(57)【要約】  血管内皮細胞の増殖速度を評価するために、方法、バイオマーカー及び発現特性を開示する。より具体的には、本発明は、腫瘍脈管構造において内皮細胞の増殖を調節するように設計された癌治療薬の薬力学効果を評価するためのバイオマーカー及び遺伝子特性として使用できる一連の遺伝子を提供する。一態様では、本発明は、哺乳類ＫＤＲ受容体活性などのキナーゼ受容体活性を阻害するように設計された化合物の効果の評価方法を提供する。
2007530047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）複数のアドレスを有する基盤を含み、各アドレスには内皮細胞増殖のバイオマーカーに特異的に結合できる捕捉プローブ又はオリゴヌクレオチドが配置されているアレイを提供することと、
ｂ）内皮細胞集団から核酸試験試料を調製することと、
ｃ）前記核酸試料を前記アレイと接触させることと、及び
ｄ）前記試験試料中の前記核酸が、前記アレイ上に存在する前記複数のアドレスそれぞれに結合するのを検出することによって発現特性を測定し、それによって前記内皮細胞の増殖速度を測定することと、
を含む、内皮細胞集団の増殖状態を測定する方法。
【請求項２】
アレイが、表３又は表４に記載された遺伝子配列から選択される１個以上の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アレイが、表３から６で同定された遺伝子から選択されたその他のバイオマーカーと組み合わせて、Ａｎｇｐｔ−２、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｉｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９）、Ｆｕｔ−４、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸試料が、腫瘍生検から得られた血管内皮細胞の集団から調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料は、腫瘍脈管構造中の内皮細胞の増殖を阻害するように企図された治療薬による治療を受けた癌患者から調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
患者が、ＫＤＲキナーゼ阻害剤で治療される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者が、化合物Ａで治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
表４及び表５で同定されたバイオマーカーからなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有する細胞集団と化合物を、前記ポリヌクレオチドが発現される条件下で接触させることと、及び内皮細胞増殖特性の発現における変化を測定することを含み、発現の変化は抗血管形成活性の指標である、抗血管形成活性用の複数の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞集団が、腫瘍脈管構造中の内皮細胞の増殖を阻害するように企図された治療薬によって治療されている癌患者の腫瘍生検から単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
治療薬が、受容体型キナーゼ阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
内皮細胞発現特性の変化が、内皮細胞増殖バイオマーカーに特異的に結合できるオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション、又はＲＴ−ＰＣＲによって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
内皮細胞増殖特性が、表５又は表６で同定された遺伝子から選択されるその他のバイオマーカーと組み合わせて、Ａｎｇｐｔ−２、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｉｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９）、Ｆｕｔ−４、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）遺伝子と特異的に結合する捕捉プローブ又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複数のアドレスを有する基盤を含み、各アドレスには表３及び表４で定義された増殖特性を含む遺伝子からなる群から選択されるバイオマーカー遺伝子のポリヌクレオチド配列に特異的に結合できる捕捉プローブ又はオリゴヌクレオチドがその上に配置されているアレイ。
【請求項１４】
表３又は表４に記載された増殖特性を含むバイオマーカー遺伝子を含む組成物。
【請求項１５】
表５又は表６に記載された発現特性を含むバイオマーカー遺伝子を含む組成物。
【請求項１６】
Ａｎｇｐｔ−２、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｉｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９）、Ｆｕｔ−４、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）遺伝子を含む内皮細胞増殖特性。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込んだ２００４年３月２６日出願の米国特許仮出願第６０／５５６６４５の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は、腫瘍内の血管内皮細胞の増殖速度を評価するための方法、バイオマーカー及び発現特性に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍脈管構造における内皮細胞の増殖を調節するように設計された癌治療薬の薬力学効果を評価するために、バイオマーカーとして使用できる一連の遺伝子を提供する。一態様では、本発明は、哺乳類ＫＤＲ受容体活性などのキナーゼ受容体活性を阻害するように設計された化合物の効果の評価方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
以下の説明では、特定の所見及び所説を支持するために、様々な科学文献の教示を利用している。特定の文章の最後にある数字の引用は、明細書の最後に含まれた文献リストの番号を意味する。
【０００４】
血管内皮細胞は、血管系全体にわたって管腔非血栓性単層を形成する。固体腫瘍は血管系が栄養と生成物代謝物の拡散により制限される小結節を越えて拡張することを必要とする。腫瘍細胞は、まず既存の宿主毛細血管に定着することができるが、腫瘍細胞の増殖はこれら既存の正常血管の破壊を導き、低酸素症を引き起こす。したがって、血管形成は多くの癌の進行に不可欠である。その後の腫瘍の増殖には、腫瘍血管形成という新たな宿主血管の内殖によって実現する血管新生が必要である。腫瘍は、血管内皮細胞用の増殖因子を分泌することによって、増殖、移動及び分化を誘導し、血管新生をもたらす。血管形成は多くの癌の進行に不可欠である。腫瘍は、内皮細胞の移動、増殖及び分化を誘導し、既存の血管から生じた血管新生をもたらす。腫瘍細胞は、主に強力な内皮細胞分裂促進因子であり、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ、ＦＬＫ−１又はＶＧＥＦ受容体）のリガンドである分泌蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生及び分泌によって血管形成を誘導する。
【０００５】
チロシンキナーゼは、アデノシン３リン酸の末端のリン酸の蛋白質基質チロシン残基への移動を触媒する酵素の１種である。チロシンキナーゼは、基質のリン酸化によって、いくつかの細胞機能のためのシグナル伝達において重要な役割を果たすと考えられ、細胞増殖、発癌及び細胞分化に関与する重要な因子であることが示された。チロシンキナーゼは、受容体型又は非受容体型として分類することができる。受容体型チロシンキナーゼは、一般的に細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分を有し、一方非受容体型チロシンキナーゼは、リガンドが結合すると、それ自体キナーゼ活性を持たない受容体の細胞内部分に細胞内キナーゼを結合させる膜受容体の例もあるが、一般的に完全に細胞内にある。チロシンキナーゼは受容体型及び非受容体型のいずれも、癌、乾癬及び過免疫応答をはじめとする数多くの病的状態を引き起こす細胞シグナル伝達経路に関与している。
【０００６】
受容体型チロシンキナーゼは、種々の生物活性をもつ多数の膜貫通受容体から構成される。実際に、受容体型チロシンキナーゼの異なるサブファミリー約２０個が同定されている。キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）は、受容体型チロシンキナーゼのＦＬＫサブファミリーに属する。ＫＤＲは、ＶＥＧＦに起因する生理学的機能の大部分を伝達する、血管内皮細胞で主に発現する膜貫通受容体チロシンキナーゼである（３、８〜１０）。ＫＤＲ触媒活性を阻害すると、腫瘍の新血管形成が阻止され、血管透過性が減少し、動物モデルでは、腫瘍増殖及び転移が阻害される。
【０００７】
腫瘍細胞は、強力な内皮細胞分裂促進因子であり、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ、ＦＬＫ−１、又はＶＥＧＦ受容体２）のリガンドである血管内皮増殖因子（ＶＤＧＦ）の産生及び分泌によって主に血管形成を誘導する（３〜７）。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞によって発現する２種類の膜貫通チロシンキナーゼ結合受容体、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）及びＫＤＲ（Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ−２）に高い親和性で結合する。ＫＤＲの細胞外領域に２量体ＶＥＧＦが結合すると、受容体の２量体化を促進して細胞内チロシンキナーゼドメインを相互に結合させ、いくつかの受容体チロシン残基のリン酸化を促進し、これらの残基の少なくともいくつかは有糸分裂誘発シグナル伝達に不可欠である。
【０００８】
ヒトの癌を治療する抗血管形成治療薬を確立するために多大な努力がなされている。腫瘍細胞によって産生分泌されたＶＥＧＦはＫＤＲを活性化し、内皮細胞の増殖を誘導するので、小分子によってＫＤＲを阻害すると腫瘍内皮細胞の増殖速度の減少が引き起こされるはずである。近年、ＫＤＲ活性の小分子阻害剤のいくつかが臨床試験で抗癌剤として評価されている。ＫＤＲは一旦活性化されるとシグナル伝達カスケードを開始し、内部移行して、最終的に分解される。ＶＥＧＦ／ＫＤＲ系を阻害するとＶＥＤＦ依存性腫瘍の血管形成及び増殖が阻害されることがいくつかの動物モデルで示された。腫瘍細胞によって産生分泌されたＶＥＧＦはＫＤＲを活性化し、内皮細胞の増殖を誘導するので、ＫＤＲキナーゼ活性を阻害すると腫瘍内皮細胞の増殖速度の減少が引き起こされることが確認されている。したがって、提案されている数々の癌治療薬は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）又はキナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１）、内皮細胞上の主なＶＥＧＦ受容体を標的とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
臨床的に、ＫＤＲ蛋白質は容易に入手可能な臨床試料では簡単には検出できないので、ＫＤＲ阻害剤の薬力学効果を直接評価することは困難である。ダイナミック造影核磁気共鳴画像法（ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）（ＤＣＥ−ＭＲＩ）によって腫瘍内の血管透過性の変化を測定することが現在最も一般的な薬力学測定法であるが、間接的な指標であり、複雑で、高価な手法である。したがって、現在の臨床研究機器に適合し、抗血管形成剤の効果を評価することができる迅速で、定量的で、再現性の良い安価な測定法が臨床の現場で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
分裂促進及び血管形成に適格なＶＥＧＦ受容体として、ＫＤＲはＶＤＧＦ依存性腫瘍血管形成及び増殖と拮抗するために特に興味ある標的である。ＫＤＲ触媒活性を阻害すると、腫瘍の新血管形成が阻止され、血管透過性が減少し、動物モデルでは、腫瘍の増殖及び転移を阻害される。しかし、ＫＤＲ蛋白質は、末梢血又は骨髄穿刺液などの容易に入手可能な生物学的材料で高濃度に発現されないので、ＫＤＲキナーゼ阻害剤のインビボでの薬力学効果を臨床的に評価することは困難を極める。したがって、ＫＤＲ阻害の現在の動力学的測定法は一般的に、評価するべき化合物に対しても敏感な代理蛋白質キナーゼマーカー（すなわち、大多数のＫＤＲキナーゼ阻害剤の場合はＦｍｓ関連チロシンキナーゼ−３（Ｆｌｔ−３）によるチロシンリン酸化）、又は血管透過性の変化を評価することができるＤＣＥ−ＭＲＩなどの画像技術に基づいている。これらの方法の欠点は、ＫＤＲ機能及び内皮細胞増殖を間接的に測定することである。
【００１１】
他の取り組みは、腫瘍内皮細胞の増殖速度に対するＫＤＲ推定阻害剤の薬力学効果を評価することである。報告されたＥＣ増殖をインビボで評価するための１方法は、内皮細胞マーカー、ＣＤ−３１及び細胞増殖の核マーカー、Ｋｉ−６７について腫瘍部分を２重免疫組織化学（ＩＨＣ）染色することが必要である（１１）。このような免疫組織化学法でＥＣの増殖画分を決定することはできるが、この実験方法は技術的に複雑で、染色した腫瘍部分それぞれに要する分析は極めて時間がかかる。これらの各要因それぞれによって、ＩＨＣをベースとした測定法を臨床的には使用できそうにない。
【００１２】
本明細書で開示し特許請求した方法は、増殖する内皮細胞に特異的なバイオマーカー、及び遺伝子発現特性の発見及び特徴付けに基づいている。培養した初代内皮細胞、培養した腫瘍細胞及びＫＤＲ阻害剤で処理した動物腫瘍モデルの組織の遺伝子発現プロファイリングデータは、腫瘍細胞に対して腫瘍内皮細胞で選択的に過剰発現し、その発現パターンが腫瘍内皮細胞の増殖速度と相関する一連の遺伝子を同定するために使用した。腫瘍脈管構造において内皮細胞の増殖を阻害することを目的とする任意の癌治療薬の薬力学指標を提供する場合、本明細書で開示し特許請求したバイオマーカー及び内皮細胞特異的発現特性には実用性が見いだされるものと考えられる。
【００１３】
本明細書で示したように、これらの遺伝子の発現レベルは、ＫＤＲ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤の活性の簡単な薬力学測定法の基礎として役立つ。本明細書で開示し特許請求した方法は、ＫＤＲ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤の臨床面での開発を支持することができる薬力学測定の基礎として使用することができる。より具体的には、本発明は、腫瘍内の血管内皮細胞の増殖速度に対するＫＤＲキナーゼ阻害剤のインビボでの効果を評価するための方法を提供する。
【００１４】
一態様では、本発明は内皮細胞の増殖状態（又は速度）の測定方法を提供する。本明細書で示したように、開示された方法は、インビトロの、又はインビボのいずれかの様式で内皮細胞の増殖状態を評価するために使用することができる。本明細書で提供した開示に基づいて確立できる、開示された遺伝子発現をベースとした薬力学測定法は、内皮細胞の増殖状態を調節するように企図された治療薬の効果を評価するように確立されたスクリーニング測定法を支持するために使用できることを当業者であれば認識するであろう。
【００１５】
第２の態様では、本発明は腫瘍内の血管内皮細胞の増殖速度の評価方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、腫瘍脈管構造において内皮細胞の増殖を調節するように設計された癌治療薬の臨床面での開発を支持するための使用に適した、遺伝子発現をベースとした薬力学測定法を提供する。たとえば、開示した方法は、ほとんど静止した内皮細胞を含有する腫瘍から増殖する内皮細胞を含有する腫瘍を区別できる薬力学測定法を確立するために使用することができるものと考えられる。特定の実施形態では、該方法は、Ａｎｇｐｔ−２、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｉｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９）、Ｆｕｔ−４、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）から成る群から選択された１個以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、腫瘍内の血管内皮細胞の増殖速度を調節するように企図された抗血管形成治療薬の活性を評価するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明はＫＤＲなどの受容体型キナーゼ阻害剤である小分子阻害剤の効果を評価する方法を提供する。たとえば、本発明のこの態様は、化合物ＡなどのＫＤＲキナーゼ阻害剤の臨床面での開発を支持するための使用に適した方法を提供する。本明細書で提供した情報を使用したところ、特に化合物Ａ及び化合物Ｂは表５に示した内皮細胞特異的発現特性を誘導した。表６は、表６で示したＫＤＲキナーゼ阻害剤（化合物Ａ及び化合物Ｂ）のインビボ投与に応じて観察される内皮細胞特異的バイオマーカー（全体として増殖配列と称する）の発現変化（抑制）を表す情報をまとめて示したものである。抗血管形成剤の効果を評価するために適した、遺伝子発現をベースとした測定法を設計し、検証することは当業者の能力の十分範囲内である。
【００１７】
本明細書で提供した開示を使用して、当業者は、内皮細胞増殖を調節するために企図された他の治療薬の効果の評価を容易にする化合物特異的発現特性を同定するために、本明細書で開示した増殖特性をまとめた表にある情報を使用することができる。たとえば、本発明のこの態様は、化合物ＡなどのＫＤＲキナーゼ阻害剤の臨床面での開発を支持するための使用に適した方法を提供する。たとえば、Ａｎｇｐｔ−２、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｉｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９）、Ｆｕｔ−４、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）遺伝子を含む遺伝子特性の発現における変化を検出する測定法を確立することによって、化合物Ａの効果はインビボで評価できるものと考えられる。
【００１８】
第４の態様では、本発明は腫瘍細胞に関連した腫瘍内皮細胞で選択的に過剰発現し、その発現パターンが腫瘍内皮細胞増殖の速度と相関する遺伝子又はバイオマーカーの組成物を提供する。本発明のこの態様の１実施形態は、それぞれのオリゴヌクレオチドが表３又は４で開示した遺伝子と特異的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも２個のオリゴヌクレオチド、並びにそれぞれのプローブが表３、４、５又は６の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも２個のプローブを含む固相支持体を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、該組成物は、表３〜６で同定されたその他の遺伝子に特異的なその他のオリゴヌクレオチド又はプローブと組み合わせて、以下の遺伝子、Ａｎｇｐｔ−２、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｉｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９）、Ｆｕｔ−４、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び／又はプローブを含む。
【００１９】
他の態様では、本発明は、内皮細胞の増殖を調節するように設計された治療薬の効果を評価するための、発現をベースとした薬力学測定法を確立するために使用できる遺伝子発現特性を提供する。当業者は、この開示で提供された情報、特に、本明細書で表３（ＨＤＭＶＥＣ増殖特性）、表４（ＲＨＮＶＥＣ増殖特性）、表５（化合物Ａ及びＢ誘導内皮細胞特異的配列）及び表６（ＫＤＲキナーゼ阻害剤投与によるＥＣ特異的増殖特性の変化）と称する増殖特性の表に含まれる情報を利用して、その他の抗血管形成化合物の効果をモニターするために適した内皮細胞増殖特性を解明することができるものと考えられる。本明細書で示したように、本明細書で開示し特許請求した遺伝子発現特性は、主に静止状態のＥＣを含有する腫瘍から、主に増殖するＥＣを含有する腫瘍を区別するために使用することができる。
【００２０】
開示した測定法は、治療を開始した後で比較的迅速に血管形成阻害を検出する能力を有し、腫瘍の微小血管系の形態学的変化を視覚化するのに長い時間を必要としないものと考えられる。さらに、開示した方法は、生検の小組織試料（すなわち、穿刺吸引物）又は形態学的に不十分な組織試料などの、免疫組織化学が不適切であるか、又は実行不可能な環境で特に有用であると考えられる。リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）様式において、開示された測定法は、既存の臨床研究機器に容易に適合できる非常に敏感な測定法となると予測される。
【００２１】
癌治療の薬力学効果の発現プロファイリングをベースとしたモニタリングは、潜在的に多くの利点を有する。臨床の場で使用する場合、この技術は現在の臨床研究機器に適合できる、迅速で、定量的で、再現性の良い安価な測定法となる。本明細書で開示した測定法などの注意深く設計された、遺伝子発現をベースにした測定法は、抗腫瘍薬の投与をより効果的にしたり、特定治療から利益を最も得る可能性がある患者集団を同定したり、新規治療薬の臨床開発時間を減少させたりする見込みがある。これらの側面はそれぞれ、腫瘍の反応速度の増加及び、ヒトの健康の増進をもたらすだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下の説明では、当業者に公知の多くの用語及び表現を使用している。明瞭かつ一貫性のある解釈のために、いくつかの用語及び表現の定義を挙げる。
【００２３】
本発明は、細胞の状態に応じて、すなわち、増殖細胞と静止細胞とでは異なって発現し得る遺伝子の発現レベルを検出する組成物及び方法を提供する。本明細書では、「発現レベルを検出すること」という表現は、発現レベルを定量する方法並びに関心のある遺伝子が確かに発現するかどうかを決定する方法を含む。したがって、この表現は本明細書で使用されるとき、発現量を定量する必要なくはっきりした結果をもたらす測定法は、「発現レベルを検出すること」が必要な測定法である。増殖内皮細胞で異なって発現していることが同定された遺伝子は、所与の試料における遺伝子以上遺伝子の発現レベルを検出又は定量するための様々な核酸検出測定法で使用することができる。たとえば、従来のノザンブロッティング、ヌクレアーゼ保護、ＲＴ−ＰＣＲ及びディファレンシャルディスプレイ法は、遺伝子発現レベルを検出するために使用することができる。
【００２４】
本明細書では、本明細書で説明した遺伝子の１種以上と相補的なオリゴヌクレオチド配列とは、厳密な条件下で少なくとも前記遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドのことである。このようなハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは一般的に、前記遺伝子に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約７５％の同一性を示し、好ましくは前記遺伝子に対して約８０％又は８５％の配列同一性を示し、より好ましくは約９０％又は９５％以上の配列同一性を示す。
【００２５】
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダイゼーションを意味し、標的ポリヌクレオチド配列の望ましい検出を実現するために、ハイブリダイゼーション媒体の厳密性を減少させることによって適応可能な小さなミスマッチを容認する。
【００２６】
「〜に特異的にハイブリダイズする」という表現は、その配列が複合体混合物（たとえば、全細胞の）ＤＮＡ又はＲＮＡに存在するとき、厳密な条件下で特定のヌクレオチド配列又は配列類に実質的に、又はそれらとのみ分子が結合するか、２本鎖形成するか、又はハイブリダイズすることを意味する。
【００２７】
本発明の測定法及び方法は、少なくとも約１００個、好ましくは約１０００個、より好ましくは約１００００個、最も好ましくは約１００００００個以上の異なる核酸ハイブリダイゼーションで同時にスクリーニングするために使用可能な様式を利用できる。
【００２８】
ＶＥＧＦシグナリング経路を標的とする抗血管形成治療の薬力学を直接評価することは困難である。ＫＤＲチロシン蛋白質キナーゼを阻害すると内皮細胞増殖が抑制されるが、インビボでこれらの細胞の増殖速度を評価することは困難である。使用されてきた１方法は、増殖する内皮細胞を定量するために腫瘍部分をＣＤ３１及びＫｉ６７について２重免疫組織化学染色する方法である。使用されている第２の方法は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による血管透過性の変化の評価である。いずれの方法にも欠点がある。免疫組織化学（ＩＨＣ）は比較的大きな、完全な腫瘍試料が入手できる研究に限定される。その場合でも、薬剤候補による処理の前後を比較するために対となる腫瘍採取試料が入手できることは希である。臨床の場で穿刺吸引（ＦＮＡ）によって得られた生検試料はこの方法によって分析することはできない。さらに、微小血管密度又は腫瘍全体の増殖内皮細胞の割合を正確に評価することは、半自動又は自動の顕微鏡装置を用いても多大な労力を必要とする。血管透過性の変化を評価するためのＭＲＩ画像の分析もまた多大な労力を必要とし、撮像装置の操作及び画像の解釈には十分に訓練された職員が必要である。
【００２９】
内皮細胞増殖の遺伝子発現をベースにした薬力学測定法を設計する戦略は、培養された初代微小血管細胞において一般的な分裂促進剤誘導増殖特性を最初に同定するゲノム範囲の遺伝子発現プロファイリングを採用することである。特定の遺伝子の発現プロフィール、組織、病状又は疾患の進行段階は、毒性、薬剤効果、薬剤代謝、成長及び疾患のモニターを評価するための分子手段となる。基準プロフィールから発現プロフィールへの変化は、このような影響の指標として使用することができる。当業者は、発現プロフィールの変化を観察するために、様々な公知の技術のいずれかを使用して本出願で同定した１種以上の遺伝子及び／又はＥＳＴの発現を評価することができる。
【００３０】
初代内皮細胞の分裂促進剤誘導性増殖によってインビトロで調節されることが示された多様な遺伝子を手始めに、内皮細胞に比較的特異的な小集団を同定した。次に、内皮細胞特異的なインビトロ増殖特性から遺伝子の小集団を同定した。２種類の異なる同系腫瘍モデルを使用して、インビボにおいてＫＤＲキナーゼ阻害剤に曝露すると腫瘍内の血管内皮細胞の増殖速度の抑制と一致した様式で活発な遺伝子発現の変化が媒介されることが示される。遺伝子発現変化は、ＶＥＧＦシグナリングの阻害と一致しており、内皮細胞増殖の阻害は各動物モデルの腫瘍で検出された。
【００３１】
推定バイオマーカーの内皮細胞特異性は、免疫蛍光顕微鏡によって確かめられた。該バイオマーカーはさらに、内皮細胞増殖の独立した、免疫組織化学測定にインビボ遺伝子発現変化を相関させることによって検証した。
【００３２】
３種類の腫瘍モデルのうち少なくとも２種類においてＫＤＲキナーゼ阻害剤に全身的に曝露することによって調節される遺伝子は、内皮細胞増殖バイオマーカーとして選択された。（マイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定したような）これらのバイオマーカーの遺伝子発現変化は、プロファイルした腫瘍並びに他の、独立した動物腫瘍研究の腫瘍の両方において、定量リアルタイムＰＣＲによって確かめられた。
【００３３】
開示された一連のバイオマーカーは、（プロファイルした同様のラット腫瘍において再び）免疫組織化学染色によって測定したように、化合物誘導性の遺伝子発現変化を増殖する腫瘍内皮細胞数の化合物誘導性変化と相関させることによって検証した。本明細書で開示し特許請求したバイオマーカー発現（遺伝子特性）の（ラット腫瘍モデルの場合の）内皮細胞特異性は、同定した遺伝子の蛋白質産物がＣＤ３１発現細胞に限定されることを示すことによって確立される。本明細書で示した開示に基づいて、腫瘍内の血管内皮細胞の増殖速度を反映する遺伝子発現特性を同定することはおそらく可能で、それによって医師が治療に対する腫瘍応答性を予測することが可能であると考えられる。
【００３４】
本明細書で説明したデータに基づいて、本発明は、インビトロにおいて初代微小血管系内皮細胞の増殖を分裂促進剤で誘導している間に、及びインビボにおいてＫＤＲキナーゼ阻害剤に対する全身的な曝露に応じて調節される一連の遺伝子又は集合的に本明細書で遺伝子特性と称するバイオマーカーを提供する。ＫＤＲの阻害に応じたこれらのバイオマーカーの発現レベルの変化は、腫瘍内皮細胞増殖速度の変化の指標である。調節することで腫瘍血管内皮細胞の増殖速度の変化が示される本明細書で開示し特許請求した遺伝子発現特性（又はバイオマーカー）の同定は、抗血管形成治療薬に曝露した後の非侵襲性の安価な測定法を提供するものと考えられる。
【００３５】
全ての選択基準に合致する遺伝子を偶然に同定するという見込みは少なかったが、一連の７種類の有望なバイオマーカー遺伝子（Ａｎｇｐｔ−２、Ｅｎｄｒｂ（Ｅｔｂ）、Ｆｕｔ−４、Ｃｌｕ（ＡｐｏＪ）、Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１）、Ｐｌａｕ（ｕＰＡ）及びＩｆｉｔ−３（Ｇａｒｇ４９））を同定した。注目に値すべきことに、同定された７種のバイオマーカーのそれぞれは内皮細胞の生物学に関与することが知られているか、又は見なされている。我々は内皮細胞特異的遺伝子に対するバイオマーカー選択に重点を置いているが、我々の多数の基準に合致する遺伝子が内皮細胞において公知のいずれかの機能を有するという保証はない。驚くべきことに、同定されたほとんど全ての遺伝子が内皮細胞機能の調節に直接関与していると見なされるか、又は示された。
【００３６】
アンジオポエチン−２蛋白質（ＡＮＧＰＴ２／ＡＮＧ２）は、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン−１と相まって血管再構築を調節するように機能するＴｉｅ−２受容体チロシンキナーゼのよく特徴付けられたリガンドである（２５）。アンジオポエチン−２遺伝子発現は、我々の結果と一致して、インビボ及びインビトロの両方で、ＶＥＧＦによって直接上方制御されることが既に報告されている（２６）。
【００３７】
エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ／ＥＴ（Ｂ））は、後腸における神経節の先天的奇形、ワールデンブルグ−ヒルシュスプルング病で変異する７回膜貫通型Ｇ蛋白質結合受容体である（２７）。ＥＤＮＲＢについて発表された研究のほとんどは、神経冠発達中の神経系における役割について記載している。しかし、これは血管収縮を制御し、エンドセリン及びＥＤＮＲＢによって誘導された血管細胞増殖は原発性黒色腫で過剰発現することが示された（２８）。ＥＤＮＲＢ拮抗薬は、インビトロ及びインビボで血管細胞増殖及びヒト黒色腫の細胞増殖を阻害することが報告された（２９、３０）。
【００３８】
フコシルトランスフェラーゼ４（ＦＵＴ４）は、Ｅ−セレクチンの主要な生理学的結合剤であるミエログリカン（ｍｙｅｌｏｇｌｙｃａｎ）の合成に関与するアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである（３１）。これはまた、その他の多くのグリコシル化蛋白質の合成に関与するが、いくつかの腫瘍で予後と逆相関して高く発現することが報告されている（３２）。
【００３９】
クラステリンはアポトーシス細胞で過剰発現と思われる分泌型糖蛋白質であるが、その機能の多くは未だに知られていない（３３）。クラステリン発現は、抗増殖性であり（３６）、進行した前立腺癌では下方制御されていることが示された（３７〜３９）。血清クラステリン濃度の減少はまた、食道扁平上皮癌の腫瘍形成と相関する（４０）。
【００４０】
システインの豊富な蛋白質６１（ＣＹＲ６１）は、血管形成誘発特性を有する細胞外マトリックス関連ヘパリン結合蛋白質である（４１）。インビトロでは、ＣＹＲ６１は細胞外マトリックスに対する細胞接着及び化学走性を促進する（４２、４３）。それは、インテグリンαＶβ５、α６β１、αＭβ２と相互作用することによって細胞移動性を刺激し、Ｖｂ３と相互作用することによって内皮細胞増殖を刺激する（４４〜４８）。ＫＤＲキナーゼ阻害剤に曝露した後、ラット腫瘍組織でＣｙｒ６１遺伝子は上方制御されたという所見は、内皮細胞増殖の阻害と一致しないと考えられた。しかし、Ｃｙｒ６１遺伝子の上方制御は、機能性ＫＤＲの欠如を補おうとする内皮細胞の応答機構である可能性がある。
【００４１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＵ又はｕＰＡ）は、血管形成、腫瘍浸潤及び細胞外マトリックスの再構築に関与することによる転移において重要な役割を果たす蛋白質分解酵素である（４９、５０）。それは、腫瘍浸潤誘発性及び転移誘発性因子として特徴付けられている。ＰＬＡＵ活性の影響は、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換である。Ｐｌａｕ遺伝子発現は血管新生において減少が伴うと我々は期待したが、Ｃｙｒ６１のように、ＫＤＲキナーゼ阻害剤に曝露した腫瘍では、なぜ減少ではなく増加が認められたのかはわからない。Ｐｌａｕ発現の増加がなぜＶＥＧＦシグナリング経路の阻害によって惹起された代償機構であると推測することはできるが、この観察の基礎となる機構を決定するために、より研究が必要であることは明らかである。
【００４２】
Ｉｆｉｔ３（テトラトリコペプチド反復３回を有するインターフェロン誘導蛋白質、Ｇａｒｇ−４９（グルココルチコイドａｔｔｅｎｕａｔｅｄ応答遺伝子）及びＩＲＧ２（インターフェロン応答遺伝子２）としても知られる）は、未だに機能が知られていない遺伝子である。リポポリ多糖又はインターフェロンによって誘導されたグルココルチコイドａｔｔｅｎｕａｔｅｄ応答遺伝子を同定する研究の一環として、マウスからのクローニングし、保存性が高いＩＦＩＴ３のテトラトリコペプチドの反復ドメインは、蛋白質−蛋白質相互作用を媒介すると考えられる（５１〜５４）。Ｉｆｉｔ３のヒト相同分子種はヒト細胞では同定されていないが、Ｉｆｔ４と称する相同遺伝子は、蛋白質配列の同一性が６０％、類似性が７８％である（ＢＬＡＳＴＰ、（５５））。
【００４３】
実際には、少数の遺伝子をベースにした遺伝子発現ベースの薬力学測定法は、臨床研究室が熟知している従来の定量的リアルタイムＰＣＲ技術を使用して比較的少ない労力で実施することができる。リアルタイムＰＣＲに十分なＲＮＡは、少ないミリグラム量の組織試料から単離することができる。現在、試薬を予め添加したマイクロフルイディクスカードと共に定量的サーマルサイクラーを使用することが可能で、複数遺伝子の発現をベースにした測定法を日常的に臨床で使用することが現実的な目的となっている。
【００４４】
本明細書で例示した方法以外の別の測定様式を、表３〜６で同定した遺伝子の発現を変更する推定癌治療薬の能力をモニターするために使用することができる。たとえば、前述のように、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸にプローブをハイブリダイズすることによって直接モニターすることができる。しかし、本発明の方法及び測定法は、大量の遺伝子の発現を検出するためのアレイ又はチップハイブリダイゼーションをベースとした方法によって最も効果的に設計されている。溶液ベースの、及び固相ベースの測定様式を含めた任意のハイブリダイゼーション測定様式を使用することができる。好ましい固相は、ＤＮＡチップ又は遺伝子チップとしても知られている高密度アレイである。１アッセイ様式では、表５〜６の少なくとも２種類の遺伝子に対するプローブを含有する遺伝子チップは、腫瘍の脈管構造の内皮細胞増殖を調節するように設計された推定癌治療薬に曝露した患者から調製された内皮細胞を含有する生物学的試料における遺伝子発現の変化を直接モニターするか、又は検出するために使用することができる。
【００４５】
個別に発現する遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブを含有する固相は、当業者に公知の任意の固体又は半固体支持材料であることができる。適切な例には、限定はしないが、膜、フィルター、組織培養皿、ポリ塩化ビニル皿、ビーズ、試験用切片、シリコン又はガラスをベースにしたチップなどが含まれる。適切なガラスウェーハ及びハイブリダイゼーション法は広く入手可能で、たとえば、Ｂｅａｔｔｉｅ（ＷＯ９５／１１７５５）で開示されたものがある。オリゴヌクレオチドが直接的に、又は間接的に、共有結合的に、又は非共有結合的に結合できる任意の固相表面を使用できる。いくつかの実施形態では、いくつかのオリゴヌクレオチドが共有結合し、その他が同じ固相に非共有的に結合していることが望ましい。
【００４６】
好ましい固相は、高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらは、アレイの予め決定された位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含有する。予め決定されたそれぞれの位置は、複数のプローブ分子を含有することができるが、予め決定された位置の各分子は同一の配列を有する。このような予め決定された位置は特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）と呼ばれる。単一の固相上に、このような特徴が２、１０、１００、１０００から１００００、１０００００又は４０００００個存在することができる。該プローブが結合した固相又は領域は、平方センチメートルの程度であることができる。
【００４７】
発現をモニターするためにオリゴヌクレオチドプローブアレイを作製して、当業界で公知の任意の技術によって使用することができる（たとえば、Ｌｏｃｋｈａｒｔ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４、１６７５〜１６８０；ＭｃＧａｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３、１３５５５〜１３４６０を参照のこと。)。このようなプローブアレイは、本明細書で説明した２種類以上の遺伝子と相補的な、又はハイブリダイズする少なくとも２種類以上のオリゴヌクレオチドを含有することができる。このようなアレイはまた、本明細書で説明した少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０種類以上の遺伝子と相補的な、又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有することができる。
【００４８】
溶液をベースとした測定様式及び固相をベースとした測定様式を含めた任意のハイブリダイゼーション測定様式を使用することができる。個別に発現する本発明の遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを含有する固相は、フィルター、ポリ塩化ビニル皿、シリコン又はガラスをベースにしたチップでよい。このようなウェーハ及びハイブリダイゼーション法は広く入手可能で、たとえば、Ｂｅａｔｔｉｅ（ＷＯ９５／１１７５５）で開示されたものがある。オリゴヌクレオチドが直接的に、又は間接的に、共有結合的に、又は非共有結合的に結合することができる任意の固相表面を使用することができる。好ましい固相は、高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらは、アレイの予め決定された位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含有する。予め決定されたそれぞれの位置は、複数のプローブ分子を含有することができるが、予め決定された位置の各分子は同一の配列を有する。このような予め決定された位置は特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）と呼ばれる。単一の固相上に、このような特徴が約２、１０、１００、１０００から１００００、１０００００又は４０００００個存在することができる。該プローブが結合した固相又は領域は、平方センチメートルの程度であることができる。
【００４９】
前記に挙げた技術の中で最も敏感で、最も柔軟な定量法は、ＲＴ−ＰＣＲで、薬剤処理をした、又はしていない正常組織及び腫瘍組織の様々な試料集団におけるｍＲＮＡ濃度を比較して、遺伝子発現パターンを特徴付けたり、密接に関与するｍＲＮＡとの間を区別したり、ＲＮＡ構造を分析したりするために使用できる。
【００５０】
第１段階は、標的試料からのｍＲＮＡの単離である。開始物質は一般的に、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株及び対応する正常組織又は細胞株からそれぞれ単離された全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、健康なドナーから収集したＤＮＡと共に乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの腫瘍を含む様々な原発腫瘍又は腫瘍細胞株から単離することができる。ｍＲＮＡの原料が原発腫瘍の場合、ｍＲＮＡは、たとえば、凍結又は保存されたパラフィン包埋及び固定（たとえば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【００５１】
ＲＮＡは、ＰＣＲの鋳型としては使用できないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロフィリングの第１段階はｃＤＮＡへのＲＮＡ鋳型の逆転、その後のＰＣＲ反応の対数的増幅である。２種類の最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ（ａｖｉｌｏ）骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写段階は、環境及び発現プロファイリングの目的に応じて、一般的に特異的プライマー、ランダムヘキサマー又はオリゴ−ｄＴプライマーを使用して刺激される。たとえば、抽出したＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、製造者の指示に従って逆転写できる。次に、得られたｃＤＮＡをその後のＰＣＲ反応で鋳型として使用できる。誤差及び試料間の変動の影響を最小限に抑えるために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を使用して実施する。理想的な内部標準は、異なる組織でも一定濃度で発現し、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンの標準化に最も良く使用されるＲＮＡは、本明細書で使用したようなハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）又はβアクチン遺伝子のｍＲＮＡである。
【００５２】
ＰＣＲの段階は様々な熱安定性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、一般的に、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有し、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠如したＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する。したがって、ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．ＰＣＲは一般的に、その標的単位複製配列に結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するためにＴａｑ又はＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を備えたいかなる酵素も使用することができる。ＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を生じるために、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。３番目のオリゴヌクレオチド又はプローブは、２種類のＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計される。該プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長されることはなく、リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。２種類の色素が該ブローブ上にあって近接した位置にあるとき、レーザーによって誘発されるリポーター色素からの放射は消光色素によって消光される。増幅反応中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は鋳型に依存した方法でプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたリポーター色素の信号は第２の蛍光体の消光効果を受けない。合成された新規分子それぞれについてリポーター色素１分子が遊離するので、消光されないリポーター色素を検出することがデータの定量的解釈の基礎となる。
【００５３】
ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．ＲＴ−ＰＣＲは、市販の装置、たとえば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００．ＴＭ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ．ＴＭ．（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施することができる。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ法は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００．Ｔ．Ｍ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ．ＴＭ．などのリアルタイム定量ＰＣＲ装置で操作する。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ及びコンピュータから構成される。該システムは、サーモサイクラー上の９６ウェル形態中で試料を増幅する。増幅中、レーザー誘発蛍光信号は、９６ウェル全部について光学繊維ケーブルによってリアルタイムで収集し、ＣＣＤで検出する。該システムは、装置の作動及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ技術の最新の方法は、デュアル標識蛍光発生プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブ）によってＰＣＲ生成物の蓄積を測定するリアルタイム定量ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、標的配列それぞれの内部競合相手を標準化に使用する定量的競合ＰＣＲ、及び試料内に含有される標準遺伝子又はＲＴ−ＰＣＲ用ハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの両方に適合している。より詳細は、たとえば、Ｈｅｌｄ他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６〜９９４（１９９６）を参照のこと。
【００５５】
本発明によって測定される遺伝子は、一般的にｍＲＮＡ、又は逆転写されたｍＲＮＡの形態である。該遺伝子は、クローニングされているか、又はされていなくてよく、該遺伝子は増幅されているか、又はされていなくてよい。クローニング自体は集団内の遺伝子の表現に偏るものではないようである。しかし、少ない処理段階で使用できるので、原料としてポリＡ＋ＲＮＡを使用することが好ましい可能性がある。ｍＲＮＡ抽出の一般的な方法は当業界で周知で、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含めた分子生物学の標準参考書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出方法は、たとえば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、及びＤｅ  Ａｎｄｒｓ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は精製キット、緩衝液セット及び商用製造者、たとえば、Ｑｉａｇｅｎの蛋白質分解酵素を使用して、製造者の指示に従って実施することができる。その他の市販のＲＮＡ単離キットには、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ．ＴＭ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ．ＲＴＭ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）及びＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）が含まれる。組織試料の全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離することができる。腫瘍から調製したＲＮＡは、たとえば、塩化セシウム密度勾配遠心によって単離することができる。
【００５６】
当業者には明らかなように、本発明の方法及び測定法で使用した核酸試料は、入手可能な任意の方法又は工程によって調製することが可能である。全ｍＲＮＡの単離方法はまた、当業者には周知である。たとえば、核酸の単離及び精製方法は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの３章、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐａｒｔ  Ｉ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｊｓｓｅｎ、（１９９３）（著）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓに詳細に記載されている。このような試料には、ＲＮＡ試料が含まれるが、細胞又は関心のある組織から単離されたｍＲＮＡ試料から合成されたｃＤＮＡもまた含まれる。このような試料にはまた、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡが含まれる。当業者は、ホモジェネートに存在するＲＮアーゼを阻害するか、又は破壊してから、均一化を使用できることが望ましいであろうことを理解するだろう。
【００５７】
生物学的試料は、任意の生物の任意の生物学的組織又は液体又は細胞並びに細胞株及び組織培養細胞などのインビトロで生成した細胞であってよい。しばしば、該試料は患者から得られる試料「臨床試料」である。一般的な臨床試料には、限定はしないが、唾液、血液、血液細胞（たとえば、白血球）、組織又は穿刺生検試料、尿、腹水及び胸水又はそれらからの細胞が含まれる。生物学的試料はまた、組織切片、たとえば、組織学のために採取された凍結切片又はホルマリン固定切片を含めることができる。
【００５８】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示するために提示される。
【００５９】
方法及び材料
本発明を実施するには、特記しない限り、当業界の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来技術を使用する。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、ｅｄ．、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、４．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ著、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他著、１９８７）；及び「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓ他著、１９９４）等の文献に十分に説明されている。
【００６０】
化合物：本発明の例で使用した小分子ＫＤＲキナーゼ阻害剤、化合物Ａ及び化合物Ｂの構造は以下の通りである。
【００６１】
【化１】
2007530047.tif 000003
【００６２】
細胞培養：初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）及びラット心臓微小血管内皮細胞（ＲＨＭＶＥＣ）は、ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｅｎｎｅｓｌａｅｒ、ＮＹ）から購入し、供給者の指示に従って培養した。内皮細胞単層は、ヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングした組織培養フラスコ内で、完全培地ＭＣＤＢ−１３１（１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び増殖因子カクテルＥＮＤＯＧＲＯ、ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給したＭＣＤＢ−１３１）を使用して、５％ＣＯ２湿潤雰囲気内において３７℃で維持した。
【００６３】
インビトロにおけるＭＶＥＣ増殖実験では、細胞は凍結保存から培養を開始した後３〜６回継代培養する間にトリプシン処理することによって収集し、計数して、フィブロネクチンをコーティングした組織培養プレート（１．５ｘ１０６細胞／プレート、直径１００ｍｍのプレート）に集密度７５％で接種した。細胞増殖は分裂促進剤を使用中止することによって２４時間停止させ、次にＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ又はＥＮＤＯＧＲＯ２００μｇ／ｍｌを添加することによって刺激した。増殖停止のために、培地は１０％ＦＢＳを補給し予備加温したＤＭＥＭに変更した。細胞増殖を刺激するために、増殖停止培地は、１０％ＦＢＳ及び適切な増殖因子を補給したＭＤＣＢ−１３１に置換した。各刺激条件について、刺激性の増殖因子を補給しなかった対応する対照プレートを作製した。増殖因子で刺激した後所望する時点で、培地を吸引によって迅速に除去して、該細胞をＲＬＴ緩衝液（ＲＮＡ安定化及び精製のためのグアニジンチオシアネート溶解緩衝液、ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）１．２ｍｌで溶解した。細胞溶解物はＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒで均一にして、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  ＭＩＮＩアフィニティーカラムで単離した（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）。８種の独立したＶＥＧＦ刺激培養物、７種のＥＮＤＯＧＲＯ刺激培養及び４種のｂＦＧＦ刺激培養物全体の遺伝子発現特徴はＨＤＭＶＥＣについて決定した。４種の独立したＶＥＧＦ刺激培養物、４種のＥＮＤＯＧＲＯ刺激培養物及び４種のｂＦＧＦ刺激培養物の特徴はＲＨＭＶＥＣについて決定した。
【００６４】
動物腫瘍モデル：ラットグリア細胞株（Ｃ６、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）及びラット乳腺癌（ＭａｔＢＩＩＩ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６６）は、動物腫瘍モデル用に使用した。Ｃ６細胞はＬ−グルタミン２ｍＭ、重炭酸ナトリウム１ｍｇ／ｍｌ、ウマ血清１５％、牛胎児血清２．５％、ペニシリン１０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ（いずれの培地成分もＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手。）を補給したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地で５％  ＣＯ２湿潤雰囲気において３７℃で培養を維持した。ＭａｔＢＩＩＩ細胞は、グルタミン１．５ｍＭ、ＦＢＳ１０％、ペニシリン１０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌを補給したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地で増殖させた。Ｃ６又はＭａｔＢＩＩＩ細胞からＲＮＡを単離するために、直径１００ｍｍの組織培養用プレートで増殖させた細胞２ｘ１０６個を、直接ＲＬＴ緩衝液１．２ｍｌで溶解した。細胞溶解物をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒでホモゲナイズした後、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  ＭＩＮＩアフィニティーカラムで単離した。
【００６５】
Ｃ６グリア細胞及びＭａｔＢＩＩＩ腺癌細胞は、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（Ｆ３４４）ラットから得られ、したがって、免疫適格性Ｆ３４４動物において同系腫瘍を生成するために使用できるので、動物モデルのために選択した。移植前に細胞を収集し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２ｘ１０７（Ｃ６）又は２ｘ１０６（ＭａｔＢＩＩＩ）細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。
【００６６】
Ｃ６神経膠腫側腹部腫瘤モデル：Ｃ６細胞をＦ３４４雄ラットの右脇腹に皮下注射した（１５０〜１７５ｇ、動物１匹当たり１０７細胞）。細胞を注射した後、動物は体重によって無作為化し、媒体（メチルセルロース０．５％）又は薬剤（メチルセルロース０．５％に溶かして、化合物Ｂ  １０ｍｐｋ／投与又は化合物Ａ  ４０ｍｐｋ／投与）のいずれかを投与した（１２〜１５）。腫瘍細胞を移植後７日目に、１日１回の経口投与を開始し、１、２又は３日間継続して、その時点で動物を殺処分した。腫瘍は二分して、半分はＲＮＡ抽出のために液体窒素で急速冷凍して保存し、半分は組織学又は免疫蛍光顕微鏡用に固定した。媒体で処理した５匹の動物及び化合物で処理した５匹の動物を各時点で殺処分した。ＲＮＡは、腫瘍試料からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムで標準的方法（ＱＩＡＧＥＮ）によって抽出した。簡単に説明すると、凍結した腫瘍試料の重量を量り、ＲＬＴ緩衝液（組織３０ｍｇ当たりＲＬＴ６００μｌ）を含有する試験管に入れ、すぐに回転子／固定子ホモゲナイザーを使用して１０〜２０秒間ホモゲナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙアフィニティーカラムでホモゲナイズした組織溶解物から単離し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁して、−８０℃で凍結した。ビークル処理集団それぞれの５個の腫瘍から得られたＲＮＡを一緒にして、３種類の参照ＲＮＡプールを形成した。各集団の５匹の化合物処理ラットから得られた腫瘍試料それぞれから単離されたＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション中に、ＲＮＡの適切な時間対応参照プールと比較した。さらに、個々のビークル処理ラットから得られたＲＮＡは、動物間の変動を評価するために、時間対応ビークル処理プールと比較した。
【００６７】
ＭａｔＢＩＩＩ乳癌転移モデル：２０〜３０回継代したＭａｔＢＩＩＩ細胞をＦ３４４メスラット（１５０〜１７５ｇ）の左４番目の乳頭の周りの乳腺脂肪体に注射した（１０６細胞／動物）。投与前に、動物を腫瘍の大きさ及び体重に応じて無作為に群に分けた。化合物Ａ（メチルセルロース０．５％で調製、４０ｍｐｋ／投与）又は媒体（メチルセルロース０．５％）の１日１回経口投与は、腫瘍細胞移植後７日目に開始し、さらに４日間継続した。ビークル処理動物６匹及び化合物処理動物６匹を１１日目の最後の投与４時間後に殺処分した。検死時に、腫瘍を取り出してすぐに重量を量った。各腫瘍の半分を組織学及び免疫蛍光顕微鏡用にＺｎ−Ｔｒｉｓで固定し、その他の半分はＲＮＡ抽出用に液体窒素ですぐに急速冷凍した。全ＲＮＡは、Ｃ６腫瘍研究と同様の方法で単離した。ビークル処理集団のＲＮＡを一緒にして、対照ＲＮＡプールを形成した。化合物処理ラットから得られた腫瘍試料それぞれから単離したＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション中に、ＲＮＡの対照プールと比較した。個々のビークル処理動物から得られたＲＮＡは、動物間の変動を評価するためにビークル処理プールと比較した。
【００６８】
遺伝子発現プロファイリング：培養細胞又は腫瘍組織試料から単離された全ＲＮＡは、既に記載されたようなＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズする蛍光標識相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を作製するために使用した（１６、１７）。簡単に説明すると、個々の腫瘍試料又はインビトロでの内皮細胞培養物から得られた全ＲＮＡ４μｇを使用して、逆転写によって２本鎖ＤＮＡを合成した。ｃＲＮＡはインビトロ転写によって作製し、合成後にＣｙ３又はＣｙ５で標識した。インクジェット技術でその場で合成したオリゴヌクレオチドアレイに競合ハイブリダイゼーションさせることによって、標識したｃＲＮＡの２集団、参照集団及び実験集団を互いに比較した。蛍光色素の逆の戦略を使用して、各ｃＲＮＡ試料対で２種類のハイブリダイゼーションを実施した。動物の腫瘍の研究のために、適切な媒体投与群における腫瘍それぞれから等量のｃＲＮＡを収集することによって参照ｃＲＮＡプールを作製した。ハイブリダイゼーション後、アレイを走査して、特徴それぞれの蛍光強度を記録した。アレイ強度データを標準化し修正した後に、転写存在量の比（実験集団対対照集団）を得た。遺伝子発現データの分析は、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ  Ｃｌｉｅｎｔソフトウェア（ｖ３．２、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋｉｒｋｌａｎｄ、ＷＡ）で実施した。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）試験を使用して遺伝子発現の統計学的有意な変化を決定した。
【００６９】
定量リアルタイムＰＣＲ：定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、公表された方法（ＡＢＩ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｒｅｖ  Ａ、ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３３３４５８．ｐｄｆ）に従って遺伝子特異的ＰＣＲプライマー対及び単位複製配列特異的蛍光プローブ（ＴａｑａＭａｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって実施した。１段階定量的逆転写ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ’ｓ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）  １段階ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃４３０９１６９）及び全ＲＮＡ鋳型２５ｎｇを使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓで実施した。２段階逆転写ＰＣＲ実験は、ＡＢＩ’ｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（ＡＢＩ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃４３２２１７１）を使用して全ＲＮＡ２５ｎｇを鋳型としてｃＤＮＡを合成することによって開始した。２段階定量リアルタイムＰＣＲは、標準試薬（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＡＢＩ  Ｐｒｏｄｕｃｔ＃４３２４０１８）によってＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで実施した。リアルタイムＰＣＲ反応は、３８４ウェルプレートにおいて反応量２５μｌで２連で実施した。各遺伝子のために使用した、プライマー及びプローブ配列は以下に挙げる。ＲＮＡ試料毎に、ＧＡＰＤＨの転写存在量を測定した。
【００７０】
さらに、関心のある遺伝子及びＧＡＰＤＨの遺伝子の転写存在量は、ヒト肺全ＲＮＡ又はラット肺全ＲＮＡのいずれかのＲＮＡ試料標準物質について測定した。遺伝子発現の倍変化は、ΔΔＣＴ法（ＡＢＩ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２、Ｒｅｖ  Ｂ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３０３８５９．ｐｄｆ）を使用して計算した。この教示は全て、参照として組み込まれる。
【００７１】
表３〜６で開示された増殖及び発現特性を含む個々のバイオマーカー遺伝子の配列は公開されたデータベースで容易に入手できる。表３及び表４で定義された特性（それぞれＨＤＭＶＥＣ増殖特性及びＲＨＭＶＥＣ増殖特性）は、含まれるバイオマーカーの遺伝子バンク登録番号及び遺伝子記号を表し、その配列は本明細書に参照として組み込まれる。表５及び表６に定義された内皮細胞特異的特性はまた、発現特性を含むバイオマーカーの遺伝子バンク登録番号及び遺伝子記号を表す。以下のリストは名称、登録番号並びにバイオマーカーのサブセット検出のために使用したプライマー及びプローブを示す。
【００７２】
Ｈｓとはホモサピエンスのことである。Ｒｎとは、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）のことである。
【００７３】
【表１】
2007530047.tif 000004
2007530047.tif 000005
免疫組織化学：腫瘍試料は、殺処分した動物からとり出すとすぐに、免疫組織化学用Ｚｎ−トリス固定溶液（ＩＨＣ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に室温で（ＲＴ、２２℃）２４時間浸漬し、その後７０％エタノールにさらに２４時間ＲＴで浸漬することによって固定した。その後の段階は全てＲＴで実施した。腫瘍試料はパラフィン（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＶＩＰ加工／浸漬用溶媒、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｉｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）中に包埋し、Ｓａｋｕｒａ  Ａｃｃｕ−Ｃｕｔ  ＳＲＭミクロトーム（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）で３μｍの切片に切断した。組織切片は、キシレンで脱蝋し、段階的エタノール洗浄によって再水和した。脱イオンＨ２０（ｄＨ２０）及びトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄した後、疎水性ペン（Ｓｕｐｅｒ  Ｐａｐ  Ｐｅｎ、＃７１３１０）で組織切片の周りに疎水性バリアを設置した。
【００７４】
ＣＤ３１染色：ＣＤ３１は内皮細胞特異的蛋白質であることが確認されている（１８〜２０）。切片をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）で３０分間ブロックし、ブロッカーを含むＤＡＫＯ抗体希釈液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）で１：１０００に希釈した抗ＣＤ３１抗体（マウス抗ラット、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）と共に２時間インキュベートした。ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で数回簡単に洗浄した後、切片をビオチン化抗マウスＩｇＧ第２抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎアルカリホスファターゼキットＬｉｎｋ  Ｋ−０６１０）と共に１０〜３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴで数回洗浄し、アルカリホスファターゼに結合させたストレプトアビジン（ＤＡＫＯアルカリホスファターゼキットＫ−０６１０）と共に１０〜３０分間インキュベートした。次に、ＴＢＳＴを数回取り替えて切片を再度洗浄し、抗体の結合したＣＤ３１をＶｕｌｃａｎ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ基質（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ、ＣＡ）と共に１０分間インキュベートすることによって視覚化した（発色を顕微鏡でモニターした。）。次に、切片をｄＨ２Ｏで洗浄し、ＴＢＳ中で一晩保存した。
【００７５】
Ｋｉ６７染色：Ｋｉ６７は増殖細胞でのみ発現することが確認された核蛋白質である（２１、２２）。Ｋｉ６７の抗体認識を容易にするために、高温での抗原検索方法を使用した。切片は、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ容器（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ＤＣ２００２）内でＴａｒｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液（ｄＨ２Ｏで希釈した１ｘＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓ１６９９）中に浸漬し、１９５℃で１分間加熱した。切片はＨｄＨ２Ｏを検索溶液に流し入れて冷却し、次にＴＢＳで濯いだ。残存するペルオキシダーゼ活性はＴＢＳに溶かした３．０％Ｈ２Ｏ２で２０分間インキュベートすることによってブロックした。切片をＴＢＳで数回洗浄し、次に抗体希釈液で１：２０００に希釈した抗Ｋｉ６７抗体（ウサギ抗ヒト、Ｎｖａｃａｓｔｒａ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、ＵＫ）と共に２時間インキュベートした。切片をＴＢＳＴで洗浄して、次に希釈していないビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｌｉｎｋ  Ｋ−０６０９）と共に１０分間インキュベートした。切片はＴＢＳＴで洗浄して、次に西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｋ０６０９）と共に１０分間インキュベートした。切片をＴＢＳＴで再度洗浄して、Ｋｉ６７に結合した抗体は、ジアミノベンジジン及び基質（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＤＡＢ＋）と共に５分間インキュベートすることによって視覚化した（発色は顕微鏡でモニターした。）。切片はｄＨ２Ｏで洗浄して、ＤＡＢ増強剤で２０分間ＲＴでインキュベートし、ｄＨ２Ｏで再度洗浄した。腫瘍切片は濾過したＭａｙｅｒ’ｓヘマトトキシリン（Ｌｉｌｌｉｅ’ｓ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で２分間対比染色して、次に洗浄水に色が残存しなくなるまで水道水で洗浄した。次に、切片をｄＨ２Ｏで濯ぎ、１００％エタノールで脱水して、キシレンで洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）で封入した。
【００７６】
内皮細胞増殖の免疫組織学的分析：ＣＤ３１／Ｋｉ６７二重標識腫瘍切片の連続的明視野画像は、自動ステージ（Ｐｒｉｏｒ  Ｈ１２８、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）及び４０倍対物レンズを装備したオリンパスＢＸ−５０顕微鏡に装着した３−ＣＣＤカラービデオカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ）で得られた。切片毎の画像数は、全組織領域に応じて１０００枚と４０００枚との間にした。ＣＤ３１染色及びＫｉ６７染色は、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアパッケージ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して各画像について定量した。増殖する内皮細胞は、細胞質がＣＤ３１で染色され、核がＫｉ６７で染色された細胞と同定された。ＣＤ３１については陽性に染色したが、Ｋｉ６７については核が染色されなかった細胞は、非増殖性内皮細胞として記録した。増殖する内皮細胞の割合は、内皮細胞に関連したＫｉ６７陽性核領域を内皮細胞に関連した全核領域（Ｋｉ６７＋及びＫｉ６７−の両方）によって除することで算出した。内皮細胞増殖の割合は、腫瘍切片当たりＣＤ３１染色を有する少なくとも１００枚の画像の総合分析結果を表す。
【００７７】
免疫蛍光顕微鏡：腫瘍試料は前記の免疫組織化学で説明したように固定し、包埋し、切断して、脱蝋し、再水和した。その後の段階は全て室温で実施した。ＴＢＳで簡単に濯いだ後、組織切片はＳｎｉｐｅｒブロック試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）と共に５〜１０分間インキュベートすることによってブロックし、ＴＢＳで濯ぎ、ＤＡＫＯ抗体希釈液で１：１０００に希釈した第１抗体と共に２時間インキュベートした（ＡＮＧＰＴ２、ＣＬＵ、ＣＹＲ６１及びＰＬＡＵに対する抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手し、ヤギ又はウサギで育てた。ＥＤＮＲＢに対する抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手し、ヒツジで育てた。ＣＤ３１に対する抗体はＳｅｒｏｔｅｃから入手し、マウスで育てた。）。次に、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）で切片を洗浄し、ブロッキング血清を含むＤＡＫＯ抗体希釈液で１：２００（１０μｇ／ｍｌ）に希釈した適切な２次抗体と共に４５分間インキュベートした（Ａｌｅｓａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ヤギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ヒツジＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、正常ロバ及び正常ヤギブロッキング血清、Ｓｉｇｍａ）。さらにＴＢＳＴで洗浄した後、切片をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１ｍｇ／ｍｌ保存液をＭＱＨ２Ｏで１：２０００に希釈）で３０分間対比染色した。次に、切片をＴＢＳＴで洗浄し、１００％ＥｔＯＨで脱水して、キシレンで洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔでカバーガラス下に封入した。画像は、４０ｘ対物レンズを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５倒立蛍光顕微鏡に連結したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍ  ｍＨＲ  ＣＣＤカメラで撮影した。各蛍光体について、全画像は等しいカメラ積分時間を使用して撮影した。
【実施例１】
【００７８】
増殖する微小血管内皮細胞の遺伝子発現変化の同定
静止内皮細胞と比べて、増殖する内皮細胞で調節される遺伝子を同定するために、増殖因子とのインキュベーションによって初代培養微小血管内皮細胞が静止状態から増殖を始めたインビトロ血管形成モデルを使用した。初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）、又は４回から７回継代したラット心臓微小血管内皮細胞（ＲＨＭＶＥＣ）を組織培養皿で単層で増殖させ、分裂促進剤を２４時間欠乏させて、その後ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ又はＥＮＤＯＧＲＯに曝露することによって増殖を誘導した。
【００７９】
ＨＥＭＶＥＣ又はＲＨＮＶＥＣは、培養を３回継代した後トリプシン処理して、フィブロネクチンをコーティングした、６ウェル組織培養プレートに１００００細胞／ウェルの密度で接種した。細胞増殖は分裂促進剤を２４時間使用中止することによって停止させ、次にＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ又はＥＮＤＯＧＲＯ２００μｇ／ｍｌを添加することによって刺激した。刺激されなかった細胞のウェル及び停止しなかった細胞を含有するウェルを対照として含めた。増殖因子刺激後７２時間して、細胞をトリプシン処理することによってプレートから取り除き、明視野顕微鏡で血球計数器によって計数した。
【００８０】
ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＥＮＤＯＧＲＯ（ｂＦＧＦが豊富なウシ脳抽出物、ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が異なる増殖因子受容体によって情報伝達されたことを確かめるために、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２に対して１００倍活性が少ない小分子ＫＤＲキナーゼ阻害剤である化合物Ａの存在下で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ又はＥＮＤＯＧＲＯに細胞を曝露した（表１）（１２〜１５）。
【００８１】
【表２】
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【００８２】
分裂促進剤を欠乏させた静止ＨＤＭＶＥＣ及びＲＨＭＶＥＣの遺伝子発現パターンを活発に分割する内皮細胞の発現パターンと比較すると、増殖する血管内皮細胞に特異的な、有意な（ｐ値＜０．０１）遺伝子発現変化が示される。簡単に説明すると、内皮細胞培養物を培養して増殖させ、前述したように２４時間分裂促進剤を欠乏させた。増殖因子で２４時間刺激した後、培地を迅速に吸引し、細胞をＲＮＡ安定化緩衝液中で溶解した。各刺激条件について、刺激性の増殖因子を補給しない対応対照プレートが存在し、それらから単離されたＲＮＡは、刺激された細胞のＲＮＡと比較する参照物として使用した。
結果：１０％ＦＢＳを補給した増殖培地は内皮細胞を増殖させるために十分ではなかったが、１０％ＦＢＳ＋その他の増殖因子は迅速な内皮細胞増殖を誘発した。
【００８３】
図１に示したデータは、ＨＤＭＶＥＣ（図１Ａ）及びＲＨＭＶＥＣ（図１Ｂ）を化合物Ａに曝露すると、血球計数器で生細胞を計数することによって測定したところ、ＶＥＧＦによって誘導された微小血管内皮細胞のインビトロでの増殖が選択的に阻害されることを示唆している。図２に示した遺伝子発現プロフィールは、増殖するＨＤＭＶＥＣ（パネルＡ）培養物及びＲＨＭＶＥＣ（パネルＢ）培養物の特徴である遺伝子発現特性を例示している。色の強度は調節の程度を表しており、ｍＲＮＡのコピー数を表しているのではない。
【００８４】
表３は、表２で例示した発現プロフィールで同定したＨＤＭＶＥＣ増殖特性を含む遺伝子のリストである。表４は、表２で例示した発現プロフィールで同定したＲＨＭＶＥＣ増殖特性を含む遺伝子のリストである。表３及び表４で示した情報を使用して、インビトロ又はインビボいずれかのスクリーニング測定法形式で血管内皮細胞の増殖を評価するのに適した、遺伝子発現をベースにした測定法の設計及び検証は十分当業者の能力の範囲内である。
【実施例２】
【００８５】
初代内皮細胞におけるＶＥＧＦ誘導遺伝子発現特性のＫＤＲキナーゼ阻害剤による抑制
実施例１で同定された増殖因子誘導増殖特性がＫＤＲキナーゼ阻害剤に敏感かどうかを決定するために、ＨＤＭＶＥＣ又はＲＨＭＶＥＣを化合物Ｂ  １００ｎＭの存在下でＶＥＧＦ又はｂＦＧＦで２４時間刺激した。ＶＥＧＦはｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ１）及びＫＤＲに結合し活性化する（２３、２４）。ＦＬＴ１及びＫＤＲは両方とも化合物Ｂ（表１）によって阻害される。ｂＦＧＦはＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２に結合するが、ＦＬＴ１及びＫＤＲには結合しない。ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２はいずれも化合物Ｂに比較的影響を受けない（表１参照）。
【００８６】
簡単に説明すると、ＥＣ単層は、集密度が約７５％に達するまで完全ＭＣＤＢ−１３１培地で維持し、次に分裂促進剤を２４時間欠乏させることによって静止状態に誘導した。次に、増殖させるために細胞を、化合物Ｂの存在下又は非存在下で、ＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌで２４時間刺激した。ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ＋化合物Ｂに曝露した細胞から単離したＲＮＡ集団をＶＥＧＦにも化合物Ｂにも曝露していない静止細胞から単離した対応対照ＲＮＡと比較した。
【００８７】
結果：図３に示したデータは、ＨＤＭＶＥＣ  ＶＥＧＦ誘発遺伝子発現特性は化合物Ｂによって効果的に抑制されたが、ｂＦＧＦ誘導特性は影響を受けなかったことを示している。並行した実験をＲＨＭＶＥＣで実施した（データは示さず）。プロットの各点は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上に存在する遺伝子配列を表し、その遺伝子の２種類のｍＲＮＡ濃度（実験試料強度：対照試料強度、縦軸）と総ｍＲＮＡ量（実験試料強度：対照試料強度、横軸）との比に従ってプロットされている。
【実施例３】
【００８８】
内皮細胞特異的増殖特性の同定
上記で示した実験データは、遺伝子発現プロフィール又は増殖する内皮細胞に特異的な発現特性の確認に役立つ。しかし、内皮細胞増殖中に調節される遺伝子の多くはまた、他の種類の増殖細胞においても発現する（たとえば、細胞周期及び代謝過程を調節する遺伝子）。腫瘍は、様々な細胞種の複雑な混合体で、２０００個に約１個（０．０５％）の細胞が増殖性内皮細胞である（Ｊｏａｎｎｅ  Ａｎｔａｎａｖａｇｅ、Ｒｏｓｅｍａｒｙ、ＭｃＦａｌｌ、及びＫｅｎ  Ｔｈｏｍａｓ、私信）。したがって、腫瘍内皮細胞増殖を特異的に測定する薬力学測定法を開発しようとする試みには、ＨＤＭＶＥＣ及びＲＨＭＶＥＣ増殖特性の内皮細胞特異的部分を同定する必要があった。内皮細胞特異的遺伝子候補は、分裂促進剤に対するインビトロでの増殖反応中では発現が調節されるが、非内皮細胞では比較的低濃度で発現することが特徴の遺伝子として定義された。
【００８９】
前述の発現プロファイリング研究から得られた、各アレイ特性に結合した標識ｃＲＮＡの数に対応し、ｍＲＮＡコピー数に比例するマイクロアレイ強度のデータを使用し、ＨＤＭＶＥＣ増殖実験から得られたマイクロアレイ強度のデータと比較した。活発に増殖する腫瘍由来の細胞株（ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ｄａｕｄｉ、Ｇ３６１、Ａ５４９、Ｋ５６２、ＭＣＦ７）のパネルから得られた既存の強度データを使用して、ＥＣ：腫瘍マイクロアレイ強度の比が３：１未満である遺伝子は考察には入れなかった。
【００９０】
７０２個のＨＤＭＶＥＣ配列はこの方法で内皮細胞特異的として選択された（表３参照）。この方法によって多くの公知の内皮細胞特異的遺伝子（すなわち、ＥＳＭ−１ＫＤＲ、ＦＬＴ−１）並びに数多くの新規配列を同定した。並行して、ＲＨＭＶＥＣ実験から得られたマイクロアレイ強度を、培養で活発に増殖するラットＣ６神経膠腫細胞の遺伝子発現プロファイリング実験から得られたデータと比較することによって、増殖するＲＨＭＶＥＣで調節される遺伝子に対する内皮細胞の特異性の測定値を得た。ＲＨＭＶＥＣ：Ｃ６強度比が３：１を上回る４９３個の遺伝子を同定した（表４参照）。
【実施例４】
【００９１】
経口投与したＫＤＲキナーゼ阻害剤は、同系動物の腫瘍において有意な遺伝子発現変化を誘導する
同系のラット腫瘍モデル２種（すなわち、Ｃ６神経膠腫側腹部腫瘤モデル及びＭａｔＢＩＩＩ乳癌転移モデル）を使用して、インビトロにおいて内皮細胞増殖中に制御される内皮細胞特異的と同定された遺伝子に対する小分子ＫＤＲキナーゼ阻害剤、化合物Ａ及び化合物Ｂの効果を評価した。腫瘍の研究は、材料及び方法で前述したように実施した。該腫瘍モデルは、いずれもＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラットから得られたＣ６神経膠腫及びＭａｔＢＩＩＩ乳癌細胞株を使用した。これらの細胞株はそれぞれＶＥＧＦを分泌し、ＫＤＲキナーゼ阻害剤に敏感な、高度に血管化した腫瘍を形成する。
【００９２】
神経膠腫側腹部腫瘤モデル：Ｃ６細胞をラットの右脇腹に皮下注射し、７日間腫瘍を形成させた。その時点で、化合物Ａ、化合物Ｂ又は媒体の１日１回経口投与を開始し、全部で１、２又は３日間継続した（図４、パネルＡ「Ｃ６プロファイリング研究）。図４は、ＫＤＲキナーゼ阻害剤曝露後の確立されたラット腫瘍の増殖速度論を示す。腫瘍の量はノギス計測によって測定した。腫瘍は、２方向（長さ及び幅）をノギスで測り、腫瘍量は式（長さ）ｘ（幅）ｘ（１／２幅）に従って計算した。
【００９３】
化合物処理動物から単離された腫瘍におけるゲノム範囲の遺伝子の発現は、ビークル処理動物から単離された腫瘍の遺伝子発現と比較した。図５に示したデータでは、各行は個々の動物から得られた異なる腫瘍を表している。各列は遺伝子を表す。調節された（上方制御又は下方制御された）遺伝子に対応する点は様々な灰色の影で示されている。図５のパネルＡで示されたデータは、ＫＤＲキナーゼ阻害剤化合物Ｂに全身を曝露してから２４、４８又は７２時間後に調節されたラットＣ６側腹部腫瘍から得られた遺伝子を示す。図５のパネルＢで示されたデータは、ＫＤＲキナーゼ阻害剤化合物Ａに全身を曝露してから２４、４８又は７２時間後に調節されたラットＣ６側腹部腫瘍から得られた遺伝子を示す。
【００９４】
化合物Ａ（図５、パネルＢ）及び化合物Ｂ（図５、パネルＡ）の両方は特に４８時間以上化合物に曝露した後で、Ｃ６腫瘍遺伝子発現において遺伝子発現変化を強く誘導することを観察した（個々の配列についてｐ値＜０．０５）。
【００９５】
ＭａｔＢＩＩＩ乳癌転移モデル：ＭａｔＩＩＩ乳腺癌細胞をメスラットの乳腺脂肪体に注射した。７日間腫瘍を定着させた後、化合物の１日１回経口投与を開始し、全部で５日間継続した（図４Ｂ）。図５のパネルＣで示されたデータは、ＫＤＲキナーゼ阻害剤化合物Ａに全身を曝露してから１００時間後に調節されたラットＭａｔＢＩＩＩ乳癌から得られた遺伝子を示す。化合物処理ラットの腫瘍遺伝子発現パターンをビークル処理対象と比較したとき、再度有意な差を発見した（図５、パネルＣ、個々の配列についてｐ値＜０．０５）。３種類の研究の間でＫＤＲキナーゼ阻害によって誘導された遺伝子発現変化には重複があったが、遺伝子発現変化の大部分は研究特異的であった（データは示さず）。
【実施例５】
【００９６】
内皮細胞増殖の遺伝子発現バイオマーカーの同定
実施した３種類の動物実験それぞれにおいて、培養中に増殖するＲＨＭＶＥＣに特異的であると同定した遺伝子の画分についてＫＤＲキナーゼ阻害剤によって誘導された発現の変化を検出できることを所見した。図６は、本明細書で開示した様々な測定様式で同定された一連の遺伝子の間の重複程度をまとめたベン図である。より具体的に、図６ＡはＣ６側腹部腫瘍とＭａｔＢＩＩＩ乳癌との間の、ＫＤＲキナーゼ阻害剤に対する腫瘍遺伝子発現応答の重複程度をまとめて示す。図６Ｂは、分裂促進剤によってインビトロで、及びＫＤＲキナーゼ阻害剤によって腫瘍組織で調節されることが測定された一連の内皮細胞特異的遺伝子の重複の程度を示している。パネルＢで示された遺伝子／配列は全て、分裂促進剤曝露後にインビトロで認められたものとは対照的な方法でＫＤＲキナーゼ阻害剤によってインビボで調節されることが認められた。
【００９７】
最も興味深いことに、各実験で、これらの遺伝子のいくつかは内皮細胞増殖の抑制と一致して調節されることを発見した。実際に、これらの遺伝子はインビボの腫瘍研究と比較してインビトロの増殖実験で反対に調節された。いずれの場合においても、内皮細胞が非増殖条件下において低濃度で増殖し発現するとき、該遺伝子の発現が多かった。したがって、３種類の動物腫瘍実験のそれぞれにおいて「反対に制御」された内皮細胞特異的遺伝子を同定し、複数の実験（図６Ｂ並びに表５及び表６）でそれ自体制御された遺伝子を同定した。表５及び表６は、化合物Ａによって調節されることが認められた遺伝子のリストを示す。表５は、化合物誘導性の内皮細胞特異的発現特性を定義するために、Ｃ６側腹部腫瘤及びＭａｔＢｉｌｌ乳癌転移モデルにおいて得られたデータを利用する。表５は、遺伝子バンク登録番号、遺伝子記号を示し、観察された遺伝子発現の化合物誘導性倍数変化をまとめて示す。表５で示された発現特性は、一般的には抗血管形成剤、特にＫＤＲキナーゼ阻害剤のインビボでの効果の評価において利用性があると考えられる。表６は、インビボでのＫＤＲ阻害剤投与に応答して、本明細書で開示されたＥＣ特異的増殖特性を含む個々のバイオマーカーで認められた変化（すなわち、発現の抑制）をまとめて示す。
【００９８】
バイオマーカーとして考えられる遺伝子は、インビボで化合物に誘導されて少なくとも１．６倍の発現変化を生じるべきであるという必要性を課すことによって、化合物Ａ及び化合物Ｂの両方の実験において「反対に調節された」７個の遺伝子及び３種類全ての実験において「反対に調節された」２個の遺伝子を同定した。本発明の開示でもたらされたデータをベースにして、両方の化合物Ａ動物実験によって同定された７個の遺伝子（Ａｎｇｐｔ２、Ｅｄｎｒｂ、Ｐｌａｕ、Ｃｌｕ、Ｆｕｔ４、Ｉｆｉｔ３及びＣｙｒ６１）を腫瘍内皮細胞増殖の有望なバイオマーカーとして同定した。これらの遺伝子を同定し、表２に記載する。
【００９９】
【表３】
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【０１００】
注目に値すべきことに、これらの遺伝子それぞれは内皮細胞機能に密接に関与することが報告されている。
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
【表９】
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【実施例６】
【０１０７】
バイオマーカーの検証
腫瘍内皮細胞増殖の有望なバイオマーカーとして同定した７種類の遺伝子が腫瘍の脈管構造で特異的に発現し、その発現レベルは内皮細胞増殖速度を反映することを確認するために、いくつかの検証実験を実施した。まず、マイクロアレイハイブリダイゼーションの結果を確かめるために、定量的リアルタイムＰＣＲによって動物腫瘍ＲＮＡ試料における遺伝子発現レベルを独立して評価した。前述したマイクロアレイ実験で得られたバイオマーカーデータは、リアルタイム定量リアルタイムＰＣＲによって検証された。
【０１０８】
結果：定量リアルタイムＰＣＲは、遺伝子特異的ＰＣＲプライマー対及び単位複製配列特異的蛍光プローブ（ＴａｑＭａｎ）によって実施した。試験したそれぞれのＲＮＡ試料について、ＧＡＰＤＨの転写存在量を測定した。さらに、関心のある遺伝子及びＧＡＰＤＨの遺伝子の転写存在量は、ＲＮＡ試料標準物質（ラット肺総ＲＮＡ）のために測定した。（Ａ）ビークル処理動物の腫瘍に対するＫＤＲキナーゼ処理動物の腫瘍における遺伝子発現の倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）は、ΔΔＣＴ法（材料及び方法を参照）を使用して計算した（材料及び方法）。ラット腫瘍における各遺伝子のｍＲＮＡ濃度はまた、相対標準物質ＲＮＡプール（Ｂ）に対して示される。図７に示したように、リアルタイムＰＣＲ研究から得られた結果は、ＤＮＡマイクロアレイ研究の結果と密接に一致した（図７）。
【０１０９】
遺伝子発現プロファイリングを実施しなかった第４の動物実験のもう一組のラットＭａｔＢＩＩＩ腫瘍において、バイオマーカー遺伝子の発現レベルをまた測定した。この独立した研究において、確立したＭａｔＢＩＩＩ乳癌を有する動物に（細胞移植後７日間）化合物Ａ又は媒体を全部で８日間毎日１回経口投与した。
【０１１０】
動物腫瘍研究の各腫瘍の半分を固定し、材料及び方法で説明したように切片法及び免疫組織化学のために保存した。バイオマーカー遺伝子の発現が腫瘍内の内皮細胞に特異的かどうかを決定するために、免疫蛍光顕微鏡によってラット腫瘍組織切片の蛋白質生成物を視覚化した。バイオマーカー蛋白質生成物７種のうち５種に対する抗体が市販されており、免疫蛍光染色に最適な条件を決定することができた。厚さ約３〜５μｍの個々の腫瘍切片を脱蝋し、再水和して、（腫瘍の脈管構造を標識するために）バイオマーカー蛋白質の１つに対する抗体及び内皮細胞表面蛋白質ＣＤ３１に対する抗体とも一緒にインキュベートした。脱蝋し、再水和したＭａｔＢＩＩＩ腫瘍切片をＣＤ３１及び以下のバイオマーカー蛋白質、ＣＬＵ、ＡＮＧＰＴ２、ＣＹＲ６１、ＥＮＤＲＢ又はＰＬＡＵの１つに対する抗体とインキュベートした。バイオマーカー蛋白質及びＣＤ３１と結合した1次抗体は、それぞれ材料及び方法で説明したＡｌｅｘａ４８８標識及びＡｌｅｘａ５４６標識２次抗体で視覚化した。カバーガラス下に封入した後、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍで４０倍対物レンズを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５蛍光顕微鏡によって画像を捕捉した。
結果：調べた５種類の蛋白質（ＡＮＧＰＴ２、ＣＬＵ、ＣＹＲ６１、ＥＮＤＲＢ及びＰＬＡＵ）はそれぞれＭａｔＢＩＩＩ腫瘍の腫瘍脈管構造に特異的に局在することを発見した（図８）。ラット乳癌でのバイオマーカー蛋白質発現は血管に局在していることを示した。Ｃｙｒ６１以外の遺伝子は全て、ＫＤＲキナーゼ阻害剤に対する曝露に応じて予測したとおりに発現レベルが変化した。
【０１１１】
最後に、化合物Ａで処理した腫瘍におけるバイオマーカー遺伝子の確認された発現変化を腫瘍内皮細胞増殖の独立した測定と相関させた。Ｍｕｎｄｈｅｎｋｅ他（Ｍｕｎｄｈｅｎｋｅ、２００１）によって記載された方法の変法を使用して、腫瘍切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１及び核増殖マーカーＫｉ６７で２重免疫組織化学染色することによって内皮細胞増殖速度を測定した。ビークル処理動物５匹及び化合物Ａ処理動物５匹（媒体又は化合物について投与量３種で７２時間）のＣ６側腹部腫瘤を分析した。
【０１１２】
結果：ビークル処理動物の腫瘍における内皮細胞増殖速度が３４％＋／−５％であることを測定した。対照的に、化合物Ａで処理した動物の腫瘍においては、内皮細胞増殖速度が１９％＋／−５％であることを測定した。
【０１１３】
本発明は、具体的な実施形態であると考えられるものを参照にして説明してきたが、本発明をこのような実施形態に限定するものでないことを理解されたい。反対に、本発明は添付した特許請求の精神及び範囲に含まれる様々な変更及び同等物を含むものとする。たとえば、ＫＤＲキナーゼ阻害剤の効果を検出するために開示したバイオマーカーを使用することに本開示は焦点を当てているが、腫瘍内の血管内皮細胞の増殖状態を調節するその他の癌治療の能力を評価する同様の方法の使用は、具体的に本明細書の範囲内である。
【０１１４】
開示全体にわたって引用された参考文献は全て、参照により明らかに本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＫＤＲキナーゼ阻害によるインビトロにおける血管内皮細胞（ＶＥＣ）増殖の阻害を示した図である。ＨＥＭＶＥＣ及びＲＨＮＶＥＣは、培養を３回継代した後トリプシン処理して、フィブロネクチンをコーティングした６ウェル組織培養プレートに１００００細胞／ウェルの密度で接種した。細胞増殖は分裂促進剤を使用中止することによって２４時間停止させ、次にＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ又はＥＮＤＯＧＲＯ２００μｇ／ｍｌを添加することによって刺激した。刺激されなかった細胞のウェル及び停止しなかった細胞のウェルを対照として含めた。増殖因子刺激の７２時間後に、細胞をトリプシン処理することによってプレートから取り除き、明視野顕微鏡下で血球計数器によって計数した。
【図２】インビトロで増殖する血管内皮細胞の遺伝子発現特性の同定を示した図である。ＨＤＭＶＥＣ及びＲＨＭＶＥＣは培養して増殖させ、図１及び方法で説明したように分裂促進剤を２４時間除去した。増殖因子で２４時間刺激した後、培地を迅速に吸引し、細胞をＲＮＡ安定化緩衝液中で溶解した。各刺激条件について、刺激性の増殖因子を補給しなかった対応対照プレートが存在し、それらから単離されたＲＮＡは、刺激された細胞のＲＮＡと比較する参照物として使用した。調節された（たとえば、上方制御又は下方制御された）遺伝子に対応する線は様々な灰色の影で示されている。色の強度はｍＲＮＡのコピー数ではなく調節の程度を表す。
【図３】培養した血管内皮細胞でのＶＥＧＦ誘導遺伝子発現の特異的抑制を示した図である。ＥＣ単層は、集密度が約７５％に達するまで完全ＭＣＤＢ−１３１培地で維持し、次に分裂促進剤を２４時間除去することによって静止状態に誘導した。次に、細胞を化合物Ｂの存在下又は非存在下でＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌで２４時間刺激して増殖させた。ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ＋化合物Ｂに曝露した細胞から単離したＲＮＡ集団を、ＶＥＧＦにも化合物Ｂにも曝露していない静止細胞から単離した対応する対照ＲＮＡと比較した。プロットの各点は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上に存在する遺伝子配列を表し、その遺伝子の２種類のｍＲＮＡ濃度（実験試料強度：対照試料強度、縦軸）と総ｍＲＮＡ量（実験試料強度＋対照試料強度、横軸）との比に従ってプロットされている。濃い色の点は上方制御された遺伝子を示す。淡灰色の点は下方制御された遺伝子を示す。
【図４】ＫＤＲキナーゼ阻害剤に曝露された後の確立されたラット腫瘍の増殖速度論を示した図である。腫瘍の研究は、材料及び方法で説明したように実施した。図４Ａ及び４Ｂは、Ｃ６プロファイリング研究（図４Ａ）及びＭａｔｔＩＩＩプロファイリング研究（図４Ｂ）において、ノギスで計測して測定した動物の腫瘍量を示している。腫瘍は、２方向（長さ及び幅）をノギスで測り、腫瘍量は式（長さ）ｘ（幅）ｘ（１／２幅）に従って計算した。
【図５Ａ】インビボにおいてＫＤＲキナーゼ阻害剤によってラット腫瘍に誘導された遺伝子発現変化を同定した図である。各行は個々の動物の異なる腫瘍を表す。各列は遺伝子を表す。灰色の点／線はＫＤＲキナーゼによって調節された（たとえば、上方制御又は下方制御された）遺伝子を示す。図５Ａは、ＫＤＲキナーゼ阻害剤化合物Ｂに全身を曝露してから２４、４８又は７２時間後の調節されたラットＣ６側腹腫瘍の遺伝子発現変化を示している。
【図５Ｂ】インビボにおいてＫＤＲキナーゼ阻害剤によってラット腫瘍に誘導された遺伝子発現変化を同定した図である。各行は個々の動物の異なる腫瘍を表す。各列は遺伝子を表す。灰色の点／線はＫＤＲキナーゼによって調節された（たとえば、上方制御又は下方制御された）遺伝子を示す。図５Ｂは、ＫＤＲキナーゼ阻害剤化合物Ａに全身を曝露してから２４、４８又は７２時間後の調節されたラットＣ６側腹腫瘍の遺伝子発現変化を示している。
【図５Ｃ】インビボにおいてＫＤＲキナーゼ阻害剤によってラット腫瘍に誘導された遺伝子発現変化を同定した図である。各行は個々の動物の異なる腫瘍を表す。各列は遺伝子を表す。灰色の点／線はＫＤＲキナーゼによって調節された（たとえば、上方制御又は下方制御された）遺伝子を示す。図５Ｃは、ＫＤＲキナーゼ阻害剤化合物Ａに全身を曝露してから１００時間後の調節されたＭａｔＢＩＩＩ乳癌の遺伝子発現変化を示している。
【図６】ＫＤＲ阻害剤によって惹起された異なる腫瘍遺伝子の発現応答を示した図である。図６Ａで示したベン図は、Ｃ６側腹腫瘍とＭａｔＢＩＩＩ乳癌との間のＫＤＲキナーゼ阻害剤に対する腫瘍遺伝子発現応答の重複の程度を示している。パネルＢで示されたベン図は、分裂促進剤によってインビトロで、及びＫＤＲキナーゼ阻害剤によって腫瘍組織で調節された内皮細胞特異的遺伝子の組の間の重複の程度を示している。図６Ｂで示された遺伝子（バイオマーカー）は全て、分裂促進剤曝露後にインビトロで認められたものとは反対の様式で、ＫＤＲキナーゼ阻害剤によってインビボで調節される。
【図７】リアルタイム定量リアルタイムＰＣＲによってマイクロアレイデータを確認した図である。定量リアルタイムＰＣＲは、遺伝子特異的ＰＣＲプライマー対及び単位複製配列特異的蛍光プローブ（ＴａｑＭａｎ）で実施した。試験したそれぞれのＲＮＡ試料について、ＧＡＰＤＨの転写存在量を測定した。さらに、関心のある遺伝子及びＧＡＰＤＨの遺伝子の転写存在量は標準物質ＲＮＡ試料（ラット肺総ＲＮＡ）についても測定した。図７Ａは、ΔΔＣＴ法（材料及び方法を参照）を使用して計算した、ビークル処理動物の腫瘍に対するＫＤＲキナーゼ処理動物の腫瘍における遺伝子発現の倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を示している。図７Ｂは、標準物質ＲＮＡプールに対するラット腫瘍における各遺伝子のｍＲＮＡ濃度を示している。
【図８】ラット乳癌でのバイオマーカー蛋白質発現は血管に局在している。脱蝋し、再水和したＭａｔＢＩＩＩ腫瘍部分をＣＤ３１に対する抗体及び以下のバイオマーカー蛋白質、ＣＬＵ、ＡＮＧＰＴ２、ＣＹＲ６１、ＥＮＤＲＢ又はＰＬＡＵの１つとインキュベートした。バイオマーカー蛋白質及びＣ３１と結合した1次抗体は、それぞれ材料及び方法で説明したＡｌｅｘａ４８８標識及びＡｌｅｘａ５４６標識２次抗体で視覚化した。カバーガラス下に封入した後、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍで４０倍対物レンズ及びＡｘｉｏｃａｍ  ｍＨＲ  ＣＣＤカメラを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５蛍光顕微鏡によって撮影した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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