(57)【要約】本発明は、組織因子に結合し、組織因子の活性を阻害する化合物と化学療法化合物との組み合わせを含む新規医薬組成物に関する。本発明は、病態生理的組織因子（ＴＦ）機能に関連する疾病又は疾患の予防又は治療におけるそれらの使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、
（ｉｉ）前記第一の因子とは異なる、抗癌化合物である第二の因子と、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、前記第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の必要に応じて使用されるさらなる因子と、
（ｉｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と（但し、前記第一の因子がＴＦに対する抗体であれば、前記第二の因子及び必要に応じて使用されるさらなる因子はＩＬ−２１、その類縁体又は誘導体ではない。）、
を含む、病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するのに有用な医薬組成物。
【請求項２】
前記第二の化合物が細胞毒性化合物である、請求項１に記載の薬学的薬学的化合物。
【請求項３】
前記第二の化合物が、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ザミル、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、組織因子に対する抗体、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ；killer Ig-like receptor）及びラミニン−５、ｃｄｃ−２５、ＮＳＣ６６３２８４、フラボピリドール、７−ヒドロキシスタウロスポリン、ロスコビチン、ＢＩＢＲ１５３２  ＳＯＴ−０９５、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ；TNF-related apoptosis-inducing ligand）／アポトーシス−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＮＦα及びアンチセンスＢｃｌ−２、アバスチン、ネオバスタット、サリドマイド、ＰＴＫ７８７、ＺＫ２２２５８４、ＺＤ−６４７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ５４７，６３２、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＣＥＰ−７０５５、ＮＭ−３、ＳＵ１１２４８、ＱＳ２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、リポ多糖及びポリイノシン：ポリシチジン酸、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＰＥＧ−ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド又は幹細胞因子、自家ＴＩＬ、シスプラチン、タモキシフェン、ＤＴＩＣ、カルムスチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、テモゾロミド、ビンデシン、５−フルオロウラシル、ホテムスチン、自家ＬＡＫ細胞及びゲムシタビンからなる群から選択される化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物の質量による比が、約１００：１ないし約１：１００（ｗ／ｗ）である、請求項１ないし３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物の重量比が、約１：９０ないし約１：１（ｗ／ｗ）である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第一の因子が不活性なＶＦＩＩａポリペプチドである、請求項１ないし５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記不活性なＶＦＩＩａポリペプチドが、活性部位において触媒的に不活性化された野生型ヒトＦＶＩＩａ又はその断片である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記不活性なＦＶＩＩａポリペプチドが、活性部位において触媒的に不活性化された野生型ヒトＦＶＩＩａである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＦＶＩＩａポリペプチドが、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、トシル−Ｌｙｓ−クロロメチルケトン、２，４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、フッ化フェニルメチルスルホニルからなる群から独立に選択されるクロロメチルケトン阻害剤を用いて、活性部位において触媒的に不活性化される、請求項１ないし８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記第一の因子が、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する抗体である、請求項１ないし５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒト凝固因子ＶＩＩａのヒトＴＨへの結合を阻害する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記エピトープが、残基Ｔｒｐ４５、Ｌｙｓ４６及びＴｙｒ９４の一又は複数を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０ないし１２の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１０ないし１３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗体がＦａｂ断片である、請求項１０ないし１４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗体がＦ（ａｂ）２断片である、請求項１０ないし１４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、請求項１０ないし１４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗体が一本鎖Ｆｖ断片である、請求項１０ないし１４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、１０−１５ないし１０−８Ｍの範囲内の、ヒトＴＦへの結合に対するＫｄを有する、請求項１０ないし１１８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記抗体が、１０−１５ないし１０−１０Ｍの範囲内の、ヒトＴＦへの結合に対するＫｄを有する、請求項１９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記第二の因子が、タンパク質イオノフォア、細胞分裂阻害剤、化学療法化合物、アポトーシスを誘導する化合物、放射性核種を含有する化合物、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＬＮＡからなる群から独立に選択されるアンチセンスヌクレオチド分子からなる群から選択される、請求項１ないし２０の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記第二の因子が細胞毒性タンパク質又はペプチドを含む、請求項１ないし２０の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
病態生理学的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を治療するための医薬の製造のための、抗癌剤である第二の因子と組み合わされたＴＦアンタゴニストである第一の因子の使用。
【請求項２４】
前記第一の因子が、請求項６ないし２０の何れか一項に記載されている、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記第二の因子が、請求項２１ないし２２の何れか一項に記載されている、請求項２３ないし２４の何れか一項に記載の使用。
【請求項２６】
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、
（ｉｉ）前記第一の因子とは異なる、抗癌化合物である第二の因子と、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、前記第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の必要に応じて使用されるさらなる因子と、
（ｉｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、治療的有効量の医薬組成物を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、
病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するための方法。
【請求項２７】
前記医薬組成物が請求項１ないし２２の何れか一項に記載されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである、第一の因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
（ｉｉ）抗癌化合物である、第一の因子とは異なる第二の因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
（ｉｉｉ）抗癌剤である、第一及び第二の因子とは異なる一又は複数のさらなる因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することとを含む、
病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するための方法。
【請求項２９】
前記第一の因子が、請求項４ないし１８の何れか一項に記載されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第二の因子が、請求項２１ないし２２の何れか一項に記載されている、請求項２８又は２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
病態生理的なＴＦ機能を伴う前記疾病又は疾患が、深部静脈血栓症、慢性血栓塞栓症又はフィブリン形成を伴う疾患、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、脳卒中、癌、腫瘍転移、病的血管新生、血栓溶解、アテローム性動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄、炎症などの急性及び慢性の症状、敗血性ショック、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、低血圧症、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺塞栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、血管再狭窄、血小板沈着、心筋梗塞、血管新生、又は血栓症の危険性があるアテローム動脈硬化性血管を伴う哺乳類の予防的治療；ぜんそく、気管支炎、特発性肺繊維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、内毒素誘発の肺損傷、非細胞肺がん；炎症性大腸炎、膵炎、外傷誘発性ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、嚢胞性線維症、脳卒中、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、変形性関節症、痛風、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、炎症性腸疾患に伴う脊椎炎、若年性関節症又は若年性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染又は感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、「血管炎性症候群」に関係する関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ル・ゲネック肉芽腫症、リウマチ性多発筋腫症、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着による関節炎、偽痛風、非関節リウマチ、滑液包炎、腱鞘炎、上顆炎（テニス肘）、手根管症候群、反復使用損傷（タイピング）、混合型の関節炎、神経障害性関節疾患（シャルコー関節）、関節血症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多中心性細網組織球症、特定の疾患に関係する関節炎、サルコイドーシス、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球病及び他のヘモグロビン疾患、高リポタンパク質血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能亢進症、末端肥大症、家族性地中海熱、ビハット疾患、全身性エリトマトーデス、再発、及び何らかの先行する病的プロセスによって生じる多臓器不全である、請求項２６ないし３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、抗癌化合物である第二の因子と、必要に応じて使用される薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む薬学的キット。
【請求項３３】
前記第一の因子が、請求項６ないし２０の何れか一項に記載されている、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記第二の因子が、請求項２１ないし２２の何れか一項に記載されている、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織因子に結合し、組織因子の活性を阻害する化合物と、抗癌化合物である別の化合物との組み合わせを含む新規組成物に関する。本発明は、新規医薬組成物、並びに癌、炎症、アテローム性動脈硬化及び虚血／再灌流を含む、病態生理的組織因子（ＴＦ）機能に関連する疾病又は疾患の予防又は治療におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子（ＴＦ）は、血漿凝固因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）に対する細胞膜貫通受容体であり、細胞表面上でのＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成は、インビボでの凝固カスケードの引き金を引く。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、凝固因子ＩＸ及びＸを効率的に活性化する。生じたプロテアーゼ因子Ｘａ（ＦＸａ）は、プロトロンビンをトロンビンへと活性化し、次いで、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンマトリックスへと変換する。
【０００３】
通常、ＴＦは、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞など、血液と接触していない数多くの血管外細胞種の表面上に恒常的に発現されているが、内皮細胞及び単球など、血液と接触する細胞の表面上には発現されていない。しかしながら、ＴＦは、癌、炎症、アテローム性動脈硬化及び虚血／再灌流内の病状の進行にＴＦが関与していると考えられていると考えられている様々な病態生理学的症状においても発現される。このように、ＴＦは、現在、増加された発現を伴う症状における治療的介入に対する標的として認識されている。
【０００４】
ＦＶＩＩａは、インビボでの止血の複雑な制御に関与している、５０キロダルトン（ｋＤａ）ビタミンＫ依存性の二本鎖血漿セリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩａは、その一本鎖チモーゲンであり、血漿中に約０．５μｇ／ｍＬで存在する第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）から得られる単一ペプチド結合のタンパク質分解から生成される。チモーゲンは、触媒として不活性である。チモーゲンＦＶＩＩの、活性化された二本鎖分子への変換は、内部ペプチド結合の切断によって起こる。カルシウムイオンの存在下で、ＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩａに対する補因子として作用する露出されたＴＦに対して、高い親和性で結合し、その基質であるＦＶＩＩ、第ＩＸ因子及びＦＸのタンパク質分解による活性化を増強する。
【０００５】
凝固プロセスの阻害剤としての、その確立された役割に加えて、ＴＦは、最近、ＴＦの細胞質ドメインの細胞骨格との相互作用によって、又はＦＶＩＩａ−プロテアーゼ依存性シグナル伝達を補助することによって、細胞内活性の媒介物質として機能することが示された。このような活性は、少なくとも部分的には、腫瘍の発育、転移及び血管新生におけるＴＦの推定される役割にとって必要とされる可能性がある。ＴＦ活性の細胞曝露は、血管損傷の危険がある際には有利であるが、これら様々な病状に存在するので、暴露が持続されると致命的となり得る。このため、健康を維持する上でＴＦ機能の発現を制御することは極めて重要である。
【０００６】
活性化されたＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａｉ）は、触媒として不活性であるように修飾されたＦＶＩＩａである。このように、ＦＶＩＩａｉは、ＦＸのＦＸａへの変換を触媒することができないが、活性な内在性ＦＶＩＩａと競合して、ＴＦに強固になお結合することができ、これによって、ＴＦ機能を阻害する。
【０００７】
国際特許出願ＷＯ  ９２／１５６８６、ＷＯ  ９４／２７６３１、ＷＯ  ９６／１２８００、ＷＯ  ９７／４７６５１は、ＦＶＩＩａｉ及びその使用に関する。国際特許出願ＷＯ  ９０／０３３９０、ＷＯ  ９５／００５４１、ＷＯ  ９６／１８６５３及び欧州特許ＥＰ５００８００は、ＴＦ／ＦＶＩＩａアンタゴニスト活性を有するＦＶＩＩａ由来ペプチドを記載する。国際特許出願ＷＯ  ０１／２１６６１は、ＦＶＩＩ及びＦＸａの二価阻害剤に関する。
【０００８】
Hu Z and Garen A (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98; 12180-12185, Hu Z and Garen A (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97; 9221-9225, Hu Z and Garen A (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96; 8161-8166、及び国際特許出願ＷＯ  ０１０２４３９は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域と変異ＦＶＩＩポリペプチドとを含む、ＴＦに結合するが、血液凝固を開始しない免疫抱合体に関する。
【０００９】
さらに、国際特許出願ＷＯ  ９８／０３６３２号は、一又は複数のＧ共役型受容体に対する親和性を有する二価アゴニストを記載し、「Burgess, L.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8348-8352 (July 1999)」は、「ヒト肺トリプターゼの強力な選択的非ペプチド性阻害剤」を記載している。
【発明の概要】
【００１０】
比較的低用量で病態生理的ＴＦ機能を効率的に阻害し、及び望ましくない副作用を生じない、改善された組み合わせ療法に対する必要性が、本分野においてなお存在する。従って、病態生理学的ＴＦ機能に対して特異的に作用し、同時に、患者中で抗癌反応を惹起する薬学的組み合わせを提供することが本発明の目的である。本発明は、広い側面において、ＴＦアンタゴニストによる組み合わせ療法に関する。
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、ＴＦアンタゴニストと抗癌化合物とを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、ＴＦアンタゴニストに関連する疾病及び疾患の治療における、医薬組成物の使用にも関する。
【００１３】
第一の側面において、本発明は、
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、
（ｉｉ）前記第一の因子とは異なる、抗癌化合物である第二の因子と、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、前記第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の必要に応じて使用されるさらなる因子と、
（ｉｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と（但し、前記第一の因子はＴＦに対する抗体であり、前記第二の因子及び必要に応じて使用されるさらなる因子はＩＬ−２１、その類縁体又は誘導体ではない。）、
を含む、病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するのに有用な医薬組成物に関する。
【００１４】
第二の側面において、本発明は、病態生理学的ＴＦ機能に関連する疾病又は疾患を治療するための医薬の製造のための、抗癌化合物である第二の因子と組み合わせたＴＦアンタゴニストである第一の因子の使用に関する（但し、前記第一の因子はＴＦに対する抗体であり、前記第二の因子及び必要に応じて使用されるさらなる因子はＩＬ−２１、その類縁体又は誘導体ではない）。
【００１５】
第三の側面において、本発明は、（ｉ）ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、
（ｉｉ）前記第一の因子とは異なる、抗癌化合物である第二の因子と、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、前記第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の必要に応じて使用されるさらなる因子と、
（ｉｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と（但し、前記第一の因子はＴＦに対する抗体であり、前記第二の因子及び必要に応じて使用されるさらなる因子はＩＬ−２１、その類縁体又は誘導体ではない。）、
を含む、治療的有効量の医薬組成物を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するための方法に関する。
【００１６】
さらなる側面において、本発明は、
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである、第一の因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
（ｉｉ）抗癌化合物である、第一の因子とは異なる第二の因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、第一及び第二の因子とは異なる一又は複数のさらなる因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと（但し、前記第一の因子はＴＦに対する抗体であり、前記第二の因子及び必要に応じて使用されるさらなる因子はＩＬ−２１、その類縁体又は誘導体ではない。）、
を含む、病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するための方法に関する。
【００１７】
さらなる側面において、本発明は、ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、抗癌化合物である第二の因子と、必要に応じて使用される薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む薬学的キットに関する。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、
（ｉｉ）前記第一の因子とは異なる、抗癌化合物である第二の因子と、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、前記第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の必要に応じて使用されるさらなる因子と、
（ｉｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と、
を含む、治療的有効量の医薬組成物を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療するのに有用な医薬組成物に関する。
【００１９】
さらなる側面において、本発明は、病態生理学的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を治療するための医薬の製造のための、抗癌化合物である第二の因子と組み合わされたＴＦアンタゴニストである第一の因子の使用に関する。
【００２０】
さらなる側面において、本発明は、
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである第一の因子と、
（ｉｉ）前記第一の因子とは異なる、抗癌化合物である第二の因子と、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、前記第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の必要に応じて使用されるさらなる因子と、
（ｉｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と、
を含む、治療的有効量の医薬組成物を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するための方法に関する。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は、
（ｉ）ＴＦアンタゴニストである、第一の因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
（ｉｉ）抗癌化合物である、第一の因子とは異なる第二の因子の治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
（ｉｉｉ）抗癌化合物である、第一及び第二の因子とは異なる一又は複数の因子のさらなる治療的有効量を、病態生理的なＴＦ機能を伴う疾病又は疾患の予防又は治療を必要とする哺乳動物に投与することと、
を含む、病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患を予防又は治療するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本発明は、別の抗癌剤と組み合わせたＴＦアンタゴニストに関する。ＴＮアンタゴニストは、高親和性と特異性でＴＦを結合するが、血液凝固を開始しない。本発明の一実施形態では、前記ＴＦアンタゴニストは、活性部位において化学的に不活性化された第ＦＶＩＩａ因子ポリペプチドである。本発明の別の実施形態では、ＴＦアンタゴニストは、ＴＦに対する抗体である。本発明の一実施形態では、ＴＦアンタゴニストは、ＴＦに対する完全なヒト抗体である。一実施形態において、前記ヒト抗体は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する。一実施形態では、前記好ましいエピトープは、残基Ｔｒｐ４５、Ｌｙｓ４６及びＴｙｒ９４の一又は複数を含む。一実施形態では、好ましいエピトープは、残基Ｔｒｐ４５を含む。一実施形態では、好ましいエピトープは、残基Ｌｙｓ４６を含む。一実施形態では、好ましいエピトープは、残基Ｔｙｒ９４を含む。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態では、単離されたヒト抗体は、ＴＦとＦＶＩＩａ間のインターフェース内のエピトープに結合する。
【００２４】
一実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態において、前記抗体はヒトモノクローナル抗体である。一実施形態において、前記抗体はヒトに対する抗体である。
【００２５】
本明細書において使用される「ＴＦアンタゴニスト」という用語は、ＴＦに直接結合し、ＴＦによって媒介されるＦＶＩＩａ活性を阻害する任意の化合物を意味するものとする。
【００２６】
本明細書において使用される「ＴＦによって媒介されるＦＶＩＩａ活性」という用語は、任意のＴＦ依存性活性を意味する。本用語は、ＴＦによって媒介される凝固活性及びＴＦによって媒介されるシグナル伝達活性（例えば、ＴＦによって媒介されるＭＡＰＫシグナル伝達）の両方を含むものとする。一実施形態において、ＴＦによって媒介されたＦＶＩＩａ活性は、ＭＡＰＫシグナル伝達である。
【００２７】
「ＴＦによって媒介されるＭＡＰＫシグナル伝達」という用語は、ＦＶＩＩポリペプチドのＴＦへの結合に応答した、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）又はその相同体の活性化を媒介する細胞内現象のカスケードを意味するものとする。１）細胞外調節キナーゼ（Ｅｒｋ１／２又はｐ４４／４２）、２）ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及び３）ｐ３８キナーゼという、ＭＡＰキナーゼの３つの異なる群が、哺乳動物細胞中に同定されている。
【００２８】
Ｅｒｋ１／２経路は、Ｅｒｋ１（ｐ４４）及び／又はＥｒｋ２（ｐ４２）のリン酸化を含む。活性化ＭＡＰキナーゼ、例えば、ｐ４４／４２ＭＡＰＫは、核へと転移することができ、ここで、活性化ＭＡＰキナーゼは、（Ｅｌｋ１）を含む転写因子並びにシグナル伝達物質及び転写の活性化因子（Ｓｔａｔ）をリン酸化し、活性化することができる。Ｅｒｋ１／２は、細胞質中又は核内のキナーゼｐ９０ＲＳＫもリン酸化することが可能であり、次いで、ｐ９０ＲＳＫは、幾つかの転写因子を活性化することが可能である。ＭＡＰＫシグナル伝達は、アッセイ５に記載されているように測定することができる。
【００２９】
「タンパク質キナーゼ」という用語は、ペプチド及び／又はタンパク質中のセリン及び／又はスレオニン及び／又はチロシンをリン酸化することが可能な酵素を表すものとする。        
ＴＦアンタゴニストには、活性部位において化学的に不活性化された因子ＦＶＩＩａポリペプチド、抗ＴＦ抗体、例えば、ヒトＴＦに対するヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製する方法は、国際特許出願０３／０２９２９５号に記載されており、その内容全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。国際特許出願０３／０７６４６１、ＤＫ０３／００４８１及びＤＫ０３／００４８０は、本発明に従って使用され得る異なるＴＦアンタゴニストの調製を記載しており、その内容全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本明細書において使用される「ヒト組織因子」又は「ヒトＴＦ」という用語は、野生型ヒト組織因子のアミノ酸１ないし２６３を含む完全長ポリペプチド受容体に関する。
【００３２】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原（例えば、ヒトＴＦ）に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子及びその断片を表すものとする。完全長抗体は、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互に結合された２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲ又はＶＨと略記される。）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲ又はＶＬと略記される。）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散りばめられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へと、さらに再分割することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４から配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。このため、抗原（例えば、ヒトＴＦ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の一又は複数の断片も、抗体の定義に含まれる。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。「抗体」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ  Ｉドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用し、ＶＬ及びＶＨ領域が対を成す単一のタンパク質鎖として作製し、一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-42
6:and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)を参照。）を形成するようにすることができる合成リンカーによって連結することが可能である。このような一本鎖抗体も、「抗体」という用語に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、包含される。ダイアボディとは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対を成すように強制して、２つの抗原結合部位を作出する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123参照）。ヒトＴＦは、（１）ヒトＴＦ内の単一ペプチド鎖からなるペプチド抗原決定基と、（２）各アミノ酸配列がヒトＴＦポリペプチド配列に沿ってバラバラに位置している、空間的に連続する２以上のペプチド鎖からなる立体構造的抗原決定基と、及び（３）全体的に又は部分的に、炭水化物基など、翻訳後にヒトＴＦに共有結合される分子構造からなる翻訳後抗原決定基を含む一又は複数の抗原決定基を有し得ることが理解される。
【００３３】
本明細書において使用される「ヒト抗体」及び「ヒトＴＦ抗体」という用語は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされない、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中のアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異導入によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される突然変異）を含むことができる。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなど、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列上に移植されている抗体、例えば、いわゆるヒト化抗体又はヒト／マウスキメラ抗体を含まないものとする。
【００３４】
本明細書において使用される「単離されたヒト抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないヒト抗体（例えば、ヒトＴＦを特異的に結合する単離された抗体は、ヒトＴＦ以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）を表すものとする。しかしながら、ヒトＴＦを特異的に結合する単離された抗体は、他の種から得られるＴＦ分子（以下で、さらに詳細に論述されている。）など、他の抗原に対して交叉反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことができる。
【００３５】
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖の側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性及び特異的な電荷特性を有する。
【００３６】
本明細書において使用される「免疫反応する」又は「免疫反応性」という用語は、１０−４Ｍ未満の解離定数Ｋｄで、抗体がそのエピトープに結合することを意味する。「免疫反応する」又は「免疫反応性」という用語は、適宜、「特異的に結合する」という用語と互換的に使用される。
【００３７】
本明細書において使用される「阻害する」という用語は、基準に比した任意の減少を意味する。例として、ヒト凝固因子ＶＩＩａのヒトＴＦへの結合を阻害する抗体は、抗体の不存在下で、ヒト凝固因子ＶＩＩａがヒトＴＦを結合する能力に比べて、ヒト凝固因子ＶＩＩａがヒトＴＦを結合する能力を減少させる、任意の抗体を意味する。
【００３８】
本明細書において使用される「親和性」という用語は、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の強度は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄ（［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、非結合抗原のモル濃度である。）によって測定される。親和定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。競合的阻害によってＭａｂの特異性及び親和性を決定するための好ましい方法は、「Harlow, et al., Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), and Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)」に見出すことができ、これらの参考文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
一実施形態において、ＴＦアンタゴニストは、ＦＶＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を９８％阻害するヒト抗体である。一実施形態において、前記ヒト抗体は、ＦＶＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を９０％阻害する。一実施形態において、前記ヒト抗体は、ＦＶＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を７０％阻害する。一実施形態において、前記ヒト抗体は、ＦＶＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を５０％阻害する。一実施形態において、前記ヒト抗体は、ＦＶＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を３０％阻害する。
【００４０】
「ＦＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化」という用語は、哺乳類細胞中で、ＦＶＩＩａがＴＦに結合することによって、ＭＡＰＫシグナル伝達を誘導することを表すものとする。
【００４１】
「ＭＡＰＫシグナル伝達」という用語は、様々な細胞外刺激に応答した、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）又はその相同体の活性化を媒介する細胞内現象のカスケードを意味するものとする。１）細胞外調節キナーゼ（Ｅｒｋ１又はｐ４４／４２）、２）ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及び３）ｐ３８キナーゼという、ＭＡＰキナーゼの３つの異なる群が、哺乳動物細胞中に同定されている。Ｅｒｋ１／２経路は、Ｅｒｋ１（ｐ４４）及び／又はＥｒｋ２（ｐ４２）のリン酸化を含む。活性化ＭＡＰキナーゼ、例えば、ｐ４４／４２ＭＡＰＫは、核へと転移することができ、ここで、活性化ＭＡＰキナーゼは、（Ｅｌｋ１）を含む転写因子並びにシグナル伝達物質及び転写の活性化因子（Ｓｔａｔ）をリン酸化し、活性化することができる。Ｅｒｋ１／２は、細胞質中又は核内のキナーゼｐ９０ＲＳＫもリン酸化することが可能であり、次いで、ｐ９０ＲＳＫは、幾つかの転写因子を活性化することが可能である。
【００４２】
「タンパク質キナーゼ」という用語は、ペプチド及び／又はタンパク質中のセリン及び／又はスレオニン及び／又はチロシンをリン酸化することが可能な酵素を表すものとする。
【００４３】
「ＦＩＩａによって誘導される、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化」という用語は、哺乳類細胞中で、ＦＶＩＩａがＴＦに結合することによって、ＭＡＰＫシグナル伝達を誘導することを表すものとする。
【００４４】
「ＴＦによって媒介される凝固活性」という用語は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成、並びに、それぞれＦＩＸ及び第Ｘ因子のＦＩＸａ及びＦＸａへの活性化を通じて、ＴＦによって開始される凝固を意味する。ＴＦによって媒介される凝固活性は、ＦＸａ生成アッセイにおいて測定される。本明細書において使用される、「ＦＡｘ生成アッセイ」という用語は、ＦＸの活性化が、ＴＦ、ＦＶＩＩａ、ＦＸ、カルシウム及びリン脂質を含む試料中で測定される任意のアッセイを意味するものとする。ＦＸａ生成アッセイの例は、アッセイ１に記載されている。
【００４５】
ＴＦアンタゴニストの例には、ＦＶＩＩａｉ及びＴＦに対する阻害抗体が含まれるが、これらに限定されない。ＦＶＩＩａｉ分子中のＦＶＩＩａタンパク質分解活性の不活性化は、共有結合活性部位阻害剤（例えば、クロロメチルケトン）によって、インビトロで得られる。ＦＶＩＩａｉ分子は、野生型ＦＶＩＩの結合に比べて、ＦＶに対して増加した親和性を有する。
【００４６】
本明細書において使用される「ＴＦ提示細胞」という用語は、細胞表面の形質膜上にＴＦタンパク質が存在することを表す。ＴＦが存在する細胞膜は、ＴＦがタンパク質合成によって合成される細胞とすることができ、又は別の細胞によって合成された流出したＴＦタンパク質を含有する細胞とすることができる。
【００４７】
本明細書において使用される「病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患」という用語は、ＴＦが関連する任意の疾病又は疾患を意味する。これには、ＴＦによって媒介される凝固活性に関連する疾病又は疾患、血栓症若又は凝固異常に関連する疾病又は疾患、呼吸器疾病又は疾患及び炎症性疾病又は疾患  又は疾病又は疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
その一実施形態において、前記血栓及び凝固関連疾病又は疾患、呼吸器疾病又は疾患及び炎症性疾病又は疾患には、深部静脈血栓症、慢性血栓塞栓症又はフィブリン形成を伴う疾患、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、脳卒中、癌、腫瘍転移、病的血管新生、血栓溶解、アテローム性動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄、炎症などの急性及び慢性の症状、感染性ショック（ｓｅｐｔｉｃ  ｃｈｏｃｋ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、低血圧症、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺塞栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、血管再狭窄、血小板沈着、心筋梗塞症、血管新生、又は血栓症の危険性があるアテローム硬化性血管を伴う哺乳類の予防的治療；ぜんそく、気管支炎、特発性肺繊維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、内毒素誘発の肺損傷、非細胞肺がん；炎症性大腸炎、膵炎、外傷誘発性ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、嚢胞性線維症、脳卒中、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、変形性関節症、痛風、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｐａｔｈｒｉｓ）、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、炎症性腸疾患に伴う脊椎炎（ｅｎｔｅｒａｐａｔｈｒｉｃ）、若年性関節症又は若年性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染又は感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、「血管炎性症候群」に関係する関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ル・ゲネック肉芽腫症、リウマチ性多発筋腫症、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着による関節炎、偽痛風、非関節リウマチ、滑液包炎、腱鞘炎、上顆炎（テニス肘）、手根管症候群、反復使用損傷（タイピング）、混合型の関節炎、神経障害性関節疾患（シャルコー関節）、関節血症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多中心性細網組織球症、特定の疾患に関係する関節炎、サルコイドーシス（ｓｕｒｃｏｉｌｏｓｉｓ）、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球病及び他のヘモグロビン疾患、高リポ蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能亢進症、末端肥大症、家族性地中海熱、ビハット疾患、全身性エリトマトーデス、再発、及び何らかの先行する病的プロセスによって生じる多臓器不全が含まれる。
【００４９】
一実施形態において、前記疾病又は疾患は、呼吸器疾病及び炎症性疾病である。一実施形態において、呼吸器疾病及び炎症性疾病には、全身性炎症反応症候群、ぜんそく、気管支炎、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺繊維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、内毒素誘発の肺損傷、非細胞肺がん；炎症性大腸炎、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸窮迫症候群、膵炎、外傷誘発性ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、嚢胞性線維症、脳卒中、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、変形性関節症、痛風、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｐａｔｈｒｉｓ）、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、炎症性腸疾患に伴う脊椎炎（ｅｎｔｅｒａｐａｔｈｒｉｃ）、若年性関節症又は若年性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染又は感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、「血管炎性症候群」に関係する関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ル・ゲネック肉芽腫症、リウマチ性多発筋腫症、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着による関節炎、偽痛風、非関節リウマチ、滑液包炎、腱鞘炎、上顆炎（テニス肘）、手根管症候群、反復使用損傷（タイピング）、混合型の関節炎、神経障害性関節疾患（シャルコー関節）、関節血症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多中心性細網組織球症、特定の疾患に関係する関節炎、サルコイドーシス（ｓｕｒｃｏｉｌｏｓｉｓ）、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球病及び他のヘモグロビン疾患、高リポ蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能亢進症、末端肥大症、家族性地中海熱、ビハット疾患、全身性エリトマトーデス、再発、及び何らかの先行する病的プロセスによって生じる多臓器不全が含まれる。
【００５０】
別の実施形態において、前記疾病又は疾患は、血栓症又は凝固異常関連疾病又は疾患である。一実施形態において、血栓症又は凝固異常関連疾病には、深部静脈血栓症、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、脳卒中、腫瘍転移、炎症、敗血症ショック、低血圧症、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺塞栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、敗血症、全身性炎症反応症候群        （ＳＩＲＳ）、血管再狭窄、血小板沈着、心筋梗塞、血管新生、又は血栓症の危険性があるアテローム硬化性血管を伴う哺乳類の治療、及び先行する病理的プロセスの何れかに起因する多臓器不全などの血管の疾病及び炎症性反応が含まれる。
【００５１】
病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患は、上述されているものなどのインビボ凝固異常疾患に限定されず、透析処置、血液ろ過又は手術中の血液バイパスのようなプロセスにおいて、患者からインラインに採取された血液など、血液の体外循環から生じ得る凝固など、エクソビボでのＴＦ／ＦＶＩＩａ関連プロセスが含まれる。
【００５２】
一実施形態において、病態生理的ＴＦ機能を伴う疾病又は疾患は、癌、腫瘍増殖、腫瘍転移及び病的血管新生からなる群から選択される。
【００５３】
「癌」又は「腫瘍増殖」という用語は、嚢胞性及び充実性腫瘍の両方、骨組織及び軟組織腫瘍を含む、良性及び悪性腫瘍の両方を含む、肛門組織、胆管、膀胱、血液細胞、骨、骨（二次）、腸（結腸及び直腸）、脳、脳（二次）、乳、乳（二次）、カルチノイド、頸部、小児癌、眼、食道、頭部及び首、カポジ肉腫、腎臓、喉頭、白血病（急性リンパ芽球）、白血病（急性骨髄性）、白血病（慢性リンパ性）、白血病（慢性骨髄性）、白血病（その他）、肝臓、肝臓（二次）、肺、肺（二次）、リンパ節（二次）、リンパ腫（ホジキン）、リンパ腫（非ホジキン）、悪性黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、軟組織肉腫、胃、精巣、甲状腺、不明な原発性腫瘍、膣、外陰部、子宮中の腫瘍を含む、あらゆる形態の新生物細胞増殖を表すものと理解される。
【００５４】
軟組織腫瘍には、良性神経鞘腫モノソミー、類腱腫、脂肪芽細胞腫、脂肪腫、子宮平滑筋腫、明細胞肉腫、皮膚繊維肉腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、粘液性脂肪肉腫、脂肪肉腫、十分に分化した胞巣状横紋筋肉腫及び滑膜肉腫が含まれる。
【００５５】
具体的な骨腫瘍には、非骨化性繊維腫、単房性骨嚢胞、内軟骨腫、動脈瘤性骨嚢胞、骨芽細胞腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、骨化性線維腫及びエナメル上皮腫、巨細胞腫、線維性骨異形成、ユーイング肉腫、好酸球性肉芽腫、骨肉腫、軟骨腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫及び転移性癌が含まれる。
【００５６】
白血病とは、骨髄によって産生される白血球の癌を表す。これには、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄芽球性(ＡＭＬ)、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性(ＣＭＬ)という４つの主要な種類の白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
別の実施形態において、前記医薬は、静脈内投与用、好ましくは注射又は注入、特に注射用に調合される。
【００５８】
一実施形態では、前記医薬は、単一単位剤形で調合され、別の実施形態では、ＴＦアンタゴニストの調製物を含む第一の単位剤形及び抗癌化合物を含む第二の単位剤形の形態で調合される。
【００５９】
一実施形態において、ＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物は、約１０００：１ないし約１：１０００（ｗ／ｗ）の質量比で、薬学的製剤中に存在する。
【００６０】
「治療」及び「治療する」という用語は、何らかの症候又は病状が生じるのを予防する目的で、又は既に生じたこのような症候又は病状を治癒若しくは軽減する目的で、有効量の本発明の治療的活性化合物を送達することを意味する。このため、「治療」という用語は、予防的処置を含むものとする。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記第一の因子は、不活性なＦＶＩＩａポリペプチドである。本発明のさらなる実施形態では、前記第一の因子は、不活性なＦＶＩＩａであり、不活性なＶＦＩＩａポリペプチドは、活性部位において触媒的に不活性化された野生型ヒトＦＶＩＩａ又はその断片である。一実施形態において、前記不活性なＦＶＩＩａポリペプチドは、活性部位において触媒的に不活性化された野生型ヒトＦＶＩＩａである。一実施形態において、前記ＦＶＩＩａポリペプチドは、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、トシル−Ｌｙｓ−クロロメチルケトン、２，４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、フッ化フェニルメチルスルホニルからなる群から独立に選択されるクロロメチルケトン阻害剤を用いて、活性部位において触媒的に不活性化される。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態において、前記第一の因子は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する抗体である。一実施形態において、前記抗体は、ヒト凝固因子ＶＩＩａのヒトＴＨへの結合を阻害する。一実施形態では、前記エピトープは、残基Ｔｒｐ４５、Ｌｙｓ４６及びＴｙｒ９４の一又は複数を含む。一実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態において、前記抗体は組換え抗体である。一実施形態において、前記抗体はＦａｂ断片である。一実施形態において、前記抗体はＦ（ａｂ）２断片である。一実施形態において、前記抗体はＦ（ａｂ’）２断片である。一実施形態において、前記抗体は一本鎖Ｆｖ断片である。一実施形態において、前記抗体は、１０−１５ないし１０−８Ｍの範囲内の、ヒトＴＦへの結合に対するＫｄを有する。一実施形態において、前記抗体は、１０−１５ないし１０−１０Ｍの範囲内の、ヒトＴＦへの結合に対するＫｄを有する。
【００６３】
本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、タンパク質イオノフォア、細胞分裂阻害剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）、化学療法化合物、アポトーシスを誘導する化合物、放射性核種を含有する化合物、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＬＮＡからなる群から独立に選択されるアンチセンスヌクレオチド分子からなる群から選択される。
【００６４】
本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、細胞毒性タンパク質又はペプチドを含む。
【００６５】
本発明の一実施形態において、病態生理的なＴＦ機能を伴う前記疾病又は疾患は、深部静脈血栓症、慢性血栓塞栓症又はフィブリン形成を伴う疾患、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、脳卒中、癌、腫瘍転移、病的血管新生、血栓溶解、アテローム性動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄、炎症などの急性及び慢性の症状、敗血性ショック、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、低血圧症、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺塞栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、血管再狭窄、血小板沈着、心筋梗塞症、血管新生、又は血栓症の危険性があるアテローム硬化性血管を伴う哺乳類の予防的治療；ぜんそく、気管支炎、特発性肺繊維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、内毒素誘発の肺損傷、非細胞肺がん；炎症性大腸炎、膵炎、外傷誘発性ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、嚢胞性線維症、脳卒中、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、変形性関節症、痛風、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｐａｔｈｒｉｓ）、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、炎症性腸疾患に伴う脊椎炎（ｅｎｔｅｒａｐａｔｈｒｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、若年性関節症又は若年性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染又は感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、「血管炎性症候群」に関係する関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ル・ゲネック肉芽腫症、リウマチ性多発筋腫症、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着による関節炎、偽痛風、非関節リウマチ、滑液包炎、腱鞘炎、上顆炎（テニス肘）、手根管症候群、反復使用損傷（タイピング）、混合型の関節炎、神経障害性関節疾患（シャルコー関節）、関節血症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多中心性細網組織球症、特定の疾患に関係する関節炎、サルコイドーシス（ｓｕｒｃｏｉｌｏｓｉｓ）、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球病及び他のヘモグロビン疾患、高リポ蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能亢進症、末端肥大症、家族性地中海熱、ビハット疾患、全身性エリトマトーデス、再発、及び何らかの先行する病的プロセスによって生じる多臓器不全である。
【００６６】
本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、細胞増殖抑制剤である。本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、化学療法化合物である。本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、放射性核種を含有する化合物である。本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、アンチセンスヌクレオチド分子である。本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、メルファランである。本発明の一実施形態において、前記第二の因子は、Ｉ１２５を含有する化合物である。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態において、前記第二の因子は、細胞毒性タンパク質又はペプチドである。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態において、前記第二の因子は、アミノ酸配列（ＫＬＡＫＬＡＫ）ｎ（ｎは、１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される。）を含む。一実施形態において、ｎは２である。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態において、前記第二の因子は、アミノ酸配列（ＫＬＡＫＬＡＫ）２を有する。
【００７０】
本明細書において使用される「抗癌化合物」という用語は、癌の治療に有効な化合物を表す。これには、腫瘍細胞を死滅させ、及び／又は腫瘍のサイズを減少し、及び／又は腫瘍の増殖及び／又は拡散を抑制する化合物が含まれる。本用語は、伝統的な化学療法剤及び細胞毒性剤も包含する。
【００７１】
他の典型的な抗癌化合物には、例えば、ネオマイシン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、カルシウムイオノフォア、カルシウム流動誘導化合物、抗チュブリン薬、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びコンブレタスタチンが含まれる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、モノクローナル抗体などの抗体である。
【００７３】
ＭＡｂは、白血病及びリンパ腫並びに充実性腫瘍の治療のために開発されており、この原理に対する関心は増大しつつある。これらの抗体は、腫瘍細胞の生存にとって不可欠である機能を阻害することによって、毒性の搭載物（ｐａｙｌｏａｄ）を送達することによって、重要なシグナル伝達現象を妨げることによって、又は腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの誘導によって機能する。腫瘍細胞の死は、免疫系を「予防接種する」腫瘍抗原の放出をもたらし、二次反応を生じた後、腫瘍を標的とするように刺激する場合があり得る（すなわち、以下に記載されている、「体内予防接種」）。過剰発現された発癌遺伝子及び腫瘍特異的抗原は、開発中の多くのｍＡｂに対する重要な標的である。腫瘍抗原は、例えば、「Stauss H, Kawakami Y and Parmiani G:Tumor antigens recognized by T cells and antibodies. Taylor and Frances (2003).」に記載されている。本発明は、これらの標的に対して産生された抗体を含む。本発明は、ウイルス抗原に対して産生された抗体も包含する。
【００７４】
本発明の一実施形態において、前記抗癌化合物は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ザミル（Ｚａｍｙｌ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、組織因子に対する抗体、Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）及びラミニン−５などの抗体である。
【００７５】
一実施形態において、前記抗癌化合物は、さらなるＡＤＣＣ増強化合物、例えば、遮断抗ＫＩＲ抗体又は活性化ＮＫＧ２Ａ抗体又はＩＬ−２とさらに組み合わされる。
【００７６】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、ウイルス抗原に対する抗体である。
【００７７】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、細胞周期調節及び／又はアポトーシスの制御物質である。
【００７８】
一連の制御物質が、正常な細胞周期の維持に関与している。（ｉ）ｃｄｃ２５（非限定的な例としてＮＳＣ６６３２８４）（Pu et al (2003) J Biol Chem 278, 46877）、（ｉｉ）細胞周期を過剰刺激するサイクリン依存性キナーゼ（その非限定的な例は、フラボピリドール（Ｌ８６８２７５、ＨＭＲ１２７５；Ａｖｅｎｔｉｓ）である。）、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１、ＫＷ−２４０１；  Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ）及びロスコビチン（Ｒ−ロスコビチン、ＣＹＣ２０２；Cyclacel)-Fischer & Gianella-Borradori (2003) Exp Op Invest Drugs 12, 955-970）に総説が記載されている。）及び（ｉｉｉ）癌細胞がそのテロメアを再構築するのを助ける酵素であるテロメラーゼなどの制御物質を標的とする化合物も本発明に属し、ＢＩＢＲ１５３２  (Damm et al (2001) EMBO J 20, 6958-6968)及びSOT-095 (Tauchi et al (2003) Oncogene 22, 5338-5347)などが非限定的な例である。さらに、以下の非限定的例：ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）／アポトーシス−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮα及びアンチセンスＢｃｌ−２などアポトーシス経路を妨害する薬物が本発明に属する(Igney and Krammer (2002) Nature Rev. Cancer 2, 277-288; Makin; Dive (2003) Trends Mol Med 9, 2519; Smyth et al (2003) Immunity 18, 1-6; Panaretakis et al. (2003) Oncogene 22, 4543-4556及びこれらの中の参考文献）。
【００７９】
本発明の上記実施形態において、前記化合物は、ｃｄｃ−２５、ＮＳＣ  ６６３２８４、フラボピリドール、７−ヒドロキシスタウロスポリン、ロスコビチン、ＢＩＢＲ１５３２  ＳＯＴ−０９５、ＴＦＮ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）／アポトーシス−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮα及びアンチセンスＢｃｌ−２を含む群から選択される。
【００８０】
一実施形態において、前記抗癌化合物は、増殖因子に対する抗体など、増殖因子阻害剤である。
【００８１】
癌の治療のために、増殖因子及び増殖因子受容体に対する数多くのｍＡｂが開発中である。このため、非限定的な例として、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）ファミリーのメンバーは、多くの上皮性腫瘍中で異常に活性化されており、これは、より悪性の臨床経過と相関することが多い。これらの受容体の細胞外リガンド結合ドメインに対する抗体及びそれらのチロシンキナーゼドメインを阻害する低分子量分子は、後期臨床開発段階にあるか、又は単一化合物として、若しくは他の癌薬物と組み合わせて、癌の治療に対して承認されている。非限定的な例は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（モノクローナル抗体）、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（モノクローナル抗体）、Ｔａｒｃｅｖａ（低分子量阻害剤）及びＩｒｅｓｓａ（低分子量阻害剤）である。さらに、前記リガンドは、受容体に結合する前に、中和することが可能である。本発明の一実施形態において、前記増殖因子阻害剤は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（モノクローナル抗体）、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（モノクローナル抗体）、Ｔａｒｃｅｖａ（低分子量阻害剤）及びＩｒｅｓｓａ（低分子量阻害剤）を含む群から選択される。
【００８２】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、抗血管新生薬である。
【００８３】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、抗転移化合物である。
【００８４】
腫瘍増殖は、十分な血液供給に依存し、このため、新しい血管の発育に依存する。充実性腫瘍のかかる一般的な特徴は、治療的観点から魅力的に見える。すなわち、抗血管新生薬で癌患者を治療すると、腫瘍増殖の低下及び腫瘍の退行が予測される。現在、天然に存在するエンドスタチン及びアンギオスタチンを含む、６０を超える抗血管新生薬が臨床試験中である（「Marx (2003) Science 301, 452-454」に総説が記載されている。）。しかし、これより古い化学療法薬、他の医薬及び放射線治療も、抗血管新生効果を有する。本発明の一実施形態において、前記抗血管新生化合物は、エンドスタチン、アンギオスタチン、血管新生を開始する因子を遮断する抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ−Ａｖａｓｔｉｎ）、関連するシグナル伝達経路中の主要な要素を阻害することによって血管新生を阻害する低分子化合物からなる群から選択される。
【００８５】
腫瘍の脈管構造及び細胞外マトリックスを攻撃することは、注目を集めつつある。以下の原理、がこれまでに開発されている。すなわち、内皮細胞の封鎖、アンギオスタチン及びエンドスタチンの投与、ＶＥＧＦの標的誘導及び細胞外マトリックス。
【００８６】
本発明の実施形態において、抗血管新生薬は、アバスチン、ネオバスタット、サリドマイド、ＰＴＫ７８７、ＺＫ２２２５８４、ＺＤ−６４７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ５４７，６３２、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＣＥＰ−７０５５、ＮＭ−３、ＳＵ１１２４８からなる群から選択される（Nature Biotech 20, 1067-1068）。
【００８７】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、ウイルス標的誘導化合物である。ウイルス標的誘導は、腫瘍を直接破壊するために、組換えウイルス（通常、複製能がないもの）を使用する。実際には、ウイルスが、キャプシド中に封入される前に、複製が少なくとも１ラウンド起こる。このため、腫瘍は溶解され、生じた保護を伴う全身免疫がこれによってしばしばもたらされる。免疫反応を増強するために、遺伝子修飾を用いて、このアプローチはさらに洗練されている。例えば、ワクチンの効力を改善するために、単純ヘルペスウイルス２型ベクター中へのヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の遺伝的挿入が使用されてきた。
【００８８】
本発明の一実施形態では、前記抗癌化合物は、ホルモン化合物である。ホルモン化合物は、主として、抗アンドロゲン及び抗エストロゲン療法など、卵巣癌、乳癌及び前立腺癌などのホルモン依存性癌の治療において公知である。
【００８９】
治療の効力を増強することによって、癌の組み合わせ療法において、ＴＦアンタゴニストと一緒に使用することが可能な成分又は化合物の以下のリストは、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものではない。
【００９０】
ａ）アジュバント：
免疫療法は、特異的な様式及び非特異的な様式からなる。非特異的な免疫療法の例としては、主として免疫反応を開始させるための触媒として作用するアジュバントがある。このようなワクチンアジュバントの非限定的な例は、ＱＳ２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、リポ多糖及びポリイノシン酸：ポリシチジン酸である。
【００９１】
本発明の一実施形態において、前記ＴＦアンタゴニストは、一又は複数のアジュバントと組み合わされる。本発明の一実施形態では、アジュバントは、ＱＳ２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、リポ多糖及びポリイノシン酸：ポリシチジン酸からなる群から選択される。
【００９２】
ｂ）サイトカイン
サイトカインの非限定的な例には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＰＥＧ−ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド又は幹細胞因子である。サイトカインと組み合わせることができる他の化合物には、自家ＴＩＬ、シスプラチン、タモキシフェン、ＤＴＩＣ、カルムスチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、テモゾロミド、ビンデシン、５−フルオロウラシル、ホテムスチン、自家ＬＡＫ細胞及びゲムシタビンである。
【００９３】
ｃ）受動免疫療法
受動免疫療法の例は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の再注入、腫瘍特異抗原の増殖、Ｔ細胞の遺伝的強化及び阻害的受容体の遮断である。
【００９４】
ｄ）細胞養子療法
細胞養子療法には、患者からの抗癌反応を刺激又は惹起することができる細胞を単離すること、これらの細胞を増殖させて数を増大させること、及び患者中に再導入することが含まれ得る。一側面において、これは、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原を認識するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞であり得る。別の側面において、これは、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原に対して特異的な抗体を発現するＢ細胞であり得る。別の側面において、これは、腫瘍細胞を死滅させることが可能なＮＫ細胞であり得る。好ましい側面において、これは、ＤＣ増殖化合物（例えば、ＧＭ−ＳＣＦ又はＦｌｔ３−Ｌ）とともにインビボで培養され、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原が搭載され、及びインビボに再導入された樹状細胞（ＤＣ）であり得る。本発明の一側面において、細胞養子療法は、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原を認識するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。本発明の一側面において、細胞養子療法は、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原に対して特異的なＢ細胞発現抗体を含む。本発明の一実施形態において、細胞養子療法は、腫瘍細胞を死滅させることが可能なＮＫ細胞を含む。
【００９５】
本発明の一実施形態において、細胞養子療法は、樹状細胞（ＤＣ）を含む。
【００９６】
上記の一実施形態において、前記樹状細胞は、ＤＣ増殖化合物（例えば、ＧＭ−ＳＣＦ又はＦｌｔ３−Ｌ）とともにインビボで培養され、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原が搭載され、インビボに再導入される。
【００９７】
ｅ）細胞内シグナル伝達阻害剤
チロシンキナーゼ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｒ）、イマチニブメシラート）、ｒａｓシグナル伝達経路の妨害及びタンパク質輸送の制御因子など、多数の様々な原理が探索されてきた。本発明の一実施形態において、細胞内シグナル伝達阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、タンパク質−チロシンホスファターゼ阻害剤、二重特異性ホスファターゼ阻害剤又はセリン／スレオニンホスファターゼ阻害剤からなる群から選択される。
【００９８】
ｆ）抗アネルギー化合物
抗アネルギー化合物とは、腫瘍及び癌抗原に対する寛容を破壊することができる、小化合物、タンパク質、糖タンパク質又は抗体である。
【００９９】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在は、多数の異なる癌形態における臨床的転帰の改善と相関するが、腫瘍抗原に対するアネルギー又は寛容のため、これらのＴＩＬの活性を向上させる必要性が明確に存在する。アネルギー状態は、かなり多数の症例において、ＣＴＬＡ−４によって誘導されたアネルギー又は寛容を抑制するモノクローナル抗体によって打ち消され得る。ＣＴＬＡ−４の遮断は、動物モデルにおいて、癌治療の有効性を向上させることが示されており、癌及び腫瘍抗原に対する寛容を破壊するために、ＣＴＬＡ−４遮断を使用できることが示唆される。ＴＩＬの活性の誘導のために使用され得るモノクローナル抗体の非限定的な例は、ＭＤＸ−０１０である（Phan et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:8372）。
【０１００】
ｇ）治療ワクチン
ほぼ全てのヒトの癌の発生は、遺伝的な変化を伴い、これが、それぞれ、腫瘍細胞中に変化された分子の発現及び正常な分子の過剰発現を引き起こし得る。原理的に、これらの変化は、宿主からの免疫応答（免疫監視）を引き起こすはずである。明らかに、免疫系の理論的な活性化は、例外的な極めて少ない症例で、腫瘍の自発的な退化を引き起こすにすぎない。他にも要因はあるが、これは、「警告シグナル」の欠如によるものであり得、関心が増大している現象である。
【０１０１】
腫瘍特異抗原が同定されており、このような抗原を用いたワクチン接種は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）を根絶するために、免疫系を刺激することができる。腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）は、比較的少ない抗原の群であり、癌精巣抗原がその例である。これらの遺伝子は、正常な組織中では発現されていないが、癌細胞によって発現される。これらの遺伝子は、疾病の高度に特異的なマーカーであり、悪性黒色腫中に見出されるＭＡＧＥ（悪性黒色腫抗原遺伝子）が含まれる。
【０１０２】
腫瘍関連抗原。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、通常、正常な細胞によって発現される分化抗原であるが、癌性組織中では極めて過剰発現されている。当初、特定の癌に対して特異的であると考えられた標的は、実際には、ガングリオシド及びムチン抗原など、多くの腫瘍中で極めて一般的である。古典的な分化抗原には、ＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞によって認識される悪性黒色腫抗原）及びｇｐ１００（何れも、悪性黒色腫から得られる。）、チロシナーゼ及びｇｐ７５が含まれる。
【０１０３】
突然変異抗原。点変異は、多くの癌において一般的であり、多くの場合、Ｐ５３癌遺伝子の共通の突然変異など類似の位置に発生する。変異及び野生型ｐ５３のペプチドに対するヒト細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応のインビトロでの誘導が報告されている。マウスモデルでは、ｐ５３パルス処理された変異樹状細胞は、ｐ５３特異的ＣＴＬを誘導し、確立された腫瘍の増殖を阻害することが可能であった。
【０１０４】
ウイルス抗原。ある種のウイルスは発癌性であり、これらのウイルスによってコードされる遺伝子産物は免疫反応を惹起することが可能であり、このため癌抗原としての役割を果たすことが可能である。例は、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６から得られるＥ６及びＥ７タンパク質であり、該タンパク質は、インビトロで、細胞毒性Ｔリンパ球応答を誘導することが示されている。
【０１０５】
腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原及び／又は変異抗原及びウイルス抗原は、抗癌免疫反応を惹起させるためのワクチンとして、ペプチド、組換え精製された単一因子抗原、組換え精製された抗原の組み合わせ及び／又は癌細胞若しくは腫瘍細胞から単離された、精製された抗原又は抗原のプールの何れかとして使用され得る。同様に、ペプチド、組換え精製された単一因子抗原、組換え抗原の組み合わせ及び／又はウイルス感染細胞から単離された、精製された抗原又は抗原のプールは、ウイルス感染細胞に対する応答を惹起するためのワクチン中で使用することができる。治療用ワクチンは、癌及びウイルス感染細胞に対する免疫応答を惹起するために、ＤＮＡワクチンの形態とすることも可能である。抗腫瘍応答又はウイルス感染細胞に対する応答の、前記ワクチンによって媒介される惹起は、アジュバント、サイトカイン、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、樹状細胞、ＧＭ−ＣＳＦ又は熱ショックタンパク質を投与することによって増強され得る。本発明の一実施形態において、組み合わせ療法は、アジュバント、サイトカイン、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、樹状細胞、ＧＭ−ＣＳＦ又は熱ショックタンパク質を加えて又は加えずに、一又は複数の治療用ワクチンとともに、ＴＦアンタゴニストを投与することによって行われる。
【０１０６】
ｈ）メタロプロテイナーゼ阻害剤
転移性癌細胞は、標的臓器（異所性部位）へ転移するために、血管の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と基底膜を貫通する。ＥＭＣは、炭水化物複合体（ヘパラン硫酸ペプチドグリカン）中に包埋されたタンパク質からなり、腫瘍を取り囲むプロテアーゼは、宿主組織を分解する上で活性である。抗転移化合物は、このようなプロテアーゼの効果を拮抗する（例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤）（Coussens et al. Science 2002;295:2387-2392)）。
【０１０７】
ｉ）体内ワクチン接種療法
「体内ワクチン接種」及び「体内ワクチン接種療法」とは、典型的には、（ｉ）腫瘍細胞全体、又は（ｉｉ）（ａ）分泌されたタンパク質、糖タンパク質若しくは他の産物、（ｂ）膜結合型タンパク質若しくは糖タンパク質又は膜と会合し若しくは膜の中に挿入された他の成分、及び（ｃ）細胞内タンパク質若しくは他の細胞内成分を含む腫瘍細胞の一部に対して誘導された免疫応答の惹起を引き起こす腫瘍細胞の、薬物又は放射線によって誘導された細胞死を表す。免疫応答は、腫瘍細胞又はその一部を認識する細胞毒性Ｔリンパ球の発達など（これに限定されない。）、液性（すなわち、抗体−補体媒介性）又は細胞媒介性であり得る。体内ワクチン接種は、他のワクチン接種操作と多くの類似性を有しており、造血及び免疫系の同一細胞成分の多く又は全部を含み、免疫原又は抗原性成分が内在性であるため、腫瘍細胞の抗原レパートリーを代表するという利点がある。このため、体内ワクチン接種は、腫瘍細胞死をもたらす癌治療に対する一般的手順の使用によって惹起される、個別化されたワクチン接種とすることができる。放射線療法の他に、前記腫瘍細胞死の誘導及び体内ワクチン接種を誘導するために使用できる薬物及び化合物の非限定的な例は、慣用の化学療法化合物、細胞周期阻害剤、抗血管新生薬、モノクローナル抗体、アポトーシス誘導化合物及びシグナル伝達阻害剤である。
【０１０８】
本明細書において使用される「細胞毒性ドメイン」又は「細胞毒性化合物」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する物質及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を表す。「細胞毒性ドメイン」及び「細胞毒性化合物」という用語は、互換的に使用され得る。本用語には、放射性同位体又は放射性核種（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、細胞増殖抑制剤及び細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素的に活性な毒素などの毒素又はこれらの断片が含まれるものとする。細胞毒性化合物には、ミトコンドリアのシトクロムＣの放出及びアポトーシスを直接的に媒介するペプチド、例えば、両鏡像異性体を含む（ＫＬＡＫＬＡＫ）２も含まれる（Ellerby et al. Nature medicine 5, (9) 1032-1038, 1999）。
【０１０９】
「化学療法化合物」とは、癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法化合物の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、サイトシンアラビノサイド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タクソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）、例えば、タキソール（TAXOLTM, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）及びドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）、トクソテール（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、他のナイトロジェン・マスタード関連物質が含まれる。この定義には、タモキシフェン及びオナプリストンなどの、腫瘍に対するホルモン作用を制御又は阻害するように作用するホルモン化合物も含まれる。アミノグルテチミド、アスパラギネーゼ、ブレオマイシン、Ｌ−ブチアミンスルホキシド、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、サイクロフォスファミド、シタラビンＨＣｌ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキドルビシンＨＣｌ、エダトレキセート、エストラムスチン、リン酸ナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルタミド、亜硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、アルファ２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類縁体）、ロムスチン、メクロレタミンＨＣｌ、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、タキサン、アルキル化薬、抗生物質、トピソメラーゼ抑制剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、タキソイド、チオグアニン、チオテパ、チアソフラン、トポテカン、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン２、ミトグアゾン、メチルグリオキサールビスグアニルヒドラゾン、ペントスタチン、セムスチン及びテニポシドも含まれる。
【０１１０】
細胞毒性化合物には、治療的有効量の、毒素；薬物；酵素；サイトカイン；放射性核種；光力学的化合物及びアポトーシスを誘導する分子（例えば、Ｆａｓリガンド又は２−メトキシエストラジオール）が含まれるが、これらに限定されない。毒素には、リシンＡ鎖、変異シュードモナス外毒素、ジフテリアトキソイド、ストレプトニグリン、ボアマイシン、サポリン、ゲロニン及び西洋ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質の治療的有効量が含まれ得る。薬物には、治療的有効量の、フルダラビン、クロラムブシル、ダウノルビシン、ドキソルビシン（例えば、リポソーム中）、シスプラチン、ブレオマイシン、メルファラン、マイトマイシンＣ及びメトトレキサートなどの細胞毒性薬物が含まれ得るが、これらに限定されない。Ｂ細胞は放射線に対して感受性があるので、放射性核種には、隣接するＴＦ提示細胞によって吸収され得る、高エネルギーβ粒子を放射するイットリウム、及びオージェ電子を放射するＩ１２５などの放射性金属で標識されたタンパク質が含まれ得るが、これらに限定されない。光力学的化合物には、治療的有効量のポルフィリン及びそれらの誘導体が含まれ得る。治療用化合物とリガンドを結合する方法又は分子を標的誘導する方法は、当業者に周知である（例えば、Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63:209-34；米国特許第５，７８９，５５４号にまとめられている抱合体；その開示内容は、参照により、本明細書中に組み込まれる。）。このような方法は、多くの場合、分子を結合又は連結するために使用される、利用可能な数種のヘテロニ機能性試薬のうちの一つを使用する。
【０１１１】
本発明での使用に適した細胞毒性化合物には、ビンブラスチン、アンスラサイクリン、ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）(Schally VA and Nagy A (1999) Eur J Endocrinol 141, 1-14, Vasey PA et al (1999) Clin Cancer Res 5, 83-94)、ブレオマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、シタラビン、シクロホスファミド（Ｎ，Ｎ−ビス−（β−クロルエチル）−アミノ−１−オキサ−３−アザ−２−ホスホシクロヘキサン−２−オキシド）及びシスプラチナムを含む抗腫瘍抗生物質などの慣用の化学療法剤、並びに、「Cancer:Principles and Practice of Oncology, 2d ed., V. T. DeVita, Jr., S. Hellman, S. A. Rosenberg, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., 1985, Chapter 14」に記載されている他の慣用の化学療法剤が含まれる。本発明に属する別の適切な細胞毒性化合物は、トリコテセンである。トリコテセンは、不完全菌類綱の土壌菌類によって産生される薬物又はバッカラス・メガポタミカ（Ｂａｃｃｈａｒｕｓ  ｍｅｇａｐｏｔａｍｉｃａ）から単離される薬物である（Bamburg, J. R. Proc. Molec. Subcell. Biol. 8:41-110, 1983; Jarvis & Mazzola, Acc. Chem. Res. 15:338-395, 1982）。トリコテセンは、炭素、水素及び酸素のみを含有する最も毒性の高い分子と思われる（Tamm, C. Fortschr. Chem. Org. Naturst. 31:61-117, 1974)）。トリコテセンは、全て、リボソームのレベルで、開始、伸長又は終結相におけるタンパク質合成の阻害剤として作用することが報告されている。
【０１１２】
トリコテセンには、中心のセスキテルペノイド構造のみを有するもの、及びさらなる大環状環（それぞれ、単純トリコテセン及び大環状トリコテセン）を有するものという、２つの大きなクラスが存在する。単純トリコテセンは、米国特許第４，７４４，９８１号及び第４，９０６，４５２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、さらに、３つの群（すなわち、群Ａ、Ｂ及びＣ）に分けることができる。群Ａ単純トリコテセンの代表的な例には、スキルペン（Ｓｃｉｒｐｅｎｅ）、ロリジン（Ｒｏｒｉｄｉｎ）Ｃ、ジヒドロトリテセン、スキルペン（Ｓｃｉｒｐｅｎｅ）４，８−ジオール、ベルカロール（Ｖｅｒｒｕｃａｒｏｌ）、スキルペントリオール（Ｓｃｉｒｐｅｎｔｒｉｏｌ）、Ｔ−２テトラオール、ペンタヒドロキシスキルペン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｅ）、４−デアセチルネオソラニオール（ｄｅａｃｅｔｙｌｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ，）、トリコデルミン（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、ジアセチルカロネクトリン（ｄｅａｃｅｔｙｌｃａｌｏｎｅｃｔｒｉｎ）、カロネクトリン（ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉｎ）、ジアセチルベルカロール（ｄｉａｃｅｔｙｌｖｅｒｒｕｃａｒｏｌ）、４−モノアセトキシスキルペノール（４−ｍｏｎｏａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、４，１５−ジアセトキシスキルペノール（ｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、７−ヒドロキシジアセトキシスキルペノール（７−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、８−ヒドロキシジアセトキシスキルペノール（８−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）（Ｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、７，８−ジヒドロキシジアセトキシスキルペノール（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、７−ヒドロキシ−８−アセチルジアセトキシスキルペノール（７−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ａｃｅｔｙｌｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、８−アセチルネオソラニオール（８−ａｃｅｔｙｌｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、ＮＴ−１、ＮＴ−２、ＨＴ−２、Ｔ−２及びアセチル  Ｔ−２トキシンが含まれる。群Ｂ単純トリコテセンの代表的な例には、トリコテコロン（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｏｌｏｎｅ）、トリコセチン（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｎ）、デオキシニバレノール（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、３−アセチルデオキシニバレノール（ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、５−アセチルデオキシニバレノール（ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ），３，１５−ジアセチルデオキシニバレノール、ニバレノール（Ｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、４−アセチルニバレノール（Ｆｕｓａｒｅｎｏｎ−Ｘ）、４，１５−イダセチルニバレノール（ｉｄａｃｅｔｙｌｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、４，７，１５−トリアセチルニバレノール（ｔｒｉａｃｅｔｙｌｎｉｖａｌｅｎｏｌ）及びテトラアセチルニバレノール（ｔｅｔｒａ−ａｃｅｔｙｌｎｉｖａｌｅｎｏｌ）が含まれる。群Ｃ単純トリコテセンの代表的な例には、クロトコール及びクロトシンが含まれる。代表的な大環状トリコテセンには、ベルカリンＡ、ベルカリンＢ、ベルカリンＪ（Ｓａｔｒａｔｏｘｉｎ  Ｃ）、ロリジンＡ（Ｒｏｒｉｄｉｎ  Ａ）、ロリジンＤ（Ｒｏｒｉｄｉｎ  Ｄ）、ロリジンＥ（Ｒｏｒｉｄｉｎ  Ｅ）（Ｓａｔｒａｔｏｘｉｎ  Ｄ）、ロリジンＨ（Ｒｏｒｉｄｉｎ  Ｈ）、サトラトキシンＦ（Ｓａｔｒａｔｏｘｉｎ  Ｆ）、サトラトキシンＧ（Ｓａｔｒａｔｏｘｉｎ  Ｇ）、サトラトキシンＨ（Ｓａｔｒａｔｏｘｉｎ  Ｈ）、ベルチスポリン（Ｖｅｒｔｉｓｐｏｒｉｎ）、ミトキシンＡ（Ｍｙｔｏｘｉｎ  Ａ）、ミトキシンＣ、ミトキシンＢ、ミロトキシン（Ｍｙｒｏｔｏｘｉｎ  ）Ａ，ミロトキシンＢ、ミロトキシンＣ、ミロトキシンＤ、ロリトキシンＡ（Ｒｏｒｉｔｏｘｉｎ）、ロリトキシンＢ及びロリトキシンＤが含まれる。さらに、一般的な「トリコテセン」セスキテルペノイド環構造は、高等植物バッカリス・メガポタミカから単離される「バッカリン」という名称の化合物中にも存在し、これらは、文献中に記載されており、例えば、「Jarvis et al. (Chemistry of Alleopathy, ACS Symposium Series No. 268:ed. A. C. Thompson, 1984, pp. 149-159)」に開示されている。
【０１１３】
本発明に属する他の適切な細胞毒性化合物には、Ｎ，Ｎ−シス（２−クロロエチノル）Ｎ−ニトロソ−尿酸（ＢＣＮＵ）、Ｄ−ミオ−イノシトール−１，２，６−三リン酸塩，メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）（ｐ−Ｄｉ−（２−クロロエチル）−アミン−Ｌ−フェニルアラニン）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ｐ−（Ｎ’−メチル−ヒドラジノメチル）−Ｎ−イソプロピル−ベンザミド）、ダクチノマイシン、（アクチノマイシン  Ｄ）、ポリエストラジオルリン酸塩、サリドマイド、テモゾロマイド、ミトゾロマイド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、メルカトプリン、Ｎ−メチルホルムアミド、２−アミノ−１，３，４−チアジアゾール、ヘキサメチルメラミン、硝酸ガリウム、３％  チミジン、ジオクロロメトトレキサート（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、スラミン、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、セムスチン、１−（２−クロロエチル）−３−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジル）−１−ニトロソウレア、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド、アザシチジン、ジブロモズルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、エルウィニアのアスパラギナーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、イホスファミド、２−メルカプトエタンスルホン酸塩、テニポシド、タキソール、３−デアザウリジン（ｄｅａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、可溶性ベーカー抗葉酸剤、ホモハリントニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ）、シクロシチジン、アシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ）、ＩＣＲＦ−１８７、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、レバミゾール、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、アジリジニルベンゾキノン、スピロゲルマニウム，アクラルビシン、ペントスタチン、ＰＡＬＡ、カルボプラチン、アムサクリン、カラセマイド（ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ），イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、ミソニダゾール（ｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、ジヒドロ−５−アザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、４’−デオキシ−ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メノガリル、リン酸トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）、チアゾフリン（Ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）、エチオフォス（ｅｔｈｉｏｆｏｓ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−アセトアミド、ミトキサントロン、アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ）、アモナファイド（ａｍｏｎａｆｉｄｅ）、リン酸フルダラビン、ピベンジモール（ｐｉｂｅｎｚｉｍｏｌ）、ダイデムニンＢ、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、ジヒドロレンペロン（ｄｉｈｙｄｒｏｌｅｎｐｅｒｏｎｅ）、フラボン−８−酢酸、オキサントラゾール（ｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ）、イポメアノール，トリメトレキサート、デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、エチノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）及びジデオキシシチジンが含まれ、好ましい（NCI Investigational Drugs, Pharmaceutical Data 1987, NIH Publication No.88-2141,Revised November 1987）。
【０１１４】
本発明の一実施形態において、前記細胞毒性化合物は、フリーラジカルＮＯ＊、Ｏ２＊の産生を刺激する。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、細胞毒性化合物は、ｐ５３、スーパーオキシドジスムターゼ、ホスホリパーゼＣ、シクロオキシゲナーゼ２、カスパーゼ会合動因ドメイン（ＣＡＲＤ）の制御によるアポトーシスを刺激する。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、細胞毒性化合物は、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、アポプチン、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）（例えば、ＣＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３（アポプチン）米国特許第５，９８１，５０２号）、スルホラファン（ＳＵＬ）からなる群から選択される。
【０１１７】
本発明において有用な放射性核種には、γ放射体、陽電子放射体、オージェ電子放射体、Ｘ線放射体及び蛍光放射体が含まれ、治療用途に対してはβ又はα放射体が好ましい。放射性核種は、本分野において周知であり、１２３−Ｉ、１２５−Ｉ、１３０−Ｉ、１３１−Ｉ、１３３−Ｉ、１３５−Ｉ  ４７−Ｓｃ、７２−Ａｓ、７２−Ｓｅ、９０−Ｙ、８８−Ｙ、９７−Ｒｕ、１００−Ｐｄ、１０１ｍ−Ｒｈ、１１９−Ｓｂ、１２８−Ｂａ、１９７−Ｈｇ、２１１−Ａｔ、２１２−Ｂｉ、１５３−Ｓｍ、１６９−Ｅｕ、２１２−Ｐｂ、１０９−Ｐｄ、１１１−Ｉｎ、６７−Ｇａ、６８−Ｇａ、６４−Ｃｕ、６７−Ｃｕ、７５−Ｂｒ、７６−Ｂｒ、７７−Ｂｒ、９９ｍ−Ｔｃ、１１−Ｃ、１３−Ｎ、１５−Ｏ、１６６−Ｈｏ及び１８−Ｆが含まれる。好ましい治療用放射性核種には、１８８−Ｒｅ、１８６−Ｒｅ、２０３−Ｐｂ、２１２−Ｐｂ、２１２−Ｂｉ、１０９−Ｐｄ、６４−Ｃｕ、６７−Ｃｕ、９０−Ｙ、１２５−Ｉ、１３１−Ｉ、７７−Ｂｒ、２１１−Ａｔ、９７−Ｒｕ、１０５−Ｒｈ、１９８−Ａｕ及び１９９−Ａｇ、１６６−Ｈｏ又は１７７−Ｌｕが含まれる。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、ＴＦアンタゴニストは、ガドフリン、例えば、ガドフリン−２（以前には、ビス−ガドリニウム−メソポルフィリンと称された。）を含む（Pislaru SV. et al., Circulation, 99 (5) pp.690-696, 1999）。
【０１１９】
本明細書において使用される「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びこれらの断片又は部分を表し、並びに、一本鎖又は二本鎖であり得るゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡを表し、センス又はアンチセンス鎖を表す。同様に、本明細書において使用される「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列及びこれらの断片又は部分を表し、並びに天然又は合成分子を表す。
【０１２０】
本明細書において、「アミノ酸配列」と表記されている場合、天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を表し、「アミノ酸配列」及び「ポリペプチド」又は「タンパク質」などの類似の用語は、当該アミノ酸配列を表記タンパク質分子に伴う完全な野生型アミノ酸配列に限定するものではない。
【０１２１】
本明細書において使用される「ＰＮＡ」又は「ペプチド核酸」という用語は、リジンなどのアミノ酸残基及びアミノ基が付加されたオリゴマーを含む分子を表す。これらの小分子（抗遺伝子因子とも称される。）は、核酸の相補鎖に結合することによって転写物の伸長を停止する（Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。
【０１２２】
本明細書において使用される「アンチセンス」という用語は、特異的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を表す。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖を表す際に使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能とするウイルスプロモーターに目的の遺伝子を逆の方向で連結することによる合成など、任意の方法によって産生され得る。一旦細胞中に導入されると、転写されたこの鎖は、細胞によって産生された天然配列と結合して、二重鎖を形成する。次いで、これらの二重鎖は、さらなる転写又は翻訳の何れかを遮断する。このようにして、変異表現型を作製することができる。アンチセンス鎖を表す際に、「ネガティブ」という表記が使用される場合があり、センス鎖を表す際に、「ポジティブ」という表記が使用される場合がある。
【０１２３】
さらなる好ましいアンチセンス分子には、２’ヒドロキシル基が、糖環の３’又は４’炭素原子に連結されていることにより、二環糖部分を形成する、ロックされた核酸（ＬＮＡ；Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）が含まれる。結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基（ｎは、１又は２である。）である。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２号及びＷＯ  ９９／１４２２６号に記載されている。
【０１２４】
本明細書において使用される「ＦＶＩＩａポリペプチド」又は「ＦＶＩＩａポリペプチド」という用語は、野生型第ＶＩＩａ因子並びに野生型第ＶＩＩａ因子に比較して一又は複数のアミノ酸配列の変化を含有する第ＶＩＩａ因子の均等物（すなわち、第ＶＩＩ因子バリアント）及び／又は野生型第ＶＩＩａ因子に比べて末端切断されたアミノ酸配列（すなわち、第ＶＩＩａ断片）を含有する第ＶＩＩａ因子の均等物を意味する。このような均等物は、安定性、リン脂質の結合、変化された比タンパク質分解活性など、野生型第ＶＩＩａ因子に比べて異なる特性を示し得る。
【０１２５】
本明細書において使用される「第ＶＩＩ因子均等物」には、ＴＦ結合活性を示す第ＶＩＩａ因子の均等物が包含されるが、これに限定されない。本明細書において使用される「ＴＦ結合活性」という用語は、第ＦＶＩＩａポリペプチド又はＴＦアンタゴニストが、細胞表面ヒトＴＦへの組換えヒト１２５Ｉ−ＦＶＩＩａの結合を阻害する能力を意味する。ＴＦ結合活性は、アッセイ３に記載されているように測定することができる。
【０１２６】
第ＶＩＩ因子均等物には、タンパク分解的に不活性なＦＶＩＩａのバリアントも含まれる。本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ヒトＦＶＩＩａの３４１位に対応するリジンのアミノ酸置換を有するヒトＦＶＩＩａである。
【０１２７】
本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ヒトＦＶＩＩａの３４４位に対応するセリンのアミノ酸置換を有するヒトＦＶＩＩａである。
【０１２８】
本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ヒトＦＶＩＩａの２４２位に対応するアスパラギン酸のアミノ酸置換を有するヒトＦＶＩＩａである。
【０１２９】
本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ヒトＦＶＩＩａの１９３位に対応するヒスチジンのアミノ酸置換を有するヒトＦＶＩＩａである。
【０１３０】
一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドはＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）である。
【０１３１】
一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドはＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）である。
【０１３２】
一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドはＦＶＩＩ−（Ｄ２４２Ａ）である。
【０１３３】
一実施形態において、ＦＶＩＩａポリペプチドはＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）である。
【０１３４】
本明細書において使用される具体的なアミノ酸置換に対する用語は、以下のとおりである。最初の文字は、野生型ヒトＦＶＩＩａの位置に、天然に存在するアミノ酸を表す。以下の数字は、野生型ヒトＦＶＩＩａ中の位置を表す。第二の文字は、天然アミノ酸に対して置換された異なるアミノ酸を表す。例は、野生型ヒトＦＶＩＩａの３４１位のリジンがアラニンによって置換されているＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）である。別の例では、ＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ／Ｓ３４４Ａ）、野生型ヒトＦＶＩＩａの３４１位のリジンがアラニンによって置換されており、同じ第ＶＩＩ因子ポリペプチド中で、野生型ヒトＦＶＩＩａの３４４位中のセリンがアラニンによって置換されている。
【０１３５】
「第ＶＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩ」という用語は、それらの切断されていない（チモーゲン）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを意味するものとする。
【０１３６】
「第ＶＩＩａ因子」又は「ＦＶＩＩａ」という用語は、ＦＶＩＩの野生型生物活性形態を意味するものとする。典型的には、ＦＶＩＩは、残基１５２及び１５３の間で切断されて、ＦＶＩＩａを与える。「第ＶＩＩａ因子」という用語には、（米国特許第４，７８４，９５０号に記載されているような）野生型ヒト第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列１ないし４０６を有するポリペプチド並びに、例えば、ウシ、ブタ、イヌ、マウス及びサケ第ＶＩＩａ因子などの他の種に由来する野生型第ＶＩＩａ因子を包含するものとするが、これらに限定されるものではない。第ＶＩＩａ因子は、さらに、ある個体から別の個体に存在し、発生し得る、第ＶＩＩａ因子の天然対立遺伝子変異を包含する。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に応じて、変動し得る。
【０１３７】
本明細書において、「バリアント」という用語は、親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換され、及び／又は親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が欠失され、及び／又はタンパク質中に一又は複数のアミノ酸が挿入され、及び／又は一又は複数のアミノ酸が親タンパク質に付加された配列番号１の配列を有するヒト第ＶＩＩ因子を表すものとする。このような付加は、親タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又はその両方に行うことができる。本発明の一実施形態において、前記バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０からなる群から独立に選択される総量のアミノ酸置換及び／又は付加及び／又は欠失を有する。
【０１３８】
任意の細胞毒性化合物が、腫瘍細胞標的の溶解を媒介する能力をアッセイすることが可能である。目的の腫瘍細胞を増殖し、インビボ又はインビトロで標識する。腫瘍細胞培養に細胞毒性化合物を添加する。溶解された細胞からの標識の放出によって、標的腫瘍細胞の細胞溶解を検出する。次いで、インビトロ試験において細胞の切断、溶解又はアポトーシスを媒介することができる細胞毒性化合物を、当該患者に治療的に使用することが可能である。
【０１３９】
ＦＶＩＩａに関して、本明細書において使用される場合、「活性部位」などの用語は、「Schecter, I. and Berger, A., (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 7:157-162」によって定義される、ＦＶＩＩａの「Ｓ１」部位という用語など、触媒及びチモーゲン基質結合部位を表す。
【０１４０】
「ＴＦによって媒介される凝固活性」という用語は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成、並びに、それぞれＦＩＸ及び第Ｘ因子のＦＩＸａ及びＦＸａへの活性化を通じて、ＴＦによって開始される凝固を意味する。ＴＦによって媒介される凝固活性は、ＦＸａ生成アッセイにおいて測定される。本明細書において使用される、「ＦＡｘ生成アッセイ」という用語は、ＦＸの活性化が、ＴＦ、ＦＶＩＩａ、ＦＸ、カルシウム及びリン脂質を含む試料中で測定される任意のアッセイを意味するものとする。ＦＸａ生成アッセイの例は、アッセイ１に記載されている。
【０１４１】
ＴＦ／ＦＶＩＩａによって媒介され又は随伴されるプロセス若しくは現象又はＴＦ媒介凝固活性を伴うプロセス若しくは現象は、ＴＦ／ＦＶＩＩａの存在を必要とする任意の現象である。
【０１４２】
このようなプロセス又は現象には、血栓形成を引き起こす、フィブリンの形成；例えば、血小板沈着；内膜過形成又は再狭窄など、血管壁中の平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖（これは、血小板沈着及び血栓形成、化学遊走因子及び分裂促進因子の放出、並びに動脈セグメントの内膜中への、血管平滑筋細胞の遊走及び増殖など、生物学的プロセスの複雑な相互作用に起因するものと考えられている。）；及び、例えば、冠状動脈血栓溶解を生じている急性心筋梗塞患者など、虚血後再灌流に伴う有害な現象が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
再流動現象の不存在、すなわち、以前に虚血であった組織の微小血管系への均一な環流の欠如は、Ｋｒｕｇら（Circ. Res. 1966;19:56-62）によって、初めて記載された。
【０１４４】
血栓形成の一般的な機序は、「Ganong, in Review of Medical Physiology, 13th ed., Lange, Los Altos Calif., pp 411-414 (1987)」によって概説されている。凝固には、血小板凝集を誘導するトロンビンの産生及び血小板血栓を安定にするフリブリン（ｆｒｉｂｒｉｎ）の形成という２つのプロセスの集合が必要である。本プロセスは、幾つかの段階を含み、各段階が、別個のプロ酵素及びプロ因子の存在を必要とする。本プロセスは、フィブリン架橋及び血栓形成に至る。フィブリノーゲンは、トロンビンの作用によってフィブリンへと変換される。次いで、プロトロンビンのタンパク分解切断によって、トロンビンが形成される。このタンパク分解は、活性化された血小板の表面に結合するＦＸａによって行われ、ＦＶａ及びカルシウムの存在下で、プロトロンビンを切断する。ＴＦ／ＦＶＩＩａは、凝固の外因性経路によるＦＸのタンパク分解活性化にとって必要である。従って、ＴＦ／ＦＶＩＩａによって媒介されるプロセス若しくはＴＦ／ＦＶＩＩａが関連するプロセス又はＴＦによって媒介される凝固活性には、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成からフィブリン血小板凝結塊の形成に至り、最初に、ＴＦ／ＦＶＩＩａの存在を必要とする、凝固カスケード中の任意の段階が含まれる。例えば、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ＦＸのＦＸａへの活性化、ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化、及びさらにＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの活性化による外来的経路を開始する。ＴＦ／ＦＶＩＩａによって媒介若しくは随伴されるプロセス又はＴＦによって媒介される凝固活性は、ＦＶ／ＦＶＩＩａ及び他の必要な試薬の存在下で、ＦＸのＦＸａへの変換について、「Roy, S., (1991) J. Biol. Chem. 266:4665-4668」及び「O’Brien, D. et al., (1988) J. Clin. Invest. 82:206-212」に記載されているアッセイなどの標準的なアッセイを使用して便利に測定することが可能である。
【０１４５】
本明細書において使用されるペプチド、タンパク質及びアミノ酸は、「天然」、すなわち天然に存在するアミノ酸、並びに、一般的なアミノ酸のＤ異性体を含む（これに限定されない。）「非古典的」Ｄアミノ酸、αイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）及びアミノ酸類縁体全般を含み、又は表すことができることに留意すべきである。さらに、アミノ酸は、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸；γ−Ａｂｕ、４−アミノ酪酸；ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノ−イソ酪酸；β−Ａｌａ、３−アミノプロピオン酸；Ｏｒｎ，オルニチン；Ｈｙｐ、トランス−ヒドロキシプロリン；Ｎｌｅ、ノルロイシン；Ｎｖａ、ノルバリンを含むことが可能である。
【０１４６】
本明細書において使用される三文字表記「ＧＬＡ」は、４−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシグルタミン酸）を意味する。
【０１４７】
「ＦＶＩＩａポリペプチドの活性部位において触媒的に不活化されている」とは、ＦＶＩＩａ阻害剤がＦＶＩＩａポリペプチドに結合され、ＦＶＩＩａによって触媒されるＦＸのＦＸａへの変換を減少又は抑制することを意味する。ＦＶＩＩａ阻害剤は、「Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924 (1997)）」によって記載されているＦＶＩＩａアミド分解アッセイにおいて、４００μＭの物質の濃度において、アミド分解活性を少なくとも５０％減少させる物質として同定され得る。好ましいのは、３００μＭの物質の濃度でアミド分解活性を少なくとも５０％減少させる物質であり、さらに好ましいのは、２００μＭの物質の濃度でアミド分解活性を少なくとも５０％減少させる物質である。
【０１４８】
［ＦＶＩＩａ阻害剤］は、ＦＶＩＩａ誘導された阻害剤の幾つかの群のうち任意の一つから選択され得る。このような阻害剤は、本発明において、ｉ）ＦＶＩＩａに可逆的に結合し、ＦＶＩＩａによって切断可能な阻害剤、ｉｉ）ＦＶＩＩａに可逆的に結合するが、切断不能な阻害剤、及びｉｉｉ）ＦＶＩＩａに不可逆的に結合する阻害剤に大きく分類される。セリンプロテアーゼの阻害剤の総説については、「Proteinase Inhibitors (Research Monographs in cell and Tissue Physiology; v. 12) Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York (1990)」を参照されたい。
【０１４９】
ＦＶＩＩａ阻害剤部分は、不可逆的なＦＶＩＩａセリンプロテアーゼ阻害剤でもあり得る。このような不可逆的な活性部位阻害剤は、一般的には、プロテアーゼ活性部位とともに共有結合を形成する。このような不可逆的な阻害剤には、ペプチドクロロメチルケトン（Williams et al., J. Biol. Chem. 264:7536-7540(1989)を参照）又はペプチジルクロロメタンなどの一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤；アザペプチド；様々なグアニジノ安息香酸塩誘導体及び３−アルコキシ−４−クロロイソクマリンなどのアシル化剤；フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などのフッ化スルホニル；ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）；トシルプロピルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；トシルリジルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）；ニトロフェニルスルホン酸塩及び関連化合物；イソクマリン及びクマリンなどの複素環プロテアーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ペプチド性不可逆的ＦＶＩＩａ阻害剤の例には、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＡｒｇクロロメチルケトンＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
ＦＶＩＩａ阻害剤の例には、ＰＣＴ／ＤＫ／９９／００１３８に記載されているようなベンズオキサジノン又はその複素環類縁体も含まれる。
【０１５２】
他のＦＶＩＩａ阻害剤の例には、例えば、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｌ−及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇなどの小ペプチド；ペプチド模倣物；ベンズアミジン系；一又は複数のアミジノ基で置換された複素環構造；一又は複数のＣ（＝ＮＨ）ＮＨＲ基（ＲはＨ、Ｃ１−３アルキル、ＯＨ又はインビボで容易に開裂する基）で置換された芳香環系又は複素芳香環系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】
本明細書に定義されているＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物は、同時又は順次に投与することができる。前記因子は、単回投薬形態で供給することができ、該単回投薬形態は両化合物を含有し、又は第一の単位投薬形態としてＴＦアンタゴニストの調製物と、第二の単位投薬形態として抗癌化合物の調製物とを含むパーツのキットの形態である。本明細書を通じて第一又は第二又は第三などの単位投薬が挙げられる場合には常に、これは、投与の好ましい順序を示すものではなく、単に、便宜上、挙げられているものにすぎない。
【０１５４】
ＴＦアンタゴニストの調製物と抗癌化合物の調製物の「同時」投薬とは、単一投薬形態で化合物を投与すること、又は、第一の因子を投与した後に、１５分以下、好ましくは１０分、さらに好ましくは５分、さらに好ましくは２分の時間間隔で、第二の因子を投与することを意味する。何れの因子を最初に投与してもよい。
【０１５５】
「順次」投薬とは、第一の因子を投与した後に、１５分超の時間間隔で第二の因子を投与することを意味する。２つの単位投薬形態又は凝固因子タンパク質の何れを最初に投与してもよい。好ましくは、両製品が同じ静脈内アクセスを通じて注射される。
【０１５６】
本明細書において、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名法委員会（ＣＢＮ）によって承認された表１に示されている略号を用いて表される。名前又は以下の略号によって表された、異性体を有するアミノ酸などは、別段の記載がなければ、天然のＬ型である。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左末端及び右末端は、それぞれ、別段の記載がなければ、Ｎ及びＣ末端である。
【表１】
2007523099.tif 000002
【０１５７】
本発明は、上記ＴＦアンタゴニストにも関する。ＴＦアンタゴニストは、組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。この目的のために、ヒトＦＶＩＩａをコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによってタンパク質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって単離され得る（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989参照）。本目的のために、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ヒト起源のＤＮＡ配列、すなわち、ヒトゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーに由来するＤＮＡ配列である。
【０１５８】
ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えば、「Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869」によって記載されているホスホアミダイト法又は「Matthes et al., EMBO Journal 3(1984), 801-805」によって記載されている方法によって、合成的に調製することもできる。ホスホルアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機中で合成され、精製され、アニールされ、連結され及び適切なベクター中にクローニングされる。
【０１５９】
ＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、「Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, or Sambrook et al.,  上記」に記載されているように、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【０１６０】
ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、通常、任意のベクターとすることができ、組換えＤＮＡ操作に便利に供することができる組換えベクター中に挿入され、ベクターの選択は、多くの場合、その中に導入されるべき宿主細胞に依存するであろう。このように、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、該ベクターがその中に組み込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【０１６１】
ベクターは、好ましくは、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡの転写に必要とされる追加のセグメントに作用可能に連結される発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、プラスミド若しくはウイルスＤＮＡに由来し、又は両方の要素を含有し得る。「操作可能に連結された」という用語は、セグメントがそれらの所期の目的のために協調して機能するように、例えば、転写がプロモーター中で開始し、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通じて進行するように、セグメントが配置されていることを示す。
【０１６２】
プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列とすることができ、該宿主細胞に対して同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。
【０１６３】
哺乳類細胞中でヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を誘導するための適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターであり（Subramani et al., Mol.Cell Biol. 1(1981), 854-864）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814）、ＣＭＶプロモーター（Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985）又はアデノウイルス２主要後期プロモーター（Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982）である。
【０１６４】
昆虫細胞中で使用するための適切なプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター（米国特許第４，７４５，０５１号；Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11）、Ｐ１０プロモーター（Ｊ.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ  ３９７  ４８５）、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号；米国特許第５，１６２，２２２号）、又はバキュロウイル３９Ｋ  遅延初期遺伝子プロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号；米国特許第５，１６２，２２２号）である。
【０１６５】
酵母宿主細胞中で使用するための適切なプロモーターの例には、酵母解糖系遺伝子からのプロモーター（Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434）又はアルコール脱水酵素遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.),Plenum Press, New York, 1982)又はＴＰＩ１（米国特許第４，５９９，３１１号）又はＡＤＨ２−４ｃ（Russel et al, Nature 304(1983),652-654）プロモーターが含まれる。
【０１６６】
糸状菌宿主細胞中で使用するための適切なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーター（McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099）又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ・ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ニガー又はＡ．アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、Ａ．オリザエのアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニデュランスのアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターである。好ましいのは、ＴＡＫＡ−アミラーゼ及びｇｌｕＡプロモーターである。適切なプロモーターは、例えば、ＥＰ２３８  ０２３号及びＥＰ３８３  ７７９号に挙げられている。
【０１６７】
ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、必要であれば、ヒト成長ホルモンのターミネーター（Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814)又はTPI1(Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434）又はＡＤＨ３（McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099）ターミネーターなどの、適切なターミネーターに作用可能に接続することもできる。ベクターは、プロモーターの下流に位置し、且つＦＶＩＩａ配列自体に対する挿入部位の上流に位置する一群のＲＮＡスプライス部位も含有し得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から取得することができる。挿入部位の下流に位置するポリアデニル化信号も、発現ベクター中に含有されている。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来の初期又は後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ｉｂｉｄ）、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNoto et al. Nuc. Acids Res.9:3719-3730, 1981）又はヒトＦＶＩＩ遺伝子若しくはウシＦＶＩＩ遺伝子由来のポリアデニル化信号が含まれる。発現ベクターには、プロモーターとＲＮＡスプライス部位間に位置する、アデノウイルス２の三分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーなどの非コードウイルスリーダー配列；及びＳＶ４０エンハンサーなどのエンハンサー配列も含み得る。
【０１６８】
組換えベクターは、さらに、当該宿主細胞中でのベクターの複製を可能とするＤＮＡ配列を含み得る。このような配列の例（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）は、ＳＶ４０の複製起点である。
【０１６９】
宿主細胞が酵母細胞である場合には、ベクターの複製を可能とする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点である。
【０１７０】
ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）若しくはスキゾサッカロミセス・ポンベＴＰＩ遺伝子（P.R. Russel, Gene 40,1985,pp.125-130によって記載されている。）をコードする遺伝子など、その産物が宿主細胞中の欠陥を相補する遺伝子、又は、薬物、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートに対して耐性を付与する遺伝子も含み得る。糸状菌の場合、選択的なマーカーには、ａｍｄｓ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ又はｓＣが含まれる。
【０１７１】
本発明のヒトＦＶＩＩａポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に誘導するために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる。）を、組換えベクター中に与えることができる。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠中のヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般に、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置する。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質に付随する分泌シグナル配列とすることができ、又は別の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。
【０１７２】
酵母細胞からの分泌の場合、分泌シグナル配列は、発現されたヒトＦＶＩＩａポリペプチドの、細胞の分泌経路中への効率的な誘導を確保する任意のシグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド、又は機能的なその一部とすることができ、又はシグナルペプチドは、合成ペプチドとすることができる。適切なシグナルペプチドは、α因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O.Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０号参照）又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137参照）であることが見出されている。
【０１７３】
酵母中での効率的な分泌の場合、リーダーペプチドをコードする配列は、シグナル配列の下流及びヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に挿入することもできる。リーダーペプチドの機能は、発現されたペプチドを小胞体からゴルジ体へと誘導し、培養培地中に分泌するために分泌小胞へとさらに誘導できるようにすることである（すなわち、細胞壁を横切って、又は少なくとも細胞膜を通過して、酵母細胞の細胞膜周辺腔中にヒトＦＶＩＩａポリペプチドを排出）。リーダーペプチドは、酵母α因子リーダーであり得る（その使用は、例えば、米国特許第４，５４６，０８２号、米国特許第４，８７０，００８号、ＥＰ  １６  ２０１号、ＥＰ  １２３  ２９４号、ＥＰ  １２３  ５４４号及びＥＰ  １６３  ５２９号に記載されている。）。あるいは、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチド（すなわち、自然には見出されないリーダーペプチド）とすることができる。合成リーダーペプチドは、例えば、ＷＯ  ８９／０２４６３号又はＷＯ  ９２／１１３７８号に記載されているように構築することができる。
【０１７４】
糸状菌中で使用する場合、シグナルペプチドは、アスペルギルス種のアミラーゼ若しくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ若しくはプロテアーゼ又はフミコラ・ラヌギノサのリパーゼをコードする遺伝子から便利に得ることができる。シグナルペプチドは、好ましくは、Ａ．オリアゼのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性アミラーゼ又はＡ．ニガーのグルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来する。適切なシグナルペプチドは、例えば、ＥＰ２３８  ０２３号及びＥＰ２１５  ５９４号に開示されている。
【０１７５】
昆虫細胞中で使用する場合、シグナルペプチドは、鱗翅目タバコススメガの脂質動員ホルモン前駆体シグナルペプチド（米国特許第５，０２３，３２８号を参照）など、昆虫遺伝子から便利に得ることができる（ＷＯ  ９０／０５７８３号参照）。
【０１７６】
それぞれ、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター及び必要に応じてターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を連結し、複製に必要な情報を含有する適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989参照）。
【０１７７】
哺乳類細胞を形質移入し、細胞中に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、「Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; and Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845」に記載されている。
【０１７８】
選択可能なマーカーは、目的の遺伝子と同時に、別個のプラスミド上で細胞中に導入することができ、又は同一プラスミド上に導入することができる。同じプラスミド上に存在する場合、選択可能なマーカーと対象遺伝子は、異なるプロモーター又は同一プロモーターの制御下にあることができ、後者の配置は二シストロン性メッセージを産生する。このタイプの構築物は、本分野において公知である（例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，米国特許第４，７１３，３３９号）。「担体ＤＮＡ」として知られる追加のＤＮＡを、細胞中に導入される混合物に添加することも有利であり得る。
【０１７９】
細胞がＤＮＡを取り込んだ後、対象遺伝子の発現を開始するために、典型的には１ないし２日間、適切な増殖媒地中で細胞を増殖させる。本明細書において使用される「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖及び目的とするヒトＦＶＩＩａポリペプチドの発現に必要とされる栄養素及び他の成分を含有する培地を意味する。培地は、一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須の糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質及び増殖因子が含まれる。γカルボキシル化されたタンパク質を産生する場合、培地は、好ましくは、約０．１μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬの濃度で、ビタミンＫを含有するであろう。次いで、安定な様式で、選択可能なマーカーを発現している細胞の増殖について選択するために、薬物選択を適用する。増殖可能な選択可能マーカーを形質移入された細胞の場合、クローニングされた配列の増加したコピー数を選択することにより、発現レベルを増加させるために、薬物濃度を増加させることができる。次いで、目的のヒトＦＶＩＩａポリペプチドの発現についてスクリーニングするために、安定に形質移入された細胞のクローンをスクリーニングする。
【０１８０】
ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がその中に導入された宿主細胞は、翻訳後修飾されたヒトＦＶＩＩａポリペプチドを産生することが可能な、酵母、真菌及びさらに高等な真核細胞を含む任意の細胞とすることができる。
【０１８１】
本発明において使用するための哺乳類細胞株の例は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）及び２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３；  Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）細胞株である。好ましいＢＨＫ細胞株は、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株（Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982，参照により本明細書に組み込まれる。）であり、以降、ＢＨＫ５７０細胞と称される。ＢＨＫ５７０細胞株は、ＣＲＬ  １０３１４の受託番号で、米国菌収集培養所、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．  ２０８５２に寄託された。ｔｋ−ｔｓ１３  ＢＨＫ細胞株は、受託番号ＣＲＬ１６３２でＡＴＣＣから入手することも可能である。さらに、Ｒａｔ  Ｈｅｐ  Ｉ（ラット肝細胞腫；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６００）、Ｒａｔ  Ｈｅｐ  ＩＩ（ラット肝細胞腫；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８０６５）、ＮＣＴＣ  １４６９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）及びＤＵＫＸ細胞（Urlaub and Chasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220,1980）など、多数の他の細胞株を本発明において使用することができる。
【０１８２】
適切な酵母細胞の例には、サッカロミセス種又はスキゾサッカロミセス種、特に、サッカロミセス・セレビシアエ又はサッカロミセス・クルイベリの株の細胞が含まれる。酵母細胞に異種ＤＮＡを形質転換し、そこから異種ポリペプチドを産生する方法は、例えば、米国特許第４，５９９，３１１号、米国特許第４，９３１，３７３号、米国特許第４，８７０，００８号、米国特許第５，０３７，７４３号及び米国特許第４，８４５，０７５号に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。形質転換された細胞は、選択可能なマーカー、一般的には薬物耐性又は特定の栄養素（例えばロイシン）の不存在下での増殖能によって決定される表現型によって選択される。酵母中で使用するための好ましいベクターは、米国特許第４，９３１，３７３号に開示されているＰＯＴ１ベクターである。ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えば、上述のように、シグナルペプチドが先行し、必要に応じて、リーダー配列が先行することができる。適切な酵母細胞のさらなる例は、Ｋ．ラクティスなどのクルイベロミセス、ハンセヌラ、例えば、Ｈ．ポリモルファ又はピキア、例えば、Ｐ．パストリス（Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465；米国特許第４，８８２，２７９号を参照）の株である。
【０１８３】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルス種、ニューロスポラ種、フザリウム種又はトリコデルマ種、特にＡ．オリザエ、Ａ．ニダランス又はＡ．ニガーの株の細胞である。タンパク質を発現するためのアスペルギルス種の使用は、例えば、ＥＰ２７２  ２７７、ＥＰ２３８  ０２３、ＥＰ１８４  ４３８に記載されている。Ｆ．オキシスポラムの形質転換は、例えば、「Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156」によって記載されているように実施され得る。トリコデルマ種の形質転換は、例えば、ＥＰ  ２４４  ２３４に記載されているように実施することができる。
【０１８４】
糸状菌が宿主細胞として使用される場合には、組換え宿主細胞を得るために、宿主の染色体中にＤＮＡ構築物を組み込むことによって、便利に、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換し得る。ＤＮＡ配列は細胞中で安定に維持される可能性が高いので、この組み込みは、一般的には、有利であると考えられる。宿主染色体中へのＤＮＡ構築物の組み込みは、慣用の方法に従って、例えば、相同的組換え又は非相同的組換えによって行うことができる。
【０１８５】
昆虫細胞の形質転換及び昆虫細胞中での異種ポリペプチドの産生は、米国特許第４，７４５，０５１号；米国特許第４，８７９，２３６号；米国特許第５，１５５，０３７号；第５，１６２，２２２号；ＥＰ３９７，４８５号に記載されているとおりに行うことができ、これらは全て、参照により、本明細書に組み込まれる。宿主として使用される昆虫細胞株は、適切には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプロシア・ニー細胞（米国特許第５，０７７，２１４号）などのレピドプテラ細胞株であり得る。培養条件は、適切には、例えば、ＷＯ  ８９／０１０２９号若しくはＷＯ  ８９／０１０２号又は先述された参考文献の何れかに記載されているとおりであり得る。
【０１８６】
次いで、上記形質転換又は形質移入された宿主細胞を、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドの発現を可能とする条件下で、適切な栄養媒地中で培養し、その後、得られたペプチドの全部又は一部を培養から回収し得る。細胞を培養するために使用される培地は、最少培地又は適切な補充物を含有する複合培地など、宿主細胞を増殖するのに適切な任意の慣用培地であり得る。適切な培地は、販売業者から入手することができ、又は公表されている製法（例えば、米国菌培養収集所のカタログ）に従って調製することができる。次いで、細胞によって産生されるヒトＦＶＩＩａポリペプチドは、遠心又はろ過によって培地から宿主細胞を分離すること、対象とするポリペプチドの種類に応じて、様々なクロマトグラフィー操作、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど、アフィニティークロマトグラフィーなどによる塩（例えば、硫酸アンモニウム）精製を用いて上清又はろ液のタンパク質成分を沈殿させることを含む慣用の手順によって、培地から回収することができる。
【０１８７】
組換えヒトＦＩＩａポリペプチドを調製する場合、クローニングされた野生型ＦＶＩＩａＤＮＡ配列を使用する。この配列は、所望のＦＶＩＩａバリアントをコードするように修飾され得る。ヒトＦＶＩＩａに対する完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列が公知である。組換えヒトＦＶＩＩａのクローニング及び発現が記載されている米国特許第４，７４８，９５０号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ウシＦＶＩＩａ配列は、「Takeya et al., J. Biol. Chem, 263:14868-14872 (1988)」に記載されており、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
アミノ酸配列の変化は、様々な技術によって達成され得る。ＤＮＡ配列の修飾は、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。部位特異的突然変異誘発に対する技術は、本分野において周知であり、例えば、「Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984)」によって記載されている。このように、ＦＶＩＩのヌクレオチド及びアミノ酸配列を使用して、選択した変化を導入することができる。
【０１８９】
本発明における使用のためのＤＮＡ配列は、典型的には、適切な翻訳後プロセッシング（例えば、グルタミン酸残基のγカルボキシル化）及び宿主細胞からの分泌を得るために、ＦＶＩＩａタンパク質のアミノ末端にプレプロペプチドをコードするであろう。プレプロペプチドは、ＦＶＩＩａ又は、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロテインＣ又はプロテインＳなどのビタミンＫ依存性の他の血漿タンパク質のプレプロペプチドとすることができる。当業者であれば自明であるように、タンパク質が凝固因子として作用する能力を著しく損なわないように、ＦＶＩＩａのアミノ酸配列中にさらなる修飾を施すことができる。例えば、触媒的三連構造中のＦＶＩＩａは、米国特許第５，２８８，６２９号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に一般的に記載されているように、チモーゲンＦＶＩＩを、その活性化された二鎖形態へ変換するのを阻害するために、活性化切断部位中において修飾することも可能である。
【０１９０】
本発明において、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドを作製するためにトランスジェニック動物技術を使用することができる。宿主雌哺乳動物の乳腺内でタンパク質を産生することが好ましい。目的タンパク質の乳腺中での発現及び、該タンパク質の乳中へのその後の分泌は、他の採取源からタンパク質を単離する際に遭遇する多くの困難を克服する。乳は、直ちに集められ、大量に取得することが可能であり、生化学的に十分に性質が決定されている。さらに、主要な乳タンパク質は、高濃度（典型的には、約１ないし１５ｇ／Ｌ）で乳中に存在する。商業的な観点からは、高い乳産生量を有する種を、宿主として使用することが明らかに好ましい。マウス及びラットなどのような小型の動物を使用することも可能であるが（原理段階の検査では好ましい）、本発明においては、ブタ、ヤギ、ヒツジ及びウシなどの（これらに限定されない。）家畜哺乳動物を使用することが好ましい。ヒツジで遺伝子組み換えが行われてきたという従前の歴史、乳の産生量、費用及びヒツジの乳を集めるための装置の入手しやすさなどの要因のため、ヒツジが特に好ましい。宿主の種の選択に影響を及ぼす因子の比較については、ＷＩＰＯ公開公報ＷＯ  ８８／００２３９号を参照。一般的には、Ｅａｓｔ  Ｆｒｉｅｓｌａｎｄヒツジなど、酪農用に飼育されてきた宿主動物の品種を選択するか、又は、後日に、トランスジェニック系統を品種改良することによって搾乳用家畜を導入することが望ましい。何れにしろ、健康状態が優れた公知の動物を使用すべきである。
【０１９１】
乳腺中での発現を得るために、乳タンパク質遺伝子からの転写プロモーターが使用される。乳タンパク質遺伝子には、カゼイン（米国特許第５，３０４，４８９号を参照。参照により本明細書中に組み込まれる。）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトグロブリン及び乳漿酸性タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）プロモーターが好ましい。ヒツジのβ−ラクトグロブリン遺伝子の場合には、該遺伝子の５’隣接配列の少なくとも近位４０６ｂｐの領域が一般的に使用されるが、５’隣接プロモーターとβ−ラクトグロブリン遺伝子の非コード部分とを包含する約４．２５ｋｂｐ  ＤＮＡセグメントなど、最大約５ｋｂｐの５’隣接配列のさらに大きな部分が好ましい。「Whitelaw et al., Biochem J. 286:31-39 (1992)」を参照。他の種からのプロモーターＤＮＡの類似の断片も適切である。
【０１９２】
発現されるべき遺伝子のゲノム領域と同様に、β−ラクトグロブリン遺伝子の他の領域も構築物中に取り込ませることができる。イントロンを欠如する構築物は、例えば、このようなＤＮＡ配列を含有する構築物と比べて、発現が良好でないことが、一般に、本分野において認められている（Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1:3-13 (1991); WO 89/01343；及びＷＯ  ９１／０２３１８、それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。）。これに関して、可能な場合には、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の野生型イントロンの全部又は一部を含有するゲノム配列を使用することが一般に好ましく、このため、例えば、β−ラクトグロブリン遺伝子から得られるイントロンの少なくとも幾つかをさらに含めることが好ましい。このような領域の一つは、イントロンスプライシングと、ヒツジのβ−ラクトグロブリン遺伝子の３’非コード領域からのＲＮＡポリアデニル化とを与えるＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然３’非コード配列を置換する場合には、このヒツジβ−ラクトグロブリンセグメントは、目的のタンパク質又はポリペプチドの発現レベルを増強し、安定化することが可能である。他の実施形態では、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードする配列の開始ＡＴＧを取り囲む領域は、乳特異的タンパク質遺伝子からの対応する配列と置換される。このような置換は、発現を増強するために、組織特異的な開始環境を与えると推定される。ヒトＦＶＩＩａポリペプチドのプレプロ配列全体及び５’非コード配列を、例えば、ＢＬＧ遺伝子のものと置換することが便利であるが、これより小さな領域を置換してもよい。
【０１９３】
トランスジェニック動物中でヒトＦＶＩＩａポリペプチドを発現する場合、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、発現ユニットを産生するために、その発現のために必要とされる追加ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される。このような追加セグメントには、上記のプロモーター、並びにｍＲＮＡの転写及びポリアデニル化の終結を与える配列が含まれる。発現単位には、さらに、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードするセグメントに作用可能に連結された分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントが含まれる。分泌シグナル配列は、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドの野生型分泌シグナル配列とすることができ、又は乳タンパク質など、別のタンパク質の分泌シグナルとすることもできる。例えば、「von Heinje, Nuc. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)」;及び「Meade et al., 米国特許第4,873,316号」（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照。
【０１９４】
トランスジェニック動物中で使用するための発現単位の構築は、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドをコードする配列を、追加ＤＮＡセグメントを含有するプラスミド又はファージベクター中に挿入することによって、便利に実施されるが、発現単位は、実質的に全ての連結の配列によって構築することができる。乳タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターを提供し、乳タンパク質に対するコード配列を、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドのコード配列と置換することによって、乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物を作出することが特に便利である。いずれにしても、プラスミド又は他のベクター中での発現単位のクローニングは、ヒトＦＶＩＩａポリペプチドの増幅を促進する。増幅は、細菌（例えば、Ｅ．コリ）宿主細胞中において便利に実施され、このため、ベクターは、典型的には、複製起点と、細菌宿主細胞中で機能的な選択可能マーカーとを含む。
【０１９５】
次いで、発現単位は、選択された宿主の種の受精卵（初期段階の胚を含む。）中に導入される。異種ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション（例えば、米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルス注入（Jaenisch, Science 240:1468-1474(1988)）又は胚性幹（ＥＳ）細胞を使用する部位特異的な組み込み（「Bradley et al., Bio/Technology 10:534-539 (1992)」によって概説されている。）など、複数の経路のうちの一つによって達成することが可能である。次いで、偽妊娠した雌の卵管又は子宮の中に卵を着床させ、発育させる。それらの生殖系列中に前記導入されたＤＮＡを有する子孫は、このＤＮＡを、通常のメンデル形式で、それらの後代へ伝え、トランスジェニック群の発育が可能となる。
【０１９６】
トランスジェニック動物を作製するための一般的な手順は本分野において公知である。例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:179-183(1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32:645-651(1985); Buhler et al., Bio/Technology 8:140-143(1990); Ebert et al., Bio/Technology 9:835-838(1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844-847(1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113-120(1992);米国特許第4,873,191号及び第4,873,316号;WIPO公開公報WO 88/00239号、ＷＯ  ９０／０５１８８号、ＷＯ  ９２／１１７５７；及びＧＢ  ８７／００４５８号を参照（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。外来ＤＮＡ配列及びそれらの生殖細胞を哺乳動物中に導入するための技術は、最初、マウスで開発された。例えば、「Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980); Gordon and Ruddle, Science 214:1244-1246(1981); Palmiter and Brinster, Cell 41:343-345(1985); and Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442(1985)」を参照されたい。これらの技術は、続いて、家畜種などのさらに大きな動物での使用に対して改変された（例えば、ＷＩＰＯ  公開公報ＷＯ  ８８／００２３９号、ＷＯ  ９０／０５１８８号及びＷＯ  ９２／１１７５号７；並びにSimons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988)を参照）。要約するために、現在まで、トランスジェニ
ックマウス又は家畜の作製において使用された最も効率的な経路では、目的のＤＮＡの線形分子数百を、確立された技術に従って、受精卵の前核の一つに注入する。接合子の細胞質中への、ＤＮＡの注入を使用することも可能である。トランスジェニック植物中での作製も使用され得る。発現は、全体化されるか、又は塊茎などの特定の器官へと誘導され得る。「Hiatt, Nature 344:469-479(1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453(1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221(1990)；及び欧州特許出願公開ＥＰ  ２５５，３７８号を参照。
【０１９７】
本発明に従って作製されたＦＶＩＩａは、アフィニティークロマトグラフィー又は抗ＦＶＩＩ抗体カラムによって精製され得る。免疫吸着カラムは、高特異性モノクローナル抗体を含むことが好ましい。「Wakabayashi et al., J. Biol. Chem, 261:11097-11108,(1986)及び「Thim et al., Biochem. 27:7785-7793, (1988)」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているような、カルシウム依存性モノクローナル抗体の使用が、特に好ましい。高性能液体クロマトグラフィーなどの慣用の化学的精製手段によって、さらなる精製を達成することもできる。クエン酸バリウム沈殿などの、他の精製方法も本分野において公知であり、本明細書に記載されているＦＶＩＩａの精製に対して適用することができる（概説として、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照。）。薬学的用途の場合には、少なくとも約９０ないし９５％均一性の実質的に純粋なＦＶＩＩａが好ましく、９８ないし９９％以上の均一性が最も好ましい。所望に応じて、部分的に又は均一になるまで精製されれば、ＦＶＩＩａは、次いで、治療的に使用され得る。
【０１９８】
一本鎖ＦＶＩＩの、活性な二本鎖ＦＶＩＩａへの変換は、「Hedner and Kisiel (1983, J. Clin. Invest. 71:1836-1841)」によって記載されているように、第ＸＩＩａ因子を用いて、又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ（Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42, 1983）を用いて達成することができる。あるいは、モノＱ．ＲＴＭ．（Pharmacia Fire Chemicals)など(Bjoern et al., 1986, Reserach Disclosures 269:564-565）などの、イオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させることによって、ＦＶＩＩを自己活性化させてもよい。本発明のＦＶＩＩａ分子及びその医薬組成物は、血管内凝固を伴う様々な症状を治療するために、ヒトに投与するのに特に有用である。
【０１９９】
本発明の化合物は、一又は複数の不斉中心を有する場合があり、分離された、純粋な、又は部分的に精製された立体異性体又はそのラセミ混合物としての立体異性体（光学異性体）が本発明の範囲に含まれるものとする。
【０２００】
本発明において、ＴＦアンタゴニストは、有機酸及び無機酸の塩を含む、薬学的に許容される塩、特に酸付加塩の形態で調製されることができる。このような塩の例には、ギ酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸などの有機酸の塩が含まれる。適切な無機の酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの塩が含まれる。薬学的に許容される無機又は有機酸付加塩のさらなる例には、「Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)」に列記されている薬学的に許容される塩が含まれ、これらは、当業者に公知である。
【０２０１】
本発明の化合物が形成し得る水和物も、薬学的に許容される酸付加塩として想定される。
【０２０２】
酸付加塩は、化合物合成の直接産物として取得することができる。別の方法としては、適切な酸を含有する適切な溶媒中に遊離塩基を溶解し、溶媒を蒸発させることによって、又はその他の方法で塩と溶媒を分離することによって塩を単離することができる。
【０２０３】
本発明の化合物は、当業者に公知の方法を用いて、低分子量の標準的溶媒と溶媒和を形成することができる。
【０２０４】
ＴＦアンタゴニストは、薬学的に許容される酸付加塩の形態で投与されることができ、又は、適宜、アルカリ金属若しくはアルカリ土類金属若しくは低級アルキルアンモニウム塩として投与されることができる。このような塩形態は、遊離の塩基形態と概ね同じレベルの活性を示すと考えられる。
【０２０５】
医薬組成物
別の側面において、本発明は、薬学的に許容される担体又は希釈剤と一緒に、活性成分として、ＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物又は薬学的に許容されるこれらの塩を含む医薬組成物をその範囲内に含む。
【０２０６】
必要に応じて、本発明の医薬組成物は、抗凝固活性を示す一又は複数の他の化合物（例えば、血小板凝集阻害剤）をさらに含み得る。
【０２０７】
本発明の化合物は、該化合物と薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む医薬組成物へと調合され得る。このような担体には、水、生理的食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール又はプロピレングリコール）又は植物油が含まれる。本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」は、任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗真菌剤、防腐剤、等張剤なども包含する。慣用溶媒が活性成分及び所期の使用に適合しない場合を除いて、本発明の組成物中でのその使用が想定される。
【０２０８】
組成物は、慣用技術によって調製され、慣用の形態で、例えば、カプセル、錠剤、溶液又は懸濁液で生じる。使用される薬学的担体は、慣用の固体又は液体担体であり得る。固体担体の例は、ラクトース、石膏、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油及び水である。同様に、担体又は希釈剤には、単独の又は蝋と混合された、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンなど本分野で公知の任意の徐放物質が含まれ得る。前記製剤は、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、防腐剤、甘味剤又は着香剤も含むことができる。本発明の製剤は、当業者に周知の操作を使用することによって、患者に投与した後に、迅速な、持続的な又は遅延した、活性成分の放出を与えるように調合し得る。
【０２０９】
医薬組成物は、所望であれば、滅菌し、活性化合物と有害に反応しない補助剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤及び／又は着色物質などと混合することが可能である。
【０２１０】
投与の経路は、経口又は非経口、例えば、直腸、経皮、皮下、鼻内、筋肉内、局所、静脈内、尿道内、眼用溶液又は軟膏など、適切な作用部位又は所望の作用部位へ活性化合物を効果的に輸送する任意の経路とすることができ、経口経路が好ましい。
【０２１１】
経口投与のために固体担体が使用されるのであれば、調製物を錠剤化し、粉末又はペレットの形態で硬ゼラチンカプセル中に配置し、又はトローチ若しくは薬用キャンディーの形態とすることが可能である。固体担体の量は幅広く変動し得るが、通常、約２５ｍｇから約１ｇまでであろう。液体担体が使用されるのであれば、前記調製物は、シロップ、エマルジョン、軟ゼラチンカプセル又は水性若しくは非水性液体懸濁液又は溶液などの注射可能な無菌液体の形態とすることができる。
【０２１２】
鼻内投与の場合、調製物は、エアロゾル適用のために、液体担体、特に水性担体中に溶解又は懸濁された式（Ｉ）の化合物を含有し得る。前記担体は、可溶化剤、例えば、ポリエチレングリコールなどの添加物、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）若しくはシクロデキスロリンなどの吸収増強剤又はパラベンなどの防腐剤を含有し得る。
【０２１３】
非経口適用の場合、注射可能溶液又は懸濁液、好ましくは、多ヒドロキシル化されたヒマシ油中に活性化合物が溶解された水溶液が特に適切である。
【０２１４】
タルク及び／又は炭水化物担体又は結合剤などを有する錠剤、糖衣錠又はカプセルが、経口適用に特に適している。錠剤、糖衣錠又はカプセルのための好ましい担体には、ラクトース、コーンスターチ及び／又はポテトスターチが含まれる。甘味ビヒクルを使用できる場合には、シロップ又はエリキシルを使用することが可能である。
【０２１５】
慣用の錠剤技術によって調製され得る典型的な錠剤は、以下のものを含有する。
【０２１６】
コア：
活性化合物（遊離化合物又はその塩として）              １０ｍｇ
コロイド状二酸化ケイ素（Ａｒｅｏｓｉｌ（Ｒ））          １．５ｍｇ
セルロース微結晶（Ａｖｉｃｅｌ（Ｒ））                  ７０ｍｇ
修飾されたセルロースゴム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（Ｒ））    ７．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム
コーティング：
ＨＰＭＣ                                            約９ｍｇ
＊Ｍｙｗａｃｅｔｔ（Ｒ）９−４０  Ｔ                  約０．９  ｍｇ
フィルムコーティングのための可塑剤として使用される、アクリル化されたモノグリセリド。
【０２１７】
本発明の化合物は、哺乳動物、特に、上述されているような、様々な血栓溶解又は凝固異常疾病又は疾患の治療、予防、除去、緩和又は軽減を必要としているヒトに投与され得る。このような哺乳動物には、動物（家畜動物、例えば、家庭のペット、及び野生生物などの非家畜動物の両方）も含まれる。
【０２１８】
不可欠な成分（ａ）ＴＦアンタゴニスト及び（ｂ）抗癌化合物は、全体で、治療されている患者に対する薬学的有効量となる各成分の量を、製剤の投薬が与えるような割合で、製剤中に存在する。投与されるべき本発明の組成物の投薬量は、年齢、体重、症候、所望される治療的効果、投与の経路、及び治療の期間などに応じて決定される。典型的には、ＴＦアンタゴニストと抗癌化合物の量の重量比は、約１００：１ないし約１００：１（ｗ／ｗ）の比を変動し得る。抗癌化合物に対するＴＦアンタゴニストの比は、このため、例えば、約１：１００、若しくは１：９０、若しくは１：８０、若しくは１：７０、若しくは１：６０、若しくは１：５０、若しくは１：４０、若しくは１：３０、若しくは１：２０、若しくは１：１０、若しくは１：５、若しくは１：２、若しくは１：１、若しくは２：１、若しくは５：１、若しくは１０：１、若しくは２０：１、若しくは３０．１、若しくは４０：１、若しくは５０：１、若しくは６０：１、若しくは７０：１、若しくは８０：１、若しくは９０：１、若しくは１００：１；、又は約１：９０ないし約１：１、若しくは約１：８０ないし約１：２、若しくは約１：７０ないし約１：５、若しくは約１：６０ないし約１：１０、若しくは約１：５０ないし約１：２５、若しくは約１：４０ないし約１：３０、若しくは約９０：１ないし約１：１、若しくは約８０：１ないし約２：１、若しくは約７０：１ないし約５：１、若しくは約６０：１ないし約１０：１、若しくは約５０：１ないし約２５：１、若しくは約４０：１ないし約３０：１；、若しくは約１０：１ないし約１：１０、若しくは約５：１ないし約１：５とすることができる。
【０２１９】
本発明の一実施形態では、ＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物の質量による比は、約１００：１ないし約１：１００（ｗ／ｗ）である。本発明の一実施形態では、ＴＦアンタゴニスト及び抗癌化合物の質量による比は、約９０：１ないし約１：１（ｗ／ｗ）である。
【０２２０】
経口、経鼻、経肺又は経皮投与に適したＴＦアンタゴニストの投与量は、対象の体重、症状及び症状の重篤度に応じて、７０ｋｇの対象に対して、負荷及び維持量として、約０．０５ｍｇから約５００ｍｇ／日まで、例えば、約１ｍｇから約２００ｍｇ／日まで、又は、例えば、約５ｍｇから約１７５ｍｇ／日までの範囲である。
【０２２１】
前記化合物は、経口、直腸又は非経口（皮下を含む。）経路によって、薬学的に許容される担体又は賦形剤と平行して、同時に、又は一緒に投与され得る。化合物は、しばしば、及び好ましくは、そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩の形態を採る。
【０２２２】
適切な投薬範囲は、投与の正確な様式、投与される形態、投与の対象となる適応症、関与する対象及び関与する対象の体重、並びに担当の医師又は獣医師の好み及び経験に応じて、上述のように変動する。
【試験法】
【０２２３】
ＦＶＩＩａ／リン脂質包埋ＴＦによって触媒されるＦＸの活性化の、ＴＦアンタゴニストＦＸａ生成アッセイによる阻害（アッセイ１）：
以下の実施例では、全ての濃度は最終濃度である。ＦＸ（５０ｎＭ）を添加する前に、ＨＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ，  ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中の脂質化されたＴＦ（１０ｐＭ）、ＦＶＩＩａ（１００ｐＭ）及びＴＦアンタゴニスト又はＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａ（０ないし５０ｎＭ）を、室温で６０分インキュベートする。さらに１０分後、１／２容量の停止緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ｐＨ  ７．４、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ、２０  ｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止する。基質Ｓ２７６５（０．６ｍＭ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添加し、４０５ｎｍの吸光度を、１０分間連続して測定することによって、生成されたＦＸａの量を決定する。ＦＶＩＩａ／脂質化ＴＦによって媒介されるＦＸの活性化の、ＴＦアンタゴニストによる阻害に対するＩＣ５０値を計算し得る。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａに対するＩＣ５０値は、本アッセイにおいて、５１＋／−２６ｐＭである。
【０２２４】
ＦＶＩＩａ／細胞表面ＴＦによって触媒されるＦＸの活性化の、ＴＦアンタゴニストによる阻害（アッセイ２）：
以下の実施例では、全ての濃度は最終濃度である。ＦＶＩＩａ／ＴＦによって触媒されるＦＸの活性化におけるＦＸ源として、ＴＦを恒常的に発現するヒト肺繊維芽細胞ＷＩ−３８（ＡＴＴＣ番号ＣＣＬ−７５）又はヒト膀胱癌腫細胞株Ｊ８２（ＡＴＴＣ番号ＨＴＢ−１）又はヒトケラチン生成細胞株ＣＣＤ  １１０２ＫｅｒＴｒ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３１０）の単層を使用する。９６ウェルプレート中の集密細胞単層を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ｐＨ４．７５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４  ｍＭ  ＫＣｌ及び１１  ｍＭグルコース）中で一回、及び緩衝液Ｂ（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ及び５ｍＭ  Ｃａ２＋を補充した緩衝液Ａ）中で一回洗浄する。緩衝液Ｂ中の、ＦＶＩＩａ（１ｎＭ）、ＦＸ（１３５ｎＭ）及び様々な濃度のＴＦアンタゴニスト又はＦＦＲ−ｒＦＶＶＩＩａを、細胞に同時に添加する。３７℃で１５分間、ＦＸａを形成させる。各ウェルから５０μＬのアリコットを取り出し、５０μＬの停止緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを補充した緩衝液Ａ）に添加する。上記混合物５０μＬをマイクロタイタープレートウェルに移し、２５μＬのＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  Ｘ（最終濃度０．６ｍＭ）をウェルに添加することによって、生成されたＦＸａの量を決定する。４０５ｎｍの吸光度を連続的に測定し、ＦＸａ標準曲線を用いて、発色の初速度をＦＸａ濃度に変換する。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａに対するＩＣ５０値は、本アッセイにおいて、１．５ｎＭである。
【０２２５】
細胞表面ＴＦへの１２５Ｉ−ＦＶＩＩａの結合の、ＴＦアンタゴニストによる阻害（アッセイ３）：
以下の実施例では、全ての濃度は最終濃度である。全てＴＦを恒常的に発現している、ヒト膀胱癌腫細胞株Ｊ８２（ＡＴＴＣ番号ＨＴＢ−１）又はヒトケラチン生成細胞株ＣＣＤ１１０２ＫｅｒＴｒ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３１０）又はＮＨＥＫ  Ｐ１６６（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ番号ＣＣ−２５０７）を用いた結合研究を使用する。２４ウェル組織培養プレート中の集密単層を、５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充した緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ｐＨ７．４５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４  ｍＭ  ＫＣｌ及び１１  ｍＭグルコース）中で一回、次いで緩衝液Ａで一回、及び緩衝液Ｂ（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ及び５ｍＭ  Ｃａ２＋を補充した緩衝液Ａ）中で一回洗浄する。１００μＬの冷たい緩衝液Ｂとともに、前記単層を２分間プレインキュベートする。様々な濃度のＭａｂ（又はＦＦＲ−ＦＶＩＩａ）及び放射線標識されたＦＶＩＩａ（０．５ｎＭ  １２５Ｉ−ＦＶＩＩａ）を、細胞に同時に添加する（最終容量２００μＬ）。プレートを、４℃で２時間インキュベートする。インキュベーションが終了した時点で、未結合の物質を除去し、氷冷された緩衝液Ｂで細胞を４回洗浄し、３００μＬの溶解緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶解する。ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ，  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で放射能を測定する。結合データを分析し、ＧｒａＦｉｔ４（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｌｔｄ．，（Ｕ．Ｋ．））を用いてカーブフィッティングを行う。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａに対するＩＣ５０値は、本アッセイにおいて、４ｎＭである。
【０２２６】
バイオセンサーアッセイ（アッセイ４）：
ＴＦアンタゴニストの標準溶液を、ＴＦが固定化されたチップ上に通過させることによって、Ｂｉａｃｏｒｅ装置上でＴＦアンタゴニストを検査する。この後に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．０００３％  ポリソルベート  ２０を含有する１０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４中のｓＴＦの様々な濃度を加える。一体型Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて、センサーグラムからＫｄを算出する。
【０２２７】
ＦＶＩＩａ／ＴＦによって誘導されたｐ４４／４２  ＭＡＰＫ活性化の、エフェクタードメインを有するＴＦアンタゴニストによる阻害（アッセイ５）：
化学発光の定量的測定（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ−１０００）によって、ウェスタンブロット分析から、リン酸化されたｐ４４／４２  ＭＡＰＫ及び／又はＡｋｔ及び／又はｐ９０ＲＳＫの量を測定する。細胞を静止状態にするために、実験の２４又は４８時間前に、ヒトＴＦを発現する細胞、例えば、ＣＣＤ１１０２ＫｅｒＴｒ、ＮＨＥＫ  Ｐ１６６、ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７又はヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１を、０ないし０．１％のＦＣＳを加えた媒地中で培養する。実験当日に、細胞は７０ないし８０％の集密度となるはずである。１０ないし１００ｎＭのＦＶＩＩａを添加する前に、３７℃で３０分間、無血清培地中で、過剰のＴＦアンタゴニスト又はＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａとともに細胞をプレインキュベートし、１０分間インキュベートすることによって実験を行う。細胞シグナル伝達の陽性対照として、１０％  ＦＣＳで細胞を１０分間処理する。溶解緩衝液（０．１ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）ベンゼン−スルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）及び１ｍＭ  ベンズアミジンを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、１０ｍＭ  βグリセロリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ７．５）中で細胞を溶解する前に、氷冷したＰＢＳ中で、細胞を２回洗浄する。１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、５μｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍＬアプロチニンを、使用直前に添加する。可溶化液をＳＤＳ試料緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せた。各ゲル上には、ビオチン化された標準的なタンパク質マーカーを載せる。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離されたタンパク質を、電子ブロッティングによってニトロセルロースへと転写し、リン特異的抗体を用いたイムノブロッティングによって、キナーゼｐ４４／４２  ＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びｐ９０ＲＳＫを可視化し、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ１０００によって、化学発光を定量する。
【０２２８】
本発明は、実施例中に開示されている具体的な実施形態によって、範囲が限定されるものではなく、実施例は、本発明の多数の側面を例示することを目的としたものであり、機能的に均等である任意の実施形態が、本発明の範囲に属する。当業者であれば、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を知悉しており、又は一般的な実験操作を用いて確定することが可能であろう。これら及び他の全ての均等物が、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１−１】図１は、ネイティブ（野生型）ヒト凝固因子ＶＩＩの完全なアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１−２】図１は、ネイティブ（野生型）ヒト凝固因子ＶＩＩの完全なアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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