(57)【要約】  Ｓｅｃ系分泌シグナルペプチドを用いる、組換えタンパク質を生産するための改良された方法および原核生物の発現系を記載し、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ分泌系が用いられる。組換えタンパク質およびペプチドの改良された分泌のための融合タンパク質およびコード配列のような、具体的で新規なＳｅｃ系分泌シグナルペプチドを記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナル、外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択されるシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)のＳｅｃ系分泌ペプチドについての分泌シグナルのコード配列か、またはそのコード配列と実質的に相同な配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項２】
配列が、リン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナル、またはそのpbpシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項１の核酸。
【請求項３】
配列が、配列番号：２と少なくとも８０％または少なくとも８５％同一である、請求項２の核酸。
【請求項４】
配列が、配列番号：２と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項２の核酸。
【請求項５】
配列が、pbp分泌シグナルをコードする配列、配列番号：２の配列、配列番号：２と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：２と少なくとも８５％同一な配列、配列番号：２と少なくとも９０％同一な配列および配列番号：２と少なくとも９５％同一な配列から選択される核酸配列にハイブリダイズする、請求項１の核酸。
【請求項６】
核酸配列を発現させるために選択される宿主生物のコドンプレファレンスを反映させるために適応させた配列番号：２の配列を含む、請求項１の核酸。
【請求項７】
配列が、外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナル、またはそのOprEシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項１の核酸。
【請求項８】
配列が、配列番号：４と少なくとも８０％同一であるか、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項７の核酸。
【請求項９】
配列が、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項１の核酸。
【請求項１０】
配列が、配列番号：６と少なくとも８０％同一であるか、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項９の核酸。
【請求項１１】
配列が、アズリン分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項１の核酸。
【請求項１２】
配列が、配列番号：８と少なくとも８０％同一であるか、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項１１の核酸。
【請求項１３】
配列が、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項１の核酸。
【請求項１４】
配列が、配列番号：１０と少なくとも８０％同一であるか、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項１３の核酸。
【請求項１５】
配列が、リポタンパク質Ｂ分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項１の核酸。
【請求項１６】
配列が、配列番号：１２と少なくとも８０％同一であるか、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項１５の核酸。
【請求項１７】
配列が、配列番号：４と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：６と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：８と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：１０と少なくとも８０％同一な配列および配列番号：１２と少なくとも８０％同一な配列からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズする、請求項１の核酸。
【請求項１８】
核酸配列を発現させるために選択される宿主生物のコドンプレファレンスを反映させるために適応させた核酸配列であって、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１の核酸。
【請求項１９】
ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下である、請求項５または１７の核酸。
【請求項２０】
ハイブリダイゼーションが６８℃である、請求項１９の核酸。
【請求項２１】
ｐｂｐ分泌シグナル、ＯｐｒＥ分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択される、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドをコードする核酸の分泌シグナル配列；その分泌シグナル配列と実質的に相同な配列；またはその分泌シグナル配列にハイブリダイズする配列を含む、組換えベクター。
【請求項２２】
分泌シグナル配列が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２および配列番号：１２からなる群より選択されるか、またはその分泌シグナル配列と実質的に相同な配列である、請求項２１のベクター。
【請求項２３】
分泌シグナル配列が、リン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナル、またはそのｐｂｐシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項２１のベクター。
【請求項２４】
分泌シグナル配列が、配列番号：２と少なくとも８０％または少なくとも８５％同一である、請求項２３のベクター。
【請求項２５】
分泌シグナル配列が、配列番号：２と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、請求項２３のベクター。
【請求項２６】
核酸配列を発現させるために選択される宿主生物のコドンプレファレンスを反映させるために適応させた配列番号：２の分泌シグナル配列を含む、請求項２３のベクター。
【請求項２７】
分泌シグナル配列が、外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナルをコードするか、または配列がそのシグナル配列と実質的に相同である、請求項２１のベクター。
【請求項２８】
分泌シグナル配列が、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項２１のベクター。
【請求項２９】
分泌シグナル配列が、アズリン分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項２１のベクター。
【請求項３０】
分泌シグナル配列が、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項２１のベクター。
【請求項３１】
分泌シグナル配列が、リポタンパク質Ｂ分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同である配列をコードする、請求項２１のベクター。
【請求項３２】
分泌シグナル配列が、配列番号：４と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：６と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：８と少なくとも８０％同一な配列、配列番号：１０と少なくとも８０％同一な配列および配列番号：１２と少なくとも８０％同一な配列からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズする、請求項２１のベクター。
【請求項３３】
分泌シグナル配列が、核酸配列を発現させるために選択される宿主生物のコドンプレファレンスを反映させるために適応させた配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群より選択される、請求項２１のベクター。
【請求項３４】
分泌シグナル配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項２１のベクター。
【請求項３５】
ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下である、請求項３４のベクター。
【請求項３６】
ハイブリダイゼーションが６８℃である、請求項３５のベクター。
【請求項３７】
分泌シグナル配列が機能できるように、関心対象の組換えタンパク質またはペプチドについてコードする配列に結合している、請求項２１のベクター。
【請求項３８】
組換えタンパク質またはペプチドが宿主を起源とする、請求項３７のベクター。
【請求項３９】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナス・フルオレッセンスを起源とする、請求項３８のベクター。
【請求項４０】
組換えタンパク質またはペプチドが、宿主生物を起源としないタンパク質またはペプチドに由来する、請求項３７のベクター。
【請求項４１】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナス(Pseudomonad)ではない生物に由来する、請求項３７のベクター。
【請求項４２】
組換えタンパク質またはペプチドが真核生物に由来する、請求項３７のベクター。
【請求項４３】
組換えタンパク質またはペプチドが哺乳動物に由来する、請求項３７のベクター。
【請求項４４】
シグナルペプチド配列と、組換えタンパク質またはペプチド配列との間に連結配列をさらに含む、請求項３７のベクター。
【請求項４５】
連結配列がシグナルペプチダーゼによって切断される、請求項４４のベクター。
【請求項４６】
組換えタンパク質またはペプチド配列が機能できるように、第二のシグナル配列に結合している、請求項３７のベクター。
【請求項４７】
第二のシグナル配列が、外膜分泌シグナルを対象とする配列を含む、請求項４６のベクター。
【請求項４８】
ベクターがプロモーターをさらに含む、請求項２１のベクター。
【請求項４９】
プロモーターが細菌の宿主細胞を起源とする、請求項４８のベクター。
【請求項５０】
プロモーターが細菌の宿主細胞を起源としない、請求項４８のベクター。
【請求項５１】
プロモーターがエシェリキア・コリ(E.coli)を起源とする、請求項４８のベクター。
【請求項５２】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項４８のベクター。
【請求項５３】
プロモーターがｌａｃプロモーターまたはｌａｃプロモーターの誘導体である、請求項４８のベクター。
【請求項５４】
ｐｂｐ分泌シグナル、ＯｐｒＥ分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドをコードする核酸分泌シグナル配列；その分泌シグナル配列と実質的に相同な配列；もしくは分泌シグナル配列にハイブリダイズする配列、またはそのコード配列と実質的に相同な配列を含む、組換え細胞。
【請求項５５】
分泌シグナル配列が発現ベクター内に存在する、請求項５４の組換え細胞。
【請求項５６】
分泌シグナル配列がｐｂｐ配列である、請求項５４の組換え細胞。
【請求項５７】
分泌シグナル配列がＯｐｒＥ配列である、請求項５４の組換え細胞。
【請求項５８】
分泌シグナル配列が機能できるように、関心対象の組換えタンパク質またはペプチドに結合している、請求項５４の組換え細胞。
【請求項５９】
細胞が、その核酸によってコードされる分泌シグナルペプチドに機能できるように結合している関心対象のタンパク質またはペプチドを発現する、請求項５４の組換え細胞。
【請求項６０】
タンパク質またはペプチドがその細胞のペリプラスム領域内で発現する、請求項５９の細胞。
【請求項６１】
細胞内の酵素が関心対象のタンパク質またはペプチドからシグナルペプチドを切断する、請求項５４の細胞。
【請求項６２】
細胞が細菌の宿主に由来する、請求項５４の細胞。
【請求項６３】
宿主がシュードモナスである、請求項６２の細胞。
【請求項６４】
宿主がシュードモナス・フルオレッセンスである、請求項６３の細胞。
【請求項６５】
宿主がエシェリキア・コリである、請求項６２の細胞。
【請求項６６】
ｐｂｐ分泌シグナル、ＯｐｒＥ分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドをコードするアミノ酸配列か、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項６７】
分泌ペプチドが、リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ）分泌シグナルを含むか、またはそのｐｂｐシグナル配列と実質的に相同な配列である、請求項６６のペプチド。
【請求項６８】
アミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸２−２４と少なくとも９０％同一である、請求項６６のペプチド。
【請求項６９】
アミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸２−２４と少なくとも９５％同一である、請求項６６のペプチド。
【請求項７０】
アミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸２−２４と少なくとも９８％同一である、請求項６６のペプチド。
【請求項７１】
分泌ペプチドが、外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナルか、またはそのＯｐｒＥシグナル配列と実質的に相同な配列を含む、請求項６６のペプチド。
【請求項７２】
アミノ酸配列が、配列番号：３のアミノ酸２−２１と少なくとも９０％同一である、請求項６６のペプチド。
【請求項７３】
分泌ペプチドが、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナルか、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列を含む、請求項６６のペプチド。
【請求項７４】
分泌ペプチドが、アズリン分泌シグナルか、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列を含む、請求項６６のペプチド。
【請求項７５】
分泌ペプチドが、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルか、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列を含む、請求項６６のペプチド。
【請求項７６】
分泌ペプチドが、リポタンパク質Ｂ分泌シグナルか、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列を含む、請求項６６のペプチド。
【請求項７７】
関心対象の組換えタンパク質またはペプチドに機能できるように結合している、請求項６６のペプチド。
【請求項７８】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナス・フルオレッセンス生物ではない生物に由来する、請求項７７のペプチド。
【請求項７９】
組換えタンパク質またはペプチドを発現させるための発現系であって：
ａ．宿主細胞；ならびに
ｂ．  ｐｂｐ分泌シグナル、ＯｐｒＥ分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列に、機能できるように結合している組換えタンパク質またはペプチドを含むベクター
を含む発現系。
【請求項８０】
分泌シグナル配列がｐｂｐ配列である、請求項７９の系。
【請求項８１】
分泌シグナル配列がＯｐｒＥ配列である、請求項７９の系。
【請求項８２】
分泌シグナル配列がＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナルである、請求項７９の系。
【請求項８３】
分泌シグナル配列がアズリン分泌シグナルである、請求項７９の系。
【請求項８４】
分泌シグナル配列が鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルである、請求項７９の系。
【請求項８５】
分泌シグナル配列がリポタンパク質Ｂ分泌シグナルである、請求項７９の系。
【請求項８６】
分泌シグナル配列が機能できるように、関心対象の組換えタンパク質またはペプチドに結合している、請求項７９の系。
【請求項８７】
細胞が、その核酸によってコードされる分泌シグナルペプチドに機能できるように結合している関心対象のタンパク質またはペプチドを発現する、請求項７９の系。
【請求項８８】
タンパク質またはペプチドがその細胞のペリプラスム領域内で発現する、請求項８７の系。
【請求項８９】
細胞内の酵素が関心対象のタンパク質またはペプチドからシグナルペプチドを切断する、請求項８７の系。
【請求項９０】
細胞が細菌の宿主に由来する、請求項７９の系。
【請求項９１】
宿主がシュードモナスである、請求項９０の系。
【請求項９２】
宿主がシュードモナス・フルオレッセンスである、請求項９１の系。
【請求項９３】
宿主がエシェリキア・コリである、請求項９０の系。
【請求項９４】
発酵培地をさらに含む、請求項７９の系。
【請求項９５】
発酵培地がケミカルインデューサーを含む、請求項９４の系。
【請求項９６】
ｐｂｐ分泌シグナル、ＯｐｒＥ分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌シグナル、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列に、機能できるように結合している組換えタンパク質またはペプチドをコードするベクターを含む細胞を提供する工程、ならびにその組換えタンパク質またはペプチドの発現を実現する条件下でその細胞を培養する工程を含む、宿主細胞内で組換えタンパク質またはペプチドを発現させるための方法。
【請求項９７】
分泌シグナルがｐｂｐ分泌シグナルである、請求項９６の方法。
【請求項９８】
分泌シグナルがＯｐｒＥ分泌シグナルである、請求項９６の方法。
【請求項９９】
分泌シグナルがＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナルである、請求項９６の方法。
【請求項１００】
分泌シグナルがアズリン分泌シグナルである、請求項９６の方法。
【請求項１０１】
分泌シグナルが鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルである、請求項９６の方法。
【請求項１０２】
分泌シグナルがリポタンパク質Ｂ分泌シグナルである、請求項９６の方法。
【請求項１０３】
細胞を無機塩培地で培養する、請求項９６の方法。
【請求項１０４】
細胞を高い細胞密度で培養する、請求項９６の方法。
【請求項１０５】
細胞を少なくとも２０ｇ／Ｌの細胞密度で培養する、請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
組換えタンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項９６の方法。
【請求項１０７】
アフィニティークロマトグラフィーによって組換えタンパク質を精製する、請求項９６の方法。
【請求項１０８】
組換えタンパク質と分泌シグナルとの機能的な連結が、宿主細胞を起源とする酵素によって切断され得る、請求項９６の方法。
【請求項１０９】
発現の間に組換えタンパク質から分泌シグナルが切断される、請求項１０９の方法。
【請求項１１０】
組換えタンパク質またはペプチドが宿主生物を起源とするタンパク質またはペプチドに由来する、請求項９６の方法。
【請求項１１１】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナス・フルオレッセンス生物を起源とするタンパク質またはペプチドに由来する、請求項９６の方法。
【請求項１１２】
組換えタンパク質またはペプチドが宿主生物を起源としないタンパク質またはペプチドに由来する、請求項９６の方法。
【請求項１１３】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナスではない生物に由来する、請求項９６の方法。
【請求項１１４】
組換えタンパク質またはペプチドが真核生物に由来する、請求項９６の方法。
【請求項１１５】
組換えタンパク質が少なくとも二つのシステイン残基を含む配列を含む、請求項９６の方法。
【請求項１１６】
細胞内の組換えタンパク質において少なくとも一つのジスルフィド結合が形成される、請求項９６の方法。
【請求項１１７】
シグナルペプチド配列と、組換えタンパク質配列またはペプチド配列との間に連結配列をさらに含む、請求項９６の方法。
【請求項１１８】
少なくとも５０％の組換えタンパク質が天然のアミノ末端を含む、請求項９６の方法。
【請求項１１９】
少なくとも８０％の組換えタンパク質が天然のアミノ末端を含む、請求項９６の方法。
【請求項１２０】
少なくとも９０％の組換えタンパク質が天然のアミノ末端を含む、請求項９６の方法。
【請求項１２１】
少なくとも５０％の組換えタンパク質が活性である、請求項９６の方法。
【請求項１２２】
少なくとも８０％の組換えタンパク質が活性である、請求項９６の方法。
【請求項１２３】
少なくとも５０％の組換えタンパク質がペリプラスム領域内で発現する、請求項９６の方法。
【請求項１２４】
少なくとも７５％の組換えタンパク質がペリプラスム領域内で発現する、請求項９６の方法。
【請求項１２５】
少なくとも９０％の組換えタンパク質がペリプラスム領域内で発現する、請求項９６の方法。
【請求項１２６】
細胞がシュードモナス細胞である、請求項９６の方法。
【請求項１２７】
細胞がシュードモナス・フルオレッセンス細胞である、請求項１２６の方法。
【請求項１２８】
細胞がエシェリキア・コリ細胞である、請求項９６の方法。
【請求項１２９】
組換えＳｅｃ系分泌シグナル配列に機能できるように結合している組換えタンパク質またはペプチドをコードするベクターを含むシュードモナス・フルオレッセンス細胞を提供する工程、ならびにそのタンパク質またはペプチドの発現を実現する条件下でその細胞を培養する工程を含む、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞内での組換えタンパク質の改良された発現のための方法。
【請求項１３０】
シグナル配列がシュードモナス・フルオレッセンスのゲノムに由来する、請求項１２９の方法。
【請求項１３１】
シグナル配列がシュードモナス・フルオレッセンスのゲノムに由来しない、請求項１２９の方法。
【請求項１３２】
シグナル配列がエシェリキア・コリのゲノムに由来する、請求項１２９の方法。
【請求項１３３】
細胞を無機塩培地で培養する、請求項１２９の方法。
【請求項１３４】
細胞を高い細胞密度で培養する、請求項１２９の方法。
【請求項１３５】
細胞を少なくとも２０ｇ／Ｌの細胞密度で培養する、請求項１３４の方法。
【請求項１３６】
組換えタンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項１２９の方法。
【請求項１３７】
アフィニティークロマトグラフィーによって組換えタンパク質を精製する、請求項１３６の方法。
【請求項１３８】
組換えタンパク質と分泌シグナルとの機能的な連結が、宿主細胞を起源とする酵素によって切断され得る、請求項１２９の方法。
【請求項１３９】
発現の間に組換えタンパク質から分泌シグナルが切断される、請求項１３８の方法。
【請求項１４０】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナス生物に由来する、請求項１２９の方法。
【請求項１４１】
組換えタンパク質またはペプチドがシュードモナスではない生物に由来する、請求項１２９の方法。
【請求項１４２】
組換えタンパク質またはペプチドが真核生物に由来する、請求項１２９の方法。
【請求項１４３】
組換えタンパク質が、少なくとも二つのシステイン残基を含む配列を含む、請求項１２９の方法。
【請求項１４４】
細胞内の組換えタンパク質において少なくとも一つのジスルフィド結合が形成される、請求項１２９の方法。
【請求項１４５】
シグナルペプチド配列と、組換えタンパク質配列またはペプチド配列との間に連結配列をさらに含む、請求項１２９の方法。
【請求項１４６】
少なくとも５０％の組換えタンパク質が天然のアミノ末端を含む、請求項１２９の方法。
【請求項１４７】
少なくとも８０％の組換えタンパク質が活性である、請求項１２９の方法。
【請求項１４８】
少なくとも９０％の組換えタンパク質が活性である、請求項１２９の方法。
【請求項１４９】
少なくとも５０％の組換えタンパク質がペリプラスム領域内で発現する、請求項１２９の方法。
【請求項１５０】
少なくとも７５％の組換えタンパク質がペリプラスム領域内で発現する、請求項１２９の方法。
【請求項１５１】
少なくとも９０％の組換えタンパク質がペリプラスム領域内で発現する、請求項１２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「Ｓｅｃ系分泌によって改良された発現系」という名称で、２００３年１１月２１日に出願された米国仮出願第６０／５２４，１２４号についての優先権を主張する。
【０００２】
本発明はタンパク質生産の分野内にあり、本発明は、適切に処理された異種タンパク質を生産するために改良された、Ｓｅｃターゲティングペプチドおよびシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ分泌系を利用することによる方法である。
【背景技術】
【０００３】
組換え的に生産された１５０を超えるタンパク質およびペプチドをバイオテクノロジー薬剤およびワクチンとして使用することが、米国食品医薬品局(FDA)によって認可されており、その他に３７０のものが臨床試験の状態にある。化学合成を経て生産される小分子の治療学とは異なり、タンパク質およびペプチドは生きている細胞で最も効果的に生産される。しかしながら、細菌内で組換えタンパク質を生産する現在の方法では、不適切に折りたたまれたタンパク質、凝集したタンパク質または不活性なタンパク質が生産されることが多く、タンパク質の多くのタイプには、公知の方法によっては、不十分にしか達成されない二次的な修飾が必要である。
【０００４】
公知の方法に伴う一つの主要な問題は、細胞質内で凝集したタンパク質から作られる封入体の形成にあり、この形成は、過剰量のタンパク質が細胞内で蓄積する時に生じる。組換えタンパク質の生産におけるその他の問題は、発現されたタンパク質について、適切な二次構造および三次構造を確立することである。一つの障壁は、細菌の細胞質がジスルフィド結合の形成を積極的に妨害することであり、この結合は多くの場合、タンパク質の適切な折りたたみの基礎となる(Derman et al. (1993) Science 262:1744-7)。結果として、多数の組換えタンパク質、特に真核生物起源のものは、細菌内で生産された場合、不適切に折りたたまれて不活性となる。
【０００５】
組換え系において、適切に折りたたまれたタンパク質の生産を高めるための数え切れないほど多くの試みが行われてきた。たとえば、研究者は発酵条件を変化させたり(Schein (1989) Bio/Technology, 7:1141-1149)、プロモーターの強さを変更したり、または過剰発現されたシャペロンタンパク質を用いてきた(Hockney (1994) Trends Biotechnol. 12:456-463)、このタンパク質は封入体形成の妨害を助ける能力を有する。
【０００６】
分泌
適切に折りたたまれたタンパク質の収量を増やすための他に採り得るアプローチは、細胞内の環境からそのタンパク質を分泌することである。グラム陰性細菌においては、細胞質から分泌されるタンパク質がペリプラスム空間内に留まること、外膜に結合すること、または細胞外の培養液内に出ることが可能である。タンパク質がその細胞の細胞質から分泌される場合、凝集したタンパク質から成る封入体は通常は形成されない。ペリプラスム空間内への分泌も、適切なジスルフィド結合の形成を促進する周知の効果を有する(Bardwell et al. (1994) Phosphate Microorg. 270-5; Manoil (2000) Methods in Enz. 326: 35-47)。組換えタンパク質を分泌することは魅力的である。というのは、そのタンパク質の単離をより効率的とすることができる；遺伝子組換えタンパク質の適切な折りたたみとジスルフィド結合の形成とを促進し、活性型タンパク質のパーセンテージを高めることができる；封入体の形成を減少させ、宿主細胞への毒性を低減することができる；および可溶型の組換えタンパク質のパーセンテージを高めることができるからである。関心対象(interest)のタンパク質を培地内に排出する潜在性が、タンパク質を生産するために、バッチ培養よりも連続培養を促進できるかもしれない。
【０００７】
グラム陰性細菌は、それらの二重膜を横断してタンパク質を積極的に排出するための数え切れないほど多くの系を進化させてきた（図１を参照）。これらの分泌経路としては、たとえば：原形質膜および外膜の両方を横断するワンステップトランスロケーションのためのＡＢＣ（Ｉ型）経路、Ｐａｔｈ／Ｆｌａ（ＩＩＩ型）経路およびＰａｔｈ／Ｖｉｒ（ＩＶ型）経路；原形質膜を横断するトランスロケーションのためのＳｅｃ（ＩＩ型）経路、Ｔａｔ経路、ＭｓｃＬ経路およびＨｏｌｉｎｓ経路；ならびに原形質膜および外膜を横断するツーステップトランスロケーションのためのＳｅｃプラスフィンブリアル・アッシャー・ポーリン（ＦＵＰ）経路、Ｓｅｃプラスオートトランスポーター（ＡＴ）経路、Ｓｅｃプラスツーパートナー分泌（ＴＰＳ）経路、Ｓｅｃプラスメイン・ターミナル・ブランチ（ＭＴＢ）経路、およびＴａｔプラスＭＴＢ経路が挙げられる。すべての細菌がこれらの分泌経路のすべてを有しているわけではない。
三つのタンパク質系（Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）が、１つのエネルギー共役工程において両方の膜を横断してタンパク質を分泌する。四つの系（Ｓｅｃ、Ｔａｔ、ＭｓｃＬおよびＨｏｌｉｎｓ）が、内膜のみを横断して分泌し、そしてその他の四つの系（ＭＴＢ、ＦＵＰ、ＡＴおよびＴＰＳ）が外膜のみを横断して分泌する。
【０００８】
シグナル配列を伴うペプチドの分泌の最も一般的な形式は、Ｓｅｃ系に関係する。Ｓｅｃ系は、Ｎ−末端のシグナルペプチドを伴うタンパク質が細胞膜を横断する排出を担当している(Agarraberes and Dice (2001) Biochim Biophys Acta. 1513:1-24; Mueller et al. (2001) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 66:107-157を参照)。Ｓｅｃファミリーのタンパク質複合体は、原核生物および真核生物において広く見出される。細菌のＳｅｃ系は、輸送タンパク質、シャペロンタンパク質(SecB)またはシグナル認識粒子(SRP)およびシグナルペプチダーゼ（SPase IおよびSPase II）から成る。エシェリキア・コリ(E.coli)におけるＳｅｃ輸送複合体は、三つの内在性膜タンパク質、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥおよびＳｅｃＧ、ならびに細胞質内のＡＴＰａｓｅ、ＳｅｃＡから成る。ＳｅｃＡはＳｅｃＹ／Ｅ／Ｇ複合体を動員して、活性なトランスロケーションチャネルを形成させる。シャペロンタンパク質ＳｅｃＢは初期のポリペプチド鎖と結合して、折りたたみを防ぎ、ＳｅｃＡに向かわせる。次いで、線状のポリペプチド鎖がＳｅｃ  ＹＥＧチャネルを経由して輸送され、シグナルペプチドの切断の後にペリプラズム内でこのタンパク質が折りたたまれる。三つの補助的なタンパク質（ＳｅｃＤ、ＳｅｃＦおよびＹａｊＣ）は、分泌には必須ではないが、多くの条件下、特に低温の条件下で分泌を１０倍まで促進させる複合体を形成する。
【０００９】
ペリプラズム内に輸送される、すなわちII型分泌系によって輸送されるタンパク質を、さらなる工程において細胞外の培地に排出することもできる。このメカニズムは一般的に、オートトランスポーター、ツーパートナー分泌系、メイン・ターミナル・ブランチ系またはフィンブリアル・アッシャー・ポーリンを経由してなされる。
【００１０】
グラム陰性細菌において知られている十二の分泌系のうちの八つは、発現されたタンパク質の一部として見出されるターゲティングシグナルペプチドを利用することが知られている。これらのシグナルペプチドは、細胞がタンパク質をその適切な目標に正確に導くように、分泌系のタンパク質と相互に作用する。これらの八つのシグナルペプチドに基づく分泌系のうちの五つは、Ｓｅｃ系に関係する分泌系である。これらの五つのものは、Ｓｅｃ依存性細胞膜トランスロケーションに関係するものとしてみなされ、そこで作用するこれらのシグナルペプチドは、Ｓｅｃ依存性分泌シグナルとみなすことができる。適切な分泌シグナルを開発する際の課題の一つは、そのシグナルが適切に発現され、発現されたタンパク質から切断されることを確実にすることである。
【００１１】
Ｓｅｃ依存性タンパク質の排出の痕跡は、排出されたタンパク質において、短く（約３０アミノ酸）主に疎水性のアミノ末端シグナル配列が存在することである。このシグナル配列はタンパク質の排出を助け、排出されたタンパク質がペリプラズムに到達した時に、ペリプラスムのシグナルペプチダーゼによって切り離される。典型的なＮ−末端Ｓｅｃシグナルペプチドは、少なくとも一つのアルギニン残基またはリジン残基を伴うＮ−ドメイン、次いで疎水性残基の配列を含むドメイン、およびシグナルペプチダーゼについての切断部位を含むＣ−ドメインを含む。
【００１２】
細菌のタンパク質の生産系は、タンパク質を細胞質外にターゲット化しようとして、遺伝子組換えタンパク質構築物を関心対象のタンパク質および分泌シグナルの両方を含む融合タンパク質として設計するように開発されてきた。
【００１３】
細胞から上清内にタンパク質を分泌させるための戦略が開発されてきた。たとえば、Georgiouによる米国特許第5，348，867号では、細胞表面上でのペプチドの発現に焦点を当てている。Korea Advanced Institute of Science and Technologyによる米国特許第6，329，172号では、シュードモナス・フルオレッセンスにおけるABCトランスポーターと、関心対象のタンパク質と共に同時発現されたこのトランスポーターを利用してタンパク質を細胞外に排出する方法とが記載されている。Novo NordiskによるPCT公報WO96/17943号では、関心対象のタンパク質をペリプラズムに向けるためにそれらタンパク質に結合した、エイ・リティカス(A. lyticus)のプロテアーゼIまたはある種のバシラス(Bacillus)のプロテアーゼの配列の一部を用いた、ペリプラズムからの漏出による細胞からのタンパク質の細胞外発現に焦点を当てている。Boehringer Ingelheim, Int.によるPCT公報WO02/40696号および米国公開公報第2003/0013150号では、細菌のシグナルペプチドOmpAを用いた、細胞外でのタンパク質の発現が記載されている。これらの公報は、ＯｍｐＡがＳｅｃＥと単独でまたはアミノ酸配列ＳＥＧＮを含むタンパク質もしくはペプチドと一緒に相互作用することを教示する。
【００１４】
発現を高めるためのその他の戦略は、タンパク質をペリプラズムに向けることに向けられて(targeting)いる。いくつかの研究では、非Ｓｅｃ型分泌に焦点を当てている（たとえばTrustees of the University of PennsylvaniaによるPCT公報WO03/079007号；Georgiouによる米国公報第2003/0180937号、WeinerおよびTurnerによる米国公報第2003/0064435号；およびResearch Foundation of the State University of New YorkによるPCT公報WO00/59537号を参照すること）。しかしながら、研究の大部分はＳｅｃ型分泌系による外因性タンパク質の分泌に焦点を当てられてきた。
【００１５】
組換えペプチドまたはタンパク質を発現させる際に用いるための分泌シグナルが多数記載されている。たとえば、Celtrix Pharmaceuticals社による米国特許第5,914,254号では、インターロイキン１様タンパク質に由来する融合パートナーおよびリーダー配列を用いて、タンパク質の溶解性および活性を高めることが記載されている。
【００１６】
Genentechによる米国特許第4，963，495号では、エシェリキア・コリのエンテロトキシンについての配列のような原核生物のシグナル配列による、真核生物のタンパク質、特にヒト成長ホルモンの発現が記載されている。Genentechによる欧州特許第0 177 343号ではペリプラスムＨＧＨの発現が記載されており、シュードモナス・アエルギノーサ(P. aeruginosa)のエンテロトキシンＡのシグナル配列を利用して成し遂げることができる。
【００１７】
Biogenによる米国特許第5，082，783号では、ＤＮＡシグナル配列、たとえば酵母由来のＭｆα１シグナル配列に機能できるように結合した最大限でも中間的な強さのプロモーター、たとえば、アクチンまたはイソ−１−シトクロムｃプロモーターからの、タンパク質、たとえばソマトメジンＣ、組織プラスミノゲンアクチベータまたは腫瘍壊死因子の発現が記載されている。
【００１８】
PastanらによるPCT公報WO89/10971号では、ＯｍｐＡシグナル配列を用いたエシェリキア・コリにおけるシュードモナスのエキソトキシンの発現が記載されており、ペリプラズムおよび培地において、タンパク質の部分が異なって発現していることが示されている。
【００１９】
Novo Nordiskによる米国特許第6,156,552号では、エシェリキア・コリまたはリパーゼ欠損型シュードモナス・メンドシナ(P. mendocina)において、シグナル配列を用いて改変されたシュードモナスのリパーゼの発現が記載されている。このシグナル配列は、エシェリキア・コリのphoAシグナル配列でもよい。Novozymeによる米国特許第6，495，357号;第6，509，181号;第6，524，827号;第6，528，298号;第6，558，939号;第6，608，018号;および第6，617，143号でも、シグナル配列を用いてシュードモナス起源の酵素を含めたリパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼおよびその他の酵素の生産が記載されており、ここで、このシグナル配列は発現された酵素を起源とするものが好ましいが、たとえばリゾムコール種に由来するもの、サッカロマイセス・セレビシエに由来するα-因子についての遺伝子またはバシラス種に由来するアミラーゼ遺伝子もしくはプロテアーゼ遺伝子であってもよい。
【００２０】
Xomaによる米国特許第5,595,898号;第5,698,435号;および第6,204,023号では、ペクチンリアーゼのシグナルペプチドを用いるキメラ抗体断片の産生が記載されている。この特許では、ペクチンリアーゼ酵素がシュードモナス・フルオレッセンスを含めた種々の生物にあることが知られていることが開示されているが、これらの配列は例示されていない。
【００２１】
Genentechによる米国特許第6,258,560号では、エシェリキア・コリにおける、既に記載されているようなタンパク質を好ましくは起源とする細菌のシグナル配列によるＤＮＡ消化タンパク質の発現が記載されているが、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンのリーダー配列からなる群より選択されるものでも可能である。この特許でも、シューオモナス(Pseuomonads)においてタンパク質を発現させることもできることが述べられているが、その例示はない。
【００２２】
HabermannおよびErtlならびにAventisによるPCT公報WO01/21662号、WO02/068660号および米国公開公報2003/0044906号では、エシェリキア・コリに由来するヒルジン誘導体の分泌が記載されている。記載されたシグナル配列のうちの一つは、シュードモナス・フルオレッセンスのＯｐｒＦタンパク質に由来する配列である。PCT公報WO01/21662号において一致した本出願は、配列ＮＴＬＧＬＡＩＧＳＬＩＡＡＴＳＦＧＶＬＡであり、これはDe (1995) FEMS Micr. Let. 127:263-272に記載された。この刊行物においては、シュードモナス内で発現プラスミドを用いる記載は無く、この戦略を用いたヒルジン発現の増加は、エシェリキア・コリにおけるコントロールの発現と比較した場合、最低限に過ぎない。
【００２３】
Unilever Patent Holdings B.V.による米国第5，641，671号は、タンパク質を安定化させることによる、ピー・グルメ(P. glumae)に由来するシュードモナスのリパーゼ、好ましくはそのリパーゼ遺伝子に内在するシグナル配列による発現を対象としている。
【００２４】
Atkinsonらによる欧州特許EP 0 121 352号では、タンパク質のペリプラスム発現を促進するためにベクター内で用いるための、シュードモナス種ＲＳ−１６のカルボキシペプチダーゼに由来するシステインの無いリーダー配列が記載されている。この特許では、シグナル配列におけるシステイン残基によって、細胞膜と遅延する分泌との間の相互作用を促進させることができることが開示されている。開示されたシグナル配列はＭＲＰＳＩＨＲＴＡＩＡＡＶＬＡＴＡＦＶＡＧＴである。
【００２５】
細胞質外にタンパク質をターゲット化するためのシグナル配列に依存する戦略は、多くの場合、不適切に加工（プロセス）された(processed)タンパク質を生産する。このことは、Ｓｅｃ系を経由して分泌を導くようなアミノ末端分泌シグナルについて特に当てはまる。この系によって加工されるタンパク質は、多くの場合、分泌シグナルの部分が維持されたままであるか、不適切に切断されることが多い連結要素を必要とするか、またはその末端で先端が切断されるかのいずれかとなる。
【００２６】
上記の技術から明らかなように、タンパク質を宿主細胞のペリプラズムに向けるための多数の戦略が開発されてきた。しかしながら、公知の戦略は、治療用に精製できるような、正確に加工された活性な組換えタンパク質を高収率で一貫してもたらすことは無かった。以前の戦略における一つの主要な限界は、不適切な細胞系においては能力の低い分泌シグナル配列を伴うタンパク質が発現することであった。
【００２７】
結果として、正確に加工（プロセシング(processing)）された形態の遺伝子組換えタンパク質を生産するための組換えポリペプチドの分泌と正確な加工とを可能とする大規模発現系を改良するための、本技術分野における必要性がまだ存在する。理想的な系によって高レベルの可溶性タンパク質が生産され、そのタンパク質をペリプラズムに向けること、そして可能であれば細胞外の培地に向けることが可能となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、正確に加工された組換えタンパク質の宿主細胞内での発現を高める系(system)および方法(method)を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、活性な組換えタンパク質の宿主細胞内での発現を高めるための系および方法を提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、正確に加工された組換えタンパク質の高レベルの発現を伴った工業規模の系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、細胞発現系において、高レベルの正確に加工された組換えタンパク質を生産するための改良された組成物および方法を提供する。本発明は、シュードモナス・フルオレッセンスが、分泌されたタンパク質の生産のための改善されたプラットフォームであるという驚くべき発見の上に築かれている。特に、シュードモナス・フルオレッセンスは、意外にも、その他の細菌の発現系において通常見られるより高レベルで、そのＳｅｃ分泌系に向けられた外因性タンパク質を生産し、これらのタンパク質を、細胞のペリプラズム内にてより高レベルで輸送し、完全に加工された組換えタンパク質の回収の増加を導く。本発明は、シュードモナス・フルオレッセンス生物に由来する新しく特定された分泌シグナルを含み、ペプチド、ベクターおよびこれらの配列を組み込んだ発現系を含む。これによって、発現された関心対象のタンパク質またはペプチドを、グラム陰性細菌のペリプラズムにまたは細胞外の環境内に向けることを促進することができる。本発明はさらに、シグナルペプチドのリーダー配列と共に外因性タンパク質が発現された時に、ペリプラズム内で、正確に加工された形態の外因性タンパク質の改良された生産をもたらすシュードモナス・フルオレッセンスの宿主細胞を含む。
【００３２】
一つの実施形態においては、リン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナル、外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドの配列、またはそれと実質的に相同な配列を伴う単離されたペプチド。
【００３３】
別の実施形態においては、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドの配列、またはそれと実質的に相同な配列を含むペプチドをコードする配列を伴う単離された核酸が提供される。別の実施形態においては、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドの配列を含むペプチド、またはそれと実質的に相同な配列を含むペプチドをコードする配列を伴う核酸にハイブリダイズする核酸が提供される。一つの実施形態においては、この核酸は厳密な条件下でハイブリダイズする。
【００３４】
一つの実施形態においては、ペプチド配列は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ（配列番号：１）の少なくともアミノ酸２−２４のリン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、そのペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列：ａｔｇ  ａａａ  ｃｔｇ  ａａａ  ｃｇｔ  ｔｔｇ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｇｃａ  ａｔｇ  ａｃｔ  ｔｔｔ  ｇｔｃ  ｇｃｔ  ｇｃｔ  ｇｇｃ  ｇｔｔ  ｇｃｇ  ａｃｃ  ｇｃｃ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｇｔｇ  ｇｃｃ（配列番号：２）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、配列番号：２の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００３５】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ（配列番号：３）の少なくともアミノ酸２−２１の配列を有する外膜ポーリンＥ（ＯｐｒＥ）分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、そのペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列：ａｔｇ  ａａｇ  ａａｇ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｔ  ｇｔｇ  ｇｃｔ  ｇｔａ  ａｃｇ  ｔｔｇ  ｇｇｃ  ｇｃａ  ａｔｃ  ｇｃｃ  ｃａｇ  ｃａａ  ｇｃａ  ｇｇｃ  ｇｃｔ（配列番号：４）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、配列番号：４の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００３６】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号：５）の少なくともアミノ酸２−２０の配列を有するアズリン分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、そのペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列：ａｔｇ  ｔｔｔ  ｇｃｃ  ａａａ  ｃｔｃ  ｇｔｔ  ｇｃｔ  ｇｔｔ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ａｃｔ  ｃｔｇ  ｇｃｇ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｔｔｇ  ｃｔｔ  ｇｃｔ（配列番号：６）と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、配列番号：６の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００３７】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｌａ（配列番号：７）の少なくともアミノ酸２−２３の配列を有するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質（ＬＡＯｂｐまたはＫＲＯｂｐ）分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、そのペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列：ａｔｇ  ｃａｇ  ａａｃ  ｔａｔ  ａａａ  ａａａ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｔｃ  ｔｃｇ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｔｔｃ  ａｇｃ  ｇｃｃ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｇｃａ（配列番号：８）と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、配列番号：８の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００３８】
さらに別の実施形態においては、ペプチド配列は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ（配列番号：９）の少なくともアミノ酸２−３２の配列を有する鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質［Ｆｅ（ＩＩＩ）ｂｐ］分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、そのペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列：ａｔｇ  ａｔｇ  ａｔｃ  ｃｇｔ  ｇａｃ  ａａｃ  ｃｇａ  ｃｔｃ  ａａｇ  ａｃａ  ｔｃｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ｃｇｃ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ａｃｃ  ｃｔｃ  ａｃｃ  ｃｔａ  ｃｔｃ  ａｇｃ  ｃｔｇ  ａｃｃ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ｔｃｇ  ｃｃｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｃａｔ  ｔｃｔ（配列番号：１０）と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、配列番号：１０の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００３９】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ（配列番号：１１）の少なくともアミノ酸２−１７の配列を有するリポタンパク質Ｂ（ＬｐｒＢ）分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、そのペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列：ａｔｇ  ａｔｃ  ａａａ  ｃｇｃ  ａａｔ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ｇｔｔ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ｃｔｇ  ｔｔｇ  ａｇｃ  ｇｃｔ（配列番号：１２）と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、配列番号：１２の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００４０】
別の実施形態は、機能できるようにプロモーターに結合している核酸であって、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルの配列、またはそれと実質的に相同な配列を伴う、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドの核酸を含む発現ベクターである。別の実施形態においては、このベクターは、関心対象の組換えタンパク質またはペプチドの発現のためのコード配列をさらに含む。一つの実施形態においては、この発現ベクターは、分泌シグナルについてのコード配列または組換えタンパク質もしくはペプチドについてのコード配列に隣接したタグ配列をさらに含む。
【００４１】
発現ベクターを含む細胞も提供される。一つの実施形態においては、この細胞は、本明細書で記載されるように、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌シグナルに結合した組換えタンパク質を発現する。この細胞は、ペリプラズム領域内にそのタンパク質を発現してもよい。特定の実施形態においては、この細胞は、組換えタンパク質を外側の細胞壁を経由して細胞外に生産してもよい。一つの実施形態においては、この細胞は細菌細胞であり、そして特定の下位実施形態においては、この細胞はシュードモナス・フルオレッセンス細胞またはエシェリキア・コリ細胞である。その他の実施形態においては、この細胞は真核細胞であり、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物の細胞または植物細胞でもよい。
【００４２】
一つの実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞である。別の実施形態においては、この細胞はシュードモナスであり、そして特定の実施形態においては、この細胞はシュードモナス・フルオレッセンス細胞である。
【００４３】
別の実施形態においては、宿主細胞内で組換えタンパク質を作製するための、改良された方法および系が提供される。この改良点には、関心対象の組換えタンパク質またはペプチドに機能するように結合した、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質もしくはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるペプチド、またはそれと実質的に相同なペプチドであるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドの宿主細胞内での発現が含まれる。一つの実施形態においては、この発現は、高密度の細胞培養で生じる。細胞内の成熟タンパク質からこのＳｅｃ分泌シグナルが切断されてもよい。別の実施形態においては、この分泌シグナルは切断されずに、その細胞は分泌シグナルに結合した組換えタンパク質を発現する。一つの実施形態においては、タグ配列は、関心対象のタンパク質に機能するように結合されている。
【００４４】
別の実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス内で、Ｓｅｃ系分泌シグナルに結合したタンパク質を発現させることによって、分泌された組換え型外因性タンパク質を作製するための方法(process)が提供される。本実施形態は、分泌されたタンパク質の発現のための改良された発現プラットフォームとして、シュードモナス・フルオレッセンスを認識したことに基づく。一つの実施形態においては、Ｓｅｃ分泌シグナルはシュードモナス・フルオレッセンスのゲノムに由来し、しかしながら別の実施形態においては、Ｓｅｃ分泌シグナルはエシェリキア・コリのゲノムに由来する。その他の実施形態においては、この分泌シグナルは、発現されるタンパク質を起源としてもよい。
【００４５】
一つの実施形態においては、この宿主細胞はペリプラズムを有し、Ｓｅｃ系ペプチドの発現によって、組換えタンパク質を細胞のペリプラズムに向けることができる。下位実施形態においては、この発現によって細胞外タンパク質の生産が導かれる。この方法は、ペリプラズムからまたは細胞外の培地から組換えタンパク質を精製する工程を含んでもよい。タンパク質に結合したＳｅｃシグナルを発現させることができ、細胞からこのシグナル結合タンパク質を精製することができる。従って、一つの実施形態においては、この単離されたペプチドは、分泌シグナルと関心対象のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質である。しかしながら、タンパク質がペリプラズムに向けられた場合、その分泌シグナルもそのタンパク質から切断することができる。一つの実施形態においては、Ｓｅｃ系分泌シグナルとタンパク質またはペプチドとの間の連結を改変して、分泌シグナルの切断を促進する。
【００４６】
一つの実施形態においては、この方法によって、正確に加工された組換えタンパク質を細胞内で生産することができる。別の実施形態においては、Ｓｅｃ系ペプチドの発現によって、活性な組換えタンパク質を細胞内で生産することができる。本発明の方法はまた、そのタンパク質がＳｅｃ分泌シグナルを用いずに発現した場合と比較して、組換えタンパク質の収量の増加を導くことができる。
【００４７】
一つの実施形態においては、この方法によって、少なくとも０．１ｇ／Ｌの正確に加工されたタンパク質が生産される。別の実施形態においては、この方法によって、０．１から１ｇ／Ｌの正確に加工されたタンパク質が細胞内で生産される。下位実施形態においては、生産されたすべてのタンパク質は、少なくとも約２．０から約５０．０ｇ／Ｌであり得る。いくつかの実施形態においては、正確に加工されたタンパク質の生産量は、生産されたすべての組換えタンパク質の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％またはそれを超える。
【００４８】
関心対象のタンパク質またはペプチドは、治療的に有用なタンパク質またはペプチドであり得る。一つの実施形態においては、このタンパク質またはペプチドは真核生物種に由来する。別の実施形態においては、このタンパク質配列は哺乳動物の配列に由来する。別の実施形態においては、タンパク質の活性型は少なくとも一つのジスルフィド結合を含む。さらに別の実施形態においては、このタンパク質またはペプチドは、ホルモン、増殖因子、細胞外レセプターもしくはリガンド、プロテアーゼ、キナーゼ、血液タンパク質、ケモカインもしくはサイトカインまたは抗体に由来する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明は、シュードモナス・フルオレッセンスにおいて分泌シグナル配列を発見したことに基づく。一つの実施形態においては、本発明は、シグナルペプチド配列、シグナルペプチドをコードする核酸、そのタンパク質またはペプチドと共に発現した場合に関心対象のタンパク質またはペプチドの分泌を促進させることができるシグナルペプチド配列であって、シュードモナス・フルオレッセンス生物に由来するシグナルペプチド配列をコードする核酸を含むベクター、および細胞を提供する。シュードモナス・フルオレッセンスに由来するＳｅｃ分泌シグナルを用いて、高レベルの正確に加工された組換えタンパク質を細胞発現系内で生産するための改良された方法も提供される。
【００５０】
本発明は、シュードモナス・フルオレッセンスが、種々のタンパク質の生産のために改良されたプラットフォームであるという認識でもある。特に、シュードモナス・フルオレッセンスは、その他の細菌の発現系において通常見られるよりより高レベルで、正確に加工された型の外因性Ｓｅｃ分泌系に向けられたタンパク質を生産し、これらのタンパク質をより高レベルで細胞のペリプラズムに輸送し、完全に加工された組換えタンパク質の回収の増加を導く。従って、一つの実施形態においては、本発明は、Ｓｅｃ分泌シグナルに結合したターゲットタンパク質を発現させることによって、シュードモナス・フルオレッセンス細胞内で外因性タンパク質を生産するための方法を提供する。
【００５１】
特定のシュードモナスが、その他の細菌の発現系と比較して、ペプチドおよび酵素の市販のための発現にとって有利な点を提供することは、既に実証されている。特に、シュードモナス・フルオレッセンスは有利な発現系として認められてきた。シュードモナス・フルオレッセンスは、土壌、水および植物の表面環境でコロニーを形成する一般的な非病原性の腐生細菌の一群を含む。シュードモナス・フルオレッセンスに由来する市販の酵素は、環境汚染、洗剤の添加剤のようなものを軽減させるために、および立体選択的な加水分解のために用いられてきた。シュードモナス・フルオレッセンスを農業で用いて、病原体の制御も行っている。Mycogen社（１９９０年代の後半にDow AgroSciences社によってその全体が買収された）は、１９８０年代の中ごろにシュードモナス・フルオレッセンスにおいて細菌の組換えタンパク質を発現させることに着手し、バシラス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)の毒素をシュードモナス・フルオレッセンス内で発現させることに関して、１９８５年１月２２日に最初の特許出願を行った（「生物農薬の細胞内封入」）。１９８５年から２００４年の間に、Mycogen社、後のDow Agro Sciences社ならびにその他の企業は、農薬、殺虫剤および殺線虫毒素の生産に関する特許出願、ならびに特定の毒性配列さらにはこれらの発現を促進させるための遺伝子操作に関する特許出願において、シュードモナス・フルオレッセンスを農業で使用することに資本投下した。
【００５２】
DowPharma社は最近、組換えタンパク質を生産するためにシュードモナス・フルオレッセンスを利用する分野におけるいくつかの係属中の特許出願を有している。Dow Global Technologies社によるPCT出願WO03/068926号およびWO03/068948号では、宿主細胞としてシュードモナス、特にシュードモナス・フルオレッセンスを利用できるエクストレモイズム(extremoyzme)過剰発現系を利用できることが記載されている。これらの公報では、シグナルペプチドと共にエクストレモザイム(extremozyme)が発現することが一般的に開示されているが、特定の配列についての開示がなく、この細胞が分泌に優れていることについての認識も無い。
【００５３】
Dow Global Technologies社による「ペプチドの低コスト生産」という名称で、２００３年４月２２日に出願されたPCT公報WO03/089455号では、シュードモナス、特にシュードモナス・フルオレッセンスにおける鎖状前駆体のような小ペプチド、たとえば抗菌性ペプチドの低コスト生産方法が記載されている。この公報では、シグナルペプチドと共に鎖状ペプチドの発現が開示されているが、特定の配列については開示されていない。
【００５４】
Dow Global Technologies社による「安息香酸エステルおよびアントラニル酸エステルに誘導させるプロモーター」という名称の、PCT公報WO04/005221号では、シュードモナス・フルオレッセンスに由来する、市販の原核生物の発酵系のための安息香酸エステルまたはアントラニル酸エステル誘導性プロモーターが提供されている。この公報では、シグナルペプチドをプロモーターとともに封入することは開示されているが、特定のシグナル配列については開示されていない。
【００５５】
ペプチド
一つの実施形態においては、リン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナル、外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドのアミノ酸配列であるか、またはそれと実質的に相同なアミノ酸配列を伴う単離されたペプチドが提供される。
【００５６】
別の実施形態においては、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質もしくはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルのアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同なアミノ酸配列を伴う単離されたペプチドが提供される。一つの実施形態においては、この単離されたペプチドは、分泌シグナルと関心対象のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質である。
【００５７】
一つの実施形態においては、ペプチド配列は、少なくともアミノ酸：Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ（配列番号：１）のリン酸結合タンパク質(pbp)分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。別の実施形態においては、このペプチド配列は、配列番号：１の少なくともアミノ酸２−２４を含む。別の実施形態においては、このペプチド配列は配列番号：１のトランケーションを含み、そのアミノ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸まで切断されているが、分泌シグナルの活性は保持している。
【００５８】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、少なくともアミノ酸：Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ（配列番号：３）の配列を有する外膜ポーリンＥ(OprE)分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。一つの実施形態においては、そのペプチドは、配列番号：３の少なくともアミノ酸２-２１であるか、またはそれと相同である。別の実施形態においては、このペプチド配列は配列番号：３のトランケーションを含み、そのアミノ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸まで切断されているが、分泌シグナルの活性は保持している。一つの実施形態においては、２位のＬｙｓがＴｙｒで置換されるように、配列番号：３のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、５位のＴｈｒがＳｅｒで置換されるように、配列番号：３のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、８位のＶａｌがＬｅｕで置換されるように、配列番号：３のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１０位のＶａｌがＶａｌおよびＡｒｇで置換されるように、配列番号：３のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１４位のＡｌａがＶａｌで置換されるように、配列番号：３のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１５位のＩｌｅがＬｅｕで置換されるように、配列番号：３のペプチドを改変する。
【００５９】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、少なくともアミノ酸：Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号：５）の配列を有するアズリン分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。一つの実施形態においては、そのペプチドは、配列番号：５の少なくともアミノ酸２−２０であるか、またはそれと相同である。別の実施形態においては、このペプチド配列は配列番号：５のトランケーションを含み、そのアミノ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸まで切断されているが、分泌シグナルの活性は保持している。一つの実施形態においては、２位および３位のＰｈｅ−ＡｌａがＬｅｕ−ＡｒｇまたはＩｌｅ−Ａｒｇで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、５位のＬｅｕがＡｌａで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、６位のＶａｌがＡｌａで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、６−８位のＶａｌ−Ａｌａ−ＶａｌがＩｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１１位のＬｅｕがＩｌｅで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１２位のＴｈｒがＳｅｒで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１４位のＡｌａがＬｅｕまたはＰｈｅで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１６位のＧｌｙがＡｌａで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１７位のＧｌｎがＳｅｒまたはＰｒｏで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１８位のＬｅｕがＶａｌで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。一つの実施形態においては、１８−１９位のＬｅｕ−ＬｅｕがＶａｌ−Ｐｈｅで置換されるように、配列番号：５のペプチドを改変する。
【００６０】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、少なくともアミノ酸：Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｌａ（配列番号：７）の配列を有するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質（ＬＡＯｂｐまたはＫＲＯｂｐ）分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。一つの実施形態においては、そのペプチドは、配列番号：７のアミノ酸２−２３であるか、またはそれと実質的に相同である。別の実施形態においては、このペプチド配列は配列番号：７のトランケーションを含み、そのアミノ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸まで切断されているが、分泌シグナルの活性は保持している。
【００６１】
さらに別の実施形態においては、ペプチド配列は、少なくともアミノ酸：Ｍｅｔ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ（配列番号：９）の配列を有する鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質［Ｆｅ（ＩＩＩ）ｂｐ］分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。一つの実施形態においては、そのペプチドは、配列番号：９のアミノ酸２−３２であるか、またはそれと実質的に相同である。別の実施形態においては、このペプチド配列は配列番号：９のトランケーションを含み、そのアミノ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸まで切断されているが、分泌シグナルの活性は保持している。
【００６２】
別の実施形態においては、ペプチド配列は、少なくともアミノ酸：Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ（配列番号：１１）の配列を有するリポタンパク質Ｂ（ＬｐｒＢ）分泌シグナルペプチドの配列であるか、またはそれと実質的に相同な配列である。一つの実施形態においては、そのペプチドは、配列番号：１１のアミノ酸２−１７であるか、またはそれと実質的に相同である。別の実施形態においては、このペプチド配列は配列番号：１１のトランケーションを含み、そのアミノ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸まで切断されているが、分泌シグナルの活性は保持している。
【００６３】
別の実施形態においては、分泌シグナルは、エシェリキア・コリのタンパク質に由来する分泌シグナルである。一つの実施形態においては、分泌シグナルは、エシェリキア・コリに由来するタンパク質についての天然のシグナル配列である。一つの実施形態においては、タンパク質はシャペロンタンパク質である。このタンパク質はジスルフィド結合を形成するタンパク質であり得る。一つの実施形態においては、配列は、エシェリキア・コリのシャペロンタンパク質、たとえばｓｋｐタンパク質などの天然の配列である。
【００６４】
ｓｅｃ経路のためのシグナルペプチドは一般的に、次の三つのドメインから成る：（ｉ）プラスに帯電したｎ領域、（ｉｉ）疎水性のｈ領域および（ｉｉｉ）帯電していないが極性のｃ領域。シグナルペプチダーゼ用の切断部位は、ｃ領域内に位置する。しかしながら、シグナル配列の保存性の度合いおよび長さ、ならびに切断部位の位置は、異なるタンパク質の間で違っていてもよい。たとえば、分泌シグナル配列は、分泌シグナルを特定するために設計されたコンピュータープログラム、たとえばＳｉｇｎａｌＰプログラムまたはHiller, et al. (2004) Nucleic Acids Research 32 （電子版）: W375-W379に記載されたようなもの；URL: http://www.predisi.deにおいてインターネット上で利用することができる、を用いて特定される任意の配列であり得る。
【００６５】
配列の相同性
本明細書で用いられるように、「相同」という用語は、ｉ）所定のオリジナルのタンパク質またはペプチドの配列と実質的に（すなわち少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）類似したアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドであって、オリジナルのタンパク質またはペプチドの所望の機能を保持するものか、またはｉｉ）所定の核酸の配列と実質的に（すなわち少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）類似した配列を有する核酸であって、オリジナルの核酸配列の所望の機能を保持するもの、のいずれかを意味する。本発明および開示のすべての実施形態においては、開示された任意のタンパク質、ペプチドまたは核酸を、所望の機能を保持する、相同または実質的に相同なタンパク質、ペプチドまたは核酸と置換することができる。本発明および開示のすべての実施形態において、任意の核酸が開示される場合、本発明は、その開示される核酸にハイブリダイズするすべての核酸をも包含するものとみなされるべきである。
【００６６】
一つの実施形態においては、相同なポリペプチドのアミノ酸配列は、所定のオリジナルのポリペプチドの変異であり、ここで、置換された変異がオリジナルのポリペプチドの所望の機能を保持する条件で、オリジナルのポリペプチドのアミノ酸残基の約３０％以下、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０％を含む、をその他の単数（または複数）のアミノ酸残基で置換することによって、この変異の配列を得ることができる。実質的に相同な変異アミノ酸は、所定のポリペプチドと少なくとも約７０％相同、すなわち７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％相同となる。
【００６７】
一つの実施形態においては、変異とは類似的に置換されたものかまたはオリジナルのポリペプチドの類似変異である。「類似的に置換された変異」という用語は、オリジナルのポリペプチドに関連して「類似な」アミノ酸残基の置換である異なる残基を含む変異を意味するが、その全ての相違が「類似」置換というわけではない。本明細書で用いられるように、「類似変異」という用語は、異なる残基のそれぞれが「類似」アミノ酸残基の置換であるところの変異を意味する。この文脈において用いられるように、「類似」アミノ酸残基という用語は、表１に示される１５の保存的または半保存的なグループのいずれか一つの一員であるという残基を意味する。
【表１】
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【００６８】
一つの実施形態においては、少なくとも５０％の置換が保存的なアミノ酸置換として現れ、そして残りの置換は半保存的な置換となる。その他の実施形態においては、少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、または少なくとも９０％の類似置換が保存的なアミノ酸置換として現れる。
【００６９】
別の実施形態においては、少なくとも５０％の類似置換が保存的なアミノ酸置換として現れ、それと共に、残りの類似置換が半保存的なものとして現れる。少なくとも５５％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも６５％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、または少なくとも８０％の類似置換が、保存的なアミノ酸置換として現れるだろう。一つの実施形態においては、置換された変異は、所定のオリジナルのポリペプチドの類似変異となる。
【００７０】
核酸配列
本発明は、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルと実質的に相同な配列を含むペプチドをコードする配列を伴う単離された核酸をも包含する本発明が提供される。本発明の別の実施形態においては、ｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルと実質的に相同な配列を含むペプチドをコードする配列を伴う、単離された核酸にハイブリダイズする核酸が提供される。特定の実施形態においては、ハイブリダイズしている核酸は、高ストリンジェントな条件下で結合することになる。一般的に、この高ストリンジェントな条件とは、６８℃以上でのハイブリダイゼーションを意味する。
【００７１】
一つの実施形態においては、配列番号：１の少なくともアミノ酸２−２４のリン酸結合タンパク質（ｐｂｐ）分泌シグナルペプチドの配列と実質的に相同なペプチド配列をコードする核酸が提供される。別の実施形態においては、このペプチドをコードする核酸配列は：ａｔｇ  ａａａ  ｃｔｇ  ａａａ  ｃｇｔ  ｔｔｇ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｇｃａ  ａｔｇ  ａｃｔ  ｔｔｔ  ｇｔｃ  ｇｃｔ  ｇｃｔ  ｇｇｃ  ｇｔｔ  ｇｃｇ  ａｃｃ  ｇｃｃ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｇｔｇ  ｇｃｃ（配列番号：２）である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：２の配列と少なくとも９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％同一である。別の実施形態においては、配列番号：２の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００７２】
別の実施形態においては、配列番号：３の少なくともアミノ酸２−２１の配列を有する外膜ポーリンＥ（ＯｐｒＥ）分泌シグナルペプチドの配列と実質的に相同なペプチド配列をコードする核酸が提供される。一つの実施形態においては、このペプチド配列は、２位のＬｙｓがＴｙｒで置換された；５位のＴｈｒがＳｅｒで置換された；８位のＶａｌがＬｅｕで置換された；１０位のＶａｌがＶａｌおよびＡｒｇで置換された；１４位のＡｌａがＶａｌで置換された；１５位のＩｌｅがＬｅｕで置換された配列番号：３のペプチドであるか、またはそれと実質的に相同である。別の実施形態においては、このペプチドをコードする核酸配列は：ａｔｇ  ａａｇ  ａａｇ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｔ  ｇｔｇ  ｇｃｔ  ｇｔａ  ａｃｇ  ｔｔｇ  ｇｇｃ  ｇｃａ  ａｔｃ  ｇｃｃ  ｃａｇ  ｃａａ  ｇｃａ  ｇｇｃ  ｇｃｔ（配列番号：４）である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：４の配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：４の配列と少なくとも９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％同一である。別の実施形態においては、配列番号：４の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００７３】
別の実施形態においては、配列番号：５の少なくともアミノ酸２−２０の配列を有するアズリン分泌シグナルペプチドの配列と実質的に相同なペプチド配列をコードする核酸が提供される。一つの実施形態においては、このペプチド配列は、２位および３位のＰｈｅ−ＡｌａがＬｅｕ−ＡｒｇもしくはＩｌｅ−Ａｒｇで置換された；５位のＬｅｕがＡｌａで置換された；６位のＶａｌがＡｌａで置換された；６−８位のＶａｌ−Ａｌａ−ＶａｌがＩｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａで置換された；１１位のＬｅｕがＩｌｅで置換された；１２位のＴｈｒがＳｅｒで置換された；１４位のＡｌａがＬｅｕもしくはＰｈｅで置換された；１６位のＧｌｙがＡｌａで置換された；１７位のＧｌｎがＳｅｒもしくはＰｒｏで置換された；１８位のＬｅｕがＶａｌで置換された；または１８−１９位のＬｅｕ−ＬｅｕがＶａｌ−Ｐｈｅで置換された配列番号：５のペプチドであるか、またはそれと実質的に相同である。別の実施形態においては、このペプチドをコードする核酸配列は：ａｔｇ  ｔｔｔ  ｇｃｃ  ａａａ  ｃｔｃ  ｇｔｔ  ｇｃｔ  ｇｔｔ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ａｃｔ  ｃｔｇ  ｇｃｇ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｔｔｇ  ｃｔｔ  ｇｃｔ（配列番号：６）である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：６の配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：６の配列と少なくとも９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％同一である。別の実施形態においては、配列番号：６の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００７４】
別の実施形態においては、配列番号：７の少なくともアミノ酸２−２３の配列を有するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質（ＬＡＯｂｐまたはＫＲＯｂｐ）分泌シグナルペプチドの配列と実質的に相同なペプチド配列をコードする核酸が提供される。別の実施形態においては、このペプチドをコードする核酸配列は：ａｔｇ  ｃａｇ  ａａｃ  ｔａｔ  ａａａ  ａａａ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｔｃ  ｔｃｇ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｔｔｃ  ａｇｃ  ｇｃｃ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｇｃａ（配列番号：８）である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：８の配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：８の配列と少なくとも９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％同一である。別の実施形態においては、配列番号：８の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００７５】
さらに別の実施形態においては、配列番号：９の少なくともアミノ酸２−３２の配列を有する鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質［Ｆｅ（ＩＩＩ）ｂｐ］分泌シグナルペプチドの配列と実質的に相同なペプチド配列をコードする核酸が提供される。別の実施形態においては、このペプチドをコードする核酸配列は：ａｔｇ  ａｔｇ  ａｔｃ  ｃｇｔ  ｇａｃ  ａａｃ  ｃｇａ  ｃｔｃ  ａａｇ  ａｃａ  ｔｃｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ｃｇｃ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ａｃｃ  ｃｔｃ  ａｃｃ  ｃｔａ  ｃｔｃ  ａｇｃ  ｃｔｇ  ａｃｃ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ｔｃｇ  ｃｃｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｃａｔ  ｔｃｔ（配列番号：１０）である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：１０の配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：１０の配列と少なくとも９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％同一である。別の実施形態においては、配列番号：１０の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００７６】
別の実施形態においては、配列番号：１１の少なくともアミノ酸２−１７の配列を有するリポタンパク質Ｂ（ＬｐｒＢ）分泌シグナルペプチドの配列と実質的に相同なペプチド配列をコードする核酸が提供される。別の実施形態においては、このペプチドをコードする核酸配列は：ａｔｇ  ａｔｃ  ａａａ  ｃｇｃ  ａａｔ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ｇｔｔ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ｃｔｇ  ｔｔｇ  ａｇｃ  ｇｃｔ（配列番号：１２）である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：１２の配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態においては、この核酸配列は、配列番号：１２の配列と少なくとも９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％同一である。別の実施形態においては、配列番号：１２の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整する。
【００７７】
コドン使用頻度すなわちコドンプレファレンスは、本技術分野において周知である。選択されたコード配列を、その遺伝子コードを細菌の宿主細胞が採用するものに適合するように変更することによって改変してもよい。そのコドン配列を改善して、宿主が採用するものにさらに近づけてもよい。当業者によって知られている種々の方法のいずれか、たとえばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発に従って遺伝子コードの選択およびコドン頻度の促進化を行ってもよい。この方法を支援するための便利なオンライン・インターネット・リソースとしては、たとえば：（１）かずさＤＮＡ研究所（日本国  ２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−６−７）のコドン使用頻度データベースおよびhttp://www.kazusa.or.jp/codon/で利用可能；ならびに(2)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=c.におけるＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  データベースで利用可能な遺伝子コード表が挙げられる。たとえば、シュードモナス種は、ＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎｏｍｙサイトの遺伝子コード翻訳表11を利用すること、およびかずさサイトにおいてhttp://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/で示される表のコドン使用頻度示したことが報告されている。
【００７８】
核酸の相同性
実質的に類似のペプチドの配列をコードする種々の実質的に相同な核酸を提供可能なことは、当業者にとっては自明である。コード配列についての相同性の場合において、タンパク質をコードするその核酸配列に相同なコード配列は、本明細書で開示されたタンパク質をコードする核酸配列と比較すれば、リーディングフレーム内に変化を生じさせる変異はわずかに(no more than)３０％（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０％）までしか含んでおらず、未成熟な終止コドンをまったく含まない。しかしながら、所望の発現系における種々のコドン使用頻度に基づいて、この核酸配列を設計することができる。
【００７９】
本技術分野において周知の種々の方法のいずれかに従って、核の配列の相同性を測定する。有用な配列のアラインメントの方法論および相同性測定の方法論の具体例としては、以下のものが挙げられる。
【００８０】
全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のプログラムのＭｅｇａＢＬＡＳＴ（現在はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において利用可能）を用いて、相同な配列についてのアラインメントおよび検索を実行することができる。アミノ酸配列について７０％に設定した、またはヌクレオチド配列について９０％に設定した同一性パーセントについてのオプションを伴うこのプログラムを利用することによって、照会された配列に対する７０％もしくは９０％またはそれを超える相同性を伴う配列を特定できる。本技術分野において知られているその他のソフトウェアも、相同配列、たとえば本発明に従うところのプロモーターの塩基配列またはアクチベータタンパク質をコードする塩基配列を含むインフォメーション・ストリングに対して少なくとも７０％または９０％相同な配列について、アラインメントおよび／または検索を行うことに利用することができる。たとえば、GCG Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705から利用可能）において利用できるＧＡＰプログラム、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＢＬＡＳＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＴＦＡＳＴＡプログラムを、そこで指定された初期パラメータと、相同性を７０％または９０％に拡張して設定したパラメータにて利用することによって、たとえば照会された配列に対して少なくとも７０％または９０％相同な配列を特定するための比較用配列アラインメントを実行することができる。さらにたとえばＣＬＵＳＴＡＬプログラム(Intelligenetics, Mountain View, CalからのPC/Gene software packageにおいて利用可能）を用いてもよい。
【００８１】
これらのおよびその他の配列のアラインメント方法は本技術分野において周知であり、手動のアラインメントによって、目視検査によって、または手動もしくは自動の配列アラインメント適用アルゴリズム、たとえば上記のプログラムによって具体化されたいくつかのもののうちの任意のアルゴリズムによって実行してもよい。種々の便利なアルゴリズムとしては：W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 85:2444-48 (Apr 1988)に記載された類似の検索方法；T.F. Smith and M.S. Waterman, in Adv. Appl. Math. 2:482-89 (1981) およびJ. Molec. Biol. 147:195-97 (1981)に記載された局所的な相同性の方法；S.B. Needleman and CD. Wunsch, J. Molec. Biol. 48(3):443-53 (Mar 1970)に記載された相同性アラインメントの方法；ならびにたとえばW.R. Pearson, in Genomics ll(3):635-50 (Nov 1991)に；W.R. Pearson, in Methods Molec. Biol. 24:307-31 and 25:365-89 (1994)に；ならびにD.G. Higgins and P.M. Sharp, in Comp. Appl'ns in Biosci. 5:151-53 (1989) およびGene 73(l):237-44 (15 Dec 1988)に記載された種々の方法が挙げられる。
【００８２】
高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われる核酸のハイブリダイゼーションも、本明細書で用いるための十分に相同な配列を得るための有用な技術である。一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、少なくとも６８℃の水溶液条件でハイブリダイゼーションを実施することを意味する。
【００８３】
ベクター
別の実施形態は、プロモーターに機能できるように結合しているｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルと実質的に相同な配列を伴う、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドの核酸を含む発現ベクターである。発現可能なコード配列は、選択された宿主細胞内で機能できる転写プロモーター、ならびにその他のすべての必要な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメント調節エレメントが機能できるように結合する。
【００８４】
「機能できるように結合」という用語は、、そこでの転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントがコードする配列に共有結合しているあらゆる配置であって、その配置が、そのコード配列に関して、宿主細胞内で、および宿主細胞の利用によって、その調節エレメントがそのコード配列の発現を導くことができるもの、を意味する。
【００８５】
典型的なベクターは、そのベクターを確実に維持するため、そして必要であれば宿主内での増幅を行うための一つ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含むことになる。本開示に従って行われる形質転換に適した宿主としては、シュードモナス属に含まれる様々な種が挙げられ、特にシュードモナス・フルオレッセンスの宿主細胞株が好ましい。
【００８６】
一つの実施形態においては、ベクターは、Ｓｅｃ分泌シグナルに機能できるように結合している関心対象の組換えタンパク質またはペプチドを発現させるためのコード配列をさらに含む。ターゲットポリペプチドのコード配列が、リーダー配列、転写調節エレメントならびに翻訳調節エレメントと機能できるように結合して、機能遺伝子（そこから宿主細胞がタンパク質またはペプチドを発現することができる）を形成しているポリヌクレオチドから、この組換えタンパク質およびペプチドを発現させることができる。このコード配列は、入手できるのであれば、ターゲットポリペプチドについての天然のコード配列であり得るが、選択された発現宿主細胞での使用のために：たとえば宿主種のコドンの使用傾向を反映させた遺伝子を合成することによって選択されたか、改良されたかまたは最適化されたコード配列がより好ましい。本発明の一つの実施形態においては、この宿主種はシュードモナス・フルオレッセンスであり、シグナル配列とタンパク質またはペプチド配列との両方を設計する時に、シュードモナス・フルオレッセンスのコドンの傾向が考慮される。この単数（もしくは複数）の遺伝子を一つ以上のベクター内に構築するか、または挿入する。次いでこのものを、発現宿主細胞内に形質転換させることができる。
【００８７】
その他の調節エレメントは、ベクター（「発現構築物」とも称される）内に含まれてもよい。このようなエレメントとしては、たとえば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、その他のプロモーター、アクチベータ、翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナル、転写ターミネーター、シストロニックレギュレーター、ポリシストロニックレギュレーター、タグ配列、たとえばヌクレオチド配列の「タグ」および「タグ」ペプチドコード配列であって、発現されたポリペプチドの同定、分離、精製または単離を促進させるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
別の実施形態においては、発現ベクターは、分泌シグナルについてのコード配列または組換えタンパク質もしくはペプチドについてのコード配列に隣接したタグ配列をさらに含む。一つの実施形態においては、このタグ配列によって、そのタンパク質の精製が可能となる。このタグ配列は、アフィニティータグ、たとえばヘキサヒスチヂンアフィニティータグでもよい。別の実施形態においては、このアフィニティータグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ分子でもよい。このタグは、蛍光性分子、たとえばＹＦＰもしくはＧＦＰ、またはそのような蛍光性タンパク質のアナログでもよい。このタグは、精製に有用な公知の結合パートナーについての抗体分子の一部、または公知の抗原もしくはリガンドの一部でもよい。
【００８９】
本発明に従うところのタンパク質をコードする遺伝子は、タンパク質のコード配列に加えて、機能できるように結合した次の調節エレメント：プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、転写ターミネーター、翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルを含むことができる。本発明に従うところの発現系において宿主細胞として有用な種のいずれかから、好ましくは選択された宿主細胞から、有用なRBSを得ることができる。多くの具体的なおよび種々のコンセンサスRBSが知られており、たとえば、D. FrishmanらのStarts of bacterial genes: estimating the reliability of computer predictions, Gene 234(2):257-65 (8 Jul 1999)；およびB.E. SuzekらのA probabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes, Bioinformatics 17(12): 1123-30 (Dec 2001)に記載され引用されるものである。さらに、天然のまたは合成のいずれかのRBSを用いてもよく、たとえば EP 0207459号 （合成RBS）; O. Ikehata et al., Primary structure of nitrite hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression in Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989)（天然のＲＢＳ配列のＡＡＧＧＡＡＧ）に記載のものである。本発明において有用な方法、ベクターおよび翻訳エレメントおよび転写エレメント、ならびにその他のエレメントのさらなる例は、たとえば、Gilroyによる米国特許第5，055，294号およびGilroyらによる米国特許第5,128,130号;Rammlerらによる米国特許第5,281,532号;Barnesらによる米国特許第4,695,455号および第4,861,595号;Grayらによる米国特許第4,755,465号;ならびにWilcoxによる米国特許第5,169,760号に記載されている。
【００９０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのシュードモナスによる転写を、エンハンサー配列をベクターまたはプラスミド内に挿入することによって促進させる。典型的なエンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を促進させる、通常約１０から３００ｂｐのサイズのシス作用性ＤＮＡエレメントである。具体例としては、種々のシュードモナスのエンハンサーが挙げられる。
【００９１】
一般的に、組換え発現ベクターは、シュードモナスの宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を導くための高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含むだろう。このようなプロモーターは、酵素、たとえば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、酸性ホスファターゼまたは特に熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来するものでもよい。適切なフェーズ(phase)で、翻訳開始配列および翻訳終止配列、そして好ましくは翻訳後の酵素の分泌を導くことが可能なリーダー配列を伴う異種構造配列を集合させる。必要に応じて、この異種配列が、所望の特性、たとえば安定性または発現された組換え型生産物を容易に精製できることを付与するN-末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードしてもよい。
【００９２】
本技術分野において、ベクターは、宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるために有用なものとして知られており、それらのいずれかを、本発明に従うところの遺伝子を発現させるために用いてもよい。このようなベクターとしては、たとえばプラスミド、コスミドおよびファージ発現ベクターが挙げられる。有用なプラスミドベクターの具体例としては、発現プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ、ｐＤＳＫ５１９、ｐＫＴ２４０、ｐＭＬ１２２、ｐＰＳ１０、ＲＫ２、ＲＫ６、ｐＲＯ１６００およびＲＳＦ１０１０が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。このような有用なベクターのその他の例としては、たとえば：N. Hayase, in Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (Sep 1994)；A.A. Lushbnikov et al., in Basic Life Sci. 30:657-62 (1985)；S. Graupner and W. Wackernagel, in Biomolec. Eng. 17(1):11-16. (Oct 2000)；H.P. Sctihweizer, in Curr. Opin. Biotech. 12(5):439-45 (Oct 2001)；M. Bagdasarian and K.N. Timmis, in Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1982)；T. Ishii et al., in FEMS Microbiol. Lett. 116(3):307-13 (Mar 1, 1994)；LN. Olekhnovich and Y.K. Fomichev, in Gene 140(l):63-65 (Mar 11, 1994)；M. Tsuda and T. Nakazawa, in Gene 136(1-2):257-62 (Dec 22, 1993)；C. Nieto et al., in Gene 87(1):145-49 (Mar 1, 1990)；J.D. Jones and N. Gutterson, in Gene 61(3):299-306 (1987)；M. Bagdasarian et al., in Gene 16(1-3):237-47 (Dec 1981)；H.P. Schweizer et al., in Genet. Eng. (NY) 23:69-81 (2001)；P. Mukhopadhyay et al., in J. Bact. 172(l):477-80 (Jan 1990)；D.O. Wood et al., in J. Bact. 145(3):1448-51 (Mar 1981);およびR. Holtwick et al., in Microbiology 147(Pt 2):337-44 (Feb 2001)に記載されたものが挙げられる。
【００９３】
シュードモナスの宿主細胞において有用となり得る発現ベクターのさらなる具体例としては、示されたレプリコンに由来するような、表２に列挙されたものが挙げられる。
【表２】
2007512028.tif 000003
【００９４】
発現プラスミドのＲＳＦ１０１０は、たとえばF. Heffron et al. in Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72(9):3623-27 (Sep 1975)、およびK. Nagahari and K. Sakaguchi, in J. Bact. 133(3):1527-29 (Mar 1978)に記載されている。プラスミドＲＳＦ１０１０およびその派生物は、本発明において特に有用なベクターである。典型的には、本技術分野において知られているＲＳＦ１０１０の有用な派生物としては、たとえばｐＫＴ２１２、ｐＫＴ２１４、ｐＫＴ２３１および関連するプラスミド、ならびにｐＭＹＣ１０５０および関連するプラスミド（たとえばThompsonらによる米国特許第5，527，883号および第5，840，554号を参照すること）が挙げられ、具体的にはｐＭＹＣ１８０３がある。プラスミドｐＭＹＣ１８０３はＲＳＦ１０１０に基づくプラスミドｐＴＪＳ２６０（Wilcoxによる米国特許第5，169，760号を参照すること５，１６９，７６０号を参照すること）に由来するものであり、これは制御されたテトラサイクリン耐性マーカーならびにＲＳＦ１０１０プラスミドに由来する複製座および移動座を保持している。その他の典型的な有用なベクターとしては、Puhlerらによる米国特許第4，680，264号４，６８０，２６４号に記載されたものが挙げられる。
【００９５】
一つの実施形態においては、発現プラスミドを発現ベクターとして用いる。別の実施形態においては、ＲＳＦ１０１０またはその派生物を発現ベクターとして用いる。さらに別の実施形態においては、ｐＭＹＣ１０５０もしくはその派生物、またはｐＭＹＣ１８０３もしくはその派生物を、発現ベクターとして用いる。
【００９６】
選択マーカー遺伝子を用いて、宿主細胞内にプラスミドを維持することができ、プラスミド内に存在させることもできる。これは単数（または複数）の抗生物質耐性遺伝子でもよく、この場合において対応する単数（または複数）の抗生物質は発酵培地に添加されることになり、あるいは、本技術分野において有用であると知られている選択マーカー遺伝子のその他の任意のタイプのもの、たとえばプロトトロフィー復元遺伝子でもよく、この場合においてプラスミドは対応する形質、具体的には生体触媒性の形質、たとえばアミノ酸生合成もしくはヌクレオチドを生合成する形質または炭素源を利用する形質、についての栄養素要求株である宿主細胞内で用いられることになる。
【００９７】
本発明に従って用いられるプロモーターは構成的プロモーターでもよく、または調節プロモーターでもよい。有用な調節プロモーターの一般的な例としては、ｌａｃプロモータファミリー（すなわちｌａｃＺプロモーター)に由来するファミリーのもの、特にDeBoerによる米国特許第4，551，433号に記載のｔａｃプロモータおよびｔｒｃプロモーター、ならびにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５およびＴ７ｌａｃプロモータが挙げられる。一つの実施形態においては、このプロモーターは宿主細胞生物に由来するものではない。特定の実施形態においては、このプロモーターはエシェリキア・コリ生物に由来するものである。
【００９８】
本発明に従った発現系に有用な非ｌａｃ型プロモーターの一般的な例としては、たとえば、表３に列挙されたものが挙げられる。
【表３】
2007512028.tif 000004
【００９９】
たとえば、次のものを参照すること：J. Sanchez-Romero and V. De Lorenzo (1999) Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain and J. Davies, eds.) pp.460-74 (ASM Press, Washington, D.C.)；H. Schweizer (2001) Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445；およびR. Slater and R. Williams (2000) The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker and R. Rapley, eds.) pp.125-54 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK))。選択された細菌の宿主細胞を起源とするプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターを用いて、ターゲットポリペプチド、たとえばシュードモナスのアントラニル酸エステルまたは安息香酸エステルオペロンプロモーター(Pant, Pben)をコードする導入遺伝子の発現をコントロールしてもよい。配列が同一か否かにもかかわらず、その中で二つ以上のプロモーターが別のものと共有結合しているタンデムプロモーター、たとえば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター（プロモーター間のハイブリッド）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーターを用いてもよい。
【０１００】
調節プロモーターは、プロモーターがその一部である遺伝子の転写をコントロールするために、プロモーター調節タンパク質を利用する。本明細書で調節プロモーターを用いる場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明に従うところの発現系の一部となるだろう。プロモーター制御タンパク質の具体例としては：アクチベータタータンパク質たとえばエシェリキア・コリのカタボライトアクチベータタンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写活性化因子；リプレッサータンパク質、たとえばエシェリキア・コリのＬａｃＩタンパク質；および二重機能制御タンパク質、たとえばエシェリキア・コリのＮａｇＣタンパク質が挙げられる。多数のプロモーター／プロモーター制御タンパク質のペアが本技術分野において知られている。
【０１０１】
プロモーター制御タンパク質は、プロモーターのコントロール下で、そのタンパク質が遺伝子の少なくとも一つのＤＮＡ転写制御領域から離れるかまたは結合することができるように、エフェクター化合物、すなわちその制御タンパク質と可逆的にまたは不可逆的に結合する化合物と相互作用する。それによって、遺伝子の転写を開始する際に、転写酵素の作用を可能にしたりまたは阻止する。エフェクター化合物はインデューサーまたはコリプレッサーのいずれかとして分類され、これらの化合物は天然のエフェクター化合物および無償性(gratuitous)のインデューサー化合物を含む。多数の調節プロモーター／プロモーター制御タンパク質／エフェクター化合物のトリオが本技術分野において知られている。細胞培養または発酵の間を通してエフェクター化合物を用いることができるが、調節プロモーターを用いる特に好ましい実施形態においては、宿主細胞の生物体量が所望の量または密度にまで培養した後、適切なエフェクター化合物を順番に直接的にまたは間接的に培養液に添加し、その結果、所望の単数（または複数）のターゲット遺伝子を発現させる。
【０１０２】
一例として、ｌａｃプロモータのファミリーを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子が系内に存在してもよい。このｌａｃＩ遺伝子、（通常は）構成的に発現された遺伝子である、は、これらのプロモーターのｌａｃオペレーターと結合するＬａｃリプレッサータンパク質（LacIタンパク質)をコードする。従って、ｌａｃプロモータのファミリーを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子をその発現系内に含ませてその中で発現させることができる。ｌａｃプロモータのファミリーの一員、たとえばｔａｃプロモータの場合においては、エフェクター化合物はインデューサーであり、好ましくは無償性のインデューサー、たとえばＩＰＴＧ（イソプロピル-D-1-チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも称される)である。
【０１０３】
Ｃｈａｍｐｉｏｎ（商標）ｐＥＴ発現系によって、高レベルのタンパク質の生産が提供される。強力なＴ７ｌａｃプロモータから発現を誘導する。この系は、関心対象の遺伝子を高レベルで転写させるために、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼの高い活性と特異性を活用している。プロモーター領域に位置するｌａｃオペレーターは、従来のＴ７に基づくベクターよりもより厳密な制御を提供し、プラスミドの安定性と細胞の生存可能性を高める(Studier, F. W. and B. A. Moffatt (1986) J Molecular Biology 189(1): 113-30；Rosenberg, et al. (1987) Gene 56(1): 125-35)。Ｔ７発現系は、関心対象の遺伝子を高レベルで転写させるために、Ｔ７プロモーターとＴ７のＲＮＡポリメラーゼ(T7 RNAP)とを利用する。高レベルの発現はＴ７発現系において達成される。というのは、Ｔ７のＲＮＡＰは天然のエシェリキア・コリのＲＮＡＰよりも発展的であり、関心対象の遺伝子の転写に専念するからである。特定された遺伝子の発現を、Ｔ７のＲＮＡＰのソース(source)を宿主細胞に提供することによって誘導する。Ｔ７のＲＮＡＰ遺伝子の染色体のコピーを含むＢＬ２１エシェリキア・コリ宿主を用いることによって、このことが達成される。Ｔ７のＲＮＡＰ遺伝子は、ＩＰＴＧによって誘導可能なｌａｃＵＶ５プロモーターのコントロール下にある。誘導と同時にＴ７のＲＮＡＰが発現し、関心対象の遺伝子が転写される。
【０１０４】
ｐＢＡＤ発現系によって、特定の炭素源、たとえばグルコース、グリセロールおよびアラビノースの存在を介して、厳密にコントロールされた、滴定可能な組換えタンパク質の発現が可能となる(Guzman, et al. (1995) J Bacteriology 177(14): 4121-30)。このｐＢＡＤベクターは、発現レベルに関して正確なコントロールを与えるために独特に設計されている。ｐＢＡＤベクターからの異種遺伝子の発現は、ａｒａＢＡＤプロモーターにおいて開始される。このプロモーターは、ａｒａＣ遺伝子の生産物によって正および負の両方に制御される。ＡｒａＣは、Ｌ−アラビノースと共に複合体を形成する転写レギュレーターである。Ｌ−アラビノースが無い場合、ＡｒａＣのダイマーは転写を阻止する。最大限の転写活性化を行うためには、二つの事象が必要である：（ｉ．）Ｌ−アラビノースがＡｒａＣと結合して転写の開始が可能となること、（ｉｉ．）ｃＡＭＰアクチベータタンパク質（ＣＡＰ）−ｃＡＭＰ複合体がＤＮＡと結合して、プロモーター領域の正しい位置へのＡｒａＣの結合が促進されること。
【０１０５】
ｔｒｃ発現系によって、エシェリキア・コリにおいて、ｔｒｃプロモーターからの高レベルの調節された発現が可能となる。このｔｒｃ発現ベクターは、真核生物の遺伝子をエシェリキア・コリ内で発現させるために最適化されてきた。このｔｒｃプロモーターは、トリプトファン(trp)プロモーターおよびラクトース(lac)プロモーターに由来する強力なハイブリッドプロモーターである。ｌａｃＯオペレーターおよびｌａｃＩＱ遺伝子の生産物によって、これが調節される(Brosius, J. (1984) Gene 27(2): 161-72)。
【０１０６】
発現系
一つの実施形態においては、組換えタンパク質の生産のために改良された発現系が提供される。一つの実施形態においては、この系には、宿主細胞、およびｐｂｐ分泌シグナル、ＯｐｒＥ分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルからなる群より選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌シグナルか、またはそのシグナル配列と実質的に相同な配列に、機能できるように結合している組換えタンパク質またはペプチドを含むベクターが含まれる。
【０１０７】
別の実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンスの宿主細胞、および関心対象のタンパク質またはペプチドに機能できるように結合している任意のゲノムに由来するＳｅｃ分泌シグナルを含む少なくとも一つのベクターを含む発現系が提供される。このベクターは、上記の特性のいずれかを有することができる。一つの実施形態においては、Ｓｅｃ分泌シグナルは、シュードモナス・フルオレッセンスのゲノムに由来する。しかしながら、別の実施形態においては、Ｓｅｃ分泌シグナルは、任意の細菌のゲノムに由来する。一つの実施形態においては、分泌シグナルは、シュードモナス・フルオレッセンスのゲノムではない細菌のゲノムに由来し、特定の実施形態においては、分泌シグナルはエシェリキア・コリのゲノムに由来する。特定の実施形態においては、この分泌シグナルがそのタンパク質を起源とするものでもよい。別の実施形態においては、この分泌シグナルがそのタンパク質を起源としないものでもよい。
【０１０８】
たとえば、提供される分泌系は、Ｓｅｃ分泌シグナル、たとえばｓｋｐタンパク質についての分泌シグナルを含んでもよい。組換えによって発現するタンパク質がペリプラスム領域または細胞外のいずれかに向けられている実施形態においては、関心対象のタンパク質に機能するように結合しているそのタンパク質の天然のリーダー配列はベクター内に含まれてもよい。
【０１０９】
その他の実施形態においては、異なるタンパク質に由来する分泌シグナル配列がベクター内に含まれてもよい。驚くべきことには、シュードモナス・フルオレッセンスは、種々のシグナル配列を伴うタンパク質を、そのＳｅｃ分泌経路を経由して正確にペリプラズムに向けることができる。いくつかの実施形態においては、シグナル配列と関心対象のタンパク質またはペプチドとの間において、さらなる改変は提供されない。しかしながら、特定の実施形態においては、追加的な切断シグナルを組み込んで、ペプチドのアミノ末端の正確なプロセシングを促進する。
【０１１０】
この分泌系は、発酵培地、たとえば以下に記載のものを含んでもよい。一つの実施形態においては、この系は無機塩培地を含む。別の実施形態においては、この系は培地内にケミカルインデューサーを含む。
【０１１１】
この系はプロモーター、これは選択的プロモーターでよい、およびインデューサーを含んでもよい。いくつかの場合においては、このプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスを起源としないプロモーター、たとえばエシェリキア・コリのプロモーターである。特定の実施形態においては、このプロモーターは、たとえば誘導性プロモーター、具体的にはｌａｃプロモータである。このプロモーターは、いくつかの異なるプロモーターのハイブリッドであって、そのうちの少なくとも一つがシュードモナス・フルオレッセンス生物を起源としないものでもよい。たとえば、このプロモーターはｔｒｃプロモーターであり得る。このプロモーターは、たとえばｔａｃプロモータでもよい。
【０１１２】
方法(process)
一つの実施形態においては、組換えタンパク質を生産するために改良された方法であって、Ｓｅｃ分泌シグナルに結合している関心対象の融合タンパク質を発現するシュードモナス・フルオレッセンスの宿主細胞を含む方法が提供される。この方法は、組換えＳｅｃ系分泌シグナル配列に機能できるように結合している組換えタンパク質またはペプチドをコードするベクターを含むシュードモナス・フルオレッセンス細胞を提供する工程、およびそのタンパク質またはペプチドの発現を実現する条件下でその細胞を培養する工程を含んでもよい。このベクターは、上記の特性のいずれかを有してもよい。一つの実施形態においては、このＳｅｃ分泌シグナルは、シュードモナス・フルオレッセンスのゲノムに由来する。別の実施形態においては、このＳｅｃ分泌シグナルは任意の細菌のゲノムに由来する。一つの実施形態においては、この分泌シグナルは細菌のゲノムに由来し、特定の実施形態においては、この分泌シグナルはエシェリキア・コリのゲノムに由来する。特定の実施形態においては、この分泌シグナルは、そのタンパク質を起源とするものでもよい。別の実施形態においては、この分泌シグナルは、そのタンパク質を起源としないものでもよい。
【０１１３】
別の実施形態においては、関心対象の組換えタンパク質またはペプチドに機能できるように結合したｐｂｐ、ＯｐｒＥ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質、アズリン、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質またはリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドを宿主細胞内で発現させることを含む、任意の宿主細胞内で組換えタンパク質を作製するための改良された方法が提供される。
【０１１４】
一つの実施形態においては、この宿主細胞はペリプラズムを有し、Ｓｅｃ系ペプチドの発現によって、組換えタンパク質を細胞のペリプラズムに向ける。下位実施形態においては、この発現によって細胞外タンパク質の生産が導かれる。この方法は、ペリプラズムからまたは細胞外の培地から組換えタンパク質を精製する工程を含んでもよい。タンパク質に結合したＳｅｃシグナルを発現させることができ、細胞からこのシグナル結合タンパク質を精製することができる。従って、一つの実施形態においては、この単離されたペプチドは、分泌シグナルと関心対象のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質である。しかしながら、タンパク質がペリプラズムに向けられた場合、その分泌シグナルもそのタンパク質から切断されてもよい。一つの実施形態においては、Ｓｅｃ系分泌シグナルとタンパク質またはペプチドとの間の連結を改変して、分泌シグナルの切断を促進する。
【０１１５】
一つの実施形態においては、この方法によって、タンパク質を宿主細胞のペリプラズムに局限して生産することができる。一つの実施形態においては、この方法によって、正確に加工された組換えタンパク質を細胞内で生産することができる。別の実施形態においては、Ｓｅｃ系ペプチドの発現によって、活性な組換えタンパク質を細胞内で生産できるかもしれない。本発明の方法は、そのタンパク質がＳｅｃ分泌シグナルを用いずに発現した場合と比較して、組換えタンパク質の収量の増加を導くかもしれない。
【０１１６】
一つの実施形態においては、この方法によって、少なくとも０．１ｇ／Ｌのタンパク質がペリプラスム領域内で生産される。別の実施形態においては、この方法によって、０．１から１０ｇ／Ｌのペリプラスムタンパク質が細胞内で生産される。下位実施形態においては、この方法によって、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｇ／Ｌのペリプラスムタンパク質が生産される。一つの実施形態においては、生産されたすべての組換えタンパク質は少なくとも１．０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態においては、ペリプラスムタンパク質の生産量は、生産されたすべての組換えタンパク質の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれを超える。
【０１１７】
一つの実施形態においては、この方法によって、少なくとも０．１ｇ／Ｌの正確に加工されたタンパク質が生産される。正確に加工されたタンパク質は、天然のタンパク質のアミノ末端を有する。別の実施形態においては、この方法によって、０．１から１０ｇ／Ｌの正確に加工されたタンパク質が細胞内で生産される。下位実施形態においては、この方法によって、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｇ／Ｌの正確に加工されたタンパク質が生産される。一つの実施形態においては、生産されたすべての正確に加工された組換えタンパク質は、少なくとも１．０ｇ／Ｌである。下位実施形態においては、生産されたすべての正確に加工されたタンパク質は、少なくとも約２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５．０、２０．０または５０．０ｇ／Ｌであり得る。いくつかの実施形態においては、正確に加工されたタンパク質の生産量は、正確に加工された形態におけるすべての組換えタンパク質の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれを超える。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、このタンパク質を活性型で生産することもできる。「活性」という用語は、生物学的機能または生物学的作用が存在することを意味し、ここで、この生物学的機能または生物学的作用は、対応する天然のタンパク質またはペプチドの生物学的機能または生物学的作用に匹敵するか、または実質的に相応する。タンパク質との関連において、典型的にはこのことは、標準的なパラメータとして用いる対応する天然のタンパク質またはペプチドと比較して、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物学的機能または生物学的作用が少なくとも約２０％、約５０％、好ましくは少なくとも約６０−８０％、最も好ましくは少なくとも約９０−９５％の活性であることを意味する。特定のタンパク質またはペプチドについてのアッセイであって、対応する標準の、目標とされる生物学的な比較アッセイを利用して、タンパク質またはペプチドの活性測定を行うことができる。組換えタンパク質またはペプチドの生物学的機能または生物学的作用の一つの指標は、組換えポリペプチドが天然のポリペプチドと免疫学的に交差反応するということである。
【０１１９】
別の実施形態においては、生産された遺伝子組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその断片の発現したものの５０％を超える量を、宿主細胞内で、再生可能な形態で生産することができる。別の実施形態においては、発現されたタンパク質の約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を活性型でまたは活性型に再生可能な形態で得ることができる。
【０１２０】
本発明の方法によって、組換えタンパク質の収量の増加を導くことができる。一つの実施形態においては、この方法によって、全細胞タンパク質（ｔｃｐ）の５、１０、１５、２０、２５、３０、４０もしくは５０、５５、６０、６５、７０または７５％の組換えタンパク質が生産される。「全細胞タンパク質パーセント」は、凝集した細胞タンパク質のパーセンテージとして表した、宿主細胞におけるタンパク質またはペプチドの量である。全細胞タンパク質パーセントの測定法は、本技術分野において周知である。
【０１２１】
特定の実施形態においては、無機塩培地で培養（すなわち約４℃から約５５℃までの温度範囲内で）した場合に、宿主細胞は少なくとも１％ｔｃｐの発現レベルかつ少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度にて、組換え型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその断片を有してもよい。特に好ましい実施形態においては、少なくとも１０リットルの発酵の規模の無機塩培地で培養（すなわち約４℃から約５５℃までの温度範囲内で）した場合に、この発現系は少なくとも５％ｔｃｐのペプチド発現レベルかつ少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度の組換えタンパク質を有することになる。
【０１２２】
宿主細胞
一つの実施形態においては、本発明は、Ｓｅｃ型分泌シグナルを含む組換えタンパク質を発現させるためのシュードモナス・フルオレッセンスの発現系を提供する。本発明のこの側面態様は、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ分泌系が正確なプロセシングを行う能力を持つこと、およびその分泌系がシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃシグナル系および非シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃシグナル系の両者に由来する分泌シグナルに向けられていることという驚くべき発見の上に築かれている。
【０１２３】
この実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１８」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１８」は、シュードモナス・フルオレッセンス種の亜種、変種、株およびその他のサブスペシャルな単位のすべての群と定義され、たとえば次のものに属するもの（丸括弧内に単数（または複数）の典型的な株のＡＴＣＣ番号またはその他の寄託番号を示す）を含む：シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡ、次亜種１または次亜種Ｉとも称される（ＡＴＣＣ  １３５２５）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＢ、次亜種２または次亜種ＩＩとも称される（ＡＴＣＣ  １７８１６）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＣ、次亜種３または次亜種ＩＩＩとも称される（ＡＴＣＣ  １７４００）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＦ、次亜種４または次亜種ＩＶとも称される（ＡＴＣＣ  １２９８３）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＧ、次亜種５または次亜種Ｖとも称される（ＡＴＣＣ  １７５１８）；シュードモナス・フルオレッセンス次亜種ＶＩ；シュードモナス・フルオレッセンスＰｆＯ−１；シュードモナス・フルオレッセンスＰｆ−５（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７７）；シュードモナス・フルオレッセンスＳＢＷ２５；およびシュードモナス・フルオレッセンス・サブスピーシーズ・セルローサ（ＮＣＩＭＢ  １０４６２）。
【０１２４】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１９」から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１９」は、シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡのすべての株の群と定義される。このバイオタイプの特に好ましい株は、シュードモナス・フルオレッセンス株ＭＢ１０１（Wilcoxによる米国特許第5,169,760号を参照すること)およびその派生物である。その派生物の好ましい例は、ＭＢ１０１染色体のａｓｄ（アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）座内に、天然のエシェリキア・コリのＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ構築物（すなわちこの中のＰｌａｃＺは欠失していた）を挿入することによって構築した、シュードモナス・フルオレッセンス株ＭＢ２１４である。
【０１２５】
本発明に用いることができるさらなるシュードモナス・フルオレッセンス株としては、次のＡＴＣＣ記号を有するシュードモナス・フルオレッセンス・ミグラ(Migula)およびシュードモナス・フルオレッセンス・ロイトキトク(Loitokitok)が挙げられる：［ＮＣＩＢ  ８２８６］；ＮＲＲＬ  Ｂ−１２４４；ＮＣＩＢ  ８８６５株ＣＯｌ；ＮＣＩＢ  ８８６６株ＣＯ２；１２９１［ＡＴＣＣ  １７４５８；ＩＦＯ  １５８３７；ＮＣＩＢ  ８９１７；ＬＡ；ＮＲＲＬ  Ｂ−１８６４；ピロリジン；ＰＷ２［ＩＣＭＰ  ３９６６；ＮＣＰＰＢ  ９６７；ＮＲＲＬ  Ｂ−８９９］；１３４７５；ＮＣＴＣ  １００３８；ＮＲＲＬ  Ｂ−  １６０３［６；ＩＦＯ  １５８４０］；５２−ｌＣ；ＣＣＥＢ  ４８８−Ａ［ＢＵ  １４０］；ＣＣＥＢ  ５５３［ＩＥＭ  １５／４７］；ＩＡＭ  １００８［ＡＨＨ−２７］；ＩＡＭ  １０５５［ＡＨＨ−２３］；１［ＩＦＯ  １５８４２］；１２［ＡＴＣＣ  ２５３２３；ＮＩＨ  １１；ｄｅｎ  Ｄｏｏｒｅｎ  ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ２１６］；１８［ＩＦＯ  １５８３３；ＷＲＲＬ  Ｐ−７］；９３［ＴＲ−１０］；１０８［５２−２２；ＩＦＯ  １５８３２］；１４３［ＩＦＯ  １５８３６；ＰＬ］；１４９［２−４０−４０；ＩＦＯ  １５８３８］；１８２［ＩＦＯ  ３０８１；ＰＪ  ７３］；１８４［ＩＪＪＦＯ  １５８３０］；１８５［Ｗ２  Ｌ−１］；１８６［ＩＦＯ  １５８２９；ＰＪ  ７９］；１８７［ＮＣＰＰＢ  ２６３］；１８８［ＮＣＰＰＢ  ３１６］；１８９［ＰＪ２２７；１２０８］；１９１［ＩＦＯ  １５８３４；ＰＪ  ２３６；２２／１］；１９４［Ｋｌｉｎｇｅ  Ｒ−６０；ＰＪ  ２５３］；１９６［ＰＪ  ２８８］；１９７［ＰＪ  ２９０］；１９８［ＰＪ  ３０２］；２０１［ＰＪ  ３６８］；２０２［ＰＪ  ３７２］；２０３［ＰＪ  ３７６］；２０４［ＩＦＯ  １５８３５；ＰＪ  ６８２］；２０５［ＰＪ  ６８６］；２０６［ＰＪ  ６９２］；２０７［ＰＪ  ６９３］；２０８［ＰＪ  ７２２］；２１２［ＰＪ  ８３２］；２１５［ＰＪ  ８４９］；２１６［ＰＪ  ８８５］；２６７［Ｂ−９］；２７１［Ｂ−１６１２］；４０１［Ｃ７１Ａ；ＩＦＯ  １５８３１；ＰＪ  １８７］；ＮＲＲＬ  Ｂ−３１７８［４；ＩＦＯ  １５８４１］；ＫＹ  ８５２１；３０８１；３０−２１；［ＩＦＯ  ３０８１］；Ｎ；ＰＹＲ；ＰＷ；Ｄ９４６−Ｂ８３［ＢＵ  ２１８３；ＦＥＲＭ−Ｐ  ３３２８］；Ｐ−２５６３［ＦＥＲＭ−Ｐ  ２８９４；ＩＦＯ  １３６５８］；ＩＡＭ−１１２６［４３Ｆ］；Ｍ−１；Ａ５０６［Ａ５−０６］；Ａ５０５［Ａ５−０５−１］；Ａ５２６［Ａ５−２６］；Ｂ６９；７２；ＮＲＲＬ  Ｂ−４２９０；ＰＭＷ６［ＮＣＩＢ  １１６１５］；ＳＣ  １２９３６；Ａｌ［ＩＦＯ  １５８３９］；Ｆ  １８４７［ＣＤＣ−ＥＢ］；Ｆ  １８４８［ＣＤＣ  ９３］；ＮＣＩＢ  １０５８６；Ｐ１７；Ｆ−１２；ＡｍＭＳ  ２５７；ＰＲＡ２５；６１３３Ｄ０２；６５１９Ｅ０１；Ｎｌ；ＳＣ１５２０８；ＢＮＬ−ＷＶＣ；ＮＣＴＣ  ２５８３［ＮＣＩＢ  ８１９４］；Ｈ１３；１０１３［ＡＴＣＣ  １１２５１；ＣＣＥＢ  ２９５］；ＩＦＯ  ３９０３；１０６２；またはＰｆ−５。
【０１２６】
別の実施形態においては、本方法によって、リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ）分泌シグナル、外膜ポーリンＥ（ＯｐｒＥ）分泌シグナル、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質分泌シグナル、アズリン分泌シグナル、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質分泌シグナルおよびリポタンパク質Ｂ分泌シグナルから選択されるシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌ペプチドによる融合タンパク質の発現が提供される。この方法は、分泌されたタンパク質を処理するシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ分泌シグナルの能力が、その細胞が、分泌されたタンパク質を生産することに理想的に適合していることを示すという発想の上に築かれている。従って、これらの細胞に由来するシグナル系は、多重発現系におけるこのタイプの分泌にとって理想的なシグナル系となるだろう。従って、特定されたシュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌シグナルを利用して、タンパク質またはペプチドを発現させる方法は、真核生物起源または原核生物起源のいずれかを含む任意の所定の宿主系で用いることができる。
【０１２７】
この実施形態においては、宿主細胞は組換えタンパク質またはペプチドを生産する能力を持つあらゆる細胞であり得、上記のようなシュードモナス・フルオレッセンス細胞が挙げられる。組換えタンパク質またはペプチドを生産するために最も一般的に用いられる系としては、特定の細菌細胞、特にエシェリキア・コリが挙げられる。というのは、それらを培養する必須成分は比較的安価であり、大規模バッチ培養でタンパク質を生産する潜在的な可能性があるからである。生物学的に関連する、特に研究目的のためのタンパク質およびペプチドを発現させるためには、酵母も用いられる。系(system)としては、サッカロマイセス・セレビシエまたはピヒア・パストリス(Pichia pastoris)が挙げられる。これらの系のキャラクタライゼイションは十分に行われており、これらの系によって、一般的に許容できるレベルの全タンパク質の発現が提供され、そしてこれらの系は比較的迅速であまり高価ではない。昆虫細胞の発現系も、生物学的に活性な形態の組換えタンパク質を発現させるための代替系として浮上しつつある。いくつかの場合においては、翻訳後修飾された正確に折りたたまれたタンパク質を生産することができる。哺乳動物の細胞発現系、たとえばチャイニーズハムスターの卵巣細胞、も組換えタンパク質を発現させるために用いられてきた。小規模では、多くの場合これらの発現系は効率的である。特定の生物製剤が、特に動物またはヒトの健康への適用において、タンパク質に由来してもよい。別の実施形態においては、この宿主細胞は植物細胞であり、タバコの細胞、トウモロコシ、アラビドプシス(Arabidopsis)種に由来する細胞、ジャガイモまたはコメの細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。別の実施形態においては、本方法において、多細胞生物を分析するかまたは改変し、それらはトランスジェニック生物を含むがこれに限定されるわけではない。多細胞生物を分析および／または改変するための技術は、一般的に、下記の細胞を改変するために記載された技術に基づく。
【０１２８】
一つの実施形態においては、宿主細胞は原核生物、たとえば細菌細胞であり得、エシェリキア種またはシュードモナス種が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。典型的な細菌細胞は、たとえばURL:http://www.emc.maricopa.edu/facultyv/farabee/BIOBK/BioBookDiversity#2.htmlにおいて、Estrella Mountain Community College, Arizona, USAのDr MJ Farabeeによるオンライン生物学教科書の「Biological Diversity: Bacteria and Archaeans」の章に記載されている。特定の実施形態においては、宿主細胞はシュードモナス細胞であり得、典型的にはシュードモナス・フルオレッセンス細胞であり得る。その他の実施形態においては、宿主細胞はエシェリキア・コリ細胞でもよい。別の実施形態においては、宿主細胞は真核細胞でもよく、たとえば昆虫細胞でもよく、スポドプテラ(Spodoptera)種、トリコプルシア(Trichoplusia)種、ドロソフィラ(Drosophila)種もしくはエスチジェメネ(Estigmene)種に由来する細胞が挙げられるがこれらに限定されるわけではなく、または哺乳動物の細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、サル細胞、霊長類の細胞もしくはヒト細胞が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２９】
一つの実施形態においては、宿主細胞は、細菌のいずれかの分類の一員であり得る。この細胞は、たとえば真性細菌のいずれかの種の一員であり得る。宿主は、次の分類のいずれか一つの一員であり得る：アシドバクテリア(Acidobacteria)、アクチノバクテリア(Actinobacteira)、アクイフェックス(Aquificae)、バクテロイデス(Bacteroidetes)、クロビ(Chlorobi)、クラミジエ(Chlamydiae)、コロフレキシ(Choroflexi)、クリシオジェネテス(Chrysiogenetes)、シアノバクテリア(Cyanobacteria)、デフェリバクテレス(Deferribacteres)、デイノコッカス(Deinococcus)、ジシトヨグロミ(Dictyoglomi)、フィブロバクテレス(Fibrobacteres)、フィルミキューテス(Firmicutes)、フソバクテリア(Fusobacteria)、ジェマチモナデテス(Gemmatimonadetes)、レンチスフェレ(Lentisphaerae)、ニトロスピレ(Nitrospirae)、プランクトマイセス(Planctomycetes)、プロテオバクテリア(Proteobacteria)、スピロケーテス(Spirochaetes)、サーモデスルホバクテリア(Thermodesulfobacteria)、サーモミクロビア(Thermomicrobia)、サーモトゲ(Thermotogae)、サーマス(Thermus)（サーマルス(Theramales)）または（ベルッコミクロビア（Verrucomicrobia)。真性細菌の宿主細胞の一つの実施形態においては、その細胞はシアノバクテリアを除く真性細菌のいずれかの種の一員であり得る。
【０１３０】
細菌の宿主は、プロテオバクテリアのいずれかの種の一員でもあり得る。プロテオバクテリア宿主細胞は、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリアまたはイプシロンプロテオバクテリアのいずれか一つの分類の一員であり得る。さらに、宿主は、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリアまたはガンマプロテオバクテリアのいずれか一つの分類の一員であり得、ガンマプロテオバクテリアのいずれかの種の一員であり得る。
【０１３１】
ガンマプロテオバクテリア宿主の一つの実施形態においては、宿主は、アエロモナダレス(Aeromonadales)、アルテロモナダレス(Alteromonadales)、エンテロバクテリアレス(Enterobacteriales)、シュードモナダレス(Pseudomonadales)もしくはキサントモナダレス(Xanthomonadales)の分類のいずれか一つの一員；またはエンテロバクテリアレスもしくはシュードモナダレスのいずれかの種の一員となるだろう。一つの実施形態においては、宿主細胞はエンテロバクテリアレス目に属してもよく、その宿主細胞は、エンテロバクテリアセエ(Enterobacteriaceae)科の一員かまたはエルウィニア(Erwinia)属、エシェリキア属もしくはセラチア(Serratia))属のいずれか一つの一員；またはエシェリキア属の一員となるだろう。シュードモナダレス目の宿主細胞の一つの実施形態において、宿主細胞は、シュードモナダセエ(Pseudomonadaceae)科の一員、さらにはシュードモナス属の一員となるだろう。ガンマプロテオバクテリア宿主としては、エシェリキア・コリ種の一員およびシュードモナス・フルオレッセンス種の一員が挙げられる。
【０１３２】
その他のシュードモナス生物も有用とななり得るろう。シュードモナスおよび近接種としてはグラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1が挙げられ、このサブグループは、R.E. BuchananおよびN.E. Gibbons (eds.)によるBergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, USA) (以下「Bergey (1974)」)の「Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci」として記載された科および／または属に属するプロテオバクテリアの群を含む。表４は、生物のこれらの科および属を提示している。
【表４】
2007512028.tif 000005
【０１３３】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１」は、この分類に用いられる基準に従って、この表題に分類されるであろうはずのプロテオバクテリアをも含む。この表題は、この欄に既に分類された群をも含むが、もはや、たとえばアシドボラクス(Acidovorax)属、ブレブンジモナス(Brevundimonas)属、ブルクホルデリア(Burkholderia)属、ヒドロジェノファーガ(Hydrogenophaga)属、オシアニモナス(Oceanimonas)属、ラルストニア(Ralstonia)属およびステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属（およびそれに由来するブラストモナス(Blastomonas)属)など、キサントモナス属（の種であると既に呼ばれているもの)に属する生物を再編することで生じたもの、アセトバクター属に属する生物を再編することで生じたものであるアシドントナス(Acidontonas)属のような、Bergey (1974)に定義されたようなものではない。さらに、宿主は、シュードモナス属、シュードモナス・エナリア(enalia)(ATCC 14393)、シュードモナス・ニグリファシエンス(nigrifaciens)(ATCC 19375)およびシュードモナス・プトレファシエンス(putrefaciens)(ATCC 8071)、これらはそれぞれアルテロモン、アルテロモナス・ハロプランクティス(Alteromonas haloplanktis)、アルテロモナス・ニグリファシエンス(nigrifaciens)およびアルテロモナス・プトレファシエンス(putrefaciens)として再分類されている、に由来する細胞を含むことができる。同様に、たとえばシュードモナス・アシドボランス(acidovorans)(ATCC 15668)およびシュードモナス・テストステロニ(testosteroni)(ATCC 11996)は、それぞれコマモナス(Comamonas)・アシドボランスおよびコマモナス・テストステロニとして再分類されており、ならびにシュードモナス・ニグリファシエンス(ATCC 19375)およびシュードモナス・ピシシダ(piscicida)(ATCC 15057)は、それぞれシュードアルテロモナス・ニグリファシエンス(Pseudoalteromonas nigrifaciens)およびシュードアルテロモナス・ピシシダとして再分類されている。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1」は、シュードモナダセエ科、アゾトボアクテラセアエ(Azotoboacteraceae)科（現在ではしばしはシュードモナダセエ科の「アゾトバクターグループ」の異名で呼ばれている)、リゾビアセアセ科およびメチロモナダセアエ科（現在ではしばしばは「メチロコッカセアエ(Methylococcaceae)科」の異名で呼ばれている)：の科のいずれかに属するものとして分類されているプロテオバクテリアをも含む。その結果、これらの属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1」に含まれる、ここに記載されたもの以外のさらなるプロテオバクテリア属としては：1)アゾトバクターグループのアゾリゾフィルス(Azorhizophilus)属の細菌；2)シュードモナダセエ科のセルビブリオ(Cellvibrio)属、オリジェラ(Oligella)属およびテレジニバクター(Teredinibacter)属の細菌；3)リゾビアセアセ科のケラトバクター(Chelatobacter)属、エンシフェラ(Ensifer)属、リベリバクター(Liberibacter)属（「カンジダタス(Candidatus)・リベリバクター」とも呼ばれる)およびシノリゾビウム(Sinorhizobium)属の細菌；ならびに4)メチロコッカセアエ科のメチロバクター(Methylobacter)属、メチロカルダム(Methylocaldum)属、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)属、メチロサルシナ(Methylosarcina)属およびメチロスファエラ(Methylosphaera)属の細菌が挙げられる。
【０１３４】
別の実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ2」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ2」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される（丸括弧内に、目録に列挙され、公に利用可能な状態で寄託されたその株の総数を示し、別記がない限り、すべてがATCCに寄託されている)：アシドモナス(Acidomonas)（２）；アセトバクター（９３）；グルコノバクター（３７）；ブレブンジモナス（２３）；ベイジェリンキア（１３）；デルキシア（２）；ブルセラ（４）；アグロバクテリウム（７９）；ケラトバクター（２）；エンシフェラ（３）；リゾビウム（１４４）；シノリゾビウム（２４）；ブラストモナス（１）；スフィンゴモナス（２７）；アルカリゲンス（８８）；ボルデテラ（４３）；ブルクホルデリア（７３）；ラルストニア（３３）；アシドボラクス（２０）；ヒドロジェノファーガ（９）；ズーグロエア（９）；メチロバクター（２）；メチロカルダム（１  ａｔ  ＮＣＩＭＢ）；メチロコッカス（２）；メチロミクロビウム（２）；メチロモナス（９）；メチロサルシナ（１）；メチロスファエラ；アゾモナス（９）；アゾリゾフィルス（５）；アゾトバクター（６４）；セルビブリオ（３）；オリジェラ（５）；シュードモナス（１１３９）；フランシセラ（４）；キサントモナス（２２９）；ステノトロフォモナス（５０）；およびオシアニモナス（４）。
【０１３５】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ2」の典型的な宿主細胞の種としては、次の細菌（丸括弧内に単数（または複数）のその典型的な株のATCC番号またはその他の寄託番号を示す）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：アシドモナス・メタノリサ(methanolica)(ATCC 43581)；アセトバクター・アセチ(aceti)(ATCC 15973)；グルコノバクター・オキシダンス(oxydans)(ATCC 19357)；ブレブンジモナス・ジミニュータ(diminuta)(ATCC 11568)；ベイジェリンキア・インディカ(indica)(ATCC 9039およびATCC 19361)；デルキシア・グモーサ(gummosa)(ATCC 15994)；ブルセラ・メリテンシス(melitensis)(ATCC 23456)、ブルセラ・アボラタス(abortus)(ATCC 23448)；アグロバクテリウム・チューメファシエンス(tumefaciens)(ATCC 23308)、アグロバクテリウム・ラジオバクター(radiobacter)(ATCC 19358)、アグロバクテリウム・リゾーゲネス(rhizogenes)(ATCC 11325)；ケラトバクター・ヘインチ(heintzii)(ATCC 29600)；エンシフェラ・アドヘエレンス(adhaerens)(ATCC 33212)；リゾビウム・レグミノザラム(leguminosarum)(ATCC 10004)；シノリゾビウム・フレンジ(fredii)(ATCC 35423)；ブラストモナス・ナタトリア(natatoria)(ATCC 35951)；スフィンゴモナス・パウチモビリス(paucimobilis)(ATCC 29837)；アルカリゲンス・フェイシャリス(faecalis)(ATCC 8750)；ボルデテラ・パーツシス(pertussis)(ATCC 9797)；ブルクホルデリア・セパシア(cepacia)(ATCC 25416)；ラルストニア・ピケッチ(pickettii)(ATCC 27511)；アシドボラクス・ファシリス(facilis)(ATCC 11228)；ヒドロジェノファーガ・フラバ(flava)(ATCC 33667)；ズーグロエア・ラミジェラ(ramigera)(ATCC 19544)；メチロバクター・ルーテウス(luteus)(ATCC 49878)；メチロカルダム・グラシーレ(gracile)(NCIMB 11912)；メチロコッカス・カプスラタス(capsulatus)(ATCC 19069)；メチロミクロビウム・アギール(agile)(ATCC 35068)；メチロモナス・メタニカ(methanica)(ATCC 35067)；メチロサルシナ・フィブラータ(fibrata)(ATCC 700909)；メチロスファエラ・ハンソニル(hansonii)(ACAM 549)；アゾモナス・アギリス(agilis)(ATCC 7494)；アゾリゾフィルス・パスパリ(paspali)(ATCC 23833)；アゾトバクター・クロオコクム(chroococcum)(ATCC 9043)；セルビブリオ・ミクタス(mixtus)(UQM 2601)；オリジェラ・ウレサラリス(urethralis)(ATCC 17960)；シュードモナス・アエルギノーサ(ATCC 10145)、シュードモナス・フルオレッセンス(ATCC 35858)；フランシセラ・ツラレンシス(tularensis)(ATCC 6223)；ステノトロフォモナス・マルトフィア(maltophilia)(ATCC 13637)；キサントモナス・カンペストリス(campestris)(ATCC 33913)；およびオシアニモナス・ドウドロッフィ(doudoroffii)(ATCC 27123)。
【０１３６】
別の実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ３」から宿主細胞を選択する。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ３」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；アグロバクテリウム；リゾビウム；シノリゾビウム；ブラストモナス；スフィンゴモナス；アルカリゲンス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスファエラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１３７】
別の実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ４」から宿主細胞を選択する。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ４」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスファエラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１３８】
一つの実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ５」から宿主細胞を選択する。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ５」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスファエラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１３９】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ６」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ６」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１４０】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ７」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ７」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１４１】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ８」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ８」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；シュードモナス；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１４２】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ９」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ９」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；シュードモナス；ステノトロフォモナス；およびオシアニモナス。
【０１４３】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１０」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１０」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；ステノトロフォモナス；およびキサントモナス。
【０１４４】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１１」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１１」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス；ステノトロフォモナス；およびキサントモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１２」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１２」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１３」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１３」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；およびキサントモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１４」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１４」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナスおよびキサントモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１５」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１５」は、シュードモナス属のプロテオバクテリアの群と定義される。
【０１４５】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ16」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ16」は、次のシュードモナス種（丸括弧内に単数（または複数）の典型的な株のATCC番号またはその他の寄託番号を示す）のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス・アビエタニフィラ(abietaniphila)(ATCC 700689)；シュードモナス・アエルギノーサ(ATCC 10145)；シュードモナス・アルカリゲンス(ATCC 14909)；シュードモナス・アングリセプチサ(anguilliseptica)(ATCC 33660)；シュードモナス・シトロネロリス(citronellolis)(ATCC 13674)；シュードモナス・フラベセンス(flavescens)(ATCC 51555)；シュードモナス・メンドシナ(ATCC 25411)；シュードモナス・ニトロレデュセンス(nitroreducens)(ATCC 33634)；シュードモナス・オレオボランス(oleovorans)(ATCC 8062)；シュードモナス・シュードアルカリゲネス(pseudoalcaligenes)(ATCC 17440)；シュードモナス・レジノボランス(resinovorans)(ATCC 14235)；シュードモナス・ストラミネア(straminea)(ATCC 33636)；シュードモナス・アガリシ(agarici)(ATCC 25941)；シュードモナス・アルカリフィラ(alcaliphila)；シュードモナス・アルギノボラ(alginovora)；シュードモナス・アンデルソニイ(andersonii)；シュードモナス・アスプレニ(asplenii)(ATCC 23835)；シュードモナス・アゼラシア(azelaica)(ATCC 27162)；シュードモナス・ベイジェリンキ(beijerinckii)(ATCC 19372)；シュードモナス・ボレアリス(borealis)；シュードモナス・ボレオポリス(boreopolis)(ATCC 33662)；シュードモナス・ブラシカセラム(brassicacearum)；シュードモナス・ブタノボラ(butanovora)(ATCC 43655)；シュードモナス・セルローサ(cellulosa)(ATCC 55703)；シュードモナス・アウランチアカ(aurantiaca)(ATCC 33663)；シュードモナス・クロロラフィス(chlororaphis)(ATCC 9446、ATCC 13985、ATCC 17418、ATCC 17461)；シュードモナス・フラジ(fragi)(ATCC 4973)；シュードモナス・ルンデンシス(lundensis)(ATCC 49968)；シュードモナス・タエトロレンス(taetrolens)(ATCC 4683)；シュードモナス・シッシコラ(cissicola)(ATCC 33616)；シュードモナス・コロナファシエンス(coronafaciens)；シュードモナス・ジテルペニフィラ(diterpeniphila)；シュードモナス・エロンガータ(elongata)(ATCC 10144)；シュードモナス・フレクテンス(flectens)(ATCC 12775)；シュードモナス・アゾトフォルマンス(azotoformans)；シュードモナス・ブレンネリ(brenneri)；シュードモナス・セドレラ(cedrella)；シュードモナス・コルガータ(corrugata)(ATCC 29736)；シュードモナス・エクストレモリエンタリス(extremorientalis)；シュードモナス・フルオレッセンス(ATCC 35858)；シュードモナス・ゲッサルジ(gessardii)；シュードモナス・リバネンシス(libanensis)；シュードモナス・マンデリイ(mandelii)(ATCC 700871)；シュードモナス・マルジナリス(marginalis)(ATCC 10844)；シュードモナス・ミグラエ(migulae)；シュードモナス・ムシドレンス(mucidolens)(ATCC 4685)；シュードモナス・オリエンタリス(orientalis)；シュードモナス・ローデシエ(rhodesiae)；シュードモナス・シンカンサ(synxantha)(ATCC 9890)；シュードモナス・トラーシ(tolaasii)(ATCC 33618)；シュードモナス・ベローニ(veronii)(ATCC 700474)；シュードモナス・フレデリクスベルゲンシス(frederiksbergensis)；シュードモナス・ゲニクラタ(geniculata)(ATCC 19374)；シュードモナス・ジンゲリ(gingeri)；シュードモナス・グラミニス(graminis)；シュードモナス・グリモンティ(grimontii)；シュード���ナス・ハロデニトリフィカンス(halodenitrificans)；シュードモナス・ハロフィラ(halophila)；シュードモナス・ヒビスキコラ(hibiscicola)(ATCC 19867)；シュードモナス・フッチエンシス(huttiensis)(ATCC 14670)；シュードモナス・ハイドロゲノボラ(hydrogenovora)；シュードモナス・ジェッセンイ(jessenii)(ATCC 700870)；シュードモナス・キロネンシス(kilonensis)；シュードモナス・ランセオラタ(lanceolata)(ATCC 14669)；シュードモナス・リニ(lini)；シュードモナス・マルギナタ(marginata)(ATCC 25417)；シュードモナス・メフィチサ(mephitica)(ATCC 33665)；シュードモナス・デニトリフィカンス(denitrificans)(ATCC 19244)；シュードモナス・ペルツシノゲナ(pertucinogena)(ATCC 190)；シュードモナス・ピクトラム(pictorum)(ATCC 23328)；シュードモナス・サイクロフィラ(psychrophila)；シュードモナス・フルバ(fulva)(ATCC 31418)；シュードモナス・モンテイリ(monteilii)(ATCC 700476)；シュードモナス・モッセリイ(mosselii)；シュードモナス・オリジハビタンス(oryzihabitans)(ATCC 43272)；シュードモナス・プレコグロッシシダ(plecoglossicida)(ATCC 700383)；シュードモナス・プチダ(putida)(ATCC 12633)；シュードモナス・レアクタンス(reactans)；シュードモナス・スピノサ(spinosa)(ATCC 14606)；シュードモナス・バレアリカ(balearica)；シュードモナス・ルテオラ(luteola)(ATCC 43273)；シュードモナス・スツッツェリ(stutzeri)(ATCC 17588)；シュードモナス・アミグダリ(amygdali)(ATCC 33614)；シュードモナス・アバラナエ(avellanae)(ATCC 700331)；シュードモナス・カリカパヤエ(caricapapayae)(ATCC 33615)；シュードモナス・シッコリ(cichorii)(ATCC 10857)；シュードモナス・フィクセレクタエ(ficuserectae)(ATCC 35104)；シュードモナス・フソコバギナエ(fuscovaginae)；シュードモナス・メリアエ(meliae)(ATCC 33050)；シュードモナス・シリンジャエ(syringae)(ATCC 19310)；シュードモナス・ビリジフラバ(viridiflava)(ATCC 13223)；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス(thermocarboxydovorans)(ATCC 35961)；シュードモナス・サーモトレランス(thermotolerans)；シュードモナス・チベルバレンシス(thivervalensis)；シュードモナス・バンコウベレンシス(vancouverensis)(ATCC 700688)；シュードモナス・ウィスコンシネンシス(wisconsinensis)；およびシュードモナス・キアメンシス(xiamenensis)。
【０１４６】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ17」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ17」は、たとえば次のシュードモナス種に属するものを含む「蛍光性シュードモナス」として本技術分野において知られているプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス・アゾトフォルマンス；シュードモナス・ブレンネリ；シュードモナス・セドレラ；シュードモナス・コルガータ；シュードモナス・エクストレモリエンタリス；シュードモナス・フルオレッセンス；シュードモナス・ゲッサルジ；シュードモナス・リバネンシス；シュードモナス・マンデリイ；シュードモナス・マルジナリス；シュードモナス・ミグラエ；シュードモナス・ムシドレンス；シュードモナス・オリエンタリス；シュードモナス・ローデシエ；シュードモナス・シンカンサ；シュードモナス・トラーシ；およびシュードモナス・ベローニ。
【０１４７】
その他の適切な宿主としては、参考文献のその他の部分において分類されたもの、たとえばグラム（＋）プロテオバクテリアが挙げられる。一つの実施形態においては、宿主細胞はエシェリキア・コリである。エシェリキア・コリについてのゲノム配列は、エシェリキア・コリＭＧ１６５５(Blattner, et al. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science 277(5331): 1453-74)について明らかにされており、エシェリキア・コリK12についてのDNAマイクロアレイは市販されている(MWG Inc, High Point, NC)。リッチな培地、たとえばLuria-Bertani(LB)(10ｇ/Lトリプトン、5ｇ/L NaCl、5ｇ/L酵母エキス)または定義済みの最少培地、たとえば適切な炭素源、たとえば１％グルコースなどを含むＭ９(6g/L Na2HPO4、3g/LKH2PO4、1g/LNH4Cl、0.5g/L NaCl、pH7.4)のいずれかにおいて、エシェリキア・コリを培養することができる。エシェリキア・コリ細胞を一晩培養したものを希釈し、振盪フラスコまたは発酵槽のいずれかの中の新鮮なリッチな培地または最少培地に接種し、３７℃で培養することは日常法的な操作である。
【０１４８】
宿主も哺乳動物起源、たとえば任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に由来する細胞であってよい。哺乳動物としては、霊長類、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、げっ歯類、有蹄類、ブタ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、コヒツジ、ヤギ、ウシ、シカ、ラバ、ウマ、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが挙げられ得るが、これらに限定されるわけではない。.
【０１４９】
宿主細胞は植物起源のものでもよい。遺伝子および制御配列を特定するために、任意の植物を選択することができる。遺伝子および制御配列を単離することに適した植物ターゲットの具体例としては、アルファルファ、リンゴ、アンズ、アラビドプシス、チョウセンアザミ、キバナスズシロ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、カンタロープ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、チェリーサクラ、チコリー、シラントロ、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、綿花、クランベリー、キュウリ、ダグラスファー、ナス、エンダイブチコリー、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ニンニク、ヘチマ、ブドウ、グレープフルーツ、ハニーデュー、クズイモ、キウイフルーツ、レタス、ネギ、レモン、ライム、テーダマツ、リンシード、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ネクタリン、ナッツ、カラスムギ、アブラヤシ、アブラナ、オクラ、オリーブ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパイヤ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、西洋ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアータパイン、ラディッシュオ、ダイコン、ナタネ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、ミカン、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、シバ、カブ、ブドウ、スイカ、コムギ、ヤマイモおよびズッキーニが挙げられるだろうが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、本方法に有用な植物はアラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、ダイズおよび綿花である。
【０１５０】
組換えタンパク質もしくはペプチドの発現のために、または特定された代償的遺伝子の調節のために、任意の植物プロモーターを用いることができる。プロモーターは植物のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターでもよい。植物プロモーター内に含まれるエレメントは、典型的には転写開始部位の約２５から３５塩基対上流（５’）に位置するＴＡＴＡボックスまたはＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックス、および７０から１００塩基対の間上流に位置するＣＣＡＡＴボックスでもよい。植物においては、ＣＣＡＡＴボックスは、哺乳動物のプロモーターの機能的に類似の配列よりもコンセンサス配列が異なっていてもよい(Messing et al. (1983) In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211-227)。さらに、ほとんどすべてのプロモーターは、転写開始部位の−１００  ｂｐから−１，０００  ｂｐ近傍またはさらに上流に及ぶ、追加的な上流の活性化配列またはエンハンサーを含む(Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310；Gruss et al. (1981) Proc. Nat. Acad. ScLi 78:943-947；and Khoury and Grauss (1983) Cell 27:313-314)。
【０１５１】
タンパク質の生産／発酵
本発明の方法は、好ましくは、宿主細胞における組換えタンパク質またはペプチドの生産の増加を導く。あるいは、生産の増加は、生産されたタンパク質のグラムあたりの、または宿主のタンパク質のグラムあたりの、正確に加工されたタンパク質またはペプチドの生産レベルの増加でもよい。生産の増加は、組換え体のグラムあたりの、または宿主細胞タンパク質のグラムあたりの、生産された修復可能なタンパク質またはペプチドのレベルの増加でもよい。生産の増加は、全レベルの増加と、タンパク質の正確に加工されたレベル、タンパク質の活性なレベルまたはタンパク質の可溶性のレベルとの任意の組み合わせでもよい。
【０１５２】
組換えタンパク質の発現を改良して、タンパク質の溶解性を高めることができる。宿主細胞の細胞質、ペリプラズムまたは細胞外の培地から、組換えタンパク質またはペプチドを生産し回収することができる。このタンパク質またはペプチドは不溶性でもまたは可溶性でもよい。このタンパク質またはペプチドは、一つ以上のターゲティング配列または精製を支援する配列を含むことができる。
【０１５３】
細胞培養
本技術分野において公知の形質転換の任意の方法を利用して、シュードモナス宿主細胞を単数（または複数）のベクターで形質転換してもよく、その細菌の宿主細胞をインタクトな細胞として、またはプロトプラスト（すなわち細胞質体を含む)として形質転換してもよい。典型的な形質転換の方法としては、ポレーションの方法、たとえばエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌の接合および二価カチオンによる処理、たとえば塩化カルシウム処理もしくはCaCl/Mg2+処理、または本技術分野におけるその他の周知の方法が挙げられる。たとえば、Morrison, J. Bact, 132:349-351 (1977)；Clark-Curtiss and Curtiss, Methods in Enzymology, 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983), Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))を参照すること。
【０１５４】
本明細書で用いられるように、「発酵」という用語は、文字通りの発酵が用いられる実施形態およびその他の非発酵性の培養モードが用いられる実施形態の両方を含む。発酵は任意の規模で実施してもよい。一つの実施形態においては、発酵培地をリッチな培地、最少培地および無機塩培地の中から選択してもよい；リッチな培地を用いても良いが、避けたほうが好ましい。別の実施形態においては、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。さらに別の実施形態においては最少培地が選択される。さらに別の実施形態においては、無機塩培地が選択される。無機塩培地が特に好ましい。
【０１５５】
無機塩培地は、無機塩、および炭素源、たとえばグルコース、ショ糖またはグリセロールからなる。無機塩培地の具体例としては、たとえば、M9培地、シュードモナス用培地(ATCC 179)、Davis and Mingioli培地(BD Davis and ES Mingioli (1950) in J. Bact. 60:17-28を参照すること)が挙げられる。無機塩培地を作製するために用いられる無機塩としては、たとえばリン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムならびに微量元素、たとえば塩化カルシウム、ホウ酸塩および鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の硫酸塩から選択されるものが挙げられる。無機塩培地には、有機窒素源、たとえばペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母エキスは含まれない。その代わりとして無機窒素源を用い、これは、たとえばアンモニウム塩、アンモニア水およびアンモニアガスの中から選択すればよい。好ましい無機塩培地は、グルコースを炭素源として含むものであるろう。無機塩培地と比較すれば、最少培地は無機塩および炭素源を含むことができるが、たとえば低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたはその他の成分を追加することができる。しかしが、それらの追加は極めて微量のレベルである。
【０１５６】
一つの実施形態においては、以下の表５に列挙された成分を用いて培地を調製することができる。これらの成分を次の順序で添加することができる：最初に（ＮＨ4）ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4およびクエン酸を約３０リットルの蒸留水に溶解すればよい；次いで、微量元素の溶液を添加し、次いで消泡剤、たとえばＵｃｏｌｕｂ  Ｎ  １１５を添加することができる。次いで、（たとえば約１２１℃で）加熱滅菌した後、グルコース、ＭｇＳＯ4およびチアミン塩酸塩の滅菌溶液を添加すればよい。アンモニア水を用いてｐＨを約６．８にコントロールすることができる。次いで、滅菌蒸留水を添加して、最初の体積を３７１からグリセロールストック分（１２３  ｍＬ）引いたものに調整することができる。薬品は種々の供給業者、たとえばＭｅｒｃｋ社から市販されている。この培地によって、シュードモナス種および類縁の細菌の高い細胞密度での培養(HCDC)が可能となる。バッチプロセスとしてＨＣＤＣを開始することができ、次いで、二相供給式バッチ培養とする。バッチ部における無制限の培養の後、生物体量の濃度が数倍に高まり得る時間３倍化する時間にわたって、培養をコントロールして培養の比速度を低下させることができる。このような培養手段についてのさらに詳細な点は、Riesenberg, D.；Schulz, V.；Knorre, W. A.；Pohl, H. D.；Korz, D.；Sanders, E. A.；Ross, A.；Deckwer, W. D. (1991) 「High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate」 J Biotechnol: 20(1) 17-27に記載されている。
【表５】
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【０１５７】
本発明に従った発現系を任意の発酵形式で培養することができる。本明細書では、たとえばバッチ発酵モード、フェドバッチ発酵モード、半連続発酵モードおよび連続発酵モードを採用してもよい。
【０１５８】
本発明に従った発現系は、任意の規模（すなわち体積）の発酵における導入遺伝子の発現にとって有用である。従って、たとえばマイクロリットルスケール、センチリットルスケールおよびデシリットルスケールの発酵体積を採用すればよい；そして１リットルスケールおよびより大きな発酵体積を採用することができる。一つの実施形態においては、発酵体積は１リットルかまたはそれを超えたものとなるだろう。別の実施形態においては、発酵体積は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットルもしくは５０，０００リットルかまたはそれを超えたものとなるだろう。
【０１５９】
本発明においては、形質転換された宿主細胞の増殖、培養および／または発酵を、宿主細胞が生存可能な温度範囲、好ましくは約４℃から約５５℃の範囲内の温度で行う。従って、本発明の宿主細胞に関して、たとえば本明細書で用いられるような「増殖」（「グロウス」(growth)）（および「グロウ」、「グロウイング」）、「培養」（「カルチャリング」(culturing)）（および「カルチャ」）、および「発酵」（「ファーメンテイション」(fermentation)）（および「ファーメント」、「ファーメンティング」）という用語は、本質的に、約４℃から約５５℃の温度範囲内での「増殖」、「培養」および「発酵」を意味する。さらに、「増殖」は、活発な細胞分裂および／または拡張の生物学的状態、ならびに分裂していない細胞および／または非拡張性の細胞が代謝を維持している生物学的状態の両方を示すために用いられ、「グロウス」という用語の後者の使用は、「メインテナンス」(maintenance)という用語と同義である。
【０１６０】
細胞密度
分泌された組換えタンパク質を発現させる際にシュードモナス・フルオレッセンスを用いることのさらなる利点には、シュードモナス・フルオレッセンスが、エシェリキア・コリまたはその他の細菌の発現系に比較して高い細胞密度で培養できるという能力が含まれる。このために、本発明に従ったシュードモナス・フルオレッセンスの発現系は、約２０ｇ／Ｌ以上の細胞密度を提供することができる。本発明に従ったシュードモナス・フルオレッセンスの発現系は、体積あたりの生物体量に関して述べられたように、同様に、少なくとも約７０ｇ／Ｌの細胞密度を提供することができる。ここでこの生物体量は乾燥細胞重量として測定される。
【０１６１】
一つの実施形態においては、細胞密度は少なくとも２０ｇ／Ｌとなるだろう。別の実施形態においては、細胞密度は少なくとも２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌまたは少なくとも１５０ｇ／Ｌとなるだろう。
【０１６２】
別の実施形態においては、誘導時の細胞密度は、２０ｇ／Ｌと１５０ｇ／Ｌとの間；２０ｇ／Ｌと１２０ｇ／Ｌとの間；２０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；２５ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；３０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；３５ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；４０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；４５ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；５０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；５０ｇ／Ｌと７５ｇ／Ｌとの間；５０ｇ／Ｌと７０ｇ／Ｌとの間；４０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間となるだろう。
【０１６３】
関心対象のタンパク質またはペプチドの単離
一般的に、本方法によって、通常の発現系と比べて正しくもしくは適切に加工された、発現された組換えタンパク質のレベルの増加が提供される。特に、本発明は適切なもののレベルの増加を提供する。
【０１６４】
特定の実施形態においては、本発明は、宿主細胞内の組換えタンパク質またはペプチドの溶解性を向上させるための方法を提供する。本明細書で用いられるように、「可溶性」という用語は、生理学的条件下の緩衝液で１０−３０分間回転させた場合において、約５，０００×ｇと２０，０００×ｇとの間での遠心分離によってタンパク質が沈殿しないことを意味する。可溶性タンパク質は、封入体またはその他の沈殿物の一部分ではない。同様に、「不溶性」とは、生理学的条件下の緩衝液で１０−３０分間回転させた場合において、約５，０００×ｇと２０，０００×ｇとの間での遠心分離によって沈殿し得るタンパク質またはペプチドを意味する。不溶性タンパク質またはペプチドは、封入体またはその他の沈殿物の一部分であり得る。「封入体」という用語は、細胞内に含まれる任意の細胞内の物体であって、タンパク質またはペプチドの隔離された凝集物を包含することを意味する。
【０１６５】
本発明は、活性な組換えタンパク質またはペプチドの回収を改良することもできる。活性なタンパク質のレベルを、たとえば、特定された特定されたポリペプチド、ポリペプチドの変異体、セグメントが置換されたポリペプチドおよび／または残基が置換されたポリペプチドと、親の(parent)ポリペプチド、ポリペプチドの変異体、セグメントが置換されたポリペプチドおよび／または残基との相互作用を、使いやすい任意のインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定することができる。従って、インビトロアッセイを用いて、特定されたタンパク質と関心対象のペプチド間、たとえば酵素と基質との間、ホルモンとホルモンレセプターとの間、抗体と抗原との間などの検出可能なあらゆる相互作用を測定することができる。このような検出としては、比色の変化の測定、放射能の変化の測定、溶解性の変化の測定、ゲル電気泳動および／またはゲル排除プロセスなどによって測定されるような分子量の変化の測定などが挙げられ得る。インビボアッセイとしては、生理学的影響、たとえば重量の増加、電解質のバランスの変化、血液凝固時間の変化、血栓分解の変化および抗原による応答の誘導を検出するためのアッセイが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。一般的に、特定されたポリペプチドと関心対象のポリペプチドとの間の相互作用の変化を測定するための可変性パラメータが存在する限り、あらゆるインビボアッセイを用いることができる。たとえば米国特許第5，834，250号を参照すること。
【０１６６】
ペリプラズムから組換えタンパク質を遊離させるために、薬品、たとえばクロロホルム(Ames et al. (1984) J. Bacterial, 160: 1181-1183)、グアニジン塩酸塩およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００(Naglak and Wang (1990) Enzyme Microb. Technol, 12: 603-611)を含む処理が採用されてきた。しかしながら、これらの薬品は不活性ではなく、多数の組換えタンパク質の生産物またはその後の精製手順に不利な影響を与えるかもしれない。外膜の透過処理を生じさせるエシェリキア・コリ細胞のグリシン処理について、ペリプラスムの内容物を遊離させることが報告されている(Ariga et al. (1989) J Ferm. Bioeng., 68: 243-246)。組換えタンパク質をペリプラスムから遊離させるための最も広く用いられている方法は、浸透圧ショックである(Nosal and Heppel (1966) J. Biol Chem., 241: 3055-3062；Neu and Heppel (1965) J. Biol Chem., 240: 3685-3692), hen eggwhite (HEW)-lysozyme/ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) treatment (Neu and Heppel (1964) J. Biol Chem., 239: 3893-3900；Witholt et al. (1976) Biochim. Biophys. Acta, 443: 534-544；Pierce et al. (1995) ICheme Research. Event, 2: 995- 997),およびcombined HEW-lysozyme/osmotic shock treatment (French et al. (1996) Enzyme and Microb. Tech., 19: 332-338)。このFrenchらの方法には、分画用緩衝液で細胞を再懸濁し、次いでペリプラスム画分、ここではリゾチーム処理のすぐ後に浸透圧ショックが行われる、を回収することが含まれる。組換えタンパク質、エス・サーモビオラセウス(S. thermoviolaceus)のα−アミラーゼの過剰発現と、宿主生物の増殖期が回収に与える影響も議論されている。
【０１６７】
典型的には、これらの手順には、浸透圧が安定化された培地で最初の破壊と、それに続く非安定化培地での選択的な遊離が含まれる。これらの培地の組成（pH、保護剤）および用いた破壊方法（クロロホルム、ＨＥＷ−リゾチーム、ＥＤＴＡ、音波処理）は、報告された特定の手順によって異なる。ＥＤＴＡに代えて両性イオン界面活性剤を用いてのＨＥＷ−リゾチーム／ＥＤＴＡ処理に関する変化は、Stabel et al. (1994) Veterinary Microbiol, 38: 307-314によって議論されている。エシェリキア・コリを破壊するために用いる細胞内の溶解酵素系の一般的な総説については、Dabora and Cooney (1990)in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 43, A. Fiechter, ed. (Springer-Verlag: Berlin), pp. 11-30を参照すること。
【０１６８】
細胞質から、可溶性タンパク質としてまたは屈折性粒子として組換えタンパク質を回収するための従来の方法には、機械的な破損によって細菌細胞を破壊することが含まれていた。典型的には、機械的な破壊としては、懸濁液の局部的なキャビテーションの発生、硬いビーズを伴う急激な撹拌、音波処理または細胞懸濁液の粉砕(grind)が挙げられる(Bacterial Cell Surface Techniques, Hancock and Poxton (John Wiley and Sons Ltd, 1988), Chapter 3, p. 55)。
【０１６９】
ＨＥＷ−リゾチームは生化学的に作用して、細胞壁のペプチドグリカンのバックボーンを加水分解する。この方法は、最初にZinder and Arndt (1956) Proc. Natl. Acad. Sdci. USA, 42: 586-590によって開発された。彼らはエシェリキア・コリを（ＨＥＷ−リゾチームを含む）卵のアルブミンで処理して、後になってスフェロプラストとして知られる、曲線的な細胞の球体を得た。これらの構造はいくつかの細胞壁成分を維持していたが、表面積が大きく、そこでは細胞膜が晒されていた。米国特許第5，169，772号では、たとえばＥＤＴＡ、リゾチームまたは有機化合物を用いて、浸透圧が安定化された培地内、たとえば２０％  ショ糖溶液内で細菌のエンベロープを破壊する工程、その細菌を低イオン強度の緩衝液に晒すことによって、破壊された細菌のペリプラスム空間から非ヘパリナーゼ様タンパク質を遊離させる工程、および低イオン強度で洗浄した細菌を緩衝化塩溶液に晒すことによってヘパリナーゼ様タンパク質を遊離させる工程を含む、細菌からヘパリナーゼを精製する方法が開示されている。
【０１７０】
広範囲の発現系に関して、成功した度合いが異なる、これらの方法の数多くの異なる改変法が用いられている(Joseph-Liazun et al. (1990) Gene, 86: 291-295；Carter et al. (1992) Bio/Technology, 10: 163-167)。組換え細胞培養液がリゾチームを生産するように誘導するための努力が報告されている。EP 0 155 189号では、組換え細胞培養液がリゾチームを生産するように誘導するための手段が開示されており、通常の場合、細胞壁の構造を破壊するかまたは溶解することによって、このような宿主細胞を殺すことが予想される。
【０１７１】
米国特許第4，595，658号では、エシェリキア・コリのペリプラスム空間に輸送されたタンパク質を細胞外に出すことを促す方法が開示されている。この方法によって、細胞のリゾチーム処理、機械的な粉砕または浸透圧ショック処理の必要性が無く、ペリプラズム内に位置するタンパク質の選択的な単離が可能となる。米国特許第４，６３７，９８０号では、温度に敏感なリソゲン(lysogen)を、生産物を直接的または間接的にコードするＤＮＡ分子で形質転換する工程、遺伝子産物が細胞内で発現することが許容された条件下で形質転換体を培養する工程、および温度を上昇させてファージがコードする機能を誘導することによって、生産物を細胞外に出す工程によって、細菌の生産物を生産することが開示されている。Asami et al. (1997) J. Ferment, and Bioeng., 83: 511-516では、T4ファージ感染によってエシェリキア・コリ細胞を同調させて破壊することが開示されており、Tanji et al. (1998) J. Ferment, and Bioeng., 85: 74-78では、エシェリキア・コリ細胞を穏やかに破壊するために、T4ファージにコードされた溶解遺伝子の発現をコントロールすることが開示されている。
【０１７２】
細胞溶解時に、ゲノムＤＮＡは細胞質から培地内に漏出し、その結果、遠心分離の分野において、固体の沈殿を妨害し得るような流体の粘度の顕著な上昇が生じる。せん断力、たとえばＤＮＡポリマーを破壊するための機械的な破壊の間に発揮されるせん断力が無い場合、粘稠な液体を介しての固体の沈殿速度がさらに遅くなり、その結果、遠心分離の間に固体と液体とを分離することが不十分となる。機械的なせん断力以外に、ＤＮＡポリマーを分解する核酸分解酵素が存在する。エシェリキア・コリにおいては、内因性遺伝子ｅｎｄＡは、通常はペリプラズムに向けて分泌されてエンドヌクレアーゼ的な方式でＤＮＡをオリゴデオキシリボヌクレオチドに切断するエンドヌクレアーゼ（成熟タンパク質の分子量は約２４．５  ｋＤである）をコードしている。エシェリキア・コリはｅｎｄＡを比較的弱く発現していることが示されている(Wackernagel et al. (1995) Gene 154: 55- 59)。
【０１７３】
一つの実施形態においては、ジスルフィド結合を含む特定のポリペプチドを、宿主細胞から活性を保持した可溶型で回収するために、さらなるジスルフィド結合を促進しない条件または薬剤が必要となる。一つの実施形態においては、遺伝子組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその断片は、活性状態では折りたたまれた分子内立体配置を有している。一つの実施形態においては、遺伝子組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質または断片は、活性状態では少なくとも一つの分子内ジスルフィド結合を含む；そして恐らくは、最大で２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０以上のジスルフィド結合を含む。
【０１７４】
本発明のタンパク質を単離し、本技術分野において周知の標準的な技術によって、実質的に純粋となるまで精製してもよい。かかる技術としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤による可溶化、カラムクロマトグラフィーのような基質を伴う選択的な沈降、免疫精製法およびその他の方法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。たとえば、分子付着性が立証されているタンパク質を、逆にリガンドと融合させてもよい。適切なリガンドと共に、タンパク質を精製用カラムに選択的に吸着させて、次いで比較的純粋な形態でカラムから遊離させることができる。次いで、酵素活性によって融合タンパク質を除去する。さらに、免疫アフィニティーカラムまたはＮｉ−ＮＴＡカラムを用いてタンパク質を精製することができる。一般的な技術は、たとえば、R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer- Verlag: N.Y. (1982)；Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990);米国特許第4，511，503号；S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001)；D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)；AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000)；およびR. Mukhija, et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)にさらに記載されている。さらに、たとえば、Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements)；Deutscher (1990) 「Guide to Protein Purification,」 Methods in Enzymology vol. 182,およびこのシリーズのその他の巻；Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY；ならびにタンパク質精製生産に使用する際の製造業者の文献、たとえばPharmacia, Piscataway, NJ., またはBio-Rad, Richmond, Calif. Combination with recombinant techniques allow fusion to appropriate segments, e.g., to a FLAG sequence or an equivalent which can be fused via a protease-removable sequenceも参照すること。さらに、たとえば、Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70；Hochuli (1990) 「Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent」 in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY；and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression and Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Califも参照すること。
【０１７５】
本技術分野において公知の方法によって発現されたタンパク質の検出を行い、たとえばラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降が挙げられる。
【０１７６】
遺伝子組換えによって生産され発現した酵素を、数え切れないほど多くの方法によって組換え細胞培養液から回収し精製することができる。たとえば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、必要に応じて最終的な精製工程で採用することができる。
【０１７７】
本発明において発現された特定のタンパク質は不溶性凝集物（「封入体」）を形成してもよい。いくつかのプロトコールが、封入体からのタンパク質の精製に適している。たとえば、封入体の精製は通常、たとえば、50mM TRIS/HCl pH 7.5,50mM NaCl,5mM MgCl2,1mM DTT,0.1mM ATPおよび1mM PMSFの緩衝液でインキュベーションを行うことによる宿主細胞の破壊による、封入体の抽出、分離および／または精製が必要である。通常、加圧型細胞破壊装置を介して２−３回通過させることを利用して、細胞懸濁液を溶解させる。Polytron(Brinkrnan Instruments社）を用いて、または氷上で音波処理を行って、細胞懸濁液をホモジナイズしてもよい。細菌を溶解する別の方法は、当業者にとって自明である（たとえば上掲のSambrook et al.；上掲のAusubel et al.を参照すること）。
【０１７８】
必要に応じて、封入体を可溶化してもよく、典型的にはその溶解した細胞懸濁液を遠心分離に付して不要な不溶性物を除去してもよい。封入体を形成したタンパク質を、適合性を有する緩衝液で希釈または透析を行うことによって再生してもよい。適切な溶媒としては、（約４Ｍから約８Ｍの）尿素、（体積／体積ベースで少なくとも約８０％の）ホルムアミドおよび（約４Ｍから約８Ｍの）グアニジン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変性剤ではあるが、この変性は不可逆的ではなく、（たとえば透析による）変性剤の除去または希釈によって再生するだろう。このことによって、免疫学的におよび／または生物学的に活性なタンパク質の再構成が可能となる。その他の適切な緩衝液は、当業者にとって公知である。
【０１７９】
あるいは、宿主のペリプラズムから組換えタンパク質またはペプチドを精製することも可能である。組換えタンパク質が宿主細胞のペリプラズム内に移動した場合、宿主細胞を溶解した後では、低温浸透圧ショックを本技術分野当業者において既知のその他の方法に付加することによって、細菌のペリプラスム画分を単離することができる。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するためには、たとえば、細菌細胞を遠心分離に付してペレットを形成させればよい。このペレットを、２０％ショ糖を含む緩衝液に再懸濁させてもよい。この細胞を溶解するために、細菌を遠心分離に付して、ペレットを氷冷の5mM MgSO4に再懸濁させ、氷浴内で約１０分間維持してもよい。細胞懸濁液を遠心分離に付して、その上清についてデカンテーションを行って保存してもよい。上清内に存在する組換えタンパク質を、当業者が周知の標準的な分離技術によって、宿主のタンパク質から分離することができる。
【０１８０】
初期の塩分画によって、関心対象の組換えタンパク質から、多数の不要な宿主細胞のタンパク質（または細胞の培地に由来するタンパク質）を分離することができる。このようなものの一例は、硫酸アンモニウムでありうる。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物内の水分量を効果的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質がそれらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性がより強ければ、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿すると思われる。典型的なプロトコールとしては、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が２０−３０％の間となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することが挙げられる。この濃度では、ほとんどの疎水性タンパク質が沈殿するだろう。次いで（関心対象のタンパク質が疎水性でない限り）沈殿を廃棄し、関心対象のタンパク質が沈殿することが分かっている濃度にまで硫酸アンモニウムをその上清に添加する。次いで、沈殿を緩衝液で可溶化し、必要に応じて、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解性を利用するその他の方法、たとえば冷エタノール沈殿、は当業者にとって周知であり、タンパク質複合体混合物を分画するために用いることができる。
【０１８１】
組換えタンパク質の分子量を利用して、より大きなサイズまたはより小さなサイズのタンパク質からそれを単離することができ、異なる孔径の膜（たとえばAmicon社またはMillipore社の膜）を介する限外ろ過を用いて行う。第一工程としては、関心対象のタンパク質の分子量よりも低分子量のものを遮断する孔径の膜を介して、タンパク質混合物の限外ろ過を行えばよい。次いで、限外ろ過の残留液の限外ろ過を、関心対象のタンパク質の分子量よりも大きい分子量のものを遮断する膜に対して行えばよい。組換えタンパク質はその膜を通過して、ろ液内に移るだろう。次いで、このろ液を下記のようなクロマトグラフィーに付せばよい。
【０１８２】
そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性およびリガンドに対するアフィニティーに基づいて、組換えタンパク質をその他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生(raise)された抗体をカラムの基質に結合させて、タンパク質を免疫精製することもできる。これらの方法のすべては本技術分野において周知である。当業者にとって、クロマトグラフィーの技術を、任意の規模でかつ多数の異なる製造業者（たとえばPharmacia Biotech社）からの装置を用いて実施できることは自明であろう。
【０１８３】
細胞の外膜の流動性が損傷を受けているか、または流動性が高まっていることによるかもしれないが、実際には、ペリプラズムに向けられた異種タンパク質は多くの場合、培養液内で見出されている（欧州特許EP 0 288 451号を参照すること）。この「受動的な」分泌の速度を、細胞の外膜を浸透性にさせる種々のメカニズム：コリシン(Miksch et al. (1997) Arch. Microbiol. 167: 143-150);増殖速度(Shokri et al. (2002) App Miocrobiol Biotechnol 58:386-392)；TolIIIの 過剰発現 (Wan and Baneyx (1998) Prorein Expression Purif. 14: 13-22)；バクテリオシン遊離タンパク質 (Hsiung et al. (1989) Bio/Technology 7: 267-71)、コリシンA 溶解タンパク質 (Lloubes et al. (1993) Biochimie 75: 451- 8)；ペリプラスムタンパク質を漏出する変異体 (Furlong and Sundstrom (1989) Developments in Indus. Microbio. 30: 141-8)；融合パートナー(Jeong and Lee (2002) Appl.Environ. Microbio. 68: 4979-4985)；浸透圧ショックによる回収 (Taguchi et al. (1990) Biochimica Biophysica Acta 1049: 278-85)を利用することによって上昇できるかもしれない。正確に折りたたまれかつ活性なタンパク質をエシェリキア・コリ内で生産するために、培養液内でのその後の局在化を伴う操作されたタンパク質のペリプラスム空間への輸送が利用されてきた (Wan and Baneyx (1998) Prorein Expression Purif. 14: 13-22；Simmons et al. (2002) J. Immun. Meth.263: 133-147；Lundell et al. (1990) J. Indust. Microbio.5: 215-27)。
【０１８４】
グラム陰性細菌は、それらの二重膜を横断してタンパク質を排出するための数え切れないほど多くの系を進化させてきた（図１を参照すること）。これらの分泌経路としては、たとえば：原形質膜および外膜の両方を横断するワンステップトランスロケーションのためのＡＢＣ（Ｉ型）経路、Ｐａｔｈ／Ｆｌａ（ＩＩＩ型）経路およびＰａｔｈ／Ｖｉｒ（ＩＶ型）経路；原形質膜を横断するトランスロケーションのためのＳｅｃ（ＩＩ型）経路、Ｔａｔ経路、ＭｓｃＬ経路およびＨｏｌｉｎｓ経路；ならびに原形質膜および外膜を横断するツーステップトランスロケーションのためのＳｅｃプラスフィンブリアル・アッシャー・ポーリン（FUP）経路、Ｓｅｃプラスオートトランスポーター（ＡＴ）経路、Ｓｅｃプラスツーパートナー分泌（TPS）経路、Ｓｅｃプラスメイン・ターミナル・ブランチ（MTB）経路、およびＴａｔプラスＭＴＢ経路が挙げられる。すべての細菌がこれらの分泌経路のすべてを有しているわけではない。
【０１８５】
三つのタンパク質系（Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）が、シングルエネルギー共役工程において両方の膜を横断してタンパク質を分泌する。四つの系（Ｓｅｃ、Ｔａｔ、ＭｓｃＬおよびＨｏｌｉｎｓ）が、内膜のみを横断して分泌し、そしてその他の四つの系（ＭＴＢ、ＦＵＰ、ＡＴおよびＴＰＳ）が外膜のみを横断して分泌する。
【０１８６】
本発明の分泌シグナルまたは宿主細胞を利用してペリプラズム内に輸送されるタンパク質も、さらなる工程において、細胞外の培地に能動的に排出することができる。能動輸送のための公知のメカニズムは、一般的にオートトランスポーター、ツーパートナー分泌系、メイン・ターミナル・ブランチ系またはフィンブリアル・アッシャー・ポーリンを介している。
【０１８７】
本発明の分泌シグナルまたは宿主細胞を利用してペリプラズム内に輸送されるタンパク質も、さらなる工程において、細胞外の培地に能動的に排出することができる。能動輸送のための公知のメカニズムは、一般的にオートトランスポーター、ツーパートナー分泌系、メイン・ターミナル・ブランチ系またはフィンブリアル・アッシャー・ポーリンを介している。
【０１８８】
オートトランスポーター(AT)経路を介して輸送されるタンパク質はたいてい、Ｎ−末端にＳｅｃ型シグナルペプチド、中央部にパッセンジャードメインおよびＣ−末端に２５０−３００アミノ酸残基のα−ドメインを含んでいる。種々のオートトランスポーターのα−ドメインは相同性が高いのに対して、パッセンジャードメインの配列およびサイズは著しく変化している。Ｓｅｃ系による内膜を横切った分泌とシグナルペプチドの切断に続いて、α−ドメインのオリゴマーは外膜ポーリンを形成し、これを経由してパッセンジャードメインが分泌される(Veiga et al. (2002) EMBO J., 21:2122-2131)。パッセンジャードメインは、外部環境に放出されるか、または細胞表面に留まるかのいずれかである。オートトランスポーターのほとんどは、グラム陰性病原体の病原性に関係している。
【０１８９】
ツーパートナー分泌(TPS)系は、ＡＴ系に機能的に類似しているが、配列の相同性を共有するようなタンパク質は知られていない。ＴＰＳ系は、隣接する遺伝子にコードされた、シグナルペプチドを含有する二つのタンパク質から構成される。一つのタンパク質はパッセンジャードメインを有し、その他の方はα−ドメインを有する。両方のタンパク質はＳｅｃ系によってペリプラズムに分泌され、パッセンジャードメインを持つタンパク質は、α−ドメインを有するタンパク質によって形成される外膜孔を経て、さらに排出される(Jacob-Dubuisson et al. (2001) Mol Microbiol. 40:306-13)。ＴＰＳ系のたいていの基質タンパク質は、１６５１から５６４０までのアミノ酸からなる巨大タンパク質である。それらのＮ−末端の２５０残基、すなわちトランスポーターについてのターゲティング配列である、は非常に似ているが、それらのＣ−末端の配列は非常に相違している。
【０１９０】
メイン・ターミナル・ブランチ(MTB)は、既に折りたたまれたタンパク質をペリプラズムから細胞外の培地に移動させる巨大な複合体である。この複合体は少なくとも１０のタンパク質の構成成分から成り、そのうちのいくらかは、４型線毛生物発生系と配列の相同性を共有している(Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-108)。機能的ＭＴＢ系をコードする遺伝子は一般的に、ゲノム内でクラスターを形成している。ＭＴＢによるターゲティングシグナルおよびタンパク質分泌の分子メカニズムはほとんど理解されていない。
【０１９１】
ＦＵＰ系は、グラム陰性プロテオバクテリアおよびシアノバクテリアにおける数え切れないほど多くの線毛（ピリ）の生物発生を担っている。それぞれの線毛の構造タンパク質をコードするオペロンは、線毛特異的ペリプラスムシャペロンタンパク質と、線毛特異的外膜アッシャータンパク質もコードしている。これらのタンパク質のすべてを、Ｓｅｃ型シグナルペプチドを伴う前駆体タンパク質として合成することができる。Ｓｅｃ系による内膜を横切ったトランスロケーションに続いて、線毛のサブユニットがシャペロンタンパク質と結合し、これによってペリプラズム内でのピリの自己会合を未然に防止する。シャペロンタンパク質とアッシャータンパク質との間の相互作用によってそのタンパク質のサブユニットが遊離し、続いて互いに相互反応して、アッシャータンパク質を介して外膜を横切って分泌される。
【０１９２】
再生(renaturation)および再度の折りたたみ(refolding)
不溶性タンパク質を再生または再度折りたたんで、タンパク質の二次構造および三次構造の配置を生み出すことができる。組換え型生産物の配置を完成させる際に、必要に応じてタンパク質の再折りたたみ工程を利用することができる。本技術分野において公知の、タンパク質の解離／会合を促進させるための薬剤を利用して、再折りたたみおよび再生を完成することができる。たとえば、タンパク質をジチオスレイトールと共にインキュベートし、次いで酸化型グルタチオン二ナトリウム塩と共にインキュベートし、次いで再度折りたたむための薬剤、たとえば尿素を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。
【０１９３】
たとえば、リン酸緩衝食塩水(PBS)かまたは50mM Na-酢酸、pH 6 緩衝液＋200mM NaClに対して透析することによって、組換えタンパク質を再生することもできる。あるいは、カラム、たとえばＮｉ  ＮＴＡカラム上で固定化している間に、プロテアーゼインヒビターを含む500mM NaCl、20%グリセロール、20mM Tris/HCl pH 7.4の液で、6M-1Mの尿素の直線勾配を利用することによって、タンパク質を再度折りたたむことができる。1.5時間以上をかけて、再生を実施することができる。再生後、250mMイミダゾールを添加することによってタンパク質を溶出することができる。PBSかまたは50mM酢酸ナトリウムpH6の緩衝液＋200mM NaClの液に対する最後の透析工程で、イミダゾールを除くことができる。精製されたタンパク質を4℃で貯蔵するか、または-80℃で凍結することができる。
【０１９４】
その他の方法としては、たとえば、MH Lee et al., Protein Expr. Purif., 25(1): p. 166-73 (2002), W.K. Cho et al., J. Biotechnology, 77(2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements), Deutscher (1990) 「Guide to Protein Purification」, Methods in Enzymology vol. 182,およびこのシリーズの他の巻、 Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001)；D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)に記載されたものが挙げられる。
【０１９５】
活性なタンパク質またはペプチドの分析
活性なタンパク質は、その配列の起源である天然のタンパク質またはペプチドの比活性の少なくとも２０％、３０％または４０％の比活性、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％の比活性、特に好ましくは少なくとも８０％、９０％または９５％の比活性を持つことが可能である。さらに、基質特異性（ｋcat  ／Ｋm）は、必要に応じて天然のタンパク質またはペプチドと実質的に同じでよい。典型的には、ｋcat／Ｋmは、天然のタンパク質またはペプチドのそれの少なくとも３０％、４０％または５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％である。タンパク質およびペプチドの活性ならびに基質特異性（ｋcat  ／Ｋm）をアッセイする方法および定量する方法は、当業者にとって周知である。
【０１９６】
本発明に従って生産される組換えタンパク質またはペプチド活性を、任意のタンパク質に特異的な、本技術分野において公知の従来のまたは標準的なインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定することができる。シュードモナスが生産した、分泌された組換えタンパク質またはペプチドの活性を、対応する天然のタンパク質の活性と比較することができ、同じか類似の生理学的条件下で一般的に見られる天然のタンパク質またはペプチドの活性に対して、組換えタンパク質が、実質的に同等または等価の活性を示すかどうかを決定することができる。
【０１９７】
組換えタンパク質の活性を、既に明らかにされた天然のタンパク質またはペプチドの標準的な活性と比較することができる。あるいは、組換えタンパク質またはペプチドの活性を、天然のタンパク質またはペプチドとの同時の、または実質的に同時の比較アッセイにて測定することができる。たとえば、インビトロアッセイを用いて、組換えタンパク質またはペプチドと、ターゲットとの間、たとえば発現された酵素と基質との間、発現されたホルモンおよびホルモンレセプターとの間、発現された抗体と抗原との間などにある、検出可能なあらゆる相互作用を測定することができる。このような検出としては、比色の変化の測定、増殖の変化の測定、細胞死の測定、細胞の反発性の測定、放射能の変化の測定、溶解性の変化の測定、ゲル電気泳動および／またはゲル排除方法によって測定される分子量の変化の測定、リン酸化能力の測定、抗体特異性のアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡアッセイなどを挙げることができる。さらに、インビボアッセイとしては、天然のタンパク質またはペプチドの生理学的影響、たとえば重量の増加、電解質のバランスの変化、血液凝固時間の変化、血栓分解の変化および抗原による応答の誘導と比較しての、シュードモナスが生産したタンパク質またはペプチドの生理学的影響を検出するためのアッセイが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。一般的に、あらゆるインビトロアッセイまたはインビボアッセイを用いて、シュードモナスが生産する組換えタンパク質またはペプチドの活動的な性質を測定することができ、そのような活性がアッセイ可能である限り、天然のタンパク質またはペプチドに対する比較分析が可能となる。あるいは、タンパク質またはペプチドと、通常はタンパク質またはペプチドと相互作用する分子、たとえば天然のタンパク質が通常総合作用するような基質またはシグナル経路の成分、との間の相互作用を促進するかまたは阻害する能力について、本発明において生産されるタンパク質またはペプチドをアッセイすることができる。典型的には、このようなアッセイは、タンパク質またはペプチドがターゲット分子と相互作用し、そしてタンパク質とターゲット分子とによる相互作用の生化学的な影響を検出できる条件下で、タンパク質を基質分子と結合させる工程を含んでもよい。
【０１９８】
タンパク質またはペプチドの活性を測定するために利用することができるアッセイは、たとえば、Ralph, P. J., et al. (1984) J. Immunol. 132:1858またはSaiki et al. (1981) J. Immunol. 127:1044, .Steward, W. E. II (1980) The Interferon Systems. Springer-Verlag, Vienna and New York, Broxmeyer, H. E., et al. (1982) Blood 60:595, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, L, E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989,および「Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques」, Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987, AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000), Kodama et al., J. Biochem. 99: 1465-1472 (1986)；Stewart et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 5209-5213 (1993)；(Lombillo et al., J. Cell Biol. 128:107-115 (1995)；(Vale et al., Cell 42:39-50 (1985)に記載されている。
【０１９９】
関心対象のタンパク質(protein of interest)
組換えタンパク質またはペプチドを発現するように、宿主細胞を設計することができる。このことは、任意の種および任意のサイズでありうる。しかしながら、特定の実施形態においては、組換えタンパク質またはペプチドは、治療的に有用なタンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態においては、このタンパク質は哺乳動物のタンパク質、たとえばヒトのタンパク質でもよく、たとえば、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質でもよい。組換えタンパク質またはペプチドを、天然のタンパク質またはペプチドと同様のやり方で処理することができる。特定の実施形態においては、タンパク質またはペプチドは、コード配列内に分泌シグナルを含まない。特定の実施形態においては、組換えタンパク質またはペプチドは１００ｋＤ未満、５０ｋＤ未満または３０ｋＤ未満のサイズである。特定の実施形態においては、組換えタンパク質またはペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸のペプチドである。
【０２００】
分子遺伝学および遺伝子操作技術に必要な多数の配列情報は、広く公に利用可能である。哺乳動物ならびにヒトの完全なヌクレオチド配列、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびゲノムにアクセスすることは、URLアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/EntrezにおけるGenBankから実行できる。Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)から、遺伝子およびそれらの生産物についての情報ならびに生物医学的な応用について統合された電子百科事典であるGeneCardsから、さらなる情報を得ることもできる。ヌクレオチド配列の情報も、EMBL Nucleotide Sequenceデータベース(http://www.ebi.ac.uk/embl/またはDNA Databank or Japan(DDBJ,http://www.ddbji.nig.ac.jp/)から入手することができる；アミノ酸配列についての情報のさらなるサイトには、Georgetown's protein information resource website(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/およびSwiss-Prot(http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)が挙げられる。
【０２０１】
本発明において発現させることができるタンパク質の具体例としては、たとえばレニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１−抗トリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、たとえばＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子およびフォン・ウィルブランド因子；抗凝固因子、たとえばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノゲンアクチベータ、たとえばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン、たとえばヒト血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；細菌のタンパク質、たとえばベータラクタマーゼ；Ｄｎアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(VEGF)；ホルモンまたは増殖因子のレセプター；インテグリン；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、たとえば脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、または神経成長因子、たとえばＮＧＦ−β；カルジオトロフィン（心臓肥大因子）、たとえばカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）；血小板由来増殖因子(PDGF)；線維芽細胞増殖因子、たとえばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮増殖因子(EGF)；トランスフォーミング増殖因子(TGF)、たとえばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βであって、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、たとえばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形成タンパク質(BMP)；インターフェロン、たとえばインターフェロン-α、-βおよび-γ；コロニー刺激因子(CSFs)、たとえばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、たとえばＩＬ−１からＩＬ−１０；抗ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；補体制御因子；ウイルス抗原、たとえばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；制御タンパク質；抗体などの分子；ならびに上記に列挙されたポリペプチドの任意の断片が挙げられる。
【０２０２】
特定の実施形態においては、タンパク質またはペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＥＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＶＩＰ、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；たとえばαＦＧＦ（ＦＧＦ−１）、βＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６またはＦＧＦ−７）、インスリン様増殖因子（たとえばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）；腫瘍壊死因子（たとえばＴＮＦ、リンホトキシン）、神経増殖因子（たとえばＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；インターフェロン（たとえばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；オンコスタチンＭ；幹細胞刺激因子（ＳＣＦ）；トランスフォーミング増殖因子（たとえばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）；ＴＮＦスーパーファミリー（たとえばＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＳＴＡＬＬ−１／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＬｙ５、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ）、ＴＮＦａｌｐｈａ／ＴＮＦＳＦ２およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）；またはケモカイン（ＢＣＡ−ｌ／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エクソダス−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯａｌｐｈａ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンフォタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−ｌ／ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−１□、ＭＩＰ−１□、ＭＩＰ−２□／ＧＲＯ□、ＭＩＰ−３□／エクソダス／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３／エクソダス−３／ＥＬＣ、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦｌ、ＴＡＲＣまたはＴＥＣＫ）から選択することができる。
【０２０３】
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス種の宿主細胞によって、組換え型のマルチサブユニットタンパク質またはペプチドを生産することが提供される。発現され得るマルチサブユニットタンパク質には、ホモマータンパク質およびヘテロマータンパク質が含まれる。マルチサブユニットタンパク質は二以上のサブユニットを含んでいてもよく、サブユニットは同一のものでもよく、または異なっていてもよい。たとえば、タンパク質は、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２またはそれを超えるサブユニットを含むホモマータンパク質でもよい。タンパク質はさらに、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２またはそれを超えるサブユニットを含むヘテロマータンパク質でもよい。典型的なマルチサブユニットタンパク質は：イオンチャネルレセプターを含むレセプター；コンドロイチンを含む細胞外マトリックスタンパク質；コラーゲン；ＭＨＣタンパク質，全長鎖抗体および抗体断片を含む免疫調整剤；ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを含む酵素；ならびに膜タンパク質を含む。
【０２０４】
本発明の一つの実施形態においては、宿主細胞による血液タンパク質の生産が提供される。この実施形態において発現される血液タンパク質としては、担体タンパク質たとえばヒトアルブミンおよびウシアルブミンを含むアルブミン、トランスフェリン、組換えトランスフェリンの半分子、ハプトグロビン、フィブリノゲンおよびその他の凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、基質の前駆体たとえばアンギオテンシンおよびブラジキニン、インスリン、エンドセリンおよびアルファ、ベータおよびガンマグロブリンを含むグロブリン、ならびに主として哺乳動物の血液に見られるその他のタイプのタンパク質、ペプチドおよびその断片が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。数え切れないほど多くの血液タンパク質についてのアミノ酸配列が報告されており(S. S. Baldwin (1993) Comp. Biochem Physiol. 106b:203-218を参照すること)、ヒト血清アルブミンについてのアミノ酸配列(Lawn, L.M., et al. (1981) Nucleic Acids Research, 9:6103-6114)およびヒト血清トランスフェリン(Yang, F. el al. (1984) Proca Natl. Acad. SciL USA 81:2752-2756)が含まれる。
【０２０５】
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス種の宿主細胞による組換え酵素またはコファクターの生産が提供される。この実施形態において発現される酵素およびコファクターとしては、アルドラーセ，アミノオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスパルターゼ、Ｂ12依存性酵素、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼ、カルボキシリアーゼ、ケモトリプシン(chemotrypsin)、ＣｏＡ要求性酵素、シアノヒドリンシンテターゼ、シスタチオンシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジアフォラーゼ、ジオキシゲナーゼ、エノアートレダクターゼ、エポキシドヒドラーゼ、フメラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ニトリルヒドラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシニトリラーゼ、ペプチダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、治療的に活性なポリペプチドに融合した酵素、組織プラスミノゲンアクチベータ；ウロキナーゼ、レプチラーゼ、ストレプトキナーゼ；カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ；Ｄｎアーゼ、アミノ酸ヒドロラーゼ（たとえばアスパラギナーゼ、アミドヒドロラーゼ）；カルボキシペプチダーゼ；プロテアーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、コラゲナーゼ;ノイラミニダーゼ;ラクターゼ、マルターゼ、スクラーゼならびにアラビノフラノシダーゼが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０２０６】
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス種の宿主細胞による、組換え型単鎖、Ｆａｂ断片および／または全長鎖抗体または断片またはその一部の生産が提供される。単鎖抗体としては、安定に折りたたまれたポリペプチド一本鎖上の抗体抗原結合領域を挙げることができる。Ｆａｂ断片も特定の抗体の一部であり得る。Ｆａｂ断片は抗原結合部位を含むことができる。Ｆａｂ断片は、２つの鎖：軽鎖断片および重鎖断片を含むことができる。これらの断片は、リンカーまたはジスルフィド結合を介して結合することができる。
【０２０７】
組換えタンパク質またはペプチドについてのコード配列は、利用できるのであれば、ターゲットポリペプチドについての天然のコード配列であり得るが、選択された宿主細胞での発現に用いるために選択されたか、改良されたかまたは最適化されたコード配列がより好ましいだろう:たとえば、シュードモナス種、たとえばシュードモナス・フルオレッセンスのコドンの使用傾向を反映した遺伝子を合成することによって。結果的にこの単数（または複数）の遺伝子は、一つ以上のベクター内に構築されるか、またはそのベクター内に挿入されることになり、次いでこれによって発現宿主細胞内に形質転換されるだろう。「発現可能な形態」で提供されると言われている核酸またはポリヌクレオチドとは、選択される細菌の発現宿主細胞によって発現され得る少なくとも一つの遺伝子を含む核酸またはポリヌクレオチドを意味する。
【０２０８】
特定の実施形態においては、関心対象のタンパク質は、天然のタンパク質、たとえば天然の哺乳動物もしくはヒトのタンパク質であるか、またはそれと実質的に相同なものである。これらの実施形態においては、そのタンパク質は鎖状型では見られないが、分泌シグナルにのみ結合しており、必要に応じて精製および／または認識のためのタグ配列に結合している。
【０２０９】
その他の実施形態においては、関心対象のタンパク質は、約 20から約42℃の温度で活性を持つタンパク質である。一つの実施形態においては、そのタンパク質は生理学的温度で活性であり、より高温または極端な温度、たとえば65℃を超えて加熱された場合には不活性である。
【０２１０】
一つの実施形態においては、関心対象のタンパク質は、約20から約42℃の温度で活性を持つタンパク質であり、および／またはより高温または極端な温度、たとえば65℃を超えて加熱された場合には不活性である;そしてそれは天然のタンパク質、たとえば天然の哺乳動物またはヒトのタンパク質であるかまたは実質的に相同であり、核酸から鎖状型では発現されない;ならびにプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスにおける天然のプロモーターではなく、別の生物、たとえばエシェリキア・コリに由来するものである。
【０２１１】
その他の実施形態においては、生産された時のタンパク質は、追加のターゲティング配列、たとえばタンパク質を細胞外の培地に向ける配列をも含む。一つの実施形態においては、追加のターゲティング配列は、タンパク質のカルボキシ末端に機能するように結合している。別の実施形態においては、このタンパク質は、オートトランスポーター、ツーパートナー分泌系、メイン・ターミナル・ブランチ系またはフィンブリアル・アッシャー・ポーリンについての分泌シグナルを含む。
【０２１２】
実施例１．Ｓｅｃ系分泌シグナルペプチドのキャラクタライゼイション
エシェリキア・コリのアルカリホスファターゼ(phoA)のコード配列−ゲノムＤＮＡ融合体を形成し発現させることによって、シュードモナス・フルオレッセンスのＳｅｃ系分泌シグナルペプチドのキャラクタライゼイションを行った。六つの発現された融合体の同一性について、さらにキャラクタライゼイションを行った。
【０２１３】
ＰｈｏＡ融合体として特定された、分泌された遺伝子についてのシグナル配列についての切断部位を、ＳＰＳｃａｎプログラム(Menne et al (2000) Bioinformatics 16: 741-742)によるその他のシュードモナスに由来する相同なタンパク質を比較することによって推定した。推定されるリポタンパク質の切断部位を、シグナルペプチダーゼＩＩモチーフを比較することによって推定した；特にシグナルペプチダーゼＩＩは、リポタンパク質のシグナル配列を切断する。六つのシグナルペプチドのすべてを、ＳｉｇｎａｌＰ(推定されるシグナルペプチドの分析用ソフトウェアプログラム;Technical University of DenmarkのCenter for Biological Sequence Analysisにおけるhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/から利用可能)を用いて分析した。さらに、H Nielson et al. (1997) Protein Engineering 10:1-6を参照すること。いくつかの場合においては、追加的なソースを用いてシグナルペプチドの同一性のさらなるキャラクタライゼイションを行った。ｐｂｐの場合においては、加工された融合タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（下記の実施例５を参照すること）によって切断情報を得た。この情報を表６に提示する。
【表６】
2007512028.tif 000007
【０２１４】
ｐｈｏＡ融合タンパク質のウェスタン分析
融合タンパク質が生産されたかどうかについて分析するために、遠心分離によって全細胞画分（細胞質およびペリプラズム）ならびに分離された細胞を含まない培養液画分とに分けられた培養液に関して、アルカリホスファターゼに対する抗体を用いたウェスタン分析を行った。挿入部位が決められた五株のうち、四つのシグナル配列（推定されるアズリン、推定されるリン酸結合タンパク質、推定されるペリプラスムリポタンパク質Ｂ、推定されるＦｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質）が予想されるサイズの融合タンパク質を生産し、一つのもの（推定されるｏｐｒＥタンパク質）が予想よりも約４０ｋＤ小さなタンパク質を生産し、そして一つのもの（推定されるＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質）が予想よりも約２０ｋＤ小さいタンパク質を生産していた。このウェスタン分析とＰｈｏＡの活性分析とから、シグナル配列によって、異種ＰｈｏＡタンパク質がシュードモナス・フルオレッセンスのペリプラズム内に移されたことが示される。
【０２１５】
実施例２．ｐｂｐ−ｓｃＦｖ融合体の構築、発現およびキャラクタライゼイション
リン酸結合タンパク質（すなわちＭｅｔ１を含む）の推定される２４アミノ酸シグナル配列を、ｇａｌ２  ｓｃＦｖ遺伝子（ｇａｌ２）と融合させて配列番号：１５および配列番号：１６（表を参照すること）を生産し、ペリプラズムおよび／または培養液の上清への分泌についてテストした。融合体を以下のように構築した。
【表７】
2007512028.tif 000008
【０２１６】
ｐｂｐ−ｓｃＦｖベクターの構築：オーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲを利用して、シュードモナス・フルオレッセンスのｏｐｒＦおよびリン酸結合タンパク質（ｐｂｐ）の推定されるシグナル配列を、Ｇａｌ２コード配列の一部と＋２位の位置で融合した。プライマーsig#pbp#for(gctctagagg aggtaactta tgaaactgaa acg ；配列番号：１７） およびpbp#gal2SOE#rev(ctgcacctgg gcggccaccg cgtt；配列番号：１８）(pbp#gal2SOE#forのリバース補足部 (aacgcggtgg ccgcccaggt gcag；配列番号：１９)を含む)を利用して、シュードモナス・フルオレッセンスのｐｂｐ分泌シグナルペプチドを鋳型として用いてＰＣＲを実施した。この結果、ｐｂｐシグナルペプチドのコード配列と、ｇａｌ２単鎖抗体（ｓｃＡｂまたはｓｃＦｖ）の５’末端についてのコード配列とを含むオリゴヌクレオチド断片が生産された。
【０２１７】
ｇａｌ２  ＯＲＦの増幅も行った。プライマーｐｂｐ＿ｇａｌ２ＳＯＥ＿ｆｏｒ（配列番号：１９）とｓｃＦｖ２ｒｅｖ(acgcgtcgac ttattaatgg tgatgatggt gatgtgcggc cgcacgtttg atc；配列番号：２０)とを利用して、ｇａｌ２をコードするポリヌクレオチドを鋳型として用いて、ＰＣＲを実施した。この結果、ｐｂｐシグナルペプチドの３’末端についてのコード配列と、ｇａｌ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とを含むポリヌクレオチド断片が生産された。
【０２１８】
シグナル配列の推定される−１アミノ酸（切断予定部位の手前の最後のアミノ酸）を、ｇａｌ２  ｓｃＦｖ（Ａｌａ）の＋２アミノ酸と融合させた。組換えシグナルペプチダーゼの切断部位のすぐ後ろ（＋１）のアミノ酸において、リン酸結合タンパク質シグナルペプチドのそれと一致しており、ちょうど天然のｐｂｐタンパク質における対応するアミノ酸残基のようにＡｌａである。
【０２１９】
得られた融合体を、シュードモナス・フルオレッセンスベクターｐＭＹＣ１８０３内に、Ｐｔａｃプロモータのコントロール下でクローニングして、プラスミドｐＤＯＷ１１２３（ｐｂｐ：ｇａｌ２）を得た。このプラスミドで、プラスミドｐＣＮ５１−ｌａｃＩ（ｌａｃリプレッサーを含む）を保持するシュードモナス・フルオレッセンス株ＭＢ１０１を形質転換し、結果としてＤＣ２１７株を得た。このプラスミドでエシェリキア・コリＪＭ１０９株も形質転換した。
【０２２０】
エシェリキア・コリで分泌させるためのｓｃＦｖクローンの構築：ｐｅｌＢシグナル配列がＧａｌ２の＋２位の位置のアラニン残基に融合するように、ｇａｌ２  ＯＲＦをｐＥＴ２７ｂ（＋）内に連結した。発現を分析するために、正確なクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ(Stratagene社)内に形質転換した。
【０２２１】
シュードモナス・フルオレッセンスにおけるＧａｌ２  ｓｃＦｖの分泌対エシェリキア・コリにおけるその分泌：上記のように、二つの推定されるシュードモナス・フルオレッセンス分泌シグナルを伴ったエシェリキア・コリの発現／分泌のためのｐｅｌＢ分泌シグナルを、ｇａｌ２のオープンリーディングフレームの＋２位の位置にて融合させた。すなわち、融合体内のＧａｌ２のＮ−末端のメチオニンを除去し、指示されたシグナル配列で置換した（図２）。外膜ポーリンF(oprF)およびリン酸結合タンパク質(pbp)のシグナル配列の、異種タンパク質をペリプラズムにおよび／または培地に分泌させる能力についてテストした。２０Ｌスケールにおいて、ｏｐｒＦおよびｐｂｐリーダー配列構築物の両者がシュードモナス・フルオレッセンス内で発現しプロセシングされることが分かった。両構築物は約９−１０ｇ／Ｌのタンパク質を生産し、それらのほとんどが不溶性画分内に見出された（図３Ｂ）。約５０％のｏｐｒＦシグナル配列がプロセシングを受けたのに対して、約１００％のｐｂｐシグナルがプロセシングを受けた（図３Ａおよび図３Ｂ）。
【０２２２】
さらに、ｐｂｐ：ｇａｌ２融合体から、少量（１％未満）の加工されたＧａｌ２が培地に分泌された（図３Ｂ）。ｏｐｒＦシグナル配列と同様に、ｐｅｌＢシグナル配列もプロセシングを受けた（図４）。エシェリキア・コリにおいて発現されたｐｅｌＢ−ｇａｌ２融合体は約１．６ｇ／Ｌのタンパク質を生産し、その約５４％がプロセシングを受けていた。そのうちの１１％が可溶性画分内で見られた。シュードモナス・フルオレッセンスのｐｂｐ：ｇａｌ２構築物と比較して、エシェリキア・コリの構築物については、可溶性画分におけるすべてのタンパク質のパーセンテージがより高かったが、シュードモナス・フルオレッセンスにおける加工されたタンパク質の全体的な収率は著しく高かった。
【表８】
2007512028.tif 000009
【０２２３】
ｓｃＦｖの活性の分析:酵素結合免疫アッセイ(ELISA)を開発して、精製されたＧａｌ１３およびＧａｌ２抗β−ガラクトシダーゼｓｃＦｖの活性を測定した。精製されたｓｃＦｖの量を変えて、β−ガラクトシダーゼをコートしたマイクロプレートのウェルに添加した。抗Ｈｉｓタグ抗体とアルカリホスファターゼが結合した抗マウス抗体とを用いて、結合した抗体を検出した（図５Ａ）。β−ガラクトシダーゼに対するウサギのポリクローナル抗体をポジティブコントロールとして用いた。図６Ｂに図示されるように、小規模発現実験から精製されたＧａｌ２抗体は顕著な活性を示した。これらの結果から、封入体（Ｇａｌ２）から再生可能な活性を有する抗体が単離されたことが示される。
【０２２４】
実施例３：エシェリキア・コリにおける抗ジゴキシンｓｃＦｖの分泌対シュードモナス・フルオレッセンスにおけるそれの分泌．
エシェリキア・コリ内での発現のために、坑−ジゴキシンｓｃＦｖをｐＥＴ２７ｄベクター内にクローニングした。この坑−ジゴキシンｓｃＦｖを、翻訳的に(translationally)ｐｅｌＢリーダーと融合させてｐＤＯＷ１１５３を得た。シュードモナス・フルオレッセンスにおいては、坑−ジゴキシンｓｃＦｖを、翻訳的にリン酸結合タンパク質分泌シグナル配列と融合させてｐＤＯＷ１１４２を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６）およびウェスタン分析（図７）から、シュードモナス・フルオレッセンスおよびエシェリキア・コリの両方において発現された坑−ジゴキシンｓｃＦｖが不溶性であることが示される。エシェリキア・コリのクローンは、３時間のインキュベートの後に６０μｇ／ｍｌのタンパク質を生産したが、ｐｅｌＢ分泌リーダーは生産していないようだった。シュードモナス・フルオレッセンスのクローンｐＤＯＷ１１４２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーによって測定された発現量が、ＢＳＡ標準と比較した場合に、ｐＤＯＷ１１５３に比べて約２０倍を超えるタンパク質を生産し、１．２３ｍｇ／ｍｌのタンパク質であった（図８）。ｐＤＯＷ１１４２を保持するシュードモナス・フルオレッセンスによる坑−ジゴキシンｓｃＦｖの発現量は、２０Ｌスケールでのデンシトメトリーによって測定されたように約１５−２０ｇ／Ｌであることが分かった（データは示さず）。振盪フラスコの規模において見られるように、すべてのタンパク質が正確にプロセシングを受けたことが明らかとなったる。
【０２２５】
精製された坑−ジゴキシンｓｃＦｖの活性の分析。坑−ジゴキシンｓｃＦｖを、シュードモナス・フルオレッセンスおよびエシェリキア・コリの構築物の両者から精製した。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を利用して活性を評価した。図９において示されるように、分泌された構築物ｐＤＯＷ１１４２を保持するシュードモナス・フルオレッセンスから単離される坑−ジゴキシンｓｃＦｖが、ポリクローナル抗体のコントロールと同様に活性を有していたことが分かった。しかしながら、エシェリキア・コリの細胞構築物ｐＤＯＷ１１５２は、活性を持つ坑−ジゴキシンｓｃＦｖを含むことが分かったのに対して、分泌された坑−ジゴキシンｓｃＦｖ構築物ｐＤＯＷ１１５３を保持するエシェリキア・コリから精製されたタンパク質は不活性であって、その大部分がプロセシングを受けていないことが分かった（図１０)。
【０２２６】
この結果から、シュードモナス・フルオレッセンスは、エシェリキア・コリが分泌した構築物よりも１９倍を超えるタンパク質を生産したことが示される。さらに、エシェリキア・コリの構築物で用いられたｐｅｌＢ分泌シグナルは、シュードモナス・フルオレッセンスにおけるリン酸結合タンパク質分泌シグナルと同程度の効率でプロセシングを受けてはいないことが明らかとなった。このタンパク質は、シュードモナス・フルオレッセンスおよびエシェリキア・コリの両者においてほぼ例外なく不溶性であった。それにもかかわらず、シュードモナス・フルオレッセンスが分泌した精製タンパク質は、エシェリキア・コリの精製された細胞タンパク質と同じく活性を有していたことが分かった。
【０２２７】
実施例４．ｐｂｐ：ｇａｌ２のキャラクタライゼイションを行うためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を行って、分泌された成熟タンパク質ｐｂｐ：ｇａｌ２のアミノ酸組成のキャラクタライゼイションを行い、推定されるシグナルペプチダーゼの切断が、ｐｂｐシグナルペプチドについての推定されるシグナルペプチダーゼの切断部位で生じたことの検証を行った。この分析のために、ｐｂｐ：ｇａｌ２についてのペプチド質量のフィンガープリントを得、これらのデータを、推定されるアミノ酸配列の理論的なペプチド質量のフィンガープリントと比較した。これらのペプチドの質量フィンガープリントを得るために、このタンパク質をエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化して、得られたペプチドの質量を測定した。Ｎ−末端のペプチド配列は、ポストソースディケイ（ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ）によって求めた。加工されていないタンパク質に相当するペプチドの質量は観測されなかった。この結果は推定されたとおりであった(データは示さず)。
【０２２８】
実施例５：ｐｂｐ−ｈＧＨ  融合体の構築、発現およびキャラクタライゼイション
シュードモナス・フルオレッセンスのリン酸結合タンパク質分泌リーダーを、ヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子の成熟ドメインのＮ−末端と融合させて、ペリプラズムへの分泌についてテストした。
【０２２９】
シュードモナス・フルオレッセンスのｐｂｐシグナル配列のクローンを鋳型とし、sig#pbp#for(配列番号：17)プライマーおよびpbp#hgh(gggaatggtt gggaaggcca ccgcgttggc；配列番号：21)プライマーを用いて、ｐｂｐシグナル配列コード領域のＰＣＲ増幅を行い、次いで、ゲルで精製した。この結果、ｐｂｐシグナルペプチドコード配列とｈＧＨの成熟ドメインの５■末端についてのコード配列とを含むオリゴヌクレオチド断片が生産され
た。
【０２３０】
プライマーELVIfor(agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctc ccggacgtcc；配列番号：22)およびELVIrev(agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccac；配列番号：23)とを用いて、ヒト下垂体のｃＤＮＡライブラリー(Clontech、 Palo Alto CA)からヒト成長ホルモンをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。これらのプライマーはｈＧＨの成熟ドメインのみを増幅するように設計されていた。これをｐＭＹＣ１８０３／ＳｐｅＩ  ＸｈｏＩにクローニングし、ｐＤＯＷ２４００を形成した。プライマーpbp#hgh#revcomp(gccaacgcgg tggccttccc aaccattccc；配列番号：24)およびhgh#rev(agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccacag agcggcac；配列番号：25)を用いて、成熟hGH遺伝子をpDOW2400から増幅し、次いでＳｔｒａｔａｐｒｅｐカラム(Stratagene社)で精製してプライマーおよびその他の反応成分を除去した。ｐｂｐ−ｈＧＨ融合体をコードするポリヌクレオチドを作製するために、二つの小片が結合するように、二つのPCR反応物を合わせて、sig#pbp#for(配列番号：１７）およびｈｇｈ＿ｒｅｖ（配列番号：２５）を用いて再び増幅した。この断片をｐＤＯＷ１２６９に連結してｐＤＯＷ１３２３−１０を作製し、ｐｂｐ−ｈＧＨをｔａｃプロモータのコントロール下に置いた。連結混合物でシュードモナス・フルオレッセンスを形質転換した。この融合体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ(配列番号：26)および(配列番号：27)で提示する。
【表９】
2007512028.tif 000010
【０２３１】
得られた株について、振盪フラスコの規模の点で最初にテストした。加工されたおよび加工されていないタンパク質についての予想されたサイズ（それぞれ２２．２ｋＤａおよび２４．５ｋＤａ）の誘導されたバンドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。タンパク質の約半数がプロセシングを受けており（ペリプラズムへの局在化を示している）、プロセシングを受けたものの約半数は可溶性画分に、約半数は不溶性画分にあった（データは示さず）。発現の研究を２０−Ｌのバイオリアクターにまでスケールアップした。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのデンシトメトリーから、生産されたすべてのｈＧＨの１８％がプロセシングを受けかつ可溶性であったことが示された。この株はｈＧＨのすべての型を３．２ｇ／Ｌ生産した；プロセシングを受けかつ可溶性のｈＧＨは０．６ｇ／Ｌであった。
【０２３２】
実施例６：シュードモナス・フルオレッセンスにおけるＳｋｐシャペロンタンパク質の発現
エシェリキア・コリの、天然のリーダー配列を伴うＳｋｐタンパク質を、シュードモナス・フルオレッセンスで発現させた（図１０）。培養から２４時間後に５ｍＭ安息香酸エステル（安息香酸エステルプロモーターはPCT公報WO04/005221号に記載されている）を添加して、Ｓｋｐを誘導した。誘導から１２時間後、誘導されたタンパク質および誘導されていないタンパク質のサンプルを、２０，０００ｇでの遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分とに分離した。４−１２％のＮｕＰＡＧＥ上でＭＥＳ緩衝液を用いてタンパク質を分離した。エシェリキア・コリのＳｋｐタンパク質は、誘導された可溶性のもののサンプル（図１０の矢印で示される）のみにおいて、約１７ｋＤａの分子量の位置で観察された。
【０２３３】
ＭＡＬＤＩポストソースディケイ(PSD)によって、タンパク質をＳｋｐと同定した。切り出された１７ｋＤａのタンパク質のバンドキモトリプシン消化物を調製した。二つのキモトリプシン断片、Ｓｋｐの理論的な消化物から推定されるサイズと適合するもの、が見られた（表８）。１３７８．７ｍ／ｚの質量イオンを伴うと推定されるＮ−末端のペプチドをＭＡＬＤＩ−ＰＳＤによってさらに分析し、予想のとおりに除去されたリーダー配列を示す、予想されるＮ−末端のアミノ酸配列のＡＤＫＩＡＩＶＮＭＧＳＬＦが、Ａｌａ20とＡｌａ21との間のプロセシングを受けた部位に対応することを明らかにした（図１１）。
【表１０】
2007512028.tif 000011
【０２３４】
実施例７：エシェリキア・コリにおけるシュードモナス・フルオレッセンスのシグナル配列の発現
シュードモナス・フルオレッセンスに由来するシグナル配列はエシェリキア・コリにおいて機能し、Pbp:Gal2タンパク質がプロセシングを受けてペリプラズムに分泌されることを可能とする。
【０２３５】
エシェリキア・コリ株ＪＭ１０９(Promega社)を、ｐＤＯＷ１１２３（ｐｂｐ：ｇａｌ２融合）またはｐＤＯＷ１  １４１（ｏｐｒＦ：ｇａｌ２融合）のいずれかで形質転換した。Ｐｂｐ：ｇａｌ２をコードするｐＤＯＷ１  １２３で形質転換したＪＭ１０９は、３７℃での培養中、０．４ｍＭと０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導の時点でＧａｌ２タンパク質の発現を示した（図１２）。０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された培養液はポジティブコントロール（シュードモナス・フルオレッセンスにおいて発現するＤＣ２６５，ｐｂｐ：ｇａｌ２）に匹敵する発現を示した。
【０２３６】
図１２の２８ｋＤａの領域で見られる二本のバンドは、シグナル配列の細胞内プロセシング（切断）の前および後でのＧａｌ２を表す。これらの二本のバンドは、不溶性画分内でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見られ、ＤＣ２４５（図１３）によって生産された加工されたおよび加工されていないＧａｌ２と共に移動した。ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤによるそれぞれのバンドのＮ−末端の配列決定によって、より小さなバンドがＧａｌ２であり（ＦＰＴＩＰ  ＬＳＲＰＦ）、推定されるようにプロセシングされていたことが確認された。より上方のバンドは、加工されていないＧａｌ２の配列を含んでいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ペリプラスムのサンプルのバンドが、加工されたＧａｌ２のサイズと一致していることが明らかになった（図１４）。
【０２３７】
０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し３７℃で培養したＪＭ１０９／ｐＤＯＷ１１２３サンプルの可溶性、不溶性およびペリプラスム画分についてのウェスタンブロットを行った。これらの結果から、加工されたＧａｌ２タンパク質が３画分のすべてで見られたことが示された（図１５）。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】グラム陰性細菌におけるタンパク質分泌系の概略。４つの系（Ｓｅｃ，Ｔａｔ，ＭｓｃＬおよびｈｏｌｉｎｓ）は、内膜のみを横切って輸送する。Ｓｅｃ系で分泌されるタンパク質はペリプラズム内に位置し、外膜と一体化しているか、または矢印で示されるような４つの外膜分泌系うちの一つによって外膜を横切って輸送される。Ｔａｔ系によって輸送されるタンパク質は主に、ペリプラズム内に位置するが、シュードモナス・アエルギノーサにおけるわずかなタンパク質は、ＭＴＢ系によってさらに外に輸送されることが分かっている。ＨｏｌｉｎｓおよびＭｓｃＬはタンパク質をペリプラズム内に輸送するだけである。Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型の系は、あらゆるペリプラスム中間体を伴うことなく両方の膜を横切ってタンパク質を排出する。略号：ＦＵＰ、フィンブリアル・アッシャー・ポーリン；ＡＴ、オートトランスポーター；ＴＰＳ、ツーパートナー分泌系；ＭＴＢ、メイン・ターミナル・ブランチ；ＩＭ、内膜；ＯＭ、外膜。
【図２】シュードモナス・フルオレッセンスｇａｌ２分泌構築物。ｐＤＯＷ１１２２およびpDOW1123についてのプラスミドマップを(A)のoprF:gal2融合体(Bにアミノ酸配列を示す)を含むpDOW1122、およびpbp:gal2融合体(Cにアミノ酸配列を示す)を含むpDOW1123で示す。＊は、推定されるシグナルペプチダーゼの切断部位を示す。
【図３】Ｇａｌ２の分泌された発現。ｏｐｒＦ：ｇａｌ２（ｐＤＯＷ１１２２）またはｐｂｐ：ｇａｌ２（ｐＤＯＷ１１２３）のいずれかを発現するシュードモナス・フルオレッセンスからの全培養液サンプル（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のイメージ。全培養液の１／８０希釈を１０％ＮｕＰＡＧＥゲル上に添加し、１Ｘ  ＭＯＰＳ緩衝液中で泳動させた。可溶性（Ｓ）、不溶性（Ｉ）および細胞を含まない培養液上清（ＳＮ）画分のウェスタン分析をＢに示す。培養液の添加量はＡ５７５＝３０で正規化し、ゲルの下部に示した。
【図４】エシェリキア・コリにおけるｐｅｌＢ：ｇａｌ２の発現。ｐｅｌＢ：ｇａｌ２（ｐＤＯＷ１１３８）で発現されたＧａｌ２のウェスタンブロット分析の写真を示す。不溶性（Ｉ）および可溶性（Ｓ）画分における加工されたおよび加工されていないタンパク質を矢印で示す。誘導から０（I０）および３時間（I３）後のサンプルをＡ５７５＝１で正規化した；５μＬを４−１２％ＮｕＰＡＧＥゲル上に添加して１Ｘ  ＭＥＳ緩衝液内で泳動させた。
【図５】エシェリキア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンスから精製されたｓｃＦｖの活性。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ａ）を用いて小規模（Ｂ）発酵または大規模（Ｃ）発酵から単離されたｓｃＦｖの活性を測定した。活性を吸光度として表現し；抗体および量はそれぞれのバーの下に列挙している。３つのウェルの平均を示す。
【図６】分泌された坑−ジゴキシンｓｃＦｖの発現。Ａ：は、振盪フラスコの規模でのシュードモナス・フルオレッセンスにおける分泌を示す。Ｂ：は、振盪フラスコの規模でのエシェリキア・コリにおける分泌を示す。すべてのサンプルを２０  ＯＤ（シュードモナス・フルオレッセンスについてはＯＤ５７５およびエシェリキア・コリについてはＯＤ６００）で正規化した。サンプルをＭＥＳ緩衝液中の４−１２％  ＢＴゲル上で泳動させた。Ｓ＝可溶性、Ｉ＝不溶性。数値は誘導後の経過時間である。
【図７】振盪フラスコの規模で分泌された坑−ジゴキシンｓｃＦｖのウェスタンブロット。パネルＡは、タンパク質を発現したシュードモナス・フルオレッセンスを示し、パネルＢはタンパク質を発現したエシェリキア・コリを示す。サンプルを２０  ＯＤに正規化した。両構築物において、タンパク質は１００％不溶性であった。Ｓ＝可溶性、Ｉ＝不溶性。０、３、２４、４８は誘導後の経過時間を示す。
【図８】坑−ジゴキシンｓｃＦｖの定量による構築物間の収率の比較。１０μＬの各サンプル（ＢＳＡ標準を含む）を４−１２％  ＢＴゲル上に添加し、１Ｘ  ＭＥＳ緩衝液中で泳動させた。各構築物についての誘導から０、３、２４、４８時間後のサンプルを添加した。シュードモナス・フルオレッセンスの分泌した構築物ｐＤＯＷ１１４２、エシェリキア・コリの細胞構築物（ｐＤＯＷ１１５２）および分泌した（ｐＤＯＷ１１５３）構築物について試験した。矢印は、加工されたおよび加工されていない分泌されたｓｃＦｖの移動を示す。ＢＳＡ標準曲線は次のように描かれる：１，０．１μｇ；３，０．６０μｇ；５，１．５２９μｇ；８．１．８５μｇ。
【図９】精製坑−ジゴキシンｓｃＦｖの活性のアッセイ。Ｘ軸上にてサンプルを試験した：ｐＤＯＷ１１４２，ｐＤＯＷ１１５２またはｐＤＯＷ１１５３を含む株由来の精製ｓｃＦｖ株；ポリクローナル坑−ジゴキシン抗体（ポジティブ）；またはタンパク質がない（ネガティブ）。Ｙ軸上は吸収値である。エラーバーは三連のサンプルについての標準偏差を示す。
【図１０】培養から２４時間後に、５ｍＭ安息香酸エステルでＳｋｐタンパク質を誘導した。誘導していないフラスコをコントロールとして用いた。誘導後、細胞を１２時間培養し、タンパク質を可溶性画分と不溶性画分とに分割した。ＭＥＳ緩衝液を用いてタンパク質を４−１２％  ＮｕＰＡＧＥゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上で分離した。略号は次のとおり：Ｉ、不溶性；Ｓ、可溶性；ＭＷ、分子量；ＭＷＭ、分子量マーカー。
【図１１】加工されたおよび加工されていないＳｋｐタンパク質のアミノ酸配列。下線の配列は、シグナル配列（上側）およびＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ（下側）で特定された配列に対応する。
【図１２】ｐＤＯＷ１１２３で形質転換し、３７℃で培養し、そして０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したＪＭ１０９と、ポジティブコントロールのＤＣ２６５とを比較するところの、可溶性サンプルおよび不溶性サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離イメージ。レーン１−可溶性ＤＣ２６５、レーン２−不溶性ＤＣ２６５、レーン３−ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２ラダー、レーン４−可溶性ＪＭ１０９／ｐＤＯＷ１１２３、レーン５−不溶性ＪＭ１０９／ｐＤＯＷ１１２３。５μＬの２０  ＯＤに正規化したサンプルを各ウェル内に添加した。４−１２％  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲルで、１５０ボルトにて１ｘ  ＭＥＳ緩衝液内で約５０分間泳動させた。次いでＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色した。
【図１３】ｐＤＯＷ１  １２３で形質転換され、０．０１ｍＭのＩＰＴＧで誘導され、３７℃で培養されたエシェリキア・コリ株ＪＭ１０９に由来する不溶性サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離イメージ。レーン１−３、１０μＬの不溶性サンプル。レーン４、ポジティブコントロールのシュードモナス・フルオレッセンスＤＣ２６５の、１０μＬの１：２０希釈。１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで、２００ボルトにて１ｘ  ＭＥＳ緩衝液内で約５０分間泳動させた。そしてＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔで染色した。
【図１４】ｐＤＯＷ１  １２３で形質転換され、０．０１ｍＭのＩＰＴＧで誘導され、３７℃で培養されたエシェリキア・コリ株ＪＭ１０９に由来するペリプラスムサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のイメージ。１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで、２００  Ｖにて１ｘ  ＭＥＳ緩衝液内で約５０分間泳動させた。そしてＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔで染色した。レーン１−ＤＣ２６５ポジティブコントロールの、１０μＬの１：２０希釈；レーン２−４  １０μＬのペリプラスムサンプル。
【図１５】０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で培養したＪＭ１０９／ｐＤＯＷ１  １２３の培養液の可溶性画分、不溶性画分およびペリプラスム画分のウェスタン分析のイメージ。１２％  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル上で、ＭＥＳ緩衝液内でサンプルを泳動させた。そして１時間かけて３０ボルトでニトロセルロースに移し、次いで坑−Ｈｉｓ  ＨＲＰで探知(probe)した。レーン１−ポジティブコントロールの不溶性部分の、１０μＬの１：３０希釈。レーン２−２０μＬの可溶性画分。レーン３−１０μＬの不溶性画分。レーン４−２０μＬのペリプラスム調製品。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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