(57)【要約】  本発明は全体として、２種の異なる染色体外エレメントを用いることにより、原核細胞中で、具体的には細菌中で、組換えＤＮＡ配列を生成し検出する方法、および本発明の方法の実施に使用することができる染色体外エレメント、具体的にはプラスミドに関する。この方法が関係するＤＮＡ配列は、タンパク質コード配列および非コード配列を含む。
2007523656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物中で組換えＤＮＡ配列を生成し検出する方法であって、
ａ）組換えられる第１のＤＮＡ配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができるレシピエントＤＮＡ分子、ならびに組換えられる第２のＤＮＡ配列、および遺伝子産物をコードする少なくとも第１のマーカー配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができないドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を生成する工程と、
ｂ）前記第１のマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合に前記細胞の増殖および／または繁殖だけを可能にする選択的な条件下で前記第１の原核細胞を培養する工程と、
ｃ）選択的な条件下で増殖および／または繁殖し、少なくとも第１のマーカー配列、ならびに第１および第２のＤＮＡ配列間での組換えによる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を有するハイブリッドＤＮＡ分子を含む第２の原核細胞を単離する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記ドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子が、特定の異なるプラスミドまたはバクテリオファージ中での異なる直鎖状または環状のＤＮＡ構造物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レシピエントＤＮＡ分子が、大腸菌（Escherichia coli）中で複製することができるプラスミドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記レシピエントＤＮＡ分子が、大腸菌（E. coli）プラスミドｐＡＣＹＣ１８４または大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００あるいはその誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナーＤＮＡ分子が複製起点を有さない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーＤＮＡ分子が機能的でない複製起点を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ドナーＤＮＡ分子および／またはその複製起点が、その細胞中にドナーＤＮＡ分子が導入される原核生物種以外の原核生物種に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ドナーＤＮＡ分子が、大腸菌中で複製することができない枯草菌（Bacillus subtilis）プラスミドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ドナーＤＮＡ分子が、ｓｐｅｃＲマーカーおよびｐｈｌｅｏＲマーカーを含む枯草菌（B. subtilis）プラスミドｐＭＩＸ９１、またはｔｃＲマーカーを含む枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナーＤＮＡの複製起点の機能が変異によって損傷を受ける、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーＤＮＡ構造物の第１のマーカー配列が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、および酵素のサブユニットをコードする配列からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のマーカー配列の遺伝子産物が、抗生物質に感受性の細胞に前記抗生物質に対する耐性を付与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のマーカー配列が、その遺伝子産物がスペクチノマイシンに対する耐性を細胞に付与するｓｐｅｃＲ、その遺伝子産物がフレオマイシンに対する耐性を細胞に付与するｐｈｌｅｏＲ、またはその遺伝子産物がテトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与するｔｃＲである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ドナーＤＮＡ分子が第２のマーカー配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記レシピエントＤＮＡ分子が、第３のマーカー配列を、場合によっては第４のマーカー配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２、第３および第４のマーカー配列が、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、制限酵素部位、プライマー認識部位、および酵素のサブユニットをコードする配列からなる群から選択されるタンパク質コードまたは非コード配列である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レシピエントＤＮＡ分子の第３および第４のマーカー配列の遺伝子産物が、抗生物質に感受性の細胞に前記抗生物質に対する耐性を付与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第３のマーカー配列の遺伝子産物が、テトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第４のマーカー配列の遺伝子産物が、クロラムフェニコールに対する耐性を細胞に付与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列が、少なくとも２ヌクレオチド異なる、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列が、天然に存在する配列である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えられる第１および／または第２のＤＮＡ配列が、ウイルス、細菌、植物、動物および／またはヒトに由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えられる第１および／または第２のＤＮＡ配列が人工の配列である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列のそれぞれが、１個または複数個のタンパク質コード配列および／あるいは１個または複数個の非コード配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記レシピエントＤＮＡ分子および前記ドナーＤＮＡ分子を原核細胞中に同時にまたは順次導入することにより、前記第１の原核細胞を生成する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
形質転換、接合、形質導入、伴性導入および／またはエレクトロポレーションを介して前記レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子を前記原核細胞中に導入する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のマーカー配列の遺伝子産物が耐性を付与する少なくとも１種の抗生物質の存在下で前記第１の原核細胞を培養する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のマーカー配列、前記第３のマーカー、および前記第３のマーカー配列の遺伝子産物がそれぞれ耐性を付与する第２、第３および／または第４の抗生物質の存在下で前記第１の原核細胞をさらに培養する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記原核細胞が、古細菌または真正細菌の細胞である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記真正細菌が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌またはラン藻類である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記グラム陰性細菌が大腸菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記原核細胞が機能的なミスマッチ修復系を有する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記原核細胞のミスマッチ修復系が一時的にまたは永久的に欠損している、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ミスマッチ修復系の一時的または永久的な欠損が、ミスマッチ修復系に関与する１種もしくは複数種の遺伝子の変異、欠失および／または誘導性発現もしくは抑制、ミスマッチ修復系を飽和する作用因子での処理、ならびに／あるいはミスマッチ修復系を全体的にノックアウトする作用因子での処理に起因する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記原核細胞が、変異ｍｕｔＳ遺伝子および／または変異ｍｕｔＬ遺伝子を有する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の原核細胞のハイブリッドＤＮＡ分子中に含まれる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を選択および／または単離および／または分析する、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を制限酵素切断によって単離する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離された第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を、ドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子にそれぞれ挿入し、それを別の回の組換えにかける、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ｓｐｅｃＲマーカー、ｐｈｌｅｏＲマーカー、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＳｃａＩ、ＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉを含む枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１。
【請求項４１】
ｔｃＲマーカー配列、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩを含む枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１。
【請求項４２】
原核宿主細胞中で、好ましくは大腸菌細胞中で組換えＤＮＡ配列を生成および／または検出するための請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法におけるドナーＤＮＡ分子としての枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１またはｐＭＩＸ１０１の使用。
【請求項４３】
原核宿主細胞中で、好ましくは大腸菌細胞中で組換えＤＮＡ配列を生成および／または検出するための請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法におけるレシピエントＤＮＡ分子としての大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはｐＭＩＸ１００あるいはその誘導体の使用。
【請求項４４】
大腸菌株ＡＢ１１５７または大腸菌株ＭＸＰ１または大腸菌株ＤＨＢ１０の細胞を含む第１の容器、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を含む大腸菌株ＡＢ１１５７の細胞またはプラスミドｐＭＩＸ１００を含む大腸菌株ＤＨＢ１０の細胞を含む第２の容器、およびプラスミドｐＭＩＸ９１を含む枯草菌株ＤＳＭ４３９３の細胞またはプラスミドｐＭＩＸ１０１を含む枯草菌株１Ａ４２３の細胞を含む第３の容器を少なくとも含むキット。
【請求項４５】
大腸菌株ＡＢ１１５７または大腸菌株ＭＸＰ１または大腸菌株ＤＨＢ１０の細胞を含む第１の容器、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはプラスミドｐＭＩＸ１００のＤＮＡを含む第２の容器、およびプラスミドｐＭＩＸ９１またはプラスミドｐＭＩＸ１０１のＤＮＡを含む第３の容器を少なくとも含むキット。
【請求項４６】
原核細胞中でハイブリッド遺伝子および／またはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を生成する方法であって、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法を実施し、前記ハイブリッド遺伝子および／または前記ハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を前記原核細胞中で生成し、発現後、前記ハイブリッド遺伝子および／またはそれにコードされたタンパク質を前記原核細胞中で選択し、かつ／またはそれから単離する方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法によって得られるハイブリッド遺伝子。
【請求項４８】
請求項４７に記載のハイブリッド遺伝子によってコードされ、請求項４６に記載の方法によって得られるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は全体として、２種の異なる染色体外エレメントを用いることにより、原核細胞中で、具体的には細菌中で、組換えＤＮＡ配列を生成し検出するｉｎ  ｖｉｖｏの方法、および本発明の方法の実施に使用することができる染色体外エレメント、具体的にはプラスミドに関する。この方法が関係するＤＮＡ配列は、タンパク質コード配列および非コード配列を含む。
【０００２】
（背景技術）
進化とは、遺伝的変異、および表現型の選択の連続的な過程である。集団内での個体の性能を改良する新たな変異体の組合せを作成することによって、集団の遺伝的多様性を増幅することができる。微生物の定方向進化は、連続したランダム変異導入およびスクリーニングによる古典的な株の改良の方法を介して従来より行われている。
【０００３】
定方向進化は、タンパク質を工学的に作製する手段としてこれまでほとんど排他的に使用されてきた。部位特異的変異誘発、カセット変異導入、ランダム変異導入やエラープローンＰＣＲなどの変異技術により、タンパク質機能の変異体が生成され、こうして作製されたライブラリーが、特定の機能を果たすことができるかどうかについてスクリーニングされている。この手順の再帰的な適用が、ｐＨの最適条件、耐熱性、溶媒安定性、立体選択性、触媒活性や基質特異性など、酵素の物理的触媒的特性、ならびに細菌における毒性の耐性機構、およびウイルスの宿主範囲と安定性を修飾するのにうまく使用されている。
【０００４】
酵素の新たな特性を進化させる伝統的な変異導入手法にはいくつかの制約がある。この手法は、クローン化されその機能が特徴付けられており、別個の機能を有する遺伝子または配列に適用可能であるに過ぎない。また、伝統的な変異導入手法は、単一遺伝子についても、順列の総数のうち非常に限られた数を探索できるに過ぎない。しかし、特定の状況下では、新たな特性を有するタンパク質を発現させるために、１個の遺伝子だけでなくさらなる遺伝子をも修飾することが必要となる可能性がある。そのようなさらなる遺伝子は、例えば、単一の表現型を協調的に付与する遺伝子である可能性もあり、あるいは転写、翻訳、翻訳後修飾や、遺伝子産物の分泌またはタンパク質分解など１つまたは複数の細胞機構においてある役割を有する遺伝子である可能性もある。そのような機能を有する遺伝子すべてを伝統的な変異導入手法によって個々に最適化しようと試みることは、事実上不可能な作業であるはずである。
【０００５】
従来の変異導入手法に伴う問題のほとんどは、機能的遺伝子の異なる配列のランダム組換えを引き起こす組換えの手法により克服することができ、それによって天然の類似遺伝子またはランダム変異遺伝子の分子上の混合が可能となる。従来の変異導入と組換えを比較すると、表現型が改良された変異体が得られる可能性は著しく高い。従来のＤＮＡ操作技術を上回る、組換えの手法の主要な利点は、具体的には、実験上容易であること、およびＤＮＡ配列により課せられる制約がないことである。
【０００６】
組換えの過程について知られていることのほとんどは、細菌などの単純な単細胞生物の研究に由来している。そのような生物での組換えの研究は、ＤＮＡ配列が操作し易く、多数の細胞で同期的に誘導される特定の組換え事象が研究される可能性があるという利点を有する。微生物で研究された過程が、ほとんどの点で、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞が遺伝的多様性を生じさせる方法と同一である、またはこれに類似するという確信が大きくなっていることも同様に重要である。さらに、この機構を明らかにすることによって、哺乳動物細胞で遺伝子ターゲティングおよび遺伝子置換のより効率のよい機構を開発する探求においてさらなる重要性が与えられている。
【０００７】
原核細胞中で組換えを実施する多数の様々な系が存在するが、これらのほとんどでは、新たに組み換えられたＤＮＡ配列を容易にかつ確実に検出することは不可能である。したがって、当技術分野では、具体的には組換え体の迅速かつ単純な検出および／または選択圧下での組換え体の選択を可能にする効率のよい原核生物の試験系が依然として求められている。
【０００８】
（発明の開示）
したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、原核細胞中で組換えモザイク遺伝子を単純にかつ効率よく生成し、具体的にはそのような組換え配列をスクリーニングし検出する改良された方法および手段を提供することである。
【０００９】
本発明は、原核生物中で組換えＤＮＡ配列を生成し検出する方法を提供することによって、根底にあるこの技術的な問題を解決するものであり、この方法は、
ａ）組換えられる第１のＤＮＡ配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができるレシピエントＤＮＡ分子、ならびに組換えられる第２のＤＮＡ配列、および遺伝子産物をコードする少なくとも第１のマーカー配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができないドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を生成する工程と、
ｂ）第１のマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合にその細胞の増殖および／または繁殖だけを可能にする選択的な条件下で第１の原核細胞を培養する工程と、
ｃ）選択的な条件下で増殖および／または繁殖し、少なくとも第１のマーカー配列、ならびに第１および第２のＤＮＡ配列間での組換えによる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を有するハイブリッドＤＮＡ分子を含む第２の原核細胞を単離する工程とを含む。
【００１０】
本発明は、少なくとも２種の異なる（ｄｉｖｅｒｇｉｎｇ）または異種のＤＮＡ配列または組換え基質間で、ｉｎ  ｖｉｖｏで組換え事象が起こったかどうかについてスクリーニングするための原核生物の系を提供する。本発明の系は、少なくとも２種の異なるＤＮＡ配列から、組換えられる２種のＤＮＡ配列を含む２種の染色体外エレメントからのｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡの交換を使用する方法により、速く効率のよい形で、改良された特性を有する新しい有利なＤＮＡ配列の生成を可能にする。レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子の形で、ヌクレオチド配列の相同性を示さない２種の染色体外エレメントを原核宿主細胞中に導入する。レシピエント分子は、宿主中で自発的に複製することができるが、ドナー分子は、複製能を有さない。しかし、ドナー分子は、宿主細胞のゲノム中にもレシピエント分子中にも存在しない抗生物質耐性マーカーや栄養マーカーなど、少なくとも１個の独特なタンパク質コードマーカー配列を含む。両方の染色体外エレメントを原核宿主細胞中に導入した後、２種の異種遺伝子間で組換えが行われる条件下でその細胞を培養する。この条件には、例えば、通常その細胞が感受性である抗生物質の存在下での細胞の培養、あるいはその細胞がそれ自体で合成することができず、したがって外部から供給されなければならない不可欠な栄養素を欠いた培地中での細胞の培養が含まれ得る。適用した培養条件下で、それぞれのマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合に、その細胞だけが増殖および繁殖、すなわち分裂することができる。しかし、マーカー配列の発現の必要条件は、非複製性のドナー分子および複製性のレシピエント分子が、レシピエント分子の起点から複製することができ、したがって確実にマーカー配列を維持する融合体を形成することである。この融合体の形成は、その配列が親ＤＮＡ配列と異なる新たなＤＮＡ分子の生成をもたらす２種の組換え基質間での組換えから生じる。したがって、適用した選択的な条件下で増殖および繁殖した宿主細胞は、新たに組み換えられたＤＮＡ配列を含む。したがって、本発明の方法は、組換えＤＮＡ配列を同定する容易かつ迅速な選択系を提供する。本発明の方法を用いて、組み換えられた変異ＤＮＡ配列の大きなライブラリーを容易に作製することができ、次いで適当な選択系またはスクリーニング系を用いることにより、所望の機能を獲得した変異体を同定することができる。
【００１１】
原核生物などの単純な単細胞生物における組換えの過程の研究は、ＤＮＡ配列が操作し易く、多数の細胞で同期的に誘導される特定の組換え事象が研究される可能性があるという明らかな利点を有する。さらに、過去数十年にわたって、発酵技術においても原核生物の基礎遺伝学においても専門知識が豊富に蓄積されている。原核宿主細胞の他の主要な利点は、非常に短い倍加時間に関連する。したがって、原核宿主細胞を使用することにより、多数回の細胞分裂、したがって多数回の組換えを行い、複数の新たな組換えＤＮＡ配列を短い時間内に作製することが可能である。
【００１２】
本発明の方法は、野生型の原核細胞で行うこともでき、あるいはミスマッチ修復欠損原核細胞で行うこともできる。損傷ＤＮＡを修復する過程、および遺伝子組換えの機構は密接に関係し、ミスマッチ修復の機構は、異なる配列間での組換え、すなわち相同組換えの頻度に対して抑制的な効果を及ぼすことが知られている。したがって、ミスマッチ修復系の変異は、原核細胞での組換え事象の全体的な頻度を大きく高める。その一方で、野生型の原核細胞は、２種の組換え基質中にある遠く離れたミスマッチに基づくミスマッチ修復依存的な組換え機構を有することが知られている。組換えられるＤＮＡ配列に応じて、野生型の原核細胞またはミスマッチ修復欠損原核細胞を使用して組み換えられた配列を得ることができる。
【００１３】
組み換えられたＤＮＡ配列を生成し検出する本発明の方法は、大きく異なるＤＮＡ配列を組み換えることができる利点を有する。意外にも、全体的な相異性が高度であり、非常に短い相同性または同一性領域しか有さない配列を組み換えることができることが判明した。組み換えられた配列の分析から、組換えが起こる最長の同一性領域が１８〜２２ヌクレオチドを占めるのみであることが明らかとなった。ほとんどの組換え事象は、長さが１０〜１５ヌクレオチドの相同性領域で起こった。一部の場合では、組換えは、長さがわずか４〜５ヌクレオチドの領域で起こった。
【００１４】
したがって、本発明の方法は、有利な特徴を有する組換えＤＮＡ配列を作製するために、異なる原核生物の種または異なる原核生物の属に由来するＤＮＡ配列の組換えを可能にする。
【００１５】
組み換えられたＤＮＡ配列を生成し検出する本発明の方法は、２種を超える異なる配列を組み換えることができる利点を有し、それにより、組換えられる２種の異なる配列は予め選択された配列でもよく、選択されていない配列でもよい。
【００１６】
例えば、最大で遺伝子ライブラリー全体の、種々の異なるＤＮＡ配列をレシピエントならびにドナーＤＮＡ分子中に挿入することができる。その後、個々の異なるＤＮＡ配列は、偶然によりそれ自体と組み換えることができる。最大で遺伝子ライブラリー全体の、第１の組の異なるＤＮＡ配列を、レシピエントＤＮＡ分子にのみ挿入し、最大で遺伝子ライブラリー全体の、第２の組の異なるＤＮＡ配列を、レシピエントＤＮＡ分子に挿入し、またはその逆を行い、次いでその２組を偶然により相互に組み換えることも可能である。どちらの場合でも、どの対の異なるＤＮＡ配列を組み換えるかに関して選択はなされない。
【００１７】
しかし、複数の、好ましくは予め選択された異なる配列を段階的な形で組み換えることもでき、それにより、各工程でどの対の異なるＤＮＡ配列を組み換えるかに関して選択がなされる。例えば、３種の異なるＤＮＡ配列を組み換える場合、第１の工程で第１の原核細胞が生成し、それにより、例えば、組換えられる第１のＤＮＡ配列を有するレシピエントＤＮＡ分子、および組換えられる第２のＤＮＡ配列を有するドナーＤＮＡ分子が、所与の種の細菌細胞中に導入される。それぞれのレシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子が、ドナー分子のマーカー配列の発現、および組換えられる２種のＤＮＡ配列間での組換えを可能にするハイブリッド分子を形成した細胞だけが増殖および繁殖するような選択的な条件下でこの原核細胞を培養する。こうして組換えによる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を有するハイブリッド分子を含む第２の原核細胞が得られる。第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を単離し、そのうちの一方を例えばレシピエント分子中に挿入し、その一方で組換えられる第３のＤＮＡ配列をドナー分子中に挿入する。次いで、次の工程で、組み換えられた配列のうちの一方を含むレシピエント分子、および組換えられる第３のＤＮＡ配列を含むドナー分子を原核宿主細胞中に再度導入し、それを別の回の組換えにかける。
【００１８】
例えば、４種の異なるＤＮＡ配列を組み換える場合、第１の工程で異なる２組の第１の原核細胞を生成する。例えば、第１の組の第１の原核細胞は、組換えられる第１のＤＮＡ配列を有するレシピエントＤＮＡ分子、および組換えられる第２のＤＮＡ配列を有するドナーＤＮＡ分子を細菌細胞中に導入することにより生成することができる。同様に、第２の組の第１の原核細胞は、組換えられる第３のＤＮＡ配列を有するレシピエントＤＮＡ分子、および組換えられる第４のＤＮＡ配列を有するドナーＤＮＡ分子を同じ種の細胞中に導入することにより生成することができる。組換えが行われる選択的な条件下で各組の原核細胞を培養する。こうして、組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列間での組換えによる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を有するハイブリッド分子を含む第１の組の原核細胞が得られる。また、組換えられる第３および第４のＤＮＡ配列間での組換えによる第３および第４の組み換えられたＤＮＡ配列を有するハイブリッド分子を含む別の組の原核細胞が得られる。次いで、こうして得られた第１、第２、第３および第４の組み換えられたＤＮＡ配列をそれぞれの宿主細胞から単離する。次の工程で、第１または第２の組み換えられた配列をドナーＤＮＡ分子中に挿入し、第３または第４の組み換えられた配列をレシピエントＤＮＡ分子中に挿入することができる。次いで、こうして得られたドナーＤＮＡ分子とレシピエントＤＮＡ分子をどちらも原核宿主細胞中に導入し、それを別の回の組換えにかける。このように、５種、または６種以上の異なるＤＮＡ配列を組み換えることもできる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子は、異なる直鎖状または環状のＤＮＡ構造物である。「ＤＮＡ構造物」という用語は、原核宿主細胞中に導入した後に染色体外エレメントの形で存在することを特徴とするＤＮＡ分子、例えばプラスミドやバクテリオファージなどのベクターを意味する。したがって、本発明との関係では、「染色体外エレメント」とは、原核宿主細胞の（複数の）染色体中に組み込まれないＤＮＡ分子である。
【００２０】
ドナーＤＮＡ分子は、ハイブリッド分子を形成することができるように、レシピエントＤＮＡ分子とハイブリッド形成できなければならない。好ましくは、ドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子は、組換えられるＤＮＡ配列を除いて一般に相同性を有さない。
【００２１】
本発明によれば、レシピエントＤＮＡ分子は、原核宿主細胞中への導入後その細胞中で自発的に複製できなければならない。したがって、レシピエントＤＮＡ分子は、宿主の遺伝物質とは無関係にレシピエントＤＮＡ分子の複製を可能にする少なくとも１個の複製起点を有さなければならない。本発明との関係では、「複製起点」または「ｏｒｉ」とは、細胞の酵素によってＤＮＡ分子の複製の開始に使用されるＤＮＡ分子の領域である。その起点でＤＮＡの２本の鎖が分かれて複製バブルが形成され、そのバブルの両側に一本鎖ＤＮＡの領域が作られる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼ機構が移動し、古い鎖を鋳型として用いて新たなＤＮＡ鎖を合成し始める。細菌プラスミドまたはバクテリオファージを含めた小さなＤＮＡは通常、単一の起点を有する。
【００２２】
本発明の一実施形態では、レシピエントＤＮＡ分子はプラスミド、具体的には二本鎖環状ＤＮＡ分子である。「プラスミド」とは、宿主の遺伝物質とは無関係に複製することができる染色体外エレメントである。本発明の他の実施形態では、レシピエントＤＮＡ分子はバクテリオファージ、具体的にはそのＤＮＡが原核細胞中で染色体外エレメントの形で存在するファージである。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、レシピエントＤＮＡ分子は、大腸菌（E. coli）宿主細胞中で複製することができるプラスミドである。好ましくは、レシピエントＤＮＡ分子は、大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはその誘導体である。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４はＴｅｔＲおよびＣａｍＲである。
【００２４】
本発明によれば、ドナーＤＮＡ分子は、原核宿主細胞中で複製することができないが、レシピエントＤＮＡとハイブリッド分子を形成することができるＤＮＡ分子である。したがって、少なくともマーカー配列を含み、所与の原核宿主細胞内で独立して複製することができない限り、任意のＤＮＡ分子をドナー分子として使用することができる。適切なドナー分子の例には、それだけに限らないが、環状化することができ、例えばＰＣＲによって生成され、適当なマーカー配列を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ、プラスミドおよびバクテリオファージが含まれる。プラスミドまたはバクテリオファージをドナーＤＮＡ分子として使用する場合、この分子は、（１個または複数個の）機能的な複製起点を全く有さず、あるいは使用する原核宿主細胞中では機能しない、すなわち不活性である（１個または複数個の）複製起点を有する。
【００２５】
したがって、本発明の一実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は複製起点を含まない。これは、ドナーＤＮＡ分子が、複製起点として任意の原核宿主細胞中で機能することができる配列、すなわち複製の開始に関与するタンパク質因子が結合することができる配列を全く含まないことを意味する。複製起点が存在しないことは、起点として機能するその核酸配列の欠失に起因する可能性がある。
【００２６】
本発明の他の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の複製起点の機能が、複製起点自体の機能、または複製に関与するタンパク質の機能、具体的には起点の核酸配列に結合し、それによって複製が開始するタンパク質の機能のいずれかを消失させる１個または複数個の変異によって損傷を受ける。例えば、大腸菌では、複製開始にとって重要なタンパク質であるＤｎａＡが染色体複製起点で特定の配列、いわゆるＤｎａＡボックスと結合し、３個のＡＴに富む１３ｍｅｒダイレクトリピートを融解することが知られている。開鎖領域中の一本鎖６ｍｅｒボックスにＤｎａＡタンパク質がさらに結合すると、開鎖複合体が安定化すると考えられている（総説については、Ｊｉａｎｇら、ＰＮＡＳ、１００（２００３）、８６９２〜８６９７を参照）。ＤｎａＡボックスおよびＡＴに富む領域は、様々な原核生物の複製単位の起点で一般に認められ、ＤｎａＡタンパク質はこれらの起点での複製開始に重要な役割を果たすことが示されている。したがって、複製起点の配列中のＤｎａＡボックスおよび／またはＡＴに富む領域、あるいは対応する部位の、適当な塩基置換や欠失などの特定の変異により、複製開始に必要なタンパク質の結合を妨げ、したがって染色体外エレメントの起点の機能を阻害することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の複製起点の核酸配列中、具体的には起点のＤｎａＡボックスおよび／またはＡＴに富む領域中の１個または複数個の変異によってドナーＤＮＡ分子の複製起点の機能を障害することができる。
【００２７】
さらに、単独のＤｎａＡタンパク質は、ＲＫ２、Ｐ１、Ｆ、ｐＳＣ１０１やＲ６Ｋなどのプラスミドの起点での開鎖複合体の形成に不十分であることが知られている。こうした場合、開鎖複合体の効率のよい形成は、宿主ＤｎａＡタンパク質およびＨＵまたはＩＨＦ（組込み宿主因子）タンパク質と協調したものであるが、プラスミドＲｅｐタンパク質の結合を必要とする。開鎖複合体形成にプラスミドによって特定される開始タンパク質を必要とすることは、複製起点での開始事象の頻度の調節を行うプラスミドの能力にとって重要である（総説については、Ｊｉａｎｇら、ＰＮＡＳ、１００（２００３）、８６９２〜８６９７を参照）。これは、プラスミド複製に不可欠な機能を有するタンパク質因子をコードするプラスミド核酸配列の変異によっても、染色体外エレメントの複製起点の機能が障害され得ることを意味する。したがって、本発明の他の好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の複製に不可欠な機能を有するタンパク質因子をコードする核酸配列中の１個または複数個の変異により、ドナーＤＮＡ分子の複製起点の機能を障害することができる。
【００２８】
本発明のさらなる他の好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、組換えられる２種のＤＮＡ配列間で組換えを実施するために、特定の原核宿主細胞中でのみ活性であるが、そのドナーＤＮＡ分子を導入する原核細胞中では活性でない複製起点を含む。特定の細菌種中で活性である複製起点が他の細菌種中で機能しないことが多数報告されている。例えば、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）の複製起点（ｏｒｉＣ）が、カウロバクタークレセンタス（Caulobacter crescentus）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、またはロドバクタースフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）中では不活性であることが知られている（Ｏ’ＮｅｉｌｌおよびＢｅｎｄｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０（１９８８）、３７７４〜３７７７）。枯草菌（Bacillus subtilis）のプラスミドが大腸菌細胞中で複製できないことも知られている。したがって、好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子および／またはその複製起点は、その細胞中にドナーＤＮＡ分子が導入される原核生物種以外の原核生物種に由来する。
【００２９】
特に好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は枯草菌（B. subtilis）プラスミドｐＭＩＸ９１であり、これは、プラスミドｐＩＬ２５３の誘導体であり、枯草菌中で複製できるが、大腸菌中では複製できず、ｓｐｅｃＲマーカー、ｐｈｌｅｏＲマーカー、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＳｃａＩ、ＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉを含む。他の特に好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１であり、これは、プラスミドｐＩＬ２５３の誘導体であり、枯草菌中で複製できるが、大腸菌中では複製できず、ｔｃＲマーカー配列、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩを含む。
【００３０】
本発明の他の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の複製起点は、特定の温度範囲内でのみ、例えば温度４５℃未満でのみ機能的である。ドナーＤＮＡ分子がそのような温度感受性の起点を含む場合、非許容条件下では、すなわち原核宿主細胞の増殖が未だ許容される４５℃を上回る温度では、それは複製できない。
【００３１】
本発明との関係では、「マーカー配列」という用語は、所与の原核細胞中で独特のＤＮＡ配列を指し、ドナーＤＮＡ分子上またはレシピエント分子上に、好ましくは組換え基質またはすでに組み換えられたＤＮＡ配列の上流もしくは下流に位置する。組換え基質またはすでに組み換えられたＤＮＡ配列と同じＤＮＡ分子上に、好ましくは組換え基質の他方の側に位置することができる他のマーカー配列と組み合わせてマーカー配列が存在することにより、分子的な方法でも遺伝的な方法でも、組換え基質またはすでに組み換えられたＤＮＡ配列を認識し選択することが可能となる。
【００３２】
本発明によれば、ドナーＤＮＡ分子は、組換え基質を含む交差の選択を可能にする第１のマーカー配列を含む。第１のマーカー配列は、好ましくはドナーＤＮＡ分子またはレシピエントＤＮＡ分子上に存在するさらなるマーカー配列と組み合わせて、反復する形で実施されるさらなる回の組換えも可能にする。
【００３３】
本発明によれば、「第１のマーカー配列」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、その遺伝子産物は、適用する選択的な条件下で原核宿主細胞が増殖および繁殖するのに不可欠である。第１のマーカー配列は、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、および両方またはそれ以上のサブユニットが同じ細胞中で発現している場合にのみ作用する、酵素のサブユニットをコードする配列からなる群から選択される。
【００３４】
「栄養マーカー」とは、生物または細胞の栄養要求性を補償することができ、したがってその栄養要求性の生物または細胞に原栄養性を付与することができる遺伝子産物をコードするマーカー配列である。本発明との関係では、「栄養要求性」という用語は、生物または細胞が、その栄養要求性の生物自体で合成することができない不可欠な栄養素を含む培地中で増殖しなければならないことを意味する。栄養マーカー遺伝子の遺伝子産物は、栄養要求性の細胞中に欠如しているこの不可欠な栄養素の合成を促進する。したがって、栄養マーカー遺伝子の発現後、生物または細胞は原栄養性を獲得するので、生物または細胞が増殖する培地にこの不可欠な栄養素を添加することは不要である。
【００３５】
「抗生物質耐性マーカー」とは、その遺伝子産物が、その抗生物質マーカー遺伝子の発現が起こる細胞に、所与の濃度での所与の抗生物質の存在下で増殖する能力を発現後に付与するマーカー遺伝子であるが、その抗生物質マーカーを有さない細胞は増殖することができない。
【００３６】
「酵素のサブユニットをコードする配列」は、完全な酵素構造の構築に必要な、したがってその酵素の完全な活性を得るのに必要な、酵素のすべてのサブユニットを細胞が合成できない場合、また遺伝的なかつ／または分子的な手段によって、酵素活性の有無をモニターすることができる場合にマーカー配列として使用することができる。例えば、酵素の活性が、特定の環境下で細胞の増殖および／または繁殖を可能にする、細胞の不可欠な生化学的経路に必要であり、その細胞が完全な酵素構造のすべての構成成分を合成できない場合、その細胞はその環境で生存できない。したがって、マーカー配列として使用する「酵素のサブユニットをコードする配列」によって、完全な酵素の構築およびその細胞の生存が発現後可能になる。
【００３７】
好ましくは、第１のマーカー配列の遺伝子産物は、抗生物質に感受性の細胞にその抗生物質に対する耐性を付与する。具体的には、第１のマーカー配列は、その遺伝子産物がスペクチノマイシンに対する耐性を細胞に付与するｓｐｅｃＲ、その遺伝子産物がフレオマイシンに対する耐性を細胞に付与するｐｈｌｅｏＲ、またはその遺伝子産物がテトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与するｔｃＲである。
【００３８】
本発明の他の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は第２のマーカー配列を含む。本発明のさらなる他の実施形態では、レシピエントＤＮＡ分子は第３のマーカー配列を、場合によっては第４のマーカー配列を含む。それは、本発明の一実施形態ではドナーＤＮＡ分子が少なくとも第１および第２のマーカー配列を、場合によってはさらに多数のマーカー配列を含んでもよく、これらを、例えば、組換え基質の上流または下流に配置することができることを意味する。他の実施形態では、レシピエントＤＮＡ配列は第３および第４のマーカー配列を、場合によってはさらに多数のマーカー配列を含んでもよく、これらを、例えば、組換え基質の上流または下流に配置することができる。第２の原核細胞中で形成され、２種の異なる組み換えられたＤＮＡ配列を含むハイブリッド分子が少なくとも全部で４種の異なるマーカー配列を含み得るので、このさらなるマーカーは、組み換えられたＤＮＡ配列の選択の厳密性を促進することを可能にする。
【００３９】
本発明によれば、「第２、第３および第４のマーカー配列」とは、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、プライマー認識部位、イントロン／エキソン境界、酵素の特定のサブユニットをコードする配列、プロモーター配列、下流制御遺伝子配列および制限酵素部位からなる群から選択されるタンパク質コードまたは非コード配列である。
【００４０】
「色素マーカー」とは、その遺伝子産物が、発現後に、色素マーカーが発現した細胞を染色する色素の合成に関与するマーカー遺伝子である。色素マーカーを有さない細胞は、色素を合成せず、したがって染色されない。したがって、色素マーカーは、色素マーカーを含む細胞の迅速な表現型の検出を可能にする。
【００４１】
「抗生物質感受性マーカー」とは、その遺伝子産物が、発現後に、所与の濃度での所与の抗生物質の存在下で細胞の増殖能を破壊するマーカー遺伝子である。
【００４２】
「プライマー認識部位」とは、部位特異的ＰＣＲプライマーのアニーリング部位であり、それによってＰＣＲによるそれぞれのマーカー配列の迅速な同定が可能となる。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の第２のマーカー配列、ならびにレシピエントＤＮＡ分子の第３および第４のマーカー配列はタンパク質コード配列であり、その遺伝子産物は、抗生物質に感受性の細胞にその抗生物質に対する耐性を付与する。好ましくは、第３のマーカー配列の遺伝子産物は、細胞にテトラサイクリンに対する耐性を付与し、第４のマーカー配列の遺伝子産物は、細胞にクロラムフェニコールに対する耐性を付与する。
【００４４】
本発明との関係では、「組換えられるＤＮＡ配列」および「組換え基質」という用語は、相同組換えまたは非相同組換えの過程の結果組み換えることができる任意の２種のＤＮＡ配列を意味する。
【００４５】
いくつかの型の相同組換え事象は、損傷したＤＮＡの、相同な相手との塩基対形成を特徴とし、相互作用の程度には数百のほとんど完全に整合した塩基対が関与し得る。その一方で、非正統的または非相同組換えは、相補的な塩基対を全く有さない、またはわずか少数有するＤＮＡの末端同士の結合を特徴とする。原核細胞では、非相同的な修復および組換えの事象は、相同組換え事象より有意に低い頻度で起こる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、２種の組換え基質、すなわち組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列は、異なる配列、すなわち同一ではないがある程度の相同性を示す配列である。本発明との関係では、「相同性」という用語は、２種の核酸分子の配列間に存在する同一性の程度を示すが、「相異性」は、２種の核酸分子の配列間における非同一性の程度を示す。本発明によれば、組換えられるＤＮＡ配列は、その全体的なアラインメントに関して、２箇所以上の位置において互いに異なっている。本発明の一実施形態では、その全体の長さに対する２種の組換え基質間の全体的な相異性は、０．１％を超え、具体的には５％を超え、好ましくは２５％を超える。これは、組換えられるＤＮＡ配列が３０％を超えて、４０％を超えて、さらに５０％を超えて異なり得ることを意味する。本発明の特に好ましい実施形態では、組換えられる２種のＤＮＡ配列は、少なくとも１個または複数個の相同なまたは同一の領域を有するが、それは非常に短いものとすることができる。本発明によれば、相同なまたは同一の領域は、２５個未満のヌクレオチドを、具体的には２０個未満または１５個未満のヌクレオチドを、さらに１０個未満のヌクレオチド、例えば４、５、６、７、８または９個のヌクレオチドを含むことができる。
【００４７】
組換え基質または組換えられるＤＮＡ配列は、天然または合成に由来するものとすることができる。したがって、本発明の一実施形態では、組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列は天然に存在する配列である。天然に存在する配列は、ウイルス、生きているもしくは死んでいる細菌などの原核生物、生きているもしくは死んでいる真菌、動物、植物やヒトなどの真核生物、またはその一部を含めた任意の天然供給源から、任意の適当な単離法によって単離することもでき、あるいは化学的手段によって合成することもできる。天然に存在する配列はまた、天然供給源から単離後に変異導入にさらされたような配列を含むこともできる。本発明の他の実施形態では、組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列は人工の配列であり、天然供給源中には認められない。人工の配列は、任意の既知の化学的方法によって合成することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、組換えられるＤＮＡ配列は、タンパク質コード配列、例えば天然および非天然の化合物の工業生産に利用することができる酵素をコードする配列である。酵素、または酵素の援助によって生成される化合物は、薬品、化粧品、食品などの生産に使用することができる。タンパク質コード配列は、ヒトおよび動物の健康の分野において治療に適用されるタンパク質をコードする配列とすることもできる。医学上重要なタンパク質の重要な種類には、サイトカインおよび成長因子がある。タンパク質コード配列の組換えにより、機能が変化した、好ましくは向上したかつ／または新たに機能を獲得したタンパク質をコードする新たな変異配列の生成が可能になる。このように、例えばタンパク質の熱安定性を向上させ、タンパク質の基質特異性を変化させ、その活性を向上させ、新たな触媒部位を進化させ、かつ／または２種の異なる酵素由来のドメインを融合させることが可能である。組換えられるタンパク質コードＤＮＡ配列には、天然の状況では類似のまたは同一の機能を有する同じまたは類似のタンパク質をコードする異なる種由来の配列が含まれ得る。組換えられるタンパク質コードＤＮＡ配列には、同じタンパク質または酵素のファミリー由来の配列が含まれ得る。組換えられるタンパク質コード配列は、異なる機能を有するタンパク質をコードする配列、例えば、所与の代謝経路の異なる工程を触媒する酵素をコードする配列とすることもできる。本発明の好ましい実施形態では、組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列は、β−ラクタマーゼのＯｘａスーパーファミリーの遺伝子の配列の群から選択される。
【００４９】
本発明の他の好ましい実施形態では、組換えられるＤＮＡ配列は、例えば、天然の細胞の状況内ではタンパク質コード配列の発現の制御に関与する配列などの非コード配列である。非コード配列の例には、それだけに限らないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位を含む配列、イントロン配列、ポリアデニル化配列などがある。そのような非コード配列を組み換えることによって、細胞環境中で細胞のプロセスの制御が変化した、例えば遺伝子の発現が変化した変異配列を進化させることが可能である。
【００５０】
本発明によれば、組換え基質または組換えられるＤＮＡ配列は、もちろん複数のタンパク質コード配列および／または複数の非コード配列を含むことができる。例えば、組換え基質は、１個のタンパク質コード配列＋１個の非コード配列または異なるタンパク質コード配列と異なる非コード配列との組合せを含むことができる。したがって、本発明の他の実施形態では、組換えられるＤＮＡ配列は、非コード配列が介在および／または隣接した１個または複数個の領域のコード配列からなるものとすることができる。それは、組み換えられるＤＮＡ配列が、例えば５’末端および／または非翻訳３’領域に制御配列を有する遺伝子の配列、あるいはエキソン／イントロン構造を有する哺乳動物遺伝子の配列とすることができることを意味する。本発明のさらなる他の実施形態では、組換えられるＤＮＡ配列は、オペロンなど、任意に非コード配列が介在した１個を超えるコード配列を含む長い連続したＤＮＡの領域からなるものとすることができる。組換えられるＤＮＡ配列は、１つまたは複数の組換え事象、例えば相同組換え事象および／または非相同組換え事象をすでに経た配列とすることができる。
【００５１】
組換え基質は、非変異野生型ＤＮＡ配列および／または変異ＤＮＡ配列を含むことができる。したがって、好ましい実施形態では、新たな変異配列を進化させるために、野生型配列をすでに存在する変異配列と組み換えることが可能である。
【００５２】
本発明によれば、原核細胞は、レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子を導入するための宿主細胞として使用する。「原核細胞」および「原核宿主細胞」という用語には、ゲノムが細胞質内に環状構造物として自由に存在する任意の細胞、すなわちゲノムが核膜に囲まれていない細胞が含まれる。原核細胞は、必ずしも酸素に依存せず、そのリボソームが真核細胞より小さいことをさらに特徴とする。原核細胞には、古細菌および真正細菌が含まれる。細胞壁の組成に応じて、真正細菌はグラム陽性細菌、グラム陰性細菌およびラン藻類に分類することができる。
【００５３】
したがって、本発明によれば、原核細胞は、古細菌または真正細菌の細胞であり、本発明の好ましい実施形態では、原核細胞はグラム陰性細菌、グラム陽性細菌またはラン藻類である。好ましくは、グラム陰性細菌は大腸菌（Escherichia coli）、例えば大腸菌株ＡＢ１１５７またはそのＭｕｔＳ−変異体、大腸菌株ＭＸＰ１である。
【００５４】
本発明によれば、好ましくは、機能的な修復系を有する本発明の方法の原核宿主細胞を使用することができる。ミスマッチ修復（ＭＭＲ）系は、複製中のＤＮＡポリメラーゼの誤りによる変異の回避に最も大きく貢献する一因である。しかし、ミスマッチ修復は、遺伝子組換えの正確性を確実に保つことにより、遺伝的安定性をも促進する。細菌では、また酵母および哺乳動物細胞でも、少数のミスマッチ（＜１％）を含む相同なＤＮＡ基質間での組換えは、同一の配列間ほど効率よく生じないが、組換え（遺伝子転換および／または交差）の頻度はＭＭＲが欠損した系統で劇的に上昇する。これは、組換えの高い正確性が、組換え酵素の内在的な特性によってだけでなく、ミスマッチ修復系による組換えの編集によっても生じることを意味する。したがって、ミスマッチ修復機構は、異なる配列間での組換えに抑制的な効果を有する。大腸菌では、メチル特異的なＭＭＲ系の２種のタンパク質である、すなわちＭｕｔＳおよびＭｕｔＬがこの強い抗組換え活性に必要であるが、他のＭＭＲ系のタンパク質であるＭｕｔＨおよびＵｖｒＤの効果は顕著でない。ＭＭＲおよび相同組換えにおける役割に加えて、ＭＭＲタンパク質は、遺伝子転換中の非相同ＤＮＡの除去にもある重要な役割を果たす。
【００５５】
本発明の他の好ましい実施形態では、ミスマッチ修復系が欠損している原核細胞を使用する。本発明との関係では、「ミスマッチ修復系が欠損している」という用語は、原核細胞のＭＭＲ系が一時的にまたは永久的に損傷を受けることを意味する。細胞または生物のＭＭＲ欠損は、それだけに限らないが、ＭＭＲに関与する１種または複数種の遺伝子の変異、ＭＭＲの全体的な障害が生じるＵＶ光のような作用因子での処理、ＭＭＲ系を一時的に飽和し不活性化する２−アミノプリンのような作用因子または過度の量のミスマッチを含むヘテロ二重鎖での処理、および一時的な不活性化を可能にする、例えば制御可能なプロモーターを介した、ＭＭＲに関与する１種または複数種の遺伝子の誘導性発現または抑制を含めて、ＭＭＲ系を一時的にまたは永久的に障害する任意の戦略によって実現することができる。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、原核宿主細胞のミスマッチ修復欠損は、ＭＭＲに関与する少なくとも１種の遺伝子の変異に起因する。好ましい実施形態では、原核細胞は、変異ｍｕｔＳ遺伝子、変異ｍｕｔＬ遺伝子、変異ｍｕｔＨ遺伝子および／または変異ＵｖｒＤ遺伝子を有する。
【００５７】
他の実施形態では、原核宿主細胞の１種または複数種の主要な組換えタンパク質が障害または阻害される。例えばＡｄｄＡＢ遺伝子が障害された細胞が高頻度の相同組換えおよび非相同組換えを示すことが判明している。他の実施形態では、原核宿主細胞の、ｒｅｃＡなどの主要な組換えタンパク質の１つが過剰発現している。このタンパク質は、一本鎖ＤＮＡの再生を促進して組換え事象に必要なヘテロ二重鎖分子を形成することにより相同組換えに関与し、ＤＮＡ鎖の交換を開始する。
【００５８】
本発明によれば、レシピエントＤＮＡ分子およびドナーレシピエント分子を原核宿主細胞中に同時にまたは順次導入することにより、第１の原核細胞を生成する。したがって、本発明の一実施形態では、第１の工程でレシピエントＤＮＡ分子を特定の原核宿主細胞中に導入することにより、第１の原核細胞を生成することができる。レシピエント分子を有する原核宿主細胞を回収した後、第２の工程でレシピエント分子を有する細胞中にドナーＤＮＡ分子を導入する。本発明の他の実施形態では、レシピエントとドナーのＤＮＡ分子をどちらも同時に原核宿主細胞中に導入することができる。
【００５９】
本発明によれば、原核宿主細胞中へのレシピエントＤＮＡ分子とドナーＤＮＡ分子の両方の導入は、それだけに限らないが、形質転換、接合、形質導入、伴性導入、感染および／またはエレクトロポレーションを含めた任意の知られている適当な方法によって実施することができる。
【００６０】
本発明との関係では、「形質転換」という用語は、細胞、例えば微生物細胞による、環境からの単離された、好ましくは精製された核酸分子の取り込みを意味する。桿菌属（Bacillus）や双球菌属（Diplococcus）など、一部の原核生物種の細胞は、生来形質転換受容性があるが、大腸菌など他の原核生物種の細胞は、形質転換受容性にする、すなわち細胞膜を横断する核酸分子の移動を誘導するために特別な処理を施さなければならない。複数の細菌が形質転換を介してＤＮＡを交換できることが知られている。
【００６１】
「接合」とは、細胞と細胞の接触により、一方の細菌細胞から他方の細菌細胞中へと細菌プラスミドがプラスミドを媒介して移動することを意味する。それに関与する移動機構は、プラスミドまたは接合トランスポゾンによって通常コードされている。そのようなプラスミドの例は、接合プラスミドまたはヘルパープラスミドである。接合プラスミドは、細胞と細胞の接触を促進する遺伝子（可動化遺伝子（mobilisation gene））を運搬する自己伝達性プラスミドである。そのプラスミドは、接合橋（conjugation bridge）を生成する遺伝子を含む。橋が作られた後、他のプラスミドを、さらには染色体ＤＮＡ（接合トランスポゾン）も移動することができる。可動性プラスミドは、可動化遺伝子を含むが、細胞間を移動するには接合プラスミドの「援助」を必要とする。接合は、原核細胞の異なる系統発生上の群の間、および原核生物と真核生物の間での遺伝子交換の主要な経路の１つである。
【００６２】
「伴性導入」とは、Ｆ因子またはＦプラスミドを有する原核細胞からそのＦ因子を含まない細胞（Ｆ−細胞）へと遺伝物質を移動する方法である。Ｆ因子は、通常は細菌細胞の細胞質中に存在するが、時折細菌の染色体の様々な部位に組み込まれる可能性があり、それによってＨｆｒ細胞の形成がなされる。Ｆ因子の組込みは可逆的であり、それにより、プラスミドの不正確な分解の後、細菌の染色体においてＦ因子の元の組込み部位に隣接した遺伝物質を含む可能性がある、いわゆる置換Ｆ因子（Ｆ’）が生じる。Ｆ’プラスミドは、高頻度でＦ’細胞中に移動することができる。
【００６３】
「形質導入」とは、バクテリオファージによって一方の細菌細胞から他方の細菌細胞中へと核酸分子を移動することであり、一方の細胞からのバクテリオファージの放出と、それに続く他方の細胞の感染とを含む。２種類の形質導入が存在する。溶原性バクテリオファージの溶原性の生活環中に特殊な形質導入が行われることがあり、それによって細菌の遺伝物質をバクテリオファージの一部と置換することができる。この細菌ＤＮＡの一片をファージゲノムの一部として複製し、ファージにより他のレシピエント細胞中へと移動することができる。一般的な形質導入の場合、溶菌ファージのゲノム全体を細菌ＤＮＡと置換することができる。このファージが他の細菌に感染するとき、そのファージはレシピエント中にＤＮＡを注入し、そこでそのＤＮＡをレシピエント細胞のＤＮＡの小片と交換することができる。
【００６４】
「エレクトロポレーション」とは、細胞を核酸分子と混合し、次いでそれを高電圧のパルスに短時間さらす方法である。宿主細胞の細胞膜を浸透性にし、それによって外来の核酸を宿主細胞に入れることを可能にする。
【００６５】
本発明の特に好ましい実施形態では、照射によって組換え頻度が上昇することが知られているので、原核宿主細胞中に導入する前に、ドナーＤＮＡ分子にＵＶ照射する。
【００６６】
本発明によれば、レシピエントＤＮＡ分子とドナーＤＮＡ分子の間での融合体またはハイブリッド分子の形成も、その２種の組換え基質間での組換え、好ましくは非相同組換えも生じさせる条件、すなわち組み換えられたＤＮＡ配列の選択を可能にする条件下で、レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を培養する。
【００６７】
ドナーＤＮＡ分子の第１のマーカー配列が抗生物質耐性マーカーである場合、原核宿主細胞が感受性であり、第１のマーカー配列の遺伝子産物が耐性を付与する抗生物質の存在下で、レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を培養する。特に好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子上に存在する第１のマーカー配列が、その遺伝子産物がスペクチノマイシンに対する耐性を細胞に付与するｓｐｅｃＲである場合、スペクチノマイシンの存在下で第１の原核細胞を培養する。他の特に好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子上に存在する第１のマーカー配列が、その遺伝子産物がフレオマイシンに対する耐性を細胞に付与するｐｈｌｅｏＲである場合、フレオマイシンの存在下で第１の原核細胞を培養する。他の特に好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡ分子上に存在する第１のマーカー配列が、その遺伝子産物がテトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与するｔｃＲである場合、テトラサイクリンの存在下で第１の原核細胞を培養する。
【００６８】
ドナーＤＮＡ分子の第１のマーカー配列が栄養マーカーである場合、宿主細胞自体で合成することができず、ドナー分子を導入しドナー分子に含まれる第１のマーカー遺伝子が発現した後に宿主細胞に供給される特定の不可欠な栄養素を欠く培地中で、レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を培養する。第１の栄養マーカー遺伝子が発現した後、原核細胞を増殖させる培地にこの不可欠な栄養素を添加することは不要である。
【００６９】
第２のマーカー配列、第３のマーカー配列および／または第４のマーカー配列が抗生物質耐性マーカーである場合、好ましい実施形態では、さらに第２のマーカー配列、第３のマーカーおよび第４のマーカー配列の遺伝子産物がそれぞれ耐性を付与する第２、第３および／または第４の抗生物質の存在下で、第１の原核細胞をさらに培養することができる。好ましくは、フレオマイシンまたはスペクチノマイシンまたはテトラサイクリンの存在下だけでなく、さらにクロラムフェニコールの存在下でも第１の原核細胞を培養する。最も好ましくは、フレオマイシン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンの存在下で、第１の原核細胞を増殖および繁殖させる。
【００７０】
選択的な条件下で原核細胞を培養した後、レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子によって形成される融合体またはハイブリッド分子を含む第２の原核細胞を単離する。この融合体は組換えＤＮＡ配列を含む。融合体および／または組換えＤＮＡ配列が存在することを、制限プロファイル分析、ＰＣＲ増幅および／または配列決定などいくつかの手段により検証および検出することができる。例えば、ドナー分子の第２のマーカー配列、およびレシピエント分子の第３または第４のマーカー配列が独特のプライマー認識配列である場合、それぞれのマーカーの組合せが存在することを検出するために、これらのマーカー配列を認識する適当なプライマーを使用することによって融合体の特定の断片をＰＣＲ増幅することができる。融合体が形成されなかった、すなわち組換えが起こらなかった場合、これらの断片を検出することはできない。例えば、ドナー分子の第２のマーカー配列、およびレシピエント分子の第３または第４のマーカー配列が独特の制限酵素切断部位である場合、特定のＤＮＡ断片を検出するために、融合体を制限酵素分析にかけることができる。融合体が形成されなかった、すなわち組換えが起こらなかった場合、これらの断片を検出することはできない。
【００７１】
本発明によれば、第２の原核細胞のハイブリッドＤＮＡ分子中に含まれる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列を単離および／または分析および／または選択することができる。得られた第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列は、例えば、ＰＣＲ増幅、または適当な制限酵素での切断によって単離することができる。ハイブリッドＤＮＡ分子中に含まれる第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列の分析は、例えば配列決定法によって行うことができる。
【００７２】
本発明によれば、単離された第１および第２の組み換えられたＤＮＡ配列をドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子中にそれぞれ再度挿入し、本発明の方法を使用することによりそれを別の回の組換えにかけることができる。
【００７３】
本発明の他の態様は、新規のまたは向上した機能および特性を有する新規のタンパク質、酵素および非コード配列を生成する方法に関し、それによって、原核宿主細胞中で組換えＤＮＡ配列を生成および検出する本発明の方法を使用することにより、既知のタンパク質コード配列または既知の非コード配列を１回または複数回の組換えにかける。本発明はまた、本発明の方法のいずれか１つによって生成されたタンパク質、酵素および非コード配列にも関する。
【００７４】
本発明はまた、枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１にも関し、これは、プラスミドｐＩＬ２５３の誘導体であり、枯草菌中で複製できるが、大腸菌中では複製できず、ｓｐｅｃＲマーカー、ｐｈｌｅｏＲマーカー、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＳｃａＩ、ＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉを含む。
【００７５】
本発明はまた、枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１にも関し、これは、プラスミドｐＩＬ２５３の誘導体であり、枯草菌中で複製できるが、大腸菌中では複製できず、ｔｃＲマーカー配列、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩを含む。
【００７６】
本発明はまた、枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１を含む枯草菌株ＤＳＭ４３９３（２００５年２月２１日に、ＤＳＭＺ、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen）ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツにＳＢ２０２ｐＭＩＸ９１として寄託されている）、および枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１を含む枯草菌株１Ａ４２３（２００５年２月２１日に、ＤＳＭＺ、ドイツ微生物細胞培養コレクションＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツに１Ａ４２３ｐＭＩＸ１０１として寄託されている）にも関する。
【００７７】
本発明の他の態様は、本発明の方法におけるドナーＤＮＡ分子としての枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１およびｐＭＩＸ１０１それぞれの使用、すなわち原核宿主細胞中で、好ましくは大腸菌細胞中で組換えＤＮＡ配列を生成および／または検出するためのプラスミドｐＭＩＸ９１およびｐＭＩＸ１０１の使用に関する。
【００７８】
本発明の他の態様は、本発明の方法におけるレシピエントＤＮＡ分子としての大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはｐＭＩＸ１００あるいはその誘導体の使用、すなわち原核宿主細胞中で、好ましくは大腸菌細胞中で組換えＤＮＡ配列を生成および／または検出するためのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはｐＭＩＸ１００の使用に関する。
【００７９】
本発明の他の態様は、原核宿主細胞中で組み換えられたＤＮＡ配列を生成および検出する本発明の方法の実施に使用することができるキットに関する。第１の実施形態では、キットは、原核宿主細胞として大腸菌株ＡＢ１１５７の細胞を含む第１の容器、レシピエントＤＮＡ分子として使用することができる大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４または大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００を含む大腸菌株ＡＢ１１５７の細胞を含む第２の容器、およびドナーＤＮＡ分子として使用することができる枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１を含む枯草菌株ＤＳＭ４３９３の細胞、または枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１を含む枯草菌株１Ａ４２３の細胞を含む第３の容器を少なくとも含む。本発明の第２の実施形態では、キットは、原核宿主細胞として、株ＡＢ１１５７のＭｕｔＳ−変異体である大腸菌株ＭＸＰ１の細胞を含む第１の容器、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはｐＭＩＸ１００を含む大腸菌株ＡＢ１１５７の細胞を含む第２の容器、およびプラスミドｐＭＩＸ９１を含む枯草菌株ＤＳＭ４３９３、またはプラスミドｐＭＩＸ１０１を含む枯草菌株１Ａ４２３の細胞を含む第３の容器を少なくとも含む。さらなる他の実施形態では、キットは、大腸菌株ＡＢ１１５７または大腸菌株ＭＸＰ１の細胞を含む第１の容器、大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはｐＭＩＸ１００のＤＮＡを含む第２の容器、および枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１または枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１のＤＮＡを含む第３の容器を少なくとも含む。
【００８０】
本発明の他の実施形態は、原核細胞中でハイブリッド遺伝子および／またはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を生成する方法に関する。ハイブリッド遺伝子および／またはそれにコードされたタンパク質を生成する方法は、組換えＤＮＡ配列を生成および検出する本発明の方法を実施する工程を含み、それによってハイブリッド遺伝子および／またはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質が原核細胞中で生成される。発現後、ハイブリッド遺伝子および／またはそれにコードされたタンパク質を原核細胞中で選択し、かつ／またはそれから単離する。
【００８１】
本発明はまた、ハイブリッド遺伝子を生成する本発明の方法、または組換えＤＮＡ配列を生成および検出する本発明の方法によって得られるハイブリッド遺伝子にも関する。
【００８２】
本発明はまた、ハイブリッド遺伝子を生成する本発明の方法、または組換えＤＮＡ配列を生成および検出する本発明の方法によって得られるハイブリッド遺伝子によってコードされ、かつ／あるいはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を生成する本発明の方法によって得られるタンパク質にも関する。
【００８３】
下記の配列表、図面および実施例により、本発明を説明する。
【００８４】
配列番号１および２は、ｏｘａ７を増幅し、それぞれ５’および３’末端にＳｃａＩおよびＰｐｕＭＩ制限部位を導入するためのプライマーＯＬＧ１およびＯＬＧ２それぞれの配列を示す。
【００８５】
配列番号３および４は、ｏｘａ１１を増幅し、それぞれ５’および３’末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ制限部位を導入するためのプライマーＯＬＧ３およびＯＬＧ４それぞれの配列を示す。
【００８６】
配列番号５および６は、ｏｘａ５を増幅し、それぞれ５’および３’末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ制限部位を導入するためのプライマーＯＬＧ５およびＯＬＧ６それぞれの配列を示す。
【００８７】
配列番号７および８は、ｏｘａ１を増幅し、それぞれ５’および３’末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ制限部位を導入するためのプライマーＯＬＧ７およびＯＬＧ８それぞれの配列を示す。
【００８８】
配列番号９および１０は、ｏｘａ１１を増幅し、それぞれ５’および３’末端にＳｃａＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ制限部位を導入するためのプライマーＯＬＧ９およびＯＬＧ１０それぞれの配列を示す。
【００８９】
配列番号１１はプライマーＯＬＧ１１の配列を示し、これをプライマーＯＬＧ８（配列番号８）と一緒に用いて、ｏｘａ１を増幅し、それぞれ５’および３’末端にＳｃａＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ制限部位を導入した。
【００９０】
配列番号１２および１３は、ハイブリッドプラスミドｐＭＩＸ９３に含まれる組換え遺伝子Ｒ１を増幅するためのプライマーＯＬＧ１２およびＯＬＧ１３それぞれの配列を示す。
【００９１】
配列番号１４はプライマーＯＬＧ１４の配列を示し、これをプライマーＯＬＧ１２（配列番号１２）と一緒に用いて、ハイブリッドプラスミドｐＭＩＸ９５、ｐＭＩＸ９６およびｐＭＩＸ９７の１つに含まれる組換え遺伝子Ｒ１を増幅した。
【００９２】
配列番号１５はプライマーＯＬＧ１５の配列を示し、これをプライマーＯＬＧ１７（配列番号１７）と一緒に用いて、ハイブリッドプラスミドｐＭＩＸ９３に含まれる組換え遺伝子Ｒ２を増幅した。
【００９３】
配列番号１６はプライマーＯＬＧ１６の配列を示し、これをプライマーＯＬＧ１７（配列番号１７）と一緒に用いて、ハイブリッドプラスミドｐＭＩＸ９５、ｐＭＩＸ９６およびｐＭＩＸ９７の１つに含まれる組換え遺伝子Ｒ２を増幅した。
【００９４】
配列番号１７はプライマーＯＬＧ１７の配列を示す。
【００９５】
（実施例１）
スペクチノマイシンおよび／またはフレオマイシンに対する耐性により組換えＤＮＡ配列を選択する二重プラスミド系（大腸菌／枯草菌）を使用する非相同遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え
１．材料および方法
１．１ 細菌株およびプラスミド
この実施例中で使用する細菌株およびプラスミドをそれぞれ表１および表２に示す。
【００９６】
【表１】
2007523656.tif 000003
【００９７】
【表２】
2007523656.tif 000004
【００９８】
１．２ 増殖条件および培地
大腸菌と枯草菌はどちらもＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、米国）中で３７℃で培養した。プレート中で培地を使用するとき（ＬＢＡ）、１リットル当たりに寒天（Ｄｉｆｃｏ）を１５ｇ添加した。必要なとき、培地に抗生物質を補充し、その終濃度は以下の通りであった：テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｉｍｉｅ、Ｓｔ．Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）、１２．５μｇ／ｍｌ；クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｉｍｉｅ）、３０μｇ／ｍｌ；アンピシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｉｍｉｅ）、１００μｇ／ｍｌ；エリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｉｍｉｅ）、０．５μｇ／ｍｌ；スペクチノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｉｍｉｅ）、７５μｇ／ｍｌ；フレオマイシン（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス）、２μｇ／ｍｌ。ＬＢＡにスペクチノマイシン＋フレオマイシンを補充したとき、終濃度は、それぞれ６０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった。
【００９９】
１．３ ＤＮＡおよび微生物の操作
形質導入
Ｐ１を媒介する形質導入を用いて大腸菌ＭＩＸＰ１株を構築した（３）。
【０１００】
形質転換
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆエレクトロポレーター２５１０（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を用いた電気的形質転換により、供給元の説明書に従って大腸菌株中にプラスミドを導入した。
【０１０１】
Ｙａｓｂｉｎら、（９）に記載のように、枯草菌のコンピテント細胞を調製し形質転換した。
【０１０２】
ＤＮＡ操作
分子生物学技術については確立されているプロトコールに従った（４）。ＤＮＡ操作用の酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州、米国）、ＭＢｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国）から購入し、製造元による推奨の通りに使用した。必要なときに、ＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ抽出キット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、アガロースゲルから制限エンドヌクレアーゼで消化したＤＮＡを精製した。
【０１０３】
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．、Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）を使用して、製造元の説明書に従って大腸菌からプラスミドＤＮＡを単離した。枯草菌からプラスミドＤＮＡを単離するのに同じキットを使用したが、最初の溶解工程は、細胞を２ｍｇ／ｍｌのリゾチームとともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより行った。
【０１０４】
使用したプライマーは、Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｆｒａｎｃｅ  ＳＡＳ（Ｐａｒｉｓ、フランス）により合成された。
【０１０５】
ヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）によって両方向から決定した。Ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎパッケージ（Ｇｅｎｏｐｏｌｅ  ｄ’Ｅｖｒｙ、Ｅｖｒｙ、フランス）を用いて配列を分析した。配列比較にＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した。
【０１０６】
ＰＣＲ増幅
Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を使用してＰＣＲ反応を行った。容量５０μｌで反応を実施し、ハイフィデリティーＨｅｒｃｕｌａｓｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を下記の条件下で使用した：９６℃で３分間と、９６℃で３０秒間、アニーリング温度で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクルと、７２℃で１０分間の最終伸長工程。アニーリング温度は、使用したプライマーの最も低いＴｍから５℃減じることによって決定した。必要なときに、ＮｕｃｌｅｏｎＳｐｉｎ抽出キット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用してＰＣＲ産物を精製した。０．７％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）中での電気泳動によって増幅産物を分析した。
【０１０７】
２．一般的戦略
この実験は、異なる程度の配列同一性を有する２種の親遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ組換えにより、有利な特性を示す新たな分子を生成するために行った。使用した戦略は下記の通りである。
【０１０８】
そのヌクレオチド配列が相同性を示さない、組換えられる遺伝子を２種の異なるプラスミドにより運搬する。第１のプラスミドは、大腸菌複製性プラスミドであり、クロラムフェニコール（Ｃｍ）またはテトラサイクリン（Ｔｃ）に対する耐性を付与する。それは、標準的なクローン化用ベクターｐＡＣＹＣ１８４という、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した低コピー数プラスミドに基づく。
【０１０９】
第２のプラスミドは、ｐＩＬ２５３に由来する枯草菌プラスミドである（ＳｉｍｏｎおよびＣｈｏｐｉｎ、１９８８）。それは大腸菌中で複製することができず、スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）およびフレオマイシン（Ｐｈｌｅｏ）それぞれに対する２種の抗生物質耐性マーカーを運搬する。
【０１１０】
これら２種のベクターによって運搬される非相同遺伝子の対を組み換えるために、複製性プラスミドを有する大腸菌株中に枯草菌プラスミドをエレクトロポレーションによって導入する。これを図１に概略的に示す。そのような株では、変異導入および組換えを調節するミスマッチ修復系（ＭＭＲ）が機能（＋）または欠損（−）している。
【０１１１】
エレクトロポレーション後、枯草菌プラスミドが耐性を付与する抗生物質（ＳｐｃおよびＰｈｌｅｏ）で形質転換体を選択する。枯草菌プラスミドと大腸菌プラスミドの間で形成された融合体を有する細胞だけがその条件下で増殖することができるので、そのような選択圧が非相同遺伝子間での組換えを生じさせる。ハイブリッドプラスミドは、ＳｐｃおよびＰｈｌｅｏに対する耐性を付与し、枯草菌のものは機能しないため大腸菌由来のものを複製する。さらに、それは２種の組換え遺伝子Ｒ１およびＲ２を運搬する。
【０１１２】
第１の工程は、大腸菌および枯草菌ベクター中に、組換え効率を評価するために標的として最初に選択された遺伝子をクローン化することである。
【０１１３】
野生型株とミスマッチ修復欠損株の両方でｏｘａ遺伝子間での組換え実験を行った。実験は、同一遺伝子または異なる遺伝子の対の間で行った。
【０１１４】
照射によって組換え頻度が１０倍上昇することが知られているので、エレクトロポレーションの前に、プラスミドＤＮＡにＵＶ照射した。
【０１１５】
２−アミノプリンでの処理により一時的にミューテーターにした株でも組換えを行った。２−アミノプリンはアデニンアナログであり、細菌の増殖中にＤＮＡに組み込まれ、ＭＭＲ系を飽和する。したがって、２−アミノプリンの除去後野生型の状態が回復するので一時的なミューテーターの表現型が生じる。ミスマッチ修復活性のこの一時的な調節により、組換えで使用する株の安定なバックグラウンドがもたらされ、そのゲノム中での変異の蓄積が回避される。
【０１１６】
３．結果
枯草菌ベクターの構築
組換えの標的遺伝子を運搬する枯草菌ベクターを構築するために、抗生物質スペクチノマイシン（ｓｐｅｃＲ）およびフレオマイシン（ｐｈｌｅｏＲ）それぞれに対する耐性を付与する２種の遺伝子マーカーを、２工程のクローン化戦略に従ってプラスミドｐＩＬ２５３中にクローン化した。
【０１１７】
第１に、プラスミドｐｉｃ１５６から、長さ１２９４ｂｐのＳａｃＩ断片としてｓｐｅｃＲ遺伝子を得た。その断片を精製し、次いでＳａｃＩで消化したｐＩＬ２５３にそれを連結した。その連結混合物で枯草菌ＤＳ４３９３コンピテント細胞を形質転換し、７５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢＡプレート上で形質転換体を選択した。形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それがｓｐｅｃＲ遺伝子を運搬するｐＩＬＦ２５３誘導体を有していることが確認された。
【０１１８】
第２の工程では、ｐｈｌｅｏＲ遺伝子をｐＩＬ２５３−ｓｐｅｃ中にクローン化した。プラスミドｐＵＣ１９−ｐｈｌｅｏをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、ｐｈｌｅｏＲに対応する長さ５７４ｂｐの断片をゲル精製し、同じ２種の酵素で予め消化したｐＩＬ２５３−ｓｐｅｃにそれを連結した。その連結混合物で枯草菌ＤＳＭ４３９３コンピテント細胞を形質転換し、次いで、６０μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含むＬＢＡプレート上で形質転換体を選択した。形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それがｓｐｅｃＲ遺伝子とｐｈｌｅｏＲ遺伝子の両方を運搬する予想された６．６９ｋｂのプラスミドを有していることが実証された。プラスミドをｐＭＩＸ９１と名付けた（図３を参照）。
【０１１９】
形質転換効率対照ベクターの構築
組換え実験においてスペクチノマイシンおよびフレオマイシンの選択下で大腸菌株の形質転換効率対照として使用するベクターを構築した。ベクターを以下の通りに構築した：ｐｉｃ１５６をＢａｍＨ１およびＥｃｏＲＩで消化した後、１．２５ｋｂの断片としてスペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐｅｃＲ）を得た。フレオマイシン耐性遺伝子（ｐｈｌｅｏＲ）の隣にあるｐＵＣ−ｐｈｌｅｏの対応する部位にそれをクローン化した。その連結混合物を用いた大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行った後、スペクチノマイシンおよびフレオマイシンの耐性コロニーを、それぞれ終濃度６０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの両方の抗生物質を含むＬＢＡプレート上で選択した。形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それが長さ４．４６ｋｂの予想された構築物と一致していることが判明し、それをｐＭＩＸ９２と名付けた（図３を参照）。
【０１２０】
大腸菌ベクターおよび枯草菌ベクター中へのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子のクローン化
野生型とＭｕｔＳ−変異型の両方の大腸菌株で組換え効率を評価するために、β−ラクタマーゼをコードする４種の遺伝子を標的として選択した。そのような遺伝子であるｏｘａ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７５５６２）、ｏｘａ１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２２５９０）、ｏｘａ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５８２７２）およびｏｘａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２９６７）は、そのヌクレオチド配列において異なる程度の相異性を示す。ｏｘａ１の配列と、ｏｘａ５、ｏｘａ７およびｏｘａ１１それぞれの配列は４０％異なる。ｏｘａ５の配列と、ｏｘａ７およびｏｘａ１１それぞれの配列は２２％異なる。ｏｘａ７の配列と、ｏｘａ１１の配列は５％異なる。
【０１２１】
その４種のｏｘａ遺伝子を大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４中にクローン化し、一方、ｏｘａ７、ｏｘａ１１およびｏｘａ１を枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１中に同様にクローン化した。遺伝子のクローン化を以下の通りに行った：ＳｃａＩおよびＰｐｕＭＩ部位を、増幅したＤＮＡのそれぞれ５’および３’末端に導入するように設計されたプライマー（配列番号１のプライマーＯＬＧ１、および配列番号２のプライマーＯＬＧ２）を用いて、ＰＣＲによりｏｘａ７を増幅した。それらの制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、得られた長さ９９１ｂｐの断片を、同じ酵素で予め切断したｐＭＩＸ９１に連結した。その連結混合物で枯草菌ＤＳＭ４３９３コンピテント細胞を形質転換し、７５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢＡプレート上で形質転換体の選択を行った。形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それが、ｏｘａ７を運搬する予想された６．８９ｋｂのプラスミドｐＭＩＸ９４を有していることが示された（図３を参照）。
【０１２２】
大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４中にｏｘａ７をクローン化するために、上記に記載のＰＣＲ産物をｐＡＣＹＣ１８４と同様にＰｐｕＭＩおよびＳｃａＩで消化した。消化したＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用することによって平滑末端を作製し、それらの間の連結を行った。その連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行い、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢＡプレート上で形質転換体を選択した。形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それが長さ４．３３ｋｂの予想された構築物と一致していることが判明し、それをｐＭＩＸ９３と名付けた（図３を参照）。
【０１２３】
ｐＡＣＹＣ１８４中にｏｘａ１１、ｏｘａ５およびｏｘａ１をクローン化するために、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ部位を、増幅したＤＮＡのそれぞれ５’および３’末端に導入するように設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲにより遺伝子を増幅した。ＯＬＧ３（配列番号３）／ＯＬＧ４（配列番号４）、ＯＬＧ５（配列番号５）／ＯＬＧ６（配列番号６）およびＯＬＧ７（配列番号７）／ＯＬＧ８（配列番号８）のプライマーの対を使用して、ｏｘａ１１、ｏｘａ５およびｏｘａ１をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、得られた９９７ｂｐ（ｏｘａ１１）および８３０ｂｐ（ｏｘａ５）および９３６ｂｐ（ｏｘａ１）の断片を、同じ酵素で予め切断したｐＡＣＹＣ１８４にそれぞれ独立に連結した。その連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行い、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢＡプレート上で形質転換体を選択した。形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それが、予想された６．８９ｋｂのプラスミドｐＭＩＸ９５（３．７２ｋｂ）、ｐＭＩＸ９６（３．５５ｋｂ）およびｐＭＩＸ９７（３．６６ｋｂ）と一致していることが判明した（図３を参照）。
【０１２４】
ｐＭＩＸ９１中にｏｘａ１１およびｏｘａ１をクローン化するために、ＳｃａＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉ部位を、増幅したＤＮＡのそれぞれ５’および３’末端に導入するように設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲにより遺伝子を増幅した。ＯＬＧ９（配列番号９）／ＯＬＧ１０（配列番号１０）、およびＯＬ１１（配列番号１１）／ＯＬＧ８のプライマーの対を使用して、ｏｘａ１１およびｏｘａ１をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ産物をＳｃａＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、得られた９９５ｂｐ（ｏｘａ１１）および９３４ｂｐ（ｏｘａ１）の断片を、同じ酵素で予め切断したｐＭＩＸ９１にそれぞれ独立に連結した。その連結混合物で枯草菌ＤＳＭ４３９３コンピテント細胞を形質転換し、７５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢＡプレート上で形質転換体の選択を行った。形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡの制限分析により、それが、予想されたプラスミドｐＭＩＸ９８（６．８９ｋｂ）およびｐＭＩＸ９９（６．８３ｋｂ）と一致していることが示された。図３を参照されたい。
【０１２５】
ＭｕｔＳ−変異大腸菌と比較したｗｔ大腸菌におけるｏｘａ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え
第１の工程では、ｏｘａ遺伝子を運搬するｐＡＣＹＣ１８４誘導体プラスミドであるｐＭＩＸ９３、ｐＭＩＸ９５、ｐＭＩＸ９６またはＭＩＸ９７で、大腸菌ＡＢ１１５７およびそのＭｕｔＳ−変異体である大腸菌ＭＸＰ１のコンピテント細胞をエレクトロポレーションによりそれぞれ独立に形質転換した。テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対するその耐性に基づいて形質転換体を選択した。その後、適切なプラスミドが存在することを制限分析および／またはＰＣＲ分析によって確認した。
【０１２６】
第２の工程では、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールを含む選択培地から、複製性プラスミドを有する野生型株とＭｕｔＳ−株の両方のコンピテント細胞を調製した。その後、ｏｘａ遺伝子を運搬する枯草菌プラスミドであるｐＭＩＸ９４、ｐＭＩＸ９８またはｐＭＩＸ９９で、そのようなコンピテント細胞をエレクトロポレーションによりそれぞれ独立に形質転換した。
【０１２７】
エレクトロポレーション後、枯草菌プラスミドが耐性を付与する抗生物質である、終濃度がそれぞれ６０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよびフレオマイシンを含むＬＢＡプレート上で形質転換体を選択した。枯草菌プラスミドと大腸菌プラスミドの間で形成されたハイブリッドプラスミドを有する細胞だけがその条件下で増殖することができるので、そのような選択圧がｏｘａ遺伝子間での組換えを生じさせる。プレートを３７℃で１晩インキュベートし、その後、形質転換体が、２種の組換え遺伝子Ｒ１およびＲ２を運搬する（長さが約１０．５ｋｂの）ハイブリッドプラスミドを有していることを確認するために、制限酵素での消化によって形質転換体のプラスミドＤＮＡを分析した。一部の場合では、組換え遺伝子をＰＣＲによって増幅し、その配列を決定した。それが存在するプラスミドがｐＭＩＸ９３である場合、ＯＬＧ１２（配列番号１２）／ＯＬＧ１３（配列番号１３）でＲ１を、ＯＬＧ１５（配列番号１５）／ＯＬＧ１７（配列番号１７）でＲ２を増幅した；それが存在するプラスミドがｐＭＩＸ９５、ｐＭＩＸ９６またはＭＩＸ９７である場合、ＯＬＧ１２／ＯＬＧ１４（配列番号１４）でＲ１を、ＯＬＧ１６（配列番号１６）／ＯＬＧ１７でＲ２を増幅した。
【０１２８】
組換え実験では、枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１を陰性対照として使用し、一方、大腸菌プラスミドｐＭＩＸ９２を、スペクチノマイシンおよびフレオマイシンの選択下での形質転換効率対照として使用した。その複製起点（それぞれＣｏｌＥ１およびｐ１５）が適合するので、ｐＭＩＸ９２は、ｐＡＣＹＣ１８４誘導体プラスミドを有する株の中で複製することができる。照射によって組換え頻度が１０倍上昇することが知られているので、エレクトロポレーション（２００Ｊ／ｍ２）の前に、プラスミドＤＮＡにＵＶ照射した。
【０１２９】
対照ベクターｐＭＩＸ９２で得られた形質転換効率当たりで、枯草菌プラスミドで得られた形質転換効率を割ることにより、組換え頻度を算出した。形質転換効率は、上記に記載の条件でＤＮＡ１μｇ当たりに得られたコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数として算出した。
【０１３０】
得られた結果の概要を表３に示す。野生型株では、同一のまたは５％異なるｏｘａ遺伝子を使用した実験で組換え体が得られたが、ＭｕｔＳ−変異型株では、組換えは２２％異なる遺伝子の間でも起こった。
【０１３１】
【表３】
2007523656.tif 000005
【０１３２】
２−アミノプリン（２−ＡＰ）処理大腸菌と比較したｗｔ大腸菌におけるｏｘａ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え
第１の工程では、ｏｘａ１１遺伝子を運搬するｐＡＣＹＣ１８４誘導体プラスミドであるｐＭＩＸ９５で、大腸菌ＡＢ１１５７のコンピテント細胞をエレクトロポレーションにより形質転換した。その耐性に基づいて形質転換体を選択した。適切なプラスミドが存在することを制限分析および／またはＰＣＲ分析によって確認した。
【０１３３】
第２の工程では、２００μｇ／ｍｌの２−ＡＰの存在下でこの株のコンピテント細胞を調製し、それに、ｏｘａ７を運搬する枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９４、またはｏｘａ１１を運搬するｐＭＩＸ９８でエレクトロポレーションをそれぞれ独立に行った。
【０１３４】
枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１を陰性対照として使用し、一方、ｓｐｃＲおよびｐｈｌｅｏＲマーカーを運搬する大腸菌プラスミドｐＭＩＸ９２を、形質転換効率対照として使用した。組換え頻度を上昇させるために、エレクトロポレーションの前に、プラスミドＤＮＡにＵＶ照射した。
【０１３５】
結果の概要を表４に示す。野生型株では、同一のｏｘａ遺伝子を使用した実験で組換え体が得られたが、２−ＡＰ処理株では、組換えは５％異なる遺伝子の間でも起こった。
【０１３６】
【表４】
2007523656.tif 000006
【０１３７】
２２％異なる遺伝子の間で組換えが起こり、その最も長い配列同一性領域がそれぞれ２２ヌクレオチド（ｏｘａ５／ｏｘａ１１）および１８ヌクレオチド（ｏｘａ５／ｏｘａ７）であったことは注目に値する（図５および６を参照）。ＭＥＰＳ（最小限効率処理セグメント（minimal efficient processing segment））として知られる最小限の相同性の長さを下回ると組換えが不十分となることが報告されている。ＭＥＰＳの長さは、組換えの経路に応じて様々であるが、２３〜９０塩基対の範囲であると記載されている（５）。
【０１３８】
５％または２２％異なる遺伝子を使用する実験で得られた５４個のハイブリッドプラスミドによって運搬された遺伝子Ｒ１およびＲ２の配列分析から、そのハイブリッドプラスミドのうち４６個が互いに異なるものであったことが判明した。この結果から、それらが異なる組換え事象に対応するものであり、その結果、高度の遺伝的多様性がｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによって生じたことが示唆される。
【０１３９】
ほとんどの組換え遺伝子は、４〜１０１ヌクレオチドの様々な配列同一性領域での非相互的な単一の交差によって生じた。一部の場合では、Ｒ１またはＲ２のモザイク遺伝子が生じている複数の交差が観察された。ｏｘａ７／ｏｘａ５間およびｏｘａ１１／ｏｘａ５間で得られた組換え遺伝子を図４に示す。
【０１４０】
組換え遺伝子のＤＮＡおよび推定されるアミノ酸の配列の比較から、その５３％が新たなｏｘａ遺伝子に相当することが同様に明らかとなった（表４−１を参照）。組換えの間にフレームシフトまたは終止コドンが生じなかったので、それらが３８個の新たな機能的β−ラクタマーゼをコードする可能性があると推定される。
【０１４１】
【表５】
2007523656.tif 000007
（実施例２）
【０１４２】
テトラサイクリンに対する耐性により組換えＤＮＡ配列を選択する二重プラスミド系（大腸菌／枯草菌）を使用する非相同遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え
他の二重プラスミド系を設計して、実施例１で得られた結果を検証し、遺伝子のクローン化および組換えを促進した。この系は、テトラサイクリンに耐性である細胞の選択に基づくものである。
【０１４３】
１．細菌株およびプラスミド
この実施例中で使用する細菌株およびプラスミドをそれぞれ表５および表６に示す。
【０１４４】
【表６】
2007523656.tif 000008
【０１４５】
【表７】
2007523656.tif 000009
【０１４６】
２．結果
２．１ 大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００の構築
プラスミドｐＭＩＸ１００は、ｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、並びにそのクロラムフェニコール耐性遺伝子を運搬する。ｐＭＩＸ１００はまた、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋由来の遺伝子ｌａｃＺをも運搬し、この遺伝子はクローン化実験での選択を促進する。ｌａｃＺは、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを含む培地中での組換え体の青色／白色選択のα−相補性をもたらすβ−ガラクトシダーゼの断片をコードする。したがって、ｐＭＩＸ１００を有するコロニーは、この培地中で青色であるはずであり、遺伝子がポリリンカー（ＭＣＳ）中に挿入されたプラスミドを有するものは白色であるはずである。プラスミドｐＭＩＸ１００の物理的地図を図５に示す。
【０１４７】
２．２ 枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１の構築
プラスミドｐＭＩＸ１０１は、枯草菌プラスミドｐＩＬ２５３の誘導体である。ｐＩＬ２５３のマーカーＥｒｍＲはエリスロマイシンに対する耐性を付与するが、これは大腸菌に有用でないため、組換え実験でのハイブリッド分子の選択を可能にするテトラサイクリン耐性マーカーを導入した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４からテトラサイクリン耐性遺伝子を増幅した。したがって、ｐＭＩＸ１０１は、２種のマーカー、すなわち標的遺伝子をクローン化するための枯草菌中での選択マーカーであるＥｒｍＲ、および大腸菌中で組換えハイブリッド分子を選択するＴｃＲを運搬する。プラスミドｐＭＩＸ１０１の物理的地図を図６に示す。
【０１４８】
形質転換効率対照プラスミドｐＭＩＸ１０２およびｐＭＩＸ１０３の構築
枯草菌ベクターが大腸菌で複製することができないので、組換え頻度の推定に形質転換効率対照が必要である。テトラサイクリン耐性によって組換え体が選択されるので、同じマーカーが対象ベクター中に存在しなければならない。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋の誘導体であるプラスミドｐＭＩＸ１０２は、ｐＡＣＹＣ１８４から増幅されたＴｃＲ遺伝子を含む。ｐＭＩＸ１０２では、ｐｌａｃプロモーターによってＴｃＲ遺伝子が駆動される。プラスミドｐＭＩＸ１０２の物理的地図を図７に示す。
【０１４９】
第２の対照ベクターｐＭＩＸ１０３では、ｐｌａｃと反対の方向にＴｃＲ遺伝子がクローン化されている。したがって、この遺伝子は、それ自体のプロモーターから発現される。プラスミドｐＭＩＸ１０３の物理的地図を図８に示す。
【０１５０】
大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００中へのｏｘａ７、ｏｘａ１１およびｏｘａ５のクローン化
実施例１で得られた、０％、５％および２２％異なるｏｘａ遺伝子間での組換え実験の結果を検証するために、ｏｘａ７、ｏｘａ１１およびｏｘａ５を大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００中にクローン化した。５’末端にＰｓｔＩまたはＸｈｏＩを含むプライマーを使用して、それらの遺伝子を増幅した。それらの酵素で消化した後、増幅したＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ＋ＸｈｏＩで予め切断したｐＭＩＸ１００とそれぞれ独立に連結した。その連結混合物を用いて大腸菌ＤＨＢ１０のコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行い、クロラムフェニコール耐性／Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）＋Ｘ−Ｇａｌ（８０μｇ／ｍｌ）＋ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を含むＬＢプレート上での白色により、陽性クローンを有するコロニーを表現型上選択した。各ｏｘａクローン化について、そのような形質転換体のうち５個を分析した。
【０１５１】
プラスミドＤＮＡを得、制限地図作成によりそれを分析した。その結果から、ｐＭＩＸ１０４がｏｘａ７を運搬し、ｐＭＩＸ１０６がｏｘａ１１を運搬し、ｐＭＩＸ１０７がｏｘａ５を運搬することが確認された。
【０１５２】
枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１中へのクローン化では、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩでの制限処理によりｐＭＩＸ１０４からの０．９ｋｂの断片としてｏｘａ７を得、同じ酵素で予め切断したｐＭＩＸ１０１と連結した。その連結産物での枯草菌１Ａ４２３コンピテント細胞の形質転換の後、０．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｒｍ）を含むＬＢ中で細胞を選択した。形質転換体２４個からプラスミドＤＮＡを得、制限処理によりそれを分析した。その結果から、すべてのクローンが７ｋｂのプラスミドｐＭＩＸ１０５を含むことが確認された。
【０１５３】
大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００中および枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１中にｏｘａ７、ｏｘａ１１およびｏｘａ５遺伝子をクローン化する戦略を図９に示す。
【０１５４】
２．５  ＭｕｔＳ−変異大腸菌と比較したｗｔ大腸菌におけるｏｘａ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え
大腸菌ＡＢ１１５７ｈｓｄＲ−およびそのＭＭＲ−変異体である大腸菌ＡＢ１１５７ｈｓｄＲ−ＣΔｍｕｔＳのコンピテント細胞を、プラスミドｐＭＩＸ１０４（ｏｘａ７）、ｐＭＩＸ１０６（ｏｘａ１１）およびｐＭＩＸ１０７（ｏｘａ５）を用いたエレクトロポレーションによりそれぞれ独立に形質転換した。
【０１５５】
ｏｘａ遺伝子を組み換えるために、ｐＭＩＸ１０５（ｏｘａ７）を用いて、それらのプラスミドを有する大腸菌株のエレクトロポレーションを行った。枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１を陰性対照として使用し、一方、ＴｃＲマーカーを運搬する大腸菌ベクターｐＭＩＸ１０２を、テトラサイクリン選択下での形質転換効率対照として使用した。組換え頻度を上昇させるために、エレクトロポレーションの前に、すべてのＤＮＡにＵＶ照射した。
【０１５６】
対照ベクターｐＭＩＸ９２で得られた形質転換効率当たりで、枯草菌プラスミドで得られた形質転換効率を割ることにより、組換え頻度を算出した。形質転換効率は、上記に記載の条件でＤＮＡ１μｇ当たりに得られたコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数として算出した。
【０１５７】
得られた結果の概要を表７に示す。野生型株では、同一のまたは５％異なるｏｘａ遺伝子を使用した実験で組換え体が得られたが、ＭｕｔＳ−変異型株では、組換えは２２％異なる遺伝子の間でも起こった。
【０１５８】
【表８】
2007523656.tif 000010
【０１５９】
組換え頻度は、前者の二重プラスミド系で得られたものと一致した。
【０１６０】
組換えを確認するために、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を含む液体培地中でｐＭＩＸ１０５形質転換体を増殖させた。この培養物から得られたプラスミドＤＮＡの制限分析から、その培養物が、ｏｘａ組換え遺伝子を運搬するダイマーを、それが存在するプラスミド（ｐＭＩＸ１０４またはｐＭＩＸ１０６）と一緒に有していることが判明した。さらに、コロニーからもプラスミドＤＮＡからも、特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲにより組換え遺伝子Ｒ１およびＲ２を増幅することに成功した。
【０１６１】
この結果は、選択圧としてテトラサイクリン耐性を使用して、第２の二重プラスミド系で組換え体が得られたことを実証するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】２種のＤＮＡ配列間での組換えを生成および／または検出するための本発明の方法を概略的に示す図である。第１の配列であるｏｘａ７遺伝子は、ドナーＤＮＡ分子である枯草菌プラスミドｐＴＧ２−ｐｈｌｅｏ上に存在する。ｐＴＧ２−ｐｈｌｅｏは、スペクチノマイシンおよびフレオマイシンに対する耐性を付与するｓｐｅｃＲマーカーおよびｐｈｌｅｏＲマーカーを運搬する。エレクトロポレーションにより、レシピエントＤＮＡ分子であるプラスミドｐＴＧ３を含む大腸菌宿主細胞中にｐＴＧ２−ｐｈｌｅｏを導入する。ｐＴＧ３は、第２のＤＮＡ配列であるｏｘａ１１遺伝子、およびクロラムフェニコールに対する耐性を付与するｃｍＲマーカーを含む。ｐＴＧ２−ｐｈｌｅｏの導入後、スペクチノマイシンおよびフレオマイシンの存在下で細胞を培養し、２種のプラスミド間で融合体を形成させ、同時に遺伝子間での組換えを生じさせる。したがって、培養後、新たに組み換えられたＤＮＡ配列Ｒ１およびＲ２を含むダイマープラスミドを含む大腸菌細胞が得られる。制限プロファイル分析、Ｒ１およびＲ２組換え遺伝子のＰＣＲ増幅、ならびに／またはＲ１およびＲ２の配列決定によって、組み換えられたＤＮＡ配列を分析することができる。
【図２】本発明の方法の実施に適したプラスミドの構築に使用したプラスミドｐＵＣ１９−ｐｈｌｅｏ、ｐｉｃ１５６、ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＩＬ２５３の物理的地図である。
【図３】本発明の方法を実施するために構築されたプラスミドの物理的地図である。ｏｘａ１１の代わりにそれぞれｏｘａ５およびｏｘａ１を有する以外はｐＭＩＸ９５と同様であるので、プラスミドｐＭＩＸ９６およびｐＭＩＸ９７は示していない。ｐＭＩＸ９９は、ｏｘａ１１の代わりにｏｘａ１を有する以外はｐＭＩＸ９８と同様である。
【図４】本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ組換えの方法により、２２％異なるｏｘａ遺伝子間で得られた遺伝子の構造を示す図である。交差が生じた配列同一性領域を詳細に示す。
【図５】大腸菌宿主細胞中でレシピエントＤＮＡ分子として使用することができる大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００の構造を示す図である。ｐＭＩＸ１００は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４に由来する複製起点、ならびにそれに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子を運搬する。ｐＭＩＸ１００はまた、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋に由来する遺伝子ｌａｃＺをも運搬する。
【図６】枯草菌プラスミドｐＩＬ２５３の誘導体であり、大腸菌宿主細胞中でドナーＤＮＡ分子として使用することができる枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１の構造を示す図である。ｐＭＩＸ１０１は、エリスロマイシンに対する耐性を付与するマーカーＥｒｍＲ、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与するＴｃＲを運搬する。テトラサイクリン耐性遺伝子は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から増幅した。
【図７】形質転換効率対照プラスミドｐＭＩＸ１０２の構造を示す図である。ｐＭＩＸ１０２は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋の誘導体であり、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から増幅したＴｃＲ遺伝子を含む。ｐＭＩＸ１０２中では、ＴｃＲ遺伝子はｐｌａｃプロモーターによって駆動される。
【図８】形質転換効率対照プラスミドｐＭＩＸ１０３の構造を示す図である。ｐＭＩＸ１０３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋の誘導体であり、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から増幅したＴｃＲ遺伝子を含む。ｐＭＩＸ１０３中では、ｐｌａｃと反対の方向にＴｃＲ遺伝子がクローン化されている。したがって、その遺伝子は、それ自体のプロモーターから発現される。
【図９】大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００中および枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１中にｏｘａ７、ｏｘａ１１およびｏｘａ５遺伝子をクローン化する戦略を概略的に示す図である。ｐＭＩＸ１００中へのｏｘａ７、ｏｘａ１１のクローン化では、５’末端にＰｓｔＩまたはＸｈｏＩを含むプライマーを使用して、その遺伝子を増幅した。それらの酵素で消化した後、増幅したＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ＋ＸｈｏＩで予め切断したｐＭＩＸ１００とそれぞれ独立に連結した。その連結混合物を用いて大腸菌ＤＨＢ１０のコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行い、クロラムフェニコール耐性／Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）＋Ｘ−Ｇａｌ（８０μｇ／ｍｌ）＋ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を含むＬＢプレート上での白色により、陽性クローンを有するコロニーを表現型上選択した。プラスミドＤＮＡを得、制限地図作成によりそれを分析した。その結果から、ｐＭＩＸ１０４がｏｘａ７を運搬し、ｐＭＩＸ１０６がｏｘａ１１を運搬し、ｐＭＩＸ１０７がｏｘａ５を運搬することが確認された。枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１中へのクローン化では、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩでの制限処理によりｐＭＩＸ１０４からの０．９ｋｂの断片としてｏｘａ７を得、同じ酵素で予め切断したｐＭＩＸ１０１と連結した。その連結産物での枯草菌１Ａ４２３コンピテント細胞の形質転換の後、０．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｒｍ）を含むＬＢ中で細胞を選択した。
【図１】
2007523656.tif 000011
【図２】
2007523656.tif 000012
【図３】
2007523656.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
2007523656.tif 000016
【図７】
2007523656.tif 000017
【図８】
2007523656.tif 000018
【図９】
2007523656.tif 000019
【配列表】
2007523656000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月25日(2006.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007523656000001.app
【国際調査報告】
2007523656.tif 000024
2007523656.tif 000025
2007523656.tif 000026