(57)【要約】本発明は、エングレイルド転写因子に固定されることができ、かつその活性を調節できるペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
- 配列SWWETQLIASSGのペプチド；
- 配列WSWNEEVWFPFTのペプチド
から選択される、エングレイルド転写因子に結合可能なペプチド。
【請求項２】
形質導入ドメインを含むペプチドと組み合わされた請求項1に記載のペプチドを含む組成物。
【請求項３】
前記形質導入ペプチドがペネトラチンであることを特徴とする請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記形質導入ペプチドが、エングレイルドタンパク質または少なくともそのホメオドメインを含むその断片であることを特徴とする請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
キメラポリペプチドからなることを特徴とする請求項2〜4のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項６】
- 請求項1に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
- 請求項5に規定されるキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項1に記載のペプチド、請求項2〜5のいずれか1つに記載の組成物、または請求項6に記載のポリヌクレオチドの、生細胞内のエングレイルド転写因子の活性をインビトロで調節するための使用。
【請求項８】
請求項1に記載のペプチド、請求項2〜5のいずれか1つに記載の組成物、または請求項6に記載のポリヌクレオチドの、医薬品を得るための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「エングレイルド」転写因子の活性を改変することができるペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
エングレイルドタンパク質は、ホメオドメインタンパク質クラスの転写因子である。哺乳類は、2つのエングレイルドホモログを有する：エングレイルド-1およびエングレイルド-2である。類似の活性を有するこれら2種のタンパク質は、以下において、ひとまとめにして包括的な用語、エングレイルド (EN)という。
【０００３】
新生児および成人において、ENは、気分の調節および嗜癖性行動(addictive behavior)の扇動において重要な役割を演じる黒質(パーキンソン病において退化する)および縫線核および青斑核のドーパミン作動性(DA)ニューロンにおいて発現される。
【０００４】
発達(development)の間のENの損失に続いてすぐにドーパミン作動性ニューロンの変性がおこること、およびENの転写標的の1つがα-シヌクレインであることが示されている(Simonら J Neurosci. 21 (9): 3126〜34, 2001)。α-シヌクレインは、パーキンソン病の一族のある形と遺伝的な連関が示され(Polymeropoulosら, Science. 276, 2045〜7, 1997)、ドーパミン作動性伝達の負のレギュレータを構成すると考えられている(Abeliovichら, Neuron, 25, 239〜52, 2000)。
【０００５】
これらの全ての報告は、エングレイルドが神経変性性の病理、特にドーパミン作動性ニューロンに影響を及ぼす病理、例えばパーキンソン病に関与することを強く示唆している。縫線ニューロンおよび青斑核ニューロンにおけるエングレイルドの発現により、他の病理、例えば気分障害または嗜癖における関与の仮定が考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、エングレイルドの活性の調節物質を得ることが特に所望されることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、エングレイルド活性を調節し得るペプチドが存在するかを、該タンパク質への結合により探索した。そこで、本発明者らは、エングレイルドに結合し、インビトロおよびインビボでその活性を特異的に調節することができる2つのペプチドを同定した。
【０００８】
これらのペプチド：SWWETQLIASSG (ペプチド1；配列番号1)およびWSWNEEVWFPFT (ペプチド2；配列番号2)を図1に示す。
【０００９】
エングレイルドを過剰発現する形質転換細胞内で、ペプチド1は活性化効果を有するが、一方でペプチド2は阻害効果を有する。生理的な状況において、両方のペプチドは活性化効果を有する。さらに、本発明者らは、これらのペプチドが、エングレイルドのホメオドメインに転写活性化の特性を授ける(それ自体ではこれらの特性を有さない)ことに注目した。
【００１０】
本発明の主題は、エングレイルド転写因子に結合することができ、かつ該転写因子の活性を調節できるペプチドである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の好ましい形態によると、該ペプチドはSWWETQLIASSGおよびWSWNEEVWFPFTの配列のペプチドから選択される。
【００１２】
本発明の主題は、本発明によるペプチドの、生細胞内でのエングレイルド転写因子の活性を調節するための使用でもある。
【００１３】
本発明の実行のために、該ペプチドは、種々の方法により細胞内に導入することができる。
有利には、該ペプチドは形質導入ドメイン(transducing domain)を含むペプチドと組み合わされることができる。
【００１４】
「形質導入ドメイン」の用語は、特異的な輸送体または受容体の存在とは関係なく生細胞の内部に貫入でき、かつ該細胞に種々の性質の分子または分子複合体(核酸、タンパク質、ペプチド／核酸、ヌクレオチドアナログ、リポソーム)を持ち込むことができるペプチド配列を意味し、通常、包括的な用語で「カーゴ」とよばれる。
【００１５】
種々のタイプの形質導入ペプチドがそれら自体で知られている。参考のために、例えばLidgrenら, TiPS, 21, 99〜102, (2000)；SchwarzeおよびDowdy TiPS, 21, 45〜48, (2000)；Schwarzeら Trends Cell. Biol., 10, 290〜295, (2000)；Prochiantz Current Opinion in Cell Biology, 12, 400〜406, (2000)；Cell-Penetrating Peptides. Processes and applications. Ulo Langel編 CRC Press (2002)を参照。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態によると、本発明による調節ペプチドは、ホメオドメインの第3ヘリックスに由来するペネトラチンタイプの形質導入ドメインを含むペプチドと組み合わせることができる。ペネトラチンファミリーのペプチドは、例えばJoliotら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1864〜1868, (1991)；Derossiら J. Biol. Chem., 269, 14, 10444〜10450, (1994)；Brugidouら Biophys. Biochem. Res. Com., 214, 685〜693, (1995)の出版物、および米国特許第5,888,762号、米国特許第6,080,724号、PCT出願WO 00/01417号またはPCT出願WO 00/29427号に記載されている。
【００１７】
本発明の主題は、形質導入ドメイン、好ましくはペネトラチンタイプの形質導入ドメインを含むタンパク質と組み合わされた本発明による調節ペプチドを含む組成物でもある。
【００１８】
本発明による組成物の好ましい実施形態によると、本発明による調節ペプチドは、エングレイルドまたは少なくともそのホメオドメインを含むエングレイルドの断片と組み合わされる。
これらのペプチドの組み合わせは、上記の文献に記載されるように共有結合によるか、またはフランス出願第03/00093号に記載されるように非共有結合により行うことができる。
【００１９】
本発明は、異種ペプチドに融合された本発明によるペプチドを含むいずれのキメラポリペプチドも包含する。本発明の特定の実施形態によると、該異種ペプチドは、少なくとも1つの形質導入ドメイン、好ましくはペネトラチンタイプの形質導入ドメインを含む。本発明によるキメラポリペプチドの好ましい実施形態によると、これは少なくともそのホメオドメインを含むエングレイルドの断片に融合された本発明によるペプチドを含むキメラ転写因子である。
【００２０】
本発明の主題は、
- 本発明による調節ペプチドをコードするポリヌクレオチド；
- 本発明によるキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から選択されるポリヌクレオチドでもある。
【００２１】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターも包含する。
【００２２】
本発明は、本発明による調節ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、異種ペプチド、特に形質導入ドメイン、好ましくはペネトラチンタイプの形質導入ドメインを含むペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む組成物も包含する。本発明による組成物は、例えば、本発明による調節ペプチドをコードする配列と、上記の異種ペプチドをコードする配列とを含む組換えベクターを含むことができ、これらの2つの配列が接するかまたは接さないことが可能である。あるいは、本発明による組成物は、一方は本発明による調節ペプチドをコードする配列を有し、他方は異種ペプチドをコードする配列を有する2つの異なるベクターを含むことができる。
【００２３】
本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターは、所望により、エングレイルドの発現の調節が所望される細胞内にこのポリヌクレオチドを導入してそれを発現させるために用いることができる。
【００２４】
このために、動物細胞において興味のある遺伝子を発現するために通常用いられるベクター、例えばウイルスベクターを用いることができる。有利には、形質導入ペプチドがその上に吸着されたバクテリオファージ、例えばフランス出願第03/00093号に記載されるものをベクターとして用いることができる。
【００２５】
本発明の主題は、上記で規定されるペプチドまたはポリヌクレオチドまたは組成物の、特に神経系の病理、例えばパーキンソン病のような神経変性性の病理の治療の関係において用い得る医薬品を得るための使用でもある。
【実施例】
【００２６】
本発明は、エングレイルドに結合することができかつその活性を調節することができるペプチドを得ることを説明する限定されない例に言及する、以下のさらなる記載からより明確に理解されるであろう。
【００２７】
実施例1：エングレイルドの活性を調節し得るペプチドの取得
1) エングレイルドの活性を試験する系
エングレイルドの転写活性は、Montesinosら(J. Neurosci., 21, 3350〜9, 2001)により記載されるようにして、エングレイルドの標的であるプロモーター、MAP1B (微小管付属タンパク質(microtubule-associated protein) 1B)プロモーターの制御下のプラスミドpMAP-lucに入れたルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現発現を測定することにより評価する。
【００２８】
神経上皮系統の細胞CHP 100 (Schlesingerら, Cancer Res. 36, 3904〜3100, 1976)を、16 mMグルコース、15%胎児ウシ血清、5 U/mlのペニシリンおよび5μg/mlのストレプトマイシンを補ったRPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養し、pMAP-lucと以下のベクターの1つとのエレクトロポレーションによりコトランスフェクションする：
pCL9mEn2 (Mainguyら, Natural Biotechnol. 18：746〜749, 2000)、これはCMVプロモーターの制御下にひよこの全エングレイルド-2タンパク質をコードする配列を含む；
【００２９】
pCL9mEn2ΔH1 (Joliotら, Curr Biol. 8: 856〜863, 1998)、これはホメオドメイン(DNA結合配列)の36〜46のアミノ酸が欠失されたひよこのエングレイルド-2タンパク質をコードする配列を、CMVプロモーター制御下に含む。
【００３０】
pCL9mHDEn2C、これは10〜185のアミノ酸が欠失されたひよこのエングレイルド-2をコードする配列を、CMVプロモーターの制御下に含む。
【００３１】
エレクトロポレーションを、培地350μl中で、8×105細胞当たり最大で10μgのプラスミドDNA (2μgのレポータープラスミドpMAP-luc ＋ 種々の量のEn2発現ベクター)を用いて、1050μFおよび260 mVで行う。次いで、培地400μlを加えて、この組み合わせを10分間放置する。次いで細胞を洗浄後に2つのディッシュ(直径3.5 cm)の培地中におく。
【００３２】
ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの24時間後に分析する。細胞をPBSでリンスする。溶解バッファー(20 mM Tris/H3PO4、pH 7.8、10 mM MgCl2、15%グリセロール、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1.25 mM ATP、10μg/mlルシフェリン)を細胞に加える。4℃で30分間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性をルミノメトリ(Berthold Lumat LB 9501ルミノメータ)により測定する。
【００３３】
結果を図2Aおよび2Bに示す。
【００３４】
図2Aは、エングレイルド-2 (En2)タンパク質が用量依存性の様式でMAP1Bプロモーターの発現を活性化し得ることを示す。図2Bは、この活性化が、ホメオドメインのプロモーターへの結合を必要とすることを示す。後者は、実際は、EN2ΔH1組換えタンパク質により活性化されていない。
【００３５】
MAP1Bプロモーターは、別のホメオドメインタンパク質、HOXA5によっても活性化される。
【００３６】
2) エングレイルドに結合し得るペプチドの選択
エングレイルドに特異的に結合するペプチドを、その表面で12のアミノ酸のランダムペプチドを発現するファージライブラリ(PhD 12, New England Biolabs)をスクリーニングすることにより探した。このようにして、エングレイルドに結合できるいくつかのペプチドを得た。
【００３７】
最も代表的な2つのペプチドは、SWWETQLIASSG (Pep1；配列番号1)およびWSWNEEVWFPFT (Pep2；配列番号2)である。これらのペプチドは、エングレイルドの転写活性に対するそれらの効果を試験するように選択された。これらのペプチドの配列を図1に示す。
【００３８】
Pep1またはPep2をコードする配列を、ベクターpCS2+ (TurnerおよびWeintraub, Genes and Development. 8: 1311〜1323, 1994)に、それぞれpCS2-pep1およびpCS2-pep2の発現ベクターを得るように入れた。
【００３９】
3) CHP100細胞内のエングレイルド活性に対する、選択されたペプチドの影響の試験
CHP100細胞を、上記で規定したようにして、pMAP-luc (2μg)と、pCL9mEn2またはpCL9mHDEn2C (4μg)と、4μgのpCS2-pep1またはpCS2-pep2とでエレクトロポレーションによりコトランスフェクションする。
【００４０】
図3Aは、ペプチド1がエングレイルド (pep 1＋En2)と同じときに細胞内に導入される場合に、MAP1Bの活性化が約50％増加することを示す。ペプチドのみではこのプロモーターに何の作用も有さない(pep1)。MAP1Bプロモーターは、この細胞タイプにおいてはそれ自身では活性でない(map1b)。
【００４１】
図3Bは、HDEn2Cペプチド(主にエングレイルドホメオドメインからなる)がMAP1Bプロモーターをわずかしか活性化せず(HDEn2C)、この活性化がペプチド1により大きく増大される(HDEn2C＋pep1)ことを示す。
【００４２】
図4Aは、それ自体ではMAP1Bに影響を有さないペプチド2 (pep2)が、エングレイルドによるMAP1Bの活性化の阻害剤であり(pep2＋En2)、逆に言えば、HDEn2CペプチドによるMAP1Bの活性化を増大させる(HDEn2C+pep2)ことを示す。
【００４３】
図4Bは、OTX2ホメオタンパク質に特異的に結合する配列KVWDIRYTTPHA (配列番号3)のコントロールペプチド(aOTX2)が、エングレイルドによるMAP1Bの活性化を修飾しないことを示す(aOTX2＋En2)。aOTX2ペプチドの影響およびエングレイルドの影響は、純粋に付加的(additive)である。
【００４４】
4) 中脳ニューロンの初代培養におけるエングレイルドの活性に対する、選択されたペプチドの影響の試験
生理的な細胞においてペプチド1および2の機能性を証明するために、これらのペプチドの影響を、マウス胚中脳ニューロンの初代培養において試験した。
【００４５】
マウスの中脳の断片(胎齢(embryonic day) 13.5日)を、24℃で5分間、トリプシン-EDTA中でインキュベートし、次いで33 mMグルコースを補ったリン酸バッファー、pH 7.5 (PBS)および10%胎児ウシ血清で洗浄し、続いて30μM/mlのDnaseI (Sigma, Saint Louis, MO)中で37℃で10分間インキュベートする。細胞を機械的に解離させ、PBSで3回洗浄し、200 000細胞/cm2の密度で、D,L-ポリオルニチン(1.5μg/ml)とラミニン(5μg/ml)で予め飽和させたウェルでの培養に付す。培地(MMS)は、DMEM/F12 (1/1, Life Technologies, Cergy, France)ならびに33 mMグルコース、2 mMグルタミン、10 mM HEPES、pH 7.4、9 mM NaHCO-3、5 U/mlのペニシリンおよび5μg/mlのストレプトマイシンからなる。MSSに、0.1%のオボアルブミン、25μg/mlのインシュリン、100μg/mlのトランスフェリン、20 nMのプロゲステロン、60μMのプトレッシンおよび30 nMのセレンを加える(M2OV)。
【００４６】
細胞を培養に付した次の日、各ウェルの培地をペニシリンまたはストレプトマイシンを含まない600μlのMSSに置き換える。24℃で20分間予め混合したpMAP-luc (0.5μg)および0.5μgのpCS2-pep1またはpCS2-pep2と、OPTI-MEM培地(qs 100μl)中の1 mg/mlのLipofectamine 2000 (Invitrogen)とを含むトランスフェクション混合物100μlを各ウェルに加える。次いで、細胞を37℃で2時間30分インキュベートする。次いで、培地をM2OVで置き換える。
【００４７】
結果を図5に示す。
【００４８】
これらの結果は、MAP1Bプロモーターがこれらのニューロンにおいて活性化され(map1b)、この活性化がペプチド1により (map1b＋pep1)およびペプチド2 (map1b＋pep2)により増大され、ペプチド2の活性化効果は、この状況において、ペプチド1のものより大きいようである。
【００４９】
実施例2：Pep-1およびPep-2ペプチドのインビボでの影響
エングレイルドの転写活性に対するpep1またはpep2の影響を、HH8〜HH10段階のひよこ胚の神経管において、MAP1Bプロモーターの制御下にプラスミドpMAP-lacZ (Montesinosら, 2001, 上記により記載)に入れたβ-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現を測定することにより評価した。
【００５０】
ベクターpCS2-pep1またはpCS2-pep2、およびベクターpMAP-lacZベクター(各ベクターは、1μg/μlの濃度で用いられる)を、HH8〜HH10段階のひよこ胚の神経管に、Muramatsuら(1997)のプロトコルに従って、BTX ECM 830エレクトロポレーター(25 Vおよび50 msecの4パルス) (Genetronics, San Diego, CA)を用いてエレクトロポレーションにより導入した。ベクターをマイクロピペットを用いて神経管に注入した。Hoganら(Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor laboratory, 1994)に記載されるようにして、37℃で24時間のインキュベーションの後、胚を固定してβ-ガラクトシダーゼ活性を明らかにした。
【００５１】
結果を図6 (A〜C)に示す。
図6A (pMap-LacZ)は、MAP1Bプロモーターが、エングレイルドの通常の発現に対応する中脳の中間領域(mes-metencephalic region)でインビボにおいて活性化されることを示す。この発現は、腹側の領域に制限され、この領域だけが神経管へのエレクトロポレーションの技術によりプラスミドが接近可能な領域である。
【００５２】
図6B (pMap-LacZ ＋ pCS2-Pep1)は、この活性化がペプチド1により増大されることを示す。標識もより広範にわたるようである。
【００５３】
図6C (pMap-LacZ ＋ pCS2-Pep2)は、ペプチド2もMAP1Bの活性化を増大させることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】
2007532093.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007532093.tif 000006
【図６】
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【配列表】
2007532093000001.xml
【国際調査報告】
2007532093.tif 000010
2007532093.tif 000011