(57)【要約】本発明はコラーゲン合成促進剤及びこれを含む皮膚外用剤組成物に関し、より詳しくは、下記の式１で示される化合物の中から選択される１種以上を有効成分として含むコラーゲン合成促進剤及び下記の式１で示される化合物の中から選択される１種以上のコラーゲン合成促進成分を含む皮膚外用剤組成物に関するものである。   [式１]2007508369.tif 000027                                ［式１］（式１において、Ｒは水素、メトキシ基または３-メチル-２-ブテニル基である。）【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で示される化合物の中から選択される１種以上を有効成分として含むコラーゲン合成促進剤:
【化１】
2007508369.tif 000025
［式１］
（式１において、Ｒは水素、メトキシ基または３-メチル-２-ブテニル基である）。
【請求項２】
下記式１で示される化合物の中から選択される１種以上のコラーゲン合成促進成分を含む皮膚外用剤組成物:
【化２】
2007508369.tif 000026
［式１］
（式１において、Ｒは水素、メトキシ基または３-メチル-２-ブテニル基である）。
【請求項３】
前記式１で示される化合物が、全組成物に対して０．０００００１重量％〜１０重量％の範囲で含まれる、請求項２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
粉末、ゲル、軟膏、クリームまたは液状の剤形の中から選択される、請求項２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
クリーム、泡沫剤、化粧水、パック、皮膚柔軟水、乳液、ファンデーション、メーキャップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄剤、入浴剤、日焼け止めクリーム、サンオイルまたはスプレー型液剤のタイプの中から選択される、請求項２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
前記皮膚外用剤組成物は皮膚シワ改善用化粧料組成物である、請求項２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項７】
前記皮膚外用剤組成物は傷治療用組成物である、請求項２に記載の皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコラーゲン合成促進剤及びこれを含む皮膚外用剤組成物に関し、より詳しくはコラーゲン合成促進効果に優れるコラーゲン合成促進剤ならびに及び皮膚シワ改善効果と傷治療効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンは、皮膚の繊維芽細胞で生成される主要構造蛋白質であって細胞間マトリックスに存在する。人体蛋白質全重量の約３０％を占める重要な蛋白質であって、堅固な３重螺旋構造を有する。コラーゲンは皮膚、腱（ｔｅｎｄｏｎ）、骨及び歯の有機物質のほとんどを占めるが、特に、骨と皮膚（真皮）にその含有量が高い。ほとんどの他の構造物では繊維状封入体として存在する。
【０００３】
コラーゲンは比較的弱い免疫原性であり、コラーゲンの螺旋構造が潜在的な抗原決定基を遮蔽するのがその原因の一部となっている。この螺旋構造はまた、コラーゲンに蛋白質分解に対する耐性を付与する。コラーゲンの主な機能としては、皮膚の機械的堅固性、結合組織の抵抗力と組織の結合力、細胞接着の支え、細胞分割と分化（生体の成長あるいは傷治療の間）の誘導などが知られている（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ等、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９０）。このようなコラーゲンは加齢及び紫外線照射による光老化に
よって減少し、これは皮膚のシワ形成と密接な関連があることが知られている（Ａｒｔｈｕｒ Ｋ．Ｂａｌｉｎら， Ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｋｉｎ， １９８９）。また、コラーゲンは傷の治療においても重要な役割を担っており、損傷された上皮でコラーゲンの合成を促進させることにより、傷を速かに傷跡なく治癒させることができる。
【０００４】
従来はコラーゲンの皮膚保湿効果及び傷治療効果を利用するために化粧品または軟膏のような皮膚外用剤組成物にコラーゲンを配合した製品が市販されていた。これらの製品はコラーゲン自体を皮膚表面に塗布するものであるが、高分子物質であるコラーゲンの経皮吸収が難しいために保湿作用または傷治療効果を期待することができなかったことから、本質的に皮膚機能の改善及び傷治療の機能を果たすとは言えなかった。
【０００５】
このような問題を解決するためにコラーゲン合成促進物質に関する関心が高まっており、従来知られているコラーゲン合成促進物質にはビタミンＣ、レチノイン酸、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ:ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、
Ｃａｒｄｉｎａｌｅ Ｇ．ら， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ４１，ｐ．４２５，１９７４）、動物胎盤に由来した蛋白質（ＪＰ８-２３１３７０）、ベツリン酸（ＪＰ８-２０８４２４）、クロレラ抽出物（ＪＰ９-４０５２３、ＪＰ１０-３６２８３、繊維芽細胞増殖促進作用）などがある。
【０００６】
しかし、これらの物質は皮膚に適用する時、刺激と発赤などの安全性の問題から使用量の制限があるか、効果が微少であるために実質的に皮膚機能の改善または傷治療の効果を期待することができない。したがって、従来の皮膚外用剤組成物よりも生体に安全であり、しかもより効果の高い新たな皮膚外用剤組成物の開発が切実に求められているのが実情である。
【特許文献１】ＪＰ８-２３１３７０
【特許文献２】ＪＰ８-２０８４２４
【特許文献３】ＪＰ９-４０５２３
【特許文献４】ＪＰ１０-３６２８３
【非特許文献１】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９０
【非特許文献２】Ａｒｔｈｕｒ Ｋ．Ｂａｌｉｎら， Ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｋｉｎ， １９８９
【非特許文献３】Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ４１，ｐ．４２５，１９７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明はこのような問題点を解決するためのものであって、本発明の目的は、コラーゲン合成の促進効果に優れたコラーゲン合成促進剤を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、皮膚シワ改善効果と傷治療効果に優れた皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は前記目的を達成するために、下記式１で示される化合物の中から選択される１種以上を有効成分として含むコラーゲン合成促進剤を提供する。
【０００９】
【化３】
2007508369.tif 000002
［式１］
【００１０】
（上式１において、Ｒは水素、メトキシ基または３-メチル-２-ブテニル基である。）
本発明はまた、前記式１で示される化合物の中から選択される１種以上のコラーゲン合成促進成分を含む皮膚外用剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のコラーゲン合成促進剤は皮膚の繊維芽細胞のコラーゲン合成を促進する効果に優れている。さらに、本発明の皮膚外用剤組成物は皮膚の弾力を向上させ、皮膚のシワを改善する効果に極めて優れ、傷治療効果と抗炎症効果、抗酸化効果にも優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明者らは皮膚シワ改善効果または傷治療効果があるコラーゲン促進剤及び皮膚外用剤組成物の有効成分として優れたコラーゲン合成促進効果を有する物質を開発し、下記の式１で示される化合物に極めて強力なコラーゲン合成の促進効果があることを発見して本発明を完成した。
【００１３】
【化４】
2007508369.tif 000003
［式１］
【００１４】
（前記の式１において、Ｒは水素、メトキシ基または３-メチル-２-ブテニル基である。
）
本発明のコラーゲン合成促進剤は前記式１で示される化合物の中から選択される１種以上を有効成分として含む。
【００１５】
前記式１で示される化合物の中で、Ｒが水素であるのがキサントトキソル（Ｘａｎｔｈｏｔｏｘｏｌ:８-ｈｙｄｒｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ）、Ｒがメトキシ基であるのが８-ヒ
ドロキシベルガプテン（８-ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｒｇａｐｔｅｎ:５-ｂｅｎｚｏｆｕｒａ
ｎａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、６，７-ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ-４-ｍｅｔｈｏｘｙ-ｄｅｌｔ
ａ-ｌａｃｔｏｎｅ）、及びＲが３-メチル-２-ブテニル基であるのがプランゲニジン（Ｐｒａｎｇｅｎｉｄｉｎ:５-Ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、６，７-ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ-４-（３-ｍｅｔｈｙｌ-２-ｂｕｔｅｎｙｌ）-ｄｅｌｔａ-ｌａｃｔｏｎ
ｅ）である。
【００１６】
前記の式１の化合物は生体に安全であり、皮膚の繊維芽細胞のコラーゲン合成を促進する効果があるためにコラーゲン合成促進剤としての使用に適しており、皮膚の弾力性を向上させる皮膚シワ改善効果及び傷治療効果が著しく優れている。
【００１７】
前記式１の化合物は主にセリ科植物の根に存在する化合物であり、多様な抽出方法によって得られる。例えば、セリ科植物であるヨロイグサの根（白し）を細かく切って、水、炭素数１〜４の無水または含水低級アルコール、酢酸エチル、アセトン、クロロホルムまたはこれらの混合物を添加して加熱抽出し、溶媒分画した後、再結晶化することによって得ることができる。
【００１８】
また、有効成分の抽出効率を上げるために、白しの主成分であるイムペラトリン（imperatorin）とクニジリン（cnidirin）を先に抽出した後、これをクライセン再配列反応（Claisen rearrangement）をさせて前記式１の化合物を得ることもできる。
【００１９】
本発明のコラーゲン合成促進剤に含まれる前記式１の化合物の含有量は特に制限されない。したがって、強力なコラーゲン合成促進効果を必要とする場合、前記化合物がコラーゲン合成促進剤中に１００重量％含まれてもよく、必要に応じて有効な含有量の範囲で自由に調節して用いることができ、例えば、０．００００１〜５重量％の範囲で含まれてもよい。
【００２０】
本発明のコラーゲン合成促進剤は多様な形態で人体に適用することができるものであり、経口または非経口方法で投与でき、薬理学的に許容される液相または固相タイプの担体をさらに含むこともできる。
【００２１】
また、本発明の皮膚外用剤組成物は前記の式１の化合物をコラーゲン合成促進成分として含む。本発明の皮膚外用剤組成物は人体に適用しても毒性がなく、優れた皮膚弾力及び皮膚のシワ改善効果と傷治療効果が得られる。
【００２２】
本発明の皮膚外用剤組成物は前記式１の化合物を組成物全重量に対して０．０００００１重量％〜１０重量％含むことができ、より好ましくは０．００１〜１０重量％、最も好ましくは０．１重量％〜１０重量％含むことができる。前記化合物の含量が０．０００００１重量％未満である場合には明確な効果を期待することができず、１０重量％を超える場合には含有量の増加に対応する効果の増加が現れない。
【００２３】
前記皮膚外用剤組成物は皮膚シワ改善用の化粧料組成物の用途として使用され、または傷治療用組成物の用途として使用され得る。
前記皮膚外用剤組成物は粉末剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤または液剤などのタイプで製造することができ、皮膚外用剤組成物に配合される一般的な成分、例えば、抗生剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、安定剤、保存料または香料などを１種以上適切に配合して使用することができる。
【００２４】
また、前記皮膚外用剤組成物はクリーム、泡沫剤、化粧水、化粧パック、皮膚柔軟水、乳液、ファンデーション、メーキャップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄剤（リンス）、入浴剤、日焼け止めクリームまたはサンオイル、スプレー型液剤などの剤形で製造することができ、化粧料組成物に配合される一般的な成分、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート化剤、色素、防腐剤または香料などを１種以上適切に配合することができる。
【００２５】
以下、本発明の更なる理解のために好ましい実施例を提示する。下記の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００２６】
キサントトキソルの抽出
１-１．メタノールを使用したキサントトキソルの抽出
白し（ヨロイグサ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ）または野当帰（Ａｎｇｅｌ
ｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ ｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ）の乾燥させた根１ｋｇをメタノール１０Lに入れ、リービッヒ還流冷却器が付けられている抽出機で、８０℃で３時間加
熱抽出して、８５ｇのメタノール抽出液を得た。溶媒分画によって前記メタノール抽出液からヘキサン画分を分離し、得られた画分をクロロホルムで３回分画して９ｇのクロロホルム画分を得た。前記得られたクロロホルム画分を数回にわたってシリカカラムクロマトグラフィを行ってキサントトキソルを含む画分０．３ｇを得て、この画分を分取用ＨＰＬＣ（Ｐｒｅｐ-ＨＰＬＣ）及び再結晶化法を使用して下記の式２のキサントトキソルを得
た。前記方法で得たキサントトキソルはＮＭＲと質量分析を通じて成分と含有量（９９．７重量％）を確認した。前記ＮＭＲスペクトルは図１（1Ｈ-ＮＭＲスペクトル）及び図２（13Ｃ-ＮＭＲスペクトル）に示され、各ピーク上に記載された数字は図１及び２の式に
記載された数字に対応する。また、前記キサントトキソルの質量スペクトルは図３に示した。
【００２７】
【化５】
2007508369.tif 000004
［式２］
【００２８】
１-２．クロロホルムを使用したキサントトキソル抽出
白しの乾燥根１ｋｇをクロロホルム１０Lに入れて、リービッヒ還流冷却器が取り付け
られた抽出機を用いて、１００℃で３時間加熱抽出してクロロホルム抽出液１２ｇを得た。前記クロロホルム抽出液をクロロホルムに溶かしてアルカリ水溶液（０．１ＭのＮａＯＨ水溶液）で溶媒分画してアルカリ水溶液可溶部を得た後、これをＨＣｌで中和した。これをクロロホルムで溶媒分画して得られたクロロホルム画分１ｇを分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用してキサントトキソルを得た。前記方法で得られたキサントトキソルはＮＭＲと質量分析によって成分と含量（９９．７重量％）を確認した。
１-３:メタノールを使用したイムペラトリン、クニジリンの抽出及び化学修飾
白し（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａまたはＡｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ）の乾燥根１ｋｇをメタノール１０Lに入れて、リービッヒ
還流冷却器が付けられた抽出機で８０℃の温度で３時間加熱抽出して８５ｇのメタノール抽出液を得た。溶媒分画を通じて前記メタノール抽出液からクロロホルムで３回分画して１１ｇのクロロホルム画分を得た。前記得られたクロロホルム画分をシリカカラムクロマトグラフィによって白しの主成分であるイムペラトリンとクニジリンを含有する画分を７ｇ得た。この画分に２５ｇのＮ，Ｎ-Ｄｉｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎを加えて２２０℃で１
時間加熱するクライセン再配列反応を行った。その生成物を５Ｎの塩酸溶液で洗浄し、クロロホルムに溶かして冷蔵放置することにより沈澱を製造した。得られた沈澱を分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用してキサントトキソルを得た。前記方法で得られたキサントトキソルはＮＭＲと質量分析によって成分と含量（９９．７重量％）を確認した。
【実施例２】
【００２９】
８-ヒドロキシベルガプテンの抽出
２-１:メタノールを使用した８-ヒドロキシベルガプテンの抽出
白し（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａまたはＡｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ）の乾燥根１ｋｇをメタノール１０Lに入れて、リービッヒ
還流冷却器が付けられた抽出機で８０℃の温度で３時間加熱抽出して、８５ｇのメタノール抽出液を得た。溶媒分画を通じて前記メタノール抽出液からヘキサン画分を分離し、得られた画分をクロロホルムで３回分画して９ｇのクロロホルム画分を得た。前記得られたクロロホルム画分を数回にわたってシリカカラムクロマトグラフィによって８-ヒドロキ
シベルガプテンを含む画分０．２ｇを得て、この画分を分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用して下記式３の８-ヒドロキシベルガプテンを得た。前記方法で得られた８-ヒドロキシベルガプテンは核磁気共鳴（ＮＭＲ）と質量分析によって成分と含量（９９．７重量％）を確認した。図４及び図５は各々前記８-ヒドロキシベルガプテンの1Ｈ-ＮＭＲスペク
トルと13ＣＮＭＲスペクトルを示しており、各ピーク上に記載された数字は図４及び５の式に記載された数字に対応する。また、図６は前記８-ヒドロキシベルガプテンの質量ス
ペクトルを示す。
【００３０】
【化６】
2007508369.tif 000005
［式３］
【００３１】
２-２:クロロホルムを使用した８-ヒドロキシベルガプテン抽出
白しの乾燥根１ｋｇをクロロホルム１０Lに入れて、リービッヒ還流冷却器が付けられ
た抽出機で１００℃の温度で３時間加熱抽出してクロロホルム抽出液１２ｇを得た。そのクロロホルム抽出液をクロロホルムに溶かしてアルカリ水溶液（０．１ＭのＮａＯＨ水溶液）で溶媒分画してアルカリ水溶液可溶部を得た後、ＨＣｌで中和した。これをクロロホルムで溶媒分画して得られたクロロホルム画分１ｇを分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用して８-ヒドロキシベルガプテンを得た。前記方法で得られた８-ヒドロキシベルガプテンは核磁気共鳴（ＮＭＲ）と質量分析によって成分と含量（９９．７重量％）を確認した。
２-３:メタノールを使用したイムペラトリン、クニジリンの抽出及び化学修飾
白し（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａまたはＡｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ
ｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ）の乾燥根１ｋｇをメタノール１０リットルに入れて、リ
ービッヒ還流冷却器が付けられた抽出機で８０℃の温度で３時間加熱抽出して８５ｇのメタノール抽出液を得た。前記メタノール抽出液から溶媒分画を通じてクロロホルムで３回分画して１１ｇのクロロホルム画分を得た。得られたクロロホルム画分をシリカカラムクロマトグラフィによって白しの主成分であるイムペラトリンとクニジリンを含有する画分、７ｇを得た。この画分に２５ｇのＮ，Ｎ-Ｄｉｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎを加えて２２０
℃で１時間加熱するクライセン再配列反応を行った。その生成物を５Ｎの塩酸溶液で洗浄し、クロロホルムに溶かして冷蔵放置することによって沈澱を製造した。得られた沈澱を分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用して８-ヒドロキシベルガプテンを得た。前記方法
で得られた８-ヒドロキシベルガプテンはＮＭＲと質量分析を通じて成分と含量（９９．
７重量％）を確認した。
【実施例３】
【００３２】
プランゲニジンの抽出
３-１:メタノールを使用したプランゲニジンの抽出
白し（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａまたはＡｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ
ｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ）の乾燥根１ｋｇをメタノール１０リットルに入れて、リ
ービッヒ還流冷却器が付けられた抽出機で８０℃の温度で３時間加熱抽出して、８５ｇのメタノール抽出液を得た。溶媒分画を通じてこのメタノール抽出液からヘキサン画分を分離し、得られた画分をクロロホルムで３回分画して、９ｇのクロロホルム画分を得た。得られたクロロホルム画分を数回にわたってシリカカラムクロマトグラフィーによってプランゲニジンを含む画分０．３ｇを得て、該画分を分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用して下記式４のプランゲニジンを得た。前記方法で得られたプランゲニジンは核磁気共鳴（ＮＭＲ）と質量分析によって成分とその含量（９９．７重量％）を確認した。図７と図８は各々前記プランゲニジンの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルと13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示してお
り、各ピーク上に記載された数字は、図７及び８の式に記載された数字に対応する。また
、図９は前記プランゲニジンの質量スペクトルを示す。
【００３３】
【化７】
2007508369.tif 000006
［式４］
【００３４】
３-２:クロロホルムを使用したプランゲニジン抽出
白しの乾燥根１ｋｇをクロロホルム１０Lに入れて、リービッヒ還流冷却器が付けられ
た抽出機で１００℃の温度で３時間加熱抽出してクロロホルム抽出液１２ｇを得た。このクロロホルム抽出液をクロロホルムに溶かしてアルカリ水溶液（０．１ＭのＮａＯＨ水溶液）で溶媒分画してアルカリ水溶液可溶部を得た後、ＨＣｌで中和した。これをクロロホルムで溶媒分画して得られたクロロホルム画分１ｇを分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用してプランゲニジンを得た。前記方法で得られたプランゲニジンは核磁気共鳴（ＮＭＲ）と質量分析によって成分と含量（９９．７重量％）を確認した。
３-３:メタノールを使用したイムペラトリン、クニジリンの抽出及び化学修飾
白し（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａまたはＡｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ
ｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ）の乾燥根１ｋｇをメタノール１０リットルに入れて、リ
ービッヒ還流冷却器が付けられた抽出機で８０℃の温度で３時間加熱抽出して８５ｇのメタノール抽出液を得た。前記メタノール抽出液から溶媒分画を通じてクロロホルムで３回分画して１１ｇのクロロホルム画分を得た。前記得られたクロロホルム画分をシリカカラムクロマトグラフィを行うことによって白しの主成分であるイムペラトリンとクニジリンを含有する画分、７ｇ得た。この画分に２５ｇのＮ，Ｎ-Ｄｉｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎを
加えて、２２０℃で１時間加熱するクライセン再配列反応を行った。その生成物を５Ｎの塩酸溶液で洗浄した後、クロロホルムに溶かして冷蔵放置することによって沈澱を製造した。得られた沈澱を分取用ＨＰＬＣ及び再結晶化法を使用してプランゲニジンを得た。前記方法で得られたプランゲニジンはＮＭＲと質量分析によって成分と含量（９９．７重量％）を確認した。
[試験例１]
キサントトキソルのコラーゲン合成促進効果試験
キサントトキソルをヒト由来の繊維芽細胞培養液に添加して細胞レベルでコラーゲン合成促進効果を調べた。合成されたコラーゲンの測定は、ＰＩＣＰ ＥＩＡキット（Ｐｒｏ
ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃ-Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓ
ａｙ ＫＩＴ）を使用して定量した。
【００３５】
キサントトキソルは最終濃度０．５μｇ/ｍL、１μｇ/ｍL、２μｇ/ｍL、５μｇ/ｍL、１０μｇ/ｍLになるように、各々ヒト由来の繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔ細胞）の培養培地に添加して１日間培養した。その後、培養液を取ってＰＩＣＰ Ｅ
ＩＡキットで各濃度における合成コラーゲンの量を、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。
【００３６】
効果の比較のために何も添加していない繊維芽細胞の培養培地（対照群）と、ビタミンＣを最終濃度５２．８μｇ/ｍLになるように添加した培養培地に対して同様な方法でコラーゲン合成の程度を測定した。
【００３７】
コラーゲン生成量は分光光度計の使用によりＵＶ吸光度として測定し、コラーゲン生成の増加率は、対照群に対する相対的なコラーゲン生成量の比率で計算してその結果を表１に示した。
【００３８】
濃度による細胞レベルにおけるコラーゲン合成促進効果（*反復数=６）
【表１】
2007508369.tif 000007
【００３９】
表１に見られるように、本発明のキサントトキソルはヒト由来の繊維芽細胞に対して優れたコラーゲン合成促進能を持っており、コラーゲン合成促進能力があると一般に知られているビタミンＣを適用した場合よりも少ない濃度でさらに優れたコラーゲン合成促進効果が得られることがわかる。
[試験例２]
８-ヒドロキシベルガプテンのコラーゲン合成促進効果試験
キサントトキソルの代わりに８-ヒドロキシベルガプテンを使用したことを除いては、
試験例１と同様な方法でコラーゲン生成量とコラーゲン生成増加率を測定し、その結果を表２に示した。
【００４０】
濃度による細胞レベルにおけるコラーゲン合成促進効果（*反復数=６）
【表２】
2007508369.tif 000008
【００４１】
表２に示されるように、８-ヒドロキシベルガプテンはヒト由来の繊維芽細胞に対して
優れたコラーゲン合成促進能があり、一般にコラーゲン合成促進能力があると知られてい
るビタミンＣを適用した場合より少ない濃度でさらに優れたコラーゲン合成促進効果が得られることがわかる。
【００４２】
[試験例３]
プランゲニジンのコラーゲン合成促進効果
キサントトキソルの代わりにプランゲニジンを使用したことを除いては、試験例１と同様な方法でコラーゲン生成量とコラーゲン生成増加率を測定しており、その結果を表３に示した。
【００４３】
濃度による細胞レベルにおけるコラーゲン合成促進効果（*反復数=６）
【表３】
2007508369.tif 000009
【００４４】
表３に示されるように、プランゲニジンはヒト由来の繊維芽細胞に対して優れたコラーゲン合成促進能があり、コラーゲン合成促進能力があることが一般に知られているビタミンＣを適用した場合より少ない濃度でさらに優れたコラーゲン合成促進効果が得られることがわかる。
[試験例４]
皮膚シワ改善効果試験
６週齢のへアレスマウスを使用して光照射によって誘発された皮膚シワに対するキサントトキソル、８-ヒドロキシベルガプテン及びプランゲニジンの皮膚シワ改善効果を試験
した。試料として実施例１〜３の方法で抽出されたキサントトキソル、８-ヒドロキシベ
ルガプテン及びプランゲニジンを１，３-ブチレングリコールにそれぞれ溶解して５ｍｇ/ｍLの試料溶液を調製した。へアレスマウスに太陽光照射装置を使用して２ ＭＥＤ（最小紅斑量Minimum Erythema Dose）で１週間に３日、１０週間照射して皮膚シワを形成させ
た。試料を添加していない１，３-ブチレングリコールで処置した対照群と５ｍｇ/ｍLの
試料溶液を１日２回０．５ｍL/ｃｍ2（キサントトキソルで２．５ｍｇ/ｃｍ2）ずつ６週
間処理した群を対象として改善程度を定性的に判断した。
【００４５】
シワ改善程度の判断は、まず、試料処理部位を肉眼と写真撮影によって肉眼判定し、判定基準は試料処理群及び対照群を試料処理前と比較し、改善なし、若干の改善、相当な改善の３段階で判定し、その結果を表４に示した。
【００４６】
マウスに対する皮膚シワ改善効果（各群の個体数=１０）
【表４】
2007508369.tif 000010
【００４７】
表４で見られるように、キサントトキソル、８-ヒドロキシベルガプテン及びプラン
ゲニジンの皮膚シワ改善効果が優れていることがわかる。
[試験例５]
抗炎症症効果試験
抗炎症効果はへアレスマウスのイアースウェリング（ｅａｒ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）方法
で評価した。６週齢のへアレスマウスを使用して各々の個体の左側耳を対照部位とし、右側耳を試験部位とし、試料を適用する前に両側耳を３回測定した。前記実施例２及び３の方法で抽出された８-ヒドロキシベルガプテン及びプランゲニジンを各々エタノールに１
重量％で溶かした後、前記溶液をマウスの右側耳に２０μL/ｅａｒずつ塗って、左側耳に
はエタノール２０μL/ｅａｒを塗った。１時間経過後、両側耳にアラキドン酸を２ｍｇ/
ｅａｒ塗った。再び１時間経過後、耳の浮腫（ｅａｒ ｅｄｅｍａ）の程度をマイクロメ
ーターを使用して３回ずつ測定した。また、抗炎症効果の比較のために一般的な抗炎症剤として知られているインドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｅ）を使用して同様な方法で抗炎症効果を測定した。
【００４８】
抗炎症効果は対照部位に対する試験部位において耳の厚さの測定値の比率として下記式１に基づいて計算した阻害率で表し、その計算結果を表５に示した。
【００４９】
【数１】
2007508369.tif 000011
【００５０】
マウスに対する抗炎症効果（各群の個体数=３）
【表５】
2007508369.tif 000012
【００５１】
表５で見られるように、本発明のキサントトキソル、８-ヒドロキシベルガプテン及
びプランゲニジンが抗炎症剤として知られたインドメタシンに劣らず、良好な抗炎症効果を示すことがわかる。
[試験例６]
コラーゲン合成による傷治療効果試験
５週齢雄性ラットを用いて、切開窓における傷部位の再生の質とその量を良好に反映する張力強度法（tension stiffness method）を使用して創傷治療効果を試験した。ラットの背中部位の毛を除去した後、メスで切開して切開部位を縫いあわせた。実施例２及び３の方法で抽出された８-ヒドロキシベルガプテン及びプランゲニジンをそれぞれエタノー
ルに１重量％溶かして調製した後、その溶液を毎日１回０．５ｍL/ｃｍ2ずつ６日間切開
部位に投与した。６日後、実験に用いたラットを屠殺して創傷部位の皮膚を摘出し、切開線に交差して１ｃｍ幅の皮膚片を個体ごとに３標本ずつ作成した後、レオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）でそれぞれの引張強さ（g/cm）を測定した。この測定された引張強さ（Ｔｅｎｓｉｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を再生されたコラーゲン繊維の強度の指標とした。引
張強さの増加率は、試料を添加していないエタノールのみを適用した対照群の引張強さを１００％として、それに対する相対強度で示した。測定の結果を表６に示す。
【００５２】
ラットにおける創傷治癒効果
【表６】
2007508369.tif 000013
【００５３】
[試験例７]
抗酸化効果試験
８-ヒドロキシベルガプテン及びプランゲニジンの抗酸化効果の測定は１，１-ジフェニル-２-ピクリルヒドラジル（１，１-ｄｉｐｈｅｎｙｌ-２-ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙ
ｌ、ＤＰＰＨ）を使って測定した。各試料のラジカル消去活性は分光光度計を用いて５１７ｎｍの吸光度を測定することによって計算した。前記実施例２及び３の方法で抽出された８-ヒドロキシベルガプテン及びプランゲニジンを、それぞれ３μｇ/ｍL、５μｇ/ｍL
、１０μｇ/ｍL、１２μｇ/ｍL、５０μｇ/ｍL、８０μｇ/ｍL、１００μｇ/ｍLの濃度に調製した。これらの試料液アリコート、５００μLと１．５×１０-4Ｍ濃度のＤＰＰＨメ
タノール溶液５００μLとを混合して検液とした。製造後３０分間置いた検液の残ってい
るＤＰＰＨ量を、５１７ｎｍで分光光度計を用いて測定した。検液の測定値から試料固有の吸光度値を差し引くために、同一濃度の試料液を５１７ｎｍで測定した。１．５×１０-4Ｍ濃度のＤＰＰＨメタノール溶液５００μLをメタノール５００μLと混合して３０分間放置した液を対照群として用いた。各試料のラジカル消去能は次式２で計算した。
【００５４】
【数２】
2007508369.tif 000014
【００５５】
各試料の濃度別ラジカル消去能は、各濃度におけるラジカル消去能と関係のある値である相関係数（Ｒ）を求め、ＤＰＰＨを５０％除去する値であるＩＣ ５０を算出した。ま
た、抗酸化効果の比較のためにビタミンＣについて同様の実験を行って下記表７にその計算値を示した。
【００５６】
ＤＰＰＨ方法による抗酸化効果
【表７】
2007508369.tif 000015
【００５７】
表７に見られるように、本発明の８-ヒドロキシベルガプテン及びプランゲニジンは
ビタミンＣより優れた抗酸化効果を示すことがわかる。
【００５８】
以下、本発明の有効成分を含有する皮膚外用剤組成物の剤形別製造実施例を説明する。[実施例４〜６及び比較例１]
化粧料エッセンス
下記表８のような組成を有する化粧料エッセンスを製造した。
【００５９】
【表８】
2007508369.tif 000016
【００６０】
[試験例８]
パネルテストによる化粧料エッセンスのシワ改善効果試験
実施例４〜６と比較例１の化粧料エッセンスについて、その皮膚シワ改善効果に関するパネルテストを実施した。
【００６１】
３５才から５０才までの健康な女性６０名を１５名ずつ４つの群に区分し、１群は実施例４のエッセンスを、２群は実施例５のエッセンスを、３群は実施例６のエッセンスを、４群は比較例１のエッセンスを、顔面部に毎日１回、３ヶ月間塗布した。３ヶ月後に皮膚シワの改善程度を被験者のアンケート調査を通じて評価した。
【００６２】
被験者のアンケートは、皮膚シワ改善及び皮膚弾力増進について使用前と比較して、改善なし、若干の改善、相当な改善の３段階で判定し、その結果を表９に示す。
【００６３】
本発明による実施例の皮膚シワ改善効果（アンケート調査）
【表９】
2007508369.tif 000017
【００６４】
表９に見られるように、本発明による実施例４〜６のエッセンスを用いた場合、皮膚シワ改善効果が優れていることがわかる。
[試験例９]
画像分析による化粧料エッセンスのシワ改善効果試験
試験例８と同様な方法で３５才から５０才の健康な女性を対象として前記実施例４〜６と比較例１の化粧料エッセンスの皮膚シワ改善効果に関するパネルテストを実施し、ビデオ画像分析によって前記実施例４〜６及び比較例１のシワ改善効果を調べた。
【００６５】
シワのビデオ画像分析による評価は、実験が始まる前に、目の下のレプリカ（ｒｅｐｌｉｃａ）を採取し（Ｘａｎｔｏｐｒｅｎ、Ｂａｙｅｒ）、実験終了直後にもレプリカを目の下の同一部位で採取して、画像分析により皮膚シワの２次元的解析で皮膚シワの密度を測定した。
【００６６】
画像分析に基づく皮膚シワ密度の減少率は、エッセンスを使用する前の皮膚シワ密度に対する使用後の皮膚シワ密度の比についての平均値であり、測定結果を表１０に示した。
【００６７】
皮膚シワ改善効果（画像分析）
【表１０】
2007508369.tif 000018
【００６８】
表１０からわかるように、本発明による実施例４〜６のエッセンスを使用した場合、皮膚シワの密度が比較例１の化粧料組成物に比べて著しく減少した。
【００６９】
また、前記試験過程で実施例４〜６のエッセンスによる皮膚刺激や副作用は発見されなかった。
[実施例７〜９及び比較例２]
皮膚外用軟膏
下記表１１のような組成を含む皮膚外用軟膏を製造した。
【００７０】
【表１１】
2007508369.tif 000019
【００７１】
[実施例１０〜１２及び比較例３]
化粧料クリーム
下記表１２のような組成を含む化粧料クリームを製造した。
【００７２】
【表１２】
2007508369.tif 000020
【００７３】
[実施例１３〜１５及び比較例４]
柔軟化粧水
下記表１３のような組成を含む柔軟化粧水を製造した。
【００７４】
【表１３】
2007508369.tif 000021
【００７５】
[実施例１６〜１８及び比較例５]
栄養化粧水
下記表１４のような組成を含む栄養化粧水を製造した。
【００７６】
【表１４】
2007508369.tif 000022
【００７７】
[実施例１９〜２１及び比較例６]
化粧料パック
下記表１５のような組成を含む化粧料パックを製造した。
【００７８】
【表１５】
2007508369.tif 000023
【００７９】
[実施例２２〜２４及び比較例７]
男性用スキン柔軟剤
下記表１６のような組成を含む男性用スキン柔軟剤を製造した。
【００８０】
【表１６】
2007508369.tif 000024
【００８１】
以上のように、有効成分としてキサントトキソル、プランゲニジンおよび８-ヒドロキ
シベルガプテンの中から選択される１種以上を含むコラーゲン合成促進剤は、皮膚の繊維芽細胞に対して著しく強力なコラーゲン合成促進効果を示しており、これを含む皮膚外用剤組成物はシワ改善効果と傷治療効果及び抗炎症症効果、抗酸化効果が極めて優れていることがわかった。
【００８２】
前記皮膚外用剤組成物は皮膚のシワ改善または傷治療効果のある粉末剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤または液状などの剤形で製造することができる。さらにクリーム、泡沫剤、化粧水、パック、柔軟水、乳液、ファンデーション、メークアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄剤、入浴剤、日焼け止めクリーム或いはサンオイル、スプレイ型液剤などの剤形でも製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】実施例１で得られたキサントトキソルの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例１で得られたキサントトキソルの13Ｃ-ＮＭＲスペクトルである。
【図３】実施例１で得られたキサントトキソルの質量スペクトルである。
【図４】実施例２で得られた８-ヒドロキシベルガプテンの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルである。“Methoxy”はメトキシ基である。
【図５】実施例２で得られた８-ヒドロキシベルガプテンの13Ｃ-ＮＭＲスペクトルである。“Methoxy”はメトキシ基である。
【図６】実施例２で得られた８-ヒドロキシベルガプテンの質量スペクトルである。
【図７】実施例３で得られたプランゲニジンの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルである。
【図８】実施例３で得られたプランゲニジンの13Ｃ-ＮＭＲスペクトルである。
【図９】実施例３で得られたプランゲニジンの質量スペクトルである。
【図１】
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【図２】
2007508369.tif 000029
【図３】
2007508369.tif 000030
【図４】
2007508369.tif 000031
【図５】
2007508369.tif 000032
【図６】
2007508369.tif 000033
【図７】
2007508369.tif 000034
【図８】
2007508369.tif 000035
【図９】
2007508369.tif 000036
【国際調査報告】
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