(57)【要約】  本発明は、インターロイキン−１５受容体α鎖への結合を担う、ヒトインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）のエピトープの同定に関する。このエピトープの形成には２個のＩＬ−１５領域が関与する。Ｂヘリックスに位置する配列に対応する第１領域（４４ＬＬＥＬＱＶＩＳＬ５２、ペプチド１）、およびヘリックスＣに位置する配列に対応する第２領域（６４ＥＮＬＩＩ６８、ペプチド２、または６４ＥＮＬＩＩＬ６９、ペプチド２ａ）である。アゴニストまたはアンタゴニスト特性を示すムテインは記載されており、治療剤として有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα鎖への高親和性結合をもたらすヒトＩＬ−１５のエピトープの一部であるペプチドであって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＬ４４〜Ｌ５２領域の配列（配列番号４）、またはヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＥ６４〜Ｉ６８領域の配列（配列番号６）、またはヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＥ６４〜Ｌ６９領域の配列（配列番号６７）を有することを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＬ４４〜Ｌ５２領域の配列（配列番号４）、またはヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＥ６４〜Ｉ６８領域の配列（配列番号６）を有することを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から、残基４４〜残基５２、および／または残基６４〜残基６８、および／または残基６４〜残基６９にまたがる領域内の少なくとも１つの置換、欠失、または付加によって導き出しうる配列を有し、この残基の番号はヒト成熟野生型ＩＬ−１５に対応するが、ただしそれから得られた該ＩＬ−１５ムテインは、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高いＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有することを特徴とする、ＩＬ−１５ムテイン。
【請求項５】
残基４４〜残基５２、および／または残基６４〜残基６８にかかる領域内の少なくとも１つの置換、欠失、または付加によってヒト成熟野生型ＩＬ−１５に由来することができる配列を有し、この残基番号がヒト成熟野生型ＩＬ−１５に対応するが、ただしそれから得られた該ＩＬ−１５ムテインは、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高いＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有することを特徴とする、請求項４記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項６】
上記の少なくとも１つの置換が、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲから選択される荷電基による、Ｌ、Ｖ、およびＩから選択される少なくとも１つの疎水性側鎖の置換、ならびに／あるいはＳ、Ｎ、およびＱから選択される少なくとも１つの非荷電極性側鎖の置換であることを特徴とする、請求項４または５記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項７】
前記の少なくとも１つの置換が、反対に荷電された基ＫによるＥから選択される少なくとも１つの荷電極性側鎖の置換であることを特徴とする、請求項４または５記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項８】
ＩＬ−１５アゴニストであることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項９】
前記の少なくとも１つの置換が、残基４５、５１、５２の少なくとも１つの置換であることを特徴とする、請求項８記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１０】
前記の少なくとも１つの置換が、ＤまたはＥによる残基４５の置換であることを特徴とする、請求項９記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１１】
配列番号２９または配列番号３０の配列を有することを特徴とする、請求項１０記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１２】
前記の少なくとも１つの置換が、Ｄによる残基５１の置換であることを特徴とする、請求項９記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１３】
配列番号３３の配列を有することを特徴とする、請求項１２記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１４】
前記の少なくとも１つの置換が、Ｄによる残基５２の置換であることを特徴とする、請求項９記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１５】
配列番号３７の配列を有することを特徴とする、請求項１４記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１６】
ＩＬ−１５アンタゴニストであることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１７】
前記の少なくとも１つの置換が、残基６４、６５、６８の少なくとも１つの置換であることを特徴とする、請求項１６記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１８】
前記の少なくとも１つの置換が、Ｋによる残基６４の置換であることを特徴とする、請求項１７記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項１９】
配列番号４１の配列を有することを特徴とする、請求項１８記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２０】
前記の少なくとも１つの置換が、Ｋによる残基６５の置換であることを特徴とする、請求項１７記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２１】
配列番号４５の配列を有することを特徴とする、請求項２０記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２２】
前記の少なくとも１つの置換が、Ｄによる残基６８の置換であることを特徴とする、請求項１７記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２３】
配列番号４７の配列を有することを特徴とする、請求項２２記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２４】
前記の少なくとも１つの置換が、残基６９の置換であることを特徴とする、請求項１６記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２５】
請求項２４記載のＩＬ−１５ムテインにおいて、前記の少なくとも１つの置換が、Ｒによる残基６９の置換であることを特徴とする、請求項２４記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２６】
配列番号８５の配列を有することを特徴とする、請求項２５記載のＩＬ−１５ムテイン。
【請求項２７】
請求項４〜２６のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテインの保存フラグメントであって、変異した４４〜５２領域、および／または変異した６４〜６８領域、および／または変異した６４〜６９領域を含むが、ただしそこから得られたＩＬ−１５ムテインフラグメントは、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高いＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有するＩＬ−１５ムテインの保存フラグメント。
【請求項２８】
変異した４４〜５２領域、および／または変異した６４〜６８領域を含むが、ただしそこから得られたＩＬ−１５ムテインフラグメントが、さらにヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高いＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有することを特徴とする、請求項２７記載のＩＬ−１５ムテインフラグメント。
【請求項２９】
ＩＬ−１５アゴニストであることを特徴とする、請求項２７または２８記載のＩＬ−１５ムテインフラグメント。
【請求項３０】
配列番号７〜１８のいずれか１つの配列を含むことを特徴とする、請求項２９記載のＩＬ−１５ムテインフラグメント。
【請求項３１】
ＩＬ−１５アンタゴニストであることを特徴とする、請求項２７または２８記載のＩＬ−１５ムテインフラグメント。
【請求項３２】
配列番号１９〜２８のいずれか１つの配列を含むことを特徴とする、請求項３１記載のＩＬ−１５ムテインフラグメント。
【請求項３３】
配列番号７７〜８０のいずれか１つの配列を含むことを特徴とする、請求項３１記載のＩＬ−１５ムテインフラグメント。
【請求項３４】
請求項４〜２６のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン、または請求項２７〜３３のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテインフラグメントをコードする核酸。
【請求項３５】
請求項３４記載の少なくとも１つの核酸を含むベクター。
【請求項３６】
請求項３５記載のベクターによってトランスフェクションまたはトランスフォーメーションした細胞。
【請求項３７】
請求項８〜１５のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン、および／または請求項２９または３０記載のＩＬ−１５ムテインフラグメントを含み、ならびに場合により、薬学的に許容され得るビヒクル、および／または担体、および／または希釈剤、および／またはアジュバントを含む薬物。
【請求項３８】
抗癌薬物または抗免疫不全薬物を製造するための、請求項８から１５いずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン、または請求項２９または３０記載のＩＬ−１５ムテインフラグメントの使用。
【請求項３９】
請求項１６〜２６のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン、および／または請求項３１〜３３のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテインフラグメントを含み、ならびに場合により薬学的に許容されるビヒクル、および／または担体、および／または希釈剤、および／またはアジュバントを含む薬物。
【請求項４０】
抗炎症薬を製造するための、請求項１６〜２６のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテイン、または請求項３１〜３３のいずれか一項記載のＩＬ−１５ムテインフラグメントの使用。
【請求項４１】
ＩＬ−１５アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法であって、
ｉ．請求項４〜２６のいずれか一項記載の複数のＩＬ−１５ムテイン、および／または請求項２９〜３５のいずれか一項記載の複数のＩＬ−１５ムテインフラグメントを提供する工程；
ｉｉ．それぞれのＩＬ−１５−Ｒα結合親和性と、成熟野生型ＩＬ−１５の結合親和性とを比較する工程；
ｉｉｉ．成熟野生型ＩＬ−１５の結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高い結合親和性を有するムテインまたはムテインフラグメントを選択する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
ＩＬ−１５アゴニストをスクリーニングするための方法において、該方法がさらに
ｉｖ．少なくとも１つの検出可能なＩＬ−１５誘導可能活性を選択する工程；
ｖ．工程ｉｉｉで選択したムテインまたはフラグメントに応答して誘発された前記活性レベルと、成熟野生型ＩＬ−１５によって誘発されたその活性レベルとを比較する工程；
ｖｉ．成熟野生型ＩＬ−１５の活性レベルと著しく異ならない、またはそれより高い活性レベルを誘発するようなムテインまたはフラグメントを選択する工程；
を含むことを特徴とする、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＩＬ−１５アンタゴニストを求めてスクリーニングする方法において、該方法がさらに
ｉｖ．少なくとも１つの検出可能なＩＬ−１５誘導可能活性を選択する工程；
ｖ．工程ｉｉｉで選択したムテインまたはフラグメントに応答して誘発された前記活性レベルと、成熟野生型ＩＬ−１５によって誘発されたその活性レベルとを比較する工程；
ｖｉ．成熟野生型ＩＬ−１５の活性レベルより低い活性レベルを誘発し、または検出可能な活性レベルを誘発しないようなムテインまたはフラグメントを選択する工程；
を含むことを特徴とする請求項４１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒαに対するヒトＩＬ−１５結合部位の同定について記載している。本発明はまた、ＩＬ−１５Ｒα鎖、すなわち、ＩＬ−１５Ｒ受容体複合体にそのＩＬ−１５特異性を付与する鎖を標的にするＩＬ−１５アゴニストおよびアンタゴニストも提供する。
【０００２】
本出願では、様々な科学刊行物について述べられている。これらの刊行物は、特許請求の範囲前の実施例部分の最後に収載される。刊行物の参照は、括弧内の番号として出願書類中になされ、この番号は刊行物一覧中の番号に対応する。
【０００３】
背景技術
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）が、マウスＴ細胞系の増殖を支持する際の、ＩＬ−２に代わりうる新規なサイトカインとして同定された（１、２）。両サイトカインは、４個のαヘリックスバンドルファミリー（３）に属する。ＩＬ−１５は、当初、活性化したＴ細胞（１）およびＮＫ細胞（２、４）による増殖と細胞毒性の誘発、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン合成の同時刺激（５）、ならびにＴ細胞の化学誘引（６）を含め、インビトロでＩＬ−２によって引き出されるインビトロ活性の大部分を模倣することが判明した。この重複をＩＬ−２Ｒβ／γシグナル伝達複合体のその機能性受容体内での一般的使用によって説明する。
【０００４】
このＩＬ−２Ｒβ／γ複合体は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の一般的な中程度親和性受容体（Ｋｄ＝１ｎＭ）であり、両サイトカインはこの受容体に結合するために競合している（７）。サイトカイン特異性は、構造的に関連する別の個々の鎖、ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−１５Ｒαによって付与される（８）。これらの２本の鎖は、幾つかの補体分子および付着性分子に以前に見出されている（スシドメインと呼ばれる）構造ドメインを含む（９）。ＩＬ−２Ｒαは、そのようなドメインを２個含むが、ＩＬ−１５Ｒαは１個しか含まない。１つの顕著な差は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの親和性（Ｋｄ＝０．０５ｎＭ）よりはるかに低い親和性（Ｋｄ＝１０ｎＭ）によって、ＩＬ−２はその特異的ＩＬ−２Ｒαに結合することである。それぞれの特異的鎖は、ＩＬ−２Ｒβ／γ複合体と結合して、サイトカイン特異的機能性高親和性（αβγ）受容体を形成することができる（１０〜１２）。
【０００５】
このＩＬ−２Ｒβ／γ複合体を共有しているために、両サイトカインは、Ｊａｋ−１／Ｊａｋ−３チロシンキナーゼの活性化、続くリン酸化されたＳｔａｔ−３およびＳｔａｔ−５の核移行、ＬｃｋおよびＳｙｋチロシンキナーゼの活性化、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化、およびＢｃｌ−２の誘発を含め、類似する下流シグナル経路を誘発する（１３、１４）。シグナル伝達に必要であるＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγとは対照的に、特異的受容体ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−１５Ｒαは、短い細胞内テール（それぞれ、１３および４１アミノ酸）を有し、ＩＬ−２Ｒαはシグナル伝達には役立たないと見なされている。初期研究では、シグナル伝達においてＩＬ−１５Ｒα細胞内テールの役割は不必要であることが指摘されているが（８）、より近年のデータでは、ＩＬ−１５Ｒαが何らかの細胞内機能を介在しうることが示唆されている（１５〜１７）。
【０００６】
インビトロで観察された全体的な機能余剰とは対照的に、数個の知見はインビボでのＩＬ−２およびＩＬ−１５の相補的作用および反対作用さえ示している。実際、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒα遺伝子発現は主として活性化Ｔ細胞区画に限定されるが、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα転写物は様々な細胞型および組織（単球、樹状細胞および間質細胞、ケラチノサイト、胎盤、骨格筋、心臓）によって発現し、免疫系を超えたＩＬ−１５系の別の役割を示唆している（７、８）。ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγの非存在下でＩＬ−１５Ｒαを発現する細胞は記載されており、それらの幾つかはＩＬ−１５に応答し（１７、１８）、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγが関与しない、新規な機能性ＩＬ−１５受容体複合体の存在を示唆していた。
【０００７】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５の異なる役割は、ノックアウトマウスの実験からも示唆される。ＩＬ−２−／−およびＩＬ−２Ｒα−／−マウスは、自己免疫の出現に関連する、悪化したＴ細胞およびＢ細胞の増加を発症するが、それとは反対にＩＬ−１５−／−およびＩＬ−１５Ｒα−／−マウスは正常なＴ細胞およびＢ細胞集団を有し、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、上皮内リンパ球およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞に顕著な欠陥を示す（１９、２０）。近年の研究は、インビトロで得られた結果に反して、インビボでのＩＬ−２の主要な役割は活性化Ｔ細胞の連続的増加を制限することであること示唆し、それに対してＩＬ−１５はＴ細胞分裂の開始に重大な意味を持つ（２１）。
【０００８】
いくつかの研究は、ＩＬ−１５系を標的とすることが臨床的に適切であり潜在的に有益である、ヒト疾患の同定に貢献してきた。それらの中には、自己免疫疾患および炎症性疾患、伝染病、移植拒絶、癌および免疫不全症がある（２２、２３）。この意味において、ＩＬ−１５／受容体系のアゴニストまたはアンタゴニストの合理的な設計は、主要な関心であり、高親和性ＩＬ−１５受容体複合体の構造の正確な知識が必要とされる。
【０００９】
いくつかのヒトおよびマウスＩＬ−２変異誘発研究では、ＩＬ−２Ｒα、β、およびγ鎖への結合に関与する数個の残基が同定されている。これらの研究から、全てヒトＩＬ−２のＡ−Ｂループに位置する残基Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、およびＫ４３はＩＬ−２Ｒα鎖への結合に関与するが、ヘリックスＡの残基Ｄ２０およびヘリックスＣのＮ８８はＩＬ−２Ｒβ鎖への結合に関与し、ヘリックスＤのＱ１２６はＩＬ−２Ｒγ鎖への結合に重要である（２４〜２６）。同様の領域は、マウスＩＬ−２にも同定された（２７）。
【００１０】
これに反して、異なるＩＬ−１５受容体への結合に関与するＩＬ−１５の残基に関してデータはほとんど得られない。
【００１１】
ヒトＩＬ−２について記載された変異に類似するヒトＩＬ−１５のいくつかの変異（Ｄ８およびＱ１０８）は、ＩＬ−１５の対応する領域が、それぞれＩＬ−２Ｒβおよびγサブユニットへの結合に関与することを示唆している（２８）。
【００１２】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒα鎖高親和性結合を担うＩＬ−１５のエピトープを限定するために、リガンド受容体の相互作用分析、生物活性の誘発、ペプチドスキャニング、および部位特異的突然変異誘発を含め、様々な相補的な手法に従う。
【００１３】
発明の開示
本発明は、ＩＬ−１５Ｒα鎖高親和性結合を担うヒトＩＬ−１５エピトープを提供する。このＩＬ−１５／ＩＬ−１５−Ｒαエピトープは、実質的には、２個のペプチド：ＩＬ−１５ヘリックスＢに位置するペプチド１（４４ＬＬＥＬＱＶＩＳＬ５２：図１Ｂ配列番号４）、およびヘリックスＣに位置するペプチド２（６４ＥＮＬＩＩ６８：図１Ｂ配列番号６）もしくはペプチド２ａ（６４ＥＮＬＩＩＬ６９：図１Ｂ配列番号６７）に存在する。
【００１４】
本出願では、残基番号は全て、成熟ヒトＩＬ−１５タンパク質の全配列（図１Ａ配列番号２）の参照によってコンピューター処理される。
【００１５】
ペプチド１およびペプチド２もしくは２ａは、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα高親和性結合を担うエピトープ表面を一緒になって構成する。ペプチド２および２ａは、ＩＬ−２Ｒβ形質導入サブユニットの動員にも関与する。
【００１６】
本発明は、ＩＬ−１５アゴニストおよびアンタゴニスト、より具体的には突然変異によって前記エピトープペプチドから得られる、ＩＬ−１５アゴニストおよびアンタゴニストも提供する（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、９、１０を参照）。
【００１７】
好ましいアゴニストには、Ｌ４５、Ｓ５１、およびＬ５２の少なくとも１個が荷電基（Ｄ、Ｅ、Ｒ、またはＫ）により置換されているようなムテインが含まれる。図２Ａおよび２Ｃ参照。特に好ましいアゴニストには、ＤまたはＥにより置換されているＬ４５、および／またはＤにより置換されているＳ５１、および／またはＤにより置換されているＬ５２が含まれ、すなわち、これらのＩＬ−１５ムテインは、野生型ＩＬ−１５のものより高い結合特性および生物学的特性を示し、それによってスーパーアゴニストとして挙動する。これらは、リンパ球サブセット（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞）を増加するための特に貴重なツールであり、癌または免疫不全症患者で治療剤として有用である。
【００１８】
好ましいアンタゴニストには、Ｅ６４、Ｉ６８、Ｌ６９、およびＮ６５の少なくとも１個が反対荷電基（ＫまたはＲ）により、または荷電基（Ｄ、Ｅ、Ｒ、またはＫ）により置換されているようなムテインが含まれる。図２Ｂおよび２Ｄ参照。特に好ましいアンタゴニストには、荷電基（Ｄ、Ｅ、Ｒ、またはＫ）、例えばＫによって変異を受けたＮ６５が含まれる。これらのムテインは、アンタゴニストまたは潜在的アンタゴニストであり、従ってＩＬ−１５が重要な役割を果たすと思われるリューマチ性関節炎や全身性Shwartzman反応など、炎症状態または疾患で有用であろう（２２）。
【００１９】
本発明は、ＩＬ−１５ムテインの産生方法、これらのムテインをコードする核酸、そのような核酸を含むトランスフェクションベクターおよび宿主細胞、ならびにＩＬ−１５アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング法にも関する。
【００２０】
そのようなムテインを含む薬物など、これらのエピトープペプチドおよびムテインの生物学的または医学的応用も本発明の範囲内に含まれる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１５Ｒα鎖への高親和性結合を担う、ＩＬ−１５のエピトープの同定について記載している。このエピトープは、２個のペプチド、すなわち、配列番号４のペプチド１、および配列番号６のペプチド２もしくは配列番号６７のペプチド２ａ（図１Ｂ参照）によって本質的に形成される。ヒト成熟野生型ＩＬ−１５では、ペプチド１は、ヘリックスＢに位置し、ペプチド２およびペプチド２ａは、ヘリックスＣに位置する（図３Ｂ参照）。
【００２２】
ペプチド１およびペプチド２と２ａの部位特異的突然変異誘発は、これらのペプチドがＩＬ−１５Ｒα結合に関与することを示している。
【００２３】
驚くべきことに、位置Ｌ４５、Ｓ５１、およびＬ５２（ペプチド１）での突然変異は、結合活性および生物活性の減少ではなく上昇をもたらし、その結果、得られた突然変異体はスーパーアゴニストとして挙動するようになった。これらは、リンパ球サブセット（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞）を増加させるための貴重なツールであり、癌または免疫不全症患者で治療剤として使用することができる。
【００２４】
ペプチド２および２ａの部位特異的突然変異誘発は、ペプチド２および２ａがＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−２Ｒβの結合に関わり、ペプチド２および２ａ（Ｅ６４〜Ｉ６８およびＬ６９）のアミノ酸は全て、この過程に関与することを示す。より具体的にはＬ６６およびＩ６７は、明らかに、ＩＬ−１５Ｒαに結合するＩＬ−１５により関与し、それに対してＥ６４、Ｎ６５、Ｉ６８、およびＬ６９は明らかにＩＬ−１５Ｒβの動員により関与する。位置Ｅ６４、Ｎ６５、Ｉ６８、およびＬ６９での変異は、得られた突然変異体を潜在的ＩＬ−１５アンタゴニストとして意味付ける特性を誘発し、より具体的には突然変異体はＩＬ−１５アンタゴニスト（Ｎ６５）または部分アゴニスト（Ｅ６４、Ｉ６８、Ｌ６９）として挙動する。それらは、リューマチ性関節炎および全身性Shwartzman反応のような炎症性疾患で使用することができる。
【００２５】
ＩＬ−１５ＲαへのこれらのＩＬ−１５エピトープペプチド結合を干渉する化合物は、ＩＬ−１５アゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる。このＩＬ−１５Ｒα鎖は、ＩＬ−１５Ｒ受容体複合体の特異性をＩＬ−２と比較してＩＬ−１５に授けるサブユニットなので、そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは特異性の点で特に有利である。
【００２６】
本出願は、そのようなアゴニストおよびアンタゴニスト化合物を対象とし、特に、そのようなアゴニストまたはアンタゴニスト作用を有するムテインについて記載する。
【００２７】
本明細書では、アゴニストおよびアンタゴニストの語に当分野における、それらの通常の意味を与えている。
【００２８】
化合物が、ネイティブＩＬ−１５によって誘発される生物学的応答と同様の、またはより高レベルの生物学的応答を誘発する場合、それをＩＬ−１５アゴニストと称する。好ましいアゴニストは、よりさらに高レベルの生物学的応答を誘発するアゴニスト（スーパーアゴニスト）である。
【００２９】
典型的には、ＩＬ−１５アゴニストは、少なくともネイティブＩＬ−１５の結合親和性と著しい差異がなく、ネイティブＩＬ−１５の結合親和性よりも著しく高いことが好ましいＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有する。
【００３０】
アンタゴニストは、アンタゴニストがＩＬ−１５生物活性を拮抗するように、その標的受容体または受容体鎖へのＩＬ−１５の結合に干渉する。より具体的には、化合物がそのＩＬ−１５Ｒαおよび／またはＩＬ−１５−Ｒβおよび／またはＩＬ−１５−Ｒγ受容体鎖標的と結合し、該ネイティブＩＬ−１５によってその上で誘発される生物学的応答を阻止し、または著しくこれを阻害するために、ネイティブＩＬ−１５と競合することができる場合、これをＩＬ−１５アンタゴニストと称する。従って、本明細書では部分アゴニストは用語「アンタゴニスト」のうちに包含される。アンタゴニスト候補は、ＩＬ−１５Ｒαおよび／またはＩＬ−１５Ｒβおよび／またはＩＬ−１５Ｒγに、ネイティブＩＬ−１５の親和性と著しく異なることも、または高いこともなく、かつ生物学的応答を誘発しない、またはネイティブＩＬ−１５よりも著しい低レベルの生物学的応答を誘発する結合親和性を有する化合物である。
【００３１】
前記生物学的応答は、ＩＬ−１５によって誘発された生物学的応答である。当業者は、評価またはモニターするのに適当または好都合であると判明した任意のＩＬ−１５誘導可能生物学的応答を選択することができる。
【００３２】
典型的なＩＬ−１５誘導可能生物学的応答は、例えば、ＣＴＬ−Ｌ２マウス細胞障害性Ｔリンパ腫細胞系（ＡＴＣＣアクセッション番号ＴＩＢ−２１４）またはＴＦ１−β細胞など、ＩＬ−１５感受性細胞の増殖である。
【００３３】
ＴＦ−１細胞は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.から入手することができる。http://www.lgcpromochem.com/atcc/にてＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２００３参照。
【００３４】
β鎖テンプレートは、ヒトＩＬ−２Ｒβ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｋ０３１２２）に従って、プルーフリーディングポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene NO. 600390）、ならびにセンスプライマーとして
【００３５】
【表１】
2007528726.tif 000002
【００３６】
（配列番号５１）、およびアンチセンスプライマーとして
【００３７】
【表２】
2007528726.tif 000003
【００３８】
（配列番号５２）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりHuT102（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）またはJurkat clone E6.1（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １５２）のＲＮＡから得ることができる。Zero Blunt PCR Cloning Kit（In Vitrogen Cat. NO. K2700-20）またはTOPO XL PCRクローニングキット（In Vitrogen Cat. NO. K4750-10）を使用し、ＰＣＲ産生物を効率よくクローン化する。次いで、組換えレトロウイルスを発生させるキットに記載されているように、ＩＬ−２Ｒβ遺伝子のｃＤＮＡをPantropic Retroviral Expression System（BD Biosciences Clontech NO. 631512）のｐＬＸＲＮレトロウイルス発現ベクターのマルチクローニング部位中にサブクローン化し、ＧＰ２−２９３細胞中にトランスフェクションする。次いで、ＩＬ−２Ｒβ組換えレトロウイルスを使用してＴＦ−１細胞を感染させ、Ｇ４１８含有培地で選択した後、ＴＦ−１βを発生させることができる。
【００３９】
あるいは、当業者は、チロシンキナーゼ（例えば、Ｊａｋ−１／Ｊａｋ−３、Ｌｃｋ、Ｓｙｋ）の活性化、ＭＡＰキナーゼの活性化、または核移行事象（例えば、リン酸化されたＳｔａｔ−３および／またはＳｔａｔ−５の移行）など、シグナル経路のさらに下流にあるＩＬ−１５生物学的応答を評価し、またはモニターすることを選択しうる。次いで、生物学的応答は無細胞応答であってもよい。
【００４０】
従って、本出願は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα鎖高親和性結合を担う、ヒトＩＬ−１５のエピトープの一部である３種のペプチド関する。これらは、それぞれ、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＬ４４〜Ｌ５２領域の配列（配列番号４）、またはヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＥ６４〜Ｉ６８領域の配列（配列番号６）、またはヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＥ６４〜Ｌ６９領域の配列（配列番号６７）を有する。図１Ｂ参照。
【００４１】
そのようなエピトープペプチドをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）もまた、本発明の範囲内に含まれる。核酸の例には、配列番号３、配列番号５および配列番号６６（図１Ｂ参照）の核酸が含まれる。
【００４２】
所与のペプチドまたはタンパク質に結合する抗体の産生方法は、当業者によく知られており、例えば、"Antibodies: a laboratory manual"、Ed Harlow, David Lane編、 Cold Spring Harbor Laboratory出版、1988を参照されたい。さらに、常法に従って実現したものは、モノクローナル抗体の産生であり、例えば、Kohler and Milstein 1975, Nature 256:495-497に記載されているハイブリドーマ技術を参照されたい。
【００４３】
これらの方法は、本発明のエピトープペプチドおよび／またはムテインに結合する抗体、より具体的にモノクローナル抗体の産生に使用することができる。
【００４４】
様々なイムノアッセイ型式を使用して、特定のタンパク質に特異的に免疫反応する抗体を選択しうる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを常法に従って使用し、タンパク質に特異的に免疫反応する抗体を選択する。特異的免疫活性を定量するために使用することができるイムノアッセイ型式および条件についての記載は、例えば、"Antibodies: a laboratory manual"（Ed Harlow, David Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory出版、１９８８）を参照されたい。所定の特異性を備える抗体またはモノクローナル抗体は、このようにして産生することができる。
【００４５】
有利な抗ＩＬ−１５抗体またはモノクローナル抗体は、アゴニストまたはアンタゴニストＩＬ−１５特性を有するものである。
【００４６】
本発明はまた、本発明のエピトープペプチドから導き出しうるＩＬ−１５ムテインおよびＩＬ−１５ムテインフラグメントに関する。
【００４７】
従って、本出願は、残基４４〜残基５２、および／または残基６４〜残基６８、および／または残基６４〜残基６９にかかる領域内（該領域の全終点残基を明白に含む）の少なくとも１つの置換、欠失、または付加によって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテインに関し、この残基番号はヒト成熟野生型ＩＬ−１５に対応する（そしてヒト成熟野生型ＩＬ−１５の残基番号として維持される）。
【００４８】
好ましくは、突然変異から得られたＩＬ−１５ムテインが、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合親和性と著しく異ならない、またはそれより高いＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有するように、変異は親和性を保存し、または親和性を亢進する。
【００４９】
ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から出発する場合、好ましくは、残基Ｅ４６およびＩ５０は変異させるべきではない。それらの残基によってＩＬ−１５Ｒα親和性の減少が誘発されやすくなるからである。
【００５０】
同等のムテインは、特にヒトではないが動物成熟野生型ＩＬ−１５など、他の成熟野生型ＩＬ−１５から導き出すことができ、より具体的には、ヒトではないが哺乳動物成熟野生型ＩＬ−１５、例えば、サルの、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはイヌＩＬ−１５から導き出すことができる。
【００５１】
置換は、例えば、Ｌ、Ｖ、およびＩから選択した少なくとも１つの疎水性側鎖の置換；Ｄ、Ｅ、Ｒ、およびＫから選択した荷電基によるＳ、Ｑ、およびＮから選択される少なくとも１つの非荷電極性側鎖の置換；ならびに／あるいはＫおよびＲから選択した反対荷電基によるＥから選択される少なくとも１つの電荷極性側鎖の置換であってよい。
【００５２】
本発明は、ＩＬ−１５アゴニストまたはスーパーアゴニストであるＩＬ−１５ムテインをさらに提供する。
【００５３】
好ましいアゴニストムテインは、残基４５、５１、５２の少なくとも１個を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含む。
【００５４】
ヒト成熟野生型ＩＬ−１５では、残基４５はＬ、残基５１はＳ、そして残基５２はＬである（図１Ａ配列番号２を参照）。
【００５５】
本発明は、特に、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲにより、好ましくはＤまたはＥにより残基４５を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテインを提供する。これらには、特に、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の配列により、残基４４〜残基５２にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、配列、それぞれ、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２（図２Ｃ参照）のＩＬ−１５ムテインが含まれる。最も好ましいアゴニストムテインには、配列番号２９または配列番号３０（図２Ｃ参照）の配列を含むようなムテインが含まれる。
【００５６】
他の好ましいＩＬ−１５アゴニストムテインには、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲにより、好ましくはＤにより残基５１を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むようなムテインが含まれる。これらには、特に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４の配列により、残基４４〜残基５２にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、配列、それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６（図２Ｃ参照）のＩＬ−１５ムテインが含まれる。最も好ましいアゴニストムテインには、配列番号３３の配列（図２Ｃ参照）を含むものが含まれる。
【００５７】
さらに、他の好ましいＩＬ−１５アゴニストムテインには、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲにより、好ましくはＤにより残基５２を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むようなムテインが含まれる。これらには、特に、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８の配列により、残基４４〜残基５２にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、配列、それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０（図２Ｃ参照）のＩＬ−１５ムテインが含まれる。最も好ましいアゴニストムテインには、配列番号３７（図２Ｃ参照）の配列を含むものが含まれる。
【００５８】
ペプチド１の部位特異的突然変異誘発は、Ｌ４５、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｓ５１、およびＬ５２がＩＬ−１５Ｒα結合に関与し、Ｅ４６が重要であることを示す。その酸性側鎖を塩基性側鎖（Ｅ４６Ｋ）により置換することによって、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合と生物活性が完全に消失するからである。位置Ｉ５０（Ｉ５０Ｄ）での変異によって、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合能力および細胞増殖誘発能は非常に低減された。負荷電側鎖（Ｖ４９Ｄ）によりＶ４９の疎水性側鎖を置換することによってもＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα親和性は非常に減少（１／１３倍）した。
【００５９】
従って、Ｅ４６Ｋ、Ｖ４９Ｄ、またはＩ５０Ｄなど、残基４６、４９、または５０で変異させると、結合親和性において有意な損失が誘発される傾向がある。従って、少なくとも単一点変異として導入した場合、これらは一般的に満足できるものではない。
【００６０】
本発明は、ＩＬ−１５アンタゴニストまたはアンタゴニスト候補であるＩＬ−１５ムテインをさらに提供する。
【００６１】
好ましいアンタゴニストムテインは、残基６４、６５、６８、６９の少なくとも１個を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含む。
【００６２】
ヒト成熟野生型ＩＬ−１５では、残基６４はＥ、残基６５はＮ、残基６８はＩ、残基６９はＬである（図２ＩＡ配列番号２を参照）。
【００６３】
好ましいＩＬ−１５アンタゴニストムテインには、ＫまたはＲにより残基６４を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むようなムテインが含まれる。これらには、特に、配列番号１９または配列番号２０の配列より、残基６４〜残基６８にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、配列、配列番号４１または配列番号４２（図２Ｄ参照）のＩＬ−１５ムテインが含まれる。最も好ましいアンタゴニストムテインには、配列番号４１（図２Ｄ参照）の配列を含むものが含まれる。
【００６４】
他の好ましいＩＬ−１５アンタゴニストムテインには、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲにより、好ましくはＫにより残基６５を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むようなムテインが含まれる。これらには、特に、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４の配列により、残基６４〜残基６８にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、配列、それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６（図２Ｄ参照）のＩＬ−１５ムテインが含まれる。最も好ましいＩＬ−１５アンタゴニストムテインには、配列番号４３（図２Ｄ参照）の配列を含むものが含まれる。
【００６５】
他のさらに好ましいＩＬ−１５アンタゴニストムテインには、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲにより、好ましくはＫにより残基６８を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むようなムテインが含まれる。これらには、特に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８の配列により、残基６４〜残基６８にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、配列、それぞれ、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０（図２Ｄ参照）のＩＬ−１５ムテインが含まれる。最も好ましいＩＬ−１５アンタゴニストムテインには、配列番号４７（図２Ｄ参照）の配列を含むものが含まれる。
【００６６】
他のさらに好ましいＩＬ−１５アンタゴニストムテインには、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲにより、好ましくはＲにより残基６９を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列を含むようなムテインが含まれる。これらには、特に、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、または配列番号８０の配列により、残基６４〜残基６９にかかる領域を置換することによって、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５から導き出しうる配列（図９参照）を含むＩＬ−１５ムテイン、例えば、それぞれ、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５（図１０参照）の配列のＩＬ−１５ムテインが含まれる。
【００６７】
本出願は、場合により、トランスフェクションベクターや発現ベクターなどのベクター内に含まれる、本発明のＩＬ−１５ムテインをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）にも関する。
【００６８】
次いで、ＩＬ−１５ムテインをコードするＤＮＡは、転写プロモーターもしくは転写エンハンサー、転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソームの結合部位をコードする配列、転写および翻訳の開始と停止を制御するのに適切な配列など、適当な転写または翻訳調節配列に動作可能に結合させることができる。そのようなベクターの例には、ｐＥＦ１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（In Vitrogen, V921-20）、ｐｃＤＮＡ３．１（In Vitrogen, V800-20）が含まれる。
【００６９】
ＩＬ−１５ムテインをコードするＤＮＡは、翻訳ポリペプチドの細胞外分泌を改善できるリーダー配列に結合してもよい。そのようなリーダー配列の例には、ラットのプレプロラクチン由来のＫｏｚａｋ配列およびリーダー配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ０２２９３５、ヌクレオチド１７８〜２７０、www.ncbi.nlm.nih.gov；National Center for Biotechnology Information, U.S. National library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894, U.S.A.参照）が含まれる。
【００７０】
次いで、組換えＩＬ−１５ムテインの構造コード配列を有する組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションし、またはトランスフォーメーションしてよい。
【００７１】
ＩＬ−１５ムテインの適当な発現用宿主細胞には、適当なプロモーターの制御下の原核生物、酵母、またはさらに高等な真核細胞が含まれる。原核生物には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ブドウ球菌（Staphylococcus）属中の他の様々な種が含まれる。適当な宿主細胞の例には、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母；哺乳動物細胞系統、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、チャイニーズ卵巣ハムスター細胞系ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ  ｄｕｋ−）（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＣＲＬ−９０９６）など；あるいは上皮細胞系、例えば、サル上皮細胞系ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＣＲＬ１６５１）またはヒト細胞系、例えば、２９３  ｃ１８ヒト腎細胞系統（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＣＲＬ−１０８５２）やFreeStyle 293-Fヒト腎細胞系統（In Vitrogen NO.R790-07）なども含まれる。
【００７２】
細菌宿主、昆虫宿主、酵母宿主および哺乳動物細胞宿主に使用する適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A laboratory Manual, Elsevier, N.Y. 1985に記載されている。
【００７３】
本出願は、本発明のＩＬ−１５ムテイン保存フラグメントにも関する。そのような保存性ＩＬ−１５ムテインフラグメントは、変異した４４〜５２領域、変異した６４〜６８領域、および／または変異した６４〜６９領域をさらに含み、ヒト成熟野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高いＩＬ−１５Ｒα結合親和性を保持する。
【００７４】
本出願は、より具体的には、配列番号７〜１８のいずれか１つの配列、例えば、配列番号７（Ｌ４５Ｄ）、配列番号８（Ｌ４５Ｅ）、配列番号１１（Ｓ５１Ｄ）、または配列番号１５（Ｌ５２Ｄ）のペプチドを含むフラグメントなど、ＩＬ−１５アゴニストであるＩＬ−１５ムテインフラグメントに関する。図２Ａ参照。
【００７５】
本出願は、より具体的には、ＩＬ−１５アンタゴニスト、部分アゴニスト、またはアンタゴニスト候補であるＩＬ−１５ムテインフラグメント、例えば、配列番号１９〜２８、７７〜８０（図２Ｂおよび９を参照）のいずれか１つの配列を含むフラグメントに関する。例えば、配列番号１９（Ｅ６４Ｋ）、配列番号２５（Ｉ６８Ｄ）、または配列番号８０（Ｌ６９Ｒ）のペプチドは部分アゴニストとして挙動し、配列番号８０（Ｌ６９Ｒ）は野生型ＩＬ−１５活性の２％程度と低く最高の応答を誘発する。配列番号２３（Ｎ６５Ｋ）のペプチドはアンタゴニストとして挙動する（１００ｐＭのＮ６５ＫムテインでＩＬ−１５活性の完全な阻害、以下実施例２および図８を参照）。
【００７６】
本発明のムテインについて上に記載してきたことと同様に、本出願は本発明の範囲内に、任意でベクター内に含まれる、本発明のＩＬ−１５ムテインフラグメントをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）も包含し、ならびにそのような核酸を含む任意のそのようなベクターおよび任意の宿主細胞も包含する。
【００７７】
本発明のエピトープペプチドおよびムテインは、当業者が適当と判断しうる任意の手段、例えば、化学的ペプチド合成やペプチド生合成によって産生することができる。
【００７８】
現在、化学的ペプチド合成は慣用操作であり（例えば、Anderssonら, 2000, Biopolymers (Peptide Science) 55: 227-250参照）、多くの企業がそのような合成を専門としている。
【００７９】
好ましくは、本発明のエピトープペプチドおよびムテインフラグメントは、標準ＦＭＯＣプロトコルを使用し、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）技術によって合成される（例えば、 Carpinoら, 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749；Carpino ら, 1972, J. Org. Chem. 37(22):3404-3409を参照）。
【００８０】
または、当業者は、部位特異的突然変異誘発により野生型ＩＬ−１５から得られた変異した発現カセットをインビトロでまたはインビボで翻訳することによる、ムテインまたはムテインフラグメントの生物学的産生を選択することができる（Sodoyer, 2004, Biodrugs, 18 (1): 51-62）。
【００８１】
その説明は、以下の実施例に記載されている。
【００８２】
次いで、アミノ酸スイッチングは、当業者に利用可能な任意の変異誘発手段によって、例えば、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene, La Jolla, California, U.S.A.）を用いることによって実施することができる。次いで、変異した発現カセットを宿主細胞、例えば、２９３  ｃ１８細胞（ＡＴＣＣ  ＮＯ．１０８５２）（Invitrogen, Leek, The Netherlands）にトランスフェクションすることができる。次いで、トランスフェクション細胞を培養して、変異したカセットを発現させることができる（例えば、２９３  ｃ１８細胞を１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍｇ／ｍＬグルコース、および２５０μｇ／ｍＬジェネテシンを含むＤＭＥＭ中で培養することができる）。次いで、変異した発現産生物を回収し、任意で精製することができる（例えば、培養上清の回収およびその精製）。
【００８３】
本発明によるＩＬ−１５ムテインまたはＩＬ−１５ムテインフラグメントの産生過程は、例えば以下の工程を含む。
本発明による核酸を提供する工程であって、該ムテインまたはムテインフラグメントをコードし、場合により該核酸が発現ベクターに含まれる工程；
宿主細胞がその発現産生物を産生するように、動作可能に該核酸を宿主細胞に導入する工程；
該発現産生物を回収する工程。
【００８４】
ＩＬ−１５ムテインは、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconやMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用し濃縮してよい。
【００８５】
得られた、発現し場合により濃縮したムテインを次いで、培地または抽出物から精製してよい。この培地または細胞抽出物は、精製マトリックス、例えば、疎水性クロマトグラフィー培地やアニオン交換樹脂にアプライすることができる。
【００８６】
次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣによって濃度をさらに上げてよい。
【００８７】
濃縮ムテインは、そのＮ末端ＦＬＡＧタグにより、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２を移植したイムノアフィニティカラムで精製することもできる（Sigma product NO. A 2220）。
【００８８】
他のタグ（例えば、ポリヒスチンタグ）を遺伝子工学によってムテインのＮ末端またはＣ末端に加えて、その精製過程に役立てることができる。
【００８９】
本出願は、そのアミノ酸発現またはその核酸コーディングバージョンにおける、本発明のエピトープペプチド、ＩＬ−１５ムテイン、およびＩＬ−１５ムテインフラグメントの生物学的および医学的応用にも関する。
【００９０】
本発明のアゴニストムテインは、特定のＴ／ＮＫサブセットなどのリンパ球サブセットの増加に有用である。従って、本発明は、１個またはいくつかのリンパ球集団、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋メモリー細胞を増加させるための薬剤としてのその使用に関し、そしてそのようなアゴニストムテインを含むそのような使用を意図した組成物またはキットに関する。
【００９１】
本発明は、特に、本発明のＩＬ−１５ムテインまたはＩＬ−１５ムテインフラグメント、ならびに任意により薬学的に許容されるビヒクル、担体、希釈剤、および／またはアジュバントを含む薬物またはワクチンに関する。
【００９２】
そのような薬物またはワクチンは、ＩＬ−１５活性の減少または上昇が望まれる状態または疾患の予防、治療、および／または緩和を意図している。
【００９３】
いくつかの研究は、ＩＬ−１５系を標的にすることが臨床的に適切であり潜在的に有益である疾患の同定に貢献してきた。それらの中には、自己免疫疾患、炎症性疾患、伝染病、移植拒絶、癌、および免疫不全症がある（参考文献２２、２３を参照）。
【００９４】
本出願は、特に、本発明のＩＬ−１５アゴニストである、本発明のＩＬ−１５ムテインまたはＩＬ−１５ムテインフラグメント、ならびに場合により薬学的に許容されるビヒクル、担体、希釈剤、および／またはアジュバントを含む薬物またはワクチンに関する。
【００９５】
そのような薬物またはワクチンは、ＩＬ−１５活性の増大が望まれる状態または疾患、例えば、特に癌や免疫不全の予防、治療、および／または緩和を意図している。そのような薬物またはワクチンは、（Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞などの）リンパ球の増殖、生存、および／または腫瘍細胞に対するその活性を刺激することによって働きうる。
【００９６】
本出願は、特に、本発明のＩＬ−１５アンタゴニストである、本発明のＩＬ−１５ムテインまたはＩＬ−１５ムテインフラグメント、ならびに任意により薬学的に許容されるビヒクル、担体、希釈剤、および／またはアジュバントを含むような薬物に関する。
【００９７】
そのような薬物は、ＩＬ−１５の活性の減少が望まれる状態または疾患、例えば、リューマチ性関節炎や全身性Shwartzman反応などの炎症性疾患の予防、治療、および／または緩和を意図している。
【００９８】
本出願は、さらに、以下の工程を含むＩＬ−１５アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関する。
ｉ．複数の、本発明によるＩＬ−１５ムテインおよび／またはＩＬ−１５ムテインフラグメントを提供する工程；
ｉｉ．それらのそれぞれのＩＬ−１５−Ｒα結合親和性と、成熟野生型ＩＬ−１５の結合親和性とを比較する工程；
ｉｉｉ．成熟野生型ＩＬ−１５の結合親和性と著しく異ならないか、またはそれより高い結合親和性を有するようなムテインまたはムテインフラグメントを選択する工程。
【００９９】
ＩＬ−１５アゴニストをスクリーニングするために、この過程にさらに以下の工程を含めてよい。
ｉｖ．少なくとも１つの検出可能なＩＬ−１５誘導可能活性を選択する工程；
ｖ．工程ｉｉｉで選択したムテインまたはフラグメントに応答して誘発された前記活性レベルと、成熟野生型ＩＬ−１５によって誘発されたその活性レベルとを比較する工程；
ｖｉ．成熟野生型ＩＬ−１５の活性レベルと著しく異ならないか、またはそれより高い活性レベルを誘発するようなムテインまたはフラグメントを選択する工程。
【０１００】
ＩＬ−１５アンタゴニストをスクリーニングするために、過程がさらに以下の工程含むことを特徴とする。
ｉｖ．少なくとも１つの検出可能なＩＬ１５誘導可能活性を選択する工程；
ｖ．工程ｉｉｉで選択したムテインまたはフラグメントに応答して誘発された前記活性レベルと、成熟野生型ＩＬ−１５によって誘発されたその活性レベルとを比較する工程；
ｖｉ．成熟野生型ＩＬ−１５の活性レベルより低い活性レベルを誘発し、または検出可能な活性レベルを誘発しないようなムテインまたはフラグメントを選択する工程。
【０１０１】
本発明を以下の実施例によって説明する。実施例は、例示的目的のみを意図し、本発明の範囲を限定しないものとする。
【０１０２】
実施例１
実験手順
サイトカインおよび抗体
組換えマウスＩＬ−３およびヒトＧＭ−ＣＳＦをR&D Systems（Abington, UK）から購入し、組換えヒトＩＬ−１５（ｒＩＬ−１５）をPeprotech Inc（Rocky Hill, NJ）から購入し、そして組換えヒトＩＬ−２（ｒＩＬ−２）をChiron（Emeryville, CA）から購入した。
【０１０３】
ポリクローナルヤギ抗ヒトＩＬ−２  AF-202-NAをR&D Systemsから購入し、マウス抗ヒトＩＬ−２  ｍＡｂ  IL2.66をImmunotech（Marseille, France）から購入した。
【０１０４】
モノクローナルマウス抗ヒトＩＬ−１５Ｒα  Ｍ161は、親切にもGenMab A/S（Copenhagen, Denmark）より提供を受け［以下に記載の実験には、ポリクローナル抗体AF247（R&D Systems Inc., Minneapolis, USA）を代わりに使用することができる］、ペルオキシダーゼに結合させたマウス抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ  M2はSigma（Saint Quentin Fallavier, France）から購入した。
【０１０５】
細胞培養
非付着性ＴＦ−１ヒト細胞系統は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.）から入手することができ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２００３を有する（http://www.lgcpromochem.com/atcc/を参照）。
【０１０６】
ＴＦ−１βヒト細胞は、ＴＦ−１細胞にβ鎖を動作可能にトランスフェクションし、その結果、そこから得られたＴＦ−１β細胞がＩＬ−１５に応答して増殖することによって得ることができる（参考文献２９を参照）。
【０１０７】
β鎖テンプレートは、ヒトＩＬ−２Ｒβ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｋ０３１２２）に従って、プルーフリーディングポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene NO. 600390）、ならびにセンスプライマー（配列番号５１）として
【０１０８】
【表３】
2007528726.tif 000004
【０１０９】
およびアンチセンスプライマー（配列番号５２）として
【０１１０】
【表４】
2007528726.tif 000005
【０１１１】
を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりHuT102（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）またはJurkat clone E6.1（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １５２）のＲＮＡから得ることができる。Zero Blunt PCR Cloning Kit（In Vitrogen Cat. NO. K2700-20）またはTOPO XL PCRクローニングキット（In Vitrogen Cat. NO. K4750-10）を使用し、ＰＣＲ産生物を効率よくクローニングする。次いで、組換えレトロウイルスを発生させるキットに記載されているように、ＩＬ−２Ｒβ遺伝子のｃＤＮＡをPantropic Retroviral Expression System（BD Biosciences Clontech NO. 631512）のｐＬＸＲＮレトロウイルス発現ベクターのマルチクローニング部位にサブクローニングし、ＧＰ２−２９３細胞中にトランスフェクションする。次いで、ＩＬ−２Ｒβ組換えレトロウイルスを使用してＴＦ−１細胞を感染させ、Ｇ４１８含有培地で選択した後、ＴＦ−１βを発生させることができる。
【０１１２】
付着性ＣＨＯ  ｄｕｋ細胞系は、ＡＴＣＣ（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−；アクセッション番号ＣＲＬ−９０９６）から入手することができる。
【０１１３】
細胞は全て、５％ＣＯ２下３７℃、水飽和雰囲気中で増殖させた。非付着性ＴＦ−１ヒト細胞系統、ＴＦ−１βヒト細胞、および付着性ＣＨＯ  ｄｕｋ細胞系を１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、および以下の特異的反応体、すなわち、１ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＴＦ１）、１ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２５０μｇ／ｍｌ  ジェネテシン（ＴＦ−１β）、１０μｇ／ｍｌ  アデノシン、デオキシアデノシン、およびチミジン（Ｄｈｆｒ−ＣＨＯ  ｄｕｋ−）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。非付着性ＣＴＬＬ−２マウス細胞系を８％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１５ｎｇ／ｍｌ  ｒＩＬ−２、および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。付着性２９３  ｃ１８ヒト細胞（Invitrogen, Leek, The Netherlands）を１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍｇ／ｍｌグルコース、および２５０μｇ／ｍｌジェネテシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０１１４】
可溶性ＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２融合タンパク質の調製
ヒトＩＬ−１５Ｒαテンプレートは、ヒトＩＬ−１５Ｒα配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ３１６２８）に従って、プルーフリーディングポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene NO.600390）、ならびにセンスプライマー−配列番号５３−として
【０１１５】
【表５】
2007528726.tif 000006
【０１１６】
およびアンチセンスプライマー−配列番号５４−として
【０１１７】
【表６】
2007528726.tif 000007
【０１１８】
を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりＴＦ−１細胞の（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２００３）のＲＮＡ、または血液から精製した正常ヒト単球のＲＮＡから得ることができる。ＰＣＲ産生物をZero Blunt PCR Cloning Kit（In Vitrogen Cat. NO. Ｋ２７００−２０）を使用しクローン化して、ｐＮｏ１５Ｒプラスミドを作成する。
【０１１９】
ヒトＩＬ−２テンプレートは、ヒトＩＬ−２配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００５８６）に従って、プルーフリーディングポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene NO.600390）、ならびにセンスプライマー（下線はＰｓｔ  Ｉ）−配列番号５５−として
【０１２０】
【表７】
2007528726.tif 000008
【０１２１】
およびアンチセンスプライマー（下線はＳｍａ  Ｉ）−配列番号５６−として
【０１２２】
【表８】
2007528726.tif 000009
【０１２３】
を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりＯＫＴ３抗体およびＰＭＡ（３０）で刺激したJurkat細胞クローンE6-1（ＡＴＣＣアクセッション番号ＴＩＢ−１５２）のＲＮＡから得ることができる。ＰＣＲ産生物は、Bluescriptプラスミド（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ５２３２８）のＰｓｔ  ＩとＳｍａ  Ｉ部位の間にクローン化して、ｐＢＳＳＫ−ＩＬ−２プラスミドを作成する。
【０１２４】
キメラ可溶性ＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２構築体を生成するために、センスプライマー−配列番号５７−
【０１２５】
【表９】
2007528726.tif 000010
【０１２６】
（プライマー１、下線は入れ子状態のＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位）およびアンチセンスプライマー−配列番号５８−
【０１２７】
【表１０】
2007528726.tif 000011
【０１２８】
（プライマー２、Ｐｓｔ  Ｉ下線で）を使用し、ＩＬ−１５Ｒα（ヌクレオチド１〜６９７）のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインをｐＮｏＲ１５からＰＣＲ増幅した。次いで、増幅産生物をｐＢＳＳＫ−ＩＬ−２のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＰｓｔ  Ｉ部位の間にクローン化した。
【０１２９】
最終ハイブリッド遺伝子では、（ジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎをコードする）Ｐｓｔ  Ｉ部位は、ＩＬ−１５Ｒα（５’末端）配列とＩＬ−２（３’末端）配列の間でリンカーとして挙動した。その配列を制御し、キメラ構築体をBluescriptプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉ部位間で消化し、哺乳動物発現ベクターｐＫＣＲ６（３１）のＥｃｏ  ＲＩ部位にサブクローン化した。SuperFect試薬（Qiagen, Courtaboeuf, France）を使用し、Ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞にｐＫＣＲ６−ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２をトランスフェクションした。ヒトＩＬ−２（BioSource, Nivelles, Belgium）を検出するために、融合タンパク質を産生するクローンをＥＬＩＳＡを使用し検出した。上昇濃度のメトトレキサート（Sigma）を使用し、３回のクローニングを実施した。５μＭメトトレキサートで選択した１つのクローンによって、約４．３ｍｇ／lのｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２が産生された。上清を６０％飽和の硫酸アンモニウムによる沈殿によって濃縮し、ＩＬ−２イムノアフィニティカラム（ｍＡｂ  IL2.66）にロードし、（３２）に記載されている通りＩＬ−２融合タンパク質を精製した。ヒトＩＬ−２についてその濃度をＥＬＩＳＡで定量した。既に記載されている（１２）クロラミンＴ法によりヨウ素化した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価では、分子量６０ｋＤａでその純度は少なくとも８０％であった。融合タンパク質のＩＬ−２部分の全機能を、ｒＩＬ−２を標準として使用し、ＣＴＬＬ−２増殖アッセイ（細胞増殖キットＩＩ、Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）で実証した。ＩＬ−１５Ｒα部分の高親和性ＩＬ−１５結合は、表面プラズモン共鳴技術（(Biacore AB, Uppsala, Sweden）を使用し実証した。
【０１３０】
ＩＬ−１５突然変異体の産生
ｐＥＦ−ｎｅｏ  ＰＰＬ  ＳＰ−ＩＬ−１５（ヒト）発現構築体をｐＥＦ−１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（In Vitrogen, ref V921-20）で構築した。ラットのプレプロラクチンシグナルペプチド（ＰＰＬ  ＳＰ）配列は、ラット（rattus norvegicus）プレプロラクチン配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ０２２９３５）に従って、センスプライマー（下線はＫｐｎＩ部位）−配列番号５９−として
【０１３１】
【表１１】
2007528726.tif 000012
【０１３２】
およびアンチセンスプライマー（下線はＢａｍ  ＨＩ部位）−配列番号６０−として
【０１３３】
【表１２】
2007528726.tif 000013
【０１３４】
を使用し、ＧＨ４Ｃ１細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−８２．２）から調製したｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲすることによって増幅した。成熟ヒトＩＬ−１５コード配列は、ヒトＩＬ−１５配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００５８５）に従って、センスプライマー（下線はＢａｍ  ＨＩ部位）−配列番号６１−として
【０１３５】
【表１３】
2007528726.tif 000014
【０１３６】
およびアンチセンスプライマー（下線はＥｃｏ  ＲＩ部位）−配列番号６２−として
【０１３７】
【表１４】
2007528726.tif 000015
【０１３８】
を使用し、包皮切除後得られた包皮から調製した正常ヒトケラチノサイトのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲすることによって増幅した。ＰＰＬ  ＳＰをｐＥＦ−１／ｍｙｃ−ＨｉｓのＫｐｎＩ部位とＢａｍ  ＨＩ部位の間に導入し、ＩＬ−１５をｐＥＦ−１／ｍｙｃ−ＨｉｓのＢａｍ  ＨＩとＥｃｏ  ＲＩ部位の間に導入した。
【０１３９】
ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ：配列番号６３）を二本鎖オリゴヌクレオチドとして、ＰＰＬ  ＳＰと成熟ＩＬ−１５タンパク質コード配列の間のＢａｍ  ＨＩ部位に導入した。（配列番号６４＝
【０１４０】
【表１５】
2007528726.tif 000016
【０１４１】
および配列番号６５＝
【０１４２】
【表１６】
2007528726.tif 000017
【０１４３】
ＫｐｎＩ／Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントをサブクローン化することにより、ＰＰＬ−ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５配列を含むBluescriptプラスミドを生成した。アミノ酸スイッチングは、Bluescript構築体を用いてQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene, La Jolla, CA）を使用し実施した。配列は、ＰＰＬ−ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５ハイブリッドｃＤＮＡ上に確認され、変異したＫｐｎＩ／Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントをｐＥＦ−１／ｍｙｃ−Ｈｉｓにクローン化して戻した。ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５突然変異体の産生には、標準リン酸カルシウムプロトコル後、６０ｍｍプレート中で３．２×１０６個の付着性２９３  ｃ１８細胞に１６μｇの変異させたＩＬ−１５発現構築体をトランスフェクションした。６時間後、培地を新鮮完全ＤＭＥＭ（Life Technologies, Cergy Pontoise, France）と交換し、トランスフェクション４８時間後上清を回収した。
【０１４４】
Pepscan分析
重複合成ペプチドを合成し、以前に記載されている通り（３３）クレジットカード型ミニPEPSCANカード（４５５ペプチド型／カード）を使用しスクリーニングした。
【０１４５】
試料（可溶性ＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２融合タンパク質）を５％ウマ血清（ｖ／ｖ）および５％卵白アルブミン（ｗ／ｖ）を含むブロッキング液で希釈し、共有結合ペプチドを含む４５５穴クレジットカード型ポリエチレンカードを４℃で終夜インキュベートした。洗浄後、抗ヒトＩＬ−２抗体AF-202-NA（１μｇ／ｍｌ）と共にカードを（２５℃で１時間）インキュベートし、洗浄し、さらに１．３μｇ／ｍｌ（P 0160, DakoCytomation）のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧと共にインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２、２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホナート（ＡＢＴＳ）に２μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を足したものを加え、１時間後に発色をＣＣＤカメラとイメージ処理システムを使用し数量化した。装置は、ＣＣＤカメラ、５５ｍｍレンズ（SonyＣＣＤビデオカメラXC-77RR、Nikon micro-nikkor 55 mmf/2.8レンズ）、カメラアダプタ（SonyカメラアダプタDC-77RR）、およびイメージ処理ソフトウェアパッケージOptimas, version 6.5（Media Cybernetics, Silver Spring, MD）から構成され、Pentium IIコンピュータシステムで作動する。ＣＣＤカメラは、ＡＢＴＳ基質の緑色をグレイ値（任意スケール）に翻訳するオレンジ色のフィルターを装備する。
【０１４６】
ＩＬ−１５結合アッセイ
ヒトｒＩＬ−１５を、クロラミンＴ法（３４）を使用し［１２５Ｉ］ヨウ素（比放射能２０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌ付近）で放射性標識し、以前に記載されている通り（１２）結合実験を実施した。非特異的結合を、１００倍量を超える未標識サイトカインの存在下で定量した。ＩＬ−１５結合実験には、ＴＦ−１細胞を上昇濃度の標識したｒＩＬ−１５と共にインキュベートした。一部位平衡結合方程式（Grafit, Erithacus Software, Staines, UK）を使用し、結合データの回帰分析を実施し、データをScatchard座標系にプロットした。ＩＬ−１５結合実験の阻害には、ＴＦ−１細胞を固定濃度のヨウ化処理したｒＩＬ−１５、ならびに上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５、突然変異体、またはｍＡｂと共にインキュベートした。データの回帰分析は、４パラメータロジスティック方程式（4 parameter logistic equation）（Graft, Erithacus Software）を使用し行った。
【０１４７】
増殖アッセイ
ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体の増殖誘発活性ならびにｍＡｂ阻害活性をＴＦ−１β細胞の［３Ｈ］チミジンの取込みによって評価した。細胞を培地中で３日間維持し、２度洗浄し、サイトカイン不含の同じ培地で２時間枯渇させた。細胞を、１０４細胞／１００μlで播種し、上昇濃度のｒＩＬ−１５、ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５または突然変異体を補充した培地で、あるいは固定濃度のｒＩＬ−１５および上昇濃度のｍＡｂを補充した培地で４８時間培養した。細胞を０．５μＣｉ／ｗｅｌｌの［３Ｈ］チミジンで１６時間パルスし、ガラス繊維フィルター上に回収し、細胞関連放射能を測定した。
【０１４８】
結果
Pepscan法によるＩＬ−１５ＲαのＩＬ−１５結合分析
ＩＬ−１５Ｒα結合に直接関与するＩＬ−１５領域の同定を試みるために、Pepscan法を使用した。その目的には、ヒトＩＬ−２に融合させたヒトＩＬ−１５Ｒαの細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質（ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２）を、顕在化抗体としてポリクローナル抗ヒトＩＬ−２抗体（AF-202-NA）を使用し、１２−ｍｅｒのＩＬ−１５ペプチドへの結合についてアッセイした（図３Ａ）。ＩＬ−１５配列の異なる２領域とのｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２の結合に相当する、２個の反応の主ピークが観察された。同様の濃度（３３０ｎＭ）のｒＩＬ−２による対照実験ではバックグラウンド反応が示された（図３Ａ）。３０−ｍｅｒのヒトＩＬ−１５ペプチドについてのPepscan研究では、これらの２個のＩＬ−１５領域を有するｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２の反応が確認された。反応に関連する２組のペプチド（１２−ｍｅｒおよび３０−ｍｅｒ）の分析によって、以下の配列をｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２結合、すなわち、４４ＬＬＥＬＱＶＩＳＬ５２（ペプチド１：配列番号４）および６４ＥＮＬＩＩ６８（ペプチド２：配列番号６）を担うものとして指定することができた。第１配列は、ヘリックスＢ中に、第２配列はヘリックスＣ中に位置する（図３Ｂ）。
【０１４９】
ＩＬ−１５部位特異的突然変異誘発
ＩＬ−１５Ｒα鎖結合におけるPepscanにより同定した、２個のペプチド領域の関与を確認するために、これらの領域でＩＬ−１５の点変異を実施した。推定受容体結合部位に実質的妨害を導入するために、非極性疎水性側鎖（Ｌ、Ｖ、Ｉ）および非荷電極性側鎖（Ｓ、Ｎ、Ｑ）を荷電基（Ｄ、Ｅ、またはＫ）で置換し、荷電極性側鎖（Ｅ）を反対荷電基（Ｋ）で置換した。位置４４〜５２（ペプチド１）および位置６４〜６８（ペプチド２）での突然変異体を生成した。野生型ヒトＩＬ−１５および突然変異体が、２９３  ｃ１８細胞中でＮ末端ＦＬＡＧペプチドを有する融合タンパク質として発現した。次いで、ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体をＴＦ−１細胞によって発現したＩＬ−１５Ｒαに結合するその能力についてアッセイした（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。その目的には、異なる突然変異体が、非飽和低濃度の放射性ヨウ化処理したｒＩＬ−１５のＴＦ−１細胞への結合を阻害する効率を比較できるようにする競合アッセイを使用した。競合曲線を図４Ａ、４Ｂ、４Ｃに示し、半最大阻害効果を与える突然変異体濃度（ＩＣ５０）を表Ｉに掲げる。
【０１５０】
【表１７】
2007528726.tif 000018
【０１５１】
表Ｉ  ＴＦ‐１細胞系におけるＩＬ‐１５突然変異体結合特性。ＮＤ：未検。ＮＡ：該当なし。相対活性の平均および標準偏差は３個の独立した実験から得る。
【０１５２】
ＩＣ５０が２６ｐＭであるＦＬＡＧ−ＩＬ−１５で阻害した標識ｒＩＬ−１５結合。
【０１５３】
ペプチド１内の３個の位置（Ｅ４６、Ｖ４９、およびＩ５０）での突然変異は、ＩＬ−１５の親和性に著明な影響を与えたが、Ｑ４８Ｋ変異では影響はなかった。位置Ｌ４５（Ｌ４５ＤおよびＬ４５Ｅ）、Ｓ５１、およびＬ５２での突然変異は、この競合アッセイでＩＬ−１５の親和性を再現可能に増大した（２〜３倍）。このアッセイでは、突然変異体Ｌ４４ＤおよびＬ４７Ｄを評価することができなかった。２９３  ｃ１８上清では産生レベルが低すぎたためである。ペプチド２領域の数個の突然変異（残基Ｌ６６およびＩ６７を対象とする突然変異）も、ＩＬ−１５の親和性を著しく減少させたが、位置Ｅ６４、Ｎ６５、およびＩ６８での突然変異では有意な効果はなかった。
【０１５４】
次いで、野生型ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体を、ＩＬ−１５応答ＴＦ−１β細胞に及ぼすその増殖促進効果について試験した（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび表ＩＩ）。
【０１５５】
【表１８】
2007528726.tif 000019
【０１５６】
表ＩＩ  ＴＦ‐１β細胞におけるＩＬ‐１５突然変異体増殖活性。ＮＡ：該当なし。相対活性の平均および標準偏差は３個の独立した実験から得る。
【０１５７】
ペプチド１突然変異体は、ＴＦ−１細胞で測定されたＩＬ−１５Ｒα結合効率に高く相関する生物活性を示した。すなわち、Ｌ４４Ｄ、Ｅ４６Ｋ、Ｌ４７Ｄ、およびＩ５０Ｄ突然変異はＩＬ−１５の生物活性を強力に減少したが、Ｑ４８Ｋ突然変異では有意な効果はなく、位置Ｌ４５、Ｓ５１、およびＬ５２での突然変異では生物活性において２〜４倍の上昇を誘発した。ただ一つの例外は突然変異体Ｖ４９Ｄであった。この突然変異体は結合能力を著しく減少させたが、ほぼ野生型の生物活性を示した。それに反して、ペプチド２領域の突然変異体ではＴＦ−１β細胞における生物活性とＴＦ−１細胞における結合親和性の間の相関は極めて小さかった。ＴＦ−１細胞においてほぼ野生型の結合親和性を示す突然変異体Ｎ６５ＫはＴＦ−１β細胞では不活性だった。同様にほぼ野生型の結合親和性を示した突然変異体Ｅ６４ＫおよびＩ６８Ｄは、野生型ＩＬ−１５の最大応答の約２０％の最大応答をもたらし、ＴＦ−１βにおいて部分アゴニストとして挙動した。唯一の相関は、Ｌ６６およびＩ６７位置の突然変異に見出された。突然変異体Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、およびＩ６７Ｅは、作用強度のランク付け順序が競合結合アッセイで見られたランク付け順序に類似する低い生物活性を示した。
【０１５８】
考察
低親和性でＩＬ−２に結合するＩＬ−２Ｒα鎖（３５）とは対照的に、ＩＬ−１５Ｒα鎖はそれ自体ＩＬ−１５に高親和性結合を示すことが判明した（１１）。従って、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαの間の界面は、ＩＬ−１５がその機能性高親和性（αβγ）受容体に結合する自由エネルギーのほとんどに貢献している可能性が高い。従って、ＩＬ−１５系のアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を有するタンパク質を設計するためには、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα界面の分子的特徴を良く知っていることが望ましい。今までのところその主題について利用可能なデータはなく、この研究の主目的はＩＬ−１５Ｒαの結合を担うＩＬ−１５のエピトープの定義に貢献するものであった。
【０１５９】
ＩＬ−１５Ｒαの可溶形に特異的に結合するPepscanによって、２個の領域を最初に同定した。第１の領域（４４ＬＬＥＬＱＶＩＳＬ５２、ペプチド１）は、Ｂヘリックスに位置し、第２（６４ＥＮＬＩＩ６８、ペプチド２）の領域はＣヘリックスに属する。
【０１６０】
変異誘発研究によって、これら２個の領域の関与が確認され、受容体結合と生物活性の誘発に関わるアミノ酸の同定が可能になった。
【０１６１】
その位置（Ｉ５０Ｄ）での突然変異は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合能力および細胞増殖誘発能力を著しく減少させ、結合およびシグナル伝達に作用する局所的な高次構造変化を反映しうる結果。しかし、この高次構造変化は分子の全体的構造を妨害しないように思われる。
【０１６２】
Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１、およびＬ５２は、ＩＬ−１５Ｒα結合に関与することが判明した。
【０１６３】
Ｅ４６は、その酸性側鎖を塩基性側鎖（Ｅ４６Ｋ）により置換すると、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα結合と生物活性が完全に消失するので重要である。
【０１６４】
負荷電側鎖（Ｖ４９Ｄ）によりＶ４９の疎水性側鎖を置換しても、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα親和性が著しく（１／１３倍）減少する。予想に反して、Ｖ４９Ｄ突然変異体は、ほぼ野生型生物活性を示した。結合親和性と生物活性の間の類似する相違点は、ＩＬ−２突然変異体（Ｔ５１Ｐ）について報告されている（３６）。この突然変異体は、野生型ＩＬ−２と同程度に活性であるが、１／１０の受容体結合親和性を示す。この突然変異体は、高親和性受容体の内部移行を誘発し、それによって受容体占有の持続時間を延長し生物学的応答を誘発するには不十分であったことが示されている。Ｖ４９Ｄ  ＩＬ−１５類似体が同様の特性を示すかどうかは調査する必要がある。
【０１６５】
位置Ｌ４５、Ｓ５１、およびＬ５２での突然変異は、結合および生物活性を減少させず、上昇させ、これらの残基もＩＬ−１５Ｒα結合に関与することを示した。突然変異体Ｌ４４ＤおよびＬ４７Ｄは、生物学的応答を損なったが、その結合親和性を評価することはできなかった。予想に反して、突然変異体Ｑ４８Ｋは、ほぼ野生型特性を示したが、Ｑ４８は受容体結合に関わるアミノ酸（Ｌ４５、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｓ５１およびＬ５２）によって形成されたエピトープの中央に位置する。受容体結合におけるその潜在的関与を再評価するために、この残基をさらに変異させる必要がありうる。
【０１６６】
ペプチド２領域の変異誘発の結果から、評価した５個のアミノ酸（Ｅ６４〜Ｉ６８）のうち、Ｌ６６とＩ６７のみが受容体結合に関与するらしいことが示された。突然変異体（Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、およびＩ６７Ｅ）は、結合親和性の減少と、対応するその生物活性の減少を示した。突然変異体Ｅ６４ＫおよびＩ６８Ｄは、野生型ＩＬ−１５の親和性と類似する親和性を有し、Ｅ６４およびＩ６８がＩＬ−１５Ｒα結合に関与しないことを示唆した。しかし、突然変異体は、増殖アッセイでは部分アゴニストとして挙動した。部分的アゴニズムは受容体の不完全な活性化を示している（３７）ので、Ｅ６４およびＩ６８はＩＬ−２Ｒβ／γ形質導入複合体の動員に関与している可能性がある。この結論は、Ｎ６５の突然変異（Ｎ６５Ｋ）がＩＬ−１５Ｒα結合親和性を検出可能に変化させることなく生物活性を消失させることを支持しうる。マウスＩＬ−２の変異誘発および分子モデリング研究（２７、３８）は、ヘリックスＡに位置する残基Ｄ２０に加えて（２４）、ヒトＩＬ−２のＣヘリックスもＩＬ−２Ｒβとのその相互作用に潜在的に関与することを示唆しており、近年の業績はそのヘリックスにおける変異（Ｎ８８Ｒ）がＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβ結合を劇的に（１／１０００倍）消失させる（２６）ことを示している。本発明者らの結果は、ヒトＩＬ−１５のその対応する領域、特に残基Ｅ６４、Ｎ６５、およびＩ６８がＩＬ−２Ｒβ鎖の動員にも関わることを示唆している。
【０１６７】
ＩＬ−１５突然変異体Ｅ６４Ｋ、Ｎ６５Ｋ、およびＩ６８Ｄは、潜在的ＩＬ−１５アンタゴニストとしてそれらを意味付ける特性（ＩＬ−１５Ｒα高親和性結合にも関わらず生物活性が低いまたは無い）を示す。実際、予備的実験では、Ｎ６５ＫはＩＬ−１５誘発細胞増殖を阻害できることが示唆される。
【０１６８】
ペプチド２に相当するＩＬ−１５の領域は、ＩＬ−１５Ｒα結合とＩＬ−２Ｒβ結合に関わると思われる。突然変異誘発によって、ペプチド２（Ｅ６４〜Ｉ６８）のアミノ酸が全て、この過程に関与することが判明した。
【０１６９】
ペプチド２に対応するエピトープがＩＬ−１５Ｒα結合およびＩＬ−２Ｒβの動員に関与することは、受容体組立てのダイナミクスに意味をもたらす。ＩＬ−１５は、まず、ペプチド１およびペプチド２（またはその一部）のエピトープに結合することによって、ＩＬ−１５Ｒαに高親和性結合するはずである。次いで、次のＩＬ−２Ｒβ動員が、ペプチド２エピトープの別の部分の結合に関与しうる。あるいは、ＩＬ−２Ｒβがペプチド２エピトープに結合する際にＩＬ−１５Ｒαを置換する高次構造変化が生じるかもしれない。
【０１７０】
マウスＩＬ−２の場合には、ペプチド１に対応する、ＩＬ−１５エピトープに類似するヘリックスＢの配列は、ＩＬ−２Ｒαと相互作用することが示されている（すなわち残基Ｅ７６、Ｐ７９、Ｖ８３、およびＬ８６）（２７）。ヒトＩＬ−２の場合には、ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒα結合に作用するＢヘリックスにおける突然変異については今まで記載されていなかったが、分子モデリングによって、ヒトＩＬ−２のヘリックスＢ（すなわち残基Ｋ６４およびＥ６８、またはＥ６１およびＥ６２）とＩＬ−２Ｒαの間の接触は予想されていた（３８）。それに反して、ペプチド２に対応するＩＬ−１５のエピトープに類似するヘリックスＣ内のＩＬ−２の領域は、ＩＬ−２Ｒα結合に関与しないと思われている（２７）。従って、本発明者らの結果は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαの相互作用の方式がＩＬ−２とＩＬ−２Ｒαの相互作用の方式に完全には相同ではないことは示唆している。ＩＬ−２のそのα鎖への親和性の約５００倍高い親和性をＩＬ−１５がそのα鎖に対して示すという事実をこれは反映しているかもしれない。
【０１７１】
要するに、本発明者らは、ＩＬ−１５Ｒα結合に関与し、その１つがＩＬ−２Ｒβ形質導入サブユニットを召集するためにも使用される、ＩＬ−１５の２個の領域を同定した。野生型ＩＬ−１５のものよりも高い結合特性および生物学的特性を示し、従ってスーパーアゴニストとして挙動するＩＬ−１５ムテイン（Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１ＤおよびＬ５２Ｄ）は、リンパ球サブセット（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞）を増加させるための貴重なツールであり、癌または免疫不全症患者では治療剤として有用であろう。他のムテイン（Ｅ６４Ｋ、Ｎ６５Ｋ、およびＩ６８Ｄ）は、潜在的ＩＬ−１５アンタゴニストとしてこれらを意味付ける特性を示し、ＩＬ−１５が重要な役割を果たすと思われる（２２）、リューマチ性関節炎や全身性Shwartzman反応などの炎症性疾患で有用であろう。
【０１７２】
実施例２
実験手順
ＩＬ−１５部位特異的突然変異誘発
ＩＬ−１５部位特異的突然変異誘発を実施例１に記載したように実施した（QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit）。
【０１７３】
Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５タンパク質の精製。突然変異体Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５タンパク質を親和性により精製した。４８時間後の２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション培養から回収した１００ｍｌの上清を７０％飽和濃度の硫酸アンモニウムにより沈殿させた。２９３−ＥＢＮＡ細胞は、２９３  ｃ１８という名称を有し、ＡＴＣＣからアクセッション番号ＣＲＬ−１０８５２（American Type Culture CollectionＡＴＣＣ；P.O. Box 1549 ; Manassas, VA 20108; U.S.A.）で入手することができる。ペレットをＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶解し、６〜８０００ダルトンをカットオフするSpectra/Por管でＴＢＳに対して透析した。透析液を１００μlの抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アフィニティゲル（Sigma-Aldrich）でバッチ精製した。突然変異体Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５タンパク質を８００μlの１００ｍＭグリシンｐＨ３．５によりゲルから溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で中和した。精製したタンパク質をＲＰＭＩに対して透析し、フィルター滅菌した後、増殖アッセイで試験した。
【０１７４】
増殖アッセイ。突然変異体Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５の阻害活性を６６ｎＭ抗ＩＬ−２Ｒβ  Ａ４１  ｍＡｂ［Roche Diagnostic GmbH （Penzberg, Germany）から入手。あるいは、これらの実験には、ＩＬ２Ｒβが介在する生物活性において阻害活性示す任意の抗ＩＬ２Ｒβ抗体、例えば、ポリクローナルAF-224-NA（R&S Systems Inc., Minneapolis, USA）などを使用することもできる］の存在下、（上の実施例１に記載した通りに得られた）ＴＦ−１β細胞での［３Ｈ］チミジン取り込みによって評価した。
【０１７５】
細胞を培地で３日間維持し、２度洗浄し、サイトカイン不含の同じ培地で２時間枯渇させた。細胞を、１０４細胞／１００μlで播種し、６６ｎＭのＡ４１  ｍＡｂ、１０ｐＭの固定濃度のｒＩＬ−１５、および上昇濃度の突然変異体Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５を補充した培地で４８時間培養した。細胞を０．５μＣｉ／ｗｅｌｌの［３Ｈ］チミジンで１６時間パルスし、ガラス繊維フィルター上に回収し、細胞関連放射能を測定した。
【０１７６】
結果
ＩＬ−１５部位特異的突然変異誘発。位置６４〜６８（ペプチド２）および６４〜６９（ペプチド２ａ）で突然変異体を生成し、Ｎ末端ＦＬＡＧペプチドを有する融合タンパク質として２９３−ＥＢＮＡ細胞中で発現させた。
【０１７７】
ＴＦ−１細胞により発現したＩＬ−１５Ｒαに結合するその能力について、ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５突然変異体を競合アッセイでアッセイした。このアッセイは、異なる突然変異体が、非飽和低濃度の放射性ヨウ化処理したｒＩＬ−１５のＴＦ−１細胞への結合を阻害する効率を比較できるものであった。競合曲線を図６に示し、半最大阻害効果を与える突然変異体の濃度（ＩＣ５０値）を表ＩＩＩに記載する。
【０１７８】
【表１９】
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【０１７９】
ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５は、ＩＣ５０が２３．６ｐＭの標識ｒＩＬ−１５結合を阻害した。位置Ｌｅｕ−６９での変異によって、この競合アッセイではＩＬ−１５親和性がわずかに上昇した（ＩＣ５０＝９．１ｎＭ）。
【０１８０】
次いで、突然変異体をＩＬ−１５−応答性ＴＦ−１β細胞におけるその増殖促進効果について試験した（図７）。Ｌ６９Ｒ突然変異体は、最大応答が野生型ＩＬ−１５の最大応答の約２％であるＴＦ−１βにおいて部分アゴニストとして挙動した。
【０１８１】
ＩＬ−１５のＦｌａｇ−ＩＬ−１５Ｎ６５Ｋによる阻害が、Ａ４１の存在下でＴＦ１β増殖を誘発した。細胞膜上で３本の受容体鎖ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃを発現させることによって、ＩＬ−１５に対して高親和性応答が得られるようになる。両受容体鎖ＩＬ−２Ｒβおよびγｃの発現によって、ＩＬ−１５に対して中程度の親和性増殖応答が得られるようになる。ＩＬ−２Ｒβ／γｃ受容体を特異的に阻止する抗ＩＬ−２Ｒβ  ｍＡｂ、Ａ４１を使用して、中程度親和性受容体によりＩＬ−１５が誘発する増殖を阻止した。Ｎ６５Ｋ親和性により精製したＦｌａｇ−ＩＬ−１５突然変異体は、ＴＦ−１細胞におけるそのＩＬ−１５Ｒα結合能力（ＩＣ５０＝２６．６ｐＭ）と関連して、ＩＬ−１５により誘発された増殖を１２ｐＭのＩＣ５０で完全に阻害した（図８）。細胞増殖は、１００ｐＭで完全に阻害された。
【０１８２】
考察
ペプチド２／２ａ領域での変異誘発の結果から、評価した６種のアミノ酸（Ｇｌｕ−６４〜Ｌｅｕ−６９）のうちで、突然変異体Ｅ６４Ｋ、Ｉ６８Ｄ、およびＬ６９Ｒが野生型ＩＬ−１５のものに少なくとも類似するＩＬ−１５Ｒα結合親和性を有することが示された。しかし、突然変異体は、増殖アッセイでは部分アゴニストとして挙動した。部分的アゴニズムは受容体の不十分な活性化を示しているので、Ｇｌｕ−６４、Ｉｌｅ−６８、およびＬ６９Ｒは、ＩＬ−２Ｒβ／γｃ形質導入複合体の動員に関与するであろう。
【０１８３】
この結論は、その変異（Ｎ６５Ｋ）が、ＩＬ−１５Ｒα結合親和性を検出可能に変化させることなく生物活性を消失させるＡｓｎ−６５を支持するであろう。
【０１８４】
本発明者らの結果は、ヒトＩＬ−１５ヘリックスＣの領域、特に、残基Ｇｌｕ−６４、Ａｓｎ−６５、Ｉｌｅ−６８、およびＬ６９ＲがＩＬ−２Ｒβ鎖の動員に関わることを示唆している。
【０１８５】
ＩＬ−１５突然変異体Ｅ６４Ｋ、Ｎ６５Ｋ、Ｉ６８Ｄ、およびＬ６９Ｒは、ＩＬ−１５アンタゴニスト（Ｎ６５Ｋ）または部分アゴニスト（Ｅ６４Ｋ、Ｉ６８Ｄ；Ｌ６９Ｒ）としてそれらを意味付ける特性（ＩＬ−１５Ｒα高親和性結合にも関わらず生物活性が低いまたは無い）を示す。図８に示す結果は、Ｎ６５Ｋが高親和性ＩＬ−１５誘発細胞増殖を完全に阻害することを示唆している。
【０１８６】
脚注
使用した略語は以下である：ＩＬ、インターロイキン；ｒＩＬ、組換えＩＬ；ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−１５受容体α鎖；ＮＫ、ナチュラルキラー；Ｊａｋ、Ｊａｎｕｓキナーゼ；Ｓｔａｔ、シグナル伝達物質および転写アクチベーター；Ｌｃｋ、リンパ球特異的チロシンキナーゼ；ｓｙｋ、脾臓チロシンキナーゼ；ＭＡＰ、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ；Ｂｃｌ、Ｂ細胞白血病；ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着測定法；ＲＩＡ、ラジオイムノアッセイ；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；Ｄｈｆｒ、ジヒドロ葉酸還元酵素；ＩＣ５０、阻害濃度５０％；ＥＣ５０、有効濃度５０％；ＳＰ、シグナルペプチド；ＰＰＬ、プレプロラクチン。
【０１８７】
【表２０】
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【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１Ａ】ヒトＩＬ−１５遺伝子配列（配列番号１）、およびそのＣＤＳ開始位置と停止位置、ならびにヒト成熟ＩＬ−１５タンパク質の配列（配列番号２）を示す図である。ペプチド１（Ｌ４４〜Ｌ５２）、ペプチド２（Ｅ６４〜Ｉ６８）およびペプチド２ａ（Ｅ６４〜Ｌ６９）を太字で示す。
【図１Ｂ】ペプチド１：Ｌ４４〜Ｌ５２のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および配列番号４）、ペプチド２：Ｅ６４〜Ｉ６８のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および配列番号６）、ならびにペプチド２ａ：Ｅ６４−Ｌ６９のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号６６および配列番号６７）を示す図である。
【図２Ａ】ペプチド１（Ｌ４４〜Ｌ５２：配列番号４）の配列、およびＩＬ−１５アゴニスト活性を有し、ペプチド１に由来する幾つかのムテイン（配列番号７〜１８）を示す図である。
【図２Ｂ】ペプチド２の配列（Ｅ６４〜Ｉ６８：配列番号６）、およびＩＬ−１５アンタゴニストまたは部分アゴニストであり、ペプチド２に由来する幾つかのムテイン（配列番号１９〜２８）を示す図である。
【図２Ｃ】ヒト成熟野生型ＩＬ−１５の、残基４５（配列番号２９〜３２）、または残基５１（配列番号３３〜３６）、または残基５２（配列番号３７〜４０）を置換することによって得られる、本発明の幾つかのＩＬ−１５ムテインの配列を示す図である。
【図２Ｄ】ヒト成熟野生型ＩＬ−１５の、残基６４（配列番号４１〜４２）、または残基６５（配列番号４３〜４６）、または残基６８（配列番号４７〜５０）を置換することによって得られる、本発明の幾つかのＩＬ−１５ムテインの配列を示す図である。
【図３】ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２のＩＬ−１５  １２−ｍｅｒペプチド結合の分析を示す図である。  Ａ：ヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列全体にかかる１２−ｍｅｒのペプチドをマルチウェルプレートに固定し、示すようにその異なる分子との反応性を試験した。各サブパネルの左側はＩＬ−１５のＮ末端１２−ｍｅｒのペプチドに対応する。ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２融合タンパク質（２０μｇ／ｍｌすなわち３３０ｎＭ）またはｒＩＬ−２（５μｇ／ｍｌすなわち３３０ｎＭ）をインキュベートし、ヤギAF-202-NA抗ヒトＩＬ−２抗体にペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧを加えたものでその結合が判明した。各ウェルの反応性（縦座標、任意スケール）を実験手順に記載されるように測定する。  Ｂ：ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２によって認識されるヒトＩＬ−１５ペプチド領域は、ＩＬ−１５の一次構造上に位置する。４個のαヘリックスを示す。
【図４Ａ】ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体のＩＬ−１５Ｒα親和性の定量を競合結合の研究によって示す図である。ＴＦ−１細胞を固定濃度（８０ｐＭ）の［１２５Ｉ］−ｒｌＬ−１５、ならびに（横座標に示す）上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型（ＷＴ）または突然変異体で平衡化した。  図４Ａ：ＷＴ（■）、Ｌ４５Ｄ（◆）、Ｌ４５Ｅ（◇）、Ｅ４６Ｋ（σ）
【図４Ｂ】ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体のＩＬ−１５Ｒα親和性の定量を競合結合の研究によって示す図である。ＴＦ−１細胞を固定濃度（８０ｐＭ）の［１２５Ｉ］−ｒｌＬ−１５、ならびに（横座標に示す）上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型（ＷＴ）または突然変異体で平衡化した。  図４Ｂ：ＷＴ（■）Ｑ４８Ｋ（□）、Ｖ４９Ｄ（◆）、Ｉ５０Ｄ（◇）、Ｓ５１Ｄ（σ）、Ｌ５２Ｄ（△）
【図４Ｃ】ＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体のＩＬ−１５Ｒα親和性の定量を競合結合の研究によって示す図である。ＴＦ−１細胞を固定濃度（８０ｐＭ）の［１２５Ｉ］−ｒｌＬ−１５、ならびに（横座標に示す）上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型（ＷＴ）または突然変異体で平衡化した。  図４Ｃ：ＷＴ（■）Ｅ６４Ｋ（□）、Ｎ６５Ｋ（◆）、Ｌ６６Ｄ（◇）、Ｌ６６Ｅ（σ）、Ｉ６７Ｄ（△）、Ｉ６７Ｅ（●）、Ｉ６８Ｄ（○）、
【図５Ａ】ＴＦ−１β細胞におけるＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体の増殖活性を示す図である。ＴＦ−１β細胞を（横座標に示す）上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型（ＷＴ）または突然変異体の存在下で培養した。細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジンの取込みを測定することによって評価した。  図５Ａ：ＷＴ（■）、Ｌ４４Ｄ（□）、Ｌ４５Ｄ（◆）、Ｌ４５Ｅ（◇）、Ｅ４６Ｋ（σ）、Ｌ４７Ｄ（△）
【図５Ｂ】ＴＦ−１β細胞におけるＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体の増殖活性を示す図である。ＴＦ−１β細胞を（横座標に示す）上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型（ＷＴ）または突然変異体の存在下で培養した。細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジンの取込みを測定することによって評価した。  図５Ｂ：ＷＴ（■）Ｑ４８Ｋ（□）、Ｖ４９Ｄ（◆）、Ｉ５０Ｄ（◇）、Ｓ５１Ｄ（σ）、Ｌ５２Ｄ（△）
【図５Ｃ】ＴＦ−１β細胞におけるＦＬＡＧ−ＩＬ−１５および突然変異体の増殖活性を示す図である。ＴＦ−１β細胞を（横座標に示す）上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型（ＷＴ）または突然変異体の存在下で培養した。細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジンの取込みを測定することによって評価した。  図５Ｃ：ＷＴ（■）、Ｅ６４Ｋ（□）、Ｎ６５Ｋ（◆）、Ｌ６６Ｄ（◇）、Ｌ６６Ｅ（σ）、Ｉ６７Ｄ（△）、Ｉ６７Ｅ（●）、Ｉ６８Ｄ（○）、
【図６】Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５および突然変異体のＩＬ−１５Ｒα親和性の定量を競合結合の研究によって示す図である。ＴＦ１細胞を固定濃度（８０ｐＭ）の１２５Ｉ−ｒＩＬ−１５、ならびに上昇濃度の野生型Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５または突然変異体Ｌ６９ＲとＥ４６Ｋで平衡化した。図４Ａに記載した通り、特異的ｒＩＬ−１５細胞結合を算出しプロットした。
【図７】ＴＦ−１β細胞におけるＦｌａｇ−ＩＬ−１５および突然変異体の増殖活性を示す図である。ＴＦ−１β細胞を上昇濃度のＦＬＡＧ−ＩＬ−１５野生型または突然変異体（Ｌ６９Ｒ）の存在下で培養した。細胞増殖は、［３Ｈ］チミジンの取込みを測定することによって評価した。標準偏差は小さく記号によって隠れている。
【図８】Ａ４１の存在下、ＩＬ−１５により誘発されたＴＦ−１β細胞の増殖に及ぼすＮ６５ＫのＦｌａｇ−Ｉｌ−１５突然変異体の効果を示す図である。細胞増殖は、［３Ｈ］チミジンの取込みを測定することによって評価した。６６ｎＭの抗ＩＬ−２Ｒβ  Ａ４１  ｍＡｂの存在下、固定濃度の１０ｐＭのｒ−ＩＬ−１５（対照）および親和性により精製した上昇濃度のＦｌａｇ−ＩＬ−１５Ｎ６５Ｋと共に細胞を培養した。負の対照は、トランスフェクションしていない２９３−ＥＢＮＡ細胞から条件培地をアフィニティ精製することよって調製し、Ｆｌａｇ−ＩＬ−１５Ｎ６５Ｋと同じ希釈で生物アッセイに導入した。
【図９】ペプチド２の配列（Ｅ６４−Ｌ６９：配列番号６７）、およびＩＬ−１５アンタゴニスト候補（部分アゴニスト）であり、ペプチド２に由来する幾つかのムテイン（配列番号６８〜８１）を示す図である。
【図１０】ヒト成熟野生型ＩＬ−１５の残基６９（配列番号８２〜８５）を置換することによって得られる、本発明の幾つかのＩＬ−１５ムテインの配列を示す図である。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｃ−４】
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【図２Ｃ−５】
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【図２Ｃ−６】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｄ−３】
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【図２Ｄ−４】
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【図２Ｄ−５】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007528726.tif 000054
2007528726.tif 000055
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