(57)【要約】  本発明は、ＥＶ７９と呼ばれる新規エンテロウイルス種、ならびに前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および類似体を提供する。単離または組換え抗体等の、ＥＶ７９に特異的に結合可能な蛋白性分子もまたここで提供される。本発明のウイルスおよび／または蛋白性分子は、ＥＶ７９関連病の診断に特に適している。前記ウイルスまたは蛋白性分子を含むワクチン、医薬組成物および診断キットもまた、前記ウイルスまたは蛋白性分子を生成する方法とともに提供される。本発明の診断キットはＥＶ７９の遺伝子またはその一部を、増幅および／またはハイブリッド形成することが可能なプライマ／プローブを含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１９および／または図２ｂに示される配列を含む、単離および／または組換え核酸またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸に対して少なくとも７０％相同である単離および／または組換え核酸。
【請求項３】
請求項１記載の核酸に対して少なくとも９５％相同である単離および／または組換え核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の１００の連続したヌクレオチドの伸張を含む単離および／または組換え核酸。
【請求項５】
図２０、表１０、表１１または図３に示される配列を含む単離および／または組換え蛋白性分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項６】
請求項５に記載の蛋白性分子に対して少なくとも８０％相同である単離および／または組換え蛋白性分子。
【請求項７】
請求項５に記載の蛋白性分子に対して少なくとも９５％相同である単離および／または組換え蛋白性分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の蛋白性分子の少なくとも３０の連続したアミノ酸の伸張を含む単離および／または組換え蛋白性分子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の核酸配列を含む単離または組換えウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子を含む単離または組換えウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項１２】
ＥＶ７９関連病を誘導することが可能な、請求項１０または１１に記載の、単離または組換えウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体。
【請求項１３】
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクタ。
【請求項１４】
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸に対して特異的にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１５】
請求項８または９に記載のプライマおよび／またはプローブであって、厳しい条件下で、前記核酸にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のプライマおよび／またはプローブであって、図１９および／もしくは図２ｂまたは、表４に示される配列を含むプライマおよび／もしくはプローブ。
【請求項１７】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子に特異的に結合可能な単離結合分子、および／または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離もしくは組換えウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸配列に特異的に結合可能な単離結合分子。
【請求項１９】
図１９および／または図３に示される核酸配列の少なくとも一部に特異的に結合可能な単離結合分子。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離結合分子であって、蛋白性分子である単離結合分子。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子の生成方法であって、
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体に結合可能な分子、または、請求項５〜８のいずれか１項に記載の、単離および／もしくは組換え蛋白性分子を生成することと、
前記ウイルスおよびまたは蛋白性分子に特異的な蛋白性結合分子を選択することとを含む方法。
【請求項２２】
単離または組換えウイルスであって、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の分子と免疫反応する単離または組換えウイルス。
【請求項２３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用であって、試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出する使用。
【請求項２４】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の、単離および／または組換え蛋白性分子の使用であって、試料中の、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体に特異的に結合可能な結合分子を検出する使用。
【請求項２５】
請求項２４記載の使用であって、前記結合分子は前記ウイルスに特異的な配位子よび／または抗体を含む使用。
【請求項２６】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマおよび／もしくはプローブ、
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、ならびに／または、
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の、核酸、または機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用であって、
試料中のＥＶ７９エンテロウイルスを検出および／または同定する使用。
【請求項２７】
請求項２６記載の使用であって、前記核酸は図１９および／または図３に示される配列を含む使用。
【請求項２８】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体を含むワクチン。
【請求項２９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子を含むワクチン。
【請求項３０】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を含むワクチン。
【請求項３１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を含む医薬。
【請求項３２】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用であって、エンテロウイルス関連病に対するワクチンを調製する使用。
【請求項３３】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子の使用であって、エンテロウイルス関連病に対するワクチンを調製する使用。
【請求項３４】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子の使用であって、エンテロウイルス関連病に対するワクチンを調製する使用。
【請求項３５】
試料中のエンテロウイルスを検出する方法であって、
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、または、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の、プライマおよび／もしくはプローブが使用されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
エンテロウイルスに対する結合分子を検出する方法であって、
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルス、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子が使用されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の方法であって、エンテロウイルス関連病を診断する方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の使用であって、前記エンテロウイルス関連病はＥＶ７９エンテロウイルス関連病を含む使用。
【請求項３９】
試料中の、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法であって、
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマおよび／またはプローブを用いて、前記ウイルス、または、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸を、ハイブリッド形成および／または増幅することと、
ハイブリッド形成および／または増幅した生成物を検出することとを含む方法。
【請求項４０】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルス、または機能的部分、誘導体もしくは類似体、
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、および／または
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマ／プローブを含む診断キット。
【請求項４１】
ＥＶ７９エンテロウイルス関連病に罹患している、または罹患している危険にあるヒトを治療する方法であって、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の、ワクチンまたは医薬を前記ヒトに投与することを含む方法。
【請求項４２】
ヒトがＥＶ７９エンテロウイルス関連病に罹患しているか否か判定する方法であって、
前記ヒトから試料を得ることと、
前記試料中の、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ＥＶ７９エンテロウイルス、または、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む方法。
【請求項４３】
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１３記載のベクタを含む細胞。
【請求項４４】
請求項４３記載の細胞であって、ＥＶ７９の発現可能なコード領域、または３０の連続したアミノ酸の伸張を含む前記コード領域の一部、または、前記コード領域および／もしくはその一部の、機能的誘導体および／もしくは類似体を含む細胞。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載の細胞であって、前記細胞は真核細胞である細胞。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載の細胞であって、前記細胞は原核細胞である細胞。
【請求項４７】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白性分子であって、２Ａおよび／または３Ｃプロテアーゼをコードする蛋白性分子。
【請求項４８】
化合物が、ウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害することが可能か否かを判定する方法であって、前記プロテアーゼは請求項４７記載の、プロテアーゼ、または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体であることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７記載のウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物。
【請求項５０】
請求項４９記載の化合物であって、前記化合物は、アミノ酸配列ＱＴＡＩＬＱまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む化合物。
【請求項５１】
エンテロウイルス感染症に罹患しているヒト、または罹患している危険にあるヒトの治療のための医薬であって、
前記エンテロウイルスは請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の核酸配列を含み、
前記医薬はウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む医薬。
【請求項５２】
推定３Ｃ開裂前部位のＮ−末端に位置する任意のヘキサペプチドの使用であって、医薬を調製し、エンテロウイルス感染症に罹患しているヒト、または罹患している危険にあるヒトを治療し、前記エンテロウイルスは請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の配列を含む使用。
【請求項５３】
請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の配列を含む遺伝子運搬媒介物。
【請求項５４】
請求項５３記載の遺伝子運搬媒介物であって、前記ベクタは請求項１〜４および９のいずれか１項に記載の核酸に基づく遺伝子運搬媒介物。
【請求項５５】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項５６】
図１９に示される核酸中、１〜７４８位にある配列、または、このような配列の、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むポリシストロニックメッセンジャＲＮＡ。
【請求項５７】
請求項２９記載のワクチンであって、図２０に示される配列を有する、ＶＰ１，ＶＰ２またはＶＰ３蛋白質の少なくとも免疫反応部分を含むワクチン。
【請求項５８】
請求項５７記載のワクチンであって、前記部分は図２０からの配列、または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むワクチン。
【請求項５９】
図１９に示される配列の少なくとも１０００ヌクレオチド、および別のエンテロウイルスの少なくとも１０００ヌクレオチドを含むキメラエンテロウイルスであって、
前記後者の１０００ヌクレオチドは、図１９に示される配列と５％以上配列が異なる配列を含むキメラエンテロウイルス。
【請求項６０】
ＥＶ７９感染症に罹患している、または罹患している危険にある対象を治療するための方法であって、
ケトン含有グルタミン類似体（たとえばアザグルタミン）と、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）等の一酸化窒素（ＮＯ）−遊離化合物と、ニトログリセリン（ＧＴＮ）と、硝酸イソソルビド（ＩＳＤＮ）またはグリセリジンと、５−（３，４−ジクロロフェニル）メチルヒダントインと、ビニル性エチルエステル（ＡＧ７０８８，下記の構造式１を有している）とを含むペプチドから成るグループから選択された化合物を、前記対象に投与することを含む方法。
【化１】
2007513604.tif 000015
プレコナリル、３−メチルチオ−５−アリル−４−イソチアゾールカルボニトリルまたはピリジルイミダゾリジノン等のいわゆるＷＩＮ化合物、リバビリン、ミコフェノール酸、６−アザウリジンまたはピラゾフリン等のヌクレオチド類似体、あるいは３−メチルケンペロール等のＲＮＡ合成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関連する。本発明は特に新規エンテロウイルスの単離ならびに前記エンテロウイルスの検出、同定、診断、治療および予防の方法に関連する。
【０００２】
ウイルスの最新の分類によれば、ピコルナウイルス科は６つの属に分類される。６つの属とは、ヒトエンテロウイルス、ライノウイルス、パレコウイルス、アフターウイルス、カルジオウイルスおよびヘパトウイルスである。エンテロウイルス属には以下のヒトウイルス種、すなわちポリオウイルスおよびヒトエンテロ族Ａ〜Ｄが含まれる。ポリオウイルス（ＰＶ）は３つの抗原型、すなわちポリオウイルス１（ＰＶ−１），ＰＶ−２およびＰＶ−３から成る。ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）は１２の抗原型から成り、コクサッキーウイルスＡ２，Ａ１６およびエンテロウイルス７１（これらのウイルス株に関しては表１に、より詳細に挙げられている）を含む。ヒトエンテロウイルスＢ（ＨＥＶ−Ｂ）は３７の抗原型でから成り、ヒトエンテロウイルスＣ（ＨＥＶ−Ｃ）は１１の抗原型から成り、ヒトエンテロウイルスＤ（ＨＥＶ−Ｄ）は２つの抗原型から成る。エンテロウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスである。そのゲノムはおよそ７５００ｎｔを含む。
【０００３】
エンテロウイルスは、微熱から呼吸器系感染症、髄膜炎、脳炎、麻痺性灰白髄炎、心筋炎まで、広範な臨床症候を引き起こす。アメリカでは、年間推定１千万〜３千万のエンテロウイルス感染が生じており、深刻な短期間の拡散および経済的影響を引き起こしている。生命にかかわるエンテロウイルス感染は、特に免疫不全の患者等の、危険性の高いヒトに起こり得る。
【０００４】
したがって、エンテロウイルスは広範な臨床症状を引き起こす。エンテロウイルス感染により、下痢および熱などの「一般的な」症状が出ることが多いが、その「一般的な」症状は、多くの別の種類の病気にも含まれる。したがって、エンテロウイルス感染の症状は、エンテロウイルス属関連病に直接関連付けることができない。したがって、適切な治療をするために、病原因子の特定が必要とされることが多い。病原因子が分かれば、有効な診断、予防、および／または治療が可能になる。
【０００５】
新規に発見されたエンテロウイルス（ＥＶ７９と表す）が特定され、配列が決定された。典型ＥＶ７９の核酸配列が図１９に与えられており、その一部が図２ｂに与えられている。したがって、１つの特徴において、本発明は、図１９および／または表図２ｂに示される配列を含む、単離および／または組換え核酸または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を提供する。ＥＶ７９ウイルスはその典型によって特定されるが、典型ＥＶ７９ウイルスの多くの自然変異体が存在する。ＲＮＡウイルスに関してこのような自然変異が存在することは通常のことであり、ＲＮＡウイルスには、たとえば、ゲノムを複製するポリメラーゼによる誤りの導入によって、頻繁に突然変異が起こっている。したがって、わずかに相異のある核酸配列を有するＥＶ７９ウイルスもまた本発明によって提供される。このようなウイルスは典型核酸配列を有する核酸の誘導体であるとみなされる。変異は必ずしも自然変異でなくてもよい。組換え方法によって変異体を生成することは当然可能である。たとえば、ウイルスの大部分は、ヌクレオチド置換によって変更され、特定のアミノ酸に対するトリプレット遺伝子コードにおける余分量を使用する。したがって、コード蛋白質のアミノ酸配列を変更しなくてよい。しかしながら、アミノ酸の変更でさえ、ウイルスの複製能力およびコード能力に影響を与えることなく、一般的に導入可能である。たとえば、保守的なアミノ酸置換は、許容されることが多い。典型ウイルスにおける変更は、ウイルスの複製能力を変えることなく、核酸配列の７０％まで可能である。したがって、一実施形態において、本発明は、典型ＥＶ７９の核酸に対して少なくとも７０パーセント相同である、単離および／または組換え核酸を提供する。しかしながら、大部分の生存可能な変異体は、典型ＥＶ７９に従う核酸に少なくとも９５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９９パーセント相同である。このため、ＵＴＲ領域における異種エンテロウイルス間の相同性は通常高く、本出願における相同性はＵＴＲ領域外の領域、好ましくは蛋白質コード領域において測定されている。したがって、本発明は、ＥＶ７９ウイルスの誘導体を提供し、図２０、図３、表１０または表１１に示される少なくとも１種の蛋白質コード領域において、（核酸レベルまたは蛋白質レベルで）少なくとも９５％の相同性および好ましくは少なくとも９９％の相同性を有している。ウイルスの核酸またはその部分は複製され、プローブとして用いられ、試料中のウイルスを検出する。したがって、さらに本発明は、単離および／または組換え核酸を提供し、単離および／または組換え核酸は、典型ウイルスの核酸の１００の連続したヌクレオチドの伸張または前記１００の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９５％および好ましくは９９％相同である領域を含み、前記１００ヌクレオチドはＵＴＲ領域外である。好ましい実施形態においては、該部分は、実質的にＵＴＲ領域と重なっていない。好ましい実施形態においては、前記部分は蛋白質コード領域中にある。１００の連続したヌクレオチドの伸張は、本発明のウイルスの機能的部分であるとみなされる。ＥＶ７９の好ましい部分は、図２０、表１０、表１１および図３に示される蛋白質をコードする核酸である。さらに、ＥＶ７９または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸を含むバクテリアベクタが提供される。さらに前記バクテリアベクタを含むバクテリアが提供される。他の既知のエンテロウイルスとの相異を考慮して、ＥＶ７９またはその一部の配列が使用され、ＥＶ７９に特異的でありしたがってＥＶ７９核酸を特異的に複製することが可能であるプライマを生成する。同様に、厳しい条件下でＥＶ７９核酸に対して特異的にハイブリッド形成するプローブが生成され得る。したがって、本発明はさらにプライマおよび／またはプローブを提供し、ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸に対して特異的にハイブリッド形成することが可能である。好ましくは前記プライマまたはプローブは厳しい条件のもとで、前記核酸に対してハイブリッド形成することが可能である。好ましい実施形態では、前記プライマは図１９に示される１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドの連続した伸張を含む。当業者ならば、ＥＶ７９の核酸に対する核酸の特異的なハイブリッド形成ために必要な条件を決定することは充分可能である。一般的に、特異性は、図１９に示される核酸との重なりの大きさおよび相同性が増加するにつれて増加する。核酸に対して特異的な典型的なプローブは、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む。プローブは実質的にＥＶ７９の全配列を含んでもよい。しかしながら、ＥＶ７９に特異的なプローブは、大きさが２０〜２０００ヌクレオチドであり、図１９に描かれている核酸と少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９９％の相同性を有している。プローブは媒介を経て直接または間接的に標識されてもよい。ＥＶ７９ゲノム全体の配列のためのプライマが生成されてもよい。しかしながら、ＥＶ７９配列（またはその変異体）の特異的な増幅が望まれる場合、好ましくは少なくとも１種のプライマがＵＴＲ領域外で選ばれる。特に好ましい実施形態において、両プライマはＵＴＲ領域外で選ばれる。好ましい実施形態において、プライマは、関連するエンテロウイルスと十分な配列の相異を有し、このようにＥＶ７９配列またはその変異体に対する特異性が保証される。一般的に、その配列と比較して、プライマ中に少なくとも１、好ましくは少なくとも２〜５ヌクレオチドの相異を有することによって達成され、一般的に関連するヒトエンテロウイルスから区別される。
【０００６】
特に好ましい実施形態において、前記プライマおよび／またはプローブは図２ｂまたは表４に示される配列を含む。
【０００７】
典型ウイルスの核酸は種々の蛋白質およびポリ蛋白質をコードする。これらの蛋白質は、たとえば、ウイルスを生成し、または（ポリ）蛋白質をコードする核酸で形質転換された細胞中で発現する。したがって、本発明はさらに単離および／または組換え蛋白性分子を提供し、図２０、表１０、表１１または図３に示される配列または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。必ずしも量においてではなく、質において同じ機能を有する蛋白質の、多くの異なる変異体が、上述のように、天然に存在し、人工的に生成し得る。このように本発明はさらに、上述の蛋白性分子に対して少なくとも７０％相同である単離および／または組換え蛋白性分子を提供する。このような相同な蛋白質は典型によってコードされる蛋白質の誘導体とみなされる。好ましくは、誘導体蛋白質は、典型ＥＶ７９によってコードされる蛋白質と、少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。典型ウイルスによってコードされる蛋白性分子のフラグメントおよび部分は生成されることが可能であり、したがって、このような部分もまた本発明によって提供される。好ましい実施形態において、単離および／または組換え蛋白性分子が提供され、典型ウイルスによってコードされる蛋白性分子の少なくとも３０の連続したアミノ酸の伸張を含む。典型ウイルスによってコードされる蛋白質は遺伝子コードの余分量を使用して種々の異なる核酸配列によってコードされる。したがって、本発明はさらに図２０、表１０、表１１または図３に示される蛋白質をコードする核酸を提供する。
【０００８】
したがって、本発明はさらにＥＶ７９核酸配列または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む単離または組換えウイルスを提供する。図２０、表１０、表１１または図３に示される蛋白性分子を含む単離または組換えウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体が提供される。ＥＶ７９に感染した対象は、多くの異なる臨床症状を表す、および／または無症状である。したがって、ＥＶ７９関連病、特に下痢を引き起こし得る、単離または組換えウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体が提供される。ウイルスはウイルスの物質を特異的に結合可能な特異的結合相手を生成するために使用される物質を含む。たとえば、結合相手は免疫能のある対象へのウイルスの注入によって生成される。免疫付与の結果として対象から得られた血清は、一般的にウイルスまたは、その、抗原性部分、誘導体および／もしくは類似体に特異的な多くの異なる抗体種を含む。特異的結合相手（特異的結合分子）は、当然、多くの種々の異なる技術、たとえばファージ提示技術によって生成される。特異的結合相手を生成する方法はこれに限定されない。結合は一般的に、ウイルスの蛋白性部分に特異的である。しかしながら、ウイルスに含まれる蛋白質の特異的な翻訳後修飾もまた、当然ウイルスに特異的である。したがって、本発明はさらに単離した結合分子を提供し、該結合分子は、ＥＶ７９ウイルスの物質（好ましくは蛋白性分子）を特異的に結合可能で、好ましくは典型ＥＶ７９の核酸によってコードされる蛋白性分子に対して結合可能である。好ましくは、蛋白性分子は、図２０、表１０、表１１または図３に示されるアミノ酸配列または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。結合分子はＥＶ７９、好ましくは図１９または図２ｂの核酸配列を特異的に結合可能である。結合分子は、好ましくは蛋白性分子である。しかしながら、他の結合分子もまた本発明の範囲内である。たとえば、必ずしも量においてではなく、質において、蛋白質と同じ結合性質を有する蛋白様物質または類似体を生成することは可能である。本発明に従った結合分子を生成する方法がさらに提供され、
・ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を結合可能な分子、または、ＥＶ７９の典型核酸によってコードされる単離および／または組換え蛋白性分子を生成すること、および
・前記ウイルスおよび／または蛋白様分子に特異的な蛋白性結合分子を選択することを含む。
【０００９】
他のヒトエンテロウイルスとＥＶ７９ウイルスとの全体的な相同性はあまり高くない。したがってＥＶ７９ウイルスに特異的に結合可能な多くの異なる結合分子が生成され得る。このような結合分子が使用され、試料中のＥＶ７９ウイルスを検出する。したがって本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、該単離または組換えウイルスは、ＥＶ７９ウイルスを特異的に結合可能な結合分子と免疫反応する。同様に、本発明は図２０、表１０、表１１または図３に示される単離および／または組換え蛋白性分子または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用を提供し、試料中のＥＶ７９ウイルスまたは、前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体に特異的に結合可能な結合分子を検出する。逆にＥＶ７９ウイルスが使用され、試料中の前記ウイルスに特異的に結合可能な分子を検出する。
【００１０】
感受性標的細胞へのＥＶ７９ウイルスの結合は、特異的受容体を介して起こる。この受容体は、本発明の結合分子として使用され得る。好ましくは、結合分子は抗体またはその機能的同等物を含む。検出方法が使用され、対象中のＥＶ７９関連病を診断する。一実施形態では、試料中にＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法を提供し、前記ウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸を、ＥＶ７９に特異的なプライマおよび／またはプローブでハイブリッド形成および／または増幅し、ハイブリッド形成および／または増幅された生成物を検出することを含む。さらにキットが提供され、好ましくは、診断キットは、ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明に従う結合分子、および／または本発明に従うＥＶ７９ウイルスに特異的なプライマ／プローブを含む。
【００１１】
特に好ましい実施形態において、ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能なプライマまたはプローブの使用、または、図２０、表１０、表１１または図３に示される蛋白性分子を特異的に結合可能な結合分子、または、ＥＶ７９ウイルスおよび／または核酸または、典型ＥＶ７９の、機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用を提供し、試料中のＥＶ７９エンテロウイルスを検出および／または同定する。好ましくは、前記核酸は図１９または図２ｂに示される配列を含む。
【００１２】
本発明はさらにワクチンを提供し、ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。さらにワクチンが提供され、図２０、表１０、表１１または図３に示される蛋白性分子または、このような蛋白性分子の、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。本発明の蛋白性分子はそれ自身あるいは蛋白質の一部としてまたは、その、誘導体もしくは類似体としてワクチン中に提供されてもよい。適切な類似体とは、ＥＶ７９ウイルス蛋白性分子または、その、機能的分子もしくは誘導体をコードする核酸である。核酸はＤＮＡワクチン方法に使用されてもよく、該方法はまた本発明においても提供される。さらに、少なくとも１種のＥＶ７９蛋白質に対する対象を免疫する組成物が提供され、前記組成物は、ＥＶ７０典型蛋白質あるいはＥＶ７９変異体の蛋白質あるいはＥＶ７９典型の抗原性部分、誘導体および／または類似体の蛋白質を含む。ＤＮＡワクチンの担体のように、標的細胞中でＥＶ７９ウイルス核酸の複製を可能にし、従って与えられる免疫応答の増幅を可能にするウイルスレプリコン中において、発現可能なＥＶ７９ウイルス核酸を組み込むことは適切であることが多い。このようなＤＮＡワクチン方法に特に適しているＥＶ７９ウイルスコード蛋白質は図２０、表１０、表１１または図３に示されるＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３蛋白質または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。ＶＰ蛋白質の一部は、好ましくはＶＰ蛋白質の抗原性部分を含む。
【００１３】
他の適切な候補は、ＶＰ４，２Ａ，２Ｂおよび３Ｃ蛋白質、または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。一般的にワクチンは適切なアジュバントを含む。ワクチン中での使用は別として、記載されたウイルスおよび／または蛋白質分子もまた使用され、対象中においてＥＶ７９特異的免疫応答を生み出し、促進することが可能である。免疫応答は細胞でも体液でも可能である。したがって、単離Ｔ−細胞がさらに提供され、ＥＶ７９ウイルスまたは典型ＥＶ７９ウイルスにコードされる蛋白性分子に特異的なＴ−細胞受容体を含む。さらに、単離Ｂ−細胞が提供され、ＥＶ７９ウイルスに特異的な抗体またはＥＶ７９ウイルスにコードされる蛋白性分子を生成する。抗体またはＴ−細胞受容体は複製され、細胞系は、複製された受容体または抗体をコードする核酸を含む発現カセットを与えられる。したがって、本発明はさらにこのような受容体または抗体を生成する細胞を提供する。このような細胞は好ましくは、ＣＨＯ細胞等の、記載されている蛋白質の大規模な生成に適している細胞である。
【００１４】
ＥＶ７９ウイルスに対する受動免疫を対象に与えることも可能である。このために、対象は本発明のＥＶ７９特異的結合分子を与えられる。このような免疫性が使用され、対象におけるＥＶ７９ウイルスでの（さらなる）感染のための障壁を提供し、さらに、本発明に従うＥＶ７９ウイルス特異的結合分子を含むワクチンが提供される。好ましい実施形態において、受動免疫はヒトまたは本発明のＥＶ７９ウイルスに特異的に結合可能なヒトまたはヒト化抗体によって提供される。好ましくは、抗体はヒト細胞系によって生成され、好ましくは、細胞系はｎアデノウイルスＥ１領域を含み、好ましくは、少なくともアデノウイルス２またはアデノウイルス５のＥ１Ａ領域を含む。障壁は完全でなくても良い。少なくとも結合分子の存在が、対象における他の標的細胞へのウイルスの拡散を減少する。受動免疫は、予防薬として対象に投与されてもよく、ウイルスに曝されたとき、少なくとも対象中のウイルスの拡散を減少させる。または、受動免疫はすでにウイルスに感染した対象に与えられてもよい。後者の場合には、本発明の１種またはそれ以上のＥＶ７９ウイルス特異的結合分子が医薬として使用され、少なくとも対象におけるウイルスの拡散を減少し、従って、少なくとも部分的にウイルス感染に有効である。したがってさらに、本発明は医薬を提供し、本発明に従うＥＶ７９ウイルス特異的結合分子を含む。
【００１５】
さらに、本発明のウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体または、本発明の蛋白性分子または、本発明のＥＶ７９ウイルス特異的結合分子の使用が提供され、エンテロウイルス関連病に対するワクチンを調製する。
【００１６】
さらに、ＥＶ７９関連病に罹患している、または罹患している危険性があるヒトの治療のための方法を提供し、本発明に従うワクチンまたは医薬を前記ヒトに投与することを含む。さらに別の実施形態において、ヒトがＥＶ７９関連病に罹患しているか否かを判定する方法を提供し、前記ヒトから試料を得て、前記試料中のＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することを含む。
【００１７】
さらに別の実施形態において、単離細胞あるいは組換体または細胞系を提供し、ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。好ましくは、前記細胞は霊長類細胞であり、好ましくはサルの細胞である。好ましい実施形態において、前記細胞は本発明のＥＶ７９ウイルスを複製する細胞である。特に好ましい実施形態において、細胞は腎細胞である。細胞が使用され、本発明のＥＶ７９ウイルスを生成し、ＥＶ７９を弱毒化し、病原性を弱める。ウイルスの弱毒化は、記載された好ましい細胞系での継続的な培養の際に自然に起こる。弱毒化したＥＶ７９ウイルスはワクチンとして使用される。
【００１８】
ＥＶ７９ウイルスはプロテアーゼ２Ａおよびプロテアーゼ３Ｃというエンドプロテアーゼをコードする。典型ＥＶ７９ウイルス中の配列は図（２０）に描かれている。プロテアーゼはＥＶ７９にコードされるポリ蛋白質の処理に関して重要である。プロテアーゼ作用は、ここにさらに記載されるようにウイルスプロテアーゼ阻害剤によって少なくとも部分的に阻害される。したがって、本発明はさらに、少なくとも部分的にＥＶ７９ウイルス複製を阻害する化合物を提供する。
【００１９】
これらの化合物のうちで、プロテアーゼ阻害剤が特に好ましい。
２Ａおよび３Ｃ酵素は、Ｐ（１）位でグルタミン残基を有するペプチド基質を認識するので、ケトン含有グルタミン類似体（たとえば、アザグルタミン）は阻害剤として使用される。さらに、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）、ニトログリセリン（ＧＴＮ）、硝酸イソソルビド（ＩＳＤＮ）またはグリセリジン等の一酸化窒素（ＮＯ）−遊離化合物が使用され、３Ｃ活性を阻害する。また、５−（３，４−ジクロロフェニル）メチルヒダントインは、ポリ蛋白質の後翻訳処理を妨害する。
【００２０】
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼ活性を阻害するビニル性エチルエステル（ＡＧ７０８８、下記の構造式１を参照）。
【００２１】
【化１】
2007513604.tif 000002
【００２２】
必ずしも量においてではなく、質において同じ活性を含むプロテアーゼ阻害剤の類似体もまた本発明によって提供される。このような類似体は好ましい配列を有するペプチドを含む化合物を含み、ペプチドは修飾を含む。他の類似体は好ましいアミノ酸配列に似ている蛋白様活性を有する化合物を含む。
【００２３】
エンテロウイルスＲＮＡは捕獲されず、５’末端に共有結合する（３Ｂ遺伝子でコードされている）ＶＰｇという低分子蛋白質を運搬する。いわゆるＷＩＮ化合物はピコルナウイルスのヌクレオキャプシドの疎水性ポケットの中に入っており、ウイルスがそのゲノムＲＮＡを脱殻することを防ぐことが好ましい。好ましい化合物は以下のようなものである。プレコナリル、３−メチルチオ−５−アリール−４−イソチアゾールカルボニトリルまたはピリジルイミダゾリジノン。また、リバビリン、ミコフェノール酸、６−アザウリジンおよびピラゾフリン等のヌクレオチド類似体または３−メチルケンペロール等の他のＲＮＡ合成阻害剤はピコルナウイルスの複製を阻害する。したがって、本発明はさらにＷＩＮ化合物の使用を提供し、ＥＶ７９感染の治療（のための医薬の調製）をする。
【００２４】
本発明はさらに、ＥＶ７９感染症に罹患しているまたは罹患している危険性のある対象を治療するための方法を提供し、ケトン含有グルタミン類似体（たとえばアザグルタミン）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）、ニトログリセリン（ＧＴＮ）、硝酸イソソルビド（ＩＳＤＮ）またはグリセリジン等の一酸化窒素（ＮＯ）−遊離化合物、５−（３，４−ジクロロフェニル）メチルヒダントイン、（ＡＧ７０８８、下記の構造式１を有している）ビニル性エチルエステルを含むペプチドから選択される化合物を、対象に投与することを含む。
【００２５】
【化２】
2007513604.tif 000003
【００２６】
プレコナリル、３−メチルチオ−５−アリール−４−イソチアゾールカルボニトリルまたはピリジルイミダゾリジノン等のいわゆるＷＩＮ化合物あるいはリバビリン、ミコフェノール酸、６−アザウリジン、またはピラゾフリン等のヌクレオチド類似体あるいは３−メチルケンペノール等のＲＮＡ合成阻害剤。
【００２７】
本発明はさらに、ＥＶ７９核酸にコードされる蛋白性分子を提供し、前記蛋白性分子は２Ａもしくは３Ｃプロテアーゼまたはその機能的同等物である。機能的同等物は、１種またはそれ以上の保守的アミノ酸置換を有している蛋白質分解活性部分および／または誘導体を含む。化合物が抗エンテロウイルス活性、好ましくはエンテロウイルスの抗蛋白分解活性を有するか否かを判定するための、多くの技術的に既知の方法がある。したがって、本発明はさらに方法を提供し、抗エンテロウイルス複製活性を化合物が含むか否かを判定し、前記方法はＥＶ７９または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の複製に関与するＥＶ７９ウイルスまたはＥＶ−７９蛋白質を使用する点で特徴的である。好ましくは、本発明は方法を提供し、化合物がウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害することが可能か否かを判定し、前記プロテアーゼはＥＶ７９または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の、２Ａおよび／または３Ｃプロテアーゼである点で特徴的である。３ＣＬ阻害特性に関して試験され得る好ましい化合物は、２Ａおよび／または３Ｃ開裂前部位のＮ−末端に位置するペプチド（好ましくはヘキサペプチド）であり、好ましくは、ヘキサペプチドはすぐ接して、２Ａまたは３Ｃ開裂前部位のＮ末端である配列を含み、好ましくは、（ヘキサ）ペプチドはさらなる安定性のための修飾を含む。少なくとも部分的に２Ａおよび／または３Ｃ蛋白質分解活性を阻害することにおいて有効な化合物が使用され、ＥＶ７９ウイルス感染症に罹患している、または罹患している危険性のあるヒトの治療のための医薬を調製する。
【００２８】
１種またはそれ以上の好ましい抗エンテロウイルス複製化合物が医薬として使用され、ＥＶ７９ウイルス感染症に罹患している、または罹患している危険性のある対象を治療する。したがって、本発明はさらに、医薬を提供し、エンテロウイルス感染症に罹患している、または罹患している危険性のあるヒトを治療し、前記エンテロウイルスはＥＶ７９典型ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸配列を含む。
【００２９】
本発明において、複数の異なる組換えウイルスは、骨格にＥＶ７９ウイルス核酸を使用して生成される。このような複製能力のあるまたは複製欠陥の組換えウイルスは、たとえば、遺伝子運搬媒介物として使用されることが可能である。他方、ＥＶ７９ウイルスの部分は、遺伝物質を細胞に運搬する他の手段に基づく遺伝子運搬媒介物中で使用され得る。したがって、本発明はさらに、遺伝子運搬媒介物を提供し、ＥＶ７９ウイルス核酸の少なくとも一部、好ましくは典型ウイルスの一部を含む。好ましくは遺伝子運搬媒介物は、ＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の蛋白質をコードする核酸を含む。本発明はまた、キメラエンテロウイルスを示し、少なくとも２つのエンテロウイルス由来の核酸を含み、少なくとも前記部分のうち１つはＥＶ７９ウイルスに由来する。前記ＥＶ７９ウイルス由来部分は好ましくは蛋白質コード領域の少なくとも５０ヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、前記ＥＶ７９由来部分は図１９に示される配列またはその機能的誘導体の５００、さらに好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本発明はキメラエンテロウイルスを提供し、図１９に示される配列の少なくとも１０００ヌクレオチドおよび別のエンテロウイルスの少なくとも１０００ヌクレオチドを含み、前記後者の１０００ヌクレオチドは図１９に示される配列と５％以上異なる配列を含む。
【００３０】
多くのＥＶ７９ウイルスフラグメントの配列が図２ｂおよび図３に描かれている。広範囲の遺伝子ＲＮＡにおけるフラグメントの位置が図３に描かれている。したがって本発明は、１つの特徴において、表２ｂおよび／または３に示される核酸配列を含む単離または組換えウイルス、または、前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を提供する。同定している典型フラグメントを用いて、さらにゲノムの配列を決定することは可能である。ゲノム上を歩行するプライマによってこれをなす１つの方法。プライマは、配列が既知の領域に向けられており、このプライマは未知の隣接領域の配列を決定するために使用される。次のプライマは新たに同定された配列に対して生成されることが可能であり、さらなる領域の配列が決定可能である。
【００３１】
本発明は、ＥＶ７９という新規エンテロウイルス種を提供する。ＥＶ７９ウイルスは重い下痢に罹患している免疫不全の患者から単離された。当然、このＥＶ７９ウイルスの存在は既知であるので、ＥＶ７９が存在するかについてヒトおよびヒト以外の動物をスクリーニングすることは可能である。図２ａにおいて、本発明のウイルスの５’ＵＴＲ領域が描かれている。図２ｂは、前記５’ＵＴＲに隣接する前記ウイルスのゲノムの一部を描いている。この配列によりＥＶ７９を他のエンテロウイルスと区別することが可能である。
【００３２】
したがって、１つの特徴において、本発明は、図２ｂに示される核酸配列を含む単離または組換えウイルスまたは、前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を提供する。図２ｂに示される核酸配列が提供されるので、技術的に現在の方法を使用して、ＥＶ７９ゲノムの他の部分の配列を決定することは容易である。たとえば、プローブは図２ｂの配列に基づいて生成されることが可能である。前記プローブは固体の支持体に結合されることが可能であり、前記支持体は、ＥＶ７９を含む試料で培養されることが可能である。ＥＶ７９ウイルスが結合された後、前記ウイルスは単離され、そのゲノムは続いて増幅されることが可能である。非常に関連したウイルスのゲノム配列を整列することによって、保存配列領域は同定可能であり、合成オリゴヌクレオチドの設計を可能にする。これらのオリゴヌクレオチドが使用され、ＥＶ７９ゲノムの追加および重複部分を増幅する。または、ＥＶ７９ウイルスは臨床試料または生体外で培養された試料から単離された全核酸のプールから上述のように増幅可能である。
【００３３】
図２ｂの配列に基づくプライマおよび／またはランダムなプライマを含む「一般的プライマ」セットを使用することが好ましく、好ましくは本件出願人によって所有される（ここでは参考文献で組み込まれている）特許出願ＥＰ１２７６９０１に記載されているようなものである。好ましい一実施形態において、図２ｂおよび一般的プライマセットの配列に基づくプライマの組み合わせが使用される。前記一般的プライマは上流領域に結合可能であり、ＥＶ７９ゲノムの同定されていない部分を含み、図２ｂの核酸配列の範囲を越えて伸張するゲノムの（一部の）増幅を可能にする。増幅後、得られた生成物は、たとえば、ジデオキシ法23を用いて配列決定されることが可能である。当然、ウイルス核酸の残りの部分の配列を決定する多くの他の方法が当業者に利用可能であり、これらが同様に使用されてもよい。
【００３４】
本発明はまた、単離ＥＶ７９、および／またはＥＶ７９に実質的に対応するウイルスを含む物質の組成を提供する。
【００３５】
「ＥＶ７９に実質的に対応するウイルス」という用語は、図２ｂに示される配列によって同定可能なＥＶ７９株に同一か、前記ＥＶ７９株に匹敵するような１種またはそれ以上の変異体を含むＥＶ７９ウイルスについて述べている。これらの変異体は自然変異を含んでもよい。それはＲＮＡウイルスが変異しやすいからである。さらに前記変異体は人工的に作られた変異を含むこともある。好ましくは、前記変異体は、依然としてＥＶ７９変異体の検出を可能にし、ＥＶ７９特異的核酸および／または抗体を用いたハイブリッド形成、ＮＡＳＢＡ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ等の一般的な検出方法を使用する。
【００３６】
物質の前記組成は、生きている、弱毒化したおよび／または死んだＥＶ７９ウイルスを含んでもよい。前記組成は前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／または類似体を含んでもよい。一実施形態において、前記組成はＥＶ７９ウイルス由来の組換えベクタを含む。
【００３７】
図２ｂの配列は、図３に示されるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含む。このアミノ酸配列はまた、本発明者によって得られたＥＶ７９ウイルス株の一部である。前記配列はＶＰ４領域およびＥＶ７９のＶＰ２領域の少なくとも一部を含む。したがって、別の特徴においては、本発明は図３に示されるアミノ酸配列を含む単離または組換えウイルス、または、前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を提供する。系統分析によって、ＥＶ７９がヒトエンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ２およびＡ１６を含むＨＥＶ−Ａエンテロウイルスのいくつかに対して、およそ７０％同一であり、わずかに関連していることが明らかにされた（図１）。
【００３８】
図２０、表１０、表１１および／または３に示されるアミノ酸配列は異なる核酸配列によってコードされることが可能である。たとえば、コードされたアミノ酸残基を変化させることなく、別のヌクレオチドによってコドンの第３のヌクレオチドを置換することが可能である。たとえば、セリンはコドンＴＣＴ，ＴＣＣ，ＴＣＡおよびＴＣＧによってコード可能である。したがって、「ウォッブル」理論によれば、前記コドン中の最後のヌクレオチドは他の任意のヌクレオチドに取り替えることが可能である。異なる生物は異なるコドン使用法を使用することが多いため、ＥＶ７９ウイルス（の一部）をコードする核酸が、前記ウイルスを生成するために使用される特定の生物に人工的に適用されることが可能である。さらに、ウイルス、特にＲＮＡウイルスは変異しやすいので、自然発生のＥＶ７９ウイルス株はその遺伝子中に、コードされたアミノ酸生成物に大きな影響を与えない変化を含むこともある。したがって、一実施形態において、本発明は図２０、表１０、表１１および／または図３に記載されているようなアミノ酸配列をコードする核酸を含む単離または組換えウイルス、または、前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を提供する。
【００３９】
さらに、本発明のウイルスはアミノ酸配列を含んで提供され、該アミノ酸配列は図２０、表１０、表１１および／または図３に示されるアミノ酸とある程度異なる。前記アミノ酸配列は自然にまたは人工的に、どちらで変異されてもよい。保守的アミノ酸置換が適用される。すなわち１種以上のアミノ酸残基の、一般的に同様の性質（大きさ、疎水性等）を有する別の残基での置換であり、全体的な機能が大きな影響を受けないような置換である。または、本発明の少なくとも１つのウイルスの性質において影響しない変異が存在してもよい。たとえば、特定の所望の性質が人工的に改良されてもよい。しかしながら、本発明のウイルスの機能に影響する変異もまた天然に起こる。一実施形態において、前記アミノ酸配列は、図２０、表１０、表１１および／または図３に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部に対して４５％以上相同である。前記部分は好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０、最も好ましくは少なくとも５０アミノ酸残基を含む。
【００４０】
好ましくは、前記アミノ酸配列は図３に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、少なくとも８５％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％相同である。したがって、本発明の一実施形態はアミノ酸配列を含む単離または組換えウイルスを提供し、図３に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部に対して４５％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を有する。
【００４１】
１つの特徴において、本発明はアミノ酸配列を含む単離または組換えウイルスを提供し、図３に示されるアミノ酸配列３１〜６０位の少なくとも一部に対して４３％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を有する。別の特徴において、本発明はアミノ酸配列を含む単離および組換えウイルスを提供し、図３に示されるアミノ酸配列９１〜１５０位の少なくとも一部に対して８０％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を有する。さらに別の特徴において、本発明はアミノ酸配列を含む単離または組換えウイルスを提供し、図３に示されるアミノ酸配列６１〜９０位の少なくとも一部に対して８６％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を有する。さらに別の特徴において、本発明はアミノ酸配列を含む単離または組換えウイルスを提供し、図３に示されるアミノ酸配列１〜３０位の少なくとも一部に対して９０％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を有する。
【００４２】
１つの特徴において、本発明のウイルスは、図２ｂに示される核酸配列とある程度異なる核酸配列を含んで提供される。前に示したように、ＲＮＡウイルスは変異しやすい。したがって、多くのＥＶ７９株が天然に存在し、発明者によって得られる株とある程度異なる。このような株は図２ｂに示される配列に匹敵するような変異を含み、たとえば図４に描かれている。これらの株は同じＥＶ７９種に属しているので、図２ｂに示される核酸配列に基づいた核酸配列を用いて、それらは単離、増幅および／または同定可能である。
【００４３】
ここで図２ｂに示される配列に「基づいた」核酸とは、前記核酸が前記全配列または前記配列の必須部分を含んでもよいということであり、配列はある程度修飾されてもよい。好ましくは前記配列は、図２ｂに示される配列に対して、少なくとも４５％相同であり、さらに好ましくは５５％、さらに好ましくは６５％、さらに好ましくは７５％、さらに好ましくは９０％相同である。
【００４４】
前記「必須部分」の最低限の大きさは、当然、機能の変化とともに変化する。核酸配列の一部がプライマとして使用される場合、前記最低限の大きさは好ましくは、約５ヌクレオチド、さらに好ましくは約８ヌクレオチド、さらに好ましくは約１４ヌクレオチド、最も好ましくは約２０ヌクレオチドを含む。前記核酸配列の一部がプローブとして使用される場合、前記最低限の大きさは好ましくは約１５ヌクレオチド、さらに好ましくは約２０ヌクレオチドを含む。
【００４５】
ゲノムに変異を含むＥＶ７９ウイルスは同様に人工的に作られ、たとえば、ワクチン化のために、コドンの使用法を選択の発現システムに適合させ、または前記ウイルスを弱毒化させる。好ましくは、単離または組換えウイルスが提供され、図２ｂに示される核酸に対して少なくとも４５％相同である核酸配列またはその機能的部分を含む。一実施形態において、本発明のウイルスが提供され、図２ｂに示される核酸配列に対して、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同である核酸配列またはその機能的部分を含む。さらに別の実施形態において、単離または組換えウイルスが提供され、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列の少なくとも一部に対して、少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同であり、前記部分は好ましくは、少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドを有する。
【００４６】
好ましい実施形態において、単離または組換えウイルスが提供され、核酸配列を含み、図２ａおよび図２ｂに示される核酸配列５００〜１１３４位の少なくとも一部に対して、少なくとも４５％相同であり、前記部分は好ましくは、少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドを有する。さらに好ましくは、前記核酸配列は図２ａおよび図２ｂに示される核酸配列５００〜１７４８位の少なくとも一部に対して、少なくとも４５％相同であり、前記部分は少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドを有する。さらに好ましい実施形態において、単離または組換えウイルスが提供され、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列６８３〜１１３４位の少なくとも一部に対して、少なくとも４５％相同であり、前記部分は少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドを有する。さらに別の好ましい実施形態において、前記核酸配列は図２ｂに示される核酸配列６８３〜１７４８位の少なくとも一部に対して、少なくとも４５％相同であり、前記部分は少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドを有する。
【００４７】
本発明はまた、単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ａおよび図２ｂに示される核酸配列６５１〜７００位の少なくとも一部に対して４２％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００４８】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列７０１〜７５０位の少なくとも一部に対して、５８％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００４９】
さらに別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列７５１〜８００位の少なくとも一部に対して８８％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００５０】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列８０１〜８５０位の少なくとも一部に対して、７２％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００５１】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列９０１〜９５０位の少なくとも一部に対して、５４％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００５２】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列９５１〜１０００位の少なくとも一部に対して、６４％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００５３】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列１００１〜１０５０位の少なくとも一部に対して、４８％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは５０ヌクレオチドを有する。
【００５４】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列１０５１〜１１００位の少なくとも一部に対して、５６％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００５５】
別の特徴において、本発明は単離または組換えウイルスを提供し、核酸配列を含み、図２ｂに示される核酸配列１１０１〜１１３４位の少なくとも一部に対して、５３％以上相同であり、前記部分は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを有する。
【００５６】
本発明の教示から、たとえば下痢などの「一般的な」症状を、ＥＶ７９関連病によるものとみなすことが可能となった。したがってＥＶ７９関連病は今や診断が可能であり、たとえば試料中のＥＶ７９ウイルスまたは前記ウイルスに対する抗体の存在を示すことによって可能である。
【００５７】
本発明のウイルスが提供されたので、当業者ならば前記ウイルスの、機能的部分、誘導体または類似体を生成することが充分可能である。ＥＶ７９ウイルスの機能的部分は、必ずしも量においてではなく、質において同じＥＶ７９特異的性質を有する部分として定義される。どの性質が比較される必要があるかは、特定の用途による。たとえば、ＥＶ７９感染性に関心がある場合、細胞に感染する性質が検討されるべきであり、その場合ＥＶ７９の機能的部分もまた、結局は異なる程度に細胞を感染することが可能であるべきである。しかしながら、宿主中の免疫応答を誘導する能力が検討される場合、単一のＥＶ７９ウイルスのＥＶ７９特異的エピトープが機能的部分であるとみなすことが可能である。
【００５８】
ウイルスの機能的誘導体はウイルス化合物として定義され、前記化合物の性質は量においてではなく質において実質的に同じであるように変更されている。誘導体は多くの方法で提供されることが可能であり、たとえばヌクレオチド置換（好ましくは「ウォッブル」に基づいて）、（保守的）アミノ酸置換、それに続く修飾などによってである。
【００５９】
ウイルスの類似化合物もまた技術的な方法を使用して生成されることが可能である。たとえば、キメラウイルス、すなわちキメラ蛋白質を有するＥＶ７９ウイルスが生成されることが可能である。たとえば、ＥＶ７９細胞表面蛋白質および非ＥＶ７９抗原性部分の少なくとも一部を含む細胞表面関連融合蛋白質を生成することによって、ＥＶ７９はさらに免疫抗原性になることが可能である。このようなキメラ蛋白質を含むＥＶ７９ウイルスは、たとえば、ワクチン化の目的で、宿主中で、向上した免疫応答を誘導するために使用されることが可能である。
【００６０】
ここで使用されるように、「本発明のウイルス」という用語は、前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／または類似体もまた含むということを意味する。
【００６１】
蛋白質の機能的部分は必ずしも量においてではなく、質において同じ種類の性質を有する部分として定義される。前記性質は抗原性を含んでもよい。抗原性とは、宿主中で免疫応答を誘導する能力を意味する。蛋白質の機能的誘導体は蛋白質として定義され、前記分子の性質が、必ずしも量においてではなく、質において実質的に同じであるように変更されている。誘導体は、たとえば保守的アミノ酸置換を経て、多くの方法で提供されることが可能である。
【００６２】
当業者ならば蛋白質の類似化合物を生成することが充分可能である。たとえば、これはペプチドライブラリのスクリーニングを経てなされる。このような類似体は、必ずしも量においてではなく、質において、前記蛋白質と実質的に同じ性質である。
【００６３】
ＥＶ７９ウイルスが提供されたので、本発明のウイルスの核酸に特異的にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブを生成することが可能である。特異的にハイブリッド形成するとはここでは前記プライマおよび／またはプローブが前記核酸にハイブリッド形成可能であるということを意味する。なぜなら前記プライマおよび／またはプローブは少なくとも３、好ましくは少なくとも５ヌクレオチドの配列を含み、ヌクレオチドは前記ウイルスの前記核酸に相補的であるからである。好ましい実施形態において、前記プライマおよび／またはプローブは前記ウイルスの前記核酸に相補的である配列から成る。好ましくは、前記プライマおよび／またはプローブは厳しい条件で本発明のウイルスの核酸とハイブリッドを形成することが可能である。本発明のプライマ／プローブは特にＥＶ７９ウイルスのゲノムの少なくとも一部の増幅／検出に適している。
【００６４】
一実施形態は、図２ｂに示される核酸配列に対して特異的にハイブリッドを形成することが可能なプライマ／プローブを提供する。表２において、本発明のプライマの配列が提供される。
【００６５】
本発明はまた、本発明のウイルスまたは、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を特異的に結合可能な単離分子を提供する。前記単離分子は好ましくは、蛋白性分子を含む。前記分子は、図２ｂに示される配列の少なくとも一部等の、前記ウイルスの核酸に特異的に結合可能であってもよい。しかしながら、前記分子は好ましくは前記ウイルスのアミノ酸配列に特異的に結合可能である。前記アミノ酸配列は、部分的にでも全体でも、ＥＶ７９ウイルス粒子中にあってよい。しかしながら、前記アミノ酸配列は好ましくは、エピトープなどの前記ウイルスの表面に関連する蛋白質（の一部）を含む。「表面に関連する」とは、前記ウイルスの表面に少なくとも部分的に曝されている蛋白質を意味する。たとえば、このような蛋白質はウイルスキャプシド蛋白質を含む。一実施形態において、前記アミノ酸配列は図３に示されているようなアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。前記部分は好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基を含む。
【００６６】
核酸配列を特異的に結合可能な分子とは、ここでは厳しい条件で、関連する核酸配列間を識別可能な分子という意味である。蛋白性分子に特異的に結合可能な分子は異なる蛋白性分子間を識別可能な分子として定義される。なぜならそれは前記蛋白性分子の特異的アミノ酸配列、特異的コンフォメーションなどに対してより多くの親和性を有しているからである。分子の非特異的「スティッキング（sticking）」は特異的な結合とはみなされない。
【００６７】
本発明の分子は好ましくは抗体、または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。抗体の機能的部分は必ずしも量においてではなく、質において前記抗体と実質的に同じ性質を有している。前記機能的部分は好ましくはＥＶ７９抗原に特異的に結合可能である。しかしながら、前記機能的部分は、前記抗体全体と比較して、異なる程度にこのような抗原に結合してもよい。抗体の機能的部分または誘導体は、たとえばＦＡＢフラグメントまたは単一鎖抗体を含む。たとえば抗体の類似体はキメラ抗体を含む。ここで使用されているように、「抗体」という用語はまた、前記抗体の、機能的部分、誘導体および／または類似体を含むことを意味する。
【００６８】
ＥＶ７９ウイルスを特異的に結合可能な分子は、技術的に現在の方法を使用して得ることが可能である。たとえば、ＥＶ７９に向けられた抗体は、感染したヒトから得られてもよい。たとえば前記抗体は試料から単離されることが可能であり、試料とはたとえば、血液、血清、隔膜、唾液または細胞組織の試料であり、前記感染したヒトから得られる。またはヒト以外の動物が、ＥＶ７９を接種され、免疫応答を誘導する。生成された抗体は続いて前記動物から回収されることが可能である。回収された抗体は、たとえば親和性クロマトグラフィなどによって精製される必要があることが多い。
【００６９】
さらに、前記抗体は組換え技術で生成されることが可能であり、たとえば微小組織、細胞系（すなわちモノクローナル抗体）または遺伝子組換え動物によって可能である。その場合、コドン最適化が要求されることもある。ＥＶ７９に向けられた抗体は固層合成等の一般的技術を使用して合成されてもよい。
【００７０】
本発明の分子が得られると、結合能等の所望の性質が改良されることが可能である。たとえば、蛋白性分子について、これはＡｌａ走査および／または置換ネットマッピング法（replacement net mapping method）によってなされることが可能である。これらの方法とともに、多くの異なる蛋白性分子が原型のアミノ酸配列に基づいて生成されるが、各分子は少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む。前記アミノ酸残基はアラニン（Ａｌａ走査）によって置換されるか、または任意の他のアミン酸残基（replacement net mapping）によって置換されてもよい。各変異体は続いて前記所望の性質についてスクリーニングされる。一般化されたデータが使用され、改良された蛋白性分子を設計する。
【００７１】
Ｐｒｉｍａ７に特異的に結合可能な抗体等の、本発明の分子が得られると、ＥＶ７９特異性に関してテストすることが必要なこともある。なぜなら、抗体がエンテロウイルス種領域の保存領域に向けられている場合、抗体は他のエンテロウイルスと交差反応することがあるからである。たとえば、特異性は前記分子でウェルを覆うことによってテストされ、続いて異なるエンテロウイルス種で前記ウェルを培養し、前記分子がＥＶ７９のみに、かなりの程度で特異的に結合するか否かを判定することが可能である。当然、特異性をテストするための多くの別の方法が技術的に利用可能である。したがって１つの特徴において、本発明は、本発明のウイルス、または、機能的部分、誘導体もしくは類似体に特異的に結合可能な分子を生成する方法を提供し、
・本発明のウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体に結合可能な分子を生成し、
・前記ウイルスに特異的な分子を選択することを含む。
【００７２】
本発明の抗体または、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体が使用され、試料中のＥＶ７９ウイルスの存在を検出することが可能である。前記試料は血液、血清または細胞組織試料を含む。しかしながら好ましくは、前記試料は糞便、唾液または唾液試料を含む。前記抗体または、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体は、たとえば親和性カラム中で使用可能である。前記抗体または、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体は、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上に覆われてもよく、前記プレートによってヒトまたはヒト以外の動物からの試料を培養することが可能である。前記抗体が前記試料の何らかの成分に特異的に結合する場合、前記試料中のＥＶ７９の存在を示している。ＥＶ７９成分の結合は、たとえばＥＶ７９に向けられた第２の、標識された抗体によって明らかにすることが可能である。
【００７３】
ＥＬＩＳＡに代わる別の方法として、光学バイオセンサ（たとえば、BiaCore 3000またはAffinity Sensors IAsys）が使用され、ＥＶ７９コード蛋白質および配位子（たとえば、抗体またはFab）の相互作用を検出する。これらの光学システムはＥＬＩＳＡと同様に感度が良いが、即時の検出を可能にする。
【００７４】
一般的なバイオセンサの実験周期は図７に示されている。第１段階は通常与えられた配位子の固定化であり、バイオセンサキュベット表面の制御である。複数の表面は市販されており、たとえば、ビオチン、カルボン酸、疎水性およびアミノ酸表面型を含む。次の段階は試料の追加であり、操作者は、特異的来ゲート（ligate）との固定された配位子との相互作用を調べる。この段階は結合段階と呼ばれる。それからバッファが加えられ、いかなる弱い非特異的結合分子をも解離することが可能である。第４段階は再生段階であり、表面が最初の状態に戻される。再生の後、キュベットは別の結合実験のために再使用されてもよいし、たいてい４℃で保存されてもよい7；27）。
【００７５】
本発明の分子は試料中に存在するＥＶ７９を単離するのに適している。前記試料は好ましくは、下痢に罹患しているヒトからの糞便試料を含む。高処理能力自動化分析が確立され、試験試料が本発明の分子で培養される。結合ウイルスは、たとえば本発明のプライマおよび／またはプローブを使用してウイルス粒子の染色またはＥＶ７９核酸の検出によって、検出および／または同定可能である。このような分析は簡易で迅速な診断を提供する。さらに、ＥＶ７９の異なる株を得ることが可能である。前記株は精製されてもよく、さらに調査され、たとえば、診断手順を改良することが可能である。したがって１つの特徴において、本発明はＥＶ７９に特異的に結合可能な本発明の（好ましくは蛋白性）分子に免疫反応する単離または組換えウイルスを提供する。
【００７６】
本発明のプライマおよび／またはプローブもまた、本発明のウイルスの、検出および／または同定のために使用可能である。たとえばBoom法を用いた核酸単離の後、ＰＣＲ反応は、本発明の少なくとも１種のプライマを使用して開始されることが可能である。一実施形態において、本発明の１種の（特異的）プライマは１種の「一般的な」プライマと組み合わせて使用される。別の実施形態において、本発明の２種の特異的のプライマが使用される。続いて、本発明のプローブが使用され、増幅されたＥＶ７９ウイルス生成物が得られるか否かを判定することが可能である。または、本発明のウイルスの核酸が使用され、それとともにハイブリッド形成可能な核酸の存在を検出することが可能である。一実施形態において、前記核酸は図２ｂに示される配列を含む。アンチセンス鎖が使用され、ハイブリッド形成を経てセンスＥＶ７９核酸を検出するということが認められる。
【００７７】
たとえば本発明の分子、プライマおよび／またはプローブを使用して、試料中の本発明のウイルスを検出することが可能になった。または、本発明のウイルスに向けられた特異的な配位子または抗体などの、本発明のウイルスを特異的に結合可能な分子の存在について、試料をスクリーニングすることが可能である。これは診断目的に関して望ましいことが多い。それはヒトのウイルス感染後、免疫病原性は時間とともに変化することが多いからである。第１段階の間、細胞介在型の初期免疫応答が誘起されることが多く、時間とともに体液性応答に切り換わることもある。前記変化のために、１種の免疫学的診断手順は感染の全期間に適していないこともある。肯定的結果と否定的結果とが交互に得られることもある。したがって、ＥＶ７９ウイルスの存在の測定に加えて、同様にヒトの試料中の前記ウイルスに対する抗体の存在を判定することは有利なことである。これは、本発明のウイルス（または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは誘導体）で前記ヒトの試料を培養し、技術的に一般的な方法を使用して結合抗体を検出することによって成し遂げることが可能である。したがって、本発明のウイルス、または、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を使用して、試料中の前記ウイルスに対する特異的配位子または抗体などの、本発明のウイルスに特異的に結合可能な分子を検出することもまた、ここで提供される。当然、全ウイルス粒子を使用する必要はなく、それは前記ウイルスの核酸配列および／またはアミノ酸配列もまた使用され、抗体を検出することが可能であるからである。前記アミノ酸配列は好ましくは本発明のウイルスの表面関連蛋白質のエピトープを含む。なぜならヒトの免疫システムは、ウイルス感染後、このような表面関連蛋白質に直接曝されるからである。したがって、前記表面関連蛋白質に対する抗体は最も存在する可能性がある。一実施形態において、図３に示される配列、または、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体が使用され、本発明のウイルスに対する特異的配位子または抗体などの、本発明のウイルスに特異的に結合可能な分子を検出する。
【００７８】
本発明のウイルス、または、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体は、特に、好ましくはＥＶ７９関連病に対するワクチンとしての使用に適している。好ましい実施形態において、弱毒化ウイルスあるいは表面関連蛋白質などの機能的部分、そのエピトープまたはグリコシル化結合が使用される。前記ワクチンは好ましくはスペコール（Specol）または二重油性エマルジョン（double oil emulsion）等の適切なアジュバントを含む。前記ウイルスまたは機能的部分はさらに、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはオボアルブミン等の蛋白質の抗原性結合等の適切な担体に結合されてもよい。ワクチンを生成する方法は技術的に既知である。本発明のＥＶ７９ウイルスはエンテロウイルスであるので、ＥＶ７９に対するワクチンは、ポリオウイルス等の他のエンテロウイルスに対する、現在使用されるワクチンから類推して生成されてもよい。当業者に既知のワクチンの製造方法は、たとえば死んでいるウイルスと、生きている弱毒化ウイルスと、ウイルスサブユニットと、ＤＮＡワクチンと、アデノウイルスまたはＡＡＶ等の適切なワクチンベクタ中のＤＮＡワクチンと、ウイルスベクタを一体化させることを経た遺伝子治療方法とを含む。ヒトに対するこのようなワクチンの投与は、ヒトの免疫システムの活性化を経たＥＶ７９に対する予防を提供する。
【００７９】
本発明のウイルス、または、その、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体もまた医薬としての使用に適している。たとえば、前記ウイルスは、消化管の局部治療に有益な性質を有する蛋白性分子をコードする核酸を与えられてもよい。
【００８０】
別の実施形態において、本発明の分子、好ましくは、本発明の蛋白性分子はワクチンまたは医薬として使用される。前記ワクチンまたは医薬は好ましくはＥＶ７９関連病の予防および／または治療に使用される。前記分子は、ＥＶ７９感染が起こる前に、好ましくは上述の適切なアジュバントおよび／または担体と組み合わせてヒトに投与されることが可能である。このような受動免疫は（しばしば一時的に）次の感染に対する予防を提供する。前記分子はまたＥＶ７９感染後、医薬として投与されてもよい。前記分子はＥＶ７９に特異的に結合可能であり、少なくとも部分的に、ＥＶ７９感染の影響を弱める。本発明の分子を含む医薬は、当然、炎症抑制剤等の１種またはそれ以上の他の医薬と結合されることが可能である。一実施形態において、複数の医薬はヒトに別々に投与される。しかしながら、本発明の分子はまた、ある薬剤の調製において、別の薬学的に活性な化合物と結合されることも可能である。
【００８１】
したがって、本発明は、本発明のウイルス、または、機能的部分、誘導体または類似体および／もしくは分子を含むワクチンを提供する。
【００８２】
本発明の分子を含む医薬もまたここで提供される。前記医薬は好ましくは本発明の蛋白性分子を含む。本発明のワクチンまたは医薬は、好ましくはＥＶ７９関連病を少なくとも部分的に予防および／または治療するために使用される。
【００８３】
エンテロウイルスは多種の病気に伴う下痢、呼吸困難および熱などの症状を引き起こすことが多い。したがって、これらの症状をエンテロウイルス感染に直接帰することはできない。本発明のウイルスが提供されているので、ヒトがエンテロウイルス属関連病に罹患しているか否かを判定することが可能になった。さらに具体的には、ＥＶ７９関連病が関係しているか否かを判定することが可能である。本発明のウイルス、または、機能的部分、誘導体もしくは類似体が使用され、ヒトからの試料が前記エンテロウイルスに対する抗体を含むか否かを判定することが可能である。さらに、試料中のエンテロウイルスの存在は、本発明の蛋白性分子を使用して、たとえば、親和性クロマトグラフィまたはＥＬＩＳＡを使用して判定することが可能である。試料中のエンテロウイルスの存在も同様に、前記試料の核酸をＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ，ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡなどの増幅反応し、本発明の少なくとも１種のプライマまたはプローブを使用して、増幅されたエンテロウイルス核酸が存在するか否かを判定することによって判定可能である。エンテロウイルス属関連病が診断されると、たとえば前記エンテロウイルスに特異的に向けられた抗体等の、適切な治療を施すことが可能である。あるいは、または、さらに、一般的な抗ウイルス薬が使用されてもよい。
【００８４】
したがって、エンテロウイルス属関連病の診断のための、本発明のウイルス、分子および／またはプライマ／プローブの使用もまた提供される。好ましくは前記エンテロウイルス属はＥＶ７９エンテロウイルスを含む。
【００８５】
本発明はまた診断キットを提供し、本発明のウイルス、または、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／またはプライマ／プローブを含む。本発明のキットを用いて、エンテロウイルス関連病は、たとえば、試料中のエンテロウイルスまたはエンテロウイルスに向けられた抗体の存在を示して、診断可能である。一実施形態において、前記キットはまた、核酸の単離および／または増幅のための適切な手段を含む。
【００８６】
ＥＶ７９に特異的に結合可能な本発明の分子、好ましくは蛋白性分子を含む診断キットもまた、ここで提供される。前記分子は好ましくは、マイクロタイタープレート等の適切な固体支持体上に存在する。前記キットは試料中のエンテロウイルスの存在を示すのに特に適切であり、好ましくは、同様にエンテロウイルスを染色するための適切な手段を含む。このような手段は一般的に技術的に入手可能である。
【００８７】
１つの特徴において、本発明はヒトがＥＶ７９関連病に罹患しているか否かを判定する方法を提供し、前記ヒトから試料を得ることと、本発明のプライマおよび／またはプローブを用いて前記ウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸を、ハイブリッド形成および／または増幅し、ハイブリッド形成および／または増幅された生成物を検出することによって、前記試料中のＥＶ７９ウイルス、または、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む。
【００８８】
別の特徴において、本発明はヒトがＥＶ７９関連病に罹患しているか否かを判定するための方法を提供し、前記ヒトから試料を得ることと、本発明の（蛋白性）分子と、前記ウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体との特異的結合、ならびに結合生成物の検出によって、前記試料中のＥＶ７９ウイルスまたは、その、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む。
【００８９】
さらに別の特徴において、本発明はヒトがＥＶ７９関連病に罹患しているか否かを判定するための方法を提供し、前記ヒトから試料を得ることと、本発明のＥＶ７９ウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体と、前記抗体との特異的結合、ならびに結合生成物の検出によって、前記試料中のＥＶ７９特異的抗体を検出することとを含む。
【００９０】
ＥＶ７９関連病と診断されると、本発明の医薬を用いて治療することが可能である。さらに、ＥＶ７９に感染する危険のあるヒトは、本発明のワクチンを接種されることが可能であり、ＥＶ７９関連病を予防する。たとえば、免疫不全のヒトは、ＥＶ７９ウイルスに特異的に結合可能な本発明の分子を含むワクチンを与えられることが可能である。
【００９１】
したがって、ＥＶ７９関連病に罹患している、または罹患している危険にあるヒトの治療のための方法もまた提供され、本発明のワクチンまたは医薬を前記ヒトへ投与することを含む。
【００９２】
本発明はさらに、以下の実施例によって示される。実施例は決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００９３】
実施例
Ｐｒｉｍａ７の単離
５５のピコルナウイルス単離物の全長ゲノム配列の整列において、２つの群を識別することができた。ヒトエンテロウイルスのほとんどを包含する群に関して、プライマとネスティッドＲＴ−ＰＣＲアッセイとを、この群の全てのメンバーを増幅することができるように設計した。このアッセイを用いて、２０１人のＨＩＶ陽性被験者の臨床検便試料をスクリーニングし、そのうち１７は、推定された寸法（３００ｂｐ）のＰＣＲ生成物を生成した。これらの試料のうち４つは、第１の増幅後、高いウイルス力価を指示する４５０ｂｐの一群を示した。２つのＰＣＲ生成物のクローン化されたフラグメントは、ヒトエンテロウイルス７１およびポリオウイルスの５’−ＵＴＲとそれぞれ、８９％および９１％の相同性を示した。
【００９４】
【表１】
2007513604.tif 000004
【００９５】
ウイルス性ＲＮＡ単離
ＲＮＡ抽出を、Boom et al.に記載される方法を用いて実行した。手短に述べると、エンテロウイルスパネルからの１００μＬの臨床試料または再構成された試料を、Ｌ６溶解緩衝液９００μＬ、シリカ５０μＬと混合し、次いで室温で１０分間培養した。いくつかの段階の間に核酸と結合したシリカ粒子を洗浄した後、ＲＮＡを、ヌクレアーゼの存在しない水５０μＬ中で溶出した。
【００９６】
発見のためのネスティッドＲＴ−ＰＣＲ増幅
ウイルス性ＲＮＡ単離の後、単離されたＲＮＡを含有する溶出物１０μＬを、ネスティッドＲＴ−ＰＣＲ増幅試験に用いた。ＰＩＣＧ２Ｄ１（５’−ＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣＧＧ−３’）と称され、かつエンテロウイルスの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）領域に由来する下流プライマを、ｃＤＮＡ合成に用いた。第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前述の（DeWolf et al., 1994）のように実行した。手短に述べると、第１鎖ｃＤＮＡを合成するために、４２℃で４５分間培養した後、第１ＰＣＲ増幅の対応する一般的な上流プライマ、すなわちＰＩＣＧ２Ｕ１（５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＲＣＧＣＣＴＧＴ−３’）、ＰＣＲ緩衝液、デオキシヌクレオチド３リン酸、２．５ｍＭのＭｇＣ１２、および２ＵのＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス社製）を加えた。９５℃で５分間培養した後、反応混合物に、次のプロフィール、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間で、３５周期の増幅を受けさせた。第１ＰＣＲ増幅の後、ＰＣＲ生成物５μＬを、ネスティッド上流プライマ、すなわちＰＩＣＧ２Ｕ１’（５’−ＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣ−３’）と、一般的なネスティッド下流プライマ、すなわちＰＩＣＧ２Ｄ１’（５’−ＣＡＴＣＧＲＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−３’）とからなるネスティッドＰＣＲ反応混合物に加えた。この反応混合物に、第１ＰＣＲ増幅と同じプロフィールで、２５周期の増幅を受けさせた。標的のフラグメントは、第１ＰＣＲ生成物について約４５０ｂｐの長さ、またはネスティッドＰＣＲフラグメントについて約３００ｂｐの長さであり、これらを、プラスミド調製、およびそれに続く遺伝子シークエンシング反応のために、ｔｈｅｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクタ（インビトロジェン社製、カールスバッド、カリフォルニア）に対してクローン化した。
【００９７】
ＤＮＡシークエンシングおよび分析
プラスミドを含有するエンテロウイルス−ＰＣＲ生成物を、-２１Ｍ１３およびＭ１３リバースプライマを用いて、BigDye（登録商標）Terminator Cycle Sequencingキット（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社製、フォスターシティ、カリフォルニア）によってシークエンシングした。反応混合物をシークエンシングする電気泳動法を、アプライドバイオシステムズ３７７自動シークエンサを用いて、製造者のプロトコルに従って実行した。ベクタＮＴＩスイート７ソフトウェアパッケージを、全てのシークエンシングデータを分析するために用いた。
【００９８】
完全Ｐｒｉｍａ７ゲノムのヌクレオチド配列の決定
ピコルナＶＰ４領域の保存領域に位置する第３のオリゴヌクレオチド（０７ＶＰ４Ｄ１，ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣ）を用いて、クローン０７に関する配列を、１０３４ヌクレオチドに伸長した（図５を参照）。
【００９９】
その結果生じた、推定上のＶＰ４領域の推定されるアミノ酸配列は、エンテロウイルス７０群における系統樹およびクラスタの中で他と区別可能な枝を占め、これは新規なエンテロウイルスと同定される。保存領域を標的とするプライマの組合せと、独自開発のＰＡＬＭ法とを用いて、我々は、この新しいエンテロウイルスの全長ゲノム配列を決定する過程にある。
【０１００】
推定されるオリゴヌクレオチドによる配列伸長
関連するエンテロウイルス７０，７１およびコクサッキーＡ１６の推定されるアミノ酸配列の整列によって、保存領域を同定した。これらの保存蛋白質領域の折り返し翻訳の後（表２）、適切なコドンバイアスを考慮して、退化プライマを設計し、ＲＴ−ＰＣＲに用いることができた。表２から、オリゴの適切な組合せおよび配向を選択することによって、Ｐｒｉｍａ７ゲノムＲＮＡの重複フラグメントは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅され得る。これらの重複フラグメントから、完全ゲノム配列を組立てることができる。
【０１０１】
Ｐａｌｍ
代替的に、Ｐｒｉｍａ７ゲノムの分析された部分（表３，０７ＵＶＰ０１〜０７ＵＶＰ０７）に位置する５’−オリグヌクレオチドと、３’標識ランダムプライマ（ＪＺＨ２Ｒ）との組合せを用いて、ＥＶ７９ゲノムの追加フラグメントを、前述と類似するネスティッドＲＴ−ＰＣＲプロトコルを用いて増幅した。
【０１０２】
【表２】
2007513604.tif 000005
【０１０３】
【表３】
2007513604.tif 000006
【０１０４】
細胞培養におけるＰｒｉｍａ７の増殖
臨床糞便試料を、培地Ｂ（ブイヨンＮｏ．２オキソイド２５ｇ／Ｌ、ペニシリン２５０ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン２５０ｐｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ１．５ｐｇ／ｍＬ）において再懸濁（３０％ｖ／ｖ）した。成長培地を、熱殺菌された白金線培地吸引装置を用いて、培養細胞（ベロ細胞、ヒト胎児肺繊維芽細胞またはサル腎臓細胞）を含有する管から除去した。培地Ｂに保存されている糞便を、１０分間２５００ＲＰＭで遠心分離機にかけ、その結果生じた上清１ｍＬを、４５μＭシリンジ付フィルタを用いて濾過した。その濾液３〜４滴を、培養細胞に加えた。閉じられた管を、患者材料と、ガラス壁に付着する細胞との接触を確実にするために、優しく反転させ、その管を３０分間３７℃で培養した。ＭＥＭハンクス８％ＦＣＳ（ギブコ社製）溶液を、室温で均衡させ、アンフォテリシンＢ０．３７５μｇ／ｍＬおよびネオマイシン１０ｍｇ／ｍＬ（ギブコ社製）を加えた。各管に、ＭＥＭハンクス８％ＦＣＳ１ｍＬを加え、これらの管を３７℃で培養した。少なくとも２週間、週２回、細胞を顕微鏡で観察し、ウイルス特異的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を記録する。
【０１０５】
検便試料中のＰｒｉｍａ７検出方法
Ｐｒｉｍａ７配列（表４）に基づいて、ネスティッドオリゴヌクレオチド２組を設計し、ＲＮＡ抽出を、前述のとおり実行した。ウイルス性ＲＮＡ単離の後、単離されたＲＮＡを含有する溶出物１０μＬを、ネスティッドＲＴ−ＰＣＲ増幅試験に用いた。下流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｄ１を、ｃＤＮＡ合成に用いた。
【０１０６】
【表４】
2007513604.tif 000007
【０１０７】
第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を前述6のように実行した。手短に述べると、第１鎖ｃＤＮＡを合成するために、４２℃で４５分間培養した後、第１ＰＣＲ増幅の対応する一般的な上流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｕ１、ＰＣＲ緩衝液、デオキシヌクレオチド３リン酸、２．５ｍＭのＭｇＣ１２、および２ＵのＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマーシーラス社製）を加えた。９５℃で５分間培養した後、反応混合物に、次のプロフィール、すなわち９５℃１分間、５５℃１分間、および７２℃２分間で、３５周期増幅を受けさせた。第１ＰＣＲ増幅の後、ＰＣＲ生成物５μＬを、ネスティッド上流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｕ２と、下流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｄ２とからなるネスティッドＰＣＲ反応混合物に加えた。この反応混合物に、第１ＰＣＲ増幅と同じプロフィールで、２５周期増幅を受けさせた。
【０１０８】
ポリクローナル抗体の収集方法
Ｐｒｉｍａ７ポリ蛋白質（たとえば、ＶＰ１またはＶＰ４）内の適切な領域は、適切なオリゴヌクレオチドおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、選択かつ増幅されることができる。対応する精製されたウイルス抗原を、Nicaud et al.16に述べられるように、適切な宿主（たとえばYarrowia lipolytica）における発現によって得ることができる。メスのＮＺＷウサギ（約４ｋｇ）を、ウイルス蛋白質抗原調製物０．５〜５．０ｍｇで初回免疫する。抗原を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）０．５ｍＬ中で懸濁し、等量の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化する。フロインドアジュバントは、少量の抗原が用いられ、かつ抗原の免疫原性が（おそらくではあるが）知られていないこれらの実験において使用するのに、適切な既知のアジュバントシステムである。発行された使用ガイドラインは、次のとおりであり、各部位につき０．１ｍＬに注射を限定すること、初回免疫投与にのみＣＦＡを用いることを含む。この抗原調製物（１ｍＬ全容積）を、ウサギの首の背面の弛緩性皮膚に皮下注射する。この注射経路は、免疫学的に有効であり、一方的または相互的な脇腹注射に関連する局所炎症の可能性を最小限にする（このようなその後の脇腹炎症は、動物の可動性を害する）。３週間の静止後、血液１ｍＬを、血液検査のために耳の動脈から除去する。もし所望の抗体の力価が低すぎると判断された場合、抗体を増量する。適切な抗体レベルを有するウサギを、ＣＦＡに含有される抗原１．０ｍｇを皮下注射してブーストする。ブーストされた動物を、２週間後に採血し、すなわち血液１５ｍＬを、血管を拡張させるヒートランプを用いて耳の動脈から採る。ウサギは、商業的な制限に配置し、全部で７回以下、キシラジンで安静にし、その後、キシラジン／ケタミンを用いて麻痺させた後、ウサギから、心臓穿刺によって全血を採る。
【０１０９】
ワクチン生成方法
サブユニットワクチンの生成のために、おそらくＶＰ２およびＶＰ３蛋白質と組み合わせられるＶＰ１領域を、適切な真核細胞の宿主（たとえば、Y. Lipolytica、またはベロ細胞）において発現することができ、また、優先的に２つの小さい親和性標識（たとえば、Ｈｉｓ標識またはＳｔｒｅｐＩＩ標識）を用いて精製することができた。適切な精製の後、その結果生じるウイルス性蛋白質を、サブユニットワクチンとして用いることができる。
【０１１０】
代替的に、Ｐｒｉｍａ７ウイルスを、前述のようにベロ細胞において繁殖させることができ、続いて、Wu et al.28に記載されたように処置することができる。手短に述べると、ウイルスを、２０％ポリエチレングリコール６０００を用いて培地から沈殿させ、不連続な４０〜６５％サッカロース勾配で４時間８０，０００×ｇで、続いて、線形５〜４０％ＣｓＣｌ勾配で４時間１２０，０００×ｇで、超遠心分離法によって精製する。その結果生じるウイルス調製物は、Blondel et al.3に記載されるように、３０分間６５℃で加熱することによって不活性化されることができる。
【０１１１】
光学バイオセンサにおける固定化配位子（たとえば抗体）と結合するＰｒｉｍａ７ウイルス性蛋白質のＶＰ１またはその他の分析
結合反応を、些細な修正を伴って、２０℃で、ＩＡｓｙｓ２チャネル共振ミラーバイオセンサ（アフィニティセンサーズ(Affinity Sensors)社製、サクソンヒル、ケンブリッジ、イギリス）において実行した。６００arcsの信号が１ｎｇ／ｍｍ2の結合された蛋白質に対応する２次元ビオチン表面を、製造者の取扱説明書に従ってストレプトアビジンによって誘導化した。参照は、ウイルス性蛋白質が、ストレプトアビジン誘導化ビオチン表面に結合されないことを示した（結果は図示しない）。ビオチン化抗体を、２次元ストレプトアビジン誘導化表面において固定化し、その後ＰＢＳで洗浄した。バイオセンサキュベットの表面に固定化された配位子および結合されたＶＰ１の分布を、共鳴スキャンによって検査し、これは、常に、これらの分子がセンサ表面上で規則的に分布しており、したがって微小な集合を形成していないことを示した。結合アッセイを、２０±０．１℃で最終容量のＰＢＳ３０μＬにおいて実行した。１４〜７０ｎＭの間の最終濃度のＶＰ１を与えるために、ライゲート(ligate)を、キュベットに対して、ＰＢＳ１μＬ〜５μＬ中で既知の濃度で加えた。解離段階の後、残余の結合されたライゲートを除去して、固定配位子を再生するために、２ＭのＮａＣｌ−１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）５０μＬで３回、および２０ｍＭのＨＣＬ５０μＬで３回、キュベットを洗浄した。データは、異なる量の固定化抗体（０．２、０．６および１．２ｎｇ／ｍｍ２）を用いた実験から蓄積された。ｋonの計算のために、低いライゲート（ＶＰ１）濃度を用いる一方で、ｋoffの測定のために、比較的高いライゲート濃度を、再結合するあらゆる人為的な結果を回避するために用いた（１μＭ）。この結合パラメータｋonおよびｋoffは、結合反応の結合段階および解離段階からそれぞれ算出され、算出には、機器を備える非線形カーブフィッティングFastFitソフトウェア（アフィニティセンサーズ社製）を用いた。解離定数（Ｋｄ）は、結合率定数および解離率定数から、および平衡点近くで観察される結合範囲から算出した。
【０１１２】
検便試料におけるＰｒｉｍａ７の検出方法
Ｐｒｉｍａ７配列（表５）に基づいて、ネスティッドオリゴヌクレオチド２組を設計し、ＲＮＡ抽出を前述4のように実行した。ウイルス性ＲＮＡ単離の後、単離されたＲＮＡを含有する溶出物１０μＬを、ネスティッドＲＴ−ＰＣＲ増幅試験のために用いた。下流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｄ０１を、ｃＤＮＡ合成に用いた。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前述（De Wolf et al., 1994）のように実行した。手短に述べると、第１鎖ｃＤＮＡ合成のために、４２℃で４５分間培養した後、第１ＰＣＲ増幅の対応するジェネリック上流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｕ１、ＰＣＲ緩衝液、デオキシヌクレオチド３リン酸、２．５ｍＭのＭｇＣ１２、および２ＵのＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマーシーラス社製）を加えた。９５℃で５分間培養した後、反応混合物に、次のプロフィール、すなわち９５℃１分間、５５℃１分間、および７２℃２分間で、３５周期増幅を受けさせた。第１ＰＣＲ増幅の後、ＰＣＲ生成物５μＬを、ネスティッド上流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｕ２と下流プライマ、すなわちＥＶ０７Ｄ２とからなるネスティッドＰＣＲ反応混合物に加えた。この反応混合物に、第１ＰＣＲ増幅と同じプロフィールで、２５周期増幅を受けさせた。ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲルにおいて寸法で分別し、摘出し、製造者（キアゲン社、ウェストバーグ）によって供給されたプロトコルに従って、Qiaquickカラムを用いて精製し、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）に、トポイソメラーゼ１仲介ライゲーションを介してクローン化した。各ＰＣＲ生成物について、３つのランダムに採取されたコロニーからのプラスミドを、Qiagen Spin Miniprepキットを用いて単離し、Big-Dye（アプライドバイオシステムズ社製）シークエンシングプロトコルを用いて分析した。結果は、図４に示される。
【０１１５】
核酸配列
ＰＡＬＭ法、長期ＲＴ−ＰＣＲおよび５’−ＲＡＣＥの組合せによって、エンテロウイルスＰｒｉｍａ７の完全ヌクレオチド配列を得た。
【０１１６】
系統分析は、Ｐｒｉｍａ７がヒトエンテロウイルスＡ群と群を形成することを明らかにした。最も密接に関連するＡ群のメンバーは、エンテロウイルス７１およびコクサッキーＡ１６であり、これらは、核酸レベルで、全体で６８％の配列同一性を示す（表４）。Ｐｒｉｍａ７（全図におけるＥＶ７９）が群間組換体であることから系統樹の別個の枝を占めるという可能性を排除するために、我々は、ヒトエンテロウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ群の参照配列を用いて、ＳｉｍＰｌｏｔ分析13を実行した。そのゲノムＰｒｉｍａ７がＡ群のエンテロウイルスとの最も強い類似性を維持する間中、Ｐｒｉｍａ７が群間組換体ではないことを示唆した。
【０１１７】
Ｐｒｉｍａ７配列が、ＳｉｍＰｌｏｔ分析における疑問として用いられ、全ての利用可能な全長ヒトエンテロウイルスＡ群と比較される場合、これら全てと等距離であるように見える。しかしながら、もし他のいずれのＡ群エンテロウイルスが疑問配列として用いられたとしても、Ｐｒｉｍａ７は、そのゲノム全体を通して最も低い類似性を示す。これは、Ｐｒｉｍａ７が新しいＡ群エンテロウイルスであり、単に、２つの縁戚のＡ群エンテロウイルスからの組換体であるというわけではないことを示唆する。
【０１１８】
ハイブリッドゲノム
第１キメラゲノムを、コクサッキーウイルスＡ１６（ＮＣ＿００１６１２）のヌクレオチド２１８７とＥＶ７９のヌクレオチド２１２９とを融合する、ＶＰ３における相互組換えによって生成した。組換えは、保存配列ＴＧＧＧＡにおいて生じ、大きいオープンリーディングフレームを維持し、ハイブリッド蛋白質を生成した。第２キメラゲノムを、エンテロウイルス７１（Ｕ２２５２２）のヌクレオチド３７７３と、ＥＶ７９のヌクレオチド３７１３とを再度融合する相互組換えによって生成し、ポリ蛋白質内でハイブリッド２ｂコード化領域を創出する。組換えは、保存配列ＡＴＧＧＡ内で生じた。
【０１１９】
非翻訳領域
最も強い配列保存は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）において遭遇する。なぜなら、おそらくこの領域が蛋白質合成の複製および開始において中枢の役割を果たしているからである22。５’ＵＴＲにおける逆方向反復は、多数の内部の塩基を対合させることができ、その結果生じる２次構造を、Ｍ−Ｆｏｌｄプログラム14を用いて予測され得る。開始コドンは、推定上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ(Internal Ribosome Entry Site)）またはリボソームランディングパッド(ribosome-landing-pad)の一部であるＣＴ豊富域（６４３〜６６０位）のすぐ下流に存在する。このＡＴＧは、相同性に基づいて開始コドンとして我々が同定するものと対応する。推定上の開始コドンに先行する他の全ての７つのＡＴＧは、フレーム外にあり、Ｍ−ｆｏｌｄ予測に従って、ヘアピンループにおいて配列される。
【０１２０】
オープンリーディングフレーム分析
６８３位のＡＴＧが開始コドンであるとすれば、我々は２１９９ＡＡのＯＲＦを得ることになる。芽細胞研究を、コード化されたポリ蛋白質の蛋白質分解開裂生成物を一時的に同定するために用いた。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
ワクチンとしてのキャプシド蛋白質
ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１15における、ならびにＥＶ７１ＶＰ１のためのポリオウイルス標的エピトープに対する中和抗体を、ワクチン生成のための第１の標的として提案した24,23。さらに、組換体ＶＰ１の線形エピトープに対するＩｇＧおよびＩｇＭ免疫応答を検出することは、エンテロウイルス７１感染の種々の段階を決定する有効な手段である24。病原性および組織屈性を決定する要素は、ＶＰ１26および５’ＵＴＲ8に局在化していた。コクサッキーウイルスＡ９に関して、保存配列モチーフＰＡＬＴＡＶＥＴＧＨＴの修飾は、結果として、感染性の子孫ウイルスを生成する能力を低下させる1。エンテロウイルス７９ＶＰ１が類似の配列モチーフ（赤色字，黄色背景）を含有するので、我々は、保存配列モチーフ（赤色で示される）の修飾を、弱毒化した株を得るためのツールとして断言することができた。さらに、ＶＰ１の３次構造は、小さい疎水性分子（ポケット因子）を通常含有する無極性ポケットをかくまう22。新しい抗ウイルス物質は、この無極性ポケットを標的とし、これは、ポケット因子を置換し、ウイルスゲノムの脱殻と干渉する。我々は、組換体ＶＰ１を、かかる抗ウイルス化合物のためのスクリーニングツールとして断言することができた。ＶＰ１を、親和性標識蛋白質（Ｈｉｓ標識および／またはＳｔｒｅｐＩＩ標識）として適切な微生物宿主（たとえば、大腸菌(Escherichia coli)）において発現させることができた。ｃＤＮＡをコード化するＶＰ２、ＶＰ３およびＶｐ１蛋白質は、オリゴヌクレオチドのペアであるＶＰ２−ＶＰ２Ｒ、ＶＰ３Ｆ−ＶＰ３ＲおよびＶＰ１Ｆ−ＶＰ１Ｒをそれぞれ用いてＥＲＴ−ＰＣＲによって増幅されることができる。ＰＣＲプライマは、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２部位を、それぞれ３つ全てのアンプリコンの５’末端および３’末端に加える。その結果として生じた８１８、７８５および９３８ｂｐのＰＣＲ生成物は、ゲートウェイシステム（インビトロジェン社製）のためのエントリークローンを生成するトポイソメラーゼ仲介ライゲーションによってｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェン社製）に挿入されることができる。ゲートウェイシステムは、有効なin vitro組換え反応を通じて、ａｔｔＢ１部位とａｔｔＢ２部位との間に位置するあらゆる配列の方向性のある転移を可能とする。インビトロジェン社は、大腸菌(Escherichia coli)（たとえば、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ４９、ｐＤＥＳＴ１７）、サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)（たとえば、ｐＹＥＳ２−ＤＥＳＴ５２）、バキュロウイルス(Baculovirus)（たとえばｐＤＥＳＴ２０）のみならず、昆虫類細胞系（ｐＭＴ−ＤＥＳＴ４８）および哺乳類細胞系（たとえば、ｐＴ−ＲＥＸ−ＤＥＳＴ３１）などの多数の宿主のための発現ベクタに対応するゲートウェイを供給する。
【０１２４】
一例として、ＥＶ７９由来の、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１のためのＰＣＲｃＤＮＡフラグメントを、ｐＤＯＮＲ２０１にライゲートし、ｐＥＶ２、ｐＥＶ３およびｐＥＶ４を与えるために、ｐＴｈｉｏ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社製）ゲートウェイ誘導体ｐＧＰ７に転移した。発現は、Ｎ末端Ｈｉｓ標識チオレドキシン領域を保持するＥ．ｃｏｌｉにおける、ＶＰ融合蛋白質のｐＥＶ１〜３の直接生成を構築し、この領域は、可溶性向上カセットとして、かつＣ末端ＳｔｒｅｐＩＩ親和性標識として作用する。ＨｉｓおよびＳｔｒｅｐＩＩ親和性標識は、検出および回復を促進させる。蛋白質回復の第１段階は、プロテアーゼ阻害物質の適切なカクテルを含有する緩衝液中で宿主細胞を溶解することである。あらゆる封入体は、８Ｍの尿素の存在下で音波処理によって可溶性にされる。クリアにされた溶解物を、ＮｉＮＴＡ樹脂（キアゲン社製）を含有するカラムに入れ、製造者のプロトコルに従って金属親和性精製を受けさせた。金属親和性精製の溶出液を、適切な緩衝液で希釈し、製造者（ＩＢＡゲーエムベーハー）によって指示されるように、ストレプタクチン(Streptactin)カラムに移動させた。このようにして、精製された蛋白質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成することができる。
【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
【表１１】
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【０１２７】
２Ａプロテアーゼは、ポリ蛋白質からのそれ自身の放出と、宿主蛋白質合成を停止させた後にＩＲＥＳ依存ウイルス翻訳が引き継ぐ宿主翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ9,21の不活性化とに触媒作用を及ぼす25。この機能に干渉するあらゆる化合物を、抗ウイルス物質として用いることができた。
【０１２８】
コクサッキー２Ｂの発現は、膜透過性を高め、これによって細胞内Ｃａ２＋ホメオスタシスを崩壊させ、結局、ウイルス子孫の放出を可能とする膜損傷を生じさせる26。この機能を干渉するあらゆる化合物を、抗ウイルス物質として用いることができた。
【０１２９】
３ＢまたはＶＰｇ：この蛋白質は、ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端に共有結合して付着される。
【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
ＥＶ７９配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用例
発現ベクタｐＬＸＲＮ（ジェンバンク(GenBank)受託番号ＡＦ１１３９６８）は、ポリリンカーにクローン化されるあらゆるｃＤＮＡの発現を促進するレトロウイルスの長い末端反復（Long terminal Repeat，ＬＴＲ）を用いる。ＬＴＲ活性は、バイシストロン性ｍＲＮＡの転写を生じさせ、これの第１オープンリーディングフレームは、発現されるべき蛋白質をコード化し、第２オープンリーディングフレームは、真核細胞のネオマイシン選択マーカーをコード化する。第１および第２のＯＲＦは、ＩＲＥＳ由来の脳心筋炎ウイルスによって分離され、これはネオマイシン耐性の有効な翻訳を確実にする。
【０１３２】
ＥＶ７９ＩＲＥＳによってＥＭＣＶＩＲＥＳを交換するために、第１に、ＮｃｏＩ部位は、ネオマイシン耐性遺伝子の開始コドンにおいて導入されなければならない。この制限部位は、Quickchangeキットを製造者（ストラタジーン(Stratagene)社）の取扱説明書に従って用いて、オリゴヌクレオチドｐＬＸＲＮ１および２を使用して、部位に方向付けられた突然変位生成によって生成される。その結果生じるｐＬＸＲＮ誘導体は、ＢａｍＨＩで部分的におよび完全に消化されたＮｃｏＩである。ＥＶ７９ＩＲＥＳ（ＥＶ７９ヌクレオチド１〜７４６位，図１９）は、プライマＩＲＥＳ５およびＩＲＥＳ３を用いてＲＴ−ＰＣＲによってＥＶ７９含有臨床試料から増幅されることができ、同時に、ＢａｍＨＩ部位を５’末端に、ＢｓｐＬＵ１１Ｉ部位を、ポリ蛋白質開始コドンにおいて加える。その結果生じる７６２ｂｐのアンプリコンを、ＢａｍＨＩ−ＢｓｐＬＵ１１Ｉで消化し、突然変異ｐＬＸＲＮにライゲートする。その結果生じる構造は、すなわちｐＥＶ７９であり、ここにおいてＥＭＣＶＩＲＥＳは、それのＥＶ７９相同分子種(artholog)によって置換される。ｐＥＶ７９は、前述したように、哺乳類細胞系にトランスフェクトするために用いられ得る。
【０１３３】
【表９】
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【０１３４】
サル由来のＥＶ７９
我々は、ヒトエンテロウイルスの新種を発見した。ＥＶ７９は、ＶＰ１由来の系統樹内の他と区別可能な枝を占める。ＶＰ１配列の一般的な群、主要なピコルナウイルス抗原は、抗原型に関連していることが実証された5,17。近年、新しいサルピコルナウイルス属およびいくつかの新種がＶＰ１蛋白質整列に単に基づいて提案された18。したがって、ＥＶ７９はまた、新しいエンテロウイルス抗原型を示さなければならない。ＶＰ２を基礎とする全長のポリ蛋白質由来の系統樹においても、ＥＶ７９は、最も密接に関連するＡ群エンテロウイルス（たとえばコクサッキーＡ１６およびエンテロウイルス７１）から区別可能なままであり、これは、新規なエンテロウイルスを発見したという我々の主張をさらに補強する。ＳｉｍＰｌｏｔ分析は、ゲノム全体を通して、ＥＶ７９が他の全てのヒトエンテロウイルスと異なることを示し、これは、ＥＶ７９が種間組換えによって生じる可能性を排除する。
【０１３５】
すでに、サルウイルスＡ１３、ＳＶ１９、２５、３５、４３および４６とＡ群ヒトエンテロウイルス（たとえばコクサッキーＡ１６およびＥＶ７１）との密接な関係は、ヒトへの感染能に関する推測を以前から促進させてきた18。ヒト単離ＥＶ７９の、これらのサルウイルスとのさらに密接な関係は、人畜共通感染能を証明することができた。
【０１３６】
参考文献リスト
1. Caro, V., S. Guillot, F. Delpeyroux, and R. Crainic. 2001. Molecular strategy for 'serotyping' of human enteroviruses. J. Gen. Virol. 82:79-91.
2. Oberste, M. S., K. Maher, D. R. Kilpatrick, M. R. Flemister, B. A. Brown, and M. A. Pallansch. 1999. Typing of human enteroviruses by partial sequencing of VP1. J. Clin. Microbiol. 37:1288-1293.
3. Oberste, M. S., K. Maher, and M. A. Pallansch. 2002. Molecular phylogeny and proposed classification of the simian picorna viruses. J. Virol. 76:1244-1251.
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ＥＶ７９の１５０ａａペプチド配列に基づく系統発生解析のＮＪ系図。距離（Distance）：ｐ−距離（p-distance）；ブートストラップテスト：５００
【図２Ａ】ＥＶ７９の５’ＵＴＲ領域
【図２Ｂ】ＥＶ７９のＶＰ４およびＶＰ２領域
【図３】ＥＶ７９から翻訳されたＶＰ４およびＶＰ２領域のアミノ酸配列
【図４】特異的ＲＴ−ＰＣＲを用いた糞便試料のスクリーニング
【図５】オリゴヌクレオチドおよびオープンリーディングフレームの位置を示す部分的なＰｒｉｍａ７遺伝子の制限地図。
【図６】ＥＶ７９およびヒトエンテロウイルス間の核酸およびアミノ酸配列の相同性。
【図７】バイオセンサ実験サイクル
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図４−１】
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【図５】
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【図６】
2007513604.tif 000023
【図７】
2007513604.tif 000024
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007513604.tif 000027
【図１１】
2007513604.tif 000028
【図１２】
2007513604.tif 000029
【図１３】
2007513604.tif 000030
【図１４】
2007513604.tif 000031
【図１５−１】
2007513604.tif 000032
【図１５−２】
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【図１６】
2007513604.tif 000034
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2007513604.tif 000043
【図２２−２】
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【国際調査報告】
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