(57)【要約】  ジヒドロエピアンドロステロン及び/又はデヒドロエピアンドロステロン-サルフェート、又はそれらの塩から選ばれる第一活性物質、抗コリン作用性気管支拡張薬を含む第二活性物質を含む、喘息、慢性閉塞性肺疾患、又は他の呼吸器疾患の治療用の医薬又は獣医薬組成物。本組成物は、種々の製剤、及びキットの形態で提供される。当該特許に係る製品は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、又は他の呼吸器疾患に適用される。
2007509839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬又は獣医薬として許容される担体と、喘息、慢性閉塞性肺疾患、又は呼吸器又は肺の疾患を治療するのに有効な第一活性物質及び第二活性物質を含む医薬組成物であって、
（a）当該第一活性物質が、以下の：
【化１】
2007509839.tif 000052
で表される化学式を有する非グルココルチコイド・ステロイド、及び以下の：
【化２】
2007509839.tif 000053
[両式中、
R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R12、R13、R14、及びR19は独立にH、OR、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルコキシであり、R5とR11は独立にOH、SH、H、ハロゲン、医薬として許容されるエステル、医薬として許容されるチオエステル、医薬として許容されるエーテル、医薬として許容されるチオエーテル、医薬として許容される無機エステル、医薬として許容されるモノサッカライド、ジサッカライド、又はオリゴサッカライド、スピロオキシラン、スピロチラン、-OSO2R20、-OPOR20R21、又は(C1-C10)アルキルであり、R5とR6を一緒にしたものは=Oであり、R10とR11を一緒にしたものは=Oであり；R15は、（１）R16が-C(O)OR22であるとき、H、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、又は(C1-C10)アルコキシであり、（２）R16がハロゲン、OH、又は(C1-C10)アルキルであるとき、H、ハロゲン、OH、又は(C1-C10)アルキルであり、（３）R16がOHであるとき、H、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルケニル、(C1-C10)アルキニル、ホルミル、(C1-C10)アルカノイル、又はエポキシであり、（４）R16がHであるとき、OR、SH、H、ハロゲン、医薬として許容されるエステル、医薬として許容されるチオエステル、医薬として許容されるエーテル、医薬として許容されるチオエーテル、医薬として許容される無機エステル、医薬として許容されるモノサッカライド、ジサッカライド、又はオリゴサッカライド、スピロオキシラン、スピロチラン、-OSO2R20、又は-OPOR20R21であり、又はR15とR16を一緒にしたものは=Oであり；R17とR18は独立に、（１）R6がH、OR、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、又は-Ｃ（Ｏ）ＯＲ２２であるとき、H、-OH、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、又は(C1-C10)アルコキシであり、（２）R15とR16を一緒にしたものが=Oであるとき、H、(C1-C10アルキル)アミノ、((C1-C10)アルキル)nアミノ-(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルコキシ、ヒドロキシ-(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルコキシ-(C1-C10)アルキル、（ハロゲン）m(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルカノイル、ホルミル、(C1-C10)カルバルコキシ、又は(C1-C10)アルカノイルオキシであり、（３）R17とR18を一緒にしたものは=Oであり；（４）R17とR18をそれらが結合した炭素と一緒にしたものは０又は１個の酸素原子を含む３−６員環を形成し；又は（５）R15とR17をそれらが付着した炭素と一緒にしたものはエポキシド環を形成し；R20とR21は独立に、OH、医薬として許容されるエステル、又は医薬として許容されるエーテルであり；R22はH、(ハロゲン)m(C1-C10)アルキル、又は(C1-C10)アルキルであり；nは０、１、又は２であり；mは１、２、又は３である]
で表される化学式を有する非グルココルチコイド・ステロイドから選ばれる少なくとも１の非グルココルチコイド・ステロイド、又は医薬又は獣医薬として許容されるその塩であり；
（ｂ）当該第二の活性物質が抗コリン作用性気管支拡張薬である、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記第一活性物質が以下の：
【化３】
2007509839.tif 000054
[式中、
破線は単結合、又は二重結合を表し；Rは水素又はハロゲンであり；５位のHはアルファ又はベータ配置で存在するか又は化学式Iの当該化合物は両配置のラセミ混合体を含み；そしてR1は水素であるか、又は化合物に共有結合した無機又は有機の多価ジカルボン酸である]
で表される化学式を有する非グルココルチコイド・ステロイドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記第一活性物質が、前記化学式（I）：
[式中、
前記多価の有機ジカルボン酸がSO2OM、ホスフェート、又はカルボネートであり、ここでMは対イオンを含み、ここで当該対イオンが、H、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、カルシウム、リチウム、アンモニウム、アミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリエチルアミン、エタノールアミン、コリン、トリエタノアミン、プロカイン、ベンザチン、トロメタニン、ピロリジン、ピペラジン、ジエチルアミン、以下の：
【化４】
2007509839.tif 000055
で表されるスルファチド；又は以下の：
【化５】
2007509839.tif 000056
｛式中、
R2とR3は、同じであっても異なってもよく、直鎖又は分枝鎖の（C1-C14）アルキル、又は以下の：
【化６】
2007509839.tif 000057
で表されるグルクロニドである｝
で表されるホスファチドである]
を有する非グルココルチコイド・ステロイドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第一活性物質が、デヒドロエピアンドロステロンである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記第一活性物質が、デヒドロエピアンドロステロン・サルフェートである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗コリン作用性気管支拡張薬が、イプラトロピウム又はチオトロピウムである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物がさらに、ユビキノン又は医薬又は獣医薬として許容されるその塩を含み、ここで当該ユビキノンは、以下の：
【化７】
2007509839.tif 000058
[式中、ｎは１〜１２である]
で表される化学式を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物が、吸入又は呼吸可能なサイズの粒子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記粒子が、約0.01μm〜約10μmのサイズである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記粒子が、約10μm〜約100μmのサイズである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
送達デバイスと請求項１に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項１２】
前記送達デバイスが、エアロゾル発生器又はスプレー発生器である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記エアロゾル発生器が吸入器を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記吸入器が、個別の予め計量された製剤の用量を送達することを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記吸入器が、噴霧器又は注入器を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
対象者において喘息の確率を減少するか、又は喘息を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象者に予防有効量又は治療有効量の請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
対象者において慢性閉塞性肺疾患の確率を減少するか、又はそれを治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象者に予防有効量又は治療有効量の請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
対象者において呼吸器、肺、又は悪性疾病又は症状を治療する方法、又はアデノシン又はアデノシン受容体のレベルを減少させるか又はそれに対する感受性を減少させる方法であって、そのような治療を必要とする対象者に予防的に又は治療的に有効な量の請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記疾病又は症状が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症（CF）、呼吸困難、気腫、喘鳴、肺高血圧、肺線維症、過敏応答性気道、アデノシン又はアデノシン受容体レベルの増加、アデノシン過敏性、感染症、肺気管支収縮、気管炎症又はアレルギー、肺表面活性物質又はユビキノンの欠乏、慢性気管支炎、気管支収縮、呼吸障害、肺気道の妨害及び閉塞、心臓機能のアデノシン・テスト、肺血管収縮、呼吸妨害、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、アデノシン及びアデノシン・レベル上昇剤の投与、新生児呼吸促迫症候群（新生児RDS）、痛み、アレルギー性鼻炎、癌、又は慢性気管支炎を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、DHEA-サルフェート、又はその塩などの非グルココルチコイド・ステロイドと抗コリン作用性気管支拡張薬を含む組成物に関する。この組成物は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、又はその他の呼吸器疾患の治療で有用である。
【０００２】
関連出願の参照
本出願は、2003年7月31日に出願された米国特許仮出願第60/492,226号の優先権を主張する 2003年10月29日に出願された米国特許出願第10/698,079号の部分継続であり、これらはその全てを本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
呼吸器疾患は、いろいろな症状と関連して、一般人の間できわめて多く見られる。場合によって炎症を伴い、それが肺の病状を悪化させる。呼吸器疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、及びアレルギー性鼻炎、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）,及び肺線維症など、その他の上方及び下方気道呼吸器疾患を含む。
【０００４】
例えば、喘息は、先進工業国で最もよく見られる疾病の一つである。米国では、それは医療費全体の約1%を占める。過去１０年間に喘息の罹患率と死亡率の驚くべき増加が報告されており、喘息は次の１０年間の突出した職業疾患になるであろうと予測されている。喘息は、変動する、多くの場合可逆的な気道の閉塞によって特徴づけられる病気である。このプロセスは肺の炎症、そして場合によっては肺のアレルギーと結びつけられる。多くの患者は、“喘息発作”と呼ばれる急性の症状を起こすが、慢性の症状で苦しむ人たちもいる。喘息のプロセスは、場合によっては、過敏な患者が抗原を吸入することが引き金になって起こると考えられている。この症状は一般に“外因性喘息” と呼ばれる。喘息患者によっては、この病気に対して内因性の素因を有することがあり、これは“内因性喘息”と呼ばれ、アデノシン受容体によって媒介されるもの、免疫IgEによる応答で媒介されるアレルギー疾患、その他を含む。すべての喘息が、この病気の特徴である一群の症状を示す：すなわち、一時的な気管支収縮、肺の炎症、及び肺の表面活性剤の減少である。現在、気管支拡張薬や抗炎症薬が市販されており、喘息の治療のために処方される。最もよく見られる抗炎症薬、コルチコステロイドはかなりの副作用があるが、それでもよく処方される。さらに重要なことは、喘息の治療のために利用できる薬の多くは、ある数の患者にはほとんど効力がないということである。
【０００５】
COPDは、気流の閉塞で特徴づけられ、それは一般に慢性気管支炎、気腫、又は両方によって起こる。普通、気道の閉塞は完全に可逆的でないが、患者の10-20%は治療によって気道閉塞が多少改善される。慢性気管支炎の場合、気道の閉塞は異常な気道粘液の慢性的な過剰な分泌、炎症、気管支痙攣、及び感染から生ずる。慢性気管支炎は、慢性的な咳、粘液産生、又はその両方、によって特徴づけられ、それが少なくとも三ヶ月間、少なくとも二年引き続いて起こり、他の慢性的な咳の原因が排除される場合である。気腫では、末端の細気管支の構造エレメント（エラスチン）が破壊され、気道の壁が崩壊し、“古い”空気を吐き出すことができなくなる。気腫では、肺胞の恒久的な破壊が起こる。気腫は、末端の細気管支から遠い側の空気スペースの異常な恒久的拡大と、それに伴う壁の破壊によって特徴づけられ、明らかな線維症は見られない。COPDはまた、二次肺高血圧を引き起こすことがある。二次肺高血圧自体は、肺動脈の血圧が以上に高くなる病状である。重篤な場合、高い圧力に抗して血液をポンプで送るために心臓の右側がいつもよりも懸命に働かなければならない。これが長期間続くと、心臓の右側が肥大してよく機能しなくなり、血液が足首（むくみ）と腹に集まる。やがて心臓の左側に故障が起こり始める。肺疾患によって起こる心臓の故障は肺性心（cor pulmonale）と呼ばれる。
【０００６】
COPDは、中高年の人たちがかかるということが特徴的で、世界中で病気と死亡の主要な原因の一つになっている。米国では、約1,400万人の人がこの病気にかかっており、米国における死亡原因の４番目、廃疾原因の３番目である。罹患率も死亡率も上昇しつつある。米国におけるこの病気の推定有病率は1982年以後41%増加しており、年齢調整死亡率は、1966年から1985年までに71%増加した。これは、同じ期間におけるすべての原因による年齢調整死亡率の減少（22%減少した）及び心臓血管系疾患による年齢調整死亡率の減少（45%減少した）と対照的である。1998年に、COPDは米国で112,584人の死亡原因であった。
【０００７】
しかし、COPDは予防できる。その主な原因は紙巻き煙草の煙への曝露であると考えられるからである。長期の喫煙がCOPDの最も多い原因である。それはすべての症例の80から90%を占める。喫煙者は非喫煙者に比べてCOPDで死亡する確率が10倍高い。この疾病は生涯非喫煙者には稀であり、その人たちの環境的な煙草の煙への曝露が気道の閉塞の少なくとも一部を説明する。その他の病因としては、気道の過敏な応答性や過敏さ、周辺大気の汚染、及びアレルギーが考えられる。COPDにおける気道の閉塞は、通常、喫煙を続けている人たちでは進行する。その結果、早期の廃疾と生存期間の短縮が起こる。喫煙を止めると非喫煙者の率まで減少することが見られるが、喫煙による損傷は不可逆的である。その他の危険因子としては：遺伝、副流煙、仕事及び環境における大気汚染への曝露、及び小児呼吸器疾患感染歴などがある。COPDの症状は：慢性的な咳、胸痛、休息時及び労作時の息切れ、呼吸の労力の増加、粘液産生の増加、及び頻繁な咳払いなどである。
【０００８】
COPDの症状を軽減するために、憎悪化を防止するために、最適な肺機能を保つために、そして日々の生活及び生命の質を改善するために、現在利用できることはきわめて少ない。多くの患者は、残りの生涯にわたって長期に医薬を利用し、憎悪時には用量を増やし薬を追加する必要がある。COPD患者に現在処方されている医薬としては：速効性のβ2-作用薬、抗コリン作用性気管支拡張薬、持続性気管支拡張薬、抗生物質、及び去痰薬などがある。COPDに対して現在利用できる治療のうち、抗コリン作用性の薬、β2-アドレナリン作用薬、及び経口ステロイドの投与からの、病気の進行に対する、長期的な効果ではなく、短期的な効果が認められた。経口ステロイドの投与は、急性の憎悪に対してしか勧告されず、長期の使用は死亡率と有病率を増加させる。
【０００９】
速効性及び持続性吸入β2-アドレナリン作用薬は、短期的な気管支拡張を達成し、COPD患者の症状をある程度緩和できるが、病気の進行に対して意味のある持続的効果は何も示さない。速効性のβ2-アドレナリン作用薬は、運動能力を増加させ、ある程度の気管支拡張を生じ、重篤な症例では肺機能を向上させるなど、COPD患者の症状を改善する。新しい持続性の吸入β2-アドレナリン性作用薬の最大の効果は、速効性のβ2-アドレナリン作用薬の効果と同程度であることが見出された。サルメテロールは、肺機能にはわずかな変化しか生じない又は全く変化を生じないが、症状及び生活の質を改善することが認められた。β2-作用薬の使用は、心拍数、血圧、及び心電図の結果の変化など、心臓血管系に影響を生ずる。稀な場合には、β2-作用薬の使用は、蕁麻疹、血管浮腫、発疹、及び口咽頭浮腫などの過敏反応を生ずることがある。このような場合はβ2-作用薬の使用は中止すべきである。喘息及びCOPD患者を気管支拡張薬イプラトロピウム・ブロミド又はフェノテロールによって継続的に治療することは、必要に応じて治療することに比べて優れていなかったので、維持療法には適していないと考えられる。他方、β2-アドレナリン性作用薬の最も多い、直接的な有害な副作用は振せんであり、高用量ではそれが血中カリウムの減少、律動異常、及び動脈酸素圧力の低下を引き起こすことがある。β2-アドレナリン性作用薬と抗コリン作用薬の組み合わせは、どちらかの薬を単独で用いた場合に比べて、気管支拡張をほとんど増加させない。しかし、標準用量の吸入β2-アドレナリン性作用薬にイプラトロピウム・ブロミドを約90日間にわたって追加すると、どちらかの薬を単独で用いた場合に比べて、安定したCOPD患者で多少改善が見られる。全体として、β2-アドレナリン性作用薬の有害な副作用、例えば振せんや律動異常の発生は抗コリン作用薬に比べて多い。抗コリン作用薬もβ2-アドレナリン性作用薬も、COPD患者全部に効果がある訳ではなく、二つの薬を組み合わせてもそうである。
【００１０】
抗コリン作用薬は、短期的に気管支拡張を達成してCOPD患者の症状を多少緩和するが、長期的な予後を何も改善しない。たいていのCOPD患者には、少なくともある程度の気道閉塞があり、それはイプラトロピウム・ブロミドによって多少軽減される。“肺健康調査”は、惰性と女性の喫煙者に初期COPDの肺活量測定による兆候を見出し、彼らを５年間追跡した。三つの治療法が５年間比較され、結果は、イプラトロピウム・ブロミドが患者の肺の機能的実効体積の減少に対する有意な効果を何も示さなかったのに対して、喫煙を止めることが肺の機能的実効体積の減少を遅らせる効果があることを示した。しかし、イプラトロピウム・ブロミドは、心臓症状、高血圧、皮膚発疹、及び尿閉などの有害な影響を生じた。
【００１１】
テオフィリンは、COPD患者にわずかな気管支拡張を生ずるが、有害な副作用を頻繁に生じ、治療の範囲は小さい。最適な効果のためには15-20 mg/lという血清濃度が必要であり、血清濃度を注意深くモニターしなければならない。有害な副作用としては、吐き気、下痢、頭痛、苛立ち、発作、及び心臓不整脈などがあり、非常に多様な血中濃度で起こり、多くの人では治療の範囲内でも起こる。テオフィリンの用量は、喫煙習慣、感染、他の治療、によって個別に調整しなければならず、厄介である。テオフィリンは、喘息で、特に低用量で、抗炎症効果があると言われているが、COPDでは効果は何も報告されていない。テオフィリンの有害な副作用と頻繁にモニターする必要がその有用性を制限している。
【００１２】
経口コルチコステロイドは、COPDの急性増悪で短期的な結果を改善することが示されたが、経口ステロイドの長期投与は骨粗しょう症、及び顕在糖尿病の誘発など、重大な副作用と結びつけられた。吸入コルチコステロイドは、ヒスタミンに対する気道の過敏応答に何も短期的な効果が実質的にないことが見出されている。吸入されたフルチカソンによる３年間の治療についての二つの研究では、中程度の及び深刻な増悪が有意に減少し、肺機能に影響を及ぼすことなく生活の質がやや改善された。可逆的な疾病のCOPD患者ほど吸入されたフルチカソンによる治療によって利益が得られるように見える。
【００１３】
粘液溶解薬は、増悪の頻度と持続時間に小さな有益な効果があるが、肺機能に対して有害な作用がある。しかし、N-アセチルシステインも他の粘液溶解薬も、増悪の頻度に大きな減少がみられるものの、重篤なCOPD（機能的実効体積＜50%）の人たちには有意な効果がない。N-アセチルシステインは、胃腸への副作用を生じた。酸素欠乏的COPDと鬱血性心不全患者に施される長期酸素治療は、最初の500日ほどは死亡率に何も効果がないが、それ以後は男性の生存率は増加し次の５年間一定にとどまった。しかし、女性では、酸素は研究の全体にわたって死亡率を減少させた。酸素欠乏COPD患者の19.3年にわたる連続酸素治療は、全体的な死亡の危険を減少させた。しかし、これまでのところ、ライフ・スタイルの変化、喫煙の中止、及び（酸素欠乏症における）長期酸素治療だけが、COPDの長期コースを変化させるということが見出されている。
【００１４】
また、呼吸器感染の最初の兆候で、しばしば抗生物質が、病気の肺のそれ以上のダメージと感染を防ぐために投与される。去痰薬は、気道から粘液分泌物を解放して追い出すのに役立ち、呼吸を楽にすることができる。さらに、COPDに関連した病状を抑えるために他の医薬を処方することもできる。それらは例えば：利尿剤（右心の病状に関連して過剰な水がたまることを防ぐ治療として投与される）、ジギタリス（心拍の力を強化する）、及び鎮咳剤などである。このリストの医薬は、COPDに関連した症状を軽減するのに役立つが、COPDを治療するものではない。このように、COPDの症状を軽減し、増悪を防止し、最適な肺機能を保ち、日々の生活活動と生命の質を改善するために現在利用できるものはきわめて少ない。
【００１５】
急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、又は強直肺、ショック肺、ポンプ肺及び鬱血性無気肺は肺の内部に液体がたまり、それが肺を硬直させることで起こると考えられる。この症状は、外傷、頭部の怪我、ショック、敗血症、多重輸血、医薬、肺塞栓症、重い肺炎、煙吸入、放射線、高地、溺水など、いろいろなプロセスが48時間以内に引き金を引いて起こる。一般に、ARDSは医学的緊急事態として起こり、直接又は間接に血管から液体を肺に“漏出”させる他の病気が原因になって起こる。ARDSでは、肺が膨張する能力が大きく低下して、肺の気嚢とライニング、又は内皮に広範な損傷を生ずる。ARDSで最もよく見られる症状は、苦しい速い呼吸、鼻の開閉、組織への酸素の欠乏によるチアノーゼで青ざめた皮膚、唇、爪、不安、及び一時的な呼吸停止である。ARDSの予備的診断は胸部Ｘ線と動脈血のガス測定で確認できる。場合によっては、ARDSは他の病気、例えば急性骨髄性白血病、例えばサイトシンアラビノサイドで治療した後で発現する急性腫瘍崩壊症候群（ATLS）などと関連しているように見える。しかし、一般に、ARDSは外傷、敗血症などの重篤な血液感染症、又は他の全身的な病気、高線量の放射線治療と化学療法、及び多臓器障害につながる炎症応答、そして多くの場合に死と関連しているように見える。未熟児（“preemies”）では、肺組織も表面活性物質も十分に発現していない。未熟児で呼吸窮迫症候群（RDS）が発生すると、きわめて重大な問題になる。RDSを示す未熟児は、現在、換気と酸素及び表面活性薬剤の投与で治療される。未熟児がRDSで生存すると、彼らはしばしば気管支肺形成異常（BPD）を起こし、これは慢性早期小児肺疾患とも呼ばれ、しばしば致命的である。
【００１６】
アレルギー性鼻炎はアメリカ人の５人に１人が罹患し、毎年推定40〜100億ドルの医療費を占め、すべての年齢で起こる。多くの人たちが自分の症状にしつこい風邪又は鼻の病気と言う間違ったラベルを貼っているので、アレルギー性鼻炎は多分実際よりも少なく診断されているであろう。普通、IgEが鼻でアレルゲンと結合して、化学伝達物質を産生し、細胞プロセスを誘導し、ニューロンを刺激し、根底になる炎症を引き起こす。症状としては、目と鼻の鬱血、鼻汁、くしゃみ、及びかゆみなどがある。時間がたつと、アレルギー性鼻炎の患者は、しばしば副鼻腔炎、中耳炎と滲出、そして鼻ポリープを生ずる。アレルギー性鼻炎の患者の約60%は喘息もあり、アレルギー性鼻炎の拡大は喘息を重症化させる。マスト細胞の脱顆粒によって形成された伝達物質が放出されていろいろな細胞、血管、そして粘液の腺と相互作用して典型的な鼻炎の症状を引き起こす。初期及び後期の反応の大部分は鼻でアレルゲンに曝露した後で起こる。後期の反応は慢性アレルギー性鼻炎に見られ、過剰分泌と鬱血が最も顕著な症状である。繰り返し曝露によって一つ以上のアレルゲンに対する過敏反応が生ずる。患者は冷たい空気や強い匂いなどの非特異的な引き金にも過敏になることがある。非アレルギー鼻炎は、ウイルスなどへの感染によって誘発され、又はアスピリン特異性の患者で見られるように、鼻ポリープを伴うことがある。
【００１７】
妊娠や甲状腺機能低下などの医学的状態及び職業因子又は医薬への曝露が鼻炎を引き起こすことがある。いわゆるNARES症候群（好酸球増加を伴う非アレルギー鼻炎症候群）は、鼻の分泌物における好酸球の増加を伴う非アレルギー・タイプの鼻炎であり、普通中年になって起こり、嗅覚の低下を伴う。アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎の治療は満足できるものではない。自分で投与する食塩水は鼻づまり、くしゃみ、及び鬱血を改善し、通常は何も副作用がないので、妊娠している患者が試みる最初の治療である。食塩水スプレーは、いろいろな鼻の病状に関連した粘膜の刺激と乾燥を緩和し、粘膜の肥厚を小さくし、固まった又は濃くなった粘液を除去するために一般に用いられる。食塩水スプレーは、鼻腔内のコルチコステロイド投薬の直前に用いると、薬で誘発される局部的な刺激を防ぐのに役立つ。テルフェナジンやアステミゾールなどの抗ヒスタミン剤もアレルギー性鼻炎を治療するために用いられる；しかし、抗ヒスタミン剤の使用は、Torsades de Pointsと呼ばれる、通常はケトコナゾールとエリスロマイシンなど他の医薬との相互作用による、又は根底にある心臓の問題に関係した心室性不整脈と結びつけられている。ロラタジン、鎮静作用がない別の抗ヒスタミン剤、とセチリジンは、QT間隔への有害な影響、又は心臓血管系の有害な事象と結びつけられていない。しかし、セチリジンは、ひどい眠気を生ずるので、あまり広く処方されていない。鎮静作用がない抗ヒスタミン剤、例えばクラリチンは、くしゃみ、鼻汁、及び鼻、目、及び口蓋のかゆみを多少緩和するが、喘息や他のもっと特異的な病状に関してはテストされていない。他方、テルフェナジン、ロラタジン、及びアステミゾールは、非常に控えめな気管支拡張作用、ヒスタミンに対する気管支の過敏反応性の減少、及び運動や抗原によって誘発される気管支痙攣に対する防護を示す。しかし、これらの利点のいくつかは、現在勧告されているよりも高い用量を必要とする。鎮静タイプの抗ヒスタミン剤は夜間の睡眠を誘導するが、昼間服用すると眠気を生じて行動が妨げられる。用いる場合、抗ヒスタミン剤は鬱血除去剤と組み合わせて鼻の鬱血を緩和するようにするのが普通である。交感神経様作用薬は、血管収縮薬及び鬱血除去薬として用いられる。よく処方される三つの全身用鬱血除去薬、プソイドエフェドリン、フェニルプロパノールアミン、及びフェニレフリンは、高血圧、動悸、頻脈、落ち着きのなさ、不眠症、及び頭痛を引き起こす。フェニルプロパノールアミンとカフェインの相互作用は、コーヒー２，３杯という量で血圧を顕著に上昇させる。さらに、プソイドエフェドリンなどの医薬は、小児に活動高進を誘発する。それでも局所施用の鬱血除去薬が、過剰な使用ではリバウンドして鼻道が拡張すると言われているため、限られた期間に限定して用いられる。抗コリン作用薬は、鼻漏が顕著な患者に、又は通常スパイシーな食物を嚥下して起こる“味覚鼻炎（gustatory rhinitis）”などの特定の病状で投与され、普通の風邪にある程度の有益な効果がある。例えば、クロモリンは、鼻スプレーとして予防的に用いられると、くしゃみ、鼻漏、及び、かゆみを減らし、初期及び後期の過敏応答をブロックするが、くしゃみ、一時的な頭��、及び鼻の灼熱痛を引き起こす。バンセナーゼなどの局所施用されるコルチコステロイドは、特にかゆみ、くしゃみ、及び鼻汁などの症状で鼻炎の治療に効果的であるが、鼻詰まりには効き目が弱い。しかし、製剤によっては、コルチコステロイドの鼻スプレーは過敏、刺激痛、灼熱痛、又はくしゃみも引き起こす。局部的な出血や中隔の穿孔も、特にエアロゾルが適切に目標に向けられていない場合、起こりうる。局所施用のステロイドは一般にアレルギー性鼻炎の治療ではクロモリン・ナトリウムよりも効果的である。免疫療法は、高価で不便であるが、特に他の医薬による副作用がある入院患者の場合、しばしば有益である。いわゆるブロッキング抗生物質、及び細胞のヒスタミン放出を変化させる薬は、他のいろいろな好ましい生理的変化と併せてIgEの減少をもたらすことがある。この効果は、IgEに媒介される疾病、例えば中耳の感染を繰り返すアトピー患者における過敏症に有用である。
【００１８】
肺線維症、間質性肺疾患（ILD）、又は間質性肺線維症は、肺組織を損傷し、肺の気嚢の壁に炎症を生じ、間質（又は気嚢の間の組織）の瘢痕又は線維症、及び肺の硬化を生じて肺を害する130以上の慢性的な肺疾患を含む。運動時の息切れがこれらの疾患の最初の症状の一つであり、空咳もある。多くの場合、症状もＸ腺もいろいろなタイプの肺線維症を区別するのに十分ではない。原因が知られている肺線維症患者も、原因が分からない又は特発性の肺線維症患者もいる。この疾病のコースは一般に予測不可能であり、この疾病は致命的である。その進行は、肺組織の肥厚化と硬直化、炎症、及び呼吸困難を含む。大部分の人たちは酸素治療を必要とし、唯一の治療法は肺移植である。
【００１９】
肺癌は、世界中で最も多く見られる癌である。2003年には、米国だけで肺癌の新しい症例が171,900人（男性が91,800人、女性が80,100人）、ヨーロッパでは375,000人になるであろう。肺癌は、男性と女性の両方で癌死亡の原因の第一位である。2003年には、推定157,200人（男性が88,400人、女性が68,800人）が肺癌で死亡し、米国だけですべての癌による死亡の28%を占めるであろう。結腸癌、乳癌、及び前立腺癌による死亡を合わせたよりも多くの人が肺癌で死亡している（American Cancer Society Web site, 2003, Detailed Guide: Lung Cancer: What are the Key Statistics?）。喫煙が肺癌の主原因として十分に確立されており、約90%の症例がタバコに関係していると考えられる。肺癌のリスクと一日に吸う紙巻き煙草の本数、吸入の程度、喫煙開始年齢の間にははっきりした量−応答関係がある。生涯喫煙者は非喫煙者に比べて肺癌のリスクが20-30倍高い。しかし、肺癌のリスクは、喫煙を止めた後、時間と共に減少する。男性の脱喫煙者（ex-smoker）の相対リスクは曝露は終了した後時間と共に急激に減少するが非喫煙者のリスクにまでは達しないし、女性の脱喫煙者ほどには減少しない（Tyczynski et al., Lancet Oncol. 4(1): 45-55, (2003)）。
【００２０】
しばしば、COPDと肺癌は共存症であり、根底にあるCOPDの程度によって特定患者が手術の候補になるかどうかが決まる。NSCLC（非小細胞肺癌）の場合、外科療法（放射線療法又は付随する化学療法を伴う又は伴わない）だけが治癒に至る。
【００２１】
・肺癌の１年生存率（癌と診断された後少なくとも１年間生存する人数）は、1998年に42%であったが、これは大部分外科技術の向上による。
【００２２】
・非小細胞肺癌全体のすべてのステージに関する５年生存率はわずか15%である。小細胞肺癌の場合、５年相対生存率は約6%である。
【００２３】
・NSCLCが見つかり、リンパ節や他の器官に拡がる前に手術で治療された人たちでは、平均５年生存率は約50%である。しかし、肺癌の人のうちこのように初期の局所的なステージで診断されるのはわずか15%である。
【００２４】
明らかに、肺癌の化学的予防並びに肺癌の治療に関して改善の余地は大きい。
【００２５】
デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）（3β-ヒドロキシアンドロステ-5-エン-7-オン）は、副腎皮質から分泌される明らかな化学的保護性質を有する天然のステロイドである。疫学研究は、体内生成されるDHEAのレベルの低さが何らかの形の癌、例えば女性の閉経前乳癌や両性の膀胱癌などになるリスクと相関することを示している。DHEAとDHEA類似体、例えばDHEA-S（DHEAサルフェート）、が発癌を抑える能力は、酵素グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（G6PDH）の活性を阻害する比類のない性質から生ずると考えられる。G6PDHは、細胞内リボース-5-ホスフェートとNADPHの主な源であるヘキソース・モノホスフェート経路の律速酵素である。リボース-5-ホスフェートは、リボ−及びデオキシリボ−ヌクレオチドの合成に必要な基質である。NADPHは、核酸の生合成及びヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼ（HMG CoA）の合成に関与する補因子である。HMG CoAレダクターゼは、産生される生成物、メバロネート、１モルあたり２モルのNADPHを必要とする異常な酵素である。したがって、HMG CoAレダクターゼはDHEAに媒介されるNADPHの欠乏に対してきわめて敏感であり、DHEA処理された細胞は急速にメバロネートの細胞内プールの欠乏を示すと思われる。メバロネートはDNA合成で必要とされ、DHEAはヒト細胞を細胞サイクルのＧ１フェーズで、直接のHMG CoAと良く似た仕方で停止させる。G6PDHは、タンパク質のイソプレニル化、及び糖タンパク質の生合成の前駆物質であるドリコールの合成などの細胞プロセスで必要とされるメバロン酸を産生するために必要なので、DHEAはメバロン酸を欠乏させ、タンパク質のイソプレニル化及び糖タンパク質の合成を阻害することによって発癌を抑える。メバロネートはコレステロールの合成並びにタンパク質の翻訳後修飾に関与するいろいろな非ステロール化合物、例えばファルネシル・ピロリン酸及びゲラニル・ピロリン酸の合成；及び細胞間コミュニケーションと細胞構造に関与する糖タンパク質の合成に必要なドリコールの中心的な前駆物質である。副腎皮質に由来するステロイド・ホルモンを薬理的に適当な用量で投与された患者は感染疾患の発病率が高くなることはずっと前から知られていた。米国特許第5,527,789号は、癌がDHEAに対して敏感である場合に、患者にDHEAとユビキノンを投与して癌を抑える方法を開示している。
【００２６】
DHEAは、17-ケトステロイドであり、これは定量的に、哺乳類に見出される主要な副腎皮質ステロイド・ホルモンの一つである。DHEAは、生殖腺ステロイド合成における中間物質としてやくだつように見えるが、DHEAの一次的な生理的機能は十分には分かっていない。しかし、このホルモンのレベルは２０歳代になると減少し始める（老人では初めの5%に達する）ことは知られている。臨床的には、DHEAは乾癬、痛風、高脂血症野患者を治療するために全身及び／又は局所的に使用され、冠動脈疾患後の患者に投与されている。哺乳類では、DHEAは体重を最適化し発癌を抑える効果があることが示されており、ヨーロッパではエストロゲンと合わせて更年期症状を逆転させるための薬として臨床的に用いられ、また躁鬱病、統合失調症、及びアルツハイマー病を治療するために用いられている。DHEAは、臨床的に40 mg/kg/dayという用量で進行癌及び多発性硬化症の治療に用いられている。弱い男性ホルモン作用、多毛症、及び性欲の増進、が副作用として観測されている。これらの副作用は、用量に注意して、及び／又は類似体を用いることによって解決できる。感染に対する宿主の応答を改善するためのDHEAの皮下又は経口投与が知られており、DHEAを投与するためのパッチも知られている。DHEAは、また、代謝経路の前駆物質としても知られており、それは最終的に哺乳類における免疫応答を増加させるもっと強力な物質に導く。すなわち、DHEAはプロドラッグとして作用する：DHEAは、アンドロステンジオール、すなわち、アンドロステ-5-エン-3β,17β-ジオール（βAED）、又はアンドロステントリオール、すなわち、アンドロステ-5-エン-3β,7β,17β-トリオール（βAET）、に変換されると免疫調節物質として作用する。しかし、in vitroのDHEAは、βAED及び／又はβAETに変換される前は、リンパ球毒性及び細胞増殖に対する抑制効果を有する。したがって、DHEAの投与で得られる優れた免疫増強性質はもっと強力な代謝産物への変換によって生ずると考えられる。
【００２７】
アデノシンは中間代謝に関与するプリンであり、気管支喘息、COPD、CF、RDS、鼻炎、肺線維症、その他を含むいろいろな疾病に関して肺における重要な媒介物質となる。喘息患者はエアロゾルの形のアデノシンに顕著な気管支収縮で応答するのに対して正常な人はそのように反応しないという知見からその受容体の役割の可能性が示唆された。喘息ラビット動物モデル、ヒトの喘息のハウスダスト・イエダニ・アレルギー・ラビット・モデルは、エアロゾルの形のアデノシンに同じように顕著な気管支収縮で応答するのに対して非喘息ラビットはそのような応答を示さない。この動物モデルについての最近の研究は、喘息におけるアデノシンによって誘発される気管支収縮と気管支の過敏反応は主としてアデノシン受容体の刺激に媒介されるものであることを示唆した。アデノシンは、また、以前に診断されていない過敏な気道をもつ被験者における他の疾病や病状に対する治療として投与されたときに、死亡を含む有害な作用を生ずることが示されている。アデノシンは、体内で細胞代謝の調節物質としてユニークな役割を演ずる。アデノシンは、細胞のエネルギー中間物質であるAMP、ADP及びATPの細胞レベルを高めることができる。アデノシンは、アデニレート・シクラーゼの活性を刺激又はダウンレギュレートしてcAMPレベルを調節できる。そしてcAMPが、今度は、神経伝達物質の放出、細胞分裂、及びホルモン放出にある役割を演ずる。アデノシンの主要な役割は、防護的な傷オータコイドとして働くことであるように見える。虚血、低酸素圧力、又は外傷が発生するどんな病状でもアデノシンがある役割を演ずるように見える。アデノシンの合成、放出、作用、及び／又は分解、における欠陥が脳の興奮性アミノ酸神経伝達物質の過敏性に寄与し、いろいろな病理的な状態の原因になると考えられている。アデノシンは、また、気管支喘息及びその他の呼吸器疾患の症状、気管支収縮の誘発、及び気道平滑筋の収縮の根底にある一次決定因子であると言われている。さらに、アデノシンは、喘息患者に気管支収縮を誘発するが、非喘息患者には誘発しない。他のデータは、アデノシンが中枢ドーパミン生成システムの過敏反応性を低下させることによってアレルギー及び炎症応答にも関与している可能性を示唆する。炎症細胞の表面における信号伝達の修飾が急性炎症に影響を及ぼすと考えられている。アデノシンは、刺激された好中球によるスーパーオキシドの生成を抑制すると言われている。最近の証拠は、アデノシンが、卒中、CNS外傷、てんかん、虚血性心疾患、冠状動脈バイパス、放射線曝露、及び炎症でも、防護的な役割を演ずる可能性を示唆している。全体として、アデノシンは、ATPによって細胞代謝を調節し、メチオニンのキャリアとして働き、細胞の酸素要求量を減らし、細胞を虚血性損傷から防護するように見える。アデノシンは、細胞が、虚血、酸素欠乏、細胞ストレス、及び作業負荷の増加、にさらされたとき、及び／又はATPの需要が供給を超えたときに放出される細胞ホルモン又は細胞間メッセンジャーである。アデノシンはプリンであり、その形成はATP異化作用に直接にリンクしている。アデノシンは、血管の緊張、ホルモンの作用、神経機能、血小板の凝集、及びリンパ球の分化など一連の生理的プ���セスを修飾するように見える。アデノシンは、また、DNA形成、ATPの生合成、及び一般的な中間物質代謝である役割を演ずる。アデノシンは、脳及びいろいろな末梢組織におけるcAMPの形成を調節すると示唆されている。アデノシンは、二つの受容体、A1とA2、によってcAMP形成を調節する。A1受容体によって、アデノシンはアデニレートシクラーゼの活性を減少させ、A2受容体でアデノシンはアデニレートシクラーゼを刺激する。アデノシンのCNS効果はA1受容体に媒介されると一般に考えられており、末梢への効果、例えば低血圧、徐脈などはA2受容体で媒介されると言われている。
【００２８】
呼吸器疾患と症状の治療のためにいくつかの医薬が用いられているが、一般にそれらはすべて制約がある。医薬としては、グルココルチコイド・ステロイド、ロイコトリエン拮抗薬、抗コリン作用薬、抗ヒスタミン剤、酸素療法、テオフィリン、及び粘液溶解薬などがある。グルココルチコイド・ステロイドは、良く調べられている副作用にも関わらず最も広く用いられている薬である。それにも関わらず、入手できる薬の大部分は少数の症例でしか効果がなく、喘息の治療となると全く効果がない。他の呼吸器疾患の多くに現在利用できる治療は何もない。喘息の治療で重要な薬、テオフィリンはアデノシン受容体の知られている拮抗薬であり、喘息のラビットでアデノシンに媒介される気管支収縮を抑制すると報告された。選択的なアデノシンA1受容体拮抗薬、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（DPCPX）もアレルギー・ラビットにおけるアデノシンに媒介される気管支収縮と気管支過敏応答を抑制すると報告された。しかし、現在利用できるアデノシンA1受容体特異的拮抗薬の治療と予防への応用は、その毒性のために制限される。例えば、テオフィリンは喘息の治療に広く用いられているが、治療的な用量の範囲が狭いために生ずる頻繁で顕著な毒性（胃腸、心臓血管系、神経、及び生物的な問題）と結びついている。DPCPXは、毒性が強すぎて臨床的に使用できない。数十年の広範な研究にもかかわらず、臨床的な使用のために利用できる特定のアデノシン受容体拮抗薬が何もないという事実は、これらの物質の一般的な毒性を立証している。
【００２９】
気管支拡張薬は気道のまわりで締まっている筋肉バンドをゆるめて良い多くの空気が肺を出入りできるようにし、呼吸を改善する。気管支拡張薬は、また、肺から粘液を追い出すのを助け、気道が開くと粘液はより自由に動いて、容易に咳で吐き出したりして一掃できるようになる。気管支拡張薬には、短時間作用型と長時間作用型があり、短時間作用型は喘息の症状を緩和又はストップし、長時間作用型は喘息症状をコントロールし、喘息発作を予防する。気管支拡張薬は、β2-拮抗薬（短時間作用型と長時間作用型）、抗コリン作用薬、及びテオフィリンを含む。
【００３０】
二つの市販されている抗コリン作用薬の気管支拡張薬はイプラトロピウム・ブロミドとチオトロピウム臭化物である。イプラトロピウム・ブロミドは、抗コリン作用（副交感神経遮断）性質を有する第四級アンモニウム化合物である。これは、迷走神経から放出される伝達物質であるアセチルコリンの作用に拮抗して迷走神経で媒介される反射を抑制するように見える。抗コリン作用薬は、気管支平滑筋のムスカリン様受容体とアセチルコリンの相互作用によって生ずるサイクリック・グアノシン一リン酸塩（サイクリックGMP）の細胞内濃度の増加を抑える。
【００３１】
イプラトロピウム・ブロミドは、アトロベント(商標) (Boehlinger Ingelheim) 及びコンビベント(商標) (Boehlinger Ingelheim)として、硫酸アルブテロールと組み合わせて商業的に入手できる。
【００３２】
チオトロピウム臭化物は、スピリバ(商標) (Boehlinger Ingelheim 及びPfizer) として商業的に入手できる。スピリバ(商標)は一日一回吸入されるCOPD治療薬で、長時間のM3受容体遮断によって働く。スピリバ(商標)は2002年6月にヨーロッパの５カ国（デンマーク、フィンランド、ドイツ、オランダ及びスエーデン）で発売され、その年の終わりまでに世界中の１３カ国で発売された。二つの６ヶ月調査を合わせたデータは、スピリバ(商標)がピーク及び平均FEVI（１秒間の最大努力呼気肺活量）とFVC（努力肺活量）に関してサルメテロールよりも統計的に優れていることを示した（Boehlinger Ingelheimの2003年5月5日の報道発表）。
【００３３】
米国特許第5,660,835号（及び対応するPCT公開WO 96/25935）は、患者にデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）及びDHEA関連化合物を投与することによって患者の喘息又はアデノシン欠乏を治療する新しい方法を開示している。この特許は、また、呼吸可能な粒径のDHEA又はDHEA関連化合物を含む吸入かもうな又は呼吸可能な製剤に関する新しい医薬組成物も開示している。
【００３４】
米国特許第5,527,789号は、患者にDHEA及びDHEA関連化合物を投与し、DHEA及びDHEA関連化合物によって誘発される心不全と戦うためのユビキノンを投与することによって患者の癌と戦う方法を開示している。
【００３５】
米国特許第6,087,351号は、患者にDHEA及びDHEA関連化合物を投与することによって患者の組織のアデノシンを減らし枯渇させるin vivoでの方法を開示している。
【００３６】
米国特許出願第10/454,061号、2003年6月3日出願、は、患者にDHEA及びDHEA関連化合物を投与することによって患者のCOPDを治療する方法を開示している。
【００３７】
米国特許出願第10/462,901号、2003年6月17日出願、は、容器に封入された噴霧化できる形の安定なドライ粉末製剤を開示している。
【００３８】
米国特許出願第10/462,927号、2003年6月17日出願、は、喘息及びCOPDを治療するのに適したDHEA-Sの二水和物結晶の形の安定なドライ粉末製剤を開示している。
【００３９】
上記特許及び特許出願は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
現在治療できない、又は少なくとも、効果的であって顕著な副作用がない治療法がない、呼吸器、肺、及び癌疾患を治療するための新しい有効な治療法に対する明確なニーズが存在している。これは、呼吸器気道に関わる、さらに詳しくは肺及び肺気道に関わる、呼吸困難、喘息、気管支収縮、肺炎症及びアレルギー、表面活性物質の枯渇又は分泌過少などの疾患にあてはまる。さらに、予防的及び治療的に用いることができ、少量の活性物質しか必要とせず、それを低コストにして有害な副作用が起こりにくいようにする治療法に対する明確なニーズがある。
【００４１】
さらに、医薬の服用における患者のコンプライアンスをより確実にし、喘息、COPD、又はその他の呼吸器疾患を予防又は治療するために必要な複数の化合物を容易に用いることができるようにする必要がある。
【発明の開示】
【００４２】
発明の要約
本発明は、少なくとも二つの活性物質を含む組成物を提供する。第一の活性物質は、エピアンドロステロン（EA）又はその塩などの非グルココルチコイド・ステロイドを含む。第二の活性物質は、抗コリン作用性気管支拡張薬を含む。組成物は第一の活性物質と第二の活性物質の組み合わせを含む。組成物における第一の活性物質の量と第二の活性物質の量は、対象者に投与されたときに、喘息、COPD、又はその他の呼吸器疾患に罹患する危険がある又は罹患している対象者を効果的に予防的又は治療的に処置するのに十分な量である。この組成物は、さらに、他の生物活性物質及び製剤成分を含むことができる。組成物は、ヒト又はヒト以外の動物（例えばヒト以外の哺乳類）などの対象者又は患者に投与するのに適した医薬組成物又は獣医用組成物である。
【００４３】
この組成物は、喘息、COPD、又はその他の呼吸器疾患を治療するのに有用であり、これらの疾患では、炎症とその後遺症が、役割、例えば気管支収縮、表面活性物質の欠乏、及び／又はアレルギーに関連した症状を果たす。
【００４４】
本発明は、また、喘息、COPD、肺癌、又はその他の呼吸器疾患を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする対象者にこの組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明は、また、上述した喘息、COPD、又はその他の呼吸器疾患の予防的又は治療的な処置のための医薬の製造における第一及び第二の活性物質の使用を提供する。
【００４６】
本発明は、また、この組成物と送達デバイスを含むキットを提供する。送達デバイスはこの組成物を対象者に送達することができる。好ましくは、送達デバイスは、粒子を送達するエアロゾル又はスプレー発生手段を備えた吸入器を含む。好ましくは、送達は対象者の気道に対して行われる。さらに好ましくは、送達は対象者の肺（単数又は複数）に対して行われる。好ましくは、送達は所望の箇所に直接行われる。
【００４７】
この組成物を用いる主な利点は、そのような予防又は治療を必要とする患者によるコンプライアンスにある。喘息やCOPDなどの呼吸器疾患は、多因子性疾患であり、個々の患者によって兆候と症状の現れ方が異なる。そのような訳で、多くの患者は病気の異なる側面を軽減するために複数の医薬で治療される。DHEA又はDHEA-Sなどの第一の活性物質と、イプラトロピウム又はチオトロピウムなどの第二の活性物質という固定された組み合わせは、ある一定の患者小集団に対する好適なしかし標的がしぼられた治療を可能にする。治療を単純化し、各患者のユニークな疾病属性に焦点を合わせて彼らの特定症状に最も速やかに対処することによって患者コンプライアンスが改善されるであろう。さらに、第一及び第二の活性物質を一回の投薬で投与することには、利便と時間の節約という別の利点がある。これは特に組成物が対象者の体のうち不快が感じられそうな領域に投与される場合、例えば組成物が対象者の気道に投与される場合、にあてはまる。これは特に組成物の投与が侵襲的である場合にあてはまる。
【００４８】
さらに、第一の活性物質、例えばDHEA又はDHEA-Sは、誘導気道よりは、遠位の末梢気道に、肺胞の膜及び細い気道に送達され又は沈着する際に、最も効果的である。喘息及び一部のCOPD患者は、収縮された誘導気道を有しており、それにより第一の活性物質、例えばDHEA又はDHEA-Sを送達して、遠位の末梢気道で作用させることを妨げられる（流速が遅いことにより引き起される早い沈積のためである）。したがって、気管支拡張薬（β2作用薬、高まった緊張をゆるめる抗ムスカリン剤）との組み合わせは遠位の末梢気道への抗炎症薬の送達を助ける。当該組み合わせの使用によって持続的な薬理的効果が改善され、それは疾病管理の改善になる。抗ロイコトリエン剤は非常に小さな末梢気道における間質性浮腫を減少させる。これも末梢気道の直径を増加させる効果があり、第一の活性物質の送達を助ける。これは抗ヒスタミン剤についてもあてはまり、これも末梢気道における間質性浮腫を減少させ、遠位気道での第一の活性物質の送達を助ける。
【００４９】
本明細書に添付された図面は本発明の開示の一部を成すものであり、以下で述べる本発明のいくつかの様態をさらに図示し説明している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
定義
本明細書の文脈において、“アデノシン”及び“表面活性物質”欠乏という用語は、対象者における以前のレベルに比べてその対象者において低下又は欠乏したレベル、及びその対象者における以前のレベルと本質的に同じレベルであるが、他の何らかの理由によって以前のレベルに比べてその物質のレベルを変えることによってその患者で治療的な利益が得られる様なレベルを包含するものとする。
【００５１】
“気道”という用語は、本明細書で用いる場合、空気にさらされる対象者の呼吸器システムの全部又は一部を意味する。気道は、非限定的に、喉、気管気管支樹、鼻通路、洞などを含む。気道はまた、気管、気管支、細気管支、末端細気管支、呼吸細気管支、肺胞管、及び肺胞嚢も含む。
【００５２】
“気道炎症”という用語は、本明細書で用いる場合、対象者の気道の炎症に関連した疾患又は疾病を意味する。気道炎症は、アレルギー、喘息、呼吸障害、嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー性鼻炎（AR）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、微生物又はウイルス感染、肺高血圧、肺炎症、気管支炎、癌、気道閉塞、及び気管支収縮によって生ずるか又それらを伴って生ずる。
【００５３】
“担体”という用語は、本明細書で用いる場合、気体、液体、固体担体、又はそれらの混合の形で、意図するいろいろな投与ルートに適当な生物的に受容される担体を意味する。好ましくは、担体は、医薬的に又は獣医学的に受容されるものである。
【００５４】
“有効量”とは、本明細書で用いる場合、治療的又は予防的な益が得られるような量を意味する。
【００５５】
“他の治療物質”とは、この組成物の第一の活性物質でも第二の活性物質でもない治療物質を指す。
【００５６】
“予防”という用語は、本明細書で用いる場合、対象者がある病気になる前、又は以前に診断された病状が悪化する前、対象者が症状又はそれに関連した状態になることを回避、予防、又はその確率を減らすように行われる予防的な処置を意味する。対象者は、ある病気になる危険又は以前に診断された病状が悪化する危険が大きい者であってもよい。
【００５７】
“呼吸器疾患”という用語は、本明細書で用いる場合、呼吸器システムに関連した疾病又は病状を意味する。例としては、非限定的に気道炎症、アレルギー、呼吸障害、嚢胞性線維症（CF）、アレルギー性鼻炎（AR）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、癌、肺高血圧、肺炎症、気管支炎、気道閉塞、微生物感染、及びウイルス感染、例えばSARSなどがある。
【００５８】
“治療する”、“治療”、又は“治療的”という用語は、本明細書で用いる場合、処置を施される対象者が疾病又はその他の病状の症状を表す確率を減少させるような処置を意味する。
【００５９】
本発明は、非グルココルチコイド・ステロイド、例えばエピアンドロステロン（EA）、その類似体、又はその塩（好ましくは、DHEA又はDHEA-S）を含む第一の活性物質を、抗コリン作用性気管支拡張薬を含む第二の活性物質と組み合わせて含む組成物を提供する。この組成物は、さらに、医薬的に又は獣医学的に受容される担体、希釈剤、賦型剤、生物活性物質又は成分を含むことができる。この組成物は、喘息、COPD、又はその他の呼吸器疾患を治療するのに有用である。この組成物を用いて治療できるその他の呼吸器疾患は、気管支収縮、肺炎症、及び／又はアレルギー、及び肺癌、に関連した肺と呼吸器の疾患である。
【００６０】
第一の活性物質は、エピアンドロステロン、その類似体、又は医薬的又は獣医学的に受容されるその塩である。エピアンドロステロン、その類似体、又は医薬的又は獣医学的に受容されるその塩は、以下の：
【化１】
2007509839.tif 000003
[式中、
破線は、単結合又は二重結合を表し；Rは、水素又はハロゲンであり；５位のHはアルファ又はベータ配置で存在するか、又は化学式Iの化合物は両方の配置のラセミ混合物であり；そしてR1は水素、又は当該化合物に共有結合した無機又は有機の多価ジカルボン酸である]
で表される化学式；以下の：
【化２】
2007509839.tif 000004
で表される化学式の非グルココルチコイド・ステロイド；或いは以下の：
【化３】
2007509839.tif 000005
で表される化学式の非グルココルチコイド；又はそれらの組合せ、或いは医薬的に又は獣医学的に許容されるそれらの塩
から選ばれる。
ここで、R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R12、R13、R14、及びR19は独立にH、OR、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルコキシであり、R5とR11は独立にOH、SH、H、ハロゲン、医薬的に許容されるエステル、医薬的に許容されるチオエステル、医薬的に許容されるエーテル、医薬的に許容されるチオエーテル、医薬的に許容される無機エステル、医薬的に許容されるモノサッカライド、ジサッカライド、又はオリゴサッカライド、スピロオキシラン、スピロチラン、-OSO2R20、-OPOR20R21、又は(C1-C10)アルキであり、R5とR6は一緒になって=Oであり、R10とR11は一緒になって=Oであり；R15は（１）R16が-C(O)OR22であるとき、H、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、又は(C1-C10)アルコキシであり、（２）R16がハロゲン、OH、又は(C1-C10)アルキルであるとき、H、ハロゲン、OH、又は(C1-C10)アルキルであり、（３）R16がOHであるとき、H、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルケニル、(C1-C10)アルキニル、ホルミル、(C1-C10)アルカノイル、又はエポキシであり、（４）R16がHであるとき、OR、SH、H、ハロゲン、医薬的に許容されるエステル、医薬的に許容されるチオエステル、医薬的に許容されるエーテル、医薬的に許容されるチオエーテル、医薬的に許容される無機エステル、医薬的に許容される無機エステル、医薬的に許容されるモノサッカライド、ジサッカライド、又はオリゴサッカライド、スピロオキシラン、スピロチラン、-OSO2R20、又は-OPOR20R21であり、又はR15とR16を一緒にしたものは=Oであり；R17とR18は独立に（１）R6がH、OR、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、又は-C(O)O22であるとき、H、-OH、ハロゲン、(C1-C10)アルキル、又は(C1-C10)アルコキシであり、（２）R15とR16を一緒にしたものが=Oであるとき、H、(C1-C10アルキル)アミノ、((C1-C10)アルキル)nアミノ-(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルコキシ、ヒドロキシ-(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルコキシ-(C1-C10)アルキル、（ハロゲン）m(C1-C10)アルキル、(C1-C10)アルカノイル、ホルミル、(C1-C10)カルバルコキシ、又は(C1-C10)アルカノイルオキシであり、（３）R17とR18を一緒にしたものは=Oであり；（４）R17とR18をそれらが結合した炭素と一緒にしたものは０又は１酸素原子を含む３−６員環を形成し；又は（５）R15とR17をそれらが結合した炭素と一緒にしたものはエポキシド環を形成し；R20とR21は独立にOH、医薬的に許容されるエステル、又は医薬的に許容されるエーテルであり；R22はH、(ハロゲン)m(C1-C10)アルキル、又は(C1-C10)アルキルであり；nは０，１，又は２であり；そしてmは１，２，又は３である。
【００６１】
好ましくは、化学式（I）で、多価の有機ジカルボン酸はSO2OM、ホスフェート、又はカーボネートであり、ここでMは対イオンを含む。対イオンの例としては、H、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、カルシウム、リチウム、アンモニウム、アミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリエチルアミン、エタノールアミン、コリン、トリエタノアミン、プロカイン、ベンザチン、トロメタニン、ピロリジン、ピペラジン、ジエチルアミン、スルファチド：
【化４】
2007509839.tif 000006
及びホスファチド：
【化５】
2007509839.tif 000007
[式中、R2とR3は、同じであっても異なってもよく、直鎖又は枝分かれした（C1-C14）アルキル、又はグルクロニド：
【化６】
2007509839.tif 000008
である]
である。
【００６２】
化学式Iの位置５における水素原子はアルファ配置又はベータ配置で存在してもよく、又はDHEA化合物は両配置の化合物の混合物であってもよい。上の化学式Iを例示する化合物には、非限定的に、ＤＨＥＡ（RとR1がそれぞれ水素であり、二重結合を含む）；16-アルファブロモエピアンドロステロン（RがBrであり、R1がHであり、二重結合を含む）； 16-アルファフルオロエピアンドロステロン（RがFであり、R1がHであり、二重結合を含む）；エチオコラノロン（RとR1がそれぞれ水素であり、二重結合を含まない）；及びデヒドロエピアンドロステロン・サルフェート（RがHであり、R1がSO2OMであり、そしてＭは上で定義されたようなスルファチド基であり、二重結合を含まない）などが含まれる。しかし、他にも含まれるものがある。化学式Iの好ましい化合物としては、Rがハロゲン、例えばブロモ、クロロ、又はフルオロであり、R1が水素であり、かつ二重結合が存在するものがある。化学式Iの最も好ましい化合物は16-アルファ-フルオロ・エピアンドロステロンである。別の好ましい化合物はDHEA及びDHEA塩、例えばサルフェート塩（DHEA-S）である。
【００６３】
一般に、化学式（I）、（III）、及び（IV）の化合物、それらの誘導体及びそれらの塩などの非グルココルチコイド・ステロイドは、約0.05、約0.1、約1、約5、約20から約100、約500、約1000、約1500、約1800、約2500、約3000、約3600 mg/kg体重という用量で投与される。しかし、他の用量も適当であり、本特許の範囲内であると考えられている。化学式（I）、（III）、及び（IV）の第一の活性物質は、公知の方法又は当業者には明らかなその変形に従って作ることができる。例えば、米国特許第4,956,355号;英国特許第2,240,472号; 欧州特許出願第429;187、国際特許出願第WO 91/04030号; 米国特許第5,859,000号; Abou-Gharbia et al., J. Pharm. Sci. 70: 1154-1157 (1981); Merck Index Monograph No. 7710 (第１１版、1989),などを参照のこと。
【００６４】
本発明のある実施形態では、第一の活性物質はエピアンドロステロン類似体又はその誘導体であってもよい。また、エピアンドロステロンのプロドラッグ及び活性代謝産物も本発明に包含される。当業者は、本明細書で記載される化合物が互変異性、配座異性、幾何異性、及び／又は光学異性の現象を示すことがあることを認識さするであろう。本発明は、ここに記載された一つ以上の有用性を有する化合物の互変異性、配座異性、光学異性、及び／又は幾何異性形態、並びにそれらのいろいろな異なる形態の混合物を包含することを理解されるべきである。
【００６５】
以下の参照文献に記載されているようなエピアンドロステロンの代謝産物も第一の活性物質として用いることができる「テルブタリン治療された喘息の小児の尿ステロイドのキャピラリー・ガスクロマトグラフィー」、Chromatographia (1998), 48(1/2), 163-165; ヒト肺繊維芽細胞におけるアンドロステンジオン代謝、Journal of Steroid Biochemistry (1986), 24(4), 893-7; 「ヒト肺組織及び培養された肺内皮細胞におけるアンドロステロンの代謝と5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール」、Journal of Clinical endocrinology and Metabolism (1985), 60(2), 244-50;「ヒト肺組織によるテストステロン代謝」、Journal of Steroid Biochemistry (1978), 9(1), 29-32; 「ヒト肺組織及び培養された肺内皮細胞におけるアンドロステロンの代謝と5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール」、Journal of Clinical endocrinology and Metabolism (1985 Feb), 60(2), 44-50; 「培養されたヒト肺内皮細胞におけるデヒドロイソアンドロステロンとアンドロステンジオンの代謝、Journal of Clinical endocrinology and Metabolism (1983 May), 56(5), 930-5; 「In vitroのヒト肺におけるデヒドロイソアンドロステロンとアンドロステンジオンの代謝」、Journal of Steroid Biochemistry (1977 Apr.), 8(4), 277-84; 及び、「In vitroでのイヌ肺におけるテストステロン代謝」、Steroid and lipid research (1973), 4(1), 17-23, これらの参照文献は、その全てを本明細書中に援用する。
【００６６】
第一の活性物質として用いることができる多くのDHEA類似体がここに記載される。図１９は、化学式IA, IB, IC, 及びIDの化合物を含むいくつかの適当なDHEAの類似体を示している。ここで適当なR基の図で、付着点はCH2基又は＊でマークした原子によって示される。R1とR3は線状又は分枝状アルキル、例えばベンジル、及び場合により置換されたアルキル、例えばアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、及びカルボン酸、及び場合により置換されたアリール及びヘテロアリールである。R1とR3は、例えばCF3、CH3（CH2）n（基中、ｎは好ましくは０〜４である）、
【化７】
2007509839.tif 000009
でありうる。
【００６７】
式ＩＡの化合物の例は、
【化８】
2007509839.tif 000010
を含む。
【００６８】
R2は、好ましくは二塩基酸誘導化又はアミノ酸誘導化される置換基であり、クロルアセチル誘導体及びアクリレート誘導体など、又は場合により置換されるアリール、例えばベンジル及びヘテロベンゾイルを含む。化学式IBの化合物の例としては以下の：
【化９】
2007509839.tif 000011
を含む。
【００６９】
式ＩＣの化合物の例は、以下の：
【化１０】
2007509839.tif 000012
を含む。
【００７０】
R4は、芳香族の性質のものでよく、化学式IDの適当な化合物の例としては以下の：
【化１１】
2007509839.tif 000013
を含む。
【００７１】
他の適当な類似体としては、OHを保持して修飾がC-3位置で行われる又はOHをNHで置き換える類似体がある。これらの類似体は、普通、図２０に示されているように、C-17アセタール保護されたアンドロスト−４−エン３，１７−ジオンから始めて製造される。化学式ＩＥの化合物がグリニャール試薬及び多分アリール-リチウム試薬、芳香族の性質をもつもの、から誘導され、そしてアルキニル、アルケニル、及びアルキルでありうる。R5の例は
【化１２】
2007509839.tif 000014
である。
【００７２】
化学式IEの化合物の例は
【化１３】
2007509839.tif 000015
を含む。
【００７３】
R6とR8は独立にアミンの多様な組が可能であり、R1基に関して記載されたような官能基を有するアミンを含みうる。化学式IFの適当な化合物の例は
【化１４】
2007509839.tif 000016
を含む。
【００７４】
適当なR7基はグリニャール/有機リチウム試薬から得られ、R5について述べたような官能基を包含することができる。化学式IGの化合物の例は、以下の：
【化１５】
2007509839.tif 000017
を含む。
【００７５】
式ＩＨの化合物の例は、以下の：
【化１６】
2007509839.tif 000018
を含む。
【００７６】
他の適当な類似体は、DHEAのC-2位が修飾された化合物がある。適当な修飾は図２１に示されている。R9はアルキル化剤、すなわち、アルキル、ベンジル、ヘテロベンジル、及び他の活性化されたハライドの誘導体から得られる。R9の例は以下の：
【化１７】
2007509839.tif 000019
を含む。
【００７７】
化学式IJの化合物の例は、以下の：
【化１８】
2007509839.tif 000020
を含む。
【００７８】
R10は、例えば、アリール又はヘテロアリール環との芳香族エステルであるか、又はエノール化可能なアルキルエステルでありうる。
式ＩＫの化合物の例は、以下の：
【化１９】
2007509839.tif 000021
を含む。
【００７９】
R11は、一連の芳香族及びヘテロ芳香族アルデヒド、例えばベンゼン・カルボキシアルデヒド及びその置換されたバリアント、ピリジン・カルボキシアルデヒド、又はエノール化されないアルデヒド、例えば(CH3)3CCH=Oであってよい。化学式ILの化合物の例は、以下の：
【化２０】
2007509839.tif 000022
を含む。
R12は、R6についての場合のようなアミンのサブセットでありうる。
化学式INの化合物の例は、以下の：
【化２１】
2007509839.tif 000023
を含む。
【００８０】
DHEAのC-17ケトンの適当な修飾が図２２に示されている。図２２に示されている化合物も第一の活性物質として用いることができる。
【００８１】
他の適当なDHEA類似体は、米国特許第6,635,629号；欧州特許934745号；「デヒドロエピアンドロステロンと類似体は、AP-1のDNA結合及び気道平滑筋増殖を阻害する」、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (1998), 285(2), 876-883；及び、「デヒドロエピアンドロステロンと関連ステロイドはin vitroでのミトコンドリア呼吸を阻害する」、International Journal of Biochemistry (1989), 21(10), 1103-7,に記載される。これらはすべて本明細書中に援用される。
【００８２】
第二の活性物質は抗コリン作用性気管支拡張薬である。この気管支拡張薬はイプラトロピウム又はチオトロピウムである。好ましくは、イプラトロピウムはイプラトロピウム・ハライドである。好ましくは、チオトロピウムはイプラトロピウム・ハライドである。ハライドはクロリド、ブロミド、又はヨージドである。さらに好ましくは、イプラトロピウムはイプラトロピウム・ブロミドである。さらに好ましくは、チオトロピウムはチオトロピウム・ブロミドである。
【００８３】
抗コリン作用性気管支拡張薬は、次の化学式（V）：
【化２２】
2007509839.tif 000024
[式中、
R1は、C2-4アルキル、C2-4アルケニル、又はC3-8シクロアルキル、好ましくはメチルであり、
R2は、C1-4アルキル、好ましくはメチル又はイソプロピルであり、
R3は、水素又はアシル、好ましくはアセチル又はベンゾイル、好ましくは水素であり、
X-は一価又は多価酸のアニオン、好ましくはハロゲン化水素酸のアニオンである。]
を有する。
【００８４】
好ましい化合物は、次の化学式で定義されるイプラトロピウム（(8r)-8-イソプロピル-3α-[(±)-トロポイル-オキシ]-1αH,5αH-トロパニウム）であり、以下の：
【化２３】
2007509839.tif 000025
により定義される。
【００８５】
好ましくは、イプラトロピウムはイプラトロピウム・ブロミド（N-イソプロピル・ノルトロピン・トロピン酸エステル・メトブロミドとも呼ばれる）である。
【００８６】
好ましくは、イプラトロピウムの一日の用量は150〜500 μg、好ましくは200〜350 μg、である。動作毎に、例えば20μgのイプラトロピウム・ブロミドを放出する計量型エアロゾルの場合、一回の用量40-60μgを二動作又は三動作で各鼻孔に一日三回又は四回スプレーして、一日の全投薬量が240から480μgになる。
【００８７】
化学式（V）の化合物は、米国特許第3,505,337号及び第4,385,048号（これらの特許の開示は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された方法によって調製され単離される。
【００８８】
イプラトロピウム・ブロミドは、商標名アトロベント(商標) (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., Ridgefield, CT)で市販されている。アトロベント(商標)の吸入後の気管支拡張は、気管支の平滑筋における抗コリン作用薬の効力のために十分な局所的な薬剤濃度によって得られるものであって、全身的な薬剤濃度によるものではない。COPD（慢性気管支炎と肺気腫）に関連した気管支痙攣を患う患者についてのコントロールされた90日間の調査では、肺機能の有意な改善（FEVIとFEF25-75%が15%以上増加）が15分以内に起こり、1-2時間でピークに達し、患者の多数で効果が6時間まで持続した。喘息に関連した気管支痙攣がある患者についてのコントロールされた90日間の調査では、肺機能の有意な改善（FEV１がの15%以上増加）が40%の患者に見られた。前臨床的及び臨床的証拠は、気道粘液分泌、粘膜毛様体のクリアランス、又はガス交換に対してアトロベント(商標)の有害な影響は何も示唆していない。喘息に関連した急性気管支痙攣の治療におけるアトロベント(商標)の気管支拡張効果は、６歳以上の小児についての研究で示された。これらの研究のほとんどでアトロベント(商標)は吸入されるベータ作動薬と組み合わせて投与された。データは限られているが、アトロベント(商標)は幼児及び小児におけるウイルス性細気管支炎及び気管支肺形成異常に関連した気管支痙攣の治療に治療効果があることが示された。
【００８９】
イプラトロピウム・ブロミドはまた、商標名コンビベント(商標) Inhalation Aerosol (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., Ridgefield, CT)の下で市販される。コンビベント(商標)吸入エアロゾルもβ２-アドレナリン作用性気管支拡張薬、硫酸アルブテロール（サルブタモールとも呼ばれる）を含む。投与方法は吸入である。コンビベント(商標)吸入エアロゾルの通常の用量は一日四回二度の吸入で24時間に12吸入までである。各用量は約18μgのイプラトロピウム・ブロミドと120μgの硫酸アルブテロールを含む。
【００９０】
抗コリン作用性気管支拡張薬は、また、以下の：
【化２４】
2007509839.tif 000026
[式中、
R1は、チオフェニル、フェニル、フリル、シクロペンチル、若しくはシクロヘキシル、又はメチル置換されたチオフェニル又はフェニル、又はクロロ若しくはフルオロ置換されたチオフェニル又はフェニルであり、
R2は、ヒドロキシル、C1-4アルキ、又はC1-4アルコキシであり、
Raは、水素、フルオロ、クロロ、又はメチルであり、
Qは、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH=CH-、又は
【化２５】
2007509839.tif 000027
であり、
Q’は、-NR-又は-N+RR’-であり、ここでRは、水素、ハロゲン、又はヒドロキシル置換されたC1-4アルキであり、ここでR’はC1-4アルキであり、ここで窒素原子の正電荷は等価のアニオン（X-）と結合し、ここでX-は一価又は多価酸、好ましくはハロゲン化水素酸のアニオンであり、
mは１又は２である。
【００９１】
好ましくは、チオフェニルは、当該チオフェニルのα-位で炭素鎖に共有結合される。
好ましくは、R1はチオフェニルである。
好ましくは、R2はヒドロキシルである。
好ましくは、Raは水素である。
【００９２】
好ましくは、Qは
【化２６】
2007509839.tif 000028
である。
好ましくは、Q’は-N+RR’-である。好ましくは、Rはメチルであり、R’はメチルである。好ましくは、X-はBr-である。
【００９３】
好ましくは、mは1である。
【００９４】
好ましい化合物はチオトロピウム（(1R,2R,4S,5S,7s)-7-[2-ヒドロキシ-2,2-ジ(2-チエニル)アセトキシ]-9,9-ジメチル-3-オキサ-9-アゾニアトリシクロ[3.3.1.02,4]ノナン又は6b,7b-エポキシ-3a-[2-ヒドロキシ-2,2-ジ(2-チエニル)アセトキシ]-8,8-ジメチル-1aH,5aH-トロパニウム）であり、以下の化学式：
【化２７】
2007509839.tif 000029
で表される。
【００９５】
好ましくは、チオトロピウムはチオトロピウム・ブロミドである。
化学式（VI）の化合物は、欧州特許第 EP 0 418 716 A1号（当該開示は本明細書中に援用される）に記載されている方法によって調製され単離される。化学式（VIII）の化合物もInn, R., Drugs of the Future 25(7): 693-699 (2000) に記載されている方法によって調製され単離される（その開示は、本明細書に援用される）(この論文は次のウエブサイトで見ることができる。http://www.prous.com/journal/dof/sample/html/df250693/df250693.htm）。チオトロピウム臭化物は商標名スピリバ(商標)(Boehringer Ingelheim and Pfeizer)で市販される。チオトロピウム・ブロミドの好ましい用量は、10〜160μgである。好ましい投与手段は吸入による。
【００９６】
第一及び第二の活性物質は呼吸器及び肺の疾患を治療するために用いられ、下で記載される付加的物質のいずれかは、それ自体投与されるか又は医薬的に許容される塩の形で、上で述べたように投与することができ、これらはすべて“活性化合物又は物質”と呼ばれる。第一及び第二の活性物質はまた、互いに組み合わせて、別々の製剤で、又は医薬的又は獣医学的に許容される製剤で一緒に、投与することができる。活性化合物又はそれらの塩は、以下で説明するように、全身的に又は局所的に投与することができる。
【００９７】
本発明はまた、喘息、COPD、又は多の呼吸器疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象者にこの組成物を投与するステップを含む方法を提供する。この方法は、予防又は治療を目的とする。この方法はin vivo方法である。この方法は、その原因が何であれ、例えば、ステロイド投与、アデノシン又はアデノシン受容体代謝又は合成の異常、又は他の何らかの原因であっても、複数の疾患を治療するのに有効である。この方法は、呼吸器及び肺疾患を、特に肺、肝臓、心臓、及び脳、又はそのような治療を必要とする何らかの器官において、アデノシン又はアデノシン受容体レベルを低下させることにより、アデノシンに対する過敏性を減少させることにより、又は他のメカニズムによって、治療する。ここで言及される他の呼吸器疾患は、嚢胞性線維症（CF）、呼吸困難、気腫、喘鳴、肺高血圧、肺線維症、肺癌、過敏応答気道、アデノシン又はアデノシン受容体レベルの増加、特に感染症に関連するもの、肺気管支収縮、肺炎症、肺アレルギー、表面活性物質の欠乏、慢性気管支炎、気管支収縮、呼吸障害、肺気道の妨害及び閉塞、心臓機能のアデノシン・テスト、肺血管収縮、呼吸妨害、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ある種の薬剤の投与、例えばアデノシン及びアデノシン・レベル上昇剤、及びその他の薬剤、例えば上室性頻拍症（SVT）の治療薬の投与、及びアデノシン・ストレス・テストの実施、新生児呼吸促迫症候群（新生児RDS）、痛み、アレルギー性鼻炎、肺表面活性物質の減少、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ)などである。
【００９８】
ある実施形態では、本発明は喘息を予防又は治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象者に、その対象者における喘息を予防又は治療するのに十分な量でこの組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００９９】
ある実施形態では、本発明はCOPDを予防又は治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象者に、その対象者におけるCOPDを予防又は治療するのに十分な量でこの組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１００】
ある実施形態では、本発明は気管支収縮、肺炎症、又は肺アレルギーを予防又は治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象者に、その対象者における気管支収縮、肺炎症、又は肺アレルギーを予防又は治療するのに十分な量でこの組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０１】
ある実施形態では、本発明は対象者の組織におけるアデノシンを減らす又はなくす方法であって、そのような治療を必要とする対象者にその組織におけるアデノシンを減らす又はなくすために十分な量のこの組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０２】
本発明はまた、喘息、COPD、又は肺癌を含むその他の呼吸器疾患を治療するための医薬の製造における第一の活性物質と第二の活性物質の利用を提供する。この医薬は、本明細書の開示で記述される組成物を含む。
【０１０３】
対象者に投与される第一の活性物質と第二の活性物質の一日の用量は、プログラムされた治療の全体、用いられる第一の活性物質と第二の活性物質、製剤のタイプ、投与ルート、及び患者の状態、によって異なる。実施例１１から１８までは、呼吸器又は鼻による投与、又は吸入による投与のためのデバイスで送達される本発明によるエアロゾル製剤を示す。肺内部への投与のためには液体製剤が好ましい。他の生物活性物質の場合、例えばビタミンやミネラルの場合のように、食事摂取を追加生物活性物質で補うためにFDAが勧告している量がある。しかし、特定の病状の治療のため、又は対象者の免疫応答を改善するために用いられる場合、何百倍そして何千倍も高い用量で用いることができる。ほとんどの場合、薬局方の勧告は非常に広い範囲の用量をカバーしており、医療技術者がそこから指針を引き出す。この特許で記載される例示的な物質に関する量は、一日の使用量として現在勧告されている量の範囲内であるか、そのレベルよりも下、又は上の量である。治療は、普通、低用量の気管支拡張薬と非グルココルチコイド・ステロイド、又は必要に応じて他の生物活性物質、との組み合わせからスタートして、その後各患者に対する用量を少しづつ上げてゆく。しかし、本発明の制約の範囲内で、最初の量を含むもっと高い量及び小さな量を投与することができる。
【０１０４】
ここで用いられる第一の活性物質と第二の活性物質、又は他の治療物質についての好ましい範囲は、投与ルートによって、そして公知の手順と成分に従って技術者が理解して製造するような用いられる製剤のタイプによって異なる。活性化合物は一回の投薬（一日一回）で投与することも、数回の投薬（一日数回）で投与することもできる。呼吸器、心臓、及び心臓血管系の疾患を予防し治療するためのこの組成物と方法は、成人と小児、並びに上記の病気にかかったヒト以外の動物を治療するために用いることができる。本発明は主にヒト対象者の治療に関するが、ヒト以外の哺乳類の対象、例えばイヌやネコ、並びに大型の家畜や野生動物の治療で獣医目的にも用いることができる。“アデノシン”及び“アデノシン受容体”の“高”及び“低”レベル、及び“アデノシン欠乏”という用語は、同じ対象者における以前のアデノシン・レベルと比べたときにアデノシン・レベルが高い、又は低い（欠乏している）状態、及びアデノシン・レベルが正常な範囲内にあるが、その患者における他の何らかの病状又は変化のために、アデノシン又はアデノシン受容体レベル又は過敏性を減少又は増加させることによってその患者で治療的な利益が得られるような状態の両方を包含するものとする。すなわち、この治療はそれぞれに合わせた仕方で患者を調整する（滴定する）ことができる。第一の活性物質の投与は、治療の前に正常な又は高いレベルにあった対象者におけるアデノシン・レベルを減少させ、枯渇までさせる一方、さらに第二の活性物質を投与することによって対象者の呼吸が短時間で改善される。さらに他の治療物質を追加することで、この治療を施したときに見られるかもしれない望ましくないほど低レベルのアデノシンを調整することができ、特に適当な投薬の最適な調整に達するようにすることができる。
【０１０５】
本発明の組成物に組み込むことができる他の治療物質は、ヒト及び動物に投与されるいろいろな治療物質の一つ以上である。
【０１０６】
この組成物はさらに、第一の活性物質と第二の活性物質の他に、ユビキノン及び／又はフォリン酸を含みうる。ユビキノンは以下の化学式：
【化２８】
2007509839.tif 000030
によって表される化合物であるか、又は医薬として許容されるその塩である。
【０１０７】
好ましくは、ユビキノンは上に示した化学式の化合物であって、n=1〜10 (コエンザイム Q1-10)であり、さらに好ましくはn=6〜10 (コエンザイム Q6-10)、そして最も好ましくはn=10  (コエンザイムQ10)である。ユビキノンは標的の疾患又は病気を治療するための治療的な量で投与され、用量は対象者の病状、投与されている他の物質、用いる製剤のタイプ、及び投与ルート、によって異なる。ユビキノンは、好ましくは一日の全用量が、体重1 kgあたり約0.1、約1、約3、約5、約10、約15、約30、約50、約100、約150、約300、約600、約900、約1200 mg/kgで投与される。さらに好ましくは、一日の全用量が、約1〜約150 mg/kg、約30〜約100 mg/kgであり、最も好ましくは約5〜約50 mg/kgである。ユビキノンは天然に産生する物質であり、市販されている。
【０１０８】
本発明の活性物質は、組成物の広範囲の量で提供される。例えば、化合物は組成物中に、組成物の約0.001%、約1%、約2%、約5%、約10%、約20%、約40%、約90%、約98%、約99.999%という量で含まれる。本明細書で説明するように、活性が重複する別の物質が含まれる場合、各活性物質の量を調整することができる。しかし、活性化合物の用量は対象者の年齢、体重、及び病状によって異なる。治療は、本発明の第一の活性物質の低い用量から、例えば最適よりも少ない量で開始されうる。これは第二の活性物質についても同様に、望ましいレベルに到達するまで行われる。又は、逆もあり、例えばマルチビタミン及び／又はミネラルの場合、対象者をこれらの製品に関して望ましいレベルで安定させた後に第一の活性化合物を投与することもできる。用量は、その状況で望ましい及び／又は最適な効果が達成されるまで増やすことができる。一般に、活性物質は、ひどく有害又は危険な副作用を生ずることなく効果的な結果が得られるような濃度で投与することが好ましく、一回の単位投薬で投与しても、望むなら好都合なサブユニットで一日の間に適当な回数で投与することもできる。第二の治療又は診断物質（単数又は複数）は、意図した用途で効果的であることが当業者に公知である量で投与される。第二の物質が主な物質と活性が重複している場合、一方又は両方の物質の用量は、好ましくない副作用を避ける用量範囲を超えずに望ましい効果を達成するように調整される。したがって、例えば、この組成物に鎮痛剤及び抗炎症剤が追加される場合、それらは意図した用途で当業者に公知の量で、又はそれだけを投与する場合に比べて多少少ない用量で加えられる。
【０１０９】
医薬的に許容される塩は、薬理的及び医薬的に又は獣医学的に受容できるものでなければならず、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩として、例えばナトリウム、カリウム、又はカルシウム塩として調製できる。有機塩及びエステルも本発明で用いるのに適している。活性化合物は、医薬組成物又は獣医用組成物として全身用及び局所施用製剤の形で対象者に投与することが好ましい。そのうちでも、吸入に適した、又は呼吸可能な、口腔、経口、経直腸、経膣、経鼻、肺内、点眼、眼、空洞内、気管内、器官内、局所（口腔、舌下、経皮、及び眼窩内を含む）、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、及び関節内を含む）、及び経皮的な投与に適した製剤が好ましい。
【０１１０】
本発明はまた、この組成物と送達デバイスを含むキットを提供する。組成物は、単一又は多重ユニット投薬形態、並びにバルク形態で好適に提供され、製薬の分野で周知の方法によって調製できる。キットの中の組成物は、すでに一緒に製剤された形であることも、第一及び第二の活性物質が別々に、他の成分と合わせて用意されていて、製剤への調製及び投与の仕方についての説明書がついていることもある。キットはまた、この明細書で説明したような他の物質も含むことも、例えば非経口投与の場合、無菌にするために別の容器に入れた担体と合わせて提供されることもある。本発明の組成物はまた、凍結乾燥形態で、投与前に液体溶媒を加えるための無菌である別の容器に提供きる。例えば、米国特許第4,956,355号;英国特許第2,240,472号; EPO特許出願第429,187号; PCT特許公開WO 91/04030; Mortensen, S. A. et al., Int. J. Tiss. Reac. XII(3); 155-162 (1990); Greenberg, S. et al., J. Clin. Pharm. 30; 596-608 (1990); Folkers, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8931-8934 (1990)を参照のこと。 関連する調製及び化合物部分について、上記文献を本明細書中に援用する。
【０１１１】
本発明の組成物はいろいろな全身的及び局所施用製剤で提供される。本発明の全身的又は局所施用製剤は、経口、口腔内、肺内、直腸、子宮内、皮膚内、局所施用、皮膚、非経口、腫瘍内、頭蓋内、肺内、口腔、舌下、経鼻、皮下、血管内、くも膜下、吸入、吸引、関節内、空洞内、埋め込み、経皮、イオン浸透、眼窩内、点眼、経膣、眼、静脈内、筋肉内、腺内、器官内、リンパ内、徐放型、及び腸溶コーティングの製剤から成る群から選択される。これらのいろいろな製剤の実際の調製と合成は当業者に公知であり、個々で詳述する必要はない。組成物は一日に一回又は数回投与できる。
【０１１２】
吸引、経鼻、肺内、及び吸入投与に適した製剤は、局所施用、経口、及び非経口製剤と同様に好ましい。すべての調製方法は、活性化合物を一つ以上の付属成分を成す担体と結びつけるステップを含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、又はその両方と一緒にし、次に、必要ならば、生成物を所望の製剤に剤形することによって調製される。
【０１１３】
経口投与に適当な組成物は、各々が予め定められた量の活性化合物を、粉末又は顆粒として；水性又は非水性液体の溶液又は懸濁液として；又は水中オイル又はオイル中水のエマルジョンとして含む、個別のユニット、例えばカプセル、カシェ剤、ロゼンジ、又は錠剤などで提供しても良い。
【０１１４】
非経口投与に適当な組成物は、活性化合物の無菌水性及び非水性注射溶液を含み、この製剤は意図するレシピエントの血液と等張であることが好ましい。これらの製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、及び組成物を意図するレシピエントの血液と等張二するための溶質を含むことができる。水性及び非水性無菌懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。組成物は、単位用量又は複数回用量容器で、例えば封入されたアンプル及びバイアルで、提供することができ、冷凍乾燥された状態で貯蔵し、使用の直前に無菌の液体担体、例えば注射用の塩水又は水を加えるだけでよいようにすることができる。
【０１１５】
経鼻又は点眼製剤は、防腐剤と等張化剤を含む活性化合物の精製された水溶液を含む。好ましくは、この製剤は鼻の粘膜に適合するpH及び等張状態に調整される。
【０１１６】
直腸又は膣に投与される製剤は、ココアバター、水素添加脂肪、水素添加脂肪カルボン酸などの適当な担体による座薬として提供できる。
【０１１７】
眼科製剤は、鼻スプレーと同様な方法で調製され、異なる点はpHと等張因子が好ましくは眼の性質と適合するように調整されるということである。耳用の製剤は、当業者に公知のように、流出せずに耳に容易に投与できるようにオイルなどの粘度の高い担体で調剤される。
【０１１８】
皮膚への局所施用に適した組成物は、好ましくは軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又はオイルの形を取る。使用される担体は、ヴァセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、皮膚透過促進剤、及びそれらの二つ以上の組み合わせを含む。経皮投与に適当な組成物は、レシピエントの表皮と長時間密に接触させておけるような個別パッチとして提供できる。
【０１１９】
本明細書で開示された第一及び第二の活性物質は、吸入、呼吸、経鼻投与、又は何らかの適当な手段による対象者への（肺への）肺内注入によって呼吸器システムに投与することができ、好ましくは粉末又は液体の経鼻、肺内、呼吸又は吸入可能な粒子から成るエアロゾル又はスプレーを発生させることによって投与される。活性化合物を含む呼吸又は吸入可能な粒子が対象者によって吸入される、すなわち、吸入、経鼻投与、又は呼吸管又は肺自身への注入によって吸入される。製剤は、本発明に従って、吸入されたとき口と喉を通過し、気管支そして肺の肺胞へと入ってゆくのに十分に小さなサイズの呼吸又は吸入可能な粒子を含む活性化合物の呼吸又は吸入可能な液体又は固体粒子を含む。一般に、粒子の直径は、約0.05、約0.1、約0.5、約1、約2、から約4、約6、約8、約10ミクロンまでの範囲にある。さらに詳しくは、直径が約0.5から約5 μm未満が呼吸又は吸入可能である。エアロゾル又はスプレーに含まれる呼吸できないサイズの粒子は喉に沈着して嚥下される傾向がある。したがって、エアロゾルに含まれる呼吸できないサイズの粒子の量はできるだけ少なくすることが好ましい。経鼻投与又は肺内注入の場合、約8、約10、約20、約25、から約35、約50、約100、約150、約250、約500 μm（直径）までの範囲の粒子サイズが、鼻の空洞に保持するために、又は肺への注入と直接沈着を保証するために好ましい。特に新生児や幼児に投与される場合に、液体製剤は呼吸気道（鼻）と肺に噴出されうる。
【０１２０】
エアロゾルを製造するための活性化合物の液体医薬組成物は、活性化合物を安定な溶媒、例えば無菌の発熱物質を含まない水と組み合わせることによって調製できる。微紛化された活性化合物の呼吸可能な乾燥粒子を含む固体粒状組成物は、乾燥活性化合物をモルタルと乳棒で砕き、微紛化された組成物を400メッシュのスクリーンに通して大きな塊を壊すか又は分離することによって調製できる。活性化合物から成る固体粒状組成物は、場合により、エアロゾルの形成を助ける分散剤を含む。適当な分散剤は、ラクトースであり、それを活性化合物と適当な比、例えば重量で１対１の比でブレンドする。米国特許出願第10/462,901号と第10/462,927号は、噴霧化できる形のDHEAの安定な乾燥粉末製剤、及びDHEA-Sの二水和物結晶の安定な乾燥粉末製剤をそれぞれ開示している（これらの特許出願は、その全てを本明細書中に援用する。）
【０１２１】
活性化合物を含む液体粒子のエアロゾルは、噴霧器などの適当な手段によって生成できる。例えば、米国特許第. 4,501,729を参照のこと（当該開示は、本明細書中に援用される）。噴霧器は、狭いベンチュリ・オリフィス（venturi orifice)を通る圧縮気体、普通は空気又は酸素の加速によって、又は超音波による攪拌によって、活性成分の溶液又は懸濁液を治療的なエアロゾル・ミストに変換する市販されているデバイスである。噴霧器で用いるのに適当な組成物は、液体担体中の活性成分から成り、活性成分が40% w/w組成物までを占めるが、好ましくは多くとも20%のw/w担体が普通は水又は希水性アルコール溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムを加えて体液と等張にされる。任意の添加物は、組成物が無菌に調製されていない場合は防腐剤、例えばメチル・ヒドロキシベンゾエート、抗酸化剤、芳香剤、揮発性オイル、緩衝液、及び表面活性物質などである。活性化合物を含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、固体粒状医薬エアロゾル発生器によって生成できる。対象者に固体粒状医薬を投与するためのエアロゾル発生器は、上で説明したような呼吸可能な粒子を生成し、予め定められた計量された用量の医薬を含むある量のエアロゾルを、ヒトへの投与に適当な流量で発生させる。このようなエアロゾル発生器の例としては、定量噴霧式吸入器及び注入器などがある。
【０１２２】
この組成物は、エアロゾル又はスプレー発生器など、液体又は固体粒状エアロゾルを発生させる任意の送達デバイスによって送達できる。これらのデバイスは、上で説明したような呼吸可能な粒子を生成し、予め定められた計量された用量の医薬を含むある量のエアロゾルをヒト又は動物への投与に適当な流量で発生させる。固体粒状エアロゾル又はスプレー発生器の一つの代表的なタイプは注入器であり、これは細かく粉砕された粉末の投与に適する。注入器では、粉末、例えばここで述べた治療を行うのに有効な組成物の計量された用量がカプセル又はカートリッジに入れられる。これらのカプセル又はカートリッジは普通ゼラチン、ホイル、又はプラスチックから作られ、in situで穿孔され又は開かれて、粉末は吸入によってデバイスに引き込まれる空気によって、又は手動で操作されるポンプによって、送達される。注入器で用いられる組成物は、第一及び第二の活性物質だけから成ることも、第一及び第二の活性物質の粉末ブレンドから成り、それが組成物の0.01〜100% w/wを占めることもある。組成物は、一般に第一及び第二の活性物質を約0.01% w/w、約1% w/w、約5 % w/wから約20 % w/w、約40% w/w、約99.99% w/wまでの量で含む。しかし、他の成分及び他の量の活性物質も本発明の範囲内で適当である。
【０１２３】
ある実施形態では、組成物は噴霧器で送達される。この手段は、自分の努力で組成物を吸入又は呼吸できない患者又は対象者の場合、特に有用である。重篤な症例では、患者又は対象者は人工呼吸器で生かされている。噴霧器は医薬的に又は獣医学的に許容される任意の担体を用いることができる、例えば希薄な生理食塩溶液を用いることができる。噴霧器は粉末医薬組成物を患者又は対象者の気道における標的に送達する手段である。
【０１２４】
この組成物は、また、いろいろな投与方法及び送達ルートに合わせたいろいろな形態で提供される。ある実施態様では、当該組成物は、呼吸可能な製剤、例えばエアロゾル又はスプレーを含む。本発明の組成物は、バルクで、単位用量形態で、並びに埋め込み錠、カプセル、ブリスター、又はカートリッジの形態であって、当業者に公知のように開くことができる又は穿孔できる形態で提供される。送達デバイスを含み、別の容器に本発明の組成物、及び場合により他の賦形剤、及び治療薬剤を含み、そしてキット内容の使用に関する説明書も含むキットが提供される。
【０１２５】
ある実施形態では、組成物は懸濁定量吸入（MDI）製剤を用いて送達される。このようなMDI製剤はハイドロフルオロアルカン（HFA）などの噴射剤を用いて送達デバイスによって送達できる。好ましくは、HFA噴射剤は100 パーツ・パー・ミリオン（PPM）以下の水しか含まない。
【０１２６】
ある実施形態では、送達デバイスは単一又は複数用量の組成物を送達する乾燥粉末吸入器（DPI）である。単一用量吸入器は、一回の使用のために十分な製剤を無菌で予め装荷した使い捨てキットとして提供することもできる。吸入器は加圧式吸入器として提供し、製剤は穿孔可能な又は開くことができるカプセル又はカートリッジで提供できる。キットはまた、場合により、別の容器に、他の治療物質、賦型剤、表面活性物質（治療物質並びに製剤成分として）、抗酸化剤、芳香剤及び着色剤、充填剤、揮発静オイル、緩衝物質、分散剤、表面活性物質、抗酸化剤、芳香剤、水分調節剤、噴射剤、及び防腐剤などをいろいろな製剤の適当な添加物として含むことができる。
【０１２７】
本発明を一般的に説明したが、本発明はいくつかの具体的な実施例を参照することでもっと良く理解されるであろう。これらの実施例は、分かりやすく例示するために本明細書に含められるものであり、特に断らない限り本発明及びその実施形態を制限することを意図していない。
【実施例】
【０１２８】
実施例１及び２：フォリン酸とDHEAがアデノシン・レベルに及ぼすin vivoでの効果
若い成獣雄Fischer 344ラット（120グラム）に、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）（300 mg/kg）又はメチルテストステロン（40 mg/kg）を含むカルボキシメチルセルロースを強制飼養によって１日１回14日間にわたって投与した。フォリン酸（50 mg/kg）を腹腔内に１日１回14日間にわたり投与した。15日目に、ラットはマイクロ波パルス（1.33キロワット、2450メガヘルツ、6.5秒）を頭蓋に加えることにより屠殺した。このマイクロ波パルスにより、すべての脳タンパク質が瞬時に変性し、アデノシンのそれ以上の代謝が阻止される。死亡後、１０秒以内にラットから心臓を取り出し、液体窒素で急速凍結した。死亡後30 s以内に、肝臓と肺をブロックで取り出し、急速凍結した。その後、脳組織を解剖した。組織アデノシンを抽出し、1,N6-エテノアデノシンに誘導体化し、Clark and Darの方法（J. of Neuroscience Methods 25: 243 (1988)）に従って分光蛍光測定検出を用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析された。これらの実験の結果は下の表１にまとめられている。結果を、平均±SEMで表し、対照群と比較してκp<0.05、及びＨＥＡ又はメチルテストステロン処理群と比較してΨp<0.05であった。
【０１２９】
【表１】
2007509839.tif 000031
【０１３０】
これらの実験の結果から、DHEA又はメチルテストステロンを二週間にわたって毎日投与されたラットはアデノシンの多器官欠乏を示したことが分かる。欠乏は、脳（DHEAで60%欠乏、高用量のメチルテストステロンで34%）及び心臓（DHEAで37%欠乏、高用量のメチルテストステロンで22%）で顕著であった。フォリン酸の同時投与はステロイドに媒介される欠乏を完全にうち消した。フォリン酸を単独で投与すると、調べたすべての器官でアデノシン・レベルの増加を誘発した。
【０１３１】
実施例３：無水DHEA-Sのエアージェットによる粉砕と呼吸可能な用量の決定
喘息治療としてのDHEA-Sが評価される。ナトリウム・デヒドロエピアンドロステノンサルフェート（NaDHEA-S）の固体安定性が、バルク及び粉砕された材料で調べられた（Nakagawa, H., Yoshiteru, T., and Fujimoto, Y. (1981) Chem. Pharm. Bull. 29(5), 1466-1469; Nakagawa, H., Yoshiteru, T., and Sugimoto, I. (1982) Chem. Pharm. Bull. 30(1), 242-248）。DHEA-Sは、二水和物形態で最も安定であり、結晶質である。DHEA-S無水物形態は、結晶性が低く、非常に高吸湿性である。DHEA-S無水物形態は、貯蔵の際に水を吸収しない限り安定である。部分的に結晶質の材料を水分から遮断するためには、特別な製造及び包装技術を必要とする。強い製品では、水分に対する敏感さをできるだけ小さくすることが開発プロセスで不可欠である。
【０１３２】
（１）DHEA-Sの微紛化
無水DHEA-Sがジェット粉砕（Jet-O-Mizer Series #00, 100-120 PSI nitrogen）によって微紛化された。約1ｇのサンプルがジェットミルに一回通され、約2ｇのサンプルがジェットミルに二回通された。各粉砕の実行から得られた粒子をヘキサン中に懸濁し、このヘキサン中ではDHEA-Sは不溶であり、凝集を防止するためにＳｐａ８５界面活性剤活性剤を加えた。得られた溶液は3分間超音波で処理され、完全に分散したように見えた。分散した溶液は、少量サンプラー（SVS）アタッチメントを有するMalvern Mastersize Xでテストされた。分散した材料の１サンプルが5回テストされた。粉砕されない材料の粒径の中央値、つまりD(v, 0.5)は52.56μmであり、%RSD （相対標準偏差）は5つの値で7.61であった。ジェットミルを一回通した場合のD(v, 0.5)は3.90μmであり、%RSDは1.27であり、ジェットミルを二回通した場合のD(v, 0.5)は3.25μmであり、%RSDは3.10であった。これにより、DHEA-Sをジェットミルで吸入に適当な粒径に粉砕できることをはっきりと示された。
【０１３３】
（２）HPLC分析
ジェットミルによる粉砕の間における薬の劣化を決定するために、微紛化された薬の二つのバイアル（A:一回通過；150 mgとB:二回通過；600 mg）を利用した。バイアルAとBから秤量された一定量を、粉砕されないDHEA-S（10 mg/ml）の標準溶液とアセトニトリル-水（1:1）中で比較した。粉砕されない標準溶液（10 mg/ml）のHPLC分析でクロマトグラフィー・ピーク面積は23,427という値を与えた。微紛化されたDHEA-S形態バイアルAとBの秤量された分量（5 mg/ml）がアセトニトリル-水（1:1）中で調製された。バイアルAとBのクロマトグラフィー・ピーク面積は、それぞれ、11,979及び11,677であった。明らかに、ジェットミルによる微紛化のプロセスで検出できるような薬の劣化はなかった。
【０１３４】
（３）放出される用量の研究
DHEA-S粉末をNepheleチューブに集めてHPLCで分析した。各空気流量で、テストされた三つの乾燥粉末吸入器（ロタハーラー（Rotahaler）、ディスクハーラー（Diskhaler）, 及びIDLのDPIデバイス）の各々で三重複で実験を行った。Nepheleチューブの一端にガラス・フィルター（Gelman Sciences, Type A/E, 25 μm）を取り付け、それをさらに空気流ラインに結合して、テストされるそれぞれの乾燥粉末吸入器からの放出される用量の薬を集めた。Nepheleチューブの他端に、テストされるそれぞれの乾燥粉末吸入器のマウスピースを受け入れる開口を有するシリコーン・アダプターが固定された。Nepheleチューブを通して所望の空気流量、30, 60, 又は90 L/min、が実現された。次に、各乾燥粉末吸入器のマウスピースがシリコーンラバー・アダプターに挿入し、空気流は約４ｓ続けられ、その後チューブを外し、各チューブの端にエンドキャップをはめ込んだ。フィルターを含まないチューブのエンドキャップを外して、10 mlのHPLCグレードの水−アセトニトリル溶液（1:1）をチューブに加え、エンドキャップを再び取り付け、チューブを1-2分間振とうした。次に、エンドキャップをチューブから外し、溶液をフィルターを取り付けた10 mlのプラスチック注射器（Cameo 13N Syringe Filter, Nylon, 0.22 μm）に移した。溶液のある分量が直接にHPLCバイアルにフィルターを通して入れられ、HPLCによる薬の分析が行われる。放出される用量の実験は、ゼラチン・カプセル（ロタハーラー）又はVentodiskブリスター（ディスクハーラーと単一用量DPI (IDL)）に入れられ微紛化されたDHEA-S（約12.5又は25 mg）で行われた。ゼラチン・カプセル又はブリスターに入れるために微紛化されたDHEA-S（バイアルBだけを使用）が秤量されたとき、微紛化された粉末の凝集物が数個あるように見えた。空気流量、30, 60, 及び87.8 L/minで行われた放出用量テストの結果は表２に示されている。表２は、３つの異なる流量でのロタハーラー実験、３つの異なる流量でのディスクハーラー実験、及び３つの異なる流量での複数用量実験の結果をまとめている。
【０１３５】
【表２】
2007509839.tif 000032
【０１３６】
（４）呼吸可能用量の研究
呼吸可能な用量（呼吸可能な割合）の研究は標準サンプラー・カスケード・インパクター（Andersen）を用いて行われた。これは、入口コーン（インパクターのプレ-セパレーターがここに代用される）、９個のステージ、８個の収集プレート、及び３つのスプリング・クランプとガスケットO-リング・シールによってまとめられた８つのアルミニウム・ステージ内のバックアップ・フィルターから成り、各インパクター・ステージが多数の精密に穿孔されたオリフィスを含むものである。サンプラーを通して空気が吸い込まれると、各ステージで多数の空気ジェットが空気に運ばれてきた粒子をそのステージの収集プレートの方へ導く。ジェットのサイズは各ステージで一定であるが、各引き続くステージではもっと小さくなっている。ある粒子が与えられたステージでインパクトされるかどうかは、その空気動力学的直径に依存する。各ステージで集められる粒径の範囲は、そのステージのジェット速度、及び前のステージのカットオフ・ポイントに依存する。最初のステージで集められなかった粒子は、空気の流れに乗ってプレートの縁を回って次のステージへ進み、そこでインパクトされるか通過して次のステージに進む、とそのようにしてジェットの速度がインパクションに十分になるまで続く。カスケード・インパクター・テストで粒子が反跳するのを防ぐために、個々のインパクター・プレートはヘキサン・グリース（高真空用）溶液（100:1の比）がコーティングされた。上述のように、インパクター・プレートの粒径カットオフ点は異なる空気流量で変化した。例えば、ステージ２は、60 L/minで6.2μmよりも大きな粒子というカットオフ値に対応し、30 L/minで5.8μmよりも大きな粒子というカットオフ値に対応する。そしてステージ３は、90 L/minで粒子サイズのカットオフ値が5.8μmよりも大きくなる。このように、同程度の空気流量では同じようなカットオフ粒径値、すなわち、5.6から6.2μmという範囲の値、が優先的に用いられる。乾燥粉末吸入器をテストするために米国薬局方が勧告している装置は、マウスピース・アダプター（この場合はシリコーン）がガラス咽喉（変型50 ml丸底フラスコ）及び遠位ガラス咽頭（誘導ポート）に取り付けられプレセパレーターとAndersenサンプラーにつながっているものである。プレセパレーター・サンプルは、マウスピース・アダプター、ガラス咽喉、遠位ガラス咽頭、及びプレセパレーターからの流出物などである。カスケード・インパクター実験を行う前に、5 mlアセトニトリル：水（1:1の比）溶媒がプレセパレーターに入れられ、実験は、３つの異なる乾燥粉末吸入デバイスについて３つの空気流量、30, 60, 及び90 L/min、で重複して行われた。カスケード・インパクター・プレートで集められた薬はHPLCによって分析された。各ディスクハーラー及び複数用量カスケード・インパクター実験で薬の質量バランスが調べられた、すなわち、ブリスターに残された薬の量、デバイス（ディスクハーラーのみ）に残された薬の量、シリコーンラバーのマウスピース・アダプター、ガラス咽喉、遠位ガラス咽頭、及びプレセパレーターに保持される呼吸可能でない用量、すべてを１サンプルに合わせたもの、及び呼吸可能な用量、すなわち、空気流量30及び60 L/minでのステージ２スルーフィルター・インパクター・プレート及び90 L/minでのステージ1スルーフィルター・インパクター・プレートを決定することによって質量バランスが調べられた。
【０１３７】
【表３】
2007509839.tif 000033
【０１３８】
放出用量及びカスケード・インパクター実験の結果によれば、カスケード・インパクター実験で得られた低い呼吸可能用量の値は凝集してテストされた最も高い空気流量でも分離できなかった薬粒子のためであった。薬粒子の凝集は、粒子サイズを小さくするための機械的な粉砕プロセスでたまった静電荷の結果であり、この状況にその後の粒子による水分吸収がさらに複合される。静電荷をあまり生じない、又は吸湿性がもっと小さい、十分に水和したDHEA-Sの結晶形態（すなわち、二水和物）を生ずるように微紛化する方法であれば、もっと自由に流動し凝集の可能性が小さな粉末が得られるであろう。
【０１３９】
実施例４：無水DHEA-Sのスプレー乾燥と呼吸可能用量の決定
（１）薬の微粉化
1.5 gの無水DHEA-Sを100ｍｌの50%エタノール：水に溶解して1.5%溶液を生成した。溶液はB-191 Mini Spray-Dryer (Buchi, Flawil, Switzerland)によって、入口温度55℃、出口温度40℃、１00%アスピレーター、10%ポンプ、40 mbarでの窒素の流れ、600単位のスプレー流量で、スプレー乾燥された。スプレー乾燥された生成物を、凝集を減らすためにSpan85が加えられたヘキサンに懸濁した。分散物は、3-5分間冷却しながら超音波処理して完全に分散させ、分散させた溶液を小体積サンプラー（SVS）アタッチメントを備えたMalvern Mastersizer Xでテストした。二つのバッチのスプレー乾燥された材料の二つのバッチは平均粒径が5.07±0.70μmと6.66±0.91μmであることが見出された。各バッチの分散物の光学顕微鏡による検査によって、スプレー乾燥によって呼吸可能な小さなサイズの粒子が生ずることが確認された。各バッチの平均粒径は、それぞれ、2.4と2.0μmであった。これは、DHEA-Sをスプレー乾燥によって吸入に適当な粒子サイズにすることができるということを実証している。
【０１４０】
（２）呼吸可能用量の研究
実施例３で述べたように、カスケード・インパクター実験が行われた。４つのカスケード・インパクター実験が、３つはIDL複数用量デバイスで、１つはディスクハーラーで、すべて90 L/minで行われた。このカスケード・インパクター実験の結果は下の表４に示されている。これらの実験のスプレー乾燥された無水材料では、微紛化された無水DHEA-Sに比べて呼吸可能な用量が２倍に増加した。ジェット粉砕に比べてスプレー乾燥では高い呼吸可能な用量が得られたように見える。しかし、呼吸可能な用量の割合（％）は依然として低い。これは無水形態が水分を吸収した結果であるように思われた。
【０１４１】
【表４】
2007509839.tif 000034
【０１４２】
実施例５：DHEA-S二水和物（DHEA-S・2H2O）のエアージェット粉砕と呼吸可能用量の決定
（１）DHEA-S二水和物の再結晶
無水DHEA-Sを、90%エタノール／水の沸騰混合液に溶解した。この溶液をドライアイス／メタノール槽で急速に冷やしてDHEA-Sを再結晶させる。結晶をろ過し、冷たいエタノールで二回洗浄し、真空乾燥器でRTで36時間乾燥する。乾燥プロセスの間、ときどきへらでかき混ぜて大きな凝集を壊すようにする。乾燥後、物質を500μmのふるいに通した。
【０１４３】
（２）微粉化及び物理化学テスト
DHEA-S二水和物を、ジェットミルでVenturi圧力40 PSI、ミル圧力80 PSI、フィード設定25、及び生成物フィード速度約120〜175 g/時間で、窒素ガスによって微紛化した。表面積が、５点BET分析を吸着ガスとして窒素（P/P0=0.05から0.30）を用いMicromeritics TriStar 表面積アナライザーを用いて５点BET分析を行って決定される。粒径分布を、Micromeritics Saturn Digisizerを用いてレーザー回折によって、粒子はミネラル・オイルにナトリウム・ジオクチル・ナトリウムスルフォスクシネートを分散媒として懸濁させて測定する。薬物質の水含有量はKarl Fischer titration（Schott Titroline KF）によって測定される。純水が標準として用いられ、三重測定のすべての相対標準偏差は1%未満である。粉末は直接適定媒質に加えられる。微粉化の前と後のDHEA-S二水和物の物理化学的性質は表５にまとめられている。
【０１４４】
【表５】
2007509839.tif 000035
【０１４５】
測定された唯一の顕著な変化は粒子サイズの変化である。顕著な水の減少も、不純物の増加も見られない。微紛化された物質の表面積はメディアン・サイズが3から4ミクロンの不規則な形の粒子と合致している。微粉化によって粒径は吸入に適当な範囲に減少して固体の化学には何も測定できるほどの変化はない。
【０１４６】
（３）DHEA-S二水和物のエアロゾル化
単一用量Acu-Breatheデバイスを用いてDHEA-S二水和物を評価する。約10 mgのDHEA-S二水和物粉末をホイル・ブリスターに充填し封入する。これらのブリスターをAndersenの8-ステージ・カスケード・インパクターに30〜75 L/minという範囲の流量でガラスのツイン・インピンジャー・スロートによって作動させる。Andersenインパクターのステージ1-5は一緒に水洗して微粒子の割合を推定する。多重ステージからあつめられた薬を一つの分析にプールすることによってこの方法はより高感度になる。このシリーズの実験の結果は図１に示されている。すべての流量で、二水和物はほぼ無水の物質よりも高い微粒子比率を与える。二水和物は単一用量吸入器を用いてエアロゾル化されるので、そのエアロゾル特性はほぼ無水の物質よりも著しく良いと結論することがきわめて妥当である。結晶性の高さと安定した水分含有量が二水和物の優れたエアロゾル特性を生み出している最もありそうな要因である。DHEA-S二水和物のこのユニークな特徴は以前の文献で報告されていない。二水和物形態によるDHEA-Sのエアロゾル特性の改善は顕著であるが、混じりものがない純な薬物質が最適な製剤ではないかもしれない。大きな粒径のキャリアを用いることで、普通、微粉化された薬物質のエアロゾル特性が改善される。
【０１４７】
実施例６：ラクトースを用いる場合と用いない場合の無水DHEA-SとDHEA-S二水和物の安定性
初期純度（時間＝０）が、無水DHEAとDHEA-S二水和物について高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によって決定された。次に、両方の形態のDHEA-Sにラクトースを50:50の比でブレンドするか、又は混じりけのない粉末賭して用いて開いたガラス・バイアルに入れ、4週間まで50℃に保たれた。長期安定性の結果を予測するために、これらの条件を用いて製剤にストレスをかけた。DHEA-S（無水物と二水和物）だけを含む対照バイアルは封じて4週間まで25℃に保たれた0, 1, 2, 及び4週目にサンプルを取って分析してDHEAの形成で測定される劣化の量を決定した。１週間後、封じられたガラス・バイアル中で50℃で貯蔵された、ラクトースがブレンドされた（50% w/w, 公称）ほぼ無水のDHEA-Sは、褐色の色を帯び、それはラクトース・ブレンドで黒っぽくなる。この色の変化に伴って、図１に示されたようなクロマトグラムの顕著な変化が見られる。主な劣化物質はDHEAである。図２から定性的に見て、ブレンドにおけるDHEAの量は他の二つのサンプルよりも多い。サンプルにおける%DHEAを定量的に推定するために、DHEAピークの面積をDHEA-SとDHEAピークの総面積で割る（表６を見よ）。ブレンドの分解速度が高いことはラクトースとほぼ無水のDHEA-Sの間の特定の相互作用を示す。DHEAの増加と平行して、加速された貯蔵による粉末の褐色のカラーが時間と共に増加した。加速された貯蔵で物質は時間と共に粘着性を高め、それは化学分析のためにサンプルを秤量するさいの付着によっても認められる。これらの結果によれば、ほぼ無水のDHEA-Sをラクトースと共に製剤することは不可能である。ラクトースは、乾燥粉末製剤のために最もよく用いられる吸入用賦型剤であるから、これはかなり不利になる。ほぼ無水の形態で続けるということは、製剤を混じりけなしの粉末に限定するか又は新しい賦型剤を用いるためにもっと包括的な安全研究を行うということを意味する。
【０１４８】
【表６】
2007509839.tif 000036
【０１４９】
図２と対照的に、50℃で１週間の貯蔵後、DHEAはほとんど生成されない（図３を見よ）。さらに、物質は何も色の変化を示さない。DHEA-S二水和物の水分含有量は50℃で１週間の貯蔵後もほとんど変わらない。加速された貯蔵後の水分含有量は8.66%であるが、これに対し出発値は8.8%である。この安定性プログラムの過程で測定された%DHEAを表７に示す。
【０１５０】
【表７】
2007509839.tif 000037
【０１５１】
図１と２及び表６と７を比較することによって、DHEA-Sの二水和物形態がさらに研究を進めるためにより安定な形態であることが分かる。ほぼ無水物である物質に比べてDHEA-Sとラクトースの両立性が優れていることは特許や研究の文献には報告されていない。この物質の溶解度は、噴霧器用溶液の開発研究の一部として次のセクションで報告する。
【０１５２】
実施例７：DHEA-S二水和物／ラクトース・ブレンド、呼吸可能な用量と安定性の決定
（１）DHEA-S二水和物／ラクトース・ブレンド
等しい重量のDHEA-Sと吸入グレードのラクトース（Foremost Aero Flo95）が手で混合された後、500μmのスクリーンを通してプレブレンドを調製する。次にこのプレブレンドをBelArt Micro-Millに残りのラクトースと共に入れてDHEA-Sの10% w/wブレンドを生ずる。ブレンダーは可変電圧電源に結合して回転羽根のスピードを調節する。ブレンダーの電圧は、最大電圧の30%, 40%, 45%, 及び30%を、それぞれ1, 3, 1.5, 及び1.5分間サイクルさせた。ブレンドの含有量一様性はHPLC分析によって決定された。表８は、このブレンドの含有量一様性サンプルの結果を示す。目標値は10% w/w DHEA-Sである。ブレンドの内容は目標値との近さと含有量一様性に関して満足できるものである。
【０１５３】
【表８】
2007509839.tif 000038
【０１５４】
（２）DHEA-S二水和物／ラクトース・ブレンドのエアロゾル化
ホイル・ブリスターにこの粉末約25 mgが充填され封じられて、単一用量デバイスを用いて60 L/minでエアロゾル化される。各テストに二つのブリスターが用いられ、微粒子比率（ステージ1-5の物質）に関する結果は表９に示されている。この予備的粉末ブレンドのエアロゾル結果は呼吸によるドラッグ・デリバリー・システムとして満足できるものである。粉末ブレンドとブリスター／デバイス構成を最適化することによってもっと高い微粒子比率も可能である。テスト２の全粒径分布は表１０に示されている。このエアロゾルのDHEA-Sのメディアン直径は〜2.5μmである。この直径は、レーザー回折によって測定されたDHEA-S二水和物の直径の中央値よりも小さい。不規則な形の粒子は、その最大寸法が空気流の方向にそろうので、空気動力学的にはもっと小さな粒子として振る舞う。したがって、二つの方法の間で差が見られるのは普通のことである。回折測定はインプットされる物質に関する品質管理テストであり、カスケード・インパクターによる試験は最終生成物に関する品質管理テストである。
【０１５５】
【表９】
2007509839.tif 000039
【０１５６】
【表１０】
2007509839.tif 000040
【０１５７】
（３）DHEA-S二水和物／ラクトース・ブレンドの安定性
このラクトース製剤は、また、50℃での加速安定性プログラムでテストされる。DHEA-S含有量に関する結果は表１１にある。対照はRTで貯蔵されたブレンドである。どちらの条件でも時間によるDHEA-S含有量に何も動向は見られず、すべての結果は含有量一様性テストで集められたサンプルの範囲内にある（表１１を見よ）。さらに、色の変化も不規則性もクロマトグラムで見られない。ブレンドは化学的に安定であるように見える。
【０１５８】
【表１１】
2007509839.tif 000041
【０１５９】
実施例８：DHEA-Sの噴霧器製剤
DHEA-Sの溶解度
“DHEA-S二水和物の再結晶（実施例５）”に従って調製された過剰なDHEA-S二水和物が溶媒に加えられ、少なくとも14時間ときどき振とうして平衡させる。次に、懸濁液は0.2ミクロンの注射器フィルターを通して濾過し、直ちにHPLC分析のために希釈される。冷蔵サンプルを調製するために、注射器とフィルターは冷蔵庫に少なくとも１時間貯蔵してから使用する。純水の吸入は咳刺激を生ずることがある。したがって、噴霧器製剤にハロゲン化物イオンを加えることが重要で、NaClが最もよく用いられる塩である。DHEA-Sはナトリウム塩なので、NaClは共通イオン効果によって溶解度を低下させる可能性がある。RT（(24-26℃)及び冷蔵温度（7-8℃）でのDHEA-Sの溶解度をNaCl濃度の関数として図４に示す。DHEA-Sの溶解度はNaCl濃度と共に減少する。貯蔵温度を下げると、すべてのNaCl濃度で溶解度は減少する。高いNaCl濃度では、温度の効果は弱くなる。三重複実験で、~25℃及び0% NaClでの溶解度は16.5-17.4 mg/mLという範囲にあり、相対標準偏差は2.7%である。0.9% NaClで冷蔵温度では、三重複実験での範囲は1.1-1.3 mg/mLで、相対標準偏差は8.3%である。
【０１６０】
固体のDHEA-Sと溶液状態のDHEA-Sの平衡は次のようになる：
NaDHEA-Ssolid⇔DHEA-S-+Na+
K=[DHEA-S-][ Na+]/[NaDHEA-S] solid
固体中のDHEA-Sの濃度は一定であるから（すなわち、物理的に安定な二水和物）、平衡の式は単純化されて次のようになる：
【０１６１】
Ksp=[ DHEA-S-][ Na+]
この想定によると、DHEA-S溶解度 対 全ナトリウム陽イオン濃度の逆数のプロットは勾配がKspに等しい直線である。これは図５と６に、それぞれRT及び冷蔵温度での平衡に関して示されている。相関係数に基づくと、室温と冷蔵温度の両方でこのモデルはデータに対する妥当な適合であり、平衡定数はそれぞれ2236及び665ｍＭ2である。溶解度を最大にするには、NaClレベルをできるだけ低くする必要がある。噴霧器溶液のための最小ハロゲン化物イオン含有量は20 mM又は0.12% NaClである。
【０１６２】
溶液のDHEA-S濃度を推定するために、使用時の噴霧器における10℃の温度低下を仮定する（すなわち、15℃）。平衡定数 対 絶対温度の逆数の間で内挿すると、15℃でのKspは〜1316 mM2になる。各モルのDHEA-Sが溶液のナトリウム陽イオンに寄与するから、次のようになる：
Ksp=[DHEA-S-][Na+]=[DHEA-S-][Na+ + DHEA-S-]
=[DHEA-S-]2 + [Na+][DHEA-S-]
これは[ DHEA-S-]に関して二次方程式を用いて解かれる。Kspが1316 mM2での20 mM Na+の解は27.5 mM DHEA-S-又は10.7 mg/mlである。したがって、0.12% NaClでの10 mg/mlのDHEA-S溶液が次のテストに進むための良い製剤候補として選ばれる。この製剤のための推定では、噴霧器からの水の蒸発による濃縮効果を考慮に入れていない。0.12% NaClでの10 mg/mlのDHEA-S溶液のpHは4.7から5.6までの範囲にある。吸入製剤としてこれは受容できるpHレベルであるが、20 mMリン酸緩衝液を使用する効果が評価される。緩衝された溶液と緩衝されない溶液に関するRTでの溶解度の結果が図７に示されている。製剤に緩衝液があると溶解度が低下する、特に低いNaClレベルにおいて低下する。図８に示されているように、緩衝された溶液に関する溶解度データは緩衝されない溶液に関するものと同じ平行線上にある。緩衝液による溶解度の減少はナトリウム陽イオン含有量の増加による。溶解度を最大にすることは重要な目標であるが、製剤に緩衝液を加えると溶解度は減少する。さらに、Ishihara and Sugimoto ((1979) Drug Dev. Indust. Pharm. 5(3) 263-275)は、中性のpHでもNaDHEA-Sの安定性に顕著な改善を示さなかった。
【０１６３】
安定性研究
短期の溶液安定性研究プログラムのために0.12% NaClでの10 mg/mlのDHEA-S溶液が調製される。この溶液のある分量を透明なガラス・バイアルに充填し、RT (24-26℃)及び40℃で貯蔵する。サンプルは毎日DHEA-S含有量、DHEA含有量及び外観がチェックされる。各時点で、各バイアルから重複サンプルを取り出して希釈する。この研究の期間にわたるDHEA-S含有量が図９と１０に示されている。加速された条件では、溶液は速い分解速度を示し、二日の貯蔵後に曇りが生じた。RTで貯蔵した溶液はもっと安定で、第三日目にわずかな沈澱が観察される。研究を三日目に止める。DHEA-Sの分解に伴ってDHEA含有量が図１０に示されているように増加する。DHEAは水に不溶なので、製剤中にほんの少しの量があれば溶液に曇りが生ずる（加速された貯蔵）、又は結晶質の沈澱が生ずる（室温での貯蔵）。これは、以前のDHEA-S溶解度についての肉眼評価がこの化合物の溶解度を大きく過少評価した理由を説明する；すなわち、少量のDHEAが実験者にDHEA-Sの溶解度の限界を超えたと結論させたのである。溶液は、臨床試験で溶かした日に関しては十分安定であろう。以下のセクションで、この製剤のエアロゾル特性を記述する。
【０１６４】
噴霧器研究
DHEA-S溶液はPari ProNeb UltraコンプレッサーとLC Plus 噴霧器を用いて噴霧化される。実験装置の概略は図１１に示されている。噴霧器に5 mLの溶液を充填し、出力が肉眼で意味がないと見えるまで（4 1/2から5分）噴霧化を続ける。噴霧器溶液はCalifornia Instruments AS-6 ６ステージ・インパクターでUSPスロート（throat）を用いてテストされる。インパクターは8 sの間30 L/minで8 sの間運転され、１分の噴霧化時間の後サンプルを集める。実験の間の他のすべての時間、エアロゾルはバイパス・コレクターを通して約33 L/minで吸引される。収集装置、噴霧器、及びインパクターは移動相（mobile phase）で洗浄され、HPLCによって分析される。0.12% NaCl中のDHEA-S 5mLが噴霧器で用いられる。この量は、臨床研究で使用するための実際的な上限として選ばれたものである。最初の５回の噴霧化実験の結果を下に示す。
【０１６５】
【表１２】
2007509839.tif 000042
【０１６６】
噴霧器＃1は、約5分の実行で乾くが、噴霧器＃2は、4.5分弱しかかからない。それぞれの場合に、噴霧器に残る液体の量はほぼ2 mLである。この液体は、噴霧器から出した直後は乳白色であるが、3-5分以内に透明になる。この時間の後でも、10 mg/mL溶液は少量の粗い沈澱を含んでいるように見える。液体中の微細な気泡が最初の乳白色を生じているように見える。DHEA-Sは表面活性を有するように（すなわち、発泡を促進する）ように見え、これが液体中の気泡を安定化する。10 mg/mL溶液中の沈澱は、噴霧器環境で薬物質の溶解度を超えたことを示す。したがって、表１３の追加の噴霧器実験はもっと低い濃度で行われている。表１３は、“用量”直線性 対 溶液濃度の追加データを示す。
【０１６７】
【表１３】
2007509839.tif 000043
【０１６８】
噴霧器＃3は、乾くのに4.5分弱しかかからない。バイパス・コレクターにおける質量が最初の溶液濃度に対して図１２にプロットされている。0から7.5 mg/mLまでは良い直線性があり、その後集められる量は平らになり始めるように見える。10 mg/mL溶液の計算には冷却による溶解度の減少がふくまれているが、薬及びNaCl含有量に対する濃度の影響は無視された。したがって、噴霧器の液体の過飽和によって沈澱が生ずる可能性がある。図１２のデータ及び噴霧後の10 mg/mL溶液に粒状物質が見られたことは、概念臨床試験製剤の立証のための最高溶液濃度が約7.5 mg/mLであることを示す。エアロゾル・サンプルはカスケード・インパクターに吸引されて粒径分析が行われる。粒径分布には、溶液濃度又は噴霧器ナンバーによる検出できる傾向は何も見られない。すべての噴霧化実験での平均粒径分布が図１３に示されている。エアロゾルの粒径測定値はこの噴霧器に関する公表された／広告された結果と合致している（すなわち、メディアン直径〜2μm）。In vitro実験は噴霧器製剤が呼吸可能なDHEA-Sエアロゾルを送達できることを示しているが、製剤は不安定であり、4-5分の連続噴霧を必要とする。したがって、安定なDPI製剤は著しい利点になる。DHEA-S二水和物はDPI製剤のための最も安定な固体状態と同定される。最適な噴霧器製剤は、DHEA-Sの臨床試験用の0.12% NaClでの7.5 mg/mLのDHEA-Sである。この製剤のpHはバッファー・システムなしで受容できる。DHEA-Sの水に対する溶解度はナトリウム陽イオン濃度を最小にすることによって最大になる。バッファーなしでの最小の塩化ナトリウム・レベルがこの目標を達成する。これは20 mMのCl-で噴霧化のさいに沈澱しない最も高い薬濃度である。この製剤はRTで少なくとも１時間安定である。
【０１６９】
実施例９：実験モデルの調製
HY-29細胞（ATCC, Rockville, Md.）のサブラインであり、完全に定められた無血清PC-1培地（Ventrex, Portland, ME）で成長するのに適合した細胞培養、HT-29 SF細胞を入手した。ストック培養はこの培地で37℃で（5% CO2を含む加湿雰囲気で）維持された。コンフルエンスで、培養はトリプシン／EDTA（Gibco, Grand Island, NY）を用いた解離の後に再移植され、24時間毎に栄養補給された。この条件の下で、HT-29 SF細胞の対数増殖期の倍加時間は24時間であった。
【０１７０】
フロー・サイトメトリー
細胞を105/60mm皿で撒き、これを２回行った。細胞サイクルの分布を分析するため、培養は0, 25, 50, 又は200μM DHEAに晒された。DHEAの細胞サイクル効果の逆転を分析するため、培養は0, 又は25μM DHEAに晒され、培地はMVA, CH, RN, MVAプラスCH, 又はMVAプラスCHプラスRN,で補われるか、又は補われなかった。培養物は、0, 24, 48, 又は74時間後にトリプシン処理され、Bauer et al., Cancer Res. 46, 3173-3178 (1986)の手順の変型を用いて固定され染色された。簡単に言うと、細胞は遠心分離によって集められ、冷リン酸緩衝食塩水に再懸濁された。細胞は、70%エタノールで固定され、洗浄され、リン酸緩衝食塩水に再懸濁された。1 mlの低張性染色液（50μg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma Chemical Co.), 20μg/ml Rnase A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 30 mg/mlポリエチレングリコール、0.1% Triton X-100を含む5mMクエン酸緩衝液）が加えられ、室温で10分後、1 mlの等張性染色液（ヨウ化プロプロピジウム、ポリエチレングリコール、Triton X-100を含む0.4M NaCl）が加えられ、細胞がパルス幅／パルス面積ダブレット識別を備えたフロー・サイトメーター（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA）を用いて分析された。蛍光ビーズによる校正後、最小2 x 104細胞／サンプルが分析され、データは、増加する蛍光強度の1024チャンネルの各々における細胞総数で表示され、得られたヒストグラムがCellfit分析プログラム（Becton Dickinson）を用いて分析された。
【０１７１】
細胞増殖に対するDHEAの効果
細胞は、25,000細胞／30mm皿で４回分撒き、2日後に0, 12.5, 25, 50, 又は200μM DHEAを受けた。細胞数を0, 24, 48, 及び72時間後にCoulterカウンター（モデルＺ、Coulter Electronics, Inc. Hialeah, FL）を用いて測定した。DHEA（AKZO, Basel, Switzerland）はジメチルスルホキシドに溶解され、フィルター滅菌され、使用するまで-20℃で貯蔵された。
【０１７２】
図１４は、DHEAによるHT-29細胞の増殖阻害を示す。点は細胞の数を示し、バーはSEMを示す。各データ点は四重複で得られ、実験は三回繰り返された。SEMバーが見られない場合はSEMが記号よりも小さかった。DHEAへの曝露は、12.5μM中で72時間後、25又は50μM中で48時間後、200μM中で24時間後、対照に比べた細胞数の減少を生じ、DHEAが増殖に対して時間及び用量依存的な阻害を生ずることを示した。
【０１７３】
細胞サイクルに対するDHEAの効果
細胞サイクル分布に対するDHEAの効果を調べるために、HT-29 SF細胞を撒き（105細胞／60 mm皿）、48時間後、0, 25, 50, 又は200μM DHEAで処理された。図１５は、HT-29 SF細胞における細胞サイクルに対するDHEAの効果を示す。24, 48, 及び72時間後、細胞を収穫し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色され、DNA含有量／細胞がフロー・サイトメーターによる分析で決定された。G1, S, 及びG2M期にある細胞の割合が、Cellfit細胞サイクル分析プログラムを用いて計算された。S期は分かりやすいように四角形でマークされている。重複した決定からの代表的なヒストグラムが示されている。実験は三回繰り返された。
【０１７４】
25, 又は50μM DHEAで処理された培養における細胞サイクル分布は最初の24時間の後でも変化しなかった。しかし、DHEAに曝露される時間が増すにつれて、S期にある細胞の比率がどんどん減少し、G1, S, 及びG2M期にある細胞の割合が、Cellfit細胞サイクル分析プログラムを用いて計算された。S期は分かりやすいように四角形でマークされている。重複した決定からの代表的なヒストグラムが示されている。実験は三回繰り返された。
【０１７５】
25, 又は50μM DHEAで処理された培養における細胞サイクル分布は最初の24時間の後でも変化しなかった。しかし、DHEAに曝露される時間が増すにつれて、S期にある細胞の比率がどんどん減少し、72 時間後にG1期にある細胞のパーセンテージが増加した。G2M期にある細胞の一時的な増加が48時間後に見られた。200μM DHEAへの曝露も、24時間後、G1期にある細胞の割合と同様の、しかしもっと速やかな増加と、S期にある細胞の比率の減少を生じ、これは処理の間ずっと続いた。このことは、DHEAがHT-29 SF細胞に時間−及び用量依存的な仕方でG1ブロックを生じたということを示している。
【０１７６】
実施例１０：増殖と細胞サイクルへのDHEAに媒介される効果の逆転とDHEAによる増殖阻害の逆転
細胞は上のように植えられ、２日後に0又は25μM DHEA含有培地をメバロン酸（“MVA”；mM）スクアレン（SQ；80μM）、コレステロール（CH；15μg/ml）、MVAプラスCH；リボヌクレオシド（RN；ウリジン、シチジン、及びグアノシン、各最終濃度30μM）、デオキシリボヌクレオシド（チミジン、デオキシシチジン、及びデオキシグアノシン、各最終濃度20μM）、RNプラスDN、MVAプラスCHプラスRN、で補った培地、又は補われなかった培地を受けた。すべての化合物はSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から入手した。コレステロールは使用の直前にエタノールに可溶化された。RNとDNはDHEAが存在しなければ増殖に何も影響しないと言うことが示されている最大濃度で用いられた。
【０１７７】
図１６は、HT-29 SF細胞におけるDHEAによって誘発される増殖阻害の逆転を示す。Aでは、培地は、2μM MVA, 80μM SQ, 15μg/ml CH, 又はMVAプラスCH (MVA+CH)で補うか、又は補われなかった(CON)。Bでは、培地は、ウリジン、シチジン、アデノシン、及びグアノシンを各30μMという最終濃度で含むRNの混合物；チミジン、デオキシシチジン、デオキシアデノシン及びデオキシグアノシンを各20μMという最終濃度で含むDNの混合物；RNプラスDN (RN+DN)；又はMVAプラスCHプラスRN (MVA+CH+RN)、で補われた。細胞数は48時間の処理の前と後に評価され、細胞増殖は48時間の処理期間の間の細胞数の増加として計算された。列は処理されない対照の細胞増殖割合を表す；バーはSEMを表す。処理されない対照における細胞数の増加は、173,370”6518であった。各データ点は４つの独立な実験からの四重複の皿を表す。統計解析はStudentのtテストκp<0.01；Ψp<,0.001；処理された対照と比較を用いて行われた。補ったサプリメントはDHEAが存在しないときには細胞増殖にほとんど影響を及ぼさないことに注意すべきである。
【０１７８】
これらの条件の下で、DHEAによって誘発される増殖の阻害は、MVAの添加によって、並びにMVAプラスCHの添加によって部分的に克服された。SQ又はCHを単独で添加してもそのような効果はなかった。このことは、DHEAの細胞増殖抑制作用は、一部分、内因性のメバロン酸の欠乏と、その後の細胞増殖に不可欠なコレステロール経路における初期中間物質の生合成の阻害によって媒介されたことを示唆する。さらに、増殖の部分的な回復がRNの添加後並びにRNプラスDNの添加後に見られたが、DNの添加後には見られず、このことは、DHEAの増殖阻害作用にはメバロン酸とヌクレオチド・プールの両方の欠乏が関与していることを示す。しかし、MVA, CH, 及びRNを合わせて添加することを含めて増殖回復条件はどれもDHEAの阻害作用を完全には克服できず、それは細胞毒性作用を示唆するか、又は別の生化学経路が関与していることを示唆する。
【０１７９】
細胞サイクルに対するDHEAの効果の逆転
HT-29 SF細胞が25 FM DHEAとMVA, CH, 又はRNなどのいくつかの化合物との組み合わせによって処理され、それらがDHEAの細胞サイクル特異的な効果を阻止する能力が調べられた。細胞サイクル分布は、48時間及び72時間後にフローサイトメトリーを用いて決定された。
【０１８０】
図１７は、HT-29 SF細胞におけるDHEAによって誘発される停止の逆転を示す。細胞が植えられ（105細胞／60mm皿）、48時間後に0又は25 FM DHEAによって処理された。培地は2 FM MVA；15 Fg/ml CH；ウリジン、シチジン、アデノシン、及びグアノシンを各30μMという最終濃度で含むRNの混合物；MVAプラスCH (MVA+CH)；MVAプラスCHプラスRN (MVA+CH+RN)；で補われるか、又は補われなかった。48又は72時間後、細胞が収穫され、エタノールで固定され、沃化プロピジウムで染色され、DNA含有量／細胞がフロー・サイトメーターによる分析で決定された。G1, S, 及びG2M期にある細胞のパーセンテージが、Cellfit細胞サイクル・プロファイル分析プログラムを用いて計算された。S期は分かりやすいように四角形でマークされている。重複した決定からの代表的なヒストグラムが示されている。実験は二回繰り返された。補ったサプリメントはDHEAが存在しないときには細胞サイクルの進行にほとんど影響を及ぼさないことに注意しよう。
【０１８１】
曝露時間が増すにつれて、DHEAはS期の細胞の数をどんどん減少させた。MVAを含めると最初の48時間はこの効果が一部抑えられたが、72時間後は抑えられず、MVAプラスCHの添加も72時間でS期の欠乏を部分的に抑えることができ、長時間の曝露で細胞を停止させないためにはMVAとCHの両方が必要であることを示唆する。MVA、CH、及びRNの添加は明らかに回復のために最も効果的であるが、それでもS期細胞の数を処理されない対照培養で見られる値に戻すことはできなかった。CH又はRN単独では、48時間でほとんど効果がなく、72時間では全く効果がなかった。形態的には、細胞は丸い形になってDHEAに反応したが、これはMVAを培地に加えることでのみ抑えられた。図４の72時間のDHEA曝露後のDNAヒストグラムのいくつかは、また、明らかにDNA含有量が減少した細胞の小集団の存在を示している。HT-29細胞ラインは、いろいろな数の染色体を含む細胞集団を含んでいることが知られているので（68-72; ATCC）、これは分離した染色体が少ない細胞の小集団を表しているのかもしれない。
【０１８２】
結論
上の実施例９−１０は、内因性のメバロン酸を欠乏させることが知られている濃度のDHEAにHT-29 SFヒト結腸アデノカルシノーマ細胞をin vitroで晒すと、増殖の阻害とG1停止を生じ、培地にMVAを加えるとこの効果が部分的に抑えられるという証拠を与える。DHEAは、タンパク質のイソプレニル化に対する効果を生じ、それは多くの点でロバスタチンやコンパクチンなどの特異的3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリルCoAに関して見られるものと同様である。しかし、メバロン酸生合成の直接的な阻害物質と異なり、DHEAは、リボ−及びデオキシリボヌクレオチドの生合成に関わり、多分さらに他の因子にも関わる多面的効果のような仕方で（pleiotropic manner）細胞サイクルの進行と細胞増殖に対するその効果を生ずる。
【０１８３】
【表１４】
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【０１８４】
【表１５】
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【０１８５】
【表１６】
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【０１８６】
【表１７】
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【０１８７】
以下の実施例１５−１８では、第一及び第二の活性物質は、微紛化されて上記の比率でラクトースとバルクでブレンドサレル。ブレンドは硬いゼラチン・カプセル又はカートリッジに、又は特に構成された二重ホイル・ブリスター・パック（Rotadisls blister pack, Glaxo(商標)）に充填され、Rothaler吸入器(Glaxo(商標))などの吸入器によって、又はブリスター・パックの場合はディスクハーラー吸入器によって、投与される。
【０１８８】
【表１８】
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【０１８９】
【表１９】
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【０１９０】
【表２０】
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【０１９１】
【表２１】
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【０１９２】
実施例１９：EGFで誘発されるASM増殖にDHEA-Sが単独で又はムスカリン受容体遮断と組み合わせて及ぼす効果
以下の研究では、我々はDHEA-サルフェートがヒトASM細胞における成長因子で誘発されるDNA合成を変調させ、それが重篤な慢性喘息の管理で新しい治療アプローチに結びつく可能性がないかどうか、という問題を取り上げた。
【０１９３】
ヒトASM細胞が、ペンシルバニア大学のInstitutional Review Boardの規定に従って移植ドナーの遠位気管から得られた。遠位気管は、結合組織を切り離し、酵素で消化して約1 x 104個のヒトASM細胞が得られた。次に、これらの細胞を10%ウシ胎児血清でコンフルエンスまで生育させ、1%ウシ血清アルブミンを含む無血清培地で24時間休止させた。その後、細胞は、希釈剤、PDGF (10 ng/ml)、EGF (1 ng/ml)、又はトロンビン (1 U/ml)、と共に24時間インキュベートされた。最初のインキュベーションの後、細胞は[3H]-チミジンに曝露され、DNA合成がチミジン取り込みによって24時間にわたって測定された。細胞を削り取り、フィルターに載せ、ベータ腺カウンターによってそれをカウントした。すべての実験は、最小でも３つのヒトASM細胞ラインで繰り返された。実験毎のすべての条件は６回の反復試験で調べられた。データは、平均±平均の標準誤差で表され、統計解析はBonferroni-Dunn correctionとANOVAを用いて行われ、有意性がP<0.5で示された。
【０１９４】
EGFはASM増殖に８倍の増加を生じ、それが10μMのメチルコリン（Mch）の存在下で波さらに強められる。ムスカリン性作動薬アトロピンだけではEGF応答に何も効果がないが、Mchの効果は逆転させた。DHEA-SはMchとアトロピンの組み合わせがあってもなくてもEGF応答を減少させることができた。結果については図１８を見よ。
【０１９５】
一つの作用メカニズムに限定するつもりはないが、これらの結果は、in vitroで、緊張性の気道気管支収縮薬の緊張の存在下で、アトロピンとDHEA-Sの両方は一緒に働いて気道平滑筋の増殖とリモデリングを抑制することができることを示している。
【０１９６】
DHEA-サルフェートの他に、他の非グルココルチコイド・ステロイド、例えばエピアンドロステロンと誘導体、類似体、及び医薬的に受容されるその塩を第一の活性物質として用いることができる。例えば、本明細書で化学式I, III, 及びIVで記載されているような化合物である。
【０１９７】
本発明を現在好ましいとされる実施形態について説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなくいろいろな変型が可能であることは言うまでもない。
【０１９８】
すべての刊行物、特許、及び特許出願、及びウエブサイトは、参照によってその全体が、個々の刊行物、特許、及び特許出願が参照によって本明細書に組み込まれると特定してかつ個別的に言明されたと同様に、本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、単一用量Acu-Breathe吸入器から送達される混じりけなしの微紛化DHEA-S2H2Oの微粒子比率を示す。結果はDHEA-Sとして表されている。ほとんど無水の微紛化DHEA-SについてのIDLデータも図に示されており、図では30 L/minの結果がゼロにセットされた。これは何も検出できるほどの量がインパクターに入らなかったからである。
【図２】図２は、ほとんど無水のDHEA-Sバルクの混じりけなしの状態及びラクトース・ブレンドで１週間50℃で貯蔵した後のHPLCクロマトグラムを示す。対照は、室温（RT）で貯蔵された混じりけなしのDHEA-Sだった。
【図３】図３は、DHEA-S・2H2Oバルクの混じりけなしの状態及びラクトース・ブレンドで１週間50℃で貯蔵した後のHPLCクロマトグラムを示す。対照は、RTで貯蔵された混じりけなしのDHEA-S・2H2Oだった。
【図４】図４は、二つの温度でのDHEA-Sの溶解度をNaCl濃度の関数として示す。
【図５】図５は、24-25℃におけるDHEA-Sの溶解度をナトリウム陽イオン濃度の逆数の関数として示す。
【図６】図６は、7-8℃におけるDHEA-Sの溶解度をナトリウム陽イオン濃度の逆数の関数として示す。
【図７】図７は、バッファーがある場合とない場合のRTにおけるDHEA-Sの溶解度をNaCl濃度の関数として示す。
【図８】図８は、バッファーがある場合とない場合の24-25℃におけるDHEA-Sの溶解度をナトリウム陽イオン濃度の逆数の関数として示す。
【図９】図９は、二つの貯蔵温度におけるDHEA-Sの溶液濃度  対  時間を示す。
【図１０】図１０は、二つの貯蔵温度におけるDHEAの溶液濃度  対  時間を示す。
【図１１】図１１は、噴霧化実験の概略図を示す。
【図１２】図１２は、バイパス捕集器に沈着したDHEA-Sの質量を噴霧器に入れられた初期溶液濃度の関数として示す。
【図１３】図１３は、DHEA-S噴霧器溶液についてカスケード・インパクションによる粒径を示す。示されたデータは７回の噴霧化実験全部の平均である。
【図１４】図１４は、DHEAによるHT-29 SF細胞の阻害を示す。
【図１５Ａ】図１５は、DHEAがHT-29 SF細胞における細胞サイクル分布に及ぼす影響を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、DHEAがHT-29 SF細胞における細胞サイクル分布に及ぼす影響を示す。
【図１６】図１６aと１６bは、HT-29細胞におけるDHEAで誘発される成長阻害の逆転を示す。
【図１７Ａ】図１７は、HT-29 SF細胞におけるDHEAで誘発されるG1停止の逆転を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、HT-29 SF細胞におけるDHEAで誘発されるG1停止の逆転を示す。
【図１７Ｃ】図１７は、HT-29 SF細胞におけるDHEAで誘発されるG1停止の逆転を示す。
【図１７Ｄ】図１７は、HT-29 SF細胞におけるDHEAで誘発されるG1停止の逆転を示す。
【図１８】図１８は、抗コリン作用薬とDHEA-SがヒトASM細胞に及ぼす影響を示す。
【図１９】図１９は、DHEAのいくつかの適当な類似体を示す。
【図２０】図２０は、DHEAのいくつかの適当な類似体を示す。
【図２１】図２１は、DHEAのいくつかの適当な類似体を示す。
【図２２】図２２は、DHEAのC-17ケトンの適当な修飾を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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