(57)【要約】  本発明はＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの定量化による、種子のロットの発芽能力および／または保存適性の確定に関するものである。本発明はＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの定量化を可能にする抗体にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発芽能力および／または種子ロットの保存適性を決定する方法であって、Ｘ1がＥ、ＶまたはＳを、Ｘ2がＡまたはＥを、Ｘ3がＲ、ＧまたはＱを表す、配列（Ｉ）：ＲＹＶＰＬＴＳＲＸ1Ｘ2ＱＬＸ3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で定義されるタンパク質領域に対する抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体によって認識されるタンパク質を、前記ロットから採取した種子サンプルにおいて定量化することから成ることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの定量化が、下記から選択された抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体を用いて実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
・前記タンパク質の配列（Ｉ）で定義される領域に対する抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体、
・前記タンパク質の、Ｘ4がＤまたはＥ、Ｘ5がＱまたはＫ、Ｘ6がＶまたはＩ、Ｘ7がＮまたはＳ、Ｘ8がＳ、ＥまたはＡ、Ｘ9がＩＳ、ＶＳ、ＶＴおよびＴＳの中から選択されたジペプチド、すなわちペプチド結合、Ｘ10がＩまたはＶ、Ｘ11がＫ、ＱまたはＲを表す、配列（ＩＩ）：ＱＸ4ＬＸ5ＶＸ6ＤＫＸ7Ｘ8ＤＧＳＸ9Ｘ10Ｘ11（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）によって定義される領域に対する、抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体。
【請求項３】
下記から選択された抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体を用いることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
・配列ＱＤＬＱＶＶＤＫＮＳＤＧＳＶＳＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のペプチドに対する抗体、
・配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＥＡＱＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のペプチドに対する抗体。
【請求項４】
請求項２または３のいずれか一つに記載の、抗イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体。
【請求項５】
植物材料におけるＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの定量化方法であって、請求項４に記載の抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体に前記材料を接触させることから成る方法。
【請求項６】
種子ロットの発芽能力および／または保存適性を決定するために、請求項４に記載の抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は種子のロットの老化マーカーとしてのタンパク質Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
種子の保存中に発生する種子の老化には、細胞膜の劣化、多数の酵素の触媒活性の変化（参照：ＷＡＬＴＥＲＳ  Ｃ．，１９９８；Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，８：２２３−２４４）およびＤＮＡ変異の増加が伴う。これらの現象全体が種子の発芽能力と生育力の低下を引き起こす。
【０００３】
老化の早さは内的要因（とりわけ遺伝的要因）と外的要因（保存状態）の複雑な組み合わせに依存する。老化の程度が種子の発芽品質およびその後の保存へのそれらの適性を条件付けるので、老化の程度をできる限り迅速かつ正確に決定できることが望ましい。
【０００４】
種子のロットの発芽品質を評価するために現在利用可能なテストは、ロットの発芽平均時間、経時的な発芽の広がり、発芽能力、正常な苗の頻度などの各種のパラメーターを考慮に入れる発芽試験に基づいているテストが主である。発芽能力は、きわめて若い新芽の百分率で加重した、蒔種後の所与の日数の経過後に発芽した正常な苗の百分率によって、例えば定義される。これらのテストは、ＩＳＴＡ（国際種子検査協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｅｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））の規格に従って種子認証機構によってそれぞれの品種または変種ごとに定義され、検定される。しかしながら、これらの試験は実施するのが容易ではない。他方で、種子のロットの現在の発芽能力は評価できるが、将来の変化を予測することができず、またとりわけ発芽能力の低下を全く予見することができない。
【０００５】
現時点で、種子のロットの生育力を、またなおさらその保存能力を単純かつ正確に予測することを可能にする特異マーカーはない。
【０００６】
老化過程で活性が変化すると思われる多数の酵素の中で（参照：前掲のＷＡＬＴＥＲＳ  Ｃ，１９９８，Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．，８：２２３−２４４）、発明者らはＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（ＩＡＭＴ）にとくに関心を抱いた。
【０００７】
Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．７７）はタンパク質修復酵素であり、タンパク質の中に存在する異常なＬ−イソアスパラギン酸残基とＤ−アスパラギン酸残基をＬ−アスパラギン酸残基へ転換することに関与する。
【０００８】
Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの基質を構成するＬ−イソアスパラギン酸残基とＤ−アスパラギン酸残基は、アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基の自然発生的な脱アミド化、異性化およびラセミ化の結果生じ、この脱アミド化、異性化、およびラセミ化は、種子の老化過程に関与し、これらの残基が組み込まれたタンパク質の機能性に影響する可能性のある変化の一部を構成する。
【０００９】
Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（ＩＡＭＴまたはＰＩＭＴ）は、これらの残基の少なくとも一部をＬ−アスパラギン酸残基に転換することが可能であり、このようにして修復されたタンパク質はその活性を取り戻すことができる。
【００１０】
Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼはほぼ普遍的な酵素であり、（グラム陰性の）細菌から動植物にいたるまできわめて多数の生物の中に見られる（Ｏ’ＣＯＮＮＥＲ  Ｃ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ，１９８５；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．，１３２：１１４４−１１５０）。
【００１１】
植物において、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ活性はほぼ全ての植物種に存在すると思われる。Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ活性は、とくに小麦胚芽において明らかにされており（ＴＲＩＶＥＤＩＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８２，１２８：３４９−３５４，ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２：１１１００−１１１１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９（４１）：２５６０５−２５６１２）、ついでハス（ＳＨＥＮ−ＭＩＬＬＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．，１９９５，８２（１１）：１３６７−１３８０）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３０：７２３−７３７；ＴＨＡＰＡＲ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２０００，２０：２３７−２５１）、大麦（ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９７，１１５：１４８１−１４８９）、トマト（ＫＥＳＴＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，１９９７，３０９：９４３−９４９）、トウモロコシ、ニンジンおよび米（ＴＨＡＰＡＲ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１，１２５（２）：１０２３−１０３５）において明らかにされている。
【００１２】
この活性は植物において数多くの器官で検出できるが、乾燥種子内で最大になるようである（ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３０：７２３−７３７）。ＣＬＡＲＫＥ  Ｓ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９８７，３０：８０８−８２１）は、ＩＡＭＴが異常な残基の約３０％を修復する活性を有することを試験管内で示した。したがって、その優れた作用は、種子または植物において、アミノ酸であるＬ−イソアスパラギン酸を含むタンパク質の健全性の喪失を減速させることを可能にするであろうが、ラセミ化と異性化の現象の全てを補償することはできないであろう。ＳＨＥＮ−ＭＩＬＬＥＲら（Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．，１９９５，８２（１１）：１３６７−１３８０）は、約９０年保存したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）の種子におけるＩＡＭＴ活性を定量した。発芽能力を示した種子は高いＩＡＭＴ活性を有しており、またラセミ化した残基の割合は生の種子のそれに等しく、２％であった。ＫＥＳＴＥＲら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，１９９７，３０９：９４３−９４９）の報告では、人工的に老化させたトマトの種子において、ＩＡＭＴ活性の減少は発芽能力の低下と相関している。ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９７，１１５：１４８１−１４８９）によっても、自然に老化した大麦種子において、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ活性が種子の年齢に応じて低下し、この低下に伴ってラセミ化したＬ−イソアスパルチル残基が増え、種子の生育力が喪失することが観察されている。反対に、人工的に老化させた大麦種子の場合、ラセミ化した残基の増加と発芽能力の低下は観察されたが、ＩＡＭＴ活性の低下は認められなかった。
【非特許文献１】ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３０：７２３−７３７
【非特許文献２】ＣＬＡＲＫＥ  Ｓ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９８７，３０：８０８−８２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、これらの研究によっては、発芽能力のマーカーとしてＬ−イソアスパルチルトランスフェラーゼを使用することを可能にするであろう、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの量と種子の発芽能力との間の直接的な相関関係の存在を結論づけることはできない。
【００１４】
くわえて、上述の研究に記載の結果は、ＩＡＭＴ活性テストまたはＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ検出に依拠している。
【００１５】
しかるに、酵素活性の定量は、大がかりな、放射性メタノールの使用を必要とする方法を利用するものであり、日常的な検査の枠内で実施するのが困難である。他方で、ｍＲＮＡに関しては、ＩＡＭＴ転写産物の検出とＩＡＭＴ酵素活性の間に必ずしも相関関係があるわけではないことが認められた。例えば、ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．ら（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３０：７２３−７３７）の報告によれば、シロイヌナズナにおいて、ＩＡＭＴのｍＲＮＡは（酵素活性が検出されない）苗で検出されたが、（酵素活性が最大になる）乾燥種子では検出されなかった。
【００１６】
シロイヌナズナにおいて、試験管内で活性が証明されたＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼをコードする二つの遺伝子が、現時点では識別されている。そのうち一番目のものはＭＵＤＧＥＴＴら（１９９６，前掲）によって、二番目のものはＸＵ  Ｑ．らによって報告された（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００４，１３６：１−１３）。これら二つの遺伝子は、後者のチームによってＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２と命名され、その翻訳産物はそれぞれＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２と命名された。
【００１７】
これら二つの遺伝子ＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２は、シロイヌナズナ属植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の３番染色体と５番染色体の上にそれぞれ位置している。しかしながら、生体内で測定された酵素活性におけるこれら二つの遺伝子の役割が何であるかについては現在まで報告がない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明者らは、シロイヌナズナにおいて、遺伝子ＰＩＭＴ−１の調節における突然変異を識別し、それによってこの遺伝子の発現が貯蔵中の乾燥種子の保存能力において本質的な役割を果たすことを検証することができた。さらに、ＰＩＭＴ−１タンパク質から、シロイヌナズナにおいてＰＩＭＴ−１とＰＩＭＴ−２を区別することができる抗体を得ること、かつ他の双子葉植物綱においてＰＩＭＴ−１のオルソログを認識することを可能にするペプチドと、双子葉植物綱または単子葉植物綱の他の植物種においてＰＩＭＴ−１のオルソログを認識する抗体を得ることを可能にするペプチドを識別した。
【００１９】
これらのペプチドの一方または他方に対して得られた抗体を用いるＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの定量化によって、乾燥種子内のタンパク質消失と発芽能力喪失の間の相関を確定することが可能になった。さらに、発明者らは、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの量が減少すると発芽能力が低下することを発見した。したがって、この酵素は予測マーカーとなって、種子の発芽能力を評価するだけでなく、保存過程でのその発芽能力の低下を予測することも可能にすることが明らかになった。
【００２０】
本発明は、発芽能力および／または種子ロットの保存適性を決定する方法であって、抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体によって認識されるタンパク質を、前記ロットから採取した種子サンプルにおいて定量化することから成ることを特徴とする方法を対象とするものであり、前記抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体は、前記タンパク質の、Ｘ1がＥ、ＶまたはＳを、Ｘ2がＡまたはＥを、Ｘ3がＲ、ＧまたはＱを表す、配列（Ｉ）：ＲＹＶＰＬＴＳＲＸ1Ｘ2ＱＬＸ3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で定義される領域に対するものである。
【００２１】
配列（Ｉ）のペプチドに対する抗体は、シロイヌナズナにおいてＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２を、また双子葉植物綱または単子葉植物綱の他の植物種において、これらのタンパク質のオルソログを認識する。
【００２２】
本発明による方法は免疫測定によって有利に実施することができる。この場合、配列（Ｉ）のペプチドに対する抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体を用いことができる。またタンパク質の別の領域に対する、とくに、Ｘ4がＤまたはＥ、Ｘ5がＱまたはＫ、Ｘ6がＶまたはＩ、Ｘ7がＮまたはＳ、Ｘ8がＳ、ＥまたはＡ、Ｘ9がＩＳ、ＶＳ、ＶＴおよびＴＳの中から選択されたジペプチド、すなわちペプチド結合、Ｘ10がＩまたはＶ、Ｘ11がＫ、ＱまたはＲを表す、配列（ＩＩ）：ＱＸ4ＬＸ5ＶＸ6ＤＫＸ7Ｘ8ＤＧＳＸ9Ｘ10Ｘ11（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）によって定義される領域に対する抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体を用いることもできる。
Ｑ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｆはここでは１文字表記のその通常の意味を有する。
【００２３】
例えば、シロイヌナズナにおいてＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２を区別するために、配列ＱＤＬＱＶＶＤＫＮＳＤＧＳＶＳＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）でシロイヌナズナのＰＩＭＴ−１タンパク質内に定義される領域に対する抗体、または配列ＱＥＬＫＶＩＤＫＮＥＤＧＳＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で定義される、シロイヌナズナのＰＩＭＴ−２タンパク質における対応する領域に対する抗体を用いることができる。
【００２４】
双子葉植物綱のＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼにおける配列（ＩＩ）によって定義された領域に対する抗体は、双子葉植物綱の種子に対する本発明による方法の実施に有利に使用することもできる。例えば、配列ＱＤＬＱＶＶＤＫＮＳＤＧＳＶＳＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によって定義される、シロイヌナズナのＰＩＭＴ−１タンパク質の領域に対する抗体、または他の双子葉植物網におけるＰＩＭＴ−１のオルソログの相同領域に対する抗体も、双子葉植物綱の種子に対する本発明による方法の実施に有利に使用することができる。
【００２５】
同様に、単子葉植物綱のＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの配列（ＩＩ）によって定義される領域に対する抗体は、単子葉植物綱の種子に対する本発明による方法の実施に有利に使用することができる。
【００２６】
本発明は、前記タンパク質の、上記の配列（Ｉ）によって定義される領域と配列（ＩＩ）によって定義される領域の中から選択された領域に対する、一切の抗イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体も対象とする。
【００２７】
配列（Ｉ）によって定義される領域に対する抗イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体の非制限的な例として、シロイヌナズナのＰＩＭＴ−１の配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＥＡＱＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の領域に対する抗体、シロイヌナズナのＰＩＭＴ−２の配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＶＥＱＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の領域に対する抗体、麦のＰＩＭＴの配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＳＡＱＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の領域に対する抗体、米のＰＩＭＴの配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＳＡＱＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の領域に対する抗体を挙げることができる。
【００２８】
配列（ＩＩ）によって定義される領域に対する抗イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体の非制限的な例として、シロイヌナズナのＰＩＭＴ−１の配列ＱＤＬＱＶＶＤＫＮＳＤＧＳＶＳＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の領域に対する抗体、シロイヌナズナのＰＩＭＴ−２の配列ＱＥＬＫＶＩＤＫＮＥＤＧＳＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の領域に対する抗体、麦のＰＩＭＴの配列ＱＤＬＱＶＩＤＫＳＡＤＧＳＴＳＶＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の領域に対する抗体、米のＰＩＭＴの配列ＱＥＬＱＶＶＤＫＮＡＤＧＳＶＴＶＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の領域に対する抗体を挙げることができる。
【００２９】
ここで、Ｌ−イソアスパルチルトランスフェラーゼ全体またはその断片上で、関連領域と検出可能な仕方で結合することができるが、同じＬ−イソアスパルチルトランスフェラーゼの他の領域とは検出可能な仕方で結合しない一切の抗体を、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの領域に対する抗体と定義する。モノクローナル抗体の場合、これは前記領域内に位置するエピトープを認識する一切の抗体を含んでいる。ポリクローナル抗体の場合、これはＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの他の領域と有意の交差反応を示さない一切の抗体調製物を含んでいる。
【００３０】
反対に、この抗体は他の植物種のＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの相同領域との交差反応を多少とも大きな割合で示す可能性がある。とりわけ、上述のごとく、配列（Ｉ）で定義される領域に対する抗体は一般的に非常に広い特異性を示し、単子葉植物網または双子葉植物網において、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの大きな多様性を認識することができる、他方で、配列（ＩＩ）で定義される領域に対する抗体は一般的に、より制限された特異性を示す。
【００３１】
本発明による抗体は、それ自体周知の方法によって得ることができる。通常、抗体の標的としたい領域を含む（天然、組換え、または合成ペプチドの形の）Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの断片、または少なくともエピトープＢを構成するのに十分な大きさ（通常少なくとも５から７のアミノ酸）のＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの断片を免疫原として使用する。必要ならば、前記ペプチドを、その免疫原性を増すために、アジュバントと混合するか、あるいはキャリアータンパク質に結合させる。つづいて、得られた抗体は、同様にそれ自体周知の仕方で精製することができる。通常、この精製は、抗体の標的となるペプチドを固定したカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを行う過程を少なくとも一つ含んでいる。
【００３２】
非制限的な例として、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの配列（Ｉ）で定義される領域に対する抗体は、免疫原として、および／またはアフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製のために、シロイヌナズナのＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼＰＩＭＴ−１内のこの領域に対応する、配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＥＡＱＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のペプチドを用いて得ることができる。この配列の断片、例えば、配列ＲＹＶＰＬＴＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の断片、または配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＥＡＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の断片を含むペプチドを、同様にして用いることもできる。ＰＩＭＴ−１の、より長い断片、例えば、配列ＲＹＶＰＬＴＳＲＥＡＱＬＲＧＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のペプチドを用いることもできる。
【００３３】
本発明は、植物材料におけるＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの定量化の方法であって、本発明による抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体に前記材料を接触させることから成る方法も対象とする。
【００３４】
本発明は、種子ロットの発芽能力および／または保存適性を決定するための、本発明による抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体の使用も対象とする。
【００３５】
本発明は、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの量と種子の保存適性との間の相関関係の実証、抗Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ抗体の獲得、および様々な種の種子の発芽品質を評価するためのその使用を記載する実施例に関連する以下の説明を参照して、より深く理解されるであろう。
【実施例１】
【００３６】
シロイヌナズナにおけるＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの調節における突然変異の識別と解析
【００３７】
ベルサイユにあるＩＮＲＡのシロイヌナズナのＴ−ＤＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＤＮＡ）形質転換体のバンクのスクリーニングによって、ＰＩＭＴ−１遺伝子に挿入のある突然変異体を単離することができた。この突然変異体はａｔｐｃｍ１．１-と命名された。配列決定のデータは、Ｔ−ＤＮＡの挿入がＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域内におけるＡＴＧの上流にある１７３塩基対に位置しており、そこで１３塩基対を欠失させて、アブシジン酸の応答ボックス（ＡＢＲＥボックス、Ａｂｓｃｉｓｓｉｃ  ａｃｉｄ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）を消失させることを示している。
【００３８】
Ｔ−ＤＮＡの挿入について同型接合である突然変異植物を、突然変異体の特性の研究のために選択した。
【００３９】
ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体におけるＰＩＭＴ−１遺伝子の発現
【００４０】
ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の、および野生植物の、苗および乾燥種子におけるＰＩＭＴ−１遺伝子の発現を、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって比較した。対照として、シロイヌナズナの種子の成長過程における構成的発現のプロフィールを示すＥＦ転写因子の遺伝子を使用する。
【００４１】
苗は、０．５％素寒天培地上に置かれたナイロンフィルター（ＢＵＩＳＩＮＥ、ＮＹＣＯＭ、直径５μｍメッシュ）の上に蒔種して得られた。湿低温処理（４℃、２日）の後、ペトリ皿を４日間培養室に置いた。苗を置いたフィルターは、１日間素寒天培地に移してから、ＲＮＡを抽出した。
【００４２】
全ＲＮＡを、６時間の２回目のＬｉＣｌ沈殿（最終濃度２Ｍ）を追加することによって変更した、ＶＥＲＷＯＥＲＤら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７（６）：２３６２）の高温フェノール技術によって、苗または乾燥種子から抽出した。ポリ（Ａ）+の精製は、磁気ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＤＹＮＡＬ）に固定したオリゴ（ｄＴ）25を用いて、全ＲＮＡから行った。
【００４３】
第一鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡのポリ（Ａ）+の逆転写（ＲＴ）によって合成した。
ＰＣＲ増幅はＲＴ産物１０ｎｇに対して行った。
【００４４】
Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ遺伝子には、（ＰＩＭＴ−１遺伝子に特異的な）下記のプライマー対の一つを使用する。
ＡＭＥＡｓ：
ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＡＱＬＲａ：
ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
または
ＧＴＧＹｓ：
ＧＧＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
およびＡＱＬＲａ。
また伸長因子ＥＦα遺伝子については下記のプライマー対を使用する。
Ｆ１αＡ４−ｌｏｗ：
ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
Ｆ１αＡ４−ｕｐ：
ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）。
【００４５】
増幅が線形でなくなる、すなわち初期量について反復できなくなる時を予測するために、ＰＣＲは１５、１８または２１サイクルで停止する。
【００４６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル（０．８％）上に置き、ついでナイロン膜上のアルカリ溶媒（０．４Ｎ水酸化ナトリウム）に移し、ナイロン膜を、ＰＩＭＴ遺伝子に特異的な放射性マーカーを付けたプローブ（ＩＡＭＴプローブ）またはＥＦ遺伝子に特異的な放射性マーカーを付けたプローブとハイブリダイズする。
【００４７】
ハイブリダイゼーションシグナルの定量化はＭａｃＢａｓ（登録商標）ソフトウェアで実施する。
【００４８】
５日目の苗で得られた結果：
【００４９】
その結果を図１に示した。
図１の凡例：
（Ａ）電気泳動ゲル
（Ｂ）プローブとのハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフィー
（Ｃ）シグナルの定量化
ＷＴ：野生型苗、Ａｔｐｃｍ：ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の苗、
ａ：１５サイクルのＰＣＲ、ｂ：１８サイクルのＰＣＲ、ｃ：２１サイクルのＰＣＲ
【００５０】
これらの結果は、素寒天上における５日目の苗の段階で、突然変異体よりも野生型における方が、遺伝子が１．５倍発現することを示している。
【００５１】
この実験は、培養室で４日間経過後ＲＮＡの抽出の１日前に、アブシジン酸１００μＭを含む素寒天培地上に移した苗でも実施した。
【００５２】
結果を図２に示した。
図２の凡例：
（Ａ）プローブとのハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフィー
（Ｂ）シグナルの定量化
ＷＴ：野生型苗、Ａｔｐｃｍ：ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の苗、
ａ：１５サイクルのＰＣＲ、ｂ：１８サイクルのＰＣＲ、ｃ：２１サイクルのＰＣＲ
【００５３】
これらの結果は、ＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．らが先に実施した観察の通り（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３０：７２３−７３７，前掲）、野生型の苗はＡＢＡが存在するときＩＡＭＴ遺伝子を過剰発現し、ａｔｐｃｍ１．１-の苗よりも３倍多いＩＡＭＴ転写産物を有することを示している。ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の苗は、ＡＢＡが存在するとき、ＩＡＭＴ発現を誘導する能力を明らかに喪失した。このデータにより、突然変異による欠失領域がＡＢＡに対する応答に関与する調節配列（ＡＢＲＥボックス）を確かに含んでいることが確認される。
【００５４】
乾燥種子で得られた結果：
【００５５】
結果を図３に示した。
図３の凡例：
（Ａ）プローブとのハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフィー
（Ｂ）シグナルの定量化
ＷＴ：野生型種子、Ａｔｐｃｍ：ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の種子
ａ：１５サイクルのＰＣＲ、ｂ：１８サイクルのＰＣＲ、ｃ：２１サイクルのＰＣＲ
【００５６】
野生型植物の乾燥種子にはＩＡＭＴ転写産物が一切存在せず、これはＭＵＤＧＥＴＴ  Ｍ．Ｂ．らが先に実施した観察（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３０：７２３−７３７，前掲）に一致している。逆にａｔｐｃｍ１．１-突然変異体は、乾燥種子内に無視できないレベルのＩＡＭＴ転写産物を有する。
【実施例２】
【００５７】
野生型またはＡＴＣＭ１．１-突然変異体のシロイヌナズナの種子の発芽能力に対する加速老化の影響
【００５８】
野生型とａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の間に生育力の差があるかを試験するために、採取したばかりの種子に加速老化試験を実施した。選択した老化条件は、種子の発芽能力にきわめて段階的に影響し、ついで生育力を喪失させるものである。穏やかな条件を選択することで、自然老化の条件を模倣し、老化過程での発芽能力の変化におけるＩＡＭＴの影響を細かく分析することを可能にする。
【００５９】
突然変異体と対照の野生型の種子の生産は、同時に同じ環境で母植物を栽培して行った。加速老化は４０℃（Ｊｏｕａｎ乾燥器）、４８％ＲＨ（飽和Ｍｇ（ＮＯ3）2塩で得られた）で行った（気密広口瓶および無菌濾紙袋内の種子）。温度と湿度はＴｅｓｔｏｓｔｏｒ  １７５（Ｔｅｓｔｏ）で管理した。
【００６０】
サンプルは老化の２、６、９週目に採取し、２００の種子に対して発芽試験を実施した。
【００６１】
発芽は、ＭＥＳ（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）を０．５８ｇ／ｌ添加し、ｐＨ５．９に調整し、寒天（７ｇ／ｌ）で固化した素培地上で、ペトリ皿（直径５５ｍｍ）内で行った。蒔種は、発芽開始をよりよく見出すことができるように、ペトリ皿あたり種子２５粒の割合で、培地上に規則的に配置し、層流フード下で実施した。播種した種子は毎日ルーペで観察した。種子は幼根が出たのがルーペで確認できたときに発芽したと見なされる。
【００６２】
それぞれの試験は種子２５粒で８回反復し、吸水膨潤３日後の発芽した種子の百分率の平均をグラフにした。種子は幼根が確認できたときに発芽したとする。
【００６３】
発芽は、ＭＥＳ（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）を０．５８ｇ／ｌ補充し、ｐＨ５．９に調整した固体素培地（寒天７ｇ／ｌ）上で、ペトリ皿あたり種子２５粒の割合で、ペトリ皿（直径５５ｍｍ）内で行う。
【００６４】
このテストは異なる温度条件で実施した。（１）温度２０〜２５℃の循環：これは発芽最適条件に対応し、種子の生育力の測定を可能にする。（２）温度１５℃：これは発芽にはわずかに不利である。これら条件での発芽能力の低下は種子ロットの発芽能力の低下を反映している。結果は図４に示した。
図４の凡例：貯蔵期間に応じた、２０〜２５℃（Ａ）、および１５℃（Ｂ）での、蒔種後３日の発芽能力。
◆：野生型種子
■：ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の種子
【００６５】
温度２０〜２５℃の循環で実施した発芽速度試験（図４Ａ）は、突然変異体と野生型の種子の発芽能力で有意差を示していない。反対に、発芽能力の差を明らかにすることができる温度である１５℃で種子を吸水膨潤させたとき（図４Ｂ）、突然変異型の種子の発芽能力は、加速老化６週目から、野生型のそれを約３０％上回ることが分かる。この試験は独立した生物サンプルで３回反復し、同じ結果に達した。
【実施例３】
【００６６】
抗ＩＡＭＴ抗体の産生
【００６７】
シロイヌナズナのイソアルパルチルメチルトランスフェラーゼ−１のＣ末端領域の２つのペプチド：ＱＤＬＱＶＶＤＫＮＳＤＧＳＶＳＩＫ（ペプチド１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＲＹＶＰＬＴＳＲＥＡＱＬＲ（ペプチド２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を免疫原として選択した。
【００６８】
抗体は、下記の手順でウサギにおいて調製した。
【００６９】
「免疫前」血清１．５ｍｌを採取した後、選択したペプチドの初回注射（フロイントアジュバント５ｍｌと混合したキャリアータンパク質ＫＬＨを含む溶液５ｍｌにペプチド２００μｇを溶かした溶液４ｍｇ）を実施してウサギの免疫を実施し、つづいて初回注射後１、２、４、８、１５週に、追加抗原注射を行った。免疫血清（５０ｍｌ）は初回注射後２０週に採取した。
【００７０】
抗体は、免疫原として用いたペプチドをＳＥＰＨＡＲＯＳＥゲル１グラムあたり２０ｍｇ固定し、臭化シアンで活性化した、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｆ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）のカラム上で、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００７１】
５ｍｌの１×ＰＢＳ（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２）に予め希釈した血清５ｍｌを、カラムに塗布した。
【００７２】
ゲルは１０ｍｌの１×ＰＢＳで３回洗浄する。溶出は、ｐＨ２の０．２Ｍグリシン／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液１０ｍｌを通して行った。溶出画分はｐＨ８．８の０．１ｍｌのＴｒｉｓ（１．５Ｍ）を含む試験管内に回収した。
【００７３】
抗体を含む画分を集め、（低温１×ＰＢＳ溶液に対して透析し）、ついで０．０２％アジ化ナトリウムを加えた。画分は４℃で保存した。
【００７４】
ＰＩＭＴ−１タンパク質に対する抗体の特異性を検証するために、ＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２遺伝子のｃＤＮＡを、細菌のＴ７プロモーターの制御下で、６×Ｈｉｓタグ（ＴＡＧ）の下流で、発現ベクターｐＤＥＳＴ１７（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）内に別個にクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１内に発現させた。
【００７５】
大腸菌で発現した組換えＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２タンパク質は、ニッケルビーズでアフィニティークロマトグラフィーによって個別に精製し、抗体１でウェスタンブロットによって分析した。
【００７６】
結果は図５に示した。
図５の凡例：
【００７７】
図５Ａは、ｐＤｅｓｔ１７発現ベクター内にＰＩＭＴ−１、ＰＩＭＴ−２のｃＤＮＡを含む、あるいはｃＤＮＡを含まない（Ｔ−）大腸菌のタンパク質抽出物から得られた電気泳動ゲルのクマシーブルーによる染色を示している。矢印はシロイヌナズナのＰＩＭＴタンパク質の存在を示している。
【００７８】
図５Ｂは、図６Ａに示した抽出物から精製したＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２タンパク質について抗体１で行ったウェスタンブロットを表している。
【００７９】
これらの結果は、抗体１がシロイヌナズナのＰＩＭＴ−１タンパク質を特異的に明らかにすることができることを示している。
【実施例４】
【００８０】
シロイヌナズナの乾燥種子内のＩＡＭＴタンパク質含有率、および老化に伴うその推移の、ウェスタンブロットによる確定
【００８１】
上述の実施例３に記載のごとく得られたペプチド１（抗体１）に対する抗ＩＡＭＴ抗体を、収穫したばかりの、あるいは上述の実施例２に記載のごとく２、６および９週間加齢させた、野生型および突然変異型シロイヌナズナの乾燥種子におけるＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼタンパク質の含有率の確定に使用した。
【００８２】
種子のタンパク質の抽出：
【００８３】
種子は微粉が得られるまで液体窒素内で粉砕した。粉末は、予め１００℃に加熱した２×ＬＡＥＭＭＬＩ緩衝液（ＬＡＥＭＭＬＩ  Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７；６８０）を加えた、２ｍｌのエッペンドルフチューブに３分の１まで移した。サンプルは１００℃で５分間インキュベートしてから４℃で遠心分離にかけた（６０００ｇ、５分）。上澄みを回収し、アリコートにし、−２０℃で保存した。使用に先立って、１００μｌの上澄みを等量の２０％トリクロロ酢酸の中に沈殿させた（１３０００ｒｐｍ、５分間）。底部を２００μｌの８０％アセトンで洗浄し、乾燥させて、１ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウムの中に回収した。濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質−試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）複合体の５９５ｎｍでの吸光度を測定して確定した。ウシ血清アルブミンを用いて標準曲線を得た。
【００８４】
ウェスタンブロット：
【００８５】
ＬＡＥＭＭＬＩ（Ｎａｔｕｒｅ、１９７０、２２７；６８０）に従って、ポリアクリルアミドゲル（１２％）上で変性条件（０．１％ＳＤＳ）でタンパク質（１０μｇ）の電気泳動を実施した。５０分間２０Ｖの電流で、ＨＹＢＯＮＤ  Ｃ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）型ナイロン膜上でセミドライブロッティングを行った。膜をつぎにＰＢＳ−Ｔ溶液（１．４ＭのＮａＣｌ、２７ｍＭのＫＣｌ、８１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、０．００１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）内で４０分間インキュベートし、非特異的な部分を飽和させるために粉乳（５％）を添加した。
【００８６】
抗ＩＡＭＴ一次抗体を添加し（５０００分の１に希釈）、攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間３回洗浄した後、攪拌しながら常温で２時間の間、ペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に結合したウサギの抗ＩｇＧ二次抗体を加えたＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）＋乳で膜をインキュベートした。再度膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。製造者（ＣｏｖａｌＡｂ）が推奨する条件で、ＣＯＶＡＬＩＧＨＴキットを用いて、化学発光によって検出を行う。１分後、膜をオートラジオグラフィーフィルム下に移し、３０分間露光する。
【００８７】
結果は図６に図示した。
図６の凡例：野生型シロイヌナズナ種子（ＷＴ）、ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の種子（ＭＴ）、下付の２、６または９：２、６または９週齢の種子
【００８８】
いずれの場合にも、単一のバンドが観察される。認識されたタンパク質は酵素ＰＩＭＴ−１の所期のサイズに対応し、そのことは乾燥種子におけるこの酵素に対する抗体１の特異性を示している。
【００８９】
野生型の種子において、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼタンパク質の量の減少が観察され、それは加速老化の２週目から現れ、実験の終わりまで続いた。逆にａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の種子において、老化の過程で酵素量の増加が観察される。
【００９０】
この所見は、ａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の乾燥種子におけるＰＩＭＴ−１遺伝子の特異的転写産物の存在を示す実施例１で報告した結果を裏付けるものであり、実施例２で報告した、加速老化後にａｔｐｃｍ１．１-突然変異体の発芽能力が向上したことと相関させることができる。
【００９１】
これらのデータは、ＰＩＭＴ−１タンパク質の存在が種子のより長い寿命に関連しているという遺伝学的証拠を提供し、Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼタンパク質が貯蔵中の種子ロットの発芽能力の推移の興味深いマーカーになることを示している。
【実施例５】
【００９２】
トウモロコシ、セイヨウアブラナ、トマトおよびインゲン豆の種の保存適性を確定するための抗ＩＡＭＴ抗体の使用
【００９３】
シロイヌナズナのＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼに対して得られた抗体が他の植物種のオルソログの酵素も認識するか、またＩＡＭＴがこれらの種においても発芽適性のマーカーを構成するかを確認するために、補足実験を実施した。
【００９４】
栽培植物の広い範囲を調査するために、これらの実験のために複数の対象農作物種を選択した。トウモロコシは単子葉植物網を代表し、双子葉植物網においてはインゲン豆がマメ科植物であり、セイヨウアブラナはアブラナ科、トマトはナス科である。
【００９５】
加速老化は、種子を所望の水分含有率に平衡させてから（通常１６から１７％）所与の温度でインキュベートして行った。
【００９６】
種子はまず通風乾燥機内で２０％ＲＨ（〜２８℃）で過乾燥させた。水分含有率を確定するために、１０ｇの種子を粗く粉砕し、秤量してから乾燥加熱した（１３０℃、１時間）。種子の粉末は真空冷却してから再度秤量した（精度は１／１００００グラム）。つぎに、下記の式で過乾燥後の種子の初めの水分含有率を推定することができる。
【００９７】
【数１】
2007512295.tif 000002
Ｍi＝乾燥前の種子質量
Ｍf＝乾燥後の種子質量
ＴＥi＝初めの水分含有率
【００９８】
所望の値で水分含有率を一定にするために既知の種子質量に加える水の質量を確定するために、下記の式を用いる。
【００９９】
【数２】
2007512295.tif 000003
ＴＥi＝初めの水分含有率
ＴＥf＝最終水分含有率
Ｍ1＝種子質量
Ｍ2＝最終水分質量
【０１００】
種子は、計算された量の水を入れた密閉容器内に置く。吸水膨潤は撹拌しながら３日間行う。
【０１０１】
インゲン豆における老化：
【０１０２】
２つのロット（収穫２０００年＝ロット１７８、２００１年＝ロット１９７）のインゲン豆種子を水分含有率１６％で平衡させ、４０℃で気密広口瓶内に置いた。老化の３、７、１１および１４日目にサンプルを採取し、５０粒の種子について発芽テストを実施する。
【０１０３】
結果は図７Ａに図示した。
図７Ａの凡例：発芽能力を、制御劣化の時間に応じて、１００粒の種子について示した。
◇：ロット１９７
■：ロット１７８
これらの結果は、２つのロットが類似した劣化条件において同じ挙動ではないことを示しており、ロット１７８（２０００年の収穫）は老化３日目に４５％の発芽に達するのに対して、ロット１９７（２００１年の収穫）については９日間でこの発芽率に達している。
【０１０４】
２０００年および２００１年の収穫に由来するインゲン豆の乾燥種子ならびにこれら２つの収穫物を人工的に老化させた種子から得たタンパク質も、抗体１を用いてウェスタンブロットで解析した。
【０１０５】
結果は図７Ｂに図示した。
図７Ｂの凡例：１７８（２０００年の収穫）、１９７（２００１年の収穫）、
（Ｔ３）、（Ｔ７）、（Ｔ１１）日：老化３、７、１１日
【０１０６】
抗体１は大きさが約４６ｋＤａの２つまたは３つのタンパク質を明らかにする。ロット１７８よりも加速老化における保存適性が優れているロット１９７は、抗体１によって認識されるタンパク質をより多量に含んでいることが分かる。加速老化において、ロット１９７（２００１年の収穫）は、生育力を喪失する前の老化時間に対して、これらタンパク質すべての濃度の低下を示す。ロット１７８（２０００年の収穫）は、老化３日目から発芽能力が低下するが、抗体１によって認識されるタンパク質量の有意の減少を示さない。
【０１０７】
セイヨウアブラナにおける老化：
【０１０８】
種子ロット（セイヨウアブラナ オンタリオ、２００２年収穫）を、インゲン豆について先に記載した条件で加速老化処理した。サンプルは同じ老化時期に同様にして採取し、各サンプルの発芽能力（ＦＧ）を図８Ａに図示した。
図８Ａの凡例：
発芽能力（ＦＧ）は、老化時間に応じて、１００粒の種子について示した。２００２年収穫の乾燥成熟種子の発芽能力は２００３年に９２％であり、これらの種子の発芽能力は、老化処理時間Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の間にそれぞれ９１％、７４％、３％、０％に低下した。
【０１０９】
２００２年収穫に由来するセイヨウアブラナの乾燥種子ならびに人工老化種子から得たタンパク質も、抗体１を用いてウェスタンブロットで解析した。
【０１１０】
結果は図８Ｂに図示した。
図８Ｂの凡例：
抗体１は大きさが約３２ｋＤａの１つのタンパク質を明らかにする。発芽能力が上回る、老化処理を受けていない種子ロットは、抗体１によって認識されるタンパク質をより多量に含んでいることが分かる。このロットは、加速老化時間Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３において、図８Ａに示した発芽能力の低下に比例してタンパク質濃度の低下を示す。
【０１１１】
トマトにおける老化。
【０１１２】
収穫年の異なる（１９９４年と２０００年）トマト（ＰｉｃＮｉｃ種）の二つの種子ロットを、その発芽能力について２００３年に分析した（図９Ａに示した）。つまり、これら２つの種子ロットを、種子業者が従来用いているような至適保存条件で、それぞれ９年と３年の老化にかけた。
図９Ａの凡例：
収穫年（１９９４年と２０００年）に応じて１００粒の種子について示した、２００３年の発芽能力（ＦＧ）。１９９４年と２０００年に収穫した種子ロットの発芽能力はそれぞれ８９％と９６％である。
【０１１３】
２００２年収穫の、これら２年に由来する、トマトの乾燥種子から得たタンパク質も、抗体１を用いてウェスタンブロットで２００３年に解析した。
【０１１４】
結果は図９Ｂに図示した。
図９Ｂの凡例：
抗体１は大きさが約２４ｋＤａ、４０ｋＤａおよび５２ｋＤａの３つまたは４つのタンパク質を明らかにする。ＦＧが優れている、２０００年収穫のロットは、抗体１によって認識されるタンパク質をより多量に含んでいることが分かる。
【０１１５】
トウモロコシにおける老化：
【０１１６】
様々な収穫年（１９９６年、１９９９年、２０００年、２００１年）の種子ロットの発芽能力を２００２年に分析した。
【０１１７】
この分析結果は図１０Ａに示した。
図１０Ａの凡例：
収穫年（１９９６年、１９９９年、２０００年、２００１年）に応じて１００粒の種子について示した、２００２年の発芽能力（ＦＧ）。従来の保存条件において、２００１年と２０００年に収穫したトウモロコシ種子ロットは１００％の発芽を、１９９９年収穫の種子ロットは９６％、１９９６年収穫の種子ロットは７５％の発芽を示す。
【０１１８】
トウモロコシの制御劣化を実現するために、種子の含水率を１７％で一定にする。老化は４５℃で行う。老化１、３、５日目にサンプルを採取し、２００粒の種子について発芽テストを実施する。
【０１１９】
これら条件において、図１０Ｂに示したごとく、５日間で完全に発芽不能になる。
図１０Ｂの凡例：制御劣化の時間に応じた発芽率
【０１２０】
１９９６年、１９９９年、２０００年および２００１年収穫の乾燥種子のタンパク質、ならびに２００１年に収穫し人工的に老化させた種子のタンパク質を、２００３年に抽出し、抗体１と上記実施例４に記載のごとくペプチド２に対する抗体（抗体２）を用いてウェスタンブロット分析した。結果は図１０Ｃ（抗体１）と図１０Ｄ（抗体２）に示した。
図１０Ｃと図１０Ｄの凡例：９６、９９、００、０１は収穫年、（Ｔ１）、（Ｔ３）、（Ｔ５）は老化１日、３日、５日。
【０１２１】
図１０Ｃにおいて、対照として用いたインゲン豆のタンパク質抽出物に対して得られたシグナルと比較して、トウモロコシのタンパク質抽出物に対しては、抗体１ではシグナルは全く検出されない。この結果は、抗体１はトウモロコシにおいてＰＩＭＴタンパク質の検出を可能にするものではないことを示している。同様の結果（図示されていない）が、小麦やタマネギなどの他の単子葉植物においても得られた。抗体１は双子葉植物に対する特異性を示す。
【０１２２】
他方で、抗体２を使用すると（図１０Ｄ）、トウモロコシにおいて分子量が４０ｋＤａと５５ｋＤａの２つのタンパク質を検出できる。これらのタンパク質は、平行して測定した発芽率が７５％である、１９９６年に収穫の種子では検出されない。２００１年収穫に由来する種子で４０ｋＤａのタンパク質の含有率が最大であり、ついで収穫年と共に低下する。１９９９年の種子においてはほとんど検出できないが、これらの種子の発芽率はなお９６％である。５５ｋＤａのタンパク質の含有率は、逆に１９９９年と２００１年の収穫の間で比較的安定している。
【０１２３】
加速老化において、５５ｋＤａのタンパク質の量は加速老化の初日の間安定しており、そして検出できなくなる。４０ｋＤａのタンパク質は加速老化の初日から検出されなくなる。小麦やタマネギでも同じ所見が得られた（結果は図示されていない）。
【０１２４】
したがって、抗ＩＡＭＴ抗体によって認識される４０ｋＤａと５５ｋＤａのタンパク質が消失した後に、発芽能力が低下することが分かる。これらのタンパク質、とくに４０ｋＤａのタンパク質は、種子老化予測マーカーとして使用できる。この分析はまた、抗体２が単子葉植物においてもこのタンパク質の推移の追跡を可能にするが、一方抗体１は双子葉植物により特異的であることを示している。
【０１２５】
これらの結果は、本発明による抗ＩＡＭＴ抗体が、種子業者が用いるような自然な保存条件においても、制御劣化の状況においても、種子ロット間の保存適性の差を明らかにすることを可能にすることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】５日目の苗における、突然変異体と野生型の発現を示した図。
【図２】アブシジン酸を含む素寒天培地上に移した苗における、突然変異体と野生型の発現を示した図。
【図３】乾燥種子における、突然変異体と野生型の発現を示した図。
【図４】貯蔵期間に応じた、２０〜２５℃（Ａ）、および１５℃（Ｂ）での、蒔種後３日の発芽能力を示したグラフ。
【図５】ＰＩＭＴ−１、ＰＩＭＴ−２のｃＤＮＡを含む、あるいは含まない大腸菌のタンパク質抽出物の電気泳動の結果、ならびにＰＩＭＴ−１およびＰＩＭＴ−２タンパク質について抗体１で行ったウェスタンブロットの結果を示した図。
【図６】突然変異型および野生型の種子の、抗ＩＡＭＴ抗体でのウェスタンブロッティングの結果を示した図。
【図７】制御劣化の時間に応じた発芽能力を示したグラフ、および抗体１でのウェスタンブロッティングの結果を示した図。
【図８】老化時間に応じた発芽能力を示したグラフ、および抗体１でのウェスタンブロッティングの結果を示した図。
【図９】収穫年に応じた発芽能力を示したグラフ、および抗体１でのウェスタンブロッティングの結果を示した図。
【図１０】収穫年に応じた発芽能力を示したグラフ、および制御劣化の時間に応じた発芽率を示したグラフ。
【図６】
2007512295.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007512295.tif 000012
【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
2007512295.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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