(57)【要約】  本発明は、動物から得られた少なくとも１つの試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定する方法に関する。本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与された動物から得られた試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性の阻害を測定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの試料における、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素活性の阻害を測定する方法であって、比色分析または蛍光定量用検出可能部分を含む、Ｌｐ−ＰＬＡ２の基質を含む溶液を調製する工程と、前記少なくとも１つの試料を調製工程の溶液と接触させる工程と、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程とを含み、試料がＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与された動物からのものである方法。
【請求項２】
動物から得られた少なくとも１つの第２の試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性を比較することをさらに含み、前記第２の試料が、前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物から得られた複数の試料中にあるＬｐ−ＰＬＡ２活性の阻害が、前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与した後の複数の時点で測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基質が１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンの濃度が約５３μＭから約１１２５μＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンの濃度が約４４０μＭ以下である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンの濃度が約１１２μＭである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
試料が血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試料が血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血漿が、前記調製工程の溶液で約３倍から約９倍に希釈されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
試料の光学濃度を測定することによって前記Ｌｐ−ＰＬＡ２活性が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌｐ−ＰＬＡ２の基質を含む溶液が緩衝剤をさらに含み、前記緩衝剤が、前記基質を前記試料と接触させる前に前記基質と共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝剤がクエン酸一水和物を含まない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基質濃度がほぼ前記基質のＫｍに維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
血漿試料の容量が、調製工程の溶液容量約１２５μＬから約１７０μＬ中約１５μＬから約５０μＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
試料を調製工程の溶液と接触させる前に、反応のｐＨが少なくとも約７．５に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
動物から得られた試料中のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定する方法であって、
ｃ）１１０μＬに対して０．６６μＬの比率で、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウムをｐＨ７．６で含む溶液と接触させた、９０ｍＭ  １−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンを含む溶液
を含む溶液１１０μＬを、
動物からの２５μＬの組織試料の少なくとも１つ；
４、３、２、１、０．４、または０．２ｎｍｏｌ／μＬ  ｐ−ニトロフェノールを含むメタノール溶液をそれぞれ含むｐ−ニトロフェノール標準溶液２５μＬ；および、
ブランク用のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはｄｄＨ２Ｏ  ２５μＬ
と接触させる工程と、
ｄ）Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
動物から得られた試料が血漿である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
動物から得られた試料が血清である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料を得る前に、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害物質を前記動物に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料を得る前に投与される前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質によるＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性の阻害が、前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を含まない試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を比較することによって測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｅ）ｐ−ニトロフェノール標準溶液の４０５ｎｍの光学濃度（ＯＤ）値を、ｐ−ニトロフェノール（ｎｍｏｌ／ウェル）に対してプロットすることによって検量線を作成する工程と、
ｆ）検量線の勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）を計算する工程と、
ｇ）組織試料を含む溶液と、ブランクを含む溶液との両方における、３分と１分との間の吸光度変化（ΔＯＤ３ｍｉｎ−１ｍｉｎ）を計算する工程と、
ｈ）次式：
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）＝（ΔＯＤｓａｍｐｌｅ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）÷勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）÷０．０２５ｍｌ÷２分
を用いて、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を計算する工程と
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先行出願への相互参照）
本出願は、２００４年４月１６日出願の米国特許仮出願第６０／５６３０７８号に基づく権利を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、動物から得られた組織試料中のリポタンパク質結合ホスホリパーゼＡ２（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２）（本明細書では「Ｌｐ−ＰＬＡ２」）酵素活性およびその活性阻害を測定するための方法および物質に関する。
【背景技術】
【０００３】
冠状動脈心疾患（本明細書では「ＣＨＤ」）は、多くの工業国における主要な死亡原因である。アテローム硬化症は、コレステロールおよび脂質を含有するプラークが血液動脈中に進行的に蓄積する動脈硬化または動脈硬化の一形態である。この蓄積は、心臓病および冠状動脈疾患イベントが増加するリスクと関連している。動脈におけるプラークの蓄積は、内皮損傷によって引き起こされる免疫応答と関連している。最初に、平滑筋細胞の移動および蓄積を引き起こす免疫応答によって、単球由来のマクロファージが損傷部位に蓄積し、これが、マクロファージ、脂質、コレステロール、カルシウム塩、およびコラーゲンと結合して線維性プラークを形成する。そのような病変の成長によって、最終的には、動脈が遮断され、血流が制限されることがある。
【０００４】
Ｌｐ−ＰＬＡ２は、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼとしても知られており、増大しているホスホリパーゼＡ２スーパーファミリーの分泌型、カルシウム非依存性メンバーの１つである（Ｔｅｗら（１９９６年）、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ、１６（４）：５９１−９；Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４（６５２２）：５４９−５３）。Ｌｐ−ＰＬＡ２は、単球、マクロファージ、およびリンパ球によって産生され、ヒト血漿中で主としてＬＤＬ（約８０％）に結合していることが判明している。この酵素は、別名では血小板活性化因子（本明細書では「ＰＡＦ」）としても知られている１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンのｓｎ−２エステルを含めた極性リン脂質の切断を行う（Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４（６５２２）：５４９−５３）。
【０００５】
改変されていない天然リポタンパク質と比較した場合に、酸化ＬＤＬが炎症誘発性の活性を有することが多くの観測によって明らかにされている。ＬＤＬ酸化における最初期のイベントの１つは、酸化改変されたホスファチジルコリンの加水分解であり、これによってかなりの量のリゾホスファチジルコリン（本明細書では「リゾＰＣ」）および酸化脂肪酸が生成する。この加水分解は、Ｌｐ−ＰＬＡ２のみによって媒介される（すなわち、Ｌｐ−ＰＬＡ２は、ＰＡＦをリゾホスファチジルコリン［本明細書では「リゾＰＣ」］と酢酸とに加水分解する）（Ｓｔａｆｆｏｒｉｎｉら（１９９７年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７２、１７８９５）。
【０００６】
リゾＰＣは、炎症誘発性およびアテローム産生促進性の媒介因子であると推測されている。リゾＰＣは、比較的に高濃度で細胞傷害性であることに加えて、それより低い濃度でも単球およびＴ細胞走化性を刺激し、また、接着性分子および炎症性サイトカインの発現を誘導することがある。リゾＰＣは、酸化ＬＤＬの成分としても同定されているが、酸化ＬＤＬは、ＬＤＬの免疫原性に関与しており、この特性がアテローム硬化症の炎症性の性質にも寄与している可能性がある。さらに、リゾＰＣはマクロファージの増殖を促進し、様々な動脈床の内皮機能不全を誘発する。リゾＰＣと共に放出される酸化脂肪酸は単球走化性物質でもあり、細胞シグナル伝達などの他の生物活性にも関与している可能性がある。Ｌｐ−ＰＬＡ２加水分解によるこれらの産物が両方とも循環単球の強力な走化性物質であるので、Ｌｐ−ＰＬＡ２は、コレステロールエステルを搭載した細胞の、動脈への蓄積の原因となっており、これがアテローム硬化症の初期に関連した独特の「脂肪線条」を引き起こすと考えられている。
【０００７】
Ｌｐ−ＰＬＡ２は、スモールデンスＬＤＬというアテローム産生性の強いリポタンパク質部分分画中に濃縮されていることが判明している。スモールデンスＬＤＬは酸化改変を受けやすい。さらに、高脂血症、脳卒中、１型および２型糖尿病を患っている患者、ならびに閉経後の女性でも酵素レベルが高くなっている。そのように、Ｌｐ−ＰＬＡ２の血漿レベルは、アテローム性動脈硬化の促進および心血管臨床イベントを発症する危険があると考えられている個体で上昇している傾向がある。したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素の阻害は、この脂肪条痕の蓄積を停止し（リゾホスファチジルコリン形成の阻害によって）、したがって、アテローム硬化症の治療に有用であると予測されるよう。
【０００８】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質はＬＤＬの酸化を阻害する。したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質は、この酵素活性に関連した脂質過酸化が関与する任意の障害、例えば、アテローム性動脈硬化や糖尿病などの状態に加えて、慢性関節リウマチ、脳卒中、心筋梗塞（Ｓｅｒｅｂｒｕａｎｙら、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ９０（２）：１２７−３０（１９９８年））、再潅流損傷、および急性慢性炎症などの他の状態への全般的適用性を有する可能性がある。加えて、Ｌｐ−ＰＬＡ２は現在、冠状動脈心疾患（Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、２００３年５月１日）および動脈硬化（ＴｓｅｌｅｐｉｓおよびＣｈａｐｍａｎ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．、３（４）：５７−６８（２００２））のバイオマーカーとして研究されている。さらに、Ｌｐ−ＰＬＡ２は以下の疾患で役割を有していることが示されている。すなわち、呼吸困難症候群（Ｇｒｉｓｓｏｍら、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．３１（３）：７７０−５（２００３年））；免疫グロブリンＡネフロパシー（Ｙｏｏｎら、Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．６２（２）：１２８−３４（２００２年））；大腿膝窩動脈バイパスの移植開存性（Ｕｎｎｏら、Ｓｕｒｇｅｒｙ．１３２（１）：６６−７１（２００２年）；経口炎症（ＭｃＭａｎｕｓおよびＰｉｎｃｋａｒｄ、Ｇｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１１（２）：２４０−５８（２０００年））；気道炎症および反応性亢進（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ．１５；１６４（６）：３３６０−７（２０００年））；ＨＩＶおよびエイズ（Ｋｈｏｖｉｄｈｕｎｋｉｔら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．４８（１２）：１５２４−３１（１９９９年））；喘息（Ｓａｔｏｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９（３）：９７４−９（１９９９年））；若年性関節リウマチ（Ｔｓｅｌｅｐｉｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４２（２）：３７３−８３（１９９９年））；ヒト滲出性中耳炎（Ｔｓｕｊｉら、ＯＲＬ  Ｊ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｒｅｌａｔ  Ｓｐｅｃ．６０（１）：２５−９（１９９８年））；統合失調症（Ｂｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ２９；２４１（３）：６３０−５９（１９９７年））；壊死性腸炎の発症（Ｍｕｇｕｒｕｍａら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４０７：３７９−８２（１９９７年））；および虚血腸管壊死（Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ．３４（２）：２３７−４１（１９９３年））である。
【０００９】
ヒト組織試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性は、分光光度活性アッセイおよび蛍光発生活性アッセイ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社およびＫａｒｌａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて測定されている。Ｋｏｓａｋａら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ  ２９６（１−２）：１５１−６１（２０００）およびＫｏｓａｋａら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ  ３１２（１−２）：１７９−８３（２００１）も参照のこと。例えば、Ａｚｗｅｌｌ社（大阪（日本））は、１−ミリストイル−２−（ｐ−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンの合成と、ヒトＰＡＦ  ＡＨ（Ｌｐ−ＰＬＡ２）の血漿中および血清中活性測定用の比色分析基質としてのその使用を２０００年に報告した。２００２年、Ａｚｗｅｌｌ社は、この基質を利用し、かつ臨床化学アナライザーで使用するためにフォーマットされた研究使用限定のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＦアッセイキットを上市した。これらの方法は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織試料に添加された場合に、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の阻害を検出できるものでありうる。しかし、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイで提供されている方法は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質が組織試料収集前に動物に投与された場合には、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の阻害を測定するのに十分な感度をもたない。
【００１０】
阻害物質の存在下で、阻害物質が投与された動物から得られた組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定するためには、活性プロトコールが必要である。したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質が投与された動物から得られた組織試料のＬＰ−ＰＬＡ２活性およびその阻害を測定する方法が大いに必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様では、少なくとも１つの組織試料における、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素活性の阻害を測定する方法を提供し、この方法は、比色分析または蛍光定量用検出可能部分を含む、Ｌｐ−ＰＬＡ２の基質を含む溶液を調製する工程と、前記少なくとも１つの組織試料を、調製工程の溶液と接触させる工程と、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程とを含み、前記組織試料は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与された動物に由来する。
【００１２】
本発明の別の態様では、動物から得られた組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定する方法を提供し、この方法は、
ａ）１１０μＬに対して０．６６μＬの比率で、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウムをｐＨ７．６で含む溶液と接触させた、９０ｍＭ  １−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンを含む溶液
を含む溶液１１０μＬを、
動物から得られた２５μＬの組織試料の少なくとも１つ；
４、３、２、１、０．４、または０．２ｎｍｏｌ／μＬ  ｐ−ニトロフェノールを含むメタノール溶液をそれぞれ含むｐ−ニトロフェノール標準溶液２５μＬ；および、
ブランク用のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはｄｄＨ２Ｏ  ２５μＬ
と接触させる工程と、
ｂ）Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定する工程と
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
用語解説
本明細書で使用される場合、「動物」には、Ｌｐ−ＰＬＡ２、Ｌｐ−ＰＬＡ２相同体、またはそれらのオーソログを含めた、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を有する酵素を天然で産生できる任意のヒトもしくはヒト以外の哺乳動物または他の脊椎動物が含まれる。
【００１４】
「臨床試験」は、ヒト臨床試験を意味する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素活性」には、Ｌｐ−ＰＬＡ２のいかなる酵素活性も含まれるが、これらに限定されない。この活性には、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素の基質結合、産物放出、および／またはリン脂質もしくは他の分子の加水分解が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で相互に連結された２つ以上アミノ酸を含むいかなるペプチドまたはタンパク質も指す。「ポリペプチド」は、単鎖のもの、および長鎖のもの両方を指し、前者は通常、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと呼ばれ、後者は通常、タンパク質と呼ばれる。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸も含みうる。「ポリペプチド」には、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などの天然の過程で修飾されたものも含まれるが、化学修飾技法によって修飾されたものも含まれる。そのような修飾については、基礎的な教科書、およびより詳細な研究書、さらには多数の研究論文に詳細に記載されており、それらは当業者に周知である。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同程度または異なった程度で存在しうることが理解されよう。また、所与のポリペプチドが、多くのタイプの修飾を含むこともある。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ酸末端、およびカルボキシル末端を含めた、ポリペプチドのいかなる箇所でも起こりうる。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合化、ヘム部分の共有結合化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチン形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化反応、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシ化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などの、タンパク質への転移ＲＮＡ媒介型のアミノ酸付加、およびユビキチン結合が含まれる。例えば、「ＰＲＯＴＥＩＮＳ  −  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ」、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３年）、および「ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、１〜１２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中の、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、「Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」（１９８３年）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０年）、ならびに、Ｒａｔｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２年）を参照のこと。ポリペプチドは、分岐のあるものでも、環状のものでもよく、環状のものは、分岐のあるものでもないものでもよい。環状、分��、および環状分岐ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセシングによって生じたものでも、完全に合成方法によって生成されたものでもよい。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「濾過」または「フィルタリング」には、溶液からの任意の物質の除去が含まれるが、これに限定されず、濾紙、ワットマン紙、チーズクロス、または前記物質をその物理的および／または化学的特性に基づいて溶液から選択的に除去するカラムを通して、除去するべき物質を含有する溶液を通過させることを含んでもよい。濾過を介して物質を除去するのに使用できる物理的特性および化学的特性には、カラムに充填されている物質に結合する可能性の高い物質に伴ったイオン電荷、サイズ、重さ、極性、および／または化学部分が含まれうるが、これらに限定されない。濾過は、前記物質の、溶液からの除去を促進する、重力、真空、および／または遠心法の使用を含むことがある。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「シンチレーションカクテル」は、液体シンチレーション用の組織試料用の可溶化および均質的な懸濁液の維持を可能にする有機溶剤を通常含有する溶質および溶媒の混合物である。液体シンチレーションの過程では、ベータ線放出の捕捉を介した、試料中のベータ崩壊の検出が行われる。シンチレーションカクテル混合物は、ベータ線放出を捕捉し、それを光子放出に変換し、これを、シンチレーションカウンター内の光電増倍管チューブを介して検出できるように設計されている。数種類のシンチレーションカクテルが市販されている。シンチレーションカクテルの組成を改変することによって、試料に応じて、液体シンチレーションによる検出可能な測定に影響を与え、かつ／あるいは最適化できると理解されている。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「組織」には、血清、細胞溶解液、組織溶解物、尿、血漿、プラーク、単球、またはマクロファージ細胞が含まれる。これらの組織は、Ｌｐ−ＰＬＡ２、Ｌｐ−ＰＬＡ２相同体、またはそれらのオーソログを含めた、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を有する酵素を天然に産生できるヒトもしくはヒト以外の哺乳動物または他の動物から得られたものでありうる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「比色分析または蛍光定量用検出可能」は、検出可能または測定可能なシグナルを産生できる化合物の一部である。そのようなシグナルは、限定されるものではないが、可視光の発光もしくは吸光、蛍光、燐光、または他の検出可能な量子によって測定可能なものでありうる。例えば、Ｌｐ−ＰＬＡ２の基質は、Ｌｐ−ＰＬＡ２切断部位でホスファチジルコリンに結合した比色分析部分を含むものでありうる。Ｌｐ−ＰＬＡ２が比色分析部分をホスファチジルコリンから切断した際に、比色分析部分が可視光として検出可能なシグナルを発する。比色分析部分に結合するホスファチジルコリンの非限定的な一例が、１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、Ｌｐ−ＰＬＡ２「阻害物質」または「阻害」は、限定されるものではないが、酵素の基質結合、産物の放出、および／またはリン脂質もしくは他の分子の加水分解を含めた任意のＬｐ−ＰＬＡ２活性を低下または除去できるものを含めた、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を低下または除去できるいかなる方法、技法、状態、または化合物も指す。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の阻害は、阻害物質を投与された動物から得られた試料中で測定することができ、この投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与であるものとする。別法では、試料を動物から得た後に阻害物質を試料に添加することがあり、この添加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与とされよう。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「低下させる」または「低減」は、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素活性の低減または除去を指す。低下したＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定する目的とするものの非限定ないくつかの例には、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の阻害物質の存在下および非存在下で、同じ動物のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定することが含まれる。別法では、組換え発現され、かつ準精製または精製された標準酵素に対して、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定することができる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「含まない」または「本質的に含まない」とは、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を全く含有しない組織試料、またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質の濃度が十分に低く、そのため、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性がその阻害物質によって阻害されない組織試料を意味する。例えば、阻害物質が、Ｌｐ−ＰＬＡ２に関して決定されているその阻害物質の解離定数より低濃度で存在している場合、組織試料は、その阻害物質を本質的に含まないとすることができる。その動物が天然に産生しないＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与する前に、その動物から組織試料を得た場合には、その組織試料はＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質を含まないとすることができる。その動物種におけるその阻害物質の薬物動力学プロフィールに基づいてクリアランスを確実なものにするのに十分な時間が経っているときに、組織試料を動物から得た場合にも、その組織試料は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を含まない、あるいは本質的に含まないとすることができる。
【００２４】
Ｌｐ−ＰＬＡ２は、リン脂質の加水分解酵素であることが知られている。Ｌｐ−ＰＬＡ２は、リン脂質をｓｎ−２位置で切断して、リゾＰＣおよび酸化脂肪酸を産生することができる。ＰＡＦは、ｓｎ−２位置に２炭素のアシル基を有し、したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２によってＰＡＦが加水分解された場合、この短いアシル基は、分子の残りの部分、すなわちリゾＰＣから、水溶性の酢酸として切断される。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定するには、比色分析または蛍光定量用部分を有する基質を用いることができる。例えば、１−ミリストイル−２−（ｐ−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンという基質は、ｓｎ−２位置でスクシニル鎖に結合している４−ニトロフェニル基を有するＰＡＦ類似体である。Ｌｐ−ＰＬＡ２（ＰＡＦ−ＡＨ）はこの基質のｓｎ−２位置を加水分解して、４−ニトロフェニルコハク酸を産生する。この遊離は、分光光度法によって４０５ｎｍでモニターすることができ、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性は吸光度の変化によって決定される。
【００２５】
【化１】
2007532141.tif 000002
【００２６】
本発明の方法は、組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質濃度と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＬｐ−ＰＬＡ２活性との間の相関関係を実証するものであることが示されている。さらに、本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質で処理された動物から得られた組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を経時的に測定する方法を提供する。これらのデータは、ヒトなどの動物から得られた、阻害物質の薬物動力学プロフィールと相関しているものでありうる。
【００２７】
１−ミリストイル−２−（ｐ−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンを基質として用いた、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性をモニターする比色分析アッセイが開発された。Ｌｐ−ＰＬＡ２特異的な阻害物質を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物阻害研究によって、Ｌｐ−ＰＬＡ２に対するこの基質の特異性が示された。しかし、Ａｚｗｅｌｌ社提供のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイは、ここで開発されたアッセイで用いたものと同じ基質および同じ緩衝条件であったにも関わらず、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害薬をｉｎ  ｖｉｖｏで受容したヒト対象における薬物阻害を検出しなかった。このアッセイにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物解離に寄与し、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬物が結合した組織試料における薬物阻害を検出するアッセイを不可能にするものとして、アッセイ緩衝液との血漿のプレインキュベーション、血漿試料容量、基質濃度、およびＲ２Ａ緩衝液の使用などの因子が同定されている。したがって、薬物感受性の新規の比色分析Ｌｐ−ＰＬＡ２活性分析の開発では、これらの因子を修正した。ｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な薬物阻害を生成し、かつ適切なアッセイダイナミックレンジも提供するアッセイ条件が選択できるように、これらの因子の相互作用も研究した。この修正された薬物感受性アッセイは、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質をｉｎ  ｖｉｖｏ投与されたヒト対象における薬物阻害の８５〜９５％を検出することができ、したがって、臨床現場で薬物有効性を評価するためのモニターを行うアッセイとして用いることができた。このアッセイは、１００倍近くのダイナミックレンジも提供し、より広範囲のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定できるスクリーニングアッセイとしても潜在的に有用である。
【００２８】
本発明の一態様では、少なくとも１つの組織試料における、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素活性の阻害を測定する方法を提供し、この方法は、比色分析または蛍光定量用検出可能部分を含む、Ｌｐ−ＰＬＡ２の基質を含む溶液を調製する工程と、前記少なくとも１つの組織試料を、調製工程の溶液と接触させる工程と、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程とを含み、組織試料は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与された動物から得られる。これらの方法は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与する前に動物から得られた組織試料、またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質を含まない組織試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を比較することをさらに含むことがある。動物から得られた複数の試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性の阻害は、前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与した後の複数の時点で測定することができる。基質は、１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンでよく、約５３μＭから約１１２５μＭの濃度で使用できる。−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンの濃度は、４４０μＭである場合も、１１２μＭである場合もある。
【００２９】
本発明の一態様では、組織試料が血漿である場合があり、あるいは血清である場合もある。別の態様では、血漿が、調製工程の溶液で約３倍から９倍に希釈されている。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性は、試料中の光学濃度を測定することによって測定される場合がある。
【００３０】
本発明の別の態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ２の基質を含む溶液が緩衝剤をさらに含み、基質を前記組織試料と接触させる前に、この緩衝剤を基質と共にインキュベートする。別の態様では、上記緩衝剤がクエン酸一水和物を含まない。別の態様では、基質濃度がほぼ前記基質のＫｍに維持される。前記基質のｋｍは、緩衝剤からクエン酸一水和物を除去することによって低下する可能性がある。基質が１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンである場合、基質濃度は、約４４０μＭである場合も、約１１２μＭである場合もある。
【００３１】
本発明の別の態様では、血漿試料の容量が約１５μＬから約５０μＬであり、これが調製工程の溶液の容量約１２５μＬから約１７０μＬと混合される。別の態様では、血漿試料を調製工程の溶液と接触させる前に、反応のｐＨが少なくとも約７．５に維持される。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、動物から得られた組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定する方法を提供し、この方法は、
ａ）１１０μＬに対して０．６６μＬの比率で、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウムをｐＨ７．６で含む溶液と接触させた、９０ｍＭ  １−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンを含む溶液
を含む溶液１１０μＬを、
動物から得られた２５μＬの組織試料の少なくとも１つ；
４、３、２、１、０．４、または０．２ｎｍｏｌ／μＬ  ｐ−ニトロフェノールを含むメタノール溶液をそれぞれ含むｐ−ニトロフェノール標準溶液２５μＬ；および、
ブランク用のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはｄｄＨ２Ｏ  ２５μＬ
と接触させる工程と、
ｂ）Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定する工程と
を含む。
【００３３】
一態様では、動物から得られた試料が血漿である。別の態様では、上記動物がヒトである。さらに別の態様では、組織試料を得る前に、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害物質を上記動物に投与する。前記組織試料を得る前に投与される前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質によるＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性の阻害は、前記Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を含まない組織試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を比較することによって測定される。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、動物から得られた組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定する方法を提供し、この方法では、酵素活性が、
ａ）ｐ−ニトロフェノール標準溶液の４０５ｎｍの光学濃度（ＯＤ）値を、ｐ−ニトロフェノール（ｎｍｏｌ／ウェル）に対してプロットすることによって検量線を作成する工程と、
ｂ）検量線の勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）を計算する工程と、
ｃ）組織試料を含む溶液と、ブランクを含む溶液との両方における、３分と１分との間の吸光度変化（ΔＯＤ３ｍｉｎ−１ｍｉｎ）を計算する工程と、
ｄ）式、
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）＝（ΔＯＤｓａｍｐｌｅ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）÷勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）÷０．０２５ｍｌ÷２分
を用いて、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を計算する工程と
によって決定される。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、動物から得られた組織試料中のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定する方法を提供し、この方法は、
ａ）  ２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウムをｐＨ７．６で含む溶液を調製する工程と、
ｂ）  ９０ｍＭ  １−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリンを含む溶液を調製する工程と、
ｃ）  １００、７５、５０、２５、１０、および５ｎｍｏｌ／μＬのｐ−ニトロフェノールをメタノール中に含む保存液を調製する工程と、
ｄ）  工程ｃの保存液４０μＬをメタノール９６０μＬに希釈することによって、ｐ−ニトロフェノール標準物質の使用液を調製する工程と、
ｅ）  工程ｂの溶液と、工程ａの溶液とを、０．６６μＬ対１１０μＬの比率で接触させて、アッセイ緩衝液を作製する工程と、
ｆ）  １２０μＬのアッセイ緩衝液を９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに添加する工程と、
ｇ）  ９６ウェル平底プレートにおける２列の別々のウェルに、工程ｄのｐ−ニトロフェノールの各標準使用液２５μＬを添加する工程と、
ｈ）  工程ｇの平底プレートにおけるｐ−ニトロフェノール標準物質を含有しないウェルに、動物から得られた組織試料を１ウェルあたり２５μＬ添加する工程と、
ｉ）  ブランクとして用いるために、ＰＢＳまたはｄｄＨ２Ｏ  ２５μＬを平底プレートの空のウェルに添加する工程と、
ｊ）  Ｖ底プレート中のアッセイ緩衝液１１０μＬを平底アッセイプレートの各ウェルと接触させる工程と、
ｋ）  この平底アッセイプレートをプレートリーダーに配置し、４０５ｎｍで測定する工程と、
ｌ）  上記標準溶液の光学濃度（ＯＤ）値を、ｐ−ニトロフェノール（ｎｍｏｌ／ウェル）に対してプロットすることによって検量線を作成する工程と、
ｍ）  検量線の勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）を計算する工程と、
ｎ）  試験試料およびブランクの両方に関して、３分と１分との間の吸光度変化（ΔＯＤ３ｍｉｎ−１ｍｉｎ）を計算する工程と、
ｏ）  式、
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）＝（ΔＯＤｓａｍｐｌｅ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）÷勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）÷０．０２５ｍｌ÷２分
を用いて、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を計算する工程と
を含む。
【００３６】
吸光度変化の計算は、様々な間隔で行うことができ、これには、２分と０分との間、１分と０分との間、および約１０分間の反応時間全体にわたって測定される約１５秒間隔が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示する。これらの実施例は、添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。
（実施例）
【００３８】
別段の指定がない限り、すべての血漿試料が、ヒトから収集されたものであり、ヒト血漿である。別段の指定がない限り、以下の実施例の血漿試料は以下の通り収集した。ＥＤＴＡを含有するチューブの中に血液を収集した。チューブを１７３０×ｇで１０分間遠心した。血漿をホールピペットでチューブ内に移して、−８０℃で保存した。
【００３９】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織試料に添加した実験には、別段の指定がない限り、以下の手順を用いた。ＰＢＳ中に９ｍｇ／ｍＬの保存液を調製した。一連の使用希釈液を、９００００、９０００、６０００、３０００、１０００、５００、２００、１００、および０ｎｇ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳ中に調製した。各使用希釈液１μＬを、血漿または血清１００μｌ毎に添加し、その後、３７℃で１時間インキュベートした。血漿または血清中のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質の最終濃度は、９００、９０、６０、３０、１０、５、２、１、および０ｎｇ／ｍＬであった。
（実施例１）
【００４０】
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイキット
Ａｚｗｅｌｌ社製（大阪（日本））のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイキットは、米国内では、Ｋａｒｌａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ，ＣＡ）を介して購入できる。このアッセイをＯｌｙｍｐｕｓ  Ａｕ６４０臨床化学分析器で評価した。それをこの実施例１で記述する。
【００４１】
材料
Ａｚｗｅｌｌ  Ａｕｔｏ  ＰＡＦ−ＡＨアッセイキット：
Ｒ１：２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ７．６
Ｒ２Ａ：２０ｍＭクエン酸一水和物、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ４．５
Ｒ２Ｂ：９０ｍＭ  １−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリン
【００４２】
アッセイ手順
１．  オリンパスＡｕ６４０アナライザーに以下の表からアッセイパラメータを入力し、ＰＡＦ  ＡＨアッセイプログラムを作成する。
試料容量：２μＬ
試薬１：２４０μＬ
試薬２：８０μＬ
波長（主波長）：４１０ｎｍ
波長（副波長）：４８０ｎｍ
方法：速度
ポイント１（ＦＳＴ）：１４
ポイント１（ＬＳＴ）：２１
較正タイプ：ＭＢ
式：Ｙ＝ＡＸ＋Ｂ
カウント：２
ＭＢタイプ係数：１１５９５
【００４３】
２．  以下の試薬を調製する。
Ｒ１：Ａｚｗｅｌｌ  Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイキット中に供給されている通りにこの緩衝溶液を用いる。４℃で保存する。光から保護する。
Ｒ２：Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂ（Ａｚｗｅｌｌ  Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイキット中に供給されている）を１９：１の比率で混合することによって、Ｒ２使用液を調製する。４℃で保存する。光から保護する。
【００４４】
３．  各血漿試料を３０μＬ以上、２ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔマイクロチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、部品番号７２．６９４．００７）に分注する。短時間遠心して、血漿中の線維素塊／粒子を沈殿させる。
【００４５】
４．  血漿試料を含有するＳａｒｓｔｅｄｔチューブを、測定器に適合している試料チューブ上に配置する。Ａｕ６４０分析器で血漿試料を分析する。ＰＡＦ  ＡＨアッセイプログラムを選択した後、以下に示す分析手順が自動的に実施される。
試験試料（２μＬ）＋Ｒ１（２４０μＬ）、３７℃、５分間［０〜５分］
Ｒ２（８０μＬ）を添加、３７℃、５分間［５〜１０分］
４１０ｎｍおよび４８０ｎｍで吸収度を測定［６〜８分間］
ＰＡＦ  ＡＨ活性（ＩＵ／Ｌ）を計算
【００４６】
５．  各分析の品質対照として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｙｐｈｏｃｈｅｋ（登録商標）アッセイ済み化学対照レベル１およびレベル２（Ｃ−３１０−５およびＣ−３１５−５、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含める。これら２種類の対照におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性値は正常ヒト血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２の範囲内にある。
（実施例２）
【００４７】
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定用の高スループット放射測定アッセイ
試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定するための高スループット放射分析を開発した。このアッセイは国際公開第２００５／００１４１６号に十全に記載されている。高スループット活性放射測定アッセイの概要をこの実施例２に提供する。
【００４８】
機器
シンチレーションカウンター  ＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）マイクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社（旧名Ｐａｃｋａｒｄ社）、ＣＡ
遠心分離機  Ａｌｌｅｇｒａ  ２５Ｒベンチトップ遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ＣＡ
プレートシェーカー  Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｔｉｔｅｒプレートシェーカー（ＶＷＲ社カタログ番号５７０１９−６００）
オーブン  Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ社、シリーズ９０００、温度領域１０〜２５０℃（ＶＷＲ社カタログ番号５２２０５−０６５）
１２チャネルピペッター  ブランドＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅ（登録商標）−１２、ＢｒａｎｄＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｅｓｓｅｘ，ＣＴ
【００４９】
材料
ポリプロピレンプレート  Ｃｏｓｔａｒ＊ブランド９６ウェルプレート、ポリプロピレン未滅菌、ふた無し、Ｃｏｓｔａｒ３３６５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ（ＶＷＲ社カタログ番号２９４４４−１０４）
ＰｉｃｏＰｌａｔｅプレート  溶媒耐性９６ウェル白色マイクロプレート、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（カタログ番号６００５１６２）
【００５０】
試薬
ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｈ９８９７１００）
塩化ナトリウム、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｓ５１５０；５．０Ｍ）
ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｅ７８８９；０．５Ｍ）
３Ｈ−血小板活性化因子、１−Ｏ−ヘキサデシル−［アセチル−３Ｈ（Ｎ）］、（３Ｈ−ＰＡＦ）−ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｒｏｘｂｕｒｙ，ＭＡ（カタログ番号ＮＥＴ−９１０、エタノール溶液として販売、通常０．１ｍＣｉ／ｍＬ、２５０μＣｉ）
Ｃ１６−ＰＡＦ、（１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）：Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ（カタログ番号８７８１１０；５．０ｍｇ／ｍＬ）
ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（カタログ番号６０１３６２１）
無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ａ０２８１；１．０グラム）
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｔ９１５９）
【００５１】
アッセイ緩衝液
１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
５ｍＭ  ＥＤＴＡ
室温で保存する。
【００５２】
手順
１．  ３Ｈ−ＰＡＦ使用液（反応１００回分）を調製する：
ａ）  ３Ｈ−ＰＡＦ（１０μＭ＝１０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌで０．１ｍＣｉ／ｍＬ）４８０μＬと、［Ｃ１６］ＰＡＦ（５．０ｍｇ／ｍｌ；ＭＷ：５２４）１２５．３μＬとをチューブに分注する。
ｂ）  混合して、フード内で空気乾燥させる。
ｃ）  乾燥したペレットをアッセイ緩衝液１２．０ｍｌに再懸濁し、１００μＭ  ＰＡＦ（すなわち、３Ｈ−ＰＡＦ  ０．４μＭと、無放射性［Ｃ１６］ＰＡＦ９９．６μＭ）の使用液にする。
２．  アッセイ緩衝液（総カウント用およびブランク用；ｎ＝８）または血漿試料５μＬを９６ウェルプレートに２つ組で分注する。
３．  プレートを２１℃で平衡化する。
４．  ３Ｈ−ＰＡＦ溶液１００μＬを各ウェルに添加し、混合して、プレートを２１℃で５分間インキュベートする。
５．  氷冷ＢＳＡ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）５０μＬをすべてのウェルに添加し、混合して、プレートを冷蔵庫内で５分間インキュベートする。
６．  氷冷ＴＣＡ溶液（５６％）２５μＬを各ウェルに添加し、混合して、プレートを冷蔵庫内で１５分間インキュベートする。
７．  プレートを４℃、６０００ｇで１５分間遠心する。
８．  ９６ウェルポリスチレンプレートに上清４５μＬを分注する。
９．  ６箇所の総カウントウェルに３Ｈ−ＰＡＦ使用液１０μＬを添加する。
１０．  ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０シンチレーションカクテル２００μＬを各ウェルに添加する。
１１．  プレートをプレートテープでカバーし、最大スピードで１０分間ボルテックス混合する。
１２．  濡らしたティッシュでプレートを拭き、汚れていない別のティッシュを用いて乾燥させることによって、プレートから静電気を除く。
１３．  ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンターでそれぞれ２分間カウントを行う。
１４．  Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を計算する：
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）＝１６０×（ＣＰＭ４５μＬ−ｓｕｐｅ−ＣＰＭＢｌａｎｋｓ）／（ＣＰＭ１０μＬ−ｓｐｉｋｉｎｇ−ＣＰＭＢｌａｎｋｓ）
式中、ＣＰＭ４５μＬ−ｓｕｐｅは各試料の平均カウントであり、
ＣＰＭＢｌａｎｋｓはブランクの平均カウントであり、
ＣＰＭ１０μＬ−ｓｐｉｋｉｎｇは、総カウントの平均したカウントである。
（実施例３）
【００５３】
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイと高スループット放射測定アッセイとの相関関係
実施例２で記載の高スループット放射測定アッセイを用いて、３箇所の臨床試験所で、健常ヒトボランティアから得た１２０の血漿試料からなるパネルにおけるＬｐ−ＰＬＡ２活性をアッセイした。同じ試料パネルを、実施例１に記載のＡｚｗｅｌｌ社製Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイを使用し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｕ６４０分析器でアッセイした。
【００５４】
同じ試料パネルに関して高スループット放射測定アッセイによって生成されたデータとの相関関係を得た。３箇所の臨床試験所における、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイ対、放射測定アッセイの相関係数（ｒ）はそれぞれ０．９６、０．９４、および０．９５であった。Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイにおける２検体の試料間の平均ＣＶは２．１４％であった。
（実施例４）
【００５５】
低スループット放射測定アッセイ
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定できる低スループット放射測定アッセイを以下に示す。
【００５６】
材料
シンチレーションバイアル  Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｏｍｎｉ  Ｖｉａｌｓ社、Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ（カタログ番号２２５４０２）
シンチレーション液  ＥｃｏＬｉｔｅ（商標）、ＩＣＮ社、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ（カタログ番号８８２４７５）
【００５７】
機器
ベータ線カウンター  Ｂｅｃｋｍａｎ液体シンチレーションカウンター、ＬＳ  ５０００ＴＡ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ
水浴  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ
微量遠心機  Ｊｏｕａｎ社、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ、モデル番号Ａ−１４
【００５８】
試薬
ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（カタログ番号Ｈ９１３６）
塩化ナトリウム  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（カタログ番号Ｓ７６５３）
クロロホルム  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ（カタログ番号３６，６９２−７）
メタノール  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ（カタログ番号２７，０４７−４）
３Ｈ−血小板活性化因子、１−Ｏ−ヘキサデシル−［アセチル−３Ｈ（Ｎ）］、（３Ｈ−ＰＡＦ）  ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｒｏｘｂｕｒｙ，ＭＡ（カタログ番号ＮＥＴ−９１０、エタノール溶液として販売、通常０．１ｍＣｉ／ｍＬ）
Ｃ１６−ＰＡＦ、（１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）  Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ（カタログ番号８７８１１０、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ３溶液として販売）。
【００５９】
アッセイ緩衝液
ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３７℃、ｐＨ７．４。
【００６０】
アッセイ溶液
３Ｈ−ＰＡＦ使用液：５μＣｉ（通常は販売会社によって供給される溶液５０μＬ）の３Ｈ−ＰＡＦ保存液を、１．４ｍＬのガラスバイアルにピペットで移す。３４０μｇ（５ｍｇ／ｍＬ溶液６８μＬ）のＣ１６−ＰＡＦを添加する。換気フード内における穏やかな窒素気流の下で乾燥するまで気化させる。ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液１．３ｍＬで再構成する。これによって、アッセイチューブ約６２本分として十分な使用液が調製されるであろう。
【００６１】
アッセイマスターミックス：１５ｍＬポリプロピレンチューブ内で、ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液７．３ｍＬと、３Ｈ  ＰＡＦ使用液１．１ｍＬとを混合する。血漿試料を添加した後、最終反応混合物中のＰＡＦ（無標識Ｃ１６−ＰＡＦ＋３Ｈ−ＰＡＦ）最終濃度は５０μＭである（反応容量２００μＬに１０ｎｍｏｌのＰＡＦを含有する）。
【００６２】
血漿中のＬｐＰＬＡ２活性の阻害を試験するために、以下の通りにアッセイを行った。
（１）ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液１１０μＬ＋Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質の適当な使用希釈液２０μＬ＋血漿試料５０μＬを、１．５ｍＬ微量遠心チューブに添加し、３７℃で、１５分間インキュベートした。
（２）３Ｈ−ＰＡＦ使用液２０μＬを添加し、試料を３７℃で３０秒インキュベートした。
（３）ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ  ６００μＬを添加して反応を終了させ、ここに記載のアッセイ手順によって処置を行った。
【００６３】
アッセイ手順
１．  血漿試料を融解させ、温度平衡に至るまで３７℃の水浴の中に置く。
２．  アッセイマスターミックス１５０μＬを１．５ｍＬのポリプロピレンチューブに添加し、３７℃の水浴の中に置く。温度平衡させるために５分間置く。
３．  緩衝液ブランク用に血漿試料５０μＬまたはＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液５０μＬ（すべての試料を２検体でアッセイする）を、アッセイマスターミックスを含有する適当なチューブに添加し、短時間ボルテックスし、３７℃の水浴の中で３０秒間インキュベートする。
４．  ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ溶液６００μＬを添加することによって反応を停止させ、よくボルテックスする。
５．  遠心する直前に、試料再度、短時間ボルテックスする。微量遠心機内で、最高回転数で、２分間遠心することによって、有機物質相と水相とを分離する。
６．  上側の水相２５０μＬを収集し、新規の１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移す。
７．  ＣＨＣｌ３  ２５０μＬを添加し、よくボルテックスする。
８．  微量遠心機内で、最高回転数で、１分間遠心することによって、有機物質相と水相とを分離する。
９．  上側の水相１５０μＬを収集し７ｍＬのシンチレーションバイアルに移す。
１０．  ＥｃｏＬｉｔｅ（商標）または同等な液体シンチレーション液２ｍＬを添加する。
１１．  ｃｐｍ、計数効率、およびｄｐｍを決定するように設定されているカウントプログラムを用いて、液体シンチレーション中の試料のカウントを行う。
１２．  反応液中の総放射能を測定するために、アッセイマスターミックスの２検体１５０μＬアリコートのカウントを行う。
【００６４】
データの縮小および分析
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の計算には、ｃｐｍ値またはｄｐｍ値のいずれを用いてもよい。試料、緩衝液ブランク、および総放射能バイアルにおける計数効率が同じ場合には、ｃｐｍ値を用いることができる。計数効率の相違が観測された場合には、ｄｐｍ値を用いるべきである。この報告におけるすべての結果に関して、活性計算にｄｐｍ値を用いた。生データからＬｐＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌｓ／分／ｍＬとして、報告される）を計算するには、式
（（ｘ−ｙ）÷ｚ）×４０
を用い、式中、
ｘ＝血漿試料のｃｐｍ（またはｄｐｍ）×１．６５（これは、各抽出における水相の全容量に関して補正する。この補正は、各抽出後に収集される水相が一部分のみなので必要である。）
ｙ＝緩衝液ブランクのｃｐｍ（またはｄｐｍ）×１．６５（２検体測定の平均）である。
ｚ＝総放射能試料のｃｐｍ（またはｄｐｍ）を１０で割ったものである（各反応チューブ内には１０ｎｍｏｌのＰＡＦが存在する）（２検体測定の平均）。
４０＝結果をｎｍｏｌ／分／ｍＬに調整する係数である（各反応は３０秒間であり、各反応で使用された血漿の容量は５０μＬである）。
（実施例５）
【００６５】
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＦアッセイおよび低スループット放射測定アッセイによって測定された、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の阻害の比較
６人のヒト対象から、臨床試験中にＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質をｉｎ  ｖｉｖｏで薬物投与した後の様々な時点に血漿を収集した。下記に示す化学式Ｉを、対象＃１７および＃１８には１２０ｍｇ、対象＃２４および＃２５には１８０ｍｇ、そして、対象＃２１および＃２２には２４０ｍｇ投与した。対象＃２１および＃２５は別の日にプラセボを受容した。実施例４に記載の低スループット放射測定アッセイによってＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定したところ、薬物処置を受けた６人の対象全員で＞９０％の阻害が観測された。しかし、実施例１に記載のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイによって測定した場合には、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害が明らかでなかった。Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬｐ−ＰＬＡ２の薬物阻害に対して非感受性である。下記表１を参照のこと。
【００６６】
【表１】
2007532141.tif 000003
【００６７】
Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｕ６４０におけるＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイの、測定間可変性および測定内可変性は、一貫して低く、２検体相互のＣＶは５％未満であった。この実験では、２検体相互の平均ＣＶは、プラセボ試料では２％、そしてすべての薬物試料では３％であった。しかし、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイで測定されたＬｐ−ＰＬＡ２活性は、薬物対象およびプラセボ対象の両方で、経時的な変動を示した。同様に、プラセボ対象の放射測定活性値は、経時的に変動を示し、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイと比較して、％ＣＶが高くなっていた。表２を参照のこと。観測された、プラセボ対象のＬｐ−ＰＬＡ２活性の可変性は、生物学的な可変性のようである。
【００６８】
【表２】
2007532141.tif 000004
【００６９】
下記に化学式Ｉ、すなわち２−（２−（３，４−ジフルオロフェニル）エチル）−１  Ｈ−キノリン−４−１−イルＮ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）−アセトアミド酒石酸水素塩を示す。これは国際公開第０２／３０９０４号に記載されている。
【００７０】
【化２】
2007532141.tif 000005
（実施例６）
【００７１】
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイおよび低スループット放射測定アッセイによって測定されたＬｐ−ＰＬＡ２活性阻害の比較
臨床試験中に第２のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質１００ｍｇを受容した８人の対象から得た血漿試料を評価した。この研究に使用されたＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質、すなわち１−（Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン酒石酸水素塩を下記に化学式ＩＩとして示す。これは、国際公開第０１／６０８０５号に記載されている。
【００７２】
【化３】
2007532141.tif 000006
【００７３】
これら８人の対象のうち４人は、別の日にプラセボを受容した。
【００７４】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の低スループット放射測定アッセイを用いて、９０％を超えるＬｐ−ＰＬＡ２活性の阻害が観測された。しかし、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイでは阻害が測定されなかった（表３を参照）。
【００７５】
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイによって測定されたＬｐ−ＰＬＡ２活性値は、薬物対象およびプラセボ対象の両方で変動を示した。これは明らかに生物学的変動によるものである。
【００７６】
【表３】
2007532141.tif 000007
（実施例７）
【００７７】
基質特異性試験
Ａｚｗｅｌｌ社（大阪（日本））製造の１−ミリストイル−２−（ｐ−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリン基質を用いた、手動の比色分析Ｌｐ−ＰＬＡ２活性アッセイを開発した。このアッセイは、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイに対応する、分光光度プレートリーダーに適合したマイクロタイタープレートバージョンである。このアッセイは、基質の物理学的特性を評価するのに用いた。ここにでは、基質の特異性に関するデータを示す。
【００７８】
材料
Ｒ１：２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、４℃で保存する。
Ｒ２Ａ：２０ｍＭクエン酸一水和物、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ４．５、
Ｒ２Ｂ：１−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリン、９０ｍＭ
ｐ−ニトロフェノール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（カタログ番号１０４８−２５Ｇ）
エタノール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（カタログ番号７０２３）
メタノール：ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ（カタログ番号ＥＭ−ＭＸ０４８２−６）
【００７９】
試薬調製
Ｒ２：Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂを１０：１の比率で混合する。４℃で保存する。使用前に２週間より長い間保存しない。
ｐ−ニトロフェノール標準物質：メタノール中に１Ｍ  ４−ニトロフェノール溶液を調製する。１００μＬ、７５μＬ、５０μＬ、２５μＬ、１０μＬ、５μＬの１Ｍ溶液を１ｍＬのメタノール中に希釈して、それぞれ、１００、７５、５０、２５、１０、および５ｎｍｏｌ／μＬ保存液を調製する。保存液１００μＬをメタノール９００μＬに希釈（１：１０希釈）することによって、各標準物質の使用液を作製する。保存液および使用液の両方を４℃で保存する。
【００８０】
アッセイ手順
１．  プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳ３８４  ＵＶ／ＶＩＳマイクロプレート分光光度計、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の温度を２１℃に設定する。
２．  マルチチャンネルピペッターを用いて、９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルにＲ１を１２０μＬ添加する。
３．  第１列および第２列の２つ組のウェルそれぞれに、ｐ−ニトロフェノール標準物質使用液１０μＬを添加する。検量線を作成するのに、７種類の標準物質濃度、すなわち０、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｍｏｌ／ウェルを用いる。ウェル１Ｈおよび２Ｈをブランク対照用に残しておく。
４．  血漿５μＬを各ウェルに個々に添加する。各試料を２検体で用いる。ウェル１Ｈおよび２Ｈに、血漿の代わりにｄｄＨ２Ｏ  ５μＬを添加することによって、ブランク対照を用意する。プレート内を手操作でよく混合する。
５．  プレートを３７℃で５分間インキュベートする。
６．  プレートをプレートリーダー内、２１℃で５分間冷却する。
７．  プレートをプレートリーダーから取り出す。マルチチャンネルピペッターを用い、各添加の後でチップを交換し、各ウェルにＲ２を４０μＬ添加する。Ｒ２添加を開始したときを記録する。
８．  マルチチャンネルピペッターを用い、各添加の後でチップを交換し、各ウェルにエタノールを２μＬ添加する。この工程の目的は、ウェル中に生成した気泡をすべて取り除くことである。最初にＲ２を添加してから、工程＃９でプレートを測定するまでの間の時間は４分間である。
９．  ２分間隔で２０分間、４０５ｎｍでプレートを測定する。プレート測定の前に、２分間の自動混合が含まれる。
【００８１】
活性計算
１．  ０分および２０分における７種類の標準物質の平均ＯＤ値（ＯＤ０ｍｉｎおよびＯＤ２０ｍｉｎ）を、ｐ−ニトロフェノール（ｎｍｏｌ／ウェル）に対してプロットすることによって検量線を生成する。検量線の勾配を計算する。
２．  各ブランクウェルにおける２分と４分との間のΔＯＤ値（ＯＤ４ｍｉｎ−ＯＤ２ｍｉｎ）を計算し、ブランクにおける２つのΔＯＤ値を平均する。
３．  各試料ウェルについて、２分と４分との間のΔＯＤ値を計算し、次いで、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）＝（ΔＯＤｓａｍｐｌｅ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）÷勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）÷０．００５ｍｌ÷２分を計算する。
４．  ２検体試料ウェルの平均活性値を計算する。
【００８２】
結果
２種類のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質化合物、すなわち、実施例６に記載の化学式ＩＩと、下記に示す化学式ＩＩＩとを用いることによって、Ｌｐ−ＰＬＡ２に対する基質特異性をアッセイした。
【００８３】
【化４】
2007532141.tif 000008
【００８４】
化学式ＩＩＩ、すなわち、１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５−（１−メチルピラゾール−４−イルメチル）ピリミジン−４−オンは、国際公開第００／６６５６７号に記載されている。
【００８５】
４人の健康な患者から得た血漿試料を、様々な量の化学式ＩＩＩと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。阻害物質溶液を反応混合物に添加するために、１００ｍＭ保存液をＤＭＳＯ中に調製した。１０ｍＭから０．０１ｎＭまでの範囲の濃度が得られるよう、一連の１：１０使用希釈液をＤＭＳＯ中に調製した。各使用希釈液の１μＬアリコートを各反応に添加した。Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質の最終濃度は、６００００、６０００、６００、６０、６、０．６、０．０６、０．００６、０．０００６、０．００００６、および０（ｎＭにおける）であった。
【００８６】
表４に示す通り、４種類の血漿すべてがＬｐ−ＰＬＡ２活性の低下を示した。４つの試料すべてで、化学式ＩＩＩによってもたらされた阻害が９０％を超えた。放射測定活性アッセイで使用された、天然のＬｐ−ＰＬＡ２基質であるＰＡＦに匹敵するものである。化学式ＩＩも、同じ４つの血漿試料と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートされた際に、９０％を超える、基質加水分解の阻害を示した。
【００８７】
【表４】
2007532141.tif 000009
【００８８】
上記の実験で使用されたアッセイ緩衝剤は、界面活性剤を高濃度で含有する（７．５ｍＭ  ＣＨＡＰＳおよび１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム）。アッセイから界面活性剤を除いた場合、化学式ＩＩＩは、血漿試料＃１０における加水分解活性の約６５％を阻害したのみであった。平行実験において界面活性剤が添加された場合には、９５％を超える阻害が得られた。したがって、この基質は、表５に示す通り、界面活性剤を含む緩衝液の存在下でアッセイされた場合にのみ、Ｌｐ−ＰＬＡ２に特異的であると考えられる。
【００８９】
【表５】
2007532141.tif 000010
（実施例８）
【００９０】
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定用の薬物感受性修正比色分析アッセイ
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイでは、血漿試料が約１６０倍に希釈され、基質はＫｍより高い濃度で使用される。基質の濃度がＫｍより高い場合には、Ｌｐ−ＰＬＡ２に結合した薬物と基質が競合し、酵素からの薬物解離を促進するようである。例えば、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイで使用される基質濃度は１１００μＭであり、これはＫｍより５倍以上高い（酵素源として血漿を使用し、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨプロトコールによってアッセイした場合、Ｋｍは約２００μＭである。実施例１を参照）。アッセイ反応開始前に血漿を、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイにおける緩衝剤Ｒ１と共にプレインキュベーションするのも、薬物解離を促進するようである。したがって、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイと比較して、大きな血漿試料容量と、低い基質濃度とを用いることによって、本発明のアッセイを修正した。さらに、基質を添加する前に、血漿をＲ１と共にプレインキュベーションする工程を除いた。さらに、緩衝液Ｒ２Ａを除去することによって、反応速度が上昇し、次にこれによって、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイと比較して、さらに低い基質濃度およびさらに短いアッセイインキュベーション時間の使用が可能となった。薬物の解離は、アッセイインキュベーション時間中に起こる。
【００９１】
材料
Ｒ１：２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、
Ｒ２Ｂ：９０ｍＭ  １−ミリストリル−２−（４−ニトロフェニルスクシニル）ホスファチジルコリン
ｐ−ニトロフェノール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（カタログ番号１０４８−２５Ｇ）
【００９２】
試薬調製
アッセイ緩衝剤：Ｒ１およびＲ２Ｂを１１０μＬに対して０．６６μＬの比率で混合する。氷上または４℃で保存する。使用の直前に調製する。
ｐ−ニトロフェノール標準物質：１Ｍ  ｐ−ニトロフェノール溶液をメタノール中に調製する。１Ｍ  ｐ−ニトロフェノール１００、７５、５０、２５、１０、および５μＬをメタノール１ｍＬに希釈し、それぞれ、１００、７５、５０、２５、１０、および５ｎｍｏｌ／μＬ保存液を調製する。保存液４０μＬをメタノール９６０μＬに希釈（１：２５希釈）することによって、各標準物質の使用液を調製する。保存液および使用液を４℃で保存する。
【００９３】
アッセイ手順
１．  マルチチャンネルピペッターまたはロボットを用いて、アッセイ緩衝液１２０μＬを９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３８９７、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルに添加する。
２．  別の９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１７、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）における第１列および第２列の２つ組のウェルに、ｐ−ニトロフェノール標準物質使用液２５μＬを添加する。検量線を作成するのに、７種類の標準物質濃度、すなわち０，５，１０，２５，５０，７５，１００ｎｍｏｌ／ウェルを用いる。ブランク対照用にＰＢＳ  ２５μＬをウェル１Ｈおよび２Ｈに添加する。
３．  線維素塊／粒子を沈殿させるために、血漿を短時間遠心する。ｐ−ニトロフェノール標準物質を含有している、同じ平底プレートの第３〜１２列に１ウェルあたり２５μＬの血漿を添加する。各試料を２検体で用いる。
４．  マルチチャンネルピペッターまたはロボットを用いて、アッセイ緩衝液１１０μＬをＶ底プレートから、血漿試料およびｐ−ニトロフェノール標準物質を含有している平底アッセイプレートに移す。Ｚｙｍａｒｋ  ＲａｐｉｄＰｌａｔｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）は、ウェルに気泡を発生させずに、この工程を行うことができる。Ｒ１の界面活性剤含有量が高いため、他の移動方法は気泡を発生させる可能性がある。気泡を除去するのに小容量のエタノールを用いることができる。
５．  アッセイプレートを直ちにプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳ３８４  ＵＶ／ＶＩＳマイクロプレート分光光度計、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上に配置し、１５秒間自動混合を行う。
６．  １５秒間隔で１０分間、室温、４０５ｎｍでプレートを測定する。酵素反応開始（アッセイプレートへのアッセイ緩衝液の添加）から、最初の吸光度測定の完了までの時間は、１分間である。
このアッセイは室温で行うことができる。実験室内または実験室間で室温が変動する場合には、より厳密な温度調整が必要となることもある。
【００９４】
活性計算
１．  ０分および１０分における７種類の標準物質の平均ＯＤ値（ＯＤ０ｍｉｎおよびＯＤ１０ｍｉｎ）を、ｐ−ニトロフェノール（ｎｍｏｌ／ウェル）に対してプロットすることによって検量線を生成する。検量線の勾配を計算する。
２．  １分と３分との間における各ブランクウェルの値の変化（ΔＯＤ）（ＯＤ３ｍｉｎ−ＯＤ１ｍｉｎ）を計算し、ブランクにおける２つのΔＯＤ値を平均する。
３．  各試料ウェルに関して、１分と３分との間のΔＯＤ値を計算し、次いで、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）＝（ΔＯＤｓａｍｐｌｅ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）÷勾配（ＯＤ／ｎｍｏｌ）÷０．０２５ｍｌ÷２分を計算する。
４．  ２検体試料ウェルの平均活性値を計算する。
（実施例９）
【００９５】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質存在下におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性の放射測定対、薬物感受性修正比色分析測定の比較
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与された健康ヒト対象から得た血漿試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を、実施例２に記載の高スループット放射測定アッセイおよび以下の小さな変更を伴った実施例８の方法を用いて測定した。使用されたウェルあたりの血漿容量は２５μＬであった。基質濃度は１１２５μＭであった。また、２μＬの基質溶液Ｒ２Ｂを４０μＬのＲ２Ａに混合し、その後、９５μＬのＲ１をさらに混合して、アッセイ緩衝液を調製した。投与後の５つの時点（投与後０．５、１．０、６．０、４８、および９６時間）で血漿試料を収集した。表６に示す通り、各試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性およびパーセント阻害を測定するのに、放射測定アッセイと比色分析アッセイとの両方を使用した。表６に示す通り、放射測定アッセイによって測定された、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性のパーセント阻害は、投与の１時間後に約９４％のピーク阻害を示した。一方、薬物感受性の修正比色分析アッセイは、６時間後の時点で、活性の約６４％を阻害するピーク阻害を示した。これらのデータは、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与された動物から得た試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性の阻害を測定するのに、両方の方法が使用できることを実証するものである。投与の９６時間後には、ヒトから得た血液試料は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を本質的に含まないものとする。
【００９６】
【表６】
2007532141.tif 000011
（実施例１０）
【００９７】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害の臨床試験から得た血漿試料の試験
新規のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質である化学式Ｉ（実施例５を参照）の臨床試験に採用された４人のヒト対象は、異なった用量の薬物を受容した。対象＃１３、＃３６、＃２４、および＃４１の薬剤投与量は、それぞれ、８０ｍｇ、１２０ｍｇ、１８０ｍｇ、および２４０ｍｇであった。血漿は、薬物投与の０、０．５、１、および３時間後に収集した。これらの血漿試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を、実施例４に記載の低スループット放射測定アッセイ、実施例１に記載のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイ、および実施例８に記載の薬物感受性修正比色分析アッセイによってアッセイした。放射測定活性アッセイは、４人の対象すべてで、投与の３時間後にＬｐ−ＰＬＡ２活性が＞９０％阻害されたことを示したが、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイは薬物阻害を示さなかった。しかし、表７に示す通り、実施例８の薬物感受性修正比色分析アッセイは８５〜９０％の薬物阻害を示した。
【００９８】
【表７】
2007532141.tif 000012
【００９９】
同様に、表８に示す通り、放射測定アッセイおよび薬物感受性の修正比色分析アッセイは両方とも、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与した後、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性への測定時間依存的な効果を示した。表８に示す通り、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイを用いた場合、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性への影響はほとんど観測されなかった。
【０１００】
【表８】
2007532141.tif 000013
【０１０１】
放射測定アッセイおよび薬物感受性の修正比色分析アッセイで生成された活性値は異なっているが、これらの１６の臨床血漿試料における２つのアッセイ相互の相関関係はｒ＝０．９７５である。したがって、本明細書に記載の、薬物感受性修正比色分析法は、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイと同じ基質を用いているにも関わらず、薬物で処置されたヒト対象における、Ｌｐ−ＰＬＡ２のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物阻害を検出する能力があることを実証しており、一方、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイはそれに失敗している。
（実施例１１）
【０１０２】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害の臨床試験から得た追加の血漿試料の試験
化学式ＩのＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質に関する臨床試験における１０人の対象から血漿試料を収集した。対象＃１０９、＃１１４、＃１１５、＃１４２、および＃１４５は化学式Ｉを５０ｍｇ受容し、一方、対象＃１１８、＃１１９、＃１２１、＃１２３、および＃１２４はこの化合物を１２０ｍｇ受容した。これらの血漿試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を、実施例４に記載の高スループット放射測定アッセイ、実施例１に記載のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイ、および実施例８に記載の薬物感受性修正比色分析アッセイによってアッセイした。一貫して、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイは、これらの試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性の薬物阻害の測定に失敗しており、対象＃１２３で検出された２９％の阻害が最大のものであった。しかし、実施例８の薬物感受性修正比色分析アッセイは、すべての対象で放射測定アッセイに匹敵する薬物阻害を示した。表９に示す通り、放射測定アッセイおよび薬物感受性修正比色分析アッセイでの阻害値は、４つの時点（＃１１４／１２ｈｒ、＃１１５／１２ｈｒ、＃１４２／０．５ｈｒ、および＃１４２／１２ｈｒ）を除いたすべて１５％以内の一致を示した。
【０１０３】
【表９−１】
2007532141.tif 000014
【表９−２】
2007532141.tif 000015
【表９−３】
2007532141.tif 000016
【０１０４】
この研究で分析された１００の試料に関して、薬物感受性の修正比色分析アッセイと、放射測定アッセイとの間で、ｒ＝０．９５の相関関係が得られた。Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイは、これらの投薬試料では、放射測定アッセイとの相関関係が低かった（ｒ＝０．３１）。
（実施例１２）
【０１０５】
アッセイダイナミックレンジ
定量における測定器下限
０．６７μＬのＲ２Ｂを含有する１１０μＬのＲ１に２５μＬのＰＢＳを添加した。１６の複製を調製し、マイクロタイタープレート全体からランダムに選ばれたウェル内に入れた。４０５ｎｍの吸光度を測定し、複製間の標準偏差を計算した。標準偏差（６ｘＳＤ）の６倍を、このマイクロタイタプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳ３８４  ＵＶ／ＶＩＳマイクロプレート分光光度計、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の定量の下限と定義した。１の複製から得られたＯＤの平均測定値は０．０４３７であり、標準偏差は０．０００９であった。このマイクロタイタプレートリーダーの定量の下限は、アッセイインキュベーション中における、ＯＤ単位６ｘ０．０００９すなわち０．００５４の変化と定義された。
【０１０６】
ｐ−ニトロフェノールの線形検出範囲
ｐ−ニトロフェノールの系列希釈をメタノール中に調製した。各濃度について、２５μＬのｐ−ニトロフェノールを、マイクロタイタープレート中のＲ１（Ｒ２Ｂを含まない）１１０μＬに添加した。４０５ｎｍにおける吸光度は、０．０５から１２５ｎｍｏｌまでのｐ−ニトロフェノールで線形であった（ｒ＝０．９９６）。しかし、０．０５ｎｍｏｌ  ｐ−ニトロフェノール試料のブランク補正した吸光度は０．００４１５しかなかった。これは、上記に定義したマイクロタイタプレートリーダーの定量の下限である０．００５４  ＯＤより低い。したがって、ｐ−ニトロフェノールの線形検出範囲は、ｐ−ニトロフェノールの１ウェルあたり０．１から１２５ｎｍｏｌまでの間に設定される。
【０１０７】
アッセイダイナミックレンジ
自家生成した組換型ヒトＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質（ｈｒＬｐ−ＰＬＡ２）と、ヒト血漿から自家精製したＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質との両方を用いることによって、アッセイダイナミックレンジを定義した。
【０１０８】
ｈｒＬｐ−ＰＬＡ２の系列希釈を作製し、各希釈ｈｒＬｐ−ＰＬＡ２  ２５μＬを薬物感受性の修正比色分析アッセイでアッセイした（データを表１０に示す）。２番目に少ない量のｈｒＬｐ−ＰＬＡ２では、２０６ｎｇ／ｍＬがアッセイされ、これは１．５ｎｍｏｌ／分／ｍｌの活性を示した。現行のアッセイ設定において、そのような活動レベルは、２分間の基質加水分解反応で０．０７５ｎｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成するのみであろう。したがって、これは、最終生産物であるｐ−ニトロフェノールの線形検出範囲より低い。１３２００ｎｇ／ｍＬを超えるｈｒＬｐ−ＰＬＡ２はプラトー活性を示した。４１２から１３２００ｎｇ／ｍＬまでの間のｈｒＬｐ−ＰＬＡ２活性は、Ｒ値０．９９７の線形性を示した。したがって、さらに下の限界およびさらに上の限界も定義できるかもしれないが、このアッセイのダイナミックレンジは、４．４から３９７ｎｍｏｌ／分／ｍＬまでの間のようである（表１０を参照）。
【０１０９】
【表１０】
2007532141.tif 000017
【０１１０】
血漿から精製されたｈＬｐ−ＰＬＡ２の系列希釈も作製し、各希釈液２５μＬを薬物感受性の修正比色分析アッセイでアッセイした（データを表１１に示す）。精製されたｈＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質の活性は、６．２５から１２００ｎｇ／ｍＬまでの範囲にわたり、Ｒ値０．９７の線形性を示した。したがって、精製されたｈＬｐ−ＰＬＡ２を用いて評価したダイナミックレンジは、２．４７から３６３．６０ｎｍｏｌ／分／ｍＬまでの間のようである（表１１を参照）。これは、ｈｒＬｐ−ＰＬＡ２によって定義されたものに匹敵する。精製されたｈＬｐ−ＰＬＡ２によって決定されたダイナミックレンジの上限が比較的に低いのは、精製された産物中に存在する干渉因子および／または精製工程の間に導入される干渉因子の結果であるかもしれない。これをさらに調査するには、そのような精製タンパク質の利用可能性が限定されていることが障害となっている。
【０１１１】
【表１１】
2007532141.tif 000018
（実施例１３）
【０１１２】
基質の安定性
室温で１２０分間以上１５分間毎に吸光度変化をモニターすることによって、修正アッセイ緩衝剤（１１０μＬ  Ｒ１＋０．６７μＬ  Ｒ２Ｂ＋２５μＬ  ＰＢＳ）中での基質の安定性を検査した。ゆるやかな基質分解を反映して、吸光度は、ゆっくりではあるが一貫して２時間超の間増大するが、吸収度の変化は、１５分間あたりＯＤ単位０．００２にすぎなかった。したがって、基質分解は、修正されたアッセイ条件下では、２時間を超える時間、穏やかなようである。アッセイは、完了するのに１０分間しかかからず、活性は、２分間の反応時間に基づいて計算されるので、基質分解による吸光度変化は微々たるものであり、ブランク補正することが可能である。
（実施例１４）
【０１１３】
ヒト血漿を緩衝液Ｒ１とプレインキュベーションすることの、薬物感受性への影響
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨアッセイでは、血漿を緩衝剤Ｒ１と共に３７℃で５分間プレインキュベートする。このプレインキュベーション工程は、Ｌｐ−ＰＬＡ２に結合した薬物の解離を反応開始前に加速している可能性がある。解離の加速が起こるかどうか試験するため、ヒト対象（＃１０）から得た血漿試料を、様々な量のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質と共に３７℃で１時間インキュベートした。化学式ＩＩの薬物でｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置された血漿２５μＬを、その後、１００μＬのＲ１と共に、室温で様々な時間プレインキュベートし、その後、４０μＬのＲ２を添加して（最終基質濃度１１００μＭ）、室温でアッセイを１０分間行った。血漿をＲ１と共にプレインキュベーションすることによって、薬物阻害が低減し、これは、特に薬物濃度が低いときに顕著であった。表１２に示す通り、最高レベルの薬物阻害は、Ｒ１とＲ２とが予め混合され、プレインキュベーションせずに直接血漿に添加された場合に得られた。室温の代わりに３７℃で、Ｒ１中で血漿をプレインキュベーションすると、薬物阻害がさらに悪化する。
【０１１４】
【表１２】
2007532141.tif 000019
（実施例１５）
【０１１５】
薬物感受性への基質濃度の影響
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＦアッセイでは、基質濃度が１１００μＭであるが、これはＫｍより５倍以上高い（酵素源として血漿を使用し、Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＨプロトコールによってアッセイした場合、Ｋｍ＝２００μＭである）。基質濃度が高いと、Ｌｐ−ＰＬＡ２への薬物結合と競合する可能性がある。この可能性を試験するため、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害物質である化学式ＩＩでｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置されたヒト血漿試料２５μＬを、予め混合されていて、様々な量の基質を含有しているＲ１（１００μＬ）およびＲ２（４０μＬ）に添加した。直ちに、基質加水分解を、室温で１０分間モニターした。基質濃度が低い程、より大きな薬物阻害を示す。基質を１５４μＭ以下で用いた場合には、加水分解速度が遅いことによって、薬物濃度が高くなるのに連れて、活性値が定量の下限に近づいた。したがって、薬物阻害レベルを維持しながら、迅速な基質加水分解を誘導するためには、表１３に示す通り、基質濃度はＫｍより若干上に維持するべきである。
【０１１６】
【表１３】
2007532141.tif 000020
（実施例１６）
【０１１７】
薬物感受性へのヒト血漿試料容量の影響
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＦアッセイでは、血漿２μＬが３２０μＬの反応でアッセイされ、これは、１６０倍の血漿希釈係数に相当する。血漿希釈率が高いと、Ｌｐ−ＰＬＡ２からの薬物解離を促進する可能性がある。したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質である化学式ＩＩでｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置された血漿試料５から５０μＬを、様々な容量のＲ１と、４０μＬのＲ２とで希釈し、最終容量が１６５μＬとなり、１１００μＭの基質を含有するように調製した直ちに、加水分解を室温で１０分間モニターした。表１４に示す通り、血漿試料容量が大きいほど、大きな薬物阻害が観測された。
【０１１８】
【表１４】
2007532141.tif 000021
（実施例１７）
【０１１９】
薬物感受性への緩衝液２Ａ欠失の影響
Ａｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＦアッセイでは、基質保存液Ｒ２Ｂを緩衝液Ｒ２Ａ（２０ｍＭ  クエン酸一水和物、１０ｍＭ  １−ノナンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）に予め混合する。緩衝液Ｒ２Ａは、基質安定化剤として作用する。基質は、Ｒ２Ａ中に希釈された後、４℃で１４日間安定に維持される。Ｒ２Ａをアッセイから除いた際に、より速い加水分解速度が観測された。例えば、１８０ｎｍｏｌの基質（Ｒ２Ｂ  ２μＬ）と、２５μＬまたは５０μＬいずれかの血漿とを用いて、比色分析アッセイを行った。さらに、試料は、０μＬまたは４０μＬいずれかのＲ２Ａを含有していた。Ｒ１ですべての反応液を１２５μｌまたは１６５μＬのいずれかに希釈した。緩衝剤成分を予め混合し、ヒト血漿を添加して、反応を開始させた。直ちに、基質加水分解を室温で１０分間モニターした。Ｖｍａｘ（ミリＯＤ／分）を計算し、異なった条件相互で比較した。表１５に示す通り、血漿容量に関わりなく、Ｒ２Ａを除いた際に、より高い加水分解速度が観測された。
【０１２０】
【表１５】
2007532141.tif 000022
【０１２１】
Ｒ２Ａは、ｐＨが４．５であり、他のアッセイ緩衝液成分と比較して低いので、Ｒ２Ａの添加によってアッセイ反応液のｐＨが影響を受けたかどうか測定した。Ｒ１  １１０μＬ、０．６６μＬ  Ｒ２Ｂ、および血漿またはｄｄＨ２Ｏのいずれか２５μＬを含有するアッセイ反応液のｐＨは、それぞれ７．５２と７．５３であった。これらのアッセイ試料に４０μＬのＲ２Ａを添加した場合、ｐＨがそれぞれ７．４３と７．４２に低下した。基質のＬｐ−ＰＬＡ２加水分解速度へのＲ２Ａの影響は、おそらくｐＨ関連の影響より大きいものである。
【０１２２】
アッセイからＲ２Ａを除くことによって加水分解速度が増大した。それによって、さらに低い基質濃度およびさらに短いアッセイインキュベーション時間の使用が可能となるが、これらは両方とも薬物解離を低減する。実施例１４に記載の通り、１５４μＭの基質およびＲ２Ａを用いて２５μＬの血漿を測定した際、Ｌｐ−ＰＬＡ２の活性値が定量の下限に近づいた。化学式ＩＩでｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置された血漿（対象＃１０）５０μＬと、Ｒ１およびＲ２Ｂのみを含有している（Ｒ２Ａを含まない）アッセイ緩衝液７５μＬとを用いて、基質滴定実験を反復した。アッセイを、室温で１０分間、４０５ｎｍでモニターし、Ｖｍａｘおよび薬物阻害を計算した。６５μＭという低い基質濃度の場合でさえ、薬物が９００ｎｇ／ｍＬおよび９０００ｎｇ／ｍＬのときに加水分解活性が定量の下限を超えている（表１６を参照）。したがって、修正された比色分析活性アッセイでは、Ｒ２Ａを除き、さらに、より低い基質濃度を組み込んだ。
【０１２３】
【表１６】
2007532141.tif 000023
【０１２４】
以前の研究によって、２５μＬのヒト血漿と併用する基質濃度を２２００μＭから２７３μＭに低下させた際により高い薬物阻害が得られたことを示した。しかし、５０μＬの血漿を用い、基質濃度を２７３μＭから６５μＭに低下させた際には、薬物阻害への有意な影響が観測されなかった。これは、血漿容量が比較的大きく、基質レベルがこの範囲で低い場合には、基質による薬物解離の促進がないことを示している。
（実施例１８）
【０１２５】
実験計画ソフトウェア
元のＡｕｔｏ  ＰＡＦ  ＡＦアッセイの薬物無感受性に寄与する個々の因子を同定した後に、個々の因子の相互作用を調査する実験を設計するため、そして、適切なダイナミックレンジで薬物阻害を検出するための最適な組合せを特定するために、ＪＭＰソフトウェア（実験計画、本明細書では「ＤＯＥ」）を用いた。
【０１２６】
ＤＯＥ実験＃１
第１のＤＯＥ実験では、緩衝液Ｒ１容量（２レベル）、血漿容量（４レベル）、基質濃度（８レベル）、および薬物処置（２レベル）を含めた４つの因子に注目した。［示されている基質濃度のレベルは、別段の支持がない限り、各反応に添加される、予め混合されたＲ２Ｂ／Ｒ１のアリコートにおける基質濃度を指す。］変数の完全な要因の組合せでは、１２８のアッセイ反応が必要となるであろうが、Ｄ−最適計画は４８の異なった組合せを示唆した。予め化学式ＩＩとｉｎ  ｖｉｔｒｏ、３７℃で１時間インキュベートした後、あるいはインキュベートせずに、単一血漿試料を用いて、これらの４８の反応を２検体で行った。基質をＲ１中に直接希釈し、その後、血漿を添加して、室温で加水分解を開始させた。Ｖｍａｘおよび薬物阻害は、室温、４０５ｎｍにおける５分間にわたる吸光度の測定値に基づいて計算した。
【０１２７】
ＪＭＰは、血漿１５μＬまたは２５μＬと、２７３μＭから１１００μＭの基質含有するＲ１  １１０μＬとの組合せが、９０％以上の薬物阻害を示すであろうと予測した。この条件セットは、適度に大きなＶｍａｘも生じるであろう。そのため、薬物による強度の処置を受けた血漿が定量の下限未満まで低下することもないであろう。この実験に含まれていた最も低い基質濃度は、Ｒ１  １１０μＬ中における６５μＭであったが、この濃度では、血漿２５μＬを用いた場合（最終基質濃度５３μＭ）に、９３．４１％の薬物阻害が検出されると予測された。しかし、予測されたＶｍａｘは、薬物で処置されなかった試料でも１６．７９という低い値であった。そのような条件は、その後に最適化には進まなかったが、低レベルかる狭い範囲のＬｐ−ＰＬＡ２活性を有する特定の試料セットをアッセイするのに使用できるかもしれない。
【０１２８】
ＤＯＥ実験＃２
第２のＤＯＥ実験では、その前のＤＯＥ実験によって同定された条件に注目した。この実験では、Ｒ１容量（１レベル）、血漿容量（２レベル）、基質濃度（４レベル）、および薬物処置（４レベル）を含めたすべての変数の完全な要因の組合せを設計した。３２条件を２検体でアッセイした。アッセイプロトコールは第１のＤＯＥ実験と同一であった。［示されている基質濃度のレベルは、今度も、別段の支持がない限り、各反応に添加される、予め混合されたＲ２Ｂ／Ｒ１のアリコートにおける基質濃度を指す。］Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒは、血漿２５μＬと、５４５μＭの基質を含有するＲ１  １１０μＬとによって、薬物処置されていない血漿で７６ミリＯＤ／分のＶｍａｘが生じ、９００ｎｇ／ｍＬの薬物でｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置された血漿では９５％近くの薬物阻害を示すであろうと予測した。したがって、薬物感受性の修正アッセイでは、血漿２５μＬと、５４５μＭの基質を含有するＲ１  １１０μＬとを用い、このアッセイでの最終基質濃度は４４０μＭとなる。
【０１２９】
代替の条件セット（血漿１５μＬ、および５４５μＭの基質を含有するＲ１  １１０μＬ、このアッセイにおける最終基質濃度４７５μＭ）も同定した。この条件では、９４％の薬物阻害と、薬物で処置されていない血漿におけるＶｍａｘ＝５３ミリＯＤ／分が示唆されている。
（実施例１９）
【０１３０】
反応時間
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害薬でｉｎ  ｖｉｖｏで処置された単一の対象から得た４時点のヒト血漿試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を、基質４４０μＭおよび血漿２５μＬを含有する、薬物感受性の修正比色分析アッセイ（実施例８に記載）によってアッセイした。同じ４つの血漿試料は、同じアッセイプロトコールではあるが、血漿５０μＬと基質１５４μＭを用いたアッセイプロトコールによってもアッセイした（表１７参照）。各反応について、最初の５分間の加水分解をモニターし、反応開始から１分、２分、３分、４分、または５分の時間間隔に基づいて、５つのＶｍａｘ値を計算した。高度のＬｐ−ＰＬＡ２阻害（投与後１および３時間）に対応する試料は、血漿２５μＬおよび基質４４０μＭを用いた場合、さらに長いアッセイ反応時間にわたって、さらに高いＶｍａｘ値を示した。これは、薬物と基質との間の競合が比較的強いそのような条件下では薬物解離が起こりうることを示している。対照的に、さらに多くの血漿と、さらに少ない基質とを用いた場合（例えば、５０μＬ血漿／１５４μＭ基質）には、投与後１および３時間の時点におけるＶｍａｘ値がアッセイ反応時間に依存しない。しかし、薬物阻害がより低い試料（０および０．５時間）では、アッセイ反応時間が長い程、Ｖｍａｘ値が低下する傾向があり、特に、血漿容量が大きく、基質濃度が低い場合には、かなりの総基質量が高レベルのＬｐ−ＰＬＡ２活性によって消費されるので、その傾向が強い。したがって、アッセイ性能は、３つの属性に影響を与える少なくとも３つの因子によって影響を受ける。すなわち、
（１）血漿容量が大きく、インキュベーション時間が短く、かつ基質濃度が低いと、高レベルの薬物阻害の測定が促進され、
（２）血漿容量が小さく、インキュベーション時間が短く、かつ基質濃度が高いと、定量の上限の上昇が促進され、
（３）血漿量容量が大きく、インキュベーション時間が長く、かつ基質濃度が高いと、定量の下限の高感度化が促進される。
【０１３１】
血漿への基質の添加と、プレートリーダーでの最初の吸収度測定との間の時間を短縮するために、ロボット工学の実装が推奨されている。現行のプロトコールは、マイクロタイタープレート全体の反応を構築し、混合し、そして、プレート上で最初の反応を開始させた１分間後にプレートの測定を開始する。活性計算は、１分と３分とにマイクロタイタプレートリーダーで収集されるデータに基づいている。しかし、吸光度の測定値は、１５秒間隔で１０分間にわたって収集されるので、アッセイの目的および特定の試料セットに見られる活性範囲に応じて、さらに短い反応時間および／またはさらに早期の反応時間、あるいはさらに長い反応時間をＬｐ−ＰＬＡ２活性を計算するのに選ぶこともできるであろう。
【０１３２】
【表１７】
2007532141.tif 000024
（実施例２０）
【０１３３】
その他のアッセイ試験
アッセイ間検証
１０人の健康な（絶食していない）ヒト対象から得た血漿試料を用いてアッセイ内可変性を評価した。各対象から得た血漿の６つの複製を同じアッセイプレートでアッセイした。表１８に示す通り、個々の対象のＣＶは２．５７から９．１４％の範囲に及び、平均のアッセイ内ＣＶは５．３６％であった。
【０１３４】
【表１８】
2007532141.tif 000025
【０１３５】
アッセイ間可変性
１０人の健康な（絶食していない）ヒト対象から得た血漿試料を用いてアッセイ間可変性を評価した。これらの血漿試料は、異なった日に行われた３つの別々のアッセイでアッセイした。個々の血漿試料のアッセイ間ＣＶは、１．９０から２３．７８％の範囲にわたり、平均のアッセイ間ＣＶは７．５９％であった。表１９に示す通り、対象＃５１８１４８０（アッセイ間ＣＶ＝２３．７８％）から得た血漿は、短時間の遠心後に、白色／混濁の外観を表した。これは、試料中の高い脂質含量を示す。
【０１３６】
【表１９】
2007532141.tif 000026
【０１３７】
操作者間可変性
１０人の健康対象から得た血漿試料を用いて、操作者間可変性を評価した。これらの血漿試料は、異なった日に３人の異なった操作者によってアッセイされた。表２０に示す通り、個々の血漿試料の操作者間ＣＶは５．１１から１４．９１％の範囲にわたり、平均の操作者間ＣＶは８．３２％であった。
【０１３８】
【表２０】
2007532141.tif 000027
【０１３９】
凍結融解の影響
血漿試料は通常、凍結され、その状態で保存される。反復して分析される場合、通常、試料は凍結／融解サイクルに曝される。１０の血漿試料を４回の凍結／融解サイクルそれぞれの後に分析した。表２０に示す通り、Ｌｐ−ＰＬＡ２値における決定的な傾向は観察されなかった。これは、試料を４回凍結融解してもよいことを示す。
【０１４０】
【表２１】
2007532141.tif 000028
（実施例２１）
【０１４１】
高度の薬物阻害およびアッセイダイナミックレンジ
基質４４０μＭおよび血漿試料容量２５μＬは、それらが、適当なアッセイダイナミックレンジを維持しながら、高い検出可能なｉｎ  ｖｉｖｏ薬物阻害を示すので、現行の修正アッセイプロトコールに使用するのに選択した。しかし、基質濃度をさらに低減し、かつ／あるいはアッセイにおける血漿試料容量を増大させることによって、アッセイダイナミックレンジを犠牲にして、さらに高い測定可能なｉｎ  ｖｉｖｏ薬物阻害を検出することができた。臨床試験で化学式ＩＩを９日間受容した５人のヒト対象から得た血漿試料を、１０日目の異なった時点に収集した。試験０日目における各対象の投与前血漿試料も利用可能であった。このアッセイで、基質４４０μＭと血漿２５μＬとを用いた場合、表２２に示す通り、最大６８％の薬物阻阻害が、４時間目の時点に対象Ｎ０３０で観測された。血漿容量２５μＬに維持しながら、基質濃度を１１２μＭに低下させたところ、薬物阻害が７６％に増大した。さらに、基質濃度を１１２μＭに低下させ、かつ、血漿容量を４５μＬに増加させることによって、４時間目の時点における薬物阻害を７９％まで増大させることが実現した。
【０１４２】
【表２２】
2007532141.tif 000029
【０１４３】
基質４４０μＭ／血漿２５μＬ、および基質１１２μＭ／血漿４５μＬの両アッセイ条件を用いて、他の４人の対象から得た血漿試料を分析した。表２３に示す通り、基質４４０μＭおよび２５μＬの血漿によって検出された最大の薬物阻害は、これらの対象では６８％から８０％までの間であった。しかし、基質１１２μＭおよび血漿４５μＬの使用によって、同じ対象でさらに測定可能な薬物阻害が改善され、最大の阻害が８７％から９８％までの間となった。基質１１２μＭ／血漿４５μＬでは、実施例１２に記載した通り、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の絶対値が有意に低下しており、薬物阻害が最も高い時点での活性絶対値は、ｐ−ニトロフェノールの線形検出範囲の下限に近づいていた。例えば、対象Ｎ０２８の４時間目の時点での血漿は、１．３１ｎｍｏｌ／分／ｍＬのＬｐ−ＰＬＡ活性を示した（表２３を参照）。そのような活動レベルは、実施例８に記載の薬物感受性修正比色分析アッセイに基づくと、２分間のアッセイ時間中に０．１２ｎｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成するのみであろう。これは、ｐ−ニトロフェノールの線形検出範囲の下限である０．１ｎｍｏｌよりわずかに多い程度である。
【０１４４】
【表２３−１】
2007532141.tif 000030
【表２３−２】
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【０１４５】
基質１１２μＭおよび血漿４５μＬを用いた場合のアッセイダイナミックレンジを決定するため、系列希釈された組換型ヒトＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質のＬｐ−ＰＬＡ２活性をアッセイした。４．８８から３１２．５０ｎｇ／ｍＬの間のｈｒＬｐ−ＰＬＡ２の活性は、Ｒ値０．９６の線形性を示した（表２４を参照）。したがって、ダイナミックレンジは、２．７１〜８４．１４ｎｍｏｌ／分／ｍＬのようである。実施例１２でｈｒＬｐ−ＰＬＡを用いて決定した、基質４４０μＭ、血漿２５μＬのダイナミックレンジである４．４から３９７ｎｍｏｌ／分／ｍＬと比較して、基質１１２μＭ／血漿４５μＬでは、定量化の下限を低下させてはいるが、限定的なアッセイ範囲しか提供できないであろう。したがって、低い基質濃度および大きな試料容量を有する条件は、高い測定可能なｉｎ  ｖｉｖｏ阻害が望まれる場合に使用できるであろうが、一方で、試験試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性の範囲が制限されており、損なわれている場合さえありうる。そのような条件が適用できるであろう１例が、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害薬に関する臨床試験であり、そのような臨床試験では、投薬後試験試料のほとんどが、薬物阻害の結果として低いＬｐ−ＰＬＡ２活性を示す。そのような条件を使用する場合には、アッセイダイナミックレンジを改善するために、活性計算により早期、かつより短時間の反応時間の使用を考慮することができる。
【０１４６】
【表２４】
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【０１４７】
ｈｒＬｐ−ＰＬＡ２によって決定された２．７１から８４．１４ｎｍｏｌ／分／ｍＬというアッセイダイナミックレンジは、反応開始後３分と１分との間の吸光度変化に基づいて計算されている。反応における１分と０分との間の吸光度変化を、同じデータからＬｐ−ＰＬＡ２活性を計算するのに使用した場合、ダイナミックレンジが、３．２から１９６．５ｎｍｏｌ／分／ｍＬに有意に改善された（表２５を参照）。活性計算における反応時間を３０秒に短縮することによって、さらにごくわずかな改善があった。
【０１４８】
【表２５】
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（実施例２２）
【０１４９】
血清中のＬｐ−ＰＬａ２活性およびそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物阻害の検出
血清中のＬｐ−ＰＬＡ２活性、および、特にその薬物阻害を測定する修正比色分析アッセイの有用性を評価するために１０人の正常なドナーから収集した血清試料をアッセイした。表２６で示す、これらの血清試料で測定されたＬｐ−ＰＬＡ２活性は、１３０から１９０ｎｍｏｌ／分／ｍＬまでの間にわたった。各試料の２検体の％ＣＶは、ほとんどの場合５％未満であった。分析に利用可能な、一致した血漿試料は得られなかった。しかし、実施例１０および１１に記載した１４人の対象から得た投与前血漿試料は、８０〜２００ｎｍｏｌ／分／ｍＬの範囲のＬｐ−ＰＬＡ２活性を示しており、これに匹敵するものである。
【０１５０】
【表２６】
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【０１５１】
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質を投与されたヒト対象の血清試料を利用することができなかったので、２つの血清試料（ＢＲＨ２８８６１およびＢＲＨ２８８６７）を、様々な用量のＬｐ−ＰＬＡ２阻害物質化学式ＩＩでｉｎ  ｖｉｔｒｏで前処置した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられた用量域は、化学式ＩＩの臨床試験中に薬物を受容したヒト対象における、そのような阻害物質のｉｎ  ｖｉｖｏ血漿濃度の範囲を含むものであった。薬物動力学データに基づいて、９０ｎｇ／ｍＬを、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与された際の化学式ＩＩのピーク血漿中レベルとした。その後、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏで薬物処置された血清試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を、修正比色分析アッセイによってアッセイした。表２７は、９０ｎｇ／ｍＬの化学式ＩＩを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置された際に、ＢＲＨ２８８６１およびＢＲＨ２８８６７におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性の阻害が、それぞれ８８．２５％および９０．７７％にまで達したことを示した。薬剤投与量をさらに９００ｎｇ／ｍＬレベルに増大させることによって、これら２つの血清試料における薬物阻害がさらに増強され、それぞれ９７．７１％および９２．２８％にまでなった。
【０１５２】
【表２７】
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【０１５３】
限定されるものではないが、特許および特許出願を含めた、本明細書に引用されたすべての出版物および参考文献を、個々の出版物または参考文献のそれぞれが明確かつ個別的に、参照により本明細書に、完全に記述されているものとして組み込まれていると示されているのと同じように、参照により全体として本明細書に組み込む。この出願が優先権を主張するいかなる特許出願も、出版物および参考文献に関して上述した通りに、参照によりその全体において本明細書に組み込む。
【国際調査報告】
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