(57)【要約】  アッセイされるべき試料をヘパリナーゼの作用により脱重合化した後、必要な場合、得られた前記脱重合化物を還元した後、分析を高速液体クロマトグラフィーにより実施することを特徴とする、ヘパリン又は低分子量ヘパリンを分析するための方法。
2007530932.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）分画されていないヘパリン及び分画されたヘパリンから選択される材料の試料を酵素的方法によって脱重合化すること、および
（ｂ）段階（ａ）の前記脱重合化された試料における構成成分の量を高速液体クロマトグラフィーにより検出すること
を含む、前記試料における構成成分の量を定量するための方法。
【請求項２】
前記酵素的方法が少なくとも1つのヘパリナーゼを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素的方法がヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）の混合物を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分画されたヘパリンがエノキサパリンナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）で使
用される前記高速液体クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｂ）で使用される前記高速液体クロマトグラフィーが強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記強陰イオン交換クロマトグラフィーがＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ（Ｒ）ＳＡＸカラムを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記高速液体クロマトグラフィーが、約２００ｎｍないし約４００ｎｍの波長を有する紫外線光に対して透過性である移動相において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記高速液体クロマトグラフィーが、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホン酸塩及びリン酸塩から選択される少なくとも１つの塩を含む移動相において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記高速液体クロマトグラフィーが、過塩素酸ナトリウム塩を含む移動相において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記強陰イオン交換クロマトグラフィーが約２．０ないし約６．５のｐＨで実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記強陰イオン交換クロマトグラフィーが約３のｐＨで実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記移動相が、ｐＨ約３．０に維持されている過塩素酸ナトリウム溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記脱重合化された試料が次式
【化１】
2007530932.tif 000014
2007530932.tif 000015
2007530932.tif 000016
のいずれか１つから選択される少なくとも１つのオリゴ糖鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記脱重合化試料が、その末端が１，６−無水結合で修飾されている少なくとも１つのオリゴ糖鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのオリゴ糖鎖が次式
【化２】
2007530932.tif 000017
のいずれかから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脱重合化された試料が次式
【化３】
2007530932.tif 000018
のいずれかから選択される少なくとも１つの１，６−無水物残基を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの１，６−無水物残基が前記試料の重量平均分子量の１５％ないし２５％の範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ｂ）の前記脱重合化された試料において検出される構成成分が、アセチル化された糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
アセチル化されている糖は吸収するがアセチル化されていない糖は吸収しない波長において測定される吸光度から、アセチル化されている糖及びアセチル化されていない糖の両者が吸収する波長において測定される吸光度を差し引くことによって、前記アセチル化された糖が選択的に検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出されたアセチル化されている糖が、アセチル化されているオリゴ糖であるΔＩＶａ、ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ、ΔＩａ、ΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）の混合物を使用してエノキサパリンナトリウムの試料を脱重合化すること、および
（ｂ）高速液体クロマトグラフィーによって段階（ａ）の前記脱重合化された試料において１，６−無水物残基の量を検出すること
を含む、前記試料において前記１，６−無水物残基の量を定量する方法。
【請求項２３】
前記１，６−無水物残基の量が前記試料のオリゴ糖平均分子量の１５％ないし２５％の範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）酵素的方法によって試料を脱重合化すること、
（ｂ）段階（ａ）の前記脱重合化された試料を還元すること、および
（ｃ）（ｂ）の前記還元された試料における構成成分の量を高速液体クロマトグラフィーにより検出すること
を含む、分画されていないヘパリン及び分画されたヘパリンから選択される材料の試料における構成成分の量を定量する方法。
【請求項２５】
前記酵素的方法が少なくとも１つのヘパリナーゼを使用して実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
酵素的方法がヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）の混合物を使用して実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
段階（ａ）の前記脱重合化された試料を還元することが、還元剤への曝露によって実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記還元剤がＮａＢＨ４又は水素化ホウ素陰イオンのアルカリ金属塩である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記分画されたヘパリンがエノキサパリンナトリウムである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記還元することが、１，６−無水物形態ではないエノキサパリンナトリウムの前記還元末端を還元する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
段階（ｃ）で使用される前記高速液体クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｃ）で使用される前記高速液体クロマトグラフィーが強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記強陰イオン交換クロマトグラフィーがＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ（Ｒ）ＳＡＸカラムを使用して実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記高速液体クロマトグラフィーが、約２００ｎｍないし約４００ｎｍの波長を有する紫外線光に対して透過性である移動相において実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記高速液体クロマトグラフィーが、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホン酸塩及びリン酸塩から選択される少なくとも１つの塩を含む移動相において実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記高速液体クロマトグラフィーが、過塩素酸ナトリウム塩を含む移動相において実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記強陰イオン交換クロマトグラフィーが約２．０ないし約６．５のｐＨで実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記強陰イオン交換クロマトグラフィーが約３のｐＨで実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記高速液体クロマトグラフィーが、約３．０に維持されている過塩素酸ナトリウム溶液を含む移動相を利用する、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記脱重合化された試料が次式
【化４】
2007530932.tif 000019
2007530932.tif 000020
2007530932.tif 000021
（式中、前記オリゴ糖鎖はその還元形態にある。）のいずれかから選択される少なくとも１つのオリゴ糖鎖を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記脱重合化された試料が、１，６−無水結合によりその末端が修飾された少なくとも１つのオリゴ糖鎖を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのオリゴ糖鎖が次式
【化５】
2007530932.tif 000022
のいずれかから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記脱重合化された試料が次式
【化６】
2007530932.tif 000023
を含む１，６−無水物残基の混合物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
１，６−無水物残基の前記混合物が前記試料の重量平均分子量の１５％ないし２５％の範囲である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
段階（ｂ）の脱重合化された試料において検出される構成成分が、アセチル化されている糖である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４６】
前記糖が、アセチル化されている糖は吸収するがアセチル化されていない糖は吸収しない波長において測定される吸光度から、アセチル化されている糖及びアセチル化されていない糖の両者が吸収する波長において測定される吸光度を差し引くことによって選択的に検出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出されたアセチル化されている糖が、アセチル化されているオリゴ糖であるΔＩＶａ、ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ、ΔＩａ、ΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）ヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）の混合物を使用してエノキサパリンナトリウムの試料を脱重合化すること、
（ｂ）段階（ａ）の前記脱重合化された試料を還元すること、および
（ｃ）段階（ｂ）の前記還元された試料において前記１，６−無水物残基の量を、高速液体クロマトグラフィーにより検出すること
を含む、前記エノキサパリンナトリウムの試料において１，６−無水物残基の量を定量する方法。
【請求項４９】
前記１，６−無水物残基の量が前記試料の重量平均分子量の１５％ないし２５％の範囲である、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施態様は、分画されたヘパリン又は分画されていないヘパリンの試料中において、１，６−無水物構造又はアセチル化されている糖を有する構成成分の量を検出又は定量する方法である。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、天然資源から抽出されるグリコサミノグリカンファミリーの生物的に活性のある因子であり、価値のある抗凝血性特性及び抗血栓性特性を有する。特に、ヘパリンは手術後の静脈性血栓症の治療に有用である。
【０００３】
元のヘパリンから低分子量ヘパリン(ＬＭＷＨ)を作製するため、前記長めのヘパリン性多糖鎖を、より低分子量の短めの鎖へと分解しなければならない。このことは、化学的脱重合化又は酵素的脱重合化のいずれかによってなされうる。前記結果は、約５，０００ＤａのＬＭＷＨ多糖鎖についての平均分子量でありうる。分画されていないヘパリンと同様、ＬＭＷＨは、前記多糖鎖のあるものに沿って分配されている特定の五糖類配列においてＡＴＩＩＩへ結合することによって凝固を阻害する。
【０００４】
認可された製剤の各ＬＭＷＨ製造者は、異別の脱重合化プロセスを利用している。２箇所の製造者が同一のプロセスを使用するにもかかわらず、プロセスの差異が異別の化学構造を有するＬＭＷＨを生じ、それゆえ、臨床使用のための異別の薬理活性及び異別の認可された効能に至る。結果として生じるＬＭＷＨは、それらの製造に使用される脱重合化プロセスによって構造的に分離される（Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔほか、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ  １９９９；  ２５（３補）：５−１６）。結果として、ＬＭＷＨはヘパリンよりも異なった部分からなる。各異別のプロセスによって、多糖鎖に対する独特で高度に複雑な構造上の修飾が生じる。これらの修飾には、鎖の長さ及び鎖の配列における差異、並びに構造上のフィンガープリントにおける差異が含まれる。結果として、異別のＬＭＷＨは異別の薬理学的特性及び異別の認可された臨床効能を有しうる。
【０００５】
エノキサパリンナトリウムはＡｖｅｎｔｉｓ社から入手可能であり、Ｌｏｖｅｎｏｘ（Ｒ）（他のある国ではＣｌｅｘａｎｅ（Ｒ））という登録商標のもとで、エノキサパリンナトリウム注入液の形態で米国において販売されている。一般に、エノキサパリンナトリウムはブタ腸管粘膜由来のヘパリンベンジルエステルのアルカリ分解によって得られる。その構造は、例えば鎖の非還元末端にある２−Ｏ−スルホ−４−エンピラノスロン酸基、及び鎖の還元末端にある２−Ｎ，６−Ｏ−ジスルホ−Ｄ−グルコサミンを特徴とする。平均分子量は約４５００ダルトンである。前記分子量の分配は、
２０００ダルトン未満            ２０％以下
２０００ないし８０００ダルトン  ６８％以上
８０００ダルトン超              １８％以下
である。エノキサパリンナトリウムの製造において、以下に示される「１，６無水物」と呼ばれる誘導体の形成に至る、グルコサミンの６-Ｏ-脱硫化（ｄｅｓｕｌｆａｔｉｏｎ）がある（国際特許出願第ＷＯ０１／２９０５５号）。
【０００６】
【化７】
2007530932.tif 000003
【０００７】
誘導体のこのタイプは、末端グルコサミンが６-Ｏ-脱硫化されているオリゴ糖鎖についてのみ得られる。
【０００８】
末端が１，６−無水結合で修飾されているオリゴ糖鎖の割合は、エノキサパリンナトリウムのオリゴ糖混合物の構造的特徴であり、それを測定することが可能であるべきである。現在の知識に基づいて、エノキサパリンナトリウムの構成成分の１５％ないし２５％はそれらの鎖の還元末端に１，６−無水物構造を有する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の実施態様はそれゆえ、分画されていないヘパリン及び分画されたヘパリンを分析するための方法を提供する。本明細書で使用される「分画されたヘパリン」は、脱重合化を経ているいずれかのヘパリン、例えばエノキサパリンナトリウムを含む低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、及び目録記載薬物としてＬｏｖｅｎｏｘ（Ｒ）／Ｃｌｅｘａｎｅ（Ｒ）（エノキサパリンナトリウム注入液）としての引用を求める申請に従った、行政当局による承認を求めるいずれかのＬＭＷＨを指す。
【００１０】
ある実施態様において、本発明に記載の分析方法は以下のとおりである。
【００１１】
アッセイされるべき試料をヘパリナーゼの作用により脱重合化した後、必要に応じて、得られた脱重合化物を還元した後、分析を高速液体クロマトグラフィーにより実施する。
【００１２】
前述の方法はそれゆえ、末端が１，６−無水結合（「１，６−無水物基」）で修飾されているオリゴ糖鎖の存在を検出するために前記脱重合化物を分析することを特徴とする。
【００１３】
関連した実施態様において、アッセイされるべき試料をまずヘパリナーゼ、例えばヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）の混合物により徹底的に脱重合する。このとき、例えば各ヘパリナーゼは０．５単位／ｍｌとして存在する（これらの酵素はＧｒａｍｐｉａｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓグループによって市販されている。）。
【００１４】
本発明の対象はそれゆえ、分画されていないヘパリン又は分画されたヘパリンを分析するための方法であり、以下の段階を含む。すなわち、
（ａ）ヘパリナーゼの作用による前記試料の脱重合化
（ｂ）必要な場合、前記脱重合化物の還元
（ｃ）高速液体クロマトグラフィーによる段階（ａ）又は（ｂ）の前記試料の分析
である。
【００１５】
ある実施態様において、本発明の対象は、前記ヘパリナーゼが、ヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）の混合物の形態にある前述に定義される方法である。従って、１，６−無水物形態にはない前記還元末端を還元するために、調製した前記脱重合化物を処理できる（特許出願第ＷＯ０１／７２７６２号において記載される製剤）。ある実施態様において、前記１，６−無水物形態にはない前記還元末端を還元するために、前記脱重合化物を酢酸ナトリウム中でＮａＢＨ４溶液により処理できる。最後に、後述の二糖類１及び２を定量化することができるよう、ヘパリナーゼにより脱重合化した低分子量ヘパリンの前記試料を、ＮａＢＨ４などの還元剤の作用により還元できる。
【００１６】
本発明の対象はそれゆえ、前記脱重合化したヘパリンがその後還元される、前述に定義される方法である。
【００１７】
本発明の対象はさらに、前記還元剤がＮａＢＨ４である、前述に定義される方法である。リチウム又はカリウムなどの水素化ホウ素の他のアルカリ金属塩も使用できる。
【００１８】
本発明に記載のアッセイの方法によって、１，６−無水物誘導体を含有しない他の低分子量ヘパリンからエノキサパリンナトリウムを明確に分離できる。反対に、本発明の方法によって、低分子量ヘパリンがエノキサパリンナトリウムの物理化学的特性を有さず、それゆえ事実上異別であることを確定できる。
【００１９】
本発明に記載の方法は、例えば、エノキサパリンナトリウムを製造するためのプロセスの標準化を提供するため、及び均一なバッチを得るため、試料のプロセス内調節の間、産業プロセスへ提供できる。
【００２０】
酵素的脱重合化及び前記還元末端の必要により行なわれる還元の後、エノキサパリンナトリウムの１，６−無水物誘導体は４個の基本的形態において存在する。すなわち、二糖類１、二糖類２、二糖類３、及び四糖類１である。本発明の対象はそれゆえ、次式
【００２１】
【化８】
2007530932.tif 000004
を含む脱重合化反応の間に前記１，６−無水物残基が得られる前述の方法でもある。末端二糖類単位に前記１，６-無水物端を含有し、該末端二糖類のウロン酸上に２-Ｏ-硫酸塩を含有しないオリゴ糖類又は多糖類はすべて、ヘパリナーゼによって完全に脱重合され、二糖類１及び２の形態にある。一方、前記末端糖類がウロン酸上に２−Ｏ−硫酸塩を含有し、及びそれがマンノサミン形態にあるとき、前記１，６−無水物誘導体は四糖類１の形態（ヘパリナーゼに対して抵抗性のある形態）にある。
【００２２】
三糖類１（後述参照）も混合物中に存在しうる。三糖類１は、次式
【００２３】
【化９】
2007530932.tif 000005
の構造に至る別の分解プロセスから派生される（エノキサパリンナトリウムの化学的脱重合化の間に観察されるピーリング現象）。
【００２４】
前記混合物の他の構成成分は、エノキサパリンナトリウムの単なる特徴ではない。もちろん、前記ヘパリン鎖には８個の要素の二糖類がある。これら８個の要素の二糖類は、とりわけ、Ｓｉｇｍａ社によって市販されている。
【００２５】
他の二糖類を本発明に記載の方法によって前記混合物中において同定した。すなわち、２ガラクツロン酸の形成に至る、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）−及びＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ−のアルカリ２−Ｏ−脱硫化物を元として有する二糖類ΔＩＩＳｇａｌ及びΔＩＶＳｇａｌである。これらは通常、ヘパリンの元の構造には存在しない（Ｕ．Ｍ．Ｄｅｓａｉほか、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ３０６（２）４６１−４６８（１９９３））。
【００２６】
【化１０】
2007530932.tif 000006
【００２７】
３-Ｏ-硫酸化グルコサミンを含有するオリゴ糖は、ヘパリナーゼによる開裂に抵抗し、四糖類の形態のままである。
【００２８】
ほとんどの低分子量ヘパリンの場合、これらヘパリンはブタ粘膜から抽出され、これらの主要な四糖類は後述に表される。これらの四糖類は酵素的脱重合化に抵抗し、抗トロンビンＩＩＩに対する親和性を有する配列を反映する。これらの四糖類は以下のように記号で表される。すなわち、ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕである（Ｓ．Ｙａｍａｄａ，  Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｍ．Ｓｕｇｉｕｒａ，  Ｋ−Ｈ  Ｋｈｏｏ，  Ｈ．Ｒ．Ｍｏｒｒｉｓ，  Ａ．  Ｄｅｌｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２７０（７），  ４７８０−４７８７  （１９８３））。
【００２９】
【化１１】
2007530932.tif 000007
【００３０】
ヘパリナーゼで開裂した前記混合物の最終構成成分は、グリコセリン末端のΔＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒである（Ｋ．Ｓｕｇａｈａｒａほか、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２７０（３９），  ２２９１４−２２９２３  （１９９５）、Ｋ．Ｓｕｇａｈａｒａほか、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２６７（３），  １５２８−１５３３  （１９９２））。後者は一般に、エノキサパリンナトリウムにほぼ不在である（実施例５におけるＮＭＲ参照）。
【００３１】
【化１２】
2007530932.tif 000008
【００３２】
別の態様において、本発明は、１，６−無水物基を検出するためのクロマトグラフィープロセスを提供する。ある実施態様において、前記方法は、脱重合化及びＮａＢＨ４などの還元剤による必要に応じた処理の後で得られるさまざまなオリゴ糖を分離することを包含する。
【００３３】
本発明に記載のさまざまなオリゴ糖の分離は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により実施できる。ある実施態様において、前記ＨＰＬＣは陰イオン交換クロマトグラフィーである。関連する実施態様において、前記陰イオン交換クロマトグラフィーは強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）である。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「強陰イオン交換クロマトグラフィー」（ＳＡＸ）という語は、ｐＨ約２ないし１２の範囲にある一定の正味の正の電荷を維持するいずれかの樹脂上で実施される陰イオン交換クロマトグラフィーを包含する。本発明のある実施態様において、強陰イオン交換クロマトグラフィーは、四級アンモニウム交換基により機能化された固体支持体を使用する。例えば、約５μｍの粒子サイズ、約２５ｃｍのカラム長及び約１ｍｍないし約４．６ｍｍのカラム直径を有するＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ（Ｒ）ＳＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）などのカラムが使用できる。
【００３５】
使用される装備は、溶出勾配の形成を可能にし、アセチル化されている糖の選択的検出に適した適切な紫外線検出器の装備されたいずれかのクロマトグラフでありうる。本発明のある実施態様において、前記紫外線検出器は、前記構成成分の紫外線スペクトルを発生し、記録される２個の異別の波長における吸光度間の差異から複合信号を生じさせるダイオードの配列である。このようなダイオード配列検出器によって、アセチル化されたオリゴ糖の特異的検出が可能になる。関連した実施態様において、２００ｎｍまでの紫外線領域において透明なＨＰＬＣ移動相が使用される。本実施態様において、ＮａＣｌの腐食力に抵抗するために、不動態化したクロマトグラフを必要とする更なる不利を有する前記塩化物に基づいた既存の移動相は排除される。本発明の前記実施態様に従って使用できる移動相には、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホン酸塩又はリン酸塩に基づいた移動相が含まれるがこれらには限定されない。ある実施態様において、前記移動相はメタンスルホン酸アンモニウムの水溶液である。
【００３６】
本発明の対象はそれゆえ、約２００ｎＭないし約４００ｎＭの紫外線領域において透明な移動相が使用される陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離による、前述に定義された分析の方法でもある。
【００３７】
ある実施態様において、強陰イオンクロマトグラフィー分離はｐＨ約２．０ないし約６．５で実施される。関連した実施態様において、約３の領域にあるｐＨが使用されるであろう。前記ｐＨは例えば、ｐＨ＝３で緩衝力を有する移動相へ塩を添加することによって調節できる。本発明のある実施態様において、過塩素酸塩よりもｐＨ３において大きな緩衝力を有するリン酸塩などの塩が使用される。典型的なクロマトグラフィー分離条件は以下に与えられる。
【００３８】
移動相
溶媒Ａ：  Ｈ３ＰＯ４を添加することによってｐＨ２．９へ調整されたＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ
溶媒Ｂ：１ＮのＮａＨ２ＰＯ４中の、Ｈ３ＰＯ４を添加することによってｐＨ３．０へ調整されたＮａＣｌＯ４、２．５ｍＭ
前記溶出勾配は以下のとおりでありうる。すなわち、
Ｔ＝０分、Ｂ％＝３、Ｔ＝４０分、Ｂ％＝６０、Ｔ＝６０分、Ｂ％＝８０
である。
【００３９】
適切な温度、例えば約４０℃ないし約５０℃、及びポンプ流速は、使用されるカラムに従って選択される。
【００４０】
ＳＡＸクロマトグラフィーにより試料を精製する他の方法は当業者に公知である。例えば、ＳＡＸ法は、Ｋ．Ｇ．Ｒｉｃｅ及びＲ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９０，  ２１９−２３３  （１９８９）、Ａ．Ｌａｒｎｋｊａｅｒほか、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２６６，  ３７−５２  （１９９５）、及び特許第ＷＯ９０／０１５０１号によって記載されている（実施例２）。これらの参考文献の内容は本明細書にその全体が組み込まれる。
【００４１】
本発明の別の態様は、分画されていないヘパリン又は分画されたヘパリンにおいて見出される特定の基を検出する方法である。
【００４２】
ある実施態様において、この方法はヘパリン又はＬＭＷＨ基の紫外線検出の特異性を増加させる。アセチル化されていない多糖類はすべて、与えられたｐＨでかなり似ている紫外線スペクトルを有するため、アセチル化されていない糖類の吸光性が消去されるように選択された２波長における吸光度間の差異をシグナルとして取ることによって、前記アセチル化された糖を選択的に検出できる。
【００４３】
実施例によって後述に示されるように、２０２ｎｍ及び２３０ｎｍは、検出波長及び基準波長として選択でき、前記２０２ないし２３０ｎｍのシグナルが記録できる。当業者は、本発明に従って使用できる波長の選択が前記移動相のｐＨに依存するであろうことを正しく認識するであろう（数ｎｍの調整が前記ｐＨの最適値であるようにするために必要でありうる。）。
【００４４】
２つ以上の波長で吸光度を同時に測定できるいずれかの紫外線検出器が本発明において使用できる。本発明のある実施態様において、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＤＡＤ１１００検出器が使用される。この実施態様において、二重検出が、一方では２３４ｎｍで、もう一方では２０２ないし２３０ｎｍで実施されるであろう。アセチル化オリゴ糖の選択的検出の原理は、硫酸化した二糖類ΔＩｓの紫外線スペクトルが、アセチル化した二糖類ΔＩａのそれと比較される図１において説明される。
【００４５】
本発明の対象はそれゆえ、アセチル化されている糖を前記検出方法によって選択的に検出できる、前述に定義された分析の方法でもある。
【００４６】
ある実施態様において、この分析方法はＳＡＸクロマトグラフィーによる分離を使用し、アセチル化されていない糖の吸光性が消去されるよう選択された２波長における吸光度間の差異を測定することによって、アセチル化した糖が選択的に検出される。
【００４７】
前述の４個の１，６−無水物残基の定量化は、混合物の他の構成成分すべてに関連してクロマトグラフィー系の十分な選択性を必要とする。しかしながら、一般に同時溶出される前記２つの二糖類１及び２は、特に後者がその２つのα及びβアノマーの形態で存在するため、ΔＩＩａに関してほとんど分離されない。
【００４８】
前記２つの二糖類１及び２の同一性は、ＮａＯＨを添加することによってｐＨ１３へ調整されたΔＩＩｓの水溶液中で前記２つの二糖類が室温において数時間で形成されるため、簡単に確証できる。しかしながら、もし二重検出が使用されれば、アセチル化されているオリゴ糖であるΔＩＶａ、ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ、ΔＩａ、ΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ、及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕは簡単に同定可能である。
【００４９】
前記ピークの分岐の原因は、アノマー形態であり、一方では、前記ピークがオリゴ糖鎖における末端位置にあるとき、少ない程度に、ΔＩＩｓ、ΔＩＩＩｓ及びΔＩｓについて部分的に存在するグルコサミン⇔マンノサミンエピマー化である。
【００５０】
本発明のある実施態様において、二糖類１及び２は、ＮａＢＨ４の作用を介してヘパリナーゼによりすでに脱重合化された低分子量ヘパリンの試料を還元することによって定量化される。
【００５１】
【化１３】
2007530932.tif 000009
【００５２】
この還元は、前記末端オリゴ糖環を開口することによって前記α⇔βアノマー化を除去する利点を有する。前記アノマー化が除去されるため、得られたクロマトグラムはより単純である。さらに、ΔＩＩａの還元は、前記カラム上でのその保持を低下させ、二糖類１及び２を簡単にアッセイできる。
【００５３】
図２及び３に記載されるクロマトグラムの実施例は、この方法のこれらの現象及び利点を明確に示す。
【００５４】
実施例
以下の実施例は、本発明のさまざまな特徴を説明するために企図される。当業者は、本発明が以下に具現化される実施態様に制限されないことを正しく認識するであろう。
【実施例１】
【００５５】
酵素による脱重合化の一般的な記述。
【００５６】
以下は、酵素による脱重合化をいかに実施し及び本発明においていかに使用できるかに関する一般的な記述である。
【００５７】
アッセイされるべきエノキサパリンナトリウムの２０ｍｇ／ｍｌを含有する溶液の５０μｌ、２ｍＭ酢酸カルシウムを含有するｐＨ７．０の１００ｍＭ酢酸／ＮａＯＨ溶液の２００μｌ及びＢＳＡの１ｍｇ／ｍｌを、３つのヘパリナーゼのストック溶液と混合することによって、前記酵素による脱重合化を室温で４８時間実施する。前記ヘパリナーゼを−３０℃で保存する。前記ヘパリナーゼは緩衝液中にあり、各ヘパリナーゼについての力価は０．５ＩＵ／ｍｌである（前記緩衝液の組成：２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充された０．０１モル／ｌの濃度のＫＨ２ＰＯ４のｐＨ７の水溶液）。
【００５８】
使用直前に調製した１００ｍＭ酢酸ナトリウムに３０ｇ／ｌのＮａＢＨ４溶液の１０μｌを添加することによって、前記ヘパリナーゼで脱重合化した生成物の６０μｌに関して還元を実施する。
【実施例２】
【００５９】
実施例１の一般的な記述に従って得られる二糖類３のＮＭＲ。
【００６０】
Ｄ２Ｏ中のプロトンスペクトル、４００ＭＨｚ、Ｔ＝２９８Ｋ、δ（ｐｐｍ）：  ３．３４  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝７及び２Ｈｚ，  Ｈ２）、３．７２  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  Ｈ６）、３．９０  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ３）、４．０３  （１Ｈ，  ｓ，  Ｈ４）、４．２０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  Ｈ６）、４．２３  (１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５Ｈｚ，  Ｈ３’）、４．５８  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ２’）、４．７８  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ５）、５．５０  （１Ｈ，  ｓ，  Ｈ１）、５．６０  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝６及び１Ｈｚ，  Ｈ１’）、６．０３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝５Ｈｚ，  Ｈ４’）
【実施例３】
【００６１】
実施例１の一般的な記述に従って得られる四糖類１のＮＭＲ。
【００６２】
Ｄ２Ｏ中のプロトンスペクトル、４００ＭＨｚ、Ｔ＝２９８Ｋ、δ（ｐｐｍ）：  ３．１５  （１Ｈ，  ｓ，  Ｈ２）、３．２５  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ２”）、３．６０  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ３”）、３．７０ないし４．７０  （１４Ｈ，  分離されていない混成体，  Ｈ３／Ｈ４／Ｈ６，  Ｈ２’／Ｈ３’／Ｈ４’／Ｈ５’，  Ｈ４”／Ｈ５”／Ｈ６”，  Ｈ２”’／Ｈ３”’）、４．７５  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ５）、５．２０ないし５．４０  (２Ｈ，  ｍ，  Ｈ１’及びＨ１”）、５．４５  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ１”’）、５．５６  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ１）、５．９４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝５Ｈｚ，  Ｈ４）
【実施例４】
【００６３】
実施例１の一般的な記述に従って得られる三糖類１のＮＭＲ。
【００６４】
Ｄ２Ｏ中のプロトンスペクトル、６００ＭＨｚ、（δ（ｐｐｍ））：  ３．２８  （１Ｈ，  ｍ）、３．６１  （１Ｈ，  ｔ，  ７Ｈｚ）、３．７９  （１Ｈ，  ｔ，  ７Ｈｚ）、３．９５  （１Ｈ，  ｄ，  ６Ｈｚ）、４．００  （１Ｈ，  ｓ）、４．２０  (１Ｈ，  ｍ）、４．２８  （２Ｈ，  ｍ）、４．３２  （１Ｈ，  ｄ，  ４Ｈｚ）、４．４１  （１Ｈ，  ｓ）、４．５８  (１Ｈ,  ｓ)、４．６１  （１Ｈ，  ｓ）、４．９０  （１Ｈ，  幅広  ｓ）、５．２４  （１Ｈ，  ｓ）、５．４５  （１Ｈ，  ｓ）、５．９５  （１Ｈ，  ｓ）
【実施例５】
【００６５】
本発明に従って得られるΔＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−ＳｅｒのＮＭＲ。
【００６６】
Ｄ２Ｏ中のスペクトル、５００ＭＨｚ（δ（ｐｐｍ））：  ３．３０  （１Ｈ，  ｔ，  ７Ｈｚ）、３．３４  （１Ｈ，  ｔ，  ８Ｈｚ）、３．５５  （１Ｈ，  ｔ，  ７Ｈｚ）、３．６０  （１Ｈ，  ｔ，  ７Ｈｚ）、３．６３ないし３．８５  （１０Ｈ，  ｍ）、３．９１  （２Ｈ，  ｍ）、３．９６  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７及び２Ｈｚ）、４．０２ないし４．１０  （３Ｈ，  ｍ）、４．１２  （１Ｈ，  ｄ，  ２Ｈｚ）、４．１８  （１Ｈ，  ｍ）、４．４０  （１Ｈ，  ｄ，  ６Ｈｚ）、４．４６  （１Ｈ，  ｄ，  ６Ｈｚ）、４．６１  （１Ｈ，  ｄ，  ６Ｈｚ）、５．２９  （１Ｈ，  ｄ，  ３Ｈｚ）、５．８５  （１Ｈ，  ｄ，  ３Ｈｚ）。
【実施例６】
【００６７】
前記定量化の原理。
【００６８】
還元された溶液で得られたクロマトグラムにおける１，６−無水物含有量を、標準化された面積比方法によって決定する。
【００６９】
不飽和ウロン酸のモル濃度吸光度係数を定数として取り、その結果として、多糖類の応答ファクターはその分子量に比例する。
【００７０】
本発明の方法において、混合物中に含有される不飽和オリゴ糖の全部が５５００モル−１・ｌ・ｃｍ−１に等しい同一のモル吸光度を有するという広く受理された仮説を作る。
【００７１】
前記２つの同時溶出された１，６−無水物残基である二糖類１及び２は互いに統合されている。
【００７２】
それゆえ、出発物質である分画されていないヘパリン若しくは分画されたヘパリンにおける脱重合化した混合物の構成成分全部、例えば、１，６−無水物誘導体又はアセチル化した糖誘導体などの構成成分の重量による割合を決定できる。前記ピーク７、８、１３、及び１９に対応する４つの１，６−無水物誘導体、すなわち二糖類１、二糖類２、二糖類３、及び四糖類１について、次式
【００７３】
【数１】
2007530932.tif 000010
の重量による割合を得た。
【００７４】
面積７、面積８、面積１３及び面積１９は、前記ピーク７、８、１３及び１９の各々の面積に対応する。これら４つの化合物の各々の分子量はそれぞれ、４４３、４４３、５４５及び１２１０である。ΣＭｗｘ・面積ｘは、前記対応する生成物の分子量によるクロマトグラムの各ピークの面積の比に対応する。
【００７５】
もしＭｗが、検討した低分子量ヘパリンの平均重量であれば、１，６−無水物環で終結するオリゴ糖鎖の割合を以下のよう
【００７６】
【数２】
2007530932.tif 000011
に得る。
【００７７】
同様に、分画されていないヘパリン及び分画されたヘパリンから選択される材料の試料における他の構成成分の重量による割合を決定できる。
【００７８】
実際の分子量はクロマトグラム上で同定されるピーク全部に帰属させられる（表１参照）。
【００７９】
【表１】
2007530932.tif 000012
2007530932.tif 000013
【００８０】
以下は、図２及び３のピーク数に対応する糖類の命名である。
【００８１】
１：  ΔＧｌｃＡβ１−３  Ｇａｌ  β１−３  Ｇａｌβ１−４  Ｘｙｌ  β１−Ｏ−Ｓｅｒ
２：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノシルナトリウム塩
３：  ΔＧｌｃＡβ１−３  Ｇａｌ  β１−３  Ｇａｌβ１−４  Ｘｙｌ  β１−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ
４：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンガラクトピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルコピラノース二ナトリウム塩
５：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノシルナトリウム塩
６：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル二ナトリウム塩
７：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−４−エンピラノシルロン酸−（１→４）−１，６−無水−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルコピラノース二ナトリウム塩（二糖類１）
８：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−４−エンピラノシルロン酸−（１→４）−１，６−無水−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−マンノピラノース二ナトリウム塩（二糖類２）
９：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノシル二ナトリウム塩
１０：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンガラクトピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルコピラノース三ナトリウム塩
１１：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルコピラノシル三ナトリウム塩
１２：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノシル三ナトリウム塩
１３：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−４−エンピラノシルロン酸−（１→４）−１，６−無水−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルコピラノース三ナトリウム塩（二糖類３）
１４：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル三ナトリウム塩
１５：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル）五ナトリウム塩
１６：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル四ナトリウム塩
１７：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル）六ナトリウム塩
１８：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−Ｏ−スルホ-α-Ｌ-イドピラノシルロン酸六ナトリウム塩
１９：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−イドピラノシルロン酸−（１→４）−１，６−無水−２−デオキシ−スルファミド−β−Ｄ−マンノピラノース、六ナトリウム塩（四糖類１）
２０：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルシトールナトリウム塩
２１：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルシトール二ナトリウム塩
２２：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルシトール二ナトリウム塩
２３：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール二ナトリウム塩
２４：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルシトール二ナトリウム塩
２５：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンガラクトピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルシトール三ナトリウム塩
２６：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール三ナトリウム塩
２７：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルシトール三ナトリウム塩
２８：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール三ナトリウム塩
２９：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール）五ナトリウム塩
３０：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール三ナトリウム塩
３１：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール）六ナトリウム塩
３２：  ４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−イドピラノシルロン酸六ナトリウム塩（ＮａＢＨ４で還元された形態）
使用される略語
ｉｄｏＡ：  α−Ｌ−イドピラノシルロン酸
ＧｌｃＡ：  β−Ｄ−グルコピラノシルロン酸
ΔＧｌｃＡ:  ４,５-不飽和酸：  ４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘックス−エンピラノシルロン酸
Ｇａｌ：  Ｄ−ガラクトース
Ｘｙｌ：  キシロース
ＧｌｃＮＡｃ：  ２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノース
ＧｌｃＮＳ：  ２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノース
２Ｓ：  ２−Ｏ−硫酸塩
３Ｓ：  ３−Ｏ−硫酸塩
６Ｓ：  ６−Ｏ−硫酸塩
【００８２】
本発明は、その精神又は本質的な特性から解離せずに他の特定の形態において具現化できる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、アセチル化したオリゴ糖の選択的検出を示し、硫酸化二糖類ΔＩｓの紫外線スペクトルが、アセチル化した二糖類ΔＩａの紫外線スペクトルと比較されている。ｘ軸は波長（ｎｍ）を、ｙ軸は吸光度（ｍＡｍｐｓ）を表す。
【図２】図２は、ＮａＢＨ４による還元前後のヘパリナーゼにより脱重合化したエノキサパリンのクロマトグラフィー分離を示す（細い黒におけるシグナル：２３０ｎｍでの紫外線、太い黒におけるシグナル：２０２ないし２３４ｎｍでの紫外線）。ｘ軸は溶出時間（分）を、ｙ軸は吸光度（ｍＡｍｐｓ）を表す。
【図３】図３は、ＮａＢＨ４による還元前後のヘパリナーゼにより脱重合化したヘパリンのクロマトグラフィー分離を示す（細い黒におけるシグナル：２３０ｎｍでの紫外線、太い黒におけるシグナル：２０２ないし２３４ｎｍでの紫外線）。ｘ軸は溶出時間（分）を、ｙ軸は吸光度（ｍＡｍｐｓ）を表す。
【図１】
2007530932.tif 000024
【図２】
2007530932.tif 000025
【図３】
2007530932.tif 000026
【国際調査報告】
2007530932.tif 000027
2007530932.tif 000028
2007530932.tif 000029