(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病患者の特定の脳領域における細胞質スルホトランスフェラーゼの発現の差を開示する。この知見に基づき、本発明は被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断または予測診断するための、または被験者がそのような疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法を提供する。さらに、本発明は、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子を用いた、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患を治療または予防するための治療的および予防的方法を提供する。神経変性疾患の調節物質についてのスクリーニング方法および組み換え動物モデルもまた開示される。
2007508810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体、
のレベルおよび／または活性を測定し、および前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１が細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１スプライス変異体１および／または細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１スプライス変異体２である、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
下記の段階（ｉ）および（ｉｉ）によって、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断または予測診断する、または被験者のそのような疾患を発症する傾向または素因を判定するためのキットであって、
（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出、および（ｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の前記レベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値とおよび／または既知の疾患状態を表す参照値と比較し、および前記転写産物および／または前記翻訳産物の前記レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、既知の健康状態を表す参照値と比較して変化し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と同様または等しい、
ａ）（ｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬および（ｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも一つの試薬
を含む前記キット。
【請求項５】
（ｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
の活性および／またはレベルに直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質を被験者へ投与することを含む、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療または予防する方法。
【請求項６】
細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする非天然遺伝子配列を含む、遺伝子操作非ヒト動物。
【請求項７】
非ヒト動物が、哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウス、ラットまたはモルモット、または非脊椎動物、好ましくは昆虫、より好ましくはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）といったハエである、請求項６に記載の遺伝子操作非ヒト動物。
【請求項８】
前記遺伝子操作の発現が、神経変性疾患に類似した神経病理の症状、特にＡＤに類似した症状を発症する素因を示すおよび／または症状を示す前記非ヒト動物を結果として生じる、請求項６および７に記載の遺伝子操作非ヒト動物。
【請求項９】
前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた作用のために、前記遺伝子操作の発現が、神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤ症状の低減を示すおよび／またはＡＤの症状を有しない前記非ヒト動物を結果として生じる、請求項６および７に記載の遺伝子操作非ヒト動物。
【請求項１０】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物、物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するための、請求項７から９に記載の遺伝子操作非ヒト動物の使用。
【請求項１１】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）細胞を被験化合物と接触させること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；および
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞中の物質のレベルおよび／または活性を比較すること（但し、接触させた細胞中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示す）
を含む前記方法。
【請求項１２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質に関して、神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している被験動物に、被験化合物を投与すること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質に関して、およびそのような被験化合物が投与されていない、神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している対応する対照動物において、（ｉ）または（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物における物質の活性および／またはレベルを比較すること（但し、被験動物における物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示す）
を含む前記方法。
【請求項１３】
前記被験動物および／または前記対照動物が、天然の細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１遺伝子転写調節配列ではない転写調節配列の調節下にある、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体を発現する遺伝子操作非ヒト動物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リガンドと、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法であって、
（ｉ）前記細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える；
（ｉｉ）結合の前記阻害についてスクリーニングする一または複数の化合物を前記複数の容器に加える；
（ｉｉｉ）検出可能なリガンド、特に蛍光検出可能なリガンドを前記容器に加える；
（ｉｖ）前記細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記リガンドの懸濁液をインキュベートする；
（ｖ）前記細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１タンパク質に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に結合した、検出可能なリガンド、好ましくは蛍光の量を測定する；および
（ｖｉ）前記リガンドの、前記細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する
段階を含む前記測定法。
【請求項１５】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的としての、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体である、配列番号１および／または配列番号２のタンパク質分子の使用。
【請求項１６】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防する、または治療する、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての使用のための、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体である、配列番号１および／または配列番号２のタンパク質分子の使用。
【請求項１７】
被験者由来の試料中の細胞の病理状態を検出するための、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体の使用であって、前記免疫原が、配列番号１および／または配列番号２の、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体であり、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化が、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病と関係する前記細胞の病理状態を示すものである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における神経変性疾患の進行を診断、予測、および監視する方法に関する。さらに、神経変性疾患の調節物質の治療コントロールおよびスクリーニングの方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物、キット、および組み換え動物モデルも開示する。
【０００２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の生活を強く衰弱させる影響を与える。さらに、これらの疾患は、甚大な健康上の、社会的な、および経済的な負担を構成する。ＡＤは最も一般的な神経変性疾患であり、痴呆の症例全体の約７０％を占め、６５歳超の人口の約１０％および８５歳超の最大４５％が罹患する、おそらく最も破壊的な加齢関連神経変性症状である（最近の総説はヴィッカーズ（Ｖｉｃｋｅｒｓ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００，６０；１３９−１６５を参照）。現在、これは米国、欧州、および日本において推定約１２００万例に達する。この状況は、発展途上国における高齢者数の人口統計上の増加（「ベビーブーマーの高齢化」）に伴い不可避的に悪化する。ＡＤを有する人の脳に生じる神経病理学的な顕著な特徴は、アミロイド−βタンパク質で構成される老人斑、および異常な線維状構造の出現および神経原線維変化の形成と一致して現れる著しい細胞骨格変化である。
【０００３】
アミロイド−β（Ａβ）タンパク質は、さまざまな種類のプロテアーゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の開裂から生じる。β／γ−セクレターゼによる開裂はさまざまな長さのＡβペプチドの形成に繋がり、典型的には、４０アミノ酸から構成される短くより可溶性が高く凝集が遅いペプチド、および細胞外で迅速に凝集し特徴的なアミロイド斑を形成する、より長い４２アミノ酸ペプチドである（セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ），Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ２００１，８１；７４１−６６；グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，５；Ｄ７２−８３）。それらは主に大脳皮質および海馬に見出される。脳における毒性のＡβ沈着物の生成は、ＡＤの経過のごく早期に開始し、およびＡＤの病理に繋がるその後の破壊過程の中心的存在であると論じられている。ＡＤの他の病理学的な顕著な特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴ）および、ニューロピル・スレッドと表現される異常な神経突起である（ブラーク（Ｂｒａａｋ）およびブラーク（Ｂｒａａｋ），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １９９１，８２；２３９−２５９）。ＮＦＴは神経細胞の内部に出現し、および互いに絡まり合う対のらせん状線維を形成する、化学的に変化したタウタンパク質から成る。神経原線維変化の出現およびその数の増加は、ＡＤの臨床的重症度とよく相関する（シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００，５５；３７０−３７６）。
【０００４】
ＡＤは進行性疾患であり、初期の記憶形成の障害を伴い、および最終的にはより高次の認知機能の完全な衰退に繋がる。認知障害には、とりわけ、記憶障害、失語症、失認症、および実行機能の喪失がある。ＡＤの病因の特徴的性質は、脳の特定の領域および神経細胞の部分集団の、変性過程に対する選択的な不安定性である。具体的には、側頭葉領域および海馬は、疾患の経過中に早期におよびより重度に冒される。一方、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は大体は損なわれないままであり、神経変性から守られている（テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１，１０；１８４−９２）。ＡＤの発症年齢は５０年の範囲内でさまざまであり、６５歳未満の人で起こる早発型ＡＤ、６５歳超の人で起こる遅発型ＡＤがある。ＡＤの全症例のうち約１０％が早発型ＡＤに罹患し、１〜２％だけが家族性の遺伝例である。
【０００５】
現在、ＡＤに治療法は無く、ＡＤの進行を止めるか、または高確率で死亡前にＡＤを診断するためさえ、有効な方法は無い。個人がＡＤを発症する素因となるいくつかのリスク因子が特定されており、中でも非常に重要なのは、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の既存の３つの異なる対立遺伝子（イプシロン２、３、および４）のイプシロン４対立遺伝子である（シュトリトマター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３， ９０； １９７７−８１；ローゼス（Ｒｏｓｅｓ），Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９８， ８５５； ７３８−４３）。
【０００６】
第２１染色体上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、第１４染色体上のプレセニリン−１、および第１染色体上のプレセニリン−２の遺伝子の遺伝的欠陥によるとされる早発型ＡＤの稀な例が存在するが、遅発型散発性ＡＤの一般的な型は、これまでのところ病因的起源は不明である。神経変性疾患の遅い発症および複雑な病因は、治療用および診断用薬の開発に困難な問題をもたらす。医薬標的および診断マーカーの候補のプールを拡大することが極めて重大である。したがって、神経疾患の病因に関する洞察を与えること、およびこれらの疾患の治療の診断および開発に特に適した方法、材料、物質、組成物、および動物モデルを提供することは、本発明の目的である。この目的は、独立請求項の条項によって解決される。下位請求項は、本発明の好ましい実施形態を定義する。
【０００７】
本発明は、ヒトアルツハイマー病脳試料中の、細胞質スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現の差およびそのタンパク質産物を基礎とする。スルホトランスフェラーゼはさまざまな医薬、生体異物および内因性分子の代謝において重要な役割を果たす（ファラニー（Ｆａｌａｎｙ），ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９７，１１：２０６−２１６）。それらは前記分子と、負に荷電したスルホン酸部分で結合することができ、それによって化合物の可溶性をより高める。このことは、修飾された物質の排泄の促進による解毒の改善に繋がる。加えて、硫酸化はその化合物の生物活性に影響しうる。三酸化硫黄スルホン酸をドナー３'−ホスホアデノシン５'−ホスホ硫酸から転移することによって酵素的に結合したそれらの化合物には、たとえば甲状腺ホルモン、ドーパミン、ステロイドおよび神経伝達物質がある。
【０００８】
スルホトランスフェラーゼのファミリーは二つの分類に再分割することができる。一方のファミリーは、主にゴルジに存在し、および、グリコサミノグリカン、糖タンパク質およびチロシン残基の硫酸化に関与することが記載されている膜結合酵素を含む。他方のファミリーは、ステロイド、モノアミン神経伝達物質、生体異物および医薬の修飾を担う細胞質酵素から成る。
【０００９】
ＳＵＬＴ４Ａ１（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）細胞質スルホトランスフェラーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２５１２６３；別名ＢＲ−ＳＴＬ−１、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８８６９８；ＳＵＬＴＸ３、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１１５３１１、および神経系細胞質スルホトランスフェラーゼ、ＮＳＴまたはＳＵＬＴｎ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２）は、ヒト、マウス、およびラット脳ライブラリからクローニングされた（ファラニー（Ｆａｌａｎｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００，３４６：８５７−８６４；サカキバラ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ）らＧｅｎｅ ２００２，２８５：３９−４７；特許出願国際公開第０２／１８５４１号パンフレット）。ヒトの長さ８５５ｂｐのオープン・リーディング・フレームは、計算分子量約３３ｋＤａを有する２８４アミノ酸をコードし、および、マウス（マウスＳｕｌｔ４Ａ１、遺伝子ＩＤ：２９８５９、遺伝子座ＮＴ＿０３９６２１）およびラットホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｏ４３７２８；ファラニー（Ｆａｌａｎｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００，３４６：８５７−８６４；サカキバラ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ）らＧｅｎｅ ２００２，２８５：３９−４７）と９８％配列同一性を共有する。ＳＵＬＴ４Ａ１は染色体２２ｑ１３にマッピングされ、７個のエクソンから成り、およびゲノムＤＮＡの計４７ｋｂｐの範囲にわたる（国際公開第０２／１８５４１号パンフレット）。バイオインフォマティクス分析は、少なくとも三種類のスプライス変異体が存在することを明らかにした。第一の スプライス変異体は、以後ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１とも呼ぶが、ＳＵＬＴ４Ａ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２）の上記の配列と同一である。第二のスプライス変異体は、以後ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２と称するが、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１）のヌクレオチド１９０〜５２８にわたる二個のエクソンを欠き、結果として１７１アミノ酸をコードする５１６ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレームを生じる。第三のスプライス変異体は、ヌクレオチド１９０〜３２０に位置する一個のエクソンの欠損によって異なり、これはＣ末端で変化したオープン・リーディング・フレームを結果として生じうると考えられる。
【００１０】
多数の一塩基多型がＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の領域にマッピングされている（イイダ（Ｉｉｄａ）ら、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１，４６：２２５−２４０）。ＳＵＬＴ４Ａ１は、スルホトランスフェラーゼファミリーの硫酸−ドナー基質の結合に関与することが示されている領域および触媒活性部位において３０％を超える配列同一性を共有しており、他のヒトスルホトランスフェラーゼとの配列類似性のため、スルホトランスフェラーゼが割り当てられている（ファラニー（Ｆａｌａｎｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００，３４６：８５７−８６４）。
【００１１】
ノーザンブロット分析は、本タンパク質が主に脳組織で発現されており、最も高い発現レベルは皮質領域に見出されることを明らかにした（ファラニー（Ｆａｌａｎｙ）ら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００，３４６：８５７−８６４；サカキバラ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ）ら、Ｇｅｎｅ ２００２，２８５：３９−４７）。二つの研究グループは、さまざまなよく知られたスルホトランスフェラーゼ基質に対する酵素活性を実証することができず、したがってＳＵＬＴ４Ａ１は非常に選択性の高い基質を有しうるかまたは多酵素複合体中で活性でありうることを示唆した（ファラニー（Ｆａｌａｎｙ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００，３４６：８５７−８６４；アドジェイ（Ａｄｊｅｉ）およびワインシルボウム（Ｗｅｉｎｓｈｉｌｂｏｕｍ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００２，２９２：４０２−４０８）。しかし、サカキバラらは、ヒトおよびマウスＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質は共にＬ−トリヨードチロニン、チロキシン、エストロン、ｐ−ニトロフェノール２−ナフチルアミン、および２−ナフトールのような内因性および生体異物化合物に対して活性であることを実証した（サカキバラ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ）ら，Ｇｅｎｅ ２００２，２８５：３９−４７）。
【００１２】
本発明では、偏りがなくおよび感受性の高いディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて、ＳＵＬＴ４Ａ１のスプライス変異体（アイソフォーム）をコードする遺伝子の転写産物がヒト脳試料中に検出される。下側頭葉、内側嗅皮質、海馬、および小脳扁桃内の神経細胞がＡＤにおける変性過程を受ける（テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１，１０：１８４−１９２）。これらの脳領域は、主に学習および記憶機能の処理に関与し、およびＡＤにおける神経損失および変性に対して選択的な静寂性を示す。対照的に、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は概ね損なわれず、および神経変性過程から守られたままである。ＡＤ患者および年齢の対応する対照健常者の前頭皮質（Ｆ）、側頭皮質（Ｔ）、および海馬（Ｈ）に由来する脳組織を、本明細書で開示する実施例に用いた。重要なことに、本発明はＡＤ患者から採取された脳試料の下側頭葉で、または海馬で、前頭皮質試料と相対的なＳＵＬＴ４Ａ１転写産物の検出、および調節の差、調節障害を開示する。そのような調節障害は、年齢の対応する対照健常者から得られた試料では観察されない。現在まで、ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子発現の調節障害と、神経変性疾患、特にＡＤの病院との間の関係を実証した実験は記載されていない。ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子およびコードされたＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質の、そのような疾患との関連は、本発明で開示される通り、前記疾患、特にＡＤの、特に診断および治療のための新しい方法を提供する。
【００１３】
ここでおよび請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈でそうでないと示されない限り、複数への言及を含む。たとえば、「ａ細胞（一つの細胞）」は複数の細胞をも意味する、など。本明細書および請求項で用いられる「および／または」の語句は、この語句の前および後の語句が選択肢としてまたは組み合わせて考えられるべきであることを示す。たとえば、「レベルおよび／または活性の測定」という言い回しは、レベルだけ、または活性だけ、またはレベルおよび活性の両方が測定されることを意味する。ここで用いられる「レベル」の語は、転写産物、たとえばｍＲＮＡ、または翻訳産物、たとえばタンパク質またはポリペプチドの、量または濃度の尺度または指標を含むことを意図する。ここで用いられる「活性」の語は、転写産物または翻訳産物が生物学的効果を生じる能力についての指標、または、生物学的に活性な分子のレベルの指標と理解すべきである。「活性」の語はまた、酵素活性を、または、結合、拮抗、抑制、阻害または中和をいう生物活性および／または薬理活性をいう。ここで用いられる「レベル」および／または「活性」の語はさらに、遺伝子発現レベルまたは遺伝子活性をいう。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生に繋がる、転写および翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用と定義される。「調節障害」は遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味することとする。遺伝子産物はＲＮＡまたはタンパク質のどちらかを含み、および遺伝子の発現の結果である。遺伝子産物の量は、遺伝子がどの程度活性であるかを測定するのに用いることができる。本明細書および請求項で用いられる「遺伝子」の語は、コード領域（エクソン）および非コード領域（たとえばプロモーターまたはエンハンサー、イントロン、リーダーおよびトレーラー配列といった非コード調節配列）の両方を含む。「ＯＲＦ」の語は「オープン・リーディング・フレーム」の頭文字であり、および、少なくとも１つの読み枠に終止コドンを持たずおよびしたがって潜在的にアミノ酸の配列に翻訳されうる核酸配列をいう。「調節配列」は、遺伝子発現を推進し調節する、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびその他の配列を含む。ここで用いられる「断片」の語は、たとえば択一的にスプライシングされ、または短縮され、またはさもなければ切断された転写産物または翻訳産物を含むことを意図する。ここで用いられる「誘導体」の語は、突然変異の、またはＲＮＡ改変された、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた転写産物、または、突然変異の、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた翻訳産物をいう。明確には、誘導体転写産物は、たとえば、一塩基または複数塩基の欠失、挿入、または交換といった変化を核酸配列に有する転写産物をいう。「誘導体」は、変化したリン酸化、またはグリコシル化、またはアセチル化、または脂質化といった過程によって、または変化したシグナルペプチド開裂またはその他の型の成熟開裂によって生じうる。これらの過程は翻訳後に起こりうる。本発明および請求項で用いられる「調節因子」の語は、遺伝子、または遺伝子の転写産物、または遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性を変化または改変することができる分子をいう。好ましくは、「調節因子」は、遺伝子の転写産物または翻訳産物の生物学的活性を変化または改変することができる。前記の調節は、たとえば、生物活性および／または薬理活性、酵素活性の上昇または低下、結合特性の変化、または遺伝子の前記翻訳産物の生物学的、機能的、または免疫学的性質の何らかのその他の変化または改変でありうる。「調節因子」は、イオンチャンネルサブユニットまたはイオンチャンネルの機能的性質を促進または阻害、したがって「調節する」、イオンチャンネルまたはイオンチャンネルサブユニットの結合、拮抗、抑制、阻害、中和または封鎖を「調節する」、および活性化、作用、アップレギュレーションを「調節する」ことができる能力を有する分子をいう。「調節」はまた、細胞の生物活性に影響を与える能力をいうのにも用いられる。「調節因子」、「物質」、「試薬」、または「化合物」の語は、細胞、組織、体液に対して、または任意の生物学的系または被験分析系の背景内で、正または負の生物学的効果を有する任意の物質、化学物質、組成物または抽出物をいう。それらは標的の作用因子、拮抗因子、部分的作用因子または逆作用因子でありうる。それらは、核酸、天然または合成ペプチドまたはタンパク質複合体、または融合タンパク質でありうる。それらはまた、抗体、有機または無機分子または組成物、低分子、薬物、および上の前記物質のうち任意のものの任意の組み合わせでありうる。それらは診断のまたは治療の目的のための試験に用いることができる。そのような調節因子、物質、試薬または化合物は、細胞培地、または細胞培養に用いられる血清中に存在する因子、栄養因子といった因子でありうる。本発明で用いられる「栄養因子」は、神経栄養因子を、サイトカインを、ニューロカインを、神経免疫因子を、脳由来因子（ＢＤＮＦ）を、およびＴＧＦベータファミリーの因子を含むがそれらに限定されない。そのような栄養因子の例は、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−ベータ、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である。「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」の語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって、与えられた標的ポリヌクレオチドとアニーリングすることができ、およびポリメラーゼによって伸長することができる、短い核酸配列をいう。それらは特定の配列に対して特異的であるように選択することができ、または任意に選択することができ、たとえばそれらはある混合物中のすべての可能な配列のプライマーとなることができる。ここで用いられるプライマーの長さは１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変動しうる。「プローブ」はここで記載および開示される核酸配列の短い核酸配列またはそれと相補的である配列である。それらは完全長配列、または任意の配列の断片、誘導体、アイソフォーム、または変異体を含むことができる。「プローブ」と分析試料との間のハイブリダイゼーション複合体の同定は、その試料内の他の類似配列の存在の検出を可能にする。ここで用いられる「ホモログまたはホモロジー」は、ヌクレオチドまたはペプチド配列の、別のもう一つのヌクレオチドまたはペプチド配列との関連性を表す本分野の語であり、比較される前記配列間の同一性および／または類似性の程度によって測定される。本分野では、「同一性」および「類似性」の語は、問い合わせ配列と、好ましくは同一の種類の別の配列（核酸またはタンパク質配列）とを、互いにマッチングさせることによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」を計算および決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧ ＢＬＡＳＴ（基礎局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５：４０３−４１０；アルチュールら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９−３４０２；デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４，１２：３８７）、 ＢＬＡＳＴＮ ２．０（ギッシュ（Ｇｉｓｈ）Ｗ．，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ，１９９６−２００２）、ＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，８５： ２４４４−２４４８）、および最長の重複を有する一対のコンティグを決定および整列するＧＣＧ ＧｅｌＭｅｒｇｅ（ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８４，４４： ５５７−５６７；ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびビュンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８： ４４３−４５３）を含むがそれらに限定されない。ここで用いられる「変異体」の語は、本発明で開示されたポリペプチドおよびタンパク質に関して、本発明の天然のポリペプチドまたはタンパク質の天然のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端におよび／または中に、１個以上のアミノ酸が付加されたおよび／または置換されたおよび／または欠失したおよび／または挿入された、任意のポリペプチドまたはタンパク質をいう。さらに、「変異体」の語は、ポリペプチドまたはタンパク質の任意のより短いかまたはより長い形を含む。「変異体」はまた、配列番号１および配列番号２のＳＵＬＴ４Ａ１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、および非常に好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する配列も含む。タンパク質分子の「変異体」は、たとえば、高度に保存された領域に保存されたアミノ酸置換を有するタンパク質を含む。本発明の「タンパク質およびポリペプチド」は、配列番号１および配列番号２のＳＵＬＴ４Ａ１のアミノ酸配列を含むタンパク質の、変異体、断片、および化学的誘導体を含む。コドンが代替的な塩基配列によって別のコドンに置き換えられ、しか���そのＤＮＡ配列によって翻訳されるアミノ酸配列が変化しないままである配列変異を含めるべきである。この本分野で知られる現象は、特定のアミノ酸を翻訳するコドンの組の冗長性と呼ばれる。アルギニンをリジンに、バリンをロイシンに、アスパラギンをグルタミンにといった、機能性にまったく影響しないアミノ酸の交換もまた含めるべきである。天然から単離することができるかまたは、組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができるタンパク質およびポリペプチドを含めることができる。ネイティブタンパク質またはポリペプチドは、天然に存在する短縮型または分泌型、天然に存在する変異型（たとえばスプライス変異体）および天然に存在する対立遺伝子変異体をいう。ここで用いられる「単離された」の語は、天然の環境から変化および／または取り出された、すなわち通常存在する細胞からまたは生体から単離され、および天然で付随して見出される共存成分から分離されたかまたは本質的に精製された分子または物質をいうと考えられ、またそれらは「非ネイティブ」であるともいう。この概念はさらに、そのような分子をコードする配列を人間の手で、自然状態では結合していないポリヌクレオチドと結合させることができること、およびそのような分子を組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができることを意味する（非ネイティブ）。前記の目的のためにそれらの配列が、当業者に既知である方法によって生体または死んだ生物に導入されても、およびそれらの配列が前記生物中にまだ存在していても、それらはなお単離されており、非ネイティブであると考えられる。本発明では、「リスク」、「感受性」、および「素因」の語は同等であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して用いられる。
【００１４】
「ＡＤ」はアルツハイマー病を意味する。ここで用いられる「ＡＤ型神経病理」は、本発明に記載されている通りの、および最先端の文献から一般に既知である通りの、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的、および臨床的な顕著な特徴をいう（イクバル（Ｉｑｂａｌ），スワーブ（Ｓｗａａｂ），ウィンブラッド（Ｗｉｎｂｌａｄ）およびウィスニュースキ（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ），『アルツハイマー病と関連疾患（疫学、病因論および治療薬）』（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ （Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）），ワイリー・アンド・サンズ社（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ），トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ），１９９９；シント（Ｓｃｉｎｔｏ）およびダフナー（Ｄａｆｆｎｅｒ），『アルツハイマー病の早期診断』（Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），ヒューマナ・プレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ），ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）２０００；マイユ（Ｍａｙｅｕｘ）およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ）『アルツハイマー病の疫学：遺伝子から予防まで』（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ； Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ），シュプリンガー・プレス社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ），ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ），ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９９；ヨーンキン（Ｙｏｕｎｋｉｎ），タンジ（Ｔａｎｚｉ）およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ），『プレセニリンとアルツハイマー病』（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），シュプリンガー・プレス社，ベルリン，ハイデルベルク，ニューヨーク，１９９８を参照）。「ブラーク病期」または「ブラーク病期分類」の語は、ブラークおよびブラークによって提案された判定基準に従った脳の分類をいう（ブラーク（Ｂｒａａｋ）およびブラーク（Ｂｒａａｋ），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１，８２：２３９−２５９）。神経原線維変化およびニューロピル・スレッドの分布に基づいて、ＡＤの神経病理学的進行は６つの病期に分けられる（病期０から６）。本発明では、ブラーク病期０から２は対照健常者（「対照」）を表し、およびブラーク病期４から６はアルツハイマー病の患者（「ＡＤ患者」）を表す。前記「対照」から得られた値が、「既知の健康状態」を表す「参照値」であり、および前記「ＡＤ患者」から得られた値が、「既知の疾患状態」を表す「参照値」である。ブラーク病期３は、対照健常者またはＡＤ患者のどちらかを表しうる。ブラーク病期が高いほど、ＡＤの症状を示す可能性が高い。神経病理学的評価、すなわちＡＤの病理学的変化が痴呆の根本にある原因である確率の推定については、ブラーク（Ｂｒａａｋ）Ｈによる提言が与えられている（ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ）。
【００１５】
本発明に記載の神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭性痴呆症、進行性核麻痺、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆症、多系統変性症、嗜銀性顆粒痴呆症およびその他のタウオパシー、および軽度の認知障害を含む。神経変性過程を含むその他の症状は、たとえば、加齢黄斑変性、ナルコレプシー、運動神経細胞疾患、プリオン病および外傷性神経損傷および修復、および多発性硬化症である。
【００１６】
一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法を扱う。その方法は：前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定すること、および、前記レベル、および／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定することを含む。「被験者において」という言い回しは、被験者が罹患する疾患に結果が関係する限りの、すなわち、前記疾患が被験者「において」存在する、開示された方法の結果をいう。
【００１７】
本発明はまた、本発明に開示される通りの核酸配列、またはその断片、または変異体に独自のプライマーおよびプローブの構築および使用に関する。そのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、蛍光、生物発光、磁性、または放射性物質で特異的に標識することができる。本発明はさらに、適当な組み合わせの前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、前記核酸配列、またはその断片および／または変異体の検出および製造に関する。ＰＣＲ分析は、当業者によく知られた方法であるが、核酸を含む試料から前記遺伝子特異的核酸配列を増幅するために、前記プライマーの組み合わせを用いて実施することができる。そのような試料は、健常者または患者のどちらかから得ることができる。増幅の結果として特定の核酸産物を生じるかどうか、および異なる長さの断片を得ることができるかどうかは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示しうる。このように、本発明は、調べる核酸配列を含む任意の試料中の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連している可能性がある、遺伝子突然変異および一塩基多型の検出に有用な、少なくとも長さ１０塩基、最大でコード配列および遺伝子配列全体の、核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する。この機能は、好ましくはまたキットの形式である、ＤＮＡに基づく迅速診断検査を開発するために有用である。
【００１８】
別の一態様では、本発明は被験者における神経変性疾患の進行を監視する方法を扱う。前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定する。前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較する。それによって前記被験者において前記神経変性疾患の、アルツハイマー病の、進行を監視する。
【００１９】
さらに別の一態様では、本発明は、前記疾患について治療されている被験者由来の試料中の（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定することを含む、神経変性疾患の治療を評価する方法を扱う。前記レベル、または前記活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記神経変性疾患の、アルツハイマー病の、治療を評価する。
【００２０】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および使用の好ましい一実施形態では、ヒトスルホトランスフェラーゼタンパク質をコードする前記遺伝子は、神経系細胞質スルホトランスフェラーゼＮＳＴまたはＳＵＬＴｎともいう細胞質スルホトランスフェラーゼ、細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１タンパク質（ＳＵＬＴ４Ａ１）（ＥＣ２．８．２）をコードする遺伝子であり、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２で表され、またはＢＲ−ＳＴＬ−１ともいいＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８８６９８またはＡＦ２５１２６３で表され、またはＳＵＬＴＸ３ともいいＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１１５３１１で表される。別の好ましい一実施形態では、前記ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子は、ＳＵＬＴ４Ａ１アイソフォーム１、別名スプライス変異体１（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１遺伝子、配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１７６３４２）をコードし、タンパク質ＳＬＪＬＴ４Ａ１スプライス変異体１（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１タンパク質、配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号０４３７２８）をコードする。本発明では、前記ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１タンパク質をコードする遺伝子はまた、一般にＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子または単にＳＵＬＴ４Ａ１という。さらに、ＳＵＬＴ４Ａ１またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１のタンパク質はまた、一般にＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質または単にＳＵＬＴ４Ａ１という。本発明では、前記ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子はＳＵＬＴ４Ａ１アイソフォーム２、別名スプライス変異体２（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２遺伝子、配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１７６３４２、ＥＳＴ  ｂｉ５５０４８３およびｂｍ８０５３５３で表されるヌクレオチド１９０〜５２８を欠く）をコードし、タンパク質ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２タンパク質、配列番号２）をコードする。本発明では、前記ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２タンパク質をコードする遺伝子はまた、一般にＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子、または単にＳＵＬＴ４Ａ１という。さらに、ＳＵＬＴ４Ａ１またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２のタンパク質はまた、一般にＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質または単にＳＵＬＴ４Ａ１という。本発明では、前記配列はここで用語が用いられる通り「単離」されている。
【００２１】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および使用の別の好ましい一実施形態では、前記神経変性疾患または障害はアルツハイマー病であり、および前記被験者または患者はアルツハイマー病患者である。
【００２２】
本発明は、対照者と比較したＡＤ患者の特定の脳領域におけるＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の、検出、および発現の差、および調節障害を開示する。さらに、本発明はＳＵＬＴ４Ａ１の遺伝子発現がＡＤ罹患脳で調節障害されていること、ＡＤ罹患脳でＳＵＬＴ４Ａ１ｍＲＮＡレベルが側頭皮質および／または海馬において前頭皮質と比較してダウンレギュレートされている、または前頭皮質において側頭皮質および／または海馬と比較して上昇していることを開示する。ＳＵＬＴ４Ａ１発現は、年齢対応する対照健常者の前頭皮質および側頭皮質および／または海馬と、ＡＤ患者の前頭皮質および側頭皮質および／または海馬とを比較して異なる。したがって、ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子およびその対応する転写および翻訳産物（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２）は、ＡＤで典型的に観察される局所性選択的神経細胞変性の原因的な役割を有する可能性がある。ＳＵＬＴ４Ａ１は、本発明で開示および説明される通り、残りの生存神経細胞に神経保護機能を与える。これらの開示に基づき、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの、診断評価および予測診断のために、および素因の検出に有用である。さらに、本発明は、そのような疾患のための治療を受けている患者の診断的監視のための方法を提供する。
【００２３】
分析および測定する前記試料は、脳組織，脳細胞または他の組織または他の体細胞から成る群から選択されるのが好ましい。試料はまた、脳脊髄液または、唾液、尿、血液、血清、血漿、または粘液を含むその他の体液を含むことができる。好ましくは、本発明に記載の神経変性疾患の診断、予測診断、進行の監視、または治療の評価の方法は、体外で実施することができ、およびそのような方法は好ましくは、たとえば、被験者または患者または対照健常者から摘出、採取、または単離された体液または細胞といった試料に関する。
【００２４】
さらに好ましい実施形態では、前記参照値は、前記神経変性疾患に罹患していない被験者由来の試料中の（対照健常者、対照試料、対照）、または、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を罹患している被験者由来の試料中の（患者試料、患者）、（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の値である。
【００２５】
好ましい実施形態では、既知の健康状態を表す参照値（対照試料）に対する、被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液中の、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／またはＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、レベルおよび／または活性における変化、変化したレベルおよび／または活性が、神経変性疾患、特にＡＤに罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の既知の疾患状態を表す参照値（ＡＤ患者試料）に対する、被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液中の、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／またはＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、等しいかまたは類似のレベルおよび／または活性は、前記神経変性疾患に罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。好ましい実施形態では、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物のレベルの測定が、被験者から得られた試料において、被験者の試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡに由来する前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせを用いた定量的ＰＣＲ分析を使用して実施される。プライマーの組み合わせは本発明の「実施例」に示されるが、本発明で開示される通りの配列から生成される他のプライマーもまた用いることができる。前記遺伝子に特異的なプローブを用いたノーザンブロットもまた適用することができる。チップを基礎とするマイクロアレイ技術によって転写産物を測定することがさらに好ましい。これらの手法は当業者に公知である（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，２００１；シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）Ｍ．，『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），２０００を参照）。免疫測定法の一例は、特許出願国際公開第０２／１４５４３号パンフレットに開示され記載される通り、酵素活性の検出および測定である。
【００２７】
さらに、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物のおよび／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性、および／または、前記翻訳産物および／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の活性のレベルは、免疫測定法、活性測定法、および／または結合測定法によって検出することができる。これらの測定法は、前記タンパク質分子と抗タンパク質抗体との間の結合の量を、抗タンパク質抗体かまたはその抗タンパク質抗体と結合する二次抗体のどちらかに結合した、酵素、色力学、放射性、磁性、または発光標識を用いることによって測定することができる。加えて、他の高親和性リガンドを用いることができる。使用することができる免疫測定法は、たとえばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および当業者に公知のその他の技術を含む（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体を用いて：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９９およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｒ，『免疫診断：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），英国オックスフォード，１９９９を参照）。これらの検出方法すべてはまた、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップ、またはタンパク質チップを基礎とする技術の形式で使用することができる（シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）Ｍ．，『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），２０００を参照）。
【００２８】
好ましい一実施形態では、前記疾患の進行を監視するため、ある期間にわたって前記被験者から採取された一連の試料中の（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が比較される。さらに好ましい実施形態では、前記被験者は前記試料収集の１回以上の前に治療を受ける。さらに別の好ましい一実施形態では、前記レベルおよび／または活性は、前記被験者の前記治療の前および後に測定される。
【００２９】
別の一態様では、本発明は被験者において神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、または被験者の神経変性疾患、特にＡＤを発症する傾向または素因を判定するためのキットを扱い、前記キットは下記を含む：
（ａ）（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも１つの試薬；および
（ｂ）・前記被験者に由来する試料中の、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出する；および
・神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、および／またはそのような疾患を発症する前記被験者の傾向または素因を判定する
段階を記載することによる、神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する被験者の傾向または素因を判定するための指示
であって、既知の健康状態を表す参照値（対照）と比較した前記転写産物および／または前記翻訳産物の、変化したレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方、および／または、既知の疾患状態、好ましくはＡＤの疾患状態を表す参照値と同様であるかまたは等しい、前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、神経変性疾患、特にＡＤの診断または予測診断、またはそのような疾患を発症する高い傾向または素因を示す。本発明に記載のキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクがある人の特定に特に有用である可能性がある。
【００３０】
したがって、別の一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断または予測診断する方法における、およびそのような疾患を発症する被験者の高い傾向または素因を判定する方法における、（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出、および（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、前記レベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値および／または既知の疾患状態を表す参照値と比較し、および前記転写産物および／または前記翻訳産物の前記レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、既知の健康状態を表す参照値と比較して変動し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と類似または等しい段階を含むキットの使用を扱う。
【００３１】
したがって、本発明の記載のキットは、疾患経過において不可逆的損傷が与えられる前に、特定された人を疾患の発症前の早期予防処置または治療的介入の対象とする方法となりうる。さらに、好ましい実施形態では、本発明で扱うキットは、被験者において神経変性疾患、特にＡＤの進行を監視、および前記被験者のそのような疾患について治療的処置の成功または失敗を監視および評価するのに有用である。
【００３２】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方に直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質の前記被験者への投与を含む、被験者において神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防する方法を扱う。前記物質は低分子を含むことができ、またはペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドを含むこともできる。前記ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドは、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列、またはその断片、または誘導体、または変異体を含むことができる。本発明に記載の、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための物質はまた、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから成ることができる。前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、センス方向かまたはアンチセンス方向のどちらかで含むことができる。
【００３３】
好ましい実施形態では、本方法は前記の一または複数の物質を投与するための遺伝子治療および／またはアンチセンス核酸技術の本質的に既知である方法の応用を含む。一般的に、遺伝子治療はいくつかの手法を含む：変異遺伝子の分子的置換、治療用タンパク質の合成を結果として生じる新しい遺伝子の付加、および組み換え発現方法によるかまたは薬剤による内因性細胞遺伝子発現の調節。遺伝子導入法は詳細に記載されており（たとえばベール（Ｂｅｈｒ），Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９３，２６：２７４−２７８ およびムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：９２６−９３１を参照）、および細胞へのＤＮＡの機械的マイクロインジェクションといった直接的遺伝子導入法、および生物ベクター（組み換えウイルス、特にレトロウイルスのような）またはモデルリポソームを用いる間接的方法、またはＤＮＡのポリカチオンとの共沈を用いた遺伝子導入に基づく方法、化学的（溶媒、界面活性剤、ポリマー、酵素）または物理的手段（機械的、浸透圧、熱、電気ショック）による細胞膜の不安定化を含む。出生後の中枢神経系への遺伝子導入は詳細に記載されている（たとえばウォルフ（Ｗｏｌｆｆ），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９３，３：７４３−７４８を参照）。
【００３４】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療、すなわちある種の重要な細胞へのアンチセンス核酸またはその誘導体の導入による、不適切に発現されたかまたは欠陥のある遺伝子のダウンレギュレーションを用いた、神経変性疾患を治療するかまたは予防する方法を扱う（たとえばギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ），ＤＮ＆Ｐ １９９２，５：３８９−３９５；アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）およびアクター（Ａｋｈｔａｒ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５，１３：１９７−１９９；クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０：８８２−６を参照）。ハイブリダイゼーション戦略以外に、リボザイム、すなわち酵素として作用するＲＮＡ分子の、疾患のメッセージを運ぶＲＮＡを破壊する適用もまた記載されている（たとえばバリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６２：１５１２−１５１４を参照）。好ましい実施形態では、治療される被験者はヒトであり、および治療的アンチセンス核酸またはその誘導体はＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物に対して向けられる。被験者の中枢神経系、好ましくは脳の細胞は、そのような方法で治療されるのが好ましい。細胞透過は、アンチセンス核酸およびその誘導体のキャリヤー粒子へのカップリング、または上記の方法といった既知の戦略によって実施することができる。標的化した治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与するための戦略は当業者に公知である（たとえばウィックシュトロム（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９２，１０：２８１−２８７を参照）。一部の場合では、デリバリーは単なる局所投与によって実施することができる。別の手法はアンチセンスＲＮＡの細胞内発現に向けられる。この戦略では、細胞は標的核酸の領域と相補的であるＲＮＡの合成を指示する組み換え遺伝子を用いてｅｘ ｖｉｖｏで形質転換される。細胞内で発現されたアンチセンスＲＮＡの治療的使用は、手続的に遺伝子治療と同様である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としてさまざまに知られる、二本鎖ＲＮＡを用いて遺伝子の細胞内発現を調節する近年開発された方法は、核酸治療のもう一つの有効な手法である可能性がある（ハノン（Ｈａｎｎｏｎ），Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１８：２４４−２５１）。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、本方法は前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳に、ドナー細胞、または好ましくは移植片拒絶を最小化または低減するように処理されたドナー細胞を移植することを含み、前記ドナー細胞は前記一または複数の物質をコードする少なくとも一つの導入遺伝子の挿入によって遺伝子組み換えされている。前記導入遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって運ばれうる。導入遺伝子は、導入遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス物理的遺伝子導入によって、特にマイクロインジェクションによってドナー細胞へ挿入することができる。導入遺伝子の挿入はまた、エレクトロポレーション、化学的媒介遺伝子導入、特にリン酸カルシウム遺伝子導入またはリポソーム媒介遺伝子導入によっても実施することができる（マクセランド（Ｍｃ Ｃｅｌｌａｎｄ）およびパーディー（Ｐａｒｄｅｅ），『発現遺伝学：迅速および高処理量法』（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），１９９９を参照）。
【００３６】
好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にＡＤを治療および予防するための前記物質は、対象細胞を前記被験者に導入し、ここで前記対象細胞は前記治療用タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されており、前記対象細胞がｉｎ ｖｉｖｏで前記被験者において治療的に有効な量の前記治療用タンパク質を発現することを含む過程によって、前記被験者、好ましくはヒトに投与することができる治療用タンパク質である。前記ＤＮＡ断片は、前記細胞へｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって挿入することができる。
【００３７】
本発明に記載の、治療の方法は、前記の細胞治療的および遺伝子治療的方法の任意のものと組み合わせた、治療的クローニング、移植、および胚性幹細胞または胚性生殖細胞および神経細胞性成体幹細胞を用いた幹細胞治療の適用を含む。幹細胞は全能性または多能性でありうる。それらはまた器官特異性でもありうる。罹患および／または損傷した脳細胞または組織を修復する戦略は、（ｉ）ドナー細胞を成体組織から採取することを含む。これらの細胞の核は、遺伝物質が除去されている未受精卵細胞に移植される。胚性幹細胞は、体細胞核移植を受けた細胞の胚盤胞期から単離される。その時、分化因子の使用は、特化した細胞型、好ましくは神経細胞への幹細胞の分化誘導に繋がる（ランザ（Ｌａｎｚａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９，９：９７５−９７７）、または（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大およびその後の移植のために、中枢神経系から、または骨髄（間葉性幹細胞）から単離された成体幹細胞を精製する、または（ｉｉｉ）内因性神経幹細胞を直接、増殖、移動、および機能する神経細胞へ分化するように誘導する（ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ＤＡ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，２：３４−４２）。成体脳の胚中心は神経細胞損傷または機能障害が存在しないため、成体神経幹細胞は、損傷したかまたは罹患した脳組織を修復する大きな可能性がある（コルマン（Ｃｏｌｍａｎ）Ａ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ２００１，７：６６−７１）。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明に記載の治療または予防の被験者は、ヒト、実験動物、たとえばマウスまたはラットまたはハエ、家畜、または非ヒト霊長類であることができる。実験動物は、神経変性疾患の動物モデル、遺伝子改変動物、たとえば、好ましくはＡＤの症状を示しＡＤ型神経病理を示す、遺伝子導入マウスまたはハエおよび／またはノックアウトマウスまたはハエであることができる。
【００３９】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子を扱う。
【００４０】
別の一態様では、本発明は、前記調節因子および好ましくは医薬キャリヤーを含む医薬組成物を扱う。前記キャリヤーは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または調節因子と共に投与する媒体をいう。
【００４１】
別の一態様では、本発明は、医薬組成物における使用のための（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子を扱う。
【００４２】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子の使用を提供する。
【００４３】
一態様では、本発明はまた、治療的にまたは予防的に有効な量の前記医薬組成物を詰めた一個以上の容器を含むキットを提供する。
【００４４】
別の一態様では、本発明はヒトおよび／またはマウスＳＵＬＴ４Ａ１（細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１）をコードする遺伝子の非天然核酸分子のおよび翻訳産物、タンパク質分子の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、配列番号３、配列番号４、配列番号６に示す核酸分子の、および配列番号１、配列番号２に示すタンパク質分子の、遺伝子導入動物および／またはノックアウト動物である組み換え、遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための標的分子としての使用を扱う。前記遺伝子操作非ヒト動物は、哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウスまたはラットまたはモルモットであることが好ましい。前記遺伝子操作非ヒト動物は、非脊椎動物、好ましくは昆虫、より好ましくはショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒといったハエであることがさらに好ましい。さらに、前記遺伝子操作非ヒト動物は、家畜、または非ヒト霊長類でありうる。一実施形態では、前記遺伝子操作の発現は、神経変性疾患に類似した神経病理の症状、特に、とりわけＡＤの組織学的性質およびＡＤに特徴的な行動変化を含む、ＡＤ（ＡＤ型神経病理）に類似した神経病理の症状を発症する素因を示すおよび／または症状を示す非ヒト動物を結果として生じる。別の一実施形態では、前記遺伝子操作の発現は、前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた有益な作用のために、神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤ症状の低減を示すおよび／またはＡＤの症状を有しない非ヒト動物を結果として生じる。
【００４５】
一態様では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号６に示す通りの、および配列番号１および配列番号２に示す通りの、ＳＵＬＴ４Ａ１（細胞質スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１）をコードする非天然遺伝子配列、またはその断片または誘導体、または変異体を含む組み換え、遺伝子操作非ヒト動物を扱う。ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする前記非天然遺伝子配列は、ヒトおよび／またはマウスＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子配列でありうる。前記組み換え、遺伝子操作非ヒト動物の作製は、（ｉ）ヒトおよび／またはマウスＳＵＬＴ４Ａ１の遺伝子配列、または断片、または前記遺伝子配列の変異体、および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構造を提供、および（ｉｉ）前記ターゲッティング構造を非ヒト動物の幹細胞へ、胚性幹（ＥＳ）細胞へ導入、および（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入、および（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植、および（ｖ）前記胚を満期まで発生させること、および（ｖｉ）ゲノムが一方または両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を特定すること、および（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子操作非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を得ることを含む。前記遺伝子操作非ヒト動物は、発現が異所性発現、または低発現、または過剰発現、または非発現である、組み換え、操作された遺伝子を発現することが好ましい。ヒトおよび／またはマウスＳＵＬＴ４Ａ１の遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含むそのようなターゲッティング構造、および、前記組み換え、操作されたＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の非ヒト遺伝子操作動物における発現の例は本発明に開示される（実施例（Ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）および図２０から２５を参照）。
【００４６】
好ましい一実施形態では、前記遺伝子破壊または抑制または活性化または前記遺伝子操作の発現は、神経変性疾患の神経病理に類似した症状、特にＡＤに類似した神経病理（ＡＤ型神経病理）の症状を発症する素因を示すおよび／または症状を示す前記非ヒト動物を結果として生じる。
【００４７】
別の好ましい一実施形態では、前記遺伝子操作の発現は、前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた、有益な作用でありうる作用のために、神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤ症状の低減を示す、および／またはＡＤの症状を有しない非ヒト動物を結果として生じる。
【００４８】
本発明の別の好ましい一実施形態では、前記遺伝子操作非ヒト動物は、哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウスまたはラットまたはモルモットである。前記遺伝子操作非ヒト動物は、非脊椎動物、好ましくは昆虫、より好ましくはショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒといったハエであることがさらに好ましい。さらに、前記遺伝子操作非ヒト動物は、家畜、または非ヒト霊長類でありうる。前記遺伝子操作非ヒトは、遺伝子導入動物および／またはノックアウト動物である。
【００４９】
別の好ましい一実施形態では、前記組み換え、遺伝子操作非ヒト動物は、本分野で一般に知られる通り、アルツハイマー病動物モデルと交雑される。ヒトアルツハイマー前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはＡＰＰの突然変異型、たとえばスウェーデン変異を有するＡＰＰ、および／または文献に記載された通りの既知の変異を有するヒトプレセニリン−１または−２（ジェイナス（Ｊａｎｕｓ）およびウェスタウェイ（Ｗｅｓｔａｗａｙ），Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ２００１，８７３−８８６；リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２３：８９８９−９００３）および／または既知の変異を有するヒトＴａｕ、たとえばＰ３０１Ｌ変異（ゴッツ（Ｇｏｔｚ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，２７６：５２９−５３４）を発現する遺伝子導入マウス、またはアルツハイマー様病理を発症するこれらまたは他のマウス突然変異体からの二または三遺伝子導入動物といった、アルツハイマー病マウスモデルを用いるのが好ましい。他のアルツハイマー病動物モデルは、神経原線維変化および／またはアミロイド斑を生じることができる組み換え動物モデル；ヒトまたはマウスｔａｕまたは４反復アイソフォームまたはＰ３０１Ｌ変異ｔａｕといったｔａｕアイソフォームのようなｔａｕタンパク質をコードする組み換え遺伝子を発現する組み換え動物モデル；アミロイド前駆体タンパク質または変異アミロイド前駆体タンパク質、またはβ−アミロイドをコードする組み換え遺伝子を発現する組み換え動物モデル；セクレターゼ、ガンマ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼまたはアルファ−セクレターゼ、プレセニリン１またはプレセニリン２をコードする組み換え遺伝子を発現する組み換え動物モデル；および上記の組み換え遺伝子の組み合わせを発現する任意の組み換え動物モデルでありうる。
【００５０】
前記交雑は、アルツハイマー病の背景で、神経変性疾患に類似の神経病理の症状、特に、とりわけＡＤの組織学的性質およびＡＤに特徴的な行動変化を含む、ＡＤに類似の神経病理の症状（ＡＤ型神経病理）を発症するおよび／または示す強化および促進された素因を有する、ＳＵＬＴ４Ａ１ノックアウト動物または遺伝子導入ＳＵＬＴ４Ａ１動物を結果として生じる。
【００５１】
別の好ましい一実施形態では、前記交雑は、アルツハイマー病の背景で、前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた有益な作用のために、ＡＤ症状が低減した、または神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症するリスクが低い、またはＡＤの症状を有しないＳＵＬＴ４Ａ１ノックアウト動物または遺伝子導入ＳＵＬＴ４Ａ１動物を結果として生じる。
【００５２】
遺伝子操作非ヒト遺伝子導入動物および／またはノックアウト動物は、実験動物として、被験動物として、神経変性疾患についての動物モデルとして、好ましくはアルツハイマーについての動物モデルとして、用いることができる。神経病理学的性質を示すおよび／または症状の低減を示すそのような遺伝子操作非ヒト動物の例は、本発明に開示される（実施例および図面を参照）。
【００５３】
そのような遺伝子導入および／またはノックアウト動物の作製および構築のための戦略および技術は当業者に公知であり（たとえばカペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４４：１２８８−１２９２ およびホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら，『マウス胚操作：実験の手引き』（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９４ およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）およびアボット（Ａｂｂｏｔｔ），『マウス遺伝学および遺伝子組み換え：実践的手法』（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会，英国オックスフォード，１９９９を参照）、および本発明に詳細に記載される（実施例および図面を参照）。
【００５４】
本発明の別の一態様では、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を調べるための動物モデルとして、そのような組み換え、遺伝子操作非ヒト動物、遺伝子導入またはノックアウト動物を利用するのが好ましい。そのような動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物、物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するのに有用な被験動物または実験動物でありうる。
【００５５】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または （ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常の、調節因子についてのスクリーニングのための測定法を扱い、その方法は下記を含む（ａ）神経変性疾患または関連する疾患または障害を発症する素因を有するかまたはすでに発症している、被験動物または実験動物または動物モデルへ被験化合物を投与、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｃ）等しく前記疾患を発症する素因を有するかまたはすでに発症している、およびそのような被験化合物が投与されていない、対応する対照動物中の前記物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物中の物質の活性および／またはレベルを比較し、ここで被験動物、または実験動物、または動物モデル中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患および障害の調節因子であることを示す。
【００５６】
好ましい一実施形態では、本発明に開示される通り、前記被験動物、または実験動物、または動物モデルおよび／または前記対照動物は、天然ＳＵＬＴ４１遺伝子転写調節配列でない転写調節配列の調節下にある、ＳＵＬＴ４１をコードする遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体を発現する、組み換え、遺伝子操作非ヒト動物である（下記参照）。
【００５７】
別の一態様では、本発明に記載の遺伝子操作非ヒト動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療のための治療法、または調節物質、または化合物の有効性を測定または評価するためのｉｎ ｖｉｖｏ検定法を提供する。
【００５８】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または（ｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常の、調節因子についてのスクリーニングのための測定法を扱う。このスクリーニング方法は下記を含む（ａ）細胞を被験化合物、物質、または調節因子と接触させること、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の前記物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞中の物質のレベルを比較し、ここで、接触させた細胞中の前記物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物、または物質、または調節因子が前記疾患および障害の調節因子であることを示し、前記調節因子は（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方でありうる。本発明で開示される通りの、ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質を過剰発現する細胞、好ましくはＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質を安定に過剰発現する細胞といった、前記スクリーニング検定法で用いられる細胞の例を下記に示す（実施例（ｖ）および図１８）。前記細胞を用いる検定法の詳細な例が本発明で開示される（実施例（ｖｉ）および図１９を参照）。
【００５９】
遺伝子操作動物および細胞およびスクリーニング検定法の例は単なる説明であり、および開示の残りを限定することを決して意図しない。
【００６０】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述のスクリーニング測定の方法によって神経変性疾患の調節因子を特定する、および（ｉｉ）調節因子を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記調節因子はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定することができる。
【００６１】
別の一態様では、別の一態様では、本発明は、リガンドと、ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を提供する。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングする一または複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える、および（ｉｖ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする、および（ｖ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に結合した蛍光の量を測定する、および（ｖｉ）前記リガンドの、前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する段階を含む。リガンドと前記ＳＵＬＴ４Ａ１翻訳産物との間の結合の阻害を測定するためには、前記ＳＵＬＴ４Ａ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体を、人工リポソーム中に再構成し、対応するプロテオリポソームを作製するのが好ましい可能性がある。界面活性剤からリポソームへのＳＵＬＴ４Ａ１ 翻訳産物の再構成の方法は詳しく説明されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８：９４５６−９４６４；クリヴォシェフ（Ｋｒｉｖｏｓｈｅｅｖ）およびウサノフ（Ｕｓａｎｏｖ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｍｏｓｃｏｗ １９９７，６２： １０６４−１０７３）。蛍光標識リガンドを利用する代わりに、一部の態様では、当業者に公知である任意のその他の検出可能な標識、たとえば放射性標識を用い、およびそれをしかるべく検出するのが好ましい可能性がある。前記方法は、新規化合物の同定に、および、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の遺伝子産物、またはその断片、または誘導体、または変異体へのリガンドの結合を阻害する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。キャリヤー粒子の使用を基礎としたこの場合の蛍光結合測定法の一例は、特許出願国際公開第００／５２４５１号パンフレットに開示され記載されている。別の一例は、特許国際公開第０２／０１２２６号パンフレットに記載された競合測定法である。本発明のスクリーニング測定法のために好ましいシグナル検出方法は、下記の特許出願に記載されている：国際公開第９６／１３７４４号、第９８／１６８１４号、第９８／２３９４２号、第９９／１７０８６号、第９９／３４１９５号、第００／６６９８５号、第０１／５９４３６号および第０１／５９４１６号パンフレット。
【００６２】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の阻害結合測定法によって、化合物を、リガンドとＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の遺伝子産物との間の結合の阻害因子として特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００６３】
別の一態様では、本発明は、ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質との、またはその断片、または誘導体、または変異体との前記化合物の結合の程度を測定する、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を扱う。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングする検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と、前記検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物をインキュベートする、および（ｉｖ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と結合した好ましくは蛍光の量を測定する、および（ｖ）前記ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質への、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への、一種類以上の前記化合物による結合の程度を測定する段階を含む。この型の測定では、蛍光標識を用いるのが好ましい。しかし、任意の他の種類の検出可能な標識もまた使用することができる。またこの型の測定では、ＳＵＬＴ４Ａ１翻訳産物またはその断片、または誘導体、または変異体を、本発明に記載の通り、人工リポソーム中に再構成するのが好ましい可能性がある。前記測定法は、新規化合物の同定に、およびＳＵＬＴ４Ａ１、またはその断片、または誘導体、または変異体へ結合する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。
【００６４】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の結合測定法によって、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の遺伝子産物への結合因子として化合物を特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００６５】
別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得ることができる薬剤を提供する。別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得られた薬剤を提供する。
【００６６】
本発明は、配列番号１および配列番号２に示される、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体、および、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的としてのその使用を扱う。
【００６７】
さらに、本発明は、配列番号１および配列番号２に示される、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体、および、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防、または治療、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての使用のためのその使用を扱う。
【００６８】
本発明は、ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体である免疫原と、特異的に免疫反応する抗体を扱う。その免疫原は、前記遺伝子の翻訳産物の免疫原性または抗原性のエピトープまたは部分を含むことができ、ここで翻訳産物の前記免疫原性または抗原性部分はポリペプチドであり、および前記ポリペプチドは抗体反応を動物において導き、前記ポリペプチドは前記抗体によって免疫特異的に結合している。抗体を作製する方法は本分野でよく知られている（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら，『抗体−実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９８８を参照）。本発明で使用される「抗体」の語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、組み換え、抗イディオタイプ、ヒト化、または一本鎖抗体、およびその断片といった、当該分野で既知のすべての型の抗体を包含する（デュベル（Ｄｕｂｅｌ）およびブライトリンク（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ），『組み換え抗体』（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），ワイリー・リース社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ），ニューヨーク州ニューヨーク，１９９９）。本発明の抗体は、たとえば（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体を用いて：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９９およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｒ，『免疫診断：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），英国オックスフォード，１９９９を参照）、酵素免疫測定法（たとえば酵素結合免疫吸収測定法、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、化学発光免疫測定法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および抗体マイクロアレイといった、最先端の方法を基礎とするさまざまな診断および治療方法で有用である。これらの方法は、ＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の検出を含む。
【００６９】
本発明の好ましい一実施形態では、前記抗体は被験者に由来する試料中の細胞の病理状態を検出するのに用いることができ、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化は、前記細胞の病理状態を示す。好ましくは、病理状態は神経変性疾患、特にＡＤに関係する。細胞の免疫細胞化学染色は、本分野でよく知られたいくつかの異なる実験法によって実施することができる。しかし、抗体結合の検出には自動化法を適用するのが好ましく、ここで、細胞の染色の程度の判定、または細胞の細胞染色または細胞成分染色のパターンの判定、または細胞表面上または細胞内のオルガネラおよびその他の細胞下構造の間の抗原のトポロジカルな分布は、米国特許第６１５０１７３号明細書に記載の方法に従って実施される。
【００７０】
本発明のその他の特性および利点は、単なる説明であり、および開示の残りを限定することを決して意図しない下記の図および実施例の説明から明らかになる。
【実施例】
【００７１】
（ｉ）ＡＤ患者由来の脳組織解剖：
ＡＤ患者および対応する年齢の対照被験者由来の脳組織を死後６時間以内に採取し、直ちにドライアイス上で凍結した。診断の組織病理的確認のため、各組織からの試料切片はパラホルムアルデヒドで固定した。発現差の分析のための脳の部分を特定し、ＲＮＡ抽出を実施するまで−８０℃にて保存した。
【００７２】
（ｉｉ）総ｍＲＮＡの単離：
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を取扱説明書に従って使用することによって、死後脳組織から抽出した。正確なＲＮＡ濃度およびＲＮＡ品質は、ＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）系を用いてアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して測定した。調製したＲＮＡの追加の品質試験、すなわち部分分解の排除およびＤＮＡ混入に関する試験は、特に設計したイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドおよび参照対照としてゲノムＤＮＡを使用して、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術を取扱説明書（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って用いて融解曲線を作成した。
【００７３】
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ合成および発現差のある遺伝子の蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ（ＦＤＤ）による特定：
異なる組織における遺伝子発現の変化を特定するために、我々は改変および改良したディファレンシャル・ディスプレイ（ＤＤ）スクリーニング法を使用した。元のＤＤスクリーニング法は当業者に公知である（リャン（Ｌｉａｎｇ）およびパーディー（Ｐａｒｄｅｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，２６７：１１８６−７）。この方法は、ＲＮＡの２つの集団を比較し、および一方の集団で発現されているが他方の集団では発現されていない遺伝子のクローンを提供する。いくつかの試料を同時に分析することができ、および同一の実験でアップおよびダウンレギュレートされる遺伝子の両方を特定できる。ＤＤ法でのいくつかの段階を調整および改良し、および技術的パラメーターを修正、たとえば冗長性を増大、総ＲＮＡの逆転写のための最適化された試薬および条件を評価、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその産物の分離を最適化することによって、高再現性および高感度の結果を可能にする方法が開発された。その応用および改良されたＤＤ法はフォン・デル・カマー（ｖｏｎ ｄｅｒ Ｋａｍｍｅｒ）ら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９９９，２７：２２１１−２２１８）によって詳細に記載された。可能なすべてのＲＮＡ種の統計的に包括的な分析を達成するために、６４種類の特に設計されたランダムプライマーの組が開発された（標準セット。さらに、蛍光標識化されたプライマーの使用に基づいて、本方法は修正されて調製用ＤＤスラブゲル法を生じた。本発明では、ＡＤ患者および対応する年齢の対照被験者の注意深く選択された死後脳組織（前頭および側頭皮質）に由来するＲＮＡ集団を比較した。
【００７４】
ＤＤ分析の開始材料として、我々は、上記（ｉｉ）の通り抽出された総ＲＮＡを用いた。各０．０５μｇの等量のＲＮＡを、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのセンシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素および１ｘＲＴ緩衝液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、１０ＵＲＮアーゼ阻害因子（キアゲン）および１μＭのいずれかの一塩基アンカーオリゴヌクレオチドＨＴ11Ａ、ＨＴ11ＧまたはＨＴ11Ｃを含む２０μｌの反応物中でｃＤＮＡに転写した（リャン（Ｌｉａｎｇ）ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４，２２： ５７６３−５７６４；チャオ（Ｚｈａｏ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９５、１８：８４２−８５０）。逆転写は６０分間３７℃にて実施し、９３℃にて５分間の最終変性段階を伴った。得られたｃＤＮＡの各２μｌは、対応する一塩基アンカーオリゴヌクレオチド（１μＭ）を、Ｃｙ３標識化ランダムＤＤプライマー（１μＭ）のいずれか１つ、１ｘジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲ緩衝液（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ2（アプライド・バイオシステムズ）、 ２μＭ ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰアマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））、５％ＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ）と共に用いて、終容量２０μｌ中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。ＰＣＲ条件は下記の通り設定した：９４℃にて３０秒間１回で変性、１℃／秒で４０℃まで冷却、４０℃にて４分間でプライマーの低厳密性アニーリング、１℃／秒で７２℃まで加熱、７２℃にて１分間で伸長。この回に続いて、高厳密性サイクル３９回を実施した：９４℃にて３０秒、１℃／秒で６０℃まで冷却、６０℃にて２分間、１℃／秒で７２℃まで加熱、７２℃にて１分間。最後のサイクルに、７２℃にて５分間の最終段階１回を加えた（ＰＣＲサイクラー：マルチサイクラーＰＴＣ２００、ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））。８μｌのＤＮＡ負荷緩衝液を２０μｌのＰＣＲ産物調製物に加え、５分間変性し、およびゲルへの負荷まで氷上に保持した。各３．５μｌを厚さ０．４ｍｍの６％ポリアクリルアミド（ロングレンジャー（Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ））／７Ｍ尿素シーケンスゲルで、スラブゲルシステム（日立ジェネティック・システムズ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ））で２０００Ｖ、６０Ｗ、３０ｍＡにて、１時間４０分で分離した。電気泳動の完了後、ゲルをＦＭＢＩＯ ＩＩ 蛍光スキャナー（日立ジェネティック・システムズ）で、適当な ＦＭＢＩＯ ＩＩ Ａｎａｌｙｓｉｓ ８．０ソフトウェアを用いてスキャンした。原寸画像を印刷し、発現差のあるバンドに印を付け、ゲルから切り出し、１．５ｍｌ容器へ移し、２００μｌの滅菌水を加え、および抽出まで−２０℃にて保存した。
【００７５】
ＤＤ産物の溶出および再増幅：２００μｌのＨ2Ｏ中で１０分間煮沸し、氷上で冷却し、および上清液からエタノール（メルク（Ｍｅｒｃｋ））およびグリコーゲン／酢酸ナトリウム（メルク）を用いて−２０℃にて一夜沈澱、および続いて１３．０００ｒｐｍで２５分間４℃にて遠心分離によって、差のあるバンドをゲルから抽出した。沈澱を氷冷エタノール（８０％）で２回洗浄し、１０ｍＭトリスｐＨ８．３（メルク）に再懸濁し、および１０％グリセロール（メルク）に対して１時間室温にて０．０２５μｍＶＳＷＰ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上で透析した。得られた調製物は、ＤＤＰＣＲ（上記参照）に用いられた通りの対応するプライマーを含む２５μｌのＰＣＲ混合物中での、初回９４℃５分間、次いで９４℃にて４５秒、６０℃にて４５秒、傾斜１℃／秒で７０℃４５秒、および７２℃にて５分間の最終段階１回以外は同一条件下での、１５ 回の高厳密性サイクルによる再増幅のためのテンプレートとして使用した。
【００７６】
ＤＤ産物のクローニングおよび配列決定：
再増幅されたｃＤＮＡをＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）システム（アジレント２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で分析し、および取扱説明書に従ってＰＣＲ−ブラント（Ｂｌｕｎｔ）ＩＩ−ＴＯＰＯベクターへライゲーションし、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆ'細胞へ形質転換した（ゼロブラント（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ）ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。クローニングされたｃＤＮＡ断片は市販の配列決定設備によって配列決定した。ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子についてのそのようなＦＤＤ実験の一つの結果を図１に示す。
【００７７】
（ｉｖ）発現の差の定量ＲＴ−ＰＣＲによる確認：
側頭皮質対前頭皮質における、および海馬対前頭皮質におけるＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子発現、すなわちそれぞれＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはｓｖ２およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の差の裏付けを、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術（ロシュ（（Ｒｏｃｈｅ））を用いて実施した。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応についての迅速熱サイクリング、および増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を扱い、およびしたがって、終点計測値でなく動力学を用いたＲＴ−ＰＣＲ産物の高精度な定量を可能にする。ＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の側頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の前頭皮質由来、ＡＤ患者および対応する年齢の健常対照者の海馬由来の、ＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡの比、およびＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の側頭皮質および前頭皮質由来のＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡの比、およびＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の海馬および前頭皮質由来のＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡの比をそれぞれ測定した（相対的定量）。
【００７８】
ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはｓｖ２の、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の、前頭皮質組織（Ｆ）と下側頭皮質組織（Ｔ）との間のｍＲＮＡ発現プロファイリングを、各ブラーク病期につき４〜最大９の組織で分析した。ブラーク３病理を有するドナー１名からの高品質組織が無かったため、ブラーク３病理を有する追加の１名のドナーの組織を含め、およびブラーク６病理を有するドナー１名からの高品質組織が無かったため、ブラーク５病理を有する追加の１名のドナーの組織試料を含めた。
【００７９】
プロファイリングの分析のため、２つの一般的手法を用いている。それぞれＳＵＬＴ４Ａ１の、ＳＵＩ＿Ｔ４Ａ１ｓｖ１の、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の、ＡＤ生理における関連の複合像に寄与する、下側頭皮質に対する前頭皮質、およびＡＤ患者に対する対照の両方の比較プロファイリング試験を下記に詳細に示す。
【００８０】
１）対照の、およびＡＤ患者の、前頭皮質組織と下側頭皮質組織との間のｍＲＮＡ発現の相対比較。この手法は、同定された遺伝子ＳＵＬＴ４Ａ１ （ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１，ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２）が、変性に対する脆弱性のより低い組織（前頭皮質）の保護に関与しているか、または、脆弱性のより高い組織（下側頭皮質）の変性過程に関与するかまたはそれを促進するかを検証することを可能にした。
【００８１】
最初に、ＰＣＲの効率を測定するため、ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはスプライス変異体２遺伝子についてのプライマー（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１とＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２とを区別しないプライマー）：
５'−ＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＧＴ−３'（配列番号３、ヌクレオチド２０６４−２０８４；配列番号４、ヌクレオチド１７２５−１７４５）を用いて、および
５'−ＣＣＧＴＴＴＣＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧ−３'（配列番号３、ヌクレオチド２１１０−２１３１；配列番号４、ヌクレオチド１７７１−１７９２）；
およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１遺伝子だけに関する特異的プライマー：５'−ＣＴＧＡＣＣＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧ−３'（配列番号３、ヌクレオチド２３５−２５２）および５'−ＧＧＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡ−３'（配列番号３、ヌクレオチド３４０−３５８）；を用いて、
およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２遺伝子だけに関する特異的プライマー：５'−ＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴ−３'（配列番号４、ヌクレオチド１７２−１９０）および５'−ＴＴＣＡＴＡＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＣＧＴ−３'（配列番号４、ヌクレオチド２５０−２７２）を用いて、標準曲線を作成した。
【００８２】
ＰＣＲ増幅（９５℃で１秒間，５６℃で５秒間、および７２℃で５秒間）を、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）混合物（ファストスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ混合物、ＳＹＢＲグリーンＩ色素、および１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＭプライマー、２μｌのｃＤＮＡ希釈系列（終濃度４０、２０、１０、５、１および０．５ｎｇヒト脳総ｃＤＮＡ；クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および、使用プライマーに応じて追加の３ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む２０μｌ容量中で実施した。融解曲線分析は、約８４℃にてＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２遺伝子プライマーについて、８７．５℃にてＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１遺伝子特異的プライマーについて、および８７．２℃にてＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２遺伝子特異的プライマーについて、それぞれに単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物の品質および大きさはＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）システムを用いて測定した（アジレント２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。試料の電気泳動図でＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２遺伝子について６８ｂｐの予測サイズに、ｆｏｒｔｈｅＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１遺伝子について１２４ｂｐに、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２遺伝子について１０１ｂｐに、それぞれ、単一ピークが観察された。
【００８３】
同様の方法で、ＰＣＲ手順を適用して、定量用の参照標準として選択された参照遺伝子の組のＰＣＲ効率を測定した。本発明では、５種類のそのような参照遺伝子の平均値を測定した；（１）シクロフィリンＢ、特異的プライマー５'−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３'および５'−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３'を用いＭｇＣｌ2を省いて（別に１ｍＭを３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ ｂｐ）の単一バンド一本を示した。（２）リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、特異的プライマー５'−ＧＧＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡ−３'および５'−ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣ−３'を用いて（例外；別に１ｍＭ ＭｇＣｌ2を３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８５℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（３）ベータアクチン、特異的プライマー５'ＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ−３'および５'−ＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３'を用いて。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（１４２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（４）ＧＡＰＤＨ、特異的プライマー５１ＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧ−３'および５'−ＧＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３'を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８１ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（５）トランスフェリン受容体ＴＲＲ、特異的プライマー５'−ＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＴＴ−３'および５'ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣ−３'を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８０ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。
【００８４】
値の計算のために、まずｃＤＮＡ濃度の対数を、ＳＵＬＴ４Ａ１について、すなわちＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２について、ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１単独について、およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２単独について、および５種類の参照標準遺伝子についてのサイクル数閾値Ｃtに対してプロットした。標準曲線の傾きおよび切片（すなわち直線回帰）をすべての遺伝子について計算した。次の段階で、ＡＤ患者のおよび対照健常者の前頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対照健常者の側頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対照健常者の海馬由来のｃＤＮＡ、および、ＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質および側頭皮質由来、およびＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質および海馬由来のｃＤＮＡを、それぞれ平行して分析しシクロフィリンＢに対して正規化した。Ｃt値を測定し、対応する標準曲線を用いてｎｇ総脳ｃＤＮＡに変換した：
１０^（（Ｃt値−切片）／傾き）       [ｎｇ総脳ＤＮＡ]
【００８５】
側頭および前頭皮質ＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡ（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の）についての値、海馬および前頭皮質ＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡについての値、およびＡＤ患者（Ｐ）および対照者（Ｃ）の前頭皮質ＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡからの値、およびＡＤ患者（Ｐ）および対照者（Ｃ）の側頭皮質ＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡについての値は、シクロフィリンＢに対して正規化し、および比を下記の式に従って計算した：
ＳＵＬＴ４Ａ１側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ側頭[ｎｇ]
比＝ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＵＬＴ４Ａ１前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ前頭[ｎｇ]
ＳＵＬＴ４Ａ１海馬[ｎｇ]／シクロフィリンＢ海馬[ｎｇ]
比＝ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＵＬＴ４Ａ１前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ前頭[ｎｇ]
ＳＵＬＴ４Ａ１（Ｐ）側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｐ）側頭[ｎｇ]
比＝ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＵＬＴ４Ａ１（Ｃ）側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｃ）側頭[ｎｇ]
ＳＵＬＴ４Ａ１（Ｐ）前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｐ）前頭[ｎｇ]
比＝ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＵＬＴ４Ａ１（Ｃ）前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｃ）前頭[ｎｇ]
【００８６】
三番目の段階で、参照標準遺伝子の組を平行して分析し、個別の脳試料それぞれについて参照標準遺伝子の発現レベルの、対照者対ＡＤ患者側頭皮質比の、対照者対ＡＤ患者前頭皮質比、およびＡＤ患者および対照者の前頭対側頭比の、およびＡＤ患者および対照者の前頭対海馬比の平均値をそれぞれ決定したシクロフィリンＢを段階２および段階３で分析し、また、一つの遺伝子から別の遺伝子への比は別々の分析で一定のままであったため、ＳＵＬＴ４Ａ１についての値、すなわちＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２について、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１単独について、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２単独についてそれぞれを、単一の遺伝子だけに対して正規化するのでなく、参照標準遺伝子の組の平均値に対して正規化することが可能であった。計算は、上記に示すそれぞれの比を、すべてのハウスキーピング遺伝子の平均値からのシクロフィリンＢの偏差で割ることによって行った。ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはスプライス変異体２を、ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１単独を、およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２単独をコードする遺伝子についてのそのような定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果およびそれぞれの計算値を図２、３および１５に、図４および１６に、および図５にそれぞれ示す。
【００８７】
２）対照とＡＤ患者との間のｍＲＮＡ発現の比較。
この分析に関して、別の時点での別の実験間のリアルタイム定量ＰＣＲ（ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）法）の絶対値は、キャリブレーターを使用しない定量比較に用いるのに十分に一貫性があることが証明された。シクロフィリンを、１００を超える組織について、ｑＰＣＲ実験のどれでも正規化のための標準物質として用いた。我々の正規化実験において、中でもシクロフィリンは最も一貫して発現されたハウスキーピング遺伝子であることが見出された。したがって、シクロフィリンに関して生じた値を用いることによって概念実証が行われた。
【００８８】
第一の分析は、３名の異なるドナー由来の前頭皮質および下側頭皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いた。分析したすべての実験で、各組織から同一のｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析の中では、データ数の小ささのため、値の正規分布は達成されなかった。したがって、中央値およびその９８％信頼レベルの方法を用いた。この分析は、絶対値の比較について中央値から８．７％の中間偏差、および相対値の比較について中央値から６．６％の中間偏差を明らかにした。
【００８９】
第二の分析は、それぞれ２名の異なるドナー由来の前頭皮質および下側頭皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いたが、異なる時点からの異なるｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析、絶対値の比較について中央値から２９．２％の中間偏差、および相対値の比較について中央値から１７．６％の中間偏差を明らかにした。この分析から、ｑＰＣＲ実験からの絶対値を使用できるが、しかし中央値からの中間偏差はさらに考慮されるべきであると結論されたＳＵＬＴ４Ａ１について絶対値の詳細な分析を実施した。したがって、シクロフィリンを用いた相対的正規化後にＳＵＬＴ４Ａ１の絶対レベルを用いた。中央値および９８％信頼レベルを対照群（ブラーク０〜ブラーク３）および患者群（ブラーク４〜ブラーク６）についてそれぞれ計算した。同じ分析を、対照群（ブラーク０〜ブラーク２）および患者群（ブラーク３〜ブラーク６）を再定義して実施し、および対照群（ブラーク０〜ブラーク１）および患者群（ブラーク２〜ブラーク６）を再定義して実施した。後者の分析は、対照とＡＤ患者との間のｍＲＮＡ発現差の初期出現を見出すことを目的とした。この分析の別の視点では、遺伝子発現調節および初期出現差の傾向を見出すため、それぞれブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３、およびブラーク病期４〜６を含む３群を互いに比較した。上記の通りの前記分析を図６および７に示す。
【００９０】
（ｖ）免疫蛍光分析（ＩＦ）：
細胞中のＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質の免疫蛍光染色のために、スウェーデン変異を有するヒトＡＰＰ６９５アイソフォームを安定に発現する（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）ヒト神経膠腫細胞株（Ｈ４細胞）を使用した（Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞）。Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞に、ＳＵＬＴ４Ａ１のコード配列（配列番号６、８５５ｂｐ）およびｍｙｃ−タグを含むＰＦＢ−Ｎｅｏベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、＃２１７５６１、６．６ｋｂ）を用いて形質導入した（ｐＦＢＮｅｏ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｃｄｓ−ｍｙｃ、ＳＵＬＴ４Ａ１ベクター、７４８３ｂｐ）。ＳＵＬＴ４Ａ１ベクターの作製については、ＳＵＬＴ４Ａ１ｃｄｓ−ｍｙｃ配列をＰＦＢ−Ｎｅｏベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）のＸｈｏｌ−ｂｌｕｎｔ／ＢａｍＨＩ制限部位へ導入した。ＦｏｒｏｆｔｈｅｗｉｔｈｔｈｅＳＵＬＴ４Ａ１ベクターを用いたＨ４ＡＰＰｓｗ細胞の形質導入には、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のレトロウイルス発現系バイラポート（ＶｉｒａＰｏｒｔ）を使用した。
【００９１】
ｍｙｃ−タグ化ＳＵＬＴ４Ａ１過剰発現細胞（Ｈ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ）を２４ウェルプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、デンマーク、ロスキルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）；＃１４３９８２）中でカバーグラス片上に、５ｘ１０4細胞の密度で播種し、および３７℃にて５％ＣＯ2で一夜インキュベートした。細胞をカバーグラス上に固定するため、培地を除去しおよび冷メタノール（−２０℃）を加えた。１５分間、−２０℃にてのインキュベート期間後、メタノールを除去し、および固定された細胞を、１時間、ブロッキング溶液（２００μｌＰＢＳ／５％ＢＳＡ／３％ヤギ血清）中で室温にてブロッキングした。第一の抗体（ポリクローナル抗ｍｙｃ抗体、ウサギ、１：５００、モビテック（Ｍｏｂｉｔｅｃ））およびＤＡＰＩ（ＤＮＡ色素、０．０５μｇ／ｍｌ、１：１０００）を含むＰＢＳ／１％ヤギ血清を加え、および１時間室温にてインキュベートした。第一の抗体を除去後、固定された細胞を３回ＰＢＳで５分間洗浄した。第二の抗体（Ｃｙ３結合抗ウサギ抗体、１：１０００、アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ドイツ）をブロッキング溶液に加え、および１時間室温にてインキュベートした。細胞を３回ＰＢＳで５分間洗浄した。パーマフロー（Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いてカバーグラスを顕微鏡スライドに載せ、および４℃で一夜保存して封入剤を固化した。細胞は顕微暗視野落射蛍光および明視野位相差照明条件（ＩＸ８１、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて視覚化した。顕微鏡像（図１８）はＰＣＯセンシカム（ＳｅｎｓｉＣａｍ）を用いてデジタル取り込みし、および適当なソフトウェアを用いて分析した（ＡｎａｌｙＳｉＳ、オリンパス光学）。
【００９２】
ｖｉ）細胞毒性／生存能測定：
ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質過剰発現細胞（実施例（ｖ）に上述のＳＵＬＴ４Ａ１細胞）に対する栄養因子欠乏の作用を分析するため、Ｈ４ＡＰＰｓｗ対照およびＨ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ過剰発現細胞を、１．５ｘ１０4細胞／ｍｌの密度で９６ウェルプレートに、ＤＭＥＭ（シグマ（Ｓｉｍｇａ））、１０％ＦＣＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））およびペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ）中に播種した。３７℃にてＣＯ2条件（８．５％）下で一夜インキュベート後、培地をペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭに交換した。毒性について陽性対照として、０．０６〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の１２種類の濃度のクロロキン（シグマ）を、対照細胞へ、およびＨ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ過剰発現細胞へ加えた（３連で）。毒性について陰性対照として、ＤＭＥＭ（シグマ）、１０％ＦＧＳ（ギブコ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ）を２４ウェルの対照細胞およびＨ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ過剰発現細胞へ加えた。栄養因子欠乏について、漸増濃度の血清（０、０．３、０．６、１．２５、２．５、５％および７．５％）を含むＤＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシンを対照細胞およびＨ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ過剰細胞へ加えた（３連で）。３７℃にてＣＯ2条件（８．５％）下で４０時間インキュベート後酸化還元指示薬アラーマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）（バイオソース（（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ））を加え、および相対蛍光（ＲＦＵ）を４時間後に５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（放出）にて、ＢＭＧフルオスター（Ｆｌｕｏｓｔａｒ）検出器を用いて測定した。毒性の％はＲＦＵ平均値を用いて、下記の式を用いて計算した：
１００ｘ（ＲＦＵ陰性対照−ＲＦＵ毒性刺激）
％毒性＝ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（ＲＦＵ陰性対照−ＲＦＵ陽性対照）
グラフはグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いて決定されている（シグモイド用量反応および可変勾配に合致する非線形回帰曲線）。
【００９３】
（ｖｉｉ）Ｓｕｌｔ４Ａ１を発現する遺伝子導入およびノックアウトマウスの作製：
Ｓｕｌｔ４Ａ１欠損マウスを下記の通りＳｕｌｔ４Ａ１構造を用いて作製した。ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子のホモログがマウスで見出されている。それはマウススルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１（Ｓｕｌｔ４Ａ１）、別名Ｓ４Ａ１（Ｕｎｉｇｅｎｅ番号：Ｍｍ．２４８７９６；遺伝子ＩＤ：２９８５９、遺伝子座ＮＴ＿０３９６２１）である。マウスＳｕｌｔ４Ａ１遺伝子は第１５染色体上に位置し、および２８４アミノ酸のタンパク質をコードする７個のエクソンから成り、および配列番号１に示すヒトＳＵＬＴ４Ａ１配列と９８％同一性を共有する。マウスＳｕｌｔ４Ａ１遺伝子についてはこれまでのところ、スプライス変異体は見出されていない。ヒトではＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の別のスプライス変異体が発見されている。ヒトＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１およびスプライス変異体２は本明細書に開示される。これらはマウス遺伝子と一部のホモロジーを共有するため、これらのスプライス変異体がマウス系にも存在することは度外視できない。マウスＳｕｌｔ４Ａ１タンパク質の機能ドメインは、エクソン１〜７からコードされるスルホトランスフェラーゼドメインである。そのドメイン内には、エクソン１、３および５上に位置する、スルホトランスフェラーゼの３個の保存されたアミノ酸モチーフ（ファラニー（Ｆａｌａｎｙ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０００，８５７−８６４）を見出すことができる。
【００９４】
Ｓｕｌｔ４Ａ１遺伝子ターゲッティングベクターの構築のために、マウスＳｕｌｔ４Ａ１ホモロジー配列をゲノムＧ５７ＢＬ／６Ｊ ＤＮＡ（マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）から、標準のＰＣＲ手順を用いて増幅した。短ホモロジーアーム（ＳＡ）は約２．９ｋｂ（エクソン１と２の間のイントロン配列）から成り、および長ホモロジーアーム（ＬＡ）は約７ｋｂから成る。Ｓｕｌｔ４Ａ１の酵素機能は、内因性マウスＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子配列のエクソン２およびエクソン３、４および５の主な部分を置換するＮｅｏカセット（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クローン選択についてＰｇｋプロモーターによって動作するネオマイシン耐性遺伝子、選択可能なマーカー配列）のエクソン２への挿入によって破壊される。構築されたターゲッティングベクターおよびターゲッティング戦略を図２０に示す。Ｎｅｏカセットは上記で概説した通り２つの高度に保存されたアミノ酸モチーフを置換し、およびそれによってスルホトランスフェラーゼドメインを破壊する。Ｎｅｏ選択マーカーはＰＧＫプロモーターによって動作し、およびＦＲＴ部位（ＦＬＰリコンビナーゼの認識部位）に隣接され、必要に応じて、ＮｅｏカセットのＦＬＰリコンビナーゼ（部位特異的リコンビナーゼ）による除去を可能にする。Ｎｅｏカセットの３'位で、スプライス受容体およびポリＡシグナル配列（ｐＡ）が、選択マーカーが除去された際に転写産物の終止を保証する。したがって、スルホトランスフェラーゼドメインの約２５アミノ酸である、エクソン１およびエクソン２の一部だけが転写される。エクソン６および７は、なおフレーム中に存在するが、スプライス受容体およびポリＡモチーフが転写を終止させるため転写されず、結果として遺伝子の機能的ノックアウトを生じる。加えて、エクソン２と５を交換することによって、ヒトで観察される通りの機能的代替スプライス型が妨げられる。
【００９５】
上記に示す構築されたターゲッティングベクターをクローニングし、およびさらに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ遺伝子導入した。ＥＳ細胞の遺伝子導入は最新技術に従って実施した（ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、『マウス胚操作：実験の手引き』（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９４ およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）およびアボット（Ａｂｂｏｔｔ），『マウス遺伝学および遺伝子組み換え：実践的手法』（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会，英国オックスフォード，１９９９）。相同組み換え後、ターゲッティングされたＥＳ細胞クローンは、サザンブロット分析によって特定され、標準的方法を用いて胚盤胞へ注入されてキメラマウスを生じた（チムス（Ｔｙｍｍｓ）およびコーラ（Ｋｏｌａ）：『遺伝子ノックアウト手順』（Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ヒューマナ・プレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）２００１）。作製されたキメラマウスの生殖細胞系列への遺伝子導入の成功後、キメラマウスをアルツハイマー病マウスモデルと交雑し、アルツハイマー病背景上でホモ接合ＳＵＬＴ４Ａ１ノックアウトマウスを作製した。
【００９６】
神経細胞でヒトＳｕｌｔ４Ａ１ｃＤＮＡを特異的に発現するようにＳｕｌｔ４Ａ１遺伝子導入マウスを作製した。この目的のために、ヒトＳｕｌｔ４Ａ１のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦＳＵＬＴ４Ａ１）ｃＤＮＡを、神経特異的発現を指示する脳−特異的Ｔｈｙ−１調節配列（Ｔｈｙ−１．２プロモーターおよび調節配列）を含みおよびしたがって脳細胞だけで発現を生じるマウスＴｈｙ１．２発現カセットへクローニングした（ルシ（Ｌｕｔｈｉ）およびファン・デル・プッテン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９７，１７：４６８８−４６９９）。Ｒｏｓａ２６遺伝子座（第６染色体上のマウスＲｏｓａベータｇｅｏ２６遺伝子；サイブラー（Ｓｅｉｂｌｅｒ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３，３１：ｅ１２）へその配列を組み込むために、導入遺伝子をＲｏｓａ２６ターゲッティングベクターへクローニングした。導入遺伝子の５'端にＮｅｏ選択マーカーを配置した（図２１参照）。Ｎｅｏカセットは、内因性Ｒｏｓａ２６遺伝子由来のＲｏｓａプロモーターによって動作するＮｅｏ選択マーカーの発現を可能にするスプライス受容体を含む（フリードリヒ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ）およびソリアノ（Ｓｏｒｉａｎｏ），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９１，５：１５１３−１５２３；ザムブロウィツ（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ他、９４：３７８９−３７９４）。Ｎｅｏマーカーの３'端のポリＡシグナル（ｐＡ）が転写およびＲｏｓａプロモーターの影響を停止する。本ターゲッティングベクターは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座への相同組み換えを可能にする、ゲノム１２９Ｓ６ＤＮＡ由来のＲｏｓａ２６ホモロジー配列を含む。短ホモロジーアーム（ＳＡ）は約１．１ｋｂから成り、長ホモロジーアーム（ＬＡ）は４．３ｋｂから成る。
【００９７】
ターゲッティングベクターはクローニングされ、およびさらに、Ｃ５７ＢＩ／６ＮマウスＥＳ細胞へ遺伝子導入される（ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、『マウス胚操作：実験の手引き』（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９４ およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）およびアボット（Ａｂｂｏｔｔ），『マウス遺伝学および遺伝子組み換え：実践的手法』（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会，英国オックスフォード，１９９９）。相同組み換え後、ターゲッティングされたＥＳ細胞クローンは、サザンブロット分析によって特定され、標準的方法を用いて胚盤胞へ注入されてキメラマウスを生じた（チムス（Ｔｙｍｍｓ）およびコーラ（Ｋｏｌａ）：『遺伝子ノックアウト手順』（Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ヒューマナ・プレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）２００１）。作製されたキメラマウスの生殖細胞系列への遺伝子導入の成功後、キメラマウスをアルツハイマー病マウスモデルと交雑し、アルツハイマー病背景上で遺伝子導入ＳＵＬＴ４Ａ１マウスを作製した。
【００９８】
（ｖｉｉｉ）遺伝子導入ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の作製：
ヒトＢＡＣＥ遺伝子導入ハエおよびヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子導入ハエを、グリーブら（Ｇｒｅｅｖｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）に従って、および本発明に記載の通り作製した。ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１のオープン・リーディング・フレーム全体（配列番号６）を含む９１８ｂｐのＮｏｔｌ／ＢｓｓＨＩ−ブラント断片を、ベクターＰＬＪＡＳＴＮｏｔｌ／Ｘｂａｌ−ブラントへＧＡＬ４結合部位ＵＡＳの下流にサブクローニングした（ブランド（Ｂｒａｎｄ）およびペリモン（Ｐｅｒｒｉｍｏｎ），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９３，１１８：４０１−１５）。 Ｐエレメント媒介生殖細胞系列形質転換を、スプラドリング（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ）およびルビン（Ｒｕｂｉｎ）によって記載された通り実施した（ルビンおよびスプラドリング，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２，２１８：３４８−５３；スプラドリングおよびルビン，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２，２１８：３４１−７）。２０の独立したヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子導入ハエ系統を作製し、および３つの異なる系統を本分析に用いた。
【００９９】
ヒトＡＰＰおよびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）プレセニリン遺伝子導入ハエ、ＵＡＳ−ＡＰＰ６９５ＩＩおよびＵＡＳ−ＤＰｓｎ−変異体（Ｌ２３５Ｐ）、はＲ．パロ（Ｐａｒｏ）およびＥ．フォーティニ（Ｆｏｒｔｉｎｉ）より提供を受けた（フォスグリーン（Ｆｏｓｓｇｒｅｅｎ）ら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：１３７０３−８；イエ（Ｙｅ）およびフォーティニ（Ｆｏｒｔｉｎｉ），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９，１４６： １３５１−６４）。アクチン−ＧＡＬ４系統はブルーミントン・ストック・センター（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。Ｆ．ピグノニ（Ｐｉｇｎｏｎｉ）からのｇｍｒ−ＧＡＬ４系統を、導入遺伝子の眼特異的発現を達成するために用いた。
【０１００】
遺伝交雑を標準ショウジョウバエ培地上で２５℃にて設定した。使用した遺伝子型は：ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ６ｇ５、ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／Ｔｍ３−ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ６ｇ５、ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＤＰｓｎｌ＿２３５Ｐ／Ｔｍ３−ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３（第３染色体、生存可能な挿入）−ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８／Ｔｍ３−ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃２２／ＣｙＯ。
【０１０１】
免疫組織化学的および組織学的分析のために、成体ハエを下記の方法にしたがって免疫染色しおよび調製した。免疫染色のためには、成体ハエを４％パラホルムアルデヒド中で３時間固定し、１ｘＰＢＳで洗浄し、および２５％ショ糖中へ移して４℃にて一夜インキュベートした。ハエを剃刀で頭部切断し、および頭部をティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）（サクラ（Ｓａｋｕｒａ））に包埋しおよび急速凍結した。１０μｍ凍結横断切片をクリオスタット（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＣＭ３０５０Ｓ）で調製した。免疫染色はベクタステイン・エリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ）キット（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて取扱説明書に従って実施した。下記の一次抗体を使用した：２４Ｂ１０（アルファ−カオプチン、１：５）、デベロップメンタル・スタディーズ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）より供給。
【０１０２】
ハイブリドーマバンクの作製：チオフラビンＳ染色については、切片を５分間マイヤーヘマトキシリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で対比染色し、水道水中で１０分間洗浄し、および３分間１％チオフラビンＳ（シグマ）水溶液中で染色した。スライドを、蒸留水を何回か交換して洗浄し、１５分間１％酢酸中でインキュベートし、水道水で洗浄し、およびベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）封入剤（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に封入した。スライドはオリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡下で分析した（励起４３０ｎｍ、放出５５０ｎｍ）。
【０１０３】
ウェスタンブロッティングによるタンパク質分析については、ハエ頭部を１ｘＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼインヒビターミックス・コンプリート（ロシュ・アプライドサイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））中でホモジナイズした。等量のタンパク質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ））へ転写し、５％スキムミルク中で２時間室温にてブロッキングし、およびモノクローナル抗体２２Ｃ１１（ＡＰＰＮ末端特異的、ケミコン・インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））とインキュベートした。結合した抗体を、ヤギ 抗マウスペルオキシダーゼ結合二次抗体（ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））で検出した。免疫沈降については、ハエ頭部を上記の通りホモジナイズし、および 溶解物をクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の抗体手順ガイドに記載の通り処理した。抗体 ｍａｂ ６Ｅ１０（アルファ−Ａベータ１−１６，シグネット・パソロジー・システムズ（Ｓｉｇｎｅｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ））およびｍａｂ４Ｇ８（アルファ−Ａベータ１７−２４、シグネット・パソロジー・システムズ）を免疫沈降に用いた。試料を１０〜２０％勾配ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）トリス−トリシンゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で分離し、およびプロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）ＢＡ７９硝酸セルロース膜（０．１μｍ、シュライヒャー・シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ／Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ドイツ・ダッセル（Ｄａｓｓｅｌ））へブロットした。ベータ−アミロイドの検出は、記載の通り（イダ（Ｉｄａ）ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６，２７１：２２９０８−１４）、ｍａｂ６Ｅ１０およびヤギ抗マウスペルオキシダーゼ結合二次抗体（ディアノバ）を用いて実施した。
【０１０４】
遺伝子導入ショウジョウバエにおけるヒトＳＵＬＴ４Ａ１発現の検出については、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ反応）反応を、本発明に記載の通り（実施例（ｉｖ））ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１特異的プライマーを用いて実施した。
【０１０５】
遺伝子導入ハエにおけるヒトＡＰＰ（ベータ−アミロイド前駆体タンパク質、ｈＡＰＰ）のアミロイド形成過程に伴う神経病理に及ぼすヒトＳＵＬＴ４Ａ１発現の潜在的影響を特徴づけるため、眼特異的ＧＡＬ４系統ｇｍｒ−ＧＡＬ４を用いることによって、成体網膜でＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１をｈＡＰＰおよびヒトＢＡＣＥ（ベータ位ＡＰＰ切断酵素、ｈＢＡＣＥ）と同時発現させた。ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下のＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の遺伝子導入発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって、スプライス変異体１特異的プライマーを用いて確認された。ＰＣＲ反応は、図２２Ａに示す通り、予想された融点およびサイズの断片を結果として生じた。３つの異なる遺伝子導入ハエ系統を用いた（ＳＵＬＴ４ｓｖＡ１＃３、＃８および＃２２）。発現効率における相対差はサイクル数に従って計算し（図２２Ｂ）およびハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。この計算に基づいて、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１遺伝子導入ハエ系統＃３はハエ系統＃８よりも１．８倍強く、およびハエ系統＃２２よりも２．７倍強く発現される（図２２Ｂ）。
【０１０６】
ショウジョウバエの成体網膜におけるｈＡＰＰおよびｈＢＡＣＥの発現は、光受容体細胞の加齢依存性変性に繋がる（グリーブ（Ｇｒｅｅｖｅ）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）。ＳＵＬＴ４Ａ１の同時発現は、若齢（図２３ＡおよびＢ、３日齢）および老齢ハエ（図２３ＡおよびＢ、８および１９日齢ハエ）において、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１導入遺伝子の発現効率に依存して、光受容体細胞変性を救済する。ＲＴ−ＰＣＲ反応に従って計算された最高の発現効率を示すハエ系統ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３（図２３Ａ）は、若齢および老齢ハエにおける変性表現型の顕著な救済に繋がる一方、ハエ系統ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８（図２３Ｂ）は弱くしか救済せず、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１（図２３Ｃ）はｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ｈＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１３遺伝子導入ハエにおいて変性表現型に干渉を示さない。Ｎｏｎｅｏｆｔｈｅ遺伝子導入ハエ系統のいずれも、ｇｍｒ−ＧＡＬ４単独の調節下で発現された場合、光受容体細胞の適切な構築および分化に干渉しない（図２３Ａ〜Ｂ、１列目）。
【０１０７】
ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ発現ハエにおける光受容体細胞変性に及ぼすＳＵＬＴ４Ａ１の神経保護作用をさらに特徴づけるため、我々は３遺伝子導入ハエにおけるｈＡＰＰの発現およびプロセシングを調査し、および我々のモデル系でＡＰＰに関連する神経病理に最高の影響を示すＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３の同時発現に焦点を当てた。ヒトＡＰＰＮ末端抗体２２Ｃ１１でプロービングした、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥを発現するハエおよびｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３を発現するハエの頭部ホモジネートのウェスタンブロットは、ｈＡＰＰ完全長タンパク質の発現もベータ位切断も、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３の同時発現によってもたらされないことを実証する（図２４Ｂ）。加えて、アミロイド形成性ペプチドＡベータの生成は、ＡベータＮ末端特異的抗体６Ｅ１０を用いた免疫沈降実験で実証される通り、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１を同時発現することによってもたらされない（図２３Ｂ参照）。
【０１０８】
ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ発現ハエの網膜におけるアミロイド斑沈着は、プレセニリンの突然変異型の同時発現によって加速される（グリーブ（Ｇｒｅｅｖｅ）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）。したがって、我々はチオフラビンＳ陽性アミロイド斑の発生を、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎｌ＿２３５Ｐを発現するハエで調べ、およびｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎｌ＿２３５ＰおよびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３を発現するハエと比較した。図２５に示す通り、対照ハエと、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３を同時発現するハエとの間に、斑沈着の開始の時間に差は観察されなかった。このように、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３の神経保護作用は、アルツハイマー病のこの非脊椎動物モデル系において、ｈＡＰＰの発現およびアミロイド形成プロセシングまたはアミロイド斑形成に依存しない。上記の通りの前記分析を図２３、２４および２５に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ画面におけるＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の発現差の最初の特定を開示する。図は、大調製用蛍光ディファレンシャル・ディスプレイゲルの切り抜きを示す。対照健常者２名およびＡＤ患者６名の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）に由来するＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲルに２連で負荷した（左から右へ）。ＰＣＲ産物は、対応する一塩基アンカーオリゴヌクレオチドおよび特異的Ｃｙ３標識化ランダムプライマーを用いた、個々のｃＤＮＡの増幅によって得られた。矢印は、前頭皮質に由来するＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の転写産物についてのシグナルの強度に、ＡＤ患者の側頭皮質に由来するシグナルと比較して、および対照健常者と比較して、有意差が存在する移動位置を示す。その発現差は、ＡＤ患者の前頭皮質と比較した、および非ＡＤ対照の側頭皮質と比較した、側頭皮質におけるＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子転写のダウンレギュレーションを反映する。非ＡＤ対照健常者の側頭皮質および前頭皮質に由来するシグナルを互いに比較して、シグナル強度に差、すなわち発現レベルの変化は検出できない。
【図２】図２および３は、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の、特にＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２の発現差をＡＤ脳組織において、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって図示する。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料（図２ａ）、およびＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）に由来する試料（図３ａ）からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクリング法によって実施した。同様に、対応する年齢の対照健常者の試料を比較した（図２ｂは前頭皮質および側頭皮質、図３ｂは前頭皮質および海馬）。データは、遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子の組の平均値の組み合わせについて正規化した。前記標準遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から成った。図は、蛍光によって測定された増幅された物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の動力学を示す。反応の指数期の間、対照健常者の前頭皮質および側頭皮質、および対照健常者の前頭皮質および海馬、のそれぞれ両方に由来するＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２ｃＤＮＡの増幅動力学は並列しており（図２ｂおよび３ｂ、矢印）、一方、アルツハイマー病では（図２ａおよび３ａ、矢印）対応する曲線の有意な分離があり、分析した脳領域のそれぞれでＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の、特にＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２の発現の差を示し、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の転写産物の、特にＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２、またはその断片、または誘導体、または変異体の、側頭皮質において前頭皮質と相対的な、および海馬において前頭皮質と相対的な、調節障害、好ましくはダウンレギュレーションを示すことに注意する。
【図３】図２および３は、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の、特にＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２の発現差をＡＤ脳組織において、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって図示する。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料（図２ａ）、およびＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）に由来する試料（図３ａ）からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクリング法によって実施した。同様に、対応する年齢の対照健常者の試料を比較した（図２ｂは前頭皮質および側頭皮質、図３ｂは前頭皮質および海馬）。データは、遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子の組の平均値の組み合わせについて正規化した。前記標準遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から成った。図は、蛍光によって測定された増幅された物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の動力学を示す。反応の指数期の間、対照健常者の前頭皮質および側頭皮質、および対照健常者の前頭皮質および海馬、のそれぞれ両方に由来するＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２ｃＤＮＡの増幅動力学は並列しており（図２ｂおよび３ｂ、矢印）、一方、アルツハイマー病では（図２ａおよび３ａ、矢印）対応する曲線の有意な分離があり、分析した脳領域のそれぞれでＳＵＬＴ４Ａ１をコードする遺伝子の、特にＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２の発現の差を示し、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の転写産物の、特にＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２、またはその断片、または誘導体、または変異体の、側頭皮質において前頭皮質と相対的な、および海馬において前頭皮質と相対的な、調節障害、好ましくはダウンレギュレーションを示すことに注意する。
【図４】図４および５は、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の発現差を、ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１）について特異的に（図４）およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２）について特異的に（図５）、ＡＤ脳組織において定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって図示する。ＲＴ−ＰＣＲ産物ｆｒｏｍＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量（図４ａおよび５ａ）は、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクル法によって実施した。同様に、対応する年齢の対照健常者の試料を比較した（図４ｂおよび５ｂ）。データは、遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子の組の平均値の組み合わせについて正規化した。前記標準遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から成った。図は、蛍光によって測定された増幅された物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の動力学を示す。反応の指数期の間、対照健常者の前頭皮質および側頭皮質に由来するＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１ｃＤＮＡのおよびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２ｃＤＮＡの増幅動力学はそれぞれ並列しており（図４ｂおよび５ｂ、矢印）、一方、アルツハイマー病では（図４ａおよび５ａ、矢印）対応する曲線の有意な分離があり、分析した脳領域のそれぞれでＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１（図４）およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２（図５）をコードする遺伝子の発現の差を示し、さらに、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の転写産物の、側頭皮質において前頭皮質と相対的な、調節障害、好ましくはダウンレギュレーションを示すことに注意する。
【図５】図４および５は、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子の発現差を、ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１）について特異的に（図４）およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２）について特異的に（図５）、ＡＤ脳組織において定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって図示する。ＲＴ−ＰＣＲ産物ｆｒｏｍＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量（図４ａおよび５ａ）は、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクル法によって実施した。同様に、対応する年齢の対照健常者の試料を比較した（図４ｂおよび５ｂ）。データは、遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子の組の平均値の組み合わせについて正規化した。前記標準遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から成った。図は、蛍光によって測定された増幅された物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の動力学を示す。反応の指数期の間、対照健常者の前頭皮質および側頭皮質に由来するＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１ｃＤＮＡのおよびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２ｃＤＮＡの増幅動力学はそれぞれ並列しており（図４ｂおよび５ｂ、矢印）、一方、アルツハイマー病では（図４ａおよび５ａ、矢印）対応する曲線の有意な分離があり、分析した脳領域のそれぞれでＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１（図４）およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２（図５）をコードする遺伝子の発現の差を示し、さらに、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の転写産物の、側頭皮質において前頭皮質と相対的な、調節障害、好ましくはダウンレギュレーションを示すことに注意する。
【図６】図６および７は、９８％信頼レベルでの中央値の統計手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の（図６）および特異的にＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の（図７）絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０から１、ブラーク病期０から２、またはブラーク病期０から３のいずれかの被験者を含む対照群を定義することによって計算し、ブラーク病期２から６、ブラーク病期３から６およびブラーク病期４から６をそれぞれ含む定義されたＡＤ患者群について計算されたデータと比較する。加えて、ブラーク病期０から１、ブラーク病期２から３およびブラーク病期４から６のどれかの被験者をそれぞれ含む３群を互いに比較した。ＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質（Ｆ）と下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して有意差が検出された。前記の差は、ＡＤ患者の側頭皮質における、対照者の側頭皮質と相対的なＳＵＬＴ４Ａ１の強いダウンレギュレーション、およびＡＤ患者の側頭皮質における、ＡＤ患者の前頭皮質と比較したＳＵＬＴ４Ａ１のダウンレギュレーションを反映する。その差はまた、ＡＤ患者の前頭皮質における、対照群被験者の前頭皮質と比較したＳＵＬＴ４Ａ１のダウンレギュレーションを反映する。ブラーク病期はＡＤ疾患の進行過程と相関し、進行過程は本発明で示す通り、ＳＵＬＴ４Ａ１の調節、レベルおよび活性の漸増する差と上記の通り関連する。前記の有意差は、ブラーク病期３ですでに観察された。
【図７】図６および７は、９８％信頼レベルでの中央値の統計手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の（図６）および特異的にＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の（図７）絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０から１、ブラーク病期０から２、またはブラーク病期０から３のいずれかの被験者を含む対照群を定義することによって計算し、ブラーク病期２から６、ブラーク病期３から６およびブラーク病期４から６をそれぞれ含む定義されたＡＤ患者群について計算されたデータと比較する。加えて、ブラーク病期０から１、ブラーク病期２から３およびブラーク病期４から６のどれかの被験者をそれぞれ含む３群を互いに比較した。ＡＤ患者のおよび対照者の前頭皮質（Ｆ）と下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して有意差が検出された。前記の差は、ＡＤ患者の側頭皮質における、対照者の側頭皮質と相対的なＳＵＬＴ４Ａ１の強いダウンレギュレーション、およびＡＤ患者の側頭皮質における、ＡＤ患者の前頭皮質と比較したＳＵＬＴ４Ａ１のダウンレギュレーションを反映する。その差はまた、ＡＤ患者の前頭皮質における、対照群被験者の前頭皮質と比較したＳＵＬＴ４Ａ１のダウンレギュレーションを反映する。ブラーク病期はＡＤ疾患の進行過程と相関し、進行過程は本発明で示す通り、ＳＵＬＴ４Ａ１の調節、レベルおよび活性の漸増する差と上記の通り関連する。前記の有意差は、ブラーク病期３ですでに観察された。
【図８】図８は、配列番号１、すなわち２８４アミノ酸を含むヒトＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号０４３７２８）のアミノ酸配列を開示する。
【図９】図９は、配列番号２、すなわち１７１アミノ酸を含むヒトＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２のポリペプチド配列を開示する。タンパク質ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号０４３７２８）の１１４アミノ酸（アミノ酸５７から１７０）を欠き、および配列番号２の５７位に追加のアミノ酸を有する点で、ＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１と異なる。
【図１０】図１０は、配列番号３、すなわち２４１９ヌクレオチドを含むヒトＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡスプライス変異体１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２）のヌクレオチド配列を表す。
【図１１】図１１は、配列番号４、すなわち２０８０ヌクレオチドを含むヒトＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡスプライス変異体２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２、ＥＳＴ ｂｉ５５０４８３およびｂｍ８０５３５３で表されるヌクレオチド１９０から５２８を欠く）のヌクレオチド配列を表す。
【図１２】図１２は、配列番号５、すなわち、蛍光ディファレンシャル・ディスプレイおよび続いてのクローニングによって特定されおよび得られた、３２ｂｐのＳＵＬＴ４Ａ１ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す（５'から３'方向の配列）。
【図１３】図１３は、配列番号６のヌクレオチド配列、すなわち、８５５ヌクレオチドを含み配列番号３のヌクレオチド２１から８７５を有する、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子のコード配列（ｃｄｓ）を示す。
【図１４】図１４は、配列番号５すなわち３２ｂｐのヒトＳＵＬＴ４Ａ１ｃＤＮＡ断片の、ヒトＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６３４２、配列番号３、ヌクレオチド２３３５から２３６６）およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体２ｃＤＮＡ（配列番号４、ヌクレオチド１９９６から２０２７）のヌクレオチド配列との配列整列の概要を示す。
【図１５】図１５および１６は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはｓｖ２について１．２７〜７．１４倍、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１単独について１．１０〜１６．６７倍；下記の式に従った逆数値）で特定されるＡＤ患者１５名、および内部参照番号Ｃ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはｓｖ２について０．４２〜２．５倍、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１単独について２．８９〜３．３３倍；下記の式に従った逆数値）で特定される対応する年齢の対照者２５名での、側頭皮質における前頭皮質と相対的なＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の発現レベル（図１５）および特にＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の発現レベル（図１６）を列記する。それぞれ、側頭皮質におけるアップレギュレーションについては、表示の数値は本明細書に記載の式（下記参照）に従って計算し、および前頭皮質におけるアップレギュレーションの場合は、逆数値を計算した。棒グラフは、異なるブラーク病期（０から６）における側頭皮質の前頭皮質に対する自然対数値ｌｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質調節因子に対する前頭皮質の自然体数値ｌｎ（ＩＦ／ＩＴ）を視覚化する。
【図１６】図１５および１６は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはｓｖ２について１．２７〜７．１４倍、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１単独について１．１０〜１６．６７倍；下記の式に従った逆数値）で特定されるＡＤ患者１５名、および内部参照番号Ｃ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７（ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはｓｖ２について０．４２〜２．５倍、およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１単独について２．８９〜３．３３倍；下記の式に従った逆数値）で特定される対応する年齢の対照者２５名での、側頭皮質における前頭皮質と相対的なＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１および／またはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ２の発現レベル（図１５）および特にＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１の発現レベル（図１６）を列記する。それぞれ、側頭皮質におけるアップレギュレーションについては、表示の数値は本明細書に記載の式（下記参照）に従って計算し、および前頭皮質におけるアップレギュレーションの場合は、逆数値を計算した。棒グラフは、異なるブラーク病期（０から６）における側頭皮質の前頭皮質に対する自然対数値ｌｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質調節因子に対する前頭皮質の自然体数値ｌｎ（ＩＦ／ＩＴ）を視覚化する。
【図１７】図１７は、ＳＵＬＴ４Ａ１遺伝子（スプライス変異体１および／またはスプライス変異体ｓｖ２）について、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１９（０．１３から１．３７倍）で特定されるアルツハイマー病患者６名、および内部参照番号Ｇ００４、Ｃ００５、Ｃ００８（０．５６から０．８２倍）で特定される対応する年齢の対照者３名における、海馬における前頭皮質と相対的な遺伝子発現レベルを列記する。表示の数値は本明細書に記載の式（下記参照）に従って計算される。散布図は、それぞれ対照試料（点）における、およびＡＤ患者試料（三角）における、前頭皮質に対する海馬の調節比の個々の対数値（ｌｏｇ（比ＨＣ／ＩＦ））を視覚化する。
【図１８】図１８は、Ｈ４ＡＰＰｓｗ対照細胞およびｍｙｃ−タグ化ＳＵＬＴ４Ａ１タンパク質を安定に過剰発現するＨ４ＡＰＰｓｗ細胞（Ｈ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ）の免疫蛍光分析を示す。ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃタンパク質は、ウサギ抗ｍｙｃ抗体（モビテック（Ｍｏｂｉｔｅｃ））およびＣｙ３結合抗ウサギ抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いて検出した（図１８ＡおよびＢ）。細胞核はＤＡＰＩで染色した（図１８ＣおよびＤ）。オーバーレイ分析は、ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃタンパク質は細胞質に局在し（図１８Ｅ）、およびＨ４ＡＰＰｓｗ対照細胞と比較してＨ４ＡＰＰｓｗ−ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃ形質導入細胞の５０％より多くで過剰発現されることを示す（図１８Ｆ）。
【図１９】図１９は、ＳＵＬＴ４Ａ１−ｍｙｃタンパク質の過剰発現が、Ｈ４−ＡＰＰｓｗ細胞をＨ４ＡＰＰｓｗ対照細胞よりも、栄養因子欠乏に高耐性にすることを示す。両方の細胞型は、０から７．５％の範囲の血清濃度を含む細胞培地中で４０時間インキュベートされている。栄養因子欠乏への細胞応答は、酸化還元指示薬アラーマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）（バイオソース（（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ））を用いおよび相対蛍光（ＲＦＵ）を測定することによって判定した。％毒性は下記に示す式に従って計算した（実施例（ｖｉ））。グラフは、２回の独立した実験から得られた毒性計算の平均値を表す。
【図２０】図２０は、ＳＵＬＴ４Ａ１欠損（ノックアウト）マウスを作製するために用いられたターゲッティング戦略を模式的に示す。マウスＳｕｌｔ４Ａ１遺伝子は、ローマ数字（Ｉ〜ＶＩＩ）付きの四角で示す７個のエクソンから成る。ターゲッティングベクターは、約２．９ｋｂの短ホモロジーアーム配列（ＳＡ）および約７ｋｂの長ホモロジーアーム配列（ＬＡ）から成る。Ｎｅｏカセット（Ｐｇｋプロモーターによって動作するネオマイシン耐性遺伝子）がエクソン２に挿入され、Ｓｕｌｔ４Ａ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３、４および５の主要部分を置換する。Ｎｅｏ選択マーカーは、ＦＲＴ部位（ＦＬＰリコンビナーゼの認識部位）に隣接され、必要に応じて、ＮｅｏカセットのＦＬＰリコンビナーゼ（部位特異的リコンビナーゼ）による除去を可能にする。Ｎｅｏカセットの３'位で、スプライス受容体およびポリＡシグナル配列（ｐＡ）が、選択マーカーが除去された際に転写産物の終止を保証する。Ｐｇｋ（構成性マウスホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター）、Ｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）
【図２１】図２１は、ヒトＳｕｌｔ４Ａ１を発現する遺伝子導入マウスを作製するために用いられたターゲッティング戦略を模式的に示す。ターゲッティングベクターは、導入遺伝子をＲｏｓａ２６遺伝子座（マウスＲｏｓａベータｇｅｏ２６遺伝子）へ組み込むために、導入遺伝子およびＲｏｓａ２６ホモロジー配列から成る。短ホモロジーアーム配列（ＳＡ）は約１．１ｋｂから成り、長ホモロジーアーム配列（ＬＡ）は約４．３ｋｂから成る。Ｒｏｓａ２６遺伝子の３個のエクソンをローマ数字（Ｉ〜ＩＩＩ）で示す。導入遺伝子は、脳特異的Ｔｈｙ１．２遺伝子の調節配列を含むマウスＴｈｙ１．２発現カセットに位置するヒトＳｕｌｔ４Ａ１（ＯＲＦＳＵＬＴ４Ａ１）のオープン・リーディング・フレームから成る。導入遺伝子の５'端にネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）およびスプライス受容体が位置し、内因性Ｒｏｓａ２６遺伝子由来のＲｏｓａプロモーターによって動作するＮｅｏ選択マーカーの発現を可能にする。Ｎｅｏマーカーの３'端のポリＡシグナル（ｐＡ）が転写を停止する。
【図２２】図２２は、３つの異なるＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１遺伝子導入ハエ系統における、ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下にあるＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１発現の検出を、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって示す。使用した遺伝子型は：ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃２２／＋；ｇｍｒＧＡＬ４／＋。野生型およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１発現ハエのＲＴ−ＰＣＲ産物の融点を図２２Ａに図示する。図２２Ｂは、３つの異なるＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１発現ハエ系統の発現効率の比較を示す。効率はサイクル数、およびＳＵＬＴ４Ａ１スプライス変異体１特異的プライマー対のＲＴ−ＰＣＲ反応の効率に従って計算する。測定は各遺伝子型について３連で実施した。使用した遺伝子型は：ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃２２／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋。
【図２３】ＳＵＬＴ４Ａ１は、ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下にあるｈＡＰＰおよびｈＢＡＣＥを発現するハエにおいて光受容体細胞変性を救済する。１０μｍクリオスタット（Ｃｒｙｏｓｔａｔ）成体脳切片を、光受容体細胞特異的抗体２４Ｂ１０を用いて、羽化の３、８、１６および１９日後に染色した。ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３（図２３Ａ）およびＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８（図２３Ｂ）の発現は、網膜の直径（白矢印）によって判定される通り光受容体細胞変性を救済し、一方、ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃２２は変性表現型に対して効果を示さなかった（図２３Ｃ）。ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下にあるＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３、＃８および＃２２だけの発現は野生型である（図２３Ａ、ＢおよびＣの左列）。使用した表現型は：ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３／ｇｍｒ−ＧＡＬ４−ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８／ｇｍｒ−ＧＡＬ４−ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃２２／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋−ｗ；ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ、ＵＡＳ−ｈＡＰＰ／＋；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３／ｇｍｒ−ＧＡＬ４−ｗ；ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ、ＵＡＳ−ｈＡＰＰ／＋；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃８／ｇｍｒ−ＧＡＬ−ｗ；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃２２／ｈＡＰＰ、ｈＢＡＣＥ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋；Ｒｅ：網膜；Ｌａ：薄層；Ｍｅ：髄質。
【図２４】図２４は、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥまたはＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３と組み合わせて発現しているハエの頭部ホモジネートのウェスタンブロットを図示する（図２４Ａ）。各レーンには等量のタンパク質が負荷された。ブロットは抗ｈＡＰＰ Ｎ末端特異的抗体２２Ｃ１１を用いてプロービングした。抗体はｈＡＰＰの完全長およびＡベータ切断Ｎ末端断片を検出する。ウェスタンブロット上での沈降および検出のためのＡベータＮ末端特異的抗体６Ｅ１０を用いた免疫沈降を図２４Ｂに示す。Ａベータペプチドは主にオリゴマー型で検出される。
【図２５】ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎｌ＿２３５ＰまたはｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３（星印で表示）を発現するハエの網膜を通るパラフィン切片上のチオフラビンＳ陽性斑。対照ハエとｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎｌ＿２３５Ｐ／ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３発現ハエの間に斑形成の開始に差は検出されなかった、ｗ；ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ、ＵＡＳ−ｈＡＰＰ／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ、ＵＡＳ−ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／＋およびｗ；ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ、ＵＡＳ−ｈＡＰＰ／＋；ＵＡＳ−ＳＵＬＴ４Ａ１ｓｖ１＃３／ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−Ｄｐｓｎｌ２３５Ｐ。
【図８】
2007508810.tif 000003
【図９】
2007508810.tif 000004
【図１０】
2007508810.tif 000005
【図１１】
2007508810.tif 000006
【図１２】
2007508810.tif 000007
【図１３】
2007508810.tif 000008
【図１４】
2007508810.tif 000009
【図１７】
2007508810.tif 000010
【図１９】
2007508810.tif 000011
【図１】
2007508810.tif 000012
【図２】
2007508810.tif 000013
【図３】
2007508810.tif 000014
【図４】
2007508810.tif 000015
【図５】
2007508810.tif 000016
【図６】
2007508810.tif 000017
【図７】
2007508810.tif 000018
【図１５】
2007508810.tif 000019
【図１６】
2007508810.tif 000020
【図１８】
2007508810.tif 000021
【図２０】
2007508810.tif 000022
【図２１】
2007508810.tif 000023
【図２２】
2007508810.tif 000024
【図２３】
2007508810.tif 000025
【図２４】
2007508810.tif 000026
【図２５】
2007508810.tif 000027
【国際調査報告】
2007508810.tif 000028
2007508810.tif 000029
2007508810.tif 000030
2007508810.tif 000031
2007508810.tif 000032