(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、非哺乳動物細胞系にクローニングされた（ヒト対象のＤＮＡにおけるその存在が、病理学的状態、病理学的状態の素因もしくは外部刺激に対する有害な反応の素因の指標となるような、又は患者の治療的介入に対する可能性の高い応答の指標となるような遺伝子バリアント（即ち、薬理遺伝学的分析において使用されるバリアント）を、少なくとも一つ含有しているヒトＤＮＡ配列を含む）少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列を含む遺伝子参照標準を提供する。ヒトＤＮＡが相同的組換えを使用して宿主ゲノム内の特定の位置にターゲティングされたそのような参照標準も提供される。本発明は、さらに、そのような参照標準を使用して遺伝子バリアントを検出する方法を提供する。【選択図】    図１
2007513623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非哺乳動物細胞系にクローニングされた少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列を含む遺伝子参照標準。
【請求項２】
動物細胞系がトリ細胞系である、請求項１に記載の遺伝子参照標準。
【請求項３】
細胞系がニワトリ（ガルス種（Ｇａｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））細胞系である、請求項２に記載の遺伝子参照標準。
【請求項４】
細胞系がＢ細胞系である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準。
【請求項５】
ニワトリ細胞系がニワトリＤＴ４０細胞系である、請求項３の遺伝子参照材料。
【請求項６】
少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列が細胞のゲノムの非必須領域にクローニングされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準。
【請求項７】
少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列が細胞のゲノムの非発現領域にクローニングされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準。
【請求項８】
クローニングされた細胞系がヒト遺伝子参照配列に関して二倍体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準。
【請求項９】
少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列が複数のヒト遺伝子参照配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準。
【請求項１０】
ヒト遺伝子参照配列又は各ヒト遺伝子参照配列が機能的な染色体ではない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準。
【請求項１１】
ＤＮＡ配列に応答性の検査を試料に対して実施すること；
検出すべき遺伝子バリアントを含んでいる参照試料に対して同検査を実施すること；
遺伝子バリアントの存在又は欠如を決定するため、該試料及び該参照試料から得られた検査結果を比較すること；
を含む、ヒトＤＮＡを含有している試料の中の遺伝子バリアントを検出する方法であって、
該参照試料が請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子参照標準であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子検査において対照として使用するための遺伝子参照材料を作製し維持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的な遺伝子診断において、検査結果が正確であることは極めて重要である。例えば、出生前診断において、偽陽性結果は、正常な胎児の中絶をもたらすかもしれないし、偽陰性結果は、影響を受けた子供の出生又は誤診をもたらすかもしれない。臨床の現場において、遺伝子検査の結果は、臨床的介入の基礎を形成するかもしれず、従って、得られる結果が確実な根拠に基づいていることは不可欠である。遺伝子検査は、疾患状態の素因を有しているかもしれない個体を集団の中から同定するためにも、次第に使用されるようになってきている。素因の知識は、臨床的介入又は生活様式要因の調整のいずれかを通した効果的な予防策をもたらし得る。
【０００３】
そのような遺伝子検査の信頼性を保証するため、遺伝子参照材料を使用することにより、各検査において陽性対照又は陰性対照が存在することが可能となり、それにより、結果が確証される。これらの参照材料はＤＮＡからなり、それは、従来、以下の三つの方法のいずれかにより提供されてきた。
【０００４】
１．ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物
２．プラスミドにクローニングされたＰＣＲ産物
３．ヒトゲノムＤＮＡ。
【０００５】
ＰＣＲにより作製されたＤＮＡの使用は、関心対象の配列を使用した遺伝子参照材料の作製にとって魅力的であると思われるかもしれないが、それは多数の短所に関連している。（典型的な患者試料の中に見出されるものより多い）そのような技術により作製された非常に大量のＤＮＡは、タイピングを行う研究室における相当の混入リスクをもたらす。さらに、生のＰＣＲにより作製されたＤＮＡは不安定であり、従って、その使用には精度が不足している。存在するもう一つの問題は、そのような技術により作製された参照遺伝子配列は、単離された状態で作製される、即ち、患者由来の試料の中に見出される正常なバックグラウンド非標的ＤＮＡを含まずに作製される。従って、そのような標準の性質は、検査試料とは相当に異なっており、アッセイにおけるアーティファクトのリスクを伴う。
【０００６】
ヒト遺伝子参照配列を含むプラスミドを大腸菌のような生物に導入することにより、プラスミドにクローニングされたＰＣＲ産物も作製され得る。そのようなメカニズムは生のＰＣＲ由来の産物より安定しているかもしれないが、作製されるＤＮＡ材料の高いレベル及び長期安定性に関する課題のため、やはり混入リスクが残っている。この安定性の不足は、とりわけ、参照ＤＮＡの質又は量の損失をもたらし得る。
【０００７】
第三のアプローチ、ヒトゲノムＤＮＡの使用は、最初の二つの方法において見られる混入及び不安定性の問題には関連していないが、それ自体の多数の短所を有している。第一に、ヒト細胞の形態のヒトゲノムＤＮＡ試料は（非特異的に増幅されない限り）使用中に迅速に消費されるため、「不死化された」細胞系が必要とされる。この不死化の過程は、多くの時間を要し、一般的に、操作者に対する健康リスクの可能性が付随している生のエプスタイン−バー・ウイルスの取り扱いを含む。このような不死化細胞系の作製は、入手するのがしばしば困難な、新鮮な患者由来の血液の使用も必要とする。これらの三つのアプローチは、全て、当然、材料が由来する患者からの完全なインフォームド・コンセントを必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
遺伝子検査を標準化するために使用され得る遺伝子参照材料の代替的な起源を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
以下の発明の概要において、「ヒト遺伝子参照配列」という用語は、ヒト対象のＤＮＡにおけるその存在が、病理学的状態、病理学的状態の素因又は外部刺激に対する有害反応の素因の指標となるような遺伝子バリアントを少なくとも一つ含有しているヒトＤＮＡ配列を含む。該遺伝子バリアントには、ヒト集団において最も一般的な配列と比べた一つ以上の塩基の変化、挿入又は欠失、並びに一塩基多型（ＳＮＰ）、突然変異、塩基又は配列の挿入、塩基又は配列の欠失、及びタンデム反復の長さの変化が含まれる。参照配列は、その全長が、少なくとも３５塩基であり、かつ３０キロ塩基を越えないことを特徴とする。いくつかの適用に関しては、参照が使用されるアッセイにおける検出を可能にするため、参照配列の最小の長さは、１００塩基超である必要があるかもしれない。５００塩基という長さは、ほぼ全ての適用にとって十分であるが、この教示の範囲内で、当業者は、ルーチンの実験により、さらなる本発明の考慮なしに、適切な長さを容易に決定することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、非哺乳動物細胞系にクローニングされた少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列を含む遺伝子参照標準を提供する。
【００１１】
好ましくは、動物細胞系は、トリ細胞系；より好ましくはニワトリ（ガルス種）細胞系、最も好ましくはニワトリＤＴ４０細胞系である。トリ細胞系がＢ細胞系であることも、最も好ましい。
【００１２】
本発明の任意の局面によると、少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列は、細胞のゲノムの非必須領域にクローニングされる。
【００１３】
また、本発明の任意の局面によると、少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列は、細胞のゲノムの非発現領域にクローニングされる。
【００１４】
また、本発明の任意の局面によると、クローニングされた細胞系は、ヒト遺伝子参照配列に関して二倍体である。
【００１５】
また、本発明の任意の局面によると、少なくとも一つのヒト遺伝子参照配列は複数のヒト遺伝子参照配列である。
【００１６】
また、本発明の任意の局面によると、ヒト遺伝子参照配列又は各ヒト遺伝子参照配列は機能的な染色体ではない。
【００１７】
さらに、ＤＮＡ配列に応答性の検査を試料に対して実施すること；
検出すべき遺伝子バリアントを含んでいる参照試料に対して同検査を実施すること；
遺伝子バリアントの存在又は欠如を決定するため、該試料及び該参照試料から得られた検査結果を比較すること；
を含む、ヒトＤＮＡを含有している試料の中の遺伝子バリアントを検出する方法であって、
該参照試料が上記の任意の局面において記載されたような遺伝子参照標準であることを特徴とする方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＤＮＡ断片の異種真核細胞系へのクローニングは、遺伝子参照材料の中間型として機能する。ゲノムに基づいているため、材料は、安定しており、かつ混入リスクを示さない。さらに、ヒト配列を含有していないため、任意のヒト検査プロトコルにおいてバックグラウンドＤＮＡが交差反応する可能性が比較的低い。患者血液は必要とされず、病原性のヒトウイルスの取り扱いも回避される。
【００１９】
必要とされるヒト遺伝子参照配列は、検査に関連した遺伝子型を保有している患者に由来し得る。又は、影響を受けていない個体から配列が入手され、ＤＮＡ配列が突然変異型又は稀な型のものと一致するよう人工的に修飾されてもよい。従って、クローニングされるＰＣＲ産物は、頬スワブに由来してもよいし、患者由来である必要すらない。また、配列は、正常なヒト細胞系に由来し、必要とされる（一つ以上の）バリアントを導入するために操作されてもよい。このように匿名のドナーに由来する細胞系を使用することによって、既知のドナーからのインフォームド・コンセントの要件が不必要になる。さらに、必要とされるヒト遺伝子参照配列の長さが十分に短いのであれば、その配列の知識からそれを合成することもできよう。
【００２０】
従って、ヒト遺伝子参照材料は、一つ以上のＤＮＡ参照配列の（異種）非哺乳動物細胞系へのクローニングにより作製され得る。相同的組換え法の使用は、調節されたコピー数の明確なヒトＤＮＡ配列を有する細胞系の作出を可能にする。相同的組換え法の使用は、ヒトＤＮＡ配列が、宿主ゲノム内の特定の位置へターゲティングされることも可能にする。
【００２１】
本発明の典型的な適用を例示するため、本発明者らは、本発明が参照材料を提供し得る多くの遺伝子スクリーンのいくつかを考慮する。遺伝子スクリーニングは、以下のような多数の目的のために実施され得る。
１．稀な疾患を引き起こす突然変異のスクリーニング；
２．一般的な疾患の素因を与えるＤＮＡバリアントのスクリーニング；及び
３．薬物応答に影響を与えるＤＮＡバリアントのスクリーニング。
【００２２】
これら三つの型の各々の例を以下に示す。引用された部分的な参照配列において、改変された塩基は、小文字の使用により示される。
【００２３】
Ｉ−遺伝学的障害を引き起こす遺伝子突然変異又はバリアント
Ｉ（ｉ）嚢胞性線維症
嚢胞性線維症は、出生約２５００例中１例に発生する、ヨーロッパ集団における一般的な（劣性）一遺伝子性疾患である。原因となる突然変異は多く存在するが、英国集団においては、９つの突然変異がＣＦ突然変異のおよそ８３％を占める［ＤＦ５０８−７５．３％；Ｇ５５１Ｄ−３．０８％；Ｇ５４２Ｘ−１．６８％；６２１＋１（Ｇ＞Ｔ）−０．９３％；１７１７−１（Ｇ＞Ａ）−０．５７％；１８９８＋１（Ｇ＞Ａ）−０．４６％；Ｒ１１７Ｈ−０．４６％；Ｎ１３０３Ｋ  ０．４６％；Ｒ５５３Ｘ−０．４６％］。
【００２４】
ＤＦ５０８  ＤＮＡ配列（ＴＴＴ欠失）：
ＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣｔｔｔＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣ
【００２５】
Ｉ（ii）鎌状赤血球性貧血
鎌状赤血球性貧血は、慢性貧血及び疼痛の定期的なエピソードを主な特徴とする遺伝性血液障害である。鎌状赤血球性貧血は、β−ヘモグロビン遺伝子（ＨＢＢ）の欠陥により引き起こされる常染色体劣性遺伝学的障害である。この疾患は、アフリカ系アメリカ人では出生５００例中約１例、スペイン系アメリカ人では出生１０００〜１４００例中１例に発生する。数百のＨＢＢ遺伝子バリアントが既知であるが、鎌状赤血球性貧血は最も一般的にはヘモグロビンバリアントＨｂ  Ｓにより引き起こされる。このバリアント（Ｅ６Ｖ）においては、ＨＢＢポリペプチド鎖の、アミノ酸の６位のグルタミン酸がアミノ酸バリンに取って代わられている。
【００２６】
ＮＣＢＩ  ＳＮＰクラスタＩＤ：ｒｓ３３４
ＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧａ/ｔＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧ
【００２７】
Ｉ（iii）筋緊張性ジストロフィー
筋緊張性ジストロフィーは、筋肉が収縮するが、弛緩する力が減少している優性遺伝病である。この状態では、筋肉が衰弱し消耗されてもいく。影響を受けていない個体は、プロテインキナーゼ遺伝子の３’非翻訳領域に５〜２７コピーの「ＣＴＧ三つ組反復」を有している。最小の影響を受けた筋緊張性ジストロフィー患者でも少なくとも５０個の反復を有しており、より重度の影響を受けた患者は、数キロ塩基対もの増大を有している。
【００２８】
II  障害の素因を与える遺伝子バリアント
II（ｉ）第二因子（プロトロンビン）
これは、血漿プロトロンビン・レベルの上昇及び静脈血栓症のリスクの増加に関連している、プロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域の２０２１０位におけるＧ→Ａトランジション変動である。微量（Ａ）対立遺伝子は、約１％の頻度で存在するため、このバリアントに関してヘテロ接合性の個体は、約２％の頻度で発生する。このバリアントに関してホモ接合性の個体は、極めて稀に、約１０，０００分の１の頻度で発生する。
【００２９】
ＮＣＢＩ  ＳＮＰクラスタＩＤ：ｒｓ１７９９９６３
ＧＴＴＣＣＣＡＡＴＡ  ＡＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＣＡＧＣｇ/ａＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣ
II（ii）第５因子
【００３０】
これは、アルギニンからグルタミンへのアミノ酸置換を引き起こす「１６９１」位におけるＧ→Ａバリアントである。やはり、これも、静脈血栓症のリスクに関連している。このバリアントに関してヘテロ接合性の個体は約５％の頻度で発生し、このバリアントに関してホモ接合性の個体は約１６５０分の１の頻度で発生する。
【００３１】
ＮＣＢＩ  ＳＮＰクラスタＩＤ：ｒｓ６０２５
ＴＣＴＧＴＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣｇ/ａＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＡ
【００３２】
II（iii）遺伝性血色素症
遺伝性血色素症は、一般的な（劣性）鉄過剰障害である。Ｃ２８２Ｙ及びＨ６３Ｄという二つの一般的な突然変異が存在する。Ｃ２８２Ｙ突然変異は、タンパク質産物のアミノ酸の２８２位におけるシステインからチロシンへの置換を生ずる、ＨＦＥ遺伝子のヌクレオチド８４５におけるＧ→Ａトランジション（８４５Ｇ→Ａ）に起因する。Ｈ６３Ｄ突然変異においては、遺伝子のヌクレオチド１８７のＧがＣに取って代わり（１８７Ｃ→Ｇ）、それにより、ＨＦＥタンパク質のアミノ酸の６３位のヒスチジンがアスパラギン酸に置換される。これらのバリアントのいずれかに関してホモ接合性又は複合ヘテロ接合性の個体は、鉄過剰疾患の増加したリスクを有している。英国集団において、Ｃ２８２Ｙは、約０．０７の対立遺伝子頻度を有しており、Ｈ６３Ｄは、約０．１４の対立遺伝子頻度を有している。
【００３３】
Ｈ６３Ｄ  ＤＮＡ配列：
ＧＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴｃ/ｇＡＴＧＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＣＧＡ
【００３４】
Ｃ２８２Ｙ  ＤＮＡ配列：
ＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＧＴｇ/ａＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣ
【００３５】
III−薬物応答に影響を与える遺伝子バリアント
III（ｉ）チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）
ＴＰＭＴ遺伝子の変動は、チオプリンクラスの薬物を代謝する個体の能力に影響を与える。研究は、３００人に１人の個体（０．３％）が低レベルのＴＰＭＴ酵素活性を有しているか、又はＴＰＭＴ酵素活性を全く有しておらず（ホモ接合性劣性）、１１％が中レベルの酵素活性を有しており（ヘテロ接合性）、そして８９％が正常〜高レベルの酵素活性を有している（ホモ接合性正常）ことを示している。ＴＰＭＴ検査によって、医師は、療法を開始する前に、チオプリンクラスの薬物に対する急性毒性を発症するリスクを有する患者を同定することができる。
【００３６】
４つのバリアントＴＰＭＴ対立遺伝子が同定されており（ＴＰＭＴ＊２、ＴＰＭＴ＊３Ａ、ＴＰＭＴ＊３Ｂ、ＴＰＭＴ＊３Ｃ）、これらが低〜中のＴＰＭＴ活性を有するカフカス人の約８０％を占めている。ＴＰＭＴ＊２は、ヌクレオチド２３８におけるＧ->Ｃ置換を含有しており、ＴＰＭＴ＊３Ａは二つのヌクレオチドトランジション突然変異（Ｇ４６０Ａ及びＡ７１９Ｇ）を含有している。ＴＰＭＴ＊３Ｂは、Ｇ４６０Ａのみを有しており、ＴＰＭＴ＊３ＣはＡ７１９Ｇのみを含有している。カフカス人の対立遺伝子頻度は、ＴＰＭＴ＊２−０．５％；＊３Ａ−４．５％；＊３Ｃ−０．３％である。
【００３７】
この一連の遺伝子スクリーンの例によって、当業者は、本発明の他の可能性のある適用を同定することができよう。上記の例においては短い配列のみが同定されているが、標準を使用したアッセイにおいて、同遺伝子バリアントを含有しているより長い配列が必要とされるのであれば、それらは、発表されている配列データを参照することにより容易に構築され得る。遺伝子バリアント（例えば、ＳＮＰ、突然変異、欠失、挿入等）は、便利に、その後のアッセイに必要とされるようなヒト遺伝子参照配列内の任意の位置に置かれ得る。しかしながら、いくつかのアッセイに関しては、ヒト遺伝子参照配列の中央へバリアントを位置づけることが特に有利である。また、好ましくは、ヒト遺伝子参照配列は、機能的な染色体でなく（即ち、宿主ゲノムから独立して安定的に複製することができず）、最も好ましくは、非動原体性である。
【００３８】
好ましくは、遺伝子検査と交差反応しない可能性が高いゲノムＤＮＡバックグランドを提供するため、ヒト遺伝子参照配列は非哺乳類真核細胞にクローニングされ得る。可能性のある種には、魚、カエル、昆虫、トリ及び植物のいくつかの種が含まれる。魚の中では、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ））細胞系が、この種のために利用可能な遺伝学的技術が多く蓄積されているため、特に適当である。植物界の中では、高い相同的組換え効率を天然に有しているため、蘚類フィスコミトレラパレンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）が特に魅力的な標的である（参照：Ｂｅｒｎｄ  Ｒ．「植物細胞における相同的組換え及び遺伝子ターゲティング（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ）」。Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ．２２８：８５−１３９，２００３及びＨｏｈｅ  Ａ，Ｅｇｅｎｅｒ  Ｔ，Ｌｕｃｈｔ  ＪＭ，Ｈｏｌｔｏｒｆ  Ｈ，Ｒｅｉｎｈａｒｄ  Ｃ，Ｓｃｈｗｅｅｎ  Ｇ  ＆  Ｒｅｓｋｉ  Ｒ．「改良された高度に標準化された形質転換法は蘚類フィスコミトレラパレンスにおける単一及び多重特異的遺伝子ノックアウトの効率的な作製を可能にする（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｓｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ−ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｓｓ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）」Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．４４：３３９−４７，２００４）。
【００３９】
組換えの頻度を増加させるためのアプローチが組み入れられてもよく、それは、当業者には明らかである。例には、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系（例えば、Ｋｏｉｋｅ  Ｈ，Ｈｏｒｉｅ  Ｋ，Ｆｕｋｕｙａｍａ  Ｈ，Ｋｏｎｄｏｈ  Ｇ，Ｎａｇａｔａ  Ｓ  ＆  Ｔａｋｅｄａ  Ｊ．「Ｃｒｅ／ｌｏｘＰにより媒介される染色体間組換えによる効率的な二対立遺伝子突然変異誘発（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．３：４３３−７，２００２；及びＢｏｄｅ  Ｊ，Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ，Ｉｂｅｒ  Ｍ，Ｓｃｈｕｂｅｌｅｒ  Ｄ，Ｓｅｉｂｌｅｒ  Ｊ，Ｓｎｅｚｈｋｏｖ  Ｅ  ＆  Ｎｉｋｏｌａｅｖ  Ｌ．「遺伝学者のツールボックス：真核生物ゲノムの特異的修飾のための新規の方法（Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ’ｓ  ｔｏｏｌｂｏｘ：ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３８１：８０１−１３，２０００参照）及びＰＡＲＰ阻害剤のような化合物（Ｓｅｍｉｏｎｏｖ  Ａ，Ｃｏｕｒｎｏｙｅｒ  Ｄ  ＆  Ｃｈｏｗ  ＴＹ．「１，５−イソキノリンジオールはマウス繊維芽細胞における相同的組換えによる遺伝子ターゲティングの頻度を増加させる（１，５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｄｉｏｌ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８１：１７−２４，２００３）の使用が含まれる。
【００４０】
トリ細胞系も、ゲノムＤＮＡがヒトのものとは実質的に異なるため、この目的に特に適している。ニワトリゲノムＤＮＡは、ヒトのものと実質的に異なるだけでなく、類似したサイズを有しているため（ヒトの３．２ギガ塩基に対しニワトリでは約１．２ギガ塩基）、これらの系のうちニワトリ（ガルス種）からの細胞は特に有利な異種宿主である。
【００４１】
ニワトリＢ細胞系ＤＴ４０（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４４：１３９−１５１，１９８５）は、組換え効率が高く、複数の組換え体コピー及びランダムな組込みに関連した不安定性の可能性を回避するため、この目的にとって特に有効な細胞系である。ＤＴ４０の遺伝子操作のための技術に関する既存の文献もかなり存在する。細胞の組換え機構を使用して、単一のＤＮＡ分子が、例えば、ターゲティングアームの使用により、明確な位置に組み込まれ得る。そのような技術は、下記の実施形態において例示される。
【００４２】
ヒト患者由来の試料において見られる状況を模倣するため、所望に応じて、ホモ接合体及びヘテロ接合体の両方が作製され得る。
【００４３】
この開示の教示によって、異なる遺伝子検査のための多数の操作された細胞系の構築を容易にするため、全ての必要とされるＤＮＡ断片を供給する単一ターゲティング構築物が、構築され得る。又は、同一のターゲティングアームを有するが、異なる抗生物質耐性遺伝子を有する１対の構築物（下記参照）が、ヘテロ接合体の作製のために使用されてもよい。最後に、複数の組換え部位の使用により、複数の参照断片を保持している単細胞系が作製され得る。このアプローチは、抗生物質耐性マーカーの再使用を可能にする、突然変異型ＬｏｘＰ部位の使用により容易になるかもしれない。
【００４４】
ターゲティングベクターの設計の方法は当業者に既知であり、以下の出典が参照のため同定される。
Ｖａｓｑｕｅｚ  ＫＭ，Ｍａｒｂｕｒｇｅｒ  Ｋ，Ｉｎｔｏｄｙ  Ｚ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＨ．（２００１）相同的組換えによる哺乳動物ゲノムの操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ．９８：８４０３−１０。
Ｍｕｌｌｅｒ  Ｕ．（１９９９）遺伝子ターゲティングの１０年：特異的マウス突然変異体、ベクターの設計から表現型の分析まで（Ｔｅｎ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ，ｆｒｏｍ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．８２：３−２１。
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐ，Ｋｉｍｂｅｒ  ＷＬ，Ｋｉｌａｎｏｗｓｋｉ  ＦＭ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＢＪ，Ｐｏｒｔｅｏｕｓ  ＤＪ  ＆  Ｄｏｒｉｎ  ＪＲ．（１９９３）挿入ベクターを使用した高頻度遺伝子ターゲティング（Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２：１２９９−３０２。
Ｍｏｒｒｏｗ  Ｂ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ．（１９９３）相同的組換えによる哺乳動物細胞における遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７７−８２。
Ｗｉｌｌｎｏｗ  ＴＥ  ＆  Ｈｅｒｚ  Ｊ．（１９９４）マウス細胞系における遺伝子置換のための相同的組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；４３  Ｐｔ  Ａ：３０５−３４。
Ｂｒｏｎｓｏｎ  ＳＫ，Ｐｌａｅｈｎ  ＥＧ，Ｋｌｕｃｋｍａｎ  ＫＤ，Ｈａｇａｍａｎ  ＪＲ，Ｍａｅｄａ  Ｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ．（１９９６）選択された部位への組込みを有する１コピートランスジェニックマウス（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｐｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｃｈｏｓｅｎ−ｓｉｔｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９３：９０６７−７２。
Ｊａｃｅｎｋｏ  Ｏ．（１９９７）トランスジェニック哺乳動物作製の戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｍｍａｌｓ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６２：３９９−４２４。
【００４５】
以下に本発明の実施形態を記載する。これらの実施例において、ベクター構築は、制限エンドヌクレアーゼに基づくインビトロ技術の使用によっているが、記載されたスキームからの逸脱には、ベクターの構築、及び大腸菌又は酵母の相同的組換え系を使用したヒト配列のベクターへの挿入が含まれ得ることが認識される。
【００４６】
添付された図面を参照することにより、本発明を説明する。
【００４７】
実施形態１
この実施形態は、ニワトリＤＴ４０細胞系のゲノムの非必須領域へのヒト遺伝子参照配列の挿入により、遺伝子参照標準を作出するために、本発明が実施され得る方式を例示する。
【００４８】
図１は、本発明を実行するために使用され得るターゲティングベクターを概略的に示している。ベクター、一般に１は、ターゲティングプラスミドの構築の細菌の段階において使用されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列２、左ターゲティングアーム３、参照材料として機能するヒトＤＮＡ断片４、抗生物質耐性遺伝子５及び右ターゲティングアーム６を含む。ターゲティングアームは、ヒト配列及び抗生物質耐性遺伝子のＤＴ４０ゲノムの特定の部位への組み込みを可能にする、相同的組換えのためのニワトリＤＮＡ配列を保持している。抗生物質耐性遺伝子５には、突然変異ＬｏｘＰ部位７、８が隣接していてもよい。図１に示された実施例においては、ＬｏｘＰ  ＲＥ突然変異体７及びＬｏｘＰ  ＬＥ突然変異体８が存在する。これらのＬｏｘＰ部位は、ベクター配列がニワトリゲノムに組み込まれた後、酵素ＣＲＥリコンビナーゼの使用による抗生物質耐性遺伝子の除去を可能にする。この技術は、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００１，１：７に記載されている。抗生物質耐性遺伝子に隣接するよう突然変異ＬｏｘＰ部位を置くことによって、その後の抗生物質耐性遺伝子の除去が可能となり、修飾された細胞系における任意のさらなる遺伝子ターゲティングイベントにおけるその抗生物質選択マーカーの再使用が容易になる。ターゲティングベクター１は、電気穿孔によってベクターを宿主ＤＴ４０細胞系へ導入する前に、制限酵素による分解によってベクターを直鎖化することを可能にする、唯一の制限酵素部位９も有している。トランスフェクションのその他の方法は、当業者には明白である。
【００４９】
典型的には、ターゲティングアーム３、６は、各々、２〜５キロ塩基のサイズである。ヒトＤＮＡにおいて、ヒトＤＮＡ断片は、典型的には約１キロ塩基のサイズであり、バリアント塩基は、断片の中央に位置付けられる。
【００５０】
この実施例において、ヒト遺伝子参照配列４は、ＤＴ４０ゲノムの非必須領域に挿入されることになっている。適当な非必須領域は、二つの関連遺伝子、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２によりコードされた高移動度タンパク質Ａ（ＨＭＧＡ）ファミリーの非ヒストン染色体タンパク質をコードする遺伝子である。ＨＭＧＡ遺伝子ファミリーは、ＤＴ４０細胞の増殖に必須ではないことが、Ｂｅｉｔｚｅｌ及びＢｕｓｈｍａｎ（「ＨＭＧＡ遺伝子ファミリーを欠く細胞の構造及び分析（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＭＧＡ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ  １：３１（１７）：５０２５−３２）によって示されている。彼らは、ＨＭＧＡ１又はＨＭＧＡ２のいずれか又は両方の欠失の後、およそ４，０００のニワトリ遺伝子の活性の有意な変化を見出さなかった。彼らは、ＨＭＧＡタンパク質がＤＴ４０細胞の増殖制御に厳密には必要とされないとの結論を下した。従って、ＤＴ４０ゲノムのこの領域は、ヒト遺伝子参照配列４の挿入のための適当な標的である。その他は、文献（例えば、Ｌｉ  Ｙ，Ｓｔｒａｈｌｅｒ  ＪＲ，Ｄｏｄｇｓｏｎ  ＪＢ．ＨＭＧ−１４ａ遺伝子の機能もＨＭＧ−１７遺伝子の機能もニワトリＤＴ４０細胞の増殖又はＤＮａｓｅＩ高感受性部位の維持に必要とされない（Ｎｅｉｔｈｅｒ  ＨＭＧ−１４ａ  ｎｏｒ  ＨＭＧ−１７  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＤＴ４０  ｃｅｌｌｓ  ｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮａｓｅＩ−ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊａｎ  １５；２５（２）：２８３−８）又は配列データベースを参照することにより、当業者によって容易に見出され得る。
【００５１】
従って、左ターゲティングアーム３及び右ターゲティングアーム６は、ＨＭＧＡ遺伝子ファミリーの発表されている配列を参照することにより構築され得る。従って、プラスミド１４は、これらのターゲティングアーム３及び６並びにヒト遺伝子参照配列４を使用して、よく確立されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物を使用して構築され得る。適当な抗生物質耐性マーカー５は、当業者には明らかであり、例えば、ネオマイシン、プラマイシン（Ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）又はプラストサイジン（Ｐｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を含む。これらの抗生物質耐性遺伝子は、ニワトリＢ−アクチンプロモーターにより駆動され得る。プラスミドの構築の詳細なプロトコルは、この教示により、当業者には直ちに明らかになる。
【００５２】
プラスミド１の構築の後、当業者は、例えば、制限部位９に特異的な制限酵素によりプラスミド１を直鎖化し、例えば、電気穿孔により直鎖化された構築物をＤＴ４０へ導入することにより、宿主ＤＴ４０細胞を形質転換することが容易にできる。
【００５３】
実施形態２
この実施形態は、二対立遺伝子遺伝子参照標準を作出するために、如何にして本発明が実施され得るかを証明する。
【００５４】
図２は、細胞系構築過程の最初の部分を例示する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列２、左ターゲティングアーム３及び右ターゲティングアーム６並びに抗生物質耐性マーカー１５を、適切なプロモーターと共に含有しているプラスミド１４が例示されている。プラスミドは突然変異ＬｏｘＰ部位７及び８も有している。対立遺伝子のうちの一つを構成する第一のヒト遺伝子参照配列は、１６として例示されている。
【００５５】
この第一工程において形質転換される宿主ＤＴ４０細胞は、クローニング部位において例示された二つのネイティブニワトリＤＮＡ対立遺伝子１２及び１３と共に、１１により表されている。
【００５６】
プラスミド１４の宿主細胞１１への導入の後の組換えの後には、三つの細胞型が存在し得る。細胞型１７は、組み込まれたヒト遺伝子参照配列１６並びに二つの突然変異ＬｏｘＰ部位７及び８が隣接している抗生物質耐性マーカー１５を含有しているヘミ接合体を表す。ヒト遺伝子参照配列１６、抗生物質耐性マーカー１５、並びに二つの突然変異ＬｏｘＰ部位７及び８に関してホモ接合性の細胞１８も存在し得る。最後に、形質転換されていない細胞１９の集団が存在する。
【００５７】
未形質転換細胞１９は、適切な抗生物質を用いた選択により排除され得、ヘミ接合体１７及びホモ接合体１８の混合された集団が残る。ランダムな（即ち、標的部位においてではない）組み込みによるプラスミド由来の遺伝子材料の付加的なコピーを含有しているいくつかの細胞も存在し得る（例示されていない）。この混合培養物からのクローン性亜集団は、例えば、希釈技術又はフローサイトメトリーにより補助された細胞分取の使用により、当業者によって容易に作製され得る。（クローン性亜集団を作製するためにフローサイトメトリーを使用することが望まれる場合には、蛍光補助細胞分取による所望の細胞の分離を可能にするため、緑色蛍光タンパク質（又は類似の蛍光タンパク質）の遺伝子が、ランダム組込み体においては保持され発現されるが、標的化組込み体からは排除され得るよう、ターゲティング構築物の一端に便利に付加され得る。）次いで、これらのクローン性細胞系は、例えば、ＰＣＲ及びサザンブロッティングを使用して、ヒト遺伝子参照配列１６に関してヘミ接合性の系１７を選択するためにスクリーニングされ得る。
【００５８】
次いで、このヘミ接合性の細胞系１７は、図３に例示される手法の第二段階のための宿主として使用される。第二のプラスミド２０が、過程のこの段階において使用される。やはり、これも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔエレメント２、左及び右ターゲティングアーム３及び６、ならびに唯一の制限部位９を含有し得る。この第二のプラスミド２０は、図２に例示された第一のマーカー１５とは別個の、第二の抗生物質耐性マーカー２１も含有している。この第二のマーカー２１には、やはり、突然変異ＬｏｘＰ部位７及び８が隣接していてもよい。この第二のプラスミド２０には、第二のヒト遺伝子参照配列２２が含まれている。これは、ホモ接合性の細胞系を作出するため、第一段階において使用されたものと同一であってもよいし、又はヘテロ接合性の標準を作出するため、ＳＮＰを含まないヒト遺伝子参照配列であってもよい。
【００５９】
ヘミ接合性の細胞系１７を出発宿主として使用し、この第二のプラスミド２０を使用して、前記と同様にして組み換えが実施され得る。これに起因する優勢な細胞型は、両方の抗生物質耐性マーカー１５、２１、並びに両方のヒト遺伝子参照配列１６及び２２を含有しているヘテロ接合体２３である。これらの配列が第一段階において挿入されたものと交換された、第二のマーカー２１及び配列２２に関してホモ接合性のいくつかの細胞型２４も存在するかもしれない。ヘミ接合性である、即ち、この第二段階においては組み換えが起こらなかった細胞１７も存在する。これらは、抗生物質の存在に対して選択される。ヘテロ接合性の細胞２３は、両方の抗生物質選択マーカーの使用により選択され得る。次いで、二つの参照配列及び非突然変異ＬｏｘＰ部位２５のみを含有している遺伝子参照標準細胞２４を作製するため、Ｃｒｅリコンビナーゼの使用により、耐性マーカー１５及び２１がこれらのヘテロ接合性の細胞２３から除去され得る。
【００６０】
本発明は、以下の特許請求の範囲に記載されるが、その中で、「ヒト遺伝子参照配列」という用語は、ヒト対象のＤＮＡにおけるその存在が、病理学的状態、病理学的状態の素因又は外部刺激に対する有害な反応の素因の指標となるような遺伝子バリアントを、少なくとも一つ含有しているヒトＤＮＡ配列を含む。遺伝子バリアントは、患者の治療的介入に対する可能性の高い応答の指標となるもの、即ち、薬理遺伝学的分析において使用されるバリアントであってもよい。該遺伝子バリアントは、ヒト集団において最も一般的な配列と比べた一つ以上の塩基の変化、挿入又は欠失を含み、一塩基多型（ＳＮＰ）、突然変異、塩基又は配列の挿入、塩基又は配列の欠失及びタンデム反復の長さの変化を含む。本発明の一実施形態において、標準が対照として使用される場合、「バリアント」自体が最も一般的な配列を含んでいてもよい。参照配列は、その全長が少なくとも３５塩基であり、３０キロ塩基を越えないことを特徴とする。いくつかの適用に関しては、参照が使用されるアッセイにおける検出を可能にするため、参照配列の最小の長さは、１００塩基超である必要があるかもしれない。５００塩基という長さは、ほぼ全ての適用にとって十分であるが、この教示の範囲内で、当業者は、ルーチンの実験により、さらなる本発明の考慮なしに、適切な長さを容易に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒト遺伝子参照配列の適当な細胞系への導入のための適当なターゲティングベクターを例示する。
【図２】ヒト遺伝子参照配列の適当な細胞系への導入のための適当なターゲティングベクターを、そのようにして作製される一連の細胞と共に、例示する。
【図３】ヘテロ接合性の細胞系が作製され得るターゲティングベクター及びスキームを例示する。
【符号の説明】
【００６２】
１    左ターゲティングベクター
２    ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列
３    ターゲティングアーム
４    ヒト遺伝子（ＤＮＡ）断片
５    抗生物質耐性遺伝子
６    右ターゲティングアーム
７    ＬｏｘＰ  ＲＥ変異体
８    ＬｏｘＰ  ＬＥ変異体
９    制限酵素部位
１１    宿主細胞
１２    ネイティブニワトリＤＮＡ対立遺伝子
１３    ネイティブニワトリＤＮＡ対立遺伝子
１４    プラスミド
１５    抗生物質耐性マーカー
１６    ヒト遺伝子参照配列
１７    ヘミ接合体
１８    ホモ接合体
１９    未形質転換細胞
２０    第二のプラスミド
２１    第二のヒト遺伝子参照配列
２２    ヒト遺伝子参照配列
２３    ヘテロ接合性の細胞
２４    細胞型
２５    非突然変異ＬｏｘＰ部位
【図１】
2007513623.tif 000003
【図２】
2007513623.tif 000004
【図３】
2007513623.tif 000005
【国際調査報告】
2007513623.tif 000006
2007513623.tif 000007