(57)【要約】本明細書において、癌を処置し、被験体中の腫瘍容積を阻害するために、抗ＴＮＦレセプター結合部分を含む多価構築物等のレセプターカップリング剤が開示される。本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はレセプターシグナル伝達を高める。別の実施形態において、レセプターカップリング剤はヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する、レセプターカップリング剤。
【請求項２】
第１レセプターに対する第１結合特異性と第２レセプターに対する第２結合特異性を含む、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項３】
前記第１結合特異性が、抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項２に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項４】
前記第２結合特異性が、抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項３に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項５】
前記第１結合特異性が、単鎖Ｆｖフラグメントにより付与される、請求項３に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項６】
前記第２結合特異性が、抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項５に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項７】
前記第１結合特異性が、前記レセプターの天然リガンドにより付与される、請求項２に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項８】
前記第２結合特異性が、抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項７に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項９】
前記第２結合特異性が、前記レセプターの天然リガンドにより付与される、請求項７に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１０】
少なくとも１つのレセプターがデスドメインを包含する、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１１】
前記レセプターが、ＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、Ｆａｓ（ＤＲ２）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ｐ７５ＮＧＦ−ＲおよびＤＲ６からなる群から選択される、請求項１０に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１２】
少なくとも１つのレセプターが組織分化に関与する、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１３】
少なくとも前記レセプターが、ＬＴＢＲ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、ＴＡＪおよびｐ７５ＮＧＦ−Ｒからなる群から選択される、請求項１２に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１４】
少なくとも１つのレセプターが免疫調節に関与する、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１５】
前記レセプターが、ＴＮＦＲＩＩ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡおよびＲＥＬＴからなる群から選択される、請求項１４に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１６】
少なくとも１つの前記レセプターが、腫瘍細胞上で過剰発現される、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１７】
少なくとも１つの前記レセプターが、正常な肝臓または内皮細胞上で過剰発現されない、請求項１６に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１８】
前記第１結合特異性が、抗ＬＴβレセプター（ＬＴβＲ）抗体、またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項２に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項１９】
前記抗ＬＴβＲ抗体が、ヒト化ＣＢＥ１１抗体に由来する、請求項１８に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２０】
前記第２結合特異性が、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項１８に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２１】
前記抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体がヒト化１４Ａ２抗体に由来する、請求項２０に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２２】
前記第１結合特異性が、ヒト化ＣＢＥ１１抗体の単鎖Ｆｖフラグメントにより付与され、前記第２結合特異性がヒト化１４Ａ２抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与される、請求項１９に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２３】
前記第１結合特異性が、少なくとも２つの三量体リガンド−Ｆｃ構築物により付与され、かつ第２の結合特異性が、３つの抗体により付与される、請求項２に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２４】
少なくとも１つの前記ＴＮＦファミリーレセプターが、細胞表面上のラフト環境で通常見られない、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２５】
少なくとも１つの前記ＴＮＦファミリーレセプターが、細胞表面上のラフト環境で通常見られる、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２６】
前記シグナル強度がレセプターにより高められる、請求項１に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２７】
少なくとも第１抗体と第２抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、各抗体が別個のＴＮＦファミリーレセプターに結合し、それによってヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する、レセプターカップリング剤。
【請求項２８】
前記第１抗体が抗ＬＴβＲ抗体に由来する、請求項２７に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項２９】
前記抗ＬＴβＲ抗体がヒト化ＣＢＥ１１抗体に由来する、請求項２８に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項３０】
前記第２抗体が抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体に由来する、請求項２８に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項３１】
前記抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体がヒト化１４Ａ２抗体に由来する、請求項３０に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項３２】
細胞膜ラフトに対してＴＮＦファミリーレセプターを局在化する方法であって、該方法は、ラフト化ＴＮＦファミリーレセプターに対する第１結合特異性とラフト化されていないＴＮＦファミリーレセプターに対する第２結合特異性とを含むレセプターカップリング剤を投与する工程を包含し、ここで、該レセプターカップリング剤の結合が、該細胞膜内のラフトに対して該ラフト化されていないＴＮＦレセプターを局所化する、方法。
【請求項３３】
レセプターシグナル伝達を高めるための方法であって、該方法は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
腫瘍容積を減少するための方法であって、該方法は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
癌の処置方法であって、該方法は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記レセプターカップリング剤がＩＦＮγの存在下で投与される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記レセプターカップリング剤が化学療法剤の存在下で投与される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、かつ第１ＴＮＦレセプターに向けられた第１結合特異性と第２ＴＮＦレセプターに向けられた第２結合特異性とを含むヘテロメリック複合体の形成を誘導する、レセプターカップリング剤。
【請求項３９】
前記第１および第２の結合特異性が、以下：
ａ）非デスドメイン含有ＴＮＦレセプターおよびデスドメイン含有ＴＮＦレセプター；
ｂ）非デスドメインを含有する２つのＴＮＦレセプター；ならびに
ｃ）デスドメインを含有する２つのＴＮＦレセプター
からなる群から選択されるＴＮＦレセプターに向けられる、請求項３８に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項４０】
少なくとも１つの結合特異性が、組織分化に関連した非デスドメイン含有ＴＮＦレセプターに向けられる、請求項３９に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項４１】
デスドメインを含有する２つのＴＮＦレセプターが、ＬＴＢＲ／Ｆｎ１４、ＬＴＢＲ／ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４／ＴＡＪ、ＬＴＢＲ／ＥＤＡＲ、ＬＴＢＲ／ＸＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＸＥＤＡＲ、ＴＡＪ／ＥＤＡＲおよびＴＡＪ／ＸＥＤＡＲからなる群から選択される、請求項３９に記載のレセプターカップリング剤。
【請求項４２】
前記非デスドメインを含有するＴＮＦレセプターおよび前記デスドメインを含むＴＮＦレセプターが、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＬＴＢＲ／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ、Ｆｎ１４／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒおよびｐ７５ＮＧＦ−Ｒ／ＴＡＪからなる群から選択される、請求項３９に記載のレセプターカップリング剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ＴＮＦファミリーの多様なメンバーによる細胞死を誘導する能力は腫瘍学者によってほぼ２０年間にわたって追求されてきた。最初は、ＴＮＦ自体を用いて固形腫瘍を処置するために使用されてきたが、最終的には全腕潅流によりメラノーマの局所処置に適用可能であることがわかった（非特許文献１））。ごく最近、リガンドまたは抗レセプター抗体によるＴＮＦレセプターの活性化が臨床的な興味を集めた。例えば、Ｆａｓレセプターの活性化はかなりの有望性を示したが、肝臓毒性により制限され得る。ＴＲＡＩＬリガンドによる別のＴＮＦファミリーメンバーのＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２の活性化はＴＲＡＩＬ感受性の癌細胞に対するアポトーシスシグナルを変換させることが報告されている（非特許文献２；および非特許文献３）。可溶性リガンドまたは作動性抗レセプターモノクローナル抗体によるＴＮＦファミリーのさらに別のメンバーであるＬＴ−β−Ｒの活性化はある癌腫の死を誘導することも示された（非特許文献４，非特許文献５）。よって、作動薬ＴＮＦ活性化剤による処置は被験体中の新生組織形成の発展、重症度および影響を処置または低減させるために有用であろう。
【非特許文献１】Ｌｅｊｅｕｎｅら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８年）１０：５７３
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）１６２：２５９７
【非特許文献３】Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９７年）７：８１３−８２０
【非特許文献４】Ｌａｗｅｒｅｎｃｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００１年）７：３８３
【非特許文献５】Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００１年）７：９５４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はレセプターシグナル伝達を高める。別の実施形態において、レセプターカップリング剤はヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は１つのレセプターに対する第１結合特異性と別のレセプターに対する第２結合特異性を含む。１つの実施形態において、第１結合特異性は、抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与されるか、もたらされる。別の実施形態において、第２結合特異性は、抗体またはその抗原結合フラグメントにより付与されるか、もたらされる。例えば、結合特異性は単一鎖Ｆｖフラグメントにより付与され得る。別の実施形態において、第１結合特異性はレセプターの天然リガンドによりもたらされ、第２結合特異性は抗体またはその抗原結合フラグメントに由来する。さらに別の実施形態において、第１結合特異性はレセプターの天然リガンドによって付与され、第２結合特異性はレセプターの天然リガンドにより付与される。
【０００３】
本発明は、少なくとも１つのレセプターがデスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）を含む、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はレセプターシグナル伝達を高めるか、またはヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導し、少なくとも１つのレセプターがデスドメインを含む。１つの実施形態において、デスドメインを含むレセプターは、ＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、Ｆａｓ（ＤＲ２）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ＤＲ６およびｐ７５ＮＧＦ−Ｒからなる群から選択される。
【０００４】
本発明は、少なくとも１つのレセプターがデスドメインを含まない、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを活性化するレセプターカップリング剤を含む。また、本発明はレセプターシグナル伝達を高めるか、またはヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する、少なくとも１つのレセプターがデスドメインを含まないレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターはデスドメインを含まず、組織分化に関与する。別の実施形態において、デスドメインを含まないレセプターは、ＬＴＢＲ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、Ｔｒｏｙ／ＴｒａｄｅおよびＴＡＪからなる群から選択される。
【０００５】
また、本発明は、少なくとも１つのレセプターが組織分化に関与する、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。また、本発明はレセプターシグナル伝達を高めるか、またはテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する少なくとも１つのレセプターが組織分化に関与するヘレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターはＬＴＢＲ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ／ＴＡＪおよびｐ７５ＮＧＦ−Ｒからなる群から選択される。
【０００６】
１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、例えば、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＬＴＢＲ／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ、Ｆｎ１４／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒおよびｐ７５ＮＧＦ−Ｒ／ＴＡＪなどの、ＴＮＦレセプターを含む非デスドメインおよびデスドメインを含むレセプターを活性化する。
【０００７】
別の実施形態において、レセプターカップリング剤は、例えば、ＬＴＢＲ／Ｆｎ１４、ＬＴＢＲ／ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４／ＴＡＪ、ＬＴＢＲ／ＥＤＡＲ、ＬＴＢＲ／ＸＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＸＥＤＡＲおよびＴＡＪ／ＥＤＡＲおよびＴＡＪ／ＸＥＤＡＲなどの、デスドメインを含まない少なくとも２つのＴＮＦレセプターを活性化する。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態において、レセプターカップリング剤は、少なくともデスドメインを含む２つのレセプターを活性化する。
【０００９】
さらに、本発明は、少なくとも１つのレセプターが免疫調節に関与する少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターは、ＴＮＦＲＩＩ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡおよびＲＥＬＴからなる群から選択される。
【００１０】
本発明は、少なくともレセプターの１つが正常な肝臓または内皮細胞上で過剰発現されない、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を提供する。
【００１１】
また、本発明は、レセプターカップリング剤が１つのレセプターに対する第１結合特異性と別のレセプターに対する第２結合特異性を含む、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、レセプターシグナル伝達を高めるか、またはヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する。１つの実施形態において、第１結合特異性は、抗ＬＴβレセプター（ＬＴβＲ）抗体、またはその抗原結合フラグメントにより付与されるか、それに由来する。抗ＬＴβＲ抗体の具体例としてヒト化ＣＢＥ１１抗体が挙げられる。１つの実施形態において、第２結合特異性は抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、またはその抗原結合フラグメントにより付与されるか、それに由来する。抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体の具体例としてヒト化またはキメラ１４Ａ２抗体である。別の実施形態において、第１結合特異性はヒト化ＣＢＥ１１抗体の単一鎖Ｆｖフラグメントにより付与され、第２結合特異性は１４Ａ２抗体により付与される。
【００１２】
本発明は、レセプターカップリング剤が１つのレセプターに対する第１結合特異性と別のレセプターに対する第２結合特異性含み、第１結合特異性が３つの二量体Ｆｃ領域と６つのリガンド分子から共通して形成される少なくとも２つの三量体リガンド−Ｆｃ構築物を含む、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。この場合、第２結合特異性は３つの抗体分子より成り立つことがある。
【００１３】
本発明は、ＴＮＦファミリーレセプターの少なくとも１つが細胞表面上のラフト（ｒａｆｔ）環境に通常見られない、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するレセプターカップリング剤を記載する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、レセプターシグナル伝達を高めるか、またはヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導し、ここで、ＴＮＦファミリーレセプターの少なくとも１つは細胞表面上のラフト環境に通常見られない。
【００１４】
本発明は、ＴＮＦファミリーレセプターの少なくとも１つが通常細胞表面のラフト環境に見られる、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するか、レセプターシグナル伝達を高めるか、またはヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を包含する。
【００１５】
さらに、本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化するか、またはシグナル強度がレセプターを通して高められるレセプターシグナル伝達を高めるレセプターカップリング剤を記載する。
【００１６】
本発明は、各抗体が別個のＴＮＦファミリーレセプターに結合することによりヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導する、少なくとも２つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含むレセプターカップリング剤を包含する。１つの実施形態において、抗体は、例えば、ヒト化ＣＢＥ１１抗体等の抗ＬＴβＲ抗体から得られる。別の実施形態において、二次抗体は、例えば、ヒト化またはキメラ１４Ａ２抗体等の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体から得られる。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、細胞膜ラフトに対してＴＮＦファミリーレセプターを局在化させる方法であって、この方法は、ラフト化ＴＮＦファミリーレセプターに対する第１結合特異性とラフト化されていないＴＮＦファミリーレセプターに対する第２結合特異性を含むレセプターカップリング剤を投与する工程を包含し、レセプターカップリング剤の結合が細胞膜内のラフトに対して、ラフト化されていないＴＮＦレセプターを局所化させる方法を包含する。
【００１８】
本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を投与する工程を包含する、レセプターシグナル伝達の増強方法も包含する。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を被験体に投与する工程を包含し、腫瘍容積を減少する方法を記載する。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化し、レセプターシグナル伝達を高め、かつヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤を被験体に投与する工程を包含する、癌の治療方法を包含する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤がＩＦＮγの存在下で投与される。別の実施形態において、レセプターカップリング剤が化学療法剤の存在下で投与される。
【００２１】
また、本発明は、少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを活性化し、かつヘテロメリック複合体の形成を誘導し、第１ＴＮＦレセプターに向けられた第１結合特異性と第２ＴＮＦレセプターに向けられた第２結合特異性を含みレセプターカップリング剤も包含する。１つの実施形態において、第１および第２の結合特異性は、非デスドメインを含むＴＮＦレセプターとデスドメインを含むＴＮＦレセプター；非デスドメインを含む２つのＴＮＦレセプター；またはデスドメインを含む２つのＴＮＦレセプター等のＴＮＦレセプターに向けられる。別の実施形態において、少なくとも１つの結合特異性が、組織分化に関連した非デスドメインを含むＴＮＦレセプターに向けられる。さらに別の実施形態において、デスドメインを含む２つのＴＮＦレセプターが、ＬＴＢＲ／Ｆｎ１４、ＬＴＢＲ／ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４／ＴＡＪ、ＬＴＢＲ／ＥＤＡＲ、ＬＴＢＲ／ＸＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＸＥＤＡＲ、ＴＡＪ／ＥＤＡＲおよびＴＡＪ／ＸＥＤＡＲからなる群から選択される。本発明の別の実施形態において、非デスドメインを含むＴＮＦレセプターおよびデスドメインを含むＴＮＦレセプターが、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＬＴＢＲ／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ、Ｆｎ１４／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒおよびｐ７５ＮＧＦ−Ｒ／ＴＡＪからなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
便宜上、本発明の更なる説明の前に、明細書、実施例および添付の請求の範囲で使用される用語をここで定義する。
【００２３】
「投与する」という用語は、薬学的組成物または治療剤等の、しかし、これらに限定されない本発明の化合物の被験体への系または被験体内または被験体表面の特定の領域への送達のどのような方法も含む。ここで用いられる「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」との語句は、中枢神経系への直接の投与ではなく、患者の系に入るような化合物、薬物または他の物質の投与を意味するため、代謝や他の類似のプロセスの影響を受けやすく、例えば、皮下投与が挙げられる。「非経口投与」および「非経口で投与される」とは、通常は注射による経腸投与と局所投与以外の投与態様を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮内、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および胸骨内の注射および注入等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
ここに用いられる「抗体」との用語は、完全でそのままの抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖおよび望ましい結合特異性を本発明の構築物に付与する他のそのフラグメントを言及することが意図される。抗体として、例えば、ネズミモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、抗−抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体ならびにそれらの多価形が挙げられる。「免疫グロブリン」または「抗体」（ここでは交換可能に用いられる）という用語は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有する抗原結合タンパク質をいい、該鎖は、例えば抗原に特異的に結合する能力を有する鎖間ジスルフィド結合によって安定化させられている。重鎖と軽鎖はともにドメインに折り畳まれる。「ドメイン」との用語は、例えばβプリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化させたペプチドループ（例えば、３〜４ペプチドループを含む）からなる重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域をいう。ドメインは、さらに、「定常」領域の場合に多様なクラスメンバーのドメイン内に配列変化が比較的少ないこと、または「可変」領域の場合に多様なクラスメンバーのドメイン内の顕著な変化に基づいてここでは「定常」または「可変」と称する。軽鎖上の「定常」ドメインは「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互いに交互可能に言及される。重鎖上の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互いに交互可能に言及される。軽鎖上の「可変」ドメインは「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互いに交互可能に言及される。重鎖上の「可変」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互いに交互可能に言及される。
【００２５】
「領域」との用語は、抗体鎖の一部または一部分をいい、ここに定義される定常または可変ドメインならびに該ドメインのさらに別々の部分を含む。例えば、軽鎖可変ドメインまたは領域として、ここに定義される、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」間に散在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」が挙げられる。
【００２６】
免疫グロブリンまたは抗体はモノマーまたはポリマー形態で存在することができる。「抗原結合（性）フラグメント」との用語は、抗原に結合するか、または抗原結合（すなわち、特異的結合）に関して、インタクトな抗体（すなわち、それらが由来する、インタクトな抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントをいう。「立体構造」との用語はタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体、抗体鎖、そのドンメインまたは領域）の三次構造をいう。例えば、「軽（または重）鎖立体構造」との語句は、軽（重）鎖可変領域の三次構造をいい、「抗体立体構造」または「抗体フラグメント立体構造」との語句は、抗体またはそのフラグメントの三次構造をいう。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的切断により生成される。結合フラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、単鎖および一本鎖抗体が挙げられる。「二重特異性」または「二官能性」免疫グロブリンや抗体以外では、免疫グロブリンまたは抗体はその結合部位のそれぞれを同一としていると理解される。「二重特異性」または「二官能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖の対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体はハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結等の多様な方法により生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照されたい。
【００２７】
「抗体構築物」という用語は、抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインに由来する２つ以上の抗原結合フラグメントを含む組換え型分子をいう。抗体構築物は５種類のＩｇクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）のいずれかに由来する抗体の定常領域の全体または一部を含んでよい。例えば、抗体構築物は、Ｃ末端に単鎖可変フラグメントを含む重鎖を有する抗体から生成されてよい。別の例において、抗体構築物は、カルボキシおよびアミノ末端に単鎖の可変フラグメントを含む抗体の２つの重鎖の定常領域の全体または一部から生成されてよい。所望の結合特異性を付与する抗体構築物の例を図９に概略的に示す。さらに別の例において、抗体構築物は、２つ以上の可変領域を有する２つの重鎖および１つ以上の可変領域を有する２つの軽鎖を含み得、その２つの重鎖がジスルフィド結合か他の共有結合により連結されている。別の例において、抗体構築物は、２つ以上の可変領域を含む２つの重鎖を含み得、その２つの重鎖がジスルフィド結合か他の共有結合により連結されている。
【００２８】
ここで用いられる「抗原」との用語は、特異的な抗体と反応性のある分子を意味する。
【００２９】
「抗原結合（性）部位」または「抗原認識部位」との用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体の領域をいう。
【００３０】
ここで用いられる「アポトーシス」、「アポトーシス細胞死」または「プログラム細胞死」との用語は、細胞分化の特定の段階または特定の刺激に対して起こる細胞事象のカスケードから生じる細胞死をいう。アポトーシス細胞死は、死につつある細胞の細胞質および核の凝集によりしばしば特性付けられる。
【００３１】
「結合特異性」との用語は、特定のＴＮＦファミリーレセプターに対する結合部位から付与され、与えられ、達成され、またはそれから得られる開示されたレセプターカップリング剤の性質である。本発明の結合特異性は、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント可溶性リガンド、ｆｃ融合物等を含む結合部分によって付与され得る。当業者は本出願の目的のために、「結合特異性」および「結合部分」との用語は文脈上の制限により特に示されなければ互換可能に用い得る。よって、結合特異性（結合部分）は、ＴＮＦファミリーレセプターと相互作用するＴＮＦリガンドを含み得る。本発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、１つのＴＮＦレセプターに対する少なくとも１つの結合特異性（または結合部分）およびもう１つのＴＮＦレセプターに対する第２の結合特異性（または結合部分）を含む。
【００３２】
「癌」または「新生組織形成」との用語は一般的に悪性新生物または細胞の自然の成長または増殖をいう。ここに用いられる用語は完全に発達した悪性の新生物と前癌状態の病変の両方を含む。例えば「癌」を有する被験体は腫瘍または白血病等の白血細胞増殖を有し得る。ある実施形態において、癌を有する被験体は固形腫瘍等の癌を有する被験体である。固形腫瘍を伴う癌としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、睾丸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、ならびに前立腺癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、皮膚癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、食道癌および膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「化学療法剤」との用語は、腫瘍細胞等の外来細胞または悪性細胞により引き起こされる疾患を処置するために用いられる低分子または生物製剤をいう。化学療法剤の非限定的な例として、ＤＮＡ合成を中断する薬剤を含み、トポイソメラーゼＩの阻害剤であり、アルキル化剤であり、または植物アルカノイドである。例示的な生物学的化学療法剤は、リツキシマブ、イブリツモマブ、ベバシズマブおよびトラスツズマブを含む。当業者は、本出願の教示に準じる他の化学療法剤が容易に識別可能なことを理解する可能性が在る。
【００３４】
「ＤＮＡ合成を中断する薬剤」との用語はＤＮＡ合成のプロセスを低減または阻害することのできる任意の分子または化合物をいう。ＤＮＡ合成を中断する薬剤の例としては、例えば、ゲムシタビン、もしくは、例えばアドリアマイシン、ダウノムビシン、ドキソルビシンおよびイダムビシン等やエトポシドやテニポシド等のエピポドフィルロトキシン類が挙げられるが、これらに限定されないアントラサイクリン化合物等の、しかし、これらに限定されないピリミジンやプリンアナログ等のヌクレオシドアナログが挙げられるが、これらに限定されない。「トポイソメラーゼＩ阻害剤」との用語は、トポイソメラーゼＩ酵素の生物活性を阻害または低下させる、例えばカンプトサール（これに限定されない）が挙げられる。「アルキル化剤」との用語は、（例えば、アミン、アルコール、フェノール、有機酸および無機酸の）求核基と反応することで、アルキル基（例えば、エチルまたはメチル基）をタンパク質または核酸等の別分子に付加するとのできる分子または化合物をいう。化学療法剤として用いられるアルキル化剤の例として、ビスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、多様なニトロソ尿素化合物、およびシスプラチンやカルボプラチン等の白金化合物が挙げられる。「植物アルカロイド」との用語は、生物活性があり、かつ細胞傷害のある植物に由来するアルカリ性の窒素含有分子のファミリーに属する化合物をいう。植物アルコイドの例として、タキソール、ドセタキセルおよびパクリタキセル等のタキサン類およびビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン等のビンカ類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「キメラ抗体」との用語は、軽鎖と重鎖の遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、通常遺伝子工学により構築された抗体をいう。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４等のヒトの定常（Ｃ）セグメントに結合させてよい。ヒトのイソタイプＩｇＧ１が好ましい。したがって、代表的なキメラ抗体はマウス抗体に由来するＶまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体に由来するＣまたはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
【００３６】
「デスドメイン」（“ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ”）との用語は、ＴＮＦが媒介する細胞死シグナル伝達およびこれらにより媒介される細胞傷害誘導に関与するそれらＴＮＦファミリーレセプターの細胞質領域をいう。この領域は、レセプターを、外因性の死の経路の活性化をもたらすアダプタータンパク質によるカスパーゼ活性化に連結する。デスドメインを含むＴＮＦレセプターの例として、ＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、Ｆａｓ（ＤＲ２）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ｐ７５ＮＧＦＲおよびＤＲ６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「有効量」との用語は、例えば、インビトロまたはインビボのいずれかで腫瘍容積を減少させる等の、しかし、これらに限定されない所望の結果を達成するのに十分な本発明の化合物、物質、または化合物を含む組成物の量をいう。本発明の薬学的組成物の有効量は、例えば、患者における癌の進行を緩和、安定化、阻止または遅延する等の、しかし、これらに限定されない所望の臨床的結果を達成するのに十分な薬学的組成物の量である。いずれの場合も、本発明の化合物の有効量は１回以上の投与で投与することができる。全身腫瘍組織量の減少、腫瘍の大きさの阻害、二次性腫瘍の増殖の減少、腫瘍組織における遺伝子の発現、生物指標の存在、リンパ節の関与、組織学的悪性度および細胞核悪性度等の、しかし、これらに限定されない上記指標の検出と測定は当業者に公知である。
【００３８】
「エピトープ」との用語は、抗体または抗体構築物が優先的かつ特異的に結合する抗原の領域をいう。モノクローナル抗体は、分子的に定義されうる分子の単一の特定エピトープに優先的に結合する。本発明において、複数のエピトープは多特異的抗体により認識され得る。
【００３９】
「Ｆｖフラグメント」との用語は、重鎖と軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントをいう。Ｆｃフラグメントとの用語は重鎖の定常領域を含む抗体のフラグメントをいう。
【００４０】
「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」との用語は、少なくとも１つのヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、少なくとも１つのヒト化軽鎖または重鎖）を含む免疫グロブリンまたは抗体をいう。「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）との用語は、ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する可変フレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、さらに好ましくは３つのＣＤＲ）とを含む可変領域を有する免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、それぞれ軽鎖または重鎖）をいい、さらに定常領域（例えば、軽鎖の場合、少なくとも１つの定常領域またはその部分、重鎖の場合、好ましくは３つの定常領域）を含む。「ヒト化可変領域」（例えば、「ヒト化軽鎖可変領域」または「ヒト化重鎖可変領域」）との用語は、ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する可変フレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む可変領域をいう。
【００４１】
「ヘテロメリックレセプター複合体」との用語は、レセプターカップリング剤と、該レセプターカップリング剤が標的化する２つ以上のレセプターを含む複合体をいう。１つの実施形態において、本発明のヘテロメリックレセプター複合体は、レセプターカップリング剤と、該カップリング剤が標的化して活性化させる少なくとも２つのＴＮＦファミリーレセプターを含む。好ましくは、レセプターによるシグナル伝達はヘテロメリックレセプター複合体形成の結果として高められる。本発明の１つの実施形態において、ヘテロメリックレセプター複合体は細胞膜内の脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ）上に形成する。別の実施形態において、本発明のヘテロメリックレセプター複合体は細胞膜上の脂質ラフトの外側に形成する。
【００４２】
「腫瘍容積の阻害」との用語は腫瘍容積の減少または低減をいう。
【００４３】
「リガンド」との用語はタンパク質上または他の分子上の特定の部位に結合する分子をいう。リガンドは、しばしば、機能的応答を誘発するように高親和性かつ特異的にレセプタータンパク質と結合するポリペプチドまたは化合物である。例えば、本発明のリガンドとして、ＴＮＦファミリーレセプターリガンドが挙げられる。「天然のリガンド」との用語は、正常な生理学的条件下でレセプターに結合するリガンドをいう。「レセプター」との用語は、ここでは、結合分子、すなわち、リガンドを認識することにより細胞応答を誘発する細胞上または細胞内に置かれた構築物、通常、ポリペプチドをいう。本発明のレセプターとして、例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＨＶＥＭおよびＬＴβＲ等のＴＮＦファミリーレセプターが挙げられる。
【００４４】
「ＴＮＦファミリーレセプター」または「ＴＮＦ−Ｒ」との用語は、「システインリッチドメイン」またはＣＲＤを形成するジスルフィド結合により特徴付けられるＴＮＦレセプタースーパーファミリーに属するレセプターをいう。ＴＮＦレセプターファミリーメンバーは一般的に細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインからなる（概説については、Ｌｏｃｋｓｌｅｙら（２００１）Ｃｅｌｌ  １０４：４８７を参照されたい）。細胞外ドメインは、１〜６コピーの堅くジスルフィドが結合したドメインから生成され、システイン残基の独自の配列に基づいて認識される（Ｂａｎｎｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：４３１）。各ＴＮＦレセプターは対応するリガンドに結合するが、１つのリガンドが幾つかのレセプターを共有することがある。
【００４５】
「リンホトキシン−ベータレセプター（ＬＴβＲ）アゴニスト」との用語は、ＬＴβＲに対するリガンド結合、細胞表面ＬＴβＲクラスタリングおよび／またはＬＴβＲシグナル伝達を増強し得る。
【００４６】
「多価抗体」または「多価抗体構築物」との用語は、２つ以上の抗原認識部位を含む抗体または抗体構築物をいう。例えば、「２価」抗体構築物は２つの抗原認識部位を有する一方で、「４価」抗体構築物は４つの抗原認識部位を有する。「一特異的」、「二重特異性」、「三特異的」、「四特異的」等との用語は、本発明の多価抗体構築物に存在する（抗原認識部位の数とは対照的に）異なる抗原認識部位特異性の数をいう。例えば、「一特異的」抗体構築物の抗原認識部位はすべて同一のエピトープに結合する。「二重特異性」抗体構築物は、第１エピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位と、第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位とを有する。「多価一特異的」抗体構築物は、すべてが同一のエピトープに結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価二重特異性」抗体構築物は複数の抗原認識部位を有し、その抗原認識部位の幾つかは第１エピトープに結合し、幾つかは第１エピトープとは異なる第２エピトープと結合する。本発明の１つの実施形態において、抗体は図９に示されるように多価の二重特異性抗体である。
【００４７】
「患者」または「被験体」または「ホスト」とはヒトまたは非ヒト動物のいずれかをいう。
【００４８】
「薬物送達デバイス」との用語は、単一または複数の薬剤を被験体に投与するために用いてよいデバイスをいう。薬物送達デバイスの非限定的なとして、皮下注射器、多室注射器、ステント、カテーテル、経皮パッチ、マイクロニードル、マイクロアブレーダーおよび移植可能な放出制御デバイスが挙げられる。１つの実施形態において、「薬物送達デバイス」との用語は注射の前に２つの化合物を混合することのできる二室注射器をいう。
【００４９】
「薬学的に受容可能な」との用語は、適切な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／危険率に相応して、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答または他の問題または面倒な事態なしに、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに適する化合物、物質、組成物および／または投薬形態を言及するためにここで使用される。
【００５０】
ここで用いられる「薬学的に受容可能なキャリア」との用語は、対象の化合物を一器官または体の一部分から別の器官または体の別の部分への輸送または移動に関与する液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、または溶媒カプセル化物質等の薬学的に受容可能な物質、組成物またはビヒクルを意味する。各キャリアは処方物の他の成分に適合性があり、患者に有害ではない意味で「受容可能な」ものでなければならない。薬学的に受容可能なキャリアとして役立ちうる物質の幾つかの例として、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖類；（２）コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン類；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテート；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂および座薬ワックス等の賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油等の油類；（１０）プロピレングリコール等のグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール類；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル等のエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／または多無水物；および（２２）薬学的処方物に用いられる他の非毒性の適合性のある物質が挙げられる。
【００５１】
「薬学的に受容可能な塩」とは、化合物の比較的毒性がない無機および有機の酸付加塩をいう。
【００５２】
「ラフト」（“ｒａｆｔ”）または「脂質ラフト」（“ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ”）との用語は、特殊化した細胞膜ドメイン（Ｓｉｍｏｎｓら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：３１を参照のこと）脂質ラフトまたはその一部をいう。特に、「脂質ラフト」との用語は真核細胞膜のコレステロールとスフィンゴ糖脂質とに富むミクロドメインをいう。脂質ラフトはシグナル伝達分子中に富む傾向があり、成長因子レセプターとセンサー分子がリガンド結合または架橋結合後に脂質ラフトに移動することが示されている。脂質ラフトは非イオン性界面活性剤による低温度での可溶化に対する抵抗により特徴付けられ、細胞内または細胞外の刺激に応答して大きさと組成を変化させることができる。特定のタンパク質−タンパク質相互作用が脂質ラフト内では好まれ、例えば、原形質膜サイトカインレセプターの場合にシグナル伝達カスケード活性の調節をもたらす可能性がある。
【００５３】
あるレセプターの「ラフティング」（“ｒａｆｔｉｎｇ”）（ここでは、膜成分、例えばレセプターの脂質ラフトへの取込みと定義される）または「脱ラフティング」（ここでは、膜成分、例えばレセプターの脂質ラフトからの除去、流出または除外と定義される）の潜在的な効果として、サイトカインレセプター媒介シグナル伝達の誘発（時には、アポトーシス細胞死の誘発）、レセプターの細胞局在およびレセプターの豊富さが挙げられる。時々、脂質ラフトはクラスタ化することがある；そのようなクラスタリングはシグナル伝達カスケードを始動させるために人為的および生理学的の両方で用いられることが報告されている。１つの実施形態において、本発明のレセプターカップリング剤は２つのＴＮＦファミリーメンバーレセプターを脂質ラフトに運び込む。別の実施形態において、本発明のレセプターカップリング剤はＴＮＦファミリーレセプターを脂質ラフトから引き出す。
【００５４】
「レセプターカップリング剤」との用語は、少なくとも２つの異なる細胞表面レセプターを活性化することのできる物質または構築物を包含する。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はタンパク質性の物質である。レセプターカップリング剤は細胞表面レセプターのシグナル伝達能力を増強するために用いられる。本発明のレセプターカップリング剤はＴＮＦファミリーレセプターに向けられている。場合によっては、レセプターカップリング剤による少なくとも２つのＴＮＦファミリーレセプターの活性化は細胞死を引き起こすことができる。発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は二重特異性多価構築物からなる。さらに別の実施形態において、レセプターカップリング剤は、抗ＬＴβＲ結合部分または特異性および抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２結合部分または特異性を有する二重特異性多価構築物である。別の実施形態において、レセプターカップリング剤は抗ＬＴβＲ抗体（例えば、ＣＢＥ１１）により付与される結合特異性と抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体（例えば、１４Ａ２）により付与される結合特異性を有する。
【００５５】
「単鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ」との用語は、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインが結合しているＦｖフラグメントをいう。１つ以上のｓｃＦｖフラグメントは他の抗体フラグメント（例えば、重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に結合して、１つ以上の抗原認識部位を有する抗体構築物を形成し得る。
【００５６】
「相乗的」との用語は２種類以上の単一物質の相加効果よりも効果的な組合せをいう。本発明の１つの実施形態において、相乗的との用語は、ＬＴ−β−Ｒアゴニストおよび化学療法剤の両者が個々に腫瘍容積を阻害する能力を有する組合せタイプの相乗的な阻害を含む。「相乗作用」との用語は、２種類以上の物質の同時に起こる効果がそれら物質の独立した効果の合計よりも高い場合をいう。
【００５７】
被験体の癌を「処置する」または癌を有する被験体を「処置する」とは、癌の程度を減少または抑えるように、被験体に薬学的処置（例えば、薬物の投与）を受けさせることをいう。処置としては、薬学的組成物等の組成物の投与が挙げられ（ただし、これらに限定されない）、予防的に行っても、もしくは障害の事象の開始に続いて行ってもよい。
【００５８】
「腫瘍容積」との用語は、腫瘍自体を含み、妥当であれば、侵されたリンパ節もさらに加えた腫瘍の全体的な大きさをいう。腫瘍容積は、従来知られている多様な方法、例えば、測径器、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャンを用いて腫瘍の大きさを測定し、例えばｚ軸直径に基づくか、または球、楕円または立方体等の標準形に基づく方程式を用いてその体積を計算することによって決定してよい。
【００５９】
（ＩＩ．レセプターカップリング剤の標的）
ＴＮＦファミリーレセプター活性化剤による処置の治療における制限要因は、しばしば、こぐ一部の腫瘍のみがそのような処置に感受性があると思われることである。レセプターカップリング剤はＴＮＦファミリーレセプターを特異的に活性化でき、例えば、ＴＮＦファミリーレセプターを接近させることによりレセプターシグナル伝達を高めることができる（ＴＮＦレセプターおよびＴＮＦファミリーの概説については、Ｌｏｃｋｓｌｅｙら（２００１）Ｃｅｌｌ  １０４：４８７を参照されたい）。本発明は、２つ以上のＴＮＦファミリーレセプターを標的とし、かつシグナル伝達を高めることができて、改良癌治療法を提供するレセプターカップリング剤を提供する。そのようなものとして、レセプターカップリング剤は、さらに強いか、またはさらに複雑なシグナルを送ることができるため、実施例３に示されるようにさらに広い範囲の腫瘍に対してさらに効果的である。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は接合させるレセプターの数を多くすることによりシグナル強度を高める（Ｈｏｌｌｅｒ  Ｎ  Ｆａｕ−Ｔａｒｄｉｖｅｌら、（２００３）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：１４２８）。別の実施形態において、レセプターカップリング剤は２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを活性化することによりシグナル強度を高め、２つの異なるシグナル伝達カスケードを始動させる。
【００６０】
本発明のレセプターカップリング剤は少なくとも２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターメンバーに向けられた結合特異性を有する。結合特異性は、標的とすべき興味のあるＴＮＦファミリーレセプターメンバーにしたがって選択される。例えば、１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はＴＮＦレセプターＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する第１の結合特異性とＴＮＦレセプターリンホトキシン−βレセプター（ＬＴβＲ）に対する第２の結合特異性を有する。以下、レセプター結合剤の標的化するよい異なる種類のＴＮＦファミリーレセプターの具体例を詳細に説明する。
【００６１】
（Ａ．デスドメインを含むＴＮＦレセプター）
レセプターカップリング剤はデスドメインを含むＴＮＦファミリーレセプターを標的化し得、このことは癌の処置に有用であり得る。「デスドメイン」または「ＤＤ」とは６つの保存αヘリックスを含むある種のＴＮＦレセプターのタンパク質ドメインをいう。デスドメインを含むＴＮＦレセプターは本発明のレセプターカップリング剤の主要な標的であり、そのような構築物の例を実施例のセクションで示す。
【００６２】
デスドメインレセプターの一例がＦａｓである。Ｆａｓ経路分子として、Ｆａｓにより引き起こされるアポトーシスまたはプログラム細胞死（ＰＣＤ）を導く経路に関与するか、またはそれに関連する分子が挙げられる。Ｆａｓ経路分子として、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、およびレセプターのＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。ＦＡＤＤ、カスパーゼ８、ｂｉｄおよびカスパーゼ３もＦａｓ経路分子として含まれる。Ｆａｓ経路分子はここに定義された他の集団に含めてもよい。
【００６３】
リンパ球の細胞傷害効果の一部は、細胞死を始動する能力のある広く存在する細胞表面レセプター（ＮａｇａｔａおよびＧｏｌｓｔｅｉｎ，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４４９−５６を参照）であるＦａｓ−Ｒ（ＤＲ−２、ＡＰＯ−１およびＣＤ９５としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５８３、Ｎｏ．２３５１０４２１、Ｎｏ．２３５１０４２３、Ｎｏ．２３５１０４２５、Ｎｏ．２３５１０４２７、Ｎｏ．２３５１０４２９、Ｎｏ．２３５１０４３１およびＮｏ．２３５１０４３４）とのリンパ球産生リガンドの相互作用により媒介される。Ｆａｓレセプターに対するＦａｓＬの結合は細胞膜上のレセプター凝集およびＤＩＳＣとして知られる細胞内シグナル分子の特定の補充、または死を誘導するシグナル複合体を導く。アダプタータンパク質であるＦＡＤＤは、ＦＬＩＣＥまたはＭＡＣＨとしても知られているカスパーゼ−８の補充を導くＦａｓの細胞内のデスドメインに結合する。Ｆａｓが誘導する細胞死は、ミトコンドリアの浸透性変化を変える経路を活性化することがある。
【００６４】
単核細胞食細胞による細胞殺傷は、Ｆａｓ−Ｒとそのリガンド（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら、（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：３９２も参照）に構造的に関連するＴＮＦとそのレセプターであるＴＮＦＲ１（ＤＲ−１、ＣＤ１２０、ｐ５５−Ｒとしても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５７５；また、ＵＳ５，３９５，７６０も参照）であるリガンド−レセプター結合対を必要とする。他のレセプター誘導効果のように、ＴＮＦレセプターおよびＦａｓ−Ｒによる細胞死の誘導は、これらの特定のレセプターの場合に細胞死をもたらすリガンド−レセプター結合から酵素的エフェクター機能の最終的な不活性化までの一連のタンパク質−タンパク質相互作用によって起こる。
【００６５】
通常の環境下において、Ｆａｓレセプターの関与は炎症細胞の侵入と二次的な壊死を伴い、さらに、炎症促進性環境で細胞（例えば、肝細胞）の死を導く免疫細胞を動員し、活性化させる細胞ケモカイン（例えば、肝臓ケモカイン）の発現を誘導することにより、炎症（例えば肝臓炎症）を誘発する。対照的に、本発明のレセプターカップリング剤は特定の標的細胞で細胞死を誘導するように設計されている。本発明の標的療法は増強シグナル伝達のためにさらに有効であろうから、低用量の薬物による処置を可能とするだろう。そのような方法は、単一の細胞表面サイトカインレセプターの活性化によりアポトーシスが全身に誘導される場合に観察される否定的な結果を最小化し得る。
【００６６】
Ｆａｓ−ＲおよびＴＮＦ−Ｒ１に加えて、デスドメインを含むＴＮＦレセプターファミリーの他のメンバーとして、ＤＲ３（ＴＲＡＭＰ、ＴＲ３およびＡｐｏ３とも称される；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５６９、Ｎｏ．２３２０００２１、Ｎｏ．２３２０００２３、Ｎｏ．２３２０００２５、Ｎｏ．２３２０００２７、Ｎｏ．２３２０００２９、Ｎｏ．２３２０００３１、Ｎｏ．２３２０００３３、Ｎｏ．２３２０００３５、Ｎｏ．２３２０００３７およびＮｏ．２３２０００３９）；ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４およびＡｐｏ２とも称される；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．２１３６１０８６）；ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５とも称される；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．２２５４７１１６およびＮｏ．２２５４７１１９）；ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１６としても知られる；ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑ．  ＮＰ＿００２４９８；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．  ４５０５３９３）；およびＤＲ６（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＧｅｎＢＡｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．２２５４７１２１）が挙げられ、これらのそれぞれがアポトーシスを直接に開始するデスドメインを含む。
【００６７】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１〜４と呼ばれる４種類のヒトＴＲＡＩＬレセプターが存在する。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＲ２は死のレセプター４および５（ＤＲ４〜５）としても知られ、細胞内領域にデスドメインを含み、アポトーシスを始動することができる（ＷａｎｇおよびＥｌ−Ｄｅｉｒｙ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：８６２８）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２はその活性化が肝細胞アポトーシスを始動しないために低減した毒性を有するだろうから、ヒトの腫瘍治療に好ましい（Ｉｃｈｉｋａｗら（２００１）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：９５４）。よって、デスドメインを含む多様なＴＮＦファミリーレセプターを、単独で、または他のＴＮＦＲ（例えばＬＴβＲ等の非デスドメインＴＮＦＲ）と併せて活性化するレセプターカップリング剤が本発明に含まれる。
【００６８】
１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はデスドメインを含むＴＮＦレセプターの毒性効果を減少させるために用いられる。デスドメインを含む一部のレセプター（例えばＴＮＦＲ１またはＦａｓ）の活性化はインビボで毒性があることが示されている一方で、これらのレセプターを他のＴＮＦレセプターにつなぐことは毒性を減少させるため、毒性抗体を毒性の少ないものとする可能性がある。例えば、ラフト会合がＴＮＦＲ１の完全なシグナル伝達に重要である場合、ラフト化されていないレセプターにつなぐことによる脱ラフティングは抗ＴＮＦＲ１毒性を減少させるために十分であろう。１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、抗ＬＴβＲ抗体を含む結合部分、またはその抗原結合フラグメント、およびデスドメインを含む抗ＴＮＦファミリーレセプターに向けられた結合部分を含む。
【００６９】
（Ｂ．非デスドメインのレセプター）
本発明のレセプターカップリング剤は、デスドメインを含まないＴＮＦファミリーレセプターを標的化してもよい。固体腫瘍の処置のために非デスドメインを含むＴＮＦレセプター、具体的には抗ＬＴβＲアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の活性化は、抗腫瘍治療としての可能性も示す（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：８６７，ＷｉｌｓｏｎおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ  ９：１３２１）。
【００７０】
非デスドメインを含むＴＮＦレセプターファミリーメンバーの一例はＬＴβＲである。ＬＴβＲは免疫系の特殊化された多様な間質細胞の成熟状態の調節に関与し、リンパ節原基の基質成分の発達中に重大な役割を果たす（Ｍｅｂｉｕｓ（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：２９２）。形質転換細胞との関連では、上皮細胞および線維芽球様細胞の発達プログラムの活性化はそれらの細胞の生存にとって有害であり、この作用はＬＴβレセプター活性化の抗腫瘍活性の一部を構成することが提唱されてきた。これらのレセプターは、ケモカイン放出をともなうか、または免疫学的な抗腫瘍応答を促進する炎症プログラムも開始することができる（Ｙｕら（２００４）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：１４１，Ｂａｕｄ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：３７２）。そのような放出は腫瘍の炎症状態に影響を与え、および／または免疫反応を促進するリンパ成分の腫瘍への侵入を引き起こす。よって、デスドメインを欠く多様なＴＮＦファミリーレセプターを、単独で、またはデスドメインを含むＴＮＦレセプターと併せて活性化するレセプターカップリング剤は本発明に含まれる。
【００７１】
ＬＴβＲに加えて、デスドメインを欠くＴＮＦレセプターの他の例として、Ｆｎ１４（ＴＷＥＡＫ−Ｒとも称される；本出願人の同時係属出願ＷＯ０２／２２１６６を参照）；ＲＡＮＫ（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＢ８６８０９、ＡＦ０１８２５３を参照）；ＴＡＪ（ＴＲＯＹとも称される；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＦ７１８２８、ＡＡＨ４７３２１、ＡＡＫ２８３９５を参照）；ＥＤＡＲ（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＤ５００７６、ＡＡＤ５００７７、ＡＦ１３０９８８を参照）；ＸＥＤＡＲ（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＧ２８７６１、ＡＡＨ３４９１９、ＡＡＮ７３２１０を参照）；およびＣＤ４０（ＣＤ４０Ｌレセプターとも称される；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ１２４１９、ＡＡＨ６４５１８、ＡＡＲ８４２３８を参照）。
【００７２】
デスドメインを欠くＴＮＦレセプターの下位集団として、発達および傷の治癒等の組織分化に関与するＴＮＦレセプターが挙げられる。いくつかのＴＮＦレセプターは発達での明確な役割を有する（例えば、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲおよびＸＥＤＡＲ（Ｍｅｂｉｕｓ（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：２９２；Ｔｈｅｉｌｌら、（２００２）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：７９５；Ｌａｒｉｋｋａｌａら、（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：２５４１；Ｒｅｎｎｅｒｔ（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１６７７を参照）。分化とは、正常な細胞が発達して体の異なる組織を形成にしたがってそれらの細胞が物理的変化および構造的変化を受けるプロセスである。分化プログラムは腫瘍にいくつかの方法で影響を与えることがある。第１に、組織分化に関与するＴＮＦレセプターは変化した細胞周期進行により腫瘍増殖を直接的に遅延する可能性を有する。第２に、形質転換という状況でのプログラムは細胞周期の不一致とデフォルトアポトーシスを導くことがある。第３に、そのような相反するインプットは化学療法に対して細胞をさらに感受性のあるものとする可能性がある。
【００７３】
ＴＮＦシグナル伝達を高めるために、組織分化を媒介することが示され、レセプターカップリング剤が標的としうるＴＮＦレセプター分子の例として、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａとしても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５６５；受託番号ＡＦ０１８５２３；米国特許第６，５６２，９４８号、第６，５３７，７６３号、第６，５２８，４８２号、第６，４７９，６３５号、第６，２７１，３４９号、第６，０１７，７２９号）；ＥＤＡＲ１（Ｄｏｗｎｌｅｓｓとしても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．１１６４１２３１；受託番号ＡＦ１３０９８８；米国特許第６，３５５，７８２号）；およびＴＡＪ／Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ（ＴＮＦＲＳＦ１９としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．２３２３８２０２およびＮｏ．２３２３８２０４；受託番号ＡＦ１６７５５５）が挙げられる。さらに、ＸＥＤＡＲ（ＥＤＡ−Ａ２Ｒとしても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．１１１４０８２３；受託番号ＡＦ１３０９８８）シグナル伝達は外胚葉性分化のプロセスに関与する。ＸＥＤＡＲはＮＦ−κΒおよびＪＮＫ経路の活性化に主要な役割を果たす。Ｆｎ１４は神経変性に関与することが示されている（Ｔａｎａｂｅら（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：９６７５）。Ｆｎ１４はＴＷＥＡＫＲおよびＴＮＦＲＳＦ１２Ａとしても知られる（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．７７０６１８６；米国特許第６，７２７，２２５号；米国特許出願第２００４／００３３２２５Ａ１号を参照）。よって、組織分化に関与する多様なＴＮＦファミリーレセプターを活性化するレセプターカップリング剤は本発明に含まれる。
【００７４】
（Ｃ．免疫調節レセプター）
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーは免疫調節に関与する幾つかのレセプターも含み、これらは本発明の構築物が標的としうるものである。そのようなレセプターとして、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５７７）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．２３２０００４１）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５８７）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５８９およびＮｏ．２３５１０４３７）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５としても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５８１およびＮｏ．２３３１２３７１）、４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９としても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．５７３００９５）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４としても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５７９）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４７５９２４６、Ｎｏ．２３２３８１９４およびＮｏ．２３２３８１９７）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂとしても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．６９１２６９４）、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃとしても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．１６４４５０２７）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７としても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．２３２３８１９２）およびＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌとしても知られる；ＧＩ  Ｎｏ．２１３６１８７３およびＮｏ．２３２３８２００）が挙げられる。免疫調節に関与するさらなるＴＮＦファミリーレセプターとして、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３とＴＲＡＩＬ−Ｒ４が挙げられる。よって、免疫調節に関与する多様なＴＮＦファミリーレセプターを活性化するレセプターカップリング剤は本発明に含まれる。
【００７５】
（Ｄ．他のＴＮＦレセプター）
他の標的ＴＮＦファミリーレセプターは腫瘍形成でのそれらの役割から選択してよく、多様な腫瘍上に存在するか、または理想的には過剰発現するＴＮＦファミリーレセプターの定義を可能とする多様な細胞型内のレセプター発現の既存のＲＮＡデータベースを用いて同定することができる。さらに、既存のＲＮＡデータベースは、ある腫瘍タイプ上または腫瘍の一部上でさらに独自に発現するが、正常な組織、特に肝臓および脈管構造では豊富ではないＴＮＦファミリーレセプターの対を同定することによりそれらレセプター対を最適化できる点でさらに利点を提供する。強いシグナルを腫瘍に送り、正常な組織を傷つけないレセプター対（あるいはそれ以上）がそのように同定される。選択されたレセプターの有効性の試験方法は下記および実施例の部分でさらに詳しく説明する。
【００７６】
本発明のレセプターカップリング剤は少なくとも２種類の別個のＴＮＦレセプターを標的化する。標的ＴＮＦレセプターはレセプターの個々の特性に基づいて選択される。例えば、レセプターカップリング剤は、分化の事象に関わる２つのＴＮＦレセプターを標的化するため、固形腫瘍の治療に効果的であろう。本発明のレセプターカップリング剤が対象とするＴＮＦレセプターの組合せの他の例を以下に説明する。
【００７７】
（非デスドメイン／デスドメインＴＮＦレセプターカップリング剤）
本発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、デスドメインを含む１つのＴＮＦレセプターと、デスドメインを含まない１つのＴＮＦレセプターを標的化し、活性化する。標的とされる非デスドメイン／デスドメインを含むＴＮＦレセプターの組合せの例として、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＬＴＢＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＬＴＢＲ／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ、Ｆｎ１４／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒおよびｐ７５ＮＧＦ−Ｒ／ＴＡＪが挙げられる。デスドメインを含むＴＮＦレセプターを非デスドメインを含むレセプターに結合させることはデスドメインを含むレセプターの活性化の毒性をさらに減少させ得る。
【００７８】
別の実施形態において、ＬＴＢＲ、ＲＡＮＫおよびＦｎ１４等の、しかし、これらに限定されない非デスドメイン含有ＴＮＦレセプターの少なくとも１つは細胞分化に関与する。以下詳細に説明するように、ＬＴＢＲ、ＲＡＮＫおよびＦｎ１４はそれぞれ細胞分化に関与する。非デスドメインＴＮＦレセプターが細胞分化に関与する非デスドメインを含むＴＮＦレセプター／デスドメインを含むＴＮＦレセプターの例として、例えば、ＬＴＢＲ／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ、Ｆｎ１４／ｐ７５ＮＧＦ−ＲおよびＴＡＪ／ｐ７５ＮＧＦ−Ｒが挙げられる。
【００７９】
（非デスドメイン／非デスドメインＴＮＦレセプターカップリング剤）
本発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、ともにデスドメインを含まない２つの別個のＴＮＦレセプターを標的とし、活性化する。レセプターカップリング剤が標的化する非デスドメインを含むＴＮＦレセプター物質／非デスドメインを含むＴＮＦとして、ＬＴＢＲ／Ｆｎ１４、ＬＴＢＲ／ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４／ＴＡＪ、ＬＴＢＲ／ＥＤＡＲ、ＬＴＢＲ／ＸＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＸＥＤＡＲ、ＴＡＪ／ＥＤＡＲ、ＴＡＪ／ＸＥＤＡＲおよびＬＴＢＲ／ＣＤ４０が挙げられる。
【００８０】
別の実施形態において、非デスドメインを含むＴＮＦレセプター／非デスドメインを含むＴＮＦレセプターの少なくとも１つは細胞分化に関与する。例えば、レセプターカップリング剤はＬＴＢＲおよびＦｎ１４を対象とし得る。Ｆｎ１４は、腺癌細胞株ＨＴ２９に細胞死を誘導する能力を有するＴＮＦリガンドであるＴＷＥＡＫに対するレセプターである（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２４０１を参照）。ＴＷＥＡＫのアポトーシス活性はＦｎ１４により媒介される。Ｆｎ１４は損傷後の組織リモデリングにも関与する。組織リモデリングに見られる分子機構は組織分化に類似しており、そのようなプログラムは腫瘍増殖に有利ではない可能性がある。別の例において、レセプターカップリング剤はＬＴＢＲおよびＲＡＮＫを対象としてよい。ＲＡＮＫシグナル伝達は乳房上皮の分化を始動させるために、別の分化誘導剤と組み合わせた場合に増強活性を有することがある。よって、レセプターカップリング剤を用いるＲＡＮＫとＬＴＢＲシグナル伝達の増強は腫瘍増殖を妨げるのに有用であろう。
【００８１】
ＬＴＢＲ、ＲＡＮＫおよびＦｎ１４に加えて、ＴＡＪ／ＴＲＯＹは、具体的には軸索再生の調節において組織の分化にある役割をはたす（Ｓｈａｏら（２００５）Ｎｅｕｒｏｎ  ４５：３５３）。ＴＡＪは、ミエリン成分に応答する神経突起伸長の抑制に関与、つまり、分化の事象に効果的に関与する。Ｆｎ１４はポストニューロン損傷（Ｔａｎａｂｅら（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：９６７５）で発現するため、ＴＡＪによる一緒になった信号は中央神経系に関連する腫瘍を処置するために用いてよい。よって、１つの実施形態において、レセプターカップリング剤はＴＡＪおよびＦｎ１４を標的化してもよい。
【００８２】
組織分化に関与するので腫瘍増殖の阻害に有益であろう非デスドメイン含有ＴＮＦレセプターの組合せの他の例として、ＬＴＢＲ／ＥＤＡＲ、ＬＴＢＲ／ＸＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＥＤＡＲ、ＲＡＮＫ／ＸＥＤＡＲ、ＴＡＪ／ＥＤＡＲおよびＴＡＪ／ＸＥＤＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
（デスドメイン／デスドメインＴＮＦレセプターカップリング剤）
本発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、ともにデスドメインを含む２つの別個のＴＮＦレセプターに結合する。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、レセプターカップリング剤が標的としうるデスドメイン／デスドメイン含有ＴＮＦレセプターの組合せの１例である。
【００８４】
（免疫ＴＮＦレセプターカップリング剤）
本発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は免疫応答に関与する２つの別個のＴＮＦレセプターに結合する。Ｂ細胞応答を媒介する免疫応答ＴＮＦレセプターの組合せ例として、ＣＤ４０／ＣＤ２７、ＣＤ４０／ＢＡＦＦ−Ｒ、ＣＤ４０／ＢＣＭＡおよびＢＡＦＦ−Ｒ／ＣＤ２７が挙げられる。Ｔ細胞免疫応答を媒介するＴＮＦレセプターの組合せ例として、ＣＤ２７／ＣＤ３０、ＣＤ２７／ＯＸ−４０、ＣＤ２７／４１ＢＢおよびＯＸ−４０／４１ＢＢが挙げられる。
【００８５】
（ＩＩＩ．レセプターカップリング剤）
レセプターカップリング剤は、レセプターカップリング剤および少なくとも２つのＴＮＦファミリーレセプターからなるヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導し得る。ＴＮＦファミリーレセプターは共通するシグナル伝達様式および特異的なレセプターに独自な特殊化された伝達機構を有する。これらのシグナル伝達経路は多くの場合に活性化される３つ以上の経路と高度に複合化している。ヘテロメリックレセプター複合体の形成を誘導するレセプターカップリング剤の使用は腫瘍増殖をさらに効果的に制限することがある。例えば、デスドメインを含有するレセプター（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）から生じるカスパーゼ活性化に連動した代用ＮＦκΒ経路（Ｄｅｊａｒｄｉｎら、（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：５２５）を活性化するＬＴβＲの比較的まれな能力を標的化するレセプターカップリング剤は低下した腫瘍増殖をもたらす可能性がある。さらに、そのような物質は、２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターを、シグナル変換機構成分が新規で潜在的に非生理学的な凝集体とされる結合をもたらす１つの複合体へと並列させる。
【００８６】
本発明のレセプターカップリング剤は、ＴＮＦファミリーレセプターを、シグナル伝達に影響を与える独自の細胞膜環境中に再度向かわせるために用いてもよい。一部レセプターのシグナル伝達能力は脂質ラフト内等の特殊な膜環境内のそれらの位置に依存する。そのようなＴＮＦファミリーレセプターの例として、Ｆａｓおよび場合によりＴＮＦＲＩレセプターが挙げられる（ＭｕｐｐｉｄｉおよびＳｉｅｇｅｌ（２００４）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：１８２，Ｌｅｇｌｅｒら、（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：６５５）。ＴＲＡＩＬレセプターは複雑な局所化パターンを示す（Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：３９６１）。脂質ラフト内に通常存在するあるレセプターを、ラフトに通常存在しない別のレセプターに結合させるレセプターカップリング剤は第２レセプターをラフト環境内に押し入れて、そのシグナル伝達能力を高める可能性がある。同様に、脂質ラフト外に通常存在するあるレセプターを、ラフト内に通常存在する別のレセプターに結合させるレセプターカップリング剤は第１レセプターをラフト環境外にあるように強いて、そのシグナル伝達能力を減少させることがある。
【００８７】
本発明のレセプターカップリング剤はシグナル強度を高め、新規なシグナル伝達特性を実体化し、および／またはレセプターを、シグナル伝達がさらに効果的であるか、または効果的ではない環境に再配置する新しい非生理学的ヘテロメリックレセプター複合体を形成することがある。１つの実施形態において、本発明のレセプターカップリング剤は、ＴＮＦファミリーレセプターをＴＮＦファミリーレセプターが通常見られない脂質ラフト中にもたらすために用いられる。別の実施形態において、レセプターカップリング剤はＴＮＦファミリーレセプターを脂質ラフトの外側に再配置することができる。
【００８８】
本発明のレセプターカップリング剤として、少なくとも２つの別個のＴＮＦレセプターとヘテロメリック複合体を形成することのできる物質が挙げられる。レセプターカップリング剤は、２つの別個のＴＮＦレセプターに向けられた少なくとも２つの結合特異性を有する。結合特異性として、レセプターシグナル伝達に影響を与える、例えば、レセプターシグナル伝達を増強または減少させる構成要素が挙げられる。本発明のレセプターカップリング剤を調製するために用いることのできる結合特異性物質の例として、抗体、その抗原結合フラグメント、ＴＮＦレセプターに対するリガンド、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
（Ａ．抗体）
１つの実施形態において、本発明のレセプターカップリング剤は、ＴＮＦレセプターファミリーメンバーを対象とする少なくとも２つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれに由来する結合特異性または結合特異的部分を含む。二官能性構築物であるレセプターカップリング剤は、目的のＴＮＦレセプターに対する親抗体から得られた配列を含み得る。２つのＴＮＦレセプターを組合せて、活性化することのできる二官能性構築物は、２つの別個のＴＮＦレセプターを活性化する能力を実体化することで、２つの抗体を１つの医薬混合物にまとめる煩わしさといった医薬製造の観点からの複雑な製法をさけるため、これら構築物は新しい方法を提供する。
【００９０】
１つの実施形態において、レセプターカップリング剤は、ＴＮＦファミリーレセプターのアゴニストからなる多価構築物であり、レセプターカップリング剤は各レセプターに結合することができ、かつ活性化シグナルを誘導することができる少なくとも２つのドメインを含む。本発明の抗体構築物は、ＴＮＦファミリーレセプターへの結合に特異的な抗原認識部位を構成する１つ以上の可変領域を含む重鎖およびＴＮＦファミリーレセプターに特異的な抗原認識部位を構成する２つ以上の可変領域を含む軽鎖を含むことができる。抗体構築物は、別個のＴＮＦファミリーレセプターへの結合に特異的なＣＤＲを含む２つ以上の可変領域を含む重鎖または軽鎖のみを含むように構築してもよい。１つの実施形態において、多価抗体はＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲに結合することができる抗原結合部位または結合部分を含む。
【００９１】
１つの態様において、本発明は、ＬＴβＲおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２アゴニスト等の、しかし、これらに限定されないＴＮＦレセプターアゴニストである多価抗体構築物を提供する。１つの実施形態において、多価抗体構築物はＬＴβＲエピトープに特異的な少なくとも１つの抗原認識部位を含む。別の実施形態において、多価抗体構築物はＴＲＡＩＬ−Ｒ２エピトープに特異的な少なくとも１つの抗原認識部位を含む。ある実施形態では、抗原認識部位の少なくとも１つがｓｃＦｖ領域内に置かれるが、別の実施形態では、すべての抗原認識部位がｓｃＦｖ領域に置かれる。
【００９２】
ある実施形態において、レセプターカップリング剤は二特異性である。他の実施形態において、構築物は、ＬＴβＲエピトープおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２エピトープ等の、しかし、これらに限定されないレセプターのＴＮＦファミリーの少なくとも２つのメンバーに特異的である。多特異的構築物のいずれにおいても、少なくとも１つの抗原認識部位はｓｃＦｖドメインに置かれてよく、ある実施形態では、すべての抗原認識部位はｓｃＦｖドメインに置かれてよい。さらに別の実施形態において、本発明の抗体構築物は配列番号５および配列番号７（ＬＴ−ＢＳ１構築物）に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
抗原認識部位または全可変領域を含む結合特異性または結合特異部分は１つ以上の親抗体に由来するものであってよい。親抗体としては、天然の抗体または抗体フラグメント、天然の抗体から改作された抗体または抗体フラグメント、抗体の配列を用いて新たに構築された抗体またはＬＴ−ベータレセプターに特異的であることが知られている抗体フラグメントを挙げることができる。親抗体に由来し得る配列として、重鎖および／軽鎖可変領域および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域またはその他の部分が挙げられる。本発明の１つの実施形態において、レセプターカップリング剤を生成するために使用される親抗体は、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体（例えば、１４Ａ２）および抗ＬＴβＲ抗体（例えば、ＣＢＥ１１）である。
【００９４】
多価の多特異的抗体は、２つ以上の可変領域を含む重鎖および／または１つ以上の可変領域を含む軽鎖を含み得、該可変領域の少なくとも１つはＬＴ−ベータレセプター上の異なるエピトープを認識する。
【００９５】
多価抗ＴＮＦレセプター抗体を含むレセプターカップリング剤は、ネズミまたはヒト化ＢＨＡ１０（ＷＯ０４／００２４３１；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、（１９９６）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１８３：８６７も参照）、ネズミまたはヒト化ＣＢＥ１１（それぞれ米国特許第６，３１２，６９１号およびＷＯ０２／３０９８６）および／または親抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ネズミまたはキメラ１４Ａ２（配列番号１および配列番号３を参照）等の親抗ＬＴβＲ抗体に由来する多様な異なる配列を用いて多様な異なる方法で作ってよい。
【００９６】
本発明のレセプターカップリング剤のために用いることのできるネズミの抗ＬＴβＲ抗体の例として、ＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０が挙げられる。抗体構築物配列が由来する抗ＬＴβＲ抗体を生成するために、モノクローナル抗ＬＴ−β−Ｒ抗体を産生する下記のハイブリドーマ細胞株を用いてよく、これら細胞株はブタペスト条約の規則にしたがって既にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、以下に示すＡＴＣＣ受託番号が付与されている：
【００９７】
【数１】
2007530588.tif 000002
本発明と併せて用いることのできるヒト化抗ＬＴβＲ抗体の例として、ヒト化ＣＢＥ１１およびヒト化ＢＨＡ１０が挙げられる。抗体構築物配列が由来する抗ＬＴβＲ抗体を生成するために下記ハイブリドーマ細胞株を用いてよく、これら細胞株はブタペスト条約の規則にしたがって既にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、以下に示すＡＴＣＣ受託番号が付与されている：ＰＴＡ−３３５７および３７６５（ヒト化ＣＢＥ１１；ＷＯ０２／３０９８６を参照）およびＰＴＡ−４７２６（ヒト化ＢＨＡ１０；ＷＯ０４／００２４３１を参照）。
【００９８】
本発明のレセプターカップリング剤と適合性のある抗ＴＮＦレセプター抗体の他の例は、デスドメインを含むＴＮＦレセプターに対する抗体に由来するものであってよい。多くの抗体がデスドメインを含むＴＮＦレセプターに対して生成されており、当該分野で公知である。そのような抗体として、抗ＴＮＦ−Ｒ１モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ抗ＴＮＦ−Ｒ１；Ｔｕｌａｒｉｋ  ｍＡｂ＃９８５、米国特許第６，１１０，６９０号、第６，４３７，１１３号）、抗ＦａｓレセプターｍＡｂ  ＣＨ−１１（米国特許第６，３１２，６９１号；ＷＯ９５／１０５４０）、抗ＤＲ３抗体（米国特許第５，９８５，５４７号；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＬＡ，  ｅｄ．  Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂ．Ｏ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；米国特許第６，４６２，１７６号、第６，４６９，１６６号）および抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体（米国特許第５，７６３，２２３号、第６，０７２，０４７号、第６，２８４，２３６号、第６，５２１，２２８号、第６，５６９，６４２号、第６，６４２，３５８号および米国特許第６，４１７，３２８号）が挙げられる。
【００９９】
多くの抗体が組織分化に関与するＴＮＦレセプターに対しても生成されており、当該分野で公知である。組織分化に関与するＴＮＦレセプターに特異的な抗ＴＮＦレセプター抗体の例として、抗ＲＡＮＫモノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｅｘ−米国特許第６，５６２，９４８号、第６，５３７，７６３号、第６，５２８，４８２号、第６，４７９，６３５号、第６，２７１，３４９号、第６，０１７，７２９号；Ｋｏｍｅｄ−ＷＯ０３／０８０６７１）、抗ＥＤＡＲポリクローナル（抗ヒト）およびモノクローナル（抗マウス）抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＭＡＢ７４５、ＢＡＦ１５７；Ｅｌｏｍａａら（２００１）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１０：９５３）、抗ＸＥＤＡＲモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＭＡＢ１０９３およびＡＦ１０９３）、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体（Ｎａｋａｙａｍａら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：３４１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−２およびＩＴＥＭ−４クローン）、抗ＴＲＯＹ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なＴ３３２３）および抗ＮＧＦＲ（抗げっ歯類）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ米国）が挙げられる。
【０１００】
多くの抗体が免疫調節に関与するＴＮＦレセプターに対しても生成されており、当該分野で公知である。免疫調節に関与するＴＮＦレセプターに特異的な抗ＴＮＦレセプター抗体の例として、免疫調節レセプターに対して生成された多くの他の抗体のなかでも、抗ＨＶＥＭ抗体（ＨＧＳＩ−ＷＯ０３／０８６３０１）、抗ＣＤ４０抗体（Ｂｉｏｇｅｎ−ＷＯ９７／２００６３；Ｃｈｉｒｏｎ−米国特許第５，６７７，１６５号、第５，８７４，０８２号、第６，００４，５５２号、第６，０５６，９５９号、第６，３１５，９９８号；米国出願公開第２００２／０１０６３７１号；米国出願公開第２００３／００５９４２７号、第ＵＳ２００３０１１８５８８Ａ１号、第２００３／０２１１１００Ａ１号、第ＵＳ２００２０２０１４２３５８Ａ１号；米国特許第ＵＳ６３１２６９３号、第ＵＳ６０５１２２８号；Ｆａｎｓｌｏｗら−ＵＳ５８０１２２７）、抗４−１ＢＢ（ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０８４９９９；ＥＰ０９４８３５３；米国特許第６２１０６６９号；Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ−ＷＯ０３／０８３０６９）および抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体（ウサギポリクローナル−ＰｒｏＳｃｉカタログ＃３０９７）が挙げられる。
【０１０１】
ＴＮＦレセプターに対する多価構築物は、例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、欧州特許出願第１８４，１８７号、欧州特許出願第１７１，４９６号、欧州特許出願第１７３，４９４号、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号、米国特許第４，８１６，５６７号、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら、（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら、（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら、（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒら、（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；ならびにＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−９９）に記載のように慣用の組換えＤＮＡ技術を用いて当業者によって開発されてもよい。好ましくは、非ヒト抗体は、非ヒト抗原結合ドメインをヒト定常ドメインに連結することにより「ヒト化」される（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−５５）。
【０１０２】
多価抗ＴＮＦレセプター抗体構築物を調製するために用いてよい他の方法は、下記刊行物：Ｇｈｅｔｉｅら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−１３９８；Ｗｏｌｆｆら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５；Ｇｈｅｔｉｅら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：７５０９−７５１４；Ｋｉｍら（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−５４７；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；Ｃｏｌｏｍａら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１５９−１６３；Ｚｕｏら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（補遺）１３（５）：３６１−３６７；Ｓａｎｔｏｓら（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ；Ｐｒｅｓｔａ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２３７−２５６；ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌら（２０００）Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３９１−３９７に記載されている。
【０１０３】
（Ｂ．ＴＮＦリガンド）
本発明のレセプターカップリング剤は、少なくとも２つの慣用のＴＮＦファミリーリガンドをともに結合させる結合特異性も有する。ＴＮＦファミリーリガンドの例として、ＴＮＦ−α（ＮＰ＿０００５８５．２、ＧＩ  Ｎｏ．２５９５２１１１）ＬＴ−α、（ＮＰ＿０００５８６．２、ＧＩ  Ｎｏ．６８０６８９３）、ＦａｓＬ（ＮＰ＿０００６３０；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  Ｎｏ．４５５７３２９）、ＡＰＯ−３Ｌ（ＮＰ−００３８００、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５９７；ＮＰ＿６９４５５７、ＧＩ  Ｎｏ．２３５１０４４１）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ−２Ｌ、ＮＰ＿００３８０１、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５９３）、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１、ＮＰ＿００３６９２、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７５９５；ＮＰ＿１４３０２６、ＧＩ  Ｎｏ．１４７９０１５２）、ＥＤＡＲ１＆ＸＥＤＡＲリガンド（ＥＤ１、ＮＰ＿００１３９０、ＧＩ  Ｎｏ．４５０３４４９；Ｍｏｎｒｅａｌら（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．６３：３８０）、Ｆｎ１４リガンド（ＡＰＯ−３Ｌ／ＴＷＥＡＫ）、Ｔｒｏｙ／ＴｒａｄｅリガンドＮＧＦ（ＮＧＦ−β、ＮＰ＿００２４９７、ＧＩ  Ｎｏ．４５０５３９１）、ＮＧＦファミリー（ＮＧＦ−２／ＮＴＦ３、ＮＰ＿００２５１８、ＧＩ  Ｎｏ．４５０５４６９；ＮＴＦ５、ＮＰ＿００６１７０、ＧＩ  Ｎｏ．５４５３８０８；ＢＤＮＦ：ＮＰ＿００１７００、ＧＩ  Ｎｏ．２５３０６２６７；ＮＰ＿７３３９２７、ＧＩ  Ｎｏ．２５３０６２３５；ＮＰ＿７３３９２８、ＧＩ  Ｎｏ．２５３０６２５３；ＮＰ＿７３３９２９、ＧＩ  Ｎｏ．２５３０６２５７；ＮＰ７３３９３０、ＧＩ  Ｎｏ．２５３０６２６１；ＮＰ＿７３３９３１、ＧＩ  Ｎｏ．２５３０６２６４；ＩＦＲＤ１、ＮＰ＿００１５４１、ＧＩ  Ｎｏ．４５０４６０７）、ＴＮＦＲＩＩリガンド（ＴＮＦ、上記）、ＨＶＥＭリガンド（ＮＰ＿００３７９８、ＧＩ  Ｎｏ．２５９５２１４４；ＮＰ＿７４２０１１、ＧＩ  Ｎｏ．２５９５２１４７）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０抗原、ＮＰ＿００１２４３、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７６０５）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３、ＮＰ＿００１２３５、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７６０７）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４、ＮＰ＿００００６５、ＧＩ  Ｎｏ．４５５７４３３）、４−１ＢＢ−Ｌ（ＩＬＡリガンド、ＮＰ＿００３８０２、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７６０９）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ、ＮＰ＿００３３１７、ＧＩ  Ｎｏ．４５０７６０３）、ＧＩＴＲＬ（ＡＩＴＲＬ／ＴＬ６、ＮＰ＿００５０８３、ＧＩ  Ｎｏ．４８２７０３４）およびＢＡＦＦ（ＴＡＬＬ１、ＮＰ＿００６５６４、ＧＩ  Ｎｏ．５７３００９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
（Ｃ．抗体／レセプター組合せ）
また、本発明のレセプターカップリング剤として、上記の抗ＴＮＦレセプター抗体およびＴＮＦリガンドの組合せも挙げられる。例えば、レセプターカップリング剤は、２つの三量体リガンドと３つの抗体または高次複合体とを有する分子を生成する形におけるＴＮＦファミリーレセプターに対する抗体に結合させたリガンド−Ｆｃ構築物の組合せを含み得る。１つの実施形態において、第１の結合特異性は、３つの二量体Ｆｃドメインおよび６つのリガンド分子から共通して形成される少なくとも２つの三量体リガンド−Ｆｃ構築物を含む。この場合、第２の結合特異性は３つの抗体分子からなるだろう。また、本発明は、ＴＮＦファミリーレセプターの抗体に結合させたＴＮＦファミリーレセプターに対する慣用のリガンド（Ｉｇ融合タンパク質ではない）の組合せも含む。
【０１０５】
（ＩＶ．レセプターカップリング剤の製造方法）
ＴＮＦレセプターの組合せに向けられたレセプターカップリング剤の有効性は、細胞傷害または増殖阻害を評価するインビトロアッセイ、軟寒天コロニー形成アッセイおよび三次元腫瘍培養系等、標準的なアッセイ（例えば乳癌のために確立したもの等）により評価することができる。有効性はインビボ異種移植片モデルによっても検証することができる。ヒトの肺、肝臓および内皮の初代細胞株の使用は全体の毒性のインビトロ予測を可能にする。通常、誘導されたアポトーシスおよびＶＣＡＭまたはＩＣＡＭ等の表面接着分子の表示は潜在的なマーカーとして働く。例えば、ＩＬ−８および／またはＩＰ−１０は、有害でありうる炎症促進性プログラムの毒性または誘導の良好なマーカーとして働く。
【０１０６】
本発明のレセプターカップリング剤を試験するために使用することのできる癌細胞株は当該分野に公知である。結腸直腸癌の標準モデルにしばしば用いられる細胞株の例として、例えば、ＴＮＦレセプター活性化剤評価用のＨＴ２９細胞株が挙げられる。この細胞株は２つの変異体であるＨＴ２９およびＷｉＤｒとして存在し、ＨＴ２９細胞株が、潜在的な新しい化学療法剤のためのスクリーニングパネルにおいて米国立癌研究所により使用されてきた。それ自体として、幾つかの抗癌剤の可能性を評価するのに良好な道具である。他の結腸直腸細胞株の例として、ＫＭ２０Ｌ２、ＬＳ１７４ＴおよびＣＡＣＯ−２が挙げられる。レセプターカップリング剤の有効性を試験するために使用できる乳癌細胞株の例として、ＭＣＦ７およびＭＤＡ２３１が挙げられる。レセプターカップリング剤の有効性を試験するために使用できる子宮頚部癌細胞株の例として、ＨｅｌａおよびＭＥ１８０が挙げられる。さらに、メラノーマ細胞株の例としてＡ３７５が挙げられ、横紋筋肉腫の例としてＲＤが挙げられ、肉腫細胞株の例はＳＡＯＳ−２である。
【０１０７】
候補抗体構築物はその活性について多様な公知のアッセイを用いてスクリーニングしてよい。例えば、結合特異性を決定するスクリーニングアッセイはよく知られており、当該分野で慣用的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な議論について、Ｈａｒｌｏｗら（編集）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８８年，第６章を参照されたい。下記例は、候補抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲアゴニスト抗体構築物によるレセプターカップリング剤活性化の有効性を決定するアッセイを提供する。
【０１０８】
上記のレセプターカップリング剤は薬学的組成物としての使用のために適当な純度まで精製してよい。一般的に、精製された組成物は、組成物中に存在するすべての種の約８５％を超える１つの種を有するか、存在するすべての種の約８５％、９０％、９５％、９９％を超えるかまたはそれ以上の１つの種を有することがある。目的とする種は、本質的な均一（混入種が慣用の検出方法により組成物中に検出することができない）まで精製してよく、つまり、組成物が本質的に単一の種から構成されるまで精製してよい。当業者は、ここでの教示に照らして、タンパク質精製の標準的な技術、例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を用いて本発明のポリペプチドを精製してよい。ポリペプチドの純度は、例えば、アミノ末端アミノ酸配列分析、ゲル電気泳動および質量分光分析等の当業者に公知の多くの方法により決定してよい。
【０１０９】
１つの実施形態において、本発明のレセプターカップリング剤は化学療法剤に連結させて相乗的に腫瘍容積を抑制することができる。本発明の抗体に連結させることのできる例示的な化学療法剤として、放射性複合体（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈおよびその他）、腫瘍活性化プロドラッグ（メイタニシノイド類、ＣＣ−１０６５アナログ、クリケアミシン誘導体、アントラサイクリン類、ビンカアルカロイド類およびその他）、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
一部の実施形態において、本発明のレセプター結合多価抗体および抗体フラグメントは所望の効果を提供するために化学的に修飾してよい。例えば、本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６；およびＥＰ０４０１３８４（これらそれぞれを本明細書中に全体として参考として援用する）の参考文献に記載されているように当該分野で公知のペグ化反応のいずれかにより実施してよい。好ましくは、ペグ化は反応性ポリエチレングリコール分子（または類似性のある反応性水溶性ポリマー）によるアルキル化反応またはアシル化反応により実施される。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化に好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ここで用いられる「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール等、他のタンパク質を誘導体化するために用いられてきたいずれかの形のＰＥＧを包含することを意味する。
【０１１１】
本発明のペグ化抗体および抗体フラグメントの調製方法は、一般的に、（ａ）抗体または抗体フラグメントを、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等のポリエチレングリコールと、抗体または抗体フラグメントが１つ以上のＰＥＧ基と結合するようになる条件下で反応させる工程および（ｂ）反応生成物を得る工程からなるだろう。公知のパラメータおよび所望の結果に基づく最適反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に明らかであろう。
【０１１２】
ペグ化抗体および抗体フラグメントは、ここに記載の抗体および抗体フラグメントの投与により緩和または調節されうる症状を治療するために一般的に用いてよい。一般的に、ペグ化抗体および抗体フラグメントは、非ペグ化抗体や抗体フラグメントと比較して長い半減期を有する。ペグ化抗体および抗体フラグメントは単独、ともに、または他の薬学的組成物と組合せて用いてよい。
【０１１３】
本発明の他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントを、認知されている技術を用いて卵白に連結させる。本発明の別の実施形態において、多価抗体、またはそのフラグメントを修飾して、潜在的なグリコシル化部位を減少または除去する。そのような修飾抗体は「非グリコシル化」抗体としばしば呼ばれる。抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性を向上させるために、抗体のグリコシル化部位は、例えば、突然変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発）により変えることができる。「グリコシル化部位」とは糖残基結合の場所として真核細胞により認識されるアミノ酸残基をいう。オリゴ糖などの炭水化物が結合するアミノ酸は、通常、アスパラギン（Ｎ結合）、セリン（Ｏ結合）およびスレオニン（Ｏ結合）残基である。抗体または抗原結合フラグメント内に潜在的なグリコシル化部位を同定するために、抗体の配列は、例えばＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより提供されるウエブサイト（Ｎ結合グリコシル化部位を予想するために、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／を参照）およびＯ結合グリコシル化部位を予想するために、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／を参照）等の公に利用可能なデータベースを用いることにより調べられる。抗体のグリコシル化部位を変えるさらなる方法は米国特許第６，３５０，８６１号および第５，７１４，３５０号に記載されている。
【０１１４】
本発明のさらに別の実施形態において、多価抗体またはそのフラグメントであるレセプターカップリング剤を変えて、未修飾抗体に比較して少なくとも１つの定常領域媒介生物エフェクター機能を減少させるように抗体の定常領域を修飾することができる。本発明の抗体がＦｃレセプター（ＦｃＲ）に対して低下した結合を示すように修飾するために、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントをＦｃＲ相互作用に必要な特定の領域において変異できる（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３；およびＬｕｎｄら、（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７を参照）。また、抗体のＦｃＲ結合能力の低減は、オプソニン化および食作用および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害等のＦｃＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能も減少させることがある。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明は、エフェクター分子（例えば、補体またはエフェクター細胞上のレセプター）に結合する能力等の変化したエフェクター機能を有するレセプター結合多価抗体をさらに特徴とする。特に、本発明のヒト化抗体は、変化させた定常領域（例えば、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基または側鎖に置換されることによりＦｃＲに結合する抗体の能力を低減されているＦｃ領域）を有する。また、抗体のＦｃＲ結合能力の低減は、オプソニン化および食作用および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害等のＦｃＲ相互作用に依存する、他のエフェクター機能も減少させることがある。１つの実施形態において、修飾ヒト化抗体はＩｇＧクラスであり、例えば非修飾のヒト化抗体に比較して、該ヒト化抗体は変化したエフェクター機能を有するように少なくとも１つのアミノ酸残基置換をＦｃ領域に含む。特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、免疫原性が低くなるように（例えば、望ましくないエフェクター細胞活性、溶解または補体の結合を起こさないように）、および／またはＬＴβＲに対する特異性は保持しながら、さらに望ましい半減期を有するように変化させられたエフェクター機能を有する。
【０１１６】
もしくは、本発明は、ＦｃＲ結合（例えば、ＦｃγＲ３結合）を増強するように定常領域を変えたレセプター結合多価ヒト化抗体を特徴とする。そのような抗体は、エフェクター細胞機能を調節するために（例えば、ＡＤＣＣ活性を高めるために）、例えば、特に本発明の癌研究用途での使用のために有用である。ここで用いられる「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応をいう。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、抗体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ、例えば抗体と別の物質もしくは他の抗体との複合体を発現する。
【０１１７】
本発明の実施は他に特に示されない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を用いることがある。そのような技術は文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻、第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編集、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓら米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；専門書であるＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻、第１５５巻（Ｗｕら編集），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編集、１９８６年）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８６年）を参照されたい。ｍｕＢＨＡ１０およびｍｕＣＢＥ１１可変領域、マウス−ヒトＢＨＡ１０およびＣＢＥ１１キメラ抗体、作り変えられたＢＨＡ１０およびＣＢＥ１１可変領域、ｈｕＢＨＡ１０およびｈｕＣＢＥ１１をコードする発現ベクター、五量体ｃｈＣＢＥ１１抗体の生産ならびにそれらの精製およびアッセイ方法は、参考のためにここにその全体が援用される出願人の同時係属出願ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２２７８８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／３０９８６号、ＰＣＴ出願第ＷＯ０４／００２４３１号およびＷＯ０４／０５８１９１に既に記載されている。
【０１１８】
（Ｖ．薬学的組成物）
本発明は、上記のレセプターカップリング剤を含む薬学的組成物を提供する。ある実施形態において、薬学的組成物はさらに化学療法剤を含んでよい。１つの態様において、本発明は治療効果のある量の１つ以上の上記化合物を、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア（添加物）および／または希釈剤とともに処方して含む、薬学的に受容可能な組成物を提供する。別の態様のある実施形態において、本発明の化合物はそのままで投与しても、または薬学的に受容可能なキャリアとの混合物で投与してもよく、また他の化学療法剤と併せて投与してもよい。よって、包括（併用）療法は、最初に投与された有効化合物の治療効果が次の有効化合物が投与された時に完全になくならないように、活性化合物の順次投与、同時投与および別々の投与または共同の投与を含む。
【０１１９】
選択された投与経路には関係なく、適切な水和形で用いてよい本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は当業者に公知の慣用の方法により薬学的に受容可能な投与形態に処方される。本発明の化合物は単独で投与できるが、この化合物を薬学的処方物（組成物）として投与することが望ましい。本発明による化合物は、他の医薬から類推して、ヒト医薬または動物薬に使用するのに便利な方法で投与されるように処方してよい。
【０１２０】
以下詳細に説明するように、本発明の薬学的組成物は、（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性溶液もしくは非水性溶液または懸濁液）、錠剤（例えば、頬、舌下および全身吸収を目的とする錠剤、ボーラス、粉剤、顆粒、舌投与用ペースト；（２）非経口投与（例えば、滅菌溶液または懸濁液または持続放出処方物として、例えば皮下、筋内、静脈内または硬膜外注射による非経口投与）；（３）皮膚に適用される、例えばクリーム、軟膏または制御放出パッチまたはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームとしての膣内投与または直腸内投与；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮的；または（８）鼻等に適合させた薬学的組成物等の固体または液体の形態での投与のために特別に処方してもよい。１つの実施形態において、薬学的組成物は非経口投与用に処方される。１つの実施形態において、薬学的組成物は動脈内注射用に処方される。別の実施形態において、薬学的組成物は全身投与用に処方される。
【０１２１】
別の場合において、本発明の化合物は１つ以上の酸性官能基を含んでよいため、薬学的に受容可能な塩基と薬学的に受容可能な塩を形成することができる。
【０１２２】
湿潤剤、乳化剤および滑剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および香料、防腐剤および酸化防止剤も組成物中に存在させてよい。
【０１２３】
本発明の処方物として、経口、鼻、局所（口腔および舌下等）、直腸、膣および／または非経口投与に適する処方物が挙げられる。処方物は便利には単位投与量形で示されてよく、薬学の分野で周知の方法により調製してよい。単一の投与形を生成するためにキャリア材料と組合せてよい活性成分の量は、治療するホスト、投与の特定の態様に基づいて変えられる。単一の投与形を生成するためにキャリア材料と組合せてよい活性成分の量は、通常は治療効果を生む化合物の量である。
【０１２４】
本発明の化合物の経口投与の液体投形として、薬学的に受容可能な乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体投与形は、例えば、水または他の溶媒、溶解補助剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に綿実油、ラッカセイ油、コーンオイル、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、およびそれらの混合物等の通常この分野で用いられる不活性希釈剤を含んでよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料および防腐剤等のアジュバントを含んでもよい。活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物等の懸濁化剤を含んでよい。
【０１２５】
経口投与に適する本発明の処方物は、活性成分として所定量の本発明の化合物をそれぞれ含むカプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント等の味をつけた基剤を用いる）、粉剤、顆粒剤の形態であるか、または水性もしくは非水性液体中の溶液または懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、またはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア等の不活性基剤を用いる）として、および／またはうがい薬等であってよい。本発明の化合物は大きな丸薬、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０１２６】
経口投与用の本発明の固体投与形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤、顆粒剤等）において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸２カルシウム等の１種類以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび／または以下のいずれかと混合される：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸等の充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア等の結合剤；（３）グリセロール等の保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩および炭酸ナトリウム等の崩壊剤；（５）パラフィン等の溶液緩染剤；（６）四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコール、グリセロールモノモステアレートおよび非イオン性表面活性剤等の湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイトクレイ等の吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物等の滑剤；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合、薬学的組成物は緩衝剤を含んでもよい。類似の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖等の賦形剤、ならびに高分子量のポリエチレングリコール等を用いる軟質シェルまたは硬質シェルのゼラチンカプセル中に増量剤として用いてもよい。
【０１２７】
錠剤は、任意に１つ以上の副成分とともに圧縮または成形により作ってよい。圧縮錠剤は、バインダー（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコール酸塩または架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤または分散剤を用いて調製してよい。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適当な機械で成形することによって作ってよい。錠剤、および本発明の薬学的組成物の他の固形剤型、例えば、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒は、コーティングおよびシェル（例えば、医薬処方技術分野で周知の腸溶コーティングや他のコーティング）を用いて任意に評価または調製してよい。それらは、希望の放出性、他の重合体マトリクス、リポソームおよび／または小球体を提供するために、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを種々の比率で用いて、活性成分の遅いまたは制御された放出を提供するように処方してもよい。迅速な放出のために処方してもよく、例えば凍結乾燥される。例えば、細菌を保持するフィルタによる濾過によるか、または使用の直前に滅菌水または他の注射可能な無菌媒体に溶解してよい無菌の固体組成物の形で殺菌剤を配合することにより滅菌してよい。これらの組成物は任意に不透明化物質を含んでよく、活性成分のみ、または優先的に胃腸管の特定の部分で、任意に遅延して放出する組成を有してもよい。使用してよい包埋組成物の例として、高分子物質および蝋が挙げられる。活性成分は、適当であれば、上記賦形剤の１種類以上を有するマイクロカプセル化された形にあってもよい。
【０１２８】
本発明の化合物の局所的または経皮的な投与のための剤型として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性化合物は無菌条件下に薬学的に許容性のあるキャリアおよび必要とされ得る防腐剤、緩衝剤または高圧ガスと混合してよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物脂肪や植物脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物等の賦形剤を含んでよい。粉末とスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれら物質の混合物等の賦形剤を含むことができる。スプレーはさらに、クロロフルオロハイドロカーボン、およびブタンやプロパン等の揮発性未置換ハイドロカーボン等の慣用の高圧ガスを含むことができる。
【０１２９】
非経口的投与に適する本発明の薬学的組成物は、糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、またはこの処方物を意図する受容者の血液と等張にする溶質、または懸濁剤か増粘剤を含んでよい、１種類以上の薬学的に許容できる無菌等張の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、または使用直前に注射可能な滅菌溶液または分散液に再構築してよい滅菌粉末と組み合わせた本発明の１つ以上の化合物を含む。これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤等のようなアジュバントを含んでもよい。多様な抗菌剤や抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を包含させることにより本発明の化合物に対する微生物の作用を確実に防止することができるだろう。また、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含有させるのも望ましいだろう。さらに、注射可能な薬物形の長期の吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を包含させることによりもたらされることがある。
【０１３０】
いくつかの場合で、医薬の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの医薬の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶性または無定形材料の液体懸濁物を使用することにより達成できる。医薬の吸収の速度は、従ってその溶解速度に依存し、この溶解速度は結晶サイズと結晶形とに依存することがある。もしくは、非経口投与の医薬形の吸収の遅延は、医薬を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。注射可能な貯蔵形は、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解ポリマー中に本発明の化合物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより生成される。医薬に対するポリマーの比率、および使用される特定のポリマーの性質に基づいて、医薬放出の速度が制御できる。他の生物分解ポリマーの具体例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。貯蔵形の注射可能な処方物はまた、体組織に適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに医薬を取り込むことによっても調製される。
【０１３１】
（ＶＩ．投与方法とデバイス）
本発明の薬学的組成物は、皮下注射器、多室注射器、ステント、カテーテル、経皮パッチ、マイクロニードル、マイクロアブレーダーおよび移植可能な制御放出デバイスを含む多様な医薬送達デバイスを用いて投与してもよい。１つの実施形態において、医薬送達デバイスは、少なくとも有効量のレセプターカップリング剤を含むか、またはそれを装填することができる。そのようなデバイスは送達前にデバイス内に抗体構築物の凍結乾燥形を再構成する能力を有することがある。一部の実施形態において、医薬送達デバイスは、少なくとも有効量のレセプターカップリング剤と有効量の化学療法剤を含むか、またはそれらを装填することができる。デバイスは、一部の実施形態において、レセプターカップリング剤と化学療法剤を同時に送達もしくは投与できるものであってよい。デバイスはこのデバイスによる投与前に抗体構築物と化学療法剤を混合する能力を有することがある。さらに別の実施形態において、デバイスはアゴニスト抗体構築物および化学療法剤を連続的に投与できることがある。
【０１３２】
１つの医薬送達デバイスは注射前に２つの化合物を混合またはそれらを順次に送達することのできる多室のシリンジである。典型的な二室シリンジと、前充填されたそのようなシリンジの自動化製造方法は、Ｎｅｕｅ  Ｖｅｒｐａｃｋｕｎｇ，Ｎｏ．３，１９８８，ｐ．５０−５２；Ｄｒｕｇｓ  Ｍａｄｅ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｐａｇ．１３６−１４０（１９８７）；Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｄ．４６，Ｎｒ．１０（１９８４）ｐ．１０４５−１０４８およびＰｈａｒｍ．Ｉｎｄ．４６，Ｎｒ．３（１９８４）ｐ．３１７−３１８に開示されている。シリンジタイプのアンプルは、ニードル取付け用フロントボトルタイプ、２つのピストン、および前室内の凍結乾燥粉剤を後部室内の再構成用液体と混合するための外側のバイパスを有する二室デバイスである。記載されたプロセスは、シリンジ容器を洗浄、シリコン処理し、複数の容器を搬送トレイに入れ、滅菌し、中間ピストンを容器後端から導入し、トレイをひっくり返し、粉末溶液を前部の開口から導入し、乾燥粉末になるまで凍結乾燥し、凍結乾燥室にあるうちに前部の開口を閉じ、トレイを回転させ、再構成液体を容器後端から導入し、後部ピストンを挿入し、トレイから生成物を取り出し、最終的な調節と包装をする主要な工程を含む。多様な成分を前充填したアンプルはシリンジを用いる使用のために製造してよい。
【０１３３】
別の実施形態において、多室シリンジはＬｙｏ−ｊｅｃｔシステム（Ｖｅｔｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａ  Ｔｕｒｍ，Ｙａｒｄｌｅｙ、ペンシルベニア州）である。Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔにより、使用者は、迅速な再構築および注射のために希釈剤が詰められたシリンジ中で医薬を直接凍結乾燥することができる。それは米国特許第４，８７４，３８１号および第５，０８０，６４９号に記載されている。
【０１３４】
別の実施形態において、化合物は、２つの分離したシリンジ、カテーテル、マイクロニードル、または注射を達成することのできる他のデバイスを用いて投与される。
【０１３５】
本発明の薬学的組成物は、侵された組織または血流中、またはその近く、さもなければそれに連通して置かれたミクロスフィア、リポソーム、他の微粒子送達システムまたは持続放出処方物を用いて投与してもよい。持続放出キャリアの適当な例として、坐剤またはマイクロカプセル等の造形品の形の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能であるか、または微粒子の持続放出マトリックスとして、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマＬグルタミン酸エチルとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、（１９８５）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５６）；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ，（１９８２）Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５）が挙げられる。
【０１３６】
本発明の組成物は扱われる特定の臨床症状を治療するために効果的な投与量で投与されることがある。好ましい医薬処方物および所与の適用のための治療有効性のある投薬レジメンの決定は、例えば、患者の状態と体重、望まれる治療の程度および治療に対する患者の耐性を考慮すれば十分に当該分野の範囲内にある。
【０１３７】
経皮パッチは本発明の化合物の体への制御送達を提供する別の利点を有する。そのような剤形は化合物を適当な媒体に溶解または分散させることにより生成することができる。吸収促進薬は化合物の経皮膚の流れを高めるように用いることもできる。そのような流れの速度は速度調節膜を提供するか、もしくは化合物をポリマーマトリックスまたはゲル中に分散させることにより制御することができる。
【０１３８】
（ＶＩＩ．治療方法）
したがって、本発明は、任意に上記の送達デバイスを用いて、有効量の薬学的組成物を被験体に投与することを包含する癌を治療する新規な治療方法をさらに提供する。本発明の方法は固形腫瘍の治療等の、しかし、これらに限定されない癌の治療に用いてよい。本発明の化合物により治療することのできる固形腫瘍の例として、乳、精巣、肺、卵巣、子宮、頚部、膵臓、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、結腸、ならびに前立腺、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、皮膚、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）、食道および膀胱癌等が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本方法は有効量の本発明の薬学的組成物を被験体に非経口的に投与することを包含する。１つの実施形態において、本方法はこの組成物を被験体に動脈内投与することを包含する。別の実施形態において、本方法は有効量のこの組成物を被験体の腫瘍の動脈血液供給に直接投与することを包含する。１つの実施形態において、本方法はカテーテルを用いて有効量のこの組成物を癌性腫瘍の動脈血液供給に直接投与することを包含する。カテーテルを用いてこの組成物を投与する実施形態において、カテーテルの挿入は蛍光透視または当該分野で公知のカテーテル挿入を案内または観察する他の方法により観察および／または案内してよい。別の実施形態において、本方法は化学塞栓形成を含む。例えば、化学塞栓形成は、樹脂様材料をオイル基剤（例えば、エチオドール中のポリビニルアルコール）および１つ以上の化学療法剤に混合して構成される組成物によって、癌性腫瘍に供給する血管をブロックすることを包含しえる。さらに別の実施形態において、本方法は被験体へのこの組成物の全身投与を包含する。
【０１３９】
一般的に、本発明の薬学的組成物を利用する化学塞栓形成術または直接の動脈内または静脈内注射治療は、注射部位に関わらず通常は類似の方法で実施される。簡単に説明すれば、Ｘ線写真が撮られる際、塞栓を起こさせる領域の血管造影法（血管の道筋）またはさらに具体的にはある実施形態においては動脈造影法を、まず挿入されたカテーテルにより放射不透明性造影剤を（塞栓を起こさせるか、または注射する部位に基づいて）動脈または静脈に注入することにより、実施してよい。カテーテルを経皮的または手術により挿入してよい。次に、血流が止まることが観察されるまで、本発明の薬学的組成物をカテーテルを通して還流することにより血管に塞栓を起こさせてよい。血管造影を繰り返すことにより閉塞を確認してよい。直接の注入が用いられる実施形態では、次に血管に本発明の薬学的組成物が所望の投与量で注入される。
【０１４０】
一般的に、塞栓形成療法は、結果的に、阻害剤を含む組成物を治療すべき腫瘍または血管塊の間隙の至るところに分布させる。動脈腔を詰まらせる塞栓性粒子の物理的な大きさは血液供給の閉塞をもたらす。この効果に加えて、抗脈管形成因子の存在は、腫瘍または血管塊に供給する新しい血管の形成を妨げて、血液供給を切断するという活力低下効果を増強する。一般的に、直接的な動脈内または静脈内注射も同じく、結果的に、阻害剤を含む組成物を治療すべき腫瘍または血管塊の間隙の至るところに分布させる。しかし、通常は、血液供給がこの方法で閉塞されるとは予測されない。
【０１４１】
本発明の１つの態様内において、肝臓または他の組織の原発腫瘍および二次性腫瘍は、塞栓形成または直接の動脈内または静脈内注射療法を利用して治療してよい。簡単に説明すれば、カテーテルを大腿動脈または上腕動脈を経て、蛍光透視の案内に基づいて動脈系を通して走査することにより肝臓動脈に進める。このカテーテルは、正常な構造に供給を行うできるだけ多くの動脈枝を傷付けないようにしながら、腫瘍に供給する血管の完全な閉塞を可能とするのに必要である限り肝臓動脈樹内に進める。理想的には、これは肝臓動脈の分節的な分岐であるが、胃十二指腸動脈の基点より遠位の全肝臓動脈、または複数の別々の動脈でさえもが腫瘍の程度およびその個々の血液供給に基づいてブロックされる必要がある可能性が在る。望ましいカテーテルの位置がいったん達成されたら、遮断すべき動脈の流れが止まるまで、好ましくはなおも５分間の観察後に、（上記のように）組成物を動脈カテーテルを通して注入することにより動脈を閉塞する。動脈の閉塞は、放射不透明性造影剤をカテーテルを通して注入し、蛍光透視またはＸ線フィルムによって、造影剤で以前満たされた血管がもはやそうではないことを示すことにより確認してよい。直接的な注入が用いられる実施形態において、（上記のように）組成物を動脈カテーテルを通して所望の用量で注入することにより動脈に注ぎ込む。同じ操作を、閉塞すべき各栄養動脈で繰り返してよい。
【０１４２】
ほとんどの実施形態において、本発明の組成物は、患者に治療効果のある量の配合治療剤または他の物質を予防上または治療上の処置の一部として投与するのに十分な量で送達されるように単一または複数の物質を配合してよい。粒子内の活性化合物の望ましい濃度は、医薬の吸収、不活性化および排泄率ならびに化合物の送達速度に依存することがある。用量値は緩和すべき障害の重症度によっても変わることに注意されたい。特定の被験体のために、特定の投薬レジメンは個々の必要性、および組成物を投与するかまたは組成物投与を管理する人の専門的な判断力にしたがって経時的に調節しなければならないことにもさらに理解されるべきである。典型的には、投与量は当業者に公知の技術を用いて決定される可能性がある。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の化合物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出率または代謝、治療時間、他の医薬、使用される特定の化合物と組合せて用いられる化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および前の病歴、および医学分野で周知の類似の因子等の多様な因子に基づくことがある。
【０１４３】
用量は患者の体重１ｋｇあたり組成物の量に基づく。他の量は当業者に公知であり、容易に決定され得る。もしくは、本発明の用量は組成物の血漿濃度を参照して決定してもよい。例えば、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）および時間０から無限までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ（０−４））を用いてもよい。本発明の用量として、ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−４）について上記値を生じる用量およびこれらのパラメータに対して大きいか、小さい値をもたらす他の用量が挙げられる。
【０１４４】
通常の技量を有する医師または獣医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医は、薬学的組成物に使用される本発明の化合物の投与量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルから始めて、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に上げることができよう。
【０１４５】
一般的に、本発明の化合物の適当な１日用量は、治療効果を生むのに有効な最も低い投与量である化合物の量になる。一般に、そのような効果的な投与量は上記因子に依存する。所与の患者において最も効果的な治療を生む投与の正確な時間および任意の特定化合物の量は、特定化合物の活性、薬物動態学および生物利用性、患者の生理学的状態（年齢、性別、障害のタイプおよび段階、一般的な健康状態、所定の用量に対する応答性および薬物療法のタイプ等）、投与経路等に依存することがある。ここで紹介する指針は、治療を最適化するため（例えば最適時間および／または投与の量を決定するため）に用いてよく、これらは被験体のモニタリング、用量の調節および／または時間的調節からなる慣用的な実験を必要とするだけである。
【０１４６】
被験体が治療されている間、関連する指標の１つ以上を一定の時点で２４時間測定することにより患者の健康をモニタリングしてよい。サプリメント、量、投与時間および処方等の治療はそのようなモニタリングの結果にしたがって最適化してよい。患者は同じパラメータを測定することにより改善の程度を決定するために定期的に再評価してよく、そのような最初の再評価は通常は治療の開始から４週間の終わりに行い、その後の再評価は治療中の４〜８週間毎に、さらにその後は３ヶ月間毎に行う。治療は数ヶ月間からさらに数年間続けてもよく、最低１ヶ月間がヒトの通常の治療期間である。投与される物質の量の調節および場合により投与時間の調節をこれらの再評価に基づいて行ってよい。
【０１４７】
治療は化合物の最適な投与量よりも低い小用量から始めてよい。その後、最適な治療効果が得られるまで用量を少しずつ増加させてよい。
【０１４８】
異なる成分の効果の発現およびその効果の継続期間は相補的なものであるため、本発明の幾つかの化合物の併用もしくは他の化学療法剤の使用では、個々の成分の必要とされる用量を減らしてもよい。そのような併用療法において、異なる有効物質を一緒にまたは別々に、１日以内に同時にまたは異なる時に送達してよい。本発明の化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するために細胞培養または実験動物での標準的な薬学操作により決定してよい。大きな治療指標を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してよいが、副作用を低減するために、化合物を所望の部位に向けさせる送達システムを設計するように注意しなければならない。
【０１４９】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを用いて、ヒト使用ために広い用量を処方してよい。任意のサプリメントの用量もしくはサプリメント内の任意の成分の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は使用される投薬形態および利用される投与経路に基づきながら、この範囲内で変化させてよい。本発明の物質に関して、治療効果のある投与量は、最初に細胞培養アッセイから予想してよい。投与量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方してよい。そのような情報はヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決定するために用いてよい。血漿中のレベルは例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定してよい。
【０１５０】
（ＶＩＩＩ．レセプターカップリング剤の併用療法での使用）
一部の実施形態において、本発明は、癌を治療し、および／または腫瘍増殖を阻害するために、化学療法剤と組み合わせたレセプターカップリング剤の使用をさらに提供する。同様に、多様な化学療法剤のいずれもを、本発明の方法に使用しても、または該方法に使用するために試験してもよい。そのような化学療法剤として、代謝拮抗剤、アルキル化剤、白金系製剤、アントラサイクリン類、抗生物質製剤、トポイソメラーゼ阻害剤等が挙げられる。化学療法剤および／または他の生物活性剤の多様な形態を用いてよい。これらには、限定するものではないが、腫瘍に移植、注入、さもなければ挿入された場合に生物活性化される非電荷分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミド等の形態が含まれる。
【０１５１】
本発明のレセプターカップリング剤と組み合わされて用いられるか、複合体（例えば、免疫毒素複合体）の形で用いられる化学療法剤は、それらが癌細胞内でどのように特定の化学物質に影響を与えるか、どの細胞活性またはプロセスに医薬が干渉するか、および細胞周期のどの特定の相に医薬が影響を与えるかに基づいて幾つかの種類に分けることができる。
【０１５２】
ある実施形態では、化学療法剤は、ＤＮＡ合成を中断させる物質である。１つの実施形態において、ＤＮＡ合成を中断させる物質はヌクレオシドアナログ化合物である。ある実施形態では、ヌクレオシドアナログ化合物はゲムシタビンである。別の実施形態において、ＤＮＡ合成を中断させる物質はアントラサイクリン化合物であり、ある実施形態では、アントラサイクリン化合物はアドリアマイシンである。
【０１５３】
他の実施形態において、化学療法剤はトポイソメラーゼＩ阻害剤である。ある実施形態において、トポイソメラーゼＩ阻害剤はＣａｍｐｔｏｓａｒである。
【０１５４】
他の実施形態における化学療法剤はアルキル化剤であってよい。アルキル化剤は直接ＤＮＡに作用して癌細胞が再生するのを妨げる。薬物群として、これらの物質は期に特有でない（言い換えると、それらは細胞周期のすべての期で作用する）。アルキル化剤は、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、および肺、胸（乳）および卵巣のある種の癌に対して一般に活性がある。アルキル化剤の例として、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびメルファランが挙げられる。１つの実施形態において、アルキル化剤はプラチナ化合物であり、ある実施形態においてカルボプラチンとシスプラチンからなる群から選択してよい。ある実施形態では、プラチナ化合物はシスプラチンである。
【０１５５】
さらに他の実施形態において、化学療法剤は植物アルカロイドであってよい。１つの実施形態において、植物アルカロイドはタキサンであり、ある実施形態においてタキソールであってよい。
【０１５６】
腫瘍の阻害が起こることを決定するために化学療法剤と組み合わせて候補レセプターカップリング剤を試験する方法は、参考としてその全体がここに援用される出願人の同時係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１２４３号に教示されている。
【０１５７】
別の態様において、本発明は、細胞毒、医薬または放射性同位元素等の別の治療的部分に複合体化させた修飾抗体および抗体複合体またはそれらのフラグメントを特徴とする。修飾抗体という用語はまた、例えば、抗体の一部を欠失、付加または置換することにより修飾したモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体を含むことも意図する。例えば、定常領域を欠失させ、それを抗体の半減期、例えば、血清半減期、安定性または親和性を増加するように意図された定常領域に置換することにより抗体を修飾することができる。
【０１５８】
例示的な放射性同位元素として、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、ｌ６６Ｈｏ、ｌ７７Ｌｕ、ｌ８６Ｒｅ、およびｌ８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は、核ＤＮＡ中に複数のストランド破壊を引き起こして、細胞死を導く電離放射線を生成することによって作用する。治療複合体を生成するために用いられる同位元素は、通常、短い経路の長さを有する高エネルギーαまたはβ粒子を生成する。そのような放射性核種はそれが近接する細胞、例えば、複合体が付着したか、またはそれが入った新生細胞を殺す。それらは非局所化された細胞にほとんどまたは全く影響を与えない。放射性核種は本質的には非免疫原性である。
【０１５９】
本発明と組合せた放射線標識複合体の使用に関して、本発明のポリペプチドを（例えばヨウ素化により）直接標識してもよく、またはキレート剤の使用により間接的に標識してもよい。本明細書に使用されるように、「間接的な標識」と「間接的な標識アプローチ」との語句はともにキレート剤が抗体に共有結合し、少なくとも１つの放射性核種がキレート剤に会合していることを意味する。そのようなキレート剤はポリペプチドと放射性同位元素の両方に結合するので、通常は二官能性キレート剤と呼ばれる。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシクマトベンジル−３−メチルジオチレントリアミンペンタ酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）とシクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤はＰ−ＤＯＴＡとＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的な標識に特に好ましい放射性核種として１１１Ｉｎと９０Ｙが挙げられる。
【０１６０】
細胞毒に複合化すると、これらの抗体複合体は「免疫毒素複合体」と呼ばれる。細胞毒または細胞傷害薬として、細胞に有害である（例えば、殺す）か、細胞の増殖を阻害する任意の物質が挙げられる。具体例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、腫瘍活性化プロドラッグ（例えば、メイタンシノイド類（例えば、米国特許６，４４１，１６３号に記載されているＤＭ−１）、ピューロマイシンとそのアナログまたホモログ、ドラスタチン１０またはそのアナログ（例えば、オーリスタチンＥ（ＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））が挙げられる。また、治療薬として、例えば代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデルカルバジン）、アルキル化剤、（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（旧名、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ＣＣ−１０６５アナログ、クリケアミシン（ｃｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）誘導体、アントラマイシン類、ビンカアルカロイド等）、リシン、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素も挙げられる。本発明の抗体に複合化できる治療的細胞毒素の他の例としてカリケアミシン類とデュオカルミシン類が挙げられる。
【０１６１】
特定の実施形態において、本発明のヒト抗体はメイタンシノイドまたはその誘導体と複合化することにより免疫毒素複合体を形成する。米国特許６，４４１，１６３号は、ジスルフィド化学を用いて、メイタンシノイド類およびメイタンシノイド類の誘導体を抗体に複合化する方法を記載する。簡単に説明すれば、複合体を生成する１つの方法において、ジスルフィド部分を有する過剰量のメイタンシノイド化合物を水溶液中で抗体と混合する。反応物を過剰なアミンで急冷し、抗体複合体をゲルろ過により精製する。
【０１６２】
本発明の抗体複合体は所定の生物学的応答を修正するために用いることができ、医薬の部分は伝統的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、医薬の部分は所望の生物活性をプロセシングするタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質として、例えば、酵素的に活性のある毒素またはその活性のあるフラグメント（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、破傷風トキソイドまたはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γ）；または生物学的反応修飾物質（例えばリンフォカイン類、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子）が挙げられることがある。診断用途のために、抗体は簡単な単離または検出のために、ある部分（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射活性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ）を含んでよい。抗体はその血清半減期を延ばすことのできる部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分および免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメント（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の一部、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域）を含んでもよい。
【０１６３】
抗体に対するそのような治療的部分の複合体化技術は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）およびＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０１６４】
（ＩＸ．キット）
本発明は多様な癌を治療するためのキットを提供する。例えば、キットは１つ以上の上記の薬学的組成物と任意にそれらの使用説明書を含んでよい。さらに別の実施形態において、本発明は、１つ以上の薬学的組成物およびそのような組成物の投与を達成するための１つ以上のデバイスを含むキットを提供する。例えば、本発明のキットは薬学的組成物および組成物の癌性腫瘍への直接的な動脈内注入を達成するためのカテーテルからなってよい。他の実施形態において、本発明のキットは、送達デバイスとの使用のために任意に医薬として処方されるか、または凍結乾燥されたレセプターカップリング剤の前もって充填されたアンプルを含む。
【０１６５】
本発明を、限定すべきと見なされるべきではない下記実施例によりさらに説明する。本出願に全体にわたり引用されるすべての参考文献、特許および公開された特許出願ならびに図面および配列表の内容を、参考のためにここに援用する。
【実施例】
【０１６６】
（実施例１：腫瘍細胞死を誘導する多価抗ＴＮＦアゴニスト物質の有効性）
複数の抗ＴＮＦレセプター抗体を同時に用いて結腸癌細胞に細胞死を引き起こして、２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターの活性化がレセプターアゴニスト物質の有効性を向上するかどうか決定した。その結果は、複数の抗体が、腫瘍細胞の殺傷に対して単一の種類の抗ＴＮＦ抗体の投与に比べて、より効果的であることを示す。
【０１６７】
ＴＮＦファミリーレセプターＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲそれぞれに対するアゴニスト抗体１４Ａ２およびＣＢＥ１１をアッセイに用いた。モノクローナルマウス抗ＬＴβＲ抗体ＣＢＥ１１はＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２７８８および米国特許第６，３１２，６９１号に既に記載されており、ヒト化ＣＢＥ１１はＷＯ０２／３０９８６に記載されている。
【０１６８】
抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体はＴＮＦ分野で周知であり、１４Ａ２に類似した抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が記載されている（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら，（２００１）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：９５４；Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉ，Ａ．ら，（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：４８９１）。抗体１４Ａ２を得るために、簡単には、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｉｇ融合タンパク質によるマウスの免疫化による標準的なハイブリドーマ技術により抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｍＡｂを作った。続いて、ハイブリドーマをＴＲＡＩＬ−Ｒ２部分に対する結合に関してスクリーニングした。そのような１つの抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ハイブリドーマである１４Ａ２がＦＡＣＳ分析でＷｉＤｒ結腸直腸腺癌細胞に結合した。１４Ａ２は、抗マウスＩｇＦｃドメイン捕捉抗体を経てプラスチック表面上に固定化された場合に腫瘍細胞死を誘導しうるｍＡｂと同定された（図１ｂ、黒四角を参照）。
【０１６９】
ＴＮＦレセプターであるＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲを活性化する併用効果を決定するために、結腸癌ＷｉＤｒ細胞を、可溶性マウス抗体ＣＥＢ１１のみ、１４Ａ２のみ、およびＣＢＥ１１と１４Ａ２の組み合わせに曝した。ＷｉＤｒ細胞を、８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いる４日のＭＴＴアッセイに用いた。ＷｉＤｒ細胞を、培養培地に加えられた抗ＬＴβＲ  ｍＡｂ  ＣＢＥ１１（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら，（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：８６７）または１４Ａ２とともに培養した場合に、細胞増殖の比較的制限された阻害が観察された。しかし、表２ａに示されるように、抗ＴＮＦレセプターマウス抗体ＣＢＥ１１および１４Ａ２の組み合わせはさらに効果的であった。同様に、抗ＣＢＥ１１は同様なアッセイでＴＮＦ活性を増強することができた（Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．ら，（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：３２９９）。よって、２つのＴＮＦファミリーレセプターを同時に活性化するときのマウス抗体ＣＢＥ１１および１４Ａ２の組み合わせは抗体単独よりも腫瘍細胞の死滅にさらに効果的であった。
【０１７０】
（実施例２：二重特異性ＴＮＦレセプターカップリング剤の構築）
少なくとも２つの別個のＴＮＦレセプターを活性化させるカップリング剤が個々の活性化部分よりも改良された有効性を有するかどうかを決定するために、２つの別個のＴＮＦファミリーレセプター、例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲに結合する二重特異性多価抗体の形のレセプターカップリング剤が生成された。ＣＢＥ１１および１４Ａ２エピトープ結合ドメインを含む二重特異性多価抗体を構築した。
【０１７１】
抗ｈｕ  ＴＲＡＩＬＲ２／抗ｈｕ  ＬＴβＲ二重特異性抗体（ＬＴ−ＢＳ１と命名）は下記のように構築した。１４Ａ２免疫グロブリン重鎖および軽鎖の抗体可変領域は１４Ａ２ハイブリドーマを用いるＰＣＲにより決定した。次に、可変領域を定常ヒト軽鎖領域に結合して完全なキメラマウス−ヒト１４Ａ２軽鎖を形成した。キメラ１４Ａ２軽鎖を、ヒトκ定常領域に融合させたマウスλ軽鎖の可変領域を用いて構築した。次に、λ−κ軽鎖を二重特異性抗体の構築に用いた。重鎖可変領域を、ＣＢＥ１１のＣ末端Ｆｖフラグメントを有するヒトＩｇＧ１重鎖の非可変領域に結合させた。単鎖Ｆｖタイプのヒト化ＣＢＥ１１の構築はＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３９３（ＷＯ０４／０５８１９１）に既に記載されている。したがって、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＬＴ−ＢＳ１重鎖は、Ｃ末端に融合した改変ｈｕＣＢＥ１１  ｓｃＦｖを有する抗ｈｕＴＲＡＩＬＲ２  １４Ａ２−ｈｕＩｇＧ１重鎖（配列番号１および配列番号２）を含み、一方でＨｅｒｃｕｌｅｓ軽鎖はキメラ１４Ａ２−ｈｕκ軽鎖である（配列番号３および配列番号４）。ＬＴ−ＢＳＩ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ構築物の配置図を図９に示す。ＬＴ−ＢＳ１抗体構築物のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を配列番号５〜８に示す。
【０１７２】
ＣＨＯ細胞の重鎖と軽鎖の共発現は、ここでは単純にＬＴ−ＢＳ１と呼ばれる１４Ａ２／ＣＢＥ１１二重特異性分子（ＬＴβＲ／ＴＲＡＩＮ−Ｒ２二重特異性−１）の産生をもたらした。ＬＴ−ＢＳ１を培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。サイズ排除クロマトグラフィーにより検出可能な凝集体は存在しなかった。
【０１７３】
（実施例３：二重特異性ＴＮＦ−レセプターカップリング剤の腫瘍細胞死を誘導する有効性）
図１に示されるように、元のマウス１４Ａ２およびＣＢＥ１１の両モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はプラスチックに固定化（捕捉）された場合にＨＴ２９細胞増殖を阻害することができた。しかし、溶液中の両抗体ともに弱い有効性を示しただけであった。２つの個々のｍＡｂとしてともに結合させた場合、ＬＴβＲおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２の同時活性化は増殖阻害活性を図２ａに示すように増強した。したがって、両抗体を２つの別個のＴＮＦファミリーレセプターに結合させることにより達成された高い効力が存在した。
【０１７４】
ＬＴ−ＢＳ１構築物は、図２ｂに示されているように、２つの個々のｍＡｂの組み合わせと同じく効力があった。２つのｍＡｂは１つの分子的存在へと結合させたときでも活性があり、さらなる利点のために抗レセプターｍＡｂｓを２つの別個のＴＮＦファミリーメンバーに結合させる原理を明らかにしていることがＬＴ−ＢＳ１構築物により示された。
【０１７５】
二重特異性ＬＴ−ＢＳ１抗体の効力をさらに調べるために、精製ＬＴ−ＢＳ１を、標準的なプロトコールにしたがってＨＴ２９またはＷｉＤｒの３〜４日増殖アッセイに用いた。ＷｉＤｒは類似の挙動を有するＨＴ２９変異系である。ＬＴ−ＢＳ１は、ＬＴβＲに向けられた多価抗体と並行してＷｉＤｒ細胞中で調べた。使用された抗ＬＴβＲ抗体はＬＬ−ＭＳ１（ＣＢＥ１１抗原認識部位を含む一重特異的抗体）およびＬＬ−ＢＳ１（ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０抗原認識部位を含む二重特異性抗体）であった。ＬＬ−ＭＳ１およびＬＬ−ＢＳ１構築物の説明と配列は、参考のためにここに援用される本出願人の同時係属ＰＣＴ出願ＷＯ０４／０５８１９１に記載されている。図３に示されているように、ＬＴ−ＢＳ１はＷｉＤｒ結腸癌細胞において細胞死を誘導することができ、結腸癌細胞においてＬＬ−ＭＳ１とＬＬ−ＢＳ１構築物の効力に匹敵する効力を示した。
【０１７６】
興味深いことに、ＬＴ−ＢＳ１と、ＣＢＥ１１／１４Ａ２組み合わせとを比較して類似の結果が得られたＷｉＤｒ結腸癌細胞株での増殖試験とは対照的に、ＬＴ−ＢＳ１は、ＬＴ１７４Ｔ結腸癌細胞株で細胞死を誘導するのにＣＢＥ１１／１４Ａ２組み合わせよりも効果的であった。図４に示されるように、マウスＣＢＥ１１と１４Ａ２の組み合わせのみが細胞死にほとんど効果を持たなかった一方で、ＩＦＮγと組み合わされたＬＴ−ＢＳ１またはＬＴ−ＢＳ１への曝露は細胞の生存に著しい減少をもたらした。
【０１７７】
２つの別々のマウスｍＡｂの組み合わせよりも改良されたＬＴ−ＢＳ１の効力を表１および図５〜８に示されるように多様な細胞株を用いてさらに調べた。増殖アッセイは、標準的な４日のＭＴＴ増殖アッセイプロトコールにしたがって可溶性抗体を用いる８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγの存在下または非存在下で実施した。子宮頸癌や乳癌細胞株を含む一連の腫瘍タイプを調べた。
【０１７８】
その結果は、ＬＴ−ＢＳ１は親ｍＡｂであるＣＢＥ１１および１４Ａ２のみまたはそれらの組み合わせよりも広い範囲の腫瘍に対して効果的であったことを示している。ＬＴ−ＢＳ１の活性は、ＨＴ２９およびＷｉＤＲ腫瘍系等の一部の細胞株においてＩＮＦγの存在に依存し、これはこの細胞タイプによるＴＮＦファミリーレセプター活性化に特有であった。しかし、一部の腫瘍タイプに対する有効性はＩＦＮγ添加に依存しなかった。ＷｉＤｒ／ＨＴ２９によってでさえＩＦＮγが要求されることは絶対的ではなく、例えば、良好な抗腫瘍有効性が、外因性のＩＦＮγが完全に存在しないインビボ異種移植片腫瘍モデルでのＨＴ２９中の抗ＬＴＢＲｍＡｂにより観察された（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７）。ＬＴ−ＢＳ１の抗腫瘍活性の増強範囲は、ＴＮＦファミリーレセプターの多様な組み合わせが独自の活性を有しうるとの原理を示している。この増強活性は個々の親ｍＡｂの活性からは予想されないだろう。
【０１７９】
【表１】
2007530588.tif 000003
ＭＥ１８０およびＭＤＡ２３１は反応性の異なるパターンを示す頚部細胞株と乳癌細胞株を示す。両腫瘍細胞株はＣＢＥ１１または１４Ａ２ｍＡｂのいずれか単独に対しても、もしくは強力なＬＴβＲアゴニスト五量体ＣＢＥ１１（ＣＢＥ１１ｐ）にも応答しなかった；しかし、二重特異性ＬＴ−ＢＳ１は、図５（ＭＥ１８０頚部細胞株）および６（ＭＤＡ３２１乳癌細胞株）に示されているように、インビトロ培養で増殖を低減するのに非常に効果的であった。ＬＴ−ＢＳ１活性はＭＥ１８０頚部細胞株でＩＦＮγにより増強したが、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１での効力はＩＦＮの存在により達成されなかった。
【０１８０】
Ｈｅｌａ子宮頚部細胞癌細胞も図７に示されているように分析した。Ｈｅｌａ細胞を用いて、ＬＴ−ＢＳ１構築物は細胞死を誘導するのにマウスＣＢＥ１１か１４Ａ２単独またはそれらの組み合わせよりも効力があることを示した。
【０１８１】
細胞株の異なるタイプおよびそれぞれの細胞株におけるＬＴ−ＢＳ１の有効性の比較を、ＣＢＥ１１の五量体形（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３９３、ＷＯ０４／０５８１９１に記載されたＣＢＥ１１ｐ）に比較して図８に示す。要約すれば、ＬＴ−ＢＳ１はＣＢＥ１１ｐよりもはるかに有効であった。
【０１８２】
上記の結果に基づけば、二重特異性構築物ＬＴ−ＢＳ１は、腫瘍細胞内で細胞死を誘導するのに、各抗体のみを組み合わせて導入するよりも効果的であった。いずれかのレセプターの二量体化は不十分であったため、二重特異性構築物は新規なシグナル変換事象を導き、および／またはレセプターの１つの位置を変えてシグナル伝達をより効果的にするのであろう。二重特異性ＬＴ−ＢＳ１構築物の向上した有効性は新規な事象が誘導されたことを示している。
【０１８３】
個々のｍＡｂである１４Ａ２およびＣＢＥ１１よりも高いＬＴ−ＢＳ１の有効性は上記の機構（すなわち、新規なシグナル変換複合体の組み立てまたはレセプターの改変配置）から生じえる。別の可能性のある機構はＬＴ−ＢＳ１のオリゴマー化／凝集から起こりえて、それ自体として、有効性（感受性細胞による）を高めたＣＢＥ１１五量体形またはオリゴマー１４Ａ２抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｍＡｂに似ている。精製ＬＴ−ＢＳ１の生化学的分析は、それがフリーザーからの新しいものでも、４℃で５ヶ月後のものでも検出可能な高分子量形を有さないことを示した。
【０１８４】
（実施例４：ＴＮＦレセプターの架橋）
２つのレセプター間の架橋、すなわち、レセプターカップリング剤を用いて両レセプターを組み合わせることが活性を高めることを示すために、レセプター−免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質をレセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１と前もって混合して、レセプター−Ｉｇ融合物がＬＴ−ＢＳ１活性をブロックするかどうかを決定した。ＬＴＢＲ−ＩｇまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＩｇのいずれかをＬＴ−ＢＳ１に前もって混合して構築物の一面を中和することが活性を同様にブロックすることを予想した。実験は３種類の腫瘍系ＷｉＤｒ、ＭＥ１８０およびＭＤＡ２３１を用いて実施した。すべての３例で、両レセプター−Ｉｇ融合物（ＬＴβＲまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）がＬＴ−ＢＳ１活性の効果的なブロッカーであった。さらに、溶液中の単一のｍＡｂは不活性であった（ただし、可溶性のＣＢＥ１１のみがＷｉＤｒに対して比較的弱い活性を有し、これがこのｍＡｂを臨床研究のために選択するための基礎とした）。この実験は、レセプターカップリング剤による２つのＴＮＦレセプターの架橋は増強活性をもたらすことを示す。
【０１８５】
（実施例５：さらなるＴＮＦ−ファミリーレセプター対の設計と試験）
結合レセプター剤の別の例は、ＴＷＥＡＫのレセプターであるヒトＦｎ１４レセプターに対する物質である。ヒトＦｎ１４レセプターに対する抗体は野生型マウス、またはＦｎ１４レセプター欠損マウスまたは他の種の、組換えＦｎ１４−Ｆｃ融合タンパク質または可溶性Ｆｎ１４による免疫化により調製する。ハイブリドーマは慣用の方法で調製し、Ｆｎ１４結合に関してスクリーニングを行う。
【０１８６】
作動性ＴＮＦｍＡｂはＮＦｋΒ活性化の分析により同定する。Ｆｎ１４の場合、ＮＦｋΒ活性化はＩＬ−８または他のケモカインの放出を導き、これが単純な細胞ベースのスクリーニング方法を形成する。抗体がアゴニスト性であるかどうかを決定するために、モノクローナル抗体を溶液に加えるか、プラスチックに固定化する。抗体を加えると、ケモカインの放出がレセプター活性化を示す。もしくは、ＮＦｋΒ活性化をモニターするための広い範囲のレポーター細胞株が現在市販されており、または容易に構築できる。抗体が活性化するかどうかを決定する別の方法として、死のプログラムの誘導を試験するために通常用いられる細胞増殖おおび細胞死およびカスパーゼ活性化のアッセイが挙げられる。
【０１８７】
アゴニスト抗体が標準的なスクリーニング技術により同定されたら、Ｉｇ分子をコードするＲＮＡの配列決定を行い、これらのｍＡｂの組換え形を設計することができる。ＣＢＥ１１  ｓｃＦｖ構築物を作動性Ｆｎ１４  ｍＡｂ配列のＣ末端に付加し、そのような二重特異性な形の抗Ｆｎ１４−抗ＬＴＢＲ組み合わせを発現させて、プロテインＡクロマトグラフィーにより単離する。元のマウスＦｃを用いるか、または元の抗Ｆｎ１４  ｍＡｂをヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを有するキメラｍＡｂに変換する。もしくは、作動性抗Ｆｎ１４  ｓｃＦｖを設計し、キメラ形の抗ＬＴＢＲ、例えばＣＢＥ１１に付加する。
【０１８８】
Ｆｎ１４およびＬＴＢＲ等の２つの別個のＴＮＦレセプターに向けられた二重特異性抗体が構築されたら、得られたタンパク質を、両レセプターを発現する腫瘍系に対する活性に関してインビトロで試験する。相加または相乗活性を、異種移植片移植における腫瘍に対する二重特異性のインビボ試験を用いて確認する。そのようなレセプターペアリングが適当な頻度、すなわち集団中で５〜３０％を超えて起こるのかどうかを決定するためにヒト腫瘍データベースをスクリーニングする。適当な頻度で腫瘍を標的化する上記のような活性物質がヒト試験のための候補物である。
【０１８９】
（実施例６：腫瘍治療のための潜在的なＴＮＦファミリーレセプター対の選択）
特定の腫瘍タイプ、例えば管状浸潤性乳癌上に発現するこれらのレセプターを発見するために既存の公の遺伝子発現データベースに対してクエリーを行う。レセプター（例えばＬＴβＲおよびＲＡＮＫ）の腫瘍特異的な対が選択され、微小血管系および肝臓細胞等の重大な細胞種に豊富に発現していないレセプターは優先順位が低い。
【０１９０】
インビトロアッセイを用いて予測法をさらに検証する。例えば、ＬＴ−ＢＳ１構築物は上で規定するようにＭＤＡ２３１等の腫瘍細胞を殺しうる。別の例において、ＬＴ−ＢＳ１を初代内皮細胞の培養物に加え、次に内皮活性化の証拠を幾つかの方法で調べる。最初に、これらの細胞からのケモカイン放出はシグナル伝達能力の指標として役立つため、これを調べる。内皮細胞の炎症促進性活性化は、白血球付着および交換を促進する多様な付着分子の誘導された表示をともなう。Ｅセレクチン、ＶＣＡＭおよびＩＣＡＭはそのような分子であり、それらの誘導後にＦＡＣＳ分析を行う（例えば、Ｈｏｃｈｍｎａら（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ４６：２２０を参照）。ＬＴ−ＢＳ１は内皮細胞を効率的に活性化しないようである。対照的に、ＴＮＦは強力な炎症促進性シグナルであり、それはこれら３種類のすべての分子の発現を上方調節する。チップ技術を用いる遺伝子発現分析も有効に使用して、これらの新規な二重特異性抗体が特異で潜在的に有害な結果を有するかどうかのさらに詳細な状況を得る。上皮活性化および上皮細胞または肝細胞の細胞死は負の指標である。
【０１９１】
内皮細胞または肝細胞上の減少した発現に関して有利な予測と結び付けられる独自の腫瘍指向性のレセプター組み合わせを発見するためのプロファイリングを用いることにより、選択プロセスを最適化する。選択物はインビトロ腫瘍増殖アッセイならびに内皮活性化と生存性とのアッセイを使用することにより検証する。
【０１９２】
（等価物）
当業者は、詳細な発明の説明で記載された発明は本発明の精神と範囲から離れることなく多くの修正と変更を行ってよいことを認識する。ここに提供される実施例は単に例示であって、添付の請求の範囲に示された発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【０１９３】
ここに示された全ての出版物や特許はそれら個々の出版物や特許が具体的かつ個々に示されて参考のために援用されているかのごとくそれら全体が参考のためにこの明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１は、ＷｉＤｒ細胞４日増殖アッセイの結果をグラフで示す。結果は、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体１４Ａ２および抗ＬＴβＲ抗体ＣＢＥ１１がともにアゴニスト活性によりＷｉＤｒ死を誘導できたことを示す。
【図２】図２は、ＷｉＤｒ結腸癌細胞における４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。結果は、二重特異性ＬＴβＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体（ＬＴ−ＢＳ１）が個々の親抗体ＣＢＥ１１と１４Ａ２（図２ａ）よりも高い細胞死活性（図２ｂ）を有することを示す。
【図３】図３は、ＬＴβＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２二重特異性抗体（ＬＴ−ＢＳ１）を４価ＬＴβＲ二重特異性抗体ＬＬ−ＢＳ１（抗体ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０）およびＬＬ−ＭＳ１（抗体ＣＢＥ１１）と比較した、ＷｉＤｒ結腸癌細胞における８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いる４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。
【図４】図４は、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞における８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いるか、用いない４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。その結果は、レセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１および抗体１４Ａ２およびＣＢＥ１１の結腸癌細胞（ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞）増殖を阻害する有効性を示す。
【図５】図５は、ＭＥ１８０腫瘍細胞における８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いるか、用いない４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。その結果は、レセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１および抗体１４Ａ２およびＣＢＥ１１の子宮頚部癌細胞（ＭＥ１８０腫瘍細胞）増殖を阻害する有効性を示す。
【図６】図６は、ＭＤＡ２１３腫瘍細胞における８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いるか、用いない４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。その結果は、レセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１および抗体１４Ａ２およびＣＢＥ１１の乳癌細胞（ＭＤＡ２３１腫瘍細胞）増殖を阻害する有効性を示す。
【図７】図７は、Ｈｅｌａ腫瘍細胞における８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いるか、用いない４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。その結果は、レセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１および抗体１４Ａ２および抗体ＣＢＥ１１のＨｅｌａ頚部癌細胞増殖を阻害する有効性を示す。
【図８】図８は、乳癌、頚部癌および直腸癌を含む一連の腫瘍細胞株における８０Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを用いる４日ＭＴＴ増殖アッセイの結果をグラフで示す。その結果は、レセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１および五量体ＣＢＥ１１抗体の乳（Ａ、Ｂ）、頚部（Ｃ）および結腸（Ｄ）を含む多様な種類の癌細胞の増殖を阻害する有効性を示す。
【図９】図９は、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体１４Ａ２およびＬＴβＲ  ｓｃＦｖ抗体ＣＢＥ１１からなるレセプターカップリング剤ＬＴ−ＢＳ１構築物（縞模様）の概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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