(57)【要約】  本発明は、中胚葉細胞から神経幹細胞を生成する方法に関する。本発明はさらに、神経幹細胞様特徴を有する細胞個体群を提供する。本発明に従って作製される神経幹細胞は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病の治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子が存在しない、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含む培地において、及び２０％（ｖ／ｖ）未満の酸素濃度を有する大気下で、間葉系幹細胞を培養することを含む、神経幹細胞を生成する方法。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞が、成体骨髄、臍帯血及び成体脂肪組織から成る群より選択される組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、成体骨髄細胞及び臍帯血細胞から成る群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞を、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２の存在下で少なくとも１０日間培養する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞を、１５％（ｖ／ｖ）未満の酸素濃度を有する大気下で培養する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞を、神経細胞への実質的な分化が起こらない条件下で培養する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記間葉系幹細胞を、ＮＥＳを発現する細胞の個体群が得られる条件下で培養する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞を、ＦＮ１を発現する細胞の個体群が得られる条件下で培養する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を用いて神経幹細胞を生成すること；及び
（ｂ）工程（ａ）で得た細胞に製薬上許容される担体又は希釈剤を添加すること
の工程を含む、薬剤を製造するための方法。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって得られる中胚葉由来神経幹細胞の個体群。
【請求項１１】
前記神経幹細胞がＮＥＳ及びＦＮ１を発現することを特徴とする、中胚葉由来神経幹細胞の個体群。
【請求項１２】
前記神経幹細胞が、マーカー分子ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３及びＣＤ１６６の発現を実質的に欠く、請求項１０又は１１に記載の中胚葉由来神経幹細胞の個体群。
【請求項１３】
（ｉ）神経幹細胞におけるＮＥＳ発現の量が、骨髄間質細胞におけるＮＥＳ発現の量と比べて少なくとも２００％上昇しており、及び
（ｉｉ）神経幹細胞におけるＦＮ１発現の量が、骨髄間質細胞におけるＦＮ１発現の量の５０％〜１５０％である、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の中胚葉由来神経幹細胞の個体群。
【請求項１４】
神経障害の治療のための薬剤を製造するための、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の中胚葉由来神経幹細胞の個体群の使用。
【請求項１５】
前記中胚葉由来神経幹細胞を患者の脳に移植する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記中胚葉由来神経幹細胞が自家細胞である、請求項１４又は１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中胚葉細胞から神経幹細胞を生成する方法に関する。本発明はさらに、神経幹細胞様特徴を有する細胞個体群を提供する。本発明に従って作製される神経幹細胞は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病の治療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
ある特異性細胞の変性及び機能障害に関係する重篤な疾患がある。幹細胞技術の急速な開発の結果、細胞補充療法によりこれらの障害治療において興味深い可能性が開かれてきた。幹細胞は自己更新及び多くの分化した子孫を生産する能力を有する。幹細胞は成長中の胚及び特定の成体組織から単離することができる。しかし、全細胞タイプへの分化に対する幹細胞の潜在能は次第に、より限られた範囲の細胞、典型的には幹細胞（前駆細胞）が存在する成熟組織に制限されるようになる。
【０００３】
クローン原性神経幹細胞（ＮＳＣ）は、脳特異的細胞型へと分化する能力を保持し［Fricker et al., 1999;Kilpatrick & Bartlett, 1993; Uchida et al., 2000］、また疾患を生じた脳組織を置換又は修復し得る［Kim et al., 2002; Pluchino et al., 2003; Carvey et al., 2001］、自己更新型細胞である。ＮＳＣは、胎児又は成体神経組織から直接単離するか［Reynolds & Weiss, 1992;Kilpatrick & Bartlett, 1993; Cattaneo & McKay, 1990］、又は胚幹細胞から誘導することができる［Bain et al., 1995; Lee et al.,2000］。
【０００４】
組織培養プラスチックへの選択的付着によって骨髄細胞懸濁液から成長する骨髄間質細胞（ＭＳＣ）は効率的に増殖することができる（図１ａ）［Friedenstein et al., 1975; Reyes et al., 2001; Sekiya et al., 2002］。ＭＳＣは、骨、軟骨、脂肪及び筋肉を含む多数の中胚葉組織へと分化することができる［Prockop, 1997, Sekiya et al., 2002; Reyes et al., 2002］。加えて、これらの細胞は、胚葉拘束の障壁を突破して、インビボ及びインビトロで神経及びグリアマーカーを発現する細胞へと分化することができる［Woodbury et al., 2000; Sanchez-Ramos et al., 2000; Zhao et al., 2002］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、分化した神経細胞が分離とその後の移植手順を生き延びる確率が低いことは周知である。従って、神経幹細胞又は未熟神経細胞は、完全に分化した神経細胞に比べて神経移植戦略により適する。神経移植に適した細胞ソースへの需要はますます高まりつつある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、ＭＳＣが、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含む培地で培養することによって未分化ＮＳＣに転換し得ることを発見した。生じる細胞は、インビトロで増殖し、グリア及びニューロンへと分化することができる。
【０００７】
本発明は、それ故、肝細胞増殖因子が存在しない、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含む培地で間葉系幹細胞を培養することを含む、神経幹細胞を生成する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ここで使用する、「間葉系幹細胞」という用語は、増殖し、筋原性、骨原性、軟骨原性及び脂質生成性系統へと分化することができる細胞を表わす。間葉系幹細胞は、例えば骨髄、臍帯血又は脂肪組織に由来し得る。通常、間葉系幹細胞は、マーカー分子ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ６１、ＣＤ９０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０９、ＣＤ１７２ａ及びＣＤ１０５（エンドグリン）を発現するが、ＣＤ４５、ＣＤ３４及びＣＤ１３３は発現しない［Vogel et al., 2003］。
【０００９】
間葉細胞は、骨髄、好ましくは成体骨髄、より好ましくはヒト成人骨髄から単離することができる。あるいは、間葉系幹細胞は、臍帯血、好ましくはヒト臍帯血から、又は脂肪組織から単離することができる。様々なソースから間葉系幹細胞を単離する方法は当業者に公知である（例えばFiedler et al., 2002;Vogel et al., 2003; Ashjian et al., 2003; Erices et al., 2000; Romanov et al., 2003; Tholpady et al., 2003; Wickham et al., 2003参照）。
【００１０】
「成人」という用語は、好ましくは少なくとも約１６歳、例えば約１６歳〜約４５歳、より好ましくは少なくとも約１８歳、例えば約１８歳〜約３０歳の年齢の個人を指す。しかし、１６歳未満又は４５歳以上の年齢の個人も適切なドナーであり得る。
【００１１】
ここで使用する、「神経幹細胞」という用語は、自己更新し、グリア細胞及びニューロンへと分化することができる細胞を表わす。通常、神経幹細胞は、マーカー分子、ネスチン、ＣＤ１５、ＣＤ５６、ＣＤ９０、ＣＤ１６４及びＮＧＦＲを発現するが、ＣＤ４５、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１０９及びＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦ−ＲＢ）は発現しない［Vogel et al., 2003］。
【００１２】
「自己更新」という用語は、有糸分裂を受け、分裂して２つの娘細胞を生産する細胞の能力を指す。
【００１３】
本発明によれば、間葉系幹細胞を、ＥＧＦ（＝上皮増殖因子）及びＦＧＦ−２（＝塩基性ＦＧＦ＝線維芽細胞増殖因子２）を含む培地で培養する。ＥＧＦ及びＦＧＦ−２は市販されている。培地中のＥＧＦの濃度は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌ、より好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、さらに一層好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌである。培地中のＦＧＦ−２の濃度は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌ、より好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、さらに一層好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌである。
【００１４】
間葉系幹細胞は、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２の存在下で少なくとも２日間、好ましくは少なくとも１０日間、最も好ましくは少なくとも２０日間、例えば２０〜７０日間培養し得る。１つの態様では、間葉系幹細胞を、ニューロスフェアが認められるまで、例えば１０〜２０日間、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２の存在下で培養する。これらのニューロスフェアを、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含む培地で１〜１５週間、好ましくは２〜１０週間、さらに増殖させてもよい。
【００１５】
本発明の特定実施形態では、２０％（ｖ／ｖ）未満の酸素濃度を有する大気下で間葉細胞を培養する。好ましくは、酸素濃度は１５％（ｖ／ｖ）未満、より好ましくは１０％（ｖ／ｖ）未満、さらに一層好ましくは５％（ｖ／ｖ）未満、最も好ましくは約３％（ｖ／ｖ）である。最小酸素濃度は０．１％（ｖ／ｖ）又は１％（ｖ／ｖ）であり得る。５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、９２％（ｖ／ｖ）Ｎ2及び３±２％（ｖ／ｖ）Ｏ2の大気下で細胞を培養し得る。
【００１６】
細胞は、約３５〜３８℃、好ましくは約３６〜３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で培養し得る。
【００１７】
細胞は、神経細胞への分化が実質的に認められない条件下で培養し得る。これは、神経分化を誘導することが知られている物質、例えば肝細胞増殖因子（国際公開広報第ＷＯ０２／０８６１０８  Ａ１号）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インターロイキン−１、インターロイキン−１１、白血病阻害因子（ＬＩＦ）等、を培地から除外することによって達成される。
【００１８】
本発明の方法は、以下の工程の１又はそれ以上をさらに含み得る：
−ＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含む培地での培養後、得られた中胚葉由来神経幹細胞を、例えば細胞の少数分画として存在し得る望ましくない細胞から分離することによって、濃縮することができる。そのような望ましくない細胞の例は、死細胞、残存する間葉系幹細胞、完全に分化した神経細胞及びグリア細胞を含むが、これらに限定されない；
−前述した方法によって得た中胚葉由来神経幹細胞を、確立されているプロトコール（Bruder et al., 1997; De Bari et al., 2001）に従って凍結保存し得る；
−前述した方法によって得た中胚葉由来神経幹細胞を、当技術分野において公知のプロトコールによってニューロン又はグリア細胞へとさらに分化させ得る。この実施形態では、薬剤を含んだ適切な分化誘導物質を含有する培地で神経幹細胞をさらに培養する。グリア細胞誘導については、ＰＤＧＦが使用でき、ニューロン誘導については、ＢＤＮＦが使用し得る。どちらの成長因子もレチノイン酸と組み合わせ得る。分化は通常７〜２０日間、好ましくは１０〜１４日間を要する。好ましくは、グリア又はニューロンへの分化の間、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２は存在しない。
−神経幹細胞を特定細胞型について濃縮又は枯渇させ得る。例えばＯ４に対する抗体と細胞選別（ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ）を用いて希突起神経膠細胞を選択し得る。
−間葉系幹細胞を培養する前に、細胞を特定細胞型について枯渇又は濃縮させ得る。例えば造血細胞を枯渇させるか又は単核細胞を単離し得る。骨髄間質細胞は、組織培養プラスチックへの選択的付着によって濃縮し得る。
【００１９】
特定実施形態では、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２の存在下での間葉系幹細胞の培養の前に単核細胞の濃縮及び／又は単離を実施しない。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は、（ａ）前述した方法を用いて神経幹細胞を生成すること；及び（ｂ）神経幹細胞に製薬上許容される担体又は希釈剤を添加すること、の工程を含む、薬剤を製造するための方法である。適切な担体又は希釈剤は、生理的電解質溶液、例えば塩化ナトリウム溶液を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
もう１つの態様では、本発明は、前述した方法によって得られる中胚葉由来神経幹細胞の個体群に関する。本発明に従った方法によって得られる細胞は、神経幹細胞と類似した特性を示す。それらは通常、マーカー分子ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ１３３及びＣＤ１６６の発現を欠く。マーカー分子の発現は、実施例で述べるようにＦＡＣＳ分析によって測定することができる。
【００２２】
本発明に従って得られる細胞は、ＮＥＳ（ネスチンをコードする）及びＦＮ１（フィブロネクチンをコードする）を発現する。特定遺伝子の発現の量は、実施例において述べるように定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。
【００２３】
中胚葉由来神経幹細胞の個体群におけるＮＥＳ発現の量は、間葉系幹細胞の出発個体群におけるよりも有意に高い。好ましくは、ＮＥＳ発現の量は、間葉系幹細胞の個体群に比べて少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高い。
【００２４】
中胚葉由来神経幹細胞の個体群におけるＦＮ１発現の量は、間葉系幹細胞の出発個体群におけるＦＮ１発現の量に比べて約５０％〜約１５０％である。好ましくは、中胚葉由来神経幹細胞の個体群におけるＦＮ１発現の量は、間葉系幹細胞の出発個体群におけるＦＮ１発現の量に比べて約８０％〜約１２０％である。
【００２５】
本発明の中胚葉由来神経幹細胞は、グリアマーカー遺伝子ＧＦＡＰ及び神経マーカー遺伝子ＴＵＢＢ４／ＩＩＩ及びＳＮＣＡの低い量だけを発現する。通常、ＧＦＡＰの発現の量は、完全に分化したグリア細胞、例えば星状細胞における量の約５０％未満、好ましくは約２５％未満である。通常、ＴＵＢＢ４／ＩＩＩの発現の量は、完全に分化した神経細胞、例えばドーパミン作動性神経細胞における量の約５０％未満、好ましくは約２５％未満、より好ましくは約１５％未満である。通常、ＳＮＣＡの発現の量は、完全に分化した神経細胞における量の約５０％未満、好ましくは約２５％未満、より好ましくは約１５％未満である。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、神経障害の治療のための薬剤を製造するための、本発明に従った中胚葉由来神経幹細胞の個体群の使用である。神経障害は、ニューロン及び／又はグリア細胞に実質的な喪失を有する障害、例えば卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
ここで開示する方法に従って得られる細胞は、確立された移植プロトコールを用いてその必要のある患者に投与し得る。そのような投与は、当技術分野において公知の方法、例えば手術、注入カニューレ、針等によって実施しうる。
【００２８】
投与する中胚葉由来神経幹細胞の数は、１００〜１００，０００，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００，０００、より好ましくは１０，０００〜１０，０００，０００、最も好ましくは１００，０００〜１０，０００，０００細胞の範囲である。通常は、１００〜１０，０００，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００，０００、より好ましくは１０，０００〜１０，０００，０００、さらに一層好ましくは１００，０００〜５，０００，０００細胞、最も好ましくは１，０００，０００〜５，０００，０００細胞を１〜１００μｌの容量で投与する。細胞は、１回又は２〜２４週間の間隔で数回（例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回）投与し得る。
【００２９】
本発明のもう１つの態様は、神経障害の治療のための薬剤を製造するための、間葉系幹細胞の使用である。この実施形態によれば、間葉系幹細胞を、最初にＥＧＦ及びＦＧＦ−２の存在下に（肝細胞増殖因子の不在下に）インビトロで培養する。そのようにして得た中胚葉由来神経幹細胞を、製薬上許容される担体又は希釈剤と組み合わせ得る。その後、治療する状態を改善するためにその必要のある患者に前記細胞を投与し得る。
【００３０】
患者に投与する細胞は、通常、ヒト細胞である。好ましくは、患者に投与する細胞は自家細胞である。
【００３１】
本発明はさらに、ここで述べる中胚葉由来神経幹細胞の治療有効量を個体に投与することを含む、個体において神経障害を治療するための方法に関する。この方法の好ましい実施形態は、上述した好ましい実施形態に一致する。
【００３２】
本発明は、ヒト成人骨髄間質細胞（ＭＳＣ）の神経幹様細胞個体群（ｈＭＮＳＣ、ヒトに関しては中胚葉由来ＮＳＣ）への効率的な転換に関する［Friedenstein et al., 1976; Prockop, 1997; Reyes et al., 2002］。これらの細胞は、ニューロスフェアにおいて増殖し、高レベルのＮＳＣマーカーネスチンを発現するが、中胚葉間質細胞の特徴を喪失する。選択増殖因子の存在下で、ｈＭＮＳＣは３つの主要神経表現型：アストログリア、オリゴデンドログリア及びニューロンへと分化することができる。クローン分析は、個々のｈＭＮＳＣが多能性であり、グリアとニューロンの両方を生じる能力を保持することを明らかにする。ここで述べる細胞培養系は、成人ヒトＮＳＣにおける神経分化の分子機構を検討するための強力なツールを提供する。ｈＭＮＳＣは、最終的に、急性及び慢性神経変性疾患を治療するのを助け得る。
【実施例】
【００３３】
以下の非制限的実施例は本発明をさらに説明するものである。
【００３４】
＜方法＞
細胞培養。成人ヒト骨髄を、インフォームドコンセントを得た上でＵｌｍ大学倫理委員会の規定に従って常套的手術手順から収集した（３試料、年齢１８〜３０歳）。先に述べられているように［Fiedler et al., 2002］ｈＭＳＣを単離し、培養した。細胞を週に1回継代した。ｈＭＳＣ表現型を、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６（陽性）並びにＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５（陰性）に関するＦＡＣＳ分析によって、及び骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞に分化する潜在能によって明らかにした。
【００３５】
２〜１０（約１０〜５０個体群倍加）継代後、ｈＭＳＣのニューロスフェアへの変化が開始させた。詳細には、細胞を０．０５％トリプシン／０．０４％ＥＤＴＡによって解離し、５％ＣＯ2、９２％Ｎ2及び３±２％Ｏ2で、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２（いずれもSigma,  St. Louis, MOより）２０ｎｇ  ｍｌ-1を添加したＰ４−８Ｆ培地（AthenaES, Baltimore, MD）中１．０〜２．０×１０5細胞  ｃｍ-2の濃度で組織培養低付着プラスチックフラスコにプレートした。１０〜２０日後、スフェア形成が認められた。これらのニューロスフェアをさらに２〜１０週間（２〜４継代；約５〜３０個体群倍加）増殖させた後、グリア又は神経分化を開始させた。培地を週に１回交換し、増殖因子を週に２回添加した。神経分化の誘導は、０．５μｍｏｌ  ｌ-lの全トランス型レチノイン酸（Sigma）、及び１％ＦＣＳ、５％ウシ血清、１％Ｎ2補足及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてGibcoより）、及び１０ｎｇ  ｍｌ-l  ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（グリア誘導；R＆D Systems, Minneapolis,  MN）又は１０ｎｇ  ｍｌ-l  ｒｈ−ＢＤＮＦ（神経誘導；Promega, Madison, WI）を添加したＮＢ培地（Gibco, Tulsa, OK）中１．５〜２．０×１０5細胞  ｃｍ-2の濃度でポリ−Ｌ−リシン被覆カバーガラスに細胞をプレートすることによって開始した。諸細胞を１０〜１４日間分化させた。
【００３６】
クローン分析のために、ｈＭＮＳＣを９８マルチウエルプレートのｈＭＮＳＣ増殖培地に連続希釈した。前記培地に、増殖因子を含むろ過したｈＭＮＳＣ順化培地を５０％まで添加することによって単一細胞だけを増殖させた。細胞を３〜６週間増殖させ、グリア誘導プロトコールを使用してｈＭＮＳＣに関して上述したようにさらに処理した。
【００３７】
フローサイトメトリー。ｈＭＳＣ及びｈＭＮＳＣをトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco）で処理し、ＰＢＳで洗った。死細胞を前方散乱光ゲーティングによって分析から除外した。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター及びＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエア（どちらもBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJより）を用いて分析した。各々の試料について最小限１２，０００事象を得た。
【００３８】
免疫細胞化学。細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに固定した。標準プロトコールを用いて免疫細胞化学を実施した。細胞核を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。抗体と希釈は以下の通りであった：ＴＨモノクローナル１：１０００、β−チューブリンＩＩＩモノクローナル１：１０００、フィブロネクチンモノクローナル１：４００（すべてSigmaより）、ＭＡＰ２ａｂモノクローナル１：３００及びＧＦＡＰモノクローナル１：１０００（どちらもPharmingen, San Diego, CA），ＧａｌＣモノクローナル１：７５０、ＧＦＡＰポリクローナル１：１０００、ネスチンポリクローナル１：５００（すべてChemicon International, Temecula, USA）、及び蛍光標識二次抗体（Jackson, West Grove, PA）。
【００３９】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。全細胞ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ  全ＲＮＡ精製キット及びそれに続くＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（Qiagen, Hilden, Germany）による処理を用いてｈＭＳＣ、ｈＭＮＳＣ及び分化ｈＭＮＳＣ（ニューロン誘導培地）から抽出した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Roche, Mannheim, Germany）を用いて定量的リアルタイム一段階ＲＴ−ＰＣＲを実施し、蛍光染料ＳＹＢＲグリーンＩの二本鎖ＤＮＡへの結合を測定することによって増幅を観測し、分析した。全ＲＮＡ１μｌを逆転写し、その後ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲグリーンＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Qiagen）及びセンス及びアンチセンスプライマー０．５μｍｏｌ  ｌ-lを用いて増幅した。全ＲＮＡの１０倍希釈を外部標準として使用した。標準と試料を同時に増幅した。増幅後、生成物の特異性を明らかにするためにＲＴ−ＰＣＲ産物の融解曲線を作成した（図４）。結果をハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢ（β−アクチン）又はＨＭＢＳ（ポルホビリノーゲンデアミナーゼ；ＰＢＧＤ）と比して表わしている。プライマー配列及び生成物の長さを表１に示す：
【表１】
2007502104.tif 000002
【００４０】
電気生理学。細胞を、ＥＰＣ−７増幅器（List electronics, Heidelberg, Germany）による標準ホールセルパッチクランプ手法及びｐＣｌａｍｐデータ取得（Axon Instruments）を用いて、分化後１０〜２０日の間に膜電流に関して検討した。より良好なシーリングのために、パッチクランプ実験の３〜５日前に１０％ＦＣＳを添加した。浴液（ｍＭ）：１００  ＮａＣｌ、５４  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ2、２  ＭｇＣｌ2、１０  ヘペス、１０  Ｄ−グルコース。ピペット溶液：１３０  ＫＣｌ、０．５  ＣａＣｌ2、２  ＭｇＣｌ2、５  ＥＧＴＡ、１０  ヘペス、３  Ｎａ−ＡＴＰ。ホウケイ酸ピペットは３〜４ＭΩの抵抗を有していた。ホールセルモードでのシール抵抗は０．１〜１ＧΩであった。ｐＣｌａｍｐ８．０、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ９７及びＯｒｉｇｉｎ  ５．０ソフトウエアを用いてデータを分析した。
【００４１】
電気化学的検出を伴う逆相ＨＰＬＣ。ドーパミン産生及び放出の特定のために、培地を採集する３日前にテトラヒドロビオプテリン１００μｍｏｌ  ｌ-l及びアスコルビン酸２００μｍｏｌ  ｌ-lを培地に添加した。培地及び先に報告されているように［Storch et al., 2001］ＥＧＴＡ／グルタチオン溶液で安定化した細胞外緩衝液においてドーパミンレベルを測定し、分析まで−８０℃で保存した。ドーパミンのアルミニウム吸収及びＨＰＬＣ分析は記述されている［Storch et al., 2001］。
【００４２】
細胞計数及び統計。所与の実験において所与のマーカーを生産する細胞のパーセンテージの定量のために、ウエル表面全体の陽性細胞数をＤＡＰＩ標識核の総数に比して測定した。典型的実験では、マーカー当り合計５００〜１，０００細胞を計数した。ダンネットのｔ検定によって統計比較を行った。データが正規分布でない場合は、結果の比較のためにノンパラメトリック検定（マン-ホイットニーＵ検定）を使用した。全てのデータを平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表わしている。
【００４３】
＜補足方法＞
細胞培養。ＭＳＣ及びｈＭＮＳＣを骨芽細胞に分化させるために、先に記述されている（Fiedler et al., 2002; Reyes et al., 2001）標準プロトコールを使用した。簡単に述べると、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（全てBiochrom Seromed, Berlin, Germanyより）を含むＤＭＥＭ培地において２×１０4細胞  ｃｍ-2で細胞をプレートすることによって分化を誘導した。６〜１０継代からの両方の細胞型を使用した。骨原性分化のために、培地にデキサメタゾン０．１μｍｏｌ  ｌ-l、アスコルビン酸５０ｍｇ  ｍｌ-l及びβ−グリセロリン酸２．１６ｍｇ  ｍｌ-l（全てSigma, St. Louis, MOより）を添加した。細胞を１０日間培養し、培地を週に２回交換した。
【００４４】
免疫細胞化学。骨芽細胞を視覚化するために、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色キット（Sigma）を使用して、標準プロトコールに従ったアルカリホスファターゼ活性に関する酵素試験によって培養物を分析した（Fiedler et al., 2002）。ＡＰを生産する細胞のパーセンテージの定量のため、位相差顕微鏡下でウエル表面全体の陽性細胞数を総細胞数に比して測定した。典型的実験では、マーカー当り合計５００〜１，０００細胞を計数した。ダンネットのｔ検定によって統計比較を行った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表わした。
【００４５】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ分析。ｈＭＳＣ及びｈＭＮＳＣの分化状態を、以下の骨原性マーカー：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｒｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）及び転写因子ＳＯＸ９及びｃ−Ｆｏｓ、の発現に関してＲＴ−ＰＣＲによって検討した。ＰＣＲ結果を確認するためにグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として使用した。ＲＮＡｅａｓｙ  全ＲＮＡ精製キットを用いて全細胞ＲＮＡを作製し、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキットで逆転写を実施した（全てQIAGEN, Hilden, Germanyより）。ＰＣＲ反応は、基本的に先に述べられているように実施した（Fiedler et al., 2002）。
【００４６】
プライマー配列（正、逆）及び増幅産物の長さは以下の通りであった：
【表２】
2007502104.tif 000003
【００４７】
＜結果及び考察＞
成人ｈＭＳＣを、ＮＳＣの特徴を有する細胞に転換するために、２〜１０継代（約１０〜５０個体群倍加）後にｈＭＳＣを分離し、非被覆フラスコにおいて上皮増殖因子（ＥＧＦ）及び線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）を添加した無血清Ｐ４−８Ｆ培地中で培養した。細胞は組織培養フラスコの表面に付着しなかった。ｈＭＳＣの３分の１（３７±１７％、ｎ＝５）が３日後に死亡したが、１０〜１４日後、残りの細胞は浮遊細胞の小さなスフェアを形成した（図１ａ、ｂ）。これらのｈＭＮＳＣの表現型は、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３及びＣＤ１６６陰性であった；ｈＭＮＳＣは、低レベルのＣＤ９及びフィブロネクチン、及びより高レベルのＣＤ９０及び、ＣＮＳ幹細胞中に存在する中間径フィラメントタンパク質、ネスチンを発現した（図１ａ、ｃ）［Cattaneo & McKay, 1990; Reynolds & Weiss, 1992; Vogel et al., 2003]。ｈＭＮＳＣは、形態及び表現型を変えることなくインビトロで２〜１０週間増殖した（約５〜３０個体群倍加；図１ｂ）。ｈＭＮＳＣ表現型は、胎児前脳由来のヒト神経前駆細胞に類似していた［Vogel et al., 2003; Uchida et al., 2000]が、ｈＭＳＣとは異なっていた（ＣＤ９+、ＣＤ１５-、ＣＤ３４-、ＣＤ４５-、ＣＤ９０low/+、ＣＤ１６６+、ＣＤ１３３-、フィブロネクチン+及びネスチン９０-/low（図１ａ、ｃ）［Fiedler et al., 2002; Vogel et al., 2003］。特に、ＣＤ１３３発現は、神経前駆細胞に関する以前の報告［Vogel et al., 2003; Uchida et al., 2000］と一致して、小さなｈＭＮＳＣサブセットでのみ検出された（＜１％）。さらに、ｈＭＳＣ、ｈＭＮＳＣ及び神経分化ｈＭＮＳＣにおけるいくつかの間葉及び神経遺伝子の発現パターンを検討するために定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した（図２、図４も参照のこと）。そのようにして、フィブロネクチンをコードするＦＮ１遺伝子のｈＭＳＣにおける高レベル発現が、グリア及びニューロンへのインビトロ分化後のｈＭＮＳＣでは実質的に失われることを明らかにした（図２）。さらに、ＮＥＳ（ネスチンをコードする）の定量的分析は、ｈＭＳＣがＮＥＳをほとんど有していないのに対し、ｈＭＮＳＣはＮＥＳ  ｍＲＮＡの劇的上昇を示すことを明らかにした（図２）。
【００４８】
細胞をポリ−Ｌ−リシンにプレートし、サイトカイン及びＮＳＣの成熟グリア又は神経細胞への分化を誘導することが知られている増殖因子を添加することにより、それぞれグリア及び神経誘導プロトコールを用いてインビトロでｈＭＮＳＣを分化させた（図３ａ、ｂ）。アストログリア及びオリゴデンドログリア細胞への分化は、ＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含まないが、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）及びレチノイン酸（グリア誘導培地）を含む培地にｈＭＮＳＣをプレートすることを必要とした。１０〜１４日後、ｈＭＮＳＣの４５±４％（ｎ＝３）が星状細胞の形態及び表現型特徴（グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）+）を獲得し、２７±５％が希突起神経膠細胞の形態及び表現型特徴（ガラクトセレブロシダーゼ（ＧａｌＣ）+）を獲得したが、少数の細胞だけが初期神経マーカー、クラスＩＩＩ  β−チューブリンを示した（図３ｂ）。成熟ＭＡＢ２ａｂ+ニューロンは検出できなかった。グリア誘導プロトコールを用いて分化させたｈＭＮＳＣの電気生理学的分析は、細胞の４０％（４７個の記録細胞のうち１９個）が数百ｐＡから６ｎＡまでの持続的外向き電流を示すことを明らかにした。これらの電流は、電位依存性活性化及び遅延整流性Ｋ+チャネルに特徴的な動態を有していた（図３ｄ）。少数の細胞では、電位依存性及び電位活性化Ｎａ+チャネルに典型的な動態を有する小さな内向き電流を特定することができた（図３ｅ）。そのような電流は、発育中及び成体グリア細胞において記述されている［Kressin et al., 1995］。
【００４９】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びレチノイン酸を含む神経誘導培地を使用して、初期神経特徴（クラスＩＩＩ  β−チューブリン発現）を有する４２±６％のｈＭＮＳＣ及び成熟ニューロンについてのマーカー分子、ＭＡＰ２ａｂを発現する６±２％のｈＭＮＳＣを得たが、細胞の１３±４％だけがＧＦＡＰ発現及びアストログリア形態を有していた（図３ａ、ｂ）。これらの免疫細胞化学結果と一致して、ｈＭＮＳＣの神経分化の間にグリア遺伝子ＧＦＡＰ並びに神経遺伝子ＴＵＢＢ４／ＩＩＩ（β−チューブリンＩＩＩをコードする）及びＳＮＣＡ（α−シヌクレイン）の発現が有意に上方調節された（図２）。ＭＡＰ２ａｂ及びＧＦＡＰは、同じ細胞内に全く認められなかった。興味深いことに、これらの培養物において、細胞の１１±７％が、ドーパミン合成の律速酵素である、カテコールアミン作動性マーカー、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ｎ＝３）を発現した。それと一致して、本発明者らは、分化ｈＭＮＳＣの培養物におけるＴＨ遺伝子発現（図２）並びにドーパミン産生及びカリウム依存性放出の上方調節を示すことができた（図３ｆ）。残念ながら、これらの細胞における神経特徴を明らかにするためのパッチクランプ実験は、十分に高いシール抵抗を得るためには１０％ＦＣＳの添加が必要であったが、これはグリア細胞の広汎な過剰増殖を導いたため、成功しなかった。しかし、ｈＭＮＳＣの分化能力は、様々な種の胎児及び成体脳由来のＮＳＣと同様であった［Cattaneo & McKay, 1990; Song et al., 2002; Carvey et al., 2001;Kilpatrick & Bartlett, 1993; Uchida et al., 2000; Reynold & Weiss, 1992］。これに対し、神経誘導プロトコールを用いたｈＭＳＣの分化は、成熟ＭＡＰ２ａｂ+ニューロン又はＴＨ+／ドーパミン産生細胞（ｎ＝５）を生産せず、ＴＵＢＢ４／ＩＩＩ又はＧＦＡＰ遺伝子発現の上方調節を導かなかった（データは示していない）。
【００５０】
個々のｈＭＮＳＣがニューロン及びグリアの両方を生成することができるかどうかを判定するため、幼若スフェア又はＭＳＣを解離し、超低付着マルチウエルプレートへの限界希釈によって個々の細胞を単離した；単細胞を３〜６週間培養した。単細胞の１１％が増殖してニューロスフェアを生じた（図３ｃ）。その後クローン細胞を１０日間分化させた。二重免疫染色法は、これらのクローン中の個々の細胞が星状細胞（ＧＦＡＰ+）及びニューロン（β−チューブリンＩＩＩ+）の形態及び表現型特徴を獲得したことを明らかにした（図３ｃ）。
【００５１】
本発明者らは次に、ｈＭＮＳＣがまだインビトロで間葉細胞型に分化できるかどうかを試験した。それ故、標準プロトコール及び高密度培養を使用してｈＭＳＣ及びｈＭＮＳＣが骨芽細胞に分化する能力を比較した（方法については、「補足方法」参照）［Fiedler et al., 2002; Reyes et al., 2001]。１４日後、ｈＭＳＣの６０±３％、一方ｈＭＮＳＣの１７±５％だけが、骨芽細胞の形態及び表現型特徴を獲得した（アルカリホスファターゼ（ＡＰ）+；ｎ＝３；Ｐ＜０．０１、ｔ検定）。これと一致して、骨芽細胞マーカー遺伝子の発現レベルは、分化ｈＭＮＳＣにおいて非常に低いか又は存在しなかった（詳細については、図５参照）。
【００５２】
本発明の中心的知見は、ＮＳＣの重要な特徴を有する細胞が、胚幹細胞からのＮＳＣの生産と同様に、ｈＭＳＣ、例えば成体ｈＭＳＣから高い効率で生成できるということである［Bain et al., 1995; Lee et al., 2000］。提示するヒト中胚葉由来ＮＳＣは、間葉分化潜在能が著しく低下していながら、成熟機能性脳特異的細胞型へと分化する能力を保持しており、それ故ＮＳＣの主要判定基準全てを満たす、クローン原性自己更新細胞である。そこで本発明者らは、ヒトＭＳＣのＮＳＣへの変化の証拠を提供する。しかし、拘束間葉系幹細胞のリプログラミング（分化形質転換）又は既にｈＭＳＣ懸濁液中に内包されているより多分化能の幹細胞の増殖及び分化が、本発明者らの系における細胞型転換の責任を担うかどうかを判定するために、今後の実験が必要であると考えられる［Sanchez-Ramos, 2002; Jiang et al., 2002］。典型的な実験では、各々１×１０6のｈＭＳＣごとに、常套的に１．６×１０8の中胚葉由来ＮＳＣ、０．１×１０8のニューロン、０．７×１０8のアストログリア及び０．４×１０8のオリゴデンドログリア細胞を得た。数字上では、それぞれ少なくとも７×１０7のｈＭＮＳＣ又は０．５×１０7のニューロン、３×１０7のアストログリア及び２×１０7のオリゴデンドログリア細胞を、骨髄試料から採集された１個のｈＭＳＣから生産することができた。これは、多数の転換及び分化段階全体を通じての増殖、細胞死及び選択的分化の全てのパラメータの総計を表わす。これらの細胞量は、大部分の移植プロトコールのため並びに分子生物学又はタンパク質生化学方法、例えば遺伝子アレイ分析又はプロテオミクスによる成体ＮＳＣの広汎な特性決定のために十分である。例えば、ｈＭＮＳＣは成人ヒトＮＳＣにおける神経分化の分子機構の理解を容易にし得る。ＭＳＣの神経細胞への転換に関するこれまでのプロトコール［Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000］と比較してもう１つの利点は、未分化ＮＳＣ又は未熟神経細胞を生成することの可能性である。分化神経細胞は分離及びその後の移植手順を生き延びることが困難であることが周知であるので、これらの細胞型は、完全に分化した神経細胞に比べて一般的に使用され、神経移植戦略のためにより適している［Kim et al., 2002;Pluchino et al., 2003; Carvey et al., 2001;Bjoerklund & Lindvall, 2000］。ここで提示するデータは、ｈＭＮＳＣが、機能的特性、例えばグリア細胞における外向き整流性カリウムチャネル及びナトリウムチャネルの発現並びにドーパミンの産生及びカリウム依存性放出、を示す成熟神経細胞へと分化することを明らかにしている。実際に、本発明の方法は、初めて、成人ヒトＮＳＣを用いた神経移植における自家アプローチを広汎に検討する可能性を提供するものである。
【００５３】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、増殖の間の成人ｈＭＳＣ及びヒト中胚葉由来神経幹細胞（ｈＭＮＳＣ）の特徴を示す。  ａ．形態、ｈＭＳＣ（左パネル）及びｈＭＮＳＣ（右パネル）のフィブロネクチン及びネスチン発現。全てのｈＭＳＣが高レベルのフィブロネクチンを発現するが、約５％の細胞だけが非常に低いレベルのＮＳＣマーカーネスチンを発現し、一方、一部のｈＭＮＳＣが低レベルのフィブロネクチンを発現するが、全ての細胞が高レベルのネスチンを発現する。核をＤＡＰＩで対比染色している（青色）。スケールバーは１００μｍである。  ｂ、ｈＭＳＣからの転換の１、５、１２及び２１日後のｈＭＮＳＣの代表的な位相差顕微鏡写真のシリーズ。血球計の下で各々の時点で細胞を計数することによって明らかにしたｈＭＮＳＣの増殖曲線（ｎ＝５；算定倍加時間＝２．６日）。スケールバーは５０μｍである。  ｃ、それぞれ１０〜５０及び５〜３０個体群倍加のために培養したｈＭＳＣ（左パネル）及びｈＭＮＳＣ（右パネル）を、ＣＤ９、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６に対するＦＩＴＣ結合抗体又は免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体で標識した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて細胞を分析した。黒色の線は対照免疫グロブリン、赤色の線は特異抗体である。
【図２】図２は、１４日間の神経誘導プロトコールを用いた、ｈＭＳＣ、ｈＭＮＳＣ及びグリア及び神経細胞型への分化ｈＭＮＳＣの遺伝子発現プロフィールを示す。ＦＮ１（フィブロネクチンをコードする）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＧＦＡＰ（ＧＦＡＰ）、ＴＵＢＢ４／ＩＩＩ（β−チューブリンＩＩＩ）、ＳＮＣＡ（α−シヌクレイン）及びＴＨ（ＴＨ）に関する定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）を用いて実施し、発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢ（β−アクチン）又はＨＭＢＳ（ポルホビリノーゲンデアミナーゼ）と比較して表わしている。プライマーについては表１参照、増幅したＰＣＲ産物の特異性を明らかにする代表的標準曲線及び融解曲線分析については図４参照。＃は、ｈＭＳＣと比較したときＰ＜０．０５、＃＃はＰ＜０．０１を示す；＋は、ｈＭＮＳＣと比較したときＰ＜０．０５を示す。
【図３】図３は、ｈＭＳＣ由来ニューロスフェアのアストログリア、オリゴデンドログリア及び神経細胞型へのインビトロでの分化を示す。ｈＭＮＳＣを、１４日間のポリ−Ｌ−リシンに関するグリア誘導又は神経誘導プロトコールを用いて５〜３０個体群倍加後に分化させた。  ａ、分化したｈＭＮＳＣを、それぞれ星状細胞（ＧＦＡＰ）、希突起神経膠細胞（ＧａｌＣ）、ニューロン（β−チューブリンＩＩＩ、ＭＡＰ２ａｂ）、又はカテコールアミン作動性細胞（ＴＨ）のマーカーに関して染色した。核をＤＡＰＩで対比染色している（青色）。スケールバーは１００μｍである。  ｂ、それぞれグリア及び神経誘導プロトコールで分化させたｈＭＮＳＣの１４日間培養の定量。示されているデータは、少なくとも３つの独立したｈＭＳＣ製剤からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。グリア誘導プロトコールからの有意差を、１個（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）又は２個（Ｐ＜０．０１、ｔ検定）の星印で示している。  ｃ、ｈＭＮＳＣのクローン分析。プレーティングから１、４、９、１９、３０及び３９日後のｈＭＮＳＣクローンの連続的な位相差顕微鏡写真（上のパネル）。単細胞由来のニューロスフェアの子孫は、ニューロン（β−チューブリンＩＩＩ+、緑色）及び星状細胞（ＧＦＡＰ+、赤色）に分化することができる。核をＤＡＰＩで対比染色している（青色）。スケールバーは１００μｍである。  ｄ、電気生理学的記録。電位固定測定のために、細胞を−８０ｍＶに保持し、−１６０から＋７０ｍＶの間を１０ｍＶ段階で過分極又は脱分極した。−Ｐ／４プロトコールを用いた、漏洩減算なしで及び漏洩減算して（挿入図）示した持続的外向き電流の例。漏洩減算して記録した規格化外向き電流の電流−電位関係（ｎ＝７）。  ｅ、漏洩減算なしで及び漏洩減算した（挿入図：−４０、−２０、０、２０及び６０ｍＶへの脱分極段階についての電流だけを示している）内向き電流の例。漏洩減算した、同じ細胞についての電流−電位関係。線は、以下の等式：Ｉ（Ｖ）／Ｉmax＝ｇ×（Ｖ−Ｖrev）／（１＋ｅｘｐ（（Ｖ−Ｖ0.5）／ｋv）への適合性を示し、Ｉ（Ｉmax）は（最大）膜電流であり、ｇは最大コンダクタンス、Ｖは適用電圧、ＶrevはＮａ+についての逆転電位、Ｖ0.5は半最大活性化の電位及びｋvはスロープ係数である。  ｆ、ドーパミン産生と放出を、神経誘導プロトコールを用いて分化させたｈＭＮＳＣにおいて測定した。３日間順化した培地（左）、４５分間順化した細胞外緩衝液（中央）及び４５分間順化した細胞外緩衝液＋５６ｍＭ  ＫＣｌ（右）における、ドーパミン濃度のＨＰＬＣ−ＥＣＤ測定を示す。＃は、細胞外緩衝液と比較したときＰ＜０．０５を示す（対応のあるｔ検定）。
【図４】図４は、ｍＲＮＡレベルでの間葉及び神経遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。  ａ、フィブロネクチンをコードするＦＮ１  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析。上のグラフ：連続希釈ＦＮ１  ｍＲＮＡのＳＹＢＲグリーン検出から得た蛍光対サイクル数のプロット。交差する線は閾値の位置を表わす。下のグラフは、交差点のサイクル数対希釈係数をプロットすることによって得た標準曲線（左）並びに融解曲線分析（右）を示す。  ｂ、ＳＹＢＲグリーン染料が、単一ピークを生じる特異的ＰＣＲ産物だけを検出したかどうかを確認するために、本試験において使用した他の全てのリアルタイムＰＣＲ反応の融解曲線分析を実施する。ＡＣＴＢ  ｍＲＮＡ分析（左上のグラフ）では、水（青色の線）及びＲＴマイナス試料（緑色の線）の両方の融点曲線分析も含めている。
【図５】図５は、ｈＭＳＣ及びｈＭＮＳＣの両方の骨原性分化能力の分析を示す。両方の細胞型が、１０日間の骨芽細胞分化プロトコールを用いて６〜１０継代後に分化した（詳細については、「補足実験プロトコール」参照）。  ａ、分化したｈＭＳＣ（上のパネル）及びｈＭＮＳＣ（下のパネル）を骨原性マーカー、アルカリホスファターゼ（ＡＰ+）に関して染色した。スケールバーは５０μｍである。  ｂ、それぞれ、骨芽細胞培養のために常套的に使用される通常大気酸素レベル（２１％）及び我々の神経系において使用した低大気酸素レベル（３％）の下で骨芽細胞に分化した、ｈＭＳＣ及びｈＭＮＳＣの１０日間培養の定量。示されているデータは、少なくとも３つの独立した細胞試料からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｈＭＳＣからの有意差を、１個（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）又は２個（Ｐ＜０．０１、ｔ検定）の星印で示している。  ｃ、通常及び低大気酸素レベル（それぞれ２１％及び３％）の下での骨原性分化後のｈＭＳＣ及びｈＭＮＳＣにおける骨原性マーカー遺伝子の発現。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｒｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）及び転写因子Ｓｏｘ９及びｃ−ｆｏｓ、並びにＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１、ｈＭＮＳＣ（２１％Ｏ2）；レーン２、ｈＭＮＳＣ（３％Ｏ2）；レーン３、ｈＭＳＣ（３％Ｏ2）；レーン４、ｈＭＳＣ（２１％Ｏ2）。
【図１】
2007502104.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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