(57)【要約】  本発明は、分析における分析物の定量検出または定性検出のための方法、およびそのための適切な試薬、特にホモジニアスな結合試験に関する。本発明に係る分析物特異的な結合パートナーＲ１は、シグナルを形成する系の成分に連結した特異的結合パートナーＸに関する特異的結合部位を１個より多く含み、一方で、第二の分析物特異的結合パートナーＲ２は、同様にシグナルを形成する系の成分に連結した特異的結合パートナーＹに関する特異的結合部位を１個より多く含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物特異的結合パートナーＲ１および／またはＲ２を用いて、サンプル中の分析物を定量的または定性的に検出するためのホモジニアスな方法であって、分析物特異的結合パートナーＲ１が、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸに特異的な結合部位を有し、分析物特異的結合パートナーＲ２が、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＹに特異的な結合部位を有し、該Ｒ１および／またはＲ２は、それぞれのシグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーのための結合部位を１個より多く有する、上記方法。
【請求項２】
Ｒ１および／またはＲ２は、分析物との結合反応の前、その間、またはその後に、Ｘおよび／またはＹを介してシグナル生成系成分に連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が有する特異的結合パートナーＸに関する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、さらに特に好ましくは少なくとも１５個である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ２が有する特異的結合パートナーＹに関する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、さらに特に好ましくは少なくとも１５個である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２は、１種の同一な分析物特異的結合パートナー、または異なる分析物特異的結合パートナーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ２は、分析物に特異的に結合することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１またはＲ２は、修飾された分析物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１が有する特異的結合パートナーＸに関する結合部位は、ハプテン、または特異的な結合対のその他の種類であり、特に好ましくはビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸の鎖、およびジニトロフェノールである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ２が有する特異的結合パートナーＹに関する結合部位は、ハプテン、または特異的な結合対のその他の種類であり、特に好ましくはビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸の鎖、およびジニトロフェノールである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＸおよびＹは、１種の同一な特異的結合パートナーであるか、または異なる特異的結合パートナーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｘは、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸の鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、または、特定のポリペプチド、オリゴペプチドもしくは酵素に特異的に結合することができる抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｙは、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸の鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、または、特定のポリペプチド、オリゴペプチドもしくは酵素に特異的に結合することができる抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
シグナル生成系成分は互いに、分析物がＲ１および／またはＲ２に結合した結果として、該成分間の相互作用（特にエネルギー移動）が可能になる距離に移動し、そして、この相互作用の大きさが測定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
シグナル生成系成分は互いに、分析物がＲ１またはＲ２に結合した結果として、該成分間の相互作用が不可能であるか、または、極めてわずかな相互作用しかできない距離、特にエネルギー移動が不可能であるか、または、極めてわずかなエネルギー移動しかできない距離に移動し、そしてこの相互作用の残留した大きさが測定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
シグナル生成系成分は、微小粒子であり、好ましくはラテックス粒子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
シグナル生成系成分は、微小粒子に連結した光線感作物質、および微小粒子に連結した化学発光物質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸに特異的な結合部位を１個より多く有する分析物特異的結合パートナーＲ１を含み、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＹに特異的な結合部位を１個より多く有する分析物特異的結合パートナーＲ２を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を実施するための試験キット。
【請求項１８】
シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸおよび／またはＹをさらに含む、請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
請求項３に記載の分析物特異的結合パートナーＲ１、および／または、請求項４に記載の分析物特異的結合パートナーＲ２を含む、請求項１７または１８に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中で分析物を定量的または定性的に検出するための方法、および、この目的に適した試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析物を検出するために、検出しようとする分析物が、分析物特異的結合パートナーに特異的に結合することにより、サンプル中で上記分析物の存在、非存在または量に関する結論を導き出すことが可能な結合試験がしばしば使用されている。結合試験の例としては、イムノアッセイ、または、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがハイブリダイズする方法が挙げられる。
【０００３】
「ヘテロジニアスな結合試験」は、１またはそれ以上の分離工程および／または洗浄工程があることを特徴とする。この分離は、例えば、免疫沈降、ポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウムのような物質を用いた沈殿、ろ過、磁気を用いた分離、または、固相への結合によって実行することができる。このような「固相」は、多孔質および／または非多孔質の材料からなり、これは、概して水不溶性である。これは、極めて広範囲の形態を取ることができ、例えば：容器、小さいチューブ、マイクロタイトレーションプレート、球体、微小粒子、ロッドもしくはストリップ、または、ろ紙もしくはクロマトグラフィーペーパーなどが挙げられる。サンドイッチ様式のヘテロジニアスな結合試験の場合において、分析物特異的結合パートナーの一方は、概して、固相に結合し、「分析物／分析物特異的結合パートナー」の結合複合体を液相から分離するのに用いられ、同時に、他方の分析物特異的結合パートナーは、結合複合体を検出するための検出可能な標識（例えば酵素、蛍光標識、または、化学発光標識など）を含む。これらの試験方法はさらに、一段階サンドイッチ試験と呼ばれる方法と、二段階サンドイッチ試験に細分され、一段階サンドイッチ試験とは、２種の特異的結合パートナーをサンプルと一緒にインキュベートするものであり、二段階サンドイッチ試験とは、まず第一にサンプルと固相試薬とをインキュベートし、分離工程と洗浄工程の後に、固相に結合した結合複合体（分析物と分析物特異的結合パートナーとからなる）を、検出試薬とインキュベートするものである。
【０００４】
「ホモジニアスな結合試験」において、遊離のシグナル生成系成分と、「分析物／分析物特異的結合パートナー」複合体に結合しているこの系の成分との分離は行われない。分析物特異的結合パートナー、シグナルを形成する成分、および、サンプルを含む試験混合物が、結合反応の後に、または、結合反応の際にも、さらなる分離および／または洗浄工程を全く行うことなく測定され、対応する測定シグナルが決定される。ホモジニアスなイムノアッセイの例（また、ＢｏｇｕｓｌａｓｋｉおよびＬｉ（１９８２年）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：４０１〜４１４も参照）は、多数の濁度測定方法または比濁分析方法であり、このような検出に用いられる分析物特異的結合パートナーは、ラテックス粒子に連結させることができ；例えばＥＭＩＴ（R）テスト；ＣＥＤＩＡ（R）テスト；蛍光偏光免疫測定法；発光酸素チャネリングイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，“ＬＯＣＩ”，ＥＰ−Ａ２−０ ５１５ １９４；Ｕｌｌｍａｎ等，（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.，９１：５４２６〜５４３０；Ｕｌｌｍａｎ等，（１９９６年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：１５１８〜１５２６参照）；などである。比濁分析ラテックス試験のようなホモジニアスなサンドイッチ式イムノアッセイにおいては、抗体試薬をサンプルと共にインキュベートし、インキュベートの際に、および／または、その後にシグナルが測定されるが、測定の前に分離工程または洗浄工程を行わない。言い換えれば、抗体が結合した分析物を、遊離の分析物または分析物とまったく結合していない抗体から分離しない。
【０００５】
また、ホモジニアスおよびヘテロジニアスな結合試験は、「サンドイッチ分析」と呼ばれる試験の形態で行うこともできる。この場合、例えばヘテロジニアスな結合試験において、分析物は、固相に連結した分析物特異的結合パートナー、および、シグナル生成系成分に連結する分析物特異的結合パートナーと結合する。サンドイッチイムノアッセイにおいて、分析物特異的結合パートナーとしては、抗体または抗原またはハプテンが可能である。
【０００６】
「間接的なイムノアッセイ」は、ヘテロジニアスまたはホモジニアスな結合試験のその他の特別な実施形態である。この場合、分析物は抗体である。分析物特異的結合パートナーの一種は、検出しようとする抗体（＝分析物）の抗原または修飾抗原であり、他方の分析物特異的結合パートナーは一般的に、免疫グロブリン結合タンパク質であり、例えば、検出しようとする抗体（＝分析物）に特異的に結合することができる抗体である。
【０００７】
ホモジニアスまたはヘテロジニアスな「競合的結合試験」において、サンプル分析物、および、試薬分析物（例えば「修飾された分析物」であり、例えば、標識された分析物、分析物フラグメント、または、分析物類似体である）は、限定された数の分析物特異的結合パートナーへの結合について競合する。原理を説明するための例は以下の通り：（ｉ）サンプル分析物は、シグナル生成系成分に連結している試薬分析物と、固相に連結した分析物特異的結合パートナーへの結合について競合する、または、（ii）サンプル分析物は、固相に連結した分析物（＝試薬分析物）と、シグナル生成系成分に連結している分析物特異的結合パートナーとの結合について競合する。
【０００８】
しかしながら、多くの結合試験において、試薬を製造する際に多大な困難が生じるが、これは、分析物特異的結合パートナーの、固相または粒状のシグナル生成系成分（例えば微小粒子）への結合は、この方式で結合した分析物特異的結合パートナーの活性を損なう原因となることが多く、および／または、これらの結合パートナーの特性（例えばコンフォメーションまたは安定性に関する）における変化を生じさせるためである。これは、特に、結合した分析物特異的結合パートナーが、抗体または酵素のようなタンパク質である場合に当てはまる。
【０００９】
それゆえに、「万能試薬」と呼ばれるものを導入することによってこの問題を改善する試みがなされてきた（例えばＥＰ−０ １０５ ７１４を参照）。従って、ＥＰ−０ ２４５ ９２６によれば、万能な固相試薬としてアビジンで被覆した固相を用い、そこにビオチン化した分析物特異的結合パートナーを結合させることによって分析物を検出することが可能である。その他の方法では、ビオチン化した分析物特異的結合パートナーが用いられており、これは、例えば、万能な検出試薬として用いられるストレプトアビジン／酵素複合体に結合することができる。しかしながら、これらの試験において、分離工程（例えば洗浄工程）は、試験の実施の際に必須の構成要素である。
【００１０】
万能試薬の使用に関する特別な難点は、ホモジニアスな結合試験、特に、粒状の万能試薬（例えばストレプトアビジンで被覆した微小粒子）の使用に基づくホモジニアスな結合試験において起こる。分析物特異的結合パートナーが２価または多価である場合、すなわち、粒状の万能試薬に関する２またはそれ以上の結合部位を有する場合（例えば、それらが２またはそれ以上のビオチン分子が結合した抗体である場合）、これらは、サンプル中に存在する分析物がなくても、凝集した微小粒子を発生させる可能性がある。そのため、その後に誤った測定がなされる可能性がある。それゆえに、ＥＰ−０ ３５６ ９６４、ＥＰ−０ ３４９ ９８８、および、ＥＰ−０ ４４４ ５６１によれば、分析物特異的結合パートナーが万能試薬に関して１価であること、すなわち結合パートナーが、万能試薬（例えばストレプトアビジン−ラテックス粒子）に関して１個の結合部位しか有さないことが、上記のようなホモジニアスな試験の実行に必須であると考えられている。ホモジニアスなＬＯＣＩ試験の場合も同様に（ＥＰ−０ ５１５ １９４を参照）、発明者等は、測定シグナルの生成は、いずれの場合も１個の感作物質の粒子と、１個の化学発光粒子とからなる粒子対の形成に依存することを指摘している（Ｕｌｌｍａｎ等，（１９９６年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：１５１８〜１５２６）。これらの方法の不利点は、対応する分析物特異的結合パートナー上の結合部位の数を正確に制御しなければならないことである。
【００１１】
ＥＰ−０ １３８ ２９７では、その他のアプローチを採用している。この場合、アビジンで被覆したラテックス粒子に結合するビオチン化した抗体の数は、遊離のビオチンを添加する必要性があることによって制御される。しかしながら、この特徴の測定は、試薬の安定性と試験の分析感度の両方にマイナスの作用を有する。その上、この場合における万能試薬は、実際の試験方法の前に、対応する分析物特異的結合パートナーと反応する、すなわちラテックス粒子にビオチン／アビジン架橋を介して結合している抗体が、この試験で用いられる試薬の構成要素となる。これは、万能試薬は、行われる試験によっては、分析ユニットで、数種の分析物特異的結合パートナーと共に用いることができないという不利点を被る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえに、上述の不利益を示さない、特にホモジニアスな試験手法を用いて分析物を検出するための改善された方法を開発することが、目的である。この特徴を有する方法は、自動分析機器で特に有利に用いることができる。
【００１３】
この目的は、請求項に記載の、新規の方法および材料を提供することによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この新規の方法は、分析物に特異的な試薬（分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２）とは独立して、特定の趣旨にあわせて調節することができる万能試薬（特異的結合パートナーＸまたはＹ、これらはそれぞれ、シグナル生成系成分に連結する）を利用可能にすること、および、それによって、分析物を高い感度と精度で検出可能にすることによってこの目的を達成する。
【００１５】
シグナルを生成する成分の分析物特異的結合パートナーを互いに独立して用いることができ、さらに、分析物特異的結合パートナーと、シグナルを生成する成分を、互いに独立して所定の必要条件にあわせて最適に調節することができるため、本発明はまた、以下のホモジニアスな結合試験の一般的な問題、すなわち、最適な識別と最適な感度に必要な必要条件がそれぞれ逆であること：試薬濃度は、一方では、バックグラウンドシグナルができる限り低くなるように限定すべきであり、一方では、試薬は、十分な単位時間あたりのシグナルの変化を達成するために、高度に濃縮および標識されるべきである、ということも解決する。
【００１６】
分析物に特異的な、新規の結合パートナーＲ１および／またはＲ２は、シグナル生成系成分に連結するそれぞれの特異的結合パートナーＸまたはＹに関する結合部位を１個より多く提示していることを特徴とする。この新規の方法において、好ましくは、シグナル生成系成分を含む万能試薬を用いることであり、ここにおいて、このシグナル生成系成分は、例えばエネルギー移動の形態で極めて短い距離で互いに相互作用することができる。
【００１７】
驚くべきことに、ホモジニアスな試験方法における所定の万能試薬に関する結合部位を１個より多く有する分析物特異的結合パートナーの新規の使用は、誤った測定を起こさず、それどころか、分析物に特異的な測定シグナルに対するバックグラウンドシグナル比も改善されていることが発見された（例えば表３および４を参照）。
【００１８】
所定の万能試薬に関する分析物特異的結合パートナーの結合部位は、好ましくは、低分子物質、例えばハプテン、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、ＤＮＰまたはＦＩＴＣからなり、これらは、好ましくは分析物特異的結合パートナーに共有結合で結合しているため、概して、Ｒ１またはＲ２の分析物に特異的な活性または結合能は損なわれないか、または、わずかしか損なわれない。また、このような結合部位は、修飾されていない分析物特異的結合パートナーの一部であってもよい。従って、分析物特異的結合パートナーは、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体によってその他の種から特異的に認識される数種の結合部位を有するヒトＩｇＧ抗体であってもよい。
【００１９】
本発明は、好ましくは、一例において、分析物特異的結合パートナーＲ１および／またはＲ２を用いて、サンプル中の分析物を定量的または定性的に検出するためのホモジニアスな方法に関し、ここにおいて、分析物特異的結合パートナーＲ１が、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸに特異的な結合部位を有し、分析物特異的結合パートナーＲ２が、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＹに特異的な結合部位を有し、該Ｒ１および／またはＲ２は、それぞれのシグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーのための結合部位を１個より多く有する。本発明の特定の利点は、ＥＰ−０ １３８２９７で説明されているように、特異的結合パートナーＸおよび／またはＹ（例えばアビジン、ストレプトアビジンなど）は、遊離の「特異的な結合部位」（例えばビオチン）を添加することによって飽和させなくてもよいことである。
【００２０】
この新規の方法は、特に好ましくはホモジニアスな結合試験であり、なかでも、ホモジニアスなイムノアッセイである。上記で説明したように、このホモジニアスな結合試験は、特に、サンドイッチ分析、間接的なイムノアッセイ、または、競合的結合試験の形態で行うことができる。
【００２１】
本発明を説明するのに用いられたいくつかの用語を、以下でより詳細に説明する：
「定量検出」は、サンプル中の分析物の量、濃度または活性を測定することである。用語「定量検出」は、サンプル中の分析物のおよその量、濃度または活性を単に記録するか、または、単に相対的な量、濃度または活性の指標を得るのに用いることができる半定量的な方法も包含する。「定性検出」は、単に、サンプル中に分析物またはその活性が存在するか、または存在しないかを検出すること、または、サンプル中の分析物の量、濃度または活性が、１つの特定の閾値または複数の特定の閾値より高いか低いかを示すことを意味するものと理解される。
【００２２】
用語「分析物」は、この新規の方法で検出しようとする物質を意味するものと理解される。分析物の例は、ＥＰ−Ａ２−０ ５１５ １９４の第８〜１５頁に列挙されている。分析物は、特異的な結合対メンバーとなることができる。分析物は、１個の結合部位（１価、通常はハプテン）を有していてもよいし、または、数個の結合部位（多価）を有していてもよい。このような結合部位は、免疫化学試験ではエピトープと呼ばれることも多い。加えて、分析物は、単一の物質でもよいし、または、共有の結合部位を少なくとも１つ有する物質群でもよい。
【００２３】
１価の分析物は、一般的に、約１００〜２０００、特に１２５〜１０００の分子量を有する。多くのオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖類、医薬、薬物、代謝産物、殺虫剤などは、この用語「１価の分析物」に含まれる。多価の分析物は、一般的に、２０００より大きい、通常、１０,０００より大きい分子量を有する。多価の分析物の例は、ポリペプチド、多糖類、核酸、細胞、細胞の構成要素、例えば染色体、遺伝子、ミトコンドリア、およびその他の細胞小器官、細胞膜などである。タンパク質が、検出しようとする物質であることが多い。これらのタンパク質は、類似の構造的特徴および／または類似の生物学的機能を特徴とするタンパク質ファミリーの一種であり得る。分析的に関心のあるタンパク質ファミリーの例は、病原体タンパク質、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、腫瘍マーカー、代謝マーカー、組織特異的抗原、ヒストン、アルブミン、グロブリン、硬タンパク質、リンタンパク質、ムチン、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、受容体、ＨＬＡ、凝固因子、心筋梗塞マーカー（例えばミオグロビン、トロポニン、プロＢＮＰ等）などである。その他の分析的に関心のある物質の例は、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、および、ポリヌクレオチドである。
【００２４】
本発明における意味の範囲内で、「サンプル」とは、検出しようとする物質（「分析物」）を含む可能性のある材料と理解される。例えば、用語「サンプル」は、生体液または組織、特にヒトまたは動物から採取した生体液または組織を包含し、例えば血液、血漿、血清、痰、滲出液、気管支肺胞洗浄液、リンパ液流体、滑液、精液、膣粘液、便、尿、脊髄液、毛髪、皮膚および組織サンプル、または、組織切片である。また、この用語は、細胞培養サンプル、植物性の流動体または組織、法医学的なサンプル、水および汚水サンプル、食材および医薬品も含む。
【００２５】
加えて、用語「サンプル」は、検出しようとする物質（「分析物」）をキャリアー物質から放出された形態または増幅された形態で含む可能性のある、前処理されたサンプルも包含する：分析物を本検出方法で利用可能にするために、または、干渉するサンプル成分を除去するために、多数のサンプルを前処理する必要がある。このようなサンプルの前処理は、細胞の分離および／または溶解、サンプル成分（例えばタンパク質）の沈殿、加水分解または変性、サンプルの遠心分離、有機溶媒（例えばアルコール、特にメタノール）でのサンプルの処理；または、界面活性剤でのサンプルの処理を含んでいてもよい。サンプルは、しばしば、他の（通常は水性）媒体に移されるが、これは、検出方法において発生する可能性のある干渉を最小限にすることを目的とする。また、分析物は、増幅されていてもよい。核酸の増幅により、例えば、検出しようとする核酸の鎖の１またはそれ以上のコピーの生成が生じる。このような増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑベータレプリカーゼを用いた増幅、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、シングルプライマー増幅（ＡＳＰＰ）などが、当業者周知である。
【００２６】
「分析物特異的結合パートナー」は、分析物に特異的に結合することができる特異的結合パートナー、または、その他の分析物特異的結合パートナーに結合することができる特異的結合パートナー（例えば修飾された分析物）のいずれかと理解される。概して、「修飾された分析物」とは、少なくとも、分析物特異的結合パートナーに結合することができるが、追加の結合部位が欠失しているか、または、それらが存在している点でサンプル分析物とは異なる物質であり、例えばビオチン化した分析物であり、または、シグナル生成系成分に連結した分析物である。修飾された分析物は、例えば競合試験で用いられる。
【００２７】
「特異的結合パートナー」は、特異的な結合対のメンバーと理解される。特異的な結合対のメンバーは、２種の分子であり、それらはそれぞれ、他方の分子が有する構造に相補的な少なくとも１つの構造を有し、これら２種の分子は、相補的な構造間の結合を介して、共に特異的に結合することができる。この点について、用語「分子」は、分子複合体も包含し、例えば、アポ酵素と補酵素からなる酵素、数種のサブユニットからなるタンパク質、タンパク質と脂質からなるリポタンパク質などが挙げられる。特異的結合パートナーは、天然に存在する物質でもよいし、または、例えば、化学合成、微生物学的技術および／または組換えＤＮＡ方法の手段によって製造されるその他の物質でもよい。従って、現在のところ、ファージディスプレイライブラリー、合成ペプチドデータベース、または、組換え抗体ライブラリーを用いて特異的結合パートナーを選択することが可能である（ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ（１９９１年）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２：１７２〜１８９）。用語「特異的結合パートナー」を説明するための例として以下を挙げるが、当然ながらこれらに限定されない：チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結合タンパク質など。特異的な結合対の例は、以下の通り：抗体−抗原、抗体−ハプテン、ジゴキシゲン／抗ジゴキシゲン抗体、フルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、オペレーター−リプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、レクチン−多糖類、ステロイド−ステロイド結合タンパク質、活性化合物−活性化合物受容体、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡ、相補的なオリゴヌクレオチド、または、ポリヌクレオチドなど。いわゆるホモジニアスな遺伝子プローブ試験において、特異的結合パートナーは、概して、検出しようとする核酸の鎖のセグメントに少なくとも部分的に相補的な核酸の鎖である。
【００２８】
本発明における意味の範囲内で、用語「抗体」は、免疫グロブリン、例えば、クラスまたはサブクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4またはＩｇＭの免疫グロブリンを表すと理解される。抗体は、抗原またはハプテン上のエピトープ（しばしば、抗原決定基ともいう）に関する少なくとも１つの結合部位（しばしば、パラトープともいう）を有する。このようなエピトープは、例えば、その空間的な構造、および／または、極性基および／または無極の基の存在を特徴とする。抗体が有する結合部位は、エピトープに相補的である。抗原−抗体反応またはハプテン−抗体反応は、いわゆる「鍵と錠の原理」に従って機能し、概して、高度に特異的であり、すなわち抗体は、一次構造、電荷、空間的な構造、および、抗原またはハプテンの立体配置のわずかな差を区別することができる。抗体が有する、いわゆる相補性決定領域は、抗体の抗原またはハプテンへの結合に、特定の貢献をしている。
【００２９】
用語「抗原」は、１価および多価の抗原を包含する。多価の抗原は、１個より多くの免疫グロブリンが同時に結合できる分子または分子複合体であり、それに対して、常に１価の抗原には、ただ一つの抗体しか結合できない。それ自体は免疫原性ではないが、免疫化の目的で、一般的にキャリアーに結合する分子を、通常、ハプテンという。
【００３０】
本発明における意味の範囲内で、用語「抗体」は、完全抗体を表すだけでなく、特に抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂ’；および、さらにキメラ、ヒト化、二重特異性、多重特異性または一本鎖の抗体；および、その上さらに、免疫グロブリンおよび／またはそれらの抗原またはハプテンに結合する特性を示すフラグメントの、集合体、ポリマーおよび複合体も表すと理解される。抗体フラグメントは、例えば、ペプシンまたはパパインのような酵素を用いて酵素的に切断された抗体によって製造することができる。抗体の集合体、抗体ポリマー、および、抗体の複合体は、多種多様の方法を用いて生産することができ、例えば、熱処理、グルタルアルデヒドのような物質との反応、免疫グロブリン結合分子との反応、抗体のビオチン化、続いて、それらをストレプトアビジンまたはアビジンと反応させること等によって生産することができる。
【００３１】
本発明における意味の範囲内で、抗体は、モノクローナル抗体でもよいし、または、ポリクローナル抗体でもよい。このような抗体は、慣例的な方法を用いて製造されたものでもよく、例えばヒトまたは動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ラクダ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはヒヨコ）を免疫化し（また、Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄ（１９９６年）ＢＩＯｆｏｒｕｍ，１１：５００〜５０２も参照）、その後、抗血清を単離すること；または、ハイブリドーマ細胞を確立し、その後分泌された抗体を精製すること；または、自然抗体の抗原および／またはハプテンへの結合に関与するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはそれらの改変型のクローニングおよび発現によって製造されたものでもよい。また、組換えＤＮＡ方法は、必要に応じて、植物、例えば酵母細胞（Ｆｉｓｃｈｅｒ等（１９９９年）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，３８０：８２５〜８３９；Ｈｉａｔｔ等（１９９２年）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１４，４９〜６４））、動物細胞、原核細胞（例えば、ＷＯ９５／２５１７２を参照）、および、単離されたヒト細胞における抗体を生産させるのに用いることもできる。
【００３２】
「シグナル生成系」は、１またはそれ以上の成分で構成されていてもよく、その成分のうち少なくとも１つは、検出可能な標識である。標識は、それ自体シグナルを生産するか、または、蛍光物質物質、放射活性物質、酵素または化学発光物質のようなシグナルの生産を誘導できるあらゆる分子と理解される。このようなシグナルは、例えば、酵素活性、発光、光吸収、光散乱、放出された電磁放射または放射線照射、または化学反応を用いて、検出または測定することができる。
【００３３】
「標識」は、追加の成分が必要なくなるように、そのものが検出可能なシグナルを生成できるものであってもよい。多くの有機分子が紫外線および可視光を吸収するが、これらの分子は、光の吸収によって移動したエネルギーの結果として励起されたエネルギー状態になり、入射光の波長とは異なる波長の光の形態で吸収されたエネルギーを放出することができる。さらにその他の標識、例えば放射性同位体、色素、または、磁気性および非磁性の微小粒子は、検出可能なシグナルを直接生成することができる。
【００３４】
さらにその他の標識は、シグナルを生成するために追加の成分を必要とし、すなわち、このような場合、シグナル生成系は、例えば基質、補酵素、クエンチャー、促進剤、追加の酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補因子、阻害剤、イオンなど、シグナル生成に必要な全ての成分を含む。
【００３５】
適切な標識の例（また、ＥＰ−Ａ２−０ ５１５ １９４；ＵＳ５,３４０,７１６；ＵＳ５,５４５,８３４；Ｂａｉｌｅｙ等（１９８７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ５：６４９〜６５８も参照）は酵素であり、例えば、以下が挙げられる：ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、および、アセチルコリンエステラーゼ；色素；蛍光物質、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、エチジウムブロマイド、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル塩化物、および、希土類の蛍光性のキレート；化学発光物質、例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン（dioxene）、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリンおよびエクオリン；感作物質、例えば、エオシン、９,１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、ポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、および、ローズベンガル；補酵素  ；酵素基質；放射性同位体、例えば、125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、59Ｆｅ、57Ｃｏ、および、75Ｓｅ；粒子、例えば、磁気粒子、または、粒子、好ましくはラテックス粒子、これらは、そのものを、例えば色素、感作物質、蛍光物質、化学発光物質、同位体またはその他の検出可能な標識で標識することができる；ゾル粒子、例えば、金ゾル、または、銀ゾル；リポソームまたは細胞、これらは、そのものを、検出可能な標識で標識することができる；など。
【００３６】
また、シグナル生成系は、互いに空間的に近い場合、例えばエネルギードナーおよびエネルギーレシピエントの形態で検出可能な相互作用を起こすことができる成分を含んでいてもよく、このような形態としては、例えば光線感作物質と化学発光物質（ＥＰ−Ａ２−０ ５１５ １９４）、光線感作物質と蛍光団（ＷＯ９５／０６８７７）、放射性ヨウ素125と蛍光団（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ等（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：８６７２〜８６７６）、蛍光団と蛍光団（Ｍａｔｈｉｓ（１９９３年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：１９５３〜１９５９）、または、蛍光団と蛍光クエンチャー（ＵＳ３,９９６,３４５）が挙げられる。
【００３７】
成分間の相互作用は、例えば、光放射または電子線の結果としての成分間の直接のエネルギー移動を含み、さらに、一時的な反応性化学分子を介した成分間の直接のエネルギー移動も含む。加えて、１つの成分の活性を、１またはそれ以上のその他の成分によって阻害または増加させるプロセス、例えば酵素活性の阻害または増加、または、影響を受けた成分によって放出された電磁放射の阻害、増加または変更（例えば波長シフト、偏光）も含まれる。また、成分間の相互作用は、酵素カスケードも含む。この場合、これらの成分は酵素であり、そのうちの少なくとも１種は、その他の酵素のための基質を供給し、それによって、最大または最小速度を有する共役した基質反応が生じる。
【００３８】
概して、成分間の効率的な相互作用は、これらの成分が空間的に隣接している場合に起こり、このような空間的な隣接は、例えば、数μｍの範囲の距離内であり、特に、６００ｎｍ未満、好ましくは４００ｎｍ未満、さらに特に好ましくは２００ｎｍ未満の範囲である。
【００３９】
本発明に係る極めて特に好ましい方法において、シグナル生成系は、微小粒子に連結した光線感作物質、および、微小粒子に連結した化学発光物質を含む。
【００４０】
微小粒子は、固相および／または標識として用いられることが多い。本発明における意味の範囲内で、用語「微小粒子」は、およその直径が少なくとも２０ｎｍ、かつ、２０μｍ以下、一般的に４０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは０.１〜１０μｍ、特に好ましくは０.１〜５μｍ、さらに特に好ましくは０.１５〜２μｍの粒子を表すと理解される。微小粒子は、規則的な形状を有していてもよいし、または、不規則な形状を有していてもよい。微小粒子は、球体、回転楕円体、または、様々な大きさの空隙または孔を有する球体であり得る。微小粒子は、有機材料もしくは無機材料で構成されていてもよいし、または、両方の材料の混合物もしくは組み合わせで構成されていてもよい。微小粒子は、多孔質または非多孔質の材料で構成されていてもよいし、膨潤性または非膨潤性の材料で構成されていてもよい。微小粒子は、原則的にあらゆる濃度が可能であるが、好ましくは、水の濃度に近い濃度、例えば約０.７〜約１.５ｇ／ｍｌの濃度の粒子である。好ましい微小粒子は、水溶液に懸濁することができ、できるだけ長い期間、懸濁液中で安定である。微小粒子は、透明、部分的に透明、または、不透明のものが可能である。微小粒子は、数種の層で構成されていてもよく、これは、例えば、コアと、１またはそれ以上の外被層を有するいわゆるコア・シェル型粒子である。用語「微小粒子」は、例えば、色素の結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、磁気粒子、ポリマー粒子、油滴、脂質粒子、デキストラン、および、タンパク質凝集体を包含する。好ましい微小粒子は、水溶液に懸濁することができ、水不溶性ポリマー材料（特に置換ポリエチレン）からなる粒子である。極めて特に好ましくは、ラテックス粒子であり、例えば、ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリ酢酸ビニルアクリラート、ポリビニルピリジン、または、塩化ビニル−アクリラートで構成されるラテックス粒子である。特異的結合パートナーを、例えば共有結合でラテックス粒子に結合させることができるカルボキシル、アミノまたはアルデヒド基のような反応性基を表面上に有するラテックス粒子が特に重要である。ラテックス粒子の製造は、例えばＥＰ ０ ０８０ ６１４、ＥＰ ０ ２２７ ０５４、および、ＥＰ ０ ２４６ ４４６で説明されている。
【００４１】
用語「〜に連結（した）」は、広義で理解され、そして、例えば、共有結合および非共有結合、直接の結合および間接的な結合、表面への吸収、および、陥入または空隙への封入等を含むものとする。共有結合の場合では、特異的結合パートナーは、例えば、化学結合を介して標識に結合する。共有結合は通常、第一の分子の少なくとも１つの原子核が、第二の分子の少なくとも１つの原子核と電子を共有する場合、２個の分子間に存在すると言われている。非共有結合の例は、表面吸着、空隙への封入、または、２つの特異的結合パートナーの結合である。標識への直接の結合に加えて、特異的結合パートナーはまた、その他の特異的結合パートナーとの特異的な相互作用を介して標識に間接的に結合することもできる。これは、ビオチン化した抗フルオレセイン抗体が、標識に結合したアビジンを介して標識に結合することができるという例によって説明される。
【００４２】
微小粒子は、例えば、粒子表面へのサンプル成分の非特異的結合を抑制または予防するために、または、例えば、懸濁安定性、貯蔵安定性、立体構造の安定性、または、ＵＶ光、破壊作用を有する微生物またはその他の物質に対する耐性の点で改善を達成するために、１またはそれ以上の層からなるコーティングを有していてもよく、この層は、例えば、タンパク質、炭水化物、バイオポリマー、有機ポリマー、またはそれらの混合物で構成されていてもよい。従って、このコーティングは、特に、タンパク質層、または、ポリマー層、例えばシクロデキストリン、デキストラン、ヒドロゲル、アルブミンまたはポリアルブミンで構成されていてもよく、これらは、共有結合によって、または、吸着によって、微小粒子に付着している。
【００４３】
本発明の方法において、Ｒ１および／またはＲ２は、分析物との結合反応の前、その最中、またはその後に、Ｘおよび／またはＹを介してシグナル生成系成分に連結することができる。上記サンプルは、まず最初に、分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２とインキュベートし、続いて、その後に、特異的結合パートナーＸおよびＹを添加することができる。しかしながら、試薬もまた、その他の順番で添加することもできる。
【００４４】
新規のホモジニアスな結合試験の特に好ましい実施形態を実施する際に、まず第一に、サンプルを、分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２と連続的に、または、同時に混合し、その後、この混合物に、結合パートナーＸおよびＹと共に、シグナル生成系成分を連続的に、または、同時に添加する。
【００４５】
新規の分析物特異的結合パートナーＲ１が有する特異的結合パートナーＸに関する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、さらに特に好ましくは少なくとも１５個であり、新規の分析物特異的結合パートナーＲ２が有する特異的結合パートナーＹに関する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、さらに特に好ましくは少なくとも１５個である。
【００４６】
また、新規の分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２は、１種の同一な分析物特異的結合パートナーでもよいし、または、異なる分析物特異的結合パートナーでもよい。従って、サンドイッチイムノアッセイにおいて、分析物特異的結合パートナーＲ１、および、分析物特異的結合パートナーＲ２としていずれも、例えば分析物がその抗体に関するエピトープを１個より多く有する場合、モノクローナル抗体を用いることができる。
【００４７】
この新規の方法において、分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２はいずれも、サンドイッチ分析または直接的なイムノアッセイの場合、分析物に特異的に結合することができる。サンドイッチイムノアッセイの場合において、例えば、分析物特異的結合パートナーは、分析物に特異的な抗体が可能であり、または、分析物そのものが抗体である場合、その抗原または「修飾された抗原」、または、抗原類似体が可能である。競合試験の設定において、新規の分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２の一方が、修飾された分析物である。
【００４８】
新規の分析物特異的結合パートナーＲ１が有する特異的結合パートナーＸに関する結合部位は、好ましくはハプテンである。新規の分析物特異的結合パートナーＲ１が有する結合部位は、特に好ましくは、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸の鎖、または、ジニトロフェノールである。しかしながら、各条件下で特異的な結合対のメンバーとなるその他の分子を使用することも可能である。
【００４９】
新規の分析物特異的結合パートナーＲ２が有する特異的結合パートナーＹに関する結合部位は、好ましくはハプテンである。新規の分析物特異的結合パートナーＲ２が有する結合部位は、特に好ましくは、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸の鎖、または、ジニトロフェノールである。しかしながら、各条件下で特異的な結合対のメンバーとなるその他の分子を使用することも可能である。
【００５０】
新規の特異的結合パートナーＸおよびＹは、１種の同一な特異的結合パートナーでもよいし、または、異なる特異的結合パートナーでもよい。また、新規の特異的結合パートナーＸは、好ましくはアビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸の鎖、または、抗ハプテン抗体である。しかしながら、これは、酵素、酵素基質、または、特定のポリペプチド、オリゴペプチドもしくは酵素に特異的に結合することができる抗体も可能である。また、新規の特異的結合パートナーＹは、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸の鎖、または、抗ハプテン抗体も可能である。しかしながら、酵素、酵素基質、または、特定のポリペプチド、オリゴペプチドもしくは酵素に特異的に結合することができる抗体も可能である。
【００５１】
この新規の方法の特に好ましい実施形態において、シグナル生成系成分は互いに、分析物がＲ１および／またはＲ２に結合した結果として、これらの成分間の相互作用（特にエネルギー移動）が可能になる距離に移動する。次に、サンプル中で分析物を定量的または定性的に検出するために、この相互作用の大きさが測定される。この方法は、サンドイッチ分析、および、間接的なイムノアッセイに特に適している。
【００５２】
この新規の方法のその他の特に好ましい実施形態において、シグナル生成系成分は、分析物がＲ１またはＲ２に結合した結果として、これらの成分間の相互作用が不可能であるか、または、極めてわずかな相互作用しかできない距離、特にエネルギー移動が不可能であるか、または、極めてわずかなエネルギー移動しかできない距離に移動する。次に、サンプル中で分析物を定量的または定性的に検出するために、この相互作用の残留した大きさが測定される。この方法は、競合的結合試験に特に適している。
【００５３】
分析物特異的結合パートナーが有する特異的結合パートナーＸまたはＹに関する結合部位の数を、分析物特異的結合パートナーの特異性または感度を減少させることなく増加させるために、分析物特異的結合パートナーと結合部位の両方が結合できるキャリアー分子を導入することが可能である。それゆえに、この新規の方法において、これは、Ｒ１が、キャリアー分子に連結した１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーであり、このキャリアー分子が、特異的結合パートナーＸに関する結合部位を有することができる場合に有利である。さらに、これは、Ｒ２も、キャリアー分子に連結した１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーであり、このキャリアー分子が、特異的結合パートナーＹに関する結合部位を有することができる場合に有利である。
【００５４】
本発明に係る特に好ましい実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、各条件下で、このようなキャリアー分子に連結している。適切なキャリアー分子の例は、タンパク質、例えば抗体、酵素、アルブミン、例えばウシ血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミン、または、タンパク質ポリマー、デキストラン、シクロデキストリン、デンドリマー、または、類似の構造である。特に好ましいタンパク質ポリマー、または、タンパク質凝集体は、抗体、アルブミン分子、酵素、またはそれらの混合物で構成されていてもよく、これらは、互いに連結しており、好ましくは共有結合で結合している。極めて特に好ましくは、キャリアー分子として、ビオチン化したデキストラン、および、ビオチン化したタンパク質ポリマー（例えばビオチン化した抗体ポリマー）を用いることである。
【００５５】
特に好ましいキャリアー分子は、実施例７で説明されているように製造することができる。この場合、マウス抗体、好ましくはマウスＩｇＧ抗体は、カップリング試薬を用いて共有結合で互いに結合している。また、本発明に係るキャリアー分子は、類似の方法で酵素、抗体（例えばマウスまたはヤギ抗体、特にＩｇＧ抗体）、アルブミンまたはそれらの混合物から製造することもできる。特異的結合パートナーＸまたはＹ、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸の鎖、ジニトロフェノールなどのための結合部位は、当業者既知の方法を用いて、これらのタンパク質ポリマーと結合することができ、この場合、共有結合が好ましい。
【００５６】
キャリアー分子に連結した分析物特異的結合パートナーは、例えば、以下のように製造することができる：分析物特異的結合パートナー（好ましくは抗体、特に好ましくは抗体フラグメント）を、当業者既知の方法を用いて、例えばカップリング試薬を用いて、キャリアー分子に結合させる。この結合は、可能な限り共有結合であるべきである。適切なキャリアー分子は、例えば、ビオチン化したデキストラン（実施例５を参照）であるか、または、上述のような他のキャリアー分子の一つであり、特に実施例７で説明されている抗体ポリマーのようなものである。ビオチン化したデキストランなどの場合において、特異的結合パートナーＸまたはＹに関する結合部位は、分析物特異的結合パートナーとキャリアー分子との結合反応の前に導入してもよいし、または、実施例７で説明されているように、その後に導入してもよい。また、１種のみの分析物特異的結合パートナーではなく、数種の分析物特異的結合パートナーも、キャリアー分子に結合することができる。しかしながら、この本発明に係る好ましい実施形態に加えて、数種のキャリアー分子を、１種の分析物特異的結合パートナーに結合させることも可能である。
【００５７】
本発明の主題のその他の部分は、１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーに連結するキャリアー分子、好ましくは、それらに共有結合で結合するキャリアー分子である。この主題の一実施形態において、キャリアー分子は、タンパク質ポリマー、例えば抗体（実施例７を参照）、アルブミン分子、酵素、またはそれらの混合物であり、これらは共有結合で互いに結合しており、加えて、特異的結合パートナーＸまたはＹに関する結合部位、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸の鎖、ジニトロフェノール等を有することができる。このような結合部位の数は、１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーに連結したキャリアー分子あたり、少なくとも２個、さらにより好ましくは５個より多く、好ましくは１０個より多く、特に好ましくは１５個より多く、さらに特に好ましくは１８個より多い。この本発明に係る実施形態において、分析物特異的結合パートナーは、好ましくは抗体もしくは抗体フラグメント、抗原、ハプテン、または、核酸の鎖である。
【００５８】
また、サンプル中での分析物を定量的または定性的に検出するためのホモジニアスまたはヘテロジニアスな結合試験（特にホモジニアスまたはヘテロジニアスなイムノアッセイ）における、１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーに連結した上述のキャリアー分子の使用も本発明に係る。
【００５９】
以下の点で、本発明に係るキャリアー分子に連結した分析物特異的結合パートナーもまた、結合体という。これらの結合体もまた、当然ながら、ヘテロジニアスな結合試験、同様に、ホモジニアスな結合試験で有利に用いることができる。
【００６０】
本発明に係る結合体は、１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーに連結したキャリアー分子からなり、この結合体は、特異的結合パートナーＸまたはＹに関する追加の結合部位を有する。結合体の特別な実施形態において、キャリアー分子は、デキストラン、シクロデキストリンもしくはデンドリマーからなるか、または、一緒に結合した抗体、一緒に結合したアルブミン分子、一緒に結合した酵素もしくは一緒に結合したそれらの混合物からなる。それらの結合は、好ましくは共有結合である。本発明に係る結合体が有する追加の結合部位は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、または、一本鎖核酸の鎖が可能である。本発明に係る結合体の特に好ましい実施形態において、キャリアー分子は、１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーに共有結合で結合する。本発明に係る結合体の特異的結合パートナーＸまたはＹに関する追加の結合部位は、少なくとも２、好ましくは５個より多く、特に好ましくは１０個より多く、さらに特に好ましくは１５個より多く、最適には１８個より多い。極めて特に好ましくは、キャリアー分子が、共有結合で一緒に結合した抗体（好ましくはマウスまたはヤギＩｇＧ抗体）からなる結合体である。本発明はまた、これらの結合体を１種またはそれ以上含む試薬、および、このような試薬を含む試験キットに関する。
【００６１】
本発明に係る結合体は、サンプル中で分析物を定量的または定性的に検出するための、ホモジニアスまたはヘテロジニアスな結合試験（例えばイムノアッセイ）で用いることができる。本発明に係る結合試験、特にホモジニアスな結合試験の一実施形態において、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸに特異的な結合部位を有する本発明に係る結合体は、サンプル中で分析物を定量的または定性的に検出するために用いられる。その他の実施形態において、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＹに特異的な結合部位を有する本発明に係るさらなる結合体は、加えて、サンプル中で分析物を定量的または定性的に検出するために用いられる。特異的結合パートナーＸまたはＹに関する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、さらに特に好ましくは少なくとも１５個である。ＸおよびＹは、１種の同一な特異的結合パートナーでもよいし、または、異なる特異的結合パートナーでもよい。好ましくは、結合パートナーＸまたはＹとして、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸の鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、または、特定のポリペプチド、オリゴペプチドもしくは酵素に特異的に結合することができる抗体を用いることができる。本発明における意味の範囲内で、極めて特に好ましくは、１またはそれ以上の本発明に係る結合体を用いた結合試験であり、好ましくはホモジニアスな結合試験であり、ここにおいて、シグナル生成系成分が、分析物特異的結合パートナーの結合の結果として、これらの成分間の相互作用（特にエネルギー移動）が可能になる距離に移動し、この相互作用の大きさが測定されるか、または、シグナル生成系成分が、分析物特異的結合パートナーの結合の結果として、これらの成分間の相互作用が不可能であるか、または、極めてわずかな相互作用しかできない距離、特にエネルギー移動が不可能であるか、または、極めてわずかなエネルギー移動しかできない距離に移動し、この相互作用の残留した大きさが測定される。このような試験において、微小粒子、特にラテックス粒子は、好ましくは、シグナル生成系成分として用いられる。極めて特に好ましくは、このような試験方法におけるシグナル生成系成分として、微小粒子に連結した光線感作物質、および、微小粒子に連結した化学発光物質を用いることである。
【００６２】
この新規の方法において、シグナル生成系成分として、微小粒子、特にラテックス粒子を使用することが可能である。微小粒子に連結した感作物質、特に光線感作物質、および、微小粒子に連結した化学発光物質は、シグナル生成系成分として極めて特に好ましい。
【００６３】
その結果として、微小粒子（特にラテックス粒子）（この微小粒子に結合する特異的結合パートナーＸまたはＹを介して、本発明に係る結合体が結合する）、および、新規の方法におけるこの微小粒子の使用は、本発明の主題のその他の部分を構成している。この点について、好ましくは、シグナル生成系成分として、光線感作物質または化学発光物質に連結している微小粒子である。
【００６４】
ＬＯＣＩ法に基づく試験（ＥＰ−０５１５１９４で詳細に説明されている）は、本発明に係るこの新規の方法の特に好ましい実施形態である。この試験は、光線感作物質と、シグナルを生成する成分としていわゆるアクセプターを用いることに基づく。光に晒されると、光線感作物質は、一重項酸素を生成し、この一重項酸素は、化学発光成分であるアクセプターと反応する。活性化された化学発光成分は光を生産し、この光が測定される。この好ましい方法を、本発明に係るサンドイッチ分析に基づきより詳細に説明する：分析物は、例えば、分析物特異的結合パートナーＲ１に結合しており、この分析物特異的結合パートナーＲ１は、特異的結合パートナーＸによっていわゆる感作物質の粒子に結合しているキャリアー分子に連結することができる。励起状態において、感作物質の粒子に連結した感作物質の分子は、一重項酸素を生成することができる。この一重項酸素は、いわゆる化学発光粒子に連結した化学発光化合物と反応することができ、ここで、形成された準安定な化合物は、光のフラッシュの生成で再び分解する。キャリアー分子に連結することができる分析物特異的結合パートナーＲ２は、特異的結合パートナーＹによって化学発光粒子に結合している。一重項酸素だけが水溶液中で短期間安定であるため、化学発光粒子は、分析物特異的結合パートナーに連結し、サンドイッチ複合体形成の結果として、光で刺激された感作物質の粒子と隣接するようになり、化学発光粒子は、例えば、刺激されて光を放出する。放出された光の波長が測定されるが、この波長は、化学発光粒子において適切な蛍光性の色素を用いることによって変更できる。この方法において、サンプルは、好ましくは、まず、分析物特異的結合パートナーＲ１およびＲ２とインキュベートされ、その後に、感作物質の粒子および化学発光粒子に連結した特異的結合パートナーＸおよびＹがそれぞれ添加される。
【００６５】
同様にこの新規の方法で用いることができるその他のエネルギー移動方法は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒによるエネルギー移動（Ｍａｔｈｉｓ，Ｇ．（１９９３年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：１９５３〜１９５９；ＵＳ５，５２７，６８４）、または、光線感作物質と蛍光団の使用（ＷＯ９５／０６８７７）、または、放射性の放射線照射と蛍光団の組み合わせ（Ｓ．Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ等（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｍａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：８６７２〜８６７６）、または、適切な酵素カスケードの使用（ＵＳ４，６６３，２７８）に基づく。
【００６６】
この新規の方法のその他の実施形態において、分析物特異的結合パートナーＲ１は、シグナル生成系成分に連結しており、分析物特異的結合パートナーＲ２は、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＹに特異的な結合部位を有し、ここにおいて、Ｒ２は、シグナル生成系成分に連結する所定の特異的結合パートナーＹに関する結合部位を１個より多く有する。
【００６７】
本発明はまた、上述の本発明に係るキャリアー分子の１種またはそれ以上を含むかまたは本発明に係る微小粒子を含む、液状または凍結乾燥状の試薬に関し、ここにおいて、上記キャリアー分子は、各条件下で、１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーに連結している。本発明はまた、このような試薬を含む試験キットも包含する。これはまた、サンプル中で、分析物を定量的または定性的に検出するためのホモジニアスまたはヘテロジニアスな結合試験を実施するための、好ましくは、本発明の請求項に記載のホモジニアスな方法の一種を実施するための、上記試薬および／または試験キットの使用も包含する。
【００６８】
本発明はまた、本発明に係るホモジニアスな結合試験を実施するための試験キットに関する。この試験キットは、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸに特異的な結合部位を１個より多く有する分析物特異的結合パートナーＲ１を含むことを特徴とし、さらに、この試験キットは、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＹに特異的な結合部位を１個より多く有する分析物特異的結合パートナーＲ２を含むことを特徴とする。
【００６９】
また、本発明に係る試験キットは、シグナル生成系成分に連結する特異的結合パートナーＸおよび／またはＹを追加で含んでいてもよい。加えて、本発明に係る試験キットはまた、試験を実施するのに必要な、同封の情報リーフレット、希釈緩衝液、標準、コントロール、システム試薬、および／または、その他の試薬、ならびに、材料（例えばキュベット、および、サンプル採取用具）を含んでいてもよい。
【００７０】
本発明に係る試験キットは、好ましくは、ビオチン化したデキストラン、ビオチン化したタンパク質ポリマー、ビオチン化した抗体ポリマー、または、その他のキャリアー分子に連結した１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーからなる分析物特異的結合パートナーＲ１、および、／または、ビオチン化したデキストラン、ビオチン化したタンパク質ポリマー、ビオチン化した抗体ポリマー、または、その他のキャリアー分子に連結した１またはそれ以上の分析物特異的結合パートナーからなる分析物特異的結合パートナーＲ２を含む。
【００７１】
以下に記載する実施例は、本発明の特徴を説明するために提供されたものであり、限定を表すものとして理解するべきではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１：感作物質の粒子または化学発光粒子の製造
感作物質の粒子および化学発光粒子の製造は、ＥＰ０５１５１９４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９６年）４２：１５１８〜１５２６、および、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４年）９１：５４２６〜５４３０で詳細に説明されている。このような粒子は、例えば、デキストランの外被を有していてもよく、加えて、結合したストレプトアビジンを有していてもよい（また、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４年）９１：５４２６〜５４３０も参照）。以下に、一例として、感作物質の粒子の変形種と化学発光粒子の製造を説明する（また、さらなる詳細については、ＥＰ０５１５１９４，実施例８も参照）：
【００７３】
感作物質の粒子の製造：
クロロフィルａのベンジルアルコール溶液（１.０ｍｌ；０.６ｍＭ）を、１０５℃に加熱したベンジルアルコール８.０ｍｌに添加した。このベンジルアルコール溶液に、ラテックスビーズ（１７５ｎｍ，カルボキシルで修飾されたラテックス，バングス・ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），カーメル，インディアナ州）の水への懸濁液（１０％；１.０ｍｌ）を添加した。この混合物を１０５℃で５分間撹拌し、次に、室温に冷却した。エタノール１０ｍｌを添加し、この混合物を遠心分離した。ペレットを、１：１の水−エタノール混合物（１０ｍｌ）に懸濁し、この懸濁液をさらにもう１回遠心分離した。同じ手法を水を用いて繰り返し、その後ペレットを生理学的塩化ナトリウム溶液に溶解させた。
【００７４】
化学発光粒子（＝アクセプター粒子）の製造：
カルボキシルで修飾されたラテックス粒子の懸濁液（水への１０％懸濁液）２０ｍｌを、２−エトキシエタノール２０ｍｌと混合した。この混合物を９０℃に加熱した。１０ｍＭジオキセン、３−（２−チエノイル）−１，１，１−トリフルオロアセトンという薬品（コダック（Ｋｏｄａｋ），ＣＡＳ番号１４０５４−８７−６）（ＥｕＴＴＡ）との２０ｍＭユーロピウムキレート、および、２−エトキシエタノール中の６０ｍＭトリオクチルホスフィン酸化物（ＴＯＰＯ）で構成される溶液２０ｍｌを、粒子懸濁液に添加した。この混合物をさらに９７℃で７分間加熱した。室温に冷却した後に、エタノール４０ｍｌを添加し、この混合物を遠心分離した。次にペレットを８０％エタノールに懸濁し、遠心分離した。この洗浄プロセスを１０％エタノールを用いて繰り返した。すなわち、この粒子を生理学的塩化ナトリウム溶液に溶解させた。
【００７５】
実施例２：万能試薬である、ストレプトアビジンを含む化学発光粒子（＝アクセプター粒子）の製造：
アクセプター粒子２０ｍｇを、カップリング緩衝液（０.０５Ｍのβ−モルホリノエタンスルホン酸；Ｓｅｒｖａ製，Ａｒｔ．２９８３４）中で、ストレプトアビジン（Ｇｅｒｂｕ製，高純度，＃３０５８）２.０ｍｇ、および、水素化シアノホウ素ナトリウム０.２ｍｇ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製，Ｓ８６２８）と共に混合し、この混合物を＋３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベートの際のカップリング条件は、以下の通り：カップリング１ｍｌあたり粒子５０ｍｇ、カップリング１ｍｌあたり水素化シアノホウ素ナトリウム０.５ｍｇ、粒子２０ｍｇあたりストレプトアビジン２ｍｇ。
インキュベートの後に、カルボキシメトキシルアミンヘミ塩酸塩（アルドリッチ（Ａｒｄｒｉｃｈ）製，９８％濃度，カタログ番号Ｃ１，３４０−８）の０.４８Ｍ溶液６５.６μｌを添加し、混合し、この混合物を＋３７℃でさらに２時間インキュベートした。
上清を遠心分離で分離し、粒子をカップリング緩衝液（０.６ＭのＮａＣｌを含む，メルク（Ｍｅｒｃｋ）製）に懸濁した。その後、上清をさらにもう１回、遠心分離で分離し、粒子を貯蔵用緩衝液（０.１Ｍトリス−ＨＣｌ，０.３ＭのＮａＣｌ，２５ｍＭのＥＤＴＡ，０.１％ＢＳＡ，０.１％デキストランＴ−５００，０.１％の両性界面活性剤３−１４，０.０１％ゲンタマイシン，１５ｐｐｍのＰｒｏＣｌｉｎ−３００，ｐＨ８.０）に溶解させ、懸濁した。
【００７６】
ストレプトアビジンを含む感作物質の粒子：
「ストレプトアビジンを含む化学発光粒子（＝アクセプター粒子）」のカップリングと同様にして、感作物質の粒子をカップリングした。
【００７７】
抗ジゴキシゲニンを含む感作物質の粒子：
感作物質の粒子１５ｍｇを、カップリング緩衝液（０.０５Ｍのβ−モルホリノエタンスルホン酸；Ｓｅｒｖａ製，Ａｒｔ．２９８３４）中で、抗ジゴキシゲニン抗体（Ｍａｂ  ＤＩＧ２Ｈ６，デイド・ベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．）製）３ｍｇ、および、水素化シアノホウ素ナトリウム（シグマ製，Ｓ８６２８）０.１５ｍｇと共に混合し、この混合物を＋３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベートの際のカップリング条件は、以下の通り：カップリング１ｍｌあたり粒子３２.８ｍｇ、カップリング１ｍｌあたり抗体６.６ｍｇ、カップリング１ｍｌあたり水素化シアノホウ素ナトリウム０.３３ｍｇ、粒子１５ｍｇあたり抗体３ｍｇ。
インキュベートの後に、カルボキシメチルアミンヘミ塩酸塩（アルドリッチ製，９８％強度，カタログ番号Ｃ１，３４０−８）の０.４８Ｍ溶液４９.２μｌを添加し、混合し、この混合物を＋３７℃でさらに２時間インキュベートした。
上清を遠心分離で分離し、粒子をカップリング緩衝液に懸濁した（０.６ＭのＮａＣｌを含む，メルク製）。その後に、上清を、さらにもう１回遠心分離で分離し、粒子を溶解させ、貯蔵用緩衝液（０.１Ｍトリス−ＨＣｌ，０.３ＭのＮａＣｌ，２５ｍＭのＥＤＴＡ，０.１％ＢＳＡ，０.１％デキストランＴ−５００，０.１％両性界面活性剤３−１４，０.０１％ゲンタマイシン，１５ｐｐｍのＰｒｏＣｌｉｎ−３００，ｐＨ８.０）に懸濁した。
【００７８】
抗ジゴキシゲニンまたは抗トロポニンを含む化学発光粒子（＝アクセプター粒子）：
「抗ジゴキシゲニンを含む感作物質の粒子」カップリングと同様にして、アクセプター粒子を、ジゴキシゲニンまたはトロポニンに対して向けられた抗体にカップリングした。
【００７９】
以下の実施例において、万能試薬Ａ（ストレプトアビジンを含むアクセプター粒子）を、万能試薬Ｂ（抗ジゴキシゲニンを含む感作物質の粒子）と組み合わせて用いるか、または、万能試薬Ａ（抗ジゴキシゲニンを含むアクセプター粒子）を、万能試薬Ｂ（ストレプトアビジンを含む感作物質の粒子）と組み合わせて用いた。
【００８０】
実施例３：ＰＳＡ分析
ＰＳＡに特異的な試薬の製造
結合体Ｃ１（ビオチン化した抗ＰＳＡ抗体）：
ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）製，Ａｒｔ．２１３３６，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ）０.２３ｍｇを、ＤＭＳＯ（ＲｄＨ製，３４９４３）に溶解し、抗ＰＳＡ抗体（ＭＡＫ＜ＰＳＡ＞９２−２８４／０３，デイド・ベーリング・マールブルグ社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ＧｍｂＨ），０.１Ｍ炭酸ナトリウム中（ＲｄＨ製，３１４３２））２.３ｍｇに添加し、混合し、この混合物を＋４℃で１６時間インキュベートした。モル比［Ａｂ］：［ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ］は、１：３５を用いた。
【００８１】
この結合体を、リン酸緩衝液（０.０５Ｍリン酸二水素ナトリウム，  ０.１５Ｍ塩化ナトリウムを含む，ｐＨ７.５）を用いて、ＰＤ−１０セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｍ（ファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）製，コード１７−０８５１−０１）カラムに通過させて精製した。
【００８２】
結合体Ｃ２（ジゴキシゲニンで標識された抗ＰＳＡ抗体）：
抗ＰＳＡ抗体（ＭＡＫ＜ＰＳＡ＞９２−２８３／０２９，デイド・ベーリング・マールブルグ社）を、ＤＩＧ−抗体標識キット（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）製，注文番号１３６７２００，実施：ＤＩＧ−ＮＨＳ１．モノクローナル抗体でのタンパク質標識）の使用のための指示書／説明書に従って、ジゴキシゲニンで標識した。
【００８３】
分析緩衝液
０.１ｍｏｌ／ｌのトリス、０.３ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、２５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０.１％ＲＳＡ、０.１％デキストランＴ−５００、０.１％両性界面活性剤３−１４、０.０１％ゲンタマイシン、および、１５ｐｐｍのＰｒｏＣｌｉｎ−３００（ｐＨ８.００）を含む。
【００８４】
ＰＳＡ分析の実施
この試験を実施するために、以下のように成分を混合し、インキュベートした：
サンプルを１０μｌ、
分析緩衝液を７５μｌ、
それぞれ０.９６μｇ／ｍｌの結合体Ｃ１（ビオチン化した抗ＰＳＡ抗体）、および、結合体Ｃ２（ジゴキシゲニン化した抗ＰＳＡ抗体）を２５μｌ、
インキュベートを３７℃で３７１秒間、
分析緩衝液を１００μｌ、
抗ジゴキシゲニンを含む感作物質の粒子（０.２ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ、
ストレプトアビジンを含むアクセプター粒子（０.２ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ、
インキュベートを３７℃で７６２.５秒間。
【００８５】
測定
この試験を行い、改造されたテカン（Ｔｅｃａｎ）のサンプルプロセッサーで測定し（Ｕｌｌｍａｎ等，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５１８〜１５２６，１９９６年，ＥＰ０５１５１９４Ａ２を参照）、シグナルを記録した。
【００８６】
結果
【表１】
2007512543.tif 000002
【００８７】
【表２】
2007512543.tif 000003
【００８８】
上記の表は、この新規の方法において測定された値は、正常の範囲内で、比較方法（アボットＩＭｘトータルＰＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｉｍｘ  ｔｏｔａｌ  ＰＳＡ），リスト番号１Ｄ８５）の値と一致したことを示す。これは、本発明に係る方法が機能していることを確認するものである。
【００８９】
実施例４：抗体あたりのビオチン標識の数を変化させること
実施例３で説明されているビオチン化方法に従って、抗ＰＳＡ抗体（Ｍａｂ＜ＰＳＡ＞９２−２８４／０３，デイド・ベーリング・マールブルグ社）を様々な量のビオチン分子と結合させ、抗ＰＳＡ抗体（Ｍａｂ＜ＰＳＡ＞９２−２８３／０９，デイド・ベーリング・マールブルグ社）を様々な量のジゴキシゲニン分子と結合させた。以下の表に、この抗体対を用いて得られた結果を示す。
【００９０】
【表３】
2007512543.tif 000004
【００９１】
実施例５：デキストラン−抗体−ビオチン結合体の製造
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を用いた抗体の活性化
０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（リーデル・デ・ハーン（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ）製，３１４３２）中の、抗ＰＳＡ抗体（Ｍａｂ＜ＰＳＡ＞９２−２８４／０３，デイド・ベーリング・マールブルグ社）１０.４ｍｇを、混合緩衝液（ＬｉＢＯ3／２０％ジオキサン）ｐＨ８.５に再緩衝化し、ＤＭＦ中のＳＡＴＡ（ピアース製）（２ｍｇ／ｍｌ）１０４μｌと混合した。この混合物を３７℃で１.５時間インキュベートした後、ＮＨ2ＯＨ（２００μｌ）と４５分間インキュベートした。
次に、この結合体を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＰＤ−１０カラムを通過させて脱塩した。
【００９２】
活性化されたビオチン−デキストランの製造
フルカバイオデックス（ＦｌｕｋａＢｉｏＤｅｘ）（７００００ｋＤａ，商品番号１４４０２，ビオチン置換２０ｍｏｌ／ｍｏｌ）３.９ｍｇ（１.９５ｍｌ）を、混合緩衝液（２ｍｇ／ｍｌ）に溶解させ、ジオキサン中のＧＭＢＳ溶液（Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル，ピアース製）（６ｍｇ／ｍｌ）２６μｌと混合した。この混合物を１８℃で１時間インキュベートした。次に、この結合体を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＰＤ−１０カラムに通過させて脱塩した。
【００９３】
活性化された抗体の活性化されたビオチン−デキストランへのカップリング
結合体１：
抗体−ＳＡＴＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１.７ｍｌを、フルカバイオデックス−ＧＭＢＳ溶液（１.３２ｍｇ／ｍｌ）５０９μｌと混合した。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次に、ｎ−エチルマレイミドの０.１Ｍ溶液２２０μｌで停止した。精製／脱塩を、０.１Ｍトリス／ＨＣ１、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７.４）を用いてセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ３００（直径１.６ｃｍ，ゲルベッド高さ９０ｃｍ，ローディング量約２ｍｌ）に通過させて行った。この結合体を含む分画をプールし、１.７ｍｌ（〜０.６５ｍｇ／ｍｌ）まで濃縮した。
【００９４】
結合体２：
抗体−ＳＡＴＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１.７ｍｌを、フルカバイオデックス−ＧＭＢＳ溶液（１.３２ｍｇ／ｍｌ）１０２μｌと混合した。この混合物は、３７℃で２時間インキュベートし、次に、ｎ−エチルマレイミドの０.１Ｍ溶液１８０μｌで停止した。精製／脱塩を、０.１Ｍトリス／ＨＣ１、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７.４）を用いて、フルカのセファクリルＳ３００（直径１.６ｃｍ，ゲルベッド高さ９０ｃｍ、ローディング量約２ｍｌ）に通過させて行った。この結合体を含む分画をプールし、１.７ｍｌ（〜０.６４ｍｇ／ｍｌ）まで濃縮した。
【００９５】
配合が異なるために、結合体１については、抗体あたり約１８個のビオチン分子の比率が得られ、結合体２については、抗体あたり約３個のビオチン分子の比率が得られた。
【００９６】
これらの結合体を、上述のＰＳＡ分析において、抗体／ジゴキシゲニンの比率を高めながら上述のジゴキシゲニン化した抗ＰＳＡ抗体と組み合わせて用いた。デキストラン結合体の濃度は、９.７５μｇ／ｍｌであり、ジゴキシゲニン化した抗ＰＳＡ抗体は、濃度８.８μｇ／ｍｌで用いた。以下の表に、結果を示す。
【００９７】
【表４】
2007512543.tif 000005
【００９８】
実施例６：風疹ＩｇＭ分析
風疹ＩｇＭ特異的な試薬の製造
結合体Ｃ１（ビオチン化した抗ヒトＩｇＭ抗体）：
抗ＰＳＡ抗体のビオチン化（実施例３を参照）と同様に、ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｐａｂ＜ｈ−ＩｇＭ＞  ６２ＦＸ０２２，デイド・ベーリング・マールブルグ社）をビオチン化した。
【００９９】
結合体Ｃ２（ジゴキシゲニンで標識された抗風疹抗体）：
抗風疹抗体（Ｍａｂ＜ｒｕｂｅｌｌａ＞９３−９／０８，デイド・ベーリング・マールブルグ社）を、ＤＩＧ−抗体標識キット（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ製，注文番号１３６７２００，実施：ＤＩＧ−ＮＨＳ１．モノクローナル抗体を用いたタンパク質標識）の使用のための指示書／説明書に従って、に従ってジゴキシゲニンで標識した。
【０１００】
分析緩衝液：
０.１ｍｏｌ／ｌのトリス、０.３ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、２５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０.１％ＲＳＡ、０.１％デキストランＴ−５００、０.１％両性界面活性剤３−１４、０.０１％ゲンタマイシン、１５ｐｐｍのＰｒｏＣｌｉｎ−３００（ｐＨ７.３）を含む。
【０１０１】
リウマチ因子（ＲＦ）吸収剤：
デイド・ベーリング・マールブルグ社製のリウマチ因子（ＲＦ）吸収剤（商品番号ＯＵＣＧ）である。
【０１０２】
風疹抗原：
インタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ），ＣＤＰ製（ロット８３２０）である。
【０１０３】
風疹ＩｇＭ分析の実施
この試験を実施するために、以下のように成分を混合し、インキュベートした：
サンプルを１０μｌ（ＲＦ吸収剤で１＋９部に希釈）、
分析緩衝液を４０μｌ、
結合体Ｃ１（ビオチン化した抗ヒトＩｇＭ抗体，８μｇ／ｍｌ）、および、結合体Ｃ２（ジゴキシゲニン化した抗風疹抗体，２μｇ／ｍｌ）を２５μｌ、
風疹抗原（４μｇ／ｍｌ）を２５μｌ、
インキュベートを、＋３７℃で４５３.５秒間、
分析緩衝液を７５μｌ、
抗ジゴキシゲニンを含むアクセプター粒子（０.０５μｇ／ｍｌ）を２５μｌ、
ストレプトアビジンを含む感作物質の粒子（０.４ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ、
インキュベートを＋３７℃で４３２.５秒間。
【０１０４】
測定
この試験を行い、改造されたテカンのサンプルプロセッサー（Ｕｌｌｍａｎ等，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５１８〜１５２６、１９９６年，ＥＰ０５１５１９４Ａ２を参照）で測定し、シグナルを記録した。
【０１０５】
風疹ＩｇＭ分析の結果
【表５】
2007512543.tif 000006
【０１０６】
上記の表から明らかなように、本発明に係る方法を用いて得られた結果は、正常の範囲内で、比較方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ，ＥＴＩ−ＲＵＢＥＫ−Ｍ ｒｅｖｅｒｓｅ，Ｐ２４７１）で得られた値と一致した。これは、本発明に係る方法が、間接的な試験手法でも機能していることを確認するものである。
【０１０７】
実施例７：ビオチン化したキャリアー分子−Ｆａｂ’結合体とのビオチン標準結合体を比較するためのトロポニン分析の使用
ビオチン化したキャリアー分子−Ｆａｂ’結合体（「Ｍ−ＩｇＧ−ビオチン−抗トロポニン結合体」）の製造：
０.１Ｍリン酸緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７.０）中の、マウスＩｇＧ抗体（「Ｍ−ＩｇＧ」）（１５.０ｍｌ，１ｍｌあたりＭ−ＩｇＧ２.６ｍｇ，０.２６ｍｍｏｌ）の溶液を、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ−ベンゾアート水溶液（０.６６ｍｌ，２.０ｍｇ／ｍｌ）と混合した。２５℃で１時間の反応時間の後に、この混合物をゲルろ過カラム（ＡｃＡ２２，サイファージェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ），ファーモント，カリフォルニア州）を用いて濃縮し、精製した。モノマーの活性化されたＭ−ＩｇＧ（ＨＰＬＣ試験済み）を含む分画をプールした。
【０１０８】
０.１Ｍリン酸緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ６.０）中の、抗トロポニン抗体のＦ（ａｂ’）2フラグメントの溶液（３.０ｍｌ，１０ｍｇ／ｍｌ）を、ジチオスレイトール（１５.４ｍｇ／ｍｌ）、および、２−メルカプトエタノール（１５.６μｌ／ｍｌ）の混合物０.０９１ｍｌと混合した。３７℃で１時間の反応時間の後に、この混合物を、ゲルろ過カラム（ＡｃＡ２２，サイファージェン，ファーモント，カリフォルニア州）を用いて濃縮し、精製した。Ｆａｂ’抗体フラグメントを含む分画をプールした。
【０１０９】
活性化されたＭ−ＩｇＧ（２０.５ｍｇ；０.１４ｍｍｏｌ）と、Ｆａｂ’フラグメント（２０.５ｍｇ；０.４１ｍｍｏｌ）の混合物を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外ろ過セルを用いて、ｐＨ７.０のリン酸緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ）に再緩衝化した。この混合物を１ｍｌあたりタンパク質５.０ｍｇまで濃縮し、２〜８℃で２４〜７０時間インキュベートした。その後、Ｎ−エチルマレイミド水溶液（２０ｍｇ／ｍｌ；タンパク質溶液１ｍｌあたり５０μｌ）を添加した。室温で１時間の後に、この溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７.０）中でゲルろ過カラム（ＡｃＡ２２，サイファージェン，ファーモント，カリフォルニア州）を用いて濃縮し、精製した。  タンパク質分画をプールした。
【０１１０】
ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアース・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ），ロックフォード，イリノイ州；０.０９５ｍｌ，０.５ｍｇ／ｍｌ）の水溶液を、ｐＨ７.０のリン酸緩衝液（６ｍｌ；０.８ｍｇ／ｍｌ；１６μｍｏｌ）中のＦａｂ’−Ｍ−ＩｇＧ結合体に添加した。室温で４時間の反応時間の後に、この混合物をｐＨ７.０のリン酸緩衝液に対してろ過した。
【０１１１】
Ｆａｂ’−ビオチン結合体（「標準のビオチン−抗トロポニン結合体」）の製造
１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７.０）中の、抗トロポニン抗体のＦａｂ’フラグメント（タンパク質溶液１ｍｌあたり５ｍｇのものを２ｍｌ）の溶液を、ピアース・ケミカル・カンパニー（ロックフォード，イリノイ州）製のＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ；ＤＭＦ中で４ｍｍｏｌ）０.２２ｍｌと混合した。室温で４時間の反応時間の後に、この混合物をｐＨ７.０のリン酸緩衝液に対してろ過した。タンパク質濃度をピアース・ケミカル・カンパニー製のＢＣＡタンパク質分析を用いて決定した。
【０１１２】
トロポニンイムノアッセイ
Ａ）試験の実施
この試験を実施するために、以下のように成分を混合し、インキュベートした：
サンプルを２０μｌ、
水を１０μｌ、
結合体（標準のビオチン−抗トロポニン結合体：１２.５μｇ／ｍｌ、またはＭ−Ｉｇ
Ｇ−ビオチン−抗トロポニン結合体：８μｇ／ｍｌ）を１５μｌ、
抗トロポニン抗体を含むアクセプター粒子（２１０μｇ／ｍｌ）を１３μｌ、
インキュベートを＋３７℃で４３５秒間、
ストレプトアビジンを含む感作物質の粒子（１.５ｍｇ／ｍｌ）を１３μｌ、
水を１０μｌ、
インキュベートを＋３７℃で８７秒間、
水を１６９μｌ。
【０１１３】
測定
この試験を行い、改造されたテカンのサンプルプロセッサー、（Ｕｌｌｍａｎ等，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１５１８〜１５２６，１９９６年，ＥＰ０５１５１９４ Ａ２を参照）で測定し、シグナルを記録した。
【０１１４】
Ｂ）結果
【表６】
2007512543.tif 000007
ビオチン化したキャリアー分子−Ｆａｂ’結合体（＝Ｍ−ＩｇＧ−ビオチン−抗トロポニン結合体）は、かなり急勾配の検量線を示し、それによって、試験により大きい精度を付与する。
【国際調査報告】
2007512543.tif 000008
2007512543.tif 000009
2007512543.tif 000010
2007512543.tif 000011
2007512543.tif 000012
2007512543.tif 000013
2007512543.tif 000014
2007512543.tif 000015