処置1時間以内に、Bz-423はリンパ様細胞においてROS産生を用量依存的に増加させた。ケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるBz-423に対する抗増殖反応が同様にROS産生を含むか否かを決定するために、Bz-423処置細胞における細胞内ROSレベルを測定した。図6に示すように、平均細胞蛍光として評価したROS反応は、Bz-423の250 nMもの低い用量で双方の細胞タイプにおいて認められた。ROS反応は、双方の細胞タイプにおいて用量依存的に増加した。調べた全ての濃度において、ケラチノサイトは線維芽細胞より大きいROS反応を生じた（図6）。類似の知見は、ROS産生を平均細胞蛍光よりむしろベースラインを超えた細胞分画に関して評価した場合に得られた。本発明は特定のメカニズムに限定されない。実際にメカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、リンパ様細胞におけるこれまでの知見と同様に、これらの結果は、Bz-423に曝露した場合のケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるROSレベルの初期上昇を示している。そのため、リンパ様細胞においてミトコンドリアROS産生標的に対する直接結合を含むと既に決定されたBz-423の作用機序は、ケラチノサイト増殖および表皮過形成を低減することに関係する。
【０３５７】
実施例38
ケラチノサイトにおけるEGF受容体発現およびErk燐酸化に及ぼすBz-423の効果
EGF受容体の活性化およびMAPキナーゼ経路を通しての下流のシグナル伝達は：i）ケラチノサイト増殖を誘導する刺激に反応して活性化される,およびii）表皮過形成の発病において役割を有することから、Bz-423処置ケラチノサイトにおいて、EGF受容体活性化およびMAPキナーゼ（Erk 1/2）シグナル伝達が影響を受けるという仮説を立てた。この可能性を調べるために、EGF受容体の総および燐酸化型を、マイトゲン刺激後の無処置およびBz-423処置細胞において測定した。増殖因子を枯渇したケラチノサイトをBz-423（0、0.5 または1.0μM）と共に10分間プレインキュベートした後、EGF（10 ng/ml）によって刺激した。EGFを加える直前、EGF刺激5分後、および15分後の同一の試料から調製した溶解物を、A：総および燐酸化EGF受容体発現, ならびにB：総および燐酸化ERK 1/2発現に関して分析した。相対的タンパク質レベルを走査型密度測定によって定量した。総または燐酸化EGF受容体のレベルの差が検出された。同様に、ケラチノサイトのマイトゲン刺激前および直後のErk 1/2の燐酸化状態を、Bz-423の存在下または非存在下で評価した。総Erk 1/2タンパク質において変化を認めなかったが、EGF誘発Erk燐酸化はBz-423によって用量依存的に低減した。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、これらの結果は、ケラチノサイトにおけるBz-423の抗増殖作用がErk活性化の低減に関連していること、しかしその効果は下流のEGF受容体発現によって媒介されることを示している。これらの知見は、活性化EGF受容体とErk 1/2とのシグナル伝達に関係している一つまたは複数のキナーゼ／ホスファターゼが、Erk 1/2自身を含めて、Bz-423によって調節される（ROSを通して直接または間接的に）ことを示している。
【０３５８】
実施例39
過形成実験の考察
過去の研究は、表皮過形成（乾癬のような疾患において起こると共に局所レチノイド治療の結果として起こる）が、EGF受容体に対するリガンドの皮膚内産生およびオートクラインまたはパラクラインによるEGF受容体活性化を含むという確信できる証拠を提供した（例えば、Gottlieb AB, et al., (1988)J. Exp. Med. 167:670〜675；Elder JT, et al., (1989)Science 243:811〜814；Piepkon M, et al., (1998)J Invest Dermatol 111:715〜721；Piepkorn M, et al., (2003)Arch Dermatol Res 27:27；Cook PW, et al.,(1992)Cancer Res 52:3224〜3227；Varani J, et al., (1998)Pathobiology 66:253〜259を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。EGF受容体の活性化および付随する下流のシグナル伝達事象は、生理的なケラチノサイト増殖がEGF受容体遮断の存在下で継続することから（例えば、Varani J, et al., (2001)J. Invest. Dermatol 117:1335〜1341；Varani J, et al., (1998)Pathobiology 66:253〜259を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）および真皮の機能がEGF受容体活性に依存しないことから（例えば、Varani J, et al., (2001)J. Invest. Dermatol 117:1335〜1341；Varani J et al., (1998)Pathobiology 66:253〜259；Tavakkol A et al., (1999)Arch Dermatol. Res. 291:643〜651を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）、過形成状態における治療のための標的を提供する。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、本発明の過程において実行された実験は、新規ベンゾジアゼピン類似体であるBz-423および関連化合物が、線維芽細胞機能に有害な効果を及ぼすことなく、ヒト皮膚臓器培養においてレチノイド誘導表皮過形成を阻害することを証明している。
【０３５９】
Bz-423は、自己免疫疾患および特定の悪性疾患に対して有効性を有する前アポトーシス物質として当初開発された。双方の状況において、目標は、意図される標的細胞の細胞障害性であった。これらの過去の研究において、細胞障害活性の他に、Bz-423はまた、いくつかの条件において細胞抑制性であった。本出願（例えば、正常な表皮または真皮の事象を抑制することなく、表皮における過形成生長を阻害する）は、この分子の細胞抑制能を利用する。
【０３６０】
本発明は、、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、Bz-423が過形成表皮生長を抑制するメカニズムは完全に理解されていない。悪性Bリンパ球に関して行った試験は、細胞内ROSの低レベル産生が、生長阻害および細胞障害性を有するROSのより高用量の産生に相関することを証明した。Bz-423に反応した細胞内ROS産生は、皮膚においても起こる可能性がある。単層培養の表皮ケラチノサイトにおいてROS産生を誘導したBz-423濃度は、臓器培養において過形成を抑制した同じ濃度であった。最後に、細胞に浸透する二つの抗酸化剤を用いると、ケラチノサイトにおけるBz-423の抗増殖効果が部分的に逆転した。過去の研究から、紫外光に対する表皮ケラチノサイトの曝露が、酸素ラジカル生成に依存するプロセスにおいてEGF受容体燐酸化を誘導することが示されている。Bz-423による処置の結果としてEGF受容体の燐酸化状態に変化を認めなかった。一方、Erk燐酸化は、同じ処置によってダウンレギュレートされた。Erk活性化（燐酸化によって証明）は、EGF受容体活性化の下流の標的であるが、同様に多数の他の受容体-リガンド相互作用の下流の結果としても起こる（例えば、Alpin AE, et al., (1998)Pharmacol. Rev. 50:197〜263を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、細胞内ROS産生は、多数の異なる開始点に由来するシグナル伝達事象とはカップリングしないと企図される。
【０３６１】
表皮機能に影響を及ぼすことなくレチノイド誘導表皮過形成を妨害できることは、治療経路を提供する。一般的に、RAの局所適用後に皮膚において起こる過形成は、レチノイド処置を伴う付随する皮膚刺激がいくぶん原因であると容認される。レチノイド誘発皮膚刺激の主な発現は発赤およびフレーキングである（例えば、Kang S, et al., (1995)J Invest Dermatol. 105:549〜556を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。刺激反応の基礎となる細胞および分子事象は完全には理解されていない。部分的に、それらは、急速に増殖するケラチノサイト集団におけるインターロイキン-1（IL-1）と他のサイトカインの労作を反映する可能性がある（例えば、Maas-Szabowski N, et al., (2000)J. Invest. Dermatol. 114:1075〜1084；Wood LC, et al., (1996)J. Invest. Dermatol. 106:397〜403を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。これらのサイトカインは、血管機能の局所的な変化を生じ（例えば、Nguyen M, et al., (2001)Cell Biol. 33:960〜970を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）、次に皮膚の発赤の直接原因であると考えられる浮腫および炎症細胞の流入を促進する。一方、フレーキングは、皮膚からの過剰な表皮の脱落を反映する可能性がある。同時に、表皮および真皮におけるレチノイドの作用は同じ経路を通して起こると考えられた。そのため、真皮におけるレチノイド処置の有用な効果（例えば、線維芽細胞の活性化、プロコラーゲン産生の増加、マトリクスメタロプロテナーゼの労作の減少）（例えば、Griffiths CEM, et al., (1993)New Eng. J. Med. 1993:329:530〜534；Fisher GJ, et al., Datta  SC, et al., (1996)Nature, 379:335〜338；Varani J, et al., (2000)J. Invest. Dermatol. 114:480〜486を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）と皮膚の刺激とは、分離することができないように思われる。しかし、最近の研究は、EGF受容体チロシンキナーゼ活性の拮抗は、真皮における有益な効果を干渉することなく、表皮過形成を抑制することを証明した（例えば、Varani J, et al., (2001)J. Invest. Dermatol 117:1335〜1341を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。他の研究は、下流のシグナル伝達の阻害がまた、線維芽細胞機能を遮断することなく、ケラチノサイト増殖を阻害できることを示した（例えば、Bhagavathula N, et al., (2004)J. Invest Dermatol. 122:130〜139を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、Bz-423および関連化合物は、EGF受容体活性化から増殖に至る経路において中間のシグナル伝達事象（Erk活性化）を干渉することによって、類似の効果を有しうるであろう。表皮過形成を阻止するためにErk活性化を完全に抑制する必要はない。実際に、Erk燐酸化の完全な抑制は、細胞抑制よりむしろ細胞障害性に関連している（例えば、Zeigler ME, et al., (1999)J Cell Physiol., 180:271〜284を参照されたい；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３６２】
本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、EGF受容体媒介表皮過形成を干渉する物質は、抗乾癬剤として有用である。乾癬における誘発事象は、免疫系の欠損であるが（例えば、Valdimarsson H, et al., (1995)Immunology Today, 16:145〜149；Austin LM, et al., (1999)J. Invest. Dermatol. 113:101〜108を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）、過形成に関与する下流の事象には、病変皮膚表皮におけるEGF受容体のオートクラインまたはパラクライン活性化が含まれることは多くのアプローチが示している（例えば、Gottlieb AB, et al., (1988)J. Exp. Med. 167:670〜675；Elder JT, et al., (1989)Science 243:811〜814；Piepkorn M, et al., (1998)J Invest Dermatol 111:715〜721；Piepkorn M, et al., (2003)Arch Dermatol Res 27:27；Cook PW, et al., (1992)Cancer Res 52:3224〜3227；Varani J, et al., (1998)Pathobiology 66:253〜259を参照されたい；そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３６３】
Bz-423は、培養において多くの細胞タイプに対して細胞障害性および細胞抑制作用を有するベンゾジアゼピン類似体である。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実践にとって必要ではない。それにもかかわらず、本発明の過程において行われた実験は、臓器培養におけるBz-423および関連化合物によるヒト皮膚の処置が、併用したレチノイド処置に起因する表皮過形成を抑制することを証明する。ヒト皮膚臓器培養においてレチノイド誘導過形成を抑制できることは、皮膚におけるレチノイド刺激反応を緩和するための組成物および方法を提供する。
【０３６４】
実施例40
細胞死の検出
Jurkat T細胞を以下の化合物に曝露した：
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式中、RはH、NH2、またはニコチンである。それぞれの化合物によってJurkat T細胞において細胞死が起こった。特に、R＝Hでは90％の細胞死が起こった；R＝NH2では、90％の細胞死が起こった；およびR＝ニコチンでは50％の細胞死が起こった。対数生長期の細胞を遠心（300 g、5分）によって回収して、新鮮な培地（1％または0.2％FBSを含む）に交換して、細胞100,000〜300,000個/mLの濃度に希釈した。薬物を50倍保存液から加えて、細胞を24時間培養（37℃、5％CO2）した後に分析した。細胞をMTT色素変換アッセイによって分析して、相対的細胞数／生存率を決定し、フローサイトメトリーによって細胞生存率を計数した。
【０３６５】
実施例41
ベンゾジオン誘導体は、ATP加水分解を阻害するが、細胞合成特性に影響を及ぼさず、細胞生存率にも影響を及ぼさない
本実施例は、ベンゾジオン誘導体（例えば、T5：
2007534770.tif 000111
）がATP加水分解を阻害することができるが、細胞合成を阻害せず、細胞生存率に影響を及ぼさないこと、およびその活性が、ミトコンドリアF0F1 ATPアーゼの他の成分（例えば、F1サブユニット）に沿ってまたは共に、OSCPの結合に関連することを証明する。特に、図7はBz-423とT5とのあいだのATP加水分解の比較を示し、図8は、Bz-423とT5とのあいだのATP合成の比較を示し、および図9はBz-423とT5とのあいだの細胞生存率の比較を示す。
【０３６６】
上記の明細書において言及した全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特異的な好ましい態様に結びつけて記述してきたが、請求される本発明は、そのような特異的態様に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際に、本発明を行うために記述の様式の様々な改変が当業者に明白であり、それらも以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１】OSCP成分がBz-423の結合タンパク質であることを証明するデータを示す。
【図２】Bz-423と精製ヒトOSCPとの結合等温線を示すグラフである。
【図３】OSCPのsiRNA調節を示す。
【図４】本発明の化合物によって処置された細胞の遺伝子発現プロフィールを示すデータを示す。Bz-423の存在下でアップレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Aに提示する。Bz-423の存在下でダウンレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Bに提示する。Bz-OMeの存在下でアップレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Cに提示する。Bz-OMeの存在下でダウンレギュレートされた遺伝子の発現分析からのデータを図4Dに提示する。
【図５】Bz-423がレチノイド誘導表皮過形成を遮断することを示す。上のパネル：組織学的外観。皮膚の2 mm穿孔生検を臓器培養において8日間インキュベートして、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色後、光学顕微鏡によって調べた。AおよびD：無処置皮膚は、正常な組織学的外観を維持した。BおよびE：RA（1μg/ml）の持続的な存在下で培養した皮膚は、顕著な表皮過形成を示した。CおよびF：RA-誘導表皮肥厚は、RA（1μg/ml）およびBz-423（1μg/ml）を含む培地において培養した標本において実質的に低減した。A〜C 160倍、D〜F 400倍。下のパネル：定量的データ。示した値は、異なる被験者5人からの臓器培養に基づく平均値および標準誤差である。
【図６】Bz-423が処置の1時間以内に細胞におけるROSを増加させることを示す。ケラチノサイト（白丸）および線維芽細胞（黒丸）の単層培養に、ROS特異的指標であるDCFHをローディングして、表記の濃度のBz-423と共に1時間インキュベートした後、分析した。1回の実験につき3個ずつのデータポイントにおける平均DCF蛍光強度±標準偏差を表示する。
【図７】Bz-423とT5のあいだのATP加水分解の比較を示す。
【図８】Bz-423とT5のあいだのATP合成の比較を示す。
【図９】Bz-423とT5のあいだの細胞生存率の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ａ−５】
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【図４Ａ−６】
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【図４Ａ−７】
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【図４Ａ−８】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｂ−３】
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【図４Ｂ−４】
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【図４Ｂ−５】
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【図４Ｂ−６】
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【図４Ｂ７】
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【図４Ｂ−８】
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【図４Ｂ−９】
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【図４Ｂ−１０】
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【図４Ｂ−１１】
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【図４Ｂ−１２】
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【図４Ｂ−１３】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｃ−４】
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【図４Ｃ−５】
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【図４Ｃ−６】
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【図４Ｃ−７】
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【図４Ｃ−８】
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【図４Ｃ−９】
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【図４Ｃ−１０】
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【図４Ｃ−１１】
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【図４Ｃ−１２】
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【図４Ｃ−１３】
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【図４Ｃ−１４】
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【図４Ｃ−１５】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｄ−３】
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【図４Ｄ−４】
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【図４Ｄ−５】
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【図４Ｄ−６】
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【図４Ｄ−７】
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【図４Ｄ−８】
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【図４Ｄ−９】
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【図４Ｄ−１０】
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【図４Ｄ１１】
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【図４Ｄ−１２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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