(57)【要約】癌など、ＴＧＦ−βの存在を伴う病気および健康状態を治療するための方法であって、ＴＧＦ−βのリンパ球回避作用を克服するために、ＴＧＦ−βアンタゴニストおよびカテプシンＢインヒビターとして作用する薬剤、または、そのような薬剤を発現する遺伝子によって形質転換されたリンパ球を治療上有効な量投与する方法が提供される。本発明は、癌に罹患する患者を処置するための方法であって、以下、少なくとも一個体の腫瘍を有する動物から単離されたリンパ球を提供する工程であって、該リンパ球が、ＴＧＦ−βアンタゴニストを発現するように改変されている工程、および該患者に該改変リンパ球を治療上有効な量投与する工程を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患する患者を処置するための方法であって、以下の工程：
少なくとも一個体の腫瘍を有する動物から単離されたリンパ球を提供する工程であって、該リンパ球が、ＴＧＦ−βアンタゴニストを発現するように改変されている工程、および
該患者に該改変リンパ球を治療上有効な量投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記腫瘍を有する動物が前記患者と同一であり、前記改変が、ＡＨＳＧを発現し得るＤＮＡを導入する工程によって前記リンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換する工程が、アデノ関連ウイルスベクターの使用を介して前記ＤＮＡを導入する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与する工程が、前記改変リンパ球を静脈内、体液内、筋肉内、または皮下に注入する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
癌に罹患する患者を処置するための方法であって、以下：
該患者からリンパ球を単離する工程、
該単離リンパ球を改変して、該リンパ球がＡＨＳＧタンパク質を発現し得るようにする工程、および、
該患者に治療上有効な量の該改変リンパ球を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記投与する工程が、前記改変リンパ球を静脈内、体液内、筋肉内、または皮下に注入する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記改変する工程が、ＡＨＳＧをコードするＤＮＡで前記単離されたリンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンパ球が、ＣＤ８発現リンパ球に富む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記改変リンパ球が、薬学的に受容可能なキャリアに懸濁されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換工程が、前記単離されたリンパ球を、ＡＨＳＧをコードするＤＮＡを含むＡＡＶベクターと接触させる工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
リンパ球の免疫学的能力を高めるための方法であって、ＡＨＳＧを発現するように該リンパ球を改変する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記改変する工程が、ＡＨＳＧをコードする核酸を使って前記リンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、さらに、動物から前記リンパ球を単離する工程、および、前記改変する工程の後に、該リンパ球を同一の動物または別の動物に再導入する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＦ−βの存在に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者を処置するための方法であって、該患者に治療上有効な量の薬剤を投与する工程を包含し、該薬剤は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ−βレセプターとのＴＧＦ−βの結合を遮断する工程によってＴＧＦ−βを遮断する薬剤である、方法。
【請求項１５】
前記疾患または医学的状態が、癌、移植、自己免疫疾患、創傷治癒、瘢痕形成、および、前記患者の１種以上の組織に影響を与える炎症から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１種以上の組織が、眼、腎臓、肝臓、腺、心血管、肺、および心筋からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、ＴＧＦ−βレセプターに対する該薬剤の競合的な結合によってＴＧＦ−βを遮断する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、その核酸の作用を通じて発現される場合、ＴＧＦ−βの活性を遮断する生物活性化合物をコードする核酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸がＡＨＳＧをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤がＡＨＳＧである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がＡＨＳＧである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＴＧＦ−βの存在に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者を処置するための方法であって、該患者に治療上有効な量のリンパ球を投与する工程を包含し、該リンパ球は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ−βレセプターとのＴＧＦ−βの結合を遮断する工程によってＴＧＦ−βを遮断する薬剤を発現し得るリンパ球である、方法。
【請求項２３】
前記リンパ球が、前記薬剤をコードする核酸を該リンパ球に導入する工程によって改変されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸がＡＨＳＧをコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンパ球が、インビボ遺伝子治療によって改変されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記リンパ球が、エキソビボ遺伝子治療によって改変されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が、ウイルスベクターをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸が、ＡＨＳＧをコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶを含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年７月１６日に出願された米国特許仮出願番号６０／４８７，６５９の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は癌に対する免疫反応を促進する分野および癌を治療する細胞治療法に関し、特にＡＨＳＧのような化合物およびＴＦＧ−βの生物学的作用を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
β‐形質転換増殖因子（「ＴＦＧ−β」）は二量体ポリペプチド増殖因子の一員で、細胞の増殖と分化、胚発生、創傷治癒および血管形成を調節するシグナル伝達経路において本質的な役割を果たしている。生体内のほぼ全細胞がＴＧＦ−βを産生し、増殖因子を結合する受容体を有する。ＴＧＦ−βの作用は、アテローム性動脈硬化症；肺、肝臓、腎臓、および心臓血管系の線維化性疾患、過剰な創傷治癒ならびに癌などの多くの症状に関係している。
【０００４】
（（ａ）眼）
ＴＧＦ−βは創傷治癒を促進する、生体中でもっとも有力な増殖因子である。眼の多くの疾患と病気には、損傷に対する瘢痕形成反応に起因する失明の進行過程が含まれる。この自然な瘢痕形成反応はＴＧＦ−βによってもたらされ、これまでに効果がないと判明している数種の治療戦略の標的になっている。
【０００５】
ＴＧＦ−βが原因で生じる瘢痕化が、視力の喪失または減退をもたらす創傷治癒を引き起こした疾患の例は、緑内障の手術後の瘢痕形成、および角膜、白内障、後水晶襄における瘢痕形成を含む。さらに、ＴＧＦ−βは、眼の増殖性硝子体網膜症、黄班変性症およびその他の増殖性疾患の一因となっている。
【０００６】
増殖性硝子体網膜症は、網膜剥離の外科的治療を受けた眼の１０例中に１例発生する疾病過程であり、この病気は失明に至る可能性がある。この疾患では、眼球内での過剰な線維形成がＴＧＦ−βの活動の著しい増加に連関しており、眼球内のＴＧＦ−βレベルを低下させるのに効果的な方法がこの病気の進行を抑えたり止めたりする可能性があることを示唆している。
【０００７】
治療モダリティとしてＴＧＦ−βの活動を抑制しようとする方法は、さまざまな問題があるためにほとんど成功していない。増殖性疾患を対象とする方法については、がん治療に用いられる薬剤（例えばマイトマイシンおよびフルオロウラシル）などの増殖抑制薬を用いるが、これらの薬品の有害な副作用である、失明に至る感染症や低眼圧症をもたらす漏出水泡による著しい使用上の制約が伴っている。創傷治癒に関与する因子を特異的に標的にしようとする方法は今までのところ規制当局の認可を受けるに至っていない。ＴＧＦ−βに対して特異的な抗体であるｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂが開発されていて、現在までに視覚障害に関する人体への臨床試験の後期段階に至っている。組織内での抗体の保持時間が限られるために反復して施用しなければならないため、また、免疫原性や不適切なターゲティングが抗体そのものによって仲介される可能性があるため、眼への抗体の投与は治療法としての有効性が制限される。ＴＧＦ−β活性（インビボ）を標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチドも、眼の術後瘢痕形成を治療するために開発中であるが、これらの物質は、特にヌクレアーゼ安定性、アンチセンスの効力、および標的特異性など、すべてのアンチセンス法に共通する課題を含む、数多くの課題に直面している。
【０００８】
本発明の態様は、眼の疾患、特にＴＧＦ−βが介在する疾患などを治療するための改良された治療薬、および該治療薬を選択する方法を提供することである。
【０００９】
（（ｂ）肝臓）
中毒性肝障害、胆汁うっ滞性肝障害、アルコール性肝障害、（例えば肝硬変）、炎症性肝障害、およびそれ以外のタイプの肝障害など、ヒト疾患においても、このような疾患の動物モデルにおいても、ＴＧＦ−βは、肝臓における線維増殖の調節に関与する主要なサイトカインである。ＴＧＦ−β活性の上昇がこれらの疾病の発生および進行に重要な役割を果たしているため、ＴＧＦ−β活性を低下させることは魅力的な治療標的である。
【００１０】
末期肝臓線維症の唯一の治療法は移植であるが、臓器提供者の数および患者の病態がこの治療法を制約している。他の治療法によって、線維症の症状を緩和すること、または線維増殖性病変をもたらした肝臓損傷の根本原因を阻止することが試みられている。しかし、肝臓線維症を直接治療する治療法は今のところ存在してない。
【００１１】
本発明の更なる態様は、肝臓線維症を治療する改良された治療法を提供することである。
【００１２】
（（ｃ）腎臓）
腎臓の線維症は、肝臓の線維症と非常によく似ている。すなわち、ＴＧＦ−βの活性によってもたらされる病気の進行が大きくなるとともに治療不能となる。アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のインヒビターは糖尿病性腎臓病の進行を遅らせる可能性があり、また、アンギオテンシン・レセプター遮断薬（ＡＲＢ）はＩＩ型糖尿病性腎症における腎機能の喪失を遅らせるという長所を示している。両薬剤種の効果は、第一義的には、それらが介在する糸球体輸出細動脈の狭窄の弛緩および糸球体内部圧力の解除から生じると考えられるが、部分的には、これも両種類の薬剤によって仲介される、アンギオテンシンのＴＧＦ−β活性化サイトカイン活性抑制によって生じる可能もある。しかし、ＡＣＥのインヒビターとＡＲＢはどちらも、病的状態にある腎臓におけるＴＧＦ−βのレベルを完全には正常化できず、また、すべての患者の末期腎臓病を予防または遅延させることもできない。
【００１３】
本発明の更なる様態は、腎臓疾患、特にＴＧＦ−βが介在する肝臓疾患を治療するための重要な治療法を提供することである。
【００１４】
（（ｄ）肺繊維症）
肺線維症は、肺における細胞外基質の合成および蓄積が促進され、この病気の病理が主にＴＧＦ−β活性の上昇によって促進されるという特徴をもつ。この病気の５年後の生存率は５０％未満であるので、現行の治療法は明らかに不適切である。肺線維症の進行を阻止または無効化するために、ＴＧＦ−βの活性を直接的に抑制または下方制御する治療薬で現在利用可能なものは存在しない。
【００１５】
本発明のなお更なる態様は、肺線維症を治療するための、改良された治療法を提供することである。
【００１６】
（（ｅ）心筋線維）
拡張機能障害は高血圧性心疾患および心筋症に共通した特徴である。線維組織の過剰な蓄積は、肥大心における血液送り出し機能の低下およびその他数多くの心室機能障害の主な原因である。残念ながら、左心室拡張機能を改善するために利用できる具体的な治療法はまだ存在せず、したがって本発明のなお別の態様はこのような方法を提供することである。
【００１７】
ＴＧＦ−βは、線維芽細胞の増殖、およびそれに続いて生じる、症状部の下にある線維組織塊を主に構成する細胞外基質の蓄積を調節する主要なサイトカインである。動物実験によって、圧力過負荷状態の心臓では、ＴＧＦ−βの過剰発現と病原線維症との間に因果関係のあることが示された。さらに、人体を使った研究により、心臓肥大および線維症においてＴＧＦ−β発現が増加することが確かめられた。抗ＴＧＦモノクローナル抗体の使用が提案されているが、ヒトの治療において有効であるとはまだ実証されておらず、いずれにしても、その使用は、注入された抗体タンパクが分解されない状態で治療上の有効性にとって必要な体内部位に残る時間が限られていることによって制約される。
【００１８】
本発明の別の更なる態様は、拡張性機能障害の治療法を提供することである。
【００１９】
本発明の別のなお更なる態様は、より集中的な治療法で心筋線維症に取り組むことである。
【００２０】
（（ｆ）遺伝子治療）
遺伝子治療法は、有益な産物をコードする遺伝子、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、オトリＲＮＡもしくはリボザイムを標的組織に移入することによって、病気を緩和しようとする。一般的に、遺伝子治療法は、より長い効果の持続時間、およびさらには場合によってはより高い安全性を提供しつつ、タンパク質およびＲＮＡの標的された送達に対する障害を克服し、また、効力を改善させる可能性を有している。動物では、遺伝子治療法が関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病および紅斑性狼瘡などのモデルにおいて効果があることが分かっている。４００例を超えるヒトでの臨床研究が進行中であるが、遺伝子治療法は、本明細書に記載した線維症疾患のいずれについてもまだ承認されていない。
【００２１】
本発明のなお別の態様は、遺伝子治療法を最大限に利用する治療薬を提供することである。
【００２２】
腫瘍細胞に関連した免疫原性にもかかわらず、腫瘍細胞は、生体の監視システム、すなわち、免疫監視の主要構成要素である細胞障害性リンパ球（「ＣＴＬ」）およびナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞の両方によるシステムから身を隠す不思議な能力をさらに有している。
【００２３】
本発明のなお更に別の態様は、一定の癌細胞に固有な特徴であると考えられているクローキング・メカニズム（ｃｌｏａｋｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を克服する方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらになお別の更なる態様は、魅力的な癌治療法を提示するために細胞障害性リンパ球およびナチュラルキラー細胞の機能を促進することである。
【００２５】
本発明の更なる態様は、ＡＨＳＧを発現するようにリンパ球を形質導入もしくは形質転換するのに適した、新規のｃＤＮＡを提供して、該タンパク質がＴＧＦ−βレセプターへの競合的結合を介して２機能的な役割を提供し、それによってＴＧＦ−βレセプターの作用と拮抗し、カテプシンＢ活性の強力なインヒビターとして作用する。
【００２６】
より通常の方法は腫瘍細胞の免疫原性を促進することに依存してきた。例えば、研究では、腫瘍細胞がインターフェロン（「ＩＬ−２、ＩＬ−１２」）は顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）のようなサイトカインを発現できるよう試みられている。これらのタンパク質のいずれか一つの発現が、免疫系が癌細胞を検出する能力を促進する（Ｓｍｉｔｈ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａ１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２６：１３０（２００３）。これらの遺伝子いずれか一つの発現が、インビトロでは癌細胞の増殖の退行もしくは遅延をもたらす可能性がある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３８０（２００１））。残念ながら、インターフェロンはインビトロでは十分に機能するが、人体での臨床試験の結果は期待はずれであり、インビトロでの研究から予測された成功は実現していない（ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３：１１８８（１９９９）；Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａ，Ｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０：１６５（１９９７））。
【００２７】
腫瘍細胞を免疫系に対してより感受性にする別の方法は、Ｂ７−１およびＢ７−２のようないわゆるアクセサリー分子の発現を含む。いずれかの遺伝子を癌細胞に挿入すると、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）の発現が誘導される。腫瘍細胞上にこの複合体が存在すると、リンパ球が標的細胞を識別しやすくなる（ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３：１１８８（１９９９）；Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａ，Ｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０：１６５（１９９７））。治療研究の可能性のある別の手段は、先天性免疫系の一部であるＮＫ細胞の特徴に依存する。これらの研究から生じた情報によって、ＮＫ細胞を活性化させる新たな方法の開発が将来可能となる（Ｃｏｌｕｃｃｉ，Ｆ．ｅｔ  ａ１  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４１３（２００３））。免疫活性を増大させようとするこれまでの努力は、ＩＬ−２を用いた研究のように、しばしば炎症反応を伴っていた。
【００２８】
免疫細胞の機能を抑制する因子は、例えば、免疫細胞の機能を抑制する増殖因子の古典的な例であるＴＧＦ−βなどである。ＴＧＦ−βを発現する癌細胞は、このタンパク質を用いて、選ばれた免疫監視細胞の機能を抑制して、検出されることを免れる（Ｃｏｌｕｃｃｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４１３（２００３））。多くの研究によって、種々の細胞内におけるＴＧＦ−βとｍＲＮＡとの関係、すなわち、神経膠腫、黒皮腫、乳癌、結腸癌、胃癌、および前立腺癌などの悪性腫瘍の患者から採取した血清中に増殖因子が存在することが記録されており、また、記録され続けている（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．２０：１３３（２００１）；Ｗｉｅｓｅｒ，Ｒ．Ｃｏｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３：７０（２００１）；Ｐａｓｃｈｅ，Ｂ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １８６：１５３（２００１））。
【００２９】
ＴＧＦ−βの作用が癌の悪性度を助長するメカニズムが概観されている（Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａ，Ｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０：１６５（１９９７）；ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３：１１８８（１９９９）；Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２９：１１７（２００１））。腫瘍発生におけるＴＧＦ‐βの重要性の洗練された実証実験は、Ｔ−リンパ球内でのＩＩ型ＴＧＦ‐βレセプターの発現が明白でなかったノックアウトマウスの研究によるものである。これらのマウスから採取した細胞には、シンジェニック（同質遺伝子）マウスモデルにおいてＴＧＦ‐βを発現する腫瘍を根絶する能力がある（Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：４６（２００２））。
【００３０】
ＴＧＦ−βの特徴はＳｐｏｒｎ（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．Ｍｌｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  １：１２５１（１９９９））による論文の中で概説されており、また、該因子のシグナル伝達活性が他の論文の中で詳しく説明されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  １：１２６５（１９９９）；Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １：１６９（２０００））。要するに、ＴＧＦ−βは細胞から潜在型で分泌されるため、血清には顕著なレベルの該因子の潜在型が含まれる。潜在型ＴＧＦ−βはＴＧＦ−βレセプターと結合しない。潜在に関連するタンパク質である１１０ｋＤ（キロダルトン）のホモ二量体（「ＬＡＰ」）はこのＴＧＦ−β先駆体の一部である。ＬＡＰは、大型ＴＧＦ−β結合タンパク質（「ＬＡＢＰ」）という名の少なくとも４種類の異なった特異的キャリアタンパク質に結合する。ＬＴＢＰは、潜在型ＴＧＦ−βの活性化および貯蔵に関与する。活性型ＴＧＦ−βは、潜在型ＴＧＦ−βから切断された２５ｋＤのホモ二量体である。潜在型ＴＧＦ−βは血清の中を循環し、いくつかのプロテアーゼによって活性化されうる。これらプロテアーゼのグループの一つが、潜在型ＴＧＦ−βを活性化することができるマトリックスプロテアーゼ（「ＭＭＰ」）である。活性化されたＴＧＦ−βは、ＭＭＰインヒビター、例えばメタロプロテアーゼの組織インヒビター（「ＴＩＭＰ」）の発現を抑制する。ＴＧＦ−βの活性化へのこれらのプロテアーゼの関与は、腫瘍細胞（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  １０：４１５（２０００））の侵襲力の増大を伴う。プロテアーゼを介した活性化メカニズムの阻害も、ＴＧＦ−βの作用を阻止するための有望な標的として働く可能性がある。
【００３１】
細胞表面上でＴＧＦ−βがＩ型およびＩＩ型のレセプターに結合すると、増殖因子によって開始されるシグナル伝達を仲介する最初のステップとして働く。ＴＧＦ−βは、その効果を、Ｉ型およびＩＩ型のアイソフォームからなる、細胞膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼレセプターのヘテロ重合体の複合体に結合して誘発する。ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター（「ＴｂＲ−ＩＩ」）がＴＧＦ−βに直接結合すると、その後、Ｉ型ＴＧＦ−βレセプター（「ＴｂＲ−Ｉ」）の補充およびリン酸化が起こり、次いで、シグナル伝達経路が開始される。したがって、ＴｂＲ−ＩＩを模倣または抑制する因子は、ＴＧＦ−βの作用に拮抗する別の有望な手段を提供する。
【００３２】
他の研究は、ＴＧＦ−β結合タンパク質、デコリン（Ｄｅｃｏｒｉｎ：Ｍｏｎｚ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：１０３２（１９９９）；Ｓｔａｎｄｅｒ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１１８７（１９９８））、またはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に融合させた細胞外ドメインＴｂＲ−ＩＩというキメラ分子のようなＴＧＦ−βアンタゴニストを用いて腫瘍免疫性を誘発することを試みてきたが、たいした成果はあがっていない（Ｗｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１２７３（１９９９）；Ｋｏｍｅｓｌｉ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５４：５０５（１９９８））。他の研究は、α２マクログロブリンタンパク質にもＴＧＦ−βの作用と拮抗する能力があることを示した（Ｈａｒｔｈｕｎ，Ｎ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２１：８５（１９９８））。しかし、このタンパク質は、その質量が大きいため（７２０ｋＤ）、また、四量体として存在しているため、利用するのは困難である。別の研究では、このタンパク質の２０アミノ酸ペプチドの断片にＴＧＦ−β結合作用があることが示唆されている（Ｗｅｂｂ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ９：１９８６  （２０００）。
【００３３】
α２ヘレマンズ−シュミッド糖タンパク質（「ＡＨＳＧ」）はグロブリン様タンパク質であり、ウシのタンパク質であるフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）のヒトにおけるホモログである。フェチュインは胎児血清のタンパク質の主要成分と同定された（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．  Ｎａｔｕｒｅ  １５４：５７０（１９４４））。フェチュインの機能は、造血器系および免疫系の発達及び成熟に関連している可能性がある（Ｄｚｉｅｇｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａ１  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６：３１９（１９９６））。フェチュインと同様に、ＡＨＳＧは陰性急性期タンパク質として肝臓から分泌される（Ｌｅｂｒｅｔｏｎ  Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ６４：１１１８（１９７９））。ＡＨＳＧは、そのタンパク質構造によって、シスタチン・スーパーファミリーの一員であることが明らかになっている。このタンパク質スーパーファミリーの特徴は、直列に並んだ２つのシスタチンドメイン、およびプロリン及びグリシンに富む３番目のドメインを持っていることである。タンパク質の２次修飾には、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化（Ｈａｙａｓｅ，Ｔ．ｅｔ  ａ１  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：４９１５  （１９９２）；Ｅｄｇｅ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：１６１３５（１９８７））およびセリンのリン酸化（Ｊａｈｎｅｎ−Ｄｅｃｈａｎｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２６：５９（１９９４））を含む。これらの修飾は、種々の生物種に由来するフェチュインに関して記述されている（Ｅｌｚａｎｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２２７：１６７（１９８８））。シスタチンドメインは、システインプロテアーゼインヒビターのスーパーファミリーにおいて保存されている。このドメインは、保存された配列モチーフをもつドメインを含む、１００個から１２０個のアミノ酸残基が少なくとも１回反復しているという特徴をもつ。
【００３４】
ヒトＡＨＳＧの成熟型は、システイン残基間のジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド鎖を有する。これらの２つのポリペプチド鎖は単一のポリペプチドから、タンパク質分解による切断によって産生される（Ｊａｈｎｅｎ−Ｄｅｃｈａｎｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｕ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２６：５９（１９９４））。ＡＨＳＧについて提示されている機能は、オプソニン化作用、脂質輸送、細胞増殖、インスリンレセプターのチロシン・キナーゼによる阻害、プロテアーゼ阻害および造血細胞ホーミングなど多様である（Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：５（１９９７））。ラットの質量６３ｋＤａのリン酸化Ｎ−糖タンパク質、ｐｐ６３は、ラットのフェチュインのリン酸化型である。この修飾型フェチュインは、肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）に結合して、その活性を抑制すると報告されている（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４３：７５３（１９９７））。ＡＨＳＧも、ＴＧＦ−βレセプターに競合的に結合することによってＴＧＦ−βの作用に拮抗すると報告されている（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１２７５５（１９９６））。
【００３５】
一定の腫瘍は、ＴＧＦ−βが腫瘍細胞に存在すると免疫系による検出を回避できるので、ＴＧＦ−βに依存して発生する（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２９：１１７（２００１））。ＴＧＦ−βのＩＩ型レセプターを発現しない「ノックアウト」マウスのリンパ球が、ＴＧＦ−βの作用に耐性であり、またそのようなマウスの細胞は他のマウスの腫瘍を一掃できることも報告されている（９）。
【００３６】
従来技術によって教示された、ＧＦ−βの活性に拮抗する方法には２つある。第１の方法は、基質結合型タンパク質を使用することであり、その一例はデコリンである（Ｈａｕｓｓｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３５３：２４３（１９９４））。この具体的なアンタゴニストは腫瘍組織を取り囲み、そうすることによって、細胞に達しうる活性型ＴＧＦ−βの濃度を低下させる。悪性のグリオーマ細胞株にデコリンを導入したところ、その潜在的悪性度を低下させることに成功した（Ｓｔａｎｄｅｒ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１１８７（１９９８））。ＴＧＦ−βの作用に拮抗する第２の方法は、ＡＨＳＧ，ＴｂＲＩＩ−Ｆｃまたはα２マクログロビンを使用することである。
【００３７】
Ｒｅａｄらに付与された米国特許第５，５４３，１４３は、感染症を治療するために、ＴＧＦ−βアンタゴニストを哺乳動物に投与してマクロファージを活性化することが記載されているが、癌を治療するためにＴＧＦ−βアンタゴニストを使用することに関する開示はない。最近、可溶型のＴＧＦ−βレセプターと、それに関連して、ＴＧＦ−βインヒビターとして使用するアンチセンス法が、Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙらに付与された米国特許出願第０９／７３４，３００号、およびＳｃｌｉｎｇｅｎｓｉｅｐｅｎらに付与された米国特許出願第１０／１４６，０５８号で開示されていた。血清タンパク質ＡＨＳＧには、ＴＧＦ−βと競合して、ＴＧＣ−βレセプターの共通結合モチーフに相同的なＡＨＳＧ内ペプチドドメインを介してＴＧＦ−βレセプターに結合する能力がある。
【００３８】
本発明の更なる態様は、ＴＧＦ−βの抗腫瘍効果を増大させることである。
【００３９】
本発明の更なる態様は、ＴＧＦ−βレセプターとの結合において、ＴＧＦ−βと競合させるためにＡＨＳＧを利用することである。
【００４０】
本発明の更なる態様は、リンパ球が癌細胞を認識し破壊する免疫学的能力を増強する新しい治療法を提供し、それによって癌を治療する改良法を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４１】
（発明の開示）
本発明の種々の態様および原理によれば、リンパ球がより積極的に腫瘍増殖と格闘できるようにする新しい方法であって、ＡＨＳＧを発現させうるＤＮＡによってそのような細胞を形質転換させること、および、その後、そのような細胞を用いて、癌を患っているか、または患う恐れのある患者を治療することを含む方法が提供される。そのような形質転換細胞は、癌細胞に対する活性をインビボおよびインビトロで増加させることが見出されている。特別な理論または解釈に拘束されるつもりはないが、このようなことは、癌細胞周囲の微小環境における、ＴＧＦ−βのアンタゴニストとしてのＡＨＳＧの効果を介して生じる。
【００４２】
ＡＨＳＧは、フェチュインと呼ばれるウシの肝タンパク質のヒトホモログである。ＡＨＳＧの効果は完全に定義されているわけではないが、ＴＧＦ−βを含むタンパク質ファミリーに属しているタンパク質の作用遮断することに関与していると推測されている。
【００４３】
成人におけるＡＨＳＧの血中濃度は０．３から０．６ｍｇ／ｍｌの範囲にあると報告されている（Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ６４：１１１８（１９７９））。血清中に高濃度のＡＨＳＧが存在しても、これはＴＧＦ‐βによって開始される機構を利用する腫瘍細胞の作用を阻止するには十分ではないため、それらは免疫反応を回避できる。腫瘍細胞のこのような生存機構を克服するために、本発明者らはリンパ球でＡＨＳＧを発現させて、インビボおよびインビトロでこれらの細胞の細胞傷害性活性を増大させた。これらの結果は、リンパ球周囲の微小環境の重要性、および、ＴＧＦ‐βアンタゴニストであるＡＨＳＧをこの環境に分泌させて、自己分泌的に作用させことによってリンパ球の機能性を変えることができることを示している。
【００４４】
代替的な実施態様において、本発明は、細胞に基づく方法を用いて腫瘍および腫瘍病巣を攻撃する新しい方法を提供する。血液中のＡＨＳＧレベルが顕著であることだけでは、腫瘍の発生または増殖を阻止するのに十分でないことは明白であるが、そのタンパク質の局所レベルを上げれば腫瘍部位におけるＴＧＦ‐βの作用を抑制できる。
【００４５】
Ｔリンパ球およびＮＫ細胞は、癌に対する宿主免疫反応において決定的な役割を果たしており、また、ＴＧＦ‐βは、免疫反応の強力なサプレッサーとして機能するため、ＡＨＳＧのような、このサイトカインのアンタゴニストまたはインヒビターを新たに利用して、癌細胞治療に有効に用いることができる。本発明によって提供されるこの新しい方法は、ＡＨＳＧを、ヒト、マウスおよびＣＤ８＋細胞のリンパ球系細胞と併用する。改変することなく、ＴＧＦ‐βに曝露すると、細胞の３［Ｈ］‐チミジンを取り込む能力は抑制された。これに対し、ベクターｐＳＲ‐ＡＨＳＧによって形質転換されてＡＨＳＧを発現するようになった細胞は、ＴＧＦ‐β存在下で増殖抑制を示さなかった。
【００４６】
また、これらの効果は、ＡＨＳＧのｃＤＮＡをアデノ関連ウイルスベクター（「ＡＡＶ）」にクローニングしたときの本発明の別の実施態様においても示された。このベクターからＡＡＶ‐ＡＨＳＧウイルス粒子を産生させて、リンパ系細胞を形質転換するために使用した。形質転換されたリンパ球細胞は、ＡＨＳＧｍＲＮＡを発現し、すなわち、ＡＨＳＧタンパク質を合成した。好都合にも、ＡＡＶは、高効率の遺伝子導入およびＡＨＳＧの持続発現をもたらした。未改変細胞をＴＧＦ‐βで処理すると細胞の増殖能力が顕著に抑制された場合には、ＡＡＶ‐ＡＨＳＧに感染させられたか、またはＡＡＶ‐ＡＨＳＧによって形質転換された細胞の増殖は、未処理細胞の増殖と顕著に異なってはいなかった。これらの研究によって、ＴＧＦ‐βが野生型の非ＡＨＳＧ発現細胞の増殖を抑制するよう作用することが明らかになった。これに対し、ＡＨＳＧ発現細胞はＴＧＦ‐βの作用から保護されるため、その増殖がＴＧＦ‐βによっては抑制されず、未処理の細胞と全く同じように増殖した。
【００４７】
ＡＡＶ‐ＡＨＳＧを感染させた細胞の細胞障害性効果を、Ｃ５７ＢＬ系統のマウス由来の悪性細胞株である、ルイス肺癌細胞（「ＬＬＣ１）について試験した。Ｔ細胞リンパ球を、ＬＬＣ１を有するマウスの脾臓から単離、培養、増幅して、ＡＡＶ‐ＡＨＳＧに感染させた。ＡＡＶ‐ＡＨＳＧを感染させたリンパ球細胞と接触させたところ、インビトロにおいて、ＬＬＣ１細胞に対する細胞障害性活性の顕著な誘導が認められた。ＡＡＶ‐ＡＨＳＧを感染させたＴ細胞リンパ球をＬＬＣ１の混合物とともにマウスに注射したところ、インビボでのＬＬＣ１に対する細胞障害性活性も実証された。注射されたマウスの腫瘍増殖を観察した。ＬＬＣ１、およびＡＨＳＧを担持するリンパ球を注射したマウスの６０％が腫瘍増殖から保護された。この作用は特異的で、Ｂ１６‐Ｆ１腫瘍を有する他の動物には見られなかった。すなわち、ＬＬＣ１を有するマウスから単離されたリンパ球には癌を探し出す能力があるが、癌を殺す能力はない。なぜなら、癌細胞はリンパ球から逃れためにＴＧＦ‐βを分泌するからである。ＬＬＣ１腫瘍を有するマウスから単離されたリンパ球をＡＡＶ‐ＡＨＳＧによって改変して、ＴＧＦ‐βアンタゴニストを発現できるようにした。このような改変細胞は、癌細胞を探し出すことができるだけでなく、癌細胞によって発現されるＴＧＦ‐βの防御作用に拮抗するか、それに打ち勝つことができるため、癌細胞を破壊することもできる。
【００４８】
異なった２つの技術を用いて、改変リンパ球または非改変リンパ球がＬＬＣ１細胞を殺すことができるか試験した。まず、ＬＬＣ１およびリンパ球を混合して注射するインビトロの混合研究を行った。ＬＬＣ１に、ＴＧＦ‐βを発現させる全リンパ球を加えた混合物を注射したマウスでは、６０％が腫瘍を持たなかった。これに対して、ＬＬＣ１と非改変リンパ球を注射したマウスでは、腫瘍を持たないものはなく、すなわち、０％のマウスが無腫瘍であった。次に、別の組のマウスにＬＬＣ１細胞を注射した後、改変リンパ球および非改変リンパ球を尾静脈から注射した。改変ＣＤ８＋リンパ球を投与されたマウスでは、６２．５％が腫瘍のない状態を維持したが、非改変リンパ球を投与されたマウスで腫瘍のない状態を維持したものは０％であった。これらの作用をＢ１６‐Ｆ１腫瘍細胞についても試験した。これらの実験では、Ｂ１６‐Ｆ１癌（その増殖もＴＧＦ‐βに依存する）を有するマウスから単離したリンパ球を、ＡＨＳＧを発現させるよう改変されたバッチと、改変されていないバッチとに分けた。次に、これらのリンパ球をＬＬＣ１癌について試験した。ＬＬＣ１細胞に曝露されていないマウスから生じたこれらのリンパ球を付加したところ、ＬＬＣ１癌を有するマウスに投与されたいずれのバッチも、ＬＬＣ１癌の増殖には効果がなく、いずれのグループにおいても、腫瘍がない状態を維持したマウスは一匹もいなかった。これらの結果は、ＡＨＳＧが、ＴＧＦ‐β増殖因子に曝露されている細胞内で発現されると、ＴＧＦ‐βの作用を阻止できることを示している。
【００４９】
本発明の好適な実施態様は、有効な癌細胞治療を行う目的で免疫機構を改変させる方法を提供する。
【００５０】
さらに別の好適な実施態様は、ＡＨＳＧ遺伝子で形質転換された、ＣＤ８に富むリンパ球集団を用いる。
【００５１】
ＡＨＳＧは、ＴＧＦ‐βレセプターに結合できること（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１２７５５（１９９６））に加えて、カテプシンＢ酵素のタンパク質分解活性を抑制することもできる。カテプシンＢは、潜伏型のＴＧＦ‐βのアクチベーターでもある。ＴＧＦ‐βは、より大きな潜伏型または休眠型で存在しているが、活性型かつより小さな型への転換にはタンパク質分解による切断が必要であり、また、多くの癌細胞が細胞周囲カテプシンＢを発現させることが知られている。すなわち、癌細胞は、潜在型のＴＧＦ‐βを活性型に転換させることができ、それによって免疫機構から逃れることができる。
【００５２】
正常なリンパ球には検出可能なカテプシンＢが全く存在しないが、これは、従来の観察結果と一致する。カテプシンＢによる圧力は現状に変化をもたらし、潜在型ＴＧＦ‐βをその活性型に転換させて、リンパ球活性の自己阻害をもたらす。ところで、ＴＧＦ‐βを利用して免疫監視機構を回避している癌細胞では、細胞周辺に存在するカテプシンＢが、活性型ＴＧＦ‐βによってそれ自体が囲まれるようにしている。ＡＨＳＧがカテプシンＢ活性をもつという最近の発見は、ＡＨＳＧがＴＧＦ‐βの作用を阻止する機構を定義する上で重要である。このことは、ＡＨＳＧを発現するように改変されたリンパ球を使って立証されているが、ＡＨＳＧは細胞から分泌された可能性が高く、いったん細胞外に出ると自己分泌的に作用してＴＧＦ‐βの作用を遮断する。本発明を実施するためには、基礎的な機構を正確に理解する必要はないが、ＡＨＳＧがＴＧＦ‐βの作用を阻止できることは、カテプシンＢの活性を阻害する作用およびＴＧＦ‐βレセプターに競合的に結合する作用をＡＨＳＧが合わせもつことから生じていると思われる。要するに、リンパ球中で発現されるＡＨＳＧには、癌細胞が産生するＴＧＦ‐βの活性を妨げる能力がある。リンパ球には癌細胞の位置を定める本来の能力があるが、リンパ球がその部位に到達すると、癌細胞が分泌したＴＧＦ‐βが存在しているために、野生型リンパ球の作用は阻止される。しかし、本発明の方法によって、ＴＧＦ‐βの作用に起因する免疫学的にアネルギー性である腫瘍の微小環境であって、ＴＧＦ−βの作用によって生じる環境の中に移動するとＡＨＳＧを産生するよう改造されたリンパ球は、このリンパ球の免疫作用から逃れる癌の能力に打ち勝つ。
【００５３】
シスタチン・ファミリーに属する他のタンパク質が、このようなどメインを含んでいて、システインプロテアーゼを阻害することが知られている。カテプシンＢはシステインプロテアーゼ・ファミリーの一員である。しかし、シスタチンドメインと相同性を示す多くのタンパク質が、カテプシンＢ阻害活性を持つことは証明されていない。ＡＨＳＧはシスタチンモチーフのタンデムな反復を有し、本発明者らは、ＡＨＳＧがカテプシンＢのインヒビターであることを発見した。ＡＨＳＧがカテプシンＢの機能を阻害できることは、細胞増殖の調節とって重要な意味を持つ。なぜなら、細胞表面上にあるカテプシンＢは潜在型ＴＧＦ‐βを活性化することが知られているからである（Ｆｕ，Ｓ．Ｑ．  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ８９：１４６０（１９９７）；Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ８９：４６６４（１９９７））。
【００５４】
アデノウイルスにとって、導入遺伝子をリンパ球に挿入するのは困難である（Ｆｕ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ８９：１４６０（１９９７）；Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ８９：４６６４（１９９７））ため、本発明の一つの実施態様は、ＡＡＶウイルスを用いてリンパ球を形質転換するための改良法を提供する。この遺伝子送達系のさらなる魅力的な特徴は、低い宿主免疫反応を誘発しつつ、また、所望のタンパク質を高レベルで産生することを可能にする持続的発現と結びついた低毒性を提示しつつ、広範な宿主細胞に感染できることによる。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様は、ＡＨＳＧを発現させる能力を備えたリンパ球であって、注射された部位から、遠位で投与され局在化されたＬＬＣ１細胞まで移動する能力のあるリンパ球を提供する。この方法は、ＩＩ型ＴＧＦレセプターの遺伝子ターゲティングを用いてＴＧＦ‐βのシグナル伝達を阻止するよう設計された方法とは全く異なっている（Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：４６（２００２））。リンパ球には、癌性細胞を含む部位を探し出して、その部位へ移動する自然の能力がある。本発明によるＡＨＳＧ発現リンパ球には、癌細胞が免疫機構から逃れるために利用するクローキング・メカニズムを克服する能力がある。
【００５６】
本発明のさらなる実施態様は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ‐βがそのレセプターに結合するのを遮断する薬剤を患者に対して治療用に投与することを提供する。この薬剤は、上記の作用を達成するために直接働く化合物、または、所望の効果を達成するタンパク質をコードする核酸であるかもしれない。この核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡでもよく、また、エンハンサー、プロモーターなどのような機能的因子に自身をさらに結合させているリポゾームもしくはウイルスベクターのようなキャリアの中に存在していてもよい。
【００５７】
本発明のさらなる実施態様は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ‐βがそのレセプターに結合するのを阻止できるように患者のリンパ球を治療することによって、癌治療に特に適した治療方法を提供する。このような治療は、インビボ遺伝子治療法によって行うことでき、または患者から単離したリンパ球を所望の薬剤をコードする核酸によって形質転換してから、形質転換されたリンパ球を患者に投与することによってエキソビボで行うこともできる。
【００５８】
本明細書に取り込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の好適な実施態様を例示し、また、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００５９】
本発明の種々の原理および態様は以下の図を参照することでさらに理解することが可能になろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
（発明の詳細な説明および最良の形態）
本発明の所望の目標による本発明者らの最初のステップは、ＴＧＦ‐β作用のインヒビターを同定することであった。ヒトＡＨＳＧには、ＴＧＦ‐βレセプターへの結合に対する競合によってＴＧＦ‐βの作用を阻止する潜在能力があるので、この目的のためにヒトＡＨＳＧを使うことにした。
【００６１】
ヒトＡＨＳＧを用いて、免疫系の細胞を改変する治療法を開発する前に、発明者らは、これにＴＧＦ‐βの作用を阻止する能力があることを確認する必要があった。その活性を確認するため、発明者らは、通常ヒトＡＨＳＧを発現しない細胞で該遺伝子を発現させた。最初のステップは、ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、全ＨｅｐＧ２ＲＮＡからＡＨＳＧ配列を増幅し、ＳＲαによって作動する発現ベクターの中に、このｃＤＮＡをクローニングすることであった。得られた発現ベクターをｐＳＲαＡＨＳＧと名付けた（マップ１参照）。次に、通常はＡＨＳＧタンパク質を発現しない造血細胞にｐＳＲα‐ＡＨＳＧ構築物を挿入した。最初の一連の実験では、Ｔ８‐ＩＩＭ細胞を用いた。なぜなら、これらの細胞の増殖は、ＴＧＦ‐βによって阻害されることが知られているからである（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８２：１１７８（１９９１））。その結果（図１Ａ）、３［Ｈ］−チミジンの取り込みを測定して判定すると、野生型細胞の増殖は、ＴＧＦ‐βへの曝露によって阻害されることが示された。これに対し、ｐＳＲα‐ＡＨＳＧで形質転換された細胞は、ＴＧＦ‐βの抑制効果に対して抵抗性を示した。これらの知見によって、ヒトＡＨＳＧを発現する能力を与えられた細胞は、ＴＧＦ‐βの増殖抑制作用から保護されることが示された。
【００６２】
最も好適な実施態様において、本発明は、治療上有効なレベルでＡＨＳＧを発現するようにされたヒトリンパ球を用いてヒト癌を治療する方法を提供する。特に有利な実施態様において、該リンパ球はＣＤ８＋細胞に富んでいた。そのような細胞は、電磁ビーズを用いてヒト末梢リンパ球から都合よく単離して、ｐＳＲα‐ＡＨＳＧで形質転換することができる。Ｔ８−ＩＩＭのように、ヒトＡＨＳＧのｃＤＮＡで形質転換されたＣＤ８＋リンパ球は、ＴＧＦ‐βの増殖抑制効果から保護された（図１Ｂ）。一方、対照プラスミドを担持するリンパ球は、形質転換されていない野生型細胞と全く同じ挙動を示し、ＴＧＦ‐βに曝露されると、３［Ｈ］−チミジン取込みの減衰を示した。本発明の結果として、ＡＨＳＧの機能をヒトリンパ球に導入することが可能になり、その結果、ＡＨＳＧの作用によって、ＴＧＦ‐βの細胞増殖に対する阻害作用を阻止することが可能になる。動物モデルにおいて、この方法の有効性を確認した（図１Ｃ）。
【００６３】
（ヒトＡＨＳＧのクローニング）
ヒトＡＨＳＧをコードするｃＤＮＡを得るために、該遺伝子を発現する細胞型（ＨｅｐＧ２）からＲＮＡを単離した。ヒト肝臓組織または培養細胞株が、全ＲＮＡの抽出に適している。ヒト胎児骨髄細胞も、ＡＨＳＧを発現すると報告されている（Ｄｚｉｅｇｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６：３１９（１９９６））。単離した全ＲＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応法に用いてから、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲを用いて増幅した（以下、便宜的にＲＴ−ＰＣＲという）。ＡＨＳＧのｃＤＮＡは、ヘパトーマ細胞株であるＨｅｐＧ２から抽出した全ＲＮＡを使って調製し、得られた全ＲＮＡをＲＴ‐ＰＣＲの鋳型として用いた。該細胞からのＲＮＡは、酸性グアニジン・チオシアネート法を用いて抽出した。ＲＴ‐ＰＣＲで使用したプライマー配列は、５’‐ｇｇｇｇｔａｃｃｃａｔｇａａｇｔｃｃｃｔｃｇｔｃｃｔｇｃｔｃ‐３’及び５’‐ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔｃｔｇｔｇｃｃａａａｃｃｔｃｃｔｃａｔｃ‐３’であった。これらのプライマーの５’末端は、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩによって認識される付加的配列を含んでいた。これらの制限酵素部位の付加によって、ｃＤＮＡ産物をクローニングベクターｐＣＤＬ８１に挿入してｐＳＲ‐ＡＨＳＧを得ることが可能になった（図６参照）。このベクターによって、プラスミドを細胞に挿入した場合にＳＲαによって作動されるＡＨＳＧタンパク質の発現が可能になった（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４６６（１９８８））。ＡＨＳＧコーディングのコード領域を、塩基配列解析によって確認したところ、報告された配列と同一であることが判明した（Ｓｗｉｓｓ‐Ｐｒｏｔ：Ｐ０２７６５）。
【００６４】
（ＡＡＶ‐ＡＨＳＧの構築および産生）
ＡＡＶは、このウイルスに対するレセプターを発現する細胞型を標的にする。このレセプターは、硫酸ヘパリンおよび線維芽細胞増殖因子であるＦＧＦのレセプターからなる（Ｑｉｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：７１（１９９９））。このＡＡＶレセプターの発現はＣＤ３４＋造血始原細胞中では低いが、この特徴が、マウスリンパ球のＡＡＶ感染効率がＨｅｌａ細胞では十分の一未満であった理由を説明するのに役立つかもしれない（データ省略）。このＡＡＶレセプターの発現は、ＣＤ３４＋造血始原細胞中では低いが、この特徴は、マウスリンパ球のＡＡＶ感染効率がＨｅＬａ細胞では十分の一未満であった理由を説明するのに役立つかもしれない（データ省略）。ＡＡＶによる遺伝子導入は、カプシド遺伝子を改変することによって、特定の型の標的細胞に対する感染効率を向上させる可能性がある（Ｓｈｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２：１６９７（２００１））。ＡＡＶを用いることのさらなる特徴は、造血細胞でより確実な効果を認めるためには、より高力価のウイルス粒子が必要であるかもしれないという点にある。ＡＡＶのこれらの特徴が、ＡＡＶをして、ＡＨＳＧを標的細胞に導入するのに有用なベクターたらしめている。
【００６５】
ＡＨＳＧ発現を試験するに先立って、ＬａｃＺ遺伝子によって形質転換された２つの細胞型（非リンパ球対リンパ球細胞）を比較して感染効率を測定してから、インシチュ染色法およびプラーク形成活性を用いてβ‐ガラクトシダーゼ活性を測定した（データ省略）。ＡＡＶを用いたリンパ球への遺伝子導入の効率は低かったが、それにもかかわらず、発明者らのデータ（図２）はＡＡＶ‐ＡＨＳＧの顕著な発現を示した。ヒトＴリンパ球由来の細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞では、ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染したため、該細胞株はＴＧＦ‐βの抑制効果から保護された（図２Ａ及び２Ｂ）が、ＡＡＶ‐ＬａｃＺによる感染では保護されなかった。ＡＨＳＧ・ｍＲＮＡの発現およびβ‐ガラクトシダーゼ活性の発現は、ＡＡＶ‐ＡＨＳＧまたは−ＬａｃＺのいずれかに感染してから少なくとも３０日間持続した（図２Ｃ及び２Ｄ）。これらの結果は、癌の細胞治療法を開発するために、所望の細胞中でＡＨＳＧを誘発するためにＡＡＶの選択することを支持するものである。
【００６６】
ＡＡＶベクターの使用が、米国特許第５，６２２，８５６号、第５，９４５，３３５号、第６，００１，６５０号、第６，００４，７９７号および第６，０２７，９３１号に記載されており、その開示内容はすべて、参照されて本明細書に組み込まれる。Ｋｐｎ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩ断片をｐＳＲ‐ＡＨＳＧから切り出したところ、この断片はＡＨＳＧのコード領域を含んでいた。この断片をｐＣＭＶ‐ＭＣＳにサブクローニングして、ｐＡＡＶ‐ＡＨＳＧを得た（図７参照）。ＡＡＶ粒子を産生するのに必要な要素を含むプラスミドＤＮＡをすべて、標準的アルカリＳＤＳ法を用いて抽出・精製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、次に塩化セシウム超遠心分離を用いて精製した。この方法を用いて精製したプラスミドＤＮＡであるｐＡＡＶ‐ＡＨＳＧまたはｐＡＡＶ‐ＡＨＳＧのどちらか、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣを混合して、（ＡＴＣＣから入手した）ＨＥＫ２９３細胞に同時形質転換して、所望のウイルス粒子を産生させた。該ＤＮＡを形質転換するために利用した方法は、従来のリン酸カルシウム沈殿法であった。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ＦＣＳを添加したダルベッコの修正イーグル培地ＤＭＥＭの中で３日から５日間培養した。これらの細胞を、培養容器からかき集めて、１ディッシュあたり１ｍｌのＰＢＳ‐ＭＫ（１ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）及び１ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）を加えたＰＢＳ）に再懸濁した。
【００６７】
ＡＡＶ粒子を細胞から放出させるために、−８０℃と２０℃での凍結融解を２回用いて細胞膜を破壊した。ＲＮＡ分解酵素およびＤＮＡ分解酵素Ｉを、それぞれ最終濃度を５０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌになるよう組み合わせて用いて、細胞ＲＮＡと溶解したＤＮＡを消化した。４℃、１５００ｇで遠心分離を行って細胞残渣を除去した。清澄な上清を２回濾過した。最初の濾過は、孔径５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＳＶ  Ｒ２５  ＬＳ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、次に孔径０．８μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＳＬＡＡ０２５  ＬＳ）を用いた。次に、遠心分離濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ−１００Ｋ  ＮＭＷＬ，ＵＦＶ２ＢＨＫ４０）を用いて、濾液中のＡＡＶ粒子を濃縮した。ＡＡＶ粒子を濃縮して、容器の上部に保持した。ｐＨ７．４のＰＢＳ‐ＭＫを加えて、この材料を１回洗浄して該ＡＡＶ濃縮物を希釈してから、ふたたび沈降させて低分子量の成分を除去した。ウイルス保存液の品質は、リンパ球などの培養細胞を感染させる用途には十分だった。形成済みのイオジキサノールのグラジエントによる超遠心分離を用いた後、ヘパリン−アガロースカラムでのＨＰＬＣによって、さらなる精製を行うことができる。この付加的ステップを行うことによって、本発明者らは、ＡＡＶを２０倍以上に精製できた。得られたウイルス調製物は、後の実験で使用するために等量液にして−８０℃で凍結した。ウイルスの力価を測定するために、ＡＡＶ‐ＬａｃＺを用いて、Ｈｅｌａ細胞に感染させて、ＬａｃＺ発現の量を指示させた。代表的な調製物は、ＡＡＶ１ｍｌあたり２×１０７から５×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）まで変動した。ＡＡＶ‐ＡＨＳＧおよびＡＡＶ‐ｌａｃＺ両方の調製および単離を並行して行った。ＡＡＶ‐ＡＨＳＧの力価を測定する内部レポーター遺伝が存在しないため、ＡＡＶ‐ＡＨＳＧおよびＡＡＶ‐ｌａｃＺの力価は並行調製に基づいて同一であると推定した。
【００６８】
（末梢血からのヒトリンパ球細胞の単離）
Ｔリンパ球を含有するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インフォームド・コンセントによる同意を受けて健康な成人から採取した。Ｔリンパ球に富む、細胞の所望の画分を、標準的なＦｉｃｏｌｌ‐Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離法を用いて単離した。所望のリンパ球上の表面マーカーに特異的な抗体を塗布した鉄ビーズを用いて、リンパ球の特定の集団をＰＢＭＣから都合よく分離することができる。腫瘍免疫に最も重要な細胞の一つである細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８という表面マーカータンパク質を発現する。ヒトＣＤ８に対する抗体を塗布したＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）を用いて、全ＰＢＭＣからＣＤ８＋細胞を濃縮した。ビーズに結合したリンパ球を、磁石を用いて回収し、鉄ビーズに特異的ＩｇＧを結合させているスペーサーＤＮＡ分子を分解するためにＤＮＡ分解酵素Ｉを用いて、鉄ビーズから解離させた。細胞を解離させた後、磁石を用いて、残った鉄ビーズを除去した。この方法は、ＣＤ８＋細胞を濃縮するのに役立ったため、ＦＡＣＳ解析法を用いて測定すると、集団は、そのような細胞を９０％から９５％含んでいた。この結果生じた細胞集団をＣＤ８＋濃縮細胞と名付けた。全リンパ球細胞またはＣＤ８＋濃縮細胞を、２μｍ／ｍｌのＰＨＡ‐Ｌ、５％の熱不活性化ＦＣＳ、２００単位／ｍｌのＩＬ‐２．５μ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ中で３日間培養した。インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａ）のレクチンであり、リンパ球の既知のマイトジェンであるＰＨＡ‐Ｌを、まず増殖を促進するための培地に加えた。このように、活性化されたリンパ球は、ＰＨＡ‐Ｌを省いた同一の培地の中で最大１４日間増殖できる。
【００６９】
（マウスリンパ球の脾臓からの単離）
ヒトではＰＢＭＣがリンパ球の供給源を提供しているが、マウスでは脾臓がリンパ球のより実際的な供給源となっている。Ｃ５７ＢＬマウスの脾臓を切除し、すり潰し、先端が平らなピンセットを用いて圧搾し、１０％のＦＣＳを含む１０ｍｌのＲＰＭＩ中に懸濁した。細胞懸濁液を室温に５分間放置して、脾臓の切片の大きなものを単細胞懸濁液から分離した。上清液に単細胞リンパ球の懸濁液が得られるので、それを別の試験管に慎重に移した。リンパ球細胞の単細胞懸濁液を１５０×ｇで５分間遠心分離して回収した。赤血球をＦｉｃｏｌｌ‐Ｈｙｐａｑｕｅの不連続勾配を用いた遠心分離で除去した。勾配から目的のバンドを取り出してリンパ球を回収した後、５％の熱不活性化ＦＣＳを含むＲＰＭＩで洗浄した。これらの細胞を、４μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ、５％の熱不活性化ＦＣＳ、２００単位／ｍｌのＩＬ２、５μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび５０μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ中で３日から５日間培養した。コンカナバリンＡはリンパ球のマイトジェンである。
【００７０】
（３［Ｈ］‐チミジンの取り込みアッセイ）
活性型のＴＧＦ‐β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．  または  ＢｉｏＳｈｏｐ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ）を２４ウェルプレート中１ウェルあたり５×１０５個のリンパ球に加えて、２４時間インキュベートした。ＴＧＦ‐βの濃度は、図面の説明で特定したように、０．５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの範囲内にあった。次に、１μＣｉの［３Ｈ］‐チミジンを１ｍｌの培養基と細胞の培養液に加えて４時間インキュベートした。放射性標識細胞を０．４ｍｌのＰＢＳで３回洗浄してから、同容量の１０％トリクロロ酢酸中に懸濁した。ＴＣＡ固定細胞を５％のトリクロロ酢酸０．４ｍｌで３回、また７０％エタノール０．４ｍｌで２回洗浄した。沈殿した細胞を０．１Ｎ水酸化ナトリウム０．１ｍｌ中に溶解して、同量の０．１Ｎ塩酸を用いて中和した。細胞に取り込まれた３Ｈ‐チミジンの量を液体シンチレーションカウンターでカウントした。
【００７１】
（ＡＨＳＧｍＲＮＡ発現の検出）
ＡＨＳＧ発現の有無を検出するために、ＡＡＶ‐ＡＨＳＧ感染細胞をウイルスに暴露後３日で回収した。上記の方法を用いて、全細胞ＲＮＡを単離した。感染細胞の全ＲＮＡを用いたＲＴ‐ＰＣＲを利用して、ＡＨＳＧの発現を測定した。反応液中にＡＨＳＧのｃＤＮＡが発見されることで、発現の存在が示された。この反応液で使用されたプライマー配列は５’‐ｔｃｃａａａｃａｃａｇｃｃｃｇｔｇａｃｃｔｃ‐３’および５’‐ｃｔｃａｔｃｔｃｔｇｃｃａｔｇｔｃｔａｇｃｃ‐３’であった。プライマーのこのセットは、ヒトＡＨＳＧｍＲＮＡに特異的である。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして標的としたが、ヒトＧＡＰＤＨｍＲＮＡを検出するために用いたプライマーは５’‐ｃａｃｃａａｃｔｇｃｔｔａｇｃａｃｃｃｃ‐３’および５’‐ｔｇａａｇｔｃａｇａｇｇａｇａｃｃａｃｃ‐３’であった。
【００７２】
（細胞傷害性アッセイ）
ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ１）は、マウスで最も癌性が強い細胞型である。ＬＬＣ１細胞はＣ５７ＢＬマウスで腫瘍化する。この細胞は、５×１０４個のＬＬＣ１細胞をマウスの肩甲骨内領域に注射すると、直径５ｍｍ以上の癌になりうる。注射後１０日から１４日目に、注射された部位を視診するとＬＬＣ１腫瘍を検出できる。この腫瘍モデルは既述されている（Ｂｕｄｄｚｙｎｓｋｉ，Ｗ．Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）３０：３６３（１９８２））。
【００７３】
ＡＡＶ‐ＬａｃＺまたはＡＡＶ‐ＡＨＳＧに感染したリンパ球が、ＬＬＣ１腫瘍の増殖に影響を与えることができるかを判定するために、本発明者らは両タイプのリンパ球を５×１０４個のＬＬＣ１細胞と混合し、その混合物をマウスの肩甲骨内部に注射した。これらの実験で、本発明者らは、腫瘍（ＬＬＣ１）を有するマウスの脾臓から単離した全リンパ球またはＣＤ８＋濃縮リンパ球を用いた。この細胞を、前述したように培養した。ＡＡＶ‐ＡＨＳＧまたはＡＡＶ‐ｌａｃＺに感染したリンパ球を３日間培養すると、ウイルスがＬａｃＺまたはＡＨＳＧを発現するようになった。３日間の終わりに、感染細胞を単離して、注射の前に５×１０４個のＬＬＣ１細胞と混合した。
【００７４】
これらの研究の目的は、リンパ球が、標的細胞を破壊することのできる細胞傷害能力をもつか試験することであった。我々は、細胞傷害性細胞を「エフェクター」と呼び、また、腫瘍細胞を「ターゲット」と呼ぶ。インビトロ実験とインビボ実験の両方を行った。インビトロ実験では、リンパ球の細胞傷害活性を、エフェクターに暴露された細胞からの乳酸脱水素酵素すなわちＬＤＨの放出を追跡して測定した。
【００７５】
これらの実験では、リンパ球をＬＬＣ１と混合し、インビトロで癌腫細胞を破壊すると、ＬＤＨが放出されるので、標準的な比色試験法を用いて測定した。標的ＬＬＣ１細胞を、５％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中で維持した。標的ＬＬＣ１細胞を、底がＶ字形の９６ウェルプレートに、体積１００μｌに細胞数１×１０４個になるよう播種した。リンパ球を各ウェルに加えてから、１，０００×ｇで３分間遠心して、エフェクター細胞を確実に標的細胞に接触させた。エフェクター対標的の比率、すなわちＥ／Ｔ比は、大部分の実験では１から２００の範囲であったが、１から１０のより小さい範囲が好ましかった。エフェクター細胞の標的細胞との相互作用を試験するために、細胞を二酸化炭素５％の培養器内で、３７℃で４時間インキュベートして、培養液中のＬＤＨ活性を、登録商標ＣｙｔｏＴｏｘ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコールに従って測定した。
【００７６】
インビトロアッセイに加えて、リンパ球の細胞傷害活性をインビボでも試験することが望ましかった。これらのインビボ実験では、発明者らは、エフェクター細胞とターゲット細胞をＣ５７ＢＬマウスに注射した。１ｍｌあたり５×１０５個のリンパ球を１×１０６ＰＦＵのＡＡＶ‐ＡＨＳＧまたはＡＡＶ‐ｌａｃＺに感染させた。感染細胞を３日間培養してから、２００ｕ／ｍｌのＩＬ２および２ｕｇ／ｍｌのＣｏｎＡを含む新鮮な培地を加えた。２×１０５個のリンパ球を２×１０４個のＬＬＣ１細胞と混合してから、肩甲骨内部に皮下注射した。腫瘍の増殖を１４日間以上観察してから、最後の日にマウスを殺した。ノギスを用いて腫瘍のサイズを測定して、直径を記録した。腫瘍を増殖しなかったマウスは、ＬＬＣ１細胞を注射してから更に最大限２ヶ月間観察して、腫瘍が増殖しないことを確認した。
【００７７】
（ヒト造血細胞におけるＡＨＳＧ発現のＴＧＦ−βアンタゴニスト作用）
ウシのフェチュインはＴＧＦ−βアンタゴニスト作用をもつと予測されている。この可能性がヒトＡＨＳＧに関連したものであるかを検討するために、本発明者らは、ＳＲαプロモーターを利用して、ＡＨＳＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを発現させた。ＳＲαは、シミアン・ウイルス４０の早期プロモーター、および１型ヒトＴ細胞白血病ウイルスのＲ−５Ｕセグメントからなる（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４６６（１９８８）。本発明者らは、このプロモーターをＩＬ−２の発現を作動するのに使用すると、他のよく使用される配列であるＣＭＶプロモーターと比較して１０倍高いＩＬ−２発現があったため（Ｔｓａｎｇ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ５：２９５（２０００））、このプロモーターを選択した。ヒトＡＨＳＧｃＤＮＡにＳＲαプロモーターを融合したものからなるクローンを作成して、ｐＳＲα−ＡＨＳＧを得た（図６参照）。
【００７８】
本発明者らは、ヒトＡＨＳＧをコードするｃＤＮＡを、通常はこの遺伝子を発現しない造血細胞株に挿入した。細胞を利用した癌治療法として有用となるには、ＡＨＳＧの細胞内発現が、ＴＧＦ−βの作用に拮抗できなければならない。これらを実験するために、本発明者らはＴ８−ＩＩＭ細胞を選んだ。なぜなら、この細胞はＣＤ８＋細胞株であり、その免疫機能がＴＧＦ−βに依存しているからである。未改変のＴ８−ＩＩＭ細胞をＴＧＦ−βに暴露すると、３［Ｈ］‐チミジンを取り込む能力が、対照と比較して７９±４％抑制された。これに対して、ｐＳＲ−ＡＨＳＧで形質転換されたＴ８−ＩＩＭ細胞は、ＴＧＦ−βの増殖抑制作用を完全に無効化した（図１）。これらの細胞では、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みが、ＴＧＦ−βに暴露されなかった細胞による取り込みと同じであった。この発見は、ＡＨＳＧの発現が、ＴＧＦ−βの抑制作用を遮断したことを意味していた。ＴＧＦ−βを発現する癌細胞は、免疫系細胞による検出を回避するためにこのメカニズムを利用するため、この観察結果は、ＣＴＬ本来の活性を改変して、癌細胞によって利用されるクローキング・メカニズムを出し抜こうという本発明者らの目的を後押しするものであった。
【００７９】
次に、本発明者らは、ヒト末梢血リンパ球から濃縮されたＣＤ８＋細胞におけるｐＳＲα−ＡＨＳＧの発現を試験した。これらの実験では、本発明者らは、ＣＤ８＋に対する抗体でコートされた磁気ビーズを使用して、末梢血由来のＣＤ８＋細胞を濃縮した。天然型ＣＤ８＋細胞をＴＧＦ−βに暴露すると、３［Ｈ］‐チミジンの取り込み能力が、対照と比較して６３±２％低下した。これに対し、ｐＳＲ−ＡＨＳＧをＣＤ８＋細胞に形質転換させると、これらの細胞の３［Ｈ］‐チミジン取り込み能力が強化されて（図１Ｂ）、ＡＨＳＧを発現せず、ＴＧＦ−βに暴露されていない対照細胞と同じになった。
【００８０】
本発明者らは、ＡＨＳＧの発現が、３［Ｈ］‐チミジン取り込みに影響しないだろうと予想したが、この観察結果は、ＣＤ８＋細胞からＴＧＦ−βが内生的に分泌されることによるものと考えている。したがって、内生的なＴＧＦ−β発現の抑制をもたらすＡＨＳＧの発現が、この観察結果をもたらしたのかもしれない。ＴＧＦ−βの添加は、３［Ｈ］‐チミジンの取り込み能力を抑制し、ＡＨＳＧの過剰発現は、この増殖因子の作用に拮抗した。しかし、３［Ｈ］‐チミジンの取り込み能力は、ＡＨＳＧで形質転換され、ＴＧＦ−βで処理されなかった細胞の取り込み能力のレベルにまでは回復しなかった。これらの知見に対しては２つの説明が可能である。１つ目は、外来のＴＧＦ−βが、ＩＬ−１０など、他の抑制サイトカインの誘因となる可能性である（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｏｎ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：３８１５（１９９１）；Ｔａｇａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９６４（１９９３））。ＡＨＳＧの作用は特異的で、ＴＧＦ−βの作用を阻止することに限られており、他のサイトカインの作用には影響しないと考えられている。２つ目のもう一つ考えられる説明は、ＴＧＦ−βが細胞のアポトーシスを誘導し、断片化した細胞が、３［Ｈ］‐チミジン取り込みアッセイの間に取り除かれていなかったというものである。しかし、メカニズムの如何に関わらず、ＡＨＳＧが、ＴＧＦ−βの存在下でのリンパ球増殖を行わせないことは明らかである。
【００８１】
（マウス脾臓細胞におけるＡＨＳＧ発現はＴＧＦ−βの作用に拮抗する）
次に、本発明者らは、ヒト細胞株および初代培養ヒトリンパ球の使用から得られた観察結果を、動物モデルにまで広げたいと考えた。これらの実験に向けて、本発明者らは、ＴＧＦ−βシグナルのＡＨＳＧによる抑制が、癌治療に有用であるか否かを試験するための便利な動物モデルとしてマウスを使用することにした。以下の実験の目的は、動物由来の免疫細胞におけるヒトＡＨＳＧの活性が、ヒト細胞のものと同じような作用をするか否かを調べることであった。したがって、本発明者らは、マウス由来のリンパ細胞においてヒトＡＨＳＧｃＤＮＡを発現させて、ＴＧＦ−β作用のアンタゴニストとしての有効性を調べた。
【００８２】
これらの実験では、マウスの脾臓細胞をＩＬ−２およびコンカナバリンＡで処理して、Ｔ細胞リンパ球の増殖を促進した。これら活性化Ｔ細胞リンパ球を利用して、ＡＨＳＧの作用を調べた。図１Ｃに示したように、対照細胞をＴＧＦ−βに暴露すると、それらが３［Ｈ］‐チミジンを取り込む能力は、未処理細胞に較べて７９％に低下した（カラム１と３を比較されたい）。しかし、もっと高い濃度のＴＧＦ−βを加えても、チミジン（図１、奇数カラム）を取り込む能力はそれ以上抑制されなかった。ｐＳＲα−ＡＨＳＧで形質転換されたマウスＴ細胞リンパ球では、該遺伝子の発現によって、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みが、非形質転換対照と較べると１１８％高くなった（図１Ｃ、カラム１と２を比較されたい）。さらに、ＡＨＳＧを発現した形質転換細胞は、予想されたＴＧＦ−β作用の効果を示さなかった。これらの細胞を、ＴＧＦ−βの用量を次第に上げながら暴露したところ、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みを、対照細胞と比較して１００％より低くすることができなかった（図１Ｃ、奇数番目のカラムと比較されたい）。ＡＨＳＧ発現細胞においては、チミジンの取り込みは、同じ用量のＴＧＦ−βで処理された対照細胞における取り込みよりも常に高かったことに留意されたい。これらの結果はともに、マウス脾臓のＴ細胞リンパ球が、ＴＧＦ−βに対する反応において、ヒトＣＤ８＋細胞および末梢血ＣＴＬと非常によく似た挙動を取ることを示している。同様に重要なのは、これらの細胞にＡＨＳＧを発現する能力を備えさせても、それらのＴＧＦ−βに対する反応を遮断したという観察結果である。
【００８３】
（ＡＡＶに媒介されるＡＨＳＧの遺伝子導入）
以前の実験は、ヒトおよびマウスの細胞において、ＡＨＳＧｃＤＮＡの一過性形質転換を用いて有用な結果をもたらしたが、より効率的なメカニズムを用いて、宿主細胞において外来遺伝子を発現させることができる。例えば、遺伝子送達のためにアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を使用することに対する興味が最近出てきた。本発明者らの最近の実験結果によると、先天性免疫応答は、アデノウイルスベクターと比較すると一過性的かつ最小限である（Ｚａｉｓｓ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：４５８０（２００２））。ＡＡＶの別のよく知られた特徴は、広範な宿主および細胞型に感染できることである。さらに、ＡＡＶベクターは、リンパ球への形質導入に高い効率性を示す（Ｚｈｏｕ，Ｓ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１８６７（１９９４））。同じように魅力的なのは、ＡＡＶには宿主細胞のなかに取り込まれる潜在能力があるため、ＡＡＶを用いた遺伝子の発現は長時間持続することである（Ｌｅｂｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：３９８８（１９８８））。
【００８４】
ヒトＡＨＳＧｃＤＮＡを、ＡＡＶベクターの中にクローニングして、ｐＡＡＶ−ＡＨＳＧを得た（図７参照）。この構築物から作出されたウイルス粒子を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞に感染させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、急性Ｔ細胞白血病に由来するヒトのＴリンパ球株であり、ＡＨＳＧがＴＧＦ−β活性を抑制できるかを試験し、また、ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染させてから該遺伝子の発現の継続時間を測定するのに便利な宿主細胞として利用できる。
【００８５】
結果（図２Ａ参照）は、対照細胞をＴＧＦ−βに暴露した場合には、それらの３［Ｈ］‐チミジン取り込み能力は５７％まで低下することを明らかにした（カラム５と６を比較されたい）。同様に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であるｌａｃＺを担持するＡＡＶに感染したＪｕｒｋａｔ細胞は、対照細胞と同じ挙動を示した。ＬａｃＺの作用は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の機能またはＴＧＦ−βの作用に影響しないはずである。ＡＡＶ−ＬａｃＺに感染したＪｕｒｋａｔ細胞をＴＧＦ−βに暴露すると、ＴＧＦ−βに暴露されなかったＡＡＶ−ＬａｃＺ感染細胞による取り込みに比較して、３［Ｈ］‐チミジン取り込みが４６％遮断された（図２Ａ、カラム３と４を比較されたい）。ＡＨＳＧｃＤＮＡによって形質転換された他の細胞と同様、ＡＡＶ−ＬａｃＺに感染したＪｕｒｋａｔ細胞は、ＴＧＦ−βの作用に反応しなかった。ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染したＪｕｒｋａｔ細胞をＴＧＦ−βに暴露しても、３［Ｈ］‐チミジン取り込みには影響を与えなかった（図２Ａ、カラム１と２を比較されたい）。これらの結果はまとめて、Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＴＧＦ−βに対する反応において、ヒトＣＤ８＋細胞、末梢血ＣＴＬ、およびマウス全リンパ球と似た挙動を取ることを示している。本発明者らは、予想外にも、ＡＨＳＧを発現する能力をもつＪｕｒｋａｔ、または、本発明者らが試験したその他いずれかの細胞も、ＴＧＦ−βに対する該細胞の反応を遮断した。
【００８６】
以下の実験では、実験をＪｕｒｋａｔ細胞に対するＴＧＦ−βの作用は用量依存的であるか否かを判定するよう設計した。さらに、本発明者らは、ＡＨＳＧを発現させるためにＡＡＶを使用した場合、これらの細胞にＴＧＦ−βの用量増加に対する防御を与えることができるか否かも調べた。まず、一組のＪｕｒｋａｔ細胞にＡＡＶ−ｌａｃＺを感染させて、コントロールとして使用した（図２Ｂ）。ｌａｃＺ発現細胞をＴＧＦ−βに暴露し、その濃度を培養培地中０から５ｎｇ／ｍｌまで次第に上げたところ、最下点で対照細胞の６０％（１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β用量）に至る、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みの用量依存的な抑制があった。
【００８７】
次に、この実験をＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染させたマウス脾臓Ｔ細胞リンパ球で反復した。これらの細胞におけるＡＨＳＧの発現は、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みの上昇を伴い、これは、対照であるｌａｃＺ発現細胞の１２５％まで達した。さらに、ＡＨＳＧ発現細胞において、ＴＧＦ−βが添加されると、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みを抑制できなくなるだけでなく、３［Ｈ］‐チミジンの取り込みの僅かな用量依存的取り込みがあり、ＴＧＦ−β用量が１ｎｇ／ｍｌで、対照であるｌａｃＺ発現細胞の最大１５５％まで達した。ＡＨＳＧ発現細胞におけるチミジン取り込みの増加は、上記したマウスの全リンパ球で観察された増加と同様であった。
【００８８】
（ＡＡＶに媒介される遺伝子導入の持続性）
長時間にわたるＡＨＳＧ発現の持続性を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｌａｃＺ遺伝子またはＡＨＳＧ遺伝子を担持するＡＡＶを感染したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＡＨＳＧｍＲＮＡの存在量を測定した。その結果（図２ＣおよびＤ）、ＡＨＳＧ発現は、試験時間の最後であった３０日後まで持続することが示された。発現の相対的程度は、感染後４日目が最も高く、約１５日目に定常状態に達したと思われる。３０日目の発現は、１５日目の発現とあまり違いがない。これらの知見によって、ＡＡＶの使用が、細胞にＡＨＳＧを発現させる効率的な方法であり、また、発現は感染後３０日以上持続すると考えられることが示された。より重要なのは、これらの細胞におけるＡＨＳＧの発現が、それら細胞にＴＧＦ−βの増殖抑制作用を克服する能力を与えるということである。このように、本発明者らは、意外にも、ヒトＡＨＳＧは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の中で発現すると、ＴＧＦ−βの作用に拮抗することを発見した。
【００８９】
（ＡＡＶ−ＡＨＳＧを用いた細胞傷害性の活性化）
前記データは、ＡＨＳＧが、ＴＧＦ−βの作用を遮断することができ、ヒトおよびマウス由来のリンパ球の増殖を可能にしていることを示している。Ｔ細胞におけるＡＨＳＧの発現によって、抗癌治療の開発にとって必須の活性である細胞傷害性が変化するか否かは分かっていなかった。それらを調べるために、細胞の悪性度に直接比例してＴＧＦ−βを分泌することが知られているルイス肺癌（ＬＬＣ１）細胞（Ｐｅｒｒｏｔｔｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：１５８７（１９９０））を選んだ。
【００９０】
腫瘍細胞に免疫原性がある場合、腫瘍を有するマウスのリンパ球は、癌細胞に対して細胞傷害活性を示すはずである。しかし、腫瘍細胞には発癌性があったため、免疫学的監視を回避する機構を保持していた。説明のために、以下の実験において、本発明者らは、リンパ球には、その細胞傷害活性から「エフェクター（Ｅ）」細胞というラベルを付け、元の腫瘍細胞には「標的（Ｔ）」細胞というラベルを付けた。Ｅ細胞がＴ細胞を破壊する効率を決定するために、Ｅ細胞とＴ細胞の比、すなわちＥ／Ｔ比を用いて細胞傷害活性を比較した。低いＥ／Ｔ比における相対的な細胞傷害活性は、そのリンパ球がＴ細胞を破壊するのに有効であることを示唆する。さまざまな標的細胞を用いてリンパ球の特異性を決定した。現在の実験においては、ＬＬＣ腫瘍を有するマウスからリンパ球を単離したため、リンパ球すなわちＥ細胞は、標的すなわちＬＬＣ細胞に特異的であるはずである。Ｅ細胞は、ＬＬＣ１に対し細胞傷害活性を有するが、他の標的細胞に対しては細胞傷害活性を有さないはずであり、これが事実であると確認されれば、細胞傷害活性は標的細胞に対して特異的であった。
【００９１】
最初の一連の実験では、ＬＬＣ１細胞をマウスの肩甲骨間領域の皮下に埋め込んだ。この処理は、注射されたマウスの免疫系をＬＬＣ１細胞に暴露するものである。ＬＬＣ１に暴露されたマウスは、殺処分された場合にリンパ球の供給源として利用し、これらのマウスの脾臓からリンパ球を単離した。脾臓由来の細胞がＥ細胞として働き、また、ＬＬＣ１がこれらの細胞の標的として用いられた。リンパ球の細胞傷害活性を測定するために、それらを以下のように処理した。脾臓からリンパ球を単離し、ＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧによって形質転換し、その後、以下の記載したように３日間培養した。培養したリンパ球を回収し、アッセイを行う前４時間、ＬＬＣ１と混合した。インキュベーションの終わりに、培地に放出されたＬＤＨの量を、製造業者の手順書に従って測定した（登録商標ＣｙｔｏＴｏｘ９６キット、非放射性細胞傷害性アッセイ法、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００９２】
予想通り、ＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧのいずれかに感染したＥ細胞が多いほど、標的細胞から放出されるＬＤＨが多かった（図３Ａ）。予想外の発見は、いずれのＥ／Ｔ比で使用しても、Ｅ／Ｔ比１で、ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染したＥ細胞は、ＡＡＶ−ｌａｃＺで形質転換された対照リンパ球に較べると顕著に高い細胞傷害活性、すなわち、より多いＬＤＨ放出を示した（図３Ａ、上のグラフがＡＨＳＧ発現細胞のＬＤＨ放出である）。これは、同数のリンパ球とＬＬＣ１を一緒に混合する、すなわちＥ／Ｔ比を１にすると、ＡＡＶ−ＡＨＳＧが、４時間以内に傷害活性を１４．２±１．８％から２０．６±０．９％まで促進したことを意味していた。さらに、この細胞傷害活性は、ここで試験したＥ／Ｔ比を用いてリンパ球内で発現されたＡＡＶ−ＡＨＳＧの量に比例すると考えられた（図３Ｂ）。
【００９３】
ＡＡＶ−ｌａｃＺで形質転換された対照リンパ球に較べると（図３Ａ、上のグラフがＡＨＳＧ発現細胞のＬＤＨ放出である）、ＬＤＨ放出はＥ／Ｔ比が１であった。これは、同数のリンパ球とＬＬＣ１を一緒に混合すると（Ｅ／Ｔ比１）、ＡＡＶ−ＬａｃＺに感染したリンパ球が、４時間で１４．２±１．８％のＬＬＣ１を傷害したことを意味していた。他方、これに対応するＡＡＶ−ＡＨＳＧ感染リンパ球は、２０．６±０．９％のＬＬＣ１を傷害した。さらに、この細胞傷害活性は、ここで試験したＥ／Ｔ比を用いてリンパ球内で発現されたＡＡＶ−ＡＨＳＧの量に比例すると考えられた（図３Ｂ）。
【００９４】
Ｔ細胞は、ＬＬＣ１を注射したマウスに由来したため、同じタイプの腫瘍細胞だけを認識して、それ以外の腫瘍細胞は認識しないという特異性をもつと予想された。このことを確認するために、ＬＬＣ１を注射されたマウスのリンパ球をＬＬＣ１またはＢ１６−Ｆ１に暴露して細胞傷害活性を測定した。Ｂ１６−Ｆ１は、同じマウス系統の悪性黒色腫細胞株である（図３Ｃ）。その結果、ＬＬＣ１を注射されたマウスに由来し、ｌａｃＺを発現する能力を与えられたＴ細胞が、ＬＬＣ１細胞に対して、Ｂ１６−Ｆ１細胞に対する細胞傷害活性レベルと同様のレベルを示したことが明らかになった。これらのＴ細胞におけるＡＨＳＧ発現は、Ｂ１６−Ｆ１細胞を攻撃する能力を高めることはなかったが、この改変は、対照遺伝子であるｌａｃＺにおけるよりも２倍高くなるように、標的ＬＬＣ１細胞に対する細胞傷害活性を増強した。これらの結果、ＡＡＶ−ＡＨＳＧが、比較的低いＥ／Ｔ比であってもリンパ球の特異的細胞傷害活性を促進できるという予想外の発見が明確に実証された。より重要なことに、ＡＨＳＧ発現は、ＬＬＣ１、または接種する細胞型に対してはＴ細胞の細胞傷害活性を強める一方で、無関係な癌細胞型に対しては、それを強めない。
【００９５】
リンパ球細胞にＡＨＳＧ発現能力を具備させると、それらの細胞傷害能力が促進されたということが、腫瘍細胞からのＬＤＨ放出を用いてさらに実証された。これらの実験では、ＬＬＣ１を注射したマウスの脾臓から単離されたリンパ球が用いられた。これらのマウスのリンパ球をマイトジェンで処理してから、ＬＬＣ１または無関係のＢ１６−Ｆ１癌細胞と混合する前にＡＡＶ−ＡＨＳＧまたはＡＡＶ−ｌａｃＺに感染させた。その結果（図３）、ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染したリンパ球がその細胞傷害活性を促進させたことが示された。ＡＨＳＧの作用は、Ｅ／Ｔ比が低くても明白であった。さらに、促進された細胞傷害活性は、そのリンパ球が由来したマウスに注射されたものと同じ細胞である、本来の癌性ＬＬＣ１細胞に対して特異的に向けられた。しかし、この細胞傷害活性は、Ｂ１６−Ｆ１癌細胞にまで広げられることはなかった。炎症反応が生じうる１つの経路は、非特異的免疫反応であると考えられている。本方法は、リンパ球の細胞傷害活性を、その本来の癌細胞に対して特異的に増強させるという事実によって、自己免疫療法に対する魅力的なアプローチとなる。
【００９６】
（インビボにおける細胞傷害活性）
ＬＬＣ１細胞は非常に発癌性が高いと報告されているが、マウスにおける転移能力は低い。本発明者らは、段階別に、ＡＡＶ−ＡＨＳＧによって形質転換されたＴ細胞リンパ球のＬＬＣ１細胞に対する細胞傷害能力をインビボで試験した。最初のステップは、Ｔ細胞リンパ球のＬＬＣ１細胞との相互作用を、この２つの細胞型を皮下注射する前に混合することによって最大化することであった。これらの実験では、２×１０４個のＬＬＣ１細胞を、ＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧのいずれかによって形質転換された５×１０５個のＴ細胞と混合して、マウスの肩甲骨間領域に皮下注射した。
【００９７】
以前の実験では、ＬＬＣ１細胞を注射すると、投与後７日から１０日の間に注射部位に腫瘍が発生した（Ｂｕｄｚｙｎｓｋｉ，Ｗ．Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ  （Ｗａｒｓｚ）３０：３６３（１９８２））。本発明者らの最初の目標は、ＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧで形質転換されたＴ細胞リンパ球の細胞傷害活性に違いがあるか、また、その活性がＬＬＣ１の腫瘍増殖に影響したかを判定することであった（表１）。６匹のマウスに、ＬＬＣ１細胞、およびＡＡＶ−ｌａｃＺを担持するリンパ球を注射した。１４日目の終わりに、すべてのマウス（６／６すなわち１００％）が、顕著な腫瘍増殖を示した（これらのうち３つを図４に示す）。これに対し、ＬＬＣ１細胞、およびＡＡＶ−ＡＨＳＧを担持するリンパ球を注射されたマウス６匹のうち４匹（すなわち６７％）は腫瘍増殖を示さなかった（６匹のうち１つを図４Ｃに示す）。さらに、腫瘍増殖を示した２匹のマウスのうち１匹では、腫瘍は小さかった（対照マウスでは１５ｍｍであったのに対し＜５ｍｍ）。腫瘍の色は白くかったが、これは、腫瘍の周囲にある血管新生組織の量が少ないことを反映したのかもしれない。この小さな腫瘍の組織学的解析では、分裂指数が低く、染色体の密度も低かったため、より良性の表現型であることが示唆された（図４Ｄ）。腫瘍を増殖させたもう１匹のマウスの病変部のサイズは、対照マウスのものと変わらなかった。これらの結果をまとめると、ＡＡＶ−ＡＨＳＧによるＴ細胞リンパ球の形質転換は、それらの細胞傷害活性を亢進し、インビボにおけるＬＬＣ１細胞の発癌能力を低下させることができることが実証されている。ＬＬＣ１とリンパ球を混合することで、これら２つの細胞型が確実に互いに直接接触するようにした。
【００９８】
（表１：マウスに注射されたＬＬＣ１腫瘍および全リンパ球細胞またはＣＤ８＋細胞を用いたインビボ実験）
【００９９】
【表１】
2007528862.tif 000002
これらの結果は、１０日後に腫瘍を増殖させていなかったマウスの数と割合を示している。
【０１００】
ＬＬＣ１：２×１０４細胞／マウス、リンパ球：５×１０５細胞／注射。
【０１０１】
（ＬＬＣ１細胞の皮下注射およびリンパ球ＩＶの静脈内注射）
前記した実験では、リンパ球の細胞傷害活性を改変し、ＬＬＣ１細胞を破壊する能力を強化するＡＡＶ−ＡＨＳＧの効率を示した。この実験デザインでは、早期にリンパ球による腫瘍の破壊を可能にしたため、楽観的な条件を再現した。腫瘍発生モデルをより現実的に反映するシナリオを作成するために、２×１０４個のＬＬＣ１細胞をマウスに皮下注射し、その４日後に、ＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧのいずれかよって形質転換された５×１０５個のＴ細胞リンパ球をマウスの尾静脈から注射した。実験の最初の組では、全リンパ球（濃縮されたＣＤ８＋リンパ球だけではないという意味）を注射に用いた。これらの実験の結果、まずＬＬＣ１を注射されて、その後ＡＡＶ−ｌａｃＺで形質転換されたリンパ球を注射された４匹の動物はすべて（１００％）腫瘍を増殖させた。以前の実験とは異なり、ＬＬＣ１、およびＡＡＶ−ＡＨＳＧで形質転換されたリンパ球を注射された１２匹のマウスのうち８匹（７５％）が、１４日目に腫瘍を増殖させた。この知見は、２５％のマウスだけが防御されて腫瘍を増殖させなかったことを意味した。
【０１０２】
本発明者らは、この実験デザインにおいて腫瘍増殖に対する防御レベルが低かったのは、以下の少なくとも２つの可能性のうち１つが原因であると考える。一つの説明として可能なのは、細胞傷害性細胞が腫瘍部位に到達できなかったということであり、もう一つの説明として可能なのは、強化された細胞傷害活性をもつ細胞の数が治療効果をもたらすのには十分ではなかったという説明である。この状況に取り組むため、注射された細胞の相対的細胞傷害活性を強化するために、磁気ビーズを用いて全リンパ球からＣＤ８＋細胞を単離し、これら単離した細胞を注射に用いた。ＬＬＣ１、およびＡＡＶ−ｌａｃＺで形質転換された５×１０５個のＣＤ８＋リンパ球を注射された対照マウス６匹のすべてが腫瘍を増殖させた。これに対し、ＡＡＶ−ＡＨＳＧで形質転換されたリンパ球を注射された８匹のマウスのうち５匹（６２．５％）が、腫瘍を全く発生させなかった。このことは、意外にも、ＣＤ８＋濃縮リンパ球が、ＡＡＶ−ＡＨＳＧ形質転換によって誘導される細胞傷害活性を強化すると見られることを示した。
【０１０３】
（ＡＨＳＧｃＤＮＡによって改変されたリンパ球は、ＬＬＣ１に対して特異的であるが、Ｂ１６−Ｆ１に対しては特異的でない）
ＴＧＦ−βに依存するＬＬＣ１細胞に対する、細胞を利用した治療法の現行モデルにおいて、本発明者らは、Ｔ細胞リンパ球においてＡＨＳＧを発現させると、該細胞に、ＴＧＦ−βを利用して免疫系を回避する癌細胞を認識できる特異性が付与されることを発見した。このことは、上記と同じ方法を用いて、マウスの肩甲骨内領域にＢ１６−Ｆ１癌細胞を注射し、その後、同日にＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧのいずれかで形質転換されたＴ細胞リンパ球を静脈内注射して確認した。これらの実験の結果、Ｂ１６−Ｆ１と、ＡＡＶ−ｌａｃＺによって形質転換されたＴ細胞とを注射されたマウスのすべてが腫瘍を増殖させたことが示された。また、Ｂ１６−Ｆ１と、ＡＡＶ−ＡＨＳＧによって形質転換されたＴ細胞とを注射されたマウスのすべても腫瘍を増殖させた。磁気ビーズを用いてＣＤ８＋リンパ球を濃縮し、それをＡＡＶ−ｌａｃＺまたはＡＡＶ−ＡＨＳＧのいずれかによって形質転換したさらなる実験では、腫瘍増殖速度に変化は見られなかった。どちらのタイプのＴ細胞リンパ球を注射されたマウスもすべて腫瘍を増殖させた。これらの知見は、ＡＨＳＧを発現させるよう形質転換されたＴ細胞リンパ球の細胞傷害活性が、ＬＬＣ１細胞のようなＴＧＦ−β依存性の細胞に限定され、Ｂ１６−Ｆ１癌細胞のようにＴＧＦ−βに依存しない細胞には及ばないらしいことを示唆している。
【０１０４】
（ＡＨＳＧのカテプシンＢに対する効果）
本実施例において、本発明者らは、ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣと呼ばれる蛍光発生基質を用いた。このペプチドは、細胞には進入せず、カテプシンＢの活性を測定するのに特異的なものである。この基質は、細胞の外に留まることができるため、細胞周囲にあるカテプシンＢの酵素活性を測定することが可能になる２。多くのヒトおよびマウスの癌細胞株には、その細胞表面上にカテプシンＢ活性がある。
【０１０５】
カテプシンＢの活性に対するＡＨＳＧの効果を測定するために、本発明者らは、発現ベクターであり、ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を形質転換するために使用したベクター、ｐＡＡＶ−ＡＨＳＧまたはｐＣＤＮＡ−ＡＨＳＧを用いてＡＨＳＧを発現させた。これらの細胞は、普通にカテプシンＢを発現する（Ｈｕｌｋｏｗｅｒ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７：４１６５（２０００））。そのため、非特異的ベクターによって形質転換された細胞にこの基質を加えると、このペプチドが分解され、その結果得られたカテプシンＢ活性のレベルを任意に１００とした（図７、左側カラム）。ｐＡＡＶ−ＡＨＳＧによって形質転換した後のカテプシンＢ活性は、対照細胞における活性よりもおおむね２５％低かった（図７、第２カラム）。次に、２５ｎＭの既知のカテプシンＢインヒビターであるＣＡ０７４をアッセイ中に加えた。この因子が存在すると、予想されたようにカテプシンＢ活性の阻害が生じた（図７、第３カラム）。予想どおり、カテプシンＢの阻害は、ｐＡＡＶ−ＡＨＳＧで形質転換され、また、ＣＡ−０７４に暴露された細胞に関連して最も高かった（図７、第４カラム）。β−ガラクトシダーゼ活性のインシチュ染色を用いて測定したところ１０％から２０％の範囲という、ＬＬＣ細胞の低い形質転換効率にもかかわらず、ＡＨＳＧ存在下におけるカテプシンＢの減少が観察されたことは、ＡＨＳＧの発現が、細胞表面におけるカテプシンＢの活性を抑制するという本発明を裏付けている。
【０１０６】
もう一つの発現ベクターであるｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから購入した）を用いてＡＨＳＧを発現させた、別の組の実験（図７、カラム５〜９）でも同じような結果が示された。結果は、空のベクターｐＣＤＮＡによって形質転換された細胞で使用済みの培養培地では、カテプシンＢの活性が阻害されないことが示された。これに対し、ｐＡＡＶ−ＡＨＳＧ構築物を使用すると、ほぼ２５％カテプシンＢが阻害され、（図７、カラム６）、同様の阻害が、ｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧで形質転換された細胞の培地でも観察された（図７、カラム７）。予想されたように、２５ｎＭのＣＡ−０７４が存在すると、カテプシンＢ活性が阻害され（図７、カラム８）、ｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧとＣＡ−０７４を併用すると、カテプシンＢ活性がさらに低下した（図７、カラム９）。本実験では蛍光のバックグランドが変動したせいで、カラム８から９は、カラム３から４に較べてより低い阻害を示した。バックグランドの量は、細胞の調製に違いがあるため、僅かながら異なっていた。これらの実験をまとめると、細胞におけるＡＨＳＧの発現が、カテプシンＢを遮断する活性を有したことが示されている。
【０１０７】
この観察結果がＬＬＣ細胞に限定されるものでないことを確かめるために、ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染したＨＥＫ２９３細胞の上清に含まれているカテプシンＢに対するＡＨＳＧの阻害活性も測定した。本実験において、ＨＥＫ２９３細胞の使用済み培地でＡＨＳＧを発現するものと発現しないものを回収した。ＡＡＶウイルスを使用する理由は、ＨＥＫ２９３細胞において、より効率的なＡＨＳＧ発現を可能にしたからである。ＨＥＫ２９３細胞は、一般的に、ウイルスの生産に使用され、ベクターに含まれる導入遺伝子も発現するはずである。その結果（図８）、ｐＡＡＶ−ｌａｃＺに感染した細胞において、カテプシンＢ阻害活性は存在しなかったため、１００と設定した（「対照」カラム）。上記実験で示したように、ＣＡ−０７４が存在するとカテプシンＢの活性が阻害された。ＡＡＶ−ＡＨＳＧまたは−ＬａｃＺに感染したＨＥＫ２９３細胞の使用済み培地を用いて、ＡＨＳＧ阻害活性を試験した。予想どおり、ヒト血漿から部分精製されたものである、購入したＡＨＳＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）には、予測されたＴＧＦ−β阻害活性があった（図８、カラム９）。ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染したＨＥＫ２９３細胞の使用済み培地を部分精製して濃縮した。ＡＡＶ−ＡＨＳＧウイルスに感染したＨＥＫ２９３細胞に由来する、ＡＨＳＧを含む濃縮培地（図２、カラム５および６）、および、Ｓｉｇｍａ社から購入したＡＨＳＧを加えると、細胞周囲のカテプシンＢ活性の顕著な阻害が示された（図８、カラム９）。さらに、培地の濃度を倍にすると、ＴＧＦ−β阻害活性が２倍高くなった。すなわち、６２．５ｕｇ／ｍｌまたは１２５ｕｇ／ｍｌのＡＨＳＧを含む培地が存在すると、カテプシンＢの活性が、それぞれ２３％および４６％低下する結果となった（図８、カラム５および６）。
【０１０８】
ＡＡＶ−ｌａｃＺに感染した陰性対照細胞で観察されたカテプシンＢ活性のわずかな阻害（図８、カラム３および４）は、培地の成分であるウシ血清に含まれていた内在性のフェチュインが原因である可能性がある。購入したＡＨＳＧの各ロットにおいて、細胞周囲カテプシンＢの阻害活性はさまざまなであった。しかし、ＡＨＳＧの一つのロットがカテプシンＢの活性を完全に阻害したが、必要なタンパク質の量は、成人の血液におけるＡＨＳＧの濃度（０．３から０．６ｍｇ／ｍｌ）の１０％未満であった。ＡＨＳＧは、グリコシル化およびリン酸化によって修飾される。これらの修飾が、カテプシンＢの阻害活性に影響を与えた可能性があり、また、タンパク質に対するこれらの修飾は、抽出されたＡＨＳＧ調製物によって変動する可能性がある。
【０１０９】
（材料と方法）
（細胞の調製）
細胞周囲にあるカテプシンＢを検出するための最適な条件は、急速に増殖する細胞にある。この条件を満たすには、６０ｍｍ培養皿に４×１０６個の細胞を播種して、翌日のカテプシンＢアッセイに使用した。ＬＬＣ細胞の形質転換は、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｙ．，ＫＪ  Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）を用い、製造業者の指示にしたがって実施した。６０ｍｍ培養皿上の単層細胞を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄してから、０．８ｍｌの通常の増殖培地（１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ）に懸濁した。細胞を５分間放置して、細胞塊の大きな集まりを沈殿させてから、細胞懸濁液の上層から０．６ｍｌを、５ｍｌポリスチレン製チューブに移した。３０μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔを、５μｇのプラスミドＤＮＡを含むＤ−ＭＥＭ１５０μｌに加えてＳｕｐｅｒｆｅｃｔ−ＤＮＡ複合体を作成した。この懸濁液を１０分間室温に放置した後、０．６ｍｌの単一細胞懸濁液に加えた。ＤＮＡと細胞の混合液をＣＯ２培養器内で３時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄してから、通常の増殖培地（１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ）で一晩培養した。翌日、細胞を継代培養し、次に、４×１０６個の細胞を６０ｍｍ培養皿に播種し、これらの形質転換細胞を一晩増殖させてから、カテプシンＢアッセイに使用した。６０ｍｍ培養皿から得た細胞を、４ｍｌのＰＡＢ緩衝液（重炭酸ナトリウムを含まないハンクス液、０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  １−システインおよび２５ｍＭ  ｐＨを７．０に調整したＰＩＰＥＳ）で激しくピペッティングして培養皿から取り出した。この細胞懸濁液をポリスチレン製チューブに移した。細胞塊の大きな集まりを取り除くため、チューブを５分間室温に放置した後、アッセイを行うために細胞懸濁液の上層３ｍｌを慎重に取り出した。
【０１１０】
（カテプシンＢアッセイ）
５０μｌの細胞懸濁液を、壁面が黒色の（Ｂｌａｃｋ  ｗａｌｌｅｄ）９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．８２２０，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）に加えた。適当な濃度のカテプシンＢのインヒビター、精製されたＡＨＳＧ、または濃縮された培地を、５μｌのＰＡＢに希釈して、該細胞懸濁液を９６ウェルのそれぞれに加えた。このプレートを４０℃で３０分間前培養した。カテプシンＢによって分解される蛍光発生基質ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の２００μＭ溶液５０μｌを加えて、反応を開始させた。この基質は、ＰＡＢに溶解し、使用前に４０℃でインキュベートしておいた。カテプシンＢの加水分解活性によって、基質ペプチドから遊離ＡＭＣが産生され、蛍光の上昇をもたらした。３５５ｎｍ励起フィルターおよび４２０ｎｍ発光フィルターを備えたＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ蛍光スキャンマイクロプレート読み取り装置を用いて蛍光強度を測定した。ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣの保存液をＤＭＳＯで濃度１０ｍＭに溶解して、−８０℃で保存した。カテプシンＢ特異的インヒビターであるＣＡ−０７４とＡｃ−ＬＶＫ−ＣＨＯ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を水で１０ｍＭ濃度に溶解し、等量液にし、−８０℃で保存した。
【０１１１】
（ＡＡＶ−ＡＨＳＧ感染ＨＥＫ２９３由来のＡＨＳＧ）
実験当日、ＨＥＫ２９３細胞を４０％コンフルエントな細胞密度で継代培養した。６時間増殖させた後、細胞に、ＡＡＶのＭ．Ｏ．Ｉ．を３にして、ＡＡＶ−ＡＨＳＧまたは陰性対照であるＡＡＶ−ｌａｃＺを感染させた。翌日、培養培地を、５％ＦＣＳを添加した新鮮なＤ−ＭＥＭで置換して、さらに２日間培養した。この培養培地を、孔サイズ０．２２ミクロンのフィルターで濾過してから、−８０℃で保存した。ＡＨＳＧの分子量は５５ｋＤである。分子量が１００ｋＤから３０ｋＤである使用済み培地を部分的に精製し、濃縮した。遠心濾過用装置であるＮａｎｏＳｅｐ  １００（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を利用して、１００ｋＤよりも低い分子量のものを回収した。ＮａｎｏＳｅｐ  １００からの素通り画分０．４ｍｌを、ＮａｎｏＳｅｐ３０に適用し、フィルター膜上に残ったタンパク質を、４０μｌのＰＡＢ（重炭酸ナトリウムを含まないハンクス液、０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  １−システインおよび２５ｍＭ  ｐＨを７．０に調整したＰＩＰＥＳ）に再懸濁した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、タンパク質の濃度を測定した。タンパク質溶液の等量液を液体窒素で瞬間凍結して、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１２】
治療法は遺伝子治療に限定されず、タンパク質、低分子、また化合物など、活性成分置換法によって所望の機能活性を、それを必要とする患者に提供するものを投与することも含む。
【実施例】
【０１１３】
（実施例１）
（眼）
多くの理由で、眼は、遺伝子治療法にとって潜在的に理想的な器官であると見なされるかもしれない。数多くの眼病が、現在、分子レベルで十分に定義されており、適当な動物モデルがしばしば利用可能であり、眼の形態や機能は簡単に決定することができ、眼の免疫特権性は、遺伝子治療法にとって有益であり、また、第２の眼を動物モデルにおいて治療法を開発および試験する際に対照として使用することがしばしば可能である。
【０１１４】
本発明の原理と態様にしたがって、眼に、カテプシン活性およびＴＧＦ−βレセプター結合の両方を下方制御する能力を備えさせることによって、眼の疾患を治療する方法が提供される。これは、例えば、眼に、例えばＡＨＳＧなど、カテプシン阻害活性とＴＧＦ−βレセプター遮断活性をともに有するタンパク質を眼に提供することによって行われうる。同様に、カテプシン活性およびＴＧＦ−β活性の両方を低下させることができるペプチドなども同等とみなされ、本発明において予定されている。
【０１１５】
本発明の好適な実施態様において、例えばＡＨＳＧなどのタンパク質であるが、それらに限定されない本発明の薬剤を、例えば局所的または眼内など、さまざまな方法で眼に提供することができる。
【０１１６】
例えばＡＨＳＧによって提供される本発明の所望の活性も、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど、核酸の形にして送達することが可能である。具体的に考えられる一つの方法は、例えば、ＡＨＳなどのタンパク質またはその変異体をコードするＤＮＡの送達を含む。該ＤＮＡは、理想的には、ウイルスベクター方式または非ウイルス的移入技術によって遺伝子治療法の一部として提供することができる。
【０１１７】
非ウイルス核酸移入技術には、エレクトロポレーション、遺伝子銃による輸送、リポソーム封入法による送達、または単に裸のＤＮＡを注入する方法などがある。ウイルスの核酸を移入する技術は、ベクターとして、レトロウイルス（例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ヒトまたはサルの免疫不全症ウイルスなどのレンチウイルス、または水疱性口内炎ウイルス）およびアデノウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン−バーウイルスなどのヘルペスウイルス）など、いくつか異なるウイルス科のいずれかから選択されたウイルスを有利に利用することができる。
【０１１８】
本発明の好適な実施態様は、選択した核酸を、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）をベクターとして用いて送達することを含む。ＡＡＶは、病原性を比較的欠失しており、長期間にわたって導入遺伝子の発現を誘導することができ、また、光受容体、網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞、網膜神経節細胞、小柱網細胞、および角膜内皮細胞など、さまざまなタイプの眼の細胞を形質転換することが示されているため、核酸を眼に送達するためのベクターとして特に有用である。ＡＡＶ−ＤＮＡベクターは、網膜下腔あるいはイントラビトゥリアリー（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ）など、さまざまな場所で眼に注入することができる。
【０１１９】
ＡＡＶ−ＤＮＡベクターは、さらに、眼に提供された導入遺伝子の発現を作動させるのに役立つさまざまなプロモーターを都合よく含む。特に、本発明の好適な実施態様は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）とニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）のプロモーターを含む。眼における発現を作動するのにも用いられる別のプロモーターは、血小板由来増殖因子およびニューロン特異的エノラーゼのプロモーターなどである。好適な実施態様において、アデノ関連ウイルスベクターに入れて患者に提供される、タンパク質コード核酸は、ＡＨＳＧまたはその変異体をコードする。
【０１２０】
また、本発明は、免疫機能障害、創傷治癒、瘢痕形成および感染症に関係する眼の病気の治療法を提供する。免疫機能障害に関連する眼の疾患は、自己免疫疾患および移植などである。本発明の適用が特に有益である自己免疫疾患は、自己免疫性ブドウ膜炎であり、予防的な方法でも、継続的な長期治療としても治療することが可能である。本発明が有益である別の自己免疫性疾患は、ドライアイ症候群であるが、これは、涙腺の炎症という特徴をもつ。
【０１２１】
移植に伴う続発症は、特に、本発明による治療法の影響を受けやすい。患者に移植される組織は、本発明の核酸を利用する遺伝子治療法により、エキソビボ（生体外）で処理することができる。このような処理は、移植された組織が宿主の免疫系に対してより刺激を与えないようにするため、移植の前に行われる方が好ましい。あるいは、またはさらに、本発明の薬剤は、そのような続発症を軽減するために、移植の前、その最中、および／またはその後に、宿主に対して直接提供することができる。組織不適合性による５年間の失敗率が約５０％であって、また、有毒な全身性免疫抑制剤の使用が現在の標準的な医療であるため、全層角膜移植（角膜移植）は、本発明の恩恵を特に受けることができる移植処理である。
【０１２２】
眼の感染性疾患も、本発明の薬剤および方法によって良好に治療することができる。本発明が特によく効く可能性のある眼の主な感染症はＩ型ヘルペスウイルスによって誘発される角膜炎である。この病気は、しばしば再発性であるため、特に、本発明の薬剤であって、核酸の長期保持、ひいてはＴＧＦ−β活性の下方制御とカテプシン活性の下方制御を同時に付与するペプチドまたはタンパク質の長期発現をもたらす薬剤の核酸送達から得られる長期にわたる有効性に資する。
【０１２３】
さらに、眼の創傷治癒疾患も、本発明の方法および薬剤による治療から有利に恩恵を受けることができる。本発明の好適な実施態様は、緑内障ろ過手術の後に起こる創傷治癒を調節することを含む。緑内障の手術後の主な創傷治癒部分は、手術のすぐ後２週間で生じるため、また、ＴＧＦ−β活性が、眼における線維増殖性瘢痕形成反応に関係する主要サイトカインであるため、本発明の薬剤は、理想的には、この期間の前および／または最中に眼に提供される。このような薬剤は、マイトマイシン、５−フルオロウラシルおよびその他の代謝拮抗物質のような他の治療薬とともに、またはそれらなしで提供することが可能である。緑内障手術の患者に提供することができる、考案された本発明の薬剤には、ＡＨＳＧ、またはそれ以外で同様の作用をするポリペプチド、または、カテプシン下方制御活性およびＴＧＦ−β阻害活性を有利に提供するペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸があるが、これらに限定されるものではない。このような核酸は、ウイルスに封入された形または裸の形で、直接眼に有利に提供するか、または、エキソビボで別の細胞に提供した後、引き続き眼に導入することができる。
【０１２４】
本発明の方法および薬剤による治療法から恩恵を受けることができる眼の別の創傷治癒性疾患は、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）である。ＰＶＲは、網膜復位術に失敗する主な原因であり、細胞外基質タンパク質の沈着および線維性血管膜の形成を伴うが、これらの事象は、一部、ＴＧＦ−βの活性によって仲介される。ＰＶＲを予防または治療するために網膜復位患者に提供することができる本発明の薬剤には、ＡＨＳＧ、またはそれ以外で同様の作用をするポリペプチド、または、カテプシン下方制御活性およびＴＧＦ−β阻害活性を有利に提供するペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸があるが、これらに限定されるものではない。核酸を、ウイルスに封入された形または裸の形で眼に提供する場合には、直接眼に有利に提供するか、または、後に眼に導入される別の細胞にエキソビボで提供することができる。
【０１２５】
（実施例２）
（肝臓）
ＴＧＦ−βは、炎症および／または線維症および線維成長を含む肝臓疾患の進行に対して中心的な存在である。したがって、ＴＧＦ−β活性とカテプシン活性を低下させることは、非常に有益な治療法であることを示している。本発明によって考案されたさまざまな薬剤および方法は、中毒性肝障害、胆汁うっ滞性肝障害、アルコール性肝障害、（例えば肝硬変）、炎症性肝障害など、また、胆道閉鎖症など、以外のタイプの肝障害を治療する上で有用である。
【０１２６】
本発明の一つの実施態様は、ＴＧＦ−βおよびカテプシンの生物活性を低下させるために、本発明の治療薬を肝臓に提供することを含む。このような薬剤は、ポリペプチドとして、または核酸の形で都合よく送達することができ、それらは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供し、また、患者に直接提供するか、あるいは、別の細胞に提供してから患者に提供することもできる。好適な実施態様において、本発明の薬剤を患者に直接提供し、肝臓を目的とする場合には、門脈を経由して投与することができる。別の好適な実施態様において、該薬剤は、患者の循環血液の中に注射することによって患者に提供することができる。
【０１２７】
肝臓は、それ自体、遺伝子をインビボで送達するための優れた標的である。なぜなら、肝臓の毛細血管に付いている大きな孔隙を介して容易に接触することができ、毛細血管自体も、患者の循環血液の中に該薬剤を注射することによって適宜接触可能であるからである。適当な遺伝子送達手段は、リポソーム、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）−タンパク質複合体、ウイルスベクター、導入遺伝子を含む細胞（例えば、肝細胞）、または裸のＤＮＡ、ＲＮＡなどを含む。本発明の好適な実施態様において、送達される核酸はＤＮＡである。本発明の最も好適な実施態様において、該核酸はウイルスベクターによって送達される。別の好適な実施態様において、該核酸は、ＡＨＳＧ、またはカテプシンとＴＧＦ−βの両方の下方制御活性を提供する別のポリペプチドをコードする。別の特に好適な実施態様において、ウイルスベクターはアデノ関連ウイルスを含み、もっとも好ましくは、アルブミン遺伝子、サイトメガロウイルスの前初期遺伝子、ヒト・ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子、モロニーマウス白血病ウイルスの５’−ＬＴＲ、およびニワトリβ―アクチン遺伝子に随伴するプロモーターから選ばれた、該核酸の発現を作動させるプロモーターをさらに含む。
【０１２８】
（実施例３）
（腎臓）
糸球体における細胞外基質の蓄積は、末期腎不全をもたらす進行性腎臓疾患のほぼすべての発症に共通した主な原因である。現在のところ、腎線維症の進行を治療または予防するために利用できる具体的かつ効果的な治療法はない。ＴＧＦ−βは、例えば糸球体腎炎および糖尿性ネフロパシーなどの腎線維症の進行において不可欠な役割を果たしている。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むわけではないが、本発明者らは、ＴＧＦ−βレセプター結合およびカテプシン活性の下方制御によって、線維沈着が減少し、その後の腎症の進行が抑制されると考えている。
【０１２９】
本発明の治療上の処置という実施態様は、腎臓に対して、その中にあるＴＧＦ−βおよびカテプシンの活性を低下させるために、治療上有効量の薬剤を提供することを含む。肝臓の治療におけると同様に、このような薬剤は、ポリペプチドとして、または核酸の形で有利に送達することができ、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって輸送されてもされなくてもよく、直接患者に適用するか、または、患者に提供される前に別の細胞に適用することができる。
【０１３０】
例えば、理想的にはＡＨＳＧを患者に提供して、繊維性腎臓疾患を治療または予防することができる。本発明の別の実施態様において、ＴＧＦ−β下方制御活性およびカテプシン下方制御活性を提供する、治療上有効量のポリペプチドを患者に提供することができる。本発明の別の実施態様において、ＴＧＦ−β下方制御活性およびカテプシン下方制御活性を提供するＡＨＳＧまたはポリペプチドは、静脈注射によって提供することができる。本発明の別の実施態様において、ＴＧＦ−β下方制御活性およびカテプシン下方制御活性を提供するＡＨＳＧまたはポリペプチドは、核酸を直接患者に導入することによって患者に提供することができる。この核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであるが、理想的には、生きた患者の体内でそのタンパク質が発現されると、患者に提供されるＡＨＳＧまたはポリペプチドに治療上有益な活性をもたらすという比較活性をもつＡＨＳＧまたはポリペプチドをコードする。本発明の別の実施態様において、核酸は生体外にある哺乳動物（好ましくはヒト）細胞の集団に投与することができ、その後、これら形質転換された細胞を患者に提供し、そこで、ＡＨＳＧまたはその他のポリペプチドを発現して、ＴＧＦ−βおよびカテプシンの活性を下方制御し、その結果、患者の治療をもたらすことができる。好適な実施態様において、核酸はＤＮＡである。別の好適な実施態様において、核酸を、ウイルスベクターを用いて体内または体外のいずれかにある細胞に送達する。さらにより好適な実施態様において、ウイルスベクターはアデノ関連ウイルスを含む。別の好適な実施態様において、核酸の送達とは、循環血の中に、直接腎臓の中に、または腎実質の中に注射することである。別の好適な実施態様において、ＡＡＶウイルスベクター中の核酸の送達は、促進剤の付加によって、都合良く促進することができる。このような促進剤は、以下の薬剤リストから選択される。（１）ＤＮＡを損傷する薬剤（シスプラチンや電離放射線など）、（２）細胞内のヌクレオチドプールを枯渇させる薬剤（ヒドロキシウレアなど）、（３）トポイソメラーゼ活性を阻害する薬剤（エトポシドやカンプトセシンなど）、または（４）（細胞周期を停止させる薬剤（アフィジコリンなど）。
【０１３１】
（実施例４）
（肺）
ＴＧＦ−βの過剰発現が、肺線維症の発症を特徴づける細胞外基質の沈着主要な原因であり、また、それに寄与する。特発性肺線維症に通常使用されているステロイド剤およびその他の免疫抑制剤は、理想的な有効性よりも弱く、一般的に、５年目の生存率が５０％よりも低い結果となっている。本発明は、ＴＧＦ−β活性およびカテプシン活性を都合よく下方制御する方法および薬剤を考えて、肺線維症の治療法および予防法の改良されたものを提供する。
【０１３２】
本発明の考案された実施態様は、肺線維症を治療または予防するために、ＴＧＦ−β活性およびカテプシン活性を下方制御できるタンパク質を肺に送達することを含む。このタンパク質は、例えば、タンパク質として、発現されるタンパク質をコードする核酸として、または、該タンパク質をコードする核酸を運ぶ細胞としてなど、さまざまな方法によって送達することができる。核酸は、裸のＤＮＡとして、またはベクターに乗せて、都合よく送達することができる。このようなベクターは、例えば、アデノ関連ウイルスすなわちＡＡＶなどのウイルスを含むことができる。タンパク質の送達は、どのような方法によるにせよ、例えば気管内、静脈内、または気管内という経路によって行うことができる。静脈内または気管内という経路によって送達する場合には、その送達は、例えば注射によって行うことができる。静脈内経路によって送達させる場合、目的のタンパク質は、肝臓、肺、および腎臓に蓄積するのを見られることがあり、このことが、静脈内投与を、これら器官に関連する多くの線維性疾患を治療する上で特に効率的なものにしている。気管内または経鼻経路によって送達される場合、当業者によく知られている方法にしたがったエアロゾル装置によって送達するために、エアロゾルの形に都合よく処方することができる。
【０１３３】
（実施例５）
（心筋）
ＴＧＦ−βは、心臓における線維芽細胞増殖、線維芽細胞から筋線維芽細胞への表現型の変化、および細胞外基質産生の主要な刺激因子である。このような線維組織の心臓内での蓄積は、肥大心における硬化障害およびポンプ能力低下、ならびに、さまざまな心室機能障害、ひいては拡張機能障害および心不全をもたらす。本発明前には、ＴＧＦ−β活性の下方制御およびカテプシン活性の低下によってＴＧＦ−β刺激を阻止することを利用できていなかった。
【０１３４】
本発明の好適な実施態様は、例えば心臓拡張機能障害のような心臓血管線維症を治療または予防するために、ＴＧことを含む。本発明のタンパク質は、静脈内、筋肉内もしくは腹腔内またはその他の経路によって送達することも可能であり、または、直接心臓組織に、もしくは近傍の細胞組織に注射することも可能である。本発明の別の実施態様において、タンパク質は、裸、またはウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターに担時させるかしたＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の形で送達することも可能である。本発明の最も好適な実施態様において、タンパク質はＡＨＳＧを含み、注射によって直接提供されるか、それをコードする遺伝子が、ＡＡＶベクターまたはアデノウイルスベクターに入れて同様に提供される。
【０１３５】
（実施例６）
（眼への施用、および眼への施用に有効な化合物を選択し、適正な投薬量を同定するための手順）
（増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）のウサギモデルの利用）
常法にしたがって、ウサギで実験的なＰＶＲを誘発し、推定治療薬を注射し、ＰＶＲの発症を監視して、該治療薬の有効性レベルを判定する。所望の治療薬は、ＴＧＦ−βレセプター遮断活性とカテプシン阻害活性を有するタンパク質またはペプチドなどの化学物質であろう。そのようなタンパク質の一例はＡＨＳＧである。また、該治療薬は、発現されるタンパク質またはペプチドがＴＧＦ−βレセプター遮断活性とカテプシン阻害活性を示すのであれば、それをコードする核酸によって送達されるものであってもよい。公知技術にしたがって、該核酸を封入せずに、ウイルスベクターに担持させて、リポソームなどの形質転換促進剤に担持させて、または、そのまま患者に送達される細胞に入れて投与することができる。適当なウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス、または、目的とする細胞にコード配列を送達するのに役立つことが知られているその他のウイルスまたはウイルス成分などである。抗ＰＶＲ活性をもつことが示されているタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を同定するための遺伝子技術は、それらを適当なウイルスベクターにスプライスする技術として公知であり、ここに記載するまでもない。これらの態様は、本明細書に記載する試験用モデルのすべてに適用される。
【０１３６】
ＰＶＲのウサギモデルはＯｓｈｉｍａ（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１２１４（２００２）、そのすべてが参照することにより本明細書に組み込まれる）によって記載されており、このモデルを用いて、眼におけるＴＧＦ−β発現の低下が、ＰＶＲの臨床的指標を低下させることを実証した。この著者らは、試験用ウサギの眼においてＰＶＲの臨床的指標を低下させる因子（すなわち、この文献においては、ウイルスベクターによって送達される遺伝子）が、ヒトの眼におけるＰＶＲを治療するための（遺伝子）治療法のモデルであると提案している。
【０１３７】
大まかにいえば、ＯｓｈｉｍａのウサギＰＶＲモデルでは、塩酸ケタミン（１４ｍｇ／ｋｇ）および塩酸キシラジン（１４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射によって成獣のウサギを麻酔する。１滴の１０％フェニレフリン、１％トロピカミド、および１％硫酸アトロピンによって瞳を拡張させる。それぞれのウサギの片方の眼に、０．１ｍＬのＢＳＳ溶液に入れた５００，０００個の線維芽細胞を扁平部から硝子体腔の中に注射し、その後、硝子体茎切除術を行う。その後直ちに、治療薬を眼の硝子体内に１回注射して、標準的な活性滴定技術（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｉｔｒａｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって、」どれへの投薬が識別できるかをスクリーニングする。対照として同じ数の眼に、線維芽細胞と平衡塩類溶液だけを投与する。すべての眼を、術後１ヶ月に至るまで毎日検眼鏡検査し、ＰＶＲの進展をファステンバーグの臨床基準（Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）を用いて分類する。
【０１３８】
眼の中に遺伝子を運び込むためのウイルスベクターの選択は治療結果に影響を与える。組換えアデノ関連ウイルスは、眼に送達するための他のウイルスベクターに対して、重要な長所をいくつか提供する。特に、病原性が比較的低いこと、および長期間にわたる導入遺伝子発現が可能なこと（Ｍａｒｔｉｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：２６７  （２００２））において概説されている）である。ＡＡＶの６つのサブタイプを調べると、眼において最も高い発現は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５というサブタイプを用いたときに達成される（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１（２００２））。
【０１３９】
ＴＧＦ−βおよびそのレセプターの間の結合を遮断できるため、ＡＨＳＧと同様の有効性をもつ可溶性ＴＧＦ−βレセプターをコードする遺伝子であって、ウイルスベクターに担持された遺伝子の有効投薬量は０．１ｍｌの１０３ＰＦＵであることがＯｓｈｉｍａによって発見された。これらの著者らの研究から結論を導き出すと、ウサギの眼は人の眼の量の約１０分の１であるから、ヒトの眼を治療するために適当な出発投薬量は、直接の硝子体内注射によって送達するときには（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１２１４（２００２）、０．１ｍｌの希釈剤（好ましくは滅菌食塩水）に１０４ＰＦＵを入れたものであろう。しかしながら、眼におけるＡＡＶウイルスの力価を調べたところ、力価が高いほど遺伝子移入効率が高く、マウスの眼において最もよい結果は、１ｍｌ当り１０１０ＰＦＵの濃度で提供されるとき１０７ＰＦＵで得られることが明らかになった（Ｓａｒｒａ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４２：５４１（２００２））。このことは、最適な遺伝子導入効率は、ヒトの眼が大きさがマウスの眼よりも約１００倍大きいとすれば、０．１ｍｌ中に濃度１０１０ＰＦＵ／ｍｌのとき約１０９ＰＦＵという投薬量で達成される可能性がより高いことを示唆している。したがって、ヒトへの投薬量を最適にするための出発範囲は１０４から１０９ＰＦＵであって、より高い形質導入効率、ひいては範囲の上限から予想されるよりも高い治療効果が得られる。ウイルスは、まず月に１回ずつ硝子体内に注射し、繰り返し注射する必要があるかは、ファステンバーグの臨床基準（Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ９３：５６５  （１９８２））を用いてＰＶＲの進行を検査して確認する。硝子体内注射の方法についての詳細な説明は、Ｍａｒｔｉｎと同僚ら（Ｍａｒｔｉｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：２６７  （２００２））によって開示されており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。ファステンバーグの等級による病気の進行度は、治療薬の反復投与の必要性を示している。
【０１４０】
（高眼圧症の霊長類モデルの使用）
別の有用なスクリーニング法および用量漸増法は、サルにおいて高眼圧を誘発させ、その後、緑内障の線維柱帯切開術を行って、同定すべき、またはその治療投薬量を同定すべき治療薬を送達する霊長類モデルを含む。次に、創傷治癒過程を監視して、該治療薬の有効性のレベルを判定する。記載された治療薬は、ＡＨＳＧによって証明できるようなＴＧＦ−βレセプター遮断活性およびカテプシン阻害活性を示すはずである。
【０１４１】
高眼圧症の霊長類モデルは、Ｈｅａｔｌｙと同僚ら（Ｈｅａｔｌｅｙ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：９４９（２００４））によって記載されているが、当時、このモデルは、ヒトにおける緑内障手術の後に起きる線維性創傷治癒疾患の正確なモデルとして役立つと提案されている。この霊長類モデルにおいて成功する治療法は、ヒト患者に対して成功する治療的介入と相関すると考えられている。ヒトにおける期待される最適な投薬量範囲（すなわち、ＰＦＵおよび濃度）、ウイルスベクターの選択、および好適な投与経路は、（ヒト疾患の霊長類モデルにおいて述べた通りではなく、ウサギモデルについて述べた通りである）。眼圧を調べるための標準的な臨床方法（ＩＯＰ）を利用し、それには、Ｇｏｌｄｍａｎの圧平眼圧計側法があるが、この方法は、サルとヒトの両方に適用可能であることが知られている（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ａｒｃｈ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  ９８：５４２（１９８０））。緑内障手術の後の術後瘢痕形成に関する積極的な成果を調べる方法、およびこれらの方法を積極的な成果に結びつける議論が、Ｍｅａｄらによって開示されており（Ｍｅａｄ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４４：３３９４（２００３））、また、ヒトの臨床試験基準が、Ｃｏｒｄｅｉｒｏらによって開示されている（Ｃｏｒｄｅｉｒｏ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４０：２２２５（１９９９））。記載されたようにヒト患者を治療し、標準的な基準を用いて臨床的に成功したかを調べた後に、瘢痕形成が進行するか、ＩＯＰが上昇するのは、治療薬を反復投与すべき必要性を示している。
【０１４２】
Ｈｅａｔｌｅｙのモデルにおいて、カニクイザルを塩酸ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、眼にゴニオレンズを載せる。レーザーを使用して、小柱網を１８０度切除して、眼圧（ＩＯＰ）の上昇を毎日監視する。動物に線維柱帯切開術を一度行うと、房水流出率の顕著な低下を示し、また、ＩＯＰが持続的に上昇する。手術のために、筋肉内ケタミンの後、ペントバルビタール・ナトリウム（１５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射によって動物を麻酔して、従来の線維柱帯切開術を上位４分の１で実施する。結膜とテノン嚢を切開して約８ｍｍを上位角膜輪部から切り出してから、高密度に粘着性のテノン嚢の溶解を、輪部と強膜床が完全に焼灼される限界まで行う。治療薬または対照薬剤に浸漬させたＷｅｃｋ−Ｃｅｌスポンジを結膜下腔に５分間置く。このスポンジを取り出して、その場所をＢＳＳで濯いで、２×２ｍｍで半分の厚さの強膜線維柱帯切開術用フラップを作成する。Ｋｅｌｌｙ  Ｄｅｓｃｅｍｅｔパンチ装置を用いて、幅広の孔（オストミー）を作成して、部分的な虹彩切除を行う。強膜フラップを、２本のナイロン製縫合糸によって両端で閉じる。フラップが貫流することを、輪部穿刺を介し、ＮＳＳによって前房を膨らませて確認し、結膜切開部を一連の登録商標Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸によって単層にして閉じる。手術後、抗生物質およびステロイドを局所的に適用する。手術後、前房をセルとフレアについて、角膜と水晶体の明澄さ、結膜の炎症、虹彩とフィステルの状態、および外科手術水疱の形態についてスコアをつけて、細隙灯検査により動物を評価する。Ｈａａｇ−Ｓｔｒｅｉｔ細隙灯を用いたミニフィールドＧｏｌｄｍａｎ圧平眼圧測定法によってＩＯＰを測定する。
【０１４３】
（実施例７）
（肝臓への適用）
（肝臓線維症のラットモデルの利用）
持続性肝線維症のジメチルニトロソアミン・ラットモデルが、ヒト肝硬変の病態生理学に酷似した、確立されたモデルとして記載されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １：４８９（１９８５）；Ｊｅｚｅｑｕｅｌ，Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５：１７４（１９８７）、両文献とも全部が参照されて本明細書に組み込まれる）。ラットにおける、この実験的な疾患の進行への治療的介入の成功は、肝硬変など、ヒトの持続性肝線維症において使用するための治療的介入療法の成功に比例すると期待されている（Ｑｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９６：２３４５（１９９９））。
【０１４４】
この周知の動物モデルによって、肝線維症をラットにおいて誘発し、スクリーニングまたは投薬量を決定すべき治療薬を送達する。次に、肝線維症を調べて治療薬の有効性レベルを判定する。この動物モデルでは、約１０週齢で体重約３５０グラムのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍｌの治療薬または食塩水を門脈から１回注入して投与する。あるいは、該治療薬を筋肉内注射で提供することも可能である。そして、各ラットにジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ、１０マイクログラム／グラム）を、週３回ずつ３週間にわたって腹腔内注射して、不可逆的な肝線維症を開始させる。３週間の終わりに、静脈血を採取して、ラットを殺す。ヒアルロン酸、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアラニンアミノトランスフェラーゼなどの生化学的パラメータを、常法を用いて測定する。組織検査のために肝臓を４％パラホルムアルデヒドによって固定する。組織切片をマッソン３色染色法によって染色するか、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、アルファ平滑筋アクチン、ＴＧＦ−β、または単球／マクロファージに対する抗体を用いた免疫組織染色法を行う。ビオチン化抗マウス（または抗ウサギ）ＩｇＧ抗体、ペルオキシダーゼ標識されたストレプトアビジン、およびジアミノベンジジンを用いて免疫反応物質を可視化する。線維症を半定量的に分析するために、マッソン３色染色切片の青色に染色した領域を、デジタル画像解析装置を用いてビデオスクリーンディスプレイ上で測定することができる。
【０１４５】
肝臓は、循環血液に注射されたベクターが肝臓毛細血管の大きな孔を通って簡単に接触できる優れた標的であるため、ヒトにおける肝線維症を治療する方法として、インビボにおける治療用遺伝子送達療法を選択するよう提案できる（Ｆｒａｓｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３：８６３（１９９７））。アデノ関連ウイルスは、ヒトの肝臓細胞へ治療用遺伝子を送達する最善の手段である可能性が高い。なぜなら、非ウイルスによる遺伝子送達法またはアデノウイルスベクターによる送達法とは対照的に、効率的で安定した発現を示し、最小限の免疫反応をしか引き起こさないからである（Ｘｉａｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１０２２２（１９９８）に概説されている）。肝臓におけるインビボ発現にとって非常に効果的なプロモーターは、長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターまたはアルブミンプロモーターである（Ｓｙｎｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２７０（１９９７）；Ｘｉａｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１０２２２（１９９８））。ヒトの治療に用いるウイルス投与量は、マウスで観察された用量応答曲線、１０１１感染単位という効率的な遺伝子導入のための最適なマウス投与量、および既知のマウス対ヒトの用量：用量換算に基づいて約５×１０１４感染単位で最適なると予想されている（Ｘｉａｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１０２２２（１９９８））。導入遺伝子を担持するウイルスベクターのヒトへの投与は直接的で、門脈の循環血に注入する必要があるだけである（Ｓｙｎｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２７０（１９９７）；Ｘｉａｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１０２２２（１９９８））。治療薬投与の有効性を調べるために利用可能な方法がいくつかある。肝臓の標本は、患者からの生検によって得ることができ、また、マッソン３色染色法を用いて、線維症を組織学的に等級分けすることができる（Ｆｅｒｒｅｌｌ，Ｌ．Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １３：６７９（２０００））。線維症がないことは、該治療法が有効であることを実証するが、線維症が進行すれば、さらなる投与および／またはより高い用量の治療薬が必要であることを示す。
【０１４６】
（実施例８）
（腎臓への適用）
（糸球体腎炎のラットモデルの利用）
抗胸腺細胞血清によって誘発された糸球体腎炎のラットモデルは、ヒトの腎線維症を反映するとＯｋｕｄａによって記述されている（Ｏｋｕｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８６：４５３（１９９０）、参照されて全文が本明細書に組み込まれる）。このラットモデルにおいて線維症の抑制をもたらす治療法が、ヒトの線維症性腎疾患において治療として使用されるときにも有効であると期待される（Ｂｏｒｄｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：３６１（１９９２）、参照されて全文が本明細書に組み込まれる）。
【０１４７】
このＯｄｕｄａの動物モデルにおいて、ラットで糸球体腎炎を誘発し、その後、スクリーニングするか、投薬量を決定すべき治療薬を送達する。そして、線維症性腎疾患の進行を調べて、治療薬の有効性のレベルを判定する。糸球体腎炎は、抗胸腺細胞血清の静脈内注射によって４〜６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて誘発する。抗胸腺細胞を注射した１時間後、６日間毎日、０．５ｍｌの治療薬か、リン酸緩衝食塩水を対照として、ラットに静脈内注射して投与する。７日目にすべてのラットから尿を採取して、尿タンパク質とクレアチニンを測定する。動物を殺処理し、糸球体内のフィブロネクチンを定量して、糸球体腎炎において基質の蓄積を阻止する治療薬の能力を評価する。また、フィブロネクチンのエクトラドメインＡおよびテネイシンに対する抗体で糸球体を染色してＴＧＦ−β活性を検出するか、または酸−シッフ染色によって組織学的に解析することができる。尿タンパク質の尿クレアチニンに対する割合はタンパク尿の発生を示す。
【０１４８】
動物に送達すべき治療薬が、アデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターとの関連で提供されるときも、それに代わって、該薬剤は、側腹切開して腎臓を曝露し、各腎臓のいくつかの部位に、リン酸緩衝食塩水に入れたウイルスを注射することによって腎臓に直接送達することもできる。
【０１４９】
ヒトの腎臓疾患を治療する方法として遺伝子治療を行うには、送達系を注意深く考える必要がある。リポソーム複合ＤＮＡを腎臓細胞においてインビボで発現させることができるが、その発現は一過的であり、またそれほど高くない（Ｔｏｍｉｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８６：１２９（１９９２）；Ｉｓａｋａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：２５９７（１９９３）；Ｌｉｅｎ，Ｙ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５２：Ｓ８５（１９９７）で概説されている；これらはすべて、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる）。レトロウイルスベクターは、分裂している細胞のみが容易に形質導入できるため、腎臓への不効率な形質導入をもたらし（Ｂｏｓｃｈ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １：４９（１９９３））、アデノウイルスベクターでは、発現が数週間しか持続しない結果となる（Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４５：１２２０（１９９４））。組換えアデノ関連ウイルスが、ヒトの腎臓疾患を治療するための最も魅力的なベクターである。なぜなら、ＡＡＶは細胞媒介性免疫を活性化せず、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入でき、長期にわたる発現を行わせることができ、また、同時感染するヘルパーウイルスが存在しないと複製できないからである（Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２８：４７５（１９９６））。ヒトへの適当な投薬量は、マウスの腎臓へのＡＡＶの有効な形質導入用量から推定することが可能である。腎臓に直接注射されたマウスは、腎臓当り８０μｌのリン酸緩衝食塩水に１０６感染単位で効率的に形質導入できたため、ヒトに対する適当な出発投薬量は、直接注射によって投与する場合、ヒト腎臓当り約１０１０感染単位と見積もることができよう（Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １０：１９０８（１９９９））。ヒトへの投与経路は、腎臓動脈灌流（Ｄａｎｉｅｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６３：１１８５（２００３））、または腎臓そのもののいくつかの位置に直接注射すること（Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １０：１９０８（１９９９））が最も有用である。ヒトのメサンギウム増殖性糸球体腎炎ではフィブロネクチンが非常に増加するので、治療の有効性および更なる投与の必要性を決定するために、標準的な臨床法を用いてフィブロネクチンを監視することができる（Ｏｏｍｕｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｓ  Ａ  Ｐａｔｈｏｌ  Ａｎａｔ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏ  ４１５：１５１（１９８９）；Ｃｏｕｒｔｏｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ    Ｂｉｏｌ  ８７：６９１（１９８０）；Ｃｏｕｒｔｏｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｈｅｍ  ３０：８７４（１９８２）；Ｂｏｒｄｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ３４：４１９（１９８８））。安定したフィブロネクチンは、有効なヒトの治療法であることを示すが、一方、フィブロネクチンレベルの上昇は、病気が進行していることを示す。
【０１５０】
（実施例９）
（肺への適用）
（肺線維症のマウスモデルの利用）
肺線維症のマウスモデルがＳｈｉｍｉｚｕｋａｗａによって開示されており（Ｓｈｉｍｉｚｕｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４：Ｌ５２６（２００３）；Ｓｗｉｄｅｒｓｋｉ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５２：８２１（１９９８）、両文献とも全文が参照されて本明細書に組み込まれる）、このモデルは、ヒトの特発性肺線維症の症状と発病機序を模倣すると考えられている。このマウスモデルにおける治療的介入の成功は、ヒトの肺線維症において使用するための治療的介入療法の成功に比例すると提唱されている（Ｓｗｉｄｅｒｓｋｉ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５２：８２１（１９９８）；Ｏｎｕｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１４７（２００１）、両文献とも全文が参照されて本明細書に組み込まれる）。
【０１５１】
この従来からのモデルによって、マウスにおいて肺線維症を誘発した後、治療薬を送達する。そして、肺線維症の進行を調べて、該治療薬の有効性レベルを判定する。肺線維症は、１２週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｌの食塩水中０．７５ｍｇの塩素酸ブレオマイシンを１日おきに７日間腹腔内に点滴して誘発する。２．５％のトリブロモエタノールによる麻酔下で気管の中に直接注射する気管内経路によるか、２９ゲージ針で頸静脈に注射する静脈内経路によって治療薬を送達する。１ヶ月後、動物を殺処理して、肺に１０％の緩衝ホルマリンを気管から注入し、室温で１６時間固定した。ＨＰＬＣによってヒドロキシプロリン含量について肺を分析するか、パラフィンに包埋して、ヘマトキシリン、エオシンおよびエラスチカ−マッソン染色した切片を調製する。有効量の治療薬で処理した動物では、陽性対照と比較してヒドロキシプロリン含量が低下することが発見され、また、組織学的分析によって、有効量の治療薬で処理した動物の胸膜下領域では、陽性対照と比較して、線維増殖が低下し、ミクロハニカム様病斑の減少することが示される。
【０１５２】
ＤＮＡを担持するウイルスベクターの静脈内投与が、肺における発現をもたらすことが実証されている（Ｂｏｒｄｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６１（１９９２）が、実質的な発現は、気管内投与によって実証されているだけである（Ｓｈｉｍｉｚｕｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４：Ｌ５２６（２００３））。滅菌食塩水に溶解したウイルスを麻酔下で直接気管注射することが、最も良い結果をもたらすと期待される。というのは、これが、肺にウイルス遺伝子を送達するマウスモデルにおいて有効であることが実証された投与方法であるからである。既に検討したように、ＡＡＶは細胞媒介性免疫を活性化せず、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入でき、長期にわたる発現を行わせることができ、また、同時感染するヘルパーウイルスが存在しないと複製できないため、ヒトの疾患を治療するためには、組換えアデノ関連ウイルスが最も魅力的なベクターである。ヒト患者の肺において所望のタンパク質を治療上有効な発現を達成するために適当なヒトへの投薬量は、マウスの最適な投薬量から推定することができ、気管内経路で投与する場合、３０μｌの滅菌食塩水中１０９感染単位であることが分かっている（Ｓｈｉｍｉｚｕｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４：Ｌ５２６（２００３））。ヒトの肺は、マウスの肺の量の約５０００倍であるから、直接気管内に注射して投与する場合、適当な出発投薬量は約５×１０１２感染単位である。ヒト治療法の有効性を判定するために、ヒト肺にＸ線またはＣＡＴ走査を行って、異常な瘢痕形成を判定することができるが、ヒトにおける肺線維症の進行を測定するのに好適な可視化プロトコールはＨＲＣＴである（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １６５：７３１（１９８７））。病気の安定化が有効な治療法であることを示すが、進行すれば、該薬剤の追加投与が必要であることを示す。
【０１５３】
（実施例１０）
（心臓血管への適用：心筋線維症のラットモデルの利用）
心筋線維症のラットモデルがＫｕｗａｈａｒａと同僚によって記載されており（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：１３０（２００２）、全文が参照されて本明細書に組み込まれる）、このモデルは、ヒトの拡張性心臓機能障害および最終的には心不全を反映すると考えられている。このラットモデルにおける治療の成功は、ヒト患者に対する治療的介入の成功を示すと考えられている。このモデルでは、心筋線維症をラットで誘発してから、治療薬を送達する。そして、心筋線維症の進行を調べて、スクリーニングするか、投薬量を決定すべき治療薬の有効性のレベルを判定する。平均動脈圧の上昇を、オスの８週齢のＷｉｓｔａｒラットを、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）麻酔下で副腎腹大動脈狭窄することによって誘導する。左心室の肥大は、動脈狭窄してから７日後に試験動物において次第に増加するはずである。ラットに、骨格筋の中への静脈内注射によるか、冠動脈内投与によって治療薬を提供する。心筋線維症、Ｉ型およびＩＩＩ型のコラーゲンの誘導、および線維芽細胞および筋線維芽細胞の増殖が、有効な治療薬を投与されていない動物では観察されたが、有効な治療薬を投与された動物では観察されない。超音波心臓検査および血流力学による研究をさらに利用して、治療薬の有効性を調べることができる。
【０１５４】
成人の筋細胞に遺伝子がインビボで送達されることが、プラスミドＤＮＡの注射によって実証されているが、形質導入および発現の効率が低いことにより制約を受ける（Ｌｉｎ，  Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：２２１７（１９９０））。アデノウイルスによる、ＤＮＡのウイルス送達が齧歯類で成功したことが示されており、１０〜５０倍高い発現レベルでの発現は１ヶ月までは続くがその後は低いレベルになる（Ｇｕｚｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ７３：１２０２（１９９３）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９０：１１４９８（１９９３））。治療法としてヒトの心臓に遺伝子を送達する好適な方法であって、齧歯類の心臓において示された成功に由来する方法は、直接的な冠動脈内投与である（（Ｇｕｚｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ７３：１２０２（１９９３））。アデノ関連ウイルスが好適な送達ベクターである。なぜなら、長期間にわたる発現をもたらすが、顕著な細胞媒介型免疫反応はもたらさないからである（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  １０：２９（１９９９）；Ｃｈｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｔｈｏｒ  Ｃａｒｄ  Ｓｕｒｇ  １２６：６７１（２００３））。ウイルスの心臓への送達が、直接的な筋肉内注射によって、また、冠動脈へのウイルスの注入によって実証されている（Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：１４５（１９９６））。ＤＮＡのウイルスによるヒトへの送達は、以下の心筋注射によって行われている。心筋の病変領域内の１〜１．５ｃｍずつ離れた部位に１０回注射をするが、各注射液は、１００μｌの滅菌食塩水に溶解させた４×１０８から４×１０１２感染単位からなる（Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：４６８（１９９９））。したがって、治療の好適な方法は、Ｒｏｓｅｎｇａｒｔによって述べられて居るとおりであり、本発明らの興味の対象である遺伝子（例えば、ＡＨＳＧをコードする遺伝子など）を担持するＡＡＶベクターを利用する。治療の成功の判定は、従来から理解されているとおり、心筋線維症のヒト用臨床マーカーによる。
【０１５５】
（実施例１１）
（ＡＨＳＧは、治療法として提供される場合、癌細胞の増殖を抑制する）
治療法が癌細胞の増殖を阻害できるかを判定するのに適したモデルは、皮下注射されたルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を投与されたＣ５７ＢＬマウスに試験すべき治療法を提供し、次に、生じた腫瘍の成長を長時間にわたって測定する（Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ  ７０：２１１（２００４））ためのものである。ＬＬＣ細胞を皮下注射されたＣ５７ＢＬマウスに提供されると腫瘍増殖を阻害する治療法は、ヒトの癌患者を治療するための有望な治療法であると考えられる。
【０１５６】
市販されているｐｃＤＮＡ３ベクターを用いた形質転換によって、ＬＬＣ細胞にＡＨＳＧ  ＤＮＡを提供した。ＡＨＳＧを含むｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧ）の構築は、標準的なＤＮＡ組換え技術を用いて行った。スーパーフェクト（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）試薬を用いて、製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ，ＫＪ  Ｖｅｎｌｏ，オランダ）にしたがい、ＬＬＣ細胞への形質転換効率を上げた。対照として、ＡＨＳＧ  ＤＮＡを含まないｐｃＤＮＡ３ベクターを、ＬＬＣ細胞の対照培養液に形質転換させた。Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬの濃度で２週間使用して、形質転換されたＬＬＣ細胞を選抜した後、クローンを取り出して、培養液の中で展開し、５％ＤＭＳＯ存在下で液体窒素に入れて保存した。ｐｃＤＮＡ３によって形質転換されたＬＬＣ細胞の２個のクローン（Ｃ１とＣ２）を単離し、また、ｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧによって形質転換されたＬＬＣ細胞の２個のクローン（Ａ１とＡ２）も単離した。図９に示すように、ＰＣＲ、その後ゲル電気泳動によって、ＡＨＳＧの発現についてＡ１、Ａ２、Ｃ１およびＣ２クローンを解析した。形質転換されたＬＬＣ細胞からいつもＲＮＡが単離されていることを確認するために、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のＲＴ−ＰＣＲも行った。
【０１５７】
ｐｃＤＮＡ３−ＡＨＳＧによって形質転換された５×１０４個のＬＬＣ細胞（クローンＡ１）を１００μｌのＤ−ＭＥＭに懸濁して、８匹のＣ５７ＢＬマウスの後方部に皮下注射した。対照として、ＡＨＳＧを含まないｐｃＤＮＡ３で形質転換された５×１０４個のＬＬＣ細胞（クローンＣ１）を１００μｌのＤ−ＭＥＭに懸濁して、２匹のＣ５７ＢＬマウスの後方部に皮下注射した。ノギスを使用して、０日目、１０日目、１４日目および２０日目に、注射部位における腫瘍増殖の進行を測定した。０日目、１０日目、１４日目および２０日目の平均腫瘍サイズを図１０に示す。対照マウス（ｐｃＤＮＡ３は含むがＡＨＳＧを含まない）の２０日目における平均腫瘍サイズは、図１１に示すように、１２．１５ｍｍ＋／−０．１５ｍｍであった。ｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧによって形質転換されたＬＬＣ細胞を投与されたマウスの２０日目における平均腫瘍サイズは、図１１に示すように、１２．６ｍｍ＋／−２．６ｍｍであった。これらの結果は、ＡＨＳＧが、癌を治療するために治療上有用であることを示している。
【０１５８】
上記開示には、本発明のさまざまな実施態様が記載および具体的に説明されているが、本発明は、当然ながら、これらの具体的な実施態様に制限されるものではない。多くの変更および修正がすでに当業者に想到されよう。本発明の範囲の完全に画定するには、添付の請求の範囲を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】リンパ球またはリンパ球由来細胞株による３［Ｈ］‐チミジンの取込みに対するヒトＡＨＳＧの拮抗効果を示す。細胞増殖に対するＴＧＦ‐βの効果がＤＮＡ合成に反映されるものとして、その効果を細胞内の３［Ｈ］‐取り込みを用いて測定した。ＳＲ‐αプロモーターによって作動される、ヒトＡＨＳＧｃＤＮＡを含むｐＳＲα‐ＡＨＳＧプラスミドを、後述する標準的な形質移入法を用いて、目的とする細胞（パネルＡ、Ｂ、およびＣ；それぞれ、ヒトＣＤ８＋細胞株であるＴ８‐ＩＩＭ、末梢血由来のヒトＣＤ８＋リンパ球、およびマウスの全リンパ球）に導入した。ＤＮＡに取り込まれた３［Ｈ］‐チミジンの相対量を検出し、一定量のタンパク質に対して発現させた。ＡＨＳＧを運搬するベクターまたは空のベクターによって形質転換された細胞を、対照用培地またはＴＧＦ−βを含む培地に曝露した。
【図２】異なった細胞における、ＡＡＶを用いたＡＨＳＧの遺伝子導入の効果を示す。ここで、パネルＡは、ＡＨＳＧが、ヒトのＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔにおいてＴＧＦ−βの増殖抑制作用を阻止できることを示している。細胞にＡＡＶ−ｌａｃＺ（斜線つきの棒）またはＡＡＶ−ＡＨＳＧ（影つき棒）に感染させてから、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで処理した。パネルＢは、マウスの全リンパ球についての同様の実験を示す。パネルＣは、回収前にＡＡＶ−ＡＨＳＧによって形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＡＨＳＧ・ＲＮＡの長期発現を示すデータを含んでいる。ＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＨＳＧ・ｍＲＮＡの相対量を検出し、その結果、ＡＡＶ−ＡＨＳＧに感染した後３０日まで持続発現することが示された。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を内部対照として用いた。パネルＤは、ＬａｃＺの発現を、酵素活性を用いて調べたところ、同様の挙動が示されることを示している。
【図３】腫瘍をもつマウス由来のマウスＣＤ８＋細胞を用いた、ＡＡＶ−ＡＨＳＧによる細胞障害性活性の誘導を示す。パネルＡは、ＬＬＣ細胞を標的として、ＡＡＶ−ＡＨＳＧまたはＡＡＶ−ｌａｃＺに感染させたリンパ球の細胞障害性活性を示す。リンパ球がＬＬＣ１細胞を溶解する能力を、さまざまなエフェクター「Ｅ」対標的「Ｔ」の比率の下で測定した。リンパ球に感染させるため用いたＡＡＶのＭ．Ｏ．Ｉは１であった。ＬＬＣ１細胞からのＬＤＨの放出を細胞障害性のマーカーとして利用した。パネルＢは、Ｍ．Ｏ．Ｉ．を増加させると、固定したＥ／Ｔ比においてより効果的な溶解をもたらすことができることを示している。リンパ球の感染に使用したウイルス量に対して細胞障害性を測定した。ウイルスの量が増加すると、同じＥ／Ｔ比でより高い溶解がもたらされた。パネルＣは、高くなった細胞障害性活性がＬＬＣ１に対して特異的であるが、Ｂ１６−Ｆ１０細胞には特異的でないことを示している。リンパ球は、この実験でマウスに注射されたＬＬＣ１から単離された。Ｍ．Ｏ．Ｉは１、およびＥ／Ｔは２．５であった。
【図４】インビボモデルにおける細胞障害性を示す。パネルＡは、ＬＬＣ１と、ＬＬＣ１を有するマウスのリンパ球を混合して、マウスの肩胛骨内領域に注射したことを示している。パネルＢは、マウスの肩胛骨内領域にＬＬＣ１細胞を注射してから、ＬＬＣ１細胞を有するマウスからリンパ球を単離したことを示している。尾静脈に注射する前に、これらの細胞をＡＡＶ−ＡＨＳＧまたはＡＡＶ−ｌａｃＺに感染させた。パネルＣは、パネルＡに示した計画を用いて動物に注射して生じさせた腫瘍を示す。２頭のマウスで腫瘍がないことに注意されたい。パネルＤは、ＬＬＣ１と、ＡＡＶ−ｌａｃＺ（左側パネル）またはＡＡＶ−ＡＨＳＧ（右側パネル）を発現するリンパ球を注射したマウス由来の腫瘍の組織学的特徴を示している。
【図５】ｐＳＲα−ＡＨＳＧプラスミドの概要マップ図を示す。
【図６】ｐＡＶＶ−ＡＨＳＧプラスミドの概要マップ図を示す。
【図７】ＡＨＳＧ発現ベクターによって形質転換されたＬＬＣ細胞の表面における相対的カテプシンＢ活性を示す。
【図８】細胞周辺のカテプシンＢの活性に対する部分精製ＡＧＳＴの効果を示す。
【図９】クローンＡ１、Ａ２、Ｃ１およびＣ２からのＡＨＳＧおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を示すＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル図を示す。
【図１０】ｐｃＤＮＡ３（対照）またはｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧ（ＡＨＳＧ−ＬＬＣ）のどちらかを含むＬＬＣ細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬマウスにおける腫瘍増殖の時間依存性を示すグラフを示す。
【図１１】ｐｃＤＮＡ３（対照）またはｐｃＤＮＡ−ＡＨＳＧ（ＡＨＳＧ−ＬＬＣ）のどちらかを含むＬＬＣ細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬマウスにおける２０日目の腫瘍の大きさを示すグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2007528862.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月17日(2006.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一個体の腫瘍を有する動物から単離されたリンパ球を含有する、癌に罹患する患者を処置するための組成物であって、該リンパ球が、ＴＧＦ−βアンタゴニストを発現するように改変され、投与のために治療有効量で処方される、組成物。
【請求項２】
前記腫瘍を有する動物が前記患者と同一であり、前記改変が、ＡＨＳＧを発現し得るＤＮＡを導入する工程によって前記リンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記形質転換する工程が、アデノ関連ウイルスベクターの使用を介して前記ＤＮＡを導入する工程を包含する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、静脈内、体液内、筋肉内、または皮下に注入するために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
癌に罹患する患者を処置するための組成物であって、以下：
該患者から単離されたリンパ球を含有し、ここで、
該単離されたリンパ球が改変され、それによって該リンパ球がＡＨＳＧタンパク質を発現し得；そして該組成物が投与のために処方される、
組成物。
【請求項６】
前記組成物が、静脈内、体液内、筋肉内、または皮下に注入するために処方される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記改変する工程が、ＡＨＳＧをコードするＤＮＡで前記単離されたリンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記リンパ球が、ＣＤ８発現リンパ球に富む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記改変リンパ球が、薬学的に受容可能なキャリアに懸濁されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記形質転換工程が、前記単離されたリンパ球を、ＡＨＳＧをコードするＤＮＡを含むＡＡＶベクターと接触させる工程を包含する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
リンパ球の免疫学的能力を高めるためのインビトロの方法であって、ＡＨＳＧを発現するように該リンパ球を改変する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記改変する工程が、ＡＨＳＧをコードする核酸を使って前記リンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、さらに、非ヒト動物から前記リンパ球を単離する工程、および、前記改変する工程の後に、該リンパ球を同一の動物または別の非ヒト動物に再導入する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＦ−βの存在に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者を処置するための組成物であって、治療上有効な量の薬剤を含有し、該薬剤は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ−βレセプターとのＴＧＦ−βの結合を遮断する工程によってＴＧＦ−βを遮断する薬剤である、組成物。
【請求項１５】
前記疾患または医学的状態が、癌、移植、自己免疫疾患、創傷治癒、瘢痕形成、および、前記患者の１種以上の組織に影響を与える炎症から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１種以上の組織が、眼、腎臓、肝臓、腺、心血管、肺、および心筋からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記薬剤が、ＴＧＦ−βレセプターに対する該薬剤の競合的な結合によってＴＧＦ−βを遮断する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記薬剤が、その核酸の作用を通じて発現される場合、ＴＧＦ−βの活性を遮断する生物活性化合物をコードする核酸を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸がＡＨＳＧをコードする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記薬剤がＡＨＳＧである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化合物がＡＨＳＧである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
ＴＧＦ−βの存在に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者を処置するための組成物であって、治療上有効な量のリンパ球を含有し、該リンパ球は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ−βレセプターとのＴＧＦ−βの結合を遮断する工程によってＴＧＦ−βを遮断する因子を発現し得るリンパ球である、組成物。
【請求項２３】
前記リンパ球が、前記因子をコードする核酸を該リンパ球に導入する工程によって改変されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸がＡＨＳＧをコードする、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リンパ球が、インビボ遺伝子治療によって改変されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記リンパ球が、エキソビボ遺伝子治療によって改変されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記核酸が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記核酸が、ウイルスベクターをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記核酸が、ＡＨＳＧをコードする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶを含む、請求項２８に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月26日(2007.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一個体の腫瘍を有する動物から単離されたリンパ球を含有する、癌に罹患する患者を処置するための組成物であって、該リンパ球が、ＴＧＦ−βアンタゴニストを発現するように改変され、投与のために治療有効量で処方される、組成物。
【請求項２】
前記腫瘍を有する動物が前記患者と同一であり、前記改変が、ＡＨＳＧを発現し得るＤＮＡを導入する工程によって前記リンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記形質転換する工程が、アデノ関連ウイルスベクターの使用を介して前記ＤＮＡを導入する工程を包含する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、静脈内、体液内、筋肉内、または皮下に注入するために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
癌に罹患する患者を処置するための組成物であって、以下：
該患者から単離されたリンパ球を含有し、ここで、
該単離されたリンパ球が改変され、それによって該リンパ球がＡＨＳＧタンパク質を発現し得；そして該組成物が投与のために処方される、
組成物。
【請求項６】
前記組成物が、静脈内、体液内、筋肉内、または皮下に注入するために処方される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記改変する工程が、ＡＨＳＧをコードするＤＮＡで前記単離されたリンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記リンパ球が、ＣＤ８発現リンパ球に富む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記改変リンパ球が、薬学的に受容可能なキャリアに懸濁されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記形質転換工程が、前記単離されたリンパ球を、ＡＨＳＧをコードするＤＮＡを含むＡＡＶベクターと接触させる工程を包含する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
リンパ球の免疫学的能力を高めるためのインビトロの方法であって、ＡＨＳＧを発現するように該リンパ球を改変する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記改変する工程が、ＡＨＳＧをコードする核酸を使って前記リンパ球を形質転換する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、さらに、非ヒト動物から前記リンパ球を単離する工程、および、前記改変する工程の後に、該リンパ球を同一の動物または別の非ヒト動物に再導入する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＦ−βの存在に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者を処置するための組成物であって、治療上有効な量の薬剤を含有し、該薬剤は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ−βレセプターとのＴＧＦ−βの結合を遮断する工程によってＴＧＦ−βを遮断する薬剤である、組成物。
【請求項１５】
前記疾患または医学的状態が、癌、移植、自己免疫疾患、創傷治癒、瘢痕形成、および、前記患者の１種以上の組織に影響を与える炎症から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１種以上の組織が、眼、腎臓、肝臓、腺、心血管、肺、および心筋からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記薬剤が、ＴＧＦ−βレセプターに対する該薬剤の競合的な結合によってＴＧＦ−βを遮断する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記薬剤が、その核酸の作用を通じて発現される場合、ＴＧＦ−βの活性を遮断する生物活性化合物をコードする核酸を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸がＡＨＳＧをコードする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記薬剤がＡＨＳＧである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化合物がＡＨＳＧである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
ＴＧＦ−βの存在に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者を処置するための組成物であって、治療上有効な量のリンパ球を含有し、該リンパ球は、カテプシンＢの活性を阻害し、かつＴＧＦ−βレセプターとのＴＧＦ−βの結合を遮断する工程によってＴＧＦ−βを遮断する因子を発現し得るリンパ球である、組成物。
【請求項２３】
前記リンパ球が、前記因子をコードする核酸を該リンパ球に導入する工程によって改変されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸がＡＨＳＧをコードする、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リンパ球が、インビボ遺伝子治療によって改変されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記リンパ球が、エキソビボ遺伝子治療によって改変されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記核酸が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記核酸が、ウイルスベクターをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記核酸が、ＡＨＳＧをコードする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
眼を冒す疾患または医学的状態を処置するための薬学的組成物の製造のための、ＡＨＳＧタンパク質、またはＡＨＳＧタンパク質をコードする核酸の組成物。
【請求項３２】
前記ＡＨＳＧをコードする核酸が、ベクターをさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＡＨＳＧをコードする核酸が、ウイルスベクターをさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスまたはアデノウイルスを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ４サブタイプまたはＡＡＶ５サブタイプを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記薬学的組成物が、局所投与、眼内投与、または眼への注射に適合している、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記眼を冒す疾患または医学的状態が、眼の創傷治癒、瘢痕形成、炎症、自己免疫疾患を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記眼を冒す疾患または医学的状態が、緑内障または白内障を含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記眼の自己免疫疾患が、自己免疫性ブドウ膜炎である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ＡＨＳＧを発現するように改変された、単離されたリンパ球。
【請求項４２】
ＡＨＳＧをコードするポリヌクレオチドを含む、アデノ関連ベクター。
【国際調査報告】
2007528862.tif 000014
2007528862.tif 000015
2007528862.tif 000016
2007528862.tif 000017
2007528862.tif 000018
2007528862.tif 000019