(57)【要約】  本発明は、以下の式（Ｉ）、ここで、Ｒ1、Ｒ2、ｎ、Ａｒ1及びＡｒ2は明細書で定義される、の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体、薬学的に許容されるその塩、治療及び医薬組成物におけるその使用、並びにそれを用いた治療法に関する。例示的な化合物は、１−（２−（ナフチルメトキシ）−１−フェニルエチル）ピペラジン誘導体である。本化合物は、うつ病及び他の疾患に対して医学的適応性のある、ニューロキニン１（ＮＫ1）受容体アンタゴニスト及び／又はセロトニン再取り込み阻害剤である。  【化１】2007532636.tif 000012
2007532636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造式Ｉ：
【化１】
2007532636.tif 000011
〔式中、
Ｒ1及びＲ2は、Ｃ1-6アルキル又はＣ1-6アルケニルから独立に選択され、又は、それらが結合しているＮと共に、６、７若しくは８個の原子を含む複素環、又は、その様な複素環であって、水素；ハロゲン；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルコキシ；又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキル；アミノ；又はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ又は０、１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルで置換されたアミノから独立に選択される基で置換された複素環を形成し；
Ｒ4は、水素であり；
ｎは、０、１又は２であり；
Ａｒ1は、フェニル、又は、水素、ハロゲン、−Ｓ−Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ、又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルから独立に選択される基で置換されたフェニルであり；そして、
Ａｒ2は、フェニル、ナフチル、テトラリン、又は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ、又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルから独立に選択される基で置換された、フェニル、ナフチル又はテトラリンである〕
で表わされる化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体、及び薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
生理学的に許容されるアニオンを提供する無機又は有機酸を用いて作られる、請求項１に記載の化合物の薬学的に許容される塩。
【請求項３】
無機酸又有機酸が塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、スルファミン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、フマル酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、サリチル酸及びキナ酸から選択される酸である、請求項２に記載の薬学的に許容される塩。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項５】
ＳＲＩ活性と組み合わせたＮＫ1受容体の拮抗作用が有益である病状の治療法であって、請求項１に記載の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩の有効量を温血動物に投与することを含む治療法。
【請求項６】
ＮＫ1受容体の拮抗作用が有益である病状の治療法であって、請求項１に記載の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩の有効量を温血動物に投与することを含む治療法。
【請求項７】
ＳＲＩ活性が有益である病状の治療法であって、請求項１に記載の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩の有効量を温血動物に投与することを含む治療法。
【請求項８】
ＮＫ1受容体の拮抗作用又はＳＲＩ活性が有益である病状に使用する医薬品の製造における、請求項１に記載の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項９】
ＮＫ1受容体の拮抗作用及びＳＲＩ活性が有益である病状に使用する医薬品の製造における、請求項１に記載の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項１０】
高血圧、癌患者のうつ病、パーキンソン病患者のうつ病、心筋梗塞後うつ病、亜症候群症状性うつ病、不妊女性のうつ病、小児性うつ病、大うつ病、単一エピソードうつ病、反復性うつ病、幼児虐待誘導性うつ病、産後うつ病、全般性不安障害、広所恐怖症、対人恐怖症、単純恐怖症、外傷後ストレス症候群、回避的人格障害、早漏症、拒食症、多食症、肥満症、アルコールへの、コカインへの、ヘロインへの、フェノバルビタールへの、ニコチンへの又はベンゾジアゼピンへの依存症；群発性頭痛、片頭痛、疼痛、アルツハイマー病、強迫神経症、パニック障害、認知症、健忘症、加齢関連の認知力減退、パーキンソン病性認知症、神経抑制剤誘発パーキンソニズム、遅発性ジスキネジー、高プロラクチン血症、血管痙攣、脳血管系血管痙攣、小脳性運動失調症、胃腸管障害、統合失調症の陰性症状、月経前症候群、線維筋肉痛症候群、緊張性尿失禁、トゥーレット症候群、抜毛癖、窃盗癖、男性勃起不全、注意欠陥運動性障害、慢性発作性片頭痛及び血管障害に伴う頭痛から選択される哺乳類の疾患又は状態を治療するための方法であって、ＮＫ1受容体の拮抗作用及びＳＲＩ活性が有益であり、それらの疾患又は状態の治療に有効な請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
化合物が薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロトニン、Ｐ物質又はニューロキニンＡが関与する病気、例えば、高血圧、うつ病、全般性不安障害、 恐怖症、外傷後ストレス症候群、回避的人格障害、早漏、摂食障害、肥満、薬物依存、群発性頭痛、片頭痛、疼痛、アルツハイマー病、強迫神経症、パニック障害、記憶障害、パーキンソン病、内分泌異状性血管痙攣、小脳性運動失調症、胃腸系障害、統合失調症の陰性症状、月経前症候群、線維筋肉痛症候群、緊張性尿失禁、トゥーレット症候群、抜毛癖、窃盗癖、男性勃起不全、注意欠陥運動性障害、慢性発作性片頭痛及び頭痛などの疾患又は状態の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類のニューロキニンは、末梢及び中枢神経系に見出されるペプチド性神経伝達物質である。主要な３つのニューロキニンは、Ｐ物質 (ＳＰ)、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）及びニューロキニンＢ（ＮＫＢ）である。少なくともＮＫＡにはＮ末端伸長型が知られている。主要ニューロキニンに対する３種の受容体が知られている。ニューロキニンＳＰ、ＮＫＡ及びＮＫＢに対する相対的な選択性に基づいて、受容体は、それぞれニューロキニン１（ＮＫ1）、ニューロキニン２（ＮＫ2）及びニューロキニン３（ＮＫ3）受容体に分類される。末梢部位において、ＳＰ及びＮＫＡは、Ｃ−線維として知られる非有髄神経終末を特徴とするＣ−求心性知覚ニューロンに局在し、そのニューロンの選択的脱分極又はＣ−線維の選択的刺激によって放出される。Ｃ−線維は気道上皮組織に局在しており、タキキニンは、喘息に見られる多くの症状と明らかに類似した深刻な結果をもたらすことが知られている。哺乳類の気道におけるタキキニンの放出又は導入の影響には、気管支収縮、微小血管透過性亢進、血管拡張、粘液分泌亢進及び肥満細胞活性化が挙げられる。ＮＫ1、ＮＫ2及びＮＫ3受容体と相互に作用し、異なる化学構造を有するニューロキニンＡアンタゴニストが報告されている。特に、国際公開ＷＯ９８／０７７２２号、ＷＯ９６／３９３８３号及びＷＯ９８／２５６１７号、並びに広域公開ＥＰ４２８４３４号、ＥＰ４７４５６１号、ＥＰ５１５２４０号及びＥＰ５５９５３８号には、さまざまな化学構造の製造法が開示されている。
【０００３】
ＮＫ1活性はうつ病及び不安症にも関与しており、遺伝子組み替えされたＮＫ1受容体を有するマウスは、不安に関連する挙動が減少すること（Santarelli, L., et. al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2001), 98, 1912）、及びＮＫ1アンタゴニストは、うつ病のモデル動物に効果のあることが報告されている（Papp, M., et. al., Behav. Brain Res. (2000),
115, 19）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）は、大うつ病障害（ＭＤＤ）の治療に広く使われており、耐容性が良く投与し易いと考えられている。しかし、ＳＳＲＩは作用発現が遅く、性機能不全などの好ましくない副作用に関連しており、そしておそらく３０％の患者には効果がない（M. J. Gitlin, MJ, J. Clin. Psych., 55, 406-413, 1994）。
【０００５】
ＮＫ1アンタゴニスト及びセロトニン再取り込み阻害剤としての二通りの作用を有する化合物は、又、抗うつ剤の新たな種類を提供する可能性がある。実際、ＮＫ1拮抗作用とセロトニン再取り込み阻害作用を併せ持つ化合物がこれまでに文献に記載されている（Ryckmans, T., et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2002), 12, 261）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ニューロキニン１（ＮＫ1）アンタゴニスト活性及び／又はセロトニン再取り込み阻害（ＳＲＩ）活性を有する化合物に関する。本発明のアリールグリシン化合物は、式Ｉ：
【化１】
2007532636.tif 000003
ここで、
Ｒ1及びＲ2は、Ｃ1-6アルキル又はＣ1-6アルケニルから独立に選択され、又は、それらが結合しているＮと共に、６、７若しくは８個の原子を含む複素環、又はその様な複素環であって、水素；ハロゲン；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルコキシ；又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキル；アミノ；又はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ又は０、１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルで置換されたアミノから独立に選択される基で置換された複素環を形成し；
Ｒ4は、水素であり；
ｎは、０、１又は２であり；
Ａｒ1は、フェニル、又は、水素、ハロゲン、−Ｓ−Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ、又は１、２若しくは４個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルから独立に選択される基で置換されたフェニルであり；そして、
Ａｒ2は、フェニル、ナフチル、テトラリン、又は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ、又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルから独立に選択される基で置換された、フェニル、ナフチル又はテトラリンである；
で表わされる化合物である。
【０００７】
本発明は、又、式Ｉの化合物の、生体内で加水分解可能な前駆体及び薬学的に許容される塩、それらを含む医薬組成物及び製剤、病気又は状態を治療するための、単独或いは他の治療的に活性な化合物又は物質との併用の何れかによる、それらの使用、それらを製造するために用いられる方法及び中間体、医薬品としてのそれらの使用、医薬品製造におけるそれらの使用及び診断並びに分析を目的としたそれらの使用を包含する。
【０００８】
本発明の化合物は、ＮＫ1アンタゴニスト活性及び／又はＳＲＩ活性を有する。従って、本発明は、それらの化合物、それらの化合物を含む医薬組成物、並びに中枢神経系（ＣＮＳ）及び他の疾患を治療するためにそれらの化合物を使用する方法を含む。
【０００９】
本発明は、次の式Ｉ：
【化２】
2007532636.tif 000004
ここで、
Ｒ1及びＲ2は、Ｃ1-6アルキル又はＣ1-6アルケニルから独立に選択され、又は、それらが結合しているＮと共に、６、７若しくは８個の原子を含む複素環、又は、水素；ハロゲン；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルコキシ；又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキル；アミノ；又はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルで置換されたアミノから独立に選択される基で置換された複素環を形成し；
Ｒ4は水素であり；
ｎは、０、１又は２であり；
Ａｒ1は、フェニル、又は、水素、ハロゲン、−Ｓ−Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルから独立に選択される基で置換されたフェニルであり；そして、
Ａｒ2は、フェニル、ナフチル、テトラリン、又は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ又は１、２若しくは３個のハロゲンで置換されたＣ1-4アルキルから独立に選択される基で置換された、フェニル、ナフチル又はテトラリンである；
で表わされる化合物、生体内で加水分解可能なそれらの前駆体、及び薬学的に許容されるそれらの塩に係るものである。
【００１０】
本発明の注目すべき化合物は、本明細書の実施例の化合物である。
【００１１】
本発明の別の態様は、生理学的に許容されるアニオンを提供する無機又は有機酸によって作られる、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩である。
【００１２】
注目される薬学的に許容される本発明の化合物の塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、スルファミン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、フマル酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、サリチル酸及びキナ酸から選択される無機又は有機酸の塩である。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。
【００１４】
更に本発明の別の態様は、ＮＫ1受容体の拮抗作用及び／又はＳＲＩ活性が有効であり、有効量の本発明化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩を温血動物に投与することを含む、病状の治療法である。
【００１５】
本発明の更に別の態様は、ＮＫ1受容体の拮抗作用及び／又はＳＲＩ活性が有効である病状に使用する医薬品の製造における、本発明の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩の使用である。
【００１６】
本発明の更なる態様は、高血圧、癌患者のうつ病、パーキンソン病患者のうつ病、心筋梗塞後うつ病、亜症候群症状性うつ病、不妊女性のうつ病、小児性うつ病、大うつ病、単一エピソードうつ病、反復性うつ病、幼児虐待誘導性うつ病、産後うつ病、全般性不安障害、広所恐怖症、対人恐怖症、単純恐怖症、外傷後ストレス症候群、回避的人格障害、早漏症、拒食症、多食症、肥満症、アルコールへの、コカインへの、ヘロインへの、フェノバルビタールへの、ニコチンへの又はベンゾジアゼピンへの依存症；群発性頭痛、片頭痛、疼痛、アルツハイマー病、強迫神経症、パニック障害、認知症、健忘症、加齢関連の認知力減退、パーキンソン病性認知症、神経抑制薬誘発パーキンソニズム、遅発性ジスキネジー、高プロラクチン血症、欠陥痙攣、脳血管系欠陥痙攣、小脳性運動失調症、胃腸管障害、統合失調症の陰性症状、月経前症候群、線維筋肉痛症候群、緊張性尿失禁、トゥーレット症候群、抜毛癖、窃盗癖、男性勃起不全、注意欠陥運動性障害、慢性発作性片頭痛及び血管障害に伴う頭痛から選択される哺乳類の疾患又は状態を治療するための方法であり、ＮＫ1受容体の拮抗作用及び／又はＳＲＩ活性が効果をもたらし、それらの疾患又は状態の治療に有効な本発明の化合物又は薬学的に許容されるその塩を投与することを含む。
【００１７】
本発明の特定の態様において、本明細書に記載される疾患又は状態の治療法は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本発明の化合物の投与を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
式Ｉの化合物、及び生体内で加水分解可能なそれらの前駆体又は薬学的に許容されるそれらの塩は、本明細書に記載し例示した方法及びそれと類似した方法、並びに化学技術で公知の方法によって作ることができる。もしこれらの方法の出発原料が市販品として入手できない場合は、既知の化合物の合成と同様な又は類似した手法を用い、化学技術から選択した手順で作ることができる。
【００１９】
薬学的に許容される塩は、対応する酸から、従来の方法で作ることができる。薬学的に許容されない塩も中間体として使うことができ、そのこと自体は本発明の別の態様である。
【００２０】
光学活性体の製造方法（例えば、ラセミ体の分割又は光学活性な出発原料からの合成）は当業界で公知であり、全ての光学活性体、エナンチオマーは本発明の化合物である。更に、エナンチオマーの混合物がセロトニン及びニューロキニンのどちらか一方又は両者の活性を有することができ、及び／又は純粋なエナンチオマーのどちらか一方がセロトニン及び／又はニューロキニン活性を有することができる。
【００２１】
以下の、生物学的試験法、データ及び実施例は、本発明を例示し更に解説するためのものである。
【００２２】
本発明の化合物、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬学的に許容されるその塩（以後、まとめて「化合物」と言う）の有用性は、以下に記載される文献に公開されているものを含めて、標準的な試験及び臨床試験によって示すことができる。
【００２３】
生物学的アッセイ：
試験Ａ−ＳＥＲＴ結合アッセイ：
ヒト５−ＨＴＴ受容体を安定的に発現する形質導入されたＨＥＫ２９３細胞株の凍結した膜調製物は、Receptor Biology (PerkinElmer)から購入した。凍結物のアリコートを急速に解凍して均質化し、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１２０ｍＭ）及びＫＣｌ（５ｍＭ）を含みＮａＯＨでｐＨ７.４に調整したアッセイ緩衝液（ＡＢ）で希釈した。最終のタンパク質濃度は４０μｇ／ｍＬであった。試験化合物は、放射性リガンドとしてNEN（PerkinElmer）から購入した［3Ｈ］−塩酸イミプラミンを用い、競合アッセイで評価した。ストック放射性リガンドは、最終濃度が約２ｎＭになるようにＡＢで希釈した。［3Ｈ］−塩酸イミプラミンのＫｄ（結合解離定数）の測定値は２.７ｎＭであった。競合アッセイは、９６ウェルプレート上で、プレート当たり２薬剤で行った。ＤＭＳＯで調製した１０ｍＭのストック化合物溶液から、１０個の連続希釈液（通常、１μＭから３８ｐＭの最終濃度まで）を調製した。全ての連続希釈液は、２０％ＤＭＳＯを用いて作成した。アッセイ内のＤＭＳＯ含量は、１％未満である。インキュベーション混合物は、９６ウェルプレート（Coastar）で四重に調製した。ウェル当たりの最終アッセイ容量は、化合物／非特異物質／対照（１％ＤＭＳＯ）が１０μＬ，膜溶液が２０μＬ、［3Ｈ］−塩酸イミプラミンが２０μＬ及びＡＢが１５０μＬであった。特異的結合は、１０μＭのイミプラミンを使用して規定した。結合反応は、緩衝液と試験化合物、非特異物質又は対照の何れかを含むウェルに、放射性リガンドを添加し、その直後に膜溶液を添加して開始した。アッセイプレートをプレート振とう器に載せ、反応が平衡に達するまでの間、３０分間振とうした。次に、プレートを、Packard Filtermate 196を用い、６％ＰＥＩに前浸漬したBeckman GF/Bフィルターで濾過した。フィルターを０.２ｍＬの氷冷した洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（５ｍＭ）、ｐＨ７.４）で５回洗浄した。フィルターを乾燥させ、Microscint 20（Packard）（３５μＬ）を各ウェルに添加した。次にプレートをPackard TopCountで計測し、ウェル当たりのＣＰＭを測定した。各試験化合物のＫｉ値は、図解及び解析ソフトウェア・パッケージのGraphPad Prismを用いて測定した。
【００２４】
試験Ｂ−Fluo-4 Dyeを用いたＮＫ1のＦＬＩＰＲアッセイ：
ＦＬＩＰＲアッセイは、Molecular Devices Inc. から販売されている、高処理能力の全細胞アッセイで細胞蛍光を正確に測定するように設計された装置を用いて行った。（Schroeder et. al., J. Biomolecular Screening, 1(2), p 75-80, 1996）。
ＮＫ1受容体アゴニストであるアセチル−［Ａｒｇ6，Ｓａｒ9，Ｍｅｔ（Ｏ2）11］−Ｐ物質（ＡＳＭＳＰ）に対するＵ３７３細胞の応答に対して、化合物が阻害する強さを、ＦＬＩＰＲ機器を用いて評価した。
Ｕ３７３細胞に、Fluo-4 Dye（Molecular Probes）を３７℃で４５分間取り込ませ、勾配をつけた濃度の化合物に室温で１５分間曝した後、１０ｎＭ〜１２ｎＭ（おおよそＥＣ80の濃度）のＡＳＭＳＰでチャレンジした。応答は、アゴニスト添加後のピーク相対蛍光強度として測定した。ｐＩＣ50は、それぞれの化合物について、１１点の濃度応答の曲線から求めた。
【００２５】
試薬：
細胞培養用培地：
イーグルＭＥＭ、アールの塩及びＬ−グルタミン添加（500mL）    Cellgro 10-010-CV
非必須アミノ酸、１００×（５mL）                             Cellgro 25-025-CI
ピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ（５mL）                     Cellgro 25-000-CI
Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ（５mL）                           Cellgro 25-005-CI
牛胎児血清（50mL）                                           Cellgro 35-010-CV細胞回収試薬：
ＤＰＢＳ、１×Ｃａ++及びＭｇ++不含                           Cellgro 21-031-CV
１×トリプシン−ＥＤＴＡ(0.5％トリプシン、0.53％EDTA−４Na) Cellgro 25-052-CI
細胞平板培養用培地：
UltraCULTURE                                             BioWhittaker 12-725F
Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ（５mL／500mL）                Cellgro 25-005-CI
作業用緩衝液：
１０×ハンクの平衡塩溶液（100mL／mL）                    Gibco 14065-056
ＨＥＰＥＳ緩衝液、１Ｍ（15mL／Ｌ、最終濃度15mM）         Cellgro 25-060-CI
プロベネシド（１Ｌ用として0.71ｇを６mLの１ＭＮａＯＨに溶解、最終濃度2.5mM）
Sigma P-8761
ＤＤＨ2Ｏ（二回蒸留水）で１Ｌにし、ＮａＯＨでｐＨ７.４に調整。
色素溶液：
Fluo-4、AM色素、Molecular Probes F-14201。凍結乾燥した色素（５０μｇ）をＤＭＳＯ（２３μＬ）とPluronic F-127（Molecular Probes P-3000）（２３μＬ）の混合液に溶解する。溶解したFluo-4色素（４６μＬ）を作業用緩衝液（１０ｍＬ）に加え、作業用色素濃縮液（５μＭ）にする。希釈した色素液（１０ｍＬ）は、３８４ウェルプレートの細胞に対してウェル当たり２５μＬ添加するのに十分な量である。
アゴニスト：
アセチル−［Ａｒｇ6，Ｓａｒ9，Ｍｅｔ（Ｏ2）11］−Ｐ物質（ＡＳＭＳＰ）
３.３３×１０-2Ｍの保存溶液。１００ｍｇをＤＭＳＯ（３.０５ｍＬ）に溶解し、分割して４℃で保存。
その他：
ＤＭＳＯ（化合物の溶解及びチップ洗浄用）。
【００２６】
細胞培養及び平板培養法：
Ｕ３７３細胞は、上記の細胞培養用培地（Ｔ−１５０フラスコ当たり３０ｍＬ）で増殖させ、飽和増殖になった時点で下記のようにして回収した。培地を吸引除去し、細胞をＣａ++及びＭｇ++不含ＤＰＢＳ（１２ｍＬ）で一回洗浄した。ＤＰＢＳを吸引除去し、トリプシン含有ＥＤＴＡ（３ｍＬ）で置換した。トリプシン／ＥＤＴＡを加えた細胞を室温で約２分間、細胞がフラスコから離脱するまでインキュベートした。細胞回収の反応は９ｍＬの培養用培地を添加して停止させ、細胞を摩砕によって再懸濁させた。
【００２７】
細胞は、１：４の移植密度で４日毎に継代した。実験のためには、細胞数を計測し、４００ｘｇで５分間遠心してペレット状にし、そして再度４８０,０００細胞／ｍＬの細胞密度になるように細胞平板培養用培地に懸濁した。この細胞懸濁液（２５μＬ）を、Labsystems Multidrop 384を用いて黒色壁３８４ウェルプレート（Falcon Microtest, 353962）の各ウェルに移し、ウェル当たり１２,０００個の細胞数にした。使用前に、プレートを３７℃で一晩（最低１５時間、最大２３時間）インキュベートした。
【００２８】
化合物及びアゴニストの調製：
化合物を１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、その溶液（１２０μＬ）を、丸底９６ウェルのポリプロピレン製保存プレート（Costar 3365）の各横列の最初のウェル（縦第１列）に入れた。次にその様な２枚のプレート上の化合物を、Biomek 2000を用いて、ＤＭＳＯで連続的に同時に希釈した。各希釈液（４μＬ）を、あらかじめ用意した、各ウェルに新しく調製した作業用緩衝液（４００μＬ）が入った深底ウェルプレート（Beckman Coulter 267006）に移した。この操作で作られた濃度を表１に示した。アッセイにおける最終の化合物濃度は、１０μＭと０.１ｎＭの間で、３.３倍（half-log）増加率の１１点にした。
【００２９】
ウェルの内容物を混合し、２つの９６ウェルプレートから各希釈液（４５μＬ）を、ポリプロレン製３８４ウェルの化合物負荷プレート（Fisher 12-565-507）に重複して移し、３８４ウェルプレートに各濃度の化合物が二通り含められるようにした。プレートの縦２３及び２４列は、化合物を含まない対照として使った。プレートの縦２３及び２４列内のＡ〜Ｎウェルは、アゴニストのみが負荷され、従って最大応答を示す。プレートの縦２３及び２４列内のＯ〜Ｐウェルは、アゴニストが入らず緩衝液のみが負荷され、従って最小応答を示す。
【００３０】
ＡＳＭＳＰアゴニスト負荷プレートは、ＡＳＭＳＰの保存濃縮液を使い、作業用緩衝液で３.３×１０-8Ｍの濃度に希釈して作成した。この溶液（４５μＬ）を、ポリプロピレン製３８４ウェルアゴニスト負荷プレート（Fisher 12-565-507）の、緩衝液のみを含み刺激無しの対照として使うＯ２３、Ｏ２４、Ｐ２３及びＰ２４ウェル以外の、全てのウェルに移した。
【００３１】
細胞への色素負荷及び化合物添加：
各３８４ウェルアッセイプレートの細胞用に、上記の方法／試薬の項に述べたようにして、希釈Fluo-4色素溶液（１０ｍＬ）を調製した。最初に、各３８４ウェルの細胞プレートを、CCS Packard製のプレート洗浄器上で、作業用緩衝液で１回洗浄した。ウェル内に残る洗浄後の緩衝液を手動で除去し、ウェル当たり２５μＬのFluo-4色素液を、Labsystems Multidrop 384を用いて添加した。細胞プレートを３７℃のインキュベーターに戻して４５分間放置し、色素を細胞に浸透させた。４５分間の色素負荷の後、各ウェルに３０μＬの液量を残しながら作業用緩衝液で細胞プレートを２回洗浄した。希釈化合物（５μＬ）を、PlateMateを用いて、化合物プレートから細胞プレートに移した。アッセイプレートは、化合物の存在下、暗所、室温で１５分間インキュベートした後、ＦＬＩＰＲにかけた。
【００３２】
ＦＬＩＰＲによる応答の記録：
化合物を１５分間予備インキュベートした後、プレートをＦＬＩＰＲ機器にかけ、ＡＳＭＳＰアゴニスト（１５μＬ）を添加して、アゴニストに対する細胞性応答を９０秒間記録した。応答は、アゴニスト添加後のピーク相対蛍光強度として測定した。
データ解析：
ＦＬＩＰＲが作る「.stat」ファイル内のデータを、Excelの解析テンプレートに貼り付け、異常値を排除した後、XLfitソフトウェアを用いてテンプレート内のＩＣ50値を求めた。個別のＩＣ50値はｐＩＣ50と並べて提示した。１つの化合物に対して得られる２つのＩＣ50値が３倍以上違った場合、更に１回又は２回アッセイしてその化合物の値を再測定した。
結果：
ＳＥＲＴアッセイで得られた本発明の化合物のＫｉ値は、２ｎＭ未満から約１８０ｎＭまで分布していた。ＦＬＩＰＲアッセイで得られた本発明の化合物のＩＣ50値は、約７０ｎＭから約２μＭまで分布していた。
【００３３】
〔実施例〕
本発明は、これらに限定されないが以下の実施例で説明される。その説明において、適用可能であり、特に断らない限り、以下の用語、略号及び条件が使用される。
ａｑ．：水性；ａｔｍ：大気圧；ＢＯＣ：１，１−ジメチルエトキシカルボニル；ＡＣＮ：アセトニトリル；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＥｔＯＨ：エタノール；Ｅｔ2Ｏ：ジエチルエーテル；ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル；ｈ：時間；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＭｅＯＨ：メタノール；ｍｉｎ：分；ＭＳ：質量スペクトル；ＮＭＲ：核磁気共鳴；ｐｓｉ：ポンド／平方インチ；ＲＴ：室温；ｓａｔ．：飽和；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン。
【００３４】
用語「複素環」が単独で使用される場合、又は接尾語若しくは接頭語として使用される場合は、環状構造又は環構造部分として、Ｏ、Ｎ、Ｐ又はＳから独立に選択される原子である、１個又はそれ以上の多価原子価のヘテロ原子を有する少なくとも３個から２０個までの原子からなる環状分子を意味する。複素環は、飽和していても、部分飽和でも又は不飽和でもよく、１つ又はそれ以上の二重結合で結合した原子を有してもよく、結合又は縮合してもよい１つ又はそれ以上の環を形成してもよく、ここで、縮合環は、その間に少なくとも２個の原子を共有する。複素環は、芳香族性を有しても、有さなくてもよい。
【００３５】
温度は、摂氏（℃）で表し、特に断らない限り、操作は室温、又は、外気温度（１８〜２５℃）で行った。
有機溶液は、無水の硫酸ナトリウム又はマグネシウムで乾燥し、溶媒の蒸発は、ロータリーエバポレーターを用い減圧下（４.５〜３０ｍｍＨｇ）、６０℃までの浴温で行った。
【００３６】
クロマトグラフィーは、特に断らない限り、シリカゲルを用いたフラッシュ・カラム・クロマトグラフィーを意味し、溶媒混合物の組成は、容積パーセント又は容積比で表す。
ＮＭＲデータが与えられている場合、３００ＭＨｚで測定した、主要測定プロトンに対するデルタ値として示される（内部標準としてのテトラメチルシランに対する百万分率（ｐｐｍ）で表される）。
融点は補正していない。
【００３７】
質量スペクトル（ＭＳ）は、特に断らない限り、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）による自動化システムで得られた。主要同位体成分に対応する質量、又は、殆ど等しい量の存在比を有する多重質量（同位体スプリッティング）の化合物に対する最少質量が報告される。
【００３８】
最終化合物を、クエン酸塩に転換したことが示してある場合は、遊離の塩基を、ＭｅＯＨ、ＤＣＭ又はＡＣＮに溶解し、ＭｅＯＨ中のクエン酸（１.０当量）と組み合わせて、減圧下で濃縮し、減圧乾燥（２５〜６０℃）した。塩をＥｔ2Ｏの濾過で単離したことが示してある場合は、化合物のクエン酸塩を、Ｅｔ2Ｏ中で４〜１８時間撹拌し、濾過で回収し、Ｅｔ2Ｏで洗浄し、そして、減圧乾燥（２５〜６０℃）した。
【００３９】
〔実施例１〕
４−｛［２−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−２−ピペラジン−１−イルエトキシ］メチル｝−３−メトキシ−２−ナフトニトリル
４−｛１−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−２−［（３−シアノ−２−メトキシ−１−ナフチル）メトキシ］エチル｝ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１００ｍｇ、０.１８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、そして、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。２時間後、揮発分を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に取り込み、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、珪藻土のパッドを通して濾過し、揮発分を減圧下で除去した。残留物を、ＳｉＯ2（０〜５％：２ＭのＮＨ3のＭｅＯＨ／ＤＣＭ溶液）を用いたクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物（８１.６ｍｇ、７９％）を灰色を帯びた白色の固体として得た。クエン酸（１.０当量）を標題化合物のメタノール溶液に加えて、クエン酸塩を形成した。減圧下で濃縮し、該生成物の所望の塩を灰色を帯びた白色の粉末として得た。
MS m/z 454.4 (M+H)+。 1H NMR (300.1 MHz, DMSO + TFA) δ 8.64 (s, 1H), 8.08 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.80 (dd, J = 1.9, 7.1 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55 - 7.45 (m, 2H), 5.06 (dd, J = 15.4, 11.0 Hz, 2H), 4.78 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.20 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.41 - 3.34 (m, 6H), 3.23 - 3.19 (m, 2H), 2.75 (dd, J = 33.0, 15.4 Hz, 4H), 1.83 (s, 1H)。
【００４０】
必要な、４−｛１−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−２−［（３−シアノ−２−メトキシ−１−ナフチル）メトキシ］エチル｝ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを、以下の方法を用いて合成した。４−［１−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６５ｍｇ、０.１８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１.８ｍＬ）に溶解した。４−（ヨードメチル）−３−メトキシ−２−ナフトニトリル（７０ｍｇ、０.２２  ｍｍｏｌ）を加え、次いで、ＮａＨ（９ｍｇ、０.３６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で終夜反応させた後、水（６０ｍＬ）を加えた。混合物を、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、珪藻土のパッドを通して濾過し、揮発分を減圧下で除去した。残留物を、ＳｉＯ2（０〜３０％：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶液）を用いたクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物（９９ｍｇ）を得た。ＭＳ：（ｍ／ｚ）５５４.６（Ｍ＋Ｈ）+。
【００４１】
必要な、４−［１−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを、以下の方法を用いて合成した。
【００４２】
ボラン−メチルスルフィド錯体（２ＭのＴＨＦ溶液、１.０７ｍＬ）をＴＨＦ（３ｍＬ）中［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］（３−クロロ−４−フルオロフェニル）酢酸の溶液（２００ｍｇ、０.５４ｍｍｏｌ）に加えた。室温で３０分間放置した後、反応溶液を４時間還流下で加熱した。反応溶液を室温に冷却した後、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を徐々に加えた。ＳｉＯ2（０〜５０％：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いたクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物（１６０ｍｇ、８３％）を得た。ＭＳ：（ｍ／ｚ）３５９.３（Ｍ＋Ｈ）+、３０３.２（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ブチル）。
【００４３】
必要な、［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］（３−クロロ−４−フルオロフェニル）酢酸を、以下の方法を用いて合成した。（３−クロロ−４−フルオロフェニル）ボロン酸（４４０ｍｇ、２.５２ｍｍｏｌ）、ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４６９ｍｇ、２.５２ｍｍｏｌ）及びグリオキシル酸一水和物（２３２ｍｇ、２.５２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中で、終夜、還流下で反応させた。揮発分を減圧下で除去した。ＳｉＯ2（０〜１０％：ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を用いたクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物（７６７ｍｇ、８２％）を得た。
MS m/z 373.1 (M+H)+, 317.1 (M+H-t-ブチル)。1H NMR (300.1 MHz, DMSO) d 12.80 (s, 0.6H), 7.59 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 4.09 (s, 1H), 3.30 (s, 2H), 3.16 (s, 2H), 2.35 (m, 4H), 1.38 (s, 9H)。
【００４４】
〔実施例２〜２９〕
以下の表に示された化合物は、実施例１で記載された方法と類似の方法で製造した。
【表１】
2007532636.tif 000005
【００４５】
【表２】
2007532636.tif 000006
【００４６】
【表３】
2007532636.tif 000007
【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
2007532636.tif 000010
【国際調査報告】
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