(57)【要約】  本発明は、細胞または生物の自然突然変異の頻度を低下させる方法、ならびにそのような細胞および生物を産生する方法と、自然突然変異の頻度が低下している細胞および／または生物と、自然突然変異の頻度が低下している細胞を用いることによってタンパク質の発現系を産生する方法、タンパク質を産生する方法、および発酵産物を産生する方法とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの変異を細胞または生物に導入することによって、前記細胞または生物における自然突然変異の頻度を低下させる方法であって、その複合作用が少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化をもたらす、方法。
【請求項２】
少なくとも２つの変異を生物の少なくとも１つの細胞に導入することによって、自然突然変異の頻度が低下している細胞または生物を産生し、前記生物が多細胞生物である場合には、それから前記生物を再生する方法であって、その複合作用が少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化をもたらす、方法。
【請求項３】
前記細胞が原核細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記原核細胞が古細菌または真正細菌の細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記真正細菌の細胞がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が真核細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記真核細胞が、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物が、真菌、動物、または植物である、請求項１、２、または５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つの変異の複合作用が、自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化をもたらす、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
自然発生した突然変異を修復するミスマッチ修復系、複製後修復系、および／またはＳＯＳ修復系の能力が強化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの変異が、ＭｕｔＬタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＭｕｔＳタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＤＮＡポリメラーゼＩＶまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が、ベクターを細胞内に導入することによって実現され、前記ベクターが、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、またはそれらの相同タンパク質の過剰発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、ｍｕｔＬ遺伝子、ＭｕｔＬの相同タンパク質をコードする遺伝子、ｍｕｔＳ遺伝子、またはＭｕｔＳの相同タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが多コピープラスミドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記調節ユニットが誘導性または構成的プロモーターである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
１コピーまたは複数コピーのそれぞれのｍｕｔ遺伝子を１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に宿主細胞の染色体に導入すること、および／または対応する野生型細胞と比較して、それぞれのＭｕｔタンパク質の産生が増強されるように、１つまたは複数の変異を、天然のＭｕｔタンパク質の発現を制御する調節ユニットに導入することによって、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が実現される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｉｎＢ１０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｎａＥ９１１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１の複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞または野生型生物と比較して少なくとも１０分の１に低下する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ｄｉｎＢ１０、ｄｎａＥ９１１、および過剰発現したｍｕｔＬの複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞または野生型生物と比較して少なくとも５０分の１に低下する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも２つの変異の複合作用によって、細胞生存率の増強に導かれる、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
自然突然変異の頻度の低下および／または細胞生存率の増強を有し、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法で取得可能な細胞であって、前記細胞が少なくとも２つの変異を含み、その複合作用が少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化をもたらす、細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、細菌、真菌、植物、または動物細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
自然突然変異の頻度が低下しており、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な生物であって、前記生物の細胞が少なくとも２つの変異を含み、その複合作用が少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化をもたらす、生物。
【請求項２４】
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０（ＤＳＭ１７０１６）。
【請求項２５】
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０１７）。
【請求項２６】
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ（ＤＳＭ１７０１８）。
【請求項２７】
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０１９）。
【請求項２８】
大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ（ＤＳＭ１７０１５）。
【請求項２９】
大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０１４）。
【請求項３０】
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ（ＤＳＭ１７０２０）。
【請求項３１】
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０２１）。
【請求項３２】
タンパク質の発現系を産生する方法であって、前記タンパク質のアミノ酸配列が自然発生した突然変異に対して安定化されており、
ａ）  少なくとも２つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化をもたらす工程、または
ｂ）  前記タンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも２つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化をもたらす工程と、
ｃ）  適当な培地中で前記宿主細胞を培養および／または維持する工程と
を含む方法。
【請求項３３】
タンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質のアミノ酸配列が自然発生した突然変異に対して安定化されており、
ａ）  少なくとも２つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化をもたらす工程、または
ｂ）  前記タンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも２つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化をもたらす工程と、
ｃ）  適当な培地中で、前記タンパク質の発現を可能にする条件下に前記宿主細胞を培養する工程と、
ｄ）  発現された前記タンパク質を単離する工程と
を含む方法。
【請求項３４】
前記タンパク質が培地から単離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が宿主細胞から抽出される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質が、治療に使用できるタンパク質、詳細にはサイトカインまたは成長因子である、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ベクターが、プラスミド、バクテリオファージ、またはコスミドである、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記調節ユニットが、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、サイレンサー、および／または３’転写ターミネーターである、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質をコードする核酸配列が、細胞小器官、細胞内区画、細胞外間隙、または培地中への、発現されたタンパク質の輸送を指示するリーダー配列に機能的に連結されている、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
発酵産物、および／または発酵産物の形成に関与する少なくとも１つの酵素を産生する細胞を培地中で培養することによって、発酵産物を産生する方法であって、少なくとも２つの変異によって前記細胞のゲノムが自然発生の配列変化に対して安定化されており、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化をもたらす、方法。
【請求項４１】
前記発酵産物が、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、酸、糖質、ビタミン、抗生物質、またはアルカロイドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
自然発生した突然変異を修復するミスマッチ修復系、プルーフリーディング機構、および／またはＳＯＳ修復系の能力が強化される、請求項３２から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも２つの変異が、ＭｕｔＬタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＭｕｔＳタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＤＮＡポリメラーゼＩＶまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから選択される、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が、細胞内のベクターの存在によるものであり、前記ベクターが、ｍｕｔＬ遺伝子、ＭｕｔＬの相同タンパク質をコードする遺伝子、ｍｕｔＳ遺伝子、またはＭｕｔＳの相同タンパク質をコードする遺伝子を、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、またはそれらの相同タンパク質の過剰発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
それぞれのｍｕｔ遺伝子を１コピーまたは複数コピー追加して、１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に宿主細胞の染色体に導入すること、および／またはそれぞれのＭｕｔタンパク質の産生が、対応する野生型細胞と比較して増大するように、天然のＭｕｔタンパク質の発現を制御する調節ユニットに１つまたは複数の変異を導入することによって、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が実現される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｉｎＢ１０である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｎａＥ９１１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１の複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞と比較して少なくとも１０分の１に低下する、請求項３２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ｄｉｎＢ１０、ｄｎａＥ９１１、および過剰発現したｍｕｔＬの複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞と比較して少なくとも５０分の１に低下する、請求項３２から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも２つの変異の複合作用によって、細胞生存率の増強に導かれる、請求項３２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項３２から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、請求項２１、２２、または２４から３１のいずれか一項に記載の細胞であるか、あるいは請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法で取得可能である、請求項３２から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が液体培地中で培養される、請求項３２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が連続培養またはバッチ培養で培養される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が固定される、請求項３２から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が固体または半固体の培地上で培養される、請求項３２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記発酵産物が前記細胞から単離される、請求項４０から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記発酵産物が培地から単離される、請求項４０から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
請求項３２から６０のいずれか一項に記載の方法で取得可能なタンパク質。
【請求項６２】
請求項４０から６０のいずれか一項に記載の方法で取得可能な発酵産物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、細胞または生物の自然突然変異の頻度を低下させる方法、ならびにそのような細胞および生物を産生する方法と、自然突然変異の頻度が低下している細胞および／または生物と、自然突然変異の頻度が低下している細胞を用いることによって、タンパク質の発現系を産生する方法、タンパク質を産生する方法、および発酵産物を産生する方法とに関する。
【０００２】
（背景技術）
変異は、生体システムの特徴であり、自然選択の材料を提供する。細菌などの生物では絶えず自然突然変異が起きている。変異の発生率は、生物、例えば特定の遺伝子のサイズ、および塩基対置換による不活性化に対する遺伝子の感受性によって大きく異なる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）では、１ゲノム複製あたり、１ゲノムあたりの変異の値がμｇ＝０．００２５であり、ゲノムサイズ４．６×１０６塩基対の中での１複製あたり、１塩基対あたりの変異率がμｂ＝５．４×１０−１０である。Ｇ−Ｃ→Ａ−Ｔなど、詳細が明らかにされている単一の経路の発生率でさえ、単一遺伝子内の異なった部位では、２０００倍を越える相違を有することがあり、これは、いまなお大部分が謎である、局所的ＤＮＡ配列およびＤＮＡ構造の影響によるものと考えられている。変異の種類、およびそれらを生成する過程は、両方とも多様であり、部分的にしか発見されていない。
【０００３】
変異は多細胞生物でも重要である。ここではしかし、遺伝物質の変化における２つの異なった種類、すなわち配偶子の変異、換言すれば生殖細胞系変異と、体細胞の変化、換言すれば体細胞変異とを区別しなければならない。生殖細胞系変異はその生物の子孫へと引き継がれるが、体細胞変異は引き継がれない。しかし、体細胞変異は癌の発生に寄与するので、重要である可能性がある。生殖細胞系変異の検出、特にヒトの生殖細胞系変異の検出、およびヒトにおける変異率の測定には、二倍性の問題がある。ほとんどの前進変異は劣性であり、したがって、接合体が２コピーの変異対立遺伝子を得ない限り検出されないであろう。復帰変異の頻度は、通常、それよりはるかに低いが、それは、遺伝子に変異導入する方法が、既存の変異を元に戻す方法よりもはるかに多く存在するためである。ヒト細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究から、総合的なヒト変異率は、原核および真核の様々な微生物のものに極めて類似していると推算されている。
【０００４】
遺伝物質の遺伝的変化など、変異は、大域的変化、詳細には染色体レベルでの変化である場合も、あるいは細胞学的な異常として視覚化されないこともある点変異である場合もある。点変異には、トランジションおよびトランスバージョン、ならびにフレームシフト変異などの塩基対置換が含まれる。遺伝子のタンパク質コード領域における塩基置換変異の結果は、置換のタイプとその位置に依存する。そのような塩基対置換はサイレント、すなわちタンパク質配列中で新規のアミノ酸残基をもたらさないこともある。しかし、それらはアミノ酸置換をもたらすこともある。そのようなミスセンス変異は、鎌状赤血球貧血の場合のように、極めて重大な結果をもたらすことも、軽度の結果をもたらすことも、全く何の結果ももたらさないこともある。最後に、タンパク質コード領域における塩基置換は、アミノ酸コドンを終止コドンに変異させることもあれば、その逆もある。前者のタイプは、未熟な状態に短縮されたタンパク質をもたらし、ナンセンス変異と呼ばれる。塩基置換変異は、遺伝子のプロモーターもしくは５’調節領域、またはイントロンなど、遺伝子の発現の調節に関与する配列で起こることもあり、さらに、それらの転写、翻訳またはスプライシングに影響を与えることもある。β−サラセミアの多くが、グロビン遺伝子の発現レベルに影響を与えるこのタイプの非構造変異の結果である。フレームシフト突然変異は、遺伝子のコード領域における１つまたは複数（ただし３の倍数ではない）のヌクレオチドの挿入または欠失から生じる。これがリーディングフレームの変更を引き起こす。この種類の変異は下流のすべてのアミノ酸を改変し、産物が正常なタンパク質から大きく異なる場合があるので、機能しない産物を生成する可能性が非常に高い。
【０００５】
自然突然変異は、細胞内での自然の過程の結果起こり得るものであり、外部因子、すなわち変異原とのＤＮＡの相互作用の結果起こる変異である誘導性変異と区別することができる。自然突然変異の重要な発生源は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの不正確な作用による、ＤＮＡ複製における誤りである。ＤＮＡポリメラーゼが誤りをおかす頻度は、この自然突然変異の頻度に影響を与えるであろう。そして、それによって、異なったＤＮＡポリメラーゼに、精度の相違があることが観測されている。ＤＮＡポリメラーゼの精度に影響を与える重要な一要因は、ポリメラーゼによって挿入された誤対合塩基を除去するプルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼの存在である。この３’−５’エキソヌクレアーゼの機能は、ＤＮＡ複製中の誤取込みを防止し、変異を防止することである。
【０００６】
自然突然変異の別の主要な発生源は、互変異性化と呼ばれる核酸の塩基の構造変化である。塩基は、２つの形で存在でき、それらの間で相互変換する。例えば、グアニンはケト型およびエノール型で存在できる。様々な互変異性体型の塩基は異なった対合特性を有する。ＤＮＡ複製中にＧがエノール型である場合、ＤＮＡポリメラーゼは、それの向かいに正常なＣではなくＴを付加する。したがって、互変異性化はトランジション変異の原因となる。細胞で起こる別の変異原性の過程は、自発性の塩基分解である。細胞内では、シトシンからウラシルへの脱アミノ化が有意な発生率で起こる。脱アミノ化は、ＤＮＡ中に通常存在しないウラシルを検出する特異的な修復過程によって修復することができ、それが起こらない場合、Ｕがその向かい側にＡの挿入を引き起こし、ＤＮＡ複製の際にＣ：ＧからＴ：Ａへのトランジションを引き起こすことができる。発生頻度の高い自発性ＤＮＡ損傷の第３のタイプは、酸素のフリーラジカルによる塩基の損傷である。これらは、細胞内で酸化代謝の結果起こり、また、放射線照射などの物理的作用因子によっても形成される。重要な酸化生成物の１つに８−ヒドロキシグアニンがあり、これはアデニンとの誤対合を起こし、その結果、Ｇ：ＣからＴ：Ａへのトランスバージョンをもたらす。さらに別のタイプの自発性ＤＮＡ損傷が、アルキル化、すなわちＤＮＡの塩基またはバックボーンへのアルキル基の付加である。アルキル化は、Ｓ−アデノシルメチオニンなどの化合物の、ＤＮＡとの反応を介して起こり得る。アルキル化された塩基は、自発性の分解または誤対合の対象となる。
【０００７】
さらに、ＤＮＡ複製中における、鋳型鎖と新規に合成された鎖との間の「スリップ誤対合（ｓｌｉｐｐｅｄ  ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）」と呼ばれる機構によって、自発性のフレームシフト変異が生じることもある。
【０００８】
自然突然変異はゲノムのいかなる部位でもランダムに起こり、そのため、自然発生した突然変異の大部分が、影響を受ける生物に有害であり、有利な変異が起こる確率は非常に低くなっている。したがって、生物は、過度の変異率から自らを防御する機構を進化させている。これらの防御機構は、ＤＮＡの複製または自発性の脱アミノ化の結果、ＤＮＡ中に生じたミスマッチを認識および修正し、外因性または内因性の変異原とのＤＮＡの反応の結果生じた潜在的に変異原性である変化を認識し除去する。
【０００９】
特に、発酵工程などの生物工学の工程では、変異が極めて望ましくない。変異は、発酵細胞のゲノム中のいかなる部分にも生じ得るので、発酵産物の生成または組成に影響を与えることがある。例えば、発酵産物がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードする核酸配列の変異は、改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質変種に導くことがある。発酵細胞のわずかな部分のみが変異の影響を受けた場合にさえ、これによって、その変種に汚染された最終タンパク質調製物を生じる結果となり得る。これは、そのタンパク質がヒトの疾患の治療に用いられることとなっている場合、例えば、タンパク質の抗原特性が改変された場合に、予見できない劇的な結果をもたらす可能性がある。発酵細胞集団内での変異の発生も、その変異が、例えば、発酵産物、または所望の発酵産物の発現を制御する調節ユニットの形成に関与する酵素などの上流の調節経路に影響を与える場合、産物生成の速度に影響を与えることがある。
【００１０】
さらに、変異が、発酵細胞集団のわずかな部分にのみ影響を与える希少な事象である場合でさえ、それらが、影響を受けた細胞に、変異導入されていない細胞と比較して選択有利性を与える場合、そのような集団でそれらが迅速に広まることがある。特に、定常状態を維持するために定常的に細胞を除去する連続培養では、これによって、培養時間の進行に伴う、変異導入された細胞と比較した、変異導入されていない細胞の漸進的減少に導かれる。
【００１１】
特に発酵時間中の変異が極めて望ましくない別の理由が、いわゆる定常期変異の現象であるが、これは、適応変異とも呼ばれる。発酵の定常期中に行われる選択など、致死的でない選択に微生物集団が曝露された場合、選択圧を軽減する変異が高頻度で発生する（Ｃａｉｒｎｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２８（１９９１年）、６９５−７０１）。当初は、有用な変異のみが現れると思われたが、選択された変異には、選択されていない変異も伴うこと、すなわちこの過程が有用遺伝子へと方向付けられていないことが、現在では明らかである（Ｆｏｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９（１９９７年）、１５５０−１５５４）。適応変異に関するほとんどの研究は、ラクトースを利用することができない（Ｌａｃ−）が、ラクトースが唯一の炭素源である場合に容易にラクトース利用性（Ｌａｃ＋）に復帰する大腸菌株に関して集中的に行われた。適応変異を生成する過程は、正常成長中にＬａｃ＋変異を生成する過程と同じものではない。成長に依存した変異とは異なり、ほとんどすべての適応型のＬａｃ＋変異は、大腸菌のＲｅｃＢＣＤ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系の相同組換え機能など、組換え機能に依存している（Ｃａｉｒｎｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２８（１９９１年）、６９５−７０１；Ｆｏｓｔｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４７（１９９３年）、４６７−５０４；Ｈａｒｒｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４（１９９４年）、２５８−２６０）。
【００１２】
（発明の開示）
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、細胞または生物によって、タンパク質などの発酵産物を産生する方法および手段を提供し、その際、自然発生した突然変異、中でも発酵工程の定常期中に発生する変異に対して、産生を行う細胞または生物が保護および／または安定化され、かつ発酵産物、詳細にはタンパク質の形成速度および組成の両方が長期的に保障および保護されるようにすることである。
【００１３】
本発明は、少なくとも２つの変異を細胞または生物に導入することによって上記細胞または生物における自然突然変異の頻度を低下させる方法を提供することによって、この技術的課題を解決し、その際、上記少なくとも２つの変異は、それらの複合作用によって、少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化に導くものである。
【００１４】
本発明は、自然突然変異の頻度が低下している細胞または生物を、少なくとも２つの変異を導入し、さらにその生物が多細胞生物である場合にはそれから生物を再生することによって産生する方法を提供することによっても、その根底にある技術的課題を解決し、その際、上記少なくとも２つの変異は、それらの複合作用によって少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化に導くものである。
【００１５】
本発明によれば、自然発生した突然変異を修正する細胞性ＤＮＡ修復機構の能力が大幅に強化され、それによって、異なった修復系に影響を与える少なくとも２つの異なった変異が細胞に導入される。本発明による、少なくとも２つの異なった変異の導入によって得られた、自然発生した突然変異を修正する細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化によって、細胞で安定的に遺伝する変異の頻度の低下に導かれ、それによって、変異率の総合的な低下に導かれると有利である。
【００１６】
したがって、本発明によれば、驚くべきことに、特定の細胞性ＤＮＡ修復機構を改変することによって、詳細には自然発生した突然変異を修復するこれらのＤＮＡ修復系の能力をより効率的に強化する特定の変異を導入することによって、野生型細胞の自然突然変異率を劇的に低下できることが見出された。例えば、本発明によれば、驚くべきことに、ＭｕｔＳタンパク質の過剰発現によって、増殖期に、宿主細胞の変異性の有意な低下に導かれることが見出された。これはしかし、現在の技術において記載されている結果と対照的である。米国特許第６６５６７３６号によれば、酵母または他の生物の野生型または変異型ＭＭＲタンパク質の過剰発現の結果、ミスマッチ修復系の欠損が生じ、それによって、そのようなミスマッチ修復系の欠陥を有する酵母細胞は高変異性となる。さらに、ｄｉｎＢ１０の欠失と、抗変異原アレルｄｎａＥ９１１とを保持する細菌株は、対応する野生型株と比較して１０分の１に低下した変異性を示す。ミスマッチ修復系に関与するＭｕｔＬタンパク質を追加して過剰発現すると、変異性の低下が５０分の１にまで達する。別の系では、特定のフレームシフト変異の復帰変異の低下が１０００分の１に達する可能性さえあると示されるはずである。このようにして、成長に依存した変異の発生率だけでなく、適応変異中の変異発生率、すなわち定常期に依存した変異の発生率も有意に低下させることができる。観測された、宿主細胞の自然突然変異発生率に対するいくつかの変異の影響は、驚くべきことに、相加的ではなく、相乗的に共働しているようである。
【００１７】
さらに、本発明によれば、驚くべきことに、これらの変異の導入は、自然発生した突然変異を修正する細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導くだけではなく、有利なことに、細胞生存率も大幅に増大させることが見出された。例えば、発酵細菌株におけるＭｕｔＬタンパク質の過剰発現によって、約１０３倍の細胞生存率の増大が観測された。
【００１８】
自然発生した突然変異を修正する細胞性ＤＮＡ修復機構の能力を増強するいくつかの変異を導入することによる、本発明の細胞内自然突然変異率の低減および本発明の細胞生存率の増大は、タンパク質などの発酵産物の発現および／または産生に使用される細胞または株に特に大きな価値を有する。そのような細胞の使用によって、例えば、得られたタンパク質産物のアミノ酸配列を、産生を行う細胞または生物で何代にもわたって、変化させずに維持することができる。そのような細胞の使用によって得られたタンパク質調製物は、変異によるタンパク質変種によって汚染されておらず、したがって、治療薬としての適用において何の問題も起こさず、また、受容する身体に対する望ましくない影響も導かない。細胞性ＤＮＡ修復機構の能力が強化されているそのような本発明の細胞の使用は、組換え体タンパク質の産生に特に有用である。
【００１９】
しかし、細胞性ＤＮＡ修復機構の能力が強化されている本発明の細胞の使用は、発酵細胞によるタンパク質産生に限定されない。原則として、本発明の細胞は、抗生物質、有機酸など、あらゆる種類の発酵産物用に使用することができる。宿主細胞内での変異率の低下によって、産物生成速度の有効性を制御する因子も、安定かつ不変に維持されるであろうから、これらの細胞における自然突然変異率の大幅な低下によって、産物組成の完全性の長期的な維持のみでなく、産物生成速度の高さの維持も提供される。
【００２０】
本発明のコンテクストにおいて、「細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く変異」という用語は、細胞のゲノムにおける、少なくとも１つの特定のＤＮＡ修復機構に関与するタンパク質または酵素をコードする部分の任意の遺伝的改変、あるいはＤＮＡの複製もしくは自発性の脱アミノ化、または自然発生の突然変異に導く任意の他の自然過程の結果としてＤＮＡで生じた細胞内または生物内でのゲノム規模の誤りの認識および修正の強化に導く、細胞性ＤＮＡ修復機構の構成要素の発現調節に関与する、ゲノムの部分の任意の遺伝的改変を意味する。したがって、「細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く変異」は、所与の細胞または生物のゲノム内の自然発生した誤りの、より効率的かつより正確な修正を提供する。
【００２１】
したがって、「細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く変異」は、集団内で安定的に遺伝する変異の頻度の低下、すなわちその集合内での変異頻度の低下に導く。本発明のコンテクストでは、「変異の頻度」を、集団の個体総数に対する変異体数の比率として定義する。「細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く変異」は、所与の遺伝子が複製中に変異し、かつ該遺伝子のこの変異が安定的に遺伝するであろう確率として定義される変異発生率の低下も導く。さらに、本発明のコンテクストにおいて、細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く変異は、トランスポゾンに媒介された変異導入の低下も導く。
【００２２】
したがって、細胞または生物は、細胞性修復機構の能力の強化に導く変異の存在によって、非常に低い自然突然変異率を示し、それは、詳細には、その変異を有しない相当する細胞または生物よりかなり低いものである。細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く変異には、細胞性ＤＮＡ修復に関与する酵素をコードする構造遺伝子の欠失、例えば、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子の欠失；細胞性ＤＮＡ修復に関与する酵素をコードする構造遺伝子における、塩基の置換、欠失、逆位、および／または付加、例えば、抗変異原表現型またはＤＮＡポリメラーゼの忠実度の改善に導くことができるもの、細胞または生物の成長、分化、または増殖における特定のフェーズで律速的になるタンパク質の過剰発現、タンパク質、例えば、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼの発現の低下などが含まれるが、これらに限定されない。しかし、本発明のコンテクストでは、細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く個々の変異それぞれが、第２または第３の細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化も導くことがある。さらに、細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導く個々の変異それぞれが、細胞生存率の増強も導くことがある。
【００２３】
本発明のコンテクストにおいて、「２つの変異の複合作用によって少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構に導かれる」という用語は、両方の変異が少なくとも２つの異なったＤＮＡ修復機構に影響を与え、それによって、変異導入されていないＤＮＡ修復系と比較して、自然発生したゲノム規模の変異をより効率的かつより正確に修復するこれらのＤＮＡ修復系の能力が強化されることを意味する。
【００２４】
本発明のコンテクストにおいて、「細胞性ＤＮＡ修復機構」という用語は、細胞または生物が、ゲノム内の、ＤＮＡ複製によって生じた誤りならびに／または塩基変化および塩基損傷による誤りを、それによって認識および修正できる酵素機構または酵素系を意味する。本発明の好ましい実施形態では、これらの細胞性ＤＮＡ修復機構に、ミスマッチ修復系、複製後（組換え）修復系、およびＳＯＳ修復系が含まれる。ミスマッチ修復の強化に導く変異は、ミスマッチ修復に関与するタンパク質のうちの１つが律速的となる状況を打開する変異である。
【００２５】
細胞内の全修復事象の９９％が「ミスマッチ修復系」（ＭＭＲ）によるものである。この修復系は、大腸菌の複製忠実度に対する貢献が最も大きい系であり、それによって、その成分タンパク質が転写共役ＤＮＡ修復および超短鎖パッチ修復（ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ）に用いられることによって、他のＤＮＡ修復経路でも作用する。ＭＭＲは、それなしではゲノムの再編成を引き起こし得る、不正確な相同性を有するもの相互の組換えを抑制することによって、遺伝的安定性の強制も行う。ミスマッチ修復は、トランスポゾンの切り出しを編集することによっても、遺伝的安定性を増強する。大腸菌ＭＭＲタンパク質の相同体は、他の細菌、酵母、マウス、およびヒトで同様の機能を行う（Ｍｏｄｒｉｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６（１９９４年）、１９５９−１９６０；Ｒａｄｍａｎら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ、３４７（１９９５年）、９７−１０３）。大腸菌では、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳ、およびｍｕｔＵの遺伝子産物がＭＭＲに関与している。この系は、メチル化のため、親鎖ではなく新規に合成された鎖を認識する。ｍｕｔＳ遺伝子産物は、ＤＮＡ塩基ミスマッチを認識し、結合する。ｍｕｔＬ遺伝子産物は、ミスマッチ結合の後にＭｕｔＳと相互作用し、ＭｕｔＳをＭｕｔＨと組み合わせると考えられている。その後、ＭｕｔＨエキソヌクレアーゼが、メチル化されていない新規のＤＮＡ鎖にニックをいれる。ＭｕｔＵヘリカーゼは、一本鎖ニックの箇所でＤＮＡに進入し、ニックの入った鎖を除去する。ミスマッチ修復の強化に導く変異は、ミスマッチ修復に関与するタンパク質の１つが律速的となる状況を打開する変異である。
【００２６】
複製後修復系は、後に続く複製ラウンドでＤＮＡ中の損傷を修復する系である。娘鎖中の損傷したＤＮＡの複製によって、ギャップが作られる。欠失している遺伝情報は、組み換えによって、親鎖の対応するＤＮＡ領域によって補填される。損傷を含むＤＮＡの複製は、損傷乗り越え合成とも呼ばれる過程であり、点変異の主要な発生源である。最近、関与しているＤＮＡポリメラーゼが同定されたため、この過程に関する多くの理解が得られた（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２０００年）、５６８１−５６８３）。
【００２７】
ＳＯＳ応答は、概してＤＮＡ複製を妨害するものである様々な遺伝毒性ストレスおよび代謝ストレスへの細胞の曝露によって誘導される１セットの細胞反応である。ＳＯＳ系の調節は、ＬｅｘＡおよびＲｅｃＡタンパク質によって媒介される。ＬｅｘＡは、ｒｅｃＡおよびｌｅｘＡを含めた約３０の様々な遺伝子のリプレッサーとして作用する。ＳＯＳを誘導するシグナルは、一本鎖ＤＮＡであり、これにＲｅｃＡが結合して、コプロテアーゼ（ＲｅｃＡ＊）として活性化される。ＲｅｃＡ＊は、ＬｅｘＡレプレッサーおよび一部のファージリプレッサーのタンパク分解性自己切断を促進し、それによって、ＳＯＳレギュロンを抑制解除する。大腸菌は、ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）、ポリメラーゼＩＶ（Ｐｏｌ  ＩＶ）、およびポリメラーゼＶ（Ｐｏｌ  Ｖ）の、少なくとも３つのＳＯＳ誘導性ポリメラーゼを有する。
【００２８】
本発明によれば、ＭｕｔＬタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＭｕｔＳタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＤＮＡポリメラーゼＩＶまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから、少なくとも２つの変異が選択される。本発明のコンテクストにおいて、「抗変異原アレル」は、対応する野生型細胞と比較して、細胞または生物の自然突然変異の頻度の低下を引き起こすアレルを意味する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、ＭｕｔＬまたはその相同タンパク質の発現、およびＭｕｔＳまたはその相同タンパク質の発現の上方制御は、それぞれ、ベクターを細胞内に導入することによって実現され、上記ベクターは、それぞれ、ｍｕｔＬ遺伝子またはＭｕｔＬの相同タンパク質をコードする遺伝子、およびｍｕｔＳ遺伝子またはＭｕｔＳの相同タンパク質をコードする遺伝子を、それぞれのＭｕｔタンパク質の過剰発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に含む。上記ベクターは、多コピープラスミドであることが好ましい。上記調節ユニットは、誘導性または構成的プロモーターであることが好ましい。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＭｕｔＬまたはその相同タンパク質の発現、およびＭｕｔＳまたはその相同タンパク質の発現の上方制御は、それぞれ、宿主細胞または宿主生物における天然のＭｕｔタンパク質の発現を指示する調節ユニットを、天然のＭｕｔタンパク質が、細胞で通常観測されるよりも多くの量で、細胞内で生成されるように改変することによって実現される。これは、染色体に存在する、それぞれのＭｕｔタンパク質をコードする天然のヌクレオチド配列から相補的なＲＮＡ配列への転写、および／またはそのようにして得られたコードＲＮＡ配列からＭｕｔタンパク質のポリペプチド鎖への翻訳を指示する調節ユニットが、他の適当な相同または異種の調節ユニットによって、対応する野生型の細胞または生物で観測されるものより高い天然Ｍｕｔタンパク質の産生が得られるように、変異導入または置換されることを意味する。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、それぞれのｍｕｔ遺伝子を１コピーまたは複数コピー追加して、適当な調節ユニットの機能的制御下に宿主細胞の染色体に導入することによって、それぞれのＭｕｔタンパク質の過剰発現が実現され、その際、追加のｍｕｔ遺伝子は、別の種に由来する天然遺伝子か、または異種遺伝子のいずれかであり得る。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＶまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｉｎＢ１０であり、これは、事実上ｄｉｎＢ遺伝子の欠失である。ｄｉｎＢによってコードされているＤＮＡポリメラーゼＩＶ（Ｐｏｌ  ＩＶ）は、最近同定された、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼのＹファミリー、すなわちＵｍｕＣ／ＤｉｎＢヌクレオチジルトランスフェラーゼファミリーに属する。ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢ、Ｒａｄ３０、およびＲｅｖ１サブファミリーがこのファミリーを代表する（Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６（１９９９年）、１１９２２−１１９２７）。ｄｉｎＢによってコードされている大腸菌のＤＮＡ  ポリメラーゼＩＶは、自然突然変異生成と、翻訳合成（ＴＬＳ）と呼ばれている過程であり、点突然変異の主要な発生源である、損傷を含有するＤＮＡの複製とに関与することが示されている。ＤＮＡポリメラーゼＶと同様に、Ｐｏｌ  ＩＶも、ＤＮＡ損傷に対するＳＯＳ応答の一部として誘導される。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルが使用され、それは、ｄｎａＥ９１１であることが好ましい。細胞のＤＮＡ合成の９０％超がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＨＥ）によるものであり、また、この酵素は、主要な複製後ミスマッチ修正経路にも必要である。ポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は、無塩基部位を通過する損傷乗り越えＤＮＡ合成を効果的に実行することが示されている。大腸菌のｄｎａＥ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のαサブユニットをコードし、このαサブユニットはポリメラーゼ活性を提供する。したがって、αサブユニットは、忠実度の主要な決定因子の１つである。ＦｉｊａｌｋｏｗｓｋａおよびＳｃｈａａｐｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７７（１９９５年）、５９７９−５９８６から、いくつかのｄｎａＥ抗変異原アレルが知られており、それらは、ミスマッチ修復欠損性のｍｕｔＬ株における高変異性を抑制する。
【００３４】
本発明によれば、ｄｉｎＢ１０変異およびｄｎａＥ９１１変異の複合作用によって、細胞の自然突然変異の頻度が、野生型細胞または野生型生物と比較して少なくとも１０分の１に低下する。本発明の別の好ましい実施形態では、ｄｉｎＢ１０、ｄｎａＥ９１１、および過剰発現したＭｕｔＬタンパク質の複合作用によって、細胞内の自然突然変異の頻度が、野生型細胞または野生型生物と比較して、少なくとも５０分の１に低下する。
【００３５】
細胞性ＤＮＡ修復機構の増強および／または細胞生存率の増強がそれらの複合作用によって導かれる少なくとも２つの変異は、任意の知られている方法によって、詳細には、細胞性ＤＮＡ修復系の１つに関与していることが知られている遺伝子に変異導入することを目的として所与の細胞に変異導入することによって、あるいは既知の変異またはアレルをその細胞内に導入することによって、細胞に導入することができる。
【００３６】
限定されるものではないが、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、オリゴヌクレオチドカセット変異導入、または誤りがちなＰＣＲによる点変異導入を含めた多数の異なった変異導入法が存在する。ランダム変異導入は、例えば、亜硝酸、ヒドラジンなどの化学物質で処理することによって、クローニングされたＤＮＡ断片中にランダムに分布した多数のヌクレオチド置換変異の生成を引き起こす。誤りがちなＰＣＲは、クローニングされた遺伝子にランダムな点変異を導入するために開発された。ＰＣＲ反応の忠実度を低下させる改変には、ＭｇＣｌ２濃度の増大、ＭｎＣｌ２の添加、または４種類のｄＮＴＰの相対濃度の改変が含まれる。これらの伝統的な変異導入法は、別々の選択可能な表現型を有する個々の遺伝子の改変に焦点をしぼって行われる。通常の戦略は、遺伝子のクローニングを行い、その遺伝子および／またはその機能をモニターできるアッセイを確立し、遺伝子内の選択された位置に変異導入し、そして、その遺伝子の機能が改変されている遺伝子変種を選択するというものである。その後、機能が改変された変種を所望の細胞型に導入して、発現させることができる。その遺伝子の所望の機能を得るために、変異導入法のサイクルを反復して実行することができる。遺伝子の機能を改変する別の手法は、十分に確立されている多数の系のうちの１つを用いた組換えによるものである。
【００３７】
当然ながら、既存のアレルまたは変異を本発明の目的に用いることもできる。そのような既存のアレルまたは変異は、任意の知られている方法によって細胞に導入することができる。本発明によれば、細胞内への少なくとも２つの変異の導入は、限定されるものではないが、形質転換、接合、形質導入、伴性導入、感染、および／またはエレクトロポレーションを含めた任意の知られている適切な方法によって実施できる。
【００３８】
本発明のコンテクストにおいて、「形質転換」という用語は、細胞、例えば微生物細胞による、環境からの、単離された核酸分子、好ましくは精製された核酸分子の取込みを意味する。「接合」は、細胞間接触を介した、細菌プラスミドの、ある細菌細胞から別の細菌細胞の中へのプラスミド媒介性の移入を意味する。関与する移入機構は、通常、プラスミドまたは接合トランスポゾンによってコードされている。そのようなプラスミドの例は、接合性プラスミドまたはヘルパープラスミドである。接合は、原核生物細胞の異なった表現形グループ間、および原核生物と真核生物との間の遺伝子交換の主要経路の１つである。「形質導入」は、バクテリオファージによる、ある細菌細胞から別の細菌細胞の中への核酸分子の移入を意味し、それは、一方の細胞からのバクテリオファージの放出と、それに続く、もう一方の細胞の感染とを含む。２つのタイプの形質導入がある。特殊形質導入は、溶原バクテリオファージの溶原生活環中に起こることがあり、それによって、細菌の遺伝物質が、バクテリオファージゲノムの一部を置換することがある。細菌ＤＮＡのこの小片は、ファージゲノムの一部として複製し、そのファージによって別の受容細胞の中に移入されることがある。普遍形質導入の場合には、溶菌ファージの全ゲノムが細菌ＤＮＡによって置換される可能性を有する。「エレクトロポレーション」は、細胞を核酸分子と混合して、その後、高電位の短いパルスに曝露する過程である。宿主細胞の細胞膜が貫通可能となり、それによって、外来核酸が宿主細胞内に入るのが可能となる。
【００３９】
自然突然変異率を低下させる本発明の方法、および自然突然変異率が低下している細胞または生物を産生する本発明の方法で用いられる細胞は、いかなる原核細胞でも、真核細胞でもよい。
【００４０】
「真核細胞」および「真核細胞宿主細胞」という用語には、膜に結合した核、細胞小器官、および染色体に組織化された遺伝物質を有し、染色体において、ＤＮＡがヒストンに結合しているいかなる細胞も含まれる。細胞骨格は、真核生物に特有な別の特徴であり、これは、細胞膜に繋ぎ止められて、細胞辺縁を縦横に走るタンパク質フィラメント、主としてアクチンおよびチューブリンのネットワークである。「真核生物」は、分類学上の原生生物界、菌類界、植物界、および動物界を含む。真核生物は、原生生物、例えば、ゾウリムシおよびアメーバなどの単細胞生物である場合も、様々な真菌、動物、および植物などの多細胞生物である場合もある。自然突然変異率を低下させる本発明の方法の好ましい実施形態では、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞が使用されている。
【００４１】
「原核細胞」および「原核細胞の宿主細胞」という用語には、ゲノムが環状構造として細胞質中に遊離して存在している細胞、すなわちゲノムが核膜によって囲まれていない細胞のいかなるものも含まれる。原核細胞はさらに、それが必ずしも酸素に依存していないこと、およびそのリボソームが真核細胞のものより小さいことを特徴とする。原核細胞には、古細菌および真正細菌が含まれる。細胞壁の組成物に応じて、真正細菌を、グラム陽性菌、グラム陰性菌、およびラン細菌に分類することができる。自然突然変異率を低下させるか、あるいはそれに対応する生物を産生する本発明の方法の好ましい実施形態では、使用される原核細胞が古細菌または真正細菌の細胞であり、上記原核細胞が、グラム陰性細菌、グラム陽性菌、またはラン細菌であることが特に好ましい。
【００４２】
本発明は、自然突然変異の頻度の低下および／または細胞生存率の増強を有する細胞にも関し、これは、細胞または生物の自然突然変異の頻度を低下させる本発明の方法、または自然突然変異の頻度が低下している細胞もしくは生物を生成させる本発明の方法によって取得可能であり、上記細胞は、少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の増強が、それらの複合作用によって導かれる少なくとも２つの変異を含む。本発明の好ましい実施形態では、上記細胞が細菌細胞、例えば、大腸菌などのグラム陰性細菌、もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのグラム陽性菌、真菌細胞、植物細胞、または昆虫細胞もしくは哺乳類細胞などの動物細胞である。
【００４３】
本発明の好ましい特定の実施形態では、上記細菌が、プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０、プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ、プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ、またはプラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔである。
【００４４】
本発明は、自然突然変異率が低下している生物を産生するための、自然突然変異率の低下および／または細胞生存率の増強を有する本発明の細胞の使用、タンパク質発現用の宿主細胞としての本発明の細胞の使用、発酵産物産生用の発酵生物としての本発明の細胞の使用、候補薬物の作用を研究するためのモデル系としての本発明の細胞の使用、ヒト、動物、または植物の病気を研究するためのモデル系としての本発明の細胞の使用、およびトランスジェニック生物の産生、特に育成または培養のための本発明の細胞の使用にも関する。
【００４５】
当業者は、完全な多細胞生物、特に植物または動物を単一細胞から産生することのできる多数の方法を知っている。本発明の細胞から産生された多細胞生物も、同様に、総合的な自然突然変異率が低下していることを特徴とする。
【００４６】
本発明は、自然突然変異の頻度が低下している生物にも関し、これは、細胞または生物内の自然突然変異の頻度を低下させる本発明の方法、または自然突然変異の頻度が低下している細胞または生物を産生する本発明の方法によって取得可能であり、上記生物の細胞は少なくとも２つの変異を含み、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の強化および／または細胞生存率の増強に導かれる。本発明の好ましい実施形態では、上記多細胞生物が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）などの真菌、植物、特にトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）などの農業有用性のある植物、または動物、特に哺乳動物、例えば、所与の疾患、または所与の疾患を治療するための薬物候補の作用を研究するためのモデル系として使用できる哺乳動物である。
【００４７】
本発明は、経済的、医学的、または農業的に重要なタンパク質など、タンパク質を発現および／または産生するための宿主としての本発明の生物の使用、トランスジェニック生物を育成または培養するための本発明の生物の使用、疾患を研究するためのモデル系としての本発明の生物の使用、および候補薬物の作用を研究するためのモデル系としての本発明の生物の使用にも関する。
【００４８】
本発明の根底にある技術的課題は、タンパク質の発現系を産生する方法を提供することによっても解決され、その際、上記タンパク質のアミノ酸配列は、自然発生した突然変異に対して安定化されており、上記方法は、
ａ）  少なくとも２つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導かれる工程、または
ｂ）  上記タンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも２つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導かれる工程と、
ｃ）  適当な培地中で上記宿主細胞を培養および／または維持する工程と
を含む。
【００４９】
タンパク質の発現系を産生する本発明の方法は、特に、タンパク質の発現をその中で行うことができ、自然突然変異率が非常に低く、特に他の既知の宿主細胞より低いことを特徴とする宿主細胞の産生を対象とするものである。したがって、本発明の方法によって産生された発現系は、所与のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が変異によって変化し、それによって、そのタンパク質のアミノ酸配列が変化する確率が大幅に低下するのを確実にするものである。したがって、本発明の方法によって提供され、低自然突然変異率および増強された細胞生存率を有する本発明の宿主細胞に基づく発現系は、その完全性が長期的に保障されるタンパク質の発現および産生に用いることができる。本発明の発現系は、特に、治療目的で使用されることになっているタンパク質であって、そのアミノ酸配列のいかなる変化も、例えば、そのタンパク質の生物活性の変化に導くか、あるいはそのタンパク質の抗原特性を改変する変化も、そのタンパク質の治療効果に有害な影響を与える恐れがあるタンパク質に使用できる。したがって、発現系を産生する本発明の方法は、産生されたタンパク質調製物における、変異導入された異常なタンパク質による最小限の汚染さえも回避するのに有用である。本発明の方法によって提供され、低自然突然変異率を有する本発明の宿主細胞に基づく発現系は、特定のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の長期的な維持に使用でき、それによって、ヌクレオチド配列が改変しているか否かを判定するために、シーケンシングによって定期的に検査する必要性を取り除くものが有利である。
【００５０】
本発明のコンテクストにおいて、「発現系」は、特に、細胞における所与のタンパク質の効率的発現、すなわちそのタンパク質の大量生産を可能にする細胞システムを意味する。詳細には、「発現系」は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列から相補的なＲＮＡ配列に転写し、非コード配列部分を除去するために、該ＲＮＡ配列のスプライシングを行い、そして、コードＲＮＡ配列部分を翻訳し、それによって、該タンパク質のポリペプチド鎖を取得するのを可能にする細胞環境に関する。「発現系」は、タンパク質のグリコシル化、またはタンパク質からの既存のリーダー配列の除去など、翻訳後プロセシング工程を可能にする細胞環境にも関するものである場合がある。したがって、「発現系の産生」は、コードされている遺伝子産物の発現を所与の細胞環境で制御および指示する適当な調節ユニットに、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されていなければならないこと、および該タンパク質の最適な発現が実現されるように、使用される調節ユニットが機能するであろう適当な宿主細胞が提供されなければならないことを意味する。
【００５１】
本発明によれば、タンパク質を発現するための系で使用される宿主細胞における自然突然変異率の低下および生存率の増強が、少なくとも２つの変異を使用することによって得られ、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導かれ、それによって、宿主細胞内に存在するいずれの核酸で自然発生した突然変異も修復される。詳細には、これらの少なくとも２つの変異によって、自然発生した突然変異を修復する、ミスマッチ修復系、プルーフリーディング機能、および／またはＳＯＳ修復系の能力が強化される。本発明の好ましい実施形態では、これらの変異が、ＭｕｔＬタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＭｕｔＳタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＤＮＡポリメラーゼＩＶまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから選択される。
【００５２】
本発明の一実施形態において、ＭｕｔＬまたはその相同タンパク質の発現の上方制御、およびＭｕｔＳまたはその相同タンパク質の発現の上方制御は、それぞれ、ベクターを宿主細胞に導入することによって実現することができ、上記ベクターは、それぞれ、ｍｕｔＬ遺伝子またはその相同タンパク質をコードする遺伝子、およびｍｕｔＳ遺伝子またはその相同タンパク質をコードする遺伝子を、対応する野生型宿主細胞との比較において、それぞれのＭｕｔタンパク質の過剰発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に含む。ＭｕｔＬまたはＭｕｔＳのいずれかのタンパク質の過剰発現に用いるベクターは、１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にそれぞれのｍｕｔ遺伝子を含む多コピープラスミドであることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、それぞれのｍｕｔ遺伝子の過剰発現を制御する調節ユニットは誘導性プロモーターでも、構成的プロモーターでもよい。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、ＭｕｔＬまたはその相同タンパク質の発現の上方制御、およびＭｕｔＳまたはその相同タンパク質の発現の上方制御は、それぞれ、細胞の染色体にそれぞれのｍｕｔ遺伝子を１コピーまたは複数コピー追加して導入することによって、あるいは対応する野生型細胞と比較して、細胞内におけるそれぞれのＭｕｔタンパク質のより高い産生がもたらされるように、天然の染色体に位置するｍｕｔ遺伝子の転写を指示する調節ユニットに１つまたは複数の変異を導入することによって実現することができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｉｎＢ１０である。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｎａＥ９１１である。
【００５５】
本発明によれば、産生された発現系は、いかなるタンパク質の発現にも用いることができる。本発明のコンテクストにおいて、「タンパク質」という用語は、アミド連結で連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む分子である。したがって本発明によれば、「タンパク質」という用語には、ペプチド、例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはドメインなどの天然に存在するタンパク質の一部が含まれる。発現されるタンパク質は、そのアミノ酸配列が天然に存在するタンパク質の配列であってもよく、すなわち野生型の配列を有するものでもよい。当然ながら、上記の発現系によって発現されるタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、例えば、異なったアミノ酸組成および／または異なった長さによって改変されたアミノ酸配列を有するものでもよい。したがって、発現されるタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、１つまたは複数の位置に異なったアミノ酸残基を有するものでもよい。発現されるタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、先端切除されていても、延長されていてもよい。さらに、発現されるタンパク質は、対応する野生型タンパク質と異なる特徴を有するものでもよい。これらの異なる特徴は、改変された熱安定性、異なった基質特異性、異なった活性、改変された触媒部位、または新規の触媒部位などに関するものでよいが、これらに限定されない。発現されるタンパク質は、２つ以上の個別のポリペプチドを含む融合タンパク質でも、第２のポリペプチドの１つまたは複数のドメインを追加して含む融合タンパク質でもよい。タンパク質のそのような改変または変異は、当技術分野で知られているタンパク質をコードするヌクレオチド配列を適切に操作し、その後、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、自然突然変異率が低下している宿主細胞のゲノムに挿入するか、あるいはベクターに挿入して、その後、それをその宿主細胞に導入することによって得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、発現されるタンパク質が組換え体タンパク質、すなわち遺伝工学的手法および／またはＤＮＡ組換え技法によって改変されたタンパク質である。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、発現されるタンパク質が、天然化合物および非天然化合物の工業生産に利用できる酵素であってもよい。酵素、または酵素の補助によって生産それらの化合物は、薬物、化粧品、食品などの生産に用いることができる。発現されるタンパク質は、ヒトおよび動物の健康に関する分野で治療応用を有する物質でもよい。医学的に重要なタンパク質の重要なクラスには、例えば、サイトカインおよび成長因子が含まれる。
【００５７】
本発明の方法によれば、タンパク質をコードする核酸配列を、１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、ゲノムまたはベクターのいずれかに挿入する。遺伝子および遺伝子産物の発現をそれぞれ制御および指示する調節ユニットには、プロモーター、リボゾーム結合部位、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化部位、および／または３’転写終結区が含まれるが、これらに限定されない。調節ユニットは、宿主細胞の所与の区画、または細胞の外に向けたタンパク質の発現を指示するリーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。そのような調節ユニットの使用は、使用される宿主細胞のタイプに依存する。所与の原核宿主細胞または真核宿主細胞で使用できる調節ユニットは、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版（１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、ＮＹ，ＵＳＡを参照のこと）。
【００５８】
好ましい実施形態では、タンパク質をコードするヌクレオチド配列をベクターにクローニングする。プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、またはコスミドをベクターとして使用するのが好ましい。当業者は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を所与の宿主細胞に導入するのに使用できる、真核宿主細胞用または原核宿主細胞用の適当なベクターを多数知っている。
【００５９】
さらに、当業者は、調節ユニットに機能的に連結された、タンパク質をコードするヌクレオチド配列をクローニングする方法、およびヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する方法を多数知っている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照）。
【００６０】
本発明のさらに別の態様は、タンパク質の産生する方法に関し、上記タンパク質のアミノ酸配列は、自然発生した突然変異に対して安定化されており、この方法は、
ａ）  少なくとも２つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導かれる工程、または
ｂ）  上記タンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも２つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導かれる工程と、
ｃ）  適当な培地中で、タンパク質の発現を可能にする条件下に宿主細胞を培養する工程と、
ｄ）  発現された上記タンパク質を単離する工程と
を含む。
【００６１】
上記タンパク質をコードする核酸配列がリーダー配列またはシグナル配列に機能的に連結されているかどうかに応じて、発現されたタンパク質は、特定の細胞小器官、特定の細胞内区画、細胞外間隙、または細胞が培養されている培地中に輸送される。したがって、タンパク質は、細胞内に蓄積されるか、あるいは細胞から分泌されるかのいずれかであり得る。タンパク質を産生する本発明の方法の好ましい実施形態では、それゆえ、タンパク質が培地から単離される。タンパク質を産生する本発明の方法の別の好ましい実施形態では、タンパク質を宿主細胞から、例えば、特定の細胞小器官から抽出する。また、当業者は、細胞、細胞小器官、または培地からタンパク質を単離する多数のプロトコールを知っている。
【００６２】
本発明によれば、いかなる真核細胞も、あるいは原核細胞も、タンパク質を発現または産生するための宿主細胞として用いることができる。特に好ましい例には、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、古細菌、ラン細菌、グラム陽性菌、およびグラム陰性菌が含まれる。
【００６３】
本発明は、タンパク質を産生する本発明の方法によって取得可能なタンパク質にも関する。
【００６４】
本発明の別の態様は、発酵産物、および／または培地中での発酵産物の生成に関与する少なくとも１つの酵素を産生する細胞を培養することによって発酵産物を産生する方法に関し、上記細胞のゲノムは、少なくとも２つの変異によって自然発生の配列変化に対して安定化されており、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に導かれる。
【００６５】
したがって、本発明の方法は、細胞の、発酵を目的とした使用、すなわち発酵産物を生産するための使用を対象とし、その際、上記細胞のゲノムは、自然発生の配列変化に対して安定化されており、それによって、非常に低い自然突然変異率を示す。さらに、使用される細胞は、改善された細胞生存率を有する。自然突然変異率が低下している細胞を使用することによって、本発明の方法は、所与のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が変異によって変化し、それによって、そのタンパク質のアミノ酸配列が変化する確率が大幅に低下するのを確実にする。これらの細胞は、細胞生存率の大幅な増強を示すので、これらの細胞の使用は、さらに、発酵工程中に撹乱が起こらないこと、および発酵産物の高い生産性が得られることを確実にする。
【００６６】
本発明のコンテクストにおいて、「発酵」という用語には、微生物、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞の嫌気的または好気的代謝によって、あるいはそのような細胞からの酵素を使用することによって特定の産物を産生するいかなる過程も含まれ、上記酵素は、単離、精製、および／または固定することができる。「発酵」には、微生物細胞、植物細胞、真菌細胞、および／または動物細胞の１つまたは複数の酵素の作用によって引き起こされる、有機基質のあらゆる酵素的化学的変成が含まれる。所望の発酵産物は、細胞それ自体の中で、例えば、タンパク質の発現によって、または細胞の代謝の結果として産生されることがあり、それによって、発酵産物が細胞内に蓄積されることもあれば、細胞から環境中に輸送されることもあり、あるいは細胞によって１つまたは複数の酵素が産生され、それが、細胞外に分泌された際に、培地中に存在する基質から、所望の発酵産物への変換を触媒する。発酵産物が核酸、または核酸によってコードされたタンパク質である場合には、本発明の方法は、変異による発酵産物の最小限の汚染さえも回避し、それによって、発酵産物の長期的な完全性を保障するのに有用である。発酵産物の産生が、細胞によって産生された１つまたは複数の酵素の作用による場合には、本発明の方法は、それぞれの酵素の完全性を維持し、それによって、発酵産物の産生に導く代謝過程の特異性および有効性を維持するのに有用である。
【００６７】
発酵産物を産生する本発明の方法は、ある経路に関与する遺伝子クラスター、および／またはそのような遺伝子クラスターによってコードされた遺伝子産物の完全性を維持し、それによって、そのような遺伝子クラスターによってコードされた遺伝子産物が関与する経路の特異性および有効性を維持するのにも有用であり得る。そのような遺伝子クラスターの例には、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）クラスターが含まれるが、これに限定されない。ポリケチド代謝産物は、放線菌および粘液細菌などの細菌ならびに真菌によって産生される、様々な構造および生物活性を有する天然物の大きなグループである。複合ポリケチドは、動物の長鎖脂肪酸合成に類似した機構を用いた多機能性ＰＫＳによって産生される。サッカロポリスポラエリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）のエリスロマイシンＰＫＳの研究は、モジュール構成を明らかにした。複合ポリケチド合成は、前進性反応機序に従い、ＰＫＳ内の各モジュールは、ほぼ直線的な順序の反応を触媒する、ひと続きになった３つから６つの酵素ドメインを有する。
【００６８】
本発明によれば、発酵を目的として使用される細胞における自然突然変異率の低下、および高い細胞生存率が、少なくとも２つの変異を使用することによって得られ、上記細胞内に存在するいかなる核酸に自然発生した突然変異も修復する少なくとも２つの細胞性ＤＮＡ修復機構の能力の強化に、上記少なくとも２つの変異の複合作用によって導かれる。詳細には、これらの少なくとも２つの変異は、上記細胞の自然発生した突然変異を修復するミスマッチ修復系、プルーフリーディング機能、および／またはＳＯＳ修復系の能力を強化する。本発明の好ましい実施形態では、これらの変異が、ＭｕｔＬタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＭｕｔＳタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、ＤＮＡポリメラーゼＩＶまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから選択される。
【００６９】
本発明の一実施形態において、ＭｕｔＬまたはその相同タンパク質の発現の上方制御、およびＭｕｔＳまたはその相同タンパク質の発現の上方制御は、それぞれ、発酵に使用される細胞にベクターを導入することによって実現でき、上記ベクターは、それぞれ、ｍｕｔＬ遺伝子またはその相同タンパク質をコードする遺伝子、およびｍｕｔＳ遺伝子またはその相同タンパク質をコードする遺伝子を、対応する野生型宿主細胞との比較における、それぞれのｍｕｔタンパク質の過剰発現を可能にする１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に含む。ＭｕｔＬまたはＭｕｔＳいずれかのタンパク質の過剰発現に用いるベクターは、１つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にそれぞれのｍｕｔ遺伝子を含む多コピープラスミドであることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、それぞれのｍｕｔ遺伝子の過剰発現を制御する調節ユニットは誘導性プロモーターでも、構成的プロモーターでもよい。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、ＭｕｔＬまたはその相同タンパク質の発現の上方制御、およびＭｕｔＳまたはその相同タンパク質の発現の上方制御は、それぞれ、細胞の染色体にそれぞれのｍｕｔ遺伝子を１コピーまたは複数コピー追加して導入することによって、あるいは対応する野生型細胞と比較して、細胞内におけるそれぞれのＭｕｔタンパク質のより高い産生がもたらされるように、天然の染色体に位置するｍｕｔ遺伝子の転写を指示する調節ユニットに１つまたは複数の変異を導入することによって実現することができる。
【００７１】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｉｎＢ１０である。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルがｄｎａＥ９１１である。
【００７２】
本発明によれば、発酵を目的として使用する細胞の中にｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１が存在すると、その細胞の自然突然変異の頻度が、対応する野生型宿主細胞と比較して少なくとも１０分の１に低下する。ｍｕｔＬタンパク質をさらに過剰発現する細胞の中にｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１が存在すると、その細胞の自然突然変異の頻度が、野生型宿主細胞と比較して少なくとも５０分の１に低下する。
【００７３】
本発明の方法によって得られる発酵産物は、細胞の一次代謝物である場合も、二次代謝物である場合もある。一次代謝物は、生細胞によって合成され、かつ細胞構造の形成および代謝過程を維持するために、細胞に必ず必要とされる物質である。一次代謝物と対照的に、二次代謝物は、細胞によって合成され、細胞の機能の維持には必ずしも必要でない化合物、特に低分子化合物である。通常、二次代謝物は、特定の環境における選択有利性をその細胞または生物に与えることができる。本発明の方法によって得られる発酵産物は、古典的な意味での発酵産物、すなわちアルコール発酵、乳酸発酵、プロピオン酸発酵等の産物など、もっぱら微生物によって行われる、酸素を用いた糖質の酵素的分解である場合もある。
【００７４】
発酵産物の例には、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、アミノ酸、有機酸、アルコール、糖質、ビタミン、抗生物質、およびアルカロイドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、発酵産物が核酸であり、詳細には、治療上の有用性がある核酸、例えばワクチンとして使用されることになっている核酸である。
【００７６】
本発明のコンテクストにおいて、「核酸」は、ホスホジエステル結合によって連結された少なくとも２つのヌクレオチドを含む分子である。したがって、「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチドも意味する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。この核酸は、一本鎖でも、二本鎖でもよい。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、発酵産物がタンパク質であり、詳細には、治療上の有用性がある酵素もしくはタンパク質、またはドメインなど、それらの部分である。好ましい酵素の例。好ましい酵素の例には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、およびグルコースイソメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。治療上の有用性があるタンパク質の好ましい例には、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン、成長因子、血液凝固因子、抗体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
有機酸の好ましい例には、クエン酸、乳酸、または酢酸が含まれるが、これらに限定されない。アルコールの好ましい例には、エタノール、プロパノール、およびブタノールが含まれるが、これらに限定されない。糖質の好ましい例には、ショ糖、マルトース、もしくはパラチノーゼなどの糖、キシリトールもしくはマルチトールなどの糖アルコールが含まれるが、これらに限定されない。ビタミンの好ましい例には、ビタミンＢ１２もしくはリボフラビンが含まれるが、これらに限定されない。抗生物質の好ましい例には、ペニシリン、セファロスポリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシンなどのポリケチド抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
発酵産物は、発酵細胞、または培養に使用された培地のいずれかから単離することができる。
【００８０】
したがって、本発明は、発酵産物を産生する本発明の方法によって取得可能な発酵産物にも関する。
【００８１】
発酵産物を産生する本発明の方法では、真核細胞および原核細胞の両方が使用可能である。発酵産物を産生する本発明の方法の好ましい実施形態では、使用される真核細胞が、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である。発酵産物を産生する本発明の方法で使用される原核細胞は、ラン細菌、古細菌、グラム陽性菌、またはグラム陰性細菌であることが好ましい。
【００８２】
当然ながら、対応する野生型宿主細胞と比較して、自然突然変異率が、好ましくは大幅に、低下しているいかなる細胞も、発酵工程を産生する本発明の方法で使用することが可能である。詳細には、自然突然変異率を低下させる本発明の方法によってその自然突然変異の頻度が低下している細胞または生物、あるいは自然突然変異の頻度が低下している細胞または生物を産生する本発明の方法によって産生された細胞または生物の使用が好ましい。
【００８３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、適当な液体培地中で細胞を培養する。当業者は、発酵産物を産生するために、細胞、例えば原核細胞または真核細胞を、その中で培養できる多数の液体培地を知っている。本発明によれば、細胞を連続培養またはバッチ培養のいずれかで培養することができる。バッチ培養は、細胞を播種された液体培地から始まり、培養中、培地の交換が連続的に行われない培養であって、場合によっては、酸素などの気体のみが導入される。産物生成の異化抑制を回避するために、バッチ培養を流加培養で行ってもよい。流加培養の場合には、したがって、所与の糖など、基質の消費がその基質の追加分量を配送することによって補填される。連続培養は、１回だけ細胞で播種され、その後、細胞量の増大または産物の蓄積に応じて、消費済みの培養培地を新たな培地で連続的に置換し、それによって、消費済みの培地と共に、場合によってはさらに細胞と共に、発酵産物を培養から同時に取り出す培養である。連続培養は発酵槽で行うことができる。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、細胞が、固定された形態で培養中に存在する場合がある。本発明の方法の別の実施形態では、細胞を固体または半固体の培地上で培養する。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明は、生物、詳細には原核生物、最も好ましくは大腸菌株に関し、これは、
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０（ＤＳＭ１７０１６）、
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０１７）、
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ（ＤＳＭ１７０１８）、
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０１９）、
大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ（ＤＳＭ１７０１５）、
大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０１４）、
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ（ＤＳＭ１７０２０）、および
プラスミドｐｍｕｔＬを含有する大腸菌ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ（ＤＳＭ１７０２１）
からなる群から選択される。
【００８６】
上記に特定された微生物は、ブダペスト条約に従って、２００５年１月３日に、上記に特定したＤＳＭ番号の下に、ＤＳＭＺ（独国、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ所在の独国微生物細胞培養収集館（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ））に寄託した。
【００８７】
本発明を、以下の配列表、図、および実施例によって例示する。
【００８８】
配列番号１および２は、それぞれ、ＭｕｔＬタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーＭｕｔＬＮｃｏＩｈｉｎおよびＭｕｔＬＸｈｏＩｈｅｒの配列を示す。
【００８９】
配列番号３および４は、それぞれ、ＭｕｔＳタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーＭｕｔＳＢａｍ−ＨＩｈｉｎおよびＭｕｔＳＸｈｏＩｈｅｒの配列を示す。
【００９０】
配列番号５から配列番号１０は、それぞれ、ＤａｐＡタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーｄａｐＡＢａｍＨＩＩＦ、ｄａｐＡＢａｍＨ１＋１、ｄａｐＡＢａｍＨ１＋２、ｄａｐＡＸｈｏＩ、ｄａｐＡＥｃｏＲＩｈｉｎ、およびｄａｐＡＨｉｎｄＩＩＩｈｅｒの配列を示す。
【００９１】
配列番号１１および１２は、それぞれ、クロラムフェニコール耐性をコードするＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーｃｍＢｂｖＣＩｈｉｎおよびｃｍＡｈｄＩｈｅｒの配列を示す。
【００９２】
実施例１
（様々な大腸菌株のリファンピシン耐性に対する自然突然変異の頻度（ＳＭＦ）の測定）
通常、細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細胞は、抗生物質リファンピシンに対して感受性であって、すなわちそれらは、この抗生物質を含有する培地で増殖できない。しかし、リファンピシンに対する耐性を与える変異は、大腸菌ゲノムで低頻度で自然に発生する。したがって、リファンピシンを含有する培地上に、多数の細胞（１０８）をプレーティングした場合、ほとんどの細胞は抗生物質によって殺されるであろうが、いくつかのコロニーが成長するであろう。これは、リファンピシンに対する耐性を与える変異が、細胞ゲノム中で自然に発生するために可能である。それらの変異は、その次に、元の変異体の子孫によって引き継がれる。この変異は、リファンピシンが存在する環境においてのみ有益であり、おそらく、他のほとんどの条件下においては、それは、その変種に何の利点も与えないことに留意するのが重要である。リファンピシンは、主として、結核およびライ病、および場合によっては他の疾患を治療するのに使用される抗生物質である。耐性は、膜透過性の変化、またはｍＲＮＡポリメラーゼをコードするｒｐｏＢ遺伝子における変異によるものである。これらの機構は両方とも、染色体突然変異を介して起動する。しかし、大腸菌の染色体には、リファンピシンに対する細菌の耐性を与え得るいくつかの標的遺伝子が存在する。
【００９３】
自然突然変異の頻度（ＳＭＦ）を計算するために、リファンピシンに対する耐性を与える自然突然変異の頻度を、培養中の生存細胞の総数で割って求めた。
【００９４】
【数１】
2007523657.tif 000002
【００９５】
Ａ）  強度の変異誘発性表現型（ｍｕｔＬおよび／またはｄｎａＱの染色体欠失）を示す大腸菌株におけるＭｕｔＬの過剰発現および抗生物質リファンピシン上への該細胞のプレーティング
（実験の概要）
（１．ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳの過剰発現プラスミドの構築）
ａ）  ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺへのｍｕｔＬのクローニング
このプラスミドは、大腸菌におけるＭｕｔＬの高レベルで、かつ「制御された」発現を実現するために構築した。
【００９６】
大腸菌株ＭＧ１６５５から調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマー１（配列番号１）および２（配列番号２）（表１も参照）によって、ＭｕｔＬタンパク質をコードする１８４８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ断片を消化し、ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片として、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺにクローニングして、プラスミドｐｍｕｔＬを産生した。プラスミドｐｍｕｔＬの物理構造を図１に示す。ＰＣＲ条件（温度（℃）／時間（分））は以下の通り、すなわち（９８／１０）（９６／０．７５；５５／０．５０；７２／２．５）３５（７２／１０）；（Ｔａｑ／Ｐｆｕ）の比率（５／１）であった。
【００９７】
得られたクローンのうち６クローンを単離し、ＥｃｏＲＶによる制限消化によって分析した（予測された断片：８７１ｂｐおよび５３７３ｂｐ）。６クローンすべてが正しい移動パターンを示した。
【００９８】
ｂ）  ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺへのｍｕｔＳのクローニング
このプラスミドは、大腸菌におけるＭｕｔＳの高レベルで、かつ「制御された」発現を実現するために構築した。
【００９９】
大腸菌株ＭＧ１６５５から調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマー３（配列番号３）および４（配列番号４）（表１を参照）によって、ＭｕｔＳタンパク質をコードする２５６２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ断片を消化し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片として、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺにクローニングして、プラスミドｐｍｕｔＳを産生させた。プラスミドｐｍｕｔＳは、図１に示すプラスミドｐｍｕｔＬと原則的に同じ物理構造を有する。
【０１００】
ＰＣＲ条件（温度（℃）／時間（分））は以下の通り、すなわち（９８／１０）（９６／０．７５；５５／０．５８；７２／３）３５（７２／１０）；Ｈｅｒｃｕｌａｓｅであった。
【０１０１】
得られたクローンのうち６クローンを単離し、ＥｃｏＲＶによる制限消化によって分析した（予測された断片：１１８６ｂｐおよび５７７５ｂｐ）。６クローンすべてが正しい移動パターンを示した。
【０１０２】
【表１】
2007523657.tif 000003
【０１０３】
（２．ウェスタンブロット分析）
ａ）  ＭｕｔＬの検出
ＥＳ５６８（ｍｕｔＬ１３；Ｍｕｔ−）  ｐｍｕｔＬの終夜培養物２０μｌを０．４％グルコースおよびアンピシリン（１００μｇ／ｍ）を含有するＬＢ１０ｍｌに播種し、ＯＤが約０．５に達するまで培養した。グルコースを除去するために、細胞を遠心分離し、必要な抗生物質を含有するＬＢ５ｍｌに懸濁した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって、ＰｌａｃからのｐｍｕｔＬの発現を誘導した。この培養物を３７℃で１６時間インキュベートし、その後、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。ウェスタンブロット分析は、ＡＰ結合抗Ｈｉｓ−ｔａｃ抗体を用いて行った（データは示されていない）。
【０１０４】
ｂ）  ＭｕｔＳの検出
構築されたプラスミドｐｍｕｔＳで、菌株Ｔｏｐ１０の野生型細胞を形質転換し、得られた形質転換体を精製した。これらの細菌の終夜培養物２０μｌを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）および０．４％グルコースを含有するＬＢ１０ｍｌに播種し、ＯＤが約０．５に達するまで培養した。グルコースを除去するために、細胞を遠心分離し、必要な抗生物質を含有するＬＢ５ｍｌに懸濁した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって、ＰｌａｃからのｐｍｕｔＳの発現を誘導した。この培養物を３７℃で１６時間インキュベートし、その後、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。ウェスタンブロット分析は、ＡＰ結合抗Ｈｉｓ−ｔａｃ抗体を用いて行った（データは示されていない）。
【０１０５】
（３．増殖研究）
菌株ＥＳ５６８（ｍｕｔＬ１３；Ｍｕｔ−）、ＭＧ１６５５  ｄｎａＱ：：ｋｎ（Ｍｕｔ−）、および野生型株ＭＧ１６５５（Ｍｕｔ＋）を、プラスミドｐｍｕｔＬまたは親プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺで形質転換した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレート上で、得られた単一コロニーを精製し、その後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢに播種し、３７℃で終夜培養した。
【０１０６】
これらの細菌の終夜培養物２０μｌを、０．４％グルコースと、必要な抗生物質（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ；カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）とを含有するＬＢ５ｍｌに播種し、ＯＤが約０．５に達するまで培養した。グルコースを除去するために、細胞を遠心分離し、対応する抗生物質を含有するＬＢ５ｍｌに懸濁した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって、ＰｌａｃからのｐｍｕｔＬの発現を誘導した。この培養物を、３７℃で終夜インキュベートし、細胞を遠心分離し、培地容積を１／１０（ｖ／ｖ）にまで減少させた。
【０１０７】
最後に、培養物を希釈して、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、または１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋１００μｇ／ｍｌリファンピシンを含有する寒天プレート上にプレーティングし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０１０８】
ウェスタンブロット分析によって、ＭｕｔＬの発現を確認した。
【０１０９】
要約および結論：（ｍｕｔＬ＋バックグランドにおける）ＭｕｔＬの過剰発現によって、自然突然変異の頻度が約２０分の１に低下することを観測した。高い突然変異率を示すｍｕｔＬ−細胞またはｄｎａＱ−細胞でも、同様の効果が観測された（データは示されていない）。
【０１１０】
Ｂ）  様々な組合せのｄｉｎＢ欠失および／またはｄｎａＥ９１１抗変異原アレルを保持する大腸菌株におけるＭｕｔＬの過剰発現
（１．菌株の構築）
ａ）  大腸菌株ＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５ｄｉｎＢ１０の細菌細胞を感染させるために、大腸菌株ＥＳ１４８４（ｍｕｔＬ２１８：：Ｔｎ１０）からＰ１ｖｉｒ溶解物を調製した。
【０１１１】
（Ｐ１ｖｉｒの調製）
大腸菌株ＥＳ１４８４（ｍｕｔＬ２１８：：ｔｅｔ）の終夜培養物のアリコートを、ＣａＣｌ２（５ｍＭ）を含有する３７℃のＬＢに播種した。指数関数的増殖期に、（野生型株ＭＧ１６５５の）Ｐ１ｖｉｒを添加した。感染した培養物を３７℃で約４ｈ、細胞溶解が観察されるまでインキュベートした。ＣＨＣｌ３を添加し、溶解物を遠心分離し、ＣＨＣｌ３を含有する新しいチューブに上清を移して、４℃で保存した。
【０１１２】
（Ｐ１形質導入）
宿主株ＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０の終夜培養物のアリコートをＬＢに播種し、指数関数的増殖期に達するまで３７℃で培養した。細胞を遠心分離し、ＣａＣｌ２（ｃＥ＝５ｍＭ）を含有するＭｇＳＯ４（ｃＥ＝１０ｍＭ）に再懸濁し、調製されたＰ１ｖｉｒ溶解物を添加し、細胞混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。（ファージ感染を停止させるために）クエン酸ナトリウムを添加し、栄養源としてＳＯＣを添加した。細胞を３７℃で１ｈインキュベートした後、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレート上にアリコートをプレーティングした。得られた単一コロニーを精製し、試験し、単離された株を保存した。
【０１１３】
ｂ）  大腸菌株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０、ＭＧ１６５５  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、およびＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔの細菌細胞を感染させるために、ｄｎａＥ株ＮＲ１０１７１（ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ）から、Ｐ１ｖｉｒ溶解物を調製した。得られた単一コロニーを精製し、試験し、単離された株を保存した。
【０１１４】
（２．増殖研究）
細菌株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０、ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ、ＭＧ１６５５  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、およびＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔを、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＡまたはｐｍｕｔＬで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢに播種し、３０℃で終夜培養した。
【０１１５】
これらの細菌の終夜培養物２０μｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３０℃のＬＢ５ｍｌに播種した。指数関数的増殖期に、ＰｌａｃからのＭｕｔＬの発現を強化するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。この培養物を１時間、３０℃に維持し、その後、温度を３７℃に変化させ、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。
【０１１６】
細胞を遠心分離し、培地の容積を１／１０（ｖ／ｖ）にまで減少させた。
【０１１７】
最後に、培養物を希釈して、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、または１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋１００μｇ／ｍｌリファンピシンを含有する寒天プレート上にプレーティングし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０１１８】
リファンピシン耐性への自然突然変異の頻度（ＳＭＦ）の値を表２に示す。図２はＭｕｔＬの発現による変異性の抑制を示す。
【０１１９】
【表２】
2007523657.tif 000004
【０１２０】
ｄｉｎＢ１０（欠失）またはｄｎａＥ９１１（アレル）などの抗変異原の作用を介して、変異性（ＳＭＦ値）がそれぞれ４または３分の１に低下する。さらに、それらの株でＭｕｔＬを発現させることによって、変異性がさらに低下する（２から７分の１）ことを観測した。ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１の両方の抗変異原を保持する細菌株は、野生型株ＭＧ１６５５と比較して、変異性の１０分の１の低下を示す。ＭｕｔＬを追加して発現させても、変異性に変化は見られない。
【０１２１】
ｍｕｔＬ遺伝子の染色体欠失は、宿主株の変異性を、強烈に約１０３倍に増大させる。この変異性は、抗変異原ｄｉｎＢ１０（５分の１）、ｄｎａＥ９１１（３分の１）、ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１（１０分の１）を介して低下した。ＭｕｔＬを追加して誘導することによって、変異性が５０分の１にまで（ＭＧ１６５５  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔでは５０分の１、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔでは２２分の１、ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔでは２０分の１、そして、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔでは１１分の１）低下する。
【０１２２】
要約および結論：抗変異原ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１は、自然突然変異の頻度を３から４分の１で低下させる。これらの菌株でＭｕｔＬを発現させることによって、この頻度がさらに２から７分の１で低下した。
【０１２３】
Ｃ）  様々な組合せのｄｉｎＢ欠失および／またはｄｎａＥ９１１抗変異原を保持するｍｕｔＳ−株の変異性
前述の結果を確認するために、ｄｉｎＢ１０（ポリメラーゼＩＶの欠失）および／またはｄｎａＥ９１１（ポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットのコード配列内のアレル）の抗変異原効果をｍｕｔＳ−バックグランドで試験した。
【０１２４】
（１．菌株の構築）
大腸菌株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０、ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ、およびＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍの細菌細胞を感染させるために、Ｐ１ｖｉｒ溶解物を大腸菌株ＥＳ１４８１（ｍｕｔＬ２１５：：Ｔｎ１０）から調製した。得られた単一コロニーを精製し、試験し、その菌株を保存した。
【０１２５】
（２．増殖研究）
これらの細菌の終夜培養物１０μｌを、１２：５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する３０℃のＬＢ１０ｍｌに播種した。指数関数的増殖期（８ｈの増殖の後）に、温度を３７℃に変化させ、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。
【０１２６】
細胞を遠心分離し、培地の容積を１／１０（ｖ／ｖ）にまで減少させた。
【０１２７】
最後に、培養物を希釈して、リファンピシン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下に寒天プレートにプレーティングし、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１２８】
リファンピシン耐性への自然突然変異の頻度（ＳＭＦ）の値を表３に示す。図３は、ｍｕｔＳ−バックグランドにおける変異性の抑制を示す。
【０１２９】
【表３】
2007523657.tif 000005
【０１３０】
ｄｉｎＢ１０またはｄｎａＥ９１１などの抗変異原の存在下では、野生型と比較して、変異性（ＳＭＦ値）が低下している（約１．５分の１）。さらに、抗変異原ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１を保持する細菌株は、野生型ＭＧ１６５５と比較して、変異性の４．５分の１の低下を示す。
【０１３１】
ｍｕｔＳ遺伝子の染色体欠失は、宿主株の変異性を劇的に増大させる。この変異性は、抗変異原ｄｉｎＢ１０（１２．５分の１）、ｄｎａＥ９１１（１０分の１）、ｄｉｎＢ１０およびｄｎａＥ９１１（６０分の１）によって低下する。
【０１３２】
結論および要約：ｄｉｎＢ１０またはｄｎａＥ９１１によって引き起こされた抗変異原効果は、ｍｕｔＳの染色体欠失によって引き起こされたＭｕｔ−表現型を部分的に補完する。
【０１３３】
実施例２
（ｄａｐＡ変異の復帰変異）
特定の標的遺伝子における点変異およびフレームシフト変異の復帰変異を研究するために、大腸菌において栄養要求変異株表現型を有する系（ｄａｐＡ−株）を用いた。
【０１３４】
ｄａｐＡ遺伝子はジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードし、この酵素はピンポン機構を介してＬ−アスパラギン酸−β−セミアルデヒドおよびピルビン酸からジヒドロピコリン酸への縮合を触媒するが、その機構では、ピルビン酸が、リジン残基とシッフ塩基を形成することによって、この酵素に結合する。機能しない遺伝子産物に導くｄａｐＡ遺伝子変異を有する細菌細胞は、ＤＬ−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含有しない培地では増殖できない。
【０１３５】
ｄａｐＡ−バックグランド（ｄａｐＡ１５（ＤａｐＡ−表現型を有する点突然変異）またはｄａｐＡ：：ｋｎ）において、ｄａｐＡＩＦ（ｗｔ  ＯＲＦ）、ｄａｐＡ＋１（フレームシフト変異）、ｄａｐＡ＋２、またはｄａｐＡ１５（点突然変異）をコードするプラスミドの存在下に、ＭｕｔＬを発現させる。復帰変異体は、ＤＬ−ジアミノピメリン酸を欠失したプレート上で検出する。
【０１３６】
（実験の概要）
（１．プラスミドの構築）
ａ）  ｄａｐＡのクローニング
（ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺへのｄａｐＡ（ｄａｐＡ１５）、ｄａｐＡ＋１（ｄａｐＡ１５＋１）、ｄａｐＡ＋２（ｄａｐＡ１５＋２）のクローニング）
大腸菌株ＭＧ１６５５（ｗｔ）またはＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５）から調製されたゲノムＤＮＡを使用し、プライマー５（配列番号５）、６（配列番号６）、７（配列番号７）、および８（配列番号８）（表４を参照）によって、ＤａｐＡタンパク質をコードする７３２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ断片を消化し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片として、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺにクローニングして、プラスミドｐｄａｐＡＩＦ、ｐｄａｐＡ＋１、およびｐｄａｐＡ＋２を産生させた。プラスミドｐｄａｐＡＩＦの物理構造を図４Ａに示す。ＰＣＲ条件（温度（℃）／時間（分））は以下の通り、すなわち（９８／１０）（９６／０．７５；５５／０．５０；７２／２）３５（７２／１０）；Ｈｅｒｃｕｌａｓｅであった。
【０１３７】
それぞれの場合について、得られたクローンのうち８クローンをＢｓｔＥＩＩによる制限消化によって分析した（予測された断片：１３１４ｂｐおよび３９６４ｂｐ）。試験された合計２４クローンのうち２３クローンが正しい移動パターンを示した。
【０１３８】
（ｐＳＵ１９およびｐＳＵ４０へのｄａｐＡ１５のクローニング）
大腸菌株ＡＴ９９７から調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマー９（配列番号９）および１０（配列番号１０）（表４も参照）によって、ＤａｐＡタンパク質をコードする７３２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ断片を消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、プラスミドｐＳＵ１９およびｐＳＵ４０にクローニングして、プラスミドｐＳＵ１９ｄａｐＡ１５およびｐＳＵ４０ｄａｐＡ１５を産生させた。プラスミドｐＳＵ４０ｄａｐＡの物理構造を図４Ｂに示す。
【０１３９】
ＰＣＲ条件（温度（℃）／時間（分））は以下の通り、すなわち（９８／１０）（９６／０．７５；５５／０．５０；７２／２）３５（７２／１０）；（Ｔａｑ／Ｐｆｕ）の比率（５／１）であった。
【０１４０】
得られたクローンのうち１０クローンを単離し、ＮｈｅＩ（予測された断片：ｐＳＵ４０では１１２２ｂｐおよび２５５７ｂｐ）またはＡｐｏＩ（予測された断片：４７８ｂｐおよび３１９２ｂｐ）による制限消化によって分析した。すべてのクローンが正しい移動パターンを示した。
【０１４１】
２）  ｍｕｔＬのクローニング
ａ）  ｐＳＵ４０へのｍｕｔＬのサブクローニング
プラスミドｐｍｕｔＬをＳｐＨＩ−ＸｍｎＩ消化し、３６２９ｂｐの断片をゲル電気泳動によって単離した。プラスミドｐＳＵ４０をＳｐｈＩ−ＨｉｎｃＩＩ消化し、２６８０ｂｐの断片をゲル電気泳動によって単離した。精製された２つの断片を粘着端−平滑端連結して、プラスミドｐＳＵ４０ｍｕｔＬを産生させた。プラスミドｐＳＵ４０ｍｕｔＬを産生するストラテジーを図５に示す。
【０１４２】
得られたクローンのうち６クローンを、ＮｃｏＩ（予測された断片：２６７５ｂｐおよび３６３４ｂｐ）、ＰｖｕＩ（予測された断片：１３６８ｂｐおよび４９４１ｂｐ）、およびＢｇｌＩ（予測された断片：１８２８ｂｐおよび４４８１ｂｐ）による制限消化によって分析した。試験された６クローンのうち３クローンが正しい移動パターンを示した。
【０１４３】
ｂ）  プラスミドｐｍｕｔＬｓｐｅｃ：  ｓｐｅｃによるｂｌａの置換
（プラスミドｐｍｕｔＬにおける、スペクトマイシン耐性遺伝子によるアンピシリン耐性遺伝子の置換）
プラスミドｐＩＣ１５６から調製されたＤＮＡをＦｓｐＩ−ＸｍｎＩ消化し、ゲル電気泳動を用いて１３０４ｂｐの断片を単離し、プラスミドｐｍｕｔＬから調製されたＤＮＡをＳｃａＩ−ＸｍｎＩ消化し、ゲル電気泳動を用いて５４４３ｂｐの断片を単離した。精製された２つの断片を平滑端−平滑端連結して、プラスミドｍｕｔＬｓｐｅｃを産生させた。
【０１４４】
得られたクローンのうち１２クローンをＥｃｏＲＩ（予測された断片：１２９１ｂｐおよび５４５６ｂｐ）による制限消化によって分析した。試験された１２クローンのうち２クローンが正しいサイズを示した。
【０１４５】
【表４】
2007523657.tif 000006
【０１４６】
（２．ウェスタンブロット分析）
ａ）  ＤａｐＡ／ＤａｐＡ１５の検出
菌株ｄａｐＡ：：ｋｎを、ｐｄａｐＡＩＦ、ｐｄａｐＡ＋１、ｐｄａｐＡ＋２、ｐｄａｐＡ１５ＩＦ、ｐｄａｐＡ１５＋１、およびｐｄａｐＡ１５＋２で形質転換し、観察された形質転換体を精製した。
【０１４７】
これらの細菌の終夜培養物２０μｌを、０．４％グルコース、ＤＬ−ジアミノピメリン酸（１００μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ１０ｍｌに播種し、ＯＤが約０．５に達するまで培養した。グルコースを除去するために、細胞の一部を遠心分離し、必要な抗生物質を含有するＬＢ５ｍｌに懸濁した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって、Ｐｌａｃからの様々なｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ派生物の発現を誘導した。この培養物を３７℃で１６時間インキュベートし、その後、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。ウェスタンブロット分析は、ＡＰ結合抗Ｈｉｓ−ｔａｃ抗体を用いて行った（データは示されていない）。
【０１４８】
ｂ）  ＭｕｔＬの検出
野生型株Ｔｏｐ１０をプラスミドｐｍｕｔＬｓｐｅｃで形質転換し、得られた形質転換体を精製した。これらの細菌の終夜培養物２０μｌを、スペクトマイシン（７５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ１０ｍｌに播種し、ＯＤが約０．５に達するまで培養した。この培養物を５ｍｌアリコートに分割し、プロモーターＰｌａｃからのＭｕｔＬの発現を誘導するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを１回、添加した。この培養物を３７℃で４時間インキュベートし、その後、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。ＭｕｔＬの発現を証明するために、ＡＰ結合抗Ｈｉｓ−ｔａｃ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った（データは示されていない）。
【０１４９】
（３．菌株の構築）
大腸菌株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０、ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ、ＭＧ１６５５  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、ＭＧ１６５５  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔ、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１  ｚａｅ：：ｃｍ  ｍｕｔＬ：：ｔｅｔの細菌細胞を感染させるために、Ｐ１ｖｉｒ溶解物を大腸菌株ｄａｐＡ：：ｋｎから調製した。得られた単一コロニーを精製し、試験し、単離された株を保存した。
【０１５０】
（４．増殖研究）
ａ）  点突然変異の復帰変異：
細菌株ＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５）およびＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄａｐＡ：：ｋｎを、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺおよびｐＳＵ１９ｄａｐＡ１５、またはプラスミドｐｍｕｔＬおよびｐＳＵ１９ｄａｐＡ１５で形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰを含有するＬＢに播種して、３７℃で終夜培養した。
【０１５１】
ｂ）  フレームシフト変異の復帰変異：
細菌株ＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５；ＤａｐＡ−）を、プラスミドｐＳＵ４０およびｐｄａｐＡＩＦ、プラスミドｐＳＵ４０ｍｕｔＬおよびｐｄａｐＡＩＦ、プラスミドｐＳＵ４０およびｐｄａｐＡ＋１、プラスミドｐＳＵ４０ｍｕｔＬおよびｐｄａｐＡ＋１、プラスミドｐＳＵ４０およびｐｄａｐＡ＋２、またはプラスミドｐＳＵ４０ｍｕｔＬおよびｐｄａｐＡ＋２で形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および５０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰを含有するＬＢに播種して、３７℃で終夜培養した。
【０１５２】
細菌細胞の終夜培養物２０μｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰを含有する３０℃のＬＢ１０ｍｌに播種した。指数関数的増殖期に、ＰｌａｃプロモーターからのＭｕｔＬの発現を強化するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。この培養物を１時間、３０℃に維持し、その後、温度を３７℃に変化させ、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。
【０１５３】
最後に、培養物を希釈して、９ｍｌの培地を取り除き、残っている細胞を希釈し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、または１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰを含有する寒天プレート上にプレーティングし、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１５４】
野生株およびＭｕｔＬ過剰発現株におけるｄａｐＡ変異の復帰変異の値を表５に示す。図６は、ＭｕｔＬの発現による変異性の抑制を示す。
【０１５５】
【表５】
2007523657.tif 000007
【０１５６】
対照株（１〜３）であるＴｏｐ１０（ｗｔ；ＤａｐＡ＋）、ＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５；ＤａｐＡ−）、およびＭＧ１６５５ｄａｐＡ：：ｋｎ（ＤａｐＡ−）は、予測通りのｄａｐ−／ｄａｐ＋値、すなわち野生型株では約１（ＤＬ−ジアミノピメリン酸非存在下で増殖する）、そして、ｄａｐＡ−株では０（ＤＬ−ジアミノピメリン酸非存在下で増殖しない）を示す。
【０１５７】
機能するｄａｐＡ遺伝子がプラスミドｐｄａｐＡＩＦに存在するので、ＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５）  ｐｄａｐＡＩＦ  ｐＴｒｃ（４）、およびＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５）  ｐｄａｐＡＩＦ  ｐｍｕｔＬ（５）の２株は、予測通りの野生型表現型を示す。ｄａｐＡ−宿主中のプラスミドにコードされているｄａｐＡのフレームシフト変異体（６、８）または点突然変異（１０）は、ＤＡＰの非存在下における細胞増殖を抑制するはずであり、一方、導入された変異の復帰変異（７、１１）は、ＤＡＰの非存在下における増殖を可能にする。
【０１５８】
要約および結論：いずれの場合（フレームシフトおよび点突然変異）も、変異からの復帰が、ＭｕｔＬの非存在下でより高い割合で観察された。フレームシフト変異では、ｄａｐ−／ｄａｐ＋値が１０００分の１にまで低下し、点突然変異では１０分の１にまで低下した。これは、ＭｕｔＬの発現が、変異からの復帰を抑制し、それによって、染色体における自然突然変異の修復に対抗して作用することを意味する。
【０１５９】
実施例３
（「発酵状態」中におけるＭｕｔＬの発現）
トリプトファンによって制御されたＧ−ＣＳＦ発現ベクターを保持する産生株ＪＭ８３  ｐＸＸ７の変異性を、Ａ）細胞をリファンピシリン上にプレーティングすることによる自然突然変異の発生率の計算、Ｂ）細胞をホスホマイシン上にプレーティングすることによる自然突然変異の発生率の計算、およびＣ）産生プラスミドｐＸＸ７（Ｇ−ＣＳＦをコードする）へのレポータ遺伝子の導入によって分析した。
【０１６０】
Ｂ）に向けて、実験条件下では、ホスホマイシンに対する耐性が大腸菌でより迅速に発生するので、リファンピシリンをホスホマイシンで置換した。ホスホマイシンは、無併発性の下部尿路感染の治療に主として使用される細胞壁阻害剤である。
【０１６１】
（実験の概要）
（１．クローニング）
ａ）  ｐＸＸ７へのクロラムフェニコールカセットのクローニング：
プラスミドｐＳＵＩ９から調製されたＤＮＡを使用して、プライマー１１（配列番号１１）および１２（配列番号１２）（表６）によって、クロラムフェニコール耐性をコードするＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ断片を消化し、ＢｂｖｃＩ−ＡｈｄＩ断片として、プラスミドｐＸＸ７にクローニングして、プラスミドｐＸＸ７ｃｍを産生させた。プラスミドｐＸＸ７ｃｍを産生するストラテジーを図７Ａに示す。選択過程を単純化するために、「シャイン−ダルガルノ」配列の−１０領域のみをクローニングした。
【０１６２】
ＰＣＲ条件（温度（℃）／時間（分））は以下の通り、すなわち（９８／１０）（９６／０．７５；５５／０．５０；７２／１）３５（７２／１０）；Ｈｅｒｃｕｌａｓｅである。
【０１６３】
【表６】
2007523657.tif 000008
【０１６４】
ｂ）  プラスミドｐＸＸ７へのサイレントｔｅｔＡ遺伝子のクローニング：
プラスミドｐＧＢＧ１の選択カートリッジを単離し、ＭｓｌＩ−ＳｍａＩ断片として、プラスミドｐＸＸ７にクローニングして、プラスミドｐＸＸ７ｔｅｔを産生させた（平滑端−平滑端連結）。プラスミドｐＸＸ７ｔｅｔを産生するストラテジーを図７Ｂに示す。
【０１６５】
プラスミドｐＧＢＧ１は、様々なグラム陰性菌における移動性エレメントおよび他の自然突然変異の単離および特性分析を目的として構築された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ  ４４、２０１−２０７（２０００年））。選択カートリッジは、変異導入の標的を含有し、バクテリオファージλのＰＲプロモーターの制御下にあるサイレントｔｅｔＡ遺伝子で構成されており、このＰＲプロモーターはλＣＩリプレッサーで抑制される。ｃＩを不活性化するか、あるいはＣＩの結合部位を除去する自然突然変異（点突然変異、欠失、および挿入）はＰＲを抑制解除し、それによって、ｔｅｔＡ発現の引き金となる。変異導入の標的は、約１ｋｂの長さである。この場合、ＭｕｔＬの発現は、変異の発生率を低下させ、それによって、所与の宿主株におけるテトラサイクリン耐性を減少させるはずである。
【０１６６】
（２．増殖研究）
Ａ）  細胞をリファンピシリン上にプレーティングすることによる大腸菌の自然突然変異の頻度（ＳＭＦ）の測定
細菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７を、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ（対照プラスミド）およびｐｍｕｔＬで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、その細胞を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢに播種し、３０℃で終夜培養した。これらの細菌の終夜培養物３ｍｌを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３０℃のＲＭＧ１００ｍｌに播種した。指数関数的増殖期に、プラスミドｐｍｕｔＬのＰｌａｃプロモーターからのＭｕｔＬの発現を強化するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに、プラスミドｐＸＸ７からのＧ−ＣＳＦの発現を誘導するために、最終濃度１００μｇ／ｍｌのトリプトファンを添加した。誘導の１時間後に、播種温度を３０℃から３７℃に変化させ、その後、細胞を終夜、３７℃に維持した。
【０１６７】
細胞を遠心分離して、培地容積を１０ｍｌまで減少させた。
【０１６８】
最後に、培養物を希釈して、
ａ）  １００μｇ／ｍｌアンピシリン、および必要に応じて５０μｇ／ｍｌカナマイシン、
ｂ）  １００μｇ／ｍｌアンピシリン、ならびに、必要に応じて５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌリファンピシン
を含有する、Ａ）  ＬＢＡプレート、Ｂ）  ＲＭＧプレート、およびＣ）  Ｍ９プレート上にプレーティングし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０１６９】
菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７、ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬのリファンピシン耐性への自然突然変異の頻度の値を図８に示す。産生株ＪＭ８３  ｐＸＸ７は約０．４５のＳＭＦ値を示す。このＳＭＦ値は、産生株に「空」のベクターであるｐＴｒｃを追加して導入した場合でも維持される。しかし、さらにｐｍｕｔＬをＪＭ８３  ｐＸＸ７に導入すると、ＭｕｔＬが過剰発現された場合、ＳＭＦ値の約２分の１の低下が引き起こされる。
【０１７０】
Ｂ）  細胞をホスホマイシン上にプレーティングすることによる大腸菌の自然突然変異の頻度（ＳＭＦ）の測定
細菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７を、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＡおよびｐｍｕｔＬで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、それぞれの株（ＪＭ８３  ｐＸＸ７、ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐＴｒｃＡ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬ）につき２０の独立かつ特有の細胞を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢに播種し、３０℃で終夜培養した。
【０１７１】
これらの細菌の終夜培養物１０μｌを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３０℃のＲＭＧ１０ｍｌに播種した。指数関数的増殖期に、プラスミドｐｍｕｔＬのＰｌａｃからのＭｕｔＬの発現を強化するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに、プラスミドｐＸＸ７のＰｔｒｐからのＧ−ＣＳＦの発現を誘導するために、最終濃度１００μｇ／ｍｌのトリプトファンを添加した。誘導の１時間後に、播種温度を３０℃から３７℃に変化させ、その後、細胞を終夜、３７℃に維持した。
【０１７２】
細胞を遠心分離して、培地容積を１ｍｌにまで減少させた。
【０１７３】
最後に、培養物を希釈して、
ａ）  １００μｇ／ｍｌアンピシリン、および必要に応じて５０μｇ／ｍｌカナマイシン、
ｂ）  １００μｇ／ｍｌアンピシリン、ならびに、必要に応じて５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３０μｇ／ｍｌホスホマイシン
を含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０１７４】
菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７、ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬのホスホマイシン耐性への自然突然変異の頻度の値を図９に示す。産生株ＪＭ８３  ｐＸＸ７は、約４．９のＳＭＦ値を示す。このＳＭＦ値は、産生株に「空」のベクターであるｐＴｒｃを追加して導入した場合でも維持される。しかし、さらにｐｍｕｔＬをＪＭ８３  ｐＸＸ７に導入すると、ＭｕｔＬが過剰発現された場合、ＳＭＦ値の約３分の１の低下が引き起こされる。
【０１７５】
要約および結論：ＭｕｔＬの過剰発現は、Ｇ−ＣＳＦ産生株の変異性を約３分の１に低下させ、さらに、細胞生存率を１０３倍にまで増強する。
【０１７６】
Ｃ）  レポータ遺伝子の導入による大腸菌株ＪＭ８３ｐＸＸ７の自然突然変異の測定
ａ）  Ｇ−ＣＳＦの発現
ｂ）  Ｇ−ＣＳＦの発現および抑制
Ｇ−ＣＳＦ活性をモニターすることができなかったので、プラスミドｐＸＸ７にレポータ遺伝子を導入した。
【０１７７】
変異生成を２つの異なった系でアッセイした。第１の系では、クロラムフェニコール耐性遺伝子を使用し、これを弱いプロモーターによって制御する。ｃｍ遺伝子の発現を不活性化する点変異、欠失、および挿入などの自然突然変異は、クロラムフェニコール耐性を低減する。ＭｕｔＬの不在は、培養中の生存細胞の総数に対する、クロラムフェニコール耐性を与える自然突然変異の割合の減少として報告されるはずである。第２の系では、バクテリオファージλのＰＲプロモーターおよびλｃＩリプレッサーの制御下にサイレントｔｅｔＡ遺伝子を含有するカセットを使用し、λｃＩリプレッサーはｔｅｔＡの発現を阻止する。ｃＩを不活性化するか、あるいはＣＩの結合部位を除去する、点突然変異、欠失、および挿入などの自然突然変異は、ＰＲの抑制解除に導き、それによって、ｔｅｔＡ発現の引き金となる。ＭｕｔＬの発現は、培養中の生存細胞の総数に対する、テトラサイクリン耐性を与える自然突然変異の割合の減少として報告されるはずである。
【０１７８】
ａ）  Ｇ−ＣＳＦの発現
細菌株ＪＭ８３をプラスミドｐＸＸ７ｃｍ、ｐＸＸ７ｃｍ  ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ、ｐＸＸ７ｃｍ  ｐｍｕｔＬ、ｐＸＸ７ｔｅｔ、ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ、およびｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐｍｕｔＬで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢに細胞を播種し、３０℃で終夜培養した。
【０１７９】
これらの細菌の終夜培養物１０μｌを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３０℃のＲＭＧ１０ｍｌに播種した。指数関数的増殖期に、プラスミドｐｍｕｔＬのＰｌａｃからのＭｕｔＬの発現を強化するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに、プラスミドｐＸＸ７のＰｔｒｐからのＧ−ＣＳＦの発現を誘導するために、最終濃度１００μｇ／ｍｌのトリプトファンを添加した。誘導の１時間後に、播種温度を３０℃から３７℃に変化させ、その後、細胞を終夜、３７℃に維持した。
【０１８０】
細胞を遠心分離して、培地容積を１ｍｌにまで減少させた。
【０１８１】
最後に、培養物を希釈して、様々な抗生物質（表７に示す）を含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３０℃で４日間インキュベートした。
【０１８２】
【表７】
2007523657.tif 000009
【表７−２】
2007523657.tif 000010
【０１８３】
菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐｍｕｔＬのクロラムフェニコール耐性レポータ遺伝子における自然突然変異の頻度の値を図１０に示す。ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍおよびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐＴｒｃの２株では、変異性の値が０．２８または０、３５（Δ１．２５）であった。ＭｕｔＬの発現によって、変異性の値が０．４９（Δ１．７５）に低下する。これは、ＭｕｔＬの発現が、クロラムフェニコール耐性からクロラムフェニコール感受性への転換を抑制し、それによって、染色体における自然突然変異の修復に対抗して作用することを意味する。
【０１８４】
菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐｍｕｔＬのサイレントｔｅｔＡレポータ遺伝子における自然突然変異の頻度の値を図１１に示す。ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔおよびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐＴｒｃの２株では、変異性の値が０．４３または０．３９（Δ１．１）であった。ＭｕｔＬの発現によって、変異性の値が０．２５（Δ１．７２）に低下する。これは、ＭｕｔＬの発現が、テトラサイクリン感受性からテトラサイクリン耐性への転換を抑制し、それによって、染色体における自然突然変異の修復に対抗して作用することを意味する。
【０１８５】
ｂ）  Ｇ−ＣＳＦの発現および抑制
野生型細菌株ＪＭ８３を、プラスミドｐＸＸ７ｃｍ、ｐＸＸ７ｃｍ  ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ、ｐＸＸ７ｃｍ  ｐｍｕｔＬ、ｐＸＸ７ｔｅｔ、ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ、およびｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐｍｕｔＬで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、その細胞を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢに播種し、３０℃で終夜培養した。
【０１８６】
これらの細菌の終夜培養物１０μｌを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、そして、必要に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３０℃のＲＭＧ１０ｍｌに播種した。指数関数的増殖期に、プラスミドｐｍｕｔＬのＰｔｒｃプロモーターからのＭｕｔＬの発現を強化するために、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。この培養物を２等分割し、プラスミドｐＸＸ７のＰｔｒｐプロモーターからのＧ−ＣＳＦの発現を誘導するために、最終濃度１００μｇ／ｍｌのトリプトファンを１回添加した。誘導の１時間後に、播種温度を３０℃から３７℃に変化させ、その後、細胞を終夜、３７℃に維持した。
【０１８７】
細胞を遠心分離して、培地容積を１ｍｌにまで減少させた。
【０１８８】
最後に、培養物を希釈して、様々な抗生物質（表７参照）を含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で終夜インキュベートした。
【０１８９】
発酵状態中における、改変された産生株ＪＭ８３  ｐＸＸｃｍの変異性を図１２に示す。Ｇ−ＣＳＦの非存在下では、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐｍｕｔＬの、測定されたクロラムフェニコール耐性の頻度が５０と５５との間を移行する。Ｇ−ＣＳＦの誘導によって、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔおよびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐＴｒｃの値が３分の１に低下する。しかし、菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬでは、Ｇ−ＣＳＦが発現された際に、クロラムフェニコール耐性が維持されている。
【０１９０】
ＭｕｔＬの発現は、クロラムフェニコール耐性からクロラムフェニコール感受性への変換を抑制する。ＭｕｔＬは、染色体における自然突然変異の修復に対抗して作用する。
【０１９１】
図１３は、発酵状態中における、改変された産生株ＪＭ８３  ｐＸＸ７の変異性が有意に増大していることを示す。しかし、プラスミドによってコードされたＭｕｔＬを発現する菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬでは、Ｇ−ＣＳＦが発現された際にテトラサイクリン耐性が一定に保たれている。ＭｕｔＬの発現は、テトラサイクリン耐性からテトラサイクリン感受性への転換を抑制し、染色体における自然突然変異の修復に対抗して作用する。
【０１９２】
結論および要約：得られた結果は、ＭｕｔＬの過剰発現が、Ｇ−ＣＳＦ産生中のＧ−ＣＳＦ発酵株の変異性を約３分の１に低下させることを示す。さらに、ＭｕｔＬの過剰発現が細胞生存率を１０３倍にまで増強することも見出された。
【０１９３】
Ｇ−ＣＳＦの誘導は、試験された産生株の自然突然変異の発生率を約２から３倍に上昇させる。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】プラスミドｐｍｕｔＬの物理構造を示す図である。このプラスミドは、原則的にｐｍｕｔＳプラスミドと同じ構造を有する。
【図２】野生型、ｄｉｎＢ１０、ｄｎａＥ９１１、ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１、ｍｕｔＬ−、ｍｕｔＬ−  ｄｉｎＢ１０、ｍｕｔＬ−  ｄｎａＥ９１１、およびｍｕｔＬ−  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１株のリファンピシン耐性への自然突然変異の頻度の値のグラフ表示である。図が示すように、ＭｕｔＬの発現によって変異性が強く抑制される。データは、ＳＭＦ値として示す。プラスミドｐｍｕｔＬは、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺのｍｕｔＬ＋派生物である。全てのセットの遺伝子操作に野生型株ＭＧ１６５５（ｗｔ）を選択した。関連する遺伝子型が示されている。棒グラフは三つ組みに分割されており、各三つ組みは、同一の遺伝子型を示し、かつａ）最初の棒グラフ：細菌株、ｂ）プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺを保持する対応する細菌株、およびｃ）プラスミドｐｍｕｔＬを保持する対応する細菌株から構成されている。
【図３】野生型、ｄｉｎＢ１０、ｄｎａＥ９１１、ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１、ｍｕｔＳ−、ｍｕｔＳ−  ｄｉｎＢ１０、ｍｕｔＳ−  ｄｎａＥ９１１、およびｍｕｔＳ−  ｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１株のリファンピシン抵抗性への自然突然変異の頻度の値のグラフ表示である。この図は、ｍｕｔＳ−バックグランドにおける、ｄｉｎＢ１０、ｄｎａＥ９１１、およびｄｉｎＢ１０  ｄｎａＥ９１１による変異性の抑制を示す。データは、ＳＭＦ値として示す。関連する遺伝子型が示されている。
【図４】プラスミドｐｄａｐＡＩＦ（Ａ）およびプラスミドｐＳＵ４０ｄａｐＡ（Ｂ）の物理構造を示す図である。
【図５】プラスミドｐＳＵ４０ｍｕｔＬを産生するストラテジーを示す図である。
【図６】菌株Ｔｏｐ１０（野生型；ｄａｐＡ＋）、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄａｐＡ：：ｋｎ（ｄａｐＡ−）、ＡＴ９９７（ｄａｐＡ１５、ｄａｐＡ−）、ＡＴ９９７  ｐｄａｐＡｌＦ  ｐＴｒｃ（ｄａｐＡ＋）、ＡＴ９９７  ｐｄａｐＡｌＦ  ｐｍｕｔＬ（ｄａｐＡ＋）、ＡＴ９９７  ｐｄａｐＡ＋１  ｐＴｒｃ（ｄａｐＡ−）、ＡＴ９９７  ｐｄａｐＡ＋１  ｐｍｕｔＬ（ｄａｐＡ−）、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄａｐＡ：：ｋｎ  ｐｄａｐＡ１５  ｐＳＵ４０（ｄａｐＡ−）、ＭＧ１６５５  ｄｉｎＢ１０  ｄａｐＡ：：ｋｎ  ｐｄａｐＡ１５  ｐＳＵ４０ｍｕｔＬ（ｄａｐＡ−）におけるｄａｐＡ点突然変異の復帰変異のグラフ表示である。この図は、ＭｕｔＬの発現による変異性の抑制を示す。ＤＡＰに対する耐性を与える変異の値は、生存細胞の総数で割ることによって表される。プラスミドｐｍｕｔＬは、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺまたはｐＳＵ４０のｍｕｔＬ＋派生物である。全てのセットの遺伝子操作に野生型株ＭＧ１６５５（ｗｔ）を選択した。関連する遺伝子型が示されている。図は、対照の三つ組みの１つと、検査する株の３つの二つ組みとに分割されている。各二つ組みは、ａ）最初の棒グラフ：親ベクターを保持する細菌株、およびｂ）ｍｕｔＬ＋派生物を保持する細菌株で構成されている。使用されたすべての細菌株は染色体の野生型ＭｕｔＬを発現する。
【図７】プラスミドｐＸＸ７の派生物を示す図である。  Ａ）ｐＸＸ７へのクロラムフェニコールカセットのクローニング。それによってプラスミドｐＸＸ７ｃｍを得た。得られたクローンのうち９クローンを、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ（予測された断片：１６７７ｂｐおよび３２９２ｂｐ）による制限消化によって分析した。試験されたクローンのすべてが正しい移動パターンを示した。  Ｂ）プラスミドｐＸＸ７へのサイレントｔｅｔＡ遺伝子のクローニング。それによってプラスミドｐＸＸ７ｔｅｔを得た。得られたクローンのうち２４クローンを、ＥｃｏＲＩ（予測された断片：４１４１ｂｐおよび３１１３ｂｐ）による制限消化によって分析した。試験されたクローンのうち１クローンが正しい移動パターンを示した。
【図８】菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７、ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬにおけるリファンピシン抵抗性への自然突然変異の頻度を示す図である。プラスミドｐｍｕｔＬは、プラスミドｐＴｒｃのｍｕｔＬ＋派生物である。ＳＭＦ値は、生存細胞の総数に対するリファンピシン耐性として与えられる。野生型株ＪＭ８３は、染色体の野生型ＭｕｔＬを発現する。
【図９】菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７、ＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬにおける、ホスホマイシン耐性への自然突然変異の頻度の値を示す図である。プラスミドｐｍｕｔＬは、プラスミドｐＴｒｃのｍｕｔＬ＋派生物である。ＳＭＦ値は、生存細胞の総数に対するホスホマイシン耐性として与えられる。野生型株ＪＭ８３は、染色体の野生型ＭｕｔＬを発現する。
【図１０】菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍ  ｐｍｕｔＬのクロラムフェニコール耐性レポータ遺伝子における自然突然変異の頻度によるｃｍＲコロニーの数を示す図である。プラスミドｐＸＸ７ｃｍは、ｐＸＸ７のｃｍ＋派生物である。プラスミドｐｍｕｔＬは、ｐＴｒｃのｍｕｔＬ＋派生物である。生存細胞の総数が割った、クロラムフェニコールに対する感受性を導入する変異の値が示されている。対照株であるＪＭ８３ｐＸＸ７、ＪＭ８３ｐＸＸ７  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬは、クロラムフェニコールに対する、予測通りの感受性を示す（クロラムフェニコール耐性遺伝子を保持していない）。
【図１１】菌株ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔ  ｐｍｕｔＬのサイレントｔｅｔＡレポータ遺伝子における自然突然変異の頻度によるｔｅｔＲコロニーの数を示す図である。プラスミドｐＸＸ７ｔｅｔは、サイレントｔｅｔＡを保持するｐＸＸ７派生物である。プラスミドｐｍｕｔＬは、ｐＴｒｃのｍｕｔＬ＋派生物である。生存細胞の総数が割った、テトラサイクリンに対する耐性を導入する変異の値が示されている。対照株であるＪＭ８３ｐＸＸ７，ＪＭ８３ｐＸＸ７  ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３ｐＸＸ７  ｐｍｕｔＬは、テトラサイクリンに対する、予測通りの感受性を示す（テトラサイクリン耐性遺伝子を保持していない）。ＪＭ８３  ｐＸＸ７およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔの２株では、変異性の値が０．４３または０．３９であった（Δ１．１）。ＭｕｔＬの発現によって、変異性の値が０．２５（Δ１．７２）に低下する。
【図１２】「発酵状態」中における、改変された産生株ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｃｍの変異性を示す図である。Ｇ−ＣＳＦが抑制（Ａ）または（Ｂ）発現された際の、細胞におけるクロラムフェニコール耐性の頻度が示されている。試験したそれぞれのケースで、ＭｕｔＬが染色体から発現された。対照株であるＪＭ８３  ｐＸＸ７、ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｐＴｒｃ、およびＪＭ８３  ｐＸＸ７ｐＴｒｃ  ｐｍｕｔＬは、ケース（Ａ）およびケース（Ｂ）でクロラムフェニコールに対する予測通りの感受性を示す。
【図１３】「発酵状態」中における、改変された産生株ＪＭ８３  ｐＸＸ７ｔｅｔの変異性を示す図である。図は、Ｇ−ＣＳＦが抑制（Ａ）または（Ｂ）発現された際の、細胞のテトラサイクリン耐性の頻度を示す。試験したそれぞれのケースで、ＭｕｔＬが染色体から発現された。
【図１】
2007523657.tif 000011
【図２】
2007523657.tif 000012
【図３】
2007523657.tif 000013
【図４】
2007523657.tif 000014
【図５】
2007523657.tif 000015
【図６】
2007523657.tif 000016
【図７】
2007523657.tif 000017
【図８】
2007523657.tif 000018
【図９】
2007523657.tif 000019
【図１０】
2007523657.tif 000020
【図１１】
2007523657.tif 000021
【図１２】
2007523657.tif 000022
【図１３】
2007523657.tif 000023
【配列表】
2007523657000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月25日(2006.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007523657000001.app
【国際調査報告】
2007523657.tif 000027
2007523657.tif 000028