(57)【要約】  リンカーを介してヌクレオチド誘導体に連結される修飾シアニン色素を有する蛍光標識レポーター化合物が開示される。前記化合物は核酸配列解析に有用である。前記蛍光標識レポーター化合物は、リンカーを介して、修飾ＤＮＡ塩基のようなヌクレオチド誘導体に連結される環固定シアニン色素である。これらの蛍光標識レポーター化合物は、３’末端が蛍光標識されたＤＮＡ断片を生成するために、ＤＮＡ合成のＤＮＡ鎖ターミネーターとして使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（１）の蛍光レポーター化合物であって、
【化１】
2007532718.tif 000022
（１）
Ｚはヌクレオチドであり、
Ｌは、該ヌクレオチドの誘導体の核酸複製酵素による全体的な結合及び認識にシアニン色素が有意な干渉をしないように前記ヌクレオチドの誘導体を前記シアニン色素に結合するのに十分な長さのリンカーであり、
Ｃｙは以下の化学式（２）のシアニン色素で、
【化２】
2007532718.tif 000023
（２）
Ａ及びＢは、それぞれ独立に、シアニン核を形成するのに必要な原子であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立にＣ１−Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ３は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ及びＳＯ３−からなるグループから選択され、
ｎは２ないし４の整数である、蛍光レポーター化合物。
【請求項２】
Ｌは長さが少なくとも８個の原子の鎖を有するリンカーである、請求項１に記載の蛍光レポーター化合物。
【請求項３】
以下の化学式（３）の構造を有し、
【化３】
2007532718.tif 000024
（３）
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９又はＣＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
Ｙは、３ないし２０個の原子を有するジラジカル原子団であって、該原子のうち少なくとも３個は、アルキニル基と、１個または２個以上のヘテロ原子とを含む、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
以下の化学式（４）の構造を有し、
【化４】
2007532718.tif 000025
Ｃ及びＤは、ベンゼン又はナフタレン環を構成するのに十分な数の炭素原子を有する環構造を表し、
ｍは１ないし６の整数である、請求項１、２又は３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４及びＲ５は両方ともＳＯ３−である、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１及びＲ２は両方ともＣ１−Ｃ４アルキル基である、請求項１ないし５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２は同一である、請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
水溶液中で測定された蛍光最大発光波長が７５０ｎｍを超える、請求項１ないし７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
以下の化学式（５）の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【化５】
2007532718.tif 000026
（５）
【請求項１０】
以下の化学式（６）の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【化６】
2007532718.tif 000027
（６）
【請求項１１】
請求項１に記載の蛍光レポーター標識化合物を第１核酸配列と反応させて該蛍光レポーター標識化合物で標識された第２核酸配列を作成するステップと、
第２核酸配列のレポーターを検出するステップとを含む、核酸配列解析方法。
【請求項１２】
４個のＤＮＡ塩基のそれぞれに対応する請求項１に記載の蛍光レポーター標識化合物の混合物を用意するステップと、
ＤＮＡテンプレートを、複製酵素、ＤＮＡヌクレオチドの混合物及び前記蛍光レポーター標識化合物の混合物と反応させるステップと、
各ＤＮＡ断片の３’末端残基に共有結合で結合した蛍光レポーター標識化合物を有するＤＮＡ断片を作成するステップと、
前記蛍光レポーター標識ＤＮＡ断片を分離するステップと、
分離された蛍光レポーター標識ＤＮＡ断片のそれぞれについてレポーターを検出してＤＮＡ配列を同定するステップとを含む、ＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１３】
以下の化学式（７）の構造を有する化合物であって、
【化７】
2007532718.tif 000028
（７）
Ａ及びＢは、それぞれ独立に、シアニン核を形成するのに必要な原子であり、
ＸはＯ、Ｓ、ＮＲ９又はＣＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ３は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
Ｒ４及びＲ５は、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも１つがＳＯ３−であることを条件として、それぞれ独立に、水素及びＳＯ３−からなるグループから選択され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
ｐは２ないし８の整数であり、
ｎは２ないし４の整数である、化学式（７）の構造を有する化合物。
【請求項１４】
Ｒ４及びＲ５は両方ともＳＯ３−である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
以下の化学式（８）の構造を有する、請求項１３に記載の化合物。
【化８】
2007532718.tif 000029
（８）
【請求項１６】
以下の化学式（９）の構造を有する、請求項１３に記載の化合物。
【化９】
2007532718.tif 000030
（９）
【請求項１７】
Ｒ１及びＲ２は両方ともＣ１−Ｃ４アルキル基である、請求項１３ないし１６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１及びＲ２は同一である、請求項１３ないし１７のいずれかに記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列決定用ヌクレオチド誘導体に結合可能な蛍光標識に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオチド誘導体は核酸鎖のターミネーションを起こさせる基質であって、蛍光標識に結合すると蛍光標識された鎖ターミネーターになる。これらの蛍光標識鎖ターミネーターは、核酸配列を同定するために、核酸断片に、好ましくは、核酸断片の３’末端に取り込まれる場合がある。蛍光利用核酸配列決定法における核酸鎖ターミネーター基質として有用であるために、前記鎖ターミネーター基質は蛍光レポーター及びヌクレオチド誘導体を含まなければならない。該ヌクレオチド誘導体は、核酸配列には付加されるが、複製酵素によって次のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を該核酸配列に結合させるために使うことはできない。
【０００３】
生体分子を検出するため、特に核酸鎖ターミネーター基質を標識する蛍光レポーターとして使用されるシアニン色素は既知である。しかし、これらの化合物は、前記ヌクレオチド誘導体の前記複製酵素との結合又は相互作用に干渉する場合があったり、不安定であったり、人工合成による製造が困難であったり、自動化システムには問題のある蛍光検出波長をであったりする。生体分子検出用の蛍光プローブについてのさらなる情報は、非特許文献１−９及び特許文献１−３にある。
【非特許文献１】Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８：７５１−７５６（１９９７）
【非特許文献２】Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：２  １０５−１１１（１９９３）
【非特許文献３】Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１０：１１−１９（１９８９）
【非特許文献４】Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，７：３５６−３６２（１９９６）
【非特許文献５】Ｏｚｍｅｎ，Ｂ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１：９１８５−９１８８（２０００）
【非特許文献６】Ｓｈｅａｌｙ，Ｄ．Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：２４７−２５１（１９９５）
【非特許文献７】Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ，Ｐ．Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１１４１８−４３０（１９９０）
【非特許文献８】Ｓｔｒｅｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７：４５７８−４５８０（１９９２）
【非特許文献９】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６５：６０１−６０５（１９９３）
【特許文献１】米国特許第５，４５３，５０５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５７１，３８８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，００２，００３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ヌクレオチド複製に干渉せず、安定で、自動化システムに適する蛍光検出波長を有する、蛍光標識核酸鎖ターミネーターの必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本発明によると、一般式Ｚ−Ｌ−Ｃｙで表される蛍光レポーター化合物が提供される。この実施態様によると、Ｚはヌクレオチドで、Ｌは、該ヌクレオチドの誘導体の核酸複製酵素による全体的な結合及び認識にシアニン色素が有意な干渉をしないように前記ヌクレオチドの誘導体を前記シアニン色素に連結するのに十分な長さを有する、長さが少なくとも８個の原子の鎖を有するジラジカル原子団のようなリンカーで、Ｃｙは以下の化学式（１）のシアニン色素である。
【０００６】
【化１】
2007532718.tif 000002
（１）
【０００７】
化学式（１）において、Ａ及びＢは、それぞれ独立に、シアニン核を形成するのに必要な原子であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立にＣ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｒ３は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ及びＳＯ３−からなるグループから選択され、ｎは２ないし４の整数である。
【０００８】
前記蛍光レポーター化合物では、Ｒ４及びＲ５は両方ともＳＯ３−で、Ｒ１及びＲ２は両方ともＣ１−Ｃ４アルキル基であることが好ましいが、必要ではない。Ｒ１及びＲ２が同一であることがより好ましい。
【０００９】
本発明の蛍光レポーター化合物の実施例は、以下の化学式（２）及び（３）の化合物を含む。
【００１０】
【化２】
2007532718.tif 000003
（２）
【００１１】
【化３】
2007532718.tif 000004
（３）
【００１２】
本発明の蛍光レポーター化合物の水溶液中で測定される蛍光最大発光波長（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍａｘｉｍａ）が７５０ｎｍを超えることは好ましいが必要ではない。
【００１３】
以下の化学式（４）のシアニン色素も提供される。
【００１４】
【化４】
2007532718.tif 000005
（４）
【００１５】
Ａ及びＢは、それぞれ独立に、シアニン核を形成するのに必要な原子であり、ＸはＯ、Ｓ、ＮＲ９又はＣＲ９Ｒ１０であり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｒ３は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、Ｒ４及びＲ５は、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも１つがＳＯ３−であることを条件として、それぞれ独立に、水素及びＳＯ３−からなるグループから選択され、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、ｐは２ないし８の整数であり、ｎは２ないし４の整数である。
【００１６】
前記シアニン色素では、Ｒ４及びＲ５は両方ともＳＯ３−で、Ｒ１及びＲ２は両方ともＣ１−Ｃ４アルキル基であることが好ましいが必要ではない。Ｒ１及びＲ２は同一であることがより好ましい。好ましいが必要ではないシアニン色素の実施例は、以下の化学式（５）及び（６）の化合物を含む。
【００１７】
【化５】
2007532718.tif 000006
（５）
【００１８】
【化６】
2007532718.tif 000007
（６）
【００１９】
本発明によると、核酸配列解析方法も提供される。この実施態様では、一般式Ｚ−Ｌ−Ｃｙの蛍光レポーター標識化合物は、第１核酸配列と反応して、該蛍光レポーター標識化合物で標識された第２核酸配列を生成する。その後、第２核酸配列のシアニン色素が検出される。
【００２０】
本発明によると、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法も提供される。本実施態様では、４個のＤＮＡ塩基のそれぞれに対応する一般式Ｚ−Ｌ−Ｃｙの蛍光レポーター標識化合物の混合物が提供される。ＤＮＡテンプレートが、複製酵素、ＤＮＡヌクレオチドの混合物及び記蛍光レポーター標識化合物の混合物と反応させられる。その結果、蛍光レポーター標識化合物が各ＤＮＡ断片の３’末端残基に共有結合で結合したＤＮＡ断片が作成される。前記蛍光レポーター標識ＤＮＡ断片は分離され、分離された蛍光レポーター標識ＤＮＡ断片のそれぞれについてレポーターが検出される。それから、検出されたレポーター情報が解析され、ＤＮＡ配列が同定される。
【００２１】
本発明の１つの実施態様によると、リンカーを介してヌクレオチド誘導体に連結される修飾シアニン色素を含む、蛍光標識レポーター化合物が提供される。前記化合物は、核酸配列解析に利用される。より具体的には、ＤＮＡ塩基の４つのタイプに対応するシアニン色素利用蛍光レポーター化合物の混合物が、３’末端で蛍光標識されたＤＮＡ断片を作成するために、ＤＮＡ合成におけるＤＮＡ鎖ターミネーターとして利用される場合がある。前記蛍光標識ＤＮＡ断片はＤＮＡ配列を決定するために解析される場合がある。
【００２２】
本発明の蛍光標識レポーター化合物は、一般式１（化学式（７））に示すとおり、シクロアルケニル環を用いてシアニン色素発色団を環固定（ｒｉｎｇ−ｌｏｃｋｉｎｇ）することによって修飾された、修飾シアニン色素を含む。
【００２３】
【化７】
2007532718.tif 000008
（７）
一般式１  環固定シアニン色素（Ｃｙ）
【００２４】
本発明のシアニン色素は、前記化学式（７）に示すとおり、リンカーを通じて前記シアニン発色団の環固定された部分を介してヌクレオチド誘導体に連結される。前記シアニン色素発色団を環固定すること、及び、前記ヌクレオチド誘導体を前記シアニン色素の環固定された部分を介して結合することは、蛍光標識レポーター化合物に、安定性、可溶性及び量子収率の増強を提供する。これらの化合物は、近赤外領域の吸光および発光周波数と、大きな吸光係数と、水溶液への可溶性という特性を有する。さらに前記蛍光標識レポーター化合物は、高収率で核酸鎖ターミネーション反応に取り込まれる場合がある。
【００２５】
本明細書で用いられるところの以下に列挙する用語は、以下の意味を有する。
【００２６】
「シアニン核」という用語は、蛍光シアニン発色団を構成するコンジュゲーションされた系を完成するのに必要な炭素、水素及びヘテロ原子を意味する。本発明の蛍光標識に用いられる場合があるシアニン核は当業者に知られている。シアニン核の例は、置換あるいは置換のチアゾール、ベンゾチアゾール、ナフトチアゾール、ベンゾキサゾール、ナフトキサゾール、ベンゾールセラナゾール、ナフトセレナゾール、インドール及びベンゾインドール環を含む。
【００２７】
「ヘテロ環−塩基」という用語は、核酸合成に用いられる複製酵素によって認識エレメントとして作用することができるプリン又はピリミジン塩基を意味する。
【００２８】
「ヌクレオチド誘導体」という用語は、ヘテロ環−塩基、糖及びリン酸官能基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を有し、核酸配列に付加することはできるが、該核酸配列に次のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を結合するために複製酵素によって利用することはできない化合物を意味する。
【００２９】
「ヌクレオシド誘導体」という用語は、前記リン酸官能基を除いたヌクレオチド誘導体を意味する。
【００３０】
本明細書で用いられるところの用語「リン酸官能基」は、ヌクレオシド誘導体に連結されるとき、前記ヌクレオチド誘導体を核酸配列に結合するために複製酵素によって利用できるヌクレオチド誘導体を形成する、一、二又は三リン酸か、アルファチオ三リン酸のようなリン酸類似体を意味する。
【００３１】
本明細書に用いられるところの用語「糖」は、核酸配列に取り込まれるとき、該核酸配列に次のヌクレオシド又はヌクレオシド誘導体を結合させるために複製酵素によって利用することができない、５又は６員ヘテロ環を意味する。
【００３２】
本明細書に用いられるところの用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と、該用語の変形（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ等）とは、他の添加物、コンポーネント、整数又はステップを排除することを意図しない。
【００３３】
１つの実施態様では、本発明は、ヌクレオチド誘導体に結合した修飾シアニン色素を有する蛍光標識レポーター化合物である。好ましいが必要ではない本発明の環固定されたシアニン蛍光標識レポーター化合物は以下の一般式２（化学式（８））に示される。
【００３４】
【化８】
2007532718.tif 000009
（８）
一般式２
【００３５】
一般式２（化学式（８））において、「Ｚ」はヘテロ環−塩基、糖及びリン酸官能基を有するヌクレオチド誘導体を表す。
【００３６】
また一般式２（化学式（８））の「Ｌ」は、前記シアニン色素とリンカーとが核酸複製酵素による前記ヌクレオチド誘導体の全体的な結合又は認識に有意な干渉をしないように前記ヌクレオチド誘導体を前記シアニン色素に連結するのに十分な長さのリンカーを表す。かかるリンカー基は、当業者に知られており、本明細書を参照する当業者によって理解されるとおり本発明の化合物に使用するために選択することができる。好ましいが必要ではない実施態様では、リンカー（Ｌ）は長さが少なくとも８個の原子の鎖を有するジラジカル原子団である。
【００３７】
また化学式（８）のＣｙは、以下の化学式（９）のシアニン色素を表す。
【００３８】
【化９】
2007532718.tif 000010
（９）
【００３９】
化学式（９）において、Ａ及びＢは、それぞれ独立に、シアニン核を形成するために必要な原子であり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｒ３は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ及びＳＯ３−からなるグループから選択され、ｎは２ないし４の整数である。
【００４０】
より好ましいが必要ではない本発明の環固定されたシアニン蛍光レポーター化合物が一般式３（化学式（１０））に示される。
【００４１】
【化１０】
2007532718.tif 000011
（１０）
一般式３
【００４２】
一般式３（化学式（１０））において、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９又はＣＲ９Ｒ１０であり、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、Ｙは、３ないし２０個の原子を有するジラジカル原子団であって、前記原子のうち少なくとも３個は、アルキニル基と、１個または２個以上のヘテロ原子とを含み、Ａ、Ｂ、Ｚ、Ｒ１−Ｒ５及びｎは前記一般式２（化学式（８））について説明したとおりのものを表す。
【００４３】
最も好ましいが必要ではない本発明の環固定されたシアニン蛍光レポーター化合物は以下の一般式４（化学式（１１））に示される。
【００４４】
【化１１】
2007532718.tif 000012
（１１）
一般式４
【００４５】
一般式４（化学式（１１））において、Ｃ及びＤは、ベンゼン又はナフタレン環を構成するのに十分な数の炭素原子を有する環構造を表し、ｍは１ないし６の整数であり、Ｚ、Ｒ１−Ｒ５及びｎは前記一般式２（化学式（８））について説明したとおりのものを表す。
【００４６】
一般式２−４（化学式（８）、（１０）及び（１１））において、好ましいが必要ではない実施態様では、Ｒ４及びＲ５は両方ともＳＯ３−であり、Ｒ１及びＲ２は同一の低級アルキル基である。
【００４７】
一般式２及び３（化学式（８）及び（１０））において、好ましいが必要ではない実施態様では、Ａ及びＢはインドール又はベンゾインドール環を形成するために十分な数の炭素原子を有する環構造である。
【００４８】
好ましいが必要ではない実施態様では、リンカー「Ｌ」及びシアニン色素「Ｃｙ」は、一体として、以下の一般式５（化学式（１２））の化合物である。
【００４９】
【化１２】
2007532718.tif 000013
（１２）
一般式５
【００５０】
一般式５（化学式（１２））において、
Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｒ１−Ｒ５及びｎは一般式２及び３（化学式（８）及び（１０））について説明したとおりのものを表し、ｐは２ないし８の整数である。
【００５１】
一般式２−４（化学式（８）、（１０）及び（１１））において「Ｚ」として表される、鎖ターミネーターとして利用される核酸誘導体は当業者に知られている。これらの核酸誘導体は、一般的には、ヘテロ環−塩基、糖及びリン酸官能基を含む。
【００５２】
前記ヘテロ環−塩基は、ヌクレオチド合成における認識エレメントとして機能するヌクレオチド誘導体の一部である。一般に、これらは天然核酸塩基に対応するプリン又はピリミジン塩基である。シトシン、デアザアデニン、デアザグアニン、デアザヒポキサンチン及びウラシルを含むヘテロ環−塩基の例は、以下の化学式（１３）に示される。
【００５３】
【化１３】
2007532718.tif 000014
（１３）
【００５４】
核酸における認識エレメントとして機能できる、８−アザ−７−デアザプリン及び３，７−ジデアザアデニンのような他のヘテロ環−塩基も利用可能である。
【００５５】
前記ヌクレオチド誘導体の「糖」部分は、天然の酵素基質におけるデオキシリボフラノース構造部分に対応する。前記蛍光標識レポーター化合物において用いられるヌクレオチド誘導体の糖部分は、次のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を核酸配列に結合するために複製酵素によって利用可能ではないフラノースのような、修飾５又は６員ヘテロ環であることが一般的である。
【００５６】
本発明の蛍光標識レポーター化合物に用いられる核酸誘導体の「リン酸官能基」部分は、一、二又は三リン酸か、アルファ−チオ三リン酸官能基のようなリン酸類似体かであって、ヌクレオシド誘導体に結合されるとき、ヌクレオチド誘導体を核酸配列に結合するために複製酵素によって利用可能なヌクレオチド誘導体を形成する。
【００５７】
好ましいが必要ではない実施態様においては、前記核酸誘導体は以下の化学式（１４）のうちの１つである。
【００５８】
【化１４】
2007532718.tif 000015
（１４）
【００５９】
一般式２−４（化学式（８）、（１０）及び（１１））に示されるとおり、前記核酸誘導体は、リンカーを介して前記修飾シアニン色素に結合できる。好ましいが必要ではない実施態様において、前記リンカーはアルキニルアミノ基であって、前記核酸誘導体が前記アルキン基の一端を介して前記修飾シアニン色素に連結される。
【００６０】
本発明の蛍光レポーター化合物は、以下の合成経路概略図１に示すとおりに合成される場合がある。
【００６１】
合成経路概略図１  蛍光レポーター化合物の合成
2007532718.tif 000016
Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ１−Ｒ５及びｎは一般式２−４（化学式（８）、（１０）及び（１１））に説明されるものを表す。
【００６２】
合成経路概略図１に示すとおり、シアニン核を表すイミニウム塩（１Ａ）及び（１Ｂ）は、シアニン発色団（３）を形成するためにビスアミノシクロアルケン（２）と反応する。それからシアニン（３）は、シアニン色素（５）を形成するために、シアニン発色団の環固定部分の脱離基（ＬＧ）をフェニルエチルイソチオシアナート化合物（４）で置換することにより誘導体化される。次にヌクレオチド誘導体「Ｚ」が、ヌクレオチド誘導体（６）上のペンダント基のアルキニルアミンをシアニン色素（５）の前記イソチオシアナート部分と連結することによりシアニン色素（５）に連結され、蛍光レポーター化合物（７）を形成する。
【００６３】
好ましいが必要ではない実施態様において、シアニン発色団内にインドール環構造を有する本発明の修飾シアニン色素は以下の合成経路概略図２に示すとおり合成される。まず合成経路概略図２に示すとおり、ヒドラジノベンゼン（８）がケトンと反応して、インドール環（９）を形成する。つぎに前記インドール環内のアミンがハロゲン化アルキルと連結されてイミニウム塩（１０）を形成する。そして２倍のモル量のイミニウム塩（１０）がビスアミノクロロシクロヘキセン化合物（１１）と反応してシアニン色素（１２）を生成する。シアニン色素（１２）はさらに該シアニン色素の環固定部分の塩素を（ヒドロキシフェニル）エチルイソチオシアナート化合物（１３）で置換することにより誘導体化されて、シアニン色素（１４）を形成する。
【００６４】
合成経路概略図２  インドール化シアニン色素の合成
2007532718.tif 000017
【００６５】
別の好ましいが必要ではない実施態様においては、シアニン発色団内にベンゾインドール環構造を有する本発明の修飾シアニン色素は、以下の合成経路概略図３に示すとおり合成される。まず合成経路概略図３に示すとおり、ベンゾインドール（１５）がベンゾインドール（１６）を形成するためにスルホン酸化される。つぎにベンゾインドール（１６）はイミニウム塩（１７）を形成するためにハロゲン化アルキルと結合される。そして２倍のモル量のイミニウム塩（１７）がビスアミノクロロシクロヘキセン化合物（１１）と反応してシアニン色素（１８）を生成する。さらにシアニン色素（１８）は該シアニン色素の環固定部分の塩素を（ヒドロキシフェニル）エチルイソチオシアナート化合物（１３）で置換することによって誘導体化されてシアニン色素（１９）を形成する。
【００６６】
合成経路概略図３  ベンゾインドールシアニン色素の合成
2007532718.tif 000018
【００６７】
別の実施態様では、本発明は核酸配列解析方法である。１の実施態様では前記方法は、本発明の蛍光レポーター標識化合物を第１核酸配列と反応させることを含む。本反応は、前記蛍光レポーター標識化合物で標識された第２の核酸配列を生成する。つぎに第２核酸配列上のレポーターが検出される。
【００６８】
好ましいが必要ではない実施態様において、４個の蛍光標識レポーター化合物、すなわち、ダイターミネーターである、ウラシル（ｄｄＵＴＰ）、グアニン（ｄｄＧＴＰ）、シトシン（ｄｄＣＴＰ）及びアデニン（ｄｄＡＴＰ）と、これらの総称（ｄｄＮＴＰｓ）とは、４個のＤＮＡ塩基に対応し、それぞれが異なる本発明の修飾シアニン色素を有する。前記４個の蛍光標識レポーター化合物は、４個の天然（正常）ＤＮＡ塩基（ｄＮＴＰｓ）と、ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡテンプレートと、シーケンシングプライマーとともに溶液に混合される。つぎに前記混合溶液をインキュベーションして合成ＤＮＡ鎖を作成するが、該合成ＤＮＡ鎖にｄｄＮＴＰが取り込まれると反応がターミネーションされ、複数のＤＮＡ断片が生成する。そして前記ＤＮＡ断片は、サンプルプレート上での電気泳動又は毛管ゲル電気泳動にような当業者に知られた方法によってサイズにより分離される。分離された前記断片はスキャニングされ、蛍光シアニン色素が検出される。前記４個の異なるシアニン色素のそれぞれは、該色素が結合している個々のＤＮＡ塩基に対応する波長で蛍光を発する。各ＤＮＡ断片について検出される蛍光波長は、ＤＮＡ配列を決定するために組み合わされる。
【００６９】
より好ましいが必要ではない実施態様においては、前記ＤＮＡはカリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ所在のベックマン・コールター社から入手可能なベックマンＣＥＱ（商標）２０００ＤＮＡ解析システムのような自動化システムによって配列決定される。この好ましいシステム、方法及び反応試薬のより詳細な説明は、ベックマン・コールター社の１９９９年の著作物である、ＣＥＱＴＭ  ２０００  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａ  Ｓｔｅｐ  ｂｙ  Ｓｔｅｐ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＣＥＱ  ２０００，７１８１１９ＡＢに見出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
本発明は、以下の限定的ではない実施例を参照してより詳細に説明され、該実施例は本発明のさまざまな実施態様をさらに例示するために提供される。しかし、本発明の範囲内に止まりつつ、多くの変更及び改良を行うことは可能であることが理解されるべきである。
【実施例１】
【００７１】
２，３，３−トリメチルインドーリニウム−５−スルホン酸  カリウム塩（９）の調製
合成経路概略図２を参酌して、スターラーバー及び還流コンデンサを備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、酢酸（１５０ｍＬ）と、ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（８）、（５０．０ｇ、０．２６６モル）と、３−メチル−２−ブタノン（８４ｍＬ、０．７８５ミリモル）とを添加した。前記フラスコは１１５°Ｃのオイルバス中で加熱され、出発材料の全てが消費されるまで（メタノール：ＣＨ２Ｃｌ２が１：１のＴＬＣを用いて監視することによって判断される）、３時間還流された。その後前記反応フラスコは室温まで冷却された。ピンク色の固体がエチル酢酸とともにろ過することによって回収された。前記ピンク色の固体は、つぎにＭｅＯＨ（８００ｍＬ）中に溶解されて、固体不純物を除去するためにろ紙のパッドでろ過された。イソプロピルアルコール（２００ｍＬ）中の水酸化カリウム（１５ｇ）がろ液に添加され、この溶液は攪拌された。沈殿した黄色の固体が回収され、メタノール（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄され、ジエチルエーテル（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄され、その後、風乾された。前記黄色の固体はさらに高真空下で終夜４０°Ｃのオーブン内で乾燥され、６４．５ｇ（８７．５％）の化合物（９）が得られた。ＴＬＣでの移動度Ｒｆ＝０．８７５（１：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）。
【実施例２】
【００７２】
１−エチル−２，３，３−トリメチルインドールニニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｅｎｉｎｉｕｍ）−５−スルホン酸（１０）の調製
再び合成経路概略図２を参酌して、ヨウ化エチル（４０ｍＬ）中の化合物（９）（１１ｇ、０．０４モル）の混合液が窒素雰囲気中で加熱還流された。前記反応は、ＴＬＣ（４：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）を用いて、出発材料の化合物（９）（Ｒｆ＝０．６５）が完全に消失し、産物の化合物（１０）（Ｒｆ＝０．２５）が出現することについて監視された。４８時間還流後、ＴＬＣは反応が完了したことを示したので、加熱が停止された。前記反応混合液は室温まで冷却され、反応産物はろ過によって回収され、アセトン（５ｘ１００ｍＬ）で洗浄され、風乾された。その後固体産物は、アセトン（３００ｍＬ）中に懸濁され、終夜攪拌された。前記固体は、ろ過され、アセトン（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄され、高真空下で終夜４０°Ｃのオーブン内で乾燥されて、産物の化合物（１０）（１１．８ｇ、定量的収率）が得られた。最大ＵＶ吸光波長＝２８９ｎｍ。
【実施例３】
【００７３】
環固定クロロシアニン色素（１２）の調製
再度合成経路概略図２を参酌して、火炎乾燥された（ｆｌａｍｅ−ｄｒｉｅｄ）１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物（１０）（１０ｇ、３．７４ミリモル）が、化合物（１１）（６７１．９ｍｇ、１．８７ミリモル）、酢酸ナトリウム（３６８．２ｍｇ、４．４９ミリモル）及びエタノール（２０ｍＬ）とともに添加された。前記反応液は、オイルバス中で還流加熱され、窒素雰囲気下で１時間攪拌された。化合物（１１）（５００ｍｇ）及び酢酸ナトリウム（１８５ｍｇ）が前記反応液中に添加され、さらに１時間加熱された。その後、前記反応液はメタノール（５０ｍＬ）で希釈され、塩を除去するためにろ過された。前記溶媒は減圧下で前記反応液から気化され、残渣混合物はメタノール／塩化メチレンの溶媒勾配で溶出することによってカラムクロマトグラフィーにより精製された。産物の分画は混合され、約１００ｍＬに濃縮された。前記溶液はエチルエーテル（８００ｍＬ）中に注入され、得られた固体は回収され、高真空下で終夜４０°Ｃのオーブン内で乾燥されて、緑色の固体（１２）が８３８．７ｍｇ（６７％収率）得られた（Ｒｆ＝０．２３（２：１  ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）、メタノール中での最大吸光波長＝７８３ｎｍ）。
【実施例４】
【００７４】
２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルイソチオシアナート（１３）の調製
再度合成経路概略図２を参酌して、１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（１．０４ｇ、５．８ミリモル）が、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のチラミン（８００ｍｇ、５．８ミリモル）溶液に添加された。反応液は、室温で３０分間攪拌された。そして、前記溶媒は減圧下で気化されて、オレンジ色の油状物を得た。前記油状物はメタノール（２ｍＬ）中に溶解された。水（６ｍＬ）が前記溶液に添加され、イソチオシアナート（１３）が沈殿した。生成物はろ過によって回収され、冷水で洗浄された。高真空下で終夜４０°Ｃのオーブン内で乾燥された後、１．０８ｇ（定量的収率）の化合物（１３）が得られた。
【実施例５】
【００７５】
環固定Ｃｙ７（１４）の調製
再度合成経路概略図２を参酌して、２−（ヒドロキシフェニル）エチルイソチオシアナート（１３）（２１４ｍｇ、１．２ミリモル）が、火炎乾燥された１００ｍＬフラスコ内の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に窒素雰囲気下で０°Ｃで溶解された。水素化ナトリウム（９５％、２８．６ｍｇ、１．２ミリモル）が添加され、反応液は０°Ｃで１０分間攪拌されて、常温で３０分間攪拌された。フェノキシド液が、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解されたクロロシアニン色素（１２）（２００ｍｇ、０．３０ミリモル）に窒素雰囲気下で添加された。反応は、ＴＬＣを用いて化合物（１２）が消失し産物の化合物（１４）が出現することについて監視された。１８時間後、反応はメタノールで停止され、溶媒は４０°Ｃの回転式エバポレータで除去された。粗材料は酢酸エチルで洗浄され、カラムクロマトグラフィーによって精製されて、１５０ｍｇ（６２％）のシアニン色素（１４）が得られた（メタノール中の最大吸光波長＝７７０ｎｍ）。１ＨｎｍＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）  δ  ７．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．７９（ｓ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），６．６４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ），４．１２（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），２．６１    ２．８１（ｍ，６Ｈ），１．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），１．３３（ｓ，１８  Ｈ）
【実施例６】
【００７６】
１，１，２−トリメチルベンゾインドールニン−７−スルホン酸カリウム（１６）
合成経路概略図３を参酌して、１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンズインドール（１５）（１１．０ｇ、５２．６ミリモル）が、スターラーバーを備えた乾燥２００ｍＬ丸底フラスコに添加された。前記フラスコは氷水浴中で冷却され、硫酸（１０ｍＬ）が前記反応液中に攪拌しながら添加され、前記固体を部分的に溶解した。発煙硫酸（２５ｇ、３０％ＳＯ３、約９３．７ミリモル）が添加され、反応液は０°Ｃで３０分間攪拌された。そして前記反応液は湿気を排除しつつ終夜室温で攪拌された。終夜反応の後、酸性油状物は氷（２００ｍＬ）中に注入され、３０分間攪拌された。酸性溶液は水酸化カリウムで塩基性になるまで（ｐＨ＞１２）中和された。溶媒が減圧下で気化されて固体にされた。残渣の水分は、アセトンで前記固体を粉砕した後ろ過することによって除去された。乾燥した固体は、高温のメタノール（約１Ｌ）で抽出された。未溶解の塩はろ過され、ろ液は濃縮されて固体にされ、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で粉砕された。前記固体は回収され、酢酸エチル（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄され、乾燥された。さらに高真空下で終夜４５°Ｃのオーブン内で乾燥されて、１７ｇ（定量的）の産物化合物（１６）が得られた（ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２８（４：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）。
【実施例７】
【００７７】
１−エチル−２，３，３−トリメチルベンゾインドールニニウム−７−スルホン酸（１７）の調製
再び合成経路概略図３を参酌して、ヨウ化エチル（２５ｍＬ）中のスルホン酸化合物（１６）（６．５０ｇ、１９．９ミリモル）の混合液が窒素雰囲気下で加熱還流された。前記反応は、ＴＬＣ（２：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）を用いて出発材料化合物（１６）（Ｒｆ＝０．５８）が完全に消失し、生成物（１７）（Ｒｆ＝０．２２）が出現することについて監視された。４８時間還流後、ＴＬＣは前記反応がほぼ完了したことを示したので、加熱は停止された。反応混合液は室温まで冷却され、反応産物はろ過によって回収された。固体反応産物（１７）はアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄され、風乾された。固体産物（１７）は、シリカゲル状のカラムクロマトグラフィーによって（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒勾配で溶出されて）精製された。産物分画は混合され濃縮された。前記固体はろ過され、アセトン（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄され、高真空下で終夜４０°Ｃのオーブン内で乾燥されて、１．３４ｇの産物化合物（１７）（３０％収率）を得た。
【実施例８】
【００７８】
環固定クロロシアニン色素（１８）の調製
合成経路概略図３を参酌して、化合物（１７）（２００ｍｇ、０．６３ミリモル）が化合物（１１）（１１３．２ｍｇ、０．３１５ミリモル）と、酢酸ナトリウム（５１．６７ｍｇ、０．６３ミリモル）と、エタノール（１０ｍＬ）とが入った火炎乾燥された１００ｍＬ丸底フラスコに添加された。反応液はオイルバス中で１時間窒素雰囲気下で攪拌しながら還流加熱された。追加量の化合物（１１）（１００ｍｇ）と酢酸ナトリウム（２５ｍｇ）とが前記反応液中に添加され、加熱は２時間継続された。溶媒は減圧下で気化され、残渣混合物はメタノール（３ｍＬ）に溶解され、生成物は酢酸エチル（２０ｍＬ）で沈殿された。得られた固体産物はろ過によって回収され、高真空下で２４時間４０°Ｃのオーブン内で乾燥された。クロロシアニン色素（１８）の濃緑色固体（２９８ｍｇ、不純物を含む定量的収率）が得られた（ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２３（２：１  ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）；メタノール中での最大吸光波長＝８１６ｎｍ）。前記固体はこれ以上精製することなく以下の合成ステップで用いられた。
【実施例９】
【００７９】
環固定ＳＢＣｙ７（１９）の調製
再度合成経路概略図３を参酌して、２−（ヒドロキシフェニル）エチルイソチオシアナート（１３）（２７９ｍｇ、１．６ミリモル）が窒素雰囲気下０°Ｃの火炎乾燥した１００ｍＬフラスコ内の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解された。水素化ナトリウム（９５％、３７．４ｍｇ、１．６ミリモル）が添加され、反応液は０°Ｃで１０分間攪拌された。窒素雰囲気下で前記フェノキシド溶液が無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のクロロシアニン色素（１８）（３００ｍｇ、０．３９ミリモル）に添加された。前記反応は、ＴＬＣを用いて化合物（１８）の消失及び生成物（１９）の出現について監視された。１８時間後、反応はメタノールで停止され、溶媒は４０°Ｃの回転式エバポレータで除去された。粗材料は酢酸エチルで洗浄され、カラムクロマトグラフィーによって精製され、１０５ｍｇ（２９％）の化合物（１９）が得られた（メタノール中での最大吸光波長＝８０４ｎｍ）。１ＨｎｍＲ（ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）  δ  ８．２５（ｓ，２Ｈ），８．１１    ８．１５（ｍ，４Ｈ），７．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．１２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），４．１５（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），２．６０    ２．８０（ｍ，６Ｈ），１．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），１．５８（ｓ，１２Ｈ），１．３３（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）。
【実施例１０】
【００８０】
ｄｄＣＴＰ−ＲＬＣｙ７（２０）の調製
【００８１】
【化１５】
2007532718.tif 000019
（１５）
【００８２】
本発明によれば、上記化学式（１５）に示す蛍光レポーター化合物（２０）は、シアニン色素（１４）を対応する核酸誘導体と連結することによって調製される。合成経路概略図１及び２を参酌して、乾燥したシンチレーションバイアルの中で、イソプロピルアルコール（２７０μＬ）、メタノール（５４０μＬ）及び０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３  ｐＨ９．０バッファー（８１０μＬ）中の環固定エチルイソチオシアナート（１４）（１３．６ｍｇ、１６．７２マイクロモル）に、合成経路概略図１の化合物（６）でＺがジデオキシシトシンであるｄｄＣＴＰ−プロパギルアミン（４マイクロモル、４００μＬ、１０マイクロモル／ｍＬ水溶液）が添加された。反応液は暗所室温で４６時間攪拌された。反応中、８時間毎に少量のサンプルが抜き取られ、反応の進行についてＬＩＦ−ＣＥを用いてチェックされた。粗生成物はまず調製用ＴＬＣ（５００μｍ、２０ｘ２０ｃｍ、１：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）によって部分精製された。生成物のバンドはメタノールで抽出され、セライト（ｃｅｌｉｔｅ）のパッドでろ過された。溶媒は気化され、残渣は１０％メタノール水溶液（１ｍＬ）に溶解された。生成物（２０）は、５ｍＭリン酸（溶媒Ａ）とメタノール（溶媒Ｂ）との溶媒勾配を用いる逆相ＨＰＬＣで精製された。
【００８３】
分画はＣＥでテストされ、純粋な分画が混合され、蒸発乾固され、最小量の水に再溶解され、脱塩用のＢａｋｅｒ  Ｂｏｎｄ  Ｓｐｅ  Ｃ１８カラム頂部に適用された。脱塩方法は水（３ｘ５ｍＬ）による洗浄を含み、生成物は５０％メタノール／水で溶出された。前記生成物の純度はＣＥによってチェックされ、８４．６５％と計算された。溶媒は濃縮され、生成物は水（１ｍＬ）中に再溶解され、０．２Ｍ  ＴＥＡＢバッファーで平衡化されたＤＥＡＥセファデックスカラム（５ｍＬ）上に装荷された。前記カラムは、１００ｍＬ（０．１Ｍ）、１００ｍＬ（０．２Ｍ）、１００ｍＬ（０．３Ｍ）及び５００ｍＬ（０．５Ｍ）と、ＴＥＡＢバッファーの濃度を上げながら溶出した。分画はＬＩＦ−ＣＥを用いてテストされ、純粋な分画は一緒にプールされて、上記のとおり脱塩されて、蛍光レポーター化合物（２０）を得た（４ｍＬ、８４．７μＭ、純度９４．７％）。
【実施例１１】
【００８４】
ｄｄＡＴＰ−ＲＬＤＢＣｙ７（２１）の調製
【００８５】
【化１６】
2007532718.tif 000020
（１６）
【００８６】
本発明によれば、化学式（１６）に示す蛍光レポーター化合物（２１）はシアニン色素（１９）を対応する核酸誘導体に連結することによって調製される。再度合成経路概略図１及び３を参酌して、１３ｍＭｐＨ９ホウ酸バッファー（１．２ｍＬ）及びアセトニトリル（０．８ｍＬ）に溶解された環固定エチルイソチオシアナート化合物（１９）（５０ｍｇ、０．０５４ミリモル）の溶液に、合成経路概略図１の化合物（６）においてＺがジデオキシデアザアデニンであるｄｄＡＴＰ−プロパギルアミン（２０マイクロモル、１ｍＬ、２０マイクロモル／ｍＬ水溶液）が添加された。前記溶液は室温暗所で２４時間攪拌された。反応中、少量のサンプルが８時間毎に抜き取られ、反応進行についてＬＩＦ−ＣＥを用いてチェックされた。粗生成物はまず調製用ＴＬＣ（５００μｍ、２０ｘ２０ｃｍ、１：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）を用いて部分精製された。生成物のバンドはメタノールで抽出され、セライトのパッドでろ過された。溶媒は気化され、残渣は１０％メタノール水溶液（１ｍＬ）に溶解された。前記生成物は５ｍＭリン酸（溶媒Ａ）及びメタノール（溶媒Ｂ）の溶媒勾配を用いて逆相ＨＰＬＣで精製された。
【００８７】
単離された分画はＣＥでテストされ、純粋な分画は、混合され、蒸発乾固され、最小量の水に再溶解されて、脱塩用のＢａｋｅｒ  Ｂｏｎｄ  Ｓｐｅ  Ｃ１８カラムの頂部に適用された。脱塩方法は水（３ｘ５ｍＬ）による洗浄と、前記生成物の５０％メタノール水溶液を用いる溶出とを含む。前記生成物は、濃縮され、水（１ｍＬ）に再溶解されて、０．２Ｍ  ＴＥＡＢバッファーで平衡化されたＤＥＡＥセファデックスカラム（２０ｍＬ）上に装荷された。前記カラムは、１００ｍＬ（０．２Ｍ）、１００ｍＬ（０．４Ｍ）、１５０ｍＬ（０．４５Ｍ）、１５０ｍＬ（０．６Ｍ）、９００ｍＬ（０．７５Ｍ）及び７００ｍＬ（０．８Ｍ）と、ＴＥＡＢバッファーの濃度を上げながら溶出した。分画はＬＩＦ−ＣＥを用いてテストされ、純粋な分画は一緒にプールされて、上記のとおり脱塩されて、蛍光レポーター化合物（２１）を得た（５ｍＬ、２００μＭ）。
【実施例１２】
【００８８】
本発明のシアニン色素のスペクトルの比較
図１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂを参酌して、シアニン色素（１４）及び（１９）の正規化された吸光スペクトルが、それぞれ以下に示すシアニン色素Ｃｙ７及びＤＢＣｙ７のスペクトルと比較された。
【００８９】
【化１７】
2007532718.tif 000021
【００９０】
図１Ａを参酌して、シアニン色素（１４）である環固定Ｃｙ７のゲルバッファー及び水の中での正規化吸光スペクトルが既知のシアニン色素Ｃｙ７の正規化吸光スペクトルと比較された。
【００９１】
図１Ｂを参酌して、シアニン色素（１４）である環固定Ｃｙ７のゲルバッファー及び水の中での正規化蛍光スペクトルが、既知のシアニン色素Ｃｙ７の正規化蛍光スペクトルと比較された。
【００９２】
図２Ａを参酌すると、シアニン色素（１９）である環固定ＤＢＣｙ７のゲルバッファー及び水の中での正規化吸光スペクトルが、既知のシアニン色素ＤＢＣｙ７の正規化吸光スペクトルと比較された。
【００９３】
図２Ｂを参酌すると、シアニン色素（１９）である環固定ＤＢＣｙ７のゲルバッファー及び水の中での正規化蛍光スペクトルが、既知のシアニン色素ＤＢＣｙ７の正規化蛍光スペクトルと比較された。
【００９４】
図１及び２に示すスペクトルは、本発明の化合物が吸光および蛍光を利用する分光学的方法に適することを示す。前記化合物は近赤外領域に励起及び発光スペクトルがあり、発光スペクトルが重複しないので、該スペクトルを個別に検出することができる。
【実施例１３】
【００９５】
ＤＮＡ配列決定
２個の蛍光レポーター化合物（２０）及び（２１）は、ベックマン・コールターＣＥＱ２００ＤＮＡ解析システムにおける４個のダイターミネーターのうちの２個を置換した。ベックマン・コールター社の１９９９年の著作物である、ＣＥＱＴＭ  ２０００  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａ  Ｓｔｅｐ  ｂｙ  Ｓｔｅｐ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＣＥＱ  ２０００，７１８１１９ＡＢに説明される現行のシーケンシングプロトコールは、化合物（２０）及び（２１）が該プロトコールに記載のｄｄＣＴＰ及びｄｄＡＴＰ試薬の代用とされることを除いて、踏襲された。蛍光レポーター化合物（２０）及び（２１）を用いると、前記ＣＥＱ２０００のシーケンシングプロトコールを用いてテストされるときには、最大６００塩基までの配列情報が得られた。
【００９６】
本発明は、一部の好ましい実施態様を参酌してかなり詳細に説明されたが、他の実施態様も想到可能である。したがって、添付する請求の範囲のは、本明細書に含まれる好ましい実施態様の説明に限定されるべきではない。本明細書に引用される全ての参考文献は引用によってそれらの全体が本明細書に取り込まれる。
【００９７】
本発明の以上の、及びその他の特徴、局面及び利点は、以上の説明と、添付する請求の範囲と、添付する図面とからよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】本発明の修飾シアニン色素とシアニン色素Ｃｙ７との正規化吸光スペクトルを比較するグラフ。
【図１Ｂ】本発明の修飾シアニン色素とシアニン色素Ｃｙ７との正規化蛍光スペクトルを比較するグラフ。
【図２Ａ】本発明の修飾シアニン色素とシアニン色素ＤＢＣｙ７との正規化吸光スペクトルを比較するグラフ。
【図２Ｂ】本発明の修飾シアニン色素とシアニン色素ＤＢＣｙ７との正規化蛍光スペクトルを比較するグラフ。
【図１Ａ】
2007532718.tif 000031
【図１Ｂ】
2007532718.tif 000032
【図２Ａ】
2007532718.tif 000033
【図２Ｂ】
2007532718.tif 000034
【国際調査報告】
2007532718.tif 000035
2007532718.tif 000036
2007532718.tif 000037
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