(57)【要約】【課題】血液脳関門を横切って脳に核酸配列を送達する方法を提供する。【解決手段】本発明は、溶解性（lysosomatic properties）を有する、核酸、特異受容体と結合するレセプターペプチドリガンド、及びプラスに帯電したペプチド部分を含んでおり、細胞膜を横切っての核酸の送達に有用である化合物を提供する。また、本発明は、診断又は治療用途で核酸を脳へ送達するための、前記化合物の使用を提供する。【選択図】図１
2007508030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つで表される分子。
Ｉ．    ［（Ｌ）ｔ−（Ｎ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＩＩ．  ［（Ｌ）ｔ−（Ｈ）ｑ−（Ｎ）ｒ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＩＩＩ．［（Ｐ）ｓ−（Ｎ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ＩＶ．  ［（Ｐ）ｓ−（Ｈ）ｑ−（Ｎ）ｒ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ただし、Ｎは塩基長さが１〜１００の核酸配列、Ｌは特異受容体と結合するペプチドリガンド、Ｐはプラス帯電部分、Ｈは疎水性部分、ｒは１〜２５の整数、ｔは１〜５０の整数、ｓは１〜２５の整数、ｑは０〜２０の整数、ｘは１〜２０の整数である。
【請求項２】
請求項１に記載の分子であって、
前記核酸配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似物、ポリアミド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡモルホリノ、アミノエチルプロリル（ａｅｐ）ＰＮＡ、ピロリジニルＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似物、リボザイム、又はＲＮＡｉであることを特徴とする分子。
【請求項３】
請求項１に記載の分子であって、
前記核酸配列はＰＮＡであることを特徴とする分子。
【請求項４】
請求項１に記載の分子であって、
前記核酸配列は、アンチセンス、抗原又はデコイ機能であることを特徴とする分子。
【請求項５】
請求項１に記載の分子であって、
前記核酸配列は、中性である又はマイナスに帯電していることを特徴とする分子。
【請求項６】
請求項１に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンドは、トランスフェリン、インスリン、インスリン成長因子、又はレプチンの受容体と結合することを特徴とする分子。
【請求項７】
請求項６に記載の分子であって、
前記インスリン成長因子は、インスリン成長因子−Ｉ又はインスリン成長因子−ＩＩであることを特徴とする分子。
【請求項８】
請求項１に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンドは、ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.1）又はＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.2）であることを特徴とする分子。
【請求項９】
請求項１に記載の分子であって、
前記疎水性部分は核酸であることを特徴とする分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の分子であって、
前記疎水性部分は、疎水性ペプチド、脂質酸、脂質分子、オクタノール、コレステロール、疎水性ペプチド保護基、アダマンティン、ピレン、エイコセン酸、Ｃ（６−１６）グリセリド脂質、フェノキサジン、ＤＭＴ基、コラン酸、リトコール酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヘプタデシル基、ヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシアミン、ジヒドロテストステロン、１−ピレン酪酸、アルカン酸、アルカノール、又はそれらいずれかの派生物であることを特徴とする分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の分子であって、
前記アルカン酸は次の構造式で表されることを特徴とする分子。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ
ただし、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒは直鎖又は分岐鎖アルキルである。
【請求項１２】
請求項１０に記載の分子であって、
前記アルカノールは次の構造式で表されることを特徴とする分子。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ
ただし、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒは直鎖又は分岐鎖アルキルである。
【請求項１３】
請求項１０に記載の分子であって、
前記脂質酸は、ウンデカン酸及び／又はドコサヘキサエン酸であることを特徴とする分子。
【請求項１４】
請求項１０に記載の分子であって、
前記疎水性ペプチド保護基は、Ｆｍｏｃ又はＴｂｏｃであることを特徴とする分子。
【請求項１５】
請求項１に記載の分子であって、
前記プラス帯電部分は核酸であることを特徴とする分子。
【請求項１６】
請求項１に記載の分子であって、
前記プラス帯電部分は、プラスに帯電したペプチド、ペプチド模倣薬、ポリカチオン、ヒスチジン、イミダゾール基、２−Ｏ−アミノプロピル、２−Ｏ−ジメチルアミノプロピル、２−Ｏ−イミダゾリル−エチル、２−Ｏ−アミノエチルアミノ−オキシエチル、２−ジメチルアミノエチル−オキシエチル、又はそれらいずれかの派生物であることを特徴とする分子。
【請求項１７】
請求項１に記載の分子であって、
前記プラス帯電部分は、アルギニン、ポリアミン、及び／又はグアニジンの内の少なくとも１つの基を含むことを特徴とする分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の分子であって、
前記ポリアミンは、スペルミン、スペルミジン、又はプトリシンであることを特徴とする分子。
【請求項１９】
請求項１に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンド、前記核酸配列、前記疎水性部分、及び前記プラス帯電部分は、ペプチド結合によって互いに直接的に結合していることを特徴とする分子。
【請求項２０】
請求項１に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンド、前記疎水性部分、前記核酸配列、及び前記プラス帯電部分の間を結合するリンカー部分をさらに含むことを特徴とする分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の分子であって、
前記リンカー部分は、ポリエチレン・グリコール、ジスルフィド、アミド、アミン、オキシアミン、オキシイミン、モルホリン、チオエーテル、チオ尿素スルホンアミド、エーテル、エステル、炭酸塩、カルバミン酸塩、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プラリン、リジン、システイン、グアニジン、又はそれらいずれかの派生物であることを特徴とする分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の分子であって、
前記ポリエチレン・グリコールの分子量は、２０００〜４０，０００の範囲であることを特徴とする分子。
【請求項２３】
次の化学式Ｖ〜ＶＩＩＩのいずれか１つで表される分子。
Ｖ．      ［（Ｌ）ｔ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＶＩ．    ［（Ｌ）ｔ−（Ｈ）ｑ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＶＩＩ．  ［（Ｐ）ｓ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ＶＩＩＩ．［（Ｐ）ｓ−（Ｈ）ｑ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ただし、ＰＮＡは塩基長さが１〜１００のペプチド核酸、Ｌは特異受容体と結合するペプチドリガンド、Ｐはプラス帯電部分、Ｈは疎水性部分、ｒは１〜２５の整数、ｔは１〜５０の整数、ｓは０〜２５の整数、ｑは０〜２０の整数、ｘは１〜２０の整数である。
【請求項２４】
請求項２３に記載の分子であって、
前記ＰＮＡ配列は、アンチセンス、抗原又はデコイ機能であることを特徴とする分子。
【請求項２５】
請求項２３に記載の分子であって、
前記ＰＮＡ配列は、中性である又はマイナスに帯電していることを特徴とする分子。
【請求項２６】
請求項２３に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンドは、トランスフェリン、インスリン、インスリン成長因子、又はレプチンの受容体と結合することを特徴とする分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の分子であって、
前記インスリン成長因子は、インスリン成長因子−Ｉ又はインスリン成長因子−ＩＩであることを特徴とする分子。
【請求項２８】
請求項２３に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンドは、ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.1）又はＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.2）であることを特徴とする分子。
【請求項２９】
請求項２３に記載の分子であって、
前記疎水性部分は核酸であることを特徴とする分子。
【請求項３０】
請求項２３に記載の分子であって、
前記疎水性部分は、疎水性ペプチド、脂質酸、脂質分子、オクタノール、コレステロール、疎水性ペプチド保護基、アダマンティン、ピレン、エイコセン酸、Ｃ（６−１６）グリセリド脂質、フェノキサジン、ＤＭＴ基、コラン酸、リトコール酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヘプタデシル基、ヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシアミン、ジヒドロテストステロン、１−ピレン酪酸、アルカン酸、アルカノール、又はそれらいずれかの派生物であることを特徴とする分子。
【請求項３１】
請求項３０に記載の分子であって、
前記アルカン酸は次の構造式で表されることを特徴とする分子。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ
ただし、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒは直鎖又は分岐鎖アルキルである。
【請求項３２】
請求項３０に記載の分子であって、
前記アルカノールは次の構造式で表されることを特徴とする分子。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ
ただし、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒは直鎖又は分岐鎖アルキルである。
【請求項３３】
請求項３０に記載の分子であって、
前記脂質酸は、ウンデカン酸及び／又はドコサヘキサエン酸であることを特徴とする分子。
【請求項３４】
請求項３０に記載の分子であって、
前記疎水性ペプチド保護基は、Ｆｍｏｃ又はＴｂｏｃであることを特徴とする分子。
【請求項３５】
請求項３０に記載の分子であって、
前記プラス帯電部分は核酸であることを特徴とする分子。
【請求項３６】
請求項２３に記載の分子であって、
前記プラス帯電部分は、プラスに帯電したペプチド、ペプチド模倣薬、ポリカチオン、ヒスチジン、イミダゾール基、２−Ｏ−アミノプロピル、２−Ｏ−ジメチルアミノプロピル、２−Ｏ−イミダゾリル−エチル、２−Ｏ−アミノエチルアミノ−オキシエチル、２−ジメチルアミノエチル−オキシエチル、又はそれらいずれかの派生物であることを特徴とする分子。
【請求項３７】
請求項２３に記載の分子であって、
前記プラス帯電部分は、アルギニン、ポリアミン、及び／又はグアニジンの内の少なくとも１つの基を含むことを特徴とする分子。
【請求項３８】
請求項３７に記載の分子であって、
前記ポリアミンは、スペルミン、スペルミジン、又はプトリシンであることを特徴とする分子。
【請求項３９】
請求項２３に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンド、前記核酸配列、前記疎水性部分、及び前記プラス帯電部分は、ペプチド結合によって互いに直接的に結合していることを特徴とする分子。
【請求項４０】
請求項２３に記載の分子であって、
前記ペプチドリガンド、前記疎水性部分、前記核酸配列、及び前記プラス帯電部分の間を結合するリンカー部分をさらに含むことを特徴とする分子。
【請求項４１】
請求項４０に記載の分子であって、
前記リンカー部分は、ポリエチレン・グリコール、ジスルフィド、アミド、アミン、オキシアミン、オキシイミン、モルホリン、チオエーテル、チオ尿素スルホンアミド、エーテル、エステル、炭酸塩、カルバミン酸塩、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プラリン、リジン、システイン、グアニジン、又はそれらいずれかの派生物であることを特徴とする分子。
【請求項４２】
請求項２１に記載の分子であって、
前記ポリエチレン・グリコールの分子量は、２０００〜４０，０００の範囲であることを特徴とする分子。
【請求項４３】
１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は補助剤と共に、活性成分として、効果的な量の１つ以上の請求項１に記載の分子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４４】
１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は補助剤と共に、活性成分として、効果的な量の１つ以上の請求項２３に記載の分子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４５】
請求項４３に記載の組成物であって、
経口又は非経口投与用に作成されたことを特徴とする組成物。
【請求項４６】
請求項４４に記載の組成物であって、
経口又は非経口的投与用に作成されたことを特徴とする組成物。
【請求項４７】
請求項４３に記載の組成物であって、
非コート錠剤、コート錠剤、ピル、カプセル、粉末、又は懸濁液として作成されたことを特徴とする組成物。
【請求項４８】
請求項４４に記載の組成物であって、
非コート錠剤、コート錠剤、ピル、カプセル、粉末、又は懸濁液として作成されたことを特徴とする組成物。
【請求項４９】
請求項４３に記載の組成物であって、
静脈内投与用に作成されたことを特徴とする組成物。
【請求項５０】
請求項４４に記載の組成物であって、
静脈内投与用に作成されたことを特徴とする組成物。
【請求項５１】
細胞膜を横切って核酸配列を送達する方法であって、
効果的な量の１つ以上の請求項１に記載の分子を細胞に加えるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、
前記細胞は、内皮細胞、神経細胞、又はグリア細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
細胞膜を横切ってＰＮＡ配列を送達する方法であって、
効果的な量の１つ以上の請求項２３に記載の分子を細胞に加えるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、
前記細胞は、内皮細胞、神経細胞、又はグリア細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５５】
血液脳関門を横切って脳に核酸配列を送達する方法であって、
効果的な量の１つ以上の請求項１に記載の分子を患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
血液脳関門を横切って脳にＰＮＡ配列を送達する方法であって、
効果的な量の１つ以上の請求項２３に記載の分子を患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５７】
血液脳関門を横切って脳に核酸配列を送達する方法であって、
効果的な量の１つ以上の請求項４３に記載の分子を患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５８】
血液脳関門を横切って脳にＰＮＡ配列を送達する方法であって、
効果的な量の１つ以上の請求項４４に記載の分子を患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶解性を有する、核酸、特異受容体と結合するレセプターペプチドリガンド、及びプラスに帯電したペプチド部分を含んでおり、細胞膜を横切っての核酸の送達に有用である化合物に関するものである。また、本発明は、診断又は治療の用途で核酸を脳へ送達するための、前記化合物の使用に関する。本発明は、米国仮出願第６０／５１０，１３７号（２００３年１０月１４日出願）の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経疾患の治療において、血液脳関門（blood brain barrier：BBB）の保護機能は、重要な問題となっている。また、血液で運ばれる異物を排除すると、多くの潜在的な治療物質も排除することになってしまう。血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳を血管区画から分離している非常に複雑な内皮インターフェースであり、９８％の薬の脳への送達を妨げている。ＢＢＢは単層の極性化内皮細胞から成り、複雑な密着結合によって結合されている。
【０００３】
小さな薬物分子（＞５００Ｄａ）では、ＢＢＢ透過性に影響を及ぼす主な要因は、分子量、水素結合、親油性、及び血漿タンパクへの結合能力である。また、小さな分子は、栄養素輸送体（グルコース、アミノ酸、有機酸、又はアデノシンのための輸送体）を利用して、ＢＢＢを横切ることができる。しかし、栄養素輸送体は、ＢＢＢ内では、低分子量の物質しか輸送できない。当該技術分野では、ＢＢＢを介して化合物を送達する方法として、薬物の脂質化（lipidization：薬物に脂質様分子を加える）や化学的送達システム（chemical delivery systems：CDS）との関連などのいくつかの方法が知られている。しかし、これらの方法は、比較的小さな分子の送達にしか使用できない。
【０００４】
大きな分子は、インスリン受容体やトランスフェリン受容体などの受容体介在性輸送（receptor mediated transpor：RMT）機構を介して、又は、カチオン化されたアルブミンのなどの吸収介在性トランスサイトーシス（absorptive mediated transcytosis：AMT）によって毛細管関門（capillary barrier）を通過することができる。
【０００５】
当該技術分野では、ペプチドは、受容体介在性トランスサイトーシスによって血液脳関門を通過できることが知られている。この方法は、ＢＢＢの一方の側（例えば管腔膜）での受容体とペプチドとの結合、細胞質を通っての受容体−ペプチド結合体の移動（translocation）、及び、反管腔側（abluminal）膜の外面での受容体からのペプチドの分離を含んでいる。
【０００６】
アンチセンス薬は、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド、oligonucleotide：ODN）の小さな相補鎖であり、ｍＲＮＡ標的内のヌクレオチドの特定配列と結合することによってエンコードされたタンパク質の生成を抑制するように作られている。しかし、アンチセンス薬は、生体膜透過性が低く、分解性が比較的速い。そのため、一般的に、オリゴヌクレオチドの薬効は限られていると見なされている。アンチセンス薬の治療用途を向上させるため、アンチセンス薬のバックボーン（backbone）は化学的に修飾される。アンチセンス化学の第三世代は、ポリアミド（ペプチド）核酸（ＰＮＡ）代用薬である。ＰＮＡは、ＯＤＮの最初の成功した代用薬であり、天然ＤＮＡ又はＲＮＡアンチセンスをベースにした薬物と同等又はそれ以上の結合親和力を示す。ＰＮＡは、生物学的利用能が低い、無極性分子である。そのため、非修飾／裸のＰＮＡ分子の細胞膜通過性は低く、治療用途には使用できない。ＯＤＮとＰＮＡの両方は、ＢＢＢの内皮細胞膜を効率良く通過できないため、ＣＮＳ疾患用の薬を開発におけるそれらの技術の活用可能性を妨げている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある実施形態では、本発明は、次の化学式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つで表される分子を提供する。
Ｉ．    ［（Ｌ）ｔ−（Ｎ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＩＩ．  ［（Ｌ）ｔ−（Ｈ）ｑ−（Ｎ）ｒ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＩＩＩ．［（Ｐ）ｓ−（Ｎ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ＩＶ．  ［（Ｐ）ｓ−（Ｈ）ｑ−（Ｎ）ｒ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ただし、Ｎは塩基長さが１〜１００の核酸配列、Ｌは特異受容体と結合するペプチドリガンド、Ｐはプラス帯電部分、Ｈは疎水性部分、ｒは１〜２５の整数、ｔは１〜５０の整数、ｓは１〜２５の整数、ｑは０〜２０の整数、ｘは１〜２０の整数である。
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、次の化学式Ｖ〜ＩＶのいずれか１つで表される分子を提供する。
Ｖ．      ［（Ｌ）ｔ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＶＩ．    ［（Ｌ）ｔ−（Ｈ）ｑ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＶＩＩ．  ［（Ｐ）ｓ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ＶＩＩＩ．［（Ｐ）ｓ−（Ｈ）ｑ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ただし、ＰＮＡ（Polyamide Nucleic Acid：ポリアミド核酸）は塩基長さが１〜１００のペプチド核酸、Ｌは特異受容体と結合するペプチドリガンド、Ｐはプラス帯電部分、Ｈは疎水性部分、ｒは１〜２５の整数、ｔは１〜５０の整数、ｓは０〜２５の整数、ｑは０〜２０の整数、ｘは１〜２０の整数である。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、細胞膜を横切って分子を送達する方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明はさらに、血液脳関門（blood-brain barrier）を横切って、脳に核酸配列を送達する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ある実施形態では、本発明は、次の化学式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つで表される分子を提供する。
Ｉ．    ［（Ｌ）ｔ−（Ｎ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＩＩ．  ［（Ｌ）ｔ−（Ｈ）ｑ−（Ｎ）ｒ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＩＩＩ．［（Ｐ）ｓ−（Ｎ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ＩＶ．  ［（Ｐ）ｓ−（Ｈ）ｑ−（Ｎ）ｒ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ただし、Ｎは塩基長さが１〜１００の核酸配列、Ｌは特異受容体と結合するペプチドリガンド、Ｐはプラス帯電部分、Ｈは疎水性部分、ｒは１〜２５の整数、ｔは１〜５０の整数、ｓは１〜２５の整数、ｑは０〜２０の整数、ｘは１〜２０の整数である。
【００１２】
ある実施形態では、本発明は、次の化学式Ｖ〜ＩＶのいずれか１つで表される分子を提供する。
Ｖ．      ［（Ｌ）ｔ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＶＩ．    ［（Ｌ）ｔ−（Ｈ）ｑ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｐ）ｓ］ｘ
ＶＩＩ．  ［（Ｐ）ｓ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｈ）ｑ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ＶＩＩＩ．［（Ｐ）ｓ−（Ｈ）ｑ−（ＰＮＡ）ｒ−（Ｌ）ｔ］ｘ
ただし、ＰＮＡ（Polyamide Nucleic Acid：ポリアミド核酸）は塩基長さが１〜１００のペプチド核酸、Ｌは特異受容体と結合するペプチドリガンド、Ｐはプラス帯電部分、Ｈは疎水性部分、ｒは１〜２５の整数、ｔは１〜５０の整数、ｓは０〜２５の整数、ｑは０〜２０の整数、ｘは１〜２０の整数である。
【００１３】
本発明のある実施形態では、Ｎは塩基長さ１〜１００の核酸配列である。本発明の他の実施形態では、Ｎは塩基長さ１〜１０の核酸配列である。本発明の他の実施形態では、Ｎは塩基長さ１〜２０の核酸配列である。本発明の他の実施形態では、Ｎは塩基長さ２０〜３０の核酸配列である。本発明の他の実施形態では、Ｎは塩基長さ３０〜４０の核酸配列である。本発明の他の実施形態では、Ｎは塩基長さ４０〜５０の核酸配列である。本発明の他の実施形態では、Ｎは塩基長さ５０〜１００の核酸配列である。
【００１４】
本発明のある実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは１〜１００である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは１〜１０である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは１〜２０である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは２０〜３０である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは３０〜４０である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは４０〜５０である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡの塩基長さは５０〜１００である。
【００１５】
本発明のある実施形態では、ｑは０〜２０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｑは２〜１０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｑは６〜１６の整数である。本発明の他の実施形態では、ｑは８である。本発明の他の実施形態では、ｑは９である。本発明の他の実施形態では、ｑは０である。
【００１６】
本発明のある実施形態では、ｒは０〜２０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｒは１〜１０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｒは１０〜２０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｒは２〜５の整数である。
【００１７】
本発明のある実施形態では、ｓは０〜２５の整数である。本発明の他の実施形態では、ｓは２〜１５の整数である。本発明の他の実施形態では、ｓは２〜６の整数である。本発明の他の実施形態では、ｓは４である。本発明の他の実施形態では、ｓは０である。
【００１８】
本発明のある実施形態では、ｔは１〜５０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｔは５〜２５の整数である。本発明の他の実施形態では、ｔは１０〜１５の整数である。
【００１９】
本発明のある実施形態では、ｘは１〜２０の整数である。本発明の他の実施形態では、ｘは２〜１５の整数である。本発明の他の実施形態では、ｘは５〜１０の整数である。
【００２０】
本発明のある実施形態では、核酸配列はｍＲＮＡである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はｃＤＮＡである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はＤＮＡである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ類似物である。本発明の他の実施形態では、核酸配列はＰＮＡ（polyamide nucleic acid：ポリアミド核酸）である。本発明の他の実施形態では、核酸配列はＰＮＡモルホリノである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はアミノエチルプロリル（aminoethylprolyl：aep）ＰＮＡである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はピロリジニルＰＮＡである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はオリゴヌクレオチドである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はオリゴヌクレオチド類似物である。本発明の他の実施形態では、核酸配列はリボザイムである。本発明の他の実施形態では、核酸配列はＲＮＡｉである。
【００２１】
本発明のある実施形態では、核酸配列はアンチセンスである。本発明の他の実施形態では、核酸配列は抗原である。本発明の他の実施形態では、核酸配列はデコイ機能である。本発明のある実施形態では、核酸配列は中性である。本発明の他の実施形態では、核酸配列はマイナスに帯電している。本発明のある実施形態では、核酸配列は内在性配列に対してアンチセンス方向である。
【００２２】
“ヌクレオチド”という用語は、窒素含有塩基（ＤＮＡではアデニン、グアニン、チミン又はシトシン、ＲＮＡではアデニン、グアニン、ウラシル又はシトシン）、リン酸塩分子、及び糖分子（ＤＮＡではデオキシリボース、ＲＮＡではリボース）から成るＤＮＡ又はＲＮＡのサブユニットを表している。様々なヌクレオチドが結合することにより、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が形成されている。ヌクレオチドという用語は、さらに、保護グアニン、疑似グアニン（pseudo-guanine）或いは保護疑似グアニン（２，６−ジアミノプリン）、保護アデニン、保護シトシン、疑似シトシン或いは保護疑似シトシン、疑似イソシトシン或いは保護疑似イソシトシン、保護ウラシルを表している。
【００２３】
“オリゴヌクレオチド”という用語は、通常は２５個以下のヌクレオチドから成る分子を意味する。
【００２４】
“アンチセンス”は、体で作られたｍＲＮＡ分子と正反対の配列を有する核酸配列が前記ＲＮＡ分子と結合して、タンパク質の生成を防止することを意味する。
【００２５】
“ペプチド核酸（peptide nucleic acids：PNA）”は、一部の点はオリゴヌクレオチド類似物と同様であるが、その他の非常に重要な点では、その構造が大変異なる分子を意味する。ペプチド核酸では、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース核酸バックボーンは、ペプチドと糖リン酸ジエステルよりも類似したバックボーンに置き換えられる。各サブユニットは、このバックボーンに付着する、自然発生的又は非自然発生的塩基を有している。これに限定されるものではないが、一例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン又はその類似物の繰り返しユニットから構成されるバックボーンは、リンカー（例えばカルボキシメチル部分又はその類似物）を介して前記ユニットのグリシン部分の窒素原子に付着する核酸塩基を有している。前記ユニットは、グリシン部分のカルボキシル基とアミノエチル部分のアミノ基との間に形成されたアミノ結合によって互いに結合される。核酸塩基は、核酸の４つの一般的な核酸塩基の内の１つである。または、それらは、他の天然又は人工の核酸塩基を含むことができる。デオキシリボース・バックボーンの急速な逸脱（radical deviation）のために、それらの分子はペプチド核酸と名付けられた。
【００２６】
“抗原”は、二本鎖ＤＮＡと結合する分子を意味する。抗原は、細胞内での遺伝子発現を増進又は抑制することができる。
【００２７】
ある実施形態では、本発明は、ＰＮＡベースの核酸を送達する一方で、ＰＮＡをペプチドリガンドとプラス帯電部分との間のスペーサとして使用する、改善された方法を提供する。したがって、キメラは、ＲＭＴ又はＡＭＴを介して、血液脳関門を横切ることができる。したがって、ある実施形態では、ＰＮＡ／核酸は、２つのペプチド部分の間で、立体／静電相互作用を減少させるスペーサとして機能する。他の実施形態では、ＰＮＡ／核酸は、アンチセンス部分、抗原部分、又は遺伝子修飾部分として使用される。ある実施形態では、ＰＮＡ／核酸分子は、両篩型（amphiphloic）脳ベクター内で、無極性ペプチド様部分として使用される。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は、ＰＮＡ−ペプチド・キメラに疎水性部分を加えた後に、ＢＢＢを通ってＰＮＡベースの核酸を送達するための改善された方法を提供する。その結果、化合物は、その両篩型の構造、受容体を介したトランスサイトーシス、又はその両方の機構によって、ＢＢＢを横断することができる。
【００２９】
本発明のある実施形態では、ペプチドリガンドはトランスフェリンの受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、ペプチドリガンドはインスリンの受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、ペプチドリガンドはインスリン成長因子の受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、インスリン成長因子はインスリン成長因子−Ｉの受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、インスリン成長因子はインスリン成長因子−ＩＩの受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、ペプチドリガンドはレプチンの受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、ペプチドリガンドはＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.1）の受容体と結合する。本発明の他の実施形態では、ペプチドリガンドはＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.2）の受容体と結合する。
【００３０】
本発明のある実施形態では、疎水性部分は核酸である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分は核酸類似物である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分は疎水性ペプチドである。本発明の他の実施形態では、疎水性部分は脂質酸である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分は脂質分子である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分はオクタノールである。本発明の他の実施形態では、疎水性部分はコレステロールである。本発明の他の実施形態では、疎水性部分は疎水性ペプチド保護基である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分はアダマンティン（adamantine）である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分はピレンである。本発明の他の実施形態では、疎水性部分はエイコセン酸である。本発明の他の実施形態では、疎水性部分はＣ（６−１６）グリセリド脂質である。ある実施形態では、疎水性部分はフェノキサジンである。本発明のある実施形態では、疎水性部分はＤＭＴ基である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はコラン酸である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はリトコール酸である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はミリスチン酸である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はパルミチン酸である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はヘプタデシル基である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はヘキサデシルグリセロールである。本発明のある実施形態では、疎水性部分はゲラニルオキシヘキシル基である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はヘキサデシアミンである。本発明のある実施形態では、疎水性部分はジヒドロテストステロンである。本発明のある実施形態では、疎水性部分は１−ピレン酪酸である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はアルカン酸である。本発明のある実施形態では、疎水性部分はアルカノールである。本発明のある実施形態では、疎水性部分は上記したいずれかの成分の派生物である。本発明のある実施形態では、アルカン酸は次の構造式で表される分子である。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ
ただし、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒは直鎖又は分岐鎖アルキルである。他の実施形態では、ｎは６〜１６の整数である。本発明のある実施形態では、アルカノールは次の構造式で表される分子である。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ
ただし、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒは直鎖又は分岐鎖アルキルである。本発明の他の実施形態では、ｎは６〜１６の整数である。本発明のある実施形態では、脂質酸はウンデカン酸である。本発明の他の実施形態では、脂質酸はドコサヘキサエン酸である。本発明のある実施形態では、疎水性ペプチド保護基はＦｍｏｃである。本発明の他の実施形態では、疎水性ペプチド保護基はＴｂｏｃである。
【００３１】
ここでは、“アルキル基”は、直鎖、分岐鎖、及び環状アルキル基を含んでいる脂肪族飽和炭化水素を意味する。本発明のある実施形態では、アルキル基は１〜４個の炭素を有する。本発明のある実施形態では、アルキル基はメチル基である。本発明のある実施形態では、アルキル基はエチル基である。本発明のある実施形態では、アルキル基はプロピル基である。本発明のある実施形態では、アルキル基はブチル基である。アルキル基は置換されない。または、アルキル基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシカルボニル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、チオ、及びチオアルキルから成る群より選択される１つ又は複数の基と置換される。
【００３２】
ある実施形態では、分子は、本発明に係る修飾されたＰＮＡのＮ又はＣ末端と結合するプラス帯電部分を持つようにデザインされている。
【００３３】
本発明のある実施形態では、プラス帯電部分は核酸配列である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は核酸類似物である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＰＮＡである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はプラスに帯電したペプチドである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はペプチド模倣薬である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はポリカチオンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はヒスチジンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はイミダゾール基である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は２−Ｏ−アミノプロピルである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は２−Ｏ−ジメチルアミノプロピルである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は２−Ｏ−イミダゾリル−エチルである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は２−Ｏ−アミノエチルアミノ−オキシエチルである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は２−ジメチルアミノエチル−オキシエチルである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分は上記したいずれかの成分の派生物である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はアルギニンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＤ−アルギニンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はポリアルギニンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はポリアミンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はグアニジンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はスペルミンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はスペルミジンである。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はプトリシン（putricine）である。
【００３４】
本発明のある実施形態では、プラス帯電部分はカチオン性ペプチドである。本発明の他の実施形態では、カチオン性ペプチドはＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.3）である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＣＫ４ＨＫ３Ｃ（SEQ ID: No.4）である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.3）である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＣＨＫ３ＨＫ２ＨＣ（SEQ ID: No.5）である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＣ（ＨＫ）４Ｃ（SEQ ID: NO.6）である。本発明の他の実施形態では、プラス帯電部分はＣＨＫＨＫＨＨＫＨＣ（SEQ ID: No.7）である。
【００３５】
本発明のある実施形態では、ＰＮＡ配列はＣＣＧＣＴＣＣＧ（SEQ ID: No.8）である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡ配列はＣＡＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＧＴ（SEQ ID: NO.9）である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡ配列はＣＴＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＣ（SEQ ID: No.10）である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡ配列はＴＡＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴ（SEQ ID: No.11）である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡ配列はＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ（SEQ ID: No.12）である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡ配列はＧＣＡＴ（SEQ ID: No.13）である。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡは、（アミノエチルプロリル（ａｅｐ）ＰＮＡ）１−２０である。
【００３６】
ある実施形態では、ペプチドリガンド、疎水性部分、ＰＮＡ／核酸配列、及びプラス帯電部分は、ペプチド結合によって互いに直接的に結合している。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫ６ＨＣ−（ＰＮＡ）ｒ−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.14）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫ６ＨＣ−（ＰＮＡ）ｒ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.15）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＫ４ＨＫ３Ｃ−（ＰＮＡ）ｒ−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.16）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＫ４ＨＫ３Ｃ−（ＰＮＡ）ｒ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.17）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫ３ＨＫ２ＨＣ−（ＰＮＡ）ｒ−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.18）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫ３ＨＫ２ＨＣ−（ＰＮＡ）ｒ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.19）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、Ｃ（ＨＫ）４Ｃ−（ＰＮＡ）ｒ−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.20）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、Ｃ（ＨＫ）４Ｃ−（ＰＮＡ）ｒ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.21）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫＨＫＨＨＫＨＣ−（ＰＮＡ）ｒ−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.22）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫＨＫＨＨＫＨＣ−（ＰＮＡ）ｒ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.23）を含んでいる分子を提供する。本発明のある実施形態では、ｒは５〜２５である。他の実施形態では、ｒは５〜１０である。他の実施形態では、ｒは１０〜２０である。
【００３８】
ある実施形態では、本発明は、ＨＡＩＹＰＲＨ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.24）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.25）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＨＡＩＹＰＲＨ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＫ４ＨＫ３Ｃ（SEQ ID: No.26）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＫ４ＨＫ３Ｃ（SEQ ID: No.27）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＨＡＩＹＰＲＨ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＨＫ３ＨＫ２ＨＣ（SEQ ID: No.28）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＨＫ３ＨＫ２ＨＣ（SEQ ID: No.29）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＨＡＩＹＰＲＨ−（ＰＮＡ）ｒ−Ｃ（ＨＫ）４Ｃ（SEQ ID: No.30）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−（ＰＮＡ）ｒ−Ｃ（ＨＫ）４Ｃ（SEQ ID: No.31）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＨＡＩＹＰＲＨ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＨＫＨＫＨＨＫＨＣ（SEQ ID: No.32）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−（ＰＮＡ）ｒ−ＣＨＫＨＫＨＨＫＨＣ（SEQ ID: No.33）を含んでいる分子を提供する。本発明のある実施形態では、ｒは５〜２５である。他の実施形態では、ｒは５〜１０である。他の実施形態では、ｒは１０〜２０である。
【００３９】
ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫ６ＨＣ−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.34）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＣＨＫ６ＨＣ−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.35）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.36）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＨＡＩＹＰＲＨ−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.37）を含んでいる分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＧＣＡＴ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.38）を含んでいる分子を提供する。
【００４０】
本発明のある実施形態では、前記分子は、前記ペプチドリガンド、前記疎水性部分、前記ＰＮＡ／核酸配列、及び前記プラス帯電部分の間を結合するリンカー部分をさらに含んでいる。本発明の他の実施形態では、リンカー部分はポリエチレン・グリコール（polyethylene glycol：PEG）である。本発明の他の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、２０００〜４０，０００の範囲である。本発明のある実施形態では、リンカー部分はジスルフィドである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はアミドである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はアミンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はオキシアミンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はオキシイミンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はモルホリンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はチオエーテルである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はチオ尿素スルホンアミドである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はエーテルである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はエステルである。本発明のある実施形態では、リンカー部分は炭酸塩である。本発明のある実施形態では、リンカー部分はカルバミン酸塩である。本発明のある実施形態では、リンカー部分はグアニジンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はアビジンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はストレプトアビジンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はビオチンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はプラリン（praline）である。本発明のある実施形態では、リンカー部分はリジンである。本発明のある実施形態では、リンカー部分はシステインである。
【００４１】
ある実施形態では、ポリエチレン・グリコールと結合した標識リンカー又はペプチドは、分子と結合する。そして、隔壁透過性（phramacokinetic）を向上させ、両親媒性ＰＮＡによって生じる副作用の可能性を克服する。ある実施形態では、リンカーは、周知の方法によって分子と結合する。ある実施形態では、本発明はさらに、薬学的に許容される賦形剤又は補助材と共に、活性成分として、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を含んでいる組成物を提供する。本発明のある実施形態では、前記組成物は経口又は非経口投与用に作成される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、非コート錠剤、コート錠剤、ピル、カプセル、粉末、又は懸濁液として作成される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、静脈内投与用に作成される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、経鼻投与用に作成される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、エアロゾルによって投与される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、経皮投与用に作成される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、軟膏、クリーム又はゲル形態で作成される。本発明の他の実施形態では、前記組成物は、液体投薬形態で作成される。適切な液体投薬形態の例としては、水中の溶液又は懸濁液、薬学的に許容される脂肪又は油、アルコール又は他の有機溶媒（エステル、乳濁液、シロップ、又はエリキシル剤）、溶液及び／又は水懸濁液がある。
【００４２】
適切な賦形剤又は担体は固体又は液体であり、種類は投与形態に応じて選択される。また、組成物を送達するのにリポソームを使用することもできる。適切な固形担体の例としては、乳糖、ショ糖、ゼラチン、及び寒天がある。経口投薬形態は、適切な結合剤、滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香料添加剤、流動促進剤、及び融解剤を含み得る。液体投与形態は、例えば、適切な溶媒、防腐剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味料、増粘剤、及び融解剤を含み得る。非経口及び静脈内投与形態は、それらを注射又は選択された送達システムの種類に適合させるためのミネラル及び他の物質を含み得る。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る分子を合成する方法を提供する。
【００４４】
ある実施形態では、本発明はさらに、細胞膜を横切ってＰＮＡ／核酸配列を送達する方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を細胞に加えるステップを含む方法を提供する。本発明のある実施形態では、前記細胞は内皮細胞である。本発明の他の実施形態では、前記細胞は神経細胞である。本発明の他の実施形態では、前記細胞はグリア細胞である。本発明の他の実施形態では、前記細胞は筋肉細胞である。
【００４５】
ある実施形態では、本発明は、哺乳類細胞にＰＮＡを送達する改善された方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、神経、内皮送達特性が改善された、両親媒性ＰＮＡキメラ部分を提供する。
【００４６】
ある実施形態では、本発明はさらに、細胞内顆粒へのＰＮＡ／核酸配列の細胞内標的方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を細胞に加えるステップを含む方法を提供する。ある実施形態では、電荷分布、無極性ＰＮＡ／核酸鎖の長さ、及び疎水性が、細胞内の適合性（compartization）に影響を与える。ある実施形態では、本発明は、細胞内顆粒へのＰＮＡ／核酸配列の細胞内標的方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る細胞膜を横切る分子を細胞に加えるステップを含む方法を提供する。
【００４７】
ある実施形態では、本発明はさらに、血液脳関門を横切って、脳にＰＮＡ／核酸配列を送達する方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を患者に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、血液脳関門を横切って、脳にＰＮＡ／核酸配列を送達する方法であって、本発明に係る組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００４８】
本発明のある実施形態では、ＰＮＡベースの構成物（construct）のＢＢＢ貫通性を高めるのに、ポリアルギニン・オリゴマーが使用される。本発明の他の実施形態では、ＰＮＡベースの構成物のＢＢＢ貫通性を高めるのに、アルギニン・グアニジノ基が使用される。本発明のある実施形態では、ＢＢＢを介しての脳への取り込みは、基性アミノ酸輸送体によっての増加する。本発明のある実施形態では、脳への取り込みの向上は、正電荷の存在に起因する透過面の増加によってＡＭＴが増大した結果である。
【００４９】
本発明のある実施形態では、ＰＮＡベースの構成物のＢＢＢ貫通性を高めるのに、ポリアミンが使用される。本発明の他の実施形態では、ポリアミンはプトリシン（putricine）である。本発明の他の実施形態では、ポリアミンはスペルミジンである。本発明の他の実施形態では、ポリアミンはスペルミンである。ある実施形態では、ＢＢＢを介しての脳への取り込みは、ポリアミン輸送体によって増加する。本発明のある実施形態では、脳への取り込みの向上は、正電荷の存在に起因する透過面の増加によってＡＭＴが増大した結果である。
【００５０】
ある実施形態では、本発明はさらに、脳内で発現させるために、血液脳関門を横切って遺伝子を送達する方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を患者に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、脳内で発現させるために、血液脳関門を横切って遺伝子を送達する方法方法であって、本発明に係る組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５１】
ある実施形態では、本発明はさらに、遺伝子発現を調節する方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を患者に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、遺伝子発現を調節する方法であって、本発明に係る組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５２】
ある実施形態では、本発明は、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を含んでいるキットを提供する。他の実施形態では、前記キットは、遺伝子の標識付け（ラベリング）を可能にする。他の実施形態では、前記キットはさらに、ラベリング及び／又は反応緩衝液を含んでいる。他の実施形態では、前記分子は、蛍光標識、比色標識、放射性標識、又は化学標識と結合する。
【００５３】
ある実施形態では、本発明はさらに、病気を治療、予防、及びコントロールする方法であって、効果的な量の１つ以上の本発明に係る分子を患者に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明はさらに、病気を治療、予防、及びコントロールする方法であって、本発明に係る組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態では、前記病気は、中枢神経系関連疾患である。
【００５４】
以下、実施例（実験の詳細）によって、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、以下の実施例は、本発明の理解をより容易にするためのものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５５】
《手法》
〈ＰＮＡ及びペプチドの合成〉
オリゴマーは、ＣｈｅｍＳｐｅｅｄ社製の自動合成装置を用いて、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護された核酸塩基モノマー又はアミノ酸（amino-acids：AA）を、各結合サイクルで１：３の比率で二重結合させることによって、５ミクロモルのスケールで作成される。使用される樹脂は、アミノ酸が充填済のワング（wang）樹脂（０．５７ｍｍｏｌｅ／ｇ）又はＴＧＡ樹脂９ Ｎｏｖａｓｙｎ（０．１５ｍｍｏｌｅ／ｇ）である。反応総量は、２５０マイクロリットルであり、使用されるカップリング試薬はＢＯＰ又はＨＢＴＵである（ジイソプロピルエチルアミン及び２，６−ルチジンの存在下で）。ペプチドと結合したＰＮＡ又はＰＮＡは、トリエチルシリル（２ｈ）を含んでいるトリフルオロ酢酸１ｍｌによって、脱保護され樹脂から除去される。生成物は、冷やされたジエチルエーテル１４ｍｌで沈殿させることにより回収され、５０℃で、１０ミクロンのＶＹＤＡ社製カラム上でＲＰ−ＨＰＬＣされる。２５分間、ＲＴ−１０分間で、アセトニトリル（ＡＣＮ）を１０％から９０％まで濃度勾配させる。分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて質量スペクトルを測定する。
【００５６】
〈細胞培養〉
神経細胞及びＢＢＢのインビトロ・モデルとしては、ヒト神経芽細胞腫ＮＭＢ細胞系、ラット・カテコールアミン細胞系ＰＣ１２、及びマウス脳由来内皮細胞系ｂＥＮＤを使用する。ＮＭＢ細胞は、１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ社製の仔牛血清を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco modified Eagle medium：DMEM）で成長するように調節される。ＰＣ１２細胞は、１０％ウマ血清及び５％仔牛血清を含んでいるＤＭＥＭで培養される。ｂＥＮＤ３細胞は、２ｍＭグルタミンが追加された１０％仔牛血清を含んでいるＤＭＥＭで培養される。細胞は、ＣＯ２濃度が１０％の加湿された培養器内で、３７℃で維持される。細胞は、４〜５日間毎に、規定どおりに継代培養される。細胞（５×１０３）は、９６ウエルに蒔かれ、シャーレはポリ−Ｌ−オルニチンによって前処理される。
【００５７】
〈取り込み実験〉
ＰＮＡ及びＰＮＡ結合体の取り込みは、フルオレセイン標識されたペプチド−ＰＮＡ結合体、又はフルオレセイン標識された非修飾ＰＮＡの培養後、細胞内に残存する蛍光性を測定することにより決定される。化合物は、ＮＭＢ、ＰＣ１２、又はｂＥＮＤ３と共に、様々な期間で培養される。培養後、細胞は氷で冷やしたＰＢＳで何度も洗浄され、その後、酸（１．０Ｍ ＮａＣｌ／０．４Ｍ ＮａＯＡｃ、ＰＨ３．３）で洗浄される。取り込まれなかったオリゴマー及び死細胞の両方を除去する手法は周知である。最後の洗浄の後、細胞内の蛍光性を、フルオレメータ（fluoremeter：BMG Labtechnologies社製のFLUOstar）で測定する。
【００５８】
《実施例》
〈例１：ＰＣ１２細胞〉
［ＰＮＡ結合体の神経細胞系ＰＣ１２への取り込み］
細胞は、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされている９６ウエルシャーシ上に蒔かれる。蒔いた翌日、培地は、様々な濃度（０．１〜１μＭ）のＰＮＡを含んでいる新鮮な無血清培地と取り替えられる。３時間後、培養培地は取り除かれ、細胞は酸洗浄溶液で３回洗浄される。そして、蛍光性が測定される（図１）。
対照=ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ（SEQ ID: No.39）
ＫＢＰ１０＝ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.40）−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ（SEQ ID: No.39）−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.41）
ＫＢＰ１１＝ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.40）−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−（SEQ ID: No.39）−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.41）
図１に示すように、ＫＢＰ１０又はＫＢＰ１１のＰＣ１２細胞への取り込みは、ＰＮＡ単独の取り込みよりもはるかに高い。
【００５９】
［細胞毒性の測定］
ＰＣ１２細胞は、ＰＮＡ又はペプチド−核酸結合体と共に４８時間培養される。培養終了後、光学顕微鏡によって細胞形態が検査される。培地は、ニュートラルレッドを含んでいる培地と交換される。分光光度計によってニュートラルレッド取り込み量が測定され、細胞毒性の指標として使用される（図２）。
対照（ＰＮＡ）=ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ（SEQ ID: No.39）
ＫＢＰ１０＝ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.40）−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ（SEQ ID: No.39）−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（SEQ ID: No.41）
ＫＢＰ１１＝ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.40）−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−（SEQ ID: No.39）−ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID: No.41）
図２に示すように、ＫＢＰ１０とＫＢＰ１１とでは、ニュートラルレッドのＰＣ１２細胞への取り込みに著しい差はなかった。
【００６０】
〈例２：ｂＥＮＤ３細胞系（ＢＢＢ細胞モデル）〉
フルオレセイン標識されたＰＮＡ（ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ）（SEQ ID.No.39）又はペプチドＰＮＡの、ｂＥＮＤ３（ＣＨＫ６ＨＣ（SEQ ID: No.40）−ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＡＴ−（SEQ ID: No.39）ＨＡＩＹＰＲＨ（SEQ ID. No.41）への取り込み。
【００６１】
ｂＥＮＤ３細胞は、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングされた３５ｍｍシャーシ上に蒔かれる。蒔いた２４時間後、細胞培養培地は、１０μＭ ＰＮＡ又はペプチドＰＮＡを含んでいるＤＭＥＭと取り替えられる。細胞は４時間培養される。培養後、細胞はＰＢＳで３回洗浄される。そして、細胞を共焦点顕微鏡で観察できるように、培地は新鮮なＤＭＥＭと交換される（図３）。図３に示すように、ペプチド−ＰＮＡの取り込みは、はっきりと観察された。しかし、ＰＮＡ単独の取り込みは見られなかった。
【００６２】
〈例３：ＮＭＢ細胞系〉
ＰＮＡ（ＧＣＡＴ）又はペプチド−ＰＮＡ結合体（ＧＣＡＴ−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ）（SEQ ID: No.42）のヒト神経細胞系ＮＭＢへの取り込み。細胞は、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングされた９６ウエルシャーシ上に蒔かれる。蒔いた１日後、培地は、１マイクロモル ＰＮＡを含んでいる新鮮な無血清培地と交換される。１５又は６０分後、培養培地は取り除かれ、細胞は酸洗浄溶液で３回洗浄される。そして、蛍光性が測定される（図４）。
【００６３】
〈例４：インビボでの脳への取り込み−頸動脈内注入〉
ペプチド−ＰＮＡ結合体（ＫＢＰ１０、ＫＢＰ１１）のラットの脳毛細血管の管腔側への取り込みを、１μＭ ＰＮＡ溶液を頸動脈内注入した後に測定した。ｌｍｌ／３００ｇのEquitezine（ペントバルビタールナトリウム、抱水クロラール）を腹腔内投与することによって、３００ｇのウイスターラットに麻酔をかけた。ラットをあお向けにし、胸筋と下顎との間の正中線で切断した。筋肉は、鈍的切開により分離され、血管を露出させた。外頸動脈（external carotid）、蝶口蓋管（pterygopalatine）、及び後頭動脈（occipital arteries）を、縫合糸を使用して閉塞した。そして、分岐部（bifurcation）の手前の総頸動脈（common carotid）及び内頸動脈（internal carotid）にクランプを取り付けた。分岐部の近傍の動脈を切開し、後の使用のために分岐部の下に縫合糸を挿入した。生理食塩水を充填済みの透明なビニールチューブ（ＩＤ ０．５ｍｍ、ＯＤ ０．８ｍｍ）を挿入した。そして、血管内でチューブを保持すべく及びリッキングを防止すべく、前記縫合糸を使用して縫合閉塞した。前記チューブには微量注入ポンプが接続され、溶液を１ｍｌ／１０分の割合で注入した。溶液は、総量で０．５ｍｌ注入した。その後、チューブを取り出し、血管を閉塞し、ラットをＰＢＳ（ｘｌ）で潅流した。ＰＢＳ溶液の後に、脳を４％のパラホルムアルデヒドで潅流した。脳を取り出し、共焦点顕微鏡用のスライド用に８μｍに切断する。ＫＢＰ１０（図５Ａ）又はＫＢＰ１１（図５Ｂ）を頸動脈内注入した５分後に、共焦点顕微鏡でＦＩＴＣ標識されたＫＢＰ１０又はＫＢＰ１１の取り込みを分析した。ＫＢＰ１０又はＫＢＰ１１の実質的な分布は、化合物がＢＢＢをはっきりと横切ったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＰＮＡ結合体のＰＣ１２細胞内への取り込みを示している。
【図２】ＰＮＡ結合体を４８時間培養した後の、ニュートラルレッドのＰＣ１２細胞への取り込みを示している。
【図３Ａ】フルオレセイン標識されたペプチド−ＰＮＡ結合体、又はフルオレセイン標識された非修飾ＰＮＡと共に培養されたｂＥＮＤ３細胞の蛍光画像を示している。
【図３Ｂ】フルオレセイン標識されたペプチド−ＰＮＡ結合体、又はフルオレセイン標識された非修飾ＰＮＡと共に培養されたｂＥＮＤ３細胞の蛍光画像を示している。
【図４】ＰＮＡ結合体のヒト神経系ＮＭＢ細胞への取り込みを示している。ＰＮＡ結合体のＰＣ１２細胞内への取り込みを示している。
【図５Ａ】インビボでのＰＮＡ結合体の脳への取り込みを示している。
【図５Ｂ】インビボでのＰＮＡ結合体の脳への取り込みを示している。
【図１】
2007508030.tif 000003
【図２】
2007508030.tif 000004
【図３Ａ】
2007508030.tif 000005
【図３Ｂ】
2007508030.tif 000006
【図４】
2007508030.tif 000007
【図５Ａ】
2007508030.tif 000008
【図５Ｂ】
2007508030.tif 000009
【国際調査報告】
2007508030.tif 000010
2007508030.tif 000011