(57)【要約】前述の発明について明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明および付属のクレームの真の範囲から乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７０で表される配列を含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマー。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物。
【請求項３】
共刺激性分子が、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合している、請求項２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項５】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、および抗原をさらに含む、免疫調節性組成物。
【請求項７】
抗原が、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択される、請求項６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項８】
抗原がアレルゲンである、請求項６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１１】
配列番号１７１で表される配列を含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマー。
【請求項１２】
請求項１１に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物。
【請求項１３】
共刺激性分子が、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合している、請求項１２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、および抗原をさらに含む、免疫調節性組成物。
【請求項１７】
抗原が、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択される、請求項１６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１８】
抗原がアレルゲンである、請求項１６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項２０】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１６に記載の免疫調節性組成物。
【請求項２１】
気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者を治療的に処置する方法であって、該患者にイムノマーを投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含み、および１つより多い５’末端を有しており、ここで少なくとも１個の前記ヌクレオチドは、到達可能５’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、および免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫刺激性ジヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’− 置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
イムノマーが、配列番号１７０で表される配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
イムノマーが、配列番号１７１で表される配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
イムノマーが、配列番号１７２で表される配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
イムノマーが、配列番号１７３で表される配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
疾病または疾患に関連する抗原を投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
イムノマーもしくは抗原または両者が、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
アジュバントを投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者における免疫反応を調節する方法であって、該患者にイムノマーを投与することを含む、前記方法。
【請求項３２】
免疫反応がＴｈ１免疫反応である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
免疫反応がＴｈ２免疫反応である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含み、および１つより多い５’末端を有しており、ここで少なくとも１個の前記ヌクレオチドが、到達可能５’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、および免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
免疫刺激性ジヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’− 置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
イムノマーが、配列番号１７０で表される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
イムノマーが、配列番号１７１で表される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
イムノマーが、配列番号１７２で表される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
イムノマーが、配列番号１７３で表される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
疾病または疾患に関連する抗原を投与することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
イムノマーもしくは抗原または両者が、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合している、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
アジュバントを投与することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年１２月５日に出願された米国仮出願第60/528,277号の利益を主張し、この仮出願は参照としてその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明分野
本発明は、オリゴヌクレオチドを免疫刺激剤として用いる免疫学および免疫治療の用途に関する。
【０００３】
関連分野の概要
オリゴヌクレオチドは現代の分子生物学において必須のツールとなっており、診断プローブ法からＰＣＲや遺伝子発現のアンチセンス阻害および免疫治療的用途に至るまでの、広い種類の技法に用いられている。オリゴヌクレオチドのこの広範囲の使用のため、オリゴヌクレオチドを合成する、迅速で安価で効率的な方法に対するさらなる需要が生じている。
【０００４】
アンチセンスおよび診断的用途のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在ルーチンに実施することができる。例えば、Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonulcleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal ed., Humana Press, 1993)；Oligonulcleotides and Analogues, A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein ed., 1991)；およびUhlmann and Peyman、上記；Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995)；およびAntisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)を参照のこと。初期の合成のアプローチは、ホスホジエステルおよびホスホトリエステルの化学を含んでいた。例えば、Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972)には、オリゴヌクレオチドの合成のためのホスホジエステルの化学が開示されている。Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978)には、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のための、ホスホトリエステルの化学が開示されている。これらの初期にアプローチは、合成のためのより効率的なホスホラミダイトアプローチおよびＨ−ホスホネートアプローチに大きく道を譲っている。例えば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)には、ポリヌクレオチドの合成におけるデオキシリボヌクレオシドホスホラミダイトの使用が開示されている。Agrawal and Zamecnikの米国特許第5,149,798号（1992）には、Ｈ−ホスホネートアプローチによるオリゴヌクレオチドの最適化された合成について開示されている。これら最新のアプローチの両方は、種々の修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するために用いられている。Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987)には、ホスホラミダイトの化学を用いたオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成が教示されている。Connoly et al., Biochem. 23:3443 (1984)には、ホスホラミダイトの化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成について開示されている。Jager et al., Biochem. 27: 7237 (1988)には、ホスホラミダイトの化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホラミデート（phosphoramidate）の合成について開示されている。Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7079-7083 (1988)には、Ｈ−ホスホネートの化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホラミデートおよびオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成について開示されている。
【０００５】
近年、数人の研究者らにより、免疫療法の用途においてオリゴヌクレオチドを免疫刺激剤として用いることの有効性が示された。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘導できるとの観察は、この副作用を治療ツールとして開発することへの関心を創出した。これらの努力は、ジヌクレオチド天然ＣｐＧを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに集中された。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含むホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロン−アルファおよびガンマの合成を誘導し、ナチュラルキラー活性を増強できることを教示している。Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)は、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)は、かかるオリゴヌクレオチドがヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、インフルエンザウィルスに対する免疫反応を増強することを教示している。McCluskie and Davis, J. Immunol.161:4463-4466 (1998)は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、強力なアジュバントとして作用し、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に対する免疫反応を増強することを教示している。
【０００６】
ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾は、免疫反応の調節剤として作用するそれらの能力にも影響を及ぼし得る。例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182；Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 52:1537-1544；Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502；Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458；Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054；Yu et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588；Yu et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267；およびKandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001)9:807-813を参照のこと。
【０００７】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが調節可能な反応の１つは、喘息である。アレルギー性喘息反応は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）リンパ球の活性化を特徴とする。Ｔｈ２リンパ球により誘導された反応は、喘息におけるアレルギー性炎症の発症機序および進行に主要な役割を果たす。Ｔｈ２サイトカインＩＬ−５は、好酸球の産生と生存を増加させ、気道の好酸球の増加を導く。他のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−９およびＩＬ−１３）もまた、アレルゲン特異的ＩｇＥの産生、マスト細胞増殖、上皮細胞接着分子発現、および気道過敏性を誘導することにより、アレルギー炎症において重要な役割を果たす。コルチコステロイドのみが、現在、アレルギー性喘息の処置に広く用いられている。ステロイドの処置は、炎症の発現を最小化することにのみ効果的であるが、疾病を治療はしない。アレルギー性喘息の進行を防ぐための、連続的な治療が求められる。
これらの報告は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドにより生じる免疫反応を、増強し改変することの必要性が存在することを明白に示している。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチド化合物によって引き起こされる免疫反応を増強し改変するための方法を提供する。本発明による方法は、免疫療法用途のために免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増加させることができる。本発明者らは驚くべきことに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、その５’末端を最適に提示するよう修飾することにより、その免疫刺激能力が劇的に増強されることを見出した。かかるオリゴヌクレオチドを、本明細書においては「イムノマー」と呼ぶ。
【０００９】
従って第１の側面において、本発明は、その３’末端、ヌクレオシド間結合、または官能化核酸塩基もしくは糖において、非ヌクレオチドリンカーを介して結合している少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含むイムノマーを提供し、ここで少なくとも１個の前記オリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、到達可能５’末端を有している。
１つの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマーは、配列番号１７０で表される配列を含む。
【００１０】
第２の側面において、本発明は、配列番号１７０で表される配列を含む免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み；並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物を提供する。本発明のこの側面において、共刺激性分子は随意的に、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合しており、そして免疫調節性組成物はさらに、随意的に、アジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１１】
第３の側面において、本発明は、配列番号１７０で表される配列を含む免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み；並びに、抗原をさら含む免疫調節性組成物を提供し、ここで抗原は、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択されるか、または抗原はアレルゲンである、。本発明のこの側面において、免疫調節性組成物はさらに、随意的に、アジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含む。
他の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマーは、配列番号１７１で表される配列を含む。
【００１２】
第４の側面において、本発明は、配列番号１７１で表される配列を含む免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み；並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物を提供する。本発明のこの側面において、共刺激性分子は随意的に、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合しており、そして免疫調節性組成物はさらに、随意的に、アジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１３】
第５の側面において、本発明は、配列番号１７１で表される配列を含む免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み；並びに、抗原をさら含む免疫調節性組成物を提供し、ここで抗原は、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択されるか、または抗原はアレルゲンである。本発明のこの側面において、免疫調節性組成物はさらに、随意的に、アジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含む。
他の態様において、本発明は、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、該患者にイムノマーを投与することを含む。
【００１４】
第６の側面において、本発明は患者を治療的に処置する方法を提供し、ここでイムノマーは、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含み、および１つより多い５’末端を有しており、ここで少なくとも１個の前記ヌクレオチドは、到達可能５’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、および免疫刺激性ジヌクレオチドを含む。免疫刺激性ジヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’− 置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンである。
【００１５】
第７の側面において、本発明は患者を治療的に処置する方法を提供し、ここでイムノマーは、配列番号１７０で表される配列、または配列番号１７１で表される配列、または配列番号１７２で表される配列、または配列番号１７３で表される配列を含む。
【００１６】
第８の側面において、本発明は、疾病または疾患に関連する抗原を投与することをさらに含む、患者を治療的に処置する方法を提供し、ここでイムノマーもしくは抗原または両者は、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合しており、および／または、該方法はアジュバントを投与することをさらに含む。
他の態様において、本発明は、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者における免疫反応を調節する方法であって、該患者にイムノマーを投与することを含む、前記方法を提供し、ここで免疫反応は、Ｔｈ１および／またはＴｈ２免疫反応である。
【００１７】
第９の側面において、本発明は、患者における免疫反応を調節する方法を提供し、ここで、イムノマーは、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含み、および１つより多い５’末端を有しており、ここで少なくとも１個の前記ヌクレオチドは、到達可能５’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、および免疫刺激性ジヌクレオチドを含む。免疫刺激性ジヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−２’− 置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシンである。
【００１８】
第１０の側面において、本発明は、患者における免疫反応を調節する方法を提供し、ここでイムノマーは、配列番号１７０で表される配列、または配列番号１７１で表される配列、または配列番号１７２で表される配列、または配列番号１７３で表される配列を含む。
【００１９】
第１１の側面において、本発明は、疾病または疾患に関連する抗原を投与することをさらに含む、患者を治療的に処置する方法を提供し、ここでイムノマーもしくは抗原または両者は、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合しており、および／または、該方法はアジュバントを投与することをさらに含む。
【００２０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫療法用途のための免疫刺激剤としての、オリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。本明細書中に引用の発行された特許、特許出願、および参考文献は、その各々が具体的また個別に参照として組み込まれると示された場合同様に、参照としてここに組み込まれる。本明細書に引用された任意の参考文献の任意の教示と本明細書の間に不一致がある場合は、本発明のために後者を優先する。
【００２１】
本発明は、免疫療法用途、例えば、限定はされないが、成人および小児および獣医学的用途における、癌、自己免疫疾患、喘息、呼吸アレルギー、食物アレルギー、並びに細菌、寄生虫およびウィルス感染症の処置に用いられる免疫刺激性化合物によって引き起こされる免疫反応を、増強し改変するための方法を提供する。アレルギー性喘息は、本方法および化合物による処置に特に好ましい状態である。従って、本発明はさらに、免疫療法のために最適レベルの免疫刺激効果を有する化合物、およびかかる化合物を作製し用いるための方法を提供する。さらに、本発明のイムノマーは、ＤＮＡワクチン、抗体、アレルゲン、化学療法剤、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせたアジュバントとして有用である。
本発明者らは驚くべきことに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドがその５’末端を最適に提示するよう修飾することが、その免疫刺激能力に劇的に影響することを見出した。かかるオリゴヌクレオチドを、本明細書において「イムノマー」と呼ぶ。
【００２２】
第１の側面において、本発明は、その３’末端、またはヌクレオシド間結合、または官能化核酸塩基もしくは糖において、非ヌクレオチドリンカーに結合している少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含むイムノマーを提供し、ここで少なくとも１個の前記オリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、到達可能５’末端を有している。本明細書において、用語「到達可能５’末端」とは、イムノマーを認識して結合し免疫系を刺激する因子が到達できるように、オリゴヌクレオチドの５’末端が十分に利用可能であることを意味する。到達可能５’末端を有するオリゴヌクレオチドにおいて、末端の糖の５’ＯＨ位置は、２個より多いヌクレオシド残基と共有結合していない。随意的に、５’ＯＨはホスフェート、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート部分、芳香族もしくは脂肪族リンカー、コレステロール、または到達可能性を損なわない他の実体と結合することができる。
【００２３】
本発明において、用語「イムノマー」とは、その３’末端またはヌクレオシド間結合、または官能化核酸塩基もしくは糖において、直接もしくは非ヌクレオチドリンカーを介して結合している少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む、任意の化合物であって、少なくとも１個の前記オリゴヌクレオチドは（イムノマーの文脈において）免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、到達可能５’末端を有し、ここで前記化合物は、脊椎動物に投与された場合に免疫反応を誘導する。ある態様において、脊椎動物は哺乳類であり、ヒトを含む。
ある態様において、イムノマーは２個または３個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、（イムノマーの文脈において）これらは同一でも異なっていてもよい。好ましくは、かかる免疫刺激性オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも１つの到達可能５’末端を有する。
【００２４】
ある態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（複数を含む）に加えて、イムノマーはまた、遺伝子に相補的な少なくとも１個のオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において、用語「相補的な」とは、オリゴヌクレオチドが、生理条件下で遺伝子の領域にハイブリダイズすることを意味する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは遺伝子の発現を下方制御する。かかる下方制御オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムオリゴヌクレオチド、小阻害性ＲＮＡ（small inhibitory RNA）およびデコイオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるのが好ましい。本明細書において用語「遺伝子を下方制御する」とは、遺伝子の転写または遺伝子産物の翻訳を阻害することを意味する。従って、本発明のこれらの態様によるイムノマーは、１つまたは２つ以上の特定疾病ターゲットを標的化し、一方で免疫システムを刺激するのに用いることができる。
【００２５】
ある態様において、イムノマーは、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において、用語「リボザイム」は、触媒作用を有するオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、リボザイムは、特定の核酸標的に結合して、該標的を開裂する。本明細書において、用語「デコイオリゴヌクレオチド」は、配列特異的様式で転写因子に結合し、転写活性を阻むオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドは二次構造を示し、これには、限定なく、ステムループまたはヘアピン構造が含まれる。ある態様において、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドはポリ（Ｉ）−ポリ（ｄＣ）を含む。ある態様において、少なくとも１組のＮｎは、３〜１０個のｄＧおよび／またはＧのストリング、または２’−置換リボもしくはアラビノＧを含む。
【００２６】
本発明のためには、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指す。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法により製造される。好ましい態様においては、各ヌクレオシド単位は、複素環塩基および、ペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２'−デオキシ−２'−置換アラビノース、２'−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多くの知られたヌクレオシド間結合の任意のものによって互いに結合され得る。かかるヌクレオシド間結合は、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１つまたは２つ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−もしくは （ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドも含む。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、任意のかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図し、前記結合がホスフェート基を含むか含まないかは問わない。ある好ましい態様においては、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート結合、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２７】
ある態様において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約３〜約３５のヌクレオシド残基を、好ましくは約４〜約３０のヌクレオシド残基を、より好ましくは約４〜約２０のヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８、または約５〜約１４のヌクレオシド残基を含む。本明細書において、用語「約」とは、正確な数値が重要ではないことを意味する。従って、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要ではなく、１個もしくは２個少ないヌクレオシド残基、または１個から数個の余分なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドもまた、上記の態様の各々と等価であると考えられる。ある態様において、１個または２個以上のオリゴヌクレオチドは１１個のヌクレオチドを有する。
【００２８】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定なく、タンパク質基、親油性基、インターカレート剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ポリマーを含有する他の任意の核酸塩基を含み、これらは、限定なく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、および、アルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２９】
本明細書において、用語「二次構造」は、分子内および分子間水素結合を指す。分子内水素結合は、ステムループ構造の形成をもたらす。分子間水素結合は、二重の核酸分子の形成をもたらす。
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはこれらの混合物を含むことができる。本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分またはこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで述べるような非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様においては、修飾ヌクレオシドは２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシドである。
【００３０】
本発明のためには、用語「２’−置換リボヌクレオシド」は、ペントース部分の２’位におけるヒドロキシル基が置換されて２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドとなるリボヌクレオシドを含む。好ましくは、かかる置換は、１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によりなされ、かかるアルキルまたはアリール基は、無置換でもよく、または、例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、もしくはアミノ基により置換されていてもよい。かかる２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドの例は、限定なく、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドを含む。
【００３１】
用語「２’−置換リボヌクレオシド」はまた、２’−ヒドロキシル基が、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基またはアミノもしくはハロ基により置換されている、リボヌクレオシドを含む。そのような２’−置換リボヌクレオシドの例は、限定なく、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドを含む。
用語「オリゴヌクレオチド 」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種より多いヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの好ましい１例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート部位および、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えばPederson et al.、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照）。
【００３２】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種より多いヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい１例は、リボヌクレオチド、または２’−置換リボヌクレオチド部位、およびデオキシリボヌクレオチド部位を含む（例えばMetelev and Agrawal、米国特許第5,652,355号、第6,683,167号、第6,346,614号および第6,143,881号を参照)。
本発明のためには、用語「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、魚類、鳥類または哺乳類などの脊椎動物に投与された場合に免疫反応を引き起こす、上記のオリゴヌクレオチドを指す。本明細書において、用語「哺乳類」は、限定なく、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、家畜、ウシ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。有用な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Agrawal et al.の、１９９８年１１月５日に公開されたWO 98/49288；２００１年２月２２日に公開されたWO 01/12804、２００１年８月２日に公開されたWO 01/55370、２００１年４月３０日に申請されたPCT/US01/13682；および２００１年９月２６日に申請されたPCT/US01/30137に記載されている。好ましくは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００３３】
ある態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式：５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’で表される免疫刺激性ジヌクレオチドを含み、式中、Ｐｙｒは天然または合成ピリミジンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは天然または合成プリンヌクレオシドである。本明細書において、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がピリミジン塩基であるヌクレオシドを指す。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がプリン塩基であるヌクレオシドを指す。本発明のためには、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３４】
本発明による好ましいピリミジンヌクレオシドは、構造（Ｉ）：
【化１】
2007530449.tif 000002
（ｉ）式中、
Ｄは、水素結合供与体（hydrogen bond donor）であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体（hydrogen bond acceptor）、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
【００３５】
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ｘは、炭素または窒素であり；および
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
【００３６】
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのＮ３を含む。
ある態様において、（Ｉ）の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しない好ましいピリミジン塩基の例は、限定なく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルを含む。しかし、ある態様において５−ブロモシトシンは特異的に除外される。
【００３７】
ある態様において（Ｉ）の糖部分Ｓ’は、天然に存在しない糖部分である。本発明のためには、「天然に存在する糖部分」は、例えばリボースおよび２’−デオキシリボースなどの、核酸の一部として天然に存在する糖部分であり、「天然に存在しない糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しない任意の糖であるが、オリゴヌクレオチドの骨格において用いることのできるもの、例えばヘキソースである。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００３８】
本発明による好ましいプリンヌクレオシド類似体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
2007530449.tif 000003
（ｉｉ）式中、
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各Ｌは、独立してＣ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択され；および、
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００３９】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１を含む。
ある態様において、（ＩＩ）の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しない好ましいプリン塩基の例は、限定なく、６−チオグアニンおよび７−デアザグアニンを含む。ある態様において、（ＩＩ）の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について上記したように、天然に存在する糖部分である。
【００４０】
好ましい態様において、免疫刺激性ジヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、アラビノシチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドまたは稀にしか存在しないピリミジンヌクレオシドであり；Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’ 置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドまたは稀にしか存在しないプリンヌクレオシドであり、そしてｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合である。ある好ましい態様において、免疫刺激性ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性部分を、免疫刺激性ジヌクレオチドの片側または両側に含むことができる。従って、ある態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性ドメインにおいて構造（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙは、シチジン、２’デオキシチミジン、２’デオキシシチジン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−デオキシチミジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたはその他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり；
【００４２】
Ｚは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換―アラビノグアノシン、２’デオキシイノシン、またはその他の非天然プリンヌクレオシドであり；
Ｎ１は、各々の場合に、好ましくは天然に存在するかもしくは合成のヌクレオシド、または免疫刺激性部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルもしくは修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、限定することなく、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択され；
【００４３】
Ｎｎは、各々の場合に、好ましくは天然に存在するヌクレオシドまたは免疫刺激性部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、および修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、好ましくは、アミノリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびメチルホスホネートヌクレオシド間結合からなる群から選択される；
を含み、
ただし、Ｎ１またはＮｎの少なくとも１つは免疫刺激性部分であり；
ここでｎは、０〜３０の数であり；および
ここで、３’末端、ヌクレオシド間リンカー、または誘導体化核酸塩基または糖は、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、免疫刺激性であってもなくてもよい、他のオリゴヌクレオチドに結合されている。
【００４４】
ある好ましい態様において、ＹＺは、アラビノシチジンまたは２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジンおよび、アラビノグアノシンまたは２’デオキシ−２’−置換アラビノグアノシンである。好ましい免疫刺激性部分はホスフェート骨格の修飾を含み、これには、限定なく、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホラミデート、特に１級アミノ−ホスホラミデート、Ｎ３ホスホラミデートおよびＮ５ホスホラミデート、および立体特異的結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）が含まれる。
【００４５】
本発明による好ましい免疫刺激性部分は、糖修飾を有するヌクレオシドをさらに含み、これには限定なく以下が含まれる：限定なく２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボース、および２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを含む、２’−置換ペントース糖；限定なく３’−Ｏ−メチルリボースを含む、３’−置換ペントース糖；１’，２’−ジデオキシリボース；アラビノース；限定なく１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノース、および２’−置換アラビノース糖を含む、置換アラビノース糖；限定なく１，５−アンヒドロヘキシトールを含む、ヘキソース糖；並びにアルファ−アノマー。修飾糖が３’−デオキシリボヌクレオシドまたは３’−Ｏ−置換リボヌクレオシドである態様においては、免疫刺激性部分は、２’−５’ヌクレオシド間結合によって隣接するヌクレオシドに付着している。
【００４６】
本発明による好ましい免疫刺激性部分は、他の炭水化物骨格修飾物および置換物を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、これには以下が含まれる：ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、および約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有する骨格リンカー部を有するオリゴヌクレオチドであって、限定なくアルキルリンカーまたはアミノリンカーを含むもの。アルキルリンカーは、分枝または非分枝であってもよく、置換または無置換であってもよく、キラル的に純粋であってもラセミ混合物であってもよい。最も好ましくは、かかるアルキルリンカーは約２〜約１８個の炭素原子を有する。ある好ましい態様においては、かかるアルキルリンカーは約３〜約９個の炭素原子を有する。あるアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオエーテルからなる群から選択される、１個または２個以上の官能基を含む。かかる官能基アルキルリンカーのあるものは、式−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（ｎ＝１〜９）で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーである。他の官能基アルキルリンカーのあるものは、ペプチドまたはアミノ酸である。
【００４７】
本発明による好ましい免疫刺激性部分は、限定なくβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドおよびα−デオキシリボヌクレオシドを含むＤＮＡアイソフォームを、さらに含む。本発明による好ましい免疫刺激性部分は、３’修飾を組み込み、そして、限定なく２’−５’、２’−２’、３’−３’および５’−５’結合を含む、非天然のヌクレオシド間結合位を有するヌクレオシドをさらに含む。
本発明による好ましい免疫刺激性部分は、修飾複素環塩基を有するヌクレオシドをさらに含み、これらには、限定なく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、７−デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、Ｃ５−プロピニルピリミジン、および限定なく２，６−ジアミノプリンを含むジアミノプリンが含まれる。
【００４８】
具体的な例により、そして限定することなく、例えば、構造（ＩＩＩ）の免疫刺激性ドメインにおいて、Ｎ１位またはＮｎ位のメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、免疫刺激性部分であり、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｘ１位のＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーは免疫刺激性部分であり、そしてＸ１位のβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドは免疫刺激性部分である。免疫刺激性部分の代表的な位置および構造については、下の表１を参照のこと。特定位置における免疫刺激性部分としてのリンカーの言及は、その位置のヌクレオシド残基がその３’−ヒドロキシルにおいて指定のリンカーによって置換され、それによって、そのヌクレオシド残基と３’側の隣接するヌクレオシドとの間に修飾ヌクレオシド間結合を生成することを意味すると理解される。同様に、特定位置における免疫刺激性部分としての修飾ヌクレオシド間結合の言及は、その位置のヌクレオシド残基が、３’側の隣接するヌクレオシドに、列挙された結合によって結合されていることを意味する。
【００４９】
表１
【表１】
2007530449.tif 000004
【００５０】
表２は、上流増強ドメイン（upstream potentiation domain）を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド内の免疫刺激性部分の代表的な位置および構造を示す。本明細書において、用語「スペーサー９」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−、式中ｎは３である、で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーを指す。用語「スペーサー１８」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、式中ｎは６である、で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーを指す。本明細書において、用語「Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−、式中ｑは２〜１８の整数である、で表されるリンカーを指す。従って、用語「Ｃ３リンカー」および「Ｃ３アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−で表されるリンカーを指す。スペーサー９、スペーサー１８、およびＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーの各々について、リンカーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合によって、隣接するヌクレオシドに結合される。
【００５１】
表２
【表２】
2007530449.tif 000005
【００５２】
表３は、下流増強ドメイン（downstream potentiation domain）を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド内の免疫刺激性部分の代表的な位置および構造を示す。
表３
【表３】
2007530449.tif 000006
【００５３】
本発明によるイムノマーは、その３’末端、ヌクレオシド間結合、または官能基化核酸塩基もしくは糖において、非ヌクレオチドリンカーを介して結合した、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む。本発明のためには、「非ヌクレオチドリンカー」は、オリゴヌクレオチドに共有結合または非共有結合で結合できる任意の部分である。好ましくは、かかるリンカーの長さは約２オングストローム〜約２００オングストロームである。好ましいリンカーの幾つかの例が、以下に記されている。非共有結合には、限定はされないが、静電相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、および水素結合が含まれる。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上記のような、例えばホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート官能基などの、２個のヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基を直接結合するヌクレオシド間結合を指すことは意味しない。本発明のためには、かかる直接３’−３’結合は「ヌクレオチド結合」と考えられる。
【００５４】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは金属であり、限定なく、金粒子を含む。他のある態様において、非ヌクレオチドリンカーは可溶性または不溶性の生体分解性ポリマービーズである。
さらに他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの付着を許容する官能基を有する有機部分である。かかる付着は、任意の安定な共有結合によるのが好ましい。非限定的例として、リンカーは、図１３に示されるように、ヌクレオシドの任意の好適な位置に付着することができる。ある好ましい態様において、リンカーは、３’−ヒドロキシルに付着する。かかる態様において、リンカーは好ましくはヒドロキシル官能基を含み、これは好ましくは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは非ホスフェートに基づく結合によって３’−ヒドロキシルに付着する。
【００５５】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは生体分子であり、限定なく、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖を含む。他のある態様において、非ヌクレオチドリンカーは小分子である。本発明のためには、小分子は１，０００Ｄａ未満の分子量を有する有機部分である。ある態様において、小分子は７５０Ｄａ未満の分子量を有する。
ある態様において、小分子は脂肪族または芳香族炭化水素であり、これらのどちらも、随意的に、オリゴヌクレオチドを結合する直鎖においてまたはそれに付加されて、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオ尿素からなる群から選択される１個または２個以上の官能基を含むことができる。小分子は、環式または非環式であることができる。小分子リンカーの例は、限定はされないが、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含む。しかし、非ヌクレオチドリンカーを記述するために、用語「小分子」はヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００５６】
ある態様において、小分子リンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表されるグリセロールまたはグリセロールホモログであり、式中、ｏおよびｐは独立して、１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である。他のある態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン誘導体である。幾つかのかかる誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨで表され、式中、ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である。
本発明によるある非ヌクレオチドリンカーは、図１に模式的に示すように、２個より多いオリゴヌクレオチドの付着を許容する。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合的にそれに付着できる３個のヒドロキシル基を有する。本発明によるあるイムノマーは、従って、非ヌクレオチドリンカーに３’末端で結合する、２個より多いオリゴヌクレオチドを含む。幾つかのかかるイムノマーは、その各々が到達可能５’末端を有する、少なくとも２個の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。
【００５７】
本発明によるイムノマーは、図５および図６に模式的に示されるように、また例にさらに記載されるように、自動合成装置およびホスホラミダイトアプローチを用いて好都合に合成することができる。ある態様において、イムノマーは、直線合成アプローチ（図５参照）により合成される。本明細書において、用語「直線合成」は、イムノマーの１つの末端から開始して、直線的に他の末端へと進行する合成を指す。直線合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成および／または組み込まれる化学修飾に関して）のモノマー単位を、イムノマーに組み込むことを許容する。
【００５８】
合成の代替的な様式は「パラレル合成」であり、ここで合成は中心リンカー部分から外向きに進行する（図６参照）。パラレル合成には、米国特許第5,912,332号に記載されているように固体サポート付着リンカー（solid support attached linker）を用いることができる。代替的に、例えばホスフェートが付着した制御ポアガラスサポートなどの、ユニバーサル固体サポートを用いることもできる。
【００５９】
イムノマーのパラレル合成は、直線合成に対して幾つかの利点を有する：（１）パラレル合成は同一のモノマー単位の組み込みを許容する；（２）直線合成とは異なり、両方（または全て）のモノマー単位が同時に合成され、そのため合成に必要な合成ステップ数および時間が、モノマー単位のそれらと同じになる；および（３）合成ステップ数の減少は、最終イムノマー産物の純度および収率を改善する。
直線合成またはパラレル合成プロトコルによる合成の最後に、イムノマーは好都合に脱保護することができ、これは濃縮アンモニア溶液を用いて、またはもし修飾ヌクレオシドが組み込まれる場合はホスホラミダイト供給者による推奨に従って行う。イムノマー産物は好ましくは、逆相ＨＰＬＣにより精製され、脱トリチル化され（detritylated）、脱塩されそして透析される。
【００６０】
表４Ａおよび４Ｂは、本発明による代表的イムノマーを示す。さらなるイムノマーは、例に記載されている。
表４．イムノマー配列の例
【表４】
2007530449.tif 000007
【表５】
2007530449.tif 000008
【００６１】
表４Ｂ
【表６】
2007530449.tif 000009
Ｘ＝グリセロールリンカー；Ｒ＝アラビノグアノシン；Ｒ＝２’−デオキシ−７’− デアザグアノシン、Ｒ’＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン；Ｙ＝Ｃ３リンカー
【００６２】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性核酸を提供し、ここで前記免疫刺激性核酸は、二次構造を有する。この側面において、免疫刺激性核酸は、式（Ｉ）に詳述された構造を含む。
ドメインＡ−ドメインＢ−ドメインＣ      （Ｉ）
【００６３】
ドメインは、約２〜約１２個のヌクレオチド長であってよい。ドメインＡは、ＣｐＧ、ＹｐＧ、ＹｐＲ、ＣｐＲ、Ｒ＊ｐＧおよびＲ＊ｐＲからなる群から選択される少なくとも１個のジヌクレオチドを含むかもしくは含まないパリンドロームドメインまたは自己相補的ドメインを、有するかまたは有さない、５’−３’もしくは３’−５’もしくは２’−５’ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであることができ、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’デオキシシチジンであり、Ｇは、グアノシンまたは２’デオキシグアノシンであり、Ｙは、シチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシシチジン、２’ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｒ＊は、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；Ｒは、グアノシンまたは２’デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’ 置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、そしてｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合である。ある好ましい態様において、免疫刺激性ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００６４】
ある態様において、ドメインＡは、ドメインＡオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する、ＣｐＧ、ＹｐＧ、ＹｐＲ、ＣｐＲ、Ｒ＊ｐＧおよびＲ＊ｐＲからなる群から選択される、１個より多いジヌクレオチドを含む。
ドメインＢは、ドメインＡとＣを結合するリンカーであり、３’−‘５’結合、２’−５’結合、３’−３’結合、ホスフェート基、ヌクレオシド、または非ヌクレオシドリンカーであることができ、これは脂肪族、芳香族、アリール、環式、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコール、または複素環部分であってよい。
【００６５】
ドメインＣは、ＣｐＧ、ＹｐＧ、ＹｐＲ、ＣｐＲ、Ｒ＊ｐＧおよびＲ＊ｐＲからなる群から選択されるジヌクレオチドを有することができるかもしくはできないパリンドローム配列または自己相補的配列を、有するかまたは有さない、５’−３’もしくは３’−５’、２’−５’ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ポリＩ−ポリＣであることができ、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’デオキシシチジンであり、Ｇは、グアノシンまたは２’デオキシグアノシンであり、Ｙは、シチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシシチジン、２’ジデオキシ−５−ハロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｒ＊は、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；Ｒは、グアノシンまたは２’デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’ 置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、そしてｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合である。ある好ましい態様において、免疫刺激性ジヌクレオチドはＣｐＧではない。ある態様において、ドメインＢは好ましくはドメインＡとドメインＣのオリゴヌクレオチドを結合する非ヌクレオチドリンカーであり、これらを「イムノマー」と呼ぶ。ある好ましい態様において、ドメインＣはジヌクレオチドＣｐＧ、ＹｐＧ、ＹｐＲ、ＣｐＲ、Ｒ＊ｐＧまたはＲ＊ｐＲを有さない。
【００６６】
ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、長さが約１２〜約５０ヌクレオチドである。ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、長さが約１２〜約２６ヌクレオチドである。
【００６７】
非限定的な例により、この側面のある態様において、免疫刺激性核酸は、式（ＩＩ）：
【数１】
2007530449.tif 000010
に詳述される構造を有する。
当業者が認識するように、二次構造要素が分子の３’末端に分子内ステムループの形態で存在する。
【００６８】
非限定的例により、この側面のある態様において、免疫刺激性核酸は、式（ＩＩＩ）：
【数２】
2007530449.tif 000011
に詳述される構造を有する。
式（ＩＩＩ）に示された構造は、本明細書において、２つの３’末端の配列が相補的であり、分子間水素結合を許容するために、２つの分子の３’末端がブロックされているため、「末端ディマー（terminal dimmer）」と呼ぶ。さらに、ドメインＡおよびＡ’は同一であってもなくてもよく、ドメインＢおよびＢ’は同一であってもなくてもよく、ドメインＣおよびＣ’は同一であってもなくてもよい。
【００６９】
非限定的な例により、この側面のある態様において、免疫刺激性核酸は、式（ＩＶ）：
【数３】
2007530449.tif 000012
に詳述される構造を有する。
【００７０】
当業者により認識されるように、示された分子の３’末端は、その３’末端の相補配列がこの領域に結合する水素であるために、二次構造を有する。ある態様において、細胞での取り込みを促進するため、または分子の安定性を改善するために、リガンドなどの分子を３’末端に付着させることができる。
本発明の幾つかの核酸分子の非限定的例を、表２４Ｂ−Ｃおよび２５Ｂ−Ｃに示す（下記参照）。
【００７１】
第２の側面において、本発明は、上記のイムノマーおよび、到達可能５’末端以外の位置で該イムノマーに結合した抗原を含む、イムノマー結合体を提供する。ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに結合した抗原を含む。他の態様において、抗原は、オリゴヌクレオチドにその到達可能３’末端以外の位置で結合する。ある態様において、抗原はワクチン効果を生じさせる。
【００７２】
抗原は、病原菌に関連する抗原、癌に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、および限定はされないが例えば獣医学的疾患または小児疾患などの他の疾病に関連する抗原、または抗原がアレルゲンであるものからなる群から選択されるのが好ましい。本発明のためには、用語「関連する」とは、病原菌、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー、喘息または他の疾病が存在する場合には抗原が存在するが、病原菌、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー、または疾病が不在の場合は、抗原が存在しないかまたは少ない量で存在することを意味する。
【００７３】
イムノマーは、抗原に共有結合で結合するか、そうでなければ、抗原と動作可能に結合する。本明細書において、用語「動作可能に結合する」とは、イムノマーおよび抗原両方の活性を維持する任意の結合を指す。かかる動作可能な結合の非限定的な例は、同じリポソームまたは他のかかる送達ビヒクルもしくは試薬の一部となることである。イムノマーが抗原に共有結合で結合している態様において、かかる共有結合は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの到達可能５’末端以外の、イムノマー上の任意の位置であるのが好ましい。例えば、抗原は、ヌクレオシド間結合に付着してもよく、または非ヌクレオチドリンカーに付着してもよい。代替的に、抗原はそれ自体が非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００７４】
第３の側面において、本発明は、本発明によるイムノマーまたはイムノマー結合体、および生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。本明細書において、用語「生理学的に許容し得る」とは、イムノマーの有効性を妨げず、細胞、細胞培養物、組織、または生物などの生体系と適合する物質を指す。好ましくは、生体系は脊椎動物などの生物である。
【００７５】
本明細書において、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、溶解剤、脂質、または医薬製剤において用いるために当分野で知られている他の物質を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の用途のための投与経路に依存することが理解される。これらの物質を含む薬学的に許容し得る製剤の製造は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００７６】
第４の側面において、本発明は、脊椎動物において免疫反応を生成するための方法を提供し、かかる方法は、本発明によるイムノマーまたはイムノマー結合体を脊椎動物に投与することを含む。ある態様において、脊椎動物は哺乳類である。本発明のために、用語「哺乳類」は、ヒトを含むことを明白に意図する。好ましい態様において、イムノマーまたはイムノマー結合体は、免疫刺激の必要な脊椎動物に投与される。
【００７７】
本発明のこの側面による方法において、イムノマーの投与は任意の好適な経路で実施でき、これには、限定することなく、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃により、皮膚パッチまたは点眼液またはうがい薬の形態を含む。イムノマーの治療組成物の投与は、既知の方法と用量を用いて、疾病の症状または代理マーカーを低減するのに効果的な期間で、実施することができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルのイムノマー血中濃度を達成するのに十分な用量で投与するのが好ましい。局所投与に対しては、これより大幅に低い濃度も効果的であることができ、そして大幅に高い濃度も耐容され得る。好ましくは、イムノマーの総用量は、約０．００１ｍｇ／患者・日〜約２００ｍｇ／体重１ｋｇ・日の範囲である。本発明の１種または２種以上の治療組成物の、治療的に有効な量を、１回の処置として、同時にまたは連続して個人に投与するのが望ましい。
【００７８】
ある好ましい態様において、本発明のイムノマーは、ワクチン、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントと組み合わせて投与し、免疫反応の特異性または強さを増強する。これらの態様において、本発明のイムノマーは、アジュバントとして種々に作用することができ、および／または直接免疫刺激効果を生成することができる。
【００７９】
イムノマーもしくはワクチンまたは両者は、随意的に、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性担体タンパク質、または任意の他の免疫原性担体タンパク質もしくは非免疫原性担体タンパク質に結合してもよい。任意の大量のアジュバントを用いることができ、これらには、限定なく、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１、イミキモド（imiquimod）、Ｒ８４８を含むサポニン、またはこれらの組合せが含まれる。
【００８０】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、感染のセンサーとして機能し、固有の適合的免疫反応の活性化を誘導する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる広い範囲のリガンドを認識する。保存されている病原体関連分子産物を認識すると、ＴＬＲは、その細胞内情報伝達ドメイン、すなわちトール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン、および下流のアダプタータンパク質ＭｙＤ８８を通して宿主防御反応を活性化させる。樹状細胞およびマクロファージは通常、それらが産生もする、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンドおよびサイトカイン（例えばインターロイキン−１β；ＩＬ−６および腫瘍壊死因子、ＴＮＦ）に応答する；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞も、前炎症性回路（pro-inflammatory circuit）に関与する。細菌性化合物によるＴＬＲの刺激の後、固有免疫細胞はある範囲のサイトカインを放出する。ＴＬＲリガンドの幾つかの例には、限定はされないが、リポタンパク質；ペプチドグリカン、ザイモサン（ＴＬＲ２）、二本鎖ＲＮＡ、ポリＩ：ポリＣ（ＴＬＲ３）、リポ多糖類、熱ショックタンパク質、タキソール（ＴＬＲ４）、フラゲリン（ＴＬＲ５）、およびイミダゾキノリン−Ｒ８４８、レシキモド（resiquimod）、イミキモド；ｓｓＲＮＡ（ＴＬＲ７／８）が含まれる。
【００８１】
本発明のこの側面のために、用語「組み合わせて」は、同一患者の同一疾病を処置する過程において、イムノマーおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントを任意の順序で投与することを含むことを意味し、これは同時投与および、数日間までの時間的に間隔をあけた順序での投与を含む。かかる組み合わせ処置はまた、イムノマーおよび／または独立してワクチン、および／または独立してアジュバントを、１回を超えて投与することを含むことができる。イムノマーおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一または異なる経路で実施してよい。
本発明のこの側面による方法は、免疫系のモデル研究に有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物の疾病の予防または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児科および獣医学のワクチン用途に有用である。
【００８２】
第５の側面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、該患者に対して、本発明によるイムノマーまたはイムノマー結合体を投与することを含む。種々の態様において、処置すべき疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病である。病原体は、細菌、寄生虫、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面について記載されたように実施する。
本発明のために、用語「アレルギー」は、限定なく、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症としても知られる）、アレルギー性結膜炎、じんましん（urticaria）（じんましん（hives）としても知られる）、呼吸器アレルギー、およびラテックス、薬物および虫刺されなどの他の物質へのアレルギー反応、またはアレルギー性鼻炎−副鼻腔炎および中耳炎から一般に生じる問題を含む。用語「気道炎症」とは、限定なく喘息を含む。喘息の具体的な例は、限定なく、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息および夜間喘息を含む。
【００８３】
アレルギー性喘息は、アレルギーに関連し、アレルゲンと呼ばれる物質により引き起こされる気道の閉塞を特徴とする。アレルギー性喘息の引き金となるものには、限定なく、空中の花粉、かび、動物の鱗屑、ハウスダスト、ダニ、およびゴキブリのふんが含まれる。非アレルギー性喘息は、ウィルス感染、ある種の薬剤または空中に見いだされ、鼻および気道をさらに悪化させる刺激物によって引き起こされる。非アレルギー性喘息の引き金となるものは、限定なく、空中の粒子（例えば、石炭やチョークダスト）、大気汚染物質（例えば、煙草の煙、木材の煙）、強い臭気物質またはスプレー（例えば、香水、家庭用クリーナー、調理の煙、塗料またはニス）、ウィルス感染（例えば、風邪、ウィルス性肺炎、副鼻腔炎、鼻ポリープ）、アスピリン感受性、および逆流性食道炎（ＧＥＲＤ）を含む。運動誘発性喘息（ＥＩＡ）は、激しい身体活動によって引き起こされる。多くの喘息患者においてＥＩＡの症状は種々の程度で生じ、運動中に冷たく乾燥した空気を吸うことによって引き起こされやすい。ＥＩＡの引き金となるものは、限定なく、運動中に空中の花粉を吸い込むこと、運動中に大気汚染物質を吸い込むこと、ウィルス性呼吸器官感染症にかかっているときに運動すること、および冷たく乾燥した空気中で運動することを含む。職業性喘息は、仕事場に見出される刺激物質および他の潜在的な有害物質を吸い込むことに直接関連する。職業性喘息の引き金となるものは、限定なく、煙、化学物質、ガス、樹脂、金属、ダスト、蒸気および殺虫剤を含む。
【００８４】
本明細書において、用語「自己免疫疾患」は、「自己」タンパク質が免疫系の攻撃を受ける疾患を指す。かかる用語には、自己免疫性喘息が含まれる。
特定のいかなる学説にも拘束されることを意図するものではないが、細菌への暴露の減少は、先進国における喘息、アトピー性皮膚炎、および鼻炎などのアレルギー性疾患の罹患率、重篤度、および死亡率の増加の、部分的な原因である可能性がある。この仮説は、細菌感染または産物が、実験動物モデルおよび臨床研究におけるアレルギー性疾患の発症を抑制できるとの証拠によって支援される。ある配列コンテクスト（ＣｐＧ ＤＮＡ）における、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む細菌ＤＮＡまたは合成オリゴデオキシヌクレオチドは、固有の免疫反応を強力に刺激し、これによって免疫が得られる。ＣｐＧ ＤＮＡに対する免疫反応には、固有の免疫細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、Ｔｈ１サイトカイン分泌の誘導、および免疫グロブリン（Ｉｇ）の産生が含まれる。ＣｐＧ ＤＮＡによる免疫細胞の活性化は、分子パターン認識受容体であるトール様受容体９（ＴＬＲ９）を介して起こる。ＣｐＧ ＤＮＡは、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの分泌を特徴とする、強いＴｈ１優勢免疫反応を誘導する。イムノマー（ＩＭＯ）のみ、またはアレルゲン結合体としてのイムノマーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩｇＥの産生を低下させ、アレルギー性喘息のマウスモデルにおける好酸球を減少させる。ＩＭＯ化合物はまた、Ｔｈ２反応をＴｈ１反応に変換することにより、確立されたアトピー性好酸球気道疾病を効率的に逆転させる。
【００８５】
ミョウバンと共存するＯＶＡは、種々のマウスおよびラットモデルにおいて、Ｔｈ２優勢免疫反応を確立するのに一般に用いられる。Ｔｈ２免疫反応には、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生の増加、総および抗原特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１の血清濃度の増加、およびＩｇＧ２ａの濃度の低下が含まれる。ＩＭＯ化合物は、マウスにおいて、確立されたＴｈ２優勢免疫反応を予防し逆転させる。ＩＭＯ化合物とＯＶＡ／ミョウバンのマウスへの同時投与は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生を低下させ、抗原再刺激を与えた脾臓細胞培養物中のＩＦＮ−γ産生を誘導する。さらに、ＩＭＯ化合物は、これらのマウスにおいて抗原特異的ＩｇＥおよび総ＩｇＥを抑制し、ＩｇＧ２ａ産生を増強する。
【００８６】
ＯＶＡ／ミョウバンおよびＩＭＯ化合物の注射は、マウスにおいて、Ｔｈ２関連サイトカイン、ＩｇＥおよびＩｇＧ１の低濃度と、Ｔｈ１関連サイトカインおよびＩｇＧ２ａの高濃度を特徴とする、リンパ球の抗原リコール反応（lymphocyte antigen-recall response）（Ｔｈ１型）を誘導する。ＩＭＯ化合物と他の種類の抗原、例えばS. masoni卵および雌鶏卵リゾチームなどの同時投与も、in vivoおよびin vitro研究においてＴｈ２反応をＴｈ１優勢反応に逆転させる。本明細書に記載のように、ＩＭＯ化合物はＴｈ２免疫反応の発達を効果的に予防し、強いＴｈ１反応を許容する。
Ｔｈ２サイトカインがＩｇＥおよびＩｇＧ１の産生に向うＩｇアイソタイプスイッチの引き金となる一方で、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γは、Ｂリンパ球によるＩｇＧ２ａの産生を誘導する。ＯＶＡ／ミョウバンおよびＩＭＯ化合物を注射されたマウスは、ＯＶＡ／ミョウバンのみを注射されたマウスに比べて、低いＩｇＥおよびＩｇＧ１濃度と高いＩｇＧ２ａ濃度に伴い、低濃度のＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３、および高濃度のＩＦＮ−γを産生する。このことは、抗原およびＩＭＯ化合物を付与されたマウスにおいて、Ｔｈ１サイトカイン誘導と、免疫グロブリンアイソタイプスイッチとの間の緊密なリンクの存在を示唆する。
【００８７】
血清中の抗原特異的ＩｇＥ濃度および総ＩｇＥ濃度は、ＯＶＡ／ミョウバンのみを付与されたマウスより、ＯＶＡ／ミョウバンおよびＩＭＯ化合物を付与されたマウスにおいて大幅に低い。対照的に、ＯＶＡ／ミョウバンのみを付与されたマウスに比べて、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１濃度はわずかに変化し、総ＩｇＧ１濃度はわずかにのみ減少した（データ示されず）。この反応の違いは、両方のアイソタイプはＩＬ−４およびＩＬ−１３による影響を受けるにもかかわらず、ＩｇＥおよびＩｇＧ１クラススイッチの制御に関与する、異なる機構の結果による可能性がある。例えば、ＩＬ−６はＢリンパ球を促進して、ＩＬ−４の存在下においてＩｇＧ１を合成する。
【００８８】
本発明による任意の方法において、イムノマーまたはイムノマー結合体は、イムノマーの免疫刺激効果を減少させることなく疾病または状態の処置に有用な、任意の他の剤と組み合わせて投与することができる。本発明のこの側面のために、用語「組み合わせて」は、同一患者の同一疾病を処置する過程において、イムノマーおよび剤を任意の順序で投与することを含むことを意味し、これは同時投与および、任意の時間間隔での投与、例えば、１つの直後に他の１つを連続するものから、数日間までの間隔をあけた投与を含む。かかる組み合わせ処置はまた、イムノマーおよび、独立して剤を、１回を超えて投与することも含むことができる。イムノマーおよび剤の投与は、同一または異なる経路で実施してよい。
【００８９】
本発明による任意の方法において、疾病または状態の処置に有用な剤は、限定なく、抗原、アレルゲン、または例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸などの共刺激性分子を含む。剤は付加的に、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを含むキットを提供し、ここで後者は、イムノマーが１つより多い５’末端を有するように一緒に結合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの前記オリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。他の側面において、キットは、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または免疫刺激性オリゴヌクレオチド結合体および／またはイムノマーまたはイムノマー結合体、および生理学的に許容し得る担体を含む。キットは一般に、使用のための指示書のセットも含む。
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００９０】
例
例１：免疫調節性部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌスケール上でＤＮＡ自動合成装置（Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）を用いて、図５および図６に概説した直線合成またはパラレル合成方法に従って合成した。
【００９１】
デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイトは、Applied Biosystem (Foster City, CA)から入手した。１’，２’−ジデオキシリボースホスホラミダイト、プロピル−１−ホスホラミダイト、２−デオキシウリジンホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）ペンチルアミジル］−２−プロパノールホスホラミダイトおよびメチルホスホラミダイトは、Glen Research (Sterling, VA)から入手した。β−Ｌ−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイト、α−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイト、モノ−ＤＭＴ−グリセロールホスホラミダイトおよびジ−ＤＭＴ−グリセロールホスホラミダイトは、ChemGenes (Ashland, MA)から入手した。（４−アミノブチル）−１，３−プロパンジオールホスホラミダイトは、Clontech (Palo Alto, CA)から入手した。アラビノシチジンホスホラミダイト、アラビノグアノシン、アラビノチミジンおよびアラビノウリジンは、Reliable Pharmaceutical (St. Louis, MO)から入手した。アラビノグアノシンホスホラミダイト、アラビノチミジンホスホラミダイトおよびアラビノウリジンホスホラミダイトは、Hybridon, Inc. (Cambridge, MA)にて合成した(Noronha et al. (2000) Biochem., 39:7050-7062)。
全てのヌクレオシドホスホラミダイトは、３１Ｐおよび１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより特性を明らかにした。修飾ヌクレオシドは、特定部位に通常のカプリングサイクルを用いて組み込んだ。合成の後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製して、透析した。ナトリウム塩形態の精製オリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。純度は、ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより試験した。
【００９２】
例２：脾臓細胞増殖の解析
脾細胞増殖のin vitro解析を、前に記載した標準的方法（例えば、Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182(1996)を参照）を用いて行った。結果を図８Ａに示す。これらの結果は、高濃度において、２つの到達可能５’末端を有するイムノマー６が、到達可能５’末端を有さないイムノマー５または１つの到達可能５’末端を有するオリゴヌクレオチド４よりも、多くの脾細胞増殖をもたらすことを示す。イムノマー６はまた、ＬＰＳ陽性対照よりも多くの脾細胞増殖をもたらす。
【００９３】
例３：in vivo脾腫試験
in vitroでの結果をin vivoモデルに適用可能かどうかを試験するために、選択したオリゴヌクレオチドをマウスに投与し、免疫刺激活性レベルの指標として脾腫の程度を測定した。５ｍｇ／ｋｇの一回量をＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜６週齢、Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT）に腹腔内投与した。オリゴヌクレオチド投与の７２時間後にマウスを犠牲にし、脾臓を採取して重量測定した。図８Ｂに結果を示す。これらの結果は、２つの到達可能５’末端を有するイムノマー６が、オリゴヌクレオチド４またはイムノマー５よりも大幅に高い免疫刺激効果を有することを示す。
【００９４】
例４：サイトカイン解析
脊椎動物細胞における、好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞またはヒトＰＢＭＣにおける、ＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準サイトカインを含む必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAより購入した。ＥＬＩＳＡプレート（Costar）は、ＰＢＳＮ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの適当な抗体を用いて４℃にて１晩インキュベートし、次にＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて３７℃にて３０分間ブロックした。細胞培養上清および標準サイトカインは、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳで適切に希釈し、前記プレートにトリプリケート（triplicate）で添加し、２５℃で２時間インキュベートした。プレートに１μｇ／ｍＬの適当なビオチン化抗体を加え、２５℃で１．５時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Tween 20）でよく洗浄し、ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ（Sigma, St. Louis, MO）を加えた後２５℃で１．５時間さらにインキュベートした。プレートをSure Blue（登録商標）（Kirkegaard and Perry）発色試薬で発色させ、Stop Solution（Kirkegaard and Perry）を加えて反応を終了させた。色の変化をCeres 900 HDI分光光度計（Bio-Tek Instruments）で測定した。下の表５Ａに結果を示す。
【００９５】
健康なボランティアの末梢血から、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll-Paque密度勾配遠心分離（Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO）により単離した。簡単に述べると、ヘパリン化された血液を円錐遠心分離機内のHistopaque-1077上（等量）に層状にし、４００×ｇで３０分間室温にて遠心分離した。単核細胞を含む軟膜（buffy coat）を注意して採取し、等浸透圧のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、２５０×ｇで１０分間の遠心分離により洗浄した。得られた細胞ペレットは次に、Ｌ−グルタミンを含有するRPMI 1640培地（Media Tech, Inc., Herndon, VA）内に再懸濁させ、熱により不活性化させた１０％ＦＣＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充した。細胞は、２４ウェルプレートで異なる期間、１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルで、オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で培養した。インキュベーション期間の終わりに上清を収集し、サンドイッチＥＬＩＳＡによる、ＩＬ−６（BD Pharmingen, San Diego, CA）、ＩＬ−１０（BD Pharmingen）、ＩＬ−１２（BioSource International, Camarillo, CA）、ＩＦＮ−α（BioSource International）およびＩＦＮ−γ（BD Pharmingen）およびＴＮＦ−α（BD Pharmingen）を含む種々のサイトカインのアッセイまで、−７０℃で凍結して保存した。結果を下の表５および５Ａに示す。
【００９６】
全ての場合において、細胞培養上清におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６の濃度は、同じ実験条件下で作製したＩＬ−１２およびＩＬ−６の標準カーブからそれぞれ計算した。細胞培養上清におけるＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−αの濃度は、同じ実験条件下で作製したＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−αの標準カーブからそれぞれ計算した。
【００９７】
表５．ヒトＰＢＭＣ培養物におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表７】
2007530449.tif 000013
Ｄ１およびＤ２はドナー１およびドナー２である。
【００９８】
表５Ａ．ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞培養物におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表８】
2007530449.tif 000014
【００９９】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す；イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
【化４】
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さらに、図７Ａ〜７Ｃに示された結果は、２つの到達可能５’末端を有するオリゴヌクレオチド２は、１つまたは０個の到達可能５’末端をそれぞれ有するオリゴヌクレオチド１または３と比べて、より低い濃度においてＩＬ−１２およびＩＬ−６濃度を上昇させるが、ＩＬ−１０濃度は上昇させないことを示す。
【０１００】
例５：イムノマーの免疫刺激活性に及ぼす鎖長の効果
オリゴヌクレオチド鎖の長さの効果を検討するため、各鎖に１８、１４、１１および８個のヌクレオチドを含むイムノマーを合成し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞培養物中のサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を誘導するそれらの能力を計測することにより、免疫刺激活性を試験した（表６〜８）。この中で、および以下の全ての例において、サイトカインアッセイは、例４で記載されたＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞培養物において実施した。
【０１０１】
表６．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表９】
2007530449.tif 000016
【０１０２】
表７．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１０】
2007530449.tif 000017
【０１０３】
表８．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１１】
2007530449.tif 000018
結果は、オリゴヌクレオチド鎖の長さが１８マーから７マーへと減少するにつれて、イムノマーの免疫刺激活性が増加することを示唆する。６マーまたは５マーの短いオリゴヌクレオチド鎖長さを有するイムノマーは、１つの５’末端を有する１８マーオリゴヌクレオチドと同程度の免疫刺激活性を示した。しかし、６マーまたは５マーの短いオリゴヌクレオチド鎖長さを有するイムノマーは、リンカーの長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームの場合には、免疫刺激活性が増加した。
【０１０４】
例６：非天然ピリミジンヌクレオシドまたは非天然プリンヌクレオシドを含むイムノマーの免疫刺激活性
表９〜１１に示すように、免疫刺激活性は、非天然ピリミジンヌクレオシドまたは非天然プリンヌクレオシドを免疫刺激性ジヌクレオチドモチーフに含む種々の長さのイムノマーにおいて維持された。
表９．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１２】
2007530449.tif 000019
【０１０５】
表１０．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１３】
2007530449.tif 000020
【０１０６】
表１１．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１４】
2007530449.tif 000021
【０１０７】
例７：免疫刺激活性に及ぼすリンカーの効果
２つのオリゴヌクレオチドを結合するリンカーの長さの効果を試験するため、同じオリゴヌクレオチドを含むがリンカーの異なるイムノマーを合成し、免疫刺激活性を試験した。表１２に示す結果は、リンカーの長さがイムノマーの免疫刺激活性に役割を果たすことを示唆する。最大の免疫刺激効果は、Ｃ３〜Ｃ６−アルキルリンカーまたは分散されたホスフェート電荷（interspersed phosphate charge）を有する脱塩基リンカーにより達成された。
【０１０８】
表１２．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１５】
2007530449.tif 000022
【０１０９】
例８：免疫刺激活性に及ぼすオリゴヌクレオチド骨格の効果
一般に、天然のホスホジエステル骨格を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドより免疫刺激性が低い。この低い免疫刺激活性の程度は、部分的に、実験条件下におけるホスホジエステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解による可能性がある。オリゴヌクレオチドの分解は、第１に、オリゴヌクレオチドを３’末端から消化する３’エキソヌクレアーゼの結果である。この例のイムノマーは遊離の３’末端を含まない。従って、ホスホジエステル骨格を有するイムノマー化合物は、実験条件下において対応するモノマーオリゴヌクレオチドより長い半減期を有するはずであり、従って改善された免疫刺激活性を示す。表１３に示す結果はこの効果を示しており、イムノマー８４および８５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞培養物においてサイトカイン誘導により決定されたように、免疫刺激活性を示す。
【０１１０】
表１３．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１６】
2007530449.tif 000023
Ｌ＝Ｃ３リンカー
【０１１１】
例９：イムノマー７３〜９２の合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌスケール上でＤＮＡ自動合成装置（Expedite 8909; PerSeptive Biosystems）を用いて合成した。デオキシヌクレオシドホスホラミダイトは、Applied Biosystem（Foster City, CA）から入手した。７−デアザ−２’−デオキシグアノシンホスホラミダイトはGlen Research（Sterling Virginia）から入手した。１，３−ビス−ＤＭＴ−グリセロール−ＣＰＧは、ChemGenes（Ashland, MA）から入手した。修飾ヌクレオシドは、特定部位に通常のカプリングサイクルを用いてオリゴヌクレオチドに組み込んだ。合成の後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製して、透析した。ナトリウム塩形態の精製オリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドの純度は、ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Bruker Proflex III MALDI-TOF質量分析計）により検査した。
【０１１２】
例１０：イムノマーの安定性
オリゴヌクレオチドは、１０％ウシ血清を含むＰＢＳ中で、３７℃にて４、２４、または４８時間インキュベートした。無傷のオリゴヌクレオチドを、毛細管ゲル電気泳動により決定した。表１４に結果を示す。
表１４．１０％ウシ血清ＰＢＳ溶液中でのオリゴヌクレオチドの消化
【表１７】
2007530449.tif 000024
Ｘ＝Ｃ３リンカー、Ｕ，Ｃ＝２’−ＯＭｅ−リボヌクレオシド
【０１１３】
例１１：到達可能５’末端の免疫刺激活性に及ぼす効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜８週齢）の脾臓細胞を、ＲＰＭＩ完全培地中で培養した。マウスマクロファージ様細胞である、Ｊ７７４（American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび抗生物質（１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンＧ／ストレプトマイシン）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地中で培養した。他の全ての培養試薬は、Mediatech（Gaithersburg, MD）から購入した。
ＩＬ−１２およびＩＬ−６のためのＥＬＩＳＡ。ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞またはＪ７７４細胞を、それぞれ５×１０６または１×１０６細胞／ｍＬの密度で２４ウェルディッシュにプレートした。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ））に溶解したＩＭＯ化合物を、最終濃度が０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬとなるようにマウス脾臓細胞培養物に、そして１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬとなるようにＪ７７４細胞培養物に添加した。細胞は次に、３７℃で２４時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡアッセイ用に上清を収集した。実験は、各ＩＭＯ化合物に対して各濃度につきトリプリケートで、２回または３回実施した。
【０１１４】
ＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌はサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。ＥＬＩＳＡプレート（Costar）は、ＰＢＳＮ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの適切な抗体で一晩４℃でインキュベートし、次にＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて３７℃で３０分間ブロックした。細胞培養上清および標準サイトカインは、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで適切に希釈し、プレートにトリプリケートで添加し、２５℃で２時間インキュベートした。プレートを１μｇ／ｍＬの適当なビオチン化抗体で洗浄およびインキュベートし、２５℃で１．５時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ／０．０５％Tween 20でよく洗浄し、ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ（Sigma）を加えた後２５℃で１．５時間さらにインキュベートした。プレートをSure Blue（登録商標）（Kirkegaard and Perry）発色試薬で発色させ、Stop Solution（Kirkegaard and Perry）を加えて反応を終了させた。色の変化をCeres 900 HDI分光光度計（Bio-Tek Instruments）で４５０ｎｍの波長で測定した。細胞培養上清のＩＬ−１２およびＩＬ−６の濃度は、同じ実験条件下で作製したＩＬ−１２およびＩＬ−６の標準カーブからそれぞれ計算した。
結果を表１５に示す。
【０１１５】
表１５：試験に用いたホスホロチオエートＣｐＧ ＤＮＡ配列および修飾ａ
【表１８】
2007530449.tif 000025
ａ：ｂ−１の化学構造についてはチャート１参照；５’−ＣＧ−３’ジヌクレオチドは下線で示す。
【０１１６】
チャート１
【化５】
2007530449.tif 000026
【０１１７】
【表１９】
2007530449.tif 000027
【０１１８】
合わせると、本結果は、ＣｐＧ ＤＮＡの到達可能５’末端は、その最適な免疫刺激活性に必要であり、ホスホロチオエート、モノヌクレオチド、またはジヌクレオチドなどの小さな基は、ＣｐＧ ＤＮＡの５’末端の、免疫刺激経路に関与する受容体または因子への到達可能性を、効果的にブロックしていないことを示唆する。しかし、フルオレセインと同等かそれより大きい分子の、ＣｐＧ ＤＮＡの５’末端における結合は、免疫刺激活性を無効にすることができた。これらの結果は、ＣｐＧ ＤＮＡ−抗原／ワクチン／モノクローナル抗体（ｍＡｂ）結合体の免疫刺激活性の研究に直接の影響を有する。ワクチンまたはｍＡｂなどの大きな分子の、ＣｐＧ ＤＮＡの５’末端における結合は、ＣｐＧ ＤＮＡの準最適な免疫刺激活性を導くことができた。機能的リガンドのＣｐＧ ＤＮＡの３’末端における結合は、ヌクレアーゼ安定性の増加だけでなく、in vivoでのＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激効力の増加にも寄与する。
【０１１９】
例１２：サイトカイン分泌に及ぼすリンカーの効果
この試験のために以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これら修飾オリゴヌクレオチドの各々は、イムノマーに組み込むことができる。
表１７．ＣｐＧ ＤＮＡの置換位置を示す配列
【０１２０】
【表２０】
2007530449.tif 000028
【表２１】
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ａ：置換１〜９の化学構造については図１４を参照。全てのＣｐＧ ＤＮＡは、ホスホロチオエート骨格が修飾されている。
【０１２１】
免疫刺激活性の増強作用のための最適リンカーサイズを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞培養物中で修飾ＣｐＧ ＤＮＡにより誘導されるＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を測定した。全てのＣｐＧ ＤＮＡは、濃度依存的にＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を誘導した。図１５は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’隣接配列の５番目のヌクレオチド位置においてリンカーを有する、選択されたＣｐＧ ＤＮＡである１１６、１１９、１２６、１３０および１３４の１μｇ／ｍＬ濃度において得られたデータを、親ＣｐＧ ＤＮＡと比較して示す。Ｃ２リンカー（１）、Ｃ３リンカー（２）およびＣ４リンカー（３）を含むＣｐＧ ＤＮＡは、親ＣｐＧ ＤＮＡ４のそれと同様のＩＬ−１２産生の分泌を誘導した。５’隣接配列のＣｐＧジヌクレオチドから５番目のヌクレオチド位置におけるＣ６およびＣ９リンカー（４および５）を含むＣｐＧ ＤＮＡは、親ＣｐＧ ＤＮＡより低レベルのＩＬ−１２分泌を誘導し（図１５）、Ｃ４リンカーより長いリンカーの置換は、低いレベルのＩＬ−１２誘導を生じることを示唆した。リンカーを有する５つのＣｐＧ ＤＮＡ全ては、親ＣｐＧ ＤＮＡより２〜３倍高いＩＬ−６分泌を誘導した。これらのＣｐＧ ＤＮＡにおけるリンカーの存在は、リンカーを有さないＣｐＧ ＤＮＡと比べて、ＩＬ−６分泌に大きな効果を示した。しかし、ＩＬ−６分泌に対して、長さに依存したリンカーの効果は観察されなかった。
【０１２２】
エチレングリコールリンカーを含むＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激活性に対する効果を試験するために、それぞれ、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’隣接配列の５番目のヌクレオチド位置、および３’隣接配列の４番目のヌクレオチド位置においてトリエチレングリコールリンカー（６）を含む、ＣｐＧ ＤＮＡ１３７および１３８を合成した。同様に、ＣｐＧ ＤＮＡ１３９および１４０は、ＣｐＧジヌクレオチドに対してそれぞれ５’または３’隣接配列中に、ヘキサエチレングリコールリンカー（７）を含む。これら全４つの修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（１３７〜１４０）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でのサイトカイン誘導（ＩＬ−１２，ＩＬ−６およびＩＬ−１０）について、親ＣｐＧ ＤＮＡ４と比較して試験した。これらＣｐＧ ＤＮＡは全て、試験した濃度範囲（０．０３〜１０．０μｇ／ｍＬ）において、濃度依存的にサイトカイン産生を誘導した（データ示されず）。表１８に、ＣｐＧ ＤＮＡ１３７〜１４０の０．３μｇ／ｍＬ濃度において誘導されたサイトカインのレベルを示す。ＣｐＧ ＤＮＡ１３７および１３９は、５’隣接配列中にエチレングリコールリンカーを有し、親ＣｐＧ ＤＮＡ４と比べて、高いレベルのＩＬ−１２（２１０６±１４３および２０６６±１５３ｐｇ／ｍＬ）およびＩＬ−６（２３６２±１６６および２５０７±６６ｐｇ／ｍＬ）分泌を誘導した（表１８）。同じ濃度において、１３７および１３９は、親ＣｐＧ ＤＮＡ４に比べてわずかに低いレベルのＩＬ−１０分泌を誘導した（表１８）。ＣｐＧ ＤＮＡ１３８は、３’隣接配列中により短いエチレングリコールリンカー（６）を有し、親ＣｐＧ ＤＮＡと同等のＩＬ−１２分泌を誘導したが、大幅に低いレベルのＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルを誘導した（表１８）。ＣｐＧ ＤＮＡ１４０は、より長いエチレングリコールリンカー（７）を有し、親ＣｐＧ ＤＮＡと比べて大幅に低いレベルで、全３つのサイトカインを誘導した（表１８）。
【０１２３】
トリエチレングリコールリンカー（６）はＣ９リンカー（５）と類似した鎖長を有するが、トリエチレングリコールリンカーを含むＣｐＧ ＤＮＡは、脾臓細胞培養物中でのサイトカイン分泌の誘導によって決定されたように、Ｃ９リンカーを含むＣｐＧ ＤＮＡより優れた免疫刺激活性を有した。これらの結果は、より長いアルキルリンカー（４および５）を含むＣｐＧ ＤＮＡにおいて観察されるより低い免疫刺激活性は、それらの長さの増加に関連するのではなく、疎水性の特徴に関連することを示唆する。この観察により、親水性の官能基を含む分枝アルキルリンカーの置換の、免疫刺激活性への影響を試験することとした。
【０１２４】
表１８．ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でエチレングリコールリンカーを含むＣｐＧ ＤＮＡにより誘導されるサイトカイン分泌
【表２２】
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分枝アルキルリンカーを含むＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激活性に対する効果を試験するため、ヒドロキシル（８）またはアミン（９）官能基を含む２つの分枝アルキルリンカーを、親ＣｐＧ ＤＮＡ４に組み込み、得られた修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（１５０〜１５４、表１９）の免疫刺激活性に対する効果を試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中（増殖）およびin vivo（脾腫）において、異なるヌクレオチド位置にアミノリンカー９を含むＣｐＧ ＤＮＡ１５０〜１５４について得たデータを、表１９に示す。
【０１２５】
表１９．ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物およびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾腫における、アミノブチリルプロパンジオールリンカーを含むＣｐＧ ＤＮＡにより誘導された、脾臓細胞増殖
【表２３】
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【０１２６】
親ＣｐＧ ＤＮＡ４は、濃度０．１μｇ／ｍＬにおいて増殖指数３．７±０．８を示した。同じ濃度において、アミノリンカー９を異なる位置に含む修飾ＣｐＧ ＤＮＡ１５１〜１５４は、親ＣｐＧ ＤＮＡより高い、脾臓細胞増殖をもたらした（表１９）。他のリンカーで観察されるように、置換がＣｐＧジヌクレオチドに隣接して位置されると（１５０）、親ＣｐＧ ＤＮＡに比べて低い増殖指数が示され（表１９）、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接したリンカー置換の位置が免疫刺激活性に有害な効果を有することを、さらに確認する。一般に、アミノリンカーで５’隣接配列の２’−デオキシリボヌクレオシドを置換すると（１５１および１５２）、３’隣接配列中の置換（１５３および１５４）で見出されるより高い脾臓細胞増殖がもたらされる。類似の結果が脾腫アッセイにおいても観察され（表１９）、脾臓細胞培養物で観察された結果を確認する。グリセロールリンカー（８）を含む修飾ＣｐＧ ＤＮＡは、アミノリンカー（９）を含む修飾ＣｐＧ ＤＮＡで観察されたのと同等またはやや高い免疫刺激活性を示した（データ示されず）。
【０１２７】
リンカー８および９を含むＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激効果を比較するために、５’隣接配列に置換を有するＣｐＧ ＤＮＡ１４５および１５２を選択し、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物においてサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を誘導するこれらの能力を分析した。ＣｐＧ ＤＮＡ１４５および１５２の両方は、濃度依存的なサイトカイン分泌を誘導した。図１６は、マウス脾臓細胞培養物中０．３μｇ／ｍＬの濃度で１４５および１５２により誘導されたＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを、親ＣｐＧ ＤＮＡ４と比較して示す。両方のＣｐＧ ＤＮＡは、親ＣｐＧ ＤＮＡ４より高いレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘導した。グリセロールリンカー（８）を含むＣｐＧ ＤＮＡは、アミノリンカー（９）を含むＣｐＧ ＤＮＡよりも僅かに高いレベルのサイトカイン（特にＩＬ−１２）を誘導した（図１６）。これらの結果は、親水基を含むリンカーはＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激活性により好適であることをさらに確認する。
【０１２８】
ＣｐＧ ＤＮＡにおける複数リンカーの置換の、２つの異なる側面を試験した。１つの実験セットにおいて、ヌクレオチド配列の長さを１３マーに維持し、１〜５個のＣ３リンカー（２）置換を５’末端に組み込んだ（１２０〜１２４）。これらの修飾ＣｐＧ ＤＮＡにより、リンカーの長さの増加の効果を、溶解性の問題を引き起こすことなく検討することができる。第２の実験セットにおいて、同じリンカー置換（３、４、または５）のうちの２つを、ＣｐＧジヌクレオチドの５’隣接配列の隣接位置に組み込んで、免疫刺激活性に任意の付加効果が生じるかどうかを検討した。
【０１２９】
修飾ＣｐＧ ＤＮＡは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるサイトカイン産生を誘導するそれらの能力について、親ＣｐＧ ＤＮＡ４と比較して検討した。全てのＣｐＧ ＤＮＡは、濃度依存的サイトカイン産生を誘導した。１．０μｇ／ｍＬの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで得られたデータを表２０に示す。このアッセイにおいて、親ＣｐＧ ＤＮＡ４は、９６７±２８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２、１５９３±９４ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６、および１４±６ｐＧ／ｍＬのＩＬ−１０分泌を、１μｇ／ｍＬの濃度において誘導した。表２０に示されたデータは、リンカー置換の数が減少すると、ＩＬ−１２誘導が減少することを示唆する。しかし、ＣｐＧ ＤＮＡ１２３および１２４による低いレベルのＩＬ−１２分泌の誘導は、ＣｐＧ ＤＮＡの短い長さの結果である可能性がある。１５ヌクレオチドより短い非修飾ＣｐＧ ＤＮＡを用いた我々の試験は、少ない免疫刺激活性を示した（データ示されず）。長さもリンカー置換の数も、ＩＬ−６分泌に対してはより効果が少なかった。ＩＬ−１０分泌はリンカー置換と共に増加したが、これらのＣｐＧ ＤＮＡによる全体的なＩＬ−１０分泌は最小であった。
【０１３０】
ＣｐＧジヌクレオチドに対する５’隣接配列の４番目および５番目の位置において２つのリンカー置換を有するＣｐＧ ＤＮＡ（リンカー３−１２７；リンカー４−１３１;リンカー５−１３５）、およびそれぞれに対応する５’切断版１２８、１３２、および１３６を、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でサイトカイン分泌を誘導するそれらの能力について試験した。１．０μｇ／ｍＬの濃度において分泌されたＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを、図１７に示す。図１７に示された結果は、免疫刺激活性が、組み込まれたリンカーの性質に依存することを示唆した。４番目および５番目のヌクレオシドをＣ４リンカー３で置換すると（ＣｐＧ ＤＮＡ１２７）、親ＣｐＧ ＤＮＡ４に比べて、サイトカイン分泌にわずかな効果のみを有し、これらの位置における核酸塩基および糖環が、受容体認識および／または結合に必要ではないことを示唆する。リンカー置換の向こうのヌクレオチドの欠失（ＣｐＧ ＤＮＡ１２８）は、ＣｐＧ ＤＮＡ４および１２７に見られるよりも高いＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌をもたらした。予想されたように、２つのＣ６リンカー（４）の置換は、親ＣｐＧ ＤＮＡ４よりも低いＩＬ−１２分泌および、親ＣｐＧ ＤＮＡ４と同程度のＩＬ−６分泌をもたらした。５’切断ＣｐＧ ＤＮＡ１３２は、ＣＰＧ ＤＮＡ１３１よりも高いサイトカイン分泌を誘導した。ＣｐＧ ＤＮＡ１３５および１３６は、２つのＣ９リンカー（５）を有し、わずかなサイトカイン分泌を誘導し、上記のように同じリンカーを含む一置換ＣｐＧ ＤＮＡで得られた結果を確認した。
【０１３１】
例１３：ホスホジエステル結合のサイトカイン誘導に及ぼす効果
ホスホジエステル結合の、イムノマーが誘導するサイトカイン誘導への効果を試験するために、以下の分子を合成した。
表２１．ＰＯイムノマー配列および解析データ
【表２４】
2007530449.tif 000032
ａ矢印は、各ＤＮＡ分子におけるＣｐＧジヌクレオチドの５’−３’方向性を示し、ＸおよびＹの構造はボックス内に示す。
ｂＰＳおよびＰＯはそれぞれ、ホスホロチオエートおよびホスホジエステル骨格を表わす。
ｃＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により決定した。
【０１３２】
ＰＯ−ＣｐＧ ＤＮＡ１５５を対照として、ＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４（表２１）は、マウスにおいて免疫反応を誘導することが見出された（データ示されず）。ＰＯイムノマー１５６および１５７はそれぞれ、それらの３’末端でグリセリルリンカーＸ（表２１）を介して結合している、親ＣｐＧ ＤＮＡ１５５の２つの同一の切断型コピーを有する。１５６および１５７の各々は１４塩基の同じオリゴヌクレオチドセグメントを含むが、１５７の５’末端は２つのＣ３リンカーＹ（表２１）の付加により修飾されている。全てのオリゴヌクレオチド４、１５５〜１５７は、マウスの免疫系を活性化することが知られている‘ＧＡＣＧＴＴ’の六量体モチーフを含む。
【０１３３】
ヌクレアーゼに対するＰＯイムノマーの安定性を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（加熱による不活性化なし）を含む細胞培養培地中でＣｐＧ ＤＮＡ４、１５５〜１５７を３７℃にて４、２４、および４８時間インキュベートすることにより評価した。反応混合物中に残留する無傷のＣｐＧ ＤＮＡを、次にＣＧＥにより決定した。図１８Ａ〜Ｄは、１０％ＦＢＳ中で２４時間インキュベートしたＣｐＧ ＤＮＡ４、１５５〜１５７のヌクレアーゼ消化プロファイルを示す。各時点で残留している完全長ＣｐＧ ＤＮＡを、図１８Ｅに示す。予想されたように、親ＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４が、血清ヌクレアーゼに対してもっとも耐性が高い。１８マー４の約５５％が、４８時間のインキュベーション後に分解されずに残留した。対照的に、完全長ＰＯイムノマー１５５の約５％のみが同じ実験条件下で４時間後に残留し、ホスホジエステル結合を含むＤＮＡが迅速に分解されることを確認した。予想の通り、ＰＯイムノマー１５６および１５７の両方は、１５５よりも血清ヌクレアーゼに対して耐性が高かった。４時間後に、１５５の５％と比較して、１５６と１５７はそれぞれ６２％と７３％が無傷であった（図１８Ｅ）。４８時間後でさえも、１５６と１５７のそれぞれ２３％および３７％が未分解であった。３’−３’結合ＰＯイムノマーが血清ヌクレアーゼに対してより安定でありことを示すとともに、これらの研究は、５’末端における化学修飾がヌクレアーゼの安定性をさらに高め得ることを示す。
【０１３４】
ＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激活性を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス脾臓細胞培養物において、分泌されたサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを測定することによりさらに検討した。全てのＣｐＧ ＤＮＡは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中で濃度依存的なサイトカイン分泌を誘導した（図１９）。３μｇ／ｍＬにおいて、ＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４は、それぞれ２６５６±２５６および１２２３４±１１８０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２とＩＬ−６を誘導した。親ＰＯ−ＣｐＧ ＤＮＡ１５５は、１０μｇ／ｍＬの濃度の場合を除き、背景より高いレベルにサイトカインレベルを上昇させなかった。この観察は、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果と整合する。対照的に、ＰＯイムノマー１５６および１５７は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でＩＬ−１２およびＩＬ−６両方の分泌を誘導した。
【０１３５】
図１９に示された結果は、ＰＳ−およびＰＯ−ＣｐＧ ＤＮＡのサイトカイン誘導プロファイルにおける明白な違いを示す。ＰＯイムノマー１５６および１５７は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物においてＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４よりも高いレベルのＩＬ−１２を誘導した（図１９Ａ）。対照的に、３μｇ／ｍＬまでの濃度において、これらはごく少量のＩＬ−６を産生した（図１９Ｂ）。最高濃度においてさえも（１０μｇ／ｍＬ）、ＰＯイムノマー１５６はＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４よりも大幅に少ないＩＬ−６を誘導した。ＰＯイムノマー１５７の５’末端におけるＣ３リンカーの存在は、１５６に比べて、わずかに高いレベルのＩＬ−６分泌を生じた。しかし、重要なことは、ＰＯイムノマー１５７により産生されたＩＬ−６のレベルが、ＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４により誘導されたレベルよりはるかに低いことである。図１９Ａ中の挿入図は、３μｇ／ｍＬの濃度において分泌されたＩＬ−６に対するＩＬ−１２の割合を示す。ＩＬ−１２分泌の増加に加えて、ＰＯイムノマー１５６および１５７は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４によるよりも高いレベルのＩＦＮ−γを誘導した（データ示されず）。
【０１３６】
ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でＰＯ−およびＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡにより誘導された、異なるサイトカインプロファイルのために、我々は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス脾臓細胞培養物（ＬＰＳ低応答性株）中でのＣｐＧ ＤＮＡのサイトカイン誘導パターンの検討を促進させた。このアッセイにおいて試験した全３つのＣｐＧ ＤＮＡは、濃度依存的なサイトカイン分泌を誘導した（図２０ＡおよびＢ）。ＰＯ−ＣｐＧ ＤＮＡ１５５はＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でサイトカイン分泌の誘導に失敗したため、これについてはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス脾臓細胞培養物中でさらには試験しなかった。ＰＯイムノマー１５６および１５７の両方とも、ＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４よりも高いＩＬ−２の産生を誘導した（図２０Ａ）。しかし、３μｇ／ｍＬまでの濃度において、両方ともＩＬ−６の産生は誘導しなかった。試験された最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）において、両方ともＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡ４より大幅に低いＩＬ−６を誘導した（図２０Ｂ）。分泌されたＩＬ−１２のＩＬ−６に対する比率を計算して、ＰＳおよびＰＯＣｐＧ ＤＮＡのサイトカイン分泌プロファイルを識別した（図２０Ａの挿入図）。さらに、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ脾臓細胞培養物の結果は、ＣｐＧ ＤＮＡに観察される反応は、ＬＰＳ汚染によるものではないことを示唆する。
【０１３７】
ＰＳ−ＣｐＧ ＤＮＡは、in vivoで強力な抗腫瘍活性を誘導することが示されている。ＰＯ−ＣｐＧ ＤＮＡはin vitroアッセイにおいてより大きなヌクレアーゼ安定性を示し、より高いレベルのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ分泌を誘導したので、ＰＯイムノマーのこれらの望ましい特性が、in vivoでの抗腫瘍活性を改善するかどうかに興味を覚えた。ＰＯイムノマー１５７を、皮下的に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日おきに、野生型ｐ５３を発現するＭＣＦ−７乳癌細胞、または変異ｐ５３を発現するＤＵ−１４５前立腺癌細胞の腫瘍異種移植片を有するヌードマウスに投与した。ＰＯイムノマー１５７は、生理食塩水対照に比べて、１５日目にＭＣＦ−７腫瘍の５７％成長阻害を与えた（図２１Ａ）。これはまた、３４日目にＤＵ−１４５腫瘍の５２％成長阻害を作り出した（図２１Ｂ）。これらの抗腫瘍試験は、提案されたデザインのＰＯイムノマーが、in vivoで強力な抗腫瘍活性を示すことを示唆する。
【０１３８】
例１４：短イムノマー
短イムノマーのサイトカイン誘導に対する効果を試験するため、以下のイムノマーを用いた。これらの結果は、セグメント当たり５ヌクレオチドの短いイムノマーが、サイトカイン産生を誘導するのに効果的であることを示す。
【０１３９】
表２２．ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表２５】
2007530449.tif 000033
標準字体は、ホスホロチオエート結合を表わす。
【０１４０】
【化６】
2007530449.tif 000034
【０１４１】
例１５：ヒトＢ細胞およびプラズマ細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の単離
健康なボランティアから採取した新鮮な血液からのＰＢＭＣ（CBR Laboratories, Boston, MA）を、フィコール密度勾配遠心分離法（Histopaque-1077, Sigma）により単離し、Ｂ細胞をＰＢＭＣから、ＣＤ１９細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いて、製造業者の指示に従い正の選択により単離した。
【０１４２】
例１６：Ｂ細胞増殖アッセイ
全部で１×１０５のＢ細胞／２００μｌを、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍＬ濃度のＣｐＧ ＤＮＡで６４時間刺激し、次に０．７５μＣｉの［３Ｈ］−チミジンでパルスし、８時間後に収穫した。放射能の取り込みを、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。表２３は、最終濃度１０．０μｇ／ｍＬにおける６つのＣｐＧ ＤＮＡについての、Ｂ細胞増殖の平均±ＳＤを示す。
【０１４３】
表２３．ヒトＢ細胞増殖アッセイ（７２時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表２６】
2007530449.tif 000035
標準字体はホスホロチオエート結合を表わす；下線は２’−ＯＭｅリボヌクレオチドを表わす；イタリック体はホスホジエステル結合を表わす。
【０１４４】
例１７：ヒトｐＤＣ培養物およびＩＦＮ−αＥＬＩＳＡ
ｐＤＣは、ヒトＰＢＭＣから、ＢＤＣＡ−４細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用い、製造業者の指示に従って単離した。ｐＤＣは、９６ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルでプレートした。ＣｐＧ ＤＮＡを、最終濃度０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍＬで細胞培養物に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。上清を次に採取して、ＩＦＮ−αについてヒトＩＦＮ−αＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ）を用いてアッセイした。表２４Ａ〜２４Ｃは、１．０および１０．０μｇ／ｍＬの濃度の６つのＣｐＧ ＤＮＡについて、ＩＦＮ−αの平均±ＳＤを示す。
【０１４５】
表２４Ａ．ヒト樹状細胞アッセイ（７２時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表２７】
2007530449.tif 000036
【０１４６】
表２４Ｂ．ヒト樹状細胞アッセイ（２４時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表２８】
2007530449.tif 000037
【０１４７】
表２４Ｃ．ヒト樹状細胞アッセイ（２４時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表２９】
2007530449.tif 000038
【０１４８】
例１８
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なボランティアの末梢血から単離し、例４に記載したようにして調製した。表２５Ａ〜２５Ｃは、１０．０μｇ／ｍＬの濃度の５つのＩＭＯ化合物についての、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−γの平均±ＳＤを示す。
表２５Ａ．ヒトＰＢＭＣアッセイ（７２時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表３０】
2007530449.tif 000039
【０１４９】
表２５Ｂ．ヒトＰＢＭＣアッセイ（２４時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表３１】
2007530449.tif 000040
【０１５０】
表２５Ｃ．ヒトＰＢＭＣアッセイ（２４時間）におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表３２】
2007530449.tif 000041
表２３、２４Ａ〜２４Ｃおよび２５Ａ〜２５Ｃのためのみに、標準字体はホスホロチオエート結合を表わす；下線は２’−ＯＭｅリボヌクレオチドを表わす；イタリック体はホスホジエステル結合を表わし、Ｒ、Ｒ１、ＸおよびＸ１は以下のように定義する：
【０１５１】
【化７】
2007530449.tif 000042
【０１５２】
例１９：脾臓細胞試験
５〜６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Taconic Farms（Germantown, NY）から入手し、ＯＶＡを含まない食餌で維持した。５匹のマウスのグループを免疫化試験に用いた。ＩＭＯ化合物（図２２）を合成し、精製し、上記のように解析した。
各マウスは、１００μｌのＰＢＳ中の１０μｇのニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ；グレードＶ、Sigma, St. Louis, MO）を等容量のミョウバン溶液（Imject-Alum, Pierce, Rockford, IL）と混合して、０日および１４日目に皮下（ｓ．ｃ．）注射することにより感作し、４０μｌのＰＢＳ中の２０μｇのＯＶＡで２８、２９および３０日目に鼻腔内（ｉ．ｎ．）でチャレンジした（図２）。２００μｌのＰＢＳに溶解したＩＭＯ１および２（３０または６０μｇ）を、３３、３７、４０および４３日目にマウスにｓ．ｃ．注射した。３３日目の最初のＩＭＯ化合物注射の２時間後に、麻酔下のマウスからretro-orbital穿刺により血液サンプルを採取し、サイトカインアッセイ用に血清を収穫した。各マウスは、４０μｌＰＢＳ中の１０μｇＯＶＡにより、４４日目にｉ．ｎ．でチャレンジした。最後のＯＶＡチャレンジの２４時間後にマウスを出血させ、肺および脾臓を取り出した。
【０１５３】
単一の脾臓細胞浮遊物を冷却ＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma）内に調製し、各実験群用に、１０％ＦＣＳ（HyClone, Logan UT）および１００μｇ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（HyClone）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、５×１０６細胞／ｍｌにてプールした。脾臓細胞（０．２ｍｌ／ウェル）を、１００μｇ／ｍｌのＯＶＡの存在下で９６ウェル平底培養プレート（Costar, Cambridge, MA）内で３７℃にて、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。７２時間のインキュベーションの後に、サイトカインアッセイ用に培養上清を収穫した。
ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γのレベルは、BD Biosciences（San Diego, CA）からのマウス抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。ＩＬ−６およびＩＬ−１３レベルは、マウスのDuoSet ELISAキット（R&D System, Minneapolis, MN）にて、製造業者の指示に従って評価した。
【０１５４】
ＯＶＡ特異的および総ＩｇＥおよびＩｇＧ２ａレベルは、マウス血清中でＥＬＩＳＡにより評価した。ＯＶＡ特異的Ｉｇ検出のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Immulon 2; Dynatech, Chantilly, VA）をｐＨ９．６のＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのＯＶＡで被覆した。総Ｉｇ検出のために、プレートを１μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＥ（clone R35-72）および１μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ２ａ（clone R11-89）で被覆した。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、室温にて１時間ブロックした。血清の連続希釈物（ＩｇＥに対して１：１０、ＩｇＧ２ａに対して１：１００）をプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのビオチン化抗マウスＩｇＥ（clone R35-116）を０．２５μｇ／ｍｌにて、またはＩｇＧ２ａ（clone R19-15）を０．２５μｇ／ｍｌにて、プレートに加え、室温で２時間インキュベートした。全ての抗体はBD Biosciencesから入手した。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルにて０．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Sigma）を加え、室温で１時間インキュベートした。アッセイは、１００μｌ／ウェルのTMB Substrate Solution（KPL, Gaithersburg, MD）中で、続いて１００μｌ／ウェルのStop Solution1（KPL）で発現させた。Ａ４５０（ＯＤ４５０と同じ？）を、マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instrument, Inc. Winooski, VT）を用いて測定し、データはKC Juniorソフトウェア（High Point, NC）で解析した（図２４参照）。
【０１５５】
例２０：肺組織学
４５日目に取り出した肺を、中性ホルマリン中に固定し、Mass Histology Service（Warwick, RI）に送付して、処理およびヘマトキシリン＆エオジン（ＨＥ）染色およびパス（ＰＡＳ）染色を行った。肺組織切片を光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。
統計的解析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。ＯＶＡ免疫群およびＩＭＯ処置群をスチューデントｔ検定を用いて比較した。結果は平均±ＳＥＭで表わした。全ての比較は両側検定で行い、統計的有意性は＊ｐ＜０．０５で示した。
【０１５６】
例２１：予防モデルの検討
ＩＭＯ化合物の、マウスにおいてＯＶＡ誘導アレルギー炎症を予防する能力について試験した。各マウスは、１００μｌＰＢＳ中の２０μｇニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ；グレードＶ、Sigma, St. Louis, MO）を同量のミョウバン溶液（Imject-Alum, Pierce, Rockford, IL）と混合し、０、７および１４日目に皮下（ｓ．ｃ．）注射により感作した。マウスのナイーブ群はミョウバン注射のみを受けた。ＯＶＡ／ミョウバン混合物中に溶解したＩＭＯ化合物（１０μｇ）は、０、７および１４日目にマウスに投与した。最終免疫化の１４日後に、イソフルラン（Abbott Laboratories, North Chicago, IL）による麻酔下のマウスをretro-orbital穿刺により出血させ、犠牲にして脾臓を取り出した。
【０１５７】
例２２：ＩＭＯ化合物の、抗原特異的リコール免疫反応におけるＴｈ２サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３に及ぼす効果
ＩＭＯ化合物の、ＯＶＡ／ミョウバンを注射されたマウスにおけるＴｈ２優勢免疫反応を変化させる能力を決定するために、ＩＭＯ化合物をＯＶＡ／ミョウバンと共に、０および１４日目に注射した。脾臓細胞を２８日目にマウスから単離し、ＯＶＡと共に７２時間インキュベートした（抗原リコール）。ＯＶＡ／ミョウバンのみを注射されたマウスからの脾臓細胞は、ナイーブマウスよりも高いレベルのＴｈ２関連サイトカイン、例えばＩＬ−４（〜２倍）、ＩＬ−５（１３０倍）、およびＩＬ−１３（２８倍）を産生した（図２３Ａおよび図２３Ｂ参照）。ＣｐＧ ＤＮＡまたはＩＭＯ化合物およびＯＶＡを付与されたマウスからの脾臓細胞は、有意に少ないこれらのサイトカイン、特にＩＬ−５およびＩＬ−１３を分泌した；ＩＬ−５は２０％〜９７％減少し、ＩＬ−１３は６０％〜９５％減少した。これらの結果は、ＩＭＯ化合物が、Ｔｈ２関連サイトカイン分泌を抑制する効果を有することを示唆する。
【０１５８】
例２３：ＩＭＯ化合物の、抗原特異的リコール免疫反応におけるＩＦＮ−γ産生に及ぼす効果
同じ抗原リコール実験において、ＯＶＡ／ミョウバンおよびＩＭＯ化合物を注射されたマウスの脾臓細胞は、ナイーブマウスまたはＯＶＡ／ミョウバン注射マウスの細胞より有意に高いレベルのＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γを産生した（図２３Ａおよび図２３Ｂ参照）。ＯＶＡ／ミョウバンおよび従来のＣｐＧ ＤＮＡ１を注射されたマウスの脾臓細胞は、ナイーブ脾臓細胞が産生したのと同等レベルのＩＦＮ−γを産生した。これらの結果は、ＯＶＡ／ミョウバンを注射されたマウスのＩＭＯ化合物による処置は、脾臓細胞が産生するサイトカインに反映されるように、免疫反応をＴｈ２優勢から主にＴｈ１型へと変化させ得ることを示す。
【０１５９】
例２４：ＩＭＯ化合物の、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＥ産生に及ぼす効果
ＩＭＯ化合物のＩｇＥ産生に及ぼす効果を評価するために、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＥの血清レベルを、最後のＯＶＡ／ミョウバン注射の１４日後に試験した。ＯＶＡ／ミョウバンでの感作は、マウスにおいて高レベルのＯＶＡ特異的ＩｇＥ産生をもたらした；ＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルは、ＩＭＯ化合物をＯＶＡ／ミョウバンと共に付与されたマウスにおいて有意に低かった（ナイーブマウスのレベルと同等）（図２４Ａおよび図２４Ｂ参照）。血清総ＩｇＥレベルも、ＯＶＡ／ミョウバンとＩＭＯ化合物を注射されたマウスにおいて低かった。
【０１６０】
例２５：ＩＭＯ化合物の、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生に及ぼす効果
ＩＭＯ化合物のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生に及ぼす効果を評価するために、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血清レベルを試験した。ＯＶＡ／ミョウバンの注射を受けた動物は、高レベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧ１および、少ないレベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａを産生した（図２４Ａおよび図２４Ｂ参照）。ＩＭＯ化合物のマウスへの注射は、効果を有さないか、またはＯＶＡ／ミョウバン注射のマウスに見出されるレベルより、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１のレベルを低下させた。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体レベルは、ＯＶＡ／ミョウバンのみを付与されたマウスよりも、ＩＭＯ化合物を付与されたマウスの血清において有意に高かった。これらのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルは、ＯＶＡ／ミョウバンのみを付与されたマウスに比べて、ＯＶＡ／ミョウバンと共にＩＭＯ化合物を付与されたマウスにおける、より高いＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比率に翻訳された。
同様の結果は、血清総Ｉｇ産生についても見出された。ＯＶＡ／ミョウバンとＩＭＯ化合物を付与されたマウスの血清は、ＯＶＡ／ミョウバンのみを付与されたマウスよりも、より低い総ＩｇＧ１レベルおよびより高い総ＩｇＧ２ａレベルを有した。
【０１６１】
例２６：治療モデルにおける検討
ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の治療可能性を、喘息のマウスモデルにおいて試験した。マウスをＯＶＡで感作およびチャレンジし、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２を用いて上のプロトコルに記載したように処置した。
ＩＭＯ１およびＩＭＯ２による処置の局所的免疫反応への効果を決定するために、ナイーブマウスおよび、ＯＶＡ／ミョウバンで感作およびチャレンジし、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２による処置有り、無しのマウスの肺の組織学を、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の最終注射の４８時間後に試験した。ＯＶＡで感作およびチャレンジしたマウスでＩＭＯ１およびＩＭＯ２の処置無しのものは、ナイーブマウスと比べて重篤な炎症性細胞浸潤および気道上皮過形成を示した（データ示されず）。逆に、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置したマウスは、無処置のマウスと比べてより少ない炎症性細胞浸潤およびより少ない気道上皮過形成を有した（データ示されず）。これらの結果は、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の、ＯＶＡで感作およびチャレンジしたマウスにおけるＯＶＡ誘導の肺の炎症を逆転させる能力を示す。
【０１６２】
例２７：ＩＭＯ１およびＩＭＯ２による処置の、抗原特異的リコール免疫反応におけるＴｈ２およびＴｈ１サイトカインに及ぼす効果
ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の、ＯＶＡで感作およびチャレンジしたマウスにおけるＴｈ２優勢免疫反応を逆転させる能力を決定するために、４５日目のマウスから脾臓細胞を単離し、これをＯＶＡと共に７２時間インキュベートした。脾臓細胞をＯＶＡで再刺激した後、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−５およびＩＬ−１３）の産生に、処置群の間で大きな違いを観察した。ＯＶＡのみを注射したマウスからの脾臓細胞は、高レベルのＴｈ２関連サイトカインを産生した（図２５）。ＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置したマウスは、有意に少ないレベルのＯＶＡ誘導のＴｈ２サイトカインを産生した（図２５）。抗原リコール実験において、ナイーブマウスおよびＯＶＡ／ミョウバンで感作およびチャレンジしたマウスからの脾臓細胞の培養物中には、低いレベルのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γのみが誘導された。ＯＶＡチャレンジの後にＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置されたマウスからの脾臓細胞は、有意に高いレベルのＩＦＮ−γを産生した（図２５）。
【０１６３】
例２８：ＯＶＡで感作およびチャレンジしたマウスにおける、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２による処置の、ＯＶＡ特異的および総血清ＩｇＥ産生に及ぼす効果
ＩｇＥ産生に及ぼすＩＭＯ１およびＩＭＯ２の効果を評価するために、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＥの血清レベルを試験した。ＯＶＡで感作およびチャレンジしたがＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置していないマウスは、血清に高レベルのＯＶＡ特異的ＩｇＥを有したが（図２６）、一方、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置したマウスは、有意に低いレベルのＯＶＡ特異的ＩｇＥを有した。血清総ＩｇＥレベルも、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の処置を受けたマウスにおいて低かった（図２６）。
【０１６４】
例２９：ＯＶＡ／ミョウバンで感作およびチャレンジしたマウスにおける、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２による処置の、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＧ２ａ産生に及ぼす効果
ＩｇＧ２ａ産生に及ぼすＩＭＯ１およびＩＭＯ２の処置の効果を評価するために、ＯＶＡ特異的および総ＩｇＧ２ａの血清レベルを試験した。ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の処置なしで、ＯＶＡで感作およびチャレンジしたマウスは、少ないレベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａを有した（図２６）。ＯＶＡで感作およびチャレンジし、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置したマウスは、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体レベルの増加を示した（図２６）。同様の結果が、血清総Ｉｇ産生にも見出された（図２６）：ＯＶＡで感作およびチャレンジし、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置したマウスは、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２で処置しなかったマウスより高いレベルの総ＩｇＧ２ａを有した。
【０１６５】
例３０：ＩＭＯ化合物の一回高用量vs複数回低用量の、ナイーブマウスにおける局所的および全身的Ｔｈ１サイトカインレベルに及ぼす効果
ＩＭＯ処置の用量の効果を決定するために、３３μｇのＩＭＯ１またはＩＭＯ３を１、２、および３日目にマウスの鼻腔内に処置するか、または１００μｇのＩＭＯ１またはＩＭＯ３を一回でマウスの鼻腔内に投与して処置した。マウスは出血させて、最終処置の５時間後に肺を取り出した。１００μｇの一回量は高レベルの全身的サイトカイン反応を誘導したが、３回の低用量（３×３３μｇ）は、高い局所（ＢＡＬＦ）サイトカイン反応を誘導した（図２７）。
ＩＭＯ化合物の低用量の複数回投与が、ナイーブマウスにおける局所的および全身的サイトカインレベルに及ぼす用量依存的効果を決定するために、マウスを２．５μｇ、１０．０μｇまたは４０．０μｇのＩＭＯ１で１、２および３日目に鼻腔内処置した。マウスは出血させ、最終処置の５時間後に肺を取り出した。ＩＭＯ化合物は、局所（ＢＡＬＦ）サイトカインレベルを増加させたが、低用量を複数回投与したマウスにおける全身的サイトカインレベルは増加させなかった（図２８）。この効果は、用量依存的であった。
【０１６６】
例３１：ＩＭＯ化合物およびコルチコステロイドの効果のin vitroでの比較
マウスを、１０ｍｇＯＶＡを０および１４日に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して感作し、４０μｌＰＢＳ中の１０μｇのＯＶＡで２８日目に鼻腔内でチャレンジした。脾臓細胞を３０日目に採集し、１００μｇ／ｍＯＶＡで、１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＩＭＯ化合物またはブデソニドの有り、無しにて、７２時間インキュベートした。ＩＭＯ１およびブデソニドの両方は、ＯＶＡ誘導のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬＢ）の分泌を抑制した（図２９）。しかし、ＩＭＯ１のみが、強いＴｈ１サイトカインの誘導（ＩＬ−１２、ＦＮ−８）を示した。
【０１６７】
均等
前述の発明について明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明および付属のクレームの真の範囲から乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の代表的なイムノマーの模式図である。
【図２】本発明の幾つかの代表的なイムノマーを表す図である。
【図３】本発明のイムノマーの直線合成に好適な代表的小分子リンカーの群を表す図である。
【図４】本発明のイムノマーのパラレル合成に好適な代表的小分子リンカーの群を表す図である。
【図５】本発明のイムノマーの直線合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【図６】本発明のイムノマーのパラレル合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【０１６９】
【図７Ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、イムノマー１〜３によるＩＬ−１２の誘導を示すグラフである。これらのデータは、到達可能５’末端を有するイムノマー２は、モノマーオリゴ１より強いＩＬ−１２の誘導因子であること、および、到達可能５’末端を有さないイムノマー３は、オリゴ１に比べて同等かまたは低い免疫刺激を生成する能力を有することを示唆する。
【図７Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、イムノマー１〜３によるＩＬ−６の誘導（それぞれ上から下へ）を示すグラフである。これらのデータは、到達可能５’末端を有するイムノマー２は、モノマーオリゴ１より強いＩＬ−６の誘導因子であること、および、到達可能５’末端を有さないイムノマー３は、オリゴ１に比べて同等かまたは低い免疫刺激を誘導する能力を有することを示唆する。
【図７Ｃ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、イムノマー１〜３によるＩＬ−１０の誘導（それぞれ上から下へ）を示すグラフである。
【図８Ａ】到達不能５’末端および到達可能５’末端をそれぞれ有する異なる濃度のイムノマー５および６による、細胞培養物におけるＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図８Ｂ】ＣｐＧモチーフの５’隣接配列に免疫化学的修飾を有するイムノマー４〜６による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾腫大を示すグラフである。ここでも、到達可能５’末端を有するイムノマー化合物（６）は、到達可能５’末端を有さないイムノマー５およびモノマーオリゴ４と比べて、脾腫大を増加させるより強い能力を有する。
【図９Ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１２の誘導を示すグラフである。
【図９Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−６の誘導を示すグラフである。
【図９Ｃ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１０の誘導を示すグラフである。
【０１７０】
【図１０Ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、イムノマー１４、１５および１６による細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図１０Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のイムノマー１４〜１６による、ＩＬ−１２による細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図１０Ｃ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のイムノマー１４〜１６による、ＩＬ−６による細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図１１Ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、オリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０による細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−１２細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図１１Ｃ】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−６細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【０１７１】
【図１２】オリゴヌクレオチド４並びにイムノマー１４、２３および２４を用いた、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾腫大を示すグラフである。
【図１３】オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドの略図であり、非ヌクレオチド結合が、３’位または２’位の核酸塩基においてヌクレオシドに付着できることを示す図である。
【図１４】例１３で用いられた化学的置換を示す図である。
【図１５】例１３の修飾オリゴヌクレオチドを用いて得たサイトカインプロファイルを示す図である。
【図１６】アミノリンカーと比較したグリセロールリンカーの相対的なサイトカイン誘導を示す図である。
【図１７】種々のリンカーおよびリンカーの組合せについての相対的なサイトカイン誘導を示す図である。
【０１７２】
【図１８】Ａ〜Ｅは、種々のＰＳおよびＰＯイムノマー並びにオリゴヌクレオチドについて、相対的ヌクレアーゼ耐性を示す図である。
【図１９】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較したＰＯイムノマーの相対的サイトカイン誘導を示す図である。
【図２０】Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較したＰＯイムノマーの相対的サイトカイン誘導を示す図である。
【図２１】Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス脾臓細胞培養物において、イムノマーの高濃度における、ＰＳイムノマーと比較したＰＯイムノマーの相対的サイトカイン誘導を示す図である。
【図２２】イムノマー（ＩＭＯ）の配列および化学的修飾を示す図である。
【０１７３】
【図２３Ａ】脾臓細胞培養物におけるサイトカイン反応により示された、ＩＭＯによるＯＶＡ誘導Ｔｈ２免疫反応の阻止を示す図である。
【図２３Ｂ】脾臓細胞培養物におけるサイトカイン反応により示された、ＩＭＯによるＯＶＡ誘導Ｔｈ２免疫反応の阻止を示す図である。
【図２４Ａ】血清抗体反応により示された、ＩＭＯによるＯＶＡ誘導Ｔｈ２免疫反応の阻止を示す図である。
【図２４Ｂ】血清抗体反応により示された、ＩＭＯによるＯＶＡ誘導Ｔｈ２免疫反応の阻止を示す図である。
【図２５】マウスにおいて確立されたＯＶＡ誘導アレルギー性喘息に対する、ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の用量依存的効果を示す図である。サイトカイン分泌は、脾臓細胞培養物中のＯＶＡリコール反応におけるものである。ＩＭＯ１およびＩＭＯ２の両方は、ＩＬ−５の分泌を用量依存的な様式で有意に抑制した。ＩＬ−１３は、両方のＩＭＯ化合物により有意に抑制された。両方のＩＭＯ化合物は用量依存的にＩＦＮ−γ分泌を誘導した。
【図２６】血清の抗原特異的抗体および総抗体を示す。ＩＭＯ１およびＩＭＯ２は、用量依存的にＯＶＡ特異的ＩｇＥを減少させ、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａを増加させた。
【図２７】ＩＭＯ化合物の一回高用量ｖｓ複数回低用量の、ナイーブマウスにおける局所的および全身的Ｔｈ１サイトカインレベルに及ぼす効果を示す図である。１００ｍｇの一回量は、より高いレベルの全身的サイトカイン反応を誘導した。逆に、３回の低用量（３×３３ｍｇ）は、より高い局所（ＢＡＬＦ）サイトカイン反応を誘導した。
【図２８】ＩＭＯ化合物の低用量複数回投与の、ナイーブマウスにおける局所的および全身的サイトカインレベルに及ぼす用量依存的効果を示す図である。ＩＭＯ１は、低用量で複数回投与された場合、マウスにおいて局所（ＢＡＬＦ）サイトカインレベルを増加させたが、全身サイトカインレベルは増加させなかった。この効果は用量依存的である。
【図２９】ＩＭＯおよびコルチコステロイドのin vitroでの効果を比較する図である。ＩＭＯ１およびブデソニドの両方は、ＯＶＡ誘導Ｔｈ２サイトカイン分泌を抑制した。しかし、ＩＭＯ１のみが強いＴｈ１サイトカイン誘導を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月23日(2007.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７４で表される配列を含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマー。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物。
【請求項３】
共刺激性分子が、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合している、請求項２に記載の免疫調節性組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、および抗原をさらに含む、免疫調節性組成物。
【請求項５】
抗原が、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択される、請求項４に記載の免疫調節性組成物。
【請求項６】
抗原がアレルゲンである、請求項４に記載の免疫調節性組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項２または４に記載の免疫調節性組成物。
【請求項８】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項２または４に記載の免疫調節性組成物。
【請求項９】
気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者を治療的に処置するための医薬組成物の製造への、配列番号１７４で表される配列を含むイムノマーの使用。
【請求項１０】
気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者における免疫反応を調節するための医薬組成物の製造への、配列番号１７４で表される配列を含むイムノマーの使用。
【請求項１１】
免疫反応がＴｈ１免疫反応である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
免疫反応がＴｈ２免疫反応である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
医薬組成物が、疾病または疾患に関連する抗原とともに投与されるものである、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１４】
イムノマーもしくは抗原または両者が、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合している、請求項９、１０または１３に記載の使用。
【請求項１５】
医薬組成物が、アジュバントとともに投与されるものである、請求項９または１０に記載の使用。
【国際調査報告】
2007530449.tif 000083
2007530449.tif 000084
2007530449.tif 000085