(57)【要約】  ＧＰＣＲ１４２／リラキシン３およびＧＰＣＲ１４２／ＩＮＳＬ５複合体が記述される。該複合体はＧＰＣＲ１４２受容体活性の調節物質のスクリーニングのためのアッセイ試薬として有用である。
2007509602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リラキシン３若しくはリラキシン３の活性フラグメントを含有するリガンド成分に結合されたＧＰＣＲ１４２若しくはＧＰＣＲ１４２の活性フラグメントを含有する受容体成分を含んでなり、かつ、該受容体および該リガンド成分の少なくとも一方が実質的に純粋な形態にある、受容体−リガンド複合体。
【請求項２】
受容体成分がヒト、マウス、ラット、サル、ウシ若しくはブタに由来し、かつ、リガンド成分がヒト、マウス、ラットに由来する、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３】
前記リガンド成分が放射性同位元素標識を担持する、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項４】
ＧＰＣＲ１４２が配列番号２および配列番号４から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項５】
前記受容体成分が、組換えＧＰＣＲ１４２宿主細胞の細胞表面上での発現の産物である、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項６】
前記受容体成分が、単離された細胞膜若しくは脂質小胞と結合したＧＰＣＲ１４２若しくはＧＰＣＲ１４２の活性フラグメントを含有する、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項７】
前記受容体成分および前記リガンド成分の双方が実質的に純粋な形態にある、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項８】
前記リガンド成分が、組換え発現の産物として実質的に純粋な形態にある、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項９】
受容体およびリガンド成分の前記少なくとも一方が、単離、ペプチド合成若しくは組換え発現の産物として実質的に純粋な形態にある、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１０】
前記リガンド成分が、ペプチド合成の産物として実質的に純粋な形態にある、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列若しくはその相補物を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドよりなるベクター。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１５】
（ａ）化合物および緩衝溶液を含む試験サンプルを、請求項１に記載の受容体−リガンド複合体を含むアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）受容体−リガンド複合体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定された結果を、受容体−リガンド複合体が緩衝溶液と接触された対照の測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２／リラキシン３複合体の生物学的活性を増大若しくは減少させる化合物の同定方法。
【請求項１６】
受容体−リガンド複合体のＧＰＣＲ１４２成分が組換えＧＰＣＲ１４２宿主細胞の細胞表面上での発現の産物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
受容体−リガンド複合体の生物学的活性の前記測定がセカンドメッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記セカンドメッセンジャー応答が、細胞内ｐＨ、細胞内カルシウムイオン濃度若しくは細胞内ｃＡＭＰ濃度により測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アッセイ試薬が、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを含有する単離された膜調製物を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
受容体−リガンド複合体の生物学的活性の前記測定が、単離された膜調製物のタンパク質リン酸化の量を測定することを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
単離された膜調製物のタンパク質リン酸化の量が、γ−リン酸標識ＧＴＰ分子を使用して測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
γ−リン酸標識ＧＴＰ分子が、３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３３Ｐ−ＧＴＰγＰおよび３２Ｐ−ＧＴＰγＰから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを、試験化合物および標識したリラキシン３若しくはその活性フラグメントと接触させる段階；
（ｂ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントに結合する標識したリラキシン３若しくはその活性フラグメントの量を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定された量を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが試験化合物の非存在下で標識したリラキシン３若しくはその活性フラグメントと接触された対照の測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントに結合する化合物の同定方法。
【請求項２４】
標識したリラキシン３若しくはその活性フラグメントが放射性同位元素標識で標識されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）試験化合物を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と接触させること；
（ｂ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントの生物学的活性を測定すること；および
（ｃ）段階（ｂ）で測定された結果を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが試験化合物の非存在下でリラキシン３若しくはその活性フラグメントと接触された対照の測定値のものと比較すること
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２を結合しかつリラキシン３を模倣する化合物の同定方法。
【請求項２６】
ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが組換え細胞の表面に由来現される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが単離された細胞膜調製物内にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＮＳＬ５若しくはＩＮＳＬ５の活性フラグメントを含有するリガンド成分に結合されたＧＰＣＲ１４２若しくはＧＰＣＲ１４２の活性フラグメントを含有する受容体成分を含んでなり、かつ、該受容体および該リガンド成分の少なくとも一方が実質的に純粋な形態にある、受容体−リガンド複合体。
【請求項２９】
受容体成分がヒト、マウス、ラット、サル、ウシ若しくはブタに由来し、また、リガンド成分がヒト、マウス若しくはラットに由来する、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３０】
前記リガンド成分が放射性同位元素標識を担持する、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３１】
ＧＰＣＲ１４２が、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３２】
前記受容体成分が、組換えＧＰＣＲ１４２宿主細胞の細胞表面上での発現の産物である、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３３】
前記受容体成分が、単離された細胞膜若しくは脂質小胞と結合したＧＰＣＲ１４２若しくはＧＰＣＲ１４２の活性フラグメントを含有する、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３４】
前記受容体成分および前記リガンド成分の双方が実質的に純粋な形態にある、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３５】
前記リガンド成分が組換え発現の産物として実質的に純粋な形態にある、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３６】
受容体およびリガンド成分の前記少なくとも一方が、単離、ペプチド合成若しくは組換え発現の産物として実質的に純粋な形態にある、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３７】
前記リガンド成分がペプチド合成の産物として実質的に純粋な形態にある、請求項２８に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項３８】
配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９に対応するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドよりなるベクター。
【請求項４０】
配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項４１】
（ａ）化合物および緩衝溶液を含んでなる試験サンプルを、請求項２８で定義されたところの受容体−リガンド複合体を含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）受容体−リガンド複合体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定された結果を、受容体−リガンド複合体が緩衝溶液と接触された対照の測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２／ＩＮＳＬ５複合体の生物学的活性を増大若しくは減少させる化合物の同定方法。
【請求項４２】
受容体−リガンド複合体のＧＰＣＲ１４２成分が組換えＧＰＣＲ１４２宿主細胞の細胞表面上での発現の産物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
受容体−リガンド複合体の生物学的活性の前記測定が、セカンドメッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記セカンドメッセンジャー応答が、細胞内ｐＨ、細胞内カルシウムイオン濃度若しくは細胞内ｃＡＭＰ濃度により測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
アッセイ試薬が、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを含有する単離された膜調製物を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
受容体−リガンド複合体の生物学的活性の前記測定が、単離された膜調製物のタンパク質リン酸化の量を測定することを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
単離された膜調製物のタンパク質リン酸化の量が、γ−リン酸標識ＧＴＰ分子を使用して測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
γ−リン酸標識ＧＴＰ分子が、３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３３Ｐ−ＧＴＰγＰおよび３２Ｐ−ＧＴＰγＰから選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを、試験化合物および標識したＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントと接触させる段階；
（ｂ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントに結合する標識したＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントの量を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定された量を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが試験化合物の非存在下で標識したＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントと接触された対照の測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントに結合する化合物の同定方法。
【請求項５０】
標識したＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントが放射性同位元素で標識されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）試験化合物を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と接触させること；
（ｂ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントの生物学的活性を測定すること；および
（ｃ）段階（ｂ）で測定された結果を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが試験化合物の非存在下でＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントと接触された対照の測定値のものと比較すること
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２を結合しかつＩＮＳＬ５を模倣する化合物の同定方法。
【請求項５２】
ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが組換え細胞の表面に由来現される、請
求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントが単離された細胞膜調製物内にある、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への交差引用
本出願は、“Ｒｅｌａｘｉｎ３−ＧＰＲ１４２  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ（リラキシン３−ＧＰＲ１４２複合体ならびにそれらの製造および使用）”と題された２００３年８月７日出願の米国仮出願第６０／４９３，９４１号明細書に対する優先権の利益を主張する。本出願は、“ＧＰＣＲ１４２−ＩＮＳＬ５  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ（ＧＰＣＲ１４２−ＩＮＳＬ５複合体ならびにそれらの製造および使用）”と題された２００４年６月１６日出願の米国仮出願第６０／５８０，０８３号明細書に対する優先権の利益もまた主張する。これらの優先出願の開示は引用することにより本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明は、ＧＰＣＲ１４２／リラキシン３複合体およびＧＰＣＲ１４２／ＩＮＳＬ５複合体に関する。本発明はまた、こうした複合体の製造方法およびそれらの使用方法にも関する。本発明はさらに、異なる種からのＧＰＣＲ１４２ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
特許文献１に記述されるとおり、リラキシン３はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の１種、ＧＰＣＲ１３５の天然のリガンドである、ＧＰＣＲ１３５がリラキシン３（ＩＮＳＬ７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７３１８４）ともまた称される）の内因性受容体であることが発見され、アミノ酸レベルでＧＰＣＲ１３５に対する４０％の相同性をもつ遺伝子を含有するＤＮＡ配列連結断片（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＬ３５５３８８）が発見され、ＧＰＣＲ１４２と命名されている。
【０００４】
ＧＰＣＲは、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド、脂質、イオン、光、匂い物質、ヌクレオチド、脂肪酸誘導体および他の化学物質メディエーターを包含する多彩な細胞外シグナルの伝達の原因である膜貫通受容体タンパク質である。例えば特許文献２を参照されたい。ＧＰＣＲは優れた薬物標的として確立されているため、それらは薬物発見にとりわけ重要である。すなわち、それらは市販の薬物の５０％の標的である。増大する数の疾患がＧＰＣＲと関連することが見出された。ＧＰＣＲを標的とする薬物は心血管系ないし胃腸からＣＮＳおよび他者までの広範な障害を治療するのに使用されている（非特許文献１）。
【０００５】
ＧＰＣＲに媒介されるシグナル伝達事象は、しばしばＧＰＣＲへの特異的リガンドの結合に際して開始される。各ＧＰＣＲは、細胞外Ｎ末端ドメイン、７個の異なる膜貫通セグメントおよび細胞内Ｃ末端ドメインから構成される。ＧＰＣＲの細胞外Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン若しくは細胞内ループへのリガンドの結合は、ＧＰＣＲと結合した細胞内ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）の活性化に至るコンホメーション変化をもたらす。これらの活性化されたＧタンパク質は順に細胞生理学を調節する多様な細胞内応答を媒介する。従って、リガンドは、ＧＰＣＲの生理学的機能の解明手段ならびにＧＰＣＲのシグナル伝達活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【０００６】
現時点で、約２００種のみのＧＰＣＲが、約７０種の既知のリガンドにより活性化される既知のＧＰＣＲとして分類されている。配列分析により、ＧＰＣＲがヒトゲノムの最大のスーパーファミリーの１つに属することが発見された。すなわち、ＧＰＣＲをコードする１０００を超える遺伝子で評価された（非特許文献２）。多数の推定のＧＰＣＲが、それらの天然のリガンドが未知であるためにオーファン受容体として記述されている。これらの特徴付けられていないオーファンＧＰＣＲのいくつかは治療上の標的として有用でありうる。ＧＰＣＲに対する特定のリガンドの同定は、これらのオーファンＧＰＣＲの潜在的な治療上の利益を利用するための手掛かりである（非特許文献３）。
【０００７】
上に示されたとおり、リラキシン３（ＩＮＳＬ７としてもまた知られる）がＧＰＣＲ１３５ならびにＧＰＣＲ１４２のリガンドであることが見出された。非特許文献４；および
非特許文献５を参照されたい。リラキシン３はインスリン／リラキシンス―パーファミリーの１メンバーである。このファミリーのメンバーは３個のジスルフィド結合により結合されたペプチドサブユニット（Ａ鎖およびＢ鎖）を特徴とする。該３個のジスルフィド結合のうち２個はサブユニット間結合であり、そして別の１個はＢ鎖中の鎖内結合である。該ファミリーで、インスリン、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２は、１回膜貫通する受容体であるチロシンキナーゼ／成長因子受容体による糖代謝およびシグナルの調節に関与していると報告されている。該ファミリーの２種の他のメンバーは、Ｎ末端細胞外ドメインにロイシン豊富な反復配列をもつＧＰＣＲであるＬＧＲ７および／若しくはＬＧＲ８のリガンド、リラキシンおよびＩＮＳＬ３である。リラキシン３はＬＧＲ７の付加的なリガンドであることもまた報告された。リラキシン／インスリンスーパーファミリーの別のメンバーはＩＮＳＬ５である（非特許文献６）。
【０００８】
ＧＰＣＲ１３５がＩＮＳＬ７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７３１８４）ともまた称されるリラキシン３の内因性受容体であることを発見したので、われわれは、アミノ酸レベルでＧＰＣＲ１３５に対する４０％の相同性をもつ遺伝子を含有するＤＮＡ配列連結断片（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＬ３５５３８８）を見出し、われわれはＧＰＣＲ１４２と命名した。しかしながら、ＧＰＣＲ１４２のリガンドは以前に同定されていなかった。
【特許文献１】２００４年２月２５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５６６６号明細書
【特許文献２】ＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０２／００７１９号明細書
【非特許文献１】Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８、Ｂｒｉｔｈｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２５：１３８７−１３９２
【非特許文献２】Ｃｉｖｅｌｌｉら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４：２３０−２３７
【非特許文献３】Ｈｏｗａｒｄら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２：１３２−１４０
【非特許文献４】Ｌｉｕら、２００３ａ、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｘｉｎ−３  ａｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＣＲ１３５”、ＪＢＣ  ２７８：５０７５４−５０７６４
【非特許文献５】Ｌｉｕら（２００３ｂ）、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｒｅｌａｘｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＰＣＲ１４２”、ＪＢＣ  ２７８：５０７６５−５０７７０
【非特許文献６】Ｃｏｎｋｌｉｎら  １９９９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６０（１）：５０−５６
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
今や、ＧＰＣＲ１４２がリラキシン３により選択的に活性化されることが発見され；さらに、今や、ＧＰＣＲ１４２がＩＮＳＬ５により選択的に活性化されるがしかしＧＰＣＲ１３５はされないことが発見された。
【００１０】
一般的な一局面において、本発明は従って、リラキシン３若しくはリラキシン３の活性フラグメント、またはＩＮＳＬ５若しくはＩＮＳＬ５の活性フラグメントから選択されるリガンド成分に結合されたＧＰＣＲ１４２若しくはＧＰＣＲ１４２の活性フラグメントを含有する受容体成分を含んでなる受容体−リガンド複合体に関し、ここで、受容体およびリガンド成分の少なくとも一方が実質的に純粋な形態にある。
【００１１】
他の一般的な局面において、本発明は：配列番号１に対応するヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド若しくはその相補物；配列番号２、４、７、８および９に対応するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド；こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドよりなるベクター；ならびにこうしたベクターを含んでなる組換え宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明のさらなる一般的な局面はアッセイ若しくはスクリーニング方法に関する。例えば、ＧＰＣＲ１４２／リラキシン３複合体若しくはＧＰＣＲ１４２／ＩＮＳＬ５複合体のいずれかの生物学的活性を増大若しくは減少させる化合物の一般的な一同定方法は：化合物および緩衝溶液を含んでなる試験サンプルを、本発明の受容体−リガンド複合体を含んでなるアッセイ試薬と接触させること；受容体−リガンド複合体の生物学的活性を測定すること；および、その測定で得られた測定値を、受容体−リガンド複合体を緩衝溶液と接触させた対照の測定値と比較することを含んでなる。ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントに結合する化合物の同定の別の一般的なアッセイ方法は：ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを、試験化合物および標識したリラキシン３若しくはその活性フラグメント、または標識したＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントのいずれかと接触させること：およびＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントに結合する標識したリガンド成分若しくはその活性フラグメントの量を測定すること、ならびにその後、その量を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを試験化合物の非存在下で標識したリガンド成分若しくはその活性フラグメントと接触させた対照の測定値と比較することを含んでなる。さらなる一般的な一アッセイは：試験化合物を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と接触させること；ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントの生物学的活性を測定すること；および、この結果を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを試験化合物の非存在下でリラキシン３若しくはその活性フラグメント、またはＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントのいずれかと接触させた対照の測定値のものと比較することを含んでなる、ＧＰＣＲ１４２を結合しかつリラキシン３若しくはＩＮＳＬ５のいずれかを模倣する化合物の同定方法に関する。
【００１３】
本発明の他の局面、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様、ならびに付属として付けられる請求の範囲を包含する以下の開示から明らかであろう。
［発明の詳細な記述］
下に引用される全部の刊行物の開示はこれにより本明細書に引用することにより組込まれる。別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、本発明が関する当業者に一般に理解されると同一の意味するところを有する。
【００１４】
以下は、下で本明細中でときに使用される略語である：ｂｐ＝塩基対；Ｃａ２＋＝カルシウムイオン；ｃＡＭＰ＝環状アデノシン一リン酸；ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ；ＣＮＳ＝中枢神経系；ｋｂ＝キロ塩基対；１０００塩基対；ｋＤａ＝キロダルトン；ＧＰＣＲ＝Ｇタンパク質共役型受容体；Ｇタンパク質＝ＧＴＰ結合タンパク質；ＧＴＰ＝グアノシン５’−三リン酸；ｎｔ＝ヌクレオチド；ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム；ＳｉＲＮＡ＝低分子干渉ＲＮＡ；およびＵＴＲ＝非翻訳領域。
【００１５】
「包含すること」、「含んでなること」および「含有すること」という用語は本明細書でそれらの公然の制限しない意味で使用される。
【００１６】
ポリペプチド若しくは核酸の「活性」、「生物学的活性」若しくは「機能的活性」は、標準的技術に従ってｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるところのポリペプチド若しくは核酸分子により発揮される活性を指す。こうした活性は、第二のタンパク質との結合若しくはそれに対する酵素活性のような直接活性、または第二のタンパク質との該タンパク質の相互作用により媒介される細胞のシグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。例えば、リラキシン３の具体的に説明する一生物学的活性は、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を結合しかつそれらにより実施されるシグナル伝達事象（１種若しくは複数）を開始するその能力である。ＧＰＣＲ１４２の例示的一生物学的活性は、ＧＰＣＲ１３５のように、リラキシン３への結合に際してそれがＧＴＰに対する高親和性を有するＧタンパク質を活性化することを介して環状ＡＭＰおよびカルシウムのような細胞内シグナル伝達分子（セカンドメッセンジャー分子）の濃度を変える一連の事象を活性化することである。これらの細胞内シグナル伝達分子は順に該細胞の生理学および挙動を変える。
【００１７】
「クローン」は単一の細胞すなわち共通の祖先から有糸分裂により派生する細胞の一集
団である。「細胞株」は多くの世代の間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定な増殖が可能である初代細胞のクローンである。
【００１８】
「リラキシン３およびＧＰＣＲ１４２の複合体に関する障害」は、リラキシン３およびＧＰＣＲ１４２の複合体の過活性若しくは不十分な活性を伴う障害若しくは疾患、ならびにこうした障害若しくは疾患に付随して起こる状態を意味している。「過活性」という用語は、リガンドおよび受容体の複合体の増大された発現若しくは該複合体の増大された生物学的活性のいずれも指す。「不十分な活性」という用語は、リガンドおよび受容体の複合体の減少された発現若しくは該複合体の減少された生物学的活性のいずれも指す。
【００１９】
「遺伝的バリアント」若しくは「バリアント」は、一集団の最低１個体の特定の一遺伝子座に存在しかつ野性型と異なる特定の遺伝的バリアントを意味している。
【００２０】
本明細書で使用されるところの「ＧＰＣＲ１４２」は、ヒトＧＰＣＲ１４２（配列番号４）、マウスＧＰＣＲ１４２（配列番号２）、サルＧＰＣＲ１４２（配列番号７）、ウシＧＰＣＲ１４２（配列番号８）若しくはブタＧＰＣＲ１４２（配列番号９）に対応するか、または本明細書に記述されるヒト、マウス、サル、ウシ若しくはブタＧＰＣＲ１４２タンパク質に対し生じられた抗体、例えばポリクローナル若しくはモノクローナル抗体に結合することが可能であるポリペプチドを指す。ヒトＧＰＣＲ１４２のｃＤＮＡ若しくはタンパク質配列は、米国特許第５，９５５，３０９号明細書ならびにＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０１／３６４７１号、同第ＷＯ  ０２／６１０８７号および同第ＷＯ  ０２／００７１９号明細書（それらの開示は本明細書に引用することにより組込まれる）に提供されている。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は、ベクター上か若しくは細胞染色体に組み込まれたかのいずれかのＤＮＡ分子を含有する細胞を指す。宿主細胞は、該ＤＮＡ分子を内因性に含有する天然の宿主細胞若しくは組換え宿主細胞のいずれでもあり得る。
【００２２】
「単離された」核酸分子は、異なる核酸配列を含む核酸分子から実質的に分離されているものである。本発明の単離された核酸分子の態様は、好ましくはヒト起源のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡならびにＲＮＡを包含する。
【００２３】
「単離された」若しくは「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性のフラグメント若しくは部分は、該タンパク質が産生かつ単離される細胞若しくは組織供給源からの細胞性物質若しくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まないか、または該タンパク質が化学的に合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。例えば、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、若しくは好ましくは２０％、若しくはより好ましくは１０％、若しくはなおより好ましくは５％（乾燥重量）未満の汚染するタンパク質を有するタンパク質の調製物を包含し得る。タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分が組換え的に産生される場合、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、例えば、培地はタンパク質調製物の容量の約２０％、若しくはより好ましくは１０％、若しくはなおより好ましくは５％未満に相当する。タンパク質が化学合成により製造される場合、それは、好ましくは化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは該タンパク質の合成に関与する化学的前駆体若しくは他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質のこうした調製物は、目的のポリペプチド以外に約３０％、若しくは好ましくは２０％、若しくはより好ましくは１０％、若しくはなおより好ましくは５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体若しくは化合物を有する。
【００２４】
単離された生物学的に活性のポリペプチドはいくつかの異なる物理的形態を有し得る。単離されたポリペプチドは完全長の新生すなわちプロセシングされていないポリペプチド、または部分的にプロセシングされたポリペプチド若しくはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在し得る。完全長の新生ポリペプチドは、特異的タンパク質分解性切断事象により翻訳後に改変されて該完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらし得る。フラグメント若しくはフラグメントの物理的結合が完全長のポリペプチドに関連した生物学的活性を有し得；もちろん、個々のフラグメントに関連する生物学的活性の程度は変動し得る。
【００２５】
「リンカー領域」若しくは「リンカードメイン」という用語は、クローニングベクター若しくは融合タンパク質の構築で使用される１種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列を指す。リンカー領域の機能は、ヌクレオチド配列中へのクローニング部位の導入、２個のタンパク質ドメイン間への可動成分若しくは空間創製領域の導入、または特異的分子相互作用を助長するための親和性タグの創製を包含し得る。リンカー領域を、所望の場合はポリペプチド若しくはヌクレオチド配列の構築の間に融合タンパク質に導入し得る。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「核酸」という用語は、１個若しくはそれ以上のヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくは双方から構成される分子を指す。該用語はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの単量体および多量体を包含し、リボヌクレオチドおよび／若しくはデオキシリボヌクレオチドは、多量体の場合、５’から３’の結合を介して一緒に結合される。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの多量体は一本鎖若しくは二本鎖でありうる。しかしながら、結合は例えば５’から３’の結合を含んでなる核酸を包含する当該技術分野で既知の結合のいずれも包含しうる。ヌクレオチドは天然に存在しうるか、若しくは天然に存在する塩基対と塩基対の関係を形成することが可能である合成で製造されたアナログでありうる。塩基対形成の関係を形成することが可能である天然に存在しない塩基の例は、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびにピリミジン環の炭素および窒素原子の１個若しくはそれ以上がヘテロ原子、例えば酸素、イオウ、セレン、リンなどにより置換されている他の複素環塩基アナログを包含する。さらに、「核酸配列」という用語は相補配列を企図し、そして該核酸配列およびその相補物双方に実質的に相同であるいかなる核酸配列も包含する。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」はホスホジエステル結合により一緒に結合された最低２ヌクレオチドの直鎖状多量体を指し、そしてリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドを含みうる。
【００２８】
「多形」は一集団中の個体間の特定の一遺伝子座での一組の遺伝的バリアントを指す。
【００２９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により直鎖に相互に結合された２個若しくはそれ以上のアミノ酸を含んでなるいかなるペプチド若しくはタンパク質も指す。本明細書で使用されるところの該用語は、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともまた当該技術分野で称される短い鎖、ならびに多くの型が存在する当該技術分野でタンパク質としばしば称されるより長い鎖の双方を指す。ポリペプチドがしばしば、２０種の天然に存在するアミノ酸と一般に称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有すること、ならびに、末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸が、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然の過程ならびに当該技術分野で既知の化学修飾技術のいずれかにより所定のポリペプチド中で改変され得ることが認識されるであろう。ポリペプチド中に天然に存在する一般的な修飾はここで網羅的に列挙するには多すぎるが、しかし、基礎的な教科書および詳述されたモノグラフ、ならびに研究論文に記述されており、そして従って当業者の範囲内にある。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の修飾のうち、具体的に２〜３例を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転写ＲＮＡ媒介性の付加、およびユビキチン化である。
【００３０】
グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化のようないくつかの一般的な修飾は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ――ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）を包含する多くの基礎的な教科書に記述されている。ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｊｏｈｎｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８３）中、Ｗｏｌｄ、“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”、１〜１２ページ；Ｓｅｉｆｔｅｒら（１９９０）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、６２６−６４６；およびＲａｔｔａｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”（１９９２）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３、４８−６２により提供されるもののような多くの総説もまたこの主題に関して利用可能である。
【００３１】
既知であるとおりかつ上で示されたとおり、ポリペプチドは常に完全に直鎖状ではないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチドは（天然のプロセシング若しくは人的操作を介してを包含する）翻訳後に修飾され得る。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドを、翻訳によらない天然の過程および完全に合成の方法により同様に合成し得る。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノ若しくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のどこでも起こり得る。例えば、共有修飾によるポリペプチド中のアミノ若しくはカルボキシル基または双方の封鎖は天然に存在するおよび合成のポリペプチド中で一般的であり、そしてこうした修飾は本発明のポリペプチド中に存在し得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくは他の細胞中で作成されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プロセシングの前にほとんど常にＮ−ホルミルメチオニンであることができる。該ペプチドの翻訳後修飾の間にＮＨ２末端のメチオニン残基が欠失され得る。従って、本発明は、該タンパク質のメチオニンを含有するおよびメチオニンなしの双方のアミノ末端バリアントの使用を企図している。
【００３２】
ポリペプチド中に存在する修飾は、しばしば、それがどのように作成されるかの関数であることができる。例えば、宿主中でのクローン化された遺伝子の発現により作成されるポリペプチドについて、修飾の性質および程度は大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力および該ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されることができる。例えば、既知であるとおり、グリコシル化は、しばしば、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中で起こらない。従って、グリコシル化が望ましい場合は、ポリペプチドをグリコシル化する宿主、一般には真核生物細胞中で発現させるべきである。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を実施し、そして、この理由上、昆虫細胞発現系がとりわけ天然のグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発された。類似の考慮が他の修飾に当てはまる。同一の型の修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位で同一若しくは変動する程度で存在し得ることが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有し得る。一般に、本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」という用語は、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることにより組換えで合成されたポリペプチド中に存在するものを包含する全部のこうした修飾を包含する。
【００３３】
「プロホルモン転換酵素（ＰＣ）」は、その全部が細菌のエンドプロテアーゼ、ズブチリシン（細菌）および酵母ケキシンに対する相同性を有するＣａ２＋依存性セリンプロテアーゼの一ファミリーを指す。フリン／ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＰＡＣＥ）としてもまた知られるこのファミリーは、例えばＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６およびＰＣ７／ＰＣ８／リンパ腫プロタンパク質転換酵素ならびにＳＫＩ−１を包含する。それらはそれらの触媒ドメイン内で５０〜７０％のアミノ酸同一性の程度を共有する（ＰＣに関する総説については、Ｓｅｉｄａｈら、１９９９、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、２７：８４８（１−２）、４５−６２を参照されたい）。
【００３４】
「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列である。プロモーターはしばしば遺伝子の転写開始部位の上流（す
なわち５’から３’）にある。「遺伝子」は、コーディング領域、コーディング領域に先行する（「５’ＵＴＲ」）および後に続く（「３’ＵＴＲ」）非コーディング領域、ならびに個々のコーディングセグメント（「エキソン」）の間の介在非コーディング配列（「イントロン」）を包含する、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の産生に関与するＤＮＡのセグメントである。「コーディング」はＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの三塩基トリプレット（「コドン」）中の特定のアミノ酸若しくは終止シグナルの指定を指す。
【００３５】
「組換え宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列により形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞である。本明細書で使用されるところの細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合にこうした外因性ＤＮＡにより「形質転換」されている。外因性ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され）ても組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物および酵母中では、外因性ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上で維持されうる。真核生物細胞に関して、安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞は、該外因性ＤＮＡが染色体の複製により娘細胞により遺伝されるようにそれが染色体に組み込まれたようになったものである。この安定性は、該外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の一集団から構成される細胞株すなわちクローンを樹立する真核生物細胞の能力により示される。組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株のような哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ由来の細胞株のような昆虫細胞を包含する原核生物でも真核生物でもありうる。「組換え宿主細胞」という用語が特定の主題の細胞のみならずしかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫も指すことがさらに理解される。ある種の修飾が、突然変異若しくは環境の影響いずれかにより後の世代で起こり得るため、こうした子孫は実際には親細胞に同一でないことがあるが、しかしなお本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。
【００３６】
「組換えポリペプチド」は組換えＤＮＡ技術により製造される、すなわち所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されるポリペプチドを指す。「合成ポリペプチド」は化学合成により製造されるものを指す。
【００３７】
「リラキシン３」は：（１）ヒトリラキシン３（配列番号６）（Ｂａｔｈｇａｔｅら、２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１１４８−１１５７、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号：ＮＰ＿５４３１４０）に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性を有する；（２）ヒトリラキシン３（本明細書に記述されるタンパク質）に対し生じられた抗体、例えばポリクローナル若しくはモノクローナル抗体に結合することが可能である；または（３）緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で、ヒトリラキシン３  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド受託番号：ＮＭ＿０８０８６４）に対する約６０％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを指す。
【００３８】
「ＩＮＳＬ５」は：（１）ヒトＩＮＳＬ５（配列番号５）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１３３８１６）に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性を有する；（２）本明細書で記述されるヒトＩＮＳＬ５タンパク質に対し生じられた抗体、例えばポリクローナル若しくはモノクローナル抗体に結合することが可能である；または（３）緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で、ヒトＩＮＳＬ５  ｃＤＮＡに対する約６０％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを指す。
【００３９】
「リガンド成分」は、リラキシン３若しくはその活性フラグメント、またはＩＮＳＬ５若しくはその活性フラグメントのいずれかを指す。
【００４０】
好ましい態様において、リガンド成分は、ヒトリラキシン３若しくはヒトＩＮＳＬ５いずれかに対する６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５パーセント以上のアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドである。他の好ましい態様において、リガンド成分は、緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で、ヒトリラキシン３  ｃＤＮＡ若しくはヒトＩＮＳＬ５  ｃＤＮＡいずれかに対する６５、７０、７５、８０、８５、９０若しく
は９５パーセント以上のヌクレオチド配列の同一性を有する配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
【００４１】
例示的リラキシン３リガンドは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号：ＮＰ＿５４３１４０）、ラット（Ｂｕｒａｚｉｎら、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８２：１５５３−１５５７；ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号ＮＰ＿７３３７６７；ヒトのものに対する７６．４％の配列の同一性）、マウス（Ｂａｔｈｇａｔｅら、２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１１４８−１１５７；ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号ＸＰ＿１４６６０３；ヒトのものに対する７８．７％の配列の同一性）、ならびにブタおよびサルを包含する他の動物で同定されたリラキシン３オルソログを包含する。「リラキシン３」は、リラキシン３の全３種の形態、すなわちリラキシン３プレプロペプチドすなわち前駆体（シグナル配列およびリラキシン３プロペプチド配列よりなる細胞内ポリペプチド）；リラキシン３プロペプチド（プロテアーゼ切断部位により結合されたリラキシン３の鎖Ａ、ＣおよびＢの配列を有する分泌型ポリペプチド）；ならびに成熟リラキシン３ペプチド（ジスルフィド架橋により結合されたリラキシン３ポリペプチドの鎖ＡおよびＢよりなる分泌型タンパク質）を包含する。「リラキシン３の活性フラグメント」は、ＧＰＣＲ１４２への結合のようなリラキシン３の生物学的活性を維持するリラキシン３タンパク質のいかなるフラグメントも包含する。ヒトリラキシン３のタンパク質若しくはｃＤＮＡ配列は、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０１／６８８６２号、同第ＷＯ  ０１／８１５６２号および同第ＷＯ  ０２／２２８０２号明細書に開示されている。ラット若しくはマウスのリラキシン３のタンパク質若しくはｃＤＮＡ配列はＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０１／８１５６２号明細書に開示されている。
【００４２】
例示的ＩＮＳＬ５リガンドはヒトＩＮＳＬ５を包含する。「ＩＮＳＬ５」はその形態の全部（例えばプレプロペプチドすなわち前駆体；プロペプチド；および成熟ペプチド）を包含する。「ＩＮＳＬ５の活性フラグメント」は、ＧＰＣＲ１４２への結合によりＩＮＳＬ５の生物学的活性を維持するＩＮＳＬ５タンパク質のいかなるフラグメントも包含する。
【００４３】
「細胞のセカンドメッセンジャー応答」は、発明のリガンド成分の結合に際してＧＰＣＲ１４２の活性化により媒介される細胞の細胞性応答を指す。それは、例えば、シグナル伝達事象、またはプロトン（ｐＨ）、カルシウム若しくはｃＡＭＰのようなセカンドメッセンジャー分子の細胞内濃度の変化を包含しうる。
【００４４】
「配列」は多量体中に存在する単量体の直線的順序、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序若しくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味している。
【００４５】
当該技術分野で既知のところの「配列の同一性若しくは類似性若しくは相同性」は、配列を比較することにより決定されるところの２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、一連のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列間の適合により決定されるところのこうした配列間の配列の関係性の程度もまた意味している。
【００４６】
２種のアミノ酸配列若しくは２種の核酸の同一性若しくは類似性パーセントを決定するために、該配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、第二のアミノ酸若しくは核酸配列との至適のアライメントのために第一のアミノ酸の配列若しくは核酸配列中にギャップを導入し得る）。対応するアミノ酸位置若しくはヌクレオチド位置のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドをその後比較する。第一の配列中のある位置が第二の配列中の対応する位置と同一若しくは類似のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドにより占有される場合には、該分子はその位置で同一若しくは類似である。２配列間の同一性若しくは類似性パーセントは、該配列により共有される同一若しくは類似の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数（例えばオーバーラップする位置）×１００）。
【００４７】
同一性および類似性の双方は容易に計算し得る。同一性パーセントの計算においては正確な適合のみをカウントする。配列間の同一性若しくは類似性を決定するのに一般に使用される方法は、例えばＣａｒｉｌｌｏら（１９８８）、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  
Ｍａｔｈ．４８、１０７３に開示されるものを包含する。同一性の好ましい決定方法は、試験される配列間の最大の適合を与えるように設計する。同一性および類似性の例示的決定方法はまた商業的コンピュータプログラムにも提供される。２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい一例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７でのように改変されたＫａｒｌｉｎら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６３−２２６８のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。比較の目的上ギャップを導入したアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記述されるところのＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用し得る。あるいは、分子間の離れた関係性を検出するＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して統合型検索（ｉｎｔｅｒａｔｅｄ  ｓｅａｒｃｈ）を実施し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。加えて、ＦＡＳＴＡ法（Ａｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３）を使用し得る。配列の比較に有用な数学的アルゴリズムの別の好ましい例はＭｙｅｒｓら（１９８８）、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２（１）、３８７）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。
【００４８】
ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列に関して本明細書で使用されるところの「実質的に類似の」という用語は、同一の配列、ならびに所望の生物学的活性部分を維持しかつその保存されたモチーフを有する改変された配列をもたらすそれに対する欠失、置換若しくは付加を包含する。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は、処置、観察若しくは実験の対象である動物若しくはヒトを指す。好ましくは、被験体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００５０】
受容体若しくはリガンド成分に関して本明細書で使用されるところの「実質的に純粋な形態」という用語は、リガンド−受容体結合を妨害しうる汚染物質を本質的に含まない生物学的試薬として有用なポリペプチドを意味している。実質的に純粋な形態のポリペプチドは例えば単離、精製、ペプチド合成若しくは組換え発現により製造しうる。例示的態様において、リガンド成分は単離若しくは組換え発現により製造し、また、受容体成分は全細胞の表面上で発現されたＧＰＣＲ１４２である。他の態様において、受容体およびリガンド双方の成分は、生じる複合体のいずれも、コンホメーション研究で使用しうる複合体の共結晶構造を生じるためのｘ線結晶学、またはリラキシン３／ＧＰＣＲ１４２若しくはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２の相互作用の調節（例えば受容体活性化作用若しくは拮抗作用）により媒介される障害の治療において有用な薬物の設計において補助するためのコンピュータモデル化のような応用で使用し得るように、実質的に純粋な形態にある。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「タグ」という用語は、タグを含有するタンパク質の単離、精製若しくは検出を助長するアミノ酸配列若しくはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なこうしたタグが当業者に既知であり、そして本発明での使用に適する。適するタグは、例えばＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジン、ＦＬＡＧおよび多様な抗体エピトープ結合部位を包含する。
【００５２】
本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」という用語は、処置されている疾患若しくは障害の症状の軽減のような、研究者、獣医師、医師若しくは他の臨床家により探求されている組織系、動物若しくはヒトにおいて生物学的若しくは医学的応答を導き出す活性成分若しくは製薬学的剤の量を意味している。製薬学的組成物の治療上有効な用量の慣例の決定方法が当該技術分野で既知である。
【００５３】
「ベクター」という用語は、それが結合されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクター（発現ベクター）は、それらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。組換えＤＮＡ技術で有用なベクターはプラスミドの形態にありうる。あるいは、同等な機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態のベクターを使用しうる。
リガンド／受容体複合体
本発明のリガンドおよび受容体の複合体の好ましい態様において、リガンド成分はヒト、マウス若しくはラットに由来するリラキシン３であるか、または、リガンド成分はヒトに由来するＩＮＳＬ５であるかのいずれかである。好ましくは、リガンド成分は組換えで発現されたリラキシン３若しくはＩＮＳＬ５のいずれかである。
【００５４】
本発明のリガンドおよび受容体の複合体の他の好ましい態様において、リガンド成分は、放射性同位元素若しくは蛍光分子のような検出可能な剤で標識される。標識技術は使用される標識剤の型に基づき選択され、そして当業者の範囲内にある。例えば、標識は、リガンド分子の原子の１個を対応する放射活性同位元素で置換することにより達成し得る。水素原子はトリチウムすなわち３Ｈで置換し得；炭素原子は炭素−１４すなわち１４Ｃで置換し得るか；若しくは、ストロンチウム原子をストロンチウム−３８すなわち３８Ｓｒで置換し得る。別の例示的標識方法においては、リガンドのいずれかの原子を放射活性同位元素で置換することよりもむしろ同位元素をリガンド分子に付加し得る。こうした放射活性同位元素は例えばヨウ素−１２５すなわち１２５Ｉおよび鉄−５９すなわち５９Ｆｅを包含する。なお別の例示的標識方法において、標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかでのペプチドの合成の間にメチオニン−３５（３５Ｓ）若しくはリン酸−３３（３３Ｐ、タンパク質リン酸化の）のような適切に放射標識した前駆体を使用することにより実施し得る。好ましくは、本発明のリガンド成分はヨウ素−１２５すなわち１２５Ｉで標識する。
【００５５】
複合体の受容体はヒトＧＰＣＲ１４２でありうる。他の種を探求するために、マウスおよびラットゲノムデータベース情報を、クエリとしてヒトＧＰＣＲ１４２配列を使用して検索し、そしてマウスおよびラットＧＰＣＲ１４２遺伝子を同定した。マウスＧＰＣＲ１４２遺伝子をクローン化し、そしてオープンリーディングフレームをＤＮＡシークェンシングにより確認した。マウスＧＰＣＲ１４２の完全なコーディング領域をＧｅｎＢａｎｋに寄託した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ６３３７６５）。全体として、マウスＧＰＣＲ１４２はヒトのものに対し７４％の配列の同一性を共有する。ヒトＧＰＣＲ１４２は３７４アミノ酸を有する一方、マウスの同等物はより長く４１４アミノ酸をもつ。Ｃ末端で、マウスＧＰＣＲ１４２はヒトＧＰＣＲ１４２と異なりかつはるかにより長いＣ末端尾部を有する。ラットゲノムデータベースを検索して、ＧＰＣＲ１４２に対応するラット遺伝子の存在を確認した。しかしながら、該ラット遺伝子は機能的ＧＰＣＲをコードするオープンリーディングフレームを有さず、そして従ってラットＧＰＣＲ１４２は偽遺伝子であるようである。サル、ウシおよびブタからのＧＰＣＲ１４２遺伝子もまたクローン化した。ＤＮＡシークェンシング結果は、サル、ウシおよびブタからのＧＰＣＲ１４２遺伝子が全部オープンリーディングフレームを有しかつヒトＧＰＣＲ１４２に対する高い相同性をもつ推定の受容体をコードすることを示した。異なる種からのＧＰＣＲ１４２間の相同性を図２に示す。サル、ウシおよびブタからのＧＰＣＲ１４２の完全なコーディング領域をＧｅｎＢａｎｋに寄託した（それぞれ受託番号ＡＹ６３３７６６、ＡＹ６３３７６７およびＡＹ６３３７６８）。
【００５６】
ヒトＧＰＣＲ１４２のリガンド結合特性に対し組換えサル、マウス、ウシおよびブタＧＰＣＲ１４２のリガンド結合特性を比較するため、競合結合実験を実施した。該結果は、試験した全部の種からのＧＰＣＲ１４２が、ウシについて０．８７±０．６４ｎＭ、サルについて１．３４±０．３２ｎＭ、ヒトについて１．４５±０．２２ｎＭ、ブタについて１．５９±０．４５ｎＭ、およびマウスについて５．４５±１ｎＭのＩＣ５０値を伴う高親和性でヒトリラキシン３を結合することを示した。特異的結合は擬似トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞で観察されなかった。異なる種からのＧＰＣＲ１４２をＧＴＰγＳ結合およびＣａ２＋可動化アッセイでもまた比較した。ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、ヒトリラキシン３は、それぞれウシについて０．４５±０．０７ｎＭ、ブタについて０．９６±０．１５ｎＭ、ヒトについて０．９８±０．２３ｎＭ、サルについて１．１±０．２ｎＭ、およびマウスについて３．５±０．７６ｎＭのＥＣ５０値を伴い、全部のＧＰＣＲ１４２受容体を強く刺激した。以前に、リラキシン３がヒトＧＰＣＲ１４２およびＧα１６を発現する細胞中でのＣａ２＋シグナル伝達を刺激することが示された（Ｌｉｕら、２００３ｂ）。サル、ウシおよびブタＧＰＣＲ１４２は、Ｇα１６と共発現される場合に、５０から１００ｎＭまでの範囲にわたるＥＣ５０値を伴いヒトＧＰＣＲ１４２のものに類似に挙動した。しかしながら、リラキシン３は、マウスＧＰＣＲ１４２およびＧα１６を発現する細胞中で検出可能なＣａ２＋応答を刺激しなかった。
【００５７】
従って、本発明のリガンドおよび受容体複合体は、好ましくはヒト、マウス、サル、ウシ若しくはブタに由来するＧＰＣＲ１４２を含んでなる。従って、好ましい一態様において、ＧＰＣＲ１４２ポリペプチドは、配列番号４、配列番号２、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９から選択される。
【００５８】
ある好ましい一態様において、ＧＰＣＲ１４２はＧＰＣＲ１４２宿主細胞、好ましくは組換えＧＰＣＲ１４２宿主細胞の細胞表面上で発現される。別の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１４２はＧＰＣＲ１４２宿主細胞、好ましくは組換えＧＰＣＲ１４２宿主細胞からの単離された細胞膜と結合している。なお別の好ましい態様において、該複合体の受容体成分は、リラキシン３リガンド若しくはＩＮＳＬ５リガンドに結合することが可能なＧＰＣＲ１４２のフラグメントである。
【００５９】
該複合体のリガンド成分は、完全長のリラキシン３、若しくはＧＰＣＲ１４２に結合することがなお可能であるその活性フラグメントのいずれでもあり得る。図２Ｃおよび３に示される結果から明らかなとおり、Ｂ鎖はＧＰＣＲ１４２を結合しかつ活性化することが可能である。該複合体のリガンド成分はまた、完全長のＩＮＳＬ５、若しくはＧＰＣＲ１４２に結合することがなお可能であるその活性フラグメントのいずれでもあり得る。
【００６０】
当業者に既知のリガンド成分および受容体の複合体のいずれの適する構成方法を使用してもこうした複合体を形成しうる。一般に、該方法は、リガンド成分を含んでなるサンプルを、受容体成分を含んでなるサンプルと混合することを含んでなる。
【００６１】
リガンド成分を含んでなるサンプルは、リガンド成分を含有する組織若しくは細胞抽出物、または精製したリガンド成分であり得る。本サンプルは、リガンド成分の天然の供給源、例えば、ヒトを包含する温血動物のリガンド成分の内因性宿主細胞若しくは組織から調製し得る。好ましくは、リガンド成分を含んでなるサンプルは、増大された量のリガンド成分を発現する組換え宿主細胞から調製する。リガンド成分の組換え宿主細胞は、機能的リガンド成分を発現することが可能なＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより構築しうる。
【００６２】
ヒト若しくは他の温血動物の組織若しくは細胞からの製造において、リガンド成分のポリペプチドは、ヒト若しくは他の温血動物の組織若しくは細胞をホモジェナイズすること、該ホモジェネートを酸若しくは別の適する抽出剤で抽出すること、ならびに、例えば逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー処置の組合せを介して抽出物からリガンド成分のポリペプチドを単離することを含んでなる方法により精製かつ単離し得る。
【００６３】
本発明のリガンド成分は既知のペプチド合成手順によってもまた製造し得る。ペプチド合成方法は、適する固相合成および液相合成技術から選択しうる。例えば、所望のペプチ
ドを、該タンパク質を構成することが可能な部分的ペプチド若しくはアミノ酸をその残余の部分と縮合すること、および、該生成物が保護基を有する場合には該保護基を除去することにより製造し得る。ペプチド合成の間の縮合および脱保護方法は、文献に、例えば：ＢｏｄａｎｓｚｋｙとＯｎｄｅｔｔｉ、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９６６；ＳｈｒｏｅｄｅｒとＬｕｅｂｋｅ、“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９６５；Ｉｚｕｍｉｙａら、“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｍａｒｕｚｅｎ、１９７５；ＹａｊｉｍａとＳａｋａｋｉｂａｒａ、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  １、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ”、２０５、１９７７；ａｎｄ  Ｙａｊｉｍａ（編）、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ−Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ、１４、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｓｈｏｔｅｎに記述されている。
【００６４】
ペプチド合成反応後、タンパク質生成物は、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーおよび再結晶のような慣習的精製技術の適する組合せにより精製かつ単離し得る。単離されたタンパク質が遊離の形態にある場合には、それを既知の方法により適する塩に転化し得る。逆に、単離された生成物が塩である場合は、それを当該技術分野で既知の方法から選択される適する方法により遊離のペプチドに転化し得る。
【００６５】
ポリペプチドのアミドは、アミド化に適するペプチド合成のための樹脂を使用することにより得ることができる。例示的樹脂は、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル−アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂および４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂を包含する。こうした樹脂を使用して、そのα−アミノ基および機能的側鎖基（Ｒ基）が適して保護されているアミノ酸を、当業者に既知である多様な縮合技術により目的のペプチドの配列に従って樹脂上で縮合する。一連の反応の終了時に、ペプチド若しくは保護されたペプチドを樹脂から分離し、そして保護基を除去して目的のポリペプチドを得る。
【００６６】
ＧＰＣＲ１４２受容体を含んでなるサンプルは、細胞表面上で発現された受容体を含む無傷の宿主細胞、該受容体の宿主細胞からの単離された細胞膜、若しくは該リガンドに結合することが可能である該受容体の精製されたフラグメントを含み得る。ＧＰＣＲ１４２受容体の内因性の宿主細胞を使用し得るとは言え、細胞表面上で増大された量のＧＰＣＲ１４２を発現する組換え宿主細胞が好ましい。
【００６７】
ＧＰＣＲがときにその細胞外ドメインでその内因性リガンドに結合することが既知である。こうした結合ドメインは、配列分析、タンパク質−タンパク質相互作用分析、タンパク質構造解析のような当業者に既知の多様な方法、若しくはこれらの方法の組合せにより同定し得る。例えば、代謝調節型グルタミン酸受容体中のリガンド結合ドメインが、その細胞外ドメイン中のＶｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐモジュール（ＶＦＴＭ）として同定された（Ｏ’Ｈａｒａら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｎ、１１（１）：４１−５２；Ｄａｖｉｄら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：３３４８８−３３４９５）。好ましい一態様において、ＧＰＣＲ１４２のリガンド成分結合ドメインが上の方法を使用して最初に同定され得、そしてこうしたリガンド成分結合ドメインを組換え発現させ、精製しかつ本発明の複合体の形成において使用し得る。
【００６８】
所望の種のＧＰＣＲ１４２は、下の実施例に記述されるもののような技術を使用してクローン化しうる。当該技術分野で既知の多様な手順のいずれも、本発明の核酸分子を単離するのに使用し得る。例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー、または上で同定された適する細胞からの全ｍＲＮＡを鋳型として、および適切なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、本発明の核酸分子を標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅し得る。ＰＣＲからそのように増幅された核酸を適切なベクター中にクローン化し得、そ
してＤＮＡ配列分析により特徴付け得る。プライマーは標準的合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して製造し得る。
【００６９】
本発明の核酸分子の別の単離方法は、当業者に利用可能な手順を使用して、１種若しくはそれ以上の天然の若しくは人工的に設計したプローブでゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーまたは全ｍＲＮＡをプロービングすることである。例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｃｃｏｓｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク１９９２を参照されたい。好ましいプローブは３０から５０塩基までを有することができる。こうしたプローブを、プローブの同定を助長するために分析で検出可能な試薬で標識し得る。有用な試薬は、例えば放射性同位元素、蛍光色素、若しくは検出可能な産物の形成を触媒することが可能な酵素を包含する。該プローブは、マウスならびにヒト、ラット、サル、ウシおよびブタのようなＧＰＣＲ１４２をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡポリヌクレオチドの相補的コピーを当業者が単離することを可能にする。
【００７０】
核酸分子の別の製造方法は標準的な合成技術による（例えば自動ＤＮＡ合成機を使用することである）。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーの調製、若しくは同定された供給源細胞からの全ｍＲＮＡの単離は、当該技術分野で既知の標準的技術により実施し得る。これらの技術は例えばＭａｎｉａｔｉｓら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出し得る。
【００７１】
別の局面において、本発明は、マウスＧＰＣＲ１４２を発現することが可能である核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなる。従って、該組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１個若しくはそれ以上の制御配列を包含する。組換え発現ベクターに関して使用される場合、「作動可能に連結された」は、（例えば、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、若しくはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で）目的のヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列の発現を見込む様式で制御配列（１個若しくは複数）に連結されることを意味することを意図している。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択および所望のタンパク質の発現のレベルのような因子に依存し得ることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入されてそれにより本明細書に記述されるところの核酸によりコードされる融合タンパク質若しくはペプチドを包含するタンパク質若しくはペプチドを産生し得る。
【００７２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）））または真核生物細胞（例えば昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞若しくは哺乳動物細胞）中での本発明のポリペプチドの発現のため設計し得る。適する宿主細胞は慣例で決定しうる。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳し得る。
【００７３】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合若しくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施しうる。融合ベクターは、タンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。こうした融合ベクターは、典型的には以下の目的、すなわち組換えタンパク質の発現を増大させるため；組換えタンパク質の溶解性を増大させるため；アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製で補助するため；およびマーカーとしてはたらくことにより組換えタンパク質の検出を助長するための１種若しくはそれ以上に使用される。しばしば、融合発現ベクター中では、タンパク質分解性切断部位が、該融合タンパク質の精製の後の融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分および組換えタンパク質
の接合部に導入される。こうした酵素およびそれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、プロテインＡ若しくはポリＨｉｓを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈら、（１９８８）、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）若しくはｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を包含する。
【００７４】
適する誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、（１９８８）、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を包含する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大限にするために一戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する損なわれた能力を伴う宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で優先的に利用されるものになるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである。本発明の核酸配列のこうした変化は標準的ＤＮＡ合成技術により実施し得る。
【００７５】
別の好ましい態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒＪａｎら（１９８２）、Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）およびｐＰｉｃＺ若しくはＰｉｃｈｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
【００７６】
あるいは、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、例えば、ｐＡｃシリ―ズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を包含する。組換え発現に有用な商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターはｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を包含する。
【００７７】
なお別の好ましい態様において、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。哺乳動物発現ベクターの例は、例えばｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｉｎａｎら、（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：１８７−１９５）を包含する。組換えプロテアーゼＣＯＸ−３発現に適し得る商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、例えば、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）および１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を包含する。
【００７８】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で既知である。適する組織特異
的プロモーターの例は、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅら（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏら（１９８９）、ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（ＢａｎｅｉＪｉら（１９８３）、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎら、（１９８３）、Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｍｅら（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許公開第２６４，１６６号明細書）を包含する。発達的に調節されるプロモーター、例えば海生（ｍａｒｉｎｅ）ｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌら（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびβ−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓら（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含する。
【００７９】
本発明はさらに、ベクター中にアンチセンスの向きでクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子が、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で制御配列に作動可能に連結されている。多様な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンスの向きでクローン化された核酸に作動可能に連結された制御配列、例えばウイルスプロモーターおよび／若しくはエンハンサーを選び得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的若しくは細胞型特異的発現を指図する制御配列を選び得る。アンチセンス発現ベクターは、ベクターが導入される細胞型によりその活性が決定され得る高効率制御領域の制御下にアンチセンス核酸が産生される組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒ウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（“Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”、Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照されたい。
【００８０】
本発明はまた、好ましい一態様において、哺乳動物細胞中での低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成を指図する組換えベクター系も提供する。多くの生物体は、遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞中に存在する場合にＲＮＡ干渉として知られる過程によりいかなる遺伝子発現も阻害する機構を有する。特定の一遺伝子の活性を低下させるためのｄｓＲＮＡの使用の技術は、線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して最初に開発され、そしてＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉと称されている（Ｆｉｒｅら（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡｉは以来多くの生物体で有用であることが見出され、そして最近、培養物中の哺乳動物細胞に拡大された（Ｍｏｓｓ（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：Ｒ７７２−５による総説を参照されたい）。ＲＮＡｉが２１〜２５ヌクレオチドの低分子ＲＮＡの生成を巻き込むことが示された場合に重要な進歩がなされた（Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３−６；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３）。これらの低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡは、当初、該過程を開始するより大きなｄｓＲＮＡに由来するとみられ、そして最終的には分解される標的ＲＮＡに相補的である。ｓｉＲＮＡはそれら自身が各端で短いオーバーハングを伴う二本鎖であり；それらは相補領域中での標的の単一の切断を指図するガイドＲＮＡとして作用する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅら（２０００）、Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３）。
【００８１】
マウスＧＰＣＲ１４２に相補的であるヌクレオチドを含んでなるｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０１／７５１６４号明細書に記述される方法を使用して製造しうるか、若しくは安定な発現系を使用して哺乳動物細胞からｉｎ  ｖｉｖｏで産生させ得る。哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡの合成を指図する例示的一ベクター
系はｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−３）である。
【００８２】
本発明の例示的ベクターはまた、細菌−酵母若しくは細菌−動物細胞若しくは細菌−真菌細胞若しくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を可能にする特別に設計されたベクターも包含する。多数のクローニングベクターが当業者に既知であり、かつ、適切なクローニングベクターの選択は当業者の範囲内にある。原核生物および真核生物双方の細胞のための他の適する発現系については、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、上記の第１６および１７章を参照されたい。
【００８３】
本発明はまた、本発明の組換えベクターが導入された組換え宿主細胞も提供する。トランスフェクションに適し得かつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞株は、例えばＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）若しくはネズミのＬ細胞、およびＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、ならびにサル腎細胞を包含する。
【００８４】
ベクターＤＮＡは、慣習的な形質転換若しくはトランスフェクション技術を介して原核生物若しくは真核生物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」若しくは「トランスフェクション」という用語は、細胞が外来ＤＮＡを取り込みかつその外来ＤＮＡをそれらの染色体中に組み込んでも組み込まなくてもよい過程を指す。トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法若しくはプロトプラスト融合を包含する多様な技術により達成し得る。宿主細胞に適する形質転換若しくはトランスフェクション方法は例えばＭａｎｉａｔｉｓら（上記）に見出し得る。
【００８５】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して細胞の小画分のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込みうることが既知である。これらの組み込み体を同定かつ選択するために、（例えば抗生物質に対する耐性についての）選択可能なマーカーをコードする遺伝子を目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入しうる。好ましい選択可能なマーカーはＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与するものを包含する。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を薬物選択により同定し得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【００８６】
別の態様において、細胞、細胞株若しくは微生物内の内因性核酸の発現の特徴を、挿入された調節エレメントが内因性遺伝子と効果的に連結されかつ該内因性遺伝子を制御、調節若しくは活性化するような、細胞、安定細胞株若しくはクローン化した微生物のゲノム中に目的の内因性遺伝子に対し異種のＤＮＡ調節エレメントを挿入することにより改変し得る。例えば、米国特許第５，２７２，０７１号明細書およびＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ９１／０６６６７号明細書に記述されるところの標的を定めた相同的組換えのような技術を使用して、異種調節エレメントが内因性遺伝子と効果的に連結されかつその発現を活性化するような安定細胞株若しくはクローン化した微生物に異種調節エレメントを挿入し得る。
【００８７】
本発明の好ましい一態様は、本質的に配列番号７、８若しくは９のアミノ酸配列よりなる実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、発明のポリペプチドの発現若しくは単離方法にも関する。
【００８８】
一態様において、ポリペプチドは、標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームにより、それを天然に発現する細胞若しくは組織供給源から単離し得る。別の態様において、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により製造する。あるいは、本発明のポリペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系中で合成し得る。さらにあるいは、本発明のポリペプチドは標準的ペプチド合成技術を使用して化学合成し得る。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子を上述された発現ベクター中にクローン化すること、こうしたベクターを本明細書で記述されるところの原核生物若しくは真核生物宿主細胞に導入すること、および組換えタンパク質の製造に適する条件下で該宿主細胞を増殖させることにより組換え的に発現し得る。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に繁殖させ、そして個々に分析してそれらが本発明のポリペプチドを産生するかどうかを決定する。動物のＧＰＣＲ１４２を発現する宿主細胞クローンの同定は、抗動物ＧＰＣＲ１４２抗体との免疫学的反応性、およびリラキシン３結合若しくはＩＮＳＬ５結合のような宿主細胞に関連したＧＰＣＲ１４２の活性の存在を包含するいくつかの手段により行ない得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は当該技術の熟練内にある。ポリペプチドを組換え的に発現させる技術は例えばＭａｎｉａｔｉｓら、上記に記述されている。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、当該技術分野で既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系を使用してもまた製造し得る。例えば、合成のサル、ラット、ウシ若しくはブタＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡ若しくは細胞から単離されたｍＲＮＡを、コムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を包含する多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳し得る。あるいは、サル、ラット、ウシ若しくはブタＧＰＣＲ１４２  ｃＤＮＡのコーディング配列をＴ７プロモーターの制御下にクローン化し得る。その後、この構築物を鋳型として使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳系で、例えばＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から商業的に入手可能なもののようなＴＮＴ  Ｔ７を組み合わせた網状赤血球ライセート系を使用してタンパク質を製造し得る。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、上述されたところの方法を使用する化学合成によってもまた製造し得る。
【００９２】
マウスＧＰＣＲ１４２タンパク質は当業者に既知の方法により精製し得る。例えば、それは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣ、ならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組合せ若しくは個別の適用により、天然の若しくは組換えの宿主細胞からの細胞ライセートおよび抽出物から精製し得る。
組換え細胞からのリラキシン３の製造
リラキシン３はジスルフィド架橋により結合された２本のポリペプチド鎖（Ａ鎖およびＢ鎖）から構成される分泌型タンパク質であるため、リラキシン３のプレプロペプチドからの成熟リラキシン３の産生にプロテアーゼが関与している。シグナル配列ペプチダーゼが該プロペプチドからシグナル配列を切断分離してリラキシン３プロペプチドをもたらす。該プロペプチドはその後、プロホルモン転換酵素によりリラキシン３の鎖Ａ、ＢおよびＣに切断される。Ａ鎖およびＢ鎖は最終の成熟リラキシン３を形成し、そしてＣ鎖は該成熟リラキシン３の部分でない。プロホルモン転換酵素は若干のニューロン細胞若しくは内分泌細胞のようなホルモンを分泌するある細胞型でのみ選択的に発現されるため、リラキシン３プロペプチドは、ＣＯＳ７のような他の細胞型から組換え的にそれが発現される場合にしばしば効率的にプロセシングされない。
【００９３】
リラキシン３は：リラキシン３プロペプチドの鎖ＡとＣとの間および／若しくは鎖ＣとＢとの間のペプチド接合部に挿入された１個のプロテアーゼ切断部位を伴う改変リラキシン３プロペプチドをコードすることが可能なＤＮＡ分子を構築すること；該改変リラキシン３プロペプチドを発現することが可能なベクターを構築すること；挿入されたプロテアーゼ切断部位（１個若しくは複数）で該改変リラキシン３プロペプチドを切断し得るプロテアーゼを発現することが可能な別のベクターを構築すること；双方のベクターを宿主細胞中に導入すること；ならびに、該プロテアーゼが改変リラキシン３プロペプチドの鎖ＡとＣ若しくは鎖ＣとＢとの間でペプチド結合を効率的に切断することができるように、改変リラキシンプロペプチドおよびプロテアーゼ双方の発現に適する条件下で該宿主細胞を増殖させることを含んでなる段階により、組換え細胞から製造しうる。
【００９４】
配列分析は、プロホルモン転換酵素の１メンバー、フリンが天然のリラキシン３プロペプチドの鎖ＣとＢとの間のペプチド結合を切断し、また、別の同定されていないプロテア
ーゼが天然のプロペプチドの鎖ＡとＣとの間のペプチド結合を切断することを示唆した。ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ（ＲＧＲＲ）のアミノ酸配列をもつフリン切断部位を鎖ＡとＣのペプチド接合部に挿入しうる。この変異体リラキシン３の発現ベクターおよびフリンの別の発現ベクターを宿主細胞中にコトランスフェクトする。適する増殖条件下で、リラキシン３プロペプチドはほとんど完全に成熟ペプチドＡ、ＢおよびＣにプロセシングされる。フリンの代わりに他のプロテアーゼもまた使用し得る。同一のプロテアーゼ切断部位をプロペプチドの鎖ＡとＣおよび鎖ＣとＢとの間に挿入し得る。使用し得るプロテアーゼの例は、例えば、フリン、ＰＣ１およびＰＣ２のようなプロホルモン転換酵素を包含する（Ｈｏｓａｋａら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３５６４−３５６８；Ｔｈｏｍａｓら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５２９７−５３０１）。
【００９５】
リラキシン３に対するその高い相同性のため、ＩＮＳＬ５がＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８の付加的なリガンドであり得ることが推測された。従って、ヒトＩＮＳＬ５ペプチドを組換え的に発現させた。ＩＮＳＬ５がＧＰＣＲ１４２のアゴニストであるがしかしＧＰＣＲ１３５のアゴニストでないことが見出された。
【００９６】
ＧＰＣＲ１４２とＩＮＳＬ５との間の同定された相互作用は、ＧＰＣＲ１４２遺伝子および／若しくはＩＮＳＬ５遺伝子が導入若しくは破壊されているノックアウトマウスのようなトランスジェニック動物の開発を見込む。該受容体とリガンドとの間の同定された相互作用はまた、ＩＮＳＬ５およびＧＰＣＲ１４２の複合体に関する障害の治療におけるそれらの潜在的な有効性について化合物を同定するためのスクリーニング方法若しくはアッセイにおけるＧＰＣＲ１４２若しくはＧＰＣＲ１４２／ＩＮＳＬ５複合体の使用も見込む。
【００９７】
好ましい一態様において、タンパク質の単離若しくは精製を助長するために、ＨＡ、ポリＨｉｓ若しくはＦＬＡＧのようなタグを、改変リラキシン３プロペプチド若しくはＩＮＳＬ５のいずれかに付加し得る。ＰＣＲのような、こうしたＤＮＡ分子によりコードされるアミノ酸のある種の所望の変化を引き起こすようにＤＮＡ分子を改変することが既知の技術を使用しうる。
リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２若しくはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体いずれかの活性の調節物質の同定方法
本発明の別の一般的な局面は、リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２複合体若しくはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体いずれかの生物学的活性を増大するか若しくは減少するかのいずれかである調節物質の同定方法に関する。こうした調節物質は、ＣＮＳ障害（不安、統合失調症、うつ、気分、睡眠／覚醒）、代謝障害、摂食／飲酒障害、水および栄養素の恒常性、ならびに内分泌障害のような、リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２複合体若しくはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体いずれかに関する疾患若しくは障害に苦しめられている被験体の処置において治療薬として有用であるはずである（Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４３８：８６−１２２を参照されたい）。
【００９８】
「阻害剤」は、リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２複合体の発現若しくは活性またはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体の発現若しくは活性のいずれかを減少、予防、不活性化、脱感作若しくはダウンレギュレートする化合物を指す。「活性化物質」は、リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２複合体の発現若しくは活性またはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体の発現若しくは活性を増大、活性化、助長、感作若しくはアップレギュレートする化合物である。「調節物質」は「阻害剤」および「活性化物質」双方を包含する。
【００９９】
化合物の同定方法は慣習的な実験室の形式を使用して若しくはハイスループットに適合されたアッセイで実施し得る。「ハイスループット」という用語は、同時に複数のサンプル若しくは単一サンプルの迅速な容易なスクリーニングを可能にするアッセイ設計を指し、そしてロボット操作の能力を包含し得る。ハイスループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成させるための試薬の使用を低下させるか若しくは操作の回数を最小限にするよう至適化されているアッセイ設計である。アッセイ形式の例は、９６ウェル若
しくは３８４ウェルプレート、浮揚液滴、および液体を取扱う実験に使用される「チップ実験室（ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」マイクロチャンネルチップを包含する。もちろん、プラスチック型および液体取扱い装置の小型化が進歩する際に、若しくは改良されたアッセイ装置が設計される際に、より多数のサンプルが発明のアッセイを使用してより効率的にスクリーニングされることが可能になるであろう。
【０１００】
スクリーニングの候補化合物は多数の化学的分類、好ましくは有機化合物の分類から選択し得る。候補化合物は巨大分子であり得るとは言え、好ましくは、候補化合物は小分子有機化合物、すなわち５０以上かつ２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物はポリペプチドとの構造的相互作用に必要な１個若しくはそれ以上の機能的化学基を有する。好ましい候補化合物は、最低１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基、好ましくは最低２個のこうした官能基、およびより好ましくは最低３個のこうした官能基を有する。候補化合物は、上で例示された官能基の１個若しくはそれ以上で置換された環状炭素若しくは複素環構造部分および／または芳香族若しくは多環芳香族構造部分を含み得る。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジンのような生体分子、上の誘導体若しくは構造アナログ、またはそれらの組合せなどでもあり得る。化合物が核酸である場合、該化合物は好ましくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であるが、とは言え非天然の結合若しくはサブユニットを有する修飾核酸もまた企図している。
【０１０１】
候補化合物は合成若しくは天然の化合物のライブラリーを包含する多様な供給源から得ることができる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する多数の手段が、多様な有機化合物および生体分子の無作為および定方向合成に利用可能である。候補化合物はまた：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる（例えばＬａｍ（１９９７）、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５を参照されたい）。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか、若しくは慣例に製造しうる。加えて、天然のおよび合成で製造したライブラリーおよび化合物を、慣習的な化学的、物理的および生化学的手段により慣例で改変し得る。
【０１０２】
さらに、既知の薬理学的剤を、該剤の構造的アナログを製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化およびアミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような定方向若しくは無作為の化学修飾にかけ得る。候補化合物は無作為に選択し得るか、または、ＧＰＣＲに結合しかつ／またはその機能若しくは活性を調節する既存の化合物に基づき得る。従って、候補の剤の供給源は、ＧＰＣＲ１４２に類似の構造をもつＧＰＣＲの活性化物質若しくは阻害剤を包含する分子の既知の若しくはスクリーニングされたライブラリーである。こうした化合物の構造は、該分子の１個若しくはそれ以上の位置により多い若しくは少ない化学的部分または多様な化学的部分を含有するように変化させうる。アナログ活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において該分子に対しなされる構造変化は、定方向、無作為、または定方向および無作為双方の置換および／若しくは付加の組合せであり得る。
【０１０３】
多様な他の試薬もまたアッセイ混合物中に包含し得る。これらは、塩、緩衝剤、中立のタンパク質（例えばアルブミン）のような試薬、ならびに至適のタンパク質−タンパク質および／若しくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用し得る洗剤を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的すなわちバックグラウンドの相互作用も低下させ得る。ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬などのようなアッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用し得る。
【０１０４】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら
（１９９４）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出し得る。化合物のライブラリーは、溶液中に（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）若しくはファージ（例えばＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０を参照されたい）上に提示し得る。
【０１０５】
従って、一般的な一局面において、本発明は：
（ａ）緩衝剤および候補若しくは試験化合物を含んでなる溶液を、リラキシン３およびＧＰＣＲ１４２の複合体を含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）リラキシン３およびＧＰＣＲ１４２の複合体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）の結果を、リラキシン３およびＧＰＣＲ１４２の複合体を緩衝液のみと接触させた対照のものと比較する段階
を含んでなる、リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２複合体の生物学的活性を増大若しくは減少させる化合物の同定方法に関する。
【０１０６】
好ましい一態様において、該方法におけるリラキシン３およびＧＰＣＲ１４２の複合体は、細胞表面上にＧＰＣＲ１４２を発現する細胞と結合されている。
【０１０７】
別の一般的局面の本発明は：
（ａ）緩衝剤および候補若しくは試験化合物を含んでなる溶液を、ＩＮＳＬ５およびＧＰＣＲ１４２の複合体を含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）ＩＮＳＬ５およびＧＰＣＲ１４２の複合体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）の結果を、ＩＮＳＬ５およびＧＰＣＲ１４２の複合体を緩衝液のみと接触させた対照のものと比較する段階
を含んでなる、ＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体の生物学的活性を増大若しくは減少させる化合物の同定方法に関する。
【０１０８】
好ましい一態様において、該方法におけるＩＮＳＬ５とＧＰＣＲ１４２の複合体は、細胞表面上にＧＰＣＲ１４２を発現する細胞と結合されている。
【０１０９】
「細胞」という用語は、検出方法の感度に適切な最低１個の細胞若しくは複数の細胞を指す。本発明に適する細胞は細菌細胞でありうるが、しかし好ましくは酵母、昆虫若しくは哺乳動物のような真核生物である。細胞は、細胞表面上で大量の哺乳動物のＧＰＣＲ１４２を発現する内因性のＧＰＣＲ１４２の天然の宿主細胞、好ましくはＧＰＣＲ１４２の組換え宿主細胞であり得る。
【０１１０】
リラキシン３／ＧＰＣＲ１４２複合体若しくはＩＮＳＬ５／ＧＰＣＲ１４２複合体のいずれも、それぞれリラキシン３若しくはＩＮＳＬ５いずれかを、精製されたタンパク質の形態、またはリラキシン３若しくはＩＮＳＬ５いずれかを含有する細胞若しくは組織抽出物の形態でＧＰＣＲ１４２宿主細胞に添加することにより形成させ得る。リラキシン３若しくはＩＮＳＬ５のいずれも、完全長の成熟ポリペプチド、若しくはＧＰＣＲ１４２に結合することがなお可能であるフラグメントであり得る。
【０１１１】
好ましい態様において、本発明のリガンド成分／ＧＰＣＲ１４２複合体の生物学的活性は、細胞のセカンドメッセンジャー応答により測定し得る。例えば、該複合体の生物学的活性は、活性化されたＧＰＣＲ１４２により誘発されるシグナル伝達事象により測定し得る。このシグナル伝達事象は、当該技術分野で既知の１種若しくはそれ以上の適する方法を使用して、細胞の形態学、移動若しくは走化性のような細胞生理学の１種若しくはそれ以上の変化を測定することによって間接的に測定し得る。それは、シグナル伝達経路に関与するタンパク質のリン酸化、例えばＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）のリン酸化を測定することにより直接にもまた測定し得る。例えばγ−リン酸上で放射標識されてい
るＡＴＰ若しくはＧＴＰ分子を使用することによるタンパク質リン酸化の測定方法が当該技術分野で既知である。
【０１１２】
本発明のリガンド成分／ＧＰＣＲ１４２複合体の生物学的活性は、当該技術分野で既知の多数の適する技術のいずれかを使用して、セカンドメッセンジャー分子の細胞内濃度によってもまた測定し得る。例えば、ｐＨの変化はアクリジンオレンジのようなｐＨ感受性色素を使用して測定し得る。カルシウム濃度は、蛍光定量的画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）若しくは共焦点顕微鏡を使用して、ｆｌｕｏ−３（五カリウム塩、細胞不浸透性の形態；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）若しくはｆｌｕｏ−３（ＡＭ）（アセトキシメチルエステルの形態のｆｌｕｏ−３、Ｔｅｆｌａｂｓ）のようなＣａ２＋に対し感受性の蛍光指示薬（例えばＬｉｕら、２００１、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９９：１２１−３０を参照されたい）の光学的画像化を介して測定し得る。ｃＡＭＰ濃度は、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥ環状ＡＭＰアッセイ系（１２５Ｉ）、カタログ番号：ＳＭＰ００１Ａ、ＮＥＮ；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５８２６−３２もまた参照されたい）を使用して、若しくは、β−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子の発現がｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるレポーター系（Ｍｏｎｔｍｉｎｙら、１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１３（５）：１８４−８）を介して検出し得る。
【０１１３】
試験化合物は、２種の細胞（機能的ＧＰＣＲ１４２を含有する第一の細胞および機能的ＧＰＣＲ１４２を欠くことを除き第一のものに同一の第二の細胞）に対するその影響を比較することによりさらに特徴付け得る。この技術は、これらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においてもまた有用である。当業者は、この対照機構が、機能的ＧＰＣＲ１４２の調節に応答性である細胞性変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。従って、好ましい態様において、該スクリーニング法は：（ａ）細胞表面上で発現されたＧＰＣＲ１４２を有する第一の細胞をリガンド成分および試験化合物と接触させる段階；（ｂ）試験化合物に対する第一の細胞中でのセカンドメッセンジャー応答を測定する段階、および、第一の細胞がリガンド成分とのみ接触されしかし試験化合物と接触されない対照のものとそれを比較する段階；（ｃ）第二の細胞をリガンド成分および試験化合物と接触させる段階（ここで、該第二の細胞はそれが細胞表面上でＧＰＣＲ１４２を発現しないことを除きそれ以外は第一の細胞に同一である）；（ｄ）試験化合物に対する第二の細胞のセカンドメッセンジャー応答を測定する段階、および、該第二の細胞がリガンド成分とのみ接触されしかし試験化合物と接触されない対照のものと該セカンドメッセンジャー応答を比較する段階；ならびに（ｅ）（ｂ）の結果の（ｄ）のものとの比較を比較する段階を含んでなる。
【０１１４】
一方がその細胞表面上でＧＰＣＲ１４２を発現しかつ他方がしないことを除きそれ以外は同一である２種の細胞を得るための多数の方法が存在する。一態様において、第一の細胞は、その細胞表面上にＧＰＣＲ１４２を構成的に発現するＧＰＣＲ１４２の組換え宿主細胞であり、そして、第二の細胞は、ＧＰＣＲ１４２組換え細胞がそれから構築される親細胞である。別の態様において、細胞表面上でのその発現が誘導可能なプロモーターの制御下にあるようなＧＰＣＲ１４２の組換え宿主細胞が構築される。第一の細胞は、その細胞表面上でのＧＰＣＲ１４２の発現を可能にする誘導可能な条件下で増殖させた組換え細胞であり、また、第二の細胞は、ＧＰＣＲ１４２の発現を可能にしない誘導可能でない条件下で増殖させた該組換え細胞である。なお別の態様において、第一の細胞は、その細胞表面上に該ポリペプチドを発現するＧＰＣＲ１４２の天然の宿主細胞であり、そして、第二の細胞は、ＧＰＣＲ１４２遺伝子が突然変異誘発により不活性化された天然の宿主由来の変異体細胞である。標準的分子生物学の方法を使用して、ＧＰＣＲ１４２の組換え宿主細胞を構築若しくはＧＰＣＲ１４２遺伝子を不活性化し得る。
【０１１５】
他の好ましい態様において、本発明は：（ａ）リガンド成分とともにＧＰＣＲ１４２を含んでなる単離された膜調製物を、試験化合物およびγ−リン酸上で標識したＧＴＰ分子と接触させる段階；ならびに（ｂ）膜調製物に結合された標識の量を測定する段階；なら
びに（ｃ）（ｂ）での標識の量を、膜調製物がリガンド成分および標識ＧＴＰとのみ接触されしかし試験化合物と接触されない対照のものと比較する段階を含んでなる、リガンド成分／ＧＰＣＲ１４２複合体の活性を増大若しくは減少させる化合物の同定方法を提供する。
【０１１６】
該膜調製物は、その細胞表面上でＧＰＣＲ１４２を発現する天然の宿主細胞から、若しくは、好ましくは、その細胞表面上で増大された量のＧＰＣＲ１４２を発現する組換え宿主細胞から単離し得る。それはまたＧＰＣＲ１４２宿主細胞を含んでなる組織からも単離し得る。
【０１１７】
蛍光分子、若しくは３５Ｓ、３２Ｐなどのような放射活性同位元素のような多様な標識を使用して、γ−リン酸上でＧＴＰ分子を標識し得る。
【０１１８】
なお他の態様において、本発明は：ａ）ＧＰＣＲ１４２を試験化合物および標識したリガンド成分と接触させる段階；ｂ）ＧＰＣＲ１４２に結合する標識したリガンド成分の量を測定する段階；およびｃ）（ｂ）の測定された量を、ＧＰＣＲ１４２が標識したリガンド成分とのみ接触されしかし試験化合物と接触されない対照のものと比較する段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２に結合する化合物の同定方法を提供する。
【０１１９】
好ましい一態様において、細胞表面上にＧＰＣＲ１４２を発現するＧＰＣＲ１４２宿主細胞（組換え若しくは天然）を結合アッセイに使用し得る。別の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１４２を含んでなる単離された膜調製物を結合アッセイに使用し得る。なお別の好ましい態様において、リラキシン３に結合することが可能であるＧＰＣＲ１４２の実質的に精製された細胞外フラグメントを結合アッセイに使用し得る。
【０１２０】
ＧＰＣＲ１４２に結合する標識したリガンド成分若しくはそのフラグメントの量は、最初に未結合の標識したリガンド成分若しくはフラグメントをＧＰＣＲ１４２から分離すること、およびその後ＧＰＣＲ１４２と結合している標識の量を測定することにより測定し得る。
【０１２１】
未結合の標識したリガンド成分若しくはそのフラグメントからのＧＰＣＲ１４２タンパク質の分離は多様な方法で達成し得る。便宜的には、ＧＰＣＲ１４２を固体支持体上に固定することができ、それからリガンド成分を容易に分離し得る。固体支持体は多様な素材からおよび多様な形状に（例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティックおよび樹脂粒子）作成し得る。該支持体は、好ましくは、Ｓ／Ｎ比を最大にするように、主としてバックグラウンド結合を最小限にするように、ならびに分離の容易さおよび費用のため選ばれる。
【０１２２】
分離は、例えばビーズ若しくはディップスティックを液貯めから取り出すこと、マイクロタイタープレートのウェルのような液貯めを空にする若しくは希釈すること、またはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム若しくはフィルターを洗浄溶液若しくは溶媒ですすぐことにより遂げ得る。該分離段階は、好ましくは複数のすすぎ若しくは洗浄を包含する。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、該ウェルを、例えば塩、緩衝剤、洗剤、非特異的タンパク質などのような特異的結合に参画しないインキュベーション混合物の成分を包含する洗浄溶液で数回洗浄し得る。固体支持体が磁性ビーズである場合、該ビーズを洗浄溶液で１回若しくはそれ以上洗浄し得、そして磁石を使用して単離し得る。
【０１２３】
ＧＰＣＲ１４２は多数の方法を使用して固体支持体に固定し得る。一態様において、ＧＰＣＲ１４２タンパク質をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質若しくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）若しくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ得、それをその後試験化合物および標識したリガンド成分と結合させ、そして複合体形成につながる条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）該混合物をインキュベートする。インキュベーション後に、ビーズ若しくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の化合物も除去し、そして、複合体形成を例えば上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれかで
測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして標識したリガンド成分のＧＰＣＲ１４２への結合のレベルを、標準的技術を使用して測定し得る。
【０１２４】
マトリックスにタンパク質を固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、ＧＰＣＲ１４２をビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定し得る。ビオチニル化ポリペプチドを、当該技術分野で既知の技術（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォードから入手可能なビオチニル化キット）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造し得、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定し得る。
【０１２５】
あるいは、ＧＰＣＲ１４２と反応性しかしリガンド成分若しくは試験化合物へのＧＰＣＲ１４２の結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに結合させ得、そしてＧＰＣＲ１４２をその後、抗体結合によりウェル中で捕捉し得る。
【０１２６】
直接検出（例えば放射活性、発光、光学若しくは電子密度）または間接検出（例えばＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ若しくはワサビペルオキシダーゼのような酵素タグ）を提供するもののような多様な標識を使用して、リガンド成分若しくはそのフラグメントのいずれかを標識し得る。
【０１２７】
候補化合物の存在および非存在下でのリガンド成分に対するＧＰＣＲ１４２の相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠沈管を包含する。
【０１２８】
別の一般的な局面において、本発明は：
（ａ）試験化合物を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントの生物学的活性を測定する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）の結果を、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントを試験化合物の非存在下でリガンド成分若しくはその活性フラグメントと接触させた対照のものと比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１４２を結合しかつリガンド成分を模倣する化合物の同定方法に関する。
【０１２９】
本方法の好ましい一態様において、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントは組換え細胞から、好ましくは細胞表面上で発現される。別の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１４２若しくはその活性フラグメントは単離された細胞膜調製物内にある。
【０１３０】
生物学的活性は、活性化されたＧＰＣＲ１４２により誘発されるシグナル伝達事象若しくはセカンドメッセンジャー分子の細胞内濃度の変化のような、受容体およびリガンド成分の複合体と関連する生物学的活性、若しくはＧＰＣＲ１４２およびこうしたリガンド成分の相互作用のいずれでもあり得る。これらの生物学的活性は上述された方法を使用して測定し得る。リガンド成分を「模倣する」試験化合物は、こうしたリガンド成分の変化と類似のＧＰＣＲ１４２の生物学的活性の変化を導き出す。
【０１３１】
さらに、受容体は構成的活性を生じるように改変し得る。この構成的活性はインバースアゴニストにより抑制され得る。
【０１３２】
以下の実施例は本発明の多様な局面およびその好ましい態様をさらに具体的に説明する。
実施例
以下の実験プロトコルにおいて、ヒトインスリン、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２はＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ヒトＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ６、酸化されたリラキシン３のＡ鎖およびＢ鎖ペプチドはＰｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ（カリフォルニア州ベルモント）から購入した。ブタリラキシンはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（カリフォルニア州トーランス）から購入した。ヒトリラキシン３はＬｉｕら、２００３ａにより記述されたとおり組換えで製造した。別の方法で示されない限り、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して：変性のため９４℃、３０秒；アニーリングのため６５℃、３０秒；および伸長のため７２℃３分の条件で４０周期、実施した。
【０１３３】
他のペプチドの全部は組換えで製造した。
【実施例１】
【０１３４】
多様な種のＧＰＣＲ１４２の分子クローニング
ヒトＧＰＣＲ１４２配列の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＬ３５５３８８）を、ＧＰＣＲ１３５に対するその相同性に基づいてヒトゲノムから同定した。ヒトＧＰＣＲ１４２の完全なコーディング領域を、２種のプライマー、すなわちフォワードプライマー（配列番号１０）＝５’ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＣ
ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  Ｃ  ３’；リバースプライマー（配列番号１１）＝５’ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  Ｔ  ３’を使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１３５】
完全なコーディング領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲを含有するサルＧＰＣＲ１４２遺伝子は、ヒトＧＰＣＲ１４２遺伝子配列に従って設計した２種のプライマー（フォワードプライマー（配列番号１２）：５’ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ３’；リバースプライマー（配列番号１３）：５’ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  Ｇ  ３’）を使用して、ブタオザル（Ｍａｃａｃａ  Ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは５５℃のアニーリング温度を除き上述されたとおり実施した。サルＧＰＣＲ１４２のコーディング領域配列をＰＣＲ産物の直接シークェンシングにより得た。サルＧＰＣＲ１４２のコーディング領域をその後、新たに集成したサルＧＰＣＲ１４２配列に従って設計したフォワードプライマー（配列番号３９）（５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  Ｔ  ３’）およびリバースプライマー（配列番号４０）（５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  Ｔ  ３’）を使用してサルゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏにＥｃｏＲ１とＮｏｔ１部位との間にクローン化した。挿入物領域をシークェンシングして配列の同一性を確認した。
【０１３６】
マウスＧＰＣＲ１４２コーディング領域を、フォワードプライマー（配列番号１４）５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＴＣＣ
ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣ  ３’およびリバースプライマー（配列番号１５）５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  Ｇ  ３’を使用してＢａｌｂ／ｃマウスゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして該ＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏにＥｃｏＲ１とＮｏｔ１部位との間にクローン化した。該プラスミドの挿入物領域をシークェンシングして配列の同一性を確認した。
【０１３７】
ウシおよびブタのＧＰＣＲ１４２遺伝子は、ヒトＧＰＣＲ１４２遺伝子の５’端および３’端のＵＴＲに従って設計した２種のプライマー（フォワードプライマー（配列番号４１）：５’ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  ３’；リバースプライマー：（配列番号４２）５’ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ３’）を使用してそれぞれウシおよびブタのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲはアニーリング温度として５５℃を使用して上述されたとおり実施した。ＰＣＲ産物をシークェンシングし、そしてその後ウシおよびブタのＧＰＣＲ１４２遺伝子のコーディング領域を集成した。ウシＧＰＣＲ１４２の完全なコーディング領域をその後、新たに集成したウシＧＰＣＲ１４２配列に従って設計した２種のプライマー（フォワードプライマー（配列番号１６）：５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ
ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＣ  ３’；リバースプライマー（配列番号１７）：５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  Ａ
ＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＣ  ３’）を使用してウシゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして該ＰＣＲ産物をｐＣＩｎｅｏにクローン化した。同様に、ブタＧＰＣＲ１４２の完全なコーディング領域を、新たに集成したブタＧＰＣＲ１４２配列に従って設計した２種のプライマー（フォワードプライマー（配列番号１８）：５’ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＡＡＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＣ  ３’；リバースプライマー（配列番号１９）：５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＧＡＴ
ＴＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  Ｃ  ３’）を使用してブタゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そしてｐＣＩｎｅｏにクローン化した。生じるクローンの挿入物をシークェンシングしてそれらの同一性を確認した。
【実施例２】
【０１３８】
ヒトリラキシン３の発現、精製およびヨウ化
ヒトリラキシン３の完全なコーディング配列を、フォワードプライマー（配列番号２０）、５’ＡＣＧ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ３’、およびリバースプライマー（配列番号２１）、５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣ  ３’を使用して、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＳａｌ１とＢａｍＨ１部位との間にクローン化した。クローン化したｃＤＮＡをシークェンシングして同一性を確認した。
【０１３９】
発現ベクターを、製造元の説明書に従ってリポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション３日後に、トランスフェクトした細胞の上清を収集し、ｐＨを３．０に調節し、そして混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−２５陽イオン交換カラムに負荷した。カラムを１Ｍ酢酸で洗浄し、そして２Ｍピリジンおよび１Ｍ酢酸で溶出した。溶出されたタンパク質をＣ−１８  ＢｏｎｄＥｌｕｔカラムに負荷し、０．１％ＴＦＡで洗浄し、そして６０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡで溶出した。溶出されたタンパク質を凍結乾燥し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で再構成し、そしてＧＴＰγＳ結合アッセイで試験した。
【０１４０】
リラキシン３ペプチドの精製を助長するため、リラキシン３ペプチドおよびリラキシン３のＮ末端のＦＬＡＧタグを含んでなる分泌型融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。こうした発現ベクターは、リラキシン３のシグナル配列を、αペプチドシグナル配列、次いでＦＬＡＧ配列で置換することにより構築する。
【０１４１】
ヒトリラキシン３のプロペプチドのコーディング領域は、ヒトリラキシン３  ｃＤＮＡを鋳型として用い、フォワードプライマー（配列番号２２）、５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  Ｃ  ３’およびリバースプライマー（配列番号２３）、５’ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＡＣＴ
ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣ  ３’を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、改変したｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１（Ｐｓｔ１とＥｃｏＲ１部位との間の配列を、αペプチドシグナル配列、次いでＦＬＡＧタグをコードする配列、すなわち５’ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ３’で置換することによりポリクローニング部位を改変した）にクローン化した。ヒトリラキシン３プロペプチドのコーディング領域をその後、ＦＬＡＧタグの下流のＥｃｏＲ１とＢａｍＨ１部位との間にクローン化した。生じるクローンをシークェンシングして同一性を確認した。
【０１４２】
ＦＬＡＧ−リラキシン３融合ペプチドを発現するプラスミドをＣＯＳ−７細胞にトラン
スフェクトした。トランスフェクション２日後に、抗ＦＬＡＧアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）を使用して、組換え融合ペプチドを細胞培地からアフィニティー精製した。簡潔には、培地を抗ＦＬＡＧアフィニティーカラムに負荷した。該カラムをリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）溶液で洗浄し、そして０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８で溶出した。溶出されたタンパク質を１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和した。Ｎ末端のＦＬＡＧタグをエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で融合ペプチドから切断し、そして、野性型リラキシン３ペプチドを、Ｃ−１８カラムおよび０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣによりさらに精製しかつＧＴＰγＳ結合アッセイで試験した。
【０１４３】
プロホルモン転換酵素によるプロリラキシン３の成熟リラキシン３へのプロセシング効率を増大させるため、アミノ酸配列ＲＧＲＲよりなるフリン切断部位を、プロリラキシン３中でＣ鎖およびＡ鎖の接合部に創製した。この突然変異は２段階のオーバーラップするＰＣＲ反応により創製した。５’端を、ＦＬＡＧ−リラキシン３  ｃＤＮＡを鋳型として用い、フォワードプライマー（Ｐ１）（配列番号２４）、ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  Ａ  ３’およびリバースプライマー（Ｐ２）（配列番号２５）、５’ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＧＡ
ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧＧ
ＴＴＣ  ＣＴＴ  Ｇ  ３’を使用してＰＣＲ増幅した。３’端は、ＦＬＡＧ−リラキシン３  ｃＤＮＡを鋳型として用いて、フォワードプライマー（Ｐ３）（配列番号２６）、５’ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  Ｃ  ３’およびリバースプライマー（Ｐ４）（配列番号２７）、５’ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ
ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣ  ３’を使用してＰＣＲ増幅した。５’端および３’端のＰＣＲ産物を精製し、そして上述されたところのフォワードプライマー（Ｐ１）およびリバースプライマー（Ｐ４）を使用する第二段階のＰＣＲの鋳型として一緒に混合した。最終ＰＣＲ産物をｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１にＰｓｔ１とＢａｍＨ１部位との間にクローン化し、そして挿入物領域をシークェンシングして同一性を確認した。
【０１４４】
新たなリラキシン３発現ベクターを、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）を使用して、ヒトプロホルモン転換酵素フリン発現ベクターとともにＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクトした。該ヒトフリン発現ベクターは、フォワードプライマー（配列番号２８）、５’ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＴＧ
３’およびリバースプライマー（配列番号２９）、５’ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  Ｇ  ３’を伴う２種のプライマーを使用して、ヒトｃＤＮＡライブラリーからヒトフリンｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより構築した。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＨｉｎｄ  ＩＩＩとＮｏｔ１部位との間にクローン化した。フリン発現ベクターの挿入物領域をシークェンシングしてその同一性を確認した。分泌型リラキシン３をその後、上述されたとおり抗ＦＬＡＧアフィニティーカラムを使用して精製し、エンテロキナーゼで切断しそして逆相ＨＰＬＣにかけた。トランスフェクトした細胞の培地から精製したリラキシン３を再度ＧＴＰγＳ結合アッセイで試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは精製されたタンパク質の単一バンドを示した。ＨＰＬＣ分析は、リラキシン３プロホルモンが成熟ペプチドに完全にプロセシングされかつ保持時間が均一であったことを示した。
【０１４５】
精製したリラキシン３を、Ｎａ１２５Ｉ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下にクロラミンＴを使用して標識した。
【実施例３】
【０１４６】
ヒト組換えＩＮＳＬ５の発現および精製
ヒトＩＮＳＬ５  ｃＤＮＡをヒト結腸ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ精製し、そして、Ｃ鎖とＡ鎖との間にフリン切断部位を付加することにより２個の好ましいフリ
ンプロテアーゼ切断部位（Ｂ鎖とＣ鎖との間の天然の部位「ＲＷＲＲ」、およびＣ鎖とＡ鎖との間の人工的な部位「ＲＷＷＲＲ」）を有するよう工作した。これは２段階ＰＣＲ反応により達成した。第一段階は、鋳型としてヒト結腸ｃＤＮＡ、および２種のプライマー（フォワードプライマー（Ｐ５）（配列番号３０）：５’ＡＴＡ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  Ｃ  ３’；リバースプライマー（Ｐ６）（配列番号３１）：５’ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＴＣ  ３’を使用して実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、６５℃３０秒および７２℃１分の条件で４０周期実施した。第一段階からの生じるＰＣＲ産物を、２種のプライマー（フォワードプライマー（Ｐ７）（配列番号３２）：５’ＡＴＡ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  Ｃ  ３’；リバースプライマー（（Ｐ８）（配列番号３３）：５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣ  ３’）を使用する第二段階のＰＣＲの鋳型として使用した。該ＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、６５℃３０秒および７２℃１分の条件で２０周期実施した。該第二段階のＰＣＲ反応の産物をその後ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、そしてｐＣＭＶ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８（５０）：５０７５４−５０７６４））（分泌のためのシグナルペプチドおよび組換えペプチドの精製のためのＮ末端ＦＬＡＧタグのコーディング領域を含有する改変したバージョンの哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。生じるＩＮＳＬ５  ＤＮＡ発現構築物をシークェンシングして同一性を確認し、そしてその後フリン発現プラスミド（Ｌｉｕら、２００３ａ）とともにＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクトした。細胞培地中に分泌された組換えＩＮＳＬ５ペプチドを抗ＦＬＡＧアフィニティーカラム（Ｓｉｇｍａ）により精製した。アフィニティー精製したペプチドをエンテロキナーゼで切断してＦＬＡＧタグを除去した。タグのついていないＩＮＳＬ５ペプチドをその後、Ｃ１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。
【実施例４】
【０１４７】
放射リガンド受容体結合アッセイ
ヒトリラキシン３を１２５Ｉで標識しかつ逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＧＰＣＲ１４２を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞からの細胞膜を、結合緩衝液すなわち５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡ中２００μＬの最終容量で、９６ウェルプレート中、多様な濃度の多様な競合物質の存在若しくは非存在下のいずれかで１２５Ｉ−リラキシンとともにインキュベートした。結合混合物を室温で１時間インキュベートし、そしてその後９６ウェルＧＦＣプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）を通して濾過し、かつ氷冷洗浄緩衝液すなわち５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。５０マイクロリットルのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−４０を各ウェルに添加し、そしてプレートをＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＴＸ（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。放射リガンド結合の結果はＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して解析した。
【０１４８】
この結合アッセイはＧＰＣＲ１３５を使用してもまた実施した。
【実施例５】
【０１４９】
ＧＴＰγＳ結合アッセイ
上述されたＧＰＣＲ１４２発現ベクターを、製造元の説明書に従ってリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２日後に細胞を収集し、そして冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で細胞をホモジェナイズすること、次いで４℃  １０００ｇで１０分間の遠心分離により細胞膜を調製した。上清を４℃  ２０，００
０ｇで３０分間遠心分離し、そして、ポリトロン組織ホモジェナイザーを使用してペレットをＧＴＰγＳ結合緩衝液すなわち５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌに再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤を、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチンの濃度の緩衝液に添加した。細胞膜および多様な濃度のリガンドを９６ウェルプレートに添加し、そして室温で２０分間インキュベートした。３５Ｓ−ＧＴＰγＳ（ＮＥＮ）をその後、２００μＬの最終容量中２００ｐＭの最終濃度で各ウェルに添加した。反応を室温で１時間進行させ、そしてその後、９６ウェルＧＦＣフィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ）を通して混合物を濾過し、そして冷洗浄緩衝液すなわち５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄した。５０マイクロリットルのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−４０（Ｐａｃｋａｒｄ）を各ウェルに添加し、そしてプレートをトップカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＴＸ、Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。
【０１５０】
同一のアッセイを、ＧＰＣＲ１４２の代わりにＧＰＣＲ１３５を使用することを除き上述されたとおり実施した。
【０１５１】
図３に具体的に説明されるＧＴＰγＳ結合アッセイの結果は、ヒト組換えリラキシン３がＧＰＣＲ１４２発現膜およびＧＰＣＲ１３５発現膜中でＧＴＰγＳ結合を刺激したことを示す。図１２に具体的に説明されるＧＴＰγＳ結合アッセイの結果は、ヒト組換えリラキシン３がＧＰＣＲ１４２発現膜およびＧＰＣＲ１３５発現膜中でのＧＴＰγＳ結合を刺激した一方、ヒト組換えＩＮＳＬ５はＧＰＣＲ１４２発現膜中でのＧＴＰγＳ結合を刺激したがしかしＧＰＣＲ１３５発現膜中でしなかったことを示す。
【実施例６】
【０１５２】
細胞内のｃＡＭＰの蓄積および測定
ＧＰＣＲ１４２を安定に発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、複数のｃＡＭＰ応答配列の制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞へのＧＰＣＲ１４２を発現するプラスミドのトランスフェクションにより樹立した。トランスフェクトした細胞をＧ４１８選択（４００ｍｇ／Ｌ）下で培養することにより安定なトランスフェクタントを選択した。受容体を発現する細胞を、３０，０００細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに接種した。２４時間後にフォルスコリンまたは多様なペプチドで細胞を刺激した。細胞を追加の６時間培養し、そして、細胞内のｃＡＭＰ蓄積を表す細胞内β−ｇａｌ活性をＬｉｕら（２０００）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５９、４２０−４２６により記述されるとおり測定した。
【０１５３】
同一の実験を、ＧＰＣＲ１３５を使用して実施した。
【０１５４】
図４に描かれる結果は、リラキシン３がＧＰＣＲ１４２を安定に発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中でのフォルスコリンに誘導されたβ−ガラクトシダーゼ発現を用量依存的に阻害することを示す。図１３に描かれる結果は、リラキシン３は、ＧＰＣＲ１４２を安定に発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞およびＧＰＣＲ１３５を安定に発現する細胞中でのフォルスコリンに誘導されたβ−ガラクトシダーゼ発現を用量依存的に阻害する一方、ＩＮＳＬ５はＧＰＣＲ１４２を安定に発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中のフォルスコリンに誘導されたβ−ガラクトシダーゼ発現を用量依存的阻害するがしかしＧＰＣＲ１３５を発現する細胞ではしないことを示す。
【実施例７】
【０１５５】
Ｃａ２＋可動化アッセイ
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、リポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）を使用して、ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２を発現するプラスミドでトランスフェクトしたか、またはＧｑｉ５（Ｃｏｎｋｌｉｎら（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３、２７４−２８０）若しくはＧα１６（Ａｍａｔｒｕｄａら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８、５５８７−５５９１）を発現するプラスミドとコトランスフェクトした。トランスフェクション２日後に細胞をＰＢＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡで剥離した。剥離させた細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（フェノールレッドを含まない、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、そして５０，０００細胞／ウェルの細
胞密度で黒色ポリＤリシン被覆９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）に接種した。カルシウム色素Ｆｌｕｏ−３（ＡＭ）（ＴＥＦＬＡＢＳ、テキサス州オースチン）を４μＭの最終濃度で細胞に負荷し、そしてリガンドに刺激されたＣａ２＋可動化を、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してモニターした。
【０１５６】
図５に描かれる結果は、リラキシン３が、Ｇα１６およびＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかを共発現する細胞中でのＣａ２＋可動化を刺激したが、しかしＧα１６単独を発現する細胞中ではしなかったことを示す。図１４に描かれる結果は、リラキシン３が、Ｇα１６およびＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかを共発現する細胞中でのＣａ２＋可動化を刺激した一方、ＩＮＳＬ５はＧα１６およびＧＰＣＲ１４２を共発現する細胞中でＣａ２＋可動化を刺激したが、しかしＧα１６およびＧＰＣＲ１３５を共発現する細胞若しくはＧα１６単独を発現する細胞ではしなかったことを示す。
【実施例８】
【０１５７】
多様なヒト組織中でのＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡ発現のＰＣＲ検出
ヒトＧＰＣＲ１４２のコーディング領域に従って設計したＧＰＣＲ１４２のフォワードプライマー（配列番号３４）：５’ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  Ｔ  ３’およびリバースプライマー（配列番号３５）：５’ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  Ａ  ３’を使用して、多様な組織からのヒトｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＰＣＲ増幅した。同時の実験において、フォワードプライマー（配列番号３６）（５’ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＣＧＣ  ＴＣＧ
ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＴ  ３’）およびリバースプライマー（配列番号３７）（５’ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ３’）を伴うヒトβ−アクチンプライマーを使用して、内部対照としてヒトβ−アクチンｍＲＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、９４℃４０秒間、６０℃４０秒間および７２℃２分間で３５周期実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で泳動し、臭化エチジウムで染色しかつＵＶ照射下に写真撮影した。
【実施例９】
【０１５８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
Ｂａｌｂ／ｃマウスを４％パラホルムアルデヒドで灌流し、そして全脳の３０μｍ厚の冠状切片を滑走式ミクロトームで切断しそしてスライドガラスにマウントした。組織をプロテイナーゼＫで消化し、脱水しかつ約１０７ｃｐｍ／ｍＬの濃度のＧＰＣＲ１４２アンチセンス若しくはセンスプローブと一夜ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後のため、組織をＲＮアーゼＡで処理し、洗浄し、脱水しかつ富士イメージングプレートに２日間露出させた。スライドガラスをその後脱脂し、ＮＢＴ２原子核乳剤（Ｋｏｄａｋ）に浸積しかつ１７日後に発色した。自由裁量で、正に標識される細胞は、細胞の大きさの領域内のシルバーグレインのなんらかの蓄積（バックグラウンドレベルの３〜５倍であった）と定義した。
【実施例１０】
【０１５９】
ｃＲＮＡプローブ
マウスＧＰＣＲ１４２の標識したアンチセンスおよびセンスプローブを、それぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの直線化後、およびそれぞれＴ７若しくはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のクローン化したｃＤＮＡフラグメントから合成した。プローブを３５Ｓ−ＵＴＰで標識した。標識したセンス鎖が対照としてはたらき、そして細胞の局在化のいかなる特異的標識も示さなかった。３５Ｓ−ＵＴＰプローブの比活性はおよそ２〜３×１０６ｃｐｍ／μｇであった。
【実施例１１】
【０１６０】
放射リガンド競合結合アッセイ
ＩＮＳＬ５をＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の可能なリガンドとして特徴付けるため、ヒトＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞からの細胞膜を、Ｌｉｕら（２００３ａ、２００３ｂ）により記述されるところの放射リガ
ンドとして［１２５Ｉ］−リラキシン３を使用する放射リガンド結合アッセイで使用した。簡潔には、多様な濃度の未標識のリラキシン３、ＩＮＳＬ５若しくは他のペプチドを、放射リガンドとしての１００ｐＭの［１２５Ｉ］−リラキシン３の存在下に、競合物質として、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかを発現するＣＯＳ−７細胞からの膜に添加した。結合アッセイを室温で１時間のインキュベーション時間の間実施した。結合混合物をその後、０．３ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ）で予め飽和させたＧＦＣフィルターを通して濾過し、そして冷結合緩衝液で洗浄した。結合した放射リガンドは、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−４０を用いてトップカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ／ＮＴＸ、Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。結果をＰｒｉｓｍ  ３．０ソフトウェアにより解析した。
【０１６１】
ＩＣ５０値は特異的結合全体の５０％を阻害する未標識リガンドの濃度である。図１５に描かれる結果は、未標識のリラキシン３がＧＰＣＲ１４２およびＧＰＣＲ１３５双方への１２５Ｉ−リラキシン３の結合を特異的に置換した一方、未標識のＩＮＳＬ５は１２５Ｉ−リラキシン３のＧＰＣＲ１４２への結合を特異的に置換したがしかしＧＰＣＲ１３５への結合はしなかったことを示す。
多様な結果の論考
ＧＰＣＲ１４２の同定および配列分析
ＧＰＣＲ１４２はＧＰＣＲ１３５に対する４３％の配列の同一性を有する。膜貫通ドメイン領域で、該２種の受容体は５０％以上のアミノ酸配列の同一性を共有する（図１）。ヒトＧＰＣＲ１４２の完全なコーディング領域を、上述されたところのＰＣＲ増幅を使用してヒトゲノムＤＮＡからクローン化し、そして、クローン化したＤＮＡのＤＮＡ配列が、ＧＰＣＲ１４２の推定のオープンリーディングフレームを確認したことを見出した。Ｇｅｎｂａｎｋの検索は、ＧＰＣＲ１４２配列がＮＣＢＩ特許データベース中のオーファンＧＰＣＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ１４８１９２）に同一でありかつ単一塩基の差違を除き別のＧｅｎｂａｎｋ提出物（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２８８４１５）にほぼ同一であることを示した。１個のオープンリーディングフレームがマウスゲノム中で見出された。ラットゲノム中に高度に関係したＤＮＡ配列が存在するとは言え、その配列は、ＧＰＣＲ１４２の機能的受容体をコードするオープンリーディングフレームを有しない。
放射リガンド結合アッセイを使用するＧＰＣＲ１４２の特徴付け
１２５Ｉ−リラキシン３、およびＧＰＣＲ１４２を一過性に発現するＣＯＳ−７からの細胞膜を使用して、飽和結合および競合結合アッセイを上述されたとおり実施した。結果は、１２５Ｉ−リラキシン３がＧＰＣＲ１４２を発現する細胞膜に特異的に結合することを示した。対照細胞膜は特異的結合を示さなかった（図２Ａ）。飽和等温実験において、１２５Ｉ−リラキシン３が１．９±０．２ｎＭのＫｄ値を伴い飽和可能な様式でＧＰＣＲ１４２を結合したことが見出された（図２Ｂ）。競合結合アッセイにおいて、ＧＰＣＲ１４２への１２５Ｉ−リラキシン３の結合は、未標識のリラキシン３およびリラキシン３のＢ鎖によってのみ置換される（図２Ｃ）が、しかしリラキシン、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４（Ｋｏｍａｎら（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２０２３８−２０２４１）、ＩＮＳＬ６（Ｌｏｋら（２０００）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６２、１５９３−１５９９）、インスリンおよびリラキシン３のＡ鎖を包含する他のインスリン／リラキシンファミリーのメンバーのいずれによっても置換されないことが見出された。競合結合アッセイにおけるリラキシン３およびリラキシン３のＢ鎖のＫｉ値はそれぞれ１．２±０．１５ｎＭおよび８５±１５ｎＭであった。
ＧＴＰγＳ結合およびｃＡＭＰ蓄積阻害アッセイによるＧＰＣＲ１４２の機能的特徴付け
ＧＴＰγＳ結合アッセイからの結果は、リラキシン３およびリラキシン３のＢ鎖が、ＧＰＣＲ１４２を発現する細胞膜中での３５Ｓ−ＧＴＰγＳの結合をリガンド濃度依存性の様式で刺激することを示した。他のインスリン／リラキシンファミリーのメンバーのいずれも、ＧＰＣＲ１４２を発現する細胞膜への検出可能な３５Ｓ−ＧＴＰγＳの結合を刺激しなかった。ＧＰＣＲ１４２発現を伴わない対照細胞膜は、類似のアッセイにおいてリラキシン３刺激に応答しなかった。ＧＴＰγＳ結合アッセイで観察されたＥＣ５０値はリラキシン３について０．９３±０．１２ｎＭであった（図３）。リラキシン３のＢ鎖は、お
よそ１００ｎＭのＥＣ５０値を伴うはるかにより弱いアゴニスト活性を示した。リラキシン／インスリンファミリーの他のメンバーはアゴニスト活性を示さなかった。
【０１６２】
ＧＰＣＲ１４２を、それがｃＡＭＰ阻害に結びつけられるかどうかを知るためにさらに特徴付けした。ＣＲＥエレメントの制御下にβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子をもつＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を宿主細胞として使用した（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ）。該細胞中では、細胞内ｃＡＭＰ濃度がβ−ガラクトシダーゼ活性により反映される。該結果は、リラキシン３が、０．８５±０．０９ｎＭのＥＣ５０値を伴い、ＧＰＣＲ１４２を過剰発現する細胞中でフォルスコリンに刺激されたβ−ｇａｌ活性を用量依存的に阻害することを示した（図４）。リラキシン３のＢ鎖は、有意により低い効力を伴うにもかかわらずリガンド活性を示した。ＧＰＣＲ１４２発現を伴わないＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌはリラキシン３刺激に応答しなかった。
Ｃａ２＋可動化アッセイによるＧＰＣＲ１４２の特徴付け
Ｇｑｉ５は、ＧＰＣＲのシグナル伝達をｃＡＭＰ阻害からカルシウム可動化に移動させることが可能であることが報告されている（Ｌｉｕら（２０００）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９、４２０−４２６）。リラキシン３が、ＧＰＣＲ１３５およびＧｑｉ５を共発現する２９３細胞中でＣａ２＋可動化を刺激することが見出されたので、ＧＰＣＲ１４２を用いて類似の実験を実施した。リラキシン３に刺激されたＣａ２＋シグナル伝達は、ＧＰＣＲ１４２およびＧｑｉ５を共発現する２９３細胞中で観察されなかった。Ｇα１６は、通常はＣａ２＋シグナル伝達に結びつけられない多くのＧＰＣＲと結合しかつそれらのシグナル伝達をＣａ２＋シグナル伝達に移動させることが可能である（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓら（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１５１７５−１５１８０）ことが報告された（Ａｍａｔｒｕｄａら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８、５５８７−５５９１）。ＧＰＣＲ１４２を２９３細胞中でＧα１６と共発現させた場合、リラキシン３は、トランスフェクトした細胞中の強いＣａ２＋シグナルを用量依存性の様式で刺激した。Ｃａ２＋可動化アッセイで観察されたＧＰＣＲ１４２へのリラキシン３結合のＥＣ５０はおよそ５０ｎＭであった（図５）。リラキシン３はまた、およそ５ｎＭのＥＣ５０値を伴い、ＧＰＣＲ１３５およびＧα１６を共発現する２９３細胞中でのＣａ２＋可動化も刺激した。Ｇα１６単独によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞はリラキシン３刺激に応答しなかった。
ＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡの組織発現プロファイル
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、多様なヒト組織中でのＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡ発現を研究した。該結果は、ＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡが脳、腎、精巣、胸腺、胎盤、前立腺、唾液腺、甲状腺および結腸を包含する多くの組織で検出されることを示した（図６）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、脳中のＧＰＣＲ１４２のｍＲＮＡ発現をさらに研究した。ＧＰＣＲ１４２遺伝子はラットにおいて偽遺伝子であるようであるため、ＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡの脳の発現パターンを、マウスＧＰＣＲ１４２プローブを使用してマウスで研究した。該結果は、ＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡの少ない分布が視床の中隔領域で検出されることを示した（図７）。
【０１６３】
要約すれば、ＧＰＣＲ１４２は全体としてＧＰＣＲ１３５に類似に挙動した。放射リガンド結合アッセイにおいて、リラキシン３は高親和性でＧＰＣＲ１４２に結合した。ＧＰＣＲ１３５に比較して、ＧＰＣＲ１４２に対する結合はより低いＳ／Ｎ比をもたらし、これはわずかにより低い親和性若しくはより低い受容体発現レベルによると思われる。ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、ＧＰＣＲ１４２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞膜はリラキシン３刺激に応答した。リガンドに刺激されたＧＴＰγＳの取り込みは、再度、ＧＰＣＲ１３５でトランスフェクトした細胞からのものに比較して一貫してより低く、これは受容体発現レベル若しくは受容体／Ｇタンパク質結合効率によると思われる。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ／ＣＲＥ−β−ｇａｌ細胞で実施したｃＡＭＰ蓄積アッセイにおいて、リラキシン３はフォルスコリンで刺激されたｃＡＭＰ蓄積を阻害し、ＧＰＣＲ１４２がＧｉ／ｏタンパク質に結合することを示唆した。ｃＡＭＰ蓄積およびＧＴＰγＳ結合アッセイから派生したＥＣ５０値は、結合アッセイから得られたＫｄおよびＫｉ値（１から２ｎＭまでの範囲
にわたる）と一致する。
【０１６４】
Ｇｑｉ５がＣＰＧＲ１３５のシグナル伝達をＣａ２＋可動化に移動させることが可能であることが示された。ＧＰＣＲ１４２とＧＰＣＲ１３５との間の１つの差違は、ＧＰＣＲ１４２がＧｑｉ５と結合しないことである。リラキシン３は、ＧＰＣＲ１４２およびＧｑｉ５を共発現する２９３細胞中でいかなる検出可能なＣａ２＋シグナルも刺激しない。１つの理由は、人工的キメラＧタンパク質Ｇｑｉ５が全部のＧｉ結合型（Ｇｉ−ｌｉｎｋｅｄ）ＧＰＣＲに結合するわけでないことであり得る。類似の現象は、ＧＰＲ７およびＧＰＲ８（ｃＡＭＰ阻害に結びつけられる２種の高度に関連したＮＰＷ受容体）を研究した場合に観察された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３５８２６−３５８３２；Ｂｒｅｚｉｌｌｏｎら（２００３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、７７６−７８３）。ＮＰＷはＧＰＲ７およびＧｑｉ５を共発現する２９３細胞中でＣａ２＋シグナルを刺激した一方、それはＧＰＲ８およびＧｑｉ５を共発現する細胞に同じことをしなかった。Ｇα１６は、ＧＰＣＲ１４２およびＧＰＣＲ１３５双方と結合しかつそれらのシグナル伝達をＣａ２＋シグナル伝達に移動させることが可能であると思われる。しかしながら、リラキシン３は、ＧＰＣＲ１４２およびＧＰＣＲ１３５双方についての他のアッセイ由来の効力に比較して、Ｃａ２＋アッセイで有意により低い効力を示した。数種の他のＧｉ結合型受容体について類似の現象が観察され（Ｌｉｕら（２００１）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２９９、１２１−１３０；Ｃｈｅｎら（２００３）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４６７、５７−６５）、そして該差違が非天然の受容体／Ｇタンパク質結合若しくはＣａ２＋アッセイが前平衡アッセイであるという事実のいずれかにより得ることが理由付けられている。
【０１６５】
ＧＰＣＲ１４２とＧＰＣＲ１３５との間の別の差違はそれらのｍＲＮＡ発現パターンである。ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡは脳中での顕著な発現を伴い制限された組織中で発現される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ（２０００）、Ｇｅｎｅ  ２４８、１８３−１８９）一方、ＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡはより広範な末梢組織中で発現され、ＧＰＣＲ１４２がＧＰＣＲ１３５の生理学的役割と異なるものを有しうることを示唆している。
【０１６６】
本発明の多様な局面を実施例および好ましい態様を参照することにより上に具体的に説明したとは言え、本発明の範囲は前述の記述により定義されず、しかし特許法の原理のもとで適正に解釈されるところの以下の請求の範囲により定義されることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】ヒトＧＰＣＲ１４２（配列番号２）とＧＰＣＲ１３５（配列番号３８）との間のアミノ酸配列の比較を提供する。推定の膜貫通領域ＴＭ１ないしＴＭ７に下線が付けられている。
【図２】図２Ａ−２Ｃ  放射リガンド結合アッセイによるＧＰＣＲ１４２の特徴付けを示す。
【０１６８】
図２Ａ
ＧＰＣＲ１４２を発現するＣＯＳ−７細胞からの膜へのリラキシン３の結合を具体的に説明する。１２５Ｉ−リラキシン３を放射リガンドとして最終濃度として１００ｐＭで使用した。ＧＰＣＲ１４２を発現するＣＯＳ−７細胞からの膜を１２５Ｉ−リラキシン３（配列番号６）とともにインキュベートし、そしてその後ＧＦＣフィルターを通して濾過した。結合された１２５Ｉ−リラキシン３をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＴＸでカウントした。非特異的結合対照は５μＭの未標識リラキシン３の存在下で同一条件で実施した。擬似トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、同一条件下での平行実験で陰性対照として使用した。
【０１６９】
図２Ｂ
ＧＰＣＲ１４２の飽和結合アッセイの結果を描く。ＧＰＣＲ１４２を発現するＣＯＳ−
７細胞からの膜を、結合アッセイにおいて多様な濃度の１２５Ｉ−リラキシン３とともにインキュベートした。非特異的結合対照は５μＭの未標識リラキシン３の存在下で同一条件で結合実験を実施することにより得た。特異的結合は、総結合から非特異的結合を差し引くことにより計算した。
【０１７０】
図２Ｃ
ＧＰＣＲ１４２の競合結合アッセイの結果を示す。結合アッセイにおいて、ＧＰＣＲ１４２を発現するＣＯＳ−７細胞からの膜を、多様な濃度の多様な競合物質の存在下で１００ｐＭの１２５Ｉ−リラキシン３とともにインキュベートした。
【図３】ＧＰＣＲ１４２を発現する細胞での３５Ｓ−ＧＴＰγＳ結合のリラキシン３刺激を示す。多様な濃度を伴う多様なペプチドを、ヒトＧＰＣＲ１４２を発現する細胞膜に添加して、ＧＴＰγＳの取り込みを刺激した。特異的な３５Ｓ−ＧＴＰγＳ取り込みは、リガンドを伴うカウントからリガンドを伴わないカウントを差し引くことにより得た。
【図４】フォルスコリン刺激されたｃＡＭＰ産生のリラキシン３による阻害を具体的に説明する。ＧＰＣＲ１４２を安定に発現する細胞を、ＣＲＥプロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ／ＣＲＥ−β−ｇａｌ）で樹立した。多様な濃度を伴う多様なペプチドを細胞に添加した。その後、フォルスコリンを５μＭの最終濃度で全サンプルに添加した。細胞中のｃＡＭＰ濃度を反映するサンプル中のβ−ｇａｌ活性を、β−ｇａｌ活性アッセイを使用して測定した。
【図５】ＧＰＣＲ１４２およびＧα１６を共発現するＨＥＫ２９３細胞中でのＣａ２＋可動化のリラキシン３刺激を描く。Ｇα１６単独（Ｇα１６）でトランスフェクトしたか若しくはヒトＧＰＣＲ１４２およびＧα１６（ＧＰＣＲ１４２／Ｇα１６）によりコトランスフェクトしたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞を、リガンドとして多様な濃度のリラキシン３を使用するＣａ２＋可動化アッセイに使用した。リガンドで刺激された細胞内Ｃａ２＋可動化をＦＬＩＰＲによりモニターした。Ｇα１６およびＧＰＣＲ１３５によりコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＧＰＣＲ１３５／Ｇα１６）を比較のため同一の実験で使用した。
【図６】多様なヒト組織中でのＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡ発現プロファイルのＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で泳動し、臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ照射下で可視化した。
【図７】ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡの発現を示す脳切片の画像を提供する。切片は富士フィルムバイオイメージングアナライザー装置で処理したオートラジオグラムからの擬似カラー画像である。矢状脳切片を、アンチセンスプローブ（Ａ）およびセンスプローブ（Ｂ）を使用してＧＰＣＲ１４２プローブとハイブリダイズさせた。冠状脳切片は、中隔領域（Ｃ）および視床領域（Ｄ）中でのＧＰＣＲ１４２  ｍＲＮＡの少ない分布を示す。
【図８】ヒトＩＮＳＬ５（配列番号５）およびヒトリラキシン３（配列番号６）のポリペプチド配列間の相同性を具体的に説明する配列アライメントである。
【図９】ヒトＧＰＣＲ１４２（配列番号４）、サルＧＰＣＲ１４２（配列番号７）、ウシＧＰＣＲ１４２（配列番号８）、ブタＧＰＣＲ１４２（配列番号９）およびマウスＧＰＣＲ１４２（配列番号２）のアミノ酸配列比較を提供する。コンセンサス配列を太字で示す。推定の７個の膜貫通ドメインは下線を付けられ、そしてＴＭ１ないしＴＭ７を示す。マウス、サル、ウシ（乳牛）およびブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））のＧＰＣＲ１４２のＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋに寄託された（受託番号：それぞれＡＹ６３３７６５；ＡＹ６３３７６６；ＡＹ６３３７６７；ＡＹ６３３７６８）。
【図１０】ヒトＧＰＣＲ１４２  ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を提供する。
【図１１】マウスＧＰＣＲ１４２  ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を提供する。
【図１２】ヒト組換えＩＮＳＬ５がＧＰＣＲ１４２発現膜でのＧＴＰγＳ結合を刺激するがしかしＧＰＣＲ１３５膜ではしないことを示す、ＧＴＰγＳ結合アッセイの結果のプロットである。
【図１３】ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方についてのＩＮＳＬ５およびリラキシン３のそれぞれを用いるβ−ガラクトシダーゼアッセイからの比較結果のプロットである。
【図１４】ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方についてのＩＮＳＬ５およびリラキシン３のそれぞれを用いるＣａ２＋可動化アッセイからの比較結果のプロットである。
【図１５】ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方の競合物質としてのＩＮＳＬ５およびリラキシン３のそれぞれとともにトレーサーとして１２５Ｉ−リラキシン３を使用する競合結合アッセイからの比較結果を描く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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