(57)【要約】  繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドは、免疫介在性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防、及び／又は治療に有用である。ＦＨＡは、自己抗原若しくは外来抗原、又はそのペプチドを含み得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫介在性疾患の予防及び／又は治療のための、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤の使用。
【請求項２】
自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤の使用。
【請求項３】
繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ若しくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｅｔｉｃａ）若しくはパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は他の細菌からの関連分子に由来する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
上記薬剤が、ＦＨＡ若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
上記薬剤が、ＦＨＡと、自己抗原若しくは外来抗原、又はそれらのペプチドとの組合せを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
上記薬剤が自己抗原に応答したＴｒ細胞の生成を促進する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ＦＨＡが、インビボで、共投与された自己抗原又は外来抗原に対するＴｒ細胞の誘導を促進するように免疫調節剤として作用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
上記自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原、並びに動物性抗原としてホコリダニ抗原及びネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶反応に関与する抗原、並びに変異したペプチドのリガンドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
上記移植拒絶反応に関与する抗原は、レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
上記自己抗原は、ミエリンタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質及びコラーゲン並びにそれらのペプチドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
上記ミエリンタンパク質はミエリン塩基性タンパク質又はそのペプチドである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
上記ミエリン塩基性タンパク質はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
上記ミエリン塩基性タンパク質はＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記薬剤がプロ炎症性サイトカインの産生を調節する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
上記薬剤が抗炎症性サイトカインの誘導を促進する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
先天性免疫システムに関与する細胞に対するＦＨＡの免疫調節効果が、トル様受容体リガンドとの同時活性化によって向上される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
上記トル様受容体リガンドは、ＬＰＳ、又はＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＰａｍ３Ｃｙｓから選択される任意の一つ又はそれ以上である別のトル様受容体リガンドである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ＦＨＡが、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生を促進する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
ＦＨＡが、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−６の産生を促進する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
ＦＨＡが、ＬＰＳと相乗作用して、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６の産生を促進する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
ＦＨＡが、ＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を誘導する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ＦＨＡが、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、又は他の炎症性メディエータを抑制する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
上記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２７のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
上記炎症性ケモカインは、マクロファージ炎症性タンパク質−１α又はマクロファージ炎症性タンパク質−１βである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
ＦＨＡが、樹状細胞が亜成熟の表現型に成熟することを促進する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
ＦＨＡが、ＴＬＲ−リガンドとの同時活性化の後に樹状細胞の成熟を促進する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
ＦＨＡが、ＴＬＲ−リガンドにより誘導された樹状細胞の活性化を抑制する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
ＦＨＡが実質的にエンドトキシンを含まない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
ＦＨＡが、免疫調節剤、アジュバント、免疫治療薬、又は抗炎症薬の形態である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
上記薬剤が感染又は外傷によって誘導される炎症性サイトカインの産生を調節する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
上記免疫介在性疾患は、敗血症、又は感染、外傷若しくは損傷によって惹起される急性炎症である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
上記免疫介在性疾患は多発性硬化症である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
上記免疫介在性疾患は、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、関節リウマチ及び乾癬のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
上記免疫介在性疾患は大腸炎である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の使用
【請求項３５】
上記免疫介在性疾患は喘息又はアトピー性疾患である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
上記薬剤が、経口、鼻腔内、静脈内、経皮、皮下又は筋内投与用の形態である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
上記薬剤の反復投与を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと抗原との組合せを含み、該抗原は、自己抗原及び外来抗原から選択される製品。
【請求項３９】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、ＴＬＲリガンドとの組合せを含む製品。
【請求項４０】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、ＴＬＲリガンド及び自己抗原との組合せを含む製品。
【請求項４１】
上記ＴＬＲリガンドは薬剤的に許容されるＴＬＲリガンドである、請求項３９又は４０に記載の製品。
【請求項４２】
上記ＴＬＲリガンドは、ＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＰａｍ３Ｃｙｓのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４３】
ＦＨＡは、その誘導体、変異体、変異体若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４４】
上記自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原、並びに動物性抗原としてホコリダニ抗原及びネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶反応に関与する抗原、並びに変異したペプチドのリガンドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４５】
上記移植拒絶反応に関与する抗原は、レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含む、請求項４４に記載の製品。
【請求項４６】
上記自己抗原は、ミエリンタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、及びコラーゲン並びにそれらのペプチドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４７】
上記ミエリンタンパク質はミエリン塩基性タンパク質又はそのペプチドである、請求項４６に記載の製品。
【請求項４８】
上記ミエリン塩基性タンパク質はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドである、請求項４７に記載の製品。
【請求項４９】
上記ミエリン塩基性タンパク質はＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項４８に記載の製品。
【請求項５０】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５１】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを、自己抗原又は外来抗原による免疫のためのアジュバントとして含む医薬組成物。
【請求項５２】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと抗原との組合せを含み、該抗原は、自己抗原及び外来抗原から選択される医薬組成物。
【請求項５３】
ＦＨＡは、その誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項５４】
上記自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原、並びに動物性抗原としてのホコリダニ抗原及びネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶反応に関与する抗原、並びに変異したペプチドのリガンドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
上記移植拒絶反応に関与する抗原は、レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含む、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
上記自己抗原は、ミエリンタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、及びコラーゲン並びにそれらのペプチドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
上記ミエリンタンパク質はミエリン塩基性タンパク質又はそのペプチドである、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
上記ミエリン塩基性タンパク質はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドである、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
上記ミエリン塩基性タンパク質はＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、ＴＬＲリガンドとの組合せを含む医薬組成物。
【請求項６１】
上記ＴＬＲリガンドは薬剤的に許容されるＴＬＲリガンドである、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む、免疫調節剤。
【請求項６３】
免疫調節効果を有する、組み換えＦＨＡ。
【請求項６４】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含むワクチン。
【請求項６５】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、抗原とを含む、請求項６４に記載のワクチン。
【請求項６６】
ＦＨＡ及び抗原が、０．０１：１〜１００：１の範囲内の重量比で存在する、請求項６５に記載のワクチン。
【請求項６７】
ＦＨＡ及び抗原が、１：１０〜１０：１の範囲内のモル比で存在する、請求項６５に記載のワクチン。
【請求項６８】
ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドに対する抗体。
【請求項６９】
実質的に純粋なＦＨＡ製剤を調製する方法であって、ＦＨＡ製剤を透析してタンパク質を変性させ、混入エンドトキシンを露出させるステップと、残留した混入エンドトキシンを除去するステップとを含む方法。
【請求項７０】
上記混入エンドトキシンはＬＰＳである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
上記エンドトキシンが洗浄剤を使用して除去される、請求項６９又は７０に記載の方法。
【請求項７２】
精製カラムを充填し、
透析されたＦＨＡ製剤を加え、
洗浄剤で洗浄し、
実質的に純粋なタンパク質を溶出するステップを含む、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、免疫介在性疾患の予防及び／又は治療方法。
【請求項７４】
繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、自己免疫疾患の予防及び／又は治療方法。
【請求項７５】
繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ若しくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｅｔｉｃａ）若しくはパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は他の細菌の関連分子に由来する、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項７６】
上記薬剤が、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
上記薬剤が、ＦＨＡと、自己抗原若しくは外来抗原、又はそれらのペプチドとの組合せを含む、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
上記薬剤が自己抗原に応答したＴｒ細胞の生成を促進する、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
ＦＨＡが、インビボで、共投与された自己抗原又は外来抗原に対するＴｒ細胞の誘導を促進するように免疫調節剤として作用する、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
上記自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原、並びに動物性抗原としてホコリダニ抗原及びネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶反応に関与する抗原、並びに変異したペプチドのリガンドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
上記移植拒絶反応に関与する抗原は、レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
上記自己抗原は、ミエリンタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、及びコラーゲン、並びにそれらのペプチドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
上記ミエリンタンパク質はミエリン塩基性タンパク質又はそのペプチドである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
上記ミエリン塩基性タンパク質はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ミエリン塩基性タンパク質はＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
上記薬剤がプロ炎症性サイトカインの産生を調節する、請求項７３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
上記薬剤が抗炎症性サイトカインの誘導を促進する、請求項７３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
先天性免疫システムに関与する細胞に対するＦＨＡの免疫調節効果が、トル様受容体リガンドとの同時活性化によって向上される、請求項７３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
上記トル様受容体リガンドは、ＬＰＳ、又はＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＰａｍ３Ｃｙｓから選択される任意の一つ又はそれ以上である別のトル様受容体リガンドである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＦＨＡが、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生を促進する、請求項７３〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
ＦＨＡが、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−６の産生を促進する、請求項７３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
ＦＨＡが、ＬＰＳと相乗作用して、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０、ＴＧＦβ及びＩＬ−６の産生を促進する、請求項７３〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
ＦＨＡが、ＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を誘導する、請求項７３〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ＦＨＡが、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、又は他の炎症性メディエータを抑制する、請求項７３〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
上記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２７のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
上記炎症性ケモカインは、マクロファージ炎症性タンパク質−１α、又はマクロファージ炎症性タンパク質−１βである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
ＦＨＡが、樹状細胞が亜成熟の表現型に成熟することを促進する、請求項７３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
ＦＨＡが、ＴＬＲ−リガンドとの同時活性化の後に樹状細胞の成熟を促進する、請求項７３〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
ＦＨＡが、ＴＬＲ−リガンドにより誘導された樹状細胞の活性化を抑制する、請求項７３〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
ＦＨＡが実質的にエンドトキシンを含まない、請求項７３〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
ＦＨＡが、免疫調節剤、アジュバント、免疫治療薬、又は抗炎症薬の形態である、請求項７３〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
上記薬剤が、感染又は外傷によって誘導される炎症性サイトカインの産生を調節する、請求項７３〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
上記免疫介在性疾患は、敗血症、又は感染、外傷又は損傷によって惹起される急性炎症である、請求項７３〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
上記免疫介在性疾患は多発性硬化症である、請求項７３〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
上記免疫介在性疾患は、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、関節リウマチ及び乾癬のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である、請求項７３〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
上記免疫介在性疾患は大腸炎である、請求項７３〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
上記免疫介在性疾患は、喘息又はアトピー性疾患である、請求項７３〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
上記薬剤は、経口、鼻腔内、静脈内、経皮、皮下又は筋内投与用の形態である、請求項７３〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
上記薬剤の反復投与を含む、請求項１０８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性免疫システムに関与する細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が機能的に独立したＴｈ１、Ｔｈ２、又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒ）のサブタイプへ分化することを誘導する。保存された微生物の分子がトル様受容体（ＴＬＲ）及びインテグリンのような病原体認識受容体（ＰＲＲ）に結合することによる未熟ＤＣの活性化は、成熟とリンパ節への定着と共に起こり、成熟したＤＣはリンパ節内でナイーブＴ細胞に抗原を提示する。病原体由来の分子によるＤＣの活性化は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が別々のＴ細胞サブタイプへ分化することの調節に重要な役割を果たす（１、２）。Ｔｈ１細胞は、細胞内感染に対する防御を提供するが、同時に炎症応答、及び自己免疫疾患にも関係する。これに対してＴｈ２細胞は、アレルギー応答に関係している。Ｔｒ細胞はＴｈ１及びＴｈ２応答を抑制する能力を有している。
【０００３】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、経過の長い重篤な疾患を起こし、度々二次感染及び肺炎を併発し、幼児では死に至る場合もある。この感染症からの回復は、百日咳菌に特異的なＴｈ１細胞の発達と関連しており、このＴｈ１細胞が細菌の呼吸器からの駆逐に重要な役割を果たす。しかしながら、肺及び局所リンパ節内での抗原特異的なＴｈ１応答は、感染症の急性期では高度に抑制されている。百日咳菌は、進化の過程で、防御免疫応答から逃れる多数の手段を獲得してきた。
【０００４】
百日咳菌由来の病原性因子である繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）は、ＬＰＳによるマクロファージのＩＬ−１２産生を抑制し、マウスの敗血症ショックモデルにおいてＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ産生を抑制し（３）、また互いに関連のない病原因子であるインフルエンザウイルスを同時に気道に感染させた際に起こるＴｈ１応答を抑制する能力を有している（４）。ＦＨＡは、基本的にはアドヘシンとして作用し、白血球応答性インテグリン（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ）及びインテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７）複合体への結合を介して百日咳菌のβ２−インテグリン（ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、αＭβ２）への結合を仲介すると考えられている（５）。ＦＨＡはまた、先天性免疫システムの細胞と相互作用することにより、百日咳菌の急性感染期において、制御活性を有するＴ細胞を誘導させてＴｈ１応答を抑制することにも寄与し得る。ＦＨＡは、ＤＣと直接的に相互作用してＩＬ−１０を誘導させ、ＬＰＳ誘導ＩＬ−１２及び炎症性ケモカインの産生を抑制する（６）。ＦＨＡとの相互作用後に生じたＤＣは、ナイーブＴ細胞からのＴｒ１細胞の分化を選択的に刺激する。急性感染したマウスの肺からは、百日咳菌由来のＦＨＡ及びパータクチン（ＰＲＮ）に特異的なＴｒ１クローンが発生した。これらのＴｒ１細胞はＩＬ−１０を高いレベルで産生し、インビトロ及びインビボで百日咳に対する防御的なＴｈ１応答を抑制した（６）。これらの発見は、防御免疫を回避するために呼吸器の病原因子によって利用されるＴｒ１細胞の新たな機能を提示するものであり、これらの制御性細胞がＤＣにより誘導され、病原因子由来の分子と相互作用した後にＩＬ−１０産生が活性化され、ＩＬ−１２が抑制されるという証拠を提供するものである。
【０００５】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系を冒す自己免疫疾患である。この疾患に罹患している人は、自己反応性のＴ細胞（自己抗原を認識するＴ細胞）を有し、これがインターロイキン（ＩＬ）−１β及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αと共に神経繊維のミエリン鞘に沿った炎症性病変の形成に関与する。ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）は活性化Ｔ細胞を含み、これが脳組織に浸潤してミエリンを破壊するという特徴的な炎症性病変を起こす。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳの動物モデルである。ＥＡＥは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）若しくはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）又はそれらのペプチドを、フロイント完全アジュバントと共に注入することによってマウス又はラット内で誘導される。この疾患はまた、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞（Ｔｈ１細胞と称される）の中でＭＢＰ又はＭＯＧに特異的なものを移入することによっても誘導され得る。動物の中枢神経系のミエリン鞘に細胞浸潤が起こり、その結果、脱髄が起こってついには麻痺を発症する。その臨床徴候及び病理学的変化は、ＭＳと類似する。
【０００６】
クローン病及び潰瘍性大腸炎は、ヒトの腸の炎症性疾患である。これら自己免疫疾患は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に仲介される腸の炎症状態である。制御性Ｔ細胞（Ｔｒ細胞）は正常な人においては自己免疫疾患の発症を防止している。ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ（ナイーブ）Ｔ細胞を注入することで重症複合性免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに大腸炎が発生し得るが、これはＣＤ４５ＲＢｌｏｗ又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の同時注入により防ぐことができる（７）。また、ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を除去すると、そのような処置を施さなければ正常であったマウス又はラットに種々の自己免疫疾患が自然に発症する（８）。
【非特許文献１】ＭｃＧｕｉｒｋ、Ｐ．、及びＫ．Ｈ．Ｇ．Ｍｉｌｌｓ．  ２００２．  Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｖｏｋｅ  ａ  ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：４５０−４５５。
【非特許文献２】Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｅ．、Ｅ．ＭｃＮｅｅｌａ、Ｍ．Ｅ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｏ．Ｌｅａｖｙ、Ｓ．Ｃ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、及びＫ．Ｈ．Ｇ．Ｍｉｌｌｓ．  ２００３．  Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｔｈ２  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：２３８４−２３９２。
【非特許文献３】ＭｃＧｕｉｒｋ、Ｐ．、Ｃ．ＭｃＣａｎｎ、及びＫ．Ｈ．Ｇ．Ｍｉｌｌｓ．  ２００２．  Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  １  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９５：２２１−２３１。
【非特許文献４】ＭｃＧｕｉｒｋ、Ｐ．及びＫ．Ｈ．Ｇ．Ｍｉｌｌｓ．  ２０００．  Ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ：  ＩＬ−１０−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：４１５−４２２。
【非特許文献５】ＭｃＧｕｉｒｋ、Ｐ．、Ｐ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．Ｒｙａｎ、及びＫ．Ｈ．Ｇ．Ｍｉｌｌｓ．  ２０００．  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８２、  １２８６−１２８９。
【非特許文献６】Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ、Ｙ．、Ｓ．Ｃｌａｕｓ、及びＤ．Ａ．Ｒｅｌｍａｎ．  １９９４．  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ＣＲ３  （ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：１２２５−１２３３。
【非特許文献７】Ａｓｓｅｍａｎ、Ｃ．、Ｍａｕｚｅ、Ｓ．、Ｌｅａｃｈ、Ｍ．Ｗ．、Ｃｏｆｆｍａｎ、Ｒ．Ｌ．及びＰｏｗｒｉｅ、Ｆ．  １９９９．  Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９０：９９５−１００４。
【非特許文献８】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ｓ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｔ．、Ｙａｍａｚａｋｉ、Ｓ．、Ｋｕｎｉｙａｓｕ．、Ｙ．、Ｉｔｏｈ、Ｍ．、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ｎ．及びＳｈｉｍｉｚｕ、Ｊ．  ２００１．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｅｌｆ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ３：９１１−８。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先天性免疫システム細胞に抗炎症性サイトカインを誘導させる方法、又はインビボでＴｒ細胞を誘導するように先天性免疫細胞を調節する方法は、炎症性疾患及び自己免疫疾患並びにアレルギーの治療に有用である可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、免疫介在性疾患の予防及び／又は治療方法が提供される。
【０００９】
本発明によれば、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、自己免疫疾患の予防及び／又は治療方法が提供される。
【００１０】
本発明は更に、免疫介在性疾患の予防及び／又は治療のための、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤の使用も提供する。
【００１１】
本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤の使用も提供する。
【００１２】
一実施態様において、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ若しくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｅｔｉｃａ）若しくはパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は他の細菌からの関連分子に由来する。関連分子は、ＦＨＡ内の配列と相同な配列を有する他の細菌からのタンパク質を含み得る。
【００１３】
本発明の一実施形態において、薬剤は、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含む。
【００１４】
一実施態様において、薬剤は、自己抗原若しくは外来抗原、又はそれらのペプチドと組合せたＦＨＡを含む。
【００１５】
本発明の一実施態様において、薬剤は、インビボで抗炎症性サイトカインの産生を促進する。
【００１６】
本発明の一実施態様において、薬剤は、自己抗原に応答したＴｒ細胞の誘導を促進する。
【００１７】
本発明の別の一実施態様において、ＦＨＡは、共投与された自己抗原又は外来抗原に対するＴｒ細胞の誘導を促進するようにインビボで免疫調節剤として作用する。
【００１８】
自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原、及び動物性抗原としてホコリダニ抗原及びネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶反応に関与する抗原、及び変異したペプチドのリガンドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上であることが好ましい。移植拒絶反応に関与する抗原は、レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含む。
【００１９】
自己抗原は、ミエリンタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、及びコラーゲン並びにそれらのペプチドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上であり得る。
【００２０】
好ましくは、ミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質又はそのペプチドである。ミエリン塩基性タンパク質は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチド、最も好ましくはＭＯＧペプチド（３５〜５５）である。
【００２１】
本発明の一実施態様において、薬剤は、炎症性サイトカインの産生を調節する。
【００２２】
一実施態様において、薬剤は抗炎症性サイトカインの誘導を促進する。
【００２３】
本発明の別の一実施態様において、先天性免疫システムに関与する細胞に対するＦＨＡの免疫調節効果は、トル様受容体のリガンドとの同時活性化により高められる。トル様受容体（ＴＬＲ）のリガンドは、ＬＰＳ、又はＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＰａｍ３Ｃｙｓのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上の他のトル様受容体リガンドであり得る。
【００２４】
本発明の一実施態様において、ＦＨＡは、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生を促進する。
【００２５】
本発明の一実施態様において、ＦＨＡは、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−６の産生を促進する。
【００２６】
本発明の更なる実施態様において、ＦＨＡは、ＬＰＳ又は他のＴＬＲリガンドとの相乗効果によって、マクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０、ＴＧＦβ及びＩＬ−６の産生を促進する。
【００２７】
本発明の一実施態様において、ＦＨＡは、ＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を誘導する。
【００２８】
別の一実施態様において、ＦＨＡは、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン又は他の炎症性メディエータを抑制する。炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２７のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上であり得る。
【００２９】
炎症性サイトカインは、マクロファージ炎症性タンパク質−１α又はマクロファージ炎症性タンパク質−１βであり得る。
【００３０】
一実施態様において、ＦＨＡは、樹状細胞が亜成熟した表現型に成熟することを促進する。
【００３１】
一実施態様において、ＦＨＡは、ＴＬＲ−リガンドとの同時活性化の後に、樹状細胞の成熟を促進する。
【００３２】
別の一実施態様にて、ＦＨＡは、ＴＬＲ−リガンドにより誘導される樹状細胞の活性化を抑制する。
【００３３】
ＦＨＡは、エンドトキシンを実質的に含まないことが好ましい。ＦＨＡは、タンパク質１μｇ当たり３００ｐｇ未満のエンドトキシンを含み得る。
【００３４】
本発明の一実施態様において、ＦＨＡは、免疫調節剤、アジュバント、免疫治療薬又は抗炎症薬の形態で存在する。
【００３５】
本発明の一実施態様において、薬剤は、感染又は外傷により誘導される炎症性サイトカインの産生を調節する。
【００３６】
別の一実施態様において、免疫介在性疾患は、敗血症、又は感染、外傷若しくは損傷によって惹起される急性炎症である。疾患は、多発性硬化症であり得る。
【００３７】
本発明の一実施態様において、免疫介在性疾患は、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、関節リウマチ及び乾癬から選択される任意の一つ又はそれ以上である。他の免疫介在性疾患は、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群から二次的に発生した乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷に対するアレルギー応答、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症（ｓｃｉｅｒｏｄｅｒｍａ）、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病リバーサル反応、ハンセン病性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、突発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、突発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、アルツハイマー病及びセリアック病の任意の一つ又はそれ以上を含む。
【００３８】
本発明の別の一実施態様において、免疫介在性疾患は、大腸炎、喘息又はアトピー性疾患である。
【００３９】
薬剤は、経口、鼻腔内、静脈内、経皮、皮下又は筋内投与用の形態で存在することが好ましい。薬剤は反復して投与され得る。
【００４０】
本発明は更に、ＦＨＡを含む免疫調節剤を提供する。
【００４１】
本発明はまた、免疫調節効果を有する組み換えＦＨＡも提供する。
【００４２】
本発明は更に、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含むワクチンを提供する。ワクチンは、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、抗原とを含み得る。
【００４３】
ＦＨＡ及び抗原は、０．０１：１〜１００：１の範囲内の重量比にて存在することが好ましい。ＦＨＡ及び抗原は、１：１０〜１０：１のモル比にて存在することが好ましい。
【００４４】
本発明はまた、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドに対する抗体も提供する。
【００４５】
本発明はまた、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと抗原との組合せを含む製品も提供し、ここで該抗原は自己抗原及び外来抗原から選択される。
【００４６】
一実施態様において、製品は、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、ＴＬＲリガンドとの組合せを含む。
【００４７】
別の一実施態様において、製品は、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドと、ＴＬＲリガンド及び自己抗原との組合せを含む。
【００４８】
ＴＬＲリガンドは、薬剤的に許容されるＴＬＲリガンドが好ましい。ＴＬＲリガンドは、ＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＰａｍ３Ｃｙｓから選択される任意の一つ又はそれ以上であり得る。
【００４９】
製品は、その誘導体、変異体、断片若しくは変種若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含み得る。
【００５０】
本発明はまた、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む医薬組成物も提供する。
【００５１】
本発明の一実施態様において、医薬組成物は、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを、自己抗原又は外来抗原による免疫のためのアジュバントとして含む。
【００５２】
別の一実施態様において、医薬組成物は、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはペプチドと抗原との組合せを含み、該抗原は自己抗原及び外来抗原から選択される。
【００５３】
ＦＨＡは、その誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド、又はそれらの物質によって活性化された細胞から産生される物質を含み得る。
【００５４】
自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、花粉としての杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原、及び動物性抗原としてホコリダニ抗原及びネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶反応に関与する抗原、及び変異したペプチドのリガンドのうちから選択された任意の一つ又はそれ以上であり得る。移植拒絶反応に関与する抗原は、レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含み得る。
【００５５】
自己抗原は、好ましくはミエリンタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、及びコラーゲン並びにそれらのペプチドのうちから選択される任意の一つ又はそれ以上である。ミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質又はそのペプチドであり得る。ミエリン塩基性タンパク質は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドであり得る。ミエリン塩基性タンパク質は、ＭＯＧペプチド（３５〜５５）であり得る。
【００５６】
一実施態様において、医薬組成物は、ＦＨＡ、又はその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドとＴＬＲリガンドとの組合せを含む。ＴＬＲリガンドは、薬剤的に許容されるＴＬＲリガンドが好ましい。
【００５７】
本発明は更に、炎症性及び／又は免疫介在性疾患の治療、及び／又は予防のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用を提供する。
【００５８】
本発明はまた、トル様受容体依存性シグナル伝達に関与する疾病又は病状の予防及び／又は治療のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用も提供する。
【００５９】
本発明はまた、喘息又はアレルギーの予防及び／又は治療のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用も提供する。
【００６０】
本発明はまた、免疫介在性疾患の予防のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用も提供する。
【００６１】
本発明はまた、多発性硬化症の予防及び／又は治療のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用も提供する。
【００６２】
本発明はまた、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、関節リウマチ、及び乾癬のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上の疾病の予防及び／又は治療のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用も提供する。
【００６３】
本発明はまた、大腸炎、炎症性腸疾患又は喘息若しくはアレルギーの予防及び／又は治療のための、ＦＨＡ、若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチドを含む薬剤、又はこの薬剤によって活性化された細胞から産生される物質を含む薬剤の使用も提供する。
【００６４】
更なる実施態様において、本発明はＦＨＡの精製方法を提供し、この方法はＬＰＳを実質的に含まないＦＨＡを提供するための方法を含む。本発明は、実質的に純粋なＦＨＡ製剤を調製する方法を提供し、この方法は、ＦＨＡの標本を透析してタンパク質を変成させ混入エンドトキシンを露出させ、残留したエンドトキシンを除去するステップを含む。エンドトキシンは、洗浄剤を使用して除去されてもよい。
【００６５】
ある場合にて、この方法は、
精製カラムを充填し、
透析されたＦＨＡの標本を加え、
洗浄剤で洗浄し、
実質的に精製されたタンパク質を溶出するステップを含む。
【００６６】
明細書全体を通して、用語「免疫介在性疾患」は、免疫応答が発病に寄与する任意の疾患であって、自己免疫疾患を含むがそれに限定されない疾患と解釈される。
【００６７】
用語「自己免疫疾患」は、自己の免疫システムによる炎症及び組織破壊を原因とするもので、自己組織の成分又は産生物に対してそれらを外来物として処理する細胞性又は体液性の免疫応答に関与する多数の互いに関連のない疾患の一つを指す。
【００６８】
本願で使用されているように、用語「誘導体、変異体、断片、変種又はペプチド」は、ＦＨＡの機能的部分から構成される任意の分子、又は巨大分子を含むものと理解される。断片、変種又はペプチドは、当業者に通常知られた技術によって調製され得る。これらはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８又はＣＤ４７／ＣＤ６１と相互作用するＦＨＡの領域に対応し、ＲＧＤモチーフを含んでもよいペプチド又は断片を含む。ＦＨＡのＲＧＤ含有領域に対応する合成ペプチドに関する先駆的なデータは、これらがマクロファージ又は樹状細胞からＩＬ−１０を誘導させ、及び／又はＩＬ−１２産生を抑制することが可能であり得ることを示唆している。
【００６９】
用語「抗原」は、抗原のレシピエント内で体液性及び／又は細胞性の免疫応答を引き起こし得る分子を指す。体液性及び／又は細胞性の免疫応答は、例えば抗原に特異的な抗体の産生、又は抗原を認識するか又は抗原に結合するＴ細胞の誘導を含み得る。本明細書全体において用語「抗原」は、抗体又はＴ細胞の受容体に特異的に結合する任意の物質を含むものと解釈される。用語「自己抗原」は、自己組織又は自己の細胞上にある、外来のものではない内在性の抗原を意味するものと解釈される。用語「外来抗原」は、病原体（細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫）由来の抗原を意味するものと解釈される。
【００７０】
本発明の組成物及び方法には、自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶反応に関与する抗原が使用され得る。自己免疫疾患に関与する抗原の例は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自己のＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の構成要素、チログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体を含む。アレルギーに関与する抗原の例は、例えば杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原のような花粉抗原、例えばホコリダニ抗原及びネコ抗原のような動物由来の抗原、組織適合抗原を含む。移植拒絶反応に関与する抗原の例は、例えば心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓のようなレシピエント内に移植されるべきグラフトの抗原性成分、及び神経グラフトの成分を含む。抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な、変異したペプチドのリガンドでもあり得る。
【００７１】
本発明の組成物及び方法に使用することができる多様な抗原の例には、βアミロイドタンパク質及びアミロイド前駆体タンパク質がある。
【００７２】
用語「アジュバント」は、インビボで抗原と共に使用されて抗原に対する免疫応答を高める物質を含むものと解釈される。
【００７３】
用語「免疫調節剤」は、細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌の病原体由来の分子を含む、免疫システム細胞の応答を調節、即ち増大及び／又は低下させる任意の分子を含むものと解釈される。
【００７４】
用語「樹状細胞（ＤＣ）の亜成熟の表現型」とは、未熟ＤＣと成熟ＤＣの中間の表現型を意味する。未熟ＤＣとは、組織内に存在し、未だ刺激を受けていないＤＣを意味する。成熟ＤＣは、トル様受容体リガンドにより単独で、又はサイトカインと共に刺激された後に、未熟ＤＣから分化する。成熟とは、細胞表面上で共刺激分子及びＭＨＣ分子の発現が増大していることを意味する。
【００７５】
本発明は以下の添付の図面を参照とした実施例の説明から、より明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明者等は、百日咳由来の繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）が、免疫介在性疾患の治療に、又は自己免疫疾患に対するワクチンを含む免疫介在性疾患に対するワクチン中の免疫調節剤として使用できることを見出した。実験的アレルギー性脳髄膜炎（ＥＡＥ）、即ちマウスの多発性硬化症モデルにおいて、このマウスにＦＨＡ存在下でミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）合成ペプチドを非経口的に投与して免疫すると、疾病徴候、及び病態の発現が防止できることを発見した。ＦＨＡ存在下で自己抗原又は外来抗原により免疫すると、バイスタンダー抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の誘導が促進され、これらの制御性Ｔ細胞が、自己免疫状態に繋がる自己反応性免疫応答を防止することができるものと思われる。
【００７７】
多発性硬化症の治療のための現在のアプローチは、疾病徴候の発現が既に始まっている個人の脳内の炎症を減少させることを狙いとする治療戦略に焦点を当てている。
【００７８】
本発明者等は、抑制活性を有し、かつミエリンタンパク質に特異的な記憶Ｔ細胞をＦＨＡにより誘導することによって、ＥＡＥの臨床徴候の発現を防止し得ることを見出した。
【００７９】
本発明者等は、ＦＨＡの皮下投与により、ナイーブＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞の移入によってＳＣＩＤマウス内で誘導された腸の炎症が減少され、大腸重量の増加及び収縮が低減され、体重低下が防止されることも見出した。このことは、ＦＨＡが、おそらくは制御性Ｔ細胞の誘導によって、又は制御性Ｔ細胞の誘導を促進する、若しくは自己免疫疾患を仲介する免疫応答に対して直接的な抑制効果を有する、内因性のＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを産生させることによって、自己免疫疾患の発症を防止し得ることを示している。
【００８０】
ＦＨＡを外来抗原と共投与すると、共投与された抗原に特異的な制御性Ｔ細胞が刺激される。ＦＨＡは、ＩＬ−５及びＩＬ−１０を分泌するＴ細胞の誘導を促進するが、ＩＬ−４又はＴＮＦ−αを分泌するＴ細胞の誘導は促進しないことが見出され、これによってＦＨＡはインビボでタイプ１制御性Ｔ細胞（ＴＲ１）の誘導を支配することが示された（図８）。
【００８１】
本発明者等は、自己抗原及びＦＨＡにより免疫されたマウスが、レシピエントマウス内に移入後、ＥＡＥに対する防御を獲得することを見出した。ＦＨＡの単独投与による治療では、ＥＡＥの臨床徴候が減少した。
【００８２】
想定され得る医薬製品の一つは、ＦＨＡと、例えば自己抗原若しくは外来抗原であり得る薬剤的に許容される抗原との組合せ、又は自己抗原若しくは外来抗原のペプチドとの組合せであり得る。このような組合せ製品は、ＦＨＡがそれと組合せた成分と相乗的に作用する点で有利な効果を有すると予見される。このような製品は、当業者に一般に知られた工程を用いて製造することができる。
【００８３】
本発明者等は、ＦＨＡによるＩＬ−１０の産生と、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの抑制とが、例えばＬＰＳのようなトル様受容体リガンド（ＴＬＲリガンド）の存在により向上されることを見出した。他のＴＬＲリガンドは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ又はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）から選択される任意の一つ又はそれ以上であり得る。ＦＨＡと薬剤的に許容されるＴＬＲリガンドとの組合せは、向上された免疫調節効果を有すると思われる。ＦＨＡと、薬剤的に許容されるＴＬＲリガンド及び自己抗原との組合せも、向上された免疫調節効果、及び／又は抗炎症効果を提供することが予見される。
【００８４】
ＦＨＡは既にヒトへの使用が認可されており、現在数種の無細胞百日咳ワクチンの成分となっている。そのワクチン中でＦＨＡは、水酸化アルミニウムに吸着されている。
【００８５】
ＦＨＡ又はその誘導体は、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、関節リウマチ又は乾癬を含むが、これらに限定されない免疫介在性疾患の治療に使用されるか、又はその予防のための療法若しくはワクチンの成分として使用され得る。
【００８６】
ＦＨＡ又はその誘導体はまた、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節症、乾癬性関節炎を含む）、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群から二次的に発生した乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷に対するアレルギー応答、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症（ｓｃｉｅｒｏｄｅｒｍａ）、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病リバーサル反応、ハンセン病性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、突発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、突発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、アルツハイマー病及びセリアック病のうちから選択される任意の一つ又はそれ以上の免疫介在性疾患の治療に使用されるか、又はその予防のための療法若しくはワクチンの成分として使用され得る。
【００８７】
ＦＨＡ又はその誘導体は、喘息若しくはアトピー性疾患の治療に使用されるか、又はその予防のための療法若しくはワクチンの成分としても使用され得る。
【００８８】
以上詳述した疾患の多くは満足した治療法を有さず、殆どの場合、ステロイド及び非ステロイド性抗炎症薬が使用される。しかしながら、これらの薬物は非特異的な薬物であり、副作用が発生する。比較的最近になって、キーとなる炎症性サイトカイン、特に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを抑制する薬物が開発された。これらの薬物は、特定の自己免疫疾患に有効な抗体、又は可溶性ＴＮＦ受容体を含んでいるが、副作用（再発性結核を含む）を伴い、ＴＮＦ−αが病状の重要な調節物質となっている疾患に限られる。別の治療的アプローチの一つは、抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１０）の直接投与であるが、これはインビボでのサイトカインの半減期が短いため十分である。代替的戦略としては、インビボで直接的な免疫抑制効果を有するＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインを誘導する薬剤を使用し得る。
【００８９】
抗炎症性サイトカインを刺激し、先天性免疫システムに関与する細胞からのプロ炎症性サイトカインの産生を抑制し、サプレッサー、即ち制御性Ｔ細胞の誘導を促進する分子は、炎症性免疫応答、及びＴｈ１に仲介される免疫応答を制限する可能性を有する。ＦＨＡは、先天性及び適応性のＩＬ−１０を刺激することにより免疫療法剤若しくは免疫調節剤、又は免疫介在性疾患を予防するワクチンのアジュバントとして作用する可能性を有する。
【００９０】
クローン病の慢性腸炎症は、Ｔヘルパー１細胞（Ｔｈ１）、並びにプロ炎症性サイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２（９）の過剰産生と関連している。これら有害な炎症及び組織破壊的な免疫応答は、抗炎症応答の欠陥、又は共生細菌性抗原に対する耐性が失われた結果であり得るとの証拠が存在している。ＮＯＤ−２、即ち細菌性ペプチドグリカンからのムラミルジペプチドに対する細胞内病原体認識受容体（ＰＲＲ）に変異を有するクローン病患者においては、ＴＬＲ−２リガンド及び腸内細菌に応答する抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生が相当減少され、かつＴｈ１応答が増大されている（１０、１１）。その代わりに、Ｔｒ細胞の生成不全の結果として炎症応答に対抗する調節が失われることによって免疫介在性疾患が生じ得る（８）。Ｔｒ細胞を移入することによって、動物大腸炎モデルにおいて腸の炎症に対する防御が獲得されることが示されている（１２）。従って、インビボで抗炎症性サイトカイン及びＴｒ細胞を誘導させることを目標とした戦略は、クローン病に対する新たな治療法開発の上でかなり有望である。
【００９１】
クローン病の治療には、ＴＮＦ抗体又はＴＮＦ拮抗剤や、アザチオプリンを使用した免疫抑制療法が行われる。本発明者等が現在知るところによれば、これらの療法は、キーとなるプロ炎症性調節物質の直接的な抑制、又は活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘導によりその効果を生じるものであり、ＤＣ機能の調節によるものではない（１３、１４）。抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０の直接投与も検討されたが、ＩＬ−１０はインビボでの半減期が短いため、臨床試験では中程度の治療的有用性が見られたのみである（１５）。ＩＬ−１０を発現するように遺伝子操作された細菌も、動物モデルにて大腸炎を減少させることが示されている（１６）。本発明にて採用された代替的手法では、病原体由来の免疫調節分子により適切な宿主細胞を標的とすることによって、インビボで抗炎症性サイトカインの産生を刺激する。
【００９２】
ＦＨＡは、先天性免疫細胞の機能を調節して抗炎症性サイトカインを産生させる能力を有し、これは続いてＴｒ細胞の二次的な誘導を介して増幅され得る。本発明においては、ＦＨＡの注入により所属リンパ節及び遠位リンパ節、並びにパイエル板内でＩＬ−１０及びＴＧＦ−βが即時に（２〜６時間）誘導され、このことはＦＨＡが組織ＤＣ又はマクロファージをリンパ節及び二次リンパ組織に移動するように調節して、抗炎症応答を開始させることを示唆している。Ｔ細胞が介在する大腸炎の予防にはＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの両方が重要であり（１２、１７）、ＦＨＡで処理した重症複合性免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスの脾臓内に検知されたＩＬ−１０産生Ｔ細胞の存在の原因となっていると思われる。ＰＢＳ処理マウスと比較して、ＦＨＡ処理マウスでは、大腸炎の減少、脾細胞ＩＬ−１０の増加、及びそれに伴うプロ炎症性Ｔｈ１型サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α）の減少が見られた。興味深いことに、ＦＨＡはＩＬ−１０−／−及び野生型ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を移入したＳＣＩＤマウスにおいても大腸炎に対する同程度の防御を誘導し、これは、このような防御がＴ細胞誘導ＩＬ−１０により仲介されるものではないことを示唆している。Ｔｒ細胞はまた、ＴＧＦ−β産生及び細胞間接触を介して免疫応答を抑制することができるため、このことはＴｒ細胞のこの防御における役割を除外するものではない。
【００９３】
脾臓Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生の増大は、ＦＨＡ刺激による免疫調節応答が局部組織に限定されずに、腸を含む遠位部位にも起こることを示している。
【００９４】
ＦＨＡは、ＤＣ上のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合して、ＩＬ−１０産生Ｔｒ細胞を生成するように細胞の機能を調節する。Ｔｒ細胞は次に、そのＩＬ−１０産生能に依存せずに大腸炎の発症を抑制する。ＤＣの免疫調節、及びその結果としてのＴｒ細胞の単独、又は集合的な活性化は、大腸炎の予防において有用な戦略となり得る。ＦＨＡはクローン病の治療法としての相当の可能性を有する。
【００９５】
本発明は、以下の実施例により更に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００９６】
＜ＦＨＡの精製＞
Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ寒天プレート上で百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を３日間増殖させた。溶血性であるコロニーを用いてＳｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培地内で、ジメチル−βシクロデキストリン（ＣＤＸ、Ｓｉｇｍａより購入）を補充して最終濃度を０．５ｇ／ｌとし、液体前培養（３０ｍｌ）を開始した（ＣＤＸは、細菌表面からのＦＨＡ放出を誘導する）。この前培養物を攪拌下で一夜、３７°Ｃで増殖させ、大きい培地への播種に使用した（１Ｌフラスコ中、２５０ｍｌのＳＳ培地）。この培養物を攪拌下で３６〜４８時間、３７°Ｃで増殖させた。プラトー相に到達した後（培養物の光学密度を測定して決定）、培地内の細胞を４°Ｃで２０分間、７０００ｒｐｍで遠心分離して、上清を回収した。
【００９７】
ＰＢＳでｐＨ７．４に平衡化したヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の基質を用いたＦＰＬＣを使用して、上清からＦＨＡを精製した。サンプルを充填した後、カラムをＰＢＳで洗浄して、０．５Ｍ  ＮａＣｌを加えたＰＢＳを用いて室温で流速２ｍｌ／分にて溶出した。ピーク溶出を伴うフラクションがＦＨＡを含有していた。混入しているＬＰＳをエンドトキシン除去カラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（登録商標）エンドトキシン除去ゲル、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）上で除去した。このステップの後、色素産生性カブトガニアメーバ様溶菌液（ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）では、標本中にエンドトキシンは検知されなかった。
【００９８】
ＦＨＡ標本中には、残留エンドトキシン又はリポ多糖（ＬＰＳ）が存在する。しかしながら、このエンドトキシンの残留量は非常に小さい。混入エンドトキシンの濃度は、概してタンパク質１μｇにつき３００ｐｇ未満である。
【００９９】
現在までに商業的に入手可能なＦＨＡ製剤、及び当該技術分野で検討されているＦＨＡ製剤は、これよりも相当高い濃度のエンドトキシンが混入している。本発明者等は、混入ＬＰＳを除去するために、以下のような更なるＦＨＡ精製ステップを行った。
【０１００】
タンパク質製剤に、以下の透析ステップを行った。１）ＦＨＡタンパク質製剤を、新鮮な８Ｍ尿素製剤に対して１時間、次いで一夜透析する。２）ＦＨＡタンパク質製剤を、新鮮な４Ｍ尿素製剤に対して１時間、次いで一夜透析する。３）ＦＨＡタンパク質を、新鮮な１Ｍ尿素製剤に対して１時間、次いで一夜透析する。
【０１０１】
これら最初のステップの目的は、タンパク質を確実かつ完全に変性させることにある。これによりＦＨＡの内部疎水性領域に結合したＬＰＳが露出する。尿素の濃度は徐々に低下させる必要があり、さもなければ、タンパク質が修復不能な損傷を受け、リフォールディングが正確に行われなくなる。その後、残留したＬＰＳを以下のように除去する。
【０１０２】
ｉ）エンドトキシンを含まない、１％デオキシコール酸ナトリウムを含む水５ｍｌでＥｔｏｘａｔｅカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を洗浄する。
ｉｉ）エンドトキシンを含まない水５ｍｌでカラムを洗浄する。
ｉｉｉ）タンパク質溶液を加える。
ｉｖ）１％デオキシコール酸ナトリウム５ｍｌで再度カラムを洗浄して、１〜２ｍｌのフラクションを収集する。
ｖ）６００ｎｍにおける光学密度を調べて各フラクションのタンパク質濃度を測定することにより、最大タンパク質濃度を有するフラクションを決定する。
【０１０３】
デオキシコール酸ナトリウムは、Ｅｔｏｘａｔｅカラムに結合した全てのＬＰＳを除去する。しかしながら、タンパク質に結合していないＬＰＳの大部分は、密度の相違により、タンパク質に結合したＬＰＳとは別のフラクション内に溶出される。
【０１０４】
本発明者等は、ＦＨＡによるＩＬ−１０産生の刺激が、トル様受容体−４（ＴＬＲ−４）を介したＬＰＳのシグナル伝達によって増大されるように思われることを説明してきた。ＦＨＡ効果の増大に要求されるＬＰＳ量は、精製されたＦＨＡ標本中に存在し得るＬＰＳの残留量よりも相当大きい。ＦＨＡ標本中に存在する濃度（０．２ｎｇ／ｍｌ）のＬＰＳ単独によるＤＣ処理では、ＤＣはインビトロで活性化されなかった。図２は、ＦＨＡが単独で、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ及びＴＬＲ−４欠損Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来の腹膜マクロファージによるＩＬ−１０産生を刺激し、これはＩＬ−１０産生がＬＰＳに依存するのではなく、ＬＰＳにより向上されるか、又はＴＬＲ−４を介したシグナル伝達に依存することを示したものである。ＬＰＳを追加すると、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の腹膜マクロファージによるＦＨＡ誘導ＩＬ−１０産生が向上したが、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来の腹腔マクロファージによるＦＨＡ誘導ＩＬ−１０には殆ど影響がなかった。ＦＨＡはまた、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の樹状細胞によるＩＬ−１０の産生を低いレベルで刺激したが、ＴＬＲ−４欠損Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスでは刺激が見られなかった。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の樹状細胞からのＦＨＡ誘導によるＩＬ−１０の産生は、ＬＰＳの追加によって向上した。
【０１０５】
図３は、濃度５μｇ／ｍｌのＦＨＡが、樹状細胞からのＬＰＳ誘導によるＩＬ−１０産生を向上させることを示したものである。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスのＴＬＲ−４シグナル伝達の非存在下で、ＦＨＡはＤＣからのＩＬ−１０産生を刺激しないが、濃度１〜５μｇ／ｍｌではＬＰＳ誘導ＩＬ−１０産生を向上させる。これらの結果から、免疫調節剤としてのＦＨＡの効果は、薬剤的に許容されるＴＬＲリガンドとの同時注入により向上し得ることが示唆される。
【０１０６】
ＦＨＡは、ヒト単球からのＩＬ−１０の産生を誘導し、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ誘導によるＩＬ−１２産生を抑制する（図１）。また、ＦＨＡの注入はインビボでＩＬ−１０の産生を刺激し、ＩＬ−１２の産生を抑制する（図５）。
【０１０７】
ＦＨＡを長期間保存しても、その活性に影響がないものと思われた。ＦＨＡは、マウスのマクロファージによるＩＬ−１０の産生を刺激し、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ産生を抑制し、この効果はＦＨＡを凍結乾燥して長期間保存した後でも維持されることが見出された（図４）。
【０１０８】
図６は、マウスにＦＨＡを皮下注射すると、注射から１〜２時間以内にリンパ節内における抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生が向上し、この効果は投与６時間後においても持続して向上していることを示したものである。
【０１０９】
ＦＨＡの皮下注射から１時間以内にＴＧＦ−βが転写レベルで誘導され、この効果は少なくとも６時間継続した（図７）。
【０１１０】
＜マウスの多発性硬化症モデル＞
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、マウスにおける多発性硬化症のモデルである。１ｍｇ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を加えたフロイント完全アジュバント中に乳化された１５０μｇＭＯＧペプチドの皮下投与、及び５００ｎｇ百日咳毒素の腹腔内注射、続く２日後の再度の５００ｎｇ百日咳毒の腹腔内注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＡＥを誘導した。マウスは、麻痺の症状を発症した。自己免疫疾患に対するワクチンのアジュバントとしてのＦＨＡの効果を評価する実験において、リン酸緩衝生理食塩水中の５０μｇＭＯＧペプチド（残基３５〜５５）及び５．０μｇＦＨＡの皮下投与によってマウスを免疫した。これを２１日後に再度行った。コントロールマウスは、ＭＯＧペプチド又は生理食塩水のみを投与した。２度目の免疫から７日後。マウスのＥＡＥ臨床徴候を毎日評価し、以下のように評点した。１＝尾部麻痺、２＝歩行不安定、３＝後脚弱化、４＝後脚麻痺、５＝後肢及び前肢の完全麻痺、６＝死。
【０１１１】
表１に、疾病スコア及び疾病指標を示す。この結果は、アジュバントとしてのＦＨＡの投与が、疾病の進行を有意に抑制することを示す。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
発症率は、試験マウス数に対するＥＡＥ臨床徴候のいずれかを発症したマウス数を示す。疾病指標は、毎日の平均疾病スコアを全部加算して、発症日の平均で割り、１００を掛けて計算した。
【０１１４】
図９に、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における、ミエリンオリゴデンドロサイト（ＭＯＧ）ペプチド及びＦＨＡの疾病の進行に対する免疫効果（平均疾病指標）を示す。図１０に、ＥＡＥモデルにおける、ある期間に亘る平均疾病スコアを示す。組織学的所見により、ＭＯＧ及びＦＨＡの免疫効果が明らかに示されている（図１１）。
【０１１５】
ＭＯＧ＋ＦＨＡで免疫されたマウスにおいて、自発的なＭＯＧ特異的かつＰＭＡ及び抗ＣＤ３誘導ＩＬ−１０が増加した。対称的に、ＭＯＧ＋ＦＨＡで免疫されたマウスにおいてＭＯＧ特異的ＩＦＮ−γ産生は有意に減少した。図１２は、ＥＡＥ誘導前のＭＯＧ及びＦＨＡによる予防的処理が、ＭＯＧ特異的ＩＦＮ−γ産生を抑制することを示している。
【０１１６】
免疫調節剤としてのＦＨＡを用いた予防的免疫療法は、自己抗原との共免疫に依存する。ＦＨＡ及びＭＯＧによる免疫がＥＡＥの発症を防止するのに対し、コントロール抗原（ＫＬＨ）及びＦＨＡによる免疫はＥＡＥの発症を防止しない。このことは、ＦＨＡを用いた予防的免疫療法（即ち、ＥＡＥ誘導前の投与）が、自己抗原（本実施例ではＭＯＧペプチド）との共投与に依存することを示す（図１３）。
【０１１７】
本発明者等は、ＭＯＧ及びＦＨＡで免疫したマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、それがレシピエントマウス内に移入された後、ＥＡＥに対する防御を提供することを見出した（図１４）。ＭＯＧ及びＦＨＡで免疫したマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をＥＡＥ誘導から７日後に移入すると、ＥＡＥの発症が防止された。対称的に、ＭＯＧ単独又はＭＯＧ及びＣｐＧで免疫したマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＡＥに対する防御を提供しなかった。このことは、ＭＯＧ及びＦＨＡによる免疫によりＭＯＧ特異的Ｔｒ細胞の集団が誘導され、これがＥＡＥ発症に繋がる免疫応答を抑制することを示している。
【０１１８】
本発明者等は、ＦＨＡの単独投与による治療がＥＡＥの臨床徴候を減少させることを見出した（図１５）。疾病指標及び疾病スコアは、図９及び図１０に説明したように計算した。ＥＡＥ発症後のＦＨＡの単独投与は、疾病の重症度を低下させた。
【０１１９】
ＦＨＡ及びタイプＩＩＩコラーゲンによる免疫は、マウスのコラーゲン誘導関節炎の発症を抑制することを見出した（図１６）。コラーゲン及びＦＨＡで免疫したマウスの疾病の重症度は、ＫＬＨ及びＦＨＡで免疫したマウスと比較して低下した。
【０１２０】
＜マウスのヒト大腸炎モデル＞
図１７に、マウス大腸炎モデルの腸炎症の発症に対するＦＨＡの皮下投与を示す。重症複合性免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにＣＤ４５ＲＢｈｉナイーブＴ細胞を注入した。これにより、注入から６〜８週間後に慢性の大腸炎症が発症した。ＦＨＡによる皮下治療は、大腸の炎症及び体重低下を防止した（図１７Ａ）。ＦＨＡ処理されたマウスは、未処理のＣＤ４５ＲＢｈｉ移入コントロールマウスと比較して、腸炎症の顕著な減少、大腸重量の低下、及び大腸縮小の減少が見られた（図１７Ｂ及び図１７Ｃ）。
【０１２１】
組織学的所見は、腸壁の全層内に単核細胞の流入、肥厚、及び腸管上皮細胞の分化の低下により特徴付けられた（図１８及び図１９）。
【０１２２】
６匹のＳＣＩＤマウスのグループにＣＤ４５ＲＢｈｉナイーブＴ細胞を単独で、若しくはＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞と共に静脈注射するか、又はＣＤ４５ＲＢｈｉナイーブＴ細胞を注射すると共にＦＨＡを皮下投与した（１０μｇ／マウス、２週間ごと）。体重を記録して、８〜１２週間後、マウスを犠牲死させた。大腸の重量を記録して、大腸のヘマトキシリン及びエオシンで染色した部分上で組織学的検査を行った（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。ＦＨＡによる処理は、正常な野生型及びＩＬ−１０欠損マウス由来のナイーブＴ細胞を受容したＳＣＩＤマウスの体重低下を防止し、大腸炎症を有意に減少させた。これはＦＨＡの防御的効果が、Ｔ細胞誘導ＩＬ−１０に依存することを示す。
【０１２３】
野生型ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を注射してＰＢＳ、ＦＨＡ又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞で処理した、又はＩＬ−１０−／−マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を注射してＦＨＡで処理したＳＣＩＤマウスに大腸炎を誘導してから８週間後に、脾細胞を除去した。脾臓標本から未分離脾細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を選別し、抗ＣＤ３及び抗Ｃ２８で２度刺激して、２度目の刺激から２日後、上清中のサイトカイン濃度を測定した（図２１及び図２２）。野生型ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈを注射してＦＨＡで処理したマウスからの脾細胞塊は、ＰＢＳ処理したマウス又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞を同時注入したマウスと比較して有意に多いＩＬ−１０を産生した（２４４±３０ｐｇ／ｍｌ対４３±７ｐｇ／ｍｌ及び４８±１０ｐｇ／ｍｌ）（図２１）。更に、ＩＬ−１０の産生は、ＦＨＡ処理マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して脾細胞塊内で有意に高かった（２４４±３０ｐｇ／ｍｌ対１２１±３１ｐｇ／ｍｌ）。
【０１２４】
予想通り、ＩＬ−１０−／−のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウスからの脾細胞塊及びＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激しても、ＩＬ−１０は全く検出されなかった（検出限界２０ｐｇ／ｍｌ）。
【０１２５】
ＰＢＳ処理マウスから回収した脾細胞内に、比較的高濃度のプロ炎症性Ｔｈ１型サイトカイン、ＩＦＮ−γ（図２２Ａ）、及びＴＮＦ−α（図２２Ｂ）が検出され、これらのマウスは重症の大腸炎に罹患していた。対称的に、野生型、又はＩＬ−１０−／−マウス由来のＴ細胞を注入したＦＨＡ処理ＳＣＩＤマウスからの脾細胞は、ＰＢＳ処理ＳＣＩＤマウスからの脾細胞と比較して、有意に低い濃度のＴｈ１サイトカイン、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ、並びにＴｈ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を産生していた。この発見により、実験的大腸炎が、脾臓内に検出され得るＴｈ１型サイトカイン産生の向上と関連し、ＦＨＡによる処理がプロ炎症性サイトカインを抑制し得る一方で、ＩＬ−１０を増大させることが証明された。
【０１２６】
＜薬物製剤の用量及び投与方法＞
本発明は、選択された抗原に対する哺乳動物内の免疫応答の調節方法を含む。本方法は、哺乳動物にＦＨＡ若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド、若しくはそれらの物質で活性化された細胞から産生される物質を含む治療量の薬剤を投与すること、又はＦＨＡ若しくはその誘導体、変異体、断片、変種若しくはそれらのペプチド及び抗原、若しくはＦＨＡ及び薬剤的に許容されるトル様受容体（ＴＬＲ）リガンドを含む治療量の薬剤を投与することを含む。
【０１２７】
投与のための組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかの形態である注射剤として調製され、また注射の前に液体の懸濁液又は溶液にされるのに適した固形物としても調製され得る。また製剤は乳剤にされてもよく、又は組成物をリポソーム内に封入してもよい。活性免疫原性成分は、多くの場合、薬剤的に許容され、かつ活性成分と適合可能な担体と共に混合される。「薬剤的に許容される担体」という用語は、投与される対象者にアレルギー反応又は他の望ましくない効果を惹起しない担体を指す。薬剤的に許容される適切な担体は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール又は同様物、及びそれらの組合せのうちの一つ又はそれ以上を含む。加えて、所望であれば免疫調節剤／製剤は、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又は製剤／免疫調節剤の有効性を高めるアジュバントのような少量の補助物質を含有してもよい。
【０１２８】
本発明の組成物は、例えば皮下、経皮、又は筋肉内のいずれかの注射により非経口的に投与され得る。他の投与形態に適した更なる製剤には坐薬が含まれ、場合により、経口用製剤、鼻腔内製剤、又はエアロゾルとして分散されるのに適した製剤が含まれる。坐薬用には、従来の結合剤及び担体は、例えばポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。このような坐薬は０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲内の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口用製剤は、例えば医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム及び同様物のような通常使用されている賦形剤を含有している。この組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を有し、かつ１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有する。
【０１２９】
本発明の組成物は、中性若しくは塩の形態で免疫調節剤組成物に調製されてもよい。薬剤的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）を含み、これらは例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸及び同様物のような有機酸と共に形成される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄（ＩＩＩ）のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン及び同様物のような有機塩基から誘導することもできる。
【０１３０】
組成物は、投与形態と適合可能な形態で、かつ予防的及び／又は治療的に有効となる量で投与され得る。投与されるべき量は、治療される対象者に依存し、それには例えば対象者の免疫システムの抗炎症性サイトカインの合成能、又は制御性Ｔ細胞の誘導能、及び所望される防御の程度が含まれる。適切な用量の範囲は、１回のワクチン接種につき活性成分が数百μｇのオーダーにあり、好ましい範囲が約０．１μｇ／ｇ〜１０００μｇ／ｇ、例えば約０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲内にある。初回投与及び追加投与のための適切な処方計画もまた様々であるが、初回投与、及びそれに続く接種又は別様の投与により類型化される。投与に要求される活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、おそらく各対象者に特有のものであろう。
【０１３１】
ＦＨＡ組成物の治療的有効量は、とりわけ投与計画、投与される抗原の単位用量、ＦＨＡが他の治療薬と組合せて投与されるか否か、レシピエントの免疫状態及び健康、並びに特定のＦＨＡ／抗原複合体の治療的活性に依存することが、当業者には明らかであろう。
【０１３２】
組成物は、単一の投与計画、又は好ましくは複数の投与計画に基づいて投与され得る。複数の投与計画は、最初の投与過程が１〜１０回の個別投与を含んでもよく、続いて免疫応答上の効果を維持又は強化するために必要な間隔を置いて他の投与が行われ、例えば１〜４ヶ月目に２度目の投与が行われ、必要であれば、数ヶ月後に次の投与が行われる投与計画である。所望の防御レベルを維持するためには、１〜５年、通常３年の間隔を置いた周期的投与が望ましい。
【０１３３】
一連のワクチン接種は、例えば３ヶ月、４ヶ月、又は６ヶ月の間隔を置いて実施されてもよい。このような一連の接種は、合計で、例えば３、４又は５回のワクチン接種を含み得る。乳児に実施されるワクチン接種では、一連の接種は、例えば生誕時、又は生誕から１週間以内、及びその後６、１０及び１４週齢に実施され得る。一連の接種は、生誕時、並びに１、３及び６ヶ月齢に実施されてもよい。
【０１３４】
治療的使用のために、組成物は、１週間に数回、例えば１週間に２回、毎週、１ヶ月に数回、数週間、数ヶ月、１年又は数年間の間に毎月投与され得る。治療的使用のための組成物は、活性成分のみ、又は活性成分と自己抗原との組合せを含み得る。この治療は、同時の（同一又は別個の製剤中で）又は時間間隔を置いた他の薬物の投与を含んでもよい。
【０１３５】
治療的に有効な用量は、投与経路及び剤形に応じて変動し得る。疾病状態、年齢、体重、通常の健康状態、性別、対象者の日常の飲食物、投与間隔、投与経路、排泄率及び薬物の組合せに応じて、特定の用量が調製され得る。有効量を含有する剤形のいずれもが日常的な実験の範囲内にある。本発明者の組成物は、自己免疫疾患の治療に使用されている薬物を含む他の薬物と共に投与されてもよい。組成物は、自己免疫疾患の他の治療に使用されている投与計画と同様の投与計画を用いて、単独で投与されてもよい。用語「治療」は、疾患若しくは疾病に関連した症状の緩和、症状の更なる進行若しくは悪化の停止、又は疾病若しくは疾患の予防を含むことを意図する。
【０１３６】
治療過程は、インビトロでの例えばＬＰＳによる刺激を伴う、又は伴わない免疫システム細胞によるエクスビボでのサイトカイン産生を試験することによって追跡され得る。アッセイは、抗体及び同様物を用いて、細胞の培養及びサイトカインの定量のための従来の試薬を用いて実施することができる。これらの手法は、当業者に通常知られている。
【０１３７】
本発明は、詳細部が変動し得る前述の実施態様に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ＦＨＡがヒト単球からのＩＬ−１０の産生を刺激し、ＩＬ−１２の産生を抑制することを示すグラフである。ＣＤ１４＋単球は、正常なドナー由来のヒト末梢血単核細胞から、ＭＡＣＳマイクロビーズと自動ＭＡＣＳソーティング装置とを用いたポジティブセレクションにより精製した。単球（１×１０６／ｍｌ）を培養液のみ、ＦＨＡ（５μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）、又はＦＨＡ、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γで刺激した。２４時間後に上清を回収し、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図２】ＦＨＡがマウスのマクロファージ（Ａ）及び樹状細胞（Ｂ）からのＩＬ−１０の産生を刺激し、かつこの効果がトル様受容体−４（ＴＬＲ−４）を介したＬＰＳのシグナル伝達により増大されることを示すグラフである。正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ及びＴＬＲ−４欠損Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔から腹腔洗浄によりマクロファージを回収した。未熟骨髄由来の樹状細胞を、正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ及びＴＬＲ−４欠損Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの大腿骨及び脛骨から得た骨髄から生成させ、これをＧＭ−ＣＳＦ含有上清で７日間培養した。腹腔マクロファージ又は樹状細胞（１×１０６／ｍｌ）を培養液のみ、ＦＨＡ（５μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、又はＦＨＡ（５μｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。２４時間後に上清を回収して、ＩＬ−１０濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図３】ＦＨＡの濃度を上昇させたときのＬＰＳ誘導ＩＬ−１０産生に対する効果を示すグラフである。未熟骨髄由来の樹状細胞を、正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ及びＴＬＲ−４欠損Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの大腿骨から得た骨髄から生成させ、これをＧＭ−ＣＳＦ含有上清で７日間培養した。樹状細胞（１×１０６／ｍｌ）を培養液のみ、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）単独で又はＦＨＡ（１０〜５０００ｎｇ／ｍｌ）と共に刺激した。２４時間後に上清を回収して、ＩＬ−１０濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した
【図４】長期間保存した後の凍結乾燥製剤の免疫調節活性を示すグラフである。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔からマクロファージを回収した。５年間凍結乾燥されていたＦＨＡ製剤を、マクロファージ（１×１０６）に加えるに先立ちＰＢＳ内で融解した。細胞をＦＨＡ（５μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）、又はＦＨＡ（５μｇ／ｍｌ）存在下のＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。２４時間後に上清を回収して、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ４０濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図５】ＦＨＡを注射したマウス由来の脾細胞によるＩＬ−１０産生の増大、及びＩＬ−１２産生の抑制を示すグラフである。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦＨＡ（１０μｇ／マウス）又はＰＢＳを皮下注射し、２４時間後脾臓を取り出し、脾細胞をＬＰＳ（０．００１〜１．０μｇ／ｍｌ）又は培養液のみで刺激した。２４時間後に上清を回収して、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ４０濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図６】ＦＨＡがインビボで抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生を誘導することを示すグラフである。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦＨＡ（１０μｇ／マウス）又はＰＢＳを皮下注射し、２又は６時間後、鼠経リンパ節、腸間膜リンパ節、パイエル板、及び血清を回収した。血清（Ａ）中のＩＬ−１０タンパク質濃度を測定した。ホモジナイズしたリンパ組織中のＩＬ−１０（Ｂ）及びＴＧＦ−α（Ｃ）タンパク質を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。ＰＢＳ処理マウスと比較して統計的に有意な差異が見られる。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】ＦＨＡがインビボでＴＧＦ−βのｍＲＮＡの発現を誘導することを示すＰＣＲ結果である。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦＨＡ（１０μｇ／マウス）又はＰＢＳを皮下注射し、１又は６時間後、鼠経リンパ節を取り出した。リンパ節をホモジナイズして全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現を測定した。
【図８】ＦＨＡの外来抗原との共投与が、共投与された抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を刺激することを示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスをオブアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド（３２３〜３３９）（５０μｇ／マウス）及びＦＨＡ（５μｇ／マウス）で（０及び２０日目に）鼻腔内免疫した。最終免疫から７日後に脾臓を取り出し、インビトロでＯＶＡペプチドと共に再培養した。これら培養物からＯＶＡに特異的なＴ細胞系を樹立した後、限界希釈法でクローン化した。Ｔ細胞系／クローンをＯＶＡペプチド及び抗原提示細胞（照射した同系の脾細胞）で刺激した。２日後に上清を回収し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−α濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図９】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、即ちマウスの多発性硬化症モデルにおける疾病の進行に対するミエリンオリゴデンドロサイト（ＭＯＧ）ペプチド及びＦＨＡによる免疫の効果（平均疾病指標）を示すグラフである。マウスを、リン酸緩衝生理食塩水中の５０μｇＭＯＧペプチド（残基３５〜５５）及び５．０μｇＦＨＡで皮下免疫した。これを２１日後に再度行った。コントロールマウスは、ＭＯＧペプチド又は生理食塩水のみを投与した。２度目の免疫から７日後、５ｍｇ／ｍｌ結核菌を加えた、フロイント完全アジュバント中に乳化した１５０μｇＭＯＧペプチドの皮下投与、及び５００ｎｇ百日咳毒素の腹腔内注射、続く２日後の５００ｎｇ百日咳毒素の２度目の腹腔内注射によりＥＡＥを誘導した。マウスをＥＡＥの臨床徴候について毎日評価し、以下のように評点した。１＝尾部麻痺、２＝歩行不安定、３＝後脚弱化、４＝後脚麻痺、５＝後肢及び前肢の完全麻痺、６＝死。疾病指標は、毎日の平均疾病スコアを全て加算し、発症日の平均で割り、１００を掛けて計算した。
【図１０】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における、ある時間に亘るＦＨＡ及びＭＯＧペプチドの免疫効果を平均疾病スコアにより示すグラフである。
【図１１】ＥＡＥ誘導後の（未処理）、又はミエリンオリゴデンドロサイトペプチド（ＭＯＧ）若しくはＭＯＧペプチド＋ＦＨＡ（ＭＯＧ＋ＦＨＡ）で免疫後の、マウス脊髄の組織病理学用切片を示す顕微鏡写真である。ＥＡＥが誘導され、マウスは図８に説明したように免疫された。ＥＡＥ誘導から２３日後、マウスの脊髄部分を取り出し、ヘマトキシリン（ｈａｒｍａｔｏｙｌｉｎ）及びエオシンで染色した。未処理マウス及びＭＯＧ免疫マウスに誘導されたＥＡＥは、単核細胞の浸潤が顕著であり、ＭＯＧ及びＦＨＡによる免疫は単核細胞の浸潤、脳炎、血管周辺への細胞湿潤及び脱ミエリン化を防止した。未処理ＥＡＥでは、表面の脳内白質線維及び軟膜にて、ミエリン空胞化、軸索退縮及びリンパ球及びマクロファージ浸潤が見られる。ＭＯＧ免疫したマウスでは、病変は未処理ＥＡＥと同様である。ＦＨＡ＋ＭＯＧ免疫マウスでは、脳内白質線維は正常に見え、少数の白血球が軟膜に制限されている。
【図１２】ＥＡＥ誘導前のＭＯＧ及びＦＨＡによる予防的処理が、ＭＯＧ特異的ＩＦＮ−γ産生を抑制することを示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０及び２１日目に、ＰＢＳのみで、又はＭＯＧ（５０μｇ）及びＦＨＡ（５μｇ）で皮下免疫した。７日後、１ｍｇ結核菌を加えた、フロイント完全アジュバント中の１５０μｇＭＯＧ３５〜５５ペプチドの皮下投与、及び５００ｎｇ百日咳毒素の腹腔内注射、続く２日後の５００ｎｇ百日咳毒素の２度目の腹腔内注射によりＥＡＥを誘導した。ＥＡＥ誘導から２３日後、脾細胞を回収してインビトロでＭＯＧペプチド３５〜５５（１０又は２５μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ３及びＰＭＡ、又は培養液のみで再刺激した。培養３日後、上清を回収し、ＩＦＮ−γ（図１２Ｂ）及びＩＬ−１０（図１２Ａ）濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図１３】アジュバントとしてのＦＨＡによる予防的免疫療法が、自己抗原との共免疫に依存することを示すグラフである。（Ａ）は疾病指標、（Ｂ）は平均疾病スコアを表す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０及び２１日目に、ＰＢＳ、ＭＯＧ（５０μｇ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（外来抗原モデル）、（５０μｇ）及びＦＨＡ（５μｇ）、又はＭＯＧ（５０μｇ）及びＦＨＡ（５μｇ）で皮下免疫した。７日後、ＥＡＥをフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中の１５０μｇＭＯＧ３５〜５５で皮下投与により、５００ｎｇ百日咳毒素（ＰＴ）で腹腔内投与により誘導した。ＰＴ（５００ｎｇ）は２日後にも腹腔内投与された。疾病指標及び平均疾病スコアを、図９に示したように計算した（１グループにつきｎ＝６）。
【図１４】ＭＯＧ及びＦＨＡで免疫されたマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞が、レシピエントマウス内に移植後、ＥＡＥに対する防御を提供することを示すグラフである。ドナーマウスは０及び２１日目に、ＭＯＧ（５０μｇ）、ＭＯＧ（５０μｇ）及びＦＨＡ（５μｇ）、又はＭＯＧ（５０μｇ）及びＣｐＧ（２５μｇ）のいずれかの２回の皮下注射を受けた。２度目の免疫から７日後、脾細胞を回収して精製し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＣＤ４＋Ｔ細胞精製カラムを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。レシピエントマウスは、ＥＡＥ誘導から７日後、ＭＯＧ、ＭＯＧ及びＦＨＡ、又はＭＯＧ及びＣｐＧで免疫されたマウスから０．９×１０６ＣＤ４＋Ｔ細胞を静脈内に受容した。コントロールマウスは細胞を受容しなかった。ＥＡＥが誘導され、発症日に疾病スコア（図１５Ｂ）及び疾病指標（図１４Ａ）を、図９（１グループにつきｎ＝８）に説明したように計算した。
【図１５】ＦＨＡの単独投与による治療で、ＥＡＥの臨床徴候が減少したことを示すグラフである。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中の１５０μｇＭＯＧ３５〜５５を皮下免疫し、５００ｎｇ百日咳毒素（ＰＴ）を腹腔内投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの疾病指標を示す。２日目に再度、百日咳毒素（ＰＴ）を腹腔内投与した。９日目に、マウスに５μｇＦＨＡを１回皮下注射した。疾病指標（図１６Ａ）及び疾病スコア（図１６Ｂ）は、図９に説明したように計算した。
【図１６】ＦＨＡ及びタイプＩＩコラーゲンによる免疫で、マウスのコラーゲン誘導関節炎の発症が抑制されることを示すグラフである。雄ＤＢＡ／１マウスを０及び２１日目に、タイプＩＩコラーゲン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びＦＨＡ、又はコラーゲン及びＦＨＡのいずれかで免疫した。７日後、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中のタイプＩＩコラーゲンの皮内注射により関節炎を誘導した。２１日後、マウスをＰＢＳ中のコラーゲンの静脈内注射で追加免疫した。疾病の過程を４０日間監視した。以下のスコアに従って、マウスを毎日評点した。０−正常、１−紅斑、２−紅斑及び膨潤、３−機能損失。各マウスの４つの足全てのスコアを加算しグループの平均を計算して（１グループにつきｎ＝６）、関節の指標を算出した。
【図１７】マウス大腸炎モデルにおける腸の炎症の発生に対するＦＨＡの皮下投与の効果を示すグラフである。ＳＣＩＤマウスの３グループに、１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を腹腔内注射した。マウスの１グループは２週間毎にＰＢＳが皮下注射され、マウスの他の１グループは２週間毎に１０μｇＦＨＡが皮下注射され、マウスの第３グループは０日目に４×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞が腹腔内注射された（図１７Ａ）。体重を１週間に２度記録した。ＦＨＡによる処理、又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞の注射により、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞の注射により誘導された消耗性疾患が有意に減少した（各々、単一因子ＡＮＯＶＡ、ＣＩ９５％を用いたときＰ＜０．０１及びＰ＜０．０００１）（図１７Ｂ）。実験の終わりに（５６日目）、大腸の重量及び長さを計測した。＊＊は、ＰＢＳ処理マウスと比較して統計的に有意な差を示す（Ｐ＜０．０１）。ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞の投与はＳＣＩＤマウスにおいて体重低下を伴う重篤な腸炎症の発生と関連していた。ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ細胞の移入は、炎症及び体重低下を防いだ。ＦＨＡによる皮下治療は、炎症及び体重低下を防いだ。ＦＨＡ処理マウスでは、未処理のコントロールＣＤ４５ＲＢｈｉ移入マウスと比較して腸炎症が顕著な減少し、大腸重量及び大腸収縮が有意に（Ｐ＜０．０１）低下した。
【図１８】ＦＨＡが大腸の炎症を防ぐことができるという組織学的証拠を示す顕微鏡写真である。大腸炎を誘導させ、マウスを図１７に説明したように処理した。５６日目に大腸を切除し、切片を作成し、マウントしてＨ＆Ｅで染色した。Ａ）１×１０５個のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を腹腔内注射し、０日目から２週間毎にＰＢＳを注射したＳＣＩＤマウス。Ｂ）１×１０５個のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ及び４×１０５個のＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞を０日目に皮内注射したＳＣＩＤマウス。Ｃ）１×１０５個のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈナイーブＴ細胞を腹腔内注射し、２週間毎にＦＨＡを皮下注射したＳＣＩＤマウス。
【図１９】ＦＨＡが実験的大腸炎モデルにて大腸の炎症を有意に減少させたことを示すグラフである。大腸炎を誘発させ、マウスを図１８に説明したように処理した。大腸を異なる炎症特徴について０〜４のスケールで評点した。ＰＢＳ処理マウスと比較して、統計的に有意な差異が見られる。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２０】マウスのＴ細胞介在性大腸炎の誘導に対するＦＨＡの保護効果における、Ｔ細胞誘導ＩＬ−１０の役割を示すグラフである。以下のように、４つの実験グループを用いた。グループ１：１×１０５個のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウス、未処理グループ２：１×１０５個のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ及び４×１０５個のＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウスグループ３：１×１０５個のＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を注射し、２週間毎に１０μｇＦＨＡで皮下処理したＳＣＩＤマウスグループ４：１×１０５個のＩＬ−１０欠損ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を注射し、２週間毎に１０μｇＦＨＡで皮下処理したＳＣＩＤマウス  （Ａ）体重を１週間に２度記録した。（Ｂ）実験の終わりに（５６日目）、大腸を切除して組織学的検査のために準備し、異なる炎症特徴について０〜４のスケールで評点した。ＰＢＳ処理マウスと比較して、統計的に有意な差異が見られる。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２１】ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞を注射し、かつＦＨＡ処理したＳＣＩＤマウスの脾細胞によるＩＬ−１０産生の増大を示すグラフである。図２０に説明したように、マウスの４つの実験グループを用いた。処理から８週間後、マウスの４グループから脾細胞を回収した。ＦＡＣＳ法を使用して脾細胞塊からＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。未分離の脾細胞、又は精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激した。２度目の刺激から２日後、回収した上清中のＩＬ−１０濃度を測定した。結果は３つの培養物についての平均＋／−ＳＤである。この結果では、ＦＨＡ処理マウスからの脾臓Ｔ細胞（ｐ＜０．０５）及び精製ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生の有意な増大が見られる（統計的に有意ではない）。
【図２２】ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞を注射したＦＨＡ処理マウスの脾細胞による、プロ炎症性サイトカイン産生の低下を示すグラフである。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞の注射、及び図２０にて説明した処理を行った８週間後、ＳＣＩＤマウスから脾細胞を回収した。脾細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激した。２度目の刺激から２日後、回収した上清中のＩＦＮ−γ（Ａ）、ＴＮＦ−γ（Ｂ）、ＩＬ−４（Ｃ）及びＩＬ−５（Ｄ）濃度を測定した。この結果では、脾臓Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ及びＩＬ−５産生の有意な抑制（ｐ＜０．０５）が見られる。結果は３つの培養物についての平均＋／−ＳＤである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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