(57)【要約】    本発明は、スクリーニングの新しい模範を使用している産生性の患者癌疾患修飾抗体のための方法に関するものである。抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、原発腫瘍と腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。  抗癌抗体は、毒素、酵素、放射性合成物と血液原細胞に抱合型でありえる。更なる発明は、ラミニン受容体１前駆体タンパク質３７ＬＲＰと結合する５ＬＡＣ２３モノクローナル抗体（またはそこから引き出される抗原性の結合フラグメント）の能力の周りを回転するそのような診断と処置に関するものであり、具体的には、通常、認識される特定の抗原性部位で肝細胞腺腫細胞で過剰発現した５ＬＡＣ−２３の直接的な結合に依存するさまざまな平均値による肝細胞腺腫の診断と処置に関する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および／または遅延疾患進行を延長する方法であり、前記腫瘍は特にそれについて、モノクローナル抗体の確認している特徴を寄託番号ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておくモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと結合する抗原を発現する方法であって、  前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを含み、  それによって、疾患進行は遅延性であるおよび／または、生存率が高まる方法。
【請求項２】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項２の方法。
【請求項４】
前記抗体が補体を起動させる請求項１の方法。
【請求項５】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項１の方法。
【請求項６】
前記抗体がマウス抗体である請求項１の方法。
【請求項７】
前記抗体がヒト化抗体である請求項１の方法。
【請求項８】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項１の方法。
【請求項９】
ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードされた単離モノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である請求項９の抗体。  
【請求項１１】
キメラ化抗体である請求項９の抗体。
【請求項１２】
請求項９の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
請求項１０のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１１のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項９、１０、１１、１２、１３、またはｌ４のどれでもの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで接合し、それによって、抗体複合体は形成される抗体または抗原結合フラグメント
【請求項１６】
ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣで寄託された単離されたクローン。
【請求項１７】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞の存在を決定する結合アッセイ  であって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること；  ＰＴＡ−５６９１としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードした単離モノクローナル抗体を提供すること；前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること；ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、前記組織標本の前記癌細胞の存在が示される結合アッセイ。
【請求項１８】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣のおよび胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項１７の結合アッセイ。  
【請求項１９】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること；  ＰＴＡ−５６９１としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードされた単離モノクローナル抗体を提供すること；前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること；ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、前記癌細胞は前記結合で分離され、前記組織標本のそれらの存在が確認される、プロセス。
【請求項２０】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣のおよび胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項１９のプロセス。
【請求項２１】
単離モノクローナル抗体は、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードした。
【請求項２２】
ヒト化抗体である請求項２１の抗体。
【請求項２３】
キメラ化抗体である請求項２１の抗体。
【請求項２４】
請求項２１の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
請求項２２のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
請求項２３のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。  
【請求項２７】
細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで接合した請求項２１，２２，２３，２４，２５または２６のどれでもの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、それによって抗体複合体は形成される単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託された単離されたクローン。
【請求項２９】
ヒト腫瘍から選択される組織試料で癌細胞の存在を決定する結合アッセイであって、  前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンでコードされる単離抗原またはそれの抗原結合フラグメン、または抗体複合体を提供すること、前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること、ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定すること  を含み、それによって前記組織標本の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項３０】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞を分離するか、映るプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメント、またはの抗体複合体を提供すること、  前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること、ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、それによって前記癌細胞は前記結合で分離される、そして、前記組織標本のそれらの存在は確認される、プロセス。
【請求項３２】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項３１のプロセス。
【請求項３３】
組織標本でラミン受容体１前駆体（３７ＬＲＰ）を確認する方法であって、  組織標本を提供すること、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞またはその抗原性結合フラグメントで産生されるで単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと前記組織標本と接触させること、前記単離モノクローナル抗体に独自に結合されながら特徴づけられる前記抗原性部位；そして、前記抗原性部位の結合を決定すること；  それによって、３７ＬＲＰが同定される、方法。
【請求項３４】
肝細胞癌を患っている患者を診断する方法であって、肝細胞癌を患うと疑われる患者から組織標本を提供すること；寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞またはその抗原性結合フラグメントで産生される単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと前記組織標本と接触させること、前記単離モノクローナル抗体に独自に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、そして、前記抗原性部位の結合しているｄｅｔｅπｎｉｎｉｎｇ；それによって、肝細胞癌の診断が同定される、方法。
【請求項３５】
３７ＬＲＰを表す細胞の分化、処置または画像診断のための方法であって、前記細胞の試料を提供すること；単離モノクローナル抗体を含む抱合部位またはそれの抗原結合フラグメントを提供すること、それの前記抗体または抗原結合フラグメントそれについて表された３７ＬＲＰ抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであって、モノクローナル抗体の同定している特徴をＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位とし、それについて、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも１人のメンバーと活用している前記単離モノクローナル抗体または抗原性の結合フラグメント、それによって前記細胞による前記抱合部位の結合は、前記細胞の分化、処置または画像診断に帰着する、方法。
【請求項３６】
癌疾患に罹ってる患者を処置する方法であって、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合型の半量、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて表された３７ＬＲＰ抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供すること、モノクローナル抗体の同定している特徴をＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、  それについて、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも１人のメンバーと活用している前記単離モノクローナル抗体または抗原性の結合フラグメント、そして、前記患者に前記抱合型の成分を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
特にＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと結合する３７ＬＲＰ抗原性部位を表す細胞の存在を決定する結合アッセイであって、細胞試料を提供すること；単離された単クローン抗体またはそれの抗原結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて前記表された３７ＬＲＰ抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の同定している特徴をクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位は、ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託した前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触させること；そして、  前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定すること、それによって  特に前記単離モノクローナル抗体と結合する３７ＬＲＰ抗原性部位を表す細胞の存在またはそれの抗原結合フラグメントは、決定される、結合アッセイ。
【請求項３８】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項３４の方法。
【請求項４２】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項３５の方法。
【請求項４３】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項３５の方法。
【請求項４４】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項３６の方法。
【請求項４５】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項３６の方法。
【請求項４６】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項３７の方法。
【請求項４７】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項３７の方法。
【請求項４８】
哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および／または遅延疾患進行を延長する方法であって、そこで前記腫瘍は特にそれについて、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および／または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを成立している寄託番号ＰＴＡ−５６９０が広げられるにつれて、モノクローナル抗体の確認している特徴をＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておくモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと結合する抗原を発現する、方法。
【請求項４９】
モノクローナル抗体またはそれについてモノクローナル抗体の同一化している特徴を哺乳類でヒト腫瘍の処置のために薬の製造で寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードされた抗原結合フラグメントの使用であって、前記腫瘍は特にそれによって、進行が遅延するおよび／または生存がされる疾患を前記モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメント（前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で投与されている前記モノクローナル抗体）に結合する抗原を発現する、モノクローナル抗体またはそれについてモノクローナル抗体の使用。
【請求項５０】
モノクローナル抗体の使用またはそれについてモノクローナル抗体の同定している特徴を哺乳類でヒト腫瘍の治療のために薬の製造で寄託番号ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておく抗原結合フラグメント、そこで  前記腫瘍は特に前記モノクローナル抗体と結合する抗原またはそれの抗原結合フラグメントを発現し、疾患進行が遅延性であるおよび／または生存が広げられるそれによって前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で投与されているモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項５１】
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用であって、それの前記抗体または抗原結合フラグメントそれについて表された３７ＬＲＰ抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであり、  モノクローナル抗体の同定している特徴をＰＴＡ−５６９０（ｓ）としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、癌疾患に罹ってる患者を処置するための薬の製造において、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも１人のメンバーと抱合型で、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントを補助する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用。
【請求項５２】
単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用であって、モノクローナル抗体の確認している特徴をＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメント、癌疾患に罹ってる患者を処置するための薬の製造で、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも１人のメンバーと抱合型である、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用。
【請求項５３】
一団の被験者から選択する方法、被験者が癌を患う所で、単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントでの処置に影響されやすいそれらはそれについて分解し、それは３７ＬＲＰを発現する抗原性部位と結合する方法であって、癌を患っている被験者から組織標本を提供して、ハイブリドーマ細胞系によって発生される単離モノクローナル抗体で前記組織標本を接触させることは寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原性の結合フラグメントで寄託した。そして、それは３７のＬＲＰによって表される抗原性部位と結合する。そして、前記抗原性部位が前記単離モノクローナル抗体に独自に束縛されながら特徴づけられた；そして、前記抗原性部位の結合を決定すること、それによって  被験者の選択は、なされる方法。
【請求項５４】
請求項６にもとづく方法であって、単離モノクローナル抗体をもつ被験者またはそれの抗原性の結合断片を処置することを更に含む、３７ＬＲＰを発現する抗原性部位と結合する、方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および生産に、そして、治療的で診断過程の、任意に一つ以上の化学療法剤と結合するこれらのＣＤＭＡＢの使用に関するものである。更なる発明は、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関するものである。より詳しくは、この発明は、診断とラミニン受容体１前駆体タンパク質３７ＬＲＰと結合する５ＬＡＣ−２３モノクローナル抗体（またはそこから引き出される抗原性の結合フラグメント）の能力の周りを回転するガン疾患の治療に関するものであり、特に特にそれによって、そして、通常、認識される特定の抗原性部位で５ＬＡＣ−２３の直接的な結合に依存するさまざまな平均値による肝細胞腺腫の診断と処置に対するほとんどは、肝細胞腺腫細胞で過剰発現する。
【背景技術】
【０００２】
かかわらず、同様に、同じ段階で、現在の治療は、同じ癌種を有する全ての患者を処置する。これらの患者の少なくとも３０パーセントは第１の線治療に失敗する。このように、処置の更なる回と治療失敗、転移と、最後に、死亡の増加した確率に導く。処置への優れたアプローチは、特定の個人のための治療の専用化である。専用化に向く唯一の現在の治療は、手術である。化学療法と放射線治療は患者に合わせて調整されることができない、そして、ほとんどの場合、手術は単独で産生性の治癒に不十分である。モノクローナル抗体の出現で、各々の抗体が一つのエピトープに導かれることができる時から、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらにまた、独自に特定の個人の腫瘍を定義するエピトープの星座にあてられる抗体の組合せを発生することは、可能である。ガンで通常の細胞との間の有意差が癌細胞が悪性変換細胞に特有である抗原を含むということであると認めて、科学界はモノクローナル抗体が特に特にこれらの癌抗原と結合することによって悪性変換細胞を目標とするようになっていることがありえると長く考えた；このように信念を引き起こして、そのモノクローナル抗体は、癌細胞を除去するために、「魔法のＢｕｌｌｅｔｓ」として用いられることができる。しかしながら、一つのモノクローナル抗体も癌の全ての例でサーブすることができるというわけでないと現在広く認められる、そして、目標とされた癌治療として、クラスとして、そのモノクローナル抗体は展開されることができる。すぐに開示された発明の教義に従って分離されるモノクローナル抗体は、全身腫瘍組織量を減らすことによる例のために、患者に有益で、ここでは癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体とさまざまに称する方法でガン疾病経過を修正することが示された。今のところ、癌患者には通常処置のほとんど任意選択がない。癌治療への規格化されたアプローチは、世界的な生存と罹患率の改善をもたらした。しかしながら、特定の個人に、これらの改善された統計が、それらの個人状況の改善と、必ずしも相関するというわけではない。このように、開業医は同じコホートでそれぞれに他の患者の各々の腫瘍を処置することができた方法論が出される場合、これはちょうどその一人の人に裁断治療の固有の接近ができるようにするだろう。治療のそのようなコースは、理想的には、治癒の率を増加させて、より良好な結果を生む。そして、それによってｌｏｎｇ−フェルト必要を満たす。歴史的に、ポリクローナル抗体の使用が、ヒト癌の治療における限られた成功で使われた。リンパ腫と白血病ｈａｖｅｂｅｅｎはヒト血漿と交渉した、しかし、ほとんど遷延性緩解または反応がなかった。さらにまた、再現性と付加給付でない欠如が、化学療法と比較してあった。乳癌、黒色腫と腎細胞癌のような固形腫瘍は、対応して予測不可能で無効な結果で、人血、チンパンジー血清、ヒト血漿とウマ血清で治療されもした。モノクローナル抗体の多くの臨床試験が、固形腫瘍のためにあった。１９８０年代に、少なくとも４つの臨床試験が、１人の応答者だけを特異性抗原に対して抗体を使用しているか、組織選択性に基づく少なくとも４７人の患者から作り出したヒト乳癌のためにあった。それは、３７人の患者が約４分の１が部分的な反応率を持った、そして、追加２５セントには軽度のまたは安定病態進歩があった反応のために評価されてあった本研究においてＣＩＳＰＬＡＴＩＮ．と結合してヒト化の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）を使用している成功した臨床試験があった１９９８年まで、なかった。進行に時間の中央値の間で応答者は、５．３ヵ月の反応期間の中央値による８．４ヵ月であった。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮが、ＴａｘｏｌＲ（３．０ヵ月）単独を受けた群に、割に、結果が抗体療法を受けた人々のために疾患進行までの時間の中央値の増加に示したＴａｘｏｌＲ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ検査さらにＴａｘｏｌＲ（６．９ヵ月）と結合して第１の線使用のために１９９８年に承認された。わずかな増加が、生存期間の中央値でもあった；ＴａｘｏｌＲ処置腕を加えたＨＥＲＣＥＰＴＩＮ対ＴａｘｏｌＲ処置のための２２対１８ヵ月は、単独で武装する。加えて、完全（８対２パーセント）で部分的な応答者（３４対１５パーセント）ｉｎｔｈｅ抗体さらにＴａｘｏｌＲの組合せ群の数の増加が、単独で割にＴａｘｏｌＲにあった。しかしながら、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮとＴａｘｏｌＲによる処置は、ＴａｘｏｌＲ処置（１３対１パーセントそれぞれ）単独に、割に心毒性のより高い発生率に導いた。免疫組織化学で測定されるにつれて、臨床試験では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの表現レベルはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療に対する反応を予測した。転移性乳癌患者の間で、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（スケールを記録している病理学の上で２−３＋に指定される）の過剰発現を持つ人々だけは、抗体療法から利益を得た。転移性乳癌が認められる約２５パーセントの患者は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現して、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮで治療されることができた；過剰発現以外の患者、そして、このように、利益を得なくて、抗体を用いた治療を受けない。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療のための選択は疾患の分子マーカーの識別に基づく処置にふさわしい患者を選択する方法を意味する、そして、この方法はアメリカ食品医薬局によって診断ルーチンとして承認された。しかしながら、乳癌患者の大きい会ったことのない必要が、まだある。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ処置を利益を受けることができる人々さえ、化学療法をまだ必要として、従って、少なくともある程度に、この種の処置の副作用をまだ扱わなければならない。結腸直腸癌を調査している臨床試験は、糖蛋白と糖脂質目標に対して抗体を含む。１７−アイソレーション増幅器（それには、腺癌のために若干の特異性がある）のような抗体受けられたＰｈａｓｅ  ２を分析的にするパーシャルレスポンスを持っている１人の患者だけを有する６０人以上の患者で試験。他の試行において、１７−１Ａの使用は、添加されたシクロホスファミドを使用しているプロトコルで、５２人の患者の間で１つの完全寛解と２つのやや有効だけを発生した。１７−１Ａが関係している他の試行は、類似していた結果を得た。現在まで、示されない１７−ＩＡｈａｖｅのＰｈａｓｅ臨床実験中は、段階ＨＩ大腸癌のためにアジュバント療法として効力を高めた。まず最初にイメージングのためにも承認されるヒト化のネズミのモノクローナル抗体の使��は、腫瘍退縮を発生しなかった。最近だけ、どんな陽性結果でも、モノクローナル抗体を用いて結腸直腸癌臨床研究からあった。２００４年に、ＥＲＢＩＴＵＸはイリノテカンに基づく化学療法に不応性であるＥＧＦＲを表している転移性の結腸直腸癌患者の第２の線治療のために承認された。２−腕Ｐｈａｓｅ  ＩＩ臨床研究と一回の腕検査からの成績は、イリノテカンと結合するＥＲＢＩＴＵＸがそれぞれ４．１と６．５ヵ月の疾患進行までの時間の中央値でそれぞれ２３と１５パーセントの反応率を持つことを示した。同じ２−腕Ｐｈａｓｅ  ＩＩ臨床研究ともう一つの一回の腕検査からの成績は、ＥＲＢＩＴＵＸ単独による処置がそれぞれ１．５と４．２ヵ月の疾患進行までの時間の中央値でそれぞれ１１と９パーセントの反応率に帰着することを示した。従ってスイスと米国で、イリノテカンとｉｎｔｈｅアメリカ合衆国（ＥＲＢＩＴＵＸ処置単独）と結合するＥＲＢＩＴＵＸ処置は、失敗した第１の線イリノテカン治療を受ける大腸癌患者の第２の線治療として承認された。従って、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮの様に、スイスの処置は、モノクローナル抗体と化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、スイスと米国での処置は、第２の線治療として患者のために承認されるだけである。また、２００４年に、ＡＶＡＳＴＩＮは転移性の結腸直腸癌の第１の線治療として、静脈内５−フルオロウラシルに基づく化学療法と結合して、使用のために承認された。第三相臨床研究結果は、５−フルオ尿ウラシル（２０ヵ月対１６ヵ月それぞれ）単独を用いた治療を受ける患者と比較してＡＶＡＳＴＩＮ＋５‐フルオロウラシルで治療される患者の生存期間の中央値で、延長を示した。しかしながら、再びＨＥＲＣＥＰＴＩＮ  ａｎｄＥＲＢＩＴＵＸの様に、処置はモノクローナル抗体と化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、承認された診断ルーチンが免疫組織化学プラットフォームに基づく癌診断のために、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮとＥＲＢＩＴＵＸ抗原性の目標に基礎をおいたアメリカＦ．Ｄ．Ａが、ある。同様に、等しく劣った結果が、肺、脳、卵巣の（膵臓の）前立腺と胃癌のためにあった。抗ＧＤ３モノクローナル抗体のいくらかの限られた成功ｉｎｔｈｅ使用が、黒色腫のためにあった。このように、ヒトの必要条件である成功した小さい動物試験にもかかわらず、臨床試験（ここまで試験された抗体）が大部分のためで、効果がなかったことが分かる。肺、脳、卵巣の（膵臓の）前立腺、胃癌と肝細胞癌のための劣った結果であり続ける。非−肺小細胞癌のために最も有望な最近の結果は、処置がモノクローナル抗体を含んだＰｈａｓｅ  ＩＩ臨床試験から生まれた（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６（抗Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ））化学療法剤ＴＡＸＯＴＥＲＥ．と結合する細胞殺害薬ドキソルビシンに抱合型であるＴＡＸＯＴＥＲＥは、肺癌の第２の線治療のための唯一の食品医薬品庁承認された化学療法である。最初のデータは、単独でＴＡＸＯＴＥＲＥと比較して改善された総生存率を示す。本研究のために補充された６２人の患者から、残留する３分の１が単独でＴＡＸＯＴＥＲＥを受ける間、３分の２はＴＡＸＯＴＥＲＥと結合してＳＧＮ−１５を受けた。ＴＡＸＯＴＥＲＥと結合するＳＧＮ−１５の投与を受けた患者のために、総生存率の中央値は単独で割にＴＡＸＯＴＥＲＥの投与を受けた患者のための５．９ヵ月につき７．３ヵ月であった。１年と１８ヵ月総生存率は、それぞれ単独でＴＡＸＯＴＥＲＥの投与を受けた患者のためにそれぞれ２４と８パーセントと比較してＳＧＮ−１５＋ＴＡＸＯＴＥＲＥを受けている患者のための２９と１８パーセントであった。更なる臨床試験は、この薬のために予定される。ＳＧＮ−１５がマーケティングのために承認されなかったにもかかわらず、癌のためのいくつかの他の抗体複合体は２０００年以降アメリカ食品医薬局の承認を得た。これらは、再発性非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫の治療のために、再発された急性骨髄性白血病の治療、非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫の治療のためのＺＥＶＡＬＩＮ（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ、Ｙｔｔｒｉｕｍ抱合型のＲＩＴＵＸＥＶＩＡＢ、ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂ）、ＢＥＸＸＡＲ（１−１３１は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂを活用させた、抗ＣＤ２０  ＭＡｂ）のためにＭＹＬＯＴＡＲＧ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ、ヒト化抗ＣＤ３３  ＭＡｂ）を含む。これらの抗体は癌特異的な分子に対して開発された。そして、それはいずれの毒素もまたは同位元素にそれらを接合に適当にした。血液原疾患だけが抱合型の抗体を用いた現在うまく治療を受けることは明瞭である、そして、固形腫瘍（例えば肝細胞癌）はそのような治療をまだ必要とする。浸潤と転移がそうである腫瘍は、癌細胞を含む一連のプロセスと宿主によって余分の細胞マトリックスを特徴づけた。基底膜は、それらに基づく細胞を系統化することにおいて重要な役割を果たす専門余分の細胞構造である。腫瘍細胞の転移は、細胞外基質（ＥＣＭ）の構成要素で、細胞の相互作用を含む。ラミニンは細胞付着（増殖）を促進する基底膜の主要成分である成長、分化、そして、遊走（クラインマン・ヘキソキナーゼその他は、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８５（２１７：３１７−２５）である。小マーティンＧは、アール、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８７、３である：５７−８５。小ＢｅｃｋＫは、アール、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９０、４である：１４８−６０）．生体外でインビボのモデルは癌浸潤と関係しているラミニンと結合している腫瘍細胞を示した、遊走、そして、転移するｃａｂｉｌｉｔｙ（小テッラノーヴァＶＰは
、アール、Ｃａｎｃｅｒレニウム１９８２、４２である：２２６５〜２２６９。Ｖａｒａｎｉ  Ｊなど、病理Ａｍ  Ｊは、１９８３、１１１ある：２７−３４．小バースキーＳＨは、アール、ＪクランＩｎｖｅｓｔ  １９８４、７４：８４３    ―  ８４８    ―  である。Ｍａｌｉｎｏｆｆ  ＨＬ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９８４、３３：６５１−６５５。小カネモトＫは、アール、ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ米国１９９０、８７である：２２７９−２２８３）。６７ｋＤラミニン受容体（６７ＬＲ）、非インテグリン高親和性は表現が癌細胞でかなり増加して、他の細胞表面タンパク質の間でラミニンと相互に作用するラミニン−結合タンパク質である（Ｍａｌｉｎｏｆｆ  ＨＬその他は、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｎａｃｅｒ  １９８４（３３：６５１−６５５）である。ラオＣＮその他は、Ｂｉｃｏｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９８３（１１１：８０４    ―  ８０８  ）である。テッラノーヴァＶＰその他は、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８３（８０：４４４−４４８）である。ＭａｌｉｎｏｆｆＨその他は、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８３（９６：１４７５〜１４８０）である。Ｒｕｙｍａｎ  ＲＢその他は、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８８（１０７：１８６３〜１８７１）である。アルベルダ・スフィンゴミエリンその他は、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９０（４：２８６８〜２８８０）である。雹Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｍｐｌｏｙｍｅｎｔその他は、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０（１１０：２１７５    ―  ２１８４  ）である）。それは６７ＬＲの表示が胸部（大腸）のような癌で増加することを明らかにされた、そして、正常組織と比較した胃癌‖（Ｃｉｏｃｅ  Ｖその他は、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９１（８３：２９−３６）である。カストロノバＶその他は、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９０（１３７：１３７３〜１３８１）である。Ｄ’Ｅｒｒｉｃｏ  Ａその他は、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９１（４：２３９−２４６）である）。６７ｋＤラミニン受容体（６７ＬＲ；表１）最初はネズミの黒色腫の細胞膜から分離した（小ラオは、アール（１９８３）である。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓレニウム。Ｃｏｍｍｕｎ。１１１：８０４−８０８）、線維肉しゅ細胞（Ｍａｌｉｎｏｆｆ及びＷｉｃｈａ（１９８３）。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９６：１４７５−１４７９）、そして、通常のウシの筋細胞‖（小Ｌｅｓｏｔは、アール（１９８３）である。ＥＭＢＯ  Ｊ  ２：８６１）．それ以来、それは多数の種で発見されていて、人体組織の幅広い範囲で存在する（見本用は、Ｂａｒｓｏｕｍローラーとコギン２０００をみる。細胞ＭｏＩ  Ｂｉｏｌレット語。５：２０７−２３０；小メナードが、アール（１９９８のＪ．  Ｃｅｌｌ．）である生化学６７：１５５−１６５；  Ｍｅｃｈａｍ  １９９１アンヌＲｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：７１−９１）。
【０００３】
【表１】
2007530460.tif 000003
【０００４】
３７ｋＤ  ラミニン結合タンパク質（３７ＬＢＰ）未成熟ラミニンは、受容体たんぱく（ｉＬＲＰ）：６７ＬＲのための３２ｋＤ  ラミニン結合タンパク質（ＬＢＰ  ３２）ヒト相補ＤＮＡは最初は悪性結腸癌から分離された（それゆえに、タンパク質は大腸癌ラミニン結合タンパク質としても知られている；小雌羊は、アール（１９８８）である。８５：６３９４−６３９８）、そして、最初に予想されるより、小さい。相補ＤＮＡ予測された配列は、３２ｋＤの算出量で、２９５のアミノ酸性蛋白のためにコードする。しかしながら、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上で３７−４４ｋＤで通常動作する。そして、それは酸性タンパク質（算出π４．８３）の還元型の電気泳動易動度による可能性がある。Ａ少数（１６）、Ｎ末端の方のプレゼントは、疎水性アミノ酸である（カストロノバ、Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ及びソーブル（１９９１）。Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：２０４４０−２０４４６）、それは細胞膜にわたる可能性がある。３７ｋＤタンパク質と６７ｋＤタンパク質は抗原性に関連があることが示された（小ラオは、アール（１９８９）である；生化学２８：７４７６−７４８６）黒色腫細胞に対して行われるパルス‐チェイス実験が発生する３７ｋＤタンパク質が６７ｋＤ製品に追跡されることを示す、（小カストロノバは、アール（１９９１）である。生化学Ｂｉｏｐｈｙｓ。レニウム。Ｃｏｍｍｕｎ。１７７：１７７−１８３）．これらの結果は、２つのタンパク質の直接的な前駆体−製品関係があることを示唆した。それ故、３７ｋＤタンパク質は、３７ｋＤラミニン受容体前駆体と称される（３７ＬＲＰ；表１）。パルス‐チェイス実験は前駆体と最終的な６７ＬＲ（カストロノバなど、１９９１）の間で少しの中間形もの存在を明らかにしなかった、しかし、５ＯｋＤ分解生成物は発見されていた。３７ｋＤポリペプチドには細胞質と膜での多機能性の役割がある可能性があって、６７ＬＲの配位子を結合している構成要素である可能性がある（エリアス・カンポその他、病理Ａｍ  Ｊは、１９９２、１４１ある：ノー１０７３．５−１０８３）。癌細胞において、６７ｋＤタンパク質に対する抗体が細胞表面と細胞質（Ｗｅｖｅｒ  ＵＭその他は、Ｃａｎｃｅｒレニウム１９８７、４７である：５６９１−５６９８）と結合することを示された。それは完全には、最終的なレセプターが、脂肪酸パルミチン酸塩によるアシル化以外は、６７ｋＤレセプターを成し遂げるために細胞によって作られるよく理解されている方法でない。そして、オレイン酸剤とステアリン酸エステルは含まれる可能性がある（ランドヴスキ、Ｄｒａｔｚ及びスターキー（１９９５）。３４：１１２７６−８７；小Ｂｕｔｏは、アール（１９９８のＪ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６９）である：２４４−２５１）．広範囲な糖化は、複雑にならない。予測された相補ＤＮＡ配列はＮにリンクされた糖化のために、そして、セリンとトレオニン残りの存在にもかかわらず共通配列部位を含まない、Ｏにリンクされたグリコシル群の証拠がない（小カストロノバは、アール（１９９１）である。生化学Ｂｉｏｐｈｙｓ。レニウム。Ｃｏｍｍｕｎ。１７７：１７７−１８３；ランドヴスキ、Ｄｒａｔｚ及びスターキー（１９９５）。３４：１１２７６−８７）．しかしながら、カストロノバ（カストロノバ（１９９３のＩｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １３）：１−３０）は６７ＬＲがｃｒｏｓｓ−がβ−ガラクトシダーゼ結合性レクチンと反応するエピトープを表すように提案した。６７ＬＲは、脂質（ランドヴスキ、Ｄｒａｔｚ及びスターキー、１９９８）によって結合される前駆体ポリペプチドの二量体の成り立つ可能性がある。ヘテロ二量体化がレクチンのようなタンパク質またはガレクチン３で起こる可能性があることを示唆された（小カストロノバは、アール（１９９１）である；小Ｂｕｔｏは、アール（１９９８）である）。抗ガレクチン−３抗体は、ガレクチン３だけでなく６７ＬＲ（小Ｂｕｔｏが、アール（１９９８）である）も認めた。レセプターの最終的な構造は、解明されていない。培養で細胞の表面から放棄されるとき６７ＬＲラミニンと結合するその能力を保持する（小Ｋａｒｐａｔｏｖａは、アール（１９９６）である。Ｊ．  Ｃｅｌｌ。生化学６０：２２６−５０３）。６７ＬＲがどのように細胞膜に取り付けられるかは、いまだ明らかでない。レセプターがそのＮ末端の終わりの方へ１６の疎水性アミノ酸を持つにもかかわらず、それが必須膜タンパク質として存在することよりむしろ会合分子と対話するかもしれない。ｉｔｈａｓにしかしなから、確立するポリペプチドのアミノ末端基が、実際、この領域が他の分子と相互に作用することを示唆している非−透過させられた細胞で到達できない（小カストロノバは、アール（１９９１）である。Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３０２０４４０−２０４４６；小Ｗｅｗｅｒは、アール（１９８７のＣａｎｃｅｒレニウム）である。４７：５６９１−５６９８）．アクセサリーファクターが６７ＬＲを伴う可能性がある、または、それがアクセサリー分子自体として作用することを示唆された。そのような性質は、結合している細胞表面および／またはラミニンに輸送を援助する可能性がある。６７ＬＲの同時発現と肺小細胞癌細胞系のαｅβｉがラミニンに細胞接着で直接相互関係のある点に注意された‖（小Ｐｅｌｌｅｒｇｒｉｎｅは、アール（１９９４）である。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ８：１１６−１２０）．ヒト黒色腫細胞が両方の６７ＬＲラミニンとｏｔで処置された？原形質膜に共同転位置されたβｉ（小ロマノフ王朝は、アール（１９９４）である。細胞Ａｄｈｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ。２：２０１−２０９）．α６βｉを伴う６７ＬＲは、ラミニンにヒト記憶Ｔ細胞の集団の高いアビディティ付着の媒介となった（Ｃｌａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄＫｈａｋｏｏ（１９９９）。Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ。１６３：３４３０−３４４０）．ｅｔａｌなＡｒｄｉｎｉ、１９９７ｎｏｔｅｄｔｈａｔ‖６７ＬＲ、そして、共同局在化させられなかったα６β４同時制御された、６７ＬＲとα６サブユニットの間の物理的な相互作用を経て（小Ａｒｄｉｎｉは、アール（１９９７）である；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２３４２−２３４５）。しかしながら、卵巣癌で３７ＬＲＰメッセンジャーＲＮＡとタンパク質の表現度がα６サブユニットから独立していること（Ｇｉｖａｎｔ−ホーウィッツ（２００３人のクラン）。ｅｘｐ．転移２��：５９９−６０９；小Ｓｋｕｂｉｔｚは、アール（１９９６）である。病理Ｊは、１４８：１４４５−１４６１である）。一緒に、これらの結果は６７ＬＲが細胞質でラミニンに特有のインテグリン（特にα６サブユニット）を一体にする可能性があることを示唆する。そして、両方のレセプターがラミニンの認識に関与する総合ビルとして細胞膜に到達して、相互作用が高さか低親和性（ランドヴスキ、Ｄｒａｔｚ、スターキー、１９９５）のうちの１つであるかどうか決定する。３ｐ２１．３に活発な人間の３７ＬＲＰ遺伝子地図、癌を伴う遺伝子の変更にしばしば関与している染色体場所（小木材選別人は、アール（１９９６）である。オンコジーン１３：４９５−５０３）．活性遺伝子は７つのエキソンと６つのイントロンを含む（小木材選別人は、アール１９９６である。オンコジーン１３：４９５−５０３；小鳥類の遺伝子Ｃｌａｕｓｓｅは、アール（１９９６のＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５）である：１００９−  １０２３）．それは古典的タタボックスを含まない、しかし、複数の転写開始点がある可能性がある。部位がプロモーター領域に示す４つのＳｐＩ、イントロン１の６つのＳｐＩ部位と２つのＡＩｕ配列が可変スプライシングに影響を及ぼす可能性があるイントロン３にある。イントロン４は核内低分子ＲＮＡ  Ｅ２のために配列を含む（小木材選別人は、アール１９９６である。オンコジーン１３：４９５−５０３）．遺伝子の少なくとも２６部は、ヒトゲノムで存在する、高いｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｔｈｅ機能的な遺伝子を示している全て（ｅｔａｌな木材選別人（１９９６）。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ。１３０５：９８−  １０４）．これらのコピーのうちの１９は、分析されて、機能不全のコピーを引き起こしている謄写刷政府印刷物偽遺伝子であることが示された。これらの偽遺伝子がレトロ位置的なイベントによってきっと発生したと思われる‖（小木材選別人は、アール（１９９６）である。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ。１３０５：９８−１０４）．ラットとヒト配列が９９％の相同性を共有する間、相補ＤＮＡはマウス、ウシとヒト配列の間で少なくとも９８．３％の相同性で進化の全体を通じて非常に節約される（見本用は、メナードなどを見る、１９９７。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：１５５−１６５）。３７ＬＲＰ遺伝子は、３７ＬＲＰ以外の多数の機能蛋白質を生じるように見える。３７ＬＲＰタンパク質は、９９％の相同性をｐ４０リボソーム関連のタンパク質と共有する（ｐ４０ポリペプチド；ｐ４０；リボソームタンパク質社；ＩｔＰＳＡ）翻訳の機械に関係する（小Ｍａｋｒｉｄｅｓは、アール（１９８８）である。核のＡｃｉｄレニウム。１６：２３４９；小Ｔｏｈｇｏは、アール（１９９４）である。ＦＥＢＳレット語。３４０：１３３−１３８；ローゼンタール及びＷｏｒｄｅｍａｎ  １９９５。Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １０８：２４５−２５６）．胚目の開発の位置的なマーカーは３７ＬＲＰ相補ＤＮＡと同一の遺伝子にもよってコードされる（小Ｒａｂａｃｃｈｉは、アール（１９９０）である。発現１０９：５２１−５３１；ＭｃＣａｆｆｅｒｅｙ、ネーブとドレーガー（１９９０）。ＰＮＡＳ  ８７：８５７０−８５７４）．腫瘍胎児性抗原（ＯＦＡ；３７−４４ｋＤ）、免疫原性の糖蛋白は、齧歯目で人間の腫瘍と初期の胎児で表される。ネズミの３７ＬＲＰは、最高９９．５％のアイデンティティをＯＦＡと共有する（コギン、Ｂａｒｓｏｕｍ、ローラー１９９９。抗癌性のＲｅｓｅａｒｃｈ  １９：５５３５−５５４２）．それは、３７ＬＲＰの自動免疫原性の相同体と称された。ＯＦＡはマウスとヒトでＴとＢリンパ球を刺激して、癌において免疫原性の役割を果たすことが示された特に腎臓癌で‖（小Ｚｅｌｌｅ−Ｒｉｅｓｅｒは、アール（２００１）である。Ｊ．  Ｕｒｏｌ。１６５：１７０５−９；小ホールトは、アール（２００２）である。臨床癌レニウム。８：３３６９−３３７６；小ローラーは、アール（１９９２）である；Ｊ．  Ｎａｔｌ．  ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ。（ベセズダ）８４：６０２−６０９；ｅｔａｌなローラー（１９９４）。Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ。１５５：７５５−７６４；小ローラーは、アール（１９９５）である。Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ。１５５：５７１９−５７２７；ローラーなど、２００１。モッズ。態様Ｉｍｍｕｎｉｂｉｏｌ。１：１９１−１９５；小ローラーは、アール（１９９９）である。Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：６８８０−６８９２）．３７ＬＲＰと６７ＬＲｍａｙのアイソフォームまたは相同体が存在することを示唆するなにかの証拠が、ある。５５ｋＤタンパク質は、アイデンティティを３７ＬＲＰと共有しているヒトと鈍い内皮細胞で特定された（ｅｔａｌなアイルランド（１９９８）。臨床ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。１１２：２５５−２６１）、アイソフォームのａｎｄａ数はネズミの脳組織で見つかった（小シモノーは、アール（２００３）である。生物学Ｃｈｅｍ．３８４：２４３−２４６）．これらのタンパク質はさまざまな方向で翻訳後に修正されていておよび／または他の分子と相互に作用している３７ＬＲＰに起因する可能性があるか、他の非常に相同性遺伝子に起因する可能性がある。６７ＬＲの配布があった過剰発現と異常な表面は腫瘍の幅広い範囲にデモをした、メッセンジャーＲＮＡとタンパク質レベルのさまざまな技術によって発見された（見本用は、メナードなどを見る１９９８；小Ｂａｒｓｏｕｍは、アール（２０００）である）。３７ＬＲＰのレベルの変化および／または６７ＬＲは、疾患進行、感染度、転移、積極性と予後に関
して腫瘍生物学に影響を及ぼすことが示された。６７ＬＲの過剰発現は腫瘍発達で役割を果たしているレセプターと関係していた、進行の段階が腫瘍タイプに依存している可能性がある、（小カンポは、アール（１９９２）である。Ｊは、Ｐａｔｈｏｌ  ４１である：１０７３−８３；小デメテルは、アール（１９９２のＣａｎｃｅｒレニウム）である。５２：１５６１−１５６７；小Ｍａｒｔｉｇｎｏｎｅは、アール（１９９２）である。臨床ｅｘｐ．転移１０：３７９−３８６：乳癌；小バッソは、アール（１９９３）である；癌１５：４５５−４６１：黒色腫；小Ｂｏｕｋｅｒｃｈｅは、アール（２００４）である。Ｇｅｎｅ３４３：１９１−  ２０１：黒色腫；小Ｗａｌｔｒｅｇｎｙは、アール１９９７である。Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８９：１２２４−１２２７）。冷凍された結腸直腸組織の中の３７ＬＲＰメッセンジャーＲＮＡの増加は腺腫と比較して腺癌で見られることができたのに、レベルは正常なおよび腺腫組織の間で一定だった。これらの結果は３７ＬＲＰの表示または６７ＬＲが腺腫から腺癌／デュークスＣ癌まで疾患進行で遅いイベントで相互関係のあることを示唆する（小カンポは、アール（１９９２）である。Ｊは、Ｐａｔｈｏｌ  ４１である：１０７３−８３．）．対照的に、３７ＬＲＰメッセンジャーＲＮＡは疾患進行で初期のイベントを提案している腺腫頸部病変が増加した（小デメテルは、アール（１９９２のＣａｎｃｅｒレニウム）である。５２：１５６１−１５６７）．６７ＬＲは、単球の急性骨髄性白血病で血統関連の抗原としても関係した（ＡＭＬ；小Ｍｏｎｔｏｕｒｉは、アール（１９９９）である。臨床癌レニウム。５：１４６５−１４７２）．他の検査は６７ＬＲが感染度と転移で役割を果たす可能性があることを示した、それがさまざまな腫瘍で転移表現型の獲得において重要な役割を果たすことを意味する（小Ｗｅｗｅｒは、アール（１９８７）である。癌レニウム４７：５６９１−８；カストロノバ及びソーブル１９９０。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６８：１１１０−１１１７；小Ｃｉｏｃｅは、アール（１９９１）である。Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８３：２９−３６；ソーブル（１９９３人のセミン）。癌Ｂｉｏｌ．  ４：３１１−３１７；カストロノバＩｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９９３  １３：１−３０；あなたなど、１９８８。ＰＮＡＳ  ８５：６３９４−６３９８；小Ｐｅｌｏｓｉは、アール（１９９７）である。Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ。１８３：６２−６９；小Ｂｏｕｋｅｒｃｈｅは、アール（２００４）である。遺伝子３４３：１９１−２０１）。例えば、メッセンジャーＲＮＡのレベルはより大きな悪質な可能性でヒト大腸細胞系と組織が増加することが示された（小Ｋｏｎｄａｈは、アール（１９９２）である。癌レニウム５２：７９１−７９６）．細胞がｐｒｅ−であったとき、ヒト線維肉腫細胞系の転移の抑制が思いついて免疫グロブリンＧ分数（Ｐ４Ｇ）と交渉した３７ＬＲＰ−一般システムズ理論ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎで免疫されるウサギからの血清の（３４５ｂｐ相補ＤＮＡ；１３ｋＤ；  ｅｔａｌなナルミ（１９９９）。Ｊｐｎ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９���：４２５−４３１）．血清も、用量依存的な方法で細胞付着性をラミニンに下げた。３７ＬＲＰのアンチセンスＲＮＡも、生体外で低分化ヒト結腸癌細胞系の感染度を阻害した（マフネとＲａｖｉｋｕｍａｒ（１９９２）。Ｊ．  Ｓｕｒｇ。レニウム。５２：３４０−３４６）．転移の間の表現がもう一つの非インテグリン・ラミニン結合タンパク質の表現度で減少によって平行にされてしばしばある６７ＬＲで増加、ガレクチン−３（バン巣ブリュレｅｔａｌ（１９９４）。Ｅｕｒ．。Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３２Ａ：１５９８−１６０２；ｅｔａｌなスー（１９９５）。いる。Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ。１４７：８１５−  ８２２；小カストロノバは、アール（１９９５）である。Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ。１７９：４３−４８；小ロッツは、アール（１９９３）である。ＰＮＡＳ  ９０：３４６６−  ３４７０）．これらの結果はこれらの２つのラミニン受容体が反対に調整されることを示唆する、そして、これはレセプターが使われているラミニン−結合能の変化を説明する可能性がある。対照的に、ガレクチン３の発現増加と結腸癌の悪性間の直接的な相互関係は、観察された（Ｓｃｈｏｅｐｐｎｅｒ．ｅｔアール（１９９５のＣａｎｃｅｒ  ７５）：２８１８〜２８２６）。発現増加が増殖と著しい腫瘍成長と関係している傾向がある時から、６７ＬＲ表現は腫瘍の積極性のためのマーカーである可能性もある。３７ＬＲＰメッセンジャーＲＮＡの増加したレベルはヒト肺癌組織で発見されていた（小サトウは、アール（１９９２）である。生化学Ｂｉｏｐｈｙｓ。レニウム。Ｃｏｍｍｕｎ  １８２：７４６−７５２）、そして、膵内分泌腫瘍‖（小Ｐｅｌｏｓｉは、アール（１９９７）である。Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ。１８３：６２−６９）、それは急速に増殖性だった。ヒト乳頭腫ウイルスと関連する頸部新生物において、３７ＬＲＰメッセンジャーＲＮＡの増加したレベルは、細胞（デメテルなど、１９９２）の浸潤性質によるよりむしろ細胞の増殖性の性質と相関していた。ネズミの肺癌細胞系ＴＩｌへのアンチセンス３７ＬＲＰ  ＲＮＡの導入はそれらの倍加時間を延長した（小サトウは、アール（１９９９）である。臭素。Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８０：１１１５−１１２２）．これらの細胞もラミニンでより弱い相互作用を示した、そして、皮下に、アンチセンスＲＮＡを用いた治療を受ける細胞を接種されるマウスの生存期間は長くなった。それが舌端ノルマル１のタンパク分解性の裂開を強化する可能性がある時から、６７ＬＲが腫瘍ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｓｓで役割を果たす可能性もあって、従って、基底膜の低下率で援助する（小Ａｒｄｉｎｉは、アール（２００２）である。癌レニウム。６２：１３２１−１３２５）．３７ＬＲＰの過剰発現および／または６７ＬＲは数種類の腫瘍で予後不良を伴う可能性もある（見本用は、Ｂａｒｓｏｕｍローラーとコギン２０００をみる。細胞ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．５：２０７−２３０；小メナードが、アール（１９９８のＪ．  Ｃｅｌｌ．）であるＢｉｏｃｈｅｍ．６７：１５５−１６５；メナード、タリアブーエとＣｏｌｎａｇｈｉ（１９９８）。胸部Ｃａｎｃｅｒレニウム。処置５２：１３７−１４５）．予後はラミニンも生産している乳癌で好ましくない（小Ｍａｒｔｉｇｏｎｅは、アール１９９３である。Ｊ  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ学会８５：３７９−３８６；小ペッレグリーニは、アール（１９８５のＢｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ３５）である：１９５−  １９９）．ヒト・リンパ腫において、６７ＬＲは表面ｏｆＣＤ３０＋未分化大細胞リンパ腫に関して、そして、優秀なＢ細胞の小さいサブセットで検出可能だった非ホジキンまたはホジキンリンパ腫‖（小カルボーネは、アール（１９９５）である。うなりなさい。病理学２：５４１−５４６）．近年では、６７ＬＲは腫瘍生物学以外の生物過程に関係した。レセプターがサイトカイン、炎症性の試薬、ラミニンを含む細胞外基質タンパク質に対する相互作用とステロイド（見本用は、メナードなどを見る、１９９８）によって上方制御されるとわかった。そして、３７ＬＲＰと６７ＬＲが標準状態の下で調整される可能性があることを示唆した。レセプターは、ホスト防御機構でリンパ球化学走性、癒着と自動誘導またはでａｒｏｌｅを演奏する可能性がある。６７ＬＲｈａｓ人間の活性化の記憶末梢血Ｔ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋は、良い面を選び出す）の集団（１０−１５％）の表面で発見する。それは神経ペプチドに反応した上方制御されることも示された（小チェンは、アール（２００２人のナット）である。ｍｅｄ．  ８：１４２１−１４２６）．フェラリーニによって検査など、γδ＋リンパ球からレセプターのための免疫学的な役割が部位が肺癌細胞を殺してできた肺腫瘍で局在化させた１９９６支持物、６７ＬＲに対する相互作用によって仲介する（小フェラリーニは、アール（１９９６）である。Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｈｉｓｔ．。８８：４３６−４４１）．ラミニンが共刺激シグナルを提供することができたのに対して、殺害はナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、リンフォカイン活性化の（ＬＡＫ）細胞とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）から独立していることが示された。６７ＬＲｍａｙも、他の細胞型の成長、遊走と輸送に影響を及ぼす。６７ＬＲはα（αＧＭＲ）と対話する、そして、ＧＭ−ＣＳＦレセプターのβ（βＧＭＲ）サブユニット‖（小チェンは、アール（２００３）である。ＰＮＡＳ  １００：１４０００−１４００５）、そして、ＧＭ−ＣＳＦレセプター複合体の形成を阻害する。ＧＭ−ＣＳＦは骨髄様前駆細胞の成長、分化と成熟を調整して、成熟した好中球、好酸球と単核貪食細胞の機能を強化する。６７ＬＲは、防止ＧＭ−ＣＳＦ複合体形成によってこれらの活性を阻害する可能性がある。それが刷子縁で、そして、パネート細胞分泌顆粒で見つかった時から、６７ＬＲのための分泌源とエンドサイトーシスの役割は黙示的なでもあった（小Ｓｈｍａｋｏｖは、アール（２０００）である。Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ。１９１：３１８−３２２）．６７ＬＲがラミニンと相互に作用する正確な方法は、未決定のままである。２つのペプチド領域は、可能なラミニン結合部位として６７ＬＲから確認された。これら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇ、３７ＬＲＰの配列に由来する合成ペプチドのうちの１つは、パリンドローム配列ＬＭＷＷＭＬを含む。それは、内皮細胞に腫瘍細胞の結合を阻害するために、ラミニンを結合することが示された、そして、ヌードマウスでヒト黒色腫細��の転移を増加させること（小カストロノバは、アール（１９９１のＪ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６）である：２０４４０−２０４４６；カストロノバ、Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉとソーブル１９９１。癌レニウム。５１：５６７２−５６７８；小Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉは、アール（１９９３）である。Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ。学会８５：２３５−２４０）．ペプチドＧが増加して、腫瘍細胞の上でラミニンを結合することを安定させるということを発見された‖（小逸品は、アール（１９９６）である。Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：３１１７９−  ３１１８４）．第２の可能なラミニンを結合している領域は、３７ＬＲＰのＣ末端の配列の疎水性からの予測されたであった（ａ．ａ．２０５−２２９；ランドヴスキ、Ｕｔｈａｙａｋｕｍａｒ、スターキー、１９９５。臨床ｅｘｐ．転移１３：３５７−３７２）．レセプターのラミニン認識がラクトースに依存している時から、６７ＬＲのレクチン領域がラミニンと相互に作用することが、可能でもある（小カストロノバは、アール（１９９１）である。生化学Ｂｉｏｐｈｙｓ。レニウム。Ｃｏｍｍｕｎ。１７７：１７７−１８３）．６７ＬＲは、ラミニン残基ＹＩＧＳＲと結合する可能性がある（ａ．ａ。９２９−９３３；βｌ鎖；Ｍａｓｓｉ、ラオとハッベル（１９９３）。Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：８０６３−８０５９；ランドヴスキ、Ｕｔｈａｙａｋｕｍａｒ、スターキー、１９９５。１３：３５７−７２）、ＩＫＶＡＶ（ａ．ａ．２０９１−２１０８；α鎖；小Ｋｉｂｂｅｙは、アール（１９９３）である。ＰＮＡＳ  ９０：１０１５０−１０１５３）、そして、ＬＧＴＩＰＧ‖（ａ．ａ．４４２−４４６；βｌ鎖；Ｍｅｃｈａｍｅｔａｌ  １９８９  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１６６５２−１６６５７）．６７ＬＲは、ラミニン、特にポリ酢酸ビニル（ｌａｃｔｏｓａｍｉｎｏ）構造、ガラクトース（αｌ，３）ガラクトース結合とターミナルの非−還元性のβ−ガラクトシル残りの炭水化物成分と結合する可能性もある（Ｍｅｃｈａｍ（１９９１人のアンヌ）。Ｃｅｌｌ師。生物学７：７１−９１）。残りＹＩＧＳＲに対する結合は転移を阻害する（小イワモトは、アール（１９９６）である。臭素。Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：５８９−５９５）、転移がＩＫＶＡＶ相互作用によって刺激される、（小Ｂｒ
ｅｓａｌｉｅｒは、アール（１９９５）である。癌レニウム。５５：２４７６−２４８０）．第１のラミニン受容体の発見以来、６７ＬＲ、１９８３年に、少なくとも１４の他のラミニン受容体は記載され（Ｍｅｃｈａｍ  １９９１）て、ラミニンの上で同じ結合部位を利用する可能性がある。６７ＬＲも、ラミニンに加えて他の分子と相互に作用する。これらはエラスチンを含む（小グロッソは、アール（１９９１）である。生化学３０：３３４６−３３５０）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＩＶ型コラーゲン（小ナラシマンは、アール（１９９４）である。ＰＮＡＳ  ９１：７４４０−７４４４；小イワブチは、アール（１９９６のＢｌｏｏｄ  ８７）である：３６５−３７２）、そして、ヘパリン‖（小グアノシンは、アール（１９９２）である。ＰＮＡＳ  ８９：３０４０−３０４４）．他の検査は、６７ＬＲがシンドビスウイルスのためにレセプターとして用いられることを示した（小ワングが、アール（１９９２のＪ．  Ｖｉｒｏｌ．）である６６：４９９２−５００１）、３７ＬＲＰがプリオン蛋白の取り込みを可能にする、（小リーガーは、アール（１９９７）である。ナット。ｍｅｄ．  ３：１３８３−１３８７）．  
【０００５】
肝臓癌
肝臓で最も普通型原発性悪性腫瘍は、ｈｅｐａｔｏｃｅｕｌｌａｒ癌（ＨＣＣ）である。ＨＣＣの発生率はＨｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂのリスクが高い集団で増加する、そして、すでに慢性肝炎、肝硬変、ヘモクロマトーシスと２つの先天性の肝障害（α−１−アンチトリプシン欠損症とｔｙｒｏｓｉｎｅｍａ）を被っているＣ．  ＰａｔｉｅｎｔｓはＨＣＣを呈するより大きな危険でもある。特定の毒素と化学製品はアフラトキシンを含む原発性肝癌を引き起こす可能性もある。そして、型からの製品がアフリカで不適当に貯蔵型のピーナッツで見つかる。ＨＣＣが切除によってうまく除去される場合、再発と転移はありそうである。多数の検査は原発性肝癌と転移性の再発のためにさまざまな予後のマーカーを現した（見本用は、ＱｉｎとＴａｎｇ（２００４）を見る。Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３０：４９７−５１３）．ＨＣＣによる肝疾患の関連は、設計上の変化が原発性肝癌を呈する可能性を増加させる可能性があることを示唆する。標準状態の下で、肝細胞は基底膜（ＳｃｈａｆｆｈｅｒとＰｏｐｐｅｒ  １９６３  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ４４：２３０−２４２）の欠如によって特徴づけられる。細胞外基質タンパク質（ラミニンを含む）肝硬変が発現するにつれて、生じられることができる、そして、構造基底膜を形成して、類洞周辺で寄託する。ラミニン５が通常であるか腫瘍周囲の硬化性の組織で始原ＨＣＣ小結節で以外存在しないとわかった（小Ｇｉａｎｎｅｌｌｉは、アール（２００３）である。臨床。Ｒｅｓｅａｒｃｈ。９：３６８４−３６９１）．ラミニンはラミニン沈澱物が他のタンパク質の異常な表現度を生じることを示唆しているサイトケラチン１９の表現度を誘導することも示された（小Ｓｕは、アール（２００３）である。世界Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ：９２１−９２９）．それは、ラミニンの表現度がそのレセプターのいずれかの表示を増加させるということである可能性がある。６７ＬＲが１９９０年に肝細胞で表されるとわかった（小クレメントは、アール（１９９０）である。Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１０：１８５−１９２）、それが唯一のラミニン受容体でなかったにもかかわらず、現れなさい。６７ＬＲ陽性細胞の数の増加は、ＨＣＣと肝硬変患者から取り出される肝臓試料で、近隣の実質と比較して腫瘍性領域で観察された（Ｇｒｉｇｉｏｎｉなど（１９９１（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３８）：６４７−６５４）。もう一つの検査（小オザキは、アール（１９９８）である。腸４３：８３７−８４２）正常肝組織で発見された弱い３７ＬＲＰメッセンジャーＲＮＡ表現。メッセンジャーＲＮＡ濃度は慢性肝炎で非癌肝臓組織が増加して、腫瘍地方に更に上昇した。３７ＬＲＰ翻訳と発現タンパク質は本研究の未検であった（小オザキは、アール（１９９８）である。腸４３：８３７−８４２）．６７ＬＲのさらなる生合成はＲＮＡとタンパク質の増加間の直接的な相互関係で転移性のＨＣＣ組織で観察された（小鄭は、アール（１９９７）である。Ｊ  Ｔｏｎｇｊｉ医科大学。１７：２００−２０２）．Ｌ−０２通常の肝細胞と癌細胞系ＨｅｐＧ２とＳＭＭＣ−７７２１は細胞系の腫瘍州と相関しなかった３７ＬＲＰメッセンジャ���ＲＮＡと６７ＬＲ表現の様々なパターンを示した（小鄭は、アール（２００２）である。中国のＪ  Ｃａｎｃｅｒ  ２２：２４８−２５２）．しかしながら、細胞全体が結合研究のために使われた時からこれが単独で６７ＬＲに帰されることができないにもかかわらず、癌細胞系ＳＭＭＣ−７７２１は他の細胞系より高いラミニン結合能を表す可能性がある。しかしながら、プロテオミクス検査で６７ＬＲが高転移性の細胞系ＭＨＣＣ９７−Ｈで上方制御されることが分かった、低転移性の相対物ＭＨＣＣ９７−Ｌと比較して（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ７：  ６３０−６３６；  Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４；  ９８２−  ９９４）．６７ＬＲがＨＣＣにおいて直接的な役割を果たすかどうかに関係なく、転移は決定待ちのままである。  
【０００６】
先行特許  
米国特許第５，７５０、１０２号は、患者の腫瘍からの細胞が患者由来の細胞または組織からクローンをつくられる可能性があるＭＨＣ遺伝子で形質移入されるプロセスを開示する。これらのトランスフェクション細胞は、それから、患者に予防接種をするのに用いられる。
【０００７】
米国特許第４，８６１，５８１号は、哺乳類の腫瘍性で通常の細胞の内部細胞構成要素に特有であるモノクローナル抗体を得るが、外部部品以外に、モノクローナル抗体にラベルをつけるステップから成立していて、新生細胞を殺すために治療を受けた哺乳類の組織で標識抗体を接触させていて、標識抗体を変性している腫瘍細胞の内部細胞構成要素に結合することを測定することによって治療の効果を決定しているプロセスを開示する。人間の細胞内抗原に導かれる抗体を準備する際に、特許資格は悪性細胞がそのような抗原の便利な供給源を表すと認める。
【０００８】
米国特許第５，１７１，６６５号は、新しい抗体とその生産方法を提供する。具体的には、特許は強くヒト腫瘍（例えば大腸と肺のそれら）を伴う蛋白抗原と結合する性質を持つモノクローナル抗体の形成を教える、その一方で、非常により小さい程度に正常細胞と結合する。
【０００９】
米国特許第５，４８４，５９６号はヒト癌患者から外科的に除去腫瘍組織から成立している癌治療の方法を提供する。そして、同時に転移を阻害する間、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置して、生存可能であるが、非腫瘍形成性腫瘍細胞を放射線で治療して、原発腫瘍の抑制性の再発ができる患者のためにワクチンを用意するためにこれらの細胞を使用する。特許は、腫瘍細胞の表面抗原で反応性であるモノクローナル抗体の発現を教える。第４カラム第５行以下参照で述べられるように、特許資格はヒト新形成で活発な特異的免疫療法を表しているモノクローナル抗体の進展で自所性腫瘍細胞を利用する。
【００１０】
米国特許５，６９３，７６３号は、ヒト癌に特有の糖蛋白抗原が起源の上皮組織に依存していないことを教える。
【００１１】
米国特許５，７８３，１８６号は、細胞を表しているＨｅｒ２、抗体を生産しているハイブリドーマ細胞系、抗体を使用している癌を処置する方法と前記抗体を含んでいる医薬組成物でアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体に引き出される。米国特許第５，８４９，８７６号は、腫瘍と非腫瘍組織ソースから精製されるムチン抗原に、モノクローナル抗体の生産のために、新しいハイブリドーマ細胞系を記載する。
【００１２】
米国特許第５，８６９，２６８号は、方法によって生産されるモノクローナル抗体と同様に、望ましい抗原（モノクローナル抗体を生産する方法）に特有の抗体を生産しているｔｏａｍｅｔｈｏｄｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇａヒトｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅをつがれる。特許は、特に診断に役立つ抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の生産と癌の治療に引かれる。
【００１３】
米国特許５，８６９，０４５号は、抗体（ヒト癌細胞で反応性抗体フラグメント、抗体複合体と単鎖の免疫毒素）に関するものである。抗体にはカルシノーマ細胞の中で内在化する能力があるという点で分子がヒト癌の表面で出席している細胞膜抗原で反応性で、より遠いという点で、これらの抗体が機能する機構は二倍である。そして、結合の後である。そして、それらを特に形成性抗体−薬と抗体−毒素複合体に役立つようにする。それらの無修飾フォームにおいて、抗体も特異的な集中で細胞障害性の性質を呈する。
【００１４】
米国特許５，７８０，０３３号は、腫瘍治療と予防のために自己抗体の使用を開示する。しかしながら、この抗体は、老いた哺乳類からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる１種類の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」から来るので、自己抗体が実際に、処置されている患者から来る必要条件がない。加えて、特許は老いた哺乳類から天然で単クローン系抗核自己抗体を開示する、そして、ハイブリドーマ細胞系が単クローン系抗核自己抗体を生産する。
【特許文献１】米国特許第５，７５０、１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献８】米国特許５，８６９，０４５号
【特許文献９】米国特許５，７８０，０３３号
【発明の開示】
【００１５】
本発明者らは、以前得た米国特許６，１８０，３５７（個々にカスタマイズされた癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と名付けられる）。この文書、「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）が同義的に使われる可能性があって、適当なものとして、ハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）、免疫複合体と免疫グロブリンフラグメントによって生産される完全な免疫グロブリンと免疫グロブリン、キメラのたとえば〜などとヒト化の免疫グロブリンに由来する組換え型のタンパク質を参照する可能性がある期間、のためにＦ（腹筋』）、そして、２が分解するＦ（腹筋）、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域（Ｆｖ）ｓ、融合タンパク質など。この文書、「組織標本」が少なくとも１つのセル、意味すると理解される用語または細胞の集合の目的が哺乳類から得たＦｏｒ。芸術で、若干のアミノ酸配列が構造に対する重要な効果またはタンパク質の機能なしでポリペプチドで多様であることができるとよく認められる。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換（保存的置換は好まれる）、削除または追加。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢで標準の化学療法（例えば放射性核種）を活用させることはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中させる。ＣＤＭＡＢは毒素、細胞毒性部位、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。６ＢＤ−２５と称されるハイブリドーマ細胞系に由来するモノクローナル抗体に抱合型であるように、そのような抱合部位はこの中に例示される；類似の抗体複合体は、５ＬＡＣ−２３と称されるハイブリドーマ細胞系に由来するモノクローナル抗体を利用して形成されることができた。細胞障害性の薬剤のための担体としての腫瘍関連のモノクローナル抗体の使用は、ここ数年で相当な注意を受けた。このｗｏｒｋｈａｓの多くの目的抱合型の薬または毒素の望まれないものとしばしば時間中毒性副作用を減弱させている間、抗癌薬の効力を高めるためにある。このアプローチが効果的であるために抗体が高く選択的な腫瘍であることが、必要である、まったく、本剤は実行中の、細胞障害性の形の引渡済みである。ＭＥＴＨＯＴＲＥＸＡＴＥのような細胞毒、ＤＡＵＮＯＭＹＣＩＮ  ＭＩＴＯＭＹＣＩＮ  Ｃ（独占・合併管理委員会）、そして、ＶＩＮＣＡｈａｖｅ抗体に取り付ける、そして、派生複合体は、抗腫瘍活性のために調査された。加えて、シュードモナス属Ｅｘｏｔｏｘｉｎのような生物学的製剤とＣａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎとＡｕｒｉｓｔａｔｉｎｓのようなより新しい毒素は、それぞれ、抗ＣＤ３３と抗ＣＤ３０抗体の有効性を強化するために使用された。多くの例は、遅い非特異的な解放を受ける比較的安定化学結合によって薬に抗体の結合を例示する芸術の中に存在する。Ｉｏｄｉｎｅ１３１、Ｙｔｔｒｉｕｍ９０またはＩｎｄｉｕｍ１１１のような放射性核種は、腫瘍破壊の目的のためにまたは画像診断のために抗体に抱合型でもありえる。アプローチにかかわりなく、主要な目的は、腫瘍を破壊することになっている：特異的なアプローチは、３７ＬＲ抗原を表している細胞を目標とする利用できる方法がかなり異なることができるように、利用される特定の抗３７ＬＲ抗体で測定されることができる。『モノクローナル抗体を修正しているガン疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの３５７の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に１つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を可能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害（細胞障害能）か細胞増殖を（細胞分裂停止）性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび／または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。発生する全ての抗体はａｎｔｉ−のライブラリに加えられる。そして、他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、癌が抗体である。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数ででもガン疾患を処置するために役立つ可能性がある。実質的にＵＳ  ６，１８０，３７０の、そして、ＵＳ  ６，６５７，０４８で概説するものとしてのプロセスを使用して、マウス・モノクローナル抗体６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３は、それぞれ患者の胸部と肺腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。６ＢＤ−２５抗原は、まず最初に細胞ＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳによって種々の人間の正常なおよび癌細胞系の上で、発見されていなかった。ビオチンに６ＢＤ−２５抗体の接合を通して分析の感度を増加させた後に、抗原は乳癌細胞系最低降下高度−ＭＢ−２３１と卵巣癌細胞系Ｃ−１３（ＯＶＣＡ−４２９とＯＶ２００８）の上で発見されていた。乳癌細胞系Ｈｓ５７４．Ｔは、浄化されていない６ＢＤ−２５の細胞毒性に影響されやすかった。ＭＣＦ−乳癌細胞系７、卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３と大腸癌細胞系ＳＷｌ  １１６は細胞系が試験したわずか３つの癌であった。そして、純化された６ＢＤ−２５の細胞毒性に影響されやすかった。ＦＡＣＳ分析を用いることにより、５ＬＡＣ−２３のための抗原は、ＳＷ６２０大腸癌細胞系の上で見つけられて、他の細胞系の何の上でも、試験されなかった。胸部（Ｈｓ５７４．Ｔ）、肺（ＮＣＩ−Ｈ６６１）と皮膚（Ａ２０５８）癌細胞系は、浄化されていない５ＬＡＣ−２３の細胞毒性に影響されやすかった。卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３は細胞系が試験した唯一の癌であった。そして、純化された５ＬＡＣ−２３の細胞毒性に影響されやすかった。マウスに移植されるとき、ＯＶＣＡＲ−３とＳＷｌに対する６ＢＤ−２５細胞毒性の結果は１１６セル、培養でこれらの細胞の方へその抗腫瘍活性によって更に広げられた。大腸癌のインビボのモデルにおいて、ヒトＳＷｌ１１６細胞が襟首で卵巣癌のインビボのモデルのためにの間皮下に移植されたこと、人間のＯＶＣＡＲ−３細胞は、腹腔内に移植された。両方のモデルのために、それは特定の免疫細胞の欠如によるヒト腫瘍細胞を拒絶することができないにつれて、免疫不全のマウスが使われた。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。マウスの異種移植片は、支質、中心壊死とネオ脈管構造を発達させている固形腫瘍として成長する。腫瘍細胞系ＯＶＣＡＲ−３とＳＷｌ  １１６は、免疫不全のマウスでインビボの異種移植モデルとして評価された。良好な移植またはＯＶＣＡＲ−３とＳＷｌ１１６腫瘍の『ｔａｋｅ−ｒａｔｅする』、そして、標準の化学療法剤に対する腫瘍の感度は、それらを適切なモデルとして描写した。親の細胞系と細胞系の異型が、広範囲にわたる治療薬を評価するために、異種移植腫瘍モデルで使われた。ヒト大腸癌の予防的インビボのモデルにおいて、６ＢＤ−２５は、７週の期間の間毎週の注射が続く腫瘍細胞の着床の前に、マウス一日に与えられた。６ＢＤ−２５処置は、バッファ制御より、治療期間の間に腫瘍成長を抑制することに有意に効果的だった（ｐ＝０．００１）。処置相終了後、６ＢＤ−２５を与えられるマウスは、対照群のわずか５４パーセントに増大した腫瘍が認められた。後処理追跡調査期間の間に、６ＢＤ−２５の処置効果は維持された、そして、処置群の平均の腫瘍容積は測定相（ｐ＝０．００２）の終わりまでの対照よりかなり少なくし続けた。それが毒性（還元型の体重または臨床苦痛の他の表れを含む）の少しの合図も誘導しなかったので、６ＢＤ−２５処置は安全に見えた。このように、それがヒト大腸癌の安定したモデルで制御処置群と比較して腫瘍成長を遅延させたので、６ＢＤ−２５処置は有効だった。大腸癌の予防的インビボの腫瘍モデルの他に、６ＢＤ−２５は、予防卵巣のインビボの腫瘍モデルで、ＯＶＣＡＲ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。この異種移植腫瘍モデルにおいて、ＯＶＣＡＲ−３卵巣の癌細胞は、合計１０の用量のために移植の後、日を始めている処置で、免疫不全のマウスにｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｅｎａｌｌｙに移植された。６ＢＤ−２５による処置は、バッファ制御と比較された。体重が、腫瘍発達の代わりの程度として使われた。重量増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。移植後の（処置の終わりの後の１６日）日８０で、投与群のマウスは、対照群（ｐ＝０．００２）よりかなり少ない体重を持った。重要な生存利点が、６ＢＤ−２５対バッファ制御（ｐ＜０．０２）の処置でもあった。また、それが毒性または臨床苦痛の少しの表れも誘導しなかったので、６ＢＤ−２５処置は安全に見えた。６ＢＤ���２５の抗腫瘍活性と毒性のその見た目の不足は、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着しているａｐｏｏｒ結果を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球によるａｎｔｉ¬癌抗体の配送には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、Ｔｈｅｒｅは抗体の５つのクラスである、そして、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、ネズミの免疫グロブリンＭとＩｇＧ２ａ抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のＣＩ構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動させることができる。ヒト抗体のために、抗体を起動させている最も効果的ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−は、通常、免疫グロブリンＭとＩｇＧｌである。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧｌとＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で（いわゆる触媒抗体）さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。より広く認められる抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに２つの機構が、ある。第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチ
ンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第２は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。明白に疾患病因に関与する３０，０００の既知の遺伝子の製品の間で、疾患を処置する新薬の発見は、関連した目標の識別の不足によって妨げられる。腫瘍学調査において、潜在的薬目標は、それが腫瘍細胞で過剰発現されるという事実のために、単にしばしば選択される。このように特定される目標は、それから合成物の多数で、相互作用のために放送される。潜在的抗体療法の場合、これらの候補合成物は、通常、ケーラーとミルシテイン（１９７５、ネイチャー、２５６、４９５−４９７、ケーラーとミルシテイン）によって置かれる基本的な原理に従って、モノクローナル抗体生成の従来の方法に由来する。ひ細胞は抗原（例えば細胞全体、細胞分画、精製された抗原）で予防接種をされるマウスから集められて、不滅にされたハイブリドーマ・パートナーと融和する。結果として生じるハイブリドーマは映写される、そして、目標に熱心に抗体の分泌のためにどのｂｉｎｄｍｏｓｔを選択したか。多くの治療的で診断抗体はＨＥＲＣＥＰＴＩＮとＲＩＴＵＸＩＭＡＢを含む癌細胞に対して指示した。そして、ｈａｖｅｂｅｅｎがこれらの方法を使用して発生されて、目標のそれらの親和性と特異性を基礎として選択された。細胞障害能による抗原特異性の試薬の発現は腫瘍細胞の上で生じて、認められた抗原（ｓ）を表している細胞を結合して、そして、これらの試薬が正常な菌体群の上で重要な有害作用なしで腫瘍細胞の発達（進行と転移）を阻害するように、それ自身による、または毒素（薬または同位元素）のような他の分子と関連する、細胞でインビボの生理活性を持つ、治療的な可能性として非常に有益である、そして、または診断ツール。癌関連の目標として５ＬＡＣ−２３エピトープを確認するために、冷凍正常な人体組織の５ＬＡＣ−２３抗原の表現度は、決定された。免疫組織化学によって、５ＬＡＣ−２３抗原は、正常組織の表現を制限したことが示された。これは、組織配列スライドの中でホルマリン固定パラフィン包埋通常の器官で５ＬＡＣ−２３抗原の表現度を調べることによって確認された。全部で、弱い染色が正常組織のうちの５ＬＡＣ−２３時までにある。そして、ＨＣＣ（下記参照）のような癌と比較して正常肝、胃、脳と腎臓組織で抗原の制限されて還元型の表現度を示す。そのような表現は、時々生体内で、細胞質（それは通常、完全な抗体にとって到達できない）にも限定された。胃腺癌の表現もあったにもかかわらず、同じ組織配列において、５ＬＡＣ−２３抗原の表現度はＨＣＣにおいて卓越していた。ＨＣＣの目標のより広範囲な研究は、免疫組織化学によって有病率ｏｆｔｈｅ  ５ＬＡＣ−２３の抗原ｉｎｔｈｉｓ癌を調べるために行われた。驚くべきことに、肝臓癌の５５の試料の７３％は、この目標を表した。診断法、ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ、予後徴候または療法の目標として、有用性を示すために、マッチされた正常肝と肝臓癌の目標の配布の比較は、行われた。明らかに、５ＬＡＣ−２３は腫瘍試料だけを染色して、悪質な組織をこれらの断片において代表する中心���域に特有だった。アイソタイプ対照でけがされるとき、断面は負だった。そして、５ＬＡＣ−２３を結合することがはっきりしていたことを示して、５ＬＡＣ−２３抗原の癌特異性のサポートを与えた。更に、５ＬＡＣ−２３抗原がウエスタンブロット法、ＦＡＣＳ分析とイムノ組織化学豚小屋を通って例えば、種々の分析（それの若干の非極限の実施形態は例の方法によって含まれる）で発見されていることがありえることを示された。当業者にとって明らかで、この発明の範囲の中にある他の分析は、以下を含む：ＥＬＩＳＡ、免疫細胞学、ｉｍｍｕｎｏａｆｆｍｉｔｙベースの分析（例えばＳＥＬＤＩ質量分光）、表面プラズモン反響の決定、放射性同位元素標識免疫測定法と分子診断検査法。この中に概説されるように、付加的な生化学データも５ＬＡＣ−２３時までに認められる抗原が３７ＬＲＰのエピトープであることを示す。これは、二次元電気泳動とウエスタンブロット法による５ＬＡＣ−２３抗原と質量分光を確認することによって裏付だった。標的抗原の識別はｃｏ−を示すことによって確認された。そして、抗体による目標の限局化が組織の免疫組織化学検査と同様にウェスタンブロットと明確な３７ＬＲＰに知られているか、３７ＬＲＰ相補ＤＮＡで形質移入される細胞でＨ−１５０のような３７ＬＲＰと結合するために知られていた。重要なことに、５ＬＡＣ−２３は、他の抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０）と比較して、ユニークな製本見本を示した。より制限された結合を示している５ＬＡＣ−２３で、これは２つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。さらに、例で、１２Ｈの−１５０は細胞系の合計３７ＬＲＰを見つける、しかし、５ＬＡＣ−２３によって認識される抗原エピトープの表示は異なる細胞可溶化物全体で変化して、いくつかで存在しなかった。両方の抗体をＣＨＯ細胞可溶化物に結合することが類似していた時から、抗体のこの違いはＨ−１５０と比較してその抗原のために５ＬＡＣ−２３の下部の親和性によらなかった。５ＬＡＣ−２３  ａｎｄＨ−１５０によって見つけられるエピトープの違いを支援して、５ＬＡＣ−２３は、非還元の状況（図１６Ｂ、レーン１２）の下で、ＬＳ１７４Ｔ溶解産物でほぼＨＯｋＤのユニークな汚れを見つけた。このスミアは、３７ＬＲＰ前駆体に対応している帯域の増加なしで、還元性の状況の下で消えた。既知の抗ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０と比較して、これらの結果は、３７ＬＲＰの上で５ＬＡＣ−２３時までに認識されるエピトープがユニークであるという更なる証拠を提示する。これらのＩＨＣと生化学結果は、５ＬＡＣ−２３がユニークな３７ＬＲＰ抗原エピトープに向けられることを証明する。制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のよく認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点（処置が生存に悪影響を与えないところ）は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準はアメリカ食品医薬品局（Ｆ  ．Ｄ．  Ａ。）のような一般に認められて調節性体であるこれらの利点を発���する薬を承認する（ハーシェフェルドその他は、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ４２である：１３７−１４３  ２００２）．これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。会計年度末の（２００３）より、このプロセス中で承認される１６の薬があった、そして、これらの、４は完全な承認（すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査）に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための１つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅその他は、国立癌研究所９２（３）ジャーナルである：２０５−２１６  ２０００）．そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、充実性腫瘍研究グループ（癌の一団の国際的な専門家）で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、症状発現前モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少（それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある）が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる（エックハートその他は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓである：Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣｏｍｐｏｕｎｄｓのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓの大当りとＦａｉｌｕｒｅｓ；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ、３９回目の年会、２００３、ページ２０９−２１９）。全部で、この発明は、治療薬の目標として、６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３抗原の使用を教える。それは、投与されるとき、６ＢＤ−２５が抗原を表している癌で哺乳類で全身腫瘍組織量を減らすことができて、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできることを証明する。生体内６ＢＤ−２５処置とＳＷｌ  １１６とＯＶＣＡＲ−３細胞の抗原式の付随する検出不可能であるか低いレベルの有効性は、抗原表現のレベルがインビボの有効性と必ずしも相関するというわけではないことをそれぞれ示す。さらにまた、この発明も、癌細胞で６ＢＤ−２５  ５ＬＡＣ−２３抗原を見つけることが診断、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後に役立つことがありえることを教える。それは、診断法、ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ、予後徴候または療法の目標として、更に５ＬＡＣ−２３抗原の���用を示す。したがって、特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。
【００１６】
ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、これらは癌細胞に関して細胞毒性である。それは抗原性のフラグメントとして定義されて単離モノクローナル抗体で３７ＬＲＰの特定のエピトープの結合のためにラミニン受容体１前駆体タンパク質（指定の３７ＬＲＰ）を確認する発明の更なる目的、指定の５ＬＡＣ−２３またはそれのフラグメントである。抗原フラグメントは前記特定のエピトープと結合する、そしてそれは、単離モノクローナル抗体は同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から産生性の癌疾患修飾抗体のための方法によって発生された。
【００１７】
抗原フラグメントは前記特定のエピトープと結合する、そしてそれは、単離モノクローナル抗体は癌疾患修飾抗体を同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から作り出す方法によって発生された。５ＬＡＣ−２３時までに認識される３７ＬＲＰの特定のエピトープで結合ができる抱合部位を提供することは、この発明の更なる目的である。
【００１８】
それは抗体がそれについて、前記特定のエピトープと結合する５ＬＡＣ−２３またはフラグメントである薬−抗体複合体と称されてこの中にある、そして、複合体は放射性核種でありえる、または、生物学的であるか化学毒素または合成物の形の活発な抗腫瘍剤が化学療法剤を含むがこれに限らず等価の抗腫瘍活性を持つ。活発な抗腫瘍剤を届ける方法を教えることはこの発明のもう一つの目的である。
【００１９】
そして、酵素または放射性核種が抗腫瘍剤としてまたは抱合部位と抗原エピトープの選択的な結合が起こるそれによって本発明に従って哺乳類に抱合部位を投与することを成立している哺乳類の腫瘍細胞の部位に対する画像診断の方法の援助として効果的である。悪性の存在を示すのに十分なレベルで３７ＬＲＰ前駆体タンパク質で５ＬＡＣ−２３抗体の選択的な結合を立証するためにどんな平均値ででも癌細胞の存在を測定する方法を教えることは、まだ本発明のさらなる目的である。
【００２０】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後、治療、イメージングと３７ＬＲＰの特定の抗原性部位で５ＬＡＣ−２３、抗原性の結合断片（先に定義されるように）または複合体半量（先に定義されるように）の結合に依存する方法を利用しているガンであるか前癌性の細胞のモニタリングのための方法を教えることになっている。それのＣＤＭＡＢと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。
【００２１】
細胞毒性がＡＤＣＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、本発明の更なる目的である。細胞毒性がＣＤＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【００２２】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つＣＤＭＡＢを発生することである。この発明の他の目的と長所はそこで以下の説明（図と例の横道）から明らかになる。そして、この発明の実施形態が述べられることを確信している。
【００２３】
（図面の簡単な説明）
図１は、６ＢＤ−２５、５ＬＡＣ−２３と抗ファス（正の制御）抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
図２は、予防ＳＷｌ１１６大腸癌モデルの腫瘍成長に関する６ＢＤ−２５の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図３は、予防ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌モデルの体重の６ＢＤ−２５の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図４は、６ＢＤ−２５またはバッファ制御による腫瘍を含んだマウス後処理の残存。マウスは、２４０日以上後処理のために生存をモニターされた。
図５Ａと５Ｂは、全細胞可溶化物（Ｔ）と細胞質の分数（Ｃ）のウエスタンブロットは、アイソタイプ対照（パネルＡ）か５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）で染色されるＯＶＣＡＲ−３  Ｃｅｌｌｓから作った。異なった帯域は５ＬＡＣ−２３で見つけられて、黒い矢で示される。
図６Ａと６Ｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質のタンパク質のウエスタンブロットは、２次元の電気泳動によって分かれた。パネルＢが５ＬＡＣ−２３で探索される汚点を示す間、パネルＡは免疫グロブリンＭアイソタイプ対照と探索されるブロットを示す。矢は、５ＬＡＣ−２３時までに認められる点に対応する。
図７Ａ、７Ｂと７Ｃは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質のタンパク質の２次元  ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット。図中パネルＡは、細胞質の分数のシルバー染色されたゲルである。Ｐａｎｅｌ  Ｂがアイソタイプ制御抗体で探索される類似の汚点を示す間、パネルＣは５ＬＡＣ−２３時までに認められるタンパク質の位置を示す。
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃと８Ｄは、５ＬＡＣ−２３よって認められる点に対応する。ＯＶＣＡＲ−３細胞質の分数のウエスタンブロットは、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０の（Ａ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｆ−１８（Ｂ）、免疫グロブリンＭアイソタイプ制御（Ｃ）と５ＬＡＣ−２３（Ｂ）で深く探った。
図９Ａと９Ｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞からの細胞質のタンパク質の２−次元ウエスタンブロット。Ｂｌｏｔ  Ａの矢は、５ＬＡＣ−２３が結合する主要発疹を示す。Ｂｌｏｔ  Ｂの線は、抗３７ＬＲＰ（Ｈ−１５０）抗体に特有である点を示す。汚点の上で明かされる他の点は、抗体のアイソタイプでまたは使用される二次抗体で相互作用による。
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃと１０Ｄは、５ＬＡＣ−２３（一番下の列）と免疫グロブリンＭアイソタイプ制御（一番上の列）で３７ＬＲＰ（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ）コードしているヒト相補的ＤＮＡクローンを表しているプラスミドで形質移入されたＣＨＯ細胞（１０Ｘ拡大）の免疫染色される。細胞はＦｕｇｅｎｅ試薬（甲欄）単独で形質移入されたか、ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰの量を増加させていた（１マイクログラム：柱Ｂ；２マイクログラム：柱Ｃ；４マイクログラム：柱Ｄ）。細胞が５ＬＡＣ−２３でけがされたとき、陽性細胞（茶色の）の増加性の数はプラスミドの増加性の量で見られることができる。
図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、アイソレーション増幅器。３７ＬＲＰコードしているヒト相補的ＤＮＡクローンを表しているプラスミドで形質移入されるＣＨＯ細胞（４０Ｘ）の免疫染色される（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ；２マイクログラム）。細胞は５ＬＡＣ−２３（Ａ）で染色された、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ｂ）と抗６７ＬＲ抗体ＭＬｕＣ５（Ｃ）と陽性細胞は全部で見られることができる免疫染色する。
図１２Ａ、１２Ｂと１２Ｃは、ウエスタン分析によってさまざまな抗体によって見つけられるＥ．ｃｏｌｉのヒト３７ＬＲＰの表示。細菌反応混合物に含まれたプラスミドは、Ｃ末端のＨｉｓβ−タグ（レーン１）で、Ｃｏｎｔｒｏｌ媒介生物ＧＦＰを含んだ、ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（３７ＬＲＰ；レーン２）ａｎｄｐｒＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｊＳ６（ａＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌＨｉｓ６−タグによる３７ＬＲＰ；レーン３）。汚点は、免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（パネルＡ）、５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）と抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（パネルＣ）で探索された。
図１３Ａ、１３Ｂと１３Ｃは、５ＬＡＣ−２３（一番下の列）と免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（一番上の列）と一緒のパラフィン包埋組織の染色。断面は、通常の胃（甲欄）、ｎｏπｎａｌ肝臓（柱Ｂ）と肝細胞癌（柱Ｃ）から取り出された。
図１４Ａ、１４Ｂと１４Ｃは、マッチされたｎｏπｎａｌ（一番上の列）とマッチされた腫瘍組織（一番下の列）からの寒冷保存された肝臓組織に対するさまざまな抗体の結合。使用される抗体は、免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（甲欄）、５ＬＡＣ−２３（柱Ｂ）と抗サイトケラチン８（柱Ｃ）であった。
図１５Ａと１５Ｂは、５ＬＡＣ−２３（）と免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（）と一緒の通常の肺上皮細胞系列Ｂｅａｓ−２Ｂのイムノ組織化学染色。細胞は成長される（柱Ｂ）か、外で（甲欄）Ｖｉｔｒｏｇｅｎであった。
図１６Ａと１６Ｂ。非還元の条件のウエスタンブロット法によって発見されたものとしての多数の腫瘍と形質転換細胞系の表現ｏｆｔｈｅエピトープ  抗３７ＬＲＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙＨ−１５０の（Ａ）と５ＬＡＣ−２３（Ｂ）。細胞系は、野生型ＣＨＯ細胞（レーン１）とヒト細胞系を含んだ：ＨＢ４ａＲ４．ａ（レーン２）、ＨＭＴ  ３５２２（レーン３）、ＭＣＦ−７（レーン４）、最低降下高度−ＭＢ−２３１（レーン５）；最低降下高度−ＭＢ−３６１（レーン６）、ＯＶＣＡＲ−３（レーン７）、チャンのＬｉｖｅｒ（レーン８）、ＨｅｐＧ２（レーン９）；Ａ３７５（レーン１０）、ＤＬＤ−Ｉ（レーン１１）、ＬＳ１７４Ｔ（レーン１２）とＳＷ６２０（レーン１３）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
実施例１
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞系：６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３
それぞれ寄託番号ＰＴＡ−５６９１とＰＴＡ−５６９０の下で、２００３年１２月９日の２０１１０−２２０９  ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ）（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ｏｎ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ９，  ２００）、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３は寄託された。３７の運賃込み条件１．８０８に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３のクローン、上清と細胞ＥＬＩＳＡスクリーニングの派生は、以前ＵＳ  ６，６５７，０４８で記載された。６ＢＤ−２５  ５ＬＡＣ−２３モノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度／週でハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）で培養することによって生産された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）で、標準の抗体精製処置によって精製された。６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３は、細胞毒性分析（表２）で、多数の陽性（抗ファス（ＥＯＳ９．１、免疫グロブリンＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、カッパ、５マイクログラム／ｎｉＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ホーンビー、ＯＮ）、Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００マイクロモル、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、アジ化ナトリウム（０．１％、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ））で陰性の（１０７．３（抗喘ぎ、ＩｇＧｌ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗喘ぎ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、最大許容濃度−１１（抗原特異性未知数、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、免疫グロブリンＧ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％）、免疫グロブリンＭバッファ（２％））対照と比較された。乳癌（最低降下高度−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、最低降下高度−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ  １１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）、前立腺癌（ＰＣ−３）と非癌（ＣＣＤ−２７ｓｋ、Ｈｓ８８８．Ｌｕ）細胞系は、試験された（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡからの全て）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞毒性分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得られた。分析は、下で概説される変化で、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。２日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから���１００マイクロリットルは細胞板に転写されて、５日の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで暖められた。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、３回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。ＤＰＢＳで希釈される蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、３０分の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで３７０Ｃで暖められた。プレートはパーキン−エルマーＨＴＳ７０００蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで分析された、そして、結果は表１で表化された。データは、平均４つの実験が三通りで検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した：４／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋＋）、３／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋）、２／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋）。表１の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。比較のためにも含まれた他の抗体のｎｉｉ  Ｎｉ  Ｐｔｔｅｇａｖｅｏｓｕｍｂｅｒが生物学的細胞分析の限定を与えられるＣｌ  Ｃｔｔｏｒｎｏｓｏｎｒ期待されるとして実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。６ＢＤ−２５抗体は胸部（卵巣のおよび大腸癌細胞系選択的に）で細胞毒性を示した、その一方で、非変わる正常細胞の上に無効を持った。また、非−の上に無効を持つことが正常細胞を変える間、５ＬＡＣ−２３抗体は選択的に卵巣癌細胞系で細胞毒性を示した。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３はそれらの活性で選択的だった。さらにまた、それが非−癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３は機能的な特異性を示した。そして、それは重要な治療的な因子である。  
【００２５】
【表２】
2007530460.tif 000004
【００２６】
癌と正常な細胞系の前述のパネルに対する６ＢＤ−２５の結合は、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって評価された。細胞は、まず最初にＤＰＢＳ（Ｃａ＋’’１なしで」、そして、Ｍｇ＋＋）で細胞単層を洗うことによって、ＦＡＣＳの準備ができていた。細胞解離バッファ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、バーリントン、ＯＮ）はそうだった、そして、３７°Ｃ．  Ａｆｔｅｒ遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、細胞はＭｇＣｌ２を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水で再懸濁された。そして、ＣａＣｌ２ａｎｄ２５パーセント・ウシ胎児血清が４０Ｃ（メディアを洗う）状態にあられて、計数されて、適当な細胞密度に等分されて、細胞に小球をぶつけるために下って回転して、３０分の間氷の上で２０マイクログラム／ｍＬで６ＢＤ−２５（非抱合型であるかビオチンで抱合型の）、５ＬＡＣ−２３または制御抗体（アイソタイプ制御または抗ファス）を含んでいる染色メディア（ＤＰＢＳは、ＭｇＣｌ２と塩化カルシウムを含んでいる）で再懸濁された。ビオチンに６ＢＤ−２５を接合することは、ビオチン標識試薬（ピアスＥ２−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−集線装置−ビオチン、ロックフォード、ＩＬ）で実行された。ビオチン標識試薬は６ＢＤ−２５まで２０回モル過剰で加えられて、振盪で室温で２時間の間暖められた。ビオチン標識された６ＢＤ−２５は、それから４０ＣでＰＢＳに対して終夜透析された。Ａｌｅｘａフルーアの追加の前に４８８抱合型の二次抗体（非抱合型の主要な抗体のために）またはストレプトアビジンＲ−フィコエリトリンが二次抗体（ビオチン標識された６ＢＤ−２５のために）を接合したこと、細胞は洗浄メディアで一度洗われた。染色メディアの中の適当な二次抗体は、それから２０分の間加えられた。細胞は、それから最後の時間の間洗われて、ヨウ化１マイクログラムの／ｍＬのプロピジウムを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）を使用しているＦＡＣＳｃａｎの上で試料を走らせることによって評価された。細胞のフォワード（国際販売会社）と側方散乱（ＳＳＣ）は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とＳＳＣ探知器に追い迫る。細胞が約１−５単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２とＦＬ３）のための探知器は適当な二次抗体が続く精製されたアイソタイプ制御抗体で染色される走行細胞によって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約１０，０００の有効な細胞は、表３に示される分析と結果のために後天性だった。表３はアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に示される：１．５未満（）；１．５〜２つの（＋）；２〜３（＋＋）；３〜１０の（＋＋＋）と＞１０（＋＋＋＋）。６ＢＤ−２５  ５ＬＡＣ−２３抗体の代表的なヒストグラムは、図１のために編集された。非抱合型の６ＢＤ−２５は、まず最初に、ＦＡＣＳによって試験���れる少しの細胞系も結合しなかった。しかしながら、ビオチンに６ＢＤ−２５を接合することによって分析の感度を増加させた後に、抗原の低レベルが最低降下高度−ＭＢ−２３１、Ｃ−１３、ＯＶＣＡ−４２９とＯＶ２００８癌細胞の表面で存在することを証明された。ＦＡＣＳによって、５ＬＡＣ−２３は、大腸癌細胞系ＳＷ６２０に高くて特異的な結合を見せた。６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３のために、これは結合の程度がその同族の抗原の抗体結紮の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結紮の前後関係が抗体結合よりはむしろ細胞毒性で決定的なことを示唆した。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
実施例２
生体内の大腸予防的腫瘍実験  
８週間目まで図２、４に示されるデータに関して、雌の重篤複合免疫不全マウスは、１００マイクロリットルの塩水湖の１１６のヒト大腸癌細胞が襟首で皮下に注射した５００万のＳＷｌで入れられた。マウスは、１０の２つの投与群に、ランダムに分けられた。着床より前の日に、２０ｍｇ／ｋｇの６ＢＤ−２５試験抗体またはバッファ制御は、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯＷＨ２Ｏと２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４＾Ｈ２Ｏを含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、ｉｎｔｒａｐｅｒｔｉｏｎｅａｌｌｙに投与された。同じ様式の７週の期間の間の１週当たり、抗体はそれから投与された。腫瘍成長は最高１６週の間のカリパス副木による正確に計ったざっとあらゆる７回目の日であったか、個々の動物までＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）エンドポイントまたは日１１２の間カナダの会議に達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通じてなかった。データは独立試料試験を使用して分析された、そして、有意性は平均値の同等のためにｔ検定を使用して測定された。日５０（最終的な処置の後の１日）で、腫瘍容積ｉｎｔｈｅ  ６ＢＤ−２５の処置群は、バッファ制御（ｐ＝０．００１）の５４パーセントであった。発育遅延ｏｆｔｈｅ腫瘍は、治療期間過ぎに続いた。日１１２（６３日後処理）で、抗体投与群の腫瘍容積は、バッファ制御（ｐ＝０．００２）の５９パーセントであった。要約すると、６ＢＤ−２５抗体処置は、ヒト大腸癌のよく認識されたモデルで、割に全身腫瘍組織量をバッファ制御に下げた。これらの結果は、人を含む他の哺乳類で、治療としてこの抗体（６ＢＤ−２５）の潜在的薬理学で製薬利点を暗示する。
【００２９】
実施例２
生体内の卵巣予防的腫瘍実験：  
図３と４に示されるデータに関して、４〜８週間目、雌のＳＣＥＤマウスは、１０００マイクロリットルの食塩注入された腹腔内で、５００万のＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞で挿入された。マウスは、１０の２つの投与群に、ランダムに分けられた。移植の後の日に、２０ｍｇ／ｋｇの６ＢＤ−２５試験抗体または抗体バッファは、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４＊  ７Ｈ２Ｏと２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４＾Ｈ２Ｏを含んだ賦形薬による家畜濃度からの希釈の３００マイクロリットル後にの量の投与された腹腔内であった。同じ様式の９週の期間の間の１週当たり、抗体はそれから投与された。体重は最高１１週の間の正確に計ったざっとあらゆる７回目の日であったか、個々の動物までＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）エンドポイントまたは日７６の間カナダの会議に達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通じてなかった。体重が、腫瘍発達（図３）の代わりの程度として使われた。重量増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。有意性は、ダネットのｔ検定を使用して測定された。移植後の（処置の終わりの後の１６日）日８０で、６ＢＤ−２５投与群のマウスは、緩衝対照群（ｐ＝０．００２）よりかなり少ない体重を持った。ログランク検定で測定されるにつれて、バッファ制御（図４）と比較した６ＢＤ−２５による処置による生存も強化された。対照群のマウスは、８７．０日の生存期間の中央値対６ＢＤ−２５投与群（ｐ＜０．０２）の１０７．５の日を過ごした。また、緩衝投与群の全てのマウスは、日中１２０のポスト着床（５６日後療法）になって死んだ。抗体投与群において、生存しているまだ１匹のマウスが、日２５０後処理（１８６日後処理）でいた。要約すると、６ＢＤ−２５抗体処置は、ヒト癌疾患のもう一つのよく認識されたモデルで、バッファ制御に割に全身腫瘍組織量を予防した。６ＢＤ−２５も、卵巣の異種移植モデルで生存を強化した。全体として、６ＢＤ−２５は、重篤複合免疫不全マウスで大腸と卵巣癌の予防腫瘍異種移植モデルで腫瘍成長を抑制することでのバッファ制御よりかなり効果的である。６ＢＤ−２５にもよる処置は、人を含む他の哺乳類で治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を提案しているヒト卵巣癌疾患のよく認識されたモデルで、生存利点を示した。さらにまた、ＳＷｌ１１６とＯＶＣＡＲ−３細胞の抗原式の検出不可能であるか低いレベルは、抗原表現のレベルがインビボの有効性と必ずしも相関するというわけではないことをそれぞれ示す。
【００３０】
実施例４
ウエスタンブロット法による結合タンパク質の同定  
抗原を表している抗体５ＬＡＣ−２３、細胞可溶化物と細胞質の分数によって認められる抗原（ｓ）を特定することは、ゲル電気泳動に従属して、膜に移った。ウエスタンブロット法は、この抗体によって見つけられるタンパク質を決定するのに用いられた。  
【００３１】
１．  １次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  
前の仕事はＦＡＣＳ分析によって５ＬＡＣ−２３の弱い結合を卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３に示した、そして、その５ＬＡＣ−２３はこの細胞系（米国特許出願Ｎｏ．１０／８１０、１６３、いずれが参照によって組み込まれてこの中にあるかという内容）に対して細胞毒性を持つことが示された。全細胞可溶化物は、ＲＩＰＡバッファで準備された［５ＯｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．２）；１５ＯｍＭ  ＮａＣｌ；０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ；１％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸ナトリウム；１％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ−１００］細胞分画がＭｅｍ−ＰＥＲ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ摘出キットを使用しているようにされる、（ネコ。Ｎｏ．８９８２６；ピアス；Ｔａｔｔｅｎｈａｌｌ、チェシャー、英国）。発生する親水性の断片は、膜成分の除去によって基本的に豊かにされて、細胞質の断片であると考慮された。プロテアーゼ阻害薬（ＳＩＧＭＡ  Ｐ８３４０）は、全ての細胞溶解ステップに含まれた。細胞標品のアリコートは３０分の間６０Ｖで１２％のゲル類ａｎｄｒａｎに積まれた、それから、染料正面までの１５０Ｖはゲル類の一番下に着いた。ゲル類は、ＮＯＶＥＸ  ＸＣｅＩｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（インビトロゲン、ペイズリー、英国）を用いて、２時間３０ＶでＰＶＤＦ膜上へタンパク質の転送の準備ができていた。転送の後で、膜は４０Ｃで終夜０．５％のツイーン（ＴＢＳＴ）を含んでいるＴｒｉｓ−緩衝食塩水の５％の脱脂粉乳によるブロック状態のであった。膜は、室温で４時間主要な抗体で暖められた。主要な抗体含まれた５ＬＡＣ−２３（５つのμｇ／ｍＬ）、そして、アイソタイプ制御‖（マウス抗トリニトロフェノール、免疫グロブリンＭ、Ｋ；Ｇ１５５−２２８のクローンをつくりなさい；ネコ。Ｎｏ．５５３４７２；ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；オックスフォード、オックスフォード大学の、英国の；５μｇ／ｍｌ）。膜がＴＢＳＴで３回洗われた、膜は接合される西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で暖められたヤギ抗マウス免疫グロブリンＭ、μ鎖特異抗体（１／１０，００００；ネコ。数１１５−０３５〜０７５；ジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、アメリカ合衆国）Ｉｈ．のために５回膜を洗った後に、ＨＲＰは腸クロム親和性細胞様西洋のＢｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム）を使用しているのを見つけられた。帯域を産生されるＯＶＣＡＲ−３細胞の細胞質の分数に対する５ＬＡＣ−２３の結合は、近いＭＷ  ４ＯｋＤａ（図５）黒い矢で示されるように、の。この帯域はＯＶＣＡＲ−３細胞から作られる全細胞可溶化物が非常に不得意だった。そして、抗原が細胞質の分数を生み出して濃縮されることができたｔｈａｔｔｈｅを関係させた。帯域は、５ＬＡＣ−２３に対する相互作用がはっきりしていたことを示しているアイソタイプ対照によって、見つけられなかった。優性の帯域が約７ＯｋＤでも観察されたにもかかわらず、この帯域はより少ない強度でアイソタイプ対照にもよって見つけられた。この実験から、５ＬＡＣ−２３は、特に約４０ｋＤのタンパク質と結合するように見える。  
【００３２】
２．  ２次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  
上で述べられるように、細胞質のタンパク質が準備した合計、プラスＯｎｅを使用している沈降したは、２次元のＣｌｅａｎ−Ｕｐキットであった（ネコ。Ｎｏ．８０−６４８４−５１；アマシャム、リトル・チャルフォント、バックス、英国）、それから、ｐＨ範囲３−１０で両性電解質を含んでいる再水和バッファで再懸濁される。第１のアスペクト等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、７ｃｍの固定されたｐＨ  ３−１０勾配（ＩＰＧ）で、ＩＰＧｐｈｏｒ（アマシャム）の上で実行された−再水和溶液の面前で細片（アマシャム、リトル・チャルフォント、バックス、英国）の基礎を形成する（８Ｍの尿素（２％のＣＨＡＰＳ）；アマシャム）。電圧限度は再水和を起こらせる１４時間の３０Ｖであった、そして、１時間の２００Ｖ、１時間の５００Ｖ、３０分の間の１０００Ｖと８０００Ｖｈまでの８０００Ｖは達された。ＩＥＦ分離の後で、細片は１５分の間２．５％のヨードアセタミドでＤＴＴなしでＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡バッファで平衡化された。細片は１０％のゲルの表面に配置されて、０．５％のアガロースで封着された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは３０分の間６０Ｖで動作した、それから、染料正面までの１５０Ｖはゲル類の一番下に着いた。ゲル類は、Ｈｏｅｆｅｒ  ＴＥ  ７７を用いてＰＶＤＦ膜上へタンパク質の転送のために、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｎｉｔ（アマシャム）を用意された。転送の後で、膜は４０Ｃで終夜０．５％のツイーン（ＴＢＳＴ）を含んでいるトリス−緩衝食塩水の５％の脱脂粉乳によるブロック状態のであった。膜は、室温で４時間主要な抗体で暖められた。主要な抗体含まれた５ＬＡＣ−２３（５つのμｇ／ｍＬ）、そして、アイソタイプ制御‖（マウス抗トリニトロフェノール、免疫グロブリンＭ、Ｋ；Ｇ１５５−２２８のクローンをつくりなさい；ネコ。Ｎｏ．５５３４７２；ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；オックスフォード、オックスフォード大学の、英国の；５μｇ／ｍＬ）。膜がＴＢＳＴで３回洗われた、膜は接合される西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で暖められたヤギ抗マウス免疫グロブリンＭ、μ鎖特異抗体（１／５０００−１０，００００；Ｃａｔ．Ｎｏ。１１５−０３５−０７５；ジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ（ＰＡ，ＵＳＡ））Ｉｈ．のために５回膜を洗った後に、ＨＲＰは腸クロム親和性細胞様西洋のＢｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム）を使用しているのを見つけられた。図６は、５ＬＡＣ−２３で暖められるＯＶＣＡＲ−３細胞質の分数から得られるウエスタンブロットを示す。アイソタイプ対照（図６ａ）と暖められる汚点と比較して、一つの異なった点は、５ＬＡＣ−２３（図６ｂ）で探索される汚点で見られることができる。ユニークな発疹は矢で示されて、分子量で酸性のπを３６ＩｃＤタンパク質マーカーと類似しているようにする。二次元電気泳動法は、より広い通りを使用して繰り返された（１８ｃｍ；アマシャム）、それを確認するために、５ＬＡＣ−２３は酸性タンパク質と結合した。そして、タンパク質点の分離を改善して、以降の質量分析分析のために十分なタンパク質を得ることが可能だった。再水和とＩＥＦは、プログラムさ���た設定によって実施された：３０Ｖ  １４時間；２００Ｖ  ３０分；５００Ｖ  ３０分；勾配の１０００ＶのＩｈ；勾配の６５００Ｖ  ３時間；８０００Ｖ。完全Ｖｈは、５４，０００−６０，０００であった。ＩＥＦ分離の後で、細片は１５分の間２．５％のヨードアセタミドでＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡バッファで平衡化された。細片は１２％のゲルの表面に配置されて、０．５％のアガロースで封着された、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは６０Ｖで終夜実行された。ゲル類のうちの１つは、ＰｌｕｓＯｎｅ  Ｓｌｉｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇキットを使用しているタンパク質のために染色された（ネコ。第１７−１１５０−０１；アマシャム）ＭＳ分析と互換性を持つようにという製造業者の指示に従うこと。他のゲル類は、先に述べたようにＰＶＤＦ膜上へタンパク質の転送の準備ができていた。膜は、先に述べたように５ＬＡＣ−２３とアイソタイプ対照と探索された。転送の後で、ゲル類はタンパク質点の配列で援助するために、先に述べたようにタンパク質のためにも染色された。５ＬＡＣ−２３が結合するＯＶＣＡＲ−３細胞質の分数からのタンパク質点は、図７で明らかに見られることができる。図中図７ａは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質の分数の銀の染色されたゲルである。図７ｂは、一つの異なった点も３６ｋＤタンパク質マーカーと類似の分子量で５ＬＡＣ−２３（図７ｃ）で探索される汚点で明瞭な間、アイソタイプ制御が少しのタンパク質点もと結合しなかったことを明らかにする。点がアイソタイプ対照（図７ｂ）と発見されていなかったので、５ＬＡＣ−２３の結合ははっきりしていた。この実験は、５ＬＡＣ−２３時までに結合される抗原性部位が約３６のＫＤ（酸性のπを有する）であることを確認した。
【００３３】
実施例５
質量分析法による結合タンパク質の同定
５ＬＡＣ−２３によって認識される３７ないし４０ｋＤタンパク質スポットに対応するゲル領域を無菌のピペットで切り出した。ゲル・プラグが、それから質量分光によってタンパク質の識別のために使われた。試料は、ａＭＷＧＲｏｂｏｓｅｑ  ４２０４ロボット（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用しているトリプシンで、ｉｎ−ｇｅｌ消化に従属した。ペプチドは、１％のｆｏπｎｉｃ酸と２％のアセトニトリルでゲル・プラグから自由にされた。一部の結果として生じるダイジェスト上清は、ペプチド分離のために８桁、７５ｍｍの塩素を使用しているＭｉｃｒｏＭａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｇｌｏｂａｌの上で分析された。データは、ＭＡＳＣＯＴを使用して検索された。５ＬＡＣ−２３時までに認められたゲルの領域でＭＳ分析によって特定されるタンパク質は、表４に示される。質量分光によって確認される５ＬＡＣ−２３のための抗原は、ラミニン受容体１であった。  
【００３４】
【表４】
2007530460.tif 000006
【００３５】
実施例６
５ＬＡＣ−２３のための抗原の確認  
【００３６】
１．  共局在化検査による確認  
推定上の抗原の確認は決定することによって援助されたどうか、抗体がそうすることができた既知の抗３７ＬＲＰは５ＬＡＣ−２３による共局在化である。ＯＶＣＡＲ−３細胞からの細胞質の分数のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されて、ニトロセルロース膜上へ拭かれた。ウエスタンブロット法は、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、先に述べたように実行された。主要な抗体は５ＬＡＣ−２３（５つのμｇ／ｍＬ）を含んだ、免疫グロブリンＭアイソタイプは制御する（先に述べたように；５μｇ／ｍＬ）、Ｈ−抗３７ＬＲＰ抗体１５０（０．２のμｇ／ｍＬ；ネコ。Ｎｏ．ｓｃ−２０９７９；サンタクルスＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；サンタクルス、ＣＡ、アメリカ合衆国；この抗体は、ヒト３７ＬＲＰのＡＡ  １１０−２５０に対応している組換え型のタンパク質に対して起毛していた）、Ｆ−抗３７ＬＲＰ抗体１８（０．４のμｇ／ｍＬ；ネコ。第ｓｃ−２１５３４；サンタクルス）、そして、正常なウサギ免疫グロブリンＧ‖（０．２のμｇ／ｍＬ；ネコ。Ｎｏ．ＡＢ−１０５Ｃ；研究開発Ｓｙｓｔｅｍｓ；アビンドン、オックスフォード大学の、英国の）。二次抗体は、上述のＨＲＰ抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンＭを含んだ（１／５０００−１０，０００；ジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）免疫グロブリンＭの検出のために、ＨＲＰ抱合型の抗ウサギの免疫グロブリン（１／２０００；Ｃａｔ．ｎｏ。Ｐ０４４８；ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ、ＣＡ、アメリカ合衆国）、そして、ＨＲＰ抱合型の抗ヤギの免疫グロブリン‖（１／２０００；ネコ。Ｎｏ．Ｐ０４４９）。２つの抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０とＦ−１８）は、近似のＭＷ  ４０ＩｃＤ（図８Ａと８Ｂ）で、ａｂａｎｄと結合する。免疫グロブリンＭ  ｉｓｏｔｙｏｐｅ制御がそうしない間、５ＬＡＣ−２３も類似のサイズ（図４Ｄ）の帯域と結合する。そして、このタンパク質による相互作用ｏｆ５ＬＡＣ−２３がはっきりしていることを確認する。２次元  ＳＤＳ−ＰＡＧＥセクションで記述されるにつれて、ＯＶＣＡＲ−３細胞からの細胞質のタンパク質の更なる２次元の西部劇は準備されたが、ＩＥＦはｐＨ範囲を制限するために３．５−５でπでｐｈａｒｍｙｌａｔｅｓを使用して実行された。ブロッティングのために使用される初等・中等抗体は、上で記載される。５ＬＡＣ−２３とＨ−１５０をウエスタンブロットに結合することは、図９で示されて、適当なアイソタイプ対照（示されないデータ）と探索される汚点と比較された。５ＬＡＣ−２３時までに認められるタンパク質点は図９Ａで示される。そして、黒い矢で示される。抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０）は、５ＬＡＣ−２３も結合したゲルの付近と一致する黒線（図９Ｂ）で強調されるタンパク質のより幅広い汚れと結合した。Ｈ−１５０によって認められるスミアが少なくとも３つのタンパク質点を含んで、タンパク質の異なるアイソフォームがＯＶＣＡＲ−３細胞から細胞質の分数で存在することを示す可能性があることは、ありそうである。汚点の上で見つけられる他のタンパク質は、抗体または二次抗体のアイソタイプによる相互作用によって、どちらの５ＬＡＣ−２３もＨ−１５０にも特有でない。抗３７ＬＲＰ抗体と５ＬＡＣ���２３は、３７ＬＲＰが実際５ＬＡＣ−２３のための抗原であるという約４ＯｋＤ  ｐｒｏｖｉｄｎｇ更なる証拠のタンパク質と結合した。しかしながら、分子量が同程度だったにもかかわらず、５ＬＡＣ−２３は他の抗３７ＬＲＰ抗体と比較してユニークな製本見本を示した。より制限された結合を示している５ＬＡＣ−２３で、これは２つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。  
【００３７】
２．  トランスフェクション試験による確認  
推定上の抗原の確認は、５ＬＡＣ−２３が相補的ＤＮＡクローンｏｆ３７ＬＲＰで形質移入された細胞と結合することができたかどうか決定することによって実行された。３７ＬＲＰコードしている相補ＤＮＡのクローンは、ｐｌａｓｍｉｄｐＣＭＶ６−ＸＬ５で得られた（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰとしてを参照した；部材ＴＣ１０７９３８番；寄託番号：ＮＭ−００２２９５；ＯＲＩＧＥＮＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ロックビル、ＭＡ、アメリカ合衆国）。中国のＨａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞は、６穴のプレートの６０−７０％の集密的であるために大きくなった（Ｆ１２ハムＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ；１０％のＦＢＳ；２ｍＭのＧｌｕｔａｍｉｎｅ）。細胞は、製造業者のプロトコルに従ってＦｕｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用しているｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰで形質移入された（ネコ。Ｎｏ．１９８８３８７；ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ルイス、イースト・サセックス、英国）。細胞は、免疫染色の前に少なくとも４８時間大きくなった。細胞はＰＢＳで二回洗われて、それから氷冷アセトンを据えられた：３分の間のメタノール（１：１）。アセトン：メタノールは除去された、そして、細胞は風乾された。それはＰＢＳで３回洗われて、それから３０分の間ＰＢＳで２％のＦＢＳで遮断された。主要な抗体は加えられた、そして、細胞は室温で１時間孵化した。主要な抗体は５ＬＡＣ−２３（５μｇ／ｍｌ）を含んだ、免疫グロブリンＭアイソタイプは制御する（先に述べたように；５μｇ／ｍＬ），ｔｈｅ抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０；０．２のμｇ／ｍＬ；サンタクルスＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ−６７ＬＲ抗体‖（ＭＬｕＣ５；ネコ。ａｂ３０９９番；４つのμｇ／ｍＬ；制限される真横、ケンブリッジ、Ｃａｍｂｓ、英国）、そして、正常なウサギ免疫グロブリンＧ‖（０．２のμｇ／ｍＬ；ネコ。Ｎｏ．ＡＢ−１０５−Ｃ；研究開発Ｓｙｓｔｅｍｓ；アビンドン、オックスフォード大学の、英国の）。細胞が洗われた３回ｗｉｔｈＰＢＳ（二次抗体）であった、（ＨＲＰ−は、ヤギ抗マウス免疫グロブリンＭ（１／１０００）をｃｏｎｊｕａｇｔｅｄした；ジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、加えられて、１時間孵化した。二次抗体は、上述のＨＲＰ抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンＭを含んだ（１／１０００；ジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、免疫グロブリンＭの検出とＨＲＰ−のために、抗ウサギの免疫グロブリンは接合した（１／２００；ＤＡＫＯ）。ＨＲＰがＤＡＢ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキットを使用しているのを見つけられる前に、細胞は３回洗われた（ネコ。第ＳＫ−４１００；ベクター研究室；ピーターバラ（Ｃａｍｂｓ．，ＵＫ））製造業者の指示に対する従って。免疫染色するＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ）の量として５ＬＡＣ−２３増加でけがされる陽性の（茶色の）細胞の数が増加する（図１０）ことを明らかにする。アイソタイプ制御はＣＨＯ細胞をいくらかの背景染色でけがした、しかし、これはトランスフェクション処置（図１０、Ｔｏｐ列）に含まれたＤＮＡの量を問わず類似している。そして、一過性に形質移入された細胞に対する５ＬＡＣ−２３���結合がはっきりしていることを示した。これらの結果は、５ＬＡＣ−２３のための結合タンパク質が３７ｋｄのＬＲＰであることを確認する。やあ、５ＬＡＣ−２３によるトランスフェクション細胞染色への追加、と、また、２つの他の抗体で染色される若干の細胞が３７ＬＲＰと６７ＬＲ（図１１）に対して指令した。３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０が細胞質（図１つのＩＢ）に局在化させて形質移入された数セル、認めたａｎｔｉ−。異なるパターンでであるけれども、第二抗体ＭＬｕＣ５（それは６７ＬＲを認める）はまた、若干の細胞（図ハイドロコーチゾン）と結合した５ＬＡＣ−２３とＨ−１５０（図１つのアイソレーション増幅器とハイドロコーチゾン）のそれに。他の研究者は、ＭＬｕＣ５が形質移入されたＣＨＯ細胞と結合するのに失敗したことを発見した。これは、実験的な違い（例えば異なるプロモーター、二次抗体またはクローンの使用または染色テクニックにおける変化）による可能性がある。ラミニンとの接触に応じて取付けのためにレセプターの発散を可能にして、ＭＬｕＣ５の染色がリソソームの膜である可能性がある区画に制限される点に注意しなさい。これらの結果は、形質移入されたタンパク質（３７ＬＲＰ）がＣＨＯ細胞でうまく表されることを確認する。これらの結果も、６７ＬＲが３７ＬＲＰポリペプチドに関連があるという、そして、それがＣＨＯ細胞で合成されることができるという証拠を提供する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、５ＬＡＣ−２３が約３７−４５ｋＤ（例４）であるタンパク質と結合するにつれて、６７ｋＤラミニンよりむしろ前駆体分子に対する５ＬＡＣ−２３ひもが受容体たんぱくことを示唆する。トランスフェクション細胞の免疫染色パターンが５ＬＡＣ−２３の位置が主に細胞質で、ＭｌｕＣ５結合によりＨ−１５０結合と類似していることを示すことを明らかにしているこの実験からの結果‖全体としてやあ、この証拠の合計は、５ＬＡＣ−２３のための抗原が６７ＬＲよりむしろ３７ＬＲＰ前駆体分子であることを示唆する。  
【００３８】
２．  ３７ＬＲＰの細菌表示による確認  
更に５ＬＡＣ−２３の推定上の抗原を評価するために、３７ＬＲＰ相補ＤＮＡは、細胞フリーな生体外翻訳系で、タンパク質の生合成のために、発現ベクターにクローンをつくられた。プラスミドｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ（上記を記載した；ＯＲＩＧＥＮＥは）プライマー５’−ＧＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣ−３による３７ＬＲＰ相補ＤＮＡの増幅のテンプレートとして使用した』（合成Ｎｄｅ  Ｉ部位を含む）、そして、５−ＣＣＴＡＴＧＣ  ＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＧＡＣＣＡＧ−３』（ａｓｔｏｐコドンと合成Ｓｍａｌ部位を含む）。ＰＣＲ増幅は、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（戦略）を使用して実行された。ＤＮＡテンプレートの後に９４０Ｃで５分の間変性させられて、３０サイクル（９４０Ｃ、６００Ｃの４５分、７２０Ｃの１分の４５分）が続いて、７２０Ｃで１０分の間広げられた。３７ＬＲＰ  ＰＣＲ製品はいずれのｐＩＶＥＸ２．３ｄもとｐＩＶＥＸ２．４ｄにクローンをつくられた（ネコ。ｎｏ．  ０３  ２６９  ０１９  ００１；ロシュ）Ｎｄｅ  ＩとＳｍａ  Ｉ部位を使用すること。発生したプラスミドは、ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（Ｈｉｓ６−タグのない３７ＬＲＰ）ａｎｄｐｒＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｉＳ６（Ｎ末端の終わりのＨｉｓ６−タグによる３７ＬＲＰ）を含む。３７ＬＲＰタンパク質の表示は、バクテリアで細胞フリーな生体外翻訳系を使用して実行された（ＲＴＳ  １００大腸菌ＨＹキット；ネコｎｏ．  ３１８６  １４８；ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ルイス、英国）製造業者の指示に従うこと。反応混合物のアリコートは、１０％のゲル類に積まれて、ニトロセルロースへ移された。膜は、終夜４０ＣのＴＢＳＴの５％の脱脂乳によるブロック状態のであった。主要な抗体は加えられた、そして、汚点は３時間室温で暖められた。５がＴＢＳＴで洗ったあと、二次抗体は室温で１時間加えられた。主要な抗体は５ＬＡＣ−２３（５つのμｇ／ｍＬ）を含んだ、免疫グロブリンＭアイソタイプは制御する（先に述べたように；５μｇ／ｍＬ），ｔｈｅ抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０；０．２のμｇ／ｍＬ；サンタクルスＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、そして、正常なウサギ免疫グロブリンＧ‖（０．２のμｇ／ｍＬ；研究開発Ｓｙｓｔｅｍｓ）。二次抗体は、上述のＨＲＰ抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンＭを含んだ（１／５０００−１０，０００；ジャクソンＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）免疫グロブリンＭとＨＲＰ抱合型の抗ウサギの免疫グロブリンの検出のために（１／２０００；ＤＡＫＯ）。５回を洗った後に、ＨＲＰ抱合型の抗体は、発見されたｗｉｔｈＥＣＬ西洋のＢｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム）であった。ウエスタンブロット分析で両方の抗３７ＬＲＰ抗体、Ｈ−１５０と５ＬＡＣ−２３が細菌反応混合物だけで合成されるタンパク質と結合することが分かった３７ＬＲＰのテンプレート（ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（３７ＬＲＰ  ａｎｄｐｒＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｉｓ６）は、反応混合物（図１２）に含まれた。ＧＦＰを表している制御プラスミドが反応混合物に含まれたとき、５ＬＡＣ−２３とＨ−１５０は反応混合物と結合しなかった。Ｃ末端のＨｉｓ６−タグに対す��抗体は、ＧＦＰタンパク質が合成される（示されないデータ）ことを確認した。反応混合物は、ｐＩＶＥＸＬＲＰ構造物からの最低２つのタンパク質製品で、おそらくこれらの構造物（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ結合部位の直後に１と１は、クローニングのために使用されるＮｄｅ  Ｉ部位を計上する）の２つの開始コードンのために、またはｐｏｓｔ−に翻訳のｍｏｄｉｆｃｉａｔｉｏｎｓを生成するだろうように見えた。５ＬＡＣ−２３とＨ−１５０が２つの類似のタンパク質帯域を認めるにもかかわらず、結合のパターンは全く明瞭である。５ＬＡＣ−２３は、優先して、可能な翻訳後修飾を提案しているより多くのスミアとして現れる一番上の帯域と結合する。Ｈ−１５０は異なった帯域と結合する（各々の帯域がダブレットである点に注意しなさい；写真の中で見える）。トップ３７ＬＲＰ  ｂａｎｄｂｙ  ｔｈｅＩｇＭアイソタイプ制御に対する若干の結合であるように見える‖（図８；タンパク質のオーバーロードによる非特異的な結合による可能性があるパネルＡ）。更なるこれらの結果は３７ｋＤ  ＬＲＰに５ＬＡＣ−２３の結合を確認して、この抗体の結合がユニークなエピトープにあるという更なる証拠を提供する。そして、既知の抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０の結合とは別である。ロシュからＲＴＳシステムを使用して、多数の翻訳後修飾は、３７ＬＲＰ製品の生合成から除外されることができる。これらはＮ−を含む、そして、Ｏにリンクされた糖化、リン酸化反応とジスルフィドは形成を結合する。他の分子がポリペプチド（例えば脂質と硫酸化された群）に加えられる可能性があって、５ＬＡＣ−２３が結合するエピトープの一部である可能性があるかもしれない。ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ（Ｅｘｐａｓｙ）は３７ＬＲＰ配列が多数のリン酸化部位、２Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｌｙａｔｉｏｎ部位とチロシン硫酸化部位があることをを予想する。Ｅ．ｃｏｌｉがこの変形を収めることができない時から、潜在的ｍｙｒｉｓｔｙｌ群は５ＬＡＣ−２３のエピトープから除外されることができる。リン酸化反応の欠如は５ＬＡＣ−２３がペプチド配列と結合する場合、この配列が正常なヒト細胞でリン酸化される可能性があって、腫瘍細胞で非ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｙｌａｔｅｄされている可能性があるというで興味深い可能性がある。このように、５ＬＡＣ−２３の抗原を露出させる。
【００３９】
実施例７
寒冷保存された正常組織のヒトの抗原分布のＩＨＣ検査  
研究が実行されたＩＨＣは、正常な人体組織で５ＬＡＣ−２３抗原分布を特徴づけるために、組織を凍結保存した。正常な人体組織の寒冷保存されたスライドは、Ｃｏｖａｎｃｅ（英国）から入手可能にされた。それをそれから二回洗浄バッファ（０．０２％のツイーン−２０によるＰＢＳ）で洗われる１０分の間のアセトン中で固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性は、１５分の間のメタノールの中の０．６％の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、ＲＴで２０分の間洗浄バッファで１％のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。それは、２％のＢＳＡのブロック状態のであった（ＳＰ−５０５０；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）更なる２０分の間。内因性ビオチン部位は、製造業者の指示に従ってアビジン／ビオチン遮断キット（ＳＰ−２００１；媒介生物Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用しているブロック状態のであった。５ＬＡＣ−２３、サイトケラチン−８抗（Ｍ０６３１；ダコＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、そして、免疫グロブリンＭ抗眼球運動計アイソタイプ制御‖（５５０３４０；ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、暖められたｗｉｔｈｔｈｅは、ＲＴの６０分の間の２％のＢＳＡ／洗浄バッファの５つのμｇ／ｍＬのスライドであった。スライドは、ヤギの潜伏より前の抗マウスの免疫グロブリンＭが従属的にビオチン標識したという洗われた３つの時であった（Ｂ９２６５；シグマアルドリッチ社社）、１を希釈した：ＲＴの３０分の間の１％のウマ血清／洗浄バッファの１００。スライドは３回洗われて、アビジン−ＨＲＰで孵化した、マウス免疫グロブリンＧベクタステインＡＢＣキットによってメイクアップする（ＰＫ−６１０２；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）ＲＴの３０分の間：３回を洗った後に、スライドは製造業者によるとＤＡＢを使用して開発される色であった』ｓ指導（ＳＫ−４１００；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。水洗浄の後でスライドが脱水の前に水のおびただしい量で洗われるハリスのｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｔｈｅｎで対比染色剤で着色されて、ＤＰＸ封入剤でマウントしたこと（Ｍ／Ｄｌ  １０／０８；フィッシャーＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。寒冷保存された正常組織の上で、５ＬＡＣ−２３は、弱く、通常の脳と尿細管と試験される（表５）他の組織のいずれもと結合しない。  
【００４０】
【表５】
2007530460.tif 000007
【００４１】
これらの結果は、５ＬＡＣ−２３のための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体がヒトの限定された数の組織だけと結合することを示唆した。
【００４２】
実施例８
ヒトの正常なおよび腫瘍ＩＨＣ  
人体組織結合結果は、それから、ホルマリン固定人体組織のより広いパネルで結合を調べることによって延長された。ホルマリン固定パラフィン包埋通常の器官と腫瘍は、スライドを配列する（Ｂ  Ａ３；アクセス方式サービスＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ｄｅ−はアルコールを通してワックスを塗られた。スライドは、洗浄バッファ（０．０２％のツイーン−２０によるＰＢＳ）に、短時間に浸漬された。抗原検索は、低ｐＨ目標検索溶液で、２０分の間全速力でミクロ・ウィービングによって実行された（Ｓ１６９９；ダコＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。内因性過酸化物活性は、１５分の間のメタノールの中の０．６％の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、ＲＴで２０分の間洗浄バッファで１％のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。内因性ビオチン部位は、アビジン／ビオチン遮断キットを使用しているブロック状態のであった（ＳＰ−２００１；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）製造業者の指示に対する従って。５ＬＡＣ−２３て、そして、免疫グロブリンＭ  ａｎｔｉ−、眼球運動計アイソタイプは、制御する（５５０３４０；ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＲＴで９０分の間１％のウマ血清洗浄バッファで、０．７５のμｇ／ｍＬでスライドで暖められた。スライドは、従属的でビオチン標識されるヤギ抗マウス免疫グロブリンＭで、潜伏の前に二回洗われた（Ｂ９２６５；シグマアルドリッチ社社）、１を希釈した：ＲＴの３０分の間の１％のウマ血清／洗浄バッファの１００。二回洗った後に、スライドがアビジン−ＨＲＰで暖められたこと、マウス免疫グロブリンＧベクタステインＡＢＣキットによってメイクアップする（ＰＫ−６１０２；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）ＲＴの３０分の間。スライドは、二回洗われた、そして、色はキットによってＤＡＢを使用することを開発した‖（ＳＫ−４１００；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。水洗浄の後で、スライドはそれからＤＰＸ封入剤で脱水とマウンティングの前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色された（ＭｆＤｌ  １０／０８；フィッシャーＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。表６は、組織がパラフィン埋め込まれているとき、５ＬＡＣ−２３が弱く骨格筋、正常肝と通常の胃と結合することを証明する。前の例の場合のように、５ＬＡＣ−２３結合は、正常組織で制限される。５ＬＡＣ−２３は、肝細胞癌（ＨＣＣ）に最も強く、そして、弱く、胃腺癌と結合する。それは、試験される他の正常なまたは腫瘍組織のいずれかと結合しない。これらのＩＨＣ検査で、結合の明確な差が正常肝と大部分の他の正常組織と比較してＨＣＣにあることが分かった。  
【００４３】
【表６】
2007530460.tif 000008
【００４４】
通常の胃（カラムＡ）、正常肝（カラムＢ）と肝腫瘍（カラムＣ）のうちの５ＬＡＣ−２３による染色の例は、図１３で見られることができる。そこで、アイソタイプで組織のいずれかと結合しているｉｓｎｏは、５ＬＡＣ−２３の結合がはっきりしている示度を制御する。５ＬＡＣ−２３は細胞の細胞質と主に結合した、しかし、若干の膜状の局在化は観察された。５ＬＡＣ−２３は非常に弱く正常肝と通常の胃と結合するが、強く悪質な肝臓と結合する。
【００４５】
実施例９
ヒト肝腫瘍部に対する５ＬＡＣ−２３の結合  
ＩＨＣ検査は、ヒト肝臓癌で５ＬＡＣ−２３抗原の癌関連を決定するために行われた。ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓配列は、滑動する（ＣＳｌ；アクセス方式サービスＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、アルコールを通して非ワックスを塗った。スライドは、洗浄バッファ（０．０２％のツイーン−２０によるＰＢＳ）に、短時間に浸漬された。抗原検索は、低ｐＨ目標検索溶液で、２０分の間全速力でミクロ・ウィービングによって実行された（Ｓ１６９９；ダコＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。内因性過酸化物活性は、１５分の間のメタノールの中の０．６％の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、ＲＴで２０分の間洗浄バッファで１％のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。内因性ビオチン部位は、アビジン／ビオチン遮断キットを使用しているブロック状態のであった（ＳＰ−２００１；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）製造業者の指示に対する従って。５ＬＡＣ−２３と免疫グロブリンＭ抗眼球運動計アイソタイプは、制御する（５５０３４０；ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＲＴで９０分の間１％のウマ血清洗浄バッファで、０．７５のμｇ／ｍＬでスライドで暖められた。スライドは、従属的でビオチン標識されるヤギ抗マウス免疫グロブリンＭで、潜伏の前に二回洗われた（Ｂ  ９２６５；Ｓｉｇｍａ−オールドリッチ社社）ＲＴで３０分の間１％のウマ血清／洗浄バッファで、１：１００に希釈される。二回洗った後に、スライドがアビジン−ＨＲＰで暖められたこと、マウス免疫グロブリンＧベクタステインＡＢＣキットによってメイクアップする（ＰＫ−６１０２；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）ＲＴの３０分の間。スライドは、二回洗われた、そして、色はキットによってＤＡＢを使用することを開発した‖（ＳＫ−４１００；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。水洗浄の後で、スライドはそれからＤＰＸ封入剤で脱水とマウンティングの前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色された（Ｍ／Ｄｌ１０／０８；フィッシャーＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。１、２試料でほんの少数の細胞だけが染色されたにもかかわらず、５ＬＡＣ−２３は、ＨＣＣ組織配列スライド（表７を見る）の上で、７３％のＨＣＣ断面と結合した。染色は、主に細胞質だった。これらの結果は、５−ＬＡＣ−２３抗原が他の組織タイプと比較して肝臓癌でとても表されるだけではない、しかし、それが異なる患者から大部分のヒト肝臓癌で表されることを示す。  
【００４６】
【表７】
2007530460.tif 000009
【００４７】
実施例１０
マッチされた正常なおよび肝腫瘍染色
マッチされた近隣の通常で始原ヒト肝細胞癌肝臓組織のスライドを凍結保存した（Ｔ６２３５１４９；アクセス方式サービスＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、除氷されて、風乾された。それをそれから二回洗浄バッファ（０．０２％のツイーン−２０によるＰＢＳ）で洗われるｌＯｍｉｎｓのためのアセトン中で固定した。内因性過酸化物活性は、１５分の間のメタノールの中の０．６％の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、ＲＴで２０分の間洗浄バッファで１％のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。それは、２％のＢＳＡのブロック状態のであった（ＳＰ−５０５０；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）更なる２０分の間。内因性ビオチン部位は、製造業者『ｓ指導によってアビジン／ビオチン遮断キット（ＳＰ−２００１；媒介生物Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用しているブロック状態のであった。５ＬＡＣ−２３、サイトケラチン−８抗（Ｍ０６３１；ダコＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、そして、免疫グロブリンＭ抗眼球運動計アイソタイプ制御（５５０３４０；ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＲＴで６０分の間２％のＢＳＡ／洗浄バッファで、５つのμｇ／ｍＬでスライドで暖められた。スライドは、ヤギの潜伏より前の抗マウスの免疫グロブリンＭが従属的にビオチン標識したという洗われた３つの時であった（Ｂ９２６５；Ｓｉｇｍａ−オールドリッチ社社）、１を希釈した：ＲＴの３０分の間の１％のウマ血清／洗浄バッファの１００。スライドは３回洗われて、アビジン−ＨＲＰで暖められた。そして、ＲＴで３０分の間マウス免疫グロブリンＧベクタステインＡＢＣキット（ＰＫ−６１０２；媒介生物Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）によって占められた。３回を洗った後に、スライドは製造業者の指示に従ってＤＡＢを使用して開発される色であった（ＳＫ−４１００；ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。水洗浄の後でスライドがそれから脱水の前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色されて、ＤＰＸ封入剤でマウントしたこと（ＭＴＤ１１０／０８；フィッシャーＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。図１４は、同じ個人からマッチされた正常なおよび腫瘍組織の寒冷保存された肝臓断片を示す。サイトケラチン８（パネルＣ）が通常の肝細胞と結合に局在化させる注は正常組織に制限される。そして、断面の一部が通常でガン組織の混合物であることを示す。５ＬＡＣ−２３は腫瘍試料と結合して、悪質な組織をこの断片において代表する中心領域に特有なだけである。アイソタイプ対照でけがされるとき、断面は負である。そして、５ＬＡＣ−２３の結合がはっきりしていることを示す。染色パターンは、５ＬＡＣ−２３から、患者試料で、抗体がそれによってそれを魅力的なｄｒｕｇｇａｂｌｅな目標としている悪性細胞に非常に特有だったことを示した。
【００４８】
実施例１１
変えられた増殖条件による正常細胞の結合の誘導  
実験は、５ＬＡＣ−２３発現が選択された状況の下で正常細胞で誘発されることができたかどうか調査するために行われた。Ｂｅａｓ−２Ｂ『通常の』肺上皮細胞は、コーティングしてないフラスコの上で大きくなって、ｖｉｔｒｏｇｅｎでおおわれていた（０．０３ｍｇ／ｍｌ  ｖｉｆｒｏｇｅｌ；結合Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。細胞は、気管支の上皮細胞増殖培養液で大きくなった（ＣＣ−３１７０；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）３７０Ｃの９５％の空気／５％のＣＯ２の加湿された空気で。約８０％融合性のとき、細胞は細胞解離溶液（ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ．番号Ｃ５９１４）で取り出されて、二回ｉｎＰＢＳを洗って、１０％のホルマリンｆｏｒ３０分で固定した。細胞ペレットは固形パラフィンの懸濁させたである前にアルコールで脱水されて、６０分の間４５０Ｃで暖められた。固形パラフィンは冷却していて、固まっている４５°Ｃ．  Ａｆｔｅｒで６０分の潜伏で３回よみがえった、３μｍ部はライカ磁気レイノルズ数の上で２１３５のミクロトームを切られて、ガラス・スライド上へ焼かれた。断面は、上述のマッチされた肝臓試料に関しては、５μｇ／ｍＬ  ５ＬＡＣ−２３または免疫グロブリンＭアイソタイプ対照でけがされた。細胞がＶｉｔｒｏｇｅｎ（図１５）で大きくなる場合にだけ、通常の肺上皮細胞系列Ｂｅａｓ−２Ｂに対する５ＬＡＣ−２３の結合は見られることができる。免疫グロブリンＭアイソタイプ制御の結合は、５ＬＡＣ−２３の結合がはっきりしていたことを示しているのを見られることができない。正常細胞でさえ、これらの結果は、特定の状況では、例えば成長因子、接着分子と細胞外基質分子の面前で、５ＬＡＣ−２３の抗原の表現度が誘発されることができることを意味する可能性がある。これらの増殖条件の異常は、しばしば悪質で前悪性の国で生じて、３７ＬＲＰ（肝細胞癌で観察されるそれのような）の発現変化に関与する可能性がある。
【００４９】
実施例１２
ウエスタン分析によるさまざまなヒト細胞系の５ＬＡＣ−２３の配布  
ヒト細胞系の調査は、３７ＬＲＰの配布と５ＬＡＣ−２３のエピトープを評価するために、ウエスタン分析によって実行された。細胞可溶化物はプロテアーゼ阻害薬でＲＩＰＡバッファで多数のヒト腫瘍または形質転換細胞系から準備された、そして、１−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ    ＳＤＳ−ＰＡＧＥセクションで記述されるにつれて、ウエスタンブロットは準備された。溶解産物は、胸部細胞系ＨＢ４ａＲ４．ａ（ラジウムで変わる正常な乳房細胞）、ＨＭＴ  ３５２２（正常細胞）、ＭＣＦ−７（腫瘍細胞）、最低降下高度−ＭＢ−２３１（腫瘍細胞）から作られた；ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（乳房腫瘍による脳転移）；卵巣腫瘍細胞系ＯＶＣＡＲ−３；肝細胞は、チャンのＬｉｖｅｒとＨｅｐＧ２に沿って並ぶ；メラノーマ細胞ラインＡ３７５；そして、大腸腫瘍細胞は、ＤＬＤ−Ｉ、ＬＳ１７４ＴとＳＷ６２０に沿って並ぶ。３７ＬＲＰタンパク質が以前チャイニーズハムスターから記載された時から、野生型ＣＨＯ細胞も含まれた（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ灰白；ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：２９８０８８）．コバルト−局在化セクションで記述されるにつれて、汚点はいずれのＨ−１５０もまたは５ＬＡＣ−２３で探索された。抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０は試験される細胞系の全てでタンパク質帯域を認める。そして、野生型ＣＨＯ細胞（図１６Ａ）を含む。少なくとも２つのタンパク質帯域が異なるヒト・アイソフォームの存在を示しているＨ−１５０で見つけられて大腸細胞系（ＤＬＤ−Ｉ）にある点に注意しなさい。Ｈ−１５０と５ＬＡＣ−２３が西部劇の中で類似の大きさを設定された帯域と結合したにもかかわらず、５ＬＡＣ−２３はＨ−１５０（図１６Ｂ）のそれに異なるパターンで細胞可溶化物と結合した。Ｈ−１５０は細胞系の合計３７ＬＲＰを見つける、５ＬＡＣ−２３のエピトープの表示は異なる細胞可溶化物全体で変化する、そして、中で、一部は存在しない。ＣＨＯ細胞可溶化物に対する両方の抗体の結合が類似しているにつれて、抗体のこの違いはその抗原のためにＨ−１５０と比較してその抗原のために５ＬＡＣ−２３の下部の親和性によらない。５ＬＡＣ−２３は、近似のユニークなスミアを見つける。非還元の条件（図１６Ｂ、レーン１２）のＬＳ１７４Ｔ溶解産物のＨＯｋＤ。このスミアは還元性の状況の下で消える、しかし、増加が３７ＬＲＰ前駆体（示されないデータ）に対応している帯域にない。既知の抗ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０と比較して、これらの結果は、３７ＬＲＰの上で５ＬＡＣ−２３時までに認識されるエピトープがユニークであるという更なる証拠を提示する。５ＬＡＣ−２３は免疫組織化学（トランスフェクション部、例６）によって野生型ＣＨＯ細胞と結合しなかったが、還元性で非還元の状況（図１６）の下で、西部劇によってｗｔ  ＣＨＯ溶解産物と結合する。これは、５ＬＡＣ−２３のエピトープが高次構造的に依存している可能性があるおよび／またはエピトープが自国の状況の下で露出しないか抗体にアクセスできないことを示唆する。全体として、このデータは、５ＬＡＣ−２３の抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも５ＬＡＣ−２３抗体の結合をヒト癌組��に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。全体として、このデータは、５ＬＡＣ−２３抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも５ＬＡＣ−２３の抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。この仕様で言及される全ての特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する‖そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】６ＢＤ−２５、５ＬＡＣ−２３と抗ファス（正の制御）抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
【図１Ｂ】６ＢＤ−２５、５ＬＡＣ−２３と抗ファス（正の制御）抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
【図２】予防ＳＷｌ１１６大腸癌モデルの腫瘍成長に関する６ＢＤ−２５の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図３】予防ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌モデルの体重の６ＢＤ−２５の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図４】６ＢＤ−２５またはバッファ制御による腫瘍を含んだマウス後処理の残存。マウスは、２４０日以上後処理のために生存をモニターされた。
【図５】図５Ａと５Ｂは、全細胞可溶化物（Ｔ）と細胞質の分数（Ｃ）のウエスタンブロットは、アイソタイプ対照（パネルＡ）か５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）で染色されるＯＶＣＡＲ−３  Ｃｅｌｌｓから作った。異なった帯域は５ＬＡＣ−２３で見つけられて、黒い矢で示される。
【図６】図６Ａと６Ｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質のタンパク質のウエスタンブロットは、２次元の電気泳動によって分かれた。パネルＢが５ＬＡＣ−２３で探索される汚点を示す間、パネルＡは免疫グロブリンＭアイソタイプ対照と探索されるブロットを示す。矢は、５ＬＡＣ−２３時までに認められる点に対応する。
【図７】図７Ａ、７Ｂと７Ｃは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質のタンパク質の２次元  ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット。図中パネルＡは、細胞質の分数のシルバー染色されたゲルである。Ｐａｎｅｌ  Ｂがアイソタイプ制御抗体で探索される類似の汚点を示す間、パネルＣは５ＬＡＣ−２３時までに認められるタンパク質の位置を示す。
【図８】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃと８Ｄは、５ＬＡＣ−２３よって認められる点に対応する。ＯＶＣＡＲ−３細胞質の分数のウエスタンブロットは、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０の（Ａ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｆ−１８（Ｂ）、免疫グロブリンＭアイソタイプ制御（Ｃ）と５ＬＡＣ−２３（Ｂ）で深く探った。
【図９】図９Ａと９Ｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞からの細胞質のタンパク質の２−次元ウエスタンブロット。Ｂｌｏｔ  Ａの矢は、５ＬＡＣ−２３が結合する主要発疹を示す。Ｂｌｏｔ  Ｂの線は、抗３７ＬＲＰ（Ｈ−１５０）抗体に特有である点を示す。汚点の上で明かされる他の点は、抗体のアイソタイプでまたは使用される二次抗体で相互作用による。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃと１０Ｄは、５ＬＡＣ−２３（一番下の列）と免疫グロブリンＭアイソタイプ制御（一番上の列）で３７ＬＲＰ（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ）コードしているヒト相補的ＤＮＡクローンを表しているプラスミドで形質移入されたＣＨＯ細胞（１０Ｘ拡大）の免疫染色される。細胞はＦｕｇｅｎｅ試薬（甲欄）単独で形質移入されたか、ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰの量を増加させていた（１マイクログラム：柱Ｂ；２マイクログラム：柱Ｃ；４マイクログラム：柱Ｄ）。細胞が５ＬＡＣ−２３でけがされたとき、陽性細胞（茶色の）の増加性の数はプラスミドの増加性の量で見られることができる。
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、アイソレーション増幅器。３７ＬＲＰコードしているヒト相補的ＤＮＡクローンを表しているプラスミドで形質移入されるＣＨＯ細胞（４０Ｘ）の免疫染色される（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ；２マイクログラム）。細胞は５ＬＡＣ−２３（Ａ）で染色された、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ｂ）と抗６７ＬＲ抗体ＭＬｕＣ５（Ｃ）と陽性細胞は全部で見られることができる免疫染色する。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂと１２Ｃは、ウエスタン分析によってさまざまな抗体によって見つけられるＥ．ｃｏｌｉのヒト３７ＬＲＰの表示。細菌反応混合物に含まれたプラスミドは、Ｃ末端のＨｉｓβ−タグ（レーン１）で、Ｃｏｎｔｒｏｌ媒介生物ＧＦＰを含んだ、ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（３７ＬＲＰ；レーン２）ａｎｄｐｒＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｊＳ６（ａＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌＨｉｓ６−タグによる３７ＬＲＰ；レーン３）。汚点は、免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（パネルＡ）、５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）と抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（パネルＣ）で探索された。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂと１３Ｃは、５ＬＡＣ−２３（一番下の列）と免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（一番上の列）と一緒のパラフィン包埋組織の染色。断面は、通常の胃（甲欄）、ｎｏπｎａｌ肝臓（柱Ｂ）と肝細胞癌（柱Ｃ）から取り出された。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂと１４Ｃは、マッチされたｎｏπｎａｌ（一番上の列）とマッチされた腫瘍組織（一番下の列）からの寒冷保存された肝臓組織に対するさまざまな抗体の結合。使用される抗体は、免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（甲欄）、５ＬＡＣ−２３（柱Ｂ）と抗サイトケラチン８（柱Ｃ）であった。
【図１５】図１５Ａと１５Ｂは、５ＬＡＣ−２３（）と免疫グロブリンＭアイソタイプ対照（）と一緒の通常の肺上皮細胞系列Ｂｅａｓ−２Ｂのイムノ組織化学染色。細胞は成長される（柱Ｂ）か、外で（甲欄）Ｖｉｔｒｏｇｅｎであった。
【図１６】図１６Ａと１６Ｂ。非還元の条件のウエスタンブロット法によって発見されたものとしての多数の腫瘍と形質転換細胞系の表現ｏｆｔｈｅエピトープ  抗３７ＬＲＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙＨ−１５０の（Ａ）と５ＬＡＣ−２３（Ｂ）。細胞系は、野生型ＣＨＯ細胞（レーン１）とヒト細胞系を含んだ：ＨＢ４ａＲ４．ａ（レーン２）、ＨＭＴ  ３５２２（レーン３）、ＭＣＦ−７（レーン４）、最低降下高度−ＭＢ−２３１（レーン５）；最低降下高度−ＭＢ−３６１（レーン６）、ＯＶＣＡＲ−３（レーン７）、チャンのＬｉｖｅｒ（レーン８）、ＨｅｐＧ２（レーン９）；Ａ３７５（レーン１０）、ＤＬＤ−Ｉ（レーン１１）、ＬＳ１７４Ｔ（レーン１２）とＳＷ６２０（レーン１３）である。 
【図１Ａ】
2007530460.tif 000010
【図１Ｂ】
2007530460.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2007530460.tif 000016
【図７】
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【図８】
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【図９】
2007530460.tif 000019
【図１０】
2007530460.tif 000020
【図１１】
2007530460.tif 000021
【図１２】
2007530460.tif 000022
【図１３】
2007530460.tif 000023
【図１４】
2007530460.tif 000024
【図１５】
2007530460.tif 000025
【図１６】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年6月12日(2007.6.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほ乳動物のヒト腫瘍を処置することによる延命および／または疾患進行遅延の方法であって、前記腫瘍が、寄託番号ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定特性を持つモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現するもので、該方法が前記ほ乳動物に、前記モノクローナル抗体を前記ほ乳動物の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与することを含み、それによって疾患進行の遅延および／または延命がなされる延命および／または疾患進行遅延の方法。
【請求項２】
前記抗体が細胞毒性部位に結合する請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項２の方法。
【請求項４】
前記抗体が補体を活性化させる請求項１の方法。
【請求項５】
前記抗体が抗体依存性細胞毒性をもたらす請求項１の方法。
【請求項６】
前記抗体がマウス抗体である請求項１の方法。
【請求項７】
前記抗体がヒト化抗体である請求項１の方法。
【請求項８】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項１の方法。
【請求項９】
ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である請求項９の抗体。  
【請求項１１】
キメラ化抗体である請求項９の抗体。
【請求項１２】
請求項９の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
請求項１０のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１１のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項９、１０、１１、１２、１３、またはｌ４のいずれかの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択される構成要素と結合し、それによって抗体複合体が形成される、単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託された単離されたクローン。
【請求項１７】
ヒト腫瘍から選択される組織試料で癌細胞の存在を決定する結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること、ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはその抗体複合体を提供すること、前記組織試料に前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体を接触させること、ならびに前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体と前記組織試料との結合を決定することを含み、前記組織試料の前記癌細胞の存在が示される結合アッセイ。
【請求項１８】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣組織および胸部組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項１７の結合アッセイ。  
【請求項１９】
ヒト腫瘍から選択される組織試料の癌細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること；  ＰＴＡ−５６９１としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードされた単離モノクローナル抗体を提供すること；前記組織試料に前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体を接触させること；ならびに前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体と前記組織試料との結合を決定することを含み、それによって、前記癌細胞が前記結合によって単離され、前記組織試料での前記癌細胞の存在が確認される、ヒト腫瘍から選択される組織試料の癌細胞を単離またはスクリーニングするプロセス。
【請求項２０】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣組織および胸部組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項１９のプロセス。
【請求項２１】
寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体。
【請求項２２】
ヒト化抗体である請求項２１の抗体。
【請求項２３】
キメラ化抗体である請求項２１の抗体。
【請求項２４】
請求項２１の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
請求項２２のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
請求項２３のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。  
【請求項２７】
細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択される構成要素と結合した請求項２１，２２，２３，２４，２５または２６のいずれかの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、それによって抗体複合体が形成される、単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託された単離されたクローン。
【請求項２９】
ヒト腫瘍から選択される組織試料で癌細胞の存在を決定する結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはその抗体複合体を提供すること、前記組織試料に前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体を接触させること、ならびに前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体と前記組織試料との結合を決定することを含み、それによって前記組織試料中の前記癌細胞の存在を示す結合アッセイ。
【請求項３０】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
ヒト腫瘍から選択される組織試料の癌細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはその抗体複合体を提供すること、  前記組織試料に前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体を接触させること、ならびに前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体複合体と前記組織試料との結合を決定することを含み、前記癌細胞が前記結合によって単離され、前記組織試料での前記癌細胞の存在が確認されるプロセス。
【請求項３２】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得られる請求項３１のプロセス。
【請求項３３】
組織試料でラミン受容体１前駆体（３７ＬＲＰ）を同定する方法であって、組織試料を提供すること、前記組織試料と、３７ＬＲＰによって発現され、かつ前記単離モノクローナル抗体によって一意的に結合されることで特徴付けられる抗原性部位と結合する、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離モノクローナル抗体またはその抗原性結合フラグメントとを、接触させること、ならびに前記抗原性部位の結合を決定することを含み、それによって３７ＬＲＰが同定される方法。
【請求項３４】
肝細胞癌を患っている患者を診断する方法であって、肝細胞癌を患うと疑われる患者から組織試料を提供すること、前記組織試料と、３７ＬＲＰによって発現され、かつ前記単離モノクローナル抗体によって一意的に結合されることで特徴付けられる抗原性部位と結合する、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離モノクローナル抗体またはその抗原性結合フラグメントとを、接触させること、ならびに前記抗原性部位の結合を決定することを含み、それによって肝細胞癌の診断が確認される方法。
【請求項３５】
３７ＬＲＰを発現する細胞の分化、処置、または画像診断のためのプロセスであって、前記細胞の試料を提供すること、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合部位を提供することを含み、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、発現３７ＬＲＰ抗原結合部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位が、ＡＴＣＣにＰＴＡ−５６９０として寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体によって結合することで特徴付けられ、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、薬物、毒素、酵素、放射性化合物からなる群から選択される少なくとも１つの構成要素と結合し、それによって前記結合部位と前記細胞との結合が前記細胞の分化、処置、または画像診断をもたらす方法。
【請求項３６】
癌疾患に罹っている患者を処置する方法であって、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合部位を提供することであり、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが発現３７ＬＲＰ抗原結合部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６９０として寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体によって結合することで特徴付けられ、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、薬物、毒素、酵素、放射性化合物からなる群から選択される少なくとも１つの構成要素と結合する、前記結合部位を提供すること、ならびに前記結合部位を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３７】
ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する３７ＬＲＰ抗原性部位を発現する細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
細胞試料を提供すること、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することであり、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが前記発現３７ＬＲＰ抗原結合部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６９０として寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体によって結合することで特徴付けられる、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供すること、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料とを接触させること、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を決定することを含み、それによって単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する３７ＬＲＰ抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する結合アッセイ。
【請求項３８】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ化されている請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ化されている請求項３４の方法。
【請求項４２】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている請求項３５の方法。
【請求項４３】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ化されている請求項３５の方法。
【請求項４４】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている請求項３６の方法。
【請求項４５】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ化されている請求項３６の方法。
【請求項４６】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている請求項３７の方法。
【請求項４７】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ化されている請求項３７の方法。
【請求項４８】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと特異的に結合する抗原を発現するほ乳動物のヒト腫瘍を処置することによる延命および／または疾患進行遅延の方法であって、
前記腫瘍が、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと特異的に結合する抗原を発現するもので、該方法が、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを含み、それによって疾患進行の遅延および／または延命がなされる延命および／または疾患進行遅延の方法。
【請求項４９】
ほ乳動物のヒト腫瘍を処置するための薬剤の製造における寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、
前記腫瘍が、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現し、前記モノクローナル抗体が前記ほ乳動物の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与され、それによって疾患進行の遅延および／または延命がなされる、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項５０】
ほ乳動物のヒト腫瘍を処置するための薬剤の製造における寄託番号ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、
前記腫瘍が、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現し、前記モノクローナル抗体が前記ほ乳動物の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与され、それによって疾患進行の遅延および／または延命がなされる、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項５１】
癌疾患に罹っている患者を処置するための薬剤の製造における単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合部位の使用であって、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントをが、発現された３７ＬＲＰ抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部位であり、前記抗原性部位がＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体に結合されることによって特徴付けられ、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、薬物、毒素、酵素、放射性化合物からなる群から選択される少なくとも１つの構成要素と結合している、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合部位の使用。
【請求項５２】
癌疾患に罹っている患者を処置するための薬剤の製造における単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合部位の使用であって、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−５６９１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされたモノクローナル抗体の同定特性を有する抗体に結合されることによって特徴付けられ、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、薬物、毒素、酵素、放射性化合物からなる群から選択される少なくとも１つの構成要素と結合している、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合部位の使用。
【請求項５３】
癌に罹っている一群の被検体から、３７ＬＲＰによって発現される抗原性部位に結合する単離物モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントによる処置の影響を受けやすい被検体を選択する方法であって、
癌に罹っている被検体由来の組織試料を提供すること、寄託番号ＰＴＡ−５６９０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生され、３７ＬＲＰによって発現される抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原性結合フラグメントを、前記組織試料に接触させること、ならびに前記抗原性部位の結合を決定することを含み、それによって前記被検体の選択がなされる方法。
【請求項５４】
３７ＬＲＰによって発現される抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部位で前記被検体を処置することをさらに含む請求項６の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】    明細書
【発明の名称】  癌性疾患修飾抗体
【技術分野】
【０００１】  
この発明は、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および生産と、治療および診断プロセスでのこれらのＣＤＭＢの使用（必要に応じて一種類以上の化学療法剤と組み合わせて使用）とに関する。本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【０００２】  
より詳しくは、この発明はラミニン受容体１前駆体タンパク質３７ＬＲＰと結合する５ＬＡＣ−２３モノクローナル抗体（またはそれから誘導される抗原結合フラグメント）の能力を中心に展開する癌性疾患の診断および処置に関し、より詳しくは、５ＬＡＣ−２３と該５ＬＡＣ−２３によって特異的に認識され、かつ肝細胞癌細胞で一般に過剰発現される特定の抗原性部位に直接結合することに依存する種々の手段による肝細胞癌の診断および処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌を呈する個々の人は固有の存在であり、その人のアイデンティティと同じ程度に、他の癌とは異なる癌にかかっている。これにもかかわらず、現在の療法は同一の方法で同一種類の癌および同一の病期によって、全ての患者を扱う。これらの患者の少なくとも30パーセントは一次治療に失敗し、それにより、さらなる段階の治療がおこなわれ、治療失敗、転移、および最終的には死の可能性が増加に到る。処置のための優れた取り組みは、特定の患者に対する治療のカスタマイズである。カスタマイズ化に役立つ治療は現在のところ、手術である。化学療法および放射線治療は、患者に合わせて調整することができず、また、多くの場合、外科手術そのものでは治癒をもたらすには不十分である。
【０００４】
モノクローナル抗体の出現で、各抗体が一つのエピトープに特異性を示し得ることから、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらにまた、独自に特定の個人の腫瘍を定義するエピトープの立体配座に特異性を示す抗体の組合せを生産することが可能である。
【０００５】
癌性細胞と正常細胞との顕著な違いが形質転換細胞に特有である抗原を癌細胞が含むということを認識することで、モノクローナル抗体がこれらの癌抗原に特異的に結合することによって、形質転換細胞を特異的に標的化するように設計し得ると長い間、科学界では考えられていたことから、癌細胞を駆逐するために「魔法の弾丸」としてモノクローナル抗体を用いることができるという考えが出た。しかし、単一のモノクローナル抗体が癌のすべての例に役立つことができるというわけではないこと、しかも複数のモノクローナル抗体を１つのクラスとして、標的化された癌の処置として投入することができるということが、現在広く認められている。
【０００６】
時を移さずに開示された発明の教示に従って単離されるモノクローナル抗体が、患者に有益な方法で、例えば全身腫瘍組織量を低下させることによって、癌性疾病経過を修正することが示され、本明細書中では癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体と種々に称される。
【０００７】
今のところ、癌患者には通常、処置の選択肢がほとんどない。癌治療に対するアプローチが規格化されたことで、生存率および罹患率の改善が世界的規模でもたらされた。しかし、特定の個人にとって、これらの統計学的改善が個人状況の改善と必ずしも相関するというわけではない。
【０００８】
このように、同じ同齢集団でそれぞれに他の患者の各腫瘍を開業医が治療可能となる方法論が出されるならば、このことはまさしくそのような患者の１人にテーラーメードされた治療を施す固有のアプローチを可能とするだろう。治療のそのような流れは、理想的には、治癒率を増加させて、より良好な結果を生むことで、長年にわたる切実な要求を満たす。
【０００９】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用が、ヒト癌の処置で、ある程度の成功を収めてきた。リンパ腫および白血病の治療はヒト血漿を用いておこなわれたが、遷延性緩解または反応がほとんどなかった。さらにまた、化学療法と比較して再現性および付加的な利益に欠けていた。乳癌、メラノーマ、および腎細胞癌糖の充実性腫瘍に対して、対応して予測不可能で無効な結果を伴うヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清による処置もおこなわれた。
【００１０】
充実性腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床試験が数多くなされた。1980年代には、特異的抗原に対する抗体を使用して、または組織選択性に基づいて、ヒト乳癌に関して少なくとも４回の臨床試験が行われ、少なくとも４７人の患者からたったの１人しか応答者が得られなかった。１９９８年以降になって、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ヘルセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ））をシスプラチン（ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ）と組み合わせて使用して、臨床試験の成功が得られた。本研究では、３７人の患者の約４分の１が部分的な反応率を示し、さらにもう４分の１が軽度または安定な疾患進行を呈するという応答を評価した。複数の応答者間での進行の中央値は、８．５ヶ月であり、中央応答期間は５．３ヶ月であった。
【００１１】
ヘルセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）は、タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）と併用しての第一線での使用が承認された。治験結果は、タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）（３．０ヵ月）単独を受けた群と比較して抗体療法＋タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）（６．９ヵ月）を受けた群では、疾患進行までの時間の中央値の増加を示した。わずかな増加が、生存期間の中央値でもあった。すなわち、ヘルセプチン＋タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）処置した腕とタクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）処置単独の腕とでは、前者が２２ヶ月であるのに対して後者は１８ヵ月であった。加えて、抗体＋タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）の組み合わせ群とタクソール単独の群とを比較すると、完全な応答者（８パーセント対２パーセント）および部分的な応答者（３４パーセント対１５パーセント）の数の増加がみられた。しかし、ヘルセプチンおよびタクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）による処置は、タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）処置単独に比べて、心毒性の発生率がよりいっそう高かった（（それぞれ１３パーセント対１パーセント）。臨床試験では、免疫組織化学で測定されるように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現レベルはヘルセプチン治療に対する反応を予測した。病理学的スコアリング・スコア上で２〜３＋として指定されるＨｅｒ２／ｎｅｕの過剰発現を有するものだけが、抗体療法の恩恵を受けた。転移性乳癌が認められる約２５パーセントの患者は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現させて、ヘルセプチンで治療することがきた。すなわち、過剰発現がないもの、したがって利益が得られないものに対しては、抗体による処置を施さない。しかし、ヘルセプチンおよびタクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）による処置は、タクソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）処置単独に比べて、心毒性の発生率がよりいっそう高かった（（それぞれ１３パーセント対１パーセント）。臨床試験では、免疫組織化学で測定されるように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現レベルはヘルセプチン治療に対する反応を予測した。病理学的スコアリング・スコア上で２〜３＋として指定されるＨｅｒ２／ｎｅｕの過剰発現を有するものだけが、抗体療法の恩恵を受けた。転移性乳癌が認められる約２５パーセントの患者は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現させて、ヘルセプチンで治療することがきた。すなわち、過剰発現がないもの、したがって利益が得られないものに対しては、抗体による処置を施さない。ヘルセプチン治療のための選択は、疾患の分子マーカーの同定に基づいた処置に適した患者を選択する方法を表し、この方法は米国Ｆ．Ｄ．Ａによって診断試験として承認された。しかし、乳癌患者にとって満たされない大きな要求がまだある。ヘルセプチン処置から利益を得ることができる人々さえ、化学療法をまだ必要としていることから、少なくともある程度は、この種の処置の副作用をまだ対処しなければならない。
【００１２】
結腸直腸癌を調べる臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質標的に対する抗体を伴う。腺癌に対して何らかの特異性を持つ抗体（例えば、１７−１Ａ）は、部分的応答を呈する患者がたったの１人である６０人を上回る患者に対して第二相臨床試験を実施した。他の試験では、１７−１Ａの使用は、添加されたシクロホスファミドを使用しているプロトコルで、５２人の患者のうち１人に完全寛解が生じ、２人でやや有効であった。１７−１Ａを伴う他の試験では、類似した結果が得られた。現在まで、１７−ＩＡの臨床試験での相は、病期ＨＩ大腸癌のアジュバント療法として有効性の改善が見られた。最初にイメージングが承認されるヒト化マウス・モノクローナル抗体の使用は、腫瘍退縮を発生しなかった。
【００１３】
最近になってのみ、任意の陽性結果が、モノクローナル抗体を用いた結腸直腸癌の治験から得られた。２００４年に、エルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）はイリノテカン・ベースの化学療法に難治性であるＥＧＦＲ発現している転移性結腸直腸癌患者の二次処置のために承認された。二群第二相臨床試験および一群試験の成績は、イリノテカンと結合するエルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）が各々の疾患進行に対する時間中央値４．１ヶ月および６．５ヵ月とともに各々２３パーセントおよび１５パーセントの反応率を持つことを示した。同じ二群第二相臨床試験と別の一群試験との結果は、エルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）単独による処置が各々の疾患進行に対する時間中央値１．５ヶ月および４．２ヵ月とともに各々１１パーセントおよび９パーセントの反応率を持つことを示した。
【００１４】
したがって、スイスおよび米国ではイリノテカンと併用したエルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）処置、米国ではエルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）単独処置が、イリノテカンによる一次治療が失敗した後の結腸癌患者の二次処置として承認された。したがって、ヘルセプチンと同様に、スイスでの処置は、モノクローナル抗体と化学療法との組合せとして承認されるだけである。加えて、スイスおよび米国での処置は、二次療法として患者のために承認されるだけである。また、2004年に、アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）は転移性結腸直腸癌の一次処置として、静脈内５−フルオロウラシル・ベースの化学療法との併用のために承認された。第三相治験結果は、アバスチン・プラス・５−フルオロウラシルで処置される患者の生存期間の中央値の延長を示すもので、５−フルオロウラシル（それぞれ２０ヵ月対１６ヵ月）単独で治療される患者と比較している。しかし、再びヘルセプチンおよびエルビタックスと同様に、処置はモノクローナル抗体および化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、免疫組織化学プラットフォームに基づく癌診断用にヘルセプチンおよびエルビタックス抗原性標的に基づく米国のＦ．Ｄ．Ａ認可の診断試験がある。
【００１５】
同様に、等しく劣った結果が、肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺、および胃癌に関してあった。一部のある程度の成功がメラノーマに対する抗GD3モノクローナル抗体の使用にあった。このように、ヒト臨床試験の必要条件である小動物研究の成功にもかかわらず、ここまで検査された抗体が大部分、効果がなかったことが分かる。
【００１６】
肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺、胃癌、および肝細胞癌に関しては成績が好ましくない状態が続いている。非小細胞肺癌のために最も有望な最近の結果は、第ＩＩ相臨床試験から得られ、該試験では処置が化学療法剤タクソテレ（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）を併用するとともに細胞殺害剤ドクソルビシンと複合体を形成したモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；  ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗−Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）を含んだ。タクソテレ（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）は、肺癌の二次処置のための唯一のＦＤＡ認可の化学療法である。最初のデータは、タクソテレ単独と比較して改善された総生存率を示す。研究に採用した患者６２人のうち、３分の２がタクソテレと併用してＳＧＮ−１５を受け、残りの３分の１がタクソテレ単独を受けた。タクソテレ併用でＳＧＮ−１５を受けた患者に関して、総生存率の中央値はタクソテレ単独を受けた患者で５．９ヶ月であったのに対して、７．３ヶ月であった。１年および１８ヵ月の総生存率は、タクソテレ単独を受けている患者では各々２４および８パーセントであったのに対して、ＳＧＮ−１５とタクソテレとを受けた患者では各々２９および１８パーセントであった。この薬物に関して、さらなる臨床試験を計画する。
【００１７】
ＳＧＮ−１５が市販の承認を得られなかったにもかかわらず、癌に対する他のいくつかの抗体複合体が２０００年以降米食品医薬局（Ｕ．Ｓ．  Ｆ．Ｄ．Ａ．）の承認を得た。これらの例として、再発された急性骨髄性白血病処置のためのミロタルグ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ）（ゲムツズマブ・オゾガミシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ヒト化抗ＣＤ３３  ＭＡｂ）、非ホジキンリンパ腫処置のためのゼバリン（ＺＥＶＡＬＩＮ）（イブリツモマブ・チウクセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イットリウム抱合型リタクシマブ（ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ）、ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂ）、および再発性非ホジキンリンパ腫処置のためのベクサール（ＢＥＸＸＡＲ）（I−１３１抱合型トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）抗ＣＤ２０  ＭＡｂ）が挙げられる。これらの抗体は、癌に特有の分子に対して開発され、該分子を毒素または放射性同位元素に対する結合にふさわしいものとした。造血性疾患の治療が複合抗体で現在成功裏になされること、また充実性腫瘍（例えば肝細胞癌）がそのような治療をいまだに必要としていることは、明白である。
【００１８】
腫瘍浸潤および転移は、癌細胞および宿主細胞外マトリックスを含む一連のプロセスによって特徴づけられる。基底膜は、該基底膜上に載る細胞をまとめる重要な役割を果たす分化した細胞外構造である。腫瘍細胞の転移は、細胞外基質（ECM）の構成要素と細胞との相互作用を伴う。ラミニンは、細胞付着、増殖、成長、分化、および移動を促進する基底膜の主成分である（Kleinman HK et al. J Cell
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Hail DE et al. J Cell Biol 1990, 110:2175- 2184）。６７ＬＲの発現が、正常組織と比較して、乳癌、大腸癌、および胃癌等の癌で増加することが示された（Cioce
V et al. J Natl Cancer Inst 1991, 83:29-36. Castronovo V et al. Am J Pathol
1990, 137:1373-1381. D'Errico A et al. Mod Pathol 1991, 4:239-246）。
【００１９】
６７ｋＤラミニン受容体（６７ＬＲ、表１）は、マウス・メラノーマ細胞膜（Rao et al, 1983. Biochem
Biophys Res. Commun. 111:804-808）、線維肉腫細胞（Malinoff & Wicha, 1983. J Cell
Biol 96: 1475-1479）、および牛筋細胞（Lesot et al, 1983. EMBO J 2: 861）から最初に単離された。それ以来、それは多くの種で検出されており、広範囲のヒト組織に存在する（概要についは、Barsoum
Rohrer and Coggin 2000. Cell MoI Biol Lett. 5: 207-230; Menard et al, 1998 J.
Cell. Biochem. 67:155-165; Mecham 1991 Annu Rev Cell Biol 7:71-91を参照せよ）。
【００２０】
【表１】  
2007530460.tif 000027
【００２１】
６７ＬＲのヒト相補ＤＮＡは、本来、悪性結腸癌から単離されたもので（それゆえに、タンパク質は結腸癌ラミニン結合タンパク質としても知られている;Yow et al, 1988. 85: 6394-6398）、当初の予想よりも小さい。相補ＤＮＡ予測シーケンスは、算出質量３２ｋＤの２９５アミノ酸タンパク質をコードする。しかし、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で３７ないし４４ｋＤで移動し、このことは酸性タンパク質電気泳動移動度の減少によると思われる（計算ｐＩ４．８３）。小数（１６）の疎水性アミノ酸は、細胞膜に広がるＮ末端基に向けて存在する（Castronovo,
Taraboletti & Sobel, 1991. J. Biol. Chem. 266: 20440-20446）。３７ｋＤタンパク質および６７ｋＤタンパク質は、抗原的に関連があることが示され（Rao
et al, 1989; Biochemistry 28: 7476-7486）、その一方で、メラノーマ細胞に対しておこなわれるパルス‐チェイス実験では発生した３７ｋＤタンパク質が６７ｋＤ産物内に見出された（Castronovo
et al, 1991. Biochem. Biophys.Res. Commun. 177:177-183）。これらの結果は、２つのタンパク質のあいだに直接的な前駆体生成関係があることを示唆した。したがって、３７ｋＤタンパク質は３７ｋＤラミニン受容体前駆体と呼ばれる（３７ＬＲＰ；表１）。パルス‐チェイス実験では、前駆体と最終的６７ＬＲとのあいだに任意の中間形の存在は明らかにならなかったが、５ＯｋＤ分解生成物が検出された（Castronovo
et al, 1991）。３７ｋＤポリペプチドは細胞質および膜での多機能的役割を有するものであってもく、また６７ＬＲのリガンド結合成分であってもよい（Elias
Campo et al. Am J pathol 1992, 141 : No.5 1073-1083）。癌細胞では、６７ｋＤタンパク質に対する抗体が細胞表面と細胞質とに結合することが示された（Wever
UM et al. Cancer Res 1987, 47:5691-5698）。
【００２２】
どのようにして最終的な受容体は細胞によって形成され、６７ｋＤ受容体が達成されるかは完全には理解されていないが、脂肪酸パルミチン酸塩、オレイン酸剤、およびステアリン酸塩によるアシル化を伴うものであってもよい。広範囲な糖化は、複雑にならない。予測された相補ＤＮＡ配列はＮ結合グリコシル化のコンセンサス配列部位を含まず、セリン残基およびトレオニン残基が存在するにもかかわらず、Ｏ結合グリコシル基の証拠はない(Castronovo et al, 1991.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 177:177-183; Landowski, Dratz,& Starkey,
1995. 34: 11276-87)。しかし、カストロノバ（Castronovo）（(Castronovo, 1993 Invasion
Metastasis 13:1-30）は、６７ＬＲがβガラクトシダーゼ結合レクチンと交差反応するエピトープを発現することを示唆した（Landowski, Dratz &
Starkey, 1998）。ヘテロ二量体化がレクチン様タンパク質、すなわちガレクチン-3で生ずることもあることが示唆されている（Castronovo et al, 1991 ; Buto
et al, 1998）。抗ガレクチン−３抗体は、ガレクチン−３のみならず６７ＬＲも認識した（Buto et al, 1998）。受容体の最終的な構造は、解明されていない。
【００２３】
培養中の細胞の表面から脱する場合、６７ＬＲはラミニンと結合する能力を保持する（Karpatova
et al, 1996. J. Cell. Biochem. 60:226-503）。６７ＬＲがどのように細胞膜に付着されるかは、いまだ明らかでない。受容体がＮ末端側に１６個の疎水性アミノ酸を持つにもかかわらず、それが膜内在性タンパク質として存在することよりむしろ会合分子と相互作用する可能性がある。しかし、ポリペプチドのアミノ末端基は非透過性細胞では利用できないことか証明され、この領域が実際に他の分子と相互作用することが示唆される（Castronovo et al, 1991. J. Biol. Chem. 3020440-20446; Wewer et al,
1987 Cancer Res. 47:5691-5698）。
【００２４】
アクセサリー・ファクターが６７ＬＲを伴ってもよいこと、またはそれがアクセサリー分子自体として働くことも示唆された。そのような性質が、細胞表面への輸送および／またはラミニン結合を助けるものであってもよい。注意すべき点は、肺小細胞癌細胞株での６７ＬＲとα６β１との共発現がラミニンに対する直接細胞接着と相関する点である（Pellergrine et al, 1994. Int J
Cancer Suppl 8: 116-120）。ヒト・メラノーマ細胞をラミニンによって処理した場合、６７ＬＲおよびα６β１が形質膜に共転移した（Romanov
et al, 1994. Cell Adhes Commun. 2:201-209）。α６β１と結合した６７ＬＲは、ラミニンに対する一群のヒト・メモリーＴ細胞の高親和性付着をもたらした（Clanfield
andKhakoo, 1999. J. Immunol. 163: 3430-3440）。アルジニ（Ardini）他１９９７は、６７ＬＲおよびα６β１は共配置しないが、６７ＬＲとα６β１サブユニットとのあいだの物理的相互作用を介して、同時に調節された（Ardini
et al, 1997; J. Biol. Chem. 272:2342-2345）。しかし、卵巣癌では、３７ＬＲＰｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、α６サブユニットとは無関係である（Givant-Horwitz,
2003 Clin. Exp. Metastasis 20:599-609; Skubitz et al, 1996. Am J pathol
148:1445-1461）。同時に、これらの結果は、67LRが細胞質内のラミニンに特異的なインテグリン（特にα6サブユニット）と結合して複合体として細胞膜に到着することを示唆し、この複合体では、受容体がラミニンの認識に関与するとともに、相互作用が高または低親和性のいずれであるかを判断する（Landowski,
Dratz, Starkey, 1995）。同時に、これらの結果は、６７ＬＲが細胞質内のラミニンに特異的なインテグリン（特にα6サブユニット）と結合して複合体として細胞膜に到着することを示唆し、この複合体では、受容体がラミニンの認識に関与するとともに、相互作用が高または低親和性のいずれであるかを判断する（Jackers
et al, 1996. Oncogene 13: 495-503）。
【００２５】
活性ヒト３７ＬＲＰは、癌に関連した遺伝的変化にしばしば関与する染色体座である３ｐ２１．３に位置する（Jackers et al 1996. Oncogene 13: 495-503）。活性遺伝子は、７つのエキソンと６つのイントロンとを含む。それは典型的なタタボックスを含まない、しかし、複数の転写開始点があってもよい。それはＴＡＴＡボックスを含まないが、多数の転写開始点であってもよい。プロモーター領域には４つのＳｐＩ部位が存在し、イントロンには６つのＳｐＩ部位、および別のスプライシングに作用するイントロン３には、２つのＡＩｕ配列が存在する。イントロン４は、核内低分子ＲＮＡＥ２の配列を含む（Jackers
et al 1996. Oncogene 13: 495-503）。この遺伝子のコピーが少なくとも２６個、ヒトゲノムに存在し、これら全ては機能遺伝子と高い相同性を示す（Jackers
etal, 1996. Biochem Biophys Acta. 1305:98- 104）。この遺伝子のコピーが少なくとも２６個、ヒトゲノムに存在し、これら全ては機能遺伝子と高い相同性を示す。これらのコピーの１９個が分析され、機能不全の転写産物を生じる加工された偽遺伝子であることが示された。これらの偽遺伝子が後位の現象によって思われる最も確実に生成される（(Jackers
et al, 1996. Biochem Biophys Acta. 1305:98-104）。ｃＤＮＡは進化全体を通じて高度に保存されており、マウス、牛、およびヒトの配列間で９８．３％の相同性があり、その一方でラットおよびヒト配列は９９％相同性を共有する（総説として、Menard
et al, 1997. J Cell Biochem 67:155-165を参照せよ）。
【００２６】
３７ＬＲＰ遺伝子は、３７ＬＲＰ以外のいくつかの機能タンパク質を生ずる。３７ＬＲＰタンパク質は、翻訳機構に関与するｐ４０リボソーム結合タンパク質（ｐ４０ポリペプチド（ｐ４０）、リボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）と９９％相同性を共有する（Makrides et al, 1988. Nucleic Acid Res. 16: 2349; Tohgo et al, 1994.
FEBS Lett. 340: 133-138; Rosenthal & Wordeman 1995. J. Cell Sci. 108:
245-256）。胚眼の成長の位置マーカーもまた、３７ＬＲＰ相補ＤＮＡと同じ遺伝子によってコードされる（Rabacchi et al, 1990.
Development 109: 521-531; McCafferey, Neve and Drager, 1990. PNAS 87: 8570-8574）。
【００２７】
胎児腫瘍性抗原（ＯＦＡ；  ３７−４４ｋＤ）は、齧歯動物およびヒト腫瘍ならび初期の胎仔で発現する免疫原糖タンパク質である。マウス３７ＬＲＰは、ＯＦＡと最大で９９．５％同一性を共有する（Coggin, Barsoum, Rohrer 1999. Anticancer Research 19: 5535-5542）。それは、３７ＬＲＰの自己免疫原相同体とも呼ばれている。ＯＦＡは、マウスおよびヒトでＴおよびＢリンパ球を刺激すること、また癌、特に腎臓癌で免疫原的な役割を果たすことが示されている（Zelle-Rieser
et al, 2001. J. Urol. 165:1705-9; Holt et al, 2002. Clin. Cancer Res.
8:3369-3376; Rohrer et al, 1992; J. Natl. CancerInst. (Bethesda) 84: 602-609;
Rohrer etal, 1994. J. Immunol. 155: 755-764; Rohrer et al, 1995. J. Immunol.
155:5719-5727;Rohrer et al, 2001. Mod. Aspects Immunibiol. 1: 191-195; Rohrer
et al, 1999. J. Immunol 162: 6880-6892）。
【００２８】
３７ＬＲＰおよび６７ＬＲのイソ型または相同体が存在する可能性があることを示唆する何らかの証拠がある。５５ｋＤタンパク質は、３７ＬＲＰに対する相同性を共有するヒトおよび牛の内皮細胞で同定され（Ireland etal, 1998. Clin. Exp. Immunol. 112:255-261）、いくつかのイソ型がマウス脳組織に見出された（Simoneau
et al, 2003. Biol.  Chem.384:243-246）。これらのタンパク質は種々の方向で翻訳後に修正されて、および／または他の分子で相互作用している37LRPに起因するものであってもよく、あるいは他の高度に相同的な遺伝子に起因する場合もある。
【００２９】
６７ＬＲの過剰発現および異常な表面分布が広範囲の腫瘍で示されており、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで種々の技術によって検出されている（総説は、Menard et al 1998; Barsoum et al, 2000を参照せよ）。３７ＬＲＰレベルおよび／または６７ＬＲレベルの変化は、疾患進行、侵襲性、転移、病原力、および予後に関する腫瘍生物学に影響を及ぼすことが示された。
【００３０】
６７ＬＲの過剰発現は、腫瘍進行に役割を果たしている受容体に関連しているが、進行の病期は腫瘍に依存していると考えられる（Campo et al, 1992. Am J Pathol 41 : 1073-83; Demeter et al, 1992
Cancer Res. 52:1561-1567; Martignone et al, 1992. Clin. Exp. Metastasis
10:379-386: breast cancer; Vasso et al, 1993; Cancer 15: 455-461: melanoma;
Boukerche et al, 2004. Gene343:191- 201: melanoma; Waltregny et al 1997. J.
Natl. Caner Inst 89:1224-1227）。凍結結腸直腸組織の３７ＬＲＰｍＲＮＡの増加は腺腫と比較して腺癌で見られたが、レベルは正常組織と腺腫組織との間で一定だった。これらの結果は、３７ＬＲＰまたは６７ＬＲの発現が腺腫から腺癌/デュークスCカルシノーマまでの疾患進行における後段の現象と相関したことを示唆する（Campo
et al, 1992. Am J Pathol 41 : 1073-83）。対照的に、３７ＬＲＰｍRNAは、疾患進行で初期の現象を暗に示している腺腫頸部病変部で増加した（Demeter
et al, 1992 Cancer Res. 52:1561-1567）。６７ＬＲは、単核球性急性骨髄性白血病の系統関連抗原ともみなされている（AML;
Montouri et al, 1999. Clin. Cancer Res. 5:1465-1472）。
【００３１】
他の研究によれば、６７ＬＲが侵襲性および転移でなんらかの役割を担うことが示され、このことは、種々の腫瘍における転移表現型の獲得に重要な役割を果たすことを意味している（Wewer et al, 1987. Cancer Res 47: 5691-8; Castronovo & Sobel
1990. Biochem Biophys Res Commun 68: 1110-1117; Cioce et al, 1991. J Natl
Cancer Inst 83: 29-36; Sobel, 1993 Semin. Cancer Biol. 4: 311-317; Castronovo
Invasion Metastasis 1993 13:1-30; You et al, 1988. PNAS 85: 6394-6398; Pelosi
et al, 1997. J. Pathol. 183:62-69; Boukerche et al, 2004. Gene 343:191-201）。例えば、ｍＲＮＡのレベルは、悪性である可能性がより高いヒト結腸細胞株および組織で増加することが示された（Kondah
et al, 1992. Cancer Res 52: 791-796）。３７ＬＲＰ−ＧＳＴ融合タンパク質で免疫化されたウサギ由来の血清ＩｇＧ分画（Ｐ４Ｇ）でウサギを前処理すると、ヒト線維肉腫細胞株の転移の抑制が起こった（３４５ｂｐｃＤＮＡ：１３ｋＤ；  Narumi
et al., 1999. Jpn J. Cancer Res. 90: 425-431）。血清も、ラミニンに対する細胞付着性を用量依存的に下げた。37LRPのアンチセンスＲＮＡも、試験管内で低分化ヒト結腸癌細胞株の侵襲性を阻害した（Mafune
and Ravikumar, 1992. J. Surg. Res. 52:340-346）。
【００３２】
転移中の６７ＬＲ発現の増加は、もう一つの非インテグリン・ラミニン結合蛋白質（ガレクチン−３）の発現の減少によって、しばしば平行化される（van den Brule etal, 1994. Eur. J. Cancer 32A:1598-1602; Xu etal, 1995.
Am. J. Pathol. 147:815- 822; Castronovo et al, 1995. J. Pathol. 179:43-48; Lotz
et al, 1993. PNAS 90: 3466- 3470）。これらの結果は、２種類のラミニン受容体が可逆的に調整され、このことによってどの受容体が使用されているかに依存したラミニン結合親和性の変化が説明可能であることを示唆している。対照的に、ガレクチン-3の発現増加と結腸癌の悪性度との間の直接的な相関が観察された（Schoeppner.et
al, 1995 Cancer 75:2818-2826）。
【００３３】
６７ＬＲ発現はまた、腫瘍の病原力に関するマーカーであってもよく、その理由は発現の増加が増殖と顕著な腫瘍成長とに関係する傾向にあるからである。３７ＬＲＰｍＲＮＡの増加レベルは、ヒト肺癌組織（Satoh et al, 1992. Biochem. Biophys. Res. Commun 182: 746-752）と急速に増加する膵内分泌腫瘍（Pelosi
et al, 1997. J. Pathol. 183: 62-69）とで検出された。ヒト乳頭腫ウイルスと関連した頸部腫瘍において、３７ＬＲＰｍＲＮＡのレベル増加は、細胞の浸潤特性よりはむしろ細胞の増殖特性に相関していた。（Demeter
et al, 1992）。マウス肺癌細胞株Ｔｌ１にアンチセンス３７ＬＲＰＲＮＡを導入することで、該細胞株の倍加時間が延びた（Satoh et al,
1999. Br. J. Cancer 80: 1115-1122）。これらの細胞はまた、マウス肺癌細胞株Ｔｌ１にアンチセンス３７ＬＲＰＲＮＡを導入することで、該細胞株の倍加時間が延びた。これらの細胞もラミニンとのより弱い相互作用を示し、またアンチセンスＲＮＡを用いた処置を受けた細胞を皮下接種されたマウスにおける生存期間は長くなった。６７ＬＲはまた、腫瘍悪性度にも関与するもので、その理由はラミニン−１のタンパク質分解的切断を高めるので、基底膜の分解率を改善する（Ardini
et al, 2002. Cancer Res. 62: 1321-1325）。
【００３４】
３７ＬＲＰおよび／または６７ＬＲの過剰発現は、数種類の腫瘍で予後不良を伴う場合がある（総説として、Barsoum Rohrer and Coggin 2000. Cell MoI Biol Lett.5: 207-230;
Menard et al, 1998 J. Cell. Biochem.67:155-165; Menard, Tagliabue and Colnaghi,
1998. Breast Cancer Res. Treatment 52: 137-145を参照せよ）。予後は、ラミニンも生ずる乳癌では好ましくない（Martigone
et al 1993. J Natl. Cancer Inst. 85: 379-386; Pellegrini et al, 1985 Breast
Cancer Res Treat 35: 195- 199）。ヒト・リンパ腫において、６７ＬＲはＣＤ３０＋未分化大細胞リンパ腫の表面上および高悪性度Ｂ細胞非ホジキンまたはホジキン・リンパ腫の小集団中で検出可能であった（Carbone
et al, 1995. Hum. Pathol. 2: 541-546）。
【００３５】
近年では、６７ＬＲは腫瘍生物学以外の生物学的プロセスに関係した。受容体が、サイトカイン、炎症性試薬、ならびにラミニンおよびステロイドを含む細胞外マトリックス・タンパク質との相互作用によって上方制御されるという知見（総説として、Menard et al, 1998を参照せよ）が得られたことから、３７ＬＲＰおよび６７ＬＲが標準状態で調整可能であることが示唆される。受容体は、リンパ球化学走性、癒着、およびホーミングでの役割ならびに／または宿主防御機構での役割を果たすと考えられる。６７ＬＲは、ヒト活性記憶末梢血Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋単一陽性）の集団（１０〜１５％）の表面で見出された。それはまた、神経ペプチドに反応して上方制御されることも示された（Chen
et al, 2002 Nat. Med. 8:1421-1426）。受容体は、リンパ球化学走性、癒着、およびホーミングでの役割ならびに／または宿主防御機構での役割を果たすと考えられる。６７ＬＲは、ヒト活性記憶末梢血Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋単一陽性）の集団（１０〜１５％）の表面で見出された。それはまた、神経ペプチドに反応して上方制御されることも示された。１９９６年のフェラリーニ（Ｆｅｒｒａｒｉｎｉ）等による研究は、肺腫瘍部位で局所化されるγδ＋リンパ球が肺癌細胞を殺すことができ、そのことは６７ＬＲとの相互作用によってもたらされることから、受容体が果たす免疫学的役割を支持する（Ferrarini
et al, 1996. J. Natl. Cancer hist. 88:436-441）。ラミニンが共刺激シグナルを提供することができたのに対して、殺害はナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、リンフォカイン活性（ＬＡＫ）細胞、およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）から独立していることが示された。
【００３６】
６７ＬＲは、他の細胞型の成長、移動、および細胞内輸送に影響を及ぼすことが可能である。６７ＬＲは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のα（αＧＭＲ）およびβ（βＧＭＲ）サブユニットと相互作用するとともに（Chen et al, 2003. PNAS 100: 14000-14005）、ＧＭ−ＣＳＦレセプター複合体の形成を阻害する。ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄様前駆細胞の成長、分化、および成熟を調整して、成熟した好中球、好酸球、および単核貪食細胞の機能を高める。６７ＬＲは、ＧＭ−ＣＳＦ複合体形成を妨げることによって、これらの活性を阻害することが可能である。刷子縁よびパネート細胞分泌顆粒で見出されたことから、６７ＬＲの分泌およびエンドサイトーシスの役割も、包含された（Shmakov
et al, 2000. J. Pathol. 191:318-322）。
【００３７】
６７ＬＲがラミニンで相互作用する正確な方法は、不確定のままである。可能なラミニン結合部として、６７ＬＲから２つのペプチド領域が同定された。これらのうちの１つは、ペプチドＧであり、これは３７ＬＲＰの配列に由来する合成ペプチドであって、パリンドローム配列ＬＭＷＷＭＬを含む。これがラミニンを結合することがわかり、該結合によって血管内皮細胞と腫瘍細胞との結合が阻害され、ヌードマウスではヒト・メラノーマ細胞の転移を増加させることが示された（Castronovo et al, 1991 J Biol. Chem. 266:20440-20446; Castronovo,
Taraboletti and Sobel 1991. Cancer Res. 51: 5672-5678;  Taraboletti et al, 1993.
J. Natl. Cancer. Inst. 85: 235-240）。ペプチドＧが腫瘍細胞上のラミニン結合を増加および安定させるということが発見された（Magnifico
et al, 1996. J. Biol. Chem. 271: 31179- 31184）。第２の可能なラミニン結合領域は、３７ＬＲＰのＣ末端配列の疎水性から予測された（アミノ酸２０５〜２２９;
Landowski, Uthayakumar, Starkey, 1995. Clin. Exp. Metastasis 13: 357-372）。６７ＬＲのレクチン領域は、受容体のラミニン認識は、乳糖（Castronovo
et al, 1991. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177:177-183）に依存していることから、ラミニンで相互作用することも可能である。
【００３８】
６７ＬＲは、ラミニン残基ＹＩＧＳＲ（アミノ酸  ９２９〜９３３；  β１鎖；  Massi, Rao and Hubbell, 1993. J. Biol. Chem. 268:8063-8059;
Landowski, Uthayakumar, Starkey, 1995. 13: 357-72）、ＩＫＶＡＶ（アミノ酸２０９１〜２１０８；  α鎖；Kibbey
et al, 1993. PNAS 90: 10150-10153）、およびＬＧＴＩＰＧ（アミノ酸  ４４２〜４４６；  β１鎖； Mechametal 1989
J. Biol. Chem. 264: 16652-16657）と結合してもよい。６７ＬＲは、ラミニンの炭水化物成分、特にポリ（ラクトサミノ）構造、ガラクトース（α１，３）ガラクトース結合、末端非還元β−ガラクトシル残基と結合することが可能である（Mecham
, 1991 Annu. Rev. Cell. Biol. 7:71-91）。ＹＩＧＳＲ残基への結合は転移を抑制し（Iwamoto et al, 1996.
Br. J. Cancer 73: 589-595）、その一方でＩＫＶＡＶ相互作用によって転移が刺激される（Bresalier et al, 1995.
Cancer Res. 55: 2476-2480）。第１のラミニン受容体である６７ＬＲの発見（１９８３年）以来、少なくとも１４個の他のラミニン受容体が記述（Mecham
1991）されていることから、ラミニン上の同じ結合部を利用してもよい。
【００３９】
６７ＬＲも、ラミニンに加えて他の分子と相互作用する。これらの例として、エラスチン（Grosso et al, 1991. Biochemistry 30: 3346-3350）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＩＶ型コラーゲン
（Narasimhan et al, 1994. PNAS 91:7440-7444; Iwabuchi et al, 1996 Blood 87:
365-372）、およびヘパリン(Guo et al, 1992. PNAS 89: 3040-3044)が挙げられる。他の研究もまた、６７ＬＲがシンドビス・ウィルスとして働き（Wang
et al, 1992 J. Virol. 66:4992-5001）、その一方で３７ＬＲＰがプリオン・タンパク質の取り込みを可能にすること（Rieger
et al, 1997. Nat. Med. 3:1383-1387）を示している。
【００４０】
肝臓癌
肝臓の最も頻度の高い原発性悪性腫瘍は、肝細胞癌（ＨＣＣ）である。ＨＣＣの発生率は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎のリスクが高い集団で上昇する。すでに慢性肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、ならびに２つの先天性肝障害（α−１−抗トリプシン欠乏およびチロシン血症）を患っている患者は、ＨＣＣ発現の危険性も高い。特定の毒素および化学薬品は、アフラトキシン（アフリカの不適当に格納されたピーナッツで見つかる糸状菌由来の産物）も原発性肝癌を引き起こす可能性がある。ＨＣＣが切除によってうまく摘出される場合、再発および転移が生ずる可能性がある。多くの研究によって、原発性肝癌および転移性再発の種々の予後マーカーを明らかになった（For review see Qin and Tang, 2004. J Cancer Res Clin Oncol 130:
497-513）。
【００４１】
ＨＣＣと肝疾患との関連は、構造上の変化が原発性肝癌を発現する可能性を増加させることを示唆する。標準状態下で、肝細胞は基底膜の欠如によって特徴づけられる（Schaffher and Popper 1963 Gastroenterology 44:230-242）。肝硬変症の発現にともなって、細胞外マトリックスタンパク質（ラミニンを含む）が生じ、該タンパク質は洞様血管周辺に蓄積し、構造基底膜を形成する。ラミニン５が、正常または腫瘍周囲硬化性組織中にではなく、始原ＨＣＣ小節に存在するとわかった(Giannelli
et al, 2003. Clin. Can. Research. 9:3684-3691)。ラミニンは、ラミニン沈着物が他のタンパク質の異常な発現を生じることを示唆しているサイトケラチン１９の発現を誘発することも示された（Su
et al, 2003. World J Gastroenterol : 921-929）。そのことは、ラミニンの発現がその受容体のいずれかの発現を増加させることと考えられる。
【００４２】
肝細胞で６７ＬＲが発現されるという知見（Clement et al, 1990. J. Cell Biol. 110:185-192）が1990年に得られたが、それは存在する唯一のラミニン受容体ではなかった。６７ＬＲ陽性細胞の数の増加は、HCCおよび肝硬変症患者から得られる肝臓試料の隣接実質と比較して腫瘍性領域で観察された（(Grigioni
et al ., 1991, Am J Pathol 138:647-654)。別の研究（Ozaki et al, 1998. Gut 43: 837-842）は、正常肝臓組織中で弱い３７ＬＲＰｍＲＮＡ発現を検出した。ｍＲＮＡレベルは、慢性肝炎によって非癌肝臓組織で増加し、腫瘍領域でさらに上昇した。３７ＬＲＰ翻訳および発現タンパク質は、この研究では判断されなかった（Ozaki
et al, 1998. Gut 43: 837-842）。６７ＬＲのさらなる生合成は、ＲＮＡの増加とタンパク質の増加との間の直接的な相関によって転移性HCC組織で観察された（Zheng
et al, 1997. J Tongji Medical University. 17:200-202）。Ｌ−０２正常な肝細胞と癌細胞株ＨｅｐＧ２およびＳＭＭＣ−７７２１とは、細胞株の腫瘍状態と相関しなかった３７ＬＲＰｍＲＮＡおよび６７ＬＲ発現の変化に富むパターンを示した（Zheng
et al, 2002. Chinese J Cancer 22: 248-252）。しかし、癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１は他の細胞株より高いラミニン結合能を発現することが可能ではあるが、細胞全体が結合研究に使用されたことから、このことは６７ＬＲ単独に起因しているわけではない。しかし、低転移性相対物ＭＨＣＣ９７−Ｌと比較して、プロテオミクス研究は、６７ＬＲが高転移性細胞株ＭＨＣＣ９７−Ｈで上方制御されることを明らかにした（Li
et al, 2001. World J Gastroenterol 7: 630-636; Ding et al, 2004. Proteomics 4;
982- 994）。６７ＬＲがＨＣＣにおいて直接的な役割を果たすかどうかに関係なく、転移は未確定のままである。
【００４３】  
先行特許
米国特許第５，７５０、１０２号は、患者の細胞または組織からクローン化されるMHC遺伝子を患者腫瘍由来の細胞にトランスフェクションするプロセスを開示する。次に、これらのトランスフェクション細胞は、患者の予防接種に用いられる。
米国特許第４，８６１，５８１号は、新生細胞を殺すための処置を受けた哺乳動物の組織と標識抗体とを接触させることでモノクローナル抗体を標識するステップと、変性している新生細胞の細胞内構成要素に対する標識抗体の結合を測定することで治療の効果を測定するステップとを含むプロセスを開示している。ヒト細胞内テストに導かれる抗体を調製する際に、特許権所有者は悪性細胞がそのような抗原の簡便な供給源を表すと考えている。  
米国特許第５，１７１，６６５号は、新規の抗体とそれを生産する方法とを提供する。具体的には、この特許はヒト腫瘍（例えば大腸および肺の腫瘍）と関連したタンパク質抗原に強く結合する一方で正常細胞に対する結合はかなり劣る性質を持つモノクローナル抗体の形成を教示する。
【００４４】
米国特許第５，４８４，５９６号は、外科的にヒト癌患者から腫瘍組織を除くこと、この腫瘍組織を処置して腫瘍細胞を得ること、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にするために腫瘍細胞を放射線で処置すること、ならびにこの腫瘍細胞を用いて、原発腫瘍の再発を阻害するとともに転移を阻害することができる患者用ワクチンを調製することを含む癌治療方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原との反応性を単クローン抗体の開発を教示する。第４段落第４５行目（以下参照）に述べられるように、特許権所有者はヒト新生物形成で活性特異的免疫療法を発現しているモノクローナル抗体の開発に自所性腫瘍細胞を利用する。
【００４５】
米国特許第５，６９３，７６３号は、ヒトＣＡに特有の糖タンパク質抗原が上皮細胞起源に依存していないことを教示している。
米国特許第５，７８３，１８６号は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２発現抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、該抗体を使用して癌を治療する方法、および上記抗体を含む医薬品組成物に関する。
米国特許第５，８４９，８７６号は、腫瘍および非腫瘍組織を供給源として精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体を生産するための新規ハイブリドーマ細胞株について説明している。
米国特許第５，８６９，２６８号は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒト・リンパ球を生成する方法と、該方法によって生産されるモノクローナル抗体と同様に、モノクローナル抗体を生産するための方法とに関する。この特許は、詳しくは、診断に役立つ抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の生産と癌の処置とに関する。
米国特許第５、８６９、０４５号は、ヒト・カルシノーマ細胞に対して反応性を示す抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、および単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体が機能する機序は、分子がヒトCA表面に存在する細胞膜抗原に対して反応性を示すという点で、また抗体がカルシノーマ細胞に内在化する能力を持ち、結合後に、該細胞を特に抗体-薬物および抗体-毒素複合体の形成に役立つようにするという点で、二重である。無修飾の形態において、該抗体も特定の濃度で細胞毒性的特性を呈する。
米国特許第５，７８０，０３３号は、腫瘍の治療および予防のために自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、老いた哺乳動物由来の抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる自然抗体の1つの型であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳動物」に由来することから、自己抗体が実際に、治療されている患者に由来する必要性はない。加えて、この特許は老いた哺乳動物に由来する天然かつ単クローン系の抗核自己抗体と、単クローン系抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株とを開示している。
【発明の開示】  
【００４６】
発明の要約
本発明者らは、以前に、個々にカスタマイズされ、かつ癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を選択する方法に関する「個々の患者に特異的な抗癌抗体（Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies）」と題された米国特許第６，１８０，３５７号を取得した。この文献の目的にとって、用語「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）を同義的に使用可能であり、ハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）によって産生される完全な免疫グロブリン、免疫複合体、ならびに、必要に応じて、免疫グロブリン・フラグメントおよび組換えタンパク質、例えばキメラおよびヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組換え型可変部領域（Ｆｖ）、融合タンパク質等のことを言う。この文献の目的にとって、用語「組織試料」は、哺乳類から得られた少なくとも１つの細胞または複数の細胞が凝集したものを意味すると理解される。一部のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能の有意の作用なしでポリペチド内で変化し得ることが、当該技術分野でよく知られている。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸配列の修飾は、通常、許容され得る。これらには、限定されるものではないが、置換（保存的置換が好まれる）、欠失、または付加が含まれる。さらにまた、標準的な化学療法的手段（例えば、放射性核種）と本発明のＣＤＭＡＢとを結合させることは本発明の範囲内であり、これによって容器化学療法剤の使用に焦点が合わせられる。ＣＤＭＡＢと、毒素、細胞毒性部位、酵素（例えばビオチン複合酵素）、または造血性細胞とを結合させることで、抗体複合体が形成される。６ＢＤ−２５と称されるハイブリドーマ細胞株に由来するモノクローナル抗体との複合体の形成に応じて、そのような複合体形成部分を説明する。類似の抗体複合体を、５ＬＡＣ−２３と称されるハイブリドーマ細胞株から誘導されるモノクローナル抗体を利用して形成することができた。
【００４７】
細胞毒性剤のための担体としての腫瘍関連モノクローナル抗体の使用は、過去数年で相当な注目を受けた。この研究の多くの目的は、抗癌薬の有効性を改善する一方で、複合体を形成した薬物または毒素の不要かつ多くの場合に有毒な副作用を減らすことである。
【００４８】
このアプローチが効果的であるために、抗体が高度に腫瘍選択的であり、しかも薬物が活性のある細胞毒性形態で送達されることが必要である。細胞毒性薬、例えばメトトレキセート（ＭＥＴＨＯＴＲＥＸＡＴＥ）、ダウノマイシン・マイトマイシン（ＤＡＵＮＯＭＹＣＩＮ  ＭＩＴＯＭＹＣＩＮ）  Ｃ（ＭＭＣ）、およびビンカ（ＶＩＮＣＡ）を抗体に取り付け、誘導された複合体を抗腫瘍活性について検討することがおこなわれている。また、シュードモナス・エクソトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎ）等の生物学的製剤およびカリケアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）およびオウリスタチン（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）等のより新規な毒素が、抗ＣＤ３３および抗ＣＤ３０抗体の有効性を高めるために用いられている。多くの例が当該技術分野に存在しており、これらの例は、非特異的徐放をおこなう相対的に安定な化学結合という手段によって、薬物に対する抗体の結合を説明する。ヨウ素１３１、イットリウム９０、またはインジウム１１１もまた、腫瘍破壊目的のために、または画像診断のために抗体と複合体を形成することができる。アプローチにかかわりなく、主な目的は、腫瘍を破壊することである。すなわち、特異的なアプローチを、特定の抗３７ＬＲ抗体によって決めることができ、該特定の抗３７ＬＲ抗体を利用して３７ＬＲ抗原を発現している細胞を標的にする利用可能なアプローチをかなり変化させることができる。
【００４９】
この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための’３５７特許に教示された患者特異的抗癌抗体を生産するための方法を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍に対して特異的に作製することができることから、癌治療のカスタム化を可能にすることができる。この出願の脈絡の範囲内で、細胞殺害（細胞障害能）または細胞増殖抑制（細胞分裂停止）特性を有する抗癌抗体を以下、細胞障害能と呼ぶ。これらの抗体を癌の病期分類および診断の補助として使うことができ、また腫瘍転移の処置に使用することができる。
【００５０】
個々の抗癌処置が見込まれることから、患者管理の方法に変化がもたらされる。おそらく臨床シナリオは、提示時に腫瘍試料が得られ、積み上げられるということである。この試料から、既に存在している癌性疾患修飾抗体のパネルから腫瘍を類型化することができる。患者を従来通りに病期分類することができるが、利用できる抗体は患者をさらに病気分類するのに用いることができる。既存の抗体を用いることで、患者が素早く治療を受けることができる。また／あるいは、腫瘍に特異的な抗体のパネルは、本明細書中に概説される方法を使用して作ることができ、または本明細書中に開示されるスクリーニング法と同時にファージディスプレイ・ライブラリを用いることによって作ることができ、なぜなら、発生するすべての抗体は、抗癌抗体のライブラリに加えられる。なぜなら、他の腫瘍が治療を受けている人と同じエピトープのいくつかを持つことができるという可能性があるからである。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌を有する任意の数の患者で、癌性疾患を治療するために役立つと考えられる。
【００５１】
米国特許第６，６５７，０４８号に概説されるように、米国特許第６，１８０，３７０号のプロセスを実質的に用いることで、マウス・モノクローナル抗体６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３は、患者乳房腫瘍および肺腫瘍生検から得た細胞でマウスの免疫化を行った後に得られる。６ＢＤ−２５抗原は、細胞ＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳによって種々のヒト正常細胞株および癌細胞株上で最初に検出された。ビオチンに対する６ＢＤ−２５抗体の共役を介してアッセイの感度を高めた後に、該抗原を乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および卵巣癌細胞株Ｃ−１３、ＯＶＣＡ−４２９、およびＯＶ２００８で検出した。乳癌細胞株Ｈｓ５７４．Ｔは、未精製６ＢＤ−２５の細胞毒性の影響を受けやすかった。乳癌細胞株ＭＣＦ−７、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３、および大腸癌細胞株ＳＷｌ  １１６は、試験されたたった３種類の細胞株であり、精製された６ＢＤ−２５の細胞毒性の影響を受けやすかった。ＦＡＣＳ分析を用いることにより、５ＬＡＣ−２３の抗原は、ＳＷ６２０大腸癌細胞株上で発見されたが、試験した他の細胞株のいずれででも発見されなかった。乳房（Ｈｓ５７４．Ｔ）、肺（ＮＣＩ−Ｈ６６１）、および皮膚（Ａ２０５８）癌細胞株は、未精製の５ＬＡＣ−２３の細胞毒性の影響を受けやすかった。卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３は細胞株が検査した唯一の癌であり、精製された５ＬＡＣ−２３の細胞毒性の影響を受けやすかった。
【００５２】
ＯＶＣＡＲ−３およびＳＷ１１６細胞に対する６ＢＤ−２５細胞毒性は、マウスに移植された際にこれらの細胞に対する該毒性の抗腫瘍活性によって、さらに増大した。大腸癌の生体内モデルにおいて、ヒトＳＷｌ１１６細胞を襟首に皮下移植し、一方卵巣癌の生体内モデルでは、ヒトＯＶＣＡＲ−３細胞を腹膜内に移植した。両モデルに対して、特定の免疫細胞が欠けているためにヒト腫瘍を拒絶することができないことから、免疫不全マウスを使用した。臨床前異種移植片腫瘍モデルは、治療有効性を妥当なものとして予測するものと考えられる。マウスにおける異種移植片は、ストローマ、中心壊死、おおび新脈管系を発現している充実性腫瘍として成長する。腫瘍細胞株ＯＶＣＡＲ−３およびＳＷｌ１１６は、免疫不全マウスにおける生体内での異種移植片モデルとして評価された。ＯＶＣＡＲ−３およびＳＷｌ１１６腫瘍の良好な移植または「テイク・レート（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）」と標準の化学療法剤に対する腫瘍の感受性とは、それらが適切なモデルとして特徴付けた。親細胞株および該細胞株の変異体を、広範囲にわたる治療薬を評価するために、異種移植片腫瘍モデルで使用した。
【００５３】
ヒト大腸癌の生体内予防モデルにおいて、マウスに対して６ＢＤ−２を腫瘍細胞移植１日前に与え、続いて７週間にわたり、毎週注射した。６ＢＤ−２５処置は、緩衝液対照群よりも処置期間中に腫瘍成長抑制に有意に有効（ｐ＝０．００１）であった。処置相の終了時、６ＢＤ−２５投与マウスの腫瘍成長は対照群のたったの５４パーセントに過ぎなかった。後処理追跡調査期間中に、６ＢＤ−２５の処置作効果が持続し、投与群の平均腫瘍容積は測定相の終わりまで対照群よりも有意に少ない状態が続いた（ｐ＝０．００２）。体重減少または他の臨床苦痛の兆候等、何ら毒性の兆候を示さなかったことから、６ＢＤ−２５処置が安全であることがわかった。したがって、それがヒト大腸癌の安定したモデルで対照−投与群と比較して腫瘍成長を遅延させたので、６ＢＤ−２５処置は有効だった。
【００５４】
大腸癌の生体内腫瘍予防モデルのほかに、６ＢＤ−２５は卵巣生体内腫瘍予防モデルでのＯＶＣＡＲ−３。細胞に対する抗腫瘍活性を示した。この異種移植片腫瘍モデルでは、合計１０回用量にわたり移植後の翌日に開始する処置で、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞が免疫不全マウスに腹腔内移植された。６ＢＤ−２５による処置を緩衝液対照と比較した。体重を、腫瘍発達の代用指標として使用した。体重増加が腹水形成に起因する場合、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。移植後８０日目（処置終了後１６日目）に、処置群のマウスの体重は対照群（ｐ＝０．００２）と比較して低かった。緩衝液対照群と比較して６ＢＤ−２５の処置による有意の延命効果もみられた（ｐ＜０．０２）。また、毒性または臨床苦痛の徴候をいっさい誘発しなかったことから、６ＢＤ−２５処置は安全であると思われる。６ＢＤ−２５の抗腫瘍活性とその明らかな毒性の欠如とが、６ＢＤ−２５を魅力的な抗癌治療薬とする。
【００５５】
患者が治療の初期経過で難治性を示す場合または転移が発現する場合、腫瘍に対して特異的抗体を生成するプロセスを再治療の目的で繰り返すことができる。さらにまた、抗癌抗体を、その患者から得られ、かつ転移の処置のために再注入される赤血球と複合体を形成させることができる。これらは、転移癌に対してほとんど有効性がみられな処置であり、転移は一般に死をもたらすような乏しい結果を予告するものとなる。しかし、転移癌は通常、十分な血管化を引き起こし、赤血球による反癌抗体の送達は、腫瘍の部位で抗体を濃縮する作用を持つことができる。転移前であっても、大部分の癌細胞は宿主の血液供給に依存して生きており、また赤血球と複合体を形成する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して有効である。あるいは、抗体は他の造血性の細胞（例えばリンパ球、マクロファージ、単核細胞、またはナチュラルキラー細胞）と複合体を形成してもよい。
【００５６】
抗体には５つの種類があり、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害も、抗体依存‐細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を通して、または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）によって、もたらされると一般に考えられている。例えば、マウスの免疫グロブリンＭとＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分を結合することによって、ヒト補体を活性化することができ、それによって腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路が活性化される。ヒト抗体に関して、最も有効な補体活性化抗体は一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、採用されている細胞毒性細胞で効果的であり、該細胞は、単核細胞、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプターを持つ。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣを媒介する。
【００５７】  
抗体媒介癌殺害のもう一つの可能な機序が、細胞膜とその関連糖タンパク質またはグリコリピド、いわゆる触媒抗体とでの種々の化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いるものであってもよい。
より広く受け入れられる抗体媒介癌細胞殺害のさらに２つの機序がある。第１は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答を発生するように身体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、成長受容体を標的し、該成長受容体の機能に干渉する、あるいは該受容体を下方制御してその機能を効果的に失わせる抗体の使用である。
【００５８】
疾患を治療する新薬の発見は、３０，０００もの既知の遺伝子の産物のなかで、明白に疾患病因に関与する関連標的の同定が不足していることによって妨げられている。腫瘍学研究では、可能性のある薬剤標的は該薬剤標的が腫瘍細胞で過剰発現するという単なる事実から、しばしば選択される。このように同定された標的は、次に、多数の化合物との相互作用についてスクリーニングされる。可能性のある抗体療法の場合、これらの候補化合物は、ケーラーおよびミルシテイン（１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５−４９７，  Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって築かれた基本的な原理にもとづいて、通常モノクローナル抗体を生成する従来の方法から誘導される。抗原（例えば、全細胞、細胞分画、精製抗原）によって免疫されたマウスから脾細胞を回収し、免疫化ハイブリドーマと融合する。結果として生ずるハイブリドーマのスクリーニングおよび選択を、標的に対して最も夢中に結合する抗体の分泌についておこなわれる。癌細胞に特異的な多くの治療用および診断用の抗体（例えばヘルセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）およびリタックシマブ（ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ））は、これらの方法を用いて生産され、標的の親和性および特性に基づいて選択される。細胞毒性効果を有し、それ自身によって、毒素、薬物、または放射性同位元素等の他の分子と関連する細胞と結合する腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を持つ抗原特異的試薬の開発は、細胞および生体内生理学的活性を呈することで、これらの試薬が腫瘍細胞増殖、進行、および転移を阻害し、潜在的な治療および／または診断ツールとして著しく有用である。
【００５９】
癌関連標的として５ＬＡＣ−２３エピトープを確認するために、凍結正常ヒト組織の５ＬＡＣ−２３抗原の発現を測定した。免疫組織化学によって、５ＬＡＣ−２３抗原が正常組織で発現を制限されることが示された。これは、組織配列スライド内のホルマリン固定パラフィン包埋正常器官における５ＬＡＣ−２３抗原の発現を検討することによって確認された。全体で、正常組織の５ＬＡＣ−２３による弱い染色が存在し、ＨＣＣ等の癌と比較して、正常肝、胃、脳、および腎臓組織での抗原の発現が制限および減少することを示している（以下参照）。そのような発現は、時々、生体内で、細胞質（それは通常、完全な抗体では到達できない）にも限定された。発現が胃腺癌にもあったにもかかわらず、同じ組織配列において、５ＬＡＣ−２３抗原の発現がＨＣＣにおいて卓越していた。
【００６０】
ＨＣＣの標的のより広範囲な研究を実施することで、この癌の５ＬＡＣ−２３抗原有病率について免疫組織化学による検討をおこなった。驚くべきことに、肝癌試料５５個の内の７３％でこの標的が発現された。診断、治療的診断法（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）、予後、または治療のための標的としての利用を示すために、対応した正常肝臓および肝臓癌における標的の分布について比較した。明らかに、５ＬＡＣ−２３は腫瘍試料のみを染色し、これらの切片での悪性組織を表す中心領域に対して特異的であった。切片は、アイソタイプ対照によって染色した場合に、ネガティブであったことから、５ＬＡＣ−２３の結合が特異的であり、５ＬＡＣ−２３抗原の特異性を与えるものであることが示された。さらに、５ＬＡＣ−２３抗原は、種々のアッセイによって検出し得るものであって、そのいくつかの非限定的実施形態は実施例（例えばウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ分析、および免疫組織化学）によって包含される。当該技術分野の当業者に明らかであり、かつこの発明の範囲内にある他のアッセイとして、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学、および免疫親和性にもとづくアッセイ（例えばＳＥＬＤＩ質量分析法、表面プラズモン共鳴測定法、ラジオイムノアッセイ、および分子診断検査法）が挙げられる。本明細書中に概説されるように、別の生化学データも５ＬＡＣ−２３によって認識される抗原が３７ＬＲＰのエピトープであることを示す。このことは、二次元の電気泳動およびウェスタンブロッティング、さらに質量分析による５ＬＡＣ−２３抗原の同定によって支持された。標的抗原の同定を、標的が抗体ととともに局在化することを示すことによって確認された。重要なことに、５ＬＡＣ−２３は他の抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０）と比較して、固有の結合パターンを示した。これは、より制限された結合部位を示している５ＬＡＣ−２３によって、２つの抗体によって認識されたエピトープが異なることを示唆している。さらに実施例１２では、Ｈ−１５０は細胞株の全てにある３７ＬＲＰを検出するが、５ＬＡＣ−２３によって認識される抗原エピトープの発現は異なる細胞可溶化物全体で変化し、いくつかのものでは存在していなかった。抗体間のこのような違いは、ＣＨＯ細胞可溶化物に対する療法の抗体の結合が類似していたことから、Ｈ−１５０と比較してその抗原に対する５ＬＡＣ−２３の親和性が低いことによるものではなかった。５ＬＡＣ−２３およびＨ−１５０によって検出されるエピトープの違いの支持では、５ＬＡＣ−２３は非還元条件下でＬＳ１７４Ｔライセートに約１１０ｋＤの固有スメアが検出された（図１６Ｂ、レーン１２）。このスミアは、３７ＬＲＰ前駆体に対応している帯域の増加なしで、還元条件下で消えた。既知の抗ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０と比較して、これらの結果は、３７ＬＲＰ上で５ＬＡＣ−２３によって認識されるエピトープが固有であるというさらなる証拠を提示する。これらのＩＨＣおよび生化学結果は、５ＬＡＣ−２３が固有の３７ＬＲＰ抗原エピトープに特異的であることを証明する。
【００６１】
制癌剤の臨床上の有用性は、患者に受け入れられるリスクプロフィール下での本剤の利点に基づく。癌治療において、生存は通常、最も求められている利点であったが、寿命を延長することに加えていくつかの他の周知の利点がある。これらの他の有益性は（処置が生存に悪影響を与えない場合）、症状緩和、有害事象に対する保護、再発または無症候生存の時間的延長、および進行に対する時間的延長を含む。これらの基準は、通常、受け入れられ、米食品医薬品局（Ｆ  ．Ｄ．  Ａ）等の規制機関がこれらの利点を生ずる薬物を承認する（Hirschfeld et al. Critical Reviews in  Oncology/Hematolgy42: 137-143
2002)）。これらの基準に加えて、この種の利点を前もって知らせると思われる他の指標があることは十分に認められる。一つには、米食品医薬局によって承諾される早期承認プロセスは、患者利点をおそらく予測する代用物があると認める。年末（２００３）より、このプロセスで承認された薬物が１６あり、これらのうち４つは完全承認された。すなわち、追跡調査によって、代用の指標によって予測されるように、患者に対して直接的な利点があることが示された。充実性腫瘍で薬物効果を決定するための1つの重要な指標は、処置に対する反応を測定することによる全身腫瘍組織量の評価である（Therasse
et al. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000）。そのような評価の臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、充実性腫瘍研究グループ（Solid
Tumors Working Group）（国際的な癌専門家集団）の反応評価基準によって広められた。ＲＥＣＩＳＴ基準に従う客観的な反応で示すように全身腫瘍組織量に対して効果が示された薬物は、適当な対照群と比較して、直接的に患者の利益になることを最終的に生じる傾向がある。臨床前設定では、全身腫瘍組織量は通常、評価および記録が簡単である。臨床前研究が臨床設定に翻訳できるという点で、臨床前モデルで生存延長をもたらす薬物は、予想された臨床上の有用性が最も高い。臨床治療に好応答を発生することに類似して、臨床前設定で全身腫瘍組織量を低下させる薬物は、疾患に対して有意の直接的な影響も持つかもしれない。生存の延長が制癌剤処置から臨床転帰後、最も求められるにもかかわらず、臨床上の有用性を持つ他の利点があり、また疾患進行の遅れ、延命、またはその両方に関連していると考えられる全身腫瘍組織量の減少は、直接的な利点を導くこともあり、臨床的インパクトを持つことが明らかである（Eckhardt
et al. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial
Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting,
2003, pages 209-219）。
【００６２】
全体で、この発明は治療薬のための標的として、６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３抗原の使用を教示する。投与した場合、６ＢＤ−２５は、抗原を発現している癌で哺乳動物で全身腫瘍組織量を低下させることができるとともに、処置された哺乳動物の生存延長をもたらすことができることが示された。生体内での６ＢＤ−２５の有効性と、それに伴うＳＷ１１６およびＯＶＣＡＲ−３細胞での検出不可能または低レベルの抗原発現は、抗原発現のレベルが生体内での有効性と必ずしも相関するわけではないことを示している。さらにまた、この発明も癌細胞で６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３抗原を検出することがこの抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の診断、治療の予測、および予後に役立ち得ることを教示している。診断用標的、治療的診断法、予後または療法として、さらに５ＬＡＣ−２３抗原の使用を示す。
【００６３】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株と該ハイブリドーマ細胞株がコードされる対応の単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントとを単離するために、癌細胞に対して細胞毒性を示す一方で、同時に非癌細胞に対しては相対的に非毒性である特定の個体に由来する細胞に由来する癌性疾患修飾抗体を生産するための方法を利用することである。ラミニン受容体１を確認することは、本発明のさらなる目的である。
本発明のさらなる目的は、３７ＬＲＰの特定のエピトープと該特定のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体（５ＬＡＣ−２３と呼ぶ）またはそのフラグメント（抗原フラグメントととする）とを結合させることで、ラミニン受容体１前駆タンパク質（３７ＬＲＰと呼ぶ）を同定することであり、単離モノクローナル抗体は、癌細胞に関して細胞毒性である一方で非癌細胞に対しては同時に相対的に非毒性である特定の個体に由来する細胞から癌性疾患修飾抗体を生産する方法によって生産された。
本発明のさらなる目的は、５ＬＡＣ−２３によって認識される３７ＬＲＰの特定のエピトープと結合することができ、かつ明細書中では薬物−抗体複合体と呼ばれる結合部位を提供することであり、ここでは該抗体は、上記特定のエピトープと結合する５ＬＡＣ−２３またはそのフラグメントであり、また複合体は、放射性核種または生物学的もしくは化学的毒素の形態をした活性型抗腫瘍薬であり、または、限定されるものではないが、化学療法薬を含む等価な抗腫瘍活性を持つ化合物である。
【００６４】
この発明の別の目的は、抗腫瘍薬として、または画像診断法の補助として有効である活性抗腫瘍薬、酵素、または放射性核種を、哺乳動物体内の腫瘍細胞の部位に送達する方法を教示するもので、該方法は、本発明にもとづいて哺乳動物に結合部位を投与することを含み、それによって結合部位と抗原性エピトープとの選択的結合が生ずる。
本発明のさらに別の目的は、悪性の存在を示すのに十分なレベルで５ＬＡＣ−２３抗体と２７ＬＲＰ前駆体との選択的結合を立証するための任意の手段によって癌細胞の存在を判断する方法を教示することである。
本発明のさらなる目的は、５ＬＡＣ−２３、抗原結合フラグメント（前述の定義通り）または結合部位（前述の定義通り）を特定の３７ＬＲＰ抗原性部位に結合させることに依存する方法を利用して、癌性細胞または前癌性細胞の診断、予後、治療、画像化、およびモニタリングを行うための方法を教示することである。
本発明のさらに別の目的は、ＣＤＭＡＢおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、細胞毒性がＡＤＣＣによってもたらされるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらなる目的は、細胞毒性がＣＤＣによってもたらされるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらなる目的は、細胞毒性が細胞化学結合の加水分解を触媒する能力の関数であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
【００６５】
この発明の他の目的および長所は、図および実施例によって、この発明の特定の実施形態が述べられる以下の説明から明らかになるだろう。
（図面の簡単な説明）
図１は、いくつかの癌および非癌細胞株に特異的な６ＢＤ−２５、５ＬＡＣ−２３、および抗Ｆａｓ（陽性対照）抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図２は、ＳＷｌ１１６大腸癌予防モデルの腫瘍成長に関する６ＢＤ−２５の効果を示すもので、破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図３は、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌予防モデルにおける体重に対する６ＢＤ−２５の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図４は、６ＢＤ−２５または緩衝液対照による処置後の腫瘍担持マウスの生存を示す。後処理２４０日以上の生存について、マウスの観察をおこなった。
図５Ａおよび５Ｂは、アイソタイプ対照（パネルＡ）または５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）のいずれかで染色したＯＶＣＡＲ−３細胞から作られた全細胞可溶化物（Ｔ）および細胞質分画（Ｃ）のウエスタンブロットを示す。異なったバンドを５ＬＡＣ−２３で検出して黒矢印で示す。
【００６６】
図６Ａおよび６Ｂは、二次元電気泳動によって分離されるＯＶＣＡＲ−３細胞質タンパク質のウエスタンブロットを示す。パネルＡはＩｇＭアイソタイプ対照でプロービングされたブロットを示し、パネルＢは５ＬＡＣ−２３でプロービングされたブロットを示す。
図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質タンパク質の二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。パネルＡは、細胞質分画の銀染色ゲルを示す。パネルＣが５ＬＡＣ−２３によって認識されるタンパク質の位置を示す一方で、パネルＢはアイソタイプ対照抗体でプロービングされた類似のブロットを示す。矢印は、５ＬＡＣ−２３によって認識されるスポットに対応する。
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ａ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｆ−１８（Ｂ）、ＩｇＭアイソタイプ対照（Ｃ）、および５ＬＡＣ−２３（Ｂ）でプロービングされたＯＶＣＡＲ−３細胞質分画のウエスタンブロットを示す。
図９Ａおよび９Ｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞由来の細胞質タンパク質の二次元ウエスタンブロットを示す。ブロットＡの矢印は、５ＬＡＣ−２３が結合する主なスポットを示す。ブロットＢの線は、抗３７ＬＲＰ（Ｈ−１５０）抗体のために特異的であるスポットを示す。ブロット上で明らかにされる他のスポットは、抗体のアイソタイプまたは使用される二次抗体との相互作用に起因する。
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、および１０Ｄは、３７ＬＲＰをコードするヒトｃＤＮＡクローン発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ）によってトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の５ＬＡＣ−２３（下段）およびＩｇＭアイソタイプ対照（上段）による免疫染色を示す（１０倍）。フージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）試薬（カラムＡ）単独あるいは増加したｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ量（カラムＢでは１μｇ、カラムＣでは２μｇ、カラムＤでは４μｇ）による細胞のトランスフェクションを示す。陽性細胞（茶色）数の増加は、細胞が５ＬＡＣ−２３で染色されたプラスミド数の増加によって知ることができる。
【００６７】
図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、３７ＬＲＰをコードするヒトｃＤＮＡクローン発現プラスミド（（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ；２μｇ）でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の免疫染色を示す（４０倍）。細胞を、５ＬＡＣ−２３（Ａ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ｂ）、および抗６７ＬＲ抗体ＭＬｕＣ５（Ｃ）で染色し、全ての免疫染色で陽性細胞を見ることができる。
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、ウエスタンブロットによって種々の抗体により検出された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのヒト３７ＬＲＰの発現を示す。反応混合物に含まれるプラスミドは、Ｃ末端Ｈｉｓ６−タグ（レーン１）、ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（３７ＬＲＰ；レーン２）、およびｐＩＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｉｓ６（Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグを有する３７ＬＲＰ；レーン３）を含む対照ベクターＧＦＰである。ブロットをＩｇＭイソタイプ対照（パネルＡ）、５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）、および抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（パネルＣ）でプロービングした。
図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、５ＬＡＣ−２３（下段）およびＩｇＭイソタイプ対照（上段）によって染色されたパラフィン包埋組織を示す。切片は正常胃（カラムＡ）、正常肝（カラムＢ），および肝細胞癌（柱Ｃ）から採取したものである。
図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、対応した正常組織（上段）および腫瘍組織（下段）から得た凍結保存肝臓組織に対する種々の抗体の結合を示す。使用した抗体は、ＩｇＭアイソタイプ対照（カラムＡ）、５ＬＡＣ−２３（カラムＢ）、および抗サイトケラチン８（カラムＣ）であった。
図１５Ａおよび１５Ｂは、５ＬＡＣ−２３（）およびＩｇＭアイソタイプ対照（）による正常肺上皮細胞株Ｂｅａｓ−２Ａの免疫組織化学染色を示す。ビトロゲン存在下（カラムＢ）またはビトロゲン非存在下（カラムＡ）で細胞を増殖させた。
図１６Ａおよび１６Ｂは、非還元条件下でウエスタンブロッティングによって検出されるいくつかの腫瘍および形質転換細胞株における抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ａ）および５ＬＡＣ−２３（Ｂ）のエピトープ発現を示す。細胞株は、野生型ＣＨＯ細胞（レーン１）とヒト細胞株ＨＢ４ａＲ４．ａ（レーン２）、ＨＭＴ  ３５２２（レーン３）、ＭＣＦ−７（レーン４）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン５）；  ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（レーン６）、ＯＶＣＡＲ−３（レーン７）、Ｃｈａｎｇ’ｓ  Ｌｉｖｅｒ（レーン８）、ＨｅｐＧ２（レーン９）；  Ａ３７５（レーン１０）、ＤＬＤＩ（レーン１１）、ＬＳ１７４Ｔ（レーン１２）、およびＳＷ６２０（レーン１３）とを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】
【００６８】
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株：６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３
ハイブリドーマ細胞株６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３を、ブダペスト条約に従って、それぞれ寄託番号ＰＴＡ−５６９１およびＰＴＡ−５６９０として、２００３年１２月９日に米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209）に寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８によれば、寄託は、寄託材料の公衆による利用可能性にかけられたすべての制限を特許の付与によってただちに変更不能なかたちで取り去ることを保証するものである。６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３のクローンの輸送、上清および細胞ＥＬＩＳＡスクリーニングは既に米国特許第６，６５７，０４８号に記載されている。
回収および再播種を週２回おこないながらＣＬ−１０００フラスコ（BD Biosciences, Oakville, ON）でハイブリドーマを培養することで、６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３モノクローナル抗体を生産した。抗体の精製は、プロテインＧセファロース４ファスト・フロー（Amersham
Biosciences, Baie d'Urfe, QC）で標準的な精製手段にもとづいて精製した。
【００６９】
６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３を、いくつかの陽性（抗Ｆａｓ（EOS9.1、ＩｇＭ、カッパ、20μｇ／ｍｌ, eBioscience, San Diego, CA）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ、カッパ、５μｇ／ｍｌ、Cedarlane,
Hornby, ON）、シクロヘキシミド（１００マイクロモル、Sigma, Oakville, ON）、ＮａＮ３（０．１％、Sigma,
Oakville, ON））と陰性（１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０μｇ／ｍｌ、BD Biosciences, Oakville, ON）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０μｇ／ｍｌ、BD
Biosciences, Oakville, ON）、G155- 178（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０μｇ／ｍｌ、BD Biosciences,
Oakville, ON）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０μｇ・ｍｌ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０μｇ／ｍｌ）、ＩｇＭ緩衝液（２％）、ＩｇＭ緩衝液（２％））対照群と細胞毒性アッセイで比較した（表２）。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  （ＭＢ−２３１）  、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  （ＭＢ−４６８）  、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ  １１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）、前立腺癌（ＰＣ−３）、および非癌（ＣＣＤ−２７ｓｋ、Ｈｓ８８８．Ｌｕ）細胞株を調べた（全ての入手先はATCC,
Manassas, VA）。生／死細胞毒性アッセイは、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes） (Eugene,OR)から入手した。このアッセイを製造元の指示にしたがっておこない、その際、以下に概説した変更を加えた。アッセイに先立って適当な所定の密度で細胞を播種した。２日後、精製抗体または対照群を培地で希釈し、１００μｌを細胞プレートに移し、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間、インキュベートした。次に、プレートを反転させて空にして拭き取ることで乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有の室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズボトルから各ウエルに分注し、３回軽くたたき、反転により空にし、さらに拭き取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで希釈した蛍光カルセイン染料５０μｌを各ウエルに点火し、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃、３０分間にわたりインキュベートした。プレートをパーキン／エルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００蛍光プレート・リーダーで読み取り、データをマイクロソフト・エクセル（Microsoft
Excel ）で解析し、その結果を表１にまとめた。データは、三重に試験した４回の実験の平均を表し、以下のようにして定量的に示した。すなわち、閾値細胞毒性よりも大きい実験回数が４／４の場合を（＋＋＋）、閾値細胞毒性よりも大きい実験回数が３／４の場合を（＋＋）、閾値細胞毒性よりも大きい実験回数が２／４の場合を（＋）とした。表１中の無印の細胞は、一貫性のないもの、または閾値細胞よりも低い効果のものを示す。表１に示す無印の細胞は、細胞毒性が一貫しないものまたは細胞毒性よりも低い効果を示す。化学的細胞毒性剤がそれらの予想される細胞毒性を誘発した一方で、比較のために含まれた他のいくつかの抗体もまた、予想通りに実行され、生物学的細胞アッセイに限定が与えられた。６ＢＤ−２５抗体は、乳癌、卵巣癌、および大腸癌細胞株で選択的に細胞毒性を示した一方で、非形質転換正常細胞に対しては何ら効果を持たない。５ＬＡＣ−２３抗体は、選択的に卵巣癌細胞株で細胞毒性を示したが、同様に非形質転換正常細胞に対しては何ら効果を持たない。すべての癌細胞の種類が影響を受けやすいというわけではないことから、抗体６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３の活性は選択的であった。さらに、６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３は、重要な治療因子である非癌細胞型に対する細胞毒性を産生しなかったことから、機能的特異性を示した。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
前述した癌細胞株および正常細胞株のパネルに対する６ＢＤ−２５の結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。ＦＡＣＳのための細胞の調製は、最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない）で洗うことによっておこなった。細胞解離緩衝液（INVITROGEN, Burlington, ON）を次に使用して、３７℃で細胞培養プレートから細胞を除去した。遠心および回収をおこなった後、細胞をＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、および２５％胎仔牛血清を含むダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（４℃）に再懸濁し、計数し、適当な細胞密度に等分し、遠心により沈降させて細胞をペレット化し、さらに、６ＢＤ−２５（ビオチンと複合体化または非複合体化）、５ＬＡＣ−２３、または対照抗体（イソタイプ対照または抗Ｆａｓ）を含む染色培地（ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳ）に、２０μｇ／ｍｌで氷上、３０分間、再懸濁した。６ＢＤ−２５とビオチンとの複合体化をビオチン標識試薬（ピアスＥ２結合スルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）（Pierce E2-Link
Sulfo-NHS-LC-biotin、Rockford, IL）を用いておこなった。ビオチン標識試薬を６ＢＤ−２５よりも２０倍モル過剰で添加し、振とうさせながら室温で２時間インキュベートした。次に、ビオチニル化６ＢＤ−２５をＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。アレクサ・フルーア（Alexa
Fluor 488）結合二次抗体（非結合一次抗体用）またはストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン結合二次抗体（ビオチン標識６ＢＤ−２５用）の添加に先立って、細胞を洗浄培地で一回洗った。次に、適当な二次抗体を含む染色培地を２０分間にわたり添加した。続いて、最終回として細胞を洗い、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含む染色培地に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリーによる獲得は、セルクエスト・ソフトウェア（CellQuest
software）（BD Biosciences, Oakville, ON）を使用するＦＡＣスキャン（FACScan）にかけることで評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器で電圧利得および振幅利得を調整することによって、設定した。３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２、およびＦＬ３）の検出器を、精製アイソタイプ対照抗体、続いて適当な二次抗体で染色した細胞を流すことで、細胞が蛍光強度中央値が約１ないし５単位の均一なピークを持つように、設定した。生細胞を、ＦＳＣおよびヨウ化プロピジウム排除のためにゲーティングすることによって、獲得した。各々の試料に対して、分析用に約１０，０００個の生細胞を獲得した、結果を表３に示した。表３は、アイソタイプ対照よりも倍増した平均蛍光強度をまとめたものであり、定量的に以下のように表した。すなわち、１．５未満の場合を（−）、１．５ないし２の場合を（＋）、２ないし３の場合を（＋＋）、３ないし１０の場合を（＋＋＋）、および１０を上回る場合を（＋＋＋＋）とした。
【００７２】
６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３抗体の表わすヒストグラムは、図１用に編集した。非結合型６ＢＤ−２５は、まず最初に、ＦＡＣＳによって検査された任意の細胞株に結合しなかった。しかし、ビオチンと６ＢＤ−２５との複合体を形成することによってアッセイ感度を増加させた後に、低レベルの抗原がＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｃ−１３、ＯＶＣＡ−４２９、およびＯＶ２００８癌細胞の表面上に存在することが証明された。ＦＡＣＳによって、５ＬＡＣ−２３は大腸癌細胞株ＳＷ６２０に対する高かつ特異的な結合を見せた。６ＢＤ−２５および５ＬＡＣ−２３に関して、このことは、結合の程度がその同族の抗原の抗体連結反応の結果を必ずしも予測するものではないという証拠であり、それは自明でない発見であった。このことは、ことなる細胞での抗体ライゲーションのコンテクストが、まさに抗体結合よりも、むしろ細胞毒性で決定的なことを示唆した。
【００７３】
【表３】
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【実施例２】
【００７４】
生体内（in vivo）の大腸予防的腫瘍実験  
図２に示すデータに関して、４ないし８週齢メスＳＣＩＤマウスに５００万個のＳＷ１１１６ヒト大腸癌細胞を含む１００μｌの生理食塩水を襟首に皮下に注射して移植した。マウスを１０匹ごとに２つの処置群に分けた。移植前日に、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、および２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを含む希釈剤でストック濃度を希釈した後に、３００μｌの量で、２０ｍｇ／ｋｇの６ＢＤ−２５試験抗体または緩衝液対照を腹腔内投与した。次に、同じ方法で７週間にわたり、週に１回、抗体の投与をおこなった。
【００７５】
腫瘍の成長は、個々の動物がカナダ動物愛護協会（Canadian Council for Animal Care）(CCAC)の評価項目に達するまで、あるいは１１２日目まで、最大１６週間にわたって７日毎に、カリパスでおおざっぱに測定した。動物の体重を本研究期間中、測定した。研究終了時、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインにしたがって安楽死させた。
【００７６】
研究期間中、毒性の臨床兆候はなんら見られなかった。独自の試験試料を使用してデータの分析をおこない、平均値の同等性に関してｔ検定を用いて、有意性を決定した。５０日目（最終処置の１日後）に、６ＢＤ−２５処置群の腫瘍容積が緩衝液対照群の５４パーセント（ｐ＝０．００１）であった。腫瘍の成長遅延は、処置期間終了後も続いた。１１２日目（処置後６３日目）で、抗体処置群の腫瘍容積は緩衝液対照の５９パーセント（ｐ＝０．００２）であった。要約すると、６ＢＤ−２５抗体処置は、ヒト大腸癌の周知のモデルで、緩衝液対照と比較して、全身腫瘍組織量を減少させた。これらの結果は、ヒトを含む他の哺乳動物の治療として、この抗体（６ＢＤ−２５）に潜在的な薬理学上および製薬上の利点があることを示唆している。
【実施例３】
【００７７】
生体内（in vivo）卵巣予防的腫瘍実験
図３および４に示すデータに関して、４ないし８週齢メスＳＣＩＤマウスに５００万個のＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞を含む１００μｌの生理食塩水を腹腔内注射して移植した。マウスを１０匹ごとに２つの処置群に分けた。移植翌日に、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、および２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを含む希釈剤でストック濃度を希釈した後に、３００μｌの量で、２０ｍｇ／ｋｇの６ＢＤ−２５試験抗体または抗体緩衝液を腹腔内投与した。次に、同じ方法で９週間にわたり、週に１回、抗体の投与をおこなった。
【００７８】
体重は、個々の動物がカナダ動物愛護協会（Canadian Council for Animal Care）(CCAC)の評価項目に達するまで、あるいは７６日目まで、最大１１週間にわたって７日毎に、おおざっぱに測定した。動物の体重を本研究期間中、記録した。研究終了時、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインにしたがって安楽死させた。
【００７９】
研究期間中、毒性の臨床兆候はなんら見られなかった。腫瘍発達（図３）の代用指標として体重を用いた。体重増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。有意性を、ダネットのｔ検定を使用して測定した。移植後８０日目（処置後１６日目）に、６ＢＤ−２５処置群のマウスは緩衝液対照群よりも体重が有意に低かった（ｐ＝０．００２）。また、ログ・ランキング試験により決定されたように、緩衝液対照と比較して６ＢＤ−２５処理によって生存が高められた(図４）。対照群のマウスは、生存期間の中央値が、６ＢＤ−２５処置群では１０７．５日であったのに対して、８７．０日であった（ｐ＜０．０２）。また、緩衝処理群のすべてのマウスは、移植後１２０日目（処置後５６日目）で致死した。抗体処置群では、処置後２５０日目（処置後１２０日）で１匹のマウスが生存し続けた。要約すると、６ＢＤ−２５抗体処置は、ヒト癌疾患のもう一つの周知のモデルで、緩衝液対照と比較して、全身腫瘍組織量を妨げた。６ＢＤ−２５も、卵巣異種移植片モデルでの生存を高めた。
【００８０】
全体として、６ＢＤ−２５はＳＣＩＤマウスの結腸および卵巣癌の予防的腫瘍異種移植片モデルで腫瘍成長を抑制する上で、緩衝液対照よりも有意に効果的である。６ＢＤ−２５による処置も、ヒト卵巣癌疾患の周知のモデルの延命効果を示したことから、ヒトを含む他の哺乳動物の治療にとって、この抗体が薬理学上および製薬上の利点があることが示唆された。さらにまた、ＳＷｌ１１６およびＯＶＣＡＲ−３細胞上での抗原発現が検知不可能または低いレベルであることは、抗原発現のレベルが生体内での有効性と必ずしも相関するわけではないことを示唆している。
【実施例４】
【００８１】
ウエスタンブロッティングによる結合タンパク質の同定
抗体５ＬＡＣ−２３抗体によって認識される抗原を同定するために、この抗原を発現する細胞可溶化物および細胞質分画をゲル電気泳動にかけ、膜に移した。ウエスタンブロッティングを用いてこの抗体によって検出されたタンパク質の決定に用いた。
１．１  一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【００８２】
以前の研究で、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３に対する５ＬＡＣ−２３の結合が弱いことをＦＡＣＳ分析によって明らかになり、しかも５ＬＡＣ−２３がこの細胞株に対して細胞毒性効果を有することが示された（米国特許出願第１０／８１０，１６３号、この出願の内容全体を本明細書中に援用する）。ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に調製し、その一方で細胞分画を、Ｍｅｍ−ＰＥＲ真核膜タンパク質抽出キット（カタログ番号89826; Pierce; Tattenhall, Cheshire, UK）を用いて、作製した。生親水性分画を膜成分の除去によって事実上濃縮し、細胞質分画とした。プロテアーゼインヒビター（ＳＩＧＭＡ  Ｐ８３４０）を、すべての細胞溶解ステップに含ませた。細胞標品のアリコートを１２％ゲル上に載せ、３０分間６０Ｖで泳動させ、続いて染料の前線がゲルの底に達するまで１５０Ｖで泳動させた。ゲルに対して、ノベックスＸセルＩＩブロット・モジュール（NOVEX
Xcell II Blot Module）（Invitrogen, Paisley, UK）を用いて、２時間にわたり３０Ｖでタンパク質をＰＶＤＦ膜に移すための準備をおこなった。転送後、膜を５％スキムパウダーを含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（０．５％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）含有）で４℃、一晩にわたりブロック処理した。膜を、室温で４時間、一次抗体でインキュベートした。一次抗体は5LAC-23（5μg/ｍｌ）およびアイソタイプ対照（マウス抗トリニトロフェノール、ＩｇＭ、K;クローンＧ１５５−２８８；カタログ番号553472、BD
PharMingen;  Oxford, Oxon, UK;  ５μｇ／ｍｌ）を含んだ。膜をTBSTで3回洗った後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異抗体）（１／１０，００００；カタログ暗号１１５−０３５−０７５、Jackson
Immunologicals West Grove, PA, USA）と１時間にわたりインキュベートした。膜を５回洗った後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham）を用いてＨＲＰを検出した。
【００８３】
ＯＶＣＡＲ−３細胞の細胞質分画に対する５ＬＡＣ−２３の結合は、黒矢印で示すように分子量約４０ｋＤａのバンド（図５）を生じた。このバンドは、ＯＶＣＡＲ−３細胞から作られた全細胞可溶化物では、非常に弱かったことから、抗原が細胞質分画を生成して濃縮され得ることを意味している。バンドは、５ＬＡＣ−２３に対する相互作用が特異的だったことを示しているアイソタイプ対照によっては検出されなかった。主要なバンドが約７０ｋＤでも観察されたにもかかわらず、このバンドはより弱い強度でアイソタイプ対照でも検出された。この実験から、５ＬＡＣ−２３は特に約４０ｋＤのタンパク質と結合することが明らかである。
【００８４】
２．二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
前述のようにして調製した全細胞質タンパク質を、プラス・ワン・２−Ｄクリーンアップ・キット（Plus One 2-D Clean-Up Kit (カタログ番号80-6484-51；Amersham, Little
Chalfont, Bucks, UK）を用いて沈降させた後、ｐＨ範囲３〜１０の両性電解質を含む再水和緩衝液に再懸濁した。再水和溶液（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ；Amersham）の存在下、７ｃｍ固定化ｐＨ３〜１０勾配（ＩＰＧ）ベースの小片（Amersham,
Little Chalfont, Bucks, UK）によって、一次等電点電気泳動（ＩＥＦ）をＩＰＧｐｈｏｒ（Amersham）上で実施した。電圧限度は再水和を生じさせる14時間にわたって30V、続いて1時間にわたって200V、1時間にわたって500V、30分間にわたって1000V、さらに8000Vhに達するまで8000Vであった。IEF分離後、小片を15分間にわたり、2.5%IAAとともにDTTなしでSDS-PAGE平衡化緩衝液で平衡させた。小片を10%ゲル上に配置し、0.5%アガロースに封入した。SDS-PAGEを３０分間、６０Ｖで駆動し、続いて染料の前線がゲルの底に達するまで１５０Ｖで駆動した。ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移すために、ゲルの調製をおこなった。フーハーＴＥ７７セミ・ドライ・トランスファー・ユニット（Hoefer
TE 77 Semi-Dry Transfer Unit） (Amersham)を用いて、調製した。
【００８５】
転送後、膜を５％スキムパウダーを含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（０．５％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）含有）で４℃、一晩にわたりブロック処理した。膜を、室温で４時間、一次抗体でインキュベートした。一次抗体は5LAC-23（5μg/ｍｌ）およびアイソタイプ対照（マウス抗トリニトロフェノール、ＩｇＭ、Ｋ；クローンＧ１５５−２８８；カタログ番号553472、BD
PharMingen;  Oxford, Oxon, UK;  ５μｇ／ｍｌ）を含んだ。膜をTBSTで3回洗った後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異抗体）（１／５０００〜１０，００００；カタログ暗号１１５−０３５−０７５、Jackson
Immunologicals West Grove, PA, USA）と１時間にわたりインキュベートした。膜を５回洗った後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham）を用いてＨＲＰを検出した。
【００８６】
図６は、５ＬＡＣ−２３とインキュベートしたＯＶＣＡＲ−３細胞質分画から得られるウエスタンブロットを示す。アイソタイプ対照とインキュベートして得られたブロット（図６ａ）と比較して、一つの異なったスポットが、５ＬＡＣ−２３でプロービングされたブロットで見られる（図６ｂ）。固有のスポットを矢印で示すとともに、該スポットは３６ｋＤタンパク質マーカーに類似した分子量による酸性ｐＩを有する。
【００８７】
５ＬＡＣ−２３が酸性タンパク質に結合してタンパク質スポットの分離を改善し、また後に続くマススペクトル分析に十分なタンパク質が得られるように、より大きな細片（１８ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、二次元電気泳動法を繰り返した。５ＬＡＣ−２３は、タンパク質スポットの分離を改善して、以降のマススペクトル分析のために十分なタンパク質を得ることが可能であるために、酸性タンパク質と結合した。再水和およびＩＥＦは、プログラムされた設定によって実施した（すなわち、３０Ｖ１４時間、２００Ｖ３０分、５００Ｖ３０分、勾配上で１０００Ｖ１時間、勾配上で６５００Ｖ３時間、８０００Ｖ）。全Ｖｈは、５４，０００〜６０，０００であった。ＩＥＦ分離後、細片を１５分間、２．５％ＩＡＡを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡化緩衝液で平衡させた。細片を１２％ゲル上に配置し、０．５％アガロースで封入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを６０Ｖで一晩実行した。ＭＳ分析と互換性がある製造元の指示に従ってゲルの一つをプラスワン銀染色キット（PlusOne Silver Staining kit）（カタログ番号１７−１１５０−０１、Amersham０を用いてタンパク質染色した。上記したようにタンパク質をＰＶＤＦ膜に移すための他のゲルを調製した。上記したように、膜を５ＬＡＣ−２５およびアイソタイプ対照を用いて、プロービングした。移した後、該ゲルもまた、上記したようにタンパク質の染色をおこない、タンパク質スポットの配列を促した。  
【００８８】
５ＬＡＣ−２３が結合するＯＶＣＡＲ−３細胞質分画由来のタンパク質スポットは、図７にはっきりと見ることができる。図７ａは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質分画の銀染色ゲルを示す。図７ｂは、アイソトピック対照がいかなるタンパク質スポットにも結合せず、一方で単一の異なるスポットが３６ｋＤタンパク質マーカーに類似の分子量を持つ５ＬＡＣ−２３（図７ｃ）によってプロービングされたブロットにはっきりと見えた。５ＬＡＣ−２３の結合は、スポットがアイソタイプ対照（図７ｂ）によって検出されなかったことから特異的であった。この実験から、５ＬＡＣ−２３が結合した抗原性部位は約３６ｋＤであり、酸性ｐＩを有したことが確認された。
【実施例５】
【００８９】
質量分析による結合タンパク質の同定
５ＬＡＣ−２３によって認識される３７−４ＯｋＤタンパク質スポットに対応しているゲルの領域を、滅菌されたピペットを用いて切り出した。次に、ゲル・プラグを質量分析によるタンパク質の同定に使用した。
【００９０】
試料をＭＷＧロボセク（Ｒｏｂｏｓｅｑ）４２０４ロボット（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてトリプシンによるゲル消化にかけた。１％ギ酸および２％酢酸によりゲル・プラグからペプチドを放出させた。結果として得られる消化上清の一部を、ペプチド分離用の７５ｍｍＣ１８カラムを用いたマイクロマスＱ−ＴＯＦグローバル（（ＭｉｃｒｏＭａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｇｌｏｂａｌ）上で分析した。データをＭＡＳＣＯＴを用いて検索した。
５ＬＡＣ−２３によって認識されたゲルの領域においてＭＳ分析により同定されたタンパク質を表４に示す。質量分析により同定された５ＬＡＣ−２３に対する抗原は、ラミニン１受容体であった。
【００９１】
【表４】
2007530460.tif 000030
【実施例６】
【００９２】
５ＬＡＣ−２３に対する抗原の確認  
１．  共局在化検査による確認  
推定抗原の確認は、既知の抗３７ＬＲＰ抗体が５ＬＡＣ−２３と一緒に局在化することができたかどうか決定することによって促進された。ＯＶＣＡＲ−３細胞由来の細胞質分画のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上にブロッティングした。ウェスタンブロッティングを、上記したように、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにおこなった。一次抗体は、５ＬＡＣ−２３（５μｇ／ｍｌ）、ＩｇＭアイソタイプ対照（上記したように、５μｇ／ｍｌ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（０．２μｇ／ｍｌ、カタログ番号ｓｃ−２０９７９；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ，  ＵＳＡ、この抗体として、ヒト３７ＬＲＰのＡＡ  １１０−２５０に対応している組換えタンパク質に対して生じた）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｆ−１８（０．４μｇ／ｍｌ、カタログ番号．  ｓｃ−２１５３４；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および正常ウサギＩｇＧ  （０．２  μｇ／ｍＬ、カタログ番号．ＡＢ−  １０５−Ｃ；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；  Ａｂｉｎｇｄｏｎ，  Ｏｘｏｎ，  ＵＫ）が含まれた。二次抗体として、ＩｇＭを検出するための上記ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（１／５０００−１０，０００；  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＨＲＰ結合抗ウサギ免疫グロブリン（１／２０００；カタログ番号Ｐ０４４８；ＤＡＫＯ，  Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、およびＨＲＰ結合抗ヤギ免疫グロブリン（１／２０００；  カタログ番号．Ｐ０４４９）が含まれた。
【００９３】
２つの抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０およびＦ−１８）は、近似のＭＷ  ４０ｋＤを有するバンドに結合した（図８Ａおよび８Ｂ）。５ＬＡＣ−２３も、同程度の大きさ（図４Ｄ）のバンドと結合するが、ＩｇＭアイソタイプ対照は、そのよなバンドと結合しないことから、このタンパク質による５ＬＡＣ−２３の相互作用が特異的であることが確認される。
【００９４】
ＯＶＣＡＲ−３細胞由来の細胞質タンパク質の二次元ウエスタンブロッティングを、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのセクションに記載されたようにして調製したが、この際、ＩＥＦを、ｐＨ範囲を制限するために等電点（ｐＩ）３．５〜５でファーミレートを使用した。ブロッティングに使用した一次および二次抗体を上記のように記載した。
【００９５】
ウエスタンブロットに対する５ＬＡＣ−２３およびＨ−１５０の結合を図９に示し、適当なアイソタイプ対照（データ不図示）によってプロービングされたブロットと比較した。５ＬＡＣ−２３によって認識されるタンパク質スポットは図９Ａに表されており、黒矢印によって示される。抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０）は、５ＬＡＣ−２３も結合したゲル近傍に一致する黒線（図９Ｂ）によって強調されるタンパク質のより幅広いスミアと結合した。それは、おそらく、Ｈ−１５０によって認識されるスミアが少なくとも３つのタンパク質スポットを含んでおり、タンパク質の異なるイソ型がＯＶＣＡＲ−３細胞由来の細胞質分画に存在することを示すと思われる。ブロットの上で検出される他のタンパク質は、抗体または二次抗体のアイソタイプによる相互作用に起因し、５ＬＡＣ−２３およびＨ−１５０のいずれに対しても特異的でない。抗３７ＬＲＰ抗体および５ＬＡＣ−２３が約４ＯｋＤのタンパク質に結合することで、３７ＬＲＰが実際に５ＬＡＣ−２３に対する抗原であるというさらなる証拠が得られる。しかし、分子量が類似していたにもかかわらず、５ＬＡＣ−２３はその他の抗３７ＬＲＰ抗体と比較して固有の結合パターンを示した。より制限された結合を示している５ＬＡＣ−２３で、これは２つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。
【００９６】
２．  トランスフェクション試験による確認  
推定抗原の確認を、３７ＬＲＰのｃＤＮＡクローンによってトランスフェクションされた細胞に対して５ＬＡＣ−２３が結合することができたかどうかを判断することで、おこなった。３７ＬＲＰをコードするｃＤＮＡのクローンは、プラスミドｐＣＭＶ６−ＸＬ５（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰとして言及。アイテム番号ＴＣ１０７９３８；  寄託番号：  ＮＭ−００２２９５；  ORIGENE Technologies; Rockville, MA, USA）。pCMV-XL537LRP（カタログ番号.
1988387; Roche Diagnostics; Lewes, East Sussex, UK）による細胞へのトランスフェクションを、製造業者のプロトコルに従ってフュージーン・トランスクリプション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用しておこなった。製造業者のプロトコルに従ってフュージーン・トランスクリプション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して、細胞をｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰでトランスフェクションした。細胞の増殖は、免疫染色前に少なくとも４８時間おこなった。細胞をＰＢＳで二回洗い、その後に氷冷アセトン：メタノール（１：１）で３分間にわたり固定をおこなった。アセトン：メタノールを除去し、細胞を空気乾燥した。それらをＰＢＳで３回洗い、それから３０分間、ＰＢＳで２％ＦＢＳによるブロッキングをおこなった。一次抗体を添加し、細胞を室温で１時間インキュベートした。一次抗体は、５ＬＡＣ−２３（５μｇ／ｍｌ）、ＩｇＭアイソタイプ対照（上記したように、５μｇ／ｍｌ）、抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０；０．２μｇ／ｍｌ：Santa
Cruz Biotechnology）、抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０；０．２μｇ／ｍｌ；Santa Cruz Biotechnology）、抗６７ＬＲ抗体（ＭＬｕＣ５；カタログ番号ａｂ３０９９；４μｇ／ｍｌ；Abeam
limited, Cambridge, Cambs, UK）、および正常ウサギＩｇＧ (0.2 μg/mL; カタログ番号.AB-105-C; R&D
Systems; Abingdon, Oxon, UK）を含んだ。細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、二次抗体（ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ、１／１０００；Jackson
Immunologicals）を添加し、１時間インキュベートした。二次抗体は、ＩｇＭを検出するための上記したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（1/1000;
Jackson Immunologicals）およびＨＲＰ結合抗ウサギ免疫グロブリン (1/200; DAKO)を含んだ。ＨＲＰに先だって３回洗浄した細胞をＤＡＢ基質キット（DAB-Substrate
Kit）（カタログ番号SK-4100; Vector laboratories; Peterborough, Cambs.,UK）を用い、かつ製造元の指示に従って検出した。
【００９７】
免疫染色によって明らかにされることは、ＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ）の量が増加するのに伴って５ＬＡＣ−２３で染色される陽性（茶色）の細胞数が増加することである（図１０）。アイソタイプ対照は、一部のバックグランド染色によってＣＨＯ細胞を染色したが、このことはトランスフェクションの手法に含まれているＤＮＡの量にかかわらず類似しているため（図１０、上列）、その一過性にトランスフェクションする細胞に対する５ＬＡＣ−２３の結合が特異的であることが示される。これらの結果は、５ＬＡＣ−２３の結合タンパク質が３７ｋｄのＬＲＰであることを裏付ける。
【００９８】
５ＬＡＣ−２３によるトランスフェクション細胞染色に加えて、また、２種類の他の抗体で染色される一部の細胞は、３７ＬＲＰおよび６７ＬＲ（図１１）に対して指示した。抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０は、細胞質に局在化している一部のトランスフェクション細胞を認識した（図１１Ｂ）。また、５ＬＡＣ−２３およびＨ−１５０のパターンとは異なるパターンではあるが（図１１Ａおよび図１１Ｃ）、第二抗体ＭＬｕＣ５（６７ＬＲを認識）もまた一部の細胞に結合した（図１１Ｃ）。他の研究者は、ＭＬｕＣ５がトランスフェクションするＣＨＯ細胞と結合するのに失敗したという知見を得た。このことは、実験上の違い（例えば異なるプロモーター、二次抗体またはクローンの使用、あるいは染色法の変形例）に起因するかもしれない。注意すべき点は、ＭＬｕＣ５を染色することは、リソソーム膜とも考えられるコンパートメントに制限されることから、ラミニンとの接触に応じて付着のための受容体の放出が可能になるということである。これらの結果は、トランスフェクションするタンパク質（３７ＬＲＰ）がＣＨＯ細胞でうまく発現されることを裏付ける。これらの結果はまた、６７ＬＲは３７ＬＲＰポリペチドに関連があるという証拠を提供し、ＣＨＯ細胞で合成することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、５ＬＡＣ−２３が６７ｋＤラミニン受容体タンパク質よりむしろ前駆体分子と結合することを示唆しており、なぜなら５ＬＡＣ−２３は、ほぼ３７−４５ｋＤであるタンパク質と結合するからである（実施例４）。トランスフェクション細胞の免疫染色パターンを明らかにしているこの実験の結果は、５ＬＡＣ−２３の位置が主に細胞質であり、ＭｌｕＣ５結合よりもＨ−１５０結合と類似していることを示している。全体として、この証拠の合計は、５ＬＡＣ−２３の抗原が６７ＬＲよりはむしろ３７ＬＲＰ前駆体分子であることを示唆する。
【００９９】
２．  ３７ＬＲＰの細菌発現による確認  
５ＬＡＣ−２３の推定抗原をさらに評価するために、３７ＬＲＰ  ｃＤＮＡを無細胞生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）翻訳系でのタンパク質生合成のための発現ベクターにクローン化した。プラスミドｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ（上記。ＯＲＩＧＥＮＥ）を、プライマー５’−ＧＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣ−３’（合成Ｎｄｅ  Ｉ部位を含む）および５’−  ＣＣＴＡＴＧＣ  ＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＧＡＣＣＡＧ−３’（停止コドンと合成ＳｍａＩ部位を含む）による３７ＬＲＰｃＤＮＡの増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ増幅を、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｅｎｅ）を使用しておこなった。ＤＮＡテンプレートを９４℃で５分間変性させ、続いて３０サイクル（９４℃で４５分間、６０℃で４５分間、７２℃で１分間）をおこない、７２℃で１０分間、延ばした。３７ＬＲＰ−ＰＣＲ産物をｐＩＶＥＸ２．３ｄおよびｐＩＶＥＸ２．４ｄ（カタログ番号０３  ２６９  ０１９  ００１；  Ｒｏｃｈｅ）に、ＮｄＩおよびＳｍａＩ部位を用いてクローン化した。発生したプラスミドは、ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（Ｈｉｓ６−タグのない３７ＬＲＰ）およびｐｒＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｉＳ６（Ｈｉｓ６−タグがＮ末端にある３７ＬＲＰ）を含む。３７ＬＲＰタンパク質の発現を細菌内で無細胞生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）翻訳系を使用し、製造元の指示に従っておこなった（ＲＴＳ１００大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＨＹキット；カタログ番号３１８６  １４８；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｌｅｗｅｓ，  ＵＫ）。反応混合物のアリコートを１０％ゲルに載せ、ニトロセルロース膜へ移した。膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴで４０℃、一晩、ブロックした。一次抗体を添加しブロットを３時間にわたってインキュベートした。ＴＢＳＴで５回洗浄した後、二次抗体を室温で１時間にわたり添加した。一次抗体は５ＬＡＣ−２３（５μｇ／ｍｌ）、ＩｇＭアイソタイプ対照（上記通り。５μｇ／ｍｌ）、抗３７ＬＲＰ抗体（Ｈ−１５０；０．２μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および正常ウサギＩｇＧ（０．２μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。二次抗体は、ＩｇＭを検出するための上記のＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（１／５０００−１０，０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とＨＲＰ結合抗ウサギ免疫グロブリン（１／２０００；  ＤＡＫＯ）とを含む。５回洗浄後、ＨＲＰ結合抗体をＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）した。
【０１００】
ウエスタンブロット分析によって、抗３７ＬＲＰ抗体、Ｈ−１５０、および５ＬＡＣ−２３が、テンプレートが３７ＬＲＰ（（ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ  （３７ＬＲＰおよびｐｒＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｉｓ６）用である場合、細菌反応混合物中で合成されたタンパク質と結合した抗３７ＬＲＰ抗体、Ｈ−１５０、および５ＬＡＣ−２３は、反応混合物に含まれた（図１２）。ＧＦＰを発現している対照プラスミドが反応混合物に含まれた場合、５ＬＡＣ−２３およびＨ−１５０は、反応混合物と結合しなかった。Ｃ末端のＨｉｓ６−タグに対する抗体は、ＧＦＰタンパク質が合成される（データ示さず）ことを確認した。反応混合物は、ｐＩＶＥＸＬＲＰコンストラクトから少なくとも２つのタンパク質産物を生成するように見え、おそらく該コンストラクトに２つの開始コドンあるため（１つはリボゾーム結合部位直後あり、もうひとつはクローニングに使用するＮｄｅＩに含まれた）、あるいは翻訳後修飾によるものと考えられる。５ＬＡＣ−２３およびＨ−１５０が２つの類似のタンパク質バンドを認識するにもかかわらず、結合のパターンはかなり特徴のあるものである。５ＬＡＣ−２３は、可能な翻訳後修飾を示唆しているより多くのスミアとして現れる一番上のバンドと優先的に結合する。Ｈ−１５０は異なったバンドと結合する（各バンドが二重である点に注意する。写真では見えない）。ＩｇＭアイソタイプ対照（図８；パネルＡ）による最上に位置する３７ＬＲＰバンドに対する一部の結合があるように見え、該バンドはタンパク質のオーバーロードによる非特異的結合に起因すると思われる。これらの結果は、さらに、既知の抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０の結合とは異なる３７ｋＤＬＲＰに対する５ＬＡＣ−２３の結合を裏付け、またこの抗体の結合が固有のエピトープにあるという付加的な証拠を提供する。
【０１０１】
ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）のＲＴＳシステムを使用して、いくつかの翻訳後修飾を３７ＬＲＰ産物の生合成から除去することができる。これらは、Ｎ−およびＯ−結合グリコシル化、リン酸化、およびジスルフィド結合形成を含む。他の分子をポリペチド（例えば脂質および硫酸で処理された群）に加えてもよく、また他の分子が５ＬＡＣ−２３が結合するエピトープの一部であってもよいという可能性がある。スキャン・プロサイト（ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ）（Ｅｘｐａｓｙ）は、３７ＬＲＰ配列が多くのリン酸化部位、２Ｎ−ミリストイル化部位、およびチロシン硫酸化部位を持つと予測する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がこの修飾に適応することができないことから、潜在的なミリストイル基を５ＬＡＣ−２３のエピトープから取り除くことができる。５ＬＡＣ−２３がペプチド配列と結合するという点で、リン酸化の欠如は関心のあることかもしれず、この配列は正常なヒト細胞でリン酸化され、かつ腫瘍細胞で脱リン酸化されるので、５ＬＡＣ−２３の抗原を露出させる。
【実施例７】
【０１０２】
冷凍保存された正常組織におけるヒト抗原分布のＩＨＣ検査  
ＩＨＣ研究を冷凍保存組織に対して実施し、正常ヒト組織での５ＬＡＣ−２３抗原の分布を特徴づけた。正常ヒト組織の冷凍保存スライドは、コバンス（Ｃｏｖａｎｃｅ）（ＵＫ）から入手した。該スライドをアセトンで１０分間固定した後、洗浄緩衝液（ＰＢＳと０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、０．６％過酸化水素を含むメタノール中で１５分間インキュベートすることによってブロックした。ブロッキングに先立ってスライドを室温（ＲＴ）で２０分間、１％馬血清で洗った。スライドをさらに２０分間、２％ＢＳＡ（ＳＰ−５０５０；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）でブロッキングした。内因性ビオチン部位を、製造元の指示に従い、アビジン／ビオチン・ブロッキング・キットを使用してブロッキングした（ＳＰ−２００１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）。５ＬＡＣ−２３、抗サイトケラチン−８（Ｍ０６３１  ；  Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、およびＩｇＭ抗ＫＬＨアイソタイプ対照（５５０３４０；  ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、室温（ＲＴ）で６０分間、２％ＢＳＡ／洗浄用緩衝液中、５μｇ／ｍｌで、スライドとともにインキュベートした。インキュベーションに先立ってスライドを、１％馬血清／洗浄用緩衝液中１００：１に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＭビオチン標識二次抗体（Ｂ９２６５  ；  Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ）で３回、室温（ＲＴ）で３０分間、洗った。スライドを３回洗い、マウスＩｇＧベクタステインＡＢＣキット（ＰＫ−６１０２；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）にもとづいて構成したアビジン−ＨＲＰで、室温（ＲＴ）、３０分間にわたってインキュベートした。３回洗った後、製造元の指示書（ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）にもとづいてＤＡＢを用いてスライドを発色させた。水洗浄の後で、スライドをハリスのヘマトキシリンによる対比染色し、脱水前に大量の水で洗い、ＤＰＸ封入剤（Ｍ／Ｄ１１０／０８；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）にマウントした。
冷凍保存正常組織上で、５ＬＡＣ−２３は正常な脳および尿細管では弱く結合するが、試験した他の組織のいずれに対しても結合は見られなかった（表５）。
【０１０２】
【表５】  
2007530460.tif 000031
これらの結果は、５ＬＡＣ−２３に対する抗原が正常細胞では広範に発現されることはないので、該抗原は限られた数のヒト組織にのみ結合することが示唆された。
【実施例８】
【０１０３】
ヒト正常および腫瘍ＩＨＣ
次に、ヒトでの結合の結果をホルマリン固定組織のより広いパネルでの結合を調べることで、広げた。ホルマリン固定パラフィン包埋正常器官および腫瘍アレイ・スライド（ＢＡ３；ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）をアルコールで脱脂した。スライドを軽く洗浄用緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に浸した。抗原回復は、低ｐＨ標的回復溶液中、２０分間にわたりフルパワーでマイクロ・ウエーブ処理によっておこなった（Ｓ１６９９；    Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。内因性過酸化物を、１５分間にわたり０．６％過酸化水素含有メタノールでインキュベートすることで、該内因性過酸化物の活性をブロックした。ブロッキングに先立って、スライドを１％馬血清含有洗浄用緩衝液に２０分間入れることで洗った。内因性ビオチン部位は、アビジン／ビオチン・ブロッキング・キット（ＳＰ−２００１  ；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用い、製造元の指示に従ってブロッキングした。５ＬＡＣ−２３およびＩｇＭ抗体ＫＬＨアイソタイプ対照  （５５０３４０；  ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を１％馬血清洗浄用緩衝液中０．７５μｇ／ｍｌで、スライドガラスとともに室温（ＲＴ）、９０分間、インキュベートした。インキュベーションに先立ってスライドを、１％馬血清／洗浄用緩衝液中１００：１に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＭビオチン標識二次抗体（Ｂ９２６５  ；  Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ）で２回、室温（ＲＴ）で３０分間、洗った。２回洗った後、スライドを、マウスＩｇＧベクタステインＡＢＣキット（ＰＫ−６１０２；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）にもとづいて構成されたアビジン−ＨＲＰで、室温（ＲＴ）、３０分間にわたってインキュベートした。スライドを２回洗った後、ＤＡＢ（ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用いてスライドを発色させた。水洗浄の後で、スライドをハリスのヘマトキシリンによる対比染色し、脱水前に大量の水で洗い、ＤＰＸ封入剤（Ｍ／Ｄ１１０／０８；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）にマウントした。
【０１０４】
表６は、組織をパラフィン包埋した場合に５ＬＡＣ−２３が骨格筋、正常肝、および正常胃に弱く結合することを示す。以前の例の場合のように、５ＬＡＣ−２３結合は、正常組織で制限される。５ＬＡＣ−２３は、最も肝細胞癌（ＨＣＣ）に強く結合し、胃腺癌に対しては弱く結合する。それは、試験した他の正常または腫瘍組織のいずれにも結合しない。ＩＨＣ研究が明らかにしたことは、正常肝および他の正常組織と比較してＨＣＣに対する結合の明らかな違いが存在することである。
【０１０５】
【表６−１】
2007530460.tif 000032
【０１０６】
【表６−２】  
2007530460.tif 000033
【０１０７】
正常胃（カラムＡ）、正常肝（カラムＢ）、および肝腫瘍（カラムＣ）の５ＬＡＣ−２３による染色例は、図１３で見ることができる。いかなる組織ともアイソタイプ対照が結合しないことから、５ＬＡＣ−２３が特異的であることが示される。５ＬＡＣ−２３は細胞の細胞質に対して優先的に結合するが、いくつかの膜性の局在化が観察された。５ＬＡＣ−２３は、正常肝および正常胃に対しての結合がかなり弱いが、悪性の肝臓に対しては強く結合する。
【実施例９】
【０１０８】
ヒト肝腫瘍切片に対する５ＬＡＣ−２３の結合  
ヒト肝癌との５ＬＡＣ−２３抗原の癌関連を決定するために、ＩＨＣ研究をおこなった。ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓アレイ・スライド（ＣＳｌ；  ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をアルコールによって脱脂した。スライドを洗浄用緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）に短時間に浸漬した。原回復は、低ｐＨ標的回復溶液中、２０分間にわたりフルパワーでマイクロ・ウエーブ処理によっておこなった（Ｓ１６９９；    Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。内因性過酸化物を、１５分間にわたり０．６％過酸化水素含有メタノールでインキュベートすることで、該内因性過酸化物の活性をブロックした。ブロッキングに先立って、スライドを１％馬血清含有洗浄用緩衝液に２０分間入れることで洗った。内因性ビオチン部位は、アビジン／ビオチン・ブロッキング・キット（ＳＰ−２００１；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用い、製造元の指示に従ってブロッキングした。５ＬＡＣ−２３およびＩｇＭ抗ＫＬＨアイソタイプ対照  （５５０３４０；  ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を１％馬血清洗浄用緩衝液中０．７５μｇ／ｍｌで、スライドガラスとともに室温（ＲＴ）、９０分間、インキュベートした。インキュベーションに先立ってスライドを、１％馬血清／洗浄用緩衝液中１００：１に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＭビオチン標識二次抗体（Ｂ９２６５  ；  Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ）で２回、室温で３０分間、洗った。２回洗った後、スライドを、マウスＩｇＧベクタステインＡＢＣキット（ＰＫ−６１０２；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）にもとづいて構成したアビジン−ＨＲＰで、室温（ＲＴ）、３０分間にわたってインキュベートした。スライドを２回洗った後、ＤＡＢ（ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用いてスライドを発色させた。水洗浄の後で、スライドをハリスのヘマトキシリンによる対比染色し、脱水前に大量の水で洗い、ＤＰＸ封入剤（Ｍ／Ｄ１１０／０８；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）にマウントした。
【０１０９】
５ＬＡＣ−２３はＨＣＣ切片の７３％に結合し、ＨＣＣ組織アレイ・スライド上で（表７参照）、１つまたは２つ以上の試料内ではあるが、ほんの少しの細胞が染色されただけであった。染色は、主に細胞質だった。５−ＬＡＣ−２３抗原は、他の組織型と比較して、肝臓癌でのみ高度に発現されるのみならず、異なる患者由来の大多数のヒト肝癌で発現される。
【０１１０】
【表７−１】  
2007530460.tif 000034
【０１１１】
【表７−２】  
2007530460.tif 000035
【実施例１０】
【０１１２】
対応させた正常および肝臓染色
対応させた隣接正常および原発性ヒト肝細胞癌肝臓組織の冷凍保存スライド（Ｔ６２３５１４９；  ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を解凍し、空気乾燥した。これらをアセトン中１０分間で固定し、緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で２回洗った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、０．６％過酸化水素を含むメタノール中で15分間インキュベートすることによってブロックした。ブロッキングに先立ってスライドを室温（ＲＴ）で２０分間、１％馬血清で洗った。スライドをさらに２０分間、２％ＢＳＡ（ＳＰ−５０５０；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）でブロッキングした。内因性ビオチン部位を、製造元の指示に従い、アビジン／ビオチン・ブロッキング・キットを使用してブロッキングした（ＳＰ−２００１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）。５ＬＡＣ−２３、抗サイトケラチン８（Ｍ０６３１  ；  Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）およびＩｇＭ抗ＫＬＨ  アイソタイプ対照  （５５０３４０；  ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をスライドともに、２％ＢＳＡ／洗浄用乾燥液中、５μｇ／ｍｌの濃度で室温（ＲＴ）、６０分間にわたりインキュベートした。インキュベーションに先立ってスライドを、１％馬血清／洗浄用緩衝液中１００：１に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＭビオチン標識二次抗体（Ｂ９２６５  ；  Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ）で３回、室温（ＲＴ）で３０分間、洗った。スライドを３回洗い、マウスＩｇＧベクタステインＡＢＣキット（ＰＫ−６１０２；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）にもとづいて構成されるアビジンＨＲＰで、室温（ＲＴ）、３０分間にわたってインキュベートした。３回洗浄した後、ＤＡＢ（ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用いてスライドを発色させた。水洗浄の後で、スライドをハリスのヘマトキシリンによる対比染色し、脱水前に大量の水で洗い、ＤＰＸ封入剤（Ｍ／Ｄｌ１０／０８；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）にマウントした。
【０１１３】
図１４は、同一個体から得た対応した正常および腫瘍組織由来の冷凍保存された肝臓切片を示す。注目すべきことは、サイトケラチン８（パネルＣ）が正常肝細胞に局在化していることであり、また正常細胞への結合が制限されていることであり、いくつかの切片が正常および癌性組織の混ざり合ったものであることが示される。５ＬＡＣ−２３は、腫瘍試料のみに結合し、この切片のなかで悪性組織を表す中心領域に対してのみ特異的である。アイソタイプ対照で染色される場合、切片は陰性であることから、５ＬＡＣ−２３の結合が特異的であることが示される。５ＬＡＣ−２３由来の染色パターンは、患者試料中、抗体が悪性細胞に対して高度に特異的であり、該抗体が魅力的な薬物となり得る。
【実施例１１】
【０１１４】
代替増殖条件による正常細胞における結合の誘導
５ＬＡＣ−２３発現が選択された条件下で、正常細胞で誘発され得るかどうかを調べるために、実験をおこなった。Ｂｅａｓ−２Ｂ「正常」肺上皮細胞は、ビトロゲン（０．０３ｍｇ／ｍｌビトロゲル（ｖｔｉｒｏｇｅｌ；Ｃｏｈｅｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）をコーティングしたフラスコおよび該ビトロゲンをコーティングしていないフラスコで増殖した。細胞を、９５％空気／５％ＣＯ２（３７℃）で、気管支上皮細胞増殖培養液（ＣＣ−３１７０；  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で増殖させた。約８０％コンフルエントとなった時、細胞解離溶液（ＳＩＧＭＡカタログ番号Ｃ５９１４）で細胞を取り出し、ＰＢＳで２回洗浄し、３０分にわたり１０％ホルマリンで固定した。パラフィンワックスに懸濁する前にアルコールで細胞ペレットの脱水をおこない、６０分間にわたり４５０℃でインキュベートしたパラフィンワックスで４５℃、６０分間、インキュベートすることで、３回リフレッシュさせた。冷却および硬化後、３μｍ切片をライカ（Ｌｅｉｃａ）ＲＭ２１３５マイクロトームで切り出し、ガラス・スライド上にベーイキングした。上記の対応させられた肝臓試料に関しては、切片を５μｇ／ｍｌの５ＬＡＣ−２３またはＩｇＭイソタイプ対照で染色した。
【０１１５】
正常肺上皮細胞株Ｂｅａｓ−２Ｂに対する５ＬＡＣ−２３の結合は、ビトロゲンで細胞が増殖する場合のみに見られる（図１５）。ＩｇＭアイソタイプ対照の結合がみられないことから、5LAC-23の結合が特異的であることが示される。これらの結果は、特定の条件下、例えば成育因子、接着分子、および細胞間マトリックス分子の存在下では、正常細胞においてさえ、５ＬＡＣ−２３抗原の発現を誘発することができる。これらの増殖条件下での異常は、しばしば悪性および前悪性状態で生じ、３７ＬＲＰの発現変化、例えば肝細胞癌で見られる変化に関与していると考えられる。
【実施例１２】
【０１１６】
ウエスタン分析による種々のヒト細胞株での５ＬＡＣ−２３の分布
ヒト細胞株の調査は、ウエスタン分析を用いて３７ＬＲＰの分布および５ＬＡＣ−２３のエピトープを評価することによって、おこなわれた。細胞可溶化物をプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液中でいくつかのヒト腫瘍または形質転換細胞株から調製し、ウエスタンブロットを一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのセクションで説明したように調製した。ライセートの調製は、乳癌細胞株ＨＢ４ａＲ４．ａ（Ｒａｓによって形質転換された正常乳房細胞）、ＨＭＴ３５２２（正常細胞）、ＭＣＦ−７（腫瘍細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（腫瘍細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（乳房腫瘍からの脳転移）、卵巣腫瘍細胞株OVCAR-3、肝細胞株Chang's LiverおよびHepG2、メラノーマ細胞株Ａ３７５、および結腸腫瘍細胞株ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ、およびＳＷ６２０からおこなった。３７ＬＲＰタンパク質がチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus; NCBI 寄託番号: 298088）から既に記載されていたことから、野生型ＣＨＯ細胞もまた含まれた。共局在化のセクションで述べられたように、ブロットをＨ−１５０または５ＬＡＣ−２３のいずれかでプロービングした。
【０１１７】
抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０は、試験した全ての細胞株のタンパク質バンドを認識するもので、該細胞として野生型ＣＨＯ細胞が挙げられる（図１６Ａ）。注目すべきことは、少なくとも２つのタンパク質バンドが、Ｈ−１５０によって検出される大腸細胞株ＤＬＤ−１に存在することであり、異なるヒト・アイソフォームの存在を示している。Ｈ−１５０および５ＬＡＣ−２３をともにウエスタンで類似サイズのバンドに結合し、５ＬＡＣ−２３はＨ−１５０とは異なるパターンで細胞可溶化物に結合する（図１６Ｂ、レーン１２）。Ｈ−１５０は、細胞株の全てで３７ＬＲＰを検出し、５ＬＡＣ−２３のエピトープの発現が異なる細胞可溶化物全体で変化し、その一部での変化は存在しない。この抗体間の違いは、抗原に対するＨ−１５０と比較して、抗原に対する５ＬＡＣ−２３の低親和性によるものではなく、なぜならＣＨＯ細胞可溶化物に対する両方の抗体の結合が類似しているからである。５ＬＡＣ−２３は、非還元条件下でＬＳ１７４Ｔライセートにある約１１０ｋＤの固有のスミアを検出する。このスミアは還元条件下で消えるが、３７ＬＲＰ前駆体（示されないデータ）に対応しているバンドの増加はない（データ不図示）。既知の抗ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０と比較して、存在するこれらの結果は、３７ＬＲＰ上で５ＬＡＣ−２３に認識されるエピトープが固有であるというさらなる証拠を提示する。
【０１１８】
５ＬＡＣ−２３は免疫組織化学（トランスフェクションのセクション、実施例６）によって野生型ＣＨＯ細胞と結合しなかったが、還元および非還元条件下でウエスタンによって野生型  ＣＨＯライセートと結合する(図１６）。このことは、５ＬＡＣ−２３のエピトープが高次構造的に依存している可能性があり、および／またはエピトープがネイティブ条件下で抗体に対して露出またはアクセス可能でないことを示唆する。
【０１１９】
全体は、このデータは５ＬＡＣ−２３抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現し、また病理学的に癌標的に関連性ある。さらに、このデータもまた、ヒト癌組織に対する５ＬＡＣ−２３の結合を示すもので、診断、治療の予測、または予後となり得るアッセイに適切に使用することができる。さらに、この抗原の細胞局在は、大部分の非悪性細胞における抗原発現の欠如にもとづく細胞の癌状態を表し、この観察は、診断、治療の予測、または予後となり得るアッセイに使用されるこの抗原の使用、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質または変異体を可能にする。
【０１２０】
全体は、このデータは５ＬＡＣ−２３抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現し、また病理学的に癌標的に関連性ある。さらに、このデータもまた、ヒト癌組織に対する５ＬＡＣ−２３の結合を示すもので、診断、治療の予測、または予後となり得るアッセイに適切に使用することができる。さらに、この抗原の細胞局在は、大部分の非悪性細胞における抗原発現の欠如にもとづく細胞の癌状態を表し、この観察は、診断、治療の予測、または予後となり得るアッセイに使用されるこの抗原の使用、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質または変異体を可能にする。
【０１２１】
この明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。すべての特許および刊行物は、あたかも個々の刊行が特異的かつ個々に援用されることが具体的かつ個々に示される同程度の言及によって、本明細書中に援用される。
【０１２２】
本発明の一定の形態が例示されている一方で、本明細書中に記述または示した特定の形態または複数のパーツの配置に限定されるものではないことを理解すべきである。当業者が容易に理解することは、種々の変化が本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、本発明は明細書に示され記述されるものに限定されるように考えるものではない。当業者は、本発明が目的を実施する上で適しており、上記した目標および利点を得ることに十分適していることを、容易に理解する。本明細書中に述べられる任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペチド、生物学的に関連した化合物、方法、手法および技術は、現在のところ好ましい実施形態を表わし、例示することを目的としたものであって本発明の範囲に対する制限を意図したものではない。当業者に対する本明細書中での変化および他の使用は、例示を意図したものであって本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本発明が特定の好ましい実施形態に関連して述べられたにも関わらず、クレームされた本発明はそのような実施形態に過度に制限されてはならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための述べられた様式の種々の修飾は、以下の請求の範囲内にあることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】  いくつかの癌および非癌細胞株に特異的な６ＢＤ−２５、５ＬＡＣ−２３、および抗Ｆａｓ（陽性対照）抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
【図２】  ＳＷｌ１１６大腸癌予防モデルの腫瘍成長に関する６ＢＤ−２５の効果を示すもので、破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図３】  ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌予防モデルにおける体重に対する６ＢＤ−２５の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図４】  ６ＢＤ−２５または緩衝液対照による処置後の腫瘍担持マウスの生存を示す。後処理２４０日以上の生存について、マウスの観察をおこなった。
【図５】  図５Ａおよび５Ｂは、アイソタイプ対照（パネルＡ）または５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）のいずれかで染色したＯＶＣＡＲ−３細胞から作られた全細胞可溶化物（Ｔ）および細胞質分画（Ｃ）のウエスタンブロットを示す。異なったバンドを５ＬＡＣ−２３で検出して黒矢印で示す。
【図６】  図６Ａおよび６Ｂは、二次元電気泳動によって分離されるＯＶＣＡＲ−３細胞質タンパク質のウエスタンブロットを示す。パネルＡはＩｇＭアイソタイプ対照でプロービングされたブロットを示し、パネルＢは５ＬＡＣ−２３でプロービングされたブロットを示す。
【図７】  図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＯＶＣＡＲ−３細胞質タンパク質の二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。パネルＡは、細胞質分画の銀染色ゲルを示す。パネルＣが５ＬＡＣ−２３によって認識されるタンパク質の位置を示す一方で、パネルＢはアイソタイプ対照抗体でプロービングされた類似のブロットを示す。矢印は、５ＬＡＣ−２３によって認識されるスポットに対応する。
【図８】  図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ａ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｆ−１８（Ｂ）、ＩｇＭアイソタイプ対照（Ｃ）、および５ＬＡＣ−２３（Ｂ）でプロービングされたＯＶＣＡＲ−３細胞質分画のウエスタンブロットを示す。
【図９】  図９Ａおよび９Ｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞由来の細胞質タンパク質の二次元ウエスタンブロットを示す。ブロットＡの矢印は、５ＬＡＣ−２３が結合する主なスポットを示す。ブロットＢの線は、抗３７ＬＲＰ（Ｈ−１５０）抗体のために特異的であるスポットを示す。ブロット上で明らかにされる他のスポットは、抗体のアイソタイプまたは使用される二次抗体との相互作用に起因する。
【図１０】  図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、および１０Ｄは、３７ＬＲＰをコードするヒトｃＤＮＡクローン発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ）によってトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の５ＬＡＣ−２３（下段）およびＩｇＭアイソタイプ対照（上段）による免疫染色を示す（１０倍）。フージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）試薬（カラムＡ）単独あるいは増加したｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ量（カラムＢでは１μｇ、カラムＣでは２μｇ、カラムＤでは４μｇ）による細胞のトランスフェクションを示す。陽性細胞（茶色）数の増加は、細胞が５ＬＡＣ−２３で染色されたプラスミド数の増加によって知ることができる。
【図１１】  図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、３７ＬＲＰをコードするヒトｃＤＮＡクローン発現プラスミド（（ｐＣＭＶ−ＸＬ５３７ＬＲＰ；２μｇ）でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の免疫染色を示す（４０倍）。細胞を、５ＬＡＣ−２３（Ａ）、抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ｂ）、および抗６７ＬＲ抗体ＭＬｕＣ５（Ｃ）で染色し、全ての免疫染色で陽性細胞を見ることができる。
【図１２】  図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、ウエスタンブロットによって種々の抗体により検出された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのヒト３７ＬＲＰの発現を示す。反応混合物に含まれるプラスミドは、Ｃ末端Ｈｉｓ６−タグ（レーン１）、ｐＩＶＥＸ２．３ｄＬＲＰ（３７ＬＲＰ；レーン２）、およびｐＩＶＥＸ２．４ｄＬＲＰＮＨｉｓ６（Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグを有する３７ＬＲＰ；レーン３）を含む対照ベクターＧＦＰである。ブロットをＩｇＭイソタイプ対照（パネルＡ）、５ＬＡＣ−２３（パネルＢ）、および抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（パネルＣ）でプロービングした。
【図１３】  図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、５ＬＡＣ−２３（下段）およびＩｇＭイソタイプ対照（上段）によって染色されたパラフィン包埋組織を示す。切片は正常胃（カラムＡ）、正常肝（カラムＢ），および肝細胞癌（柱Ｃ）から採取したものである。
【図１４】  図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、対応した正常組織（上段）および腫瘍組織（下段）から得た凍結保存肝臓組織に対する種々の抗体の結合を示す。使用した抗体は、ＩｇＭアイソタイプ対照（カラムＡ）、５ＬＡＣ−２３（カラムＢ）、および抗サイトケラチン８（カラムＣ）であった。
【図１６】  図１５Ａおよび１５Ｂは、５ＬＡＣ−２３（）およびＩｇＭアイソタイプ対照（）による正常肺上皮細胞株Ｂｅａｓ−２Ａの免疫組織化学染色を示す。ビトロゲン存在下（カラムＢ）またはビトロゲン非存在下（カラムＡ）で細胞を増殖させた。
【図１７】  図１６Ａおよび１６Ｂは、非還元条件下でウエスタンブロッティングによって検出されるいくつかの腫瘍および形質転換細胞株における抗３７ＬＲＰ抗体Ｈ−１５０（Ａ）および５ＬＡＣ−２３（Ｂ）のエピトープ発現を示す。細胞株は、野生型ＣＨＯ細胞（レーン１）とヒト細胞株ＨＢ４ａＲ４．ａ（レーン２）、ＨＭＴ  ３５２２（レーン３）、ＭＣＦ−７（レーン４）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン５）；  ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（レーン６）、ＯＶＣＡＲ−３（レーン７）、Ｃｈａｎｇ’ｓ  Ｌｉｖｅｒ（レーン８）、ＨｅｐＧ２（レーン９）；  Ａ３７５（レーン１０）、ＤＬＤＩ（レーン１１）、ＬＳ１７４Ｔ（レーン１２）、およびＳＷ６２０（レーン１３）とを含む。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ】
2007530460.tif 000036
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ｂ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ｂ】
2007530460.tif 000037
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２】
2007530460.tif 000038
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３】
2007530460.tif 000039
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図４】
2007530460.tif 000040
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７】
2007530460.tif 000041
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
2007530460.tif 000042
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１３】
2007530460.tif 000043
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１５】
2007530460.tif 000044
【国際調査報告】
2007530460.tif 000045
2007530460.tif 000046
2007530460.tif 000047
2007530460.tif 000048