(57)【要約】  細胞または組織ライセートのようなサンプル内の分子（特にタンパク質）の複合体の形成を検出するための方法を提供する。1つの態様においては、複合体内の第1タンパク質に特異的な切断性プローブと、複合体内の1以上の第2タンパク質に特異的な1以上の結合性化合物とを準備する。結合に際して、切断性プローブは一重項酸素のような活性種を生成するように誘導され、該活性種は、結合性化合物に結合した分子タグを切断性プローブの局所領域内でのみ切断する。遊離した分子タグをアッセイ混合物から及びお互いから分離して、該複合体内に存在するタンパク質の数およびタイプに関連づけられる測定結果を得る。2007502417.tif 000005
2007502417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1以上のタンパク質複合体を検出するための方法であって、
前記1以上の複合体のそれぞれについて、前記1以上の複合体のそれぞれにおける第1タンパク質に特異的な切断性プローブを準備し、ここで、各切断性プローブは、有効近接範囲を有する切断誘導部分を有し、
前記1以上の複合体のそれぞれの第2タンパク質に特異的な1以上の結合性化合物を準備し、ここで、各結合性化合物は、切断可能連結によりそれにそれぞれが結合した1以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物に結合した前記1以上の分子タグは、異なる分離特性を有していて、分離に際して、異なる結合性化合物からの分子タグは分離プロファイルにおいて特有のピークを形成し、
該切断性プローブ、該結合性化合物および前記1以上の複合体を混合して、切断性プローブが該複合体の第1タンパク質に特異的に結合し、結合性化合物が該複合体の第2タンパク質に特異的に結合するようにし、該結合性化合物の切断可能連結を該切断性プローブの切断誘導部分の有効近接範囲内に配置して分子タグを遊離させ、
遊離した分子タグを分離し同定して、前記1以上のタンパク質複合体の量の存在または非存在を判定する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
該混合工程が、切断誘導部分により活性種を生成させることを含み、該活性種が、有効近接範囲の切断可能連結を切断する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
切断誘導部分が光増感剤であり、活性種が一重項酸素である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
分離特性が電気泳動移動度であり、分離プロファイルが電気泳動図である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
前記1以上のタンパク質複合体が3個までの複合体を含み、前記1以上の結合性化合物が3個までの結合性化合物を含む、請求項1、2、3または4記載の方法。
【請求項６】
切断性プローブおよび前記1以上の結合性化合物のそれぞれが抗体結合性組成物を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記1以上の複合体が、Her3受容体とPI3キナーゼとを含む複合体を包含する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
PI3キナーゼが第2タンパク質である場合には常にHer3受容体が第1タンパク質であり、Her3受容体が第2タンパク質である場合には常にPI3キナーゼが第1タンパク質である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記1以上の複合体が、第1タンパク質と前記1以上の第2タンパク質とを含む複合体を包含し、それらのそれぞれが、受容体チロシンキナーゼ、Grb2、SOS、RasおよびRafよりなる群から選ばれ、ただし、第1タンパク質が、前記1以上の第2タンパク質とは異なる、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
受容体チロシンキナーゼが、Her1、Her2、Her3、Her4、IGF-1R、VEGFR1、VERFR2、PDGFRαおよびPDGFRβよりなる群から選ばれるヒト受容体チロシンキナーゼである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第1タンパク質と1以上の第2タンパク質とを含む複合体を生物学的サンプル内で検出するための方法であって、
第1タンパク質の抗原決定基に特異的な切断性プローブを準備し、ここで、該切断性プローブは、有効近接範囲を有する切断誘導部分を有し、
第2タンパク質の抗原決定基にそれぞれが特異的である1以上の結合性化合物を準備し、ここで、各結合性化合物は、切断可能連結によりそれにそれぞれが結合した1以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物に結合した1以上の分子タグは、異なる分離特性を有していて、分離に際して、異なる結合性化合物からの分子タグは分離プロファイルにおいて特有のピークを形成し、
該切断性プローブ、前記1以上の結合性化合物および該生物学的サンプルを混合して、該切断性プローブが第1タンパク質に特異的に結合し、前記1以上の結合性化合物が前記1以上の第2タンパク質に特異的に結合するようにし、該結合性化合物の切断可能連結を該切断性プローブの切断誘導部分の有効近接範囲内に配置して分子タグを遊離させ、
遊離した分子タグを分離し同定して、該生物学的サンプル内の複合体の量の存在または非存在を判定する工程を含んでなる方法。
【請求項１２】
第2タンパク質の少なくとも1つが第1タンパク質とは異なる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
該混合工程が、切断誘導部分により活性種を生成させることを含み、該活性種が有効近接範囲の切断可能連結を切断する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
切断誘導部分が光増感剤であり、活性種が一重項酸素である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
分離特性が電気泳動移動度であり、分離プロファイルが電気泳動図である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
切断性プローブおよび前記1以上の結合性化合物が抗体結合性組成物を含む、請求項11、12、13、14または15記載の方法。
【請求項１７】
該複合体がHer3受容体とPI3キナーゼとを含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
PI3キナーゼが第2タンパク質である場合には常にHer3受容体が第1タンパク質であり、Her3受容体が第2タンパク質である場合には常にPI3キナーゼが第1タンパク質である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
該複合体が第1タンパク質と前記1以上の第2タンパク質とを含み、それらのそれぞれが、受容体チロシンキナーゼ、Shcタンパク質、Grb2タンパク質、SOSタンパク質、Rasタンパク質およびRafタンパク質よりなる群から選ばれ、ただし、第1タンパク質が、前記1以上の第2タンパク質とは異なる、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
受容体チロシンキナーゼが、Her1、Her2、Her3、Her4、IGF-1R、VEGFR1、VERFR2、PDGFRαおよびPDGFRβよりなる群から選ばれるヒト受容体チロシンキナーゼである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
第1タンパク質と1以上の第2タンパク質とを含む複合体を生物学的サンプル内で検出するための方法であって、
第1タンパク質の、異なる抗原決定基に、それぞれが特異的である1以上の結合性化合物を準備し、第2タンパク質の、異なる抗原決定基に、それぞれが特異的である1以上の結合性化合物を準備し、ここで、各結合性化合物は切断可能連結によりそれにそれぞれが結合した1以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物に結合した1以上の分子タグは、異なる分離特性を有していて、分離に際して、異なる結合性化合物からの分子タグは分離プロファイルにおいて特有のピークを形成し、第2タンパク質の少なくとも1つは第1タンパク質とは異なり、
該生物学的サンプルと、該複合体の第1タンパク質及び前記1以上の第2タンパク質に特異的である1以上の結合性化合物とを一緒にして、該結合性化合物が、それらのそれぞれの抗原決定基が利用可能である場合には常にそのような抗原決定基に特異的に結合し、そのような抗原決定基が利用不可能である場合には常に未結合のままとなるようにし、
該複合体に特異的に結合した1以上の結合性化合物の切断可能連結を切断して、分子タグを遊離させ、
遊離した分子タグを分離し同定して、該生物学的サンプル内の複合体の量の存在または非存在を判定する工程を含んでなる方法。
【請求項２２】
切断の工程の前に、未結合の結合性化合物を、該複合体に特異的に結合した結合性化合物から分離する工程を更に含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
分離特性が電気泳動移動度であり、分離プロファイルが電気泳動図である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記1以上の結合性化合物のそれぞれが抗体結合性組成物を含む、請求項21、22または23記載の方法。
【請求項２５】
該複合体がHer3受容体とPI3キナーゼとを含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
PI3キナーゼが第2タンパク質である場合には常にHer3受容体が第1タンパク質であり、Her3受容体が第2タンパク質である場合には常にPI3キナーゼが第1タンパク質である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
該複合体が第1タンパク質と前記1以上の第2タンパク質とを含み、それらのそれぞれが、受容体チロシンキナーゼ、Shcタンパク質、Grb2タンパク質、SOSタンパク質、Rasタンパク質およびRafタンパク質よりなる群から選ばれ、ただし、第1タンパク質が、前記1以上の第2タンパク質とは異なる、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
受容体チロシンキナーゼが、Her1、Her2、Her3、Her4、IGF-1R、VEGFR1、VERFR2、PDGFRαおよびPDGFRβよりなる群から選ばれるヒト受容体チロシンキナーゼである、請求項27記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、分子複合体の検出および測定方法、より詳しくは、複数タンパク質の複合体を、特に生物細胞内で同時に測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子複合体の形成および解離は、生きた生物における調節過程に決定的に重要である。特に、細胞の表面と核との間のシグナリング経路は多数の分子複合体の形成に関与しており、該形成においては複数のタンパク質が集合して、シグナリング過程に含まれる段階であるリン酸化または脱リン酸化のような分子事象を直接的または間接的に誘導する（Gompertsら, Signal Transduction (Academic Press, New York, 2002)）。多数の病態、特に癌においては、異常な経路挙動が働いているため、そのような経路およびそれらの成分は、精力的な研究の対象となっている（例えば、McCormick, Trends in Cell Biology, 9: 53-56 (1999); Blume-JensenおよびHunter, Nature, 411: 355-365 (2001); Nicholsonら, Cellular Signalling, 14: 381-395 (2002)など）。多数の癌は、例えば過剰発現によりシグナリング経路（特に、細胞増殖、細胞運動、分化および細胞死に関与している経路）の成分に影響を及ぼす突然変異または他の遺伝的改変の蓄積に関連していることが認められている（例えば、Blume-JensenおよびHunter（前掲））。残念ながら、そのようなシグナリング経路の研究は困難である。なぜなら、それらは複雑で相互に関連しているだけでなく、細胞内複合体の分析のためには破壊的方法を要するからである（例えば、Wengら, Science, 284: 92-96 (1999); Machidaら, Molecular & Cellular Proteomics, 2.4: 215-233 (2003); Priceら, Methods in Molecular Biology, 218: 255-267 (2003)）。特に、シグナリングタンパク質のリン酸化状態の研究は困難である。なぜなら、サンプル調製中に、ホスファターゼのような酵素の作用によりリン酸化状態が急速に変化するからである。
【０００３】
細胞タンパク質-タンパク質相互作用および複合体を研究するためには、免疫沈降、化学的架橋、生物発光共鳴エネルギー転移（BRET）、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）などを含む多種多様な技術が用いられている（Priceら (前掲); Sorkinら, Curr. Biol., 10: 1395-1398 (2000); McVeyら, J. Biol. Chem., 17: 14092-14099 (2001); Salimら, J. Biol. Chem., 277: 15482-15485 (2002); Angersら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 3684-3689 (2000)）。残念ながら、そのような技術の適用は困難であり、一般には、シグナリング経路の状態の正確な描写を提供するのに十分な感度を欠いている。
【０００４】
前記を考慮すると、1以上の分子複合体（特に、シグナリング経路におけるもの）を同時に検出または測定するための簡便で高感度で費用効果的な技術が利用可能となれば、そのような測定が益々重要となる多数の分野（生命科学的研究、医学的研究および診断、薬物発見などを含む）が発展するであろう。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、分子の複合体（特に、2以上のタンパク質を含む複合体）を検出および／または測定するための方法を提供する。1つの態様においては、本発明の方法は、異なる複合体メンバーに特異的な少なくとも2つの試薬を使用する。本明細書中では切断性プローブと称される一方のメンバーは、その直接的近接範囲内に、感受性結合を切断するよう誘導されうる切断誘導部分を有し、本明細書中では結合性化合物と称されるもう一方のメンバーは、切断誘導部分により切断可能な連結により結合した1以上の分子タグを有する。該方法においては、そのような異なるメンバーが複合体を形成している場合には常に、切断可能な連結（切断可能連結）が切断誘導部分の有効切断近接範囲内に来て、分子タグが遊離されうる。ついで分子タグを反応混合物から分離し定量して、複合体形成の尺度を得る。
【０００６】
1つの態様においては、本発明は、1以上の複合体の量を検出または測定するための方法であって、（i）前記1以上の複合体のそれぞれについて、前記1以上の複合体のそれぞれにおける第1タンパク質に特異的な切断性プローブを準備し、ここで、各切断性プローブは、有効近接範囲を有する切断誘導部分を有し、（ii）前記1以上の複合体のそれぞれの第2タンパク質に特異的な1以上の結合性化合物を準備し、ここで、各結合性化合物は、切断可能連結によりそれにそれぞれが結合した1以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物に結合した前記1以上の分子タグは、異なる分離特性を有していて、分離に際して、異なる結合性化合物からの分子タグは分離プロファイルにおいて特有のピークを形成し、（iii）該切断性プローブ、該結合性化合物および前記1以上の複合体を混合して、切断性プローブが該複合体の第1タンパク質に特異的に結合し、結合性化合物が該複合体の第2タンパク質に特異的に結合するようにし、該結合性化合物の切断可能連結を該切断性プローブの切断誘導部分の有効近接範囲内に配置して分子タグを遊離させ、（iv）遊離した分子タグを分離し同定して、前記1以上のタンパク質複合体の量の存在または非存在を判定する工程を含んでなる方法を含む。
【０００７】
もう1つの態様においては、本発明は、単一の複合体の量を検出または測定するための方法であって、（i）該複合体の第1タンパク質の抗原決定基に特異的な切断性プローブを準備し、ここで、該切断性プローブは、有効近接範囲を有する切断誘導部分を有し、（ii）該複合体の1以上の第2タンパク質の抗原決定基にそれぞれが特異的である1以上の結合性化合物を準備し、ここで、各結合性化合物は、切断可能連結によりそれにそれぞれが結合した1以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物に結合した1以上の分子タグは、異なる分離特性を有していて、分離に際して、異なる結合性化合物からの分子タグは分離プロファイルにおいて特有のピークを形成し、（iii）該切断性プローブ、前記1以上の結合性化合物および該生物学的サンプルを混合して、該切断性プローブが第1タンパク質に特異的に結合し、前記1以上の結合性化合物が前記1以上の第2タンパク質に特異的に結合するようにし、該結合性化合物の切断可能連結を該切断性プローブの切断誘導部分の有効近接範囲内に配置して分子タグを遊離させ、（iv）遊離した分子タグを分離し同定して、該生物学的サンプル内の複合体の量の存在または非存在を判定する工程を含んでなる方法を含む。
【０００８】
本発明が提供する、1以上の分子複合体の形成の検出または測定方法は、限定的なものではないが以下のものを含む、現在の技術に対する幾つかの利点を有する：（1）アッセイ混合物から分離された分子タグの検出および／または測定はバックグラウンドの著しい減少および感度の有意な増加をもたらす、ならびに（2）分離および検出を容易にするための特別に設計された分子タグの使用は簡便なマルチプレックス化（multiplexing；多重化）能をもたらす。本発明はまた、リン酸化が複合体の形成に関連している場合のシグナル伝達の状態の代替尺度を提供する。
【０００９】
図面の簡潔な説明
図1A〜1Iは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【００１０】
図2A〜2Eは、抗体に分子タグを結合させるための方法を図式的に示す。
【００１１】
図3A〜3Fは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【００１２】
図4A〜4Jは、設計し合成したタグの構造を示す。
【００１３】
図5A-5Dは、図6に示すタグ部分の合成の化学を示す。
【００１４】
図6A-6Cは、分子タグを電気泳動により分離する工程を実施するためのマイクロフルイディクス（microfluidics）装置を図式的に示す。
【００１５】
図7A〜7Dは、PI3キナーゼ-Her3受容体活性化複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【００１６】
図8A-8Dは、Shc/Her3受容体-アダプター複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【００１７】
図9は、MCF-7細胞のライセート中のGrb2//SHC複合体のアッセイからのデータを示す。
【００１８】
図10は、種々の濃度のIGF-1中でインキュベートした後の種々の細胞系のライセート中のIRS-1//PI3K複合体のアッセイからのデータを示す。
【００１９】
図11は、種々の濃度のIGF-1中でインキュベートした後のMCF-7細胞のライセート中のIRS-1//PI3K複合体のアッセイからのデータを示す。
【００２０】
図12は、種々の濃度のヘレグリン（heregulin）中でインキュベートした後のMCF-7細胞のライセート中のHer3//PI3K複合体のアッセイからのデータを示す。
【００２１】
図13は、種々の濃度のヘレグリン（heregulin）中でインキュベートした後のMCF-7細胞のライセート中のHer3//SHC複合体のアッセイからのデータを示す。
【００２２】
定義
「抗体」は、別の分子の特定の空間的・極性構造に特異的に結合し従ってそれに対して相補的であると定義される免疫グロブリンを意味する。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることが可能であり、当技術分野でよく知られた技術により、例えば、宿主の免疫化および血清の採取により（ポリクローナル抗体）、あるいは連続的ハイブリッド細胞系の調製および分泌タンパク質の採取により（モノクローナル抗体）、あるいは天然抗体の特異的結合に要するアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはその突然変異誘発形態のクローニングおよび発現により製造されうる。抗体には、完全免疫グロブリンまたはそのフラグメントが含まれ、免疫グロブリンには、種々のクラスおよびイソタイプ、例えばIgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2bおよびIgG3、IgMなどが含まれる。そのフラグメントには、Fab、FvおよびF(ab')2、Fab'などが含まれうる。また、適当な場合には、特定のポリペプチドに対する結合アフィニティーが維持される限り、免疫グロブリンまたはそのフラグメントの凝集体、重合体およびコンジュゲートを使用することが可能である。遊離可能な分子タグ（後記のとおり）を使用するイムノアッセイを含むイムノアッセイにおいて使用するための抗体の製造および選択の指針は、容易に入手可能な参考書およびマニュアル、例えばHarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988); HowardおよびBethell, Basic Methods in Antibody Production and Characterization (CRC Press, 2001); Wild編, The Immunoassay Handbook (Stockton Press, New York, 1994)などに見出されうる。
【００２３】
「抗体結合性組成物」は、1以上の抗体またはそのフラグメントを含む、そのような抗体または抗体フラグメントからその結合特異性を誘導する分子または分子複合体を意味する。抗体結合性組成物には、（i）第1抗体が標的分子に特異的に結合し第2抗体が第1抗体の定常領域に特異的に結合する抗体ペア；標的分子に特異的に結合するビオチン化抗体およびストレプトアビジンタンパク質（このタンパク質は、ビオチン部分を介して分子タグまたは光増感剤などのような部分により誘導体化される）、（ii）共有結合により直接的に又はストレプトアビジン-ビオチン連結により間接的に分子タグまたは光増感剤のような部分により誘導体化された重合体（例えば、デキストラン）に結合した、標的分子に特異的な抗体、（iii）分子タグまたは光増感剤のような部分により直接的または間接的に誘導体化されたビーズもしくはマイクロビーズまたは他の固相担体あるいは後者を含有する重合体に結合した、標的分子に特異的な抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
「抗原決定基」または「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する、分子（通常はタンパク質）の表面上の部位を意味し、一般には、タンパク質は幾つかの又は多数の異なる抗原決定基を有し、多数の異なる特異性の抗体と反応する。好ましい抗原決定基はタンパク質のリン酸化部位である。
【００２５】
「結合性部分」は、アナライトに特異的に結合しうる、分子タグが直接的または間接的に結合しうる任意の分子を意味する。結合性部分には、抗体、抗体結合性組成物、ペプチド、タンパク質、核酸および有機分子（1000ダルトンまでの分子量を有し、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンよりなる群から選ばれる原子よりなるもの）が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、結合性部分は抗体または抗体結合性組成物である。
【００２６】
分離カラムに関する「毛管サイズ」は、分離媒体の全体にわたる効率的な熱散逸を可能にし結果的に該媒体内の低い熱対流を伴う、分離カラムの直径または最大寸法が約25〜500ミクロンである、プレートまたはマイクロフルイディクス装置における毛管またはチャンネルを意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる「クロマトグラフィー」または「クロマトグラフィー分離」は、化合物（例えば、分子タグ）の混合物を含有する移動相（通常は液体）の流動が、移動相と固定相（通常は固体）との間の分布の差による1以上の物理的または化学的特性に基づいて、そのような化合物の分離を促進する分析方法を意味する。アナライト（例えば、分子タグ）のクロマトグラフィー分離の基礎を形成する1以上の物理的特性には、分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、極性などが含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの態様においては、本明細書中で用いる「高圧（または高速）液体クロマトグラフィー」（「HPLC」）は、（i）300mmまでの長さ及び5mmまでの内径を有する強固な円柱状分離カラムを使用する、（ii）分離カラム内に充填された、5μmまでの同じ直径を有する強固な球状粒子（例えば、シリカ、アルミナなど）を含む固相を有する、（iii）35℃〜80℃の範囲の温度および150barまでのカラム圧で行う、ならびに（iv）1μL/分〜4mL/分の範囲の流速を用いる液相クロマトグラフィー分離を意味する。好ましくは、HPLCに使用する固相粒子は更に、（i）平均粒径付近の狭いサイズ分布（実質的にすべての粒径は平均の10％以内である）を有すること、（ii）70〜300オングストロームの範囲の同じ孔径を有すること、（iii）50〜250m2/gの範囲の表面積を有すること、および（iv）1〜5/nm2の範囲の結合相密度（すなわち、単位面積当たりの保持リガンドの数）を有することにより特徴づけられる。分子タグを分離するための典型的な逆相クロマトグラフィー媒体には、表面保持リガンド（例えば、フェニル基、シアノ基、またはC8〜C18を含む群から選ばれる脂肪族基）に結合した粒子、例えばシリカまたはアルミナが含まれる。本発明におけるクロマトグラフィーには、「毛管電気クロマトグラフィー」（「CEC」）および関連技術が含まれる。CECは、毛管サイズのカラム（例えば、30〜100μmの範囲の内径を有するもの）を通る電気浸透流により流体が駆動される液相クロマトグラフィー技術である。CECはSvec, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 76: 1-47 (2002); Vanhoenackerら, Electrophoresis, 22: 4064-4103 (2001)および同様の参考文献に開示されている。CECカラムは、通常の逆相HPLCにおいて使用されるものと同じ固相材を使用したものであることが可能であり、さらに、いわゆる「一体型（monolithic）」非粒子状パッキングを用いたものでありうる。いくつかの形態のCECにおいては、電気浸透だけでなく圧力がカラム内でアナライト含有溶媒を駆動する。
【００２８】
本明細書中で用いる「複合体」は、互いに直接的または間接的に接触している分子の集合体または凝集体を意味する。1つの態様においては、分子の複合体に関する又は特異性もしくは特異的結合に関する「接触」、より詳しくは「直接的接触」は、2以上の分子が十分に接近していて、誘引性非共有結合性相互作用（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、イオンおよび疎水性相互作用など）が該分子の相互作用を支配するようになっていることを意味する。そのような態様においては、アッセイ条件下、分子の複合体は、その成分分子の非凝集化または非複合体化状態より熱力学的に有利である点で、該複合体は安定である。固定された組織サンプル内の複合体は、固定過程により、非共有結合性相互作用性分子の集合体から共有結合性分子の集合体へと変換されうると理解される。すなわち、本明細書中で用いる「複合体」なる語は、固定過程により共有結合したタンパク質の集合体または複合体を包含する。本明細書中で用いる「複合体」は、通常、2以上のタンパク質の安定な凝集体を意味し、同意義で「タンパク質-タンパク質複合体」とも称される。最も典型的には、「複合体」は、2個のタンパク質の安定な凝集体を意味する。本明細書中で用いる「細胞内複合体」または「細胞内タンパク質-タンパク質複合体」は、生物細胞の細胞質または核内に通常見出されるタンパク質の複合体を意味し、1以上の細胞内タンパク質と表面膜受容体との複合体を包含しうる。そのような複合体の一部でありうる典型的な細胞内タンパク質には、PI3Kタンパク質、Grb2タンパク質、Grb7タンパク質、Shcタンパク質およびSosタンパク質、Srcタンパク質、Cb1タンパク質、PLCγタンパク質、Shp2タンパク質、GAPタンパク質、Nckタンパク質、Vavタンパク質およびCrkタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの態様においては、そのような複合体はPI3KまたはShcタンパク質を含む。もう1つの態様においては、複合体は、2個のタンパク質、または2〜4個のタンパク質、または2〜6個のタンパク質を含む安定な凝集体である。本明細書中で用いる「シグナリング複合体」は、シグナリング経路の成分である細胞内タンパク質-タンパク質複合体である。分子の複合体に関する「二量体」は、同じ又は異なりうる2個の分子（通常はタンパク質）の複合体を意味する。同一分子の二量体は「ホモ二量体」と称され、異なる分子の二量体は「ヘテロ二量体」と称される。
【００２９】
「ErbB受容体」または「Her受容体」は、ErbB受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、EGFR（「Herl」）ErbB2（「Her2」）、ErbB3（「Her3」）およびErbB4（「Her4」）受容体を包含する。ErbB受容体は、一般には、ErbBリガンドに結合しうる細胞外ドメイン、親油性膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、およびリン酸化されうる幾つかのチロシン残基を含有するカルボキシル末端シグナリングドメインを含む。ErbB受容体は天然配列ErbB受容体またはそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、ErbB受容体は天然配列ヒトErbB受容体である。1つの態様においては、ErbB受容体は、Chuら, Biochem. J., 324: 855-861 (1997); Xiaら, Oncogene, 23: 646-653 (2004)などの開示されているEGFRvIIIおよびp95Her2を含む（これらに限定されるものではない）、Her受容体のトランケート化（末端切断型）形態を包含する。
【００３０】
「ErbB1」「表皮増殖因子受容体」および「EGFR」および「Her1」なる語は本明細書中では互換的に用いられ、例えばCarpenterら, Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987) に開示されている天然配列EGFRおよびその変異体（例えば、Humphreyら, PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)に記載の欠失変異体EGFR）を意味する。erbB1は、EGFRタンパク質産物をコードする遺伝子を意味する。EGFRに結合する抗体の具体例には、MAb 579（ATCC CRL RB 8506）、MAb 455（ATCC CRL HB8507）、MAb 225（ATCC CRL 8508）、MAb 528（ATCC CRL 8509）（Mendelsohnら, 米国特許第4,943,533号を参照されたい）およびそれらの変異体、例えばキメラ化225（C225）および再形成（reshaped）ヒト225（H225）（Imclone Systems Inc., W O 96/40210を参照されたい）が含まれる。
【００３１】
「Her2」、「ErbB2」、「c-Erb-B2」は互換的に用いられる。特に示さない限り、本明細書中で用いる「ErbB2」、「c-Erb-B2」および「Her2」なる語はヒトタンパク質を意味する。ヒトErbB2遺伝子およびErbB2タンパク質は、例えばSembaら, PNAS (USA) 82: 6497-650 (1985) およびYamamotoら, Nature 319: 230-234 (1986) (Genebankアクセッション番号X03363)に記載されている。Her2に特異的に結合する抗体の具体例には、米国特許第5,677,171号、第5,772,997号; Fendlyら, Cancer Res., 50:1550-1558 (1990)などに開示されている。
【００３２】
「ErbB3」および「Her3」は、例えば米国特許第5,183,884号および第5,480,968号ならびにKrausら, PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されている受容体ポリペプチド、ならびにそれらの変異体を意味する。Her3に結合する抗体の具体例は米国特許第5,968,511号に記載されている（例えば、8B8抗体（ATCC HB 12070））。
【００３３】
本明細書中の「ErbB4」および「Her4」なる語は、例えばEP特許出願番号599,274; Plowmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); およびPlowmanら, Nature, 366:473-475 (1993)に開示されている受容体ポリペプチド、ならびにそれらの変異体、例えばWO 99/19488に開示されているHer4アイソフォームを意味する。
【００３４】
「インスリン様増殖因子1受容体」または「IGF-1R」は、Ullrichら, EMBO J., 5:2503-2512 (1986)またはSteele-Perkinsら, J. Biol. Chem., 263:11486-11492 (1988)に開示されているものと実質的に同一であるヒト受容体チロシンキナーゼを意味する。
【００３５】
「キット」は、物質を運搬するための任意の運搬系を意味する。反応アッセイの場合には、そのような運搬系には、反応試薬（例えば、適当な容器内のプローブ、酵素など）および／または補助部材（例えば、バッファー、アッセイを行うための説明書など）の貯蔵、輸送または運搬（1つの場所から別の場所へ）を可能にする系が含まれる。例えば、キットは、関連反応試薬および／または補助部材を含有する1以上の容器（例えば、箱）を含む。そのような内容物は、一緒に又は別々に、意図される受領者に運搬されうる。例えば、第1容器は、アッセイで使用する酵素を含有することが可能であり、一方、第2容器はプローブを含有する。
【００３６】
「ホスファチジルイノシトール3キナーゼタンパク質」または同義語である「PI3Kタンパク質」は、NCBIアクセッション番号NP_852664、NP_852556およびNP_852665に記載されているヒトタンパク質のセットのヒト細胞内タンパク質ならびにそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【００３７】
「血小板由来増殖因子受容体」または「PDGFR」は、PDGFRαもしくはPDGFRβまたはそれらの変異体（Heldinら, Physiological Reviews, 79:1283-1316 (1999)に記載されているもの）と実質的に同一であるヒト受容体チロシンキナーゼタンパク質を意味する。1つの態様においては、本発明は、以下の群の1以上の二量体を測定することによる、癌の状態、前癌状態、線維性または硬化性状態の判定を含む：PDGFRαホモ二量体、PDGFRβホモ二量体およびPDGFRα-PDGFRβヘテロ二量体。特に、線維性状態には、肺または腎線維症が含まれ、硬化性状態には、アテローム性動脈硬化症が含まれる。癌には、乳癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫および卵巣癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。単に「PDGFR」と記載されている場合には、それは「PDGFRα」または「PDGFRβ」を意味すると理解される。
【００３８】
「ポリペプチド」は、1つのアミノ酸のカルボキシ基ともう1つのアミノ酸のアミノ基との間の脱水によるアミド結合により互いに化学結合したアミノ酸残基から構成される化合物のクラスを意味する。ポリペプチドはアミノ酸残基の重合体であり、非常に多数のそのような残基を含有しうる。ペプチドはポリペプチドに類似しているが、一般には、ペプチドはより少数のアミノ酸から構成される。ペプチドはオリゴペプチドと称されることもある。ポリペプチドとペプチドとの間の明瞭な区別はない。便宜上、本開示および特許請求の範囲においては、一般にペプチドおよびポリペプチドに言及するためには「ポリペプチド」を用いる。アミノ酸残基は天然体または合成体でありうる。
【００３９】
「タンパク質」は、通常、生物細胞により合成され一定の三次元構造に折り畳まれたポリペプチドを意味する。タンパク質は、一般には、分子量約5,000〜約5,000,000またはそれ以上、より通常は、分子量約5,000〜約1,000,000であり、翻訳後修飾、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタマートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化およびユビキチン化を含みうる（例えば、Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson編, Academic Press, New York, 1983中のWold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, p.1-12）。タンパク質には、例えばサイトカインまたはインターロイキン、酵素、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼなど、プロタミン、ヒストン、アルブミン、免疫グロブリン、硬タンパク質、リン酸化タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、T細胞受容体、プロテオグリカンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「受容体チロシンキナーゼ」または「RTK」は、細胞内キナーゼ活性を有しSchlessinger, Cell, 103:211-225 (2000); ならびにBlume-JensenおよびHunter（前記引用）に記載のRTKファミリーのタンパク質から選ばれるヒト受容体タンパク質を意味する。「受容体チロシンキナーゼ二量体」は、2個の受容体チロシンキナーゼタンパク質を含む、細胞表面膜における複合体を意味する。いくつかの態様においては、受容体チロシンキナーゼ二量体は2個の共有結合受容体チロシンキナーゼタンパク質を含みうる。
【００４１】
「サンプル」は、検出または測定すべき1以上の分子複合体を含有する疑いのある或る量の物質を意味する。本明細書中で用いるその用語は試料（例えば、細胞診または医学的試料）または培養（例えば、微生物培養）を含む。また、それは生物学的サンプルおよび環境サンプルの両方を含む。生物学的サンプルは、ヒトを含む動物、流体、固体（例えば、便）または組織、ならびに液体および固体の食品および飼料製品および成分、例えば乳製品、野菜、肉および肉副産物および排泄物でありうる。生物学的サンプルは、限定的なものではないが培養、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、喀痰、精液、針吸引物などを含む、患者から採取した物質を包含しうる。生物学的サンプルは、種々の科の家畜および野生動物、例えば有蹄類、クマ、魚類、げっ歯類などのような動物（これらに限定されるものではない）のすべてから得ることが可能である。環境サンプルには、環境物質、例えば表面物質、土壌、水および産業サンプルならびに食品および乳製品加工器具、用具、装置、家庭用品、使い捨て及び非使い捨て品から得たサンプルが含まれる。これらの例は、本発明に適用可能なサンプルのタイプを限定するものと解釈されるべきではない。ヒトサンプルまたは「組織サンプル」または「患者サンプル」または「患者細胞または組織サンプル」または「試料」のそれぞれは、対象または患者の組織から得た同様の細胞の採集物を意味する。組織サンプルの起源は、新鮮な、凍結されたおよび／または保存された器官または組織サンプルまたは生検または吸引物からの固体組織；血液または任意の血液構成成分；体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹腔液または間質液；あるいは対象の妊娠および発生における任意の時点からの細胞でありうる。組織サンプルは、天然では天然組織と混合していない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、バッファー、固定液、栄養素、抗体などを含有しうる。本発明の1つの態様においては、組織サンプルまたは患者サンプルを固定する（特に、通常のホルマリン固定パラフィン包埋サンプル）。そのようなサンプルは、典型的には、顕微鏡スライドまたは同等の表面上にマウントされた固定組織の薄片（例えば、厚さ3〜10μm）の形態の複合体に関するアッセイにおいて使用される。そのようなサンプルはまた、典型的には、アッセイ測定の一部または予備操作として、通常の再水和操作、および場合によっては抗原回収操作に付される。
【００４２】
分子タグの分離に関する「分離プロファイル」は、アッセイにおいて生じた各タイプの分子タグの数の測定値または尺度を与える分子タグ関連パラメーター（例えば、保持時間、質量など）に対するシグナル強度データのチャート、グラフ、曲線、棒グラフまたは他の表示を意味する。分離プロファイルは、電気泳動図、クロマトグラム、電気クロマトグラム、マススペクトログラム、または用いる分離技術に応じたデータの同様のグラフ表示でありうる。分離プロファイルに関する「ピーク」または「バンド」または「ゾーン」は、分離された化合物が濃縮されている領域を意味する。単一のアッセイに関して複数の分離プロファイルが存在することがある。例えば、異なる分子タグが、特有の発光スペクトルを有する異なる蛍光標識を有し、複数の波長においてデータを収集し記録する場合がそうである。1つの態様においては、異なる分子タグが電気泳動図上の特有のピークに対応する電気泳動図を与える、電気泳動移動度の相違により、遊離した分子タグを分離する。電気泳動図における隣接ピークの特有性（distinctness）（または重複の欠如）の尺度が「電気泳動分離能（electrophoretic resolution）」であり、これは、隣接ピーク最大間の距離を、該ピークの、2つの標準偏差のうちの大きいほうの4倍で割り算したものと理解されうる。好ましくは、隣接ピークは、少なくとも1.0、より好ましくは少なくとも1.5、最も好ましくは少なくとも2.0の分離能を有する。与えられた分離および検出系においては、少なくともピーク分離量（そのような量は、シグナル検出系、蛍光部分の性質、タグの拡散係数、篩マトリックスの存在または非存在、電気泳動装置の性質、例えばチャンネルの存在または非存在、分離チャンネルの長さなどを含む当業者によく知られた幾つかの要因に左右される）だけ異なる電気泳動移動度を有するメンバーからなる複数の分子タグを選択することにより、所望の分離能を得ることが可能である。電気泳動図は、Williamsら, 米国特許公開2003/0170734に開示されているような解析プログラムを使用して、該データ内の特徴を分子タグの存在、非存在または量と関連づけるように解析することが可能である。
【００４３】
「SHC」（「Src相同性2／α-コラーゲン関連」を表す）は、Pelicciら, Cell, 70:93-104 (1992)に記載されているものと実質的に同一であるRTKシグナリング経路におけるアダプタータンパク質（66、52および46kダルトン）のファミリーのいずれかを意味する。1つの態様においては、SHCはそのようなアダプタータンパク質のヒト形態を意味する。
【００４４】
「シグナリング経路」または「シグナル伝達経路」は、通常は細胞表面受容体および／または受容体二量体と細胞外リガンドとの相互作用から開始する或いは細胞表面受容体のリン酸化部位への細胞内分子の結合から開始する一連の分子事象を意味する。ついでそのような開始事象は一連の更なる分子相互作用または事象を誘発し、ここで、一連のそのような事象または相互作用は、例えば細胞の核内の転写の調節により又はmRNA転写産物のプロセシングもしくは翻訳の調節により、遺伝子発現の調節をもたらす。1つの態様においては、シグナリング経路はRas-MAPK経路、PI3K-Akt経路またはmTOR経路を意味する。「Ras-MAPK経路」は、Ras-GTP複合体の形成後のMAPKタンパク質のリン酸化を含むシグナリング経路を意味する。「PI3K-Akt経路」は、PI3Kタンパク質によるAktタンパク質のリン酸化を含むシグナリング経路を意味する。「mTOR経路」は、mTORタンパク質、PI3Kタンパク質、Aktタンパク質、S6K1タンパク質、FKBPタンパク質、例えばFKBP12タンパク質、TSC1タンパク質、TSC2タンパク質、p70S6Kタンパク質、raptor（ラプター）タンパク質、rhebタンパク質、PDKタンパク質、4E-BP1タンパク質（これらのタンパク質のそれぞれは翻訳後修飾部位においてリン酸化されうる）の1以上を含むシグナリング経路を意味する。mTOR経路は以下の複合体をも含みうる：FKBP12//mTOR、raptor//mTOR、raptor//4E-BPl、raptor//S6Kl、raptor//4E-BPl//mTOR、raptor//S6Kl//mTOR（ここで、「X//Y」は、XとYとが複合体を形成することを示す）。前2文のタンパク質は当業者によく知られており、参照により本明細書に組み入れる以下の参考文献に記載されている：Sawyers, Cancer Cell, 4:343-348 (2003); Xuら, International J. Oncol., 24:893-900 (2004); Fongら, Proc. Natl. Acad. Sci., 100:14253-14258 (2003); Frumanら, Eur. J. Immunol., 25:563-571 (1995); Hidalgoら, Oncogene, 19: 6680-6686 (2000)など。
【００４５】
1つの分子がもう1つの分子に結合する場合（例えば、結合性化合物またはプローブが標的アナライトまたは複合体に結合する場合）の「特異的」または「特異性」は、プローブと標的との間の認識、接触および安定な複合体の形成、ならびにプローブと他の分子との実質的にそれより低い認識、接触または複合体形成を意味する。1つの態様においては、第1の分子が第2の分子に結合する場合の「特異的」は、第1の分子が反応またはサンプル内のもう1つの分子を認識しそれとの複合体を形成する限りにおいて、それが第2の分子と最大数の複合体を形成することを意味する。1つの態様においては、この最大数は、第1の分子により形成されたすべてのそのような複合体の少なくとも50％である。一般に、特異的結合事象に関与する分子は、その表面上または腔内に、互いに結合する分子間の特異的認識をもたらす領域を有する。特異的結合の具体例には、抗体-抗原相互作用、酵素-基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド間の二本鎖または三本鎖の形成、受容体-リガンド相互作用などが含まれる。
【００４６】
複数の蛍光標識に関して本明細書中で用いる「分光的に分離可能」なる語は、それぞれの標識が結合している分子タグが、標準的な光検出系［例えば、米国特許第4,230,558号、第4,811,218号など又はFlow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985)中のWheelessら, p. 21-76に記載の系により例示される帯域通過フィルターおよび光電子増倍管の系を使用するもの］により、それぞれの標識により生成された蛍光シグナルに基づいて区別されうるのに十分な程度に、該標識の蛍光発光バンドが特有のものである（すなわち、十分に非重複性である）ことを意味する。
【００４７】
本明細書中で用いる「標識プローブ」は「結合性化合物」と同じ意味で用いられる。
【００４８】
本明細書中で用いる「VEGF受容体」または「VEGFR」は、血管内皮増殖因子（VEGF）に対する細胞受容体、通常は、血管内皮細胞上に見出される細胞表面受容体、およびヒトVEGFに対する結合能を保有するその変異体を意味する。VEGF受容体には、VEGFR1（Flt1としても公知である）、VEGFR2（Flk1またはKDRとしても公知である）およびVEGFR3（Flt4としても公知である）が含まれる。これらの受容体はDeVriesら, Science 255:989 (1992); Shibuyaら, Oncogene 5:519 (1990); Matthewsら, Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Termanら, Oncogene 6:1677 (1991); Termanら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992)に記載されている。VEGF受容体の二量体はShibuya, Cell Structure and Function, 26:25-35 (2001); およびFerraraら, Nature Medicine, 9:669-676 (2003)に記載されている。
【００４９】
発明の詳細な説明
本発明は、局所作用性切断剤を生成する切断性プローブと、該切断剤により遊離される遊離可能な分子タグで標識された結合性化合物とを含む組成物を使用することにより、サンプル内の分子複合体の量を検出または測定するための方法を提供する。少なくとも1つの切断性プローブが、結合性化合物の少なくとも1つとは異なる複合体成分に特異的に結合するよう、切断性プローブおよび結合性化合物を設計することにより、複合体形成を検出する。このようにして、複合体が形成された場合にのみ、所定のタイプの分子タグが遊離される。
【００５０】
本発明の1つの実施形態の実施を図1Aに例示する。タンパク質（104）および（102）の結合により、分子複合体（100）が形成する。切断性プローブ（108）（この図では、光増感剤「PS」が結合している）と結合性化合物（106）とを含む本発明の試薬（107）を、切断性プローブ（108）および結合性化合物（106）が、それらのそれぞれの、複合体（100）の異なるタンパク質上に存在する該複合体上の抗原決定基に特異的に結合（112）するのを可能にする条件下、複合体（100）を含有するサンプルと混合（109）する。結合後、および場合によっては洗浄またはバッファー交換後、切断性プローブ（108）を活性化して活性種を生成させ、これは、例えば一重項酸素の場合には、光増感剤から有効近接範囲（110）まで拡散する。この近接範囲内の切断可能連結が切断され、分子タグが遊離する（114）。ついで、遊離した分子タグ（116）を分離し、分離プロファイル（120）、例えば電気泳動図を得、それにおけるピーク（118）を同定し、分子タグ「mT1」と相関させる。それよりやや複雑な実施形態を図1Bに例示する。本発明の試薬（122）は、（i）切断性プローブ（108）、第1結合性化合物（106）および第2結合性化合物（107）を含む。ここで、第1結合性化合物（106）はタンパク質（102）に特異的であり、第2結合性化合物（107）は、切断性プローブ（108）が特異的である抗原決定基とは異なる抗原決定基においてタンパク質（104）に特異的である。図1Aの実施形態の場合と同様に、該試薬の結合後、切断性プローブ（108）を活性化して活性化種を生成させ、これが、該光増感剤の有効近接範囲内の分子タグの切断可能連結を切断する。遊離した分子タグ（123）を分離し、分離プロファイル（126）におけるピーク（118および124）を遊離分子タグの量と相関させる。この実施形態においては、相対ピーク高さ又は面積は、（i）第1および第2結合性化合物の、それらのそれぞれの抗原決定基に対するアフィニティーにおける相違、および／または（ii）結合性化合物が特異的である抗原決定基の存在または非存在を表す。後者は、タンパク質の翻訳後状態（例えば、リン酸化状態）をモニターするために結合性化合物を使用した場合に重要である。
【００５１】
本発明の方法は、より複雑な複合体（例えば、図1Cに例示するもの）の量を検出または測定するために使用することが可能である。複合体（130）は、抗原決定基（136および138）を有する膜貫通受容体（134）、抗原決定基（142）を有するアダプタータンパク質（140）、および抗原決定基（146）を有する細胞内タンパク質（144）を含み、これらの成分のすべては膜（132）と結合している。（130）のような複合体を検出および／または測定するためには、多数のアッセイ設計が可能である。例示されている特定の設計においては、切断性プローブ（129）は膜貫通受容体（134）の抗原決定基（138）に特異的であるが、他の設計においては、該試薬は別の抗原決定基に対するものであることが可能であろう。切断性プローブおよび結合性化合物が抗体結合性組成物を含む場合には常に、該アッセイ設計は抗体入手可能性、複合体の性質（例えば、それぞれの成分が常に存在するかどうか、または平均して僅かな時間しか幾つかの成分が存在しない点で、複合体が動的であるかどうか）、サンプル調製などに左右されうる。一般には、切断性プローブ（129）は複合体（130）の第1タンパク質に特異的に結合するが、アッセイ設計に応じて、第1タンパク質は該複合体内のタンパク質のいずれかでありうるであろう。第1タンパク質を選択した後、複合体内の残りのタンパク質は「第2タンパク質」である。本発明においては、少なくとも1つの第2タンパク質は第1タンパク質とは異なる。図1Cに戻ると、試薬（128）の特異的結合（150）を可能にする条件下、試薬（128）を、複合体（130）を含有するサンプルと一緒にする（148）。ついで、切断性プローブ（129）の切断誘導部分を活性化して分子タグ（151）を遊離させる。ついで、遊離した分子タグ（151）を分離し、前記のとおりに分離プロファイル（154）において同定する。
【００５２】
本発明のもう1つの態様を図１Dおよび1Eに例示する。これらは細胞サンプル内の複数の複合体の同時検出または測定をもたらす。細胞（160）（これはin vitro培養または患者組織の試料からのサンプルに由来するものでありうる）を細胞溶解（172）して、細胞膜に結合した分子複合体および／またはサイトゾル内の分子複合体および／または細胞核内の分子複合体を利用可能なものとする。特に関心が持たれるのは、限定的なものではないが表面受容体複合体、例えば二量体、種々のタイプのアダプターまたはスカフォールドタンパク質を含む受容体複合体、そのような複合体内のタンパク質のリン酸化部位などを含むシグナル伝達過程に関連した複合体である。細胞溶解後、得られたライセート（174）を、複数の切断性プローブ（175）と複数の結合性化合物（177）とを含むアッセイ試薬（176）と一緒にする。試薬（176）がそれらのそれぞれの標的に特異的に結合するのを可能にするアッセイ条件を選択する（178）。それにより、活性化後、切断誘導部分の有効近接範囲（180）内の切断可能連結が切断され、分子タグが遊離する（182）。前記のとおり、切断後、遊離した分子タグを分離し（184）、電気泳動図のような分離プロファイル（186）において同定し、測定された分子タグの数および量に基づき、サンプルの細胞内の、選択した分子複合体のプロファイルが得られる。
【００５３】
図1Fに例示するとおり、ホモ二量体を測定することが可能である。前記のとおり、アッセイは、3つの試薬（1128）、すなわち、切断性プローブ（1134）、第1結合性化合物（1130）および第2結合性化合物（1132）を含みうる。第1結合性化合物（1130）および切断性プローブ（1134）は、ホモ二量体（1136）または単量体（1138）としてサンプル内に存在（1140）するタンパク質（1138）上の同じ抗原決定基（1135）に特異的となるよう構築する。試薬（1128）を、試薬とそれらのそれぞれの標的との間の安定な複合体の形成を促進する条件下、サンプルと一緒にした後、アッセイ混合物内に複数の複合体（1142〜1150）が形成する。切断性プローブ（1134）および結合性化合物（1130）は同じ抗原決定基（1135）に特異的であるため、試薬の4つの異なる組合せ（1144〜1150）は、ホモ二量体を伴う複合体を形成しうる。アッセイ混合物内の複合体のうち、切断性プローブ（1134）と少なくとも1つの結合性化合物とを有するもの（1143）のみが分離および検出（1154）のための遊離分子タグ（1151）を与えるであろう。この実施形態においては、ピーク（1153）のサイズはアッセイ混合物内のホモ二量体の量に比例し、一方、ピーク（1152）のサイズは、単量体形態（1142）またはホモ二量体形態（1146および1148）のどちらにおいても、アッセイ混合物内のタンパク質（1138）の全量に比例する。図1Eは、細胞表面膜（1161）内でヘテロ二量体を形成する細胞表面受容体に関する同様の測定を例示する。細胞または組織のライセートにおいて、あるいは固定過程により膜が透過性亢進した又は除去された固定サンプルにおいて、二量体を測定することが可能である、と当業者は理解するであろう。そのような場合には、結合性化合物は細胞表面膜受容体の細胞外または細胞内ドメインに特異的でありうる。
【００５４】
図1Gおよび1Hは、固定または凍結組織サンプルにおいて受容体複合体を測定するための本発明の実施形態を例示する。固定組織サンプル（1000）、例えばホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを、ミクロトームまたは同様の器具を使用して薄く切って切片（1004）を得、これを表面（1006）（これは顕微鏡スライドでありうる）上に配置した後、それをアッセイ試薬の適用のために脱ロウ化し再水和させる。拡大図（1007）は、顕微鏡スライド（1006）の一部分（1014）上の切片（1004）の一部（1008）を示す。受容体二量体分子（1018）は、固定サンプルの膜構造の残り（1016）に埋まったものとして示されている。本発明のこの態様においては、切断性プローブおよび結合性化合物を固定サンプルと共にインキュベートして、それらがそれらの標的分子に結合するようにする。例えば、切断性プローブ（1012）（この図では、光増感剤（「PS」）が結合した抗体として示されている）および第1結合性化合物（1010）（分子タグ「mT1」が結合した抗体として示されている）は、示されている二量体のすべてに共通の受容体（1011）に特異的に結合し、第2結合性化合物（1017）（「mT2」を伴う）は受容体（1015）に特異的に結合し、第3結合性化合物（1019）（「mT3」を伴う）は受容体（1013）に特異的に結合する。それぞれの標的分子に特異的に結合しない結合性化合物および切断性プローブを除去するために洗浄した後、バッファー（1024）（この図においては、「照射バッファー」と称される）を加える。簡便には、スライド（1006）上に例えばワックスペンで疎水性障壁を設けることにより、バッファー（1024）を切片（1004）またはその一部分上に含有させることが可能である。光増感剤の照射および分子タグ（1026）の遊離の後、今や遊離分子タグ（1025）を含有するバッファー（1024）を分離装置（例えば、毛管電気泳動装置）に移し、例えば電気泳動図（1030）において遊離分子タグの分離（1028）および同定を行う。
【００５５】
特に図1Gおよび1Hに例示されている組織サンプル上で直接行う測定は、サンプル内の全細胞数および／またはサンプル内の細胞の特定のサブタイプの数を表す細胞標的または組織標的上の測定を含めることにより標準化することが可能である。正常細胞の相当部分を含みうる追加的な測定が好ましい、あるいは更には必要かもしれない。例えば、受容体の全量に関する値は以下の2つの測定の比として与えられうる：分子タグ（「mT1」）のピークの面積、およびサンプル内の細胞のすべてに共通の細胞成分または組織成分（例えば、チューブリンなど）に相関する分子タグに対応するピークの面積。サンプル内の細胞のすべてが上皮細胞であるいくつかの場合には、サイトケラチンが使用されうる。したがって、遊離可能な分子タグに基づく検出方法は、チューブリンのような標準化タンパク質に特異的な結合性化合物（特有の分子タグを伴うもの）を付与する追加的工程を含みうる。
【００５６】
共通成分を含有する二量体の相対量を測定するための実施形態を図1Iに例示する。このアッセイ設計においては、共通成分「2」をそれぞれが有する2つの異なる受容体二量体（「1-2」（1240）および「2-3」（1250））を、共通成分に対して比率的（ratiometrically）に測定することが可能である。受容体「1」（1222）と受容体「2」（1220）とを含む受容体ヘテロ二量体（1240）および受容体「2」（1220）と受容体「3」（1224）とを含む受容体ヘテロ二量体（1250）を測定するためのアッセイ設計を示す。この実施形態の重要な特徴は、切断性プローブ（1227）がヘテロ二量体のペアの共通受容体に特異的にされていることである。受容体「2」に特異的な結合性化合物（1228）は、該アッセイにおいて受容体「2」の全量に関連づけられるシグナル（1234）を与え、一方、受容体「1」に特異的な結合性化合物（1226）および受容体「3」に特異的な結合性化合物（1230）は、それぞれ受容体「2」とのヘテロ二量体として存在する受容体「1」および受容体「3」の量のみに関連づけられるシグナル（それぞれ1232および1236）を与える。図1Iの設計は、追加的な複合体の成分に特異的な結合性化合物を単に加えることにより、共通成分を含有する3以上の複合体に一般化されうる。
【００５７】
サンプルの調製
分子複合体を含有するサンプルは、受容体複合体集団を病態または健康状態に関連づけるために本発明で使用する多種多様な起源（細胞培養、動物または植物組織、患者の生検などを含む）に由来するものでありうる。好ましくは、サンプルはヒト患者のサンプルである。本発明のアッセイには、サンプルの採取源によって異なりうる通常の技術を用いてサンプルを調製する。
【００５８】
A．固体組織サンプル
生検試料および医学的試料に関しては、以下の参考文献に指針が記載されている：Bancroft JD & Stevens A編, Theory and Practice of Histological Techniques (Churchill Livingstone, Edinburgh, 1977); Pearse, Histochemistry. Theory and applied. 4th ed. (Churchill Livingstone, Edinburgh, 1980)。
【００５９】
癌性病態の分野においては、使用しうる患者組織サンプルの具体例には、乳房、前立腺、卵巣、結腸、肺、子宮内膜、胃、唾液腺または膵臓が含まれるが、これらに限定されるものではない。組織サンプルは、限定的なものではないが外科的切除、吸引または生検を含む種々の方法により得ることが可能である。該組織は新鮮なもの又は凍結したものでありうる。1つの実施形態においては、固定されパラフィンなどに包埋された組織サンプル上で本発明のアッセイを行う。したがって、そのような実施形態においては、脱パラフィン化の工程を行う。組織サンプルは、通常の方法［例えば、"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,"3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP)編, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel編, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D. Cを参照されたい］により固定（すなわち、保存）されうる。固定液の選択は、組織が組織学的に染色されるまたは分析される目的により決定される、と当業者は理解するであろう。また、固定の処理時間は組織サンプルのサイズおよび使用する固定液に左右される、と当業者は理解するであろう。例えば、組織サンプルを固定するためには、中性緩衝化ホルマリン、ブアン液またはパラホルムアルデヒドを使用することが可能である。
【００６０】
一般には、まず、組織サンプルを固定し、ついで一連の漸増濃度（ascending）アルコールで脱水し、パラフィンまたは他の切片化媒体で浸漬し包埋して、組織サンプルを切片化することが可能である。あるいは、組織を切片化し、得られた切片を固定することが可能である。例えば、通常の方法（例えば、"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 前掲を参照されたい）により、組織サンプルをパラフィンで包埋し加工する。使用しうるパラフィンの具体例には、パラプラスト（Paraplast）、ブロロイド（Broloid）およびティッシュメイ（Tissuemay）が含まれるが、これらに限定されるものではない。組織サンプルを包埋したら、該サンプルをミクロトームなどにより切片化することが可能である（例えば、"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 前掲を参照されたい）。例えば、この操作のためには、切片は、約3ミクロン〜約12ミクロンの範囲の厚さ、好ましくは、約5ミクロン〜約10ミクロンの範囲の厚さを有しうる。1つの態様においては、切片は約10mm2〜約1cm2の面積を有しうる。切断されたら、いくつかの標準的な方法により切片をスライドに結合させる。スライド接着剤の具体例には、シラン、ゼラチン、ポリ-L-リシンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、パラフィン包埋切片を、正に荷電したスライドおよび／またはポリ-L-リシンでコートされたスライドに結合させることが可能である。
【００６１】
包埋物質としてパラフィンを使用した場合には、一般には、組織切片を脱パラフィン化し、水に再水和させる。いくつかの通常の標準的方法により、組織切片を脱パラフィン化することが可能である。例えば、キシレンおよび一連の漸減濃度のアルコールを使用することが可能である（例えば、"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 前掲を参照されたい）。あるいは、商業的に入手可能な脱パラフィン化非有機物質、例えばHemo-De（登録商標）（CMS, Houston, Tex.）を使用することが可能である。
【００６２】
哺乳類組織培養細胞、新鮮な組織または同様の起源の場合には、通常の細胞溶解技術（例えば、0.14 M NaCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris-Cl (pH 8.6)、0.5％ Nonidet P-40、ならびに必要に応じてプロテアーゼおよび／またはホスファターゼインヒビター）によりサンプルを調製することが可能である。新鮮な哺乳類組織の場合には、サンプル調製は組織の脱凝集工程、例えば圧搾、切り刻み、粉砕、超音波処理などを含みうる。
【００６３】
B．細胞の磁気的単離
患者の血液からの微量転移細胞上の二量体の測定のようないくつかの用途においては、表面受容体二量体集団に関するアッセイを行う前に富化（enrichment）工程を行うことが可能である。免疫磁気的単離または富化は、参照により本明細書に組み入れる以下の代表的参考文献に開示されているような当技術分野で公知の種々の技術および物質を用いて行うことが可能である：Terstappenら, 米国特許第6,365,362号; Terstappenら, 米国特許第5,646,001号; Rohrら, 米国特許第5,998,224号; Kauschら, 米国特許第5,665,582号; Kresseら, 米国特許第6,048,515号; Kauschら, 米国特許第5,508,164号; Miltenyiら, 米国特許第5,691,208号; Molday, 米国特許第4,452,773号; Kronick, 米国特許第4,375,407号; Radbruchら, Methods in Cell Biology, Vol, 42 (Academic Press, New York, 1994)の第23章; Uhlenら, Advances in Biomagnetic Separation (Eaton Publishing, Natick, 1994); Safarikら, J. Chromatography B, 722:33-53 (1999); Miltenyiら, Cytometry, 11:231-238 (1990); Nakamuraら, Biotechnol. Prog., 17:1145-1155 (2001); Morenoら, Urology, 58:386-392 (2001); Racilaら, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:4589-4594 (1998); Zigeunerら, J. Urology, 169:701-705 (2003); Ghosseinら, Seminars in Surgical Oncology, 20: 304-311 (2001)。
【００６４】
本発明の実施に使用する好ましい磁気粒子は、コロイドとして挙動する粒子である。そのような粒子は、一般には約200ナノメートル（nm）（0.20ミクロン）未満であるそれらのサブミクロンの粒径、および長時間にわたる溶液からの重力分離に対するそれらの安定性により特徴づけられる。多数の他の利点に加えて、このサイズ範囲は、それらを、細胞分析に一般に用いられる分析技術には実質的に認識不可能なものとする。90〜150nmの範囲内および70〜90％の磁気質量を有する粒子が本発明での使用に意図される。適当な磁気粒子は、安定化するコロイド特性を付与し磁気コアに結合（例えば、物理的吸収または共有結合）した分子により包囲された超常磁性物質の結晶性コアから構成される。コーティング材は、好ましくは、サンプル内に見出される生物学的巨大分子と磁気コアとの間の非特異的相互作用を妨げるのに有効な量で適用される。そのような生物学的巨大分子は、非標的細胞の表面上のシアル酸残基、レクチン、糖タンパク質および他の膜成分を含みうる。また、該材は、可能な限り多くの磁気質量（magnetic mass）／ナノ粒子を含有すべきである。該コアを含む磁気結晶のサイズは、完全な磁区をそれらが含有しないのに十分な程度に小さい。ナノ粒子のサイズは、それらのブラウンエネルギーがそれらの磁気モーメントを上回るのに十分な程度に小さい。その結果、これらのコロイド磁気粒子の北磁極、南磁極アライメントおよびそれに続く相互引力／反発は、やや強い磁界においてさえも生じないらしく、これはそれらの溶液安定性に寄与するものである。最後に、磁気粒子は、高い磁気勾配外部フィールドセパレーター（magnetic gradient external field separator）において分離可能であるべきである。その特性はサンプルの取扱いを容易にし、強磁性ビーズまたは鋼綿が充填された、より複雑な内部勾配カラムに対する経済的利点をもたらす。前記特性を有する磁気粒子は、米国特許第4,795,698号、第5,597,531号および第5,698,271号（これらの特許を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている基材の修飾により製造されうる。
【００６５】
分子タグおよび切断可能連結
遊離可能な分子タグを使用して複合体を測定することにより、以下のものを含む多数の利点がもたらされる：（1）アッセイ混合物からの遊離分子タグの分離はバックグラウンドの著しい減少および感度の有意な増加ををもたらす；ならびに（2）分離および検出を容易にするための特別に設計された分子タグの使用は、簡便なマルチプレックス化能をもたらして、複数の複合体または複合体成分が同一アッセイにおいて同時に容易に測定されることを可能にする。分離されている分子間の1以上の物理的、化学的または光学的相違（電気泳動移動度、分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、電荷／質量比、極性などを含むが、これらに限定されるものではない）に基づいて分子を識別しうる多種多様な分離技術を用いることが可能である。1つの態様においては、複数の又は組になっている分子タグは電気泳動移動度および光学的検出特性において相違し、電気泳動により分離される。もう1つの態様においては、複数の又は組になっている分子タグは分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、極性において相違することがあり、順相または逆相HPLC、イオン交換HPLC、毛管電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーまたは同様の技術により分離される。
【００６６】
結合性化合物から遊離した後に分離技術により特有のバンドまたはピークに分離される分子タグのセット（組）が提供される。そのようなピークの同定および定量は受容体二量体の種類および量の尺度またはプロファイルを与える。セット内の分子タグは化学的に多様でありうるが、簡便には、分子タグのセットは、通常、化学的に関連している。例えば、それらはすべて、ペプチドでありうる。あるいはそれらは、同じ基本ビルディングブロックまたは単量体の、異なる組合せからなりうる。あるいはそれらは、後記で更に詳しく説明するとおり、異なる分離特性を付与するための異なる置換基を有する同じ基本スカフォールドを使用して合成されうる。複数の分子タグの数は、用いる分離方法、検出のための分子タグ上で使用する標識、結合性部分の感度、切断可能連結が切断される効率などを含む幾つかの要因に応じて様々となりうる。1つの態様においては、受容体二量体の集団を測定するための複数の分子タグの数は2〜10個の範囲である。他の態様においては、「複数」は2〜8、2〜6、2〜4、または2〜3の範囲でありうる。
【００６７】
アッセイにおいては、切断可能連結と反応して分子タグをそれらのそれぞれの結合性化合物から遊離させる切断剤により分子タグを切断する。ついで、遊離した分子タグを分離し、検出する。本発明においては、多種多様な切断可能連結および対応する切断剤を使用することが可能である。均一系アッセイ方式が望ましい場合には、好ましくは、切断剤は局所作用性物質である。すなわち、後記において更に詳しく説明するとおり、該アッセイにおいては、切断可能連結の切断のための局所的条件を与えるよう誘導されうる切断誘導部分を使用する。1つの態様においては、そのような切断誘導部分は、後記において更に詳しく説明するとおり、活性種を生成する増感剤である。また、本発明のアッセイは不均一系または非均一系方式で行うことも可能である。そのような方式においては、結合性化合物をアッセイ反応混合物内でサンプルと一緒にして、結合性化合物がそれらの標的分子または抗原決定基に、それらが安定な複合体を形成するよう利用可能な場合にはいつでも、特異的に結合しうるようにする。ついで、結合していない結合性化合物を、洗浄、濾過、遠心分離、磁気的分離などにより、該安定複合体から除去または分離する。この方式においては、該安定複合体からの分子タグの切断は近接範囲依存的である必要はない。なぜなら、結合していない結合性化合物は既に除去されているからである。したがって、より多様な切断方法を用いることが可能である。切断には尚も、酸化不安定性連結を切断するために前記のとおりの増感剤を使用することが可能であるが、種々の切断可能連結基の種々のタイプの化学的、光化学的または酵素的切断（例えば、当技術分野で公知のもの）を用いることが可能である。例えば、化学的切断可能連結の非限定的な具体例には、ジスルフィド（典型的にはジチオトレイトールを使用する還元により切断可能である）、アゾ基（ジチオナートで切断可能である）、スルホン（ジチオトレオトールの存在下または非存在下の塩基性リン酸で切断可能である）、グリコール（過ヨウ素酸で切断可能である）、およびエステル（加水分解により切断可能である）が含まれる。光不安定性リンカーには、例えばアゾ結合およびo-ニトロベンジルエーテルが含まれる。
【００６８】
洗浄後、結合性化合物と標的との安定複合体を、分子タグが遊離する溶媒と一緒にすることが可能である。切断性結合の性質および切断方法に応じて、溶媒は切断のための任意の追加的な試薬を含みうる。切断用試薬が必要でない場合には、溶媒は簡便には分離バッファー、例えば電気泳動分離媒体である。例えば、切断可能連結が光不安定性である場合には、該媒体に適当な波長の光を照射して分子タグをバッファーまたは媒体内に遊離させることが可能である。
【００６９】
いずれの方式においても、アッセイ反応条件が、用いる分離技術を妨げる場合には、分子タグの切断および分離の前にアッセイ反応バッファーを除去または交換することが必要かもしれない。例えば、いくつかの実施形態においては、アッセイ条件は、電気泳動移動度に基づいて分子タグを分離する場合の分離性能を損なう塩濃度（例えば、特異的結合に必要なもの）を含む。そのような実施形態においては、分子タグの遊離および分離の前に、アッセイバッファーを分離バッファーまたは媒体と交換する。
【００７０】
均一系または不均一系アッセイ方式のための切断剤、分子タグ、切断可能連結および他の成分の選択に関する指針は以下の参考文献に開示されている：国際特許公開WO 00/66607; WO 01/83502; WO 02/95356; WO 03/06947; ならびに米国特許第6,322,980号および第6,514,700号。
【００７１】
遊離可能な分子タグおよび切断性プローブを使用するアッセイは、検出または測定する複合体に応じて多数の異なる方式および形態で行うことが可能である。本開示に基づけば、個々の結合性化合物および切断性プローブの数および特異性の選択は、当業者にとっての設計上の選択である。
【００７２】
前記のとおり、本発明の1つの態様は、複数の異なる結合性化合物の混合物を準備することを含み、ここで、それぞれの異なる結合性化合物は、切断可能連結を介して結合した1以上の分子タグを有する。結合性化合物、切断可能連結および分子タグの性質は多種多様でありうる。結合性化合物は、抗体結合性成分、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドまたは非ペプチドリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、例えばペプチド核酸、レクチン、または関心のあるアナライト（例えば、タンパク質の複合体）との特異的結合または安定な複合体形成が可能な他の任意の分子を含みうる。1つの態様においては、以下の式：
B-(L-E)k
（式中、Bは結合性部分であり、Lは切断可能連結であり、Eは分子タグである）で表されうる結合性化合物は、結合性部分に結合した1以上の分子タグを含む。好ましくは、非ポリヌクレオチドアナライトに関する均一系アッセイにおいては、切断可能連結Lは酸化不安定性連結であり、より好ましくは、それは、一重項酸素により切断されうる連結である。「-(L-E)k」なる部分は、単一の結合性化合物が、切断可能連結を介して結合した複数の分子タグを有しうることを示す。1つの態様においては、kは1以上の整数であるが、他の実施形態においては、kは数百以上、例えば100〜500であることが可能であり、あるいはkは数百以上ないし数千、例えば500〜5000である。本発明の組成物においては、通常、複数の異なるタイプの結合性化合物のそれぞれは、異なる分子タグEを有する。切断可能連結、例えば酸化不安定性連結、および分子タグEは、通常の化学により、Bに結合している。
【００７３】
好ましくは、Bは抗体結合性組成物である。そのような組成物は、関心のあるタンパク質に特異的な多種多様な商業的に入手可能な抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）から容易に形成される。特に、上皮増殖因子受容体に特異的な抗体は、参照により本明細書に組み入れる以下の特許に開示されている：5,677,171; 5,772,997; 5,968,511; 5,480,968; 5,811,098。参照により本明細書に組み入れる米国特許第6,488,390は、Gタンパク質結合性受容体CCR4に特異的な抗体を開示している。参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,599,681号は、タンパク質のリン酸化部位に特異的な抗体を開示している。また、商業的販売業者、例えばCell Signaling Technology (Beverly, MA)、Biosource International (Camarillo, CA) およびUpstate (Charlottesville, VA)は、表IIに記載のタンパク質を含む生物学的および医学的に関心が持たれる数百のタンパク質に特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提供している。
【００７４】
Lが酸化不安定性である場合には、Lは、好ましくは、チオエーテルまたはそのセレン類似体であるか、あるいは、炭素-炭素二重結合を含有するオレフィンであり、この場合、オキソ基への二重結合の切断が分子タグEを遊離する。例示的なチオエーテル結合は、参照により本明細書に組み入れるWillnerら, 米国特許第5,622,929号に開示されている。例示的なオレフィンには、ビニルスルフィド、ビニルエーテル、エナミン、イミン［α-メチン（少なくとも1つの水素原子を有する炭素原子CH）を伴う炭素原子において置換されているもの］が含まれ、この場合、ビニル基が環内に存在することが可能であり、ヘテロ原子が環内に存在し又は環状オレフィン炭素原子上で置換されていることが可能であり、少なくとも1個かつ4個までのヘテロ原子がオレフィン炭素原子に結合しているであろう。生じたジオキセタンは、外界温度を超える加熱（通常、約75℃未満）、酸または塩基との反応、あるいは光増感剤の非存在下または存在下の光活性化により自発的に分解しうる。そのような反応は以下の代表的参考文献に記載されている：AdamおよびLiu, J. Amer. Chem. Soc. 94,1206-1209, 1972, Andoら, J. C. S. Chem. Comm. 1972, 477-8, Andoら, Tetrahedron 29,1507-13, 1973, Andoら, J. Amer. Chem. Soc. 96,6766-8, 1974, AndoおよびMigita, 同誌 97,5028-9, 1975, WassermanおよびTerao, Tetra. Lett. 21,1735-38, 1975, AndoおよびWatanabe, 同誌 47,4127-30, 1975, Zaklikaら, Photochemistry and Photobiology 30,35-44, 1979, ならびにAdamら, Tetra. Lett. 36, 7853-4, 1995。米国特許第5,756,726号も参照されたい。
【００７５】
ジオキセタンの形成は、オレフィンの一方の炭素原子において分子タグにより及び他方の炭素原子において結合性部分により置換された活性化オレフィンと一重項酸素との反応によりもたらされる。例えば、米国特許第5,807,675号を参照されたい。これらの切断可能連結は、以下の式：
-W-(X)nCα=Cβ(Y)(Z)-
［式中、
Wは、結合、ヘテロ原子、例えばO、S、N、P、M（安定な共有結合を形成する金属を意味する）またはカルボニル、イミノなどのような官能基であることが可能であり、XまたはCαに結合していることが可能である；少なくとも1つのXは脂肪族、芳香族、脂環式または複素環式であり、ヘテロ原子、例えばN、OまたはSを介してCαに結合していることが可能であり、その他のXは同一である又は異なることが可能であり、さらに、水素、脂肪族、芳香族、脂環式または複素環式であることが可能でり、通常、芳香族または芳香族複素環式であり、ここで、1つのXはYと一緒になって、それらが結合している炭素原子（一般には、水素以外の、約1〜20個、通常は1〜12個、より通常は1〜8個の炭素原子）と共に、環、通常は複素環を形成していることが可能であり、1つのXは0〜6個、通常は0〜4個のヘテロ原子を有し、その他のXは少なくとも1個かつ6個までのヘテロ原子、通常は1〜4個のヘテロ原子を有する；
YはXの定義に含まれ、通常は、ヘテロ原子を介してCβに結合しており、示されているとおり、Xと一緒になって複素環を形成していることが可能である；Zは、通常、約4〜12個、通常は4〜10個の炭素原子および0〜4個の前記ヘテロ原子を含有する、複素環式芳香族を含む芳香族であり、直接的に又は前記ヘテロ原子を介してCβに結合している
nは、分子タグがCαまたはXに結合しているかどうかに応じて1または2である；ここで、YおよびZのうちの1つは結合性部分への結合のための官能基を有するか、または例えば結合性部分Tへの連結基として働くことにより若しくは連結基を含むことにより結合性部分に結合している。］により表されうる。好ましくは、W、X、YおよびZは、切断に際して、分子タグEが、後記のサイズ限界内となるように選ばれる。
【００７６】
例示的な切断可能連結には、S(分子タグ)-3-チオールアクリル酸、N(分子タグ)、N-メチル 4-アミノ-4-ブテン酸、3-ヒドロキシアクロレイン、N-(4-カルボキシフェニル)-2-(分子タグ)-イミダゾール、オキサゾールおよびチアゾールが含まれる。
【００７７】
同様に関心が持たれるものとして、式：
-(CO)X1(A)-
［式中、
X1は、O、S、NおよびSeよりなる群から選ばれるヘテロ原子（通常は最初の3つのうちの1つ）である；
Aは、分子タグにより置換されている少なくとも2個で通常は6個以下の炭素原子の鎖であり、ここで、好ましくは、Aのその他の原子価は水素により満たされているが、該鎖は、他の基、例えばアルキル、アリール、複素環式基などにより置換されていてもよい。］の二価基により9位において置換されたN-アルキルアクリジニル誘導体が挙げられる。Aは、一般には、10個以下の炭素原子である。
【００７８】
同様に関心が持たれるものとしては、置換イミダゾール、チアゾール、オキサゾールなどにより例示されるジヘテロシクロペンタジエンのような複素環式化合物が挙げられ、ここで、該環は、通常、少なくとも1つの芳香族基により置換されており、いくつかの場合には、分子タグを遊離させるためには加水分解が必要であろう。
【００７９】
同様に関心が持たれるものとしては、テルル（Te）誘導体が挙げられ、ここで、Teは、Te原子に対してβ位に水素原子を有するエチレン基に結合しており、該エチレン基は、好ましくは芳香環と縮合しておりオキソ基を有しうる脂環式または複素環式環の一部であり、Teの残りの原子価は分子タグに結合している。該環はクマリン、ベンゾオキサジン、テトラリンなどでありうる。
【００８０】
いくつかの好ましい切断可能連結およびそれらの切断産物を図3 A-Fに例示する。図3Aに示すチアゾール切断可能連結「-CH2-チアゾール-(CH2)n-C(=O)-NH-タンパク質」は、「-CH2-C(=O)-NH-CHO」なる部分を有する分子タグを与える。好ましくは、nは1〜12、より好ましくは1〜6の範囲である。図3Bに示すオキサゾール切断可能連結「-CH2-オキサゾール-(CH2)n-C(=O)-NH-タンパク質」は、「-CH2-C(=O)O-CHO」なる部分を有する分子タグを与える。オレフィン切断可能連結（図3C）は、結合性化合物実施形態「B-L-M-D」（前記のとおりであり、Dは蛍光色素である）に関して示されている。該オレフィン切断可能連結は、他の実施形態においても使用することが可能である。例示されているオレフィン連結の切断は、「R-(C=O)-M-D」（ここで、「R」は、前記分子タグEの一般的説明に含まれる任意の置換基でありうる）の形態の分子タグを与える。好ましくは、Rは電子供与基である（例えば、Ullmanら, 米国特許第6,251,581号; SmithおよびMarch, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th Edition (Wiley-Interscience, New York, 2001)など）。より好ましくは、Rは、1〜8個の炭素原子と、O、SおよびNよりなる群から選ばれる0〜4個のヘテロ原子とを有する電子供与基である。もう1つの好ましい形態においては、Rは-N(Q)2、-OQ、p-[C6H4N(Q)2]、フラニル、n-アルキルピロリル、2-インドリルなどであり、ここで、Qはアルキルまたはアリールである。図3Cのオレフィン切断可能連結に関して更に言及すると、置換基「X」および「R」は、切断可能連結Lを示す前記式の置換基「X」および「Y」と等価である。特に、図3CにおけるXは、好ましくは、モルホリノ、-OR'または-SR''であり、ここで、R'およびR''は、1〜8個の炭素原子とO、SおよびNよりなる群から選ばれる0〜4個のヘテロ原子とを有する脂肪族、芳香族、脂環式または複素環式基である。図3Dには、「-(CH2)2-S-CH(C6H5)C(C=O)NH-(CH2)n-NH-」（ここで、nは2〜12、より好ましくは2〜6である）なる形態を有する好ましいチオエーテル切断可能連結を例示する。図3Dに示すタイプのチオエーテル切断可能連結は結合性部分Tおよび分子タグEに結合していることが可能である（前駆体化合物として、図3Eおよび3Fに示されている）。結合性部分のアミノ基を結合させるためには、通常の化学的方法により末端ヒドロキシルをNHSエステルに変換する。アミノ基との反応および結合の後、Fmoc保護基を除去して遊離アミンを得、ついでこれを分子タグのNHSエステルと反応させる。
【００８１】
複数の分子タグの分離をガスクロマトグラフィーまたは質量分析により行う場合には、本発明における分子タグEは、以下の参考文献に記載されている求電子性タグを含みうる：Zhangら, Bioconjugate Chem. , 13: 1002-1012 (2002); Giese, Anal. Chem., 2:165-168 (1983); および米国特許第4,650,750号、第5,360,819号、第5,516,931号、第5,602,273号。
【００８２】
分子タグEは、好ましくは、活性種、特に一重項酸素に対して安定であり検出またはレポーター基を含む水溶性有機化合物である。あるいはEはサイズおよび構造において多種多様でありうる。1つの態様においては、Eは約50〜約2500ダルトン、より好ましくは約50〜約1500ダルトンの範囲の分子量を有する。Eの好ましい構造は、後記で更に詳しく説明する。Eは、電気化学シグナル、蛍光シグナルまたは発色シグナルを生成するための検出基を含みうる。質量による検出を用いる実施形態においては、Eは、検出目的のための分離した部分を有していなくてもよい。好ましくは、検出基は蛍光シグナルを生成する。
【００８３】
複数の分子タグは、同じ複数物内のその他のメンバーに対して特有の分離特性および／または特有の光学特性をそれぞれが有するように選ばれる。1つの態様においては、クロマトグラフィーまたは電気泳動分離特性は、当技術分野において通常用いられる一連の標準的な分離条件（例えば、電圧、カラム圧、カラムタイプ、移動相、電気泳動分離媒体など）下の保持時間である。もう1つの態様においては、光学特性は蛍光特性、例えば発光スペクトル、蛍光寿命、蛍光強度（与えられた波長または波長バンドにおけるもの）などである。好ましくは、蛍光特性は蛍光強度である。例えば、複数物における各分子タグは同じ蛍光発光特性を有しうるが、それぞれは特有の保持時間においては互いに異なるであろう。一方、複数物における分子タグの2以上は同一の保持時間を有しうるが、該複数物のメンバーのすべてが分子分離および蛍光測定の組合せにより識別可能となるよう、それらは特有の蛍光特性（例えば、光学的に分離可能な発光スペクトル）を有するであろう。
【００８４】
好ましくは、遊離した分子タグを電気泳動分離および検出基の蛍光により検出する。そのような実施形態においては、実質的に同一の蛍光特性を有する分子タグは、電気泳動図において特有のピークが分離条件下で生じるよう、異なる電気泳動移動度を有する。好ましくは、本発明の複数の分子タグを、通常の篩マトリックスの存在下または非存在下、通常の毛管電気泳動装置により分離する。典型的な毛管電気泳動装置には、Applied Biosystems (Foster City, CA) モデル310、3100および3700; Beckman (Fullerton, CA) モデルP/ACE MDQ; Amersham Biosciences (Sunnyvale, CA) MegaBACE 1000または4000; SpectruMedix遺伝解析系（genetic analysis system）などが含まれる。電気泳動移動度はq/M2/3（ここで、qは分子上の電荷であり、Mは分子の質量である）に比例する。望ましくは、最も近い電気泳動標識の間の、測定条件下での移動度における相違は、少なくとも約0.001、通常は0.002、より通常は少なくとも約0.01であり、0.02以上でありうる。好ましくは、そのような通常の装置においては、複数の分子タグの電気泳動移動度は、少なくとも1％、より好ましくは少なくとも1〜10％の範囲の割合分異なる。
【００８５】
1つの態様においては、分子タグEは（M,D）であり、ここで、Mは移動度修飾部分であり、Dは検出部分である。「(M,D)」なる表示は、MおよびD部分の配置が、いずれかの部分が切断可能連結Lに隣接しうるようになっていることを示すために用いられる。すなわち、「B-L-(M,D)」は、2つの形態：「B-L-M-D」または「B-L-D-M」のいずれかの結合性化合物を示す。
【００８６】
検出部分Dは、蛍光標識または色素、発色性標識または色素、電気化学的標識などでありうる。好ましくは、Dは蛍光色素である。本発明で使用する典型的な蛍光色素には、水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、4,7-ジクロロフルオレセイン、ベンゾキンテン色素およびエネルギー転移色素（以下の参考文献に開示されているもの）が含まれる：Handbook of Molecular Probes and Research Reagents, 8th ed., (Molecular Probes, Eugene, 2002); Leeら, 米国特許第6,191,278号; Leeら, 米国特許第6,372,907号; Menchenら, 米国特許第6,096,723号; Leeら, 米国特許第5,945,526号; Leeら, Nucleic Acids Research, 25:2816-2822 (1997); Hobb, Jr., 米国特許第4,997,928号; Khannaら, 米国特許第4,318,846号; Reynolds, 米国特許第3,932,415号; Eckertら, 米国特許第2,153,059号; Eckertら, 米国特許第2,242,572号; Taingら, 国際特許公開WO 02/30944など。他の具体的な典型的な蛍光色素には、5-および6-カルボキシローダミン6G; 5-および6-カルボキシ-X-ローダミン、5-および6-カルボキシテトラメチルローダミン、5-および6-カルボキシフルオレセイン、5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、1',2',7',8'-ジベンゾ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、1',2',7',8'-ジベンゾ-4',5'-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、ならびに2',4',5',7'-テトラクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインが含まれる。最も好ましくは、Dはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
【００８７】
移動度修飾部分Mのサイズおよび組成は、結合から、約100個の原子、通常は約60個以下の原子、より通常は約30個以下の原子（ここで、該原子は炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素および硫黄である）の鎖まで、様々でありうる。一般には、結合以外の場合には、移動度修飾部分は約0〜約40個、より通常は約0〜約30個のヘテロ原子を有し、これは、前記ヘテロ原子に加えて、ハロゲンまたは他のヘテロ原子を含みうる。水素以外の原子の総数は、一般には原子約200個より少なく、通常は原子約100個より少ない。酸基が存在する場合には、移動度修飾部分が存在する媒体のpHに応じて、種々のカチオンが該酸基に結合しうる。該酸は有機物または無機物であることが可能であり、例えばカルボキシル、チオノカルボキシル、チオカルボキシル、ヒドロキサム酸、ホスファート、ホスフィット、ホスホナート、ホスフィナート、スルホナート、スルフィナート、ホウ酸、硝酸、亜硝酸などでありうる。正電荷の場合には、置換基はアミノ（アンモニウムを含む）、ホスホニウム、スルホニウム、オキソニウムなどを含み、ここで、置換基は、一般には、約1〜6個の炭素原子の脂肪族であり、ヘテロ原子当たりの炭素原子の総数は通常は約12未満、通常は約9未満である。側鎖は、アミン、アンモニウム塩、ヒドロキシル基（フェノール基を含む）、カルボキシル基、エステル基、アミド、ホスファート、複素環を含む。Mは、ホモオリゴマー、または同じ若しくは異なる化学的特徴を有する異なる単量体を有するヘテロオリゴマー、例えばヌクレオチドおよびアミノ酸でありうる。
【００８８】
もう1つの態様においては、(M,D)部分はコンビナトリアルライブラリーの作製において使用される化学的骨格から構築される。例えば、以下の参考文献が、多様な移動度修飾部分の作製に有用な骨格化合物を記載している：ペプチド (PCT公開番号WO 91/19735, 1991年12月26日)、コード化ペプチド (PCT公開WO 93/20242, 1993年10月14日)、ランダムバイオオリゴマー (PCT公開WO 92/00091, 1992年1月9日)、ベンゾジアゼピン (米国特許第5,288,514号)、ダイバーソマー（diversomeres）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド (Hobbs DeWitt, S.ら, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 90: 6909-6913 (1993)、ビニローグ（vinylogous）ポリペプチド (Hagiharaら J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992))、β-D-グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模擬体 (Hirschmann, R.ら, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992))、小化合物ライブラリーの同様の有機合成 (Chen, C.ら J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994))、オリゴカルバマート(Cho, C. Y.ら Science 261:1303 (1993))、ペプチジルホスホナート (Campbell, D. A.ら, J. Org. Chem. 59:658 (1994)); Chengら, 米国特許第6,245,937号; Heizmannら, "Xanthines as a scaffold for molecular diversity, "Mol. Divers. 2:171-174 (1997); Paviaら, Bioorg. Med. Chem., 4:659-666 (1996); Ostreshら, 米国特許第5,856,107号; Gordon, E. M.ら, J. Med. Chem. 37:1385 (1994)など。好ましくは、この態様においては、Dは骨格上の置換基であり、Mは該骨格の残部である。
【００８９】
また、Mは、公知重合体サブユニット合成法により製造される重合体鎖を含みうる。選択された長さのポリエチレンオキシド含有鎖を形成させるための方法はよく知られている（例えば、Grossmanら, 米国特許第5,777,096号）。直接的な又は連結基を介した一定サイズの多サブユニット重合単位の互いのカップリングを含むこれらの方法は、多種多様な重合体、例えば、ポリエーテル（例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポリエステル（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリペプチド、オリゴ糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスホキシド、ポリホスホナートおよびそれらのブロック共重合体、例えば、荷電または非荷電連結基により連結された複数のサブユニットの単位から構成される重合体に適用可能であると理解されうる。ホモ重合体に加えて、本発明で使用する重合体鎖には、選択された長さの共重合体、例えば、ポリプロピレン単位と交互なポリエチレンオキシド単位の共重合体が含まれる。もう1つの例としては、選択された長さ及びアミノ酸組成（すなわち、天然に存在する又は人工的アミノ酸残基を含有する）のポリペプチドがホモ重合体または混合重合体として挙げられる。
【００９０】
もう1つの態様においては、分子タグEは、遊離後、式：
A-M-D
［式中、
Aは-C(=O)R（ここで、Rは、1〜8個の炭素原子とO、SおよびNよりなる群から選ばれる0〜4個のヘテロ原子とを有する脂肪族、芳香族、脂環式または複素環式基である）、-CH2-C(=O)-NH-CHO、-SO2H、-CH2-C(=O)O-CHO、-C(=O)NH-(CH2)nNH-C(=O)C(=O)-(C6H5)（ここで、nは2〜12の範囲内である）；
Dは検出基、好ましくは蛍光色素である；
Mは前記と同意義を有する；ただし、A-M-Dの総分子量は約100〜約2500ダルトンの範囲内である。］により定義される。
【００９１】
もう1つの態様においては、Dはフルオレセインであり、A-M-Dの総分子量は約100〜約1500ダルトンの範囲内である。もう1つの態様においては、Mは、分子の互いの連結を通常は直鎖状としてもたらす官能基を有する、より小さな分子から合成されうる。そのような官能基には、カルボン酸、アミンおよびヒドロキシまたはチオール基が含まれる。本発明においては、電荷付与部分は、コア鎖から突き出している1以上の側鎖基を有しうる。該側鎖基は、標識への又は該電荷付与部分の別の分子への連結をもたらす官能性を有する。使用する官能基の反応から生じる一般的な官能性は、結合させるべき分子間の共有結合の形成により示される。そのような官能性としては、ジスルフィド、アミド、チオアミド、ジチオール、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテル、カルボキシラートならびに硫黄およびリンを含有するエステルおよびアミド、例えばスルホナート、リン酸エステル、スルホンアミド、チオエステルなどが挙げられる。
【００９２】
結合性部分への分子タグの結合
抗体のような結合性化合物に分子タグを共有結合させるための詳細な指針が文献中に見出されうる（例えば、Hermanson, Bioconjugate Techniques, (Academic Press, New York, 1996)など）。本発明の1つの態様においては、1以上の分子タグを結合性化合物上の共通の反応性基に直接的または間接的に結合させる。共通の反応性基は、アミン、チオール、カルボキシラート、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトンなどを包含し、商業的に入手可能な架橋剤により分子タグに結合させることが可能である（例えば、Hermanson (前掲); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition (Molecular Probes, Eugene, OR, 2002)）。1つの実施形態においては、分子タグのNHS-エステルを結合性化合物上の遊離アミンと反応させる。
【００９３】
図2Aに示すもう1つの実施形態においては、結合性化合物はビオチン化抗体（200）を結合性部分として含む。分子タグをアビジンまたはストレプトアビジン架橋（206）により結合性部分（200）に結合させる。好ましくは、実施においては、まず、結合性部分（200）を標的複合体と反応させ、ついでアビジンまたはストレプトアビジンを加えて（204）、抗体-ビオチン-アビジン複合体（205）を形成させる。そのような複合体（205）に、ビオチン化分子タグ（210）を加えて（208）、結合性化合物（212）を形成させる。
【００９４】
図2Bに示す更にもう1つの実施形態においては、結合性化合物は、複数の官能基（218）を含有する多官能性部分（216）により誘導体化された抗体（214）を含み、その官能基に分子タグ前駆体を反応させて（220）、複数の分子タグ（222）が結合した最終的な結合性化合物を得る。典型的な多官能性部分には、アミノデキストランおよび同様の物質が含まれる。
【００９５】
結合性化合物のそれぞれを異なる分子タグにより別々に誘導体化したら、それを他の結合性化合物と共にプールして複数の結合性化合物を得る。通常、それぞれの異なる種類の結合性化合物が同じ比率で組成物中に存在するが、個々の実施形態またはアッセイに関する要望または要件に応じて、特定の結合性化合物の1つ又はサブセットがより大きな又はより小さな比率で存在するよう、比率は設計選択によって様々となりうる。そのような設計選択に影響を及ぼしうる要因には、特定の標的に対する抗体のアフィニティーおよびアビディティー、標的の相対的分布、分子タグの検出部分の蛍光特性などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
活性種を生成する切断誘導部分
切断誘導部分または切断剤は、好ましくは酸化により切断可能連結を切断しうる活性種を生成する部分である。好ましくは、活性種は、短寿命の活性を示す化学種であり、その切断誘導効果はその生成部位の近接範囲内でのみ生じる。活性種は本来短寿命であり、それは、その生成の近接範囲外では有意なバックグラウンドを生成しない。あるいは、活性種を有効に捕捉するスカベンジャーを使用して、その生成部位から短い距離を越えた範囲においては、それが切断可能連結との反応に用いられないようにする。例示的な活性種には、一重項酸素、過酸化水素、NADHおよびヒドロキシルラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキシドなどが含まれる。酸化を引き起こす活性種の例示的な失活剤には、ポリエン、カロテノイド、ビタミンE、ビタミンC、チロシン、ヒスチジンおよびグルタチオンのアミノ酸-ピロールN-コンジュゲートなどが含まれる（例えば、Beutnerら, Meth. Enzymol., 319:226-241 (2000)）。
【００９７】
切断誘導部分および切断可能連結に関する重要な考慮すべき点は、それらが標的タンパク質への結合の際に互いに離れ過ぎていないことであり、増感剤により生成する活性種が拡散し、それが切断可能連結と相互作用しうる前にその活性を失うほどそれらが離れていてはいけないのである。したがって、切断可能連結は、好ましくは、結合した切断誘導部分から1000nm以内、好ましくは20〜200nmに位置する。切断誘導部分のこの有効範囲は、本明細書中では、その「有効近接範囲」と称される。
【００９８】
活性種を生成させるものには、酵素、例えばオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、キサンテンオキシダーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼ、NADH-FMNオキシドレダクターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グリセリルリン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼおよびアルコールオキシダーゼ（これらは過酸化水素を生成する）、ヒドロキシルラジカルを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ、NADHまたはNADPHを生成する種々のデヒドロゲナーゼ、高い局所pHを与えるアンモニアを生成するウレアーゼが含まれる。
【００９９】
増感剤は、反応性中間体または種（通常は一重項酸素）を生成するよう誘導されうる化合物である。好ましくは、本発明で使用する増感剤は光増感剤である。本発明の範囲内に含まれる他の増感剤としては、熱、光、電離放射線または化学活性化による励起に際して一重項酸素の分子を遊離する化合物が挙げられる。このクラスの化合物のなかで最もよく知られているものには、エンドペルオキシド、例えば1,4-ビスカルボキシエチル-1,4-ナフタレンエンドペルオキシド、9,10-ジフェニルアントラセン-9,10-エンドペルオキシドおよび5,6,11,12-テトラフェニルナフタレン5,12-エンドペルオキシドが含まれる。加熱またはこれらの化合物による光の直接的吸収が一重項酸素を遊離させる。他の増感剤は以下の参考文献に開示されている：Di Mascioら, FEBS Lett., 355:287 (1994) (ペルオキシダーゼおよびオキシゲナーゼ); Kanofsky, J. Biol. Chem. 258:5991-5993 (1983) (ラクトペルオキシダーゼ); Pierlotら, Meth. Enzymol., 319:3-20 (2000) (エンドペルオキシダーゼの熱溶解)など。
【０１００】
切断誘導部分への結合性物質の結合は直接的または間接的な共有または非共有結合であることが可能であり、文献から一般に利用可能なよく知られた技術により達成されうる。例えば、"Immobilized Enzymes, "Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) ; Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970)を参照されたい。多種多様な官能基が利用可能であり、あるいは組込まれうる。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが含まれる。多種多様な化合物の連結方法はよく知られており、文献に詳細に示されている（前記を参照されたい）。結合性物質に対する連結基の長さは、連結する化合物の性質、特異的結合特性に対する距離の効果などに応じて多種多様でありうる。
【０１０１】
例えば、生成する活性種の数を増加させるために複数の連結誘導部分を結合性物質に結合させるのが望ましいかもしれない。これは、連結のための部位として複数の官能基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ、エチレン、アルデヒドなど）を有する多官能性物質（通常は高分子）を使用することにより達成されうる。あるいは、担体を使用することが可能である。担体は、粒子（ビーズを含む）、フィルム、膜、管、ウェル、細片、棒などのような多数の形状のいずれかを有しうる。光増感剤を含有させる担体の場合には、担体の表面は、好ましくは親水性であるか又は親水性にされることが可能であり、担体の本体は、好ましくは疎水性である。担体は、それを使用する媒体中に懸濁可能でありうる。限定的なものではない例示としての懸濁可能な担体の具体例としては、高分子物質、例えばラテックス、脂質二重層、油滴、細胞およびヒドロゲルが挙げられる。他の担体組成物には、ガラス、金属、重合体、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ(塩化ビニル)、ポリアクリルアミド、ポリアクリラート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4-メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリラート、ポリ(エチレンテレフタラート)、ナイロン、ポリ(ビニルブチラート)などが含まれ、これらは単独で又は他の物質と共に使用される。担体への結合性物質の結合は直接的または間接的な共有または非共有結合であることが可能であり、前記のとおり、文献から一般に利用可能なよく知られた技術により達成されうる。例えば、"Immobilized Enzymes, "Ichiro Chibata, 前掲を参照されたい。担体の表面は通常は多官能性であるか、あるいは多官能性にされうるか、あるいは共有結合性または特異的もしくは非特異的な非共有結合性相互作用により標的結合部分などに結合しうる。
【０１０２】
切断誘導部分は、担体の表面に共有結合もしくは非共有結合させることにより又は担体の本体内に組込むことにより、担体に結合させることが可能である。表面への連結は前記のとおりに達成されうる。切断誘導部分は、担体の製造の途中または後で担体の本体内に組込むことが可能である。一般に、切断誘導部分は、活性種の必要量を得るのに必要な量で担体に結合させる。一般に、切断誘導部分の量は実験的に決定される。
【０１０３】
切断誘導部分としての光増感剤
前記のとおり、本発明の好ましい切断誘導部分は、一重項酸素を生成する光増感剤である。本明細書中で用いる「光増感剤」は、光により活性化されると分子状酸素を一重項酸素に変換する光吸着性分子を意味する。光増感剤は、クラス特異的試薬の結合性物質に、共有または非共有結合により直接的または間接的に結合させることが可能である。そのような組成物の構築のための（特に、結合性物質としての抗体に関する）指針は、例えば光線力学治療、免疫診断などの分野の文献において入手可能である。以下に典型的な参考文献を挙げる：Ullmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,5426-5430 (1994); Strongら, Ann. New York Acad. Sci., 745:297-320 (1994); Yarmushら, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst., 10:197-252 (1993); Peaseら, 米国特許第5,709,994号; Ullmanら, 米国特許第5,340,716号; Ullmanら, 米国特許第6,251,581号; McCapra, 米国特許第5,516,636号など。
【０１０４】
同様に、本発明での使用に適した光増感剤の特性および選択に関する指針が文献中に見られる。以下に典型的な参考文献を挙げる：WassermanおよびR. W. Murray. Singlet Oxygen. (Academic Press, New York, 1979); Baumstark, Singlet Oxygen, Vol. 2 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1983); ならびにTurro, Modern Molecular Photochemistry (University Science Books, 1991)。
【０１０５】
光増感剤は、光での励起による一重項酸素の生成のための増感剤である。光増感剤は色素および芳香族化合物を包含し、通常は、共有結合した原子から構成され通常は共役二重または三重結合を含有する化合物である。該化合物は、典型的には、約200〜約1,100nm、通常は約300〜約1,000nm、好ましくは約450〜約950nmの波長範囲の光を吸収し、その吸収最大における吸光係数は、励起波長において、約500M-1cm-1以上、好ましくは約5,000M-1cm-1以上、より好ましくは約50,000M-1cm-1以上である。酸素の非存在下で光の吸収後に生じる励起状態の寿命は、通常、少なくとも約100ナノ秒、好ましくは少なくとも約1ミリ秒である。一般に、寿命は、本発明の試薬中の連結の切断を可能にするのに十分な程度に長くなければならない。そのような試薬は通常は、後記の濃度で存在する。光増感剤の励起状態は通常は、その基底状態とは異なるスピン量子数（S）を有し、基底状態が通常どおり一重項（S=0）である場合には、通常、三重項（S=1）である。好ましくは、光増感剤は、高い項間交差収率を有する。すなわち、光増感剤の光励起は通常、少なくとも約10％、望ましくは少なくとも約40％、好ましくは約80％以上の効率で、三重項状態を与える。
【０１０６】
選択する光増感剤は比較的に光安定性であり、好ましくは、一重項酸素と効率的には反応しない。ほとんどの有用な光増感剤には、いくつかの構造的特徴が存在する。ほとんどの光増感剤は、強固な（しばしば芳香族）構造内に保持された少なくとも1つ（しばしば3つ以上）の共役二重または三重結合を有する。それらは、しばしば、項間交差を促進する少なくとも1つの基、例えばカルボニルまたはイミン基、または周期表の第3〜6行から選ばれる重原子（特にヨウ素または臭素）を含有し、あるいはそれらは、拡張された芳香族構造を有しうる。
【０１０７】
光増感剤を光活性化して一重項酸素を生成させるためには、多種多様な光源が利用可能である。実用的な持続時間にわたって十分な一重項酸素を生成させるのに十分な程度に強力である限り、多色源および単色源の両方を使用することが可能である。照射の長さは、光増感剤の性質、切断可能連結の性質、照射源の効力およびサンプルからのその距離などに左右される。一般に、照射時間は約1ミリ秒以下〜約10分、通常、約1ミリ秒〜約60秒の範囲でありうる。照射の強度および長さは、光増感剤分子の少なくとも約0.1％、通常は光増感剤分子の少なくとも約30％、好ましくは光増感剤分子の実質的にすべてを励起するのに十分なものであるべきである。限定的なものではなく例示としての典型的な光源には、レーザー、例えばヘリウム-ネオンレーザー、アルゴンレーザー、YAGレーザー、He/Cdレーザーおよびルビーレーザー；フォトダイオード；水銀、ナトリウムおよびキセノン放電ランプ；白熱灯、例えばタングステンおよびタングステン／ハロゲン；フラッシュランプなどが含まれる。例えば、Bjornsonら, 国際特許公開WO 03/051669に開示されている光活性化装置を使用する。簡潔に説明すると、光活性化装置は、96ウェルプレート内のすべてのウェルの同時照射を可能にするハウジング内に設けられた発光ダイオード（LED）のアレイである。本発明で使用するための適当なLEDは高出力GaAIA IRエミッター、例えば、OPTO DIODE CORP. (Newbury Park, CA)により製造されたモデルOD-880Wである。
【０１０８】
本発明において使用しうる光増感剤の具体例は、前記特性を有するものであり、以下の参考文献に列挙されている：SinghおよびUllman, 米国特許第5,536,834号; Liら, 米国特許第5,763,602号; Martinら, Methods Enzymol., 186:635-645 (1990); Yarmushら, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst., 10:197-252 (1993); Peaseら, 米国特許第5,709,994号; Ullmanら, 米国特許第5,340,716号; Ullmanら, 米国特許第6,251,581号; McCapra, 米国特許第5,516,636号; Thetford, 欧州特許公開0484027; Sesslerら, SPIE, 1426:318-329 (1991); Magdaら, 米国特許第5,565,552号; Roelant, 米国特許第6,001,673号など。
【０１０９】
増感剤の場合と同様に、ある実施形態においては、光増感剤を、担体の表面に共有結合もしくは非共有結合させることにより又は担体の本体内に組込むことにより、固相担体に結合させることが可能である。一般に、光増感剤は、一重項酸素の必要量を得るのに必要な量で担体に結合させる。一般に、光増感剤の量は実験的に決定される。
【０１１０】
1つの実施形態においては、Peaseら, 米国特許第5,709,994号、Pollner, 米国特許第6,346,384号およびPeaseら, PCT公開WO 01/84157に開示されているとおり、光増感剤ビーズを形成させるために光増感剤をラテックス粒子内に組込む。あるいは、J. Amer. Chem. Soc., 97:3741 (1975)に記載されているとおり、光増感剤（例えば、ローズベンガル）を0.5ミクロンのラテックスビーズに該ラテックス上のクロロメチル基により共有結合させてエステル連結基を生成させることにより、光増感剤ビーズを製造することが可能である。そのような光増感剤ビーズの使用を図2Cに例示する。試薬（1122）をサンプルと一緒にした後、複合体（230）を生成させる。この反応は、例えば、真空の適用により試薬の除去を可能にするウェルの1つの壁（例えば、底）を構成するフィルター膜を有する通常の96ウェルまたは384ウェルマイクロタイタープレートなどにおいて行うことが可能である。これは、結合性化合物の特異的結合に必要なバッファーが、一重項酸素の生成または分離に必要なバッファーとは異なる場合に、バッファーの簡便な交換を可能にする。例えば、抗体に基づく結合性化合物の場合には、高塩バッファーが必要である。遊離タグの電気泳動分離を行う場合には、バッファーを、電気泳動に適した、より低い塩濃度を有するものと交換することにより、より良好な成果が得られる。この実施形態においては、光増感剤を抗体のような結合性化合物に直接的に結合させるのではなく、切断性プローブが以下の2つの成分を含む：ビオチン（図2Cにおいては「bio」と示されている）のような捕捉部分により誘導体化された抗体（232）、および該捕捉部分に特異的に結合する物質（234）（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）により誘導体化された表面を有する光増感剤ビーズ（338）。ついで複合体（230）を、ビオチンのような捕捉部分を用いて光増感剤ビーズにより捕捉（236）させる。簡便には、光増感剤ビーズ（338）が通過し得ないようにフィルター膜の孔径を選択した場合には、バッファー交換は、結合していない結合性化合物を除去するようにも働き、これはシグナルの改善につながる。必要に応じて、分離のための適当なバッファーを加えた後、光増感剤ビーズ（338）に照射（240）して、一重項酸素を生成させ（242）、分子タグを遊離させる（244）。ついでそのような遊離分子タグ（346）を分離して分離プロファイル（352）を得、ピーク（348）および（350）から比率的（ratiometrically）に二量体を定量する。光増感剤ビーズは、均一系または不均一系アッセイ方式において使用することが可能である。
【０１１１】
好ましくは、固定サンプル内の抗原または細胞表面受容体のようなアナライトを検出する場合には、切断性プローブは、一次ハプテン化抗体と、複数の光増感剤分子で誘導体化された二次抗ハプテン結合性タンパク質とを含みうる。好ましい一次ハプテン化抗体はビオチン化抗体であり、好ましい二次抗ハプテン結合性タンパク質は抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンでありうる。そのような一次および二次試薬の他の組合せは当技術分野でよく知られている（例えば、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents, Ninth Edition (Molecular Probes, Eugene, OR, 2002)）。そのような試薬の典型的な組合せを図2Eに示す。この場合、ビオチン（369）で誘導体化された一次抗体（368）および遊離可能なタグ（この図においては「mT1」および「mT2」）を有する結合性化合物（366および368）が、膜（360）内の受容体二量体（362）の異なるエピトープに特異的に結合する。ビオチン特異的結合性タンパク質（370）、例えばストレプトアビジンをビオチン（369）に結合させて、複数の光増感剤（372）を結合性化合物（366および368）の有効近接範囲内に来させる。ビオチン特異的結合性タンパク質（370）は抗ビオチン抗体であることも可能であり、通常のカップリング化学法（例えば、Hermanson（前掲））により光増感剤を遊離アミノ基を介して該タンパク質上に結合させることが可能である。そのような用途のための典型的な光増感剤は、Shimadzuら, 欧州特許公開0510688に開示されているとおりに製造されるメチレンブルーのNHSエステルである。
【０１１２】
検出可能な複合体を形成する典型的なタンパク質
本発明のアッセイは、結合性化合物の特異的結合を可能にする実質的に任意の分子複合体の濃度または量を検出または測定するための用いることが可能である。特に関心が持たれるのは、細胞表面受容体および細胞内シグナリングタンパク質を含む、哺乳類シグナル伝達に関連したタンパク質複合体である。そのようなタンパク質には、以下の表Iのタンパク質が含まれるが、それらに限定されるものではない。好ましくは、以下のタンパク質およびタンパク質ファミリーのヒト形態が意図される。
【表１】
2007502417.tif 000003
【０１１３】
2007502417.tif 000004
【０１１４】
アッセイ条件
方法および具体的な条件および材料の以下の一般的な考察は例示的なものであり、限定的なものではない。当業者は、特に異なるサンプル、細胞型および標的複合体を使用して本明細書に記載の方法を他の用途に如何に応用しうるかを理解するであろう。
【０１１５】
本発明の方法の実施においては、試験するサンプル、結合性化合物および場合によっては切断性プローブを含むアッセイ成分を一緒にする。一般には、アッセイ成分を任意の順序で一緒にすることが可能である。しかし、ある用途においては、添加の順序が重要かもしれない。例えば、定量的アッセイなどの場合に、競合的結合をモニターしたいかもしれない。あるいは、集合した複合体の安定性をモニターしたいかもしれない。そのような用途においては、数工程の反応を組立てる。それらの反応は、完全な混合物を調製する前または切断反応が開始する前に、インキュベーションを要するかもしれない。
【０１１６】
各試薬の量は通常は実験的に決定される。アッセイにおいて使用するサンプルの量は、標的複合体の推定数、ならびにアッセイのシグナルをモニターするために用いる分離および検出の手段によって決まるであろう。一般に、結合性化合物および切断性プローブの量は、サンプル内の標的分子の予想量に対してモル過剰で、一般には少なくとも1.5倍のモル過剰率で、より望ましくは約10倍以上のモル過剰率で与えられる。特定の用途においては、用いる濃度は、結合性物質のアフィニティーおよび単一の細胞上に存在する標的分子の予想数に応じて、より高く又はより低くなりうる。オリゴマー性細胞表面複合体の形成に対する化合物の効果を判定する場合には、モニターする効果に応じて、プローブの添加の前、それと同時またはその後で、該化合物を該細胞に加えることが可能である。
【０１１７】
アッセイ混合物を一緒にし、細胞表面分子へのプローブの結合をもたらす条件下、通常は水性媒体中、一般には、約10〜200mMの範囲の濃度のバッファーにより維持される生理的pH（細胞を培養する場合のpHと比較しうるもの）でインキュベートする。通常のバッファー、および必要に応じて他の通常の添加剤、例えば塩、増殖培地、安定剤などを使用することが可能である。通常は、生理的な一定の温度を用いる。インキュベーション温度は、通常、約4〜70℃、通常は約15〜45℃、より通常は25〜37℃の範囲である。
【０１１８】
アッセイ混合物を調製しインキュベートしてプローブを細胞表面分子に結合させた後、該混合物を処理して切断剤を活性化して、切断剤の有効近接範囲内の結合性化合物からタグを切断し、対応タグを細胞表面から溶液内に遊離させる。この処理の性質は切断剤の作用メカニズムに作用されるであろう。例えば、切断剤として光増感剤を使用する場合には、切断の活性化は、使用する個々の増感剤に適した光の波長での混合物への照射を含むであろう。
【０１１９】
切断後、ついでサンプルを分析して、遊離したタグの同一性を確認する。複数の結合性化合物を使用するアッセイを用いる場合には、一般には、遊離したタグの分離がそれらの検出に先行する。アッセイ用のタグの設計の過程で、分離および検出の両方のための方法が決定される。好ましい分離方法は電気泳動を用いるものであり、この場合、種々のタグが、それらの電気泳動移動度における既知の相違に基づいて分離される。
【０１２０】
前記のとおり、いくつかの実施形態においては、アッセイ反応条件が、用いる分離技術を妨げる場合には、分子タグの切断および分離の前にアッセイ反応バッファーを除去または交換することが必要かもしれない。例えば、アッセイ条件は、電気泳動移動度に基づいて分子タグが分離される場合に分離性能を損なう塩濃度（例えば、特異的結合に要求されるもの）を含みうる。したがって、例えば分子タグの切断の前にそのような高塩バッファーを除去し、濾過、吸引、希釈または他の手段により、電気泳動分離に適した別のバッファーと交換することが可能である。
【０１２１】
遊離分子タグの分離
前記のとおり、1以上の物理的、化学的および／または光学的特性（本明細書中では「分離特性」と称される）に基づいて分子タグを識別しうる分離技術による分離に適するよう、分子タグを設計する。同様に前記のとおり、本発明の種々の実施形態で用いうる分離技術は順相または逆相HPLC、イオン交換HPLC、毛管電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーなどを含む。好ましくは、選択する分離技術は、分子タグ（および従って、対応アナライト）の存在または非存在に関する定量的情報および定性的情報を提供しうる。1つの態様においては、液相分離技術を用いて、分子タグの混合物を含有する溶液、例えばバッファー溶液、反応溶媒などを加工して個々の種類の分子タグの分離が生じるようにする。通常、そのような分離は分子タグの移動（そのような出発混合物から、ある経路に沿って、区別可能なピークまたはバンドが、それぞれの分子タグの濃度が増加した領域に対応するものを形成するまでの移動）の相違により達成される。そのような経路は流体流動、電界、磁場などにより決まりうる。個々の分離技術の選択は、該技術の経費および簡便さ、分子タグの化学的性質を考慮した上での該技術の分解能、分離すべき分子タグの数、用いる検出方法のタイプなどを含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、分子タグを電気泳動により分離して、分離された分子タグが特有のピークにより表される電気泳動図を得る。
【０１２２】
A．電気泳動分離
電気泳動のための方法はよく知られており、個々の多数の分子タグの形成および分離のための設計選択を当業者が行うための指針は豊富に存在する。以下は電気泳動に関する典型的参考文献である：Krylovら, Anal. Chem., 72:111R-128R (2000); P. D. GrossmanおよびJ. C. Colburn, Capillary Electrophoresis: Theory and Practice, Academic Press, Inc., NY (1992); 米国特許第5,374,527号、第5,624,800号、第5,552,028号; ABI PRISM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, January 1995, Chapter 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA)など。1つの態様においては、分子タグを毛管電気泳動により分離する。当業者の認識範囲内の設計選択は、いくつかの商業的に入手可能なモデルからの装置の選択、分離媒体のタイプおよび濃度、pH、所望の分離時間、温度、電圧、毛管のタイプおよび寸法、検出方法、分離すべき分子タグの数などを含む実施条件の選択を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
本発明の1つの態様においては、電気泳動分離の途中または後で、分離化合物の蛍光シグナルおよび泳動時間（または泳動距離）を記録することにより又は分子タグの相対蛍光および泳動順序のチャート（例えば、電気泳動図として）を作成することにより、分子タグを検出または同定する。そのような検出を行うためには、標準的な手段、例えば高輝度水銀ランプ、レーザーなどにより分子タグに照射することが可能である。典型的には、He-Neガスレーザーまたは固体ダイオードレーザーにより生成されたレーザー光により分子タグに照射する。ついで蛍光シグナルを感光検出器、例えば光電子増倍管、荷電結合素子などにより検出することが可能である。典型的な電気泳動検出系は随所に記載されており、例えば米国特許第5,543,026号、第5,274,240号、第4,879,012号、第5,091,652号、第6,142,162号などに記載されている。もう1つの実施形態においては、分子タグを、例えば米国特許第6,045,676号に記載されているとおりに、電気化学的検出により検出することが可能である。
【０１２４】
電気泳動分離は、移動度における相違に基づく、電界内での分子の泳動および分離を含む。限定的ではない例示としての種々の形態の電気泳動分離は、フリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動、毛管電気クロマトグラフィーおよびミセル動電クロマトグラフィーを包含する。毛管電気泳動は、約1〜約200マイクロメーター、通常は約10〜約100マイクロメーターの横断面寸法の管またはチャンネル内で行う電気分離（electroseparation）、好ましくは動電流（電気泳動流、誘電泳動流および／または電気浸透流を含む）によるものを含む。毛管は、ケイ素、石英、ガラスまたはプラスチックから構成されるウェハーまたはフィルム内の長い独立した毛管またはチャンネルでありうる。
【０１２５】
毛管電気分離（electroseparation）においては、分子タグを含有する反応混合物のアリコートを、増幅および他の反応を行う毛管装置の一部でありうる又はそれに連結されうる電気分離チャンネル内に該アリコートを導入することにより電気分離に付す。ついで、該混合物内の成分の泳動を引き起こすために、チャンネル内に含有された導電性媒体に電位を加える。一般には、加えた電位は、当技術分野でよく知られた常法に従い所望の成分の電気分離を達成するのに十分なものである。当業者であれば、本発明で使用する与えられた試薬の組合せおよび／または切断性プローブの性質、反応媒体の性質に適した電位を決定しうるであろう。電気分離のためのパラメーター（媒体および電位に関するものを含む）は通常、所望の成分の最大分離が達成されるように最適化される。これは実験的に達成され、当業者の認識範囲内に十分に含まれる。検出は、米国特許第5,560,811号（第11欄19〜30行）、第4,675,300号、第4,274,240号および第5,324,401号（それらの関連開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に示されている方法を含む、毛管電気泳動カラムの分析に関連した公知方法のいずれかによるものでありうる。電気泳動分野の当業者は、広範な電位または電界強度を用いうると認識するであろう。例えば、10〜1000V/cmの電界が用いられ、約200〜約600V/cmがより典型的である。市販の系に対する電圧の上限は、約40〜約60cmの毛管長で約30kVであり、最大電界は約600V/cmとなる。DNAに対しては、典型的には、電気浸透流を減少させるために毛管をコーティングし、毛管の注入末端を負電位に維持する。
【０１２６】
検出が容易となるよう、約180〜約1500nm、通常は約220〜約800nm、より通常は約450〜約700nmの範囲の波長の光が低透過損失を有することを一般に可能にする光学的に透明なプラスチック材から、装置全体を組立てることが可能である。適当な材料には、融解石英、プラスチック、石英、ガラスなどが含まれる。
【０１２７】
本発明の1つの態様においては、図6A〜6Cに図式的に例示するマイクロフルイディクス装置内の電気泳動により分子タグを分離する。マイクロフルイディクス装置は、多数の米国内および外国の特許証および公開特許出願に記載されている。例えば、米国特許第5,750,015号、第5,900,130号、第6,007,690号、ならびにWO 98/45693、WO 99/19717およびWO 99/15876を参照されたい。簡便には、アリコート、一般には約5μl以下を、直接的に統合系内への電気泳動式または空気式注入により、あるいはシリンジ、毛管などにより、マイクロフルイディクス装置のサンプル貯蔵容器に移す。分離を行う条件は通常のものであり、産物の性質によって様々となろう。
【０１２８】
例えば、図6A〜6Cは、前記アッセイにおいて生じたタグおよびプローブのサンプルのサンプルローディングおよび電気泳動分離のための、前記出願に詳細に記載されているタイプのマイクロフルイディクス装置内のマイクロチャンネルネットワーク100を示す。簡潔に説明すると、該ネットワークは、上流および下流貯蔵容器（それぞれ104および106）で終結する主分離チャンネル102を含む。該主チャンネルは、貯蔵容器110で終結する副チャンネル108、および貯蔵容器114で終結する副チャンネル112と、オフセット軸位で交差している。2つの副チャンネル間のオフセットは該主チャンネル内のサンプルローディングゾーン116を構成する。
【０１２９】
実施においては、図6Aに例示するとおり、アッセイ混合物をサンプル貯蔵容器110内に配置する。前記のとおり、アッセイ混合物は、表面結合切断剤、1以上のタンパク質プローブおよび場合によっては分子タグ標準と共に、1以上の標的細胞を含有する。標的細胞への初期プローブの結合およびそれに続くプローブ結合細胞におけるプローブリンカーの切断を含むアッセイ反応をサンプル貯蔵容器110内で行うことが可能であり、あるいはアッセイ反応を別の反応容器内で行い、反応したサンプル成分をサンプル貯蔵容器内に加えることが可能である。
【０１３０】
遊離した分子タグをサンプルローディングゾーンにローディングするために、図6Bに示す方向で貯蔵容器110、114に電界をかける。この場合、負に荷電した遊離分子タグは貯蔵容器110からローディングゾーン116に導かれ、一方、無荷電または正に荷電したサンプル成分は該サンプル貯蔵容器内に残る。ローディングゾーン内の遊離タグは今や、図6Cに示す方向で貯蔵容器104、106に電界をかけることにより、通常の毛管電気泳動により分離されうる。
【０１３１】
得られた電気泳動パターンから、分子タグおよび対応アナライトを同定することが可能である。これは典型的には以下のとおりに行う。すなわち、分離チャンネルの下流末端付近に蛍光検出器を配置し、分離した分子タグの電気泳動図を作成して、まず、前記のとおりに分離特性（この場合には電気泳動移動度）を測定し、つぎに、各プローブに結合したタグの相対量の尺度としてシグナル強度（例えば、ピーク高さ又はピーク面積）を測定する。検出可能なプローブのレベルを検出および定量するための方法はよく知られている。1つの好ましい方法においては、分子タグを蛍光標識する。標準的な蛍光発光源を分離媒体の下流部分の検出ゾーンに対して向け、該ゾーンの蛍光発光を標準的な光検出器により測定する。記録されたシグナルの高さ又は面積はサンプル内の産物および基質の濃度の尺度となる。前記検出情報により、検出された各分子タグをプローブセット内の特定のプローブに帰属させ、各検出可能プローブの相対レベルをその相対基質変換またはリガンド結合の尺度として比較することが今や可能である。
【０１３２】
B．クロマトグラフィー分離
本発明の1つの態様においては、限定的なものではないが分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、極性などを含む1以上の物理的特性に基づくクロマトグラフィーによる分離のための複数の分子タグを設計する。クロマトグラフィー分離技術を、カラムのタイプ、固相、液相などのようなパラメーターに基づいて選択し、ついで、分離されて1回の操作で特有のピークまたはバンドを形成しうる複数の分子タグを選択する。本発明で用いるためのどのようなHPLC技術を選択するかは、検出すべき分子タグの数（すなわち、「複数」のサイズ）、アッセイで生成する各分子タグの推定量、マルチプレックス化アッセイにおいて使用すべきセット（組合せ）の候補となる分子タグの合成の可能性および容易さ、用いる検出方式ならびにHPLC装置、カラムおよび溶媒の実施の可能性、頑強さ（robustness）、経費および容易さを含む幾つかの要因により決定される。一般に、限られた量のサンプルを分析するのに適しており最高分離能の分離をもたらすカラムおよび技術が好ましい。そのような選択を行うための指針は文献、例えばSnyderら, Practical HPLC Method Development, (John Wiley & Sons, New York, 1988); Millner, "High Resolution Chromatography: A Practical Approach", Oxford University Press, New York (1999), Chi-San Wu, "Column Handbook for Size Exclusion Chromatography", Academic Press, San Diego (1999)およびOliver,"HPLC of Macromolecules : A Practical Approach, Oxford University Press", Oxford, England (1989)に見出されうる。特に、カラムタイプ、固相、などのような条件が与えられた場合のクロマトグラフィー分離の系統的開発および最適化のための方法が利用可能である（例えば、Haberら, J. Chromatogr. Sci., 38:386-392 (2000); Outinenら, Eur. J. Pharm. Sci., 6:197-205 (1998); Lewisら, J. Chromatogr., 592:183-195および197-208 (1992)など）。
【０１３３】
1つの態様においては、分子タグ候補の初期選択は、選択したカラムおよび固定相により典型的には分離される分子の物理化学的特性に左右される。ついで、前記参考文献に記載されている通常の最適化方法に従うことにより、また、個々の実施形態の分離目標に、より適した候補分子タグで置換することにより、該初期選択を実験的に改良する。1つの態様においては、本発明の分離目標は、（i）60分未満、より好ましくは40分未満、さらに好ましくは10〜40分の範囲の分離時間で、複数の分子タグを、識別可能なピークまたはバンドに分離すること、（ii）任意のペアが少なくとも1.0、より好ましくは少なくとも1.25、さらに好ましくは少なくとも1.50の分離能を有するようなピークまたはバンドの形成、（iii）分離中の150 bar未満のカラム圧、（iv）25〜90℃の範囲、好ましくは35〜80℃の範囲の分離温度、および（v）複数の識別可能なピークが5〜30の範囲であり、それらのピークのすべてが同一クロマトグラム中にあることを含む。本明細書中で用いる、2つのピークまたはバンドに関する「分離能」は、それらの2つのピークまたはバンドの中心間の距離をピークの平均底幅で割り算したものである（例えば、Snyderら（前掲））。クロマトグラフィー法は、分子タグをそれらのクロマトグラフィー特性に基づいて分離するために用いる。クロマトグラフィー特性は、例えば、特定のクロマトグラフィー媒体から分子タグを溶出する特定の条件または定められた条件下の特定のクロマトグラフィー媒体上の分子タグの保持時間でありうる。また、分子タグのクロマトグラフィー特性は、定められた条件下で特定のクロマトグラフィー媒体を使用してクロマトグラフィーにより分離されている分子タグの群または組合せに含まれる分子タグの溶出の順序または溶出のパターンでありうる。分子タグのクロマトグラフィー特性は、分子タグの物理的特性ならびにクロマトグラフィー媒体および移動相とのその相互作用によって決まる。クロマトグラフィーのための定められた（defined）条件は、個々の移動相溶液、カラムの形状（カラムの直径および長さを含む）、pH、流速、圧力およびカラム操作の温度、ならびに分子タグの所望の分離を得るために変動しうる他のパラメーターを包含する。分子タグ、または分子タグのクロマトグラフィー特性は、種々のクロマトグラフィー方法を用いて検出することが可能である。
【０１３４】
単一の実験で検出される分子タグの組合せは、一般には、質量、電荷、質量-電荷比、検出可能なタグ、例えば異なる発蛍光団もしくは同位体標識または他の特有の特性により異なる化学的に関連した分子の群である。したがって、サンプル内の分子タグを分離するための適当なクロマトグラフィー媒体を選択する際には、分子タグの化学的性質と分子タグ群内の分子タグ間の個々の相違との両方が考慮されうる。
【０１３５】
液体クロマトグラフィーによる分子タグの分離は、分子タグの電荷、サイズおよび疎水性のような分子タグの物理的特性、またはアフィニティーマトリックス上の色素、レクチン、薬物、ペプチドおよび他のリガンドのような分子への分子タグの結合能のような機能的特性に基づくものでありうる。分子タグの電荷、サイズ、疎水性および他のクロマトグラフィー特性に基づく分子タグの分離には、多種多様なクロマトグラフィー媒体が適している。個々のクロマトグラフィー媒体の選択は、使用する分子タグの特性に左右されるであろう。
【０１３６】
分離された分子タグは、吸光度、蛍光または電気化学的特性のような分子タグの固有特性の検出および分子タグに結合した検出基または部分の検出を含む種々の分析方法を用いて検出することが可能である。必ずしも必要というわけではないが、クロマトグラフィー分離後の検出を促進するために種々の検出基または部分を分子タグに結合させることが可能である。
【０１３７】
液体クロマトグラフィーと共に用いる検出方法はよく知られており、商業的に入手可能であり、自動化およびハイスループットサンプリングに応用されうる。分子タグの分析のために選択する検出方法は、検出可能な基または部分を分子タグが含有するかどうか、使用する検出可能な基のタイプ、ならびに分子タグおよび検出可能な基（それを使用する場合）の物理化学的特性に左右されるであろう。種々のタイプの分子タグを検出するために、蛍光、電解質伝導度、屈折率および蒸発（evaporative）光散乱に基づく検出方法を用いることが可能である。
【０１３８】
液体クロマトグラフィーにより分離された分子タグを検出するために、種々の光学的検出器を使用することが可能である。紫外線（UV）／可視分光検出器を使用して核酸、ポリペプチド、ペプチドならびに他の巨大分子および小分子を検出するための方法はよく知られており、これにより、UV／可視検出は、HPLC分析のための最も広く用いられる検出方法となっている。透明な極性液体である移動相と共に使用した場合の巨大分子および小分子を検出するためには、赤外分光光度計を使用することも可能である。
【０１３９】
波長可変検出器およびダイオードアレイ検出器は、商業的に入手可能な2つのタイプのUV／可視分光光度計を代表するものである。いくつかの波長可変UV検出器の有用な特徴は、ピークがフローセルを通過する一方で種々の波長で分光走査および正確な吸光度測定を行いうることである。ダイオードアレイ技術は、2以上の波長での吸光度測定を可能にしてそのような吸光度測定値の比を計算することを可能にするという更なる利点をもたらす。複数の波長においてそのような吸光度の比を得ることは、ピークが1つの分子タグに相当するのか2以上の分子タグに相当するのかを判定する際に特に有用である。
【０１４０】
蛍光分子タグ（例えば、蛍光検出基を含有するもの及び本質的に蛍光性であるもの）を検出するために、蛍光検出を用いることも可能である。典型的には、蛍光感度は相対的に高く、分子タグが発蛍光団を含有する場合には他の分光検出方法に対する利点がもたらされる。分子タグは、検出可能な本質的蛍光を有しうるが、分子タグが、適当な蛍光検出基を含有する場合には、サンプル内の単一の分子タグを検出することが可能でありうる。
【０１４１】
HPLCにより分離された分子タグを検出するためには、電気化学的検出方法も有用である。電気化学的検出は、適当な電極における分子タグの酸化または還元反応から生じた電流の測定に基づく。電流のレベルは分子タグの濃度に正比例するため、所望により、電気化学的検出を定量的に用いることが可能である。
【０１４２】
蒸発（evaporative）光散乱検出は、粒子が光の多色ビームの経路を横切る際に粒子が光子散乱を引き起こしうることに基づく。まず、HPLCからの液体流出液を噴霧化し、分子タグを含有する生じたエアゾールミストを光ビームに向けて貫通させる。発色団、発蛍光団または電気活性基のような検出可能な基の存在または非存在には無関係な、サンプル内に存在する分子タグの量に比例したシグナルが得られる。したがって、分子タグ上の検出基または部分の存在は蒸発光散乱検出には要求されない。
【０１４３】
HPLCにより分離された分子タグを検出するためには、質量分析法を用いることも可能である。質量分析は、小さな質量差を有するイオンを分離し、高い精度および感度でイオンの質量を測定しうる。質量分析法は当技術分野でよく知られている（Burlingameら, Anal. Chem. 70:647R-716R (1998); KinterおよびSherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, New York (2000)を参照されたい）。
【０１４４】
任意の検出方法を用いて得られたデータの分析、例えばスペクトル解析および定量分析は手動によるもの又はコンピューターを用いるものであることが可能であり、自動化方法を用いて行うことが可能である。ピーク積分、ピーク面積、高さ及び保持時間を求めるためには、種々のコンピュータープログラムを使用することが可能である。そのようなコンピュータープログラムは、定性的または定量的に分子タグの存在を判定するために簡便に使用されうる。HPLCおよび対応検出器と共に使用するコンピュータープログラムは当業者によく知られており、商業的に入手可能なHPLCおよび検出系と共に提供される。
【０１４５】
種々の商業的に入手可能な系が分子タグのハイスループット分析に好適である。当業者は、分子タグのHPLC分析の自動化に有用な自動サンプル調製系および自動注入系のような適当な装置を決定することが可能である。自動化法は、例えば多数のサンプルを処理する場合の分子タグのハイスループット分析、または標的アナライトを検出するための本発明の方法のマルチプレックス化用途に使用することが可能である。本発明での使用に適した典型的なHPLC装置系はAgilent 1100 Series HPLC系 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)である。
【０１４６】
当業者は、特にハイスループット形態で分析を行う場合に分子タグの信頼しうる分析を得るための品質管理手段を認識するであろう。そのような品質管理手段は、外部および内部参照標準の使用、クロマトグラフピークの形状の分析、装置の性能の評価、実験方法の妥当性評価、例えば直線性の範囲、サンプルの回収、サンプルの溶解安定性および測定の精度の測定によるものを含む。
【０１４７】
C．質量分析による分析
質量分析法は当技術分野でよく知られている（Burlingameら, Anal. Chem. 70: 647R-716R (1998); KinterおよびSherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, New York (2000)）。質量分析法に関連した基本的方法はサンプル由来の気相イオンの生成およびそれらの質量の測定である。
【０１４８】
気相イオンの運動は、質量分析計内で生成した電磁界を使用して厳密に制御することが可能である。これらの電磁界内のイオンの運動はイオンのm/zに比例し、これはm/zの測定、したがってサンプルの質量の測定の基礎を形成する。これらの電磁界内のイオンの運動は、イオンが閉じ込められ集中することを可能にし、このことが質量分析の高い感度をもたらす。m/zの測定の経過中、イオンは、これらのイオンの到着を記録する粒子検出器へと高い効率で運ばれる。各m/zにおけるイオンの量はグラフ上にピークにより示され、この場合、x軸はm/zであり、y軸は相対存在量である。質量分析計は、それによって異なる分離能レベル（すなわち、質量が接近しているイオン間のピークを分離する能力）を有する。分離能はR=m/Δmとして定義され、ここで、mはイオン質量であり、Δmは質量スペクトルにおける2つのピーク間の質量における差である。例えば、1000の分離能を有する質量分析計は、100.0のm/zを有するイオンを、100.1のm/zを有するイオンから分離しうる。
【０１４９】
いくつかのタイプの質量分析計が入手可能であり、あるいは種々の形態で製造されうる。一般に、質量分析計は以下の主要成分を有する：サンプル入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系および装置制御系およびデータ系。サンプル入口、イオン源および質量分析器における相違が、一般には、装置のタイプおよびその能力を決定する。例えば、入口は毛管カラム液体クロマトグラフィー源であることが可能であり、あるいは直接的なプローブまたは段階（例えば、マトリックス介助レーザーデソープションにおいて使用されるもの）でありうる。一般的なイオン源は、例えばエレクトロスプレー、例えばナノスプレーおよびマイクロスプレーまたはマトリックス介助レーザーデソープションである。典型的な質量分析器（mass analyzer）には、四重極マスフィルター、イオントラップ質量分析器および飛行時間型質量分析器が含まれる。
【０１５０】
イオン生成過程は質量スペクトル分析の出発点である。いくつかのイオン化方法が利用可能であり、イオン化方法の選択は、分析すべきサンプルに左右される。例えば、ポリペプチドの分析の場合には、相対的に穏やかなイオン化方法、例えばエレクトロスプレーイオン化（ESI）が望ましいかもしれない。ESIの場合には、質量分析計に向かう高荷電液滴の微細スプレーを与える強力な電界を生成する高い電位で、サンプルを含有する溶液を細い針に通過させる。他のイオン化方法には、例えば高速原子衝撃（FAB）が含まれる。固体サンプルに衝突させてデソープションおよびイオン化を引き起こすために、中性原子の高エネルギービームを用いる。マトリックス介助レーザーデソープションイオン化（MALDI）は、UV吸収性化合物マトリックス内で結晶化しているサンプルに衝突させるためにレーザーパルスを使用する方法である。当技術分野で公知の他のイオン化方法には、例えばプラズマおよびグロー放電、プラズマデソープションイオン化、共鳴イオン化および二次イオン化が含まれる。結合性化合物からの切断の前、途中または後に、タグレポーターがイオン化されうる。
【０１５１】
エレクトロスプレーイオン化（ESI）は、本明細書に記載されている本発明に有用な幾つかの特性を有する。例えば、ESIは、イオン化または気化させるのが困難であるポリペプチドのような生物学的分子に用いることが可能である。また、ESIの効率は非常に高くなりうる。このことは高感度測定の基礎となる。さらに、ESIは溶液から荷電分子を生成し、このことは溶液中のタグレポーターの分析に便利である。これとは対照的に、MALDIのようなイオン化方法はイオン化の前にサンプルの結晶化を要する。
【０１５２】
ESIは溶液から直接的に荷電分子を生成しうるため、液体クロマトグラフィー系からのサンプルに適合する。例えば、画分がクロマトグラフィーカラムから質量分析計内に流動するよう、質量分析計はHPLCのような液体クロマトグラフィー用の入口を有しうる。液体クロマトグラフィー系と質量分析計とのこの直列的配置はLC-MSと称されることもある。LC-MS系は、例えば、質量分析の前に、切断されていない又は部分的に切断されたタグレポーターを、切断されたタグレポーターから分離するために用いることが可能である。また、質量分析の前にタグレポーターサンプルから塩または他のバッファー成分を除去するために、クロマトグラフィーを用いることが可能である。例えば、インラインまたはオフラインで逆相HPLCカラムを使用するサンプルの脱塩を用いて、イオン化過程の効率を増加させて、質量分析による検出の感度を改善することが可能である。
【０１５３】
種々のイオン源と組合せられうる種々の質量分析器が入手可能である。質量分析器は、当業者に公知であり本明細書に記載されている、質量分析器によって異なる利点を有する。検出のために選択する質量分析計および方法は個々のアッセイに左右され、例えば、検出のための少量のイオンが生成する場合には、より高感度の質量分析器を使用することが可能である。いくつかのタイプの質量分析器および質量分析方法を以下に記載する。
【０１５４】
四重極質量分析は四重極マスフィルターまたは分析器を使用するものである。このタイプの質量分析器は、2組の電気的に接続された2本の棒として配置された4本の棒から構成される。rfおよびdc電圧の組合せを各対の棒に加えると、マスフィルターの起点から終点にイオンが移動するにつれてイオンの振動運動を引き起こす電界が生じる。これらの電界により、1対の棒においては高域マスフィルターが、もう1対の棒においては低域フィルターが生成する。高域フィルターと低域フィルターとの重複は、両方のフィルターを通過し四重極の長さを横断しうる一定のm/zを残す。このm/zが選択され四重極マスフィルターにおいて安定なままであり、一方、すべての他のm/zは不安定な軌道を有しマスフィルター内には残らない。マスフィルターを通過し検出器に到達する次第に増加するm/zが選択されるよう、加えた電界を傾斜化（ramp）することにより、質量スペクトルが得られる。また、rfのみの電界を加えることにより全m/zのイオンを含有し通過させるよう四重極を組み立てることも可能である。これは、マスフィルタリング無しのイオン通過が必要である質量分析計の領域においてレンズまたは集束系として四重極が機能することを可能にする。これは、後記で更に詳しく説明するタンデム質量分析において有用であろう。
【０１５５】
四重極質量分析器、および本明細書に記載の他の質量分析器は、一定のm/zまたは質量範囲を分析するように調整（プログラム）されうる。質量分析計のこの特性は、本明細書に記載の本発明に有用である。切断されたタグレポーターの質量範囲はアッセイから既知であるため、推定される正しい質量範囲のイオンを通過させる一方で、より高い又はより低い質量範囲のイオンを除外するよう、質量分析計を調整することが可能である。質量範囲を選択する能力はアッセイにおけるバックグラウンドノイズを減少させて、SN比を増加させうる。また、いずれかの切断されていない又は部分的に切断された結合性化合物の分析を除外するために、一定の質量範囲を用いることが可能であり、それは、完全に切断された結合性化合物（タグレポーター）の質量より高い質量のものであろう。したがって、質量分析計は、タグレポーターの検出および同定だけでなく、本質的な分離工程をも達成しうる。
【０１５６】
イオントラップ質量分析はイオントラップ質量分析器を使用するものである。これらの質量分析器においては、全m/zのイオンが最初にトラップ（捕捉）され質量分析器内で振動するよう、電界を加える。イオンはイオン源から集束装置（例えば、八重極レンズ系）を介してイオントラップに進入する。イオントラッピング（イオン捕捉）は、励起および電極から検出器への射出の前に、トラッピング領域内で生じる。次第に増加するm/zのイオンをトラップから検出器内に射出する様態で、振動の振幅を増加させる電圧を連続的に加えることにより、質量分析は達成される。四重極質量分析とは対照的に、選択されたm/zを有するイオンを除く全てのイオンが質量分析器の電界（フィールド）内に保持される。イオントラップの1つの利点は、一度にトラップされるイオンの数を制限することに注意しさえすれば、それが非常に高い感度を有することである。イオンの数の制御は、イオンをトラップ内に注入するのにかける時間を変更することにより達成されうる。イオントラップの質量分離能は、イオントラップが低いm/z限界を有するものの、四重極マスフィルターの場合と類似している。
【０１５７】
飛行時間型質量分析は飛行時間型質量分析器を使用するものである。m/z分析のこの方法の場合には、まず、（高い電圧により生じる）電界における加速により、イオンに一定量の運動エネルギーを与える。加速後、イオンは無電界または「ドリフト」領域に進入し、そこにおいて、それは、そのm/zに反比例する速度で通過する。したがって、低いm/zを有するイオンは、高いm/zを有するイオンより速く通過する。無電界領域の長さをイオンが通過するのに要する時間を測定し、それを用いてイオンのm/zを計算する。このタイプの質量分析における1つの考慮すべき点は、調べているイオンの組を同時に分析器内に導入することである。例えば、このタイプの質量分析は、短い明瞭なパルスでイオンを生成するMALDIのようなイオン化技術に好適である。もう1つの考慮すべき点は、運動エネルギーの量におけるばらつきを有するイオンにより生じた速度の広がりを制御することである。より長い飛行管、イオンリフレクターまたはより高い加速性電圧の使用は、速度の広がりの影響を最小にするのに役立ちうる。飛行時間型質量分析器は、高レベルの感度、および四重極またはイオントラップ質量分析器より広いm/z範囲を有する。また、このタイプの質量分析器では、該質量分析器の走査が不要であるため、データを迅速に得ることが可能である。
【０１５８】
アッセイ試薬の合成
本発明の使用のための結合性化合物は、以下の参考文献（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているとおりに合成する：国際特許公開WO 00/66607、WO 01/83502、WO 02/95356、WO 03/06947ならびに米国特許第6,322,980号および第6,514,700号。結合性化合物の合成のための典型的な試薬を図4A〜Jに示す。典型的な合成方法を図5A〜7Dに例示する。
【実施例１】
【０１５９】
PI3K/Her-3受容体活性化複合体
本実施例においては、乳癌細胞系MCF-7においてHer2、Her3およびPI3Kを含む受容体複合体を測定するために、図7Aおよび7Cに示すアッセイを設計した。第1分子タグ（図中の「mT1」および後記「eTag1」）を有する結合性化合物（1106）はHer3受容体（1102）の細胞外ドメインに特異的である。第2分子タグ（図中の「mT2」および後記「eTag2」）を有する結合性化合物（1110）はPI3Kタンパク質（1100）のp85成分（1111）に特異的であり、光増感剤が結合している切断性プローブ（1108）はHer3受容体（1102）の細胞内ドメインに特異的であり、ここで、「H2」はHer2受容体（1104）を示し、「H3」はHer3受容体（1102）を示し、「p85」および「p110」は、そのp85部分を介してH3のリン酸化部位（「P」で示されている）に結合するPI3キナーゼ（1100）の成分である。図7Aの設計においては切断性プローブがHer3受容体に特異的であり、図7Cの設計においては切断性プローブがPI3キナーゼのp85成分に特異的であることを除き、それらの2つのアッセイ設計は類似している。該アッセイを以下のとおりに行った。
【０１６０】
サンプルの調製：
1．使用前に乳癌細胞培養を一晩にわたり血清飢餓させる。
2．細胞系を培地内でHRGで37℃で10分間刺激する。典型的なHRGの用量はMCF-7細胞に対しては0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMである。
3．培地を吸引し、氷上に移し、細胞溶解バッファー（細胞をin situで細胞溶解させるための前記のもの）を加える。
4．ライセートを擦り取りミクロフュージチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間遠心分離する。
5．上清をライセートおよびアリコートとして集め、使用まで-80℃で保存する。
【０１６１】
細胞溶解バッファー（新鮮に調製し氷上で保存）：
最終 μl        ストック    
1% Triton X-100                         1000          10%
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)                  200          1 M
100 mM NaCl                              200          5 M
50 mM NaF                                500          1 M
50 mM Na β-グリセロホスファート        1000          0.5 M
1 mM Na3V04                               100          0.1 M
5 mM EDTA                                100          0.5 M
10 ug/ml ペプスタチン                    100          1 mg/ml
1錠(10 ml当たり)の
Roche Completeプロテアーゼ
インヒビター(#1836170)                   N/A          N/A
水                                      6500          N/A      
合計10 ml
アッセイ設計：各図に示されている図式に基づき、受容体複合体形成を比率的（ratiometrically）に定量する。すなわち、アッセイの読取り値は分子タグのピーク比（eTag2/eTag1）である。
【０１６２】
全アッセイ容量は40μlである。ライセート容量をライセートバッファーで10μlに調節する。抗体を細胞溶解バッファーで20μlまで希釈する。典型的には、ライセートの〜5000〜500,000細胞等価体を反応当たりに使用する。
【０１６３】
方法：反応に加える前の予混抗体の実施濃度：Her3における切断性プローブとのHer-3/PI3K複合体（図7Aの設計）の場合。
10 nMのeTagl 抗Her-3（このアッセイにおいてはeTaglはProl4であった）。
10 nMのeTag2 抗PI3K（このアッセイにおいてはeTag2はProlであった）。
20 nMのビオチン 抗Her-3。
700 pMのUniversal Standard US-1。
【０１６４】
［Universal Standard US-1は、ビオチンおよび分子タグPto8と結合したBSAであり、これは、アッセイにおいてストレプトアビジン-光増感剤ビーズの量を正規化するために使用する］。通常の技術（例えば、Hermanson, 前掲）を用いて分子タグ前駆体（図4A〜4Jを参照されたい）のNHS-エステルを抗体上の遊離アミンと反応させることにより、該分子タグを抗体に直接的に結合させた。
【０１６５】
PI3Kにおける切断性プローブとのHer-3/PI3K複合体（図7Cの設計）の場合：
10 nMのeTagl 抗PI3K（このアッセイにおいてはeTaglはProlであった）。
10 nMのeTag2 抗Her-3（このアッセイにおいてはeTag2はProl4であった）。
20 nMのビオチン 抗PI3K。
700 nMのUniversal Standard US-1。
【０１６６】
1．96ウェルフィルタープレート（Millipore MAGVN2250）をアッセイするために、20μlの抗体混合物を10μlのライセートに加え、4℃で1時間インキュベートする。
2．10μlのストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ（最終4μg/ウェル）をアッセイウェルに加え、40分間インキュベートする。
3．200μlの洗浄バッファーを加え、真空にして空にする。
4．30μlの照射バッファーを加え、照射する。
5．分析のために10μlの各反応をCEアッセイプレートに移す。
【０１６７】
データ分析：
1．各分子タグの相対蛍光単位（RFU）シグナルを内部Universal Standard US-1のものに対して正規化する。
2．「無ライセート」バックグラウンド対照のRFUを対応正規化eTagレポーターシグナルから差し引く。
3．受容体複合体形成を正規化eTag2/eTag1シグナルの比（図7Bおよび7Dに示す）として表す。
【実施例２】
【０１６８】
Shc/Her-3受容体-アダプター相互作用
本実施例においては、図8Aおよび8Cに示すとおりにアッセイを設計した。図8Aにおいては、Her2受容体（1200）とHer3受容体（1202）とが細胞表面膜（1204）において二量体を形成しており、各受容体は、リン酸化部位（1209および1210）を有するものとして表されている。Shcタンパク質（1206および1208）はそれぞれリン酸化部位（1210）および（1209）に結合する。第1結合性化合物（1214）および切断性プローブ（1216）は、Her2受容体（1200）の細胞外ドメインの、異なる抗原決定基に特異的である。第2結合性化合物（1212）はShcタンパク質（1206および1208）に特異的である。図8Aの設計においては切断性プローブがHer2受容体に特異的であり、図8Cの設計においては切断性プローブがHer3受容体に特異的であることを除き、図8Aおよび8Cのアッセイ設計は類似している。したがって、前者の場合には全Her2受容体を測定し、後者の場合には全Her3受容体を測定する。アッセイを以下のとおりに行った。サンプルの調製は前記のとおりに行った（実施例1）。
【０１６９】
アッセイ設計：各図に示されている図式に基づき、受容体複合体形成を比率的（ratiometrically）に定量する。すなわち、図8Bおよび8Dにおいては、アッセイの読取り値はHRG濃度の関数としてのmT2/mT1のピーク比である。
【０１７０】
全アッセイ容量は40μlである。ライセート容量をライセートバッファーで10μlに調節する。抗体を細胞溶解バッファーで20μlまで希釈する。典型的には、ライセートの約5000〜500,000細胞等価体を反応当たりに使用する。
【０１７１】
方法：反応に加える前の予混抗体の実施濃度：Her3における切断性プローブとのHer-3/Shc複合体（図8Aの設計）の場合。
10 nMのeTagl 抗Her-3（このアッセイにおいてはeTaglはProl4であった）。
10 nMのeTag2 抗Shc（このアッセイにおいてはeTag2はProl2であった）。
10 nMのeTag3 抗ホスホTyr（このアッセイにおいてはeTag3はPro2であった）。
20 nMのビオチン 抗Her-3。
700 pMのUniversal Standard US-1。
Her-2における切断性プローブとのHer-2/Shc複合体（図8Aの設計）の場合：
10 nMのeTagl 抗Her-2（このアッセイにおいてはeTaglはProl4であった）。
10 nMのeTag2 抗Shc（このアッセイにおいてはeTag2はProl2であった）。
10 nMのeTag3 抗ホスホTyr（このアッセイにおいてはeTag3はPro2であった）。
20 nMのビオチン 抗Her-2。
700 pMのUniversal Standard US-1。
【０１７２】
1．96ウェルフィルタープレート（Millipore MAGVN2250）をアッセイするために、20μlの抗体混合物を10μlのライセートに加え、4℃で1時間インキュベートする。
2．10μlのストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ（最終4μg/ウェル）をアッセイウェルに加え、40分間インキュベートする。
3．200μlの洗浄バッファーを加え、真空にして空にする。
4．30μlの照射バッファーを加え、照射する。
5．分析のために10μlの各反応をCEアッセイプレートに移す。
【０１７３】
データ分析：
1．各分子タグの相対蛍光単位（RFU）シグナルを内部Universal Standard US-1のものに対して正規化する。
2．「無ライセート」バックグラウンド対照のRFUを対応正規化分子タグシグナルから差し引く。
3．受容体複合体形成を正規化mT2/mT1シグナルの比（図8Bおよび8Dに示す）として、そして受容体リン酸化（データ非表示）をmT3/mT1シグナルとして表す。
【実施例３】
【０１７４】
SHC//Grb2タンパク質-タンパク質相互作用
本実施例においては、細胞ライセート中のGrb2//SHCタンパク質-タンパク質複合体を検出するために、図1Bに示すとおりにアッセイを設計した。第1分子タグを有する第1結合性化合物はGrb2に特異的であった。第1結合性化合物の抗原決定基とは別のGrb2の抗原決定基に特異的である切断性プローブを準備した。第2分子タグを有するSHCに特異的な第2結合性化合物も準備した。アッセイを以下のとおりに行った。サンプルの調製は前記のとおりに行った。
【０１７５】
全アッセイ容量は40μlである。ライセート容量をライセートバッファーで10μlに調節する。抗体を細胞溶解バッファーで20μlまで希釈する。典型的には、ライセートの約5000〜500,000細胞等価体を反応当たりに使用する。
【０１７６】
方法：反応に加える前の予混抗体の実施濃度：Grb2における切断性プローブとのGrb2//SHC複合体の場合。
10 nMのeTagl 抗Grb2（このアッセイにおいてはeTaglはProl4であった）。
10 nMのeTag2 抗SHC（このアッセイにおいてはeTag2はProl2であった）。
20 nMのビオチン 抗Grb2。
700 pMのUniversal Standard US-1。
SHCにおける切断性プローブとのGrb2//SHC複合体の場合：
10 nMのeTagl 抗Grb2（このアッセイにおいてはeTaglはProl4であった）。
10 nMのeTag2 抗SHC（このアッセイにおいてはeTag2はProl2であった）。
20 nMのビオチン 抗SHC。
700 pMのUniversal Standard US-1。
【０１７７】
1．96ウェルフィルタープレート（Millipore MAGVN2250）をアッセイするために、20μlの抗体混合物を10μlのライセートに加え、4℃で1時間インキュベートする。
2．10μlのストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ（最終4μg/ウェル）をアッセイウェルに加え、40分間インキュベートする。
3．200μlの洗浄バッファーを加え、真空にして空にする。
4．50μlの照射バッファーを加え、照射する。
5．分析のために20μlの各反応をCEアッセイプレートに移す。
【０１７８】
データ分析：
1．各分子タグの相対蛍光単位（RFU）シグナルを内部Universal Standard US-1のものに対して正規化する。
2．「無ライセート」バックグラウンド対照のRFUを対応正規化分子タグシグナルから差し引く。
3．図9は、0〜100nMのヘレグリン（heregulin）で刺激した後のMCF-7細胞ライセートにおけるGrb2//SHC複合体形成を示す。
【実施例４】
【０１７９】
細胞系ライセート中のPI3K//IRS-1複合体
本実施例においては、PI3K//IRS-1複合体を検出するためのアッセイをMCF-7、DAOY、HT29、D283およびA431の細胞系上で、それぞれを別々に0、6、25および100 nM IGF-1と共にインキュベートした後で行った。該アッセイにおいては、分子タグが結合しているPI3Kに特異的な第1結合性化合物を準備し、IRS-1に特異的な切断性プローブを準備し、その他の点においては、前記と実質的に同じ方法を用いてアッセイを行った。アッセイの結果を図10に示す。
【実施例５】
【０１８０】
MCF-7ライセート中のIGF-1R//IRS-1複合体
本実施例においては、種々の濃度のIGF-1中でのインキュベーションの後でMCF-7細胞ライセート中のIGF-1R//IRS-1タンパク質-タンパク質複合体を検出するために、図1Bに示すとおりにアッセイを設計した。第1分子タグを有する第1結合性化合物はIRS-1に特異的であった。第1結合性化合物の抗原決定基とは別のIRS-1の抗原決定基に特異的である切断性プローブを準備した。第2分子タグを有するIGF-1Rに特異的な第2結合性化合物も準備した。前記と実質的に同じ方法を用いてアッセイを行った。アッセイの結果を図11に示す。
【実施例６】
【０１８１】
MCF-7ライセート中のHer3//PI3K複合体
本実施例においては、種々の濃度のヘレグリン（heregulin）中でのインキュベーションの後でMCF-7細胞ライセート中のHer3//PI3Kタンパク質-タンパク質複合体を検出するために、図1Bに示すとおりにアッセイを設計した。第1分子タグを有する第1結合性化合物はHer3に特異的であった。第1結合性化合物の抗原決定基とは別のHer3の抗原決定基に特異的である切断性プローブを準備した。第2分子タグを有するPI3Kに特異的な第2結合性化合物も準備した。前記と実質的に同じ方法を用いてアッセイを行った。アッセイの結果を図12に示す。
【実施例７】
【０１８２】
MCF-7ライセート中のHer3//SHC複合体
本実施例においては、種々の濃度のヘレグリン（heregulin）中でのインキュベーションの後でMCF-7細胞ライセート中のHer3//SHCタンパク質-タンパク質複合体を検出するために、図1Bに示すとおりにアッセイを設計した。第1分子タグを有する第1結合性化合物はHer3に特異的であった。第1結合性化合物の抗原決定基とは別のHer3の抗原決定基に特異的である切断性プローブを準備した。第2分子タグを有するSHCに特異的な第2結合性化合物も準備した。前記と実質的に同じ方法を用いてアッセイを行った。アッセイの結果を図13に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１Ａ】図1Aは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｂ】図1Bは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｃ】図1Cは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｄ】図1Dは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｅ】図1Eは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｆ】図1Fは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｇ】図1Gは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｈ】図1Hは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図１Ｉ】図1Iは、タンパク質複合体の存在を測定するための本発明の方法のいくつかの実施形態を図式的に示す。
【図２Ａ】図2Aは、抗体に分子タグを結合させるための方法を図式的に示す。
【図２Ｂ】図2Bは、抗体に分子タグを結合させるための方法を図式的に示す。
【図２Ｃ】図2Cは、抗体に分子タグを結合させるための方法を図式的に示す。
【図２Ｄ】図2Dは、抗体に分子タグを結合させるための方法を図式的に示す。
【図２Ｅ】図2Eは、抗体に分子タグを結合させるための方法を図式的に示す。
【図３Ａ】図3Aは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【図３Ｃ】図3Cは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【図３Ｄ】図3Dは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【図３Ｅ】図3Eは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【図３Ｆ】図3Fは、酸化不安定性連結、および一重項酸素により媒介されるそれらのそれぞれの切断反応を示す。
【図４Ａ】図4Aは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｂ】図4Bは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｃ】図4Cは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｄ】図4Dは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｅ】図4Eは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｆ】図4Fは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｇ】図4Gは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｈ】図4Hは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｉ】図4Iは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図４Ｊ】図4Jは、設計し合成したタグの構造を示す。
【図５Ａ】図5Aは、図6に示すタグ部分の合成の化学を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、図6に示すタグ部分の合成の化学を示す。
【図５Ｃ】図5Cは、図6に示すタグ部分の合成の化学を示す。
【図５Ｄ】図5Dは、図6に示すタグ部分の合成の化学を示す。
【図６】図6A-6Cは、分子タグを電気泳動により分離する工程を実施するためのマイクロフルイディクス（microfluidics）装置を図式的に示す。
【図７Ａ】図7Aは、PI3キナーゼ-Her3受容体活性化複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図７Ｂ】図7Bは、PI3キナーゼ-Her3受容体活性化複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図７Ｃ】図7Cは、PI3キナーゼ-Her3受容体活性化複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図７Ｄ】図7Dは、PI3キナーゼ-Her3受容体活性化複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図８Ａ】図8Aは、Shc/Her3受容体-アダプター複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図８Ｂ】図8Bは、Shc/Her3受容体-アダプター複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図８Ｃ】図8Cは、Shc/Her3受容体-アダプター複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図８Ｄ】図8Dは、Shc/Her3受容体-アダプター複合体を検出するためのアッセイ設計および実験結果を示す。
【図９】図9は、MCF-7細胞のライセート中のGrb2//SHC複合体のアッセイからのデータを示す。
【図１０】図10は、種々の濃度のIGF-1中でインキュベートした後の種々の細胞系のライセート中のIRS-1//PI3K複合体のアッセイからのデータを示す。
【図１１】図11は、種々の濃度のIGF-1中でインキュベートした後のMCF-7細胞のライセート中のIRS-1//PI3K複合体のアッセイからのデータを示す。
【図１２】図12は、種々の濃度のヘレグリン（heregulin）中でインキュベートした後のMCF-7細胞のライセート中のHer3//PI3K複合体のアッセイからのデータを示す。
【図１３】図13は、種々の濃度のヘレグリン（heregulin）中でインキュベートした後のMCF-7細胞のライセート中のHer3//SHC複合体のアッセイからのデータを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2007502417.tif 000009
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2007502417.tif 000012
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2007502417.tif 000016
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2007502417.tif 000018
【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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