(57)【要約】  本発明は、超音波造影剤を事前に投与しておいた被検体からのリンパ節の超音波画像を、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように処理する方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波造影剤を事前に投与しておいた被検体からのリンパ節の超音波画像を、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように処理する方法。
【請求項２】
事前投与に使用される超音波造影剤が、特定の超音波造影剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記特定の超音波造影剤が、マトリックス材料と、ガス又はガス前駆体又はこれらの混合物とを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記特定の超音波造影剤が、直径約０．２５〜１５μｍの平均粒径と、圧力１２０ｍｍＨｇで５０％以上の圧力安定性とを有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記超音波画像が、１回に又は複数の異なる時点で取得される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記超音波画像が、２次元又は３次元、好ましくは３次元で取得される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
画像のコントラスト増強パターンから濃度値ヒストグラムが得られるように超音波画像を処理する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記濃度値ヒストグラムから、記述的統計指標、好ましくは標準偏差、歪度又は尖度が算出される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
コントラスト増強パターンの粗さの定量的尺度が得られるように超音波画像を処理する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記処理が、境界の長さの測定値に基づく、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階ａ）〜ｃ）
ａ）リンパ節を示す画像の領域を識別する段階、
ｂ）上記領域をコントラスト増強領域と非増強領域とに分割する段階、及び
ｃ）増強領域と非増強領域との境界の長さを測定し、得られた測定値を上記領域の総面積で除す段階
を含む、請求項９又は請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
フィリングパターンのコントラスト増強の定量的尺度が得られるように超音波画像を処理する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記処理が単一の画像に基づく、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階ａ）〜ｃ）：
ａ）正常リンパ節の画像に基づいてテンプレートを得る段階、
ｂ）被検体からのリンパ節の画像にテンプレートを幾何学的にフィットさせる段階、及び
ｃ）最適適合パラメーターを計算する段階
を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記処理が一連の画像に基づく、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
リンパ節の中心領域と周縁領域との間のコントラスト増強が現れる時間的及び／又は空間的ずれの推定を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階ａ）〜ｃ）：
ａ）周縁部から中心への複数の同心円領域でモデルをリンパ節にフィットさせる段階、
ｂ）同心円領域の各々についてコントラスト増強が現れる時間を計算する段階、及び
ｃ）コントラスト増強が現れる時間差を計算する段階
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
リンパ節のテクスチャの定量的尺度が得られるように超音波画像を処理する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
以下の段階ａ）〜ｂ）：
ａ）被検体からのリンパ節を表示する画像上で関心領域を選択する段階、及び
ｂ）選択された関心領域をパターンの配向及び空間周波数について分析する段階
を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記段階ｂ）で空間フーリエ変換が計算される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記段階ｂ）で自己相関関数が計算される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
コントラスト増強パターンの粗さの定量的尺度及びリンパ節のテクスチャの定量的尺度が得られるように超音波画像を処理する、請求項１乃至請求項６記載の方法。
【請求項２３】
前記定量的尺度が、リンパ節を正常又は悪性リンパ節として特徴付けるのに用いられる、請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記段階ｃ）で計算される適合パラメーターが、リンパ節を正常又は悪性リンパ節節として特徴付けるための閾値と比較される、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
前記段階ｃ）の結果が、リンパ節を正常又は悪性リンパ節節として特徴付けるのに用いられる、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
超音波造影剤を被検体に投与し、被検体のリンパ節の超音波画像を取得し、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように画像を処理することによって、リンパ節を正常又は悪性リンパ節節として特徴付ける方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波造影剤を事前に投与しておいた被検体からの超音波画像を、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ系は、組織を始点としてリンパ液を局所リンパ節に運ぶように設計された脈管又は導管からなり、リンパ節でリンパ液を濾過・処理して次のリンパ節に送り、リンパ液は最終的には胸管に達して血流に入る。リンパ管に入るリンパ液は、組織からの物質や材料（例えば抗原、粒子、細胞など）を一緒に運んでいる。リンパ節はリンパ液をふるい分けて処理し、リンパ節内のマクロファージがリンパ液で運ばれた粒状物及び細胞材料を貪食作用によって除去する。
【０００３】
組織又は器官に癌が生じると、そのゆるい基質のため細胞が遊離して、リンパ系に入り、リンパ節に捕捉されて増殖することがある。リンパ節での癌増殖の初期段階では、癌はリンパ節に限局される。しかし、時間経過とともに、リンパ節内の蓄積物が大きく成長してリンパ節に完全に置き換わったり、下流の次のリンパ節へと拡散することがある。関心のもたれる組織又は器官（即ち、癌組織）から流入するリンパ節を所属リンパ節といい、癌を捕捉する最初のリンパ節をセンチネルリンパ節という。
【０００４】
従来、状況によって、腫瘍から転移した腫瘍細胞が潜んでいる可能性のあるすべてのリンパ節を除去するのが一般的な処置であった。この処置には高い罹患率が伴う。そのため、リンパ節、特にセンチネルリンパ節を同定・生検するための方法が幾つか開発された。センチネルリンパ節に腫瘍細胞が検出されなければ、それ以上のリンパ節生検及びリンパ節切除を避けることができる。センチネルリンパ節の同定は、担癌組織にマーキング剤を注入し、リンパ系を流れるマーキング剤の経路を辿ることで行われてきた。
【０００５】
可能なマーキング剤は、染料のような可視マーキング剤（Ａ．Ｅ．Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  ２２０，１９９４，３９１−４０１）又は米国特許５７３２７０４第に記載されているような放射性医薬化合物である。さらに、リンパ節のイメージング及び／又はセンチネルリンパ節検出に、造影剤も使用されている（例えば、国際公開第００／４５８５５号及び国際公開第００／３８５７９号参照）。
【０００６】
しかし、同定されたリンパ節の特性評価、つまり正常リンパ節と悪性リンパ節との判別のため、リンパ節の少なくとも一部を除去して悪性細胞の有無について組織学的検査を行うのが通常であった。その侵襲的性質のため、かかる処置は、患者に対して身体的ストレスを追加することとなる。
【０００７】
Ｍａｔｔｒｅｙらは、センチネルリンパ節の超音波イメージングの際に、リンパ節内の癌が造影剤材料で満たされずに、陰影欠損が残ると記載している。しかし、その確認にはさらなる研究が必要であると記載されている（Ｒ．  Ｍａｔｔｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ９，  ２００２，  Ｓ２３１−Ｓ２３５）。
【０００８】
ＰＣＴ／ＮＯ０３／００３２８号には、マイクロバブルを造影剤として使用して、超音波検出法でセンチネルリンパ節を識別する方法が開示されている。さらに、良性センチネルリンパ節と悪性センチネルリンパ節とを、それらの増強パターンの差から判別できると記載されており、良性センチネルリンパ節が一様なエコー輝度を与えるのに対して、悪性センチネルリンパ節は高エコー領域と非増強領域とが共存する不均一な増強パターンを示す。
【０００９】
以上の二段落に記載した知見に基づいて正常リンパ節と悪性リンパ節とを判別する方法の短所は、判別が視覚的評価のみに基づくので、この視覚的評価を実施するための特別の訓練を受けた医師が必要とされることである。
【特許文献１】米国特許第５７３２７０４号明細書
【特許文献２】国際公開第００／４５８５５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第００／３８５７９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９９／５５３８３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９７／２９７８３号パンフレット
【特許文献６】欧州特許出願公開第３５９２４６号明細書
【特許文献７】米国特許第４７１８４３３号明細書
【特許文献８】米国特許第４６８４４７９号明細書
【特許文献９】米国特許第５０８８４９９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５１２３４１４号明細書
【特許文献１１】国際公開第９４／２８８７４号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第９１／１５９９９号パンフレット
【非特許文献１】Ａ．Ｅ．Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  ２２０，１９９４，３９１−４０１
【非特許文献２】Ｒ．  Ｍａｔｔｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ９，  ２００２，  Ｓ２３１−Ｓ２３５
【非特許文献３】Ｌ．Ｈｏｆｆ，  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１，ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｐａｇｅ  ９９−１０９
【非特許文献４】Ｗ．Ｔ．Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．＆  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２６，２０００，１−１１
【非特許文献５】ＤｅＬａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４０：２９９７−３００１
【非特許文献６】ＭｃＧａｈａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ：Ａ  Ｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９９８）
【非特許文献７】Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｋｒｅｍｋａｕ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９８）
【非特許文献８】Ｇａｍｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、正常リンパ節と悪性リンパ節とを判別するための、非侵襲的で簡単で信頼性が高く、患者に安全な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、超音波造影剤を事前に投与しておいた被検体からのリンパ節の超音波画像の処理であって、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られる処理を用いて、正常リンパ節と悪性リンパ節とを判別できることが判明した。定量的尺度を得ることによって、判別は、主観的な視覚的評価だけではなく、客観的な基準にも基づく。さらに、ソフトウェアプログラムのような自動化ツールを用いて、生成データ（すなわち、定量的尺度）の分析を実施することもでき、ひいては視覚的評価だけに基づくことに付随する偽陽性又は偽陰性の結果がなくなる。当該方法は、超音波リンパ管造影の可能なあらゆる身体領域に適用可能であり、特に関心のもたれる領域は、乳癌、メラノーマ及び頸部腫瘍である。
【００１２】
したがって、本発明は、超音波造影剤を事前に投与しておいた被検体からのリンパ節の超音波画像を、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように処理する方法を提供する。この方法は、好ましくは、正常リンパ節と悪性リンパ節との判別に用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に関して、「被検体」とは、鳥や哺乳類のような脊椎動物、好ましくはヒトの被検体を意味する。
【００１４】
本発明に関して、「悪性」という用語は、腫瘍組織、癌性、転移性などの用語と同義に用いられる。この用語は正常な健康状態とは異なる状態を示す。
【００１５】
本発明に関して、「正常」という用語は、良性や健康などの用語と同義に用いられる。この用語は、非腫瘍／非癌／非転移状態を示す。
【００１６】
本発明による画像処理の実施前に被検体に事前に投与しておく超音波造影剤はどのような超音波造影剤であってもよく、例えば自由ガス又は安定化ガス、すななわち、例えばマトリックス材料で囲繞されたガス及び／又はマイクロバブル、ベシクル、リポソームもしくはマイクロカプセルに封入したガスなどでよい。他のガス前駆体を、事前投与用の超音波造影剤として使用してもよい。「ガス前駆体」という用語は、常温常圧で液体又は固体であって、関連温度（例えば被検体の体温）で液相から気相へと変化する物質をいう。「ガス」及び「ガス前駆体」に言及する場合、ガス及びガス前駆体の混合物も上記の定義の範囲に含まれることは明らかであろう。好ましい実施形態では、被検体には、粒状超音波造影剤、好ましくは、マトリックス材料とガス又はガス前駆体又はそれらの混合物とを含む粒状超音波造影剤を事前に投与する。他の好ましい実施形態では、粒状超音波造影剤は、マイクロバブル、ベシクル、リポソーム又はマイクロカプセル、好ましくはガス又はガス前駆体又はそれらの混合物を含むものを含む。
【００１７】
かかる好ましい粒状超音波造影剤は、炭水化物、タンパク質、脂質、天然もしくは合成高分子材料、糖類、ペプチド、タンパク性材料など又はこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のマトリックス材料を含む。
【００１８】
特に好ましい実施形態では、シェルとガス又はガス前駆体とを含み、直径約０．２５〜１５μｍの平均粒径及び圧力１２０ｍｍＨｇで５０％以上の圧力安定性を有するマイクロバブルを、本発明の方法に関連して、つまり被検体の事前投与に用いる。かかるマイクロバブルは、注入しても無傷のまま残るので、本発明の方法を正常センチネルリンパ節と悪性センチネルリンパ節との判別に用いる際に特に有用である。これらのマイクロバブルは、リンパ系及びセンチネルリンパ節に容易に取り込まるだけでなく、センチネルリンパ節に保持され、安定なまま残るので、高感度で効果的な超音波検出が可能となる。
【００１９】
「シェル」という用語は、「壁」又は「膜」という用語と同義に用いられ、マイクロバブルを囲繞もしくは画成する材料を意味する。シェルは１以上の層の形態のものであればよく、好ましくは単一の単層又は二重層（ユニラメラ層）の形態であるが、単層又は二重層を用いて１以上の単層又は二重層（オリゴラメラ層又はマルチラメラ層）を形成していてもよい。２以上の単層又は二重層が存在する場合、単層又は二重層は好ましくは同心状である。好適には、シェルは脂質、天然又は合成高分子材料、タンパク質材料、炭水化物、糖類など、或いはこれらの組合せから調製できる。好ましい実施形態では、シェルは全体として負又は正の正味電荷を有する。この場合、シェルは、過剰の負又は正電荷を有する高分子材料又はタンパク質材料からなるものでも、かかる材料を含むものでもよく、或いはシェルは負又は正に荷電した脂質からなるものでも、かかる荷電脂質を含むものでもよい。別法として、シェルは、中性の高分子、タンパク質又は脂質材料を組込み又は表面修飾によって全体として正味電荷を与える負又は正に荷電した成分と結合させたものからなるものでも、かかる材料を含むものでもよい。好ましくは、シェルは脂質、さらに好ましくはリン脂質からなるか、これを含んでおり、例えば、ホスファチジルコリン（好ましくは、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジヘプタデカノイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン又はジベヘノイルホスファチジルコリン）、ホスファチジルセリン（好ましくは、ジパルミトイル又はジステアロイルホスファチジルセリン）、ホスファチジルグリセロール（好ましくは、ジパルミトイル又はジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（好ましくは、ジパルミトイル又はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルイノシトール（好ましくは、ジパルミトイル又はジステアロイルホスファチジルイノシトール）、ホスファチジン酸（好ましくは、ジパルミトイル又はジステアロイルホスファチジン酸）、カルジオリピン或いは上述の化合物の混合物で、適宜コレステロール、コレステロールスルフェート、コレステリルヘミスクシネート、Ｎ−パルミトイルホモシステイン、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸又はアラキン酸と混合したものからなるか、或いはこれらを含む。別法として、シェルは上述の脂質のフッ素化類似体からなるか、これを含むものでもよい。別の好ましい実施形態では、シェルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（好ましくは、ＰＥＧ２０００〜８０００）のような親水性高分子に共有結合した上述の脂質（例えば、ジパルミトイル又はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００）からなるか、これを含む。特に好ましい実施形態では、シェルは、負に荷電したリン脂質、さらに好ましくは炭素原子数１４以上の脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸又はアラキン酸）に基づく負に荷電したリン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール又はジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ）を、好ましくは５０〜１００％、さらに好ましくは７０〜９０％の量で含む。別の好ましい実施形態では、シェルは、正に荷電した合成脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−１（−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）などの、核酸輸送に通常使用される陽イオン脂質）を、好ましくは１〜２０％の量で含む。別法として、シェルはリポペプチド（例えば、国際公開第９９／５５３８３号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）に記載されたようなリポペプチド）からなるか、これを含む。
【００２０】
好適には、事前投与での使用に好ましいマイクロバブルは、空気、窒素及びフッ素化化合物（部分的にフッ素化された化合物でも、完全にフッ素化（ペルフルオロ化）された化合物でもよい。）を純化合物又はこれらの混合物として含む。好ましい実施形態では、マイクロバブルはペルフルオロ化合物（例えば、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、六フッ化硫黄など）を、適宜窒素との混合物として、含む。
【００２１】
事前投与での使用に好ましいマイクロバブルは、直径０．２５〜１５μｍ、好ましくは０．５〜７μｍ、特に好ましくは１〜５μｍの平均粒径を有する。これらは、圧力１２０ｍｍＨｇで５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９５％以上の圧力安定性を有する。かかるマイクロバブルを（軟）組織に投与するのに必要な圧力は、かなり大きいものになり得るので、超音波造影剤は、かかる圧力に破壊されずに耐えることができるものでなければならない。したがって、圧力１２０ｍｍＨｇで５０％以上の圧力安定性が、かかるマイクロバブルの好ましい特性である。
【００２２】
本発明に関して、「５０％以上の圧力安定性」という用語は、１２０ｍｍＨｇの圧力に付した後のマイクロバブルの音響減衰効率が、圧力に付す前のマイクロバブルの音響減衰効率の５０％以上であることを意味する。したがって、圧力暴露の前後におけるマイクロバブルの音響減衰効率を比較すれば、マイクロバブルの超音波造影効率の尺度を得ることができる。音響減衰効率は、３．５ＭＨｚ及び／又は５．０ＭＨｚの中心周波数を有する１又は２つの広帯域変換器を用いて、マイクロバブル試料の希釈懸濁液を通過する音響ビームの減衰度（ｄＢ／ｃｍ）を測定することによって求めることができる。透過率は、パルスエコー法で測定される。即ち、短い音波パルスを変換器から発振し、測定セルのコンパートメントを通してからコンパートメントの後壁で反射させ、発振した変換器で再び受信する。パルスをオシロスコープでデジタル化し、周波数スペクトルをフーリエ変換で計算する。透過路及び変換器特性を補償するため、スペクトルを純粋な希釈剤のスペクトルに対して正規化する。減衰スペクトルの測定及び好適なシステム構成に関する詳しい説明は、Ｌ．Ｈｏｆｆ，  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１，ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｐａｇｅ  ９９−１０９（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）に記載されている。分析は、通常は０〜５０℃の範囲内、好ましくは室温で実施される。分析の第一段階では、希釈剤から基準スペクトルを取得する。好適な希釈剤は気泡を含まないものであり、マイクロバブルが安定に存在する液体が使用できる。好ましい希釈剤は、リン酸塩緩衝剤と表面張力を下げるための界面活性剤とを含む０．９％食塩水であるＩｓｏｔｏｎ  ＩＩ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社（英国ルートン））のような等張食塩水である。次の段階で、マイクロバブル試料を希釈剤と混合し、１以上の減衰スペクトルを周囲圧力下で測定する。マイクロバブル試料の濃度は、マイクロバブルの粒度に応じて調整される。好ましくは、希釈率は、マイクロバブル試料による減衰量が１５〜２０ｄＢ（即ち、約３ｄＢ／ｃｍ）となるものである。これは、通例、マイクロバブルを１０３〜１０４倍に希釈することを意味する。次の段階で、圧力を１２０ｍｍＨｇに高め、１以上の減衰スペクトルを測定する。圧力安定度の測定には、加圧前のマイクロバブル試料の音響減衰効率を１００％に設定して、加圧後のマイクロバブル試料の相対音響減衰効率が計算できるようにする。
【００２３】
他の好ましい実施形態では、事前投与での使用に好ましいマイクロバブルは、０．２以上のメカニカルインデックス（ＭＩ）の超音波造影法に伴う圧力変動に対して安定である。超音波造影圧に関連したマイクロバブル安定度の測定方法は、Ｗ．Ｔ．Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．＆  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２６，２０００，１−１１に記載されている。
【００２４】
好適には、事前投与での使用に好ましいマイクロバブルはエコー源性を有する。つまり、超音波を散乱又は反射することができる。好ましくは、マイクロバブルは超音波パルスの送信周波数とは異なる周波数の信号を返すように適合している。
【００２５】
事前投与での使用に好ましいマイクロバブルは、例えば、振盪、ボルテックス、超音波処理、押出、繰返し凍結融解サイクル、所定孔径のポアからの加圧押出及び噴霧乾燥を始めとする、当業者に自明の様々な方法で調製できる。例えば、脂質からなるマイクロバブルに関しては、脂質含有媒体を、選択に係るガス又はガス前駆体の存在下で、適当なエマルジョン形成技術（例えば、超音波処理、高圧均質化又は高剪断混合）に付せばよい。乳化段階で用いるガスは、最終マイクロバブル中のガスと同じものである必要はない。即ち、このガスの大部分は後の凍結乾燥段階で除去することができ、残留ガスは乾燥生成物の排気で除去することができる。次いで、乾燥生成物に大気圧又は過圧の所望最終生成ガスを加えればよい（例えば、国際公開第９７／２９７８３号参照。）。
【００２６】
かかるマイクロバブルのその他の形成法としては、タンパク質を含むマイクロバブルの形成（欧州特許出願公開第３５９２４６号及び米国特許第４７１８４３３号）、脂質を含むマイクロバブルの形成（米国特許第４６８４４７９号）、並びにリポソーム系マイクロバブルの形成（米国特許第５０８８４９９号、同第５１２３４１４号及び国際公開第９４／２８８７４号）が挙げられる。
【００２７】
超音波造影剤は、好ましくは製剤の形態、好ましくは液体製剤の形態で事前投与される。以下、「超音波造影剤」という用語と「超音波造影用製剤」という用語は同義に用いられる。
【００２８】
事前投与に有用な製剤は、超音波造影剤、好ましくは粒状超音波造影剤、さらに好ましくはマイクロバブルと、浸透圧剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、粘度調整剤、乳化剤、可溶化剤、懸濁剤、湿潤剤、酸化防止剤、増粘剤、張度上昇剤、塩、糖などからなる群から選択される１種以上の成分を含む。かかる成分は、超音波造影剤の最大寿命及び有効性を確保するために添加される。さらに、無菌性、等張性及び生体適合性のような考慮すべき事項によって、かかる成分の使用が左右されることもある。
【００２９】
好適な粘度調整剤としては、例えば、炭水化物やそのリン酸化及びスルホン化誘導体、ポリエーテル（好ましくは４００〜１０００００の分子量範囲のもの）、並びにジヒドロキシ−及びトリヒドロキシ−アルカン及びそれらのポリマー（好ましくは２００〜５００００の分子量範囲のもの）が挙げられる。
【００３０】
好適な乳化及び／又は可溶化剤としては、例えば、アラビアゴム、コレステロール、グリセリルモノステアレート、ラノリンアルコール、レシチン、モノ及びジグリセリド、エタノールアミン、オレイン酸ジエタノールアミン、オレイルアルコール、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８４及びポロキサマー１８１）、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミン、乳化性ワックスなどが挙げられる。
【００３１】
好適な懸濁剤及び／又は増粘剤としては、例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
カラギーナン、デキストラン、ゼラチン、グアーガム、ローカストビーンガム、ビーガム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、二酸化ケイ素、ゼオライト、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポビドン、プロピレングリコールアルギネート、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム、α−ｄ−グルコノラクトン、グリセロール及びマンニトールが挙げられる。
【００３２】
好適な懸濁剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリソルベートなどが挙げられる。
【００３３】
安定化と共に張度の増加をもたらす好適な張度上昇剤としては、例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、スクロース、プロピレングリコール及びグリセロールが挙げられる。
【００３４】
事前投与用の超音波造影剤を含む製剤は、さらに染料又は生物学的活性剤、好ましくは鎮痛薬、抗生物質、ロイコトリエン阻害薬もしくは拮抗薬、抗ヒスタミン薬、抗炎症薬、抗悪性腫瘍薬、抗コリン薬、麻酔薬、酵素、ステロイド、遺伝物質、ウィルスベクター、アンチセンス剤、タンパク質及びペプチドからなる群から選択されるものを含んでいてもよい。
【００３５】
好ましい実施形態では、製剤はさらに、マクロファージの摂食を促進する化合物、例えば、マンナン（例えば、ザイモサン）、マンノース含有オリゴ糖及び多糖、免疫グロブリン分子のＦｃ（結晶性フラグメント）部分、補体成分（例えば、Ｃ３ｂ又はＣ３ｂｉ）、スカベンジャー受容体のリガンド、トール様受容体のリガンド、ＬＲＰ（ＬＤＬ受容体様タンパク質）のリガンド、細菌糖ペプチド又はリポ多糖（例えば、ブレオマイシン又はエンドトキシン）を含む。
【００３６】
製剤は、好ましくは、水溶液又は非水溶液を始めとする適当なキャリアと、上述の成分及び／又は化合物とを含む懸濁液又はエマルジョンのような無菌の注射可能な製剤である。好ましいキャリアは水又は食塩水である。
【００３７】
事前投与用の製剤は、公知の方法で調合できる。好ましい実施形態では、製剤は使用直前、つまり被検体に投与する前に製造される。例えば、乾燥超音波造影剤、好ましくはマイクロバブル生成物を、適当なキャリア及び上述の化合物及び成分の１種以上と混合すればよい。別の好ましい実施形態では、マイクロバブル製剤を使用直前に製造するとともに、製剤の製造時にマイクロバブルをその場で生成する。例えば、所望のガス及びマイクロバブルのシェルを構成する成分を含むバイアルに適当なキャリアを添加し、この混合物を撹拌すればよい。事前投与用の製剤は、好ましくは被検体への投与前に滅菌され、及び／又は無菌出発原料から製造される。製剤の滅菌は、細菌保持フィルターでの濾過、滅菌剤の配合、照射などで達成できる。
【００３８】
画像取得前の超音波造影剤の事前投与は、血管内投与以外の様々な方法で実施できる。非経口投与が好ましく、特に限定されないが、筋肉内投与、経皮投与、リンパ管への直接投与、組織内投与、腹腔内投与、くも膜下投与、皮下投与、滑膜内投与、（経皮投与を含む）経上皮投与、皮膚投与、皮内投与、皮下投与、腫瘍又は病理過程自体などが挙げられる。好ましくは、超音波造影剤は組織内に事前投与され、好ましくは皮下注射及び皮内注射を始めとする組織内投与で投与される。好ましい実施形態では、超音波造影剤は腫瘍の近傍（腫瘍周囲）に注射される。また、リンパ節への蓄積を確実にするため、超音波造影剤を２以上の非経口モードの組合せで（例えば、筋肉内、皮下及び病理過程に）投与することもできる。
【００３９】
超音波造影剤は、通常、超音波造影剤が確実に移動してリンパ循環に取り込まれる部位及び手段で投与される。これは、撮像すべき系に応じて異なる。検査すべき所属リンパ節に適切にドレナージできるようにするため、複数の注射部位が好ましいことがある。場合によっては、腫瘍又は生検部位の周辺への注射が望ましい。また、特定の鞘又は窩への注射が好ましいこともある。手指又は足指の趾間への注射は、末梢リンパ管の検査に常用されるモードである。リンパ節の位置を決定するため、超音波造影剤は術前及び／又は術中に被検体に投与できる。本発明の方法は、超音波造影剤を関心領域に事前投与してからリンパ節に到達するまでのリードタイムをさほど必要としないので、リンパ節を即座にリアルタイムで識別することができる。さらに、注射部位のマッサージ又は流れの促進を始めとして、リンパ節への超音波造影剤の輸送を修正又は変更するための追加の方法を使用できる。好ましくは、超音波造影剤の注射部位にマッサージを施す。
【００４０】
本発明の方法での使用が好ましいマイクロバブルを用いるときは、当該方法を用いてリンパ節の位置を探し出して、正常センチネルリンパ節と乳癌に関連した悪性センチネルリンパ節とを判別することができる。腫瘍内や腫瘍周辺並びに腫瘍に隣接した皮下にマイクロバブル製剤を注射することによって、腋窩、鎖骨下及び鎖骨上リンパ節の画像を得ることができる。腫瘍と同側の肋骨下部位に片側注射を行い、次いで両側のリンパ節造影を行うことができる。製剤を腫瘍近傍に注射することで、医師は、センチネルリンパ節に通じる関連リンパ管が腋窩、内胸又は鎖骨上リンパ節に向かうことが分かるので、各注射後の適切な時間に超音波検出を行う。
【００４１】
正常センチネルリンパ節と乳癌に関連した悪性センチネルリンパ節との判別に本発明の方法を用いる場合、両側の乳房の乳輪組織の周囲に製剤を注射し、次いで腋窩、内胸又は鎖骨上リンパ節を検出するのが好ましい。乳輪周囲への注射に加えて、腋窩リンパ管の可視化には製剤の指間投与を用いることもできる（ＤｅＬａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４０：２９９７−３００１参照。）。指間及び乳輪周囲への製剤の複合投与で、罹患腋窩リンパ節への取込み量増加の実証精度を高めることができる。また、乳癌又は黒色腫の患者には、マイクロバブルの腫瘍内注射を行うこともできる。
【００４２】
超音波造影剤は有効量（即ち、十分な検出が可能となる量）で投与すべきである。液体形態の超音波造影剤の体積は、通常、例えば事前投与部位、製剤の濃度、注射の回数、製剤の組成及び／又は製剤中に存在する超音波造影剤の種類、並びに各被検体に特有の性質に応じて変化する。
【００４３】
事前投与後、超音波造影剤をリンパ節に蓄積させる。
【００４４】
本願明細書第１１頁及び１２頁に記載したように事前投与を実施すれば、超音波造影剤がリンパ節に到達してそこに蓄積するまでに要するリードタイムはさほど長くない。これは、特に事前投与用の超音波造影剤として、シェルとガス又はガス前駆体とを含み、直径約０．２５〜１５μｍの平均粒径及び圧力１２０ｍｍＨｇで５０％以上の圧力安定性を有するマイクロバブルを使用する場合にいえる。かかるマイクロバブルに関して本願明細書第４頁で詳細に説明した。そこで、超音波造影剤の投与後にリンパ節を速剤にリアルタイムで識別することができる。一般に、事前投与での使用に好ましいマイクロバブルは、６０分未満でリンパ節に蓄積できるものにすべきである。好ましい実施形態では、超音波造影剤は、１５分未満、特に好ましくは５分未満でリンパ節に蓄積する。
【００４５】
超音波画像の取得に関しては、本発明での使用が想定される超音波撮像技術は当技術分野で公知であり、例えば、ＭｃＧａｈａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ：Ａ  Ｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９９８）及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｋｒｅｍｋａｕ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９８）に記載されている。本発明で有用な具体的な超音波撮像モードとしては、ハーモニック又は非線形イメージング、グレースケール（Ｂモード）イメージング、ドップラーイメージング（パルスウェーブ、パワー、フロー、カラー、振幅、スペクトラル及びハーモニックドップラーイメージングを含む）、３Ｄイメージング、ゲートイメージングなどが挙げられる。非線形イメージングに関しては、本発明は広帯域ハーモニックイメージング及びパルスインバージョンハーモニックイメージングに適合することは自明であろう。
【００４６】
ハーモニックイメージングの使用が望まれ、超音波造影装置が特定周波数で撮像を行うように設定される場合、音響変換器に供給される送信波形はイメージング周波数の分数（例えば、１／２、２／３、１／３など）或いはイメージング周波数の整数倍又は分数倍（例えば、２、３、４など）とすることができる。マイクロバブル製剤と励起周波数とのいかなる組合せでも、ある高調波が優勢となる。第二高調波が一般的な例である。明らかにこれらの最も強い高調波が好ましいが、複数の画像の形成又はバックグラウンドの除去のような理由から、他の高調波又は周波数を選択することもできる。さらに、高調波及び非高調波周波数又はこれらのの組合せを始めとする幾つかの周波数を同時に検出して所望の画像を得ることもできる。つまり、好ましい実施形態では、送信周波数以外の任意の周波数を用いて所望のデータを得ることができる。超音波造影剤の簡単な実験によって主高調波を決定できることは当業者には自明であろう。
【００４７】
超音波造影剤によって発生した再放射超音波エネルギーの検出には、従来の超音波スキャナー装置の改良型又は市販の非線形イメージング装置が使用できる。これらの装置は、超音波画像作成用のマイクロバブル製剤によって放射された新しい周波数又は高調波の１以上又は全部を検出又は選択できる。換言すれば、放射周波数と異なる周波数を検出する。ハーモニック超音波イメージングに適した装置は、国際公開第９１／１５９９９号に開示されている。ただし、多くの慣用超音波造影装置では広帯域幅の動作が可能な変換器が用いられており、変換器に送信される送信波形はソフトウェア制御されている。このような理由から、検出するものとは異なる波形を発信するための再プログラミングは十分に当業者の技術レベルの範囲内にある。
【００４８】
高調波超音波イメージング、第二高調波超音波イメージング又は好ましくはパルスインバージョンのような非線形超音波イメージングが、本発明の方法での使用に特に好ましいが、Ｂモード（グレイスケールイメージング）、Ｆモード（カラーフロー又はドップラー金属間化合物ーニング）のような他のタイプの常用超音波イメージングも本発明に適合しており、本発明の技術的範囲に属する。
【００４９】
Ｂモードイメージングでは、超音波システムは通例、所望の視野を走査するように操作された一連のビームを走査線に沿って送信する。超音波システムは通例、送信ビームに対応した方法で「受信ビーム」を操作する。各受信ビームから得られたデータは画像表示サブシステムに送られ、そこでＢモードデータから二次元グレイスケール画像が再構成され、コンソール上に表示される。単一の線に沿って送られる一連のパルスは、同一のものであってもよいし、等しい周波数又は異なる周波数のものであってもよいし、或いは周囲の組織からの超音波造影剤の識別を促進するため１８０度近い位相シフト（反転パルス）を有していてもよい。
【００５０】
Ｆモードイメージングは、超音波システムが一連のビームを発信及び受信して視野を走査するという点で、Ｂモードイメージングと類似の方法で行われる。ただし、Ｆモードイメージングでは標的の速度の計算が必要であるので、各線は数回にわたって発信及び受信される。Ｂモードイメージングと同じく、各線の各発信で得られたデータを用いてコンソール上に画像が再構成される。
【００５１】
Ｆモードイメージングは、Ｂモードイメージングと同時に使用されることが多々ある。例えば、Ｂモード走査から再構成されたグレイスケール画像を、同じ視野又はそれよりも小さい包含視野のＦモード走査から再構成されたＦモード画像と重ね合わせることができる。Ｆモード情報は色を用いて表示することができ、画素を重ね合わせたＢモード画像部分における様々な正又は負の流速或いは乱流が異なる色で表示される。Ｆモードイメージングは患者の体内における標的の運動の単なる定性的知見を得るためのものであるので、超音波システムによるＦモード信号の処理は振幅又は画素解像度について高い空間又は速度解像度をもつ必要がない。
しかし、Ｆモードイメージングの重要な価値は生体内の解剖学的構造に対する流れを検出することにあるので、Ｆモード画像をスクリーン上のＢモード画像と適切に位置合わせするのが一般に重要である。この技術は一つのパルスから得られた信号と次の信号との相関に依存し、しかも最初のパルスでマイクロバブルが破壊されることがあるので、運動とは関係しないＦ信号が発生する。こうした相関の喪失は様々な表示形式で示すことができるが、通常は色で表示される。
【００５２】
本発明での使用が想定されるその他の技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ｇａｍｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９８）に記載されている。
【００５３】
標的組織のイメージングには、被検体の少なくとも一部に超音波エネルギーを当てればよい。すると被検体の内部領域の可視画像が得られるので、リンパ節の同定を確実に行うことができる。
【００５４】
一般に、画像は様々な時点で取得できるし（可変時間分解能は数ミリ秒〜数分間）、或いは１回で画像を取得することもできる。さらに、超音波データセットを２次元又は３次元で取得することもできる（２Ｄ及び３Ｄデータ）。リンパ節は小さい寸法でしかないので、超音波データセットを３次元で取得し、本発明の方法による処理を３Ｄデータで実施するのが好ましい。
【００５５】
リンパ節の超音波画像の取得後、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように画像を処理する。
【００５６】
上述の通り、画像は複数の異なる時点で取得できる。本発明の方法による画像の処理は、１回に取得した画像に基づくものでも（静態分析）、複数の異なる時点で取得した一連の画像に基づくものでもよい（動態分析）。
【００５７】
本願明細書の背景技術の項に記載した通り、ＰＣＴ／ＮＯ０３／００３２８号には、良性センチネルリンパ節が一様なエコー輝度を与えるのに対して、悪性センチネルリンパ節は高エコー領域と非増強領域とが共存する不均一なコントラスト増強パターンを示すことが開示されている。この理論に束縛されるものではないが、超音波造影剤がリンパ節内に蓄積した後にリンパ節で増強のみられない領域が、悪性組織を表す領域であると考えられる。換言すれば、悪性リンパ節の画像は、正常リンパ節の画像よりも暗領域を含む割合が高い。そこで、本発明の方法による取得画像の一つの好ましい処理法は、濃度値ヒストグラムを作成することである。濃度値ヒストグラムは、個々の濃度値（通常０〜２５５の範囲の整数値）毎に、画像内でその濃度値を有する画素の数を示す関数であり、反射超音波信号の局所的強度の対数に相当する。かかるヒストグラムの重心は、関心領域の平均濃度値であるが、機器のゲイン設定及び組織での超音波の未知の減衰によって変化することも予想される。これを悪性度の指標として用いることができるかもしれないが、標準偏差、歪度、尖度のような記述的統計指標が減衰及びゲインとは独立しているので好ましい。これらの値を、好ましくは、正常リンパ節に対応する値と比較する。
【００５８】
正常なコントラスト増強リンパ節における画像細部の空間的サイズは正常な超音波画像「スペックル」で占められているが、悪性リンパ節内の画像細部は、悪性組織を表す大きな暗領域による変化で占められる。そこで、本発明の別の好ましい実施形態は、コントラスト増強パターンの粗さの定量的尺度が得られるように取得超音波画像を処理することである。画像処理には、幾つかの好適な方法を使用できる。好ましい実施形態では、尺度は境界の長さの測定値に基づく。リンパ節として識別された画像の領域だけを処理する。まず、領域を、正常な組織を表す領域（コントラスト増強）と悪性と見込まれる組織を表す領域（非増強）とに分割する。分割は、好ましくは局所的な画像輝度に基づくもので、通例、局所的な輝度を、リンパ節全体の輝度値の実際のスパンから導かれる閾値と比較することによって行われる。好ましい実施形態では、閾値は、画素輝度値の平均又はメジアンである。次の段階で、暗領域と明領域との境界の長さを測定して、領域の総面積で除す。悪性リンパ節に関連する明領域及び暗領域の粗いパターンは短い境界を与えるが、微粒状パターンは長い境界を与える。上記の処理の実施前に、適宜、二次元ローパスフィルターで画像をスムージングしてもよい。かかるローパスフィルターは、ノンパラメトリックなもの、例えば、メジアンフィルターであってもよい。
【００５９】
正常リンパ節では、造影剤の流入及び蓄積時のコントラスト増強は特有のパターン（以下、「フィリングパターン」という）に従う。投与後の初期段階、つまり検査中のリンパ節に超音波造影剤がちょうど進入し始めたときは、超音波画像は中央の暗いコアの周囲に明るい「リム」を示す。その後しばらくして、つまり造影剤がリンパ節に蓄積した後、リンパ節は一段と一様に明るくなる。転移組織の領域を含む悪性リンパ節のフィリングパターンは正常リンパ節のフィリングパターンとは異なり、その相違を定量化できる。そこで、本発明の方法の別の好ましい実施形態は、フィリングパターンの定量的尺度が得られるように取得超音波画像を処理することである。
【００６０】
好ましい実施形態では、上記処理は、造影剤の投与直後から造影剤がリンパ節に完全に蓄積した時点までの期間に取得した一連の画像から選択される１枚の画像に基づく。好ましくは、この選択した画像は、投与後に正常リンパ節と悪性リンパ節とのコントラスト増強パターンの差が最大となる時点でのコントラスト増強パターンを表示する。好ましい実施形態の第一段階では、造影剤投与後のこうした時点での典型的な正常リンパ節の外観に基づいてテンプレートを作成する。第二段階では、テンプレートを、検査中のリンパ節の選択された超音波画像に幾何学的にフィットさせる。一般に、幾何学的フィッティング法は当技術分野で公知であり、例えば標準の平行移動、回転、変形及び拡大縮小を伴う。通例、アフィン変換が用いられる。ベストフィットが得られるまで幾何学的フィッティングを最適化する。汎用誤差最小化アルゴリズムによる自動フィッティング法が好ましい。最適化すべき適合度の尺度は、テンプレートと画像からの幾何学的に対応する画素輝度値間の相関に基づくものでもよい。第三段階では、適合パラメーターの適合度を、通例は第二段階の適合関数の最適値をとることによって計算する。必要に応じて、パラメーターが画像の面積又は平均画素輝度に依存しないようにするため、パラメーターを無次元にスケーリングする。正常リンパ節はパラメーターの最適値に近い値をもつ（適合良好）が、悪性リンパ節は最適とはいえない値（適合不良）となる。
【００６１】
もう一つの好ましい実施形態では、上記処理は、造影剤の投与直後から造影剤がリンパ節に完全に蓄積した時点までの期間に取得した一連の画像全体又は一連の画像の一部に基づく。上述の通り、正常リンパ節のフィリングパターンは、まずリンパ節のリムつまり周縁部で増強がみられ、増強はリンパ節の中心に向かって徐々に広がる。したがって、正常リンパ節のフィリングは円対称に進行するが、悪性リンパ節のフィリングは非対称的又は無秩序に進行する。標準フィリングパターンつまり正常リンパ節のフィリングパターンからのずれを同定するために幾つかの方法が適用できる。好ましい実施形態では、リンパ節の周縁領域と中心領域とのコントラスト出現の時間的及び／又は空間的ずれを、好ましくは周縁部から中心への複数の同心円領域でモデルをリンパ節にフィットさせ、各領域についてコントラスト出現時間（例えば、最高強度の半分までの時間）を計算し、次いで出現時間の差を計算することによって、推計する。他の好ましい実施形態では、利用可能な動的情報をさらに活用するため、前段落で説明した通り算出される適合パラメーターの適合度の経時的推移を用いる。正常リンパ節からの予測値に対するパラメーターのずれは、リンパ節を悪性又は非悪性に分類するのに用いられる。
【００６２】
上述の通り、正常リンパ節の超音波画像はほぼ一様なコントラスト増強を示すが、正常な超音波スペックルも含んでいる。かかる画像は、放射状に配向した不規則な筋状パターンも示す。しかし、悪性リンパ節の画像は、もっと無秩序な暗領域と明領域のパターンを示す。コントラスト増強パターン（もっと正確には、リンパ節のテクスチャ）の相違は定量化できる。そこで、本発明の方法の別の好ましい実施形態は、リンパ節のテクスチャの定量的尺度が得られるように取得超音波画像を処理することである。好ましい実施形態の第一段階では、検査中のリンパ節を表示する画像上で関心領域（ＲＯＩ）を選択する。このＲＯＩはリンパ節を包含する。ＲＯＩはオペレータが選択してもよいし、或いは自動技術を用いて選択してもよい。好ましくは、空間ローパスフィルタリングなどによって、ＲＯＩからスペックルを除去する。ただし、超音波スキャナの設定（例えば、周波数、イメージング帯域幅）によっては、これが必要ないこともあり、省略してもよい。ＲＯＩを、パターンの配向について分析する。
【００６３】
分析には幾つかの数学的方法を用いることができ、これらの方法は２Ｄ画像と３Ｄ画像の両方に適用できる。分析の好ましい実施方法は、ＲＯＩで空間フーリエ変換を計算するフーリエ変換に基づく方法である。正常リンパ節と悪性リンパ節は、それらの空間パワースペクトルによって判別される。好ましい、それらのスペクトルバンド幅又はｋ空間での広がりによって判別する。正常リンパ節が高周波数空間成分のバックグラウンド（ランダムで一様なスペックルを表す）と上述の繰返し配向線を表す離散スペクトルピークとを示すのに対して、悪性リンパ節は、悪性組織の大きな領域を表す大多数の低周波数成分を示す。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、空間的自己相関を用いてパターンの配向の分析を実施する。自己相関関数は２Ｄ又は３Ｄ空間で計算される。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、テクスチャの定量的尺度をパターンの粗さの定量的尺度と組合せる。そこで、本発明の方法の他の好ましい実施形態は、パターンの粗さの定量的尺度とリンパ節のテクスチャの定量的尺度が得られるように取得超音波画像を処理することである。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法による正常リンパ節と悪性リンパ節との判別に神経回路網を適用する。神経回路網は、好ましくは、上述のリンパ節画像で増強領域と非増強領域とに分割した画像に適用される。
【００６７】
本発明の別の態様は、超音波造影剤を事前に投与しておいた被検体からのリンパ節の超音波画像を処理する方法であって、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度を得て、該尺度をリンパ節を正常又は悪性リンパ節節として特徴付けるのに用いる方法である。
【００６８】
本発明の別の態様は、超音波造影剤を被検体に投与し、被検体のリンパ節の超音波画像を取得し、リンパ節のコントラスト増強パターンの定量的尺度が得られるように画像を処理することによって、リンパ節を正常又は悪性リンパ節節として特徴付ける方法である。
【００６９】
特性決定は、得られる定量的尺度単独又は定量的尺度と正常リンパ節の対応する定量的尺度との比較に基づく。
【００７０】
以下非限定的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１
センチネルリンパ節のインビボ検出及び特性評価
メラノーマ腫瘍をもつ麻酔したＳｉｎｃｌａｉｒブタを用いて、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）を用いたセンチネルリンパ節の検出及び特性決定を検討した。
【００７２】
３つのメラノーマ腫瘍をもつＳｉｎｃｌａｉｒブタの各原発腫瘍の周囲に１ｍｌのＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）を皮内投与した。注射部位を５分間穏やかにマッサージした後、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｅｌｅｇｅｒａスキャナで超音波走査を実施した。高周波パルスインバージョンデジタルグレイスケールイメージングで、センチネルリンパ節は強いコントラスト増強を示した。リンパ節の１つは一様なコントラスト増強パターンを示したが、残る２つは斑点状の不均一な増強パターンを示した。超音波画像の視覚的評価から、第１のリンパ節を正常と特徴付け、後の２つのリンパ節を悪性として特徴付けた。顕微鏡によるリンパ節の組織学的検査によって、最初のリンパ節には腫瘍が存在せず、後の２つのリンパ節には腫瘍が存在することが確認された。
【００７３】
正常リンパ節の画像を空間ローパスフィルタリングによって若干スムージングし、解剖学的情報を保存しながら画像のランダムスペックルを除去する。画像のリンパ節を含む部分を、悪性として特徴付けられた２つのリンパ節を分析するためのテンプレートとして用いる。
【００７４】
実施例２
テンプレート相関によるリンパ節画像の分析
Ｎｅｌｄｅｒ−Ｍｅａｄの滑降シンプレックス法のような反復アルゴリズムを用いて、実施例１のテンプレートを実施例１の悪性リンパ節の画像と位置合わせする。自由度６のアフィン変換によって、悪性リンパ節の画像に対して、テンプレートの移動、サイズのスケーリング、傾斜及び回転を実施し、変換を記述するパラメーターをアルゴリズムによって最適適合度に自動調節する。適合パラメーターの適合度を、悪性リンパ節の画像とテンプレート画像の幾何学的に対応する画素濃度値間の相関係数として計算する。アルゴリズムで得られた適合度の最大値を、リンパ節がどれくらいテンプレートと類似しているかの尺度として用いる。低い値（典型的には０．８未満の値）はリンパ節での転移増殖（悪性リンパ節）を示す。
【００７５】
実施例３
境界長に基づく分析
注射して約１０〜２０分後に、実施例１に記載の通りリンパ節の画像を取得する。画像を実施例１に記載の通りスムージングし、画像内のリンパ節を含む関心領域（ＲＯＩ）をユーザが画定する。この領域内のメジアン画素濃度値を計算し、領域内の画素をメジアン値よりも暗いか明るいかによって、暗又は明として分割する。ＲＯＩ内の画像画素列を横断して暗として分類された画素と明として分類された画素との間の移行の総数を数えることによって、明領域と暗領域の境界の長さの測定値を計算する。境界の長さは以下の通り推計される。
【００７６】
【数１】
2007512894.tif 000002
式中、Ｄｐは画素列間の距離であり、ｎは移行の数である。リンパ節のサイズに依存しない尺度を作り出すため、長さの推計値を領域の面積で除す。正常リンパ節から得た基準値よりも低い結果は、転移組織の存在を示す。
【００７７】
実施例４
自己相関関数に基づく分析
リンパ節の画像を実施例３に記載の通り取得し、実施例１に記載の通りスムージングする。ＲＯＩ画像の正規化２Ｄ自己相関関数を、フーリエ変換法（２Ｄパワースペクトルの逆変換）又は離散的計算法によって計算する。自己相関ピークのサイズを、値が０．５を上回る自己相関マトリックス内の画素数として推定する。自己相関関数の主ピークに関係しない局所ピークを表す画素は無視する。約４ｍｍ２の画像面積に相当する数値よりも大きな数値はリンパ節での転移組織の領域による粗いテクスチャを示す。