(57)【要約】    本発明は、新規スクリーニング規範を用いて、患者癌疾患修飾抗体を生産するための方法に関する。終点として癌細胞細胞障害性を用いて抗癌抗体を分離することで、そのプロセスは治療および診断目的のための抗癌抗体の生産を可能にする。そのような抗体は、癌の病期分類および診断を助け、原発腫瘍および腫瘍転移の処置に用いられる。抗癌抗体を毒素、抗体、放射性化合物、および造血性細胞とコンジュゲートさせることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたモノクローナル抗体であって、受託番号ＰＴＡ−５０６５としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
キメラ化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
受託番号ＰＴＡ−５０６５としてＡＴＣＣに寄託された単離クローン。
【請求項５】
ヒト腫瘍から選択された組織試料中の癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
前記ヒト腫瘍から組織試料を提供することと、受託番号ＰＴＡ−５０６５としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させることと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を決定することと、を含むことで、
前記組織試料中の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項６】
前記ヒト腫瘍組織試料が、大腸、卵巣、肺、および胸部組織からなる群から選択された組織に生じている腫瘍から得られる、請求項５に記載の結合アッセイ。
【請求項７】
ヒト腫瘍から選択された組織試料中の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供することと、
受託番号ＰＴＡ−５０６５としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することと、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、前記組織試料と接触させることと、前記組織試料によって、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を決定することと、を含み、前記癌細胞が、前記結合による単離によって得られ、前記組織試料でのそれらの存在が確認される、方法。
【請求項８】
前記ヒト腫瘍組織が、大腸、卵巣、肺、および乳房組織からなる群から選択された組織に由来する腫瘍から得られる、請求項７に記載の方法。  
【請求項９】
請求項１の前記単離されたモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項２の前記ヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項３のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
細胞障害性部分、酵素、放射活性化合物、および造血細胞から選択された構成要素とコンジュゲートした請求項１、２、３、９、１０，および１１のいずれかの単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および生産と、このようなＣＤＭＡＢを、必要に応じて１種類以上の化学療法薬と組み合わせて、治療および診断プロセスで用いることとに関する。本発明は、さらに、結合アッセイに
関し、この結合アッセイは本発明のＣＤＭＡＢを利用する。
【背景技術】
【０００２】
癌を呈する各々の個体は、ユニークであり、その人の個性と同程度に他の癌とは異なる癌を有する。これにもかかわらず、現在の治療は、同一種類の癌を持つすべての患者を、同一の病期に同一の方法で処置する。これらの患者の少なくとも３０％が一次治療に失敗するので、さらなる処置段階をもたらし、処置の失敗、転移、および究極的には死に至る確率が高くなる。処置に対する優れた取り組みは、特定の個人に対する治療をカスタマイズすることである。現在の方法でそれ自体がカスタマイズに適合する唯一の方法は、手術である。化学療法および放射線治療は、患者に合うように調整することはできず、また、多くの場合、手術それ自体が治癒を生ずるには不十分である。
モノクローナル抗体の出現で、カスタマイズ化された治療を開発するための方法の可能性がより現実的になった。なぜなら、各抗体が単一のエピトープを標的にすることができるからである。さらに、特定の個々の腫瘍を一意的に定めるエピトープの立体配座を標的にする抗体の組み合わせを生産することが可能である。
開発する癌細胞と正常細胞との著しい違いが、癌化した細胞に特異的である抗原を癌細胞が含むことであるという認識を持つことで、科学界では、それらの癌抗原に対して特異的に結合することで癌化細胞を特異的に標的化するモノクローナル抗体を設計することができると、長い間、考えられていたため、モノクローナル抗体が「魔法の弾丸」として用いることができるという信仰が生み出された。
即座に開示された発明の教示にもとづいて単離されるモノクローナル抗体は、患者にとって有益な方法で、例えば、全身腫瘍組織量を減少させることによって、癌疾患プロセスを修飾することが示され、本明細書では癌疾患修飾抗体（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ＣＤＭＢ））または「抗癌（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ）」抗体として、様々に呼ばれる。
現在のところ、癌患者は通常、処置に関する選択肢をほとんどもっていない。癌治療に対する規格化されたアプローチによって、全体的な生存率および罹患率の改善が得られている。しかし、特定の個人に対しては、これらの改善された統計値が個人的状況の改善と必ずしも相関するというわけではない。
したがって、同一の同齢集団（コホート）の他の患者とは独立して各腫瘍を開業医が処置することを可能にする方法論が提案された場合、このことはまさにその一人の人間に対する治療をテーラーメイドするユニークなアプローチを可能とする。そのような治療過程は、理想的には、治癒率を高め、良好な結果をもたらし、それによって長い間の切実な要求が満たす。
【０００３】
従来、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌の処置では、ある程度の成功を収めながら活用されていた。リンパ腫および白血病に対しては、ヒト血漿を用いた治療が施されていたが、ほとんど長期寛解または反応がなかった。さらにまた、再現性に欠け、化学療法と比較して何ら付加的な利点がなかった。乳癌、黒色腫、および腎細胞癌等の固形腫瘍もまた、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、および馬血清によって処置されており、これらは一致して予測不可能かつ無効な結果を伴っていた。
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床試験が数多くなされた。１９８０年代に、特異的抗原に対する抗体を用いて、または組織選択性に基づいてヒト乳癌に関する少なくとも４通りの臨床試験がおこなわれたが、少なくとも４７人の患者のうち応答者は一人だけであった。１９９８年になって、シスプラチンと併用してヒト化抗ｈｅｒ２抗体を用いた臨床試験が成功した。この臨床試験では、３７人の患者について反応の評価がおこなわれ、約１／４が部分的反応率を有し、残りの部分が軽度または安定した病態の進行を有していた。
結腸直腸癌を調べる臨床試験は、糖タンパク質標的および糖脂質標的の両方に対する抗体を必要とする。抗体（例えば、腺癌に対して多少なりとも特異性を持つ１７−１Ａ）の第２相臨床試験を６０人を越える患者に対しておこなったところ、部分的寛解が生じたのはたったの１人であった。他の治験では、１７−１Ａ添加を用いることで、添加されたシクロホスファミドを活用するプロトコールでは患者５２人中、完全寛解が生じたのはたったの１人であり、やや有効であったのは２人だけであった。１７−１Ａが関与する他の治験でも類似の結果が得られた。画像化が最初に認められたヒト化マウス・モノクローナル抗体を用いても腫瘍退縮が生じなかった。現在まで、結腸直腸癌に対して有効な抗体は存在していなかった。同様に、肺癌、脳癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および胃癌に対しても、好ましくない結果が等しく得られていた。黒色腫に対して抗ＧＤ３モノクローナル抗体を用いることで、ある程度の成功が収められている。このように、ヒト臨床試験の必要条件である小動物を用いた研究の成功にもかかわらず、試験された抗体のほとんどに効果が認められなかったことがわかる。
【０００４】
（先行特許）
米国特許第５，７５０，１０２号（特許文献１）は、患者の腫瘍から得た細胞にＭＨＣ遺伝子（該患者の細胞または組織からクローニングしたものであってもよい）によるトランスフェクションをおこなう方法を開示されている。そのため、このようなトランスフェクション細胞を用いて患者に予防接種がおこなわれる。      
米国特許第４，８６１，５８１号（特許文献２）が開示しているプロセスは、新生および正常細胞の細胞内構成要素に対しては特異的ではあるが、細胞外構成要素に対しては非特異的であるモノクローナル抗体を得るステップと、該モノクローナル抗体を標識するステップと、標識された抗体を、新生細胞を殺す治療を受けた哺乳類の組織と接触させるステップと、変性していく新生細胞の細胞内構成要素に対する標識抗体の結合を測定することによって、治療の効果を決定するステップと、を含む。ヒト細胞内抗原を標的とする抗体を調製する際に、悪性細胞がそのような抗原の好都合な源を代表することを特許権者が認識している。
米国特許第５，１７１，６６５号（特許文献３）は、新規抗体とその生産のための方法とを提供する。具体的には、本特許は、ヒト腫瘍（例えば、大腸および肺）に関連したタンパク質抗原に強固に結合する一方で、正常細胞に対してはかなり低い度合いで結合する特性を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。
米国特許第５，４８４，５９６号（特許文献４）が提供する方法は、癌治療の方法であって、ヒト癌患者から外科的に腫瘍組織を除去することと、その腫瘍組織を処置して複数の腫瘍細胞を得ることと、これらの腫瘍細胞に放射線を照射して、生存可能ではあるが非腫瘍形成性とすることと、これらの細胞を用いて、原発腫瘍の再発を阻害する一方で同時に転移を阻害することが可能な、患者に対するワクチンを調製することとを含む。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原に反応性を示すモノクローナル抗体の開発を教示する。第４段落第３５行（以下参照）で述べられているように、特許権者は、ヒト新形成での積極的な特異的免疫療法で自所性腫瘍細胞を利用する。
米国特許第５，６９３，７６３号（特許文献５）は、ヒト癌腫に特有ではあるが、その源である上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
米国特許第５，７８３，１８６号（特許文献６）では、Ｈｅｒ２発現細胞（その抗体を生産するハイブリドーマ細胞系）でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体と、該抗体を用いる癌処置法と、上記抗体を含有する医薬組成物とが述べられている。
米国特許第５，８４９，８７６号（特許文献７）では、腫瘍源と非腫瘍組織源とから精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗原を生産するための新規なハイブリドーマ細胞系について、記述されている。
米国特許第５，８６９，２６８号（特許文献８）では、所望の抗原に特異的な抗体を生産するヒトリンパ球の生成方法、モノクローナル抗体を生産するための方法、ならびにその方法によって生産されたモノクローナル抗体について記述されている。この特許は、特に、癌の診断および処置にとって有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の生産について記述されている。
米国特許第５，８６９，０４５号（特許文献９）は、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、およびヒト癌細胞に対して反応性を示す単鎖抗毒素に関する。これらの抗体が働く機能は、それらの分子が、ヒト癌腫の表面で細胞膜抗原に反応性を示す点と、さらにまた、結合の後、それらの抗体が癌細胞内に内在化する能力を有する点とから２重（ｔｗｏ−ｆｏｌｄ）であり、そのような機能によって、抗体と薬物とのコンジュゲートあるいは抗体と毒素とのコンジュゲートを形成するのに特に有用である。それらの非修飾形態では、上記抗体もまた、特定の濃度で細胞障害性の特性を呈する。
米国特許第５，７８０，０３３号（特許文献１０）は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示している。しかし、この抗体は、老いた哺乳類に由来する抗細胞核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見いだされる自然抗体の一種であると言われている。自己抗体が「老いた哺乳類」に由来することから、自己抗体が実際に、処置されている患者に由来するものである必要性はない。また、この特許は、天然かつモノクローナルである抗細胞核自己抗体と、モノクローナル抗細胞核自己抗体を生産するハイブリドーマ細胞系とを開示している。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号公報
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号公報
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号公報
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号公報
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号公報
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号公報
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号公報
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号公報
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号公報
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号公報
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、以前に、癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためにプロセスを対象とする「個々の患者に特異的な抗癌抗体（”Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）と題された米国特許第６，１８０，３５７号を授与している。
この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞系を単離するための’３５７特許に教示されたように、患者特異的抗癌抗体の生産方法を利用する。これらの抗体は、特に、１種類の腫瘍に対して作ることができることから、癌治療の専用化（カスタマイゼーション）を可能にする。この出願の文脈の中で、細胞致死（ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）（細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ））または細胞増殖抑制（ｃｅｌｌ−ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）（細胞増殖抑制性（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ））の特性を持つ抗癌抗体は、今後、細胞障害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）と呼ぶ。これらの抗体を癌の病期分類および診断の補助として用いることができ、また腫瘍転移の処置に用いることができる。
個別的抗癌処置の見通しは、患者を管理する方法の変化をもたらす。可能性がある臨床シナリオは、腫瘍細胞を提示時に得て積み上ることである。この試料から、既存する癌疾患修飾抗体のパネルから癌を類型化することができる。患者は従来通りに病期分類されるが、さらに病期分類する際に、入手可能な抗体を用いることができる。患者を直ちに既存の抗体によって処置し、腫瘍に対して特異的な抗体のパネルを、本明細書で概説される方法を用いて、あるいは本明細書に開示したスクリーニング方法と組み合わせたファージ・ディスプレイ・ライブラリーの使用を介して、生成することができる。生成された全ての抗体を抗癌抗体のライブラリーに添加する。なぜなら、他の腫瘍が、処置されているものと同様のエピトープのいくつかを持ち得る可能性が存在するからである。この方法にもとづいて生産された抗体は、これらの抗体に結合する癌を持つ不特定多数の患者の癌疾患を処置する上で、有用であると思われる。
抗癌抗体に加え、患者は多様な処置法の一部として現在推奨される治療を受けることに決めることができる。本方法論を介して単離された抗体が非癌細胞に対して相対的に非障害性であるという事実は、単独または従来の治療とともに使用される高用量の抗体の組み合わせを可能にする。治療係数が高いこともまた、処置耐性菌出現の可能性を減少させなければならない短い時間的尺度での再処置を可能にする。
さらに、標準的な化学療法の種類（例えば放射性核種）と本発明のＣＤＭＡＢとを組み合わせることで、上記化学療法の使用に重点を置くことは、この発明の範囲内である。
患者が治療の初期経過または転移発症に対して不応性である場合、腫瘍に対する特異抗体を生成するプロセスを、再処置のために繰り返すことができる。さらにまた、抗癌抗体を患者から得た赤血球に結合させ、転移を処置するために再度注入することができる。転移癌に対する有効な処置はほとんど存在せず、通常、転移は死をもたらす転帰不良の前兆となる。しかし、転移癌は、一般にかなり血管新生化しており、赤血球細胞による抗癌抗体の送達によって腫瘍部位に抗体を集中させる効果を得ることができる。転移前に先立っても、多くの癌細胞の生存は該癌細胞の宿主による血液供給に依存しており、赤血球細胞に結合した抗癌抗体が同様に、元の位置にある（ｉｎ  ｓｉｔｕ）腫瘍に対して効果的であり得る。あるいは、上記抗体を他の血行性細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、およびナチュラルキラー細胞に結合させてもよい。
【０００６】
抗体には５つの種類があり、各々は重鎖によって与えられる機能と関係している。一般に考えられていることは、裸の抗体によって殺される癌細胞が抗体依存型細胞傷害性または補体依存型細胞障害性のいずれかを介してもたらされるということである。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ１補体を結合することで、ヒト補体を活性化させることができ、それによって腫瘍の溶解をもたらす補体活性の古典経路が活性化する。ヒト抗体については、最も効果的な補体活性抗体が、概してＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞致死に至るＦｃ受容体を持つ補充細胞障害性細胞で効果的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２イソタイプの両方のヒト抗体がＡＤＣＣを媒介する。
抗体を介して癌を致死させる機構として考えられるものにもう一つあり、その機構が働くことで、細胞膜内およびそれに結合した糖タンパク質または糖脂質の種々の化学結合の加水分解が触媒される。
抗体媒介癌細胞致死には、より広く認められている機構がさらに２つある。第１の機構は、ワクチンとして抗体を用いることで、身体に対して、腫瘍細胞上にある推定上の癌抗原に対する免疫応答の生成を誘導させることである。第２の機構は、抗体を用いて、成長受容体を標的化させ、該受容体の機能を妨害するか、または受容体の機能が効果的に喪失されるように、受容体を下方制御することである。
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞系と、対応の単離モノクローナル抗体と、その抗原結合フラグメント（上記ハイブリドーマ細胞系がコードされている）とを単離するために、癌細胞に関して細胞障害性であり、その一方で同時に非癌細胞に対して相対的に非障害性である特定の個体に由来する細胞から癌疾患修飾抗体を生産するための方法を利用することである。
本発明の別の目的は、癌疾患修飾抗体とその抗原結合フラグメントとを教示することである。
本発明の他の目的は、抗体依存型細胞障害性を介して細胞障害性が媒介される癌疾患修飾抗体を生産することである。
本発明のさらなる目的は、補体依存型細胞障害性に介して細胞障害性が媒介される癌疾患修飾抗体を生産することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が、細胞の化学結合の加水分解を触媒する能力の関数である癌疾患修飾抗体を生産することである。
本発明のさらなる目的は、癌疾患修飾抗体を生産することで、前記抗体は癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイで有用である。
この発明の目的および利点は、この発明の例証および実施例（いくつかの実施形態）として述べられる以下の説明から明らかになろう。
【０００７】
（図面の簡単な説明）
図１は、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する１０Ａ３０４．７抗体、イソタイプ対照抗体、抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
【実施例１】
【０００９】
ハイブリドーマ生産  −  ハイブリドーマ細胞系１０Ａ３０４．７：
ブタペスト条約にもとづいて、ハイブリドーマ細胞系１０Ａ３０４．７を２００２年１１月２６日付で米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  大学通り、マナッサス、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）に寄託した（寄託番号ＰＴＡ−５０６５）。米国特許法施行規則（３７ＣＦＲ）１．８０８によれば、寄託者は、公衆に対する寄託材料の利用可能性に課された全ての制限は、特許の付与によって最終的に取り除かれることを保証する。
抗癌抗体を生産するハイブリドーマを生産するために、ＨＴ−２９大腸癌細胞系に由来し、かつＳＣＩＤマウスで増殖させた結腸腫瘍の単細胞懸濁液を、冷ＰＢＳで調製した。イミューンアシイ（ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ）（商標）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ベンロ（Ｖｅｎｌｏ）、オランダ）アジュバンドを使用するために、該アジュバンドを穏やかにボルテックスして調製した。１００マイクロリットルのイミューンアシイ（ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ）（商標）マウス・アジュバンドを１千万個のＨＴ−２９細胞を含む微小遠心管に加えて混合し、室温で１５分間放置した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、２５０万個の細胞を含む１００マイクロリットルの抗原アジュバントを筋肉注射することで、該マウスの免疫化をおこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初期免疫化後２週目に、２５０万個の細胞を含む２５０マイクロリットルを腹腔内注射することによって、免疫マウスに対する追加免疫をおこなった。最終免疫後２日目に、脾臓を用いて融合をおこなった。単離脾臓細胞を、融合相手であるＮＳＯ−１ミエローマと融合させることで、ハイブリドーマを調製した。ハイブリドーマをサブ・クローニングするために、融合物から得た上清を調べた。
ハイブリドーマによって分泌された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭ型のものであるかどうかを判断するために、ＥＬＩＳＡアッセイを採用した。濃度がコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．２〜９．６）中２．４マイクログラム／ｍｌであるヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を１００マイクロリットル／ウエル、４℃で、ＥＬＩＳＡプレートに一晩添加した。このプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗った。１００マイクロリットル／ウエルのブロッキング緩衝液（５％ミルク含有洗浄緩衝液）をプレートに室温で１時間添加した後、洗浄緩衝液で３回洗った。１００マイクロリットル／ウエルのハイブリドーマ懸濁液を添加し、そのプレートを室温で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、１／５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ西洋わさびペルオキシダーゼ・コンジュゲート（１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈）のいずれかを１００マイクロリットル／ウエル、添加した。室温で１時間、プレートをインキュベートした後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００マクロリットル／ウエルのＴＭＢ溶液を室温で１〜３分、インキュベートした。１００マイクロリットル／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することで呈色反応を停止させ、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）  ＨＴＳ７０００プレート・リーダーを用いて、このプレートを４５０ｎｍで読み取った。表１に示すように、１０Ａ３０４．７ハイブリドーマは、最初にＩｇＧイソタイプの抗体を分泌した。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
限界希釈１回目の後、ハイブリドーマ懸濁液を、細胞ＥＬＩＳＡアッセイで標的細胞に結合した抗体について、試験した。３種類の大腸癌細胞系（ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、およびＳＷ６２０）を試験した。平板培養された細胞を使用前に固定した。プレートをＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＰＢＳで３回、室温で洗浄した。ＰＢＳで希釈した２％パラホルムアルデヒド１００マイクロリットルを書くウエルに、室温で１０分間添加した後、捨てた。このプレートを再び、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＰＢＳで３回、室温で洗浄した。ブロッキングを、１００マイクロリットル／ウエルの５％ミルク含有洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）によって、室温で１時間、おこなった。このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ハイブリドーマ懸濁液を１００マイクロリットル／ウエルで、室温で１時間添加した。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈）とコンジュゲートさせた１／５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭを１００マイクロリットル／ウエルの濃度で添加した。室温で１時間インキュベートした後、１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ基質を室温で１〜３分間インキュベートした。この反応を１００マイクロリットル／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）  ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置を用いて、このプレートを４５０ｎｍで読み取った。表１に集計したように、１０Ａ３０４．７ハイブリドーマは、最初にＩｇＧイソタイプの抗体を分泌した。表１に集計したように、結果を、ＩｇＧイソタイプ対照（３ＢＤ−３７）と比較したバックグラウンドを越える倍率の数として表した。１０Ａ３０４．７ハイブリドーマ由来の抗体は、ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、およびＳＷ６２０細胞で、バックグラウンドを超えて、それぞれ２２．８倍、１３．１倍、および２３．９倍高い結合を呈した。このことは、他のものよりもいくつかの癌細胞でより多く発現された抗原に抗体が結合したことを示した。
抗体結合に関する試験と同時に、ハイブリドーマ懸濁液の細胞傷害性効果をいくつかの大腸癌細胞系、すなわちＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、およびＳＷ６２０で試験した。生（Ｌｉｖｅ）／死（Ｄｅａｄ）細胞障害性アッセイは、モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕ、ＯＲ）から得た。上記アッセイは、以下に概説する変更を加えて、製造元の指示に従って実施した。所定の適当な密度でアッセイ前に細胞を平板培養した。２日後、１００マイクロリットルの懸濁液をハイブリドーマ・マイクロタイター・プレートから細胞プレートへ移して、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間、インキュベートした。正の対照として働くウエルを空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウムおよび／またはシクロヘキシミドを添加した。３ＢＤ−２７モノクローナル抗体がＨＴ−２９大腸癌細胞に結合しないことが知られているので、この抗体もイソタイプ対照として添加した。上記アッセイでは、比較のために抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２２５）も使用した。処置の５日後、上記プレートを逆さにして空にし、拭いて乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有する室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分注し、３回軽くたたき、逆さまにして空にし、さらに拭き取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで希釈した蛍光性の生（Ｌｉｖｅ）／死（Ｄｅａｄ）染料を５０マイクロリットルずつ各ウエルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、３０分間インキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）  ＨＴＳ７０００蛍光プレート読み取り装置で読み取り、データをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）で分析した。結果を表１に集計した。１０Ａ３０４．７ハイブリドーマは、ＳＷ１１６細胞で１１％の特異的細胞障害性を生じた。この細胞障害性は、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５によって得られたものと類似していた。ＳＷ１１１６細胞に対する１０Ａ３０４．７の強固な結合は、このレベルの抗体結合がそれらの癌細胞に対する細胞障害性を媒介するのに十分であったことを示した。細胞ＥＬＩＳＡアッセイによるＨＴ−２９およびＳＷ６２０癌細胞に対する１０Ａ３０４．７抗体の強固な結合があったにもかかわらず、このことは細胞障害性を誘導しなかった。このことは、抗体結合単独ではＨＴ−２９およびＳＷ６２０細胞に対する１０Ａ３０４．７の細胞障害性を媒介するには十分ではなかったことを示唆していた。表１に集計したように、１０Ａ３０４．７抗体と同一イソタイプの、しかもＨＴ−２９大腸癌細胞に対して結合しないことが既に知られている３ＢＤ−２７抗体は、そのような癌細胞系では細胞障害性を生じなかった。既知の非特異的細胞障害性剤であるアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドは、予想どおりに細胞障害性を生じた。比較として、明確な抗癌抗体Ｃ２２５は、ＳＷ１１１６癌細胞で１３％細胞障害性を生じた。表１の結果は、癌細胞に対する１０Ａ３０４．７の結合が細胞障害性を生ずる上で重要なステップと考えられるが、それ自身はこのイベントを媒介する上で十分ではないことを示している。
【実施例２】
【００１２】
抗体生産：
１０Ａ３０４．７モノクローナル抗体の生産は、週に２回、回収および再播種をおこなうことで、ハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  バイオサイエンス、オークビル、ＯＮ）で培養し、プロテインＧセファローズ４ファースト・フロー（アマシャム・バイオサイエンス、バイエ・デュルフェ、ＱＣ）による標準的抗体精製手順によって、おこなった。ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。１０Ａ３０４．７を、多くの正の対照（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、カッパ、２０ｍｇ／ｍｌ、イーバイオサイエンス、サンジエゴ、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、カッパ、１０ｍｇ／ｍｌ、インター・メディコ、マークハム、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５ｍｇ／ｍｌ、セダールレーン、ホーンバイ、ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００ｍＭ、シグマ、オークビル、ＯＮ）、およびＮａＮ３（０．１％、シグマ、オークビル、ＯＮ）と、負の対照（１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０ｍｇ／ｍｌ、ＢＤバイオサイエンス、オークビル、ＯＮ）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性が未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０ｍｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ緩衝液（２％））との両方と細胞障害性アッセイで比較した（表２）。
乳癌（ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＣａＣＯ２、ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、ＳＷ６２０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、膵癌（ＢｘＰＣ−３）、前立腺癌（ＰＣ−３）、および非癌（ＯＣＤ  ２７ｓｋ、Ｈｓ８８８  Ｌｕ）細胞系を試験した（全てＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡから入手）。モレキュラー・プローブ（ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）、ＯＲ）から生／死細胞傷害アッセイを得た。このアッセイを、以下に概説する変更を加えた製造元の指示に従って実行した。
【００１３】
【表２】
2007523838.tif 000004
【００１４】
所定の適当な密度でアッセイをおこなう前に、細胞を平板培養した。２日後、１００マイクロリットルの精製抗体を培地に希釈し、さらに細胞プレートに移して５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間インキュベートした。次に、このプレートを逆さまにして空にし、拭き取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有する室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分注し、３回軽くたたき、逆さまにして空にし、さらに拭き取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで希釈した蛍光性の生／死染料を５０マイクロリットルずつ各ウエルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、５分間インキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）  ＨＴＳ７０００蛍光プレート読み取り装置で読み取り、データをマイクロソフト・エクセルで分析し、結果を表２に集計した。データは、三重反復で試験した４回の実験の平均値を表し、以下の様式で定性的に表された。すなわち、バックグラウンドを越える１５％細胞障害性を持つ４／４実験（＋＋＋＋）、バックグラウンドを越える１５％細胞障害性を持つ２／４実験（＋＋＋）、バックグラウンドを越える１０〜１５％細胞障害性を持つ少なくとも２／４実験（＋＋）、ならびにバックグラウンドを越える８〜１０％細胞障害性を持つ少なくとも２／４実験。表２中の印のない細胞は、矛盾したものまたは閾値細胞障害性よりも効果が低いものを表した。１０Ａ３０４．７抗体は、ＳＷ１１１６大腸細胞系で３１％細胞障害性を誘導した明確な抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５の細胞障害性効果を３５％生じた。この細胞系に対する両方の抗体の効果は、表１の結果と一致している。さらに、１０Ａ３０４．７は、Ｃ２２５と比較した、他の癌細胞に対して著しく高い細胞障害性を誘導し、例えば乳癌細胞系ＭＤＡ  ＭＢ２３１（１１１％）およびＭＣＦ−７（８５０％）、前立腺癌細胞系ＰＣ−３（３７５％）、および卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ（６６７％）が挙げられる。重要なことに、１０Ａ３０４．７は、数多くの非癌細胞（例えば、ＣＣＤ  ２７ｓｋまたはＨｓ８８８  Ｌｕ）に対する細胞障害性を生成せず、上記抗体が種々の癌細胞に対して特異的であることを示した。化学的細胞傷害剤は、期待される細胞毒性を誘導する一方で、比較のために誘導された多くの他の抗体もまた、予想どおりに実行され、生物学的細胞アッセイの限界を与えた。
最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない）で洗浄することで、細胞をＦＡＣＳ用に調製した。細胞解離緩衝液（インビトロゲン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ））を用いて、３７℃で細胞培養プレートから細胞を遊離させた。遠心および回収後、細胞をダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＭａｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、および２５％胎仔牛血清を含む）（洗浄用の培地）に４℃で懸濁して計数し、適当な細胞密度となるように等分割（アリコート）し、細胞を遠心により沈殿させ、さらに、３０分間にわたって氷上、２０マイクログラム／ｍｌの濃度で、試験抗体（１０Ａ３０４．７）または対照抗体（イソタイプ対照、抗ＥＧＦ−Ｒ、または抗Ｆａｓ）の存在下にある開始培地（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、および２％胎仔牛血清を含むＤＰＢＳ）に、４℃で再懸濁した。アレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８コンジュゲート２次抗体の添加に先立って、細胞を洗浄用培地で１回洗浄した。染色用培地に含まれるアレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８コンジュゲート２次抗体を２０分間、添加した。次に、細胞を最終時間にわたって洗浄し、１マイクログラム／ｍｌのよう化プロピジウムを含む染色用培地に再懸濁した。フロー・サイトメトリーによる細胞の収集を、セルクウェスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェア（ＢＤ  バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いてＦＡＣＳｃａｎ上に試料を走らせることで、評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器上での電圧および増幅利得を調節することで設定した。３通りの蛍光チャンネル（ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３）に対する検出器を、精製イソタイプ制御により染色した細胞を走らせることで、調節し、その後、細胞が適当な１〜５単位のメジアン蛍光強度を持つ均一なスピークを持つように、アレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８コンジュゲート２次抗体が続く。生細胞の獲得を、ＦＳＣおよびヨウ化プロピジウムのためのゲート開閉によって取得した。例えば、約１０，０００個の生細胞を分析のために獲得し、結果を表３に示した。
【００１５】
【表３】
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【００１６】
表３に集計された平均蛍光強度倍率がイソタイプ対照を超えて増加し、定量的に、３ないし５未満（＋）；  ５ないし２５（＋＋）；２５ないし５０（＋＋＋）、および約５０を越える値（＋＋＋＋）として表される。１０Ａ３０４．７抗体の代表的なヒストグラムを図１用に、またいくつかの場合で、例証した二峰性のピークを含んでいる結合特性の証拠用に、編集した。Ｈ０Ａ３０４．７は、全ての細胞系に対して非特異的に結合し、非癌細胞ＣＣＤ−２７ｓｋおよびＨｓ８８８Ｌｕに対する高い結合を含むが、結合の度合いは種々の細胞系で異なった。したがって、１０Ａ３０４．７は、選択的に、異なる濃度で細胞系に結合した。表２および３の結果から示されることは、腫瘍細胞に対する１０Ａ３０４．７の結合が、抗体媒介細胞障害性にとって必要ではあるが、このイベントをトリガーするには不十分であった。
この明細書で言及される特許および刊行物の全てが、本発明が関係する当業者のレベルを示すものである。全ての特許および刊行物が、あたかも個々の刊行物が特異的および個別的に本明細書中で援用されることを示すように、同程度に全ての特許および刊行物が本明細書の一部として援用される。
本発明の特定の形状が例示される一方で、本明細書中に記載および示した部分の特異的な形状または配置に限られるわけではないことが理解されるだろう。
種々の変更を本発明の範囲から逸脱することなくできることは当業者にとって明らかであり、明細書に何が示され、かつ説明されたかに本発明が限定されるものではない。当業者は、本発明が目的を実行するために十分に適しており、また上記した結論および利点を、本明細書中に記載したものと同様に、実行することに十分に適していると、容易に理解するだろう。本明細書中に記載されるいかなるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ、好ましい実施形態を代表するものであり、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中での変化および他の用途は、本発明の精神の範囲内で含まれて、かつ添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、クレームされたように本発明は、そのような特定の実施形態に対して過度に制限を加えるものではないことを理解すべきである。実際、当業者にとって明らかである本発明を実行するための記載された態様の種々の修飾は、請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する１０Ａ３０４．７抗体、イソタイプ対照抗体、抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを包含する。
【図１】
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【国際調査報告】
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2007523838.tif 000008