(57)【要約】  ＣＤ４４抗原性部位を発現するヒト腫瘍の処置ならびに癌細胞の単離および同定方法のための抗体（ＣＤＭＡＢ）Ｈ４６０−１６−２の使用。ＣＤ４４抗原性部位に結合するモノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２（ＡＴＴＣ受託番号ＰＴＡ−４６２１）は、癌細胞に対する細胞障害性を有する。ここで、細胞障害性は、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害作用（ＣＤＤ）を介して調節される。モノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２は、ヒト腫瘍の疾患進行遅延に有用である。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患を患っている患者を処置する方法であって、
前記患者に対して、癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産方法に基づいて生産され、癌組織の細胞に対する細胞障害性を示し非癌細胞に対しては本来毒性を持たないという性質を持つ抗癌抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、  
前記抗体またはそのフラグメントを医薬的に許容されるアジュバントと混合し、前記癌疾患の処置を調節するのに有効な量で投与し、
前記抗体が、前記癌組織によって発現される抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体によって結合しているという性質を持つ、癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されている、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置するための方法。
【請求項３】
請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法であって、  前記抗体またはその抗原結合フラグメントを毒素、酵素、放射性化合物と血液原細胞からなる群から選択されるものと複合体化することで抗体複合体を形成すること、
前記患者に前記抗体複合体または結合フラグメントを投与すること、
前記抗体複合体または結合フラグメントを医薬的に許容されるアジュバントと混合し、前記癌疾患の処置を調節するために、効果的量で投与することを含む、
請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が抗体依存型細胞障害性に依存している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、補体従属する細胞障害性を通して調節される、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項７】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して調節される、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項８】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、腫瘍細胞にあっている推定上癌抗原に対して免疫反応を生産することを通して調節される、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項９】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜蛋白のターゲッティングを通して調節される、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１０】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、細胞殺害をイニシエートするためにシグナルを生産するために、効果的細胞タンパク質で、構造変化の生産を通して調節される、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１１】
生産の前記方法は、特定の個体から得られるガンで非ガン細胞を含んでいる組織標本を利用する組織標本を利用する、請求項１にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１２】
抗体または抗原結合フラグメントが癌疾患を処置する際に有用である抗癌抗体の生産のための方法に従って生産した前記患者に投与することは、ガン組織の細胞に対して細胞障害性で、非癌細胞に基本的に良性の抗体であり、前記抗体はＰＴＡ−４６２１としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されたクローンによってコードされる単離したモノクローナル抗体を投与すること、医薬的に許容可能なアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調節するために、効果的量で投与される、癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１３】
前記抗体またはそれのフラグメントは、ヒト化またはキメラ化した、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１４】
抗体複合体が形成されるそれによって毒素、酵素、放射性化合物と血液原細胞からなる群から選択されるメンバーとそれの前記抗体またはフラグメントを抱合することを含み、前記患者にそれの投与している前記抗体複合体またはフラグメント；そこで前記結合抗体は医薬的に許容可能なアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調節するために、効果的量で投与される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１５】
前記抗体またはフラグメントが前記サブセットから選択されるその点では、ヒト化またはキメラ化した、請求項１４にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１６】
癌疾患を患っている患者を処置する方法：それの前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、抗体従属する細胞障害性を通して調節される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１７】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、抗体従属する細胞障害性を通して調節される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１８】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して調節される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１９】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、腫瘍細胞にあっている推定上癌抗原に対して免疫反応を生産することを通して調節される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２０】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜蛋白のターゲッティングを通して調節される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２１】
前記抗体またはフラグメントの細胞障害性は、細胞殺害をイニシエートするためにシグナルを生産するために、効果的細胞タンパク質で、構造変化の生産を通して調節される、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２２】
生産の前記方法は、特定の個体から得られるガンで非ガン細胞を含んでいる組織標本を利用する、請求項１２にもとづく癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２３】
細胞表面の上でＣＤ４４抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞障害性を調節する方法であって、
単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントによる前記腫瘍細胞を接触させ、前記抗体または抗原結合はそれについて単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントであることを分解し、また、前記発現されたＣＤ４４抗原性部位に対する結合は細胞傷害性が前記結合の結果として起こるそれによってＰＴＡ−４６２１と同程度ＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定し、細胞障害性が前記結合の結果として生ずる、細胞表面上のＣＤ４４抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞障害性を調節するプロセス。
【請求項２４】
前記単離した抗体またはそれの抗原結合フラグメントは、ヒト化またはキメラ化した、請求項２３のプロセス。
【請求項２５】
抗体複合体が形成されるそれによって細胞障害性の部分、酵素、放射性化合物と血液原細胞からなる群から選択されるメンバーと複合体形成させた、前記単離した抗体または抗原結合フラグメントがある請求項２３のプロセス。
【請求項２６】
前記単離した抗体または抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化した請求項２３のプロセス。
【請求項２７】
前記単離した抗体または抗原結合フラグメントがマウスである請求項２３のプロセス。
【請求項２８】
ヒト腫瘍組織試料が大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択  される組織から生じている腫瘍から得られる、請求項２８のプロセス。
【請求項２９】
単離したモノクローナル抗体に対する特異的結合がＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードしたＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する結合実験またはそれの抗原結合フラグメントを発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、
単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを提供する、前記抗体または抗原結合は、それについて単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントであることを分解する前記発現されたＣＤ４４抗原性部位（ＰＴＡ−４６２１と同程度ＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定している特徴を有している抗体に結合していて特徴づけられる前記抗原性部位）にどの結合；前記細胞試料で前記単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触させること；そして、前記細胞試料で前記単離したモノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定することを含み、前記単離したモノクローナル抗体に対する特異的結合またはそれの抗原結合フラグメントがそうであるＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する、結合アッセイ。
【請求項３０】
前記細胞試料が大腸、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られてれる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＣＤ４４抗原性部位を発現する試料に含まれる細胞を単離またはスクリーニングするためのものであり、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードした抗体に結合することによって特徴づけられるプロセスであって、
細胞試料を提供すること、単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合は、それについて単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントであることを分解する前記発現されたＣＤ４４抗原性部位（ＰＴＡ−４６２１と同程度ＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定している特徴を有している抗体に結合していて特徴づけられる前記抗原性部位）にどの結合；前記細胞試料で前記単離したモノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触させること、ならびに前記細胞試料で前記単離したモノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定すること、特に単離したモノクローナル抗体に対する結合がＰＴＡ−４６２１としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されたクローンによってコードしたＣＤ４４抗原性部位を発現するそれによって前記細胞は前記結合によって単離することで、前記細胞試料のそれらの存在が確認される、プロセス。
【請求項３２】
細胞試料が大腸、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項３１のプロセス。
【請求項３３】
ほ乳類のヒト腫瘍を処置することで、生存率を高め、および／または疾患進行を遅らせる方法であって、
前記腫瘍は、前記哺乳類に投与することを含んでいる受託番号ＰＴＡ−４６２１が疾患進行が後発性であるおよび／または生存が広げられるそれによって前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量でモノクローナル抗体を言ったので、特にモノクローナル抗体に対する結合またはクローンでコードされるモノクローナル抗体の同定している特徴を有する抗原結合フラグメントがそれについてＡＴＣＣで堆積させた抗原を発現する、方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞障害性の部分に抱合した、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞障害性の部分が放射性同位元素である、請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用を調節する、請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウスの抗体である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化された抗体である請求項３３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患の診断および処置、詳しくは腫瘍細胞の細胞障害性の調節、および最も詳しくは細胞障害性反応をイニシエートするための手段としての癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用（一種類以上の化学療法剤と任意に併用させた状態で）に関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球に対するモノクローナル抗体の産生は、ＣＤ４４抗原の発見をもたらした。このＣＤ４４抗原は、単鎖のヒアルロン酸（ＨＡ）結合糖タンパク質であり、広範囲に及ぶ正常組織および全ての種類の造血細胞上で発現する。ＣＤ４４抗原は、当初、リンパ球活性化およびリンパ球ホーミングに結びつけて考えられていた。現在、一般に考えられているその生理学的役割として、炎症性遺伝子の活性化、細胞周期の変調、細胞増殖の誘導、分化および発現の誘導、細胞骨格再構成および細胞移動の誘導、ならびにアポトーシスに対する細胞生存／耐性も挙げられる。
【０００３】
ヒトでは、ＣＤ４４の単一遺伝子コピーが第１１染色体の短腕（１１ｐ１３）上に位置している。この遺伝子は、１９個のエクソンを含み、最初の５個が定常、次の９個が可変、その後の３個が定常、さらに最後の２個が可変である。選択的スプライシングによって、１，０００を上回る異なったアイソホームを得ることができる。しかし、現在のところ、同定された天然の変異体は数十にすぎない。
【０００４】
ＣＤ４４標準糖タンパク質は、Ｎ末端細胞外（２０アミノ酸長のリーダー配列および膜近位領域（８５アミノ酸長）を含む）領域（２７０アミノ酸長）、膜貫通領域（２１アミノ酸長）、ならびに細胞質尾部（７２アミノ酸長）からなる。細胞外領域は、Ｎ末端に連結モジュールも有する。この領域は、９２アミン酸長であり、多のＨＡ結合連結タンパク質に対して相同性を示す。ヒトＣＤ４４の形態とマウスＣＤ４４の形態とのあいだに高い相同性がある。そのタンパク質の可変型をエクソン５のカルボキシル基末端に挿入すると発現の際に細胞外に位置する。ＣＤ４４の血清可溶型も天然に生じ、停止コドン（可変領域内）またはタンパク質分解活性に起因し得る。
【０００５】
ＣＤ４４の血清可溶形も天然に生じ、終止コドン（可変領域内）またはタンパク質分解活性のいずれかに起因し得る。ＴＮＦ−αを含む種々の刺激による細胞の活性化によって、腫瘍細胞によるＣＤ４４受容体の遊離放出が生ずる。この受容体の遊離放出は、腫瘍細胞によっても見られ、それによってＣＤ４４の血清濃度が最高１０倍まで増加する。ＣＤ４４の血清濃度が高いことは、悪性（例外として卵巣癌）であることを示唆している。
【０００６】
ＣＤ４４の標準形態は、分子量約３７ｋＤを有するものとして存在する。翻訳後の修飾は、分子量を８０〜９０ｋＤに増加させる。このような修飾として、アスパラギン残基でのアミノ末端細胞外領域Ｎ結合グリコシル化、細胞外領域のカルボキシ末端でのセリン／スレオニン残基のＯ−結合グリコシル化、およびグリコサミノグリカン付加が挙げられる。スプライス変異体の大きさは、８０〜２５０ｋＤの範囲内にある。ほ乳類動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置する多糖類であるＨＡは、主要なＣＤ４４リガンドとして考えられる。しかし、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン等のタンパク質にＣＤ４４が結合するという知見も得られている。
【０００７】
不活性ＣＤ４４（ＨＡに結合せず）のグリコシル化の度合いは最も高く、活性ＣＤ４４（ＨＡに結合）の場合は最も低く、誘導性ＣＤ４４（サイトカイン、モノクローナル抗体、増殖因子等によって活性化されない限り、ＨＡに結合しないか、結合しても弱い）のグリコシル化の度合いは、活性型と不活性型とのおおよそ中間にある。
【０００８】
ＣＤ４４は、細胞の相互作用、刺激、および環境に左右される複数のシグナル伝達経路を介して、その機能の一部を調節することができる。これらの伝達経路の一部として、ＮＦｋＢシグナル伝達カスケード（炎症反応に関連）、Ｒａｓ−ＭＡＲＫシグナル伝達経路（細胞周期および増殖の活性化に関連）、タンパク質のＲｈｏファミリー（細胞骨格再構築および細胞移動に関連）、ならびにＰＩ３−Ｋ−関連シグナル伝達経路（細胞生存に関連）が挙げられる。上記機能の全てが主要疾患開始および進行と密接に関係している。ＣＤ４４も種々の付加的な機構によって癌の原因に関係があるとされている。これらの機構として、悪性疾患に関係する受容体に対するＣＤ４４の細胞表面上に存在する細胞表面プロテオグリカンによる増殖因子、ケモカイン、およびサイトカインの提示が挙げられる。また、ＣＤ４４−ＨＡ複合体のインターナリゼーション後にリソソーム・ヒアウロニダーゼによるＨＡの細胞内分解によって、ＥＣＭを介した新脈管形成の誘導と腫瘍侵襲性の可能性とが潜在的に増加し得る。さらに、生存またはアポトーシスのシグナルの伝達は、標準的または可変的ＣＤ４４受容体を介して生ずることが示されている。ＣＤ４４は、細胞分化および移動に関係することが示唆された。全てではないにしても、これらの機構の多くが環境および細胞に依存しており、さらにいくつかは結果にばらつきが生じた。したがって、何らかの結論が出される前に、より多くの研究をおこなうことが求められている。
【０００９】
癌でのＣＤ４４の潜在的な機能的役割を確認するために、ＣＤ４４の発現を検討して、その受容体が疾患進行と相関するかどうかを判断した。しかし、大部分の種類の腫瘍で得られた知見は矛盾するものであり、このことは研究者間で試薬の組み合わせ、手法、病理学的採点法、および細胞種が異なることによると考えられる。腎細胞癌および非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫は、例外であると思われる。高ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者の生存期間は、その対照となる低または非ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者の生存期間よりも一貫して短かった。
【００１０】
癌との関連性により、抗癌療法の開発がＣＤ４４を標的としておこなわれてきた。ＣＤＤの標準型または変異型が腫瘍進行に必要かどうかについての論争が依然としておこなわれている。両方の観点を指示する生体内動物データがあり、また一方では腫瘍型に依存し、さらには細胞型にも依存すると考えられる。異なる治療的アプローチとして、可溶性ＣＤ４４タンパク質、ヒアルロナン・シンターゼｃＤＮＡ、およびヒアルロニダーゼの注射と、ＣＤ４４アンチセンスおよびＣＤ４４特異抗体の使用とが含まれていた。各々のアプローチは、ある程度の成功をもたらし、それによって抗ＣＤ４４癌療法に対するサポートが得られた。
【００１１】
変異体ＣＤ４４特異的モノクローナル抗体および標準ＣＤ４４特異的モノクローナル抗体の産生は、実験的におこなわれてきた。しかし、ほとんどの場合、これらの抗体は固有の生物活性を持たず、むしろ該抗体が認識するＣＤ４４のタイプに対して特異的に結合する。しかし、一部のものは、生体外または生体内のいずれかで活性を示す（しかし一般に両方で活性を示すことはない）。いくつかの抗ＣＤ４４抗体が、細胞で生ずる現象を調節することが示された。例えば、ヒト赤血球ルセラン抗原ＣＤ４４標準型に対するマウス抗体Ａ３Ｄ８は、ＣＤ（９−１抗体）およびＣＤ（ＯＫＴ３抗体）媒介Ｔ細胞活性化を高めることが示され、別の抗ＣＤ４４抗体は類似の効果を生じた。Ａ３Ｄ８は、単球からのＩＬ−１放出およびＴリンパ球からのＩＬ−２放出もおこなう。興味深いことに、ダウノルビシン、ミトキサントロン、およびエトポシド等の薬剤と併用してＡ３Ｄ８の使用は、第二メッセンジャーであるセラミドの生成を抑制することによって、ＨＬ６０およびＮＢ４ＡＭＬ細胞でのアポトーシス誘導を阻害した。固有の活性を持たずＣＤ４４の同様なエピトープに対するＪ１７３抗体は、薬剤誘導アポトーシスを阻害しなかった。８５〜１１０ｋＤおよび２００ｋＤ形のＣＤ４４に対するＮＩＨ４４−１抗体は、ＣＤ４４の交叉結合または凝集であると著者が推測する経路を介して、Ｔ細胞増殖を増強させた。ひとまとめにして考えると、このような抗体が癌に対するもの（例えば、リンパ球の活性化）ではなく、細胞増殖を誘導するものでもなく、あるいは細胞障害性薬とともに使用した際に癌細胞の薬物誘導死をもたらすこともないことから、これらが癌治療を目的とした用途に適しているという証拠はない。
【００１２】
いくつかの抗ＣＤ４４抗体が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で抗腫瘍効果を示すということが記載された。抗体１．１ＡＳＭＬ（ＣＤ４４の変異体に対するマウスＩｇＧ１）によってラット膵臓腺癌ＢＳｐ７３ＡＳＭＬのリンパ節および肺転移が減少することが示されている。処置した動物の生存は、同時に増加した。この抗体は、リンパ節コロニー形成前に投与される場合のみに効果的であり、リンパ節での細胞増殖を妨げた。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での腫瘍細胞に対する抗体の直接的な細胞障害性は見られず、この抗体によって補体媒体細胞障害性または免疫エフェクター細胞機能が高められることはなかった。ヒト細胞に対する抗体の有用性については、記載されていない。
【００１３】
ブレイヤー（Ｂｒｅｙｅｒ）他は、同所移植されたラット膠芽腫の進行を中断させるために、ＣＤ４４に対する市販の抗体を用いることを記載した。ラット膠芽腫細胞系Ｃ６を前頭葉に移植し、１週間後、ラットに対して、脳内注射による抗体処置を３回おこなった。処置されたラットでは、腫瘍の増殖減少が示され、また緩衝液またはアイソタイプ対照処置ラットよりも体重が重かった。抗体は、細胞外マトリックス成分によって被覆されたカバーグラスに対する生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞接着を阻害することが可能であったが、細胞に対する直接的な細胞障害性効果を有しなかった。この抗体の試験は、ヒト細胞に対してはおこなわれなかった。
【００１４】
ＣＤ４４（ＩＭ−７．８）に対する抗体の有効性をＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）と比較する研究がおこなわれた。高転移性マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０株（両方のＣＤ４４イソ型を発現）がマウスに静脈内移植された。２日後、本研究期間にわたって３日毎に抗体の投与がなされた。両抗体ともに、肺転移の数を５０％を上回るほど著しく減少させ、２つの抗体間で有効性の有意な差はみられなかった。抗体は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での増殖に影響を及ぼさず、著者であるザバズキ（Ｚａｂａｄｚｋｉ）他は腫瘍増殖阻害がＣＤ４４とそのリガンドとの相互作用を抗体が阻害することによるものと推測した。ＩＭ−７．８．１を用いた別の研究では、ザバズキ（Ｚａｂａｄｚｋｉ）他は、抗体およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントがマウスＴ細胞リンパ腫ＬＢによってリンパ節浸潤を阻害することが可能であることを証明した。これは、マウスに対して顕著な延命効果を与えた。ヴァラッハ−ダヤン（Ｗａｌｌａｃｈ−Ｄａｙａｎ）他は、腫瘍を自発的に形成しなＬＢ−ＴＲマウスのリンパ種がＣＤ４４ｖ４−１０によるトランスフェクションによって腫瘍形成能を与えられたことを示した。ＩＭ−７．８．１投与によって、イソ型対照抗体と比べて、移植トランスフェクト細胞の腫瘍サイズが減少した。これらの研究のいずれも、この抗体に関するヒトでの有用性については示されなかった。
【００１５】
ＧＫＷ．Ａ３（マウスＩｇＧ２ａ）は、ヒトＣＤ４４に対して特異的であり、ＳＣＩＤマウスでのヒト黒色腫異種移植の形成および転移を妨げる。この抗体を転移性ヒト細胞系ＳＭＭＵ−２と混合して皮下注射した。処置は、その後３週間にわたって続けられた。４週間後、未処置の動物では１００パーセントであるのに比べて、１０匹のマウスのうち１匹のみが注射部位で腫瘍を発生させた。抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、腫瘍形成を同様に阻害することを示したことから、その作用機序が補体または抗体依存性細胞障害に依存しないことが示唆された。初回抗体注射の１週間前に腫瘍細胞を注射した場合、８０パーセントの動物で原発部位に腫瘍が生じた。しかし、留意すべき点は、生存期間が依然として著しく高いということであった。抗体遅延投与が原発腫瘍形成に対して何ら効果を示さなかったことにかかわらず、未処置の動物では存在した肺、腎臓、副腎、肝臓、および腹膜への転移を完全に防いた。この抗体は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で上記細胞系に対して直接的な細胞障害性をまったく示さないか、あるいはＳＭＭＵ−２細胞の増殖を妨げ、さらに転移または増殖に影響を及ぼすことで腫瘍形成に対して大きな効果を有すると思われる。この抗体の１つの顕著な特徴は、それがＣＤ４４の全てのイソ型を認識したということであり、このことは治療を目的とした使用の可能性に限界があることを示唆した。
【００１６】
シュトローベル（Ｓｔｒｏｂｅｌ）他は、マウス異種移植モデルでヒト卵巣癌細胞の腹膜移植を阻害するために抗ＣＤ４４抗体（クローン５１５）を用いることを記述している。ヒト卵巣の細胞系３６Ｍ２を、抗ＣＤ４４抗体または対照抗体の存在下で、マウスへ腹腔内移植し、その後の２０日間にわたって処置薬を投与した。５週間後に、抗体処置群の腹膜腔で小結節の数が著しく少なかった。抗ＣＤ４４処置群および対照処置群に由来する小結節の大きさは、同じであり、このことは細胞がひとたび移植されると、抗体は腫瘍増殖に対して何ら効果を示さなかったことを示唆した。細胞を皮下移植した場合も腫瘍増殖に対する効果はなく、抗体それ自体が抗増殖または細胞障害性効果を持たないことを示した。また、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での細胞増殖に対する抗体の効果はみられなかった。
【００１７】
ＶＦＦ−１８（ＢＩＷＡ１とも表される）は、ポリペプチドの３６０〜３８７０領域に対して特異的であるＣＤ４４のｖ６変異体に対する高親和性抗体である。この抗体は、１２人の患者の第１相臨床試験で９９ｍテクネチウム標識複合体として用いられている。この抗体を、頭部および頚部に扁平上皮癌を持つ患者での標的化可能性と安全性とについて、試験した。注射後の４０時間、注射投与量の１４パーセントが腫瘍に取り込まれ、その際、腎臓、脾臓、および骨髄を含む他の器官での蓄積は最小であった。高度に選択的な腫瘍結合は、この抗体の放射免疫療法での役割を示唆している一方で、この抗体の非常に高い親和性が腫瘍のより深い層への浸透を妨げている。ＢＩＷＡ１の適用をさらに制限するものは、マウス抗体の免疫原性（患者１２人中１１人にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が生じた）、腫瘍全体に及ぶ異質性の蓄積、および抗体可溶性ＣＤ４４複合体の形成である。ＷＯ０２／０９４８７９は、ＨＡＭＡ応答を克服するために設計されたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と命名）を開示している。ＢＩＷＡ４の抗原結合親和性が親ＶＦＦ１８抗体よりも著しく低いという知見が得られた。驚くべきことに、低親和性ＢＩＷＡ４抗体は、高親和性ＢＩＷＡ８ヒト化ＶＦＦ−８抗体よりも優れた腫瘍取り込み特性を有した。患者３３人に対する第１相臨床試験をおこなうことで、９９ｍテクネチウム標識および１８６レニウム標識ＢＩＷＡ４抗体の安全性、耐容性、腫瘍蓄積、および最大許容投与量（１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の場合）を評価した。１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の全ての用量で腫瘍反応がみられなかったにみられなかったけれども、いくつかのものは安定病態を有し、用量規定毒性が６０ｍＣｉ／ｍ２で生じた。有害事象率は５０〜６５パーセントであり、患者３３人中１２人が深刻な有害事象（血小板減少症、白血球減少症、および発熱）を有すると思われ、またそのうちの６人（全員が１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４による処置を受けた）が処置または経過観察の過程で疾患進行により死亡した。１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の用量を段階的に増量する第１相試験を患者２０人に対して実施した。口腔粘膜炎および用量規定血小板減少症および白血球減少症が観察され、１人の患者ではＨＡＨＡ反応が出現した。安定病態は、６０ｍＣｉ／ｍ２という最も高い用量で処置された患者５人にみられた。達成される有効性について安全性および耐容性の両方の面から許容可能であると考えられるにもかかわらず、これらの研究は、臨床試験で他の非放射性同位元素併用生物学的療法に比べて、有害事象率が高い。米国特許出願第２００３／０１０３９８５号は、腫瘍治療を目的として、メイタシオイドを抱合させたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と命名）を開示している。ヒト化ＶＦＦ１８抗体（ＢＩＷＡ４）は、毒素（すなわち、ＢＩＷＩ１）を抱合した場合に、外陰部ヒト扁平上皮細胞癌、咽頭有棘細胞癌、または乳癌のマウス・モデルで顕著な抗腫瘍効果を示すという知見が得られた。非抱合型バージョンであるＢＩＷＡ４は抗腫瘍効果を示さず、また抱合型バージョンであるＢＩＷＩ１はヒトでの安全性および有効性に関する証拠を何ら示していない。
【００１８】
ＭａｂＵ３６は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂヒト下咽頭癌細胞免疫化ならびに癌および組織特異性に対する選択性によって得られたマウス・モノクローナルＩｇＧ１抗体である。ｃＤＮＡクローニングおよび配列分析を通しての抗原特徴付けは、ケラチノサイト特異的ＣＤ４４スプライス変異体エピカンのｖ６領域をＭａｂＵ３６の標的として特定した。免疫組織化学的検査では、このエピトープが細胞膜に限定されていることが示された。さらに、ＭａｂＵ３６は、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の９４％を強く標識し、またこの腫瘍内で均一な細胞染色がみられた。患者１０人の９９ｍＴｃ標識ＭａｂＵ３６を検査したところ、ＨＮＳＣＣ癌に対する抗体の選択的蓄積（２日間で２０．４±１２．４パーセント注入量／ｋｇ）がみられ、副作用は報告されていないが、患者２人にＨＭＡＡが発症した。放射性ヨウ素標識マウスＭａｂＵ３６の検査では、患者１８人中、ＨＡＭＡの症例が３件あり、選択的かつ一様なＨＮＳＣＣへの取り込みがみられた。ＭａｂＵ３６の抗原性を低下させるとともにＨＡＭＡの率を低下させるために、キメラ抗体が作られた。キメラおよび本来のマウスＭａｂＵ３６は、いずれもＡＤＤＣ活性を示さなかった。ＭａｂＵ３６が持つ本来の機能活性に関する証拠はみられない。この第１相試験では、投薬量増量治験患者１３人に対して、探索量の９９ｍＴｃ標識キメラＭａｂＵ３６が与えられ、続いて１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６が投与された。急性有害事象の報告はなかったが、後処置投与量を制限する骨髄毒性（１．５ＧＢｑ／ｍ２）が患者３人のうち２人にみられ、また最大許容投与量（１．０ＧＢｑ／ｍ２）による処置を受けた１人の患者に血小板減少症が認められた。腫瘍サイズに対して多少の効果があったにもかかわらず、これらの効果は処置に対する他感的応答基準を満たすものではなかった。１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６に関するさらなる研究は、顆粒球コロニー刺激因子刺激全血返血という戦略を利用して最大耐容活性を２．８Ｇｙに倍化させた。頭頚部に種々の腫瘍を持つ患者９人に対するこの研究で、３人が薬物関連貧血症のために輸血を必要とした。他の毒性として、重度（グレード３）の骨髄毒性および中等度（グレード２）の粘膜炎が挙げられる。安定病態が５人の患者で３〜５ヵ月間達成されたにもかかわらず、客観的腫瘍反応は既報告でなかった。したがって、わかることは、ＭａｂＵ３６が非常に特異的な抗体であるにもかかわらず、抗癌効果を達成するために放射性免疫複合体を必要とすることが障害になって、その有益性が制限されることであり、その理由として、達成される臨床効果に関連して治療に伴う毒性がある。
【００１９】
要約すると、ＣＤ４４ｖ６（１．１ＡＳＭＬ）およびＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）モノクローナル抗体は、それぞれ、転移性膵臓腺癌を注射されたラットまたは悪性黒色腫を注射されたマウスの転移活性を減少することが示されている。別の抗ＣＤ４４ｖ６抗体（ＶＦＦ−１８とその誘導体）は、メイタンシノイドまたは放射性同位元素に抱合される場合のみに、抗腫瘍効果を有することが示された。抗標準ＣＤ４４モノクローナル抗体は、ラット・グリア芽細胞腫（抗ＣＤ４４）による大脳内進行、マウスＴ細胞リンパ腫によるリンパ節浸潤（ＩＭ−７．８．１）を抑制すること、同様にヌードマウス（クローン５１５）でのヒト卵巣癌細胞系の移植、マウス・メラノーマ細胞系の肺転移（ＩＭ−７．８．１）、およびＳＣＩＤマウス（ＧＫＷ．Ａ３）でのヒト・メラノーマ細胞ラインの転移を阻害することが明らかになった。放射性同位元素結合ＭａｂＵ３６抗ＣＤ４４ｖ６抗体およびその誘導体は、臨床試験で、顕著な毒性を伴う抗腫瘍活性を有した。これらの結果は、彼らを励ますとともに可能性のある癌療法としての抗ＣＤ４４モノクローン抗体の開発を支持したにもかかわらず、ヒト癌に対する有効性、安全性、および適用性に限界があることを示している。
【００２０】
したがって、癌細胞障害性を調節する抗体組成物が単離されるならば、癌細胞上のＣＤ４４の細胞表面発現に対するその親和性の効用として、有益な診断および治療方法が実現されるだろう。
【００２１】
従来技術
特許文献１は、患者腫瘍由来の細胞にＭＨＣ遺伝子を形質移入するプロセスを開示しており、このＭＨＣ遺伝子はその患者の細胞または組織からクローニングすることが可能である。
【００２２】
特許文献２は、ほ乳類の腫瘍性および正常細胞の細胞内構成要素に対して特異的であり、細胞外構成要素に対しては非特異的であるモノクローナル抗体を得る工程と、そのモノクローナル抗体を標識する工程と、標識された抗体と腫瘍性の細胞を殺すための治療を受けたほ乳類の組織とを接触させる工程と、変性腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する標識抗体の結合を測定することによって治療の効果を決定する工程とを含むプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に対する抗原を調製している際に、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の便利な供給源であることを認識する。
【００２３】
特許文献３は、新規な抗体とその生産方法とを提供する。詳しくは、この特許は、ヒト腫瘍（例えば、大腸および肺の腫瘍）に関連したタンパク質抗原と強固に結合し、その一方で正常細胞への結合の度合いがかなり低いという性質を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。
【００２４】
特許文献４は、癌治療のための方法を提供するもので、この方法は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に除去すること、腫瘍組織を処理することで腫瘍細胞を得ること、腫瘍細胞に放射線を照射することで、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にすること、ならびにこれらの細胞を用いて、原発性腫瘍の再発を妨げると同時に転移を阻止することが可能な患者用アクチンを調製することを含む癌治療の方法を提供する。この特許は、モノクローナル抗体の開発を教示しており、このモノクローナル抗体は腫瘍の表面抗原に対して反応する。第４段落４５行目（以下参照）に記載されているように、特許権者は、ヒト腫瘍形成で有効かつ特異的な免疫治療を示すモノクローナル抗体の開発で自所性の腫瘍細胞を利用する。
【００２５】
特許文献５は、ヒト上皮性悪性腫瘍に特有であり、かつそれが由来する上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
【００２６】
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞系、上記抗体を用いて癌を処置する方法、および上記抗体を含む医薬組成物に関する。
【００２７】
特許文献７は、精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体を生産するための新規ハイブリドーマ細胞系を記載している。
【００２８】
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生産する方法、モノクローナル抗体を生産する方法、およびこの方法によって生産されるモノクローナル抗体に関する。この特許は、特に癌の診断および処置に有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の生産に関する。
【００２９】
特許文献９は、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、およびヒト上皮性悪性腫瘍細胞と反応する単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体作用が２倍になるメカニズムは、ヒト癌の表面に存在する細胞膜抗原と反応する点で、また抗体は癌細胞内に内在化する能力を持つという点であり、結合の後で、抗体薬物複合体および抗体毒素複合体の形成に特に有用となる。未修飾形態では、抗体もまた、特定の濃度で細胞障害性を発現する。
【００３０】
特許文献１０は、腫瘍の治療および予防に自己抗体を使用することを開示している。ｓかし、この抗体は、老いたほ乳類の抗核抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見いだされる自然抗体の一種であると考えられる。なぜなら、自己抗体は「老いたほ乳類」に由来し、自己抗体が実際に、処置している患者に由来することを必要とはしない。また、この特許は老いたほ乳類に由来する天然またはモノクローナル抗核自己抗体とモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞系とを開示している。
【００３１】
特許文献１１は、ＣＤ４４遺伝子の変異体エクソンｖ６に対する特異的抗体（ＶＦＦ−１８）とその変異体とを開示している。この抗体は、ラットＣＤ４４ｖ６変異体よりもむしろヒトＣＤ４４ｖ６変異体を認識するという点で、コンパレーター抗体をしのぐ改善である。さらに、この抗体は、ＣＤ４４ｖ６発現のための診断アッセイを開示する。この抗体に関して、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での作用はみられなかった。
【００３２】
特許文献１２は、ＣＤ４４遺伝子のヒト・エクソン６Ａによりコードされる配列を含む合成ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体Ｖｅｒ３．１を開示している。詳しくは、この抗体はヒトＣＤ４４の９０ｋＤ形に結合せず、Ｈｅｒｍｅｓ−３抗体と区別される。ＣＤ４４のｖ６変異体を検出する方法を提供するとともに、この抗原に基づく悪性転換をスクリーニングして評価するための方法を提供する。血清中の抗原の検出に基づいて免疫疾患をスクリーニングするための方法も提供する。
【００３３】
特許文献１３は、４３アミノ酸ペプチドを産生するヒトＣＤ４４変異体６の１２９ｂｐエクソンに結合する特異的抗体を開示している。このモノクローナル抗体は、いくつかのハイブリドーマ細胞系、すなわちＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６によって産生される。この抗体は、新規ＣＤ４４ｖ６アミノ酸配列の少なくともヘキサペプチドを含む融合タンパク質から生ずる。さらに、癌診断に使用し得るエクソン６変異体を検出するための免疫アッセイが開示されている。注目すべきことは、開示されたこの抗体の生体外および生体内作用はみられない。
【００３４】
特許文献１４は、ＣＤ４４様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドおよびその変異体を用いて組み換えタンパク質を作る方法とを開示している。これらのポリペプチドに対して抗体がクレームされているが、具体例はなく、またそのような抗体を分泌する寄託されたクローンもない。ノーザン・ブロットは、いくつかの種類の組織でポリヌクレオチドの出現を示しているが、このポリヌクレオチドの翻訳および発現に付随する証拠は挙げられていない。したがって、このポリペプチドの遺伝子産物に対して作られた抗体（該抗体は生体外または生体内作用を有すると思われる）が存在していたという証拠はなく、また該抗体がヒトの癌疾患に関連していると考えられる証拠もない。
【００３５】
特許文献１５は、ＣＤ４４の変異体エピトープと反応する抗体と該抗体を用いて変異体を同定する方法とを開示している。この変異体をコードする単離ポリペプチドはラット細胞から単離されたもので、この変異体に対する抗体（ｍＡｂ１．１ＡＳＭＬ）は、分子量１２０ｋＤ、１５０ｋＤ、１８０ｋＤ、および２００ｋＤのタンパク質を認識する。モノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬの投与は、同系ラットでのラットＢＳｐ７３ＡＳＭＬの増殖および転移を遅らせた。注目すべきことに、１．１ＡＳＭＬは、ＬＣＬＣ９７ヒト大細胞肺癌に対する反応性が欠けていたことに示されるように、ヒト腫瘍を認識しない。ヒト・ホモログはＬＣＬＣ９７から単離されるが、このホモログを認識する等価な抗体は産生されなかった。したがって、ラットＣＤ４４の変異体に特異的な抗体が作られ、ラット腫瘍の増殖および転移に影響を及ぼすことが示された。より具体的には、本発明者らはこの抗体がヒト癌を認識しないことを指摘している。
【００３６】
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号公報
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号公報
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号公報
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号公報
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号公報
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号公報
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号公報
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号公報
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号公報
【特許文献１０】米国特許第５，９１６，５６１号公報
【特許文献１１】米国特許第５，７８０，０３３号公報
【特許文献１２】米国特許第５，６１６，４６８号公報
【特許文献１３】米国特許第５，８７９，８９８号公報
【特許文献１４】米国特許第５，９４２，４１７号公報
【特許文献１５】米国特許第５，８８５、５７５号公報
【発明の開示】
【００３７】
既に本発明者らは、癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためのプロセスに対する「個別的患者特異的抗癌抗体」と題された米国特許第６，１８０，３５７号を既に交付されている。この文献の目的のために、用語「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）を同義的に用いることが可能であり、ハイブリドーマ（例えば、マウスまたはヒト）、免疫複合体、さらに必要に応じて、免疫グロブリンのフラグメントおよび該免疫グロブリンに由来する組み換え体タンパク質によって生産される完全な免疫グロリンのことをいい、例えばキメラおよびヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組み換え体免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）、融合タンパク質が挙げられる。タンパク質の構造または機能に有意な効果を生ずることなく、一部のアミノ酸配列がポリペプチド内で変異し得ることは、当該技術分野で十分に理解されている。抗体の分子内転位では、一般に、主鎖領域の核酸またはアミノ酸配列を修飾し得る。このような修飾の例として、限定されるものではないが、置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加が挙げられる。さらに、標準的な化学療法のための手段（例えば、放射性核種）と本発明のＣＤＭＡＢとを抱き合わせることは、この発明の範囲内であり、このことから上記化学療法剤の使用に注目する。ＣＤＭＡＢもまた、毒素、細胞毒部位、酵素（例えば、ビオチン複合酵素）、または造血細胞と結合することができ、それによって抗体複合体が形成される。
【００３８】
この出願は、実質的に、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞系の単離を目的とした‘３５７号特許に教示されたような患者特異的抗癌抗体を生産するための方法を利用する。これらの抗体を、１つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能となる。この出願の文脈の中で、細胞殺害（細胞障害性）または細胞増殖阻害（細胞増殖抑制性）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、細胞障害性という。これらの抗体を癌の病期分類および診断の補助として用いることができ、また原発腫瘍と同様に腫瘍転移を処置するために用いることができる。
【００３９】
個別的抗癌処置の見込みは、患者を管理する方法の変化をもたらす。可能性のある臨床シナリオは、腫瘍試料が提示に得られて積み上げられることである。この試料から、既存の癌疾患修飾抗体パネルにより腫瘍の型を決めることができる。患者の病期分類を従来どおりに行うけれども、利用可能な抗体を患者のさらなる病期分類に用いることができる。患者に対して既存の抗体を用いて迅速な処置を施すことができ、および／または腫瘍に特異的な抗体パネルを、本明細書中に概説された方法を用いることで、あるいは本明細書中に開示されたスクリーニング方法と同時にファージ・ディスプレイ・ライブラリーを用いることを介して、生産することができる。産生された抗体の全てを抗癌抗体ライブラリーに加える。他の腫瘍が処置したものと同様のエピトープのいくつかを所有することが可能である。この方法にもとづいて産生される抗体は、該抗体に結合する癌を持つ患者の多くで癌疾患を処置するのに有用であると思われる。
【００４０】
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号を用いることで、患者の肺腫瘍生検から得た細胞によるマウスの免疫化の後に、マウス・モノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２を得ることができた。Ｈ４６０−１６−２で抗原は、異なる組織起源からヒト細胞系の幅広い範囲の細胞表面の上で発現された。乳癌細胞系最低降下高度−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）と皮膚癌細胞系Ａ２０５８は、そうであった生体外でＨ４６０−１６−２の細胞障害効果に感受性である。マウス（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００で開示されるように）に移植されるとき、培養のＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１６−２で細胞障害性の結果はこれらの癌細胞の方へその抗腫瘍活性によってさらに広げられた。
【００４１】
症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療効力の有効な予言者と考えられる。ヒト乳癌の予防的生体内モデルで、Ｈ４６０−１６−２で処置はアイソタイプ対照抗体より、治療期間の間に腫瘍増殖を抑制することに有意に効果的だった（ｐ＜  ＯＯＯｌ）。そして、それは構造とサイズのＨ４６０−１６−２と同一だったが、結合ＭＢ−２３１の細胞ができなかった。処置相終了後、Ｈ４６０−１６−２を与えられるマウスは、対照群のわずか１．３パーセントに増大した腫瘍を有した。後処理追跡調査期間の間に、Ｈ４６０−１６−２の処置効果は維持された、そして、投与群の平均の腫瘍容積は測定相の末端までの対照よりかなり少なくし続けた。抗体有効性の基準として生存を使用して、Ｈ４６０−１６−２で投与群で死亡する危険が７０日後処理の抗体バッファ制御群（ｐ＝０．０２８）の約７１パーセントであると推定された。これらのデータは、Ｈ４０−１６−２で処置が対照治療をうけている群と比較して延命効果を与えることを証明した。それが還元型体重と臨床苦痛を含む毒性のいかなる合図も誘導しなかったので、Ｈ４６０−１６−２で処置は安全に見えた。このように、それが腫瘍増殖を遅延させて、ヒト乳癌の十分確立されたモデルで対照治療をうけている群と比較して生存を強化したので、Ｈ４６０−１６−２で処置は有効だった。加えて、Ｈ４６０−１６−２は、確立した生体内腫瘍モデル（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００で概説されるように）で、ＭＢ−２３１細胞に対して抗腫瘍活性を示した。Ｈ４６０−１６−２による処置は比較された標準的化学療法薬（シスプラチン）であった、そして、シスプラチンとＨ４６０−１６−２で投与群がいずれの抗体希釈剤緩衝液もまたはアイソタイプ対照抗体を用いた治療を受ける群と比較して有意により少ない平均の腫瘍容積を有する（ｐ＜０．００１）ことを示された。Ｈ４６０−１６−２で処置はとても重要な（１９．２パーセント）減量（ｐ＜０．００３）と臨床苦痛のない以外シスプラチン化学療法の約３分の２であった腫瘍抑制を調節した。
【００４２】
そして、２つの処置関連死亡を含んだ。そして、シスプラチン処置で観察された。Ｈ４６０−１６−２の抗腫瘍活性とその軽微な毒性は、それに魅力的な抗癌治療薬を作る。後処理期間に、Ｈ４６０−１６−２で群で死亡する危険が＞７０日後処理でアイソタイプ対照抗体群でそれの半分についてであったので、Ｈ４６０−１６−２は重要な延命効果（ｐ＜０．０２）を示した。観察された延命効果は、アイソタイプ対照の１００パーセントと治療をうけているマウスが有したシスプラチンがＨ４６０−１６−２で投与群の６７パーセントと比較して死亡した過去１２０日後処理を続けた。Ｈ４６０−１６−２は、アイソタイプ対照抗体群と比較して、２６パーセント遅延腫瘍増殖によって腫瘍抑制を維持した。３１日後処理で、Ｈ４６０−１６−２はアイソタイプ対照群と比較して４８パーセント還元性の腫瘍増殖によって腫瘍サイズを制限した。そして、それは処置終了後観察される４９パーセントの減少と同等である。乳癌の確立した腫瘍モデルにおいて、これらの結果は処置相を越えて腫瘍抑制を維持するためにＨ４６０−１６−２の可能性を示して、全身腫瘍組織量を減らす抗体の能力を示して、哺乳類で生存を強化する。乳癌の確立した生体内腫瘍モデルの薬効に加えて、化学療法薬（シスプラチン）と結合するＨ４６０−１６−２で処置は、確立した生体内前立腺癌の−３の細胞がモデル化するＰＣに対して、抗腫瘍活性を有した。ペアードｔ−検定、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチン処置を使用することは、バッファ制御（ｐ＜０．０００１）、シスプラチン処置（ｐ＝０．００４）単独またはＨ４６０−１６−２で処置（ｐＯ．ＯＯＯｌ）単独より、治療期間の直後に腫瘍増殖を抑制することにかなり効果的だった。処置相終了後、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンを与えられるマウスは、バッファ制御群のわずか２８．５パーセントに増大した腫瘍を有した。ＰＣ−３  ＳＣＩＤ異種移植モデルのために、体重が疾患進行の代わりの指標として使われることができる。全ての群のマウスは、重篤な減量を経験した。この研究において、全ての群のマウスは、治療期間末までには約２３〜３５パーセントの減量を示した。
【００４３】
Ｈ４６０−１６−２による治療群は、減量（２１．７パーセント）で最も少ない程度を示した。処置（日４８）の後、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンの処置と関係している重要な増量損失が、割にバッファ制御（ｐ＝０．５０４２）になかった。このように、それがヒト前立腺癌の十分確立されたモデルでアイソタイプ対照投与群と比較して腫瘍増殖を遅延させたので、Ｈ４６０−１６−２さらにシスプラチン処置は有効だった。薬物標的としてＨ４６０−１６−２でエピトープを確認するために、正常な人体組織のＨ４６０−１６−２で抗原の発現は、以前決定された（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００）。本研究は、抗ＣＤ４４抗体と比べると広げられた；Ｌｌ  ７８（Ｓ．Ｎ．  １０／６４７，８１８で概説される）のクローンをつくって、ＢＵ７５（本明細書中に概説される）のクローンをつくりなさい。Ｈ４６０−１６−２によるＩＨＣ染色によって、大部分の組織は、不可欠な器官（例えば肝臓、腎臓（管状上皮細胞の縁の染色を除いて）、心臓と肺）の細胞を含むＨ４６０−１６−２で抗原を発現するのに失敗した。組織染色からの結果は、Ｈ４６０−１６−２が種々の細胞型に制限された結合を見せるが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を有することを示した。ＢＵ７５抗体は、類似の染色パターンを示した。しかし、重要な少なくとも１つの違いが、あった；リンパ球の染色は、Ｈ４６０−１６−２まで割にＢＵ７５でより強度だった。Ｈ４６０−１６−２で抗原で、母集団（乳癌患者の間のたとえば〜など）内のその有病率がＨ４６０−１６−２の治療的な使用を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要であると決定している限局化。癌患者から乳房腫瘍でＨ４６０−１６−２で抗原発現に対処するために、５０人の個体乳癌患者からの腫瘍組織試料は、以前Ｈ４６０−１６−２で抗原（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００）の発現のためにスクリーニングされて、Ｌ１７８（Ｓ．Ｎ．  １０／６４７，８１８）と比較してあった。現在の仕事は、Ｈ４６０−１６−２の染色をＢＵ７５と抗Ｈｅｒ２抗体ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較した。本研究の結果は、前の結果と類似していて、７３パーセントの乳房腫瘍組織はＢＵ７５エピトープが陽性の間、６２パーセントの組織標本がＨ４６０−１６−２で抗原のために良い面を染色したことを示した。染色が悪性細胞に制限されたので、患者試料の範囲内のＨ４６０−１６−２の発現は癌細胞のために特異的に見えた。ＢＵ７５が８にしみをつける間、Ｈ４６０−１６−２は乳癌患者から正常組織の１０の試料のうちの４つにしみをつけた。Ｈ４６０−１６−２とＢＵ７５抗原の乳房腫瘍発現は主に悪性細胞の細胞膜に局所化されると思われた。そして、治療のためにＣＤ４４に魅力的な標的を作った。Ｈ４６０−１６−２で発現はホルモン類エストロゲンとプロゲステロンのために受容体の乳房腫瘍発現に基づいてさらに評価された。そして、それは開発、処置と乳房腫瘍の予後において重要な役割を果たす。相互関係は、どちらのエストロゲンもまたはプロゲステロンのためにＨ４６０−１６−２で抗原の発現と受容体の発現の間で明瞭でなかった。腫瘍が基づかれて分析された、それら病期分類する、または癌が進んだ程度��また、Ｈ４６０−１６−２で抗原発現と腫瘍の病期間のはっきりした相互関係が、なかった。同様の結果がＢＵ７５で得られた。ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、Ｈ４６０−１６−２は、Ｈ４６０−１６−２で抗原が陽性だった乳房腫瘍組織標本の５２パーセントが乳癌患者のこれまでに会ったことのない標的にされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２発現が陰性だった完全に異なる染色プロフィールを示した。
【００４４】
染色の強度の違いが、Ｈ４６０−１６−２とＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに正常な乳房組織切片のうちの１つを染色した。さらにＨ４６０−１６−２の潜在的治療上の利益を延長するために、種々のヒト癌組織の範囲内の抗原の周波数と限局化は、以前決定されもし（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００）て、クローンＬ１７８（Ｓ．Ｎ．  １０／６４７，８１８）と比較してもあった。大部分のこれらの腫瘍タイプは、Ｌｌ  ７８抗原が陽性でもあった。ヒト乳房腫瘍組織、Ｈ４６０−１６−２とＬと同様に、１７８の限局化は、腫瘍細胞の膜に起こった。しかし、実質的により多くの膜限局化が、Ｈ４６０−１６−２抗体と比較して、Ｌ  １７８であった。また、Ｈ４６０−１６−２とＬｌ  ７８によってしみをつけられた腫瘍タイプの、組織の４３パーセントは、１７８の抗体にＬで色付けしている高等強度を示した。必ずしも文献からＩＨＣデータで比較に基づいてこの中に示されるＩＨＣデータにマッチするＣＤ４４の形状でなく見える。ＣＤ４４の標準形は、ヒト脳で通常発現される；Ｈ４６０−１６−２で抗原は、そうでない。汎ＣＤ４４アイソフォームに向けられる抗体は、肝臓を染色しない。（Ｋｕｐｐｆｅｒ細胞を含む）、そして、生殖周期の全ての相で、子宮内膜腺を明らかに染色しなさい。Ｈ４６０−１６−２で抗原は、Ｋｕｐｐｆｅｒ細胞の上で明らかにあって、生殖周期の分泌子宮内膜腺の上であるだけである。Ｈ４６０−１６−２で抗原は組織マクロファージの上で明らかにある。また、変異体だけはＶ４／５を形成する。また、Ｖ８／９は随時のマクロファージ染色を示す。抗ＣＤ４４  Ｌ  １７８と現在ＢＵ７５に比較でＨ４６０−１６−２で見られる類似であるが、異なった結合パターンは、Ｈ４６０−１６−２で抗原がＣＤ４４のユニークなエピトープであることを示す。以前に概説される（Ｓ．Ｎ．  １０／６４７，８１８）ように、付加的な生化学データもＨ４６０−１６−２によって認められる抗原がＣＤ４４の形状のうちの１つであることを示した。これは、ＣＤ４４に対して反応性モノクローナル抗体（Ｌ１７８）が免疫沈降によってＨ４６０−１６−２に結合していたタンパク質を同定することを示した研究で支えられた。ウエスタンブロッティング研究も、Ｈ４６０−１６−２によって認識されるＣＤ４４のエピトープがｖ６またはｖｌＯの上でないことを示唆した。Ｈ４６０−１６−２でエピトープも従属する炭水化物と立体構造であることによって特徴づけられたのに、多くの抗ＣＤ４４抗体はＣＤ４４のペプチド部分に向けられる。
【００４５】
これらのＩＨＣと生化学結果は、そのＨ４６０−１６−２で結合をＣＤ４４抗原の変異体に示した。このように、証拠の優越性はＨ４６０−１６−２がＣＤ４４の変異体の上であるユニークな炭水化物従属する立体配置的エピトープの連結反応を通して抗癌効果を調節することを示した。この発明の目的で、モノクローナル抗体で結合にその能力によって特徴づけられる「ＣＤ４４抗原性部位」がハイブリドーマ細胞系Ｈ４６０−１６−２、それの抗原性の結合フラグメントまたはそれの抗体複合体によってコードしたので、前記エピトープは所定である。Ｈ４６０−１６−２の抗癌効果の後でさらに機構を説明するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）結合実験は、実行された。『Ｈ４６０−１６−２の１．８７の（＋／−１．０１）μｇ／ｍＬの平均濃度が、ＨＡ．に最低降下高度−ＭＢ−２３１細胞の５０パーセントの癒着を得ることを要求されたと決定されたこれらの結果は、少なくとも一つには、Ｈ４６０−１６−２がＨＡに結合の原因となって、従って電子逆探装置を通して新脈管形成または腫瘍侵襲性のダウンレギュレーションを通してその抗癌効果を説明していることができたＣＤ４４の上で領域（ｓ）で相互作用することを示した。ＨＡ結合実験に加えて、細胞循環実験は、Ｈ４６０−１６−２で生体外で生体内抗癌効果が細胞周期の調節によったかどうか決定するために実行された。２４時間後に、そして、Ｈ４６０−１６−２の２０のμｇ／ｍＬで、最低降下高度−ＭＢ−２３１プログラム死細胞の数の増加が、割にアイソタイプ対照にあった。この効果も、従属する投与量であると思われた。したがって、Ｈ４６０−１６−２の有効性は、そのプログラム死誘導している能力に対する与えられべきもの（全体または一部の）でもあるかもしれない。全体として、このデータは、Ｈ４６０−１６−２で抗原が癌関連抗原であって、ヒトで発現されて、病的関連した癌標的であることを証明する。さらに、このデータもＨ４６０−１６−２で抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断に役立つことがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえるアッセイのために、適切に使われることができる。加えて、この抗原の細胞膜限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の発現の欠如による細胞の癌状態で表示、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質またはその変異体の使用が診断に役立つことがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえるアッセイのために使われることができる。他の研究は、抗ＣＤ４４抗体の使用を含んで、Ｈ４６０−１６−２によって示されない治療的な可能性の限定を有する。
【００４６】
Ｈ４６０−１６−２は、生体外で生体内抗腫瘍活性を示す。前述した抗体はそのようなＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２である、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３とＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６はそれらのものとされる生体外であるか生体内細胞障害性とＶＦＦ−１８を有しない、そして、ＭａｂＵ３６は固有の腫瘍細胞障害性を示さない。加えて、示された生体内腫瘍効果も有する他の抗ＣＤ４４抗体は、Ｈ４６０−１６−２で明白でないある種の限界を有する。例えば、ＡＳＭＬｌ．１、Ｋ９２６、抗ＣＤ４４ｓとＩＭ−７８．１は、それぞれ異種移植モデルで大きくなるラット、マウス、ラットとマウスの腫瘍に対して生体内抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト癌のモデルで、抗腫瘍活性を示す。ＡＳＭＬ１．１のような抗体がラットＣＤ４４だけを認識する間、Ｈ４６０−１６−２はヒトＣＤ４４にも向けられる。クローン５１５抗ＣＤ４４抗体は、人間の卵巣の細胞系の腹膜腫瘍移植を阻害するが、腫瘍増殖を予防しないか、阻害する。
【００４７】
Ｈ４６０−１６−２は、重症複合性免疫不全マウス異種移植モデルでヒト乳房腫瘍増殖を阻害することができる。ＧＫＷ  ．Ａ３は、中でマウスで大きくなる人間の転移性の黒色腫の腫瘍増殖を阻害することができる抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体である予防的確立したモデルでない以外の。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト乳癌の予防的で確立したマウスの異種移植モデルで、示された重要な抗腫瘍活性を有する。従って、Ｈ４６０−１６−２が前述した抗ＣＤ４４抗体に割に優れた抗腫瘍特性を有することは、全く明瞭である。それは重篤複合免疫不全マウスでヒト乳房腫瘍に関して示された生体外で生体内抗腫瘍活性を有して、ヒトＣＤ４４に向けられる。それもヒト乳癌の予防的で確立した（より臨床的に関連する）モデルで活性を示す、そして、それはヒト前立腺癌の確立したモデルでシスプラチンで活性を示す。全部で、この発明は、治療薬のために標的としてＨ４６０−１６−２で抗原の使用を教える。その投与される、哺乳類（このように遅延疾患進行）で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができて、そして、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできる。この発明もＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−１６−２で）とその誘導体の使用を教える。また、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らして、この抗原を発現する腫瘍を運んでいる哺乳類の生存を延長するためにその抗原を標的にする。加えて、この発明は、その抗原に対する結合の後、Ｈ４６０−１６−２はヒアルロン酸で相互作用する癌細胞の能力に干渉することができて、癌細胞がアポトーシスを受ける原因になることもありえることを教える。
【００４８】
さらにまた、この発明も、診断のために有用でありえる癌細胞でＨ４６０−１６−２で抗原を検出する効果、治療の予測とこの抗原を発現する腫瘍を運んでいる哺乳類の予後を教える。患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が出現する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者から得られる赤血球に抱合されることができて、転移の処置のために再注入されることができる。ほとんど効果的処置が転移癌のためになかった、そして、転移は通常、死に帰着している転帰不良を予告する。しかし、転移癌は通常ウェル血管化のである。また、赤血球による抗癌抗体の送達は腫瘍の部位で抗体に集中する効果を有することができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している。また、赤血球に抱合される抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合されることができる。また、Ｔｈｅｒｅは抗体の５つのクラスである。また、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を通して調節されると通常、思われる。例えば、マウスのマクログロブリンとＩｇＧ２ａ抗体は、結合によってヒト補体を活性化させることができるそれによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を活性化させている補体系のＣＩ構成要素。ヒト抗体のために、最も効果的補体活性化させている抗体は、通常、マクログロブリンとＩｇＧｌである。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウスの抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球とある種のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプタを有する細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧｌとＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣを調節する。抗体調節された癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連糖タンパク質または糖脂質で（いわゆる触媒抗体）種々の化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりあることができる。より広く認められる抗体調節された癌細胞殺害のさらに２つの機構が、ある。第一は、癌細胞にある推定上抗原に対して免疫反応を生産するために身体を誘発するワクチンとしての抗体の使用である。事実上その機能が失われるように、第２は増殖受容体を標的にして、それらの機能に干渉するか、減少してその受容体を調整する抗体の使用である。したがって、方法を同時に、それについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされるハイブリドーマ細胞系と対応する単離した単クローン抗体と抗原結合フラグメントを単離するために、非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関する細胞障害性である特定の個体に由来する細胞から癌疾患修飾抗体を生産することのために利用することは、本発明の目的である。単離したモノクローナル抗体を利用する方法を教えることは本発明の更なる目的である、または、それの抗原結合フラグメントは特に単離したモノクローナル抗体に対する結合またはそれの抗原結合フラグメントがＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードしたＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞の存在を決定するためにＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードした。単離したモノクローナル抗体の使用を経て癌疾患を有している患者の生存を強化する方法を教えることはまだ本発明の更なる目的である、または、それの抗原結合フラグメントはＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣで寄託されたクローンによってコードした、そしてそれは、抗体が特にＣＤ４４抗原性部位に対する結合である。それは、ＣＤＭＡＢを教える本発明とそれの抗原結合フラグメントの更なる目的である。細胞障害性がＡＤＣＣを通して調節されるＣＤＭＡＢを生産することは、本発明の更なる目的である。細胞障害性がＣＤＣを通して調節されるＣＤＭＡＢを生産することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞障害性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるＣＤＭＡＢを生産することは、まだ本発明の更なる目的である。本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合実験で有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。この発明の他の目的と長所は、そこで以下の説明から明らかになる、
【００４９】
（図面の説明）
図および実施例（この発明のいくつかの実施形態）のために、述べる。特許または帯出者登録簿が色で仕上げられる最低１つの図面で含む図面の簡単な説明。この特許のコピーまたはカラー図面による特許出願刊行は、要請と必要な料金の支払いに応じて局によって提供される。
図１は、正常な人体組織アレイから扁桃の組織切片の上でＨ４６０−１６−２で（Ａ）と抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）で得られる結合パターンを示している代表的な顕微鏡写真器。Ｈ４６０−１６−２でより厳しくて広く分散リンパ球の染色が、ＢＵ７５である。芽中心（緑の矢）は、両方の抗体のためにより弱い染色を有した。拡大は、２００Ｘである。
図２は、乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）に対するＨ４６０−１６−２で結合の代表的な顕微鏡写真器。パネルの黄色とオレンジ矢は、それぞれ悪性細胞の間質細胞とシートを示している。拡大は、１０ＯＸである。
図３は、ヒト乳癌組織アレイからｐａｇｅｔの疾患乳房組織切片の上でＨ４６０−１６−２で（Ａ）と抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）で得られる結合パターンを示している代表的な顕微鏡写真器。ＢＵ７５による悪性細胞対Ｈ４６０−１６−２によるネガティブ染色の膜状の染色が、ある。拡大は、４００Ｘである。
図４は、ヒト乳癌組織アレイから乳房組織切片から髄様癌に関してＨ４６０−１６−２で（Ａ）と抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる結合パターンを示している代表的な顕微鏡写真器。Ｈ４６０−１６−２による悪性細胞対抗Ｈｅｒ２によるネガティブ染色の強い膜状の染色が、ある。拡大は、２００Ｘである。
図５は、確立したＰＣ−３前立腺癌モデルの腫瘍増殖のＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２で＋シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図６は、確立したＰＣ−３前立腺癌モデルの体重のＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２で＋シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
図７は、ヒアルロン酸（ＨＡ）に対する最低降下高度−ＭＢ−２３１乳癌細胞結合のＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（正の制御）またはアイソタイプ対照の効果。
図８は、Ｈ４６０−１６−２の効果または２４の時間の間の最低降下高度−ＭＢ−２３１細胞後処理の細胞周期分布のアイソタイプ対照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
実施例１
ハイブリドーマ細胞系Ｈ４６０−１６−２を寄託番番号ＰＴＡ−４６２１として２００２年９月４日の２０１１０−２２０９米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209 on November 11, 2003）にブダペスト条約に従って寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。
【００５１】
抗体産生：Ｈ４６０−１６−２でモノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度／週でハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）で培養することによって生産された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）で、標準の抗体精製手順によって精製された。人間であるか、ヒト化またはキメラ化されたか、マウスの抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、この発明の範囲内である。
【００５２】
２つのＮｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ＩＨＣ研究がヒト（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００）で、そして、Ｌ１７８（Ｓ．Ｎ．  １０／６４７，８１８）に対する比較でＨ４６０−１６−２で抗原分布を特徴づけるために伝導されて以前にあった実施例。以前に生化学方法で測定されるにつれてＨ４６０−１６−２で抗原がＣＤ４４の癌変異体であることができる時から、現在の研究はＨ４６０−１６−２をＣＤ４４（ＢＵ７５）に向けられるもう一つの抗体と比較する。５９の正常な人体組織に対する抗体の結合は、人間の正常な器官組織アレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ、癌腫）を使用して実行された。全ての主要な抗体（Ｈ４６０−１６−２；ＢＵ７５抗ＣＤ４４（ＢＩＯＣＡＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ミシソーガ、ＯＮ）；そして、マウスＩｇＧｉ負の対照（ダコ、トロント、ＯＮ））、５つのμｇ／ｍｌ（前の最適化ステップの最適濃度であることを分かる）の濃度に、抗体希釈剤緩衝液（ダコ、トロント、ＯＮ）で希釈された。負の対照抗体は、製造業者によって全ての哺乳類の組織に負であることが示された。ＩＨＣの手続きは、以下の通りである。切片が１時間の間５８℃で乾燥器で乾燥してｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄされて、コプリンのそれぞれ４分の間５回をキシレンに浸漬することによってｄｅｗａｘｅｄした組織は、揺れる。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％−７５％）を通しての処置の後で、切片は水の中で再水和された。スライドはそれからそれぞれ５分の間高さ、培地と低い推力設定で電子レンジで調理されるｐＨ  ６（ダコ、トロント、オンタリオ）で１０ｍＭのクエン酸の緩衝液に没頭していて、最終的に冷たいＰＢＳに没頭していた。スライドはそれから６分の間３パーセントの過酸化水素水に没頭していた。そして、それぞれ５分の間３回、ＰＢＳで洗われて、乾燥して、室温で５分のＵｎｉｖｅｒｓａｌ遮断溶液（ダコ、トロント、オンタリオ）でインキュベートされた。Ｈ４６０−１６−２、ＢＵ７５またはアイソタイプ対照抗体（黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼの方へ、指令するありもしなく哺乳類の組織で誘導性でもない、酵素）は、その働く濃度（各々の抗体のための５つのμｇ／ｍＬ）に抗体希釈剤緩衝液（ダコ、トロント、オンタリオ）で希釈されて、室温で１時間の間インキュベートされた。スライドをＰＢＳそれぞれ５分の間の３回で洗浄した。室温で３０分に供給される（ダコＥｎｖｉｓｉｏｎシステム、トロント、オンタリオ）につれて、主要な抗体の免疫活性は西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体で検出して／視覚化した。これがスライドに段をつけることになることをＰＢＳそれぞれ５分と室温で１０分の間免疫ペルオキシダーゼ染色のＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジンｔｅｔｒａｈｙｄｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ、ダコ、トロント、オンタリオ）色原体基質解決を加えることによって出現される呈色反応のための３回で洗浄した。スライドを水道水で洗うことは、色素反応を終了した。マイヤーのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（シグマＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）による対比染色の後で、滑り面は段階的なエタノール（７５−１００％）でｄｅｈｙｒｄａｔｅｄされ���、キシレンで掃除された。マウンティング培地（ダコＦａｒａｍｏｕｎｔ、トロント、オンタリオ）を使用して、スライドはカバースリップされた。
【００５３】
スライドは、ノーザンブロットのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ミシソーガ、ＯＮ）を使用して、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（ツァイス・カナダ、トロント、ＯＮ）とディジタル画像を取得して貯蔵型に扱って、顕微鏡的に検討された。結果は読み込まれて、勝ち取られて、病理学者によって解釈された。表１はＨ４６０−１６−２とＢＵ７５  ａｎｔｉ−の結果の概要を示す。そして、ＣＤ４４が正常な人体組織のアレイの染色される。Ｈ４６０−１６−２による組織の染色は、以前に記載され（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００）てそれと類似している。抗原が通常、肝臓、腎臓、心臓と肺を含む不可欠な器官で細胞の上でない点に再び注意されなければならない。Ｈ４６０−１６−２で抗体はマクロファージとリンパ球に結合をする。また、それらの存在はこれらの切片で器官の一部で観察される。しかし、ＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体（図１）で見られるリンパ球の染色の高等強度が、あった。Ｈ４６０−１６−２が陽性だった組織は、通常ＢＵ７５抗ＣＤ４４（時々より大きな強度に）が陽性でもあった。食道とリンパ節の１つの試料のような２、３の例外があるが、Ｈ４６０−１６−２が陰性だった組織は通常、ＢＵ７５抗ＣＤ４４が陰性でもあった。これらの結果はそのＨ４６０−１６−２で結合をＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体によって認められる組織のより小さいサブセットに示す、そして、組織の範囲内で、染色の強度は時々より少なくもある。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２のための抗原が正常組織（まったく特にヒトの限定された数の組織に対する抗体結合）の上で広く発現されないことを示す。Ｈ４６０−が１６−２でＣＤ４４（すなわちこれらのＩＨＣ研究のために使用されるＢＵ７５によって認められるものより異なる変異体）のエピトープに向けられるという点で、それも生化学データを支持する。
【００５４】
【表１】
2007530456.tif 000002
【００５５】
実施例３
ヒト乳癌腫瘍染色  
【００５６】
以前のＩＨＣ研究がヒト乳癌に対して行われ、Ｈ４６０−１６−２で抗原の癌共同を決定することを引き受ける。また、Ｈ４６０−１６−２で抗体がヒト癌（Ｓ．Ｎ．  １０／６０３，０００）と方法を認めるために可能性があったかどうかに関係なく、それはＬ１７８（Ｓ．Ｎ．  １０／６４７，８１８）で抗ＣＤ４４染色に比較した。現在では、比較はＢＵ７５抗ＣＤ４４染色（黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼに向けられるｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２と抗体）のために、哺乳類の組織（負の対照）で誘導性どちらのあるｎｏｒ−でもない酵素とされた。乳癌組織アレイは５０人の乳癌患者に由来した、そして、乳癌患者で非腫瘍性の乳房組織に由来する１０の試料が使われた（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、癌腫）。以下の情報は、各々の患者に提供された：年齢（Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）腫瘍の病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）とプロゲステロン受容体（ＰＲ）状態に関する性的、アメリカのＪｏｉｎｔ委員会）。実施例５からのＩＨＣの手続きは、従われた。全ての抗体が、１．５のμｇ／ｍＬの濃度で使われた抗Ｈｅｒ２を除いて、５つのμｇ／ｍＬの働く濃度で使われた。表２と３は、それぞれＨ４６０−１６−２の概要と乳癌組織アレイのＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体染色を提供する。各々のアレイは、５０人の個体患者から腫瘍試料を含んだ。全体として、試験される５０人の患者の６２パーセントは、ＢＵ７５  ａｎｔｉ−ＣＤ４４のために７３パーセントと比較してＨ４６０−１６−２で抗原が陽性だった。Ｈ４６０−１６−２とＢＵ７５抗ＣＤ４４が同じ組織を染色したケースにおいて、試料の４５パーセントは、Ｈ４６０−１６−２まで割にＢＵ７５抗ＣＤ４４で染色している高等強度を有した。Ｈ４６０−１６−２とＢＵ７５抗原のために、それぞれ、乳癌患者からの１０の正常な乳房組織試料からの４と８は、陽性だった。エストロゲンとプロゲステロン受容体状態間のはっきりした相互関係は、明白でなかった。それも、Ｈ４６０−１６−２のより大きな陽性発現と高等腫瘍の病期によるＣＤ４４抗原に向かう傾向であると思われなかった。
【００５７】
【表２】
2007530456.tif 000003
【００５８】
【表３】
2007530456.tif 000004
【００５９】
支質細胞が明らかに悪性細胞がネガティブであり、シードであった図２で、非常に陽性のことを証明した。Ｈ４６０−１６−２で抗原で見られる細胞局在パターンは、ｍａｊｏｒｉｔｙｏｆケースで細胞膜に限定された。ＢＵ７５  ＣＤ４４抗体はより多くの乳癌試料を染色して、Ｈ４６０−１６−２（表４）と比較した細胞質の限局化より高い膜の程度を示した。ＢＵ７５抗ＣＤ４４もページェット病の悪性細胞にしみをつけた。そして、それはＨ４６０−１６−２（図３）のために本当でなかった。Ｈ４６０−１６−２で染色が陽性だった正常組織由来乳癌患者の試料は、ＢＵ７５抗ＣＤ４４染色に対してもポジティブでもあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、Ｈ４６０−１６−２は、Ｈ４６０−１６−２で抗原のために陽性であるとする３１の乳房腫瘍組織標本からの１６が会ったことのないが乳癌患者（５を表に記入しなさい、図４）の治療的な必要を標的にしたことを示しているＨｅｒ２発現が陰性だった完全に差染色しているプロフィールを示した。染色の強度の違いが、Ｈ４６０−１６−２とＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった；Ｈ４６０−１６−２で抗原が非常に陽性だった若干の乳房腫瘍組織切片は、Ｈ４６０−１６−２が乳癌患者の異なる一団を治療的標的にすることを再び示しているＨｅｒ２とその逆が少し陽性であるだけだった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに正常な乳房組織切片のうちの１つを染色した。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２のための抗原が乳癌患者のほぼ３分の２によって発現されることができることを示唆する。加えて、Ｈ４６０−１６−２で処置のために適当なそれらの大多数は、抗Ｈｅｒ２処置のために適当でなかった。染色パターンは患者試料で、抗体が悪性細胞のために非常に特異的であることを示した、そして、Ｈ４６０−１６−２で抗原はそれによってそれに魅力的なｄｒｕｇａｂｌｅな標的を作っている細胞膜に局所化される。類似的である。Ｈ４６０−１６−２のより限られた染色対ＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体が再びＨ４６０−１６−２でエピトープの可能性を示す、ＣＤ４４のより制限された変異体である。
【００６０】
【表４】
2007530456.tif 000005
【００６１】
【表５】
2007530456.tif 000006
乳房組織
【００６２】
実施例４
生体内ＰＣ−３確立化学療法組み合わせ腫瘍実験
図５および図６を参照すると、８週間目の雄の重篤複合免疫不全マウスに対する６、６、襟首で皮下に注射される１００マイクロリットルの生理食塩水で、１００万のＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞で入れられた。腫瘍増殖は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが２１日ポスト移植で８０のｍｍ３（範囲５０−１３０  ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。Ｈ４６０−１６−２で抗体、化学療法薬シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ希釈剤で、標準的な濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１５または６ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内投与された。Ｈ４６０−１６−２またはバッファ制御は、それから、移植後日４１まで同じ様式で全体で１１の投与量のために１週につき３回が続く第１の週の間、１週につき４回投与された。シスプラチンは、抗体治療期間の日０、５、１０と１５に投与された。腫瘍増殖は移植後日４８までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定された、または、個体までは、動物はＣＣＡＣ終点に着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。ペアードｔ−検定を使用して、処置と関係している後処理全身腫瘍組織量減少（図５）が、いずれのシスプラチンもまたはＨ４６０−１６−２とシスプラチンの組合せであった。日４８（７日後処理）で２つの処置がバッファ制御（ｐＯ．ＯＯＯｌ）、シスプラチン処置（ｐ＝０．００４）単独またはＨ４６０−１６−２で処置（ｐＯ．ＯＯＯｌ）単独より治療期間の直後に腫瘍増殖を抑制してよりかなり効果的だったシスプラチンとＨ４６０−１６−。ＰＣ−３は前立腺癌の悪液質モデルである。そこにおいて、異種移植モデルの増加した全身腫瘍組織量と疾患進行には減量が付いてくる。図６で示される平均重量によって示されるにつれて、全ての群のマウスは重篤な減量を経験した。この研究において、全ての群のマウスは、治療期間末までには約２３〜３５パーセントの減量を示した。Ｈ４６０−１６−２による治療群は、減量（２１．７パーセント）で最も少ない程度を示した。処置の末端の直後に、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチン処置と関係している体重の追加重要な損失が、割にバッファ制御（ｐ＝０．５０４２）になかった。したがって、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンは、ヒト乳癌疾患のよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。これらの結果は、人を含む哺乳類で、癌治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を示唆する。
【００６３】
実施例５
ヒアルロン酸（ＨＡ）結合アッセイ
最低降下高度−ＭＢ−２３１の細胞（以前、ＦＡＣＳ分析によってＨ４６０−１６−２で抗原（ＣＤ４４）を発現することが示される）がそうであった実施例５は組織培養皿から使いきった培地を吸引した後に分離した。そして、細胞が分離するまで、ＰＢＳでプレートを洗って、５ｍＬの解離緩衝液を各々のプレートに加えて、３７℃でプレートをインキュベートした。細胞は、それから計数されて、５０ｍＬの管（ｓ）に集められた。細胞は５分の間１２００ｒｐｍで回転して、１００万〜５００万のｃｅｌｌｓ／ｍＬを産生するために、培地で再懸濁された。１ｍＬは、それから２ｍＬのディープウェルの各々のウェルに加えられた。細胞は５分の間１２００ｒｐｍでプレートを回転させることによって小球をぶつけられた、そして、過剰な上澄みはペーパータオル上へプレートを逆にすることによって除去された。ディープウェル・プレートは、それから、細胞ペレットを除去して、分解するために、穏やかにボルテックスされた。１ｍＬのＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（正の制御、ＢＩＯＣＡＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ミシソーガ、ＯＮ）またはアイソタイプ負の対照（１０７．３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）抗体は、各々のウェルに加えられて、それから穏やかなｖｏｒｔｅｘｉｎｇによって混合された。プレートは、それから２時間３７℃でインキュベートされた。一方、４８−ウェル・プレートは、３７℃で１−２時間の間４ｍｇの／ｎｉＬ  ＨＡ原液／ウェルの３００のμｌをインキュベートすることによって、ＨＡでおおわれていた。インキュベーションの後、過剰なＨＡは離れて吸引された、そして、プレート（ｓ）は層流で完全にフードを空気乾燥させておかれた。抗体−細胞インキュベーションが完了状態であったあと、細胞はＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔがペーパータオルの上でディープウェルを逆にして除去された５分の間１２００ｒｐｍで再び小球をぶつけられた。各々のウェルに、塩化マグネシウムと塩化カルシウムを含んでいるＰＢＳで、ディープウェルは２つのμＭ  ｃａｌｃｅｉｎ−ａｍの１．２ｍＬの追加が続く細胞ペレットを解離させるために、再びボルテックスされた。細胞は再懸濁された、そして、２５０μｌ／ウェルはＨＡおおわれているプレートに転写された。ＨＡ被覆プレートは、それから、癒着を許すために、２時間の間３７℃でインキュベートされた。インキュベーションの後、独立の細胞は、吸引を通して取り出された。各々のウェルは、それから、いかなる独立の細胞でもまたは細胞集団を除去するために塩化マグネシウムと塩化カルシウムを含んでいるＰＢＳで、２−３回洗われた。プレートはパーキン−エルマーＨＴＳ７０００蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで分析された、そして、結果は表６または図７で表化された。平均６つの別々の実験からの結果は、Ｈ４６０−１６−２の平均１．８７の（＋／−１．０１）μｇ／ｍＬがＨＡ（表６）に最低降下高度−ＭＢ−２３１細胞の結合の５０パーセントの減少を引き起こすために必要なことを明らかにした。ＨＡに対する最低降下高度−ＭＢ−２３１細胞結合のＨ４６０−１６−２の効果は、従属する投与量であった；Ｈ４６０−１６−２の２０のμｇ／ｍＬは、ＨＡ（図７）に、細胞結合の６０パーセントの減少についてのに帰着した。これらの結果は、少なくとも一つには、Ｈ４６０−１６−２がＨＡに結合の原因となって、従って電子逆探装置を通して新脈管形成または腫瘍侵襲性のダウンレギュレーションを通してその抗癌効果を説明していることができたＣＤ４４の上で領域（ｓ）で相互作用することを示した。
【００６４】
【表６】
2007530456.tif 000007
【００６５】
実施例６
細胞周期アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞周期に対するＨ４６０−１６−２の効果を、ＦＡＣＳ分析を使用することを評価した。Ｈ４６０−１６−２で抗体（０、０．２、２．０、２０μｇ／ｍＬ）またはアイソタイプ対照（クローン１０７．３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）は、２４、４８と７２時間、最低降下高度−ＭＢ−２３１乳癌細胞でインキュベートされた。治療を受けて未処置の細胞はヨウ化プロピジウムでけがされた、そして、単細胞は相対的なＤＮＡ含有量を評価するためにフローサイトメトリによって分析された。低二倍体染色を示している細胞と同様に単細胞母集団のゲーティングによって、取得したデータ・セットは、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔを使用して分析された。この分析の後、２４時間の間１６−２でＨ４６０−で処置される細胞は、下位Ｇｉ母集団の投与量従属する増加と同様に循環細胞のパーセンテージの全体の減少を示した。下位Ｇｉ母集団の中に現れた細胞は、細胞膜完全性の損失による失われたＤＮＡを有して、プログラム死細胞集団（図８）を表すことができる細胞である。このデータは、Ｈ４６０−１６−２が細胞循環とこの効果がプログラム死細胞の数の投与量従属する増加にもたらした最低降下高度−ＭＢ−２３１に影響を及ぼすことを証明した。図中証拠の優越性は、ＨＡに対するＣＤ４４のＨ４６０−１６−２が炭水化物従属する立体配置的エピトープの連結反応を通しての効果がＣＤ４４の変異体の上で提示する。また、このエピトープが結合に少なくとも部分的に関係している抗癌を調節することをである。このエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合が対応する細胞の上でアポトーシスに導くことができるという証拠も、ある。Ｓ．Ｎ．  １０／７１３，４５１で、抗体が同族の抗原を最低降下高度−ＭＢ−２３１細胞のような細胞を発現することから免疫沈降させるのに用いられることができることをＨ４６０−１６−２に明らかにされた。それに対して、実例を示されるが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ．に限られていない技術を利用して、さらに、Ｈ４６０−１６−２で抗体がＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。どの特に結合このように、免疫沈降されたＨ４６０−１６−２で抗原がそのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣアッセイを使用しているそのような細胞または組織にＨ４６０−１６−２の結合を阻害することができることを示されることができた。さらに、Ｈ４６０−１６−２で抗体と同様に、他の抗ＣＤ４４抗体は他の型のＣＤ４４抗原を免疫沈降して、単離するのに用いられることができた、そして、抗原はアッセイの同一形式を使用している抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。ＣＤ４４（すなわち汎ＣＤ４４抗体）の全ての形状を認める抗ＣＤ４４抗体がその同族の抗原を単離するのに用いられる場合、その抗原がその抗原を発現する細胞または組織にＨ４６０−１６−２で抗原の結合を阻害することもできることを示されることもできた。そして、このようにまた、その抗原を発現している細胞および組織の上でＨ４６０−１６−２の結合をＣＤ４４���エピトープに示した。あるいは、Ｈ４６０−１６−２の比較と競合結合測定のようなアッセイの汎ＣＤ４４抗体。ＥＬＩＳＡ、細胞ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳまたはその種の他のもの両方の抗体があるところその抗原を発現している細胞および組織のＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合を示すこともできる。
【００６６】
この明細書で言及される全ての特許と刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルで表示。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって本明細書中に組み込まれる。本発明のある種の形状が例示される間、それが本明細書中に記載される部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。種々の変化が本発明の範囲から逸脱することなくなされることができることは当業者にとって明らかである。また、本発明は示されて、明細書で記載されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、本発明が物体を実行して、言及される末端と利点を得るのに適しているウェル（その中で固有のそれらと同様に）であると容易に認める。本明細書中に記載されるいかなるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、本発明の精神の範囲内で含まれて、添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。本発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその本発明請求する。そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである搬出本発明のための描かれたモードの種々の修飾は、以下の請求の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】正常な人体組織アレイから扁桃の組織切片の上でＨ４６０−１６−２で（Ａ）と抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）で得られる結合パターンを示している代表的な顕微鏡写真器。Ｈ４６０−１６−２でより厳しくて広く分散リンパ球の染色が、ＢＵ７５である。芽中心（緑の矢）は、両方の抗体のためにより弱い染色を有した。拡大は、２００Ｘである。
【図２】乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）に対するＨ４６０−１６−２で結合の代表的な顕微鏡写真器。パネルの黄色とオレンジ矢は、それぞれ悪性細胞の間質細胞とシートを示している。拡大は、１０ＯＸである。
【図３】ヒト乳癌組織アレイからｐａｇｅｔの疾患乳房組織切片の上でＨ４６０−１６−２で（Ａ）と抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）で得られる結合パターンを示している代表的な顕微鏡写真器。ＢＵ７５による悪性細胞対Ｈ４６０−１６−２によるネガティブ染色の膜状の染色が、ある。拡大は、４００Ｘである。
【図４】ヒト乳癌組織アレイから乳房組織切片から髄様癌に関してＨ４６０−１６−２で（Ａ）と抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる結合パターンを示している代表的な顕微鏡写真器。Ｈ４６０−１６−２による悪性細胞対抗Ｈｅｒ２によるネガティブ染色の強い膜状の染色が、ある。拡大は、２００Ｘである。
【図５】確立したＰＣ−３前立腺癌モデルの腫瘍増殖のＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２で＋シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図６】確立したＰＣ−３前立腺癌モデルの体重のＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２で＋シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【図７】ヒアルロン酸（ＨＡ）に対する最低降下高度−ＭＢ−２３１乳癌細胞結合のＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（正の制御）またはアイソタイプ対照の効果。
【図８】Ｈ４６０−１６−２の効果または２４の時間の間の最低降下高度−ＭＢ−２３１細胞後処理の細胞周期分布のアイソタイプ対照。
【図１】
2007530456.tif 000008
【図２】
2007530456.tif 000009
【図３】
2007530456.tif 000010
【図４】
2007530456.tif 000011
【図５】
2007530456.tif 000012
【図６】
2007530456.tif 000013
【図７】
2007530456.tif 000014
【図８】
2007530456.tif 000015
【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年4月16日(2007.4.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患を患っている患者を処置する方法であって、
前記患者に対して、癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産方法に基づいて生産され、癌組織の細胞に対する細胞障害性を示すとともに非癌細胞に対しては本来障害性を持たないという性質を持つ抗癌抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、  
前記抗体またはそのフラグメントが、医薬的に許容されるアジュバントとの混合状態に置かれて、前記癌疾患の処置を調節するのに有効な量で投与され、
前記抗体が、前記癌組織によって発現される抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部位が、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体によって結合しているという性質を持つ、癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されている、請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項３】
請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法であって、  前記抗体またはその抗原結合フラグメントを毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞からなる選択される構成要素と生存率を高める、および／または疾患進行を遅らせる方法することで抗体複合体を形成すること、ならびに
前記患者に前記抗体複合体またはその複合化フラグメントを投与することを含み、
前記抗体複合体またはその複合化フラグメントが、医薬的に許容されるアジュバントとの混合状態に置かれるとともに、前記癌疾患の処置を調節するのに有効な量で投与される、請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化している、請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項５】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が抗体依存型細胞障害性を介して調節される請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項６】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が補体依存型細胞障害性を介して調節される請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項７】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が細胞化学結合の加水分解を触媒することを介して調節される請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項８】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が、腫瘍細胞に存在する推定癌抗原に対して免疫反応を生産することを介して調節される請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項９】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が、それらの機能に干渉する細胞膜タンパク質を標的化することを介して調節される請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１０】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性は、細胞殺害を開始させるシグナルの生成に有効な細胞タンパク質で構造的変化を生じさせることを介して調節される請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１１】
前記生産方法が、特定の個体から得られる癌および非癌細胞を含む組織試料を利用する請求項１記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１２】
癌疾患を患っている患者を処置する方法であって、
前記患者に対して、癌疾患の処置に有用である抗癌抗体の生産方法に基づいて生産され、癌組織の細胞に対する細胞障害性を示すとともに非癌細胞に対しては本来障害性を持たないという性質を持つ抗癌抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
前記抗体が、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによって単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、医薬的に許容されるアジュバントとの混合状態に置かれるとともに、前記癌疾患の処置を調節するのに有効な量で投与される癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１３】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１４】
前記抗体またはそのフラグメントを、毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞からなる群から選択される構成要素と生存率を高める、および／または疾患進行を遅らせる方法することで抗体複合体を形成すること、ならびに
前記抗体複合体またはその複合化フラグメントを前記患者に投与することを含み、
前記複合化された抗体が、医薬的に許容されるアジュバントとの混合状態に置かれるとともに、前記癌疾患の処置を調節するのに有効な量で投与される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１５】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化されているサブセットから選択される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１６】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が抗体依存型細胞障害性を介して調節される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１７】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が補体依存型細胞障害性を介して調節される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１８】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が細胞化学結合の加水分解を触媒することを介して調節される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項１９】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が、腫瘍細胞に存在する推定癌抗原に対して免疫反応を生産することを介して調節される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２０】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性が、それらの機能に干渉する細胞膜タンパク質を標的化することを介して調節される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントの細胞障害性は、細胞殺害を開始させるシグナルの生成に有効な細胞タンパク質で構造的変化を生じさせることを介して調節される請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２２】
前記生産方法が、特定の個体から得られる癌および非癌細胞を含む組織試料を利用する請求項１２記載の癌疾患を患っている患者を処置する方法。
【請求項２３】
細胞表面の上でＣＤ４４抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞障害性を調節する方法であって、
前記腫瘍細胞を、前記発現されたＣＤ４４抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって前記抗原部位がＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合することで特徴づけられる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、接触させることを含み、  
細胞障害性が前記結合の結果として生ずる、細胞表面上のＣＤ４４抗原性部位を発現するヒト腫瘍細胞の細胞障害性を調節するプロセス。
【請求項２４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化している請求項２３記載のプロセス。
【請求項２５】
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞からなる選択される構成要素と生存率を高める、および／または疾患進行を遅らせる方法することで抗体複合体を形成する請求項２３記載のプロセス。
【請求項２６】
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化されている請求項２３記載のプロセス。
【請求項２７】
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスである請求項２３記載のプロセス。
【請求項２８】
ヒト腫瘍組織試料が大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織に発生する腫瘍から得られる請求項２３記載のプロセス。
【請求項２９】
ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞の存在を測定する結合アッセイであって、
細胞試料を提供すること、
前記発現されたＣＤ４４抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原部位がＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合することで特徴づけられる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供すること、
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させること、
前記単離されたものモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記試料との結合を測定すること、を含み、
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＣＤ４４抗原部位を発現する細胞の存在を測定する結合アッセイ。
【請求項３０】
前記細胞試料が大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織に発生する腫瘍から得られる請求項２９記載のプロセス。
【請求項３１】
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原フラグメントに対して特異的に結合し、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合することで特徴づけられるＣＤ４４抗原部位を発現する試料に含まれる細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、
細胞試料を提供すること、
前記発現されたＣＤ４４抗原性部位に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原部位がＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合することで特徴づけられる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供すること、
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させること、
前記単離されたものモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記試料との結合を測定すること、を含み、
ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ４４抗原部位を発現する前記細胞が、前記結合によって単離され、前記細胞試料での該細胞の存在が確認される、細胞を単離またはスクリーニングの方法。
【請求項３２】
前記細胞試料が大腸、卵巣、肺、前立腺、および乳房組織からなる群から選択される組織に発生する腫瘍から得られる請求項３１記載のプロセス。
【請求項３３】
寄託番号ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の同定された特徴を持つモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するほ乳類のヒト腫瘍を処置することで、生存率を高めるとともに／または疾患進行を遅らせる方法であって、
前記ほ乳類の腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の前記モノクローナル抗体を前記ほ乳類に投与することを含み、それによって疾患の進行が遅くなり、および／または生存率が高くなる、生存率を高めるとともに／または疾患進行を遅らせる方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞障害性部位と複合化する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞障害性部位が放射性同位元素である請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を活性化させる請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存型細胞障害作用を調節する請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウスの抗体である請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項３３記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】    明細書
【発明の名称】  ＣＤ４４表面発現を示している細胞の細胞障害性調節
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患の診断および処置、詳しくは腫瘍細胞の細胞障害性の調節（mediation）、および最も詳しくは細胞障害性反応を引き起こすための手段としての癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用（一種類以上の化学療法剤と任意に併用させた状態で）に関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球に対するモノクローナル抗体の産生は、ＣＤ４４抗原の発見をもたらした。このＣＤ４４抗原は、単鎖のヒアルロン酸（ＨＡ）結合糖タンパク質であり、広範囲に及ぶ正常組織および全ての種類の造血細胞上で発現する。ＣＤ４４抗原は、当初、リンパ球活性化およびリンパ球ホーミングに結びつけて考えられていた。現在、一般に考えられているその生理学的役割として、炎症性遺伝子の活性化、細胞周期の変調、細胞増殖の誘導、分化および発現の誘導、細胞骨格再構成および細胞移動の誘導、ならびにアポトーシスに対する細胞生存／耐性も挙げられる。
【０００３】
ヒトでは、ＣＤ４４の単一遺伝子コピーが第１１染色体の短腕（１１ｐ１３）上に位置している。この遺伝子は、１９個のエクソンを含み、最初の５個が定常、次の９個が可変、その後の３個が定常、さらに最後の２個が可変である。選択的スプライシングによって、１，０００を上回る異なったイソホームを得ることができる。しかし、現在のところ、同定された天然の変異体は数十にすぎない。
【０００４】
ＣＤ４４標準糖タンパク質は、Ｎ末端細胞外（２０アミノ酸長のリーダー配列および膜近位領域（８５アミノ酸長）を含む）領域（２７０アミノ酸長）、膜貫通領域（２１アミノ酸長）、ならびに細胞質尾部（７２アミノ酸長）からなる。細胞外領域は、Ｎ末端に連結モジュールも有する。この領域は、９２アミノ酸長であり、多のＨＡ結合連結タンパク質に対して相同性を示す。ヒトＣＤ４４の形態とマウスＣＤ４４の形態とのあいだに高い相同性がある。そのタンパク質の可変型をエクソン５のカルボキシル基末端に挿入すると発現の際に細胞外に位置する。
【０００５】
ＣＤ４４の血清可溶形も天然に生じ、終止コドン（可変領域内）またはタンパク質分解活性のいずれかに起因し得る。ＴＮＦ−αを含む種々の刺激による細胞の活性化によって、腫瘍細胞によるＣＤ４４受容体の遊離放出が生ずる。この受容体の遊離放出は、腫瘍細胞によっても見られ、それによってＣＤ４４の血清濃度が最高１０倍まで増加する。ＣＤ４４の血清濃度が高いことは、悪性（例外として卵巣癌）であることを示唆している。
【０００６】
ＣＤ４４の標準形態は、分子量約３７ｋＤを有するものとして存在する。翻訳後の修飾は、分子量を８０〜９０ｋＤに増加させる。このような修飾として、アスパラギン残基でのアミノ末端細胞外領域Ｎ結合グリコシル化、細胞外領域のカルボキシ末端でのセリン／スレオニン残基のＯ−結合グリコシル化、およびグリコサミノグリカン付加が挙げられる。スプライス変異体の大きさは、８０〜２５０ｋＤの範囲内にある。
【０００７】
ほ乳類動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置する多糖類であるＨＡは、主要なＣＤ４４リガンドとして考えられる。しかし、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン等のタンパク質にＣＤ４４が結合するという知見も得られている。不活性ＣＤ４４（ＨＡに結合せず）のグリコシル化の度合いは最も高く、活性ＣＤ４４（ＨＡに結合）の場合は最も低く、誘導性ＣＤ４４（サイトカイン、モノクローナル抗体、増殖因子等によって活性化されない限り、ＨＡに結合しないか、結合しても弱い）のグリコシル化の度合いは、活性型と不活性型とのおおよそ中間にある。
【０００８】
ＣＤ４４は、細胞の相互作用、刺激、および環境に左右される複数のシグナル伝達経路を介して、その機能の一部を調節することができる。これらの伝達経路の一部として、ＮＦκＢシグナル伝達カスケード（炎症反応に関連）、Ｒａｓ−ＭＡＲＫシグナル伝達経路（細胞周期および増殖の活性化に関連）、タンパク質のＲｈｏファミリー（細胞骨格再構築および細胞移動に関連）、ならびにＰＩ３−Ｋ関連シグナル伝達経路（細胞生存に関連）が挙げられる。上記機能の全てが主要疾患開始および進行と密接に関係している。ＣＤ４４も種々の付加的な機構によって癌の原因に関係があるとされている。これらの機構として、悪性疾患に関係する受容体に対するＣＤ４４の細胞表面上に存在する細胞表面プロテオグリカンによる増殖因子、ケモカイン、およびサイトカインの提示が挙げられる。また、ＣＤ４４−ＨＡ複合体の内在化後にリソソーム・ヒアウロニダーゼによるＨＡの細胞内分解によって、ＥＣＭを介した新脈管形成の誘導と腫瘍侵襲性の可能性とが潜在的に増加し得る。さらに、生存またはアポトーシスのシグナルの伝達は、標準的または可変的ＣＤ４４受容体を介して生ずることが示されている。ＣＤ４４は、細胞分化および移動に関係することも示唆された。全てではないにしても、これらの機構の多くが環境および細胞に依存しており、さらにいくつかは結果にばらつきが生じた。したがって、何らかの結論が出される前に、より多くの研究をおこなうことが求められている。
【０００９】
癌でのＣＤ４４の潜在的な機能的役割を確認するために、ＣＤ４４の発現を検討して、その受容体が疾患進行と相関するかどうかを判断した。しかし、大部分の種類の腫瘍で得られた知見は矛盾するものであり、このことは研究者間で試薬の組み合わせ、手法、病理学的採点法、および細胞種が異なることによると考えられる。腎細胞癌および非ホジキン（Hodgkin）リンパ腫は、例外であると思われる。高ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者の生存期間は、その対照となる低または非ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者の生存期間よりも一貫して短かった。
【００１０】
癌との関連性により、抗癌療法の開発がＣＤ４４を標的としておこなわれてきた。ＣＤＤの標準型または変異型が腫瘍進行に必要かどうかについての論争が依然としておこなわれている。両方の観点を指示する生体内（in vivo）動物データがあり、また一方では腫瘍型に依存し、さらには細胞型にも依存すると考えられる。異なる治療的アプローチとして、可溶性ＣＤ４４タンパク質、ヒアルロナン・シンターゼｃＤＮＡ、およびヒアルロニダーゼの注射と、ＣＤ４４アンチセンスおよびＣＤ４４特異抗体の使用とが含まれていた。各々のアプローチは、ある程度の成功をもたらしたことから、抗ＣＤ４４癌療法に対するサポートが得られた。
【００１１】
変異体ＣＤ４４特異的モノクローナル抗体および標準ＣＤ４４特異的モノクローナル抗体の産生は、実験的におこなわれてきた。しかし、ほとんどの場合、これらの抗体は固有の生物活性を持たず、むしろ該抗体が認識するＣＤ４４のタイプに対して特異的に結合する。しかし、一部のものは、生体外（in vitro）または生体内（in vivo）のいずれかで活性を示す（しかし一般に両方で活性を示すことはない）。いくつかの抗ＣＤ４４抗体が、細胞で生ずる現象を調節することが示された。例えば、ヒト赤血球ルセラン抗原ＣＤ４４標準型に対するマウス抗体Ａ３Ｄ８は、ＣＤ（９−１抗体）およびＣＤ（ＯＫＴ３抗体）調節Ｔ細胞活性化を高めることが示され、別の抗ＣＤ４４抗体は類似の効果を生じた。Ａ３Ｄ８は、単球からのＩＬ−１放出およびＴリンパ球からのＩＬ−２放出もおこなう。興味深いことに、ダウノルビシン、ミトキサントロン、およびエトポシド等の薬剤と併用してＡ３Ｄ８の使用は、第二メッセンジャーであるセラミドの生成を抑制することによって、ＨＬ６０およびＮＢ４ＡＭＬ細胞でのアポトーシス誘導を阻害した。固有の活性を持たずＣＤ４４の同様なエピトープに対するＪ１７３抗体は、薬剤誘導アポトーシスを阻害しなかった。８５〜１１０ｋＤおよび２００ｋＤ形のＣＤ４４に対するＮＩＨ４４−１抗体は、ＣＤ４４の交叉結合または凝集であると著者が推測する経路を介して、Ｔ細胞増殖を増強させた。ひとまとめにして考えると、このような抗体が癌に対するもの（例えば、リンパ球の活性化）ではなく、細胞増殖を誘導するものでもなく、あるいは細胞障害性薬とともに使用した際に癌細胞の薬物誘導死をもたらすこともないことから、これらが癌治療を目的とした用途に適しているという証拠はない。
【００１２】
いくつかの抗ＣＤ４４抗体が生体内（in vivo）で抗腫瘍効果を示すということが記載された。抗体１．１ＡＳＭＬ（ＣＤ４４の変異体に対するマウスＩｇＧ１）によってラット膵臓腺癌ＢＳｐ７３ＡＳＭＬのリンパ節および肺転移が減少することが示されている。処置した動物の生存は、同時に増加した。この抗体は、リンパ節コロニー形成前に投与される場合のみに効果的であり、リンパ節での細胞増殖を妨げた。生体外（in vitro）での腫瘍細胞に対する抗体の直接的な細胞障害性は見られず、この抗体によって補体媒体細胞障害性または免疫エフェクター細胞機能が高められることはなかった。ヒト細胞に対する抗体の有用性については、記載されていない。
【００１３】
ブレイヤー（Breyer）他は、同所移植されたラット膠芽腫の進行を中断させるために、ＣＤ４４に対する市販の抗体を用いることを記載した。ラット膠芽腫細胞株Ｃ６を前頭葉に移植し、１週間後、ラットに対して、脳内注射による抗体処置を３回おこなった。処置されたラットでは、腫瘍の増殖減少が示され、また緩衝液またはイソタイプ対照処置ラットよりも高体重であった。抗体は、細胞外マトリックス成分によって被覆されたカバーガラスに対する生体外（in vitro）細胞接着を阻害することが可能であった。しかし、細胞に対する直接的な細胞障害性効果を有しなかった。この抗体の試験は、ヒト細胞に対してはおこなわれなかった。
【００１４】
ＣＤ４４（ＩＭ−７．８．１）に対する抗体の有効性をＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）に対する抗体と比較する研究がおこなわれた。高転移性マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０株（両方のＣＤ４４イソタイプを発現）がマウスに静脈内移植された。２日後から、３日毎に抗体の投与が本研究継続中なされた。両抗体ともに、肺転移の数を、５０％を上回るほど著しく減少させ、２つの抗体間で有効性に有意な差はみられなかった。抗体は、生体外（in vitro）での増殖に影響を及ぼさず、著者であるザバズキ（Zabadzki）他は腫瘍増殖阻害がＣＤ４４とそのリガンドとの相互作用を抗体が阻害することによるものと推測した。ＩＭ−７．８．１を用いた別の研究では、ザバズキ（Zabadzki）他は、抗体およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントがマウスＴ細胞リンパ腫ＬＢによってリンパ節浸潤を阻害することが可能であることを証明した。これは、マウスに対して顕著な延命効果を与えた。ヴァラッハ−ダヤン（Wallach-Dayan）他は、腫瘍を自発的に形成しなＬＢ−ＴＲマウスのリンパ種がＣＤ４４ｖ４−１０によるトランスフェクションによって腫瘍形成能を与えられたことを示した。ＩＭ−７．８．１投与によって、イソタイプ対照抗体と比べて、移植トランスフェクト細胞の腫瘍サイズが減少した。これらの研究のいずれも、この抗体に関するヒトでの有用性については示されなかった。
【００１５】
ＧＫＷ．Ａ３（マウスＩｇＧ２ａ）は、ヒトＣＤ４４に対して特異的であり、ＳＣＩＤマウスでのヒト黒色腫異種移植の形成および転移を妨げる。この抗体を転移性ヒト細胞株ＳＭＭＵ−２と混合して皮下注射した。処置は、その後３週間にわたって続けられた。４週間後、未処置の動物では１００パーセントであるのに比べて、１０匹のマウスのうち１匹のみが注射部位で腫瘍を発生させた。抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、腫瘍形成を同様に阻害することを示したことから、その作用機序が補体または抗体依存性細胞障害に依存しないことが示唆された。初回抗体注射の１週間前に腫瘍細胞を注射した場合、８０パーセントの動物で原発部位に腫瘍が生じた。しかし、留意すべき点は、生存期間が依然として著しく高いということであった。抗体遅延投与が原発腫瘍形成に対して何ら効果を示さなかったことにかかわらず、未処置の動物では存在した肺、腎臓、副腎、肝臓、および腹膜への転移を完全に防いた。この抗体は、生体外（in vitro）で上記細胞株に対して直接的な細胞障害性をまったく示さないか、あるいはＳＭＭＵ−２細胞の増殖を妨げ、さらに転移または増殖に影響を及ぼすことで腫瘍形成に対して大きな効果を有すると思われる。この抗体の１つの顕著な特徴は、それがＣＤ４４の全てのイソタイプを認識したということであり、このことは治療を目的とした使用の可能性に限界があることを示唆した。
【００１６】
シュトローベル（Strobel）他は、マウス異種移植モデルでヒト卵巣癌細胞の腹膜移植を阻害するために抗ＣＤ４４抗体（クローン５１５）を用いることを記述している。ヒト卵巣の細胞株３６Ｍ２を、抗ＣＤ４４抗体または対照抗体の存在下で、マウスへ腹腔内移植し、その後の２０日間にわたって処置薬を投与した。５週間後に、抗体処置群の腹膜腔で小結節の数が著しく少なかった。抗ＣＤ４４処置群および対照処置群に由来する小結節の大きさは、同じであり、このことは細胞がひとたび移植されると、抗体は腫瘍増殖に対して何ら効果を示さなかったことを示唆した。細胞を皮下移植した場合も腫瘍増殖に対する効果はなく、抗体それ自体が抗増殖または細胞障害性効果を持たないことを示した。また、生体外（in vitro）での細胞増殖に対する抗体の効果はみられなかった。
【００１７】
ＶＦＦ−１８（ＢＩＷＡ１ともいう）は、ポリペプチドの３６０〜３７０領域に対して特異的であるＣＤ４４のｖ６変異体に対する高親和性抗体である。この抗体は、１２人の患者の第１相臨床試験で９９ｍテクネチウム標識複合体として用いられている。この抗体を、頭部および頚部に扁平上皮癌を持つ患者での標的化可能性と安全性とについて、試験した。注射後の４０時間、注射投与量の１４パーセントが腫瘍に取り込まれ、その際、腎臓、脾臓、および骨髄を含む他の器官での蓄積は最小であった。高度に選択的な腫瘍結合は、この抗体の放射免疫療法での役割を示唆している一方で、この抗体の非常に高い親和性が腫瘍のより深い層への浸透を妨げている。ＢＩＷＡ１の適用をさらに制限するものは、マウス抗体の免疫原性（患者１２人中１１人にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が生じた）、腫瘍全体に及ぶ異質性の蓄積、および抗体可溶性ＣＤ４４複合体の形成である。ＷＯ０２／０９４８７９は、ＨＡＭＡ応答を克服するために設計されたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と命名）を開示している。ＢＩＷＡ４の抗原結合親和性が親ＶＦＦ１８抗体よりも著しく低いという知見が得られた。驚くべきことに、低親和性ＢＩＷＡ４抗体は、高親和性ＢＩＷＡ８ヒト化ＶＦＦ−８抗体よりも優れた腫瘍取り込み特性を有した。患者３３人に対する第１相臨床試験をおこなうことで、９９ｍテクネチウム標識および１８６レニウム標識ＢＩＷＡ４抗体の安全性、耐容性、腫瘍蓄積、および最大許容投与量（１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の場合）を評価した。１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の全ての用量で腫瘍反応がみられなかったにみられなかった。しかし、いくつかのものは安定病態を有し、用量規定障害性が６０ｍＣｉ／ｍ２で生じた。有害事象率は５０〜６５パーセントであり、患者３３人中１２人が深刻な有害事象（血小板減少症、白血球減少症、および発熱）を有すると思われ、またそのうちの６人（全員が１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４による処置を受けた）が処置または経過観察の過程で疾患進行により死亡した。１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の用量を段階的に増量する第１相試験を患者２０人に対して実施した。口腔粘膜炎および用量規定血小板減少症および白血球減少症が観察され、１人の患者ではＨＡＨＡ反応が出現した。安定病態は、６０ｍＣｉ／ｍ２という最も高い用量で処置された患者５人にみられた。達成される有効性について安全性および耐容性の両方の面から許容可能であると考えられるにもかかわらず、これらの研究は、臨床試験で他の非放射性同位元素併用生物学的療法に比べて、有害事象率が高い。米国特許出願第２００３／０１０３９８５号は、腫瘍治療を目的として、メイタシオイドを結合させたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と命名）を開示している。ヒト化ＶＦＦ１８抗体（ＢＩＷＡ４）は、毒素（すなわち、ＢＩＷＩ１）を結合した場合に、外陰部ヒト扁平上皮細胞癌、咽頭有棘細胞癌、または乳癌のマウス・モデルで顕著な抗腫瘍効果を示すという知見が得られた。非結合型バージョンであるＢＩＷＡ４は抗腫瘍効果を示さず、また結合型バージョンであるＢＩＷＩ１はヒトでの安全性および有効性に関する証拠を何ら示していない。
【００１８】
ＭａｂＵ３６は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂヒト下咽頭癌細胞免疫化ならびに癌および組織特異性に対する選択性によって得られたマウス・モノクローナルＩｇＧ１抗体である。ｃＤＮＡクローニングおよび配列分析を通しての抗原特徴付けは、ケラチノサイト特異的ＣＤ４４スプライス変異体エピカンのｖ６領域をＭａｂＵ３６の標的として特定した。免疫組織化学的検査では、このエピトープが細胞膜に限定されていることが示された。さらに、ＭａｂＵ３６は、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の９４％を強く標識し、またこの腫瘍内で均一な細胞染色がみられた。患者１０人の９９ｍＴｃ標識ＭａｂＵ３６を検査したところ、ＨＮＳＣＣ癌に対する抗体の選択的蓄積（２日間で２０．４±１２．４パーセント注入量／ｋｇ）がみられ、副作用は報告されていないが、患者２人にＨＡＭＡが発症した。放射性ヨウ素標識マウスＭａｂＵ３６の検査では、患者１８人中、ＨＡＭＡの症例が３件あり、選択的かつ一様なＨＮＳＣＣへの取り込みがみられた。ＭａｂＵ３６の抗原性を低下させるとともにＨＡＭＡの率を低下させるために、キメラ抗体が作られた。キメラおよび本来のマウスＭａｂＵ３６は、いずれもＡＤＤＣ活性を示さなかった。ＭａｂＵ３６が持つ本来の機能活性に関する証拠はみられない。１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６を用いて、治療薬としてのＭａｂＵ３６の有用性について判断した。この第１相試験では、投薬量増量治験患者１３人に対して、探索量の９９ｍＴｃ標識キメラＭａｂＵ３６が与えられ、続いて１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６が投与された。急性有害事象の報告はなかったが、後処置投与量を制限する骨髄障害性（１．５ＧＢｑ／ｍ２）が患者３人のうち２人にみられ、また最大許容投与量（１．０ＧＢｑ／ｍ２）による処置を受けた１人の患者に血小板減少症が認められた。腫瘍サイズに対して多少の効果があったにもかかわらず、これらの効果は処置に対する他感的応答基準を満たすものではなかった。１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６に関するさらなる研究は、顆粒球コロニー刺激因子刺激全血返血という戦略を利用して最大耐容活性を２．８Ｇｙに倍化させた。頭頚部に種々の腫瘍を持つ患者９人に対するこの研究で、３人が薬物関連貧血症のために輸血を必要とした。他の障害性として、重度（グレード３）の骨髄障害性および中等度（グレード２）の粘膜炎が挙げられる。安定病態が５人の患者で３〜５ヵ月間達成されたにもかかわらず、客観的腫瘍反応は既報告でなかった。したがって、わかることは、ＭａｂＵ３６が非常に特異的な抗体であるにもかかわらず、抗癌効果を達成するために放射性免疫複合体を必要とすることが障害になって、その有益性が制限されることであり、その理由として、達成される臨床効果に関連して治療に伴う障害性がある。
【００１９】
要約すると、ＣＤ４４ｖ６（１．１ＡＳＭＬ）およびＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）モノクローナル抗体は、それぞれ、転移性膵臓腺癌を注射されたラットまたは悪性黒色腫を注射されたマウスの転移活性を減少することが示されている。別の抗ＣＤ４４ｖ６抗体（ＶＦＦ−１８とその誘導体）は、メイタンシノイドまたは放射性同位元素に結合される場合のみに、抗腫瘍効果を有することが示された。抗標準ＣＤ４４モノクローナル抗体は、ラット・グリア芽細胞腫（抗ＣＤ４４）による大脳内進行、マウスＴ細胞リンパ腫によるリンパ節浸潤（ＩＭ−７．８．１）を抑制すること、同様にヌードマウス（クローン５１５）でのヒト卵巣癌細胞株の移植、マウス・メラノーマ細胞株の肺転移（ＩＭ−７．８．１）、およびＳＣＩＤマウス（ＧＫＷ．Ａ３）でのヒト・メラノーマ細胞株の転移を阻害することが明らかになった。放射性同位元素結合ＭａｂＵ３６抗ＣＤ４４ｖ６抗体およびその誘導体は、臨床試験で、顕著な障害性を伴う抗腫瘍活性を有した。これらの結果は、彼らを励ますとともに可能性のある癌療法としての抗ＣＤ４４モノクローン抗体の開発を支持したにもかかわらず、ヒト癌に対する有効性、安全性、および適用性に限界があることを示している。
したがって、癌細胞障害性を調節する抗体組成物が単離されるならば、癌細胞上のＣＤ４４の細胞表面発現に対するその親和性の効用として、有益な診断および治療方法が実現されるだろう。
【００２０】
先行特許
特許文献１は、患者腫瘍由来の細胞にＭＨＣ遺伝子を形質移入するプロセスを開示しており、このＭＨＣ遺伝子はその患者の細胞または組織からクローニングすることが可能である。
特許文献２は、ほ乳類の腫瘍性および正常細胞の細胞内構成要素に対して特異的であり、細胞外構成要素に対しては非特異的であるモノクローナル抗体を得る工程と、そのモノクローナル抗体を標識する工程と、標識された抗体と腫瘍性の細胞を殺すための治療を受けたほ乳類の組織とを接触させる工程と、変性腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する標識抗体の結合を測定することによって治療の効果を決定する工程とを含むプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に特異的な抗体を調製する際に、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の簡便な供給源であることを認めている。
特許文献３は、新規な抗体とその生産方法とを提供する。詳しくは、この特許は、ヒト腫瘍（例えば、大腸および肺の腫瘍）に関連したタンパク質抗原と強固に結合し、その一方で正常細胞への結合の度合いがかなり低いという性質を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。
【００２１】
特許文献４は、癌治療のための方法を提供するもので、この方法は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に除去すること、腫瘍組織を処理することで腫瘍細胞を得ること、腫瘍細胞に放射線を照射することで、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にすること、ならびにこれらの細胞を用いて、原発性腫瘍の再発を妨げると同時に転移を阻止することが可能な患者用アクチンを調製することを含む癌治療の方法を提供する。この特許は、モノクローナル抗体の開発を教示しており、このモノクローナル抗体は腫瘍の表面抗原に対して反応する。第４段落４５行目（以下参照）に記載されているように、特許権者は、ヒト腫瘍形成で有効かつ特異的な免疫治療を示すモノクローナル抗体の開発で自所性の腫瘍細胞を利用する。
特許文献５は、ヒト上皮性悪性腫瘍に特有であり、かつそれが由来する上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、上記抗体を用いて癌を処置する方法、および上記抗体を含む医薬組成物に関する。
特許文献７は、精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体を生産するための新規ハイブリドーマ細胞株を記載している。
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生産する方法、モノクローナル抗体を生産する方法、およびこの方法によって生産されるモノクローナル抗体に関する。この特許は、特に癌の診断および処置に有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の生産に関する。
【００２２】
特許文献９は、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、およびヒト上皮性悪性腫瘍細胞と反応する単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体作用が２倍になるメカニズムは、ヒト癌の表面に存在する細胞膜抗原と反応する点で、また抗体は癌細胞内に内在化する能力を持つという点であり、結合の後で、抗体薬物複合体および抗体毒素複合体の形成に特に有用となる。未修飾形態では、抗体もまた、特定の濃度で細胞障害性を発現する。
特許文献１０は、腫瘍の治療および予防に自己抗体を使用することを開示している。ｓかし、この抗体は、老いたほ乳類の抗核抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見いだされる自然抗体の一種であると考えられる。なぜなら、自己抗体は「老いたほ乳類」に由来し、自己抗体が実際に、処置している患者に由来することを必要とはしない。また、この特許は老いたほ乳類に由来する天然またはモノクローナル抗核自己抗体とモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株とを開示している。
特許文献１１は、ＣＤ４４遺伝子の変異体エクソンｖ６に対する特異的抗体（ＶＦＦ−１８）とその変異体とを開示している。この抗体は、ラットＣＤ４４ｖ６変異体よりもむしろヒトＣＤ４４ｖ６変異体を認識するという点で、コンパレーター抗体をしのぐ改善である。さらに、この抗体は、ＣＤ４４ｖ６発現のための診断アッセイを開示する。この抗体に関して、生体外（in vitro）または生体内（in vivo）での作用はみられなかった。
特許文献１２は、ＣＤ４４遺伝子のヒト・エクソン６Ａによりコードされる配列を含む合成ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体Ｖｅｒ３．１を開示している。詳しくは、この抗体はヒトＣＤ４４の９０ｋＤ形に結合せず、ヘルメス（Hermes）−３抗体と区別される。ＣＤ４４のｖ６変異体を検出する方法を提供するとともに、この抗原に基づく悪性転換をスクリーニングして評価するための方法を提供する。血清中の抗原の検出に基づいて免疫疾患をスクリーニングするための方法も提供する。
【００２３】
特許文献１３は、４３アミノ酸ペプチドを産生するヒトＣＤ４４変異体６の１２９ｂｐエクソンに結合する特異的抗体を開示している。このモノクローナル抗体は、いくつかのハイブリドーマ細胞株、すなわちＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６によって産生される。この抗体は、新規ＣＤ４４ｖ６アミノ酸配列の少なくともヘキサペプチドを含む融合タンパク質から生ずる。さらに、癌診断に使用し得るエクソン６変異体を検出するための免疫アッセイが開示されている。注目すべきことは、開示されたこの抗体の生体外（in vitro）作用および生体内（in vivo）作用はみられない。
特許文献１４は、ＣＤ４４様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドおよびその変異体を用いて組み換えタンパク質を作る方法とを開示している。これらのポリペプチドに対して抗体がクレームされているが、具体例はなく、またそのような抗体を分泌する寄託されたクローンもない。ノーザン・ブロットは、いくつかの種類の組織でポリヌクレオチドの出現を示しているが、このポリヌクレオチドの翻訳および発現に付随する証拠は挙げられていない。したがって、このポリペプチドの遺伝子産物に対して作られた抗体（該抗体は生体外または生体内作用を有すると思われる）が存在していたという証拠はなく、また該抗体がヒトの癌疾患に関連していると考えられる証拠もない。
特許文献１５は、ＣＤ４４の変異体エピトープと反応する抗体と該抗体を用いて変異体を同定する方法とを開示している。この変異体をコードする単離ポリペプチドはラット細胞から単離されたもので、この変異体に対する抗体（ｍＡｂ１．１ＡＳＭＬ）は、分子量１２０ｋＤ、１５０ｋＤ、１８０ｋＤ、および２００ｋＤのタンパク質を認識する。モノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬの投与は、同系ラットでのラットＢＳｐ７３ＡＳＭＬの増殖および転移を遅らせた。注目すべきことに、１．１ＡＳＭＬは、ＬＣＬＣ９７ヒト大細胞肺癌に対する反応性が欠けていたことに示されるように、ヒト腫瘍を認識しない。ヒト・ホモログはＬＣＬＣ９７から単離されるが、このホモログを認識する等価な抗体は産生されなかった。したがって、ラットＣＤ４４の変異体に特異的な抗体が作られ、ラット腫瘍の増殖および転移に影響を及ぼすことが示された。より具体的には、本発明者らはこの抗体がヒト癌を認識しないことを指摘している。
【００２４】
【特許文献１】  米国特許第５，７５０，１０２号公報
【特許文献２】  米国特許第４，８６１，５８１号公報
【特許文献３】  米国特許第５，１７１，６６５号公報
【特許文献４】  米国特許第５，４８４，５９６号公報
【特許文献５】  米国特許第５，６９３，７６３号公報
【特許文献６】  米国特許第５，７８３，１８６号公報
【特許文献７】  米国特許第５，８４９，８７６号公報
【特許文献８】  米国特許第５，８６９，２６８号公報
【特許文献９】  米国特許第５，８６９，０４５号公報
【特許文献１０】  米国特許第５，７８０，０３３号公報
【特許文献１１】  米国特許第５，９１６，５６１号公報
【特許文献１２】  米国特許第５，６１６，４６８号公報
【特許文献１３】  米国特許第５，８７９，８９８号公報
【特許文献１４】  米国特許第５，９４２，４１７号公報
【特許文献１５】  米国特許第５，８８５，５７５号公報
【発明の開示】
【００２５】
本発明者らは、癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためのプロセスに対する「個別的患者特異的抗癌抗体」と題された米国特許第６，１８０，３５７号を既に交付されている。この文献の目的のために、用語「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）を同義的に用いることが可能であり、ハイブリドーマ（例えば、マウスまたはヒト）によって産生される無傷の免疫グロブリン、免疫複合体、および必要に応じて、免疫グロブリン・フラグメント、ならびに組換え体タンパク質に、例えばキメラ化免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組み換え体免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）、および融合タンパク質が挙げられる。タンパク質の構造または機能に有意な効果を生ずることなく、一部のアミノ酸配列がポリペプチド内で変異し得ることは、当該技術分野で十分に理解されている。抗体の分子内転位では、一般に、主鎖領域の核酸またはアミノ酸配列を修飾し得る。このような修飾の例として、限定されるものではないが、置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加が挙げられる。さらに、標準的な化学療法のための手段（例えば、放射性核種）と本発明のＣＤＭＡＢとを抱き合わせることは、この発明の範囲内であり、このことから上記化学療法剤の使用に注目する。ＣＤＭＡＢもまた、毒素、細胞障害性部位、酵素（例えば、ビオチン複合酵素）、または造血細胞と結合することができ、それによって抗体複合体が形成される。
【００２６】
この出願は、実質的に、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株の単離を目的とした‘３５７号特許に教示されたような患者特異的抗癌抗体を生産するための方法を利用する。これらの抗体を、１つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能となる。この出願の文脈の中で、細胞殺害（細胞障害性）または細胞増殖阻害（細胞増殖抑制性）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、細胞障害性という。これらの抗体を癌の病期分類および診断の補助として用いることができ、また原発腫瘍と同様に腫瘍転移を処置するために用いることができる。
【００２７】
個別的抗癌処置の見込みは、患者を管理する方法の変化をもたらす。可能性のある臨床シナリオは、腫瘍試料が提示に得られて積み上げられることである。この試料から、既存の癌疾患修飾抗体パネルにより腫瘍の型を決めることができる。患者の病期分類を従来どおりに行うけれども、利用可能な抗体を患者のさらなる病期分類に用いることができる。患者に対して既存の抗体を用いて迅速な処置を施すことができ、および／または腫瘍に特異的な抗体パネルを、本明細書中に概説された方法を用いることで、あるいは本明細書中に開示されたスクリーニング方法と同時にファージ・ディスプレイ・ライブラリーを用いることを介して、生産することができる。他の腫瘍が処置したものと同様のエピトープのいくつかを所有することが可能であることから、産生された抗体の全てを抗癌抗体ライブラリーに加える。この方法にもとづいて産生される抗体は、該抗体に結合する癌を持つ患者の多くで癌疾患を処置するのに有用であると思われる。
【００２８】
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号を用いることで、患者の肺腫瘍生検から得た細胞によるマウスの免疫化の後に、マウス・モノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２を得ることができた。Ｈ４６０−１６−２抗原は、異なる組織由来の広範囲なヒト細胞株の細胞表面上で発現した。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）および皮膚癌細胞株Ａ２０５８は、生体外（in vitro）でＨ４６０−１６−２の細胞障害作用の影響を受けやすい。
培養中のＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１６−２細胞障害性の効果は、これらの癌細胞に対する抗腫瘍活性により、マウスに移植した場合にさらに拡大した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に開示）。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療効力を予測する有効な手段と考えられた。
ヒト乳癌の生体内（in vivo）予防モデルでは、イソタイプ対照抗体（構造およびサイズがＨ４６０−１６−２と同一であったが、ＭＢ−２３１細胞を結合することはできなかった）と比較して、Ｈ４６０−１６−２処置が処置期間中の腫瘍増殖抑制において有意な効果を示した（ｐ＜０．００１）。処置相終了時に、Ｈ４６０−１６−２投与マウスでの腫瘍増殖は、対照群のわずか１．３パーセントであった。治療後追跡期間中、Ｈ４６０−１６−２の処置効果が持続し、処置群での平均腫瘍体積が測定相の終わりまで対照群よりも有意に小さかった。基準の抗体有効性として生存率を使用することで、Ｈ４６０−１６−２での死亡リスクが、処置後７０日目で、抗体バッファ対照群の約７１パーセント（ｐ＝０．２８）であると推定された。これらのデータは、Ｈ４６０−１６−２処置が対照群と比較して延命効果を与えることを示した。体重の減少および臨床的苦痛を含む障害性の兆候を何ら誘導するものではなかったことから、Ｈ４６０−１６−２処置が安全であると考えられた。このように、確立されているヒト乳癌モデルで対照群と比較して、Ｈ４６０−１６−２処置による腫瘍増殖の遅延および生存率の強化が得られたことから、Ｈ４６０−１６−２処置が有効であった。
【００２９】
また、確立された生体内腫瘍モデルでＭＢ−２３１細胞に対する抗腫瘍活性を示した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に概説）。Ｈ４６０−１６−２による処置を標準的化学療法薬であるシスプラチンと比較したところ、シスプラチンおよびＨ４６０−１６−２処置群が、抗体希釈バッファまたはイソタイプ対照抗体のいずれかによって処置された群と比較して、平均腫瘍容積が有意に少なかった（ｐ＜０．００１）。Ｈ４６０−１６−２処置は、腫瘍抑制を調節した。この腫瘍抑制は、シスプラチン化学療法による腫瘍抑制の３分の２であるが、シスプラチンによる処置で観察されたような有意な体重減少（１９．２パーセント）がなく（ｐ＜０．００３）、またシスプラチンによる処置で観察されたような処置関連死２件等の臨床的苦痛もみられなかった。Ｈ４６０−１６−２が抗腫瘍活性およびその最小障害性を示すことから、Ｈ４６０−１６−２が魅力的な抗癌治療薬となった。後処理期間中、Ｈ４６０−１６−２は有意な延命効果を示した（ｐ＜０．０２）。なぜなら、Ｈ４６０−１６−２群で死亡するリスクが、処置後７０日を過ぎたところで、イソタイプ対照抗体群での死亡のリスクの約半分であった。観察された延命効果は、処置後１２０日を過ぎても持続し、Ｈ４６０−１６−２処置群の致死率が６７パーセントであったのに対してイソタイプ対照群およびシスプラチン処置マウスの致死率は１００パーセントがであった。Ｈ４６０−１６−２は、イソタイプ対照抗体群と比較して２６パーセント、腫瘍増殖を遅らせることで、腫瘍抑制を保った。処置後３１日目に、Ｈ４６０−１２−２は、イソタイプ対照群と比較して、腫瘍増殖を４８パーセント減少させることで、腫瘍のサイズを制限した。この腫瘍増殖減少は、処置終了時に観察される４９パーセント減少に匹敵する。確立された乳癌腫瘍モデルでは、これらの結果は、処置相を超えて腫瘍抑制効果を保つＨ４６０−１６−２の可能性を示し、また全身腫瘍組織量を減少せるとともにほ乳類の生存率を高める抗体の能力を示した。
【００３０】
確立された生体内乳癌モデルの有益な効果に加えて、化学療法薬（シスプラチン）と組み合わせたＨ４６０−１６−２処置は、確立した生体前立腺癌モデルではＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を呈した。対応のあるｔ−検定を使用して、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンとを組み合わせた処置が、バッファ対照群（ｐ＜０．０００１）、シスプラチン単独による処置（ｐ＝０．００４）、またはＨ４６０−１６−２単独による処置（ｐ＜０．０００１）よりも、処置後、より短時間で腫瘍増殖を抑制する点で有意な効果があった。処置相終了時に、Ｈ４６０−１６−２とともにシスプラチンを与えられたマウスは、バッファ対照群のたった２８．５パーセントしか増殖しなかった。ＰＣ−３・ＳＣＩＤ異種移植モデルに関して、疾患進行の代用指標として、体重を用いることができる。実験した全ての群のマウスで著しい体重減少が生じた。この研究では、全ての群のマウスが処置期間終了までに約２３ないし３５パーセントの体重減少を示した。Ｈ４６０−１６−２を処置した群は、体重減少の度合いが最も低かった（２１．７パーセント）。処置後、４８日目、バッファ対照群と比較してＨ４６０−１６−２およびシスプラチンの処置に関連した体重減少の有意な増大はみられなかった（ｐ＝０．５０４２）。したがって、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンとを組み合わせた処置は、ヒト前立腺癌の十分確立されたモデルでのイソタイプ対照処置群と比較して、腫瘍の増殖が遅れた。
【００３１】
Ｈ４６０−１６−２エピトープが薬物標的であることを実証するために、正常ヒト組織でのＨ４６０−１６−２の発現を事前に測定した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。この研究を、抗ＣＤ４４抗体、すなわちクローンＬ１７８（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８に概説）およびクローンＢＵ７５（本明細書に概説）との比較まで広げた。Ｈ４６０−１６−２によるＩＨＣ染色によれば、組織の大部分がＨ４６０−１６−２の発現に失敗した。これらの組織には、肝臓、腎臓（管状上皮細胞の周辺染色を除く）、心臓、および肺等の重要な臓器が含まれる。組織染色の結果が示すことは、Ｈ４６０−１６−２が種々の細胞型に対しての結合が制限されるが、浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞への結合を示すことを示唆した。ＢＵ７５抗体は、類似の染色パターンを示した。しかし、顕著な違いが少なくとも１つあった。すなわち、リンパ球の染色は、Ｈ４６０−１６−２と比較して、ＢＵ７５よりも強度が高かった。
Ｈ４６０−１６−２抗原の局在化と、集団（例えば、乳癌患者間）内でのその有病率の決定とが、Ｈ４６０−１６−２の治療的使用の評価と有効な臨床試験の設計とに重要である。癌患者の乳癌腫瘍でのＨ４６０−１６−２抗原発現に対処するために、５０人の乳癌患者から得た腫瘍組織試料のスクリーニングを、Ｈ４６０−１６−２抗原（Ｓ．Ｎ。１０／６０３，０００）の発現に関しておこない、Ｌ１７８（Ｓ．Ｎ．１０．６４７，８１８）と比較した。本研究は、Ｈ４６０−１６−２の染色をＢＵ７５および抗Ｈｅｒ２抗体ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較した。本研究の結果は、以前の結果と類似しており、組織試料の６２パーセントがＨ４６０−１６−２抗原に関して陽性に染色され、一方乳癌腫瘍の７２パーセントがＢＵ７５に関して陽性に染色された。患者試料内でのＨ４６０−１６−２の発現は、染色が悪性細胞に限られていることから、癌細胞に対して特異的であることが示された。Ｈ４６０−１６−２は、乳癌患者由来の正常組織試料１０個のうち４つを染色し、一方ＢＵ７５は８つを染色した。Ｈ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗原の両方の乳房腫瘍発現は、悪性細胞の細胞膜に主に局在化して現れ、ＣＤ４４が治療にとって好適な標的となった。Ｈ４６０−１６−２発現を、エステロゲンおよびプロゲステロンというホルモンに対する受容体の乳房腫瘍発現にもとづいて、さらに評価した。これらのホルモンは、乳房腫瘍の進行、処置、および予後にとって重要な役割を演じる。Ｈ４６０−１６−２の発現と、エステロゲンまたはプロゲステロンのいずれもの受容体の発現との間で、なんら相関関係は生じなかった。腫瘍細胞の病期、あるいは癌進行の度合いに基づいて腫瘍を分析する場合、ここでもＨ４６０−１６−２抗原発現と腫瘍病期との間に明らかな相関がなかった。同様の結果は、ＢＵ７５で得られた。ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較して、Ｈ４６０−１６−２は完全に異なる染色の様相を示しており、Ｈ４６０−１６−２抗原に対して陽性である乳房腫瘍組織の５２パーセントがＨｅｒ２発現に対して陰性であり、今までにない標的療法が乳癌患者に求められていることを示した。Ｈ４６０−１６−２およびＨｅｒ２の両方について陽性である乳房腫瘍組織切片間の染色強度にも違いがあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体もまた、正常乳房組織切片の一つを陽性染色した。
【００３２】
Ｈ４６０−１６−２の潜在的かつ治療的な利益を広げるために、種々のヒト癌組織内の抗原の頻度および局在化もまた、既に決定されており（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）、またクローンＬ１７８との比較もなされた（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）。これらの腫瘍型の大部分はまた、Ｌ１７８抗原に陽性であった。ヒト乳房腫瘍組織と同様に、Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８の局在化は、腫瘍細胞の膜上で生じた。しかし、Ｈ４６０−１６−２抗体と比較して、Ｌ１７８による実質的に多くの膜局在化があった。また、Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８の両方によって染色された腫瘍型のうち、４３パーセントの組織がＬ１７８抗体によって、より強く染色されることが示された。
文献のＩＨＣデータとの比較に基づいて本明細書中に示したＩＨＣデータに正確に一致するＣＤ４４の形状はないように思われる。ＣＤ４４の標準形は、通常、ヒト脳で発現されるが、Ｈ４６０−１６−２抗原は発現されない。総（ｐａｎ−）ＣＤ４４イソフォームに対する抗体は、肝臓（クッパー細胞）を染色せず、生殖周期の全ての相で子宮内膜腺を陽性に染色する。Ｈ４６０−１６−２抗原は、クッパー細胞上に明らかに存在しており、また生殖周期の分泌子宮内膜腺に存在するだけである。Ｈ４６０−１６−２抗原は、明らかに組織マクロファージに存在し、また変異形Ｖ４／５およびＶ８／９は、しばしばマクロファージ染色を示す。抗ＣＤ４４Ｌ１７８と比較して、類似はしているが異なる結合パターンがＨ４６０−１６−２に見られたことから、Ｈ４６０−１６−２抗原がＣＤ４４の特異エピトープであることをＢＵ７５が示している。
【００３３】
既に概説されたように（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）、追加の生化学データもまた、Ｈ４６０−１６−２によって認識される抗原がＣＤ４４の形状のうちの一つであることを示した。このことは、ＣＤ４４に対して反応性のあるモノクローナル抗体（Ｌ１７８）が免疫沈降によってＨ４６０−１６−２に結合するタンパク質であることを示す研究によって支持された。ウェスタン・ブロッティングによる研究もまた、Ｈ４６０−１６−２によって認識されるＣＤ４４のエピトープがｖ６またはｖ１０に存在しないことを示唆した。Ｈ４６０−１６−２エピトープもまた、炭水化物であることおよび立体配座依存性であることによって区別され、一方多くの抗ＣＤ４４抗体がＣＤ４４のペプチド・タンパク質に向けられている。これらのＩＨＣおよび生化学的結果は、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４抗原の変異体と結合することを示した。したがって、証拠の優越は、Ｈ４６０−１６−２が、ＣＤ４４の変異体に存在するユニークな炭水化物依存性立体配座的エピトープのライゲーションを介して抗癌作用を調節することを示している。この発明の目的のために、上記エピトープは、ハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２、その抗原結合フラグメント、またはその抗体複合体にコードされるモノクローナル抗体に結合する能力によって特徴づけられる「ＣＤ４４抗原部位」として定義される。
【００３４】
Ｈ４６０−１６−２抗癌作用の背後にあるメカニズムを説明するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）結合アッセイをおこなった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１がＨＡに対して５０パーセント付着する上で、平均濃度が１．８７（±１．０１）μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２を必要とすることがわかった。このような結果から、Ｈ４６０−１６−２が、少なくとも部分的に、ＨＡへの結合に関与するＣＤ４４上の領域と相互作用し、それによってＥＣＭを介して新脈管形成または腫瘍侵襲性の下方制御を通してその抗癌効果を解明し得ることが示された。ＨＡ結合アッセイに加え、細胞周期実験を、Ｈ４６０−１６−２生体外（in vitro）および生体内（in vivo）抗癌作用が細胞周期の調節によるものであるかどうかを判断するためにおこなった。２４時間後かつ２０μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２で、イソタイプ対照群と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１アポトーシス細胞の数が増加した。この効果はまた、用量依存的であるように思われた。したがって、Ｈ４６０−１６−２の有効性もまた、全体的または部分的に、そのアポトーシス誘導能によるものと言えるかもしれない。
【００３５】
全体として、このデータは、Ｈ４６０−１６−２抗原が癌関連の抗原であり、またヒトで発現され、病理学的に関連した癌標的であることを示している。さらに、このデータは、ヒト癌組織に対するＨ４６０−１６−２抗体の結合も示しており、診断、治療の予知、または予後であるアッセイに適切に利用される。さらに、この抗原の細胞膜局在化は、多くの非悪性細胞で抗原の発現が欠如していることによる細胞の癌状態を表し、さらに、この観察は、診断、治療の予知、または予後であり得るアッセイに使用される、この抗原、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質または変異体の使用を可能にする。
【００３６】
他の研究は、抗ＣＤ４４抗体の使用を伴うもので、Ｈ４６０−１６−２によって示されない治療的な可能性に限界がある。Ｈ４６０−１６−２は、生体外および生体内抗腫瘍活性の両方を示す。ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６は、それらに帰する生体外および生体内細胞障害性を持たず、ＶＦＦ−１８およびＭａｂＵ３６は、何ら固有の腫瘍細胞障害性を示さない。また、生体内腫瘍効果を示す他の抗Ｄ４４抗体もまた、Ｈ１４０−６−２では明白ではないある種の制限を有する。例えば、ＡＳＭＬ１．１，Ｋ２９６、抗ＣＤ４４，およびＩＭ−７８．１は、ラット、マウス、異種モデルで増殖するラットおよびマウス腫瘍に対して、それぞれ生体内抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト癌モデルで抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２はまた、ヒトＣＤ４４に特異的であり、一方ＡＳＭＬ１．１等の抗体はラットＣＤ４４のみを認識する。クローン５１５抗ＣＤ４４抗体は、ヒト卵巣細胞株の腹膜腫瘍移植を阻害するが、腫瘍増殖の防止または阻害をおこなうものではない。Ｈ４６０−１６−２は、ＳＣＩＤマウス異種移植モデルにおけるヒト乳房腫瘍増殖を抑制することができる。ＧＫＷ．Ａ３は、抑制性ではあるが確立されたモデルではないモデルにおいてマウスで増殖するヒト転移黒色腫の腫瘍増殖を阻害する能力を持つ抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体である。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト乳癌の予防的および確立されたマウス異種移植モデルで有意の抗腫瘍活性を示した。したがって、既に説明した抗ＣＤ４４抗体と比較して、Ｈ４６０−１６−２は優れた抗腫瘍特性を有することが、かなり明瞭である。
それは、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳房腫瘍で生体外および生体内抗腫瘍活性が示され、ヒトＣＤ４４に向けられている。ヒト乳癌の予防的および確立された（より臨床的に関連する）モデルで活性を示すとともに、ヒト前立腺癌の確立されたモデルでシスプラチンによる活性を示す。
【００３７】
全体として、この発明は、投与された際にほ乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減少させることが可能であり（したがって疾患進行が遅れる）、また処置を受けたほ乳類の生存期間を延ばすことが可能である治療薬の標的としてのＨ４６０−１６−２抗原の使用を教示している。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−１６−２）およびその誘導体を、それの抗原に対して使用することで、腫瘍を持つほ乳類での癌の全身腫瘍組織量を減少させ、かつこの抗原を発現する腫瘍を持つほ乳類の生存期間を延ばす。また、この発明は、それの抗原に結合した後に、Ｈ４６０−１６−２が、ヒアルロン酸と相互作用する癌細胞の能力と相互作用し得ることであり、また癌細胞のアポトーシスを引き超すこともできることを教示する。さらに、この発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を持つほ乳類の診断、治療の予測、および予後に有用であり得る癌細胞でＨ４６０−１６−２抗原の検出を用いることも教示している。
【００３８】
もし患者が治療の最初の過程に対して不応性であるか、もしくは転移が生ずる場合、再処置のために腫瘍に対して特異的な抗体を産生するプロセスを繰り返すことができる。さらに、抗癌抗体を、その患者から得た赤血球と結合させ、転移の処置を目的として再注入することができる。転移癌に対してはほとんど有効な処置がなく、また転移は通常、死に到る転帰不良の前兆となる。しかし、一般に転移癌はかなり血管化しており、赤血球細胞による抗癌抗体の送達は腫瘍部位での抗体の濃縮化作用を持つことができる。転移前であっても、大部分の癌細胞はその生存を宿主血液供給に依存しており、赤血球細胞に結合した抗癌抗体は、同様に原発部位（in situ）の腫瘍に対して効果的であると考えられる。あるいは、抗体を他の血液原細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、またはナチュラルキラー細胞）に結合させてもよい。
【００３９】
抗体には５つのクラスがあり、各々がその重鎖によって与えられる機能に関連づけられている。一般に、むき出しの抗体（naked antibody）による癌殺害が抗体依存型細胞調節細胞障害性（ＡＤＣＣ）または補体依存型細胞障害性（ＣＤＣ）のいずれかによって調節されると考えられる。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分を結合することで、ヒト補体を活性化させることができ、それによって腫瘍溶解をもたらし得る補体活性化の古典的経路が活性化される。ヒト抗体に関しては、補体活性化抗体のほとんどが概ねＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、およびある種のリンパ球による細胞殺害に到るＦｃ受容体を持つ細胞障害性細胞の補充の際に有効である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソタイプのヒトの抗体は、ＡＤＣＣを調節する。
【００４０】
抗体調節癌殺害についての他の可能性のあるメカニズムは、細胞膜内での種々の化学結合の加水分解を触媒する働きをおこなう抗体ならびにそれに関連した糖タンパク質または糖脂質（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものであってもよい。
【００４１】
抗体調節細胞殺害の機序として、さらに２つの機序があり、これらはより広く受けている。第１の機序は、癌細胞にある推定抗原に対して身体が免疫応答するようにさせるワクチンとしての抗体の使用である。第２は、成長受容体を標的にし、該受容体の機能に干渉し、あるいは受容体の機能が効果的に失われるように下流制御する抗体の使用である。
【００４２】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株と、該ハイブリドーマ細胞がコードする対応の単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、癌細胞に関して細胞障害性である一方で同時に非癌細胞に対しては相対的に非障害性である特定個人に由来する細胞から癌疾患修飾抗体を生産する方法を利用することである。
本発明のさらなる目的は、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞の有無を決定するために、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを利用する方法を教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＣＤ４４抗原性部位に特異的に結合する抗体である、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を介した癌疾患を有する患者の生存を高める方法を教示することである。
本発明の目的は、ＣＤＭＡＢおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。
【００４３】
本発明のさらなる目的は、細胞障害性がＡＤＣＣを介して調節（mediate）されるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞障害性がＣＤＣを介して調節（mediate）されるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が細胞化学結合の加水分解触媒能の作用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明の他の目的および利点は、この発明の特定の実施形態が図示および例示によって示される以下の説明から明らかになる。 
【００４４】
（図面の簡単な説明）
本特許または出願書類は、カラー仕上げの図面を少なくとも１つ含む。カラー図面を有するこの特許または出願書類の写しは、申請および必要な手数料を支払うことで特許庁から得られる。
図１。正常ヒト組織アレイから得た扁桃組織切片上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｈ４６０−１６−２に比べてＢＵ７５のほうがリンパ球を強く、かつ広範囲に染色している。両抗体とも胚中心（緑色矢印）では、より薄く染色された。倍率は２００倍である。
図２。乳癌腫瘍（浸潤性腺管癌）に結合したＨ４６０−１６−２の典型的な顕微鏡写真。パネル内の黄色および橙色矢印は、それぞれ間質細胞と悪性細胞シートとを示している。倍率は１００倍である。
図３。ヒト乳癌組織アレイから得たパジェット病乳房組織切片上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。ＢＵ７５によって悪性細胞が膜染色されたのに対して、Ｈ４６０−１６−２ではネガティブ染色であった。倍率は４００倍である。
図４。ヒト乳癌組織アレイから得た乳房組織切片由来の髄様癌上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｈ４６０−１６−２によって悪性細胞が強く膜染色されたのに対して、抗Ｈｅｒ２ではネガティブ染色であった。倍率は２００倍である。
図５。確立したＰＣ−３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対するＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチン、または緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与されていた期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。
図６。確立されたＰＣ−３前立腺癌モデルでの体重に対するＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンまたは緩衝液対照群の効果。
図７。ヒアルロン酸（ＨＡ）に結合するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対するＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（陽性対照）またはイソタイプ対照の効果。
図８。２４時間処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞周期分布に対するＨ４６０−１６−２またはイソタイプ対照の効果。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】
【００４５】
ハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２は、ブダペスト条約に従って、寄託番号ＰＴＡ−４６２１として２００３年１１月１１日付で米国菌培養収集所（American Type Culture Collection, 10801 University
Blvd., Manassas, VA 20110-2209）に寄託された。３７ＣＦＲ１．８０８に従って、この寄託者は、寄託された材料の公衆に対する利用可能性に課された全ての制限が特許付与によって変更不能に取り除かれることを保証する。
【００４６】
抗体産生：
Ｈ４６０−１６−２モノクローナル抗体の産生を、週に２回回収および再播種しながらハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（BD Biosciences, Oakville, ON）で培養することによって、おこなった。この抗体を、プロテインＧセファローズ４ファスト・フロー（Protein G Sepharose 4 Fast Flow）(Amersham
Biosciences, Baie d’Urfe, QC）による標準的な抗体精製法に従って、精製した。ヒト、ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、この発明の範囲内である。
【実施例２】
【００４７】
正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究が既にヒトのＨ４６０−１６−２抗原分布を特徴づけるためにおこなわれており（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００）、またＬ１７８と比較されている（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）。したがって、本研究は、このＨ４６０−１６−２抗原は、生化学的方法で既に決定されたＣＤ４４の癌変異体であると考えられることから、Ｈ４６０−１６−２を、ＣＤ４４（ＢＵ７５）に対して向けられた別の抗体と比較することである。ヒト正常器官組織アレイ（Imgenex, San Diego, CA）を用いて、５９個の正常ヒト組織に対する抗体の結合をおこなった。全ての一次抗体（Ｈ４６０−１６−２；ＢＵ７５抗ＣＤ４４（BIOCAN Scientific Inc., Mississauga, ON）；およびマウスＩｇＧ１陰性対照（Dako, Toronto, ON）を抗体希釈緩衝液（Dako, Toronto, ON）で５μｇ／ｍｌの濃度（以前の最適化ステップで最適濃度であることがわかった）に希釈した。陰性対照抗体は、製造元によって全てのほ乳類組織に対して陰性であることがわかっている。ＩＨＣに関する方法は、以下の通りである。
【００４８】
組織切片をオーブンで５８℃、１時間加熱することで、脱パラフィン化し、コプリン（Coplin）ジャー内でキシレンに５回（各々４分）浸すことで、脱ろうした。一連の段階エタノール洗浄（１００％〜７５％）で処理した後、切片を水で再水和した。スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Dako, Toronto, Ontario）に浸し、続いて、電子レンジ（高、中、および低電力レベルにそれぞれ５分間設定）にかけ、最後に冷ＰＢＳに浸した。次に、スライドを３パーセントの過酸化水素水に６分間浸し、ＰＢＳで３回（各々５分間）洗い、乾燥させ、室温で５分間、ユニバーサル（Universal）ブロッキング溶液（Dako, Toronto, Ontario）とともにインキュベートした。Ｈ４６０−１６−２、ＢＵ７５、またはイソタイプ対照抗体（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）グルコースオキシダーゼ（ほ乳類組織に存在せず、また該組織で誘導することはできない酵素）に対する抗体）を、その作用濃度（各抗体に対して５μｇ／ｍｌ）まで、抗体希釈緩衝液（Dako, Toronto, Ontario）に希釈して、室温で１時間にわたってインキュベートした。スライドをＰＢＳで５分間、それぞれ洗った。一次抗体の免疫活性を、供給元（Dako Envision System, Toronto, Ontario）の指示通りに３０分間、室温でＨＲＰ結合二次抗体によって、検出／視覚化した。このステップの後、スライドをＰＢＳで各々、５分間、３回にわたって洗浄し、室温で１０分間、免疫ペルオキシダーゼ染色用のＤＡＢ（３，３‘−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Dako, Toronto, Ontario）発色基質を添加することで、呈色反応を生じさせた。スライドを水道水で洗うことで、呈色反応を停止させた。マイヤーのヘマトキリシン（Meyer’s Hematoxlin）（Sigma Diagnostics,
Oakville, ON）を用いて対比染色した後、スライドを段階的なエタノール（７５〜１００％）によって脱水し、キシレンによって透徹させた。封入剤（Dako Faramount, Toronto, Ontario）を用いて、スライドにカバースリップを載せた。スライドの顕微鏡検査をアキソバート（Axisovert）２００（Zeiss Canada, Toronto, ON）を用いておこない、このスライドをノーザン・イクリプス・イメージング・ソフトウェア（Northern Eclipse Imaging Software）（Mississauga,
ON）を用いて保存した。結果の読み取り、記録、および解析は、病理学者がおこなった。
【００４９】
表１は、一連の正常ヒト組織をＨ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗ＣＤ４４染色した結果をまとめたものである。Ｈ４６０−１６−２による組織染色は、以前に記述したもの（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）に類似している。ここで再び言及しておくべきことは、この抗原が通常は肝臓、腎臓、および肺等の重要器官の細胞に存在しないことである。Ｈ４６０−１６−２抗体は、マクロファージおよびリンパ球に結合し、それらの存在は切片状のいくつかの器官で観察される。しかし、ＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体によってリンパ球がより強く染色されていた（図１）。
【００５０】
Ｈ４６０−１６−２に対して陽性であった組織もまた、通常、ＢＵ７５抗ＣＤ４４に対して陽性であった（しばしば、強度がより高い）。Ｈ４６０−１６−２に対して陰性であった組織もまた、ＢＵ７５抗ＣＤ４４に対し、食道およびリンパ節の一試料等のいくつかの例外はあるが、概して陰性であった。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２が、ＢＵ７５およびＣＤ４４抗体によって認識されるより小さな群の組織に結合し、組織内での染色強度もまた、しばしばより低くなる。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２の抗原は、正常組織では広範に発現されるものではなく、その上、この抗体は限られた数のヒト組織に特異的である。また、Ｈ４６０−１６−２はＣＤ４４のエピトープに特異的であり、これはこれらのＩＨＣ研究で使用されるＢＵ７５によって認識されるものとは異なる変異体である。
【００５１】
【表１−１】
2007530456.tif 000016
【００５２】
【表１−２】
2007530456.tif 000017
【００５３】
【実施例３】
ヒト乳癌腫瘍組織染色  
以前のＩＨＣ研究は、Ｈ４６０−１６−２抗体がヒト癌を認識する可能性があったかどうかについてＨ４６０−１６−２抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定するために（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）、またそれがどのようにして抗ＣＤ４４染色とＬ１７８とを比較するか（Ｓ。Ｎ．１０／６４７，８１８）についておこなわれた。現在のところ、比較は、ＢＵ７５抗ＣＤ４４染色、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２、および黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）グルコースオキシダーゼに特異的な抗体（ほ乳類組織に存在も誘導もされない酵素（負の対照））についておこなった。５０人の乳癌患者に由来する一群の乳癌組織と、乳癌患者の非新生乳房組織由来の試料１０個とを用いた（Imgenex Corporation, San Diego, CA）。各々の患者について、年齢、性別、対癌米国合同委員会（American Joint Committee on Cancer、AJCC）腫瘍病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）、およびプロゲステロン受容体（ＥＲ）状態に関する情報が提供された。実施例５からのＩＨＣの手順に従った。全ての抗体を作用濃度５μｇ／ｍｌで使用し、例外として抗Ｈｅｒ２の濃度を１．５μｇ／ｍｌで使用した。
【００５４】
表２および表３は、それぞれ乳癌組織群のＨ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体染色をまとめたものである。各々の群は、患者５０人から得た腫瘍試料から構成されるものであった。概して、試験した患者５０人の６２パーセントが、ＢＵ７５抗ＣＤ４４に関しては７３パーセントであるのに対して、Ｈ４６０−１６−２抗原については陽性であった。Ｈ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗ＣＤ４４が同一組織を染色した例では、該試料の４５パーセントがＨ４０−１６−２と比較して、ＢＵ７５抗ＣＤ４４での染色強度が高かった。Ｈ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗原に関して、乳癌患者由来の正常乳房組織試料１０個のうち、それぞれ４個および８個が陽性であった。エストロゲン受容体状態とプロゲステロン受容体状態とのあいだに、何ら明確な相互関係は認められなかった。それはまた、より高い腫瘍病期によってＨ４６０−１６−２およびＣＤ４４抗原の陽性発現が大きくなる傾向にあるとは思われなかった。
【００５５】
【表２】
2007530456.tif 000018
【００５６】
【表３】
2007530456.tif 000019
【００５７】
Ｈ４６０−１６−２染色は、図２に示すように、正常細胞と比較して、癌細胞に対して特異的であり、間質細胞が明らかに陰性であり、かつ悪性細胞シートがかなり陽性であった。Ｈ４６０−１６−２抗原により見られる細胞局在化のパターンは、大多数の例で細胞膜に限定された。ＢＵ７５ＣＤ４４抗体は、より多くの乳癌試料を染色し、Ｈ４６０−１６−２と比較して細胞質局在化よりも膜の度合いが高かった（表４）。ＢＵ７５抗ＣＤ４４はまた、パジェット病の悪性細胞を染色したが、このことはＨ４６０−１６−２の例では見られなかった（図３）。Ｈ４６０−１６−２染色に対して陽性であった乳癌患者由来の正常組織試料もまた、ＢＵ７５抗ＣＤ４４染色に対して陽性であった。
【００５８】
ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較して、Ｈ４６０−１６−２は、相対的に異なる染色の様相を示した。ここでは、Ｈ４６０−１６−２抗原に対して陽性であった３１個の乳癌腫瘍組織試料のうち１６個がＨｅｒ２発現に関して陰性であり、依然として満たされていない標的治療薬が乳癌患者にとって必要であることが示されている（表５、図４）。Ｈ４６０−１６−２およびＨｅｒ２の両方に対して陽性であった乳房腫瘍組織切片間に染色強度の違いもあった。すなわち、Ｈ４６０−１６−２抗原に対して高度に陽性であったいくつかの乳房腫瘍組織は、Ｈｅｒ２に対しては中程度に陽性であったのみであり、その逆もまたしかりであり、Ｈ４６０−１６−２抗原が乳癌患者の異なる集団を治療的に標的化することを説明している。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体もまた、正常乳房組織切片の一つを陽性に染色した。
【００５９】
これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２に対する抗原が乳癌患者のほぼ２／３で発現されることを示唆している。また、Ｈ４６０−１６−２処置に適したこれらの大部分が抗Ｈｅｒ２処置に適するものではなかったと思われる。染色パターンは、患者試料において、抗体が悪性細胞に対して高度に特異的であり、Ｈ４６０−１６−２抗原が細胞膜に局在化することでそれが魅惑的な薬となり得る標的となることを示した。同様ではあるが、よりいっそう限定されたＨ４６０−１６−２対ＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体の染色は、ＣＤ４４のより制限された変異体であるＨ４６０−１６−２エピトープの可能性を再び示す。
【００６０】
【表４−１】
2007530456.tif 000020
【００６１】
【表４−２】
2007530456.tif 000021
【００６２】
【表５−１】
2007530456.tif 000022
【００６３】
【表５−２】
2007530456.tif 000023
【００６４】
【実施例４】
生体内ＰＣ−３確立化学療法組み合わせ腫瘍実験
図５および６を参照すると、６ないし８週齢の雄ＳＣＩＤマウスに、１００万個のＰＣ−３ヒト前立腺ガン細胞を含む１００マイクロリットルの生理食塩水を首筋に皮下注射することで、移植した。腫瘍の増殖を、毎週、カリパスを用いて測定した。集団の大部分が移植後２１日目で腫瘍容積８０ｍｍ３（範囲５０〜１３０ｍｍ３）に達した時点で、４通りの処理群の各々に、マウス８匹を無作為に割り当てた。Ｈ４６０−１６−２抗体、化学治療薬シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンとの組み合わせ、あるいは緩衝液対照を、２．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤によりストック濃度を希釈した後、３００マイクロリットルの容量で、抗体またはシスプラチンをそれぞれ１５または６ｍｇ／ｋｇで、腹腔内投与した。次に、Ｈ４６０−１６−２または緩衝液対照を第一週目は一週あたり４回投与し、その後一週あたり３回投与し、移植後４１日目まで同様のやり方で、合計１１回分投薬した。シスプラチン投与は、抗体処置期間の第０日目、５日目、１０日目、および１５日目におこなった。腫瘍増殖を、移植後４８日目または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで、ほぼ７日毎にカリパスを用いて測定した。動物の体重を研究期間中記録した。研究終了時、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインに沿って安楽死させた。
【００６５】
対応のあるｔ検定を用いて、シスプラチンまたはＨ４６０−１６−２とシスプラチンとの組み合わせによる後処理腫瘍全身腫瘍組織量の減少（図５）がみられた。４８日目（処理後７日目）において、シスプラチンおよびＨ４６０−１６−２を処置することで、バッファ対照（ｐ＜０．０００１）、シスプラチン処理単独（ｐ＝０・００４）、またはＨ４６０−１６−２処理単独（ｐ＜０．０００１）よりも、処理期間終了間もない腫瘍の増殖を抑制するのに、よりいっそう有意な効果がえられた。ＰＣ−３は前立腺癌の悪液質モデルであり、体重の減少に伴って、異種移植モデルでの全身腫瘍組織量および疾患進行の増加が生ずる。図６に示す平均体重減少に示されるように、全ての群のマウスで、顕著な体重減少がみられた。この研究では、全ての群のマウスが処置期間終了までに約２３ないし３５パーセントの体重減少を示した。Ｈ４６０−１６−２で処置した群は、体重減少の度合いが最も低かった（２１．７パーセント）。処置終了の直後、対照群と比較して、Ｈ４６０−１６−２にシスプラチンを加えての処置に関連した体重のさらなる顕著な減少はみられなかった（ｐ＝０．５０４２）。したがって、Ｈ４６０−１６−２にシスプラチンを加えたものは、ヒト乳癌疾患の周知モデルで、緩衝液対照群と比較して、腫瘍全身腫瘍組織量を低下させた。これらの結果は、ヒトを含むほ乳類の癌治療に対するこの抗体の薬理学的および製薬学的利点を示唆している。
【００６６】
【実施例５】
ヒアルロン酸（ＨＡ）結合アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（既に、ＦＡＣＳ分析によってＨ４６０−１６−２抗原（ＣＤ４４）が発現されるのが示された）を、組織培養プレートから得た使用済み培地を吸引し、ＰＢＳで洗い、各プレートに解離緩衝液５ｍＬを添加し、細胞が離れるまで３７℃で細胞をインキュベートした後に、解離させた。次に、細胞を計数し、５０ｍｌ管に移した。細胞を１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、培地に懸濁することで１〜５００万細胞／ｍｌが得られた。次に１ｍｌを２ｍｌの深いウェルの各々のウェルに添加した。このプレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートをペーパータオル上で逆さまにすることで過剰な上清を取り除いた。次に、深いウェルプレートをゆっくりとボルテックスし、細胞ペレットを除去し、この細胞ペレットを破壊した。１ｍｌのＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（陽性対照、BIOCAN Scientific Inc., Missisauga, ON）またはイソタイプ陰性対照（１０７．３、BD Bioschiences, Oakville, ON）抗体を各ウェルに添加し、次に穏やかにボルテックスをかけることで混合した。次に、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。しばらくして、４８ウェルプレートを、３７℃で１〜２時間にわたり１ウェルあたり４ｍｇ／ｍｌＨＡストック溶液３００μｌでインキュベーションすることによって、ＨＡで被覆した。インキュベーション後、過剰のＨＡを吸引除去し、層流フード内でプレートを完全に空気乾燥させた。抗体細胞インキュベーションを完了させた後、１２００ｒｐｍ、５分間で再び細胞をペレット状にした。深いウェルをペーパータオル上で逆さまにすることで、上清を取り除いた。深いウェルを再びボルテックスすることで、細胞ペレットを解離させ、各々のウェルに対して、２μＭカルセイン含有ＰＢＳ（ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む）１．２ｍｌを添加した。細胞を再懸濁させ、２５０μｌ／ウェルをＨＡ被覆プレートに移した。次に、ＨＡ被覆プレートを３７℃で２時間インキュベートすることで、付着させた。インキュベーション後、付着していない細胞を吸引により取り除いた。次に、いっさいの付着していない細胞または細胞の塊を取り除くために、各ウェルをＰＢＳ（ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む）によって２〜３回洗った。プレートの読み取りをパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーでおこない、データをマイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）で分析し、さらに結果の一覧を表６または図７に示した。実験を別々に６回おこなって得た平均値からなる結果によって、平均で１．８７（±１．０１）μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２が、ＨＡに対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の結合を５０％減少させるのに必要であることが明らかになった（図７）。ＨＡに結合しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１２の効果は、用量依存的であり、２０μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２によって、ＨＡに対する細胞結合の減少が６０％を超えた（図７）。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２が、少なくとも部分的に、ＨＡへの結合に関与するＣＤ４４上の領域と相互関係し、その結果、血管形成の下流制御を介した抗癌効果またはＥＣＭを介した腫瘍侵襲性を解明することができた。
【００６７】
【表６】
2007530456.tif 000024
【００６８】
【実施例６】
細胞周期アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞周期に対するＨ４６０−１６−２の効果を、ＦＡＣＳ分析を用いて評価した。Ｈ４６０−１６−２で抗体（０、０．２、２．０、２０μｇ／ｍＬ）またはイソタイプ対照（クローン１０７．３、BD Biosciences、Oakville、ON）を、２４、４８、および７２時間にわたって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞とインキュベートした。処置および未処置の細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、単一の細胞をフローサイトメトリで分析することで、相対的なＤＮＡ含有量を見積もった。取得したデータ・セットを、低二倍体染色を示している細胞と同様に単細胞母集団上でゲーティングすることで、ＢＤセルクエスト（CellQuest）を用いて分析した。この分析後、Ｈ４６０−１６−２で２４時間処理した細胞では、周期性を示す細胞の割合が全体的に減少することが示されるとともに、ｓｕｂ−Ｇ１集団の用量依存的増加とを示した。ｓｕｂ−Ｇ１集団に現れた細胞は、細胞膜の完全性が失われたことによるＤＮＡの損失があり、アポトーシスを起こした細胞の集団を現す場合がある（図８）。このデータは、Ｈ４６０−１６−２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞周期に対する効果を有し、またこの効果がアポトーシス細胞の数を用量依存的に増加させた。
【００６９】
証拠の優越性によって示されることは、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４変異体上に存在する炭水化物依存性立体構造エピトープのライゲーションを介して抗癌効果を調節すること、またこのエピトープは少なくとも部分的にＨＡに対するＣＤ４４変異体の結合に関与することである。対応する細胞で、このエピトープに対してＨ４６０−１６−２の結合がアポトーシスを誘導するという証拠もある。Ｓ．Ｎ．１０／７１３，４５１では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞等の発現細胞から同種抗原を免疫沈降させる際に、Ｈ４６０−１６−２抗体を用いることでことができることが示されている。さらに、限定されるものではないがＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって示される技術を用いて、４６０−１６−２抗体に特異的に結合するＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞および／または組織の検出でＨ４６０−１６−２抗体を使用し得ることを示すことができるかもしれない。
【００７０】
したがって、免疫沈降したＨ４６０−１６−２抗原は、そのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを用いて、そのような細胞または組織に対するＨ４６０−１６−２の結合を阻害することができる。さらに、Ｈ４６０−１６−２抗体と同様に、他の抗ＣＤ４４抗体を使用してＣＤ４４抗体の他の形態を免疫沈降および単離することが可能であり、またこの抗原を用いて同一タイプのアッセイを持ち手抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害させることもできる。また、示すことができたことは、ＣＤ４４の全ての形態（すなわち、ｐａｎ−ＣＤ４４抗体）を認識する抗ＣＤ４４抗体を使用してその同種抗原を単離するならば、その抗原はまた、Ｈ４６０−１６−２抗原が該抗原を発現する細胞または組織に対して結合することを阻害することができ、それによって上記抗原を発現する細胞および組織上のＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合も示される。あるいは、Ｈ４６０−１６−２およびｐａｎ−ＣＤ４４抗体の比較を、両抗体が存在する競合結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、細胞ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ，あるいはその他のアッセイで比較することもまた、上記抗原を発現する細胞および組織上のＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合を示すことができる。
【００７１】
この明細書で指摘した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物を、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個々に参照によって援用されるかのように、同一の程度に参照によって本明細書中に援用する。本発明の特定の形態を例示する一方で、本明細書中に記載または示した構成要素の特定の形態または配置に限定されないことが理解される。種々の変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、また本発明が明細書に示し、かつ記載したものに限定されるものではないと考えられることは、当業者にとって明らかである。当業者は、本発明に固有のものと同様に、目的を実施すること、また上記した結果および利点を得ることに、本発明が十分に適していることを容易に理解する。本明細書に記載したいっさいのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、例示を意図したものであって範囲を限定することを意図したものではない。ここでの変更および他の用途は、当業者が想到するものであり、本発明の精神の範囲内に包含されるとともに添付した請求の範囲によって定義される。本発明の説明を特定の好ましい実施形態と関連させておこなったが、理解すべきことは、請求項に記載された通りの本発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないということである。実際、当業者に明らかである本発明を実行するための上記した態様の種々の変更は、別紙の請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【００７２】
【図面の簡単な説明】
【図１】  正常ヒト組織アレイから得た扁桃組織切片上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｈ４６０−１６−２に比べてＢＵ７５のほうがリンパ球を強く、かつ広範囲に染色している。両抗体とも胚中心（緑色矢印）では、より薄く染色された。倍率は２００倍である。
【図２】  乳癌腫瘍（浸潤性腺管癌）に結合したＨ４６０−１６−２の典型的な顕微鏡写真。パネル内の黄色および橙色矢印は、それぞれ間質細胞と悪性細胞シートとを示している。倍率は１００倍である。
【図３】  ヒト乳癌組織アレイから得たパジェット病乳房組織切片上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。ＢＵ７５によって悪性細胞が膜染色されたのに対して、Ｈ４６０−１６−２ではネガティブ染色であった。倍率は４００倍である。
【図４】ヒト乳癌組織アレイから得た乳房組織切片由来の髄様癌上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｈ４６０−１６−２によって悪性細胞が強く膜染色されたのに対して、抗Ｈｅｒ２ではネガティブ染色であった。倍率は２００倍である。
【図５】  確立したＰＣ−３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対するＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンまたは緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与されていた期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。
【図６】  確立されたＰＣ−３前立腺癌モデルでの体重に対するＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンまたは緩衝液対照群の効果。
【図７】  ヒアルロン酸（ＨＡ）に結合するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対するＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（陽性対照）またはイソタイプ対照の効果。
【図８】２４時間処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞周期分布に対するＨ４６０−１６−２またはイソタイプ対照の効果。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図５】
2007530456.tif 000025
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
2007530456.tif 000026
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７】
2007530456.tif 000027
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８】
2007530456.tif 000028
【国際調査報告】
2007530456.tif 000029
2007530456.tif 000030
2007530456.tif 000031
2007530456.tif 000032
2007530456.tif 000033