(57)【要約】Toll様受容体2（TLR2）は、特に新生児において、HSV感染の一定の効果を媒介することが見いだされた。TLR2発現または活性を減少させる化合物は、このような有害作用を寛解させるために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TLR2発現または活性を阻害することが公知である候補化合物を得る工程；
候補化合物を、HSVに感染した細胞に投与する工程；および、
候補化合物が細胞におけるHSV感染の少なくとも1つの指標を阻害するかどうかを決定する工程、
を含む、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染の治療のために候補治療化合物を同定する方法であって、
細胞におけるHSV感染の指標を阻害する試験化合物は、HSV感染の治療のための候補治療化合物である、方法。
【請求項２】
HSVがHSV-1またはHSV-2である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
HSV感染の指標が、転写因子活性化、ケモカイン分泌、またはサイトカイン分泌からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
転写因子が核因子-κB（NF-κB）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ケモカインまたはサイトカインが、IL-1、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子（TNF）、単球化学誘引物質タンパク質-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1：MCP-1）、またはマクロファージ炎症タンパク質（Macrophage Inflammatory Protein-1：MIP-1）の1つまたは複数である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
細胞が、生きている哺乳動物内にある、請求項1記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
症候が脳症の症候である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
脳症の症候が、倦怠感、発熱、頭痛、悪心、無気力、混乱、譫妄、発作、失語症、脳神経欠損、および半側不全麻痺からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物が新生児であり、かつ症候がTORCH症候群の症候である、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
症候が、発熱、摂食障害（difficulties feeding）、肝脾腫大、皮膚徴候（cutaneous manifestation）、難聴（hearing impairment）、および眼の異常からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
皮膚徴候が、点状出血、紫斑病、黄疸、および経皮赤血球新生（dermal erythropoiesis）からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
症候が、角膜、皮膚、または粘膜上の疱疹、そう痒、灼熱感、うずき（soreness）、皮膚潰瘍、鼠径部におけるリンパ節の拡大および/または痛み、かすみ目、頭痛、発熱、排尿の間の灼熱感、および一般的な倦怠感からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
細胞が哺乳動物の試験集団にあり、および哺乳動物におけるHSV感染の指標は、脳症またはトキソプラスマ症、その他の感染、風疹、サイトメガロウイルス、およびヘルペス（TORCH）症候群の少なくとも1つの症候であり、哺乳動物の対照集団と比較した哺乳動物の集団における症候の重篤度の減少によって、化合物がHSV感染を治療するための候補化合物であることが示される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
候補化合物がTLR2アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
候補化合物がTLR2ドミナントネガティブポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
候補化合物がTLR2細胞外結合ドメインである、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
候補化合物がTLR2に特異的に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
候補化合物が抗TLR2抗体またはその抗原結合性断片である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
TLR2発現または活性を阻害することが公知である候補化合物を得る工程が、
TLR2を含む試料を得る工程；
試料を試験化合物と接触させる工程；
試料におけるTLR2の発現または活性を評価する工程；および、
試料においてTLR2発現または活性を阻害する試験化合物を選択する工程、
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
試験化合物が核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプトイド、抗体、非ペプチドオリゴマー、および小分子からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
HSV感染のための治療を必要とする対象を同定する工程と、TLR2発現または活性を減少させる化合物の治療上有効な量を対象に投与する工程とを含み、これにより対象におけるHSV感染を治療する、対象における単純ヘルペスウイルス（HSV）感染を治療するための方法。
【請求項２５】
対象が哺乳動物である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
対象がヒトである、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
対象が新生児である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
対象が脳症の少なくとも1つの症候を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
対象が子供または成体である、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
化合物がTLR2アンチセンス核酸または低分子干渉RNA（siRNA）である、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
化合物がTLR2ドミナントネガティブポリペプチドを含む、請求項24記載の方法。
【請求項３２】
化合物がTLR2細胞外ドメインを含む、請求項24記載の方法。
【請求項３３】
試験化合物がTLR2に特異的に結合することができる、請求項24記載の方法。
【請求項３４】
化合物が抗TLR2抗体またはこれらの抗原結合性断片である、請求項24記載の方法。
【請求項３５】
HSVがHSV-1またはHSV-2である、請求項24記載の方法。
【請求項３６】
HSV感染の治療的および/または予防的処置のための医薬物の製造における、TLR2活性または発現を阻害する化合物の使用。
【請求項３７】
HSV感染の治療的および/または予防的処置に使用するための、TLR2活性または発現を阻害する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ウイルス感染を治療するための方法および化合物に関する。
【０００２】
優先権の主張
本出願は、35 USC§119（e）下で2004年1月22日に出願の米国特許出願第第60/538,324号（その全ての内容が、参照として本明細書に組み入れられる）に対する優先権を主張する。
【０００３】
連邦政府によって後援された研究または開発
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された助成金番号R01 AI49309、R01 AI51415、PO1 NS35138、RO1 GM63244、およびRO1AI39576下において、政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
単純ヘルペスウイルス１（HSV-1）は、世界中のヒト集団の大部分において、終生の感染および周期的疾患を生じさせる（たとえば、Corey, Herpes Simplex Viruses, in Braunwald et al., Eds., Harrison's Principles of Internal Medicine.15th ed. New York： McGraw Hill, 2001, Chap. 182, pp. 1100-1106（非特許文献1）；およびWhitley et al., N. Engl. J. Med., 324： 450-4 （1991）（非特許文献2）を参照されたい）。ヘルペス群ウイルス（HSV、VZV、およびCMVを含む）は、通常、成体および年上の子供に限られた疾患を引き起こすだけであった。
【０００５】
ヒトでは、HSV-1は、通常幼児期に獲得され、限定された過程を経る咽頭炎として存在することが多い。HSV-1感染の再活性化は、時に「口辺ヘルペス」または「熱性疱疹」と呼ばれる口周囲病変と関連している。しかし、HSV（HSV-1またはHSV-2）感染がある新生児（多くの場合1週齢未満にて）では、「敗血症様」の症候群と共に存在する可能性があり、まれではあるものの、破壊的であり得るし、血圧不安定性、ショック、発熱、黄疸、肝脾腫大、および播種性血管内血液凝固の発症、深刻なTORCH感染で一般に見られることが多い症候（トキソプラスマ症、その他の感染、風疹、サイトメガロウイルス、およびヘルペス）（同上）、並びに致死的脳炎（Whitely, 2001, in Fields' Virology, Knipe, ed., Chapter 73, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA（非特許文献3）； Whitley et al., N. Engl. J. Med. 324： 450-454 （1991）（非特許文献4））によって特徴づけられることが多い。単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）は、新生児脳炎の主要な原因である。腫瘍感染経路は、母体産道を介するが、まれに、血液原性経胎盤性子宮内感染が生じ得る。CNSは、約30%の感染乳児に含まれる。感染により、発作、小頭症、小眼球症、脳室拡大、多嚢胞性脳軟化症、および死を生じ得る。病理検査では、急性および慢性の、実質並びに軟髄膜炎症を示す。成体で見られる側頭/前頭側偏向とは対照的に、HSV新生児感染は、びまん性であり、したがって、広範囲にわたって脳破壊を生じ得る。
【０００６】
また、単純ヘルペス1（HSV-1）は、ヒトにおける散発性（非流行性）脳炎で最も一般に診断される原因である。早期治療をしないと、HSV-1脳炎は、破壊的な疾患であり、典型的には致命的である。生存者の中には、一般に深刻な後遺欠陥が見られる。HSVは、免疫無防備状態の宿主において播種感染、肺炎、および肝炎を含む種々の疾病を生じさせるが、脳炎は、正常免疫応答患者においても一般に見られる。
【０００７】
【非特許文献１】Corey, Herpes Simplex Viruses, in Braunwald et al., Eds., Harrison's Principles of Internal Medicine.15th ed. New York： McGraw Hill, 2001, Chap. 182, pp. 1100-1106
【非特許文献２】Whitley et al., N. Engl. J. Med., 324： 450-4 （1991）
【非特許文献３】Whitely, 2001, in Fields' Virology, Knipe, ed., Chapter 73, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA
【非特許文献４】Whitley et al., N. Engl. J. Med. 324： 450-454 （1991）
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、一部において、Toll様受容体2（TLR2）が単純ヘルペスウイルス（HSV）-1およびHSV-2に対する炎症性サイトカイン反応を媒介すること、およびTLR2発現がHSV-1感染によって生じる致死的ウイルス性脳炎と関連するという知見に基づいている。さらに、本発明は、一部において、新生児のHSVで誘導される敗血症がTLR2活性化に関連があるという知見に基づいている。したがって、本発明は、HSV感染に関連する障害の治療のための化合物、このような化合物を同定するための方法、およびこのような化合物を使用するための方法を含む。
【０００９】
したがって、本発明は、HSV（たとえば、HSV-1またはHSV-2）感染を治療するための候補化合物を同定する方法に関する。本方法は、TLR2発現または活性を阻害する試験化合物を同定する工程、試験化合物をHSVに感染した細胞に投与する工程、および化合物が細胞におけるHSV感染の少なくとも1つの指標を阻害するかどうかを決定する工程を含み、その結果、細胞におけるHSV感染を阻害する化合物が、HSV感染を治療するための候補化合物である。
【００１０】
したがって、本発明は、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染の治療のための候補治療化合物を同定するための方法を含む。本方法は、TLR2発現または活性を阻害することが公知である候補化合物を得る工程；HSV、たとえばHSV-1またはHSV-2に感染した細胞、たとえばヒトまたはマウス細胞などの哺乳動物細胞に候補化合物を投与する工程；および候補化合物が細胞におけるHSV感染の少なくとも1つの指標、たとえば転写因子活性化（たとえば、核因子-κB（NF-κB））、ケモカイン分泌、またはサイトカイン分泌（たとえば、IL-1、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子（TNF）、単球化学誘引物質タンパク質-1（MCP-1）、マクロファージ炎症タンパク質-1（MIP-1）の1つまたは複数）を阻害するかどうかを決定する工程を含む。細胞におけるHSV感染の指標を阻害する試験化合物は、HSV感染の治療のための候補治療化合物である。
【００１１】
一部の態様において、細胞は、生きている哺乳動物、たとえばマウスまたはヒトにあり、本方法は、候補化合物を哺乳動物に投与することによって実施される。
【００１２】
一部の態様において、症候は、脳症の症候、たとえば倦怠感、発熱、頭痛、悪心、無気力、混乱、譫妄、発作、失語症、脳神経欠損、および半側不全麻痺の1つまたは複数である。
【００１３】
一部の態様において、哺乳動物は新生児であり、症候は、TORCH症候群の症候、たとえば発熱、摂食障害（difficulties feeding）、肝脾腫大、皮膚徴候（cutaneous manifestation）（たとえば、点状出血、紫斑病、黄疸、および経皮赤血球新生（dermal erythropoiesis））、難聴（hearing impairment）、および眼の異常である。
【００１４】
一部の態様において症候は、角膜、皮膚、または粘膜上の疱疹、そう痒、灼熱感、うずき（soreness）、皮膚潰瘍、鼠径部におけるリンパ節の拡大および/または痛み、かすみ目、頭痛、発熱、排尿の間の灼熱感、および一般的倦怠感からなる群より選択される。
【００１５】
一部の態様において、細胞は、哺乳動物の試験集団にあり（たとえば、本方法は、試験集団において実施される）、哺乳動物におけるHSV感染の指標は、脳症またはTORCH症候群の少なくとも1つの症候であり、哺乳動物の対照集団と比較した哺乳動物の集団における症候の重篤度の減少により、化合物がHSV感染を治療するための候補化合物であることが示される。
【００１６】
一部の態様において、候補化合物は、TLR2アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）、TLR2ドミナントネガティブポリペプチド、TLR2細胞外結合ドメイン、または抗TLR2抗体もしくはこれらの抗原結合性断片である。一部の態様において、候補化合物は、TLR2に結特異的に合する。
【００１７】
一部の態様において、TLR2発現または活性を阻害することが公知である候補化合物を得る工程は、TLR2を含む試料を得る工程；試料を試験化合物と接触させる工程；試料におけるTLR2の発現または活性を評価する工程；および、試料においてTLR2発現または活性を阻害する試験化合物を選択する工程を含む。試験化合物は、たとえば、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプトイド、抗体、非ペプチドオリゴマー、および小分子あることができる。
【００１８】
もう一つの局面において、本発明は、HSV感染のための治療を必要とする対象を同定する工程、およびTLR2発現または活性を減少させる化合物の治療上有効な量を対象に投与する工程により、これにより対象におけるHSV感染を治療する、単純ヘルペスウイルス（HSV、たとえばHSV-1またはHSV-2）感染を治療するための方法を含む。
【００１９】
一部の態様において、対象は、哺乳動物、たとえばヒト、たとえば新生児、子供、または成体である。一部の態様において、対象は、脳症の少なくとも1つの症候を有する。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、細胞、たとえば哺乳動物、たとえばヒトの細胞における単純ヘルペスウイルス（HSV）感染を阻害または治療するための方法を特徴とする。本方法は、HSV感染に感受性である細胞またはHSVに感染した、たとえばHSV-1またはHSV-2に感染した細胞を同定する工程；および細胞をTLR-2発現または活性を阻害することができる候補化合物と、TLR-2活性を阻害するために十分な量および時間接触させる工程とを含み、これにより細胞におけるHSV感染を阻害または治療する。
【００２１】
本明細書に記述した方法に使用するために適した細胞は、たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒトまたはマウス細胞）あることができる。細胞は、培養内に、または生き動物（たとえば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物）内にあることができる。一部の態様において、細胞は、生きている哺乳動物にあり、HSV-1感染の徴候は、脳症の少なくとも1つの症候である。一部の態様において、細胞は、新生児哺乳動物にあり、HSV感染の指標は、TORCH感染の少なくとも1つの症候、たとえば血圧不安定性、ショック、発熱、黄疸、肝脾腫大、および播種性血管内血液凝固の発症の1つまたは複数である。
【００２２】
また、本方法は、哺乳動物の試験集団において実施することができる。このような方法において、哺乳動物におけるHSV感染の指標は、脳症またはTORCH感染の少なくとも1つの症候であり、その結果、哺乳動物の対照集団と比較した哺乳動物の集団における症候の重篤度の減少により、化合物がHSV感染を治療するための候補化合物であることが示される。
【００２３】
本明細書に記述した方法に使用するための適切な化合物は、たとえばTLR2アンチセンス核酸、低分子干渉RNA（siRNA）、またはTLR2ドミナントネガティブポリペプチド（たとえば、変異した全長TLR2、または断片、たとえばTLR2細胞外結合ドメイン）であることができる。化合物は、TLR2ポリペプチドと特異的に結合することができる（たとえば、抗TLR2抗体またはこれらのTLR2結合断片）。
【００２４】
また、本発明は、細胞におけるHSV感染を阻害または治療する方法にも関する。本方法は、細胞、たとえばHSV感染に感受性である細胞またはHSVに感染した細胞を提供する工程、および細胞をTLR-2発現または活性を阻害することができる候補化合物と、TLR-2活性を阻害するために十分な量および時間接触させる工程とを含み、これにより細胞におけるHSV感染を阻害または治療する。HSVは、たとえばHSV-1またはHSV-2であることができる。細胞は、生きている哺乳動物（たとえば、マウスまたはヒト）にあることができる。ある態様において、哺乳動物は、新生児、子供、または成体である。
【００２５】
本明細書に記述した方法によってスクリーニングされ、細胞におけるHSV感染を阻害する際に有用であることが決定された試験化合物は、候補化合物であるとみなすことができる。たとえば、HSV感染のインビボのモデルにおいて、たとえばHSV-TORCH症候群または脳炎のモデルにおいてスクリーニングされ、および障害に対して、たとえば障害の症候の1つまたは複数に対して望ましい効果を有することが決定された候補化合物は、候補治療薬とみなすことができる。一旦臨床的状況でスクリーニングされた候補治療薬は、治療薬として使用される。候補治療薬および治療薬は、任意に最適化および/または誘導体化させて、生理的に許容される賦形剤と共に処方して薬学的組成物を形成させることができる。
【００２６】
もう一つの局面において、本発明は、対象におけるHSV感染を治療する方法に関する。本方法は、HSV感染（たとえば、HSV-1またはHSV-2感染）の治療を必要とする対象（たとえば、新生児、子供、または成体）を同定する工程、およびTLR2発現または活性を減少させる化合物の治療上有効な量を対象に投与する工程を含み、これにより対象におけるHSV感染を治療する。対象は、新生児、子供、または成体の哺乳動物（たとえば、マウスまたはヒト）であることができる。対象は、本明細書に記述したような脳症またはTORCH感染の少なくとも1つの症候を有していてもよい。
【００２７】
本明細書に使用されるTORCH症候群は、任意の感染因子群、たとえばトキソプラスマ症、その他の感染、風疹、サイトメガロウイルス、またはヘルペスによる、発達中の胎児または新生児の感染をいう。本明細書に使用される「その他の感染」は、梅毒、B型肝炎、コクサッキーウイルス、EBウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびヒトパルボウイルスを含むことができる。
【００２８】
「HSV」感染は、HSV-1またはHSV-2の一方または両方による感染を含む。本明細書に使用される「HSV感染（たとえば、HSV-1および/またはHSV-2感染）を治療する」には、HSV感染の副作用、たとえば本明細書に記述したような、たとえば脳炎および/または新生児におけるTORCH感染の敗血症様症候などの中枢神経系に対する作用を寛解させることを含むことができる。したがって、本明細書に記述した治療は、（たとえば、新生児、子供、および成体において）HSV感染の効果を減少させるために使用される。
【００２９】
「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後の修飾を問わず、アミノ酸の鎖を意味する。本明細書に使用される「TLR2」という用語は、TLR2ポリペプチドを意味する。たとえば、TLR2ポリペプチドは、全長TLR2タンパク質であることができる（たとえば、Genbankアクセッション番号NP003255（遺伝子NM_003264；ヒトTLR2）、またはAAH14693（遺伝子NM_011905；マウスTLR2）。「ドミナントネガティブ」TLR2は、機能的TLR2と同時発現されたときに、機能的TLR2の活性を有意に減少させるTLR2変種ポリペプチドである。
【００３０】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質またはその他の混在タンパク質が実質的にないか、または化学的に合成したときに、化学的前駆体またはその他の化学物質が実質的にない。一つの態様において、「実質的にない」という専門用語は、約30%未満（乾燥重量による）、たとえば約20%、10%、または5%のその他のポリペプチドまたは化学的前駆体もしくは化学物質（また、本明細書において「混在タンパク質」とも称する）を有するポリペプチド標品を意味する。ポリペプチドまたはこれらの生物学的に活性な部分が、組換えで産生されるときは、これは、一般に培地が実質的になく、すなわち、培地がタンパク質製剤の体積の約20%未満、たとえば約10%または5%未満を表す。
【００３１】
本明細書に使用される、TLR2の「生物学的に活性な部分」は、天然に存在するTLR2の少なくとも1つの生物活性を有するTLR2タンパク質の断片を含み、たとえば断片は、TLR2分子とTLR2の天然に存在する結合パートナー（リガンド）分子との間の相互作用に関与することができ、転写因子（たとえば、核因子-κB（NF-κB））を活性化することができ、および/またはケモカイン分泌またはサイトカイン分泌（たとえば、IL-1、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子（TNF）、単球化学誘引物質タンパク質-1（MCP-1）、および/またはマクロファージ炎症タンパク質-1（MIP-1）の1つまたは複数の分泌）を誘導し、または増大することができる。TLR2タンパク質の生物学的に活性な部分は、TLR2タンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同的か、または由来するアミノ酸配列を含む（これは、全長TLR2タンパク質よりも短いアミノ酸を含み、およびTLR2タンパク質の少なくとも1つの活性（たとえば、TLR2リガンド、たとえばHSVに対する結合）を示す）ポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、TLR2タンパク質の少なくとも1つの活性をもつドメイン（たとえば、細胞外ドメイン）またはモチーフ、たとえばザイモサンなどのTLR2リガンドに対して結合することができるドメインまたはモチーフを含む。TLR2タンパク質の生物学的に活性な部分は、たとえば、長さが10アミノ酸以上、たとえば約25、50、100、200、またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであることができる。TLR2タンパク質の生物学的に活性な部分は、TLR2を媒介した活性、たとえば新生児におけるHSV-1感染の有害作用を減少させることなどの本明細書に記述した生物活性を調整する薬剤を開発するための標的として使用することができる。
【００３２】
TLR2およびこれらの断片、並びにTLR2配列の誘導体およびその他の変異体は、ひとまとめにして「TLR2ポリペプチド」と称する。このようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子は、ひとまとめにして「TLR2核酸」と称する。「TLR2」分子は、TLR2核酸、ポリペプチド、およびTLR2抗体（TLR2と特異的に結合する抗体）をいう。
【００３３】
本明細書に使用される「核酸分子」という用語は、DNA分子（たとえば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（たとえば、mRNA）、およびたとえばヌクレオチド類似体の使用によって作製されるDNAまたはRNAの類似体を含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることができる。
【００３４】
「単離された核酸分子および精製された核酸分子」という用語は、核酸の天然の供与源に存在するその他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。一般に、このような配列は、隣接する遺伝子から分離されている。核酸分子が合成供与源に由来するときは、このような分子は、配列に関して実質的に均一な標品のものある。実質的に均一な標品は、10%未満、たとえば5%未満または1%未満の混入する配列を有する。
【００３５】
第二の分子と特異的に結合する分子は、第二の分子と結合するが、実質的に試料中のその他の分子、たとえば第二の分子を天然に含む生体試料に対して結合しないものである。たとえば、TLR2と特異的に結合する分子は、TLR2と結合するが、TLR2を含む試料、たとえば生体試料中のその他の分子を実質的に結合しないが分子である。
【００３６】
本明細書に使用される「対象」とは、哺乳動物、たとえばヒト、または実験動物もしくは疾患モデルをいう。対象は、ヒト以外の動物、たとえばマウス、ラット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはその他の家畜であることができる。
【００３７】
「新生児」は、ほぼ1月齢未満である対象である。たとえば、ヒト新生児は、出生後約28日以下である。早期に出産された乳児の場合、乳児は、その予測される出生日から28日以下の新生児である。一部の態様において、新生児は、1週齢未満である。新生児マウスは、3週齢まで、および3週齢を含む。一般に、新生児期間の間にHSV（たとえば、HSV-1またはHSV-2）に感染した対象は、新生児期の間に、新生児のHSV感染の少なくとも1つの症候を示す。したがって、HSVに感染した新生児の治療、または（たとえば、本明細書に記述した方法における）使用は、新生児が新生児期の間にHSVに感染したが、新生児期を越えて新生児の治療または使用を延長してもよい。
【００３８】
本明細書に使用される「治療的に有効な」量または用量は、HSV感染の少なくとも1つの症候の回復を生じさせるために十分な化合物の量をいう。このような症候は、本明細書に記述されており、当技術分野において公知である（たとえば、Berkow et al., The Merck Manual, Merck Research Laboratories, Rahway, N. J., 1992を参照されたい）。
【００３９】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的な用語は、一般に本発明が属する当業者によって当技術分野において理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明に使用するために本明細書に記述してあり；その他の当技術分野において公知の適切な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、例証であり、限定することは企図されない。本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、これらの全体が参照として組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本願明細書が統制する。
【００４０】
本発明のその他の特徴および効果は、以下の詳細な説明および図から、並びに請求の範囲から明らかであろう。
【００４１】
詳細な記載
本明細書において、TLR2がHSV-1に対する炎症性サイトカイン応答を媒介すること、および新生児および成体におけるHSV感染と関連する重篤な症候の原因となることを証明する。マクロファージでの機能喪失研究により、HSV-1暴露後の炎症性サイトカイン産生におけるTLR2の必須な役割を証明し、一方で、機能獲得研究により、HEK293細胞におけるTLR2の発現がHSV-1への応答性を与えるのに十分であったことを証明した。HSV-1で誘導される炎症反応におけるTLR2の役割と一致して、HSV-1での感染は、血清中において、および脳内の両方において、野生型またはTLR4-/-マウスと比較してTLR2-/-マウスにおいて鈍いサイトカイン応答を誘導した。この減弱されたサイトカイン応答は、野生型およびTLR4-/-マウスと比較して、TLR2-/-マウスにおける脳炎の症候の減少と平行した。
【００４２】
HSV-1に感染したTLR2-/-新生児マウスは、軽度の症候を発病し、死亡率は、21日の期間を通し40%未満であった。対照的に、野生型およびTLR4-/-新生児は、迅速にHSV-1感染に屈し、6日までに90%＞死亡率であった。したがって、驚くべきことに、本明細書に提供したデータは、HSV-1に対するTLR2を媒介したサイトカイン応答が、保護的ではなく、むしろ、宿主に対して、特に脳内で有害であることを証明する。
【００４３】
新生児動物（およびヒト）と成体のHSV感染に対する応答との間の大きな矛盾の理由は、以前には確立されていなかった。本明細書に提供したデータは、新生児の感受性がTLR2依存的であることを証明する。新生児における感染に関連した不十分な結果は、未成熟な免疫系ではウイルスを抑制することができないためであることが示唆された。本明細書に開示した知見は、成体よりも応答性がないのではなく、むしろウイルス抗原に対する新生児応答（生得的免疫応答により、TLR2を介する）は、成体で見られるものよりも強力であることを証明する。
【００４４】
TLR2欠損マウスは、野生型マウスよりもHSV-1暴露で死亡する可能性が高くないという驚くべき知見は、新生児動物が、あまりウイルスを抑制することができないのではなく、むしろ少なくとも部分的には、これらがウイルス抗原に対して過剰なサイトカイン応答を生じるために死亡することを証明する。したがって、生得的免疫応答（たとえば、TLR2シグナリングによって媒介される生得的免疫応答）を低下する薬物またはその他の療法により、HSVによって生じる罹患率および死亡率（たとえば、新生児、子供、および成体におけるHSV-1またはHSV-2感染）を低下させる。
【００４５】
したがって、本明細書に記述した新たな方法は、脳炎などの中枢神経系の感染における副作用および新生児におけるTORCH症候群の症候を含むHSV感染（たとえば、HSV-1およびHSV-2感染）を治療するために有用である化合物の同定に関する。したがって、本方法は、TLR2発現または活性を（たとえば、TLR2に結合することによって）減少させかつHSV感染の効果を（たとえば、新生児、子供、および成体において）減少させる、両方の化合物を同定することに関する。このような方法を使用して同定される化合物は、HSV感染のリスクがある対象またはHSVに感染した対象を治療するために有用である。
【００４６】
スクリーニングアッセイ法
部分的には、新たな方法には、HSV感染の治療に使用するためのTLR2を媒介したシグナリングを減少させる化合物の同定のためのスクリーニングアッセイ法を含む。このような化合物は、当技術分野において利用可能な情報から、またはTLR2シグナリング、特に、たとえば新生児におけるHSV感染と関連するTLR2シグナリングを阻害するモジュレーター、すなわち試験化合物もしくは薬剤（たとえば、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態、ペプトイド、無機小分子、非核酸有機小分子、核酸（たとえば、アンチセンス核酸、siRNA、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド）もしくはその他の薬物）を同定するための検査方法を使用して同定することができる。たとえば、このような化合物は、TLR2ポリペプチドと結合してもよく、たとえばTLR2の発現または活性を阻害することによって、TLR2シグナリングと関連するHSV感染の指標に対して阻害作用を有していてもよい。したがって、同定された化合物は、治療プロトコルにおいて、たとえば新生児のHSV-1感染の効果を調整するために使用することができる。また、このような化合物は、TLR2の生物学的機能を同化するためにも有用である。
【００４７】
一部の場合において、アッセイ法には、TLR2発現または活性を阻害する化合物を同定する工程、および化合物が細胞における、または対象におけるHSV感染の望ましくない効果の1つまたは複数を減少させることができるかどうかを決定する工程を含む。TLR2の発現または活性を阻害する化合物を同定する方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記述されている。また、TLR2の発現または活性を阻害できることが以前に同定された化合物を一定の方法に使用することができる。
【００４８】
一部の場合において、TLR2発現または活性の阻害剤を同定するためのアッセイ法は、TLR2タンパク質またはこれらの生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させて、試験化合物がTLR2活性を調整する能力を決定するという細胞に基づいたアッセイ法である。試験化合物がTLR2活性を調整する能力を決定する工程は、たとえば、IL-6活性をモニタリングすることによって達成することができる。細胞は、たとえば哺乳動物起源、たとえばマウスまたはヒトであることができる。一般に、有用な細胞型は、HSV（たとえば、HSV-1またはHSV-2）に感染し得るのである。
【００４９】
また、試験化合物がTLR2リガンドに対するTLR2結合を調整するか、またはTLR2と結合する能力を評価することもできる。LTA（リポテイコ酸）、ザイモサン、ペプチドグリカン、ara-リポラビノマンナン、およびヒトサイトメガロウイルスを含む多くのTLR2リガンドが当技術分野において公知である。TLR2補助受容体が当技術分野において公知であり、TLR1およびTLR6を含む。次いで、このような化合物を、これらが発現または活性（たとえば、IL-6およびNF-κBなどのTLR2シグナリング経路の1つまたは複数の成分の活性化）を阻害する能力について試験することができる。
【００５０】
TLR2に結合する化合物は、たとえば、化合物を放射性同位元素または酵素標識と結合させることによって同定することができ、その結果、複合体中の標識化合物を検出することによってTLR2に対する化合物の結合を決定することができる。または、試験化合物が、複合体中のTLR2リガンドに対するTLR2結合を調整する能力をモニターするために、アッセイ法の成分を放射性同位元素または酵素の標識と結合させることができる。たとえば、化合物は、125I、35S、14C、または3Hで直接または間接的に標識し、放射線放出を直接計数することによって、またはシンチレーション計数によって放射性同位元素を検出することができる。または、化合物は、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識して、適切な基質の産物への変換を決定することによって酵素標識を検出することができる。
【００５１】
化合物がTLR2と相互作用する能力は、任意の反応体の標識化の有無にかかわらず評価することができる。たとえば、マイクロフィジオメーターを使用して、標識化のないTLR2と、化合物またはTLR2のいずれかの化合物の相互作用を検出することができる（McConnell et al., Science 257：1906-1912 （1992））。本明細書に使用される「マイクロフィジオメーター」（たとえば、Cytosensor(登録商標)）は、光アドレス指定可能な電位差測定のセンサー（LAPS）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物とTLR2との間の相互作用の指標として使用することができる。
【００５２】
また、TLR2タンパク質またはこれらの生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させて、試験化合物がTLR2タンパク質またはこれらの生物学的に活性な部分に結合する能力を評価する無細胞アッセイ法も提供される。一般に、アッセイ法に使用されるTLR2ポリペプチドの生物学的に活性な部分は、非TLR2分子との相互作用に関与する断片、たとえば表面確率スコアが高い断片を含む。
【００５３】
単離されたタンパク質（たとえば、TLR2ポリペプチド）の可溶型および/または膜結合型の形態が無細胞アッセイ法に使用される。タンパク質の膜結合型の形態を使用するときは、溶解剤を利用することは望ましい。このような溶解剤の例は、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-114、Thesit(登録商標)、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）n、3-[（3-クロラミドプロピル）ジメチルアンミニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[（3-クロラミドプロピル）ジメチルアンミニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）、またはN-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナートなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【００５４】
無細胞アッセイ法には、TLR2ポリペプチドと試験化合物の反応混合物を、2つの成分が相互作用して結合することができるような条件下かつ十分な時間で調製して、こうして、除去および/または検出することができる複合体を形成する工程を含む。いくつかのアッセイ法では、試験化合物がTLR2ポリペプチドとTLR2リガンドとの間の結合を阻害する能力が決定される。
【００５５】
また、2つの分子の間の相互作用は、たとえば、蛍光エネルギー移動（FET）を使用して検出することができる（たとえば、Lakowicz et al.,米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulos et al.,米国特許第4,868,103号）。第一の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、その放射された蛍光エネルギーが第二の「アクセプタ」分子上の蛍光標識によって吸収され、次いで吸収エネルギーによって蛍光可能なように選択される。または、「ドナー」タンパク質分子には、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプタ」分子標識を「ドナー」のものと区別し得るように、異なる波長の光を放射する標識が選択される。標識間のエネルギー移転の効率は、分子が離れる距離に関連があるので、分子の空間的な関係を評価することができる。分子間で結合が生じる状況では、アッセイ法における「アクセプタ」分子標識の蛍光発光が最大であるはずである。FET結合イベントは、都合よくは、当技術分野において周知の標準的な蛍光定量的検出手段によって（たとえば、蛍光計を使用して）測定することができる。
【００５６】
もう一つの態様において、TLR2ポリペプチドが標的分子と結合する能力を決定する工程は、リアルタイム生体分子相互作用解析（BIA）を使用して達成することができる（たとえば、Sjolander et al., Anal. Chem. 63：2338-2345（1991）およびSzabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5：699-705 （1995））。「表面プラスモン共鳴」または「BIA」は、いずれの反応体も標識化することなく、リアルタイムで生物特異的相互作用を検出する（たとえば、BIAcore）。結合表面における質量の変化（結合イベントを示す）により、表面近くの光の屈折率の変化（表面プラスモン共鳴（SPR）の光学現象）を生じ、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる検出可能なシグナルを生じる。
【００５７】
一つの態様において、TLR2または試験物質は、固相上にアンカーされる。固相上にアンカーされたTLR2/試験化合物複合体は、反応終了後に検出することができる。一般に、標的遺伝子産物は、固体表面上にアンカーし、試験化合物（これは、アンカーされていない）を本明細書において論議した検出可能な標識で直接または間接的に標識することができる。
【００５８】
タンパク質の一方または両方の複合体を形成していない形態から複合体形成した形態の分離を容易にするために、並びにアッセイ法のオートメーションに適応させるために、TLR2ポリペプチド、抗TLR2抗体、またはTLR2結合分子（たとえば、TLR2リガンド）を固定することが望ましい。TLR2ポリペプチドに対する試験化合物の結合、または試験化合物の有無における標的分子とTLR2ポリペプチドの相互作用は、反応物を含めるのに適した任意の容器中で達成することができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管を含む。一つの態様において、タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することができるドメインを添加する融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/TLR2融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質は、グルタチオンSepharose(商標)ビーズ（Sigma Chemical、St. Louis, MO）またはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれを試験化合物、または試験化合物と非吸着TLR2結合分子もしくはTLR2ポリペプチドと合わせて、混合物を複合体形成に貢献する条件下で（たとえば、塩およびpHのための生理学的条件にて）インキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、任意の結合していない成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックス固定された、複合体を、たとえば上記のように直接または間接的に決定する。または、複合体をマトリックスから解離させて、標準的技術を使用してTLR2結合または活性のレベルを決定することができきる。
【００５９】
TLR2タンパク質または標的分子をマトリックス上に固定するためのその他の技術には、ビオチンおよびストレプトアビジンの抱合の使用を含む。ビオチン化されたTLR2タンパク質または標的分子を、当技術分野において公知の技術を使用してビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製し（たとえば、ビオチン標識キット、Pierce Chemicals、Rockford、IL）、ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定することができる。
【００６０】
アッセイ法を行うためには、固定されていない成分をアンカーされた成分を含むコーティング表面に添加する。反応完全後に、形成されたいずれの複合体も固体表面上に固定されたままである条件下で、反応していない成分を除去する（たとえば、洗浄することによって）。固定表面上にアンカーされた複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。事前に固定されていない成分が事前に標識されている場合、標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。事前に固定されていない成分が、事前に標識されていない場合、表面上にアンカーされた複合体を検出するために、たとえば、固定された成分に対して特異的な標識抗体を使用して、間接的な標識を使用することができる（抗体は、次に、直接標識し、またはたとえば標識された抗Ig抗体で間接的に標識することができる）。
【００６１】
一部の場合において、アッセイ法は、TLR2ポリペプチドまたはリガンドと反応性であるが、リガンドに対するTLR2ポリペプチドの結合を妨害しない抗体を利用して行われる。このような抗体をプレートのウェルに誘導体化して、結合していないリガンドまたはTLR2ポリペプチドを抗体抱合によってウェルにトラップすることができる。このような複合体を検出するための方法は、GSTで固定された複合体について上記したものに加えて、TLR2ポリペプチドまたはリガンドと反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、並びにTLR2ポリペプチドまたはリガンドと関する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイ法を含む。
【００６２】
または、無細胞アッセイ法を液相で行うことができる。このようなアッセイ法では、以下のもの含む（しかし、限定されるわけではない）任意の多数の公知の技術によって、反応生成物を反応していない成分から分離する：分画遠心分離（たとえば、Rivas and Minton, Trends Biochem Sci 18： 284-7 （1993）を参照されたい）；クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）；電気泳動法（たとえば、Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley： New York.を参照されたい）；および免疫沈降（たとえば、Ausubel et al., eds., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley： New Yorkを参照されたい）。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当業者に公知である（たとえば、Heegaard、J. Mol. Recognit., 11：141-148 （1998）；Hage et al., J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 699：499-525 （1997））。さらに、蛍光エネルギー移転も、都合よくは、本明細書に記述したように、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出するために利用してもよい。
【００６３】
本アッセイ法は、TLR2ポリペプチドをTLR2に結合することが公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、試験化合物とアッセイ法混合物を接触させる工程、および試験化合物がTLR2ポリペプチドと相互作用する能力を、たとえば公知の化合物と比較して試験化合物が優先してTLR2またはこれらの生物学的に活性な部分と結合するか、またはTLR2の活性を調整する能力を決定することによって決定する工程を含むことができる。
【００６４】
また、有用なアッセイ法は、試験化合物がTLR2に対する結合を介して、またはTLR2標的分子の下流エフェクター、たとえばNF-κBの活性を調整することにより、TLR2タンパク質の活性を調整する能力を決定するための方法を含む。たとえば、前述したように、適切な標的に対するエフェクター分子の活性を決定することができ、または適切な標的に対するエフェクターの結合を決定することができる。
【００６５】
TLR2と、その細胞の（たとえば、補助受容体）または細胞外の（たとえば、リガンド）結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するためには、TLR2および結合パートナーを含む反応混合物を、2つの成分が相互作用して複合体を形成できるような条件下かつ十分な時間で調製する。阻害剤を試験するためには、反応混合物を試験化合物の有無において提供する。試験化合物を最初に反応混合物に含めることができ、または標的遺伝子とその細胞のまたは細胞外の結合パートナーとの添加に後の時期に添加することができる。対照反応混合物は、試験化合物なしで、または偽薬と共にインキュベートする。次いで、TLR2ポリペプチドと細胞または細胞外パートナーとの結合との間の何らかの複合体の形成を検出する。対照反応中の（しかし、試験化合物を含む反応混合物中ではない）複合体の形成は、化合物がTLR2ポリペプチドと相互作用的結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【００６６】
対象におけるHSV感染を治療するために有効な化合物を同定するもう一つの方法は、たとえば試験化合物の存在下において、機能的なTLR2を発現する（および、一部の場合において、HSVに感染した）細胞における炎症性サイトカインまたはケモカイン（たとえば、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1、および/またはTNF）の産生または、たとえばNF-κBによる遺伝子発現の活性化をアッセイすることによって、TLR2活性に対する化合物の効果を決定することである。このようなアッセイ法を行うための方法は、当技術分野において公知であり、いくつかを本明細書に記述してある。TLR2活性を、たとえば参照、たとえば試験化合物の非存在下での対照のTLR2活性と比較して減少させる試験化合物は、HSVに感染した対象の治療のために有効な化合物であると考えることができる。有効な化合物は、HSV-1に感染した対象において、化合物で治療されていない対象で誘導される炎症性サイトカインのレベルと比較して、TLR2シグナリング経路によって誘導される炎症性サイトカインのレベルを減少させ、これによりHSV感染のネガティブ効果を減少させることが予想される。同様に、HSV感染のTLR2を媒介した効果を治療するために有用な化合物は、化合物と接触されなかった対照細胞と比較して、HSVに感染し、かつ化合物と接触した細胞のTLR2シグナリング経路の活性化と関連する炎症性サイトカインの誘導を阻害する。
【００６７】
本明細書に記述したアッセイ法は、不均一または均一な形式で行うことができる。不均一アッセイ法は、固相上に標的遺伝子産物または結合パートナーのいずれかをアンカーする工程、および反応終了後に固相上でアンカーされた複合体を検出する工程を含む。均一アッセイ法では、全反応を液相で実施する。いずれのアプローチにもおいて、試験する化合物に関する種々の情報を得るために、反応物の添加の順序に変更を加えることができる。たとえば、TLR2ポリペプチドと結合パートナーとの間の相互作用を、たとえば競争によって妨害する試験化合物（たとえば、TLR2リガンド）は、試験物質の存在下において反応を行うことによって同定することができる。または、予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物、たとえばより高い結合定数をもち、複合体からの成分のうちの1つを置換する化合物は、複合体が形成された後に、反応混合物に試験化合物を添加することによって試験することができる。種々の形式の例を下記に簡単に説明してある。
【００６８】
不均一アッセイ法系では、TLR2または相互作用する細胞または細胞外の結合パートナーを固体表面（たとえば、マイクロタイタープレート）上にアンカーし、一方で、アンカーされていない種を直接または間接的に標識する。アンカーされた種は、非共有結合または共有結合によって固定することができる。または、アンカーされる種に特異的な固定された抗体を使用して、固体の表面に種をアンカーすることができる。
【００６９】
アッセイ法を行うためには、固定された種のパートナーを試験化合物の有無において、コーティング表面に曝露する。反応完了後に、反応していない成分を除去して（たとえば、洗浄よって）、形成される任意の複合体は、固体の表面上に固定されるままであると考えられる。固定されていない種が事前に標識されている場合、表面上に固定された標識が検出されると、複合体が形成されたことを示す。固定されていない種が事前に標識されていない場合、表面上にアンカーされた複合体を検出するために間接的標識を使用することができる；たとえば、初めに固定されていない種に特異的な標識抗体を使用する（次に、抗体を直接または間接的に、たとえば標識された抗Ig抗体で標識することができる）。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物を検出することができる。
【００７０】
または、反応は、試験化合物の有無において液相で行うことができ、反応生成物は、たとえば溶液中で形成される任意の複合体をアンカーするための、結合成分のうちの1つに対して特異的な固定された抗体と、アンカーされた複合体を検出するための、その他のパートナーに対して特異的な標識された抗体とを使用して、反応していない成分および検出される複合体から分離する。再び、液相に対する反応物の添加の順序に応じて、複合体を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物を検出することができる。
【００７１】
一部の場合には、均一アッセイ法を使用することができる。たとえば、TLR2ポリペプチドとTLR2の相互作用する細胞または細胞外の結合パートナーとの予め形成された複合体（その中で、TLR2またはこれらの結合パートナーのいずれかが標識されているが、標識によって生じるシグナルは、複合体形成によりクエンチされる）を調製する（たとえば、免疫アッセイのためにこのアプローチを利用する米国特許第4,109,496号を参照されたい）。予め形成された複合体由来の種のうちの1つと競合して置換する試験物質の添加を添加することにより、バックグラウンド異常のシグナルを生じる。このような方法で、TLR2-結合パートナーの相互作用を崩壊する試験物質を同定することができる。
【００７２】
化合物
本明細書に記述した方法に使用される試験化合物は、以下を含む当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法の任意の多くのアプローチを使用して得られたものを含むことができる：生物学的ライブラリー（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、または核酸）；ペプトイドライブラリー（ペプチドの官能性を有するが、酵素的分解に耐性な非ペプチドバックボーンをもち、しかし、それにもかかわらず生理活性のままである分子のライブラリー；たとえば、Zuckermann et al., J. Med. Chem., 37： 2678-2685 （1994））；空間的にアドレス指定可能な平行な固相または溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリー・アプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方、その他の4つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子ライブラリーを適用できる（Lam, Anticancer Drug Des. 12： 145 （1997））。
【００７３】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、たとえば以下において見いだすことができる：DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 6909 （1993）； Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91： 11422 （1994）； Zuckermann et al., J. Med. Chem.,37： 2678 （1994）；Cho et al., Science,261： 1303 （1993）； Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33： 2059 （1994）； Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,33：2061 （1994）； and in Gallop et al., J. Med. Chem.,37： 1233 （1994）。化合物のライブラリーは、溶液中（たとえば、Houghten, (1992) Biotechniques 13： 412-421）、またはビーズ（Lam, (1991) Nature 354： 82-84）、チップ（Fodor, (1993) Nature, 364： 555-556）、細菌（Ladner, 米国特許第5,223,409号）、胞子（Ladner、米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al., (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89： 1865-1869）、またはファージ（Scott and Smith, (1990) Science, 249： 386-390； Devlin, (1990) Science 249： 404-406； Cwirla et al., (1990) Proc. Natl Acad. Sci. 87： 6378-6382； Felici, (1991) J. Mol. Biol., 222： 301-310； Ladner, 前記）中に存在し得る。
【００７４】
TLR2ポリペプチド
一部の場合において、新たな方法には、単離されたTLR2ポリペプチド（全長TLR2タンパク質または変異体、たとえばこれらの突然変異体または断片）、たとえば細胞外ドメインなどの生物学的に活性な部分を使用する。TLR2の人工および天然に存在する変異体の両方が使用される（たとえば、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するTLR2ポリペプチド）。TLR2ポリペプチドは、本明細書に記述したように、たとえば抗TLR2抗体を生じさせ、もしくは試験する（または、より一般には、結合する）ためか、または阻害化合物として役立つ（たとえば、TLR2ドミナントネガティブ）免疫原または抗原（たとえば、TLR2の抗原性断片）として有用である。このようなポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用して細胞または組織源から単離することができる。TLR2ポリペプチドは、天然の供与源から単離することができ、組換えDNA方法によって産生することができ、または化学的に合成することができる。
【００７５】
TLR2ポリペプチドの例は、Genbankアクセッション番号NP_003255（遺伝子NM_003264；ヒトTLR2）およびAAH14693（遺伝子NM_011905；マウスTLR2）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。一部の場合において、TLR2ポリペプチドは、公知のTLR2ポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性、たとえば少なくとも85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ公知のTLR2の少なくとも1つの生物活性を有する（たとえば、天然に存在するTLR2リガンドまたは補助受容体に結合することができ、遺伝子転写の活性化を誘導することができ（たとえば、NF-κBを介す）、またはケモカインもしくはサイトカイン、たとえばIL1、IL-6、IL-8、TNF、MCP-1、もしくはMIP-1の分泌を誘導する）アミノ酸配列を含む。天然に存在するTLR2リガンドおよび補助受容体には、TLR1、TLR6、ザイモサン、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、およびara-リポアラビノマンナンを含む。
【００７６】
また、本明細書に記述した方法に有用なTLR2ポリペプチドの変異体は、少なくともTLR2の細胞外結合ドメインまたはこれらの突然変異体を含む断片を含むことができる。このような断片は、阻害活性を有することが示された。たとえば、LeBouder et al., J Immunol.,171： 6680-9 （2003）を参照されたい。さらに有用なポリペプチド断片は、たとえば、TLR2リガンド（たとえば、HSV）の結合に関して全長TLR2と競合する能力よって同定することができる。天然に存在するTLR2アミノ酸配列の変異体を、これらがTLR2活性、たとえばHSV感染と関連するシグナリングを阻害する能力について試験することができる。本明細書に記述したもの以外のその他の適切な配列が、当技術分野において公知であり、本明細書に開示した方法に使用することができる。
【００７７】
また、TLR2ドミナントネガティブポリペプチド（すなわち、その発現が有意に野生型、たとえば内因性TLR2の活性を阻害するポリペプチド）も、本明細書に記述した方法に有用である。ドミナントネガティブ、およびこれらを作製し、試験するための方法は、当技術分野において公知である。TLR2ドミナントネガティブポリペプチドの例は、たとえば全長TLR2より短い断片および欠失変異体を含み、これらは、本明細書に記述した方法に有用である。ドミナントネガティブポリペプチドは、典型的にはTLR2の細胞外ドメインを包含し（たとえば、アミノ酸1〜587のまわりを含むポリペプチド）、保存された細胞内Toll/インターロイキン-1受容体（TIR）をドメイン欠いたTLR2欠失変異体（たとえば、アミノ酸1〜642のまわりを含むポリペプチド）（たとえば、Sandor et al., J. Cell Biol. 162 （6） ： 1099-1110 （2003）； Xu et al., Nature 408 （6808） ： 111-5 （2000）を参照されたい）またはたとえば、Genbankアクセッション番号NP_003255（遺伝子NM_003264；ヒトTLR2）もしくはAAH14693（遺伝子NM_011905；マウスTLR2）のSer40〜Ile64からのアミノ酸（Fujita et al., J. Immunol. 171 （7） ： 3675-83 （2003））を含むことができる。ドミナントネガティブ突然変異体は、点変異体、たとえばP681H（Xu et al.,2000、前記）、L107E、L112E、およびL115E突然変異体（Fujita et al.,2003、前記）を含むことができる。
【００７８】
本明細書に使用される「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸ファミリー内のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換を意味する。アミノ酸ファミリーは、当技術分野において認識されており、アミノ酸側鎖の物理的および化学的特性に基づく。ファミリーには、以下を含む：塩基性側鎖をもつアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）；酸性側鎖をもつアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、およびグルタミン酸）；無電荷極性側鎖をもつアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、およびシスチン）；無極性側鎖をもつアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）；分枝側鎖をもつアミノ酸（たとえば、スレオニン、バリン、およびイソロイシン）；および芳香族側鎖をもつアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）。アミノ酸は、複数のファミリーに属し得る。
【００７９】
抗体
もう一つの局面において、抗TLR2抗体（TLR2抗体とも称する）である抗体が、提供される。本明細書に使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、またはその免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、F（ab）およびF（ab'）2断片を含み、これらはペプシンのような酵素によって抗体を処理することによって作製することができる。
【００８０】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、組換え型、たとえばキメラもしくはヒト化、完全ヒト、非ヒト、たとえば、マウス、または一本鎖抗体であることができる。一部の場合において、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。抗体は、毒素またはイメージング剤に結合することができる。
【００８１】
全長TLR2タンパク質またはTLR2の抗原性ペプチド断片を免疫原として使用することができ、またはその他の免疫原、たとえば細胞、膜標品等で作製された抗TLR2抗体（TLR2抗体）を同定するために使用することができる。TLR2ポリペプチドの抗原性ペプチドは、TLR2タンパク質の少なくとも8アミノ酸残基を含むべきである。一般に、ポリペプチドは、TLR2のエピトープ、たとえば細胞外ドメインを包含する。抗原性ペプチドは、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、または少なくとも30アミノ酸残基を含むことができる。
【００８２】
また、TLR2の断片、たとえば細胞外ドメインを含む断片、たとえばNP_003255（ヒトTLR2）またはAAH14693（マウスTLR2）の残基1〜587のまわりも、TLR2の細胞外領域に対する抗体を作製するために使用される。抗原性ペプチドによって包含されるエピトープは、一般に、TLR2のタンパク質の表面上に位置する領域、たとえば親水性領域、並びに高抗原性である領域である。たとえば、ヒトTLR2タンパク質配列のEmini表面確率解析は、TLR2タンパク質の表面に局在化するものにおいて特に高い確率を有し、したがって、抗体産生を標的するために有用な表面残基を構成する可能性が高い領域を示すために使用することができる。
【００８３】
一部の態様において、抗体は、TLR2タンパク質の細胞外部分と結合することができる、たとえば、これは、TLR2タンパク質を発現する細胞全体と結合することができる。もう一つの態様において、抗体は、TLR2タンパク質の細胞内部分に結合する。
【００８４】
キメラ、ヒト化、たとえば完全ヒト抗体が、反復投与を含む適用、たとえばヒト対象の治療的処置（およびいくつかの診断的適用）が望ましい。
【００８５】
抗TLR2抗体は、単鎖抗体であることができる。単鎖抗体（scFV）は、操作してもよい（たとえば、Colcher et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 880： 263-80（1999）；およびReiter, Clin. Cancer Res. 2： 245-52 （1996）を参照されたい）。単鎖抗体は、二量体化または多量体化して、同じ標的TLR2タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を作製することができる。
【００８６】
一部の場合において、抗体は、Fc受容体と結合する能力が減少されたか、または全く有さない。たとえば、抗体は、Fc受容体に対する結合を補助しないアイソタイプまたはサブタイプ、断片またはその他の突然変異体であることができ、たとえばこれらには、変異誘発されたか、または欠失したFc受容体結合領域を有する。
【００８７】
抗TLR2抗体（たとえば、モノクローナル抗体）は、HSV感染と関連したTLR2シグナリングを阻害する方法に使用される。また、このような抗体は、TLR2発現もしくは活性を阻害する化合物を同定するスクリーニング法の一部として、細胞または組織におけるTLR2タンパク質レベルまたは局在化をモニターするために（たとえば、HSV感染の間に）使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）（すなわち、抗体標識化）によって促進することができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを含み；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、並びに適切な放射性物質の例は、125I、131I、35S、または3Hを含む。
【００８８】
抗体の断片を使用するときは、標的抗原（たとえば、TLR2）と結合する最も小さな阻害性断片が使用される。たとえば、抗体のFv領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができる。
【００８９】
一部の態様において、抗体は、阻害抗体であり、たとえば、抗体は、TLR2の活性を有意に阻害することができる。阻害抗体は、たとえば、Sandor et al.,2003、前記およびMeng et al., J. Clin. Inv. 113（10）：1473-1481（2004）に記載されているように、当技術分野において公知である。
【００９０】
アンチセンス核酸分子、リボザイム、siRNA、および修飾核酸分子
新たな方法に有用な化合物には、TLR2に対してアンチセンスである単離された核酸分子、またはTLR2転写、プロセシング、もしくは翻訳を阻害することができるその他の核酸分子を含む。アンチセンス核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的、たとえば二本鎖cDNA分子のコード鎖に対して相補的またはmRNA配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。アンチセンス核酸分子は、TLR2コード鎖全体に対してまたはこれらの一部（たとえば、ヒトTLR2のコード領域）に対して相補的であることができる。一部の場合において、アンチセンス核酸分子は、TLR2のコード領域または「非コード領域」の一部のみ（たとえば、5'および3'非翻訳領域）に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。
【００９１】
アンチセンス核酸は、TLR2 mRNAのコード領域全体またはこれらの一部に対して相補的であるようにデザインすることができる。一般に、アンチセンス分子は、TLR2 mRNAのコード領域または彦オード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、TLR2 mRNAの翻訳開始部位を囲む領域、たとえば関心対象の標的遺伝子ヌクレオチド配列の-10〜+10の間に対して相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであることができる。当技術分野において公知の、および本明細書に開示した配列に基づいて、当業者であれば、本発明に従って使用するための任意の多くの適切なアンチセンス分子を容易に選択し、合成することができる。たとえば、標的核酸の長さにわたって15〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子歩行」を調製し、続いて標的遺伝子発現の阻害について試験することができる。任意に、5〜10ヌクレオチドのギャップをオリゴヌクレオチド間に残して、合成および試験するオリゴヌクレオチドの数を減少させることができる。
【００９２】
アンチセンス核酸は、当技術分野において公知の手順を使用して、化学合成および酵素の結合反応を使用して構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、たとえば、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大するように、もしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理安定度を増大するようにデザインされた多様に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、たとえばホスホロチオアート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドを使用することができる。また、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの向きにサブクローニングした発現ベクターを使用して、生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、以下のサブセクションにおいてさらに記述した、関心対象の標的核酸に対してアンチセンスの向きである）。
【００９３】
新たなアンチセンス核酸分子は、典型的には、これらがTLR2タンパク質をコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズし、または結合して、これにより、たとえば転写および/または翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するように、対象に投与されるか（たとえば、組織部位に直接注射することよって）、またはインサイチューで産生される（たとえば、アンチセンス分子をコードする配列を含む発現ベクターを使用する）。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞をターゲットするように修飾し、次いで全身投与することができる。全身投与のためには、アンチセンス分子を、これらが選択した細胞表面上に発現される受容体または抗原と特異的に結合するように、たとえば細胞表面受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体に対してアンチセンス核酸分子を連結することによって修飾することができる。また、アンチセンス核酸分子は、本明細書に記述したベクターを使用して細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、一般に、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に配置されたベクター構築物が使用される。
【００９４】
一部の場合において、アンチセンス核酸分子は、α-アノマーの核酸分子であることができる。α-アノマーの核酸分子は、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドであって、通常のβ-ユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に走っている二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al., Nucleic Acids., Res. 15： 6625-6641 （1987））。また,アンチセンス核酸分子は、2'-o-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucleic Acids Res.,15：6131-6148（1987））またはキメラRNA-DNA類似体（Inoue et al., FEBS Lett.,215：327-330 （1987））を含むことができる。
【００９５】
本明細書に記述した方法に有用であるもう一つのアンチセンス核酸は、リボザイムである。TLR2をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムは、TLR2 cDNAのヌクレオチド配列に対して相補的な1つまたは複数の配列と、mRNA切断の役割を担うことが公知の触媒配列を有する配列とを含むことができる（米国特許第5,093,246号またはHaselhoff and Gerlach,1988, Nature,334： 585-591を参照されたい）。たとえば、活性部位のヌクレオチド配列がTLR2をコードするmRNA内で切断されるヌクレオチド配列に対して相補的であるテトラヒメナ（Tetrahymena）L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる（たとえば、Cech et al.,米国特許第4,987,071号；およびCech et al.,米国特許第5,116,742号）。または、TLR2 mRNAを使用して、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することができる（たとえば、BartelおよびSzostak、Science,261：1411-1418 （1993））。
【００９６】
一部の態様において、アンチセンス核酸は、モルホリノオリゴヌクレオチドである（たとえば、Heasman、Dev. Biol., 243：209-14 （2002）；Iversen、Curr. Opin. Mol. Ther., 3：235-8 （2001）；Summerton、Biochim. Biophys. Acta., 1489：141-58 （1999）を参照されたい）。
【００９７】
TLR2遺伝子発現は、標的細胞におけるTLR2遺伝子の転写を防げる三重らせん構造を形成するように、TLR2の制御領域に対して相補的なヌクレオチド配列（たとえば、TLR2プロモーターおよび/またはエンハンサー）をターゲットすることによって阻害することができる（たとえば、Helene, Anticancer Drug Des.,6： 569-84 （1991）；Helene, Ann. N. Y. Acad. Sci.,660： 27-36 （1992）； and Maher, Bioassays,14： 807-15 （1992））。三重らせんをターゲットすることができる潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増大することができる。スイッチバック分子は、交互に5'-3'、3'-5'様式で合成され、その結果、これらは、最初に二重鎖の一方の鎖と、次いで他方と塩基対形成し、二重鎖の一方の鎖に相当の大きさの一続きのプリンまたはピリミジン誘導体の必要がなくなる。
【００９８】
TLR2核酸分子は、塩基部分、糖残基、またはリン酸塩バックボーンにて修飾をして、たとえば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善することができる。たとえば、ペプチド核酸を作製するために、核酸分子のデオキシリボースリン酸バックボーンを修飾することができる（Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry,4： 5-23 （1996）を参照されたい）。本明細書に使用される「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンが偽ペプチドバックボーンによって置換されており、かつ4つの天然の核酸塩基だけが保持されている核酸擬態、たとえばDNA擬態をいう。PNAの中性バックボーンにより、低いイオン強度条件下でのDNAおよびRNAに対する特異的ハイブリダイゼーションが可能になる。PNAオリゴマーの合成は、たとえば、Hyrup et al., 1996、前記、およびPerry-O' Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93： 14670-675 （1996）記述したとおりの標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して行うことができる。
【００９９】
TLR2核酸分子のPNAは、治療的および診断的用途に使用することができる。たとえば、PNAは、たとえば転写もしくは翻訳停止を誘導するか、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗遺伝子薬として使用することができる。このような化合物は、HSV感染によって生じる望ましくないTLR2を媒介した効果を治療するために有用である。
【０１００】
その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドなどのその他の付属する基（たとえば、インビボにおいて宿主細胞受容体をターゲットするため）、または細胞膜（たとえば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：6553-6556 （1989）；Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84：648-652 （1987）；PCT公開番号国際公開公報第88/09810号）または血液-脳関門（たとえば、PCT公開番号国際公開公報第89/10134号）を超える輸送を容易にする薬剤を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションでトリガーされる切断薬（たとえば、Krol et al., Bio-Techniques 6：958-976（1988））または挿入剤（たとえば、Zon、Pharm. Res., 5：539-549（1988））で修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子（たとえば、ペプチド、ハイブリダイゼーションでトリガーされる架橋剤、輸送因子、またはハイブリダイゼーションでトリガーされる切断薬）に抱合してもよい。
【０１０１】
また、TLR2核酸に対して相補的である少なくとも1つの領域と、2つの相補的領域（一方がフルオロフォアを有し、かつ一方がクエンチャーを有する）とを有する分子ビーコンオリゴヌクレオチドプライマおよびプローブ分子も使用することができる（その結果、分子ビーコンは、試料中のTLR2核酸の存在を定量化するために有用である）。分子ビーコン核酸は、たとえば、Lizardi et al.,米国特許第5,854,033号；Nazarenko et al.,米国特許第5,866,336号、およびLivak et al.,米国特許第5,876,930号に記述されている。
【０１０２】
一部の場合において、オリゴヌクレオチドは、TLR2に向けられた低分子干渉RNA（siRNA）である。これらの二重鎖RNA（二本鎖RNA）分子は、一般にそれぞれの鎖に16〜30、たとえば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドで含み、鎖の一方は、mRNAの標的領域に対して、実質的に同一、たとえば少なくとも80%（またはそれ以上、たとえば85%、90%、95%、または100%）同一であり、たとえば、3、2、1、または0個のミスマッチヌクレオチドを有し、他方の鎖は、第一の鎖に対して相補的である。dsRNA分子は、化学的に合成することができ、またはインビトロでDNA鋳型から、もしくはインビボで、たとえば低分子ヘアピンRNA（shRNA）から転写することができる。siRNA配列を選択し、これらを調製する方法は、当技術分野において公知であり、このような同定および合成のために市販の供与源を利用することができる（たとえば、Dharmacon、Lafayette、Co；Ambion、Austin、TX；Quigen、Inc., Valencia、CA）。
【０１０３】
ネガティブ対照siRNAは、選択されたsiRNAと同じヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムに対して有意な配列相補性を有するべきではない。このようなネガティブ対照は、選択したsiRNAのヌクレオチド配列をランダムに混ぜてデザインすることができ；相同性検索を行って、ネガティブ対照が適切なゲノム内の他のいかなる遺伝子に対する相同性も欠いていることを確認することができる。加えて、ネガティブ対照siRNAは、配列に1つまたは複数の塩基ミスマッチを導入することによってデザインすることができる。
【０１０４】
本明細書に記述した方法に有用である核酸組成物は、siRNAおよび架橋したsiRNA誘導体の両方を含む。架橋は、組成物の薬物動態を変更するために、たとえば体内での半減期増加するために使用することができる。したがって、本発明は、2つの鎖が架橋されるように、核酸の2つの相補鎖を有するsiRNAを含むsiRNA誘導体を含む。たとえば、鎖の一方の3'OH末端を修飾することができ、または3'OH末端にて2つの鎖を架橋し、修飾することができる。siRNA誘導体は、単一の架橋を含むことができる（たとえば、ソラレン架橋）。一部の態様において、siRNA誘導体は、その3'末端にてビオチン分子（たとえば、光切断可能なビオチン）、ペプチド（たとえば、Tatペプチド）、ナノ粒子、ペプチド擬態、有機化合物（たとえば、蛍光色素などの色素）、またはデンドリマーを有する。このような方法でsiRNA誘導体を修飾することにより、対応するsiRNAと比較して、細胞の取り込みを改善し、または生じるsiRNA誘導体の細胞のターゲティング活性を増強してもよく、対応するsiRNAと比較して、細胞におけるsiRNA誘導体を追跡するために有用であり、またはsiRNA誘導体の安定性を改善する。
【０１０５】
核酸組成物は、抱合されていなくてもよく、またはナノ粒子などの別の部分に抱合して、組成物の特性、たとえば吸収、有効性、生物学的利用能、および/または半減期などのファーマコキネティックパラメーターを増強することができる。抱合は、当技術分野において公知の方法によって、たとえば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev., 47： 99-112 （2001）（ポリアルキルシアノアクリレート（PACA）ナノ粒子に充填した核酸を記述する）；Fattal et al., J. Control Release, 53： 137-43 （1998）（ナノ粒子に結合した核酸を記述する）；Schwab et al., Ann. Oncol. 5Suppl., 4：55-8（1994）（挿入剤、疎水基、ポリカチオン、またはPACAナノ粒子に連結された核酸を記述する）；およびGodard et al., Eur. J. Biochem., 232：404-10（1995）（ナノ粒子に連結された核酸を記述する）の方法を使用して達成することができる。
【０１０６】
また、核酸分子は、当技術分野において公知の方法を使用して標識することができる。たとえば、核酸組成物は、フルオロフォア、たとえばCy3、フルオレッセイン、またはローダミンで標識することができる。標識化は、キット、たとえばSILENCER(商標)siRNA標識化キット（Ambion）を使用することにより実施することができる。さらに、siRNAは、たとえば、3H、32p、またはその他の適切な同位元素を使用して放射標識することができる。
【０１０７】
より長期の発現のためのオリゴヌクレオチドの送達
本明細書に記述した合成siRNAまたはその他のオリゴヌクレオチドもしくは核酸は、陽イオン性リポソームトランスフェクションおよび電気穿孔法によって細胞に送達することができる。一般に、外来性siRNAは、短期のサイレンシング効果（約4〜5日）の持続を示すだけである。機能的な二本鎖siRNAを発現することができる哺乳動物Pol IIIプロモーター系（たとえば、H1、またはU6/snRNAプロモーター系（Tuschl、Nature Biotechnol., 20：440-448（2002））；（Bagella et al., J. Cell. Physiol.,177：206-213 （1998）；Lee et al., Nature Biotechnol., 20：500-505 （2002）；Miyagishi et al., Nucleic Acids Res. Suppl., 2：113-114 （2002）；Paul et al., Nature Biotechnol.,20：505-508 （2002）；Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99 （9）： 6047-6052 （2002）；Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99 （6）： 5515-5520 （2002））を含む組換えDNA構築物から細胞内でsiRNA二重鎖を発現するためのいくつかのストラテジーでは、細胞においてより長期間の標的遺伝子抑圧が可能である。RNA Pol IIIによる転写終結が、DNA鋳型における4つの連続したT残基で生じ、特定の配列にてsiRNA転写物を終結させるためのメカニズムを提供する。siRNAは、5'-3'および3'-5'の向きの標的遺伝子の配列に対して相補的であり、siRNAの2つの鎖は、同じ構築物に、または別々の構築物に発現させることができる。H1またはU6 snRNAプロモーターよって駆動され、細胞に発現されるヘアピンsiRNAにより、標的遺伝子発現を阻害することができる。また、T7プロモーターの制御下にsiRNA配列を含む構築物は、ベクター発現T7 RNAポリメラーゼと共に細胞に同時トランスフェクトしたときに、機能的なsiRNAを産生する（Jacque, Nature,418：435-438 （2002））。
【０１０８】
動物細胞は、マイクロRNA（miRNA）と呼ばれる約22ヌクレオチドの非翻訳RNAの範囲を発現し、動物発生の間に、遺伝子発現を転写後または翻訳のレベルにて調節することができる。miRNAの一つの共通の特色は、これらの全てが、おそらくRNase III型酵素であるDicerまたはこれらの相同体によって約70ヌクレオチドの前駆体RNAステム-ループから切除されることである。miRNA前駆体のステム配列を標的mRNAに相補的なmiRNA配列と置換することによって、新規miRNAを発現するベクター構築物を使用して、哺乳動物細胞の特定のmRNA標的に対してRNAiを開始するようにsiRNAを産生することができる（Zeng, Mol. Cell, 9： 1327-1333 （2002））。ポリメラーゼIIIプロモーターを含むDNAベクターを発現したときに、ヘアピンにデザインされたマイクロRNAは、遺伝子発現をサイレンスすることができる（McManus（2002）前記）。また、ウイルスを媒介した送達メカニズムを使用して、たとえばRNA Pol IIプロモーター転写調節下で、siRNAを収容する組換えアデノウイルスを産生することによって、siRNAの発現を介したターゲットされた遺伝子の特異的サイレンシングを誘導することができる、（Xia et al., Nat. Biotechnol., 20：1006-1010 （2002））。このような組換えアデノウイルスによるHeLa細胞の感染により、内因性標的遺伝子発現を減弱することができる。組換えアデノウイルスベクターを、siRNAの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに注射することにより、インビボにおける標的遺伝子発現が減少することとなる（id）。動物モデルでは、胚全体の電気穿孔法により、移植後のマウス胚に合成siRNAを効率的に送達することができる（Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99：14236-14240 （2002））。成体マウスでは、「高圧」送達技術（尾静脈を経て動物に大量のsiRNA含む溶液を迅速に（5秒以内で）注射すること）によってsiRNAの効率的送達を達成することができる、（Liu, Gene Ther.,6： 1258-1266 （1999）； McCaffrey, Nature,418： 38-39 （2002）； Lewis, Nature Genetics,32： 107-108 （2002））。また、動物にsiRNAを送達するために、ナノ粒子およびリポソームを使用することができる。
【０１０９】
RNAiを誘導するための操作されたRNA前駆体の使用
本明細書に記述したように、細胞または生物体全体に導入された、操作されたRNA前駆体は、siRNA分子などの所望のオリゴヌクレオチドの産生を引き起こすと考えられる。次いで、このようなsiRNA分子は、RNAi経路の内因性タンパク質成分と会合して、切断および破壊のために特定のmRNA配列に結合して、ターゲットする。この様式で、操作されたRNA前駆体から産生されたsiRNAによってターゲットされるmRNAは、細胞または生物体から枯渇されて、細胞または生物体における、そのmRNAによってコードされるタンパク質の濃度の減少を引き起こす。
【０１１０】
アプタマー
また、TLR2タンパク質に特異的なアプタマー分子を使用することもできる。アプタマーは、これらがタンパク質リガンドと特異的に結合するのを可能にする三次構造を有する核酸分子である（たとえば、Osborne、et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1：5-9 （1997）；およびPatel、Curr. Opin. Chem. Biol., 1：32-46 （1997））。核酸分子は、多くの場合、治療的タンパク質分子よりも標的細胞に便利に導入されるので、アプタマーにより、多能性の効果を有し得る薬物またはその他の分子を導入することなく、TLR2活性を特異的に減少させることができる方法がもたらされる。
【０１１１】
HSV感染の決定
本明細書に記述したとおり、HSVに感染された新生児で観察されるものなどの、HSV感染において有害なTLR2を媒介した効果を生じさせるのは、宿主反応（すなわち、TLR2シグナリングの誘導）である。本明細書に記述した一定の方法は、HSV感染細胞におけるTLR2シグナリングを阻害する化合物の同定に関する。一部の態様において、このような化合物は、化合物で処置した細胞へのHSVの感染力に有意な影響を及ぼして、したがってHSV感染を治療するために有用であるとは予想されない。したがって、HSV感染細胞におけるTLR2シグナリングを阻害する化合物を、これらの感染力に対する効果につても試験することができる。一般に、TLR2シグナリングを減少させることができる試験化合物と接触した組織または細胞におけるプラーク形成単位（pfu）の数を決定して、化合物と接触しなかった感染細胞におけるpfuの数と比較する。感染力は、本明細書に記述したように、または当技術分野において公知のその他の方法を使用して、測定することができる。したがって、TLR2シグナリングに対して影響を及ぼすが、ウイルスの量に対して影響を及ぼさない化合物は、HSV感染を治療するために有用な可能性のあるTLR2にターゲットされる化合物である。このような使用のために許容される化合物は、感染力を減少させても、または減少させなくてもよい。
【０１１２】
また、HSV感染を治療するために有用であると同定された化合物を、本明細書に記述した方法を使用して、たとえばこれらが、HSV感染に関連したTLR2シグナリングを阻害する能力について試験することができる。したがって、本方法は、たとえば新生児において、HSV感染を治療するために特に有用である化合物の同定を含む。
【０１１３】
HSVおよびTORCH感染の症候
いくつかの方法において、化合物がHSV感染の1つまたは複数の症候を寛解させる能力について、化合物を試験する。新生児、子供、および成体におけるHSV感染の症候は、本明細書に記述し、および当技術分野、たとえば、The Merck Manual, Seventeenth Edition, Rahway, NJ, 1999-2004において公知である。
【０１１４】
一般の経口および生殖HSV感染により、典型的には、皮膚または粘膜上に小さな疱疹の発疹を生じる。HSVでの口腔感染症は、通常ヘルペス性歯肉口内炎（口潰瘍）を生じさせる。加えて、冒された者は、一般に気分が悪くなり、発熱、頭痛、および体の痛みを有する。口潰瘍は、10〜14日持続し得るし、非常に重篤で、飲食が極めて不快となり得る。一部の最初の口腔感染症では、歯ぐきの腫大が唯一の症候であり；時には症候が発症しない。ヘルペス性の歯肉口内炎は、最も一般的には子供に発症する。HSV-2症候は、通常軽微であり、性域のそう痒、灼熱感、うずき、および小さな疱疹；小さな皮膚潰瘍（これは、疱疹が壊れる時に形成される）；局在化した疼痛（たとえば、尿が生殖器潰瘍にふれた場合）；鼠径部の拡大したおよび/または痛みを伴うリンパ節；並びに頭痛、発熱、および一般的な倦怠感を含み得る。
【０１１５】
最初の生殖器HSV感染は、重篤かつ持続性であり、陰部に複数の有痛性の疱疹を伴い得る。発熱および一般的な倦怠感が共通しており、一部の場合には排尿の間の灼熱感を伴う。時折、感染者は、症候を有しない可能性もある。典型的な症候（たとえば、局部的な刺痛、不快感、そう痒、または鼠径部の痛み）と共に、一般に、数時間〜2-3日だけ疱疹に先行して、陰部ヘルペスの繰り返しの発作が始まる。赤みがかった端によって囲まれた痛みを伴う疱疹が、生殖器の皮膚または粘膜上に出現する。疱疹は、急速に壊れて、潰瘍が残る。一部の場合には、疱疹が腿上、殿部、または肛門周辺にも出現する。生殖器疱疹は、女性の陰門上に発病することもあり；これらの疱疹は、通常見やすく、非常に痛みを伴う。内部疱疹は、膣内に、または頚部上に発症することもあり；これらは、あまり痛みを伴わず、見えにくい。典型的な陰部ヘルペスの繰り返される発症は、約1週間続く。
【０１１６】
HSV-1またはHSV-2は、時折、皮膚（たとえば指の）の破壊を介して侵入し、腫大した、痛みを伴う、赤い指先を生じさせ；この状態は、疱疹性のひょう疽として公知である。
【０１１７】
HSV-1は、時に眼の角膜に感染し（単純ヘルペス角膜炎として公知の症状）、痛みを伴う潰瘍およびかすみ目を特徴とする。時間とともに、角膜が曇ってきて、著しい視覚の喪失を生じさせ、角膜移植を必要とし得る。
【０１１８】
TORCH症候群は、任意の感染因子群、たとえば、トキソプラスマ症、その他の感染、風疹、サイトメガロウイルス、またはヘルペスによる、発生中の胎児または新生児の感染をいう。本明細書に使用される「その他の感染」は、梅毒、B型肝炎、コクサッキーウイルス、EBウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、およびヒトパルボウイルスを含むことができる。これらの任意の因子での感染により、以下を含む冒された新生児と同様の症候型を生じ得る。発熱；摂食障害；皮膚下の小領域の出血（小さな赤みがかった、または紫がかった点を出現させる）；肝脾腫大（肝臓および脾臓の腫張）；皮膚徴候（点状出血、紫斑病、黄疸、および経皮赤血球新生を含む）、難聴；眼の異常；および/またはその他の症候および知見。また、それぞれの感染因子は、多くの要因（たとえば、胎児の発育の段階）によって変化し得るさらなる異常を生じる可能性がある。新生児のHSV感染における症候には、単一の、または群化した、皮膚小胞、経口潰瘍、または結膜炎を含み得る。たとえば、Epps et al., Semin. Dermatol. 14 （2）： 179-86 （1995）を参照されたい。
【０１１９】
最もHSV感染のリスクがある対象は、免疫抑制された個体（たとえば、免疫抑制療法中の個体またはHIVに感染した個体）を含む。
【０１２０】
動物モデルおよびヒト対象
いくつかの方法では、対象がHSVに感染したことを確認することが望ましい。このような方法は、当技術分野において公知である（たとえば、The Merck Manual, Seventeenth Edition, Section. 19, Chapter 260； Merck & Co, Inc., Rahway, N. J.,1999-2004）。たとえば、感染は、培養細胞を疑わしい感染部位由来の試料で感染させる工程、および培養からウイルスを単離する工程によって確認することができる。ヒトまたはヒト以外の起源の種々の株化細胞をこの方法に使用することができる。対象からのウイルスの回収は、たとえば皮膚小胞、口、眼、またはCDF（脳脊髄液）からすることができる。脳炎を示す一部の新生児では、脳においてのみウイルスが見いだされる。また、試験は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用して行うことができる。細胞病理学的効果は、通常、接種の24〜48時間後の組織培養において証明することができる。また、HSV-1感染の決定は、たとえば適切な高力価抗血清での中和；病変切屑の免疫蛍光（たとえば、HSV-1に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を使用する）；および電子顕微鏡法によって確認することができる。このような方法は、化合物（すなわち、TLR2シグナリングを減少させる化合物）が、HSV感染の症候を減少することができるかどうかを決定することに関するアッセイ法に有用である。
【０１２１】
HSV感染の動物モデルは、当技術分野において公知であり、たとえばWeber, Animal Models in Virology, in Schmidt and Weber （eds） , Animal Testing in Infectiology. Contrib Microbiol. Basel, Karger, 2001, 9 ： 15-30に記載されているとおりである。たとえば、本明細書において論議したマウスモデルを使用することができる。また、齧歯類、たとえばラット、マウス、およびモルモット、並びに兎目、たとえばウサギも、HSVに曝露したときのHSV感染の優れたモデルとなる。
【０１２２】
予測医薬
また、本明細書に記述した方法は、診断アッセイ法、予後アッセイ法、およびモニタリング臨床試験を予後の（予測的）目的のために使用することにより、HSVに感染した個体を治療する予測医薬の分野に属する。特に、HSVに感染したか、または曝露され、および脳炎などのHSV感染のTLR2を媒介した効果に関するリスクのある患者を、TLR2活性の活性化についてモニターすることができる。HSVに感染した対象でTLR2活性が増大されたことは、対象がHSV感染のTLR2を媒介した効果を発症するリスクがあることを示す。次いで、このような対象を、HSV感染の間のTLR2活性と関連する有害な症候の早期発見のためにモニターするか、またはTLR2活性を減少させるために、もしくはこのような感染と関連する症候を治療する予防的治療を施してもよい。
【０１２３】
対象、たとえば対象由来の試料におけるTLR2活性を決定する方法には、TLR2活性の徴候、たとえばNF-κB活性化、サイトカインおよび/またはケモカイン、たとえばIL-1、IL-6、腫瘍壊死因子（TNF）、MCP-1、MIP-1α、および/またはIL-8の産生を、たとえば血液白血球またはその他の組織もしくは血清サイトカイン/ケモカインレベルによってアッセイする工程を含む。また、TLR2活性のその他の徴候をアッセイすることもできる。このような徴候をアッセイする方法は、当技術分野において公知である。
【０１２４】
薬学的組成物
HSV-1感染のTLR2を媒介した効果を治療するために有用である本明細書に記述した化合物は、薬学的組成物に組み込むことができる。このような組成物は、典型的には、化合物（たとえば、核酸分子、ペプチド、または抗体）と薬学的に許容される担体とを含む。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」という専門用語は、薬学的投与に適合性の溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、並びにその他を含む。また、抗ウイルス剤などの補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１２５】
薬学的組成物は、その企図された投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、非経口的（たとえば、経静脈、皮内、皮下、吸入、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸）、または経口投与を含む。非経口的適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用蒸留水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、または燐酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口的調製は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多数回投与バイアルに封入することができる。
【０１２６】
注射可能な使用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体は、生理食塩液、静菌水、Cremophor EL(商標)（BASF, Parsippany, NJ）または燐酸緩衝生理食塩液（PBS）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易なシリンジ操作性で、ある程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、その他）を含む溶媒または分散媒質、並びにこれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、たとえばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、その他によって行うことができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいと考えられる。注射可能な組成物は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって持続的に吸収させることができる。
【０１２７】
無菌注射用溶液は、先に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に活性化合物の必要量を組み入れて、必要であれば濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基礎分散媒質および先に列挙した必要なその他の成分を含む滅菌溶媒に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に濾過滅菌したその溶液から、活性成分プラスさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２８】
一般的に、経口組成物には不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。また、経口組成物は、マウスウォッシュとして使用される液体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤および/またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、任意の以下の成分、または類似の特性を有する化合物を含むこともできる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローテスなどの潤滑剤；二酸化珪素コロイドなどの滑り剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香料。
【０１２９】
吸入投与のためには、化合物は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１３０】
Lipofectin(登録商標)またはリポソームを使用して細胞内に化合物（たとえば、ポリペプチドもしくは抗体、またはTLR2を結合するFab領域の断片）を送達することができる。また、ポリペプチド、抗体、およびこれらの断片、たとえばTLR2に結合する単鎖中和抗体を、たとえば標的細胞群内にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することによって投与することができる（たとえば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 7889-7893 （1993）を参照されたい）。
【０１３１】
また、全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても行うことができる。経粘膜または経皮投与のためには、浸透すべき障壁に対して適当な浸透剤を製剤中で使用する。このような浸透剤は、一般的に当技術分野において公知であり、たとえば、経粘膜投与のためには、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を使用して行うことができる。経皮投与のためには、活性化合物は、当該技術分野において一般的に公知のように軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに処方される。
【０１３２】
また、化合物は、直腸送達のための坐剤（たとえば、カカオバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤と共に）または浣腸の形態で調製することができる。
【０１３３】
一つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む徐放性製剤などの、化合物が体から迅速に消失しないようにする担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための方法は、当業者に明らかである。また、材料は、Alza Corporation（Mountain View, CA）から購入することができる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、たとえば米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１３４】
投与を容易にするため、および用量を均一にするために、単位用量で経口または非経口組成物を処方することが有利である。本明細書に使用される、用量単位形態は、治療される対象に関して単位用量として適している物理的に個別の用量であって；各単位が必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の規定量を含むものを意味する。
【０１３５】
HSVに感染した対象におけるTLR2発現または活性を調整する薬剤（化合物）を本明細書に記述した。薬剤は、小分子であることができる。たとえば、このような小分子は、ペプチド、ペプチド擬態（たとえば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モルあたりの分子量が約10,000グラム未満の有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機または有機金属化合物を含む）、1分子あたりの分子量が約5,000グラム未満の有機または無機化合物、1分子あたりの分子量が約1,000グラム未満の有機または無機化合物、1分子あたりの分子量が約500グラム未満の有機または無機化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル、およびその他の薬学的に許容される形態を含むがこれらに限定されない。
【０１３６】
本明細書に記述した方法に使用することができる抗体（またはこれらの断片）は、Segalらによって米国特許第4,676,980号に記載されるように、第2の抗体に結合して抗体のヘテロ結合体を形成することができる。
【０１３７】
本明細書に記述した核酸分子（たとえば、治療的に有用な核酸分子をコードする核酸分子、たとえばTLR2をターゲティングするアンチセンス核酸またはsiRNAを含むオリゴヌクレオチド、およびTLR2ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸分子）は、ベクターに挿入して、オリゴヌクレオチドまたは核酸分子を産生するために、または遺伝子療法ベクターとして使用するために使用することができる。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号を参照されたい）によって、または定位注射（たとえば、Chen et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91： 3054-3057）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達媒体が抱埋された徐放性マトリクスを含むことができる。または、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え型細胞、たとえばレトロウイルスベクターから無処置で作製することができる場合、薬学的製剤には、遺伝子送達系を生じる1つまたは複数の細胞を含むことができる。
【０１３８】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、ディスペンサーを含むことができる。
【０１３９】
本明細書に記述した化合物は、本明細書に記述した任意の治療方法に使用するための医薬物の調製のために使用されるにすることができる。
【０１４０】
治療方法
新たな方法には、HSV-1感染のリスクがある（または感受性である）か、またはHSV-1感染と関連した障害およびTLR2活性と関連した障害の効果を有する対象を治療する、予防的および治療的方法を含む。本明細書に使用される「治療」という用語は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、治療、改善、和らげる、改善もしくは影響を及ぼす目的で、対象（たとえば、ヒト患者）に対する治療薬の適用もしくは投与、または疾患、疾患の症候、もしくは疾患に対する素因を有する対象由来の摘出組織もしくは株化細胞に対する治療薬の適用もしくは投与を含む。治療薬には、前記記述した小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４１】
一つの局面において、本発明は、対象に対してTLR2発現または少なくとも1つのTLR2活性を調整する薬剤を投与することによって、対象における、HSV感染と関連する異常な、もしくは望まれないTLR2発現または活性と関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。望まれないTLR2発現もしくは活性によって生じるか、または寄与する徴候についてのリスクのある対象は、たとえば本明細書に記述した診断もしくは予後アッセイ法のいずれか、または組み合わせによって同定することができる。予防薬の投与は、TLR2発現または活性に特徴的な症候の現われる前に行うことができ、その結果、TLR2活性の望ましくない効果（たとえば、HSV感染によって引き起こされる）が予防されるか、または代わりに、これらの進行が遅延される。
【０１４２】
たとえばTLR2阻害活性を示すことを証明する本明細書に記述した方法を使用して同定された化合物、たとえばTLR2活性を阻害する薬剤は、本発明に従って使用して、HSV感染と関連したTLR2を媒介した症候を予防および/または寛解させることができる。このような分子は、以下を含むことができるが、これらに限定されるわけではない：核酸、ポリペプチド、ペプチド、リンペプチド、小有機もしくは無機分子、または抗体（たとえば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは単鎖抗体、並びにFab、F（ab'）2、およびFab発現ライブラリー断片、scFV分子、並びにこれらのエピトープ結合断片を含む）。TLR2に対して特異的であり、かつTLR2活性を減少させる抗体を作製することができる。TLR2活性を減少させる抗体またはこれらの抗原結合断片は、HSV-1感染に関連した望ましくないTLR2を媒介した効果の治療のために有用である。
【０１４３】
また、TLR2の発現を阻害するアンチセンスおよびリボザイム分子は、本明細書に記述した方法に従って、TLR2発現のレベルを減少させ、したがって、効率的にTLR2活性のレベルを減少させるために使用することができる。また、三重らせん分子およびアプタマーを利用してTLR2活性のレベルを減少させることができる。アンチセンス、リボザイム、アプタマー、および三重らせん分子は、上で論議したとおりである。
【０１４４】
TLR2発現または活性を阻害する化合物は、たとえば新生児にHSV感染を予防し、治療し、または寛解させるために、治療的に有効な用量にて患者に対して投与することができる。治療的に有効な用量は、本明細書に記述したような、HSV感染を治療するために十分な化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療有効性は、本明細書に記述したような、標準的な薬学的手順によって決定することができる。
【０１４５】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いられる幅広い用量を処方するために使用することができる。このような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さないED50を含む循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いる投与剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してもよい。本発明の方法に使用されるいずれの化合物に関しても、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたIC50（すなわち、症状の最大阻害の半量を得る試験化合物の濃度）を含む循環中の血漿濃度範囲を得るように動物モデルにおいて（例えば、マウスまたは霊長類において）処方してもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１４６】
一部の態様において、治療化合物の治療的有効量（すなわち、有効投薬量）は、約0.001〜30mg/kg体重、好ましくは約0.01〜25mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜20mg/kg体重、およびさらにより好ましくは約1〜10 mg/kg、2〜9mg/kg、3〜8mg/kg、4〜7mg/kg、または5〜6mg/kg体重の範囲である。化合物は、1日あたり1回、2回、または3回投与することができ；または連続注入として提供することができる。場合によっては、化合物は、約1〜10週間、一般に2〜8週間、3〜7週間、または約4、5、もしくは6週間の間に週1回投与することができる。当業者であれば、疾患または障害の重篤度、これまでの治療、対象の全身健康および/または年齢、および存在するその他の疾患を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）特定の要因が、対象を有効に治療するために必要な投薬量および時期に影響を及ぼす可能性があることを認識すると考えられる。そのうえ、化合物の治療上有効な量による対象の治療には、一回治療が含まれ、または好ましくは一連の治療が含まれ得る。
【０１４７】
一部の態様において、たとえば抗体に関して、投薬量は、一般的に0.1mg/kg体重（一般的に10mg/kg〜20mg/kg）である。抗体が脳において作用する場合、通常50mg/kg〜100mg/kgの用量が適当である。一般的に、部分的なヒト抗体および完全なヒト抗体は、他の抗体よりもヒトの体内において長い半減期を有する。したがって、より低い用量およびあまり頻繁でない投与が可能なことが多い。脂質付加などの修飾を使用して抗体を安定化させ、組織の（たとえば、脳への）取り込みおよび浸透を増強することができる。抗体の脂質付加方法は、Cruikshank et al.（J. Acquir. Immune.Defic. Syndr. Hum. Retrovirol.,14 （3） ： 193-203 （1997））に記載されている。
【０１４８】
個体のための有効な用量の決定のもう1つの例は、試験対象の血清中の「遊離」および「結合した」化合物のレベルを直接アッセイする手法である。このようなアッセイ法は、分子インプリンティング技術によって作製された抗体擬態および/または「バイオセンサ」を利用し得る。TLR2活性を（たとえば、HSV感染細胞において）調整することができる化合物を鋳型または「インプリンティング分子」として使用して、これらが触媒試薬と重合する前に空間的に重合性単量体を組織化する。その後にインプリンティング分子を除去することにより、化合物の繰り返しの「陰性像」を含む重合体マトリクスが残り、生物学的アッセイ条件下で選択的に分子を再結合することができる（たとえば、Ansell et al., Curr. Op. Biotechnol.,7： 89-94 （1996）； Shea, Trends Polymer Sci.,2： 166-173 （1994））。このような「インプリントされた」アフィニティーマトリックスは、リガンド-結合アッセイに受け入れられ、これにより、固定されたモノクローナル抗体成分が適切にインプリントされたマトリックスによって置換される。この様式でのこのようなマトリックスの使用の例は、Vlatakis et al. （Nature,361： 645-647 （1993））に記述されている。同位元素標識化を使用することにより、TLR2の発現または活性を調整する化合物の「遊離」の濃度を容易にモニターし、IC50の算出に使用することができる。
【０１４９】
また、このような「インプリントされた」アフィニティーマトリックスは、光量子放射特性が標的化合物の局所的および選択的結合によって測定可能に変化する蛍光性の基を含むようにデザインすることができる。これらの変化は、適切な光ファイバー装置を使用してリアルタイムで容易にアッセイすることができ、次に試験対象における用量を、その個々のIC50に基づいて迅速に最適化することができること。このような「バイオセンサ」の基本例は、Kriz et al.（Anal. Chem., 67：2142-2144 （1995））において論議されている。
【０１５０】
化合物の適切な用量は、一般に、調整される発現または活性に関する化合物の能力に依存する。これらの化合物の1つまたは複数が、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物またはヒトに投与するときは、医師、獣医師、または研究者は、たとえば、最初に比較的低用量を処方して、その後に適当な反応が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、任意の特定の動物対象の特定の用量レベルも、使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、全身体重、全身健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および調節すべき発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１５１】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法によって、たとえば、LD50（集団における50%に致死的な用量）およびED50（集団における50%において治療的に有効な用量）を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表記することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小限にして、これにより副作用を減少させるために、このような化合物を患部組織の部位にターゲティングする送達系を設計するように注意しなければならない。たとえば、CNSへのTLR2発現または活性の阻害剤の直接送達（たとえば、CSFへの注入よる）は、使用することができる伝達方法である。
【０１５２】
もう一つの本発明の局面は、治療目的、たとえばHSV-1感染を治療するために、TLR2発現または活性を調整する方法に属する。したがって、例示的態様において、本発明の修飾方法は、細胞（たとえば、HSV感染細胞）を、TLR2の活性の1つまたは複数を減少させる化合物と接触させる工程を含む。TLR2活性を減少させることができる化合物は、核酸またはポリペプチドなどの本明細書に記述したような化合物になり得る。たとえば、化合物は、TLR2またはこれらの断片に特異的に結合する抗体（TLR2抗体）、TLR2アンタゴニスト、TLR2アンタゴニストのペプチド擬態、またはその他の小分子であることができる。その他の阻害剤の例は、TLR2に向けられたアンチセンス核酸分子またはsiRNA分子を含む。これらの修飾方法は、インビトロで（たとえば、薬剤と共に細胞を培養することによって）、または代わりに、インビボで（たとえば、対象に薬剤を投与することによって）行うことができる。したがって、本発明は、TLR2もしくは核酸分子の異常な、もしくは望まれない発現または活性によって特徴づけられるHSV感染にかかった個体を治療する方法を提供する。たとえば、このような活性は、新生児において望ましくない。一つの態様において、本方法は、TLR2発現または活性を調整する（たとえば、ダウンレギュレートする）薬剤（たとえば、本明細書に記述したスクリーニングアッセイ法によって同定された薬剤または薬剤の組み合わせ）を投与する工程を含む。
【０１５３】
実施例
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。本実施例は、例証の目的のみのために提供される。これらは、いかなる形であれ本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈されることはない。
【０１５４】
実施例1：HSV-1は、TLR2を経てサイトカインを誘導する
ヒト細胞が、これらの表面上のTLRの有無にかかわらず、KOS株単純ヘルペスウイルス-1に応答する能力を調べた。ヒトTLR2を発現するHEK293株化細胞は、Kurt-Jones et al.（Blood,100：860-868 （2002））に記載されているようにクローン化した。ヒトTLR3、TLR9、TLR4、およびMD2を発現するHEK293株化細胞は、Latz et al.（J. Biol. Chem.,277：47834-47843 （2002））に記述されている。HEK293株化細胞は、Lien et al.（J. Biol. Chem.,274：33419-33425 （1999））に記述された親HEK293細胞と同じ株に由来した。
【０１５５】
TLRを媒介したシグナリングの活性化をアッセイするために、GeneJuice(商標)トランスフェクション試薬を使用して、細胞にNF-κBホタル・ルシフェラーゼ・リポータ・プラスミドおよび対照ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ・プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされたHEK293細胞をウイルスまたはヒトIL-1-β（100ng/ml）での暴露の前に一晩インキュベートした。次いで、細胞を溶解して、ホタル・ルシフェラーゼ活性を、Dual-Glo(商標)Luciferase Assay System（Promega、Madison、Wisconsin）を使用して測定した。ルシフェラーゼ活性は、NF-κB非依存的ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対するNF-κB依存的ホタル・ルシフェラーゼ活性の比として、RLUで算出した。
【０１５６】
HSV-1 KOS株を本明細書に記述した実験に使用した。ウイルスは、ベロー細胞（アフリカミドリザルに由来する株化細胞）中で培養し、Brockman et al., J. Virol.,76：3678-3687 （2002）に記載されているように細胞上清から収集した。一般に、マウスには、マウスあたり109（成体または104（新生児）pfuのi.p.注射によって感染させた。血清は、Gel Sep(登録商標)チューブに収集した。脳を1%FCS（ウシ胎児血清）および0.1%のグルコースを含む氷冷無菌リン酸緩衝食塩水中にホモジナイズした。ウイルス力価は、Brockman et al.,前記に記述されているように、プラーク検定法で決定した。サイトカイン解析のためには、ホモジネートをComplete(商標)プロテアーゼ阻害剤（Roche、Indianapolis、IN）を含むPBSに1：1希釈して、ELISAによって解析した。ホモジネートは、解析前に-70℃で凍結して貯蔵した。
【０１５７】
生存曲線は、Stata Survival Analysis and Epidemiological Tables Reference Manual （Stata Statistical Software： Release 8.0., Stata Press,2003 College Station Texas）に記載されているように、ブレスロウの一般ウィルコクソン検定を使用して比較した。サイトカインレベルは、Stata Base Reference Manual（Stata Press, 2003）において記述されているように、コルモゴルフ-スミルノフ検定を使用して比較した。
【０１５８】
トランスフェクトしたヒト細胞（HEK293）での実験では、安定なTLR2トランスフェクタントが、HSV-1暴露に応答してNF-κBを活性化した（しかし、TLR3またはTLR4トランスフェクタントでは、活性化しなかった）ので、HSV-1は、TLR2を介してNF-κBを活性化することが明らかになった（図1A）。また、TLR9トランスフェクタントは、HSV-1（図1B）に対する感受性が鈍かったが、最近の報告では、HSV-1およびHSV-2が、TLR9を介してシグナルを送っている可能性をを示唆する Lund et al., J Exp Med, 198： 513-520 （2003）； Krug et al., Blood （2003）。これらのデータは、TLR2シグナリングがHSV-1感染によって活性化されることを証明する。
【０１５９】
HSV-1に関するシグナルトランスデューサーとしてのTLRの役割をさらに定義するために、野生型、TLR4ノックアウト、またはTLR2ノックアウトマウス由来の腹腔浸出細胞によるサイトカイン産生を調べた。
【０１６０】
TLR2、TLR4、またはTLR6が欠損したマウスをTakeuchi et al., J. Immunol.,165： 5392-5396 （2000）； Takeuchi et al., Int. Immunol.,13： 933-940 （2001）； Takeuchi et al., J. Immunol.,169： 10-14 （2002）；およびTakeuchi et al., Immunity,11： 443-451 （1999）に記載されているように遺伝子ターゲティングによって作製し、F2交配129×C57BL/6マウスとして提供した。対照マウスは、Jackson Laboratories（B6129F2/J., Bar Harbor、ME）から得たC57BL/6×129 F2マウスから繁殖した。全てのマウスを繁殖させて、感染に対するこれらの感受性に対する環境の効果を最小化するために、これらの実験にこれらを含める前に少なくとも3世代収容した（およびAnimal Facilityで同じ部屋に収容した）。
【０１６１】
野生型およびTLR4-/-マウス腹腔マクロファージは、HSV-1での暴露に応答してIL-6を産生した。対照的に、TLR2-/-マウス由来の腹腔マクロファージは、HSV-1暴露に応答してIL-6をほとんど産生しなかった（図1C）。対照培養でも、TLR2-/-マクロファージは、ザイモサン（TLR2リガンド）に応答することができなかったが、TLR4リガンドであるLPSに暴露したときにIL-6を分泌した。これらのデータは、TLR2シグナリングがHSV-1感染に応答して刺激されることを確証させる。したがって、TLR2シグナリングを崩壊させる化合物は、TLR2シグナリングによって媒介される、HSVで誘導された症候を治療するために有用である。
【０１６２】
TLR2は、TLR1またはTLR6と組み合わせてヘテロ二量体としてシグナル伝達すると考えられる。TLR6ノックアウト、TLR2ノックアウト、および野生型腹腔浸出細胞のHSV-1に対する応答を比較した。
【０１６３】
ノックアウトおよび対照マウスからの細胞を得るために、マウスに4%のチオグリコラーを注射して、腹腔浸出細胞（PEC）を4日後に収集した。PECを24ウェルプレートに1ウェルあたり106個でプレートにまき、ウイルス、フェノール抽出したLPS（リポ多糖（10ng/ml、TLR4リガンド）、ザイモサン（10μg/ml、TLR2リガンド）、IL-1□（100ng/ml）、または培地単独に暴露した。IL-6およびMCP-1レベルを、BD Pharmingen OptEIA(商標)（San Diego, California）およびR&D DuoSet(登録商標)（Minneapolis、Minnesota）キットを使用してELISAによって決定した。全てのアッセイ法は、2回行った。
【０１６４】
野生型およびTLR6-/-腹腔マクロファージは、両方とも、HSV-1に暴露したときにIL-6を分泌し（図1D）、TLR6は、HSV-1で誘導されるシグナリングに必要とされなかったことを示す。したがって、TLR1/TLR2ヘテロ二量体は、HSV-1感染と関連するTLR2シグナリングのメディエーターである。したがって、TLR1およびTLR2間の会合を崩壊させる化合物は、HSV感染を治療するための候補化合物である。
【０１６５】
IL-6に加えて、HSV-1に暴露すると、野生型およびTLR4-/-由来の腹腔マクロファージからのMCP-1分泌を誘導したが、TLR2-/-マウスでは、誘導しなかった。HSV-1によるサイトカインの誘導は、100までの感染効率にて用量依存的であった（図1Bおよび1C）。生きたHSV-1およびUV照射を受けたHSV-1は、両方ともマウスマクロファージからのIL-6分泌を誘導したことがら、サイトカイン誘導のためにウイルスの複製は必要とされなかったことを示す。
【０１６６】
実施例2：TLR2を欠損したマウスは、致死的HSV-1暴露に耐性である
HSV感染の間のインビボにおけるTLR2の役割を、致死的HSV-1脳炎のマウスモデルを使用して調べた。マウスには、i.p.で送達してHSV-1 KOS株で感染させた。次いで、マウスを脳炎または死亡についてモニターした。全身不随および/または発作を示す瀕死の動物は、屠殺した。野生型動物は、速やかに感染に屈したが、TLR2-/-マウスがでは、死亡が遅延し、死亡率が全体的に減少した。8匹のTLR2-/-マウスのうちの5匹は、1〜2×109 pfuのKOSウイルスによる暴露で生存し、8匹の野生型マウスのうちの2匹だけが生存した（図2、P=0.03ウィルコクソン検定）。また、野生型またはTLR4-/-マウスと比較して、TLR2-/-マウスにおいて症候が減少した。別々の研究（マウスは、脳サイトカインレベルのために4日にて屠殺した）、8匹の野生型のうちの6匹および8匹のTLR4-/-マウスのうちの6匹が、部分的または総麻痺および/または発作を示した、8匹のTLR2-/-マウスのうちのわずか3匹は、症候があった。TLR2-/-マウスの症候は、野生型およびTLR4-/-マウスよりも軽度であった。たとえば、TLR2-/-マウスは、いずれも全身不随または発作を有さなかった。
【０１６７】
これらのデータは、TLR2シグナリングが、感染動物で観察されるHSV感染の重篤な症候に関与することを示す。さらに、これらは、TLR2シグナリングの除去が、動物の感染生存能力に有意な改善を生じさせ、症候の重篤度を減少させることを証明する。
【０１６８】
実施例3：新生児のHSV-1死亡率は、TLR2-/-マウスにおいて野生型よりも高い
成体マウスは、ヒト成人と同様に、HSV-1暴露に屈する可能性は低い。一方、新生児は、致死的HSV-1に対して非常に感受性が高い。したがって、本発明者らは、HSV-1暴露に対する4日齢マウスの応答を調べた。新生児には、104pfu HSV-1をi.p.で注射して、少なくとも4日間モニターした（図3）。全ての新生児は同様であり、通常、感染後の最初の4〜5日間に発病した。野生型およびTLR4-/-新生児は、感染6日後にHSV-1暴露に屈した（90%＞死亡率）。対照的に、60%を超えるのTLR2-/-新生児は、HSV-1暴露で生存した。目立って、少なくとも50%のTLR2-/-マウスは、全2週の研究期間の間に症候がなく、別の12%のTLR2-/-新生児は、軽度の一過性の症候のみを示した。TLR4-/-マウスは、野生型マウスと見分けがつかず、麻痺が速やかに発症し、感染6日後に死亡した（図3）。
【０１６９】
データは、TLR2シグナリングが、新生児におけるHSV感染の重篤な有害作用を媒介すること、およびTLR2シグナリングの減少が、生存を改善し、新生児におけるHSV感染に関連した症候の重篤度を減少することを証明する。
【０１７０】
実施例4：野生型（TLR2ノックアウトマウスではない）では、HSV-1暴露後に高い血清IL-6レベルを有する
インビボにおけるサイトカイン産生に対するTLR2欠損の効果を、HSV-1感染した動物において調べた。野生型マウスおよびTLR2-/-マウスをHSV-1に暴露した（2×109 pfu HSV-KOS i.p.）。IL-6のレベルの上昇は、野生型マウスの感染1日後の血清において見いだされたが、TLR2-/-マウスでは、これらの血清中にごくわずかなIL-6しか有さなかった（図4、P<0.004）。同様に、MCP-1は、感染1日後の血清において検出された。血清サイトカインレベルは、感染2日後までにベースラインに戻った。
【０１７１】
これらの研究は、HSV-1感染の炎症性サイトカインの急性産生が、感染した宿主におけるTLR2発現に依存的であったことを示す。
【０１７２】
実施例5：MCP-1レベルは、野生型（TLR-2ノックアウトマウスではない）の脳において上昇する
免疫応答に必須であることが多いサイトカインに加えて、TLRとの相互作用も、宿主細胞からのMCP-1などのケモカインの産生を誘導する。したがって、MCP-1のレベルを、i.p.で送達して（109pfu HSV i.p.）HSV-1 KOSで感染させた野生型、TLR2-/-、およびTLR4-/-マウスにおいてアッセイした。この用量では、野生型において4日目に50%致死であったが、TLR2-/-マウスでは、50%致死でなかった。野生型マウスでは、4日目に脳内出血で瀕死であることが見いだされたが、TLR2-/-マウスでは、見いだされなかった。MCP-1レベルは、ELISAによって脳ホモジネートにおいて測定した。野生型およびTLR4-/-マウスは、これらの脳において暴露後1日に高いMCP-1レベルを示した。全てのマウスにおいて、MCP-1レベルは、暴露後2および3日でベースラインに戻った（<10pg/ml）。脳炎の症候（たとえば、動物は、瀕死であり、出血し、発作を有し、麻痺し、痙攣性肢動作、または鼓脹した）が4日目に現われたときに、脳におけるMCP-1産生の第二波が、野生型およびTLR4ノックアウトマウスにおいて検出された（図5A）。TLR4-/-マウスにおける脳MCP-1レベルは、野生型マウスのレベルと見分けがつかなかった（P=1.00）。対照的に、有意に低レベルのMCP-1が、TLR2-/-マウスの脳において検出された（図5A、P=0.02）。MCP-1産生が増大されたのと同時に、有意な出血が、野生型脳組織において現われたが、TLR2-/-脳は、全体に正常な外見を有した。
【０１７３】
したがって、HSV-1感染に応答するTLR2シグナリングの活性化を阻害する化合物は、HSV-1に感染したが、化合物で処置されていない対照と比較して、MCP-1発現または活性を減少すると考えられる。また、このような化合物は、対照と比較して出血を減少させ、化合物で治療した感染動物の全体の脳形態は、対照（たとえば、正常）と比較して改善されている。
【０１７４】
HSV-1ウイルスは、TLR2-/-、並びに野生型およびTLR4-/-マウスの脳において検出されたが、ウイルスのレベルは、群間で有意な相違はなかった（図5B）。これらのデータは、ウイルスの感染力がTLR2の欠如に有意な影響を受けないと共に、TLR2シグナリングが存在しないと、ウイルス感染の効果を寛解させることができることを証明する。
【０１７５】
また、これらのデータは、HSV-1感染のTLR2を媒介した症候を治療するために有効な化合物にとって、ウイルスの感染力を減少させることは必要ないことを証明する。
【０１７６】
実施例6：野生型およびTLR4ノックアウト（しかし、TLR2ノックアウトマウスではない）は、HSV-1暴露後に、脳に炎症性病変を有する
HSV感染したマウス由来の脳の顕微鏡検査により、単核細胞浸潤および野生型およびTLR4ノックアウトマウスの髄質における顕著な血管周囲のカフィング（cuffing）が明らかになった。対照的に、TLR2ノックアウト動物は、正常な排臨脳組織を有した（図6A-I）。TLR2-/-マウスの脳におけるウイルス力価は、TLR4-/-および野生型マウスの脳におけるものと異ならなかったので（図5B）、TLR2ノックアウト脳における明らかな病態がないことは、特に目立った。したがって、ウイルス自体よりも、むしろ宿主反応が、HIV感染症に応答する脳における病的変化の原因でなる。
【０１７７】
HSV感染したマウスにおける脳病病態の顕微鏡検査により、TLR2シグナリングを減少させる化合物が脳におけるHSV感染の有害作用を減少させるために有効であるかどうかを決定するためのさらなるアッセイ法が提供される。
【０１７８】
実施例7：HSV-2に対する応答におけるTLR2の役割
上記した実験では、HSV-1に対して応答する反応におけるTLR2の役割を確認したが、HSV-2に対する応答におけるTLR2の役割は確認しなかった。新生児疾患は、肝臓および脳の両方の破壊的病巣を含み得るが、多くの特色が、これらのウイルスがTLRを刺激する能力に関連している可能性のある「敗血症様」の画像を示す。
【０１７９】
宿主タンパク質（特に、サイトカインおよびケモカイン）の転写に対するHSV感染の効果を調べるために、およびHSV-1とHSV-2とに対する応答を比較するために、HSV-1並びにHSV-2がヒト末梢血単核細胞からサイトカイン（ケモカイン）応答を誘導する能力を調査した（図7A）。HSV-1およびHSV-2のいずれかへの暴露により、ヒト末梢血単核細胞からのサイトカイン（IL-6）およびケモカイン（IL-8）分泌を用量依存的様式で活性化した（図7A）。HSV-1およびHSV-2は、それぞれTLR2をトランスフェクトしたHEK細胞におけるNF-κB活性化を誘導したが、いずれのウイルスも、TLR4を発現するHEK細胞または対照HEK細胞においてNF-κBを活性化しなかった（図7B）。これらの実験では、細胞暴露前にウイルスをUV不活性化してあり、ウイルス複製が、NF-κBの活性化またはサイトカイン分泌の刺激のために必要ではなかったことを示す。本明細書に記述したように、ノックアウトマウスで行った実験により、HSV-1およびHSV-2によって誘導されるサイトカイン産生のためにTLR2が絶対必要であることが明らかになった。
【０１８０】
したがって、正常な成体白血球は、これらの炎症性サイトカインの産生によって測定すると、HSV-1およびHSV-2の両方の暴露に対して強い自然免疫応答を展開する。これらの研究では、不活性化したウイルスを使用しており、またウイルス自体によって生じ得るいずれのさらなる組織破壊の原因にもならないため、HSV-2と比較して、HSV-1で観察されるインビトロでの応答の相対的な程度は、臨床結果と十分な相関がない可能性がある。これらの応答を見るためには高い感染効率が必要であり、TLR応答をトリガーするために必要なウイルスの閾値レベルがあることを示唆する。
【０１８１】
実施例8：新生児および成体の細胞におけるサイトカイン反応
新生児は、成体と比較して、一定の微生物の病原体に対するサイトカイン応答を強調した証拠がある（Karlsson et al., Infect. Immun., 70：6688-96 （2002））。
【０１８２】
これらの観察をHSV-1に対する応答にも適用されるかどうかを決定するために、新生児および成体の細胞のサイトカイン応答を比較した。健康な新生児および成体のこのコホートにおいて、HSV-1暴露に応答するサイトカイン（IL-6およびIL-8）分泌を、全血アッセイ法を使用して定量化した。全血アッセイ法では（図8A-B）、サイトカイン分泌のレベルは、細胞あたりに基づいて、単離された単核細胞の培養におけるレベルよりも低い（図7A-B）。しかし、全血には、多形核および単核細胞が表されている。そのうえ、全血培養では、CD14などの可溶性付属タンパク質の供与源として、外来性のウシ胎児血清ではなく、むしろ自己血清を使用する。したがって、全血アッセイ法は、微生物暴露に対する応答に対して、より正確にドナー機能的能力を反映する可能性が高い。高いレベルの血清サイトカインを有した播種性HSV-1疾患である新生児の臨床症例に基づいて、HSV-1に対する成体および新生児のサイトカイン応答を調べた。IL-6応答の解析により、新生児由来の臍帯血細胞は、HSV刺激に応答して、成体血液細胞よりも有意に高いレベルのIL-6を産生することが明らかになった（図2A）。同様に、新生児血液細胞は、成体血液細胞よりも高レベルのIL-8を分泌した（図2B）。
【０１８３】
したがって、HSVに対する新生児の宿主応答の調査では、成体よりもHSVに応答して、より少ないIL-6およびIL-8を産生するのではなく、むしろ新生児は、成体よりも多くのこれらのサイトカインを産生することを示す。
【０１８４】
なぜ、新生児で見られる疾患は、粘稠の子供または成体で見られるものとこれほど異なるのか？新生児の宿主応答は、多くの方法で不完全である。多形核白血球産生および遊走における欠陥、並びに補体レベルおよびインターフェロン産生が考証された（Kohl et al., J. Immunol., 136：3038-44 （1986）；Wilson、J. Pediatr.,108：1-12 （1986））。加えて、新生児動物のマクロファージは、成体マウス由来のマクロファージよりも低い抗ウイルス活性を有する（Hirsch et al., J. Immunol.,104：1160-5 （1970））。したがって、新生児は、成体よりも高いウイルスレベルを有することが予想される。しかし、大部分の感染症の症候（たとえば、発熱、血管不安定性、または血小板減少症）は、細菌またはウイルス侵入者それ自体によって引き起こされるのではなく、これらの微生物上の抗原に対する宿主応答によって引き起こされると考えられる。
【０１８５】
本明細書に記述したデータは、HSV-1に対する過増殖新生児サイトカインおよびケモカイン応答を示しており、成体と比較して新生児におけるヘルペス群ウイルスの独特の臨床症状について説明する可能性を提供する。成体よりも応答性ではないことよりも、むしろ一定の抗原に対する新生児の応答、特に自然応答がTLR2を介している応答は、成体で見られるものよりもさらに強力である（Karlsson et al., Infect. Immun., 70：6688-96 （2002）；Schultz et al., Pediatr. Res., 51：317-22 （2002））。
【０１８６】
播種性新生児ヘルペスウイルス感染の典型となる知見の臨床的布置は、発熱、頻脈、血行動態不安定性、および検査的異常（白血球増多症および血小板減少症を含む）を含む。これらの臨床的および検査的知見は、一般に炎症性のサイトカインの産生に関連している。トキソプラスマ（Mun et al., Int. Immunol., 15：1081-7 （2003））、サイトメガロウイルス（Compton et al., J. Virol., 77：4588-96（2003））、およびHSV（および、おそらく風疹）は、全てTLR2リガンドであるという知見は、TORCH疾患に共通の臨床的特徴（McIntosh, Viral Infections of the Fetus and Newborn, in Avery and Taeusch, Eds., Schaffer' s Diseases of the Newborn. 5th ed., Philadelphia, PA, W. B. Saunders,1984； Overall, Jr. and Glasgow, J. Pediatr.,77： 315-33 （1970））が、TLR2とこれらの病原体の共通の相互作用に関連し得ることを示唆する。したがって、表面上のTLRタンパク質を結合して、遮断する療法は、これらの疾患の治療に有用である可能性が高い。
【０１８７】
その他の態様
本発明は、これらの詳細な説明と組み合わせて記述したが、前述の記述は、本発明の範囲を例証しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことが企図されることが理解されるはずである。その他の局面、利点、および修飾も、特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図1Aは、ヒトTLR2、TLR3、またはTLR4 MD2を発現するヒト胚腎臓細胞（HEK293）にNF-κB駆動ホタル・ルシフェラーゼ・リポータープラスミドをトランスフェクトして、100の感染効率（MOI）にて単純ヘルペスウイルス１（KOS株）で、または陽性対照としてIL-1β（100ng/ml）で6時間刺激した実験の結果を示す棒グラフである。ルシフェラーゼ活性は、NF-κB非依存的ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対するNF-κB依存的ホタル・ルシフェラーゼ活性の比として、RLU（相対的ルシフェラーゼ単位）で算出した。結果は、3つのウェルの平均±SDとして示してある。それぞれの株化細胞を3〜10回の独立した実験で試験した。  図1Bは、ヒトTLR2またはTLR9を発現するHEK293細胞をHSV-1 KOS（MOI 3〜100、CpG DNA（0.1〜3μM）、GpC対照DNA（0.1〜3μM）、または培地単独で暴露した実験の結果を図示するグラフである。NF-κBルシフェラーゼ活性は、上記のとおりに測定した。  図1Cは、野生型またはTLR2-/-もしくはTLR4-/-マウス由来の腹腔浸出細胞を培地単独で、または1、10、および100のMOIのHSV-1 KOSで刺激した実験の結果を示す棒グラフである。IL-6レベルは、刺激の16時間後に収集した上清で測定した。結果は、二つのウェルの平均±SDとして示してある。それぞれのマウス株は、少なくとも3回の独立した実験にて試験した。  図1Dは、野生型、TLR6-/-、またはTLR2-/-、腹腔浸出細胞をHSV-1 KOS（MOI 100）、Pam2CSK4（100ng/ml、TLR2/TLR6リガンド）、またはLPS（10ng/ml TLR4リガンド）に暴露した実験の結果を図示す棒グラフである。IL-6レベルは、上記のとおりに測定した。
【図２】成体野生型（黒四角）またはTLR2-/-（白丸）マウス群をi.p.で送達した109 pfuのHSV-1 KOSウイルスに暴露した実験の結果を示す線グラフである。マウスは、暴露後1週間観察した。マウスで見られたHSV-1感染の症候は、無気力、乱れた毛皮、後肢麻痺、および発作を含んだ。全ての生存マウスは、症候がなかった。それぞれの群には、8匹のマウスを含み、4日目におけるTLR2-/-対野生型マウスは、P＜0.03。
【図３】4日齢の野生型（黒四角）、TLR4-/-（白三角形）、またはTLR2-/-、（白丸）マウス群を、i.p.送達した104pfuのHSV-1 KOSウイルスに暴露した実験の結果を示す線グラフである。マウスは、暴露後3週間観察した。新生児マウスで観察されたHSV-1感染の症候は、痙攣性肢動作、後肢および全身不随、および鼓脹を含んだ。群あたり14〜17匹のマウスがおり、6日目におけるTLR2-/-対野生型マウスについてP＜0.001。
【図４】109 HSV-KOS i.p.を感染させたか、または感染させていない野生型（白三角形）またはTLR2-/-（白丸）マウスの実験の結果を示すグラフである。血液を感染24時間後に収集し、血清IL-6レベルは、ELISAによって決定した。（24時間におけるTLR2-/-対野生型についてP=0.004）。
【図５】図5Aは、HSV-1 KOS感染した野生型（白三角形）、TLR2-/-（白丸）、およびTLR4-/-（白四角）マウスの脳におけるMCP-1のレベルを、ELISAを使用して決定した実験の結果を示すグラフである。個々の脳におけるMCP-1レベルを示してある。MCP-1の幾何平均レベルは、バーによって示してある。  図5Bは、感染させた野生型（白四角）、TLR2-/-（白丸）、およびTLR4-/-（白三角形）マウスの脳においてウイルス力価を決定した実験の結果を示すグラフである。結果は、i.p.送達したウイルスでの暴露の4日後の感染マウスの脳におけるHSV-1 KOSのプラーク形成単位（pfu）の数として表してある。個々の脳におけるウイルスのレベルを示してある。幾何平均pfuは、バーによって示してある。
【図６】図6A-Iは、HSV-1 KOS感染マウスからの一連の組織病理脳切片である。切片は、i.p.で送達したHSVで感染の4日後の野生型の（6A、DおよびG）、TLR4-/-（6B、E、およびH）、TLR2-/-（6C、F、およびI）マウスの小脳からのヘマトキシリン/エオシン染色切片の顕微鏡写真の複製である。図6A-Cは、単核細胞が野生型およびTLR4ノックアウトにおいて浸潤することを図示する髄膜の顕微鏡写真である。TLR2ノックアウトマウスの髄膜は、正常であった。図6D-Fは、野生型およびTLR4ノックアウトにおける単核細胞浸潤および活性化されたグリア細胞の存在を証明する小脳の顕微鏡写真である。TLR2ノックアウトマウスからの小脳の組織は、正常であった。図6G-Iは、野生型およびTLR4ノックアウト脳における内皮表面に沿って単核細胞が蓄積している血管、並びに血管周囲のカフィングを図示する顕微鏡写真である。TLR2ノックアウトマウスの脳の血管は、正常であり、炎症性単核細胞蓄積の証拠を伴わなかった。
【図７】図7Aは、UV不活性化されたHSV-1、UV不活性化されたHSV-2、またはLPS（陽性対照）で18時間刺激したヒト末梢血単核細胞を示す棒グラフである。培養液上清中のIL-8およびIL-6レベルは、ELISAによって測定した。全ての実験は、複数回繰り返し、同一の結果であった。示したエラーバーは、3つのウェルに基づいている。  図7Bは、NF-κB駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子および対照ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトしたヒトTLR2/CD14またはTLR4/MD2を発現するヒト胚腎臓（HEK）293細胞および対照HEK細胞を示す線グラフである。細胞は、HSV-1（KOS株）およびHSV-2（186株）の感染の多重性（MOI）を変化させて、またはTNF-α（陽性対照）で6時間刺激した。感染力を除去するために、細胞を刺激する前にウイルスを紫外光に曝露した。示したMOIは、UV不活性化の前の力価に基づいた。ルシフェラーゼ活性は、DualGlo(商標)試薬を使用して測定して、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を使用して規準化した。
【図８】図8Aおよび8Bは、HSV-1に対する成体および新生児のサイトカイン反応の比較の結果を示す点プロット線である。10人の健康な新生児からの臍帯血細胞および4人の健康な成体からの末梢血を18時間HSV-1（MOI 40）で刺激した。培地単独の値（バックグラウンド）を減算した。P値を、順位和検定（マン-ホイットニー）を使用して算出し、群を比較する。8A：IL-6レベル（P=0.033）は、ELISAによって測定する。8B：IL-8レベル（P=0.066）は、ELISAによって測定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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