(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の２−フェニル−ベンゾフラン化合物（これは、発酵の間に微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）によって形成される）、その製造のための方法、並びに細菌性感染症又は真菌症の処置及び／又は予防のための薬剤としての使用に関する。【化１】2007512238.tif 000018
2007512238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2007512238.tif 000013
（式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立してＨ、ＯＨ又は−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、互いに独立してＨ、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル又は−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルである）
の化合物、又は該式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がＨである請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7が、互いに独立してＨ又はメチルである請求項１又は２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
式（II）
【化２】
2007512238.tif 000014
の化合物によって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
式（III）
【化３】
2007512238.tif 000015
の化合物によって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
式（IV）
【化４】
2007512238.tif 000016
の化合物によって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
式（Ｖ）
【化５】
2007512238.tif 000017
の化合物によって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
１．１つ又はそれ以上の式（Ｉ）の化合物が培養基中に生じるまで、培養基中で微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）又はその変異体及び／若しくは突然変異体のうちの１つを発酵させ、
２．培養基から式（Ｉ）の化合物を単離し、そして
３．必要によって式（Ｉ）の化合物を誘導体化するか、そして／又は式（Ｉ）の化合物を生理学的に許容される塩に転換する、
ことを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【請求項９】
発酵の間に、式（II）の化合物を工程１において形成させ、式（II）の化合物を工程２において単離し、そして工程３において、必要によって式（II）の化合物を誘導体化して、式（Ｉ）の化合物を得るか及び／又は生理学的に許容される塩に転換する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト又は動物の医療における医薬品を製造するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項１１】
細菌性感染症及び／又は真菌症の処置及び／又は予防用医薬品を製造するための、請求項１０に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの本発明の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容される塩を含有する医薬品。
【請求項１３】
少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を、１つ又はそれ以上の薬理学的に適切な補助物質又はキャリア物質と混合する工程を含む、請求項１２に記載の医薬品の製造方法。
【請求項１４】
微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２−フェニル−ベンゾフラン誘導体、その製造方法及びその使用に関する。  
【背景技術】
【０００２】
多くの抗生物質が、細菌によって引き起こされる感染症の処置のために治療的に利用される。しかし病原体は、利用される薬物にますます耐性になってきている。多耐性生物と称される生物に起因して生じる深刻な危機の脅威さえ存在し、この生物は、単に１つの抗生物質群（例えば、β−ラクタム抗生物質、糖ペプチド又はマクロライド）に耐性になるだけではなく、実際に同時にいくつかの耐性を保有する。市販のすべての抗生物質に耐性になる病原体さえ存在する。これらの生物によって引き起こされる感染症を処置することは、もはや不可能である。この理由のために、耐性生物に対して使用され得る新規の組成物に対する多大な必要性が存在する。何千もの抗生物質が文献に記載されているが、これらの大半は、極めて有毒性なので薬物として使用されることができない。
【０００３】
グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の細胞壁は、大半の部分についてペプチドグリカン（ムレイン）からなり、これは、ムレインサキュルスと称されるように細胞を完全に取り囲み、そしてその機械的安定性を与え、並びにその形態学的形状を決定するのに役立つ。ペプチドグリカンは高分子であり、これは、１,４−β−グリコシド結合したアミノ糖Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルムラミン酸の交互配列から構成される。短いペプチドブリッジを経由した架橋は、糖鎖に高度の安定性を提供する。ペプチドグリカンの生合成は、多くの酵素によって触媒され、これらの酵素は、細胞質中に溶解されるか、又はそうでなければ膜に結合される。これらの酵素の多くは、細菌に特異的であり、そして新規の抗生物質の探索において理想的な攻撃点を表す。
【０００４】
二価の細菌性Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧｌｍＵ）は、二段階反応においてグルコサミン−１−リン酸からＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの形成を触媒する。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、細菌性細胞壁の生合成における基礎的な基本成分であり、従ってその形成の阻害は、新規の抗菌性治療薬剤の発見のための有望な経路である（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１、２７６（１５）、１１８４４〜１１８５１）。
【０００５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓの培養物由来の化合物の報告がすでに存在している（例えば、ｆｌａｖｉｐｉｎ（Ｒａｉｓｔｒｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５６、６３、３９５）（これは、呼吸鎖のインヒビターであると記載されている）、及びｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎ  ｆｌａｖｉｐｕｃｉｎｅ（Ｆｉｎｄｌａｙら、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ  １９７２、２０７１）又は化合物Ｆ−９０５５８（Ｋｕｒａｙａら、ＪＰ  ２００１２８６２２９２  Ａ２）（これは、抗新生物因子であると記載されている））。ピリミジン−２−イルアミン置換されたフェニルベンゾフランは、例えば、Ｂｕｒｒｉら、ＷＯ  ０２／１０１５６に記載される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
驚くべきことに、株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）は、新規の抗生物質を形成し得、この抗生物質は、ＧｌｍＵの有効なインヒビターであり、そして抗菌活性を有するさらなる薬剤の開発のためのモデル構造としての使用に適切であることがここで見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の式（Ｉ）
【化１】
2007512238.tif 000003
（式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立してＨ、ＯＨ又は−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、互いに独立してＨ、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル又は−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルである）
の化合物、又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩に関する。
【０００８】
（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルは、６つの炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の炭化水素基（例えば、メチル（Ｍｅ）、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル又はｎ−ヘキシル）を示し、好ましくはメチルである。
【０００９】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1及びＲ2がＨであることが好ましい。
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7が、互いに独立してＨ又はメチルであることがさらに好ましい。
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1及びＲ2がＨであり、そしてＲ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7が、互いに独立してＨ又はメチルであることが特に好ましい。
【００１０】
さらに本発明は、以下の式（II）の化合物、
【化２】
2007512238.tif 000004
以下の式（III）の化合物、
【化３】
2007512238.tif 000005
以下の式（IV）の化合物、
【化４】
2007512238.tif 000006
及び以下の式（Ｖ）の化合物
【化５】
2007512238.tif 000007
によって特徴付けられる式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の式（Ｉ）の化合物のすべての明白な化学的等価物に関する。これらの等価物は、わずかな化学的差異を示し、そしてその結果として等しい効果を有する化合物であるか、又は穏やかな条件下で、本発明の化合物に転換される化合物である。上記の化合物としてはまた、例えば、式（Ｉ）の化合物の塩、還元生成物、酸化生成物、エステル、エーテル、アセタール又はアミド、並びに当業者が標準的な方法を用いて製造し得る等価物、並びにさらにすべての光学対掌体及びジアステレオマー、並びにすべての立体異性形態が挙げられる。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、１４１８頁（１９８５））に記載されるようなその有機塩及びその無機塩の両方であることが理解される。その物理学的及び化学的安定性、並びにその溶解性のために、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びアンモニウム塩がとりわけ酸性群として好ましく、塩酸塩、硫酸塩及びリン酸塩、又はカルボン酸塩若しくはスルホン酸塩、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩及びｐ−トルエンスルホン酸塩がとりわけ塩基性群として好ましい。
【００１３】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、慣習的な抗生物質（例えば、β−ラクタム（ペニシリン及びセファロスポリン）、アミノグリコシド（ストレプトマイシン）、マクロライド（エリスロマイシン）、キノロン（シプロフロキサシン）、スルホンアミド並びに糖ペプチド（バンコマイシン））とは無関係である。
【００１４】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の製造方法に関し、その方法は、以下の工程、
１．１つ又はそれ以上の式（Ｉ）の化合物が培養基中に生じるまで、培養基中で微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）又はその変異体及び／若しくは突然変異体のうちの１つを発酵させる工程と、並びに
２．この培養基から式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、並びに
３．しかるべき場合に、式（Ｉ）の化合物を誘導体化するかそして／又は生理学的に許容される塩に転換する工程、
を含む。
【００１５】
本発明は好ましくは、式（Ｉ）の化合物の製造方法に関し、ここで工程１において、発酵の間に式（II）の化合物を形成し、工程２において、式（II）の化合物を単離し、そして工程３において、必要によって式（II）の化合物を誘導体化して式（Ｉ）の化合物を与えるか及び／又は生理学的に許容される塩に転換する。
【００１６】
この方法は、培養基中において好気性条件下でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）を培養する工程を含み、この培養基は、炭素源、窒素源、無機塩及必要によって微量元素を含む。この培養基において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）は、式（Ｉ）の化合物の混合物を形成する。１つ又はそれ以上の本発明の化合物の量的比率は、培養基の組成に依存して変化され得る。さらにこの培養基の組成は、個々の化合物の合成を駆動するために使用され得る。
【００１７】
発酵に適切な炭素源は、同化可能な炭水化物及び糖アルコール（例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、グリセロール、デンプン又はＤ−マンニトール）、及びまた炭水化物含有天然物（例えば、麦芽抽出物及び酵母抽出物）である。窒素含有栄養素の例は、アミノ酸；ペプチド及びタンパク質並びにまたそれらの分解産物（例えば、カゼイン、ペプトン又はトリプトン）；肉抽出物；酵母抽出物；グルテン；地上の種（例えば、トウモロコシ由来、コムギ由来、オートムギ由来、マメ由来、ダイズ由来又はワタ由来）；アルコール産物由来の蒸留残留物；肉のひき割り；酵母抽出物；アンモニウム塩；硝酸塩である。窒素源が、合成的又は生合成的に得られる１つ又はそれ以上のペプチドであることが好ましい。無機塩の例は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルト及びマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩である。微量元素の例は、コバルト及びマンガンである。
【００１８】
培養基は好ましくは、グルコース、デンプン、ロールドオート及び／又はグリセロールを含む。
【００１９】
本発明の化合物は、特に好ましくは栄養液中で形成され、この栄養液は、約０.０５％〜５％、好ましくは２％〜３％のジャガイモデンプン、及び約０.０５％〜３％、好ましくは０.０５％〜１％の酵母抽出物を含む。パーセント値は、各々の場合において栄養液全体の重量に基づく。
【００２０】
微生物は、好気的に培養され、すなわち例えば、振盪フラスコ若しくは発酵槽中で振盪若しくは撹拌されながら水中に浸漬されるか、又は固形培地上で、しかるべき場合に空気若しくは酸素を導入しながら培養される。この微生物は、約１５℃〜３５℃の範囲の温度で、好ましくは約２０℃〜３０℃、特に２５℃で培養され得る。ｐＨ範囲は、３と１０との間、好ましくは４.５と６.５との間にあるべきである。一般に、この微生物は、これらの条件下で２〜３０日間、好ましくは７２時間〜３６０時間にわたって培養される。この生物は有利に、いくつかの工程において培養され、すなわち１つ又はそれ以上の予備培養物が、液体栄養培地において最初に調製され、次いでこれらの予備培養物が、実際の産生培地に例えば、１：１０〜１：１００の容量比で接種される（すなわち本培養）。この予備培養物は、例えば、菌糸体を栄養液に接種し、そして約７２時間〜３６０時間、好ましくは９６時間〜２４０時間成長させることによって得られる。この菌糸体は、例えば、株を約１日〜２０日間、好ましくは６日〜１０日間、固形又は液体の栄養基質（例えば、酵母麦芽寒天、ロールドオート寒天又はジャガイモデキストロース寒天）上で成長させることによって得られ得る。
【００２１】
発酵の経過及び本発明の式（Ｉ）の化合物の形成は、当業者に公知の方法に従ってモニターされ得、例えば、バイオアッセイにおいて生物学的活性を検出することによって、又はクロマトグラフ的方法（例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）若しくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によってモニターされ得る。
【００２２】
菌類Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）は、例えば、固形栄養基質上での表面培養又は静置培養によって式（Ｉ）の化合物を形成し得る。固形栄養基質は、例えば、寒天又はゼラチンを水性栄養培地に添加することによって調製される。しかし、菌類Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）を水中に浸漬しながら（すなわち水性懸濁液において）発酵させることによって式（Ｉ）の化合物を得ることがまた可能であり、化合物（Ｉ）は通常、培養細胞集団中に位置する。従って、濾過又は遠心分離によって発酵溶液を分離することが好都合である。この濾液は、固相として吸着樹脂を用いて抽出される。菌糸体及び表面培養物は、有機溶媒を用いて好都合に抽出され、この有機溶媒は、水と混和性又は部分的に混和性であり、例えば、（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコール、好ましくはメタノール又は２−プロパノールである。
【００２３】
抽出は、広いｐＨ範囲にわたって実行され得るが、中性又は弱酸性の媒体、好ましくはｐＨ３とｐＨ７との間の媒体において、しかるべき場合に還元剤の付加存在下において実行することが好都合である。この抽出物は、例えば、真空中で濃縮及び乾燥され得る。
【００２４】
本発明の化合物を精製する１つの方法は、それ自体公知の様式における固定相と移動相との間の溶液分配の方法であり、例えば、吸着樹脂（例えば、Ｄｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ−２０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃａｓｅｉ  Ｃｏｒｐ.，Ｔｏｋｙｏ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ  ７（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，ＵＳＡ）又はＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（登録商標）ＣＧ（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ））上のクロマトグラフィーによる。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の文脈内で周知のような非常に多くの逆相支持体（例えば、ＲＰ8及びＲＰ18）がまた適切である。
【００２５】
本発明の抗生物質を精製するための別の可能性は、それ自体公知の様式における順相クロマトグラフィー支持体と称される支持体（例えば、シリカゲル若しくはＡｌ2Ｏ3又は他の支持体）の使用である。
【００２６】
別の単離方法は、それ自体公知の様式におけるモレキュラーシーブ（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＳＫ  ＨＷ−４０（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））の使用である。これに加えて、結晶化を用いて濃縮物質からｂｉｆｌａｖｉｐｉｎをまた単離し得る。有機溶媒及びそれらの混合物（無水又は水が付加された状態のいずれか）が、例えばこの目的に適切である。本発明の抗生物質を単離及び精製するためのさらなる方法は、好ましくはｐＨ４〜１０の範囲におけるアニオン交換体の使用、及び好ましくはｐＨ２〜５の範囲におけるカチオン交換体の使用からなる。有機溶媒の一部分が付加されている緩衝液の使用が、この目的に特に適切である。
【００２７】
微生物株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８の単離物は、ブタペスト条約の規則に従って、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １Ｂ，３８１２４  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙにおいて番号ＤＳＭ  １５２９０の下で寄託された。
【００２８】
菌類Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）は、白色の基質菌糸体を有する。胞子形成の間、菌糸体の色は、黄色から褐色に変化する。約１０日目のＣｚａｐｅｋ寒天培地上の培養物は、多量の黄色から褐色がかった滲出物を形成する。分生子は、無色及び円形であり、２〜３μｍの直径を有する。第一の小柄及び第二の小柄は、類似した長さ（５〜６μｍ）であり、そして色は褐色である。
【００２９】
株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）の代わりに、本発明の式（Ｉ）の化合物のうちの１つを産生し得るその突然変異体及び／又は変異体のうちの１つを使用することがまた可能である。
【００３０】
突然変異体は、ゲノム中の１つ又はそれ以上の遺伝子が改変されている微生物であり、本発明の場合において、生物が１つ又はそれ以上の式（Ｉ）の化合物を産生する能力を担う遺伝子（１つ又は複数）は機能的なままであり、そして遺伝される。
【００３１】
これらの突然変異体は、それ自体公知の様式において、物理学的手段（例えば、紫外線若しくはＸ線を用いるような照射）を用いて、又は化学的突然変異原（例えば、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）若しくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ））を用いて、又はＢｒｏｃｋら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，２３８〜２４７頁（１９８４）に記載されるように作製され得る。
【００３２】
変異体は、微生物の表現型である。微生物は、環境に適応する能力を有し、従って顕著な生理学的柔軟性を示す。表現型適応の場合において、微生物のすべての細胞が関係され、変化の本質は遺伝的に調節されず、そして変更された環境下において可逆的である（Ｈ．Ｓｔｏｌｐ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｃｏｌｏｇｙ：ｏｒｇａｎｉｓｍ，ｈａｂｉｔａｔｓ，ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＧＢ，１８０頁、１９８８）。
【００３３】
１つ又はそれ以上の本発明の化合物を合成する突然変異体及び／又は変異体についてのスクリーニングは、以下のスキームに従って達成される。
- 発酵培地の凍結乾燥
- 凍結乾燥物の有機溶媒での抽出
- 固相を用いた培養濾液からの化合物の抽出
- ＨＰＬＣ若しくはＴＬＣによる分析、又は生物学的活性の試験による分析
【００３４】
上記の発酵条件は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）並びにその突然変異体及び／又は変異体の両方に適用される。
【００３５】
誘導体化は、以下の通りに実行される。式（Ｉ）の化合物のヒドロキシル基（Ｒ3〜Ｒ7は、互いに独立してＨである）を、活性酸、好ましくは酸塩化物Ｃｌ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルを用いてエステル化し得る（Ｒ3〜Ｒ7は、互いに独立して−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルである）。さらにヒドロキシル基を、例えば、酸性媒体中での（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルハロゲン化物との反応によって、又はトリメチルシリルジアゾ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル化合物、好ましくはトリメチルシリルジアゾメタンとの反応によってエステル化し得る。フェニル性アルデヒド官能基（Ｒ1及び／又はＲ2は、Ｈである）を、例えば、酸化マンガン又はＪｏｎｅｓ試薬（硫酸クロム（ＶＩ）オキシド（ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ｃｈｒｏｍｉｕｍ（VI）  ｏｘｉｄｅ）を用いて酸官能基に酸化させる。この結合において形成される酸官能基を、Ｓｔｅｇｌｉｃｈ条件下で４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）によって、又は酸性媒体において（Ｃ1〜Ｃ6）−アルコールを用いてエステル化し得る。上記の誘導体化は、それ自体公知の方法の例であり、そしてとりわけ、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，第４版、１９９２に記載される。この反応を選択的に実行するために、それ自体公知の様式において、反応の前に保護基を導入することが有利であり得る。この保護基を反応後に除去し、次いで反応生成物を精製する。
【００３６】
本発明の化合物は、細菌性Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧｌｍＵ）の強力なインヒビターである。従って、本発明の化合物は、細菌性感染又は真菌症によって引き起こされる疾患の処置及び／又は予防に適する。
【００３７】
ＧｌｍＵの阻害は、以下の方法を用いた生化学的試験において決定され得る。
アッセイを、３８４プレートフォーマットにおいて実行した。反応容量は、１試験当たり４０μｌであった。この反応混合物は、試験物質１０μｌ、並びにアセチルＣｏＡ及びＤ−グルコサミン−１−リン酸からなる基質溶液１５μｌを含んだ。酵素反応を、ＧｌｍＵ酵素溶液１５μｌの添加によって開始した。３０℃での６０分間のインキュベーション後、反応を、現像試薬（グアニジンに溶解したＤＴＮＢ）１０μｌの添加によって停止した。次いでこのプレートを遠心分離し（１分間、１０００ｒｐｍ）、そして、吸収を光度計において４０５ｎｍで読む前に室温でさらに４５分間保管した。試験化合物の阻害活性を計算し得るために、ポジティブコントロール（ＧｌｍＵを含むシグナル）及びネガティブコントロール（ＧｌｍＵを含まないシグナル）を、各プレートに含めた。非特異的な物質の影響（例えば色）によって引き起こされ得る偽のポジティブサンプルを除外するために、物質を含むがＧｌｍＵを含まないブランクプレートを、試験プレートと並行して含めた。ブランクについての補正後、この物質の阻害活性を、以下の式に従って計算した。
阻害(％)＝１００×［１−(ＯＤ405nm物質／ＯＤ405nmポジティブコントロール)］
【００３８】
１μＭの阻害定数、ＩＣ50を、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧｌｍＵ）に対する式（II）の化合物の阻害効果について決定した。
【００３９】
従って本発明はさらに、ヒト又は動物の医療における医薬品を製造するための、特に細菌性感染症及び／又は真菌症の処置及び／又は予防についての医薬品を製造するための式（Ｉ）の化合物、好ましくは式（II）の化合物又はそれらの生理学的に許容される塩の使用に関する。
【００４０】
さらに本発明は、少なくとも１つの本発明の式（Ｉ）の化合物の含有量を有する医薬品、好ましくは式（II）の化合物の含有量を有する医薬品に関する。
上記の医薬品は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を、１つ又はそれ以上の薬理学的に適切な補助物質又はキャリア物質と混合し、そしてこの混合物を投与に適切な形態にすることによって製造される。
【００４１】
本発明の医薬品は、経口的又は非経口的に投与され得るが、直腸を介してこの医薬品を使用することがまた原理上可能である。適切な固体又は液体のガレヌス製剤（ｇａｌｅｎｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の形態の例は、顆粒剤、散剤、錠剤、糖衣錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ剤、エマルジョン、懸濁剤、エーロゾル、ドロップ、又はアンプル形態における注入可能溶液、及びまた活性化合物の遅延性放出を与える製剤であり、これらの使用において、製品は、薬理学的に適切なキャリア物質又は補助物質（例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、グライダ、潤滑剤、香味剤、甘味剤又は可溶化剤、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他の糖、タルク、ラクトアルブミン、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース及びその誘導体、動物油又は植物油、ポリエチレングリコール並びに溶媒（例えば、水、アルコール、グリセロール及び多価アルコール））から慣習的に作製される。
【００４２】
しかるべき場合に、経口投与についての投薬単位はマイクロカプセル化されて、例えば、活性化合物を、粒子形態で適切なポリマー、ろうなどの中にコーティングするか又は埋め込むことによるように放出を遅延し得るか又はより長い時間にわたって放出を延長し得る。
【００４３】
体重１ｋｇ当たり０.１〜１０００ｍｇ、好ましくは０.２〜１００ｍｇが、適切な用量として投与される。これらの量は、投薬単位で適切に投与され、この単位は、少なくとも本発明の化合物の有効な毎日の量（例えば、３０〜３０００ｍｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇ）を含む。
【００４４】
投与されるべき日用量は、体重、年齢、性別及び哺乳動物の状態に左右される。しかし、より多い日用量及びより少ない日用量が、時折また適切であり得る。日用量は、単独の投薬単位形態又はいくつかのより少ない投薬単位形態における１回のみの投与、及び所定の間隔での細分化用量の多重投与の両方によって投与され得る。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の範囲をいかなる方法においても限定することなく、本発明を例示することが意図される。
パーセンテージ値は、重量に関連付けられる。液体の場合の混合比は、別段の通知がない限り容量に関連付けられる。
【００４６】
実施例１
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）のグリセロール培養の調製
栄養液（麦芽抽出物２.０％、酵母抽出物０.２％、グルコース１.０％、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ０.０５％、ｐＨ６.０）３０ｍｌを、滅菌した１００ｍｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）で接種し、そして２５℃及び１４０ｒｐｍで回転振盪機上で６日間インキュベートした。この培養物１.５ｍｌを、引き続いて８０％グリセロール２.５ｍｌで希釈し、そして−１３５℃で保管した。
【００４７】
実施例２
ＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）の予備培養の調製
栄養液（麦芽抽出物２.０％、酵母抽出物０.２％、グルコース１.０％、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ０.０５％、ｐＨ６.０）１００ｍｌを、滅菌した３００ｍｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）で接種し、そして２５℃及び１４０ｒｐｍで回転振盪機上で４日間インキュベートした。次いで、この予備培養物２ｍｌを、本培養の調製の目的について接種した。
【００４８】
実施例３
ＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）の発酵
各場合において、栄養液（ジャガイモデキストロースブロス２.４％、酵母抽出物０.２％、ｐＨ５.２）１００ｍｌを、滅菌した３００ｍｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ  １５２９０）で接種し、そして２５℃及び１４０ｒｐｍで回転振盪機上で１１日間インキュベートした。次いで、この予備培養物３００ｍｌを、本培養の調製の目的について接種した。
【００４９】
実施例４
発酵槽におけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ  ＳＴ００３８７８（ＤＳＭ １５２９０）の発酵
１０Ｌの発酵槽を、以下の条件下で操作した。
栄養培地：ジャガイモデキストロースブロス２４ｇ／Ｌ
酵母抽出物２ｇ／Ｌ
ｐＨ５.２（滅菌前）
インキュベーション時間：１６６時間
インキュベーション温度：２８℃
撹拌速度：１８０ｒｐｍ
エアレーション：１６Ｌ／分
泡沫形成を、多価アルコールのエタノール性溶液を繰り返し添加することによって抑制した。産生の最大量は、約１６０時間後に達した。
【００５０】
実施例５：式（II）の化合物の単離
実施例４に記載されるように得られる培養液２５リットルは、式（II）の化合物９０ｍｇを含んだ。この培養ブロスを濾過し、そして菌糸体（１.６５ｋｇ）を、２−プロパノール１０リットルで抽出した。透明なアルコール相を、真空中で２Ｌまで濃縮し、そして抗酸化剤としてアスコルビン酸１ｇの添加後、吸着樹脂ＭＣＩ  Ｇｅｌ（登録商標）ＣＨＰ２０Ｐで満たされた７８５ｍｌ容量のカラム上に供給した。カラム寸法：幅×高さ：１０ｃｍ×２５ｃｍ。カラムを、水中における５％アセトニトリルから１００％アセトニトリルの溶媒グラジエントで溶出し、そしてカラムのスループットは、１時間当たり１５リットルであった。各々２.５リットルを含む画分を収集した。画分７〜９（これは、式（II）の化合物を含んだ）を、ＨＰＬＣ分析によって確認し、貯め、そして真空中で濃縮した。この溶液（これは、大いにイソプロパノールを除去されている）のｐＨをまた、４.２に調整し、そしてもう一度ＭＣＩ  Ｇｅｌ（登録商標）ＣＨＰ２０Ｐカラム（４９０ｍｌ、カラム寸法：５ｃｍ×２５ｃｍ）上に供給した。溶出を、０.０１％ギ酸アンモニウム（ｐＨ４.２）から１００％アセトニトリルのグラジエントを用いて達成した。カラムのスループットは、１分間当たり４０ｍｌであり、２００ｍｌを含む画分を獲得した。画分１２及び１３は、濃縮された式（II）の化合物を含んだ。これらを合わせ、真空中で濃縮し、そしてさらなるクロマトグラフィー精製の目的のために、Ｌｕｎａ  １０μ  Ｃ１８  ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）カラム（カラム寸法：２１ｍｍ×２５０ｍｍ）上で分離した。０.０２５％トリフルオロ酢酸及び０％〜１００％のアセトニトリルを溶離剤として使用し、フロースルー速度は、２５ｍｌ／分であった。画分の容積は、５０ｍｌであった。画分１４は、極めて濃縮された式（II）の化合物を含んだ。これを真空中でいくらか濃縮し、そして＋４℃で静置した。淡黄色の式（II）の化合物を晶出させ、そして濾過し、乾燥させ、そしてアルゴン下で詰めた（２０ｍｇ）。
【００５１】
実施例６：式（II）の化合物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
カラム：ＹＭＣ−ＰＲＯ  １８（登録商標）、１２０°Ａ、２５０〜４.４、予備カラムを含む
移動相：Ａ：０.０２％トリフルオロ酢酸における５％アセトニトリル、２分間
Ｂ：１００％アセトニトリル
グラジエント：ＡからＢまで１８分間
流量：１分間当たり１ｍｌ
２１０ｎｍでのＵＶ吸収による検出
式（II）の化合物は、１３.９分の保持時間を有することが見出された。
【００５２】
実施例７：式（II）の化合物の特徴付け
３５７.０６７３のモル質量（Ｍ−Ｈ）を、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、ネガティブモードにおいて見出し、一方ポジティブモードにおいて、３５９.０８１１の分子量（Ｍ＋Ｈ）を見出し、実験式Ｃ18Ｈ14Ｏ8及び分子量３５８.３１に対応した。
化合物（II）の物理化学的性質及び分光学的性質は、以下のように要約され得る。
外観：中程度の極性有機溶媒及び極性有機溶媒に可溶性の淡黄色の結晶性物質。中性媒体及び弱酸性媒体中で安定であるが、強酸性溶液及びアルカリ性溶液中、並びに酸素の影響下で不安定であった。
実験式：Ｃ18Ｈ14Ｏ8
分子量：３５８.３１
ＵＶ最大値：ｐＨ２において水／アセトニトリル（１：１）中２２０ｎｍ、２４５ｎｍ、３０７ｎｍ及び３６５ｎｍ
【００５３】
【表１】
2007512238.tif 000008
【００５４】
実施例８：式（II）の化合物のメチル化
実施例５に記載されるように得られる式（II）の化合物１２ｍｇを、メタノール３ｍｌに溶解し、その後（トリメチルシリル）ジアゾメタン（ヘキサン中の２Ｍ溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍｌを添加した。この反応混合物を、室温で静置し、そして反応経過を、ＨＰＬＣによってモニターした。利用される式（II）の化合物が完全に反応した後、この反応を、水の添加によって終結させ、そして真空中で濃縮した。得られるメチル化生成物を、０.０２％トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを含むグラジエントを用いて、Ｌｕｎａ  ５μ  ＲＰ１８  ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）カラム上でクロマトグラフ的に精製した。純粋な画分を凍結乾燥した後、以下を、ＨＰＬＣによって得た（条件は実施例５の通りである）。
式（III）の化合物２ｍｇ、モノメチルエーテル、保持時間１５.４分
式（IV）の化合物２.７ｍｇ、ジメチルエーテル、保持時間１６.９分
式（Ｖ）の化合物１.９ｍｇ、トリメチルエーテル、保持時間１９.４分
【００５５】
実施例９：式（III）の化合物の特徴付け
ＥＳＩ−ＭＳにおいて、式（III）の化合物は、ポジティブモードにおいて（Ｍ＋Ｈ）
３７３.０の分子ピーク、及びネガティブモードにおいて（Ｍ−Ｈ）  ３７１.０の分子ピークを与え、ＭＷ＝３７２及び実験式Ｃ19Ｈ16Ｏ8に対応した。
【化６】
2007512238.tif 000009
【００５６】
【表２】
2007512238.tif 000010
【００５７】
実施例１０：式（IV）の化合物の特徴付け
ＥＳＩ−ＭＳにおいて、式（ＩＶ）の化合物は、ポジティブモードにおいて（Ｍ＋Ｈ）３８７.１の分子ピーク、及びネガティブモードにおいて３８５.０の分子ピークを与え、ＭＷ＝３８６及び実験式Ｃ20Ｈ18Ｏ8に対応した。
【表３】
2007512238.tif 000011
【００５８】
実施例１１：式（Ｖ）の化合物の特徴付け
ＥＳＩ−ＭＳにおいて、式（Ｖ）の化合物は、ポジティブモードにおいて（Ｍ＋Ｈ）４０１.１の分子ピーク、及びネガティブモードにおいて（Ｍ−Ｈ）３９９.０の分子ピークを与え、ＭＷ＝４００及び実験式Ｃ21Ｈ20Ｏ8に対応した。
【表４】
2007512238.tif 000012
【国際調査報告】
2007512238.tif 000019
2007512238.tif 000020
2007512238.tif 000021
2007512238.tif 000022