(57)【要約】本発明は、サンプル核酸のための参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタを作成する方法であって、複数の核酸分子を含むアレイを用意すること、ここで前記複数の核酸分子は、少なくとも２つの異なる起源から由来する、前記アレイを少なくとも２つの異なる参照核酸とハイブリダイゼーションすることによって、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを用意すること、ここで前記少なくとも２つの異なる参照核酸の前記起源が、少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づいて少なくとも２つのグループに分離可能である、そして外的基準のない多変量解析によって前記参照ハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化することを含む方法に関する。本発明はさらに、サンプル核酸を型特定する方法であって、本発明に従う方法を使用することによって、サンプル核酸に、参照ハイブリダイゼーションパターンの少なくとも２つの異なるクラスタを作成すること、前記参照ハイブリダイゼーションパターンを作成するために使用されたものと同じアレイをサンプル核酸とハイブリダイゼーションして、サンプルハイブリダイゼーションパターンを得ること、そして前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを参照ハイブリダイゼーションパターンの前記少なくとも２つの異なるクラスタのうちの１つに割り当てることを含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル核酸のための参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタを作成する方法であって、
複数の核酸分子を含むアレイを用意すること、ここで前記複数の核酸分子は、少なくとも２つの異なる起源から由来する、
前記アレイを少なくとも２つの異なる参照核酸とハイブリダイゼーションすることによって、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを用意すること、ここで前記少なくとも２つの異なる参照核酸の前記起源が、少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づいて少なくとも２つのグループに分離可能である、そして
外的基準のない多変量解析によって前記参照ハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化すること
を含む前記方法。
【請求項２】
前記アレイは、複数のゲノムＤＮＡフラグメント、好ましくは少なくとも２つの異なる起源からのゲノムＤＮＡフラグメントの混合物から無作為に選択された複数のゲノムＤＮＡフラグメントからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記複数のアレイ核酸分子の上記少なくとも２つの異なる起源のうちの少なくとも１つがまた、前記少なくとも２つの異なる参照核酸のうちの少なくとも１つの起源である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アレイ中の前記分子の平均サイズが約200〜5000の間のヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アレイは、前記少なくとも２つの異なる起源から無作為に選択された約1500〜5000の間の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のアレイ核酸分子は、天然起源、より好ましくはウィルス起源、細菌起源、動物起源又は植物起源、さらにより好ましくは原核生物起源から得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のアレイ核酸分子のための前記少なくとも２つの異なる起源が、（分類学的に）密接に関連づけられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のアレイ核酸分子は、原核生物の少なくとも２つの異なる種から得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のアレイ核酸分子は、同じ属に属する少なくとも２つの異なる原核生物株から得られる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のアレイ核酸分子は、同じ種に属する少なくとも２つの異なる原核生物株から得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のアレイ核酸分子は、原核生物の純粋培養から得られる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のアレイ核酸分子は、真核生物のＤＮＡから得られる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のアレイ核酸分子は、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、そしてさらにより好ましくは少なくとも８つの異なる起源から得られる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
主成分分析（ＰＣＡ）に基づくパターンの表現をクラスタ化することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル核酸を型特定する方法であって、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を使用することによって、一つのサンプル核酸のために、参照ハイブリダイゼーションパターンの少なくとも２つの異なるクラスタを作成すること、
前記参照ハイブリダイゼーションパターンを作成するために使用されたものと同じアレイをサンプル核酸とハイブリダイゼーションして、サンプルハイブリダイゼーションパターンを得ること、そして
前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを参照ハイブリダイゼーションパターンの前記少なくとも２つの異なるクラスタのうちの１つに割り当てること
を含む前記方法。
【請求項１６】
前記サンプル核酸は、ゲノムＤＮＡ、より好ましくはゲノムＤＮＡフラグメントからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズが、約50〜5000の間のヌクレオチドである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、さらにより好ましくは少なくとも５０の異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを含む参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタと比較することを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記比較は、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンと一緒に前記参照ハイブリダイゼーションパターンの外的基準のない多変量解析を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
主成分分析（ＰＣＡ）に基づくパターンの表現をクラスタ化することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記割り当てることは、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンと一緒に前記参照ハイブリダイゼーションパターンの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を含み、及びその値が前記参照ハイブリダイゼーションパターンについて知られているところの少なくとも１つの表現型パラメータ（該情報は、ＰＬＳ−ＤＡ分析を監督するために使用される）が、前記サンプル核酸又はそれが由来する起源についてさらに決定され又は推定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析に基づきパターンの表現をクラスタ化することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記クラスタは、関心のある表現型パラメータの値を共有するパターンを表わす、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のアレイ核酸分子のための少なくとも２つの異なる起源が、サンプル核酸の起源と（分類学的に）密接に関連づけられる、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレイ技術、診断学法及び分子生物学の分野に関する。より特には、本発明は、核酸アレイを用いてサンプル核酸を型特定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレイ技術は、生物学及び医学に関連付けられる様々な分野において重要な手法となっている。アレイの幾つかのタイプが、数年をかけて開発されてきている。小型化及びオートメーションの出現で、ますます多くの情報がアレイ内に入ってきている。アレイ技術における現在の傾向は、アレイ上にますます多くの情報を運ぶ、ずっと大きなアレイを生成することである。
【０００３】
アレイに基づく診断法では、ハイブリダイゼーションパターン、すなわちアレイ上の様々なスポットがサンプル核酸とハイブリダイゼーションするところの強度のパターンが、他のサンプル核酸のそれと比較されるべきであるところのデータを含む。慣用のアレイでは、１スポット当たりのヌクレオチドの数は好ましくは、経済性及び正確性の理由でできるだけ低く維持されている。
【０００４】
アレイ上に含まれるより高いレベルの情報は、核酸サンプルのより詳細な分析を提供するために、すなわち比較されるべきである２つのそのようなサンプル間の些細な差を可視化し又は明らかにするために主に使用される。例えば、ヒトの診断法において、アレイは、同じ疾病を有しているが、異なる予後を有している患者のグループを分類し、そしてその結果、予後におけるこの違いの原因である遺伝子を明らかにするために使用される。そのような実験は、発現アレイに基づいてほとんど行われる。なぜならば、ある遺伝子の発現のレベルのみが２つのグループの患者間を識別するために、すなわちそれらの間で十分な識別力を提供するために必要な解決を提供すると信じられている。
【０００５】
発現プロファイリングとして知られているこれらの診断方法において、アレイを調査するために使用される核酸（すなわち、発現されたｍＲＮＡ）が、複雑な核酸を提供する。特に、複雑な核酸がアレイを調査するために使用される場合、アレイ内のより多くの数のヌクレオチドの導入が今、他の困難性をもたらす。発現プロファイリングの状況において、多くの数のスポットは、スポットにおける核酸の全てが核酸を調査するためにハイブリダーゼーションされるとは限らないという事実を示す値０及び１の間のシグナルを有し、それは、関与する遺伝子の発現のレベルを決定し又は数値化するために使用される特徴である。
【０００６】
結局、異なるハイブリダイゼーションパターンを比較する際に、アレイのどのシグナルが分析に含められ及びどれが除かれるかの決定がされなければならない。通常、これは、あるスポットの強度における最も顕著な又は最大の変化を含める方向へ分析にバイアスをかけるために導入された切り捨て値に基づいて生じる。参照パターン、試験物質又はサンプル核酸を用いて生成されたパターンが比較されるところのパターンがこのプロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。先行技術の方法に関する問題は今、核酸の発現は有機体がいる状態を表わし、それは同じ有機体が状況に依存して異なる発現パターンを有しうることを意味するということである。従って、先行技術方法は、それら代謝状態に関係なく有機体の型特定を提供するためにあまり適していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は今、比較アレイハイブリダイゼーション実験において使用するための参照ハイブリダイゼーションパターンを作成する方法を提供することによってこの問題を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、そのような高い識別力を提供する参照ハイブリダイゼーションパターンを作成する方法であって、該方法が、サンプル核酸の型特定のあるレベル（驚くほどに詳述される）を可能にするところの方法を今見つけた。例えば、本発明者らは、異なる細菌株のサンプル核酸が抗生物質に対する耐性としてそのような詳述された表現型パラメータの該レベルで型特定されることを可能にする参照ハイブリダイゼーションパターンを作成する方法を今見つけた。一方、型特定それ自体は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づき生じる。そのような全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーション手法では、アレイ上の核酸分子及びサンプル核酸の両方が、（ランダム）ゲノムＤＮＡフラグメントからなる。細菌株の間で、抗生物質耐性及び感受性のサブタイプ間で識別することがゲノムＤＮＡの組成に基づいて可能であろうことを当業者が予測しない以上、詳述のこのレベルが達成されることは驚くべきことである。
【０００９】
１つの観点では、本発明は、サンプル核酸のための参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタを作成する方法であって、
複数の核酸分子を含むアレイを用意すること、ここで前記複数の核酸分子は、少なくとも２つの異なる起源から由来する、
前記アレイを少なくとも２つの異なる参照核酸とハイブリダイゼーションすることによって、少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを用意すること、ここで前記少なくとも２つの異なる参照核酸の前記起源が、少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づいて少なくとも２つのグループに分離可能である、そして
外的基準のない（unsupervised）多変量解析によって前記参照ハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化すること
を含む方法を提供する。
【００１０】
従って、本発明に従う参照ハイブリダイゼーションパターンを作成する方法は、アレイ核酸のための多数の起源並びに参照核酸のための多数の起源を使用する。これらの起源は、同じであっても又は異なっていてもよい。好ましくは、参照ハイブリダイゼーションパターンはまた、アレイ核酸のための起源から由来する核酸を用いて得られ、従って、様々な起源は多面的機能を有しうる。従って、上記複数のアレイ核酸分子の上記少なくとも２つの異なる起源のうちの少なくとも１つがまた、前記少なくとも２つの異なる参照核酸のうちの少なくとも１つの起源である。
【００１１】
好ましい実施態様では、本発明の方法は全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーション手法を支援する。従って、好ましくは、該アレイは、複数のゲノムＤＮＡフラグメント、好ましくは少なくとも２つの異なる起源からのゲノムＤＮＡフラグメントの混合物から無作為に選択された複数のゲノムＤＮＡフラグメントからなる。また、サンプル核酸は好ましくは、ゲノムＤＮＡ、より好ましくはまたゲノムＤＮＡフラグメントからなる。
【００１２】
好ましい実施態様では、複数のアレイ核酸分子のための少なくとも２つの異なる起源が、サンプル核酸の起源に（分類学的に）密接に関連づけられる（べきであると少なくとも疑われる）。すなわち、それらは、同じ目（order）、好ましくは同じ科（family）、より好ましくは、同じ属（genus）、さらにより好ましくは同じ種（species）、さらにより好ましくは同じ遺伝的亜種に属する。
【００１３】
他の好ましい実施態様では、前記アレイ中の前記分子の平均サイズが約200〜5000の間のヌクレオチドである。
【００１４】
他の好ましい実施態様では、前記アレイは、前記少なくとも２つの異なる起源から無作為に選択された約1,500〜5,000の間の核酸分子を含む。
【００１５】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、天然起源、より好ましくはウィルス起源、細菌起源、動物起源又は植物起源、さらにより好ましくは原核生物起源から得られる。
【００１６】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子のための前記少なくとも２つの異なる起源が、（分類学的に）密接に関連づけられる。
【００１７】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、原核生物の少なくとも２つの異なる種から得られる。
【００１８】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、同じ属に属する少なくとも２つの異なる原核生物株から得られる。
【００１９】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、同じ種に属する少なくとも２つの異なる原核生物株から得られる。
【００２０】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、原核生物の純粋培養から得られる。
【００２１】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、真核生物のＤＮＡから得られる。
【００２２】
他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子は、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、そしてさらにより好ましくは少なくとも８つの異なる起源から得られる。
【００２３】
他の好ましい実施態様では、前記方法は、主成分分析（ＰＣＡ）に基づくパターンの表現をクラスタ化することをさらに含む。
【００２４】
他の観点では、本発明は、サンプル核酸を型特定する方法であって、
本発明に従いサンプル核酸のための参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタを作成するための方法を使用することによって、一つのサンプル核酸のために、参照ハイブリダイゼーションパターンの少なくとも２つの異なるクラスタを作成すること、
前記参照ハイブリダイゼーションパターンを作成するために使用されたものと同じアレイをサンプル核酸とハイブリダイゼーションして、サンプルハイブリダイゼーションパターンを得ること、そして
前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを参照ハイブリダイゼーションパターンの前記少なくとも２つの異なるクラスタのうちの１つに割り当てること
を含む方法を提供する。
【００２５】
１つの好ましい実施態様では、前記サンプル核酸は、ゲノムＤＮＡ、より好ましくはゲノムＤＮＡフラグメントからなる。
【００２６】
他の好ましい実施態様では、前記サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズが、約50〜5000の間のヌクレオチドである。
【００２７】
さらに他の好ましい実施態様では、前記方法は、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンを、少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、さらにより好ましくは少なくとも５０の異なる参照ハイブリダイゼーションパターンを含む参照ハイブリダイゼーションパターンのクラスタと比較することを含む。
【００２８】
さらに他の好ましい実施態様では、前記比較は、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンと一緒に前記参照ハイブリダイゼーションパターンの外的基準のない多変量解析を含み、さらにより好ましくは、主成分分析（ＰＣＡ）に基づくパターンの表現をクラスタ化することをさらに含む。
【００２９】
さらに他の好ましい実施態様では、前記割り当てることは、前記サンプルハイブリダイゼーションパターンと一緒に前記参照ハイブリダイゼーションパターンの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を含み、及びその値が前記参照ハイブリダイゼーションパターンについて知られているところの少なくとも１つの表現型パラメータ（該情報は、ＰＬＳ−ＤＡ分析を監督する（supervise）ために使用される）が、前記サンプル核酸又はそれが由来する起源についてさらに決定され又は推定される。
【００３０】
さらに他の好ましい実施態様では、前記方法は、外的基準のある（supervised）ＰＬＳ−ＤＡ分析に基づきパターンの表現をクラスタ化することをさらに含む。
【００３１】
さらに他の好ましい実施態様では、前記方法は、クラスタにおける存在又は不存在に基づき前記サンプル核酸を型特定することをさらに含む。
【００３２】
さらに他の好ましい実施態様では、前記クラスタは、関心のある表現型パラメータの値を共有するパターンを表わす。
【００３３】
さらに他の好ましい実施態様では、前記複数のアレイ核酸分子のための少なくとも２つの異なる起源が、サンプル核酸の起源と（分類学的に）密接に関連づけられる。
【００３４】
さらに他の好ましい実施態様では、前記パラメータは抗生物質耐性である。
【００３５】
さらに他の好ましい実施態様では、前記パラメータは、伝染性特徴、病原性、毒性、共生、耐熱性、ｐＨ耐性、残存及び／又は細胞死である。
【００３６】
さらに他の観点では、本発明は、パーツのキットであって、前記キットが、本明細書の上記で定義された少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターン又は参照核酸と一緒に、本明細書の上記で定義されたアレイの組み合わせを含む前記キットを提供する。
【００３７】
図１は、研究において使用された31個の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株のRiboPrint（商標）分類を示す。全ての株は、株型集団からの１つの参照株(TTC 03.151)を除き、黄色ブドウ球菌病院単離物である。該図は、各株の特異的なRiboPrint（商標）パターン（中央のバンドパターン）及びRiboPrint（商標）パターン間の（ピアソン-）相関の程度を示す系統樹（左）を示す。右に、各株について、ＴＴＣ番号（ＴＮＯ型集団、TNO（TNO Type Collection）、ザイスト、オランダ）が与えられる（詳細について図３を参照）。右端の記号
2007534334.tif 000002
は、図２のＰＣＡ−クラスタに従う株分類を示す。
【００３８】
図２は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のないＰＣＡ分析による、黄色ブドウ球菌のクラスタ化を示す。31個の異なる黄色ブドウ球菌株のCy−ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、黄色ブドウ球菌ゲノムの表現を含む35個のアレイ（４株、２回）とハイブリダイゼーションされた。黄色ブドウ球菌株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを表す）が、主成分分析（ＰＣＡ）を用いて解析された。下記ＰＣＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す（テキストを伴う小円は株TTC.03番号を示す、詳細について図３を参照）。２回ハイブリダイゼーションされた株は、塗りつぶされた小円及び太字テキストを用いて示されている。明瞭さの理由のために、互いに接近して投射された株は、楕円によって手動でクラスタ化される。各クラスタは、図１においてRiboPrint（商標）分類された株の右側にまた示されている記号
2007534334.tif 000003
によって識別された。注：Cy5/Cy3比は、切り捨て0.5によって０及び１データセットに変換された；平均中央がスケーリングのために使用された。
【００３９】
図３は、黄色ブドウ球菌株及びそれらの耐性特徴の概要を示す。抗生物質に対する耐性が、古典的な寒天拡散試験（第２〜３カラム：U=未知、S=感受性、I=中間物、R=耐性）によって決定された。研究された黄色ブドウ球菌株は、ＴＮＯ型集団番号(ＴＴＣ番号)によって示される。リストされた全ての株は、培養集団からの型株である最後の項目以外は、病院分離物である。
【００４０】
図４は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、黄色ブドウ球菌株の抗生物質に対する耐性のためのクラスタ化を示す。31個の異なる黄色ブドウ球菌株のCy-ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、黄色ブドウ球菌ゲノムの表現を含むアレイとハイブリダイゼーションされた。黄色ブドウ球菌株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを示す）が、各黄色ブドウ球菌株の既知の抗生物質感受性（Ｓ）又は耐性（Ｒ）に基づき、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いて解析された。下のＰＬＳ−ＤＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す（テキストを伴う小円は株TTC.03番号を示す）。２回ハイブリダイゼーションされた株は、太字で示される。データセットの特定部分に基づき、ＰＬＳ−ＤＡ分析は、２つの異なる抗生物質に対する株の既知の抗生物質耐性に従い、２つの別々のクラスタにおける株をクラスタ化しうる（図４ａ−ｂ）。注:ＰＬＳ−ＤＡスケーリングは、平均中央である。図４ａ：ＰＬＳ−ＤＡによって解析された場合の黄色ブドウ球菌のゲノム組成に基づく黄色ブドウ球菌ゲンタマイシン耐性及び感受性株のクラスタ化。図４ｂ：ＰＬＳ−ＤＡによって解析された場合の黄色ブドウ球菌のゲノム組成に基づく黄色ブドウ球菌オキサシリン耐性及び感受性株のクラスタ化。データセットの番号は、図３において示される株番号をいう。
【００４１】
図５は、黄色ブドウ球菌株及びそれらの伝染性特徴の概要を示す。各ＭＲＳＡ株は、固有のＴＮＯ型集団番号（ＴＴＣ番号、第１カラム）によって識別される。各株は、RiboPrint（商標）分類によって黄色ブドウ球菌株として特徴付けられた（第２カラム）。伝染性特徴が、日常の病院実務から決定された（第３カラム）。
【００４２】
図６は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、ＭＲＳＡ株の伝染性のためのクラスタ化を示す。19個の異なるＭＲＳＡ株のCy-ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、黄色ブドウ球菌ゲノムの表現を含むアレイとハイブリダイゼーションされた。黄色ブドウ球菌株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを示す）は、各ＭＲＳＡ株の既知の伝染性特徴に基づき、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いて解析された。下のＰＬＳ−ＤＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す（テキストを伴う小円は図５における株TTC.03番号を示す）。２回ハイブリダイゼーションされた株は、太字テキストで示される。データセットの特定部分に基づき、ＰＬＳ−ＤＡ分析は、株の既知の伝染性に従い、２つの別々のクラスタ（手動で置かれた楕円、E=伝染性及びN=非伝染性を示す）における株をクラスタ化しうる。注：Cy5/Cy3比は、切り捨て0.5によって０及び１データセットに変換された。ＰＬＳ−ＤＡスケーリングは、平均中央である。非伝染性株”236”は、ＰＬＳ−ＤＡによってE-及びN-クラスタ間内に置かれた。データセットの番号は、図５において示される株番号をいう。
【００４３】
図７は、黄色ブドウ球菌株及びそれらの侵入性特性の概要を示す。各ＭＲＳＡ株は、固有のＴＮＯ型集団番号（ＴＴＣ番号、第１カラム）によって識別される。各株は、RiboPrint（商標）分類によって黄色ブドウ球菌株として特徴付けられた（第２カラム）。伝染性特徴が、日常の病院実務から決定された（第３カラム）。
【００４４】
図８は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、黄色ブドウ球菌株の侵入性のためのクラスタ化を示す。27個の異なる黄色ブドウ球菌株のCy-ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、黄色ブドウ球菌ゲノムの表現を含むアレイとハイブリダイゼーションされた。黄色ブドウ球菌株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを示す）が、各黄色ブドウ球菌株の既知の侵入性特徴に基づき、部分最小二乗法判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を用いて解析された。下のＰＬＳ−ＤＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す。データセットの特定部分に基づき、ＰＬＳ−ＤＡ分析は、株の既知の侵入性特徴に従い、２つの別々のクラスタ（ｏ  非侵入性、＋侵入性）における株をクラスタ化しうる。データセットの番号は、図７において示される株番号をいう。
【００４５】
図９は、エンテロバクタークロアカ（Enterobacter cloacae）株及びそれらの感染性特徴（I=感染性、NI=非感染性）の概要を示す。各エンテロバクタークロアカ株は、固有のＴＮＯ型集団番号（ＴＴＣ番号、第１カラム）によって識別される。各株は、RiboPrint（商標）分類によってエンテロバクタークロアカ株として特徴付けられた（第２カラム）。感染性特徴が、日常の病院実務から決定された（第３カラム）。
【００４６】
図１０は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、エンテロバクタークロアカ株の感染性のためのクラスタ化を示す。１８個の異なるエンテロバクタークロアカ株のCy-ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、エンテロバクタークロアカゲノムの表現を含むアレイとハイブリダイゼーションされた。エンテロバクタークロアカ株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを示す）は、各エンテロバクタークロアカ株の既知の侵入性特徴に基づき、部分最小二乗法判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を用いて解析された。下のＰＬＳ−ＤＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す。データセットの特定部分に基づき、ＰＬＳ−ＤＡ分析は、株の既知の感染性特徴に従い、２つの別々のクラスタ（ｏ感染性、＋感染性）における株をクラスタ化しうる。データセットの番号は、図９において示される株番号をいう。
【００４７】
図１１は、レジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）株及びそれらの病原性特徴の概要を示す。各レジオネラニューモフィラ株は、固有のＴＮＯ型集団番号（ＴＴＣ番号、第１カラム）及び実験ＩＤ（第２カラム）によって識別される。各株は、RiboPrint（商標）分類によってレジオネラニューモフィラ株として特徴付けられた（第３カラム）。病原性特徴が、日常の病院実務から決定された（第４カラム）。
【００４８】
図１２は、全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、レジオネラニューモフィラ株の病原性のためのクラスタ化を示す。30個の異なるレジオネラニューモフィラ株のCy-ラベル付けされたゲノムＤＮＡが、レジオネラニューモフィラゲノムの表現を含むアレイとハイブリダイゼーションされた。レジオネラニューモフィラ株の数値化された蛍光ハイブリダイゼーションパターン（非常に複雑なｎ−次元データセットを示す）は、各レジオネラニューモフィラ株の既知の病原性特徴に基づき、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いて解析された。下のＰＬＳ−ＤＡプロットは、２次元面における各単一株複雑ハイブリダイゼーションパターンの単一の点投射を示す。上部のプロットは図１１に記載された実験名を含み、下部のプロットは記述的な名前を含む。データセットの特定部分に基づき、ＰＬＳ−ＤＡ分析は、株の既知の病原性特徴に従い、２つの別々のクラスタ（pat=患者から得られた、omg=環境起源）における株をクラスタ化しうる。データセットの番号は、図１１において示される株番号をいう。
【００４９】
図１３はＤＡの原理を示し、その目的は、グループ手段において大きな違いを示す元のデータにおける構造を見つけ且つ識別することである。このプロセスは、サンプルが類似の特徴を有する演繹的な知識を含み、それ故に外的基準のある分析技術であるといわれる。図面の解釈についての詳細は、本明細書の下記に与えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明は、アレイ上でますます多くの情報を運ぶより大きなアレイを生成するために、アレイ技術における流行を追う。その上、本発明のアレイは複数の核酸分子を含み、該複数の核酸分子は、核酸の少なくとも２つの異なる起源から得られる。本発明のアレイは核酸分子を含むことができ、その特徴（起源、数、長さ）が、単一の分析によって得られうる情報を最大化するために選択される。
【００５１】
典型的に、本発明のアレイは、それら上に少なくとも500,000個のヌクレオチドを含む。好ましくは、該アレイは、それら上にさらに多くのヌクレオチドを運ぶ。好ましい実施態様では、該アレイは少なくとも１つのメガ塩基（106個のヌクレオチド）を含む。好ましくは、それらは、少なくとも２つのメガ塩基を含む。慣用のアレイに反して、１つのスポット当たりの塩基の数は高い、すなわち200〜5000個の間のヌクレオチドである。
【００５２】
アレイ上でヌクレオチドのより多い数の使用はオリゴヌクレオチドの価格を増加させ且つ望ましい配列に関して誤差のためのより大きい傾向を同時にもたらすという上記された欠点は、天然起源、好ましくは生体材料から得られる又は由来する核酸の好ましい使用を介する本発明によって少なくとも一部分は克服される。
【００５３】
サンプル核酸と参照核酸との間の遺伝子比較と一緒に（例えば、同時に、前に又は後に）、少なくとも１つの非核酸に基づくパラメータ（本明細書では、表現型パラメータ又は表現型特徴（例えば、形態学的特徴、生理学的特徴、血清学的特徴若しくは病理学的特徴）が参照核酸の各起源について決定されること、従って該表現型パラメータがハイブリダイゼーションパターンの統計的分類を高めるために及び／又はサンプル核酸の起源に属する表現型パラメータを予測するために使用されることが本発明の特徴である。
【００５４】
本発明の文脈において、形態的特徴は、外部的に観察しうる特徴（例えば、有機体の形状）；特定の生化学物質（例えば、細胞膜ペプチド、色素、（糖）タンパク質、脂質又は細胞壁成分（例えばミコール酸）の所有；特定の受容体の所有又は欠如；胞子又は嚢胞の生産；鞭毛の所有；鎖で若しくは糸状で成長すること、又は他の外部的な特徴（例えば、細胞若しくはコロニー形態）；又は着色特徴（例えば、細菌のグラム反応）をいうと理解される。
【００５５】
本発明の文脈において、生理的特徴は、特定の異化特徴（例えば、タンパク質分解）、若しくは特定の基体（例えば、多糖、タンパク質、脂肪又は核酸）上で成長する能力；特定の栄養要求；特定の代謝経路の所有；酸素への感受性又は抗生物質への感受性；温度又は酸性度依存；特定の代謝最終生産物の生産；バクテリオシン又は抗生物質の分泌；ガスの生産；有機体のエネルギー供給の様式；細胞におけるタンパク質の集団のサイズ、成分若しくは他の特徴（プロテオーム）；又は細胞における低分子有機物質の集団の特徴（メタボローム）をいうと理解される。
【００５６】
本発明の文脈において、血清学特徴は、特定の抗体又はモノクロナールと反応するための能力；特定の表面抗原又はエピトープ（例えば、糖脂質又は糖タンパク質）の所有又は欠如をいうと意味される。
【００５７】
本発明の文脈において、病理的特徴は、細胞を感染させるための有機体の能力：毒素分泌；伝染病が進行する様式；有機体が伝染性又は非伝染性かどうかという事実；溶血特性又は他の病理的特徴（例えば、自然の生息地、又は有機体によって影響される組織若しくは細胞型）をいうと意味される。
【００５８】
本発明は、一般にサンプル核酸を分類するためにディファレンシャルハイブリダイゼーションを使用し、そして有機体を分類し且つ型特定するために全ゲノムディファレンシャルハイブリダイゼーションを特に使用する。１つの実施態様において本発明は、臨床的に関連する特徴（例えば、抗生物質耐性、伝染性、毒性、病原性など）に従い、「新しい」細菌を分類するために細菌の異なる株のプールから複数のランダムゲノムＤＮＡフラグメントのアレイを用いる方法に関する。
【００５９】
従って、本発明は、少なくとも２つの異なる参照核酸の起源が、関心のある少なくとも１つの表現型パラメータの値に基づき少なくとも２つのグループに分けられなければならいことを規定する場合に、本発明の方法は、好ましい実施態様において、耐性及び感受性サブタイプ、伝染性及び非伝染性サブタイプ、侵入性及び非侵入性サブタイプ、感染性及び非感染性サブタイプ、及び／又は環境及び臨床サブタイプの間での識別を可能にする。
【００６０】
少なくとも１つの表現型特徴についての情報を参照核酸の起源に提供する追加的ステップが、本発明の１つの観点において、異なる有機体からなるグループからの例えばゲノムＤＮＡフラグメントの非特異的集団を使用して、例えば該グループ内又は外の未知のメンバーのｇＤＮＡとともに得られるハイブリダイゼーションパターンをクラスタ化しそして分類する方法、及び少なくとも１つの表現型特徴に基づきそれらのクラスタをさらに識別し又は分離しうる方法を提供する。
【００６１】
語  非特異的は、意識的に使用される。なぜならば、本発明のアレイは、アレイ上にスポットされた核酸に関連する核酸の分析のために必ずして適していない分析ツールを提供するが、アレイ上の核酸から分類学的に除去される又は関係しないゲノムの分析を可能にするための基本的に十分な識別力を提供するからである。さらに、アレイの複数の核酸分子のための核酸並びに参照ハイブリダイゼーションパターンのための参照核酸を、サンプル核酸が非常にそれに関連するように（すなわち、そのハイブリダイゼーションは参照パターン間で又はとともにクラスタ化される）選択する際に、最良の結果及び最高の識別力が達成される。
【００６２】
アレイ上の複数の核酸分子は、核酸の少なくとも２つの異なる起源から得られ、好ましくは該複数の核酸分子は、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも５つ、そしてさらにより好ましくは少なくとも８つの異なる起源から得られる。これは、アレイ核酸分子の十分な多様性を提供するためである。アレイ核酸分子に他の必須要件はない。
【００６３】
アレイ核酸分子は、典型的に、有機体の（通常、一重鎖）ゲノムＤＮＡフラグメントであり、従ってアレイ核酸の起源は、典型的に有機体のゲノムである。
【００６４】
核酸の他の起源は、参照ハイブリダイゼーションパターンを生成するために使用される参照核酸の起源である。本発明の方法では、参照核酸の起源は、表現型特徴又はパラメータ（本明細書では、関心のある少なくとも１つの表現型パラメータの値とも名付けられる）に基づきクラスタ内に分離できる。語「値」は、量的な及び質的な値の両方を含む。従って、例えば、アレイは、伝染性細菌株からのゲノムＤＮＡフラグメント並びに非伝染性細菌株からのゲノムＤＮＡフラグメントを含む。本発明の方法は、微生物、特に細菌の迅速な且つ正確な型特定のために非常に適切に適用されうることが、なかんずく今見つけられた。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の場合、非伝染の株から伝染の株を区別することがさらに可能である。
【００６５】
それ故に、本発明の特に好ましい観点では、少なくとも２つの原核生物の株から得られる又は由来する（参照）核酸が、参照ハイブリダイゼーションパターンを生成するために使用される。好ましくは、少なくとも５、そしてより好ましくは少なくとも５０の参照ハイブリダイゼーションパターンが、異なる原核生物の株から得られる又は由来する核酸によって生成され、そしてクラスタ化されうる。特に好ましい実施態様では、本質的に全ての参照ハイブリダイゼーションパターンが、原核生物の株の核酸によって生成される。好ましくは、異なる原核生物の株は、同じ原核生物の属に属する。このようにして、ある原核生物の属から由来する核酸のそれへの存在のためにサンプルを型特定することを可能にする。より好ましくは、異なる原核生物の株は、同じ原核生物の種に属する。このようにして、特定の原核生物の種のある株から由来する核酸のそれへの存在のためにサンプルを型特定することを可能にする。
【００６６】
この特に好ましい実施態様は好ましくは、参照及びサンプルハイブリダイゼーションパターンを比較するために統計解析と組み合わされる。このように、サンプルにおける原核生物が、或る原核生物の種の全てではないが幾つかの株の或る表現型特徴又は遺伝子型の関連性を含む可能性を決定することが可能である。原核生物の核酸はＲＮＡから得られうるが、好ましくは原核生物のＤＮＡから由来する又は得られる（すなわちゲノムから得られる）。従って、本発明の好ましい実施態様では、核酸分子は原核生物のＤＮＡから得られる。
【００６７】
参照ハイブリダイゼーションパターンは、本発明のアレイを参照有機体とハイブリダイゼーションすることによって典型的に得られ、典型的に１つの有機体は、１つの参照ハイブリダイゼーションパターンを生じる。好ましくは、同じ種の有機体間の関係を決定するために、該少なくとも２つの異なる参照核酸及びサンプル核酸が、同じ種の異なる株から得られる。１つの実施態様において、本発明は、有機体（すなわち、試験有機体）のゲノムＤＮＡを分類する方法であって、前記有機体のＤＮＡを無作為に選択された多くのゲノムＤＮＡフラグメントを含むＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションすることを含み、該ゲノムＤＮＡフラグメントは、前記参照有機体間で前記有機体のゲノムＤＮＡを分類するために、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも８つの異なる参照有機体の混合物から得られるところの方法に関する。
【００６８】
本明細書で使用される場合、語  有機体は、微生物、植物及びヒトを含む動物を含む。本発明の方法に付される好ましい有機体は、微生物及びヒトである。植物又は動物の場合、該方法は、前記植物又は動物の体液又は組織のサンプル上で非常に適切に実行されうる。微生物の場合、該方法は、前記微生物の１以上の細胞上で非常に適切に実行されうる。本発明の文脈おいて微生物は、ウィルス、細菌、酵母、真菌及び寄生体、特に原核生物、好ましくは細菌、最も好ましくは感染症を引き起こす細菌を含む。
【００６９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡアレイは、約1,000〜約10,000、好ましくは約1,500〜約5,000、最も好ましくは約1,800〜約2,400、さらにより好ましくは約1,900〜約2,200の無作為に選ばれたゲノムＤＮＡフラグメントを含む。
【００７０】
好ましい実施態様では、無作為に選ばれたゲノムＤＮＡフラグメントは、約500〜約5,000、より好ましくは約1,000〜約2,000、より好ましくは約1,300〜約1,800、より好ましくは約1,400〜約1,600ヌクレオチドの長さを有する。従って、最も好ましい実施態様では、本発明の方法において使用されるＤＮＡアレイは、約３メガ塩基を含む。
【００７１】
他の実施態様では、本発明は、微生物を型特定する方法に関する。
【００７２】
本発明の方法は、多くの数（約1000〜約10,000、好ましくは約1,500〜約5,000、最も好ましくは約1,800〜約2,400、さらにより好ましくは約1,900〜約2,200）の無作為に選択されたゲノムＤＮＡフラグメント（好ましくは、約500〜約5,000、より好ましくは約1,000〜約2,000、より好ましくは約1,300〜約1,800、より好ましくは約1,400〜約1,600ヌクレオチドの長さを有する）を含むＤＮＡアレイを使用し、該ゲノムＤＮＡフラグメントは、微生物のゲノムＤＮＡを分類するために、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、例えば５、６又は７、さらにより好ましくは少なくとも８つの異なる微生物の混合物から得られる。該混合物は、微生物の様々な株、好ましくは微生物の異なる株、及び微生物（好ましくは細菌）の同じ種のｇＤＮＡプールを適切に表しうる。
【００７３】
本発明の方法は好ましくは、ハイブリダイゼーションによって、他の有機体における比較の（すなわち相補的な）ＤＮＡ領域の存在又は不存在を調査する又は決定するために全ゲノムアレイを使用する。先行技術方法と対照的に、本発明は好ましくは、アレイ上の核酸分子として所謂オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）プローブを使用しない。そのようなプローブは、特定の遺伝子のフラグメント、又は単一の有機体若しくは有機体の唯一のグループのｇＤＮＡフラグメントから得られ、そしてそれのみを検出する。代わりに、本発明は好ましくは、二重鎖ｇＤＮＡフラグメントを得るために、消化されたゲノムＤＮＡを使用し、次に該フラグメントは好ましくは、本発明のアレイの構築のために適切な複数の核酸分子を形成するために組み合わされうる一重鎖ランダムｇＤＮＡプローブとして役立つために変性される。原核生物のＤＮＡを型特定するための本発明の方法の他の好ましい実施態様では、先行技術方法を超える更なる改良が、様々な及び異なる株のｇＤＮＡプールから得られるランダムゲノムＤＮＡフラグメントのアレイを提供することによって実現される。単一の実験又はアッセイを用いて、該関係が、試験有機体と、定義された分類学的範囲を有する及び／又は定義された表現型特徴を有する参照有機体のグループとの間で確立されうることが、有利点を有する。
【００７４】
本発明は、有機体における多重遺伝子特徴の研究を今、結局のところ可能にする。従って、本明細書で記載された手法は、有機体の（例えば、それらの遺伝的基礎にかかわらず試験有機体の抗生物質耐性のような）表現型特徴の分類の取り込みを支援し又は可能にする。従って、本方法を微生物の分類に適用し、且つ前記微生物のための少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータ（例えば、抗生物質耐性又は伝染性）を含む場合、それは、２つの間の任意の原因となる関係に関係なく、種を分類する遺伝的特徴のみだけでなく、その種の組み合わされた遺伝的及び表現型特徴である。
【００７５】
アレイ上に存在する配列の詳細な知識を有することは必要でない。本発明において、パターンが互いに比較される。
【００７６】
少なくとも２つの異なる起源（有機体）のゲノム幅表現を含むアレイを構築するための適切な方法は、少なくとも２つの有機体（例えば、特定の種の細菌株）のｇＤＮＡを混合することによって少なくとも２つの有機体の混合されたゲノムライブラリーを構築することによって開始されうる。任意的に、必ずしも必要ではないが、表現型パラメータ（例えば、細菌の場合、抗生物質の広いセットに対する耐性の異なるプロファイル、好ましくは抗生物質耐性のほとんどの型を一緒にカバーする）の異なる値を夫々示す有機体が選択される。好ましくは、有機体は、それらの単離されたｇＤＮＡのアガロースゲル分析において有意なプラスミドバンドを含まない。次に、該ｇＤＮＡ混合物は断片化されることができ（例えば、音波処理によってばらばらにされる）、そして該フラグメントは例えばアガロースゲルにおいて分離される。次に、適切なサイズ（好ましくは、約1〜3kb）のＤＮＡフラグメントが、（例えば、ゲルから切除され、そして固体担体（例えば、ガラスミルク）への結合によって）単離されうる。ｇＤＮＡフラグメントの適切な数はgＤＮＡ混合物から無作為に回収され、そしてこの数は、約1,000〜約10,000、好ましくは約1,500〜約5,000、最も好ましくは約1,800〜約2,400、さらにより好ましくは約1,900〜約2,200の無作為に選択されたゲノムＤＮＡフラグメントの範囲でありうる。多数の有機体のｇＤＮＡ混合物の効果は、そこからＤＮＡフラグメントを単離すると、様々な有機体からのフラグメントのランダムプールが得られ、それは該アレイを構築するために使用されるということである。
【００７７】
無作為に選択された単離されたフラグメントは好ましくは、材料の適切な在庫を用意するためにさらに増加される。フラグメントの増加は例えば、下記実施例１に記載されたように、クローニング及び核酸増幅技術の組み合わせによって実行されうる。次に、二重鎖ｇＤＮＡフラグメントは、例えばＰＣＲ増幅反応（ここで、プライマーの１つ又は両方は、Ｃ６−リンカーを介して該プライマーの５’末端に結合された遊離のNH2基を含む）を実行することによって、アレイ表面上にそれらを固定化することを可能にするために末端修飾されうる。
【００７８】
次に、無作為に選択された単離された及び任意的に増幅されたgＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡマイクロアレイを提供するために、表面上にスポットされうる。フラグメントのカップリングを容易にするためにアレイの表面（例えばスライド、その表面は、なかんずくガラス、金などでありうる）が修飾されうる。スポッティングは、利用可能な任意の方法によって、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）マイクロアレイプリンティングを使用することによって生じうる。該フラグメントのスポッティング後、該スライス表面は、核酸の更なる付着を防ぐために、例えばホルムアルデヒド修飾されたガラススライド表面の場合、ボロ無水物（boro-anhydride）での処理によって、ブロックされうる。
【００７９】
個々の有機体の元のｇＤＮＡ材料の一部は、アレイとハイブリダイゼーションされうる材料を提供するために、すなわち参照核酸を提供するために使用される。成功したハイブリダイゼーションの検知を容易にするために、該ｇＤＮＡは、好ましくは蛍光的に（例えば、Ｃｙ（商標）ラベル[Amersham Pharmacia Biotech]を使用することによって）、適切にラベル付けされる。蛍光ラベル付けキットは、様々な製造者から商業的に入手可能である。
【００８０】
サンプル核酸の平均サイズは、アレイ上でのシグナル分布に対する影響を有する。より大きいサンプル分子はより大きい情報を含み、従って、スポットのより多くにおいて適切なハイブリダイゼーションパートナーを見つける可能性がありそうである。サンプル核酸の平均サイズを減少することは、この現象を減少しうる。他方、サンプル核酸があまりにも小さい場合、サンプルにおける核酸フラグメントは、あまりにも小さな遺伝子情報を含み及びまた多くのスポットにおいて適切なハイブリダイゼーションパートナーを見つける。サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズは好ましくは、約50〜5000の間のヌクレオチドである。より好ましくは、サンプル核酸におけるフラグメントの平均サイズは、約50〜1000の間のヌクレオチド、より好ましくは約50〜500の間のヌクレオチドのサイズを含む。
【００８１】
サンプル核酸は好ましくは、全サンプルゲノムを表わす。アレイ上のサンプル核酸を用いて得られたハイブリダイゼーションパターンは、参照ハイブリダイゼーションパターンと比較される。参照ハイブリダイゼーションパターンは、例えば参照サンプルの核酸組成の知識（例えば、有機体のゲノム配列が知られているところの有機体のゲノム配列）を使用することを介して人工的に生成されうる。しかしながら、好ましい実施態様では、参照ハイブリダイゼーションパターンは、参照核酸をアレイとハイブリダイゼーションすることによって生成される。サンプルハイブリダイゼーションパターンの該参照との比較は、サンプル核酸が参照核酸と同じ又は類似であるかどうかを決定するために少なくとも使用されうる。当業者が例えばサンプル核酸が特定の原核生物を含むかどうかを決定するために必要とされる場合に、これは有用である。この設定では、参照ハイブリダイゼーションパターンは特定の原核生物の核酸を用いて生成され、及びサンプルハイブリダイゼーションパターンが参照ハイブリダイゼーションパターンと基本的に同じである場合に、該サンプルは特定の原核生物を含むとして識別される。本発明の方法では、サンプルハイブリダイゼーションパターンは、少なくとも１つの他の参照ハイブリダイゼーションパターンと比較される。このように、該サンプルは、少なくとも２つの異なる参照核酸と比較される。もちろん、アレイの継続的使用をすると、ますます多くのパターンが生成され、そしてこれらの全ては、サンプル核酸と比較するために使用されうる。したがって、一旦パターンがサンプル核酸を用いて生成されれば、このパターンは後の実験において、参照ハイブリダイゼーションパターンとして使用されうる。従って、好ましい実施態様では、本発明の方法は、ハイブリダイゼーションパターンを、少なくとも２、そして好ましくは少なくとも５の参照ハイブリダイゼーションパターン、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００の参照ハイブリダイゼーションパターンと比較することをさらに含む。
【００８２】
本発明のアレイはプローブ核酸における特定の配列を識別し、従って１つ又は少数のスポットにおけるシグナルに基づいてプローブ核酸を型特定するために使用されうるけれども、アレイの完全な真価は、該スポットにおいて得られた全てのシグナルの解釈にある。この解釈は当業者によって行われうるが、統計的ソフトウェアを使用して、コンピューターによって典型的に行われる。サンプルハイブリダイゼーションパターン及び参照ハイブリダイゼーションパターンは、アレイから得られたシグナルのサブセットでありうる。パターンは1つのシグナルからなりうる；好ましくは、該パターンは、アレイへの下記ハイブリダイゼーションから得られたシグナルの少なくとも２０％からなる。より好ましくは、該パターンは、アレイからのシグナルの少なくとも５０％からなる。特に好ましい実施態様では、該パターンは、アレイのシグナルの少なくとも８０％を含む。
【００８３】
本発明の方法は、サンプル核酸が特定の参照核酸と同じであるかどうかを決定するためにのみ使用されえない。特に、原核生物の核酸がサンプル核酸として使用される場合、サンプルハイブリダイゼーションパターンは、任意の参照ハイブリダイゼーションパターンとたまたま異なりうる。本発明の方法及びアレイの特に有用な特徴は、またこの場合、本発明の方法が有用な情報を提供しうるということである。サンプル核酸がそれから由来する又は得られるところの有機体と関連付けられる表現型特徴は、多数の異なる配列及び／又は遺伝子の相互作用の結果で非常にしばしばありうる。これらの状況において、１以上のスポットにおいて得られたシグナルに基づいて特定のサンプルを型特定することは可能でない。それどころか、非常に多くの異なるスポットのシグナルが比較される必要がある。本発明の方法及びアレイは、この種の分析のために特に適している。この目的のために、参照ハイブリダイゼーションパターン及びサンプルハイブリダイゼーションパターンが、統計ソフトウェアを使用して解析される。１つの実施態様では、本発明の方法は、サンプル核酸によって生成されたパターンと一緒に、参照ハイブリダイゼーションパターンの外的基準のない多変量解析（ＰＣＡ）をさらに含む。この解析に基づいて、パターンがｎ次元値（ｎは、解析に含まれるデータポイントの総数を表す）を与えられ、それはその基本的な成分に、好ましくは２に減少されることができ、これら成分は多次元視覚化において、好ましくは２次元視覚化において視覚化されうる。成分の該次元値は全てのパターンのためにプロットされることができ、それは、パターンの好ましくは２次元値のグループ化又はクラスタ化が調べられうるとところの解析に含まれる。好ましい実施態様では、サンプルハイブリダイゼーションパターンの二次元値は、参照ハイブリダイゼーションパターンの全ての二次元値と比較される。このように、該含まれる参照と比較して、サンプル核酸がそれから得られる又は由来する有機体の関連性の統計的推定を提供することが可能である。
【００８４】
語「クラスタ化」は、同じ又は類似の特徴をクラスタ又はクラスタ項目内に集めること（collecting）、結集すること（assembling）、又は結合すること（uniting）の活動をいい、「クラスタ」は、集められた又は互いに近くで生じる同じ又は類似の項目のグループ又は数をいう。「クラスタ化された」は、項目がクラスタ化に付されたことを示す。本発明の方法において使用されるクラスタ化の過程は、測定可能なパラメータからのデータを通じて、手によって又は眼によって又は特徴、属性、特性、質、効果などにおける類似性のための項目を比較するために知られた何らかの（数学的）過程によって行われうる。統計解析が使用されうる。
【００８５】
ハイブリダイゼーションパターンが参照及び／又はサンプル核酸がそこから得られる又は由来するところの有機体上のさらなる情報を用いて拡張されることが本発明の特徴である。例えば、パターンは、核酸ハイブリダイゼーションと異なる方法において決定されるパラメータを用いて拡張されうる。例えば、原核生物が研究の目的である場合、原核生物の抗生物質耐性表現型を知ることはしばしば重要である。この耐性パラメータは、統計解析に追加されうる。このパラメータの値（耐性若しくは耐性でない、又は更なる微調整）は、該パターンに又は該パターンの統計解析に追加されうる。引き続き、クラスタ化はこの追加のパラメータに基づきうる。従って、本発明によれば、少なくとも１つの非核酸に基づく（すなわち表現型）パラメータが、参照ハイブリダイゼーションパターンの起源であった有機体について決定される。引き続き、統計解析が、サンプル核酸の起源であった有機体のこのパラメータの値を決定するために又は推定するためにに使用されうる。好ましい実施態様では、本発明の方法は、サンプル核酸によって生成されたパターンと一緒に参照ハイブリダイゼーションパターンの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）をさらに含み、その値が参照ハイブリダイゼーションパターンについて知られていることろの少なくとも１つのパラメータがＰＬＳ−ＤＡ分析を監督するために使用される。
【００８６】
部分最小二乗法（ＰＬＳ）
部分最小二乗法（ＰＬＳ）は、文献（P. Geladi and B. R. Kowalski, Partial Least Squares Regression: A Tutorial, Analytica Chimica Acta, 第185巻, 1986年, 第1-17頁、H. Martens and T. Naes, Multivariate Calibration, John Wiley & Sons, Chichester,1989年）において広く記載されている。主成分分析（ＰＣＡ）モデルは記述的性質を有する一方、ＰＬＳモデルは予測的性質を有する。ＰＬＳでは、スコア×ローディング対（潜在的変数（ＬＶ）とも呼ばれる）が予測するデータセットにおいて、説明された変数を最大化するためだけでなく、予測されるべきデータを有する共分散を最大化するためにまた計算されない。ＰＬＳモデルは、式（１）及び式（２）によって数学的に要約されうる。
【００８７】
2007534334.tif 000004
【００８８】
行列Ｘ（Ｘ−ブロックとも呼ばれる）は独立変数のｎ×ｐ行列（例えば、クロマトグラムあたりのｐリテンション時間を有するｎクロマトグラム）を表し、行列Ｙ（Ｙ−ブロックとも呼ばれる）は従属変数（例えば、濃度）を含むｎ×ｑマトリックスであり；ＰＴ及びＱＴは、夫々従属及び独立変数ローディングを含む、Ｓ×ｐ及びＳ×ｑ転置行列であり；Ｔは、Ｓ潜在スコアのｎ×Ｓ行列であり、ＢはＹ−データのスコア上でＸ行列のスコアの回帰を表すＳ×Ｓ行列であり；Ｅ及びＦは、夫々独立及び従属変数の残余を含むｎ×ｐ及びｎ×ｑ行列である。
【００８９】
Ａ  ＬＶを抽出後、標準誤差（ＳＥＶ）が、式（３）から計算される。
【００９０】
2007534334.tif 000005
ここで、Ｉｃは検量サンプルの数であり、yi,jはオブジェクトｉにおける成分ｊの濃度の真の値であり；Yj,iはyijのＰＬＳ予測値であり；qはＹ−変数の数である。ＬＶの抽出は、ＳＥＶが有意に改善される限り続けられる。
【００９１】
選択されたＬＶの数は、関心のある変数の最適な予測を生じなければならない。しかしながら、変数と偏り（又は適合）との間のペイオフがある：あまりにも複雑なモデルは十分に適合するが、非常に貧弱に予測しうる。これは、最適なモデル複雑性の概念をもたらす：適合と変数との間の最適なバランスが得られる。すなわち、該モデルの増加された複雑性がデータにおけるより多くの特徴を適合することが一般にできるが、推定されたパラメータの変数が上昇し、そして全結果が最適なモデル複雑性で最小値を達成する。
【００９２】
ＸとＹとの間の純粋な線形関係は、通常２〜５のＬＶを有する単純なモデルをもたらすだろう。複雑な非線形の関係がまた、モデル化されうる。しかしながら、これらは、ＹをＸに関連付けるために有意により多くのＬＶを取り上げるだろう。
【００９３】
部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）
ＰＬＳ−ＤＡにおいて、クラス（予め定められたグループ）は、従属変数として使用される。Ｙ−ブロックＹは、クラスのn×数の行列である。Ｙ−ブロックは、０及び１で満たされる。
【００９４】
例えば:
2007534334.tif 000006
【００９５】
各サンプルがＰＬＳに属するクラス上に依存する０及び１で満たされるＰＬＳにおけるＹ−ブロックを使用することは、ＰＬＳを判別分析に変える。ＰＬＳ−ＤＡの代わりとして、データセットの分類のために最近発展した解析ツールの任意の１つ、例えばnearest shrunken centroid（NSC）、サポートベクターマシン（SVM）又はPenalized Logistic regression（PLR）方法が使用されうる。
【００９６】
主成分判別分析（ＰＣ−ＤＡ）
関心がサンプルのグループ間の相違に合わされた場合、判別分析（ＤＡ） [D. L. Massart, B.G.M. Vandeginste, L. M.C. Buydens, S. De Jong, P. J. Lewi and J. Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part A, Elsevier, Amsterdam, 1997年; B.G.M. Vandeginste, D.L. Massart, L.M.C. Buydens, S. De Jong, P.J. Lewi and J. Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part B, Elsevier, Amsterdam, 1998年]が適用される。該技術は、同じグループのサンプルが他のグループのサンプルと比較して、より類似しているという仮定に基づく。ＤＡの目的は、グループ手段において大きな違いを示す元のデータにおける構造を見つけ且つ識別することである。このプロセスは、そのサンプルが類似するところの演繹的な知識を含む。それ故に、ＤＡは外的基準のある（supervised）分析技術であるといわれる。これは、それを、サンプルについて演繹的な知識を要求しない他の外的基準のない技術（例えば、主成分分析（ＰＣＡ））と区別する。
【００９７】
ＤＡにおける第一歩は、これらの新しい変数の最小数によって測られたスペースにおける元のサンプルの投射がグループ手段間の相違を最大化するように、元の変数を相互に独立した新しい変数のセットに結合することである。この原理は図１３において示される。サンプルの２つのグループが、２つの変数Ｘ１及びＸ２で測定される。主成分（ＰＣ）最大分散基準を使用して、これらのサンプルが、図１３において線Ｐによって示されるサンプルを介して線上に投射されるべきである。サンプルの異なるクラスタ間を区別するために、これは最適な解決法でない。しかしながら、線Ｄ上のサンプルの投射は、２つのクラスタ間の完全な分離を示す。計算された係数は、判別式軸すなわちＤ軸と呼ばれる。他のすべての投射は、サブの最適な解決法を与える。これは、Ｄ線上のサンプルの投射をＸ１又はＸ２軸上のそれと比較することによって、図１３において示される。
【００９８】
ＤＡは、サンプルのグループ間の相違を最も効率的に記述する。しかしながら、変数の数は、サンプルの数と比較してしばしば大きい。これは、解決法を悪化させることを生じうる。例えば、３つのサンプルは、それらの類似性の独立した２つの変数によって常に分離されうる。より多くのサンプルが含まれる場合、この悪化効果は消えるだろう。一般的な経験則は、サンプルの数が変数の数の少なくとも４倍であるべきということである。例えば、この規則は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルの試験において問題をもたらしうる。天然物の分析では、ＮＭＲスペクトル当たりのピークの数（変数）が、ほぼ数百程度で一般にある。正常な環境下で、これは、当業者が少なくとも400〜800のサンプルを測定すべきであることを意味するだろう。実際上、これは決して生じない。これに基づき、天然物のＮＭＲスペクトル上でＤＡを行なうことが不可能であろう。しかしながら、この問題に対する解決法がある。Hoogerbrugge等[R. Hoogerbrugge, S. J. Willig and P.G. Kistemaker, Discriminant Analysis by Double Stage Principal Component Analysis, Analytical Chemistry, 第55巻, 1983年, 第1710-1712頁]は、変数の数が最初にＰＣＡ、次に第１ＰＣ軸上のサンプルのスコア上のＤＡによって減少されるところのスキームを開発した。この技術は、主成分判別分析（ＰＣ−ＤＡ）と呼ばれる。含めるべきＰＣの正確な数を決定することは困難である。該数は、あまりにも小さくないべきである。なぜならば、最初の少数だけを含むことは、多くのグループ間情報の損失を生じうるからである。該数はまた、あまりにも大きすぎないべきである。なぜならば、それは、４によって割られたサンプルの数の規則を超過するだろう。それ故に、４で割られたサンプルの数の最大まで有意な量の分散（例えば、元の分散の１％より上である）を説明する全てのＰＣを含むことが望ましく見える。これらＰＣによって説明された分散の総量が非常に低い場合、次に該数は常に増加されうる。しかしながら、説明された分散が低い場合、元の分散間の相関性がまた低いだろう。結果として、ＤＡが元の問題と同様に複雑である結果を生成するだろう。
【００９９】
ＰＬＳ−ＤＡ分析において使用されるパラメータは好ましくは、表現型パラメータである。語「表現型パラメータ」は、有機体又は有機体の機能的部分によって示される又は発現される何らかの特性を記述する任意のパラメータを定義するために本明細書において使用される。この分析に基づき、パターンが、好ましくは２次元視覚化において表現型特徴との最適な相関のためのその（好ましくは２つの）主要成分に減少されうるｎ次元値（ｎは分析において含まれるデータポイントを識別するための総数を表す）を与えられる。パターンの好ましくは２次元値のグループ化又はクラスタ化が調べられうると、この好ましい二次元値は、分析に含まれる全てのパターンについてプロットされうる。好ましい実施態様では、サンプルハイブリダイゼーションパターンの二次元値は、参照ハイブリダイゼーションパターンの全ての二次元値と比較される。このように、サンプル核酸が得られる又は由来する有機体が或る表現型パラメータを含むかどうかという可能性の統計的推定を提供することを可能にする。この表現型パラメータは、参照核酸がそれから得られる又は由来するところの有機体について知られていることを、これは勿論必要とする。好ましい実施態様では、参照ハイブリダイゼーションパターンの二次元値が、外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析に基づきクラスタ化される。
【０１００】
クラスタ化は好ましくは、サンプルハイブリダイゼーションパターンがそのために調査される表現型パラメータに基づいて行われる。クラスタ化は好ましくは２つのクラスタをもたらし、１つのクラスタはある表現型を有し及び他は有していず、違うようにいうと、２つの異なる参照核酸の起源は、１つの表現型パラメータの値に基づいて２つのクラスタ内に分離可能である。従って、サンプルハイブリダイゼーションパターンは、ある表現型を有しているか又は有していないかとして容易に識別されうる。本発明の方法は好ましくは、クラスタにおける存在又は不存在に基づき前記サンプル核酸を型特定することをさらに含む。この型特定が典型的に、分類についての誤差の統計的マージン、すなわちサンプル核酸が或る表現型特徴を有している又は有していないとして誤って分類される統計的機会に関連付けられている。該クラスタの境界は、誤差のより小さい又はより大きい統計的機会を提供するために設定されうる。好ましい実施態様では、該パラメータは、抗生物質耐性、伝染性特徴、病原性、毒性、共生、熱耐性、ｐＨ許容、残存、細胞死、及び潜在的な関心のある他の特徴を含む。
【０１０１】
同様の手法が、多種多様の核酸のために追随されうる。上記されたように、アレイは好ましくは、天然起源から得られる又は由来する核酸から生成される。この起源は、ウィルス、微生物、動物又は植物起源でありうる。真核生物起源の場合、反復核酸がアレイを生成する前に少なくとも部分的に除去されるように、有機体からの核酸が或る種の選考システムを介して最初に置かれることが好まれる。このように、アレイは多くの冗長な情報を含むことが防止される。これを達成するための１つの方法は、真核生物における機能的ＲＮＡをコードする配列を選択することである。この所謂コード核酸は典型的に、反復の核酸をもしあればほとんど含まない。代替的に、選択は他の方法に基づく。唯一の配列について豊かにするための１つのそのような他の方法は、反復核酸が好ましくはハイブリダイゼーションされる条件下（Cotカーブを利用する）で真核生物の有機体からの核酸をハイブリダイゼーションすることである。一重鎖核酸が増幅され及び／又はクローニングされうると、ハイブリダイゼーションされた核酸が一重鎖核酸から分離されうる。好ましい実施態様では、該起源は単純な真核生物、好ましくは単細胞真核生物である。これらの起源はより単純なゲノムを含み、従ってそれほど余分でない核酸を含む。特に好ましい実施態様では、該起源は原核生物である。原核生物は余分の核酸をほとんど含まず、従って特別の選択工程が効率的なアレイを生成するために実行される必要がない。原核生物の特別の実施態様では、原核生物の先祖に由来すると考えられる核酸を含む真核細胞細胞器官が、アレイ構築のための核酸の起源及び／又はサンプル核酸として使用される。
【０１０２】
本発明の方法の重要な利点は今、有機体が最初に分類学的に分類され（例えば識別され）、次に識別された種に属する臨床的に関連するパラメータが、例えば既知の参照株に対するデータのリストとの比較に基づき決定されうることが必要ないことである。従って、種決定が、例えばある抗生物質に対する試験有機体の感受性（若しくは耐性）の存在又は何らかの他の臨床的に関連するパラメータを決定するために要求されないことが本発明の有利点である。これは、そのような情報がアレイの複数の核酸分子”内”に今用意されるという事実によって達成される。
【０１０３】
本方法は、ヒトのための医学的診断手続きにおける支援として例外的に十分に適している。本発明の方法は、例えば個々間の相違の包含及び、特に臨床的に関連するパラメータ（例えば、癌の傾向及び／又はそのような診断手続きにおける憂鬱）の包含を可能にする。
【０１０４】
本発明の方法では、サンプル核酸は好ましくは、参照ハイブリダイゼーションパターンを生成するために使用される有機体、属、種又は株として同じ有機体、属、種又は株から得られる核酸を含む。パターンを生成するために使用されるサンプル及び／又は参照核酸は、それから由来する又は得られる有機体、属、種、又は株の核酸のサブセットを含みうる。しかしながら、好ましくは、真核生物起源のために述べられたそれら以外の選択は実行されない。いかなる場合でも、好ましくは、選択は、サンプル及び参照核酸について同じ又は類似である。これは、参照ハイブリダイゼーションパターンとサンプルハイブリダイゼーションパターンとの容易な比較を可能にする。
【０１０５】
語「から得られる又は由来する核酸」では、アレイ上にハイブリダイゼーションするために使用される核酸が起源から直接的に得られることが必須でないことが意味される。それは、ハイブリダイゼーションのための使用の前に、クローニング、選択及び他の操作を経験したかもしれない。サンプル核酸及び参照核酸は例えば、クローニングされたライブラリー、例えば発現又はゲノムライブラリーから得られうる。代替的に、サンプル及び参照核酸は、例えば進行中のゲノム効果の結果として、データベースにおける核酸情報に基づき、スクラッチから生成されうる。
【０１０６】
しかしながら、好ましくは、サンプル及び参照核酸は、天然起源から直接的に又は増幅を介して得られる。サンプルは、例えば複数の微生物を含む叢（flora）から得られたサンプルの場合、有機体の混合物を含みうる。この場合、様々な微生物叢から生成された参照ハイブリダイゼーションパターンが、それに対して又はそれとサンプルハイブリダイゼーションパターンを比較するために使用されうる。上記されたように、天然起源は好ましくは、原核生物起源である。好ましくは、サンプル及び参照ハイブリダイゼーションパターンが原核生物の単培養から開始して生成される。このように、１つの有機体のみがアレイ上で分析され、及び同時に、生成されたパターンが原核生物株から生成されたパターンであることが保証される。
【０１０７】
１つの好ましい実施態様では、本発明は、その様々な観点において、複数の核酸分子を含むアレイを使用し、該核酸分子は約200〜5000の間の平均サイズのヌクレオチドを含む。好ましくは、核酸分子は、約200〜5000の間の平均サイズのヌクレオチドを含む。本発明のアレイは好ましくは、その上に少なくとも500,000のヌクレオチドを含む。好ましくは、該アレイは、その上にさらに多くのヌクレオチドを運ぶ。好ましい実施態様では、該アレイは少なくとも１メガ塩基（106ヌクレオチド）を含む。好ましくは、それらは少なくとも２メガ塩基を含む。慣用のアレイとは反対に、１スポット当たりの塩基の数は高く（すなわち２００ヌクレオチドよりも多い）、好ましくは塩基の数は200〜5000の間のヌクレオチドである。好ましくは、前記複数の核酸分子は、天然起源から得られる。好ましくは、前記複数の核酸分子は、原核生物のＤＮＡから得られる。それにもかかわらず原核生物の異なる株（一方、同じ種に属する）は、それが運ぶＤＮＡの種類において非常に変わりうることが見つけられた。
【０１０８】
従って、好ましい実施態様では、本発明の観点において使用されたアレイは、原核生物の（好ましくは同じ種の）少なくとも２つの異なる株から得られる複数の核酸分子を含む。このように、該アレイは、原核生物種の全遺伝的多様性のより多くの表現である。特に好ましい実施態様では、該アレイは、原核生物の（好ましくは同じ種の）少なくとも３つの異なる株から得られる複数の核酸分子を含む。該アレイにおける複数の核酸を生成するために原核生物種の株の数を増加させることによって、該アレイは、原核生物種の完全な遺伝的潜在性をますます模倣し、従って型特定がますます有益になる。これは、異なる原核生物株の減少された数を運ぶアレイを用いて型特定することは有効な手法でないことを意味しない；それは、予測及び推定がより正確且つ完全になることを単に意味する。
【０１０９】
上記本明細書でより詳細に記載されているアレイそれ自体は、本発明の観点として検討される。
【０１１０】
本発明の他の観点は、部分のキットであって、該キットは、上記本明細書で定義された少なくとも２つの異なる参照ハイブリダイゼーションパターンと一緒に、上記本明細書においてまた定義されたアレイの組み合わせを含み、該ハイブリダイゼーションパターンは、サンプル核酸の各分析を可能にするために、例えばコンピューター読み取り可能な形式において提供されうる。
【０１１１】
本発明は、下記の制限しない実施例にって今示されるだろう。
実施例
【実施例１】
【０１１２】
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のないＰＣＡ分析による、黄色ブドウ球菌のクラスタ化
31個の異なる黄色ブドウ球菌株の一組の蛍光的にラベル付けされたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が、８個の異なる黄色ブドウ球菌株の混合物の無作為的に選択されたｇＤＮＡフラグメント（ほぼ2100個のフラグメント／アレイ、ほぼ1500 bp／フラグメント）を用いて覆われたアレイと別々にハイブリダイゼーションされた。各試験された株についてゲノムＤＮＡフラグメント当たりハイブリダイゼーションシグナルのリストを生じた蛍光ハイブリダイゼーションパターンが、数値化された。より詳細には、各アレイは２個のラベル付けされたｇＤＮＡと同時にハイブリダイゼーションされた：１つは、調査下の特定の黄色ブドウ球菌株に関し（Cy5でラベル付けされた）、及び他は、全ての個々のスライド上で作成されたハイブリダイゼーションを正規化するための参照として役立つアレイを作成するために使用された８個の黄色ブドウ球菌の標準混合物に関する（Cy3でラベル付けされた）。引き続き、データ分析は、データのフィルタリング、正規化、そして切り捨て処理、引き続き主成分分析（ＰＣＡ）を含んだ。これは、全ゲノムディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく類似の黄色ブドウ球菌株のクラスタ化をもたらす。再現性が、幾つかの株について２回のハイブリダイゼーションによって示された。
【０１１３】
異なる細菌株の一組
31個の黄色ブドウ球菌の一組が、実施例１のために使用された（図１）。該セットは、30個の病院単離物及び型特定株集合物からの１個の参照株（図１、TTC.03.151株）からなる。それらのリボソームＤＮＡの部分のRiboPrint（商標）（DuPont Qualicon, Wilmington, Del.、米国特許明細書）分析（DuPont Qualicon, 3531 Silverside Rd, Bedford Building, Wilmington, DE 19810）は、該セットの異なる株間の関係の様々な程度を示した（図１）。
【０１１４】
黄色ブドウ球菌株の成長及びｇＤＮＡ単離
黄色ブドウ球菌単離物は、ＴＳＡ−寒天プレート及び／又はＴＳＡ培地（一晩、３７℃）上で（単一コロニーを介して）成長され、そしてグリセロール培養物として保管された（-80℃）。ｇＤＮＡ単離のために、プレート成長した細菌（例えば、10〜20のコロニーの量）が、2 mlバイアル中の400μｌ TE-バッファ（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5）内に再懸濁された。該細胞は400μl水洗された0.1mmジルコニウムガラスビーズ懸濁液（Biospec Products,Inc., Bartlesville,、オクラホマ州、米国）を添加することによって溶解され、氷上で予め冷やされ、細胞破壊機（minibeadbeater 8, Biospec Products, Inc）において、120秒間、中レベルで振とうされ、そして氷上で冷却された。遠心分離（5分、14 krpm、4℃）後、ｇＤＮＡが、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出（室温）、クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出（室温）によって標準手順(Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989年). Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Habour Laboratory Press、ニューヨーク)に従い透明な溶解物から単離され、エタノール／酢酸ナトリウムを用いて沈殿し（−20℃、４℃で回転）、70％エタノールを用いて洗浄し（−20℃、４℃で回転）、乾燥し（真空）、RNAseA（１〜100μg/ml）を有する100μl TE-バッファ内にペレットを溶解し、そして0.6％アガロースエチジウムブロミド染色されたゲル上のｇＤＮＡ量（例えば、１〜5μｌ調製物／スロット）を半数値化した。
【０１１５】
黄色ブドウ球菌ｇＤＮＡアレイ（スライド）の構築
種  黄色ブドウ球菌のゲノム全体に渡る表現を含むアレイを作るために、有機体の混合ゲノムライブラリーが、８つの黄色ブドウ球菌株のｇＤＮＡを混合することによって作られた（株選択のために、図３を参照）。（ａ）（抗生物質耐性のほとんどの型を一緒にカバーする）抗生物質の広いセットに対する各異なるプロファイルを示した株、及び（ｂ）それらの単離されたｇＤＮＡのアガロース−ゲル分析において有意なプラスミドバンドを含まなかった株が選択された。ｇＤＮＡ混合物は、音波処理（Branson sonifier 450, Branson, Danbury、コネチカット州、米国）によって剪断され、そして0.8％のアガロースゲルのいくつかのレーンにおいて単離された。ＤＮＡフラグメント（およそ1〜3 kb)が、ガラスミルク（Bio101-kit, Qbiogene, Irvine、カリフォルニア州、米国）への結合を介して切り取られ、そして単離された。該単離されたフラグメントは、細菌プラスミド(pSmartHCkan vector, CloneSmart Blunt Cloning Kit, Lucigen Corp.)内への効率的な(平滑な)クローニングを容易にするために、DNA-terminator End-repair kit (Lucigen Corp., Middleton、ウィスコンシン州、米国）を用いて前処理された。ライゲーション混合物の一部（1μl）が、エレクトロポレーション（25μF、200オーム、1.6 kV）でBioRad Gene Pulser[BioRad Laboratories, Hercules、カルフォルニア州、米国]を使用して、0.1cm-ギャップキュベット[Eurogentec Ltd.、サウサンプトン、英国]）によって、25μl大腸菌細胞（E. kloni 10G supreme electrocompetent cells, Lucigen Corp.）に形質転換され、TB-培地において再生され、そして30μｇ/mlカナマイシンを有するTYプレート上に置かれ、一晩、37℃で成長された。爪楊枝を使用して、コロニーが96穴マイクロタイタープレート（32プレート、穴当たり150μlの30μg/mlカナマイシンを含むTY培地）内に移された。37℃で一晩成長後、グリセロールが添加され（最終濃度15％）、そして該グリセロールストックが−80℃で保存された。
【０１１６】
穴プレートにおける各クローンからのゲノム挿入物が、96穴ＰＣＲプレート（22個のプレート）においてＰＣＲ増幅を使用して増加された。ＰＣＲ反応物は、1×SuperTaqバッファ、0.2 mMの各dNTP（Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ）、0.4μMプライマーL1（5'-cag tcc agt tac gct gga gtc-3'）及び0.4μMプライマーR1（5'-ctt tct gct atg gag gtc agg tat g-3'）、1.5 U SuperTaq-DNA-ポリメラーゼ、及びｇＤＮＡバンクの対応する穴からの１μlグリセロールストック溶液を有する50μl反応混合物／穴を含んだ。両方のプライマーが、プライマーの5'末端にC6-リンカーを介して結合された遊離NH2基を含む。下記ＰＣＲプログラムが使用された：4分94℃、30回（30秒94℃、30秒50℃、3分72℃）、10分72℃、そして4℃で浸す。増幅に引き続き、50μlのＰＣＲ生成物が96穴丸底プレートに移され、そして150μl酢酸ナトリウム／イソプロパノール混合物（夫々、0.2M 酢酸ナトリウム、67％イソプロパノール最終濃度）を添加することによって沈殿され、１時間、−80℃でインキュベーション、回転（１時間、2.5 krpm、4℃）、上清の除去、そして100μlの70％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットが50μl水／穴中に再懸濁され、384穴プレートに移され、乾燥され（スピード真空）、そして穴当たり10μlの3xSSCバッファ中に再懸濁された。およそ2100個のＰＣＲ生成物を含む6個の生じた384穴プレートは、マイクロアレイをスポットするために使用された。該ＰＣＲ生成物は、24個のTeleChem Stealth micro spotting quill-pins（ほぼ100μm直径）（TeleChem International, Inc., Sunnyvale、カリフォルニア州、米国）と一緒に、エレクトロスプレーイオン化（ESI）マイクロアレイプリンターを使用して、一連の最大75個の「アルデヒド」コーティングされたスライド（Cell Associates, Inc., The Sea Ranch、カリフォルニア州、米国）上でスポットされた。スポット後に、スライド表面が、室温でボロ無水物での処理（0.2％ SDS中2x 5分、水中2x 5分、ボロ無水物バッファ(510 ml PBS-バッファ及び170 mlの100％エタノール中1.7g NaBH4)中10分、0.2％ SDS中3x 5分、水中3x 5分、100℃水中2秒、窒素フローでの乾燥）によってブロックされた。PBS（リン酸緩衝生理食塩水）は、6.75 mM Na2HP04、1.5 mM K2HP04、140 mM NaCl及び2.7 mM KCl、pH 7.0(リットル当たり、1.2 g Na2HP04、0.2 g K2HP04、8.0 g NaCl、0.2 g KCl、pH 7.0)である。
【０１１７】
ｇＤＮＡのラベル付け
ｇＤＮＡの蛍光ラベル付けが、BioPrime（商標）DNA Labeling System（Invitrogen, Carlsbad、カルフォルニア州、米国；カタログ番号：18094-011）に基づき、25μl反応物において、1.5時間の間、37℃で、0.5〜2μgの単離された黄色ブドウ球菌ｇＤＮＡ上で実行された。該反応物は、1x RandomPrimer溶液(50 mM Tris-HCI pH 6.8、5 mM MgCl2、30μg/mlランダムオクタマー、Bioprime（商標）)、lxlowT dNTP混合物(0.25 mM dATP、0.25 mM dGTP、0.25 mM dCTP、O.l mM dTTP)、0.06 mM Cy-dUTP（Cy = Cy5又はCy3のいずれか、1μ1の1 mMストック、Amersham Biosciences)及び20ユニットのＤＮＡポリメラーゼ(Klenowフラグメント；0.5μlの40U/μlストック、Bioprime（商標））を含んだ（最終濃度）。反応後、塩類、取り込まれなかった（ラベル付けされた）ヌクレオチド及びプライマーが、Autoseq G50カラム(Amersham Biosciences)を介する精製によって除去された。精製後、ラベル付けされた物質の１０分の１部が、ＤＮＡ(A260nm)及びCy5(A649nm)又はCy5(A550nm)の量を決定するために分光学的分析のために使用された。ラベル付けされた物質の残りが、アレイハイブリダイゼーションのために使用された。
【０１１８】
アレイの（プレ）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの調製において、スライドが、ペトリ皿において、20 mlのプレハイブリダイゼーション溶液（1％BSA、5xSSC、0.1％SDS、0.45μmフィルターを通じて濾過された、42℃）中に置かれ、そして45分間、42℃で、（緩やかな回転によって）穏やかに振とうされた。次に、該スライドは、（40 mlのキャップされたチューブ中）40 mlの水において２回洗浄され、そしてN2銃を使用して迅速に乾燥された。
【０１１９】
Cy5-dUTP及びCy3-dUTPでラベル付けさられた適切なｇＤＮＡサンプルは、4μｌの酵母ｔＲＮＡ（25μｇ／μｌ）と一緒にされ、乾燥され（SpeedVac（商標）、TeleChem International, Inc.を使用）、40μｌEasyHyb溶液 (Roche Applied Science, Roche Diagnostics Nederland B.V.、アルメレ、オランダ)、変性され（1.5分、95℃）、簡単に遠沈され（1秒、10 krpm)、予め温められた（42℃金属プレート）乾燥プレハイブリダイゼーションアレイ上にピペットで置かれ、プラスチックカバースリップ（Hybrislip, Molecular Probes）で覆われ、水−蒸気飽和された予め温められた（42℃）ハイブリダイゼーションチャンバー（Corning Life Sciences B. V., Schiphol-Rijk、オランダ）内に挿入され、そして42℃の水浴中で一晩ハイブリダイゼーションされた。試験株からの各ハイブリダイゼーションｇＤＮＡはCy5-dUTPでラベル付けされ、一方参照プール（アレイ構築のために使用された株からのｇＤＮＡの混合物）がCy3-dUTPでラベル付けされた。ハイブリダイゼーション後、該アレイはキャップされた40 mlチューブにおいて40 mlの（異なる）バッファ中で４回スライドを振とうすることによって洗浄された(洗浄バッファ１：１x SSC、0.2％SDS、37℃、5〜10秒；洗浄バッファ２：0.5x SSC、37℃、5〜10秒；洗浄バッファ３及び４：0.2x SSC、20℃、夫々10分)。
【０１２０】
スキャンニング及び画像分析
洗浄後、スライドが、（Cy蛍光の消失を防ぐために）暗所中に保存され、又はScanAlyzeソフトウェア(Michael Eisen's lab, University of California at Berkeley (UCB)、Packard Bioscienceによって配布された、Perkin Elmer Life And Analytical Sciences, Inc.、ボストン、マサチューセッツ州、米国)を備えたスキャンニング装置(PerkinElmerからのScanArray 4000(PerkinElmer, Wellesley、マサチューセッツ州、米国)を用いて蛍光Cy染料をスキャンするために直接的に使用された。クイックスキャン(解像度30μm/ピクセル)が、低シグナル又は飽和されたシグナルの過剰を防ぐために、最適なレーザー（強度）及び検出（光電子増倍管）設定を選択するために実行された。スライドが、Cy5-及びCy3-蛍光のために２回走査された。ディジタル走査は、ImaGeneソフトウェア (バージョン4.2, BioDiscovery, Inc. El Segundo、カルフォルニア州、米国)を用いて数値化され、スポット識別、並びにアレイ上の各スポットについてCy5及びCy3の両方のシグナル（Ｓ）及びバックグラウンド（Ｂ）値をもたらした。該データは電子ファイルに格納され、そして更なるデータ処理のために使用された。
【０１２１】
データ前処理
表計算ソフトウェア(エクセル、マイクロソフト)を使用することによって、下記計算が各スポットについて行われた：Cy3とCy5のためのS-B値、及びCy5/Cy3比の[R=Cy5(S-B)]/[(Cy3(S-B)]。低品質データが除去された（例えば、S<2Bを有するCy3データを有するスポット）。次に、正規化係数Nが、スライド上の全てのスポットについて平均Cy5-及びCy3-シグナルに基づき、各スライドについて計算された(N=[平均Cy5(S-B)/[平均Cy3(S-B)]。次に、正規化された比(Rn)が、全てのアレイ上の各スポット(Rn=R/N)について計算された。多くのスライド（スライドは黄色ブドウ球菌株に関連する）について、スポット当たりの正規化された比の行列（データセット）が、更なるデータ前処理のために使用された。
【０１２２】
Cy3シグナルがほとんどのスポットについて一般的に存在し(8つの株のCy3ラベル付けされた参照ｇＤＮＡプールが全てのスライドにハイブリダイゼーションされた)、及びCy5シグナルは変化しうる（異なる株のCy5ラベル付けされたｇＤＮＡは単一のスライドと夫々ハイブリダイゼーションされた）故に、ｇＤＮＡフラグメントがCy5試験株において夫々存在する又は存在しない場合に、Cy5/Cy3比が、理論的に２つの値（１又は０）を有しうる。しかしながら、実際上、これらの値は１及び０あたりを変化する。それ故に、０及び１についての多くの分析切り捨て値は、更なる分析の前に比データセット上に適用された（例えば、Rn<0.5及びRn>0.5が０及び１に夫々置換され、又はRn<0.3及びRn>0.7が０及び１に夫々置換され、一方0.3及び0.5の間のRn値を維持する）。これら「切り捨てデータセット」が、最終データ分析に使用された。
【０１２３】
ＰＣＡデータ分析
データセットが、選択されたスケーリング方法として中央平均を用いて主成分分析（ＰＣＡ）によって解析された。同等の結果がスケーリング方法無し若しくは代替のスケーリング方法（例えば自動スケーリング）又は代替の多変量統計方法を用いて得られうる。
【０１２４】
結果
31個の黄色ブドウ球菌株の一組が、確立されたRiboPrint（商標）分類法のために（図１）、及び全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＣＡ分析に基づく本発明の分類方法のために（図２）処理された。図１及び図２の比較は、本発明の方法（図２）が先行技術方法（すなわち、図１のRiboPrint（商標））よりも有意に異なる株クラスタ化をもたらすことを示す。アレイ／ＰＣＡ方法（図２）が全ゲノムディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づくので、それは、特定のＤＮＡ配列（例えば、リボゾームＤＮＡ配列多型、図１）上のみに基づく又は制限された表現型情報（例えば、成長条件、細菌染色など）のみに基づく古典的な分類方法よりも密接に関連付けられた有機体の分類のためのより高い潜在性を有する。
【実施例２】
【０１２５】
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、黄色ブドウ球菌株の特定の抗生物質に対する耐性に基づくクラスタ化
２つの異なる抗生物質に対する既知の耐性／感受性を有する31個の異なる黄色ブドウ球菌株の一組の蛍光的にラベル付けされたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、８個の異なる黄色ブドウ球菌株の混合物の無作為的に選択されたゲノムＤＮＡフラグメント（ほぼ2100個のフラグメント／アレイ、ほぼ1500 bp／フラグメント）で覆われたアレイと別々にハイブリダイゼーションされた。蛍光ハイブリダイゼーションパターンが数値化され、各試験された株についてゲノムＤＮＡフラグメント当たりのハイブリダイゼーションシグナルのリストをもたらした。より詳細には、各アレイは、２つのラベル付けされたｇＤＮＡと同時にハイブリダイゼーションされた：１つは調査下の特定の黄色ブドウ球菌株に関し（Cy5でラベル付けされた）、及び他は、全ての個々のスライド上で作成されたハイブリダイゼーションを正規化するために参照として役立つアレイ構築のために使用された８個の黄色ブドウ球菌の標準混合物に関する（Cy3でラベル付けされた）。
【０１２６】
次のデータ分析は、データのフィルタリング、正規化、そして切り捨て処理、引き続き２つの抗生物質（分析当たり１つの抗生物質）への株の既知の感受性／耐性に基づく部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を含む。同じデータセット（分析された株の量が僅かにのみ異なる：その耐性プロファイルが明確だったところの株のみが更なる分析のために選択された）の２つの独立のＰＬＳ−ＤＡ分析が、２個の抗生物質の各々に対してそれらの既知の感受性／耐性に従う黄色ブドウ球菌株の一組内に２個の有意な分離をもたらした。各抗生物質について、感受性及び耐性クラスタは、それらの既知の抗生物質耐性／感受性に従い異なるサブセットの株を含んだ。これは、各抗生物質について、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの異なる部分が抗生物質耐性特異的情報を含むことを示す。
【０１２７】
異なる細菌株の組
31個の黄色ブドウ球菌株の一組が、実施例２のために使用された（図３）。該組は、30個の病院単離物及び型株集合物からの１つの参照株からなった（図３、TTC.03.151株）。ほとんどすべての株について、それらの抗生物質耐性／感受性が、２つの異なる抗生物質（ゲンタマイシン及びオキサシリン）についてアガー拡散試験（NCCLSプロトコルに従う）によって決定された。全ての実験手順が、実施例１に記載されたように実行された。
【０１２８】
ＰＬＳ−ＤＡデータ分析
データセットが、単一の抗生物質への株の既知の感受性／耐性に基づき、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）によって解析された。同等の結果がスケーリング方法無し又は代替のスケーリング方法（例えば自動スケーリング）又は代替の多変量統計方法を用いて得られうる。
【０１２９】
結果
31個の異なる黄色ブドウ球菌株の一組が、全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＬＳ−ＤＡ分析のために処理された（図４）。
【０１３０】
同じデータセット（分析された株の量が僅かにのみ異なる）の２つの独立のＰＬＳ−ＤＡ分析が、２個の抗生物質の各々に対してそれらの既知の感受性／耐性に従う黄色ブドウ球菌株の一組内に２個の有意な分離をもたらした。各抗生物質について、感受性及び耐性クラスタは、それらの既知の抗生物質耐性／感受性に従う異なるサブセットの株を含む。これは、各抗生物質について、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの異なる部分が抗生物質特異的情報を含むことを示す。抗生物質特異的な全ゲノムハイブリダイゼーションデータは、知られていない黄色ブドウ球菌株の抗生物質耐性／感受性を予測するために使用されうる。
【実施例３】
【０１３１】
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、伝染性及び非伝染性黄色ブドウ球菌株間の識別に基づくクラスタ化
異なる細菌株の組
19個の複数の耐性黄色ブドウ球菌株の一組が、実施例３のために使用された（図５）。該セットは、19個の病院単離物からなる。全ての株について、それらの伝染性特徴が、日常の病院実務から取り出された（図５）。これらの株についてマイクロアレイ結果の生成のために使用された全ての実験手順が、実施例１における記載に従った。
【０１３２】
結果
19個の異なる黄色ブドウ球菌単離物の一組が、全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＬＳ−ＤＡ分析のために処理された（図６）。
【０１３３】
ＰＬＳ−ＤＡ分析が、黄色ブドウ球菌株の既知の伝染性特徴（E=伝染性、N=非伝染性）に従い、該黄色ブドウ球菌株び有意なクラスタ化をもたらした。
【０１３４】
これは、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの一部が知られていない黄色ブドウ球菌株の伝染性を予測するために使用されうる予測情報を含むことを示す。
【実施例４】
【０１３５】
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、侵入性及び非侵入性黄色ブドウ球菌株間の識別に基づくクラスタ化
異なる細菌株の組
病院において単離された27個の黄色ブドウ球菌株の一組が、実施例４のために使用された（図７）。全ての株について、それらの侵入性特徴が、日常の病院実務から取り出された（図７）。これらの株についてマイクロアレイ結果の生成のために使用された全ての実験手順は、下記を除いて実施例１における記載に従った：ImaGeneバージョン5.6が走査された画像を解析するために使用され、及びデータ前処理がKim等(Genome Biology 3:research0065.1-research0065.17, Epub, 2002年10月29日)に従った。それらのEPP方法は、0％及び100％EPP（存在の予想される可能性）値上で決定するために使用され、そしてデータポイントが３つのグループに分割された：0％より下のデータが値-0.5を与えられ、100％EPPよりも上のデータが値0.5を与えられ、そして0％〜100％EPPの間のデータが-0.5〜0.5の間に直線的に引かれた。この前処理は、各個々のデータデット（アレイ）について行われた。該変換されたデータは、更なる分析のために使用された。
【０１３６】
結果
27個の異なる黄色ブドウ球菌単離物の一組が、全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＬＳ−ＤＡ分析のために処理された（図８）。
【０１３７】
ＰＬＳ−ＤＡ分析は、それらの既知の侵入性特徴（図８、I=侵入性、NI=非侵入性）に従い、黄色ブドウ球菌株の有意なクラスタ化をもたらした。
【０１３８】
これは、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの一部が知られていない黄色ブドウ球菌株の侵入性可能性を予測するために使用されうる予測情報を含むことを示す。
【実施例５】
【０１３９】
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、感染性及び非感染性エンテロバクタークロアカ株間の識別に基づくクラスタ化
実験詳細
これらの株についてマイクロアレイ結果の生成のために使用された全ての実験手順は、下記を除いて実施例１における記載に従った：図９に示されるように８個のエンテロバクタークロアカ株が、アレイ構築のために使用され、そして3000個のスポットがアレイ上に置かれた。ImaGeneバージョン5.6が走査された画像を解析するために使用され、及びデータ前処理がKim等(Genome Biology 3: research0065.1-research0065.17、2002年)に従った。それらのEPP方法は、0％及び100％EPP（存在の予想される可能性）値上で決定するために使用され、そしてデータポイントが３つのグループに分割された：0％より下のデータが値-0.5を与えられ、100％EPPよりも上のデータが値0.5を与えられ、そして0％〜100％EPPの間のデータは-0.5〜0.5の間に直線的に引かれた。この前処理は、各個々のデータデット（アレイ）について行われた。該変換されたデータは、更なる分析のために使用された。
【０１４０】
異なる細菌株の一組
病院において単離された18個のエンテロバクタークロアカ株の一組が、実施例５のために使用された（図９）。全ての株について、それらの侵入性特徴が、日常の病院実務から取り出された（図９）。
【０１４１】
結果
18個のエンテロバクタークロアカ単離物の一組が、全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＬＳ−ＤＡ分析のために処理された（図１０）。
【０１４２】
ＰＬＳ−ＤＡ分析は、それらの既知の感染性特徴（図１０、I=感染性、NI=非感染性）に従い、エンテロバクタークロアカ株の有意なクラスタ化をもたらした。
【０１４３】
これは、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの一部が知られていないエンテロバクタークロアカ株の感染性の可能性を予測するために使用されうる予測情報を含むことを示す。
【実施例６】
【０１４４】
全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、環境の及び患者レジオネラニューモフィラ株間の識別に基づくクラスタ化
実験詳細
これらの株についてマイクロアレイ結果の生成のために使用された全ての実験手順は、下記を除いて実施例１における記載に従った：図１１に示されるように、８個のレジオネラニューモフィラ株がアレイ構築のために使用され、そして4000個のスポットがアレイ上に置かれた。ImaGeneバージョン5.6が走査された画像を解析するために使用され、及びデータ前処理がKim等(Genome Biology 3: research0065.1-research0065.17、2002年)に従った。それらのEPP方法は、0％及び100％EPP（存在の予想される可能性）値上で決定するために使用され、そしてデータポイントが３つのグループに分割された：0％より下のデータが値-0.5を与えられ、100％EPPよりも上のデータが値0.5を与えられ、そして0％〜100％EPPの間のデータは-0.5〜0.5の間に直線的に引かれた。この前処理は、各個々のデータデット（アレイ）について行われた。該変換されたデータは、更なる分析のために使用された。
【０１４５】
異なる細菌株の組
患者及び環境場所（主に水源）から単離された30個のレジオネラニューモフィラカ株の一組が、実施例６のために使用された（図１１）。全ての患者株について、それらの病原性特徴が、日常の病院実務から取り出された（図１１）。
【０１４６】
結果
30個のレジオネラニューモフィラカ単離物の一組が、全ゲノムマイクロアレイ上のディファレンシャルハイブリダイゼーションからのデータのＰＬＳ−ＤＡ分析のために処理された（図１２）。
【０１４７】
ＰＬＳ−ＤＡ分析は、それらの既知の病原性特徴（図１２、pat=患者、omg=環境）に従い、レジオネラニューモフィラカ株の有意なクラスタ化をもたらした。
【０１４８】
これは、総ディファレンシャルハイブリダイゼーションデータセットの一部が知られていないレジオネラニューモフィラカ株の病原性の可能性を予測するために使用されうる予測情報を含むことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株のRiboPrint(商標)分類を示す図である。
【図２】全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のないＰＣＡ分析による黄色ブドウ球菌のクラスタ化を示す図である。
【図３】黄色ブドウ球菌株及びそれらの耐性特徴の概要を示す表である。
【図４ａ】ＰＬＳ−ＤＡによって解析された場合の黄色ブドウ球菌のゲノム組成に基づく黄色ブドウ球菌ゲンタマイシン耐性及び感受性株のクラスタ化を示す図である。
【図４ｂ】ＰＬＳ−ＤＡによって解析された場合の黄色ブドウ球菌のゲノム組成に基づく黄色ブドウ球菌オキサシリン耐性及び感受性株のクラスタ化を示す図である。
【図５】黄色ブドウ球菌（S. aureus）株及びそれらの伝染性特徴の概要を示す表である。
【図６】全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、ＭＲＳＡ株の伝染性のクラスタ化を示す図である。
【図７】黄色ブドウ球菌株及びそれらの侵入性特性の概要を示す表である。
【図８】全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、黄色ブドウ球菌株の侵入性のためのクラスタ化を示す図である。
【図９】エンテロバクタークロアカ（Enterobacter cloacae）株及びそれらの感染性特徴（I=感染性、NI=非感染性）の概要を示す表である。
【図１０】全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、エンテロバクタークロアカ株の感染性のためのクラスタ化を示す図である。
【図１１】レジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）株及びそれらの病原性特徴の概要を示す表である。
【図１２】全ゲノムアレイディファレンシャルハイブリダイゼーションデータの外的基準のあるＰＬＳ−ＤＡ分析による、レジオネラニューモフィラ株の病原性のためのクラスタ化を示す図である。
【図１３】ＤＡの原理を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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