(57)【要約】本発明は、哺乳動物の血漿におけるコレシストキニン（ＣＣＫ）の基礎レベルを維持するための方法、またはコレシストキニン（ＣＣＫ）のレベルを低下させるための方法に関する。さらに、本発明は、哺乳動物における痛みを処置するための方法、より具体的には、哺乳動物における腹痛を処置するための方法を提供する。上記方法は、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。本発明の方法は、急性膵炎または慢性膵炎および関連した状態を患う哺乳動物における腹痛を処置するために、特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において腹痛を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、該哺乳動物に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
哺乳動物において食物の投与の後にコレシストキニン（ＣＣＫ）の最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）を低下させるための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、食物と共に該哺乳動物に投与する工程
を包含し、該低下は、（ａ）食物投与の後の該プロテアーゼの非存在下における該Ｃｍａｘを（ｂ）食物投与の後の該プロテアーゼの存在下における該Ｃｍａｘと比較することによって測定され、そして該低下は、
（ｉ）少なくとも約１０％〜約２５％の低下；
（ｉｉ）少なくとも約２５％〜約５０％の低下；
（ｉｉｉ）少なくとも約５０％〜約７５％の低下；および
（ｉｖ）少なくとも約７５％〜約１００％の低下
からなる群より選択される、方法。
【請求項３】
哺乳動物においてＣＣＫ関連疾患を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、該哺乳動物に投与する工程
を包含し、該プロテアーゼを投与した後の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルは、該プロテアーゼを投与する前の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルに満たないかまたは同じレベルであり、そして該プロテアーゼを投与した後の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルは、
（ａ）該プロテアーゼの投与の０時間後と約４時間後との間；
（ｂ）該プロテアーゼの投与の０時間後と約８時間後との間；および
（ｃ）該プロテアーゼの投与の０時間後と約１２時間後との間
からなる群より選択される期間の間、該プロテアーゼを投与する前の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルに満たないかまたは同じレベルであり続ける、方法。
【請求項４】
哺乳動物において腹痛を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、該哺乳動物に投与する工程
を包含し、該プロテアーゼを投与した後の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルは、該プロテアーゼを投与する前の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルに満たないか、または同じレベルであり、そして該プロテアーゼを投与した後の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルは、
（ａ）該プロテアーゼの投与の０時間後と約４時間後との間；
（ｂ）該プロテアーゼの投与の０時間後と約８時間後との間；および
（ｃ）該プロテアーゼの投与の０時間後と約１２時間後との間
からなる群より選択される期間の間、該プロテアーゼを投与する前の該哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルに満たないか、または同じレベルであり続ける、方法。
【請求項５】
哺乳動物において腹痛を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、該哺乳動物に投与する工程
を包含し、該プロテアーゼは、該哺乳動物においてコレシストキニン（ＣＣＫ）の最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）の低下を引き起こし、該低下は、（ａ）食物投与の後の該プロテアーゼの非存在下における該Ｃｍａｘを（ｂ）食物投与の後の該プロテアーゼの存在下における該Ｃｍａｘと比較することによって測定され、そして該低下は、
（ｉ）少なくとも約１０％〜約２５％の低下；
（ｉｉ）少なくとも約２５％〜約５０％の低下；
（ｉｉｉ）少なくとも約５０％〜約７５％の低下；および
（ｉｖ）少なくとも約７５％〜約１００％の低下
からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
哺乳動物において腹痛を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、該哺乳動物に投与する工程
を包含し、該プロテアーゼは、該哺乳動物において血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルの低下を引き起こす、方法。
【請求項７】
哺乳動物において腹痛を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、食物と共に該哺乳動物に投与する工程
を包含し、該プロテアーゼは、食物の投与の間に該プロテアーゼが存在しない場合の該哺乳動物におけるＣＣＫの最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）と比較して、該哺乳動物におけるＣＣＫのＣｍａｘを低下させる、方法。
【請求項８】
哺乳動物における食欲不振を処置するための方法であって、該方法は、
治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含有する組成物を、該哺乳動物に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
前記非膵臓プロテアーゼが、アスパラギン酸ペプチダーゼ、チオールペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼ、アルカリペプチダーゼ、セミアルカリペプチダーゼ、中性プロテアーゼ、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非膵臓プロテアーゼが、セアプローゼ、セラペプターゼ、プロナーゼ、プロナーゼ成分またはそれらの混合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記非膵臓プロテアーゼが、結晶性形態、半結晶性形態または非晶質形態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、賦形剤またはキャリアをさらに含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記賦形剤が、塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマーおよびポリアミノ酸からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、リパーゼおよびアミラーゼからなる群より選択される１種以上の酵素をさらに含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療上有効な量の前記非膵臓プロテアーゼが、１用量あたり約５，０００ＵＳＰ単位〜約１，０００，０００ＵＳＰ単位である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療上有効な量の前記非膵臓プロテアーゼが、１用量あたり約５，０００ＵＳＰ単位〜約７５０，０００ＵＳＰ単位である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療上有効な量の前記非膵臓プロテアーゼが、１用量あたり約５，０００ＵＳＰ単位〜約５００，０００ＵＳＰ単位である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療上有効な量の前記非膵臓プロテアーゼが、１用量あたり約５，０００ＵＳＰ単位〜約２５０，０００ＵＳＰ単位である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非膵臓プロテアーゼが、多官能性架橋剤、ホモ二官能性架橋剤、ヘテロ二官能性架橋剤、０次架橋剤、ジアルデヒド架橋剤、ハロトリアジン架橋剤、ハロピリミジン架橋剤、無水物架橋剤、ハロゲン化物架橋剤、Ｎ−メチロール化合物、ジイソシアネート架橋剤、ジイソチオシアネート架橋剤およびアジリジン架橋剤からなる群より選択される架橋剤で架橋されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記非膵臓プロテアーゼが、液体、固体、懸濁物または分散物として、前記哺乳動物に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロテアーゼが、経口経路、経腸経路または非経口経路によって前記哺乳動物に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼが、酸抑制剤の同時投与を伴わずに、経口経路によって前記哺乳動物に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記非膵臓プロテアーゼが、スラリー、錠剤、カプレット、カプセル剤または糖剤として前記哺乳動物に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記非膵臓プロテアーゼが、非腸溶コーティングされた錠剤として前記哺乳動物に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記非膵臓プロテアーゼが、１回の食事あたり錠剤１個と錠剤６個との間の用量で哺乳動物に投与され、該錠剤は、
（ａ）約２０ｍｇ〜約５００ｍｇの間；
（ｂ）約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの間；および
（ｃ）約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの間
からなる群より選択される活性プロテアーゼレベルを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記非膵臓活性プロテアーゼが、１回の食事あたり１個以上の錠剤として哺乳動物に投与され、該錠剤は、
（ａ）哺乳動物１ｋｇあたり約１ｍｇと哺乳動物１ｋｇあたり約１０ｍｇとの間；
（ｂ）哺乳動物１ｋｇあたり約１ｍｇと哺乳動物１ｋｇあたり約３ｍｇとの間；および
（ｃ）哺乳動物１ｋｇあたり約１ｍｇと哺乳動物１ｋｇあたり約２ｍｇとの間
からなる群より選択される活性プロテアーゼ用量を提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記非膵臓プロテアーゼが、結晶の形態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記非膵臓プロテアーゼが、セアプローゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記腹痛が、膵臓機能不全、急性膵炎、慢性膵炎、嚢胞性線維症または術後胃腸手術に関連する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づいて、２００３年１０月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５１５，５５２号、および２００３年１２月５日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５２７，４９０号の利益を主張し、それらの開示は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）濃度を維持するための方法に関する。さらに、本発明は、哺乳動物における痛みを処置するための方法、およびより具体的には、哺乳動物における腹痛を処置するための方法を提供する。本発明の方法は、非膵臓プロテアーゼまたはそれらを含む組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する。これらの方法は、急性または慢性の膵炎を患う哺乳動物における腹痛を処置するために、特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
消化は、摂取した食物が、容易に吸収される栄養成分（ビタミンおよび微量元素を含む）に分解されることによる、生理学的プロセスである。摂取に続いて、食物は、胃腸（ＧＩ）管の種々の節を通過し、そして消化が、主に消化酵素によって行われる。このプロセスに欠くことのできない消化酵素の３つの群としては、プロテアーゼ（タンパク質の消化のため）、リパーゼ（脂肪の消化のため）およびアミラーゼ（炭水化物の消化のため）が挙げられる。
【０００４】
食物の消化および栄養分の吸収は、小腸で起こる。そこで、摂取した食物は、迅速な吸収のために、消化酵素によって分解される。ほとんどの消化酵素は、膵臓によって分泌され、膵管を通して小腸に到達する。
【０００５】
ラットの上部小腸に位置するトリプシンインヒビターが、膵酵素の分泌を刺激したという１９７０年代初期における観測は、トリプシンおよびキモトリプシンが、膵臓による消化酵素の分泌を制御するために重大な意味を持つという理解をもたらした（非特許文献１）。同様に、上部小腸由来の胆汁および膵液の除去または転換（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）もまた、膵酵素の分泌を刺激すると観測された。これらのデータは、以下のネガティブフィードバック機構を示唆した：膵酵素の分泌の刺激は、小腸の内腔内のトリプシン活性のレベルによって制御される。
【０００６】
膵臓機能不全の場合において、膵臓は、正常な消化プロセスを維持するための十分な量の消化酵素を産生および／または分泌できない。この不全は、代表的に消化不良を引き起こし、次に、吸収不良を引き起こす。膵臓機能不全は、疾患（例えば、膵炎（急性および慢性の形態の両方）および嚢胞性線維症）、およびＧＩ外科手術後の一部において、その膵臓機能不全を表す。
【０００７】
慢性および急性の膵炎は、線維症および膵臓の外分泌機能の不可逆的損失によって特徴付けられる疾患である。この疾患はまた、膵臓内の消化酵素の放出および活性化によって特徴付けられ、器官自体の自己消化を引き起こす。一部の患者が、上皮小体の外科的切除によって処置されているが、慢性膵炎は、世界中で、ほとんど対処できない疾患である（非特許文献２）。米国単独におけるこの疾患についての罹患率は、毎年１００，０００人を超える（非特許文献３）。
【０００８】
現在まで、膵臓機能不全のための治療は、主に、リパーゼ成分、プロテアーゼ成分およびアミラーゼ成分を含む、経口投与されたブタの膵酵素抽出調製物に基づいている。そのような酵素調製物は、代表的に、脂肪便（脂肪の消化不良／吸収不良に起因する、脂肪の排泄）の処置のために高レベルのリパーゼを含み；一方で、高プロテアーゼレベルは、一般に、窒素便（ａｚｏｔｏｒｒｈｅａ）（タンパク質の消化不良／吸収不良に起因する、タンパク質の排泄）を処置する際により効果的であると考えられる。数個の理由のために、そのような膵臓抽出物は、腹痛の処置のためにある程度の成果を示している。プロテアーゼは、そのような抽出物のうちの比較的少ない割合のみを構成し、その画分内に、さらにより少量のトリプシンを構成する。
【０００９】
膵臓機能不全患者において痛みの原因となる機構は、ほとんど理解されていないままである（非特許文献４；非特許文献５）。
【００１０】
腹痛を含む、痛みの根底となる１つの提案された機構は、コレシストキニン（以下「ＣＣＫ」）の誘発、十二指腸の粘膜の上皮細胞によって放出されるペプチド、および腸の神経系に関連しており、栄養分の消化を調節する。ＣＣＫの増加は、膵臓由来の破壊的な酵素の放出を刺激することが、示されている。上皮細胞由来のＣＣＫの放出は、２つの他のペプチド（モニターペプチドおよび腸管のＣＣＫ放出因子（ＣＣＫ−ＲＦ））の分泌によって調節され、特定の内分泌性細胞表面レセプターと相互作用する（非特許文献６）。これらのペプチドの両方を分解し得る腔内のトリプシンは、ＣＣＫの放出を阻害して、その結果、膵酵素の分泌を阻害する。トリプシンインヒビターおよび食物が、トリプシン結合基質としての機能を果たすために存在する場合、逆の効果が、達成される。その結果として、ＣＣＫの持続性の増加が、膵酵素産生の連続的な刺激を引き起こし、次いで、痛みを引き起こし得る。この機構に基づいて、慢性膵炎およびその関連した痛みについての１つの提案された処置は、混合された長さのポリペプチドおよび中鎖トリグリセリドを含むエマルジョンを使用してＣＣＫレベルを制御することを追求することである（特許文献１）。
【００１１】
痛みの減少が、ブタの膵酵素の補充療法で報告されているが、痛みを処置するためのプロテアーゼの役割は、一般的に、不明なままである。例えば、ある研究は、アミラーゼまたはリパーゼを用いてないが、膵臓プロテアーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンを用いる十二指腸内の灌流が、慢性膵炎を患う患者における膵臓の外分泌を抑制することを示している（非特許文献７）。他の研究は、そのような膵臓プロテアーゼが、痛みの減少における主要な要因ではないが、しかし、代わりにそれらが、痛みの減少のためにリパーゼ成分およびアミラーゼ成分と相乗的に作用することを報告している（非特許文献８；非特許文献９）。対照的に、他の研究は、膵臓プロテアーゼ処置または抽出物処置の後に、痛みの改善はないと報告している（非特許文献１０；非特許文献１１）。いくつかの場合において、大量の酵素で処置された患者は、腹部の痙攣を発現する傾向がある（非特許文献１２）。
【特許文献１】国際公開第９８／３６７３４号パンフレット
【非特許文献１】Ｇ．Ｍ．ＧｒｅｅｎおよびＲ．Ｌ．Ｌｙｍａｎ、「Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．」１９７２年、第１４０巻、ｐ．６−１２
【非特許文献２】Ｓ．ＳｉｄｈｕおよびＲ．Ｋ．Ｔａｎｄｏｎ、「Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．」１９９６年、第７２巻、ｐ．３２７−３３３
【非特許文献３】「Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、ＮＩＤＤＫ、２００３年
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｅｓｓｎｅｒ、「Ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｓ」１９９９年、第７９巻、ｐ．８６１
【非特許文献５】Ｎ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ、「Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｕｐｄａｔｅ」１９９９年、第２８巻、ｐ．６８９
【非特許文献６】Ｒ．Ａ．Ｌｉｄｄｌｅ、「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９９５年、Ｇ３１９−Ｇ３２７
【非特許文献７】Ｊ．Ｓｌａｆｆら、「Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ」１９８４年、第８７巻、ｐ．４４−５２
【非特許文献８】Ｇ．ＩｓａｋｓｓｏｎおよびＩ．Ｉｈｓｅ．「Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．」１９８３年、第２８巻、ｐ．９７−１０２
【非特許文献９】Ｊ．Ｓｌａｆｆら、「Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ」１９８３年、第８７巻、ｐ．４４−５２
【非特許文献１０】Ｈ．Ｈａｌｇｒｅｅｎら、「Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．」１９８６年、第２１巻、ｐ．１０４−１０８
【非特許文献１１】Ｊ．Ｍｏｅｓｓｎｅｒら、「Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ」１９９２年、第５３巻、ｐ．５４−６６
【非特許文献１２】Ｐ．Ｇ．Ｌａｎｋｉｓｃｈ、「Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ」１９８７年、第３７巻、ｐ．４７−５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
膵炎における腹痛を含む、痛みの処置のための膵臓プロテアーゼの役割を詳細に説明する試みにもかかわらず、さらなる治療レジメンについての必要性が依然として、存在する。本発明は、その必要性を扱う。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）濃度の基礎レベルを維持するための方法、または血漿ＣＣＫ濃度を低下させるための方法に関する。本発明は、非膵臓プロテアーゼまたはその組成物を、前記哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における痛み、具体的には腹痛を処置するための方法をさらに提供する。本発明に従って、非膵臓プロテアーゼの結晶性形態、半結晶性形態または非晶質形態、あるいはその組成物は、慢性もしくは急性の膵炎または関連した状態における痛みを患う哺乳動物を処置するための方法において有利に使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記の非膵臓プロテアーゼは、プロテアーゼ結晶の形態である。
【００１４】
本発明の他の目的は、本明細書中の開示を考慮して、当業者によって理解される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非膵臓プロテアーゼが、哺乳動物の血漿中のＣＣＫ濃度の基礎レベルを維持するためか、またはＣＣＫ濃度を低下させるために使用され得るという発見に関する。結晶性形態、半結晶性形態、液体形態および非晶質形態を含む、全ての形態における非膵臓プロテアーゼは、血漿中のＣＣＫ濃度を制御し、次いで、痛みの減少をもたらすために、特に有用である。特定のプロテアーゼ（例えば、セアプローゼ（ｓｅａｐｒｏｓｅ）、セラペプターゼ（ｓｅｒｒａｐｅｐｔａｓｅ）（もしくはセラチオペプチダーゼ（ｓｅｒｒａｔｉｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ））、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）またはプロナーゼ成分、あるいはそれらの混合物）が、この目的のために、特に有利である。
【００１６】
（定義）
本明細書中で他に定義されない場合、本発明と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって、一般的に理解される意味を有するべきである。さらに、文脈によって他に必要とされない場合、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むべきである。
【００１７】
他に示されない場合、以下の用語は、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【００１８】
用語「コレシストキニン」（「ＣＣＫ」）とは、哺乳動物の上部腸における分泌細胞および神経線維から放出される統合ペプチド、調節性ペプチドをいう。このペプチドまたはホルモンは、タンパク質および脂肪の摂取によって血液中に分泌される。ＣＣＫの生理的作用としては、膵臓分泌物および胆嚢収縮の刺激、胃内容排出（ｅｍｐｔｙｉｎｇ）の調節、ならびに満腹の誘導が挙げられるが、これらに限定されない。従って、ＣＣＫは、非常に統合された様式において、栄養分の消化を調節するために役立つ。脳は、主に、ＣＣＫ（ＣＣＫ−８）のＣＯＯＨ−末端の直鎖状オクタペプチドを産生および処理するが、消化管は、より大きい形態のペプチド（例えば、ＣＣＫ−５８、ＣＣＫ−３３、およびＣＣＫ−２２）を産生する。組織および血液中のＣＣＫは、４〜８３個の範囲のアミノ酸のサイズであるが、より小さい形態（例えば、ＣＣＫ−８）は、脳（神経伝達物質として）および末梢系（ホルモンとして）の両方においてより大きい形態の生物学的活性を示す。ＣＣＫは、種々の行動性の状態および障害において、調節性の役割を果たす神経ペプチドとして、主に見出されている。
【００１９】
用語「栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）ペプチド」とは、一般に、末梢系ならびに中枢神経系（「ＣＮＳ」）を通して栄養補給および食物摂取の調節に影響する統合ペプチドのクラスをいう。本明細書中で使用される場合、栄養補給ペプチドは、末梢においてより限定された統合機能または十分には立証されていない統合機能を有する調節性ペプチドのより一般的なクラスと区別され得る。ＣＣＫもまた、当該分野において栄養補給ペプチドといわれている。
【００２０】
用語「食物」とは、哺乳動物によって摂取され得るか、または非経口手段によって哺乳動物に送達され得て、エネルギーを生じる、任意の物質を含む。本明細書中で使用される場合、食物は、任意の形態（例えば、固体の形態または液体の形態を含む）の任意の食べ物（ｓｕｓｔｅｎａｎｃｅ）（例えば、栄養補給剤を含む）を含む。
【００２１】
用語「モニターペプチド」とは、また、腸管上皮細胞の増殖を刺激し、哺乳動物の小腸への膵酵素の分泌を誘導する膵臓分泌性トリプシンインヒビター（「ＰＳＴＩ」）をいう。モニターペプチドは、通常、タンパク質摂取に応答して活性化され、腸からＣＣＫの分泌および放出を誘導する。それはまた、当該分野において一般に、「トリプシン感受性ＣＣＫ放出ペプチド」ともいわれる（Ｓ．Ｔｓｕｚｕｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９、２４５−２５２（１９９１）；Ｒ．Ｙａｍａｎｉｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９１、５７−６３（１９９３））。
【００２２】
用語「腸管ＣＣＫ放出因子」とは、部分的に特徴付けられているタンパク質または脂肪の摂取の後のＣＣＫ分泌の刺激において役割を果たすと考えられている腸管起源の因子をいう。機構は、ほとんど知られていないが、このＣＣＫ放出因子および他のＣＣＫ放出因子（すなわちモニターペプチド）は、ＣＣＫ分泌の調節のためのポジティブフィードバック機構およびネガティブフィードバック機構を提供すると考えられている。
【００２３】
用語「哺乳動物」とは、ヒトまたは動物をいう。例えば、動物は、ヒトでない霊長類、げっ歯類、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウマおよびヤギであり得る。本発明の好ましい実施形態において、上記哺乳動物は、ヒトである。
【００２４】
用語「消化不良」とは、栄養分（例えば、炭水化物、タンパク質、脂肪）のそれらの吸収性構成物質（単糖、二糖、またはオリゴ糖、アミノ酸、オリゴペプチド、脂肪酸およびモノグリセリド）への、十分に機能を果たさない分解をいう。
【００２５】
用語「吸収不良」とは、小腸または大腸からの、ビタミンおよび微量元素を含む消化された栄養分の十分に機能を果たさない吸収をいう。これは、腸管の内面による欠損した粘膜の摂取または消化の特定の異常に起因し得る。腸管の吸収不良は、多くの栄養分または特定の多量養素、すなわち、炭水化物、脂肪またはタンパク質について、ならびに微量養素（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、およびビタミン）について起こり得る。吸収不良は、１または数個の状態から生じ得、それらのいくつかとしては、例えば、乳糖不耐症、セリアック病、クローン病および膵臓機能不全、細菌異常増殖、短腸症候群（ｓｈｏｒｔ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アミロイド症、短腸憩室、硬皮症、熱帯性スプルー、ヘリコバクターピロリ感染、放射線療法、化学療法、胸管閉塞、例えば、腸リンパ管拡張症、好酸球性腸炎、リンパ腫、肥満細胞症、タンパク喪失性腸症およびメネトリエ病が挙げられる。
【００２６】
用語「慢性膵炎」とは、膵臓組織の自己消化が、その独自の酵素によって起こる再発性プロセスをいう。この疾患において、栄養分の消化を正常に促進する膵酵素は、膵管または膵臓の中の腺房細胞内で活性化され、そして膵管または腺房細胞から膵臓へ漏れ出る（ｅｓｃａｐｅ）か、あるいは漏出（ｌｅａｋ）し、それらは、組織壊死を誘発する。慢性的に、そのような作用は、長期間、器官の形態的損失および機能的損失を引き起こし得る。成人における慢性膵炎の２つの最も頻繁な型は、アルコール誘発性膵炎および特発性膵炎である。小児において、慢性膵炎は、嚢胞性線維症によって頻繁に引き起こされる。
【００２７】
「急性膵炎」とは、膵周囲炎組織または離れた器官系、あるいはその両方を含み得る膵臓の急性の炎症性プロセスである。それは、単発的な発作として起こり得るか、または発作の間に正常な組織に回復して、別の発現において再発し得る。定義によって、急性膵炎は、改善可能であり；急性膵炎は、継続的な炎症、不可逆的な構造変化、ならびに外分泌性の膵機能および内分泌性の膵機能の持続的な機能障害がないことによって、慢性膵炎と区別される。急性膵炎は、さらに、軽い型および重篤な型に分類される。軽い急性膵炎は、最小の器官機能障害および平穏無事な回復に関連する。重篤な急性膵炎は、膵臓壊死に関連し、そして、器官不全および／または局所合併症を引き起こし得る。急性膵炎の局所合併症としては、流体堆積、偽性嚢胞形成、膿瘍、膵臓壊死、出血、静脈血栓症、および偽動脈瘤形成が挙げられる。
【００２８】
用語「痛み」とは、実際の組織損傷または潜在的な組織の損傷に関連する知覚経験をいう。痛みの肉体的な感覚は、別々の原因から生じ得、疾患の関連した症状を構成し得るか、あるいは痛み自体が、主要な問題（例えば、神経障害の痛み）を構成する症候群であり得る。本発明の１つの実施形態において、いくらかの自己免疫反応もしくは炎症応答または疾患によって、痛みは引き起こされないか、あるいは併発されない。本発明の別の実施形態において、用語「腹（ａｂｄｏｍｉｎａｌ）」痛は、婦人科学的な機能または疾患に起因する女性の骨盤の痛みを含まない。本発明の別の実施形態において、用語「腹」痛は、慢性的な子宮傍組織炎を含む、女性の慢性的な骨盤の痛みの症候群を含まない。
【００２９】
用語「プロテアーゼ」とは、タンパク質の内部のアミドペプチド結合の切断を触媒する任意の酵素である、プロテイナーゼ、タンパク質分解酵素またはペプチダーゼをいう。具体的には、プロテアーゼは、１つのアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ基との間のアミド結合を切断することによって、タンパク質のそれらの成分のアミノ酸への変換を触媒する。プロテアーゼは、一般に、それらの触媒型によって同定される（例えば、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システイン（チオール）ペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼ、アルカリプロテアーゼまたはセミアルカリプロテアーゼ（ｓｅｍｉ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、中性、および未知の触媒機構のペプチダーゼ）（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋを参照のこと）。好ましい実施形態に従って、本発明の方法において有用なプロテアーゼは、非膵臓プロテアーゼである。用語「非膵臓プロテアーゼ」とは、以下：（１）ヒトもしくは動物の膵臓組織または膵臓抽出物から精製されず、（２）トリプシンを含まず、そして必要に応じて（３）トリプシンまたはキモトリプシンが、ヒトもしくは動物の膵臓組織または膵臓抽出物から精製されるか否か、あるいは微生物宿主または単細胞宿主において産生されるか否かにかかわらず、キモトリプシンを含まない、プロテアーゼをいう。本発明の好ましい実施形態に従って、非膵臓プロテアーゼは、微生物宿主または単細胞宿主において産生される。そのような単細胞宿主は、培養物中の細菌、酵母菌、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の細胞のうちのいずれか１つから選択され得る。本発明の好ましい実施形態に従って、非膵臓プロテアーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓによって産生される。あるいは、本発明に有用な非膵臓プロテアーゼは、従来のペプチド合成技術によって合成され得る。
【００３０】
「セアプローゼ」（「ＳＡＰ」）とは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓによって産生される均質的な結晶質のセミアルカリタンパク質分解酵素をいい、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．（日本）から市販されている。ＳＡＰは、液体または固体の発酵プロセスのいずれかによって、調製され得る。セアプローゼはまた、セアプローゼ−Ｓ、アスペルギルスアルカリプロテイナーゼ；アスペルギロペプチダーゼ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ｂ；ＡＰＩ  ２１；アスペルギロペプシン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ）Ｂ；アスペルギロペプシンＦ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓセミアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓアルカリプロテイナーゼ；アスペルギルスセリンプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｙａアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓアルカリプロテイナーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓアルカリプロテイナーゼ；プロザイム（ｐｒｏｚｙｍｅ）；Ｐ  ５３８０；キョリナーゼ（ｋｙｏｒｉｎａｓｅ）；セミアルカリプロテアーゼ；スミザイム（ｓｕｍｉｚｙｍｅ）ＭＰ；プロザイム  １０；オノプローゼ；オノプローゼ（ｏｎｏｐｒｏｓｅ）ＳＡ；プロテアーゼＰ；プロメラーゼ（ｐｒｏｍｅｌａｓｅ）、アルカリプロテイナーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）；アルカリプロテイナーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）；アレルゲンＡｓｐ  ｆｌ  １（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；アレルゲンＡｓｐ  ｆｌ  １３（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；アレルゲンＡｓｐ  ｆ  １３（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）；アレルゲンＰｅｎ  ｃ２（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）；アスペルギロペプチダーゼＢ；ＰｅｐＤ；ｐｒｔＡおよびＳＵＢ２（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）ともいわれる。セアプローゼは、約３０ｋＤの分子量を有し、ｐＨ５．０〜９．０の範囲内で安定である。さらに、セアプローゼは、酵素的切断に関係するプロテアーゼであり、より具体的には、それは、タンパク質の鎖のＰ１位におけるＰｈｅ残基を含む基質を優先的に切断する。本発明の１つの実施形態に従って、セアプローゼの１つ以上の形態または型が、使用され得る。あるいは、セアプローゼは、セアプローゼ以外の１種以上の非膵臓プロテアーゼとの組み合わせにおいて使用され得る。
【００３１】
用語「リパーゼ」とは、グリセロールと単純な脂肪酸とへの脂質の加水分解（すなわち、水の添加によってフラグメント中の化合物のヒドロキシル基と水素原子とを分離する）を触媒する酵素をいう。この酵素反応は、通常、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を必要とする。膵臓によって分泌されるリパーゼは、小腸の上部ループにおける脂肪（トリグリセリド）の消化のために非常に重要である。リパーゼは、例えば、動物供給源由来であり得るか、または微生物供給源もしくは単細胞供給源から調製され得る。
【００３２】
用語「アミラーゼ」とは、全ての哺乳動物ではないが、ヒトにおいて膵臓およびまた唾液線中にも産生される酵素をいう。ヒト唾液アミラーゼは、プチアリンとして公知である。アミラーゼは、小腸においてデンプンの２つの成分（アミロースおよびアミロペクチン）の単糖への変換を触媒することによって、炭水化物（例えば、多糖）の消化の原因となる主要な消化酵素である。より具体的には、アミラーゼは、デンプン、グリコーゲン、およびデキストリンを加水分解して、グルコース、マルトース、および限界デキストリンを形成する。臨床的に、血中アミラーゼレベルは、しばしば、急性膵炎の状態において上昇し、そして、慢性膵炎の状態において上昇する場合もある。アミラーゼは、例えば、動物供給源に由来し得るか、または微生物供給源もしくは単細胞供給源から調製され得る。
【００３３】
用語「プロテアーゼ」、「アミラーゼ」および「リパーゼ」は、消化酵素の３つの主要な分類として多かれ少なかれ当業者に広く知られているが、これらの分類の各々と適合する多くの型の酵素が存在し、明確に専門化された機能を果たす。例えば、膵機能を援助するタンパク質分解酵素としては、エンドペプチダーゼ（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびカリクレイン）ならびにエキソペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼＡおよびカルボキシペプチダーゼＢ）が挙げられる（Ｅ．Ｌｅｂｅｎｔｈａｌら、Ｐａｎｃｒｅａｓ  ９、１−１２（１９９４））。プロテアーゼの他の例としては、バシロリシン（ｂａｃｉｌｌｏｌｙｓｉｎ）、ブロメライン、フィシン、オリジン（ｏｒｙｚｉｎ）、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＳ、セアプローゼ、セラペプチダーゼ、サブチリシン、サーモライシン、トロンビン、および他の類似した酵素が挙げられる。本発明と関連して使用され得る非膵臓プロテアーゼの要約を、以下の表１に例示する。
【００３４】
【表１−１】
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【００３５】
【表１−２】
2007509982.tif 000003
【００３６】
本発明の方法に有用なプロテアーゼ、ならびに任意の他の酵素は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるものを含む、微生物起源、細菌起源、真菌起源、植物起源または動物起源に由来し得る。あるいは、それらは、従来のペプチド合成技術によって産生され得る。好ましい実施形態に従って、本発明の方法に有用なプロテアーゼは、非膵臓プロテアーゼである。本発明の好ましい実施形態において、非膵臓プロテアーゼは、セアプローゼ、セラペプターゼ、プロナーゼ、プロナーゼ成分、またはそれらの混合物である。プロナーゼの例としては、以下：プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＢ、メタロエンドペプチダーゼおよびメタロプロテイナーゼが挙げられる。好ましい非膵臓プロテアーゼの特性および現在までのそれらの使用を、以下の表１ａに挙げる。
【００３７】
【表１−３】
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【００３８】
【表１−４】
2007509982.tif 000005
【００３９】
本発明の方法における使用のための非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物の投薬形態は、液体、固体、懸濁物または分散物の形態であり得る。非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物についての投薬経路は、任意の従来の投与経路（例えば、経口経路、腸内経路、経皮経路または非経口経路が挙げられる）によるものであり得る。最終的に、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物は、スラリー、錠剤、分割錠（ｓｃｏｒｅｄ  ｔａｂｌｅｔ）、コーティング錠、カプレット（ｃａｐｌｅｔ）、カプセル剤または糖剤として投与され得る。
【００４０】
本明細書中に使用される場合、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼは、一用量あたり、約５，０００〜約１，０００，０００米国薬局方（ＵＳＰ）単位のプロテアーゼ活性である。好ましい実施形態において、上記治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼは、一用量あたり約５，０００〜７５０，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ活性である。さらに別の好ましい実施形態において、上記治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼは、一用量あたり約５，０００〜５００，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ活性である。より好ましい実施形態において、上記治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼは、一用量あたり約５，０００〜２５０，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ活性である。これらの活性単位の範囲の全てについて、プロテアーゼの１ＵＳＰ単位は、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」において定義される（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，ＵＳＰ  ２６／ＮＦ２１，２００３  ｐｇ  １３８９−１３９１）。処置方法が、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含む組成物を使用して行われる場合、そのような量は、処方物の一用量あたり、上記のプロテアーゼの活性単位のうちの１つを提供するものである。
【００４１】
あるいは、本発明に従って、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物は、１回の食事につき、約２０ｍｇと約５００ｍｇとの間の活性なプロテアーゼレベルを有する形態で哺乳動物に投与される。別の実施形態において、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物は、１回の食事につき、約５０ｍｇと約５００ｍｇとの間の活性プロテアーゼレベルを有する形態で哺乳動物に投与される。代替的な実施形態において、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物は、１回の食事につき、約５０ｍｇと約２５０ｍｇとの間の活性プロテアーゼレベルを有する形態で哺乳動物に投与される。活性は、上記に規定した通りに測定される。
【００４２】
代替的な実施形態において、１回の食事あたりの活性プロテアーゼの全体の用量が、哺乳動物の体重１ｋｇにつき約１ｍｇと哺乳動物の体重１ｋｇにつき約１０ｍｇとの間、好ましくは、哺乳動物の体重１ｋｇにつき約１ｍｇと哺乳動物の体重１ｋｇにつき約３ｍｇとの間、または好ましくは、哺乳動物の体重１ｋｇにつき約１ｍｇと哺乳動物の体重１ｋｇにつき約２ｍｇとの間であるように、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物が、哺乳動物に投与される。
【００４３】
本発明に従って、非膵臓プロテアーゼは、結晶性形態、半結晶性形態または非晶質形態であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「非晶質」としては、非晶質の固体ならびに液体が挙げられる。非膵臓プロテアーゼは、好ましくは、固体状態において結晶性の物質を形成するために、結晶化され得るか、または固体状態において非晶質（完全に結晶でない）もしくは半結晶性（結晶領域および非晶質領域を有する）の形態として存在し得る。例えば、結晶は、特徴的な特性、（格子構造、特徴的な形状および光学的性質（例えば、屈折率））を示す。結晶は、三次元において周期的に繰り返すパターンで配置される原子から構成される。一方、非晶質の固体は、結晶性固体状態の分子格子構造の特性を有さない。非膵臓プロテアーゼの結晶は、架橋された形態であっても、架橋されていない形態であってもよい。さらに、そのような非膵臓プロテアーゼの非晶質の形態もまた、架橋された形態であっても、架橋されていない形態であってもよい。
【００４４】
用語「基礎レベル」または「基礎濃度」とは、一晩絶食した後の特定の患者もしくは哺乳動物における血漿中のＣＣＫのレベルまたは濃度をいう。一旦、食物が摂取されると、血漿中のＣＣＫ濃度は、上記の基礎レベルを増加させ、次いで、酵素および炭酸水素イオンを含む膵液を分泌するために、膵臓を刺激する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、語句「最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）」とは、食物の投与後に測定されたピーク血漿濃度をいう。Ｃｍａｘについての値は、ピーク血漿濃度から基礎濃度を減算することによって得られる。
【００４６】
本発明の１つの実施形態に従って使用される場合、用語「低下する」または「低下」とは、食物の投与後の哺乳動物のＣｍａｘ低下の割合をいう。この低下は、（ａ）非膵臓プロテアーゼの非存在下における食物の投与後の哺乳動物におけるＣｍａｘを、（ｂ）非膵臓プロテアーゼの存在下における食物の投与後のＣｍａｘと比較することによって測定される。Ｃｍａｘ低下の割合が、１００％である場合、非膵臓プロテアーゼは、基礎濃度においてＣＣＫ濃度を「維持する」。低下の割合が１００％より大きい場合、非膵臓プロテアーゼは、基礎レベルより低くＣＣＫ濃度を低下させる。本発明の別の実施形態に従って、「低下する」または「低下」とは、特定の哺乳動物において食物投与がない場合の基礎濃度に対するＣＣＫ濃度の低下をいう。例えば、食物の非存在下で投与される非膵臓プロテアーゼは、基礎濃度より低くＣＣＫ濃度を低下させ得る。これは、例えば、胃腸疾患、吸収不良症候群、急性感染および慢性感染ならびに摂食障害（例えば、神経性食欲不振）の処置において所望され得る。本発明のなおさらなる実施形態において、用語「低下する」または「低下」とは、非膵臓プロテアーゼの投与前に、絶食をしていない任意の時に測定される特定の哺乳動物におけるＣＣＫ濃度の任意の低下をいう。
【００４７】
本発明の方法に有用な非膵臓プロテアーゼは、賦形剤と組み合わされ得る。本発明に従って、「賦形剤」は、薬学的組成物中に使用される充填剤または充填剤の組み合わせとして作用する。このカテゴリーに含まれる好ましい賦形剤は、以下のいずれかの塩である：１）アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン）；２）炭水化物（例えば、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース））；３）二糖（例えば、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース）；４）多糖（例えば、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン）；５）アルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、ラクチトール（ｌａｃｔｉｔｏｌ）、ソルビトール）；６）グルクロン酸、ガラクツロン酸；７）シクロデキストリン（例えば、メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび類似物（ａｌｉｋｅ））；８）無機分子（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩、ホウ酸、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム）；９）有機分子（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩）；１０）アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリン、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体のような乳化剤または可溶化剤／安定化剤；ならびに、１１）寒天、アルギン酸およびその塩、グアールガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールなどの粘度増加試薬。さらに好ましい賦形剤の群としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、イノシトール、ナトリウムおよびカリウムの塩（例えば、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩）、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリリシン、ポリアルギニンが挙げられる。
【００４８】
本発明の１つの実施形態において、上記賦形剤は、以下：塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマーおよびポリアミノ酸からなる群より選択される。別の実施形態において、上記賦形剤は、以下：プロタミン、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン、ポリアミノ酸（例えば、ポリアルギニン、ポリリシンおよびポリグルタミン酸）、ポリエチレングリコールおよびデンドリマー、ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびアルギン酸塩）からなる群より選択される。
【００４９】
本発明に従って、非膵臓プロテアーゼはまた、１つ以上の他の治療剤と組み合わされ得る。治療剤の例としては、例えば、好ましくは単細胞宿主または微生物宿主において産生されるか、あるいは従来のペプチド合成技術によって産生される酵素（例えば、アミラーゼおよび／またはリパーゼ）が挙げられる。
【００５０】
本発明に従って、非膵臓プロテアーゼは、結晶性形態であろうと非晶質形態であろうと、それらの構造に安定性を与えるために、架橋され得る。有用な架橋試薬としては、表２に示すような、以下の多機能性の架橋試薬が挙げられるが、それらに限定されない。架橋のための手順は、任意の従来の架橋技術に従って、実施され得る。
【００５１】
【表２−１】
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【００５２】
【表２−２】
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【００５３】
（哺乳動物の血漿における基礎ＣＣＫレベルを維持するための方法または哺乳動物の血漿におけるＣＣＫレベルを低下させるための方法）
ＣＣＫは、大量にあり、広く分布された哺乳動物ペプチドであるので、多くの疾患または障害が、本発明に従う非膵臓プロテアーゼまたはその組成物を使用して、ＣＣＫのレベルを維持することによって、有利に処置され得る。ＣＣＫによって媒介されているか、または媒介され得る疾患状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：膵炎（急性または慢性）、タンパク質吸収不良（窒素便）、脂肪吸収不良（脂肪便）、胃腸障害、胆嚢疾患、脳血管障害（「ＣＶＡ」）、胃食道疾患、消化性潰瘍疾患、ガストリノーマ、腸運動性障害、オッディ括約筋機能不全、胆石症、総胆管結石症、胆石仙痛、遷延性胆管炎、摂食障害、肥満、薬物嗜癖（ＣＣＫは、線条において高度に存在し、ＣＣＫ系およびドーパミン系の共分布は、動機付けのある状態において、報酬、精神刺激薬の感作および薬物の習慣形成の性質に関して内因性のＣＣＫに関連する）、（Ｓ．ＬｅｉｂｏｗｉｔｚおよびＢ．Ｇ．Ｈｏｅｂｅｌ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ、Ｂｒａｙら（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．（２００１））、パニック／不安関連障害（Ｓ．ＲｏｔｚｉｎｇｅｒおよびＦＪ．Ｐ．Ｖａｃｃａｒｉｎｏ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８、１７１−１８１（２００３）；Ｚｗａｎｚｇｅｒら、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５、６９９−７０３（２００１））、気分障害、精神分裂病、パーキンソン病、鬱病、注意／記憶の機能（全てのドーパミン関連状態の概説については、Ｆ．Ｎｏｂｌｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５１、７４５−７８１（１９９９）を参照のこと）、真性糖尿病、栄養管（例えば、胃、空腸管など）の詰まり、消化性潰瘍疾患、胃潰瘍および十二指腸潰瘍ならびに癌（ＣＣＫ−Ｂレセプターは、９０％を超える転移性髄質甲状腺の症例においてだけでなく、高い割合の小細胞の肺癌、間質の卵巣、ならびに胃腸腺癌、神経内分泌腫瘍、および悪性神経膠腫を含む、可能性のある種々の他の腫瘍においても存在する（一般に、Ｌ．Ｍａｎｎｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２９、７４４−７５０（２０００）；Ｍ．ＢｅｈｅおよびＴＭ  Ｂｅｈｒ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６６、３９９−４１８（２００２）を参照のこと））を含む、種々の末梢神経障害（Ｌ．Ｍａｎｎｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２９、７４４−７５０（２０００）を参照のこと）。
【００５４】
本発明の１つの実施形態に従って、非膵臓プロテアーゼは、食物の投与後の哺乳動物の血漿におけるＣＣＫのレベルを制御するために、使用され得る。１つの実施形態において、本発明は、ＣＣＫ関連疾患を処置するための方法を提供し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。代替の実施形態において、本発明は、哺乳動物における血漿ＣＣＫレベルを維持するための方法または哺乳動物における血漿ＣＣＫレベルを低下させるための方法を提供し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５５】
血漿中のＣＣＫの基礎濃度は、代表的に、一晩絶食した後の血漿中のＣＣＫの濃度として定義される。一旦、食事または食物補充物が摂取されると、血漿中のＣＣＫ濃度は、基礎レベルより高く増加し、その結果として、膵臓刺激および酵素と、炭酸水素イオンとを含む膵液の分泌を生じる。本発明の１つの実施形態は、食物投与の後の延長された期間にわたる、哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）濃度の維持または低下に関する。
【００５６】
同様に、本発明は、哺乳動物におけるＣＣＫの最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）を有意に低下させるための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物における食物の投与後のコレシストキニン（ＣＣＫ）の最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）の低下のための方法に関し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、食物と共に前記哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前記の低下は、（ａ）食物投与後の前記プロテアーゼの非存在下における前記Ｃｍａｘを、（ｂ）食物投与後の前記プロテアーゼの存在下での前記Ｃｍａｘと比較する工程によって測定され、ここで、前記の低下は、以下：（ｉ）少なくとも約１０％〜約２５％の低下、（ｉｉ）少なくとも約２５％〜約５０％の低下、（ｉｉｉ）少なくとも約５０％〜約７５％の低下、および（ｉｖ）少なくとも約７５％〜約１００％の低下、からなる群より選択される。あるいは、上記低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の低下のいずれかであり得る。好ましい実施形態において、上記非膵臓プロテアーゼは、セアプローゼ、セラペプターゼ、プロナーゼ、プロナーゼ成分、またはそれらの混合物からなる群より選択される。さらに別の好ましい実施形態において、上記プロテアーゼは、セアプローゼである。
【００５７】
代替の実施形態において、本発明の方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、哺乳動物に投与する工程によって、上記哺乳動物におけるＣＣＫ関連疾患を処置することに関し、ここで、上記プロテアーゼを投与する工程の後の前記動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルは、上記プロテアーゼを投与する工程の前の上記動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベル未満であるか、または同じレベルであり、そして、（ａ）投与の０時間後と約４時間後との間、（ｂ）投与の０時間後と約８時間後との間；および（ｃ）投与の０時間後と約１２時間後との間からなる群より選択される期間の間、上記プロテアーゼを投与する工程の前の上記動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベル未満であり続けるか、または同じレベルであり続ける。あるいは、その期間は、投与後、４時間、６時間、８時間、１０時間または１２時間のうちのいずれかより選択され得る。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明の方法は、上記哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルの低下に関し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５９】
（哺乳動物における痛みを処置するための方法）
本発明はまた、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を使用して、哺乳動物における痛みを処置するための方法を提供する。そのような痛みを処置する１つの利点は、活性プロテアーゼ薬剤が、常習性ではなく、多くの他の痛みを減少させる薬剤であることである。別の利点は、非膵臓プロテアーゼが、非侵襲性に、痛み（例えば、慢性膵炎に関連する痛み）を処置するためのいくつかの従来の方法で利用できない経路（例えば、膵管の中への内視鏡の位置のステントおよび食物の静脈内投与）に、投与され得ることである。
【００６０】
本発明に従う方法は、膵臓機能不全に関連する痛み（例えば、急性膵炎、慢性膵炎、嚢胞性線維症および術後胃腸手術（ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）に関連する痛み）を患う患者を処置するために使用され得る。膵炎と診断された個体を処置するための１つのそのような治療方法は、例えば、腹痛を患う個体を選択する工程、上記個体の血漿ＣＣＫレベルの測定に基づいて個体の処置のためのプロテアーゼ投与の効果を決定する工程、非膵臓プロテアーゼを、上記個体のＣＣＫレベルの測定の決定に基づいて個体に投与する工程、および痛みの症状の改善をモニタリングする工程を包含する。
【００６１】
別の局面において、本発明は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、哺乳動物に投与する工程を包含する、痛みを処置するための方法を提供する。
【００６２】
（哺乳動物における腹痛を処置するための方法）
上記に議論したように、食物は、管内のトリプシンに対して、トリプシン結合基質として作用し得る。このことは、次いで、トリプシンが、モニターペプチドおよび腸管のＣＣＫ−ＲＦを分解することを防ぎ、これらの両方は、ＣＣＫの放出を促進する。続いて、ＣＣＫの増加が、痛みを引き起こす。
【００６３】
本発明の１つの実施形態に従って、哺乳動物に対する非膵臓プロテアーゼの投与は、食物摂取の後の血漿中のＣＣＫの基礎レベルを維持するか、または血漿中のＣＣＫレベルを低下させる。その結果として、本発明の方法は、種々の胃腸疾患および胃腸障害（膵炎（急性または慢性）、タンパク質吸収不良（窒素便）、脂質吸収不良（脂肪便）、真性糖尿病、潰瘍疾患、およびそれらの組み合わせ、胆石仙痛、胆嚢炎、上行胆嚢炎、胆石症、麻薬嗜癖、オッディ括約筋機能不全、遅延胃内容排出ならびに化学療法損傷が挙げられるが、これらに限定されない）に関連した腹痛の処置のために有用である。本発明の方法はまた、ＣＣＫ拮抗作用、空腹の減少および食欲不振の治療のために有用である。
【００６４】
より詳細には、本発明は、哺乳動物における腹痛を処置するための方法を提供し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００６５】
上記に議論したように、血漿中のＣＣＫの基礎濃度は、代表的に、一晩絶食した後の特定の患者または哺乳動物における血漿中のＣＣＫの濃度として定義される。一旦、食事または食物補充物が、摂取または取り込まれると、血漿中のＣＣＫ濃度は、基礎レベルより上に増加し、膵臓刺激および膵液の分泌（酵素および炭酸水素イオンを含む）を生じる。本発明の１つの実施形態は、食物投与の後の延長された期間にわたって哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）濃度を維持することに関する。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物における腹痛を処置することに関し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、上記プロテアーゼを投与した後の上記哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルは、上記プロテアーゼを投与する前の上記哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベル未満であるか、または同じレベルであり、そして、（ａ）上記プロテアーゼ投与の０時間後と約４時間後との間；（ｂ）上記プロテアーゼ投与の０時間後と約８時間後との間；および（ｃ）上記プロテアーゼ投与の０時間後と約１２時間後との間からなる群より選択される期間の間、上記プロテアーゼを投与する前の上記動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベル未満であり続けるか、または同じレベルであり続ける。あるいは、その期間は、投与後、４時間、６時間、８時間、１０時間または１２時間のうちのいずれかより選択され得る。
【００６７】
本発明はまた、哺乳動物におけるＣＣＫの最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）を有意に低下させるための方法を提供する。本明細書中で使用される場合、語句「最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）」とは、食物の投与後に測定されたピーク血漿濃度をいう。従って、本発明の１つの実施形態は、哺乳動物における腹痛を処置するための方法に関し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、上記動物に投与する工程を包含し、ここで、その投与は、上記投与後の上記哺乳動物における血漿コレシストキニン（ＣＣＫ）レベルの低下を生じる。
【００６８】
本発明に従う方法の全ては、非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、食物と共にかまたは食物なしに、上記哺乳動物に投与する工程によって行われ得る。この点で、本発明の他の方法と同様に、食物と一緒の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物の投与としては、各食事における非膵臓プロテアーゼ投与と目下一緒の、または非膵臓プロテアーゼ投与に続く食物の投与が挙げられる。その投与は、食事の最中または代替的に、食事の終わりに開始し、１回の食事につき、１回または２回または３回のいずれかである。本発明の他の実施形態は、哺乳動物における腹痛を処置するための方法に関し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、食物と共にまたは食物なしに上記哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、上記プロテアーゼは、食物の投与の間に存在する上記プロテアーゼを有さない上記哺乳動物におけるＣＣＫのＣｍａｘと比較して、上記哺乳動物におけるＣＣＫの最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）を低下させる。
【００６９】
さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における腹痛を処置するための方法に関し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含む組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、上記プロテアーゼは、上記哺乳動物におけるコレシストキニン（ＣＣＫ）の最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）の低下を引き起こし、ここで、上記低下は、（ａ）食物投与後の前記プロテアーゼの非存在下における上記Ｃｍａｘを、（ｂ）食物投与後の上記プロテアーゼの存在下における上記Ｃｍａｘと比較する工程によって測定され、ここで、上記低下は、（ｉ）少なくとも約１０％〜約２５％の低下；（ｉｉ）少なくとも約２５％〜約５０％の低下；（ｉｉｉ）少なくとも約５０％〜約７５％の低下；および（ｉｖ）少なくとも約７５％〜約１００％の低下からなる群より選択される。その低下はまた、少なくとも約１０％〜約１００％の低下であり得る。あるいは、その低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の低下のいずれかであり得る。
【００７０】
（哺乳動物における食欲不振を処置する方法）
食物の摂取の後に、上昇したＣＣＫレベルは、満腹感を生み出す。低下させたＣＣＫ血漿レベルを維持することによって、本発明に従う方法は、食欲不振を処置するために使用され得る。同様に、本発明に従う方法は、栄養失調を処置するために使用され得る。１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物における食欲不振を処置するための方法を提供し、その方法は、治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼまたは治療上有効な量の非膵臓プロテアーゼを含む組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００７１】
（非膵臓プロテアーゼの投薬形態）
本発明に従う方法のいずれかは、酸抑制剤（ａｃｉｄ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含まない非腸溶性（ｎｏｎ−ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏａｔｅｄ）非膵臓プロテアーゼ錠剤を使用して行われ得る。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明の方法は、痛み（好ましくは、膵臓機能不全に関する腹痛）、および食欲不振の処置のための、酸抑制剤を含まない非腸溶性非膵臓プロテアーゼ錠剤の使用に関する。別の実施形態において、本発明の方法は、食物投与前に測定される基礎レベルに対する食物投与後のコレシストキニン（ＣＣＫ）レベルの低下のための、酸抑制剤を含まない非腸溶性非膵臓プロテアーゼ錠剤の使用に関する。
本発明に従う１つの実施形態において、上記非膵臓プロテアーゼ錠剤は、１回の食事につき、錠剤１個と錠剤６個との間の、好ましくは錠剤１個と錠剤２個との間の、最も好ましくは１個の錠剤の用量で哺乳動物に投与され、ここで、その錠剤は、約２０ｍｇ〜約５００ｍｇの間の活性プロテアーゼレベルを含む。別の実施形態において、本発明に従う上記非膵臓プロテアーゼ錠剤は、１回の食事につき、錠剤１個と錠剤６個との間、好ましくは錠剤１個と錠剤２個との間、最も好ましくは１個の錠剤の用量で哺乳動物に投与され、ここで、その錠剤は、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの間の活性プロテアーゼレベルを含む。あるいは、上記非膵臓プロテアーゼ錠剤は、１回の食事につき、錠剤１個と錠剤６個との間、好ましくは錠剤１個と錠剤２個との間、最も好ましくは１個の錠剤の用量で哺乳動物に投与され、ここで、その錠剤は、約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの間の活性非膵臓プロテアーゼレベルを含む。
【００７３】
あるいは、非膵臓活性プロテーゼは、１個以上の錠剤として哺乳動物に投与され、哺乳動物１ｋｇにつき約１ｍｇと哺乳動物１ｋｇにつき１０ｍｇとの間、好ましくは哺乳動物１ｋｇにつき約１ｍｇと哺乳動物１ｋｇにつき３ｍｇとの間、または哺乳動物１ｋｇにつき約１ｍｇと哺乳動物１ｋｇにつき２ｍｇとの間である１回の食事あたりの活性プロテアーゼ用量を提供する。
【００７４】
本発明が、より理解され得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、いずれの様式においても本発明の範囲に限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７５】
以下の材料を、以下に記載する実施例において使用した。
【００７６】
（材料）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ由来である、市販の原料のまま（ｒａｗ）のセアプローゼ（ＳＡＰ）粉末（ＣＡＳ＃９０７４−０７−０１）を、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．（日本）（名古屋、日本）から入手した。ＳＡＰは、液体または固体のいずれかの発酵プロセスによって、調製され得る。本明細書中の本発明の実施例において使用したＳＡＰ粉末を、固体発酵によって調製した。炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、第二リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。メタノール、トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手し、グルタルアルデヒドを、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。注射用の水（ＷＦＩ）または米国薬局方（ＵＳＰ）精製水を、全ての緩衝液およびプロテアーゼ溶液のために使用した。ＷＦＩおよびＵＳＰの水の基準の比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｒｅｈｔｓ．ｃｏｍ／ＵＳＰ．ｈｔｍにおいて見出され得る。実験用食餌を、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄから入手した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から入手した。ケタミンおよびキシラジンを、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎから入手した。カゼイン（カタログ番号Ｃ−５８９０）、トリプシン（カタログ番号Ｔ−７３０９）およびダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ、カタログ番号Ｔ−９００３）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｃｒｅｏｎ（登録商標）−２０（Ｓｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））およびＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８（Ａｘｃａｎ  Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ、Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ））を、地元の薬局から購入した。ＣＣＫ放出ペプチド、ＬＣＲＦ１−３５（Ａ．Ｗ．Ｓｐａｎｎａｇｅｌら、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７３、１６１−１６４（１９９８）；Ａ．Ｗ．Ｓｐａｎｎａｇｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３、４４１５−４４２０（１９９６））を、ＰｅｐＳｃａｎ（オランダ）から入手し、セラチオペプチダーゼ（Ｓｅｒｒａｔｉｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．（Ｃｈｉｎｏ，ＣＡ）（カタログ番号Ｂ−０３１８７５、ＣＡＳ  ９０３１−９４−１）から入手した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロナーゼを、ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ／Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）（カタログ番号８１７４８）から購入した。Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）（バニラ風味を有する高タンパク質（２４％））を、地元の薬局から購入した。微結晶性セルロース１０３を、ＦＭＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃ（アイルランド）から入手した。コスポビドン（Ｃｏｓｐｏｖｉｄｏｎｅ  ＸＬ）を、ＩＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）から入手した。Ｃｏｌ．二酸化ケイ素を、Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）から入手した。タルクを、Ｌｕｚｅｎａｃ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）から入手した。ステアリン酸マグネシウムＮＯ−ＢＯＶを、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手した。無水エンコンプレス（Ｅｎｃｏｍｐｒｅｓｓ）を、Ｐｅｎｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｅｄａｒ  Ｒａｐｉｄｓ，ＩＡ）から入手した。
【００７７】
（ＣＣＫ放出ペプチドのインビトロでの加水分解のための酵素調製のための条件）
セアプロ−ゼ（ｐＨ６．０）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのセアプロ−ゼを、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１４００Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の１ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１４００Ｕ）溶液に添加して、１００ｍｌの最終容積かつ０．０１ｍｇ／ｍｌ（１４Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を得た。次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の１．０７ｍｌの上記０．０１ｍｇ／ｍｌ（１４Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ１．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの１．５Ｕ／ｍｌのセアプロ−ゼ（最終０．１５Ｕ）と混合し、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００７８】
セアプロ−ゼ（ｐＨ４．５）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのセアプロ−ゼを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１４００Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の１ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１４００Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１００ｍｌの最終容積かつ０．０１ｍｇ／ｍｌの最終濃度（１４Ｕ／ｍｌ）を得た。次いで、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の２．５ｍｌの上記０．０１ｍｇ／ｍｌ（１４Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ３．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、酢酸ナトリウム（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの３．５Ｕ／ｍｌのセアプロ−ゼ（最終０．３５Ｕ）と混合し、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００７９】
セラチオペプチダーゼ（ｐＨ６．０）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのセラチオペプチダーゼを、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１２５０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の１ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１２５０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１００ｍｌの最終容積かつ０．０１ｍｇ／ｍｌ（１２．５Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を得た。次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の１．２ｍｌの上記０．０１ｍｇ／ｍｌ（１２．５Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ１．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの１．５Ｕ／ｍｌのセラチオペプチダーゼ（最終０．１５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８０】
セラチオペプチダーゼ（ｐＨ４．５）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのセラチオペプチダーゼを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１２５０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の１ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１４００Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１００ｍｌの最終容積かつ０．０１ｍｇ／ｍｌ（１２．５Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を得た。次いで、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の２．８ｍｌの上記０．０１ｍｇ／ｍｌ（１２．５Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ３．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの３．５Ｕ／ｍｌのセラチオペプチダーゼ（最終０．３５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８１】
プロナーゼ（ｐＨ６．０）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのプロナーゼを、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の１ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１００ｍｌの最終容積かつ０．０１ｍｇ／ｍｌ（１０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を得た。次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の１．５ｍｌの上記０．０１ｍｇ／ｍｌ（１０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ１．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、リン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの１．５Ｕ／ｍｌのプロナーゼ（最終０．１５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８２】
プロナーゼ（ｐＨ４．５）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのプロナーゼを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の１ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１００ｍｌの最終容積かつ０．０１ｍｇ／ｍｌ（１０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を得た。次いで、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の３．５ｍｌの上記０．０１ｍｇ／ｍｌ（１０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ３．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの３．５Ｕ／ｍｌのプロナーゼ（最終０．３５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８３】
Ｖｉｏｋａｓｅ−８（ｐＨ６．０）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのＶｉｏｋａｓｅ−８を、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１２０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の０．１２５ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１２０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ１．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの１．５Ｕ／ｍｌのＶｉｏｋａｓｅ−８（最終０．１５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８４】
Ｖｉｏｋａｓｅ−８（ｐＨ４．５）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのＶｉｏｋａｓｅ−８を、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１２０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の０．２９２ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１２０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ３．５Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの３．５Ｕ／ｍｌ  Ｖｉｏｋａｓｅ−８（最終０．３５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８５】
トリプシン（ｐＨ６．０）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのトリプシンを、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１１３０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を、容量フラスコ中の０．４４２ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１１３０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ５０Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの５０Ｕ／ｍｌのトリプシン（最終５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８６】
トリプシン（ｐＨ４．５）。容量フラスコを使用して、１０ｍｇのトリプシンを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中に溶解し、１０ｍｌの最終容積にして、１ｍｇ／ｍｌ（１１３０Ｕ／ｍｌ）の最終濃度を有する溶液を得た。次に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）を、容量フラスコ中の０．４４２ｍｌの上記１ｍｇ／ｍｌ（１１３０Ｕ／ｍｌ）溶液に添加して、１０ｍｌの最終容積かつ５０Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。最終的に、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．５）中の２２５μｌのＣＣＫ放出ペプチド（ＬＣＲＦ１−３５）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２５μｌの５０Ｕ／ｍｌのトリプシン（最終５Ｕ）と混合して、種々の時間間隔で３７℃にてインキュベーションした。
【００８７】
（分析技術およびアッセイ）
ＵＶ−ＶＩＳ吸収および光学顕微鏡検査。ＵＶ−ＶＩＳ分光写真（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ）を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））によって得た。光学顕微鏡写真を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１顕微鏡を使用して、明視野画像化によって得て、４０×〜４００×の倍率の下で、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ  Ｌ．Ｐ．（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））を使用して、Ｓｏｎｙ  ＤＸＣ−９７０ＭＤ  ３ＣＣＤカラーデジタルビデオカメラによって取り込んだ。
【００８８】
逆相ＨＰＬＣ。上記ＣＣＫ放出ペプチドの消化／加水分解されたペプチドを、自動積分およびクロマトグラフピークの分析のための、コンピューターインターフェースおよびソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）が装備されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムを用いて分離した。Ｓｕｐｅｌｃｏから入手したＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８逆相カラム（１００×２．１ｍｍ、３μｍ）を、上記消化されたペプチドを分離するために使用した。ペプチド（２１４ｎｍと２８０ｎｍでモニターした）の線形勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ）を、水（溶媒Ａ）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）中の０．０８％ＴＦＡからなる溶媒系を使用して、３０℃にて０．２５ｍｌ／分の流速を用いて得た。この勾配溶出は、以下：０〜３分（０％緩衝液Ｂ）、３〜３８分（０〜７０％緩衝液Ｂ）、３８〜４０分（７０％緩衝液Ｂ）および４０〜４０．５分（７０〜０％緩衝液Ｂ）であった。
【００８９】
ＣＣＫ精製。Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  ３  ｃｃ（５００ｍｇ）カートリッジを、抽出マニホルドの上に挿入して、１５ｍｌの１００％メタノールで調整した。カラムを、Ｈ２Ｏ中の１５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化にして、標識した円錐状遠心分離管を、抽出マニホルドの中に挿入して、カートリッジからロード／洗浄溶出液を回収した。次いで、血漿サンプルを、ＣＣＫの分解を防ぐために、ラットから回収後すぐにロードした。夾雑物を、Ｈ２Ｏ中のＴＦＡを用いて上記カラムから洗浄した。抽出マニホルド中の標識した円錐状遠心分離管によって、各Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジから上記ＣＣＫ含有溶出液を回収して、そのＣＣＫを、アセトニトリル中のＴＦＡを用いて上記カラムからゆっくりと溶出した（流速＜１ｍｌ／分）。一旦、上記溶出を完了させ、チューブにふたをかぶせて、ドライアイスで凍結した。内容物を、凍結乾燥機を使用して、２４〜４８時間、凍結乾燥して、使用するまで−８０℃にて保存した。
【００９０】
（実施例１）
セアプロ−ゼの結晶化。原料のままのセアプロ−ゼ粉末（１００ｇ、約７０％純粋）を、１０００ｍｌの１０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５０）中に溶解した。次いで、得たセアプローゼ溶液を、０．２２μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通過させることによって、フード中で濾過滅菌した。上記溶液を、４℃にて電磁攪拌機で一晩攪拌した。その次の日、生じた結晶を、２０分間、２，０００ｒｐｍ（ＧＨ  ３．８回転バケットローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ  ｂｕｃｋｅｔ  ｒｏｔｏｒ）を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｍｏｄｅｌ  ＧＳ−６Ｒ）で遠心分離することによって、上記溶液から分離して、続いて、その上清を除去した。結晶を、最小容積（８０ｍｌ）の１０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５０）で、再び洗浄して、２０分間、３，０００ｒｐｍで再び遠心分離した。次いで、上記の洗浄した上清を除去して、１．２Ｌ（１０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）の全容積中で上記結晶を再懸濁して、乳白色の溶液（Ａｂｓ２８０＝３４ｍｇ／ｍｌ）を得た。上記の再び溶解した結晶を、さらなる再結晶化のために、４℃で２〜３日間、静置させた。上記の精製したセアプローゼ結晶の最終収率は、４４％であった（図１を参照のこと）。
【００９１】
（実施例２）
セアプローゼ結晶の架橋。架橋を、グルタルアルデヒド（１％の最終濃度）を使用して行った。上記に調製したように、２０ｍｌのセアプローゼ結晶（１０ｍＭ炭酸ナトリウム中、２０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９．５）を、回転（ｔｕｍｂｌｉｎｇ）させた状態で４℃にて２４時間、８００μｌの２５％グルタルアルデヒド溶液で処理した。上記の架橋させた結晶溶液を、滅菌条件下で２０〜２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に濃縮した。２４時間後、上記結晶を、遠心分離して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄（５×）した。
【００９２】
（実施例３）
ラットにおける種々の外因性酵素補充物を含む食餌に対する血漿ＣＣＫ応答。従来のように、集団収容され、自由に水および実験用食餌に接近できるラット（各々約３５０ｇの重量）を、ランダムに８つの処置群に分け、さらに５つの集団に細かく分けて、各集団を３匹のラットにした。全てのラットを、一晩（２０〜２２時間）絶食させて、その次の朝（午前７時〜９時の間）、手術後（ＰＯ）、口胃（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃ）チューブに取り付けた給餌針（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｎｅｅｄｌｅ）を介して、５ｍｌの液体を胃の中へ経口投与した。上記５ｍｌのアリコートを、１〜８群について以下に示した成分から調製した。例えば、１群についての処置は、ビヒクル（５ｍｌの水を含む）、２群についての処置は、カゼインコントロール（水に９００ｍｇのカゼインを含み、５ｍｌの最終容積にした）、３群についての処置は、カゼイン＋セアプローゼ結晶（水に９００ｍｇのカゼインに加えて１４４ｍｇ（２０１，６００ＵＳＰ単位）のセアプローゼ結晶を含む）、４群についての処置は、カゼイン＋トリプシン（水に９００ｍｇのカゼインに加えて１０００ｍｇ（１，２５０，０００ＵＳＰ単位）のトリプシンを含む）、５群についての処置は、カゼイン＋架橋されたセアプローゼ結晶（水に９００ｍｇのカゼインに加えて２９４ｍｇ（２０１，６００ＵＳＰ単位）の架橋されたセアプローゼ結晶を含む）、６群についての処置は、カゼイン＋ダイズトリプシンインヒビター（水に９００ｍｇのカゼインに加えて２ｍｇのダイズトリプシンインヒビターを含む）、７群についての処置は、カゼイン＋Ｃｒｅｏｎ（登録商標）−２０（水に９００ｍｇのカゼインに加えて１０００ｍｇ（２０１，０３８ＵＳＰ単位）のＣｒｅｏｎ（登録商標）−２０を含む）、および８群についての処置は、カゼイン＋Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８（水に９００ｍｇのカゼインに加えて１０００ｍｇ（１０４，５００ＵＳＰ単位）のＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８を含む）である。次いで、麻酔として、１ｍｌのケタミン：キシレジン（１０ｍｌケタミン（１００ｍｇ）と１ｍｌキシレジン（１００ｍｇ）との混合物）の腹腔内（ｉｐ）過剰摂取をラットに与え、胸腔を開いて、右心室の心臓穿刺によって血液を抜き取った。１０ｃｃ注射器（１６ゲージ）を使用して、血漿サンプルを各ラットから得て、灌流の間の以下の５つの時点（前処置（絶食させた）、試験処方物投与後、７．５分、１５分、３０分および９０分）にヘパリン添加血液チューブ中に回収した（表３を参照のこと）。上記血漿サンプルを、遠心分離（４℃にて１０分、３０００ｒｐｍ）によって分離して、クリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）の中にデカントした。次いで、ＣＣＫを、上記のようにＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジを使用して血漿から精製した。ＣＣＫレベルを、ＣＣＫ−８硫酸塩に対して産生された特異性の高い抗血清（ガストリン−１７に対して０．５％より小さい交差反応性）およびトレーサーとしてＩ１２５（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから提供されるＣＣＫ  ＲＩＡキット）を使用して、競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した。種々の食餌性液体の口胃からの給餌の後、時間に対する血漿中のＣＣＫレベルの変化を、��３および図２に示す。ＣＣＫの最も低いレベル（すなわち、最も高い抑制）は、上記試験処方物中のセアプローゼで処置した両方の群において生じた。
【００９３】
【表３】
2007509982.tif 000008
【００９４】
（実施例４）
ラットにおける種々の外因性酵素補充物を含む食餌に対する血漿ＣＣＫ応答。従来のように、集団収容され、自由に水および実験用食餌に接近できるラット（各々約３５０ｇの重量）を、ランダムに６つの処置群に分けて、さらに６つの集団に分けて、各集団を３匹のラットにした。全てのラットを、一晩（２０〜２２時間）絶食させて、その次の朝（午前７時〜９時の間）、口胃チューブに取り付けた給餌針を介して、５ｍｌの液体を胃の中へ経口投与した。上記５ｍｌのアリコートを、１〜６群について以下に示した成分から調製した。１群の処置については、ビヒクル（５ｍｌの水を含む）、２群の処置については、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）コントロール（５ｍｌのＥｎｓｕｒｅ（登録商標）を含む）、３群の処置については、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に１４３ｍｇまたは２００，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にし、４群の処置については、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に５７ｍｇまたは８０，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にし、５群の処置については、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に１４ｍｇまたは２０，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にし、そして６群の処置については、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に３．６ｍｇまたは５，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にした。次いで、ラットに、（実施例３のように）１ｍｌのケタミン：キシレジンの過剰摂取（ｉｐ）を与え、体幹の血液を、灌流の間の以下の６つの時点（前処置（接触させた）、試験処方物投与後、７．５分、１５分、３０分、６０分、および９０分）にヘパリンでコーティングしたチューブの中に回収した（表４を参照のこと）。次いで、血漿サンプルを、１０ｃｃ注射器（１６ゲージ）を使用して各ラットから回収して、ヘパリン添加血液チューブ中に回収した。上記血漿サンプルを、遠心分離（４℃にて１０分、３０００ｒｐｍ）によって分離して、クリオチューブの中にデカントした。次いで、血漿サンプルを、上記のように、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ上で処理した。ＣＣＫレベルを、ＣＣＫ−８硫酸塩に対して産生された特異性の高い抗血清（ガストリン−１７に対して０．５％より小さい交差反応性）およびトレーサーとしてＩ１２５（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから提供されるＣＣＫ  ＲＩＡキット）を使用して、競合ＲＩＡによって測定した。種々の食餌性液体の口胃からの給餌の後、時間に対する血漿中のＣＣＫレベルの変化を、表４および図３に示す。ＣＣＫのより低いレベル（すなわち、より高い抑制）が、上記試験処方物中のより高い用量のセプローゼ結晶で処置した群において明らかになった。
【００９５】
【表４】
2007509982.tif 000009
【００９６】
（実施例５）
ラットにおける種々の外因性酵素補充物を含む食餌に対する血漿ＣＣＫ応答。従来のように、集団収容され、自由に水および実験用食餌に接近できるラット（各々約３５０ｇの重量）を、ランダムに６つの処置群に分けて、さらに６つの集団に分けて、各集団を３匹のラットにした。全てのラットを、一晩（２０〜２２時間）絶食させて、その次の朝（午前７時〜９時の間）、５ｍｌの液体を、口胃チューブに取り付けた給餌針を介して、胃の中へ経口投与した（ＰＯ）。上記５ｍｌのアリコートを、１〜６群において以下に示した成分から調製した。例えば、１群は、ビヒクル（５ｍｌの水を含む）、２群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）コントロール（５ｍｌのＥｎｓｕｒｅ（登録商標）を含む）、３群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に３．６ｍｇまたは５，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にし、４群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に２１ｍｇまたは５，０００ＵＳＰ単位の架橋されたセアプローゼ結晶（Ｓｅａｐｒｏｓｅ−ＣＬＥＣ）を含み、５ｍｌの最終容積にし、５群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に２ｍｇまたは５，０００ＵＳＰ単位のトリプシンを含み、５ｍｌの最終容積にし、そして６群は、Ｅｎｓｕｒｅ中に７２．３ｍｇまたは５，０００ＵＳＰ単位の市販のＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８を含み、５ｍｌの最終容積にした。次いで、ラットに、（実施例３のように）１ｍｌのケタミン：キシレジンの過剰摂取（ｉｐ）を与え、体幹（心臓）の血液を、ヘパリンでコーティングされたチューブの中に以下の６つの時点（前処置（絶食させた）、試験処方物投与後、７．５分、１５分、３０分、６０分、および９０分）に回収した（表５を参照のこと）。次いで、血漿サンプルを、１０ｃｃ注射器（１６ゲージ）を使用することによって、各ラットから回収して、ヘパリン添加血液チューブ中に回収した。上記血漿サンプルを、遠心分離（４℃にて１０分、３０００ｒｐｍ）によって分離して、クリオチューブの中にデカントした。次いで、血漿サンプルを、上記のように、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ上で処理した。ＣＣＫレベルを、ＣＣＫ−８硫酸塩に対して産生された特異性の高い抗血清（ガストリン−１７に対して０．５％より小さい交差反応性）およびトレーサーとしてＩ１２５（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから提供されるＣＣＫ  ＲＩＡキット）を使用して、競合ＲＩＡによって測定した。種々の食餌性液体の口胃からの給餌の後、時間に対する血漿中のＣＣＫレベルの変化（ｐｍｏｌ／Ｌ）を、表５および図４に示す。ＣＣＫのより低いレベル（すなわち、より高い抑制）が、他の処方物と比較した場合、上記試験処方物中のセアプローゼ結晶で処置した群において明らかになった。例えば、Ｃｍａｘの低下の割合を、以下のように計算した：０％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標））、９３．９２％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）＋セアプローゼ結晶）、８５．５６％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）＋Ｓｅａｐｒｏｓｅ−ＣＬＥＣ）、８０．２５％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）＋トリプシン）、および３５．０８％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）＋Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８）。
【００９７】
【表５】
2007509982.tif 000010
【００９８】
（実施例６）
ラットにおける外因性酵素補充物の反復用量を含む食餌に対する血漿ＣＣＫ応答。従来のように、集団収容され、自由に水および実験用食餌に接近できるラット（各々約３５０ｇの重量）を、ランダムに４つの処置群に分けて、さらに６つの集団に分けて、各集団を５匹のラットにした。全てのラットに、連続して３日間、自由に標準的な食餌を与えた。さらに、４群のラットに、連続して３日間にわたって、胃管栄養法によって、２０，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼを含む、５ｍｌのＥｎｓｕｒｅ（登録商標）を与えた（処置ラット）。全てのラットを、４日目に、一晩（２０〜２２時間）絶食させて、午前７時〜９時の間に、口胃チューブを通して、胃への点滴注入によって、５ｍｌの液体処方物を与えた。上記５ｍｌのアリコートを、１〜４群について、以下に示す成分から調製した。例えば、１群は、ビヒクル（５ｍｌの水を含む）、２群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）コントロール（５ｍｌのＥｎｓｕｒｅ（登録商標）を含む）、３群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に１４ｍｇまたは２０，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にし、４群は、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）中に１４ｍｇまたは２０，０００ＵＳＰ単位のセアプローゼ結晶を含み、５ｍｌの最終容積にした（図６を参照のこと）。次いで、ラットに（実施例３のように）１ｍｌのケタミン：キシレジンの過剰摂取（ｉｐ）を与え、体幹（心臓）の血液を、ヘパリンでコーティングされたチューブの中に以下の６つの時点（前処置（絶食させた）、試験処方物投与後、７．５分、１５分、３０分、６０分、および９０分）に回収した。次いで、血漿サンプルを、１０ｃｃ注射器（１６ゲージ）を使用することによって、各ラットから回収してヘパリン添加血液チューブ中に回収した。上記血漿サンプルを、遠心分離（４℃にて１０分、３０００ｒｐｍ）によって分離して、クリオチューブの中にデカントした。次いで、血漿サンプルを、上記のように、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ上で処理した。ＣＣＫレベルを、ＣＣＫ−８硫酸塩に対して産生された特異性の高い抗血清（ガストリン−１７に対して０．５％より小さい交差反応性）およびトレーサーとしてＩ１２５（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから提供されるＣＣＫ  ＲＩＡキット）を使用して、競合ＲＩＡによって測定した。種々の食餌性液体の口胃からの給餌の後、時間に対する血漿中のＣＣＫレベルの変化を、表６および図５に示す。３群および４群の両方は、匹敵するＣＣＫレベルの抑制を示し、それによって、セアプローゼへの曝露前のラットは、ＣＣＫの抑制のレベルが変化しなかったことを示す。例えば、Ｃｍａｘの低下の割合を、以下のように計算した：０％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標））、９５．８３％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）＋セアプローゼ結晶、直後）、および９７．６９％（Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）＋セアプローゼ結晶、反復）。
【００９９】
【表６−１】
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【０１００】
【表６−２】
2007509982.tif 000012
【０１０１】
（実施例７）
ｐＨ６．０における種々のプロテアーゼを用いるＣＣＫ放出ペプチドのインビトロでの加水分解。ＣＣＫ放出ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）を、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に懸濁して、ウォーターバス中で３７℃にて、０．１５単位（ＵＳＰ単位）のセアプローゼ（ＳＡＰ）とインキュベーションした（上記の酵素調製のための条件を参照のこと）。異なる時間間隔（０時間、１時間、２時間および４時間）にて、１０μｌのサンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００逆相ＨＰＬＣシステムの中に注入して、消化されたぺプチドを、勾配溶出を使用してＣ１８逆相カラム上で分離した。消化されていないＣＣＫ放出ペプチドは、２２．８分で溶出した。プロテアーゼ消化後、残存している消化されていないＣＣＫ放出ペプチドの量を、２２．８分におけるピーク下の領域から計算して、その結果を表７に示す。同様のＣＣＫ加水分解アッセイを、セラチオペプチダーゼ、プロナーゼ、トリプシン、またはＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８などのプロテアーゼを使用して行った。その結果を、表７に示す。
【０１０２】
【表７】
2007509982.tif 000013
【０１０３】
ｐＨ６．０において、真菌／細菌プロテアーゼは、Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）またはトリプシン（それらの両方は、膵臓起源である）のいずれかより活性的であり、ＣＣＫ放出ペプチドを、トリプシンまたはＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）のいずれかより速く加水分解した。真菌／細菌酵素は、Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）またはトリプシンのいずれかより高い比活性を有するので、そのような酵素のより少量が、Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）またはトリプシンのいずれかより、ＣＣＫ放出ペプチドを加水分解するために、重量ベースあたり、必要とされる。
【０１０４】
（実施例８）
ｐＨ４．５における種々のプロテアーゼを用いるＣＣＫ放出ペプチドのインビトロでの加水分解。ＣＣＫ放出ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中に懸濁して、ウォーターバス中で３７℃にて、０．３５単位（ＵＳＰ単位）のセアプローゼ（ＳＡＰ）とインキュベーションした（酵素調製のための上記の条件を参照のこと）。異なる時間間隔（０時間、１時間、２時間および４時間）にて、１０μｌのサンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００逆相ＨＰＬＣシステムの中に注入して、いくらかの消化されたペプチドを、勾配溶出を使用して、Ｃ１８逆相カラム上で分離した。消化されていないＣＣＫ放出ペプチドは、２０．６分で溶出した。プロテアーゼ消化後、残存している消化されていないＣＣＫ放出ペプチドの量を、２０．６分におけるピーク下の領域から計算した。その結果を表８に示す。同様のＣＣＫ加水分解実験を、セラチオペプチダーゼ、プロナーゼ、トリプシンまたはＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）−８などのプロテアーゼを使用して行った。その結果を、表８に示す。ｐＨ４．５において、真菌プロテアーゼは、Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）またはトリプシン（それらは膵臓起源である）のいずれかより活性であり、ＣＣＫ放出ペプチドを、トリプシンまたはＶｉｏｋａｓｅ（登録商標）のいずれかより速く加水分解した。真菌酵素は、Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）またはトリプシンのいずれかより高い比活性を有するため、より少量が、ＣＣＫ放出ペプチドを加水分解するために、重量ベースあたり、必要とされる。
【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
（実施例９）
圧縮された状態におけるプロテアーゼ酵素活性の決定および痛みの処置のための圧縮されたプロテアーゼ錠剤を使用する実行可能性。ヒトにおける膵臓の痛みを処置する際に、１回の食事あたりの一用量のプロテアーゼの量は、各個体における痛みの重症度に依存して変化する。今までのところ、膵臓の痛みについての現状の処置は、１日に４回、１回の食事につき４個〜７個のカプセルを投与する工程を包含し；そのカプセルは代表的に、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ（例えば、Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）−１６）の混合物を含む、ブタベースの膵酵素抽出物を含む。Ｖｉｏｋａｓｅ（登録商標）−１６の酵素カプセルレジメンにおいて、例えば、全膵酵素の約２ｇ〜３．５ｇが、各食事の間に投与される。
【０１０７】
外因性膵臓プロテアーゼは、十二指腸において所望の活性を有するために、腸溶コーティングがない状態で投与されなければならない（Ｖ．Ｓｉｎｇｈら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５、１１０−１１６、（２００３））。しかし、腸溶コーティングがない外因性膵臓プロテアーゼは、代表的に、プロテアーゼが、所望の活性を有して十二指腸に届くことを確実にするために、酸抑制剤（例えば、プロトンポンプインヒビターまたはＨ２レセプターアンタゴニスト）とともに投与される（同書、１１３）。この目的のために使用されるプロトンポンプインヒビターとしては、例えば、オメプラゾール（Ｌｏｓｅｃ）、エソメプラゾール（Ｅｓｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）（Ｎｅｘｉｕｍ）、ランソプラゾール（Ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ）（Ｚｏｔｏｎ）、パントプラゾール（Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ）（Ｐｒｏｔｉｕｍ）、ラベプラゾール（Ｒａｂｅｐｒａｚｏｌｅ）ナトリウム（Ｐａｒｉｅｔ）、そしてＨ２レセプターアンタゴニストとしては、例えば、シメチジン（Ｔａｇａｍｅｔ、Ｄｙｓｐａｍｅｔ）、ファモチジン（Ｐｅｐｃｉｄ）、ニザチジン（Ａｘｉｄ）、ラニチジン（Ｚａｎｔａｃ）、ラニチジンクエン酸ビスマス（Ｐｙｌｏｒｉｄ）が挙げられる。
【０１０８】
本発明の方法の１つの利点は、非膵臓プロテアーゼが、腸溶コーティングまたは酸抑制剤の付加を必要とせずに哺乳動物に固体形態として投与され得ることである。微生物に由来するプロテアーゼ（例えば、真菌プロテアーゼ）は、胃酸に対して膵酵素より安定であるので、酸抑制剤の必要性が、最小限であるか、または存在しない。
【０１０９】
一般に、タンパク質は、錠剤圧縮の間、安定でないと考えられているので、消化不良を制御するために使用される従来のプロテアーゼは、代表的に、カプセル形態で投与される。本発明は、腸溶コーティングおよび酸抑制剤を含まずに活性なままである、圧縮された錠剤の形態の非膵臓プロテアーゼを提供する。
【０１１０】
本発明に従う方法の処置のためのプロテアーゼの圧縮された錠剤の実行可能性および活性を試験するために、以下の試験を実施した。冷凍保存からセアプローゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ、結晶質ＳＡＰ）を除去し、それを２時間未満、室温で暖めることによって、表９に示す３つの処方物を、調製した。所定の処方物についての全ての賦形剤を組み合わせてポリエチレンバッグおよび乾燥混合物にすることによって、プラシーボ混合物を調製した。例えば、１４０ｍｇのプラシーボ混合物と６０ｍｇのセアプローゼ（８１，６００ＵＳＰ単位）を測定および混合し、この混合物を単一の穴を開ける装置のダイキャビティに移して、錠剤を形成するために混合物に圧縮を適用することによって、２００ｍｇの錠剤を調製した。１００ｍｇのセアプローゼを秤量することによって調製して、それを単一の穴を開ける装置のダイキャビティに移して、それを錠剤形態に圧縮することによって、賦形剤を含まないセアプローゼ（純粋な形態）を調製した。本出願人らは、６０ｍｇの量のセアプローゼは、使用した圧縮ツール（Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｕｎｃｈ  Ｔａｂｌｅｔ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｍｏｄｅｌ  ＭＴＣＭ−Ｉ、Ｇｌｏｂｅｐｈａｒｍａ、Ｉｎｃ．）によって圧縮されるには、少量すぎることを見出した。
【０１１１】
【表９】
2007509982.tif 000015
【０１１２】
【表１０】
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【０１１３】
上記発明は、理解を明確にする目的のための説明および実施例によって、いくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲を含む、本明細書中の開示の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に対して成され得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、光学顕微鏡によって画像化された、１０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）の存在下で増加したセアプローゼ結晶を示す。実施例１を参照のこと。
【図２】図２は、種々の外因性酵素補充物を含む食餌に応答する、ＣＣＫラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）によって測定されたラットの血漿中のＣＣＫレベルを示す。実施例３を参照のこと。
【図３】図３は、外因性セアプローゼ結晶補充物を含む食餌に応答する、ＣＣＫラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）によって測定されたラットの血漿中のＣＣＫレベルを示す。実施例４を参照のこと。
【図４】図４は、種々の外因性酵素補充物を含む食餌に応答する、ＣＣＫラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）によって測定されたラットの血漿中のＣＣＫレベルを示す。実施例５を参照のこと。
【図５】図５は、外因性セアプローゼ結晶補充物を含む食餌に応答する、ＣＣＫラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）によって測定されたラットの血漿中のＣＣＫレベルを示す。実施例６を参照のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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