(57)【要約】  アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、リン酸、及び／又はカルボキシルから選択される薬物の遊離官能基を、ＰＥＧ部分が結合される対象の基である９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）又は２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）など軽度の塩基性条件に感受性のある基で誘導体化することによって、可逆的ＰＥＧ化薬物が提供される。これらのＰＥＧ化薬物では、ＰＥＧ部分及び薬物残基は、互いに直接結合されているのではなく、むしろ双方の残基が、塩基に対する感受性が高く生理的条件下で除去可能なＦｍｏｃ又はＦＭＳ構造骨格の異なる位置に結合されている。この薬物は、好ましくはアミノ基、最も好ましくは低分子量又は中分子量のペプチド及びタンパク質を含む薬物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｘ）ｎ−Ｙの化合物、及び薬剤として許容されるその塩：
［式中、
Ｙは、遊離のアミノ基、カルボキシル基、リン酸基、ヒドロキシル基及び／又はメルカプト基から選択される少なくとも１つの官能基を有する薬物部分であり、
Ｘは、式（ｉ）〜（ｉｖ）からなる基の群から選択される基であり、
【化１】
2007528354.tif 000035
（式中、
Ｒ１はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む基であり、
Ｒ２は水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（Ｃ１〜Ｃ８）アルカリル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロゲン、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨＲ、アミノ、アンモニウム、カルボキシル、ＰＯ３Ｈ２、及びＯＰＯ３Ｈ２からなる群から選択され、
Ｒは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及び（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールからなる群から選択され、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及び（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールからなる群から選択され、
Ａは、薬物Ｙのカルボキシル基、リン酸基又はメルカプト基にその基が結合されているときは共有結合であり、薬物Ｙのアミノ基又はヒドロキシル基にその基が結合されているときはＯＣＯ−である、
ｎは、少なくとも１である整数である］。
【請求項２】
Ｘが式（ｉ）の基である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（ｉ）において、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素であり、Ａが−ＯＣＯ−である（以降、「Ｆｍｏｃ」）、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
式（ｉ）において、Ｒ２がフルオレン環の２位の−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素であり、Ａが−ＯＣＯ−である（以降、「ＦＭＳ」）、請求項２記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１が式−Ｒ５−Ｒ６−ＰＥＧの基である、請求項１記載の化合物：
［式中、
Ｒ５は、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＰＯ２−、及びＰＯ３−からなる群から選択され、
Ｒ６は、結合又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分がそれを通じてＲ５に共有結合している基である］。
【請求項６】
Ｒ５は−ＮＨ−であり、
Ｒ６は、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＯ−ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ、
【化２】
2007528354.tif 000036
（Ｚは、ＰＥＧ部分に結合されているＯ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択される）、
からなる群から選択される、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｒ１基が、分子量２００〜２００，０００の範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
Ｙが少なくとも１つのアミノ基を含む薬物部分である、請求項６記載の化合物。
【請求項１２】
前記薬物が、ゲンタマイシンやアンホテリシンなどのアミノグリコシド系抗生物質、又はアミノレブリン酸、ダウノルビシン及びドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬である、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
前記薬物が低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である、請求項１１記載の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
以下の式の請求項６記載の化合物：
【化３】
2007528354.tif 000037
［式中、Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、Ｙは、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物の残基であり、ＰＥＧは、分子量２００〜２００，０００の範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分である］。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ２がＨである、本明細書でＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−薬物結合物として示す、請求項１５記載の化合物。
【請求項２０】
前記結合物が式（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−薬物（ｎは１〜３、好ましくは１又は２の整数である）を有する、請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項２０記載の化合物。
【請求項２２】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項２１記載の化合物。
【請求項２４】
前記薬物が、ゲンタマイシンやアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質、又は、アミノレブリン酸、ダウノルビシン及びドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬である、請求項２０記載の化合物。
【請求項２５】
前記薬物が低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である、請求項２０記載の化合物。
【請求項２６】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ２が−ＳＯ３Ｈである、本明細書でＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物として示す、請求項１５記載の化合物。
【請求項２８】
前記結合物が式（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物（ｎは１〜３、好ましくは１又は２の整数である）を有する、請求項２７記載の化合物。
【請求項２９】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項２８記載の化合物。
【請求項３０】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項２９記載の化合物。
【請求項３１】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項３０記載の化合物。
【請求項３２】
前記薬物が、ゲンタマイシンやアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質、又は、アミノレブリン酸、ダウノルビシン及びドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬である、請求項２８記載の化合物。
【請求項３３】
前記薬物が低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である、請求項２８記載の化合物。
【請求項３４】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項３３記載の化合物。
【請求項３５】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物がインスリンである、請求項３４記載の化合物。
【請求項３６】
前記インスリンがヒトインスリンである、請求項３５記載の化合物。
【請求項３７】
前記化合物が、本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−インスリンとして特定される、請求項３６記載の化合物。
【請求項３８】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物がインターフェロンである、請求項３４記載の化合物。
【請求項３９】
前記インターフェロンがＩＦＮ−α２である、請求項３８記載の化合物。
【請求項４０】
前記化合物が、本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮ−α２又は結合物（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮ−α２として特定される、請求項３９記載の化合物。
【請求項４１】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物がＰＹＹアゴニストである、請求項３４記載の化合物。
【請求項４２】
前記ＰＹＹアゴニストがＰＹＹ３〜３６［配列番号１２］である、請求項４１記載の化合物。
【請求項４３】
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６として特定される、請求項４２記載の化合物。
【請求項４４】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である、請求項３４記載の化合物。
【請求項４５】
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨ又は結合物（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨとして特定される、請求項４４記載の化合物。
【請求項４６】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物が心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）［配列番号１３］である、請求項３４記載の化合物。
【請求項４７】
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰとして特定される、請求項４６記載の化合物。
【請求項４８】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物がエキセンディン又はエキセンディンのアゴニストである、請求項３４記載の化合物。
【請求項４９】
前記エキセンディンがエキセンディン−４［配列番号１］である、請求項４８記載の化合物。
【請求項５０】
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４として特定される、請求項４９記載の化合物。
【請求項５１】
前記エキセンディンがエキセンディン−３［配列番号２］であり、又は、前記エキセンディンのアゴニストが、［配列番号３］、［配列番号４］、［配列番号５］、［配列番号６］、［配列番号７］、［配列番号８］、［配列番号９］、及び［配列番号１０］からなる群から選択される、請求項４８記載の化合物。
【請求項５２】
以下の式の請求項６記載の化合物：
【化４】
2007528354.tif 000038
［式中、Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、Ｙは、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物の残基であり、ＰＥＧは、分子量２００〜２００，０００の範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分である］。
【請求項５３】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項５２記載の化合物。
【請求項５４】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項５３記載の化合物。
【請求項５５】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項５３記載の化合物。
【請求項５６】
Ｙが少なくとも１つのアミノ基を含む薬物部分である、請求項５２記載の化合物。
【請求項５７】
前記薬物が、ゲンタマイシンやアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質、又は、アミノレブリン酸、ダウノルビシン及びドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬である、請求項５６記載の化合物。
【請求項５８】
Ｙが低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である、請求項５２記載の化合物。
【請求項５９】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項５８記載の化合物。
【請求項６０】
Ｒ５は−Ｓ−であり、
Ｒ６は
【化５】
2007528354.tif 000039
［式中、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨである］、
からなる群から選択される、
請求項５記載の化合物。
【請求項６１】
Ｒ５は−ＣＯであり、
Ｒ６はＯ−、−ＮＨ−、ＮＨ−Ｒ７−ＣＯＯ−、−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ、−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ、
【化６】
2007528354.tif 000040
［式中、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨである］、
からなる群から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択される、
請求項５記載の化合物。
【請求項６２】
Ｒ５は−ＣＨ２−であり、
Ｒ６は−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ｎは０〜１８である）である、
請求項５記載の化合物。
【請求項６３】
Ｒ５は−ＳＯ２−であり、
Ｒ６はＯ、−ＮＨ−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓである、
請求項５記載の化合物。
【請求項６４】
Ｒ５は−ＰＯ２−であり、
Ｒ６はＯ又は−ＮＨ−である、
請求項５記載の化合物。
【請求項６５】
前記Ｒ１基が、分子量２００〜２００，０００の範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分を含む、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６６】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項６５記載の化合物。
【請求項６７】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項６６記載の化合物。
【請求項６７】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項６６記載の化合物。
【請求項６８】
Ｙが少なくとも１つのアミノ基を含む薬物部分である、請求項６５記載の化合物。
【請求項６９】
前記薬物が、ゲンタマイシンやアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質、又は、アミノレブリン酸、ダウノルビシン及びドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬である、請求項６８記載の化合物。
【請求項７０】
Ｙが低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分である、請求項６５記載の化合物。
【請求項７１】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項７０記載の化合物。
【請求項７２】
請求項１記載の化合物又は薬剤として許容されるその塩、及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７３】
請求項５記載の化合物を含む、請求項７２記載の医薬組成物。
【請求項７４】
請求項６記載の化合物を含む、請求項７３記載の医薬組成物。
【請求項７５】
請求項１５記載の化合物を含む、請求項７４記載の医薬組成物。
【請求項７６】
請求項１７記載の化合物を含む、請求項７５記載の医薬組成物。
【請求項７７】
請求項２８記載の化合物を含む、請求項７６記載の医薬組成物。
【請求項７８】
請求項３０記載の化合物を含む、請求項７７記載の医薬組成物。
【請求項７９】
請求項３２記載の化合物を含む、請求項７８記載の医薬組成物。
【請求項８０】
請求項３３記載の化合物を含む、請求項７９記載の医薬組成物。
【請求項８１】
請求項３４記載の化合物を含む、請求項８０記載の医薬組成物。
【請求項８２】
請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のインスリンのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項８１記載の医薬組成物。
【請求項８３】
糖尿病及び高血糖症を治療するための、請求項８２記載の医薬組成物。
【請求項８４】
請求項３９又は４０に記載のＩＦＮ−α２のＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項８１記載の医薬組成物。
【請求項８５】
ウイルス性疾患を治療するための、請求項８４記載の医薬組成物。
【請求項８６】
前記ウイルス性疾患がＢ型肝炎又はＣ型肝炎である、請求項８５記載の医薬組成物。
【請求項８７】
癌を治療するための、請求項８４記載の医薬組成物。
【請求項８８】
前記癌が膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、又はエイズ関連カポジ肉腫である、請求項８７記載の医薬組成物。
【請求項８９】
請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のＰＹＹ３〜３６のＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項８１記載の医薬組成物。
【請求項９０】
食物摂取量を低減し、かつ、肥満、及び高血圧症、異脂肪血症、心臓血管のリスク、インスリン抵抗性、糖尿病など食物摂取量の低減によって軽減することができる疾患、状態又は障害を治療するための、請求項８９記載の医薬組成物。
【請求項９１】
請求項４４又は４５に記載のｈＧＨのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項８１記載の医薬組成物。
【請求項９２】
病理学的に低身長の子どもを治療するための、請求項９１記載の医薬組成物。
【請求項９３】
抗加齢治療のための、請求項９１記載の医薬組成物。
【請求項９４】
請求項４６又は４７に記載のＡＮＰのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項８１記載の医薬組成物。
【請求項９５】
心臓血管疾患、うっ血性心不全、高血圧症、急性腎不全又は成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療するための、請求項９４記載の医薬組成物。
【請求項９６】
請求項４８〜５１のいずれか一項に記載のエキセンディン又はエキセンディンのアゴニストのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項８１記載の医薬組成物。
【請求項９７】
請求項５０記載のエキセンディン−４のアゴニストのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、請求項９６記載の医薬組成物。
【請求項９８】
インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、又は妊娠性糖尿病を治療するための、或いは高血糖症を予防するための、請求項９６又は９７に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
以下の式の中間体化合物：
【化７】
2007528354.tif 000041
［式中、Ｒ１は、式−Ｒ５−Ｒ６−Ｂの基であり、
Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、
Ｂは、マレイミド、−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３又はＰＥＧ部分であり、
Ｒ５は、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＰＯ２−、及びＰＯ３−からなる群から選択され、
Ｒ６は、結合又はマレイミド、−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３、若しくはＰＥＧ部分がそれを介してＲ５に結合されている基である］。
【請求項１００】
Ｒ５は−ＮＨ−であり、
Ｒ６は−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ、
【化８】
2007528354.tif 000042
、及び−ＣＯ−Ｒ８−からなる群から選択され、
ＺはＯ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキレンであり、Ｂがマレイミド又は−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３であるとき、好ましくはエチレンである、
請求項９９記載の化合物。
【請求項１０１】
本明細書で前駆体１〜７として特定される、請求項１００記載の化合物。
【請求項１０２】
本明細書で前駆体８又は以下の式のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳとして特定される、請求項１００記載の化合物。
【化９】
2007528354.tif 000043
【請求項１０３】
本明細書で式（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙによって特定される結合物：
［式中、Ｙは、ペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分であり、ｎは、少なくとも１、好ましくは１又は２である整数であり、Ｙは、アミノ基を通じてＦＭＳ基に結合されている］。
【請求項１０４】
Ｙが、インスリン、ＩＦＮ−α２、ＰＹＹ３〜３６、エキセンディン−４、ｈＧＨ及びＡＮＰからなる群から選択される、請求項１０３記載の結合物。
【請求項１０５】
請求項２８記載の、本明細書で示す結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物（ＦＭＳは２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、ｎは１〜３の整数であり、薬物は低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である）を調製するための方法であって、
（ｉ）低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳと反応させ、それにより結合物（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物を得、及び
（ｉｉ）結合物（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物をＰＥＧ−ＳＨと反応させ、それにより結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物を得る、
ことを含む方法。
【請求項１０６】
ｎが１又は２である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
ｎが１である、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１１】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１１２】
請求項２８記載の、本明細書で示す結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物（ＦＭＳは２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、ｎは１〜３の整数であり、薬物は低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である）を調製するための方法であって、
（ｉ）ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳをＰＥＧ−ＳＨと反応させ、それにより結合物ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳを得、及び
（ｉｉ）低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量のＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳと反応させ、それにより結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物を得る、
ことを含む方法。
【請求項１１３】
ｎが１又は２である、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
ｎが１である、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａの分枝型分子である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＰＥＧ部分が５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１８】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項１１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の可逆的ＰＥＧ化、及び生理的条件で薬物に緩徐に変換されるＰＥＧ化薬物に関する。
【０００２】
略語：ＡＮＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド；ｔ−Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＵ、ジシクロヘキシル尿素；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＤＴＮＢ、５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）；ＥＳＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトキシカルボニル；Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、Ｆｍｏｃ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ＦＭＳ、２−スルホ−９−フルオレニル−メトキシカルボニル；ＧＳＨ、還元グルタチオン；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモン；ＨＯＳｕ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＩＦＮα２、ヒトインターフェロン−α２；ｉｆｎａｒ２−ＥＣ、ＩＦＮα２受容体の細胞外部分；ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ、Ｎ−［２−（マレイミド−プロピオニルアミノ）−７−スルホ−フルオレン−９−イル−メトキシ−カルボニルオキシ］スクシンイミド（前駆体８）；ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳｕ、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ；ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＥＧ、ポエチレングリコール；ＰＥＧ５０００、５，０００Ｄα−ＰＥＧ；ＰＥＧ４０又はＰＥＧ４００００、４０，０００Ｄａ−分枝ＰＥＧ；ＰＥＧ４０−ＳＨ、スルフヒドリル部分を含む４０ｋＤａ−分枝ＰＥＧ；ＰＥＧ４０−ＯＳｕ、ＰＥＧ４０−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ＳＣ、皮下；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＮＢＳ、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸。
【背景技術】
【０００３】
大半のペプチド薬物及びタンパク質は短寿命であり、多くの場合、循環血液中でのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は短い。このことは、分子量５０ｋＤａ未満の非グリコシル化タンパク質に特に当てはまる。タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで短寿命であることは、腎臓の腎糸球体ろ過及びタンパク質分解を含めて、いくつかの因子が原因となっている。ペプチド薬物及びタンパク質薬物が経口的に吸収されないことを考慮すると、循環血液中で治療上有効な薬物を長期間維持することは、明らかに臨床的に重要な望ましい特徴である。分子量が６０ｋＤａを超えるタンパク質は、大抵の場合、腎糸球体ろ過を逃れ、その主要部分は腎臓でろ過されない。したがって、それらは、より小型のタンパク質よりも、より長い間循環血液中にとどまる。
【０００４】
小型タンパク質薬物の臨床的性質を改善するための魅力的な戦略は、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）（又は以下で使用するＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ））として知られるようになってきている。この戦略により、有効な分子量を増やすためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のいくつかの親水性の鎖がタンパク質に共有結合される。ＰＥＧ化により、重要な臨床的利点が得られる。例えば、一部の例ではｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命を数分から数時間に延長することができる。これは、立体的干渉によりｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解から結合物を保護し、また、分子量の増加により、腎臓によるろ過を妨げるためである。タンパク質のＰＥＧ化は、恐らくは結合物が免疫系により外来性の抗原として認識されるのを防ぐことによって、免疫原性も低減させる。
【０００５】
治療用タンパク質をＰＥＧ化することによって多くの場合重要な利点が得られるにもかかわらず、この技術には重大な欠点がある。一方では、ＰＥＧ鎖をタンパク質に共有結合させることにより、タンパク質分解から結合物を保護し、また、それらを免疫系から防御して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命を延長する。その一方で、ＰＥＧ鎖の立体的干渉は、しばしば、甚大な損失をもたらし、又は結合物中のタンパク質の生物学的効力及び薬理学的効力を破壊しさえもする（Ｆｕｅｒｔｇｅｓ及びＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ、１９９０年；Ｋａｔｒｅ、１９９３年；Ｂａｉｌｏｎ及びＢｅｒｔｈｏｌｄ、１９９８年；Ｎｕｃｃｉ他、１９９１年；Ｄｅｌｇａｄｏ他、１９９２年；Ｆｕｎｇ他、１９９７年；Ｒｅｄｄｙ、２０００年；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、２００１年）。原理上は、この欠陥は、加水分解の影響を受けやすく、又は血清プロテアーゼ若しくはエステラーゼにより酵素的に切断できる化学結合を介してＰＥＧ鎖を導入することによって克服することができる。加水分解速度が一定していることが重要であるのは明らかである。したがって、必須条件は、結合物からのＰＥＧ鎖の加水分解が、低速度で、且つｉｎ  ｖｉｖｏで均質な方法で起こることができることである。
【０００６】
加水分解によってＰＥＧを放出することができる、タンパク質若しくはペプチド又は小型薬物分子のＰＥＧ誘導体をデザインすることが、極めて望ましいはずである。適切な可逆的ＰＥＧ結合物は、生理的条件で緩徐に且つ自発的に加水分解されなければならず、また、不活性なＰＥＧ化タンパク質及びペプチドを時間依存的に再活性化することを可能にするはずである。
【０００７】
可逆的ＰＥＧ化のいくつかの方法が提案されている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ他、１９９９年、２０００年；Ｌｅｅ他、２００１年；Ｇａｒｍａｎ及びＫａｌｉｎｄｊｉａｎ、１９８７年；Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、１９９９年）。しかし、それらには、重大な潜在的欠点がある。例えば、律速段階としての酵素的脱離（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ他、１９９９年、２０００年；Ｌｅｅ他、２００１年）に依存して、血清プロテアーゼ及び／又はエステラーゼにより結合物からＰＥＧを脱離すると、ｉｎ  ｓｉｔｕで望ましい薬物動態プロファイルを生じないことがある。さらに、この信頼度は、酵素の有効性に依存的である。ジスルフィド結合された結合物は、体液の非還元性環境では切断することができない（Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、１９９９年）。遊離のＳＨ官能基と反応することができる活性部分をまだ保持している可逆的なＰＥＧ化結合物は、望ましくない架橋結合を有する複合物を生じることがある（Ｇａｒｍａｎ及びＫａｌｉｎｄｊｉａｎ、１９８７年）。これらの欠陥を克服する可逆的ＰＥＧ化の変法をデザインすることは非常に望ましいはずである。
【０００８】
本出願人によるＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９８／０５３６１号は、少なくとも１つの遊離アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、及び／又はメルカプト基を有する薬物を、塩基に対する感受性が高く且つ緩和な塩基性条件下で除去可能な部分で誘導体化することにより、薬物の半減期を延長させるための新規の概念の手法を記載している。得られるプロドラッグは不活性であるが、体内の生理的条件下で活性薬物へと変換される。前記部分の例は、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）及び２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＳ）である。この概念に従い、インスリンやヒト成長ホルモンなどのペプチド性薬物、並びにプロパノロール、セファレキシン、及びピペラシリンなどの非ペプチド性薬物のＦｍｏｃ及びＦＭＳ誘導体が、前記ＷＯ  ９８／０５３６１において記載されている。その後、サイトカインのＦＭＳ誘導体がＷＯ  ０２／３６０６７において開示され、また、エンケファリン、ドキソルビシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及び性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のＦＭＳ誘導体がＷＯ  ０２／７８５９で開示された。
【０００９】
米国特許第６４３３１３５号は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ又はＧｎＲＨ）のアナログのＰＥＧ化誘導体を開示しており、このアナログ中で、ＰＥＧ部分は、前記ＬＨＲＨアナログのセリン残基に共有結合されている。固相ペプチド合成法により前記ＰＥＧ−ＬＨＲＨアナログを調製するプロセスでは、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＥＧ）−ＯＨ又はｔＢｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＥＧ）−ＯＨなどのＰＥＧ化セリン残基が、ＬＨＲＨアナログに導入され、作製されたＰＥＧ−ＬＨＲＨアナログが回収される（保護基Ｆｍｏｃ及びｔ−Ｂｏｃは付いていない）。
【００１０】
日本国特許出願ＪＰ３１４８２９８は、ＰＥＧ−ペプチド結合物、例えば、分子中に存在するアミノ基を保護しつつアルギニン残基のグアニジノ基をＰＥＧと反応させることによって得たＰＥＧ−ＧｎＲＨ結合物を記載している。
【００１１】
本明細書でのいかなる文書の引用も、これらの文書が本出願の任意の請求項の特許性に対して関連がある従来技術又は重んじられる資料であることを認めるものとして意図するものではない。いずれの文書の内容又は日付に関するいずれの記述も、出願時に出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの記述の正確性について認めようとするものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明により、タンパク質ＰＥＧ化技術とＦｍｏｃ若しくはＦＭＳ又は緩和な塩基性条件下で除去可能な類似の部分で誘導体化する技術とを組み合わせることにより、タンパク質ＰＥＧ化技術の重大な欠陥、主にｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＥＧ結合物の生物学的効力及び薬理学的効力の損失を克服できることが、ここに発見された。
【００１３】
したがって、本発明の一目的は、体内の生理的条件下で加水分解によってＰＥＧを放出することができる、ＰＥＧ−タンパク質結合物をデザインすることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、投与時は不活性であり、且つ、不活性化したＰＥＧ化タンパク質を体内の生理的条件下で時間依存的に再活性化することを可能にする、可逆的ＰＥＧ−タンパク質結合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明は一態様において、式（Ｘ）ｎ−Ｙの化合物
［式中、
Ｙは、遊離のアミノ基、カルボキシル基、リン酸基、ヒドロキシル基、及び／又はメルカプト基から選択される少なくとも１つの官能基を有する薬物部分であり、
Ｘは、直鎖又は分枝のＰＥＧ部分を有する、塩基に対する感受性が高く且つ緩和な塩基性条件下で除去可能な基であり、
ｎは、少なくとも１である整数である］
及び薬剤として許容されるその塩に関する。
【００１６】
得られるプロドラッグは不活性であるが、体内の生理的条件下で活性薬物Ｙへと変換される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、基Ｘは、Ｆｍｏｃ又は２−スルホ−Ｆｍｏｃ（本明細書では「ＦＭＳ」）であり、Ｙは、アミノ基を通じてＹに結合されたペプチド薬物又はタンパク質薬物であり、ｎは１又は２であり、直鎖又は分枝ＰＥＧ部分の分子量は５，０００〜４０，０００Ｄａである。
【００１８】
本発明は、別の態様において、本発明の結合物を調製するための新規の方法並びに中間体及び前駆体を提供する。
【００１９】
本発明は、さらに別の態様において、製薬上許容される担体及び本発明のプロドラッグを含む医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、薬物、特に低分子量又は中分子量のペプチド及びタンパク質の可逆的ＰＥＧ化のための新しい概念の手法を提供する。この手法によれば、ＰＥＧ部分及び薬物残基は、標準のＰＥＧ化手順でのように互いに直接結合されているのではなく、むしろ双方の残基が、塩基に対する感受性が高く生理的条件下で除去可能な構造骨格の異なる位置に結合されている。
【００２１】
本発明は、一態様において、式（Ｘ）ｎ−Ｙの化合物
［式中、
Ｙは、遊離のアミノ基、カルボキシル基、リン酸基、ヒドロキシル基、及び／又はメルカプト基から選択される少なくとも１つの官能基を有する薬物部分であり、
Ｘは、式（ｉ）〜（ｉｖ）からなる基の群から選択される基であり、
【化１】
2007528354.tif 000002
（式中、
Ｒ１はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む基であり、
Ｒ２は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリール、アルカリル、アラルキル、ハロゲン、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨＲ、アミノ、アンモニウム、カルボキシル、ＰＯ３Ｈ２、及びＯＰＯ３Ｈ２からなる群から選択され、
Ｒは、水素、アルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素、アルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ａは、薬物Ｙのカルボキシル基、リン酸基、又はメルカプト基にその基が結合されているときは共有結合であり、薬物Ｙのアミノ基又はヒドロキシル基にその基が結合されているときはＯＣＯ−である）
ｎは、少なくとも１である整数である］
及び薬剤として許容されるその塩を提供する。
【００２２】
本明細書のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の定義における「アルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アリール」、「アルカリル」及び「アラルキル」という用語は、炭素原子が１〜８個、好ましくは１〜４個のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、及びブチル、並びに炭素原子が６〜１０個のアリール基、例えばフェニル及びナフチルを示すのに使用する。「ハロゲン」という用語には、ブロモ、フルオロ、クロロ及びヨードが含まれる。
【００２３】
本発明の好ましい一実施形態では、Ｘは、式（ｉ）の基、より好ましくはＲ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素でありＡが−ＯＣＯ−である式（ｉ）の基、即ち９−フルオレニルメトキシカルボニル基（以降「Ｆｍｏｃ」）、或いは、最も好ましくはＲ２がフルオレン環の２位の−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素であり、Ａが−ＯＣＯ−である式（ｉ）の基、即ち２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基（以降「ＦＭＳ」）である。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、官能基は、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が水素でありＡが共有結合である基（ｉ）、即ち９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）基であり、これは、遊離のメルカプト基、アスパラギン酸及びグルタミン酸部分のカルボキシ官能基、並びにサイトカイン分子のＣ末端カルボキシル官能基の可逆的マスキングに適用できる。得られる９−フルオレニルメチルエステル（Ｆｍ−エステル）は緩和な塩基で処理するとβ脱離反応経路を経て親分子の遊離カルボキシル官能基を生じ、したがって、薬物のカルボキシル官能基の可逆的マスキングに同様に使用することができる。Ｆｍｏｃ基は、チロシン、セリン、及びスレオニンのヒドロキシル基の可逆的保護において同様に有用である可能性がより大きい。
【００２５】
Ｒ２が２位又は７位のハロゲン、好ましくはＣｌ又はＢｒであるハロゲン化Ｆｍｏｃ基（ｉ）、２−クロロ−１−インデニルメトキシカルボニル（ＣＬＩＭＯＣ）基（ｉｉ）、１−ベンゾ［ｆ］インデニルメトキシカルボニルウレタン（ＢＩＭＯＣ）基（ｉｉｉ）、ウレタンスルホン基（ｉｖ）、及びＡが共有結合である対応する（ｉ）〜（ｉｖ）の基を、Ｆｍｏｃ及びＦｍと同様に薬物の遊離のアミノ官能基、カルボキシル官能基、ヒドロキシル官能基、及びメルカプト官能基を置換するのに使用することができ、これにより、塩基性条件、例えば生理的条件下でこれらの基の除去に対して幅広い感受性を提供することができる。実際、上記の（ｉ）〜（ｉｖ）の基は、中性条件又は微塩基性のｐＨ条件及び緩和な条件で加水分解を受ける希少化学物質の一般的ファミリーに属しており、したがって、例えばペプチド合成におけるα−及びε−アミノ基の一時的な可逆的保護に使用することができ、緩和な塩基性条件下でβ脱離反応によってそのアミノ基を除去することができる。
【００２６】
本発明によれば、（ｉ）〜（ｉｖ）の基、好ましくはアミノ部分及び／又はヒドロキシル部分に共有結合したＦｍｏｃ若しくはＦＭＳ、又はカルボキシル部分及び／又はメルカプト部分に共有結合したＦｍは、体液中の生理的条件下で、即ち３７℃、ｐＨ７．４において、加水分解を受け（β脱離を介する）、遊離のアミノ官能基、ヒドロキシ官能基、メルカプト官能基、又はカルボキシル官能基に戻る。
【００２７】
本発明の一実施形態では、Ｒ１は式Ｒ５−Ｒ６−ＰＥＧの基である。
［式中、
Ｒ５は、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＰＯ２−、及びＰＯ３−からなる群から選択され、
Ｒ６は、結合、又はＰＥＧ部分がそれによってＲ５に共有結合している基である］
【００２８】
より好ましい実施形態では、Ｒ５は−ＮＨ−であり、Ｒ６は、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＯ−ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ、
【化２】
2007528354.tif 000003
［ＺはＯ、Ｓ、又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択される］
からなる群から選択される。
【００２９】
上記の４−クロロ−６−Ｚ−トリアジン−２−イル基では、６−Ｚ−基は、ＰＥＧ部分に結合されているのと同時に、その２位で、この場合は−ＮＨ−であるＲ５に結合されている。上記の−ＣＯ−Ｒ７−スクシンイミド基では、３位のチオ−Ｓ−基がＰＥＧ部分に結合されているのと同時に、−ＣＯ−が、この場合は−ＮＨ−であるＲ５に結合されている。
【００３０】
好ましい一実施形態では、本発明のＰＥＧ化薬物化合物は、以下の式の結合物である。
【化３】
2007528354.tif 000004
［式中、Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、Ｙは、好ましくはペプチド薬物又はタンパク質薬物である］Ｒ２がＨであるとき、本明細書で示すＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−薬物Ｙ結合物が得られる。最も好ましい実施形態では、Ｒ２は、フルオレン環の２位の−ＳＯ３Ｈであり、本明細書で示すＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物Ｙ結合物が得られる。
【００３１】
より好ましい実施形態では、本発明のＰＥＧ化薬物は、以下の式の化合物である。
【化４】
2007528354.tif 000005
［式中、Ｒ２は、Ｈ又は−ＳＯ３Ｈである］
【００３２】
最も好ましい実施形態では、本発明のＰＥＧ化薬物は、上式の化合物であり、式中、Ｒ２はフルオレン環の２位の−ＳＯ３Ｈであり、ＰＥＧ部分は４０ｋＤａの分枝ＰＥＧである。これらの結合物は、本明細書では、（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質（式中、ｎは１〜３、好ましくは１又は２、最も好ましくは１である）として特定される。
【００３３】
Ｒ５が−ＮＨ−である本発明の上記の化合物は、フルオレン環において−ＮＨ２で置換されたＮ−（９−フルオレニルメトキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）又はＮ−（２−スルホ−９−フルオレニルメトキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（ＦＭＳ−ＯＳｕ）（スキーム７、ページａ、第１行第１列で図示）から調製することができる。これは、−Ｒ６−ＰＥＧがスキーム７（ページａ、中央列）で示されるような物質である誘導体を得るために、活性化させたＰＥＧ−ＯＨ（例えばＰＥＧ−Ｏ−ＣＯ−Ｃｌ）、又は、ＰＥＧ−カルボキシレート（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、例えばＰＥＧ−ＣＯ−Ｃｌを経て）、ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ−ＣＨＯ）、ＰＥＧ−イソシアネート（ＰＥＧ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、ＰＥＧ−イソチオシアネート（ＰＥＧ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）、２，４−ジクロロ−６−Ｓ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジン、２，４−ジクロロ−６−ＮＨ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジン、２，４−ジクロロ−６−Ｏ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジンなど（スキーム７、ページａ、右列）活性化させた誘導体化ＰＥＧとアミノ基とを反応させることによりできる。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の結合物は（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ペプチド／タンパク質であり、それらの調製のための出発化合物は、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕのマレイミド誘導体、即ちスキーム３で図示する式を有する本明細書で示す前駆体７、即ちＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ若しくはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕである。
【００３５】
本発明の最も好ましい実施形態では、本発明の結合物は（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質であり、それらの調製のための出発化合物は、ＦＭＳ−ＯＳｕのマレイミド誘導体、即ちスキーム３で図示する式を有する本明細書で示す前駆体８、即ちＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ又はＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳｕである。
【００３６】
目的のペプチド／タンパク質のＰＥＧ化及び（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ペプチド／タンパク質結合物又は（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質結合物の調製に使用可能な２つの経路が本発明により提供され、これらをスキーム６に図示する。どちらの経路も２ステップの手順である。
【００３７】
１つの経路によれば、最初にＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ又はＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを目的ペプチド／タンパク質のアミン成分に結合させ、これによりＭＡＬ−ＦＭＳ−ペプチド／タンパク質結合物又はＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ペプチド／タンパク質結合物を得、次に、ＰＥＧ−ＳＨでマレイミド部分を置換して、それぞれ、（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質結合物又は（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ペプチド／タンパク質結合物を得る。
【００３８】
第２の経路では、最初にＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ又はＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをＰＥＧ−ＳＨと反応させ、これによりＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳ結合物又はＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ結合物を形成させ、次に、それを目的ペプチド又はタンパク質のアミン成分と反応させて、それぞれ、所望の（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質結合物又は（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ペプチド／タンパク質結合物を得る。この経路は、スルフヒドリル基又はジスルフィド基を含むペプチド及びタンパク質に適している。
【００３９】
Ｒ５が−ＮＨ−でありＲ６が−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＣＳ−ＮＨ−である化合物は、フルオレン環において−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページＣ、第１行及び最終行、第１列で図示）から、それらをＰＥＧ−ＮＨ２と反応させることによって、それぞれ調製することができる。これらＦｍｏｃ／ＦＭＳ種はすでに活性化されているため、活性化は必要ではない。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、Ｒ５は−Ｓ−であり、Ｒ６は、
【化５】
2007528354.tif 000006
［式中、ＺはＯ、Ｓ、又はＮＨである］
からなる群から選択される。
【００４１】
Ｒ５が−Ｓ−である本発明の上記の化合物は、フルオレン環において−ＳＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｂ、第２行第１列で図示）から調製することができる。これは、スキーム７、ページｂ、第２行右列で示す式を有するＰＥＧ−マレイミドとそれらを反応させ、これにより、スキーム７、ページｂ、第２行中央列で図示するようにＰＥＧ部分が残基を通じてフルオレン環に結合されている本発明のＰＥＧ化化合物を得ることによって、或いは、２，４−ジクロロ−６−Ｓ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジン、２，４−ジクロロ−６−ＮＨ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジン、又は２，４−ジクロロ−６−Ｏ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジンとそれらを反応させることによってできる。
【００４２】
さらに別の実施形態では、本発明のＰＥＧ化薬物では、Ｒ５はＣＯであり、Ｒ６は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯＯ−、−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ；−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ、
【化６】
2007528354.tif 000007
（ＺはＯ、Ｓ、又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択される）
からなる群から選択される。
【００４３】
Ｒ５が−ＣＯ−である本発明の上記の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｂ、第３行第１列で図示）から調製することができる。Ｒ６が−Ｏ−又は−ＮＨ−であるとき、それぞれ、ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）又はＰＥＧ−アミン（ＰＥＧ−ＮＨ２）と反応し、これにより、スキーム７、ページｂ、中央列（第３行及び第４行）で図示するように、ＰＥＧ部分がそれぞれ残基−ＣＯ−Ｏ−又は−ＣＯ−ＮＨ−を通じてフルオレン環に結合されているＰＥＧ化化合物を得ることになる。
【００４４】
Ｒ５が−ＣＯ−でありＲ６がＮＨ−Ｒ７−ＣＯＯ−である本発明の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕから調製することができる。これは、カップリング試薬（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、又はＰｙＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）／トリエチルアミン）を使用してそれらをＨ２Ｎ−Ｒ７−ＣＯ−ＯｔＢｕと反応させ、酸性条件下（例えばジオキサン中トリフルオロ酢酸又はＨＣｌ）でｔＢｕ保護基を除去し、トリホスゲンによって遊離カルボキシル基を活性化し、形成されたＮＨ−Ｒ７−ＣＯＣｌをＰＥＧ−ＯＨと反応させることにより、これにより−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−Ｏ−ＰＥＧ誘導体を得ることができる。
【００４５】
Ｒ５が−ＣＯ−でありＲ６がＮＨ−Ｒ７−ＮＨ−である本発明の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕから調製することができる。これは、カップリング試薬を使用してそれらをＨ２Ｎ−Ｒ７−ＮＨ−ｔＢｕと反応させ、前述したようにｔＢｕ保護基を除去し、遊離アミノ基をＰＥＧ−ＯＳｕと反応させることにより、これにより−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ−ＰＥＧ誘導体を得ることができる。
【００４６】
Ｒ５が−ＣＯ−でありＲ６がＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ−である本発明の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕから調製することができる。これは、カップリング試薬を使用してそれらをＨ２Ｎ−Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ−ｔＢｕと反応させ、前述したようにｔＢｕ保護基を除去し、ＤＣＣ／ＮＨＳを用いて遊離カルボキシル基を活性化し、形成された−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＰＥＧ−ＮＨ２と反応させることにより、これにより−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ誘導体を得ることができる。
【００４７】
Ｒ５が−ＣＯ−でありＲ６が−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ−Ｚ−（４−クロロ−６−Ｚ−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジン−２−イルである本発明の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕから調製することができる。これは、カップリング試薬を使用してそれらをＨ２Ｎ−Ｒ７−ＮＨ−ｔＢｏｃ、Ｈ２Ｎ−Ｒ７−Ｏ−ｔＢｕ又はＨ２Ｎ−Ｒ７−Ｓ―トリチルと反応させ、前述したようにｔＢｏｃ、ｔＢｕ、又はトリチル保護基を除去し、遊離のＮＨ２、ＯＨ、又はＳＨ基を２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジンと反応させ、こうして形成された−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ［Ｏ又はＳ］−（４−クロロ−６−ＮＨ［Ｏ又はＳ］−１，３，５−トリアジン−２−イルをＰＥＧ−ＮＨ２、ＰＥＧ−ＯＨ、又はＰＥＧ−ＳＨとさらに反応させることにより、これにより対応する−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ［Ｏ又はＳ］−（４−クロロ−６−ＮＨ［Ｏ又はＳ］−ＰＥＧ−１，３，５−トリアジン誘導体を得ることができる。
【００４８】
Ｒ５が−ＣＯ−でありＲ６が−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ−エチレン−スクシンイミドである本発明の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕから調製することができる。これは、カップリング試薬（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、又はＰｙＢＯＰ／トリエチルアミン）を使用してそれらをＨ２Ｎ−Ｒ７−エチレン−マレイミドと反応させ、次いでそのマレイミド部分をｐＨ６〜８でＰＥＧ−ＳＨと反応させることにより、これにより−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ７−エチレン−スクシンイミド−Ｓ−ＰＥＧ誘導体を得ることができる。
【００４９】
次に、本発明のＰＥＧ化Ｆｍｏｃ／ＦＭＳ薬物を、以下の実施例５で記述する１ステップの手順によってこれらの中間体から調製する。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態では、Ｒ５は−ＣＨ２−であり、Ｒ６は−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ｎは０〜１８、好ましくは１である）である。
【００５１】
Ｒ５が−ＣＨ２−でありＲ６が−ＣＨ２−Ｓ−又は−ＣＨ２−ＮＨ−である本発明の上記の化合物は、フルオレン環において−ＣＯＨで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｃ、第４行第１列で図示）から、それらをそれぞれＰＥＧ−ＳＨ又はＰＥＧ−ＮＨ２と反応させ、次いでＮａＨＢＨ３で還元することによって、調製することができる。
【００５２】
Ｒ５が−ＣＨ２−でありＲ６が−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−である本発明の上記の化合物は、フルオレン環において−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ（ＨａｌはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである）で置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｄ、第３行第１列で図示）から調製することができる。これは、ＰＥＧ−ＮＨ２又はＰＥＧ−ＳＨとそれらを反応させ、これによりそれぞれスキーム７、ページｄ、第３行及び第４行の中央列で図示するようにＰＥＧ部分が残基を通じてフルオレン環に結合されている本発明のＰＥＧ化化合物を得ることによりできる。
【００５３】
次に、本発明のＰＥＧ化Ｆｍｏｃ／ＦＭＳ薬物を、以下の実施例５で記述する１ステップの手順によって上記の中間体から調製する。
【００５４】
さらに別の実施形態では、Ｒ５は−ＳＯ２−であり、Ｒ６は−Ｏ−、−ＮＨ−、又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓである。Ｒ６が−Ｏ−又は−ＮＨ−である化合物は、フルオレン環において−ＳＯ２Ｃｌで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｃ、第３行第１列で図示）から、それらをＰＥＧ−ＯＨ又はＰＥＧ−ＮＨ２とそれぞれ反応させることによって、調製することができる。次に、本発明のＰＥＧ化Ｆｍｏｃ／ＦＭＳ薬物を、以下の実施例５で記述する１ステップの手順によってこれらの中間体から調製する。
【００５５】
Ｒ６が−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓである化合物は、フルオレン環において−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２で置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｃ、第２行第１列で図示）から、それらをＰＥＧ−ＳＨと反応させることによって、調製することができる。次に、本発明のＰＥＧ化Ｆｍｏｃ／ＦＭＳ薬物を、以下の実施例１６又は実施例１７で記述する２ステップの手順によってこれらの中間体から調製する。
【００５６】
さらに別の実施形態では、Ｒ５は−ＰＯ２−であり、Ｒ６は−Ｏ−又は−ＮＨ−である。これらの化合物は、フルオレン環において−ＰＯ２Ｃｌで置換されたＦｍｏｃ−ＯＳｕ又はＦＭＳ−ＯＳｕ（スキーム７、ページｄ、第１行第１列で図示）から、それらをＰＥＧ−ＯＨ又はＰＥＧ−ＮＨ２とそれぞれ反応させることによって、調製することができる。次に、本発明のＰＥＧ化Ｆｍｏｃ／ＦＭＳ薬物を、以下の実施例５で記述する１ステップの手順によってこれらの中間体から調製する。
【００５７】
本発明によれば、Ｙは、遊離のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、リン酸基、及び／又はメルカプト基から選択される少なくとも１つの官能基を有する薬物部分である。本発明のより好ましい実施形態では、この薬物は、少なくとも１つの遊離アミノ基を含み、ペプチド薬物若しくはタンパク質薬物、又は非ペプチド性薬物である。
【００５８】
本発明の一実施形態では、この薬物は少なくとも１つのアミノ基を含む非ペプチド性薬物であり、本発明は、そのＰＥＧ−Ｆｍｏｃ結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ結合物に関する。本発明の技術に適用しやすい非ペプチド性薬物には、ゲンタマイシンやアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質、及びアミノレブリン酸、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬が含まれる。
【００５９】
本発明のより好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物は、ヒト用又は動物用の薬物として使用することができる、ペプチド薬物又はタンパク質薬物、最も好ましくは低分子量又は中分子量のペプチド又はタンパク質である。
【００６０】
したがって、本発明により、本明細書において式（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙ又は（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−Ｙ
［式中、Ｙは、ペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分であり、ｎは、少なくとも１、好ましくは１又は２である整数であり、Ｙは、少なくとも１つのアミノ基を通じてＦＭＳ基又はＦｍｏｃ基と結合されている］
により特定されるＰＥＧ化薬物結合物ＰＥＧ−ＦＭＳ−Ｙ及びＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−Ｙがさらに提供される。最も好ましい実施形態では、結合物は（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙであり、ＰＥＧ部分はＰＥＧ４００００である。
【００６１】
本発明に従ってＰＥＧ化することができるペプチド及びタンパク質Ｙの例には、それだけには限らないが、インスリン、ＩＦＮα２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３やエキセンディン−４などのエキセンディン、エキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はロイプロリドやＤ−Ｌｙｓ６−ＧｎＲＨなどそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、並びに抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片が含まれる。
【００６２】
本発明の好ましい一実施形態では、ペプチド性薬物はインスリンであり、本発明は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−インスリン結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−インスリン結合物、並びに糖尿病及び高血糖症を治療するためのそれらを含む医薬組成物を提供する。このような結合物の例は、（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン結合物、（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−インスリン結合物、及びＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−インスリン結合物である。
【００６３】
本発明の別の好ましい実施形態では、薬物は、エキセンディン又はエキセンディンのアゴニストである。
【００６４】
より好ましい実施形態では、薬物は、配列番号１：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
により示される配列を有するエキセンディン−４である。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、薬物は、配列番号２：
ＨＳＤＧＴＦＩＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
により示される配列を有するエキセンディン−３である。
【００６６】
さらに好ましい実施形態では、薬物は、エキセンディンのアゴニストである。本明細書では、エキセンディンのアゴニストを、インスリン分泌性であり糖尿病の治療で有益な作用をエキセンディン−３又はエキセンディン−４が及ぼす場所である受容体に結合することにより、或いは、尿流量増加、尿のナトリウム排出の増大、及び／又は尿のカリウム濃度の低減に対するエキセンディンの効果を、エキセンディンがこれらの効果を生じる場所である受容体に結合することにより真似ることにより、エキセンディン−３又はエキセンディン−４の活性を真似る化合物として定義する。好ましくは、エキセンディンのアゴニストは、以下の配列番号３〜ＮＯ：１０により示されるエキセディンのアゴニストからなる、インスリン分泌性のエキセンディン−４断片及びアナログの群から選択される。
エキセンディン−４（１〜３１）  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰ  ［配列番号３］；
Ｙ３１エキセンディン−４（１〜３１）  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＹ  ［配列番号４］；
エキセンディン−４（１〜３０）  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ［配列番号５］；
エキセンディン−４（１〜３０）アミド  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ−ＮＨ２  ［配列番号６］；
エキセンディン−４（１〜２８）アミド  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮ−ＮＨ２  ［配列番号７］；
Ｌ１４，Ｆ２５エキセンディン−４アミド  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＦＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２  ［配列番号８］；
Ｌ１４，Ｆ２５エキセンディン−４（１〜２８）アミド  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＦＬＫＮ−ＮＨ２  ［配列番号９］；及び
Ｌ１４，Ａ２２，Ｆ２５エキセンディン−４（１〜２８）アミド  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲＬＡＩＥＦＬＫＮ−ＮＨ２  ［配列番号１０］。
【００６７】
この実施形態によれば、本発明は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−エキセンディン／エキセンディン・アゴニスト結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−エキセンディン／エキセンディン・アゴニスト結合物、並びに高血糖症を予防し、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、及び妊娠性糖尿病からなる群から選択される糖尿病を治療するためのそれらを含む医薬組成物を提供する。最も好ましい実施形態では、本発明のＰＥＧ化エキセンディン結合物はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４である。
【００６８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ペプチド性薬物は、インターフェロン、好ましくはＩＦＮ−αであり、本発明は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＩＦＮ−α結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−ＩＦＮ−α結合物、並びにＩＦＮ−αによって治療可能な疾患、特にウイルス性疾患、より具体的にはＢ型肝炎又はＣ型肝炎を、単独治療としてもリバビリンなどの抗ウイルス薬との併用治療によっても治療するための、或いは、癌、例えば、移行上皮癌、最も一般的なタイプの膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、及びエイズ関連カポジ肉腫を、単独治療としてもカルボプラチン及び／又はシクロホスファミドなどの細胞毒性薬との併用治療によっても治療するための、それらを含む医薬組成物を提供する。より好ましい実施形態では、結合物は（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮα２であり、又は、最も好ましくはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２である。
【００６９】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、ペプチド性薬物はＰＹＹアゴニストである。本明細書では、ＰＹＹアゴニストを、哺乳動物において食物摂取量を低減させるなどＰＹＹ−又はＰＹＹ［３〜３６］に似た生物活性を有し、また、例えばＹ２受容体に結合することにより、ＰＹＹ及びＰＹＹ［３〜３６］の機序に類似した機序によって作用する分子として定義する。ＰＹＹアゴニストは、好ましくはＹ２受容体に特異的なアゴニストであり、好ましくは、最小でもＰＹＹのアミノ酸配列２５〜３６、最も好ましくはＰＹＹの配列３〜３６を含むペプチドである。
【００７０】
本発明の一実施形態では、ＰＹＹアゴニストは、配列番号１１：
ＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２
により示される配列を有する３６ｍｅｒのペプチドＰＹＹである。
【００７１】
本発明のより好ましい実施形態では、ＰＹＹアゴニストは、配列番号１２：
ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２
により示される配列を有するペプチドＰＹＹ［３〜３６］である。
【００７２】
この実施形態によれば、本発明は、ＰＥＧ−ＦｍｏｃＰＹＹアゴニスト結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−ＰＹＹアゴニスト結合物、並びに、特に食物摂取量を減少させ、体重減少を誘導し、且つ、肥満、高血圧症、異脂肪血症、心臓血管のリスク、インスリン抵抗性、糖尿病（特にＩＩ型糖尿病）など食物摂取量の低減によって軽減することができる疾患又は障害を治療するためのそれらを含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明のＰＥＧ化ＰＹＹアゴニストはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６である。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、ペプチド性薬物は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であり、本発明は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ｈＧＨ結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−ｈＧＨ結合物、並びに、ｈＧＨによって治療可能な状態及び疾患を治療するため、特に病理学的に低身長の子どもを治療するための、また、抗加齢薬剤としての、それらを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、本発明のＰＥＧ化ｈＧＨ結合物は、（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨ及びＰＥＧ−ＦＭＳ−ｈＧＨである。
【００７４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ペプチド性薬物は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）又はそのアナログ、特に、以下の配列番号１３により示される配列を有する環状の２８アミノ酸のＡＮＰである。
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｃｙｓ７−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ２３］−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｂ−Ｔｙｒ
【００７５】
この実施形態によれば、本発明は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＡＮＰ結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−ＡＮＰ結合物、並びに、本発明によって治療可能な状態又は疾患を治療するためのそれらを含む医薬組成物を提供する。本発明は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＡＮＰ結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−ＡＮＰ結合物、並びに、ナトリウム利尿ペプチド及びその変異体によって治療可能な状態又は疾患を治療するため、特に心臓血管疾患、うっ血性心不全、高血圧症、急性腎不全、及び成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療するための、それらを含む医薬組成物を提供する。本発明の好ましい一実施形態では、ＰＥＧ化ＡＮＰは、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰ結合物である。
【００７６】
また、本発明の範囲には、薬剤として許容される本発明のＰＥＧ化結合物の塩も含まれる。本明細書では、「塩」という用語は、カルボキシル基の塩も、薬物分子、例えばペプチド又はタンパク質のアミノ基の酸付加塩も意味する。カルボキシル基の塩は、当技術分野で既知の手段によって形成させることができ、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩、又は亜鉛塩など、及び、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジンなどのアミン、ピペリジン、プロカインなどと形成される塩など有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩には、例えば、例えば塩酸や硫酸などの無機酸との塩、及び、例えば酢酸やシュウ酸などの有機酸との塩が含まれる。
【００７７】
本発明はさらに、本発明のＰＥＧ化結合物を調製するための方法、及びこれらの方法において使用するいくつかの新規の前駆体にも関する。
【００７８】
したがって、本発明は、以下の式の前駆体化合物にも関する。
【化７】
2007528354.tif 000008
［式中、Ｒ１は、式−Ｒ５−Ｒ６−Ｂの基であり、
Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、
Ｂは、マレイミド、−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３、又はＰＥＧ部分であり、
Ｒ５は、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＰＯ２−、及びＰＯ３−からなる群から選択され、
Ｒ６は、結合、又はマレイミド、−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３、若しくはＰＥＧ部分がそれを介してＲ５に結合されている基である］
【００７９】
好ましい一実施形態では、Ｒ５は−ＮＨ−であり、Ｒ６は、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＯ−ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ、−ＣＯ−Ｒ８−、
【化８】
2007528354.tif 000009
からなる群から選択され、
ＺはＯ、Ｓ、又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキレンであり、Ｂがマレイミド又は−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３であるとき、好ましくはエチレンである］
【００８０】
好ましい一実施形態では、本発明は、スキーム１及び３で図示する式を有する新規の前駆体１〜７に関する。最も好ましい実施形態では、本発明は、前駆体８として本明細書で特定される化合物即ち以下の式を有するＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳに関する。
【化９】
2007528354.tif 000010
【００８１】
前駆体８は、化合物Ｎ−［２−（マレイミド−プロピオニルアミノ）−７−スルホ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルオキシ］−スクシンイミド［又は９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）−７−スルホ−フルオレン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］であり、本明細書ではＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳｕとしても特定される。
【００８２】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ペプチド及びタンパク質のアミノ基と反応するスルホン化フルオレニルオキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルからなる水溶性のヘテロ二官能試薬である。マレイミド基がフルオレニル基の主鎖に結合されていて、スルフヒドリル含有ＰＥＧ、最も好ましくはＰＥＧ４００００−ＳＨへの結合を可能にしている。
【００８３】
したがって、本発明により、本明細書において式（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙ又は（ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−Ｙ
［式中、Ｙは、薬物、より好ましくはペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分であり、ｎは、少なくとも１、好ましくは１又は２である整数であり、Ｙは、アミノ基を通じてＦＭＳ基又はＦｍｏｃ基に結合されている］
により特定される薬物結合物前駆体がさらに提供される。
【００８４】
本発明は、結合物（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−Ｙ（式中、Ｙは、薬物、より好ましくはペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分であり、ｎは、少なくとも１、好ましくは１又は２である整数であり、Ｙは、アミノ基を通じてＦｍｏｃ基と結合されている）を調製するための方法であって、
（ｉ）薬物Ｙ、例えばペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量の前駆体７と反応させ、それにより結合物（ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−Ｙを得るステップと、
（ｉｉ）結合物（ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＹをＰＥＧ−ＳＨと反応させるステップ
とを含む方法も提供する。
【００８５】
最も好ましい実施形態では、本発明は、結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙ（式中、Ｙは、薬物、より好ましくはペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分であり、ｎは、少なくとも１、好ましくは１又は２である整数であり、Ｙは、アミノ基を通じてＦＭＳ基と結合されている）を調製するための方法であって、
（ｉ）薬物Ｙ、例えばペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳと反応させ、それにより結合物（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙを得るステップと、
（ｉｉ）結合物（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＹをＰＥＧ−ＳＨと反応させ、それにより結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙを得るステップ
とを含む方法に関する。
【００８６】
最も好ましい別の実施形態では、本発明は、結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙを調製するための方法であって、
（ｉ）ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳをＰＥＧ−ＳＨと反応させ、それにより結合物ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳを得るステップと、
（ｉｉ）薬物Ｙ、例えばペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量の結合物ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳと反応させ、それにより結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙを得るステップ
とを含む方法に関する。
【００８７】
ＰＥＧ−ＳＨ試薬は、好ましくは、ＰＥＧ部分が分子量４０，０００Ｄａの分枝ＰＥＧ部分であるＰＥＧ４０−ＳＨである。
【００８８】
本明細書の背景技術のセクションで言及したように、ＰＥＧ化技術は、安定性及び溶解性を高め、免疫原性を減らし、タンパク質分解を減らし、毒性を減らし、腎臓によるクリアランスを減らし、生物学的利用能を高め、また、循環血液中での寿命を延ばすことにより必要とされる投薬回数をより少なくするなど、その特徴の一部を改善しようとする試みにおいて、分子、特にペプチド薬物及びタンパク質薬物を修飾するのに広く使用されている。しかし、ＰＥＧ化の主要な問題の１つは、ＰＥＧ部分と薬物の間の共有結合が、ほとんどの場合、薬物の生物活性の損失又は薬理学的効力の大幅な低下を引き起こすことである。このため、ＰＥＧ化は、ＰＥＧとの反応によって不活性化される可能性のより少ない高分子量のタンパク質に対してより多く使用されるが、ペプチド及び低分子量のタンパク質に対して使用される頻度はより少ない。
【００８９】
理論的には、ＰＥＧ化によるペプチド及びタンパク質の生理活性の低下は、緩和な塩基性条件及び／又は酸加水分解の影響を受けやすく又は血清プロテアーゼ若しくはエステラーゼにより酵素的に切断できる化学結合を介してＰＥＧ鎖を結合することによって克服することができる。加水分解速度が一定していないとこのような手法が実行不可能になることは明らかである。したがって、必須条件は、結合物からのＰＥＧ鎖の加水分解が、低速度で、且つ厳密な恒常状態のｐＨ及び温度条件の哺乳動物の循環系で、均質な方法で起こることである。
【００９０】
本発明者らは、以前に、可逆的なタンパク質修飾剤として２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＦＭＳ−ＯＳｕ）（Ｇｅｒｓｈｏｎｏｖ他、１９９９年、２０００年；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２００１年、２００１ａ）を調製した。タンパク質が結合されたＦＭＳ部分は、生理的条件で緩徐に且つ自発的に加水分解され、未修飾の親分子を生じる。正常なヒト血清、ｐＨ８．５の水性緩衝液、又はｉｎ  ｖｉｖｏの循環系における、３７℃でのＦＭＳ−タンパク質結合物の加水分解は、ｔ１／２が５〜７時間の速度で起こる。提案する可逆的ＰＥＧ化技術のための骨格としてＦＭＳ部分を使用することにより、様々なＰＥＧ−ＦＭＳ−タンパク質結合物の加水分解速度を予測することが可能になる。修飾された小分子並びにＰＥＧが結合されたポリペプチド及びタンパク質の加水分解のｔ１／２は、比較的狭い範囲の８〜１４時間におさまる。ＰＥＧ−ＦＭＳ−タンパク質結合物の加水分解速度が一定であるのは、フルオレニル部分の９位で起こるβ−脱離反応が周囲の媒体のｐＨにのみ依存するためである。したがって、酵素的加水分解による結合切断に基づく手法で生じることとは対照的に、結合されるタンパク質／ペプチド部分は独自であるにも関わらず、すべての結合物から同程度のＰＥＧ−ＦＭＳ加水分解速度が予想される。本発明の手法を使用して、研究者はさらに、加水分解速度をそれぞれ上昇又は低下させる電子吸引性基又は電子誘導性基でフルオレニル部分を置換することにより、加水分解速度を制御することもできる。薬物に結合されたＰＥＧ−ＦＭＳ鎖の数も、天然の薬物が放出される速度に影響するはずである。
【００９１】
以前に示されているように、スルホン化されたフルオレン部分は有毒ではない（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２００１年）。高分子量のＰＥＧは、毒性及び免疫原性の点で安全であることが知られており、食品産業、化粧品産業、及び製薬産業で広範に使用されている（Ｗｏｒｋｉｎｇ他、１９９７年；Ｒｏｂｅｒｔｓ他、２００２年）。
【００９２】
したがって、本発明は、本明細書で「可逆的ＰＥＧ化」として示す手順を提供する。本発明に従って低分子量のポリペプチド及びタンパク質を用いて実施したこの新しい概念の手法では、ＰＥＧ部分は、標準のＰＥＧ化手順のように薬物に直接結合されるのではなく、ＰＥＧ部分は、本明細書の式（ｉ）〜（ｉｖ）の部分に直接又はリンカーを通じて結合され、薬物は、この（ｉ）〜（ｉｖ）の部分の別の位置に結合される。前記（ｉ）〜（ｉｖ）の部分は、好ましくはＦｍｏｃ又はＦＭＳ部分（ｉ）であり、塩基に対する感受性が高く、且つ緩和な塩基性条件下で除去可能である。したがって、このようにして、不活性であるが体内の生理的条件下で活性薬物へと変換されるプロドラッグが得られる。このプロドラッグの循環血液中での寿命は長いが、ＰＥＧ部分はＦｍｏｃ又はＦＭＳ部分とともに除去され、この薬物は、完全な薬理学的効力を取り戻す。
【００９３】
この新規の手法により、その他の方法ではこの技術により完全に又は部分的に不活性化されることになる低分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物に、ＰＥＧ化に伴う望ましい薬理学的特徴を与えることが可能となる。循環系中に「取り込まれた（ｔｒａｐｐｅｄ）」薬理学的に「不活性な（ｓｉｌｅｎｔ）」結合物は、望ましい薬物動態プロファイルで、共有結合されている親ペプチド又は親タンパク質を放出する。この新しい手法は、既存のペプチド薬物の寿命、生物学的利用能、効力を改善し、また、既知のペプチド薬物及びさらに発見される可能性のあるペプチド薬物候補物においてもそれらを改善すると予想されている。
【００９４】
本発明に従い、いくつかのペプチド薬物及びタンパク質薬物についてこの新技術を試験することに成功した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命を延長することに加えて、不活性であるが再活性化が可能なＰＥＧ−タンパク質結合物は、投与後の任意の時点での有効タンパク質薬物の循環血液中レベルを低く維持するという大きな利点を有する。このようにして、循環血液中で薬物の毒性化又は感度の低減の「突発的発生（ｂｕｒｓｔ）」があるという公知のリスクが回避される。
【００９５】
上記に言及したように、理論上、研究者は、血清プロテアーゼ又はエステラーゼによってＰＥＧ−タンパク質結合物から遊離させることができるＰＥＧ鎖をデザインすることができる。しかし、急速な又は予測不可能な遊離速度は有用ではない。この新技術の必須条件は、ＰＥＧ鎖が緩徐で、連続的で、且つ予測可能な速度で結合物から自発的に加水分解されなければならないということである。ＰＥＧ鎖の遊離は、長期間に渡って起こり、それにより、加水分解によってＰＥＧ鎖を除去するまで、投入された結合物を循環系内で維持するべきである。本発明は、これらの必要条件を満たす。例えば、正常なヒト血清において３７℃でインキュベートすると、ＰＥＧ鎖は、８．０±２時間の半減期でタンパク質から加水分解される。遊離速度は、Ｆｍｏｃ部分（Ｆｍｏｃ／ＦＭＳ）の性質、及び、血液血清のｐＨ及び反応性によってのみ決定され、哺乳動物は、最後に挙げたこれら２つのパラメータに関して厳密な恒常性を維持している。
【００９６】
本発明によれば、予備試験にはＰＥＧ化インスリンの合成を含んだ。（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン誘導体をｐＨ８．５で、又は３７℃の正常なヒト血清でインキュベートすると、脂質生成活性が３０±２時間の半減期で復活した。２箇所を修飾したインスリン、即ち（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−インスリンの脂質生成能力の復活は、さらに１０±１時間遅れて起こった。
【００９７】
マウスに（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンを単回皮下投与すると、循環血液中のグルコースのレベルは低められ、血糖正常値に戻るまでの半減期は天然のインスリンでの半減期の６．７倍を超えた。（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンの腹腔内投与の後では、血糖正常値に戻るのは天然ホルモンの投与後より３．４倍遅かった。要約すると、可逆的ＰＥＧの原型が確立された。これは、結合後、緩徐で自発的な加水分解を受け、生理的条件で未修飾の親薬物を再生させる。したがって、ＰＥＧ化による薬物の不活性化という重大な欠点は、本発明の技術によって解決される。ＰＥＧ−ＦＭＳ部分は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ部分（参考  ｔ１／２＝５〜７時間）と比べて速い速度で加水分解する。結合物の望ましい薬理学的特徴を得るために、２〜５つのＰＥＧ鎖をペプチド薬物又はタンパク質薬物に導入しようとするときは、ＦＭＳ−ＰＥＧ部分を含む化合物がより適している。
【００９８】
本発明の別の実施例では、天然のエキセンディン−４を４μｇ／マウスの用量で皮下投与すると、血糖値（ＢＧＬ）が２６〜２８％（１４０ｍｇ／ｄｌから１０４〜１０１ｍｇ／ｄｌに）低下し、投与の０．５〜１時間後に最大率の変化がＢＧＬに起こることを本明細書に示している。次いで、グルコース濃度は、３．７±０．３時間のｔ１／２で初期レベルに戻った。ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４を皮下投与した後は、ＢＧＬの低下はより緩やかな速度で起こった。循環血液中のグルコースは、投与の８〜１２時間後に最低の濃度に達した（９２ｍｇ／ｄｌ、３３％）。次いで、安定で低い循環血液中グルコース濃度が、さらに１２時間維持された。３０±２時間のｔ１／２で初期のグルコースレベルに戻り、これは、同用量の天然のエキセンディン−４により得られるｔ１／２の７．５倍長かった。
【００９９】
本発明の別の実施例では、ＢＩＡコア結合分析を使用して、天然のインターフェロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再生速度は６５時間の半減期を有すると推定されたことを本明細書に示している。ラットへ皮下投与した後、循環血液中での抗ウイルス力をモニターすると、活性ＩＦＮα２のレベルは、５０時間後にピークとなり、投与の２００時間後でもなお、かなりのレベルが検出された。この値は、未修飾のインターフェロンで測定された半減期が約１時間であるのと対照的である。活性ＩＦＮα２の濃度は、注射量に対して直線的に増えた。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の皮下投与を静脈内投与と比較して、本発明者らは、ＩＦＮα２の循環血液中での長寿命は、皮下体積からＰＥＧ化タンパク質が緩徐な速度で吸収されること、及び循環血液中でＰＥＧから緩徐な速度で放出されることの双方によって影響を及ぼされていることを発見した。結果の数値シミュレーションは、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された結果と良く一致していた。この新規のＰＥＧ化ＩＦＮα２結合物の薬物動態プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより長い維持と活性な天然ＩＦＮα２の再生とを兼ね備えており、末梢組織へ容易に接近することを確実にし、これにより現在使用されている製剤に対して総体的に有利である。
【０１００】
ペプチドＹＹ３〜３６（ＰＹＹ３〜３６）がマウス及びヒトにおいて満腹感を誘発することが最近示された。絶食中のマウスにＰＹＹ３〜３６を皮下投与することによって誘発した満腹感が最大３時間の半減期を有したことを本明細書に記述している。非加水分解性の結合を通してＰＹＹ３〜３６をＰＥＧ化すると、不活性な結合物を生じたが、本発明の結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６は、生理的条件下で未修飾ＰＹＹ３〜３６を徐々に放出した。マウスにＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６を皮下投与すると、遅延性の満腹感をもたらし、半減期は最大２４時間であった。したがって、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６は、ＰＹＹ３〜３６の長時間作用性のプロドラッグとして役立ち、これにより、ヒトの肥満を制御するためのより実用的な手段を提供することができる。
【０１０１】
本発明によるＰＥＧ部分は、直鎖ＰＥＧでも分枝ＰＥＧでもよく、分子量は２００〜２００，０００Ｄａの範囲、好ましくは最大８０，０００Ｄａ、より好ましくは５，０００〜４０，０００Ｄａ、最も好ましくは約２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａである。好ましくは、ＰＥＧ部分は４０，０００Ｄａの分枝ＰＥＧ分子である。
【０１０２】
本発明のプロドラッグは、ＰＥＧ化用薬剤を使用して調製する。ＰＥＧ化用薬剤とは、それだけには限らないが、Ｆｍｏｃ又はＦＭＳ部分のフルオレン環に存在するＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ２−Ｃｌ、−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＰＯ２Ｃｌ、−（ＣＨ２）ＸＨａｌなどの官能基と反応することができる任意のＰＥＧ誘導体を意味する。これらの試薬及び得られる生成物の例は、本明細書のスキーム７に図示している。本発明に従って使用できるこれらの誘導体化ＰＥＧ及び同様の試薬は、市販されている。ＰＥＧ化用薬剤は、ＰＥＧ分子の１方の終端のヒドロキシル基１つのみが結合に利用可能なモノメトキシ型で一般に使用されることに留意すべきである。しかし、例えば、２つのペプチド又はタンパク質残基が単一のＰＥＧ部分に共有結合した結合物を得ることが望まれる場合は、両方の終端が結合に利用可能な二官能形態のＰＥＧを使用してよい。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は分枝型である。分枝ＰＥＧが、通常使用される。これらは、Ｒ（ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはペンタエリスリトールやグリセリンなど中心コア部分を示し、ｍは分枝アームの数を示す）として示すことができる。分枝アームの数（ｍ）は、３〜１００以上を取ることができる。ヒドロキシル基は、化学修飾を受けやすい。
【０１０４】
分枝ＰＥＧ分子を使用することは、それらが必要とする結合部位の数がかなり少なく、生理活性の損失を最小限に抑えるということを含めて、いくつかの利点がある。分枝ＰＥＧ分子は、米国特許第６，１１３，９０６号、第５，９１９，４５５号、第５，６４３，５７５号、及び第５，６８１，５６７号に記載されており、その全体が本明細書で完全に開示されるように、参照により本明細書に組み込む。
【０１０５】
本発明はさらに、本発明によるＰＥＧ化化合物又は薬剤として許容されるその塩、及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０６】
担体は、製剤の有効成分と相容性があり（また、好ましくは、ペプチドを安定化させることができる）、治療対象に有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【０１０７】
製剤は、好都合には単位投与剤形で存在してよく、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ「製薬の科学及び実務（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２０版、２０００年）」で記載されているような薬学技術分野で公知の方法のいずれかによって調製してよい。すべての方法は、１種又は複数の副成分を構成する担体に有効成分を結合させるステップを含む。
【０１０８】
本発明の結合物をヒトに投与するため又は動物に使用するための任意の適切な経路、例えば、従来の経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、経鼻投与、及び経皮投与を介する経路が、本発明により想定される。
【０１０９】
本発明はさらに、必要とする個体に本発明のＰＥＧ化したペプチド又はタンパク質のプロドラッグを投与することを含む、ペプチド薬物及びタンパク質薬物によって治療可能な疾患、障害、及び状態を治療するための方法を提供する。
【０１１０】
以下の非限定的な実施例により、本発明をここにさらに例示する。
【実施例】
【０１１１】
Ｉ．化学の項
材料及び方法（化学の項）
【０１１２】
（ｉ）材料：ヒト（Ｚｎ２＋フリー）インスリンは、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）又はＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）により寄贈され、更に精製することなく用いた。組換えｈＧＨは、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）からの寄贈であった。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ、スイス）から得た。ＰＥＧ５−ＯＳｕ（本明細書ではＰＥＧ５，０００−ＯＳｕとも称する）及びＰＥＧ４０−ＯＳｕ（本明細書ではＰＥＧ４０，０００−ＯＳｕとも称する）は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ（現在のＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、カリフォルニア州、米国）から入手した。ＴＮＢＳ、ＤＴＮＢ、α−ラクトアルブミン、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、シスタミン−２  ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド、ゲンタマイシン及びＴＰＣＫ処理トリプシンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）から購入した。非グリコシル化ヒトＩＦＮα２は、ＷＯ０２／３６０６７に記載のように調製した。対照群として用いたエキセンディン−４、ペプチドＹＹ３−３６及び２７個のアミノ酸を有するリシンを含まない合成ペプチドであるペプチド２７（ＡＥＩＳＧＱＬＳＹＶＲＤＶＮＳＷＱＨＩＷＴＮＶＳＩＥＮ）（配列番号１４）を、ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＭＳ  ４２２、Ａｂｉｍｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｎ−Ｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）を用いた固相法で合成した。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを合成するために用いた長い一覧表の化合物を含むその他の試薬は全て分析用グレードであり、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）から購入した。
【０１１３】
（ｉｉ）逆相ＨＰＬＣは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７５７  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＳＰ８８００  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｐｅｃｔｒｏ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）で行った。カラムの流出物を、２２０ｎｍのＵＶ吸収で観察し、クロマトグラムをｃｈｒｏｍ−Ｊｅｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｖｉｅｒａ  Ｂｅａｃｈ、フロリダ州、米国）で記録した。実施例で使用したＨＰＬＣ  ｐｒｅｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎには、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−１８（７μｍ）及びＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ−１８（５μｍ）２５０−４ｍｍ（Ｍｅｒｃｋ、Ｒａｔｈｗａｙ、ニュージャージー州、米国）などのＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ２５０−１０ｍｍ、並びにｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ  Ｖｙｄａｃ  ＲＰ−１８又はＲＰ−４カラム（２２×２５０ｍｍ；ビーズの大きさ１２μｍ；Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、カリフォルニア州、米国）が含まれていた。溶液Ａ（０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ溶液）と溶液Ｂ（０．１％ＴＦＡのアセトニトリル−Ｈ２Ｏ（７５：２５）溶液）の間の直線グラジエントを用いた。分析用ＨＰＬＣ手法では、３０から１００％の間の溶液Ｂとなる直線グラジエントを、流速０．８ｍｌ／分で５０分間流した。
【０１１４】
（ｉｉｉ）ＨＰＬＣ分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５７  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＳＰ８８００  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍと、ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ  ｄａｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州、米国）で全制御されたＳｐｅｃｔｒａ−ＳＹＳＴＥＭ  ＡＳ１００  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ及びＳｐｅｃｔｒａ−ＳＹＳＴＥＭ  ＵＶ１０００を備えたＳｐｅｃｔｒａ−ＳＹＳＴＥＭ  Ｐ２０００  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍとを用いて行った。カラムの流出物は、２２０ｎｍのＵＶ吸収で観察した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣは、ｐｒｅｐａｃｋｅｄ  Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ（商標）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ（４．６×１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて行った。カラムを１０〜１００％の溶液Ｂの２液グラジエントで、流速３ｍｌ／分で１０分かけて溶離した（溶液Ａは、０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ溶液であり、溶液Ｂは、０．１％ＴＦＡのアセトニトリル：水（３：１、ｖ：ｖ）溶液であった）。ＰＥＧ化化合物をＲＰ−４カラム（２５０×４ｍｍ、ビーズの大きさ５μｍ、ＶＹＤＡＣ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、カリフォルニア州）を用い、１０〜１００％の溶液Ｂの２液グラジエントで、流速１ｍｌ／分で５０分間分析した。
【０１１５】
（ｉｖ）質量分析：質量スペクトル（ＭＳ）を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）及びエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＭＳ）技術（各々、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｒｅｆｌｅｘ−Ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎモデル、ドイツ、及びＶＧ−ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＩＩ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）を用いて測定した。ポリペプチドをシナピン酸（ｓｉｎａｐｔｉｃ  ａｃｉｄ）との共晶としての金属ターゲットに蒸着させ、質量スペクトルを陽イオンモードで測定した。
【０１１６】
（ｖ）ＵＶスペクトル：紫外線スペクトルは、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ７５００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用い、厚み１ｃｍのＵＶキュベットで得た。
【０１１７】
（ｖｉ）薄層クロマトグラフィーをシリカゲルプレートで行い、クロロホルム：メタノール：酢酸（９．２：０．５：０．３、ｖ：ｖ：ｖ、ＴＬＣ、Ａ）又はクロロホルム：メタノール（９：１、ｖ：ｖ、ＴＬＣ、Ｂ）のいずれかで展開した。
【０１１８】
（ｖｉｉ）アミノ酸分析は、１１０℃で２４時間、６Ｎ  ＨＣｌで酸加水分解した後、Ｄｉｏｎｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＰ１０９０（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。Ｎ末端配列分析を、Ｍｏｄｅｌ  ４９１Ａ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、米国）で行った。
【０１１９】
中間化合物の同定−実施例で試薬及び中間体として用いられる化合物の大半は、後述のスキーム１〜７の各式及び下記特徴により確認される。中間体は、下線をした太字ａからｋ（小文字）により、又は前駆体という用語と太字のイタリック体の数字、前駆体１〜８により確認される。
【０１２０】
（実施例１）
ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（前駆体１）の合成
スキーム１に図示した式の前駆体１を、スキーム２に図示したように、２−アミノフルオレン及びｔ−Ｂｏｃ−アラニン（ＢｏｃＡｌａ）から出発して、数ステップで調製した。
【０１２１】
１（ａ）．  ２−（ｔ−ＢｏｃＡｌａ−アミノ）フルオレン（中間体ａ）の合成
ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ（４．１６ｇ、２２ｍｍｏｌ）をジオキサン１１ｍｌに溶解した。次いで、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１Ｍ  ＤＭＦ１１ｍｌ中１１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間、攪拌しながら反応を行った。調製したジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を遠心分離で除去した。このようにして得られた対称性無水生成物（ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−無水物）を、一晩攪拌しながら、ジオキサン−水（１：１、ｖ：ｖ）３０ｍｌ中に、１１ｍｍｏｌのＮａＨＣＯ３を含む、２−アミノフルオレン（０．９２５ｇ、１１ｍｍｏｌ）の溶液と反応させた。形成された白色固体を回収し、２４時間、真空下、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。中間体ａを６０％の収率で得た（１．３１ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）。ＴＬＣ（ジクロロメタン）上でＲｔ＝０．１７で移動した。質量分析は、質量３５２．４５Ｄａを示した（質量計算値＝３５２．２Ｄａ）。
【０１２２】
１（ｂ）．  ９−ホルミル−２−（ｔ−ＢｏｃＡｌａ−アミノ）フルオレン（中間体ｂ）の合成
実施例１（ａ）で得られた中間体ａ（１．３１ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ１０ｍｌに溶解し、乾燥ＴＨＦに懸濁させた水素化ナトリウム（ＮａＨ、６０％）（０．４１２ｇ、１１ｍｍｏｌ、３．３当量）と混合した。次いで、ギ酸エチル（０．６７５ｍｌ、８．３５ｍｍｏｌ）を加え、反応をアルゴン雰囲気下で、攪拌しながら１時間行った。氷片及び水を加えた後、有機溶媒を真空で蒸発させて除去した。水溶液をエーテルで洗浄し、酢酸でｐＨ５．０に酸性化した。形成された沈殿を酢酸エチルに溶解し、有機溶液を０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３で数回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発後に形成された黄色固体をエーテルで粉砕し、真空で乾燥した。中間体ｂを３５％の収率で得た（０．４６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：酢酸、９．２：０．５：０．３、ｖ：ｖ：ｖ）上でＲｆ＝０．５９で移動した。質量スペクトル分析（エレクトロスプレーイオン化技術）は、質量３８０．２６Ｄａを示した（質量計算値＝３８０．２Ｄａ）。
【０１２３】
１（ｃ）．  ９−ヒドロキシメチル−２−（ｔ−ＢｏｃＡｌａ−アミノ）フルオレン（中間体ｃ）の合成
実施例１（ｂ）で得られた中間体ｂ（０．４６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール中に懸濁させた。固体水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（５７ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）  を数回に分けて加え、反応混合物を４時間攪拌した。得られた粗生成物を更にシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより、クロロホルム：メタノール（９５：５）で溶離して精製し、８０ｍｇ（１７％、０．２ｍｍｏｌ）の純粋な中間体ｃを得た。これはＴＬＣ（クロロホルム：メタノール、９：１、ｖ：ｖ）上でＲｆ＝０．５３で移動した。質量スペクトル分析は、質量３８２．２Ｄａを示した（質量計算値＝３８２Ｄａ）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＳＯＣＤ３）δ：１．４（Ｓ，１２Ｈ），３．８〜４．０（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｄ，１Ｈ），６．２（ｓ，幅広），７．２〜７．３（ｍ，２Ｈ），７．６〜８．０（ｍ，４Ｈ），８．４（５，１Ｈ）。
【０１２４】
１（ｄ）．  ９−ヒドロキシメチル−２−（Ａｌａ−アミノ）フルオレン（中間体ｄ）の合成
実施例１（ｃ）で得られた中間体ｃ（８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：１、ｖ：ｖ）５ｍｌに溶解した。１時間後、溶媒を蒸発させて除去し、中間体ｄをエーテルに懸濁させ、沈殿して回収し、凍結乾燥させた。
【０１２５】
１（ｅ）．  中間体ｅの合成
Ｈ２Ｏ３ｍｌ中に実施例１（ｄ）で得られた中間体ｄ（０．２ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（０．８ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ＰＥＧ５，０００−ＯＳｕ（１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応を２５℃で数時間、攪拌しながら行った。生成物の組成を、Ｃ１８カラム（Ｒｔ＝３６．６分）を用いた分析用ＨＰＬＣ手法により検証した。中間体ｅの質量スペクトル分析（ＭＡＬＤＩ）は、質量５３４２Ｄａを示した。
【０１２６】
１（ｆ）．  ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（前駆体１）の合成
実施例１（ｅ）で得られた中間体ｅ（０．２ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液に、トリホスゲン（１ｍｍｏｌ、５モル過剰）の冷クロロホルム（３ｍｌ）溶液を分割して加えた。一晩、攪拌しながら反応を行った。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を乾燥ＴＨＦ１．０ｍｌに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１００ｍｇ、４当量）及び２，４，６−トリメチルピリシン（０．１６３ｍｌ、６当量）を加え、反応を室温で２時間、攪拌しながら行った。表題生成物であるＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを、分取用ＨＰＬＣ手法により、Ｃ１８カラム（ＨＰＬＣ、Ｒｔ＝３９．０分）を用いて精製し、同質にした。質量スペクトル分析は、質量５６５４ｋＤａを示した。
【０１２７】
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕとは異なり、ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕは水溶液によく溶解し、ＵＶ領域でモル吸光係数ε２８０＝２１，２００及びε３０１＝１０，１００で吸収する。
【０１２８】
（実施例２）
ＰＥＧ５，０００−ＦＭＳ−ＯＳｕ（前駆体２）の合成
スキーム１で図示した前駆体２のＰＥＧ５，０００−ＦＭＳ−ＯＳｕを、スキーム２に図示したようにクロロスルホン酸を用いた前駆体１のＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕのスルホン化により調製した。概説すると、０℃に冷却した前駆体１のＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍｌ）溶液に、ＣｌＳＯ３ＨのＣＨ２Ｃｌ２溶液を１５分かけて滴下して加え、この溶液を２５℃で２時間攪拌した。フルオレン環の２位がスルホン化された生成物ＰＥＧ５，０００−ＦＭＳ−ＯＳｕを分取用ＨＰＬＣ手法により精製し、大規模な透析後、質量分析及び元素分析（硫黄用）により、また、ゲンタマイシン又はインスリンのいずれかに結合させた後その加水分解速度（ｐＨ８．５、３７℃での）として特徴付けた。
【０１２９】
（実施例３）
ＰＥＧ４００００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（前駆体３）の合成
スキーム１に図示した前駆体３のＰＥＧ４００００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕは、ＰＥＧ５０００−ＯＳｕをＰＥＧ４００００−ＯＳｕに置き換えた以外は同一の反応条件下で、実施例１のステップ１（ｅ）及び１（ｆ）に記載のように調製した。
【０１３０】
（実施例４）
ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ＯＳｕ（前駆体４）の合成
スキーム１に図示したように前駆体４のＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ＯＳｕは、前駆体１を前駆体３に置き換えた以外は同一の反応条件下で、実施例２に記載のように前駆体３のＰＥＧ４００００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕのスルホン化により調製した。
【０１３１】
（実施例５）
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／薬物結合物及びＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製のための「一段階」処理
本発明のＰＥＧ−Ｆｍｏｃ及びＰＥＧ−ＦＭＳの薬物との結合物の調製に、水性条件下でＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ又はＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＳｕ前駆体を一以上の薬物のアミノ基と反応させる「一段階」処理を用いてもよい。
【０１３２】
したがって、以下の実施例６〜８では、実施例１で得られた固体前駆体１のＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−ＯＳｕを、ｐＨ７．４、０℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中にゲンタマイシン又はインスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む攪拌している溶液に、１０倍モル過剰で加えた。これらの条件下、タンパク質１モルに付き５〜７モルの前駆体１を導入した。反応は固体ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの添加後、１５分以内に完了した。
【０１３３】
（実施例６）
（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−ゲンタマイシンの合成
実施例１で得られた固体前駆体１（６ｍｇ、１μｍｏｌ）を、ゲンタマイシン（０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３１．０ｍｌ中２００μｍｏｌ、ｐＨ〜７．５）を含む攪拌している溶液に加えた。反応を２５℃で３時間行い、次いで、７℃で数日間、Ｈ２Ｏで透析した。これらの透析条件下で、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃに共有結合されていない、遊離のゲンタマイシンが透析で除去された。生成物であるＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−ゲンタマイシンは、２８０ｎｍでのその吸収により、また、測定した分割単位の酸加水分解後のアミノ酸分析により判断したときに、１ｍｏｌのゲンタマイシンに共有結合した１ｍｏｌのＰＥＧ−Ｆｍｏｃを含んでいた。加水分解物は、アラニン（ＰＥＧ−ａｌａ−Ｆｍｏｃ部分から派生）と、ゲンタマイシンの酸加水分解後にプロリン及びロイシンの位置で現れた２つのピークとを含んでいた（図示せず）。
【０１３４】
（実施例７）
（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−ゲンタマイシンの合成
固体前駆体１（１１．３ｍｇ、２．１μｍｏｌ）を、攪拌しているゲンタマイシン（０．５ｍｇ、１μｍｏｌ、０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３１．０ｍｌ中）の溶液に加えた。反応を２５℃で２時間行い、一晩透析した。生成物である（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−ゲンタマイシンは、酸加水分解後のアミノ酸分析（上記実施例６参照）及びＴＮＢＳで修飾されていないアミノ基の量を測定することにより検証したときに、ゲンタマイシンに共有結合した約２モルのＰＥＧ−Ｆｍｏｃを含んでいた。
【０１３５】
（実施例８）
（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン及び（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−インスリンの合成
（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）ｌ−インスリンの調製では、攪拌しているＺｎ２＋フリーのインスリン（０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３２．０ｍｌ中１ｍｇ、０．１７２μｍｏｌ）に、前駆体１（８．８μｌ、ＤＭＦ中２０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を新たに加えた（１．７６ｍｇ、０．３２９μｍｏｌ、タンパク質より１．９モル過剰の試薬）。反応を２５℃で２時間行った。反応混合物をＨ２Ｏで一晩透析し、ＮａＨＣＯ３及びＤＭＦを除いた。表題生成物は、後述の生物学の項に記載したいくつかの手法により判断したときに、１ｍｏｌのインスリンに付き約１モルのＰＥＧ−Ｆｍｏｃを含んでいた。サンプル中のインスリンの濃度は、通常、２０μｌのアリコートを酸加水分解し、次いでアミノ酸加水分析することにより測定し、グルタミン酸（７残基）、アスパラギン酸（３残基）及びイソロイシン（２残基）により測定した。
【０１３６】
（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−インスリンの調製を、４．６３ｍｇ、０．８６５μｍｏｌの、タンパク質より５モル過剰の試薬を用いて、上述したように行った。
【０１３７】
（実施例９）
Ｎ−［２−（３−アセチルチオプロピオニルアミノ）−９−フルオレニル−メトキシカルボニルオキシ］−スクシンイミド（前駆体５）
スキーム３に図示した前駆体５を、スキーム４に図示した手順により２−アミノフルオレンから出発して、以下のように合成した。
【０１３８】
９（ａ）．  ２−（ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（中間体ｆ）の合成
ジ−ｔ−ブチル−ジカルボネート（Ｂｏｃ無水物、１４ｇ、６４．２ｍｍｏｌ）のジオキサン（５０ｍｌ）溶液を、２−アミノフルオレン（１０ｇ、５５ｍｍｏｌ、１００ｍｌのジオキサン：水（１：１、ｖ：ｖ）中）及びＮａＨＣＯ３（９．２４ｇ、１１０ｍｍｏｌ）と混合し、一晩攪拌した。このように形成した白色固体をろ過し、氷水（２００ｍｌ）で洗浄し、真空下で乾燥した。中間体ｆを６０％の収率で得た（９．２４ｇ、３３ｍｍｏｌ）。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：酢酸、９．５：０．５：０．３、ｖ：ｖ：ｖ）；Ｒｆ＝０．７３。ＥＳＭＳ計算値＝２８０．４Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値＝２８０．４５Ｄａ。
【０１３９】
９（ｂ）．  ９−ホルミル−２−（ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（中間体ｇ）の合成
ステップ９（ａ）で得られた中間体ｆ（３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で水素化ナトリウム（ＮａＨ）（６０％、１．２３ｇ、３３ｍｍｏｌ、３．３当量）の乾燥ＴＨＦ懸濁液に加えた。次いで、ギ酸エチル（２ｍｌ、２５ｍｍｏｌ、２．５当量）を加え、反応混合物を１時間攪拌した。氷片及び水を加え、有機溶媒を蒸発させ、水溶液をエーテルで洗浄し、酢酸（ｐＨ〜５）で酸性化した。このように形成した沈殿を酢酸エチルに溶解し、ＮａＨＣＯ３（０．５Ｎ）、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。黄色固体をエーテルで洗浄し、乾燥した。中間体ｇを９０％の収率で得た（２．８ｇ、９ｍｍｏｌ）。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：酢酸、９．５：０．５：０．３、ｖ：ｖ：ｖ）、Ｒｆ＝０．６６。ＥＳＭＳ計算値＝３０９Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値＝３０９．２Ｄａ。Ｍ−１：３０８．２０、Ｍ＋Ｎａ：３３２．３６、ダイマー［Ｍ＋Ｎａ］＋：６４１．５９。
【０１４０】
９（ｃ）  ９−ヒドロキシメチル−２−（ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（中間体ｈ）の合成
水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（０．３８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、ステップ９（ｂ）で得られた中間体ｇ（２．８ｇ、９ｍｍｏｌ）の乾燥メタノール懸濁液に分割して加え、反応を４時間続行させた。生成物である中間体ｈをシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより、クロロホルム：メタノール（９８：２、ｖ：ｖ）で溶離して精製し、５０％の収率で得た（１．４ｇ、４．５ｍｍｏｌ）。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール、９：１、ｖ：ｖ）、Ｒｆ＝０．５４。ＥＳＭＳ計算値＝３１１Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値＝３１１．４２Ｄａ、［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３３４．４２、［Ｍ＋Ｋ］＋＝３５０．３４。
【０１４１】
９（ｄ）．  ９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレン（中間体ｉ）の合成
ステップ９（ｃ）で得られた中間体ｈ（１．４ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を５Ｎ  ＨＣｌのジオキサン溶液１１０ｍｌに溶解した。１時間後、溶媒を蒸発させて濃縮し、生成物をエーテルで沈殿させ、凍結乾燥した。中間体ｉを８４％の収率で得た（０．７９ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール、９：１、ｖ：ｖ）、Ｒｆ＝０．３８、ＥＳＭＳ計算値＝２１１．２６Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２１１．１０Ｄａ。
【０１４２】
９（ｅ）．  ３−Ｓ−アセチルチオプロピオン酸の合成
ピリシン（６．９ｍｌ、８４．６ｍｍｏｌ）を３−メルカプトプロピオン酸（２．５ｍｌ、２８．２ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（１６ｍｌ、８４．６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。反応溶液を１６時間攪拌し、真空で濃縮した。水（５ｍｌ）を２０分で加え、溶液を真空で濃縮した。得られた油状物をエーテル（５０ｍｌ）に溶解し、水及びＫＨＳＯ４（０．５Ｎ）で洗浄した。エーテル画分をＮａ２ＳＯ４及び真空で乾燥して表題生成物を得た（収率：８５％、２４ｍｍｏｌ、３．６ｇ）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．２１（ｓ，３Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ），２．９（ｔ，２Ｈ）。
【０１４３】
９（ｆ）．  ３−Ｓ−アセチルチオプロピオン酸無水物の合成
ステップ９（ｅ）の３−Ｓ−アセチルチオプロピオン酸（１．８ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（１．４ｇ、６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に４時間溶解した。沈殿したＤＣＵをろ別し、このように形成された無水物を使用するまで４℃に保った。
【０１４４】
９（ｇ）．  ９−ヒドロキシメチル−２−（３−アセチルチオプロピオニル−アミノ）−フルオレン（中間体ｊ）の合成
ステップ９（ｄ）で得られた中間体ｉ（０．４２２ｇ、２ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（０．７４ｇ、１８ｍｍｏｌ）を水／ジオキサン（１：１、２０ｍｌ）に溶解し、ステップ９（ｆ）の３−Ｓ−アセチルチオプロピオン酸無水物のＤＭＦ溶液（１７ｍｌ、６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を１時間攪拌した。有機溶媒を真空で除去し、この溶液をエーテルで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４（０．５Ｎ）及び水で洗浄し、真空で乾燥した。得られた粗生成物である中間体ｊを、更にシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン（１：１、ｖ：ｖ）で溶離して精製した。収率：６０％、０．４ｇ、１．２ｍｍｏｌ。ＥＳＭＳ、（約４３１）Ｍ＋Ｎａ＋：４６４、ダイマー２Ｍ：６８２、ダイマー２Ｍ：Ｎａ＋：７０５．６７。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ）５．３分（１０分で１０〜１００％の溶液Ｂ、３ｍｌ／分）。
【０１４５】
９（ｈ）．  前駆体５の合成
ステップ９（ｇ）で得られた中間体ｊを、スキーム４に図示したように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びホスゲンと反応させた。したがって、ピリシン（０．２１５ｍｌ、２．７ｍｍｏｌ）を、攪拌している中間体ｊ（０．３８５ｇ、０．９ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（０．２６５ｇ、０．９ｍｍｏｌ、３当量）の乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）溶液に滴下して加えた。２０分後、沈殿したピリシン塩酸塩をろ別し、ＴＨＦを蒸発させて除去した。得られた油状物を乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解した。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５ｇ、４．４ｍｍｏｌ、５当量）及びピリシン（０．２１５ｍｌ、２．７ｍｍｏｌ）を加え、溶液を２０分間攪拌した。沈殿したピリシン塩酸塩をろ別し、ＴＨＦを真空で除去した。得られた油状物を更にシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン（１：１及び４：１）で溶離して精製した。生成物である前駆体５を、８８％の収率で得た（０．３８ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）。ＥＳＭＳ：（約４８２）Ｍ：４８２．２。ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ）６．６８分（１０分で１０〜１００％の溶液Ｂ、３ｍｌ／分）。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、１：１、ｖ：ｖ）Ｒｆ＝０．４。
【０１４６】
（実施例１０）
Ｎ−［２−（３−アセチルチオプロピオニルアミノ）−７−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ］−スクシンイミド（前駆体６）の合成
スキーム３に図示した前駆体６を、実施例２で上記したように、クロロスルホン酸を用いて前駆体５をスルホン化することにより調製した。
【０１４７】
（実施例１１）
ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ、Ｎ−［２−（マレイミドプロピオニルアミノ）フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルオキシ］−スクシンイミド（前駆体７）
スキーム３に図示した前駆体７のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを、スキーム５に図示したように、２−アミノフルオレンから出発して、上記実施例９に記載の中間体ｆからｉの合成を経由し、その後以下のステップに従って調製した。
【０１４８】
１１（ａ）．  ９−ヒドロキシメチル−２−（マレイミドプロピオニルアミノ）フルオレン（中間体ｋ）の合成
３−マレイミドプロピオン酸無水物を、３−マレイミドプロピオン酸（１ｇ、５．９ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（０．６９ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に溶解し、４時間インキュベートして調製した。ＤＣＵをろ別し、こうして形成された無水物を４℃に保った。
【０１４９】
９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレン（中間体ｉ）（０．４ｇ、１．９ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（０．７４ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）を水に溶解し、３−マレイミドプロピオン酸無水物のＤＭＦ（１２ｍｌ、２．９５ｍｍｏｌ）溶液を加えた。反応混合物を４０分間攪拌し、生成物の組成をＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎの分析用ＨＰＬＣにより観察した（Ｒｔ＝４．４６分、１０分で１０〜１００％のＢ、３ｍｌ／分）。粗生成物である中間体ｋを、分取用ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８ｃｏｌｕｍｎ、１０〜１００％のアセトニトリル：水［７５：２５、ｖ：ｖ］、６０分、１２ｍｌ／分）を用いて精製した。収率：５７％、１．０８ｍｍｏｌ、０．３９ｇ。ＥＳＭＳ計算値＝３６２．３８Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値＝３６２．４２Ｄａ）。
【０１５０】
１１（ｂ）．  ＭＡＬ−ＦＭＯＣ−ＮＨＳの合成
ステップ１１（ａ）で得られた中間体ｋ（０．３７ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（０．４２５ｇ、１．４３ｍｍｏｌ、４．２当量）を含む攪拌している乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、ピリシン（０．１６７ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。２０分後、沈殿したピリジン塩酸塩をろ別し、ＴＨＦを真空で除去した。得られた油状物を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ１０ｍｌに溶解した。次いで、ピリシン（０．２６ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を２０分間攪拌した。更にいくらか沈殿したピリシン塩酸塩をろ別し、ＴＨＦを真空で除去した。得られた油状物をクロロホルム（１００ｍｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液（０．５Ｎ、３×５０ｍｌ）、ＨＣｌ（０．１Ｎ、３×５０ｍｌ）、水（２×５０ｍｌ）及びブラインで洗浄した。クロロホルムを真空で除去し、生成物である前駆体７を乾燥した。収率：８９％（０．９ｍｍｏｌ、０．４５ｇ）。ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ）Ｒｔ＝５．７分（１０分で１０〜１００％のＢ、３ｍｌ／分）。ＥＳＭＳ計算値＝５０３Ｄａ、［Ｍ＋Ｎａ］＋ＥＳＭＳ測定値＝５２６．３８Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値［Ｍ＋Ｋ］＋＝５４２．３０Ｄａ。
【０１５１】
（実施例１２）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ、Ｎ−［２−（マレイミドプロピオニルアミノ）−７−スルホ−フルオレン−９−イル］メトキシカルボニルオキシスクシンイミド（前駆体８）の合成
スキーム３に図示され、本明細書においても略記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（又はＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳｕ）により確認される前駆体８を、スキーム５に図示したようにクロロスルホン酸で前駆体７のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをスルホン化することにより、以下のように調製した。
【０１５２】
実施例１１で得られた前駆体７（０．２ｍｍｏｌ、０．１ｇ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１０ｍｌ）溶液に、クロロスルホン酸（０．５ｍｌ）を加えた。１５分後、冷エーテル（９０ｍｌ）を加え、沈殿した生成物である前駆体８をエーテルで洗浄し（×３）、乾燥させた。収率：９５％（０．１１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）。ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ）Ｒｔ＝２．６５分（１０分で１０〜１００％のＢ、３ｍｌ／分）。ＥＳＭＳ計算値＝５８３Ｄａ、ＥＳＭＳ測定値［Ｍ−Ｈ］＋＝５８２．２４Ｄａ、［Ｍ＋Ｈ］＋＝５８４．５２Ｄａ、［Ｍ＋Ｎａ］＋＝６０６．４７Ｄａ。
【０１５３】
（実施例１３）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの化学的特徴
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ又はＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳｕは、ペプチド及びタンパク質のアミノ基と反応するスルホン化フルオレニルメトキシカルボニルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルからなる水溶性のヘテロ二官能試薬である。マレイミド基は、フルオレニル骨格に結合し、スルフヒドリル基含有ＰＥＧ４００００−ＳＨへの結合を可能にする。
【０１５４】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ペプチド、タンパク質及びアミノ配糖体のアミノ側鎖と共有結合的に反応することができる開裂可能な試薬である。本発明によれば、ＰＥＧ鎖を徐々に加水分解可能な化学結合を介してペプチド及びタンパク質と結合させることが可能となる。このように形成されたＰＥＧ−ＦＭＳ−ペプチド／タンパク質結合物は、ｐＨ８．５、３７℃のインキュベートで、ｔ１／２値８〜１４±２時間のゆっくりした速度で自然に加水分解し、修飾されていない親分子を生じる。
【０１５５】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの化学特性  ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのいくつかの特性を表１にまとめる。これは水溶性及びＤＭＦ可溶性化合物である。質量スペクトル分析は、質量計算値５８３Ｄａであった。化合物は、モル吸光係数ε２８０＝２１，０００±２００ｍｏｌ−１ｃｍ−１でＵＶ領域で吸収する。この曲線は２９０ｎｍで最大値を示し、肩部分が３３０ｎｍまで伸びている。ペプチド又はタンパク質がわずかに吸収する３２０ｎｍでは、遊離又はタンパク質に共有結合しているＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、モル吸光係数ε３２０＝１６，１００±１５０ｍｏｌ−１ｃｍ−１で吸収する（表１）。
【０１５６】
水溶液中でのＭＡＬ−官能部位の安定性  異なるｐＨ値の水溶液中でＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのマレイミド官能基の安定性を試験するために、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（１ｍＭ）を水（ｐＨ６．０）中、０．００７Ｍ酢酸（ｐＨ〜４．０）中、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、及び０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中、室温でインキュベートした。いくつかの時点で、アリコートを僅かに過剰の還元グルタチオン（ＧＳＨ）と反応させ（ｐＨ７．２で１５分）、未反応のＧＳＨの濃度を、ＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬）を用い、４０５又は４１２ｎｍにおける生成した黄色に着色した５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の吸収を測定することにより決定した。図１は、異なるｐＨ値での時間の関数として、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのＧＳＨとの反応の有効性を示す。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ｐＨ４から６で１日又は２日にわたって完全に安定であることを見出した。また、ｐＨ７．２では数時間にわたって安定である。ｐＨ８．５では、マレイミド部分は加速的に破壊された（ｔ１／２値＝２．７±０．３時間、図１）。
【０１５７】
（実施例１４）
添加試薬量の関数としてのｐＨ７．２でのＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのα−ラクトアルブミンへの結合度
試薬の関数としてのペプチド／タンパク質へのマレイミド部分の結合度を評価するために、α−ラクトアルブミンをモデルとして用いた。したがって、試料のα−ラクトアルブミン（α−ＬＡ、１ｍｇ／ｍｌの１．０ｍｌ）に、１当量から１４モル当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの濃度範囲でＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを含む、ｐＨ７．２の０．１ＭＰＢＳを、２５℃で３０分間、すなわち、スペーサのマレイミド−アルキル化可能部位が修飾されないままである実験条件下で加えた。処理ごとに、タンパク質に結合した量を、透析後に２８０ｎｍのＵＶ吸収により、また、ＴＮＢＳで修飾されていないアミノ側鎖部分の量を定量することにより決定した。図２に示すように、２．１モルの添加試薬に付き約１モルのＭＡＬ−ＦＭＳが、タンパク質より１４モル過剰までα−ＬＡに結合された。
【０１５８】
（実施例１５）
ＰＥＧ４０−ＳＨの合成
ＰＥＧ４０−ＳＨを、下記１５（ａ）に記載されるように２−トリチルチオエチルアミン及びＰＥＧ４０−ＯＳｕの反応によるか、又は下記１５（ｂ）に記載されるようにＰＥＧ４０−ＯＳｕ及びシスタミン［２，２’−ジチオ−ビス（エチルアミン）］二塩酸塩から調製した。
【０１５９】
１５（ａ）．  ２−トリチルチオエチルアミン及びＰＥＧ４０−ＯＳｕからのＰＥＧ４０−ＳＨの合成
２−トリチルチオエチルアミンの合成  ２−アミノ−エタンチオール（３ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）及びトリフェニルメチルアルコール（７ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（２０ｍｌ）に溶解し、室温で３０分間攪拌した。ＴＦＡを蒸発させて除去し、残った油状残渣をエーテル（４００ｍｌ）に溶解し、−２０℃で保管した。単離した生成物を冷エーテル及び水で洗浄した。次いで、濃アンモニア溶液（２５％、３０ｍｌ）を加え、水層をエーテルで数回洗浄した。エーテルを真空で除去し、生成物を乾燥した。収率、７８％（６．６ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）、Ｒｔ＝５．３５分。
【０１６０】
２−トリチルチオエチルアミン及びＰＥＧ４０−ＯＳｕ（０．２５ｇ、６．２５μｍｏｌ）を４ｍｌのＴＨＦ：アセトニトリル（１：２、ｖ：ｖ）に溶解した。１時間後、生成物を冷エーテルで沈殿させ、洗浄した（×３）。乾燥ペレットをＴＦＡ：トリエチルシラン：水（９５：２．５：２．５、６ｍｌ）に溶解し、１時間後、ＰＥＧ４０−ＳＨを冷エーテル（１００ｍｌ）で沈殿させ、乾燥した。
【０１６１】
１５（ｂ）．  シスタミン及びＰＥＧ４０−ＯＳｕからのＰＥＧ４０−ＳＨの合成
ＰＥＧ４０−ＯＳｕを４０ｍｇ／ｍｌ濃度でシスタミン−ジ−ＨＣｌ（１Ｍ）の水溶液中に溶解し、ＮａＨＣＯ３でｐＨ８．５にした。反応を２５℃で２時間行った。こうして得られた生成物を、一晩、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３で透析し、３０ｍＭ  ジチオスレイトールで処理し（２５℃、１ｈ）、１０ｍＭアスコルビン酸を含む０．０１Ｍ  ＨＣｌで再透析した。ＰＥＧ４０−ＳＨを９３％の収率で得た。アスコルビン酸塩の存在下でＤＴＮＢで測定したときに、ＰＥＧ４０１モルに付き１モルのスルフヒドリル基を含んでいた。ＰＥＧ４０−ＳＨを使用するまで冷凍状態にした。
【０１６２】
（実施例１６）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳからのＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製（手順Ｉ）
本発明のＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製に、スキーム６に図示したように「二段階」手順Ｉを用いてもよく、それによって以下のように、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳはアミノ基含有薬物又はペプチド薬物若しくはタンパク質薬物のアミノ基と最初に反応し、得られたＭＡＬ−ＦＭＳ−薬物結合物が更にＰＥＧ−ＳＨと反応する。
【０１６３】
１６（ａ）．  ＭＡＬ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製
最初のステップでは、薬物（１ｍｇ／ｍｌ）を含む攪拌しているｐＨ７．２の０．１ＭＰＢＳ緩衝溶液に、１〜７モル過剰の前駆体８のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを加えることにより、ＭＡＬ−ＦＭＳ−薬物結合物を調製する。反応を２５℃で３０分間行い、次いで、７℃で２４時間かけて水で透析し、過剰のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを除く。例えばペプチド医薬又はタンパク質医薬などの薬物に結合したＦＭＳ−ＭＡＬ残基の量を、モル吸光係数ε３２０＝１６，１００を用いて３２０ｎｍの吸収により、また、薬物に結合したＭＡＬ官能基を定量することの両方により決定した。これは、測定したアリコートをＧＳＨ溶液（０．１ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）に加えることにより行う。未反応のまま残ったＧＳＨの濃度はＤＴＮＢで決定される。
【０１６４】
１６（ｂ）．  ＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製
第二のステップでは、化学量論的量の固体ＰＥＧ４０−ＳＨを、ステップ１６（ａ）のＭＡＬ−ＦＭＳ−薬物結合物に加え、２ｍＭアスコルビン酸を含むｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸緩衝液中で更に６０分間反応を進行させる。こうして得られるＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物を、薬物、好ましくはＰＥＧ４０−ＳＨに共有結合していないペプチド医薬又はタンパク質医薬（又はタンパク質−ＦＭＳ−ＭＡＬ）から結合物が分解する条件下で、Ｃ４又はＣ１８逆相カラムを用いたＨＰＬＣ手法により更に精製する。
【０１６５】
（実施例１７）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳからのＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製（手順ＩＩ）
本発明のＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物は、スキーム６に図示した代替の「二段階」手順ＩＩにより調製してもよく、それによって以下のように、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳはＰＥＧ−ＳＨと最初に反応し、得られたＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳ結合物は更にアミノ基含有薬物又はペプチド医薬若しくはタンパク質のアミノ基と反応する。
【０１６６】
１７（ａ）．  ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳ結合物の調製
最初のステップでは、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを攪拌しているＰＥＧ−ＳＨを含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝溶液に加えることにより、ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳ結合物を調製する。反応を２５℃で３０分間行い、次いで、生成物をＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥させる。
【０１６７】
１７（ｂ）．  ＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物の調製
第二のステップでは、ステップ１７（ａ）の化学量論的量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ結合物をアミノ基含有薬物に加え、反応を攪拌しながら２時間進行させる。次いで、生成物をＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥させる。
【０１６８】
（実施例１８）
（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）１−インスリンの合成
（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）１−インスリンを、実施例１６に記載の二段階手順Ｉにより調製した。したがって、Ｍａｌ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（６ｇ、１０μｍｏｌ）を水（０．２５ｍｌ）に溶解し、インスリン（Ｚｎ２＋フリー、２５ｍｇ、４．１６μｍｏｌ）のＰＢＳ（０．５ｍｌ、ｐＨ＝７．４）溶液に加えた。ｐＨをＮａＨＣＯ３で７〜８に調整した。３０分後に反応を希塩酸溶液（ｐＨ＝６）で停止させた。生成物を分取用ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、１０〜８０％アセトニトリル：水、７５：２５、ｖ：ｖ、５０分、１０ｍｌ／分）を用いて単離し、エレクトロスプレー質量スペクトル（ＥＳＭＳ（約６２８０）、Ｍ−１：６２７８．８３、Ｍ＋１：６２８０．７３）を用い、一置換インスリン誘導体Ｍａｌ−ＦＭＳ−インスリンとして同定した。分析用ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ）、Ｒｔ＝４．５８分。
【０１６９】
ＰＥＧ４０−ＳＨ（２０ｍｇ、０．５μｍｏｌ）をＭａｌ−ＦＭＳ−インスリン中間体（２ｍｇ、０．３１７μｍｏｌ）のＰＢＳ（０．３ｍｌ、ｐＨ＝７．４）溶液に加え、ｐＨをＮａＨＣＯ３で７〜８に調整し、３０分後に反応を希塩酸溶液（ｐＨ＝６）で停止させた。表題生成物であるＰＥＧ４０−ＦＭＳ−インスリンを分析用ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ）、Ｒｔ＝６．６分にかけた。
【０１７０】
（実施例１９）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４の合成
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４を実施例１６に記載の二段階手順Ｉにより調製した。したがって、２８０μｇのＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（新鮮なＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのＤＭＦ溶液から２８μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、ペプチドより２．０モル過剰）を攪拌しているエキセンディン−４（０．１Ｍリン酸緩衝液１．０ｍｌ中１ｍｇ、２ｍＭアスコルビン酸塩、ｐＨ７．２、０．２３９ｍＭ）の溶液に加えた。７分後、固体ＰＥＧ４００００−ＳＨを最終濃度が０．５ｍＭ（ペプチドより２．１モル過剰）になるように加えた。反応を１時間行い、水で一晩透析し、次いで更に５０ｋＤａの分子量分画でＣｅｎｔｒｉｃｏｎでろ過し、ＰＥＧ４００００−ＳＨに結合しなかった残余のエキセンディン−４又はＭＡＬ−ＦＭＳ−エキセンディン−４を除去した。結合物の濃度を２０μｌのアリコートを加水分解し、次いでアスパラギン酸（２残基）、アラニン（２残基）及びバリン（１残基）によるアミノ酸分析をすることにより決定し、２８０ｎｍでの吸収を観察した。２８０ｎｍでの吸光係数の計算値は、エキセンディン−４（ε２８０＝５７４０）及びＰＥＧ４００００−ＦＭＳ（ε２８０＝２１２００）が加算された吸収の値、２６９４０±１００である。２０μＭ  ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディンの溶液は、ＯＤ２８０＝０．５１であった。したがって、結合物は、（上述のように、精製及び酸加水分解し、次いでアミノ酸分析した後の結合物のＵＶ吸収から測定したときに）１：１  ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ／エキセンディン化学量論であった。
【０１７１】
（実施例２０）
ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４の合成
ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４を実施例１７に記載の二段階手順ＩＩにより調製した。したがって、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＭＨＳ（１．８ｍｇ、３μｍｏｌ）をＰＥＧ５０００−ＳＨ（１５ｍｇ、〜３μｍｏｌ）のＰＢＳ（０．５ｍｌ、ｐＨ＝７．４）溶液に加え、反応溶液を３０分間攪拌した。生成物ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−ＮＨＳをＲＰ−４カラムのＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させた。
【０１７２】
次いで、ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−ＮＨＳ（２．３ｍｇ、〜０．４２μｍｏｌ）をエキセンディン−４（１．６ｍｇ、０．４μｍｏｌ）のＰＢＳ（０．５ｍｌ、ｐＨ＝８）溶液に加え、反応溶液を２時間攪拌した。生成物ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４をＲＰ−４カラムのＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させた。
【０１７３】
（実施例２１）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の合成及び特徴
４０ｋＤａの一本鎖ＰＥＧをＩＦＮα２に結合することにより、結合物の腎臓ろ過を十分大いに阻むことができると思われる（Ｂａｉｌｏｎら、２００１）。したがって、我々は一本鎖ＰＥＧ４０−ＦＭＳをＩＦＮα２に結合することで、所望の薬物動態プロファイルでＩＦＮα２を放出する、長期間作用する結合物を十分に得られるであろうと予想した。１ｍｏｌＰＥＧ４０−ＦＭＳ／ｍｏｌタンパク質を導入するのに最適と見出した手順では、ＩＦＮα２を、ｐＨ７．２で７分間、３当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳと最初に反応させ、次いで、３当量のＰＥＧ４０−ＳＨを加えてｐＨ７．２で１時間反応させた。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのＮＨＳ官能基は、長期の中性水溶液条件では比較的不安定であるが、他方スペーサのＭＡＬ官能基は、ｐＨ７．２でそのアルキル化能を数時間維持する（図示せず）。それゆえ、我々は、実施例１６の手順Ｉを使用し、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを最初にＩＦＮα２と反応させ、続いてＰＥＧ４０−ＳＨをＩＦＮα２−ＦＭＳ−ＭＡＬ結合物に結合させることを選択した。
【０１７４】
ｐＨ７．２（５２μＭ）の攪拌しているＩＦＮα２（１ｍｇ／１．０ｍｌ）のリン酸緩衝溶液に、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ９１μｇ（ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの新鮮な溶液から９．１μｌ、（１０ｍｇ／ｍｌ）のＤＭＦ溶液、タンパク質より３．０モル過剰）を加えた。７分後に、ＰＥＧ４０−ＳＨを加え、最終濃度１５６μＭ（タンパク質より３モル過剰）を得た。反応を１時間行い、次いで一晩Ｈ２Ｏで透析し、残余のＤＭＦ及びリン酸緩衝液を除去した。このようにして得られた結合物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２として特徴付けた。
【０１７５】
このようにして得られた結合物のいくつかの特性を表２にまとめる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析は、１：１  ＰＥＧ４０−ＦＭＳ／ＩＦＮα２化学量論を示す。実験に基づく質量は６３５４０Ｄａであった。これはＰＥＧ４０−ＳＨ（４３８１８Ｄａ）、ＩＦＮα２（１９２７８Ｄａ）及び結合後のスペーサ分子のもの（４７３Ｄａ）を加算した結果の質量に相当する。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２は、分析用ＨＰＬＣでＲｔ値＝４３分の幅広いピークとして移動する。結合物は水溶液に対し高い溶解性がある。これはモル吸光係数ε２８０＝３９２７０±１００であり、未変性のサイトカイン及びＦＭＳの吸収（ε２８０＝２１，２００）に相当する（Ｇｅｒｓｈｏｎｏｖら、２０００）。
【０１７６】
（実施例２２）
（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮα２の合成
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ６当量（１６μｇ、４４．５ｎｍｏｌ、１０μｌＤＭＦ中）を用いた以外は、（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮα２をＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＮＦα２で上記実施例２１に記載したように調製した。
【０１７７】
（実施例２３）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の合成
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６１モルに付きＰＥＧ４０−ＳＨ約１モルを結合するのに最適と見出した手順では、ＰＹＹ３−３６をｐＨ７．２で７分間、２当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳと最初に反応させ、次いで、２．１当量のＰＥＧ４０−ＳＨを加えてｐＨ７．２で１時間反応させた。
【０１７８】
攪拌しているＰＹＹ３−３６（１．０ｍｌリン酸緩衝液中１ｍｇ、ｐＨ７．２、１０ｍＭアスコルビン酸Ｎａ（０．２４７μＭ））の溶液に、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ２８８μｇを加えた（１０ｍｇ／ｍｌの新鮮なＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのＤＭＦ溶液から２８．８μｌ、ペプチドより２倍モル過剰）。７分後に、ＰＥＧ４０−ＳＨを加え、最終濃度０．５２ｍＭ（ペプチドより２．１モル過剰）を得た。反応を１時間行い、次いで一晩水で透析した。得られたＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより特徴付けた。
【０１７９】
（実施例２４）
（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨの合成
（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨを実施例１６に記載の二段階手順により以下のように調製した。攪拌しているヒト成長ホルモン（４．４ｍｇ、０．２２μｍｏｌ）のリン酸緩衝溶液（１ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（４当量、０．４７ｍｇ、０．８μｍｏｌ）を加えた。反応を２５℃で３０分間行い、次いで４℃で２４時間、Ｈ２Ｏ（ｐＨ６）で透析し、過剰のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを除去した。固体ＰＥＧ４０−ＳＨ（７当量、６５ｍｇ、１．５μｍｏｌ）を加え、反応をリン酸緩衝液（１ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．２、２ｍＭアスコルビン酸含有）中で２時間進行させた。このようにして得られた表題化合物を、Ｃ４カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＳＤＳゲル電気泳動（１２．５％）で特徴付けしたところ、（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨの存在を示した。
【０１８０】
（実施例２５）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨの合成
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（２８０μｇ）を、ｈＧＨ（４．５ｍｇ、０．２２５μｍｏｌ）を含むｐＨ＝７．４のＰＢＳ０．５ｍｌの溶液に加えた。１０分後に、ＰＥＧ４０−ＳＨ（１０ｍｇ）を加え、反応混合物を１時間攪拌し、一晩水で透析した。生成物であるＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【０１８１】
（実施例２６）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰの合成
攪拌している心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（０．３２μｍｏｌ、１ｍｇ）のリン酸緩衝溶液（１ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（２当量、０．２ｍｇ、０．７μｍｏｌ）を加えた。反応を２５℃で１０分間行った。固体ＰＥＧ４０−ＳＨ（２．２当量、３０ｍｇ、０．７μｍｏｌ）を加え、反応をリン酸緩衝液（１ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．２、２ｍＭアスコルビン酸含有）中で２時間進行させた。生成物を更にＨＰＬＣで精製した。
【０１８２】
ＩＩ．生物学の項
この項では、上記実施例で調製したゲンタマイシン、ペプチド及びタンパク質と、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ及びＰＥＧ−ＦＭＳとの結合物の生物学的活性を試験した。
【０１８３】
（実施例２７）
不活性ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ゲンタマイシン結合物を再活性化する。
ゲンタマイシン及びその誘導体の抗菌力を検査するために、上昇濃度のゲンタマイシン（０．０２〜２μＭ）、及び上昇濃度のＰＥＧ５０００−ゲンタマイシン誘導体（０．０２〜５０μＭ）の非存在又は存在下のいずれかで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎ−４１５６−Ｗ．Ｔ、ＬＢ培地中１％ｖ／ｖ）の懸濁液をプラスチック管（０．５ｍｌ／管）に分割し、３７℃の振とうしている水浴中でインキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ複製を６００ｎｍの吸収を測定することにより評価した。ゲンタマイシンを含まない管内のＯ．Ｄ６００ｎｍが０．６±０．１値に達したときにインキュベートを終了した。我々のアッセイ条件下では、未変性のゲンタマイシンは、０．２２±０．０２μＭ（０．１μｇ／ｍｌ）の濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ複製を最大限半分に阻害した。このアッセイでＩＣ５０値２．２±０．２μＭを示すＰＥＧ−ゲンタマイシン誘導体は、未変性のゲンタマイシンの１０％の抗菌力を有すると考えられる。
【０１８４】
それぞれ１又は２ｍｏｌＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ／ｍｏｌゲンタマイシンを含む（ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ）１−ゲンタマイシン及び（ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ）２−ゲンタマイシンを、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ部分の可逆性を評価するためのモデルとして調製した。両方の誘導体（各０．２ｍＭ）を、３７℃で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中でインキュベートし、アリコートを異なる時間にて引き上げ、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ複製を抑止する能力を分析した（上記方法（ｘｉ）参照）。各アリコートのＩＣ５０を決定した。未変性のゲンタマイシンはＥ．ｃｏｌｉ複製をＩＣ５０値０．２２±０．２μＭで阻害した。（ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ）２−及び（ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ）１−ゲンタマイシンは、それぞれ、ゲンタマイシンの０．０１及び２．１±０．１％の抗菌力を有していた。
【０１８５】
結果を図３Ａ〜３Ｂに示す。（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−ゲンタマイシンは長い遅延期間（約１５時間）の後、顕著な再活性化を示した（図３Ａ）。次いで、抗菌力に著しい上昇が生じ、３０±２又は６０±３時間のインキュベート後にはそれぞれ未変性の能力の５０又は１００％に達した（図３Ａ）。（ＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃ）１−ゲンタマイシンのインキュベートでは遅延期間は観察されなかった。再活性化は、６±０．３時間で最大値の半分の再活性化で連続的に進行し、インキュベートの３０時間後には完全に活性化（１００％）した（図３Ｂ）。
【０１８６】
（実施例２８）
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−インスリン結合物の生物学的活性
材料及び方法
（ｉ）材料  組換えヒトインスリンは、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）から入手した。Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（４〜７ｍＣｉ／ｍｏｌ）はＤｕ  Ｐｏｎｔ  ＮＥＮから得た（ボストン、マサチューセッツ州、米国）。コラゲナーゼタイプＩ（１３４Ｕ／ｍｇ）はＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ニュージャージー州、米国）から購入した。
【０１８７】
（ｉｉ）ラット脂肪細胞を、記述されているように（Ｒｏｄｂｅｌｌ、１９６４）コラゲナーゼの消化によりオスのウィスターラット（１００〜２００ｇ）の脂肪体から準備した。脂肪体をハサミで小片に切断し、ＮａＣｌ１１０ｍＭ、ＮａＨＣＯ３２５ｍＭ、ＫＣｌ５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４１．２ｍＭ、ＣａＣｌ２１．３ｍＭ、ＭｇＳＯ４１．３ｍＭ、及びＢＳＡ０．７％を含むＫＲＢ緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌに懸濁させた。消化は、２５ｍｌの軟質プラスチック瓶中で、コラゲナーゼタイプＩ（１ｍｇ／ｍｌ）を用い、カルボゲン（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）雰囲気下、３７℃で４０分間、激しく攪拌しながら行った。その後、緩衝液５ｍｌを加え、細胞を網篩に通した。次いで、細胞を室温で１５ｍｌのプラスチック試験管内に数分間静止させ、浮遊させ、緩衝液の下方を除去した。この処理（懸濁、浮遊、及び緩衝液の下方の除去）を３回繰り返した。
【０１８８】
（ｉｉｉ）脂質生成（無処置脂肪細胞への［Ｕ−ｌ４Ｃ］グルコースの結合）  ラット脂肪細胞の脂肪組織への［Ｕ−ｌ４Ｃ］グルコースの結合を、記述のように行った（Ｍｏｏｄｙら、１９７４）。脂肪細胞懸濁液（３×１０５細胞／ｍｌ）をプラスチックバイアル（０．５ｍｌ／バイアル）に分配し、カルボゲン雰囲気下、３７℃で６０分間、インスリンの非存在又は存在下のいずれかで、０．２ｍＭ［Ｕ−ｌ４Ｃ］グルコースと共にインキュベートした。脂質生成をトルエンベースのシンチレーション液（１．０ｍｌ／バイアル）を加えることにより終了させ、抽出した脂質中の放射能を計測した。典型的実験では、インスリン刺激による脂質生成は基底（基底：３×１０５細胞／ｈに付き２０００ｃｐｍ、３×１０５細胞／ｈに付きＶインスリン８，０００〜１０，０００ｃｐｍ）よりも４〜５倍高かった。このアッセイでは、インスリンは脂質生成をＥＤ５０値＝０．１５±０．０３ｎｇ／ｍｌで刺激する。ＥＤ５０値＝１５ｎｇ／ｍｌを示すインスリンアナログは、未変性ホルモンの生物学的能力の約１％を有すると考えられる。
【０１８９】
（ｉｖ）インスリン及びその誘導体のグルコース低減能力を、各実験で特定した条件下で投与後のマウスで決定した。血液サンプルを投与後の異なる時点で尾静脈から採取し、血中グルコースレベルをグルコースオキシダーゼ法によりグルコース分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州、米国）で決定した。正常で健康なＣＤ１−マウスのグルコースレベルは１４０±７ｍｇ／ｄｌ（７．７７ｍＭ）であった。各グループは４〜５匹のマウスから構成されていた。データは平均±標準誤差として示す。
【０１９０】
２８（ｉ）．  ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを用いたインスリンのアミノ酸部分の進行性修飾
ヒトインスリンを上昇濃度の前駆体１で修飾し、インスリンに結合したＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃの機能として生物学的能力の欠損を決定した。
インスリン（０．２ｍｌの０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中１７．２４ｎｍｏｌ）を、２５℃で２時間、図４Ａに示したようにタンパク質より１モル過剰で、上昇濃度のＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕと反応させた。誘導体化の割合を修飾されていない状態で、ＴＮＢＳと反応可能な遊離アミノ基の数を決定することにより定量した。理論上は、インスリンは、ＬｙｓＢ２９、ＰｈｅＢ１及びＧｌｙＡ１のアミノ側鎖で３モルのＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃと結合することができる。図４Ａに示すように、インスリンを０．６、１．３、１．９、２．５及び５．０モル過剰のＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕと反応させると、０．３±０．０３、０．５９±０．０５、１．１±０．１、１．５±０．２及び２．２±０．２モルのＰＥＧ５，０００−Ｆｍｏｃがそれぞれインスリンに結合され、インスリンの（３つのうち）２つのアミノ側鎖が容易に誘導体化を受けやすいことが示された。
インスリン１モルに付き、０．４、０．７、１．１、１．５及び２．２モルの共有結合したＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃを含むアリコートを、ラット脂肪細胞での脂質生成アッセイにおける生物学的能力を図るために検査した。アッセイ条件下で、ヒトインスリンは脂質生成をＥＤ５０値０．２±０．０２ｎｇ／ｍｌで基底レベルより４〜６倍刺激する。このアッセイでＥＤ５０２．０±０．２ｎｇ／ｍｌを示すインスリン誘導体は、未変性のインスリンの脂質生成能力の１０％を有すると考えられる。図４Ｂの結果は、０．３、０．６、１．１、１．５及び２．２モルのＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ／ｍｏｌインスリンが結合したときに、それぞれの生物学的能力が８７±４、６０±３、８±１、４±０．３及び１％未満であったことを示す。
【０１９１】
２８（ｉｉ）．  ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−インスリンは時間依存的に再活性化する。
１及び２ｍｏｌＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ／ｍｏｌインスリンを含むインスリン結合物を、３７℃で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３−０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１ｍＭ  ＮａＮ３（ｐＨ８．５）中０．１７２μＭの濃度で、異なる時間インキュベートした。結果を図５に示す。示した時点で、ラット脂肪細胞の脂質生成能力のためにアリコートを分析した（アリコートごとにいくつかの濃度で）。（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−インスリンを用いた場合は、インキュベートの最初の１０時間は再活性化を観察することができなかった。その後、脂質生成活性が増し、３０±２及び８０±４時間でそれぞれ未変性のインスリン能力の４５±３及び９０％に達した。
【０１９２】
（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンを用いた場合は、このような遅延期間は観察されなかった。活性がゆっくり回復したが、２、４、１０、１７及び８０時間のインキュベート後に、それぞれ連続的に未変性の能力の１６、２４、３０、３６及び９５％を生じた。したがって、更なる研究では、約１ｍｏｌＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ／ｍｏｌインスリン（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ１−インスリン）を含むインスリンが選択された。質量スペクトル及び分析用ＨＰＬＣ解析により、この調製物が主に一箇所修飾されたインスリンの誘導体（ＭＷ＝１１，０９６ｋＤａ）を含み、残りは未修飾のインスリン（約５％、ＭＷ＝５，８１３ｋＤａ）及び少量の二箇所（ＭＷ＝１６，５８７ｋＤａ）及び三箇所（ＭＷ＝２２，６６１ｋＤａ）修飾された誘導体であることが示された。
【０１９３】
図４Ｂに示すように、（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンは７±１％の未変性ホルモンの生物学的能力を有し、その後ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ加水分解を受ける。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらの発見に基づき、同様のグルコース低減効果を得るために、（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンが未変性のホルモンより１０倍高い濃度でｉｎ  ｖｉｖｏで投与された（下記参照）。
【０１９４】
２８（ｉｉｉ）．（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンはｉｎ  ｖｉｖｏでの長期グルコース低減作用を促進させる。
未変性のインスリン（Ｚｎ２＋フリー、１．７２ｎｍｏｌ／マウス）又は（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン（１７．２ｎｍｏｌ／マウス）をマウスのグループ（各グループ中ｎ＝５）に皮下投与し、グルコース低減プロファイルを決定した。結果を図６に示す。未変性のインスリンは血中グルコースレベルを最大３０分で減少させた。その後、循環しているグルコースレベルはｔ１／２＝１．８±０．２時間で正常値に回復した。（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）１−インスリンの皮下注射後、循環しているグルコースレベルは４時間で最低となり、その後低いグルコースレベルを更に４時間維持した後、正常値にｔ１／２＝１２±１時間で回復した（図６）。
【０１９５】
２８（ｉｖ）（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンは、腹腔内投与後にも長期グルコース低減作用を示す
腹腔内投与した（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンの長期的作用は、理論上、皮下区画から循環系への吸収速度がより遅く、さらに受容体に媒介される分解や不活性種から活性種への加水分解にさらされる投与物質が少ないことに帰結させることができる。これらの要因を見分けるために、未変性インスリン（Ｚｎ２＋フリー、０．３４５ｎｍｏｌ／マウス、０．２ｍｌ  ＰＢＳ緩衝液中）又は（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン（３．４５ｎｍｏｌ／マウス、０．２ｍｌ  ＰＢＳ緩衝液中）を腹腔内投与することにより、皮下区画を迂回した。その後、グルコース低減能を観察した。血中グルコースレベルを異なる時点で決定した。
【０１９６】
結果を図７に示す。インスリン投与後、循環しているグルコースのレベルは１５分で最低値に落ち、ｔ１／２値１．０±０．１時間で正常レベルに回復した。腹腔内投与した（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンの場合、循環しているグルコースのレベルは更に徐々に下降し、１．０時間で最低値に達した。その後、レベルは徐々に上昇し、ｔ１／２値３．４±０．１時間を示し、投与後わずか６時間で正常値に回復した（図７）。
【０１９７】
（実施例２９）
ＰＥＧ−ＦＭＳ−エキセンディン結合物の生物学的活性
エキセンディン−４は、β−膵臓細胞に結合するインスリン分泌促進グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）アゴニストであり、内因性ｃＡＭＰレベルを上昇させ、インスリンの分泌を高め、また、循環しているグルコースレベルを下げる（Ｅｎｇら、１９９２；Ｇｏｋｅら、１９９３；Ｓｃｈｅｐｐら、１９９４；Ｆｅｈｍａｎｎら、１９９４）。このＧＬＰ−１アゴニストの顕著な薬理学的効果は、いかなる投与量で投与した後でも、循環している血中グルコースレベル（ＢＧＬ）が、糖尿病でない健康なＣＤ１−マウスでの７４±７ｍｇ／ｄｌであるグルコースレベル閾値より下に下降しないことである（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００３）。
【０１９８】
本発明にしたがって、ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４結合物を調製した（実施例１９）。エキセンディン−４は、１個のＨｉｓ  Ｎα  ａｍｉｎｏ基及び２個のＬｙｓ  Ｎε  アミノ基を含んでおり、これらの３つの位置での修飾を可能にしている。実際、Ｎ−末端アミノ酸配列決定により、ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４生成物はＨＰＬＣで１つのピークとして溶離したにもかかわらず、実際には主にＮα−修飾ホルモンを含む混合物であったことが明らかにされた。しかしながら、生理学的環境で未変性のペプチド及びタンパク質ホルモンを再生する、本発明のＰＥＧ化反応の可逆性の観点では、この点は軽微な検討材料でしかない。
【０１９９】
材料及び方法
（ｉ）材料  エキセンディン−４及び２７個のアミノ酸からなるリシンを含有しない合成非関連ペプチド（配列番号１４）をｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＡＭＳ４２２（Ａｂｉｍｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）を用いた固相法により合成した。Ｆｍｏｃ法をペプチド鎖合成に採用した。５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、還元グルタチオン（ＧＳＨ）及びトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）から購入した。本研究で用いた他の全ての材料は分析用グレードである。
【０２００】
ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４及びＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４をそれぞれ実施例１８及び１９に記載したように調製した。
【０２０１】
ＰＥＧ４００００−エキセンディン−４の調製のために、エキセンディン−４（０．３ｍｇ、７５ｎｍｏｌ）をＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）に溶解し、３時間、ＰＥＧ４００００−ＯＳｕ（２０ｍｇ、４７０ｎｍｏｌ）と反応させ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（分画＝５０ｋＤａ）でろ過し（×７）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で特徴付けした（実測値４８０７４Ｄａ）。
【０２０２】
ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ペプチド２７をＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４で記載のように調製した。
【０２０３】
水溶液用のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓ．Ａ．（Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【０２０４】
紫外線スペクトルをＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ７５００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒにより、厚み１ｃｍのＵＶキュベットで得た。質量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＥＳＭＳ技術（それぞれ、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｒｅｆｌｅｘ−Ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｏｄｅｌ、ドイツ、及びＶＧ−ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＩＩ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏ  Ｍａｓｓ、英国）を用いて決定した。
【０２０５】
（ｉｉ）ＨＰＬＣ分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５７  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＳＰ８８００  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍと、ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ  ｄａｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州、米国）で全制御されたＳｐｅｃｔｒａ−ＳＹＳＴＥＭ  ＡＳ  １００  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ及びＳｐｅｃｔｒａ−ＳＹＳＴＥＭ  ＵＶ１０００を備えたＳｐｅｃｔｒａ−ＳＹＳＴＥＭ  Ｐ２０００  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍとを用いて行った。カラムの流出物は、２２０ｎｍのＵＶ吸収で観察した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣは、ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ  Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ（商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ（４．６×１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて行った。カラムを１０〜１００％の溶液Ｂの２液グラジエントで、流速３ｍｌ／分で１０分かけて溶離した（溶液Ａは、０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ溶液であり、溶液Ｂは、０．１％ＴＦＡのアセトニトリル：Ｈ２Ｏ（３：１、ｖ：ｖ）溶液であった）。ＰＥＧ化化合物をＲＰ−４カラム（２５０×４ｍｍ、ビーズの大きさ５μｍ、ＶＹＤＡＣ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、カリフォルニア州、米国）を用い、１０〜１００％の溶液Ｂの２液グラジエントで、流速１ｍｌ／分で５０分間分析した。
【０２０６】
（ｉｉｉ）分取用分離は、ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ  ＶＹＤＡＣ  ＲＰ−１８又はＲＰ−４カラム（２５０×２２ｍｍ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、カリフォルニア州）を用いて行った。カラムは、１０〜１００％の溶液Ｂを用い、６０分かけて溶離した（１２ｍｌ／分）。
【０２０７】
（ｉｖ）グルコース低減アッセイ  ３つのＣＤ１マウスのグループ（ｎ＝６／グループ）に生理食塩水、未変性のエキセンディン−４（４μｇ／マウス）又はＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４（４μｇペプチド／マウス）を皮下投与した。循環しているグルコースのレベルをグルコースオキシダーゼ法によりグルコース分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州、米国）で測定した。血中グルコース分析用の血液サンプルを尾静脈から採取した。正常で健康なＣＤ１マウスのグルコースレベルは、１４０±７ｍｇ／ｄｌ（７．７７ｍＭ）であった。
【０２０８】
２９（ｉ）ＰＥＧ−ＦＭＳ−エキセンディン−４はインキュベート時にエキセンディン−４を放出する。
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４（０．２５ｍＭ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中のエキセンディン−４に関して１ｍｌ／ｍｌ、ｐＨ８．５）の溶液を、３７℃でインキュベートした。異なる時点でアリコート（５０μｌ）を引き上げ、ＲＰ−４カラムのＨＰＬＣを用いて結合物からのエキセンディン−４の放出を分析した。図８に示すように、エキセンディン−４は、ｔ１／２ｌ６±２時間で結合物［ＰＥＧ４０−ＦＭＳ］２−エキセンディン−４からゆっくり均一様に放出された。エキセンディン−４は４８時間のインキュベート後に結合物から完全に放出された。
【０２０９】
２９（ｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４、ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４及びＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−４−ニトロ−フェネチルアミンの加水分解速度及び反応順序
ＰＥＧ−ＦＭＳ結合物であるＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−４−ニトロ−フェネチルアミン、ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４及びＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４、並びに１つのＭＡＬ−ＦＭＳ結合物であるＮ−（ＭＡＬ−ＦＭＳ）−ペプチド２７の加水分解速度及び反応順序を、ｐＨ８．５、３７℃で評価した。結合物の構造及び半減期を表３に示す。ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−４−ニトロ−フェネチルアミンを実施例２０に記載のように調製した。結合物ＭＡＬ−ＦＭＳ−ペプチド２７を非関連ペプチド２７とＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳとの反応により調製した（配列番号１４）
【０２１０】
図９は、ＰＢＳでのインキュベート後のｐＨ８．５、３７℃でのＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４（丸）及びｏｆＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−４−ニトロ−フェネチルアミン（四角）の加水分解を示す。図８及び図９の結果を、時間の関数としての放出したエキセンディン−４及び４−ニトロ−フェネチルアミンの最大ピーク領域の割合として示した。
【０２１１】
ｐＨ８．５での加水分解速度は、血清中での加水分解速度と同等である。４−ニトロ−フェニチルアミン及びエキセンディン−４の放出をＲＰ−ＨＰＬＣで観測し、一次反応であることを決定した（表３及び図８、９）。図示したように（図８〜９、表３）、ｔ１／２値９．４（ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−４−ニトロ−フェネチルアミン）、１３．８（ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４）、及び１１．９（ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４）で、ペプチド及びタンパク質を結合物からゆっくり均一様に放出した。４８時間のインキュベート後、エキセンディン−４をＰＥＧ４０結合物から完全に放出した。
【０２１２】
ペプチド２７の唯一のα−アミノ部分が誘導体化されたので、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ペプチド２７結合物はＴＮＢＳネガティブである。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ペプチド２７（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中０．５ｍＭ、ｐＨ８．５）の溶液を３７℃でインキュベートした。アリコート（０．２ｍｌ）を異なる時点で引き上げ、ＴＮＢＳを用いて遊離α−アミノ基の出現を分析した。ＦＭＳ−ＭＡＬ（Ｎ−エチルマレイミド）部分は、ｔ１／２値８．４時間でペプチドのα−アミノ部分からゆっくりほぼ均一様に加水分解した。インキュベートの３２時間後、加水分解が終了した。
【０２１３】
２９（ｉｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４は、マウスでの長期グルコース低減作用を可能にする。
図１０Ａ〜１０Ｂは、生理食塩水処置したマウスのグループと比較した、１０μｇ（図１０Ａ）又は４μｇ（図１０Ｂ）ペプチド／マウスの投与量で両方とも皮下投与された未変性のエキセンディン−４及びＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４のグルコース低減プロファイルを示す。
【０２１４】
図１０Ａは、１０μｇ／マウスの投与量で両方とも皮下投与された未変性のエキセンディン−４及びＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４のグルコース低減プロファイルを示す。未変性のペプチドを用いた場合は、血中グルコースレベルは０．５時間内に１３９±１０から９６±７まで下がり、投与（７４ｍｇ／ｄｌ）後２〜４時間で最低値に達した。その後、ｔ１／２値１４．２±１時間で最初のグルコースレベルへの回復が続いた。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４の皮下投与後、投与後０．５時間で、血中グルコースレベルでわずかな減少が見られる。その後、循環しているグルコースレベルが徐々に下がり、投与（８０〜９０ｍｇ／ｄｌ）後６〜８時間で最低グルコース濃度に達する。その後、安定な低循環グルコース濃度がほぼ５０時間以上続き、その後最初のグルコースレベルにｔ１／２値７０±３時間で回復する。
【０２１５】
図１０Ｂは、４μｇ／マウスの投与量で両方とも皮下投与された未変性のエキセンディン−４及びＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４のグルコース低減プロファイルを示す。未変性のペプチドを用いた場合、血中グルコースレベルは２６〜２８％（１４０ｍｇ／ｄｌから１０４〜１０１ｍｇ／ｄｌまで）まで下がり、投与後０．５〜１時間で血中グルコースレベルの最大％変化が生じた。その後、グルコース濃度がｔ１／２値３．７±０．３時間で最初のレベルに回復した。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４の皮下投与後、血中グルコースレベルでの減少が更に適度な速度で生じた。循環グルコースは、投与（９２ｍｇ／ｄｌ、３３％）後８〜１２時間でその最低濃度に達した。その後、安定な低循環グルコース濃度が更に１２時間続いた。最初のグルコースレベルへの回復がｔ１／２値３０±２時間で起き、これは同じ投与量の未変性のホルモンで得られたものより７．５時間長かった。
【０２１６】
正常血清及びＰＢＳ（ｐＨ８．５）中の３７℃でのＦＭＳ−エキセンディン−４（米国特許出願第１０／４０８，２６２号に記載）及びＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４の加水分解速度に基づく循環系は、各々、ｉｎ  ｖｉｖｏで〜４％のエキセンディン−４が各時間結合物から放出される（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００１）ことを明らかにした。我々は更に、この放出速度は、もし、循環系での結合物の長期持続と組合わせれば、ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４結合物の一回の皮下注射後に実際にみられたように、エキセンディン−４の加水分解に先立ち、マウスで長期間持続するグルコース低減シグナルを生じるはずであると仮定した（図１０Ｂ）。不可逆的に結合したＰＥＧ４００００−エキセンディン−４は、未変性の活性エキセンディン−４の≦１％のみを有する（ＩＣ５０＝２５０±３０ｐｍｏｌ／マウスに対して、未変性のエキセンディン−４ではＩＣ５０＝２．５±０．２４ｐｍｏｌ／マウス、図示せず）。
【０２１７】
（実施例３０）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の生物学的活性
タイプＩインターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウイルス応答及び抗増殖反応を開始するタンパク質である。インターフェロンは臨床的に重要で、いくつかのＩＦＮα２のサブタイプは、慢性骨髄性白血病及び有毛細胞白血病などの癌だけでなくＢ型及びＣ型肝炎の治療薬としても認可されていた。インターフェロンはＪａｎｕｓチロシンキナーゼ（Ｊａｋ／ＳＴＡＴタンパク質）を通し、また、Ｒａｓ／Ｒａｆ独立経路を通してリン酸化反応及びＭＥＫ１及びＥＲＫ１／２の活性化を減少させることによりシグナルを制御する  （Ｒｏｍｅｒｉｏら、２０００）。ヒトタイプＩインターフェロンは細胞効果の差異を誘導するが、２つのサブユニット、Ｉｆｎａｒ１及びＩｆｎａｒ２を含む共通の細胞表面にある受容体結合物を介して作用する。ヒトＩｆｎａｒ２は全てのタイプＩ  ＩＦＮに結合するが、Ｉｆｎａｒ結合物より親和性及び特異性が低い。ヒトＩｆｎａｒ１はヒトＩＦＮに対する固有の結合親和性が低いが、Ｉｆｎａｒ結合物の他のリガンドの特異性及び親和性を調節する（Ｃｕｔｒｏｎｅ及びＬａｎｇｅｒ、２００１）。
【０２１８】
ＩＦＮα２は筋肉内、皮下又は静脈内投与されてもよく、異なる薬物動態プロファイルが得られる。どの形態でも、投与されたサイトカインは体液及び組織により急速に不活性化され（Ｏ’Ｋｅｌｌｙら、１９８５）、投与後数時間で血漿から除去される（Ｒｏｓｔａｉｎｇら、１９９８）。循環系からのＩＦＮα２排出の主な経路は、タンパク分解、受容体を介したエンドサイトーシス、及び腎臓ろ過である（Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ、２００１）。
【０２１９】
循環系におけるＩＦＮα２の持続投与の長期化は望ましい臨床的課題である。不可逆的な１２ｋＤａ−ＰＥＧ−ＩＦＮα２結合物が、２００１年に治療に認可された。これは週に一度Ｃ型肝炎患者に投与され、未変性のサイトカインにより得られる１２％の応答速度とは対照的に２４％の持続した抗ウイルス応答速度を可能にする（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２００１年報道発表；Ｂａｋｅｒ、２００３）。しかしながら、ＰＥＧ鎖のタンパク質への共有結合はｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命を長期化するが、それはしばしば生物学的及び薬理学的活性の劇的減少又は喪失にさえなる（Ｆｕｅｒｔｇｅｓ及びＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ、１９９０；Ｋａｔｒｅ、１９９３；Ｂａｉｌｏｎ及びＢｅｒｔｈｏｌｄ、１９９８；Ｎｕｃｃｉら、１９９１；Ｄｅｌｇａｄｏら、１９９２；Ｆｕｎｇら、１９９７；Ｒｅｄｄｙ、２０００；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、２００１）。現在使用しているＩＦＮα２のＰＥＧ化製剤は、未変性のサイトカインの活性の７％であり、より高い投与量が要求される（Ｂａｉｌｏｎら、２００１）。さらに、ＰＥＧ−ＩＦＮ投与は、全組織に容易に浸透しない。１２ｋＤａのＰＥＧ−ＩＦＮα２ｂは広く分散するが、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＩＦＮα２ａは、血液及び間質液に制限される（Ｇｌｕｅら、２０００；Ｒｅｄｄｙら、２００２）。この主要な欠点は、生理的条件下で緩やかな割合で未変性のＩＦＮα２を生じ得るＰＥＧ−ＩＦＮα２結合物を設計することで克服できる。
【０２２０】
先行技術のこれらの問題は、本発明のモノ−及びビス−ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２結合物により克服でき、ここではＩＦＮα２は遅加水分解性結合をもたらすＦＭＳ部分を介してＰＥＧ部分に結合している。これらの新規な可逆性ＰＥＧ化結合物及びそのｉｎ  ｖｉｖｏでの長期抗ウイルス活性について、本明細書でさらに詳細に論じる。
【０２２１】
材料及び方法
（ｉ）材料  非グリコシル化ヒトＩＦＮα２は、Ｐｉｅｈｌｅｒ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（１９９９）により前述されたように、ＷＯ０２／３６０６７号に記載のように調製した。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２及び（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮα２の調製は、実施例２１及び２２にそれぞれ記載されている。
【０２２２】
（ｉｉ）受容体結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＳＰＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）測定結果により評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００システム、センサーチップＣＭ５、ＨＢＳ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４）及びａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔは、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。Ｉｆｎａｒ２によるチップの固定化及びＢＩＡｃｏｒｅ測定結果はＰｉｅｈｌｅｒ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２００１）により行った。要約すると、Ｉｆｎａｒ２−ＥＣは、非中和抗Ｉｆｎａｒ２−ＥＣ（Ｉｆｎａｒ２−ｅｘｔｒａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ）ｍＡｂ  ４６．１０を用いて表面に固定化し、次いで、二次ｍＡｂ（１１７．７）（Ｄ．Ｎｏｖｉｃｋ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルにより快く提供）と架橋結合する。結合曲線は、単純な相関関係の動力学モデルを用いてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）で評価した。受容体への特異的結合後のＲＵ（レゾナンスユニット）の増加は、センサー表面に結合したタンパク質の量に対応する。バルク屈折率へのタンパク質の非特異的影響からもたらされるＲＵの増加を評価するために、固定化リガンドを有しない対照表面へのタンパク質の結合も測定して、差し引いた。活性インターフェロン濃度を測定するために、平衡応答を推定初期濃度に対してプロットした。データは、下記方程式を用いて、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（バージョン３．０．４、Ａｂｅｌｂｅｃｋ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を利用してあてはめた。
【数１】
2007528354.tif 000011
式中、ＫＡの１×１０８はＩＦＮα２の結合で独立に決定され、全サンプルに適合された、ｍ１＝はＲｕ／Ｒｍａｘ（サンプル中の測定された活性インターフェロンの割合）、ｍ２はＲｍａｘであり、及びｍ０は観察されたＲｕである。
【０２２３】
（ｉｉｉ）オスのウィスターラット（１５０〜１７０ｇ）を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。ラットは皮下注射又は静脈注射された（０．２ｍｌ／ラット）。
【０２２４】
（ｉｖ）ＩＦＮα２及びその誘導体の抗ウイルス活性を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が誘発する細胞変性効果からヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞を保護するサイトカインの能力により決定した（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９８１）。
【０２２５】
（ｖ）実験データのシミュレーションをＰｒｏ−Ｋｉｎｅｔｉｃｉｓｔ  ＩＩ、２ｎｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｔｄ．、イングランド）を用いて行った。
静脈内投与では、以下のモデルを検討した。
【０２２６】
【化１０】
2007528354.tif 000012
【０２２７】
式中、ｋ１＝０．０１ｈｒ−１及びｋ２＝０．６５ｈｒ−１（抗ウイルスアッセイにより実験的に決定）。
【０２２８】
皮下注射投与では、以下のモデルを検討した。
【化１１】
2007528354.tif 000013
【０２２９】
式中、ｋ１＝０．０２ｈｒ−１、ｋ２＝０．０１ｈｒ−１、及びｋ３＝０．６５ｈｒ−１。
【０２３０】
ｋ１は直接決定できなかったが、実験データにシミュレーションをあてはめることにより０．０２ｈｒ−１になると推定した。
【０２３１】
３０（ｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２は、受容体結合能力を変更した。
ＩＦＮα２受容体の固定化された組換え細胞外部位（ｉｆｎａｒ２−ＥＣ）への本発明の改変されたＩＦＮα２の結合能力を、反射吸収分光法（ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＲＩＦＳ）と呼ばれる光プローブにより流水条件下で観測した。この方法は、見かけ上の変換器チップの光学厚みの変化により引き起こされる干渉スペクトルでのシフトとして変換器に結合されたタンパク質に対するリガンドの生体分子相互作用を検出する。１ｐｍのシフトは、表面のタンパク質約１ｐｇ／ｍｍ２に相当する。変換器表面は、デキストラン層で修飾され、７５℃、２〜８時間での融解グルタル酸無水物（ｓｉｇｍａ）との反応によりカルボキル化した。このような表面に、タンパク質の静電濃縮（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）及び共有結合固定化を標準ＢＩＡｃｏｒｅプロトコルにより行った。この処理の後、ｉｆｎａｒ２−ＥＣをカルボキシル化デキストラン層に固定化した。全測定は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中で行った。サンプル０．８ｍｌを１Ｈｚのデータ収集速度で８０秒間注入した。流速５０μｌ／ｓを適用した。これらの条件下で、フローセル中のサンプルを１秒以内に交換し、５秒以内にプロセスを分析させた。
【０２３２】
結果を表４にまとめる。一箇所修飾及び二箇所修飾されたＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の結合物は、それぞれＩＦＮα２の９±１及び０．４±０．０５％の受容体結合能力を有していた。しかし、これらの結合物の誘導体は、３７℃、リン酸緩衝液ｐＨ８．５又は正常ヒト血清中でのインキュベートで、時間依存性再活性化を受けた（図示せず）。再活性化は、一箇所及び二箇所ＰＥＧ化した誘導体では、それぞれｔ１／２値９±１及び２４±３時間で進行し、インキュベートの５０時間後にはほぼ完全な再活性化に達した（表４）。
【０２３３】
３０（ｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２は、０．０１ｈｒ−１の速度定数でインキュベートして未変性の活性ＩＦＮα２を放出する。
図１１Ａ〜Ｃに要約された一連の実験では、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２は、０．６％ＢＳＡ及び２ｍＭアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）（ｐＨ８．５、３７℃）の存在又は非存在下で、０．１Ｍリン酸緩衝液でインキュベートした。このｐＨ値でのＦＭＳ−タンパク質からのＦＭＳ加水分解速度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで正常ヒト血清中で得られたもの又はｉｎ  ｖｉｖｏで循環系で得られたものとほぼ同一である（Ｇｅｒｓｈｏｎｏｖら、２０００；Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００１及び２００２）。アリコートを異なる時点で引き上げ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１Ａ）及びＢＩＡｃｏｒｅにより、結合物からのＩＦＮα２の放出を分析し、質量作用の法則によりＩｆｎａｒ２の活性濃度を測定した（図１１Ｂ）。Ｉｆｎａｒ２表面のインターフェロン結合曲線は、未変性のインターフェロンの均質集団のものと似ており、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２がＩｆｎａｒ２を結び付けていないことを示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、ＩＦＮα２参照の既知濃度及び強度に関連付け、放出されたＩＦＮα２の量を定量した。両方の場合で、放出プロファイルは良好に一致する。ＢＩＡｃｏｒｅプロファイルで時間０で観察された１０％活性インターフェロンは、サンプル中に存在している未変性のインターフェロンに起因する。放出速度は、活性インターフェロンの量を一重指数方程式に当てはめて決定した（図１１Ｃ）。すなわち、ＩＦＮα２は、速度定数０．０１ｈｒ−１で結合物から放出される（図１１）。６６時間のインキュベートで、結合物中の５０％のＩＦＮα２が放出され、完全に活性である。曲線の当てはめで得られた外挿から、ほぼ全てのインターフェロンが最終的に放出され、完全に活性を回復するであろうことが予測された。タンパク質を３７℃で数週間保管することは望ましくないように、非常に長時間、何のＢＩＡｃｏｒｅデータも回収されなかった。
【０２３４】
３０（ｉｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の皮下投与によりその半減期がｉｎ  ｖｉｖｏで劇的に増した。
次に、我々はラットでＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の半減期及び活性を決定した。その濃度は、ＷＩＳＨ細胞でのＶＳＶにより誘発される細胞変性効果を測定することによりラット血清での抗ウイルス能力から決定することができるにもかかわらず（上記方法、抗ウイルス活性アッセイ参照）、ヒトＩＦＮα２はラットでは活性ではない。未変性のＩＦＮα２又はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２はラットに皮下投与された。血液アリコートを様々な時点で引き上げ、抗ウイルス能を分析した。未変性の未修飾ＩＦＮα２（１００μｇ／ラット）の投与後、循環している抗ウイルス活性はｔ１／２値〜１時間に下がり、投与後１２時間で２０ｐＭ  ＩＦＮα２より低いレベルに達した（図１２）。
【０２３５】
ラットに皮下投与（１２μｇ／ラット、６０μｇ／ラット、又は１２０μｇ／ラットの投与量で）後のＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の循環挙動は、明らかに明白な時間依存性挙動を示す（図１２）。１２μｇ／ラットの結合したＩＦＮα２の投与は、７０±１０ｐＭ  ＩＦＮα２の持続レベルとなり、投与後５６時間持続した。１０倍増加のＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２を投与した時、ＩＦＮα２は４５０ｐＭのモル濃度で血清中に５６時間持続して存在した。６０μｇ／ラットの結合物の投与は、５６時間で２２５ｐＭ、２００時間で２５ｐＭのインターフェロンレベルとなった。投与したサンプル中に存在する未変性のＩＦＮα２（ＢＩＡｃｏｒｅで決定した場合約１０％）は、ラットの血清中で観察される初期の高レベルのＩＦＮα２に寄与した。これらの値は、未変性のＩＦＮα２のものに類似したクリアランス曲線を示す。残った９０％のＩＦＮα２は、結合物からゆっくり放出された。
【０２３６】
３０（ｉｖ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２のラットへの静脈内投与
皮下交換の寄与を除くために、結合物及び未変性のサイトカインの両方をラット（３０μｇ／ラット）に静脈内投与した。未変性のインターフェロンでは、同じ半減期が測定され、皮下投与後に容易に循環系に浸透することが示された（図１３）。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２では、静脈内投与後１５０時間で抗ウイルス活性がまだ検出されており、ＰＥＧ化サイトカインの長期効果を示した。１０ｐＭの放出ＩＦＮα２レベルが投与後１５０時間さらに維持されたが、他方で未変性のＩＦＮα２は投与後３０時間以内に排出された。結合物の皮下投与後に観察された大きな肩（図１２）は、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２を静脈内投与したときには観察されない（図１３）。
【０２３７】
３０（ｖ）実験データのシミュレーション
ＢＩＡｃｏｒｅデータ（ＰＥＧ結合物からのＩＦＮα２の放出ではｋ＝０．０１ｈｒ−１）及び未変性のＩＦＮα２の抗ウイルスアッセイ（インターフェロンの排出ではｋ＝０．６５ｈｒ−１）の両方から得た速度定数を用いて、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の皮下投与様式及び静脈内投与様式の両方をシミュレートした（それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂ）。両方のケースで、シミュレートしたデータ及び実験結果が良好に一致した。シミュレートしたデータから明らかなように、未変性のインターフェロンを除いて、皮下容量から血流までの結合物の通過はゆっくりした速度で進行し、結合物からのインターフェロンの放出の順である。これは、活性タンパク質濃度で１０〜７０時間の間に観察された肩を説明する。予想されるように、この肩はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２を静脈内投与する場合には見られない。
【０２３８】
考察
前述したように、治療用タンパク質に応用されるＰＥＧ化技術は、しばしば結合物の生物学的及び薬理学的能力の大幅な損失に至る。この欠点はおおむね、加水分解を受けやすいか、又は血清プロテアーゼ若しくは血清エステラーゼにより酵素的に開裂可能な化学結合を介してＰＥＧ鎖を導入することにより克服できる。効果的なＰＥＧ化の必須条件は、ｉｎ  ｖｉｖｏで結合物からのＰＥＧ鎖の加水分解がゆっくりした速度で、均質様に生じることである。
【０２３９】
２つの基本的な不可逆性ＰＥＧ−ＩＦＮα２結合物は、現在治療的に使用されている。第１の１２ｋＤａ−ＰＥＧ−ＩＦＮα２は、組織に十分に浸透する。しかしながら、この調製物は、その低い分子量（質量計算値＝３２ｋＤａ）では腎臓ろ過で著しく阻まれるには不十分であるため、ｉｎ  ｖｉｖｏで比較的短寿命である。第２の剤形、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＩＦＮα２は、ｉｎ  ｖｉｖｏで非常に長寿命種である。しかしながら、この結合物は組織への浸透性が低い。投与後、結合物は血液及び腸液に分配される（Ｂａｉｌｏｎら、２００１）。したがって、我々は最適なＰＥＧ−ＩＦＮα２結合物の２つの必須の特徴、すなわち、末梢組織への自由な出入りと組み合わされたｉｎ  ｖｉｖｏでの長期持続性が、遅速加水分解性ＰＥＧ４０鎖をＩＦＮα２に結合させることにより得られることを予想した。
【０２４０】
我々は、ＦＭＳのタンパク質への結合において、ＦＭＳ−タンパク質結合物が所望の薬物動態パターンで生理的条件下で加水分解を受けることを以前に見出した（Ｇｅｒｓｈｏｎｏｖら、２０００；Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００１、２００２、２００３）。ＦＭＳ加水分解の速度は精密な恒常性下の哺乳類で維持されるｐＨ及び血清の求核性により単独で決定される（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００１）。したがって、我々は新たな開発の基礎をＦＭＳ原理においた。中性水溶液では、ＦＭＳ部分はゆっくり自然に加水分解し、未変性のタンパク質が再発生した（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００１）。この目的でＮＨＳ−ＦＭＳ−ＭＡＬを合成し、スルフヒドリル含有ＰＥＧ鎖が、加水分解性ＦＭＳ官能基を介してペプチド及びタンパク質のアミノ基に結合するのを可能にした。作業仮説は、ＰＥＧ−インターフェロン結合物が未変性のタンパク質を長時間かけて持続様式でその活性型で再発生させることができるということであった。得られた主な１箇所修飾されたＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２結合物（表２）はサイトカイン結合能を持っておらず、したがって、「プロドラッグ」とみなすことができる。インキュベート時に、未変性のサイトカインを加水分解により放出し、ＩＦＮα２のＩｆｎａｒ２への結合能が速度定数０．０１ｈｒ−１で再生する。
【０２４１】
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２の一回の皮下投与は、ラットの血清中でＩＦＮα２レベルを著しく長期化した。ＩＦＮα２は、半減期〜１時間であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで短寿命であるが、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２結合物は２００時間以上その抗ウイルス活性を発揮する。さらに、投与量とｉｎ  ｖｉｖｏでの長時間にわたる活性インターフェロンレベルの間には用量依存的割合がある。この観察は将来の臨床的使用での投与処方の最適化に有益である。
【０２４２】
ＩＦＮα２分子は理論上ＰＥＧ４０−ＦＭＳと結合可能な１３アミノ官能基を含むことに留意すべきである。ＰＥＧ化の正確な部位は決定されなかった。しかし、その不可逆性及び未変性タンパク質の発生の観点からは、この点はむしろ軽微な事柄に値するようである。
【０２４３】
要するに、薬理学的に「サイレント」な結合物が循環系で「捕捉され」、親タンパク質を所望の薬物動態プロファイルで放出するという本発明の可逆的ＰＥＧ化に対する新たな概念的アプローチにしたがって、我々はｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＦＮα２の長期持続性と活性な未変性のＩＦＮα２の放出を組み合わせて末梢組織へのアクセスを確実にすることに成功した。
【０２４４】
（実施例３１）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６結合物の生物学的活性
視床下部の神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体ファミリーは、満腹及び食料摂取量の制御に主要な役割を果たす（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２０００）。推定抑制性Ｙ２シナプス前受容体（Ｙ２Ｒ）は後室周囲核で発現し、ＮＰＹファミリーの局所及び末梢アゴニストに利用できる（Ｂｒｏｂｅｒｇｅｒら、１９９７；Ｋａｌｒａら、１９９９）。このようなＹ２Ｒアゴニストの一つがペプチドＹＹ３−３６（ＰＹＹ３−３６）であり、食事のカロリー量に比例して食後に消化管から放出される（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ−Ｂｊｅｒｇａａｒｄら、１９９６；Ａｄｒｉａｎら、１９８５；Ｇｒａｎｄｔら、１９９４）。近年、ヒト、マウス及びラットでＰＹＹ３−３６の末梢投与により食料摂取量が抑制され、ラットで体重の増加が減少することが示された［Ｐｉｔｔｎｅｒら、２００２；Ｂａｔｔｅｒｈａｍら、２００２、２００３］。したがって、ＰＹＹ３−３６を注入し、このペプチドの正常な食後の循環濃度に到達すると、１５分以内に血清ＰＹＹ３−３６中のピークがもたらされ、次いで、３０分以内に正常なレベルに急落する。この迅速な排出にかかわらず、空腹時の個体へのＰＹＹ３−３６の投与は、食欲を減退させ、食糧摂取量をＰＹＹ３−３６投与後１２時間以内に３３％までに減少させる。さらに、後の１２時間以上代償的な食糧摂取は生じない（Ｂａｔｔｅｒｈａｍら、２００２）。したがって、ＰＹＹ３−３６は肥満及びＩＩ型糖尿病及び循環器疾患などのその関連疾患の治療で、臨床的用途を見出すことができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＭｏｒｔｏｎ、２００２）。
【０２４５】
ＰＹＹ３−３６の短い循環の半減期及びその肥満の管理能力は、我々をＰＹＹ３−３６の更に長期作用型の開発に促した。実際、我々の手では、マウスでのＰＹＹ３−３６により誘導された満腹は、皮下（ｓｃ）注射後わずか２〜４時間しか続かなかった。前述したように、ＰＥＧのタンパク質及びペプチドとの共有結合はｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延ばすが、しばしば生物学的又は薬理学的活性の劇的損失をもたらす。標準的化学反応を用いて、すなわち、安定な結合形成を介してＰＥＧ化したＰＹＹ３−３６は、実際にその生物学的活性を失ったことを見出した。その後、我々は調製し、ここでＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６プロドラッグの生物学的活性を試験した。
【０２４６】
材料及び方法
（ｉ）動物  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオスのマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ）齢９±１週間（体重２０〜３０ｇ）を用いた。マウスは、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）の動物施設で、温度管理下（２１〜２３℃）及び光管理下（６：００〜１８：００に照明）で飼育した。マウスは研究開始後、少なくとも一週間で順応した。マウスは、実験の間いつでも飲料水に自由にアクセスさせた。全ての実験手順は、イスラエルｉ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌ  ｗｅｌｆａｒｅに従い、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅに認可された。
【０２４７】
（ｉｉ）試薬  ペプチドＹＹ３−３６を、ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ＡＭＳ  ４２２（Ａｂｉｍｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）を用いて固相法により合成した。得られたペプチドをＨＰＬＣ−精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）及びＮ−末端タンパク質マイクロシークエンシングにより特徴付けた。全ての他の試薬は分析用グレードであり、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した（Ｎｅｓｓ  Ｚｉｏｎａ、イスラエル）。
【０２４８】
（ｉｉｉ）分析手順  質量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びエレクトロスプレー（ＥＳ−ＭＳ）技術を用いて決定した（それぞれ、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｒｅｆｌｅｘ−Ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｏｄｅｌ、ドイツ、及びＶＧ−ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＩＩ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏ  Ｍａｓｓ、英国）。ＰＹＹ３−３６、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６及びＰＥＧ４０は、分析用ＨＰＬＣにより解析した（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−４カラム、４×２５０ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）。緩衝液Ａは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液及び緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡの７５％アセトニトリル水溶液であった。１０〜１００％の緩衝液Ｂの勾配を、流速１ｍｌ／分で、５０分かけて用いた。ＰＹＹ３−３６、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６及びＰＥＧ４０−９−スルホ−フルベンの保持時間（Ｒｔ）は、それぞれ２１．５３、３９．０３及び４４．３８７分であった。アミノ酸分析は、１１０℃で２４時間の６Ｎ  ＨＣｌ加水分解後、Ｄｉｏｎｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＰ１０９０（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。Ｎ−末端配列分析をＭｏｄｅｌ  ４９１Ａ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。
【０２４９】
（ｉｖ）合成手順：ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６は、実施例２３のように調製した。
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−グリシンエチルエステル（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＧＥＥ）攪拌しているＰＥＧ４０−ＳＨ（０．２５ｍＭの０．１Ｍ  リン酸緩衝液ｐＨ７．２−１０ｍＭ  アスコルビン酸Ｎａ）の溶液に、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ２９２μｇを加えた（ＰＥＧ４０−ＳＨより２倍モル過剰）。７分後、０．５Ｍグリシンエチルエステルの溶液から０．２ｍｌを加えた。反応を１時間行い、その後、混合物を一晩水で透析させた。得られたＰＥＧ４０−ＦＭＳ−グリシンエチルエステルを特徴付けし、２８０ｎｍ／ε２８０＝２１，２００の吸収及び２０μｌのアリコートの酸加水分解及びアミノ酸分析後の調製物中のグリシンの量により定量した。
【０２５０】
ＰＥＧ４０−ＰＹＹ３−３６  不可逆的ＰＥＧ化ＰＹＹ３−３６は、ＰＹＹ３−３６（１ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２）を４当量の固体ＰＥＧ４０−ＯＳｕ（４３ｍｇ）と反応させることにより調製した。反応を１時間行い、その後混合物を一晩水で透析した。こうして得られた結合物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで決定したように、ＰＥＧ４０１残基／ＰＹＹ３−３６を含む（ＰＥＧ４０−ＯＳｕ、４３，６２６Ｄ；ＰＹＹ３−３６、４，０４７Ｄ；結合物、４７，７１２Ｄ）。
【０２５１】
（ｖ）飼料摂取量測定：１０匹のマウスのグループに、２４時間飼料を与えず、その後、予め重さを量った過剰の標準飼料を２時間与えた。飲料水は常に与えた。マウスは、指示された投与量で、２時間の再給餌時間の開始前２４時間以内に、生理食塩水（０．１ｍｌ／マウス）、未変性のＰＹＹ３−３６又はＰＹＹ３−３６誘導体のいずれかを皮下注射した。１時間の最小間隔を注射と再給餌との間に導入して、ストレスに依存した飼料摂取の減少を回避した。飼料の消費量／グループを、給餌時間の終わりに測定した。２時間の再給餌時間の後、残った飼料の重さを量った。累積的飼料摂取量／マウス１０匹を計算した。再現実験の飼料摂取値は、生理食塩水対照群により標準化した。結果は、２〜５回の再現実験から得た飼料摂取量／マウス１０匹±ＳＤとして示す。
【０２５２】
（ｖｉ）統計分析  飼料消費の有意差を、１０匹の各グループで消費した飼料の全量を単一値として用いて、スチューデントｔ検定により決定した。生理食塩水を注射した１０匹のマウスのグループを、対照群として各実験で含めた。対応のある両側ｔ検定を、対照群と処置群との間で行った。
【０２５３】
３１（ｉ）マウスでのＰＹＹ３−３６の飼料摂取への影響
ＰＹＹ３−３６及びその誘導体の飼料摂取への影響の期間及び規模を評価するために、我々は２４時間飢餓状態にし、２時間再給餌するマウスの再給餌モデルを採用した。最初に我々は、再給餌期間の直前にＰＹＹ３−３６を投与する従来の研究を再度行った。しかし、我々は、単なるマウスの取り扱いからくるストレスが完全に矛盾した影響を飼料摂取に与えており、これにより生理食塩水とＰＹＹ３−３６との間の相違を低減させることを見出した。その後、我々は再給餌の開始１時間前にマウスに皮下注射し、ＰＹＹ３−３６及び生理食塩水の間のより一層恒常的な相違を得た。図１５は、ＰＹＹ３−３６が薬物に依存して飼料摂取を阻害したことを示す。５ｎｍｏｌ／マウスの投与量で生理食塩水又はＰＹＹ３−３６を与えられているマウスは、それぞれ、１０．７±１．２６及び５．２６±１．４７ｇの飼料／マウス１０匹を消費した（Ｐ＜０．００１、Ｎ＝５）。これらは、生理食塩水対照群と比較して、ＰＹＹ３−３６群による飼料摂取の５０％の減少に相当することを示す。阻害は、０．２ｎｍｏｌ／マウスの最低投与量も含み（０．８μｇ／マウス、Ｐ＞０．０５、Ｎ＝３）、使用した全ての投与量で統計的に有意であった。投与量応答は、約０．５ｎｍｏｌ／マウスでＰＹＹ３−３６の最大半減の効果に相当する（図１５）。
【０２５４】
その後、我々は、再給餌前の異なる時点でＰＹＹ３−３６（５ｎｍｏｌ／マウス）の皮下投与により誘導された満腹期間を測定した。ＰＹＹ３−３６により誘導される満腹は、再給餌前に１時間設けた場合で最大であり、より早い時間にＰＹＹ３−３６を投与した場合は急激に減少した。その生物学的応答の半減期は約３時間であり、再給餌前ほぼ１０時間で投与した場合には、ＰＹＹ３−３６５ｎｍｏｌでは効果は見られなかった（図１６）。
【０２５５】
マウスへのＰＹＹ３−３６の腹腔内（皮下よりむしろ）投与は、かなり短持続性の満腹効果を誘発する。実施例では、再給餌の３０分前に投与した場合、腹腔内投与量５ｎｍｏｌＰＹＹ３−３６／マウスは、完全に効果があったが、食餌２時間前に投与した場合は効果がなかった（図示せず）。
【０２５６】
その後、我々は従来のＰＥＧ化によりＰＹＹ３−３６の生物学的活性を延ばすよう試みた。したがって、モノ−ＰＥＧ化ＰＹＹ３−３６を調製し（上記材料及び方法参照）、再給餌期間前１時間で皮下投与することにより（５ｎｍｏｌ／マウス）その生物学的活性を試験した。生理食塩水対照群では飼料摂取の有意な減少は得られず、従来のＰＥＧ化は、安定なＰＥＧ化ペプチドを生じ、ＰＹＹ３−３６の生物学的活性を止めることを示した（図１７）。
【０２５７】
その後、我々はＰＹＹ３−３６の不活性化が、ＰＥＧ基の大きさに原因があるのか、又はＰＹＹ３−３６のアミノ残基の阻止に原因があるのかを試験した。ＰＹＹ３−３６の２つのアミノ基のアセチル化が、ｉｎ  ｖｉｖｏで満腹を誘発するＰＹＹ３−３６の効果を大幅になくした。したがって、生理食塩水対照群での１０．６±１．２６ｇ、ＰＹＹ３−３６群での５．２６±１．４７ｇに対して、２０μｇのＮα−Ｎε−ジアセチル−ＰＹＹ３−３６／マウスを注射したマウスは、１０．５４±０．０８ｇの飼料／マウス１０匹を食べた。それゆえ、小さいアセチル基の結合でさえＰＹＹ３−３６の生物学的活性を阻止するのに十分であった。
【０２５８】
３１（ｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の調製及び特徴付け
ＰＹＹ３−３６のアセチル化又はＰＥＧ化後の生物学的活性の欠落が、以前に実施例２３で記載したＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６結合物を調製するよう我々を促した。この生成物を質量分析により分析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によりＰＥＧ４０対ＰＹＹ３−３６の比を決定した。ＰＹＹ３−３６は、分子量４０４７．５１Ｄを示した（計算値＝４０４９．６Ｄ）。ＰＥＧ４０−ＳＨは平均質量４３，６２６Ｄを有し、結合物は４７，７１２．６Ｄの分子量に相当する大きなピークを生じる（図示せず）。ＰＥＧ４０−ＳＨとＭＡＬ−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６との１：１の結合物の質量計算値は、４８，０８７Ｄである。したがって、主生成物はこのような１：１の結合物に相当する。
【０２５９】
３１（ｉｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳは、ＰＹＹ３−３６のα−アミノ基に結合する。
ペプチドＹＹ３−３６は、イソロイシンのＮ−末端α−アミノ基及び位置２のリシンのε−アミノ基一つを含み、この双方ともＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳｕによるアシル化に利用し得る可能性がある。アシル化の部位を決定するために、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６を、ｐＨ７．０で１時間、５００モル過剰の酢酸無水物と反応させ、その後一晩水で透析した。次いで、アセチル化ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６をｐＨ８．５で４日間インキュベートすることにより、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ基を除去した。その後、生成物をＮ−末端タンパク質配列分析にかけた。図１８に示すように、サイクル１、２及び３は、それぞれ、予想量のイソロイシン、ε−アセチルリシン及びプロリンを生じた。サイクル２には遊離リシンは見付からなかった。したがって、結合物は１：１の割合のＰＥＧ４０−ＦＭＳ及びＰＹＹ３−３６から構成されている。さらに、配列決定結果に基づき、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ基は、最初にＰＹＹ３−３６のＮ−末端α−アミノ基に結合する。それにもかかわらず、この分析はそのε−リシン側鎖でモノ置換されたＰＹＹ３−３６の存在を完全に排除することはできなかった。しかしながら、未変性のペプチドの完全な再生の観点からは、この点はむしろさほど重要ではない。
【０２６０】
３１（ｉｖ）生理的条件下でＰＹＹ３−３６を得るためのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の加水分解
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６からのＰＹＹ３−３６の放出速度を評価するために、我々はリン酸緩衝液中で結合物をインキュベートした（ｐＨ８．５、０．１Ｍ、３７℃）。アリコートを異なる時点で引き上げ、ＰＹＹ３−３６からＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６を分離する溶離条件を用いて分析用ＨＰＬＣにかけた。ｐＨ８．５でのＦＭＳ−ペプチド又はタンパク質からのＦＭＳの加水分解速度は、正常ヒト血清中で得られるものとほぼ一致する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、２００１）。図１９に示すように、ＰＹＹ３−３６は、半減期５．３時間で、ゆっくり、ほぼ均一様に結合物から放出された。４０時間後、遊離ＰＹＹ３−３６の累積量は、投入ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の７９％に達した。
【０２６１】
３１（ｖ）正常マウス血清中でのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の加水分解
我々は、ＰＹＹ３−３６が３７℃の正常マウス血清中で、半減期３±０．７分で急速なタンパク質分解を受けることを見出した（図２０、挿入）。したがって、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の加水分解速度は加水分解の間に放出される２−ＰＥＧ４０−９−スルホ−フルオレンの量により上昇した。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６は、３７℃の正常マウス血清中でインキュベートした。アリコートを異なる時点で引き上げ、エタノール（３倍容量）を加えて血清タンパク質を沈殿させ、遠心分離後、上清中の２−ＰＥＧ４０−９−スルホ−フルオレンの量をＨＰＬＣで測定した。図２０に示すように、３７℃での正常マウス血清中のＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の加水分解は、ほぼ均一様に半減期７．０±０．３時間で進行した。
【０２６２】
３１（ｖｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６はマウスで長期満腹を誘導する。
次いで、我々は、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６（５ｎｍｏｌ／マウス）が飼料摂取に影響を及ぼす期間を決定した。ＰＹＹ３−３６の生物学的応答の半減期は、約３時間であった（図１６）。比較すると、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６の生物学的活性は、更に一層持続的であった（図２１）。再給餌１８時間前にＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６を与えたマウスは、対照（生理食塩水）群（Ｐ＞０．０５）と比較して、飼料摂取の５２％の減少を示す値である４．７±０．１４ｇ飼料／マウス１０匹を摂った。再給餌２４時間前にＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６を与えたマウスでは、飼料摂取の統計的に有意な２７％の減少もまた見られた（Ｐ＜０．０５、図２１）。したがって、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６により発揮される満腹効果の半減期は、約２４時間であり、すなわち、非修飾型ＰＹＹ３−３６よりも８倍長かった。対照研究では、再給餌１５時間前のＰＥＧ４０−ＦＭＳ−グリシンエチルエステル（５ｎｍｏｌ／マウス）の皮下投与は、生理食塩水と比較して飼料摂取にいかなる影響も有しなかった（図２１、右の柱）。
【０２６３】
（実施例３２）
（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨ及びＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨの生物学的活性
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、重要な下垂体ホルモンであり、末梢組織の成長及び発達を制御する。ｈＧＨは、ＦＤＡに認可された薬物であり、成長ホルモン欠損の小児の代償療法に広く使用される。５０ｋＤａ未満の分子量の他の非グリコシル化タンパク質医薬に有効であるように、ｈＧＨは、ヒトでｔ１／２値２０〜３０分で、循環系から迅速に排出される。排出は腎臓を介して最初に生じる。ｈＧＨへのＰＥＧ鎖の共有結合は、実質的に腎臓を介した糸球体ろ過による排出を減少させ、したがってｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命を引き伸ばすことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命をかなり引き伸ばすためには、いくつかのＰＥＧ鎖をｈＧＨに導入しなければならない。ＰＥＧ化は、しばしばペプチド及びタンパク質の生物学的又は薬理学的能力の劇的減少をもたらす。これは、部位１及び部位２の比較的大きな表面積のためにｈＧＨに特に有効であり、これらを介してホルモンは第一の受容体、次いで第二の受容体に結合し、信号伝達を開始するホモ二量体化受容体結合物を形成する。
【０２６４】
しかし、ＰＥＧ鎖のｈＧＨへの非可逆型共有結合は、このホルモンの生物学的能力の劇的減少をもたらす。例えばＣｌａｒｋら、１９９６は、２〜７個のＰＥＧ５０００鎖をｈＧＨのアミノ側鎖部分に結合させた。２つのＰＥＧ５０００／ｈＧＨの結合は、すでにｈＧＨの生物学的能力の〜９０％の減少しかもたらさなかった。実質的に循環の半減期を延ばすためには、このようなＰＥＧ５０００鎖を約５個は、タンパク質に結合しなければならなかった。しかし、このような（ＰＥＧ５０００）５ｈＧＨ結合物は、ｈＧＨの生物学的能力の０．１％未満であった。
【０２６５】
２つのＰＥＧ−ＦＭＳ−ｈＧＨ結合物を、本発明に従って調製した（実施例２４〜２５）。実際には、ｈＧＨは数個の結合可能なアミノ基を含んでいる。しかし、生理的条件での本発明のＰＥＧ化反応の可逆性及び未変性のペプチド及びタンパク質ホルモンの再生の観点からは、この点は軽微な事柄にしか値しない。
【０２６６】
３２（ｉ）（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨ及びＰＥＧ４０−ＦＭＳｈＧＨの受容体結合能
ｈＧＨ置換アッセイを前述のように行った（Ｔｓｕｓｈｉｍａら、１９８０）。２つのＰＥＧ４０−ＦＭＳ部分をｈＧＨへ結合させることにより調製した（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨは、約１２０ｋＤａの効果的な分子量を有し、未変性のｈＧＨの９±２％の受容体結合能を示す。受容体結合能は、３７℃で正常ラット血清中、又は３７℃で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でのインキュベートでｔ１／２値〜２０時間で再生し、インキュベートの５０時間後、７０〜８０％の未変性受容体結合能に達する（図示せず）。
【０２６７】
３２（ｉｉ）ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨの加水分解速度及び反応順序
ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ｈＧＨの加水分解速度及び反応順序を３７℃、ｐＨ＝８．５で評価した。ｈＧＨの放出をＲＰ−ＨＰＬＣで観測し、一次反応であることを確定した（表３、図２２）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ｈＧＨは受容体結合親和性を示さない。インキュベートで、未変性のｈＧＨ受容体により放出されたｈＧＨの認識が維持された（図２２）。ヒト成長ホルモンは、ゆっくりと均一様にｔ１／２値１１．８時間で結合物から放出された（表３、図２３）。
【０２６８】
（実施例３３）
ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰは生理的条件で時間依存的加水分解を受ける。
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、２８−ｍｅｒアミノ酸非リシン含有ペプチドであり、ナトリウム排泄増加、利尿及び血管弛緩作用を発揮する。それは、身体の血液量及び血圧の恒常性において重要な役割を果たす。ＡＮＰは、その受容体部位（１０ｐｍ）に対し非常に高い親和性を有し、したがって、受容体及びプロテアーゼにより媒介される事象により非常に迅速に排出される（ｔ１／２〜０．５分）。それゆえ、ＡＮＰは、ヒトの血圧の恒常性の制御のために皮下投与する薬物としては適していない。ＡＮＰのα−アミノ部分へのＰＥＧ４０鎖の共有結合により受容体結合親和性を完全に欠く結合物が生じる（データは示さず）。
【０２６９】
ＡＮＰのα−アミノ側鎖にＰＥＧ４０−ＦＭＳを結合させることにより調製されるＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰは、ＴＮＢＳ陰性である。ｐＨ８．５及び３７℃でのインキュベートで、この結合物は、ｔ１／２値２３±２時間で自然に加水分解を受け、５０時間のインキュベート後に親ＡＮＰを生じる（表５）。ラットでのｉｎ  ｖｉｖｏでの予備測定により、皮下投与されたＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰが、未変性のＡＮＰと比較して、血中半減期が６０倍増加していることが明らかにされた。この結合物は、加水分解によるＡＮＰからのＰＥＧ４０−ＦＭＳ鎖の減少より前に受容体により仲介される分解から完全に保護される。
【０２７０】
（参考文献）
2007528354.tif 000014
【０２７１】
2007528354.tif 000015
【０２７２】
2007528354.tif 000016
【０２７３】
2007528354.tif 000017
【０２７４】
2007528354.tif 000018
【０２７５】
2007528354.tif 000019
【０２７６】
【表１】
2007528354.tif 000020
ａエレクトロスプレーイオン化技術を用いて質量スペクトルを測定した。
ｂ使用したＨＰＬＣカラムは、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈカラムである；（Ｃ１８）；１０〜１００％の溶媒Ｂの直線グラジエント（３ｍｌ／分）。
ｃ過剰のＧＳＨ及びＤＴＮＢでＭＡＬ官能基を定量することにより決定した化合物濃度でのｐＨ７．２のＰＢＳ中の２８０及び３０１ｎｍの吸収に基づく。
【０２７７】
【表２】
2007528354.tif 000021
（ａ）特徴、ＩＦＮα２−ＦＭＳ−ＭＡＬは、ＰＥＧ４０−ＳＨを結合する前にＨ２Ｏで透析した。最終生成物は、５０ｋＤａの分画を有するｃｅｎｔｒｉｃｏｎでろ過した。これらの処理により、ＰＥＧ４０−ＳＨに結合しなかった、遊離ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ及びいかなる残余の未変性ＩＦＮα２又はＩＦＮα２−ＦＭＳ−ＭＡＬを除く。
（ｂ）ＵＶ分光法により測定  誘導体の濃度は、２０μｌアリコートの酸加水分解し、アミノ酸分析することにより決定し、アスパラギン酸（１４残基）、アラニン（９残基）及びイソロイシン（８残基）により計算した。
（ｃ）未変性ＩＦＮα２は、２８０ｎｍでε２８０ｎｍ＝１８０７０（３０）で吸収する。
（ｄ）質量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いることにより測定した。
（ｅ）質量計算値は、未変性のＩＦＮα２（１９２７８ダルトン）、ＰＥＧ４０−ＳＨ（４３８１８ダルトン）及び結合後のスペーサ分子（４７３ダルトン）について見出された加算した質量により得られる。
（ｆ）未変性のＩＦＮα２は、保持時間３３．９分での同一の分析用ＨＰＬＣ手法下で溶離する。
【０２７８】
【表３】
2007528354.tif 000022
ａ加水分解速度後にトリニトロベンゼンスルホン酸アッセイを行った。
ｂｋは、時間（ｈ）に対するｌｎ［ＰＥＧ−ＦＭＳ結合物］のプロットから得られる傾き定数である。
ｃｔ１／２は、式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋから決定した。
ｄ加水分解のプロットは、図２３として見出すことができる。
【０２７９】
【表４】
2007528354.tif 000023
（ａ）固定化されたｉｆｎａｒ−２−ＥＣへの受容体結合能は、反射吸収分光法−ＲＩＦＳにより評価した。
インキュベートは、０．５％ＢＳＡを含むｐＨ８．５の０．１Ｍ  リン酸緩衝液中で行った。
【０２８０】
【表５】
2007528354.tif 000024
【０２８１】
（スキーム１：前駆体１〜４）
【化１２】
2007528354.tif 000025
【０２８２】
（スキーム２：前駆体１〜４の合成）
【化１３】
2007528354.tif 000026
【０２８３】
（スキーム３：前駆体５〜８）
【化１４】
2007528354.tif 000027
【０２８４】
（スキーム４：前駆体５の合成）
【化１５】
2007528354.tif 000028
【０２８５】
（スキーム５：前駆体７及び８の合成）
【化１６】
2007528354.tif 000029
【０２８６】
（スキーム６：ＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物の調製手順）
【化１７】
2007528354.tif 000030
【０２８７】
（スキーム７（ページａ））
【化１８】
2007528354.tif 000031
【０２８８】
（スキーム７（ページｂ））
【化１９】
2007528354.tif 000032
【０２８９】
（スキーム７（ページｃ））
【化２０】
2007528354.tif 000033
【０２９０】
（スキーム７（ページｄ））
【化２１】
2007528354.tif 000034
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】ｐＨ値の異なる水溶液におけるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのマレイミド官能基部分の安定性を示す。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（１ｍＭ）を、Ｈ２Ｏ（ｐＨ６．０）、０．００７Ｍ酢酸（ｐＨ〜４．０）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、及び０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中で、室温でインキュベートした。指定の時間にアリコートをわずかに過剰なＧＳＨと反応させ（ｐＨ７．２で１５分）、未反応のＧＳＨの濃度を５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を用いて決定した。
【図２】ｐＨ７．２におけるα−ラクトアルブミン（α−ＬＡ）中へのＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの取り込み程度を、添加した試薬量の関数として示す。α−ＬＡのサンプル（０．１Ｍリン酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ溶液の１．０ｍｌ、ｐＨ７．２）に、１当量〜最大１４モル当量の範囲のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ濃度でＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを加えた。各処理について、透析後に２８０ｎｍでの吸光度を測定し、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いて未修飾のアミノ側鎖部分の量を定量することによって、タンパク質に取り込まれた量を決定した。
【図３】（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）２−ゲンタマイシン及び（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−ゲンタマイシン結合物の再活性化の経時変化を示す。３７℃、ｐＨ８．５でインキュベート後、アリコートを指定の時間に抜き取り、それらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製阻止能力を分析した。各アリコートのＩＣ５０を決定した。天然ゲンタマイシンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製を０．２２±０．０２μＭのＩＣ５０値で阻止した。
【図４】ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕによるヒトインスリンのアミノ酸部分の修飾の進行を、インスリンに取り込まれたＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃの関数として示す。（Ａ）インスリン（０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（０．２ｍｌ）中１７．２４ナノモル）を、グラフに示したようにタンパク質に対してモル過剰となる高い濃度のＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕと２５℃で２時間反応させた。未修飾のまま残った遊離アミノ基の数を、ＴＮＢＳを用いて定量した。（Ｂ）インスリン１モル当たり０．４、０．７、１．１、１．５、及び２．２モルの共有結合されたＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃを含むアリコートを、ラット脂肪細胞におけるそれらの脂質生成能力について分析した。分析条件のもと、ヒトインスリンは基礎レベルより４〜６倍の強さで脂質生合成を刺激し、ＥＤ５０値は０．２±０．０２ｎｇ／ｍｌであった。この分析でＥＤ５０値０．２±０．０２ｎｇ／ｍｌを示したインスリン誘導体は、天然インスリンの脂質生成能力の１０％を有しているとみなされる。
【図５】３７℃、ｐＨ８．５でインキュベートした際のＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−インスリン結合物の再活性化速度を示す。インスリン１モル当たり１及び２モルのＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃを含有するＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ−インスリン結合物を、３７℃、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３−０．５％ウシ血清アルブミン及び１ｍＭ  ＮａＮ３中で、０．１７２μＭの濃度でインキュベートした。指定の時間に、ラット脂肪細胞におけるそれらの脂質生成能力についてアリコートを（各アリコートについて数種類の濃度で）分析した。
【図６】マウスに（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンを単回皮下（ＳＣ）投与した後のグルコース低下効果の延長を示す。天然インスリン（Ｚｎ２＋無し、ＰＢＳ緩衝液０．２ｍｌ中１．７２ナノモル／マウス）又は（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン（ＰＢＳ緩衝液０．２ｍｌ中１７．２ナノモル／マウス）のいずれかをマウスにＳＣ投与した。指定の時間に血糖レベルを測定した。各点は、５匹のマウスの血糖の算術平均±標準誤差である。
【図７】（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリンを単回腹腔内（ＩＰ）投与した後のマウスにおけるグルコース低下パターンを示す。インスリン（Ｚｎ２＋無し、ＰＢＳ緩衝液０．２ｍｌ中０．３４５ナノモル／マウス）又は（ＰＥＧ５０００−Ｆｍｏｃ）１−インスリン（ＰＢＳ緩衝液０．２ｍｌ中３．４５ナノモル／マウス）のいずれかをマウスのグループにＩＰ投与した。指定の時間に血糖レベルを測定した。グラフの各点は、５匹のマウスの算術平均±標準誤差である。
【図８】３７℃、ｐＨ８．５でインキュベートした際のＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４結合物からのエキセンディン−４の放出速度を示す。指定の時間に、アリコート（５０μｌ）をＨＰＬＣに添加し、結合物からエキセンディン−４を上手く分離する条件下で流した。放出されたエキセンディン−４の最大ピーク面積に対する百分率を時間の関数として示して結果を表している。エキセンディン−４（５０μｇ）を１００％のピーク面積に割り当てた。
【図９】３７℃、ｐＨ８．５でインキュベートした際のＰＥＧ−ＦＭＳ結合物の加水分解速度を示す。ＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−エキセンディン−４溶液（丸）及びＰＥＧ５０００−ＦＭＳ−４−ニトロ−フェネチルアミン（四角）を３７℃、ｐＨ８．５、ＰＢＳ溶液中でインキュベートした。指定の時間に、ＲＰ−４カラムを用いたＨＰＬＣによりアリコート（５０μｌ）を分析した。放出されたエキセンディン−４及び４−ニトロフェネチルアミンの最大ピーク面積に対する百分率を時間の関数として示して結果を表している。
【図１０Ａ】天然エキセンディン−４及びＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４をＣＤ−１マウスに単回皮下投与した後のグルコース低下パターンを示す。天然エキセンディン−４（１０μｇ／マウス）又はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４（エキセンディン−４と当量の１０μｇ／マウス）のいずれかをＣＤ−１マウスにＳＣ投与した。指定の時間に、循環血液中のグルコースレベルを測定した。各実験グループは５匹のマウスで構成した。データは、平均±ＳＥで示した。
【図１０Ｂ】天然エキセンディン−４及びＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４をＣＤ−１マウスに単回皮下投与した後のグルコース低下パターンを示す。生理食塩水、天然エキセンディン−４（４μｇ／マウス）、又はＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４（４μｇペプチド／マウス）を、３グループのＣＤ１マウス（１グループ当たりｎ＝６）に１回皮下投与した。次いで、循環血液中のグルコースレベルをモニターした。１日の同じ時点での測定により生理食塩水で処理したグループで認められた濃度に対する、エキセンディン−４又はＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４で処理したグループにおける血漿グルコース濃度の低下率として結果を表している。
【図１１Ａ】３７℃、ｐＨ８．５でＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２をインキュベートした際の活性ＩＦＮα２の放出を示す。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２（０．３ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、２ｍＭ  ＮａＮ３及び６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液中でインキュベートした（ｐＨ８．５、３７℃）。指定の時間に、アリコートを抜き取った。結合物からのＩＦＮα２放出のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析；ＩＦＮα２放出の量を、濃度及び強度が分かっている基準ＩＦＮα２と比較して定量した（時間の増分及び百分率は図に示している）。
【図１１Ｂ】３７℃、ｐＨ８．５でＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２をインキュベートした際の活性ＩＦＮα２の放出を示す。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２（０．３ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、２ｍＭ  ＮａＮ３及び６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液中でインキュベートした（ｐＨ８．５、３７℃）。指定の時間に、アリコートを抜き取った。指定の時間に抜き取ったアリコートを、それらのＩｆｎａｒ２結合能についてＢＩＡｃｏｒｅで分析した。
【図１１Ｃ】３７℃、ｐＨ８．５でＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２をインキュベートした際の活性ＩＦＮα２の放出を示す。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２（０．３ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、２ｍＭ  ＮａＮ３及び６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液中でインキュベートした（ｐＨ８．５、３７℃）。指定の時間に、アリコートを抜き取った。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２からの天然ＩＦＮα２の放出についてのＢＩＡｃｏｒｅによる近似プロファイルである。
【図１２】天然ＩＦＮα２及びＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２のＳＣ投与の結果を示す。指定濃度の天然ＩＦＮα２（１００μｇ／ラット）又はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２結合物（１２、６０、１２０μｇ／ラット）をラットにＳＣ注射した（０．２ｍｌ／ラット、ＰＢＳに溶解）。指定の時間に血液アリコートを抜き取った。これらのアリコートの循環血液中の抗ウイルス活性を、３倍連続希釈した各アリコートを用いヒトＷＩＳＨ細胞において測定した。
【図１３】ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２のラットへの静脈内投与の結果を示す。指定濃度の天然ＩＦＮα２（３０μｇ／ラット）又はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２結合物（３０μｇ／ラット）をラットに静脈内注射した（０．２ｍｌ／ラット、ＰＢＳに溶解）。指定の時間に血液アリコートを抜き取った。これらのアリコートの循環血液中の抗ウイルス活性を、３倍連続希釈した各アリコートを用いヒトＷＩＳＨ細胞において測定した。
【図１４Ａ】初期濃度がそれぞれ６０ｎＭ及び１．５ｎＭのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２及び天然ＩＦＮα２をＳＣ投与した後の、刺激されたＩＦＮα２の挙動についての実験結果を示す。挿入図は実験のグラフである。
【図１４Ｂ】ＳＣ容量で初期濃度が２０ｎＭのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮα２、１．５ｎＭの天然ＩＦＮα２を循環血液中に結合物の無い状態でラットに静脈内投与した後の、刺激されたＩＦＮα２の挙動についての実験結果を示す。挿入図は実験のグラフである。
【図１５】マウスの食物摂取におけるＰＹＹ３〜３６の用量反応を示す。雄マウスＣ５７ＢＬ６Ｊ（１グループ当たり１０匹）を２４時間絶食させた。２３時間の時点で、生理食塩水又は指定用量のＰＹＹ３〜３６のいずれかをマウスにＳＣ注射した。２４時間の時点で、予め計量した過剰量の食物をマウスに２時間摂食させた。飲料水は常に与えていた。２時間にマウス１０匹が摂食した食物の量をＰＹＹ３〜３６用量の関数として示している。
【図１６】ＰＹＹ３〜３６によるマウスの食物摂取量の時間依存的減少を示す。図１５で記述したように、雄マウスＣ５７ＢＬ６Ｊ（１グループ当たり１０匹）を絶食させ、ＰＹＹ３〜３６（５ナノモル／マウス）を、再給餌期間を開始する前の指定の時間に投与した。結果は、４回の同一実験の平均である。
【図１７】ＰＹＹ３〜３６の生物活性に対する不可逆的ＰＥＧ化の影響を示す。天然ＰＹＹ３〜３６をＰＥＧ４０−ＯＳｕと反応させた。１０匹のマウスからなるグループに、再給餌期間の開始１時間前に生理食塩水、ＰＹＹ３〜３６、又はＰＥＧ４０−ＰＹＹ３〜３６（５ナノモル／マウス）をＳＣ注射した。結果は、２回の同一実験の平均である。
【図１８】ＰＥＧ４０−ＦＭＳがＰＹＹ３〜３６のα−アミノ基に結合されていることを示す。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６（１００μｇ）をｐＨ７で５００モル過剰の無水酢酸によってアセチル化し、透析し、３７℃、ｐＨ８．５で３日間インキュベートして、定量的にＰＥＧ４０−ＦＭＳ部分を除去した。次に、得られたアセチル化ＰＹＹ３〜３６を３サイクルのＮ末端タンパク質配列分析にかけた。得られた配列は、イソロイシン−（Ｎε−アセチル）リジン−プロリンであった。天然ペプチドの配列分析により、サイクル１、２、３のそれぞれでイソロイシン、リジン、及びプロリンが示された（グラフは示していない）。
【図１９】ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６からのＰＹＹ３〜３６放出の動態を示す。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．５、２ｍＭ  ＮａＮ３中７５０μＭ）を３７℃でインキュベートした。アリコート（１００μｌ）を指定の時間に抜き取り、遊離のＰＹＹ３〜３６をＨＰＬＣによって測定した。放出されたＰＹＹ３〜３６の蓄積量を時間の関数として示している。初期の結合物におけるＰＹＹ〜３６の量を、２０μｌのアリコートを酸加水分解し、続いてアミノ酸分析をすることにより決定した。
【図２０】正常なマウス血清におけるＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６の加水分解速度を示す。正常なマウス血清においてＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６（０．５μＭ）を３７℃でインキュベートした。アリコートを指定の時間に抜き取り、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６から放出された２−ＰＥＧ４０−９−スルホ−フルベンの量をＨＰＬＣにより測定し、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６加水分解の速度を計算するのに利用した。挿入図は、３７℃、正常なマウス血清においてＰＹＹ３〜３６が急速に分解することを示している。正常なマウス血清においてＰＹＹ３〜３６（５０ｎＭ）を３７℃でインキュベートした。指定の時間にアリコート（０．１ｍｌ）を取り出し、３倍体積のエタノールでタンパク質除去し、上清中のＰＹＹ３〜３６の量をＨＰＬＣによって測定した。
【図２１】ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６が満腹感の延長を誘発することを示す。再給餌の前の指定の時間に生理食塩水又はＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６（５ナノモル／マウス）のいずれかをマウスにＳＣ投与した点以外は、図１５で記述したプロトコールを繰り返した。結果は、３回の同一実験の平均であり、対照の生理食塩水に基づいて標準化した。
【図２２】３７℃、ｐＨ８．５でインキュベートした際のＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ｈＧＨの再活性化の経時変化を示す。ＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ｈＧＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で、０．１Ｍリン酸緩衝液、０．６％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＮａＮ３中でインキュベートした。指定の時間にアリコートを抜き取り、ウサギ肝臓原形質膜から抽出したｈＧＨ−受容体を多く含む調製物の１２５Ｉ−ｈＧＨを置換する能力について分析した。天然のｈＧＨは、この分析において０．３±０．０３ｎＭの濃度で、１２５Ｉ−ｈＧＨを最大量の半分置換する。この分析において３．０±０．３ｎＭの濃度で最大量の半分の置換を示すｈＧＨ誘導体は、天然の受容体の結合能の１０％を有しているとみなされる。挿入図は、３７℃、ｐＨ８．５でインキュベートした際のＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨの放出速度を示している。ＰＥＧ４００００ＦＭＳ−ｈＧＨ（１ｍｇタンパク質）を前述したようにインキュベートした。指定の時間に０．１ｍｌのアリコートを抜き取り、ＨＰＬＣ分析による分析にかけた。
【図２３】３７℃、ｐＨ８．５でインキュベートした際のＰＥＧ−ＦＭＳ結合物の加水分解速度を示す。各時点のＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−エキセンディン−４及びＰＥＧ４００００−ＦＭＳ−ｈＧＨの濃度をＨＰＬＣによって決定した。得られた直線状のプロットは、加水分解速度が一次反応であることを示している。結合物の半減期を、式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ（ｋは直線プロットの傾き（ｈ−１））から算出した。
【図１】
2007528354.tif 000044
【図２】
2007528354.tif 000045
2007528354.tif 000046
2007528354.tif 000047
【図５】
2007528354.tif 000048
【図６】
2007528354.tif 000049
【図７】
2007528354.tif 000050
【図８】
2007528354.tif 000051
【図９】
2007528354.tif 000052
2007528354.tif 000053
2007528354.tif 000054
2007528354.tif 000055
2007528354.tif 000056
2007528354.tif 000057
【図１２】
2007528354.tif 000058
【図１３】
2007528354.tif 000059
2007528354.tif 000060
2007528354.tif 000061
【図１５】
2007528354.tif 000062
【図１６】
2007528354.tif 000063
【図１７】
2007528354.tif 000064
【図１８】
2007528354.tif 000065
【図１９】
2007528354.tif 000066
【図２０】
2007528354.tif 000067
【図２１】
2007528354.tif 000068
【図２２】
2007528354.tif 000069
【図２３】
2007528354.tif 000070
【配列表】
2007528354000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月2日(2007.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｘ）ｎ−Ｙの化合物、及び薬剤として許容されるその塩：
［式中、
Ｙは、遊離のアミノ基、カルボキシル基、リン酸基、ヒドロキシル基及び／又はメルカプト基から選択される少なくとも１つの官能基を有する薬物部分であり、
Ｘは、式（ｉ）〜（ｉｖ）からなる基の群から選択される基であり、
【化１】
2007528354.tif 000077
（式中、
Ｒ１はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む基であり、
Ｒ２は水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（Ｃ１〜Ｃ８）アルカリル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロゲン、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨＲ、アミノ、アンモニウム、カルボキシル、ＰＯ３Ｈ２、及びＯＰＯ３Ｈ２からなる群から選択され、
Ｒは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及び（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールからなる群から選択され、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及び（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールからなる群から選択され、
Ａは、薬物Ｙのカルボキシル基、リン酸基又はメルカプト基にその基が結合されているときは共有結合であり、薬物Ｙのアミノ基又はヒドロキシル基にその基が結合されているときはＯＣＯ−である、
ｎは、少なくとも１である整数である］。
【請求項２】
Ｘが式（ｉ）の基であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素であり、Ａが−ＯＣＯ−である（以降、「Ｆｍｏｃ」）、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘが式（ｉ）の基であり、Ｒ２がフルオレン環の２位の−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素であり、Ａが−ＯＣＯ−である（以降、「ＦＭＳ」）、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が式−Ｒ５−Ｒ６−ＰＥＧの基である、請求項１記載の化合物：
［式中、
Ｒ５は、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＰＯ２−、及び−ＰＯ３−からなる群から選択され、
Ｒ６は、結合又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分がそれを通じてＲ５に共有結合している基である］。
【請求項５】
Ｒ５は−ＮＨ−であり、
Ｒ６は、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＯ−ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ、
【化２】
2007528354.tif 000078
（Ｚは、ＰＥＧ部分に結合されているＯ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択される）、
からなる群から選択される、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
前記Ｒ１基が、分子量２００〜２００，０００の範囲の、好ましくは５０００〜４００００Ｄａの範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分を含む、より好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙが、
好ましくはゲンタマイシン若しくはアンホテリシンである、アミノグリコシド系抗生物質；
好ましくはアミノレブリン酸、ダウノルビシン若しくはドキソルビシンである、抗悪性腫瘍薬；或いは、
好ましくはヒトインスリンである、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片などの、低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物、
などの、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物部分である、請求項５記載の化合物。
【請求項８】
以下の式の請求項５記載の化合物：
【化３】
2007528354.tif 000079
［式中、Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、Ｙは、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物の残基であり、かつ、ＰＥＧは、分子量２００〜２００，０００の範囲の、好ましくは５０００〜４００００Ｄａの範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分である、より好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である］。
【請求項９】
Ｒ２がＨである、本明細書でＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−薬物結合物として示す、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
前記結合物が式（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−薬物（ｎは１〜３の整数、好ましくは１又は２である）を有する、請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
前記薬物が、
ゲンタマイシン若しくはアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質；
アミノレブリン酸、ダウノルビシン若しくはドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬；或いは、
好ましくはヒトインスリンである、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片などの、低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物、
である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２が−ＳＯ３Ｈである、本明細書でＰＥＧ−ＦＭＳ−薬物結合物として示す、請求項８記載の化合物。
【請求項１４】
前記結合物が式（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物（ｎは１〜３の整数、好ましくは１又は２である）を有する、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
前記薬物が、
ゲンタマイシン若しくはアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質；
アミノレブリン酸、ダウノルビシン若しくはドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬；或いは、
好ましくはヒトインスリンである、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片などの、低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物、
である、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
前記ペプチド薬物又はタンパク質薬物が、
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−インスリンとして特定される、ヒトインスリン；
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮ−α２若しくは結合物（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮ−α２として特定される、ＩＦＮ−α２；
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６として特定される、ＰＹＹ３〜３６［配列番号１２］；
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨ又は結合物（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨとして特定される、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）；
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰとして特定される、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）［配列番号１３］；
本明細書で結合物ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−エキセンディン−４として特定される、エキセンディン−４［配列番号１］；
エキセンディン−３［配列番号２］；或いは、
［配列番号３］、［配列番号４］、［配列番号５］、［配列番号６］、［配列番号７］、［配列番号８］、［配列番号９］、及び［配列番号１０］からなる群から選択されるエキセンディンのアゴニスト、
である、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
以下の式の請求項５記載の化合物：
【化４】
2007528354.tif 000080
［式中、Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、Ｙは、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物の残基であり、かつ、ＰＥＧは、分子量２００〜２００，０００の範囲の、好ましくは５０００〜４００００Ｄａの範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分である、より好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である］。
【請求項１９】
Ｙが、
好ましくはゲンタマイシン若しくはアンホテリシンＢである、アミノグリコシド系抗生物質；
好ましくはアミノレブリン酸、ダウノルビシン若しくはドキソルビシンである、抗悪性腫瘍薬；或いは、
好ましくはヒトインスリンである、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片などの、低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物、
などの、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物部分である、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ５は−Ｓ−であり、
Ｒ６は
【化５】
2007528354.tif 000081
［式中、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨである］、
からなる群から選択される、
請求項４記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ５は−ＣＯであり、
Ｒ６はＯ−、−ＮＨ−、ＮＨ−Ｒ７−ＣＯＯ−、−ＮＨ−Ｒ７−ＮＨ、−ＮＨ−Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ、
【化６】
2007528354.tif 000082
［式中、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨである］、
からなる群から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択される、
請求項４記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ５は−ＣＨ２−であり、
Ｒ６は−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ｎは０〜１８である）である、
請求項４記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ５は−ＳＯ２−であり、
Ｒ６はＯ、−ＮＨ−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓである、
請求項４記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ５は−ＰＯ２−であり、
Ｒ６は−Ｏ−又は−ＮＨ−である、
請求項４記載の化合物。
【請求項２５】
前記Ｒ１基が、分子量２００〜２００，０００の範囲の、好ましくは５０００〜４００００Ｄａの範囲の直鎖又は分枝ＰＥＧ部分を含む、より好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｙが、
好ましくはゲンタマイシン若しくはアンホテリシンＢである、アミノグリコシド系抗生物質；
好ましくはアミノレブリン酸、ダウノルビシン若しくはドキソルビシンである、抗悪性腫瘍薬；或いは、
好ましくはヒトインスリンである、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片などの、低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物、
などの、少なくとも１つのアミノ基を含む薬物部分である、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
請求項１記載の化合物又は薬剤として許容されるその塩、及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項４記載の化合物、好ましくは請求項５記載の化合物、より好ましくは請求項８記載の化合物を含む、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１４記載の化合物、好ましくは式（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物
［ｎは１〜３の整数、好ましくは１又は２であり、
前記ＰＥＧ部分が好ましくは４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子であり、かつ
前記薬物が、
ゲンタマイシン若しくはアンホテリシンＢなどのアミノグリコシド系抗生物質；
アミノレブリン酸、ダウノルビシン若しくはドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍薬；或いは、
好ましくはヒトインスリンである、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片などの、低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物、
である］
を含む、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１７に記載のインスリンのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物を含む、糖尿病及び高血糖症を治療するための、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ＩＦＮ−α２のＰＥＧ化ＦＭＳ結合物、好ましくはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＩＦＮ−α２又は（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ＩＦＮ−α２を含む、Ｂ型肝炎若しくはＣ型肝炎などのウイルス性疾患を治療するための、又は膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、若しくはエイズ関連カポジ肉腫などの癌を治療するための、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＰＹＹ３〜３６のＰＥＧ化ＦＭＳ結合物、好ましくはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＰＹＹ３〜３６を含む、食物摂取量を低減し、かつ、肥満、及び高血圧症、異脂肪血症、心臓血管のリスク、インスリン抵抗性、糖尿病など食物摂取量の低減によって軽減することができる疾患、状態又は障害を治療するための、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ｈＧＨのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物、好ましくはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ｈＧＨ又は（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ）２−ｈＧＨを含む、病理学的に低身長の子どもを治療するための、又は抗加齢治療のための、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３４】
ＡＮＰのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物、好ましくはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＡＮＰを含む、心臓血管疾患、うっ血性心不全、高血圧症、急性腎不全又は成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療するための、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３５】
エキセンディン又はエキセンディンのアゴニストのＰＥＧ化ＦＭＳ結合物、好ましくは［配列番号１］、［配列番号２］、［配列番号３］、［配列番号４］、［配列番号５］、［配列番号６］、［配列番号７］、［配列番号８］、［配列番号９］又は［配列番号１０］を含む、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、又は妊娠性糖尿病を治療するための、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３６】
以下の式の中間体化合物：
【化７】
2007528354.tif 000083
［式中、Ｒ１は、式−Ｒ５−Ｒ６−Ｂの基であり、
Ｒ２は、フルオレン環の２位のＨ又は−ＳＯ３Ｈであり、
Ｂは、マレイミド、−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３又はＰＥＧ部分であり、
Ｒ５は、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＰＯ２−、及び−ＰＯ３−からなる群から選択され、
Ｒ６は、結合又はマレイミド、−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３、若しくはＰＥＧ部分がそれを介してＲ５に結合されている基である］。
【請求項３７】
Ｒ５は−ＮＨ−であり、
Ｒ６は−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ、
【化８】
2007528354.tif 000084
、及び−ＣＯ−Ｒ８−からなる群から選択され、
ＺはＯ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ１８の直鎖又は分枝アルキレン、フェニレン、主鎖に３〜１８個の炭素原子を有するオキシアルキレン基、２〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド残基、及び１〜１０個の単糖残基を含む糖残基からなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキレンであり、Ｂがマレイミド又は−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ３であるとき、好ましくはエチレンである、
請求項３６記載の化合物。
【請求項３８】
本明細書で前駆体１〜７、又は前駆体８若しくは以下の式のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳとして特定される、請求項３７記載の化合物。
【化９】
2007528354.tif 000085
【請求項３９】
本明細書で式（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−Ｙによって特定される結合物：
［式中、Ｙは、インスリン、ＩＦＮ−α２、ＰＹＹ３〜３６、エキセンディン−４、ｈＧＨ及びＡＮＰからなる群から選択されるペプチド薬物又はタンパク質薬物の部分であり、ｎは、少なくとも１である整数、好ましくは１又は２であり、Ｙは、アミノ基を通じてＦＭＳ基に結合されている］。
【請求項４０】
請求項１４記載の、本明細書で示す結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物（ＦＭＳは２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、ｎは１〜３の整数、好ましくは１又は２、より好ましくは１であり、薬物は低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である）を調製するための方法であって、
（ｉ）低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳと反応させ、それにより結合物（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物を得ること；及び、
（ｉｉ）結合物（ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物をＰＥＧ−ＳＨと反応させ、それにより結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物を得ること、
を含む方法。
【請求項４１】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）又はそのアナログ、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
請求項１４記載の、本明細書で示す結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−薬物（ＦＭＳは２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、ｎは１〜３の整数、好ましくは１又は２、より好ましくは１であり、薬物は低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物である）を調製するための方法であって、
（ｉ）ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳをＰＥＧ−ＳＨと反応させ、それにより結合物ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳを得ること；及び、
（ｉｉ）低分子量又は中分子量のペプチド薬物又はタンパク質薬物を少なくとも１当量のＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳと反応させ、それにより結合物（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ペプチド／タンパク質薬物を得ること、
を含む方法。
【請求項４４】
前記ＰＥＧ部分の分子量が５０００〜４００００Ｄａの範囲である、好ましくは前記ＰＥＧ部分が４００００Ｄａ又は５０００Ｄａの分枝型分子である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチド又はタンパク質が、インスリン、ＩＦＮ−α２などのインターフェロン、ペプチドＰＹＹ３〜３６などのＰＹＹアゴニスト、エキセンディン−３及びエキセンディン−４などのエキセンディン、及びエキセンディンのアナログ及びアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、ＴＮＦ−α、カルシトニン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ヒルジン、グルカゴン、又は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体断片などのモノクローナル抗体断片である、請求項４３記載の方法。
【国際調査報告】
2007528354.tif 000086
2007528354.tif 000087
2007528354.tif 000088
2007528354.tif 000089