(57)【要約】  本発明は、ＬＤＣＡＭのアゴニストおよびアンタゴニスト、並びに１以上のＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストを投与することによって、疾患および感染を治療する方法に関する。この要約は、読者が技術的開示の主題を迅速に確かめる単一の目的のために提供され、そして請求項の範囲または意味を解釈するかまたは制限するのに用いられることは意図されない。３７ＣＦＲ１．７２（ｂ）。
2007500132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２の可変重鎖アミノ酸配列を含む、単離ＬＤＣＡＭ特異的結合剤。
【請求項２】
配列番号１３の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、単離ＬＤＣＡＭ特異的結合剤。
【請求項３】
配列番号１２の可変重鎖アミノ酸配列および配列番号１３の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、単離ＬＤＣＡＭ特異的結合剤。
【請求項４】
請求項１〜３記載の結合剤のいずれか１つおよび薬学的に許容しうるキャリアー、希釈剤または賦形剤を含む、薬剤組成物。
【請求項５】
ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭの結合に拮抗する方法であって、可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドがＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の結合を遮断するように、ＬＤＣＡＭを発現する細胞またはＣＲＴＡＭを発現する細胞を可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドに曝露することを含む、前記方法。
【請求項６】
ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭの結合に拮抗する方法であって、ＬＤＣＡＭ特異的抗体がＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の結合を遮断するように、ＬＤＣＡＭを発現する細胞をＬＤＣＡＭ特異的抗体に曝露することを含む、前記方法。
【請求項７】
ＬＤＣＡＭ結合性ＣＲＴＡＭの生物学的効果をアゴナイズする方法であって、ＣＲＴＡＭ特異的抗体がＣＲＴＡＭに結合し、そしてＣＲＴＡＭ受容体を活性化するように、ＣＲＴＡＭを発現する細胞をＣＲＴＡＭ特異的抗体に曝露することを含む、前記方法。
【請求項８】
ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭの結合に拮抗する方法であって、ＬＤＣＡＭ特異的抗体がＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の結合を遮断するように、ＬＤＣＡＭを発現する細胞をＬＤＣＡＭ特異的抗体に曝露することを含む、ここでＬＤＣＡＭ特異的抗体が請求項３記載の抗体である、前記方法。
【請求項９】
ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１３＋、ＢＤＣＡ３＋およびＬＤＣＡＭ＋樹状細胞表現型を含む、単離ヒト樹状細胞集団。
【請求項１０】
請求項９の樹状細胞集団をｉｎ  ｖｉｖｏで生成する方法であって、有効量のＦｌｔ３リガンドを被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項９の樹状細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで生成する方法であって、有効量のＦｌｔ３リガンドを、造血幹細胞および前駆細胞の培養物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項９の樹状細胞集団を単離する方法であって：
（ａ）被験者から樹状細胞を得て；
（ｂ）樹状細胞をＬＤＣＡＭ特異的抗体に曝露し、ここで該抗体は選択される樹状細胞表面上のＬＤＣＡＭに結合する；そして
（ｃ）ＬＤＣＡＭ特異的抗体が結合した樹状細胞を、ＬＤＣＡＭ特異的抗体を介して捕捉することによって、該細胞を単離する
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
被験者を抗原に曝露する方法であって：
（ａ）ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１３＋、ＢＤＣＡ３＋およびＬＤＣＡＭ＋樹状細胞表現型を含む樹状細胞を被験者から単離し；
（ｂ）（ａ）の樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで抗原に曝露し；そして
（ｃ）（ｂ）の樹状細胞を被験者に投与しなおす
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
抗原が癌抗原である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
癌抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
癌抗原がペプチドである、請求項１４の方法。
【請求項１７】
癌抗原が被験者由来のアポトーシス性癌細胞の型である、請求項１４の方法。
【請求項１８】
抗原がウイルス抗原である、請求項１３の方法。
【請求項１９】
抗原が細菌抗原である、請求項１３の方法。
【請求項２０】
抗原が単細胞生物由来である、請求項１３の方法。
【請求項２１】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関してスクリーニングする方法であって、（ａ）単離ＬＤＣＡＭポリペプチドと試験化合物を合わせることを含む、前記方法。
【請求項２２】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関してスクリーニングする方法であって
（ａ）ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞と試験化合物を合わせ；
（ｂ）単離ＣＲＴＡＭポリペプチドを添加し；そして
（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞およびＣＲＴＡＭポリペプチド間の相対的結合を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関してスクリーニングする方法であって
（ａ）ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞と試験化合物を合わせ；
（ｂ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞を添加し；そして
（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞およびＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞間の相対的結合を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２４】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関してスクリーニングする方法であって
（ａ）単離ＬＤＣＡＭポリペプチドと試験化合物を合わせ；
（ｂ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞を添加し；そして
（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチド、およびＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞間の相対的結合を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２５】
ＬＤＣＡＭアゴニストに関してスクリーニングする方法であって
（ａ）単離ＣＲＴＡＭポリペプチドと試験化合物を合わせ；そして
（ｂ）試験化合物およびＣＲＴＡＭポリペプチド間の相対的結合を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２６】
ＬＤＣＡＭアゴニストに関してスクリーニングする方法であって
（ａ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞を合わせ；そして
（ｂ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞および試験化合物間の相対的結合または生物学的効果を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２７】
可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドを含むＬＤＣＡＭアンタゴニストであって、該ＬＤＣＡＭポリペプチドがＣＲＴＡＭ受容体に結合するが該受容体を活性化しない、前記ＬＤＣＡＭアンタゴニスト。
【請求項２８】
配列番号２のアミノ酸３９〜３７４を含む、請求項２７のＬＤＣＡＭアンタゴニスト。
【請求項２９】
ＣＲＴＡＭポリペプチドに結合する、配列番号２のアミノ酸３９〜３７４の断片を含む、請求項２８のＬＤＣＡＭアンタゴニスト。
【請求項３０】
Ｔ細胞表面上のＣＲＴＡＭ受容体に結合し、該受容体を架橋し、そして活性化するＬＤＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質を含む、ＬＤＣＡＭアゴニスト。
【請求項３１】
Ｔ細胞表面上のＣＲＴＡＭ受容体に結合し、そして該受容体を活性化する抗体を含む、ＬＤＣＡＭアゴニスト。
【請求項３２】
炎症誘発性サイトカイン産生を減少させる必要がある被験者において、炎症誘発性サイトカイン産生を減少させる方法であって、ＬＤＣＡＭアゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
炎症誘発性サイトカインが、インターフェロン−ガンマおよびＩＬ−２からなるリストから選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＬＤＣＡＭアゴニストが、Ｆｃドメインに連結された、配列番号２のアミノ酸３９〜３７４を含む、請求項３２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、米国仮出願第６０／４９０，０２７号、２００３年７月２５日出願の優先権を主張する。
【０００２】
背景
１．発明の分野
本発明の態様は、一般的に、ＬＤＣＡＭのアゴニストおよびアンタゴニストとともに、１以上のＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストを投与することによって疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
ＬＤＣＡＭは、同種親和性細胞接着分子であり、１以上のＴ細胞表面分子と相互作用し、それにより細胞シグナル伝達の改変を引き起こすことによって、Ｔ細胞機能を調節することが示されている。ＬＤＣＡＭは、自己会合して、ホモ二量体を形成し、そしてＢ７Ｌ−１に結合することが示された。ＬＤＣＡＭはまた、ナチュラルキラー細胞集団の増加を生じることも示された。米国特許出願第０９／７７８，１８７号、２００１年２月６日出願は、ＬＤＣＡＭを記載し、そして本明細書に完全に援用される。
【０００４】
ＬＤＣＡＭはまた、当該技術分野において、Ｉｇｓｆ４、ＴＳＬＣ１、ＳｙｎＣＡＭおよびネクチン様２とも称され、そして免疫グロブリン様細胞表面受容体のネクチン様ファミリーのメンバーであり、そして３つのＣ２  Ｉｇ様ドメインを有すると性質決定されてきている。ネクチン様受容体の細胞質テールは、バンド−４．１タンパク質結合部位およびＰＤＺタンパク質結合部位を有する。ＬＤＣＡＭは、非小細胞肺癌で欠失し、そしてＮＣＡＭに相同性を有する、腫瘍抑制遺伝子と同定されてきている（Ｇｏｍｙｏら  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２：１３９−１４６（１９９９）およびＫｕｒａｍｏｃｈｉら  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２７（４）：４２７−３０（２００１）  Ｍａｓｕｄａら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７７（３４）：３１０１４−９（２００２））。
【０００５】
本明細書に記載するように、ＬＤＣＡＭがＣＲＴＡＭに結合することが発見されてきている。ＣＲＴＡＭは、細胞表面マーカーファミリーのメンバーと記載されてきており、Ｔ細胞において、拘束された発現パターンを有することから、初めはクラスＩ拘束Ｔ細胞会合分子（ＣＲＴＡＭ）と称された（米国特許第５，６８６，２５７号）。ｃＤＮＡライブラリー・サブトラクション技術によって、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞のサブセットである、活性化マウス・アルファベータＴＣＲ＋  ＣＤ４−ＣＤ８−（ダブルネガティブ）Ｔ細胞が、ｍＲＮＡ転写物を発現することが示された。ヒトＣＲＴＡＭもまた同定されてきており、そして該分子は、マウス分子と同じ発現パターンを共有する。ＬＰＴＮおよびＣＲＴＡＭが、Ｔ細胞において、同じ発現パターンを示すことから、クラスＩ−ＭＨＣ拘束Ｔ細胞に共通の遺伝子発現プログラムが存在することが示唆される（Ｋｅｎｎｅｄｙら，  Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏ  ６７，７２５（２０００））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の態様は、ＬＤＣＡＭのアンタゴニストおよびアゴニストを提供する。１つの態様において、ＬＤＣＡＭアゴニストおよびＬＤＣＡＭアンタゴニストはＬＤＣＡＭに結合する。別の態様において、ＬＤＣＡＭアゴニストおよびＬＤＣＡＭアンタゴニストは、限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよびＢ７Ｌ−１を含む、ＬＤＣＡＭの結合パートナーの１つと結合可能である。ＬＤＣＡＭアゴニストおよびアンタゴニストには、可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドとともに、その生物学的活性断片および変異体、融合タンパク質、誘導体等が含まれる。ＬＤＣＡＭアゴニストおよびアンタゴニストにはまた、ＬＤＣＡＭまたはその結合パートナーに対して向けられる、抗体、ペプチボディおよび細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）のすべての型も含まれる。
【０００７】
本発明の側面は、マウスＣＤ８α＋樹状細胞のヒト対応物である、ヒト樹状細胞の新規サブセット（ＢＤＣＡ３＋）の発見に関する。この樹状細胞サブセットは、これらが抗原交差提示、交差プライミング、そしてまた交差寛容の原因である点で、ユニークな免疫制御抗原提示細胞に相当する。
【０００８】
１つの特定の態様は、図６に提供する配列を有する抗体を含む。ＬＤＣＡＭ特異的ｓｃｆｖは、以下により詳細に記載するように、多様な態様の形を取ることも可能であり、これには、ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。
【０００９】
ＬＤＣＡＭの別の結合パートナーが発見されてきている。ＬＤＣＡＭは、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞上に高レベルで発現される、ＣＲＴＡＭに結合する。したがって、本発明の態様には、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭの相互作用または結合のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。
【００１０】
さらなる態様を以下に詳細に記載する。
発明の詳細な説明
１．  定義
ＬＤＣＡＭを以下のセクションに定義し、そして記載する。
ＣＲＴＡＭは、本明細書に完全に援用される、米国特許第５，６８６，２５７号に定義され、そして記載される。
【００１１】
「ＬＤＣＡＭ結合パートナー」または「ＬＤＣＡＭ同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）」は、ＬＤＣＡＭの同族体であり、そして限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集または会合−シスおよび／またはトランスによる）、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７Ｌ−１（Ｎｅｃｌ−１）およびＢ７Ｌ−４（ネクチン−３）が含まれる。
【００１２】
用語「生物学的活性」は、ＬＤＣＡＭに関する場合、ＬＤＣＡＭが以下の活性の１以上を実行可能であることを意味する：ＬＤＣＡＭとＬＤＣＡＭの結合（ホモタイプ会合−シスおよび／またはトランスによるなど）；ＣＲＴＡＭへの結合；Ｂ７Ｌ−１への結合；Ｂ７Ｌ−４（ネクチン−３）への結合；活性化および増殖の防止などの、Ｔ細胞活性の調節；限定されるわけではないが、インターフェロン−ガンマおよびＩＬ−２などの炎症誘発性サイトカインの放出の減少；活性化刺激へのＴ細胞応答の調節；ＣＤ３刺激／活性化へのＴ細胞応答の調節；マイトジェン刺激／活性化へのＴ細胞応答の調節；ＮＫ−Ｔ細胞活性の調節；ＮＫ細胞活性の調節；Ｂ細胞活性の調節；限定されるわけではないが、ＩＬ−２、ＩＮＦ−ガンマおよび他の炎症誘発性サイトカインなどの、免疫細胞によるサイトカイン発現の調節；抗原提示細胞およびＴ細胞間の活性の調節；樹状細胞およびＴ細胞間の活性の調節；ＢＤＣＡ３＋樹状細胞およびＴ細胞間の活性の調節；抗原提示細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の活性の調節；樹状細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の活性の調節；ＢＤＣＡ３＋樹状細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の活性の調節；抗原提示細胞およびＮＫ細胞間の活性の調節；樹状細胞およびＮＫ細胞間の活性の調節；ＢＤＣＡ３＋樹状細胞およびＮＫ細胞間の活性の調節；ニューロンおよびＴ細胞間の活性の調節；ニューロンおよびＮＫ−Ｔ細胞間の活性の調節；並びにニューロンおよびＮＫ細胞間の活性の調節。
【００１３】
受容体を活性化する、または受容体の活性化は、本明細書において、限定されるわけではないが、受容体：リガンド相互作用などの膜結合受容体への分子結合に反応した、１以上の細胞内シグナル伝達経路（単数または複数）および細胞内シグナルの伝達（すなわちシグナル伝達）の関与と定義される。
【００１４】
「シグナル伝達」は、本明細書において、１つの物理的型または化学的型から別のものへの変換によるシグナルのリレーである。細胞生物学においては、細胞が細胞外シグナルを反応に変換するプロセスである。
【００１５】
「ペプチボディ」は、一般的に、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部および少なくとも１つのペプチドを含む分子を指す。こうしたペプチボディは、その多量体または二量体または断片であることも可能であり、そしてこれらは誘導体化されていることも可能である。ペプチボディは、当該技術分野に知られ、そして本明細書に完全に援用されるＷＯ  ９９／２５０４４およびＷＯ  ００／２４７８２により詳細に記載される。ペプチドは、ＬＤＣＡＭ  Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭのアミノ酸配列由来であることも可能である。
【００１６】
「ペプチド」は、本明細書において、１〜１００アミノ酸の分子を指す。別の態様は、５〜２０アミノ酸の分子を含む。典型的なペプチドは、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭの天然存在分子の細胞外ドメインの一部を含むか、あるいはこれらのランダム化配列を含む。
【００１７】
用語「ランダム化」は、ペプチド配列を指す場合、完全ランダム配列（例えばファージディスプレイ法またはＲＮＡ−ペプチドスクリーニングによって選択されるもの）、および天然存在分子の１以上の残基が天然存在分子のその位に現れないアミノ酸残基で置換された配列を指す。ペプチド配列を同定する典型的な方法には、ファージディスプレイ、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学薬品スクリーニング等が含まれる。
【００１８】
用語「Ｆｃドメイン」は、天然ＦｃおよびＦｃ変異体分子および以下に定義する配列を含む。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃの場合、用語「Ｆｃドメイン」には、完全抗体から消化されたかまたは他の手段によって産生された、単量体型または多量体型の分子が含まれる。
【００１９】
用語「天然Ｆｃ」は、完全抗体の消化から生じる、非抗原結合断片の配列を含む、単量体型または多量体型いずれかの分子または配列を指す。天然Ｆｃの元来の免疫グロブリン供給源は、好ましくは、ヒト起源であり、そして免疫グロブリンのいずれであることも可能であるが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃは、単量体ポリペプチドで構成され、共有結合（すなわちジスルフィド結合）および非共有結合によって連結されて、二量体型または多量体型になることも可能である。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：４０７１−９を参照されたい）。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書において、単量体型、二量体型、および多量体型の総称である。
【００２０】
用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎの結合部位をなお含む、分子または配列を指す。国際出願ＷＯ  ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公表）およびＷＯ  ９６／３２４７８は、典型的なＦｃ変異体とともに、サルベージ受容体との相互作用を記載し、そして本明細書に完全に援用される。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要でない構造的特徴または生物学的活性を提供するために取り除くことも可能な部位を含む。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択される宿主細胞との不適合、（３）選択される宿主細胞における発現に際する、Ｎ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすか、または関与する、１以上の天然Ｆｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む。Ｆｃ変異体を、これ以降、より詳細に記載する。
【００２１】
「ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」は、原型天然ペプチドより好ましい薬理学的特性、例えばａ）代謝安定性、ｂ）優れた生物学的利用能、ｃ）高い受容体親和性および受容体選択性、並びにｄ）最小限の副作用を示すペプチド類似体（ａｎａｌｏｇ）である。ペプチド擬似体を設計し、そして該擬似体を産生する方法は、当該技術分野に知られる（例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．  ６，４０７，０５９および６，４２０，１１８を参照されたい）。ペプチド擬似体は、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭの細胞外ドメインの結合部位に由来することも可能である。別の態様において、ペプチド擬似体は、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭ由来のペプチドと同じ三次元構造を有する非ペプチド化合物、あるいは上に列挙する分子由来のペプチドの一部が、同じ三次元構造を有する非ペプチド部分で置換されている化合物を含む。
【００２２】
「ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）」は、本明細書において、タンパク質上の結合部位を模倣するペプチド配列と定義される（Ｐａｒｔｉｄｏｓ，  ＣＤら，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  ２００２  ５：１５−２７を参照されたい）。ミモトープは、タンパク質のコンホメーションに依存する結合部位を模倣する能力を有することも可能である。これらのミモトープの配列は、連続する直鎖天然配列を同定しないか、または必ずしも天然存在タンパク質で生じない。ミモトープおよび産生法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，８７７，１５５およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，９９８，５７７に解説され、これらは本明細書に完全に援用される。
【００２３】
用語「酸性残基」は、酸性基を含む側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な酸性残基にはＤおよびＥが含まれる。
用語「アミド残基」は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な残基にはＮおよびＱが含まれる。
【００２４】
用語「芳香族残基」は、芳香族基を含む側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な芳香族残基にはＦ、Ｙ、およびＷが含まれる。
用語「塩基性残基」は、塩基性基を含む側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な塩基性残基にはＨ、Ｋ、およびＲが含まれる。
【００２５】
用語「親水性残基」は、極性基を含む側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な親水性残基にはＣ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、およびＱが含まれる。
用語「非官能性残基」は、酸性基、塩基性基、または芳香族基を欠く側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な非官能性アミノ酸残基にはＭ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌおよびノルロイシン（Ｎｌｅ）が含まれる。
【００２６】
用語「中性疎水性残基」は、塩基性基、酸性基、または極性基を欠く側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な中性疎水性アミノ酸残基にはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、およびＦが含まれる。
【００２７】
用語「極性疎水性残基」は、極性基を含む側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な極性疎水性アミノ酸残基にはＴ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、およびＮが含まれる。
【００２８】
用語「疎水性残基」は、塩基性基または酸性基を欠く側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な疎水性アミノ酸残基にはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、およびＮが含まれる。
【００２９】
用語「被験者」は、本明細書において、哺乳動物を指す。例えば、本発明に意図される哺乳動物には、ヒト；霊長類；イヌ、ネコなどのすべての種類のペット；ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等の家畜動物；マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの一般的な実験動物；それとともに、動物園におけるような捕獲された動物または自由な野生動物が含まれる。本明細書全体を通じて、用語、宿主は、被験者と交換可能に用いられる。
【００３０】
「単離された」は、ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはＬＤＣＡＭアゴニストが、他のタンパク質またはポリペプチドと会合していないことを意味し、例えば組換え宿主細胞培養物の精製産物のようなものまたは精製抽出物のようなものである。
【００３１】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに単数形を指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって例えば、「免疫（ａｎ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」には、複数のこうした免疫が含まれ、そして「細胞（ｔｈｅ  ｃｅｌｌ）」への言及には、１以上の細胞および当業者に知られるその同等物への言及が含まれるなどである。本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、明らかに異なって示されない限り、本発明が属する当該技術分野の一般的な当業者に、一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００３２】
明確にするため、用語を説明の適切な文脈に維持するために、他の定義は明細書全体に提供される。
本発明の多様な態様は、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、構築物、および試薬に限定されず、これはこうしたものが多様であることも可能であるためである。本明細書に用いる専門用語は、特定の態様を説明する目的のみのものであり、そして本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、付随する請求項のみによって限定されるであろう。
【００３３】
２．  ＬＤＣＡＭのアゴニストおよびアンタゴニスト
「アンタゴニスト」は、本明細書において、２つの同族体の結合を部分的にまたは完全に遮断し、それによって同族体の相互作用の下流生物学的効果を阻害する分子である。例えば、アンタゴニストは、受容体へのリガンドの結合を遮断することも可能であり、次に、その受容体の活性化を介する細胞内シグナル伝達を減少させ、そして／または防止し、次に、その受容体の活性化の下流生物学的効果、例えば限定されるわけではないが、細胞活性化、増殖、分化、サイトカイン放出、遺伝子の上方制御、タンパク質の細胞表面発現等を減少させるかまたは防止する。もちろん、アンタゴニストは、接着分子などの他の型の同族体の相互作用を遮断することも可能である。
【００３４】
したがって、「ＬＤＣＡＭアンタゴニスト」は、１以上のＬＤＣＡＭ生物学的活性に拮抗する分子である。ＬＤＣＡＭアンタゴニストには、限定されるわけではないが：１以上のＬＤＣＡＭ結合パートナー（限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７Ｌ−４、および／またはＢ７Ｌ−１など）へのＬＤＣＡＭの結合を部分的にまたは完全に遮断する、ＬＤＣＡＭ特異的抗体、ＬＤＣＡＭ特異的ペプチボディ、またはＬＤＣＡＭに結合する可溶性ポリペプチド（ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７Ｌ−４、およびＢ７Ｌ−１ポリペプチドなど）である。ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の結合を遮断するＬＤＣＡＭアンタゴニストは、ＣＲＴＡＭに結合し、そしてＣＲＴＡＭ受容体を架橋するなどによって、ＣＲＴＡＭを活性化することがない。さらなる例には：ＣＲＴＡＭ特異的抗体、ＣＲＴＡＭ特異的ペプチボディ、またはＬＤＣＡＭに結合して、そしてＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の結合を部分的にまたは完全に遮断する、ＣＲＴＡＭ可溶性ポリペプチド；Ｂ７Ｌ−１特異的抗体、Ｂ７Ｌ−１特異的ペプチボディ、またはＬＤＣＡＭに結合して、そしてＬＤＣＡＭおよびＢ７Ｌ−１もしくはＣＲＴＡＭなどの他のＬＤＣＡＭ結合パートナー間の結合を部分的にまたは完全に遮断する、Ｂ７Ｌ−１可溶性ポリペプチド；Ｂ７Ｌ−４特異的抗体、Ｂ７Ｌ−４特異的ペプチボディ、またはＬＤＣＡＭに結合して、そしてＬＤＣＡＭおよびＢ７Ｌ−４もしくはＣＲＴＡＭなどの他のＬＤＣＡＭ結合パートナー間の結合を部分的にまたは完全に遮断する、Ｂ７Ｌ−４可溶性ポリペプチドが含まれる。本明細書に提示するアンタゴニストは、以下：ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４またはＣＲＴＡＭの１以上に対して向けられる、単離、可溶性ポリペプチド、抗体、融合タンパク質およびペプチボディを含む。本明細書に提示するアンタゴニストは、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、またはＣＲＴＡＭ間の相互作用に拮抗する、ペプチド擬似体およびミモトープなどの小分子をさらに含む。さらなるアンタゴニストは、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、またはＣＲＴＡＭのｍＲＮＡを特異的にターゲティングし、そしてこれらにハイブリダイズして、それによってそれぞれのタンパク質の遺伝子翻訳を防止する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。さらなる態様は、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、またはＣＲＴＡＭの発現を静めるように調整されたＲＮＡ干渉分子による遺伝子サイレンシングを含む。特定のアンタゴニストのより具体的な定義および例を以下のセクションに提供する。
【００３５】
「アゴニスト」は、本明細書において、同族体相互作用の下流生物学的効果を活性化する分子である。例えば、アゴニストは、受容体へのリガンドの結合を模倣することも可能であり、これが受容体の活性化を介して細胞内シグナル伝達を引き起こし、次に、その受容体の活性化の下流生物学的効果、例えば限定されるわけではないが、細胞活性化、増殖、分化、サイトカイン放出、遺伝子の上方制御、タンパク質の細胞表面発現等を達成する。あるいは、アゴニストは、同族体のそれぞれの結合部位のいずれかに隣接する部位に結合し、そしてその細胞タンパク質のコンホメーション変化を誘導し、それによってその生物学的活性を増進することも可能である。例えば、アゴニストは、ＬＤＣＡＭに結合するが、ＬＤＣＡＭ／ＬＤＣＡＭ間またはＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭ間またはＬＤＣＡＭ／Ｂ７Ｌ−１間の結合を遮断せず、そしてＬＤＣＡＭ／ＬＤＣＡＭ間またはＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭ間またはＬＤＣＡＭ／Ｂ７Ｌ−１間の結合が、例えば結合対間の親和性またはアビディティー増加によるなどで増進されるように、ＬＤＣＡＭのコンホメーション変化を引き起こすことも可能である。
【００３６】
したがって、「ＬＤＣＡＭアゴニスト」は、１以上のＬＤＣＡＭ生物学的活性をアゴナイズする分子である。ＬＤＣＡＭアゴニストには、限定されるわけではないが：１以上のＬＤＣＡＭ結合パートナー（限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７Ｌ４、および／またはＢ７Ｌ−１など）へのＬＤＣＡＭの結合の下流生物学的効果を達成する、ＬＤＣＡＭ特異的抗体、ＬＤＣＡＭ特異的ペプチボディ、またはＬＤＣＡＭに結合する可溶性ポリペプチドが含まれる。さらなる例には：ＣＲＴＡＭ特異的抗体、細胞表面上のＣＲＴＡＭを架橋することが可能であり、そして該受容体を活性化するＣＲＴＡＭ特異的抗体；ＬＤＣＡＭなどの１以上のＣＲＴＡＭ結合パートナーへのＣＲＴＡＭ結合の下流生物学的効果を達成する、ＣＲＴＡＭ特異的ペプチボディまたはＣＲＴＡＭに結合する可溶性ポリペプチド（ＬＤＣＡＭなど）が含まれる。ＬＤＣＡＭアゴニストの別の態様には、限定されるわけではないがＦｃドメインに連結されたＬＤＣＡＭの細胞外ドメイン（以下に記載するとおり）などの可溶性ＬＤＣＡＭ融合タンパク質が含まれる。さらなる態様には、ＣＲＴＡＭに結合し、そして細胞表面上のＣＲＴＡＭ受容体を架橋して、そして該受容体を活性化する能力を有するＬＤＣＡＭアゴニストが含まれる。こうしたＬＤＣＡＭアゴニストには、ＣＲＴＡＭ受容体を架橋し、そして活性化することが可能な、ＣＲＴＡＭ特異的抗体およびペプチボディ、並びにＬＤＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。さらなる態様には、ＣＲＴＡＭに結合し、そして細胞表面上のＣＲＴＡＭ受容体を架橋し、そして活性化する能力を有する多量体ＬＤＣＡＭポリペプチドが含まれる。本明細書に提示するアゴニストは、以下：ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、またはＣＲＴＡＭの１以上に対して向けられる、単離、可溶性ポリペプチド、抗体、融合タンパク質およびペプチボディを含む。本明細書に提示するアゴニストは、さらに、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、またはＣＲＴＡＭ間の相互作用をアゴナイズする、ペプチド擬似体およびミモトープなどの小分子をさらに含む。さらなるアゴニストは、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、またはＣＲＴＡＭのｍＲＮＡを特異的にターゲティングし、そしてこれらにハイブリダイズして、それによってそれぞれのタンパク質の遺伝子翻訳を防止する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。さらなる態様は、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、またはＣＲＴＡＭの発現を静めるように調整されたＲＮＡ干渉分子による遺伝子サイレンシングを含む。特定のアゴニストのより具体的な定義および例を以下のセクションに提供する。
【００３７】
こうしたものとして、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストを用いて、以下：ＬＤＣＡＭとＬＤＣＡＭの結合（ホモタイプ凝集によるなど）；ＣＲＴＡＭへのＬＤＣＡＭ結合；Ｂ７Ｌ−１へのＬＤＣＡＭ結合；活性化および増殖などの、Ｔ細胞活性；活性化刺激へのＴ細胞応答；ＣＤ３刺激／活性化へのＴ細胞応答；マイトジェン刺激／活性化へのＴ細胞応答；ＮＫ−Ｔ細胞活性；ＮＫ細胞活性；Ｂ細胞活性；限定されるわけではないが、ＩＬ−２、ＩＮＦ−ガンマおよび他の炎症誘発性サイトカインなどの、免疫細胞によるサイトカイン発現；抗原提示細胞およびＴ細胞間の活性；樹状細胞およびＴ細胞間の活性；ＢＤＣＡ３＋樹状細胞およびＴ細胞間の活性；抗原提示細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の活性；樹状細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の活性；ＢＤＣＡ３＋樹状細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の活性；抗原提示細胞およびＮＫ細胞間の活性；樹状細胞およびＮＫ細胞間の活性；ＢＤＣＡ３＋樹状細胞およびＮＫ細胞間の活性；ニューロンおよびＴ細胞間の活性；ニューロンおよびＮＫ−Ｔ細胞間の活性；並びにニューロンおよびＮＫ細胞間の活性の１以上に拮抗するか、またはこれらをアゴナイズすることも可能である。
【００３８】
２．１  ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭまたはＢ７Ｌ−１に対する抗体
ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭまたはＢ７Ｌ−１と免疫反応性である抗体を、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストとして用いることも可能である。１つの特定の態様は、１Ｆ１２と称される、ＬＤＣＡＭ特異的ｓｃｆｖ抗体を含む。１Ｆ１２  ｓｃｆｖ配列を図６に示す。別の態様は、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ときに１Ｆ１２マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）と称される）である。１Ｆ１２  ｓｃｆｖ抗体を用いて、マウスＣＤ８α＋樹状細胞のヒト対応物である、ヒト樹状細胞の新規サブセットを単離した。この樹状細胞サブセットは、ＢＤＣＡ３＋樹状細胞と称される。
【００３９】
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞プライミングおよび寛容を調節するプロフェッショナル抗原提示細胞の異種集団を構成する。マウスでは、ＣＤ４およびＣＤ８α抗原の表面発現にしたがって、脾臓ＤＣを、少なくとも３つの別個の機能的サブセットに細分することも可能である。他のマウスＤＣサブセットと異なり、ＣＤ８α＋  ＤＣは、アポトーシス小体を飲み込むユニークな能力を示し、そしてしたがって、抗原交差提示に非常に重要な役割を果たすと考えられる。我々は、本明細書において、ヒト血液ＤＣサブセット上に特異的に発現される新規表面抗原をターゲティングし、そして同定する、パニング／ファージディスプレイアプローチを記載する。我々は、抗体（１Ｆ１２）が、ＢＤＣＡ３＋ヒト血液ＤＣ、並びに脾臓およびリンパ節のＴ細胞領域中のＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１３＋細胞の両方に存在する表面抗原をターゲティングすることを示す。これらの細胞は、同じヒトＤＣ下位集団の地理的に異なる提示である可能性もある。マウスでは、１Ｆ１２は、血液白血球のまれなサブセットとともに、脾臓ＣＤ８α＋  ＤＣを特異的に標識する。１Ｆ１２は、１００ｋＤａの表面タンパク質を免疫沈降し、該タンパク質は、質量分析によって、ＬＤＣＡＭと認識された。マウスおよびヒトＬＤＣＡＭ＋  ＤＣは、ＣＤ１１ｃを発現するが、ＣＤ１１ｂを発現しない。これらはまた、共通する１０の特定の遺伝子団も発現し、したがって、これらが同等の細胞集団に相当するという見方が強まる。最後に、他のヒトＤＣサブセットいずれとも異なり、ＬＤＣＡＭ＋ヒトＤＣは、アポトーシス小体を効率的に内部移行させることも可能である。我々は、ＬＤＣＡＭ発現が、表現型特性、組織学的特性、および機能特性を共有する、マウスおよびヒトにおけるＤＣのユニークな集団を定義すると結論付ける。
【００４０】
単離されそして表現型決定されたＤＣサブセット（図１を参照されたい）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで病原体に反応したＩＬ−１２産生の主な供給源であり；ＣＤ８＋  Ｔ細胞への抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ交差提示の原因であり；ｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシス小体を貪食することが可能であり；そして安定状態（炎症の非存在下など）における寛容の誘導の原因であることを含む、重要な免疫学的役割を有する。
【００４１】
ＢＤＣＡ３＋  ＤＣに対する抗体を、多様な研究、臨床および療法セッティングで用いることも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、免疫応答の結果に影響を及ぼすＢＤＣＡ３＋  ＤＣ機能の調節が含まれ、例えば抗原に連結された１Ｆ１２抗体を用いてＢＤＣＡ３＋  ＤＣをターゲティングし、そしてそれによって、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣ集団に抗原を特異的に搬送することなどが含まれる。このプロセスは、被験者にその抗原に対する免疫寛容を与えることも可能である。あるいは、炎症シグナルの存在下で、ターゲティングされた抗原は、その抗原に対する抗原特異的免疫応答を増大させるであろう。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を予後目的に用いることも可能であり、例えば正常組織および病的組織における比較または相対的ＢＤＣＡ３＋  ＤＣ定量化がある。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、多様な体液、臓器および組織からＢＤＣＡ３＋  ＤＣを精製するかまたは単離することも可能である。次いで、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞を操作し、そして操作した細胞を被験者に再注入しなおすことによって、細胞に基づく多様な免疫療法において、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを用いることも可能である。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＤＣＡ３＋  ＤＣを枯渇させるか、または限定されるわけではないが、Ｔ細胞プライミング、ＤＣホーミング、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞への抗原の交差提示などの、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣの免疫学的機能に干渉することも可能である。抗原の交差提示および抗原への交差寛容は、多くの自己免疫疾患、移植および癌に重要な細胞機構であるため、１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを通じた免疫応答を調節することによって、これらの障害を治療することも可能である。
【００４２】
さらに、１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体をｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法に用いることも可能である。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを単離し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで操作し、そして患者に再導入して疾患を治療することも可能である。例示目的のみのため、単離ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを癌抗原（限定されるわけではないが、以下の表２に提示するようなもの）に曝露して、そしてＢＤＣＡ３＋ＤＣ／プロセシングされた癌抗原を患者に注入しなおすことによって、癌に対する免疫寛容を断つことも可能である。癌抗原は患者由来であることも可能であるし、そして癌細胞の形であることも可能である。ＢＤＣＡ３＋  ＤＣが、アポトーシス細胞を貪食することが可能であり、そして癌特異的ＣＴＬエフェクターを生成するため、こうした外因性抗原をＣＤ８＋  Ｔ細胞に提示するようであることも示されてきている。
【００４３】
表２
【００４４】
【表１−１】
2007500132.tif 000003
【００４５】
【表１−２】
2007500132.tif 000004
【００４６】
別の態様において、１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣに薬剤または毒素を搬送することも可能であり、これは次に、下流免疫応答に影響を及ぼすであろう。
【００４７】
別の態様には、ＬＤＣＡＭポリペプチド、ＬＤＣＡＭポリペプチド断片、ＬＤＣＡＭポリペプチド変異体などに結合し、そして生物学的活性の定義に記載する生物学的活性を調節する、アゴニストまたはアンタゴニストである、抗体が含まれる。ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの別の態様には、ＣＲＴＡＭポリペプチド、ＣＲＴＡＭポリペプチド断片、ＣＲＴＡＭポリペプチド変異体などに結合し、そして生物学的活性の定義に記載する生物学的活性を調節する、抗体が含まれる。こうした抗体は、（非特異的結合とは対照的に）抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドに特異的に結合する。例えば、ＬＤＣＡＭ特異的抗体は、ＬＤＣＡＭポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識し、そしてこれらに結合するが、他の分子とは結合しないであろうものである。１つの好ましい態様において、抗体は、本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他のポリペプチドと交差反応しない。この方式で、ＬＤＣＡＭポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等は、上述のように、免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用可能である。
【００４８】
より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等は、抗体の形成を誘発する、抗原決定基またはエピトープを含有する。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖またはコンホメーション的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）のどちらであることも可能である。直鎖エピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分で構成されるが、コンホメーション的エピトープまたは断続的エピトープは、ポリペプチドフォールディングに際してごく近接する、ポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分で構成される（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。フォールディングしたポリペプチドは複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；が、ポリペプチドのコンホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。エピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定されることも可能である。したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下にさらに詳細に記載するように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチドに由来するエピトープは、アッセイにおいて研究試薬として、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマの上清などの物質から、特異的に結合する抗体を精製するために、使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的切断または酵素的切断、あるいは組換えＤＮＡ技術の使用など、当該技術分野に周知の技術を用いて、産生可能である。
【００４９】
本発明のポリペプチドのエピトープによって誘発可能な抗体に関しては、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のどちらも、慣用的技術によって調製可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｋｅｎｎｅｔら（監修），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，  １９８４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：３００１−３００５；Ｃｏｌｅら，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ．  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６）を参照されたい。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマを、慣用的技術によって産生しそして同定することも可能である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは高力価でｍＡｂが産生されるため、これが現在好ましい産生法である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；そしてポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体を産生するため、１以上の以下を注射することによって、多様な宿主動物を免疫することも可能である：ＬＤＣＡＭポリペプチド、ＬＤＣＡＭポリペプチドの断片、ＬＤＣＡＭポリペプチドの機能する同等物、ＬＤＣＡＭの変異体型またはＬＤＣＡＭポリペプチドの突然変異型；ＣＲＴＡＭポリペプチド、ＣＲＴＡＭポリペプチドの断片、ＣＲＴＡＭポリペプチドの機能する同等物、またはＣＲＴＡＭポリペプチドの突然変異型。こうした宿主動物には、限定されるわけではないが、ウサギ、モルモット、マウス、およびラットが含まれる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを用いて、免疫学的応答を増加させることも可能であり、こうしたアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ���カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであることも可能である。
【００５０】
さらに、ＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭ「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｔａｋｅｄａら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：４５２−４５４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，  １９８４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０）が使用可能であり、これは適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をともにスプライシングすることによる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、ブタｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。本発明のモノクローナル抗体にはまた、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型も含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術によって調製可能であり、そして抗体をヒトに投与した際、減少した免疫原性という利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含むことも可能である。キメラおよびさらなる操作モノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，  １９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，  １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，  １９８９）、並びにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９，  Ｃａｎ，  １９９３）に記載されるものが含まれる。抗体をヒト化するのに有用な技術は、米国特許６，０５４，２９７にも論じられる。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ  ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びに関連特許に見出すことも可能である。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であり；こうしたヒト抗体またはヒト化抗体を生成する技術もまた周知であり、そして例えばＭｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）から商業的に入手可能である。
【００５１】
別の態様において、ファージディスプレイ法（Ｖａｕｇｈａｎら，  １９９８，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６（６）：５３５−５３９；および米国特許第５，９６９，１０８号）、リボソームディスプレイ法（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら，  １９９９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１１９−１３５）、またはｍＲＮＡディスプレイ法（Ｗｉｌｓｏｎら，  ２００１，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（７）：３７５０−３７５５）いずれかを用いて、ヒト抗体可変ドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒトで使用するための完全ヒト抗体を産生する。ファージディスプレイ法によって産生される抗ＬＤＣＡＭ  ｓｃｆｖ抗体の例を実施例１８に記載する。
【００５２】
特異的エピトープを認識する抗原結合抗体断片は、既知の技術によって生成可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）２断片、および（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易な同定を可能にすることも可能である。一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を適応させ、ＬＤＣＡＭ遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生することもまた可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結して一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成される。こうした一本鎖抗体はまた、例えばＨＩＶ感染における遺伝子治療に関して、Ｍａｒａｓｃｏら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２２３−２３８，  １９９９）に記載されるように、細胞内でもまた（すなわち「細胞内抗体」として）有用である可能性もある。さらに、当業者に周知の技術を用いて、今度はＬＤＣＡＭポリペプチドに対する抗体を利用して、ＬＤＣＡＭポリペプチドを「模倣」し、そしてＬＤＣＡＭポリペプチドの結合パートナーに結合可能な抗イディオタイプ抗体を生成することも可能である（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，  １９９３，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【００５３】
本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体には、二重特異性抗体（すなわち第一の抗原結合ドメインを介して本発明のポリペプチドと免疫反応性であり、そしてまた、第二の抗原結合ドメインを介して異なるポリペプチドとも免疫反応性である抗体）が含まれる。多様な二重特異性抗体が調製され、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で有用であることが見出されてきている（例えば米国特許５，８０７，７０６；並びにＣａｏおよびＳｕｒｅｓｈ，  １９９８，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ９：６３５−６４４を参照されたい）。二重特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、これらには、２つの異なるハイブリドーマを融合させることによって形成するクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）、およびハイブリドーマをリンパ球と融合させることによって形成するトリオーマなどのハイブリッド−ハイブリドーマの使用が含まれる（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，  １９８３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０；米国特許４，４７４，８９３；および米国特許６，１０６，８３３）。米国特許６，０６０，２８５は、二重特異性抗体の産生法を開示し、この方法において、少なくとも、第一の特異性を有する抗体の軽鎖の遺伝子および重鎖可変部分の遺伝子を、第二の特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞にトランスフェクションする。抗体断片の化学的カップリングもまた、２つの異なる抗原に対する特異性を有する抗原結合分子を調製するのに用いられてきている（Ｂｒｅｎｎａｎら，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｇｌｅｎｎｉｅら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８７，  １３９：２３６７−２３７５；および米国特許６，０１０，９０２）。二重特異性抗体はまた、例えばＫｏｓｔｅｌｎｙら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−４５５３；１９９２）に記載されるように、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質（優先的にヘテロ二量体を形成する）由来のロイシンジッパー部分を用いることによって、組換え手段を介しても産生可能である。米国特許５，５８２，９９６は、二重特異性抗体産生において、ヘテロ二量体形成を促進するための相補的相互作用ドメイン（ロイシンジッパー部分または他の錠および鍵相互作用ドメイン構造など）の使用を開示する。四価二重特異性分子は、米国特許５，９５９，０８３に記載されるように、抗体のＦ（ａｂ’）２断片の重鎖をコードするＤＮＡを、第二のＦ（ａｂ’）２分子の重鎖をコードするＤＮＡ（ＣＨ１ドメインがＣＨ３ドメインと交換されている）、または抗体の一本鎖ＦＶ断片をコードするＤＮＡいずれかと融合させることによって調製可能である。生じた融合遺伝子の哺乳動物細胞における発現は、対応する軽鎖の遺伝子とともに、選択される抗原に対して特異性を有する、四価二重特異性分子を生じる。二重特異性抗体はまた、米国特許５，８０７，７０６に記載されるようにも産生可能である。一般的に、該方法は、第一のポリペプチドの界面で、隆起（小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖と交換することによって構築する）を、そして第二のポリペプチドの界面で、対応する空洞（大きいアミノ酸側鎖をより小さいものと交換することによって調製する）を導入することを伴う。さらに、一本鎖可変断片（ｓＦｖ）は、２つの可変ドメインを共有結合することによって調製され；生じた抗体断片は、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、二量体または三量体を形成可能である（Ｋｏｒｔｔら，  １９９７，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４２３−４３３）。
【００５４】
こうした抗体を同定可能なスクリーニング法が周知であり、そして例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴うことも可能である。抗体は、アゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性に関してスクリーニング可能である。こうした抗体は、ＬＤＣＡＭポリペプチドの細胞表面部分への結合に際して、ＬＤＣＡＭ結合パートナーがＬＤＣＡＭポリペプチドに結合すると誘導される生物学的効果と類似の生物学的効果（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体を用いて、ＬＤＣＡＭが仲介する細胞刺激経路または細胞間コミュニケーションを誘導可能である。二重特異性抗体は、２つの別個のアッセイを用いるか、または二重特異性抗体が、第一の抗原および第二の抗原（後者は検出可能部分にカップリングされている）間の架橋として働くアッセイを用いてスクリーニングすることによって、同定可能である。第一の抗原結合ドメインを介して、本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドに結合する二重特異性抗体は、以下により詳細に記載するように、診断適用に、そして自己免疫、炎症および癌を治療するのに、有用であろう。
【００５５】
本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドが、限定されるわけではないがＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１およびＣＲＴＡＭなどのＬＤＣＡＭ結合パートナーに結合するのを遮断可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１および／またはＣＲＴＡＭが仲介する細胞結合、細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激を、阻害することも可能である。こうした遮断抗体は、限定されるわけではないがＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１およびＣＲＴＡＭなどの特定の結合パートナーへの、ＬＤＣＡＭの結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて同定することも可能である。実施例に記載するもののように、ＬＤＣＡＭ結合パートナーが仲介する細胞刺激経路を阻害する能力に関して、抗体をアッセイすることも可能である。こうした抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体に仲介される生物学的活性を阻害することも可能である。このように、限定されるわけではないがＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１およびＣＲＴＡＭなどの細胞表面結合パートナーとＬＤＣＡＭの相互作用によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することも可能である。療法は、ＬＤＣＡＭ結合パートナーが仲介する生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、実施例に記載するｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体などの抗原結合抗体断片を使用する。ＬＤＣＡＭに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含む組成物を、本明細書に提供する。ＬＤＣＡＭポリペプチドを含有する組成物に関して、こうした組成物の適切な構成要素を以下に記載する。
【００５６】
本明細書にやはり提供するのは、ＬＤＣＡＭ特異的抗体に付着した検出可能（例えば診断用）剤または療法剤を含むコンジュゲートである。こうした剤の例を上に提示する。該コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかの、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいても使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【００５７】
アゴニスト性抗体またはアンタゴニスト性抗体をスクリーニングするのに使用可能なアッセイの例を以下に記載する。
【００５８】
２．２  ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７Ｌ−４、またはＢ７Ｌ−１に対するペプチボディ
ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストは、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７Ｌ−４またはＢ７Ｌ−１に対して向けられるペプチボディの形であることも可能である。さらなるＬＤＣＡＭアゴニスト態様には、細胞表面上のＣＲＴＡＭに結合し、そして該分子を活性化する能力を有するＣＲＴＡＭに向けられるペプチボディが含まれ、こうした能力には、限定されるわけではないが細胞表面上のＣＲＴＡＭの架橋が含まれる。ペプチボディは当該技術分野に知られる。例示目的のため、ペプチボディは、本明細書に完全に援用されるＷＯ  ９９／２５０４４およびＷＯ  ００／２４７８２により詳細に定義され、そして記載される。ペプチボディを生成するのに用いられるペプチドは、ＬＤＣＡＭ  Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭのアミノ酸配列由来であることも可能である。配列番号１２および１３に提供する抗ヒトＬＤＣＡＭ  ｓｃｆｖ配列を、ペプチボディに取り込むことも可能である。
【００５９】
２．３  ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭポリペプチドと相互作用する化合物の合理的設計
合理的薬剤設計の目的は、生物学的に活性である目的のポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子、例えば阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等の構造的類似体を産生することである。これらの例いずれかを用いて、該ポリペプチドの、より活性であるかまたは安定な型である薬剤、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を増進するかまたは該機能に干渉する薬剤を形作ることも可能である（Ｈｏｄｇｓｏｎ  Ｊ（１９９１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１）。１つのアプローチにおいて、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、またはコンピュータ相同性モデリングによって、あるいは最も典型的には、これらのアプローチの組み合わせによって、目的のポリペプチドの三次元構造またはポリペプチド−阻害剤複合体の三次元構造を決定する。構造を解明し、そして分子の活性部位（単数または複数）を決定するため、ポリペプチドの形状および荷電両方を確定しなければならない。より頻繁でないが、相同ポリペプチドの構造に基づいてモデリングすることによって、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる可能性もある。どちらの場合も、適切な構造情報を用いて、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭポリペプチドに類似の分子を設計するか、有効な阻害剤を同定するか、あるいはＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭポリペプチドに結合する小分子を同定する。合理的薬剤設計の有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ  ＳおよびＷｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７７９６−７８０１）に示すように、改善された活性または安定性を有する分子、あるいはＡｔｈａｕｄａ  ＳＢら（１９９３  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１３：７４２−７４６）に示すように、天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用する分子が含まれる。阻害剤設計および阻害剤−ＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭポリペプチド相互作用研究を補助するための、分子モデリングソフトウェア系における、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭポリペプチド構造情報の使用もまた、本発明に含まれる。本発明の特定の方法は、基質のありうる結合部位に関して、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭポリペプチドの三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込んだ新規分子を合成し、そして本明細書にさらに記載するように、新規分子をアッセイすることを含む。
【００６０】
本明細書にさらに記載するような、機能アッセイによって選択される、ターゲット特異的抗体を単離し、そして次いで、結晶構造を解析することもまた可能である。このアプローチによって、原則として、続く薬剤設計の基礎とすることも可能なファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。機能する薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を生成することによって、ポリペプチド結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は、元来の抗原の類似体であると予測されるであろう。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからペプチドを同定し、そして単離することも可能である。次いで、単離ペプチドは、ファーマコアとして働くであろう。
【００６１】
２．４  核酸に基づくＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト
別の態様において、核酸に基づく免疫療法を設計して、例えば、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１  ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するかまたは防止するアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１遺伝子の転写を阻害する、三重らせんアプローチ；あるいはＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１遺伝子またはその内因性プロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウト」する、ターゲティング相同組換えを用いて、内因性ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１遺伝子発現のレベルを減少させることも可能である。
【００６２】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲティングされたｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてポリペプチド翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するよう作用する。アンチセンスアプローチは、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１ポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）の設計を伴う。絶対の相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書において、ＲＮＡの一部に「相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし、それによって安定な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味する。メッセージの５’端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよび該開始コドンを含む、５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も有効に働くはずである。しかし、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１遺伝子転写物の５’または３’非翻訳、非コード領域いずれかに相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチで使用して、内因性ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１の翻訳を阻害することも可能である。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含まなければならない。アンチセンス核酸は、少なくとも長さ６ヌクレオチドでなければならず、そして好ましくは、長さ６〜約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物またはその誘導体または修飾型であることも可能である。オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善することも可能である。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば宿主細胞受容体をｉｎ  ｖｉｖｏでターゲティングするため）、または細胞膜を横切る輸送を促進する剤（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，  １９８７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号、１９８８年１２月１５日を参照されたい）、あるいはハイブリダイゼーション誘発切断剤または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えばＺｏｎ，  １９８８，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：５３９−５４９を参照されたい）などの他の付随する基を含むことも可能である。
【００６３】
例えば、アンチセンス分子を組織または細胞由来部位に直接注入することによって、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１ポリヌクレオチド配列を有する転写物をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞に、アンチセンス分子を搬送するか、あるいは所望の細胞をターゲティングするよう設計された、修飾アンチセンス分子（例えばターゲット細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を、全身投与することも可能である。別のアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下に置かれた、組換えＤＮＡ構築物を利用する。被験者において、ターゲット細胞をトランスフェクションするため、こうした構築物を使用すると、一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写が生じ、該一本鎖ＲＮＡが、内因性ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１転写物と相補的塩基対を形成して、そしてそれによって、ＩＬ−１７  ｍＲＮＡの翻訳を妨げるであろう。例えば、ベクターが細胞に取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで導入することも可能である。こうしたベクターは、転写されて、所望のアンチセンスＲＮＡを産生可能でありさえすれば、エピソームにとどまることも、また染色体に組み込まれることも可能である。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現で用いられる、プラスミド、ウイルス、または当該技術分野に知られる他のものであることも可能である。
【００６４】
ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１ポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するよう設計されたリボザイム分子が、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１  ｍＲＮＡの翻訳を防止する（例えば、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公表；米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の方式で、他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を所持するＲＮＡ分子である。このアプローチの主な利点は、配列特異的であるため、特定の配列を持つｍＲＮＡのみが不活性化される点である。２つの基本的な型のリボザイムがあり、すなわち、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｏｆｆ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５−５９１，  １９８８）および「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ型リボザイムは、長さ４塩基である配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」型リボザイムは、長さ１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列がより長ければ、ターゲットｍＲＮＡ種中で配列が独占的に生じる可能性がより高くなる。その結果、ハンマーヘッド型リボザイムは、テトラヒメナ型リボザイムより好ましい。
【００６５】
アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドで構成されることも可能である（例えば改善された安定性、ターゲティングなどのため）。搬送の典型的な方法は、トランスフェクションされた細胞が、十分な量のリボザイムを産生し、内因性ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するであろうように、強い恒常的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にあるリボザイム「コード」ＤＮＡ構築物を用いることを伴う。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるため、有効であるために、より低い細胞内濃度しか必要とされない。
【００６６】
あるいは、ターゲット遺伝子の制御領域（すなわちターゲット遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして、ターゲットＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって、内因性ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１発現を減少させることも可能である（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，  １９９１，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，  ６（６），  ５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら，  １９９２，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６６０，  ２７−３６；およびＭａｈｅｒ，  １９９２，  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２），  ８０７−８１５を参照されたい）。
【００６７】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、並びに三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子合成のための、当該技術分野に知られる方法いずれかによって、調製可能であり、そしてこれらの方法には、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから商業的に入手可能なものなど）の使用による、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成などの、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら，  １９８８，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９の方法によって、合成可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：７４４８−７４５１）の使用によって、調製可能である。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって、生成可能である。こうしたＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込んだ、非常に多様なベクターに取り込むことも可能である。あるいは、用いるプロモーターに応じて、恒常的にまたは誘導性にアンチセンスＲＮＡを合成する、アンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定して導入することも可能である。
【００６８】
別の態様において、翻訳後遺伝子サイレンシングによって、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としても知られる二本鎖ＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングによって、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１発現を遮断することも可能である。ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよび／またはＢ７Ｌ−１のＲＮＡ配列を修飾して、療法使用のため、二本鎖配列または短いヘアピンＲＮＡを提供することも可能である。
【００６９】
３．  ＬＤＣＡＭ
ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、生物学的活性を示す、本明細書記載のＬＤＣＡＭの適切な型すべてを含む。ＬＤＣＡＭは、限定されるわけではないが、樹状細胞、そして特にリンパ系由来樹状細胞を含む多様な細胞上に発現される接着分子に、限定された相同性を有する、細胞表面タンパク質である。実施例３に記載するように単離されたヒトＬＤＣＡＭをコードするヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そして該配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に記載する、コードされるヒトＬＤＣＡＭアミノ酸配列は、３８アミノ酸のリーダー配列１〜３８を含む３７４アミノ酸の予測される細胞外ドメイン（したがってリーダー配列を欠く細胞外ドメインは、アミノ酸３９〜３７４の範囲である）；２１アミノ酸の膜貫通ドメイン（３７５〜３９５）および４７アミノ酸の細胞質ドメイン（３９６〜４４２）を有する。ＬＤＣＡＭの可溶性型は、選択的スプライシングによって天然に形成される。ＬＤＣＡＭのさらなる例を以下のセクションに提供し、これらには、限定されるわけではないが、変異体、生物学的活性断片、断片、変異体の生物学的活性断片および断片、融合タンパク質、ペプチボディ、ミモトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）、誘導体等が含まれる。
【００７０】
Ｂ７Ｌ−１は、本明細書に完全に援用される、米国特許出願第０９／７７８，１８７号、２００１年２月６日出願に記載されるように、Ｂ７−１に配列類似性を有し、ＬＤＣＡＭの結合パートナーである。Ｂ７Ｌ−１はＬＤＣＡＭ結合性タンパク質であり、そしてＢ７Ｌ−１およびＬＤＣＡＭはバンド４．１およびＰＤＺファミリーメンバーの潜在的な結合部位を含む細胞内ドメイン内で相同性を示し、そして多くの同じ細胞種上で発現されるため、これらの細胞結合型は、結合された際、類似のシグナルを搬送する可能性もある。したがって、これらは、共受容体または対構造と称される。ヒトＢ７Ｌ−１の長い細胞外型および短い細胞外型をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号７および配列番号９に示す。配列番号７および配列番号９のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８および配列番号１０に開示する。
【００７１】
Ｂ７Ｌ−１が結合する細胞株を同定するため、そして続いてＢ７Ｌ−１が結合するタンパク質を単離するため、実施例１に記載するようにＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を調製し、そして実施例２に記載する結合研究を行った。実施例３は、Ｂ７Ｌ−１が結合する細胞株であるＷＩ−２６から調製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、および全長ＬＤＣＡＭヒト・クローンの同定を記載する。実施例３に記載するように単離したヒトＬＤＣＡＭをコードするヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そして該配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に記載する、コードされるヒトＬＤＣＡＭアミノ酸配列は、３８アミノ酸のリーダー配列１〜３８を含む３７４アミノ酸の予測される細胞外ドメイン；２１アミノ酸の膜貫通ドメイン（３７５〜３９５）および４７アミノ酸の細胞質ドメイン（３９６〜４４２）を有する。
【００７２】
実施例５および６は、ヒトＬＤＣＡＭ／Ｆｃの作成およびヒトＬＤＣＡＭが結合する細胞株を同定する結合研究におけるその使用を記載する。陽性に同定された細胞株の中に、Ｓ４９．１細胞、並びにＦｌｔ３−Ｌ処置マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ系樹状細胞がある。実施例７は、ネズミＬＤＣＡＭクローンを同定する発現ライブラリープールのスクリーニングを記載する。単離されたネズミＬＤＣＡＭ  ＤＮＡ配列を配列番号３に開示する。配列番号３のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列番号４に開示する。コードされるネズミＬＤＣＡＭアミノ酸配列（配列番号４）は、３５６アミノ酸の予測される細胞外ドメイン（残基１〜３５６）；２１アミノ酸の膜貫通ドメイン（３５７〜３７７）；およびアミノ酸残基３７８〜４２３を含む細胞質ドメインが含まれる。配列番号３および配列番号４は、全長成熟ネズミＬＤＣＡＭ配列を記載する。ヒトＬＤＣＡＭ配列に比較すると、シグナル配列は完全には記載されていない。
【００７３】
本明細書に記載する精製哺乳動物ＬＤＣＡＭ分子は、Ｂ７−１および他の細胞接着分子に、限定される全体の相同性を有するＩ型膜貫通タンパク質である。ＬＤＣＡＭはＢ７Ｌ−１の細胞質領域に高い相同性を有する。下の実施例６に記載するように、ＬＤＣＡＭタンパク質は広範囲の発現を示す。特に、ヒトＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡは、乳房、網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児心臓、肺、筋肉、胎盤、甲状腺、および肺癌に見られる。ＬＤＣＡＭメッセージを有する細胞株にはＷｉ−２６が含まれる。マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡは、全胚、精巣、三重ネガティブ細胞、ネズミ脾臓およびリンパ節ＣＤ８＋、Ｓ４９．１および樹状細胞上に見られる。
【００７４】
配列番号１および３に開示するＤＮＡ配列の発見によって、ヒトおよびマウスＬＤＣＡＭタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクター；該発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞；均質なタンパク質としての生物学的活性ＬＤＣＡＭ；並びにＬＤＣＡＭと免疫反応性である抗体の構築が可能になる。
【００７５】
Ｂ７Ｌ−１と同様、ＬＤＣＡＭは、ポリオウイルス受容体、デルタ・オポイド（ｏｐｏｉｄ）結合性タンパク質および接着分子に、限定された相同性を有する。さらに、実施例１３に記載するように、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡおよびＰＨＡに引き起こされるＴ細胞増殖を遮断し、これによってＬＤＡＭがＴ細胞仲介性免疫応答を調節するのに有用であることが示唆される。ＬＤＣＡＭはＴＣＲ  ｍＡｂ誘導性Ｔ細胞増殖を阻害せず、これによってマイトジェン誘導性Ｔ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの阻害効果が、サイトカイン分泌、例えばＩＬ−２の阻害のためであるか、またはＬＤＣＡＭ結合パートナーの活性化および発現増加後のＴ細胞の下流応答の制御のためであることが示唆される。こうしたものに限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ分子の特定の使用を以下に記載する。
【００７６】
本明細書において、用語ＬＤＣＡＭは、配列番号２のアミノ酸配列１〜４４２および配列番号４のアミノ酸配列１〜４２３を有するポリペプチドを含む。さらに、ＬＤＣＡＭは、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列と高い度合いの類似性または高い度合いの同一性を有し、そして生物学的に活性であるポリペプチドを含む。
【００７７】
用語「ＬＤＣＡＭ」は、少なくとも部分的に、それ自体と結合し、そして複合体形成し、Ｂ７Ｌ−１およびＣＲＴＡＭと結合し、そして抗原およびマイトジェンに反応したＴ細胞活性化シグナルを改変する、ポリペプチド属を指す。
【００７８】
用語「ネズミＬＤＣＡＭ」は、配列番号３のＤＮＡの生物学的活性遺伝子産物を指し、そして用語「ヒトＬＤＣＡＭ」は、配列番号１のＤＮＡの生物学的活性遺伝子産物を指す。用語「ＬＤＣＡＭ」にさらに含まれるのは、該タンパク質の主にＢ７Ｌ−１共結合部分を含み、生物学的活性を保持し、そして分泌可能である、可溶性または一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質である。こうした可溶性タンパク質の特定の例は、配列番号２のアミノ酸１〜３７４の配列を含むものおよび配列番号４のアミノ酸１〜３５６の配列を含むものである。あるいは、こうした可溶性タンパク質は、リーダー配列を除外し、そしてしたがって、配列番号２のアミノ酸３９〜３７４を含むことも可能である。
【００７９】
実施例９は、ＬＤＣＡＭ結合研究、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニングアッセイ、および分子の機能特性を調べることに向けられる研究で利用可能な、新規ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質の構築を記載する。他の抗体Ｆｃ領域を、実施例に記載するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と置換することも可能である。他の適切なＦｃ領域は、プロテインＡまたはプロテインＧに高親和性で結合可能であるもの、あるいはヒトまたはネズミＩｇＧ１  Ｆｃ領域の断片を含むもの、例えば鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、少なくともヒンジ領域を含む断片を含むものである。ＬＤＣＡＭ融合タンパク質は、容易に精製されるという利点を提供する。さらに、２つの別個の融合タンパク質鎖のＦｃ領域間にジスルフィド結合が形成され、二量体が生成される。
【００８０】
上述のように、本発明の側面は、可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドである。可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、天然ＬＤＣＡＭの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含むが、ポリペプチドを細胞膜上に保持するシグナルを欠く。可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、最初に合成される際は、好適に、分泌を促進する天然（または異種）シグナルペプチドを含むが、シグナルペプチドは、細胞からＬＤＣＡＭが分泌される際に切断される。本発明に含まれる可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、Ｂ７Ｌ−１に結合する能力、またはそれ自体に結合する能力を保持する。あるいは、本発明の可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、Ｔ細胞応答を改変する能力を保持する。可溶性ＬＤＣＡＭは、可溶性ＬＤＣＡＭタンパク質が分泌可能である限り、シグナルの一部、あるいは細胞質ドメインまたは他の配列の一部を含むことも可能である。
【００８１】
可溶性ＬＤＣＡＭは、培地から、例えば遠心分離によって、所望のタンパク質を発現する、損なわれていない細胞を分離し、そして所望のタンパク質の存在に関して培地または上清をアッセイすることによって、同定（そして非可溶性膜結合対応物から区別）可能である。培地中にＬＤＣＡＭが存在すれば、該タンパク質が細胞から分泌され、そしてしたがって、所望のタンパク質の可溶性型であることの指標となる。
【００８２】
ＬＤＣＡＭの可溶性型は、天然結合ＬＤＣＡＭタンパク質に勝る多くの利点を所持する。可溶性タンパク質は細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのタンパク質の精製が可能である。さらに、可溶性タンパク質は、一般的に、静脈内投与に、より適している。
【００８３】
可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドの例には、天然ＬＤＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインの実質的な部分を含むものが含まれる。例えば、可溶性ヒトＬＤＣＡＭタンパク質は配列番号２のアミノ酸３８〜３７４または１〜３７４を含み、そして可溶性ネズミＬＤＣＡＭは配列番号４のアミノ酸１〜３５６を含む。さらに、全細胞外ドメインより少ないものを含む一部切除可溶性ＬＤＣＡＭタンパク質が本発明に含まれる。宿主細胞で最初に発現される際、可溶性ＬＤＣＡＭは、以下に記載する、使用する宿主細胞内で機能する異種シグナルペプチドの１つを含むことも可能である。あるいは、該タンパク質は天然シグナルペプチドを含むことも可能である。本発明の１つの態様において、可溶性ＬＤＣＡＭは（Ｎ末端からＣ末端に）、酵母α因子シグナルペプチド、以下に記載され、そして米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、および配列番号２のアミノ酸３９〜３７４または配列番号４のアミノ酸２１〜３５６からなる可溶性ＬＤＣＡＭを含む融合タンパク質として発現可能である。この組換え融合タンパク質は、酵母細胞で発現され、そして該細胞から分泌される。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは、タンパク質の精製を容易にし、そして続いて、ウシ粘膜エンテロキナーゼを用いて可溶性ＬＤＣＡＭから切断されることも可能である。可溶性ＬＤＣＡＭタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列が、本発明に含まれる。
【００８４】
いくつかの慣用的技術いずれによって、可溶性ポリペプチドを含む一部切除ＬＤＣＡＭを調製することも可能である。それ自体知られる技術を用いて、所望のＤＮＡ配列を化学的に合成することも可能である。クローニングされた全長ＤＮＡ配列を制限エンドヌクレアーゼ消化して、そしてアガロースゲル上の電気泳動により単離することによって、ＤＮＡ断片を産生することも可能である。制限エンドヌクレアーゼ切断部位（単数または複数）を含有するリンカーを使用して、所望のＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入することも可能であるし、また天然に存在する切断部位で断片を消化することも可能である。周知のポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を増幅することもまた可能である。さらなる代替法として、既知の突然変異誘発技術を使用して、所望の点、例えば受容体結合ドメインの最後のアミノ酸コドンの直後に停止コドンを挿入することも可能である。
【００８５】
上述のように、本発明は、組換えおよび非組換え両方の単離または均質ＬＤＣＡＭポリペプチドを提供する。さらに、本発明の範囲内にあるのは、所望の生物学的活性を保持する天然ＬＤＣＡＭタンパク質の変異体および誘導体である。こうした活性には、ＬＤＣＡＭがそれ自体に結合する能力、またはＢ７Ｌ−１に結合する能力、またはＴ細胞シグナル伝達を改変する能力が含まれる。天然ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を突然変異させることによって、ＬＤＣＡＭ変異体および誘導体を得ることも可能である。いくつかの慣用法のいずれによって、天然アミノ酸配列の改変を達成することも可能である。天然配列の断片への連結を可能にする制限部位を隣接させた、突然変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異を特定の遺伝子座に導入することも可能である。連結後、生じた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。
【００８６】
あるいは、オリゴヌクレオチドが指示する部位特異的突然変異誘発法を使用して、あらかじめ決定されたコドンが、置換、欠失、または挿入によって改変されていることも可能である、改変された遺伝子を提供することも可能である。上述の改変を作製する典型的な方法がＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，  １９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，  １９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，  １２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８，  １９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７，  １９８７）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されており、これらはすべて本明細書に援用される。
【００８７】
ＬＤＣＡＭ変異体をアンタゴニストまたはアゴニストとして用いることも可能であるし、あるいは抗体、ペプチボディおよびミモトープ（ｍｉｍｅｔｏｏｐｅｓ）などのＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストを発展させるのに使用することも可能である。「ＬＤＣＡＭ変異体」は、本明細書において、天然ＬＤＣＡＭと実質的に相同であるが、１以上の欠失、挿入または置換のため、天然ＬＤＣＡＭ（ヒト、ネズミまたは他の哺乳動物種）と異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを意味する。実質的に相同な、は、上に開示するような天然アミノ酸配列に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である変異体アミノ酸配列を意味する。２つのアミノ酸または２つの核酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定可能であるし、またはより好ましくは、コンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することによって、比較を行う。典型的な好ましいコンピュータプログラムは、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）ウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７）である。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメータには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．３５３−３５８，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５，  １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の匹敵する比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の各ギャップに対する３０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに１のペナルティ、またはヌクレオチド配列の各ギャップに対する５０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに３のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし；および（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし、が含まれる。配列比較の当業者に使用される他のプログラム、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉを介しての使用に利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．０．９、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムなどもまた、使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０の標準的デフォルトパラメータ設定は、以下のインターネットサイト：ｓａｐｉｅｎｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ／＃Ｆｅａｔｕｒｅｓに記載される。さらに、該ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア化マトリックスを用い、そして使用可能な所望によるパラメーターは、以下のとおりである：（Ａ）組成上の複雑さが低いクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるようなもの；また、ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，  １９９６，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：５５４−７１も参照されたい）、または短い周期の内部反復からなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）のＸＮＵプログラムによって決定されるようなもの）をマスクするフィルターの包含、および（Ｂ）データベース配列に対するマッチを報告する、統計的有意性の閾値、またはＥスコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率論モデルにしたがった、マッチが単なる偶然によって見出されると予期される確率；マッチに割り当てられた統計的有意性がこのＥスコア閾値より高ければ、該マッチは報告されないであろう）；好ましいＥスコア閾値は０．５であり、または優先性を増加させるため、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００８８】
こうした変異体には、天然ＬＤＣＡＭに実質的に相同であるが、１以上の欠失、挿入または置換のため、天然ＩＬ−１７受容体のものとは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含まれる。特定の態様には、限定されるわけではないが、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＬＤＣＡＭポリペプチドが含まれる。別の態様は、天然配列に比較して、１〜１０のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含む、ＬＤＣＡＭポリペプチドを含む。本発明のＬＤＣＡＭをコードするポリヌクレオチドには、１以上の欠失、挿入または置換のため、ＬＤＣＡＭポリヌクレオチド配列と異なるが、生物学的活性ポリペプチドをコードする変異体が含まれる。ＬＤＣＡＭポリペプチドの変異体として含まれるのは、アレル型および選択的スプライシング型とともに、ＬＤＣＡＭポリペプチドのアミノ酸配列またはＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を修飾することによって構築された変異体である。
【００８９】
上述のように、ＬＤＣＡＭ変異体は、少なくとも１つの保存的置換アミノ酸を有する配列を含むことも可能であり、すなわち、既定のアミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を有する残基で交換されることも可能である。別の態様は、１〜１０、１〜２０、または１〜３０の間の保存的置換配列を含む、ＬＤＣＡＭ変異体を含む。一般的に、天然ポリペプチドに存在する１以上のアミノ酸の置換は、保存的に行うべきである。保存的置換の例には、活性ドメイン（単数または複数）外部のアミノ酸の置換、およびＬＤＣＡＭの二次構造および／または三次構造を改変しないアミノ酸置換が含まれる。保存的置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するなどの、１つの脂肪族残基の別のものとの置換、あるいはＬｙｓおよびＡｒｇ間；ＧｌｕおよびＡｓｐ間；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間などの、１つの極性残基の別のものとの置換が含まれる。他のこうした保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が周知である。天然存在変異体もまた、本発明に含まれる。こうした変異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から生じるタンパク質、または天然タンパク質のタンパク質分解切断から生じるタンパク質であり、こうしたタンパク質では、天然生物学的特性が保持されている。
【００９０】
例えば「保存的アミノ酸置換」は、その位で、アミノ酸残基の極性または荷電にほとんどまたはまったく影響がないように、非天然残基で天然アミノ酸残基を置換することを伴うことも可能である。さらに、「アラニン・スキャニング突然変異誘発」に関して先に記載されているように（例えばアラニン・スキャニング突然変異誘発を論じる、ＭａｃＬｅｎｎａｎら，  １９９８，  Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｓｕｐｐｌ．  ６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら，  １９９８，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５：１−２４を参照されたい）、ポリペプチド中のいかなる天然残基をアラニンで置換することもまた可能である。
【００９１】
所望のアミノ酸置換は（保存的であってもまたは非保存的であっても）、こうした置換が所望であるときに、当業者によって決定可能である。例えばアミノ酸置換を用いて、ペプチド配列の重要な残基を同定可能であるし、あるいは本明細書記載のペプチドまたはビヒクル−ペプチド分子の親和性（前述の式を参照されたい）を増加させるかまたは減少させることも可能である。典型的なアミノ酸置換を表１に示す。
【００９２】
表１−アミノ酸置換
【００９３】
【表２】
2007500132.tif 000005
【００９４】
特定の態様において、保存的アミノ酸置換はまた、典型的には、生物学的系における合成によるよりも、化学的ペプチド合成によって取り込まれる、非天然存在アミノ酸残基もまた含む。
【００９５】
上述のように、天然存在残基は、配列の修飾に有用である可能性もある、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類可能である。例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラス由来のメンバーと交換することを伴うことも可能である。こうした置換残基を、非ヒトオルソログと相同であるペプチドの領域に、または分子の非相同領域に導入することも可能である。さらに、鎖配向に影響を及ぼすため、ＰまたはＧを用いた修飾も行うことも可能である。
【００９６】
こうした修飾を作製する際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することも可能である。各アミノ酸には、疎水性および荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられてきており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００９７】
相互作用的な生物学的機能をタンパク質に与える際に、ヒドロパシーアミノ酸指数が重要であることが、当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３１（１９８２））。類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸を、特定のアミノ酸で置換して、そしてなお類似の生物学的活性を保持しうることが知られる。ヒドロパシー指数に基づいて変化を作製する際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【００９８】
当該技術分野において、同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に行うことが可能であることもまた、理解されている。隣接するアミノ酸の親水性によって規定されるような、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【００９９】
以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を作製する際、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することも可能である。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
【０１００】
当業者は、周知の技術を用いて、前述の配列に示すようなポリペプチドの適切な変異体を決定することが可能であろう。活性を破壊することなく変化させることも可能な分子の適切な領域を同定するため、当業者は、活性に重要でないと考えられる領域をターゲティングすることも可能である。例えば、同一種由来のまたは他の種由来の類似の活性を持つ類似のポリペプチドが知られている場合、当業者は、ペプチドのアミノ酸配列を類似のペプチドに比較することも可能である。こうした比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を同定することも可能である。こうした類似のペプチドに比較して保存されていないペプチド領域における変化は、ペプチドの生物学的活性および／または構造に不都合な影響を与える可能性がより低いと認識されるであろう。当業者はまた、比較的保存されている領域であっても、活性を保持しながら、天然に存在する残基を、化学的に類似のアミノ酸で置換することも可能であることも知っているであろう（保存的アミノ酸残基置換）。したがって、生物学的活性または構造に重要でありうる領域であっても、生物学的活性を破壊することなく、またはペプチド構造に不都合に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供することも可能である。
【０１０１】
さらに、当業者は、活性または構造に重要な、類似のペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再検討することも可能である。こうした比較を考慮して、類似のペプチドにおける、活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、ペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測可能である。当業者は、ペプチドのこうした予測される重要なアミノ酸残基に対する、化学的に類似のアミノ酸置換を選ぶことも可能である。
【０１０２】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を解析することも可能である。この情報を考慮して、当業者が、三次元構造に関して、ペプチドのアミノ酸残基の配置構造を予測することも可能である。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性もあるため、当業者は、こうした残基に根本的な変化を与えないように、選択することも可能である。さらに、当業者は、所望のアミノ酸残基各々の位で、単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を生成することも可能である。その後、当業者に知られる活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることも可能である。こうしたデータを用いて、適切な変異体に関する情報を集めることも可能である。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望ましくなく減少した活性、または不適切な活性を生じることが発見された場合、こうした変化を持つ変異体は回避されるであろう。言い換えると、こうした日常的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独の、または他の突然変異と組み合わせた、さらなる置換を回避すべきであるアミノ酸を容易に決定可能である。
【０１０３】
いくつかの科学的刊行物が二次構造の予測に充てられている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を越える配列同一性、または４０％を越える類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。近年、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が大きくなり、二次構造の予測可能性が増進してきており、これには、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内でのフォールディングの潜在的な数が含まれる。Ｈｏｌｍら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。既定のポリペプチドまたはタンパク質には、限定される数のフォールディングしかなく、そして決定的な数の構造が解明されたなら、構造予測は劇的に正確性を得るであろうことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０１０４】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４（１）：１５−９（１９９６））、「プロフィール解析」（Ｂｏｗｉｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．，  １８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４（１３）：４３５５−８（１９８７））、および「進化連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、上記およびＢｒｅｎｎｅｒ、上記を参照されたい）が含まれる。
【０１０５】
当業者は、既知の技術を用いて、ＬＤＣＡＭポリペプチドまたはＬＤＣＡＭポリヌクレオチド配列中にさらなる修飾を施すことも可能である。ポリペプチド配列中の目的の修飾には、選択したアミノ酸の改変、置換、交換、挿入、または欠失が含まれることも可能である。例えば、１以上のシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸と交換して、分子のコンホメーションを改変することも可能であり、この改変は、フォールディングまたは再生に際して、正しくない分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことを伴いうる。こうした改変、置換、交換、挿入または欠失のための技術は、当業者に周知である（例えば米国特許第４，５１８，５８４号を参照されたい）。別の例として、ＬＤＣＡＭ細胞外ドメインのＮ−グリコシル化部位を修飾して、グリコシル化を妨げることも可能であり、これによって哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体の発現が可能になる。ＬＤＣＡＭ細胞外ドメインのＮ−グリコシル化部位を修飾して、グリコシル化を妨げることも可能であり、これによって哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のアミノ酸いずれかであり、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。配列番号２のヒトＬＤＣＡＭポリペプチドには、アミノ酸６７〜６９、１０１〜１０３、１１３〜１１５、１６５〜１６７、３０４〜３０６、および３０８〜３１０に６つのこうしたトリプレットが含まれる。同様に、配列番号４のネズミＬＤＣＡＭポリペプチドには、アミノ酸４９〜５１、８３〜８５、９５〜９７、１４７〜１４９、２８６〜２８８、および２９０〜２９２に６つのこうしたトリプレットが含まれる。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失の結果、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の付着が防止されるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【０１０６】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学部分と共有コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートを形成することによって修飾され、誘導体を生成しうるＬＤＣＡＭポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の官能基に、あるいはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、化学部分を連結することによって、調製可能である。好ましくは、こうした改変、置換、交換、挿入または欠失は、ＬＤＣＡＭの生物学的活性を減少させない。１つの例は、天然型と本質的に同一の結合親和性で結合する変異体である。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして本明細書に示すように、慣用法によって測定可能である。さらに、限定されるわけではないが、ポリエチレングリコールなどの１以上の水可溶性ポリマーを付加することによってＬＤＣＡＭ分子を修飾して、生物学的利用能および／または薬物動態学的半減期を増加させることも可能である。
【０１０７】
生物学的利用能および／または薬物動態学的半減期を増加させるのに有用な化学部分を付着させる多様な手段が現在利用可能であり、例えば本明細書に完全に援用される、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公報第ＷＯ  ９６／１１９５３号、表題「Ｎ末端が化学的に修飾されたタンパク質組成物および方法」を参照されたい。このＰＣＴ公報は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的付着を開示する。
【０１０８】
別のポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、いかなる好適な分子量のものであることも可能であり、そして直鎖であることもまたは分枝鎖であることも可能である。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（ｋＤ）〜約１００ｋＤ、より好ましくは約５ｋＤ〜約５０ｋＤ、最も好ましくは約５ｋＤ〜約１０ｋＤの範囲であろう。ＰＥＧ基は、一般的に、アシル化または還元性アルキル化を介し、ＰＥＧ部分上の反応基（例えばアルデヒド基、アミノ基、チオール基、またはエステル基）を通じて、本発明の化合物上の反応基（例えばアルデヒド基、アミノ基、またはエステル基）に付着されるであろう。
【０１０９】
合成ペプチドのＰＥＧ化に有用な戦略は、溶液中でコンジュゲート連結を形成することを通じて、相互に、互いに対して反応性である特別の官能性を各々所持するペプチドおよびＰＥＧ部分を合わせることからなる。ペプチドは、慣用的固相合成で容易に調製可能である。ペプチドを、特定の部位で、適切な官能基で「プレ活性化」する。前駆体を精製し、そしてＰＥＧ部分と反応させる前に完全に性質決定する。ペプチドとＰＥＧの連結は、通常、水性相で行われ、そして逆相分析用ＨＰＬＣによって、容易に監視可能である。分取用ＨＰＬＣによってＰＥＧ化ペプチドを容易に精製し、そして分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸解析、およびレーザー脱離質量分析によって性質決定することも可能である。
【０１１０】
多糖ポリマーが、タンパク質修飾に使用可能な水溶性ポリマーの別の種類である。デキストランは、主にα１−６連結によって連結された個々のグルコース・サブユニットで構成される、多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、そして約１ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独で、または別のビヒクル（例えばＦｃ）と併用して、ビヒクルとして、本発明で使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ  ９６／１１９５３およびＷＯ  ９６／０５３０９を参照されたい。療法免疫グロブリンまたは診断用免疫グロブリンにコンジュゲート化されたデキストランの使用が報告されている；例えば本明細書に完全に援用される欧州特許公報第０  ３１５  ４５６号を参照されたい。デキストランを本発明にしたがったビヒクルとして用いる場合、約１ｋＤ〜約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
【０１１１】
さらなるＬＤＣＡＭ誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体としての組換え培養における合成によるなどの、他のポリペプチドまたはポリペプチドと該ポリペプチドの共有コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。融合ポリペプチドの例を、オリゴマーと関連して以下に論じる。さらに、融合ポリペプチドは、精製および同定を容易にするため付加するペプチドを含むことも可能である。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（配列番号３１）であり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ９２５９号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【０１１２】
本明細書に記載する方法で使用可能なＬＤＣＡＭのさらなる態様には、ＬＤＣＡＭポリペプチド、ＬＤＣＡＭの１以上の断片、あるいは本明細書に開示するとともに、上に列挙する米国特許に開示されるような、ＬＤＣＡＭの誘導体または変異体型いずれかを含有する、オリゴマーまたは融合ポリペプチドが含まれる。特定の態様において、オリゴマーは可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドを含む。オリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であることも可能である。別の態様において、ＬＤＣＡＭオリゴマーは、多数のＬＤＣＡＭポリペプチドを含み、こうしたポリペプチドは、ポリペプチドに融合された、オリゴマー化を促進する特性を有するペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介して連結されている。以下により詳細に記載するように、付着するポリペプチドのオリゴマー化を促進可能なペプチドの中に、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドがある。
【０１１３】
グリコシル基、脂質、リン酸基、アセチル基などの他の化学部分と共有コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートを形成することによって、ＬＤＣＡＭを修飾してＬＤＣＡＭ誘導体を生成することも可能である。ＬＤＣＡＭアミノ酸側鎖上の官能基に、あるいはＬＤＣＡＭポリペプチドのＮ末端またはＣ末端、あるいはその細胞外ドメインに、化学部分を連結することによって、ＬＤＣＡＭの共有誘導体を調製することも可能である。本発明の範囲内にあるＬＤＣＡＭの他の誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体としての組換え培養における合成によるなどの、他のタンパク質またはポリペプチドとＬＤＣＡＭまたはその断片の共有コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲートは、ＬＤＣＡＭポリペプチドのＮ末端にシグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のα因子リーダー）を含むことも可能である。シグナルペプチドまたはリーダーペプチドは、翻訳と同時に、または翻訳後に、コンジュゲートをその合成部位から、細胞膜または細胞壁の内部または外部の部位に輸送するのを指示する。
【０１１４】
ＬＤＣＡＭポリペプチド融合体は、ＬＤＣＡＭの精製および同定を容易にするため付加するペプチドを含むことも可能である。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。
【０１１５】
アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは生物学的活性または結合に必要でない末端または内部残基または配列の欠失をコードする、同等のＤＮＡ構築物が本発明に含まれる。例えば、ＬＤＣＡＭ細胞外ドメインのＮ−グリコシル化部位を修飾して、グリコシル化を妨げることも可能であり、これによって哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のアミノ酸いずれかであり、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。配列番号２のヒトＬＤＣＡＭポリペプチドには、アミノ酸６７〜６９、１０１〜１０３、１１３〜１１５、１６５〜１６７、３０４〜３０６、および３０８〜３１０に６つのこうしたトリプレットが含まれる。同様に、配列番号４のネズミＬＤＣＡＭポリペプチドには、アミノ酸４９〜５１、８３〜８５、９５〜９７、１４７〜１４９、２８６〜２８８、および２９０〜２９２に６つのこうしたトリプレットが含まれる。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失の結果、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の付着が防止されるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【０１１６】
別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改変して、Ｃｙｓ残基が欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換されるようにして、再生に際して、誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することも可能である。他の同等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増進するように、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することによって調製される。ＥＰ  ２１２，９１４は、タンパク質におけるＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。Ａｒｇ−Ａｒｇ対、Ａｒｇ−Ｌｙｓ対、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変するように、残基を欠失させ、付加し、または置換することによって、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化して、これらの隣接する塩基性残基の発生を排除する。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断に大幅により感受性でなく、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する、保存的でそして好ましいアプローチに相当する。
【０１１７】
本発明の範囲内の核酸配列には、中程度または非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に開示するＬＤＣＡＭヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして生物学的活性ＬＤＣＡＭをコードする、単離ＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｖｏｌ．１，  ｐｐ．１０１−１０４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）に定義されるような、中程度にストリンジェントな条件は、５ｘＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、および約５５℃、５ｘＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件の使用を含む。非常にストリンジェントな条件は、より高いハイブリダイゼーション温度および洗浄温度を含む。当業者は、核酸分子の長さなどの要因にしたがって、必要に応じて温度および洗浄溶液塩濃度を調整可能であることを認識するであろう。
【０１１８】
１より多いコドンが同一のアミノ酸をコード可能である、遺伝暗号の既知の縮重のため、ＤＮＡ配列が配列番号１および３に示す配列と異なり、そしてなお、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＤＣＡＭタンパク質をコードすることも可能である。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント突然変異（例えばＰＣＲ増幅中に起こるもの）から生じることも可能であるし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であることも可能である。
【０１１９】
本発明は：（ａ）配列番号１および配列番号３に示すヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズ可能であり、そして生物学的活性ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡ；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義するＤＮＡに、遺伝暗号の結果、縮重しており、そして生物学的活性ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡから選択される、生物学的活性ＬＤＣＡＭをコードする、同等の単離ＤＮＡ配列を提供する。こうしたＤＮＡ同等配列にコードされるＬＤＣＡＭタンパク質が本発明に含まれる。
【０１２０】
配列番号１および配列番号３のＤＮＡ配列に同等なＤＮＡは、配列番号２および配列番号４を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、中程度および非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするであろう。こうしたＤＮＡにコードされるＬＤＣＡＭの例には、限定されるわけではないが、上述のような、ＬＤＣＡＭ断片（可溶性断片を含む）、および不活性化Ｎグリコシル部位（単数または複数）、不活性化ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位（単数または複数）、または保存的アミノ酸置換（単数または複数）を含むＬＤＣＡＭタンパク質が含まれる。他の哺乳動物種由来のＤＮＡにコードされ、該ＤＮＡが配列番号１または配列番号３のｃＤＮＡにハイブリダイズするであろうＬＤＣＡＭタンパク質もまた、本発明に含まれる。
【０１２１】
適切なアッセイいずれかによって、Ｂ７Ｌ−１に結合する能力を所持する変異体を同定することも可能である。例えば、Ｂ７Ｌ−１の結合ドメインへの結合に対する競合（すなわち競合的結合アッセイ）によって、ＬＤＣＡＭの生物学的活性を決定することも可能である。
【０１２２】
ＬＤＣＡＭポリペプチドの競合的結合アッセイの１つの種類は、放射標識可溶性ＬＤＣＡＭ、およびＢ７Ｌ−１を発現する、損なわれていない細胞を用いる。損なわれていない細胞の代わりに、可溶性Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、またはＢ７Ｌ−１もしくは分子のＦｃ部分に対する抗体と、融合タンパク質のＦｃ領域との相互作用を通じて、固相に結合されている、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃを代用することも可能である。別の種類の競合的結合アッセイは、放射標識可溶性ＬＤＣＡＭ受容体、およびＬＤＣＡＭを発現する、損なわれていない細胞を利用する。
【０１２３】
慣用的方法論にしたがって、競合的結合アッセイを行うことも可能である。例えば、放射標識ＬＤＣＡＭを用いて、推定上のＬＤＣＡＭ相同体と競合させて、Ｂ７Ｌ−１または表面結合ＬＤＣＡＭ受容体に対する結合活性に関して、アッセイすることも可能である。競合的オートラジオグラフ・プレート結合アッセイによって定性的結果を得ることも可能であるし、またはスキャッチャードプロットを利用して、定量的結果を生じることも可能である。
【０１２４】
あるいは、Ｂ７Ｌ−１および抗ＬＤＣＡＭ抗体などのＬＤＣＡＭ結合性タンパク質を、カラムクロマトグラフィーマトリックス、あるいは表面上にＬＤＣＡＭを発現する細胞を同定するか、分離するか、または精製するのに適した類似の支持体などの固相に結合させることも可能である。いずれかの手段によって、例えばＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を構築し、そしてプロテインＡまたはプロテインＧの相互作用を通じて該融合タンパク質を固相に結合させることによって、固相接触表面へのＬＤＣＡＭ結合性タンパク質の結合を達成することも可能である。固相にタンパク質を固定する多様な他の手段が当該技術分野に周知であり、そして本発明での使用に適している。例えば、磁気微小球体を、Ｂ７Ｌ−１でコーディングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持することも可能である。ＬＤＣＡＭ発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁物を、Ｂ７Ｌ−１ポリペプチドを有する固相と接触させる。表面上にＬＤＣＡＭを有する細胞が、固定Ｂ７Ｌ−１に結合し、そして次いで、非結合細胞が洗い流される。このアフィニティー結合法は、溶液から、こうしたＬＤＣＡＭ発現細胞を精製するか、スクリーニングするか、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から遊離させる方法が当該技術分野に知られ、そしてこうした方法は、例えば、酵素の使用を含む。こうした酵素は、好ましくは細胞に対して非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう指示される。Ｂ７Ｌ−１：ＬＤＣＡＭ相互作用の場合、酵素は、好ましくは、ＬＤＣＡＭ成分から、生じた細胞懸濁物を取り除く。次いで、特に精製細胞集団が胎児組織から得られた場合、該集団を用いて、成熟（成体）組織に再移入（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）することも可能である。
【０１２５】
あるいは、ＬＤＣＡＭ＋細胞を含有すると推測される細胞混合物をまず、ビオチン化Ｂ７Ｌ−１とインキュベーションすることも可能である。インキュベーション期間は、ＬＤＣＡＭへの十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。次いで、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させると、アビジンに対するビオチンの高い親和性によって、該ビーズに細胞が結合する。アビジンでコーティングしたビーズの使用が当該技術分野に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。慣用法を用いて、非結合成分を洗浄し、そして結合細胞を遊離させる。
【０１２６】
上述のように、Ｂ７Ｌ−１を用いて、ＬＤＣＡＭを発現する細胞を分離することも可能である。別の方法において、ＬＤＣＡＭまたは細胞外ドメインまたはその断片を１２５Ｉなどの検出可能部分にコンジュゲート化して、Ｂ７Ｌ−１発現細胞を検出することも可能である。高い比活性で標識された、機能する１２５Ｉ−ＬＤＣＡＭ分子を生じるいくつかの標準的方法論いずれによって、１２５Ｉでの放射標識を行うことも可能である。あるいは分子のＢ７Ｌ−１領域またはＦｃ領域に対するヨード化抗体またはビオチン化抗体を用いることも可能である。比色反応または蛍光定量反応を触媒可能な酵素、ビオチンまたはアビジンなどの別の検出可能部分を用いることも可能である。Ｂ７Ｌ−１発現に関して試験しようとする細胞を、標識したＬＤＣＡＭと接触させることも可能である。インキュベーション後、非結合標識ＬＤＣＡＭを取り除き、そして検出可能部分を用いて、結合を測定する。
【０１２７】
上述のものに類似の競合アッセイにおいて、コンジュゲート化可溶性ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ（例えば１２５Ｉ−ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ）を用いて、ＬＤＣＡＭ（変異体を含む）の結合特性を決定することもまた可能である。しかし、この場合、固相に結合し、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃを発現する、損なわれていない細胞を用いて、ＬＤＣＡＭ変異体を含有すると推定される試料が、ＬＤＣＡＭのコンジュゲート化可溶性結合パートナーとの結合に関して競合する度合いを測定する。
【０１２８】
ＬＤＣＡＭに関してアッセイする他の手段には、抗ＬＤＣＡＭ抗体、ＬＤＣＡＭに反応して増殖する細胞株、またはＬＤＣＡＭの存在下で増殖する組換え細胞株の使用が含まれる。
【０１２９】
本明細書に開示するＬＤＣＡＭタンパク質を使用して、ＬＤＣＡＭへの結合親和性に関して、Ｂ７Ｌ−１または他のＬＤＣＡＭ結合性タンパク質の生物学的活性を測定することも可能である。一例として、Ｂ７Ｌ−１の修飾（例えば化学的修飾、一部切除、突然変異など）後、生物学的活性が保持されるかどうかを決定する際に、ＬＤＣＡＭを用いることも可能である。こうして、研究、または場合によっては臨床に使用する前に、Ｂ７Ｌ−１タンパク質の生物学的活性を確かめることも可能である。
【０１３０】
ＬＤＣＡＭタンパク質は、例えば異なる条件下でのＢ７Ｌ−１または他のＬＤＣＡＭ結合性タンパク質の貯蔵寿命および安定性を監視するための、「品質保証」研究を行うものによって、使用可能な試薬としての使用を見出す。例えば、ＬＤＣＡＭは、異なる温度で保管されているか、または異なる細胞種で産生されたＢ７Ｌ−１タンパク質の生物学的活性を測定する、結合親和性研究に使用可能である。ＬＤＣＡＭに対する修飾Ｂ７Ｌ−１タンパク質の結合親和性を、非修飾Ｂ７Ｌ−１タンパク質のものと比較して、Ｂ７Ｌ−１の生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。同様に、Ｂ７Ｌ−１を用いて、ＬＤＣＡＭタンパク質の生物学的活性を評価することも可能である。
【０１３１】
ＬＤＣＡＭポリペプチドはまた、付着する剤を、Ｔ細胞、あるいはＢ７Ｌ−１、ＬＤＣＡＭおよび／またはＣＲＴＡＭを所持する他の細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。ＬＤＣＡＭタンパク質を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこれらの細胞に搬送することも可能である。実施例５に記載するように、ＬＤＣＡＭは、ＥＢＶ形質転換細胞株であるＰＡＥ８１ＢＭ細胞株上に見られる。したがって、こうしたキャリアー使用の１つの例は、この細胞株を療法剤／ＬＤＣＡＭコンジュゲートに曝露して、該剤がＥＢＶ癌いずれかに対して細胞傷害性を示すかどうかを評価することである。さらに、ＬＤＣＡＭは、抗原提示に重要である樹状細胞およびＣＤ４０Ｌ活性化Ｂ細胞上に発現されるため、ＬＤＣＡＭは、これらの細胞をターゲットとし、同定し、そして精製するのに有用なキャリアーである。また、ＬＤＣＡＭ／診断用剤コンジュゲートを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞およびＢ細胞の存在を検出することも可能である。実施例６は、ヒトＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡ転写物が、ヒト乳房、網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児心臓、肺、胎盤、甲状腺、および肺癌に見られることを示す。マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡの発現に関する同様の研究は、マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡが、全胚、精巣、リンパ系由来樹状細胞および三重ネガティブ細胞に見られることを示した。ＬＤＣＡＭは自身に結合するため、ＬＤＣＡＭを用いて、これらの組織におけるその機能的役割を研究することも可能である。
【０１３２】
あるいは、さらなるターゲット細胞上の、限定されるわけではないが、Ｂ７Ｌ−１、ＣＲＴＡＭおよびＬＤＣＡＭなどの他のＬＤＣＡＭ結合パートナーにＬＤＣＡＭをターゲティングすることも可能である。例には、限定されるわけではないが、ＣＲＴＡＭを介した、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞；ＬＤＣＡＭを介した、ＢＤＣＡ３＋ヒト樹状細胞およびＣＤ８α＋を含む樹状細胞などの抗原提示細胞が含まれる。
【０１３３】
アッセイにおいて、ＬＤＣＡＭとともに、抗ＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭ抗体、ペプチボディ等に付着させたいくつかの異なる療法剤または他の機能するマーカーを、コンジュゲート中で用いて、細胞に対する剤の細胞傷害効果を検出し、そして比較するか、または組織および細胞におけるＬＤＣＡＭの役割を研究することも可能である。ＬＤＣＡＭポリペプチドに付着させることも可能な診断用剤および療法剤には、限定されるわけではないが、薬剤、毒素、放射性核種、発色団、比色反応または蛍光定量反応を触媒する酵素等が、意図する適用にしたがって選択される特定の剤とともに含まれる。薬剤の例には、多様な型の癌を治療する際に使用するもの、例えばＬ−フェニルアラニン・ナイトロジェンマスタードまたはシクロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード、シス−ジアミノジクロロ白金などの挿入剤、５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、並びにブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびその誘導体などの抗生物質が含まれる。毒素の例は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）である。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒが含まれる。療法使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕが含まれる。
【０１３４】
適切な慣用法いずれかによって、こうした剤を、ＬＤＣＡＭとともに、抗ＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭ抗体、ペプチボディ等に付着させることも可能である。ＬＤＣＡＭはタンパク質であるため、例えば、所望の剤上の官能基と反応して、共有結合を形成することも可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または剤を誘導体化して、所望の反応性官能基を生成するか、または付着させることも可能である。誘導体化には、多様な分子をタンパク質に付着させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの付着を伴うことも可能である。タンパク質を放射標識するいくつかの技術が知られる。例えば適切な二官能性キレート剤を用いることによって、放射性核種金属をＬＤＣＡＭに付着させることも可能である。
【０１３５】
こうして、ＬＤＣＡＭとともに抗ＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭ抗体、ペプチボディ等、および適切な診断用剤または療法剤を含む、コンジュゲート（好ましくは共有結合したもの）を調製する。該コンジュゲートを、特定の適用に適した量で投与するか、または別の方式で使用する。
【０１３６】
上述のように、ＬＤＣＡＭはＣｏｎＡおよびＰＨＡに引き起こされるＴ細胞増殖を遮断し、そしてＴＣＲ  ｍＡｂが誘導するＴ細胞増殖を阻害しないため、マイトジェン誘導性Ｔ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの阻害効果は、サイトカイン分泌、例えばＩＬ−２の阻害である可能性もある。したがって、本発明のＬＤＣＡＭの別の使用は、Ｔ細胞において、ＬＤＣＡＭがＩＬ−２産生に果たす役割を研究するための研究ツールとしてのものである。Ｂ７Ｌ−１またはその相互作用を検出するため、本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで使用することもまた、可能である。
【０１３７】
本発明の１つの態様は、機能不全免疫系と関連する障害を治療する方法に関する。より具体的には、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡのＴ細胞刺激およびＰＨＡのＴ細胞刺激を遮断することが知られるため、ＬＤＣＡＭは、Ｔ細胞応答に仲介される炎症および自己免疫障害を治療するのに有用でありうる。ＬＤＣＡＭタンパク質、好ましくは可溶性ポリペプチド、および薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーを含む組成物を哺乳動物に投与して、こうした炎症または自己免疫障害を治療することも可能である。ＬＤＣＡＭ／Ｆｃの形の可溶性ＬＤＣＡＭを注射しておいたＳＣＩＤマウスは、脾臓細胞充実度（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）の増加を経験する。この増加の一部は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）としても知られる、ＤＸ−５＋細胞の増加のためである。ＬＤＣＡＭ／ＦｃおよびＮＫ細胞増殖因子のＩＬ−１５を注射すると、ＳＣＩＤマウスは、相加的にＮＫ細胞の増加を示す。これは、ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭ断片、可溶性ＬＤＣＡＭとともにＬＤＣＡＭアゴニストがＮＫ細胞を生成する能力をさらに証明する。この発見を考慮して、本発明の別の態様には、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭ断片とともにＬＤＣＡＭアゴニストを含有する、本発明の薬剤組成物を個体に投与することによって、該個体においてＮＫ細胞数を増加させる方法が含まれる。別の態様において、ＮＫ細胞を、ＬＤＣＡＭまたはＬＤＣＡＭの可溶性型とともにＬＤＣＡＭアゴニストと接触させて、そしてＮＫ細胞が増殖するのを可能にすることによって、ｅｘ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞を増加させることも可能である。同様に、ちょうど記載したように、さらなるサイトカインまたは増殖因子と組み合わせて、ＬＤＣＡＭまたはＬＤＣＡＭの可溶性型とともにＬＤＣＡＭアゴニストを投与することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞を生成することも可能である。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＮＫ細胞を生成する本発明の方法は、ＬＤＣＡＭと連続してまたは同時に併用して、サイトカインの有効量を使用することをさらに含むことも可能である。こうしたサイトカインには、限定されるわけではないが、インターロイキン（「ＩＬ」類）、ＩＬ−１５、ＩＬ−３およびＩＬ−４、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体からなる群より選択されるコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、あるいはＴＮＦ−α、ＣＤ４０結合性タンパク質（例えばＣＤ４０−Ｌ）、４−１ＢＢアンタゴニスト（例えば４−１ＢＢおよび４−１ＢＢ−Ｌと免疫反応する抗体）またはｃ−ｋｉｔリガンドなどの他のサイトカインが含まれる。
【０１３８】
ＮＫ細胞は、Ｔリンパ球またはＢリンパ球とは、形態および機能が異なる、巨大顆粒リンパ球である。ＮＫ細胞は、非ＭＨＣ拘束方式で、特定の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の殺傷を仲介する。さらにＮＫ細胞は骨髄移植レシピエントによるドナー細胞の拒絶に関与する。ＬＤＣＡＭは、ＮＫ細胞数を増加させるため、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭ断片とともにＬＤＣＡＭアゴニストは、ウイルス感染細胞および感染性疾患と戦うのに有用である。同様に、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、およびＬＤＣＡＭ断片は、腫瘍細胞殺傷に有用である。したがって、本発明の範囲内にあるのは、感染性疾患を治療する方法および腫瘍に罹患した個体を治療する方法である。こうした療法は、腫瘍細胞を殺傷するか、または感染性疾患と戦う能力を増進するため、ＮＫ細胞数を増加させる必要がある個体に、ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭの可溶性型、またはＬＤＣＡＭ断片を投与することを伴う。同様に、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、例えばＬＤＣＡＭ融合タンパク質、またはＬＤＣＡＭ断片を、サイトカインと併用して、連続してまたは同時に投与することによって、本発明の療法を行うことも可能である。こうしたサイトカインには、限定されるわけではないが、インターロイキン（「ＩＬ」類）、ＩＬ−１５、ＩＬ−３およびＩＬ−４、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体からなる群より選択されるコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、あるいはＴＮＦ−α、ＣＤ４０結合性タンパク質（例えばＣＤ４０−Ｌ）、４−１ＢＢアンタゴニスト（例えば４−１ＢＢおよび４−１ＢＢ−Ｌと免疫反応する抗体）またはｃ−ｋｉｔリガンドなどの他のサイトカインが含まれる。さらに、本発明の範囲内にあるのは、移植のレシピエントによる臓器および骨髄移植拒絶の影響を防止するかまたは減少させる方法である。こうした方法は、ＬＤＣＡＭアンタゴニストを含む組成物でレシピエントを治療し、こうしてＮＫ細胞集団の増加を阻害して、そしてＮＫ細胞が移植を拒絶する能力を減少させることを含む。ヒト内皮細胞（大動脈および臍帯）をヒトＬＤＣＡＭの可溶性型で処理すると、細胞内のカルシウム流動が生じる。内皮細胞におけるカルシウム流動は、血管浸透性、内皮細胞遊走および血管形成、並びに白血球の接着および遊出を調節するのに重要である。したがって、ＬＤＣＡＭポリペプチドおよびＬＤＣＡＭ阻害剤を用いて、血液−脳関門を渡る薬剤搬送を改善し、腫瘍または病原体に対する免疫応答を増大させ、自己免疫または炎症症候群を和らげ、白血球接着およびアテローム斑の形成を和らげ、血管形成を遮断することも可能であり、そして病原性の血管漏出の治療に用いることも可能である。ＬＤＣＡＭポリペプチドとともに、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、共有結合または非共有結合二量体または三量体などのオリゴマーとして存在することも可能である。異なるＬＤＣＡＭポリペプチド上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合によって、オリゴマーを連結することも可能である。本発明の１つの態様において、Ｔ細胞、Ｂ７Ｌ−１またはそれ自体へのＬＤＣＡＭの結合に干渉しない方式で、抗体（例え���ＩｇＧ１）のＦｃ領域に、ＬＤＣＡＭを融合させることによって、ＬＤＣＡＭ二量体を生成する。Ｆｃポリペプチドは、好ましくは、可溶性ＬＤＣＡＭ（受容体結合部分のみを含む）のＣ末端に融合される。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的な調製は、例えば、本明細書に援用される、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ，  ３４４：６７７，  １９９０）に記載される。ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ融合タンパク質を、抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、Ｆｃポリペプチド間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、二価ＬＤＣＡＭを生じるのを可能にする。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＬＤＣＡＭ細胞外領域を持つＬＤＣＡＭオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、２つの可溶性ＬＤＣＡＭドメインをペプチドリンカーで連結することも可能である。
【０１３９】
免疫グロブリンに基づくオリゴマーとしてのアンタゴニストおよびアゴニスト。適切な型のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストには、キメラタンパク質が含まれ、該キメラタンパク質は、キメラタンパク質による二量体、三量体またはより高次の多量体の自発的形成を促進可能な第二のポリペプチドを含み、これらのキメラタンパク質は、それぞれの同族体と結合可能であり、そしてそれによって、炎症の影響および心臓血管疾患の症状を阻害するかまたは減少させる。アンタゴニストまたはアゴニストとして用いられるキメラタンパク質は、抗体分子、およびＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭ由来の可溶性ポリペプチドの部分を含有するタンパク質であることも可能である。適切な融合タンパク質には、免疫グロブリンＦｃ領域に連結された、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭポリペプチド、例えば細胞外ドメイン、または細胞外ドメインの断片が含まれる。Ｆｃ領域の断片とともに、Ｆｃ受容体に対して、減少した親和性を示すＦｃ突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）もまた使用可能である。可溶性ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭとともにその断片を、免疫グロブリンのＦｃ部分に、直接またはリンカー配列を通じて、融合させることも可能である。
【０１４０】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの１つの態様は、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合させることによって生成される２つの融合ポリペプチドを含む二量体に向けられる。こうした融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドを発現させ、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、二価分子を生じるのを可能にする。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１０１５１に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭの二価型に関しては、こうした融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対するものであることも可能である。他の免疫グロブリンアイソタイプを用いて、こうした融合体を生成することも可能である。例えば、ポリペプチド−ＩｇＭ融合は、本発明のポリペプチドの十価型を生成するであろう。
【０１４１】
抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している特定の異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの調製は当該技術分野において公知であり、そして、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ，  ３４４：６７７，  １９９０）；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｓｕｐｐｌ．４，  １０．１９．１−１０．１９．１１ページ，  １９９２）に記載されている。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２−４００１，  １９９４）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ  ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。Ｆｃ部分を含む上述の融合ポリペプチド（およびそれらから形成されるオリゴマー）は、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に対して置換することも可能である。融合ポリペプチドが抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＩＬ−１７Ｒ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。
【０１４２】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト  ペプチドリンカーに基づくオリゴマー。あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含み、または含まず、多数のＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１および／またはＣＲＴＡＭポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。適切なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。適切な慣用的技術いずれかを用いて、所望のペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を、本発明のＤＮＡ配列間に、そして該配列と同じ読み枠で挿入することも可能である。例えば、リンカーをコードする、化学的に合成したオリゴヌクレオチドを、配列間に連結することも可能である。特定の態様において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された、２〜４の可溶性ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭポリペプチドを含む。適切なペプチドリンカー、他のポリペプチドとの組み合わせ、およびその使用は、当業者に周知である。
【０１４３】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストのオリゴマー型には、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭポリペプチド、ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１および／またはＣＲＴＡＭポリペプチドの細胞外ドメイン、あるいはその開示が本明細書に援用される米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるジッパータンパク質などのジッパードメインと会合する細胞外ドメインのＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１および／またはＣＲＴＡＭ断片が含まれることも可能である。ジッパードメインの他の例は、酵母転写因子ＧＣＮ４に見られるものおよびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，  １９８９）、優先的にヘテロ二量体を形成する核トランスフォーミングタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎ（Ｏ’Ｓｈｅａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５；６４６，  １９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｊｉａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９，  １９８９）、およびネズミ・プロトオンコジーン、ｃ−ｍｙｃの遺伝子産物（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０：１７５９，  １９８８）に見られるものである。パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質もまた、ロイシンジッパードメインを所持する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５４７，  １９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３９４，  １９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：７０３，  １９９０）。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるポリペプチドのオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合性ポリペプチドで同定され、そして以来、多様な異なるポリペプチドで発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然存在ペプチドおよび誘導体がある。ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化ドメイン、またはオリゴマー形成ドメインとも称される）は、７アミノ酸反復を含み、しばしば他のアミノ酸の間に４または５のロイシン残基が散在する。ロイシンジッパーの使用およびロイシンジッパーを用いたオリゴマーの調製は、当該技術分野に周知である。
【０１４４】
本発明は、スペーサーアミノ酸連結基を含む、または含まない、融合ポリペプチドを含む。例えば、２つの可溶性ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭドメインを、米国特許第５，０７３，６２７号に記載されるような（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ）５Ｓｅｒ（配列番号３２）などのリンカー配列を用いて連結することも可能である。他のリンカー配列には、例えば、ＧｌｙＡｌａＧｌｙＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）５Ｓｅｒ（配列番号３３）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号３４）、（ＧｌｙＴｈｒＰｒｏ）３（配列番号３５）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３Ｇｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ（配列番号３６）が含まれる。
【０１４５】
ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭポリペプチドなどのＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、またはより高次の真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，エルセビア，ニューヨーク（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて、ＬＤＣＡＭポリペプチドを産生するのに使用可能である。
【０１４６】
原核生物には、例えば大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）などのグラム陰性生物またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適した原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にするため、ＬＤＣＡＭポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を含むことも可能である。Ｎ末端Ｍｅｔを、発現された組換えＬＤＣＡＭポリペプチドから切断することも可能である。
【０１４７】
ＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１またはＣＲＴＡＭポリペプチドなどのＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、好ましくは、サッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来などの酵母宿主細胞において発現可能である。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母の他の属も使用可能である。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３，  １９８０）、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９，  １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７：４９００，  １９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターが、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，  ＥＰＡ−７３，６５７またはＦｌｅｅｒら，  Ｇｅｎｅ，  １０７：２８５−１９５（１９９１）；およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：１３５−１３９（１９９０）にさらに記載される。別の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４，  １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，  １９８２）に記載されるグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。上記酵母ベクター中に、大腸菌での選択および複製のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を挿入することによって、酵母および大腸菌両方で複製可能なシャトルベクターを構築することも可能である。
【０１４８】
酵母α因子リーダー配列を使用して、ＬＤＣＡＭポリペプチドの分泌を導くことも可能である。α因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３，  １９８２；Ｂｉｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５３３０，  １９８４；米国特許第４，５４６，０８２号およびＥＰ  ３２４，２７４を参照されたい。酵母宿主由来の組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列が、当業者に知られる。３’端近傍でリーダー配列を修飾して、１以上の制限部位を含有させることも可能である。これは構造遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にするであろう。
【０１４９】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つが、Ｈｉｎｎｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，  １９７８に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地中でのＴｒｐ＋形質転換体を選択する。
【０１５０】
「リッチ」培地中の発現を誘導するため、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターによって形質転換された酵母宿主細胞を増殖させることも可能である。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【０１５１】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えＬＤＣＡＭポリペプチドを発現するのに使用可能である。昆虫細胞における異種タンパク質産生のためのバキュロウイルス系が、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に概説される。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用可能である。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であるＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株が含まれる。
【０１５２】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムより切り出されることも可能である。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供することも可能である。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含有することも可能な断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位からＢｇｌ  Ｉ部位に渡る、およそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいかまたはより大きいＳＶ４０断片もまた使用可能である。
【０１５３】
哺乳動物宿主細胞において用いるための典型的な発現ベクターを、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０，  １９８３）に開示されるように構築することも可能である。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５，  １９８６）に記載されるように構築することも可能である。Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，  １９８４に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６および米国特許出願第０７／７０１，４１５号、１９９１年５月１６日出願に記載されている。ベクターは、レトロウイルス由来であることも可能である。天然シグナル配列の代わりに、そしてイニシエーター・メチオニンに加えて、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるＩＬ−７のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるＩＬ−２受容体のシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されるＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されるＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチドなどの異種シグナル配列を付加することも可能である。
【０１５４】
上述のような組換え発現系によって、本発明記載の単離、精製または均質タンパク質としてのＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを産生することも、あるいは天然存在細胞から精製することも可能である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際して、単一のタンパク質バンドに示されるように、ＬＤＣＡＭを実質的に均質に精製することも可能である。
【０１５５】
ＬＤＣＡＭを産生する１つのプロセスは、ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ＬＤＣＡＭの発現を促進するのに十分な条件下で培養することを含む。次いで、使用した発現系に応じて、ＬＤＣＡＭを培地または細胞抽出物から回収する。当業者に知られるように、組換えタンパク質を精製する方法は、使用する宿主細胞種、および組換えタンパク質が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがって多様であろう。
【０１５６】
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を使用する場合、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて、培地をまず、濃縮することも可能である。濃縮工程後、濃縮物をゲルろ過媒体などの精製マトリックスに適用することも可能である。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダント・ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは支持体が使用可能である。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に使用される他の種類であることも可能である。あるいは、陽イオン交換工程も使用可能である。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えばペンダントメチル、または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する、１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ＬＤＣＡＭをさらに精製することも可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてが周知であり、そしてこれを使用して、実質的に均質な組換えタンパク質を提供することも可能である。
【０１５７】
ＬＤＣＡＭ結合性タンパク質のリガンド結合性ドメインを含むアフィニティーカラムを利用して、発現されたＬＤＣＡＭポリペプチドをアフィニティー精製することも可能である。慣用的な技術を用いて、例えば利用するアフィニティーマトリックスに応じて、高塩溶出緩衝液中で、そしてその後、使用のためより低塩の緩衝液中に透析することによって、またはｐＨもしくは他の構成要素を変化させることによって、ＬＤＣＡＭポリペプチドをアフィニティーカラムからはずす（ｒｅｍｏｖｅ）ことも可能である。あるいは、アフィニティーカラムは、ＬＤＣＡＭに結合する抗体を含むことも可能である。実施例１０は、ＬＤＣＡＭに対して向けられるモノクローナル抗体を生成するため、本発明のＬＤＣＡＭを使用する方法を記載する。
【０１５８】
細菌培養中で産生された組換えタンパク質を、まず宿主細胞を破壊して、遠心分離し、不溶性ポリペプチドの場合は細胞ペレットから抽出し、また可溶性ポリペプチドの場合は上清液から抽出して、その後、１以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を続けることによって、単離することも可能である。最後に、最終精製工程のため、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用することも可能である。凍結融解サイクリング、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、好適な方法いずれかによって、微生物細胞を破壊することも可能である。
【０１５９】
精製を単純化するため、好ましくは、分泌ポリペプチドとしてＬＤＣＡＭを発現する形質転換酵母宿主細胞を使用する。酵母から分泌される組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  ２９６：１７１，  １９８４）に開示されるものと類似の方法によって精製可能である。Ｕｒｄａｌらは、分取用ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２精製のための、２つの連続する逆相ＨＰＬＣ工程を記載する。
【０１６０】
ＬＤＣＡＭ核酸の有用な断片には、ターゲットＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡ（センス）またはＬＤＣＡＭ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれか）を含む、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがって、ＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡのコード領域の断片を含む。こうした断片は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチドを含む。既定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６５９，  １９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，  １９８８）に記載されている。
【０１６１】
４．  ＣＲＴＡＭ
上述のように、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、ＬＤＣＡＭなどの１以上のＣＲＴＡＭ結合パートナーへのＣＲＴＡＭ結合の下流生物学的効果を調節する、ＣＲＴＡＭ特異的抗体、ＣＲＴＡＭ特異的ペプチボディまたはＣＲＴＡＭに結合する可溶性ポリペプチド（ＬＤＣＡＭなど）を含む。ＣＲＴＡＭは、本明細書に完全に援用される米国特許第５，６８６，２５７号に記載される。ヒトＣＲＴＡＭの配列を配列番号１１に提供する。
【０１６２】
５．  ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト活性のアッセイ
本発明の精製ＬＤＣＡＭポリペプチド（ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）は、多様なアッセイで有用である。
【０１６３】
態様には、ＬＤＣＡＭアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する試験化合物を同定するスクリーニングアッセイが含まれる。限定されるわけではないが：（ａ）試験化合物と単離ＬＤＣＡＭポリペプチドを合わせ；（ｂ）単離ＣＲＴＡＭポリペプチドを添加し；そして（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチドおよびＣＲＴＡＭポリペプチド間の相対的結合を決定することを含む、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関するスクリーニング法を含む、いくつかの形式および順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が想定される。別の態様には：（ａ）ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞と試験化合物を合わせ；（ｂ）単離ＣＲＴＡＭポリペプチドを添加し；そして（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞およびＣＲＴＡＭポリペプチド間の相対的結合を決定することを含む、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関するスクリーニング法が含まれる。別の態様には：（ａ）ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞と試験化合物を合わせ；（ｂ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞を添加し；そして（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する細胞およびＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞間の相対的結合を決定することを含む、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関するスクリーニング法が含まれる。別の態様には：（ａ）単離ＬＤＣＡＭポリペプチドと試験化合物を合わせ；（ｂ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞を添加し；そして（ｃ）試験化合物の存在下および非存在下で、ＬＤＣＡＭポリペプチド、およびＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞間の相対的結合を決定することを含む、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストに関するスクリーニング法が含まれる。別の態様には：（ａ）単離ＣＲＴＡＭポリペプチドと試験化合物を合わせ；そして（ｂ）試験化合物およびＣＲＴＡＭポリペプチド間の相対的結合を決定することを含む、ＬＤＣＡＭアゴニストに関するスクリーニング法が含まれる。別の態様には：（ａ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞を合わせ；そして（ｂ）ＣＲＴＡＭポリペプチドを発現する細胞および試験化合物間の相対的結合または生物学的効果を決定することを含む、ＬＤＣＡＭアゴニストに関するスクリーニング法が含まれる。
【０１６４】
例えば本発明のＬＤＣＡＭおよびＬＤＣＡＭ様分子を用いて、ＬＤＣＡＭポリペプチドの結合パートナーを同定することも可能であり、該ポリペプチドを用いて、細胞間コミュニケーション、細胞刺激、または免疫細胞活性を調節することもまた可能である。あるいは、本発明のＬＤＣＡＭおよびＬＤＣＡＭ様分子を用いて、細胞間コミュニケーション、細胞刺激経路、または免疫細胞活性を調節する、非結合パートナー分子または物質、すなわちＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストを同定することも可能である。
【０１６５】
ＬＤＣＡＭポリペプチドはまた、結合親和性に関して、ＬＤＣＡＭ結合性ポリペプチドの生物学的活性を測定する際にも使用を見出す。例には、限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭ、Ｂ７ｌ−４、Ｂ７Ｌ−１とともに抗ＬＤＣＡＭ抗体およびペプチボディが含まれる。例えば、異なる条件下のポリペプチドの貯蔵寿命および安定性を監視するための、「品質保証」研究を行うものによって、上に列挙する例を使用することも可能である。例えば、異なる温度で保管されているか、または異なる細胞種で産生された、限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７ｌ−４、およびＣＲＴＡＭなどの結合パートナーポリペプチドの生物学的活性を測定する結合親和性研究において、ＬＤＣＡＭポリペプチドを使用することも可能である。結合パートナーポリペプチドの修飾（例えば化学的修飾、一部切除、突然変異など）後、生物学的活性が保持されるかどうかを決定するため、該ポリペプチドを用いることもまた可能である。修飾ポリペプチドの結合親和性を、非修飾結合性ポリペプチドのものと比較して、結合性ポリペプチドの生物学的活性に対して、修飾が与えたいかなる不都合な影響も検出する。
【０１６６】
結合パートナーを同定するアッセイ。ＬＤＣＡＭポリペプチドおよびその断片を用いて、結合パートナーを同定することも可能である。ＬＤＣＡＭの結合パートナーには、限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、およびＣＲＴＡＭが含まれる。例えば、適切なアッセイいずれか、例えば慣用的な結合アッセイで、候補結合パートナーに結合する能力に関して、これらを試験することも可能である。例えば、ＬＤＣＡＭポリペプチドを検出可能試薬（例えば放射性核種、発色団、比色反応または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識することも可能である。候補結合パートナーを発現している細胞と、標識したＬＤＣＡＭポリペプチドを接触させる。次いで、細胞を洗浄して、未結合の標識したポリペプチドを除去し、そして標識の性質にしたがって選択した、適切な技術によって、細胞結合標識の存在を決定する。
【０１６７】
本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドを、各々、限定されるわけではないがＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、およびＣＲＴＡＭなどの結合パートナーに関してスクリーニングするか、または該パートナーを同定する方法における試薬として用いることも可能である。例えば、ＬＤＣＡＭポリペプチドを固体支持体材料に付着させて、そしてアフィニティークロマトグラフィーと類似の方式で、結合パートナーに結合させることも可能である。特定の態様において、慣用法によって、ポリペプチドを固体支持体に付着させる。一例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含有するクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。代替法として、ＬＤＣＡＭポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質（上に論じるようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じて、プロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに付着させる。ＬＤＣＡＭポリペプチドはまた、限定されるわけではないがＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、およびＣＲＴＡＭなどのＬＤＣＡＭ結合パートナーを、細胞表面上に発現する細胞を同定するのにも使用を見出す。精製ＬＤＣＡＭポリペプチドとともに、変異体、断片、融合タンパク質または誘導体などの他の型を、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは類似の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば磁気微小球体を該ポリペプチドでコーティングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器に保持することも可能である。潜在的な結合パートナーの発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドを有する固相と接触させる。細胞表面上に結合パートナーを発現している細胞は固定ポリペプチドに結合し、そして未結合細胞は洗い流される。あるいは、ＬＤＣＡＭポリペプチドを検出可能部分にコンジュゲート化し、次いで、結合パートナー発現に関して試験しようとする細胞とインキュベーションする。インキュベーション後、未結合標識物質を取り除き、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を決定する。さらなる代替法において、結合パートナーを発現していると推測される細胞の混合物を、ビオチン化したポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション期間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。次いで、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによって、アビジンに対するビオチンの高い親和性が、所望の細胞のビーズへの結合を提供する。アビジンでコーティングしたビーズの使用法が知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９，  １９８６を参照されたい）。未結合成分を取り除く洗浄、および結合細胞の遊離は、慣用法を用いて行われる。いくつかの場合、結合パートナーに関してスクリーニングするか、または該パートナーを同定する上記の方法はまた、こうした結合パートナー分子またはそれらを発現している細胞などを用いるかまたは修飾して、単離するかまたは精製することも可能である。こうした方法によって���見される結合パートナーの例には、限定されるわけではないが、実施例に記載するように、ＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、およびＣＲＴＡＭが含まれる。
【０１６８】
結合アッセイ法の１つの例は以下のとおりである。候補結合パートナーｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを構築する（限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、およびＣＲＴＡＭなど）。１０ｃｍ２プレート中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞をこの組換え発現ベクターでトランスフェクションする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターから駆動されるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であった。トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして次いで、各プレート中の細胞を２４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクション細胞（約４ｘ１０４細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２を含有するＲＰＭＩ１６４０）である。次いで、該細胞を、多様な濃度の、例えば上述のように作成したＬＤＣＡＭの可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと、３７℃で１時間インキュベーションする。次いで、細胞を洗浄し、そして結合培地中で、１２５Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃度で、穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後、トリプシン処理を介して細胞を遊離させる。上に使用するマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることも可能である。該抗体は標準的クロラミン−Ｔ法を用いて放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞に結合しているいかなるＬＤＣＡＭポリペプチド／ＦｃポリペプチドのＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、１２５Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合ポリペプチド／Ｆｃの非存在下でアッセイするとともに、Ｆｃ融合ポリペプチドおよび２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセイする。細胞結合１２５Ｉ抗体を、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）はＭｉｃｒｏｖａｘコンピュータ上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。結合はまた、高処理スクリーニング法に適した方法を用いても検出可能であり、これらの方法は例えばシンチレーション近接アッセイ（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら，  １９８５，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：８６７２−８６７６）、均質時間分解蛍光法（Ｐａｒｋら，  １９９９，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９：９４−１０４）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法（Ｃｌｅｇｇ  ＲＭ，  １９９５，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ���ｏｌ  ６：１０３−１１０）、または結合されたポリペプチドを潜在的な結合パートナーに曝露した際、例えばＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン・ウプサラ）に供給されるものなどのバイオセンサーを用いて、表面プラズモン共鳴のいかなる変化も測定する方法である。ＬＤＣＡＭおよび／またはＬＤＣＡＭ様ポリペプチドへの結合に関してアッセイ可能な化合物には、限定されるわけではないが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）、Ａｒｑｕｌｅ（マサチューセッツ州ウォバーン）、Ｅｎｚｙｍｅｄ（アイオワ州アイオワシティー）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（英国・コーンウォール州トレビレット）、ＭＤＳ  Ｐａｎｌａｂｓ（ワシントン州ボセル）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ニュージャージー州プリンストン）、およびＴｒｅｇａ（カリフォルニア州サンディエゴ）などの企業から−しばしば大きいコンビナトリアルケミストリー化合物「ライブラリー」の一部として−商業的に入手可能なものなどの、小有機分子が含まれる。これらのアッセイを用いてスクリーニングするのに好ましい小有機分子は、通常、１０Ｋ分子量未満であり、そして細胞侵入（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を増進し、分解に抵抗し、そして／またはその生理学的半減期を延長する、いくつかの物理化学的および薬理学的特性を所持することも可能である（Ｇｉｂｂｓ，  Ｊ．，  １９９４，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｃｅｌｌ  ７９（２）：１９３−１９８）。天然産物、無機化学薬品、並びにタンパク質および毒素などの生物学的に活性である物質を含む化合物もまた、ＬＤＣＡＭポリペプチドに結合する能力に関して、これらの方法を用いてアッセイすることも可能である。
【０１６９】
酵母ツーハイブリッドまたは「相互作用トラップ」アッセイ。ＬＤＣＡＭポリペプチドが、別のポリペプチド（例えばＬＤＣＡＭ（ホモタイプ凝集）、Ｂ７Ｌ−１およびＣＲＴＡＭなど）に結合するか、または潜在的に結合する場合、ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする核酸はまた、相互作用トラップアッセイ（例えばＧｙｕｒｉｓら，  Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３（１９９３）に記載されるものなど）で使用して、結合が生じる他のポリペプチドをコードする核酸を同定するか、または結合相互作用の阻害剤を同定することも可能である。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドはまた、結合相互作用のペプチドまたは小分子阻害剤またはアゴニストに関して、スクリーニングするのにも使用可能である。
【０１７０】
競合的結合アッセイ。別の種類の適切な結合アッセイは、競合的結合アッセイである。例えば、変異体の生物学的活性は、候補結合パートナーへの結合に関して、変異体が、天然ポリペプチドと競合する能力をアッセイすることによって、決定可能である。競合的結合アッセイは、慣用的方法論によって実行可能である。競合的結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識したＬＤＣＡＭ、およびＬＤＣＡＭ、Ｂ７Ｌ−１、Ｂ７Ｌ−４、またはＣＲＴＡＭ（内因性または組換え）ポリペプチドを細胞表面に発現する、損なわれていない細胞が含まれる。例えば、実施例に記載するＬＤＣＡＭ−Ｆｃ構築物などの放射標識可溶性ＬＤＣＡＭ断片を用いて、結合パートナーへの結合に関して、可溶性ＬＤＣＡＭ変異体と競合させることも可能である。Ｆｃ部分とポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ（固相上）の相互作用を通じて固相に結合した、可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドが使用可能である。ポリペプチドＡおよびポリペプチドＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なものが含まれる。
【０１７１】
細胞間コミュニケーション、細胞刺激、または免疫細胞活性の調節剤を同定するアッセイ。細胞間コミュニケーション、細胞刺激または免疫細胞活性に対するＬＤＣＡＭポリペプチドの影響を操作して、ターゲット細胞におけるこれらの活性を調節することも可能である。例えば、開示するＬＤＣＡＭポリペプチド、開示するＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする核酸、あるいはこうしたポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを細胞または細胞群に投与して、細胞結合、細胞コミュニケーション、細胞刺激、またはターゲット細胞における活性を誘導するか、増進するか、抑制するか、または停止させることも可能である。この方式で使用可能なＬＤＣＡＭポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの同定は、当業者に知られる多様なアッセイを介して実行可能である。こうしたアッセイに含まれるのは、ＬＤＣＡＭポリペプチドが、細胞結合、細胞間コミュニケーション、細胞刺激または活性に影響を及ぼす能力を評価するものである。こうしたアッセイは、例えば、ＬＤＣＡＭポリペプチドの存在下での免疫細胞相互作用の解析を伴うであろう。こうしたアッセイにおいて、ＬＤＣＡＭポリペプチドの存在下でコミュニケーションまたは細胞刺激の比率を測定し、そして次いで、こうしたコミュニケーションまたは細胞刺激が、候補アゴニストまたはアンタゴニストあるいは別のＬＤＣＡＭポリペプチドの存在下で改変されるかどうかを決定するであろう。本発明のこの側面の典型的なアッセイには、サイトカイン分泌アッセイ、Ｔ細胞同時刺激アッセイ、並びに抗原提示細胞およびＴ細胞を伴う混合リンパ球反応が含まれる。これらのアッセイは、当業者に周知である。さらなるアッセイを、以下の実施例セクションに示す。
【０１７２】
別の側面において、本発明は、試験化合物が、細胞の細胞結合、細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激活性に影響を及ぼす能力を検出する方法を提供する。この側面において、該方法は：（１）ＬＤＣＡＭポリペプチドまたはその断片を含む試験化合物と第一の群のターゲット細胞を、用いる特定のアッセイに適した条件下で接触させ；（２）ターゲット細胞間の細胞結合、細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激の純率を測定し；そして（３）試験化合物の非存在下、試験化合物が存在しない以外は、第一の群の細胞と同一の条件下で、ＬＤＣＡＭポリペプチドまたはその断片を含有する対照細胞間の細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激の純率を観察することを含む。この態様において、対照細胞における細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激の純率を、ＬＤＣＡＭ分子と試験化合物の両方で処理した細胞のものと比較する。比較によって、細胞結合、細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激のエフェクターが同定可能であるような、細胞結合、細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激の純率の相異が提供されるであろう。試験化合物は、細胞結合、細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激を活性化するかまたは上方制御することによって、あるいは阻害するかまたは下方制御することによって、エフェクターとして機能可能であり、そしてこの方法を通じて検出可能である。
【０１７３】
細胞増殖、細胞死、細胞分化、および細胞接着アッセイ。本発明のポリペプチドは、サイトカイン、細胞増殖（誘導または阻害いずれか）、または細胞分化（誘導または阻害いずれか）活性を示すことも可能であり、あるいは特定の細胞集団における他のサイトカイン産生を誘導することも可能である。現在までに発見された多くのポリペプチド因子は、１以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて、こうした活性を示してきており、そしてしたがって、該アッセイは、細胞刺激活性の好適な確認として役立つ。本発明のポリペプチドの活性は、限定なしに、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含む細胞株に関するいくつかの日常的な因子依存性細胞増殖アッセイのいずれか１つによって立証される。本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドの活性は、他の手段の中でも、以下の方法によって測定可能である：
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（ｐｐ．３．１−３．１９：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第７章：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４５：１７０６−１７１２，  １９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，  １９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：３７７８−３７８３，  １９９２；Ｂｏｗｍａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：１７５６−１７６１，  １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１７４】
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖に関するアッセイには、限定なしに：ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ，  １９９４，  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修  Ｖｏｌ．１  ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，  １９９４，  Ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．８．１−６．８．８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロントに記載されるものが含まれる。
【０１７５】
造血細胞およびリンパ球新生細胞の増殖および分化に関するアッセイには、限定なしに：Ｂｏｔｔｏｍｌｙら，  １９９１，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．３．１−６．３．１２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント；ｄｅＶｒｉｅｓら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７３：１２０５−１２１１，  １９９１；Ｍｏｒｅａｕら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０−６９２，  １９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２９３１−２９３８，  １９８３；Ｎｏｒｄａｎ，  １９９１，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．６．１−６．６．５，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント；Ｓｍｉｔｈら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：１８５７−１８６１，  １９８６；Ｂｅｎｎｅｔｔら，  １９９１，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １１，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．１５．１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント；Ｃｉａｒｌｅｔｔａら，  １９９１，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．１３．１，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロントに記載されるものが含まれる。
【０１７６】
抗原に対するＴ細胞クローン応答に関するアッセイ（とりわけ、増殖およびサイトカイン産生を測定することによる、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響を与えるとともに直接的なＴ細胞効果に影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第６章：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；第７章：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：６０９１−６０９５，  １９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １１：４０５−４１１，  １９８１；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８に記載されるものが含まれる。
【０１７７】
胸腺細胞または脾臓細胞細胞傷害性に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，  １９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２８：１９６８−１９７４，  １９８２；Ｈａｎｄａら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５：１５６４−１５７２，  １９８５；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，  １９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２８：１９６８−１９７４，  １９８２；Ｈａｎｄａら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５：１５６４−１５７２，  １９８５；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；Ｂｏｗｍａｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，  １９９１；Ｂｒｏｗｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：３０７９−３０９２，  １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１７８】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングに関するアッセイ（とりわけ、Ｔ細胞依存性抗体応答を調節し、そしてＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響を及ぼすポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：３０２８−３０３３，  １９９０；並びにＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，  １９９４，  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．３．８．１−３．８．１６，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロントに記載されるものが含まれる。
【０１７９】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（とりわけ、主にＴｈ１およびＣＴＬ応答を生じるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：３７７８−３７８３，  １９９２に記載されるものが含まれる。
【０１８０】
樹状細胞依存性アッセイ（とりわけ、未刺激（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を活性化する樹状細胞に発現されるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｇｕｅｒｙら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３４：５３６−５４４，  １９９５；Ｉｎａｂａら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７３：５４９−５５９，  １９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：５０７１−５０７９，  １９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：２５５−２６０，  １９９５；Ｎａｉｒら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：４０６２−４０６９，  １９９３；Ｈｕａｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５，  １９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：１２５５−１２６４，  １９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９４：７９７−８０７，  １９９４；およびＩｎａｂａら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７２：６３１−６４０，１９９０に記載されるものが含まれる。
【０１８１】
リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ（とりわけ、スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐポリペプチドおよびリンパ球恒常性を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５−８０８，  １９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９−６７０，  １９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５−１９５１，  １９９３；Ｉｔｏｈら，  Ｃｅｌｌ  ６６：２３３−２４３，  １９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４５：４０３７−４０４５，  １９９０；Ｚａｍａｉら，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１−８９７，  １９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：６３９−６４８，  １９９２に記載されるものが含まれる。
【０１８２】
Ｔ細胞拘束および発生の初期段階に影響を与えるポリペプチドに関するアッセイには、限定なしに：Ａｎｔｉｃａら，  Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１−１１７，  １９９４；Ｆｉｎｅら，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５：１１１−１２２，  １９９４；Ｇａｌｙら，  Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０−２７７８，  １９９５；Ｔｏｋｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７５４８−７５５１，  １９９１に記載されるものが含まれる。
【０１８３】
胚性幹細胞分化に関するアッセイ（とりわけ、胚性分化造血に影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１４１−１５１，  １９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３−４８６，  １９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら，  Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３−２９１５，  １９９３に記載されるものが含まれる。
【０１８４】
幹細胞生存および分化に関するアッセイ（とりわけ、リンパ造血を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  １９９４，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ中，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修  ｐｐ．２６５−２６８，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨーク；Ｈｉｒａｙａｍａら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５９０７−５９１１，  １９９２；Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，  ＭｃＮｉｅｃｅおよびＢｒｉｄｄｅｌｌ，  １９９４，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ中，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修  ｐｐ．２３−３９，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨーク；Ｎｅｂｅｎら，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：３５３−３５９，  １９９４；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  １９９４，  Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ中，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修  ｐｐ．１−２１，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨーク；Ｓｐｏｏｎｃｅｒら，  １９９４，  Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ中，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修  ｐｐ．１６３−１７９，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨーク；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  １９９４，  Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ中，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修  Ｖｏｌ  ｐｐ．１３９−１６２，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨークに記載されるものが含まれる。
【０１８５】
組織生成活性に関するアッセイには、限定なしに：国際特許公報第ＷＯ９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）；国際特許公報第ＷＯ９５／０５８４６号（神経、ニューロン性）；国際特許公報第ＷＯ９１／０７４９１号（皮膚、内皮）に記載されるものが含まれる。創傷治癒活性に関するアッセイには、限定なしに：ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｒｔｚ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７１：３８２−８４（１９７８）に修飾されるような、Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，  ｐｐ．７１−１１２（ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏｖｅｅ監修），  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  シカゴに記載されるものが含まれる。
【０１８６】
アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｖａｌｅら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ９１：５６２−５７２，  １９７２；Ｌｉｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７９−７８２，  １９８６；Ｖａｌｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６−７７９，  １９８６；Ｍａｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９−６６３，  １９８５；Ｆｏｒａｇｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：３０９１−３０９５，  １９８６に記載されるものが含まれる。
【０１８７】
細胞運動および接着に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第６．１２章，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１３７０−１３７６，  １９９５；Ｌｉｎｄら  ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０−１４６，  １９９５；Ｍｕｌｌｅｒら  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５８６０−５８６７，  １９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：１７６２−１７６８，  １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１８８】
止血活性および血栓溶解活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｌｉｎｅｔら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２６：１３１−１４０，  １９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  ４５：４１３−４１９，１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１−７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７−４７４，  １９８８に記載されるものが含まれる。
【０１８９】
受容体−リガンド活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第７．２８章，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ７．２８．１−７．２８．２２），  Ｔａｋａｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：６８６４−６８６８，  １９８７；Ｂｉｅｒｅｒら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６８：１１４５−１１５６，  １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９：１４９−１６０  １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９−６８，  １９９４；Ｓｔｉｔｔら，  Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０，  １９９５に記載されるものが含まれる。
【０１９０】
カドヘリン接着および浸潤抑制因子活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｈｏｒｔｓｃｈら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（３２）：１８８０９−１８８１７，  １９９５；Ｍｉｙａｋｉら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：２５４７−２５５２，  １９９５；Ｏｚａｗａら  Ｃｅｌｌ  ６３：１０３３−１０３８，  １９９０に記載されるものが含まれる。
【０１９１】
６．  ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの診断用および他の使用
本発明が提供するＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストをコードする核酸は、多くの診断または他の有用な目的に使用可能である。本発明の核酸は、解析、性質決定または療法使用のために組換えポリペプチドを発現するため；対応するポリペプチドを（恒常的に、または組織分化もしくは発生の特定の時期に、または疾患状態において）優先的に発現する組織のマーカーとして；サザンゲル上の分子量マーカーとして；染色体を同定するかまたは関連遺伝子位をマッピングするための染色体マーカーまたはタグとして（標識した場合）；潜在的な遺伝子障害を同定するために患者における内因性ＤＮＡ配列と比較するため；ハイブリダイズしそしてしたがって新規関連ＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを得るための情報供給源として；他の新規核酸を発見するプロセスにおいて、既知の配列を「取り去る（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」ためのプローブとして；発現パターンの検査用のものを含む、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着するオリゴマーを選択し、そして作成するため；ＤＮＡ免疫技術を用いて、抗ポリペプチド抗体を作成するため；抗ＤＮＡ抗体を作成するかまたは別の免疫応答を誘発するための抗原として、そして遺伝子治療のために使用可能である。ＬＤＣＡＭポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：ポリペプチドを精製し、そしてその活性を測定すること；搬送剤；療法試薬および研究用試薬；分子量マーカーおよび等電点電気泳動マーカー；ペプチド断片化用の対照；未知のポリペプチドの同定；並びに抗体の調製。これらの使用に適したいずれかの核酸またはすべての核酸を、製品として商品化するため、試薬等級またはキット形式に発展させることが可能である。上に列挙する使用を実行する方法は、当業者に周知である。こうした方法を開示する参考文献には、限定なしに、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ監修，  １９８９、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．  Ｋｉｍｍｅｌ監修，  １９８７が含まれる。
【０１９２】
プローブおよびプライマー。開示するＬＤＣＡＭ核酸、およびその断片の組み合わせの使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接ヌクレオチドを含む。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接ヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示され、そして上に詳細に記載されている。遺伝暗号の知識を、上に示すアミノ酸配列と組み合わせて用いて、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することも可能である。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離し、そして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。特定の態様において、非ヒト遺伝子ライブラリー用のプローブとして、縮重プライマーを使用することも可能である。こうしたライブラリーには、限定されるわけではないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、およびエレクトロニックＥＳＴ（発現配列タグ）またはＤＮＡライブラリーさえ含まれるであろう。次いで、この方法で同定された相同配列をプローブとして用いて、非ヒトＬＤＣＡＭ相同体を同定するであろう。
【０１９３】
染色体マッピング。当業者は、ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする核酸、並びにこれらの核酸の開示する断片および組み合わせを用い、周知の技術を用いて、これらの核酸がマッピングするヒト染色体を同定することも可能である。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッドマッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞株に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの多様な周知の技術におけるプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分を使用することが含まれる。例えば、放射ハイブリダイゼーションによって、染色体をマッピングすることも可能である。９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルを用い、目的の遺伝子の推定上のエクソン内にあり、そしてヒトゲノムＤＮＡから産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、これをＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データはスコア化され、そして放射ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた染色体割り当ておよび配置が提供される。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ非冗長データベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）、Ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／）、Ｕｎｉｇｅｎｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＵｎｉＧｅｎｅ）、ＡｃｅＶｉｅｗ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＡｃｅＶｉｅｗ）、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ）、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）、および、Ｃｅｌｅｒａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）などの私有（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）データベース、などの、公共データベースおよび私有データベース中の配列に比較することによって、ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする核酸に対応するゲノム配列をマッピングする。利用可能なゲノム配列情報のこれらのコンピュータ解析は、ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする配列に対応するゲノム配列の特定の染色体位置の同定、並びにＬＤＣＡＭゲノム配列および既知のヒト遺伝子障害の遺伝子マップ位置の間のユニークな遺伝子マッピング関係を提供することも可能である。
【０１９４】
診断法および遺伝子治療。当業者は、ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードする核酸、および開示する断片、並びにこれらの核酸の組み合わせを用い、周知の技術を用いて、これらのポリペプチドに対応する遺伝子と関連する異常を解析することも可能である。これによって、このマーカーが再編成されているかまたは欠失している状態を識別することが可能になる。さらに本発明の核酸またはその断片を位置マーカーとして用いて、未知の位置の他の遺伝子をマッピングすることも可能である。本発明の核酸に対応する遺伝子の不全または不十分な量によって（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのにも、該ＤＮＡが使用可能である。天然ヌクレオチド配列の本明細書の開示によって、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその交換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示する天然ヌクレオチド配列と、この遺伝子に不全を宿すると推測されるヒト由来の遺伝子のものとを比較することによって、検出可能である。
【０１９５】
キャリアーおよび搬送剤。ＬＤＣＡＭポリペプチド（断片、変異体、融合タンパク質、誘導体、オリゴマー等）、アンタゴニストおよびアゴニスト（本明細書に記載するすべての種類の抗体を含む）とともにペプチボディ等はまた、剤を細胞に搬送するための輸送体としての使用も見出す。ＬＤＣＡＭポリペプチド（断片、変異体、融合タンパク質、誘導体、オリゴマー等）、アンタゴニストおよびアゴニスト（本明細書に記載するすべての種類の抗体を含む）とともにペプチボディ等は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞に搬送するのに使用可能である。ポリペプチドに付着可能な検出可能（診断用）剤および療法剤には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞傷害性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色反応または蛍光定量反応を触媒する酵素等が、意図する適用にしたがって選択される特定の剤とともに含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒが含まれる。療法使用に適した放射性核種の例は、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕである。こうした剤は、いかなる適切な慣用法によって、ポリペプチドに付着させることも可能である。ポリペプチドは、例えば、所望の剤上の官能基と反応して、共有結合を形成することも可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、ポリペプチドまたは剤を誘導体化して、所望の反応性官能基を生成するか、または付着させることも可能である。誘導体化には、多様な分子をポリペプチドに付着させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの付着を伴うことも可能である。ポリペプチドを放射標識するいくつかの技術が知られる。例えば適切な二官能性キレート剤を用いることによって、放射性核種金属をポリペプチドに付着させることも可能である。こうしてポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含むコンジュゲート（好ましくは共有結合したもの）を調製する。該コンジュゲートを、特定の適用に適した量で投与するか、または別の方式で使用する。
【０１９６】
７．  ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストの療法適用
上に定義され、そして限定されるわけではないがＬＤＣＡＭポリペプチド（それとともにその変異体、断片、融合タンパク質、誘導体、ミモトープ等）、抗ＬＤＣＡＭ抗体、抗ＬＤＣＡＭペプチボディ、ＣＲＴＡＭポリペプチド（それとともにその変異体、断片、融合タンパク質、誘導体、ミモトープ等）、抗ＣＲＴＡＭ抗体および抗ＣＲＴＡＭペプチボディを含む、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、医学的状態および疾患を治療するのに有用である可能性がある。したがって本明細書全体で、「ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニスト」は、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストの定義に記載する多様な態様のすべてを指す。
【０１９７】
一般的に、これらの疾患には、限定されるわけではないが、自己免疫疾患、炎症、癌、感染性疾患とともに、以下により詳細に記載するような他の状態が含まれる。使用する単数または複数の療法分子は、治療しようとする状態の病因および関与する生物学的経路に応じるであろう。例えば、ＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭまたはＬＤＣＡＭ／ＬＤＣＡＭ相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストを、自己免疫疾患、炎症、癌、感染性疾患などに影響を及ぼす、細胞結合、細胞内シグナル伝達、細胞活性化、サイトカイン産生を伴う状態の治療のために選択することも可能である。より具体的には、ＬＤＣＡＭアゴニストは、実施例に記載するように、Ｔ細胞増殖、並びに限定されるわけではないがインターフェロン−ガンマおよびＩＬ−２などの炎症誘発性サイトカインの放出などの炎症プロセスを「冷却する」であろう。ＬＤＣＡＭアゴニストは、自己免疫疾患、接触過敏症、多発性硬化症、移植片拒絶等の治療に使用可能である。ＬＤＣＡＭアンタゴニストは、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭの結合に干渉することによって、免疫応答を増進するであろう。したがって、ＬＤＣＡＭアンタゴニストは、免疫応答増進を要する疾患および状態の治療に有用であり、そして特に、限定されるわけではないが、癌、感染（ウイルス性または細菌性）、およびいくつかの移植設定におけるものなどのＴ細胞応答不全に特徴付けられる疾患に有用であろう。
【０１９８】
限定されるわけではないが、抗原に連結させた１Ｆ１２抗体を用いてＢＤＣＡ３＋  ＤＣをターゲティングして、そしてそれによってＤＣ集団に抗原を特異的に搬送し、その抗原に対する免疫寛容を与えることも可能であるなど、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣの機能を調節して免疫応答の結果に影響を及ぼすことを含む多様な療法設定で、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣに対する抗体を用いることも可能である。あるいは、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン等の炎症シグナルの存在下で、ターゲティングされた抗原は、その抗原に対する抗原特異的免疫応答を高めるであろう。正常組織および病的組織における、比較または相対的ＢＤＣＡ３＋  ＤＣ定量化など、予後目的のため、１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いることも可能である。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、多様な体液、臓器および組織からＢＤＣＡ３＋  ＤＣを精製するかまたは単離することも可能である。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＤＣＡ３＋  ＤＣを枯渇させるか、または限定されるわけではないが、Ｔ細胞プライミング、ＤＣホーミング、ＣＤ８＋  Ｔ細胞への抗原の交差提示などの免疫学的機能に干渉することも可能である。抗原の交差提示および抗原への交差寛容は、多くの自己免疫疾患、移植および癌に重要な細胞機構であるため、１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを通じた免疫応答を適宜調節することによって、これらの障害を治療することも可能である。
【０１９９】
さらに、１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体をｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法に用いることも可能である。１Ｆ１２抗体および他の抗ＬＤＣＡＭ抗体を用いて、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを単離し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで操作し、そして患者に再導入して疾患を治療することも可能である。例示目的のみとして、単離ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを癌抗原（限定されるわけではないが、表２に提示されるようなもの、上記）に曝露して、そしてＢＤＣＡ３＋  ＤＣ／プロセシングされた癌抗原を患者に注入しなおすことによって、癌に対する免疫寛容を断つことも可能である。別の態様において、癌抗原は患者由来であることも可能であるし、そして癌細胞の形であることも可能である。ＢＤＣＡ３＋  ＤＣが、アポトーシス細胞を貪食し、そして癌特異的ＣＴＬエフェクターを生成するため、この外因性抗原をＣＤ８＋  Ｔ細胞に提示することも可能である。したがって、患者から取り除いた癌細胞または腫瘍を、放射線照射または化学薬品／薬剤などのアポトーシス誘導性刺激に曝露して、そして患者から単離したＢＤＣＡ３＋  ＤＣに曝露することも可能である。ＢＤＣＡ３＋  ＤＣは、アポトーシス癌細胞を貪食し、そしてクラスＩ  ＭＨＣの背景で、癌抗原を提示するであろう。これらのＤＣが患者に再注入されて、そして患者自身の癌抗原に対して、ＣＴＬエフェクター応答をプライミングするであろう。ＣＴＬエフェクターは、患者癌抗原を発現する細胞のみを溶解するであろう。このｅｘ  ｖｉｖｏ療法の型を、限定されるわけではないが、手術、放射線照射および／または化学療法などの、他の慣用的療法と併用することも可能である。
【０２００】
実施例１９は、ＣＲＴＡＭがＬＤＣＡＭの同族体または結合パートナーであるという発見を記載する。ＬＤＣＡＭは、樹状細胞上、および特に新規に発見されたＢＤＣＡ３＋樹状細胞上で発現され、この細胞は、上述のユニークな免疫学的特性を有するようである。ＣＲＴＡＭは、活性化Ｔ細胞上で発現される（示差発現実験によって決定されるような発現増加を示す、図１７を参照されたい）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞はどちらもＣＲＴＡＭを発現し、そして活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞上では、特に高いレベルで発現される。したがって、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の相互作用は、抗原提示細胞およびリンパ系エフェクター細胞間（ＢＤＣＡ３＋  ＤＣを含む樹状細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞などのクラスＩ拘束Ｔ細胞を含むＴ細胞間など）の免疫学的シナプスの形成に関与する可能性もある。理論に束縛されることなく、抗原提示細胞およびＴ細胞間のＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭ相互作用が殺傷の負の制御因子である可能性もある。実施例に示すように、ＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭ相互作用は、抗ＣＤ３刺激および多様なマイトジェンを含む、多様なＴ細胞活性化刺激の存在下で、Ｔ細胞の活性化を防止した。ＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭ間の相互作用が、抗原提示細胞がＴ細胞を抗原に結合させ、そしてプライミングする方法であることも可能である。これによって、ＤＣで起こることが知られる、抗原提示細胞による多数の結合が可能になるであろう。
【０２０１】
さらに、ＣＲＴＡＭが活性化ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞上で発現され、そしてこれらの細胞が糖尿病の免疫病理に関与していることが報告されている（Ｋｅｎｎｅｄｙら，  Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏ  ６７（２０００））。活性化ＮＫ細胞上で、ＣＲＴＡＭが高発現されていることを示す示差発現実験によって、このデータを確かめた（図１７）。したがって、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭ間の相互作用は、抗原提示細胞およびＮＫ−Ｔ細胞間の免疫学的シナプスの形成に関与しうる。したがって、本発明のＬＤＣＡＭアンタゴニストを用いて、糖尿病疾患症状を引き起こす、抗原提示細胞（ＤＣなど）およびＮＫ細胞および／またはＮＫ−Ｔ細胞間の相互作用を阻害するかまたは遮断することも可能である。
【０２０２】
さらに、ＬＤＣＡＭは、神経組織、特に脳で発現されることが示されている（Ｂｉｅｄｅｒｅｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７，  １５２５（２００２））。したがって、ニューロン上のＬＤＣＡＭおよびＴ細胞上のＣＲＴＡＭ間の相互作用は、神経系および免疫系間の免疫学的シナプスの形成に関与しうる。したがって、本発明のＬＤＣＡＭアンタゴニストを用いて、ＣＲＴＡＭを発現する免疫細胞（Ｔ細胞など）およびＬＤＣＡＭを発現するニューロン間の相互作用を阻害するかまたは遮断し、そしてこうしてこの相互作用から生じる疾患を防止するかまたは治療することも可能である。例には、多発性硬化症および以下に列挙する神経系の他の疾患が含まれる。ＣＲＴＡＭが活性多発性硬化症（ＭＳ）病巣で発現されることが、示差発現実験によって決定された（図１７）。これによって、ＬＤＣＡＭアゴニストが、活性化Ｔ細胞の炎症誘発反応を減少させ、そして特に、活性化Ｔ細胞からのインターフェロン−ガンマの放出を防止するかまたは減少させることを予測する、しっかりした基礎が提供される。活性ＭＳ病巣において、そして再発を経験している患者の循環レベルにおいて、インターフェロン−ガンマが増加し、そしてインターフェロン−ガンマのレベル増加が、症状悪化およびミエリン破壊と相関することが、当該技術分野には周知である。したがって、ＬＤＣＡＭアゴニストは、Ｔ細胞がインターフェロン−ガンマなどの炎症誘発性サイトカインを放出するのを遮断することによって、白質の自己免疫様破壊を防止するかまたは減少させるであろう。
【０２０３】
さらなる態様において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストを用いて、限定されるわけではないが：白血病、エプスタイン−バーウイルス陽性鼻咽頭癌、結腸癌、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、子宮頸癌および卵巣癌、肺癌、哺乳動物肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、線癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞種、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞種、網膜芽腫；急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病）などの白血病；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、および重鎖病などの癌の被験者を治療することも可能である。多様なリンパ増殖性障害もまた、治療可能であり、これらの障害には、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球白血病、毛様細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、ホジキン病、びまん性侵攻性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔガンマリンパ増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち菌状息肉症）およびセザリー症候群が含まれる。
【０２０４】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストはまた、当該技術分野に知られる他の認識される治療と併用可能である。例えば、癌の治療において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、手術、化学療法、放射療法、養子免疫療法等と併用可能である。根底にある１つの論理的説明は、腫瘍塊が最小限であり、そして／または腫瘍細胞が手術中および手術後に循環内に抜け出し、そしてＬＤＣＡＭアンタゴニストを通じた免疫療法が、この状況でより有効でありうることである。特定の態様において、本発明の防御的有用性および療法的有用性は、手術前、手術時、または手術後いずれかに癌被験者の免疫適格性を増進し、そして癌細胞に対する腫瘍特異的免疫を誘導することに向けられ、この目的は癌を阻害することであり、そして最終的な臨床上の目的は癌の退化および／または根絶である。
【０２０５】
腫瘍性疾患の進行に対するＬＤＣＡＭアンタゴニストの効果は、限定されるわけではないが：ａ）細胞性免疫の評価としての過敏性の遅延；ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞溶解性Ｔリンパ球の活性；ｃ）腫瘍特異的抗原のレベル；ｄ）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンなどの技術を用いた、腫瘍形態の変化；ｅ）高リスクの個体における特定の癌のリスクの推定上のバイオマーカーレベルの変化、およびｆ）腫瘍形態の変化を測定することを含む、当業者に知られる方法いずれかによって監視可能である。あるいは、ＣＴＬアッセイ、増殖アッセイ、抗体捕捉アッセイ等の標準的技術を用いて、目的の抗原に対する免疫応答を測定することも可能である。
【０２０６】
別の態様において、上述の抗原１以上で感作した抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いた養子免疫療法と、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを併用可能である。養子免疫療法は、感染性疾患または癌を治療する療法的アプローチを指し、ここで、免疫細胞が、直接または間接的に、感染細胞または腫瘍細胞および／または抗原性構成要素に対する特異的免疫を仲介し、そして感染性疾患の治療または腫瘍の退化を生じることを目的として、免疫細胞を宿主に投与する。１つの態様において、抗原感作ＡＰＣを、ワクチン投与前、投与と同時、または投与後に投与することも可能である。さらに、養子免疫療法の投与様式は、限定されるわけではないが、例えば皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、皮内投与または粘膜投与を含めて、多様であることも可能である。
【０２０７】
ＬＤＣＡＭアゴニストを用いて、心臓血管疾患を治療することも可能である。本発明の態様には、心臓血管疾患を有する被験者において、心臓血管疾患を治療する方法であって、１以上のＬＤＣＡＭアゴニストの有効量を単独でまたは併用いずれかで投与することを含む、前記方法が含まれる。
【０２０８】
心臓血管疾患には、心臓および血管系とともに心臓および血管系の疾患状態によって損なわれる（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）臓器および系の病態生理を有する疾患状態が含まれる。限定されるわけではないが、例には：心臓および／または血管系の炎症、例えば心筋炎、慢性自己免疫心筋炎、細菌性およびウイルス性心筋炎とともに感染性心内膜炎；心不全；うっ血性心不全；慢性心不全；心不全の悪液質；非虚血性心筋症（拡張型心筋症；特発性拡張型心筋症；心原性ショック、体外循環サポートから派生する心不全（「ポンプ後症候群」）、虚血／再灌流傷害後の心不全、脳死関連心不全（Ｏｗｅｎら，  １９９９（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９９９  Ｍａｙ  １８；９９（１９）：２５６５−７０）に記載されるようなもの）；肥厚性心筋症；拘束型心筋症；非虚血性全身性高血圧；心臓弁膜症；催不整脈右室心筋症）および虚血性心筋症（アテローム発生；アテローム性動脈硬化症；動脈硬化症；末梢血管疾患；冠状動脈疾患；脳卒中、一過性虚血性発作および心筋梗塞を含む梗塞）を含む心筋症が含まれる。心臓血管疾患の定義に含まれる、さらなる疾患状態には：動脈瘤；動脈炎；アンギナ；塞栓症；血小板関連虚血障害；虚血／再灌流傷害；再狭窄；僧帽弁および／または三尖弁逆流；僧帽弁再狭窄；無症状心筋虚血；レイノー現象；血栓症；深部静脈血栓症；肺塞栓症；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を含む血栓性微小血管障害、特発性血小板血症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、並びに異質の（ｆｏｒｅｉｇｎ）または損傷組織表面への曝露に関連する血栓症および凝血異常、血栓性静脈炎；川崎血管炎を含む血管炎；高安動脈炎；静脈閉塞症、巨細胞動脈炎、ヴェゲナー肉芽腫症；シェーンライン・ヘノッホ紫斑病とともに細菌などの１以上の口腔病原体による歯周感染から生じる心臓血管疾患が含まれる。
【０２０９】
１以上のＬＤＣＡＭアゴニストの療法使用のさらなる例には、血管形成術、頸動脈血管内膜切除術、血管移植片の吻合術、および留置カテーテルまたはシャントなどの長期心臓血管装置と併用した、肺虚血、冠状動脈虚血、および脳虚血を含む、血小板関連虚血障害後の冠状動脈疾患または傷害を患う個体の治療、そして血栓症、冠状動脈血栓症、脳動脈血栓症、心臓内血栓症、末梢動脈血栓症を含む血栓性障害；静脈血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を含む血栓性微小血管障害、特発性血小板血症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、並びに異質のまたは損傷組織表面への曝露に関連する血栓症および凝血異常後の再閉塞の防止が含まれる。
【０２１０】
さらなる適応症には、血管形成術（すなわちバルーン血管形成術、レーザー血管形成術、冠状動脈アテローム切除術および類似の技術）、頸動脈、冠状動脈、末梢動脈または他の血管内ステントなどの血管内補てつ装置、透析アクセス器具の配置、または末梢血管疾患を治療する処置を受けるかまたは受けるであろう被験者；血栓形成のリスクが高い手術（すなわち冠状動脈バイパス術、補てつバルブまたは管の挿入等）を受ける個体が含まれる。
【０２１１】
いくつかの肺障害もまた、ＬＤＣＡＭアゴニストで治療可能である。こうした状態の１つは、ＴＮＦα上昇に関連する成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）であり、そしてこれは毒性化学薬品、膵炎、外傷または他の原因への曝露を含む、多様な原因によって誘発されうる。本発明が開示する化合物、組成物および併用療法はまた、気管支肺異常形成（ＢＰＤ）；リンパ管平滑筋腫症；および早産児の慢性線維性肺疾患の治療にも有用である。さらに、本発明の化合物、組成物および併用療法を用いて、石綿沈着症、炭坑作業員塵肺症、ケイ粉症または微細粒子への長期間の曝露に関連する類似の状態を治療する。本発明の他の側面において、ＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用療法を用いて、慢性気管支炎または気腫に関連する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症、特発性肺線維症および放射線誘導性肺線維症などの線維性肺疾患；肺サルコイドーシスを含む肺障害；並びにアレルギー性鼻炎、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎および喘息を含むアレルギーを治療する。
【０２１２】
他の態様は、ＬＤＣＡＭアゴニストまたは併用療法を用いて、多様なリウマチ性障害を治療する方法を提供する。これらには：成人および若年性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；通風；骨関節症；多発性筋痛；強直性脊椎炎を含む血清陰性脊椎関節症；およびライター病が含まれる。また、本発明のＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用療法を用いて、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎を治療する。これらのＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト、並びに併用療法でやはり治療可能であるのは、スティル病および関節リウマチに関連するブドウ膜炎である。さらに、皮膚筋炎および多発性筋炎を含む、随意筋の炎症を生じる障害を治療する際に、本発明のＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用療法を用いる。さらに、本明細書に開示するＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用は、散発性封入体筋炎を治療するのに有用であり、これはこの筋疾患の進行に、ＴＮＦαが重要な役割を果たしうるためである。さらに、関節破壊、並びに顔および手の丘疹状小結節が、多核巨細胞による炎症誘発性サイトカインの過剰産生に関連する、多中心性網内系組織球症を治療するのに、本明細書に開示するＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト、並びに併用を用いる。
【０２１３】
移植に関連する障害、例えば移植片対宿主病、および心臓、肝臓、肺、皮膚、腎臓または他の臓器の移植を含む固形臓器移植から生じる合併症もまた、開示するＬＤＣＡＭアンタゴニストまたは併用療法で治療可能である。ＬＤＣＡＭアンタゴニストを投与して、例えば肺移植後の閉塞性細気管支炎の発展を防止するかまたは阻害することも可能である。
【０２１４】
開示するＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用療法で治療可能な多様な他の医学的障害には：多発性硬化症；ベーチェット症候群；シェーグレン症候群；自己免疫溶血性貧血；ベータ・サラセミア；筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）；パーキンソン病；および未知の原因の腱鞘炎とともに、遺伝的欠損と関連する多様な自己免疫障害または疾患が含まれる。
【０２１５】
レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される；および他の単離体、例えばＨＩＶ−ＬＰ））； ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒト・コクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリチウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えばハンタンウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ））；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘・帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス類）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えばアフリカ・ブタ熱ウイルス）；並びに未分類のウイルス（例えば海綿状脳症の病因学的作用因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの不全付随体と考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎の病原体（クラス１＝体内感染；クラス２＝非経口感染（すなわちＣ型肝炎））；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、並びにアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ））による感染を含む、ウイルス感染の治療および／または防止に、ＬＤＣＡＭアンタゴニストを使用可能である。
【０２１６】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えばヒト型結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌（Ｍ．  ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．  ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．  ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、単球症リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ビリダンス群）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ウシ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、フランベジア・トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）による感染を含む、細菌による感染の治療および／または防止に、ＬＤＣＡＭアンタゴニストを使用可能である。
【０２１７】
別の態様において、住血吸虫類；トリパノソーマ類；リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種；フィラリア性線形動物；トリコモナス症；肉胞子虫症；無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、煙色コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、旋毛虫症、皮膚ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、トラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）等による感染を含む、感染性単細胞生物に対して、被験者を治療するかまたは免疫するのに、ＬＤＣＡＭアンタゴニストを使用可能である。
【０２１８】
さらなる療法適用には：ＡＬＳ；アルツハイマー病；喘息；アテローム性動脈硬化症；自己免疫溶血性貧血；癌、特にＢ細胞に関連する癌；悪液質／摂食障害；慢性疲労症候群；硬変症（例えば原発性胆汁性肝硬変）；糖尿病（例えばインスリン糖尿病）；発熱；ＩｇＡ糸球体腎炎および原発性糸球体腎炎を含む糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；ギラン・バレー症候群；移植片対宿主病；橋本甲状腺炎；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；骨関節症、乾癬性関節炎および関節リウマチを含む関節の炎症状態；挫傷（ｓｔｒａｉｎ）、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形手術、感染もしくは他の疾患プロセスから生じる炎症状態；インスリン依存性糖尿病；脳虚血（例えば、各々神経変性につながりうる、外傷、癲癇、出血または脳卒中などの結果の脳傷害）を含む虚血傷害；肺疾患（例えばＡＲＤＳ）；多発性骨髄腫；多発性硬化症；重症筋無力症；骨髄性白血病（例えばＡＭＬおよびＣＭＬ）および他の白血病；筋疾患（例えば特に敗血症における筋タンパク質代謝）；神経毒性（例えばＨＩＶに誘導されるようなもの）；骨粗鬆症；疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；多発性筋炎／皮膚筋炎；自己免疫肺炎症を含む肺炎症；乾癬；ライター病；再灌流傷害；敗血症ショック；放射療法の副作用；シェーグレン症候群；一時的顎関節疾患；特発性血小板減少症および自己免疫新生児血小板減少症を含む血小板減少症；腫瘍転移；ブドウ膜炎；および血管炎が含まれる。
【０２１９】
セリアック病を含む胃腸系の状態もまた、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストまたは併用療法で治療可能である。本発明のＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用療法を用いて、クローン病；潰瘍性大腸炎；特発性胃不全麻痺；慢性膵炎を含む膵炎、および急性膵炎と関連する肺傷害を治療する。やはり含まれるのは、尿生殖器系の障害、例えば自己免疫糸球体腎炎、毒素への曝露による糸球体腎炎、あるいは溶血性連鎖球菌または他の感染性病原体の感染から派生する糸球体腎炎を含む糸球体腎炎を治療するためのＬＤＣＡＭアゴニストおよび併用療法を用いる方法である。
【０２２０】
８．  ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの配合および投与
本発明は、医学的障害、そして特にＬＤＣＡＭが仲介する障害を患う患者、好ましくは哺乳動物患者、そして最も好ましくはヒト患者を治療するための、組成物としての薬剤または療法剤、および方法を提供する。ＬＤＣＡＭが仲介するこうした障害には、ＬＤＣＡＭおよび結合パートナー、例えば限定されるわけではないがＬＤＣＡＭ、ＣＲＴＡＭおよびＢ７Ｌ−１などの間の結合によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態が含まれる。本開示の目的のため、用語「疾病」、「疾患」、「医学的状態」、「異常な状態」等は、用語「医学的障害」と交換可能に用いられる。用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、本明細書において、治癒的、防御的（例えば予防的）および対症的または改善的治療が含まれる。こうした療法的使用のため、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、周知の手段を通じて、必要な患者に投与することも可能である。本発明の薬剤組成物または療法組成物は、本明細書に記載するような、いずれかの型の１以上のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを含有することも可能である。
【０２２１】
療法的に有効な量。本発明の治療法または使用法を実施する際、本発明の療法剤の療法的有効量を、好ましくはＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの活性に関連する疾患を治療するかまたは改善するため、治療しようとする状態を有する患者に投与する。本明細書において、用語「療法的有効量」は、意味がある患者の利益、すなわち相当する医学的状態の治療、治癒、防止または改善、あるいはこうした状態の治療、治癒、防止または改善率の増加を示すのに十分な薬剤組成物または方法の各療法剤または他の活性構成要素の総量を意味する。単独で投与される、個々の療法剤または活性成分に適用した際、該用語はその成分のみを指す。併用に適用した際、該用語は、連続して、または同時に、いずれで併用して投与したのであっても、療法効果を生じる成分の併用した量を指す。本明細書において、句、療法剤の「療法的有効量を投与する」は、障害の重症度を反映する、少なくとも１つの指標において、改善、そして好ましくは持続した改善を誘導するのに十分な量および期間、前記療法剤で患者を治療することを意味する。改善は、患者が、１日以上、またはより好ましくは１週間以上離れた、少なくとも２回の機会に改善を示したならば、「持続した」とみなされる。改善の度合いは、徴候または症状に基づいて決定され、そして決定にはまた、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ−ｏｆ−ｌｉｆｅ）アンケートなどの、患者に実施されるアンケートを使用することも可能である。治療の量および期間が十分であるかどうか決定するため、患者の疾病の度合いを反映する多様な指標を評価することも可能である。選択された単数または複数の指標に関するベースライン値は、療法剤の最初の用量の投与前に、患者を検査することによって、確立される。好ましくは、ベースライン検査は、最初の用量投与の約６０日以内に行う。急性症状を治療するために療法剤が投与される場合、最初の用量は、傷害が生じた後、現実的にできるだけ速やかに投与される。選択された単数または複数の指標のベースラインを越える改善を、患者が明示するまで、ＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニストなどの療法剤を投与することによって、改善を誘導する。慢性状態を治療する際、改善のこの度合いは、少なくとも１ヶ月以上、例えば、１、２、もしくは３ヶ月またはそれ以上の期間、あるいは無期限に、この薬剤を反復投与することによって、得られる。１〜６週間の期間、または単回用量であっても、しばしば、傷害または他の急性状態を治療するのに十分である。治療後の患者の疾病の度合いが、１以上の指標にしたがって、改善されているように見えたとしても、同一レベル、あるいは減少した用量または頻度で、無期限に治療を続けることも可能である。ひとたび治療を減少させるかまたは中断したら、後に、症状が再出現した場合、元来のレベルで再開することも可能である。
【０２２２】
投薬量決定。当業者は、適切な投薬量が、治療しようとする障害の性質および重症度、患者の体重、年齢、全身状態、および以前の疾病および／または治療、並びに投与経路などの要因に応じて、多様であろうことを認識するであろう。予備的用量は、動物試験にしたがって決定可能であり、そしてヒト投与の投薬量決定を、標準的投薬量決定試験などの、当該技術分野に認められた慣例にしたがって行う。例えば、療法的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから概算可能である。投薬量は、化合物の比活性に応じるであろうし、そして日常的な実験によって、容易に決定可能である。用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含みつつ、毒性を最小限にする、循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルにおいて、配合可能である。こうした情報を用いて、ヒトにおいて、有用な用量を、より正確に決定することも可能である。最終的には、主治医が、個々の患者各々を治療する、本発明のポリペプチドの量を決定するであろう。まず、主治医は、本発明のポリペプチドを低用量で投与し、そして患者の応答を観察するであろう。患者に最適な療法効果が得られるまで、本発明のポリペプチドをより多い用量で投与することも可能であり、そしてその時点でさらに用量を増やさない。本発明の方法を実施するのに用いる多様な薬剤組成物は、ｋｇ体重あたり、約０．０１ｎｇ〜約１００ｍｇ（または約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇ、または約０．１マイクログラム〜約１ｍｇ）の本発明のポリペプチドを含有すべきであると意図される。本発明の１つの態様において、本明細書に開示する多様な医学的障害を治療するため、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを週１回投与し、別の態様において、少なくとも週２回投与し、そして別の態様において、少なくとも週３回投与する。注射する場合、成人用量あたり、有効量のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは１〜２０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、そして好ましくは約５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、均一用量を投与することも可能であり、その量は、５〜１００ｍｇ／用量の範囲であることも可能である。皮下注射によって投与される均一用量の典型的な用量範囲は、５〜２５ｍｇ／用量、２５〜５０ｍｇ／用量および５０〜１００ｍｇ／用量である。本発明の１つの態様において、２５ｍｇ／用量あるいは５０ｍｇ／用量のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを含有する、注射に許容しうる調製物を投与することによって、以下に記載する多様な適応症を治療する。２５ｍｇまたは５０ｍｇ用量を、特に慢性状態に対して、反復投与することも可能である。注射以外の投与経路を用いるならば、標準的な医学的実施にしたがって、用量を適切に調整する。多くの場合、患者状態の改善は、約２５ｍｇの用量のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、少なくとも３週間の期間に渡って、週１〜３回、あるいは約５０ｍｇの用量のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、少なくとも３週間、週１または２回、注射することによって得られるであろうが、所望の度合いの改善を誘導するのに、より長い期間の治療が必要である可能性もある。不治の慢性状態では、措置は、患者の医師によって、こうしたものが必要だと思われたならば、用量および頻度に調整を行ったうえ、無期限に続けることも可能である。前述の用量は、１８歳以上の年齢のヒトである、成人患者に関する例である。小児科患者（年齢４〜１７歳）に関しては、適切な措置は、週あたり１回以上の皮下注射によって投与される、最大用量２５ｍｇまでのＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射を伴う。ＬＤＣＡＭポリペプチドに対する抗体を、ＬＤＣＡＭアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＬＤＣＡＭポリペプチド抗体の別の好ましい用量範囲は、０．７５〜７．５ｍｇ／体重ｋｇである。ヒト化抗体、すなわち、抗体分子の抗原結合部分のみが非ヒト供給源由来である抗体が好ましい。こうした抗体を、静脈内注射または投与することも可能である。
【０２２３】
配合。本発明のＬＤＣＡＭアンタゴニストまたはアゴニスト（限定なしに組換えおよび非組換え供給源を含む、いかなる供給源由来でもよいもの）の有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含む組成物を、本明細書に提供する。用語「薬学的に許容しうる」は、活性成分（単数または複数）の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性成分を意味する。投与に適した配合物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および配合物をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することも可能である水性および非水性無菌注射溶液；並びに懸濁剤または粘稠化剤を含むことも可能な、水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがって、配合可能である。これらを、単一の活性成分として、または既定の適応症に適した他の既知の活性成分とともに、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して併用することも可能である。薬剤組成物に適した配合物には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化しているか、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル類、デキストラン等のポリマー化合物に取り込まれているか、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていることも可能である。リポソーム配合物に適した脂質には、限定なしに、モノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リゾレシチン、リン脂質類、サポニン、胆汁酸類等が含まれる。こうしたリポソーム配合物の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号に開示されるように、当該技術分野の技術レベルの範囲内である。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって、意図される適用にしたがって選択され、そのため、キャリアーの特性は、選択された投与経路に応じるであろう。本発明の１つの好ましい態様において、ＬＤＣＡＭまたはＬＤＣＡＭ様ポリペプチドの持続放出型を用いる。開示する方法で使用するのに適した持続放出型には、限定されるわけではないが、緩慢溶解生体適合性ポリマー（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸微小粒子など）に被包されたＬＤＣＡＭおよび／またはＬＤＣＡＭ様ポリペプチド、このようなポリマー（局所適用ヒドロゲル類を含む）と混合されたもの、およびまたは生体適合性半透性移植物中に入れられたものが含まれる。
【０２２４】
１つの態様において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの持続放出型を用いる。開示する方法で使用するのに適した持続放出型には、限定されるわけではないが、緩慢溶解生体適合性ポリマー（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸微小粒子など）に被包されたＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト、このようなポリマー（局所適用ヒドロゲル類を含む）と混合されたもの、およびまたは生体適合性半透性移植物中に入れられたものが含まれる。
【０２２５】
可溶性ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト療法組成物を投与する際に使用可能な持続放出技術の１つの種類は、ヒドロゲル成分、例えば光重合可能ヒドロゲル（Ｓａｗｈｎｅｙら，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１；１９９３）を利用するものである。手術後癒着形成を防止し（Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  ８３：５９，  １９９４）、そして血管傷害後の血栓および血管狭窄を防止する（Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：５９６７，  １９９４）ため、類似のヒドロゲルが用いられてきている。こうしたヒドロゲルにポリペプチドを取り込んで、活性剤の持続局所放出を提供することも可能である（ＷｅｓｔおよびＨｕｂｂｅｌ，  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２５：１３９，  １９９５；Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｒｅｓ．  ５８：７５９；１９９５）。持続局所放出ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、ヒドロゲルに取り込まれると、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの半減期が長いことから、さらに持続性となるであろう。
【０２２６】
粒子サイズ約１ｍｍの顆粒またはペレットの形の細かい多微粒子（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ）として、本発明の化合物を配合物中に含むことも可能である。カプセル投与のための材料の剤形はまた、粉末、軽く加圧されたプラグであることも、または錠剤であることさえ可能である。療法剤を加圧によって調製することも可能である。
【０２２７】
いかなる着色剤および香料を含むことも可能である。例えば、タンパク質（または誘導体）を配合し（例えばリポソームまたは微小球体被包）、そして次いで、着色剤および香料を含有する冷蔵飲料などの食用製品内にさらに含有させることも可能である。
【０２２８】
本発明の化合物の体積を、不活性成分で希釈するかまたは増加させることも可能である。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンが含まれることも可能である。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む特定の無機塩もまた、充填剤として使用可能である。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０２２９】
療法剤を固形投薬型に配合する際に、崩壊剤を含むことも可能である。崩壊剤として用いる材料には、限定されるわけではないが、デンプンに基づく商業的崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む、デンプンが含まれる。グリコール酸デンプンナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然海綿およびベントナイトはすべて使用可能である。崩壊剤の別の型は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末化粘剤は、崩壊剤として、そして結合剤として使用可能であり、そしてこれらには、寒天、カラヤゴムまたはトラガカントゴムなどの粉末化粘剤が含まれることも可能である。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
【０２３０】
結合剤を用いて、療法剤をともに保持して、硬い錠剤を形成することも可能であり、そして結合剤にはアラビアゴム、トラガカントゴム、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物由来の材料が含まれる。他のものには、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はどちらも、療法剤を顆粒化するため、アルコール性溶液中で使用可能である。
【０２３１】
配合プロセス中での粘着を防止するため、療法剤の配合中に抗摩擦剤（ａｎｔｉｆｒｉｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）を含むことも可能である。療法剤およびダイ壁の間に、層として潤滑剤を用いることも可能であり、そしてこれらには、限定されるわけではないが：マグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが含まれることも可能である。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、多様な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００などの可溶性潤滑剤もまた使用可能である。
【０２３２】
配合の間の薬剤の流動特性を改善し、そして加圧の間の再配置を補助しうる、流動促進剤を、添加することも可能である。流動促進剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和ケイアルミン酸が含まれることも可能である。
【０２３３】
水性環境への本発明の化合物の溶解を補助するため、界面活性剤を湿潤剤として添加することも可能である。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれることも可能である。陽イオン性界面活性剤も使用可能であり、そしてこれには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれることも可能である。界面活性剤として配合物中に含まれることも可能な、潜在的な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴル４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の配合物中に、単独でまたは異なる比の混合物として存在することも可能である。
【０２３４】
添加剤もまた、化合物の取り込みを増進するため、配合物に含まれることも可能である。潜在的にこの特性を有する添加物は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【０２３５】
徐放配合物が望ましい可能性もある。拡散または浸出機構いずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えば粘剤に、本発明の化合物を取り込むことも可能である。ゆっくり変性するマトリックス、例えばアルギン酸塩、多糖もまた、配合物中に取り込み可能である。本発明の化合物の徐放の別の型は、Ｏｒｏｓ療法系（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法により、すなわち、浸透圧効果によって、単一の小さい開口部を通じて、水が進入するのを可能にし、そして薬剤が押し出されるのを可能にする半透膜中に、薬剤が封入される。いくつかの腸溶性コーティングもまた、遅延放出効果を有する。
【０２３６】
他のコーティングを配合に用いることも可能である。これらには、コーティングパン中で適用可能な、多様な糖が含まれる。療法剤をフィルムコーティング錠剤中に提供することもまた可能であり、そしてこの例で用いる材料は２群に分けられる。第１群は、非腸溶材料であり、そしてメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコール類が含まれる。第２群は、通常、フタル酸のエステルである、腸溶成分からなる。
【０２３７】
成分の混合物を用いて、最適なフィルムコーティングを提供することも可能である。パンコーティング器具中または流動化ベッド中または加圧コーティングによって、フィルムコーティングを行うことも可能である。
【０２３８】
やはり本明細書に意図されるのは、本発明のタンパク質（または誘導体）の肺搬送である。タンパク質（または誘導体）は、吸入されつつ哺乳動物の肺に搬送され、そして肺上皮裏打ちを横断して血流に入る（これに関する他の報告には、Ａｄｊｅｉら，  Ｐｈａｒｍａ．  Ｒｅｓ．  （１９９０）  ７：５６５−９；Ａｄｊｅｉら（１９９０），  Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９），  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９），  Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  ３：２０６−１２（α１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（Ｍａｒｃｈ  １９９０），  “Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｓｙｍｐ．  Ｒｅｓｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，  コロラド州キーストーン（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：３４８２−８（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）およびＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる）。
【０２３９】
本発明の実施に使用が意図されるのは、療法製品の肺搬送のために設計された広範囲の機械的装置であり、限定されるわけではないが、ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器が含まれ、これらはすべて当業者に周知である。本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイスに製造されるＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、コロラド州エングルウッドに製造されるＡｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー；Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークに製造されるＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器；およびＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォードに製造されるＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０２４０】
こうした装置はすべて、本発明の化合物の分配に適した配合物の使用を要する。典型的には、各配合物は、使用する装置の種類に特異的であり、そして療法に有用な希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアーに加えて、適切な噴霧剤成分の使用を伴うことも可能である。
【０２４１】
本発明の化合物は、遠位肺への搬送を最も有効にするため、最も好適には、１０μｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒子サイズの微粒子型で調製されるべきである。
【０２４２】
薬学的に許容しうるキャリアーには、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトールなどの炭水化物が含まれる。配合物中で使用する他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣが含まれることも可能である。天然界面活性剤または合成界面活性剤も使用可能である。ＰＥＧも使用可能である（タンパク質または類似体の誘導体化における使用を別としても）。シクロデキストランなどのデキストランも使用可能である。胆汁酸塩および他の関連増進剤も使用可能である。セルロースおよびセルロース誘導体も使用可能である。緩衝配合物中の使用などで、アミノ酸も使用可能である。
【０２４３】
また、リポソーム、微小カプセルまたは微小球体、封入複合体、または他の種類のキャリアーの使用も、意図される。
ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーいずれかのネブライザーの使用に適した配合物は、典型的には、溶液１ｍｌあたり、約０．１〜２５ｍｇの生物学的活性タンパク質の濃度で、水に溶解された本発明の化合物を含むであろう。配合物はまた、緩衝剤および単糖も含むことも可能である（例えばタンパク質安定化および浸透圧制御のため）。エアロゾルを形成する際、溶液の噴霧化に引き起こされるタンパク質の表面誘導性凝集を減少させるかまたは防止するため、ネブライザー配合物はまた、界面活性剤を含有することも可能である。
【０２４４】
定量吸入装置で使用する配合物は、一般的に、界面活性剤の補助で、噴霧剤中に懸濁された本発明の化合物を含有する、細分割粉末を含むであろう。噴霧剤は、この目的に使用される慣用的成分いずれであることも可能であり、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンがあり、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはその併用が含まれる。適切な界面活性剤には、三オレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸はまた、界面活性剤としても有用でありうる。
【０２４５】
粉末吸入装置から分配するための配合物は、本発明の化合物を含有する、細分割乾燥粉末を含み、そしてまた、装置からの粉末の分散を容易にする量、例えば配合物の重量の５０〜９０％で、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールなどの充填剤を含むことも可能である。
【０２４６】
療法化合物の併用。本発明のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、それ自体または他のポリペプチドとの多量体（例えばヘテロ二量体またはホモ二量体）または複合体で、活性である可能性がある。その結果、本発明の薬剤組成物は、こうした多量体型または複合体型の本発明のポリペプチドを含むことも可能である。本発明の薬剤組成物は、本発明のポリペプチド（単数または複数）とポリペプチドまたはペプチド抗原との複合体の形であることも可能である。本発明は、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト、またはＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストと併用して同一患者に投与する１以上の他の薬剤と同時の、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの投与をさらに含み、各薬剤は、その薬剤に適した措置にしたがって投与される。「同時投与」は、併用した構成要素での同時治療または連続治療とともに、薬剤を交互に投与する措置、または１つの構成要素を長期に投与し、そして他のもの（単数または複数）を断続的に投与する措置を含む。構成要素は、同一または別個の組成物中で、そして同一または異なる投与経路によって投与可能である。本発明の薬剤組成物と同時投与可能な構成要素の例は：Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンなどの、サイトカイン類、リンホカイン類、または他の造血因子、あるいはこれらの因子いずれかの阻害剤またはアンタゴニストである。薬剤組成物はさらに、ポリペプチドの活性を増進するか、あるいは治療中のその活性または使用を補足する（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）かいずれかの他の剤を含有することも可能である。こうしたさらなる因子および／または剤を薬剤組成物中に含み、本発明のポリペプチドとの相乗効果を生じることも、または副作用を最小限にすることも可能である。逆に、本発明のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の配合物中に含み、該サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の副作用を最小限にすることも可能である。同時に投与すべき薬剤のさらなる例には、限定されるわけではないが、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤、ペントキシフィリン、サリドマイド、並びにアザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン硫酸、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、および経口金、金チオリンゴ酸ナトリウム、および金チオグルコースなどの金化合物などの疾患修飾抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）が含まれる。さらに、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、ＬＤＣＡＭおよび／またはＣＲＴＡＭポリペプチドに対する抗体またはペプチボディ、あるいは天然ＬＤＣＡＭおよび／またはＣＲＴＡＭポリペプチドの競合的阻害剤として作用するＬＤＣＡＭまたはＣＲＴＡＭポリペプチド由来ペプチドを含む、第二のＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストと併用可能である。
【０２４７】
治療期間は多様であるが、典型的には少なくとも２週間、またはそれより長い期間に渡って、反復用量が投与されるであろうし、あるいは無期限に投与されることも可能である。治療しない期間と交互に数周期の治療を行うことも可能である。中断した場合、癌の再発が起こったならば、治療を再開することも可能である。
【０２４８】
ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストでの癌の治療を、他の治療と同時に行うことも可能であり、そして化学療法または放射線治療と同時に行うことも可能である。１つの例において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、多様な腫瘍種に対して有効である剤、例えばＡｐｏ２リガンド／ＴＲＡＩＬ、または抗血管形成剤、例えばＶＥＧＦに対する抗体もしくはＥＧＦ受容体に対する抗体と同時に投与する。ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト治療はまた、特定の種類の癌をターゲットとする他の治療、例えば腫瘍特異的抗原をターゲットとするモノクローナル抗体と併用可能であるし、あるいは特定の種類の癌に用いる他の治療と併用可能である。例えば、化学療法、ホルモン治療、タモキシフェン、ラロキシフェン、またはＨＥＲ２をターゲットとする剤、例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）などの抗ＨＥＲ２抗体、あるいはその組み合わせと、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを同時投与して、乳癌を治療することも可能である。別の例において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト、並びに抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ＲＩＴＵＸＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）を併用して、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫を治療する。本発明はまた、癌の化学療法に用いる多様な可溶性サイトカイン受容体またはサイトカインまたは他の薬剤と、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの同時投与も意図する。「同時投与」は、併用した構成要素での同時治療または連続治療とともに、薬剤を交互に投与する措置、または１つの構成要素を長期に投与し、そして他のもの（単数または複数）を断続的に投与する措置を含む。こうした他の薬剤には、例えば、癌患者における骨損失を回復するのに用いられるビスホスホネート類、または同時投与される１以上のＲＡＮＫアンタゴニストの使用が含まれる。同時投与される他の薬剤の例には、限定されるわけではないが、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ類、多様な全身性化学療法措置および非ステロイド性抗炎症剤、例えばＣＯＸ  ＩまたはＣＯＸ  ＩＩ阻害剤などが含まれる。
【０２４９】
投与経路。いかなる有効な投与経路を用いて、核酸を含む組成物を含む、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、療法的に投与することも可能である。非経口投与には、例えば、多量（ｂｏｌｕｓ）注射によるか、または連続注入による、関節内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介した、注射が含まれ、そしてまた、例えば疾患または傷害部位での局所投与も含まれる。投与の他の適切な手段には、移植物からの持続放出；エアロゾル吸入および／またはガス注入；点眼剤；膣または直腸座薬；頬側調製物；丸剤（ピル）、シロップ、ロゼンジ、アイスクリームまたはチューインガムを含む経口調製物；およびローション、ゲル、スプレー、軟膏または他の適切な技術などの局所調製物が含まれる。あるいは、ポリペプチドを発現する培養細胞を移植することによって、例えばＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを発現する細胞を移植することによって、ポリペプチド性ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを投与することも可能である。細胞はまた、細胞増殖を調節するため、あるいはこうした細胞で所望の効果または活性を生じるため、本発明のポリペプチドの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されることも可能である。その後、処理した細胞を、療法目的のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入することも可能である。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質形質導入法によって投与されることも可能である。この方法では、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、限定されるわけではないが、ＴＡＴ、Ａｎｔｐ、またはＶＰ２２（Ｓｃｈｗａｒｚｅら，  ２０００，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：２９０−２９５）などのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に共有結合させる。次いで、細胞を含有する組織培地にペプチドを添加することによって、ＰＴＤ連結ペプチドを細胞に形質導入することも可能である（Ｓｃｈｗａｒｚｅら，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら，  ２０００，  ＴｉＰＳ  ２１：９９；Ｄｅｒｏｓｓｉら，  １９９８，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：８４；ＷＯ  ００／３４３０８；ＷＯ  ９９／２９７２１；およびＷＯ  ９９／１０３７６）。別の態様において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストをコードするＤＮＡでの、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのトランスフェクションによって、患者自身の細胞が、ＬＤＣＡＭポリペプチドまたはアンタゴニストを産生するよう、誘導する。このＤＮＡは、例えば、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストをコードする裸のＤＮＡまたはリポソーム被包ＤＮＡを注入することによって、あるいはトランスフェクションの他の手段によって、患者の細胞に導入可能である。本発明の核酸はまた、細胞または生物への核酸の導入のための他の既知の方法（限定なしに、ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形でのものが含まれる）によっても、患者に投与可能である。ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストを、１以上の他の生物学的に活性である化合物と併用して投与する際、これらは、同一のまたは異なる経路によって投与可能であり、そして同時に、別個に、または連続して投与可能である。
【０２５０】
経口投与。本発明のポリペプチドの療法的有効量を経口投与する際、本発明のポリペプチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形であろう。錠剤型で投与する際、本発明の薬剤組成物は、さらに、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体キャリアーを含有することも可能である。錠剤、カプセル、および粉末は、本発明のポリペプチドを約５〜９５％、そして好ましくは本発明のポリペプチドを約２５〜９０％含有する。液体型で投与する際、水、石油、ピーナツ油、ミネラルオイル、ダイズ油、またはゴマ油などの動物または植物起源の油、あるいは合成油などの液体キャリアーを添加することも可能である。薬剤組成物の液体型はさらに、生理学的生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含有することも可能である。液体型で投与する際、薬剤組成物は、本発明のポリペプチドを、重量約０．５〜９０％、そして好ましくは、本発明のポリペプチドを、約１〜５０％含有する。
【０２５１】
静脈内投与。本発明のポリペプチドの療法的有効量を、静脈内、皮膚または皮下注射によって投与する際、本発明のポリペプチドは、発熱物質不含で非経口的に許容しうる水性溶液の形であろう。ｐＨ、等張性、安定性等を十分考慮した、こうした非経口的に許容しうるポリペプチド溶液の調製は、当該技術分野の範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい薬剤組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、乳酸リンゲル注射剤、または当該技術分野に知られるような他のビヒクルなどの等張性ビヒクルを含有すべきである。本発明の薬剤組成物はまた、当業者に知られる、安定化剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、または他の添加物も含有することも可能である。本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の期間は、治療する疾患の重症度、並びに個々の患者各々の状態および潜在的な特異体質反応に応じて、多様であろう。本発明のポリペプチドの各適用期間は、連続静脈内投与１２〜２４時間の範囲内であろうと意図される。最終的には、主治医が、本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の適切な期間に関して、決定するであろう。
【０２５２】
骨および組織投与。骨、軟骨、腱または靭帯障害に有用な本発明の組成物に関しては、療法は、局所的に、全身性に、あるいは移植物または装置として局在的に、組成物を投与することを含む。投与する際、本発明に使用するための療法組成物は、もちろん、発熱物質不含で、生理学的に許容しうる型である。さらに、組成物は、望ましくは、骨、軟骨または組織損傷部位に搬送するため、粘稠性型で被包または注射することも可能である。創傷治癒および組織修復には、局所投与が適している可能性もある。場合によって上述のような組成物中に含まれていることも可能である、本発明のポリペプチド以外の療法的に有用な剤が、本発明の方法の組成物と同時にまたは連続して、交互にまたはさらに投与されることも可能である。好ましくは、骨および／または軟骨形成のため、組成物は、骨および／または軟骨損傷部位に、ポリペプチド含有組成物を搬送し、発展する骨および軟骨のための構造を提供することが可能であり、そして最適には、体に吸収されることが可能であるマトリックスを含むであろう。こうしたマトリックスは、他の移植医学的適用のため、現在用いられる素材で形成されることも可能である。マトリックス素材の選択は、生体適合性、生物分解性、機械的特性、美容的外見および界面特性に基づく。組成物の特定の適用が適切な配合を決めるであろう。組成物のための潜在的なマトリックスは、生物分解性でそして化学的に定義される、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ無水物であることが可能である。他の潜在的な素材は、骨または真皮コラーゲンなどの生物分解性で、そして生物学的によく定義されるものである。さらなるマトリックスは、純粋なポリペプチドまたは細胞外マトリックス構成要素で構成される。他の潜在的なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどの、非生物分解性でそして化学的に定義されるものである。マトリックスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、上述の種類の素材のいずれかの組み合わせで構成されることも可能である。バイオセラミックスは、カルシウム−アルミン酸−リン酸におけるように、組成が改変されていることも可能であり、そしてプロセシングされて、孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状、および生物分解性が改変されていることも可能である。現在好ましいのは、１５０〜８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔粒子の形の、乳酸およびグリコール酸の５０：５０（モル重量）コポリマーである。いくつかの適用において、カルボキシメチルセルロースまたは自己血餅などの隔絶剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を利用して、ポリペプチド組成物がマトリックスから解離するのを防止することが有用であろう。隔絶剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、およびカルボキシメチル−セルロースを含む、アルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）などのセルロース性素材であり、最も好ましい���は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩である。他の好ましい隔絶剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が含まれる。本明細書において有用な隔絶剤の量は、総配合物重量に基づいて、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、これは、ポリマーマトリックスからのポリペプチドの脱離を防止し、そして組成物の適切な取り扱いを提供するのに必要な量であり、それでもなお前駆細胞がマトリックスに浸潤するのを防止するほど多くなく、それによってポリペプチドが前駆細胞の骨形成活性を補助する機会を提供する量に相当する。さらなる組成物において、本発明のポリペプチドを、骨および／または軟骨欠損、創傷または問題の組織の治療に有益な他の剤と併用することも可能である。これらの剤には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの多様な増殖因子が含まれる。療法組成物はまた、現在、獣医学的適用にも有用である。特に、本発明のポリペプチドでのこうした治療には、ヒトに加えて、家畜およびサラブレッド系統のウマが、望ましい患者である。組織再生に使用すべきポリペプチド含有薬剤組成物の投薬措置は、ポリペプチドの作用を修飾する多様な要因、例えば形成されるのが望ましい組織の重量、損傷部位、損傷組織の状態、創傷サイズ、損傷組織の種類（例えば骨）、患者の年齢、性別、および食餌、あらゆる感染の重症度、投与期間および他の臨床的要因を考慮して、主治医によって決定されるであろう。投薬量は、再構成に用いたマトリックスの種類、および薬剤組成物中の他のポリペプチドの包含に応じて、多様である可能性もある。例えば、ＩＧＦ  Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）などの他の既知の増殖因子を最終組成に添加してもまた、投薬量が達成される可能性もある。経過は、組織／骨増殖および／または修復の定期的な評価、例えばＸ線、組織形態計測的測定およびテトラサイクリン標識によって、監視可能である。
【０２５３】
獣医学的使用。ヒト患者に加え、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストは、ペット（イヌ、ネコ、鳥類、霊長類等）、飼育農場動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、鳥類等）などの非ヒト動物、またはＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストが仲介する状態を患う動物いずれかの疾患状態の治療に有用である。こうした例では、適切な用量は、動物の体重にしたがって決定可能である。例えば、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの用量が使用可能である。あるいは、用量は、動物の表面面積にしたがって決定され、典型的な用量は、０．１〜２０ｍｇ／ｍ２、またはより好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ２の範囲である。イヌまたはネコなどの小動物に関しては、適切な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。好ましい態様において、ＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニスト（好ましくは患者と同じ種由来の遺伝子で構築される）は、動物の状態が改善されるまで、週１回以上、注射または他の適切な経路によって投与されるか、あるいは無期限に投与可能である。
【０２５４】
薬剤製造。本発明はまた、本明細書に開示する各医学的障害の防止または療法的治療のための薬剤製造における、本明細書に多様に定義するようなＬＤＣＡＭアンタゴニストおよびアゴニストの使用にも関する。
【０２５５】
本発明は、本発明の個々の側面の単一の例示として意図される、本明細書記載の特定の態様によって、範囲を制限されるものではなく、そして機能的に同等な方法および構成要素が、本発明の範囲内である。実際、当業者には、本明細書に示し、そして記載するものに加えて、本発明の多様な修飾が、前述の説明および付随する図から明らかとなるであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲に属すると意図される。
【０２５６】
本発明が記載されているが、以下の実施例は、特定の態様を例示することを意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
配列同定番号および関連分子
【０２５７】
【表３】
2007500132.tif 000006
【実施例】
【０２５８】
（実施例１）
Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質の調製
以下は、Ｂ７Ｌ−１が結合する細胞を同定するのに用いる、ヒトＢ７Ｌ−１／Ｆｃタンパク質の生成を記載する。融合タンパク質には、ヒトＢ７Ｌ−１の可溶性細胞外領域および突然変異タンパク質ヒトＦｃ領域が含まれ、そしてまず、Ｂ７Ｌ−１の細胞外領域に隣接するプライマーを用いて、ヒトＢ７Ｌ−１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを単離することによって調製された（米国特許第５，０１１，９１２号を参照されたい）。
【０２５９】
Ｂ７Ｌ−１の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド（同時係属出願Ｓ／Ｎ  ６０／０９５，６６３号、１９９８年８月７日出願の配列番号１のヌクレオチド１０８〜１２４９）を単離するため、Ｂ７Ｌ−１の細胞外領域に隣接するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応のプライマーとして用いて、反応のテンプレートのクローン＃４４９０４からＰＣＲ産物を得た。Ｓａｌ１およびＢｇｌＩＩ制限酵素を用い、プライマーによって取り込まれたＳａｌ１およびＢｇｌＩＩ部位で、生じたＰＣＲ産物を消化した。Ｆｃ受容体結合を低下させるように突然変異させたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する発現ベクター（ｐＤＣ４０９）に、生じた断片を連結した。
【０２６０】
生じたＤＮＡ構築物をサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡにトランスフェクションした（ｐｓｖ３ｎｅｏと同時トランスフェクション）。０．５％低免疫グロブリン・ウシ血清を含有する培地中で７日間培養した後、０．２％アジド溶液を上清に添加し、そして０．２２μｍフィルターを通じて上清をろ過した。次いで、４．６ｘ１００ｍｍプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａ）を用いたＢｉｏＣａｄプロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製系に、およそ１ｌの培養上清を１０ｍｌ／分で通過させた。プロテインＡカラムは上清中の融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定し、そして上清の他の構成要素がカラムを通過するのを可能にする。３０ｍｌのＰＢＳ溶液でカラムを洗浄し、そしてｐＨ３．０に調整したクエン酸を用いて、結合した融合タンパク質をＨＰＬＣカラムから溶出させた。ｐＨ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を用いて溶出すると同時に、溶出された精製融合タンパク質を中和した。
【０２６１】
（実施例２）
Ｂ７Ｌ−１結合研究
実施例１に記載するように調製したＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を用い、標準的フローサイトメトリー方法論にしたがった定量的結合研究を用いて、Ｂ７Ｌ−１結合に関して細胞株をスクリーニングした。スクリーニングする各細胞株に関して、該方法は、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、５％正常ヤギ血清および５％ウサギ血清でブロッキングされる細胞を１時間インキュベーションすることを含んだ。次いで、ブロッキングされた細胞を、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ、５％ヤギ血清および５％ウサギ血清中のＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質５μｇ／ｍｌとインキュベーションした。インキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ）で試料を２回洗浄し、そして次いで、マウス抗ヒトＦｃ／ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入）およびＳＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入したストレプトアビジン−フィコエリトリン）で処理した。この処理によって、抗ヒトＦｃ／ビオチンが結合したＢ７Ｌ−１／Ｆｃいずれにも結合し、そしてＳＡＰＥが抗ヒトＦｃ／ビオチンに結合して、細胞に結合したＢ７Ｌ−１／Ｆｃ上に蛍光同定標識を生じる。蛍光検出フローサイトメトリーを用いて、いかなる結合タンパク質に関しても、細胞を解析した。結果によって、ヒトＢ７Ｌ−１がヒト肺上皮株（ＷＩ−２８）、ヒトＢリンパ芽球株（ＤａｕｄｉおよびＰＡＥ８ＬＢＭ１）、ヒト新鮮扁桃Ｂ細胞、ｆｌｔ３−Ｌ処置動物の脾臓／リンパ節由来のネズミＣＤ８＋樹状細胞、およびネズミＴ細胞リンパ腫Ｓ４９．１によく結合することが示された。
【０２６２】
（実施例３）
Ｂ７Ｌ−１対受容体に関するＷＩ−２６発現ライブラリーのスクリーニング
以下は、実施例１に記載するように調製したＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を用いた発現クローニングライブラリーのスクリーニングを記載する。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１，  （１９８７）に記載される方法を用いて、ヒト細胞株ＷＩ−２６から発現ライブラリーを調製した。標準的間接的結合法を用いて、放射ヨウ素化Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を用いたＢ７Ｌ−１対受容体の発現に関するスライド・オートラジオグラフィーによって、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション単層をアッセイした。対受容体を発現する細胞を示す陽性スライドを同定し、そしておよそ２，０００の個々のクローンを含有する１つのプールを、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質の結合に関して潜在的に陽性であると同定した。
【０２６３】
プールを力価決定し、そしてプレーティングし、そして次いで掻き取って、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションするためのプールしたプラスミドＤＮＡを提供した。より小さいプールをスクリーニングした後、１つのプールは、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃへの結合が可能な発現遺伝子産物の存在によって示されるように、Ｂ７Ｌ−１対受容体に関して陽性であるクローンを含有した。陽性プールを力価決定し、そしてプレーティングして、個々のコロニーを得た。潜在的な候補クローン各々からＤＮＡを単離し、再トランスフェクションし、そして再スクリーニングした。生じた陽性クローンは、１５３５ヌクレオチドのｃＤＮＡ挿入物を含有した。Ｂ７Ｌ−１対受容体（ＬＤＣＡＭ）のｃＤＮＡコード領域は、配列番号１に開示するものに対応する。配列番号１がコードするアミノ酸配列を配列番号２に開示する。
【０２６４】
（実施例４）
ヒトＬＤＣＡＭの発現
以下は、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞における全長膜結合ヒトＬＤＣＡＭの発現を記載する。ｐＤＣ４０９発現ベクターに配列番号１のコード領域を連結することによって、ヒトＬＤＣＡＭを発現するためのベクター構築物を調製した。次いで、発現ベクターをＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションし、そしてＭｃＭａｈａｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１に記載される技術を用いて発現した。
【０２６５】
細胞にショックを与え、そして数日間インキュベーションし、膜結合したＬＤＣＡＭを有する細胞を採取し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、そして損なわれていない型で用いた。
【０２６６】
配列番号１のヌクレオチド８〜１１３０がコードするＬＤＣＡＭ細胞外領域を含むＬＤＣＡＭの可溶性型を発現するため、ｐＤＣ４０９発現ベクターに、配列番号１の細胞外コード領域を連結することによって、ベクター構築物を調製する。該ベクターをＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションする。
【０２６７】
新鮮培地中で３日間インキュベーションした後、可溶性型を含有するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞上清を回収し、そしてＨＰＬＣ技術またはアフィニティークロマトグラフィー技術を用いてＬＤＣＡＭを単離することによって、可溶性ＬＤＣＡＭを回収する。
【０２６８】
（実施例５）
ＬＤＣＡＭ結合研究
ＬＤＣＡＭが結合する細胞株を同定するため、以下の実施例９に記載するＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質を調製し、そして細胞結合アッセイおよびＦＡＣＳアッセイで用いた。標準的細胞結合およびＦＡＣＳ方法論を用いて、ＬＤＣＡＭが、Ｂリンパ芽球細胞株、ＤＡＵＤＩおよびＰＡＥ８ＬＢＭ１、ヒトＢ７Ｌ−１でトランスフェクションした細胞、ＬＤＣＡＭでトランスフェクションした細胞、Ｓ４９．１細胞、並びにＦｌｔ３−Ｌ処置マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ系ＤＣに結合することを見出した。
【０２６９】
（実施例６）
ＬＤＣＡＭを発現する組織の同定
標準的ＲＴ−ＰＣＲ方法論、ノーザン解析およびＥＳＴデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ）配列マッチングを用いて、ヒトＬＤＣＡＭおよびマウスＬＤＣＡＭのｍＲＮＡ発現に関して、いくつかの細胞株を調べた。結果によって、ＬＤＣＡＭが広い範囲の組織分布を有することが示された。ヒトＬＤＣＡＭの発現は、乳房、網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児心臓、肺、筋肉、胎盤、甲状腺、および肺癌に見られた。マウスｍＲＮＡ  ＬＤＣＡＭは、全胚、精巣、および三重ネガティブ細胞に見られた。
【０２７０】
（実施例７）
ネズミＬＤＣＡＭの単離
可溶性ヒトＢ７Ｌ−１がネズミ・リンパ腫Ｓ４９．１への結合を示した（実施例２）ため、ネズミＬＤＣＡＭ  ＣＤＮＡクローンに関して、Ｓ４９．１発現ライブラリーをスクリーニングした。該方法は、Ｓ４９．１細胞株ＲＮＡ、並びに配列番号７および配列番号８に示すプライマーを用いた、ＲＴ−ＰＣＲ方法論を含んだ。これらのプライマーは、データベース中に見出され、そしてヒトＬＤＣＡＭに相同性を有するネズミＥＳＴに基づく。該プライマーを用いたＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅し、Ｓ４９．１細胞にネズミＬＤＣＡＭが存在することを確認した。
【０２７１】
増幅産物をクローニングベクターにクローニングし、そしてヒトＬＤＣＡＭコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、ＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡ挿入物を含有するクローンを検出した。ヒトＬＤＣＡＭに比較して、５’伸長を持つｃＤＮＡを検出するため、ｃＤＮＡクローンの５’領域が増幅されるように、コード領域の５’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびｃＤＮＡ挿入物に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いて、アンカーＰＣＲを行った。ゲル電気泳動によって、ＰＣＲ産物を調べ、そしてその長さをヒトＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡから同様に得た増幅産物と比較した。より長い５’ＰＣＲ産物を生じるクローンのｃＤＮＡ挿入物を配列決定して、ヒトＬＤＣＡＭに比較して、最初の４アミノ酸以外をコードするネズミＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡを生じた。ネズミＬＤＣＡＭのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。配列番号３のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列番号４に提供する。
【０２７２】
（実施例８）
ネズミＬＤＣＡＭポリペプチドの発現
ネズミ細胞外Ｂ７Ｌ−１を発現するベクター構築物を調製するため、配列番号３のコード領域をｐＤＣ４０９発現ベクターに連結した。次いで、該発現ベクターをＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションし、そしてＭｃＭａｈａｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１に記載される技術を用いて発現した。
【０２７３】
細胞にショックを与え、そして数日間インキュベーションした後、可溶性ネズミＬＤＣＡＭを含有する細胞上清を収集し、そしてＨＰＬＣ技術を用いて、タンパク質を回収した。
【０２７４】
（実施例９）
ＬＤＣＡＭ／融合タンパク質の調製
以下は、ＬＤＣＡＭが結合する細胞を同定するために用いる、ヒトＬＤＣＡＭ／Ｆｃタンパク質の生成を記載する。融合タンパク質には、ヒトＬＤＣＡＭの可溶性細胞外領域および突然変異タンパク質ヒトＦｃ領域が含まれ、そしてまず、ＬＤＣＡＭの細胞外領域に隣接するプライマーを用いて、ヒトＬＤＣＡＭの細胞外領域をコードするｃＤＮＡを単離することによって調製された（米国特許第５，０１１，９１２号を参照されたい）。
【０２７５】
ＬＤＣＡＭの細胞外ドメインをコードするヌクレオチドである配列番号１のヌクレオチド１６〜１１３７を単離するため、ＬＤＣＡＭの細胞外領域に隣接するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応のプライマーとして用いて、ＷＩ−２６クローンからＰＣＲ産物を得た。プライマーを配列番号５および配列番号６に示す。Ｓａｌ１およびＢｇｌＩＩ制限酵素を用い、プライマーによって取り込まれたＳａｌ１およびＢｇｌＩＩ部位で、生じたＰＣＲ産物を消化した。Ｆｃ受容体結合を低下させるように突然変異させたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する発現ベクター（ｐＤＣ４０９）に、生じた断片を連結した。
【０２７６】
生じたＤＮＡ構築物をサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡにトランスフェクションした。０．５％低免疫グロブリン・ウシ血清を含有する培地中で７日間培養した後、０．２％アジド溶液を上清に添加し、そして０．２２μｍフィルターを通じて上清をろ過した。次いで、４．６ｘ１００ｍｍプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａ）を用いたＢｉｏＣａｄプロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製系に、およそ１ｌの培養上清を１０ｍｌ／分で通過させた。プロテインＡカラムは上清中の融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定し、そして上清の他の構成要素がカラムを通過するのを可能にする。３０ｍｌのＰＢＳ溶液でカラムを洗浄し、そしてｐＨ３．０に調整したクエン酸を用いて、結合した融合タンパク質をＨＰＬＣカラムから溶出させた。ｐＨ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を用いて溶出すると同時に、溶出された精製融合タンパク質を中和した。
【０２７７】
（実施例１０）
ＬＤＣＡＭに対するモノクローナル抗体
本実施例は、ＬＤＣＡＭに対するモノクローナル抗体を調製する方法を例示する。慣用的な技術、例えば米国特許第４，４１１，９９３号に記載される技術を用い、精製ＬＤＣＡＭ、細胞外ドメインなどのその断片、合成ペプチド、またはＬＤＣＡＭを発現する細胞を用いて、ＬＤＣＡＭに対するモノクローナル抗体を生成することも可能である。簡潔には、完全フロイントアジュバント中で乳化し、そして１０〜１００μｇの範囲の量を皮下または腹腔内注射した、免疫原としてのＬＤＣＡＭで、マウスを免疫する。１０〜１２日後、不完全フロイントアジュバント中で乳化したさらなるＬＤＣＡＭで、免疫動物を追加免疫する。毎週〜隔週の免疫スケジュールで、マウスを定期的に追加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除によって、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）によって、ＬＤＣＡＭ抗体に関して試験する。
【０２７８】
適切な抗体力価を検出した後、陽性動物に、生理食塩水中のＬＤＣＡＭを最後に一度、静脈内注射する。３〜４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そしてネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合させる。融合によってハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートに蒔く。
【０２７９】
Ｅｎｇｖａｌｌら，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ８：８７１，  １９７１および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術を適応させ、精製Ｂ７Ｌ−１に対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：４２１２，  １９９０）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＬＤＣＡＭモノクローナル抗体を含有する腹水を産生することも可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によって、フラスコまたはローラーボトル中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることも可能である。マウス腹水中で産生されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、続いてゲル排除クロマトグラフィーによって、精製可能である。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用可能であり、Ｂ７Ｌ−１への結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも使用可能である。
【０２８０】
（実施例１１）
ノーザンブロット解析によるＬＤＣＡＭ発現の検出
以下は、本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する組織および細胞種を同定するために行う、ノーザンブロット実験を記載する。
【０２８１】
１．２％アガロース・ホルムアルデヒドゲル上で、５μｇ〜１０μｇの総ＲＮＡを分画し、そしてＲＮＡをＨｙｂｏｎｄナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）上にブロッティングすることによって、ノーザンブロットを生成した。Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載されるような標準的ノーザンブロット生成法を用いた。いくつかの異なる供給源由来のｍＲＮＡ  １μｇを含有するポリＡ＋多組織ブロットを、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから購入した。
【０２８２】
製造者の指示にしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａのリボプローブ・コンビネーション・キットおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＬＤＣＡＭのコード領域を含有するリボプローブを生成した。ノーザンブロットを探査し（ｐｒｏｂｉｎｇ）、そして生じたＸ線フィルムを、陽性に結合したプローブに関して視覚化した結果によって、ネズミＬＤＣＡＭに関して、５．０ｋＢのハイブリダイズｍＲＮＡが、肺、肝臓、脳、精巣および脾臓樹状細胞で検出されたことが示される。異なるサイズを有する、さらなるハイブリダイズｍＲＮＡには、肺および精巣のおよそ１．９ｋＢのｍＲＮＡ；ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージ、肺および精巣のおよそ３．０ｋＢのｍＲＮＡ；抗Ｔ細胞受容体抗体で刺激した脾臓Ｔ細胞、ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージ、および精巣のおよそ７．０ｋＢのハイブリダイズｍＲＮＡが含まれ；そしておよそ９．０ｋＢのハイブリダイズｍＲＮＡが、胸腺および抗Ｔ細胞受容体抗体で刺激した脾臓Ｔ細胞で検出された。
【０２８３】
（実施例１２）
免疫系細胞結合研究
以下は、ＬＤＣＡＭが特定の活性化免疫系細胞に結合することを示す、ＦＡＣＳ細胞結合実験を記載する。研究および比較目的のため、Ｂ７Ｌ−１の結合特性もまた含む。研究した細胞には、ネズミＴ細胞、ヒトＴ細胞、ネズミＢ細胞、ネズミＮＫ細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト腫瘍細胞株が含まれた。
【０２８４】
ネズミＴ細胞結合を研究するため、ＢＡＬＢ／ｃネズミリンパ節（ＬＮ）細胞を、培地中、単独で、そして異なる刺激の存在下で、１８〜２０時間培養した。培養した細胞を採取し、そしてＢ７Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質および対照Ｆｃタンパク質を用いた結合研究のために調製した。一晩培養した後、ＢＡＬＢ／ｃネズミＬＮ細胞は、典型的には＞９０％  ＣＤ３＋である。フローサイトメトリー解析を用いて、結合したタンパク質を検出した。表Ｉに示す結果は、未刺激Ｔ細胞（培地）および刺激Ｔ細胞（刺激による）上の平均蛍光強度単位（ＭＦＩ）として表した観察される結合を示す。
【０２８５】
表Ｉ
【０２８６】
【表４】
2007500132.tif 000007
【０２８７】
Ｔ細胞サブセットによって解析すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＴＣＲ刺激した後、ＬＮ  ＣＤ４＋ネズミＴ細胞の７５〜８０％が、検出可能なＬＤＣＡＭ結合を示した。ＬＮ  ＣＤ８＋ネズミＴ細胞の約５０％が、検出可能な結合を示す。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ネズミＴ細胞より高いレベルのＬＤＣＡＭ結合を示す。結果によって、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃは未刺激Ｔ細胞に低レベルで結合することが立証される。しかし、ポリクローナル刺激で一晩活性化すると、結合は刺激に応じて５〜２０倍増加した。研究した刺激のうち、ＰＭＡはネズミＴ細胞に対して最低のＬＤＣＡＭ結合を誘導し、そして抗ＴＣＲは最高の結合を誘導する。
【０２８８】
ＬＤＣＡＭおよびその対構造Ｂ７Ｌ１へのヒトＴ細胞結合を研究するため、ヒト末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞を、培地中、単独で、または異なる刺激の存在下で、１８〜２０時間培養した。培養した細胞を採取し、そしてＢ７Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質および対照Ｆｃタンパク質いずれかを用いた結合研究のために調製した。フローサイトメトリー解析によって、ヒトＰＢ  Ｔ細胞上に結合したタンパク質を測定した。表ＩＩは、未刺激Ｔ細胞（培地）および刺激Ｔ細胞（刺激による）上のＭＦＩとして表した観察される結果を詳述する。
【０２８９】
表ＩＩ
【０２９０】
【表５】
2007500132.tif 000008
【０２９１】
結果は、ＰＭＡが、ネズミＴ細胞に対してより、ヒトＴ細胞に対して、より高いＬＤＣＡＭ結合を誘導することを示す。Ｂ７Ｌ１結合の非存在下で、ネズミおよびヒト両方のＴ細胞に対するＬＤＣＡＭの特異的結合が存在することから、ＬＤＣＡＭがＢ７Ｌ１または異なる分子に結合性であり、そして自身には結合性でないことが示唆される。研究によって、Ｔ細胞がほとんどまたはまったくＢ７Ｌ１を発現しないことが示されるため、ＬＤＣＡＭは別の結合パートナーを有する可能性もある。
【０２９２】
上記と類似の研究を行って、ネズミ脾臓Ｂ細胞に対するＬＤＣＡＭおよびＢ７Ｌ１結合を評価した。Ｂ７Ｌ１またはＬＤＣＡＭ結合のいずれも、未刺激ネズミＢ細胞上では検出されなかった。ネズミ脾臓Ｂ細胞をｍｕＣＤ４０ＬまたはＬＰＳと培養すると、低レベルのＬＤＣＡＭ結合が誘導されたが、認識可能なレベルのＢ７Ｌ１結合は検出されなかった。
【０２９３】
ネズミＮＫ細胞への結合を研究するため、ＩＬ−１５処置ＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスから脾臓を取り除き、そして非常に濃縮され、そして活性化されたネズミＮＫ細胞の供給源として用いた。ＩＬ−１５処置したＳＣＩＤマウスから単離した脾臓細胞は、６０〜８０％  ＤＸ−５陽性である。ＤＸ−５は全ＮＫマーカーであり、多くの異なる系統のマウス由来のＮＫ細胞上で発現される。上述のようにフローサイトメトリー解析を行って、ＤＸ−５＋  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１５活性化ネズミＮＫ細胞へのＢ７Ｌ１およびＬＤＣＡＭ結合を検出した。表ＩＩは、ネズミＮＫ細胞結合研究の結果を提供する。
【０２９４】
表ＩＩＩ
【０２９５】
【表６】
2007500132.tif 000009
【０２９６】
ネズミおよびヒトのＴ細胞上で観察されるものとは対照的に、ＬＤＣＡＭおよびＢ７Ｌ１結合が、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性化ネズミＮＫ細胞上で検出可能である。
ヒト内皮細胞へのＢ７Ｌ１およびＬＤＣＡＭ結合を研究することに向けられる実験の結果から、異なるドナー由来のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対しては結合が見られないことが示された。しかし、１つのドナーＢ７Ｌ１由来の１つのＨＵＶＥＣは、対照Ｆｃに比較して、低レベルのＣＤ６２ＥおよびＣＤ１０６を誘導した。
【０２９７】
表ＩＶは、ヒト腫瘍細胞株へのＢ７Ｌ１およびＬＤＣＡＭ結合を評価することに向けられる実験結果を詳述する。ＬＤＣＡＭまたはＢ７Ｌ１に結合する細胞の割合として、結果を示す。
【０２９８】
表ＩＶ
【０２９９】
【表７】
2007500132.tif 000010
【０３００】
＊＊対照Ｆｃの結合を引いてあり、したがってこれはバックグラウンドを越える正味の＋細胞％である。
結果によって、卵巣癌細胞株およびヒトＢ細胞腫瘍株のうち２つ（ＭＰ−１およびＴｏｎｓｉｌ  Ｇ）に対する有意なＬＤＣＡＭ結合が示される。Ｂ７Ｌ１もまた、これらの３つの腫瘍細胞株に結合するが、はるかにより低いレベルである。これらの結果によって、ＬＤＣＡＭが特定の種類のＢ細胞リンパ腫または異なる種類の癌腫のマーカーであることが示される。さらに、ＬＤＣＡＭまたはＢ７Ｌ１に仲介される生物学的シグナル伝達は、これらの種類の腫瘍に対する機能的抗腫瘍効果を仲介しうる。
【０３０１】
（実施例１３）
Ｔ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの影響
以下の議論は、ポリクローナル刺激によって誘導されるネズミおよびヒトのＴ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの影響を評価するために行った実験を記載する。
【０３０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏネズミＴ細胞増殖の標準的モデルにおいて、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質およびＢ７Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質を評価した。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスからリンパ節（ＬＮ）細胞を得て、そして培地中の培養に置いた。多様な量の対照Ｆｃ、Ｂ７Ｌ１／ＦｃおよびＬＤＣＡＭ／Ｆｃを、単独で、またはＣｏｎＡ、ＰＨＡまたは固定ＴＣＲ  ｍＡｂを含む、Ｔ細胞の異なるポリクローナル刺激の存在下で、培地に入れた。
【０３０３】
これらの実験の結果によって、ＬＤＣＡＭがＣｏｎＡ誘導性ネズミＴ細胞増殖を強く阻害し（〜０．６２５μｇ／ｍｌで５０％阻害）、ＰＨＡ誘導性増殖を中程度に阻害し（〜５μｇ／ｍｌで５０％阻害）、そして固定ＴＣＲ  ｍＡｂによって誘導される増殖を影響を与えない（ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｅｆｆｅｃｔ）ことが立証された。ヒト末梢血Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡ誘導性増殖を阻害するが、ＰＨＡまたはＯＫＴ３誘導性増殖を有効に阻害しない。Ｂ７Ｌ１／Ｆｃは、ネズミまたはヒトのＴ細胞の増殖応答に影響を与えない（ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｅｆｆｅｃｔ）。
【０３０４】
結果によって、マイトジェンに誘導されたネズミおよびヒトＴ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭ／Ｆｃの阻害効果が、ＬＤＣＡＭ結合パートナーの発現が活性化され、そして増加した後、サイトカイン分泌（特にＩＬ−２）が阻害されるためであるか、またはＴ細胞の下流応答が制御されるためであることが示唆される。ＬＤＣＡＭはまた、Ｔ細胞間、Ｔ細胞およびＡＰＣ間またはＴ細胞およびＮＫ細胞間の細胞間相互作用を調節することも可能である。ＬＤＣＡＭがＴＣＲ  ｍＡｂ誘導性増殖を阻害できなかったことから、サイトカイン異常調節が起こり、ここでＣｏｎＡおよびＰＨＡに誘導される増殖は非常にサイトカイン依存性であり、一方、抗ＴＣＲ  ｍＡｂによって誘導されるものではそれほどでもないことが示唆される。
【０３０５】
（実施例１４）
ネズミＴ細胞サイトカイン産生に対するＬＤＣＡＭの影響
以下は、ＰＨＡ、ＣｏｎＡおよびＴＣＲ  ｍＡｂでＴ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ活性化した後、ネズミＬＮ細胞または精製Ｔ細胞サイトカイン分泌に対する影響に関してＬＤＣＡＭを評価するために行う実験を記載する。結果を表Ｖに示す。検出されたサイトカインのレベルをｐｇ／ｍｌで表す。
【０３０６】
表Ｖ
【０３０７】
【表８】
2007500132.tif 000011
【０３０８】
結果は、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃが、ＣｏｎＡおよびＰＨＡのどちらにも誘導される、ネズミＬＮ  Ｔ細胞のＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ産生を有意に阻害することを示す。固定抗ＴＣＲ  ｍＡｂを用いて、ネズミＴ細胞からのサイトカイン産生を誘導した際、サイトカイン産生に対するＬＤＣＡＭのより顕著でない効果が観察された。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ活性化後のＩＦＮ−ガンマ産生を減少させた。対照的に、ＴＣＲ活性化後のＩＬ−２産生は減少しなかった。これらの実験では、Ｔ細胞によってＩＬ−４は非常にわずかしか生成されず、したがってＬＤＣＡＭがＩＬ−４または他のさらなるサイトカイン類／ケモカイン類のＴ細胞産生に影響を及ぼす（ｅｆｆｅｃｔ）のかどうかは評価しなかった。
【０３０９】
（実施例１５）
ネズミ混合細胞活性化アッセイに対するＬＤＣＡＭの影響
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合細胞アッセイを発展させて、Ｔ細胞がＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用を通じてＢ細胞を活性化させる能力を調べた。該アッセイは、脾臓細胞およびＬＮ細胞を抗ＴＣＲ  ｍＡｂとｉｎ  ｖｉｔｒｏで３６時間培養し、その後、Ｔ細胞が活性化され、そしてＢ細胞／ＡＰＣと相互作用した後に生じる、Ｔ細胞およびＢ細胞／ＡＰＣ細胞活性化のフローサイトメトリー解析を行うことを伴う。
【０３１０】
脾臓細胞を、抗ＴＣＲ  ｍＡｂ、ＣｏｎＡ、ＰＨＡと、または培地中で、対照Ｆｃのみと、またはＬＤＣＡＭ／Ｆｃと、３６時間培養した。ＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ３＋  Ｔ細胞活性化後、２色染色およびフローサイトメトリー解析を用いて、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ５４、ＣＤ４５Ｒｂ、ＣＤ４４、ＣＤ２８、ＣＤ２３、ＣＤ８６およびＣＤ１５２の細胞表面発現を調べた。
【０３１１】
ＰＨＡまたはＣｏｎＡでの活性化後、ＣＤ６９、ＣＤ５４、およびＣＤ２５の発現が、培養中のＴ細胞およびＢ細胞上で、数倍増加していることが立証された。対照Ｆｃがこれらの増加にほとんど影響を及ぼさないのに比べて、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡでの活性化を介して、この培養系において、両方の細胞種上で誘導される、ＣＤ６９、ＣＤ５４およびＣＤ２５の発現を有意に減少させた（非活性化Ｔ細胞とほぼ同レベル）。ＣｏｎＡは、表面上に活性化分子（例えばＣＤ４０Ｌ）を発現するＴ細胞を活性化させる。活性化分子は、Ｂ細胞表面上の受容体に結合し、そしてＢ細胞を活性化して、細胞表面上の多様な活性化関連タンパク質を発現させる。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞およびＢ細胞の阻害は、ＣｏｎＡで活性化された後に観察されるものより穏やかな度合いで起こった。
【０３１２】
さらに、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡと培養した脾臓細胞において、ＣＤ３＋およびＣＤ３−両方で発現されるＣＤ４５ＲＢのレベルを減少させた。ＣＤ４５ＲＢレベルの減少に対するこの効果は、ＬＤＣＡＭをＴＣＲ  ｍＡｂで刺激した脾臓細胞と培養した場合、より顕著であり、そしてＰＨＡを刺激剤として用いた場合、または細胞を培地のみで培養した場合、観察されなかった。
【０３１３】
ＴＣＲ  ｍＡｂを用いて、対照ＦｃまたはＬＤＣＡＭ／Ｆｃの存在下で培養脾臓細胞を刺激すると、この刺激により、Ｔ細胞およびＢ細胞上で誘導されるＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＣＤ２５のレベルは、ＬＤＣＡＭに影響されない（ｗｅｒｅ  ｎｏｔ  ｅｆｆｅｃｔｅｄ）ことが示された。しかし、ＬＤＣＡＭは、ＣＤ３＋  Ｔ細胞および非Ｔ細胞両方の上のＣＤ２８発現を増加させた。１つの実験において、増加は５〜１０倍であり、そして他の実験では、増加は５０％であった。これはまた、ＴＣＲ  ｍＡｂに加えて、ＣｏｎＡを刺激剤として用いた１つの実験でも観察された。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂで活性化した後のＢ細胞（５０％減少）およびＴ細胞（２０〜３０％減少）上のＣＤ４５ＲＢ発現強度の中程度の減少を引き起こした。
【０３１４】
興味深いことに、ＬＤＣＡＭは、ポリクローナルＴ細胞刺激の非存在下で脾臓細胞を培養した際、脾臓細胞上のＣＤ４５ＲＢ発現に影響を及ぼさない（ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｅｆｆｅｃｔ）。げっ歯類におけるＣＤ４５ＲＢ発現は、Ｔ細胞が未刺激細胞からメモリー細胞に進行するにつれて減少すると報告されている。また、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の異なる下位集団が高レベルまたは低レベルのＣＤ４５ＲＢを発現し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで別個の免疫機能を仲介する。
【０３１５】
上に論じる結果によって、特定の免疫刺激条件下で、特にＣｏｎＡおよびＰＨＡによる刺激下で、ＬＤＣＡＭが、混合細胞アッセイにおいて細胞レベルで、Ｔ細胞活性化を阻害し、そして少なくとも部分的に、ＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ産生を減少させることによって、これらのマイトジェンによって誘導されるＴ細胞増殖を阻害することが示唆される。
【０３１６】
ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂが誘導する活性化によって誘導されるＩＦＮガンマ産生を中程度に下方制御するが、この系において、ＩＬ−２産生にはほとんど影響がなく、そして固定ＴＣＲ  ｍＡｂによって誘導されるネズミＴ細胞の増殖に影響を及ぼさない（ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｅｆｆｅｃｔ）。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂが活性化するＴ細胞およびＢ細胞のＣＤ２８発現の増加、並びにＣＤ４５ＲＢ発現の減少を引き起こす。これらのデータに基づいて、Ｔ細胞上のＬＤＣＡＭまたはその結合パートナーは、限定されるわけではないが、抗腫瘍免疫応答、ＤＴＨ応答、およびＴ細胞依存性抗感染性疾患免疫応答を含むＴ細胞エフェクター依存性免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで制御する（増加させる、減少させる、または向け直す）ことも可能である。
【０３１７】
上記の結果は、ＬＤＣＡＭがＴ細胞活性化経路を調節するのに有用であり、そしてこれを用いて、自己免疫疾患および炎症を治療可能であることを示唆する。
【０３１８】
（実施例１６）
ＬＤＣＡＭ．Ｆｃは、ネズミＮＫ細胞に結合し、そしてＮＫ細胞増殖を引き起こす
以下は、ＬＤＣＡＭが脾臓ＮＫ細胞表面に恒常的に結合し、そしてこれらの細胞をＩＬ−１５で活性化すると、ＬＤＣＡＭ結合レベルが増加することを立証する実験を記載する。該実験はまた、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスへのＬＤＣＡＭ：Ｆｃの投与、並びに脾臓におけるＮＫ細胞増殖および活性化に対する投与の影響もまた記載する。
【０３１９】
１２匹の年齢一致メスＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスを、群あたり３匹の４群に分けた。第０日、第１日、および第２日、第Ｉ群、第ＩＩ群、第ＩＩＩ群および第ＩＶ群に以下のタンパク質をＩＰ投与した：第Ｉ群のマウスには１０μｇのヒトＩｇＧを投与し；第ＩＩ群のマウスには１０μｇのヒトＩＬ−１５を投与し；第ＩＩＩ群のマウスには１０μｇのヒトＬＤＣＡＭ：Ｆｃ（Ｉｍｍｕｎｅｘのロット番号７４８８−１６）を投与し；そして第ＩＶ群には各１０μｇのヒトＬＤＣＡＭ：ＦｃおよびヒトＩＬ−１５を投与した。
【０３２０】
第３日（実験４日目）、マウスを安楽死させ、そして脾臓細胞を取り除いた。各脾臓を別個に計数し、そして次いで、フローサイトメトリー解析のため、ともにプールした。ＤＸ−５抗体を全ネズミＮＫ細胞マーカーとして用いたフローサイトメトリーによって、各処置群の脾臓中のＮＫ細胞数を決定した。さらに、ＣＤ６９およびＣＤ５４発現を含むＮＫ細胞活性化の他の測定値を評価した。
【０３２１】
実験結果を表ＶＩに示す。ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ単独の投与（第ＩＩＩ群）によって、ヒトＩｇＧ対照群（第Ｉ群）よりも約５倍、総回収脾臓細胞数が増加した。ヒトＩＬ−１５を単独で投与する（第ＩＩ群）と、対照群（第Ｉ群）よりも約９倍、総回収脾臓細胞数が増加した。ＩＬ−１５およびＬＤＣＡＭの併用処置は、脾臓細胞数を相加的に増加させた。
【０３２２】
脾臓から回収されるＮＫ細胞数は、脾臓中の総細胞回収と相関した。より具体的には、ＬＤＣＡＭは、処置マウス脾臓からの回収ＮＫ細胞数の約５倍の増加を誘導し；ＩＬ−１５は、回収ＮＫ細胞数の約９倍の増加を誘導し；そしてＬＤＣＡＭおよびＩＬ−１５の併用は、回収ＮＫ細胞数の約１３倍の増加を誘導した。ＬＤＣＡＭはまた、ＣＤ６９およびＣＤ５４を発現する脾臓中のＮＫ細胞数も増加させた。この増加は、ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＮＫ細胞上のＣＤ６９またはＣＤ５４の発現が特異的に増加したためではなく、全ＮＫ細胞の増殖によるものであった。
【０３２３】
表ＶＩ
【０３２４】
【表９】
2007500132.tif 000012
【０３２５】
（実施例１７）
Ｆｌｔ３リガンドに由来するユニークな樹状細胞集団の同定
Ｆｌｔ３リガンドで処置したヒトの血液中のまれな細胞集団（０．２％  ＰＢＭＣ）が、未刺激ＣＤ４＋およびＣＤ８＋アロ反応性Ｔ細胞をプライミング可能であることが同定されてきており、こうした特性は樹状細胞（ＤＣまたはＤＣ類）の機能特性の１つである。健康なヒト志願者に１０ｍｇ／ｋｇ／日のＦｌｔ３リガンド（ＦＬ）を１０日間、毎日皮下注射して、第Ｉ相臨床試験を行った。Ｆｌｔ３リガンドの注射は、循環ＣＤ１２３＋＋ｐＤＣ、ＣＤ１ｃ＋  ＤＣとともに単球の数も非常に増加させることが示された。この臨床研究の途上、血液樹状細胞抗原−３（ＢＤＣＡ３）を発現するＣＤ１６２＋＋細胞のまれな集団が同定された。ＢＤＣＡ３＋  ＤＣは、正常ドナーの総ＰＢＭＣの０．０６％に相当する。Ｆｌｔ３リガンド注射後、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣの頻度は、４〜８倍増加する。抗ＢＤＣＡ３抗体に認識される抗原の性質は未知であるが、ＩＬ−３刺激によって上方制御されるようであり、したがってＣＤ１５ｓ−ＣＤ１６２＋＋  ＤＣが、末梢血ＤＣのより「成熟した」型に相当しうるという概念がより強まった。
【０３２６】
図１に示すように、これらの細胞は、いくつかの骨髄特性を示し、そしてシアリル−ルイス−Ｘ（ＣＤ１５ｓ）を発現せず、そして明レベルのＣＤ１６２（ＰＳＧＬ１）を発現する点で同定された。シアリル−ルイス−Ｘは大部分の血液ＤＣ上に発現される複合糖類である。表面タンパク質上のシアリル−ルイス−Ｘ（ＣＤ１５ｓ）の存在は、血管内皮を通じたＤＣ遊出に役割を果たす。ＤＣ上にＣＤ１５ｓ発現がないことから、これらの細胞が、遊出を通じて、血流を離れることができないことが示唆される。これらの細胞のさらなる表現型性質決定によって、骨髄関連表現型（ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１３＋＋、ＣＤ３３暗）が明らかになった。興味深いことに、他の骨髄細胞と異なり、ＣＤ１５ｓ−ＣＤ１６２＋＋  血液ＤＣは、Ｆｃ受容体またはＣＤ１１ｂを発現しない。Ｆｃ受容体の発現は、成熟に際して下方調節され、そして抗原捕捉（未成熟）段階から抗原提示（成熟）段階への移行の印となる。したがって、ＣＤ１５ｓ−ＣＤ１６２＋＋  ＤＣは他の血液ＤＣサブセットより成熟している可能性もある。
【０３２７】
ＤＣ集団に特有の細胞表面分子を同定する試みの中で、ＤＣ集団をさらに性質決定するため、ファージディスプレイ全細胞パニングおよび全遺伝子プロファイリングを使用した。全遺伝子アレイ解析によって、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣが、マウスＣＤ８ａ＋  ＤＣのヒト対応物であるらしいことが明らかになった。図２に示すように、マウスＣＤ８ａ＋  ＤＣおよびヒトＢＤＣＡ３＋  ＤＣのどちらでも、いくつかの異なる遺伝子が優先的に発現されている。これらの遺伝子のうち、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣおよびマウスＣＤ８ａ＋  ＤＣのみがＬＤＣＡＭ（Ｉｇｓｆ４とも称される）を発現する。これらの結果は、ＢＤＣＡ３＋細胞がＩｇｓｆ４発現ＤＣとしてよりよく定義されることを示す。これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ネズミＣＤ８ａ＋  ＤＣのヒト対応物であるようであり、この集団は、抗原交差提示／交差寛容に関与するＤＣの特殊化集団である。交差提示／交差寛容は、多くの自己免疫疾患、炎症プロセスとともに移植における決定的な役割を果たす細胞機構である。ＢＤＣＡ３＋  ＤＣをターゲティングする（多様な型の抗体、ペプチボディ、可溶性タンパク質、例えばＬＤＣＡＭおよび／またはＣＲＴＡＭを用いて）ことは、多くの療法分野（上述のとおり）で重要である可能性もある。
【０３２８】
ＤＣ集団のアロ活性を決定するため、Ｆｌｔ３リガンドで処置した健康なヒト志願者の血液からＣＤ１６２＋＋およびＣＤ１４＋細胞を精製し、そして１０５の同種Ｔリンパ球の存在下で４日間培養した。トリチウム化チミジンを培養の最後の１６時間添加した。結果は３回の独立した実験の代表である（図３）。これらの結果は、ＬＤＣＡＭ陽性ＤＣが強力なアロ刺激剤であることを示す。
【０３２９】
（実施例１８）
ＬＤＣＡＭ特異的抗体（１Ｆ１２）
これらの研究は、全細胞パニング・ファージディスプレイアプローチを用いて、ＬＤＣＡＭ特異的ｓｃｆｖ結合ファージを単離したこと；結合特異性に大きな改変を加えずに、抗ＬＤＣＡＭ  ｓｃｆｖ発現ファージをｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質（本明細書において、交換可能に「マキシボディ」と称する）に変換するのに成功したこと；そして抗ＬＤＣＡＭ  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質を、免疫沈降、免疫組織化学および機能アッセイに用いるのに成功したことを示す。ｓｃｆｖファージライブラリーを用いて、ヒトＢＤＣＡ３＋血液樹状細胞を、全ＰＢＭＣの背景でターゲティングした。このパニングアプローチから回収したファージのあるものは、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣに特異的に結合した。簡潔には、Ｆｌｔ３リガンド処置した健康なヒト志願者由来のＰＢＭＣをファージおよび蛍光色素コンジュゲート化抗ファージ抗体で標識した。ｓｃｆｖ繊維状ファージを、Ｆｌｔ３リガンドで処置した健康な志願者由来のＰＢＭＣとインキュベーションした。徹底的に洗浄することによって、非結合ファージを除去した。ＰＢＭＣを抗ＢＤＣＡ３抗体で標識し、そしてフローサイトメトリーによって精製した。酸性ショックによって、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣの表面からファージを溶出させた。ＢＤＣＡ３＋  ＤＣ結合ファージを大腸菌中で増幅した。第一周期のＢＤＣＡ３＋  ＤＣ結合ファージを第二選択周期で用いた。
【０３３０】
１Ｆ１２は、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣに特異的に結合することが示された。次いで、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ１４およびＢＤＣＡ３に対する抗体を添加した。図４の結果は、ファージ１Ｆ１２（下列）がＢＤＣＡ３＋  ＤＣを特異的に標識することを示す。上列は、繊維状ファージを含まない、バックグラウンド標識を示す。１Ｆ１２は、全細胞パニング・ファージディスプレイアプローチから得たファージの４％の１つであり、交差種反応性、すなわちマウスおよびヒトに対して交差種反応性である。１Ｆ１２  ｓｃｆｖは、フローサイトメトリー、組織学および免疫沈降によって、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣに結合することが示されている。マウスにおいて、１Ｆ１２  ｓｃｆｖは、実施例１７に記載するように、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化に重要な役割を果たすと考えられる、脾臓ＤＣの別個のサブセット（ＣＤ８ａ＋  ＤＣ）に特異的に結合することが示されている。
【０３３１】
１つの特異的ｓｃｆｖ−ファージ（１Ｆ１２）をｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質に変換した。当該技術分野に周知の技術を用いて、ｓｃｆｖをヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合させることによった。ｓｃｆｖをｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質に変換しても、ｓｃｆｖ結合領域の特異性に不都合な影響は生じなかった（図５に示すとおり−１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＦＡＣＳ解析のためにビオチン化されていることに注目されたい）。可変重鎖領域の配列を配列番号１２に提供し、そして１Ｆ１２の可変軽鎖領域を配列番号１３に提供する。
【０３３２】
１Ｆ１２は、ＬＤＣＡＭ（当該技術分野において、Ｉｇｓｆ４、ＴＳＬＣ１、ＳｙｎＣＡＭおよびネクチン様２としても知られる）に特異的に結合することが示されてきている。ｓｃｆｖ−Ｆｃを哺乳動物発現ベクターに導入し、そしてＣＯＳ細胞中で産生した。１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃは骨髄由来マウスＤＣから１００ｋＤａ糖タンパク質を免疫沈降することが示された（図７を参照されたい）。１００ｋＤａタンパク質は、質量分析によって、ＬＤＣＡＭであることが確認された。
【０３３３】
実施例９に記載するＬＤＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質をドットブロット結合アッセイで用いて、１Ｆ１２−ＦｃがＬＤＣＡＭに特異的に結合することを明確に示した。簡潔には、ＬＤＣＡＭ−ＦｃまたはＲＡＮＫ−Ｆｃ（関連しないＦｃ対照）の１ｍｇ／ｍｌ溶液２μｌをニトロセルロースフィルター上にスポッティングし、そして乾燥させた。ミルク／ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングした後、以下の試薬を膜上にスポッティングした：１００ｎｇの抗ＢＤＣＡ３−ビオチンｍＡｂ、１００ｎｇの１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体または抗ヒトＩｇＧ−ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、メイン州バーハーバーのマウスＦａｂ’２抗ヒトＩｇＧ−ビオチン）。ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを添加した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）によって標識を明らかにした。図８に示すように、１Ｆ１２−ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体は組換えＬＤＣＡＭ−Ｆｃに特異的に結合したが、関連しないＲＡＮＫ−Ｆｃには結合しなかった。マウスおよびヒトＬＤＣＡＭはほぼ同一で、タンパク質レベルでは９８％の同一性を有しており、このことから１Ｆ１２抗体の交差種反応性が説明される。ＢＤＣＡ３に対するｍＡｂは、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃに有意には結合せず、したがって、ＢＤＣＡ３抗原がＬＤＣＡＭとは異なることが示唆される。
【０３３４】
これらの結果は、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体（または融合タンパク質）がＬＤＣＡＭに特異的に結合することを示す。
【０３３５】
（実施例１９）
ＬＤＣＡＭがＴ細胞活性化を阻害する
これらの研究は、ＬＤＣＡＭがＴ細胞活性化を阻害することを示す。マウス（Ｂｌｋ−６）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を、プレートに結合したＬＤＣＡＭ−ＦＣおよび以下のＴ細胞活性化刺激の１つに同時に曝露した：抗ＣＤ３  ｍＡｂ、ｃｏｎＡ、ＰＨＡ、またはｃｏｎＡ＋ＩＬ−２。Ｔ細胞活性化のマーカーである、Ｔ細胞によるＩＮＦ−ガンマ産生に関して、培養上清をアッセイした。簡潔には、Ｂ６Ｄ２Ｆ１から脾臓を採取し、すりつぶし、そして赤血球を溶解し、そして細胞を計数した。製造者が示唆するプロトコルにしたがって、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｈ抗ＣＤ８（カタログ番号１３０−０４９−４０１）および抗ＣＤ４（カタログ番号１３０−０４９−２０１）ＭＡＣＴＭビーズを用いて、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞を精製した。４８ウェルプレートを、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）または陰性対照Ｐ７．５  ＦＣ（５μｇ／ｍｌ）Ｆｃ分子いずれかで３７℃で２時間コーティングし、そして２回洗浄した。Ｆｃタンパク質を含有しないウェルもまた含んだ。適切なウェルを抗ＣＤ３  ｍＡｂで３７℃で２時間コーティングし、そして２回洗浄した。１ｍｌの培地（４０％ＩＭＤＭ＋４０％Ｃｌｉｃｋｓ＋１０％ウシ胎児血清＋ピルビン酸ナトリウム＋非必須アミノ酸＋２Ｍｅ＋ＰＳＧ）中、１．２５ｘ１０６／ｍｌで細胞をプレーティングした。マイトジェン：ｃｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（２００単位／ｍｌ）またはＰＨＡ（１％）を適切なウェルに添加した。第１日および第５日に上清を抜き取り、そして商業的ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＡキットを用いて、ＩＦＮ−ガンマに関してアッセイした。
【０３３６】
図９は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよびｃｏｎＡによる活性化に対して、ＬＤＣＡＭによってアネルギー化されたことを示す（それぞれ図９Ａおよび９Ｃ）。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆおよび９Ｈは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、それぞれ、抗ＣＤ３  ｍＡｂ、ｃｏｎＡ、ＰＨＡ、およびｃｏｎＡ＋ＩＬ−２による活性化に対して、ＬＤＣＡＭによってアネルギー化されたことを示す。これらの研究は、ＬＤＣＡＭが、接触依存性に、活性化Ｔ細胞表面上に発現される分子と相互作用して、多様な刺激によるＴ細胞の活性化を防止するかまたは弱めることを示す。これらの研究は、ＬＤＣＡＭが炎症経路の制御剤であることを示す。したがって、ＬＤＣＡＭは、Ｔ細胞の活性化を防止するため、そして自己免疫疾患、炎症、移植、癌、感染等におけるように、Ｔ細胞活性化を伴う疾患の治療のため、薬剤組成物としての療法適用を有する。さらに、上に定義するようなＬＤＣＡＭのアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書に記載する疾患を治療するための療法組成物であることも可能である。
【０３３７】
（実施例１９）
ＣＲＴＡＭはＬＤＣＡＭの同族体である
これらの研究は、ＣＲＴＡＭがＬＤＣＡＭの同族体または結合パートナーであることを示す。
ＦＡＣＳ解析によって、ＬＤＣＡＭ−ＦｃがＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合し、そしてより低い度合いでＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合し（ぞれぞれ、図１０Ｄおよび１０Ｃ）、一方、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体（すなわち抗ＬＤＣＡＭ抗体）はこれらに結合しないことが示された（図１０Ａおよび１０Ｂはアイソタイプ対照である）。さらなるＦＡＣＳ解析によって、抗ＣＤ３活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、高レベルでＬＤＣＡＭ−Ｆｃに結合し（図１１Ａ）、そして１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体には最低限しか結合しない（図１１Ｂ）ことが示される。対照的に、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃは、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃに最小限の結合を（図Ｃ）、そして１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質に高レベルの結合を示した（図１１Ｄ）。Ｆｌｔ３リガンドで処置したマウス由来のＣＤ８＋脾臓細胞は、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃおよび１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ両方に異質の結合を示した（それぞれ図１１Ｅおよび１１Ｆ）。総合すると、これらの研究は、ＬＤＣＡＭが活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に結合することを示す。対照的に、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質は、これらの細胞を標識できない。これらの結果は、別のＬＤＣＡＭ対構造または同族体が、活性化ＣＴＬの表面上に存在することを示す。
【０３３８】
ＬＤＣＡＭ対構造の細胞表面発現は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面上に、一時的に発現されるものであることが示された。ＦＡＣＳ解析によって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の同族体へのＬＤＣＡＭ−Ｆｃ結合の細胞表面発現は、およそ２４時間後に減少することが示された（図１２Ｃ、１２Ｆおよび１２Ｉ）。興味深いことに、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、活性化２４時間後に、ＬＤＣＡＭ同族体の細胞表面発現の強い増加を（図１２Ｄ）、そして活性化４８時間後および７２時間後に、細胞表面発現の漸進的な減少を示した（それぞれ図１２Ｇおよび１２Ｊ）。活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面上ＬＤＣＡＭの発現は、最小限であり、そして長期に渡って不変であった（図１２Ｂ、１２Ｅ、１２Ｈおよび１２Ｋ）。
【０３３９】
結合対を免疫沈降させ、そして単離されたバンドに対して質量分析解析を行うことによって、ＬＤＣＡＭの同族体がＣＲＴＡＭであることを決定した。１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−ＦｃおよびＬＤＣＡＭ−Ｆｃは、近いが異なる分子量のタンパク質を免疫沈降した。活性化マウスＣＴＬまたはマウス骨髄由来ＤＣを表面ビオチン化し、そして界面活性剤を用いて溶解した。細胞溶解物をプロテインＡビーズマトリックスであらかじめ清浄化した。１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃをマウス骨髄由来ＤＣ細胞溶解物に添加し、そしてＬＤＣＡＭ−Ｆｃを活性化ＣＴＬ細胞溶解物に添加し、次いでこれらを、各ターゲットの免疫沈降に用いた。プロテインＡビーズマトリックスを添加して、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃおよび１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ複合体を溶解物から抜き取った。図１３に示す還元ゲル上で、沈降したタンパク質の見かけのＭＷを比較した。図１３Ａは、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃによって活性化ＣＴＬから免疫沈降したバンドである。図１３Ｂは、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃによって骨髄由来ＤＣから免疫沈降したバンドである。脾臓ＣＤ８＋  ＤＣを用いて類似の結果を得た。
【０３４０】
図１３Ａのバンドを切り出し、そして質量分析によって解析した。これらの結果を以下に提示し、そしてＣＲＴＡＭがＬＤＣＡＭの同族体であることが確認される。
【０３４１】
【化１−１】
2007500132.tif 000013
【０３４２】
【化１−２】
2007500132.tif 000014
【０３４３】
ＥＬＩＳＡ形式で、図１４は、ＬＤＣＡＭがＣＲＴＡＭ−Ｆｃに特異的に結合するが、Ｎｅｃｌ１タンパク質またはＩｇＧ対照に結合しないことを示す。別個の実験セットにおいて、マウス胸腺腫細胞株ＥＬ４（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９）に、ヒトＬＤＣＡＭ（図１５Ａ）またはヒトＮｅｃｌ１（図１５Ｂ）をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。次いで、それぞれ１Ｆ１２マキシボディまたは抗Ｎｅｃｌ１モノクローナル抗体を用いた磁気細胞選別によって、形質導入細胞を濃縮した。濃縮した形質導入細胞を、ｈｕＣＲＴＡＭ−Ｆｃ（太線）、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ（細い線）または抗Ｎｅｃｌ１抗体（点線）で探査した。垂直線は、関連しないＦｃアイソタイプマッチ抗体で測定されるような、非特異的結合の限界点に相当する。
【０３４４】
ＣＲＴＡＭの架橋は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化マウスＣＤ８＋  Ｔリンパ球によるサイトカイン分泌（ＩＦＮγ）を下方制御することが示された（図１６）。標準的ＥＬＩＳＡプレートを、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および／またはＬＤＣＡＭ−Ｆｃタンパク質いずれかでコーティングする。標準法を用いて、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離し、そしてＩｇＧ１アイソタイプ対照または可溶性ＣＲＴＡＭ−Ｆｃいずれかの存在下でウェル（単数または複数）に添加した。プレートに結合したＬＤＣＡＭ−Ｆｃによって細胞が架橋された場合、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌には、劇的な減少が見られた。逆に、プレートに結合したＬＤＣＡＭ−Ｆｃおよび細胞上に発現されるＣＲＴＡＭ間の競合剤として、アッセイにＣＲＴＡＭ−Ｆｃを添加すると、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌の増加が見られた。これらの研究は、ＬＤＣＡＭ結合およびＣＲＴＡＭ架橋の生物学的結果が、Ｔ細胞活性化、増殖、および炎症誘発性サイトカイン放出を減少させることであることをさらに立証する。こうしたものとして、限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質またはＬＤＣＡＭの多量体化型とともに細胞表面上のＣＲＴＡＭを架橋することも可能な抗ＣＲＴＡＭ抗体などのＬＤＣＡＭアゴニストは、Ｔ細胞活性化、増殖、および炎症誘発性サイトカイン放出を減少させるのに有用であろう。
【０３４５】
これらの研究は、ＬＤＣＡＭが、接触依存性に、活性化Ｔ細胞の表面上に発現されるＣＲＴＡＭと相互作用することを示す。実施例１８に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ＬＤＣＡＭおよびＣＲＴＡＭの相互作用が、多様な刺激によるＴ細胞活性化を防止するかまたは弱めることを明らかに立証する。これらの研究は、ＬＤＣＡＭおよびその同族体ＣＲＴＡＭが、炎症経路に関与することを示す。したがって、ＬＤＣＡＭは、Ｔ細胞の活性化を防止するため、そして自己免疫疾患、炎症、移植、癌、感染等におけるように、Ｔ細胞活性化を伴う疾患の治療のため、薬剤組成物としての療法適用を有する。さらに、本明細書全体に定義するようなＬＤＣＡＭ／ＣＲＴＡＭ相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書に記載する疾患を治療するための療法組成物として療法価値を有することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０３４６】
【図１】図１は、マウスＣＤ８α＋樹状細胞のヒト対応物であり、交差提示および交差寛容の非常に重要な免疫調節抗原提示細胞である、ヒト樹状細胞の新規サブセットの表現型決定を示す。
【図２】図２は、マウスＣＤ８α＋樹状細胞およびヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞間で共有される遺伝子の表である。
【図３】図３は、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞が、強力なアロ刺激剤であることを示すグラフである。
【図４】図４は、ｓｃｆｖ発現ファージ１Ｆ１２が、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞に特異的に結合することを示す、一連のＦＡＣＳスキャンである。
【図５】図５は、ｓｃｆｖファージからｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質への変換後、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質（「マキシボディ」）が、ＬＤＣＡＭへの全体的な特異性を保持したことを例示するＦＡＣＳスキャンである。
【図６】図６は、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ（抗ＬＤＣＡＭ  ｓｃｆｖ）の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図７】図７は、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃが、骨髄由来マウス樹状細胞から、１００ｋＤａ糖タンパク質を免疫沈降したことを示す免疫沈降ゲルの画像であり、該タンパク質は、続いて、質量分析によって、ＬＤＣＡＭであることが示された。
【図８】図８は、１Ｆ１２−ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体が、組換えＬＤＣＡＭ−Ｆｃに特異的に結合するが、関連しないＲＡＮＫ−Ｆｃには結合しないことを示す、イムノドットブロットである。これらの結果は、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質がＬＤＣＡＭに特異的に結合することを示す。
【図９】図９は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＬＤＣＡＭによって、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよびｃｏｎＡによる活性化に対してアネルギー化されたことを示す（それぞれ図９Ａおよび９Ｃ）。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆおよび９Ｈは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＬＤＣＡＭによって、それぞれ、抗ＣＤ３  ｍＡｂ、ｃｏｎＡ、ＰＨＡおよびｃｏｎＡ＋ＩＬ−２による活性化に対してアネルギー化されたことを示す。これらの研究は、ＬＤＣＡＭが、接触依存性に、活性化Ｔ細胞表面上に発現される分子と相互作用し、多様な刺激によるＴ細胞の活性化を防止するかまたは弱めることを示す。これらの研究は、ＬＤＣＡＭが炎症経路における制御剤であることを示す。
【図１０】図１０は、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に、そしてより低い度合いでＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合する（それぞれ、図１０Ｄおよび１０Ｃ）一方、１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体（すなわち抗ＬＤＣＡＭ抗体）が結合しないことを示す一連のＦＡＣＳスキャンである（図１０Ａおよび１０Ｂはアイソタイプ対照である）。これらの研究は、ＬＤＣＡＭが、接触依存性に、活性化Ｔ細胞表面上に発現される分子と相互作用し、多様な刺激によるＴ細胞の活性化を防止するかまたは弱めることを示す。これらの研究は、ＬＤＣＡＭが炎症経路における制御剤であることを示す。
【図１１】図１１は、抗ＣＤ３活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、高レベルでＬＤＣＡＭ−Ｆｃに結合し（図１１Ａ）、そして１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ抗体には最低限にしか結合しない（図１１Ｂ）ことを示す、一連のＦＡＣＳスキャンである。対照的に、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃは、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃに最低限の結合を示し（図Ｃ）、そして１Ｆ１２  ｓｃＦｃ融合タンパク質には高い結合を示した（図１１Ｄ）。Ｆｌｔ３リガンドで処置したマウス由来のＣＤ８＋脾臓細胞は、ＬＤＣＡＭ−Ｆｃおよび１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃ両方に異質の結合を示した（それぞれ、図１１Ｅおよび１１Ｆ）。
【図１２】図１２は、ＬＤＣＡＭ対構造（ＣＲＴＡＭ）の細胞表面発現が、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面に一時的に発現されるものであることを示す、一連のＦＡＣＳスキャンである。ＦＡＣＳ解析は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の同族体への細胞表面発現ＬＤＣＡＭ−Ｆｃ結合が、およそ２４時間後に減少することを示した（図１２Ｃ、１２Ｆおよび１２Ｉ）。興味深いことに、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、活性化２４時間後、ＣＲＴＡＭの細胞表面発現の強い増加を示し（図１２Ｄ）、そして活性化４８時間後および７２時間後に細胞表面発現の漸進的な減少を示した（それぞれ図１２Ｇおよび１２Ｊ）。活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面上のＬＤＣＡＭの発現は、最小限であり、そして長期に渡って不変であった（図１２Ｂ、１２Ｅ、１２Ｈおよび１２Ｋ）。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、免疫沈降由来のゲルである。図１３Ａは、活性化ＣＴＬからＬＤＣＡＭ−Ｆｃによって免疫沈降したバンドである。図１３Ｂは、骨髄由来ＤＣから１Ｆ１２  ｓｃｆｖ−Ｆｃによって免疫沈降したバンドである。脾臓ＣＤ８＋  ＤＣで同様の結果が得られた。図１３Ａ由来のバンドを切り出し、そして質量分析によって解析して、ＣＲＴＡＭがＬＤＣＡＭの同族体であることを確証した。
【図１４】図１４は、ＬＤＣＡＭがＣＲＴＡＭに特異的に結合することを立証するＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。
【図１５】図１５は、レンチウイルスベクターを形質導入されたＥＬ４細胞が、細胞表面上にＬＤＣＡＭ（図１５Ａ）またはＮｅｃｌ１（図１５Ｂ）を発現することを例示するＦＡＣＳアッセイを示す。形質導入細胞を可溶性組換えヒトＣＲＴＡＭ−Ｆｃに曝露した。図１５Ａは、ＣＲＴＡＭ−Ｆｃが、ＬＤＣＡＭを発現するように形質導入された細胞に結合する（太線）が、Ｎｅｃｌ１を発現するように形質導入された細胞には結合しないことを示す（図１５Ｂ）。
【図１６】図１６は、ＣＲＴＡＭとＬＤＣＡＭ−Ｆｃの架橋が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化マウスＣＤ８＋  Ｔリンパ球によるサイトカイン分泌（ＩＦＮγ）を下方制御することを立証する。
【図１７】図１７は、ＣＲＴＡＭが、より高い度合いで、マクロファージ、ＢＤＣＡ３＋  ＤＣ、マスト細胞、活性多発性硬化症白質病巣、活性化ＮＫ細胞、混合白血球、およびＴ細胞で発現されることを示す、示差発現データである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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